(57)【要約】  本開示は、メタロ-β-ラクタマーゼ、特にカルバペネマーゼを選択的検出することにより、カルバペネム耐性である細菌種を感受性である細菌系統から見分けるために有用なプローブの実施形態を包含する。6,7 R,R配置を有するセファロスポリンに基づくプローブはβ-ラクタマーゼによる切断を受けることができるが、メタロ-β-ラクタマーゼによる切断と他のβ-ラクタマーゼによる切断とを見分けることができない。β-ラクタム環の6,7位をR,R配置からS,Rに改変することにより、セファロスポリンを、メタロ-β-ラクタマーゼすなわちカルバペネマーゼにより切断可能であるが他のラクタマーゼによっては実質的に切断不可能にし得る。さらに、セファロスポリンの側鎖を改変することにより選択性を導入することができ、プローブが様々な種類のメタロ-β-ラクタマーゼ同士を見分け、細菌の系統および産生されるメタロ-β-ラクタマーゼの種類をより狭く特定できるようになる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタロ-β-ラクタマーゼによって選択的に切断可能なプローブを含む組成物であって、前記プローブは6,7-トランス配置を有するセファロスポリンとそれに結合された検出可能標識とを含む、組成物。
【請求項２】
前記プローブは下記式Iまたは式IIを有し、
【化１】
2017505612.tif 000042
式中、R1は、アルキル、置換アルキル、芳香族基、置換芳香族基、フルオロフォア、および蛍光クエンチャーからなる群から選択される、
請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
R1は、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ベンジル、およびトシルオキシからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
前記検出可能標識は、-O-、-N-、または-S-連結によって前記セファロスポリンに結合されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
前記検出可能標識は、(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)（III）または(4S)-2-(6-オキソ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロチアゾール-4-カルボン酸（IV）であり、下記構造を有する、請求項1に記載の組成物。
【化２】
2017505612.tif 000043
【請求項６】
前記プローブは、以下のものからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
【化３】
2017505612.tif 000044
2017505612.tif 000045
【請求項７】
メタロ-β-ラクタマーゼ活性を選択的に検出する方法であって、前記方法は、メタロ-β-ラクタマーゼ活性を有することが疑われる試料を、メタロ-β-ラクタマーゼにより選択的に切断可能なプローブを含む組成物に接触させ、前記プローブは、6,7-トランス配置を有するセファロスポリン部分と検出可能標識とを含む工程と；メタロ-β-ラクタマーゼ活性が前記セファロスポリン部分を切断するために有効な時間を経過させ、それによって前記セファロスポリン部分から前記検出可能標識を放出させ、検出可能シグナルを発生させる工程と；前記シグナルを検出する工程とを含み、検出可能シグナルは、前記試料がメタロ-β-ラクタマーゼ活性あるいはメタロ-β-ラクタマーゼ活性供給源を含有することを示す、方法。
【請求項８】
前記プローブは下記式Iまたは式IIを有し、
【化４】
2017505612.tif 000046
式中、R1は、アルキル、置換アルキル、芳香族基、置換芳香族基、フルオロフォア、および蛍光クエンチャーからなる群から選択される、
請求項7に記載の方法。
【請求項９】
R1は、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ベンジル、およびトシルオキシからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能標識は、色素、蛍光標識、放射性標識、ルシフェラーゼ基質、またはクエンチャーである、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出可能標識は、-O-、-N-、または-S-連結によって前記プローブに結合されている、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能標識は、(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)（III）または(4S)-2-(6-オキソ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロチアゾール-4-カルボン酸（IV）であり、下記構造を有する、請求項7に記載の方法。
【化５】
2017505612.tif 000047
【請求項１３】
前記プローブは、以下のものからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
【化６】
2017505612.tif 000048
2017505612.tif 000049
【請求項１４】
前記試料は細菌培養物である、請求項7に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料は動物対象またはヒト対象から単離されたものである、請求項7に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料は、ヒト対象または動物対象由来の試料から産生された細菌培養物である、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料はKlebsiella種またはEscherichia種のうちの少なくとも1つを含む、請求項に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能標識はルシフェラーゼ基質であり、前記方法は、反応混合物をルシフェラーゼと接触させることにより、放出されたルシフェラーゼ基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルを産生させることをさらに含む、請求項12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願への相互参照］
本願は、2014年1月17日に出願され「カルバペネム耐性細菌の検出用のプローブ」と題された米国仮特許出願第61/928,524号、および2014年3月21日に出願され「メタロ−β−ラクタマーゼを発現する細菌の検出用の6,7-トランスセファロスポリンに基づく蛍光発生プローブ」と題された米国仮特許出願第61/968,404号に基づく優先権を主張し、これらの出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
［配列表］
本開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる配列表を含む。
【０００３】
［技術分野］
本開示は、カルバペネム耐性腸内細菌科（CREs：carbapenem-resistant enterobacteriaceae）に特異的であり、6,7-トランス配置を含むように改変された立体化学的改変セファロスポリンに基づく、蛍光発生プローブに関する。本開示はさらに、メタロ−β−ラクタマーゼ（metallo-β-lactamase）活性によりカルバペネム耐性である細菌系統を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
大腸菌、クレブシエラ種、およびその他の腸内細菌科のようなグラム陰性細菌内の抗生物質耐性は、抗生物質の誤用および過用により、警戒すべき速さで世界中に現れている（Queenan & Bush (2007) Clin. Microbiol. Rev. 20: 440-458; Richard et al., (1994) J. Infect. Dis. 170: 377-383; Spellberg et al., (2013) N. Engl. J. Med. 368: 299-302）。特に、広域性β−ラクタム抗生物質に対する抵抗性は、主要な公衆衛生上の懸念となっている。多くの抗生物質のうち、カルバペネム系薬は、最も広域な活性、および、異なる種類の細菌に対して最も強い効力を有しており、重篤な細菌感染の治療における「最後の手段」となっている（Bradley et al., (1999) Int. J. Antimicrob. Agents 11: 93-100; Papp-Wallace et al., (2011) Antimicrob. Agents Chemother. 55: 4943-4960）。しかしながら、後天性のカルバペネマーゼを主な要因として、カルバペネム耐性腸内細菌科（CREs）は今や頻繁に観察され、その事例数は着実に増えている（Queenan & Bush (2007) Clin. Microbiol. Rev. 20: 440-458; Nordmann et al., (2011) Emerg. Infect. Dis. 17: 1791-1798）。
【０００５】
カルバペネマーゼは、ほとんど全てのβ−ラクタム抗生物質を加水分解する能力を有するβ−ラクタマーゼの一群であり、KPC型のアンブラー分類クラスA β−ラクタマーゼ、VIM-、IMP-、ニューデリー型メタロ−β−ラクタマーゼ（NDM）のメタロ−β−ラクタマーゼ（MBL）（アンブラー分類クラスB）、および比較的稀なOXA-48型のクラスDカルバペネマーゼを含む（Queenan & Bush (2007) Clin. Microbiol. Rev. 20: 440-458; Nordmann et al., (2011) Emerg. Infect. Dis. 17: 1791-1798; Miriagou et al., (2010) Clin. Microbiol. Infect. 16: 112-122）。カルバペネマーゼはまた、特にMBLについては、院内感染症および市中感染症における治療失敗の原因として報告されることが増えているが、これは、異なる系統間の伝播および臨床的に使用可能な阻害剤に対する感受性の乏しさのためである（Queenan & Bush (2007) Clin. Microbiol. Rev. 20: 440-458; Walsh et al., (2011) Clin. Microbiol. 49: 3222-3227）。従って、MBL産生菌の迅速かつ正確な検出は、適切な抗菌化学療法および厳重な感染管理のために決定的に重要である。
【０００６】
現在、β−ラクタマーゼの検出のための標準的な診断的方法（例えば、改変ホッジ試験（MHT：Modified Hodge Test）（Nordmann et al., (2012) Clin. Microbiol. Infect. 18: 432-438; Cohen & Leverstein-van (2010) Int. J. Antimicrob. Agents 36: 205-210; Bernabeu et al., (2012) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 74: 88-90; Dortet et al., (2012) Antimicrob. Agents. Chemother. 56: 6437-6440）および「ダブルディスクシナジー試験」（DDST：double-disk synergy test）（Arakawa et al., (2000) J. Clin. Microbiol. 38: 40-43）は、必要な特異度および感度を欠いており、かつ時間がかかり、ほとんどの細菌の正確な検出のために通常少なくとも24〜48時間を要するが、増殖速度が遅い細菌については数日間も要する。
【０００７】
PCRに基づく方法（Poirel et al., (2011) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 70: 119-125; Avlami et al., (2010) J. Microbiol. Methods. 83: 185-187; Chen et al., (2011) J. Clin. Microbiol. 49: 579-585）および質量分析（Burckhardt & Zimmermann (2011) J. Clin. Microbiol. 49: 3321-3324; Hrabak et al., (2011) J. Clin. Microbiol. 49: 3327-3332）は高い正確性と感度を有するが、コストが高いこと、装置の要求性が大きいこと、および、新たに進化したカルバペネマーゼ遺伝子は検出できないことという短所を伴う。Nordmannによって最近開発されたカルバ-NP試験（CNP）（Nordmann et al., (2012) Emerg. Infect. Dis. 18: 1503-1507; Dortet et al., (2012) J. Clin. Microbiol. 50: 3773-3776; Dortet et al., (2012) Antimicrob. Agents Chemother. 56: 6437-6440）は高い特異度を有するが、細菌溶解物にしか適用できない。
【０００８】
それに対して、蛍光ベースの生化学分析アッセイは、高い感度、使用の容易さ、迅速な検出、低いコスト、および、分析前に生物学的試料を処理する必要性がほとんどないか全くないという利点がある。高い感度でβ−ラクタマーゼ活性の検出を可能にする多数の蛍光プローブが開発されてきた（Gao et al., (2003) J. Am. Chem. Soc. 125: 11146-11147; Zlokarnic et al., (1998) Science 279: 86-88; Xing et al., (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 4158-4159; Kong et al., (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 419: 9-16; Xie et al., (2012) Nat. Chem. 4: 802-809; Watanabe et al., (2010) Bioconjugate Chem. 21: 2320-2326; Zhang et al., (2012) Angew. Chem. Int. Ed. 51: 1865-1868; Yang et al., (2007) J. Am. Chem. Soc. 129: 266-267）。しかしながら、これらのプローブのほとんどはカルバペネマーゼに対する特異性を欠いている。いくつかのプローブは、ある種の阻害剤と組み合わされた場合にのみ、カルバペネマーゼの検出のために使用されてきた（Zhang et al., (2012) Angew. Chem. Int. Ed. 51: 1865-1868）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、カルバペネマーゼを特異的に検出するために利用可能な蛍光プローブはほとんどない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、細菌におけるMBLの特異的検出に適した6,7-トランス配置のセファロスポリンをベースとする一連の蛍光発生プローブを提供する。
【００１１】
本開示は、メタロ−β−ラクタマーゼ、特にカルバペネマーゼの選択的検出のために有用なプローブの実施形態を包含するものであり、それにより、カルバペネム耐性の細菌種を感受性の細菌系統から区別する。6,7 R,R配置を有するセファロスポリンに基づくプローブはβ−ラクタマーゼによる切断を受けることができるが、メタロ−β−ラクタマーゼによる切断と他のβ−ラクタマーゼによる切断とを区別することができない。β−ラクタム環の6,7位をR,R配置からS,R配置へと改変すると、セファロスポリンは、メタロ−β−ラクタマーゼすなわちカルバペネマーゼによっては切断可能であるが他のラクタマーゼによっては実質的に切断不可能となる。さらに、セファロスポリンの側鎖を改変することによって選択性を導入することができ、プローブが様々な種類のメタロ−β−ラクタマーゼを見分けることが可能になり、従って細菌の系統および産生されるメタロ−β−カルバペネマーゼの種類をより狭く特定することが可能になる。
【００１２】
本開示の一側面は、従って、メタロ−β−ラクタマーゼによって選択的に切断可能なプローブを含む組成物の実施形態を包含し、そのプローブは、6,7-トランス配置を有するセファロスポリンとそれに結合した検出可能な標識とを含む。本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、プローブは下記式Iまたは式IIを有することができ、
【化１】
2017505612.tif 000002
式中、R1は、アルキル、置換アルキル、芳香族基、置換芳香族基、フルオロフォア、および蛍光クエンチャーからなる群から選択され得る。
【００１３】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、R1は、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ベンジル、およびトシルオキシからなる群から選択され得る。
【００１４】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、検出可能標識は、(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)（III）または(4S)-2-(6-オキソ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロチアゾール-4-カルボン酸（IV）であり、下記構造を有し得る。
【化２】
2017505612.tif 000003
【００１５】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、プローブは、以下のものからなる群から選択され得る。
【化３】
2017505612.tif 000004
2017505612.tif 000005
【００１６】
本開示の別の一側面は、メタロ−β−ラクタマーゼ活性を選択的に検出する方法の実施形態を包含し、その方法は、メタロ−β−ラクタマーゼ活性を有することが疑われる試料を、メタロ−β−ラクタマーゼにより選択的に切断可能なプローブを含む組成物に接触させ、前記プローブは、6,7-トランス配置を有するセファロスポリン部分と検出可能標識とを含む工程と；メタロ−β−ラクタマーゼ活性が前記セファロスポリン部分を切断するために有効な時間を経過させ、それによって前記セファロスポリン部分から前記検出可能標識を放出させ、検出可能シグナルを発生させる工程と；前記シグナルを検出する工程とを含み、検出可能シグナルは、前記試料がメタロ−β−ラクタマーゼ活性あるいはメタロ−β−ラクタマーゼ活性供給源を含有することを示す。
【００１７】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、プローブは下記式Iまたは式IIを有し、
【化４】
2017505612.tif 000006
式中、R1は、アルキル、置換アルキル、芳香族基、置換芳香族基、フルオロフォア、および蛍光クエンチャーからなる群から選択される。本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、R1は、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ベンジル、およびトシルオキシからなる群から選択される。
【００１８】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、検出可能標識は、(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)（III）または(4S)-2-(6-オキソ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロチアゾール-4-カルボン酸（IV）であり、下記構造を有することができ、
【化５】
2017505612.tif 000007
以下のものからなる群から選択され得る。
【化６】
2017505612.tif 000008
2017505612.tif 000009
【００１９】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、検出可能標識はルシフェラーゼ基質であり得、前記方法は、さらに、反応混合物をルシフェラーゼと接触させることによって、放出されたルシフェラーゼ基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルを生成させる工程を含み得る。
【００２０】
本開示の諸側面は、添付の図面を参照するとより容易に理解されるであろう。図面は下記の記述および実施例においてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図1Aは、本開示の蛍光発生プローブの実施形態についての設計原理を示す。  図1Bは、カルバペネマーゼを標的とする蛍光発生プローブについての設計原理およびそれらの一般的構造を示す。これらの実施形態ではフルオロフォアは-O-によってセファロスポリン部分に連結されているが、そのような連結は例えば-N-または-S-であってもよい。
【００２２】
【図２】図2A〜2Fは、本開示のプローブのβ−ラクタマーゼ選択性を例示する一連のグラフである。25μLの 1 x PBSバッファー（pH = 7.4）中室温で2時間、プローブ（10μM）とインキュベーションした後の、表示された量のβ−ラクタマーゼの相対的蛍光量。  図2A：CDC-1プローブ。図2B：(s)-CC-1。図2C：(s)-CC-3。図2D：(s)-CC-4。図2E：(s)-CC-5。図2F：(s)-CC-6。相対的蛍光量は、β−ラクタマーゼインキュベーションの有り無しでの蛍光強度の差を表す。蛍光量は363 nmにおける励起および454 nmにおける発光を用いて測定した（バンド幅＝5/7.5 nm）。エラーバーは±SDである。
【００２３】
【図３】図3A〜3Fは、1 x PBSバッファー（pH = 7.4）中室温で2時間、CRE-特異的プローブ（10μM）とインキュベーションした後の、β−ラクタマーゼ発現細菌の相対的蛍光量を示す一連のグラフである。  図3A：CDC-1プローブ。図3B：(s)-CC-1。図3C：(s)-CC-3。図3D：(s)-CC-4。図3E：(s)-CC-5。図3F：(s)-CC-6。各図において左から右へ：IMP-1を有する大腸菌E. coli（IMP1-E. coli）、VIM-27を有するK. pneumoniae（VIM27-Kp）、NDM-1を有するE. coli（NDM1-E. coli）、KPC-3を有するK. pneumoniae（KPC3-Kp）、CTX-Mを有するK. pneumoniae（CTX-Kp）、SHV-18を有するK. pneumoniae（SHV18-Kp）、TEM-1 Blaを有するE. coli（TEM1-E. coli）、AmpCを有するE. coli（AmpC-E. coli）、BlaCで形質転換したE. coli（BlaC-E. coli）、OXA-48を有するK. pneumoniae（OXA48-Kp）、IMIを有するE. coli（IMI-E. coli）。AmpCを発現するE. coliでは107 c.f.u.が代わりに用いられたことを除き、細菌数は全て表示されている通りである。相対的蛍光量は、β−ラクタマーゼインキュベーションの有り無しでの蛍光強度の差を表す。蛍光量は363 nmにおける励起および454 nmにおける発光を用いて測定した（バンド幅＝5/7.5 nm）。エラーバーは±SDである。
【００２４】
【図４】図4は、本開示のカルバペネマーゼを標的とする蛍光発生プローブの合成を模式的に示す。（a）NaNO2、2N H2SO4、DCM、0℃、1時間。（b）ROH、p-TsOH、DCM、0℃〜室温（r.t.）一晩。（c） i）：NaI、アセトン、r.t、1時間；ii）7-ヒドロキシクマリン、K2CO3、CH3CN、r.t.、2.5時間。（d）1.0等量m-CPBA、DCM、0℃、0.5時間。（e）NaI、TFAA、アセトン、0℃、1時間。（f）DCM:TFA:TIPS:H2O = 65:30:2.5:2.5、30分間、0℃。
【００２５】
【図５】図5は、(s)-CC-2プローブのβ−ラクタマーゼ選択性を例示する一連のデジタル画像を示す。25μLの1 x PBSバッファー（pH = 7.4）中室温で2時間、プローブ（10μM）とインキュベーションした後の、表示された量のβ−ラクタマーゼの相対的蛍光量。ラクタマーゼは各図において左から右へ：VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3, TEM-1、およびBlaCである。相対的蛍光量は、β−ラクタマーゼインキュベーションの有り無しでの蛍光強度の差を表す。蛍光量は363 nmにおける励起および454 nmにおける発光を用いて測定した（バンド幅＝5/7.5 nm）。エラーバーは±SDである。
【００２６】
【図６】図6は、組換えβ−ラクタマーゼの画像化を例示する。表示されたプローブ（10μM）をPBS（1×、pH = 7.4）中で様々なβ−ラクタマーゼ（4 nM）と共に室温で2時間インキュベートした。UV光（360 nm）の励起を用いて画像を取得した。
【００２７】
【図７】図7A〜13Fは、ラクタマーゼVIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1、およびBlaCを伴うプローブの蛍光活性化の時間経過を表す一連のグラフを示す。エラーバーは±SDである。黒丸：ブランク。四角：200 fmol、25μl。三角：20 fmol、25μl。逆三角：5 fmol、25μl。ひし形：1 fmol、25μl。x軸：分。  図7A〜7F：ラクタマーゼVIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1、およびBlaCをそれぞれ伴うCDC-1の蛍光活性化の時間経過。
【００２８】
【図８】図8A〜8F：ラクタマーゼVIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1、およびBlaCをそれぞれ伴う(s)-CC-1の蛍光活性化の時間経過。
【００２９】
【図９】図9A〜9F：ラクタマーゼVIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1、およびBlaCをそれぞれ伴う(s)-CC-2の蛍光活性化の時間経過。
【００３０】
【図１０】図10A〜10F：ラクタマーゼVIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1、およびBlaCをそれぞれ伴う(s)-CC-3の蛍光活性化の時間経過。
【００３１】
【図１１】図11A〜11F：ラクタマーゼVIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1、およびBlaCをそれぞれ伴う(s)-CC-4の蛍光活性化の時間経過。
【００３２】
【図１２】図12A〜12F：ラクタマーゼVIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1、およびBlaCをそれぞれ伴う(s)-CC-5の蛍光活性化の時間経過。
【００３３】
【図１３】図13A〜13F：ラクタマーゼVIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1、およびBlaCをそれぞれ伴う(s)-CC-6の蛍光活性化の時間経過。
【００３４】
【図１４】図14A〜14Gは、本開示によるプローブの、緩衝液中における自発的加水分解を示す。  図14Aは、PBSバッファー中において本開示によるプローブが自発的に加水分解してウンベリフェロンを放出することによって蛍光シグナルを発生することを示す概略図である。[S]0 = 20μM：プローブの初期濃度、[P]：形成されたウンベリフェロン（加水分解産物）の濃度。  図14B〜14Gは、加水分解産物のパーセンテージの時間経過を表す一連のグラフを示す。エラーバーは３つの複製実験の標準偏差を示す。
【００３５】
【図１５】図15は、組換え発現酵素の調製物の純度を示す典型的なSDS-PAGE分析を例示するデジタル画像である。代表例として精製VIM-27（29.1 KDa）を示している。他の酵素の分子量も約30 KDaであり（BlaC、29.5 KDa；TEM-1、32.4 KDa；NDM-1、29.5 KDa；KPC-3、32.3 KDa；IMP-1、28.2 KDa）、それらもVIM-27と同等の純度および収率を示していた。M、タンパク質標準；1、発現誘導前の溶解物；2、発現誘導後の溶解物；3、細胞溶解後の可溶性画分；4、Ni-NTA結合後のフロースルー；5、洗浄1；6、洗浄2；7、洗浄5；8、PBS中250 mMのイミダゾールで溶出；9、PD-10カラムによる精製酵素。
【００３６】
【図１６】図16は、組換えβ−ラクタマーゼVIM-27（GenBankアクセス番号HQ858608.1）（配列番号1）、IMP-1（GenBankアクセス番号KC200566.1）（配列番号2）、NDM-1（GenBankアクセス番号AF059836.1）（配列番号3）、KPC-3（GenBankアクセス番号NC_019155.1）（配列番号4）、Oxa-48（配列番号5）、およびTEM-1（GenBankアクセス番号KC493654.1）（配列番号6）をコードする発現ベクターを生成するためのテンプレートとして使用した核酸配列を示す。これら酵素の対応するアミノ酸配列のGenBankアクセス番号を括弧内に示している。図では、発現ベクターに挿入する前のPCR増幅工程のために使用したプライマー配列の位置（表2に示した通り）を太字下線で表示している。
【００３７】
【図１７】図17は、プローブ(s)-CC-1、(s)-CC-2、(s)-CC-3、(s)-CC-4、(s)-CC-5、(s)-CC-6、および(s)-CC-7の式を示す。
【００３８】
【図１８】図18は、カルバペネマーゼを標的とする(s)-CC-7蛍光発生プローブの合成についてのスキームを示す。(a) NaNO2、2N H2SO4、DCM、0℃、1h。(b) t-BuOH、p-TsOH、DCM、0℃〜r.t、一晩。(c) (i)：NaI、アセトン、r.t、1h；(ii).7-ヒドロキシクマリン、K2CO3, CH3CN、r.t、2.5 h。(d) 1.0等量m-CPBA、DCM、0℃、0.5 h。(e) DCM:TFA:TIPS:H2O = 65:30:2.5:2.5、30分間、0℃。
【００３９】
【図１９】図19Aおよび19Bは、(s)-CC-7プローブの組換えβ−ラクタマーゼ選択性およびCRE特異性を示すグラフである。25μLの1 x PBSバッファー（pH = 7.4）において室温で2時間、プローブ（10μM）と共にインキュベートした後の、表示された量のβ−ラクタマーゼ（図19A）およびβ−ラクタマーゼ発現細菌（図19B）の相対的蛍光量。図19A、左から右へ、各濃度におけるVIM、IMP、NDM、KPC、TEM-1、BlaC。図19B、左から右へ：IMP-1を有するE. coli、VIM-27を有するK. pneumoniae、NDM-1を有するE. coli、KPC-3を有するK. pneumoniae、CTX-Mを有するK. pneumoniae、SHV-18を有するK. pneumoniae、TEM-1 Blaを有するE. coli、AmpCを有するE. coli、BlaCで形質転換したE. coli、OXA-48を有するK. pneumoniae、IMIを有するE. coli。AmpCを発現するE. coliでは107c.f.u.が用いられたことを除き、細菌数は全て表示されている通りである。相対的蛍光量は、β−ラクタマーゼ／インキュベーションの有り無しでの蛍光強度の差を表す。蛍光量は363 nmにおける励起および454 nmにおける発光を用いて測定した（バンド幅＝5/7.5 nm）。エラーバーは±SDである。
【００４０】
【図２０】図20は、室温で2時間1 x PBS（pH = 7.4）中で(s)-CC-7（10μM）と共にインキュベートした組換えβ−ラクタマーゼ（4 nM）のデジタル画像である。画像はUV光（360 nm）の励起により作製された。
【００４１】
【図２１】図21A〜21Fは、VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1およびBlaCを伴う表示されたプローブの蛍光活性化の時間経過を例示するグラフである。エラーバーは±SDである。
【００４２】
【図２２】図22は、カルバペネマーゼを標的とする生物発光プローブ(s)-CL-3および(s)-CL-6の合成についてのスキームを図示する。
【００４３】
【図２３】図23は、(s)-CL-3プローブのβ−ラクタマーゼ選択性を示すグラフである。25μLの1 x PBSバッファー（pH = 7.4）において室温で2時間、プローブ（1μM）と共にインキュベートした後の、表示された量のβ−ラクタマーゼの相対的蛍光量。相対的蛍光量は、β−ラクタマーゼインキュベーションの有り無しでの蛍光強度の差を表す。蛍光量は350 nmにおける励起（バンド幅5 nm）および550 nmにおける発光（バンド幅7.5 nm）を用いて測定した。エラーバーは±SDである。
【００４４】
【図２４】図24は、(s)-CL-6プローブのβ−ラクタマーゼ選択性を示すグラフである。25μLの1 x PBSバッファー（pH = 7.4）において室温で2時間、プローブ（1μM）と共にインキュベートした後の、表示された量のβ−ラクタマーゼの相対的蛍光量。相対的蛍光量は、β−ラクタマーゼインキュベーションの有り無しでの蛍光強度の差を表す。蛍光量は350 nmにおける励起（バンド幅5 nm）および550 nmにおける発光（バンド幅7.5 nm）を用いて測定した。エラーバーは±SDである。
【００４５】
【図２５】図25は、1 x PBSバッファー（pH = 7.4）において室温で2時間、(s)-CL-3プローブ（1μM）と共にインキュベートした後の、β−ラクタマーゼ発現細菌溶解物の相対的蛍光量を例示するグラフである。AmpCを発現するE. coliは107c.f.u.であったことを除き、細菌数は全て表示されている通りである。相対的蛍光量は、β−ラクタマーゼインキュベーションの有り無しでの蛍光強度の差を表す。蛍光量は350 nmにおける励起（バンド幅5 nm）および550 nmにおける発光（バンド幅7.5 nm）を用いて測定した。エラーバーは±SDである。
【００４６】
【図２６】図26は、1 x PBSバッファー（pH = 7.4）において室温で2時間、(s)-CL-6プローブ（1μM）と共にインキュベートした後の、β−ラクタマーゼ発現細菌溶解物の相対的蛍光量を例示するグラフである。AmpCを発現するE. coliは107c.f.u.であったことを除き、細菌数は全て表示されている通りである。相対的蛍光量は、β−ラクタマーゼインキュベーションの有り無しでの蛍光強度の差を表す。蛍光量は350 nmにおける励起（バンド幅5 nm）および550 nmにおける発光（バンド幅7.5 nm）を用いて測定した。エラーバーは±SDである。
【００４７】
【図２７】図27は、異なる量の精製NDM-1＋fLucに対する生物発光の依存性を示すグラフである。1μMにおける(s)-CL-6]。
【００４８】
【図２８】図28は、異なる濃度の精製NDM-1溶解物＋fLucに対する生物発光の依存性を示すグラフである。1μMにおける[(s)-CL-6]。
【００４９】
【図２９】図29は、(s)-CL-6のβ−ラクタマーゼ選択性を示す。100μLの 1 x PBSバッファー（pH = 7.4）において室温で2時間、プローブ（1μM）と共にインキュベートし、続けて50 ngのfLucを加えた後の、400 fモルのβ−ラクタマーゼの相対的発光量。相対的発光量は、β−ラクタマーゼインキュベーションの有り無しでの発光強度の差を表す。発光はIVIS 200で測定した。エラーバーは±SDである。
【００５０】
【図３０】図30は、(s)-CL-6のβ−ラクタマーゼ選択性を示す。100μLの 1 x PBSバッファー（pH = 7.4）において室温で2時間、プローブ（1μM）と共にインキュベートし、続けて50 ngのfLucを加えた後の、2 x 105 c.f.uのβ−ラクタマーゼ発現細菌の溶解物の相対的発光量。相対的発光量は、β−ラクタマーゼ発現細菌溶解物インキュベーションの有り無しでの発光強度の差を表す。IVIS によってグラフをとった。エラーバーは±SDである。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本開示をさらに詳細に説明する前に、この開示は記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、従って言うまでもなく変化し得ることが理解されるべきである。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるのであるから、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するだけの目的のものであって限定的な意図はないことが理解されるべきである。
【００５２】
数値範囲が提供される場合には、明らかに文脈に反しない限り、その範囲の上限と下限の間にある、下限の単位の十分の一に至るまで値の各々、および、その言及された範囲におけるあらゆる他の言及された値または介在する値が、本開示内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限と下限は、その言及された範囲において特に除外された限界に服する条件で、独立してそのより小さい範囲に含まれ得、本開示内にも包含される。言及された範囲が一方または両方の限界値を含む場合には、それら含まれた限界値の一方または両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【００５３】
特に他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様あるいは同等のあらゆる方法および材料も本開示の実施または試験において使用し得るが、好ましい方法および材料を以下に説明する。
【００５４】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許は、個々の刊行物および特許の各々が特定されてかつ個別に参照により組み入れられることが示されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れられ、それらの刊行物の引用に関係する方法および／または材料を開示し記述するために参照により本明細書に組み入れられる。刊行物の引用は出願日前のその開示に関するものであり、本開示が先の開示によってそのような刊行物に先んずる資格を有さないことの自認であるとは解されるべきではない。
【００５５】
本開示を読んだ当業者には明らかとなるように、本明細書において記述され説明される個々の実施形態の各々は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され、あるいはそのような特徴と組み合わせられる、別個の構成要素および特徴を有する。記載された方法は、記載された事象の順序において、または論理的に可能な他のあらゆる順序において実行され得る。
【００５６】
本開示の実施形態は、特に他に示されない限り、医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬学等の技術を利用し、これらは当業者の技量の範囲内である。そのような技術は文献において十分に説明されている。
【００５７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」「an」および「the」は、明らかに文脈に反しない限り、複数形の指示物を包含することに留意しなければならない。従って、例えば「a support」への言及は複数のsupportを包含する。本明細書および後に続く特許請求の範囲においていくつかの用語が言及されるが、それらの用語は、相反する意図が明白である場合を除き、以下の意味を有するように定義される。
【００５８】
本明細書において使用される場合、以下の用語は、他に指定されない限り、それらに属する意味を有する。本開示において、「comprises（含む）」、「comprising（含んでいる）」、「containing（含有している）」および「having（有している）」等は、米国特許法においてそれらに属するとされる意味を有し得、「includes（包含する）」、「including（包含している）」等を意味し得る。「consisting essentially of（〜から実質的になっている）」あるいは「consists essentially（から実質的になる）」等は、本開示により包含される方法および組成物に適用される場合には、本明細書に開示されているもののような組成物であるが、追加的な構造群、組成物構成要素、もしくは工程（または上述したようなそれらの類似体もしくは誘導体）を含有し得るものを表す。しかしながら、そのような追加的な構造群、組成物構成要素、もしくは工程等は、本明細書に開示された対応する組成物または方法のものと比較して、その組成物または方法の基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えない。
【００５９】
様々な実施形態を説明する前に、以下の定義が提供され、特に示されない限りこれらの定義が用いられるべきである。
【００６０】
略語
TFAA：トリフルオロ酢酸無水物（Trifluoroacetic anhydride）。MLB：メタロ-β-ラクタマーゼ（metallo-β-lactamase）。CRE：カルバペネム耐性腸内細菌科（carbapenem-resistant enterobacteriaceae）。PBS：リン酸緩衝食塩水（Phosphate-buffered saline）。TsOH：トルエンスルホン酸（toluenesulfonic acid）（PTSAもしくはpTsOH）またはトシル酸。CPBA：クロロ過安息香酸（chloroperoxybenzoic acid）。DCM：ジクロロメタン（dichloromethane）。TFA：トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid）。TIPS。SDS：ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate）。r.t：室温（room temperature）。
【００６１】
定義
開示された発明を説明しクレームするにあたり、下記に示す定義に従って以下の用語が使用される。
【００６２】
本明細書において単独でまたは組み合わされて使用される「アシル」という用語は、ラジカルに結合されたカルボニルまたはチオカルボニル基を意味し、そのラジカルは、例えば、任意で置換された、ヒドリド、アルキル（例えばハロアルキル）、アルケニル、アルキニル、アルコキシ（アセチルオキシ、ブチリルオキシ、イソ−バレリルオキシ、フェニルアセチルオキシ、ベリゾイルオキシ、p-メトキシベンゾイルオキシ、ならびに、アルコキシアルキルおよびハロアルコキシのような置換アシルオキシを含む「アシルオキシ」）、アリール、ハロ、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、スルホニル（例えばアリルスルフィニルアルキル）、スルホニル（例えばアルキルスルホニルアルキル）、シクロアルキル、シクロアルケニル、チオアルキル、チオアリール、アミノ（例えばアルキルアミノまたはジアルキルアミノ）、およびアラルコキシから選択される。「アシル」ラジカルの代表的な例は、ホルミル、アセチル、2-クロロアセチル、2-ブロムアセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、フタロイル、マロニル、ニコチニル等である。本明細書において使用される「アシル」という用語は、-C(O)R26の基を表し、ここでR26は、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルである。例としては、ホルミル、アセチル、シクロヘキシルカルボニル、シクロヘキシルメチルカルボニル、ベンゾイル、ベンジルカルボニル等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
本明細書において使用される「アシルアミノ」という用語は、アシル-NH-基を表し、ここでアシルは前に説明した通りである。
【００６４】
本明細書において使用される「アシルオキシ」という用語は、アシル-O-基を表し、ここでアシルは前に説明した通りである。
【００６５】
本明細書において、単独で、または「チオアルキル」や「アリールアルキル」のような他の用語内で使用される「アルキル」という用語は、直鎖（すなわち直線状）または分枝鎖であり得る一価の飽和炭化水素ラジカルを意味する。本開示で使用されるアルキルラジカルは、一般に、約1〜20個の炭素原子を含み、特に約1〜10、1〜8、または1〜7個の炭素原子を含み、とりわけ約1〜6個、または3〜6個の炭素原子を含む。例示的なアルキルラジカルとしては、メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、アミル、sec-ブチル、tert-ブチル、tert-ペンチル、n-へプチル、n-アクチル、n-ノニル、n-デシル、ウンデシル、n-ドデシル、n-テトラデシル、ペンタデシル、n-ヘキサデシル、ヘプタデシル、n-オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ドシル、n-テトラコシル等、およびそれらの分枝型が挙げられる。本開示のある側面では、アルキルラジカルは、メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、アミル、トリブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、tert-ペンチル、およびn-ヘキシルを含む、あるいはこれらからなる群から選択される、C1〜C6低級アルキルである。アルキルラジカルは、任意で、本開示の化合物の調製を著しく妨げず化合物の有効性を著しく低下させない位置において、本明細書に定義される置換基で置換されてもよい。本開示のある側面では、アルキルラジカルは、ハロ、低級アルコキシ、低級脂肪族、置換低級脂肪族、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、チオ、アミノ、ケト、アルデヒド、エステル、アミド、置換アミノ、カルボキシル、スルホニル、スルフリル、スルフェニル、硫酸、スルホキシド、置換カルボキシル、ハロゲン化低級アルキル（例えばCF3）、ハロゲン化低級アルコキシ、ヒドロキシカルボニル、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルカルボニルオキシ、低級アルキルカルボニルアミノ、環状脂肪族、置換環状脂肪族、またはアリール（例えばフェニルメチル ベンジル）、ヘテロアリール（例えばピリジル）、および複素環（例えばピペリジニル、モルフォリニル）を含む1〜5個の置換基で置換される。アルキル基上の置換基はそれ自体置換されていてもよい。
【００６６】
本明細書において使用される「アルケニル」という用語は、少なくとも1つの二重結合を含む不飽和非環式の分枝状または直鎖状炭化水素ラジカルを表す。アルケニルラジカルは、約2〜24個または2〜10個の炭素原子を含み得、特に約3〜8個の炭素原子、とりわけ約3〜6個または2〜6個の炭素原子を含み得る。適切なアルケニルラジカルとしては、エチニル、プロペニル（例えばプロプ-1-エン-1-イル、プロプ-1-エン-2-イル、プロプ-2-エン-1-イル（アリル）、およびプロプ-2-エン-2-イル）、ブテン-1-イル、ブト-1-エン-2-イル、2-メチル-プロプ-1-エン-1-イル、ブト-2-エン-1-イル、ブト-2-エン-2-イル、ブタ-1,3-ジエン-1-イル、ベタ-1,3-ジエン2-3/1、ヘキセン-1-イル、3-ヒドロキシヘキセン-イル、ヘプテン-1-イル、オクテン-1-イル等が挙げられるがこれらに限定されない。アルケニルラジカルはアルキルと同様に任意で置換され得る。
【００６７】
本明細書において使用される「アルキルカルバモイル」という用語は、R'RN--CO--基を表し、ここで、RおよびR'のうちの一方は水素であり、RおよびR'のうちの他方は先に説明したようなアルキルおよび／または置換アルキルである。
【００６８】
本明細書において使用される「アルキレン」という用語は、約1〜10個、1〜8個、1〜6個、または2〜6個の炭素原子を有し、2つ以上の共有結合のための結合部を有する、直鎖状または分枝状ラジカルを表す。そのようなラジカルの例は、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、へキシレン、エチリデン、メチルエチレン、およびイソプロピリデンである。アルケニレンラジカルが別のラジカル上の置換基として存在する場合には、それは2つの置換基により形成されたラジカルではなく単一の置換基であると通常みなされる。
【００６９】
本明細書において使用される「アルケニレン」という用語は、約2〜10個、2〜8個、または2〜6個の炭素原子を有し、少なくとも1つの二重結合を有し、2つ以上の共有結合のための結合部を有する、直鎖状または分枝状ラジカルを表す。アルケニレンラジカルの例としては、1,1-ビニリデン（--CH2=C-）、1,2-ビニリデン（-CH=CH-）、および1,4-ブタジエニル（-CH=CH-CH=CH-）が挙げられる。
【００７０】
本明細書において使用される「アラルコキシカルボニル」という用語は、アラルキル-O--CO--基を表す。例示的なアラルコキシカルボニル基はベンジルオキシカルボニルである。
【００７１】
本明細書において使用される「アラルキル」という用語は、例えばベンジルのように、アルキル基を直接介して結合しているアリールまたは置換アリール基を表す。置換アリールラジカルのその他の具体的な例としては、クロロベンジルおよびアミノベンジルが挙げられる。例示的なアラルキル基としてはベンジル、フェニルエチル、およびナフチルメチルが挙げられる。
【００７２】
本明細書において使用される「アラルキルオキシ」という用語は、アラルキル-O--基を表し、ここでアラルキル基は先に説明された通りである。例示的なアラルキルオキシ基はベンジルオキシルである。
【００７３】
本明細書において使用される「アロイル」という用語は、上記で定義したアリールラジカルが本明細書で定義されるカルボニルラジカルに結合したものを表し、ベンゾイルおよびトルオイルが含まれるがこれらに限定されない。アロイルラジカルは任意で本明細書に開示される基で置換されていてもよい。
【００７４】
本明細書において使用される「アロイルアミノ」という用語は、アロイル-NH--基を表し、アロイルは先に説明した通りである。
【００７５】
本明細書において使用される「アリール」という用語は、芳香族置換基を表し、単一の芳香族環もしくは一緒に融合された複数の香族環が共有結合により連結されたもの、またはそれが共通の基（例えばメチレンもしくはエチレン基であるがこれらに限定されない）に連結されたものであり得る。その共通の連結基は、ベンゾフェノンの場合のようにカルボニルでもあり得、あるいは、ジフェニルエーテルの場合のように酸素でもあり得、あるいは、ジフェニルアミンの場合のように窒素でもあり得る。「アリール」という用語は、特に複素環芳香族化合物を包含する。芳香族環（複数可）は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン、およびベンゾフェノンを含み得るが、他のものも含み得る。特定の実施形態では、「アリール」という用語は、約5個から約10個の炭素原子、例えば5、6、7、8、9、または10個の炭素原子を含み、5員および6員の炭化水素芳香族環と複素環式芳香族環を包含する、環状芳香族を意味する。
【００７６】
アリール基は、任意で、1つまたは複数のアリール基置換基（同じものまたは異なるものであり得る）によって置換されていてもよく（「置換アリール」）、「アリール基置換基」としては、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、アラルキルオキシル、カルボキシル、アシル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン、および--NR'R''（R'およびR''はそれぞれ独立に水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、およびアラルキルであり得る）が挙げられる。
【００７７】
アリールラジカルは、任意で1〜4個の置換基で置換されていてもよく、置換基は例えばアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、ハロ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アラルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、ウレイド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルバミル、アルコキシカルボニル、アルキルチオノ、アリールチオノ、アリールスルホニルアミン、スルフェン酸、アルキルスルホニル、スルホンアミド、アリールオキシ等である。置換基は、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、またはアラルキルでさらに置換され得る。本開示のいくつかの側面では、アリールラジカルはヒドロキシル、アルキル、カルボニル、カルボキシル、チオール、アミノ、および／またはハロで置換される。
【００７８】
アリール基の具体例としては、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、インドール、カルバゾール等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本明細書において使用される「アリールオキシ」という用語は、上記のように定義されたアリールラジカルが酸素原子に結合したものを表す。例示的なアリールオキシ基としてはナフチルオキシ、キノリルオキシ、イソキリオリジニルオキシ等が挙げられる。
【００８０】
本明細書において使用される「アリールオキシカルボニル」という用語は、アリール-O--CO--基を表す。例示的なアリールオキシカルボニル基としてはフェノキシ-およびノフトキシ-カルボニルが挙げられる。
【００８１】
本明細書において使用される「アリールオキシル」という用語は、アリール-O--基を表し、ここでアリール基は先に説明した通りであって、置換アリールを含む。本明細書において使用される「アリールオキシル」という用語は、フェニルオキシルまたはヘキシルオキシル、および、アルキル、置換アルキル、ハロ、もしくはアルコキシルで置換されたフェニルオキシルまたはヘキシルオキシルを表し得る。
【００８２】
本明細書において使用される「アリールアルコキシ」という用語は、アルコキシ基に結合したアリール基を表す。アリールアルコキシ基の代表例としては、2-フェニルエトキシ、3-ナフト-2-イルプロポキシ、および5-フェニルペンチルオキシが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８３】
本明細書において使用される「生物発光」という用語は、ある種の化学発光であって、生物学的分子、特にタンパク質による光の放出を表す。生物発光のために必須の条件は、オキシゲナーゼすなわちルシフェラーゼの存在下で結合状態または遊離状態にある酸素分子であり、ルシフェラーゼは、酸素分子の存在下で基質すなわちルシフェリンに作用してその基質を励起状態に変換し、それが低エネルギーレベルに戻る際に光のかたちでエネルギーを放出する。
【００８４】
本明細書において使用される「炭素環式」という用語は、飽和または不飽和であり置換または非置換である5〜14員有機核であってその環形成原子が（水素以外には）炭素のみであるものから誘導されるラジカルを包含する。炭素環式ラジカルの例としては、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、特にフェニル、ナフチル、ノルボルナニル、ビシクロヘプタジエニル、トルオイル、キシレニル、インデニル、スティルベンジル、テルフェニリル、ジフェニルエチレニル、フェニルシクロヘキシル、アセナフトチレニル、アントラセニル、ビフェニル、ビベンンジリル、および関連するビベンンジリル同族体、オクタヒドロナフチル、テトラヒドロナフチル、オクタヒドロキノリニル、ジメトキシテトラヒドロナフチル等がある。
【００８５】
本明細書において単独でまたは組み合わされて使用される「カルバモイル」という用語は、カルボニル基における2つの共有されていない（unshared）結合のうちの1つに、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、モノシクロアルキルアミノ、アルキレイシクロアルキルアミノ、およびジシクロアルキルアミノラジカルが結合したものを表す。
【００８６】
本明細書において使用される「カルバモイル」という用語は、H2N-CO-基を表す。
【００８７】
本明細書において使用される「カルバペネム」という用語は、広範な抗菌活性を有するβ-ラクタム抗生物質の1クラスを表し、ほとんどのβ-ラクタマーゼに対して高い抵抗性を有する。カルバペネム抗生物質は初め、Streptomyces cattleya（ストレプトマイセス・カトレヤ）の天然由来産物であるカルバペネムチエナマイシンから開発された。カルバペネムは、例えばEscherichia coli（E. coli）（エシェリキア・コリ）およびKlebsiella pneumoniae（クレブシエラ・ニューモニエ）のような、多くの細菌感染に対する最後の手段的な抗生物質の1つである。これらの大腸菌群におけるカルバペネム抗生物質に対する薬剤耐性の拡散は、多くの場合カルバペネマーゼ（ニューデリー型メタロ-β-ラクタマーゼ（NDM-1）を含む）の産生に起因する。カルバペネムに対して耐性である細菌と戦うために開発されつつある新規抗生物質は現在存在せず、耐性遺伝子の世界的拡散が主要な問題であると考えられている。これらの薬剤は、ペニシリンおよびセファロスポリンのような他のβ-ラクタム類と比べて、最も広い抗菌スペクトルを有する。カルバペネムは高い親和性でβ-ラクタマーゼに結合してその酵素をアシル化し不活性にすることにより、β-ラクタマーゼを回避する。カルバペネムはグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方、ならびに嫌気性菌に対して活性であるが、ただしクラミジアのような細胞内細菌（非定型菌）は例外である。カルバペネムはまた、これまでのところ、L,D-トランスペプチダーゼを阻害する能力を有する唯一のβ-ラクタムである。カルバペネムはペニシリン（ペナム）と非常に類似しているが、その構造の第1位における硫黄原子が炭素原子に置き換えられており、1つの不飽和が導入されている。
【００８８】
本明細書において使用される「カルバペネマーゼ」という用語は、オキシイミノ-セファロスポリン、セファマイシンに対してだけでなくカルバペネムに対しても活性を有するβ-ラクタマーゼの一群を表す。カルバペネマーゼは例えばIMP型カルバペネマーゼ（メタロ-β-ラクタマーゼ）を含み、これはプラスミド媒介性カルバペネマーゼであって、腸内グラム陰性生物体であるPseudomonas spp.（シュードモナス種）およびAcinetobacter spp.（アシネトバクター種）のような細菌種に見出され得る。VIM（Verona integron-encoded metallo-β-lactamase：ヴェローナインテグロンにコードされたメタロ-β-ラクタマーゼ）は10種の構成員を包含し、これらは主にP. aeruginosa、およびP. putidaに起こり、腸内細菌科に起こることはごく稀である。IMPおよびVIMはどちらもインテグロン付随性であり、時としてプラスミド内にある。どちらもモノバクタムを除く全てのβ-ラクタムを加水分解し、全てのβ-ラクタム阻害剤を免れる。
【００８９】
β-ラクタマーゼのOXAグループは主にアシネトバクター種に起こる。OXAカルバペネマーゼはインビトロではカルバペネムを非常に遅く加水分解し、ある種のアシネトバクター宿主について見られる高いMIC（64 mg/L超）は二次的な機序を反映しているかもしれない。OXAカルバペネマーゼはまたペニシリンおよびセファロスポリンに対して低減された加水分解効率を有する傾向がある。KPC（K. pneumoniaeカルバペネマーゼ）は現在最も多くみられる腸内細菌科のカルバペネマーゼであり、KPCを産生する腸内細菌科は米国において一般的になりつつあった。CMYはEnterobacter aerogenesの病原性系統から単離された。それはプラスミドpYMG-1上に保有され、従って他の細菌系統に伝播可能である。NDM-1（ニューデリー型メタロ-β-ラクタマーゼ）はEscherichia coliおよびKlebsiella pneumoniaeに広く及んでいる。
【００９０】
本開示のラクタマーゼに感受性であり得る細菌には、例えばE. cloacae、C. freundii、S. marcescens、P. aeruginosa、K. pneumoniae、Proteus mirabilis、腸内細菌科（Escherichia spp.を含む）、Salmonella spp.、H. influenzae、N. gonorrhoeae、Kluyvera spp.、Salmonella enterica serovar Typhimurium等であるがこれらに限定されないグラム陰性細菌、および、例えばStaphylococci spp.、Streptococci spp.、Streptobacilli spp.、Bacilli spp.等であるグラム陽性細菌が含まれる。
【００９１】
本明細書において使用される「カルボニル」という用語は、4つの共有結合のうちの2つを酸素原子と共有している炭素ラジカルを表す。カルボニル-  本明細書において使用される「カルボニル」という用語は、--(C=O)--基を表す。
【００９２】
本明細書において使用される「カルボキサミド」という用語は、-CONH-の基を表す。カルボキシル-  本明細書において使用される「カルボキシル」という用語は、--COOH基を表す。
【００９３】
本明細書において、単独でまたは組み合わされて使用される「カルボキシル」という用語は、-C(O)OR25-または-C(-O)OR25を表し、ここでR25は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アミノ、チオール、アリール、ヘテロアリール、チオアルキル、チオアリール、チオアルコキシ、ヘテロアリール、またはヘテロ環状基であり、これらは任意で置換されていてもよい。本開示のいくつかの側面では、カルボキシル基はエステル化された形態であり、エステル化基として低級アルキル基を含み得る。本開示の特定の側面では、-C(O)OR25はエステルまたはアミノ酸誘導体を提示する。エステル化された形態は本明細書において特に「カルボキシルエステル」とも呼ばれる。本開示のいくつかの側面では、「カルボキシル」は置換されていてもよく、特にアリルで置換されていてもよく、アリルは任意でアミノ、アミン、ハロ、アルキルアミノ、アリール、カルボキシル、またはヘテロ環状基のうちの1つまたは複数で置換され得る。カルボキシル基の例は、メトキシカルボニル、ブトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニルのようなtert-アルコキシカルボニル、例えば低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシル、ハロ、および／またはニトロにより任意で置換されたフェニルを含むがこれに限定されない1つまたは2つのアリールラジカルを有するアリールメチオキシカルボニル、例えばベンジルオキシカルボニル、メトキシベンジルオキシカルボニル、ジフェニルメトキシカルボニル、2-ブロモエトキシカルボニル、2-ヨードエトキシカルボニル、tert-ブチルカルボニル、4-ニトロベンジルオキシカルボニル、ジフェニルメトキシ-カルボニル、ベンズヒドロキシカルボニル、ジ-(4-メトキシフェニル-メトキシカルボニル、2-ブロモエトキシカルボニル、2-ヨードエトキシカルボニル、2-トリメチルシリルエトキシカルボニル、または2-トリフェニルシリルエトキシカルボニルである。エステル化された形態のさらなるカルボキシル基は、有機シリルオキシカルボニルを含むシリルオキシカルボニル基である。そのような化合物におけるケイ素置換基は、低級アルキル（例えばメチル）、アルコキシ（例えばメトキシ）、および／またはハロ（例えば塩素）で置換され得る。ケイ素置換基の例としては、トリメチルシリルおよびジメチルtert-ブチルシリルが挙げられる。本開示のいくつかの側面では、カルボキシル基はアルコキシカルボニルであり得、特にメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、t-ブトキシカルボニル、t-ペンチルオキシカルボニル、sirヘプチルオキシカルボニル、特にメトキシカルボニルもしくはエトキシカルボニルであり得る。
【００９４】
本明細書において使用される「セファロスポリン」という用語は、ベータ-ラクタム環が6員ジヒドロチアジン環に融合してセフェム核を形成しているベータ-ラクタム化合物を表す。セフェム核に対する側鎖修飾は、抗菌活性のスペクトルの改善、薬物動態学的な利点、および追加的な副作用を付与し得る。その活性のスペクトルに基づき、セファロスポリンは4世代に広く大別することができる。
【００９５】
本明細書において使用される「環状」および「シクロアルキル」という用語は、約3個から約10個の炭素原子、例えば3、4、5、6、7、8、9、または10個の炭素原子の単環または複数環の非芳香族系を表す。シクロアルキル基は任意で部分的に不飽和であり得る。シクロアルキル基はまた任意で、本明細書で定義されるアルキル置換基、オキソ、および／またはアルキレンで置換されていてもよい。任意で、環状アルキル鎖に沿って1つ以上の酸素、硫黄、または置換もしくは非置換の窒素原子が挿入されていてもよく、ここで窒素の置換基は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり、このようにして複素環基が提供される。例示的な単環式シクロアルキル環としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルが挙げられる。複数環式シクロアルキル環としては、アダマンチル、オクタヒドロナフチル、デカリン、カンフル、カンファン、およびノルアダマンチルが挙げられる。
【００９６】
本明細書において使用される「環状脂肪族」という用語は、8個未満の炭素を持つシクロアルカン、または、3つ以下の融合した環状脂肪族環からなる融合環系を表す。そのような基の例としてはデカリン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９７】
本明細書において使用される「シクロアルケニル」という用語は、約4〜16個、2〜15個、2〜10個、2〜8個、4〜10個、3〜8個、3〜7個、3〜6個、または4〜6個の炭素原子、1つ以上の炭素-炭素二重結合、および1つ、2つ、3つ、または4つの環を含むラジカルを表し、そのような環はペンダント式に結合していてもよいし融合していてもよい。本開示のいくつかの側面では、シクロアルケニルラジカルは、3〜7個の炭素原子を有する「低級シクロアルケニル」ラジカルである。シクロアルケニルラジカルの例としてはシクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、およびシクロヘプテニルが挙げられるがこれらに限定されない。シクロアルケニルラジカルは任意で本明細書に開示されるような基で置換され得、特に1個、2個、または3個の置換基で置換され得、これらの置換基は同一であっても異なるものであってもよい。
【００９８】
本明細書において使用される「シクロアルコキシ」という用語は、シクロアルキルラジカル（とくに3〜15個、3〜8個、または3〜6個の炭素原子を有するシクロアルキルラジカル）がオキシラジカルに結合したものを表す。シクロアルコキシラジカルの例にはシクロヘキソキシおよびシクロペントキシが含まれる。シクロアルコキシラジカルは任意で本明細書に開示されるような基で置換され得る。
【００９９】
本明細書において使用される「シクロアルキル」という用語は、約3〜15個、3〜10個、、3〜8個、または3〜6個の炭素原子を有し1つ、2つ、3つ、または4つの環を含むラジカルを表し、そのような環はペンダント式に結合していてもよいし融合していてもよい。本開示のいくつかの側面では、「シクロアルキル」は、1〜2個の環を含み環あたり3〜7個の炭素原子を含む、任意で置換された、飽和炭化水素環系を表し、これらの環は不飽和C3〜C7炭素環式環とさらに融合していてもよい。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロドデシル等のような単環構造、あるいは、アダマンタニル等のような多環構造が挙げられる。本開示のいくつかの側面では、シクロアルキルラジカルは、約3〜10個、3〜8個、3〜6個、または 3〜4個の炭素原子を有する「低級シクロアルキル」ラジカルであり、特にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルである。「シクロアルキル」という用語はまた、シクロアルキルラジカルがアリールラジカルまたはヘテロシクリルラジカルと融合したラジカルも包含する。シクロアルキルラジカルは任意で本明細書に開示されるような基で置換され得る。
【０１００】
本明細書において使用される「検出可能部分」という用語は、本技術分野で知られる様々な標識部分を表す。その部分は、例えば、放射性標識（例えば3H、125I、35S、14C、32P等）、検出可能酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ等）、色素、例えばコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のような比色分析標識、ビーズ、または、発色、蛍光、化学発光、もしくは電気化学発光（ECL）シグナルのような検出可能シグナルを生じることができるその他の部分である。従って、「検出可能部分」は「標識分子」と同義に使用される。検出のために有用なものとして当業者に知られる標識分子としては、化学発光分子および蛍光分子が挙げられる。本発明の方法のために核酸を標識することのための使用に適した様々な蛍光分子が本技術分野において知られている。そのような組み入れのためのプロトコールは、使用される蛍光分子に応じて変わり得る。そのようなプロトコールはそれぞれの蛍光分子に関して本技術分野において知られている。
【０１０１】
本開示のプローブの実施形態では、カルバペネマーゼによるセファロスポリンの加水分解的切断に際してプローブから検出可能部分が放出され得ることが企図され、そうなると、（例えば）蛍光色素がもはやクエンチされなくなり、従って検出可能となる。未切断プローブから光吸収色素または放射性標識のような検出可能部分が定量的または定性的検出のために放出され分離されてカルバペネマーゼ活性の存在を表示することもさらに企図される。
【０１０２】
本明細書において使用される「検出可能に標識される」という用語は、本開示のセファロスポリンに基づくプローブのような化合物が、放射性である部分、またはフルオロフォアで置換されている部分、または、裸眼もしくは計測手段（例えばシンチレーションカウンター、比色計、UV分光光度計等であるがこれらに限定されない）によって観察もしくは検出され得る物理的もしくは化学的応答を誘導するその他の分子種で置換されている部分を含み得ることを意味する。
【０１０３】
分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段を使用してそのような標識が検出され得る。検出の装置および方法は、光学イメージング、電子的イメージング、CCDカメラを用いたイメージング、集積光イメージング、および質量分析を含み得るがこれらに限定されない。さらに、標的に結合した標識または無標識のプローブの量は定量化され得る。そのような定量化は統計学的分析を含み得る。
【０１０４】
本明細書において使用される「ジアルキルアミノ」という用語は、--NRR'基を表し、ここでRおよびR'の各々は、独立に、先に説明したようなアルキル基および／または置換アルキル基である。例示的なアルキルアミノ基としては、エチルメチルアミノ、ジメチルアミノ、およびジエチルアミノが挙げられる。
【０１０５】
本明細書において使用される「ジアルキルカルバモイル」という用語は、R'RN--CO--基を表し、ここでRおよびR'の各々は、独立に、先に説明したようなアルキルおよび／または置換アルキルである。
【０１０６】
本明細書において使用される「ジアステレオマー」という用語は、1つ以上の不斉中心を含むことができエナンチオマー、ジアステレオマー、およびその他の立体異性型（絶対的立体化学に基づいて(R)-または(S)-として定義され得る）を生じ得る本開示の化合物を表す。従って、本開示の化合物は、全ての可能なジアステレオマーおよびエナンチオマーならびにそれらのラセミ体および光学的に純粋な形態を含む。光学活性な(R)-および(S) -アイソマーは、キラル合成素子もしくはキラル試薬を使用して調製することができ、または、通常の技術を使用して分離される。本開示の化合物が幾何学的不斉の中心を含有する場合には、他に特定されない限り、その化合物はEおよびAの両方の幾何異性体を包含することが意図される。全ての互変異性形態もまた本開示の化合物の範囲に包含される。
【０１０７】
本明細書において使用される「色素」という用語は、その光吸収特性または光放出特性によりその存在が検出され得るあらゆるリポーター基を表す。例えば、Cy5はシアニン色素ファミリーの反応性水溶性蛍光色素である。Cy5は赤色領域（約650〜約670 nm）において蛍光を発する。それは、窒素側鎖のいずれか一方または両方に反応基を伴わせて合成することができ、従ってそれらが核酸またはタンパク質分子に化学的に連結できる。標識化は、可視化目的または定量化目的のために行われる。Cy5は約649 nmにおいて最大励起されて約670 nmにおいて最大発光し、これはスペクトルの赤外領域中である。量子収量は0.28である。FW=792。本開示のプローブのための適切なフルオロフォア（クロム）は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC、緑）、シアニン色素Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5 Cy7、Cy7.5（緑〜近赤外に渡る）、テキサスレッド等から選択され得るが、これらに限定することは意図されない。本開示の実施形態における使用のためのこれらの色素の誘導体は、Cy色素（アマシャムバイオサイエンス）、Alexa Fluors（モレキュラープローブス社）、HiLyte（登録商標）Fluors（AnaSpec）、およびDyLite（登録商標）Fluors（ピアース社）であり得るが、これらに限定することは意図されない。
【０１０８】
本明細書において使用される「蛍光」という用語は、冷体（cold bodies）における光学的現象として主に見出される発光を表し、そこでは光子の分子吸収がより長い（よりエネルギーの低い）波長の光子の放射を引き起こす。吸収される光子と放射される光子との間のエネルギー差が、分子回転、振動、または熱となる。時として、吸収される光子は紫外領域にあり放射される光は可視光領域にあるが、これはその特定のフルオロフォアの吸収曲線およびストークスシフトに依存する。
【０１０９】
本明細書において使用される「フルオロフォア」という用語は、分子を蛍光たらしめる分子の構成要素を表す。本明細書において使用される「フルオロフォア」という用語は、その発光特性によりその存在が検出可能となるあらゆるリポーター基を表す。それは、特定の波長のエネルギーを吸収し、異なる（しかし同様に特定された）波長においてエネルギーを再放射する、分子における官能基である。放射されるエネルギーの量および波長は、そのフルオロフォアとそのフルオロフォアの化学的環境との両方に依存する。本開示の組成物において使用するためのフルオロフォアとしては、他の非蛍光分子に化学的に連結されて多様な応用のための新規蛍光分子を創出してきた最も一般的なフルオロフォアの1つであるフルオレセインイソチオシアネート（FITC）（フルオレセインの反応性誘導体）が挙げられるが、これに限定されない。歴史的によく用いられてきたその他のフルオロフォアは、ローダミンの誘導体（TRITC）、クマリン、およびシアニンである。Alexa Fluors（登録商標）、DyLight Fluors（登録商標）、および緑色蛍光フルオロフォアであるTokyo Greenのような、より新世代のフルオロフォアは、一般に、同等の励起および放射を有する他の標準的色素より光安定であり、明るく、pH感受性が低い。
【０１１０】
本明細書において使用される「FRET」という用語は、分子間の蛍光共鳴エネルギー移動を表す。FRET法においては、1つのフルオロフォアがエネルギー供与体として作用し、別のフルオロフォアがエネルギー受容体分子として作用することができる。これらはそれぞれリポーター分子およびクエンチャー分子と呼ばれることもある。供与体分子は光の特定の波長で励起され、そのために通常は蛍光放射波長を示す。受容体分子もまたこの波長において励起され、多様な距離依存性エネルギー移動機序により供与体分子の放射エネルギーを受け取ることができる。一般に、受容体分子は、両者がごく近傍（例えば同じ分子上または隣接した分子上）にある場合に供与体分子の放射エネルギーを受け取る。FRET技術は本技術分野においてよく知られており、本開示の酸化チタン結合ペプチドを検出するために容易に使用することができる。例えば、それぞれ参照により全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第5,668,648号、5,707,804号、5,728,528号、5,853,992号、および5,869,255号（FRET色素の記述に関して）、T Mergny et al., (1994) Nucleic Acid Res. 22:920-928、およびWolf et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8790-8794（FRETについての一般的な記述および方法に関して）を参照。
【０１１１】
本明細書において使用される「ヘテロアリール」という用語は、炭素、窒素、硫黄、および酸素から選択される少なくとも1つのヘテロ原子を有する、完全に不飽和であるヘテロ原子含有環式形状芳香族ラジカルを表す。ヘテロアリールラジカルは、1つ、2つ、または3つの環を含み得、それら環はペンダント式に結合されていてもよいし融合していてもよい。本開示のいくつかの側面において、この用語は、炭素、窒素、硫黄、および酸素から選択される3〜15個、3〜10個、3〜8個、5〜15個、5〜10個、または5〜8個の環構成員であって少なくとも1つの環原子がヘテロ原子であるものを有する、完全に不飽和であるヘテロ原子含有環式形状芳香族ラジカルを表す。「ヘテロアリール」ラジカルの例としては、1〜4個の窒素原子を含有する不飽和5〜6員複素単環基、特に、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、テトラゾリル等；1〜5個の窒素原子を含有する不飽和縮合複素環基、特に、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンズイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、インダゾリル、キナゾリニル、プテリジニル、キノリジジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、シンノリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、カルバゾリル；プリニル、ベンズイミダゾリル、キノリニル、イソキノリニル、ベアゾトリアゾリル、テトラゾロピリダジニル等；酸素原子を含有する不飽和3〜6員複素単環基、特に2-フリル、ピラニル等；硫黄原子を含有する不飽和5〜6員複素単環基、特に、チエニル、2-チエニル、3-チエニル等；1〜2個の酸素原子および1〜3個の窒素原子を含有する不飽和5〜6員複素単環基、特に、フラザニル、ベンゾフラザニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、およびオキサジアゾリル；1〜2個の酸素原子および1〜3個の窒素原子を含有する不飽和縮合複素環基、特に、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル等；1〜2個の硫黄原子および1〜3個の窒素原子を含有する不飽和5〜6員複素単環基、例えば、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル等；1〜2個の硫黄原子および1〜3個の窒素原子を含有する不飽和縮合複素環基、例えば、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル等が挙げられるが、これらに限定されない。この用語はまた、複素環ラジカルがアリールラジカルと融合したラジカル、特にベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、フタラジニル、クロメニル、キサンテニル等のような二環式ラジカルも包含する。ヘテロアリールラジカルは、任意で、本明細書に開示される基によって、例えばアルキル、アミノ、ハロゲン等、特にヘテロアリールアミンによって置換され得る。この用語は、1〜4個の窒素原子を含有する不飽和5〜6員複素単環基、特に、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、2-ピリジル、3-ピリジル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル、テトラゾリル等を表し得る。ヘテロアリールラジカルは、任意で、本明細書に開示される基によって、例えばアルキル、アミノ、ハロゲン等によって置換され得、特に、置換ヘテロアリールラジカルはヘテロアリールアミ���である。
【０１１２】
本明細書において使用される「複素環式」という用語は、8個未満の炭素原子を有するシクロアルカンおよび／またはアリール環系、または、3個以下の融合環からなる融合環系であって、環炭素原子の少なくとも1つが酸素、窒素、または硫黄によって置き換えられているものを表す。そのような基の例としてはモルフォリノ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本明細書において使用される「複素環式」という用語は、炭素、窒素、硫黄、および酸素から選択される少なくとも1つのヘテロ原子を有する、飽和および部分的飽和のヘテロ原子含有環式形状ラジカルを表す。複素環式ラジカルは、1つ、2つ、または3つの環を含有し得、そのような環はペンダント式に結合されていてもよいし融合していてもよい。一側面では、この用語は、炭素、窒素、硫黄、および酸素から選択される約3〜15個、3〜10個、5〜15個、5〜10個、または3〜8個の環構成員であって少なくとも1つの環原子がヘテロ原子であるものを有する、飽和および部分的飽和のヘテロ原子含有環式形状ラジカルを表す。例示的な飽和複素環式ラジカルとしては、1〜4個の窒素原子を含有する飽和3〜6員複素単環基（例えばピロリジニル、イミダゾリジニル、およびピペラジニル）；1〜2個の酸素原子および1〜3個の窒素原子を含有する飽和3〜6員複素単環基（例えばモルフォリニル；シドノニル）；ならびに、1〜2個の硫黄原子および1〜3個の窒素原子を含有する飽和3〜6員複素単環基（例えばチアゾリジニル）等が挙げられるが、これらに限定されない。部分的飽和複素環式ラジカルの例としては、非限定的に、ジヒドロチオフェン、ジヒドロピラニル、ジヒドロフラニル、およびジヒドロチアゾリルが挙げられる。例示的な複素環式ラジカルとしては、非限定的に、アジリジニル、アゼチジニル、2-ピロリニル、3-ピロリニル、ピロリジニル、アゼピニル、1,3-ジオキソラニル、211-ピラニル、4H-ピラニル、ピペリジニル、1,4-ジオキサニル、モルフォリニル、ピラゾリニル、チオモルフォリニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチオピラニル、チオキサニル、インドリニル、2H-ピラニル、4H-ピラニル、ジオキサニル、1,3-ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、キヌエリジニル、キノリジニル等が挙げられる。
【０１１４】
本明細書において使用される「ヒドロキシアルキル」という用語は、--OH基で置換されたアルキル基を表す。
【０１１５】
本明細書において使用される「ヒドロキシル」あるいは「ヒドロキシ」という用語は、--OH基を表す。
【０１１６】
本明細書において使用される「リンカー」という用語は、本開示の化合物のセファロスポリン骨格上の官能基（例えばアミン基）を表し、あるいは、リンカーは、セファロスポリンに結合される別個の部分であって、フルオロフォアやクエンチャーのような分子がそこに結合し得るものを包含し得る。リンカーは、アミン、カルボン酸、ヒドロキシル、チオ、およびそれらの組合せのような官能基を含み得るが、これらに限定されない。リンカーは、DTPA、EDTA、DOPA、EGTA、NTA、およびそれらの組合せのような化合物を含み得るが、これらに限定されない。一実施形態では、リンカーとキレーター化合物とは同じものであるが、別の実施形態ではそれらは異なるものであり得る。
【０１１７】
本開示のプローブの有利な実施形態においては、例えばフルオロフォアであるがそれに限定されない標識が、-O-、-N-、または-S-連結によってセファロスポリン部分に結合され得ることが企図される。
【０１１８】
本明細書において使用される「低級アルキル置換ハロゲン」という用語は、最大8個までの炭素原子を含有し脂肪族水素原子の1つがハロゲンによって置き換えられているあらゆるアルキル鎖を表す。そのようなものの例としてはクロルエチル等が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１９】
本明細書において使用される「ルシフェラーゼ」という用語は、発光反応を触媒するオキシゲナーゼを表す。例えば、細菌のルシフェラーゼはフラビンモノヌクレオチドと脂肪族アルデヒドの酸化を触媒し、この反応が光を産生する。海洋節足動物に見出されるもう1つのクラスのルシフェラーゼはウミホタルルシフェリンの酸化を触媒し、別のクラスのルシフェラーゼは甲虫類ルシフェリンの酸化を触媒する。従って、「ルシフェラーゼ」は、生物発光反応を触媒する酵素または発光タンパク質を表す。ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼのようなルシフェラーゼは触媒的に作用する酵素であり、生物発光産生反応のあいだ変化しない。ルシフェリンが非共有結合的に結合したエクオリンおよびオベリン発光タンパク質のようなルシフェラーゼ発光タンパク質は、生物発光産生反応のあいだルシフェリンを放出することによって変化する。ルシフェラーゼは、生物において天然に生ずるタンパク質であるかまたはそのバリアントもしくは変異体であり、例えば、変異誘発により産生され熱安定性またはpH安定性のような1つ以上の特性を有するバリアントであって天然に起こるタンパク質とは異なるものである。ルシフェラーゼおよびその改変された変異体またはバリアント形態はよく知られている。例えば「ウミシイタケルシフェラーゼ」というと、Renilla属の構成員から単離された酵素またはその他の供給源から得られた同等な分子（例えば別の花虫綱から得られたもの、または合成により調製されたもの）を意味する。
【０１２０】
本明細書において使用される「作用可能に連結される（operably linked）」という用語は、そのように記述された成分がその通常の機能を発揮できるように構成されているという要素の配置を表す。すなわち、コード配列に作用可能に連結された所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合にそのコード配列の発現を引き起こすことができる。そのプロモーターは、コード配列の発現を誘導するように機能する限り、そのコード配列と連続的である必要はない。従って、例えば、プロモーター配列とコード配列との間に介在する、翻訳されないが転写される配列が存在し得、それでもそのプロモーター配列はそのコード配列に「作用可能に連結されている」とみなされる。
【０１２１】
本明細書において使用される「プライマー」という用語は、増幅または複製されるべきDNAセグメントと相補的なオリゴヌクレオチドを表す。典型的にはプライマーはPCRにおいて使用される。プライマーは鋳型DNAにハイブリダイズ（あるいは「アニール」）し、ポリメラーゼ酵素によって複製／増幅プロセスのための開始点として使用される。「相補的」とは、プライマー配列が鋳型と共に安定な水素結合複合体を形成することができることを意味する。
【０１２２】
本明細書において使用される「プローブ」という用語は、6,7トランス配置を有する改変セファロスポリンを表し、これは、メタロ-β-ラクタマーゼにより選択的に切断され、プローブがメタロ-β-ラクタマーゼ種間で選択的に区別できるようにアルコール由来の側鎖を有し得る。
【０１２３】
本明細書において使用される「置換アルケニル」という用語は、アルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、アルキルアルコキシ、ハロアルコキシアルキル、アルカノイル、アルカノイルオキシ、シクロアルキル、シクロアルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、カルバミル、ケト、チオケト、チオール、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、チオアルコキシ、アリール、ニトロ等のような、例えば1〜3個の置換基、好ましくは1〜2個の置換基によって置換されたアルケニルを包含する。
【０１２４】
本明細書において使用される「置換アルキル」という用語は、アルキル、アルコキシ、オキソ、アルカノイル、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アルカノイルオキシ、シクロアルキル、アシル、アミノ、ヒドロキシアミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシアミノ、アラルキルアミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、カルバミル、カルボキシルアルキル、ケト、チオケト、チオール、アルキルチオール、アリールチオ、アラルキルチオ、スルホンアミド、チオアルコキシ、およびニトロのような、例えば1〜5個の置換基、好ましくは1〜3個の置換基によって置換されたアルキル基を含み得る。
【０１２５】
本明細書において使用される「置換アリール」という用語は、芳香族環、または、少なくとも1つが芳香族である3個以下の融合した環からなる融合芳香族環系であって、環炭素上の水素原子の少なくとも1つが、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、アルキル、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族）によって置き換えられたものを包含する。そのようなものの例としては、ヒドロキシフェニル、クロルフェニル  アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、硫酸、メルカプト等が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２６】
本明細書において使用される「置換環状脂肪族」という用語は、8個未満の炭素原子を有するシクロアルカンまたは3個以下の融合した環からなる融合環系であって、脂肪族水素原子の少なくとも1つが、ハロゲン、ニトロ、チオ、アミノ、ヒドロキシ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族）によって置き換えられたものを表す。そのような基の例としては1-クロロデカリル等が挙げられるがそれに限定されない。
【０１２７】
本明細書において使用される「置換シクロアルキル」という用語は、アルキル、アルケニル、アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、ケト、チオケト、チオール、チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、およびニトロを含むがこれらに限定されない1〜5個（特に1〜3個）の置換基を有するシクロアルキル基を包含する。
【０１２８】
本明細書において使用される「置換複素環式」という用語は、シクロアルカン、および／または8個未満の炭素原子を有するアリール環系、もしくは3個以下の融合した環からなる融合環系であって、環炭素原子の少なくとも1つが酸素、窒素、または硫黄によって置き換えられ、脂肪族水素原子の少なくとも1つがハロゲン、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族）によって置き換えられたものを表す。そのような基の例としては2-クロロピラニルが挙げられるがそれに限定されない。
【０１２９】
本明細書において、単独で、または、アルキルスルホニルやアリールスルホニルのように他の用語と連結されて使用される「スルホニル」という用語は、-SO2-という二価ラジカルを表す。本開示のいくつかの側面では、スルホニル基は、置換または非置換のヒドロキシル、アルキル基、エーテル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキニル基、複素環基、炭水化物、ペプチド、もしくはペプチド誘導体に結合され得る。
【０１３０】
本明細書において使用される「置換脂肪族」という用語は、10個未満の炭素を有するアルキルまたはアルカンを表す。「置換脂肪族」という用語は、10個未満の炭素を有するアルキルまたはアルカンであって、脂肪族水素原子の少なくとも1つがハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、チオ、ケトン、アルデヒド、エステル、アミド、低級脂肪族、置換低級脂肪族、または環（アリール、置換アリール、環状脂肪族、もしくは置換環状脂肪族等）によって置き換えられたものを表す。そのような基の例としては1-クロロエチル等が挙げられるがそれに限定されない。
【０１３１】
本明細書において単独でまたは組み合わされて使用される「チオアルコキシ」という用語は、硫黄原子（S）がアルコキシ基に結合し一般化学式-SR24を有する化学官能基を表し、ここで、R24は置換されていてもよいアルコキシ基である。「チオアルコキシ基」は1〜6個の炭素原子を有し得、すなわち-S-(O)-C1〜C6アルキル基であり、ここでC1〜C6アルキルは上記で定義された意味を有する。1〜6個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状チオアルコキシ基もしくはラジカル（C1〜C6チオアルコキシともいう）の代表例としては、チオメトキシおよびチオエトキシが挙げられる。
【０１３２】
本明細書において単独でまたは組み合わされて使用される「チオアルキル」という用語は、硫黄原子（S）がアルキル（置換されていてもよい）に結合した化学官能基を表す。チオアルキル基の例は、チオメチル、チオエチル、およびチオプロピルである。チオアルキルは、置換または非置換のカルボキシル、アリール、複素環、カルボニル、もしくは複素環によって置換され得る。
【０１３３】
本明細書において単独でまたは組み合わされて使用される「チオアリール」という用語は、硫黄原子（S）がアリール基に結合し一般化学式-SR23を有する化学官能基を表し、ここで、R23は置換されていてもよいアリールである。チオアリール基および置換チオアリール基の代表例は、チオフェニル、クロロチオフェノール、パラ-クロロチオフェノール、チオベンジル、4-メトキシ-チオフェニル、4-ニトロ-チオフェニル、およびパラ-ニトロチオベンジルである。
【０１３４】
本明細書において使用される「チオール」という用語は-SHを意味する。チオールは本明細書に開示される置換基、特にアルキル（チオアルキル）、アリール（チオアリール）、アルコキシ（チオアルコキシ）またはカルボキシルで置換されていてもよい。チオールは、置換または非置換のヘテロアリールもしくは複素環で置換され得、特に、1〜4個の窒素原子を含有する置換もしくは非置換の飽和3〜6員複素単環基（例えばピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、およびピペラジニル）、または、1〜2個の酸素原子および1〜3個の窒素原子を含有する飽和3〜6員複素単環基（例えばモルフォリニル；シドノニル）、特に置換モルフォリニルもしくはピペリジニルで置換され得る。
【０１３５】
［考察］
カルバペネムはほとんどのβ-ラクタマーゼに対して高い抵抗性を有し、図1Bに示すように、そのC-6位においてS配置を、C-5位においてR配置を有する。β-ラクタム環のC-5およびC-6位におけるこのトランス配置が、β-ラクタマーゼに対して優れた安定性を有する抗生物質を提供する（Basker et al., (1980) J. Antibiot. (Tokyo) 33: 878-884）。対照的に、元々アクレモニウム真菌に由来しβ-ラクタマーゼについてのプローブを開発するための骨格として一般的に使用されてきたβ-ラクタム抗生物質の1クラスであるセファロスポリン（Gao et al., (2003) J. Am. Chem. Soc. 125: 11146-11147; Zlokarnic et al., (1998) Science 279: 86-88; Xing et al., (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 4158-4159; Kong et al., (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 419: 9-16; Xie et al., (2012) J. Nat. Chem. 4: 802-809）のような他のラクタムは、一般に、対応するC-7位においてR配置を有する。
【０１３６】
本開示は、メタロ-β-ラクタマーゼ、特にカルバペネマーゼの選択的検出のために有用なプローブの実施形態を包含し、それによって、カルバペネム耐性である細菌種を感受性である細菌系統から見分ける。抗生物質耐性細菌の検出のための、6,7 R,R配置を有するセファロスポリンに基づくプローブは、β-ラクタマーゼによる切断を受けるが、メタロ-β-ラクタマーゼによる切断と他のβ-ラクタマーゼによる切断とを区別することができない。β-ラクタム環の6,7位をR,R配置からS,Rに改変することにより、セファロスポリンが、メタロ-β-ラクタマーゼ、すなわちカルバペネマーゼによっては切断可能であるが他のラクタマーゼによっては実質的に切断不可能になることが今発見された。加えて、セファロスポリンの側鎖を改変することにより、選択性を導入することができ、本開示のプローブが様々な種類のメタロ-β-ラクタマーゼ同士を区別することができるようになり、従って、細菌の系統および産生されるメタロ-β-ラクタマーゼの種類をより狭く特定できるようになることが発見された。従って、本開示は、カルバペネム耐性細菌系統の存在を同定し、その系統を特定種類の酵素へとさらに特徴付けるために有用なプローブを提供する。
【０１３７】
特に、本開示のプローブの実施形態は、合成工程において使用されるアルコールを変えることによって、C-7位における置換基により改変することができる。本開示の実施例は、このようにして、単純なメチル部分から置換フェニル基に至るまでサイズの異なる側鎖を、オキシ結合によりセファロスポリンに取り付けられた状態で組み入れる。しかしながら、メタロ-β-ラクタマーゼのさらなる特定を可能にし得る他の側鎖が選択され得ることも企図される。
【０１３８】
本開示のプローブは、体液（血液、唾液、尿等を含む）のような生物学的試料、対象となるヒトもしくは動物におけるもしくはそれらから単離される組織、または、細菌の培養個体群の懸濁液もしくは培養物における、細菌メタロ-β-ラクタマーゼを検出するために有用である。
【０１３９】
プローブは、遊離溶液中にあってもよいし、または、試験試料と接触させるために固形支持体に繋留されていてもよい。プローブをそのような支持体に繋留する方法、ならびに、放出された標識部分の検出のために選択および／または適応される検出システムは、本技術分野においてよく知られている。
【０１４０】
本開示の改変セファロスポリンは、従って、カルバペネマーゼに特異的にする、すなわちカルバペネマーゼによっては切断可能であるが他のラクタマーゼによっては切断可能ではないかまたは実質的に低下した程度において切断可能であるようにするために、セファロスポリンのR配置からS配置への転換を含むように操作されている。
【０１４１】
図1Aおよび1Bに示されているように、本開示のカルバペネマーゼ特異的プローブは、例えばフルオロフォアであるがそれに限定されない検出可能標識部分も含み得る。本開示のプローブに有利に組み入れられ得る適切なフルオロフォアとしては、例えばセファロスポリンの3'位に結合されたアルキル化ウンベリフェロン（7-ヒドロキシクマリン）が挙げられるがこれに限定されない。そのような結合した標識部分は363 nmにおいて励起された場合にほとんど蛍光を発しない。しかしながら、いったんカルバペネマーゼによってセファロスポリンが加水分解されると、フルオロフォアが放出され、検出可能な蛍光放射がもたらされる。本開示のプローブに組み入れることができる他の有利な標識はルシフェリンである。特に有利なルシフェリン、およびその誘導体は、式(4S)-2-(6-ヒドロキシ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロチアゾール-4-カルボン酸を有するホタルD-ルシフェリンであり、これは例えば6-ヒドロキシ位を介してプローブに連結され得る。しかしながら、プローブからの切断後に検出可能となるあらゆるフルオロフォアが本開示のプローブに有用に組み入れられ得ることが企図される。
【０１４２】
図4に示すスキームに従って、C-7位においてS配置を有するセファロスポリン部分をそれぞれ含むいくつかの蛍光発生プローブを合成した。参照によりその全体が本明細書に組み入れられるDoherty et al., (1990) J. Med. Chem. 33: 2513-2521に記述されているように、セファロスポリンにおける配置の転化は、アルコールとジアゾケトン中間体との間のSN2反応によって達成され、これは、NaNO2を伴わせた7-アミノセファロスポラン酸（１）のパラ-メトキシベンジル（PMB）エステルから酸性条件下で定量的な収率において調製された。アルコールのR基を変化させて、カルバペネマーゼの基質選択性を決定するために有用な一群のプローブバリアントを生じさせることができる。全てのプローブは、生物学的アッセイに使用する前に、HPLCによって精製し、NMRおよび質量分析（MS）によって構造解析した。
【０１４３】
本開示の蛍光プローブ実施形態が他のラクタマーゼではなくカルバペネマーゼを選択的に検出する特異性を、組換えβ-ラクタマーゼを用いて調べた。参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWang et al., (2006) Antimicrob. Agents Chemother. 50: 2762-2771に記述されたプロトコールに従って、4つのカルバペネマーゼ、すなわちメタロ-β-ラクタマーゼであるVIM-27、IMP-1、およびNDM-1、ならびにクラスA β-ラクタマーゼであるKPC-3を発現させた。陰性対照として使用するために、2つの非カルバペネマーゼのクラスA β-ラクタマーゼであるTEM-1 BlaおよびBlaCも発現させた。
【０１４４】
約1〜約200 fmolの範囲内の酵素濃度を用いた酵素処理の前および後にプローブの蛍光を測定した。図2、5、および6に示すように、このプローブは、6つのβ-ラクタマーゼ酵素VIM-27、IMP-1、およびNDM-1、クラスA β-ラクタマーゼKPC-3、ならびに非カルバペネマーゼ クラスA β-ラクタマーゼTEM-1 BlaおよびBlaCに対して、明確な特異性および感度を示した。CDC-1は、Xie et al., (2012) J. Nat. Chem. 4: 802-809に記述された通り、以前に報告されたβ-ラクタマーゼのための非特異的プローブであって陽性対照として利用したものであるが、TEM-1 BlaおよびBlaCを含めこれら全ての酵素のいずれに晒された後にも確かな蛍光増強を示した。しかしながら、本開示の様々な改変セファロスポリンに基づくプローブは、カルバペネマーゼで処理された場合に異なる程度の蛍光を示した。
【０１４５】
例えば、(s)-CC-1、(s)-CC-2、および(s)-CC-5については、カルバペネマーゼVIM-27、IMP-1、NDM-1、およびKPC-3で処理された場合に高い蛍光シグナルが記録されたが、これらのプローブがラクタマーゼTEM-1 BlaおよびBlaCで処理された場合には蛍光増強はほとんど観察されなかった。従って、(s)-CC-1、(s)-CC-2、および(s)-CC-5プローブは、カルバペネマーゼのための特異的な基質であるということ、すなわち、カルバペネマーゼを特異的に検出することができるということができる。比較すると、(s)-CC-1および(s)-CC-5は、4つ全てのカルバペネマーゼを1 fmolまで低量にして処理をしても検出可能な蛍光を提供することにより、(s)-CC-2よりも高い感度を示し、(s)-CC-1および(s)-CC-5はカルバペネマーゼ全般のための特異的プローブとなり得るが他のラクタマーゼのための特異的プローブとはならないことが示された。
【０１４６】
(s)-CC-3および(s)-CC-6プローブは、VIM-27、IMP-1、およびNDM-1という3つのMBLについてのみ蛍光増強を示し、(s)-CC-3と(s)-CC-6のメタロ-β-ラクタマーゼに対する全般的特異性が示された。しかしながら(s)-CC-6プローブは、1.0 fmolまで低量の酵素を用いても蛍光増強が明確に観察されたことから、(s)-CC-3よりも優れた感度を示した。図2Cおよび2Fに示すように、アッセイにおいて使用されるKPC-3の量が200 fmolまで高くなると、どちらのプローブも蛍光シグナルを産生した。
【０１４７】
蛍光プローブ(s)-CC-4は、図2Dに示すように、IMP-1に対して高い特異性を発揮し、その蛍光シグナルは濃度依存的に漸増した。NDM-1は約200 fmolの量において晒されて初めて蛍光増加が検出可能となった。結果は、セファロスポリンのC-7位の立体化学をR配置からS配置へと反転させることが、他のラクタマーゼ種ではなくカルバペネマーゼに対して選択的となるプローブ特異性を上昇させるために十分であることを示している。
【０１４８】
異なるβ-ラクタマーゼに対する本開示のプローブの動態学的パラメータをラインウィーバーバークプロットから決定し、図7A〜13Fおよび表1に要約した。
【０１４９】
【表１】
2017505612.tif 000010
【０１５０】
図14B〜14Gに示すように、全てのプローブは、0.7〜5.9 x 10-7 s-1の範囲内の低い自発的加水分解率を有して高い安定性を示した。動態学的パラメータの比較により、全てのプローブがIMP-1に対して最も良い動態学的効率（kcat/Km= 0.2-2.5 ×106 s-1M-1）を有することが示されたが、IMP-1は最も一般的なメタロ-β-ラクタマーゼであり世界中に分布している（Oelschlaeger et al., (2010) J. Med. Chem. 53: 3013-3027; Griffin et al., (2011) Biochemistry 50: 9125-9134）。
【０１５１】
嵩高いt-ブチル側鎖を有する(s)-CC-4プローブは、IMP-1に対する高い特異性および動態学的効率（kcat/Km）を示し（2.2×105 s-1M-1）、他のカルバペネマーゼの50〜100倍に匹敵した。非カルバペネマーゼ型ラクタマーゼによる加水分解は検出されなかった。VIM-27およびKPC-3による加水分解のためにはより小さなR基が好まれるが、IMP-1およびNDM-1についてはそれほどではない。
【０１５２】
(s)-CC-5プローブは、VIM-27およびNDM-1（それぞれ2.6 × 104s-1M-1、および1.0 × 104s-1M-1）と比べて、IMP-1およびKPC-3（それぞれ1.2 ×106 s-1M-1および2.2 × 105 s- 1M-1）に対しての方がはるかに高い動態学的効率を示した。非カルバペネマーゼ型ラクタマーゼによる加水分解は観察されなかった。しかし、(s)-CC-6プローブはIMP-1、NDM-1、およびVIM- 27について高い動態学的効率を示し（それぞれ6.6 ×105s-1M-1、4.0 ×105 s-1M-1、および2.8 ×105 s-1M-1）、これはKPC-3（2.0 ×104 s-1M-1）よりも約14〜約33倍高いレベルであった。これらの動態学的測定は、図2A〜2Fに示されているように、組換えβ-ラクタマーゼを用いた特異性／感度結果と合致している。
【０１５３】
カルバペネマーゼを発現する生きた細菌を検出するためのこれらのプローブの有用性も実証された。クラスA β-ラクタマーゼであるKPC-3およびIMI、クラスB MBLであるVIM-27、IMP-1、およびNDM-1、クラスD β-ラクタマーゼであるOXA-48、ならびに臨床的に重要な非カルバペネマーゼであるCTX-M、SHV-18、TEM-1、BlaC、およびAmpCを含む、カルバペネマーゼまたはその他の臨床的に広く見出されるβ-ラクタマーゼを産生する11の細菌系統を評価した。104〜106c.f.u.の範囲内の様々な生細菌数に対するプローブ（特に示されない限り各10μM）の蛍光応答を図3A〜3Fに示す。陽性対照として、CDC-1は全ての細菌系統に関して一貫して陽性であり、これら全ての細菌がβ-ラクタマーゼ活性であることが示された。
【０１５４】
(s)-CC-1および(s)-CC-5プローブは、VIM-27、IMP-1、NDM-1およびKPC-3を発現する細菌（>=105 c.f.u.）に関して高い蛍光増強を示した。しかしながら、104 c.f.uの細菌を用いた場合には、IMP-1発現細菌のみが(s)-CC-1プローブによって検出可能であった。(s)-CC-3および(s)-CC-6プローブはVIM-27、IMP-1、およびNDM-1に関してのみ強い蛍光応答を有し、これは、図2A〜2Fに示されているように、組換え酵素の実験から得られた結果と合致している。対照的に、(s)-CC-3および(s)-CC-6プローブを用いて2時間のインキュベーション後にMBL細菌を確実に検出するためには、少なくとも1.0 x 105〜約1.0 x 106 c.f.u.の細菌が必要とされた。加えて、(s)-CC-4は、IMP産生系統について特異的嗜好性を示し、検出限界は約1×105 c.f.u.の細菌数であった。
【０１５５】
従って、セファロスポリンのC7位における立体化学を反転させることにより、CRE細菌により産生されるカルバペネマーゼ、特にメタロ-β-ラクタマーゼを特異的に検出することができる蛍光プローブが開発された。C7位における置換基はカルバペネマーゼ間の選択性をさらに調節することができ、カルバペネマーゼの種類をさらに見分けることができる。すなわち、(s)-CC-3および(s)-CC-6は、他のラクタマーゼと対比されるMBL全般について特異性および感受性を示す。しかしながら(s)-CC-4はIMP-1に関して高い特性を示す。
【０１５６】
本開示のプローブ(s)-CC-1〜(s)-CC-6は青色フルオロフォアであるクマリンを使用するが、報告されているように（Xie et al., (2012) J. Nat. Chem. 4: 802-809）、他のフルオロフォア（より長い発光周波数を有するものが含まれるがこれに限定されない）を本開示のフルオロフォアとして使用して感度を向上させ得ることが企図される。本開示のプローブ（フルオロフォアにおけるバリエーションを伴うものを含む）は、カルバペネム耐性腸内細菌科（CRE）感染を有する患者の早期診断および治療のためのCREの迅速かつ正確な検出のために有用であることが企図される。
【０１５７】
本開示の改変セファロスポリンプローブに様々な検出可能標識部分を組み入れて、それぞれ区別可能なメタロ-β-ラクタマーゼ種を産生する複数の細菌系統を同時に検出できるようにし得ることがさらに企図される。最も有利なことに、そのような検出可識部分は、カルバペネマーゼによるセファロスポリンの加水分解に際して検出可識なシグナル上昇を提供する。本開示のプローブのいくつかの実施形態では、この標識は蛍光標識である。標識がセファロスポリンに取り付けられることにより、励起放射により誘導される蛍光のクエンチング（消光）が存在する。別の実施形態では、標識は、プローブから周囲の液体媒体中に放出される色素であり得、放射性標識でもあり得る。放出された色素はその後検出のために未切断プローブから分離され得る。
【０１５８】
従って、本開示の一側面は、メタロ-β-ラクタマーゼによって選択的に切断可能である検出可能プローブを含む組成物の実施形態を包含し、前記プローブは、6,7-トランス配置を有するセファロスポリンとそれに取り付けられた検出可能標識とを含む。
【０１５９】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、プローブは、下記式Iまたは式IIを有し得、
【化７】
2017505612.tif 000011
式中、R1は、アルキル、置換アルキル、芳香族基、置換芳香族基、フルオロフォア、および蛍光クエンチャーからなる群から選択され得る。
【０１６０】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、R1は、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ベンジル-、およびトシルオキシ-からなる群から選択され得る。
【０１６１】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、検出可能標識は、-O-、-N-、または-S-連結によりセファロスポリンに取り付けられ得る。
【０１６２】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、検出可能標識は、(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)（III）または(4S)-2-(6-オキソ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロチアゾール-4-カルボン酸（IV）であり、下記の構造を有し得る。
【化８】
2017505612.tif 000012
【０１６３】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、プローブは、以下のものからなる群から選択され得る。
【化９】
2017505612.tif 000013
2017505612.tif 000014
【０１６４】
本開示の別の側面は、メタロ-β-ラクタマーゼ活性を選択的に検出する方法の実施形態を包含し、前記方法は、メタロ-β-ラクタマーゼ活性を有することが疑われる試料を、メタロ-β-ラクタマーゼにより選択的に切断可能な検出可能なプローブを含む組成物に接触させる工程であって、前記プローブは6,7トランス配置を有するセファロスポリン部分と検出可能標識とを含む工程；メタロ-β-ラクタマーゼ活性が前記セファロスポリン部分を切断するために有効な時間を経過させ、それによって前記セファロスポリン部分から前記検出可能標識を放出させ、それによって検出可能シグナルが産生される工程；および、前記シグナルを検出する工程であって、検出可能なシグナルは、前記試料がメタロ-β-ラクタマーゼ活性またはその供給源を含有することを示す工程を含む。
【０１６５】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、プローブは下記式Iまたは式IIを有し、
【化１０】
2017505612.tif 000015
式中、R1は、アルキル、置換アルキル、芳香族基、置換芳香族基、フルオロフォア、ルシフェラーゼ基質、および蛍光クエンチャーからなる群から選択され得る。
【０１６６】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、R1は、メチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチル、ベンジル-、およびトシルオキシ-からなる群から選択される。
【０１６７】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、検出可能標識は、色素、蛍光標識、放射性標識、またはクエンチャーであり得る。
【０１６８】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、検出可能標識は、-O-、-N-、または-S-連結によりプローブに取り付けられ得る。
【０１６９】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、検出可能標識は、(2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)（III）または(4S)-2-(6-オキソ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロチアゾール-4-カルボン酸（IV）であり、下記の構造を有し得る。
【化１１】
2017505612.tif 000016
【０１７０】
いくつかの実施形態では、プローブは、以下のものからなる群から選択され得る。
【化１２】
2017505612.tif 000017
2017505612.tif 000018
【０１７１】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、試料は、細菌培養物であり得る。
【０１７２】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、試料は、動物またはヒト対象から単離され得る。
【０１７３】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、試料は、ヒトまたは動物対象由来の試料から産生された細菌培養物であり得る。
【０１７４】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、試料は、Klebsiella種またはEscherichia種のうちの少なくとも1つを含み得る。
【０１７５】
本開示のこの側面のいくつかの実施形態では、検出可能標識はルシフェラーゼ基質であり得、前記方法は、反応混合物をルシフェラーゼと接触させることによって、放出されたルシフェラーゼ基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルを産生させることをさらに含み得る。
【０１７６】
比率、濃度、量、およびその他の数値データは、本明細書において範囲の形式で表現され得ることに留意すべきである。そのような範囲の形式は、簡便性および簡潔性のために使用されるのであり、従って、その範囲の上下限として明示記載されている数値だけでなく、その範囲に包含される全ての個々の数値または部分範囲もそれら各々が明示記載されているかのようにして含むという柔軟な様式で解釈すべきであることが理解される。例示すると、「約0.1%〜約5%」という濃度範囲は、明示記載された約0.1%〜約5%という濃度だけでなく、示された範囲内の個々の濃度（例えば1%、2%、3%、および4%）および部分範囲（例えば0.5%、1.1%、2.2%、3.3%、および4.4%）も含むと解釈されるべきである。「約」という用語は、±1%、±2%、±3%、±4%、±5%、±6%、±7%、±8%、±9%、もしくは±10%、またはさらなる修正された数値（複数可）を含み得る。加えて、「約『x』〜『y』」という表現は、「約『x』〜約『y』」を含む。
【０１７７】
上記で説明された本開示の実施形態は、実施についての可能な例に過ぎず、本開示の原理の明確な理解のためだけに提示されているということが強調されるべきである。本開示の趣旨および原理から実質的に逸脱することなく、上記で説明された本開示の実施形態に多くのバリエーションおよび修正を施すことができる。そのような修正およびバリエーションの全ては本明細書において本開示の範囲内に含まれることが意図される。
【０１７８】
以下の実施例は、本明細書において開示されクレームされる方法およびプローブの使用をいかに実施するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するように提示されるものである。数字（例えば量、温度等）に関しては正確性を期すよう努めたが、いくらかの誤差および偏差は考慮されるべきである。特に示されない限り、部数は重量部であり、温度は℃単位であり、圧力は大気圧またはその付近である。標準的な温度および圧力は20℃および1気圧として定義される。
【実施例】
【０１７９】
［実施例1］
カルバペネマーゼおよび非カルバペネマーゼ型ラクタマーゼのクローニング：
全長β-ラクタマーゼをpBAD/Myc-Hisベクター（インビトロジェン）中にクローニングするために使用したプライマーを表2に示す。
【表２】
2017505612.tif 000019
【０１８０】
PCRのための鋳型として、特定の酵素を過剰発現する各々の細菌系統（Klebsiella pneumoniaまたはEscherichia coli）からゲノムDNAまたはプラスミドDNAを精製した。各酵素についてF（フォワード）、R（リバース）プライマーおよび鋳型DNA（図16および表2にその配列を示す）と共にPf x 50 DNAポリメラーゼおよび製造会社のプロトコールを（インビトロジェン）を使用してPCRを実行した。精製したPCR産物を、制限酵素NcoIおよびSalIで消化し、T4 DNAリガーゼ（インビトロジェン）を使用してpBAD/Myc-Hisベクター中にクローニングした。ライゲートされたプラスミドDNAで細菌細胞BL21またはTop10を形質転換した。挿入されたDNAは配列決定分析により確認した。
【０１８１】
［実施例2］
細菌細胞からの酵素の精製：
全ての酵素は、参照により本明細書にその全体が組み入れられるDoherty et al., (1990) J. Med. Chem. 33: 2513-2521に記述されているように精製された。手短に述べると、6 x His含有β-ラクタマーゼ（BL21またはTop10細菌中のpBAD/Myc-Hisベクター）を、30℃における6時間超の0.2%アラビノース誘導により、600 nmにおける吸光度（OD600）が0.8に達するまで過剰発現させた。それからBugBuster（登録商標）タンパク質抽出試薬（ノヴァジェン）およびNi-NTAアガロースビーズ（キアゲン）を製造会社のプロトコール（洗浄バッファー1：0.01 M PBS、150 mM NaCl（pH 7.4）; 3回洗浄用の洗浄バッファー2：0.01 M PBS（pH 7.4）中20 mMイミダゾール；溶出バッファー、0.01 M PBS（pH 7.4）中250 mMイミダゾール）と共に使用してタンパク質を精製した。精製後、溶出されたタンパク質を、PD-10カラム（GEヘルスケア）を使用して精製した。12%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE、図15に示す通り）により純度を決定し、ブラッドフォードアッセイキット（バイオラッド）により濃度を決定した。
【０１８２】
［実施例３］
実験セクション：
全ての化学薬品は、市販のもの（例えばアルドリッチ、アルファエイサー、およびTCIアメリカ）を購入し、さらなる精製をせずに使用した。分析的TLCは、0.25 mmシリカゲル60Fプレートを蛍光指示薬（254 nm）と共に用いて行った。プレートは紫外線光により可視化した。HPLCは、GP50勾配ポンプおよびインライン・ダイオードアレイUV-可視光検出器を備えたダイオネクスHPLCシステム（ダイオネクスコーポレーション）上で行った。分析または精製のために、逆相C18（フェノメナックス、5μm、4.6 x 250 mm、またはダイオネクス、5μm、21.2 x 250 mm）カラムを、1または12 mL/minの流速の0.1%トリフルオロ酢酸含有MeCN/H2O勾配移動相と共に使用した。1Hおよび13C NMRスペクトルはバリアン400 MHz磁気共鳴分光器上で取得した。1H NMRスペクトルについてのデータは以下のように報告される。化学シフトは、百万分率（ppm）の単位においてクロロホルム-d（δ 7.26, s）に対するδとして報告される。多重度は、s（一重線）、d（二重線）、t（三重線）、q（四重線）、dd（二重の二重線）、m（多重線）、またはbr（広幅）として報告される。結合定数はヘルツ単位（Hz）におけるJ値として報告される。所与の共鳴についてのプロトン数（n）は、スペクトルの積分値に基づいて、nHと示される。動態学的実験はM1000マイクロプレートリーダー（TECAN、ノースキャロライナ州リサーチトライアングル）において行った。
【０１８３】
［実施例4］
4-メトキシベンジル 3-(クロロメチル)-7-ジアゾ-8-オキソ-5-チア-1-アザビシクロ [4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート  化合物2の調製：
【化１３】
2017505612.tif 000020
【０１８４】
化合物2は、以前に刊行された手順（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるDoherty et al., (1990) J. Med. Chem. 33: 2513-2521）に従って調製された。20 mL CH2Cl2中のACLEの溶液（2.0 g、5 mmol）に、水（20 mL）中NaNO2（0.35 g、5 mmol）混合物を加えた。得られた二相混合物を0℃に冷却し、それから30分間に渡り激しく撹拌しながら2N水性H2SO4（3.8 mL）を一滴ずつ加えた。この反応物を0℃で1時間連続的に撹拌した。続いて、有機層を分離し、水層をCH2Cl2で2回洗浄した。有機層をまとめ、鹹水で洗浄し、MgSO4上で乾燥させて濾過し、化合物2の黄色溶液を得た。この溶液は即座に次の工程に使用された。
【０１８５】
［実施例5］
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 3-(クロロメチル)-7-アルコキシ-8-オキソ-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0] オクト-2-エン-2-カルボキシレート （3）の調製：
CH2Cl2中の化合物2の溶液に、0℃において様々なアルコール（約10〜約100等量）を加えた。続けて20分間に渡って撹拌しながらトシル酸（1等量）を部分ごとに加えた（気体発生）。それから氷槽を取り除き、室温で一晩に渡り反応物を連続的に撹拌した。反応をTLCにより監視した。反応の完了後、反応混合物を濃縮し酢酸エチルで希釈し、続いて、飽和NaHCO3水溶液、水、および鹹水で抽出した。有機層を無水MgSO4上で乾燥させ、真空で濃縮させた。最後に、ヘキサン／EtOAc（4:1）を用いて残渣をフラッシュカラム上でクロマトグラフィー分離し、所望の化合物3を得た。アルコールとしてメタノール、エタノール、イソプロパノール、tert-ブタノール、ベンジルアルコール、およびトシル酸を使用して合成した化合物3の例が、それぞれ、下記の化合物3-1から3-6までである。
【０１８６】
【化１４】
2017505612.tif 000021
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 3-(クロロメチル)-7-メトキシ-8-オキソ-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（3-1）：収率= 38%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.37 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.30 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.69 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.31 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.65 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.56−3.49 (m, 3H), 3.40 (d, J = 18.1 Hz, 1H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ161.32, 161.25, 160.15, 130.96, 127.09, 126.92, 122.48, 114.20, 90.18, 68.52, 58.50, 56.41, 55.52, 43.62, 28.69。
【０１８７】
【化１５】
2017505612.tif 000022
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 3-(クロロメチル)-7-エトキシ-8-オキソ-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（3-2）：収率= 20%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.37 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.30 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.55 (dd, J = 1.8, 0.4 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.31 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.77-3.68 (m, 2H), 3.64 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 3.40 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 1.29−1.23 (m, 4H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ161.56, 161.35, 160.14, 130.98, 127.17, 126.95, 122.31, 114.19, 89.02, 68.51, 67.27, 57.12, 55.52, 43.65, 28.71, 15.34。
【０１８８】
【化１６】
2017505612.tif 000023
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 3-(クロロメチル)-7-イソプロポキシ-8-オキソ-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（3-3）：収率= 23%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.34 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.26 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.60 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.42 (d, J = 22.2 Hz, 1H), 1.21 (dd, J = 17.6, 6.1 Hz, 6H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ167.94, 160.92, 158.69, 130.95, 130.90, 126.84, 124.72, 122.25, 114.23, 114.19, 87.81, 74.69, 68.55, 61.17, 59.24, 55.51, 43.29, 28.67, 22.58。
【０１８９】
【化１７】
2017505612.tif 000024
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 7-(tert-ブトキシ)-3-(クロロメチル)-8-オキソ-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（3-4）：収率= 33%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.36 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 5.30 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 18.2 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.61 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.42 (d, J = 23.2 Hz, 1H), 1.25 (s, 9H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ168.01, 162.66, 158.68, 130.97, 130.91, 126.84, 124.70, 122.02, 114.24, 83.09, 76.69, 68.57, 61.19, 55.52, 43.30, 28.70, 28.10。
【０１９０】
【化１８】
2017505612.tif 000025
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル7-(ベンジルオキシ)-3-(クロロメチル)-8-オキソ-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（3-5）：収率= 18%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.82 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.41−7.31 (m, 5H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.22 (dd, J = 34.3, 11.8 Hz, 2H), 5.11 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.67 (s, 1H), 4.36 (dd, J = 27.1, 11.9 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.59 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.38 (d, J = 18.1 Hz, 1H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ160.85, 160.19, 156.85, 146.53, 131.82, 131.00, 130.54, 128.76, 128.55, 127.80, 127.20, 126.73, 126.67, 125.12, 114.25, 83.70, 68.63, 65.45, 57.31, 55.53, 28.52, 22.04。
【０１９１】
【化１９】
2017505612.tif 000026
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル3-(クロロメチル)-8-オキソ-7-(トシルオキシ)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（3-6）：収率= 20%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.83 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 22.4, 8.3 Hz, 3H), 7.02 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.23 (dd, J = 35.8, 11.7 Hz, 2H), 5.11 (dd, J = 1.8, 1.2 Hz, 1H), 4.79−4.73 (m, 1H), 4.37 (dd, J = 34.3, 11.9 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.61 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.40 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ171.44, 160.84, 160.16, 156.87, 146.56, 131.78, 130.97, 130.56, 128.81, 128.50, 126.66, 125.21, 114.14, 83.68, 68.58, 64.97, 57.25, 55.49, 43.19, 28.46, 22.01。
【０１９２】
［実施例6］
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 7-アルコキシ-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0] オクト-2-エン-2-カルボキシレート（6）の調製：
化合物6は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるBradley et al., (1999) Int. J. Antimicrob. Agents 11: 93-100およびPapp-Wallace et al., (2011) Antimicrob. Agents Chemother. 55: 4943-4960に従って合成した。アセトン中の化合物3（1.0等量）の溶液に、ヨウ化ナトリウム（1.0等量）を加えた。得られた混合物を室温で1時間撹拌し、それから減圧下で溶媒を除去した。水を加え、酢酸エチルで3回抽出した。それから、有機層をまとめたものをNa2S2O3水溶液および鹹水で洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。この粗製産物を次の工程に直接用いた。アセトニトリル中の上記産物（1.0等量）、K2CO3（3.0等量）、および7-ヒドロキシクマリン（2.0等量）の混合物を室温で2.5時間撹拌した。続いて減圧下で溶媒を除去し、残渣を水に溶解して酢酸エチルで抽出した。有機層をまとめたものをNa2S2O3水溶液および鹹水で洗浄し、MgSO4上で乾燥させた。短シリカゲルカラムにおけるフラッシュクロマトグラフィーを使用して無機不純物および剰余の7-ヒドロキシクマリンの大部分を取り除いた。得られた化合物4は、2つのアイソマーを含むものであるが、これをCH2Cl2に溶解し、それから0℃にて3-クロロペルオキシ安息香酸（m-CPBA、68%、1.0等量）をいくつかのポートにおいて加えた。0℃で30分間撹拌（TLCで監視）した後、反応混合物をCH2Cl2で希釈し、Na2S2O3（水溶液）、NaHCO3（水溶液）、および鹹水で続けて洗浄した。MgSO4上で乾燥させた後、短シリカゲルカラムにおけるフラッシュクロマトグラフィーを用いた精製を行って化合物5を得た。0℃における無水アセトン中の化合物5（1.0等量）とNaI（5.0等量）との混合物に、トリフルオロ酢酸無水物（TFAA）（5.0等量）を一滴ずつ加えた。得られた混合物を0℃で1時間撹拌し、それから、溶媒および揮発性の試薬を減圧下で除去した。残渣をNaHCO3（水溶液）に溶解し、酢酸エチルで抽出した。シリカゲルカラムにおけるフラッシュクロマトグラフィーを用いた精製後、表題の化合物6を固形物として得た。それぞれアルコールとしてメタノール、エタノール、イソプロパノール、tert-ブタノール、ベンジルアルコール、およびトシル酸を使用することにより、化合物6の実施形態（化合物6-1から6-6まで）を合成した。
【０１９３】
【化２０】
2017505612.tif 000027
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 7-メトキシ-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0] オクト-2-エン-2-カルボキシレート（6-1）：収率= 33%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.61 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.2 Hz, 3H), 6.82 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.75 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.24 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.24 (s, 2H), 4.81 (q, J = 12.4 Hz, 2H), 4.68 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.63 (d, J = 18.3 Hz, 2H), 3.52 (s, 3H), 3.46 (d, J = 18.3 Hz, 2H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ161.34, 160.15, 155.88, 143.50, 131.00, 129.19, 126.94, 122.72, 114.20, 113.81, 113.34, 112.79, 102.09, 90.32, 68.47, 67.29, 58.47, 56.29, 55.51, 27.82。
【０１９４】
【化２１】
2017505612.tif 000028
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル7-エトキシ-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ [4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（6-2）：収率 = 30%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.63 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 8.6, 3.1 Hz, 3H), 6.84 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.76 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 4.82 (q, J = 12.5 Hz, 2H), 4.67 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.76-3.62 (m, 2H), 3.62 (d, J = 18.3 Hz, 1H), 3.46 (d, J = 18.3 Hz, 1H), 1.26 (t, J = 7.0 Hz, 3H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ171.30, 161.71, 161.62, 161.23, 160.17, 155.91, 143.45, 131.04, 129.15, 126.92, 122.53, 114.21, 113.87, 113.35, 112.77, 102.16, 89.19, 68.48, 67.32, 67.25, 60.65, 57.03, 55.51, 27.83, 15.34。
【０１９５】
【化２２】
2017505612.tif 000029
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル7-イソプロポキシ-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ [4.2.0] オクト-2-エン-2-カルボキシレート（6-3）：収率= 29%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.64 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.43−7.27 (m, 3H), 6.86 (dd, J = 10.8, 5.4 Hz, 2H), 6.80−6.69 (m, 2H), 6.28 (dd, J= 9.5, 2.6 Hz, 1H), 5.26 (dt, J= 16.6, 8.4 Hz, 2H), 4.96−4.79 (m, 2H), 4.74 (dd, J= 25.3, 1.8 Hz, 1H), 4.58 (dd, J= 21.2, 1.8 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.64 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 3.58 (d, J= 17.2 Hz, 1H), 3.46 (d, J = 18.3 Hz, 1H), 1.24 (dd, J = 18.7, 6.1 Hz, 6H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ167.89, 162.69, 161.47, 160.14, 155.66, 144.40, 131.08, 131.01, 129.33, 127.08, 126.87, 123.25, 114.27, 114.23, 113.48, 113.38, 113.29, 102.15, 87.76, 74.92, 68.58, 67.31, 58.40, 55.52, 27.84, 22.63, 22.52。
【０１９６】
【化２３】
2017505612.tif 000030
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 7-(tert-ブトキシ)-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ [4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（6-4）：収率Y= 33%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.62 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.34 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 6.84 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.79−6.71 (m, 2H), 6.26 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.28−5.19 (m, 2H), 4.85−4.75 (m, 2H), 4.65 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.61 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.46 (dd, J = 9.4, 8.8 Hz, 2H), 1.26 (s, 9H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ171.37, 167.94, 162.76, 161.74, 161.18, 161.09, 160.17, 158.79, 155.89, 143.45, 131.02, 129.19, 127.34, 126.89, 126.57, 125.21, 122.18, 114.22, 113.86, 113.38, 112.74, 102.15, 83.25, 68.57, 67.12, 61.35, 59.11, 55.51, 28.09, 21.29。
【０１９７】
【化２４】
2017505612.tif 000031
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 7-(ベンジルオキシ)-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ [4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（6-5）：収率= 23%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.62 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 0.5 Hz, 4H), 7.34 (s, 1H), 7.33 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 3H), 6.80−6.64 (m, 3H), 6.27 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 1.5 Hz, 2H), 4.87 (t, J = 3.8 Hz, 1H), 4.83 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 4.80 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 4.79−4.76 (m, 1H), 4.64 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.58 (d, J = 18.2 Hz, 1H), 3.42 (d, J = 18.3 Hz, 1H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ161.59, 161.50, 161.22, 161.16, 160.18, 155.91, 143.42, 136.23, 131.05, 129.14, 128.94, 128.79, 128.60, 126.92, 122.93, 114.26, 114.22, 113.88, 113.36, 112.74, 102.17, 88.52, 83.92, 73.55, 68.49, 67.28, 57.12, 55.51, 27.75。
【０１９８】
【化２５】
2017505612.tif 000032
(6R, 7S)-4-メトキシベンジル 8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-7-(トシルオキシ)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボキシレート（6-6）：収率= 12%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ8.01 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.42−7.27 (m, 5H), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.76 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.28−5.17 (m, 2H), 5.12 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.86 (q, J = 12.7 Hz, 2H), 4.78 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.62 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.62 (d, J = 18.3 Hz, 1H), 3.46 (d, J = 18.3 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)。
【０１９９】
［実施例7］
最終的な蛍光プローブの調製：
CH2Cl2 : TFA : TIPS : H2O = 30 : 65 : 2.5 : 2.5（4 mL）の溶液に化合物6を加え、この混合物を0℃で30分間撹拌した（HPLCで監視）。C18カラム上のRP-HPLC精製により所望の最終的なプローブを得た。
【０２００】
【化２６】
2017505612.tif 000033
(6R, 7S)-7-メトキシ-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボン酸（(s)-CC-1）。収率= 77%。1H NMR (400 MHz, d6-DMSO)δ7.97 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.01 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.86 (dd, J = 26.5, 11.9 Hz, 2H), 4.75 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.70 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.55 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 3.43 (s, 3H)。13C NMR (101 MHz, d6-DMSO) δ163.45, 161.94, 161.80, 160.89, 155.93, 144.93, 132.96, 130.26, 128.14, 121.16, 113.46, 102.18, 89.60, 67.80, 57.99, 55.90, 27.65。MS：C18H15NNaO7S+([M-H]+)について計算：412.37；実測：412.06。
【０２０１】
【化２７】
2017505612.tif 000034
(6R, 7S)-7-エトキシ-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボン酸（(s)-CC-2）。収率= 80%。 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ7.98 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.95 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.85 (d, J = 15.7 Hz, 2H), 4.77 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 3.74−3.65 (m, 2H), 3.62 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 3.55 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 1.16 (t, J = 7.0 Hz, 3H)。MS：C19H16NO7S-([M-H]-)について計算：402.41；実測：402.00。
【０２０２】
【化２８】
2017505612.tif 000035
(6R, 7S)-7-イソプロポキシ-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボン酸（(s)-CC-3）。収率= 83%。1H NMR (400 MHz, d6-DMSO)δ7.98 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.6, 2.5 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.84 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.81 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.77 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 12.2, 6.1 Hz, 1H), 3.70 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 3.54 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 1.15 (dd, J = 9.3, 6.1 Hz, 6H)。13C NMR (101 MHz, d6-DMSO) δ163.48, 162.50, 161.81, 160.90, 155.94, 144.95, 130.26, 128.23, 121.00, 113.48, 102.19, 87.32, 74.02, 67.80, 58.05, 40.81, 40.60, 40.39, 40.18, 39.97, 39.77, 39.56, 27.67, 22.97, 22.89。MS：C20H18NO7S- ([M-H]-)について計算：416.43；実測：416.03。
【０２０３】
【化２９】
2017505612.tif 000036
(6R, 7S)-7-(tert-ブトキシ)-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボン酸（(s)-CC-4）。収率= 75%。1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ7.98 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.95 (dd, 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ7.98 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.98−6.92 (m, 1H), 6.29 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.83 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.80 (s, 1H), 4.76 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 3.68 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 3.53 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 1.19 (s, 9H)。13C NMR (101 MHz, d6-DMSO) δ163.53, 163.14, 161.81, 160.91, 155.93, 144.96, 130.26, 121.16, 113.50, 102.19, 82.72, 76.56, 67.79, 59.09, 28.16, 27.61。MS：C21H20NO7S- ([M-H]-)について計算：430.46；実測：430.00。
【０２０４】
【化３０】
2017505612.tif 000037
(6R, 7S)-7-(ベンジルオキシ)-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボン酸（(s)-CC-5）。収率= 72%。1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ7.98 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 12.8, 4.2 Hz, 4H), 7.01 (s, 1H), 6.95 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.94 (s, 1H), 4.91 (s, 1H), 4.87 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.63 (d, J = 11.5 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 52.7, 18.1 Hz, 2H)。13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ162.23, 146.95, 144.47, 143.24, 129.39, 128.46, 128.31, 128.24, 126.45, 124.31, 113.02, 112.59, 101.55, 88.27, 72.94, 67.09, 56.94, 26.94。MS：C24H18NO7S- ([M-H]-)について計算：464.48；実測：464.17。
【０２０５】
【化３１】
2017505612.tif 000038
(6R, 7S)-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-7-(トシルオキシ)-5-チア-1-アザビシクロ [4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボン酸（(s)-CC-6）。収率= 70%。1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ7.98 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.94 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 6.29 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.62 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 5.06 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.90 (dd, J = 36.4, 12.3 Hz, 2H), 3.60 (dd, J = 41.3, 18.1 Hz, 3H), 2.43 (s, 3H)。MS：C24H18NO9S2-([M-H]-)について計算：528.54；実測：527.88。
【０２０６】
【化３２】
2017505612.tif 000039
(6R,7S)-7-(tert-ブトキシ)-8-オキソ-3-(((2-オキソ-2H-クロメン-7-イル)オキシ)メチル)-5-チア-1-アザビシクロ[4.2.0]オクト-2-エン-2-カルボン酸5-オキシド（(s)-CC-7） 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ7.87 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 11.6, 3.1 Hz, 2H), 6.25 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.44−4.98 (m, 2H), 4.61 (d, J = 50.3 Hz, 2H), 4.15 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 4.06 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 3.90 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 3.74−3.59 (m, 1H), 1.31 (s, 1H)。MS：C21H20NO8S ([M-H]-)について計算：446.46；実測：445.98。
【０２０７】
［実施例8］
【化３３】
2017505612.tif 000040
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ8.09 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.86 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.32 (dd, J = 9.2, 1.6 Hz, 1H), 5.41 (s, 1H), 4.96 (dd, J= 25.3, 11.6 Hz, 2H), 4.84 (s, 1H), 3.52 (d, J = 17.4 Hz, 1H), 3.35 (d, J = 17.0 Hz, 4H), 2.42 (s, 3H)。13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ172.08, 166.42, 162.95, 158.54, 157.99, 157.77, 147.87, 146.62, 137.69, 131.99, 130.37, 128.19, 127.43, 126.52, 124.76, 117.30, 105.14, 84.02, 78.20, 67.01, 57.19, 48.50, 48.29, 48.08, 47.87, 47.65, 47.44, 47.23, 34.79, 26.87, 20.66。MS： C26H21N3O9S4 ([M+H]+)について計算：648.02；実測：648.40。
【０２０８】
［実施例9］
【化３４】
2017505612.tif 000041
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ8.04 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 9.1, 2.5 Hz, 1H), 5.47−5.36 (m, 1H), 4.88−4.82 (m, 2H), 4.77 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 3.88−3.80 (m, 1H), 3.80−3.75 (m, 1H), 3.73 (s, 1H), 3.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.58 (d, J= 18.1 Hz, 2H), 1.15 (dd, J = 8.7, 6.1 Hz, 6H)。MS：C22H21N3O7S3([M+H]+)について計算：536.05；実測：536.40。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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