(57)【要約】  本発明は、Imp1及びHis3の置換、リシンの側鎖に共有結合している3〜10個の負電荷部分を有する置換基を含むグルカゴン類似体の誘導体、並びにその中間体及び組成物、並びに医薬品におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
(式中、
X2は、Ser又はAibであり、
X10は、Tyr、Leu、Ile又はValであり、
X12は、Lys又はArgであり、
X15は、Asp又はGluであり、
X16は、Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val又はLysであり、
X20は、Gln、Glu、Aib又はLysであり、
X21は、Asp、Glu又はLysであり、
X24は、Gln、Ala、Glu、Aib又はLysであり、
X27は、Met、Leu又はValであり、
X28は、Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu又はLysであり、
X29は、Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu又はLysであり、
X30は、非存在であるか又はLysである)
を含むグルカゴン類似体の誘導体であって、前記誘導体は、式Iの位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の窒素原子に共有結合する置換基を含み、前記置換基は、式II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
[式中、Y1は水素であるか又はC2〜6アシル基若しくはスクシノイル部分を表し、
式中、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、それぞれ非存在であるか又はそれぞれSer残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv及び式v:
【化１】
2017509603.tif 000087
(式中、式i、ii、iii、及びivはそれぞれ、立体化学L又はDを有する)
からなる群から選択されるアミノ酸残基を表す]
を有し、但し、前記置換基は、3〜10個の負電荷部分を有する、誘導体、又は前記誘導体の薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
【請求項２】
前記グルカゴン類似体が、グルカゴン(配列番号1)と比較した場合、前記グルカゴン類似体中に3〜15個のアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む、請求項1記載の誘導体。
【請求項３】
Y12が、前記誘導体の位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の前記窒素原子に結合している、請求項1又は2に記載の誘導体。
【請求項４】
前記置換基が、リシンの側鎖のイプシロン窒素原子に共有結合している、請求項1から3のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項５】
前記置換基が、位置X24においてリシンに結合している、請求項1から4のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項６】
前記置換基が、3、4、5、6、7、8、9又は10個の負電荷部分を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項７】
前記置換基が、3〜10、例えば3〜5又は4個の式iの残基を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項８】
前記置換基のY1がアセチル基である、請求項1から7のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項９】
前記置換基が、部分:
【化２】
2017509603.tif 000088
からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１０】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式1:
【化３】
2017509603.tif 000089
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式2:
【化４】
2017509603.tif 000090
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式3:
【化５】
2017509603.tif 000091
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式4:
【化６】
2017509603.tif 000092
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式5:
【化７】
2017509603.tif 000093
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式6:
【化８】
2017509603.tif 000094
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式7:
【化９】
2017509603.tif 000095
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式8:
【化１０】
2017509603.tif 000096
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式9:
【化１１】
2017509603.tif 000097
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式10:
【化１２】
2017509603.tif 000098
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式11:
【化１３】
2017509603.tif 000099
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式12:
【化１４】
2017509603.tif 000100
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式13:
【化１５】
2017509603.tif 000101
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式14:
【化１６】
2017509603.tif 000102
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン
化学式15:
【化１７】
2017509603.tif 000103
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴニル)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]Lys
化学式16:
【化１８】
2017509603.tif 000104
Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]アセチル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式17:
【化１９】
2017509603.tif 000105
;Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式18:
【化２０】
2017509603.tif 000106
;Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式19:
【化２１】
2017509603.tif 000107
;Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式20:
【化２２】
2017509603.tif 000108
;Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式21:
【化２３】
2017509603.tif 000109
;及び
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
化学式22:
【化２４】
2017509603.tif 000110
からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１１】
本明細書に記載されるアッセイ(IV)により決定される場合、5%未満の化学分解を有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１２】
グルカゴン(配列番号1)と比較して以下の改変:
(i)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iii)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iv)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(v)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(viii)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ix)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(x)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xi)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xii)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiii)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(xv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン;
(xvi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-グルカゴン;
(xvii)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xviii)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xix)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
を含むグルカゴン類似体の形態の中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
【請求項１３】
請求項1から11のいずれか一項に記載の誘導体と、1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
【請求項１４】
医薬品において使用するための、請求項1から11のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１５】
低血糖症を処置及び/又は予防するための、請求項14に記載の誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルカゴン類似体の新規誘導体、及び低血糖症の処置などの医薬品におけるその使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴンは、インスリンの作用によって引き起こされる低血糖症を処置する際に有効であることが長く知られてきた。グルカゴンの高血糖効果は、肝グリコーゲンのグルコースへの分解(グリコーゲン分解)を刺激し、アミノ酸前駆体から誘導されるグルコース産生(糖新生)を増加させて肝臓由来のグルコース産生の増加をもたらす結果である。
【０００３】
重度の低血糖症を処置するための市販のグルカゴンは、凍結乾燥したグルカゴンを含むバイアルと、水を予め充填したディスポーザブルシリンジとからなるキットとして供給されている(Eli Lilly社及びNovo Nordisk社)。使用前に、グルカゴンは、グルカゴンを含むバイアルにシリンジから水を添加することにより、再溶解しなければならない。次いで、全てのグルカゴンが溶解するまでバイアルを穏やかに振とうしなければならず、得られた溶液をシリンジへと引き戻し、必要とするヒトへ注射しなければならない。重度の低血糖症事象では、患者は無意識か半無意識であり、したがって、グルカゴンを投与するために介助人に頼っている。
【０００４】
再溶解工程は、糖尿病患者の近縁者には煩わしいと考えられており、そのため重度の低血糖症事象の処置を遅延させるか又は妨げる場合さえあり得る。
【０００５】
充填済みの既製デバイスに対する主要な障害は、グルカゴンの本来の不安定性である。グルカゴンの溶液は、溶解後数時間以内にゲル又は線維を形成する。さらに、グルカゴンは、3〜9のpH範囲で本来低い溶解度を有する。グルカゴンは、いくつかの不安定なアミノ酸を含有し、グルカゴン組成物の化学的安定性は、主として脱アミド、異性化、酸化及び加水切断のために極めて不良である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2009/083549
【特許文献２】WO98/08871
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】IUPAC Table 1 section 3AA-1, http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/AA1n2.html#AA1
【非特許文献２】Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern.T.J.&Manning M.C., Plenum Press, New York 1992
【非特許文献３】Formulation Consideration for Proteins Susceptible to Asparagine Deamidation and Aspartate Isomerization, Wakankar and Borchardt, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006, Vol.95, no.11, p2321
【非特許文献４】Schmittschmitt and Scholtz, Protein Science, 12, 10, 2374-2378, 2003
【非特許文献５】Beaven et al, European J. Biochem. 11(1969)37-42
【非特許文献６】Remington's Pharmaceutical Science, 1985
【非特許文献７】Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995
【非特許文献８】Naiki et al.(1989) Anal.Biochem. 177, 244-249
【非特許文献９】LeVine(1999) Methods.Enzymol. 309, 274-284
【非特許文献１０】Nielsen et al.(2001) Biochemistry 40, 6036-6046
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
充填済みの既製デバイスの開発を可能にするために、新規非線維化グルカゴン類似体を開発する必要がある。さらに、溶液を室温でより長い期間維持できるようにするために、グルカゴンの化学的安定性の改善が求められる。さらに、このようなグルカゴン類似体は、皮下(SC)投与又は筋肉内(IM)投与後の早期作用開始(高血糖効果など)を有するべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態では、本発明は、式I:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
(式中、
X2は、Ser又はAibであり、
X10は、Tyr、Leu、Ile又はValであり、
X12は、Lys又はArgであり、
X15は、Asp又はGluであり、
X16は、Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val又はLysであり、
X20は、Gln、Glu、Aib又はLysであり、
X21は、Asp、Glu又はLysであり、
X24は、Gln、Ala、Glu、Aib又はLysであり、
X27は、Met、Leu又はValであり、
X28は、Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu又はLysであり、
X29は、Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu又はLysであり、
X30は、非存在であるか又はLysである)
を含むグルカゴン類似体の誘導体であって、前記誘導体は、式Iの位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の窒素原子に共有結合する置換基を含み、前記置換基は、式II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
[式中、Y1は水素であるか又はC2〜6アシル基若しくはスクシノイル部分を表し、式中、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、それぞれ非存在であるか又はそれぞれSer残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv及び式v:
【００１０】
【化１】
2017509603.tif 000002
【００１１】
(式中、式i、ii、iii、及びivはそれぞれ、立体化学L又はDを有する)
からなる群から選択されるアミノ酸残基を表す]
を有し、但し、前記置換基は、3〜10個の負電荷部分を有する、誘導体、又は前記誘導体の薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステルに関する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、グルカゴン(配列番号1)と比較して以下の改変:
(i)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iii)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iv)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(v)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(viii)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ix)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(x)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xi)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xii)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiii)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(xv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン;
(xvi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-グルカゴン
を含むグルカゴン類似体の形態の中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステルに関する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、本発明の誘導体と1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物に関する。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、医薬品において使用するための本発明により規定される誘導体に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一実施形態では、本発明は、グルカゴン類似体の新規早期作用誘導体、すなわち、投与後の生物学的作用の急速な開始が要求される場合に、例えば低血糖症の処置に使用され得るグルカゴン類似体の誘導体に関する。
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の誘導体が、溶液中で改善された化学安定性及び物理安定性を有する一方、ヒトグルカゴン受容体に対する良好な効力及び高血糖効果の早期開始を維持することを見出した。したがって、本発明の誘導体により、前記誘導体を含む液体組成物を、長期保存安定性を有する前記液体組成物とすることが可能になる。
【００１７】
誘導体は、1位にイミダゾプロピオニル(Imp)及び3位にヒスチジンのアミノ酸置換を含む。誘導体は、3〜10個の負電荷部分を有する置換基であって、リシンの側鎖の窒素原子などのアミノ酸の側鎖に共有結合している置換基を含む。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、式I:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
(式中、
X2は、Ser又はAibであり、
X10は、Tyr、Leu、Ile又はValであり、
X12は、Lys又はArgであり、
X15は、Asp又はGluであり、
X16は、Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val又はLysであり、
X20は、Gln、Glu、Aib又はLysであり、
X21は、Asp、Glu又はLysであり、
X24は、Gln、Ala、Glu、Aib又はLysであり、
X27は、Met、Leu又はValであり、
X28は、Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu又はLysであり、
X29は、Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu又はLysであり、
X30は、非存在であるか又はLysである)
を含むグルカゴン類似体の誘導体であって、前記誘導体は、式Iの位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の窒素原子に共有結合する置換基を含み、
前記置換基は、式II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
[式中、Y1は水素であるか又はC2〜6アシル基若しくはスクシノイル部分を表し、式中、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、それぞれ非存在であるか又はそれぞれSer残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv及び式v:
【００１９】
【化２】
2017509603.tif 000003
【００２０】
(式中、式i、ii、iii、及びivはそれぞれ、立体化学L又はDを有する)
からなる群から選択されるアミノ酸残基を表す]
を有し、
但し、前記置換基は、3〜10個の負電荷部分を有する、誘導体、又は前記誘導体の薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステルに関する。
【００２１】
一実施形態では、化学構造図中の記号「*」(又は代わりに波線)は、本明細書で使用される場合、誘導体において、隣接する位置への結合点を表す。
【００２２】
グルカゴンペプチド及び類似体
用語「グルカゴンペプチド」は、本明細書で使用される場合、ヒトグルカゴンを指し、その配列は、配列番号1、又はその類似体(例えば、式Iのグルカゴン類似体)として配列表に含まれている。配列番号1の配列を有するペプチドは、本明細書において「グルカゴン」と称されてもよい。一実施形態では、本明細書で使用される場合、用語「グルカゴン」は、His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(配列番号1)を指す。
【００２３】
本発明の誘導体は、グルカゴン類似体を含む。用語「グルカゴン類似体」は、本明細書で使用される場合、グルカゴン(配列番号1)の変異体であるペプチド、又は化合物を指す。一実施形態では、グルカゴン類似体は、式I:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
(式中、
X2は、Ser又はAibであり、
X10は、Tyr、Leu、Ile又はValであり、
X12は、Lys又はArgであり、
X15は、Asp又はGluであり、
X16は、Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val又はLysであり、
X20は、Gln、Glu、Aib又はLysであり、
X21は、Asp、Glu又はLysであり、
X24は、Gln、Ala、Glu、Aib又はLysであり、
X27は、Met、Leu又はValであり、
X28は、Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu又はLysであり、
X29は、Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu又はLysであり、
X30は、非存在であるか又はLysである)
を含む。
【００２４】
本発明の誘導体のグルカゴン類似体は、i)改変されるアミノ酸残基に相当するヒトグルカゴン(配列番号1)におけるアミノ酸残基(すなわち、グルカゴン(配列番号1)における相当する位置)の数、及びii)実際の改変を参照することによって記載されてよい。以下は、適切な類似体命名法の非限定例である。
【００２５】
言い換えれば、グルカゴン類似体は、ヒトグルカゴン(配列番号1)と比較した場合、いくつかのアミノ酸残基の改変を含むグルカゴンペプチドである。これらの改変は、独立して、1個又は複数のアミノ酸置換、付加、及び/又は欠失を表してよい。例えば、「[Imp1,His3,Glul5,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン」は、1位のアミノ酸がImpで置換され、3位のアミノ酸がHisで置換され、15位のアミノ酸がGluで置換され、24位のアミノ酸がLysで置換され、27位のアミノ酸がLeuで置換され、28位のアミノ酸がSerで置換されているグルカゴン(配列番号1)を示す。
【００２６】
所定の特定された変化を「含む」類似体は、配列番号1と比較した場合、さらなる変化を含んでよい。特定の実施形態では、類似体は、特定の変化を「有する」。
【００２７】
上記例から明らかであるように、アミノ酸残基は、そのフルネーム、その1文字コード、及び/又はその3文字コードによって特定されてよい。これら3つの方法は、十分に等価である。一実施形態では、ペプチド類似体及びその誘導体は、IUPAC-IUB命名法に従って標準の1文字コード又は3文字コードを使用して描かれる。
【００２８】
表現「位置」又は「相当する位置」は、グルカゴン(配列番号1)を参照してグルカゴン類似体配列における変化の部位を特徴付けるのに使用することができる。変化の位置、並びに数は、例えば、簡単な手書き及び視認によって、容易に推測される。
【００２９】
例えば、本発明の誘導体のグルカゴン類似体の文脈で使用される場合、用語「ペプチド」は、アミド(又はペプチド)結合によって相互に連結する一連のアミノ酸を含む化合物を指す。本発明のペプチドは、ペプチド結合によって連結される少なくとも5つの構成アミノ酸を含む。特定の実施形態では、ペプチドは、i)29又はii)30個のアミノ酸から構成されるa)、又はそれらからなるb)。またさらに特定の実施形態では、ペプチドは、ペプチド結合によって相互に連結するアミノ酸からなる。
【００３０】
アミノ酸は、アミノ基及びカルボン酸基、並びに場合によっては、側鎖と称されることも多い1種又は複数の付加基を含有する分子である。用語「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、コード化アミノ酸(これら20種の標準的なアミノ酸の中で)、並びに非コード化アミノ酸を含む。コード化アミノ酸は、遺伝情報によりコード化されるものである(IUPAC Table 1 section 3AA-1, http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/AA1n2.html#AA1)。非コード化アミノ酸は、天然ペプチド及び/若しくはタンパク質のいずれにも見出されず、又は標準の細胞装置により産生されない(例えば、それらは翻訳後修飾を受けていてもよい)。非コード化アミノ酸の非現定例は、Aib(アルファアミノイソ酪酸)、デス-アミノ-ヒスチジン(代替名イミダゾプロピオン酸、略称Imp)、並びにコード化アミノ酸のD-異性体である。ここで、Impは、アミノ基を含有していないが、アミノ酸と称される。
【００３１】
以下、光学異性体が明言されていないグルカゴンペプチドのアミノ酸の全ては、(他に特定されていなければ)L-異性体を意味するものと理解されるべきである。
【００３２】
グルカゴンペプチドは、グルカゴンと比較した場合、合計15個までのアミノ酸差異(ここでは改変とも称される)、例えば1種若しくは複数の付加、1種若しくは複数の欠失及び/又は1種又は複数の置換を有するグルカゴン類似体(配列番号1)であってよい。
【００３３】
一実施形態では、グルカゴン類似体は、式Iからなる。一実施形態では、X2はSerである。一実施形態では、X10はTyrである。一実施形態では、X12はLysである。一実施形態では、X15はAspである。一実施形態では、X16はSerである。一実施形態では、X20はGlnである。一実施形態では、X21はAspである。一実施形態では、X24はGlnである。一実施形態では、X27はMetである。一実施形態では、X28はAsnである。一実施形態では、X29はThrである。一実施形態では、X30は非存在である。一実施形態では、X2はAibである。一実施形態では、X10はLeuである。一実施形態では、X15はGluである。一実施形態では、X16はLeuである。一実施形態では、X16はValである。一実施形態では、X20はLysである。一実施形態では、X21はGluである。一実施形態では、X24はLysである。一実施形態では、X24はAlaである。一実施形態では、X27はLeuである。一実施形態では、X28はSerである。一実施形態では、X28はLysである。一実施形態では、X29はLysである。一実施形態では、グルカゴン類似体は、C-末端アミドを含まない。一実施形態では、グルカゴン類似体又は誘導体は、X30のC-末端に付加されるアミノ酸残基を含まない。
【００３４】
一実施形態では、グルカゴン類似体は、グルカゴン(配列番号1)と比較した前記グルカゴン類似体において、3〜15個のアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む。一実施形態では、グルカゴン類似体は、グルカゴン(配列番号1)と比較した場合、3〜15個のアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む。一実施形態では、誘導体は、グルカゴン(配列番号1)と比較した前記グルカゴン類似体において、14個までの、例えば13個までの又は12個までのアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む。一実施形態では、グルカゴン類似体は、グルカゴン(配列番号1)と比較した前記グルカゴン類似体において、11個までの、例えば10個までの又は9個までのアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む。一実施形態では、グルカゴン類似体は、グルカゴン(配列番号1)と比較した前記グルカゴン類似体において、8個までの、例えば7個までの又は6個までのアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む。
【００３５】
グルカゴン誘導体
本発明は、グルカゴン類似体の誘導体に関する。用語「誘導体」は、グルカゴン類似体などのグルカゴンペプチドの文脈において本明細書で使用される場合、1個又は複数の置換基がグルカゴンペプチドに共有結合した化学的に改変されたグルカゴンペプチドを意味する。用語「置換基」は、本明細書で使用される場合、水素原子を置き換える化学部分又は基を意味する。誘導体は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステルなどから選択される1つ又は複数の改変を含んでよい。
【００３６】
一実施形態では、誘導体は、式Iの位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の窒素原子に共有結合する置換基を含む。一実施形態では、置換基は、式II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
[式中、Y1は水素であるか又はC2〜6アシル基若しくはスクシノイル部分を表し、式中、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、それぞれ非存在であるか又はそれぞれSer残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv及び式v:
【００３７】
【化３】
2017509603.tif 000004
【００３８】
(式中、式i、ii、iii、及びivはそれぞれ、立体化学L又はDを有する)
からなる群から選択されるアミノ酸残基を表す]
を有する。
【００３９】
一実施形態では、Y12は、誘導体の位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の窒素原子に結合している。一実施形態では、置換基は、リシンの側鎖のイプシロン窒素原子に共有結合している。一実施形態では、置換基は、位置X12、X16又はX20でリシンに結合している。一実施形態では、置換基は、位置X21、X24又はX28でリシンに結合している。一実施形態では、置換基は、位置X29又はX30でリシンに結合している。一実施形態では、置換基は、位置X24でリシンに結合している。置換基は、Y12を介して、リシンの側鎖のイプシロン窒素原子に共有結合していてよい。置換基は、Y12を介して、位置X12、X16又はX20でリシンに結合していてよい。置換基は、Y12を介して、位置X21、X24又はX28でリシンに結合していてよい。置換基は、Y12を介して、位置X29又はX30でリシンに結合していてよい。置換基は、Y12を介して、位置X24でリシンに結合していてよい。
【００４０】
一実施形態では、Y1は水素であるか又はC2〜6アシル基若しくはスクシノイル部分を表す。用語「C2〜6アシル基」は、本明細書で使用される場合、
【００４１】
【化４】
2017509603.tif 000005
【００４２】
などの2〜6個の炭素原子を有する分岐状又は非分岐状のアシル基を指す。一実施形態では、Y1はアセチル基である。用語「スクシノイル」は、本明細書で使用される場合、以下の部分
【００４３】
【化５】
2017509603.tif 000006
【００４４】
を指す。一実施形態では、Y1はスクシノイル部分である。一実施形態では、Y1は水素である。
【００４５】
一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11及びY12は、存在する場合、アミド結合を介して連結されている。一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、非存在である。一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、Ser残基である。一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、Ala残基である。一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、Gly残基である。一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、式iである。一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、式iiである。一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、式iiiである。一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、式ivである。一実施形態では、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、式vである。一実施形態では、置換基は、3〜10、例えば3〜5又は4個の式iの残基を含む。
【００４６】
一実施形態では、置換基は、3〜10個の負電荷部分を有する。一実施形態では、置換基は、3、4、5、6、7、8、9又は10個の負電荷部分を有する。一実施形態では、置換基は、3〜10個の負電荷部分を有する。一実施形態では、置換基は、3〜10、例えば3〜7又は3〜5個の負電荷部分を有する。用語「負電荷部分」は、本明細書で使用される場合、負電荷となり得る化学部分、例えば、限定されないが、アミノ酸部分(例えば、Glu、ガンマGlu、Asp又はベータAsp、カルボン酸、スルホン酸又はテトラゾール部分)を意味する。一実施形態では、「負電荷部分」の数は、生理学的pH(pH7.4)で決定される。一実施形態では、「負電荷部分」はカルボン酸基である。
【００４７】
一実施形態では、置換基は、部分
【００４８】
【化６】
2017509603.tif 000007
【００４９】
である。
【００５０】
一実施形態では、置換基は、部分
【００５１】
【化７】
2017509603.tif 000008
【００５２】
である。
【００５３】
一実施形態では、置換基は、部分
【００５４】
【化８】
2017509603.tif 000009
【００５５】
である。一実施形態では、置換基は、部分
【００５６】
【化９】
2017509603.tif 000010
【００５７】
である。
【００５８】
一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式1:
【００５９】
【化１０】
2017509603.tif 000011
【００６０】
である。
【００６１】
一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式2:
【００６２】
【化１１】
2017509603.tif 000012
【００６３】
である。
【００６４】
一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式3:
【００６５】
【化１２】
2017509603.tif 000013
【００６６】
である。
【００６７】
一実施形態では、誘導体はNε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式4:
【００６８】
【化１３】
2017509603.tif 000014
【００６９】
である。
【００７０】
一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式5:
【００７１】
【化１４】
2017509603.tif 000015
【００７２】
である。
【００７３】
一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式6:
【００７４】
【化１５】
2017509603.tif 000016
【００７５】
である。
【００７６】
一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式7:
【００７７】
【化１６】
2017509603.tif 000017
【００７８】
である。
【００７９】
一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式8:
【００８０】
【化１７】
2017509603.tif 000018
【００８１】
である。
【００８２】
一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式9:
【００８３】
【化１８】
2017509603.tif 000019
【００８４】
である。
【００８５】
一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式10:
【００８６】
【化１９】
2017509603.tif 000020
【００８７】
である。一実施形態では、誘導体はNε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式11:
【００８８】
【化２０】
2017509603.tif 000021
【００８９】
である。一実施形態では、誘導体はNε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式12:
【００９０】
【化２１】
2017509603.tif 000022
【００９１】
である。一実施形態では、誘導体はNε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式13:
【００９２】
【化２２】
2017509603.tif 000023
【００９３】
である。一実施形態では、誘導体はNε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式14:
【００９４】
【化２３】
2017509603.tif 000024
【００９５】
である。一実施形態では、誘導体はNε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン
化学式15:
【００９６】
【化２４】
2017509603.tif 000025
【００９７】
である。一実施形態では、誘導体はNα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴニル)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]Lys
化学式16:
【００９８】
【化２５】
2017509603.tif 000026
【００９９】
である。一実施形態では、誘導体はNε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]アセチル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式17:
【０１００】
【化２６】
2017509603.tif 000027
【０１０１】
である。一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式18:
【０１０２】
【化２７】
2017509603.tif 000028
【０１０３】
である。一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式19:
【０１０４】
【化２８】
2017509603.tif 000029
【０１０５】
である。一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式20:
【０１０６】
【化２９】
2017509603.tif 000030
【０１０７】
である。一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式21:
【０１０８】
【化３０】
2017509603.tif 000031
【０１０９】
である。一実施形態では、誘導体はNε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
化学式22:
【０１１０】
【化３１】
2017509603.tif 000032
【０１１１】
である。
【０１１２】
薬学的に許容される塩、アミド、エステル又はカルボン酸
本発明の誘導体、類似体、及び中間生成物は、薬学的に許容される塩、アミド、カルボン酸又はエステルの形態で存在してよい。塩は、例えば、塩基と酸の間の化学反応、例えば、2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4により形成される。塩は、塩基性塩、酸性塩であってもよく、又はどちらでもない場合もある(すなわち、中性塩)。塩基性塩は、水中で水酸化物イオンを生成し、酸性塩は、ヒドロニウムイオンを生成する。一実施形態では、誘導体は、前記誘導体の薬学的に許容される塩、アミド、又はエステルである。
【０１１３】
本発明の誘導体の塩は、それぞれ、アニオン基間に付加されたカチオン、又はカチオン基間に付加されたアニオンで形成されてよい。これらの基は、グルカゴン類似体部分に、及び/又は本発明の誘導体の置換基に位置してもよい。
【０１１４】
本発明の誘導体のアニオン基の非現定例は、置換基において、並びに存在する場合、グルカゴン類似体部分において、遊離のカルボン酸基を含む。グルカゴン類似体部分は、C末端に遊離のカルボン酸基を含むことが多く、Asp及びGluなどの体内の酸性アミノ酸残基において遊離のカルボン酸基を含んでもよい。
【０１１５】
グルカゴン類似体部分におけるカチオン基の非現定例は、His、Arg、及びLysなどの体内の塩基性アミノ酸残基の任意の遊離のアミノ基を含む。
【０１１６】
本発明の誘導体のエステルは、例えば、少なくとも1つの水酸基をアルコキシ基又はアリールオキシ基で置き換えさせる、遊離のカルボン酸基とアルコール又はフェノールとの反応により形成されてよい。
【０１１７】
エステル形成は、グルカゴン類似体のC末端における遊離のカルボン酸基、及び/又は置換基における任意の遊離のカルボン酸基に関与してよい。
【０１１８】
本発明の誘導体のアミドは、例えば、遊離のカルボン酸基とアミン若しくは置換アミンとの反応により、又は遊離のアミノ基若しくは置換アミノ基とカルボン酸との反応により形成されてよい。
【０１１９】
アミド形成は、グルカゴン類似体のC末端における遊離のカルボン酸基、置換基における任意の遊離のカルボン酸基、グルカゴン類似体のN末端における遊離のアミノ基、並びに/又はグルカゴン類似体及び/若しくは置換基の任意の遊離のアミノ基若しくは置換アミノ基に関与してよい。一実施形態では、誘導体は、グルカゴン類似体のC末端アミドを含まない。
【０１２０】
一実施形態では、他に述べられていなければ、本発明の誘導体は、C末端カルボン酸基を含む。一実施形態では、本発明は、誘導体の薬学的に許容される塩、アミド又はエステルに関する。用語「薬学的に許容される塩」は、患者に有害でない塩を示すことを意図する。一実施形態では、誘導体は、薬学的に許容される塩の形態で存在する。一実施形態では、誘導体のカルボン酸は、グルカゴン類似体のC末端においてアミド基を含む誘導体、すなわちグルカゴン類似体である。別の特定の実施形態では、誘導体は、好ましくは、グルカゴン類似体のC末端にアミド基を有する薬学的に許容されるアミドの形態で存在する。またさらに特定の実施形態では、グルカゴン類似体又は誘導体は、薬学的に許容されるエステルの形態で存在する。
【０１２１】
グルカゴンペプチドの誘導体の調製
本発明の誘導体は、以下に記載された方法により調製されてよい。
【０１２２】
SPPSの一般法
使用されるべきFmoc-保護アミノ酸誘導体は、推奨される標準であってよい:例えば、Anaspec、Bachem、Iris Biotech、又はNovabioChemから供給されるFmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH及びFmoc-Lys(Mtt)-OH。3-(N-1-トリチル-イミダゾール-4-イル)-プロピオン酸は、Impを組み込むために使用される。
【０１２３】
SPPSは、Protein Technologies(Tucson, AZ 85714 U.S.A.)からのPrelude固相ペプチド合成装置にFmocベースの化学構造を使用して実施されてよい。C末端カルボン酸の調製のための適切な樹脂は、Fmoc-Thr(tBu)-Wang樹脂(Low Load、0.35mmol/g)などのアミノ酸で前処置されたWang樹脂である。置換基がC末端リシンに結合する場合、適切な樹脂は、前処置されたfmoc-Lys(Mtt)-Wangである。C末端ペプチドアミドの調製のための適切な樹脂は、H-Rink Amide-ChemMatrix樹脂(ローディング、例えば0.52nmol/g)又はRink Amide AMポリスチレン樹脂(Novabiochem、ローディング、例えば0.62mmol/g)などである。Fmoc脱保護は、NMP中20%ピペリジンで達成される。ペプチドカップリングは、予備活性化なしでDIC/HOAt/コリジン又はDIC/Oxyma Pure/コリジンのいずれかを使用することによって実施される。アミノ酸/HOAt又はアミノ酸/Oxyma Pure溶液(3〜10倍の過剰なモル濃度でNMP中0.3M/0.3M)、続いて同じモル当量のDIC(NMP中3M)、続いてコリジン(NMP中3M)を樹脂に添加する。例えば、以下のスケール反応に対して、カップリング毎に以下の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液が使用され得る:スケール/mL、0.05mmol/1.5mL、0.10mmol/3.0mL、0.25mmol/7.5mL。Mtt基は、樹脂をHFIP/DCM(75:25)(2×2分)で洗浄し、DCMで洗浄し、樹脂をHFIP/DCM(75:25)(2×20分)中に懸濁して次にピペリジン/NMP(20:80)、DCM(1×)、NMP(1×)、DCM(1×)、NMP(1×)で順に洗浄することにより、取り除かれてよい。
【０１２４】
置換基の結合
適切に保護された構成要素を使用して、上記の通り、Preludeペプチド合成装置により段階的手順で置換基が導入され、これは、アミノ酸並びにFmoc-Ado-OH、Fmoc-Glu-OtBu及び酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸又は4-メチルペンタン酸を含むカルボン酸誘導体の改変を伴う。各カップリング工程の後に、未反応のペプチド中間体は、過剰(10当量超)の無水酢酸及びコリジンを使用してキャッピングされ得る。
【０１２５】
リシンのイプシロン窒素における置換基の導入は、Mtt(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)で保護されたリシンを使用して達成される。あるいは、リシンのイプシロン窒素は、ivDde基(Fmoc-Lys(ivDde)-OH)で保護され得る。置換基におけるガンマ-Glu部分の導入は、アミノ酸Fmoc-Glu-OtBuでカップリングすることによって達成されてよい。
【０１２６】
置換基における各部分の導入は、延長したカップリング時間(1×6時間)を使用して達成され、続いて、無水酢酸又は代わりに酢酸/DIC/HOAt/コリジンでキャッピングされ得る。置換基の末端窒素のアセチル化は、NMP中の無水酢酸(10当量)及びコリジン(20当量)を使用して達成される。
【０１２７】
樹脂からの切断
合成後に、樹脂はDCMで洗浄され、ペプチドは、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)を用いて2〜3時間処理することにより、樹脂から切断され、続いてジエチルエーテルで沈殿させられる。沈殿物は、ジエチルエーテルで洗浄される。
【０１２８】
精製及び定量化
粗製のペプチドは、水/MeCN(4:1)などの水及びMeCNの適切な混合液に溶解され、C18-シリカゲルを含有するカラムで逆相分取HPLC(Waters社製のDeltaprep 4000又はGilson)により精製される。溶出は、0.1%のTFAを含有する水中でMeCNの勾配を上昇させて実施される。関連する画分は、分析HPLC又はUPLCにより確認される。純粋な標的ペプチドを含有する画分は混合され、減圧下で濃縮される。得られた溶液は分析され(HPLC、LCMS)、生成物(すなわち、誘導体)は化学発光窒素特異的HPLC検出器(Antek 8060 HPLC-CLND)を使用して、又は280nmでUV吸光を測定することによって定量化される。生成物は、ガラスバイアルに分注される。バイアルは、Millipore社製のグラスファイバープレフィルターで栓をする。凍結乾燥により、白色固体としてトリフルオロ酢酸塩型ペプチドが得られる。
【０１２９】
中間生成物
一実施形態では、本発明は、グルカゴン(配列番号1)と比較した場合、以下の改変:
(i)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iii)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iv)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(v)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(viii)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ix)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(x)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xi)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xii)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiii)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(xv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン;
(xvi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-グルカゴン
を含むグルカゴン類似体の形態の中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステルに関する。一実施形態では、本発明は、グルカゴン(配列番号1)と比較した場合、以下の改変:
(xvii)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xviii)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xix)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
を含むグルカゴン類似体の形態の中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステルに関する。
【０１３０】
一実施形態では、本発明は、中間生成物であって、グルカゴン類似体が以下のグルカゴン(配列番号1)の類似体:
(i-a)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ii-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iii-a)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iv-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(v-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vi-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vii-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(viii-a)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ix-a)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(x-a)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xi-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xii-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiii-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiv-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(xv-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン;
(xvi-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
から選択される中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステルに関する。一実施形態では、本発明は、中間生成物であって、グルカゴン類似体が以下のグルカゴン(配列番号1)の類似体:
(xvii-a)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xviii-a)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xix-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
から選択される中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド若しくはエステルに関する。
【０１３１】
本発明のグルカゴン誘導体は、(i)中間体グルカゴン類似体の調製とそれに続く(ii)置換基の結合を含む、以下の段階的な合成方法によって調製されてよい。この方法の工程(i)は、保護されたアミノ酸を使用する実験の項で記載された標準の固相合成を使用して達成することができ、樹脂からの切断後に、グルカゴン類似体が、本明細書において実験の項で記載された分取HPLCを使用して精製に供されて中間生成物を得ることができる。あるいは、この方法の工程(i)、すなわち中間生成物の調製は、WO2009/083549に記載された半組換え合成を使用して行われ得る。この方法の工程(ii)、すなわち、最終生成物へ導く置換基の中間生成物への結合、並びに置換基自体の調製は、WO2009/083549に記載された方法を使用して達成され得る。
【０１３２】
機能特性
第1の機能的実施形態では、本発明の誘導体は化学的に安定である。また、又はあるいは、第2の機能的実施形態では、誘導体は物理的に安定である。また、又はあるいは、第3の機能的実施形態では、誘導体は、グルカゴン受容体に良好な受容体結合能を有する。また、又はあるいは、第4の機能的実施形態では、誘導体は、速効性の誘導体である。また、又はあるいは、第4の機能的実施形態では、誘導体は、高い溶解度を有する。また、又はあるいは、第6の機能的実施形態では、誘導体は、GLP-1受容体におけるそのEC50とグルカゴン受容体におけるそのEC50の間の高比率[又はヒトグルカゴン(配列番号1)のものと等しい比率]を有する。一実施形態では、機能的実施形態における効果は、ヒトグルカゴン(配列番号1)に対して決定される。
【０１３３】
化学的安定性
ペプチド組成物の「化学的安定性」という用語は、本明細書で使用される場合、天然のペプチド(例えば、ヒトグルカゴン)の構造と比較して、ポテンシャルの低い生物学的能力及び/又はポテンシャルの上昇した免疫学的特性を有する化学分解生成物の形成を導くペプチド構造における化学的共有結合の変化を指す。様々な化学分解生成物が、天然のペプチドの種類及び性質、並びにペプチドが曝される環境によって形成され得る。化学分解は、ほとんどの場合完全には避けることができず、化学分解生成物の量の増加は、長期の保存の間にみられることが多い。ほとんどのペプチドは、脱アミド化する傾向にあり、そのプロセスにおいて、グルタミニル残基又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基は加水分解され、遊離のカルボン酸を形成する。他の分解経路は、2つ以上のペプチド分子が、アミド基転移及び/又はジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合して共有結合した二量体、オリゴマー及びポリマー分解生成物の形成を導く高分子量形質転換生成物の形成に関与する(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern.T.J.&Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。酸化(例えば、メチオニン残基の)は化学分解の別の変形として述べることができる。アスパラギン又はアスパラギン酸を含有するペプチドは、D-異性体及びL-異性体の両方が形成され得る相当するイソアスパラギン酸異性体に生じる中間体のアスパルチミドの形成を介して異性体化する傾向にあってよい。アスパルチミド中間体はD-アスパラギン酸異性体の形成を導く場合もある。(Formulation Consideration for Proteins Susceptible to Asparagine Deamidation and Aspartate Isomerization, Wakankar and Borchardt, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006, Vol.95, no.11, p2321)。最後に、ペプチドは、ペプチド断片又は単一のアミノ酸がペプチド結合の加水分解により切断される加水切断を受けてもよい。
【０１３４】
組成物の化学的安定性は、異なる環境条件に曝露した後に様々な時点で化学分解生成物の量を測定することによって評価され得る(分解生成物の形成は、例えば温度の上昇により加速され得ることが多い)。それぞれ別の分解生成物の量は、種々のクロマトグラフィー技術(例えば、SE-HPLC及び/又はRP-UPLC)を使用して、分子のサイズ及び/又は電荷によって分解生成物を分離することにより決定されることが多い。
【０１３５】
したがって、上で概説したように、「安定化した組成物」は、上昇した物理的安定性、上昇した化学的安定性又は上昇した物理化学的安定性を有する組成物を指す。一般に、組成物は、使用期限に到達するまで、使用及び保存の間(推奨される使用条件及び保存条件に従って)安定でなければならない。
【０１３６】
誘導体の化学的安定性は、本明細書に記載されるアッセイ(IV)における化学分解率の決定により測定してよい。一実施形態では、化学的に安定な誘導体は、5%未満、例えば4%未満、3%未満又は2%未満の化学分解率を有し、ここで、前記化学分解率は本明細書に記載されるアッセイ(IV)によって決定されてよい。一実施形態では、誘導体は、5%未満、例えば4%未満、3%未満又は2%未満の化学分解率を有し、ここで、前記化学分解率は本明細書に記載されるアッセイ(IV)によって決定されてよい。
【０１３７】
物理的安定性
ペプチドは、物理的状態の様々な変化を受ける可能性がある。例えば、pHの変化によるアミノ酸側鎖における電荷を排斥する中和により、ある特定の一連の条件で溶解度が不足してペプチドが沈殿する場合がある。別の物理的変化は、アミロイド線維の形成であり、これは、ベータシートに富む高分子線維構造への立体構造の変化に関与する。他の高分子構造は、凝集による体系的な構造の繰り返しの減少により形成されてよい。2つの後者の例では、ペプチド物質は、最終的に沈殿物として観察されてよい。実際に、これらの物理的変化は、ある程度まで相互に関連し、例えば、溶解度対pH、線維形成に関連する[Schmittschmitt and Scholtz, Protein Science, 12, 10, 2374-2378, 2003]。さらに、これらの現象を目視検査のみによって区別することは非常に困難であり、したがって、これらの変化の結果は、一般用語「沈殿」と記載されることが多い。
【０１３８】
物理的状態の他の変化には、溶液からのペプチドの含有量の減少として観察される表面への吸着、及び液体溶液からゲルへの変化が含まれる。それにもかかわらず、ゲルの性質又は形成に関係なく、沈殿の観察は、その保存中及び使用時間に注射可能な医薬においての課題である。
【０１３９】
グルカゴンは、中性のpHで非常に低い水溶性を有し、このことにより、中性pHで医薬組成物の効力が損なわれる。酸性のpHで溶解された場合でさえ、グルカゴンは、濃度及び温度に依存する様々な相転移を受ける場合があり、したがって、物理的に非常に不安定である。グルカゴンの試料を塩酸に溶解した後、試料の粘度が低く、溶液が充分に透明である場合、遅滞期が生じ得る。数時間後、粘度が増加し始め、これはゲル形成の指標となる(Beaven et al, European J. Biochem. 11(1969)37-42)。プラトーに到達した後、粘度は再び下降し、同時に線維が出現し、溶液から沈殿する場合がある。プロセスを見ることができ、少量の予備形成されたゲルを添加することにより遅滞相が減少される。ゲルの形成及び線維化は、加熱及び振とうなどの物理的ストレスに非常に依存し、両者ともにプロセスの速度を加速させる。
【０１４０】
組成物の「物理的安定性」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド及び/又はタンパク質を熱機械的ストレス及び/又は不安定化されている界面及び表面、例えば、疎水性の表面及び界面との相互作用に曝露した結果として、ペプチド及び/又はタンパク質の生物学的に不活性な及び/又は不溶性の凝集物を形成する、ペプチド及び/又はタンパク質の傾向を指す。水性ペプチド及び/又はタンパク質組成物の物理的安定性は、適切な容器(例えば、カートリッジ又はバイアル)に充填された組成物を、異なる温度で、様々な期間機械的/物理的ストレス(例えば、攪拌)に曝した後に、目視検査及び/又は濁度の測定を行うことにより評価される。組成物の目視検査は、暗視野でしっかり光を絞り込んで実施される。組成物の濁度は、例えば、0〜3のスケールで濁度の度合いをランク付けする視覚スコアで特徴付けられる(濁度を示さない組成物は、視覚スコア0に相当し、日中目に見える濁度を示す組成物は視覚スコア3に相当する)。組成物は、日中目に見える濁度を示す場合、タンパク質凝集に関して物理的に不安定と分類される。あるいは、組成物の濁度は、当業者に周知の簡単な濁度測定法により評価され得る。水性ペプチド及び/又はタンパク質組成物の物理的安定性はまた、ペプチド及び/又はタンパク質の立体構造の状態について、分光学的作用物質又はプローブを使用して評価され得る。プローブは、好ましくは、ペプチド及び/又はタンパク質の非天然の配座異性体に優先的に結合する小分子である。ペプチド及び/又はタンパク質構造の小分子分光学的プローブの一例は、チオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイド線維の検出に広く使用されてきた蛍光色素である。線維、及びおそらく、同様に他のペプチド及び/又はタンパク質の立体配置の存在下で、チオフラビンTは、線維ペプチド及び/又はタンパク質形態に結合した場合に、約450nmで新たな最大励起と約482nmで増加した発光を生じさせる。非結合チオフラビンTはこれらの波長で本質的に非蛍光である。
【０１４１】
他の小分子は、ペプチド及び/又はタンパク質構造における天然から非天然状態への変化のプローブとして使用され得る。例えば、「疎水性パッチ」のプローブは、ペプチド及び/又はタンパク質の曝露された疎水性パッチに優先的に結合する。疎水性パッチは、一般に、その天然の状態で、ペプチド及び/又はタンパク質の三次構造内に埋め込まれるが、ペプチド及び/又はタンパク質がアンフォールド又は変性し始めると曝露されるようになる。これらの小分子、すなわち分光学的プローブの例は、芳香族の疎水性の色素、例えば、アントラセン、アクリジン、フェナントロリンなどである。
【０１４２】
誘導体の物理的安定性は、本明細書に記載されるアッセイ(III)、すなわちThT線維化アッセイにおける回復率及び/又は遅滞時間によって決定されてよい。一実施形態では、物理的に安定な誘導体は、本明細書に記載されるアッセイ(III)において、70%超の回復率及び/又は7時間超の遅滞時間を有する。
【０１４３】
一実施形態では、誘導体は、本明細書に記載されるThT線維化アッセイ、例えばアッセイ(III)において、70%超の回復率を有する。一実施形態では、誘導体は、本明細書に記載されるThT線維化アッセイ、例えばアッセイ(III)において、90%超、例えば95%超又は98%超の回復率を有する。一実施形態では、誘導体は、本明細書に記載されるThT線維化アッセイ、例えばアッセイ(III)において、約100%の回復率を有する。
【０１４４】
一実施形態では、誘導体は、本明細書に記載されるThT線維化アッセイ、例えばアッセイ(III)において、7時間超、例えば20時間超又は45時間超の遅滞時間を有する。
【０１４５】
受容体結合能
本発明の誘導体は、グルカゴン受容体アゴニストである。受容体アゴニストは、受容体に結合し、天然リガンド固有の応答を誘発する誘導体として定義されてよい。一実施形態では、用語「グルカゴン受容体」は、本明細書で使用される場合、ヒトグルカゴン受容体を意味する。
【０１４６】
一実施形態では、本発明の誘導体は、グルカゴン受容体アゴニストであり、及び/又はグルカゴン受容体活性を有する。一実施形態では、本発明のグルカゴン類似体は、グルカゴン受容体アゴニストであり、及び/又はグルカゴン受容体活性を有する。一実施形態では、グルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体アゴニストであり、及び/又はグルカゴン受容体活性を有する。用語「グルカゴン受容体活性」は、グルカゴン受容体に結合し、当技術分野で知られているように生理学的効果を媒介するアデニル酸シクラーゼ及び高レベルの細胞内cAMPの活性などの細胞内シグナル伝達経路を活性化する能力を指す。例えば、本発明の誘導体又は類似体は、本明細書に記載されるアッセイ(I)(b)又はアッセイ(II)(b)を使用してグルカゴン受容体活性について試験され得る。
【０１４７】
一実施形態では、誘導体は、グルカゴン受容体のアゴニストであり、200pM以下のEC50を有する。一実施形態では、誘導体は、例えば、本明細書に記載されるアッセイ(I)(b)により決定されるように、200pM未満、例えば100pM未満又は20pM未満のEC50を有するグルカゴン受容体のアゴニストである。別の実施形態では、誘導体は、例えば、本明細書に記載されるアッセイ(I)(b)により決定されるように、10pM未満、例えば5pm未満のEC50を有するグルカゴン受容体のアゴニストである。
【０１４８】
一実施形態では、誘導体は、GLP-1受容体におけるそのEC50とグルカゴン受容体におけるそのEC50の間の比、少なくとも50、例えば少なくとも100、1000又は5000を有し、前記効力(すなわち、EC50)は本明細書に記載されるアッセイ(I)(a)及びアッセイ(I)(b)を使用して決定されてよい。
【０１４９】
一実施形態では、本発明の誘導体は、本明細書に記載されるアッセイ(II)(b)により決定されるように、100nM未満、例えば50nM未満、10nM未満又は2nM未満のIC50を有する。
【０１５０】
速効性の誘導体
一実施形態では、誘導体は、速効性の誘導体である。一実施形態では、本明細書で使用される場合、「速効性の誘導体」は高血糖効果の早発性を有する。一実施形態では、「速効性の誘導体」は、皮下投与又は筋肉内投与の後に、グルカゴン(配列番号1)のものと同等の高血糖効果の作用の発現を有する。
【０１５１】
一実施形態では、速効性の誘導体は、皮下投与又は筋肉内投与の後に、ヒトグルカゴン(配列番号1)と比較して改善されたバイオアベイラビリティーを有する。
【０１５２】
溶解度
本発明の誘導体は、可溶性グルカゴン受容体アゴニストであってよい。一実施形態では、誘導体の溶解度は、少なくとも0.1mmol/l、少なくとも0.2mmol/l又は少なくとも0.5mmol/l、例えば、少なくとも2mmol/l、少なくとも4mmol/l若しくは少なくとも8mmol/l、又は例えば、少なくとも10mmol/l若しくは少なくとも15mmol/lである。一実施形態では、用語「溶解性」「溶解度」及び「水溶性」は、本発明の誘導体に関して使用される場合、1)水中の又は2)水性塩若しくは水性緩衝溶液、例えば10mMのリン酸溶液、又は3)他の化合物を含有する水性溶液中の誘導体の溶解度を指し、前記溶解度は、6.5から8.5の間、例えば7.0から8.5の間又は7.4から8.2の間の範囲のpHで決定されてよい。
【０１５３】
一実施形態では、溶解性の誘導体は、7.0〜8.5、例えば7.4〜8.2の範囲のpHで10mMのリン酸溶液中、少なくとも0.1mmol/lの溶解度を有する。
【０１５４】
一実施形態では、誘導体は、少なくとも0.1mmol/lの溶解度を有する。一実施形態では、誘導体の溶解度は、7.4〜8.2の範囲のpHにおける10mMのリン酸緩衝液中に前記誘導体を含む組成物中で決定されてよい。
【０１５５】
医薬組成物
一実施形態では、本発明は、本発明の誘導体と1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。一実施形態では、組成物は、SC、IM又はIV投与などの非経口投与に適している。用語「医薬組成物」及び「組成物」は、本明細書において互換的に使用される。
【０１５６】
本発明の誘導体を含有する医薬組成物は、従来の技術、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 1985又はRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995に記載されるように調製されてよい。
【０１５７】
一実施形態では、本発明は、本発明の誘導体を含む医薬組成物であって、前記誘導体が、約0.01mg/mL〜約25mg/mL、例えば約0.05mg/mL〜約5mg/mL及び約0.1mg/mL〜約2mg/mLの濃度で存在し、前記組成物が、2.0〜10.0のpHを有する医薬組成物に関する。医薬組成物は、本発明の誘導体であって、約0.01mg/mL〜約50mg/mLの濃度で存在し、前記組成物が2.0〜10.0のpHを有する誘導体を含んでよい。
【０１５８】
一実施形態では、医薬組成物は、本発明の誘導体の水性溶液と緩衝液とを含み、前記誘導体は、0.01mg/mL以上の濃度で存在し、前記組成物は約2.0〜約10.0のpHを有する。別の実施形態では、医薬組成物は、本発明の誘導体の水性溶液と、緩衝液とを含み、前記誘導体は、0.01mg/mL以上の濃度で存在し、前記組成物は約6.5〜約8.5のpHを有する。
【０１５９】
一実施形態では、本発明の組成物は、約2.0〜約10.0のpHを有する。別の実施形態では、組成物は、約6.5〜約8.5のpHを有する。さらなる実施形態では、組成物は、約7.0〜約8.5、例えば約7.2〜約8.2のpHを有する。
【０１６０】
組成物は、緩衝系、保存剤、等張剤、キレート剤、安定剤及び界面活性剤をさらに含んでよい。一実施形態では、医薬組成物は、水性組成物、すなわち水を含む組成物である。このような組成物は、典型的には、溶液又は懸濁液である。本発明のさらなる実施形態では、医薬組成物は、水性溶液である。用語「水性組成物」は、少なくとも50%w/wの水を含む組成物として定義される。同様に、用語「水性溶液」は、少なくとも50%w/wの水を含む溶液として定義される。一実施形態では、組成物は、非水性有機溶媒を含む
【０１６１】
別の実施形態では、医薬組成物は、溶媒及び/又は希釈剤が、例えば医師又は患者によって使用前に添加される、凍結乾燥組成物である。
【０１６２】
別の実施形態では、医薬組成物は、いかなる事前の溶解もなく使用できる状態である乾燥組成物(例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥)である。
【０１６３】
一実施形態では、本発明は、本発明の誘導体と、1種又は複数の他の活性成分、例えばGLP-1、インスリン又はその類似体及び/若しくは誘導体とを含む組成物に関する。一実施形態では、本発明は、本発明の誘導体と、GLP-1又はその類似体及び/若しくは誘導体とを含む組成物に関する。一実施形態では、本発明は、本発明の誘導体と、インスリン又はその類似体及び/若しくは誘導体とを含む組成物に関する。本発明の誘導体と1種又は複数の他の活性成分とを含む組成物は、「共製剤」と称される場合がある。一実施形態では、このような共製剤は、物理的に安定且つ/又は化学的に安定な組成物である。
【０１６４】
本発明の誘導体が中性pHで可溶性であり得るという事実は、インスリンとの共製剤を可能にし、より安定な血中グルコースレベル、及び低血糖エピソードの数の減少、並びに糖尿病に関連する合併症のリスクの低減を可能にする。
【０１６５】
医薬投与
本発明の誘導体は、患者に非経口的に投与されてよい。誘導体の投与経路は、筋肉内(IM)、皮下(SC)、又は静脈内(IV)であってよい。患者に投与されるべき本発明の誘導体を含む組成物の投与量は、医師により選択されるよう推奨される。
【０１６６】
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジによって、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射により行われてよい。一実施形態では、本発明の誘導体を含む組成物は、グルカゴン投与のための既製のペンデバイスで使用され得る。あるいは、非経口投与は、輸液ポンプによって行われ得る。一実施形態では、本発明の誘導体を含む組成物は、グルカゴン投与のためのポンプで使用され得る。非経口投与は、鼻噴投与であってよい。さらなる選択肢として、本発明の誘導体を含むグルカゴン調製物は、経皮投与、例えば針を用いない注射又はパッチ、場合によってはイオン注入によるパッチ、又は経粘膜的投与、例えば頬側投与にも適応され得る。
【０１６７】
本発明の誘導体又は組成物の典型的な投与量は、本発明による方法で用いられる場合、1日につき体重1kg当たり約0.0001〜約1mg、好ましくは体重1kg当たり約0.001〜約1mg、さらに好ましくは体重1kg当たり約0.005〜約0.02mgの範囲である。上記の通り、本発明の誘導体は、1種又は複数の追加の治療的に活性な化合物又は物質と組み合わせて投与又は適用されてよく、適切な追加の化合物又は物質は、例えば抗糖尿病薬、抗高脂血症薬、抗肥満薬、降圧剤、及び糖尿病から生じる又は糖尿病に関連する合併症の処置のための薬剤から選択されてよい。
【０１６８】
適切な抗糖尿病薬には、インスリン、インスリン誘導体又は類似体、GLP-1(グルカゴン様ペプチド-1)誘導体又は類似体[WO98/08871(Novo Nordisk A/S)に開示されたもの、又はエクセナチド(Byetta、EliLilly/Amylin; AVE0010、Sanofi-Aventis)、タスポグルチド(Roche)、アルビグルチド(Syncria、GlaxoSmithKline)などの他のGLP-1類似体など]、アミリン、アミリン類似体(例えば、シムリン/パラムリンチド)並びに経口活性血糖降下薬が含まれる。
【０１６９】
医薬指示
本発明は、医薬品において使用するための本発明の誘導体にも関する。一実施形態では、誘導体は、低血糖症を処置する及び/又は予防するために使用される。
【０１７０】
一実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の誘導体をそれを必要とする患者に投与することを含む低血糖症を処置する及び/又は予防するための方法に関する。
【０１７１】
一実施形態では、本発明の誘導体は、低血糖症、インスリン誘導低血糖症、反応性低血糖症、糖尿病性低血糖症、非糖尿病性低血糖症、空腹時低血糖症、薬物誘導低血糖症、胃バイパス手術誘導低血糖症、妊婦における低血糖症、アルコール誘導低血糖症、インスリノーマ及び/又はフォンギールケ病の処置又は予防のために使用される。
【０１７２】
一実施形態では、本発明の誘導体は、X線、CT-及びNMR-スキャニングなどの技術を使用する胃腸管の調査と関連して有用である胃腸管の運動性の阻害における使用のためである。
【０１７３】
一実施形態では、誘導体は、ベータ遮断剤中毒の処置における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、脂肪肝の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、インスリン誘導低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、反応性低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、糖尿病性低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、非糖尿病性低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、空腹時低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、薬物誘導低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、胃バイパス手術誘導低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、妊婦における低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、アルコール誘導低血糖症の処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、インスリノーマの処置又は予防における使用のためである。一実施形態では、誘導体は、フォンギールケ病の処置又は予防における使用のためである。
【０１７４】
一実施形態では、誘導体は、治療有効量の前記誘導体を提供する投与計画で投与される。本明細書で使用される場合、本発明の誘導体の「治療有効量」という用語は、所定の疾患及び/又はその合併症の臨床症状を治療し、緩和し又は部分的に阻止するのに十分な量を指す。これを成し遂げるのに適切な量を「治療有効量」と定義する。各目的に対する有効量は、疾患又は傷害の重症度、並びに患者の体重及び全身状態による。適切な投与量の決定は、値のマトリックスを構築し、マトリックスにおける異なる点を試験することによる通常の実験であって、その全てが訓練された医師又は獣医師の通常の技術の範囲内である実験を使用することにより達成され得ることが理解される。
【０１７５】
用語「処置」「処置すること」及びその他の変化形は、本明細書で使用される場合、状態、例えば疾患又は障害と闘うための患者の管理及び治療を指す。この用語は、患者が患っている所与の状態に対する広範な処置、例えば症状若しくはその合併症を緩和するため、疾患、障害若しくは状態の進行を遅延させるため、疾患、障害又は状態を治療若しくは排除するため、及び/又は状態を予防するために問題の活性化合物を投与することを含むことを意図し、ここで、予防は、疾患、状態、又は障害と闘うための患者の管理及び治療と理解されるべきであり、症状又は合併症の発症を予防するための問題の活性化合物の投与を含む。処置される患者は、好ましくは、哺乳動物、特に人類であるが、他の動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ又はブタの処置も本発明の範囲内である。
【０１７６】
本発明の誘導体のさらなる特定の実施形態は、「特定の実施形態」の見出しの項に記載されている。
【０１７７】
特定の実施形態
以下は、本発明の非限定的な特定の実施形態である:
1.式I:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
(式中、
X2は、Ser又はAibであり、
X10は、Tyr、Leu、Ile又はValであり、
X12は、Lys又はArgであり、
X15は、Asp又はGluであり、
X16は、Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val又はLysであり、
X20は、Gln、Glu、Aib又はLysであり、
X21は、Asp、Glu又はLysであり、
X24は、Gln、Ala、Glu、Aib又はLysであり、
X27は、Met、Leu又はValであり、
X28は、Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu又はLysであり、
X29は、Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu又はLysであり、
X30は、非存在であるか又はLysである)
を含むグルカゴン類似体の誘導体であって、前記誘導体は、式Iの位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の窒素原子に共有結合する置換基を含み、前記置換基は、式II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
[式中、Y1は水素であるか又はC2〜6アシル基若しくはスクシノイル部分を表し、式中、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、それぞれ非存在であるか又はそれぞれSer残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv及び式v:
【０１７８】
【化３２】
2017509603.tif 000033
【０１７９】
(式中、式i、ii、iii、及びivはそれぞれ、立体化学L又はDを有する)
からなる群から選択されるアミノ酸残基を表す]
を有し、
但し、前記置換基は、3〜10個の負電荷部分を有する、誘導体、又は前記誘導体の薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
2.前記グルカゴン類似体は式Iからなる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
3.前記グルカゴン類似体又は誘導体は、X30のC末端に付加されたアミノ酸残基を含まない、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
4.前記誘導体の薬学的に許容される塩、アミド、又はエステルである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
5.前記グルカゴン類似体は、グルカゴン(配列番号1)と比較した場合、前記グルカゴン類似体中に3〜15個のアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
6.前記誘導体は、グルカゴン(配列番号1)と比較した場合、前記グルカゴン類似体中に14個までの、例えば13個までの又は12個までのアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
7.前記グルカゴン類似体は、グルカゴン(配列番号1)と比較した場合、前記グルカゴン類似体中に11個までの、例えば10個までの又は9個までのアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
8.前記グルカゴン類似体は、グルカゴン(配列番号1)と比較した場合、前記グルカゴン類似体中に8個までの、例えば7個までの又は6個までのアミノ酸残基の改変、例えば置換又は付加を含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
9.X2はSerである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
10.X10はTyrである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
11.X12はLysである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
12.X15はAspである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
13.X16はSerである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
14.X20はGlnである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
15.X21はAspである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
16.X24はGlnである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
17.X27はMetである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
18.X28はAsnである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
19.X29はThrである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
20.X30は非存在であるである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
21.X2はAibである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
22.X10はLeuである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
23.X15はGluである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
24.X16はLeuである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
25.X16はValである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
26.X20はLysである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
27.X21はGluである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
28.X24はLysである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
29.X24はAlaである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
30.X27はLeuである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
31.X28はSerである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
32.X28はLysである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
33.X29はLysである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
34.Y12は、前記誘導体の位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の前記窒素原子に結合している、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
35.前記置換基は、リシンの側鎖のイプシロン窒素原子に共有結合している、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
36.前記置換基は、位置X12、X16又はX20においてリシンに結合している、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
37.前記置換基は、位置X21、X24又はX28においてリシンに結合している、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
38.前記置換基は、位置X29又はX30においてリシンに結合している、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
39.前記置換基は、位置X24においてリシンに結合している、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
40.前記置換基は、3、4、5、6、7、8、9又は10個の負電荷部分を有する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
41.前記置換基は、3〜10、例えば3〜5又は4個の式iの残基を含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
42.前記置換基のY1はアセチル基である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
43.前記置換基は、部分:
【０１８０】
【化３３】
2017509603.tif 000034
【０１８１】
からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
44.前記置換基は、部分
【０１８２】
【化３４】
2017509603.tif 000035
【０１８３】
である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
45.Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式1:
【０１８４】
【化３５】
2017509603.tif 000036
【０１８５】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式2:
【０１８６】
【化３６】
2017509603.tif 000037
【０１８７】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式3:
【０１８８】
【化３７】
2017509603.tif 000038
【０１８９】
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式4:
【０１９０】
【化３８】
2017509603.tif 000039
【０１９１】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式5:
【０１９２】
【化３９】
2017509603.tif 000040
【０１９３】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式6:
【０１９４】
【化４０】
2017509603.tif 000041
【０１９５】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式7:
【０１９６】
【化４１】
2017509603.tif 000042
【０１９７】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式8:
【０１９８】
【化４２】
2017509603.tif 000043
【０１９９】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式9:
【０２００】
【化４３】
2017509603.tif 000044
【０２０１】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式10:
【０２０２】
【化４４】
2017509603.tif 000045
【０２０３】
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式11:
【０２０４】
【化４５】
2017509603.tif 000046
【０２０５】
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式12:
【０２０６】
【化４６】
2017509603.tif 000047
【０２０７】
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式13:
【０２０８】
【化４７】
2017509603.tif 000048
【０２０９】
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式14:
【０２１０】
【化４８】
2017509603.tif 000049
【０２１１】
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン
化学式15:
【０２１２】
【化４９】
2017509603.tif 000050
【０２１３】
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴニル)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]Lys
化学式16:
【０２１４】
【化５０】
2017509603.tif 000051
【０２１５】
からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
46.Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]アセチル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式17:
【０２１６】
【化５１】
2017509603.tif 000052
【０２１７】
;Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式18:
【０２１８】
【化５２】
2017509603.tif 000053
【０２１９】
;Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式19:
【０２２０】
【化５３】
2017509603.tif 000054
【０２２１】
;Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式20:
【０２２２】
【化５４】
2017509603.tif 000055
【０２２３】
;Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式21:
【０２２４】
【化５５】
2017509603.tif 000056
【０２２５】
;及び
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
化学式22:
【０２２６】
【化５６】
2017509603.tif 000057
【０２２７】
からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
47.前記グルカゴン類似体は、C末端アミドを含まない、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
48.グルカゴン受容体のアゴニストであり、200pM以下のEC50を有する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
49.本明細書に記載されるThT線維化アッセイ、例えばアッセイ(III)において、70%超の回復率を有する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
50.本明細書に記載されるThT線維化アッセイ、例えばアッセイ(III)において、7時間超の遅滞時間を有する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
51.本明細書に記載されるアッセイ(IV)により決定される場合、5%未満の化学分解を有する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
52.少なくとも0.1mmol/lの溶解度を有する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
53.前記溶解度は、7.4〜8.2の範囲のpHで、10mMリン酸緩衝液中に前記誘導体を含む組成物中で決定されてよい、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
54.GLP-1受容体におけるそのEC50効力とグルカゴン受容体におけるそのEC50効力の間の比率が少なくとも50であり、前記効力は、本明細書に記載されるアッセイ(I)(a)及びアッセイ(I)(b)を使用して決定されてよい、先行する実施形態のいずれか1つに記載の誘導体。
55.グルカゴン(配列番号1)と比較して以下の改変:
(i)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iii)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iv)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(v)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(viii)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ix)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(x)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xi)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xii)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiii)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(xv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン;
(xvi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-グルカゴン
を含むグルカゴン類似体の形態の中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
56.グルカゴン(配列番号1)と比較して以下の改変:
(xvii)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xviii)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xix)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
を含むグルカゴン類似体の形態の中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
57.グルカゴン類似体が、以下のグルカゴン(配列番号1)の類似体:
(i-a)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ii-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iii-a)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iv-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(v-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vi-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vii-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(viii-a)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ix-a)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(x-a)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xi-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xii-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiii-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiv-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(xv-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン;
(xvi-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-グルカゴン
から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
58.グルカゴン類似体が、以下のグルカゴン(配列番号1)の類似体:
(xvii)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xviii)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xix)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
59.先行する実施形態のいずれか1つに規定される誘導体と、1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
60.医薬品において使用するための、先行する実施形態のいずれか1つに規定される誘導体。
61.低血糖症を処置及び/又は予防する際に使用するための、実施形態60に記載の誘導体。
62.治療有効量の先行する実施形態のいずれか1つに規定される誘導体を、それを必要とする患者に投与することを含む。低血糖症を処置及び/又は予防するための方法。
【実施例】
【０２２８】
本発明を、以下の実施例を参照してさらに説明するが、これは、請求される本発明の範囲を如何なるようにも限定することを意図するものではない。
【０２２９】
略語のリスト
BOC:tert-ブチルオキシカルボニル
DCM:ジクロロメタン
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
LCMS:液体クロマトグラフィー質量分析
MeCN:アセトニトリル
Min:分
Mtt:4-メチルトリチル
NMP:N-メチルピロリドン
Oxyma Pure:シアノ-ヒドロキシイミノ-酢酸エチルエステル
RP:逆相
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
RT:室温
Rt:保持時間
SPPS:固相ペプチド合成
TFA:トリフルオロ酢酸
TIPS:トリイソプロピルシラン
UPLC:超高性能液体クロマトグラフィー
10EE:10の乗数(例えば、"10EE(X)"は、10の(X)乗の数、簡潔には10(X)の数を指し、すなわち5×10EE3は5×103である)
【０２３０】
一般法
この項は、樹脂に結合したペプチドを合成するための方法(アミノ酸の脱保護のための方法、樹脂からペプチドを切断するための方法、及びその精製のための方法を含むSPPS法)、並びに得られたペプチドを検出及び特性決定するための方法(LCMS及びUPLC法)に関する。
【０２３１】
SPPS一般法
この項は、固相ペプチド合成のための方法(アミノ酸の脱保護のための方法、樹脂からペプチドを切断するための方法、及びその精製のための方法を含むSPPS法)、並びに得られたペプチドを検出及び特性決定するための方法(LCMS及びUPLC法)に関する。使用されるFmoc-保護されたアミノ酸誘導体は、推奨される標準であった:例えば、Anaspec、Bachem、Iris Biotech、又はNovabiochemから供給されるFmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、又はFmoc-Val-OHなど。他に何も特定されていない場合、天然のL形態のアミノ酸を使用した。N末端Impを、3-(N-1-トリチル-イミダゾール-4-イル)-プロピオン酸を使用して組み込んだ。
【０２３２】
以下に述べたこの項の「SPPS一般法」における全ての操作は、100μmol合成スケールで実施した。
【０２３３】
C末端カルボン酸の調製のために適切な樹脂は、アミノ酸で前処置したWang樹脂、例えばFmoc-Thr(tBu)-Wang樹脂(Low Load、0.35mmol/g)であった。置換基をC末端のリシンに結合させた場合、適切な樹脂は、前処置したFmoc-Lys(Mtt)-Wangであった。
【０２３４】
SPPSは、樹脂ローディング、例えばlow load Fmoc-Gly-Wang(0.35mmol/g)に対して6倍過剰のFmocアミノ酸[300mMのHOAt又はOxyma Pure(登録商標)を有するNMP中300mM]を使用して、100μmolスケールで、Protein Technologies(Tucson、AZ 85714 U.S.A)からのPrelude固相ペプチド合成装置で実施した。Fmoc脱保護は、NMP中20%ピペリジンを使用して実施した。カップリングは、NMP中3:3:3:4のアミノ酸/Oxyma Pure(登録商標)/DIC/コリジンを使用して実施した。NMP及びDCM先端洗浄(それぞれ2×2)は、脱保護及びカップリング工程の間に実施した。カップリングの時間は、一般に、60又は120分であった。いくつかのアミノ酸は「ダブルカップリングされ」、このことは、最初のカップリングの後に、樹脂が排出され、さらに試薬が添加され{アミノ酸、[HOAt又はOxyma Pure(登録商標)]、DIC、及びコリジン}、混合物が再度反応したことを意味した。
【０２３５】
置換基の樹脂に結合した保護ペプチド骨格への結合
アクリル化されるべきリシンのイプシロンアミノ基はMttで保護された。Mtt脱保護は、ヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25、5×20ml、各10分)による処理、続いて項「SPPS一般法」で上記された洗浄によって実施した。
【０２３６】
リシンの化学的改変は、上記の通り、Fmoc-Glu-OtBu又はビルディングブロックを使用してPreludeペプチド合成装置の1又は複数の自動工程で実施した。ダブルカップリングは、カップリングにつき120分の反応時間で実施した。アセチル化は、無水酢酸を使用して達成した。
【０２３７】
樹脂からの切断
合成後、樹脂はDCMで洗浄され、ペプチドは、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)で2〜3時間処理し、続いてジエチルエーテルで沈殿させることにより樹脂から切断した。沈殿物は、ジエチルエーテルで洗浄した。
【０２３８】
精製及び定量化
粗製のペプチドは、水とMeCNの適切な混合液、例えば水/MeCN(9:1)に溶解し、C18シリカゲルを含有するカラムで逆相分取HPLC(Waters社製のDeltaprep 4000又はGilson)により精製した。溶出は、0.1%のTFAを含有する水中でMeCNの勾配を上昇させて実施した。関連する画分は、分析HPLC又はUPLCにより確認した。純粋な標的ペプチドを含有する画分を混合し、減圧下で濃縮した。得られた溶液を分析し(HPLC、LCMS)、生成物を化学発光窒素特異的HPLC検出器(Antek 8060 HPLC-CLND)を使用して、又は280nmでUV吸光を測定することによって定量化した。生成物を、ガラスバイアルに分注した。バイアルは、Millipore社製のグラスファイバープレフィルターで栓をした。凍結乾燥により、白色固体としてトリフルオロ酢酸塩型ペプチドを得た。
【０２３９】
検出及び特性決定の方法
【０２４０】
【表１】
2017509603.tif 000058
【０２４１】
【表２】
2017509603.tif 000059
【０２４２】
【表３】
2017509603.tif 000060
【０２４３】
(実施例1)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式1:
【０２４４】
【化５７】
2017509603.tif 000061
【０２４５】
UPLC01:Rt=10.2分
LCMS01:Rt=1.99分;計算値m/z=4014.3;実測値m/3=1339;実測値m/4=1004;実測値m/5=803
【０２４６】
(実施例2)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式2:
【０２４７】
【化５８】
2017509603.tif 000062
【０２４８】
UPLC02:Rt=6.3分
LCMS01:Rt=1.75分;計算値m/z=4002.3;実測値m/3=1335;実測値m/4=1001;実測値m/5=801
【０２４９】
(実施例3)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式3:
【０２５０】
【化５９】
2017509603.tif 000063
【０２５１】
UPLC02:Rt=6.7分
LCMS01:Rt=1.8分;実測値m/1=3952.3;実測値m/3=1318;実測値m/4=989;実測値m/5=791
【０２５２】
(実施例4)
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式4:
【０２５３】
【化６０】
2017509603.tif 000064
【０２５４】
UPLC02:Rt=6.2分
LCMS01:Rt=1.7分;計算値m/z=3986.3;実測値m/3=1329;実測値m/4=997;実測値m/5=798
【０２５５】
(実施例5)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式5:
【０２５６】
【化６１】
2017509603.tif 000065
【０２５７】
UPLC01:Rt=9.2分
LCMS01:Rt=1.8分;計算値m/z=4004.2;実測値m/3=1336;実測値m/4=1002;実測値m/5=801
【０２５８】
(実施例6)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式6:
【０２５９】
【化６２】
2017509603.tif 000066
【０２６０】
UPLC01:Rt=9.4分
LCMS01:Rt=1.82分;計算値m/z=4018.3;実測値m/3=1340;実測値m/4=1005;実測値m/5=804
【０２６１】
(実施例7)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式7:
【０２６２】
【化６３】
2017509603.tif 000067
【０２６３】
UPLC02:Rt=6.4分
LCMS01:Rt=1.7分;計算値m/z=4016.3;実測値m/3=1339;実測値m/4=1005;実測値m/5=804
【０２６４】
(実施例8)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式8:
【０２６５】
【化６４】
2017509603.tif 000068
【０２６６】
UPLC01:Rt=10.8分
LCMS01:Rt=1.9分;計算値m/z=4030.3;実測値m/3=1344;実測値m/4=1008;実測値m/5=807
【０２６７】
(実施例9)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式9:
【０２６８】
【化６５】
2017509603.tif 000069
【０２６９】
UPLC01:Rt=10.5分
LCMS01:Rt=1.9分;計算値m/z=4016.3;実測値m/3=1340;実測値m/4=1005;実測値m/5=804
【０２７０】
(実施例10)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式10:
【０２７１】
【化６６】
2017509603.tif 000070
【０２７２】
UPLC01:Rt=10.3分
LCMS01:Rt=1.9分;計算値m/z=4000.3;実測値m/3=1334;実測値m/4=1001;実測値m/5=801
【０２７３】
(実施例11)
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式11:
【０２７４】
【化６７】
2017509603.tif 000071
【０２７５】
UPLC02:Rt=6.4分
LCMS01:Rt=3.1分;計算値m/z=4059.3;実測値m/3=1354;実測値m/4=1015;実測値m/5=812
【０２７６】
(実施例12)
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式12:
【０２７７】
【化６８】
2017509603.tif 000072
【０２７８】
UPLC02:Rt=6.4分
LCMS01:Rt=3.2分;計算値m/z=4018.3;実測値m/3=1340;実測値m/4=1005;実測値m/5=804
【０２７９】
(実施例13)
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式13:
【０２８０】
【化６９】
2017509603.tif 000073
【０２８１】
UPLC01:Rt=9.5分
LCMS01:Rt=3.1分;計算値m/z=4017.3;実測値m/3=1340;実測値m/4=1005;実測値m/5=804
【０２８２】
(実施例14)
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式14:
【０２８３】
【化７０】
2017509603.tif 000074
【０２８４】
UPLC02:Rt=6.2分
LCMS01:Rt=3.2分;計算値m/z=4059.3;実測値m/3=1354;実測値m/4=1015;実測値m/5=812
【０２８５】
(実施例15)
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン
化学式15:
【０２８６】
【化７１】
2017509603.tif 000075
【０２８７】
UPLC01:Rt=9.4分
LCMS01:Rt=4.1分;計算値m/z=4045.3;実測値m/3=1349;実測値m/4=1012;実測値m/5=810
【０２８８】
(実施例16)
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴニル)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]Lys
化学式16:
【０２８９】
【化７２】
2017509603.tif 000076
【０２９０】
UPLC01:Rt=9.2分
LCMS01:Rt=4.1分;計算値m/z=4146.4;実測値m/3=1383;実測値m/4=1037;実測値m/5=830
【０２９１】
(実施例17)
Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]アセチル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式17:
【０２９２】
【化７３】
2017509603.tif 000077
【０２９３】
UPLC01:Rt=9.6分
LCMS01:Rt=1.8分;計算値m/z=4075.3;実測値m/3=1359.7;実測値m/4=1020.0;実測値m/5=816.2
【０２９４】
(実施例18)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式18:
【０２９５】
【化７４】
2017509603.tif 000078
【０２９６】
UPLC01:Rt=9.8分
LCMS01:Rt=1.8分;計算値m/z=3889.2;実測値m/3=1297.3;実測値m/4=973.2;実測値m/5=1178.8
【０２９７】
(実施例19)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式19:
【０２９８】
【化７５】
2017509603.tif 000079
【０２９９】
UPLC01:Rt=9.8分
LCMS01:Rt=1.8分;計算値m/z=4147.4;実測値m/3=1383.4;実測値m/4=1037.7;実測値m/5=830.4
【０３００】
(実施例20)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式20:
【０３０１】
【化７６】
2017509603.tif 000080
【０３０２】
UPLC01:Rt=10.2分
LCMS01:Rt=1.9分;計算値m/z=3974.2;実測値m/3=1325.6;実測値m/4=994.5;実測値m/5=795.8
【０３０３】
(実施例21)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式21:
【０３０４】
【化７７】
2017509603.tif 000081
【０３０５】
UPLC01:Rt=10.6分
LCMS01:Rt=2.0分;計算値m/z=3988.2;実測値m/3=1330.0;実測値m/4=998.0;実測値m/5=798.6
【０３０６】
(実施例22)
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
化学式22:
【０３０７】
【化７８】
2017509603.tif 000082
【０３０８】
UPLC01:Rt=10.0分
LCMS01:Rt=1.8分;計算値m/z=4060.3;実測値m/3=1354.3;実測値m/4=1016.0;実測値m/5=813.0
【０３０９】
アッセイ(I):GLP-1及びグルカゴン受容体の効力
このアッセイの目的は、in vitroで本発明の誘導体の活性、又は効力を試験することである。in vitroでの効力は、全細胞アッセイにおいて、それぞれヒトGLP-1受容体及び/又はグルカゴン受容体活性化の尺度である。
【０３１０】
原理
in vitroでの効力は、リポーター遺伝子アッセイにおいて、それぞれヒトGLP-1受容体又はグルカゴン受容体の応答を測定することにより決定した。アッセイは、ヒトGLP-1受容体又はヒトグルカゴン受容体のいずれかを発現し、プロモーターにカップリングしたcAMP応答要素(CRE)に対するDNA、及びホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)に対する遺伝子を含有した、安定に遺伝子導入されたBHK細胞株で実施した。ヒトGLP-1又はグルカゴン受容体が、それぞれ活性化されると、cAMPの生成を生じ、順に発現されるルシフェラーゼタンパク質を生じた。アッセイインキュベーションが完了すると、ルシフェラーゼの基質(ルシフェリン)が添加され、酵素により、ルシフェリンがオキシルシフェリンに変換され、生物発光を生じた。発光は、アッセイに対する読み出しとして測定した。
【０３１１】
(a)GLP-1受容体活性化
細胞培養及び調製
このアッセイで使用した細胞(クローンFCW467-12A/KZ10-1)は、親細胞株としてBHKTS13を有するBHK細胞であった。細胞は、ヒトGLP-1受容体を発現したクローン(FCW467-12A)に由来し、現在のクローンを得るためにCREルシフェラーゼでさらに遺伝子導入することにより確立した。
【０３１２】
細胞は、5%のCO2で、10%FBS、1×GlutaMAX、1mg/mLのG418、240nMのMTX(メトトレキサート)及び1%pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)を有するDMEM培地で培養した。これらを等分し、液体窒素中で保存した。各アッセイの前に、アリコートを得て、アッセイ緩衝液に所望の濃度で懸濁される前にPBSで3回洗浄した。96ウェルプレートに対し、懸濁を行い、5×10EE3個の細胞/ウェルの最終濃度を得た。
【０３１３】
材料
以下の化学物質をアッセイで使用した:Pluronic F-68(10%)(Gibco 2404)、オボアルブミン(Sigma A5503)、フェノールレッド非含有DMEM(Gibco 11880-028)、1MのHepes(Gibco 15630)、Glutamax 100×(Gibco 35050)及びsteadylite plus(PerkinElmer 6016757)。
【０３１４】
アッセイ培地は、フェノールレッド非含有DMEM、10mMのHepes、1×GlutaMax、2%オボアルブミン及び0.2%のPluronic F-68からなった。
【０３１５】
手順
細胞ストックを37℃の水浴で解かした。細胞は、PBSで3回洗浄した。細胞をカウントし、アッセイ培地中で5×10EE3細胞/50μl(1×10EE5細胞/mL)に調整した。細胞の50μlのアリコートをアッセイプレートの各ウェルに移した。
【０３１６】
試験化合物及び参照化合物のストックを、アッセイ培地中で0.2μMの濃度に希釈した。化合物を10倍に希釈し、以下の濃度を得た:2×10EE-6M、2×10EE-7M、2×10EE-8M、2×10EE-9M、2×10EE-10M、2×10EE-11M、2×10EE-12M及び2×10EE-13M。各化合物に対して、ブランクアッセイの緩衝液対照も含んだ。
【０３１７】
化合物又はブランクの50μlのアリコートを希釈プレートからアッセイプレートに移した。化合物は、以下の最終濃度で試験した:1×10EE-6M、1×10EE-7M、1×10EE-8M、1×10EE-9M、1×10EE-10M、1×10EE-11M及び1×10EE-12M及び1×10EE-13M。
【０３１８】
アッセイプレートは、37℃の5%CO2インキュベーター中で3時間インキュベートした。アッセイプレートは、インキュベーターから取り出し、室温で15分間静置させた。steadylite plus試薬の100μlのアリコートをアッセイプレートの各ウェルに添加した(試薬は光感応性である)。各アッセイプレートをアルミニウムホイルで覆い、光から保護して、室温で30分間振とうした。各アッセイプレートは、Packard社製のTopCount NXT機器で読み出した。
【０３１９】
計算
TopCount機器からのデータをGraphPad Prismソフトウェアに移した。ソフトウェアにより、非線形回帰[log(アゴニスト)対応答変数勾配(4つのパラメータ)]が実施された。EC50値をソフトウェアにより計算し、pMで報告した。
【０３２０】
(b)グルカゴン受容体活性化
細胞培養及び調製
このアッセイで使用した細胞(クローンpLJ6'-4-25)は、CREルシフェラーゼ遺伝子を発現する、親細胞株としてBHK570を有するBHK細胞(クローンBHK/KZ10-20-48)であり、ヒトグルカゴン受容体でさらに遺伝子導入して確立した(pHZ-1ベクター中のクローンpLJ6')。
【０３２１】
細胞は、5%のCO2で、10%FBS、1×GlutaMAX、1mg/mLのG418、240nMのMTX(メトトレキサート)及び1%pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)を有するDMEM培地で培養した。これらを等分し、液体窒素中で保存した。各アッセイの前に、アリコートを得て、アッセイ緩衝液に所望の濃度で懸濁される前にPBSで3回洗浄した。96ウェルプレートに対し、懸濁を行い、5×10EE3個の細胞/ウェルの最終濃度を得た。
【０３２２】
材料
以下の化学物質をアッセイで使用した:Pluronic F-68(10%)(Gibco 2404)、オボアルブミン(Sigma A5503)、フェノールレッド非含有DMEM(Gibco 11880-028)、1MのHepes(Gibco 15630)、Glutamax 100×(Gibco 35050)及びsteadylite plus(PerkinElmer 6016757)。
【０３２３】
アッセイ培地は、フェノールレッド非含有DEME、10mMのHepes、1×GlutaMax、2%オボアルブミン及び0.2%のPluronic F-68からなった。
【０３２４】
手順
細胞ストックを37℃の水浴で解かした。細胞は、PBSで3回洗浄した。細胞をカウントし、アッセイ培地中で5×10EE3個の細胞/50μl(1×10EE5個の細胞/mL)に調整した。細胞の50μlのアリコートをアッセイプレートの各ウェルに移した。
【０３２５】
試験化合物及び参照化合物のストックを、アッセイ培地中で0.2μMの濃度に希釈した。化合物を10倍に希釈し、以下の濃度を得た:2×10EE-6M、2×10EE-7M、2×10EE-8M、2×10EE-9M、2×10EE-10M、2×10EE-11M、2×10EE-12M及び2×10EE-13M。各化合物に対して、ブランクアッセイの緩衝液対照も含んだ。
【０３２６】
化合物又はブランクの50μlのアリコートを希釈プレートからアッセイプレートに移した。化合物は、以下の最終濃度で試験した:1×10EE-6M、1×10EE-7M、1×10EE-8M、1×10EE-9M、1×10EE-10M、1×10EE-11M及び1×10EE-12M及び1×10EE-13M。
【０３２７】
アッセイプレートは、37℃の5%CO2インキュベーター中で3時間インキュベートした。アッセイプレートは、インキュベーターから取り出し、室温で15分間静置させた。steadylite plus試薬の100μlのアリコートをアッセイプレートの各ウェルに添加した(試薬は光感応性である)。各アッセイプレートをアルミニウムホイルで覆い、光から保護して、室温で30分間振とうした。各アッセイプレートは、Packard社製のTopCount NXT機器で読み出した。
【０３２８】
計算
TopCount機器からのデータをGraphPad Prismソフトウェアに移した。ソフトウェアにより、非線形回帰[log(アゴニスト)対応答変数勾配(4つのパラメータ)]が実施された。EC50値をソフトウェアにより計算し、pMで報告した。
【０３２９】
アッセイ(II):GLP-1及びグルカゴン受容体結合
(a)GLP-1受容体結合
このアッセイの目的は、in vitroで本発明のグルカゴン誘導体の受容体結合活性を試験することである。受容体結合は、ヒトGLP-1受容体に対する化合物の親和性の尺度である。
【０３３０】
原理
ヒトGLP-1受容体への各化合物の受容体結合は、転移結合アッセイで測定した。このタイプのアッセイでは、標識化したリガンド(この場合、125I-GLP-1)を受容体に結合する。各誘導体を、一連の濃度で、ヒトGLP-1受容体を含有する単離膜に添加し、標識化したリガンドの転移をモニターした。受容体結合は、標識化されたリガンドの半数が受容体から転移する濃度、すなわちIC50値として報告する。
【０３３１】
材料
以下の化学物質をアッセイで使用した:フェノールレッド非含有DEME(Gibco 11880-028)、Pen/strep(Invitrogen 15140-122)、G418(Invitrogen 10131-027)、1MのHepes(Gibco 15630)、EDTA(Invitrogen 15575-038)、PBS(Invitrogen 14190-094)、ウシ胎仔血清(Invitrogen 16140-071)、EGTA、MgCl2(Merck 1.05832.1000)、Tween 20(Amresco 0850C335)、SPA粒子{コムギ胚芽凝集素(WGA)SPAビーズ、Perkin Elmer RPNQ0001}、[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(社内製造)、OptiPlate(商標)-96(Packard 6005290)。
【０３３２】
緩衝液1は、20mMのNa-HEPESと10mMのEDTAからなり、pHを7.4に調整した。緩衝液2は、20mMのNa-HEPESと0.1mMのEDTAからなり、pHを7.4に調整した。アッセイ緩衝液は、5mMのEGTA、5mMのMgCl2、0.005%のTween 20を補充した50mMのHEPESからなり、pHを7.4に調整した。
【０３３３】
細胞培養及び膜の調製
このアッセイで使用した細胞(クローンFCW467-12A)は、親細胞株としてBHKTS13を有するBHK細胞であった。細胞は、ヒトGLP-1受容体を発現する。
【０３３４】
細胞を5%CO2で、DMEM、10%のウシ胎仔血清、1%のPen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)及び1.0mg/mLの選択マーカーG418で成長させた。膜を調製するために、細胞をおよそ80%のコンフルエンスに成長させた。細胞をリン酸緩衝食塩水中で2回洗浄し、回収した。細胞を簡潔に遠心分離を使用してペレット化し、細胞ペレットを氷上で保持した。細胞ペレットは、適切な量の緩衝液1(例えば、10mL)中で、ULTRA-THURRAX分散機器を用い、20〜30秒間ホモジナイズした。ホモジネートは、15分遠心分離した。ペレットは、10mLの緩衝液2に再懸濁し(ホモジナイズし)、遠心分離した。この工程をもう一度繰り返した。得られたペレットを緩衝液2に再懸濁し、タンパク質濃度を決定した。膜を等分し、-80℃で保存した。
【０３３５】
手順
1.受容体結合アッセイとして、50μlのアッセイ緩衝液をアッセイプレートの各ウェルに添加した。
2.試験化合物を段階希釈して、以下の濃度とした:8×10EE-7M、8×10EE-8M、8×10EE-9M、8×10EE-10M、8×10EE-11M、8×10EE-12M及び8×10EE-13M。25μlをアッセイプレートの適切なウェルに添加した。
3.細胞膜のアリコートを解凍し、それらの作業濃度に希釈した。50μlをアッセイプレートの各ウェルに添加した。
4.WGA SPAビーズを20mg/mLでアッセイ緩衝液に再懸濁した。懸濁液は、アッセイプレートに添加する直前にアッセイ緩衝液に10mg/mLに希釈した。50μlをアッセイプレートの各ウェルに添加した。
5.インキュベーションは、アッセイプレートの各ウェルに[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2の480pM溶液25μlを添加することにより開始した。25μlのアリコートを、総数/ウェルを測定するために保存した。
6.アッセイプレートは、30℃で2時間インキュベートした。
7.アッセイプレートは、10分間遠心分離した。
8.アッセイプレートは、Packard社製のTopCount NXT機器で読み出した。
【０３３６】
計算
TopCount機器からのデータをGraphPad Prismソフトウェアに移した。ソフトウェアにより、複製物に対する値を平均し、非線形回帰を実施した。IC50値をソフトウェアにより計算し、nMで報告した。
【０３３７】
(b)グルカゴン受容体結合
このアッセイの目的は、in vitroで本発明のグルカゴン誘導体の受容体結合活性を試験することである。受容体結合活性は、ヒトグルカゴン受容体に対する誘導体の親和性の尺度である。
【０３３８】
原理
ヒトグルカゴン受容体への各化合物の受容体結合は、転移結合アッセイで測定した。このタイプのアッセイでは、標識化したリガンド(この場合、125I-グルカゴン)を受容体に結合する。各誘導体を、一連の濃度で、ヒトグルカゴン受容体を含有する単離膜に添加し、標識化したリガンドの転移をモニターした。受容体結合は、標識化されたリガンドの半数が受容体から転移する濃度、すなわちIC50値として報告する。
【０３３９】
材料
以下の化学物質をアッセイで使用した: DEME w Glutamax (Gibco 61965-026)、Pen/strep(Invitrogen 15140-122)、G418(Invitrogen 10131-027)、Versene(Gibco 15040)、1MのHepes(Gibco 15630)、PBS(Invitrogen 14190-094)、ウシ胎仔血清(Invitrogen 16140-071)、MgCl2(Merck 1.05832.1000)、EDTA(Invitrogen 15575-038)、CaCl2(Sigma、C5080)、Tween 20(Amresco 0850C335)、オボアルブミン(Sigma A5503)、SPA粒子{コムギ胚芽凝集素(WGA)SPAビーズ、Perkin Elmer RPNQ0001、[125I]-グルカゴン(社内製造)、OptiPlate(商標)-96(Packard 6005290)。
【０３４０】
HME緩衝液は、25mMのHEPES、2mMのMgCl2及び1mMのEDTAからなり、pHを7.4に調整した。結合緩衝液は、5mMのMgCl2、1mMのCaCl2、0.02%のTween 20及び0.1%のオボアルブミンを補充した50mMのHEPESからなり、pHを7.4に調整した。
【０３４１】
細胞培養及び膜の調製
このアッセイで使用した細胞(クローンBHK hGCGR A3*25)は、ヒトグルカゴン受容体をコードするcDNAを含有する発現プラスミドで安定に遺伝子導入したBHK細胞であった。
【０３４２】
細胞を5%CO2で、DMEM、10%のウシ胎仔血清、1%のPen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)及び1.0mg/mLの選択マーカーG418で成長させた。膜を調製するために、細胞をおよそ80%のコンフルエンスに成長させた。細胞をリン酸緩衝食塩水中で2回洗浄し、回収した。細胞を簡潔に遠心分離を使用してペレット化し、細胞ペレットを氷上で保持した。細胞をおよそ5mLのHME緩衝液を加えることにより溶解し、ピペッティングにより混合し、液体窒素中で急激に凍結させた。細胞溶解物は、素早く解凍し、HME緩衝液を添加して10mLにした。細胞ペレットは、ULTRA-THURRAX分散機器を用い、20〜30秒間ホモジナイズした。ホモジネートは、4℃で10分間、20.000×Gで遠心分離した。ペレットは、1-2mLのHME緩衝液に再懸濁(ホモジナイズ)した。タンパク質濃度を決定した。膜を等分し、液体窒素中で急激に凍結させ、-80℃で保存した。
【０３４３】
手順
1.受容体結合アッセイとして、50μlのアッセイ緩衝液をアッセイプレートの各ウェルに添加した。
2.試験化合物を段階希釈して、以下の濃度とした:8×10EE-7M、8×10EE-8M、8×10EE-9M、8×10EE-10M、8×10EE-11M、8×10EE-12M及び8×10EE-13M。25μlをアッセイプレートの適切なウェルに添加した。
3.細胞膜のアリコートを解凍し、それらの作業濃度に希釈した。50μlをアッセイプレートの各ウェルに添加した。
4.WGA SPAビーズを20mg/mLでアッセイ緩衝液に再懸濁した。懸濁液は、アッセイプレートに添加する直前にアッセイ緩衝液に10mg/mLに希釈した。50μlをアッセイプレートの各ウェルに添加した。
5.インキュベーションは、アッセイプレートの各ウェルに[125I]-グルカゴンの480pM溶液25μlを添加することにより開始した。25μlのアリコートを、総数/ウェルを測定するために保存した。
6.アッセイプレートは、25℃で2時間インキュベートした。
7.アッセイプレートは、1500rpmで10分間遠心分離した。
8.アッセイプレートは、Packard社製のTopCount NXT機器で読み出した。
【０３４４】
計算
TopCount機器からのデータをGraphPad Prismソフトウェアに移した。ソフトウェアにより、複製物に対する値を平均し、非線形回帰を実施した。
【０３４５】
アッセイ(III):ペプチド組成物の物理的安定性の評価のためのThT細線維化アッセイ
このアッセイの目的は、水性溶液において本発明のグルカゴン誘導体の物理的安定性を評価することである。
【０３４６】
ペプチドの低い物理的安定性によりアミロイド線維形成が導かれ、これは、試料中で秩序だった糸状の高分子構造として観察され、最終的にゲル形成が導かれ得る。これは、従来から、試料を目視検査することにより測定されてきた。しかし、この種の測定は、非常に扱いにくく、観察者によって左右される。したがって、小分子インジケータープローブの適用は、より有利である。チオフラビンT(ThT)はこのようなプローブであり、線維と結合する際に明瞭な蛍光サインを有する[Naiki et al.(1989) Anal.Biochem. 177, 244-249; LeVine(1999) Methods.Enzymol. 309, 274-284]。
【０３４７】
線維形成のための時間経過は、以下の式を用いてS字曲線で記載され得る[Nielsen et al.(2001) Biochemistry 40, 6036-6046]:
【０３４８】
【数１】
2017509603.tif 000083
【０３４９】
ここで、Fは、時間tにおけるThT蛍光光度である。定数t0は、最大蛍光光度の50%に到達するのに必要とされる時間である。線維形成を記載する2つの重要なパラメータは、t0-2τにより計算される遅延時間であり、見かけの速度定数kapp 1/τである。
【０３５０】
【数２】
2017509603.tif 000084
【０３５１】
ペプチドの一部が折り畳まれた中間体の形成は、線維化の一般的な開始機構を示唆する。これらの中間体の少数が核を形成して鋳型を形成し、そこにさらなる中間体が集合して線維化が進行する。遅延時間は、核の限界質量がビルトアップされる間隔に相当し、見かけの速度定数は、線維自体が形成される速度である。
【０３５２】
試料は、各アッセイ前に新たに調製した。各試料の組成は、凡例に記載する。試料のpHは、適切な量の濃NaOH及び濃HClを使用して所望の値に調整した。チオフラビンTを、最終濃度1μMとなるまで、H2O中のストック溶液から試料に添加した。
【０３５３】
試料のアリコート200μl(250μMのグルカゴン誘導体/10mM HEPES緩衝液中の類似体、pH7.5)を96ウェルマイクロタイタープレート(Packard社製のOptiPlate(商標)-96、白色ポリスチレン)に置いた。通常、試料毎に4又は8個の複製(1つの試験条件に相当)をウェルの1列に置いた。プレートをScotch Pad(Qiagen)で密閉した。
【０３５４】
所望の温度でのインキュベーション、振とう及びThT蛍光発光の測定をFluoroskan Ascent FL fluorescence platereader(Termo Labsystems)で行った。プレートは、振れ幅1mmで960rpmに調整して旋回振とうしながら37℃でインキュベートした。蛍光測定を444nmのフィルターを介した励起を使用して行い、発光の測定は485nmのフィルターを介して行った。各作動は、プレートをアッセイ温度で10分間インキュベートすることにより開始した。プレートを20分毎に所望の期間測定した。各測定の間、記載したようにプレートを振とうし、加熱した。
【０３５５】
ThTアッセイが完了した後、各試料について4又は8個の複製をプールし、18℃で30分間、20000rpmで遠心分離した。上清を0.22μmのフィルターを介してろ過し、アリコートをHPLCバイアルに移した。初期試料中及びろ過された上清中のペプチドの濃度を、基準として適切な標準を使用する逆相HPLCにより決定した。初期試料濃度から構成されるろ過された試料の濃度のパーセンテージ画分は、回収率として報告した。
【０３５６】
測定点を、さらなる処理のためにMicrosoft Excelフォーマットで保存し、曲線の描画及び曲線近似は、GraphPad Prismを使用して実施した。線維の非存在下でThTからの背景発光は、無視した。データ点は、典型的には、4又は8個の試料の平均であり、標準偏差のエラーバーを用いて示した。同じ実験(すなわち、同じプレート上の試料)で得られたデータのみを、実験間で線維化の相対的測定を保証する同じグラフ中で表わした。
【０３５７】
データセットを、方程式(1)に当てはめてよい。しかし、本明細書で報告された線維化前の遅延時間は、ThT蛍光が上記背景レベルを上回って有意に増加するタイムポイントを特定する曲線の目視検査により決定した。
【０３５８】
アッセイ(IV):化学的安定性の評価
このアッセイの目的は、水性溶液において本発明のグルカゴン誘導体の化学的安定性を評価することである。
【０３５９】
グルカゴン類似体の化学的安定性をRP-UPLCにより決定した。凍結乾燥した試料を8mMのリン酸緩衝液pH8.6に溶解し、続いて最終濃度が333μMとなるようにHClを使用してpH7.3に調整した。試料は、5℃及び37℃で14日間インキュベートし、続いてRP-UPLC分析を行った。純度とは、各クロマトグラムにおける積分したすべてのピークの総面積に対するメインのピークの面積の割合と定義した。37℃で14日後の純度の損失(本明細書では化学分解とも称する)として定義される化学的安定性を、5℃でインキュベートした試料又は開始試料(インキュベーションなし)と37℃でインキュベートした試料の間の純度の差を開始試料又は5℃で14日間のインキュベーション後の純度で割ったものとして決定した。
【０３６０】
RP-UPLC分析を、A:0.09Mリン酸緩衝液pH3.6(リン酸水素二アンモニウム)、10%MeCN(v/v%)、及びB:60%MeCN(v/v%)、20%イソプロパノール(v/v%)からなる移動相システムを使用して、50℃及び流速0.3mL/分で操作される、Waters社製のAcquity CSH Fluoro-phenyl 150×2.1mm、1.7μmカラムを使用して実施した。
【０３６１】
UV検出を215nmで実施した。試料のほとんどに対して使用された典型的な勾配プロファイルを以下に示す。類似体の大多数と比較して実質的に異なる保持時間で溶出する類似体に対して、勾配プロファイルに対して何らかの調整がなされ、試料に亘って純度の評価の比較がより可能になった。データにより、本発明のグルカゴン誘導体の改善された化学的安定性を確認した。
【０３６２】
高分子量タンパク質(HMWP)含有量は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE-HPLC)によって決定した。500mMのNaCl、10mMのNaH2PO4、5mMのH3PO4及び50%(v/v)2-プロパノールからなる分離する移動相を使用する50℃且つ流速0.5mL/分で操作されるWaters社製のInsulin HMWP 7.8×300mmカラムを使用して分析を実施した。UV検出を215nmで実施した。
【０３６３】
RP-UPLC分析のために使用される典型的な勾配プロファイル:
【０３６４】
【表４】
2017509603.tif 000085
【０３６５】
(実施例23):本発明の誘導体の特性
本発明の誘導体を、ヒトグルカゴン受容体(EC50 hGlucagonR)に関する効力、ヒトグルカゴン受容体(IC50 hGlucagonR)に対する親和性、本明細書に記載されるアッセイ(I)(b)、アッセイ(II)(b)、アッセイ(III)及びアッセイ(IV)を使用する物理的安定性及び化学的安定性に対して、それぞれ試験した。結果をTable 1(表5)に示す。
【０３６６】
【表５】
2017509603.tif 000086
【０３６７】
結果により、本発明の誘導体は、グルカゴン受容体に関する良好な効力、グルカゴン受容体に関する良好な親和性並びに良好又は中程度の物理的安定性及び良好な化学的安定性を有することが示される。
【０３６８】
本発明のある特定の特徴は、本明細書において説明され記載されているが、多くの改変、置換、変更及び均等が当業者に起こるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は全てのこのような改変及び変更が本発明の真の精神の範囲内にあるよう網羅することを意図することが理解される。
【配列表】
2017509603000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月17日(2017.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I:
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
(式中、
X2は、Ser又はAibであり、
X10は、Tyr、Leu、Ile又はValであり、
X12は、Lys又はArgであり、
X15は、Asp又はGluであり、
X16は、Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val又はLysであり、
X20は、Gln、Glu、Aib又はLysであり、
X21は、Asp、Glu又はLysであり、
X24は、Gln、Ala、Glu、Aib又はLysであり、
X27は、Met、Leu又はValであり、
X28は、Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu又はLysであり、
X29は、Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu又はLysであり、
X30は、非存在であるか又はLysである)
を含むグルカゴン類似体の誘導体であって、前記誘導体は、式Iの位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の窒素原子に共有結合する置換基を含み、前記置換基は、式II:
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
[式中、Y1は水素であるか又はC2〜6アシル基若しくはスクシノイル部分を表し、
式中、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11又はY12は、それぞれ非存在であるか又はそれぞれSer残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv及び式v:
【化１】
2017509603.tif 000111
(式中、式i、ii、iii、及びivはそれぞれ、立体化学L又はDを有する)
からなる群から選択されるアミノ酸残基を表す]
を有し、但し、前記置換基は、3〜10個の負電荷部分を有する、誘導体、又は前記誘導体の薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
【請求項２】
前記グルカゴン類似体が、グルカゴン(配列番号1)と比較した場合、前記グルカゴン類似体中に3〜15個のアミノ酸残基の改変を含む、請求項1記載の誘導体。
【請求項３】
Y12が、前記誘導体の位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29又はX30におけるリシンの側鎖の前記窒素原子に結合している、請求項1又は2に記載の誘導体。
【請求項４】
前記置換基が、リシンの側鎖のイプシロン窒素原子に共有結合している、請求項1から3のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項５】
前記置換基が、位置X24においてリシンに結合している、請求項1から4のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項６】
前記置換基が、3、4、5、6、7、8、9又は10個の負電荷部分を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項７】
前記置換基が、3〜10個の式iの残基を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項８】
前記置換基のY1がアセチル基である、請求項1から7のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項９】
前記置換基が、部分:
【化２】
2017509603.tif 000112
からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１０】
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式1:
【化３】
2017509603.tif 000113
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式2:
【化４】
2017509603.tif 000114
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式3:
【化５】
2017509603.tif 000115
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式4:
【化６】
2017509603.tif 000116
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式5:
【化７】
2017509603.tif 000117
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式6:
【化８】
2017509603.tif 000118
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式7:
【化９】
2017509603.tif 000119
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式8:
【化１０】
2017509603.tif 000120
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式9:
【化１１】
2017509603.tif 000121
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式10:
【化１２】
2017509603.tif 000122
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式11:
【化１３】
2017509603.tif 000123
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式12:
【化１４】
2017509603.tif 000124
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式13:
【化１５】
2017509603.tif 000125
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン
化学式14:
【化１６】
2017509603.tif 000126
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン
化学式15:
【化１７】
2017509603.tif 000127
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴニル)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]Lys
化学式16:
【化１８】
2017509603.tif 000128
Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]アセチル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式17:
【化１９】
2017509603.tif 000129
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式18:
【化２０】
2017509603.tif 000130
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式19:
【化２１】
2017509603.tif 000131
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式20:
【化２２】
2017509603.tif 000132
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン
化学式21:
【化２３】
2017509603.tif 000133
;及び
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-アセトアミド-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]アミノ]-4-カルボキシブタノイル]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
化学式22:
【化２４】
2017509603.tif 000134
からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１１】
グルカゴン(配列番号1)と比較して以下の改変:
(i)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iii)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(iv)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(v)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(vii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(viii)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(ix)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(x)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xi)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xii)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiii)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xiv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-グルカゴン;
(xv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-グルカゴン;
(xvi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-グルカゴン;
(xvii)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xviii)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-グルカゴン;
(xix)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-グルカゴン
を含むグルカゴン類似体の形態の中間生成物、又はその薬学的に許容される塩、アミド、若しくはエステル。
【請求項１２】
請求項1から10のいずれか一項に記載の誘導体又は請求項11に記載の中間生成物と、1種又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
【請求項１３】
医薬品において使用するための、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
低血糖症を処置及び/又は予防するための、請求項13に記載の組成物。
【国際調査報告】
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