(57)【要約】開示されるのは、マイクロ流体カートリッジと、液体試料における蛍光アッセイ用のコンパクトなマイクロプロセッサで制御された器具とを含む、マイクロアッセイ検査システムであって、このカートリッジは、統合されたプロセス対照と、陽性および陰性アッセイ対照とを有する。器具は、複数の光チャネルを組み込む走査検出器ヘッドを有する。好ましい構成では、アッセイは、標的被分析物と関連付けられる第１のフルオロフォアおよびプロセス対照と関連付けられる第２のフルオロフォアを監視するための二重チャネル光学部を使用して、認証される。統合された陽性および陰性アッセイ対照は、向上したアッセイ認証能力を提供し、検査結果の分析を促進する。用途として、一般に標的核酸のＰＣＲ増幅および蛍光アッセイに基づく、分子生物学的アッセイが挙げられる。
2017520239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料アッセイを行うためのマイクロアッセイカートリッジであって、
ａ）その中に封入された空気圧回路を有する、第１の成形筐体と、
ｂ）その中に封入された流体圧回路を有する、第２の成形筐体と、
ｃ）検査試料を受容するための試料入口であって、前記流体圧回路と流体連通する、試料入口と、
ｄ）前記第１の成形筐体と前記第２の成形筐体との間に介在されるラミネート層であって、前記空気圧回路および前記流体圧回路と流体連通する複数の空気流体圧膜を備える、ラミネート層と、
ｅ）前記流体圧回路と流体連通する、アッセイウェルアセンブリと、
ｆ）空気圧インターフェースを画定する空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、そこに印加される空気圧パルスを受容し、前記ポートは、前記空気圧回路と流体連通し、前記空気圧パルスは、陽圧パルスまたは陰圧パルスである、空気圧ポートのアレイと、
を備え、前記カートリッジは、前記空気流体圧膜が前記空気圧パルスによって動作可能に制御されるようにされる、カートリッジ。
【請求項２】
前記流体圧回路は、検査アッセイ回路と、対照アッセイ回路とを備える、請求項１に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項３】
前記検査アッセイ対照回路は、前記試料入口と流体連通し、前記対照アッセイ回路は、前記試料入口と流体連通しない、請求項２に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項４】
前記対照アッセイ回路は、陽性対照アッセイ回路と、陰性対照アッセイ回路とを備える、請求項３に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項５】
前記陽性対照アッセイ回路および前記陰性対照アッセイ回路は、流体連通している、請求項４に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項６】
前記陽性対照アッセイ回路および前記陰性対照アッセイ回路は、流体連通していない、請求項４に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項７】
前記検査アッセイ回路、前記陽性対照アッセイ回路、および前記陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、複数のアッセイウェルのそれぞれと流体連通する、請求項３に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項８】
前記複数のアッセイウェルは、最大３つである、請求項７に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項９】
前記複数のアッセイウェルは、３つである、請求項７に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項１０】
前記複数のウェルはそれぞれ、プロセス対照を行うように構成される、請求項７〜９のいずれかに記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項１１】
前記陽性対照アッセイウェルは、陽性対照核酸テンプレートを備える、請求項７〜９のいずれかに記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項１２】
前記流体圧回路と流体連通する核酸捕捉アセンブリをさらに備える、請求項１に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項１３】
前記核酸捕捉アセンブリは、中空筐体部材と、その中に配置される核酸捕捉膜とを備える、請求項１２に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項１４】
前記核酸捕捉膜は、シリカファイバを含む、請求項１３に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項１５】
前記筐体部材の内部に配置される、上側支持媒体および下側支持媒体をさらに備え、前記核酸捕捉膜は、前記上側支持媒体と前記下側支持媒体との間に介在される、請求項１３に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項１６】
前記上側および下側支持媒体は、ＰＯＲＥＸ（登録商標）フリットである、請求項１５に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項１７】
前記上側および下側支持媒体は、ポリプロピレンワッシャである、請求項１５に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【請求項１８】
前記アッセイウェルアセンブリは、複数のウェルとともに構成されるＰＣＲウェル層を備え、前記ウェルはそれぞれ、任意の得られた単位複製配列のＰＣＲ増幅および蛍光検出のために必要な全ての試薬を含む、請求項１に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項１９】
前記ＰＣＲウェル層は、高熱伝導ポリマーから形成される、請求項１８に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２０】
前記ＰＣＲウェル層は、終点ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、または融解曲線分析のために構成される、請求項１８に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２１】
前記第１の成形筐体は、前記アッセイウェルアセンブリを覆う光学検出ウィンドウを備え、前記光学検出ウィンドウは、前記第１の成形筐体の上側表面上の菱形形状の開口部と、前記第１の成形筐体の下側表面上のより小さい菱形形状の開口部とから形成され、前記光学ウィンドウの側面は、第１の成形筐体の上側表面から下側表面に内向きに角度付けられる、請求項１に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２２】
前記光学ウィンドウと前記アッセイウェルアセンブリとの間に介在される光学的に透明なカバー層をさらに備える、請求項２１に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２３】
前記第１の成形筐体は、前記空気圧回路および前記流体圧回路と流体連通する複数の試薬リザーバを備える、請求項１に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２４】
前記試薬リザーバは、二重層箔パックである、請求項２３に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２５】
前記箔パックは、気密接着剤シールによって前記第１の成形筐体に固定して接着される、請求項２４に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２６】
最大６つの試薬リザーバを備える、請求項２３に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２７】
前記箔パックの下方に配置される鋭利物をさらに備え、前記鋭利物は、前記箔パックが、前記空気圧回路への圧力パルスの印加によって、前記鋭利物と接触するように押勢されると、前記箔パックを破裂させるためである、請求項２４に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２８】
前記鋭利物は、金属から形成される、請求項２７に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項２９】
前記鋭利物は、前記成形筐体に対して垂直を下回る角度で突出する、返しを備える、請求項２８に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項３０】
前記角度は、約７５度である、請求項２９に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項３１】
前記試薬パックと前記鋭利物との間に介在されるバネをさらに備え、前記バネは、固有のバネ力を有し、前記バネ力は、圧力パルスの不在下、前記試薬パックと前記鋭利物との間の接触を防止する、請求項２０に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項３２】
前記空気圧ポート内に配置されるエアロゾルフィルタプラグをさらに備える、請求項１に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項３３】
前記エアロゾルフィルタプラグは、液体膨張性材料から形成される、請求項２５に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項３４】
前記陽圧および陰圧の状態は、＋１５０、＋１００、＋７０、０、−３５、および−５０ｋＰａから選択される、請求項１に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項３５】
前記空気圧インターフェースをホスト器具に接合するように構成される単回使用密閉ガスケットをさらに備える、請求項１に記載のマイクロアッセイカード。
【請求項３６】
試料アッセイを行うためのマイクロアッセイシステムであって、
ａ）ホスト器具とドッキングするために構成される使い捨てマイクロアッセイカートリッジであって、前記カートリッジは、その中に配置される流体圧回路を有し、前記流体圧回路は、それとインターフェースされた空気圧回路の制御下で動作するように構成され、前記流体圧回路は、検査アッセイ回路、陽性対照アッセイ回路、および陰性対照アッセイ回路を備える、カートリッジと、
ｂ）空気圧インターフェースを画定する１つまたはそれを上回る空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、空気圧状態を前記ホスト器具から前記空気圧回路に伝達するようにされる、空気圧ポートのアレイと、
ｃ）記ホスト器具内に配置される空気圧マニホールドであって、前記マニホールドは、そこに流体結合される複数の空気圧源を有し、複数の圧力状態で動作されるように構成され、前記空気圧インターフェースのポートを通して前記空気圧回路に流体接続される、マニホールドと、
ｄ）試料中の少なくとも１つの光学信号を検出するための検出器ヘッドであって、１〜５の検出チャネルを備える、検出器ヘッドと、
を備える、システム。
【請求項３７】
前記ホスト器具は、少なくとも１つのペルチェ熱ポンプを備える、請求項３６に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項３８】
前記マイクロアッセイカートリッジは、前記流体圧回路と流体連通し、前記ペルチェ熱ポンプと熱接触する、アッセイウェルアセンブリを備える、請求項３７に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項３９】
前記ホスト器具は、前記流体圧回路と熱接触する少なくとも１つの熱ブロックを備える、請求項３８に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項４０】
前記カートリッジは、前記流体圧回路と流体連通し、前記熱ブロックと熱接触する、核酸捕捉アセンブリを備える、請求項３８に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項４１】
前記検出器ヘッドは、前記検査試料回路および前記対照試料回路を横断する複数の離散経路上の前記マイクロアッセイカートリッジを走査するように構成され、前記離散経路はそれぞれ、少なくとも１つの基準点によって画定され、前記基準点は、ホスト器具較正の間に事前定義される空間座標である、請求項３６に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項４２】
前記空気圧インターフェースポートアレイを前記空気圧マニホールドに接合するように構成される単回使用密閉ガスケットをさらに備える、請求項３６に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項４３】
前記空気圧ポート内に配置されるエアロゾルフィルタプラグをさらに備える、請求項３６に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項４４】
約２０の空気圧ポートを備える、請求項３６に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項４５】
前記検出器ヘッドの検出チャネルはそれぞれ、励起光サンプラ鏡、中性密度フィルタ、およびＬＥＤ強度検出器を備える、ＬＥＤ強度変調回路を備える、請求項３６に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項４６】
前記カートリッジは、接地プレートに対して約１５度の角度で保持される、請求項３６に記載のマイクロアッセイシステム。
【請求項４７】
病態と関連付けられる標的蛍光信号のための制御されたアッセイを行う方法であって、
ａ）請求項３６に記載のシステムを用いて検査アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、前記標的蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第１の光チャネル内で検出され、内因性成分と関連付けられるプロセス対照蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第２の光チャネル内で検出される、ステップと、
ｂ）請求項３６に記載のシステムを用いて陽性対照蛍光信号のための陽性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、前記陽性対照蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第１の光チャネル内で検出される、ステップと、
ｃ）請求項３６に記載のシステムを用いて陰性対照蛍光信号のための陰性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、前記陰性対照蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第１の光チャネル内で検出される、ステップと、
ｄ）前記第２の蛍光プロセス対照信号が検出され、前記陽性対照の第１の蛍光信号が検出され、前記陰性対照の第１の蛍光信号が検出されない場合であって、かつその場合に限り、前記第１の標的制御信号を前記アッセイの有効結果として報告するステップと、
を含む、方法。
【請求項４８】
前記検査アッセイ回路、前記陽性対照アッセイ回路、および前記陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、最大３つのアッセイウェルをそれぞれ備える、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記最大３つのアッセイウェルはそれぞれ、特有の標的蛍光信号をアッセイするように構成される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的蛍光信号と前記陽性対照蛍光信号および前記陰性対照蛍光信号とを比較し、前記試料を前記病態に対して陽性または陰性としてスコアするステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記比較するステップは、第１の比率を計算することであって、前記第１の比率は、前記標的蛍光信号と前記陽性対照蛍光信号の比率である、ことと、第２の比率を計算することであって、前記第２の比率は、前記標的蛍光信号と前記陰性対照蛍光信号の比率である、ことと、前記第１および第２の比率と認証比率とを比較することとを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記試料は、前記第１の比率が前記認証比率よりも大きい場合、陽性としてスコアされ、前記試料は、前記第２の比率が前記認証比率未満である場合、陰性としてスコアされる、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
（技術分野）
本発明は、概して、診断アッセイにおいて使用するための光学、熱、機械、および空気流体圧システムと統合されたアッセイ対照およびコンパクトな蛍光検出器具を伴う、マイクロアッセイカートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
分子診断の役割は、今日の地球的な健康ケア環境において極めて重要である。発展途上国における死因の９５％は、感染症、例えば、急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）、マラリア、ＨＩＶ、および結核症（ＴＢ）の適切な診断およびそれらに関連するその後の処置の欠如に起因している（Ｙａｇｅｒ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  １０：１０７〜１４４，２００８）。２００９年のＨ１Ｎ１Ａ型インフルエンザパンデミックのような最近のパンデミックは、感染症を効果的に検出し、そして制御するツールの必要性を際立たせてきた。急速な病原体の変異率、非ヒト病原体のヒト病原体への形質転換、および非ヒト病原体のヒト病原体への組み換えを含む要因が、新規感染症を管理する上での新たな課題を追加した（Ｋｉｅｃｈｌｅ，ＦＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２９（３）：５５５〜５６０，２００９）。世界規模の移動性の高まりは、２００９年Ｈ１Ｎ１パンデミックの際に見られたように、発症地域から世界の他の地域への感染症の急速な広がりに拍車をかけている。感染性病原体を検出するために必要な現在の実験培養方法は、結果を提供するために、１日またはそれを上回る日数を要する。これらの問題は、感染の地球規模の広がりを防ぐために、入国港における高速でポータブルな診断現場（ＰＯＣ）デバイスの必要性を明らかにする。
【０００３】
先進国世界および発展途上世界の両方で、特定のタイプの感染症のための診断検査が、治療に対する応答を測定し、病状を監視するために、定期的に繰り返される必要がある。そのような１つのケースは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）およびＣ型肝炎等の感染についてウイルス負荷（血液ミリリットルあたりのウイルス粒子の数）を監視することにある。サハラ以南のアフリカは、ＡＩＤＳパンデミックの影響が大きい地域である。本地域の標準的検査施設や訓練された検査技師の不足は深刻な問題である。同様の問題は、米国の医療過疎地域にも存在する。地域社会全体に広められ、アクセスが容易で、場合によっては家庭でも使い得る、速くて安価な診断ツールが、病気および感染のより速い診断および監視を可能にすることでかなりの便益をもたらすであろう。
【０００４】
その誕生以降、マイクロ流体は、インビトロ診断（ＩＶＤ）のための重要なツールとなる非常に大きな可能性を示している。マイクロ流体ベースのＩＶＤの「至高の目標」は、最小限の未加工試料を使用して、複数の被分析物のための迅速、特異的、高感度、かつ定量的検査を行うことが可能であるハンドヘルド式または傾向式であって、独立型の自己較正式で自動化された安価なデバイスをもたらすことである。しかしながら、今日まで、非常に制限されたマイクロ流体デバイスのみが、そのような用途のための開発および商業化に成功を収めているにすぎない。独立型マイクロ流体デバイスの開発が直面する有意な技術的課題の１つは、空気圧、流体、機械的、電子、および光学ユニットの組み合わせを限定された空間の中に要求するシステム統合である。分析のために検査試料を効率的に調製し、標的被分析物を正確に検出することができるこれらの機能ユニットを、単一の頑丈なマイクロ流体デバイスの中でインターフェースをとり、かつ統合することは継続的課題のままである。
【０００５】
他の課題は、アッセイ認証および品質制御に関する。規制当局によって義務付けられている現在の標準では、診断ベースの健康ケアの決断において使用される全アッセイ手順の正確度および信頼性が、対照の使用を通して監視および認証されることが要求される。これらの対照は、抽出、増幅、および診断プロセスの機能性を検証する、プロセス対照ならびに陽性および陰性対照を含む。プロセス対照は、検査アッセイと同一試料に対して、そして同一検査ウェル内で行われるが、異なるセットのプライマーおよび／またはプローブを使用して、アッセイされた試料内に常時存在する対照標的を検出する。対照的に、陽性および陰性対照は、検査試料と同一プライマーおよび／またはプローブならびにウェル内に埋め込まれた既知の量のアッセイ標的（陰性対照の場合、ゼロ）を使用して、別個のアッセイウェル内で行われる。ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＢＣ  ＭＡＸ（商標）システムおよびＣｅｐｈｅｉｄ  ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）システム等のいくつかの市販のマイクロ流体診断システムでは、オンカードプロセス対照に対して行われるが、いずれのシステムも、統合された陽性および陰性対照を伴う検査カードを提供しない。外部対照は、製品パッケージ挿入物内に規定されるような第三者供給業者によって、または実際の試料を供給する顧客によって供給される付属対照キットとして、検査製造業者によっても提供され得る。
【０００６】
外部陽性および陰性アッセイ対照を用いる必要がある際、いくつかの有意な不利点が存在する。陽性および陰性アッセイ対照が、統合された検査カートリッジの一部ではないとき、固有のロット間試薬変動および／または劣化は、アッセイ結果の認証を損なわせ得る。エンドユーザにとっては、付加的な対照試薬およびデバイスを取得し、別個の対照アッセイを行うために、追加のコストおよび時間が要求される。さらに、多くの場合、対照検査の適切な頻度を判定することは、エンドユーザに任されており、ユーザに付加的負担をかける。これらの不利益は、複数のアッセイが行われるとき、ますます有意となり、リソースが不足した設定では、特に懸念される。
【０００７】
付加的課題は、携帯性である。生体外診断分析法用のプローブとしてのフルオロフォアの使用の有益性が周知であるが、そのような分析法用の最も一般的に入手可能な形式の機器は、大型で、使用が複雑で、比較的遅く、高価な共焦点光学部に依存する。これらの属性により、機器は、遠隔場所、および診療時の現場での完全一体型「サンプルツーアンサー」検査にとって不適切になり、そのような機器は、頑健、高速、コンパクト、安価、および使用容易であるよう要求される。
これらの相互に連動する問題の同時解決は、ほとんどの場合、この極めて予測不可能な技術分野で試行錯誤によって誘導される、広範な実験および開発によってのみ達成される。従って、多数の改良に対する技術上の必要があり、この改良の要素が本明細書における開示の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙａｇｅｒ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  １０：１０７〜１４４，２００８
【非特許文献２】Ｋｉｅｃｈｌｅ，ＦＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２９（３）：５５５〜５６０，２００９
【発明の概要】
【０００９】
（簡単な要旨）
本発明の実施形態は、いくつかの向上されたカートリッジ特徴を提供し、プロセス対照ならびに陽性および陰性アッセイ対照の両方をカートリッジ設計の中に統合することによって、マイクロ流体カートリッジ内の蛍光信号の確実かつ有効な検出の問題に対処する。本発明のマイクロ流体カートリッジは、分子検査のために外部アッセイ対照を用いる必要性を排除することによって、いくつかの著しい利点をエンドユーザに提供する。本発明の統合された陽性および陰性アッセイ対照はまた、診断検査結果を関心の被分析物または複数の被分析物のために陽性または陰性としてスコアするより正確な方法を提供する。
【００１０】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、概して、空気圧回路を封入する第１の成形筐体と、流体圧回路を封入する第２の成形筐体と、流体圧回路に接続される試料入口と、複数の空気流体圧膜を含む、第１および第２の成形筐体間のラミネート層と、流体圧回路に接続されるアッセイウェルアセンブリと、第１の成形筐体内の空気圧回路に接続され、空気流体圧膜の動作を制御する、空気圧パルスを受容するための空気圧ポートのアレイとから組み立てられる、マイクロアッセイカートリッジに関する。有利なこととして、空気圧回路を第１の成形筐体の中に、流体圧回路を第２の成形筐体の中に分離することは、機能故障に寄与することが発見された、空気圧ラインおよび流体圧ラインの交差を防止することによって、カートリッジの頑丈性を増加することが発見された。
【００１１】
本発明の一側面では、カートリッジの流体圧回路は、試料入口に接続される検査アッセイ回路と、試料入口に接続されない対照アッセイ回路とを含む。対照試料回路は、いくつかの側面では、陽性対照アッセイ回路および陰性対照アッセイ回路に分割されてもよい。いくつかの側面では、陽性対照アッセイ回路は、陰性対照アッセイ回路に接続される一方、他の側面では、接続されない。各アッセイおよび制御回路はさらに、複数のアッセイウェルに接続されてもよく、いくつかの側面では、各回路は、１〜３つのアッセイウェルに接続される。好ましい側面では、各回路は、３つのアッセイウェルに接続される。別の側面では、アッセイウェルはそれぞれ、付加的プロセス対照を用いるように構成される。別の側面では、陽性対照アッセイウェルは、陽性対照核酸テンプレートが埋め込まれる。
【００１２】
本発明の別の側面によると、マイクロアッセイカートリッジは、中空筐体と、筐体の内部に支持される核酸捕捉膜とから組み立てられる、核酸捕捉アセンブリを含む。いくつかの側面では、核酸捕捉膜は、シリカファイバから製作される。他の側面では、核酸捕捉アセンブリはまた、捕捉膜の上側および下側表面を支持する、２つの支持媒体を含む。支持媒体は、「フリット」と称され、ＰＯＲＥＸ（登録商標）から製作されてもよい。代替として、支持媒体は、ポリプロピレンワッシャ型構造であってもよい。
【００１３】
他の側面では、マイクロアッセイカードはまた、標的配列の増幅および蛍光検出の両方を実施するための複数のアッセイウェルを伴うＰＣＲウェル層を組み込む、アッセイウェルアセンブリを含む。いくつかの側面では、ＰＣＲ増幅は、例えば、定量的ＰＣＲを行うための、終点ＰＣＲであって、他の側面では、リアルタイムＰＣＲである。
【００１４】
さらに他の側面では、マイクロアッセイカードの第１の成形筐体は、アッセイウェルアセンブリのアッセイウェルを覆う、光学検出ウィンドウを含む。光学検出ウィンドウは、筐体の上側表面内の切り込みが、上部から底部に内向きに傾斜する、角度付けられた側面を作成するように、筐体の下側表面内の切り込みより大きい、筐体内の菱形形状の切り込みから形成される。そのような角度付けられた側面を伴うウェルから放出される蛍光光の検出は、有意に向上されることが見出された。さらに、ウェルの菱形形状の幾何学形状は、気泡の取り込みを伴わずに、ウェルの湿潤を有利に促進することが見出されて。マイクロ流体デバイス内の気泡形成は、当技術分野において長期かつ著しい技術的問題となっている。別の側面では、光学的に透明なカバー層が、アッセイウェルと第１の筐体内の光学ウィンドウとの間に配置される。カバー層は、有利には、光学検出に干渉せずに、材料がアッセイウェルから漏出しないように防止する。
【００１５】
本発明の別の側面によると、複数の試薬パックが、上側の成形筐体の中に装填される。これらの試薬パックは、細胞溶解および核酸抽出、洗浄、ならびに捕捉膜からの溶出のために要求されるもの等、試料調製のために必要な全液体試薬を含む。本発明のマイクロアッセイカードは、１〜６つの試薬パックを保持するように構成される。いくつかの側面では、試薬パックは、箔から形成され、第１の成形筐体の中に糊着され、気密シールを形成してもよい。他の側面では、鋭利物が、空気圧起動によって要求されるとき、パックを穿刺し、試薬を放出するために、各試薬パックの下方に配置される。鋭利物は、金属（例えば、鋼鉄または同等物）から形成され、筐体の底部に対して約７５度の角度で突出する、返しを有してもよい。本構成は、箔材料の優れた剪断を達成し、穿刺された縁がそれ自体に再密閉し、液体内容物の放出を妨害しないように防止することが見出された。さらに他の側面では、バネが、鋭利物と箔パックとの間に配置され、パックを時期尚早または不適切な破裂から保護してもよい。バネは、ホスト器具に由来する空気圧の力によってのみ克服される、内部バネ力を有する。いったん本力が克服されると、バネは、下方に急「スナップ」され、箔パックの破裂を良好に加速させる。
【００１６】
本発明のさらに他の側面では、マイクロアッセイカードの空気圧ポートは、液体膨張性材料から形成され得る、エアロゾルフィルタプラグで嵌合される。これらのプラグは、核酸等の液体ならびにエアロゾル化材料を捉え、したがって、器具−カートリッジ交互汚染の可能性を大幅に減少させる。
【００１７】
別の側面では、空気流体圧膜および流体圧回路機能を制御するために使用される、陽圧および陰圧状態は、＋１５０〜−５０ｋＰＡに及び、例えば、いくつかの実施形態では、陽圧および陰圧状態は、＋１５０、＋１００、＋７０、０（大気）、−３５、および−５０ｋＰａから成る群から選択される。
【００１８】
別の側面では、マイクロアッセイカードは、カードに固定された単回使用密閉ガスケットを用いて、ホスト器具に密閉される。
【００１９】
本発明の他の実施形態は、概して、ホスト器具にドッキングし、検査アッセイ回路を含む流体圧回路と、陽性対照アッセイ回路および陰性対照アッセイ回路に分割された対照アッセイ回路とを有し、流体圧回路は、それぞれ、ホスト器具からの空気圧状態を伝達する、空気圧ポートとインターフェースをとる空気圧回路によって制御される、使い捨てマイクロアッセイカートリッジと、カートリッジの空気圧回路および空気圧流体源に接続し、いくつかの空気圧状態をカートリッジに伝達する、空気圧マニホールドを伴う、ホスト器具と、検査試料中の光学信号を検出するための１〜５つの検出チャネルを伴う、検出器ヘッドとを含む、試料アッセイを行うためのマイクロアッセイシステムに関する。
【００２０】
他の側面では、ホスト器具はまた、熱循環能力をアッセイウェルアセンブリのウェルに提供し得る、少なくとも１つのペルチェ熱ポンプを含む。他の側面では、ホスト器具はまた、流体圧回路の領域を加熱し得る、少なくとも１つの熱ブロックを含む。細胞溶解および核酸抽出手順の間に熱を提供することは、効率を有意に増加させることが見出された。
【００２１】
他の側面では、ホスト器具の検出器ヘッドは、空間座標がホスト器具較正の間に事前定義される、基準点によって画定される離散経路上のカートリッジを走査する。そのような短離散経路に沿って走査することは、カートリッジ検出ウィンドウの全長を横断する連続経路とは対照的に、カートリッジ走査を行うために要求される時間を有意に短縮することが見出された。そのような増加した効率は、走査されるべきアッセイウェルの数がシステム内で増加するにつれて、ますます重要となる。
【００２２】
さらに他の側面では、本システムは、カートリッジの空気圧インターフェースポートをホスト器具の空気圧マニホールドに接合するための単回使用ガスケットと、ポートの中に設定され、汚染を防止するためのエアロゾルフィルタプラグとを含んでもよい。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、概して、病態と関連付けられる標的蛍光信号のための制御されたアッセイを行う方法であって、前述のシステムを用いて検査アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、標的蛍光信号は、存在する場合、検出器ヘッドの第１の光チャネル内で検出され、内因性成分と関連付けられるプロセス対照蛍光信号は、存在する場合、該検出器ヘッドの第２の光チャネル内で検出される、ステップと、本システムを用いて陽性対照蛍光信号のための陽性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、陽性対照蛍光信号は、存在する場合、該検出器ヘッドの第１の光チャネル内で検出される、ステップと、本システムを用いて陰性対照蛍光信号のための陰性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、陰性対照蛍光信号は、存在する場合、該検出器ヘッドの第１の光チャネル内で検出される、ステップと、第２の蛍光プロセス対照信号が検出され、陽性対照の第１の蛍光信号が検出され、陰性対照の第１の蛍光信号が検出されない場合であって、かつその場合に限り、第１の標的制御信号を有効アッセイ結果として報告するステップとを含む、方法に関する。
【００２４】
本発明の一側面では、検査アッセイ回路、陽性対照アッセイ回路、および陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、最大３つのアッセイウェルを含み、これらそれぞれは、特有の標的の分析のためのものである。
【００２５】
本発明の別の側面によると、本方法は、標的蛍光信号と陽性対照蛍光信号および陰性対照蛍光信号を比較するステップであって、試料を病態に対して陽性または陰性としてスコアするステップを含む。本発明のさらに他の側面では、この比較するステップは、標的蛍光信号と陽性対照蛍光信号の比率である、第１の比率を計算することと、標的蛍光信号と陰性対照蛍光信号の比率である、第２の比率を計算することと、第１および第２の比率と認証比率を比較することとを含む。本発明のさらに他の側面では、試料は、第１の比率が、認証比率よりも大きい場合、陽性としてスコアされ、試料は、第２の比率が認証比率未満である場合、陰性としてスコアされる。
【００２６】
本発明の別の側面によると、本方法は、標的蛍光信号と陽性対照蛍光信号を比較し、試料標的の相対的存在量を定量化するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ドッキングベイ内へのカートリッジの動画的挿入を示す、本発明の器具およびマイクロ流体カートリッジの斜視図である。
【００２８】
【図２】図２は、装置の機能ユニットの概観を提供する、ブロック図である。
【００２９】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、本発明の検出システムと併用するための挿入可能マイクロアッセイカートリッジの斜視図である。
【００３０】
【図４】図４は、カバー蓋が除去され、種々の統合された特徴を示す、マイクロアッセイカートリッジの斜視図である。
【００３１】
【図５】図５は、アセンブリの層状構造を描写する、マイクロアッセイカートリッジの分解図である。
【００３２】
【図６Ａ】図６Ａは、マイクロアッセイカートリッジの第１の成形筐体の下側表面の詳細を示す、平面図である。
【００３３】
【図６Ｂ】図６Ｂは、マイクロアッセイカートリッジの中央ラミネート層の下側表面の詳細を示す、平面図である。
【００３４】
【図６Ｃ】図６Ｃは、マイクロアッセイカートリッジの第２の成形筐体の上側表面の詳細を示す、平面図である。
【００３５】
【図７】図７は、マイクロアッセイカートリッジの機能特徴を弁および流体論理のシステムの中に統合する、一実施形態の略図である。
【００３６】
【図８Ａ】図８Ａは、核酸捕捉アセンブリの構成要素を描写する、分解等角図である。
【００３７】
【図８Ｂ】図８Ｂは、核酸捕捉アセンブリの断面図である。
【００３８】
【図９】図９は、アッセイウェルアセンブリの斜視図である。
【００３９】
【図１０】図１０は、ドッキングベイを伴う浮動台、光学部ベンチ、および器具シャーシの簡易表現であって、これらの構成要素が地面に対して角度「シータ」で載置され得ることを概念的に実証する。
【００４０】
【図１１】図１１は、加熱器ブロックおよびペルチェ熱ポンプアセンブリを分解図において示す。
【００４１】
【図１２】図１２は、器具締め付け機構と係合されたマイクロアッセイカートリッジを示す、分解図である。
【００４２】
【図１３】図１３は、二重光チャネルを伴う検出器ヘッドの斜視図である。内部構成要素を視認するために、筐体の一方の半分が除去されている。
【００４３】
【図１４】図１４は、二重光チャネルおよびＬＥＤ強度制御回路を伴う蛍光検出器の内部光学構成要素の概略図である。
【図１５】図１５は、統合された検査アッセイ回路および対照アッセイ回路を伴う、一般的マイクロアッセイデバイスの一実施形態の略図である。
【００４４】
【図１６】図１６は、統合された検査アッセイ回路および対照アッセイ回路を伴う、一般的マイクロアッセイデバイスの別の実施形態の略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（詳細な説明）
定義
検査試料：検査試料は、臨床標本であり得る生物学的試料または「バイオ試料」を含む。代表的なバイオ試料は、例えば、血液、血清、血漿、バフィーコート、唾液、傷からの滲出液、膿、肺および他の呼吸器吸引液、鼻吸引液および洗浄液、瘻孔ドレナージ、気管支肺胞洗浄液、痰、中耳および内耳吸引液、嚢胞吸引液、脳脊髄液、便、下痢液、尿、涙、乳分泌液、卵巣内容物、腹水、粘液、胃液、胃腸管内容物、尿道分泌物、滑液、腹膜液、胎便、腟液または分泌液、羊膜液、精液、陰茎分泌物、または同等物の被検物を含み、検査され得る。スワブからのアッセイ、または粘膜分泌および上皮を代表する洗浄液が受け入れ可能で、例えば、喉、扁桃腺、歯肉、鼻腔、膣、尿道、直腸、下部結腸、および眼の粘膜スワブや、あらゆる種類の組織標本のホモジネート、溶菌液、消化液もまたそうである。哺乳動物細胞は、受け入れ可能な試料である。生理学的または生物学的な液体の他に、水、工業廃棄物、食品、ミルク、空気濾過物等の試料もまた検査標本である。いくつかの実施形態では、検査試料は、デバイス内に直接載置され、他の実施形態では、分析前処理が考慮される。
【００４６】
バイオアッセイ標的分子：すなわち、「対象となる核酸」または「標的分子」または「検査被分析物」は、単一もしくは複数の核酸を含む。標的核酸は、遺伝子、遺伝子の一部、遺伝子の調節配列、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｃＤＮＡを含み、単鎖、２本鎖、または３本鎖であり得る。いくつかの核酸標的は、多形性、欠失、および代替的スプライス配列を有する。
【００４７】
病原体：感染または感染症に関連付けられる有機体。
【００４８】
病態：健康の欠如、すなわち、病気、虚弱、病的状態、または潜在的な罹患率と関連する遺伝形質によって特徴付けられる哺乳動物宿主の状態。
【００４９】
様々な実施形態は、１つまたはそれを上回る標的感染因子を含む検査試料を分析可能なマイクロ流体デバイスを含む。例示的な標的感染因子は、ＤＮＡベースのゲノムまたはＲＮＡベースのゲノムのいずれかを有する微生物および／またはウイルスを含む。いくつかの実施形態では、好適なウイルスは、限定されないが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＩおよびＩＩ型、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ＡおよびＢ型、ヒトメタニューモウイルス（ＭＰＶ）、ならびに／もしくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉおよび／またはＩＩ型を含む。
【００５０】
他の実施形態では、試料中に存在するウイルス感染因子は、限定されないが、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）ＡおよびＢ型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、アリーナウイルス、風疹ウイルス、レオウイルス、ノロウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ＭＰＶ）、単純ヘルペスウイルス１型および２型（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、狂犬病ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、マールブルグウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、エプスタイン―バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エボラウイルス、コロラドダニ熱ウイルス（ＣＴＦＶ）、および／またはライノウイルスを含む。
【００５１】
異なる実施形態では、検査試料中の細菌感染因子は、限定されないが、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、カンピロバクター、クレブシエラ、シュードモナス、リステリア菌、結核菌、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリジウム菌、百日咳菌、バクテロイデス、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、Ｂ−溶血性連鎖球菌、コリネバクテリア、レジオネラ、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、クラミジア、クロストリジウム・ディフィシル、ガードネレラ、膣トリコモナス、淋菌、髄膜炎菌、ヘモフィルスインフルエンザ、エンテロコッカスフェカリス、プロテウス・ブルガリス、プロテウスミラビリス、ヘリコバクター・ピロリ、トレポネーマ・パラジウム、ライム病菌、回帰熱ボレリア、リケッチア病原体、ノカルジア、放線菌および／またはアシネトバクターを含む。
【００５２】
さらに別の実施形態では、検査試料中の真菌感染因子は、限定されないが、クリプトコッカスネオフォルマンス、ブラストミセスデルマティティディス、ヒストプラスマカプスラーツム、コクシジオイデスイミチス、パラコクシジオイデスブラジリエンシス、カンジダアルビカンス、アスペルギルスフミガーツス、藻菌類（クモノスカビ）、スポロトリックスシェンキイ、クロモミコーシス、および／またはマズラ菌を含む。
【００５３】
さらに別の実施形態では、検査試料中に存在する寄生因子は、限定されないが、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、オンコベルバ・ボルブルス、リーシュマニア、トリパノソーマ属、住血吸虫属、赤痢アメーバ、クリプトスポリジウム、ジアルジア属、トリコモナス属、大腸バランチジウム、バンクロフト糸状虫、トキソプラズマ属、蟯虫、回虫、鞭虫、メジナ虫、吸虫、広節裂頭条虫、テニア属、ニューモシスティス・カリニ、および／またはアメリカ鉤虫を含む。
【００５４】
アッセイ対照：すなわち、「実行」対照または「増幅」対照は、陽性対照および陰性対照を含む。対照材料は、商業的に得られるか、内部で調製されるか、または他の源から得られてもよい。陽性対照材料は、精製された標的核酸、標的核酸を含む患者標本、または好ましくは不活性化された関心の微生物を、標的を含んでいないことが既知の標本の中に加えることによって産生される対照であってもよい。陽性対照は、アッセイの検出下限近傍の濃度にあるように構築されてもよい。濃度は、一貫した陽性結果を提供するために十分に高いが、検出システムを検出限界近傍に曝すために十分に低くあるべきである。複数のシステムに関して、被分析物毎の陽性対照が、含まれる。陽性対照ＰＣＲ反応は、アッセイされるべき標的を含み得る、検査試料と同一プライマー、プローブ、および酵素を使用する。陽性対照は、アッセイされている試料と別個の反応ウェル内で生じる必要がある。
【００５５】
水または緩衝液等の空の非テンプレート対照が、陰性対照の形態として使用されてもよい。陰性対照はまた、試薬によって生成される背景信号を補償するために使用されてもよい。陰性対照は、抽出プロセスを通して採取され、反応試薬の全てを含んでいてもよい。陰性対照はまた、既知の非標的生物または核酸を含む非感染個人または標本からの患者標本等、既知の非標的核酸を含む標本であってもよい。陰性対照ＰＣＲ反応は、アッセイ標的と同一プライマー、プローブ、および酵素を使用し、アッセイされている試料と別個の反応ウェル内で生じる必要がある。
【００５６】
プロセス対照：すなわち、「内部対照」または「手順対照」は、アッセイされた試料内に常時存在するか、または核酸抽出に先立ってアッセイ試料に添加される、対照標的を指す。本対照は、抽出、増幅、および検出プロセスの機能性を検証する。プロセス対照は、アッセイ標的と異なるプライマーセットを使用しなければならない。システムに応じて、プロセス対照は、アッセイ標的と異なるプローブを使用する必要があってもよい。
【００５７】
核酸：用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、限定されないが、本明細書では、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む任意の長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を含むものとして用いられる。比較的短い核酸ポリマーは、多くの場合、「プライマー」または「プローブ」として用いられる。その定義は、メチル化またはキャップ付きであり得る天然源からの核酸と、代替または誘導体化核酸塩基を含み、ペプチド骨格に基づき得る合成形態とを含む。核酸は、概して、アデノシン、グアニン、チミン、およびシトシンと、それらの「デオキシ」型のポリマーであるが、ウラシルおよびキサンチン等の他のピリミジン、またはデオキシイノシン等のスペーサーおよび汎用塩基をも含み得る。デオキシ核酸は、相補的配列の有無、ｐＨ条件、塩濃度、温度、およびホルムアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、およびＮ−メチルピロリジノン等のある種の有機溶剤の有無に応じて、単鎖または２本鎖でもよい。
【００５８】
「標的核酸配列」または「テンプレート」：本明細書で使用されるように、用語「標的」は、ポリメラーゼによってアッセイ中で増幅され、検出されようとするバイオ試料中の核酸配列を意味する。「標的」分子は、試料中の「スパイク」または未同定被験物として存在し、合成または有機体原産のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡから成り得る。「有機体」は、哺乳類に限定されるものではない。標的核酸配列は、増幅の際の相補的配列の合成用のテンプレートである。ゲノムの標的配列は、慣例的に５’末端から３’末端まで掲載される塩基の配列リストによって示される。
【００５９】
リポーター、「標識」、または「タグ」：物理的、化学的、電磁的および他の関連する分析技法によって検出され得るバイオ分子またはバイオ分子の修飾を意味する。検出可能なリポーターの例は、限定されないが、放射性同位体、蛍光体、発色体、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、染色された粒子、量子ドット（ＱＤｏｔ）、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補因子、核酸プローブに連結された酵素、および酵素基質を含む。リポーターは、試薬としてバイオアッセイに用いられ、多くの場合、別の分子に共有結合によって取り付き、固相上に吸着され、または特定の親和性結合によって結合される。
【００６０】
プローブ：「プローブ」は、室温で安定な２重らせんを形成するのに十分な相補性を持った相補的塩基対合により、標的核酸に結合できる核酸である。プローブは、リポーター群によって標識され得る。プローブに取り付けられ得る好適な標識は、限定されないが、放射性同位体、蛍光体、発色体、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、余因子、および酵素基質を含む。プローブの配列、長さ、およびハイブリダイゼーション条件の選定用ツールは、概して、当業者に周知である。
【００６１】
増幅：本明細書で用いられるように、用語「増幅」は、核酸配列濃度の初期濃度に対して核酸配列濃度における増大をもたらす「テンプレート依存プロセス」を意味する。「テンプレート依存プロセス」は、「プライマー」分子の「テンプレート依存伸長」を含むプロセスである。「プライマー」分子は、標的配列の既知部分と相補的な核酸の配列をいう。「テンプレート依存伸長」は、新たに合成される核酸ストランドの配列が、標的核酸およびプライマーの相補的塩基対合則で規定されるＲＮＡまたはＤＮＡの核酸合成を意味する。
【００６２】
アンプリコンは、先行技術増幅手段の２本鎖ＤＮＡ産物を意味し、ＤＮＡおよびＲＮＡテンプレートから形成される２本鎖ＤＮＡ産物を含む。
【００６３】
両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）アンプリコンは、タグ付きプライマー対が共有結合的に組み込まれ、第１のプライマーがペプチドハプテンまたはエピトープと結合し、第２のプライマーが、親和性リポーター、タグまたは「リガンド」と結合する、増幅手段の２本鎖ＤＮＡ産物を意味する。本明細書で使用されるように、両側アンプリコンはヘテロ二官能性」テザーとして機能し、固体基質上に分子検出複合体を形成する。
【００６４】
プライマー：本明細書で使用されるように、好適なポリメラーゼおよび補因子の存在下でテンプレート指向ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る単鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド複合体である。プライマーは、概して、少なくとも７ヌクレオチドの長さを有し、より典型的には、長さが１０〜３０ヌクレオチドまたはそれより長い。用語「プライマー対」は、増幅されるべきＤＮＡテンプレートの５’末端の相補体とハイブリダイズする５’「順」または「上流」プライマーを含む１組のプライマーと、増幅されるべき配列の３’末端とハイブリダイズする３’「逆」または「下流」プライマーとを意味する。両方のプライマーとも５’および３’末端を有し、しかも、プライマー伸長は、常に５’から３’に向かって起こることに留意されたい。したがって、５’末端またはその近傍での化学的結合は、好適なポリメラーゼによるプライマー伸長を阻害しない。プライマーは、「順」および「逆」プライマーの主体が互換性のプライマー対を指して「第１のプライマー」および「第２のプライマー」と称され得る。追加的プライマーが、ネステッド増幅に用いられ得る。
【００６５】
ポリメラーゼは、プライマー分子の３’ヒドロキシル末端を延長するために、ヌクレオシド３リン酸またはデオキシヌクレオシド３リン酸を組み込む機能で定義される酵素である。ポリメラーゼに関する一般論については、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．を参照されたい。ポリメラーゼの例は、限定されないが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ型、「クレノウ」断片、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼ、および逆転写酵素を含む。逆転写酵素の例は、ヒト免疫不全ウイルス１型由来のＨＩＶ−１逆転写酵素、テロメラーゼ、モロニーマウス白血病ウイルス由来のＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、およびニワトリ骨髄芽球症ウイルス由来のＡＭＶ逆転写酵素を含む。
【００６６】
なお、逆転写酵素は、ＲＮＡ標的に対しポリメラーゼ連鎖反応法を適用するための研究に一般に用いられることに留意されたい。古典的なＰＣＲ法は、ＤＮＡに直接的にのみ適用することができるが、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する際に逆転写酵素を用いることによりＲＮＡ標的からのＰＣＲ分析が可能となる。この技法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ）と総称される。
【００６７】
（核酸に関して）相補的とは、２重らせんを形成するようにハイブリダイズすることができる２つの単鎖核酸配列を意味する。２つの相補ストランドの２重らせんにおける塩基対のマッチングは、必ずしも絶対的なものとは限らない。ハイブリダイゼーションの選択性は、アニーリング温度、塩濃度、および溶媒の関数であり、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドのストレッチにわたって、わずか５５％程度の同一性があるとき、概して低いストリンジェンシーの下で生じ得る。ストリンジェンシーは、当業者に周知の方法で増大させることができる。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照されたい。プライマーのハイブリダイゼーションについて述べると、「完全に相補的」なプライマーは、プライマーの全長にわたって完全に相補的な配列を有し、ミスマッチを有さない。「ミスマッチ」とは、プライマー中の塩基と、それがアラインされる標的核酸中の塩基とが相補的ではないことを意味する。
【００６８】
事前装填は、試薬が、デバイスの製造中、例えば、その最終使用の前にデバイスに添加されることを意味する用語である。従って、固体試薬は、例えば、試薬中の溶媒が蒸発するように試薬の溶液を乾燥させることによってデバイス上に搭載され得る。代わりに、試薬は、全内容が参照により本明細書に組み込まれるＢａｔｔｒｅｌｌらの米国特許出願公開第２０１２／０１５６７５０号に開示されるような脱水形態で事前装填されてもよい。
【００６９】
試薬は、酵素を含む、反応に使用される任意の化学的または生化学的物質を広く意味する。試薬は、それ自体が監視され得る単一薬剤（例えば、加熱される際に監視される物質）、または２つもしくはそれを上回る薬剤の混合物を含むことができる。試薬は、生物（例えば細胞）または非生物であってもよい。核酸増幅反応用の例示的試薬は、限定されないが、緩衝液、（マグネシウム塩等の）金属イオン、キレート剤、ポリメラーゼ、プライマー、テンプレート、ヌクレオチド３リン酸、標識、染料、ヌクレアーゼ阻害物質、および同等物を含む。酵素反応用の試薬は、例えば、基質、色原体、補因子、結合酵素、緩衝液、金属イオン、阻害剤、および活性化剤を含む。全ての試薬が反応物質とは限らない。
【００７０】
特異性：標的バイオマーカーの真の陽性シグナルを任意の背景誤信号または干渉信号から確実に区別するアッセイの能力を意味する。
【００７１】
感度：負が、もはや正から確実に区別できなくなるアッセイの検出下限値を意味する。
【００７２】
安定性：保管中、例えば、活性、濃度、分解、粘度、ｐＨ値、または粒子組成等のパラメータで測定される任意の組成的変化を意味し、１０％以上の経時変化は、不安定性を示す。１０％に等しいか、またはそれを下回る変化は、安定性を示唆する。安定性が測定される期間は、組成物の意図された有用性に応じて相対的なものである。より高い温度での加速安定性は、時として、実際に測定されるよりも、長期間にわたる安定性を推定するより迅速な方法である。
【００７３】
エンドポイント：「エンドポイント」または「データポイント」は、定性的または定量的アッセイのいずれかからの「結果」の省略形として本明細書で使用され、一定の平坦域または反応物のレベルが達成される安定したエンドポイントと、速度反応、すなわち、反応物または産物の出現または消失速度が時間の関数（すなわち、傾き）であるデータポイントとの両方を意味し得る。
【００７４】
マイクロ流体カートリッジ：流体構造と、マイクロ流体的な寸法を有する内部チャネルとを有する、「デバイス」、「カード」、または「チップ」。これらの流体構造は、例えば、チャンバ、弁、ベント、ビア、ポンプ、注入口、ニップル、および検出手段を含み得る。概して、マイクロ流体チャネルは、約５００μｍよりも小さい、典型的には約０．１μｍ〜約５００μｍの、少なくとも１つの内部断面寸法を有する流体通路である。マイクロ流体チャネルは、６００μｍより小さい少なくとも１つの内部断面寸法を有する流体通路である。マイクロ流体流動様式は、ポアズイユ流または「層状」流によって特徴付けられる。粒子体積率、および、粒子径に対するチャネル径の比（Ｄ／ｄ）は、流れ特性に対し測定可能な影響を有する（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるＳｔａｂｅｎ  Ｍ  Ｅら（２００５）「Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ  ｆｌｏｗ  ｉｎ  ｎａｒｒｏｗ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．」Ｉｎｔｌ  Ｊ  Ｍｕｌｔｉｐｈａｓｅ  Ｆｌｏｗ  ３１：５２９〜４７、およびその引用文献参照）。
【００７５】
マイクロ流体カートリッジは、レーザステンシル、エンボス加工、スタンピング、射出成形、マスキング、エッチング、および三次元ソフトリソグラフィー等の技法を用いて、様々な材料から作られ得る。積層マイクロ流体カートリッジはさらに、接着剤中間層、および配向ポリプロピレンの圧力処理による等、熱的接合法により作られる。積層成形マイクロ流体カートリッジのマイクロアーキテクチャは、異なり得る。
【００７６】
マイクロ流体チャンネル（「マイクロチャンネル」とも称される）：可変長であるが、５００μｍよりも小さい１つの断面寸法を有する流体チャネルである。マイクロ流体チャネル内のマイクロ流体的な流体の流れ挙動は、高度に非理想的で層状であり、端から端までの圧力低下または断面積よりも、壁の濡れ性、粗さ、液体の粘度、接着性、粘着性により多く依存し得る。マイクロ流体の流動様式は、多くの場合、チャネル内の「仮想液体壁」の存在と関連する。しかしながら、より大きなチャネルでは、１０ｐｓｉまたはそれを上回るヘッド圧が、アッセイのすすぎ工程で重要であり得るような乱流に接する遷移流様式を生成することができる。
【００７７】
押出成形によって形成された層で構成されるマイクロチャネルは、より丸みを帯びたチャネルプロファイルと、各「ビア」の半径とを有していてもよい。射出成形部品の内部チャネル表面は、幾分より滑らかである。チャネルの流れ特性は、マイクロ流動様式における大きな表面効果のため奥深い。表面張力と粘度とが合わさって、表面粗さ効果となる。チャンネルの最も狭い寸法が、流れに最も大きな影響を有する。したがって、長方形または円形の断面プロファイルに基づくチャネル内の流れは、対角幅または直径によって制御されることとなり、設計は、典型的には、この挙動を利用するように変更される。流れ方向への先細りの減少は、２００ミクロンより小さな直径に対しウィッキング効果をもたらす。逆に、流れは、圧力が印加されない限り、バルブを形成するようにチャネルを利用することによって停止され得る。チャネル内のビアは、固体状逆止弁の一種として、方向流れを促進するように設計することができる。
【００７８】
本明細書で使用されるように、用語「下流」は、使用時に、試料がデバイスの異なる部分を通して逐次的に通過することを意味する。用語「下流」は、その範囲内に、直接流体連通しているデバイスの２つの部分を含むが、２つの部分が、例えば、弁またはデバイスの別の部分によって分離されている場合もその範囲内に含む。用語「統合」は、例えば、デバイスの同じ部分が試料をフィルタリングするのに役立ち、また溶解ユニットとして機能するように、デバイスの２つの異なる部分が単一のユニットに合わされたことを意味する。用語「統合」が、核酸増幅ユニットと組み合わせて本発明の第１および第２の側面のデバイスに適用されるとき、それは、システムの２つの部分が、使用時に互いに流体連通するように、互いに接続されていることを意味する。別の側面において、「統合」という用語は、デバイスの異なる部分が、好ましくは、共通の基板上に形成されていることを意味する。用語「接続される」は、デバイスの２つの部分に適用されるとき、２つの部分が（例えば、直接接合される、またはチャネルを介して接合されるかのいずれかによって）互いに直接流体連通し得るか、または、例えば、弁またはデバイスの別の部分によって互いに分離され得ることを意味する。好ましくは、用語「に接続された」は、デバイスの２つの部分が互いに直接接合されていることを意味する。
【００７９】
マイクロ流体ポンプ：流体の動きを強制することを目的とした、例えば、バルブ、ベローズ、ダイヤフラム、またはバブルを含み、ポンプのサブ構造は、１ミリメートルより小さい厚さまたは他の寸法を有する。そのようなポンプは、ともに本出願人に譲渡され、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＷｅｉｇｌの米国特許第６，７４３，３９９号およびＳａｌｔｓｍａｎの米国特許出願第２００５／０１０６０６６号に記載の機械的に作動する再循環ポンプを含む。このようなポンプは、ロボット操作または手動で操作され得る。電気浸透ポンプもまた、提供される。このようなポンプは、外部ドライブの代わりに、可溶化した試薬や、マイクロ流体デバイスに基づくアッセイ中の試料の流れを推進するように使用され得る。
【００８０】
ベローズ（「フィンガ」）ポンプ：空洞として形成されたデバイスであり、多くの場合、形が円筒状で、流体接続されていない第１および第２の半チャンバ（ｈａｌｆ−ｃｈａｍｂｅｒ）を形成するよう、エラストマーダイヤフラムにより冠状セクションに２分されている。ダイヤフラムは、第１の半チャンバに接続された空気圧パルス発生器によって制御される。ダイヤフラムより上の正圧がそれを膨張させて第２の半チャンバの内容物を移動させ、負ゲージ圧（吸引圧）がダイヤフラムを後退させて第２の半チャンバを拡大し、流体を引き込む。半チャンバについて、ダイヤフラムの有効面積は、正の圧力下における体積変位と吸引圧力下における体積変位との小さい方であり、したがって、第１および第２の半チャンバがおおよそ対称、またはダイヤフラムの上下の体積が等しいときに最適となるものと理解されるべきである。第２の半チャンバは、流体の注入口と排出口とに接続されている。流体の注入口と排出口は、別個のポートでも単一のポートでもよいが、いずれの場合も、弁の制御下にある。上述したように、空気パルス発生器は、概して、これもまた弁付きのマイクロチャネルによって、第１の半チャンバに空気圧接続される。完全な装置では、空気圧作動は、プログラム可能である。このように、パルス発生器によって使用されるプログラム可能な空気圧論理は、信号でダイヤフラムを作動させ、信号で弁を開閉させる２つの機能を有する。パルス発生器がカートリッジから外されるときには、ニップルまたは注入口と、空気マニホールドと、電磁弁とが設けられる。
【００８１】
使用時において、流体は、陰圧がダイヤフラムに印加されたとき（または、流体が第２のベローズポンプで押し込まれたときには受動的に）、入口弁を通りベローズポンプの第２の半チャンバに入る。次いで、正圧がダイヤフラムに印加されたときに、チャンバの流体内容物は、流出口弁を通って外に移動する。同様に、正および負の圧力信号は、弁の開閉を制御する。ダイヤフラムに正および負の圧力パルス列を供給することにより、流体がベローズポンプチャンバの内および外に動かされ得る。この流体の動きは、同期した弁論理の適用と、それによるポンプ作用によって指向的となる。
【００８２】
マイクロ流体弁：少なくとも１つの寸法が５００μｍより小さい流体圧、機械、空気圧、磁気、および静電アクチュエータ流れコントローラの属を含む。フラップ弁の代表的な属は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４３１，２１２号に記載されている。逆止弁もまた、含まれる。弁の１つのクラスは、フローチャネルおよび制御チャネルが交差し、制御チャネル内の作動力に応答して流路内に偏向または流路外に退避させることができるエラストマー膜によって分離された構成を意味する。マイクロ流体弁のの種を記載する特許は、そのいくつかがともに本出願人に譲渡され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９７１，３５５号、第６，４１８，９６８号、第６，５１８，９９号、第６，６２０，２７３号、第６，７４８，９７５号、第６，７６７，１９４号、第６，９０１，９４９号、ならびに米国特許出願第２００２／０１９５１５２号および第２００５／０２００５８１６号等である。
【００８３】
逆止弁：一方向弁である。ボールスプリング弁、フラップ弁、およびフリップフロップ弁のマイクロスケール版は、逆止弁である。
【００８４】
受動的シャットオフ弁：浸漬したとき、いずれの方向にもさらなる流れを遮断するためマイクロチャネルを閉じるように膨潤するマイクロ流体チャネル内の水和性インサートまたはコーティングである。同様に、マイクロチャネルの壁上の疎水性材料のリングから成る「表面張力弁」は、試薬の流れを遅延または停止させることが開示されている。流れの停止はまた、マイクロ流体チャネル径のテーパを広げることによって達成され得る。
【００８５】
自己プライミング：チャネルが湿潤性となり、チャネルに呼び水を差すことを概して必要とせずに毛細管流れが始まるような材料から製作されるか、またはそのような処理を施されたマイクロ流体チャネルを意味する。
【００８６】
ビア：１つの基質層から、上または下の別の基質層に流体経路を提供するマイクロ流体チャネルのステップ、層から構築された積層デバイスの特徴。
【００８７】
試薬パックまたはリザーバ：ダイヤフラムを加圧することにより試薬を送達するために使用されるオンボード試薬パックであって、ダイヤフラムにかかる圧力が「ピロー」を破裂させるような金属シェブロン等の「鋭利物」を並置してもよい（ピロー参照）。これらは、指向性の流体流れ、および試薬送達を生成するため、逆止弁または閉鎖可能なベントと併用され得る。変形可能なフィルムの好適な材料は、パラフィルム、ラテックス、フォイル、およびポリエチレンテレフタレートを含む。変形可能なフィルムを選択する際の主な要因は、降伏点および変形緩和係数（弾性率）を含む。
【００８８】
廃棄物チャンバまたは「パック」：排出される試料、すすぎ液、および廃棄物試薬を隔離するための入れ物として機能する空洞またはチャンバである。通常は、ウィッキング材または吸収性詰め物も含む（ウィック参照）。廃棄物パックはまた、マイクロ流体デバイスの本体に封着された弾性分離膜下で密封され得る。この内膜は、吸水性材料が膨張するにつれて膨張し、それにより廃棄物を封入する。分離膜の外側の空洞は、廃棄物が封じ込められ、隔離されるように大気に解放される。廃棄物パックは、随意に、乾燥状または液体状の滅菌剤を含んでいてもよい。
【００８９】
ウィック：マイクロ流体ポンプの代わりに、またはこれと協調して、毛細管湿潤により流体流れを推進させるために使用される吸水性の材料である。吸水性コアは、典型的には、天然または合成繊維の繊維ウェブもしくは吸収性詰め物を含み、また、通常、「ヒドロゲル」、「超吸収体」、または「ヒドロコロイド」材料と呼ばれる特定の吸収性ゲル化材料を多くの場合含む。材料は、紙、スポンジ、おむつ材料、コンテックワイプ（Ｃｏｎｔｅｃ−Ｗｉｐｅ）、およびその他を含む。硫酸カルシウム、硫酸カルシウム、シリカゲル等の乾燥剤が、単独で、または吸水性材料と組み合わせて、用いられ得る。
【００９０】
トラップ：ベントから廃棄物リザーバをさらに分離するダムの付いた流体トラップ。
【００９１】
ベント：内部空洞と大気との間を相互連通する細孔。「衛生的」または「分離ベント」はまた、ガスに対して透過性のフィルタ要素を含むが、疎水性であり、そして湿潤化に抵抗する。随意に、これらのフィルタ要素は、０．４５ミクロンまたはそれより小さい細孔径を有する。これらのフィルタは、順方向分離および逆方向分離の両方に機能する。このタイプおよび構造のフィルタ要素は、内部に配置され得、例えば、弁やベローズポンプを、それを制御する空気圧マニホールドから隔離する。
【００９２】
「従来」は、本発明が関連し、先行技術で知られているものを示す用語である。
【００９３】
「約」および「概して」は、ばらつきが取るに足りず、明白で、均等なユーティリティや機能を有し、さらに標準、規則、または制限に対し明らかにわずかな例外の存在をさらに示す場合において、非厳密な表現を拡大し、「多少」、「およそ」、または「ほぼ」の条件を「だいたい」の意味で記述する。例えば、様々な実施形態では、上記用語は、用語に続く値の２０％、１０％、５％、１％、または０．１％以内の量を指す。
【００９４】
本明細書で、「機能のための手段（ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」と記載される場合、本発明の範囲は、図面に図示された単数または複数のモードのみに限定されず、本明細書に記載される機能を実行するための全ての手段と、出願時に当技術分野において一般に周知の他の全ての手段とを包含すると理解されるべきである。「先行技術手段」は、いくつかの実施例を参照することにより本明細書に引用される技術の累積知識を含め、出願時に当技術分野において当業者に知られている機能を実行するための全ての手段を包含する。
【００９５】
重合手段は、例えば、逆転写酵素およびＴＡＱポリメラーゼ等、ポリメラーゼおよびその補因子および基質として記載される分子機械の様々な種を意味し、いくつかの例を参照することにより本明細書に引用される酵素学の累積知識を含む。
【００９６】
増幅するための手段として、熱循環および等温手段が挙げられる。第一の熱循環技法は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、およびＩｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．，１９９０）（これらの開示はその全体が参考として本明細書に援用される）で詳細に説明されている、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと呼ばれる）であった。ポリメラーゼ連鎖反応の方法論は、当技術分野で周知である。簡潔に言えば、ＰＣＲにおいて、標的配列の逆相補鎖上の領域に相補的である２個のプライマー配列が調製される。過剰なデオキシヌクレオシド三リン酸が、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼと共に反応混合物に添加される。標的配列が試料中に存在する場合、プライマーは標的に結合し、ポリメラーゼは、ヌクレオチドを添加することによって、マーカー配列に沿ってプライマーを伸張させる。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、伸張プライマーは、テンプレートから解離し反応生成物を形成し、過剰なプライマーは、テンプレートおよび反応生成物に結合し、過程が繰り返される。蛍光挿入剤を添加することによって、ＰＣＲ生成物をリアルタイムでまたは熱循環プロセスの最後に検出することができる。
【００９７】
１つの等温技法は、ＬＡＭＰ法（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ）で、Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．ら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２０００  ２８に記載されている。
【００９８】
ＳＤＡ法（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、核酸の等温増幅を行う別の方法で、複数回のストランド置換および合成、すなわち、ニックトランスレーションを伴う（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９２：１６９１−１６９６（本明細書中に参照して組み込まれる））。同様の方法は、ＲＣＲ法（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）と呼ばれ、増幅の標的とされる領域全体でいくつかのプローブのアニーリングと、それに続く、４つの塩基のうち２つのみが存在する修復反応とを伴う。他の２種の塩基は、検出を容易にするため、ビオチン化誘導体として追加することができる。同様のアプローチは、ＳＤＡにも使用される。標的特異的な配列は、循環プローブ反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ／ＣＰＲ）を使用しても検出され得る。ＣＰＲでは、非特異的なＤＮＡの３’配列および５’配列ならびに特異的なＲＮＡの中央配列を有するプローブを、試料中に存在するＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの際、反応をＲＮａｓｅ  Ｈにより処理し、プローブの産物が、消化後に放出される特徴的な産物として同定される。当初のテンプレートが、別の循環プローブにアニールされ、反応が繰り返される。
【００９９】
他の核酸増幅技術は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である。まず、逆転写酵素を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をＲＮＡテンプレートから作り、その後、ＰＣＲが、得られたｃＤＮＡ上で実行される。
【０１００】
増幅のための別の方法は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる欧州特許第３２０３０８号に開示されたリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲでは、２つの相補的なプローブ対が調製され、標的配列の存在下では、各対が、それらが当接するよう、標的の逆相補ストランドに結合し得る。リガーゼの存在下で、２つのプローブ対が結合して、単一のユニットを形成する。ＰＣＲの場合と同様の熱循環により、結合しライゲートされたユニットが標的から解離し、次いで、過剰のプローブ対のライゲーションのための「標的配列」として機能する。その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８８３，７５０号は、プローブ対を標的配列と結合させるためのＬＣＲと同様の方法を記載する。
【０１０１】
Ｑβレプリカーゼも、本発明において、さらに別の増幅方法として使用され得る。本方法では、標的の領域に相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列が、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、試料に添加される。ポリメラーゼが複製配列をコピーし、次いで、それが検出され得得る。
【０１０２】
その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる英国特許出願第２  ２０２  ３２８号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号に記載されたさらなる増幅法も、本発明に従って使用され得る。前者の出願では、「修飾された」プライマーが、ＰＣＲ様のテンプレート依存性かつ酵素依存性の合成に使用される。プライマーは、捕捉モエティ（例えば、ビオチン）および／または検出モエティ（例えば、酵素）で標識することにより修飾され得る。後者の出願では、標識されたプローブの過剰分が試料に添加される。標的配列の存在下で、プローブは結合し、触媒によって開裂される。開裂後、標的配列が、インタクトのまま放出され、過剰のプローブに結合される。標識されたプローブの開裂は、標的配列の存在を示すシグナルを与える。
【０１０３】
その他の核酸増幅手順は、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲ（その開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：１１７３；ＧｉｎｇｅｒａｓらのＰＣＴ出願第ＷＯ８８／１０３１５号）を含む、転写ベース増幅システム（ＴＡＳ）を含む。。ＮＡＳＢＡでは、核酸が、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床試料の熱変性、溶解緩衝液による処理、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラム、またはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出により、増幅用に調製され得る。これらの増幅技法は、標的特異的な配列を有するプライマーのアニーリングを含む。重合の後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅ  Ｈにより消化し、２本鎖ＤＮＡ分子を再び熱変性させる。いずれの場合も、第２の標的特異的なプライマーの添加により、単鎖ＤＮＡを完全に２本鎖にし、続いて重合を行う。次いで、２本鎖ＤＮＡ分子は、Ｔ７またはＳＰ６等のＲＮＡポリメラーゼにより多重転写される。等温循環反応では、ＲＮＡが単鎖ＤＮＡへ逆転写され、次いで、それが２本鎖ＤＮＡに変換され、次いで、Ｔ７またはＳＰ６等のＲＮＡポリメラーゼにより再度転写される。得られた産物は、短縮されていても、または完全であっても、標的特異的な配列を示す。
【０１０４】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤａｖｅｙらの欧州特許第３２９  ８２２号は、本発明に従って使用され得る単鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を循環的に合成することを含む核酸増幅プロセスを開示する。ｓｓＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ）により伸長される第１のプライマーオリゴヌクレオチドのためのテンプレートである。次いで、ＲＮＡは、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの２重鎖であるＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用により、得られたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から除去される。その結果得られるｓｓＤＮＡは、テンプレートと相同性のＲＮＡポリメラーゼプロモータ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）５’の配列も含む、第２のプライマーのためのテンプレートである。このプライマーは、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」断片）により伸長され、プライマー間に最初のＲＮＡのものと同一の配列を有し、１つの末端にプロモータ配列をさらに有する２本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子をもたらす。このプロモータ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼにより、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作るために使用され得る。これらのコピーは、次いで、再びサイクルに入り、極めて高速の増幅をもたらし得る。酵素の適切な選択により、この増幅は、各サイクルで酵素を添加することなく等温で実施され得る。このプロセスの循環的な性質のため、出発配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態であるように選択され得る。
【０１０５】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｉｌｌｅｒらのＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０６７００号は、標的単鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのプロモータ／プライマー配列のハイブリダイゼーション、それに続く、配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームは、循環的ではない、すなわち、得られたＲＮＡ転写物から新たなテンプレートは生成されない。他の増幅法は、「ＲＡＣＥ」および「ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲ」（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９０；Ｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：５６７３−５６７（それぞれ、その開示が参照によりその全体が本明細書に組みこまれる））を含む。
【０１０６】
得られる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で、２つ（またはそれを上回る）オリゴヌクレオチドのライゲーションに基づき、それにより、ジオリゴヌクレオチドを増幅する方法も、本発明の増幅ステップにおいて使用され得る（Ｗｕら、（１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【０１０７】
「検出のための手段」：本明細書で使用されるように、終点、すなわち、分析法の結果を表示するための装置を指し、器具フォトダイオード、比濁計、光子計数器、電圧計、電流計、ｐＨ計、容量センサ、無線トランスミッタ、磁気抵抗計、またはホール効果デバイスを含んでもよい。分析法結果の検出および解釈を向上させるために、カバープレート内の拡大レンズ、光学フィルタ、着色流体、および標識プローブが使用されてもよい。「標識」または「タグ」は、発色団およびフルオロフォア等の染料、ならびに従来技術で公知であるような化学発光を含むが、それらに限定されない。磁気ビーズ上で装飾される、ＺｎＳで被覆されたＣｄＳｅ等のＱＤｏｔｓ、またはＱＤｏｔｓおよび常磁性Ｆｅ３Ｏ４微粒子の合併は、本発明の分析法の感度を向上させる便利な方法である。蛍光消光検出終点もまた予想される。酵素結合免疫測定法と関連した種々の基質および生成物発色団もまた、当該技術分野で周知であり、分析法の感度、例えば、「上方変換」フルオロフォアを向上させるように検出信号を増幅するための手段を提供する。蛍光および光学検出器は、フォトダイオード、光起電デバイス、フォトトランジスタ、アバランシェフォトダイオード、フォトレジスタ、ＣＭＯＳ、ＣＣＤ、ＣＩＤ（電荷注入デバイス）、光電子倍増管、および逆バイアスＬＥＤを含んでもよい。検出システムは、随意で、定性的、定量的、または半定量的である。
【０１０８】
「融解分析」または「溶融曲線分析」または「高分解能融解曲線分析（ＨＲＭ）」または「ＦＲＥＴ融解分析」は、加熱の間の二本鎖ＤＮＡの解離特性の査定である。温度が上昇されるにつれて、二本鎖は、解離し始める。ＤＮＡの５０％が変性される温度は、融点として知られる。２つのＤＮＡストランド間の温度依存解離は、ＳＹＢＲグリーン、ＥｖａＧｒｅｅｎ、またはフルオロフォア標識ＤＮＡプローブ等のＤＮＡインターカレートフルオロフォアを使用して測定されることができる。ＳＹＢＲグリーン（ＤＮＡの２本のストランドの小溝内にインターカレートされる間、１０００倍強く蛍光を発する）の場合、加熱の間のＤＮＡの解離は、生じる蛍光における著しい減少によって測定可能である。代替として、並置されたプローブ（一方は、フルオロフォアを特徴とし、他方は、好適な消光剤である）が、標的配列へのプローブの相補性を判定するために使用されることができる。プローブベースの技法は、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）、新規変異、およびメチル化パターンを検出するためにＰＣＲ後に使用されてもよく、また、生成される解離パターンによって、ホモ接合野生型、ヘテロ接合型、およびホモ接合変異型対立遺伝子の間を区別することができる。
【０１０９】
「分子ビーコン」は、溶液中の特定の核酸の存在を報告するように設計されている、一本鎖ヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブである。分子ビーコンは、幹部、ヘアピンループ、末端標識フルオロフォア、および反対側末端標識消光剤といった、４つの構成要素から成る。ヘアピン状ビーコンが標的に結合されない時は、フルオロフォアおよび消光剤がともに密接して位置し、蛍光が抑制される。相補標的ヌクレオチド配列の存在下では、ビーコンの幹部が開いて標的にハイブリッド形成する。これは、フルオロフォアおよび消光剤を分離し、フルオロフォアが蛍光を発することを可能にする。代替として、分子ビーコンはまた、末端標識ドナーに近接して発光するフルオロフォアも含む。「波長偏移分子ビーコン」は、フルオロフォアがより強力に発光することを可能にする、付加的な収穫フルオロフォアを組み込む。分子ビーコンの現在の論評は、Ｗａｎｇ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，２００９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，４８（５）：８５６−８７０；Ｃｉｓｓｅｌｌ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３９３（１）：１２５−３５  ａｎｄ  Ｌｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ：ａｎ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ３７３（４）：４５７−６１を含む。近年の進歩は、Ｃａｄｙ  ＮＣ，２００９，Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５５４：３６７−７９を含む。
【０１１０】
蛍光核酸分析法は、タグ付きプライマーを用いた増幅と、プローブベースの検出化学反応とを含む。蛍光生成物は、分析法の終了時に、またはリアルタイムで増幅生成物の量を測定することによって、分析することができる。
【０１１１】
限定的ではないが、とりわけ、３’消光剤構築物を有する５’レポーター染料の変位およびポリメラーゼ媒介加水分解に依存するＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、二重オリゴＦＲＥＴベースのプローブ（Ｒｏｃｈｅ）、副溝結合剤共役ハイブリダイゼーションプローブ（ＭＧＢプローブ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ、Ｌｏｃｋｅｄ  ＮＡプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ／Ｒｏｃｈｅ）、アンプリフルア（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）プライマー化学反応、スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）プライマー化学反応、ＬＵＸプライマー、Ｑｚｙｍｅプライマー、ＲＴ−ＰＣＲが、全て本発明で好適である。インターカレーション染料も使用されてもよい。逆転写は、ＲＮＡ標的を分析するために使用され、ｃＤＮＡを形成するために別個のステップを必要とする。近年の進歩は、Ｋｒａｓｎｏｐｅｒｏｖ  ＬＮ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２０１０  Ｊａｎ  １９  ｅｐｕｂを含む。化学染料に加えて、プローブは、緑色蛍光タンパク質、量子ドット、およびナノドットを含み、その全ては蛍光性である。核酸および抗体等の分子、分析法標的に対する親和性を有する他の分子は、本発明の蛍光分析で有用なプローブを形成するようにフルオロフォアでタグ付けされてもよい。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、「プローブ」は、オリゴヌクレオチド小溝結合分子（ＭＧＢ）コンジュゲート（例えば、米国特許第５，８０１，１５５号（その内容は、全体として本明細書に開示される）に開示されるような「ＭＧＢ−Ｅｃｌｉｐｓｅ」プローブ）を指す。ＭＧＢ部分は、二本鎖ＤＮＡ分子の小溝に結合する、合成分子である。プローブは、ＭＧＢおよび消光剤部分が、フルオロフォアが３’末端にあり、その一方、オリゴヌクレオチドの５’末端にあるように構築される。ＭＧＢの５’位置付けは、ＭＧＢ−ＥｃｌｉｐｓｅプローブがＰＣＲの間、裂開されないように保護し、プローブをＰＣＲ後溶融曲線分析のために利用可能にする。蛍光増加は、標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションに応じた無作為コイル状状態から直鎖状態へのプローブの遷移によって生成される。リアルタイムＰＣＲ用途では、ＭＧＢは、二本鎖ＤＮＡ複合体の安定性、具体的には、プローブと増幅されたＤＮＡ標的との間のハイブリダイゼーションを増加させる。増加したＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド安定性は、より高い特異性を伴う、より短い検出プローブの設計を可能にする。プローブの特異性は、類似無ＭＧＢのより長い対応物プローブと比較される、完全に一致した配列とミスマッチの標的との間を判別する能力を増加させる。
【０１１３】
「ＦＲＥＴ」（蛍光共鳴エネルギー転移）は、分子間相互作用の調査を可能にする蛍光技法である。それは、ハイブリッド形成される時等の２つの分子がごく接近している時に、１つのフルオロフォアからもう１つのフルオロフォア（すなわち、ドナーおよび消光剤）へのエネルギーの転移に依存する。近年の進歩は、Ｃａｒｍｏｎａ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ［２００９，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  （ＦＲＥＴ）  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｎ  Ａｃａｄ  Ｂｒａｓ  Ｃｉｅｎｃ  ８１（３）：３８１−９２］を含む。
【０１１４】
加熱および冷却のための手段：液体で充満したチャンバを熱循環するための数多くの手段が、先行技術に記載されている。これらの先行技術手段は、概して、循環の冷却部分の間に熱を放散するためのヒートシンクと組み合わせて、電気抵抗器、熱風、レーザ、赤外線、ジュール加熱、ＴＥＣまたはペルチェ素子、ヒートポンプ、吸熱反応物、および同等物の対流および伝導加熱要素を含む。加熱手段はまた、高周波磁場によって駆動される磁気ビーズの動きによる加熱も含み得る。
【０１１５】
熱循環のための加熱、冷却装置は、２つのカテゴリ、すなわち、傾斜温度および固定温度に分類される。固定温度デバイスは、反応では比較的一定の温度を維持し、熱循環のためには少なくとも２つの反応チャンバが必要とされる。傾斜加熱装置は、少なくとも２つの設定点の間で温度を変化させ、そのため、熱循環のためには、１つの反応チャンバのみが必要とされる。加熱要素の組み合わせも、可能である。ペルチェ素子は、固定温度および傾斜用途の両方で使用され得る。水浴は、熱循環の傾斜温度制御に十分適合しない。
【０１１６】
概して、加熱および冷却手段は、流体部材とインターフェースして液体内容物との熱交換を行う。ＰＣＲのために、熱交換が行われるマイクロ流体チャネルまたはチャンバを形成する関連要素は、「ＰＣＲ流体工学および熱インターフェース」アセンブリの一部と呼ばれる。
【０１１７】
「高熱伝導ポリマー」（米国特許第７，４７６，７０２号（その内容は、全体として本明細書に開示される）に開示される）は、高熱伝導性および誘電強度を有する、ポリマー組成物である。このポリマー組成物は、ベースポリマーマトリクスと、熱伝導性の電気絶縁材料とを含む。ガラス等の補強材料が、組成物に添加されることができる。ポリマー組成物は、重量比２０％〜８０％のポリマーマトリクスと、重量比２０％〜８０％の熱的伝導性の電気絶縁セラミック材料とを含む。ポリマー組成物はさらに、重量比３％〜５０％の補強材料を含んでもよい。ポリマーマトリクスは、熱可塑性または熱硬化性ポリマーであることができる。熱的伝導性の電気絶縁セラミック材料は、アルミナ、酸化カルシウム、酸化チタン、酸化ケイ素、酸化亜鉛、窒化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ホウ素、またはそれらの混合物であることができる。補強材料は、ガラス、無機鉱物、または他の好適な材料であることができる。
【０１１８】
文脈上他の意味に解するべき場合を除き、本明細書および後に続く特許請求の全体を通して、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜を備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変化形は、広く包括的な意味で、すなわち、「〜を含むがそれに限定されない」と解釈されるものとする。
【０１１９】
本明細書における「一実施形態」または「ある実施形態」という言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、もしくは特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通した様々な箇所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、全てが同じ実施形態を指すとは必ずしも限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態で、任意の適切な方法によって組み合わされ得る。
【０１２０】
ここで図を参照すると、図１は、ドッキングベイ５０３０の中への光学ウィンドウ１１０６を伴うマイクロ流体カートリッジ１１００の前方突出部１１０５の挿入を動画的に示す、ホスト器具５０００の斜視図である。カートリッジ試料ポート１１０４およびカバープレート１１０３は、動作中、ホスト器具の外部に残る。示されるのは、タッチスクリーン表示面５０８０およびコンパクトなシャーシまたは筐体５０６０である。全ての試薬およびアッセイ対照がマイクロ流体カートリッジの中に提供されるため、器具は、完全独立型操作性を有する。ドッキングベイは、以下でより詳細に論議されるように、懸架載置され、器具基部に対してある角度を成して傾転され得る。
【０１２１】
図２は、ホスト器具アッセイ装置の機能ユニットの概観を提供する、ブロック図である。機械、空気流体圧、温度制御、光学、および入力／出力（Ｉ／Ｏ）システムは、２つのデジタルプロセッサによって協調され、第１のものは、「ホストコントローラ」と称され、ユーザコマンドを受信し、アッセイ結果を出力し、また、アッセイの機械、熱、および空気流体圧プロセスステップを取扱い、第２のものは、「埋め込みマイクロプロセッサ」と称され、検出器ヘッド内の信号取得および処理を含む、光学システムの局所制御に対して統制力を発揮し、デジタルデータをホストコントローラに通信する。埋め込みプロセッサによって制御される光学システムは、検出器ヘッド内において、装置筐体内の雑音の多いアナログ回路から遮蔽され、比較的雑音が少ない環境において高利得増幅を可能にする。各プロセッサは、別個のクロック、揮発性、および不揮発性メモリが提供され、他から自律的に機能する。
【０１２２】
概観として、器具内の浮動台（１０００、点線）は、マイクロ流体カートリッジを受容し、可逆的に締め付けるためのドッキングベイ（ここでは１００１）を支持し、走査検出器ヘッド３１１が提供される。検出器ヘッドは、ホストコントローラの制御下でマイクロ流体カートリッジの光学ウィンドウにわたって走査される。検出器ヘッドは、励起光を提供するためのサブアセンブリと、蛍光発光信号を検出、増幅、および処理するためのセンサとを含む。浮動台は、定常ベースプレートおよび器具スタンドに載置されるバネサスペンションに乗設される。
【０１２３】
ホストコントローラ１００３の制御下にある別々に制御可能な加熱ブロックおよびペルチェ熱ポンプを有するヒータモジュール、空気圧分配マニホールドとしての機能も果たす、ベースプレート３３０上に載置された空気圧サーボに接続される空気圧インターフェース、ステッピングモータおよびホストコントローラを接続するワイヤハーネス、およびクランプモータ用の配線ハーネス、ならびに、クランプおよびマイクロ流体カートリッジの位置を測定するための圧力スイッチ、バーコード読取機、および温度モニタを含む関連センサが、定常ベースプレートに固定され、浮動台と相互作用するように位置付けられる。電力が、器具スタンド内に載置されるバッテリから、または自動車等のＡＣコンバータもしくはＤＣ源への直接接続によって、全システムに分配される。
【０１２４】
ホストコントローラ１００３は、器具の操作用のタッチパッドパネル、およびＬＣＤ表示パネルも含む、マザーボード上に載置される。器具は、無線ネットワーキングカードまたは他の遠隔通信デバイスを含む、種々のデジタルシリアルＩ／Ｏリンクを介して、外部ネットワークまたはデバイスにデータを伝送してもよい。固体ＲＯＭに符号化されたソフトウェアである、ＲＡＭレジスタおよびプログラミングへのサービスアクセスのための特殊デジタル接合点が提供される。
【０１２５】
液体試料から特定の疾患または病状を診断する能力を有する、特定のマイクロアッセイカードを操作するために必要とされる、空気圧パルスおよび弁論理のシーケンス等の、器具の操作のための一般的命令が、アッセイを実行するための揮発性および不揮発性メモリが供給される、ホストコントローラと関連付けられるプログラム可能なソフトウェアによって提供される。例えば、バーコード読取機が特定のマイクロアッセイカートリッジを検出した場合、デバイスは、そのバーコードから認識される特定のアッセイを行い、結果を解釈して指定形式で表示するようにプログラムされる。
【０１２６】
しかしながら、光源強度の変調、信号増幅、およびフィルタリングを含む、信号取得光学部の動作は、検出器ヘッド３１１内のセンサＰＣＢ上の埋め込みマイクロプロセッサ１８４１内に常駐のダイモンの制御下にある。したがって、雑音に高感度である電気信号は、検出器ヘッドの中でホスト器具のより雑音の多い環境から遮蔽され、検出器ヘッドからホストＡ／Ｄ変換器へのアナログ信号の伝送は、完全に回避される。この非従来型の機能の分離は、幸いにも、完全携帯性および現場作業のために必要とされるように、器具の雑音感受性を低減するのに極めて有利であって、予想外にも、雑音の多い電子環境であることが予期されるものの中において高利得トライステート増幅器の使用を可能にすることが証明された。
【０１２７】
図３Ａおよび３Ｂは、本発明の装置と併用するための使い捨ての、単回使用であって、サンプリングから分析まで行う、マイクロ流体カートリッジの斜視図であって、カートリッジは、アッセイのための全ての試薬を含み、検査試料の導入のみを要求する。カートリッジはまた、プロセス対照ならびに陽性および陰性アッセイ対照を行うために必要な全ての試薬を含む。ここに示されるカートリッジは、内部の仕組みとともに、第１の成形筐体１１０１および第２の成形筐体１１０２と、カバープレート１１０３とから成る。ポート１１０４は、検査試料を受容するためのものであって、前方突出部１１０５は、ホスト器具のドッキングベイに挿入するためのものである。下に示されるのは、アッセイウェルアセンブリ１２０１を伴う、第２の成形筐体である。第１の成形筐体内のウィンドウ１１０６は、アッセイウェルアセンブリ１２０１内の試料ウェルを覆って形成される光学ウィンドウである。ガスケット１２０６は、ホスト器具の空気圧インターフェースマルチポートと密閉してインターフェースをとるためのものである。核酸捕捉アセンブリ１２０８は、検査試料からの核酸抽出のためのものである。
【０１２８】
図４は、マイクロアッセイカートリッジ１１００の内部構成要素を示す分解図である。本特定のカートリッジは、ＦＲＥＴまたは分子ビーコン検出を用いたＰＣＲのために設計されている。好ましくは、診断用途および満たされるべき具体的要件に従って採用されるべきカートリッジ設計および分析反応の詳細を判定することは、当業者に任され、以下の詳細な説明は、例証のためだけに供給される。
【０１２９】
検査試料は、入口ポート１１０４を通して添加される。第１の成形筐体１１０１の前方突出部上の光学ウィンドウ１１０６は、ホスト器具の中に挿入され、アッセイウェルアセンブリ１２０１のウェルが、光学ウィンドウを長さ方向に横断する直線経路を辿る、器具検出器ヘッドによって走査されるように整列される。検査試料調製に関連して追加される処理は、ベローミキサ１１０７Ａおよび１１０７Ｂと、核酸捕捉アセンブリ１２０８によって供給される。試料調製のために要求される全ての液体試薬は、密閉された破裂可能箔パウチ１２０５内に封入され、空気圧制御下で必要なときに分注される。本実施形態では、第１の成形筐体は、６つの箔パウチを提供するように構成されるが、特定の関心のアッセイの要件に応じて要求されるパウチの数を判定することは、当業者に任される。鋭利物１２０９は、ステンレス鋼から製作され、箔パウチに対して垂直を下回る角度で突出する穿刺縁１２１１を伴う。箔パウチの時期尚早破裂、すなわち、貫通は、箔パウチと鋭利物との間でインターフェースをとり、パウチを鋭利物の穿刺縁から保護する、バネ１２０７によって防止される。バネは、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）から製作され、鋭利物上で「テント」を形成するように成形される、変形可能構造である。空気圧起動に応じて、変形可能バネの固有の力は、克服され、バネは、鋭利物上で下方に「スナップ」する。バネは、箔パウチを破裂させる鋭利物の穿刺縁を通した通過を可能にする、上部内の孔とともに形成される。有利には、鋼鉄穿刺縁の角度は、剪断材料界面を再密閉から防止しながら、箔材料の剪断を促進する。我々は、本機構が液体試薬のより確実かつ効率的送達を提供することを見出した。例えば、核酸増幅および検出のための他の試薬も、乾燥形態でカード上に提供される。流体廃棄物は、陥凹面積１２１０の中に糊着され、プラスチックカバープレート１１０３の下の定位置で密閉される、吸収性詰め物内に隔離される。任意の特定の分子アッセイの詳細は、本範囲を超える。本実施形態では、内部マイクロアッセイチャネルおよびウェルを伴うアッセイウェルアセンブリ１２０１は、任意の得られた単位複製配列（アンプリコン）の熱循環および蛍光検出による核酸標的配列の増幅を提供する。
【０１３０】
図５は、マイクロ流体カートリッジ１１００の層アセンブリを描写する、分解図である。第１の成形筐体１１０１と第２の成形筐体１１０２との間でインターフェースをとるのは、以下にさらに説明されるように、例えば、弁動作および混合機能性を提供し、第１および第２の成形筐体内に形成される空気圧および液体回路を統合する、ラミネート層１３０１、１３０２、および１３０３のラミネートされたスタックである。ホスト器具によって提供される空気圧供給は、第２の成形筐体内の空気圧ポート１１１５を通して方向付けられる。空気圧供給は、「空気圧層」と称され得る、第１の成形筐体１１０１内の回路に流体接続される。本明細書で使用されるように、用語「流体接続される」とは、２つの特徴が、任意のタイプの物質、例えば、気体、液体、溶液、固体の水性懸濁液、および同等物の通過および／または移送のための導管を形成することを意味する。液体チャネルは、「液体層」およびラミネート層１３０１とも称され得る、第２の成形筐体１１０２内の回路によって形成され、試薬パック１２０５、核酸捕捉アセンブリ１１３０、およびＰＣＲアセンブリ１２０１と流体連通する。それぞれ、空気圧および液体回路の上側および下側成形筐体の中への平面隔絶は、空気および流体ラインの交差を防止し、有利に頑丈なカートリッジアーキテクチャを提供する。複数の空気流体圧膜またはダイヤフラムが、以下にさらに説明されるように、ラミネート層１３０２の中に溶接され、マイクロ流体カートリッジのミキサ、弁、および中間準備チャンバを形成する。ラミネート層１３０１、１３０２、および１３０３はさらに、孔およびチャネルが切り込まれ、第１および第２の成形筐体内に形成される空気圧および液体回路を接続する。ラミネート層１３０３および１３０１は、当技術分野において公知の接着剤材料を用いて製作され、第１および第２の成形筐体を組み立てられたマイクロ流体カートリッジの中に固定して接合する。エアロゾルフィルタプラグ１１２５は、下側成形筐体内の空気圧ポート１１１５の中に嵌合され、マイクロ流体カートリッジとホスト器具との間に物理的障壁を作成する。エアロゾルフィルタプラグ１１２５は、ＰＯＲＥＸ（登録商標）等の液体膨張性または超膨張性材料から製作され、流体の移送を防止し、かつ核酸等のエアロゾル化材料を吸収するように両方に機能してもよい。試行錯誤を通して、発明者らは、カートリッジの空気圧ポートの中へのエアロゾルフィルタプラグの嵌合が、ホスト器具をカートリッジ内の液体および固体物質から効果的に隔離することを見出した。これは、有利には、後続診断検査結果を損なわせ、著しい規制上の問題を提起し得る、ホスト器具の汚染を防止する。核酸捕捉アセンブリ１１３０は、以下にさらに詳細に説明されるように、第２の成形本体内の陥凹チャンバの中に嵌合され、液体チャネルと流体連通し、ホスト器具と熱接触する。
【０１３１】
図６Ａ−Ｃは、マイクロ流体カートリッジ１１００の空気圧および液体回路と、第１の空気圧層１１０１、ラミネート弁層１３０２、および第２の液体層１１０２の溶接された空気流体圧膜とのさらなる詳細を示す。図６Ａは、第１の成形筐体（すなわち、「空気圧層」）１１０１の底部表面の平面図である。第１の成形筐体は、テレフタル酸ポリエチレングリコール（ＰＥＴＧ）等のポリマー材料の射出成形によって製作される。空気圧層の１つの機能は、カートリッジアセンブリ内の弁層１３０２の空気圧側を密閉することである。第１の成形筐体内の空気圧ラインのネットワークは、弁（ここではライン１１５０Ａによって例示される）、ミキサ（ここではライン１１５０Ｂによって例示される）、および試薬パック分注（ここではライン１１５０Ｃによって例示される）の動作を制御する。我々は、所定の空気圧ラインの制御下、「特徴セット」（例えば、弁、ミキサ、試薬パック）の数を最小限にする必要があることを見出した。単一空気圧ラインへの特徴セットの多重化は、より高いレベルのカートリッジ故障に寄与することが見出された。試行錯誤を通して、我々は、ポンプ、弁、およびベントのための別個の圧力と個々に関連付けられた２０のポート１１６０に接続される、２０の空気圧ラインが、大部分のアッセイに好適であることを見出した。しかしながら、本発明は、本構成に限定されることを意図せず、他の好適な空気圧構成も、企図される。
【０１３２】
図６Ｂは、マイクロ流体カートリッジの弁動作、混合、および流体停止機能を行う、空気流体圧ダイヤフラム膜またはフィルムの構成の例証的実施例を描写する、ラミネート層（すなわち、「弁層」）１３０２の平面図である。マイクロ流体カートリッジにおいて使用するためのマイクロ弁、マイクロポンプ、および他の空気圧流体要素のためのダイヤフラム技術ならびにそれらの製造および溶接方法は、本出願人の同時係属中の特許出願第ＷＯ２０１４１００７４３号および第ＷＯ２０１１／０９４５７７号に説明されており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。全膜フィルムは、単一基板材料、例えば、ＭＥＬＩＮＥＸ（登録商標）ＰＥＴフィルムの中に溶接され、層１３０２を形成してもよい。本例示的構成では、弁膜１３１０は、ＤＵＲＡ−ＬＡＲ（登録商標）ＰＥＴフィルムから製作され、混合膜１３２０は、ＳＡＲＡＮＥＸＭフィルムから製作され、中間準備チャンバ１３３０および流体停止１３４０膜は、ＰＯＲＥＬＬＥ（登録商標）フィルム等のマイクロ多孔性フィルムから製作される。本図は、膜が溶接され、図６Ａに示される上側成形筐体の表面に接触する、ラミネート層の側面を示す。当業者は、任意の数の代替弁および混合構成ならびに材料がラミネート層１３０２内に採用されてもよいことを理解し得る。
【０１３３】
図６Ｃは、第２の成形筐体１１０２、すなわち、「液体層」の上側表面の平面図である。第２の成形筐体の機能の１つは、カートリッジアセンブリ内の弁層の液体側を密閉することである。第２の成形筐体内の流体ライン１１０７は、カートリッジ内の機能特徴間で流体を移送し、インビトロ診断検査、例えば、分子アッセイを行う。機能特徴は、第１の成形筐体および／またはラミネート層ならびに核酸捕捉アセンブリ１１３０、中間準備チャンバ１１８０、アッセイウェル１１８５、および流体停止１１９５内に封入または形成される、試薬パック、弁、および混合チャンバを含んでもよい。ビア１１９０Ａおよび１１９０Ｂは、第２の成形筐体とアッセイウェルアセンブリを流体により結合する。ウィンドウ１１８５は、アッセイ信号の検出のために、下側成形筐体内に切り込まれ、アッセイウェルアセンブリのウェルと噛合する。空気ポート１１１５は、前述のように、第１の成形筐体内の器具空気圧マニホールドおよび空気圧ラインと空気圧接続する。第２の成形筐体は、ポリカーボネート（ＰＣ）またはテレフタル酸ポリエチレングリコール（ＰＥＴＧ）等のポリマー材料の射出成形によって製作される。
【０１３４】
図７は、マイクロ流体カートリッジの種々の機能ユニットが、どのように例示的弁動作および流体論理によって制御され得るかを図示する、本発明の一実施形態の概略図である。示されるのは、試料入口１１０４、例示的試薬が充填された箔パック１２０５、ミキサ（すなわち、ベローポンプ）１１０７Ａおよび１１０７Ｂ、核酸捕捉膜１２０８、ＰＣＲウェル１２６０、および流体停止部１２５５である。逆転写ウェルも、特定の関心のアッセイに応じて、随意である。
【０１３５】
図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、核酸捕捉アセンブリ１１３０の詳細を示す、分解等角および断面図である。核酸捕捉アセンブリは、筐体１１３１と、捕捉マトリクス１１３２と、マトリクス支持媒体、１１３３と、接着ガスケット１１３４とを含む。筐体１１３１は、アセンブリの他の構成要素を中空内部に保持する、略中空の非対称形状の円筒形である。筐体は、ＰＣまたはＰＥＴＧ等のポリマー材料から、下側成形本体内に相補的に成形される陥凹の中に楔着する、非対称形状に成形される。第２の成形筐体内の捕捉アセンブリの適切な配向は、液体チャネルの適切な流体連通を確実にする。捕捉マトリクスまたは膜１１３２は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであり得る、標的核酸を結合および放出するように機能する。好適なマトリクスまたは膜材料は、当技術分野において周知であって、シリカまたはガラスファイバ膜を含んでもよい。核酸捕捉膜はさらに、２つの捕捉膜支持媒体ディスクまたはフリット１１３３Ａおよび１１３３Ｂによって支持される。断面図７Ｂに示されるように、２つの媒体支持フリットは、捕捉膜の上部および底部表面上に平行構成に設定される。本平行構成は、捕捉膜内のマトリクスファイバの均一分布を維持するのに役立ち、これは、発明者らによって、膜を通した液体の均一流動を維持するために重要であることを見出された。これは、構造支持の欠如に起因して、液体接触下で圧潰し、したがって、標的核酸を効率的に結合できないことが知られている、先行技術フィルタまたは膜に優る明白な改良点である。捕捉膜支持媒体１１３３Ａおよび１１３３Ｂは、ＰＯＲＥＸ（登録商標）等の任意の好適な材料から製作されてもよい。代替支持媒体実施形態もまた、本発明によって企図される。一実施形態では、ポリプロピレンワッシャが、捕捉膜のための支持を提供してもよい。ワッシャはさらに、筐体チャネルの縁を密閉し、液体試料が捕捉膜の縁の周囲に流れないように防止するように構成されてもよい。別の実施形態では、ポリマー筐体構造自体が、側方膜支持特徴を提供するように成形される。捕捉膜接着ガスケット１１３４は、捕捉アセンブリを下側成形筐体に接着するように機能し、任意の好適に接着剤材料から製作されてもよい。
【０１３６】
図９は、限定ではないが、逆転写、終点ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、および定量的ＰＣＲ、および融解曲線分析を含む、いくつかの分子反応に好適である、アッセイウェルアセンブリ１２０１の斜視図を示す。本実施形態では、図示されるアセンブリは、同一アッセイウェル内における熱循環およびＦＲＥＴ検出による終点ＰＣＲのために構成される。ＰＣＲウェル層１２５０は、溶出された核酸標的分子を増幅するように機能し、ＰＣＲのための最適熱伝達および短縮されたサイクル時間のために、ポリプロピレン等の高熱伝導ポリマーから製作される。好適なポリマーの熱伝導率は、好ましくは、１．０Ｗ／ｍＫ〜１０Ｗ／ｍＫの範囲である。一実施形態では、高熱伝導ポリマーは、ＣＯＯＬＰＯＬＹ（登録商標）Ｄ１２０１である。液体試料は、第２の成形本体内の液体チャネルと流体連通する、ビア１２８０を通してウェル層に進入する。層１２５０の各試料チャネルは、２つのウェル、すなわち、略球状ウェル１２５５および菱形形状のウェル１２６０と流体連通する。菱形形状のウェル１２６０は、増幅および検出ウェルであって、任意の得られた単位複製配列（アンプリコン）の核酸増幅および検出の両方のために必要な全ての試薬を含む。我々は、菱形形状のウェル１２６０の幾何学形状が、有利には、気泡の形成を伴わずに、乾燥試薬の湿潤および再水和を促進することを見出した。菱形形状のウェルの角度付けられた側面は、放出される蛍光光の収集および検出を向上させる、標準的垂直または丸みを帯びた縁に優る改良である。より小さい半球状ウェル１２５５は、流体停止部として機能し、ラミネート層１３０２の中に溶接された空気浸透性の液体不浸透性膜１３４６と流体連通する。本実施形態では、ＰＣＲウェルアセンブリは、最大３つの標的被分析物の検出のために、９つのアッセイウェルを含む。標的被分析物毎に、前述のように、対応する陽性および陰性の統合された対照のための２つの対照ウェルが存在する。標的被分析物の増幅および検出のためのウェルは、核酸捕捉膜と流体連通し、溶出された核酸を含む液体試料を受容する。対照的に、統合された対照ウェルは、核酸捕捉膜と流体連通せず、代わりに、空の溶出緩衝液を検査試料として受容する。空のウェル１２９９は、第２の成形本体と流体連通せず、光学検出の間、蛍光標準として機能してもよいが、他の使用も、本発明によって企図される。ＰＣＲウェル層１２５０を覆うのは、ＰＣＲウェルアセンブリを第２の成形筐体に固定して接着するための接着層１２７５である。アッセイウェルアセンブリはまた、ウェル層１２５０と接着層１２７５との間にキャッピング層を含む。キャッピング層は、ＰＣＲウェルからの液体試薬の漏出を防止しながら、標的信号の検出を可能にする、光学的に透明なカバーである。
【０１３７】
ホスト器具システム
本発明のホスト器具の機械、加熱、締め付け、光学、ソフトウェアおよびファームウェア、ホストコントローラ、および結合解除される光学機能の特定の側面は、本出願人の同時係属中の特許出願第ＷＯ２０１４／１００７２５号（参照により全体として本明細書に組み込まれる）全体を通して開示される。以下に説明される特徴は、技術水準に対する特定の代替実施形態および改良を表す。
【０１３８】
オンボード光学部ベンチおよびドッキングベイを伴う、浮動台は、器具の独特の特徴である。この特徴は、器具の主要光熱機械サブシステムの概念表現である、図１０に概念的に導入される。浮動台は、４点バネ載置されるサスペンションによって傾斜された平面上に懸架され、マイクロ流体カートリッジを受容するためのドッキングベイ１０３を支持する、トレイ状シャーシ３０１（破線ボックス）から成る。また、浮動台３００上に支持されるのは、対のガイドレール上に載置される検出器ヘッド３１１である。カートリッジは、器具１００の一部ではなく、浮動式ドッキングベイ１０３の中に挿入後、器具とインターフェースする。
【０１３９】
動作中に、浮動台は、載置板（３３０）に押し付けられ、区域加熱ブロックおよびペルチェ熱ポンプならびに関連抵抗発熱体および回路の接触面に係合する。ファンが、動作中に器具の過剰熱を消散させるために提供される。傾斜載置板にはまた、マイクロ流体カートリッジの基部に密閉してドッキングするための空気圧インターフェースポート３５０も提供される。空気圧は、傾斜載置板３３０に埋め込まれた一体型空気圧分配「マニホールド」またはシステムから、空気圧インターフェースポートを通してカートリッジに送達される。空気圧マニホールドは、傾斜載置板上に載置された発生源から陰圧および陽圧を供給する。マザーボードに載置されたプログラム可能なホストコントローラは、ベースプレート３３０および空気圧インターフェースポート３５０の中の内部マニホールドを介して、カートリッジ上のポンプおよび弁に圧力、減圧、ならびに制御パルスを駆動する、空気圧を方向付ける。
【０１４０】
検出器ヘッド３１１は動力式であり、カートリッジの走査は、ホストコントローラの制御下で行われる。ペアを成すガイドレールに沿って検出器ヘッドを走査するために、ホストコントローラは、ステッピングモータによって駆動されるウォームギアに係合する。検出器ヘッドは、マイクロ流体カートリッジの前方突出部の中の光学ウィンドウを走査し、未加工光信号を収集する、対物レンズを伴う外部ウィンドウが装着される。検出器ヘッド３１１は、光学信号取得のために、ホストコントローラから独立して機能する、独自の埋め込みマイクロプロセッサを有する。ホストコントローラはまた、加熱ブロックおよびペルチェ熱ポンプ内の温度を調整し、一式のソレノイド弁ならびに空気圧インターフェースにリンクされた陽圧および減圧ポンプリザーバを制御する。器具には、ユーザ相互作用のための表示パネルおよびタッチパネルが供給される。電力入力は融通が利き、随意で、ＡＣアダプタ、自動車のアダプタによって、または器具の下に載置された再充電可能バッテリから供給される。また、随意的な無線ＩＯおよびデジタルＩＯポートも含まれる。
【０１４１】
図１０は、浮動台３０１、ドッキングベイ１０３、検出器ヘッド３１１、およびマイクロ流体カートリッジが、接地面に対して画定された角度において器具シャーシ内に載置され得ることを概念的に示す。接地面からある角度でカートリッジを傾転させることは、流体装填の間、通気を改善し、湿潤および混合動作の間、空気取り込みを最小限にする。アッセイ結果の熱伝達および光学的問い合せに干渉する、気泡蓄積は、本明細書に開示されるこのおよび他の革新によって回避される。傾斜載置板３３０は、浮動台３０１、カートリッジ、ならびに締め付けおよび光学走査サブアセンブリの機械的構成要素の角度を確立する。我々は、気泡蓄積が核酸増幅に干渉するが、台の角度載置によって制限されることを見出した。本角度「シータ」は、接地面から１０〜４５度、より好ましくは、１０〜２０度の範囲、最も好ましくは、約１５度が有利であることが見出された。
【０１４２】
図１０に示されるように、検出器ヘッド３１１は、噛合する半分のシェル（３１２、３１３）を伴う、クラムシェル形筐体を含む。検出器ヘッドは、側方ガイドレール３０８および３０９上で摺動し、ウォーム駆動を伴う、ステッピングモータのホスト制御下にある。浮動台シャーシ３０１は、４点サスペンション内にバネ載置され、締め付けられるまで傾斜載置板３３０と直接接続しない。２つの走査ガイドレール３０８のうちの１つが、この図で容易に目に見え、浮動台シャーシまたはトレイ３０１によっていずれか一方の端で支持されている。ドッキングベイは、波線ボックス（１０３）によって示され、示されるように（二重矢印）左右に走査することが可能になる、検出器ヘッド３１１の下のマイクロ流体カートリッジの突出部の挿入のための開口部を画する。空気圧インターフェースポート３５０は、ここではドッキングベイの下の高くなったプラットフォームとして示される。電力調節、ＡＣアダプタ、およびバッテリ貯蔵機能が、平坦な表面上に静置するように設計されている器具スタンド３２９の裏面より上で傾斜載置板３３０の下に載置される。
【０１４３】
図１１は、ペルチェ熱ポンプ３４１および加熱ブロック３４２を伴う加熱器アセンブリを含む詳細の内部を図示する、器具の底部のＣＡＤ図である。加熱器アセンブリの上面は、１つまたはそれを上回る加熱ブロックと、ペルチェ熱ポンプとから成り、それぞれは、アッセイの間、カートリッジの封入されたチャネルおよびチャンバ内で生じる分子生物学的手順および／または反応の適切な動作のために、マイクロ流体カートリッジの裏面の画定された区域と熱インターフェースを形成する。これらの手順および／または反応は、細胞溶解および核酸抽出と同程度に単純であるか、または逆転写および核酸増幅と同程度に複雑であり得、概して、最適反応性および特異性のために比較的厳密な温度制御を要求する。ペルチェ熱ポンプおよび加熱ブロックは、バネで載置されてもよく、締め付け機構の下向き圧力と反対に上向きに押勢され、熱伝達のための高熱拡散性接触区域を確立する。また、示されるのは、空気圧インターフェースポート３５０であって、それぞれ、独立して、ホスト器具の空気圧分散マニホールドから陽圧または陰圧源に繋がれ、独立して、プログラム可能なホストコントローラの制御下にある。本実施形態は、２０の空気圧ポートを描写するが、他の好適な構成も、本発明によって企図される。これらの出口は、マイクロ流体カードの裏面の噛合された入口とインターフェースをとり、それを密閉し、タイミングが図られたパターンの相互連通する空気圧、減圧、および圧力パルスは、空気圧インターフェースを通して経路指定され、カートリッジ内のアッセイを駆動および制御する。
【０１４４】
図１２は、ホスト器具の締め付け機構５００と係合される、マイクロ流体カートリッジ２００を描写する、ＣＡＤ図である。また、示されるのは、ギア４００、バネ３０１、および検出器ヘッド支持体３１１である。前述のように、カートリッジの第２の成形筐体の裏面のシリコンゴムガスケットは、ホスト器具の空気圧マニホールドへのバネ力と噛合し、カートリッジが器具内に装填され、バネ圧力が印加されると、圧縮下、空気圧相互接続部を密閉する。ガスケット１２０６は、単回使用密閉ガスケットとしての役割を果たし、有利には、従来の知恵に従って器具の一部としではなく、使い捨てカートリッジが供給される。使い捨てカートリッジを伴うガスケットを含むことによって、空気圧インターフェースにおいて、より優れた、かつより清潔なシールが得られ、ガスケットを周期的に交換する必要性も排除される。本構成では、カートリッジは、空気圧制御インターフェースマルチポート上に流体によって係合し、熱ブロック３４２およびペルチェ熱ポンプ３４１と熱的に接触される。器具空気圧制御マニホールドは、調整された空気圧を空気圧インターフェースマルチポート３５０を通してカートリッジに供給する。完成器具では、載置板３３０に、カード空気圧を制御するための圧力調整器、蓄圧器、およびソレノイドが集合する。
【０１４５】
圧力状態は、概して、限定ではないが、＋１５０ｋＰａ、＋１００ｋＰａ、＋７０ｋＰａ、０ｋＰａ、−３５ｋＰａ、および−５０ｋＰａを含む、陽圧および陰圧の範囲から選択され、より高い圧力は、例えば、試薬パックを破裂させるために使用され、陰圧は、弁の開放等のために使用される。これらの圧力は、緩衝された圧力リザーバから供給されてもよい。ダイヤルアップ可変圧力供給もまた、使用されてもよい。空気圧状態は、マイクロプロセッサ制御下、マニホールドサブ回路を通してカートリッジに供給される。各アッセイは、流体圧回路を通して流体を移動させるために必要とされる、空気圧弁およびポンプ論理に従って実行されるべき一連のステップから成る。通気口もまた、回路の必要部分であって、加圧、反転圧、および通気は全て、各個々のアッセイタイプの要件に従って、器具および関連付けられたマイクロアッセイ回路の能力内にある。
【０１４６】
光学システム
図１３は、それぞれ、励起用および発光検出用の２つの光チャネルおよび電子的に隔離された回路基板（１３０１、１３０２）を有する二重チャネル検出器ヘッド１３００の斜視図である。内部構成要素を視認するために、筐体の一方の半分が除去されている。この図では、検出器ヘッドの内部構成要素を示すために、筐体１３０３の上半分が除去されている。二重チャネルは、対物レンズ（１３１０、１３３０）ならびに光路ＡおよびＢ（ＡおよびＢと印をつけた白い矢印）によって印付けられる。ＳＭＤ  ＬＥＤ励起光源（１３１１、１３３１）は、エッジ型抵抗ピンコネクタ（１３０４）を介して直角でセンサＰＣＢ（１３０２）に接続される、光源ＬＥＤプリント回路基板（１３０１）の上に載置される。光検出構成要素は、センサＰＣＢ（１３０２）の上に載置される。ファラデー箱要素（１３０６）は、フォトダイオード（１３１７）および（１３３７）ならびに周辺高利得増幅回路を遮蔽するために使用される。
【０１４７】
蛍光励起は、標的フルオロフォアの励起スペクトルに合致するように選択される、表面載置ＬＥＤ（１３３１）によって標的チャネル（矢印Ａ）の中に提供される。光源ＬＥＤ（１３３１）は、発散光線を発光し、次いで、放射された光線は光源励起レンズ（１３３２）によって平行にされる。光源レンズ（１３３２）は、ＬＥＤに対面する平面を有する、平凸レンズである。次いで、平行光線は、励起帯域通過フィルタ（１３３３）を通過させられてもよい。検出器ヘッドは、システムの熱が増加または減少するにつれて、または複数の励起強度がアッセイの間に要求されるとき、アッセイの間、ＬＥＤ強度を修正し、例えば、一定ＬＥＤ強度を経時的に維持する能力を有する。これは、約５％のコリメートされ、フィルタ処理された励起光が、光サンプラ鏡から、中性濃度フィルタを通して、ＬＥＤ強度検出器に反射される、閉ループ直接ＬＥＤ強度変調回路によって遂行される。次いで、平行のフィルタにかけられた励起光線の残りは、入射ビームに対して４５度で設置される、二色性鏡要素またはビームスプリッタ（１３３４）から反射され、平凸対物レンズ（１３３０）および検出器筐体の外部ウィンドウを通過させられる（矢印Ａ）。レンズ１３３０を通過した後、励起光は、標的フルオロフォアを有する試料液体を含む、マイクロアッセイカートリッジに埋め込まれた検出チャンバ（図示せず、図１４−１７参照）を通して集束させられる。試料液体を通る励起光の経路長は、マイクロアッセイカートリッジの後のバックミラーの使用によって２倍にされる。標的フルオロフォアは、入射光によって励起される。フルオロフォアの発光は、概して、励起波長よりも長い波長であり、標的フルオロフォアのストークス偏移に等しい量だけ偏移される。
【０１４８】
検出チャンバの中の標的フルオロフォアからの帰還発光の一部分は、平凸サンプリングレンズ１３３０によって収集され、二色性鏡１３３４に衝打する前に平行にされる。随意で、検出チャンバの後の加熱ブロック上に載置されたバックミラーによってさらに強化される、発光した光の収集を最適化するよう、レンズと試料との間の作業距離をさらに縮小するために、フレネルレンズが使用されてもよい。二色性ビームスプリッタ１３３４は、励起および発光波長の間の波長カットオフを有するため、二色性鏡１３３４は、発光した蛍光光線用の通過帯域ビームスプリッタ、および励起光用の阻止帯域フィルタとしての役割を果たす。それは、反射励起光および対物レンズウィンドウを通して光路に進入する周囲光を反射しながら、発光した蛍光を伝達する。次いで、二色性ビームスプリッタ１３３４を通過する発光した光は、発光フィルタ１３３５を通過し、その目的は、図２０と関連する説明でさらに説明される。次いで、発光フィルタ１３３５から退出する光は、平凸センサレンズ１３３６を通過し、そこで、ＰＣＢ１３０２に表面載置され、ファラデー箱１３０６によって電気的雑音から保護される、光センサ１３３７の表面の上に集束させられる。
【０１４９】
上記の光路は、複数（例えば、５つ）のチャネルの中で反復され得、いずれの蛍光放出バンドも検出する潜在力がある。第２の（対照）チャネルは、対照励起ＬＥＤ１３１１、平凸励起レンズ１３１２、励起フィルタ１３１３、二色性ビームスプリッタ１３１４、対物レンズ１３１０、対照発光フィルタ１３１５、平凸センサレンズ１３１６、および対照フォトダイオード１３１７を有する。両方のフォトダイオードからの出力は、フォトダイオードの隣で基板に内蔵され、増幅器からの慎重に遮蔽されたピンを介して、センサＰＣＢ上の埋め込みマイクロプロセッサに接地される、３段トランスインピーダンス増幅器によって増幅される。
【０１５０】
一実施形態では、フルオロフォアとしてのフルオレセインおよびテキサスレッドの使用によって例示されるように、励起ＬＥＤ１３３１は、標的チャネルに使用される４８５±１２ｎｍの本質的に単色の光を送達するための帯域通過励起フィルタ１３３３を有する４７０ｎｍＬＥＤであり、帯域通過フィルタ１３１３を有する５９０ｎｍＬＥＤ１３１１が、対照チャネルに使用された。励起ＬＥＤは、５０または６０Ｈｚにおいて、および蛍光頭上照明と関連する調和周波数において、ＡＣ電力関連雑音をフィルタにかけるよう、１３０Ｈｚのストローブ速度を使用して、オンおよびオフに変調または「ストローブ」され、また、３０または６０Ｈｚで存在してもよい、散在する周囲光および電気的雑音に関するファントム信号もフィルタにかける。上記のように、局所フィードバックセンサが、光源ＬＥＤ出力強度を監視し、安定させるために使用される。フルオロフォア発光の検出監視は、ホストコントローラによって制御されるステッピングモータの動力下で検出器ヘッドのレール上の移動と協調される。検出器ヘッドの中の埋め込みマイクロプロセッサおよび関連回路には、ＲＡＭメモリ、ＲＯＭメモリ、Ａ−Ｄ変換器、３段トランスインピーダンス増幅器、およびこれらの機能に対処するための信号処理およびコマンドシーケンスファームウェアが提供される。
【０１５１】
光センサ１３１７および１３３７のそれぞれは、共通ＰＣＢ１３０２の上に載置される。これらの光センサのそれぞれからの出力信号脚部は、それぞれの３段トランスインピーダンス増幅器（図示せず）の前置増幅器または第１の台に直接接続される。ＰＣＢ１３０２は、入力信号へのＲＦまたは電磁干渉の不要な効果を最小化するように、ハードウェア雑音低減構成要素、具体的には、埋め込み接地面およびファラデー箱１３０６を大いに利用する。増幅器は、ファラデーケージ、バイパスコンデンサ、信号調節前置増幅器、別個の接地板、金属化検出器ヘッド筐体、またはそれらの組み合わせによって電子雑音から遮蔽され、増幅器は、センサに電気的に近接近している。光学信号取得、事前調節、増幅、およびデジタル化は、遮蔽環境内で動作する自律ダイモンによって制御される。検出ヘッド内の局所制御下のこれらのハードウェア雑音低減要素と、光学データ取得、デジタル化、および処理方法の組み合わせは、不要な雑音の効果から本質的に免れる検出器設計につながる。トライステージ増幅器が、最大１０１４の利得のために構成されてもよく、所望に応じて、１０２、１０３、１０６、１０１０、または１０１２の利得のために選択的に構成される。
【０１５２】
我々は、驚くべきことに、信号経路長を最小限にし、センサダイオード導線の周囲および励起回路基板とセンサ回路基板との間の接合部等において必要な、ファラデー遮蔽の効果的使用を可能にすることによって、走査ヘッド内の信号処理のパッケージ化が、向上された信号対雑音比および感度とともに、隔離された低雑音環境を達成することを見出した。随意に、検出器筐体は、アルミニウムから製作されるか、または伝導性ポリマーでコーティングおよび接地され、さらに、内部電子機器を望ましくない干渉から遮蔽してもよい。有利には、より高い信号増幅が、本環境において実現される。
【０１５３】
図１４は、マイクロアッセイカートリッジ内の光ウィンドウとの外部光学インターフェースを示す、蛍光検出器ヘッド１３００の内部光学構成要素の概略図である。非従来的に、複数の独立光路または「チャネル」が単一の検出ヘッドに形成され、電子ＰＣＢおよび下流信号処理回路を共有するが、雑音干渉を低減するように、励起光学部は一方の回路基板の上に載置され、検出光学部はもう一方の回路基板の上に載置される。２つの基板は、角載置ピン接合点によって電気的に連結され、別個の接地板上に載置されたバイパスコンデンサを使用して電子的に隔離される。
【０１５４】
図１４には、マイクロアッセイカートリッジ１４０２内に埋め込まれた検出または試料ウェル（１４０３）の中のフルオロフォアの励起のための光学遷移が示されている。ヘッドは、走査ヘッドであり、マイクロアッセイカートリッジ１４０２（二重矢印）を横断する。ＰＣＢ１３０１上の励起ＬＥＤ１３３１からの光は、レンズ１３３２によって平行にされ、帯域通過フィルタ１３３３によって本質的に単色にされる。前述のように、ＬＥＤ強度制御ループは、コリメートされた光を、光サンプラ鏡１３３８から、中性濃度フィルタ１３３９を通して、ＬＥＤ強度検出器１３４０に反射させることによって形成される。検出ウェル１４０３の中の任意の１つまたは複数のフルオロフォア（対照フルオロフォアであろうと標的フルオロフォアであろうと）は、対物レンズ１３３０によって試料上に集束された入射光１４２０によって励起される。図Ｘでは、ルオロフォアの発光は、対物レンズ１３３０によって収集され、二色性ビームスプリッタ１３３４、発光フィルタ１３３５、およびセンサレンズ１３３６を通過した後にセンサ１３３７に伝達される。センサ１３３７は、出力信号を増幅し、ファラデー箱の中で遮蔽される、高利得トランジスタの基部と直接電気的に接触している。発光した蛍光は、概して、フルオロフォアのストークス偏移に従って、より長い波長であり、発光した光が、損失を伴わずに二色性帯域通過鏡１３３４および発光帯域通過フィルタ１３３５を通過することを可能にする。したがって、試料チャンバ１４０３ａから対物レンズ１３３０へ戻される光は、発光および反射蛍光１４２１および反射励起光１４２０の混合物である。散在する反射を捕捉するように、光トラップ（図示せず）が提供される。反射光１４２０は、二色性鏡１３３４を通過せず、光源に戻され、センサ１３３７における発光強度の測定に干渉しない。励起源、光源平行レンズ、励起フィルタ、二色性鏡、対物レンズ、励起フィルタ、センサレンズ、および増幅器を有する検出器を含む、単一チャネルの光学要素は、本質的に単色の光源波長と、標的（または対照）フルオロフォアの特性を示す特定の波長において蛍光を検出するための高度特異的センサとを有する、光学部モジュールを構成する。一方の光学部モジュールまたはチャネルが分析法標的に、他方のモジュールが対照チャネルに使用されてもよい。複数のフルオロフォアについてのデータを収集するために、タンデム載置光学部チャネルが使用されてもよく、その場合、電気的処理は、ホスト器具への伝送前に、常駐ダイモンの制御下、埋め込みマイクロプロセッサを通して多重化される。示されるように、２つのチャネルはそれぞれ、２つの回路基板のそれぞれ上で回路を共有するが、別個の光学部を有する。随意に、付加的なチャネルが、示される光学要素の複製のプロセスによって、検出器ヘッドに組み込まれてもよい。
【０１５５】
マイクロアッセイカートリッジ１４０２は、検出器ヘッド１３００に対して移動可能（二重矢印）であり、検出器ヘッドまたはカートリッジトレイあるいは載置シャーシの動力化は、走査を可能にし、カートリッジ１４０２を横断するトランセクトは、例えば、測定が試料チャンバ１４０３上で行われることを可能にする。検出器ヘッドの中で並んで載置される複数の検出光学部を使用することによって、試料チャンバを複数のフルオロフォアについて連続して走査することができる。
【０１５６】
一実施形態によれば、励起電子機器がプリント回路基板（１３０１）の上に載置され、検出電子機器が第２のＰＣＢ（１３０２）の上に載置される。エッジコネクタ１３０４が、基板を電気的に接合する。ファラデー箱１３０６が、散在する電磁雑音からセンサおよび関連高利得増幅器を保護する。ペルチェ熱ポンプの温度は、光学データが、自律プロセスにおいて、検出ヘッド内の埋め込みプロセッサによって得取される間、ホストコントローラの制御下、温度およびモータ機能を用いて、例えば、ＦＲＥＴ融解判定におけるように、走査の間、勾配をつけることができる。
【０１５７】
アッセイ認証および品質制御
驚くべきことに、本発明のホスト器具の自律検出器ヘッド機能は、各チャネルが、励起光を放射するためのＬＥＤと、励起フィルタを有する少なくとも１つの光経路と、放出フィルタと、定義された通過帯域内のフルオロフォアからの放出の検出を可能にするように調整される二色性鏡と、該励起光を濃縮し、該放出を収集するための対物レンズと、任意の通過帯域放出を受信するためのセンサと、センサからの出力を増幅させるための高利得増幅器とを備えるように、個々のフルオロフォアの検出のための別個の光チャネルを含む二重ヘッドおよびマルチヘッド検出器内で多重化されることができ、各ＬＥＤは、チャネルの照射周波数が重複しないような周波数範囲内で光を放射するように構成され、そして各光チャネルは、チャネルの放出通過帯域が重複しないように構成される。さらに、各光チャネルは、前述のように、ＬＥＤ強度を動作中に修正するために、ＬＥＤ強度制御回路とともに構成される。
【０１５８】
アッセイ認証のために、２つの（またはそれを上回る）センサチャネルが、２つまたはそれを上回るフルオロフォアを監視するために提供され、これら２つのセンサチャネルは、各フルオロフォアからの放出通過帯域が重複しないように構成される。好ましい実施形態では、第１の検出チャネルは、標的信号を検出する目的のためのものであって、第２の検出チャネルは、内部プロセス対照信号を検出する目的のためのものであって、アッセイ結果は、有効内部プロセス対照信号が報告される場合であって、かつその場合に限り、報告される。
【０１５９】
本システムは、「バイプレックス」またはマルチプレックス標的およびプロセス対照信号のペアを成す収集を要求するアッセイプロトコルの認証で有用であることが証明された。ＦＤＡ  ＣＬＩＡウェーバー要件に関して、標的およびプロセス対照テンプレートの両方が並行して増幅される場合、陽性プロセス対照信号が、検査試料のアッセイ結果を報告または請求することができる前に、存在するはずである。検出可能プロセス対照信号が存在しない場合には、検出された任意の標的信号は、有効な結果ではない。本条件が満たされる場合、１９８８年の臨床検査改善修正法案（ＣＬＩＡ）の下、単純かつ低リスク検査を統制する規制は、免除され、検査は、医院および種々の他の場所において監視を伴わずに行われることができる。これらのＣＬＩＡウェーバー要件を満たすために、蛍光検出器は、例えば、ＰＣＲによって増幅される標的感染性生物の存在だけではなく、標的または内因性ヒト遺伝子とともに共存し、同じＰＣＲ反応または器具中で並行して行われるＰＣＲ反応によって増幅される、内因性ヒト対照生物の存在も検出できることが必要である。例えば、プロセス対照は、ヒトミトコンドリア遺伝子であってもよく、本発明の好ましい実施形態では、プロセス対照は、ミトコンドリアチトクロームｃオキシダーゼサブユニット２をコードする、ＭＴＯＣ２遺伝子である。
【０１６０】
検出システムは、ＵＶ、可視領域、および近赤外スペクトル内の波長のために構成することができる。近単色出力、フィルタ、発色団、およびフルオロフォアを有する、利用可能な光源は、３００〜９００ｎｍの範囲内の同調励起および放出通過帯域を可能にする。本発明の好ましい動作モードのうちの１つである、蛍光検出モードでの用途について、装置は、ＵＶおよび可視スペクトル内の励起スペクトルを伴う特定の蛍光染料のために、ならびにＵＶ、可視、および近赤外スペクトル内の発光のために構成することができる。赤色シフトがより典型的であるが、上方変換フルオロフォアも使用されてもよい。
【０１６１】
埋め込みマイクロプロセッサへの入力は、いくつかの標的被分析物および内部プロセス対照が同時にアッセイされ得るように多重化される。検出器ヘッドは、少なくとも２つまたはそれを上回る光チャネルが提供され、それぞれは、離散波長で動作する、独立励起光学部および放出光学部を有する。白色励起光は、標的フルオロフォアおよび内部対照フルオロフォアが共通液体試料中で混合されるとき等、多重化されたアッセイ内の異なるフルオロフォア間の可能性として考えられるクロストークを排除するために使用されない。
【０１６２】
良好な実験実践標準はまた、典型的には、外部対照として行われる、陽性および陰性アッセイ対照を用いた診断検査結果の認証を要求する。技術水準に優る大きな進歩として、本発明のマイクロアッセイカートリッジは、統合された陽性および陰性対照が提供される。図１５および１６は、一般化されたマイクロ流体アッセイ回路に統合された、本発明の陽性および陰性対照回路の特定の実施形態の詳細を図示する。図１５は、本発明の一実施形態を図示する、デバイス１００の概略図である。マイクロ流体デバイス１００は、２つの独立アッセイ回路：検査アッセイ回路２００および対照アッセイ回路３００を有する。検査アッセイ回路２００は、マイクロ流体チャネル２１５および試料抽出チャンバ２２０と流体連通する、試料入口ポート２１０を含む。試料抽出チャンバ２２０は、下流チャネル２３５および１つまたはそれを上回る検査アッセイウェルと流体連通する。本実施形態では、マイクロ流体チャネル２３５は、３つの検査アッセイウェル２５０ａ、２５０ｂ、および２５０ｃと流体連通するが、当業者は、検査アッセイ回路２００が任意の数のアッセイウェルを含んでもよいことを理解し得る。アッセイウェル２５０ａ、２５０ｂ、および２５０ｃは、分子アッセイ（例えば、ＰＣＲ）を行い、アッセイ信号（例えば、蛍光信号）の有無を検出するために必要な全ての試薬を含む。各アッセイウェルは、酵素混合物２７０ａ、２７０ｂ、または２７０ｃを含み、その組成は、同じである。酵素混合物は、酵素（単数または複数）と、標的テンプレートおよびプロセス対照テンプレートの増幅のために必要な他の試薬とを含む。各アッセイウェルはさらに、プロセス対照プライマー／プローブ混合物２７５ａ、２７５ｂ、または２７５ｃを含み、その組成もまた、同じである。プロセス対照プライマー／プローブ混合物は、プロセス対照テンプレートの増幅および検出のために好適なプライマーおよびプローブを含む。各アッセイウェルはさらに、図１５において異なる色で区別される、特有の標的テンプレートの増幅および検出のために好適な特有の標的プライマー／プローブ混合物を含む。本実施形態では、アッセイウェル２５０ａは、標的配列１プライマー／プローブ混合物２８０を含み、アッセイウェル２５０ｂは、標的配列２プライマー／プローブ混合物２８５を含み、アッセイウェル２５０ｃは、標的配列３プライマー／プローブ混合物２９０を含む。本発明の実施形態は、３つの検査標的配列を検出するように構成されるが、任意の数の標的配列が、本発明のアッセイウェルおよび標的配列プライマー／プローブ混合物の数を増減することによってアッセイされてもよいことが、当業者に容易に理解され得る。
【０１６３】
マイクロ流体デバイス１００の対照アッセイ回路３００は、下流マイクロ流体チャネル３２５と流体連通する、対照緩衝液チャンバ３２０を含む。一実施形態では、対照緩衝液チャンバ３２０は、任意の生物学的材料、例えば、核酸を欠いた空の緩衝液溶液を含む。マイクロ流体チャネル３２５は、２つの対照チャネル、すなわち、陰性対照チャネル３３５および陽性対照チャネル３４５に分割される。陰性対照チャネル３３５は、陰性対照アッセイウェル３５０ａ、３５０ｂ、および３５０ｃと流体連通する。本実施形態では、陰性対照チャネルは、３つのアッセイウェルと流体連通するが、当業者は、陰性対照回路が任意の数のアッセイウェルを備えてもよいことを理解し得る。各陰性対照アッセイウェルは、特有の検査アッセイウェルのうちの１つに対応する。陰性対照アッセイウェル３５０ａ、３５０ｂ、および３５０ｃは、分子アッセイを行い、プロセス対照テンプレートおよび標的テンプレートの有無を検出するために、検査アッセイウェルと同一試薬を含む。陰性対照アッセイウェル３５０ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ、酵素混合物３７０ａ、３７０ｂ、および３７０ｃを含む。これらの酵素混合物のそれぞれの組成は、各アッセイウェル内で同じである。酵素混合物は、酵素（単数または複数）と、標的配列およびプロセス対照配列の増幅のために必要な他の試薬とを含む。アッセイウェル３５０ａ、ｂ、およびｃはさらに、プロセス対照プライマー／プローブ混合物３７５ａ、３７５ｂ、および３７５ｃを含む。これらの内部制御プライマー／プローブ混合物のそれぞれの組成もまた、各アッセイウェル内で同じである。プロセス対照プライマープローブ混合物は、プロセス対照配列の増幅および検出のために好適なプライマーおよびプローブを含む。各アッセイウェルはさらに、特有の標的配列プライマー／プローブ混合物を含む。本実施形態では、アッセイウェル３５０ａは、標的配列１プライマー／プローブ混合物３８０ａを含み、アッセイウェル３５０ｂは、標的配列２プライマー／プローブ混合物３８５ａを含み、アッセイウェル３５０ｃは、標的配列３プライマー／プローブ混合物３９０ａを含む。標的配列プライマー／プローブ混合物３８０ａ、３８５ａ、および３９０ａはそれぞれ、特有の関心の標的配列を増幅および検出するために必要なプライマーおよびプローブを含む。混合物３８０ａのプライマー／プローブは、混合物２８０のものと同じである一方、混合物３８５ａおよび３９０ａのものは、それぞれ、混合物２８５および２９０のものと同じである。
【０１６４】
陽性対照チャネル３４５は、順に、陽性対照アッセイウェル３６０ａ、３６０ｂ、および３６０ｃと流体連通する。本実施形態では、陽性対照チャネルは、３つのアッセイウェルと流体連通するが、当業者は、陽性対照回路が任意の数のアッセイウェルを備えてもよいことを理解し得る。各陽性対照アッセイウェルは、特有の検査アッセイウェルおよび特有の陰性対照アッセイウェルに対応する。それらの対応する検査アッセイウェルと同様に、陽性対照アッセイウェル３６０ａ、３６０ｂ、および３６０は、分子アッセイを行い、標的およびプロセス対照配列の有無を検出するために必要な全ての試薬を含む。重要なこととして、陽性対照ウェルには、標的核酸テンプレートの外因性試料が埋め込まれる。各陽性対照アッセイウェルは、酵素混合物３７０ｄ、３７０ｅ、または３７０ｆを含み、その組成は、各アッセイウェル内で同じである。酵素混合物は、標的およびプロセス対照配列の増幅のために必要な酵素および試薬を含む。各アッセイウェル３６０ａ、ｂ、およびｃはさらに、プロセス対照プライマー／プローブ混合物３７５ｄ、３７５ｅ、および３７５ｆを含み、その組成もまた、各アッセイウェル内で同じである。プロセス対照プライマー／プローブ混合物は、プロセス対照標的の増幅および検出のために好適なプライマーおよびプローブを含む。各アッセイウェルはさらに、特有の標的配列プライマー／プローブ混合物を含む。本実施形態では、アッセイウェル３６０ａは、標的配列１プライマー／プローブ混合物３８０ｂを備え、アッセイウェル３６０ｂは、標的配列２プライマー／プローブ混合物３８５ｂを備え、アッセイウェル３６０ｃは、標的配列３プライマー／プローブ混合物３９０ｂを備える。各標的配列プライマー／プローブ混合物３８０ｂ、３８５ｂ、および３９０ｂは、特有の関心の標的配列を増幅および検出するために必要なプライマーおよびプローブを含む。混合物３８０ｂのプライマーおよびプローブは、混合物２８０のものと同じである一方、混合物３８５ｂおよび３９０ｂのものは、それぞれ、混合物２８５および２９０のものと同じである。各陽性対照アッセイウェルはまた、本明細書では、３９５ａ、３９５ｂ、および３９５ｃとして指定される、埋め込みプロセス対照テンプレート試料を含む。埋め込みプロセス対照テンプレート試料は、既知の量のプロセス対照テンプレート核酸を含み、各陽性対照アッセイウェル内で同じである。各陽性対照アッセイウェルはさらに、本明細書では、３９７ａ、３９７ｂ、または３９７ｃとして指定される、埋め込み標的配列テンプレート試料を含む。本実施形態では、標的配列テンプレート試料３９７ａは、既知の量の標的配列１核酸テンプレートを含む一方、標的配列テンプレート試料３９７ｂおよび３９７ｃは、それぞれ、既知の量の標的配列２および標的配列３核酸テンプレートを含む。本発明の本実施形態では、各標的配列は、単一の対応する陽性対照アッセイウェルによって表されるが、複数の陽性対照アッセイウェルは、所定の標的配列のために企図されてもよく、例えば、ウェルは、異なる濃度の所定の標的テンプレートを含むことが、当業者によって理解され得る。そのような陽性対照は、例えば、定量的ＰＣＲ分析のための標準的曲線を生成する際に有用である。
【０１６５】
図１６は、本発明の対照アッセイ回路の代替構成を描写する。本実施形態では、検査回路２００の構成は、図１５に説明されるものと同じであるが、陰性対照回路３００および陽性対照回路４００の構成は、それらが流体連通せず、代わりに、独立流体回路によって表されるという点において異なる。検査および陰性対照アッセイウェル内に含まれる全ての試薬は、図１５に関して説明されるものと同じである。陽性対照試料回路４００は、マイクロ流体チャネル４１５および下流試料抽出チャンバ４２０と流体連通する、陽性対照試料ポート４１０を含む。陽性対照アッセイウェル４６０ａ、４６０ｂ、および４６０ｃは、図１５に説明されるものと同一酵素混合物試料（４７０ｄ、ｅ、およびｆ）、プロセス対照プライマー／プローブ混合物（４７５ｄ、４７５ｅ、および４７５ｆ）、および標的プライマー／プローブ混合物（４８０ｂ、４８５ｂ、および４９０ｂ）を含む。しかしながら、陽性対照アッセイウェルは、埋め込み核酸テンプレート試料を含まない。本発明のこの実施形態の実践では、ユーザは、陽性対照テンプレートを外部試料源から供給し、これは、陽性対照チャネル４００の中に試料ポート４１０を通して導入される。陽性対照試料は、抽出チャンバ４２０内で処理され、抽出された核酸は、本明細書に説明される方法のいずれかによって、アッセイウェル４６０ａ、４６０ｂ、および４６０ｃ内で分析される。本発明の別の実施形態では、非生存陽性対照テンプレート試料は、マイクロ流体カートリッジの製造の際、試料ポート４１０の中に事前装填される。非生存陽性対照試料は、死滅した細菌、プラスミドＤＮＡ、または同等物を含んでもよい。事前装填された陽性対照試料は、前述の検査試料に関して説明されるものと同じ抽出および増幅を受ける。
【０１６６】
実践では、ユーザは、関心の標的配列のためにアッセイされるべき検査試料をマイクロ流体デバイスの試料ポートに適用する。試料は、下流抽出チャンバに進入し、そこで、核酸は、当技術分野において公知の任意の手段によってＰＣＲのために抽出される。抽出された核酸試料は、前述の試薬およびプライマー／プローブ混合物との増幅および検出のために、検査アッセイウェルに進入する。本発明の実施形態のデバイスは、並行して３つの特有の検査配列の有無に関してアッセイするように構成され、各特有の増幅反応は、標的およびプロセス対照テンプレートの同時増幅のために二重化される。デバイス上で行われる特有の標的アッセイ毎に、対応する陽性および陰性対照が、統合された制御回路内で並行して行われ、付加的外部品質制御を行う必要性を排除する。
【０１６７】
陽性および陰性対照アッセイからの結果は、検査アッセイ結果の認証のさらなる基準として使用されてもよい。例えば、陽性検査アッセイ結果を認証するために、陰性対照アッセイウェル内で産生された蛍光信号が閾値を下回り、陽性検査信号が外因性テンプレートとのシステム汚染に起因するものではないことを示すことを要求する、基準が設定されてもよい。同様に、陰性検査アッセイ結果を認証するために、陽性対照アッセイウェル内で産生される蛍光信号が閾値を超え、検査試薬、プライマー、およびプローブの完全性を確認することを要求する、基準が設定されてもよい。したがって、本発明の方法は、以下の３つの基準、すなわち、１）プロセス対照信号が陽性であって、２）陰性対照信号が陰性であって、かつ３）陽性対照信号が陽性であることが満たされる場合であって、かつその場合に限り、検査アッセイを有効として報告するステップを含む、検査アッセイ結果を認証するための方法を含む。
【０１６８】
本発明の他の実施形態は、検査結果を認証し、標的およびアッセイウェル内で生成された蛍光信号を直接比較することによって、結果を標的配列に対して陽性または陰性としてスコア化する方法を含む。これらの方法のさらなる詳述は、図１５を参照して行われる。一実施形態では、プロセス対照配列は、デバイス１００によって、第１の蛍光信号を使用して検出される一方、検査標的配列は、第２の蛍光信号を使用して検出される。第１および第２の蛍光信号間の直接比較は、それぞれ、エンドユーザによって設定される恣意的認証比率に基づく、診断アッセイのための以下の５つの認証またはスコア化ステップにおいて行われてもよい。１）プロセス対照アッセイの完全性を認証するために、陽性対照ウェル３６０ａ、３６０ｂ、および３６０ｃからの第１の蛍光信号（プロセス対照信号を報告する）が、陰性対照ウェル３５０ａ、３５０ｂ、および３５０ｃのものと比較される。一実施形態では、有効結果は、陽性対照信号が陰性対照信号のものよりも約２．５倍大きい場合のみ報告される。２）標的アッセイの完全性を認証するために、陽性対照ウェル３６０ａ、３６０ｂ、および３６０ｃからの第２の蛍光信号（標的信号を報告する）が、陰性対照ウェル３５０ａ、３５０ｂ、および３５０ｃのものと比較される。一実施形態では、有効結果は、陽性対照信号が陰性対照ウェルのものよりも約５倍大きい場合のみ報告される。３）抽出プロセスの完全性を認証するために、検査アッセイウェル２５０ａ、２５０ｂ、および２５０ｃからの第１の蛍光信号（プロセス対照信号を報告する）が、陰性対照ウェル３５０ａ、３５０ｂ、および３５０ｃのものと比較される。有効結果は、検査アッセイ信号が陰性対照ウェルのものよりも少なくとも約２倍大きい場合のみ報告される。４）陽性検査アッセイ結果の完全性を認証する（すなわち、汚染に起因する偽陽性を排除する）ために、陰性対照ウェル３５０ａ、３５０ｂ、および３５０ｃの第１の蛍光信号および／または第２の蛍光信号が、増幅前の同一ウェルからの信号レベル（すなわち、背景）と比較され、有効結果は、増幅後アッセイ信号が実質的に背景を上回って増加していない場合のみ報告される。５）検査アッセイ信号を検査被分析物に対して陽性または陰性としてスコア化するために、検査アッセイウェル２５０ａ、２５０ｂ、および２５０ｃ内の第２の蛍光信号が、陰性対照ウェル３５０ａ、３５０ｂ、および３５０ｃのものと比較される。検査アッセイは、検査信号が陰性対照ウェルよりも少なくとも約３倍大きい場合、陽性として、検査信号が陰性対照ウェルよりも約３倍未満において大きい場合、陰性として報告される。前述の認証比率は、恣意的であって、多くの代替値が、特定のアッセイに特有の多くの要因に応じて、任意の所定の診断アッセイに適切であり得ることが当業者によって理解され得る。
【０１６９】
本発明のさらに別の実施形態では、走査データは、アッセイウェルが検査試料で正常に充填されたかどうかを判定するために使用されてもよい。アッセイウェルは、乾燥している間は、「充填前」として、増幅前は、「充填後」として走査される。「充填前」と「充填後」の蛍光信号の比較は、ウェルが検査試料で適正に充填されたかどうかを判定するために使用されてもよい。例えば、充填後のより低い蛍光信号を示すウェルは、適正に充填されておらず、任意のアッセイ結果が無効である可能性が高いことを示し得る。
【０１７０】
有利なこととして、我々は、カートリッジを走査するために要求される時間が、カートリッジ内の各ウェルの位置を事前検出する、工場較正プロセスによって大幅に短縮され得ることを発見した。工場較正の際、カートリッジの連続走査が行われ、「定位置」からの各ウェル位置を特定するために要求されるステッピングモータパルスの数が、検出器ヘッドファームウェア内の不揮発性メモリ内に較正データとして記憶される。動作時、検出器ヘッドは、これらの較正された位置のそれぞれにステッピングし、これらの位置においてのみ光学データを採取することによって、「離散走査」を行う。検出器ヘッドが、走査の間、各個々のウェルを特定する必要性を排除することによって、全９つのウェルの走査を行うための時間は、約１秒未満まで短縮され、これは、技術水準における明白な改良点である。
【０１７１】
例示の実施形態は、以下を含む。
実施形態１．試料アッセイを行うためのマイクロアッセイカートリッジであって、
ａ）その中に封入された空気圧回路を有する、第１の成形筐体と、
ｂ）その中に封入された流体圧回路を有する、第２の成形筐体と、
ｃ）検査試料を受容するための試料入口であって、上記流体圧回路と流体連通する、試料入口と、
ｄ）上記第１の成形筐体と上記第２の成形筐体との間に介在されるラミネート層であって、上記空気圧回路および上記流体圧回路と流体連通する複数の空気流体圧膜を備える、ラミネート層と、
ｅ）上記流体圧回路と流体連通する、アッセイウェルアセンブリと、
ｆ）空気圧インターフェースを画定する空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、そこに印加される空気圧パルスを受容し、上記ポートは、上記空気圧回路と流体連通し、上記空気圧パルスは、陽圧パルスまたは陰圧パルスである、空気圧ポートのアレイと、
を備え、
【０１７２】
上記カートリッジは、上記空気流体圧膜が上記空気圧パルスによって動作可能に制御されるようにされる。
【０１７３】
実施形態２．上記流体圧回路は、検査アッセイ回路と、対照アッセイ回路とを備える、実施形態１に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１７４】
実施形態３．上記検査アッセイ対照回路は、上記試料入口と流体連通し、上記対照アッセイ回路は、上記試料入口と流体連通しない、実施形態２に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１７５】
実施形態４．上記対照アッセイ回路は、陽性対照アッセイ回路と、陰性対照アッセイ回路とを備える、実施形態３に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１７６】
実施形態５．上記陽性対照アッセイ回路および上記陰性対照アッセイ回路は、流体連通している、実施形態４に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１７７】
実施形態６．上記陽性対照アッセイ回路および上記陰性対照アッセイ回路は、流体連通していない、実施形態４に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１７８】
実施形態７．上記検査アッセイ回路、上記陽性対照アッセイ回路、および上記陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、複数のアッセイウェルのそれぞれと流体連通する、実施形態３に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１７９】
実施形態８．上記複数のアッセイウェルは、最大３つである、実施形態７に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１８０】
実施形態９．上記複数のアッセイウェルは、３つである、実施形態７に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１８１】
実施形態１０．上記複数のウェルはそれぞれ、プロセス対照を行うように構成される、実施形態７〜９のいずれか１つに記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１８２】
実施形態１１．上記陽性対照アッセイウェルは、陽性対照核酸テンプレートを備える、実施形態７〜９のいずれか１つに記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１８３】
実施形態１２．上記流体圧回路と流体連通する核酸捕捉アセンブリをさらに備える、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のマイクロアッセイカード。
【０１８４】
実施形態１３．上記核酸捕捉アセンブリは、中空筐体部材と、その中に配置される核酸捕捉膜とを備える、実施形態１２に記載のマイクロアッセイカード。
【０１８５】
実施形態１４．上記核酸捕捉膜は、シリカファイバを含む、実施形態１３に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１８６】
実施形態１５．上記筐体部材の内部に配置される、上側支持媒体および下側支持媒体をさらに備え、上記核酸捕捉膜は、上記上側支持媒体と上記下側支持媒体との間に介在される、実施形態１３に記載のマイクロアッセイカード。
【０１８７】
実施形態１６．上記上側および下側支持媒体は、ＰＯＲＥＸ（登録商標）フリットである、実施形態１５に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１８８】
実施形態１７．上記上側および下側支持媒体は、ポリプロピレンワッシャである、実施形態１５に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
【０１８９】
実施形態１８．上記アッセイウェルアセンブリは、複数のウェルとともに構成されるＰＣＲウェル層を備え、上記ウェルはそれぞれ、任意の得られた単位複製配列のＰＣＲ増幅および蛍光検出のために必要な全ての試薬を含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のマイクロアッセイカード。
【０１９０】
実施形態１９．上記ＰＣＲウェル層は、高熱伝導ポリマーから形成される、実施形態１８に記載のマイクロアッセイカード。
【０１９１】
実施形態２０．上記ＰＣＲウェル層は、終点ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、または融解曲線分析のために構成される、実施形態１８に記載のマイクロアッセイカード。
【０１９２】
実施形態２１．上記第１の成形筐体は、上記アッセイウェルアセンブリを覆う光学検出ウィンドウを備え、上記光学検出ウィンドウは、上記第１の成形筐体の上側表面上の菱形形状の開口部と、上記第１の成形筐体の下側表面上のより小さい菱形形状の開口部とから形成され、上記光学ウィンドウの側面は、第１の成形筐体の上側表面から下側表面に内向きに角度付けられる、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のマイクロアッセイカード。
【０１９３】
実施形態２２．上記光学ウィンドウと上記アッセイウェルアセンブリとの間に介在される光学的に透明なカバー層をさらに備える、実施形態２１に記載のマイクロアッセイカード。
【０１９４】
実施形態２３．上記第１の成形筐体は、上記空気圧回路および上記流体圧回路と流体連通する複数の試薬リザーバを備える、実施形態１〜２２のいずかに記載のマイクロアッセイカード。
【０１９５】
実施形態２４．上記試薬リザーバは、二重層箔パックである、実施形態２３に記載のマイクロアッセイカード。
【０１９６】
実施形態２５．上記箔パックは、気密接着剤シールによって上記第１の成形筐体に固定して接着される、実施形態２４に記載のマイクロアッセイカード。
【０１９７】
実施形態２６．最大６つの試薬リザーバを備える、実施形態２３に記載のマイクロアッセイカード。
【０１９８】
実施形態２７．上記箔パックの下方に配置される鋭利物をさらに備え、上記鋭利物は、上記箔パックが、上記空気圧回路への圧力パルスの印加によって、上記鋭利物と接触するように押勢されると、上記箔パックを破裂させるためである、実施形態２４に記載のマイクロアッセイカード。
【０１９９】
実施形態２８．上記鋭利物は、金属から形成される、実施形態２７に記載のマイクロアッセイカード。
【０２００】
実施形態２９．上記鋭利物は、上記成形筐体に対して垂直を下回る角度で突出する、返しを備える、実施形態２８に記載のマイクロアッセイカード。
【０２０１】
実施形態３０．上記角度は、約７５度である、実施形態２９に記載のマイクロアッセイカード。
【０２０２】
実施形態３１．上記試薬パックと上記鋭利物との間に介在されるバネをさらに備え、上記バネは、固有のバネ力を有し、上記バネ力は、圧力パルスの不在下、上記試薬パックと上記鋭利物との間の接触を防止する、実施形態２０に記載のマイクロアッセイカード。
【０２０３】
実施形態３２．上記空気圧ポート内に配置されるエアロゾルフィルタプラグをさらに備える、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載のマイクロアッセイカード。
【０２０４】
実施形態３３．上記エアロゾルフィルタプラグは、液体膨張性材料から形成される、実施形態２５に記載のマイクロアッセイカード。
【０２０５】
実施形態３４．上記陽圧および陰圧の状態は、＋１５０、＋１００、＋７０、０、−３５、および−５０ｋＰａから選択される、実施形態１〜３３のいずれか１つに記載のマイクロアッセイカード。
【０２０６】
実施形態３５．上記空気圧インターフェースをホスト器具に接合するように構成される単回使用密閉ガスケットをさらに備える、実施形態１〜３４に記載のマイクロアッセイカード。
【０２０７】
実施形態３６．試料アッセイを行うためのマイクロアッセイシステムであって、
ａ）ホスト器具とドッキングするために構成される使い捨てマイクロアッセイカートリッジであって、上記カートリッジは、その中に配置される流体圧回路を有し、上記流体圧回路は、それとインターフェースされた空気圧回路の制御下で動作するように構成され、上記流体圧回路は、検査アッセイ回路、陽性対照アッセイ回路、および陰性対照アッセイ回路を備える、カートリッジと、
ｂ）空気圧インターフェースを画定する１つまたはそれを上回る空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、空気圧状態を上記ホスト器具から上記空気圧回路に伝達するようにされる、空気圧ポートのアレイと、
ｃ）記ホスト器具内に配置される空気圧マニホールドであって、上記マニホールドは、そこに流体結合される複数の空気圧源を有し、複数の圧力状態で動作されるように構成され、上記空気圧インターフェースのポートを通して上記空気圧回路に流体接続される、マニホールドと、
ｄ）試料中の少なくとも１つの光学信号を検出するための検出器ヘッドであって、１〜５の検出チャネルを備える、検出器ヘッドと、
を備える、システム。
【０２０８】
実施形態３７．上記ホスト器具は、少なくとも１つのペルチェ熱ポンプを備える、実施形態３６に記載のマイクロアッセイシステム。
【０２０９】
実施形態３８．上記マイクロアッセイカートリッジは、上記流体圧回路と流体連通し、上記ペルチェ熱ポンプと熱接触する、アッセイウェルアセンブリを備える、実施形態３７に記載のマイクロアッセイシステム。
【０２１０】
実施形態３９．上記ホスト器具は、上記流体圧回路と熱接触する少なくとも１つの熱ブロックを備える、実施形態３８に記載のマイクロアッセイシステム。
【０２１１】
実施形態４０．上記カートリッジは、上記流体圧回路と流体連通し、上記熱ブロックと熱接触する、核酸捕捉アセンブリを備える、実施形態３８に記載のマイクロアッセイシステム。
【０２１２】
実施形態４１．上記検出器ヘッドは、上記検査試料回路および上記対照試料回路を横断する複数の離散経路上の上記マイクロアッセイカートリッジを走査するように構成され、上記離散経路はそれぞれ、少なくとも１つの基準点によって画定され、上記基準点は、ホスト器具較正の間に事前定義される空間座標である、実施形態３６〜４０のいずれか１つに記載のマイクロアッセイシステム。
【０２１３】
実施形態４２．上記空気圧インターフェースポートアレイを上記空気圧マニホールドに接合するように構成される単回使用密閉ガスケットをさらに備える、実施形態３６〜４１のいずれか１つに記載のマイクロアッセイシステム。
【０２１４】
実施形態４３．上記空気圧ポート内に配置されるエアロゾルフィルタプラグをさらに備える、実施形態３６〜４２のいずれか１つに記載のマイクロアッセイシステム。
【０２１５】
実施形態４４．約２０の空気圧ポートを備える、実施形態３６〜４３のいずれか１つに記載のマイクロアッセイシステム。
【０２１６】
実施形態４５．上記検出器ヘッドの検出チャネルはそれぞれ、励起光サンプラ鏡、中性密度フィルタ、およびＬＥＤ強度検出器を備える、ＬＥＤ強度変調回路を備える、実施形態３６〜４４のいずれか１つに記載のマイクロアッセイシステム。
【０２１７】
実施形態４６．上記カートリッジは、接地プレートに対して約１５度の角度で保持される、実施形態３６〜４５のいずれか１つに記載のマイクロアッセイシステム。
【０２１８】
実施形態４７．病態と関連付けられる標的蛍光信号のための制御されたアッセイを行う方法であって、
ａ）実施形態３６に記載のシステムを用いて検査アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、上記標的蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第１の光チャネル内で検出され、内因性成分と関連付けられるプロセス対照蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第２の光チャネル内で検出される、ステップと、
ｂ）実施形態３６に記載のシステムを用いて陽性対照蛍光信号のための陽性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、上記陽性対照蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第１の光チャネル内で検出される、ステップと、
ｃ）実施形態３６に記載のシステムを用いて陰性対照蛍光信号のための陰性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、上記陰性対照蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第１の光チャネル内で検出される、ステップと、
ｄ）上記第２の蛍光プロセス対照信号が検出され、上記陽性対照の第１の蛍光信号が検出され、上記陰性対照の第１の蛍光信号が検出されない場合であって、かつその場合に限り、上記第１の標的制御信号を上記アッセイの有効結果として報告するステップと、
を含む、方法。
【０２１９】
実施形態４８．上記検査アッセイ回路、上記陽性対照アッセイ回路、および上記陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、最大３つのアッセイウェルをそれぞれ備える、実施形態４７に記載の方法。
【０２２０】
実施形態４９．上記最大３つのアッセイウェルはそれぞれ、特有の標的蛍光信号をアッセイするように構成される、実施形態４８に記載の方法。
【０２２１】
実施形態５０．上記標的蛍光信号と上記陽性対照蛍光信号および上記陰性対照蛍光信号とを比較し、上記試料を上記病態に対して陽性または陰性としてスコアするステップをさらに含む、実施形態４７〜４９のいずれか１つに記載の方法。
【０２２２】
実施形態５１．上記比較するステップは、第１の比率を計算することであって、上記第１の比率は、上記標的蛍光信号と上記陽性対照蛍光信号の比率である、ことと、第２の比率を計算することであって、上記第２の比率は、上記標的蛍光信号と上記陰性対照蛍光信号の比率である、ことと、上記第１および第２の比率と認証比率とを比較することとを含む、実施形態５０に記載の方法。
【０２２３】
実施形態５２．上記試料は、上記第１の比率が上記認証比率よりも大きい場合、陽性としてスコアされ、上記試料は、上記第２の比率が上記認証比率未満である場合、陰性としてスコアされる、実施形態５１に記載の方法。
【０２２４】
上記は、本発明の特定の実施形態の説明であるが、種々の代替案、修正、および等価物を使用することが可能である。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではないが、代わりに、均等物のそれらの全範囲とともに、添付の請求項を参照して決定されるべきである。添付の請求項は、そのような制限が「〜のための手段」という語句を使用して所定の請求項で明示的に記載されない限り、手段と機能の制限を含むものとして解釈されるものではない。本明細書で参照される、および／または添付の出願データシートで引用される、２０１４年６月１１日に出願された米国仮出願番号第６２／０１０，９１５号を含むが、それに限定されない、米国特許、米国特許出願第公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許出版物の全ては、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。なおさらなる実施形態を提供するために、種々の特許、出願、および出版物の概念を採用する必要がある場合、実施形態の側面を修正することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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