(57)【要約】  血液脳関門を通過することができ、かつターゲティング部分、抗酸化剤、および抗炎症剤を有する、ミトコンドリアを含有するナノ粒子が、外傷性脳損傷の処置に有用であり得る。
2017530941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアターゲティング部分と；
（ｉ）抗酸化剤、（ｉｉ）抗炎症剤、および（ｉｉｉ）撮像剤の１つまたは複数と
を含むナノ粒子。
【請求項２】
前記ナノ粒子は、抗酸化剤および抗炎症剤を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記抗酸化剤は、ＣｏＱ１０である、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記抗炎症剤は、ステロイド性抗炎症剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記抗炎症剤は、プレドニゾンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記撮像剤は、量子ドットである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記撮像剤は、ターゲティング分子に取り付けられ、前記ターゲティング分子は、治療に、または診断に関連する分子と相互作用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子は、直径が約３０ナノメートルから約１５０ナノメートルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ナノ粒子は、ゼータ電位が約１０ｍＶ以上である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記ミトコンドリアターゲティング部分は、疎水性の非局在化カチオン部分を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記ミトコンドリアターゲティング部分は、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）部分、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチド、およびローダミンカチオンからなる群から選択される部分を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記ミトコンドリアターゲティング部分は、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）部分またはその誘導体を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
疎水性ナノ粒子コアと；
前記コアを取り囲む親水性層と
をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記親水性ポリマー部分は、ＰＥＧを含む、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記親水性ポリマー部分は、前記コアの少なくとも一部を形成する疎水性ポリマー部分に取り付けられる、請求項１３または１４に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記親水性層は、前記コアに取り付けられる親水性ポリマー部分を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記親水性ポリマー部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
親水性ポリマー部分は、前記コアの少なくとも一部を形成する疎水性ポリマー部分を介して前記コアに取り付けられる、請求項１６または１７に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
前記コアの少なくとも一部を形成する前記疎水性ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、および乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含むポリマーから選択される、請求項１８に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
前記コアの少なくとも一部を形成する前記疎水性ポリマーは、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含む、請求項１７に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子の使用であって、これを必要とする患者において、損傷を受けた中枢神経系組織を処置するための使用。
【請求項２２】
脳関連疾患を処置または診断するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子の使用。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子の使用であって、これを必要とする患者において外傷性脳損傷を処置するための使用。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子を対象に投与することを含む方法。
【請求項２５】
神経組織の損傷の危険がある、またはこれを有する患者を処置する方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項２６】
前記患者を、神経組織の損傷の危険がある、またはこれを有する患者として同定することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
外傷性脳損傷の危険がある、またはこれを有する患者を処置する方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記患者を、外傷性脳損傷の危険がある、またはこれを有する患者として同定することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
脳関連疾患の危険がある、またはこれを有する患者を処置する方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のナノ粒子を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項３０】
前記患者を、脳関連疾患の危険がある、またはこれを有する患者として同定することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナノ粒子の投与は、前記ナノ粒子を全身投与することを含む、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の陳述
本発明は、米国政府の国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）による、認可第Ｐ３０ＧＭ０９２３７８号の政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月４日出願の米国仮特許出願第６２／０３２８２８号明細書の利益を主張し、この出願は、本明細書中に示される開示と矛盾しない限りにおいて、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、脳内に蓄積するように構成されたナノ粒子、ならびにその、診断用途および治療用途が挙げられる使用の方法に関する。一部の実施形態において、ナノ粒子は、抗酸化剤、抗炎症剤等の剤、または双方をミトコンドリアに輸送し、そして損傷を受けた脳組織を処置するために、例えば外傷性脳損傷を処置するために用いられ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、とりわけ、血液脳関門を横断して治療剤または撮像剤を送達し、かつ脳内に蓄積するナノ粒子を記載する。当該ナノ粒子は、剤をミトコンドリアに、特にミトコンドリアが豊富な細胞、または中枢神経系の領域に輸送するためのミトコンドリアターゲティング部分を含み得る。治療剤として、抗酸化剤、抗炎症剤、または抗酸化剤および抗炎症剤の双方が挙げられ得る。治療剤は、ＣＮＳの障害を処置するのに用いられ得る。一部の実施形態において、治療ナノ粒子は、損傷を受けたＣＮＳ組織、例えば損傷を受けた神経組織を処置するのに用いられる。一部の実施形態において、治療ナノ粒子は、外傷性脳損傷および脳卒中を処置するのに用いられる。撮像剤として、ＱＤ、酸化鉄、ガドリニウム、または他の臨床的に関連する撮像分子のような撮像剤が挙げられ得、これらは、ナノ粒子中に封入されてもよいし、ナノ粒子に取り付けられてもよいし、ナノ粒子中に封入され、かつナノ粒子に取り付けられてもよい。
【０００５】
添付の図面と併せて読まれれば、以下の詳細な説明に基づいて、以前のナノ粒子または処置モダリティ等に勝る、本明細書中に示される種々の実施形態の１つまたは複数の利点が、当業者に容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１Ａは、脳への抗酸化剤および抗炎症剤の送達用の、ミトコンドリア標的（Ｔ）ナノ粒子（ＮＰ）および非標的（ＮＴ）ナノ粒子の設計および構築を説明する概略図である。標的ナノ粒子および非標的ナノ粒子の、用いられたポリマーおよびペイロードの構造、ならびに視覚的な説明が表される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣｏＱ１０およびプレドニゾンを含有する標的ＮＰおよび非標的ＮＰの直径（Ｚａｖｅｒａｇｅ）、ゼータ電位、ローディング、ＥＥ、および透過型電子顕微鏡写真を示す、いくつかのグラフおよび画像である。
【図２Ａ】図２は、正常なブタ脳におけるＴ−ＮＰの蓄積、および脳白質における分布を示すいくつかのグラフおよび画像である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢、ｎ＝３）が、イソフルランを用いて麻酔された。ＴＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰが、耳静脈ＩＶを介して投与された。（Ａ）ブタモデルにおけるＩＣＰ−ＭＳによるＴ−ＮＰおよびＮＴ−ＮＰの血漿循環流および様々な臓器分布。＊＊＊Ｐ＜０．００１。（
【図２Ｂ】図２は、正常なブタ脳におけるＴ−ＮＰの蓄積、および脳白質における分布を示すいくつかのグラフおよび画像である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢、ｎ＝３）が、イソフルランを用いて麻酔された。ＴＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰが、耳静脈ＩＶを介して投与された。（Ｂ）ＩＶＩＳを用いた注射２４時間後の脳蓄積；上部：普通の写真、および底部：蛍光画像。
【図２Ｃ】図２は、正常なブタ脳におけるＴ−ＮＰの蓄積、および脳白質における分布を示すいくつかのグラフおよび画像である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢、ｎ＝３）が、イソフルランを用いて麻酔された。ＴＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰが、耳静脈ＩＶを介して投与された。（Ｃ）脳全体の冠状切片スライスのＩＶＩＳ分析による脳の白質におけるＴ−ＮＰの分布；上部：白質および灰白質を示す普通の写真；下部：蛍光画像；ならびに右側：ＩＣＰ−ＭＳによる白質および灰白質の定量分析。データは３頭の子豚の平均を表す。
【図３】図３は、ブタ脳組織のミトコンドリアにおけるＴ−ＮＰの蓄積を示すいくつかの画像である。灰白質および白質のサンプルが、各脳から単離された。脳サンプルが固定されて、ミトコンドリア標識化についてはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで、そして核染色についてはＤＡＰＩを有するＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄマウント媒体で染色された。（Ａ）Ｔ−ＮＰは、灰白質および白質の双方において、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ色素によって顕著な共局在化を示し、（Ｂ）ＮＴ−ＮＰは、灰白質および白質の脳組織において限られた存在を示し、ミトコンドリアへの共局在化は示さなかった。スケールバー：２５μｍ。
【図４Ａ】図４は、ＴＢＩ後のブタ脳に関連する変化を示すいくつかの画像およびグラフである。（Ａ）ＴＢＩ後のニューロン死、神経実質（ｎｅｕｒｏｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）浮腫、および好中球浸潤。（Ｉ）病変部位（青色の矢印）が出血で満たされており、皮質の接合部に沿う白質が、浮腫により淡く希薄である（ｐ）。（ＩＩ）対側上に変化がないことに注目されたい。（ＩＩＩ）（Ｉ）中の小さい方のボックスの４０×倍率。縮んだ赤色のニューロン細胞体および濃縮した核によって特徴付けられるニューロン細胞死が、病変部位（対側上の比較可能な領域において見られない（ＩＶ））の灰白質領域中に存在する。（Ｖ）冒された灰白質の２０×倍率。好中球は対側の比較可能な領域中に存在せず、ニューロン細胞体が明らかである（ＶＩ）。（ＶＩＩ）（Ｉ）における大きい方のボックスの４０×倍率。出血（ｈ）が、病変部位の白質中に存在し、周囲の白質が、浮腫蓄積（対側上の比較可能な領域中に存在しない（ＶＩＩＩ））のために、かなり空胞がある（ｖ）。（Ｉ、ＩＩ）スケールバー＝２ｍｍ；（Ｖ、ＶＩ）スケールバー＝２００μｍ；（ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ）スケールバー＝１００μｍ。
【図４Ｂ】図４は、ＴＢＩ後のブタ脳に関連する変化を示すいくつかの画像およびグラフである。（Ｂ）損傷のある同側上の浮腫蓄積による様々な容積測定変化。（上部）子豚の脳の冠状切片は、病変部位（青色の矢印）を示し、同側の白質領域は、対側の比較可能な領域（黒色の矢印先端）と比較して膨張しているように見える（黒色の矢印）。（下部）同側半球は、膨張のため、対側半球よりも面積が大きく、平均して１３％増大した。
【図４Ｃ】図４は、ＴＢＩ後のブタ脳に関連する変化を示すいくつかの画像およびグラフである。（Ｃ）ＴＢＩ後のＲＯＳレベルの増大。
【図４Ｄ】図４は、ＴＢＩ後のブタ脳に関連する変化を示すいくつかの画像およびグラフである。（Ｄ）ＴＢＩ後の炎症性サイトカインレベルの増大。ＩＦＮ−γ（上部）およびＴＮＦ−α（下部）双方のタンパク質レベルは、無傷の脳組織と比較して、負傷した脳組織において有意に増大した。各処置群について、ｎ≧３。
【図５Ａ】図５は、負傷したブタ脳におけるＴ−ＮＰの蓄積を示すいくつかのグラフおよび画像である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）が、イソフルランを用いて麻酔されて、ＴＢＩが誘導された。５時間後、Ｔ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰを、耳静脈ｉ．ｖ．を介して投与された。（Ａ）ＴＢＩブタモデルにおけるＴ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰの血漿循環流。脳蓄積が、注射２４時間後にＩＣＰ−ＭＳ（Ｂ）および（Ｃ）ＩＶＩＳによって追跡された。＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＝０．００１〜０．０１；ｎｓ＝有意でない。
【図５Ｂ】図５は、負傷したブタ脳におけるＴ−ＮＰの蓄積を示すいくつかのグラフおよび画像である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）が、イソフルランを用いて麻酔されて、ＴＢＩが誘導された。５時間後、Ｔ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰを、耳静脈ｉ．ｖ．を介して投与された。（Ａ）ＴＢＩブタモデルにおけるＴ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰの血漿循環流。脳蓄積が、注射２４時間後にＩＣＰ−ＭＳ（Ｂ）および（Ｃ）ＩＶＩＳによって追跡された。＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＝０．００１〜０．０１；ｎｓ＝有意でない。
【図５Ｃ】図５は、負傷したブタ脳におけるＴ−ＮＰの蓄積を示すいくつかのグラフおよび画像である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）が、イソフルランを用いて麻酔されて、ＴＢＩが誘導された。５時間後、Ｔ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰを、耳静脈ｉ．ｖ．を介して投与された。（Ａ）ＴＢＩブタモデルにおけるＴ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰの血漿循環流。脳蓄積が、注射２４時間後にＩＣＰ−ＭＳ（Ｂ）および（Ｃ）ＩＶＩＳによって追跡された。＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＝０．００１〜０．０１；ｎｓ＝有意でない。
【図６Ａ】図６は、ＮＳＣ中に抗酸化剤および抗炎症剤を運ぶミトコンドリア標的ＮＰの治療潜在性を示すいくつかのグラフである。（Ａ）ミトコンドリア標的Ｔ−ＮＰおよび非標的ＮＴ−ＮＰからの抗炎症プレドニゾンおよび抗酸化剤ＣｏＱ１０の放出動態。
【図６Ｂ】図６は、ＮＳＣ中に抗酸化剤および抗炎症剤を運ぶミトコンドリア標的ＮＰの治療潜在性を示すいくつかのグラフである。（Ｂ）Ｓｅａｈｏｒｓｅアナライザを用いての、ＮＳＣ細胞におけるＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰおよびＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰの抗酸化性。（Ｃ）ＮＳＣ中にＣｏＱ１０およびプレドニゾンを運ぶミトコンドリア標的ＮＰの抗炎症性。細胞が最初に、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で３６時間処理された。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、ＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋ＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、フリーＣｏＱ１０、フリープレドニゾン、またはフリープレドニゾン＋フリーＣｏＱ１０（全ての試験物について、ＣｏＱ１０またはプレドニゾンに関して、１μＭ）が、ＬＰＳ処理済み細胞に加えられた。ＥＬＩＳＡが、ＴＮＦ−＃、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０に対して上澄みで実行された。データは、平均±Ｓ．Ｄ．を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＝０．００１〜０．０１；＊ｐ＝０．０１〜０．０５；ｎｓ＝有意でない。
【図６Ｃ】図６は、ＮＳＣ中に抗酸化剤および抗炎症剤を運ぶミトコンドリア標的ＮＰの治療潜在性を示すいくつかのグラフである。（Ｃ）ＮＳＣ中にＣｏＱ１０およびプレドニゾンを運ぶミトコンドリア標的ＮＰの抗炎症性。細胞が最初に、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で３６時間処理された。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、ＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋ＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、フリーＣｏＱ１０、フリープレドニゾン、またはフリープレドニゾン＋フリーＣｏＱ１０（全ての試験物について、ＣｏＱ１０またはプレドニゾンに関して、１μＭ）が、ＬＰＳ処理済み細胞に加えられた。ＥＬＩＳＡが、ＴＮＦ−＃、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０に対して上澄みで実行された。データは、平均±Ｓ．Ｄ．を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＝０．００１〜０．０１；＊ｐ＝０．０１〜０．０５；ｎｓ＝有意でない。
【図７Ａ】図７は、子豚における用量依存性の１４日の毒性研究を示すいくつかのグラフおよび画像である。生理食塩水、Ｔ−ＮＰ、またはＮＴ−ＮＰ（総ＮＰに関して、２つの異なる容量、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）が静脈内注射によって投与されて、毒性が１４日間追跡された。（Ａ）５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＴ−ＮＰ、ＮＴ−ＮＰ、そして生理食塩水の単回の静脈内注射後の７日目および１４日目の完全な血清化学結果。
【図７Ｂ】図７は、子豚における用量依存性の１４日の毒性研究を示すいくつかのグラフおよび画像である。生理食塩水、Ｔ−ＮＰ、またはＮＴ−ＮＰ（総ＮＰに関して、２つの異なる容量、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）が静脈内注射によって投与されて、毒性が１４日間追跡された。（Ｂ）処置済み動物由来の脳および肝臓の、注射後１４日目の組織病理学の代表的な画像。Ｔ−ＮＰまたはＮＴ−ＮＰの注射に関係する有意な変化は観察されなかった。
【図８】図８は、ＴＢＩの子豚モデルにおける、抗酸化剤および抗炎症剤を運ぶミトコンドリア標的ＮＰの治療潜在性を示すグラフィックタイムラインおよびグラフである。（Ａ）子豚におけるＴＢＩの誘導、およびＮＰの投与を示す概略。（Ｂ）ＴＢＩ後のＲＯＳレベルの増大、および以降の、Ｔ−ＣｏＱ１０およびＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰの組合せにより処置された子豚における酸化ストレスレベルの減少。データは、平均±Ｓ．Ｄ．を表す。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＝０．００１〜０．０１；＊ｐ＝０．０１〜０．０５；ｎｓ＝有意でない。
【図９】図９は、Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰおよびＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰの直径（左）ならびにＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰおよびＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰの直径（右）のＤＬＳプロットのオーバーレイを示すいくつかのグラフである。
【図１０】図１０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）の脳全体の垂直にカットされたスライスのＩＶＩＳ分析を示すいくつかの画像である。子豚は、イソフルランを用いて麻酔されて、生理食塩水が耳静脈ＩＶを介して投与された。
【図１１】図１１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）の脳全体の垂直にカットされたスライスのＩＶＩＳ分析を示すいくつかの画像である。子豚は、イソフルランを用いて麻酔されて、ＮＴ−ＱＤ−ＮＰが耳静脈ＩＶを介して投与された。
【図１２】図１２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）の脳全体の垂直にカットされたスライスのＩＶＩＳ分析を示すいくつかの画像である。子豚は、イソフルランを用いて麻酔されて、Ｔ−ＱＤ−ＮＰが耳静脈ＩＶを介して投与された。
【図１３Ａ】図１３Ａは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）の脳全体、および脳全体の垂直にカットされたスライスのＩＶＩＳ分析を示すいくつかの画像である。子豚は、イソフルランを用いて麻酔されて、ＮＰ（Ｔ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．４６ｍｇ／ｋｇ；ＮＴ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．６２ｍｇ／ｋｇ）が耳静脈ＩＶを介して投与された。データは、各群由来の全動物の画像を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）の脳全体、および脳全体の垂直にカットされたスライスのＩＶＩＳ分析を示すいくつかの画像である。子豚は、イソフルランを用いて麻酔されて、ＮＰ（Ｔ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．４６ｍｇ／ｋｇ；ＮＴ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．６２ｍｇ／ｋｇ）が耳静脈ＩＶを介して投与された。データは、各群由来の全動物の画像を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）の脳全体、および脳全体の垂直にカットされたスライスのＩＶＩＳ分析を示すいくつかの画像である。子豚は、イソフルランを用いて麻酔されて、ＮＰ（Ｔ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．４６ｍｇ／ｋｇ；ＮＴ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．６２ｍｇ／ｋｇ）が耳静脈ＩＶを介して投与された。データは、各群由来の全動物の画像を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）の脳全体、および脳全体の垂直にカットされたスライスのＩＶＩＳ分析を示すいくつかの画像である。子豚は、イソフルランを用いて麻酔されて、ＮＰ（Ｔ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．４６ｍｇ／ｋｇ；ＮＴ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．６２ｍｇ／ｋｇ）が耳静脈ＩＶを介して投与された。データは、各群由来の全動物の画像を示す。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）の脳全体、および脳全体の垂直にカットされたスライスのＩＶＩＳ分析を示すいくつかの画像である。子豚は、イソフルランを用いて麻酔されて、ＮＰ（Ｔ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．４６ｍｇ／ｋｇ；ＮＴ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．６２ｍｇ／ｋｇ）が耳静脈ＩＶを介して投与された。データは、各群由来の全動物の画像を示す。
【図１３Ｆ】図１３ＦＤ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）の脳全体、および脳全体の垂直にカットされたスライスのＩＶＩＳ分析を示すいくつかの画像である。子豚は、イソフルランを用いて麻酔されて、ＮＰ（Ｔ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．４６ｍｇ／ｋｇ；ＮＴ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．６２ｍｇ／ｋｇ）が耳静脈ＩＶを介して投与された。データは、各群由来の全動物の画像を示す。
【図１４】図１４はいくつかの画像である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）が、イソフルランを用いて麻酔されて、ＮＰ（Ｔ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．４６ｍｇ／ｋｇ；ＮＴ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．６２ｍｇ／ｋｇ）が耳静脈ＩＶを介して投与された。肝臓サンプルが固定されて、ミトコンドリア標識化についてはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで、そして核染色についてはＤＡＰＩを有するＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄマウント媒体で染色された。肝臓において限られた量のＴ−ＮＰしか見出されず、多数のＮＴ−ＮＰが肝細胞に局在化されていた。スケールバー：２５μｍ。ＤＩＣ：微分干渉観察。
【図１５】図１５は、いくつかの画像である。雄Ｃ５７ＢＬ／６が、イソフルランＴ−ＱＤ−ＮＰを用いて麻酔された：ＮＰに関して２０ｍｇ／ｋｇが、尾静脈注射を介して投与された。ＮＰの分布が、ＩＶＩＳ分析を実行することによって研究された。データは、各群由来の全動物の画像を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、いくつかの画像である。雄Ｃ５７ＢＬ／６が、イソフルランを用いて麻酔されて、Ｔ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２０ｍｇ／ｋｇが、尾静脈注射で投与された。脳内の様々な細胞集団におけるＮＰの分布が、共焦点撮像を実行することによって研究された。組織切片の免疫染色が、様々なタイプの脳細胞マーカーに対する抗体処理を用いて実行された：ニューロン核についてＮｅｕＮ、正常内皮マーカーについてＣＤ−３１、乏突起膠細胞についてｏｌｉｇ２、そして星状細胞についてＧＦＡＰ。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、いくつかの画像である。雄Ｃ５７ＢＬ／６が、イソフルランを用いて麻酔されて、Ｔ−ＱＤ−ＮＰ：ＮＰに関して２０ｍｇ／ｋｇが、尾静脈注射で投与された。脳内の様々な細胞集団におけるＮＰの分布が、共焦点撮像を実行することによって研究された。組織切片の免疫染色が、様々なタイプの脳細胞マーカーに対する抗体処理を用いて実行された：ニューロン核についてＮｅｕＮ、正常内皮マーカーについてＣＤ−３１、乏突起膠細胞についてｏｌｉｇ２、そして星状細胞についてＧＦＡＰ。
【図１７】図１７は、グラフである。Ｓｅａｈｏｒｓｅアナライザを用いた、ＮＳＣ細胞におけるＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ（ＣｏＱ１０に関して１μＭ）の抗酸化特性、およびＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰ（総ＮＰに関して０．５ｍｇ／ｍＬ）との比較。
【図１８】図１８は、いくつかのグラフである。ＣｏＱ１０およびそのＮＰ（上部）ならびにプレドニゾンおよびそのＮＰ（下部）を用いたＮＳＣでのＭＴＴアッセイ。
【図１９】図１９は、いくつかのグラフである。細胞は最初に、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で３６時間処理された。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、ＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋ＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、フリーＣｏＱ１０、フリープレドニゾン、またはフリープレドニゾン＋フリーＣｏＱ１０（全ての試験物について、ＣｏＱ１０またはプレドニゾンに関して、１μＭ）が、ＬＰＳ処理済み細胞に加えられた。ＥＬＩＳＡが、ＩＬ−４およびＩＬ−１２に対して上澄みで実行された。
【図２０Ａ】図２０Ａは、いくつかのグラフおよび画像である。子豚における用量依存性の１４日の毒性研究。生理食塩水、Ｔ−ＮＰ、またはＮＴＮＰ（総ＮＰに関して、２つの異なる容量、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）が静脈内注射によって投与されて、毒性が１４日間追跡された。５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＴ−ＮＰ、ＮＴ−ＮＰ、そして生理食塩水の単回の静脈内注射後の７日目および１４日目の代表的な血液学データ。処置済み動物由来の脳および肝臓の、注射後１４日目の組織病理学の代表的な画像。発明者らは、凝固により、少数のサンプルで血液学的分析を実行することができなかった。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、いくつかのグラフおよび画像である。子豚における用量依存性の１４日の毒性研究。生理食塩水、Ｔ−ＮＰ、またはＮＴＮＰ（総ＮＰに関して、２つの異なる容量、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）が静脈内注射によって投与されて、毒性が１４日間追跡された。５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＴ−ＮＰ、ＮＴ−ＮＰ、そして生理食塩水の単回の静脈内注射後の７日目および１４日目の代表的な血液学データ。処置済み動物由来の脳および肝臓の、注射後１４日目の組織病理学の代表的な画像。発明者らは、凝固により、少数のサンプルで血液学的分析を実行することができなかった。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、いくつかのグラフおよび画像である。子豚における用量依存性の１４日の毒性研究。生理食塩水、Ｔ−ＮＰ、またはＮＴＮＰ（総ＮＰに関して、２つの異なる容量、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）が静脈内注射によって投与されて、毒性が１４日間追跡された。５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＴ−ＮＰ、ＮＴ−ＮＰ、そして生理食塩水の単回の静脈内注射後の７日目および１４日目の代表的な血液学データ。処置済み動物由来の脳および肝臓の、注射後１４日目の組織病理学の代表的な画像。発明者らは、凝固により、少数のサンプルで血液学的分析を実行することができなかった。
【図２１Ａ】図２１は、いくつかの画像である。（Ａ）正常なブタ、またはＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰの組合せで処置されたＴＢＩブタと比較した、生理食塩水で処理されたＴＢＩブタにおけるＲＯＳレベルの増大。ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋ＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰで処置されたＴＢＩ子豚は、Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰで処置されたＴＢＩ子豚と比較して、ＲＯＳの減少程度がより小さいことを示した。ＲＯＳが、無傷の脳切片および負傷した脳切片において、ＤＣＦ−ＤＡ染色によって検出された。
【図２１Ｂ】図２１は、いくつかの画像である。（Ｂ）脳組織のヘマトキシリンおよびエオシンの染色。壊死および出血が、病変部位に存在した。変性好中球および少数のマクロファージが病変部位に浸潤し、壊死領域および周囲の神経実質における内皮は非常に反応性であった。また、損傷に対する浮腫蓄積が、同側半球内にあった。データは、各群由来の全動物についての画像を示す。画像１〜３：生理食塩水で処理されたＴＢＩ子豚；画像４〜６：Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ＋Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰで処置されたＴＢＩ子豚；画像７〜９：ＮＴＰｒｅｄ−ＮＰ＋ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰで処置されたＴＢＩ子豚。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書中に示される概略図は、必ずしも一定のスケールであるわけではない。
【０００８】
以下の詳細な説明において、本出願の一部を形成し、かつ装置、系、および方法のいくつかの特定の実施形態が実例として示されている添付の図面に言及する。他の実施形態が考えられ、そして本開示の範囲および精神を逸脱しない範囲でなされてよいことが理解されるべきである。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味にとられるべきでない。
【０００９】
血液脳関門を効果的に通過するために、ナノ粒子は望ましくは、適切なサイズであり、適切な電荷密度および親油性を有する。ナノ粒子はまた、適切なターゲティング部分を含有し得る。ナノ粒子は好ましくは、血液脳関門を通過すると、適切な中枢神経系（ＣＮＳ）ターゲットに達し、そして好ましくは治療ペイロードをターゲットに、またはターゲットへ送達する。また、治療粒子は好ましくは、軽快化機能を発揮する。
【００１０】
ナノ粒子は、本明細書中に記載されるように、一部の実施形態において、疎水性コア、コアを取り囲む親水性層を含む。ナノ粒子は、１つまたは複数のミトコンドリアターゲティング部分を含有し得る。ＣＮＳ組織、特に脳の白質は、ミトコンドリア密度が高い組織であり得る。したがって、ミトコンドリアターゲティング部分は、ＣＮＳターゲティング部分として機能し得る。また、ミトコンドリアターゲティングは、特定の治療剤；特に、望ましくはミトコンドリア内で作用する剤の効果を高めることができる。例えば、ミトコンドリアは多くの場合、反応性酸素種の源であるので、ミトコンドリアを標的とする抗酸化剤は、ミトコンドリアを標的としない抗酸化剤よりも有効であり得る。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるナノ粒子は、抗酸化剤、抗炎症剤、または抗酸化剤および抗炎症剤の双方を含む。そのような剤は、当該剤を必要とする患者において適切なあらゆる疾患を処置するのに用いられ得る。一部の実施形態において、そのような治療剤を含有するナノ粒子は、損傷を受けたＣＮＳ組織、例えば損傷を受けた神経組織を処置するのに用いられる。一部の実施形態において、そのような治療剤を含有するナノ粒子は、外傷性脳損傷を処置するのに用いられる。
【００１１】
ミトコンドリアターゲティング部分および光増感剤を有するナノ粒子が、適切なあらゆる方法で製造されてよい。実施形態において、ナノ粒子は、（ｉ）国際公開第２０１３／１２３２９８号パンフレット（２０１２年８月２２日公開、表題Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ａｇｅｎｔｓ、概してＭａｒｒａｃｈｅ  ａｎｄ  Ｄｈａｒ（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２，２０１２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１０９（４０），ｐａｇｅｓ  １６２８８−１６２９３において開示されている情報を記載）；または（ｉｉ）国際公開第２０１３／０３３５１３号パンフレット（２０１３年３月７日公開、表題Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、２０１２年９月９日出願の米国仮特許出願第６１／５２９６３７号明細書の優先権を主張）に記載されるように構築されてよく、これらの特許出願および刊行物はそれぞれ、本開示と矛盾しない限りにおいて、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００１２】
Ｉ．コア
ナノ粒子のコアは、適切なあらゆる成分から形成されてよい。好ましくは、コアは、疎水性成分、例えば疎水性ポリマーまたはポリマーの疎水性部分から形成される。コアはまた、または代わりに、水性環境において自己集合して、疎水性コアおよび親水性外表面を有する粒子になり得る、疎水性部分および親水性部分を有するブロックコポリマーを含んでもよい。実施形態において、コアは、１つもしくは複数の生物分解性ポリマー、または生物分解性部分を有するポリマーを含む。
【００１３】
本明細書中で用いられる「親水性」ポリマーまたは化合物は、オクタノール中よりも水中で可溶性であるポリマーまたは化合物である。「疎水性」ポリマーまたは化合物は、水中よりもオクタノール中で可溶性であるポリマーまたは化合物である。一部の実施形態において、親水性ポリマーは、水中溶解度が、１リットルあたり１０ミリグラム以上である。一部の実施形態において、「疎水性」ポリマーは、水中溶解度が、１リットルあたり１ミリグラム以下である。ポリマーまたはブロックの正確な化学構造は、親水性または疎水性の程度ほど重要でない。なぜなら、ナノ粒子は好ましくは、ナノ粒子を形成するのに利用される条件下で、疎水性成分が密集する、または親水性成分が密集するように自己集合するからである。自己集合ナノ粒子合成の当業者であれば、どのポリマーが親水性であると考えられ、かつどのポリマーが疎水性であると考えられるかを容易に理解するであろう。
【００１４】
適切なあらゆる合成生体吸収性ポリマーが用いられても、適切なあらゆる天然生体吸収性ポリマーが用いられてもよい。そのようなポリマーは、当業者によって認識可能であり、かつ同定可能である。合成生物分解性ポリマーの非限定的な例として：ポリ（アミド）、例えばポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプチド）；ポリ（エステル）、例えばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、およびポリ（カプロラクトン）；ポリ（無水物）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（カーボネート）；およびそれらの化学誘導体（当業者によってルーチン的に製造される、置換物、化学基、例えばアルキル、アルキレンの付加物、水酸化物、酸化物、および他の修飾物）、フィブリン、フィブリノゲン、セルロース、澱粉、コラーゲン、およびヒアルロン酸、それらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。これらの、そして他の適切なポリマーの特性および放出プロフィールは既知であり、または容易に同定可能である。
【００１５】
種々の実施形態において、本明細書中に記載されるコアは、ＰＬＧＡを含む。ＰＬＧＡは、所望の速度での治療剤の送達および放出に用いられる周知の、かつ十分に研究された疎水性生物分解性ポリマーである。他の疎水性ポリマーの例として、ポリアクリル類、例えばポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ無水マレイン酸、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアミド、ポリイミド、ジエンポリマー、ポリエステル、ポリエーテル、フルオロカーボンポリマー、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリビニルアセタール、ポリビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルエステル、ポリビニルケトン、およびポリビニルピリジン等が挙げられる。
【００１６】
好ましくは、コアを形成するのに用いられるポリマーの少なくとも一部は、疎水性部分および親水性部分を有する両親媒性である。疎水性部分はコアを形成することができる一方、親水性領域は、ナノ粒子が免疫系による認識を逃れ、かつ循環流中半減期を高める一助となるような、コアを取り囲む層を形成することができる。両親媒性ポリマーの例として、疎水性ブロックおよび親水性ブロックを有するブロックコポリマーが挙げられる。実施形態において、コアは、ブロックコポリマーの疎水性部分、疎水性ポリマー、またはそれらの組合せから形成される。
【００１７】
疎水性ポリマーの、両親媒性ポリマーに対する比率は、ナノ粒子のサイズに変化をつけるために、変動してよい。実施形態において、疎水性ポリマーの、両親媒性ポリマーに対する比率が大きくなるにつれ、ナノ粒子の直径が大きくなる。疎水性ポリマーの、両親媒性ポリマーに対する適切なあらゆる比率が用いられてよい。実施形態において、ナノ粒子は、両親媒性ポリマーを、疎水性ポリマーに対して約５０／５０の重量比で含み、または両親媒性ポリマーを親水性ポリマーよりも多く含む比率、例えば約２０／８０の比率、約３０／７０の比率、約２０／８０の比率、約５５／４５の比率、約６０／４０の比率、約６５／４５の比率、約７０／３０の比率、約７５／３５の比率、約８０／２０の比率、約８５／１５の比率、約９０／１０の比率、約９５／５の比率、約９９／１の比率で、もしくは約１００％両親媒性ポリマーを含む。
【００１８】
実施形態において、疎水性ポリマーは、ＰＬＧＡ、例えばＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ、ＰＬＧＡ−ＯＨまたはＰＬＧＡ−ＴＰＰを含む。実施形態において、両親媒性ポリマーは、ＰＬＧＡおよびＰＥＧ、例えばＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む。両親媒性ポリマーは、分枝状の親水性部分を有する樹枝状ポリマーであってよい。分枝状ポリマーは、複数の末端を有するので、分枝状親水性ポリマー尾部の末端への複数の部分の付着を可能とする。
【００１９】
直径が約２５０ｎｍ以下であるナノ粒子は概して、直径が約２５０ｎｍを超えるナノ粒子よりも効果的にミトコンドリアを標的とする。実施形態において、ミトコンドリアターゲティングに有効なナノ粒子は、直径が約２００ｎｍ以下、約１９０ｎｍ以下、約１８０ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約６０ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、または約１０ｎｍ以下である。実施形態において、ナノ粒子は、直径が約１０ｎｍから約２５０ｎｍ、例えば約２０ｎｍから約２００ｎｍ、約５０ｎｍから約１６０ｎｍ、約６０ｎｍから約１５０ｎｍ、約７０ｎｍから約１３０ｎｍ、約８０ｎｍから約１２０ｎｍ、または約８０ｎｍから約１００ｎｍである。一部の実施形態において、ナノ粒子は、直径が約３０ナノメートルから約１５０ナノメートルである。
【００２０】
ＩＩ．コアを取り囲む親水性層
本明細書中に記載されるナノ粒子は、場合によっては、親水性コアを取り囲む親水性層を含んでよい。親水性層は、免疫系による認識を逃れる面で、ナノ粒子を補助することができ、かつナノ粒子の循環流中半減期を高めることができる。
【００２１】
先に示されるように、親水性層は、全てまたは一部が、両親媒性ポリマー、例えば疎水性ブロックおよび親水性ブロックを有するブロックコポリマーの親水性部分によって形成されてよい。
【００２２】
適切なあらゆる親水性ポリマー、または両親媒性ポリマーの親水性部分が、親水性層またはその部分を形成してよい。親水性ポリマー、またはポリマーの親水性部分は、線状ポリマーであっても樹枝状ポリマーであってもよい。適切な親水性ポリマーの例として、多糖類、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリメチレンオキシド、およびポリエチレンオキシド等が挙げられる。
【００２３】
実施形態において、ブロックコポリマーの親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。実施形態において、ブロックコポリマーは、ＰＬＧＡを含む疎水性部分およびＰＥＧを含む親水性部分を含む。
【００２４】
親水性ポリマー、またはポリマーの親水性部分は、生理的条件下で帯電する部分を含有してよく、当該生理的条件は、緩衝生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水またはクエン酸緩衝生理食塩水によって、約７．４等のｐＨに近づけられてよい。そのような部分は、ナノ粒子の電荷密度またはゼータ電位に寄与し得る。ゼータ電位は、コロイド系中の界面動電位の用語である。ゼータ電位は直接的に測定可能でないが、電気泳動移動度または動的電気泳動移動度等を用いて、実験的に判定され得る。
【００２５】
ゼータ電位は、ミトコンドリア内にナノ粒子が蓄積する能力に重要な役割を果たし得、概して、ゼータ電位が高くなるにつれ、ミトコンドリアにおける蓄積が増大することが見出された。実施形態において、ナノ粒子は、動的光散乱によって測定されるゼータ電位が、約０ｍＶ以上である。例えば、ナノ粒子は、ゼータ電位が約１ｍＶ以上、約５ｍＶ以上、約７ｍＶ以上、約１０ｍＶ以上、約１５ｍＶ以上、約２０ｍＶ以上、約２５ｍＶ以上、約３０ｍＶ以上、約３４ｍＶ以上、または約３５ｍＶ以上であってよい。実施形態において、ナノ粒子は、ゼータ電位が約０ｍＶから約１００ｍＶ、例えば約１ｍＶから５０ｍＶ、約２ｍＶから約４０ｍＶ、または約７ｍＶから約３５ｍＶである。
【００２６】
生理的条件下で帯電し得る適切なあらゆる部分は、親水性ポリマー、またはポリマーの親水性部分の一部であってもよいし、親水性ポリマー、またはポリマーの親水性部分に取り付けられていてもよい。実施形態において、部分は、ポリマー、またはポリマーの親水性部分の末端に存在する。勿論、部分は、末端以外の位置にてポリマー骨格に直接的に結合してもよいし、間接的に結合してもよい。ミトコンドリア内膜の全体に維持される相当な負の電気化学電位のために、カチオンが、特に非局在化される場合、疎水性膜を通過してミトコンドリアマトリックス内に蓄積するのに有効である。ミトコンドリアターゲティングを促進することが知られているカチオン部分が、以下でより詳細に議論される。しかしながら、選択的なミトコンドリアターゲティングに特に有効でないカチオン部分が、ナノ粒子中に含まれてもよいし、親水性ポリマー、またはポリマーの部分に結合してもよい。実施形態において、アニオン部分が、親水性ポリマー、またはポリマーの部分の一部を形成してもよいし、親水性ポリマー、またはポリマーの部分に取り付けられていてもよい。アニオン部分、またはアニオン部分を含有するポリマーは、所望の場合に、ゼータ電位を調整するためにナノ粒子中に含まれてよい。実施形態において、親水性ポリマー、またはポリマーの部分は、生理的水性環境に置かれた場合に酸素アニオンをもたらし得る水酸基を含む。実施形態において、ポリマーは、ＯＨが生理的条件下で帯電部分として機能するＰＥＧ−ＯＨを含む。
【００２７】
ＩＩＩ．ミトコンドリアターゲティング部分
本明細書中に記載されるナノ粒子は、ナノ粒子がミトコンドリアを標的とする１つまたは複数の部分を含む。本明細書中で用いられる、ナノ粒子がミトコンドリアを「標的とする」は、ナノ粒子が、他の細胞小器官内または細胞質内と比較してミトコンドリア内に、実質的に類似する非標的ナノ粒子よりも高い濃度で蓄積することを意味する。実質的に類似する非標的ナノ粒子は、標的ナノ粒子と同じ成分を実質的に同じ相対濃度（例えば、約５％以内）で含むが、ターゲティング部分を欠いている。
【００２８】
ミトコンドリアターゲティング部分は、適切なあらゆる方法により、例えばコアの部分を形成する分子への、またはコアに結合する分子への結合により、コアに連結されてよい。実施形態において、ターゲティング部分は、コアの部分を形成する疎水性ポリマーに結合する親水性ポリマーに結合する。実施形態において、ターゲティング部分は、コアの部分を形成する疎水性ブロックを有するブロックコポリマーの親水性部分に結合する。
【００２９】
ターゲティング部分は、ポリマーの適切なあらゆる部分に結合してよい。実施形態において、ターゲティング部分は、ポリマーの末端に取り付けられる。実施形態において、ターゲティング部分は、ポリマーの骨格に、またはポリマーの末端以外の位置にて骨格に取り付けられた分子に結合する。複数のターゲティング部分が、所定のポリマーに結合してよい。実施形態において、ポリマーは、複数の末端を有する樹枝状ポリマーであり、ターゲティング部分は、複数の末端に結合してよい。
【００３０】
ターゲティング部分が結合するポリマーまたはその部分は、適切な官能基を有する、または適切な官能基を有するように修飾されているターゲティング部分との反応に、またはこのターゲティング部分への結合に適した官能基、例えば−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、−Ｂｒ、−Ｃｌ、または−Ｉを含有してもよいし、含有するように修飾されてもよい。
【００３１】
ポリマーに連結するターゲティング部分の例が、反応のタイプ、および生じ得る連結を例示する目的で、本開示の全体を通して示される。しかしながら、当業者であれば、ポリマーへのターゲティング部分の連結が、既知のあらゆる化学反応プロセスに従って実行され得ることを理解するであろう。
【００３２】
ターゲティング部分は、ナノ粒子中に、適切なあらゆる濃度で存在してよい。実施形態において、濃度は、インビボ研究または使用に先立って最適化するために、最初のインビトロ分析に基づいて、容易に変動し得る。実施形態において、ターゲティング部分は、約５％から約１００％の表面被覆率を有することとなる。
【００３３】
ミトコンドリアマトリックス内でのナノ粒子の蓄積を促進するのに適したあらゆる部分が利用されてよい。ミトコンドリア内膜の全体に維持される相当な負の電気化学電位のために、非局在化親油性カチオンが、疎水性膜を通過して、ミトコンドリアマトリックス内に蓄積するのに有効である。トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）含有化合物が、ミトコンドリアマトリックス内に１０００倍超蓄積することができる。適切なあらゆるＴＰＰ含有化合物が、ミトコンドリアマトリックスターゲティング部分として用いられてよい。ＴＰＰ系部分の代表的な例が、以下で式Ｉ、式ＩＩ、または式ＩＩＩにおいて示される構造を有してよい：
【化１】
2017530941.tif 000003
【化２】
2017530941.tif 000004
式中、（表されるような）アミンは、ナノ粒子中への組込みのために、ポリマーまたは他の成分に結合し得る。
【００３４】
実施形態において、ミトコンドリアマトリックスを標的とする非局在化親油性カチオンは、ローダミンカチオン、例えば以下に表される式ＩＶを有するローダミン１２３である：
【化３】
2017530941.tif 000005
式中、（表されるような）第二級アミンは、ナノ粒子中への組込みのために、ポリマーまたは脂質等に結合し得る。
【００３５】
勿論、非カチオン化合物が、ミトコンドリアマトリックスを標的として、ミトコンドリアマトリックス内に蓄積するように機能してよい。一例として、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドは、ナノ粒子がミトコンドリアマトリックスを標的としてミトコンドリアマトリックス内に蓄積するように機能し得る。適切なあらゆるＳｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドが、ミトコンドリアマトリックスターゲティング部分として利用されてよい。適切なＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドの非限定的な例として、以下に表される式Ｖおよび式ＶＩをそれぞれ有するＳＳ−０２およびＳＳ−３１が挙げられる：
【化４】
2017530941.tif 000006
式中、（表されるような）第二級アミンは、ナノ粒子中への組込みのために、ポリマーまたは脂質等に結合し得る。
【００３６】
例示の目的で、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成のための反応スキームが、以下でスキームＩにおいて示される。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＴＰＰを合成するために、他のスキームが利用されてよいこと、そして他のミトコンドリアターゲティング部分をＰＬＧＡ−ＰＥＧに連結するために、または部分をナノ粒子の他のポリマーもしくは成分に連結するために、類似する反応スキームが利用されてよいことが理解されよう。
【００３７】
【化５】
2017530941.tif 000007
【００３８】
好ましくは、ターゲティング部分は、ターゲティング部分がナノ粒子のコアから拡張して、ターゲティング部分の効果を促進することとなるように、親水性ポリマー、またはポリマーの親水性部分に取り付けられる。
【００３９】
ミトコンドリアターゲティング部分は、ナノ粒子のゼータ電位を変えることができることが理解されよう。したがって、ナノ粒子のゼータ電位は、ナノ粒子中に含まれるターゲティング部分の量を調整することによって調整され得る。ゼータ電位はまた、他の帯電部分、例えば、親水性ポリマー、もしくはポリマーの親水性部分の帯電部分、または親水性ポリマー、もしくはポリマーの親水性部分に取り付けられる帯電部分を含むことによって調整され得る。
【００４０】
実施形態において、帯電部分は、ミトコンドリアターゲティング部分によってのみ、またはミトコンドリアターゲティング部分によって実質的に、提供される。実施形態において、帯電部分の約９５％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。実施形態において、帯電部分の約９０％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。実施形態において、帯電部分の約８５％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。実施形態において、帯電部分の約８０％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。実施形態において、帯電部分の約７５％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。実施形態において、帯電部分の約７０％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。実施形態において、帯電部分の約６５％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。実施形態において、帯電部分の約６０％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。実施形態において、帯電部分の約５５％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。実施形態において、帯電部分の約５０％以上が、ミトコンドリアターゲティング部分によって提供される。勿論、ミトコンドリアターゲティング部分は、適切なあらゆる量またはパーセンテージの帯電部分を提供してよい。
【００４１】
実施形態において、ナノ粒子は、ミトコンドリアターゲティング部分が取り付けられているポリマーを、ミトコンドリアターゲティング部分以外の帯電部分が取り付けられているポリマーと混合することによって、形成される。
【００４２】
ＩＶ．抗酸化剤
本明細書中に記載されるナノ粒子は、１つまたは複数のあらゆる抗酸化剤を含んでよい。好ましくは、１つまたは複数の抗酸化剤は、反応性酸素種と反応する。反応性酸素種は、酸素を含有する、化学的に反応性の分子である。反応性酸素種の例として、酸素イオン、酸素ラジカル、および過酸化水素等を含む分子がある。１つまたは複数の抗酸化剤が、ナノ粒子のコア中に埋め込まれてもよいし、ナノ粒子のコア内に含有されてもよい。好ましくは、抗酸化剤は、所望の速度でコアから放出される。放出速度が既知であるポリマー（ＰＬＧＡ等）またはポリマーの組合せからコアが形成される場合、放出速度は容易に制御され得る。
【００４３】
実施形態において、抗酸化剤またはその前駆体は、ターゲティング部分に関して先に記載されるようにして、ポリマー、またはナノ粒子の他の成分に結合する。抗酸化剤は、ナノ粒子がターゲット位置、例えばミトコンドリアに到達したときに抗酸化剤が放出され得るように、切断可能リンカーを介して結合してよい。
【００４４】
抗酸化剤は、適切なあらゆる濃度でナノ粒子中に存在してよい。例えば、抗酸化剤は、ナノ粒子中に、ナノ粒子の約０．０００１重量％から約４０重量％の濃度で存在してよい。
【００４５】
適切なあらゆる抗酸化剤が用いられてよい。抗酸化剤の例として、グルタチオン、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、およびコエンザイムＱ１０（ｃｏＱ１０）等が挙げられる。
【００４６】
実施形態において、抗酸化剤はＣｏＱ１０である。ＣｏＱ１０は、殆どの細胞中に、主にミトコンドリア中に存在しており、電子伝達鎖の成分である。ＣｏＱ１０は、完全に酸化した形態（ユビキノン）、部分的に酸化した形態（ユビセミキノン）、および完全に還元した形態（ユビキノール）で存在し得る。好ましくは、ＣｏＱ１０は、ユビセミキノンまたはユビキノールである。
【００４７】
Ｖ．抗炎症剤
本明細書中に記載されるナノ粒子は、１つまたは複数のあらゆる抗炎症剤を含んでよい。１つまたは複数の抗炎症剤は、ナノ粒子のコア中に埋め込まれてもよいし、ナノ粒子のコア内に含有されてもよい。好ましくは、抗炎症剤は、所望の速度でコアから放出される。放出速度が既知であるポリマー（ＰＬＧＡ等）またはポリマーの組合せからコアが形成される場合、放出速度は容易に制御され得る。
【００４８】
実施形態において、抗炎症剤またはその前駆体は、ターゲティング部分に関して先に記載されるようにして、ポリマー、またはナノ粒子の他の成分に結合する。抗炎症剤は、ナノ粒子がターゲット位置、例えばミトコンドリアに到達したときに抗炎症剤が放出され得るように、切断可能リンカーを介して結合してよい。
【００４９】
抗炎症剤は、適切なあらゆる濃度でナノ粒子中に存在してよい。例えば、抗炎症剤は、ナノ粒子中に、ナノ粒子の約０．０００１重量％から約４０重量％の濃度で存在してよい。
【００５０】
適切なあらゆる抗炎症剤が用いられてよい。抗炎症剤の例として、ステロイド性抗炎症剤および非ステロイド性抗炎症剤等が挙げられる。一部の実施形態において、抗炎症剤として、限定されないが、アルクロフェナック、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、アルゲストンアセトニド、アルファアミラーゼ、アムシナファル、アムシナフィド、アンフェナクナトリウム、塩酸アミプリロース、アナキンラ、アニロラク、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジド二ナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモール、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、プロピオン酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾン、クロピラク、プロピオン酸クロチカゾン、酢酸コルメタゾン、コルトドキソン、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、ジプロピオン酸デキサメタゾン、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、二酢酸ジフロラゾン、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサル、ジフルプレドネート、ジフタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリソン、エンリモマブ、エノリカムナトリウム、エピリゾール、エトドラク、エトフェナメート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンドサル、フェンピパロン、フェンチアザク、フラザロン、フルアザコルト、フルフェナム酸、フルミゾール、酢酸フルニソリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクァゾン、フルルビプロフェン、フルレトフェン、プロピオン酸フルチカゾン、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタゾール、酢酸ハロプレドン、イブフェナック、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダプ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、酢酸イソフルプレドン、イソキセパク、イソキシカム、ケトプロフェン、塩酸ロフェミゾール、ロモキシカム、エタボン酸ロテプレドノール、メクロフェナム酸ナトリウム、メクロフェナム酸、二酪酸メクロリゾン、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、モミフルメート、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、塩酸パラニリン、ポリ硫酸ペントサンナトリウム、グリセリン酸フェンブタゾンナトリウム、ピルフェニドン、ピロキシカム、ケイ皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピルプロフェン、プレドナゼート、プリフェロン、プロドール酸、プロクァゾン、プロキサゾール、クエン酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリット、サルコレクス、サルナセジン、サルサレート、塩化サングイナリウム、セクラゾン、セルメタシン、スドキシカム、スリンダク、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルメート、タロサレート、テブフェロン、テニダプ、テニダプナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テトリダミン、チオピナク、ピバル酸チキソコルトール、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミデート、ジドメタシン、ゾメピラクナトリウム、アスピリン（アセチルサリチル酸）、サリチル酸、コルチコステロイド、グルココルチコイド、タクロリムス、ピメコルリムス、それらのプロドラッグ、それらの共薬物、およびその組合せが挙げられる。
【００５１】
実施形態において、抗炎症剤は、プレドニゾンである。
【００５２】
ＶＩ．撮像剤
本明細書中に記載されるナノ粒子は、１つまたは複数のあらゆる撮像剤を含んでよい。１つまたは複数の撮像剤は、ナノ粒子のコア中に埋め込まれてもよいし、ナノ粒子のコア内に含有されてもよいし、ナノ粒子に取り付けられてもよい。適切なあらゆる撮像剤が用いられてよい。一部の実施形態において、撮像剤は、フルオロフォア、磁気剤、または放射性剤の１つまたは複数である。撮像剤の例として、６４Ｃｕジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース、３’−デオキシ−３’−［１８Ｆ］フルオロチミジン、ガリウム、テクネチウム−９９ｍ、タリウム、バリウム、ガストログラフィン、ヨード造影剤、酸化鉄、および量子ドットが挙げられる。
【００５３】
好ましくは、撮像剤は、治療に、または診断に関連する。治療に、または診断に関連する撮像剤の例として、撮像剤が、特定の疾患と関連する細胞または分子を標的とする分子に取り付けられた撮像剤が挙げられる。一例として、癌細胞についてのターゲットとして、癌遺伝子または変異型腫瘍抑制因子等があり得る。ターゲティング分子の例として、抗体、ポリヌクレオチド、および受容体アゴニストまたはアンタゴニスト等が挙げられる。
【００５４】
ＶＩ．ナノ粒子の合成
本明細書中に記載されるナノ粒子は、適切なあらゆるプロセスを介して合成されてもよいし、集められてもよい。好ましくは、ナノ粒子は、プロセス変動を最小にするために、単工程において集められる。単工程プロセスは、ナノ析出および自己集合を含んでよい。
【００５５】
一般に、ナノ粒子は、有機溶媒中に、好ましくは析出に用いられる水性溶媒中に混和性である溶媒中に疎水性成分を溶解または懸濁させることによって合成されてもよいし、集められてもよい。実施形態において、アセトニトリルが有機溶媒として用いられるが、適切なあらゆる溶媒（ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、またはアセトン等）が用いられてもよい。親水性成分は、適切な水性溶媒、例えば水または４重量％エタノール中に溶解される。有機相溶液は、水性相溶液に滴加されてよく、疎水性成分がナノ析出して、ナノ粒子を水性溶媒中に自己集合させることができる。
【００５６】
ナノ粒子を形成するのに適した条件を決定するプロセスが、以下の通りであってよい。簡潔に、官能化ポリマー、および、含まれる場合には、または適切なように、他の成分が、有機溶媒混合物中に共溶解してよい。この溶液は、高温の（例えば６５℃）水性溶媒（例えば、水、４重量％エタノール、その他）に滴加されて直ぐに、溶媒は蒸発することとなり、疎水性コアが親水性ポリマー成分、例えばＰＥＧによって取り囲まれたナノ粒子が生産され得る。一セットの条件において、高い（例えば＞７５％）レベルのターゲティング部分表面ローディングが達成されると、造影剤または治療剤が、ナノ粒子のナノ析出および自己集合に含まれ得る。
【００５７】
手動混合によって不所望にも結果に再現性がなければ、マイクロフルイディックチャンネルが用いられてよい。
【００５８】
ナノ粒子は、そのサイズ、電荷、安定性、ローディング、薬物放出動態、表面形態、および安定性について、周知の、または公開されている方法を用いて特徴付けられ得る。
【００５９】
ナノ粒子の特性は、（ａ）ポリマー溶液の組成を制御することによって、そして（ｂ）混合条件、例えば混合時間、温度、および水の、有機溶媒に対する比率を制御することによって、制御され得る。ナノ粒子特性の変動の可能性は、合成に必要とされるプロセシング工程数と共に増大する。
【００６０】
生産されるナノ粒子のサイズは、疎水性コア成分の、両親媒性シェル成分に対する比率を変更することによって変えられ得る。ナノ粒子サイズはまた、ポリマー長を変えることによって、混合時間を変えることによって、そして有機質の、相に対する比率を調整することによって、制御され得る。異なる長さのＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ由来のナノ粒子の事前の経験により、ナノ粒子のサイズは、短いポリマー（例えばＰＬＧＡ３０００−ＰＥＧ７５０）の最短約２０ｎｍから、長いポリマー（例えば、ＰＬＧＡ１００，０００−ＰＥＧ１０，０００）の最長約１５０ｎｍまで増大することとなると示唆される。ゆえに、ポリマーの分子量が、サイズを調整するように機能することとなる。
【００６１】
ナノ粒子の表面電荷は、ポリマーを、適切に帯電した末端基と混合することによって制御され得る。加えて、組成物および表面化学は、ポリマーを、様々な親水性ポリマー長の、分枝状親水性ポリマーと混合することによって、または疎水性ポリマーを加えることによって、制御され得る。
【００６２】
一旦形成されると、ナノ粒子は、遠心分離または遠心限外濾過等を介して収集かつ洗浄されてよい。凝集が起こる場合、ナノ粒子は、例えば、透析によって精製されてもよいし、より遅い速度でのより長い遠心分離によって精製されてもよいし、界面活性剤を用いて精製されてもよい。
【００６３】
一旦収集されると、残存するあらゆる溶媒が取り除かれてよく、そして粒子は乾燥されてよく、これらが、成分の時期尚早のあらゆる分解または放出を最小にする一助となるはずである。ナノ粒子は、使用に先立ち、増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えばマンニトールを用いて凍結乾燥されてもよいし、別の方法で貯蔵用に調製されてもよい。
【００６４】
治療剤が、その溶解度に従って有機相または水性相に置かれ得ることが理解されよう。
【００６５】
本明細書中に記載されるナノ粒子として、他の適切なあらゆる成分、例えば、ナノ粒子に含めるのに適した、当該技術において通常知られている、または理解されているリン脂質またはコレステロール成分が挙げられ得る。国際公開第２０１３／０３３５１３号パンフレットは、例えば、ナノ粒子に含まれてよいいくつかの付加的な成分を記載している。
【００６６】
ＶＩＩ．使用および試験
一般に、本明細書中に記載されるナノ粒子は、これを必要とする患者に全身投与されてよい。本開示の目的で、「全身投与」は、ＣＮＳの外側への投与を意味する。全身投与として、経口、ＩＶ、およびＩＰ等が挙げられる。一部の実施形態において、ナノ粒子は、ＣＮＳ組織の損傷、例えば神経組織の損傷を有する、またはその危険がある患者に投与される。一部の実施形態において、ナノ粒子は、外傷性脳損傷の患者に投与される。
【００６７】
本明細書中で生産されるナノ粒子の性能および特性は、適切なあらゆる方法で試験されてもよいし、研究されてもよい。一例として、治療の有効性が、細胞ベースのアッセイを用いて評価されてよい。毒性、生物分布、薬物動態、および有効性の研究が、細胞、または齧歯類もしくは他の哺乳類で試験されてよい。ゼブラフィッシュまたは他の動物モデルが、撮像研究および治療研究の組合せに利用されてよい。齧歯類、ウサギ、またはブタ等が、ナノ粒子の診断潜在性または治療潜在性を評価するのに用いられてよい。ナノ粒子の特性を最適化する目的で用いられ得る、ナノ粒子の性能または特性を評価するために実行され得る研究の一部の付加的な詳細が、以下に記載される。しかしながら、当業者であれば、他のアッセイおよび手順が容易に実行され得ることを理解するであろう。
【００６８】
造影剤を含有するナノ粒子の吸収および結合特性が、適切なあらゆる細胞系統、例えばＲＡＷ２６４．７、Ｊ７７４、ｊｕｒｋａｔ、およびＨＵＶＥＧ細胞で評価されてよい。ナノ粒子の免疫調節性の役割は、これらの細胞がナノ粒子の様々な濃度に曝された場合のサイトカインの放出を判定することによって、アッセイされ得る。オプソニン化されたナノ粒子を単離するカラムを用いて、どの経路が引き金になるかを同定するために、補体活性化が研究されてよい；例えば、Ｓａｌｖａｄｏｒ−Ｍｏｒａｌｅｓ  Ｃ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｆａｒｏｋｈｚａｄ  ＯＣ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０：２２３１−２２４０，（２００９）に記載されている。蛍光測定が、プレートリーダまたはＦＡＣＳ等を用いて実行されてよい。ナノ粒子サイズは、生体内分布を判定する重要な要因であるので、ナノ粒子は、種々のサイズ（例えば、２０〜４０、４０〜６０、６０〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、および１５０〜３００ｎｍ）ごとにまとめられて（ｂｉｎｎｅｄ）、サイズに従って試験されてよい。
【００６９】
ナノ粒子中に利用される抗酸化剤または抗炎症剤に適したあらゆる細胞型が、治療有効性または適切なターゲティングを評価するのに用いられてよい。当該技術において通常理解されている、または知られているような、治療的成果または薬理的成果に適したアッセイが利用されてよい。
【００７０】
生体内分布（ｂｉｏＤ）研究および薬物動態学的（ＰＫ）研究が、ラット、ブタ、または他の適切な哺乳類で実行されてよい。例えば、ＰＫおよびｂｉｏＤ分析のために、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、ＱＤ標識したミトコンドリアターゲティングナノ粒子を、または類似した、ターゲティング基のないナノ粒子を、外側尾静脈注射によって服用させてよい。初めに、ｂｉｏＤは、注射後１〜２４時間の蛍光イメージングが続いてよい。動物が犠牲にされてよい；そして脳、心臓、腸、肝臓、脾臓、腎臓、筋肉、骨、肺、リンパ節、腸、および皮膚が摘出されて、計量されて、ホモジナイズされてよく、そしてＱＤ由来のＣｄが、ＩＣＰ−ＭＳを用いて定量化されてよい。組織中濃度が、組織のグラムあたりの注射用量の％（％ＩＤ／ｇ）として表されてよい。血中半減期が、種々の時点での血中Ｃｄ濃度から算出され得る。
【００７１】
ヒトへの使用に有効なナノ粒子の治療投薬量が、周知の技術、例えば表面積または体重ベースのスケーリングに従って、動物実験から推定されてよい。
【００７２】
本明細書中に記載されるナノ粒子は、脳内に蓄積することが示された。したがって、本明細書中に記載されるナノ粒子は、脳関連疾患を処置または診断するのに用いられ得る。脳関連疾患の例として、脳損傷、脳卒中、外傷性脳損傷、脳癌、感染症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、およびアルツハイマー病等が挙げられる。ターゲティング分子が、ナノ粒子、治療剤、もしくは撮像剤と関連して、またはこれらに取り付けられて、ナノ粒子、治療剤、または撮像剤が、疾患状態にある細胞を標的とすることができる。
【００７３】
ＩＸ．定義
本明細書中で用いられる全ての科学用語および技術用語は、特に明記しない限り、当該技術において一般的に用いられる意味を有する。本明細書中に与えられる定義は、本明細書中で頻繁に用いられる特定の用語の理解を促進するものであり、本開示の範囲を限定することが意図されるのではない。
【００７４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を有する実施形態を包含する。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる用語「または」は通常、別段の明確な指示がない限り、「および／または」を含む意味で用いられる。
【００７５】
本明細書中で用いられる「有する」、「有している」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は、オープンエンドの意味で用いられ、通常、「含むが、限定されない」を意味する。「から本質的になる」および「からなる」等は、「含む」等に包括されることが理解されよう。
【００７６】
本明細書中で用いられる「疾患」は、正常な機能を損なっている生物、またはその１つもしくは複数の部分の症状を意味する。本明細書中で用いられる用語疾患は、疾患、障害、症状、および機能障害等の用語を包含する。
【００７７】
本明細書中で用いられる「処置する」等は、疾患の１つまたは複数の徴候を治療する、予防する、または改善することを意味する。
【００７８】
本明細書中で用いられる「結合する（ｂｉｎｄ）」または「結合した（ｂｏｕｎｄ）」等は、化学物質が、適切なあらゆるタイプの結合、例えば共有結合、イオン結合、水素結合、またはファンデルワールス力等によって結合することを意味する。「結合する」および「結合した」等は、本明細書中で「取り付ける」および「取り付けられた」等と互換可能に用いられる。
【００７９】
本明細書中で用いられる、ナノ粒子のコアに「取り付けられる」分子または部分は、コア中に埋め込まれてもよいし、コア内に含有されてもよいし、コアの少なくとも一部を形成する分子に取り付けられてもよいし、コアに取り付けられた分子に取り付けられてもよいし、コアに直接的に取り付けられてもよい。
【００８０】
本明細書中で用いられる、化合物の「誘導体」は、当該化合物に構造的に類似した化合物であり、これが誘導体である。多くの誘導体は、機能的誘導体である。すなわち、誘導体は通常、当該化合物に類似した所望の機能を有し、これが誘導体である。一例として、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）が、本明細書中でミトコンドリアターゲティング部分として記載される。なぜならこれは、ミトコンドリアマトリックスにおいて蓄積し得、またはこれが結合した化合物もしくは複合体（ナノ粒子等）を蓄積させ得るからである。したがって、ＴＰＰの機能的な誘導体は、ミトコンドリアマトリックスにおいて、ＴＰＰと類似した濃度（例えば、約１００倍の濃度範囲内、例えば約１０倍の濃度範囲内）で蓄積し、またはこれが結合した化合物もしくは複合体を蓄積させ得る、ＴＰＰの誘導体である。
【００８１】
以下において、代表的なナノ粒子、ナノ粒子を生産する方法、およびナノ粒子を用いる方法の種々の実施形態を記載する非限定的な例が示される。
【実施例】
【００８２】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は世界的に、市民生活および戦場の双方における死亡および長期の身体障害の主な原因の１つである。初期の損傷によって引き起こされる一次損傷の他に、脳組織にかなりの二次損傷をもたらす、フリーラジカルの生産および免疫応答の高まりが挙げられる事象のカスケードが迅速に起こる。二次損傷を制限することとなる神経保護治療薬を開発するという、医療コミュニティおよび研究コミュニティによってなされた多大な努力が、多数の臨床試験に至った。長年の研究および前進にも拘らず、神経保護処置オプションは、神経学的成果の向上と共に存在しない。有効性を向上させる１つの潜在的なオプションが、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するようにサイズ、電荷、親油性、およびターゲティング特性が最適化され、かつ特定の細胞内ターゲットに到達して、神経保護ペイロードを送達することができる、ナノ粒子送達系の使用である。
【００８３】
本研究において、発明者らは初めて、ＴＢＩの子豚モデルにおける、抗酸化剤および抗炎症カクテルを含有する、高度に親油性のＢＢＢ侵入生物分解性ミトコンドリア標的ナノ粒子（ＮＰ）治療の治療潜在性を調査した。標的ＮＰは、正常なブタ脳の親油性の白質中に分布することが見出された。ＴＢＩの子豚モデルにおける標的ＮＰの評価により、負傷した脳における良好な薬物動態および固有の分布が実証された。標的ＮＰ系はさらに、ミトコンドリアで作用する抗酸化剤コエンザイムＱ１０および抗炎症剤プレドニゾンを運ぶように操作された。ニューロン幹細胞における標的ＮＰ含有カクテル治療の治療潜在性により、酸化ストレスおよび抗炎症特性を引き下げる固有の能力が実証された。この技術は、脳組織にかなりの二次損傷をもたらすフリーラジカルの生産および免疫応答の高まりが挙げられる、ＴＢＩ後に迅速に起こる事象のカスケードに対する治療効果を提供する可能性を有する。
【００８４】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、米国の人々の間の死亡および長期の身体障害の主因の１つとしての「静かな流行病」である。１７０万人を超える個人が毎年ＴＢＩを患っており、おおよそ５０，０００人の患者が死亡し、そして８０，５００人の患者が長期の身体障害を有する。ＴＢＩ生存者の生活の質は多くの場合、著しく低下し、被害者は、学習記憶問題、言語によるチャレンジ、意思決定、問題解決、運動機能に悩み、そして慢性疲労、欝状態、および感情の不安定性に苦しめられる。ＴＢＩの致命的な性質は、５歳未満の小児について、ＴＢＩに関連する入院および死亡の発生率が最も高いという人口統計学があるという事実によって、強められる。ＴＢＩの結果は、脳への一次損傷によって開始され、その後迅速に、酸化および炎症性傷害が挙げられる二次事象のカスケードが続き、これらがさらに組織の損失および損傷を、そして最終的に脳機能を悪化させる。治療干渉の主要ターゲットになったのは、この二次損傷カスケードである。
【００８５】
ＴＢＩ二次損傷カスケードは、細胞レベルでの脳組織の破壊に導く機構および事象の複雑なシリーズであることが判明し、２つの主要成分がフリーラジカルの形成および免疫応答である。脳への初期の外傷の後、一連の異化プロセスが、反応性酸素種（ＲＯＳ）が挙げられるフリーラジカルの細胞内濃度の増大の原因となる。ＲＯＳ生産の増大が、細胞構造の過酸化、ＤＮＡの切断、およびミトコンドリア電子伝達鎖（ＥＴＣ）の破壊の原因となる。同時に、免疫応答の増強がさらに、二次損傷を強める。小膠細胞および浸潤マクロファージが、炎症性サイトカインおよびケモカイン、例えば腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン８（ＩＬ−８）を分泌し、これらが細胞アポトーシスのレベルを増大させる。ＴＮＦ−αは、そのコグネート受容体ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２から、カスパーゼ−８介在性アポトーシスを介して細胞死を誘導する信号を送る。細胞は最終的に、隣接細胞によってのみ込まれるアポトーシス細胞体にフラグメント化する。これらの炎症性サイトカインおよびケモカインの発現は、ＴＢＩ後のヒトの脳および血清サンプルの双方において大幅に上方制御されることが示され、頭部外傷の程度を評価するためのバイオマーカーとして用いられる。
【００８６】
二次損傷カスケードを妨げる神経保護物質が、いくつかの相ＩＩおよび相ＩＩＩ臨床試験に至った。しかしながら、臨床前齧歯類動物モデルおよび早期相無作為化二重盲検試験における有望なデータにも拘らず、神経学的成果の向上に至る神経保護処置オプションは存在しない。有効性を向上させる潜在的一オプションが、注目する血液脳関門（ＢＢＢ）、より良好なターゲット細胞、および細胞コンパートメントを通過することがより適切に可能であるアプローチによって治療送達を向上させることである。二次損傷を改善し得る治療的抗酸化剤および抗炎症剤が挙げられる、少量の小さな親油性分子しか、ＢＢＢの脂質膜を横断して自由に拡散することができない。しかしながら、ＢＢＢ侵入を高めるための小分子ベースの薬物の親油性の増大は、全体的な溶解度および生物学的利用能の低下、血漿タンパク質相互作用の増大、ならびに単核食細胞系（ＭＰＳ）の細胞による吸収の増大が挙げられる不所望の影響を及ぼす虞がある。脳への神経保護物質の送達は潜在的に、３つのマイルストーンを達成するように操作された生物分解性ナノ粒子（ＮＰ）を用いて達成され得る：（１）ＢＢＢを通過して脳中に入るような、サイズ電荷、親油性、およびターゲティング特性の最適化、（２）特異的な細胞内ターゲットへの到達、およびターゲットでのペイロードの徐放の実証、ならびに（３）そこでの軽快化機能の実行。これにより、負傷細胞、退化幹細胞および損傷組織への、神経保護物質の有効かつロバストな送達が可能となろう。末梢内皮におけるよりも大脳内皮細胞におけるミトコンドリア密度が高いことで、適切なサイズおよび電荷の、高度に親油性のミトコンドリア標的ＮＰ系を構築することによって、脳を標的とする戦略が実現する。
【００８７】
殆どの研究は、神経保護物質を開発するのに齧歯類モデルに集中してきた。これは部分的に、齧歯類において開発された治療的発見の、ヒト患者に向けた変換可能性におそらく寄与したであろうが、限られている。治療潜在性を高めるために、ヒトにより類似したモデル、例えばブタにおいて研究する努力がなされてきた。齧歯類と比較して、子豚の脳は、ヒトとの解剖学的類似点および生理学的類似点がより大きく、灰白質−白質の組成、脳サイズが類似し、双方とも皺脳を有し、齧歯類とは異なる。このことは、ブタＴＢＩモデルが神経損傷についてより有利であり得ることを示唆している。なぜなら、ヒト脳内で起こるであろうことについて成果がおそらくより予測的であるからである。また、発明者らは、撮像剤を含有する、高度に親油性のＢＢＢ侵入生物分解性ミトコンドリア標的ナノ粒子（ＮＰ）の、脳内での局在化を調査した。
【００８８】
本研究において、発明者らは、ＴＢＩの子豚モデルにおける、抗酸化剤および抗炎症カクテルを含有する、高度に親油性のＢＢＢ侵入生物分解性ミトコンドリア標的ナノ粒子（ＮＰ）治療の治療潜在性を調査した。
【００８９】
結果および考察
【００９０】
ＴＢＩ用のミトコンドリア標的親油性ＮＰ。抗酸化剤および抗炎症剤の組合せの送達においてＮＰ系を開発する際の一考慮事項は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するＮＰの能力である。さらに、酸化ストレスの細胞内位置は細胞のミトコンドリアであり、そして殆どの抗酸化剤のターゲット細胞小器官は、細胞のミトコンドリアである。さらに、炎症誘発性シグナル伝達の役割、およびミトコンドリア機能を変える炎症誘発性メディエータの能力の組合せにより、ミトコンドリア酸化ストレスが増大して、悪い炎症サイクルが促進される。ゆえに、ミトコンドリア内の過剰な酸化ストレスおよび炎症ストレスを制御することを目的とする戦略は、炎症における予防的干渉および治療干渉の双方を表し得る。ゆえに、脳組織中への抗酸化剤、抗炎症剤、または抗酸化剤および抗炎症剤の送達用のＮＰ系は好ましくは、ＢＢＢおよびミトコンドリア双方のターゲティング特性を有する。
【００９１】
ＢＢＢは、脳内で、脳血管の内側を覆う（ｌｉｎｉｎｇ）内皮細胞によって形成され、当該細胞は、末梢微小血管よりも５０〜１００倍密着した密着結合を形成する。また、星状細胞神経線維末端が、脳毛細血管表面の周りで「ロゼット」様の構造を形成し、かつ内皮細胞に通じて、血流および栄養分供給を調節する。ＢＢＢは、血漿組成物の変動から脳を守るのに、そして脳微環境におけるホメオスタシスを維持するのに重要な機構である。この密着結合は、親水性溶質が脳毛細血管から拡散するのを制限するので、ＢＢＢの侵入は、経細胞機構に効果的に制限される。ゆえに、ＮＰを循環させる血液から脳への流路は、経細胞機構によってのみ生じ得、これには、サイズおよび電荷が適切な、高度に親油性のＮＰが必要とされる。硫酸化プロテオグリカン由来の高アニオン電荷を有する脳内皮細胞表面および基底膜成分が、非脳内皮とは異なり、カチオンＮＰの吸着媒介トランスサイトーシスを可能にするであろう。ゆえに、ＮＰの小さなサイズおよび高度に親油性の表面が、脳内でのＮＰの分布の一助となり得る。さらに、末梢内皮よりも脳内皮細胞においてミトコンドリア密度が高いことで、適切なサイズおよび電荷の、高度に親油性のミトコンドリア標的ＮＰ系を構築することによって、脳を標的とする戦略が実現する。
【００９２】
発明者らは最近、高い親油性特性、非局在化陽性電荷の存在、および適切なサイズ範囲のために、効率的な脳侵入特性、および注目に値する、細胞のミトコンドリアを標的とする活性を有する、末端トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンで官能化された生物分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）−ブロック（ｂ）−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づく生体適合性ポリマーＮＰを開発した。ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰポリマー中のＴＰＰカチオンは、ミトコンドリア内膜（ＩＭＭ）の全域のかなりの陰性ΔΨｍを活かして、マトリックスの内部に効率的に蓄積する。齧歯類モデルにおいて、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰポリマーに由来する標的ＮＰ（Ｔ−ＮＰ）の最適化製剤が、脳内に効率的に蓄積することが見出された。ラットｂｉｏＤモデルにおいて、Ｔ−ＮＰは、静脈内投与されると、脳に送達された。この製剤もまた、ミトコンドリアマトリックス内に蓄積することが見出された。文献において、低分子量のＴＰＰカチオン含有小分子が脳中に吸収されることが報告されている。しかしながら、吸収の程度は、他の組織中への吸収の程度未満であり、脳分布の程度は、化合物の疎水性と相関する。発明者らは、ＮＰ表面上での−ＴＰＰカチオンの組込みが、当該ＮＰの脳蓄積において重要な役割を果たす疎水性の非局在化カチオン表面を生じさせると考えている。したがって、発明者らは、ミトコンドリアで作用する抗酸化剤コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）を封入するために、この特定のＮＰ製剤を用いて、Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰを開発した（図１Ａ）。ミトコンドリアターゲティング親油性ＴＰＰ部分が全くない非標的ポリマーＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨを用いて、コントロールＮＰ製剤ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰを生じさせた。抗炎症効果について、合成コルチコステロイド薬物プレドニゾンを用いて、Ｔ−プレドニゾン−ＮＰおよびＮＴ−プレドニゾン−ＮＰを製剤化した（図１Ｂ、図９、表２）。標的（Ｔ）ＮＰおよび非標的（ＮＴ）ＮＰを構築して、ポリマー結合量子ドット（ＱＤ）ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤを組み込むことによって、生体内分布（ｂｉｏＤ）および薬物動態（ＰＫ）プロフィール測定用のＴ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰを生じさせた（図１Ａ、表３）。標的ポリマーＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰおよび非標的コントロールＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨを、Ｍａｒｒａｃｈｅ  ａｎｄ  Ｄｈａｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０１２，１０９，１６２８８−１６２９３によって以前に記載された方法に従って合成し、特徴付けた。各調製物のサイズ、多分散性指標（ＰＤＩ）、およびゼータ電位を与えるために、ＮＰを動的光散乱（ＤＬＳ）によって特徴付けた（図１Ｂ、図Ｓ１、表Ｓ１）。Ｔ−ＮＰの小さなサイズおよび高い陽性ゼータ電位は、当該ＮＰがＢＢＢ通過およびミトコンドリア吸収特性に適切であろうことを示した。ポリマーに加えられるＣｏＱ１０およびプレドニゾンの種々の重量パーセンテージ値での、これらの薬物のローディング効率により、ＣｏＱ１０およびプレドニゾンの双方が、当該ＮＰ内に非常に高いローディング効率および封入効率（ＥＥ）でトラップされ得ることが示された（図１Ｂ、図９��表２）。当該ＮＰの形態を、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いて調査した（図１Ｂ）。
【００９３】
脳の親油性白質におけるＴ−ＮＰの分布。発明者らは最近、ラットモデルを用いて、Ｔ−ＮＰの脳蓄積特性を判定した。齧歯類の脳はヒトの脳よりもかなり小さく、解剖学的に異なるので、ラットにおいて得られたＴ−ＮＰの脳侵入特性が、ヒトにおけるＴＢＩの処置に関連するかを評価することは、困難である。したがって、発明者らは、分析を、より大きな脳を有する子豚にまで拡張した。量子ドット（ＱＤ）Ｔ−ＱＤ−ＮＰがロードされた標的（Ｔ）ＮＰおよび非標的（ＮＴ）ＮＰ（ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．４６ｍｇ／ｋｇ）を、静脈内（ｉ．ｖ．）注射を介してＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚に投与した。ＮＴ−ＱＤ−ＮＰ（ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．６２ｍｇ／ｋｇ）および生理食塩水をコントロールとして用いた。各群は、３頭の動物を有した。本研究において用いたＮＰのＮＰサイズおよびゼータ電位を、表３に表す。血液サンプルを、ｉ．ｖ．ＮＰ投与後の所定の時点にて収集し、血漿中に存在するＣｄの量を、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって判定した（図２Ａ、表１）。ＴＱＤ−ＮＰおよびＮＴＱＤ−ＮＰの血漿中Ｃｄプロフィールを用いて、ＰＫパラメータを評価した（表１）。ピーク血漿中濃度（Ｃｍａｘ）を、ＱＤについての時間−濃度曲線から直接算出した。適合パラメータは、Ｔ−ＱＤ−ＮＰで処置したブタとＮＴ−ＱＤ−ＮＰで処置したブタとの間で有意に異ならなかった（表１）。排出半減期（ｔ１／２）は、Ｔ−ＱＤ−ＮＰについて２．３時間であった。これは、ラットモデルにおいて以前に観察された半減期とほぼ一致する。２．５時間の類似したｔ１／２値が、ＮＴ−ＱＤ−ＮＰについて観察され、正に帯電したＴＰＰ部分は、Ｔ−ＮＰのクリアランスにいかなる影響も及ぼさないことが実証された。血中濃度について、曲線下面積（ＡＵＣ）値は、Ｔ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰについて高かった。より小容量の分布（Ｖｄ）が、ＴＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰの双方を受けたブタにおいて観察された（表１）。２４時間後に動物を犠牲にして、様々な臓器サンプルにおいてＣｄを定量化することによって、ｂｉｏＤを研究した（図２Ａ）。インビボ撮像系（ＩＶＩＳ）を用いる蛍光顕微鏡検査を実行することによって、脳サンプルを分析した（図２Ｂ）。Ｔ−ＮＰの顕著な分布がブタの脳において観察され、脳におけるそのような分布は、ＮＴ−ＮＰで認められなかった（図２Ｂ）。ＮＴ−ＱＤ−ＮＰは、殆どの場合、肝臓中に分布した（図２Ａ）。
【００９４】
【表１】
2017530941.tif 000008
【００９５】
脳は均質の臓器でなく、リン脂質パターンは様々な領域において変動して、異なる親油性プロフィールをもたらす。白質における総脂質含有量は、灰白質の２倍高い。白質は、総脂質含有量が高いほど、セレブロシドおよびスルファチドのレベルが高く、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルイノシトールのパーセンテージが低い。切片化した脳スライスのＩＶＩＳ分析により、親油性白質におけるＴ−ＮＰの分布の程度はより大きく示された（図２Ｃ）。このパターンは、研究した全動物にわたって一致していた（図１０〜図１３）。白質におけるＴ−ＮＰのより大きな分布はさらに、ＩＣＰ−ＭＳによって量的に確かめられた（図２Ｃ）。炎症および損傷は多くの場合、白質において広がっている。したがって、脳の白質において選択的に蓄積する当該Ｔ−ＮＰは、ＴＢＩ後に神経保護物質を送達するのに極めて有益であり得る。併せて、これらのデータは、発明者らの脳侵入Ｔ−ＮＰの、臨床的に関連し、かつ治療潜在性を示唆する、脳白質におけるＰＫプロフィール、分布パターン、そして特に蓄積を実証した。
【００９６】
脳組織のミトコンドリア内でのＴ−ＮＰの蓄積。Ｔ−ＱＤ−ＮＰ製剤が、脳内での顕著な蓄積を示し、そしてより高い蓄積が、親油性白質において観察されたので、発明者らは、白質および灰白質由来の脳組織サンプルを、付加的な共焦点撮像にかけた（図３）。Ｔ−ＮＰおよびＮＴ−ＮＰで処置したブタ脳由来の灰白質サンプルおよび白質サンプルの双方を単離し、サンプルを固定し、ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎで染色し、サンプルを撮像用に切片化した。これらのサンプルの共焦点撮像は、白質および灰白質に存在する脳細胞のミトコンドリアにおけるＴ−ＱＤ−ＮＰの顕著な関連性（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を示した。Ｔ−ＱＤ−ＮＰのミトコンドリア関連性は、灰白質と比較して白質においてより高かった。ＮＴ−ＱＤ−ＮＰは、脳組織サンプルにおいて検出されなかった（図３Ｂ）。ＮＴ−ＱＤＮＰは、肝細胞の細胞質においてランダムに分配された（図１４）。しかしながら、肝細胞においては限られたＴ−ＱＤ−ＮＰしか見出されなかった（図１４）。
【００９７】
これらの結果により、ＴＮＰは、ミトコンドリアに対する高い親和性を有することが実証され、これは、抗酸化神経保護物質のターゲティングの向上に至ることとなる。さらにＴ−ＮＰの分布を理解するために、発明者らは、ｉ．ｖ．投与による、健康なマウスにおける当該ＮＰの時間依存性の蓄積を実行した。１２、２４および４８時間の３つの異なる時点を研究して、Ｔ−ＱＤ−ＮＰの脳蓄積を、これらの３つの時点でのＩＶＩＳ撮像によって比較した（図１５）。処置したサンプルの脳内のＱＤ発光強度の比較により、ＮＰは、１２時間という早い時期に蓄積し、かつ４８時間後ですら脳内に残ることが示された。顕微鏡分析を、Ｔ−ＱＤ−ＮＰで１２時間処置した動物由来の脳サンプルに実行した。脳組織切片の免疫染色を、様々なタイプの脳細胞マーカーに対する抗体処理を用いて実行した：ニューロン核についてＮｅｕＮ、正常内皮マーカーについてＣＤ−３１、乏突起膠細胞についてｏｌｉｇ２、そして星状細胞についてＧＦＡＰ（図１６）。これらの研究により、ＴＱＤ−ＮＰが、ニューロンおよび星状細胞に勝る乏突起膠細胞および内皮細胞との選択的関連性を有することが示された（図１６）。これらの研究はさらに、Ｔ−ＱＤ−ＮＰが脳細胞によって吸収されることを確認した。
【００９８】
ブタにおけるＴＢＩの開発。ＴＢＩに有効な処置を開発する際の困難の１つが、齧歯類からヒト患者への治療の不十分なトランスレータビリティである。齧歯類と比較して、子豚脳は、ヒトとの解剖学的類似点および生理的類似点がより大きい。このことは、子豚ＴＢＩモデルが、神経損傷について広く用いられる齧歯類モデルよりも有利であり得ることを示唆している。なぜなら、未発達のヒト脳内で起こるであろうことについて成果がおそらくより予測的であるからである。子豚は、ヒトと類似の神経発達シーケンスを有する。生後の成熟シーケンスは、ブタ種がヒトと類似の形状、皺パターン、および灰白質対白質比を有することを示す。齧歯類の大脳皮質は滑らか（ｌｉｓｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ）であるのに対して、ブタ脳の表面はヒトの皺のある新皮質によく似ている。ヒト脳は６０％超が白質で構成される一方、齧歯類脳は白質を１０％未満含有する。ブタ等のより大きな動物の脳は、齧歯類よりも多く白質を含有する。このことは、白質対灰白質における血流、代謝、および損傷機構の差異のために、重要である。したがって、発明者らは、研究においてブタモデルにＴＢＩを用いた。ブタにおけるＴＢＩの生成の詳細な記載を、方法の項において議論する。ＴＢＩは、細胞レベルおよび組織レベルの双方で、脳内での顕著な変化をもたらした（図４）。ヘマトキシリンおよびエオシンの染色は、損傷の開始から２４時間後に、同側半球の脳実質において、相当な出血の存在を明らかにした（図４ＡＩ）。これは、皮質の接合部での白質における浮腫蓄積を伴った；これはおそらく、ＴＢＩにおいて一般的に直面するＢＢＢの分解による血管透過性の増大に由来する血管原性浮腫である。冒された皮質は、青色の矢印によって表される瀕死のニューロンを含有した。これは、同側半球に特異的であった。というのも、対側の皮質が正常な形態を示したからである（図４Ａ−ＩＩＩおよび図４Ａ−ＩＶ）。加えて、冒された皮質は、好中球浸潤を示した（図４Ａ−Ｖ）。これらの炎症性細胞は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）および炎症誘発性サイトカインに応答して、周辺部からＢＢＢを横断して入る。脳実質における好中球の存在はさらに、ＢＢＢの炎症および破壊を明示した。同側半球の白質領域において、相当な出血が存在し、浮腫蓄積が、高いレベルの空胞形成によって確かめられた（図４Ａ−ＶＩＩ）。この観察は、血管原性浮腫が白質の間質腔において支配的に蓄積するという以前の発見と合致した。なぜなら、灰白質神経網の密度の高い網目構造が、間質性浮腫に耐性を示すからである。浮腫蓄積は、対側半球と比較して、同側半球の領域における全体的な増大と相関した（図４Ｂ）。黒色の矢印は、対側半球上の黒色の矢印先端と比較して、同側半球上の膨張した白質の矢印を強調したものである。同側半球の面積は、それぞれの対側半球よりも平均して１３％大きかった（図４Ｂ）。
【００９９】
組織レベルでの病理生理学的改変に加えて、病状は、細胞レベルで明らかであった。同側半球の病変部位および対側半球にある組織を、興奮毒性の指標であるＲＯＳの存在を検出する分析にかけた。対側半球の対応領域と比較して、ＲＯＳの有意な増大が病変部位にあった（図４Ｃ）。さらに、神経損傷において炎症の重要なメディエータである炎症誘発性サイトカインの量を、負傷した動物および無傷の動物の双方において測定した。無傷のブタと比較して、負傷した動物において、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）タンパク質レベルおよび腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）タンパク質レベルの双方の有意な上方制御があった（図４Ｄ）。これらの結果は、神経細胞死、興奮毒性、および炎症を伴う相当な神経損傷を示した。
【０１００】
ＴＢＩの子豚モデルにおけるＴ−ＮＰの分布。発明者らは次に、ＴＢＩブタモデルにおいてＴ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ−ＮＰの分布特性を評価した。貫通ＴＢＩを、静脈内ＮＰ注射の５時間前に生じさせた。Ｔ−ＱＤ−ＮＰおよびＮＴ−ＱＤＮＰを、耳静脈注射によって投与した。正常なブタにおける研究とは対照的に、負傷した動物において評価した場合、Ｔ−ＮＰおよびＮＴ−ＮＰについてのＰＫパラメータは、有意に異なる（図５および表４）。血漿ｔ１／２値は、Ｔ−ＱＤ−ＮＰ処置とＮＴ−ＱＤ−ＮＰ処置との間で有意な差異があった。これらの結果において注目すべきは、ＮＴ−ＮＰ製剤に勝るＴＮＰのＡＵＣの増大である。これは、血漿におけるＴ−ＮＰの平均滞留時間がより長い（ＮＴ−ＮＰのｔ１／２：５．７時間と比較して、ｔ１／２：９．６時間）という観察と結び付いて、より長い時間の循環を可能にするＴＰＰ含有Ｔ−ＮＰの固有の特徴の確認となる。臓器分布は、脳内のＴ−ＱＤ−ＮＰの大きな画分を示し、殆どのＮＴＱＤ−ＮＰは肝臓中で見出された（図５Ｂ）。脳におけるＴ−ＮＰの選択的分布を、負傷脳サンプルでＩＶＩＳを実行することによって、さらに確かめた（図５Ｃ）。Ｔ−ＮＰは、ＮＴ−ＮＰよりもかなり高いレベルで脳内に存在した。Ｔ−ＮＰのＰＫおよび分布プロフィールにより、ミトコンドリア標的ＮＰが、ＴＢＩ後に神経保護物質を送達するのに極めて有益であり得ることが実証された。発明者らは、損傷が穏やかであり、かつ高度に標的とされている（１５ｍｍ×１０ｍｍ×１０ｍｍ）ことから、ＢＢＢの重要な部分が無傷のままであるという事実のために、非負傷動物および負傷動物の双方において、Ｔ−ＮＰの類似した分布パターンが示されたと考えている。この種の損傷は、多数の位置にてＢＢＢの分解の原因となるであろう、全虚血から生じるであろう損傷とは顕著に異なる。
【０１０１】
神経幹細胞（ＮＳＣ）における炎症および酸化ストレスの軽減。ＮＳＣの移植は、ＴＢＩ後の見込みのある治療を提供し得る。しかしながら、そのようなＮＳＣ移植の有効性は、大規模な移植細胞の死および不十分な組織修復のために、制限されている。神経における幹細胞がＮＳＣであり、これは、ニューロンおよび神経膠系統の生成のために更新して分化前駆細胞に分化し得る。したがって、発明者らは、ＮＳＣを用いて、プレドニゾンおよびＣｏＱ１０を含有するＢＢＢ侵入Ｔ−ＮＰの治療潜在性を研究した。
【０１０２】
フリーラジカルおよび過酸化水素が挙げられるＲＯＳの生産によって誘導される酸化ストレスは、ニューロン破壊の原因となり、かつＴＢＩ中に当該細胞においてアポトーシスおよび壊死に密接に関係する主要な機構の１つである。ミトコンドリアは、ＲＯＳ生産の主要な源であることが周知である。ＣｏＱ１０は、哺乳類のミトコンドリアにおいて内生的に合成され、抗酸化剤および酸化促進剤として作用し、そして複合体ＩまたはＩＩ、および、脂肪酸のベータ酸化から電子を移動させる、電子転移因子が挙げられる他のいくつかの電子ドナーからの電子のシャトリングに関与する。ＣｏＱ１０は、全ての細胞および細胞小器官の膜内に見出され、そこでレドックスシャトリングに関与し得る。しかしながら、ＣｏＱ１０生合成の欠陥が、ＴＢＩ中に見出されることがある。したがって、ＴＢＩ中の脳への外生的ＣｏＱ１０の投与が、局所的酸化ストレスを軽減するのに魅力的な戦略を表す可能性がある。しかしながら、ＣｏＱ１０は、水中に不溶性であり、粉末製剤は腸管吸収が非常に乏しく、そしてＢＢＢ侵入特性を有していない。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰを用いた、生物学的利用能、徐放、脳蓄積、およびＣｏＱ１０の効率的なミトコンドリア分布の向上は、ＴＢＩ処置に極めて有益であり得る。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰおよびＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰは双方とも、生理的条件下での抗酸化剤の徐放を実証した（図６Ａ）。発明者らは、ＮＳＣにおいて、ボーラス用量の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）によって酸化ストレスを誘導し、酸素消費速度（ＯＣＲ）を用いて、ミトコンドリア呼吸に及ぼすミトコンドリア標的Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰの効果を研究した。ＮＳＣへのＨ２Ｏ２の添加は、ＯＣＲを有意に引き下げた（図６Ｂ）。Ｈ２Ｏ２処理済みＮＳＣへのＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰの以降の添加により、酸化ストレスの取消し（ｒｅｖｅｒｓａｌ）を実証した。比較として、ＮＴ−ＣＯＱ１０−ＮＰおよびフリーのＣｏＱ１０は、酸化ストレスのより劣る軽減効率を示し、ＯＣＲレベルは、健康な細胞において観察されるよりも低かった。Ｔ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いるコントロール実験は、有意な酸化ストレスの軽減を何ら示さなかった（図１７）。併せて、これらの結果は、Ｈ２Ｏ２処理済みＮＳＣにおいてＯＣＲが低下することを実証した。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰの形態でのＣｏＱ１０のミトコンドリア送達は、ＮＳＣにおいてＨ２Ｏ２媒介酸化ストレスを軽減する、注目に値する効率を実証した。
【０１０３】
プレドニゾン等の免疫抑制コルチコイド系のラグは、ニューロンミトコンドリア動力学に二相性の効果を及ぼし得る。低レベルのプレドニゾンおよび慢性的高レベルが、ミトコンドリア機能の種々の態様を弱め得る。したがって、発明者らは、図６Ａに示した放出動態によって明らかなように、Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰを用いて徐放されるように、プレドニゾンをＮＳＣのミトコンドリアに送達することによって、ミトコンドリア酸化、膜電位、およびカルシウム保持能力に関係する効果を潜在的に観察することができると仮定した。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のような炎症性サイトカインは、ＴＢＩに密接に関係し、当該サイトカインは、損傷を受けた組織に悪影響を及ぼす。したがって、炎症性サイトカイン活性の制限は、ＴＢＩ組織損傷を軽減するのに大きな強みになる。発明者らは、インビトロモデルにおけるプレドニゾン−ＮＰおよびＣｏＱ１０−ＮＰの抗炎症効果を理解するために、リポ多糖（ＬＰＳ）を用いて、ＮＳＣにおけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生を刺激した（図６Ｃ）。ＬＰＳ刺激ＮＳＣを、プレドニゾン、Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、ＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ、Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、またはＴ−ＮＰおよびＮＴ−ＮＰのあらゆる組合せで処置し、ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−αの分泌は、有意に引き下げられた。脳脊髄液中のＩＬ−６レベルは、ＴＢＩの患者における血漿レベルよりも有意に高くなり得る。プレドニゾンを含有するＴ  ＮＰおよびＮＴ  ＮＰは、ＬＰＳ刺激ＮＳＣにおいてＩＬ−６のレベルを引き下げた。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰまたはＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰのプレドニゾンＮＰへの添加は、ＩＬ−６の引下げ効率を増大させた。これらの研究において用いたプレドニゾンまたはＣｏＱ１０の濃度は、いかなる細胞毒性効果も示さず、処理済みＮＳＣにおける細胞死の可能性を除外した（図１８）。発明者らは、インビトロセッティング下でのＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の引下げについて、Ｔ、ＮＴ処理済みの群間でいかなる差異も観察しなかった。ＩＬ−１０は主に、いくつかの炎症誘発性メディエータに及ぶ強力な抑制効果を有する抗炎症サイトカインである。発明者らの実験において、発明者らは、細胞をＣｏＱ１０またはプレドニゾンおよびそれらのＮＰで処理した場合、ＮＳＣにおいてＩＬ−１０が高められたことを見出した。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰおよびＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰの組合せ投与が、他の製剤と比較して、ＩＬ−１０を誘導するのにより有効であった（図６Ｃ）。ＩＬ−４は、脳細胞およびＴリンパ球の双方による炎症誘発性サイトカイン産生のネガティブレギュレータとしての役割を主に果たす。ＬＰＳと比較した場合、３８全ての試験物が、ＩＬ−４反応の低下を示した（図１９）。ＩＬ−１２は、脳における免疫炎症性反応を示す；しかしながら、自然発生的な免疫応答時のＩＬ−１２の局所産生の結末は、知られていない。発明者らの研究において、ミトコンドリア標的ＴＰｒｅｄ−ＮＰまたはＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰおよびＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰの組合せで刺激されたＬＰＳ処理済みＮＳＣは、ＩＬ−１２レベルの有意な増大を示した（図１９）。なぜミトコンドリア標的治療のみがＮＳＣからＩＬ−１２を産生するかの正確な機構は、更なる調査が必要である。
【０１０４】
脳損傷について当該ＮＰプラットホームのインビボ分布およびインビトロ有効性を実証した後に、発明者らは次に、ブタにおけるＴ−ＮＰの安全性を評価した。用量依存性の１４日の毒性および安全性の研究を、Ｔ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰの存在下で子豚において実行し、結果を、ＮＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰ処理済み動物および生理食塩水処理済み動物と比較した。各群において２頭の健康な子豚を、耳静脈を介した単回投与によってＴＥｍｐｔｙ−ＮＰ（総ＮＰに関して５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）、ＮＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰ（総ＮＰに関して５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水で処理した。図７Ａに示す７日目および１４日目の血清臨床化学データにより、殆どの値が、研究中、臨床的に許容可能な限度内にあることが示された。神経学的変化も行動に関する変化も、研究期間中に観察されなかった。唯一の異常は、注射中に１〜２分間呼吸を止めた、５ｍｇ／ｋｇのＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰを受けた１頭の子豚、および１０ｍｇ／ｋｇのＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰを受けた双方の子豚であった。しかしながら、注射の完了およびイソフルラン麻酔薬のオフの後、子豚は呼吸を開始して、正常に回復した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａフィードミルによって生産される「Ｓｔａｒｔｅｒ  １」食をアドリブで給餌し、子豚は正常な速度で体重を増やした。血小板白血球（ＷＢＣ）カウント等の標準的な血液学的パラメータの評価は、ＴＮＰ処理済み動物と、ＮＴ−ＮＰまたは生理食塩水で処理した動物との間で統計的に有意な差異を示さなかった（図２０）。これにより、Ｔ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰの用量依存性投与が、有意な変化を誘導しないことが示された。Ｔ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰが殆どの場合、脳および肝臓に分布し、ＮＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰが肝臓中に蓄積するので、発明者らはこれらの臓器の組織学的分析を実行した。非臨床的全身毒性研究中に神経系をサンプリングかつプロセシングするために、十分に固定した肝臓の切片および脳の片側切片を、Ｂｏｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１３，４１，１０２８−１０４８によって記載されるようにサンプリングした。肝臓において、全てのブタが、血液生成（赤血球生成、または赤血球生成および果粒球生成）の散乱した小病巣を有した。動物の齢を考えると、延髄外血液生成と呼ばれる、肝臓における血液生成は、おそらく正常であり、子宮内で存在するものからの残留である。他の変化は観察されなかった（図７Ｂ）。５および１０ｍｇ／ｋｇ双方についてのＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰ処理由来の脳サンプルにおいて、１０ｍｇ／ｋｇでのＮＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰ、および生理食塩水の処理は、髄膜および実質の軽度の鬱血があった。病理学者による専門家の意見により、脳内のこの軽度の鬱血は、非特異的所見であり、おそらく安楽死に関係することが示された。
【０１０５】
Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰおよびＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰの組合せが、インビボセッティング下で酸化ストレスの軽減を示す能力を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢、群あたり３頭）において研究した。ＴＢＩを、９頭全ての子豚において、１０ｍＬのナノピュア水中Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ（ＣｏＱ１０に関して５ｍｇ／ｋｇ）、およびＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ（プレドニゾンに関して５ｍｇ／ｋｇ）の混合物；１０ｍＬのナノピュア水中ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ（ＣｏＱ１０に関して５ｍｇ／ｋｇ）およびＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ（プレドニゾンに関して５ｍｇ／ｋｇ）の混合物；または生理食塩水を、静脈内注射を介して投与して１時間後に誘導した（図８Ａ）。インビボ研究において用いたＮＰのサイズおよびゼータ電位を表５に与える。４８時間後に子豚を麻酔して、脳サンプルを収集した。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰおよびＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰの組合せ処置の、ＴＢＩ誘導酸化ダメージに及ぼす効果を研究した。負傷した同側皮質におけるＲＯＳレベルの分析により、正常な子豚と比較して、生理食塩水処理群においてＲＯＳレベルが高いことが実証された（図８Ｂ、図２１Ａ）。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰおよびＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰを含有するカクテルによる処置は、対応するＮＴ−ＮＰの組合せと比較して、ＴＢＩ負傷動物におけるＲＯＳレベルの増大を大幅に弱めた（図８Ｂ）。ヘマトキシリンおよびエオシンの染色から見出される組織学的変化は、生理食塩水処理群とＴ−ＮＰ処置群間で類似しており、Ｔ−ＮＰ処置済みの動物における毒性は示されなかった（図２１Ｂ）。壊死および出血が、病変部位に存在した。変性好中球および少数のマクロファージが病変部位に浸潤し、壊死領域および周囲の神経実質における内皮は非常に反応性であった。また、損傷に対する浮腫蓄積が、同側半球内にあった。脳侵入Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰおよびＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰの組合せが、ＴＢＩパイモデルにおいて酸化ストレスを、明らかな毒性を全くなくして妨げる能力は、本研究の重要な所見である。
【０１０６】
本研究は、ＴＢＩ後の神経保護−幹細胞治療の組合せ用の潜在的ナノ医療プラットホームを提供する。ミトコンドリア標的親油性ＮＰは、抗炎症剤および抗酸化剤の組合せを徐放するように局所的に送達することができ、ＮＳＣの後続適用は、損傷を受けた組織を修復する潜在性を有する。損傷の間、炎症および酸化ストレスに富む脳の親油性白質におけるＴ−ＮＰの分布は、治療用量を局所的に同時に送達して、ＢＢＢを通過する能力が限られている静脈内投与治療剤に共通の全身毒性の問題を軽減する重要な手段を提供する。臨床応用に極めて有益であり、かつ十分に特徴付けられた生物分解性ターゲティング部分が付属するポリマーから構築されることとなる標的ＮＰは、組成が単純であり、種々の疎水性薬物を封入する潜在性を有する。このＢＢＢ侵入生物分解性ミトコンドリア標的ＮＰを、ＴＢＩにおける可能性のある使用について評価したが、この技術は、中枢神経系疾患、例えばパーキンソン病またはハンチントン舞踏病のような神経変性障害、局在脳機能障害を伴う疾患、例えば脳卒中の多血について修正されてよい。
【０１０７】
【表２】
2017530941.tif 000009
【０１０８】
【表３】
2017530941.tif 000010
【０１０９】
【表４】
2017530941.tif 000011
【０１１０】
【表５】
2017530941.tif 000012
【０１１１】
材料および方法。
動物。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢）を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆａｒｍから得、米国実験動物保護認定協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ：ＡＡＡＬＡＣ）の「Ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」、動物保護法（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ：ＡＷＡ）、ならびに他の適用可能な連邦および州のガイドラインに従って取り扱った。本明細書で提示した全ての動物研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＧｅｏｒｇｉａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【０１１２】
統計。全てのデータを、平均±Ｓ．Ｄ（標準偏差）として表した。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアｖ５．００を用いて実行した。２つの値間の比較を、独立Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を用いて実行した。ｐｏｓｔ−ｈｏｃＴｕｋｅｙ検定による一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、群間の有意差を同定した。
【０１１３】
材料および測定器。全ての化学物質を、特に明記しない限り、受け取ってからさらに精製することなく用いた。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ＫＣｌ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トリエチルアミン、５−ブロモ吉草酸、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、過酸化水素水（Ｈ２Ｏ中３０重量％）、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、ＣｏＱ１０（製品番号Ｃ９５３８）、およびプレドニゾン（製品番号Ｐ６２５４）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。カルボキシ末端ＰＬＧＡ（ｄＬ／ｇ、０．１５から０．２５）をＬａｃｔｅｌから得、分子量３３５０のＯＨＰＥＧ−ＯＨをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＴＰＰを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  ２３２２７）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ショ糖、塩化カリウム、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔｓ（カタログ番号６９５７２）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ヒト誘導多能性ＮＳＣを、ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍから購入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。Ａｃｃｕｔａｓｅを、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を除いて、ＮＳＣ拡張培地試薬を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。反応性酸素種検出用の２’７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ブタ特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットをＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓのＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒで読んだ。ヒト特異的ＥＬＩＳＡキットを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５  ＩＴＫ（商標）Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ（カタログ番号Ｑ２１５６１ＭＰ）、およびＤＡＰＩを有するｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４ウェルプレートおよびカートリッジを、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。抗グリア原線維酸性タンパク質（抗ＧＦＡＰ）抗体（カタログ番号：ａｂ４６７４）および抗ＣＤ３１抗体（カタログ番号：ａｂ２８３６４）を、Ａｂｃａｍから購入した。乏突起膠細胞転写因子（Ｏｌｉｇ２）抗体を、ＧｅｎｎＴｅｘ（カタログ番号：ＧＴＸ６２４４０）から購入した。抗ＮｅｕＮ精製抗体を、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログ番号：ＡＢＮ９０Ｐ）から得た。二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒマウス４８８−Ａ１１００１、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒモルモット４８８−���１１０７３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒウサギ４８８−Ａ１１０３４を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ニワトリ６４７−ＳＡＢ４６００１７９二次抗体を、Ｓｉｇｍａから購入した。天然ロバ血清（ＮＤＳ）を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログＮｏ．Ｓ３０−１００ＭＬ）から得た。
【０１１４】
蒸留水を、０．２２μｍフィルタを含有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｂｉｏｃｅｌ水精製系（１８．２ＭΩ）に通すことによって精製した。細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得たＣｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ細胞カウンタを用いてカウントした。ＤＬＳ測定を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ系を用いて実行した。光学測定を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計で実行した。ＴＥＭ画像を、Ｐｈｉｌｉｐｓ／ＦＥＩ  Ｔｅｃｈｎａｉ  ２０顕微鏡を用いて得た。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）研究を、ＶＧ  ＰｌａｓｍａＱｕａｄ  ３  ＩＣＰ質量スペクトロメータで実行した。プレートリーダ分析を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダで実行した。抗酸化性ストレスアッセイを、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４アナライザ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて実行した。脳サンプルの蛍光撮像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ系で実行した。脳組織サンプルの共焦点画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡でキャプチャした。血清臨床化学分析を、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｐ−Ｍｏｄｕｌａｒ系、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓで実行した。血液学的分析を、ＨｅｍａＴｒｕｅ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｈｅｓｋａで実行した。
【０１１５】
細胞培養。ヒト誘導多能性幹細胞由来神経幹細胞（ＨＩＰＴＭ  ｈＮＳＣ  ＢＣ１，  ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ（登録商標），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、本研究のインビトロ部分に用いた。ＮＳＣを、ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした組織培養皿上で、神経基本培地、２％Ｂ−２７サプリメント、１％非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−アラニン／Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および２０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦで構成される神経幹細胞培地中に維持した。培地を１日おきに変えた。ＮＳＣがコンフルエンスに達すると（おおよそ４から５日毎）、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて細胞を酵素に通し、細胞スクラッパを用いて皿から取り出した。細胞を１：４の比率で分割した。ＭＴＴおよびＲＯＳ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎアッセイ用にＮＳＣを調製するために、ＮＳＣを、ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした９６ウェル皿内に、神経幹細胞培地中、ウェルあたり４０，０００細胞の比率でプレーティングした。
【０１１６】
ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨおよびＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成。非標的ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨおよび標的ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰポリマーを、Ｍａｒｒａｃｈｅ，Ｓ．＆  Ｄｈａｒ，Ｓ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｌｅｎｄｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ａｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９，１６２８８−１６２９３，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１００９６１０９（２０１２）において以前に報告された方法に従って合成し、特徴付けた。
【０１１７】
ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤの合成。ＰＥＧ−ＱＤへのＰＬＧＡの結合を、以前に報告された方法（Ｍａｒｒａｃｈｅ  ＆  Ｄｈａｒ（２０１２），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９，１６２８８−１６２９３）に基づいて、僅かに修正して実行した。固有の粘度０．１５〜０．２５（１ｍｇ、約０．１６μｍｏｌ）のＰＬＧＡ−ＣＯＯＨを、２ｍＬ  ＤＭＦ中に溶解した。結合用にカルボキシル部分を活性化するために、ＥＤＣ（１０ｍｇ、５２μｍｏｌ）およびＮＨＳ（１０ｍｇ、８６．９μｍｏｌ）を加え、混合物を室温で５時間撹拌した。これに、ＱＤｏｔ（登録商標）７０５  ＩＴＫ  Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）量子ドット（２５０μＬ、２ｎｍｏｌ）をゆっくり滴加して、ＰＬＧＡの目に見える析出が起こらないことを確実にした。反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤを、ＤＭＦを用いた洗浄および遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１ｈ）の繰返しによって単離した。最終のＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤペレットを、２５０μＬのＤＭＦ中に再懸濁させて、更なる使用まで４℃で維持した。
【０１１８】
Ｔ−ＱＤ  ＮＰおよびＮＴ−ＱＤ  ＮＰの構築。ＱＤを含有するＴ  ＮＰおよびＮＴ  ＮＰを、ナノ析出法によって合成した。ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨまたはＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に５０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ポリマーの１００μＬ溶液を、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤ（１０μＬ、ＤＭＦ中８μＭ溶液）と混合し、ＤＭＦで５ｍｇ／ｍＬの最終ポリマー濃度に希釈した。この混合物をナノピュア水に、室温で常に撹拌しながら滴加した。ＮＰを、ドラフト内で室温にて２時間撹拌した。有機溶媒を、１００ｋＤａカットオフａｍｉｃｏｎ濾過膜を用いて、３０００ｒｐｍにて４℃で３回洗浄することによって取り除いた。ＮＰを１ｍＬナノピュア水中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させて、更なる使用まで４℃で保存した。サイズ、ＰＤＩ、およびゼータ電位を判定するために、ＤＬＳ測定を実行した。
【０１１９】
Ｔ−Ｐｒｅｄ−ＮＰおよびＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰの合成。プレドニゾンをロードしたＴ  ＮＰおよびＮＴ  ＮＰを、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰまたはＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨからナノ析出法によって合成した。ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨまたはＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧＴＰＰ（ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍＬ）を、予め定義した量のプレドニゾン（ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＤＭＦで５ｍｇ／ｍＬの最終ポリマー濃度に希釈した。発明者らの全ての研究において、発明者らは、ポリマー重量に対して３０％フィードのプレドニゾンを用いた。この混合物をナノピュア水に、常に撹拌しながら滴加した。ＮＰを、ドラフト内で室温にて２時間撹拌した。有機溶媒を、１００ｋＤａカットオフａｍｉｃｏｎ濾過膜を用いて、３０００ｒｐｍ、４℃で３回洗浄することによって取り除いた。ＮＰを１ｍＬナノピュア水中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させて、更なる使用まで４℃で保存した。サイズ、ＰＤＩ、およびゼータ電位を判定するために、約０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＰ懸濁液を用いて、ＤＬＳ測定を実行した。プレドニゾンローディングパーセントおよびＥＥ％を、ポリマーコアを０．１ｍＭ  ＮａＯＨ中に室温で一時間溶解することによって、判定した。生じた溶液をさらに、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏの５０：５０混合液中に溶解し、プレドニゾンを、ＨＰＬＣ（用いた波長：２６１ｎｍ、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ  Ｃ１８カラム、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：イソプロパノールを有する５０：５０アセトニトリル、１ｍＬ／分の流量、１１．４分の保持時間を用いた）を用いて定量化した。
【０１２０】
Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰおよびＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰの合成。ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨまたはＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ（ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭＦ中ＣｏＱ１０の１０ｍｇ／ｍＬ溶液１５０μＬと混合し、ＤＭＦで５ｍｇ／ｍＬの最終ポリマー濃度に希釈した。ＣｏＱ１０フィードは、ポリマーに対して３０％であった。この混合物をナノピュア水に、常に撹拌しながら滴加した。ＮＰを、ドラフト内で室温にて２時間撹拌した。有機溶媒を、１００ｋＤａカットオフａｍｉｃｏｎ濾過膜を用いて、３０００ｒｐｍ、４℃で３回洗浄することによって取り除いた。ＮＰをナノピュア水（１ｍＬ）中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させて、更なる使用まで４℃で保存した。サイズ、ＰＤＩ、およびゼータ電位を判定するために、ＤＬＳ測定を実行した（０．２５ｍｇ／ｍＬ、各測定値は、３個体の測定値の平均であった）。ＣｏＱ１０ローディングパーセントおよびＥＥ％を、ポリマーコアを０．１ｍＭ  ＮａＯＨ中に室温で一時間溶解することによって、判定した。生じた溶液をさらに、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏの５０：５０混合液中に溶解し、プレドニゾンを、ＨＰＬＣ（用いた波長：３２９ｎｍ、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ  Ｃ１８カラム、０．１％ＴＦＡ：イソプロパノールを有する５０：５０アセトニトリル、１ｍＬ／分の流量、７．２分の保持時間を用いた）を用いて定量化した。
【０１２１】
Ｔ−ＮＰおよびＮＴ−ＮＰからのプレドニゾンおよびＣｏＱ１０の放出。Ｔ  ＮＰおよびＮＴ  ＮＰからのプレドニゾンおよびＣｏＱ１０の放出動態を、これらのＮＰを３７℃の１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４、４Ｌ）に対する透析にかけることによって、分析した。ＮＰ（１００μＬ）を、Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒミニ透析ユニットに加えて、穏やかに振盪させたＰＢＳバス内に入れた。ＰＢＳを１２時間毎に変えた。種々の時点で２つの透析ユニットを取り除いた。残ったプレドニゾンまたはＣｏＱ１０の量を、前述のようにポリマーコアを溶解して、放出されたプレドニゾンまたはＣｏＱ１０の量を、先に記載した条件を用いるＨＰＬＣを用いて定量化することによって、判定した。
【０１２２】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＡｎａｌｙｚｅｒによるＴ  ＮＰおよびＮＴ  ＮＰの抗酸化性。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、およびフリーＣｏＱ１０を、ＮＳＣにおける酸化ストレス減軽能力について試験した。細胞を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４ウェルプレートの各ウェル上に、３０，０００細胞／ウェルの濃度でプレーティングし、一晩増殖させた。各ウェルを最初に５０μＬ  ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしてから、細胞をプレーティングした。培地を変え、細胞をＳｅａｈｏｒｓｅ基本培地で洗浄し、培地をｓｅａｈｏｒｓｅ基礎培地に置き換えた。細胞を、時間に対する酸素消費速度（ＯＣＲ）の変化について監視した。基礎リーディングを４５分間得てから、Ｈ２Ｏ２（１０μＭ）を注入した。ＯＣＲを９０分間監視して、Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ（ＣｏＱ１０に関して１μＭ）、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ（ＣｏＱ１０に関して１μＭ）、およびフリーＣｏＱ１０（１μＭ）を注入した。その後、ＯＣＲレベルをさらに４．５時間測定した。また、コントロールとして、処理なし細胞またはＨ２Ｏ２（１０μＭ）のみを処理した細胞も監視した。
【０１２３】
幹細胞におけるＮＰの抗炎症特性。ＮＳＣを、１２−ウェルプレートの各ウェル上に、ウェルあたり１×１０７個の密度でプレーティングし、一晩増殖させた（ＮＳＣ基礎培地２００μＬ中）。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）をＮＳＣに加えて、３６時間インキュベートした。Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ、Ｔ−プレドニゾン−ＮＰ、ＮＴ−プレドニゾン−ＮＰ、Ｔ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋Ｔ−プレドニゾン−ＮＰ、ＮＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ＋ＮＴプレドニゾンＮＰ、フリーＣｏＱ１０、フリープレドニゾン、またはフリープレドニゾン＋フリーＣｏＱ１０（ＮＰまたはフリー製剤について：ＣｏＱ１０またはプレドニゾンに関して１μＭ）。ＥＬＩＳＡを、発明者らによって報告された方法に従って、サイトカイン、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、およびＩＬ−４に対して上澄みで実行した。簡潔に、抗体でコーティングしたプレートを、ＰＢＳ中１０％ＦＢＳで１時間室温にてブロッキングしてから、洗浄バッファで３回洗浄した。ＮＳＣ上澄みを、プレート上で２時間室温にてインキュベートした。続いてこれを直ちに洗浄し、サイトカイン−ビオチン複合体およびストレプトアビジンワーキング溶液と順次インキュベートした。最後に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（１００μＬ）を含有する基質試薬を各ウェルに加えて、１５分間インキュベートし、５０μＬ  Ｈ２ＳＯ４（０．１Ｍ）を加えることによって反応を止めた。吸光度を、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴウェルプレートリーダを用いて、４５０ｎｍにて記録した。
【０１２４】
ＮＳＣにおけるＣｏＱ１０およびプレドニゾンのＮＰの細胞毒性。全てのＮＰの細胞毒性挙動を、ＮＳＣに対してＭＴＴアッセイを用いることによって評価した。細胞（４０，０００細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート上の、１００μＬのＮＳＣ基本完全培地中に播種して２４時間インキュベートした。細胞を（プレドニゾンおよびＣｏＱ１０に関して）様々な濃度にてＮＰで処理し、３７℃でインキュベートした。培地を１２時間後に変え、細胞をさらに６０時間インキュベートした。その後、細胞を５時間、２０μＬのＭＴＴ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）で処理した。培地を取り除き、細胞を１００μＬのＤＭＳＯで溶解し、紫色のホルマザンの吸光度を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダを用いて５５０ｎｍにて記録した。各ウェルを３通りに実行し、バックグラウンドリーディングを８００ｎｍにて記録した。
【０１２５】
ブタにおけるＮＰのＢｉｏＤおよびＰＫ。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢、群あたり３頭）を、イソフルランを用いて麻酔した。Ｔ−ＱＤ−ＮＰ（ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．４６ｍｇ／ｋｇ）、ＮＴ−ＱＤ−ＮＰ（ＮＰに関して２．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．６２ｍｇ／ｋｇ）、および生理食塩水を、耳静脈中に入れた静脈内カテーテルを介して投与した。血液サンプルを、注射後０、２、４、６、８および２４時間目にヘパリン処理済みチューブ内に収集し、使用まで４℃で保存した。血液サンプルを、２０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離して、血漿を収集した。ＮＰ由来のＱＤのパーセンテージを、ブタについて血液が体重の３．５％を構成し、かつ血漿が血液容量の５５％を構成することを考慮に入れて算出した。ＱＤ由来のＣｄの量を、ＩＣＰ−ＭＳによって血漿において算出した。術後から２４時間して、５％気化イソフルランを酸素と共に用いて、外科手術用マスクを利用して子豚を深く麻酔し、その後ＣＯ２吸入を介して安楽死させた。安楽死の後、子豚を断首して脳を取り出し、−８０℃で保存した。ｂｉｏＤ研究のために、心臓、肺、腎臓、肝臓、および脾臓を取り出して、−８０℃で保存した。全体的なｂｉｏＤを、ＩＣＰ−ＭＳによって各臓器中のＣｄの量を分析することによって算出した。また、脳サンプルを、Ｃｙ５．５発光および５００ｎｍ励起を用いるＩＶＩＳによって、１秒の露光時間で撮像した。その後、脳を５ｍｍの冠状切片に薄片化し、ＩＶＩＳによって撮像した。分析の前に、臓器を硝酸（典型的には組織１ｇ／酸１０ｍＬ）で２４時間、穏やかに加熱かつ振盪して溶解した。ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、およびＣＬ（ｔ＝０）の計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０１）で実行した。ＰＫパラメータを、１−コンパートメントモデル式を用いてデータを適合させることによって決定した。
【０１２６】
共焦点撮像用のブタ脳の凍結切片化。肝臓サンプルならびに脳由来の灰白質サンプルおよび白質サンプルを単離した。サンプルを、４％パラホルムアルデヒド中で５時間固定してから、３０％ショ糖中で凍結保護した。その後、サンプルを、最適切削温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、−８０℃で保存してから、クリオスタットを用いて５μｍに凍結切片化した。その後、切片を、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ｇｒｅｅｎ（５００ｎＭ）で４５分間室温にて染色した。その後、切片を、１×ＰＢＳで３回、ナノピュアＨ２Ｏで５回洗浄した。その後、切片を、撮像のために、退色防止試薬中に浮かせて、カバーガラスで覆った。ＤＡＰＩ染色する切片について、スライドを、ＤＡＰＩを有するＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄに浸けて、カバーガラスをかけた。
【０１２７】
ブタにおけるＴＢＩの誘導。５頭の４週齢の家畜Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚に外科手術を施した。５％気化イソフルランを酸素と共に用いて、外科手術用マスクを利用して子豚を麻酔し、外科手術中に心拍数、呼吸数、および体温を連続的に監視した。ルーチンの皮膚滅菌の後、皮膚切開を頭蓋の最上位の正中線に施した。トレフィンを用いて、直径７ｍｍの開頭術を、左側の冠状縫合および前頭縫合の前接合部の前頭骨において実行した。硬膜を無傷のままにし、皮質の表面への外傷を回避するように注意した。滅菌済みの外科手術用メスを、左前頭葉中に１５ｍｍの深さで垂直に硬膜表面まで挿入し、３６０度回転させてから取り出した。露出した皮質表面を、滅菌済みの骨ワックスで覆って、皮膚切開部を外科手術用ステープルで閉じた。子豚を全身麻酔から回復させ、歩行できるまで監視した。
【０１２８】
組織病理学。冠状脳切片を、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ルーチン的にプロセシングし、パラフィンに包埋し、おおよそ５μｍに切片化し、スライドガラス上に乗せ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１２９】
ＲＯＳ検出。脳組織サンプルを損傷部位から取り出し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。組織サンプルを１０μｍの厚さで凍結切片化し、直ちに、顕微鏡検査スライドガラス上にて４％パラホルムアルデヒド中で固定した。ＲＯＳ検出を、２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ＃Ｄ６８８３）を適用することによって実行し、３７℃で３０分間インキュベートした。スライドをリン酸バッファ生理食塩水で１回洗浄してから撮像した。撮像を、ＱＩｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｔｉｇａ  ２０００Ｒカメラを装備するＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００−Ｓ顕微鏡で実行した。露光時間は１秒であり、ＧＦＰフィルタにＥＸＦＯＸ−Ｃｉｔｅ  １２０バルブを用いた。組織切片の全体にわたって画像をランダムに撮り、画像の全体の蛍光を、ＩｍａｇｅＪを介して測定した。処置群あたりブタ３頭、ブタ１頭あたり５枚の写真を撮った。
【０１３０】
脳サンプルのＥＬＩＳＡ。脳組織サンプルを損傷部位から取り出し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。組織サンプルを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ＃  Ｍ２２２）入り低温放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解バッファ（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ＃  Ｎ６５３）中でホモジナイズした。組織ホモジネートアリコートを、１３．５００ｒｐｍにて４５分間のマイクロセントリフュージにかけた。生じた上澄みを、使用まで−８０℃で保存した。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのタンパク質レベルを、ブタ特異的アッセイ系（それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃  ＫＳＣ３０１１およびＫＳＣ００８１）を利用するＥＬＩＳＡを用いて定量化した。組織溶解物を、標準的な希釈剤バッファ（キット内に提供される）中に１：１０で希釈し、その後メーカーの説明書に従った。各サンプルを３通りにランさせた。吸光度を、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎプレートリーダを用いて４５０ｎｍにて測定した。データを、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １２．５ソフトウェアを利用して４つのパラメータロジスティックをランさせることによって分析した。
【０１３１】
ＴＢＩブタモデルにおけるＮＰのＢｉｏＤおよびＰＫ。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢、群あたり２頭）を、イソフルランを用いて麻酔し、ＴＢＩを、先に述べたように誘導した。５時間後、Ｔ−ＱＤ−ＮＰ（１．５ｍＬ、ＮＰに関して２．３３ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して０．８８９ｍｇ／ｋｇ）、ＮＴ−ＱＤＮＰ（１．５ｍＬ懸濁液、ＮＰに関して２．３３ｍｇ／ｋｇ、そしてＣｄに関して１．０５ｍｇ／ｋｇ）、および生理食塩水を、耳静脈中に入れた静脈内カテーテルを介して投与し、そしてナノ粒子溶液を投与した。血液サンプルを、眼窩洞を介した採血の注射後０、２、４、６、８、および２４時間目にヘパリン処理済みチューブ内に収集し、使用まで４℃で保存した。血液サンプルを、２０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離して、血漿を収集した。ＮＰ由来のＱＤのパーセンテージを、ブタについて血液が体重の６．５％を構成し、かつ血漿が血液容量の５５％を構成することを考慮に入れて算出した。ＱＤ由来のＣｄの量を、ＩＣＰ−ＭＳによって血漿において算出した。術後から２４時間して、５％気化イソフルランを酸素と共に用いて、外科手術用マスクを利用して子豚を深く麻酔し、その後ＣＯ２吸入を介して安楽死させた。安楽死の後、子豚を断首して脳を取り出し、−８０℃で保存した。脳の負傷領域を、分析のために５ｍｍの冠状切片に薄片化した。ｂｉｏＤ研究のために、心臓、肺、腎臓、肝臓、および脾臓を取り出して、−８０℃で保存した。全体的なｂｉｏＤを、ＩＣＰ−ＭＳによって各臓器中のＣｄの量を分析することによって算出した。また、脳サンプルを、５７０ｎｍ励起およびＣｙ５．５発光フィルタを用いるＩＶＩＳによって、１秒の露光時間で撮像した。その後、脳を５ｍｍの冠状切片に薄片化し、ＩＶＩＳによって撮像した。分析の前に、臓器および糞便を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｓｏｌｖａｂｌｅ（製品番号：６ＮＥ９１００）で少なくとも２４時間、穏やかに加熱かつ振盪して溶解した。ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、およびＣＬ（ｔ＝０）の計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０１）で実行した。ＰＫパラメータを、１−コンパートメントモデル式を用いてデータを適合させることによって決定した。
【０１３２】
ＩＣＰ−ＭＳのための灰白質および白質の単離および調製。冠状脳切片をＩＶＩＳで撮像した後、灰白質および白質を、メスを用いて手で切開した。各動物由来の灰白質および白質の双方のおおよそ２００ｍｇの組織サンプルをマイクロチューブ中に入れ、使用まで−２０℃で保存した。単離後、各ブタ由来の灰白質サンプルおよび白質サンプル（それぞれ約２００ｍｇ）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内に入れた。組織を、濃硝酸（１ｍＬ）で４時間、５０℃に加熱し、かつ穏やかに振盪して溶解した。Ｃｄの量を、ＩＣＰＭＳによって定量化した。
【０１３３】
マウスにおける時間依存性ＢｉｏＤ研究。雄（Ｃ５７ＢＬ／６）マウス（３０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＵＳＡから購入し、作業を無菌条件下で実行した。動物を、イソフルラン（２％）を等量の酸素と存在させて麻酔した。Ｔ−ＱＤ−ＮＰを、２０ｍｇ／ｋｇの用量で注射した。本研究におけるＴ−ＱＤ−ＮＰは、平均直径が６９．２±１．１ｎｍであり、ゼータ電位が３１．５±０．８ｍＶであった。注射の１２、２４、または４８時間後、外科手術を無菌条件下で実行し、大きな臓器を全て単離し、直ちに、５００ｎｍ励起およびＣｙ５．５放射フィルタを備えるＩＶＩＳを用いて、２秒の露光時間で撮像した。撮像の後、脳サンプルを、４％パラホルムアルデヒド中で４℃にて４８時間固定してから、３０％ショ糖中で凍結保護した。その後、サンプルを、ＯＣＴ化合物中に包埋し、−８０℃で保存してから、クリオスタットを用いて５μｍに凍結切片化した。その後、切片を、免疫蛍光研究用の様々な抗体で染色した。
【０１３４】
組織切片の免疫染色は、様々なタイプの脳細胞マーカー：ニューロン核についてＮｅｕＮ、正常な内皮マーカーについてＣＤ−３１、乏突起膠細胞についてｏｌｉｇ２、そして星状細胞についてＧＦＡＰに対する抗体処理を用いて実行した。脳切片は、切片領域を乱すことなくＰＢＳ（１×）で２〜３回徹底的に洗浄してから、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するＰＢＳ（１×）中１０％ＮＤＳで、室温にて１時間、ブロッキングした。組織切片を、以下の希釈物：抗ＮｅｕＮ抗体（１：５００希釈）、抗ＣＤ−３１抗体（１：５０希釈）、抗ｏｌｉｇ２（１：２５０希釈）、および抗ＧＦＡＰ（１：５００希釈）を用いて、加湿チャンバ内で、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、切片をＰＢＳ（１×）で３回洗浄した。切片を、以下の二次抗体：ＮｅｕＮについてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒモルモット４８８−Ａ１１０７３、ＣＤ３１およびＯｌｉｇ２についてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒウサギ４８８−Ａ１１０３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧＦＡＰについてニワトリ６４７−ＳＡＢ４６００１７９と１．５時間インキュベートした。切片をＰＢＳで３回洗浄し、乗せ、カバーガラスで覆い、共焦点顕微鏡下で観察した。
【０１３５】
子豚における１４日の用量依存性毒性研究。毒性研究を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢、群あたり２頭）において、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰおよびＮＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰの総ＮＰ用量で１４日間実行した。０日目に、総ＮＰに関して５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰおよびＮＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰの単回の静脈内注射液を、１ｍＬ（５ｍｇ／ｋｇについて）または２ｍｌ（１０ｍｇ／ｋｇについて）に希釈して、耳静脈を介して静脈内に与えた。本研究におけるＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰは、平均直径が４７．４±２．９ｎｍであり、ゼータ電位が４６．２±０．４ｍＶであった。本研究におけるＮＴ−Ｅｍｐｔｙ−ＮＰは、平均直径が７２．８±１．７ｎｍであり、ゼータ電位が−１６．１±０．４ｍＶであった。注射後、動物を１４日間監視した。血液を、静脈穿刺を介して７日目および１４日目に収集し、全血球算定分析のために、抗凝固剤コーティングチューブ内に保存した。また、血液サンプルを別個のチューブ内に収集し、血清を血清化学パネル分析のために単離した。動物を１４日目に安楽死させ、脾臓、腎臓、肝臓、心臓、肺、および脳を取り出し、余材をきれいにした。肝臓サンプルおよび脳サンプルを、１０％緩衝ホルマリン中で固定した。非臨床的全身毒性研究中に神経系をサンプリングかつプロセシングするために、十分に固定した肝臓の切片および脳の片側切片を、Ｂｏｌｏｎらによって記載されるようにサンプリングした。サンプルをルーチン的にプロセシングし、パラフィンに包埋してから、４μｍの切片を、ヘマトキシリン（Ｈ）およびエオシン（Ｅ）で染色した。
【０１３６】
ＴＢＩブタモデルにおけるＴ−ＣｏＱ１０およびプレドニゾンＮＰならびにＮＴ−ＣｏＱ１０およびプレドニゾンＮＰの抗炎症特性および抗酸化特性。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅの子豚（４週齢、群あたり３頭）を、イソフルランを用いて麻酔し、ＴＢＩを、先に述べたように誘導した。１時間後、１０ｍＬのナノピュア水およびＮＴＣｏＱ１０−ＮＰ（ＣｏＱ１０に関して５ｍｇ／ｋｇ）中に一緒に混合したＴ−ＣｏＱ１０−ＮＰ（ＣｏＱ１０に関して５ｍｇ／ｋｇ）およびＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ（プレドニゾンに関して５ｍｇ／ｋｇ）；１０ｍＬのナノピュア水中に一緒に混合したＮＴ−Ｐｒｅｄ−ＮＰ（プレドニゾンに関して５ｍｇ／ｋｇ）；ならびに生理食塩水を、耳静脈中に入れた静脈内カテーテルを介して１０分にわたって投与した。４８時間後、５％気化イソフルランを酸素と共に用いて、外科手術用マスクを利用して子豚を深く麻酔し、その後ＣＯ２吸入を介して安楽死させた。安楽死の後、子豚を断首して脳を取り出し、切断した。脳サンプル（約２００ｍｇのサイズ）を、ＲＯＳ検出のために単離し、急速凍結し、−８０℃で保存した。全冠状脳切片を、組織学的分析のために１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。２’７’−ジクロロフルオレセインジアセテートを用いてＲＯＳ検出を実行するために、脳組織サンプルを、先に記載した方法に従ってプロセシングした。１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した冠状脳切片を、組織学的分析のためにルーチン的にプロセシングし、パラフィンに包埋し、おおよそ５μｍに切片化し、スライドガラス上に乗せ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１３７】
このように、脳内に蓄積する治療用ナノ粒子の実施形態が開示される。当業者であれば、本明細書中に記載されるナノ粒子および方法が、開示される実施形態以外の実施形態で実行され得ることを理解するであろう。開示された実施形態は、限定ではなく説明の目的で示されている。
【図１Ａ】
2017530941.tif 000013
【図１Ｂ】
2017530941.tif 000014
【図２Ａ】
2017530941.tif 000015
【図２Ｂ】
2017530941.tif 000016
【図２Ｃ】
2017530941.tif 000017
【図３Ａ】
2017530941.tif 000018
【図３Ｂ】
2017530941.tif 000019
【図４Ａ】
2017530941.tif 000020
【図４Ｂ】
2017530941.tif 000021
【図４Ｃ】
2017530941.tif 000022
【図４Ｄ】
2017530941.tif 000023
【図５Ａ−Ｂ】
2017530941.tif 000024
【図５Ｃ】
2017530941.tif 000025
【図６Ａ−Ｂ】
2017530941.tif 000026
【図６Ｃ】
2017530941.tif 000027
【図７Ａ】
2017530941.tif 000028
【図７Ｂ】
2017530941.tif 000029
【図８】
2017530941.tif 000030
【図９】
2017530941.tif 000031
【図１０】
2017530941.tif 000032
【図１１】
2017530941.tif 000033
【図１２】
2017530941.tif 000034
【図１３Ａ】
2017530941.tif 000035
【図１３Ｂ】
2017530941.tif 000036
【図１３Ｃ】
2017530941.tif 000037
【図１３Ｄ】
2017530941.tif 000038
【図１３Ｅ】
2017530941.tif 000039
【図１３Ｆ】
2017530941.tif 000040
【図１４】
2017530941.tif 000041
【図１５】
2017530941.tif 000042
【図１６Ａ】
2017530941.tif 000043
【図１６Ｂ】
2017530941.tif 000044
【図１７】
2017530941.tif 000045
【図１８】
2017530941.tif 000046
【図１９】
2017530941.tif 000047
【図２０Ａ】
2017530941.tif 000048
【図２０Ｂ】
2017530941.tif 000049
【図２０Ｃ】
2017530941.tif 000050
【図２１Ａ】
2017530941.tif 000051
【図２１Ｂ】
2017530941.tif 000052
【国際調査報告】
2017530941.tif 000053
2017530941.tif 000054