(57)【要約】インターロイキン−１５ムテイン及び他のインターロイキン−１５関連分子、ならびにインターロイキン−１５ムテイン及び他のインターロイキン−１５関連分子を同定する方法が記載される。これらの改変も本明細書に記載され、前記改変はヒトインターロイキン−１５に比べて、ムテインまたは他分子の特性（例えば、半減期）を強化できる。医薬組成物及び使用方法も本明細書に記載される。【選択図】図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヘリックスＡ、ｂ）Ａ／Ｂヘリックス間接合、ｃ）ヘリックスＢ、ｄ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合、ｅ）ヘリックスＣ、ｆ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合、及びｇ）ヘリックスＤを含むペプチドであって、前記ペプチドがａ）〜ｇ）のうちの１つ以上に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換、付加、または欠失を更に含む、前記ペプチド。
【請求項２】
ａ）ヘリックスＡ、ｂ）Ａ／Ｂヘリックス間接合、ｃ）ヘリックスＢ、ｄ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合、ｅ）ヘリックスＣ、ｆ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合、及びｇ）ヘリックスＤを含む前記ペプチドであって、前記ペプチドが、
アミノ酸残基２（Ｗ）、４〜１２（ＮＶＩＳＤＬＫＫＩ；配列番号３７）もしくは１６（Ｉ）以外のヘリックスＡのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
アミノ酸残基３０（Ｄ）もしくは３１（Ｖ）以外のＡ／Ｂヘリックス間接合のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
アミノ酸残基３２（Ｈ）、３５（Ｃ）、４０（Ｍ）、４２〜４４（ＣＦＬ）、４７（Ｌ）もしくは５０（Ｉ）以外のヘリックスＢのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
Ｂ／Ｃヘリックス間接合のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
アミノ酸残基５９（Ｉ）、６１〜６６（ＤＴＶＥＮＬ；配列番号３８）もしくは６８〜７０（ＩＬＡ）以外のヘリックスＣのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
アミノ酸残基８５（Ｃ）もしくは８８（Ｃ）以外のＣ／Ｄヘリックス間接合のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
アミノ酸残基９９（Ｆ）、１００（Ｌ）、１０３（Ｆ）もしくは１０５〜１１２（ＨＩＶＱＭＦＩＮ：配列番号３９）以外のヘリックスＤの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；を含む、少なくとも１つのアミノ酸置換を更に含む、請求項１に記載の前記ペプチド。
【請求項３】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的置換である、請求項２に記載のペプチチド。
【請求項４】
前記ペプチドが配列番号３の生物活性と少なくとも同等の生物活性を有し、前記生物活性が生体外アッセイまたは生体内アッセイで決定される、請求項２に記載のペプチチド。
【請求項５】
前記生物活性が、ＴＮＦα産生アッセイ、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイ、Ｍ０７ｅ細胞増殖アッセイ、またはＴ−細胞ＩＦＮγ分泌アッセイからなる群から選択される生体外アッセイである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が免疫原性に悪影響を与えない、請求項２に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドの前記免疫原性が、Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープのうちの少なくとも１つをスクリーニングすることにより予測される、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記スクリーニンングが、インシリコスクリーニングシステムまたは生体外アッセイシステムのうちの少なくとも１つである、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下の領域：１３〜１５、１７〜２９、３６〜３９、５１〜５８、７１〜８４または８９〜９８のうちの少なくとも１つにある、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下の領域：１７〜２８、３６〜３８、５１〜５７、７１〜８４または８９〜９８のうちの少なくとも１つにある、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下の位置：１、３、１３〜１５、１７〜２９、３３、３４、３６〜３９、４１、４５、４６、４８、４９、５１〜５８、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１０２、１０４、１１３または１１４の少なくとも１つにある、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下の位置：１、１７〜２８、３６〜３８、４１、４５、４６、４８、４９、５１〜５７、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１１３または１１４の少なくとも１つにある、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、受容体結合に関連するアミノ酸残基の置換を含まない、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが改変ペプチドを形成するために少なくとも１つの改変を含み、
前記改変が前記ペプチドのアミノ酸配列を変更せず、及び、
前記改変が前記ペプチドの少なくとも１つの特性を向上させる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記改変ペプチドがＰＥＧ化されている、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記改変ペプチドが、前記ペプチドのＮ末端に共有結合される少なくとも１つのＰＥＧ分子を含む、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が５ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が２０ｋＤａ〜４０ｋＤａの分子量を有する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が２０ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が少なくとも３０ｋＤの分子量を有する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が少なくとも４０ｋＤの分子量を有する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記改変ペプチドがグリコシル化されている、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記改変ペプチドがＦｃ融合分子を含む、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記改変ペプチドが血清アルブミンを含む、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記改変が部位特異的である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記改変がリンカーを含む、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項２７】
前記改変が前記ペプチドの少なくとも１つの物理的特性を向上させる、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項２８】
前記物理的特性が溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期及び循環時間からなる群から選択される、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
前記改変ペプチドが成熟ヒトＩＬ−１５の活性と少なくとも同等の活性を有する、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項３０】
前記ペプチドが組み換えで産生される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項３１】
配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが表面露出型アミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
前記置換が下記の効果（ａ）前記ペプチドの少なくとも１つの物理的特性を向上させる；（ｂ）前記ペプチドの免疫原性に悪影響を与えない；または（ｃ）前記ペプチドの生物活性に悪影響を与えない；のうちの少なくとも１つを有する、前記ペプチド。
【請求項３２】
前記ペプチドが、受容体結合に関連するアミノ酸残基の置換を含まない、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３３】
前記置換が前記ペプチドの分子内ジスルフィド結合を破壊しない、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的置換である、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、アミノ酸残基３５、４２、８５及び８８のうちの１つ以上での置換ではない、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３６】
配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むペプチドであって、前記ペプチドが下記の特徴（ａ）配列番号３の前記ペプチドより免疫原性が大きくない；（ｂ）配列番号３の前記ペプチドの生物活性と少なくとも同等の生物活性を有する；（ｃ）配列番号３の前記ペプチドの少なくとも１つの物理的特性の向上を有する；のうちの少なくとも１つを有する、前記ペプチド。
【請求項３７】
前記ペプチドが少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項３８】
前記ペプチドが少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項３９】
前記ペプチドが少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４０】
前記ペプチドが少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４１】
前記ペプチドが少なくとも９０のアミノ酸残基を有する、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４２】
前記ペプチドが少なくとも１００のアミノ酸残基を有する、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４３】
前記ペプチドが少なくとも１０５のアミノ酸残基を有する、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４４】
前記ペプチドが少なくとも１１０のアミノ酸残基を有する、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４５】
前記ペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または付加を含む、請求項３６に記載のペプチド。
【請求項４６】
前記ペプチドが、受容体結合に関連するアミノ酸残基の置換を含まない、請求項４５に記載のペプチド。
【請求項４７】
前記ペプチドが表面露出型アミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項４５に記載のペプチド。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの付加、欠失または置換が前記ペプチドの分子内ジスルフィド結合を破断しない、請求項４５に記載のペプチド。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的置換である、請求項４５に記載のペプチド。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、アミノ酸残基３５、４２、８５及び８８のうちの１つ以上での置換ではない、請求項４５に記載のペプチド。
【請求項５１】
前記物理的特性が、溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期及び循環時間からなる群から選択される、請求項３１または３６に記載のペプチド。
【請求項５２】
前記ペプチドが配列番号３の生物活性と少なくとも同等な生物活性を有し、前記生物活性が生体外アッセイまたは生体内アッセイにより決定される、請求項３１または３６に記載のペプチド。
【請求項５３】
前記生体外活性がＴＮＦα産生アッセイ、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイ、Ｍ０７ｅ細胞増殖アッセイ、またはＴ−細胞ＩＦＮγ分泌アッセイのうちの少なくとも１つである、請求項５２に記載のペプチド。
【請求項５４】
前記ペプチドの免疫原性が、Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープの少なくとも１つをスクリーニングすることにより予測される、請求項３１または３６に記載のペプチド。
【請求項５５】
前記スクリーニンングが、インシリコスクリーニングシステムまたは生体外アッセイシステムのうちの少なくとも１つである、請求項５４に記載のペプチド。
【請求項５６】
前記ペプチドが改変ペプチドを産生するために少なくとも１つの改変を含み、
前記改変が前記改変ペプチドのアミノ酸配列を変更せず、及び
前記改変ペプチドが成熟ヒトＩＬ−１５の活性と少なくとも同等な活性を有する、請求項３１または３６に記載の前記ペプチド。
【請求項５７】
前記改変ペプチドがＰＥＧ化されている、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項５８】
前記改変ペプチドが、前記ペプチドのＮ末端に共有結合される少なくとも１つのＰＥＧ分子を含む、請求項５７に記載のペプチド。
【請求項５９】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が５ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量を有する、請求項５７に記載のペプチド。
【請求項６０】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が２０ｋＤａ〜４０ｋＤａの分子量を有する、請求項５７に記載のペプチド。
【請求項６１】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が２０ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項５７に記載のペプチド。
【請求項６２】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が少なくとも３０ｋＤの分子量を有する、請求項５７に記載のペプチド。
【請求項６３】
前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が少なくとも４０ｋＤの分子量を有する、請求項５７に記載のペプチド。
【請求項６４】
前記改変ペプチドがグリコシル化されている、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項６５】
前記改変ペプチドがＦｃ融合分子を含む、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項６６】
前記改変ペプチドが血清アルブミンを含む、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項６７】
前記改変が部位特異的である、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項６８】
前記改変がリンカーを含む、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項６９】
前記改変が前記ペプチドの少なくとも１つの物理的特性を向上させる、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項７０】
前記物理的特性が溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期及び循環時間からなる群から選択される、請求項６９に記載のペプチド。
【請求項７１】
前記改変ペプチドが成熟ヒトＩＬ−１５の活性と少なくとも同等の活性を有する、請求項５６に記載のペプチド。
【請求項７２】
前記ペプチドが組み換えで産生される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項７３】
前記ペプチドが組み換えで産生される、請求項３１または３６に記載のペプチド。
【請求項７４】
請求項１、２、３１または３６に記載のペプチドをコード化する核酸分子。
【請求項７５】
前記核酸分子が、生体外、細胞内または生体内の前記ペプチドをコード化する核酸分子の発現を与える発現制御要素に操作可能に連結されている、請求項７４に記載の核酸分子。
【請求項７６】
請求項７５に記載の前記核酸分子を含む、ベクター。
【請求項７７】
前記ベクターがウイルスベクターを含む、請求項７６に記載のベクター。
【請求項７８】
請求項１、２、３１もしくは３６に記載のペプチドを発現させる、形質転換細胞または宿主細胞。
【請求項７９】
請求項１、２、３１または３６に記載のペプチド、及び薬学的に許容さえる希釈剤、担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項８０】
前記賦形剤が等張性の注射液である、請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
前記医薬組成物がヒトへの投与に好適である、請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤を更に含む、請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
請求項７９に記載の前記医薬組成物を含む、滅菌容器。
【請求項８４】
前記滅菌容器が注射器である、請求項８３に記載の減菌容器。
【請求項８５】
請求項８４に記載の前記減菌容器を含む、キット。
【請求項８６】
少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤を含む第２の減菌容器を更に含む、請求項８６に記載のキット。
【請求項８７】
請求項１、２、３１または３６に記載の前記ペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項８８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項８７に記載の抗体。
【請求項８９】
前記抗体が、別々のポリペプチド中に存在する、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９０】
前記抗体が、単一のポリペプチド中に存在する、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９１】
前記抗体が重鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９２】
前記抗体が検出可能に標識化される、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９３】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９４】
前記抗体がヒト抗体である、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９５】
前記抗体が約１０７Ｍ−１〜約１０１２Ｍ−１の親和性で前記ペプチドと結合する、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９６】
前記抗体が、脂質部分、脂肪酸部分、多糖類部分、及び炭水化物部分から選択される共有結合部分を含む、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９７】
前記抗体が親和性ドメインを含む、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９８】
前記抗体が固相担体に不動化される、請求項８７に記載の抗体。
【請求項９９】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項８７に記載の抗体。
【請求項１００】
前記抗体が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である、請求項８７に記載の抗体。
【請求項１０１】
前記ｓｃＦｖが多量体化されている、請求項１００に記載の抗体。
【請求項１０２】
前記抗体が共有結合した非ペプチドポリマーを含む、請求項８７に記載の抗体。
【請求項１０３】
前記ポリマーがポリ（エチレングリコール）ポリマーである、請求項１０２に記載の抗体。
【請求項１０４】
請求項８７に記載の抗体、及び薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０５】
前記賦形剤が等張性の注射液である、請求項１０４に記載の医薬組成物。
【請求項１０６】
前記医薬組成物がヒトへの投与に好適である、請求項１０４に記載の医薬組成物。
【請求項１０７】
少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤を更に含む、請求項１０４に記載の薬学的組成物。
【請求項１０８】
請求項１０４に記載の前記医薬組成物を含む、滅菌容器。
【請求項１０９】
前記滅菌容器が注射器である、請求項１０８に記載の減菌容器。
【請求項１１０】
請求項１０９に記載の前記減菌容器を含む、キット。
【請求項１１１】
第２の治療剤を含む第２の滅菌容器を更に含む、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
治療に有効な量の請求項２、３１もしくは３６に記載のペプチドを対象に投与することを含む、対象の疾患、障害もしくは状態を治療し、または予防する方法。
【請求項１１３】
前記疾患、障害または状態が増殖性疾患である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記増殖性疾患が癌である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記癌が固形腫瘍または血液障害である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記疾患、障害または状態が免疫性または炎症性障害である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１７】
前記免疫性または炎症性障害が、炎症性腸疾患、乾癬、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、及びアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記疾患、障害または状態がウイルス性障害である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ウイルス性障害が、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及びサイトメガロウイルスからなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記対象がヒトである、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２１】
前記投与が非経口注射によるものである、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２２】
前記非経口注射が皮下で行われる、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
少なくとも１つの追加の予防剤または治療剤を投与することを更に含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２４】
配列番号３の前記アミノ酸配列を含むペプチドであって、前記ペプチドが以下の位置：１、３、１３〜１５、１７〜２９、３３、３４、３６〜３９、４１、４５、４８、４９、５１〜５８、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１０２、１０４、１１３または１１４の１つで、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記ペプチド。
【請求項１２５】
前記ペプチドが、以下の位置：１、３、１３〜１５、１７〜２５、２７〜２９、３３、３４、３６〜３９、４１、４５、４６、４８、４９、５１〜５８、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１０２、１０４、１１３または１１４で前記少なくとも１つのアミノ酸残基に代えてチロシンの置換を含む、請求項１２４に記載のペプチド。
【請求項１２６】
前記ペプチドが、以下の位置：１、３、１３〜１５、１７〜２５、２７〜２９、３３、３４、３６〜３９、４５、４８、４９、５１〜５６、５８、６０、６７、７２〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１０２、１０４、１１３または１１４で前記少なくとも１つのアミノ酸残基に代えてシステインの置換を含む、請求項１２４に記載のペプチド。
【請求項１２７】
前記ペプチドが、以下の位置：１、１３〜１５、１７〜２２、２７〜２９、３４、３６、４８、４９、５１〜５８、６０、７２〜８２、８４、８７、８９〜９８、１０２または１０４で前記少なくとも１つのアミノ酸残基に代えてＮ−Ｘ−Ｓグリコシル化モチーフの置換を含み、
前記Ｎ−Ｘ−Ｓグリコシル化モチーフのアスパラギンが前記アミノ酸の位置を表す、請求項１２４に記載のペプチド。
【請求項１２８】
前記ペプチドが、以下の位置：１、１３〜１５、１７〜２２、２９、３４、３６、４８、４９、５１〜５８、６０、７１〜７８、８０〜８２、８４、８７、８９〜９８または１０２で少なくとも１つのアミノ酸残基に代えてＮ−Ｘ−Ｔグリコシル化モチーフの置換を含み、
前記Ｎ−Ｘ−Ｔグリコシル化モチーフのアスパラギンが前記アミノ酸の位置を表す、請求項１２４に記載のペプチド。
【請求項１２９】
請求項１２４〜１２８のいずれか１項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１３０】
請求項１２９に記載の前記医薬組成物を含む、滅菌容器。
【請求項１３１】
請求項１３０に記載の前記減菌容器を含む、キット。
【請求項１３２】
治療に有効な量の請求項１２４〜１２８に記載のペプチドを対象に投与することを含む、対象の疾患、障害もしくは状態を治療し、または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月１４日出願の米国特許仮出願第６２／０６３，７８４号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は特に、インターロイキン−１５ムテイン及び他のインターロイキン−１５関連分子、これらの改変物、及びその関連する使用に関する。
【０００３】
はじめに
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、サイトカイン活性、サイトカイン分泌、ＮＫ細胞の増殖及び生存、ＣＤ８＋メモリＴ細胞及びナイーブＣＤ８＋細胞の刺激に関連するサイトカインである（Ｆｅｈｎｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１６２：４５１１−２０（１９９９）参照）。多面発現性サイトカインとして、それは自然及び獲得免疫で重要な役割を果たす（Ｌｏｄｏｌｃｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ１３（６）：４２９−３９（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００２）及びＡｌｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０２：２５４１−４６（２００３）を参照）。
【０００４】
ＩＬ−１５は、マクロファージ、単球、樹枝細胞及び線維芽細胞を含む、多数の細胞型によって構成的に発現される（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４（５１６１）：９６５−６８（Ｍａｙ１９９４））。ＩＬ−１５の発現は、例えばサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、２本鎖ｍＲＮＡ、非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチド、Ｔｏｌｌ様受容体によるリポ多糖体、及びインターフェロン（例えばＩＦＮ−γ）によって、または例えばヘルペスウイルス、ヒト型結核菌及びカンジダアルビカンスによる単球の感染後、刺激されることができる（Ｂａｍｆｏｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１６０（９）：４４１８−２６（Ｍａｙ１９９８））。
【０００５】
ＩＬ−１５は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞上の特定の受容体複合体と結合する。ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαは活性化樹枝細胞及び単球で共発現して、ならびにＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒαを有する複合体で機能する（Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２８３：４１８９−９９（２００８））。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５αは、Ｔ細胞とＮＫ細胞−ＩＬ−２Ｒβ（ＩＬ−１５Ｒβ；ＣＤ  １２２とも称される）とγｃ（ＩＬ−２ＲＧ；ＣＤ１３２；γ−ｃ；通常はγ鎖）分子上の２つの鎖に、ヘテロ二量体として結合する。β及びγｃ鎖はＩＬ−２とＩＬ−１５の間で共有され、これらのサイトカインのシグナル伝達にとって重要である（Ｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：２８２２−３０（１９９４）ａｎｄ  Ｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：３６５４−３６６３（１９９５））。
【０００６】
ＩＬ−２／ＩＬ−１５βγｃ受容体複合体を共有することと同様に、ＩＬ−１５は、生体外でＩＬ−２のものと類似の多くの機能を伝達することを示した。それらは多くの生物活性を共有して、Ｔリンパ球の残存への類似の寄与を示す（Ｗａｌｄｍａｎｎら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１７：１９−４９（１９９９）を参照）。例えばそれらの異なる産生部位、それぞれＩＬ−２α及びＩＬ−１５Ｒαと称される膜受容タンパク質と関連するそれらの強さ、ならびにこれらの余分な受容分子の調整により、ＩＬ−２とＩＬ−１５の間の生物学的差異があり得ると考えられる。ＩＬ−２及びＩＬ−１５は、ＣＤ８＋メモリ細胞の数を調整する役割を果たす。
【０００７】
例えば特定のウイルス性障害及び癌状態を含む多くの疾患、障害ならびに状態にＩＬ−１５が関係しているという事実にもかかわらず、ＩＬ−１５関連薬剤は、現在市販品として入手可能でない。したがって安全かつ有効なＩＬ−１５薬剤は、これまで満たされていない医学ニーズに対応しようとする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、ＩＬ−１５組成物及びその使用に関する。用語「ＩＬ−１５」、「ＩＬ−１５ポリペプチド（複数を含む）」、「ＩＬ−１５剤（複数を含む）」、「ＩＬ−１５分子（複数を含む）」などは、幅広く解釈されることを目的としており、例えばヒト及び非ヒトＩＬ−１５関連の同族体、変異体（ムテインを含む）及びそのフラグメントを含むポリペプチド、ならびに例えばリーダー配列（例えば、シグナルペプチド）を有するＩＬ−１５ポリペプチドを含む。特定の実施形態は、前述の改変に関する。特定の実施形態において、改変（複数を含む）は、そのペプチドの改変されていないバージョンと比較して、ペプチドの少なくとも１つの特性またはたの特徴（例えば半減期、有効性）を向上させる。特定の実施形態では、別の特徴（複数を含む）（例えば、半減期などの薬物動態学的パラメータ）を強化する場合、改変（複数を含む）は生物活性の減少をもたらし、少なくとも治療学的展望から一般的により有益な、改変されたＩＬ−１５分子をもたらす。
【０００９】
本開示の更なる実施形態は、本明細書に記載の方法に従って改変することができるＩＬ−１５の特定のアミノ酸残基またはドメインを同定するための方法及び他の技術に関する。本明細書に記載のペプチドを使用し（例えば障害もしくはその症状の治療または予防に）、同定し及び／または生成する方法も、本開示の態様である。他の態様は、例えばペプチドを含む医薬組成物を含む。
【００１０】
成熟ヒトＩＬ−１５は、１１４アミノ酸の単量体ポリペプチドである。２つの転写物が報告されており、１つは、４８アミノ酸シグナルペプチド（長いシグナルペプチド、ＬＳＰ）（図１Ａ、配列番号ｌ）によるものであり、もう１つは２１アミノ酸シグナルペプチド（短いシグナルペプチド、ＳＳＰ）（図１Ｂ、配列番号２）によるものであり、その両方は同じ成熟タンパク質を産生する（図１Ｃ、配列番号３）。本明細書に記載するように、成熟ヒトＩＬ−１５は、３つの異なるアミノ酸セグメント（Ａ／Ｂループ、Ｂ／Ｃターン及びＣ／Ｄループ）により連結される４つのヘリックス（Ａ〜Ｄ）を含むと記載される。これらのアミノ酸セグメントは、ヘリックス間接合（複数を含む）とも称される。
【００１１】
変異させる及び／もしくは改変させることができる、またはそれができない、ＩＬ−１５ヘリックスならびにヘリックス間接合のアミノ酸残基ならびに領域を、以下に論じる。一例として、ＩＬ−１５の三次元コア内に埋もれたまたは受容体結合に関連するアミノ酸残基及び領域は、一般的には改変の候補ではない。
【００１２】
本開示は、ＰＥＧまたは他の部分（例えば血清アルブミン）と少なくとも１つのアミノ酸残基への付着を容易にする置換を含む、ペプチドを想定する。そのようなペプチドの例を、以下に詳細に記載する。
【００１３】
本明細書に記載のＩＬ−１５ペプチドの免疫原性を評価するための方法を、本明細書に記載する。更に別の実施形態では、改変されたペプチドは、少なくとも１つの特性（例えば、溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期及び循環時間を含む物理的特性）の改善を有する。このような特性を、更に以下に記載する。本開示の特定の実施形態では、変異ＩＬ−１５または改変ＩＬ−１５ペプチドは、対応する非改変ＩＬ−１５ペプチドよりも免疫原性が低い（すなわち、少ない免疫反応を刺激する）。他の実施形態において、改変ＩＬ−１５ペプチドは、対応する非改変ＩＬ−１５ペプチドよりも免疫原性で中性である（すなわち、免疫原性は治療に関連する方法では変更されない）。
【００１４】
本開示は、図１Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）を含むペプチドを想定しており、前記ペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または付加を含み、前記の置換（複数を含む）、欠失（複数を含む）または付加（複数を含む）は、例えば溶解度もしくは免疫原性に悪影響を与えない。本発明は、また、配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチドを意図し、ペプチドは、ａ）配列番号３のペプチドと比較して、改善された少なくとも１つの特性（例えば、溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期及び循環時間を含む物理的特性）を有し、ならびに／またはｂ）配列番号３のペプチドより免疫原性が大きくなく、ならびに／またはｃ）配列番号３のペプチドの生物活性に少なくとも等しい生物活性を有する。
【００１５】
異なる方法論の利用（例えばＩＬ−１５の正確な濃度を定量化する異なる方法及び／またはＩＬ−１５を産生する異なる方法）は、多少活性なＩＬ−１５−タンパク質濃度の計算の差異に起因する見かけの活性または実際の活性のいずれかでも−をもたらすことができることは、当業者には明らかであろう。スキルと経験を活かして、当業者は、ＩＬ−１５分子対ｈＩＬ−１５の相対的な生物活性を決定する際、これらの差異を考慮することができる。いくつかの実施形態において、このようなＩＬ−１５分子は、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０１、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１１０、少なくとも１１１、少なくとも１１２、または少なくとも１１３つのアミノ酸残基を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上述のペプチドのアミノ酸残基の付加（複数を含む）、欠失（複数を含む）または置換（複数を含む）は、ペプチドの分子内ジスルフィド結合を破壊しない。しかし、そのような付加（複数を含む）、欠失（複数を含む）または置換（複数を含む）はおそらく１つ以上の分子間の非共有結合（例えば、水素結合）を破断させるかもしれないが、このような破断は、タンパク質機能で治療的に関連する影響を有することは望ましくないという点に留意すべきである。本開示の教示に従って、特定の実施形態において、アミノ酸置換は保存的置換でもよく、他の特定の実施形態において、アミノ酸置換は非保存的置換であり得る。
【００１７】
特定の実施形態において、本開示は、配列番号３の生物活性に少なくとも等しい生物活性を有するペプチドを想定する。生物活性は、ケモカイン放出アッセイ、ＴＮＦα阻害アッセイ、ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイ、Ｍ０７ｅ細胞増殖アッセイまたはＴ−細胞ＩＦＮγ分泌アッセイを含む、当該技術分野において既知の任意の方法により決定することができる。Ｔ−細胞のスクリーニングは、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞またはＮＫ細胞を使用して実行可能である。当業者はこのようなアッセイを熟知しており、そのいくつかの代表的なプロトコルは本明細書に記載されている。同様にペプチドの免疫原性は、Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープのうちの少なくとも１つをスクリーニングすることによる予測を含む、当業者に既知の任意の方法により予測または決定することができる。一態様では、免疫原性は、インシリコシステム及び／または生体外アッセイシステムにより予測される。
【００１８】
本開示は更に配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを想定しており、ペプチドは表面露出アミノ酸残基のうちの少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ならびに置換は生物活性、免疫原性及び／または別の性質または特徴に悪影響を与えない。特定の実施形態において、これらのペプチドは更に、受容体結合に関連する任意のアミノ酸残基の置換を含まない。しかし、許容され得るＩＬ−１５受容体結合領域内もしくはそれに近接する１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失及び／または付加は、本開示により意図されることを理解すべきである。
【００１９】
本明細書の他で詳述され、かつ図３で示されるように、成熟ｈＩＬ−１５は、ａ）ヘリックスＡ（アミノ酸残基１〜１７）、ｂ）Ａ／Ｂヘリックス間接合（Ａ／Ｂループ）（アミノ酸残基１８〜３１）、ｃ）ヘリックスＢ（アミノ酸残基３２〜５３）、ｄ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合（Ｂ／Ｃターン）（アミノ酸残基５４〜５７）、ｅ）ヘリックスＣ（アミノ酸残基５８〜７７）、ｆ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合（Ｃ／Ｄループ）（アミノ酸残基７８〜９６）、及びｇ）ヘリックスＤ（アミノ酸残基９７〜１１４）を含む。いくつかの実施形態において、本開示はａ）ヘリックスＡ、ｂ）Ａ／Ｂヘリックス間接合、ｃ）ヘリックスＢ、ｄ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合、ｅ）ヘリックスＣ、ｆ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合、及びｇ）ヘリックスＤを含むペプチドを想定しており、このようなペプチドは更に、ｉ）アミノ酸残基２（Ｗ）、４〜１２（ＮＶＩＳＤＬＫＫＩ；配列番号３７）もしくは１６（Ｉ）以外のヘリックスＡのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｉ）アミノ酸残基３０（Ｄ）もしくは３１（Ｖ）以外のＡ／Ｂヘリックス間接合のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｉｉ）アミノ酸残基３２（Ｈ）、３５（Ｃ）、４０（Ｍ）、４２〜４４（ＣＦＬ）、４７（Ｌ）もしくは５０（Ｉ）以外のヘリックスＢのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｖ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｖ）アミノ酸残基５９（Ｉ）、６１〜６６（ＤＴＶＥＮＬ；配列番号３８）もしくは６８〜７０（ＩＬＡ）以外のヘリックスＣのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｖｉ）アミノ酸残基８５（Ｃ）もしくは８８（Ｃ）以外のＣ／Ｄヘリックス間接合のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｖｉｉ）アミノ酸残基９９（Ｆ）、１００（Ｌ）、１０３（Ｆ）もしくは１０５〜１１２（ＨＩＶＱＭＦＩＮ：配列番号３９）以外のヘリックスＤの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；のうちの少なくとも１つ含む。
【００２０】
前項に記載されているペプチドを参照すると、特定の実施形態において本開示はペプチドを想定しており、少なくとも１つのアミノ酸置換は以下の領域：１３〜１５、１７〜２９、３６〜３９、５１〜５８、７１〜８４または８９〜９８のうちの少なくとも１つにある。他の実施形態において、記少なくとも１つのアミノ酸置換は以下の領域：１７〜２８、３６〜３８、５１〜５７、７１〜８４または８９〜９８のうちの少なくとも１つにある。更に別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の位置：１、３、１３〜１５、１７〜２９、３３、３４、３６〜３９、４１、４５、４６、４８、４９、５１〜５８、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１０２、１０４、１１３または１１４の少なくとも１つにある。特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の位置：１、１７〜２８、３６〜３８、４１、４５、４６、４８、４９、５１〜５７、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１１３または１１４の少なくとも１つにある。
【００２１】
体系的アプローチを用いて、上述の同定された残基は、アンカーをＰＥＧ及び／または他の改変に提供できるアミノ酸を導入するために置換された。本開示の特定の実施形態では、システイン、チロシン及びＮ−グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ及びＮ−Ｘ−Ｔモチーフ）は、このような置換の候補として以前に同定した残基のそれぞれと置換した。以下に詳細に記載しかつ図６にまとめるように前記結果は、有利なＩＬ−１５ムテインの生成に関して、当業者に特定のガイダンスを提供する。
【００２２】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のペプチドの改変（複数を含む）を意図しており、改変（複数を含む）はペプチドのアミノ酸配列を変更せず（すなわちアミノ酸の置換、付加または欠失はＩＬ−１５の一次アミノ酸配列内に導入されない）、改変（複数を含む）は、非改変バージョンのペプチドと比較して、ペプチドの少なくとも１つの特性もしくは他の特徴（例えば、薬物動態パラメータまたは有効性）を改善または強化する。
【００２３】
本開示は、有益となり得る任意の改変の導入を想定することができる。したがって特定の実施形態において、改変は、ペプチドの少なくとも１つの物理的特性（例えば溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期及び循環時間）を改善する。他の改変は、受容体切断を遮断し、ＩＬ−１５受容体（複数を含む）に対する親和性を増大させる手段を導入すること（すなわち、ＩＬ−１５分子が長期間、受容体（複数を含む）とドッキングするようにオフ速度を改変すること）を含む。更に別の実施形態では、ＩＬ−１５ペプチドの改変は、治療的に関連する免疫原性のレベルに有害な影響を引き起こさず、他の更なる実施形態では、改変したＩＬ−１５は非改変ＩＬ−１５よりも免疫原性が低くなる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、改変はＰＥＧ化であり、改変ペプチドはＰＥＧ−ＩＬ−１５である。ＰＥＧ化ペプチドは、ＩＬ−１５の少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合した、少なくとも１つのＰＥＧ分子を含んでもよい（例えばＮ末端またはＣ末端ＰＥＧ化）。ＰＥＧ分子は、リンカーを介してＩＬ−１５に共役させることができ、リンカーは以下に詳細に記載する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１５の２つ以上の異なる部位は、１つ以上の変異を導入し、その後それらの各々を改変することにより、改変されるかもしれない（例えばＰＥＧ化）。更なる実施形態でＮ末端は、１つ以上の変異体の導入及びその改変（例えばＰＥＧ化）と組み合わせて、ＩＬ−１５タンパク質内の他の箇所で改変されることができる（例えばＰＥＧ化）。更に別の実施形態で、Ｃ末端は、１つ以上の変異体の導入及びその改変（例えばＰＥＧ化）と組み合わせて、ＩＬ−１５タンパク質内の他の箇所で改変されることができる（例えばＰＥＧ化）。ＩＬ−１５のチロシン２６は、Ｎ末端のＰＥＧ化と組み合わせて改変することができる（例えばＰＥＧ化）。追加の実施形態において、ＩＬ−１５ペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端で改変を含むことができる（例えばＰＥＧ化）。代表的なＰＥＧ化条件を本明細書に記載する。更なる実施形態でＮ末端は、１つ以上の変異体の導入及びその改変（例えばＰＥＧ化）と組み合わせて、ＩＬ−１５タンパク質内の他の箇所で改変されることができる（例えばＰＥＧ化）。ＰＥＧ成分はペプチドにより許容される任意のＰＥＧであり得る。ＩＬ−１５の比較的小さなサイズが故に、ＰＥＧの分子量は、他の多くのタンパク質治療用として用いるものより大きい。一例として、改変ペプチドのＰＥＧ成分は、いくつかの実施形態において５ｋＤａ〜２０ｋＤの分子量を有し；他の実施形態において２０ｋＤａ超の分子量を有し；特定の実施形態において２５ｋＤａ超の分子量を有し；また他の実施形態において３０ｋＤａ超の分子量を有し；更に他の実施形態において３５ｋＤａ超の分子量を有し；または他の実施形態において４０ｋＤ超の分子量を有する。特定の実施形態において、ＰＥＧは２０〜４０ｋＤａの間の分子量を有する。他の分子量値を有するＰＥＧは、本明細書に記載される。
【００２５】
本開示は、非改変ペプチドの特性の改善（例えば、マスキング）を含む、望ましい特性を付与するペプチドに対する任意の改変を想定する。いくつかの実施形態で、改変ペプチドは、Ｆｃ融合分子；ＨＳＡ融合分子またはアルブミン共役体の形態であり得る、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡもしくはＢＳＡ）；またはアルブミン結合ドメインを含む。改変ペプチドは、グリコシル化またはＨＥＳ化されてもよい。前述の詳細な記述は、本開示内の他の箇所で説明される。
【００２６】
特定の実施形態では、改変は部位特異的である。更なる実施形態では、改変はリンカーを含む。いくつかの改変されたＩＬ−１５分子は、１種類より多い改変を含むことができる。本明細書に記載の改変の種類とＩＬ−１５ペプチドへのそのような改変を導入する方法は限定されず、当業者は他のそのような改変及び方法を想定することができる。
【００２７】
本明細書に記載のペプチドは、組み換えにより産生してもよい。本開示はペプチドをコード化する核酸分子を意図し、核酸分子は、生体外で、細胞内でまたは生体内でペプチドをコード化する核酸分子の発現を与える、発現制御要素に操作可能に連結できる。ベクター（例えばウイルスベクター）は、そのような核酸分子を含んでもよい。更なる実施形態で、本明細書に記載のペプチドを発現する形質転換された細胞または宿主細胞を説明する。
【００２８】
本開示は、本明細書の教示と併せて遺伝子治療の使用も意図する。遺伝子治療の使用及び方法のために、対象の細胞は、生体内で本明細書に記載のＩＬ−１５関連ポリペプチドをコード化する核酸で形質転換することができる。あるいは細胞は、導入遺伝子またはポリヌクレオチドで生体外で形質転換し、その後治療を行うために対象の組織内に移植することができる。更に初代細胞分離株または株化細胞株は、ＩＬ−１５関連ポリペプチドをコード化する導入遺伝子またはポリヌクレオチドで形質転換することができ、その後場合により対象の組織内に移植できる。
【００２９】
本開示のペプチドは、本明細書に記載するように、少なくとも１つの変異体の導入によって産生する、少なくとも１つの新規なエピトープを含むことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの新規なエピトープは、抗体（例えば、アゴニスト抗体）に（特異的にまたは非特異的に）結合する。更なる実施例において、抗体（例えば、アゴニスト抗体）の効果は、ＩＬ−１５受容体によるＩＬ−１５活性化を模倣する。
【００３０】
抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得て、例えばヒトまたはヒト化であってもよい。実施形態は、別個のポリペプチドにまたは単一ポリペプチドに存在する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗体、または例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４同位体である重鎖定常領域を含む抗体を含む。抗体は、例えばＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦａｂ’抗体でもよく、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体でもよい（多量体化され得る）。
【００３１】
更なる実施形態において、本開示の抗体は、約１０７Ｍ−１〜約１０１２Ｍ−１の親和性でペプチドに結合する。抗体は、脂質部分、脂肪酸部分、多糖類部分及び炭水化物部分から選択される共有結合部分を含んでもよい。実施形態は更に、抗体が親和性ドメインを含み、固相担体上に不動化してもよく、共有結合したまたは検出可能に標識化した非ペプチドポリマー（例えば、ポリ（エチレン）グリコールポリマー）を含むことを想定している。
【００３２】
本開示は、本明細書に記載のペプチドまたは抗体、及び薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物を包含する。いくつかの実施形態では、賦形剤は等張性の注射液である。医薬組成物は対象（例えば、ヒト）への投与に適切であり得て、１つ以上の追加の予防剤または治療剤を含んでもよい。特定の実施形態において、医薬組成物は滅菌容器（例えば、単回または複数回使用のバイアルまたは注射器）内に収容される。キットは滅菌容器（複数を含む）を含んでもよく、キットは更に、少なくとも１つの追加の予防剤もしくは治療剤、もしくは薬物治療で使用することができる任意の他の薬剤を含む、１つ以上の追加の滅菌容器を含むことができる。このような態様の例は、本明細書に記載される。
【００３３】
本開示の追加の実施形態は、本明細書に記載のペプチドの治療に有効な量を投与することを含む、対象（例えばヒト）の疾患、障害または状態を治療し、予防する方法を含む。更なる実施形態は、本明細書に記載の抗体の治療に有効な量を投与することを含む、対象（例えばヒト）の疾患、障害または状態を治療し、予防する方法を含む。本開示の様々な実施形態において、疾患、障害または状態は、癌または癌関連の疾患（例えば、固形腫瘍または血液障害）を含む増殖性疾患；免疫性または炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、乾癬、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、多発性硬化症、及びアルツハイマー病）；ウイルス性障害（例えばヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及びサイトメガロウイルス）である。
【００３４】
疾患、障害もしくは状態を治療し、または予防する方法において、本明細書に記載のペプチド（または抗体）の治療に有効な量を投与することは、非経口（例えば、皮下に）注入を含むペプチド（または抗体）のための任意の適切な経路によるものであってもよい。１つ以上の追加の予防剤または治療剤は、ペプチド（または抗体）と共に（例えば、前に、同時にまたはそれに続けて）投与されてもよい、及び／または、それはペプチド（または抗体）から分離して、または組み合わせて投与してもよい。
【００３５】
本開示の追加の実施形態は、配列番号３の前記アミノ酸配列を含み、ペプチドは以下の位置：１、３、１３〜１５、１７〜２９、３３、３４、３６〜３９、４１、４５、４８、４９、５１〜５８、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１０２、１０４、１１３または１１４の１つで、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは以下の位置：１、３、１３〜１５、１７〜２５、２７〜２９、３３、３４、３６〜３９、４１、４５、４８、４９、５１〜５８、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１０２、１０４、１１３または１１４で少なくとも１つのアミノ酸残基に代えてチロシンの置換を含む。他の実施形態において、ペプチドは以下の位置：１、３、１３〜１５、１７〜２５、２７〜２９、３３、３４、３６〜３９、４５、４８、４９、５１〜５６、５８、６０、６７、７２〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１０２、１０４、１１３または１１４で少なくとも１つのアミノ酸残基に代えてシステインの置換を含む。更なる実施形態では、ペプチドは以下の位置：１、１３〜１５、１７〜２２、２７〜２９、３４、３６、４８、４９、５１〜５８、６０、７２〜８２、８４、８７、８９〜９８、１０２または１０４で少なくとも１つのアミノ酸残基に代えてＮ−Ｘ−Ｓグリコシル化モチーフの置換を含み、Ｎ−Ｘ−Ｓグリコシル化モチーフのアスパラギンはアミノ酸の位置を表す。更に別の実施形態では、ペプチドは以下の位置：１、１３〜１５、１７〜２２、２９、３４、３６、４８、４９、５１〜５８、６０、７１〜７８、８０〜８２、８４、８７、８９〜９８または１０２で少なくとも１つのアミノ酸残基に代えてＮ−Ｘ−Ｔグリコシル化モチーフの置換を含み、Ｎ−Ｘ−Ｔグリコシル化モチーフのアスパラギンは前記アミノ酸の位置を表す。
【００３６】
本開示は、本明細書に開示されるすべての実施形態の構成要素などとして共に使用される、前項に記載されているペプチドを想定する。一例として特定の実施形態において、本開示は、前項に記載されているペプチドを含む、医薬組成物、減菌容器及びキットを含む。他の実施態様において、前項に記載されているペプチドの治療に有効な量は、本明細書に記載されるように、疾患、障害もしくは状態を治療する、または予防するために対象に与えることができる。
【００３７】
本開示の他の態様は、本明細書に記載される教示を検討すれば当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】ＩＬ−１５の長いシグナルペプチド（ＬＳＰ）タンパク質（１６２アミノ酸残基；配列番号１）を示す。シグナルペプチド（下線）は残基１〜４８を含む。
【図１Ｂ】ＩＬ−１５の短いシグナルペプチド（ＳＳＰ）タンパク質（１３５アミノ酸残基；配列番号２）を示す。シグナルペプチド（下線）は残基１〜２１を含む。
【図１Ｃ】成熟ヒトＩＬ−１５（１１４アミノ酸残基）（配列番号３）を示す。
【図２Ａ】長いシグナルペプチド（ＬＳＰ）ｃＤＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示す（１６２アミノ酸残基をコード化する４８９塩基対（配列番号４））。シグナルペプチド（下線）は、最初の４８アミノ酸をコード化する塩基対１〜１４４を含む。
【図２Ｂ】短いシグナルペプチド（ＳＳＰ）ｃＤＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示す（１３５アミノ酸残基をコード化する４０８塩基対（配列番号５））。シグナルペプチド（下線）は、最初の２１アミノ酸をコード化する塩基対１〜６３を含む。
【図２Ｃ】成熟ヒトＩＬ−１５タンパク質をコード化する核酸配列を示す（１１４アミノ酸残基をコード化する３４５塩基対（配列番号６））。
【図３】ヘリックスＡ〜Ｄ及びヘリックス間接合に対応する領域を示す、成熟ｈＩＬ−１５アミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４Ａ】ＩＬ−１５受容体のシグナル伝達複合体（ＰＤＢ  ４ＧＳ７）；ＩＬ２／１５Ｒβ、ＩＬ１５Ｒα、共通γ鎖及びＩＬ−１５のタンパク質結晶構造のリボン表示（平面図）である（ヘリックス及びヘリックス内構造は標示される）。
【図４Ｂ】ＩＬ−１５受容体のシグナル伝達複合体（ＰＤＢ  ４ＧＳ７）；ＩＬ２／１５Ｒβ、ＩＬ１５Ｒα、共通γ鎖及びＩＬ−１５のタンパク質結晶構造のリボン表示（側面図）である（ヘリックス及びヘリックス内構造は標示される）。
【図５】どの残基がＰＥＧ化の可能性のある部位を表すかを示す、成熟ヒトＩＬ−１５アミノ酸配列を表す（配列番号：３）。「＋」は残基が可能性のある部位であることを示し、「−」は残基が可能性のない部位であることを示し、「＋／−」は残基が可能性のある部位であり得ることを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、どのアミノ酸残基が、チロシンもしくはシステインとの置換により、またはＮ−グリコシル化モチーフ（Ｎ−Ｘ−ＳもしくはＮ−Ｘ−Ｔ）の生成によりＰＥＧ化の可能性のある部位を表すかを示す、成熟ヒトＩＬ−１５アミノ酸配列を示す（配列番号３）。薄灰色のセルは、ＰＥＧ化の可能性がある部位として図５に示される残基を表しており、「＋」は、その位置に挿入される変異体が活性アッセイで活性であったことを示し、その一方で空の薄灰色のセルは、その位置に挿入される変異体が活性を示さなかった、または検出可能なレベルで発現することができなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示を更に説明する前に、本開示が本明細書に記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【００４０】
値の範囲が提供される場合、上限と下限の間で明記した任意の値、または介在値で、文脈が明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までその各々の値に含まれることは、本発明に包含されると理解されるであろう。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本発明内にも包含される。表示範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。
【００４１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、他に明記されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示物を含むことに留意しなければならない。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいことに更に留意する。したがって本記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」などの排他的な専門用語の使用において、または「否定的な」限定の使用において、先行詞として機能することを目的としている。
【００４２】
本明細書で示す出版物は、本出願の出願日前のその開示のためだけに提供される。更に提供される出版物の日付は実際の出版日とは異なる場合があり、それぞれ確認する必要があり得る。
【００４３】
概略
本開示は、変異ＩＬ−１５分子（例えば、ムテイン）及び他のＩＬ−１５関連分子、ならびにその同定及びその使用の方法を意図する。本明細書に記載されるように、ＩＬ−１５は、例えば半減期の延長を含む天然型ヒトＩＬ−１５の特性を増強するように改変することができる。改変は、ＰＥＧ化、ならびにアルブミン（例えばＨＳＡ）及びＦｃとの融合を含む。特定のＩＬ−１５分子は、ヒトＩＬ−１５と同等の免疫原性、ならびに／またはヒトＩＬ−１５と少なくとも同等の生物活性、ならびに／または少なくとも１つの特性（例えば溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期及び循環時間などの物理的特性）の改善を有する。当業者は、そのような分子が、例えば非常に長い半減期である故に、有効な治療剤であり得ると理解している。本明細書に記載のＩＬ−１５分子及びその組成物（例えば、医薬組成物）は、例えば炎症性及び免疫関連疾患ならびに癌及び癌関連障害を含む、様々な疾患、障害及び状態ならびに／またはその症状を、治療するならびに／または予防するために使用してもよい。
【００４４】
本開示のポリペプチド及び核酸分子に関連する「ヒト」へのいかなる言及も、ポリペプチドまたは核酸が得られる方法または供給源に関して限定することを意図したものではなく、むしろそれは天然起源のヒトポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応する際の、配列に関してのみであるという点に留意すべきである。ヒトのポリペプチド及びそれらをコード化する核酸分子に加えて、本開示は、他の種からのＩＬ−１５関連ポリペプチド及び対応する核酸分子を想定する。
【００４５】
定義
特に指示のない限り、以下の用語は、以下に示す意味を有することを目的としている。他の用語は、明細書の全体にわたって他の場所で定義される。
【００４６】
用語「患者」または「対象」は、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、哺乳動物）を指して同じ意味で用いられる。
【００４７】
用語「投与」、「投与する」などは、それらが例えば対象、細胞、組織、器官または生体液に適用される際、例えばＩＬ−１５もしくはＰＥＧ−ＩＬ−１５、核酸（例えば、天然型ヒトＩＬ−１５をコード化する核酸）、前述を含む医薬組成物または診断薬と、対象、細胞、組織、器官または生体液との接触を意味する。細胞の文脈において、投与は、試薬の細胞への接触（例えば生体外、または生体内で）ならびに流体が細胞と接触しているところでは試薬の流体への接触を含む。
【００４８】
用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、疾患、障害もしくは状態またはその症状が診断され観察された後、一時的にもしくは恒久的に対象が患う疾患、障害もしくは状態またはその症状に関連する少なくとも１つの症候を除去し、低減し、抑制しまたは改善するために開始する行動（ＩＬ−１５またはＩＬ−１５を含む医薬組成物の投与など）の過程を意味する。したがって治療は、活動性疾患を予防すること（例えば疾患、障害もしくは状態、またはそれに関連する臨床症候の発症もしくは更なる発症を阻止する）を含む。前記用語は、ＩＬ−１５またはＰＥＧ−ＩＬ−１５が、例えば流体相またはコロイド相のＩＬ−１５受容体に接触するような状況など他の文脈でも使用することができる。
【００４９】
本明細書で使用する場合「治療を必要とする」という用語は、対象が必要とする、もしくは治療から利益を得る医師または他の介護者によって行われる判断を指す。この判断は、医師または介護者の専門知識の領域にある様々な要因に基づき行われる。
【００５０】
用語「予防する」、「予防すること」、「予防」などは、一般的に特定の疾患、障害または状態を有する傾向がある対象に関連して、一時的または恒久的のいずれかで、疾患、障害、状態などを発症する対象のリスクを予防し、抑制しもしくは低減し（例えば臨床症状の不存在により判断されるように）、またはその開始を遅延するための方法（例えば疾患、障害、状態またはその症状の開始に先立って）で開始する行動（ＩＬ−１５またはＩＬ−１５を含む医薬組成物を投与することなど）の過程を意味する。特定の場合には、本用語は、疾患、障害または状態の進行を遅くする、または有害なもしくは望ましくない状態へのその進行を阻害することも指す。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「予防を必要とする」とは、対象が必要とする、もしくは予防的ケアから利益を得る医師または他の介護者によって行われる判断を指す。この判断は、医師のまたは介護者の専門知識の領域にある様々な要因に基づき行われる。
【００５２】
語句「治療に有効な量」とは、単独でまたは医薬組成物の一部として、及び単回用量または一連の用量の一部として被験者に投与した場合、疾患、障害もしくは状態の任意の症状、態様または特徴に、任意の検出可能な積極的効果を有することができる量で、対象に薬剤を投与することを意味する。治療に有効な量は、関連する生理学的効果を測定することにより確認することができ、それは、投与レジメン及び対象の状態の診断分析などと連結して調整することができる。一例として、投与後に産生される炎症性サイトカインの量の測定は、治療に有効な量が使用されたかを示すことができる。
【００５３】
「変化をもたらすのに十分な量」という語句は、特定の療法の施与前とその後に測定された指標のレベル（例えば基準レベル）の間に検出可能な差があることを意味する。指標としては、任意の客観的パラメータ（例えばＩＬ−１５の血清濃度）または主観的パラメータ（例えば対象の満足度）が挙げられる。
【００５４】
用語「小分子」は、約１０ｋＤａ未満、約２ｋＤａ未満または約１ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を指す。小分子としては、無機分子、有機分子、無機成分を含有する有機分子、放射性原子を含む分子、及び合成分子が挙げられるが、これらに限定されない。治療的に小分子は、細胞に対してより透過性があり、劣化の影響を受けにくく、大きな分子より免疫反応を誘発する可能性が低いことがあり得る。
【００５５】
用語「リガンド」は例えば、受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用することができる、ペプチド、ポリペプチド、膜会合もしくは膜結合分子、またはその複合体を意味する。「リガンド」は、天然及び合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、ムテイン、及び抗体に由来する結合組成物、ならびに例えばサイトカインのペプチド模倣物及び抗体のペプチド模倣物を包含する。この用語は、その生物学的特性、例えばシグナル伝達または接着に特異的に影響を与えることなく、受容体に結合することができる、アゴニストでもアンタゴニストでもない物質も包含する。更にこの用語は、例えば化学的または組み換え法により、膜結合リガンドの可溶性バージョンに変更された膜結合リガンドを含む。リガンドまたは受容体は完全に細胞内であってもよく、すなわちそれは、サイトゾル、核、またはいくつかの他の細胞内区画に存在してもよい。リガンド及び受容体の複合体は、「リガンド−受容体複合体」と呼ばれる。
【００５６】
用語「抑制分子」及び「アンタゴニスト」または「活性分子」及び「アゴニスト」は、例えばリガンド、受容体、補因子、遺伝子、細胞、組織または器官の例えば活性化のために、それぞれ阻害または活性化する分子を意味する。抑制分子は、例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体もしくは細胞を、減少させ、ブロックし、防止し、活性化を遅延させ、不活性化させ、感度を下げ、または下方に調節する分子である。活性分子は、例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体もしくは細胞を、増加させ、活性化させ、助長し、活性化を強化し、感度を上げ、または上方に調節する分子である。抑制分子は、構成的活性を低下させ、ブロックし、または不活性化する分子としても定義することができる。「アゴニスト」は、標的の活性化の上昇を発生させ、または促進するために、標的と相互作用する分子である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用（複数を含む）に対向する分子である。アンタゴニストは、アゴニストの作用を防止し、減少させ、阻害しまたは中和して、アンタゴニストは、例えば識別されたアゴニストがない場合でも、標的受容体の構成的活性を妨害、阻止または低下させることもできる。
【００５７】
用語「調節する」、「調節」などは、ＩＬ−１５分子（または、それらをコード化する核酸分子）の機能または活性を、直接的にもしくは間接的に上昇させるもしくは低下させるため；またはＩＬ−１５分子と同等の効果を産生するために分子の能力を強化するための、分子（例えば活性分子または抑制分子）の能力を意味する。用語「モジュレーター」は、上述の活動に影響を与えることができる分子を広く指すことを意味する。一例として、例えば遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞のモジュレーターは、遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞の活性を変化させる分子であり、ここで活性は、その調節特性を活性化させ、抑制しまたは変化させることが可能である。モジュレーターは単独で作用し得る、またはそれは補因子、例えばタンパク質、金属イオンもしくは小分子を使用することができる。用語「モジュレーター」は、ＩＬ−１５と同じ作用機序を介して作動する化学物質（すなわち、それと類似の手法でＩＬ−１５と同一のシグナル伝達経路を調節する物質）を含み、ＩＬ−１５と同等の（またはより大きい）生物学的反応を誘発することができる。
【００５８】
モジュレーターの例としては、小分子化合物及び他の生物有機分子が含まれる。小分子化合物の多数のライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）が市販されており、調節因子を同定するための出発点として機能することができる。当業者は、１つ以上のアッセイ（例えば、生化学的または細胞系アッセイ）を開発することができ、そのような化合物ライブラリーは望ましい特性を有する１つ以上の化合物を同定するためにスクリーニングすることができる。その後医薬品の当業者は、例えばその類似体及び誘導体を合成し、ならびに評価することにより、そのような１つ以上の化合物を最適化することができる。合成及び／または分子モデリングの研究は、活性体の同定にも利用することができる。
【００５９】
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合；触媒活性；遺伝子発現または細胞のシグナル伝達、分化もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性；他分子の活性の調節などを説明するまたは意味する。この用語は、細胞間相互作用（例えば、接着）を調節する、もしくは維持することにおける活性、または細胞（例えば、細胞膜）構造の維持における活性も意味する。「活性」は、比活性、例えば［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生体区画の濃度なども意味することができる。用語「増殖活性」は、例えば正常な細胞分裂、ならびに癌、腫瘍、異形成、細胞の形質転換、転移及び血管形成を促進し、そのために必要なまたは特異的に関連する活性を包含する。
【００６０】
本明細書で使用する場合「匹敵する」、「同等の活性」、「匹敵する活性」、「同等の効果」、「匹敵する効果」などは、定量的及び／または定性的に表示できる相対的な用語である。用語の意味は、それらが使用される文脈にしばしば依存する。一例として、両方が受容体を活性化する２つの化学物質は、定性的観点から同等の効果を持つと見なすことができるが、１つの化学物質が当該技術分野で認められたアッセイ（例えば、用量反応アッセイ）、または当該技術分野で認められた動物モデルで決定される他の化学物質の活性の２０％のみを達成することができる場合、２つの化学物質は、定量的観点から同等の効果を欠いていると見なすことができる。１つの結果を別の結果と比較すると（例えば、１つの結果と参照標準）、「匹敵する」はしばしば（常にではないが）、１つの結果が３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満だけ参照標準から逸脱していることを意味する。特定の実施形態において、参照標準の１５％未満、１０％未満または５％未満だけ逸脱している場合、１つの結果は参照標準に匹敵する。一例として活性または効果は、有効性、安定度、溶解度または免疫原性を指す場合もあるが、これらに限定されない。先に示したように、異なる方法論を使用することは、ｈＩＬ−１５参照標準より−タンパク質濃度の計算における差異に起因する見かけの活性、または現実の活性のいずれかで−多少活性であるＩＬ−１５をもたらし得ることを当業者は認識する。当業者は、ＩＬ−１５分子対ｈＩＬ−１５の相対的な生物活性を決定する際、これらの違いを考慮することができる。
【００６１】
細胞、組織、器官または生物の「反応」という用語は、生化学的または生理学的挙動、例えば濃度、密度、接着もしくは生物学的区画内での移動、遺伝子発現の速度もしくは分化の状態の変化を包含しており、前記変化は、活性化、刺激もしく処置、または遺伝的プログラミングなどの内部機構と相関している。特定の文脈における、用語「活性化」「刺激」などは、内部機構により、同様に外部または環境要因により調節される細胞活性化を意味し、一方で用語「阻害」「下方調整」などは逆の効果を意味する。
【００６２】
本明細書で同じ意味で用いられる「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」とは任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指しており、それは遺伝的にコード化した及び遺伝的にコード化していないアミノ酸、化学的にもしくは生化学的に改変されたまたは誘導化されたアミノ酸、ならびに改変ポリペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ終端にメチオニン残基を有するまたは有しない異種及び相同のリーダー配列を有する融合タンパク質、免疫学的にタグ付けされたタンパク質などを含む、融合タンパク質を含むがこれらに限定されない。
【００６３】
本明細書で使用する場合、用語「変異体」及び「相同体」はそれぞれ、参照アミノ酸もしくは核酸配列に類似したアミノ酸またはＤＮＡ配列を表すために、同じ意味で用いられる。この用語は、天然起源の変異体及び天然起源ではない変異体を包含する。天然起源の変異体は、相同体（１つの種から別の種へアミノ酸またはヌクレオチド配列がそれぞれ異なるポリペプチド及び核酸）、ならびに対立遺伝子変異体（種内の１つの個体から別の個体へアミノ酸またはヌクレオチド配列がそれぞれ異なるポリペプチド及び核酸）を含む。したがって変異体及び相同体は、天然起源のＤＮＡ配列、ならびにそれによりコード化されるタンパク質及びそのアイソ型、ならびにタンパク質または遺伝子のスプライス変異体を包含する。この用語は更に、天然起源のＤＮＡ配列からの１つ以上の塩基が変化するが、それでも遺伝コードの縮重が故に天然起源のタンパク質に対応するアミノ酸配列に翻訳する核酸配列を包含する。天然起源ではない変異体及び相同体は、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化をそれぞれ含むポリペプチド及び核酸を含み、前記配列の変化は人工的に導入され（例えば、ムテイン）、例えば変化はヒトの介入（「ヒトの手」）により実験室内で発生する。したがって天然起源ではない変異体及び相同体は、１つ以上の保存的置換、及び／またはタグ、及び／または共役体により、天然起源の配列とは異なるものを意味する。
【００６４】
本明細書で使用する場合「ムテイン」とは、突然変異した組み換えタンパク質に広く関連する。これらのタンパク質は通常、単一または複数のアミノ酸置換を運び、部位特異的もしくはランダム突然変異誘発を受けたクローン化された遺伝子、または完全に合成された遺伝子にしばしば由来する。指示のない限り、「ＩＬ−１５の変異体」などの用語の使用は、ＩＬ−１５ムテインを意味する。
【００６５】
用語「ＤＮＡ」、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などは本明細書では同じ意味で用いられて、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドポリマーの形態を意味する。ポリヌクレオチドの非限定の例としては、直鎖状及び環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーなどが挙げられる。
【００６６】
本開示を通して、１文字または３文字記号によるアミノ酸を参照することは理解されるであろう。読者の便宜のために、１文字及び３文字のアミノ酸記号を以下に提供する。
Ｇ  グリシン            Ｇｌｙ    Ｐ  プロリン          Ｐｒｏ
Ａ  アラニン            Ａｌａ    Ｖ  バリン            Ｖａｌ
Ｌ  ロイシン            Ｌｅｕ    Ｉ  イソロイシン     Ｉｌｅ
Ｍ  メチオニン          Ｍｅｔ    Ｃ  システイン       Ｃｙｓ
Ｆ  フェニルアラニン   Ｐｈｅ    Ｙ  チロシン          Ｔｙｒ
Ｗ  トリプトファン     Ｔｒｐ    Ｈ  ヒスチジン        Ｈｉｓ
Ｋ  リシン              Ｌｙｓ    Ｒ  アルギニン        Ａｒｇ
Ｑ  グルタミン          Ｇｌｎ    Ｎ  アスパラギン     Ａｓｎ
Ｅ  グルタミン酸        Ｇｌｕ    Ｄ  アスパラギン酸  Ａｓｐ
Ｓ  セリン              Ｓｅｒ    Ｔ  トレオニン        Ｔｈｒ
【００６７】
天然型ヒトＩＬ−１５またはＩＬ−１５ムテインへの言及で本明細書で使用する場合、用語「改変された」、「改変」などは、ヒトＩＬ−１５またはＩＬ−１５ムテインの望ましい特性を向上させる１つ以上の変化を指す。このような望ましい特性は、例えば循環半減期を延長すること、安定性を上昇させること、クリアランスを低下させること、免疫原性またはアレルゲン性を変化させること、及び検出アッセイで使用する特定の抗体の上昇を可能にすること（例えば、新規なエピトープの導入により）を含む。以下に詳細に議論するとおり、実施され得るヒトＩＬ−１５またはＩＬ−１５ムテインは、ＰＥＧ化（１つ以上のポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）またはその誘導体との共有結合）；グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）、ポリシアリル化及びＨＥＳ化；アルブミン融合；例えば共役型脂肪酸鎖を介在したアルブミン結合（アシル化）；Ｆｃ−融合；ならびにＰＥＧ模倣体との融合を含むが、それに限定されない。いくつかの実施形態では、リンカーはこのような改変に使用され、以下に記載される。
【００６８】
ポリペプチドの構造との関係で本明細書で使用される、「Ｎ末端」（または「アミノ末端」）及び「Ｃ末端」（または「カルボキシル末端」）とは、それぞれポリペプチドのアミノ最端及びカルボキシル最端を指し、一方用語「Ｎ末端側」及び「Ｃ末端側」とは、それぞれＮ末端及びＣ末端に向かうポリペプチドのアミノ酸配列の相対的位置を指し、それぞれＮ末端及びＣ末端の残基を含み得る。「じかにＮ末端側」または「じかにＣ末端側」とは、第１及び第２のアミノ酸残基が、連続するアミノ酸配列を提供するように共有結合されている、第２のアミノ酸残基に対する第１のアミノ酸残基の位置を指す。
【００６９】
アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ−１５ポリペプチド「由来の」アミノ酸配列）との関係において「由来する」とは、ポリペプチドまたは核酸が、参照ポリペプチドまたは核酸（例えば天然起源のＩＬ−１５ポリペプチドまたはＩＬ−１５をコード化する核酸）の配列を基準にしている配列を有することを示すことを意味しており、タンパク質または核酸が作られた供給源または方法を限定することを意味しない。一例として「由来する」という用語は、参照アミノ酸配列またはＤＮＡ配列の相同体または変異体を含む。
【００７０】
ポリペプチドとの文脈において「単離された」という用語は、天然起源の場合、それが天然に存在し得るとは異なる環境にある目的のポリペプチドを指す。「単離された」は、目的のポリペプチドのために実質的に濃縮された、及び／または目的のポリペプチドを部分的または実質的に精製したサンプル内にあるポリペプチドを含むことを意味する。ポリペプチドが天然起源でない場合、「単離された」とは、ポリペプチドが合成または組み換え手段のいずれかにより作製された環境から分離されたことを示す。
【００７１】
「濃縮された」とは、サンプルが非天然的に（例えば科学者により）操作されて、その結果目的のポリペプチドが、ａ）生物学的サンプル（例えば、ポリペプチドが天然に発生する、または投与後それが存在するサンプル）などの出発サンプルのポリペプチド濃度より大きい濃度（例えば、少なくとも３倍より大きく、少なくとも４倍より大きく、少なくとも８倍より大きく、少なくとも６４倍より大きく、またはそれ以上に）で、または、ｂ）ポリペプチドが作られる環境（例えばバクテリア細胞）より高濃度で、存在することを意味する。
【００７２】
「実質的に純粋」とは、成分（例えば、ポリペプチド）が組成物の総含量の約５０％超、通常は総ポリペプチド含量の約６０％超を構成することを示す。より一般的には「実質的に純粋」とは、総組成物の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上が目的成分である組成物を指す。場合によってはポリペプチドは、組成物の総量の約９０％超、または約９５％超を構成する。
【００７３】
用語「特異的に結合する」または「選択的に結合する」は、リガンド／受容体、抗体／抗原または他の結合対を意味する場合、タンパク質と他の生物学的製剤の異質母集団におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。したがって指定した条件下で、特定のリガンドは特定の受容体に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に有意な量では結合しない。意図した方法による抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物は、その抗原または変異体またはムテインに、他の抗体またはそれから誘導される結合組成物の有する親和性より、少なくとも２倍超、少なくとも１０倍超、少なくとも２０倍超、または少なくとも１００倍超の親和性で結合する。特定の実施形態において、抗体は、例えばスキャチャード解析で決定されるように、約１０９Ｌ／ｍｏｌよりも大きい親和性を有するであろう（Ｍｕｎｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．１９８０Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）。
【００７４】
ＩＬ−１５
ＭＧＣ９７２１とも称されるＩＬ−１５は、染色体４ｑ３１上の３４ｋｂの領域によってコード化される１２．８ｋＤａの単量体糖タンパク質であると予測される。ＩＬ−１５は４つのα−ヘリックス束群に属しており、その他の要素はＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。ヒトＩＬ−１５のゲノム構造は、９つのエクソン（１〜８及び４Ａ）及び８つのイントロンを含む。ヒト及びマウスは、類似のイントロン／エクソン構造を共有する。成熟タンパク質をコード化するＩＬ−１５遺伝子の部分の全体のイントロン／エクソン構造は、ＩＬ−２遺伝子及び他の４つのα−ヘリックス束サイトカインに類似している。
【００７５】
当業者は、ＩＬ−１５核酸及びアミノ酸配列が遺伝子データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）に一般公開されていることを理解するであろう。図１Ｃに示すように（配列番号３）、成熟ヒトＩＬ−１５タンパク質は１１４アミノ酸残基（１２．８ｋＤＡ）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉで産生する組み換えヒトＩＬ−１５は、単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である（１２．９ｋＤの分子量を有するＮ末端メチオニンを含む、１１５アミノ酸残基）。２つの転写物が報告されており、両方とも同じ成熟タンパク質を産生した。図１Ａを参照すると（配列番号１）、ＩＬ−１５の長いシグナルペプチド（ＬＳＰ）タンパク質（受託番号ＢＣ０１８１４９．２）は、４８残基シグナルペプチド（下線）を含む１６２アミノ酸残基を含む。図１Ｂを参照すると（配列番号２）、ＩＬ−１５の短いシグナルペプチド（ＳＳＰ）タンパク質（受託番号ＢＣ１００９６２．１）は、２１残基シグナルペプチド（下線）を含む１３５アミノ酸残基を含む。ＬＳＰは分泌型タンパク質と記載されており、ＳＳＰは細胞内に残存すると記載されている。
【００７６】
図２Ａは、長いシグナルペプチド（ＬＳＰ）ｃＤＮＡ  ＯＲＦ（１６２アミノ酸残基をコード化する４８９塩基対（配列番号４））（受託番号ＢＣ０１８１４９．２）を示し、シグナルペプチド（下線）は最初の４８アミノ酸をコード化する塩基対１〜１４４を含む。図２Ｂは、短いシグナルペプチド（ＳＳＰ）ｃＤＮＡ  ＯＲＦ（１３５アミノ酸残基をコード化する４０８塩基対（配列番号５））（受託番号ＢＣ１００９６２．１）を示し、シグナルペプチド（下線）は最初の２１アミノ酸をコード化する塩基対１〜６３を含む。図２Ｃは、成熟ヒトＩＬ−１５タンパク質をコード化する核酸配列を示す（１１４アミノ酸残基をコード化する３４５塩基対（配列番号６））。
【００７７】
非ヒトの例示の哺乳動物のＩＬ−１５核酸またはアミノ酸配列は、例えば霊長類、イヌ科、ネコ科、ブタ科、ウマ科、ウシ科、ヒツジ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター及びモルモットからのものであり得る。例示の非ヒト哺乳動物のＩＬ−１５核酸配列の受託番号は、Ｕ１９８４３（マカク）；ＤＱ０２１９１２（マカク）；ＡＢ０００５５５（マカク）；ＮＭ＿２１４３９０（ブタ）；ＤＱ１５２９６７（ヒツジ）；ＮＭ＿１７４０９０（ウシ）；ＮＭ＿００８３５７（マウス）；ＮＭ＿０１３１２９（ラット）；ＤＱ０８３５２２（スイギュウ）；ＸＭ＿８４４０５３（イヌ）：ＤＱ１５７４５２（ウサギ）及びＮＭ＿００１００９２０７（ネコ）を含む。例示の非ヒト哺乳動物のＩＬ−１５アミノ酸配列の受託番号は、ＡＡＢ６０３９８（マカク）；ＡＡＹ４５８９５（マカク）、ＮＰ＿９９９５５５（ブタ）；ＮＰ＿７７６５１５（ウシ）；ＡＡＹ８３８３２（スイギュウ）；ＡＢＢ０２３００（ヒツジ）；ＸＰ＿８４９１４６（イヌ）；ＮＰ＿００１００９２０７（ネコ）；ＮＰ＿０３７２６１（ラット）及びＮＰ＿０３２３８３（マウス）を含む。ヒトＩＬ−１５（「ｈＩＬ−１５」）と比較した成熟マカクザルＩＬ−１５（「ｃＩＬ−１５」）の同一性は９６％であり、一方で成熟マウスＩＬ−１５（「ｍＩＬ−１５」）及び成熟ｈＩＬ−１５の同一性は７５％である。
【００７８】
ヒトＩＬ−１５は位置Ｃ４２〜Ｃ８８及びＣ３５〜Ｃ８５で２つのジスルフィド結合を含有し、前者はＩＬ−２内のＣ−Ｃと相同である。Ｎ７９及びＮｌ１２に２つのＮ−結合グリコシル化部位がある（使用する分析法に応じて、Ｎ７１は第３のグリコシル化部位であるとみなることができる）。成熟ＩＬ−１５タンパク質は、その４つのα−ヘリックス束構造を支持する、アミノ酸残基１〜１５、１８〜５７、６５〜７８及び９７〜１１４で強いヘリックスモーメント有すると予測された（Ｆｅｈｎｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ９７（１）（Ｊａｎ１，２００１））。
【００７９】
前述のように、ネクサスがＩＬ−１５とＩＬ−２の間に存在する。ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα発現の複雑な調節及び差異パターンに基づいて、この受容体／リガンド対の臨界生体内機能がＩＬ−２及びＩＬ−２Ｒαと異なる可能性は高い。ＩＬ−１５はいくつかの重要な非重複の役割を示し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ−Ｔ細胞及び腸上皮内リンパ球の発達及び機能中のその重要性を含む。ＩＬ−１５が自己免疫プロセス（例えば、リウマチ性関節炎）及び悪性腫瘍（例えば、Ｔ細胞白血病）で報告によれば役割を果たすので、通常のＩＬ−１５機能の破壊は対象の好ましくない影響に関係する。
【００８０】
両方は受容体サブユニットＩＬ−２Ｒβ及び共通γ鎖（γ（ｃ））を通ってシグナル伝達するが、ＩＬ−１５及びＩＬ−２はすべての同じ生物学的機能を共有するわけではない。ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−２Ｒβ−γ（ｃ）４成分複合体の構造において、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２−ＩＬ−２Ｒα−ＩＬ−２Ｒβ−γ（ｃ）複合体に似ているヘテロ二量体のＩＬ−２Ｒβ及びγ（ｃ）と結合する。ＩＬ−１５Ｒαは実質的にＩＬ−２ＲβのためＩＬ−１５の親和性を増加させることを示し、それは同様にＩＬ−１５トランスシグナル伝達のために必要とされる。ＩＬ−１５及びＩＬ−２は類似のシグナルを誘起し、ＩＬ−２Ｒα対ＩＬ−１５Ｒαの特異性は細胞反応を測定することを示した（Ｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（１２）：１１８７−９５（Ｄｅｃ．１３，２０１２）参照）。
【００８１】
ＩＬ−１５は主に膜結合型として存在するが、それは可溶性分子として存在し（Ｊａｋｏｂｉｓｉａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｆ２２（２）９９−１０９（Ａｐｒｉｌ２０１１））、それは２つの異なるシグナル伝達機構と関連する。第１の機構は、膜結合型複合体ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαにより介在されるトランス提示である。このシグナル伝達機構では、その細胞表面上にＩＬ−１５Ｒβγｃ複合体を有する細胞を取り囲むための次の提示により、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒα受容体と結合する。第２の機構はシス提示であり、ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５Ｒαにより同じ細胞上の１５Ｒβγｃシグナル伝達複合体に提示される。第１のシグナル伝達機構を参照すると、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα受容体の結合、及びＩＬ−１５Ｒβγｃ複合体を有する細胞を取り囲むことへの次の提示の際、ＩＬ−１５βサブユニットはヤヌスキナーゼ１（Ｊａｋ１）を活性化し及びγｃサブユニットはヤヌスキナーゼ２（Ｊａｋ２）を活性化して、それは、転写３（ＳＴＡＴ３）及びＳＴＡＴ５の信号トランスデューサならびに活性化因子の、リン酸化ならびに活性化へと続く。ＩＬ−１５及びＩＬ−２が受容体サブユニットを共有するので、それらは類似の下流効果を有し、それはＢ細胞リンパ腫（Ｂｃｌ−２）の誘導；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰ）経路、及びリンパ球−活性タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）と脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）のリン酸化反応を含み、それは細胞増殖及び成熟をもたらす（Ｓｃｈｌｕｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ３７（８）：１５６７−７１（Ａｕｇ２００５））。
【００８２】
それに対し、肥満細胞のＩＬ−１５Ｒシグナル伝達経路は、Ｊａｋｌ／３及びＳＴＡＴ３／５の代わりにＪａｋ２及びＳＴＡＴ５を含む。リン酸化ＳＴＡＴは転写因子を形成して、適切な遺伝子の転写を作動させる。ＩＬ−１５Ｒのβ鎖は、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ及びＬｙｎキナーゼを含むＳｒｃファミリーのタンパク質チロシンキナーゼを組み入れて、更に活性化する。β鎖は更にホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びＡＫＴシグナル伝達経路を活性化して、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ及びＮＦ−κＢを含む種々の転写因子の発現を誘起する（Ｊａｋｏｂｉｓｉａｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｆ２２（２）９９−１０９（Ａｐｒｉｌ２０１１））。
【００８３】
先に示したように、本開示は更に、本明細書中の教示と併せて、生体内で、試験管内で及び生体外での遺伝子治療の使用を意図する。遺伝子治療は、新規遺伝子を導入するために、既存の遺伝子の追加のコピーを導入するために、既存の遺伝子の機能を損なうために、または存在するが非機能的な遺伝子を修復するために、対象内の内因性細胞に、通常ベクターにパッケージングした遺伝物質を送達することにより行われる。細胞内で一度、核酸は細胞機構により発現し、目的のタンパク質の産生をもたらす。本開示の文脈において、遺伝子治療は、本明細書に記載の疾患、障害もしくは状態の治療または予防において使用するためのＩＬ−１５剤をコード化する核酸を送達するための治療法として使用される。本明細書で使用する場合、遺伝子治療は細胞の対象からの除去についても記載し、それはＩＬ−１５をコード化する核酸分子を有する細胞をトランスフェクションし、及びその細胞を対象に戻す。
【００８４】
上述のように遺伝子治療の使用及び方法において、対象の細胞は、生体内で本明細書に記載のＩＬ−１５関連ポリペプチドをコード化する核酸で形質転換することができる。あるいは細胞は、導入遺伝子またはポリヌクレオチドで生体外で形質転換し、その後治療を行うために対象の組織内に移植することができる。更に初代細胞分離株または株化細胞株は、ＩＬ−１５関連ポリペプチドをコード化する導入遺伝子またはポリヌクレオチドで形質転換することができ、その後場合により対象の組織内に移植できる。
【００８５】
ＰＥＧ化ＩＬ−１５
組み換えヒトＩＬ−１５の有用性はしばしば比較的に短い血清半減期によって制限されており、それは例えば腎クリアランスまたはタンパク質分解に起因し得る。その結果、その二量体構造を不利に破壊し、そのため活性に悪影響を与えることがないように、様々なアプローチはＩＬ−１５の薬物動態プロファイルを改善するために検討されてきた。ＩＬ−１５のＰＥＧ化は、例えば中国特許第１０２１４５１７８号に報告されているように、特定の薬物動態パラメータ（例えば、血清半減期）の改善をもたらす。しかし中国特許第１０２１４５１７８号は、Ｎ末端ＰＥＧ化に焦点を当てている。ＩＬ−１５及びＦｃを含む融合分子は、半減期を改善することも報告された（例えば中国特許第２００４１００６７１８２号を参照）。
【００８６】
当業者には明らかであるように、複数のポリエチレングリコール分子は複数のアミノ酸残基に付着できる。したがって本明細書で使用する場合、用語「ＰＥＧ化ＩＬ−１５」及び「ＰＥＧ−ＩＬ−１５」は、結合が安定するように一般的にリンカーを介して、ＩＬ−１５タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合で結合する、１つ以上のポリエチレングリコール分子を有するＩＬ−１５分子を指す。用語「モノＰＥＧ化ＩＬ−１５」及び「モノＰＥＧ−ＩＬ−１５」は、１つのポリエチレングリコール分子が、一般的にリンカーを介して、ＩＬ−１５の単一のアミノ酸残基に共有結合されていることを示すために使用される。条件「ジＰＥＧ化ＩＬ−１５」及び「ジＰＥＧ−ＩＬ−１５」は、１つのポリエチレングリコール分子が１つのアミノ酸残基に共有結合し、別のポリエチレングリコール分子は異なるアミノ酸残基に共有結合する、ＩＬ−１５タンパク質を記載するために用いることができる。例えば１つのポリエチレングリコール分子は、成熟ＩＬ−１５のＮ末端アミノ酸残基に共有結合することができ、別のポリエチレングリコール分子はＣ末端残基に共有結合することができる。それはタンパク質を生成することもでき、ポリエチレン分子は２超のアミノ酸残基に共有結合して、当業者はこのような分子を産生する手段に精通している。
【００８７】
特定の実施形態では、本開示で使用されるＰＥＧ−ＩＬ−１５は、１〜９つのＰＥＧ分子が、リンカーを介して、リシン残基の側鎖のＮ末端でまたはイプシロンアミノ基でアミノ酸残基のアルファ−アミノ基に共有結合される、モノＰＥＧ−ＩＬ−１５である。リンカーは、下記で更に記載する。通常容易にＰＥＧ化できない可能性がある成熟ＩＬ−１５内の部位でＰＥＧ化を行うために、ＩＬ−１５上の１つ以上の異なる部位は１つ以上の変異体を導入し、その後それらのそれぞれを改変することにより、改変される可能性がある。代表的なＰＥＧ化条件を本明細書の他の場所に記載する。
【００８８】
特定の実施形態では、ＰＥＧ部分の平均分子量は、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの間である。例えば、ＰＥＧ部分は、約５ｋＤａより大きく、約１０ｋＤａより大きく、約１５ｋＤａより大きく、約２０ｋＤａより大きく、約２５ｋＤａより大きく、約３０ｋＤａより大きく、約３５ｋＤａより大きく、約４０ｋＤａより大きく、約４５ｋＤａより大きく、または約５０ｋＤａよりも大きい分子量を有してもよい。いくつかの実施形態では、分子量は、約５ｋＤａ〜約ｌ０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約ｌ０ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約ｌ０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約ｌ０ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、または約ｌ０ｋＤａ〜約３０ｋＤａである。他の実施形態では、分子量は、約１５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約ｌ５ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、約ｌ５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、または約ｌ５ｋＤａ〜約４５ｋＤａである。
【００８９】
ＩＬ−１５のサイズ故に、２０ｋＤａ（例えば２０〜４０ｋＤａの範囲）より大きいＰＥＧは、特定の実施形態において想到される。いくつかの実施形態では、分子量は、約２０ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約４５ｋＤａ、または約２０ｋＤａ〜約５０ｋＤａである。いくつかの追加の実施形態では、分子量は、約２５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約４５ｋＤａ、または約２５ｋＤａ〜約５０ｋＤａである。更に他の実施形態では、分子量は、約３０ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約４５ｋＤａ、または約３０ｋＤａ〜約５０ｋＤａである。更に他の実施形態では、分子量は、約３５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約３５ｋＤａ〜約４５ｋＤａ、約３５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約４５ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約４５ｋＤａ〜約５０ｋＤａである。本開示は、５ｋＤａの増分で５０ｋＤａより大きい分子量を有するＰＥＧ（例えば５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａなど）を想到する。
【００９０】
本開示は、特異的な方法の使用またはＩＬ−１５へのＰＥＧの付着部位の使用を必要としないが、ＰＥＧ化がＩＬ−１５分子の活性を改善するが、それを変えず、または単に形式的に減少させることは、しばしば有利である。特定の実施形態では、半減期の増大の影響は生物活性の低下の影響よりも大きい。ＰＥＧ−ＩＬ−１５の生物活性は、細菌性抗原（リポ多糖体（ＬＰＳ））でチャレンジし、ＰＥＧ−ＩＬ−１５で処理した対象の血清中の炎症性サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）のレベルを評価することにより測定する。生物活性の測定の他の手段は、本明細書の他の場所に記載されている。
【００９１】
ＩＬ−１５変異体
ＩＬ−１５変異体は、血清半減期の増加；ＩＬ−１５に対する免疫反応の低下；精製または調製の促進；分解の減少；治療効果の改善；及び治療上の使用中の副作用の重症度または発生の軽減を含む、様々な目的を念頭に置き調製できる。いくつかは翻訳後変異体、例えばグリコシル化変異体であり得るが、アミノ酸配列変異体は通常、天然では見られない変異体をあらかじめ定めている。ＩＬ−１５の任意の変異体は、それがＩＬ−１５活性の適切なレベルを維持する場合、使用できる。ＩＬ−１５活性は、本明細書の他の場所に記載されている（例えば、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化及び増殖の調節）。
【００９２】
「保存的アミノ酸置換」という語句は、類似の酸性度、塩基度、電荷、極性を有する側鎖または類似の側鎖サイズを有するアミノ酸で、タンパク質のアミノ酸（複数を含む）を置換することにより、タンパク質の活性を保存する置換を意味する。「保存的アミノ酸置換」とは、一般的に以下の群内：１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ；２）Ｒ、Ｋ；３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ；４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ；５）Ｑ、Ｎ；及び６）Ｄ、Ｅでのアミノ酸残基の置換を指す。置換、挿入または欠失の指針は、異なる変異タンパク質または異なる種からのタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づくことができる。したがって任意の天然起源のＩＬ−１５ポリペプチドに加えて、置換が通常保存的アミノ酸置換である場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０つ、通常２０、１０または５つ以下のアミノ酸置換を有することを、本開示は想到する。場合により１つ以上の非天然アミノ酸は、部位特異的共役化を促進する手段として、ＩＬ−１５に導入してもよいことに留意すべきである。
【００９３】
本開示は、成熟ＩＬ−１５に由来する連続アミノ酸残基を含む成熟ＩＬ−１５の活性フラグメント（例えば、サブ配列）も想到する。ペプチドまたはポリペプチドのサブ配列の連続アミノ酸残基の長さは、サブ配列が由来する特定の天然起源のアミノ酸配列により異なる。一般にペプチド及びポリペプチドは、約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約４１アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５１アミノ酸〜約６０アミノ酸、約６１アミノ酸〜約７０アミノ酸、約７１アミノ酸〜約８０アミノ酸、約８１アミノ酸〜約９０アミノ酸、約９１アミノ酸〜約１００アミノ酸、約１０１アミノ酸〜約１０５アミノ酸、約１０６アミノ酸〜約１１０アミノ酸、または約１１１、１１２または１１３アミノ酸〜完全長のペプチドまたはポリペプチドであり得る。
【００９４】
そのうえＩＬ−１５ポリペプチドは、連続するアミノ酸の定義された長さにわたる参照配列（例えば、「比較ウィンドウ」）と比較して、定義した配列同一性を有し得る。比較のための配列のアラインメント方法は当該技術分野において既知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）に記載のローカル相同性アルゴリズムにより；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）に記載の相同性アラインメントアルゴリズムにより；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）に記載の類似法の探索により；これらのアルゴリズム（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のコンピュータでの実行により；または手動アラインメント及び目視検査により実施できる（参照：例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））実施することができる。
【００９５】
一例として、適切なＩＬ−１５ポリペプチドは、一続きの約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約４１アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５１アミノ酸〜約６０アミノ酸、約６１アミノ酸〜約７０アミノ酸、約７１アミノ酸〜約８０アミノ酸、約８１アミノ酸〜約９０アミノ酸、約９１アミノ酸〜約１００アミノ酸、約１０１アミノ酸〜約１０５アミノ酸、約１０６アミノ酸〜約１１０アミノ酸または約１１１、１１２もしくは１１３アミノ酸〜完全長のペプチドもしくはポリペプチドに対する、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のアミノ酸の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００９６】
更に以下で議論するように、ＩＬ−１５ポリペプチドは天然源（例えばその天然に存在する環境以外の環境）から単離することができ、組み換えで作ることもでき（例えば細菌、酵母、ピチア、昆虫細胞など遺伝的に改変された宿主細胞中で）、遺伝的に改変された宿主細胞は、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸で改変される。ＩＬ−１５ポリペプチドは、合成的に（例えば、無細胞の化学合成により）産生することができる。
【００９７】
天然起源の及び天然起源ではないアイソ型、対立遺伝子変異体及びスプライス変異体を含む、ＩＬ−１５分子をコード化する核酸分子は、本開示により想到される。天然起源のＤＮＡ配列からの１つ以上の塩基を変化させるが、引き続き遺伝コードの縮重によってＩＬ−１５ポリペプチドに対応するアミノ酸配列に翻訳された核酸配列も、本開示は包含する。
【００９８】
ＩＬ−１５変異体（例えばムテイン）及び改変ＩＬ−１５分子
本発明は、変異源物質を介したタンパク質機能の操作及びＩＬ−１５に対する他の改変を部分的に示している。いくつかの実施形態において、本発明は改変したＩＬ−１５分子を想到しており、１つ以上の有利な特性がＩＬ−１５に加えられ（特性（複数を含む）が未改変のＩＬ−１５に存在しない場合）、及び／または強化される（最適量以下であるにも関わらず、特性（複数を含む）が未改変のＩＬ−１５に存在する場合）。更に以下で論じるように、そのような分子は、例えばヒトＩＬ−１５における一連の点変異の発生を含む、合理的なドラッグデザインアプローチを介して同定し、合成できる。この一連の点変異は、一連の要素の特性（例えば、有効性）の性質及び程度を決定するために評価することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、点変異は、例えばＩＬ−１５ペプチドの合成を容易にするために使用され、ペプチドは共有結合または非共有結合の改変（例えばＰＥＧ化、Ｆｃ融合及びＨＳＡ融合）を含む。同様に改変されたペプチドの体系的評価は、ＩＬ−１５の一次アミノ酸配列の位置を画定するために実施でき、この改変はａ）タンパク質の生物活性を保持する；ｂ）特定のタンパク質機能を促進する；ｃ）他方を維持しつつ、特定のＩＬ−１５の機能を重視しない；またはｄ）ａ）〜ｃ）のいくつかを組み合わせを実行している間、影響を与えることができる。
【０１００】
本明細書で想到する合理的なドラッグデザインアプローチの１つの目標は、他の特性の追加または強化を可能にする間、生物活性への悪影響を有することなく改変できるＩＬ−１５のこれらのアミノ酸残基及び領域の同定である。これらの合理的なドラッグデザインアプローチの別の目的は、他を維持し強化する間、改変が特定のＩＬ−１５の機能の強化を選択的に抑えるために使用できる、ＩＬ−１５のアミノ酸残基及び領域を画定することである。したがって特定の実施形態では、ＩＬ−１５分子（例えばムテイン）または改変されたＩＬ−１５分子は、１つ以上の異なる役割を重視しない間ＩＬ−１５の１つ以上の役割を強調する；他に影響を与えない間（例えば、ＩＬ−１５活性の正常レベルを維持しつつ）、１つ以上のＩＬ−１５の役割を強調する；または他に影響を与えない間、１つ以上のＩＬ−１５の役割を重視しない。特定の実施形態では、別の特徴（複数を含む）（例えば、半減期などの薬物動態学的パラメータ）を強化する場合、改変（複数を含む）は生物活性の減少をもたらし、少なくとも治療学的展望から一般的により有益な改変されたＩＬ−１５分子をもたらす。
【０１０１】
特定の実施形態において、本明細書に記載の改変（複数を含む）は、そのペプチドの未改変バージョンに比べてペプチドの少なくとも１つの特性または他の特徴（例えば、溶解度）を改善する。本開示の更なる実施形態は、本明細書に記載の方法に従って改変することができるＩＬ−１５の特定のアミノ酸残基またはドメインを同定するための方法及び他の技術に関する。本明細書に記載のペプチドを使用し（例えばその障害もしくは症状の治療または予防に）同定し及び／または生成する方法も、本開示の態様である。このような態様は本明細書の他の場所で述べられる。他の態様は、例えばペプチドを含む医薬組成物を含む。
【０１０２】
特定のＩＬ−１５の機能ドメインの同定及びＩＬ−１５共役体の特定の種類の生成について説明したが、文献は、それを同定し及び／または生成する方法ならびにそれを使用する方法に伴う、本明細書に記載のＩＬ−１５分子の種類の開示がない。
【０１０３】
特定の実施形態において、本開示は、例えばヒトＩＬ−１５での一連の点変異の生成、及び哺乳動物または細菌系におけるその変異したＩＬ−１５タンパク質（例えば、ムテイン）の発現を想到する。本開示は、本明細書に記載の変異ＩＬ−１５分子と適合する任意の発現系の使用を想到する。他の実施形態では候補タンパク質発現系は、細菌（例えば大腸菌、コリネバクテリウム、グラム陰性桿菌及び枯草菌）、酵母（例えば出芽酵母）由来のもの及びバキュロウイルス感染昆虫細胞を含むが、哺乳動物のタンパク質発現系は特定の実施形態において想到される。細胞系または無細胞発現系を使用することができる。ほとんどの組み換えサイトカインは細菌封入体中で産生され、その後精製し、再び折り畳まれた。
【０１０４】
細菌細胞は、サイトカインを発現するために、通常タンパク質の再折り畳みを含む方法で使用される。しかし変異タンパク質が発現されるかを決定するために、最初に哺乳動物発現系を使用することが有利であり得る。哺乳動物細胞が変異タンパク質を発現できる場合、次にタンパク質の折り畳みは変異体により破壊されない可能性が高い。変異分子を折り畳みかつ分泌する哺乳動物細胞系の能力と、更なる評価の候補としてのその分子の生存能力の間に密接な相関がしばしばある。逆に初期発現が細菌中で行われ、変異タンパク質が正しく再折り畳みされていない場合、変異体が破壊されたか、またはタンパク質の再折り畳みプロトコルが最適以下であったかは不明である。
【０１０５】
発現系（例えば、哺乳動物細胞株ベースの発現系）でタンパク質の折り畳み及び分泌を著しく破壊しない変異ＩＬ−１５分子は、更なる評価の候補であり得る。例えばこのような変異ＩＬ−１５分子は、生体内または試験管内／生体外アッセイの１つ以上で、本明細書に記載のＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイを含む生物活性の分析を可能にするために十分に精製され得る。更なる例により、そのような変異ＩＬ−１５分子は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５結合相手の親和性測定を提供する生体外アッセイで評価することができる。更に生体内モデルは記載されており、本明細書に記載のＩＬ−１５分子の評価で使用できる。
【０１０６】
特定の実施形態において、変異ＩＬ−１５ポリペプチド分子（例えばムテイン）は、例えばＰＥＧ化により改変される。これらの改変したＩＬ−１５分子は、その後、タンパク質機能への影響を決定するために評価することができる。良好な特性（例えば、正常またはタンパク質機能に影響を与えない）を示す改変したＩＬ−１５分子は、更なる改変（例えば、より大きなまたは分枝状ＰＥＧ）及び評価（例えば、溶解度）の候補であり得る。ＰＥＧ化及び他の種類の改変を、本明細書の他の場所で詳述する。
【０１０７】
更に本開示は、本明細書に記載の生体外、生体内またはインシリコ免疫原性アッセイなどの免疫原性を決定するための１つ以上のアッセイを用いて、変異ＩＬ−１５ペプチド及び改変ＩＬ−１５ペプチドの評価を想到する。特に良好な特性（例えば、インシリコで決定されるような免疫原性を増加させることなく、強化された有効性）を示す改変されたＩＬ−１５分子は、生体内免疫原性分析及び／または生体内設定での追加の分析を含む、更なる評価の候補であり得る。特定の実施形態では、これらの改変されたＩＬ−１５分子は、対応する非改変ＩＬ−１５分子よりも免疫原性が大きくない。
【０１０８】
ＩＬ−１５フラグメント；異種タンパク質と複合したＩＬ−１５ポリペプチドを含む分子；及び核酸レベルで１つ以上の治療薬に融合したＩＬ−１５を含むＩＬ−１５融合タンパク質（例えば、抗炎症生物学的薬剤）を含む、他のＩＬ−１５分子は本明細書に包含される。そのような分子は、本明細書に記載のアプローチまたは当業者に既知の他のアプローチを用いて改変できる。
【０１０９】
本開示の合理的なドラッグデザインアプローチは、多くのソースからの結晶学的及び類似データを利用できる。一例としてＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインとの複合体のＩＬ−１５の結晶構造が記載されるＯｌｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（５１）：３７１９１−２０４（Ｄｅｃ．２１  ２００７）。更にＰｅｔｔｉｔら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２３１２−１８（１９９７））は、部位特異的突然変異、ポリエチレングリコール共有結合及びホモロジーモデリングを使用するＩＬ−１５の構造機能研究を記載する。それ自身不十分かつ不完全であるにもかかわらず、そのようなソースに記載された情報及びデータは、改変できるＩＬ−１５のアミノ酸残基及びドメインの同定に使用する成分を表すことができる。このような情報及びデータを活用した結果、変異ＩＬ−１５分子（例えば、ムテイン）ならびに改変された変異ＩＬ−１５分子（及びいくつかの実施形態では改変された天然型ｈＩＬ−１５）は、本明細書に記載の利点及び／または望ましい特徴を有すると同定された。
【０１１０】
本明細書で記載されかつ図３で示されるように、成熟ｈＩＬ−１５は、ａ）ヘリックスＡ（アミノ酸残基１〜１７）、ｂ）Ａ／Ｂヘリックス間接合（Ａ／Ｂループ）（アミノ酸残基１８〜３１）、ｃ）ヘリックスＢ（アミノ酸残基３２〜５３）、ｄ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合（Ｂ／Ｃターン）（アミノ酸残基５４〜５７）、ｅ）ヘリックスＣ（アミノ酸残基５８〜７７）、ｆ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合（Ｃ／Ｄループ）（アミノ酸残基７８〜９６）、及びｇ）ヘリックスＤ（アミノ酸残基９７〜１１４）を含む。いくつかの実施形態において、本開示はａ）ヘリックスＡ、ｂ）Ａ／Ｂヘリックス間接合、ｃ）ヘリックスＢ、ｄ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合、ｅ）ヘリックスＣ、ｆ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合、及びｇ）ヘリックスＤを含むペプチドを想定しており、このようなペプチドは更に、ｉ）アミノ酸残基２（Ｗ）、４〜１２（ＮＶＩＳＤＬＫＫＩ；配列番号３７）もしくは１６（Ｉ）以外のヘリックスＡのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｉ）アミノ酸残基３０（Ｄ）もしくは３１（Ｖ）以外のＡ／Ｂヘリックス間接合のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｉｉ）アミノ酸残基３２（Ｈ）、３５（Ｃ）、４０（Ｍ）、４２〜４４（ＣＦＬ）、４７（Ｌ）もしくは５０（Ｉ）以外のヘリックスＢのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｖ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｖ）アミノ酸残基５９（Ｉ）、６１〜６６（ＤＴＶＥＮＬ；配列番号３８）もしくは６８〜７０（ＩＬＡ）以外のヘリックスＣのうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｖｉ）アミノ酸残基８５（Ｃ）もしくは８８（Ｃ）以外のＣ／Ｄヘリックス間接合のうちの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｖｉｉ）アミノ酸残基９９（Ｆ）、１００（Ｌ）、１０３（Ｆ）もしくは１０５〜１１２（ＨＩＶＱＭＦＩＮ：配列番号３９）以外のヘリックスＤの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；のうちの少なくとも１つ含む。これらの領域の境界を図３に示す。
【０１１１】
図３で示したヘリックス及びヘリックス間接合の境界がこれらの特定領域を画定するとして当該技術分野において一般に受け入れられているが、当業者は、このような領域を画定する特定のアミノ酸残基の特定の偏差があり得ることを理解するであろう。当業者は、本開示を実行するとき、このような偏差を考慮に入れることができる。
【０１１２】
ＩＬ−１５受容体結合及びシグナル伝達の機構は完全には解明されていないが、ＩＬ−１５はＩＬ−１５Ｒαとの複合体で機能することが示された。この複合体は、ＩＬ−１５シグナル伝達を達成するために、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβ及びγｃと協調して作用する。図４ＡはヒトＩＬ−１５のタンパク質結晶構造のリボン表現（平面図）であり、特定のヘリックス及びヘリックス間接合は標示されている。特定のＩＬ−１５結合相手（例えばＩＬ−１５Ｒα）も示される。図４ＢはヒトＩＬ−１５のタンパク質結晶構造のリボン表現（側面図）であり、特定のヘリックス及びヘリックス間接合は標示されている。特定のＩＬ−１５結合相手（例えばＩＬ−１５Ｒα）も示される。
【０１１３】
改変（例えばＰＥＧ化）の不良な候補であり得るアミノ酸残基は、改変にアクセスできない疎水性コアの残基；結合界面と接触するまたはそれに極めて接近する残基（例えばＩＬ１５β／γ受容体結合に関連する残基）；及びシステイン系ＰＥＧ化した化学物質に一般的に非反応性である（ジスルフィド結合のシステインＰＥＧ化は定義されたＰＥＧ化条件を用いて達成できるが）ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。それに対し、改変（例えば、ＰＥＧ化）の可能性がある良好な候補であり得るアミノ酸残基は、タンパク質間相互作用に関与しない表面露出残基、またはヘリックス間接合を形成する残基を含む。留意すべきは、ＩＬ−１５Ｒαにより結合されないとき、ＩＬ−１５は立体構造的に「プラスチック」であると観察された（Ｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（１２）：１１８７−９５（Ｄｅｃ．１３，２０１２））。
【０１１４】
化学物質は、例えばポリペプチドのＮ末端、リシン残基、システイン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、及びＣ末端のＰＥＧ化のために一般的に存在する。上述のとおり、本開示は、同様にＰＥＧ化できる非天然型アミノ酸残基の導入を想到する。しかし、これらのアミノ酸残基のいくつかのみを、部位特異的なやり方で常にＰＥＧ化することができる。他のアミノ酸（例えば、グルタミン酸及びセリン残基）のＰＥＧ化は有用な多くの位置異性体をもたらすが、他のアミノ酸のＰＥＧ化は、複合条件下でのみ部位特異的な方法で実施できる。
【０１１５】
場合によりＰＥＧ化の影響を受けやすい成熟ＩＬ−１５内の可能性がある残基（例えば、ヒスチジン及びトレオニン）の評価は以下のとおり：ＰＥＧ化に役立つ部位であるとわかったＮ末端；ＰＥＧ化に役立つ可能性がある部位であるとわかったＣ末端；リジン（Ｋ）−７残基は成熟ＩＬ−１５に存在するが、ＰＥＧ化に役立つ部位ではないことが判明した；システイン（Ｃ）−４残基は成熟ＩＬ−１５に存在するが、ＰＥＧ化に役立つ部位ではないことが判明した；ヒスチジン（Ｈ）−４残基は成熟ＩＬ−１５に存在するが、ＰＥＧ化に役立つ部位ではないことが判明した；アスパラギン酸（Ｄ）−６残基は成熟ＩＬ−１５に存在するが、ＰＥＧ化に役立つ部位ではないことが判明した；グルタミン酸（Ｅ）−１２残基は成熟ＩＬ−１５に存在するが、ＰＥＧ化に役立つ部位ではないことが判明した；セリン（Ｓ）−１３残基は成熟ＩＬ−１５に存在するが、ＰＥＧ化に役立つ部位ではないことが判明した；スレオニン（Ｔ）−６残基は成熟ＩＬ−１５に存在するが、ＰＥＧ化に役立つ部位ではないことが判明した；である。一実施形態において、成熟ＩＬ−１５の唯一のチロシン（Ｙ）残基は、ＰＥＧ化の可能性がある部位を表す。
【０１１６】
上述した残基のそれぞれは適切な条件下でＰＥＧ化の影響を受けやすいが、商業上ＰＥＧ化の実際の候補である残基の数は上述のサブセットである。一例として、本リジンベースのＰＥＧ化計画は、位置異性体の生成のない特定のリジン（野生型ＩＬ−１５分子内の７リジン残基中から）をＰＥＧ化しない。このような位置異性体は多くの場合、治療薬で許容されない。更にそれらは、製造工程の追加の複雑さをしばしばもたらす。最後に特定のＰＥＧ化計画は、その残基が「標的」残基に対して類似の結合または環状構造を有する場合、「非標的」残基（複数を含む）のＰＥＧ化をもたらす。
【０１１７】
本明細書に記載の教示によれば、成熟ＩＬ−１５の１４４アミノ酸残基のうち、変異原性及び部位特異的化学物質の組み合わせを介したアミノ残基の改変は、４４残基に有用であるとは予想されない（図５を参照）。このような４４残基のうち、４つはジスルフィド結合に関連している可能性がある。残りの４０残基は、受容体シグナル伝達複合体と接触している、３次ＩＬ−１５構造の疎水性コア領域内に埋もれた、またはその両方の可能性がある。ＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体シグナル伝達複合体の種々の要素がどのように相互作用するか、及びシグナル伝達がどのように行われるかの理解は、本開示を実行するために必要とされない。しかし３つのＩＬ−１５Ｒサブユニット（α、β及びγｃ）のうち、シグナル伝達は、β及びγｃサブユニットへのＩＬ−１５の結合を含むと考えられている。したがっていくつかの実施形態で、このようなＰＥＧ化は少しでもあるとしたらＩＬ−１５シグナル伝達にほんのわずかな影響のみを与えるので、ＩＬ−１５Ｒαを結合するＩＬ−１５の１つ以上のアミノ酸残基のＰＥＧ化を、本開示は想到する。逆に本明細書に記載の教示に基づき、突然変異誘発及び部位特異的な化学物質の組み合わせを介したアミノ酸残基の改変は、５９残基で実行可能であることを予測し、それは表面露出であり得て、ＩＬ−１５受容体複合体またはジスルフィド結合に完全には関与していない。１１残基は、図５の「＋／−」で示されるように、ＰＥＧ化の可能性がある部位（例えば、受容体結合に関連する１つの残基及び受容体結合に関連していない別の表面露出残基を側面に置く残基）である潜在力を有すると考えられている。使用する方法論及び他のパラメータに応じて、残基のうちの１つ以上はＰＥＧ化の可能性がある部位ではないと見なされる、１つ以上の残基はＰＥＧ化の可能性がある部位であると見なされる、及び／または１つ以上の残基は場合により、異なるカテゴリーに分類され得るＰＥＧ化の可能性がある部位であると見なされる（例えば、場合によりＰＥＧ化の可能性がある部位である残基は、ＰＥＧ化の可能性がある部位と結論づけられるかもしれない）と、当業者は結論づける可能性があることを理解すべきである。
【０１１８】
上述のように５９アミノ酸残基は、ＰＥＧ化のアンカーとして機能するアミノ酸の置換によって、場合により突然変異を許容する部位を表す。これらの可能性がある５９の部位のうち、いくつかの変異体は種々の理由により特定の位置で排除される：ヒトＩＬ−１５がすでにその位置でのチロシンを含むため、残基２６（Ｙ）はチロシンに変異することはできない；残基７１（Ｎ）はすでにＮ−Ｘ−Ｓ  Ｎ−グリコシル化モチーフを含むため、Ｎ−Ｘ−Ｔモチーフのみを導入することができる；残基７９（Ｎ）はすでにＮ−Ｘ−Ｔ  Ｎ−グリコシル化モチーフを含むため、Ｎ−Ｘ−Ｓモチーフのみを導入することができる；残基１１２（Ｎ）はすでにＮ−Ｘ−Ｓ  Ｎ−グリコシル化モチーフを含むため、Ｎ−Ｘ−Ｔモチーフのみを導入することができる。残基１１３（Ｔ）と１１４（Ｓ）はそれぞれ最後から２番目の残基と最後の残基であり、したがって３アミノ酸のＮ−グリコシル化モチーフを付加することができない。３つのアミノ酸にまたがるＮ−グリコシル化部位のモチーフ（Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔ、Ｘ≠Ｐ）故に、Ｎ−グリコシル化変異体の側面に位置する残基を変異させることが場合によっては必要であるが、Ｎ−グリコシル化が目的の特定の残基で生じるように、このような変異体は設計された。変異体は本明細書に記載の方法を使用して生成され、生物活性を決定するためにＣＴＬＬ−２増殖アッセイで評価した。
【０１１９】
図６は、特定の置換のためのＣＴＬＬ−２増殖データを記載する。データの見直しにより、いくつかの一般状態観察を得る。第１にヘリックス間のループは通常、変異体への良好な場所である。しかしＡ／Ｂループ内のいくつかの残基は、改変の不良な候補である。第２に、システイン変異体は多くの場合非常に分裂しやすいが、残基６（Ｉ）及び７０（Ａ）の変異体だけは不活性だった。ＰＥＧ化の部位として機能するアミノ酸を導入するために行われ得る正確な置換に関する詳細な考察は、下記のとおりである。しかしいくつかの生物活性を保持しつつ、置換に最も受け入れられる複数の残基を、以下のとおり示す。ａ）アミノ酸残基１（Ｎ）のすべての４つの置換（すなわち、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ）、Ｎ−Ｘ−Ｓ及びＮ−Ｘ−Ｔ）は活性タンパク質を産生し、標準Ｎ末端ＰＥＧ化計画を直ちに使用することができる；ｂ）アミノ酸残基１３（Ｅ）の１５（Ｌ）への置換は良好な結果を得た；ｃ）アミノ酸残基１７（Ｑ）の２３（Ａ）への置換は良好な結果を得た；ｄ）アミノ酸残基４８（Ｑ）、４９（Ｖ）、５１（Ｓ）の５８（Ｓ）及び６０（Ｈ）への置換は活性タンパク質を産生した；ｅ）アミノ酸残基７１（Ｎ）の８４（Ｇ）への置換は良好な結果を得たが、この１３残基の全長の２つの変異体を除く；ｆ）アミノ酸残基８９（Ｅ）の９８（Ｅ）への置換は良好な結果を得た；ｇ）Ｃ末端のアミノ酸残基１１３（Ｔ）及び１１４（Ｓ）は良好な結果を得て、標準Ｃ末端ＰＥＧ化計画を直ちに使用することができる。
【０１２０】
本開示のいくつかの実施形態は、以下の領域１７〜２８、３６〜３８、５１〜５７、７８〜８４または８９〜９８のうちの少なくとも１つに、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むペプチドを想到している。他の実施形態において、ペプチドは、以下の位置１、１７〜２８、３６〜３８、４１、４５、４６、４８、４９、５１〜５７、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１１３または１１４のうちの少なくとも１つで少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。更なる実施形態において、ペプチドは、以下の位置１、３、１３〜１５、１７〜２９、３３、３４、３６〜３９、４１、４５、４６、４８、４９、５１〜５８、６０、６７、７１〜８４、８６、８７、８９〜９８、１０１、１０２、１０４、１１３または１１４のうちの少なくとも１つで少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１２１】
生物学的活性を示す変異体の同定
本明細書に記載の方法を用いて、成熟ヒトＩＬ−１５タンパク質の１１４アミノ酸残基のどれが、ＰＥＧ部分のためのアンカー部位の形成に貢献する残基との置換に許容されるかを決定するために、評価を実施した。この評価を用いて同定された残基は、置換が生物活性を示す変異体（ムテイン）をもたらすかを決定するために分析された。当業者は、生体外アッセイで活性であるすべての変異体が生体内設定で活性を有するとは限らず、そして逆もまた同様であることを理解するであろう。
【０１２２】
上述及び図５に示したとおり、１１４残基成熟ヒトＩＬ−１５ポリペプチドのうちの４４アミノ酸残基（「−」で表す）はＰＥＧ化の候補ではない。これらの４４残基のうちの４つは、ジスルフィド結合（残基３５−＞８５及び残基４２−＞８８）を形成するシステインであり、したがって変異体に利用できない。残りの４０残基は、受容体シグナル伝達複合体と接触している、３次ＩＬ−１５構造の疎水性コア領域内に埋もれた、またはその両方の可能性がある。したがって７０残基（図５でそのうちの５９は「＋」で、１１は「＋／−」で表す）は、ＰＥＧ化のアンカーとして機能するアミノ酸の置換によって突然変異を許容する可能性がある部位を表す。これらの可能性がある部位での変異体はそれから、本明細書に記載されているようにＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイを使用して評価された。
【０１２３】
評価の結果を図６Ａ〜図６Ｂにまとめる。図６Ａ〜図６Ｂの最初の行は、ＩＬ−１５の各領域：ａ）ヘリックスＡ；ｂ）Ａ／Ｂループ（すなわちＡ／Ｂヘリックス間接合）；ｃ）ヘリックスＢ、ｄ）Ｂ／Ｃターン（Ｂ／Ｃヘリックス間接合）；ｅ）ヘリックスＣ、ｆ）ＣＤループ（すなわちＣ／Ｄヘリックス間接合）；及びｇ）ヘリックスＤの境界を画定する。第２の行は、１１４残基の成熟ＩＬ−１５ポリペプチドの各アミノ酸残基を記載する。図６の次の４行は、各残基：システイン、チロシンならびにＮ−Ｘ−Ｓ及びＮ−Ｘ−Ｔ  Ｎ−グリコシル化モチーフに導入された変異体の種類に関連する。
【０１２４】
図６Ａ〜図６Ｂの影を参照すると、下記に記載の「×」のあるダークグレイの欄を除いて、ＰＥＧのアンカーとして機能することができるアミノ酸の導入の良好な候補であるとみなされなかったので、ダークグレイの欄の残基は変異せず、または分析の一部でもなく；上述のように、このような残基は、受容体シグナル伝達複合体と接触している、３次ＩＬ−１５構造の疎水性コア領域内に埋もれた、またはその両方の可能性がある。しかし、Ｎ−グリコシル化部位の導入との関係において、これらの残基のいくつかは変異した点に留意する必要がある。ライトグレイの欄内の残りの７０残基は、ホモ二量体上に表面露出する可能性が高く、受容体結合を妨げる可能性が低い残基を表す。１つ以上の残基が異なって分類できると当業者は結論づけることができることを理解すべきである（すなわち、ダークグレイの欄内にある残基は、ライトグレイの欄内に置かれてもよい）。
【０１２５】
変異体（例えば、システインまたはチロシン）は本明細書に記載の方法を使用して生成され、その生物活性は、実験の項に記載されている及びＳｏｍａｎら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ３４８（１−２）：８３−９４（２００９Ａｕｇｕｓｔ３１））に記載されているものと実質的に類似しているＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイで評価した。変異体が発現され、生物活性を示した場合、該当する欄に「＋」を入れた（例えば、アミノ酸残基４１を参照すると、チロシン変異体は活性を示すが、一方システイン変異体は示さなかった）。評価の目的のために、任意の生物活性の測定は「＋」記号を割り当てた。「＋」のないライトグレイの欄内の変異体（すなわち、空のグレイの欄）は、変異体が発現せず、またはＣＴＬＬ−２アッセイで活性ではなかったことを示す。
【０１２６】
図６Ａ〜図６Ｂの特定のアミノ酸残基に関連するライトグレイの列のいくつかで、いくつかの欄（ライトグレイ）は空である、または「＋」がはいり、他の欄はダークグレイで「×」を含む。これらの例で、ダークグレイの「×」の欄は、種々の理由で変異させることができなかった。ヒトＩＬ−１５がすでにその位置にチロシンが含まれているため、残基２６（Ｙ）は、チロシンに変異することができなかった。残基７１（Ｎ）において、タンパク質はすでにＮ−Ｘ−Ｓ  Ｎ−グリコシル化モチーフを含むため、Ｎ−Ｘ−Ｓ  Ｎ−グリコシル化モチーフを導入することができなかった。残基７９（Ｎ）において、タンパク質はすでＮ−Ｘ−Ｔ  Ｎ−グリコシル化モチーフを含むため、Ｎ−Ｘ−Ｔ  Ｎ−グリコシル化モチーフを導入することができなかった。残基１１３（Ｔ）において、Ｎ−グリコシル化モチーフが３アミノ酸長（Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔ）を含むため、Ｎ−グリコシル化部位をタンパク質の最後から２番目の基に導入できない。残基１１４（Ｓ）において、Ｎ−グリコシル化モチーフが３アミノ酸長を含むため、Ｎ−グリコシル化部位をタンパク質の最後の残基に導入できない。
【０１２７】
図６Ａ〜図６Ｂに示す及び本明細書の他の箇所に記載する教示を考慮して、当業者は、以下を認識する。１）ＰＥＧ部分を固定するために変異体が導入される、可能性のある７０残基がある（すなわち、７０のライトグレイの列がある）。２）可能性のある７０残基のうち、残基４６（Ｅ）が試験した変異体のいずれかを有する活性タンパク質を生成しなかったので、６９残基は、それらをＰＥＧ部分を固定させるための実行可能な候補とする特性を保持することを、更なる評価は示した。３）すでにチロシンである残基２６を除いて、チロシンは６９残基のそれぞれと置換して、生理活性タンパク質を産生できる。４）残基２６（Ｙ）、４１（Ｋ）、５７（Ａ）及び７１（Ｎ）を除いて、システインは６９残基のそれぞれと置換して、生理活性タンパク質を産生できる。５）残基３（Ｖ）、２３（Ａ）〜２６（Ｙ）、３３（Ｐ）、３７（Ｖ）〜３９（Ａ）、４１（Ｋ）、４５（Ｌ）、６７（Ｉ）、８３（Ｓ）、８６（Ｋ）及び１０１（Ｑ）を除いて、Ｎ−Ｘ−Ｓグリコシル化モチーフは６９残基のそれぞれで生成されて、生理活性タンパク質を産生できる。上述したように、それらが天然型ヒトＩＬ−１５の最後の２残基を表すので、残基１１３（Ｔ）及び１１４（Ｓ）はグリコシル化部位を収容することができない。残基７１（Ｎ）はすでに、Ｎ−Ｘ−Ｓグリコシル化モチーフのアスパラギンを表す。６）残基３（Ｖ）、２３（Ａ）〜２８（Ｅ）、３３（Ｐ）、３７（Ｖ）〜３９（Ａ）、４１（Ｋ）、４５（Ｌ）、６７（Ｉ）、８３（Ｓ）、８６（Ｋ）、１０１（Ｑ）及び１０４（Ｖ）を除いて、Ｎ−Ｘ−Ｔグリコシル化モチーフは６９残基のそれぞれで生成され得る。上述したように、それらが天然型ヒトＩＬ−１５の最後の２残基を表すので、残基１１３（Ｔ）及び１１４（Ｓ）はグリコシル化部位を収容することができない。残基７９（Ｎ）はすでに、Ｎ−Ｘ−Ｔグリコシル化モチーフのアスパラギンを表す。
【０１２８】
ＩＬ−１５の改変された形態の免疫原性の考察
免疫原性、対象の体液性（Ｂ細胞）及び／または細胞媒介性（Ｔ細胞）の免疫反応を誘発する抗原の能力は、「望ましい」または「望ましくない」として分類することができる。望ましい免疫原性は通常、ワクチン注射により誘発される病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）に対して開始する対象者の免疫応答を意味する。本文脈中、免疫応答は有利である。逆に望ましくない免疫原性は通常、治療用タンパク質（例えば、ＩＬ−１５）などの抗原に対して開始する対象の免疫反応を意味し、前記免疫反応は、例えば治療用タンパク質の有効性に、もしくはその薬物動態学的パラメータに悪影響を与え及び／または他の副作用に寄与する抗薬物抗体（ＡＤＡ）をもたらすことができる。本文脈中、免疫反応は不利である。
【０１２９】
タンパク質治療薬の対象の免疫反応に影響を与える、対象固有及び産生物固有の多くの要因がある。対象固有の要因は、対象の免疫状態及び反応能：アレルギーの前感作／履歴；投与経路；投与量及び頻度；対象の遺伝状態；及び内因性タンパク質に対する免疫寛容の対象の状態を含む。免疫原性に影響を与える産生物固有の要因は、産生物の起源（外因性または内因性）；産生物の１次分子構造／翻訳後修飾、３次及び４次構造など；産生物の凝集体の存在；共役化／改変（例えば、グリコシル化及びＰＥＧ化）；アジュバント活性を有する不純物；産生物の免疫調節特性；及び配合を含む。
【０１３０】
自家またはヒト様ポリペプチド治療薬は、いくつかの用途では驚くべきことに免疫原性であり、及び他では驚くべきことに非免疫原性であることが証明されている。特定のＩＬ−１５ムテイン、及び他の改変型ＩＬ−１５（例えば、ＰＥＧ化ＩＬ−１５ならびにＩＬ及びＩＬ−１５ドメイン）は、体液性及び細胞媒介性免疫反応の範囲を誘発する可能性がある。本明細書で更に議論されるように、Ｔ細胞エピトープ及び／もしくはＢ細胞エピトープの除去または改変は、免疫原性を低下することができる。実際に特定の文脈において、１つ以上のアミノ酸残基と「マスキング剤」（例えば、ＰＥＧ）との共役化及び／またはアミノ酸残基自身への変化（例えば、置換による）は、他の高度な免疫原性タンパク質の免疫原性を劇的に低下させることができる。
【０１３１】
Ｔ細胞エピトープ。更に以下で議論するように、多くの場合２次及び３次タンパク質構造に依存する複雑な三次元Ｂ細胞エピトープとは対照的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、通常約１１〜約２０アミノ酸残基長の線状ペプチド配列である。臨床免疫原性データが存在するタンパク質の範囲の比較解析は、対応するタンパク質の免疫原性を有するＴ細胞エピトープの存在と潜在能の間の強力な関係を示す。
【０１３２】
インシリコのスクリーニングツールは、包括的なＴ細胞エピトープ評価の最初の工程としてしばしば使用される。ペプチドへのヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘導は、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを必要とする。このようなペプチド結合データの解析は、治療用タンパク質の開発プロセスに利用することができる。一例として、Ａｎｔｉｔｏｐｅ  Ｌｔｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）は、３４ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子へのペプチドの結合をモデル化する、インシリコ分子モデリング技術（ｉＴｏｐｅ（商標））で独自技術を有する。個々のアミノ酸残基のペプチド結合への寄与は各対立遺伝子について決定することができ、それからこれらのデータは、Ｔ細胞エピトープが結合を破壊するように突然変異している「脱免疫化」配列の変異体のデザインで使用することができる。
【０１３３】
更に「免疫インフォマティクス」アルゴリズム及びＴ細胞エピトープを同定するための他の技術は、高リスクと低リスクのカテゴリーにタンパク質治療薬をトリアージするために使用することができる。例えばタンパク質配列は、ほとんどのヒトの遺伝的背景を「包含する」８つの共通クラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子のそれぞれへの結合の可能性をその後評価される、重複９量体ペプチドフレームを解析することができる。タンパク質内の高スコアリングフレームの密度を算出することにより、タンパク質の全体的「免疫原性スコア」を推定することができる。更に潜在的な免疫原性のぎっしりつまった高スコアリングフレームまたは「クラスター」のサブ領域を、同定することができ、クラスタースコアを計算しコンパイルできる。免疫原性の他の決定と共にタンパク質の「免疫原性スコア」は、そのタンパク質が免疫反応を誘発する可能性を決定するために、その後、使用することができる。
【０１３４】
治療用タンパク質の免疫原性を低下させる更なる手段を、用いてもよい。技術（例えば、Ａｎｔｉｔｏｐｅの商品名ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）ヒト生体外Ｔ細胞アッセイシステム）は、タンパク質、ペプチド、製剤などへのヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞応答を決定することができる。このような技術を使用して作成したデータは、出発タンパク質配列内のヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープをマッピングするために使用することができ、Ｔ細胞エピトープは、下記：ヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を低減し／排除するために突然変異を設計すること；ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体の認識を破壊するために、Ｔ細胞受容体接触残基を標的化すること；望ましいタンパク質活性を維持するために重要なアミノ酸残基の標的化及び置換を導くために、構造及び相同性解析を行うこと；及び潜在能に基づく除去のためのＴ細胞エピトープの優先順位付けを行うこと；のうちの１つ以上によってタンパク質から除去することができる。
【０１３５】
Ｂ細胞エピトープ。Ｂ細胞エピトープは、２つのカテゴリーのいずれかに入れることができる。第１のカテゴリーでは、エピトープはタンパク質の特定領域の一次アミノ酸配列によって定義され、エピトープの構成要素はタンパク質上に連続的に配置される。これらの線形Ｂ細胞エピトープは一般に、約５〜約２０アミノ酸残基長の範囲である。第２のカテゴリーでは、エピトープはタンパク質の立体構造によって定義され、エピトープの構成要素は、天然タンパク質の折り畳まれた２次または３次構造で、互いに接近するタンパク質の別個の部分に位置している。ほとんどのＢ細胞エピトープはタンパク質の立体構造に基づくので、Ｂ細胞エピトープは（それらの一次アミノ酸配列によって決定される）Ｔ細胞エピトープよりも同定することが困難である。
【０１３６】
以前使用された配列に基づくＢ細胞エピトープの予測因子の例としては、Ｓａｈａ  Ｓ，ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ  ＧＰ（“ＡＢＣＰｒｅｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”）（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（２００６）６５：４０−４８）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（２００７）３３：４２３−２８）；Ｅｌ−Ｍａｎｚａｌａｗｙ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（“ＢＣＰｒｅｄ”ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ（２００８）２１：２４３−５５）；Ｓｗｅｒｅｄｏｓｋｉ  ＭＪ，ａｎｄ  Ｂａｌｄｉ  Ｐ（“ＣＯＢＥｐｒｏ”ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ（２００９）２２：１１３−２０）；Ｗｅｅ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．（”ＢａｙｅｓＢ”  ｔｅｈｎｏｌｏｇｙ）（ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ（２０１０）１１：Ｓ２１）；Ａｎｓａｒｉ  ＨＲ，ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ  ＧＰ（“ＣＢＴＯＰＥ”ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｒｅｓ（２０１０）６：６）に記述された技術を含む。
【０１３７】
サポートベクターマシンツール（「ＢＥＳＴ」）を用いてＢ細胞エピトープを予測することは、有望な新しいＢ細胞エピトープの技術である（Ｇａｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ７（６）：ｅ４０１０４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４０１０４）。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）により、２０量体のスライドから生成した、選択スコアの平均に基づく新しいアーキテクチャを使用して、短い配列フラグメントのみから予測する多くの従来の方法とは対照的に、ＢＥＳＴ法は抗原配列からエピトープを予測する。ＳＶＭ予測因子は、既知（トレーニング）のエピトープの鎖、配列保存、類似性に由来し、ならびに２次構造及び相対的溶媒接触性を予測する情報を組み合わせることにより生成された入力の包括的かつカスタムデザインのセットを利用する。更にいくつかの事業者は、Ｂ細胞エピトープを評価するために独自の技術を利用する（例えば、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ’ｓ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳｐｏｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  Ｌｔｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）。
【０１３８】
免疫原性を評価する目的で、常にではないが一般的に抗原特異的Ｂ細胞応答を刺激する潜在的Ｔ細胞エピトープに集中することが有用である。
【０１３９】
ＩＬ−１５産生の方法
本発明のポリペプチドは、非組み換え（例えば、化学合成）及び組み換え法を含む任意の適切な方法により産生することができる。
【０１４０】
化学合成
ポリペプチドが化学合成される場合、合成は液相または固相を介して進行できる。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、非天然アミノ酸及び／またはペプチド／タンパク質骨格改変の組み込みを可能にする。９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）などのＳＰＰＳの様々な形態は、本開示のポリペプチドを合成するために利用可能である。化学合成の詳細は当該技術分野で既知である（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ  Ａ．（２００６）Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３−１０；及びＣａｍａｒｅｒｏ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８）。
【０１４１】
固相ペプチド合成は、以下に記載されるように実施され得る。アルファ官能基（Ｎα）及び任意の反応性側鎖は、酸不安定基または塩基不安定基で保護される。保護基は、アミド結合を連結するための条件下で安定的だが、形成したペプチド鎖を損なわずに容易に切断することができる。α−アミノ官能基に適した保護基としては、下記のＢｏｃ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｍｏｃ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシ−ベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブトキシ−カルボニル、Ｆｍｏｃ、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
適切な側鎖保護基は、アセチル、アリル（Ａｌｌ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）；ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル；２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）、イソプロピル、４−メトキシ−２，３，６−トリメトキシベンジルスルホニル（Ｍｔｒ）、２，３，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル（Ｔｏｓ）、２，４，６−トリメトキシベンジル、トリメチルシリル、及びトリチル（Ｔｒｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。固相合成では、Ｃ末端アミノ酸は好適な支持体材料に結合される。好適な支持体材料は、合成工程の段階的凝縮及び切断反応のための試薬ならびに反応条件に対して不活性であるもの、ならびに使用される反応媒質に溶解しないものである。市販の支持体材料の例としては、反応基で改変され得るスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、及び／または、ポリエチレングリコール；クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー；ヒドロキシメチル化またはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーなどが挙げられる。
【０１４３】
ペプチド酸の調製が望ましいとき、ポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼン、または４−ベンジルオキシベンジル−アルコールで誘導体化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）（Ｗａｎｇ−アンカー）、または２−クロロトリチルクロリドを使用できる。ペプチドアミドの場合、ポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼン、または５−（４’−アミノメチル）−３’，５’−ジメトキシフェノキシ）吉草酸（ＰＡＬ−アンカ−）もしくはｐ−（２，４−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシ基（Ｒｉｎｋアミドアンカー）で誘導化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）を使用できる。
【０１４４】
ポリマー支持体への連結は、室温または高温（例えば４０℃〜６０℃）で、例えば２〜７２時間の反応時間で、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、または類似する溶媒中の活性化試薬を添加することにより、Ｃ末端Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を支持体材料と反応させることにより達成され得る。
【０１４５】
Ｎα保護アミノ酸（例えばＦｍｏｃアミノ酸）のＰＡＬ、ＷａｎｇまたはＲｉｎｋアンカーへのカップリングは、例えばＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または他のカルボジイミド；２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）または他のウロニウム塩；Ｏ−アシル−尿素；ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）または他のホスホニウム塩；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；他のＮ−ヒドロキシイミドもしくはオキシムなどのカップリング剤を使用して、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールもしくは１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの存在下または非存在下で；例えばＨＯＢｔを加えたＴＢＴＵを使用して；例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミンもしくはＮ−メチルモルホリンなどの塩基を添加してまたは添加しないで；例えばジイソプロピルエチルアミンで反応時間２〜７２時間で（例えばアミノ酸及びカップリング剤の１．５倍〜３倍超で、例えば２倍超で、３時間、約１０℃〜５０℃の温度で、例えば２５℃で、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、またはジクロロメタン、例えばジメチルホルムアミドなどの溶媒中で）実施できる。
【０１４６】
カップリング剤の代わりに、活性エステル（例えば、ペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニルなど）、Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸の対称無水物、その酸クロリドまたは酸フルオリドを上記の条件下で使用することも可能である。
【０１４７】
Ｎα保護アミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）は、ＤＩＥＡを添加したジクロロメタン中の２−クロロトリチル樹脂に、１０〜１２０分の反応時間で、例えば２０分間で、この溶媒及びこの塩基の使用を限定せずにカップリングできる。
【０１４８】
保護アミノ酸の連続カップリングは、ペプチド合成の従来の方法に従い、通常は自動ペプチド合成装置で実行され得る。例えばジメチルホルムアミド中のピペリジン（１０％〜５０％）で５〜２０分、例えばＤＭＦ中の５０％のピペリジンで２×２分、及びＤＭＦ中の２０％のペリジンで１×１５分処理することによる、固相上に結合されたアミノ酸のＮα−Ｆｍｏｃ保護基の切断後、３〜１０倍超、例えば１０倍超の次の保護されたアミノ酸が、約１０℃〜５０℃、例えば２５℃の温度で、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはその２つの混合物などの不活性で非水性の極性溶媒中で前のアミノ酸にカップリングされる。第１のＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸をＰＡＬ、ＷａｎｇまたはＲｉｎｋアンカーへカップリングするための前述の試薬は、カップリング剤として適している。保護アミノ酸の活性エステルまたはクロリドまたはフルオリドまたはその対称無水物も、代替物として使用することができる。
【０１４９】
固相合成の終了時に、ペプチドは支持体材料から切断され、同時に側鎖保護基を切断する。切断は、トリフルオロ酢酸または他の強酸性の媒体をジメチルスルフィド、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ−クレゾール、アニソール、エタンジチオール、フェノールまたは水などの５％〜２０％Ｖ／Ｖのスカベンジャーを加えて、例えば１５％Ｖ／Ｖのジメチルスルフィド／エタンジチオール／ｍ−クレゾール１：１：１で、０．５〜３時間で、例えば２時間で実施することができる。完全に保護された側鎖を有するペプチドは、氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン２：２：６で、２−クロロトリチルアンカーを切断することにより得られる。保護されたペプチドは、シリカゲル上のクロマトグラフィーにより精製することができる。ペプチドがＷａｎｇアンカーを介して固相に連結される場合、及びＣ末端アルキルアミド化によってペプチドを得ることが意図される場合、切断はアルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンを用いたアミノ分解によって実行され得る。アミノ分解は、約１２〜２４時間（例えば、約１８時間）の反応時間で、約−１０℃〜５０℃の温度（例えば、約２５℃）で実施する。更にペプチドを、例えばメタノールで再エステル化することにより、支持体から切断することができる。
【０１５０】
ペプチドを沈殿させ、したがってエーテルに残存するスカベンジャー及び切断された保護基を分離するために、得られた酸性溶液は、３〜２０倍量の氷エーテルまたはｎ−ヘキサン、例えば１０倍超のジエチルエーテルと混合され得る。更なる精製は、氷酢酸からペプチドを数回再沈殿させることによって行うことができる。得られた沈殿物は、水もしくはｔｅｒｔ−ブタノールまたはその２つの溶媒の混合物、例えばｔｅｒｔ−ブタノール／水の１：１の混合物に取り込んで、凍結乾燥され得る。
【０１５１】
得られたペプチドは、酢酸形態中で弱塩基性樹脂のイオン交換を含む、下記の様々なクロマトグラフィー法：非誘導体化ポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ）上の疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲル上の吸着クロマトグラフィー；例えばカルボキシメチルセルロース上のイオン交換クロマトグラフィー；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５上の分配クロマトグラフィー；遠心向流分配クロマトグラフィー；または例えばオクチルまたはオクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）相上の逆相ＨＰＬＣなどの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製することができた。
【０１５２】
組み換え産生物
ＩＬ−１５（例えばマウス及びヒトＩＬ−１５）は、本明細書に記載のものなど当該技術分野で既知の標準的技術を用いて多数の方法で合成することができる。ＩＬ−１５はウイルス起源であり得て、Ｅｐｓｔａｉｎ  Ｂａｒｒウイルス（ＢＣＲＦ１タンパク質）からクローニング及びウイルス性ＩＬ−１５の発現がＭｏｏｒｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：１２３０に開示されている。更に組み換えＩＬ−１５は、多くの供給原（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）及びＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））から市販されている。
【０１５３】
部位特異的突然変異（部位特異的突然変異誘発及びオリゴヌクレオチド特定的突然変異とも参照される）は、ＤＮＡに特異的突然変異を生成して、改善した望ましい特性を有する、本開示の合理的に設計されたタンパク質（例えば、特定のＩＬ−１５ムテイン及びそのドメインを含むＩＬ−１５の他の改変バージョン）を産生するために使用できる。部位特異的突然変異誘発のための技術は、当該技術分野で周知である。初期の部位特異的変異法（例えば、クンケル法；カセット変異導入法；ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発；及びＳＰＲＩＮＰを含む全プラスミド突然変異生成）は、Ｄｅｌｉｔｔｏ  ｐｅｒｆｅｔｔｏ（Ｓｔｏｒｉｃｉ  Ｆ．ａｎｄ  Ｒｅｓｎｉｃｋ  ＭＡ，（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ４０９：３２９−４５）；形質転換「ポップインポップアウト」；ＰＣＲ及び１つのリサイクル可能なマーカーによる直接遺伝子欠失及び部位特異的突然変異；長い相同領域を用いた、ＰＣＲ及び１つのリサイクル可能なマーカーによる直接遺伝子欠失及び部位特異的突然変異；及び合成オリゴヌクレオチドによる生体内部位特異的突然変異誘発（参照、例えば：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），２ｎｄＥｄ．ＩＳＢＮ９７８−０８９６０３９１００）を含む様々な生体内方法などのより正確で効率的な方法により置き換えられる。更に部位特異的突然変異誘発を行うためのツールが市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））。
【０１５４】
ポリペプチドが組み換え技術を用いて産生される場合、ポリペプチドはそれぞれ任意の適切な構築物、及び細菌（例えば、大腸菌）などの原核細胞もしくは真核細胞であり得る、任意の適切な宿主細胞または酵母宿主細胞を用いて、細胞内タンパク質または分泌タンパク質として産生できる。宿主細胞として使用することができる真核細胞の他の例としては、昆虫細胞、哺乳類細胞及び／または植物細胞が含まれる。哺乳動物宿主細胞が使用される場合、それらは、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞）；マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞及びＣ１２７細胞）；霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１）；及びハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含んでもよい。
【０１５５】
ポリペプチドの発現に適した様々な宿主−ベクター系は、当該分野で公知の標準的な手順に従って使用することができる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９５Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを参照のこと。宿主細胞への遺伝物質の導入方法としては、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、接合、リン酸カルシウム法などを含む。導入されたポリペプチドをコード化する核酸の安定な発現を提供するように転換する方法が選択できる。ポリペプチドをコード化する核酸は、遺伝性エピソーム要素（例えば、プラスミド）として提供することができる、またはゲノム的に統合することができる。目的のポリペプチド産生に使用する種々の適切なベクターが市販されている。
【０１５６】
ベクターは、宿主細胞内の染色体外維持のために提供することができる、または宿主細胞ゲノムへの組み込みを提供することができる。発現ベクターは転写及び翻訳の調節配列を提供し、及び誘導的または構成的発現を提供することができ、コード領域は転写開始領域、転写及び翻訳終結領域の転写制御の元で作動可能に連結される。一般的に転写及び翻訳の調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含むが、これらに限定されない。プロモーターは構成的または誘導的のいずれかであり得て、強力な構成的プロモーター（例えば、Ｔ７）であり得る。
【０１５７】
発現構築物は一般的に、目的のタンパク質をコード化する核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の付近に配置される簡便な制限部位を有する。発現宿主で作動する選択マーカーは、ベクターを含む細胞の選択を容易にするために存在してもよい。更に発現構築物は、追加の要素を含んでもよい。例えば発現ベクターは１つまたは２つの複製系を有していてもよく、したがって、発現のために生物内で、例えば哺乳動物または昆虫細胞で、ならびにクローニング及び増幅のために原核生物宿主で維持することが可能である。更に発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。選択遺伝子は当該分野で公知であり、使用する宿主細胞により変化する。
【０１５８】
タンパク質の単離及び精製は、当該分野で公知の方法に従って行うことができる。例えばタンパク質は、構成的に及び／または誘導時にタンパク質を発現するように、遺伝的に改変された細胞の溶解物から、または免疫親和性の精製により合成反応混合物から単離することができ、それは一般的に、サンプルを抗タンパク質抗体と接触させ、非特異的に結合した物質を除去するために洗浄し、特異的に結合したタンパク質を溶出させることを含む。単離したタンパク質は更に、透析によって及びタンパク質精製に用いられる他の方法によって精製することができる。一実施形態でタンパク質は、金属キレートクロマトグラフィー法を用いて単離することができる。タンパク質は、単離を容易にするための改変を含んでもよい。
【０１５９】
ポリペプチドは、実質的に純粋な形態または単離された形態（例えば、他のポリペプチドを含まない）で調製され得る。ポリペプチドは、存在し得る他の成分に対して（例えば他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）、ポリペプチドが濃縮された組成物中に存在し得る。例えば精製されたポリペプチドは、ポリペプチドが他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物中に、例えば約９０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満または約１％未満存在するように提供され得る。
【０１６０】
ＩＬ−１５ポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドをコード化することができる構築物を提供するために、当該技術分野において既知の異なるＩＬ−１５関連核酸を操作する組み換え技術を用いて生成され得る。特定のアミノ酸配列が提供されるとき、当業者は、例えば個体の分子生物学の背景及び経験を考慮して、そのようなアミノ酸配列をコード化する様々な異なる核酸分子を認識することは理解されるであろう。
【０１６１】
アミド結合置換
いくつかの場合では、ＩＬ−１５はペプチド結合以外の１つ以上の連結を含み、例えば少なくとも２つの隣接するアミノ酸はアミド結合以外の連結を介して結合される。例えば、望ましくないタンパク質分解または分解の他の手段を低減もしくは排除するため、及び／または血清の安定性を増加させるために、及び／または骨格内の立体配座の柔軟性を制限もしくは増加させるために、ＩＬ−１５の主鎖内の１つ以上のアミド結合を置換できる。
【０１６２】
別の例では、ＩＬ−１５の１つ以上のアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−または−ＣＨ２ＳＯ−などのアミド結合のアイソスターである連結で置換され得る。ＩＬ−１５の１つ以上のアミド結合は、例えば減少したアイソスター偽ペプチド結合によっても置換され得る。Ｃｏｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１８１−１８４を参照のこと。そのような代替方法及びそれを達成する方法は、当業者には既知である。
【０１６３】
アミノ酸置換
１つ以上のアミノ酸置換は、ＩＬ−１５ポリペプチド内で行われる。下記は非限定的な例である。
【０１６４】
ａ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、（Ｓ）−２−アミノ酪酸、（Ｓ）−シクロヘキシルアラニン、または分枝状、環状及び直鎖状アルキル、アルケニルもしくはアルキニル置換を含むＣ１〜Ｃ１０炭素からの脂肪族側鎖により置換された他の単純なアルファ−アミノ酸置換を含む、アルキル置換の疎水性アミノ酸の置換。
【０１６５】
ｂ）フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含む、芳香族置換された疎水性アミノ酸の置換であり、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）または上述の芳香族アミノ酸のアルコキシ置換型（Ｃ１〜Ｃ４）を含み、その代表例としては、２−、３−または４−アミノフェニルアラニン、２−、３−または４−クロロフェニルアラニン、２−、３−または４−メチルフェニルアラニン、２−、３−または４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−または５−メトキシトリプトファン、２’−、３’−または４’−アミノ−、２’−、３’−または４’−クロロ−、２−、３−または４−ビフェニルアラニン、２’−、３’−または４’−メチル−、２−、３−または４−ビフェニルアラニン，及び２−または３−ピリジルアラニンがある。
【０１６６】
ｃ）置換基がヘテロ原子（アルファ窒素または遠位窒素または窒素など）上、または例えばプロＲ位置のアルファ炭素上にあるかに関わらず、前述のアミノ酸のアルキル、アルケニルまたはアリール置換された（Ｃ１〜Ｃ１０分枝状、直線状もしくは環状からの）誘導体を含む、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含む、塩基性側鎖を含有するアミノ酸の置換。代表的例として機能する化合物は、Ｎ−イプシロン−イソプロピル−リジン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ，Ｎ−ガンマ,ガンマ’−ジエチル−ホモアルギニンを含む。アルファ−メチルアルギニン、αアルファ−メチル−２，３−ジミアノプロピオン酸、アルファ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルオルニチンなどの化合物も含まれ、アルキル基はアルファ−炭素のプロＲ位を占める。アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ここでヘテロ芳香族基は、１つ以上の窒素、酸素もしくは硫黄原子を単独でまたは組み合わせて有する）、カルボン酸、または酸クロリド、活性エステル、活性アゾリド及び関連誘導体ならびにリシン、オルニチンもしくは２，３−ジアミノプロピオン酸などの多くの公知の活性化誘導体のいずれかも、含まれる。
【０１６７】
ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、アルキル、アリール、アリールアルキル、及び２，４−ジアミノプロピオン酸、オルニチンまたはリジンのヘテロアリールスルホンアミド、ならびにテトラゾール置換したアルキルアミノ酸を含む、酸性アミノ酸の置換。
【０１６８】
ｅ）アスパラギン、グルタミン、及びアスパラギンもしくはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む側鎖アミド残基の置換。
【０１６９】
ｆ）セリン、トレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、及びセリンもしくはトレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む、ヒドロキシル含有アミノ酸の置換。
【０１７０】
いくつかの場合では、ＩＬ−１５は、アミノ酸の１つ以上の天然起源の非遺伝的にコード化されるＬ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸またはＤ−エナンチオマーを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５はＤ−アミノ酸のみを含む。例えばＩＬ−１５ポリペプチドは、下記の残基：ヒドロキシプロリン、β−アラニン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノメチル安息香酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリシン、２，４−ジアミノ酪酸、ロー−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘプタン酸、ω−アミノオクタン酸、ω−アミノデカン酸、ω−アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、δ−アミノ吉草酸、２，３−ジアミノ酪酸のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１７１】
追加の改変
システイン残基またはシステイン類似体は、ジスルフィド結合を介して別のペプチドに結合を提供するために、またはＩＬ−１５ポリペプチドの環化を提供するために、ＩＬ−１５ポリペプチドに導入され得る。システインまたはシステイン類似体を導入する方法は、当該技術分野で既知である（例えば米国特許第８，０６７，５３２号を参照）。環化の他の手段は、オキシムリンカーまたはランチオニンリンカーの導入を含む。例えば米国特許第８，０４４，１７５号を参照。環化結合を形成することができるアミノ酸（または非アミノ酸部分）の任意の組み合わせが使用される、及び／または導入することができる。環化結合は、アミノ酸（またはアミノ酸と−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−もしくは−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ−）と、架橋の導入を可能にする官能基との任意の組み合わせを用いて生成することができる。いくつかの例は、ジスルフィド、ジスルフィド模倣体（例えば−（ＣＨ２）ｎ−カルバ架橋、チオアセタール、チオエーテル架橋（シスタチオニンまたはランチオニン））ならびにエステル及びエーテルを含有する架橋である。これらの例では、ｎは任意の整数であり得るが、往々にして１０未満である。
【０１７２】
他の改変は、例えばＮ−アルキル（またはアリール）置換（Ψ［ＣＯＮＲ］）、またはラクタム及び他の環状構造を構築するための骨格架橋を含む。他の誘導体は、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、ｏ−修飾誘導体（例えば、Ｃ−末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）誘導体；アルキルアミド及びヒドラジドなどの置換アミドを含むＮ−末端修飾誘導体を含む。
【０１７３】
場合によっては、ＩＬ−１５ポリペプチドの１つ以上のＬ−アミノ酸は、１つ以上のＤ−アミノ酸で置換される。
【０１７４】
場合によっては、ＩＬ−１５ポリペプチドポリペプチドは、レトロインベルソ類似体である（例えばＳｅｌａ  ａｎｄ  Ｚｉｓｍａｎ（１９９７）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：４４９参照）。レトロインベルソペプチド類似体は線状ポリペプチドの異性体であり、そのアミノ酸配列の方向は逆転し（レトロ）、例えばＬ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を用いて、内部の１つ以上のアミノ酸のキラリティ、Ｄ体もしくはＬ体が反転した（インベルソ）［例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８：７４４；及びＢｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８：６９２参照］。
【０１７５】
ＩＬ−１５ポリペプチドは「タンパク質導入ドメイン」（ＰＴＤ）を含むことができ、それは、脂質二層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜もしくは小胞膜を横断することを支援する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物または有機もしくは無機分子を意味する。別の分子に結合したＰＴＤは、細胞外空間から細胞内空間へ、またはオルガネラ内の細胞質ゾルへ行くために、膜を横断する分子を支援する。いくつかの実施形態においては、ＰＴＤはＩＬ−１５ポリペプチドのアミノ末端に共有結合するが、一方他の実施形態においては、ＰＴＤはＩＬ−１５ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合する。代表的なタンパク質形質導入ドメインとしては、最小のウンデカペプチドタンパク質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１１を含むＨＩＶ−１ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞内に直接組み入れるのに十分なアルギニン残基の数を含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０〜５０アルギニン）；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）；ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン；（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５２（７）：１７３２−１７３７）；切断されたヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ２１：１２４８−１２５６）；ポリリシン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１３００３−１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号７）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号８）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号９）；及び、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０）を含むが、これらに限定されない。代表的なＰＴＤは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）；ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１２）；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーを含むがこれらに限定されない。代表的なＰＴＤドメインアミノ酸配列は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１４）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１５）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１６）；及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１７）のいずれかを含むが、これらに限定されない。
【０１７６】
ＩＬ−１５ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基ＣＯＲ３は、遊離形態（Ｒ３＝ＯＨ）で、または生理学的に耐性のある、例えばナトリウム、カリウムもしくはカルシウム塩などアルカリもしくはアルカリ土類塩の形態などで存在することができる。カルボキシル基は、例えばメタノール、分枝状もしくは非分枝状Ｃ１〜Ｃ６アルキルアルコール、例えばエチルアルコールもしくはｔｅｒｔ−ブタノールなどの１級、２級または３級アルコールでエステル化もされ得る。カルボキシル基は、アンモニア、分枝状もしくは非分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキルアミン、またはＣ１〜Ｃ６ジアルキルアミン、例えばメチルアミンまたはジメチルアミンなどの１級または２級アミンでアミド化もできる。
【０１７７】
ＩＬ−１５ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸ＮＲ１Ｒ２のアミノ基は、遊離形態（Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝Ｈ）で、または例えば塩化物もしくは酢酸塩などの生理学的に許容される塩の形態で存在し得る。アミノ基は、Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝アセチル、トリフルオロアセチルまたはアダマンチルであるように、酸でアセチル化もされ得る。アミノ基は、上記で提供されるものなどペプチド化学で従来より使用されているアミノ保護基で保護された形態でも存在し得る（例えば、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシ−カルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、及びＡｌｌｏｃ）。アミノ基はＮ−アルキル化されることができ、Ｒ１及び／またはＲ２＝Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはＣ２〜Ｃ８アルケニルもしくはＣ７〜Ｃ９アラルキルである。アルキル残基は、直鎖、分枝状または環状（例えばそれぞれエチル、イソプロピル及びシクロヘキシル）であり得る。
【０１７８】
ＩＬ−１５機能を増強する及び／または模倣するための特定の修飾
本明細書に開示された治療法（例えば、ＩＬ−１５ムテイン）及び／またはそれらを投与する方法における１つ以上の物理的特性を向上させることは、しばしば有益であり、時には必須である。物理的特性の改善は、例えば免疫原性を調節すること；水溶解性、バイオアベイラビリティ、血清半減期及び／もしくは治療半減期、ならびに／または生物学的活性を増加する方法を含む。特定の改変は、例えば検出アッセイ（例えばエピトープタグ）で使用するための抗体を産生するために、及びタンパク質精製の容易性を提供するためにも有用であり得る。このような改変は一般的に、治療モダリティの生物活性に悪影響を与えることなく（もしくは名目上与えることなく）、及び／またはその免疫原性を増大させることなく付与される必要がある。
【０１７９】
ＩＬ−１５のＰＥＧ化は、本開示により想到される特定の一改変であり、一方他の改変は、グリコシル化（Ｎ−及びＯ−結合）；ポリシリル化；血清アルブミンを含むアルブミン融合分子（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、シアノ血清アルブミンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））；例えば共役型脂肪酸鎖によるアルブミン結合（アシル化）；及び、Ｆｃ融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。更にＰＥＧ模倣体は、本明細書で意図する他の薬物を表す。
【０１８０】
ＰＥＧ化：タンパク質治療薬の臨床効果は、短い血漿半減期及びプロテアーゼ分解を受けやすいことにより制限されることが多い。このような困難性が、非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールもしくはポリオキシアルキレンの多様なポリペプチド配列のいずれかと共役化し、または連結することを含む、様々な改変により克服され得ることを、様々な治療用タンパク質の研究は示している。これは、タンパク質及び非タンパク質ポリマー、例えばＰＥＧの両方に共有結合された連結部分によりしばしば行われる。このようなＰＥＧ共役型生体分子は、良好な物理的及び熱的安定性、酵素分解の感受性に対する保護、増大した溶解性、長い生体内循環半減期及び低下したクリアランス、低下した免疫原性及び抗原性、ならびに低下した毒性を含む、臨床的に有用な特性を有することが示される。
【０１８１】
ポリペプチド配列への共役化に適したＰＥＧは一般的に室温で水溶性であり、及び一般式Ｒ（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、式中Ｒは水素またはアルキルまたはアルカノール基などの保護基であり、ｎは１〜１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、それは一般的に１〜８つの炭素を有する。ポリペプチド配列に共役化したＰＥＧは、直鎖状または分枝状であり得る。分枝状ＰＥＧ誘導体、「スターＰＥＧ」及び多分岐ＰＥＧは、本開示により想到される。本開示で使用されるＰＥＧの分子量は、任意の特定の範囲に制限されていない。特定の実施形態は５ｋＤａ〜２０ｋＤａの間の分子量を有し、他の実施形態は４ｋＤａ〜１０ｋＤａの間の分子量を有する。追加の分子量を有するＰＥＧを記載する更なる実施形態は、本明細書の他の箇所に記載される。
【０１８２】
本開示は共役体の組成物も想到し、ＰＥＧは異なるｎ値を有し、したがって様々な異なるＰＥＧは特定の割合で存在する。例えばいくつかの組成物は共役体の混合物を含み、ここでｎ＝１、２、３及び４である。いくつかの組成物で共役体のパーセントは、ｎ＝１の場合１８〜２５％、ｎ＝２の場合５０〜６６％、ｎ＝３の場合１２〜１６％、ｎ＝４の場合最大５％である。このような組成物は、当該技術分野で既知の反応条件及び精製方法により産生できる。代表的な反応条件は、本明細書の至るところに記載されている。カチオン交換クロマトグラフィーは共役体を分離するために使用され、次に、例えば所望の数のＰＥＧが付着され、精製された共役体を含有し、非改変タンパク質配列及び他の数のＰＥＧが付着した共役体を含まないフラクションが同定される。
【０１８３】
ＰＥＧ化は最も頻繁に、ポリペプチドのＮ終端のアルファ−アミノ基、リシン残基の側鎖上のイプシロン−アミノ基、及びヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基で起こる。ほとんどの組み換えポリペプチドは単一のアルファ及び多数のイプシロンアミノならびにイミダゾール基を有しているので、多くの位置異性体はリンカー化学物質に応じて生成できる。当該分野で既知の一般的なＰＥＧ化計画を、本明細書で適用することができる。ＰＥＧは、ポリペプチド配列の１つ以上の遊離アミノ基またはカルボキシル基とポリエチレングリコールの間の結合を媒介する末端反応性基（「スペーサー」）を介して、本開示のポリペプチドに結合することができる。遊離アミノ基に結合し得るスペーサーを有するＰＥＧは、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシニルイミドで活性化させることにより調製され得る、Ｎ−ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールを含む。遊離アミノ基に結合され得る別の活性化されたポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを塩化シアヌルと反応させることにより調製され得る、２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンである。遊離のカルボキシル基に結合する活性化ポリエチレングリコールは、ポリオキシエチレンジアミンを含む。
【０１８４】
スペーサーを有するＰＥＧへの本開示のポリペプチド配列のうちの１つ以上の共役化は、様々な従来の方法により実行され得る。例えば共役化反応は、ｐＨ５〜１０の溶媒中、４℃〜室温の温度、３０分〜２０時間、タンパク質対試薬のモル比が４：１〜３０：１で実施できる。反応条件は、主に望ましい程度の置換を産生するように、反応を誘導することを選択できる。一般に、低温、低ｐＨ（例えばｐＨ＝５）及び短い反応時間は、接合されるＰＥＧの数を減少させる傾向があり、一方、高温、中性〜高ｐＨ（例えばｐＨ≧７）及び長い反応時間は、共役化されるＰＥＧの数を増加させる傾向がある。当該技術分野で既知の種々の手段は、反応を停止するために使用できる。いくつかの実施形態では、反応は、反応混合物を酸性化し、かつ例えば−２０℃で凍結することにより停止する。種々の分子のＰＥＧ化は、例えば米国特許第５，２５２，７１４号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号及び同第５，９８５，２６３号に記載されている。
【０１８５】
上述したようにＰＥＧ化は最も頻繁に、Ｎ末端、リシン残基の側鎖及びヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基で起こる。このようなＰＥＧ化の有用性は、例えば反応条件の最適化及び精製工程の改善による精密化で強化される。最近の残基特異的化学反応は、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、セリン、トレオニン及びチロシン、ならびにカルボキシ末端のＰＥＧ化を可能にする。このいくつかのアミノ酸残基は特異的にＰＥＧ化できるが、他はより無差別的である、または特定の条件下で部位特異的ＰＥＧ化のみをもたらす。
【０１８６】
追加のアミノ酸残基のＰＥＧ化を可能にする現在のアプローチは、架橋ＰＥＧ化（ジスルフィド架橋）、酵素ＰＥＧ化（グルタミン及びＣ末端）及びグリコＰＥＧ化（Ｏ−及びＮ−グリコシル化部位、または糖タンパク質のグリカン）、ならびにヘテロ二機能性ＰＥＧ化を含む。更なるアプローチは、非天然アミノ酸を含むタンパク質のＰＥＧ化、Ｃ末端ＰＥＧ化のためのインテイン融合タンパク質、トランスグルタミナーゼ介在ＰＥＧ化、ソルターゼＡ介在ＰＥＧ化及び分離可能かつ非共有結合ＰＥＧ化が示される。更に遺伝子工学技術を用いた特定のＰＥＧ化アプローチの組み合わせは、例えば直交する反応基を含有する天然または非天然アミノ酸とポリペプチドの特定のアミノ酸残基との置換によって、ポリエチレングリカンポリマーがタンパク質表面の任意の位置に本質的にカップリングすることを可能にする。一般的に例えば、Ｐａｓｕｔ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．，（２０１２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ１６１：４６１−７２；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．６４：１１６−２７；Ｊｅｖｓｅｖａｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．５：１１３−２８；及びＹｏｓｈｉｏｋａ，Ｙ．（２０１１）Ｃｈｅｍ．Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｊ．５：２５を参照のこと。
【０１８７】
ＰＥＧ化分子の治療上の価値は十分に検証されている。以前の及び／または現在の医薬品は、ＯＭＯＮＴＹＳ（Ａｆｆｙｍａｘ／Ｔａｋｅｄａ）；ＰＥＧＬＯＴＩＣＡＳＥ（Ｓａｖｉｅｎｔ）；ＣＩＭＺＩＡ（Ｎｅｋｔａｒ／ＵＣＢ  Ｐｈａｒｍａ）；ＭＡＣＵＧＥＮ（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＮＥＵＬＡＳＴＡ（Ａｍｇｅｎ）；ＳＯＭＡＶＥＲＴ（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒｏｃｈｅ）；ＤＯＸＩＬ（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）を含む。
【０１８８】
本開示はＰＥＧ模倣体の使用も想到する。いくつかの追加の有利な性質を付与する一方で、ＰＥＧの特質（例えば強化された血清半減期）を保持する組み換えＰＥＧ模倣体が開発された。一例として、ＰＥＧに類似する伸長した立体構造を形成することができる単純なポリペプチド鎖（例えばＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒを含む）は、既に目的のペプチドまたはタンパク質薬物に融合された状態で、組み換えにより産生され得る（例えばＡｍｕｎｉｘ’ＸＴＥＮ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ））。これは、製造過程中に更なる共役化工程の必要性を取り除く。更に確立された分子生物学技術は、ポリペプチド鎖の側鎖組成の制御を可能にし、免疫原性及び製造特性の最適化を可能にする。
【０１８９】
グリコシル化：本開示の目的のため、「グリコシル化」は、グリカンをタンパク質、脂質または他の有機分子に結合する酵素プロセスを広く指すことを意味する。
【０１９０】
本開示と関連した用語「グリコシル化」の使用は一般的に、１つ以上の炭水化物部分を付加する、もしくは欠失させる（潜在するグリコシル化部位を除去することによる、または化学及び／もしくは酵素手段によりグリコシル化を欠失させることによる）、ならびに／または天然配列に存在しても存在しなくてもよい１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することが意図される。更に前記語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質及び比率の変化を含有する、天然タンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。
【０１９１】
グリコシル化はＩＬ−１５などのポリペプチドの物理的性質（例えば溶解度）に劇的に影響を与える可能性があり、タンパク質の安定性、分泌及び細胞内局在性にも重要であり得る。グリコシル化ポリペプチドは更に、強化された安定性を示すことができる、または半減期など１つ以上の薬物動態特性を改善することができる。更に溶解度の改善は例えば、非グリコシル化ポリペプチドを含む製剤よりも、医薬品投与でより適した製剤の生成を可能にすることができる。
【０１９２】
適切なグリコシル化は、生物活性に必須であり得る。実際、真核生物からのいくつかの遺伝子は、グリコシル化タンパク質の細胞過程を欠く細菌（例えば、Ｅ．Ｃｏｉl）で発現されるとき、それらのグリコシル化の欠失の理由により、ほとんどまたはまったく活性がなく回収されるタンパク質をもたらす。
【０１９３】
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変更することにより達成され得る。ポリペプチドの変更は例えば、１つ以上のセリンもしくはスレオニン残基（Ｏ−結合グリコシル化部位において）もしくはアスパラギン残基（Ｎ−結合グリコシル化部位において）の付加、またはそれによる置換により行うことができる。各種類に見られるＮ−結合及びＯ−結合オリゴ糖及び糖残基の構造は、異なってもよい。両方に一般的に見られる糖の１つの種類は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以後シアル酸と称する）である。シアル酸は通常Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負の電荷により、糖タンパク質に酸性の性質を付与することができる。本開示の特定の実施形態は、Ｎ−グリコシル化変異体の生成及び使用を含む。
【０１９４】
本開示のポリペプチド配列は、核酸レベルでの変化を通じて、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように予め選択された塩基でポリペプチドをコード化する核酸を突然変異させることにより、任意に変更することができる。ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学または酵素カップリングによる。炭水化物の除去は、化学的にもしくは酵素的に、またはグリコシル化されるアミノ酸残基をコード化するコドンの置換により達成され得る。化学的脱グリコシル化技法は公知であり、ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素切断は、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。
【０１９５】
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組み換え糖タンパク質の生成のために、一般的に使用される宿主細胞である。これらの細胞は酵素ベータ−ガラクトシドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現せず、したがってアルファ−２，６結合におけるシアル酸を、これらの細胞で生成された糖タンパク質のＮ−連結オリゴ糖に付加しない。
【０１９６】
ポリシアル化：本開示は、ポリシアル化の使用、ポリペプチドの安定性及び生体内薬物動態を改善するための、天然起源の生分解性α−（２→８）結合ポリシアル酸（「ＰＳＡ」）へのポリペプチドの共役化も想到する。ＰＳＡは、高度に親水性である生分解性、非毒性の天然ポリマーであり、血中においてその血清半減期を増加させる大きな見かけ上の分子量を付与する。更にペプチド及びタンパク質の治療薬の範囲のポリシアル化は、著しく減少したタンパク質分解、生体内活性の維持、ならびに免疫原性及び抗原性の減少をもたらした（例えば、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（２００５）３００（１−２）：１２５−３０を参照）。他の共役体（例えば、ＰＥＧ）による改変と同様に、部位特異的ポリシアル化の様々な技法が利用可能である（例えば、Ｔ．Ｌｉｎｄｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ１０８（１８）７３９７−７４０２（２０１１）を参照）。
【０１９７】
アルブミン融合：共役化のための追加の好適な成分及び分子としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミンが挙げられる。
【０１９８】
約２０日の血清半減期を有する成熟ＨＳＡ、５８５アミノ酸のポリペプチド（約６７ｋＤａ）は、膠質浸透血圧の維持、血液ｐＨならびに多数の内因性及び外因性リガンドの輸送及び分布を主に担う。タンパク質は３つの構造的に相同のドメイン（ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩ）を有し、ほぼ完全にアルファヘリックスの構造にあり、１７のジスルフィド架橋により高度に安定化される。アルブミンの３つの主要な薬物結合領域は、サブドメイン内の３つのドメインＩＢ、ＩＩＡ及びＩＩＩＡの各々に位置する。
【０１９９】
アルブミン合成は肝臓で行われ、これは短寿命の一次産物であるプレプロアルブミンを生成する。したがって完全長のＨＳＡは、１８つのアミノ酸（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ；配列番号４０）のシグナルペプチド、続いて６つのアミノ酸のプロドメイン（ＲＧＶＦＲＲ；配列番号４１）を有し、この２４アミノ酸残基はプレ−プロドメインと称され得る。ＨＳＡは、プレ−プロドメインとしてのその内因性シグナルペプチドを用いて、発現かつ分泌することができる。あるいはＨＳＡは、成熟構築物に融合したＩｇＫシグナルペプチドを用いて、発現かつ分泌することができる。プレプロアルブミンは、そのアミノ末端で、小胞体内腔において素早く共翻訳的に切断されて、安定した６０９アミノ酸前駆体ポリペプチド、プロアルブミンを生成する。次いでプロアルブミンはゴルジ装置へと通過し、ここでそれはフーリン依存性アミノ末端切断により、５８５アミノ酸成熟アルブミンに変換される。
【０２００】
アルブミンの一次アミノ酸配列、構造及び機能は、アルブミン合成及び分泌のプロセスであるために、種にわたり高度に保存される。ＨＳＡと同等のアルブミン血清タンパク質は、例えばカニクイザル、ウシ、イヌ、ウサギ及びラットに見出される。非ヒト種のうち、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はＨＳＡに最も構造的に類似している（例えばＫｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｖ２００７Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９６（１１）：３１１７−２４参照）。本開示は、例えば薬物開発プロセスにおいて上に記載されるものを含むが、これらに限定されない、非ヒト種からのアルブミンの使用を想定する。
【０２０１】
本開示によると、アルブミンは、薬物分子（例えば、本明細書に記載されるポリペプチド）のカルボキシル末端、アミノ末端、カルボキシル末端とアミノ末端の両方で、及び内部に共役化され得る（例えば、米国特許第５，８７６，９６９号及び米国特許第７，０５６，７０１号を参照されたい）。
【０２０２】
本開示により想定されるＨＳＡ−薬物分子共役体において、アルブミン分泌プレ配列及びその変異体、その断片及び変異体、ならびにＨＳＡ変異体などの様々な形態のアルブミンが使用され得る。そのような形態は概して、１つ以上の所望のアルブミン活性を有する。追加の実施形態では、本開示は、直接もしくは間接的にアルブミン、アルブミン断片、及びアルブミン変異体などに融合されるポリペプチド薬物分子を含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は非融合薬物分子よりも高い血漿安定性を有する、及び／または融合タンパク質は非融合薬物分子の治療活性を維持する。いくつかの実施形態では、間接的融合は、ペプチドリンカーまたはその改変された型などのリンカーによってもたらされる。
【０２０３】
細胞内切断は、例えばフーリンまたはカスパーゼによって酵素的に行われてもよい。細胞は低レベルのその内因性酵素を発現し、これは融合分子の一部分を細胞内で切断することができる。したがってポリペプチドのうちのいくつかは、ＨＳＡに共役化されずに細胞から分泌されるが、一方、他はＨＳＡを含む融合分子の形態で分泌される。本開示の実施形態は、様々なフーリン融合構築物の使用を想定する。例えば配列ＲＧＲＲ（配列番号１８）、ＲＫＲＫＫＲ（配列番号１９）、ＲＫＫＲ（配列番号２０）またはＲＲＲＫＫＲ（配列番号２１）を含む、構築物が設計されてもよい。
【０２０４】
本開示はまた、細胞外切断（生体外切断）を想定し、それにより融合分子は細胞から分泌され、精製に供され、次いで切断される。切断は、成熟ＩＬ−１５からＨＳＡ−リンカー複合体全体、またはＨＳＡ−リンカー複合体全体未満を解離し得ることが理解される。
【０２０５】
上述のように、本開示の１つ以上のポリペプチドへのアルブミンへの融合は、例えばＨＳＡをコード化する核酸、またはそのフラグメントが、１つ以上のポリペプチド配列をコード化する核酸に接合されるように遺伝子操作で実施できる。その後、好適な宿主は、融合ポリペプチドを発現するように、例えば好適なプラスミドの形態の融合されたヌクレオチド配列で形質転換される、またはそれを遺伝子導入され得る。発現は、例えば原核細胞もしくは真核細胞から試験管内で、または例えば遺伝子導入生物から生体内でもたらされ得る。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質の発現は、哺乳動物細胞株、例えばＣＨＯ細胞株において実施される。形質転換は、外因性の遺伝的物質（外因性核酸）の細胞膜を通過する直接的な取り込み、組み込み及び発現によって生じる、細胞の遺伝子変異を指すように本明細書において広く使用される。形質転換はいくつかの細菌において天然に生じるが、他の細胞において人工的な手段によってももたらされ得る。
【０２０６】
更にアルブミン自体は、その循環半減期を延長するように改変され得る。改変アルブミンのＩＬ−１５への融合は、上述の遺伝的操作法により、または化学的共役化により達成され得、得られた融合分子は非改変アルブミンとの融合物の半減期を超える半減期を有する（ＷＯ２０１１／０５１４８９号参照）。
【０２０７】
代替的なアルブミン結合戦略：いくつかのアルブミン結合方法が、共役型脂肪酸鎖を介したアルブミン結合（アシル化）を含む、直接融合の代替物として開発されている。血清アルブミンは脂肪酸の輸送タンパク質であるため、アルブミン結合活性を有するこれらの天然リガンドは、小タンパク質治療薬の半減期の延長に使用されている。例えば、承認された糖尿病の製品であるインスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ）は、遺伝的に改変されたインスリンに共役化したミリスチル鎖を含み、長期作用インスリン類似体をもたらす。
【０２０８】
本開示は、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチド配列、及び本明細書に記載されるポリペプチドの１つ以上の配列を含む、融合タンパク質を想定する。文献に記載されるいずれのＡＢＤポリペプチド配列も、融合タンパク質の成分であり得る。融合タンパク質の成分は所望により、本明細書に記載されるそれらのリンカーなどのリンカーを介して、共有結合させることができる。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてのＡＢＤポリペプチド配列、及びＣ末端部分としての本明細書に記載されるポリペプチドを含む。
【０２０９】
本開示はまた、アルブミン結合ポリペプチドの断片を含む融合タンパク質を想定し、断片は、実質的に、アルブミン結合を維持する、または単量体単位としての少なくとも２つのアルブミン結合ポリペプチドもしくはそれらの断片を含む、アルブミン結合ポリペプチドもしくはそれらの断片の多量体を維持する。ＡＢＤ及び関連技術の一般考察に関しては、ＷＯ２０１２／０５０９２３号、ＷＯ２０１２／０５０９３０号、ＷＯ２０１２／００４３８４号、及びＷＯ２００９／０１６０４３号を参照されたい。
【０２１０】
他の分子との共役化：共役化のための追加の好適な成分及び分子は、例えば、チログロブリン；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ポリアミノ酸（ポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）など）；ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド；インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルスヌクレオタンパク質；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；ならびにＢ型肝炎コアタンパク質及び表面抗原、または前述の任意の組み合わせを含む。
【０２１１】
したがって本開示は、別のポリペプチド（例えば、対象ポリペプチドとは異種であるアミノ酸配列を有するポリペプチド）などのポリペプチド配列のＮ末端及び／もしくはＣ末端での、１つ以上の追加の成分もしくは分子、または担体分子の共役体を想定する。したがって代表的なポリペプチド配列は、別の成分または分子との共役体として提供できる。
【０２１２】
共役体改変は、第２の分子に由来する更なるもしくは相補的な機能または活性を伴う活性を維持するポリペプチド配列をもたらすことができる。例えばポリペプチド配列は、例えば溶解度、貯蔵、生体内もしくは保存半減期または安定性、免疫原性の減少、遅延または制御された生体内放出などを促進するように、分子に共役化されてもよい。他の機能または活性は、非接合ポリペプチド配列に対して毒性を減少させる体、非共役化ポリペプチド配列より効率的な種類の細胞もしくは器官を標的とする共役体、または本明細書に記載される疾患、障害もしくは状態（例えば、癌）に関連する原因もしくは作用に更に対抗する薬物を含む。
【０２１３】
ＩＬ−１５ポリペプチドは、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロースまたはセルロースビーズなどの多糖；ポリグルタミン酸またはポリリジンなどのポリマー性アミノ酸；アミノ酸コポリマー；不活性化されたウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラまたはロイコトキシン分子からのトキソイドなどの不活性化された細菌性毒素；不活性化された細菌；及び樹状細胞などの、大きくゆっくり代謝される巨大分子にも共役化され得る。このような共役化した形態は、所望する場合、本開示のポリペプチドに対して抗体を生成するように使用され得る。
【０２１４】
共役化のための追加の候補成分及び分子は、単離または精製に適したものを含む。特定の非限定的な例としては、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対）、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または固体支持体（例えば、プラスチックもしくはポリスチレンビーズ、プレート、磁気ビーズ、試験片及び膜を含む）を含む分子などの結合分子が挙げられる。
【０２１５】
カチオン交換クロマトグラフィーなどの精製方法は、共役体をそれらの様々な分子量に効率的に分離する電荷の差によって共役体を分離するために使用され得る。例えばカチオン交換カラムは、充填され、次に約２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ約４で洗浄され、次に約３〜５．５のｐＨ、例えばｐＨ約４．５で緩衝された（０Ｍ〜０．５Ｍ）ＮａＣｌの直線的勾配で溶出され得る。カチオン交換クロマトグラフィーによって得られた画分の内容物は、例えば質量分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの従来の方法、または分子量により分子実体を分離するための他の公知の方法を用いて、分子量により特定され得る。
【０２１６】
Ｆｃ融合分子：特定の実施形態では、本開示のポリペプチド配列のアミノ末端またはカルボキシル末端は、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ）と融合されて、融合共役体（または融合分子）を形成することができる。Ｆｃ融合共役体は、生物製剤の全身半減期を増加することが示され、よって、生物製剤製品は頻繁な投与をあまり必要としない可能性がある。Ｆｃは血管を覆う内皮細胞の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、結合によりＦｃ融合分子は分解から保護され、循環内に再放出され、分子をより長く循環内に保つ。このＦｃ結合は、内因性ＩｇＧがその長い血漿半減期を維持する機構であると考えられる。より最近のＦｃ融合技術は、従来のＦｃ融合共役体と比較して、生物薬剤の薬物動態及び薬力学の性質を最適化するために、生物薬剤の単一コピーを抗体のＦｃ領域に連結する。
【０２１７】
他の改変：本開示は、現在既知であるまたは将来開発される、１つ以上の性質を改善するためのＩＬ−１５の他の改変の使用を想定する。そのような１つの方法の、ポリペプチド配列の特性を改変するために、他の分子に連結されたヒドロキシエチルデンプン誘導体を利用するＨＥＳ化によるポリペプチド配列の改変を含む。ＨＥＳ化の様々な態様は、例えば米国特許出願第２００７／０１３４１９７号及び同第２００６／０２５８６０７号に記載されている。
【０２１８】
本開示は、融合タグとしての低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）を含む融合分子を想定する（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）。本明細書に記載されるポリペプチドのＳＵＭＯへの融合は、発現の増強、溶解度の改善及び／または精製方法の開発の支援を含む、いくつかの有益な効果をもたらし得る。ＳＵＭＯプロテアーゼはＳＵＭＯの３次構造を認識し、ＳＵＭＯのＣ末端で融合タンパク質を切断し、したがって所望のＮ末端アミノ酸を伴う本明細書に記載されるポリペプチドを放出する。
【０２１９】
本開示は、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（商標）（ＸＬ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧｍｂＨ（Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ））の使用も想到する。この技術は、タンパク質の治療生物活性に悪影響を及ぼすことなく、腎糸球体の孔径以上に目的のタンパク質の見かけの分子サイズを拡大させて、それによりタンパク質の腎クリアランスを低下させる。
【０２２０】
リンカー：リンカー及びその使用は上述してある。本開示のポリペプチド配列を改変するために使用される上述の成分及び分子のいずれも、リンカーを介して任意に共役化され得る。好適なリンカーは、改変されたポリペプチド配列と連結された成分及び分子との間のある程度の移動を可能にするのに一般的に十分な長さである「可動性リンカー」を含む。リンカー分子は一般的に、約６〜５０つの原子の長さである。リンカー分子はまた、例えばアリールアセチレン、２〜１０つのモノマー単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、アミノ酸、またはこれらの組み合わせであってもよい。適切なリンカーは容易に選択することができ、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０または５０超アミノ酸など任意の適切な長さであり得る。
【０２２１】
例示的な可動性リンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号２２）、ＧＧＧＳｎ（配列番号２３）、（ＧｍＳｏ）ｎ、（ＧｍＳｏＧｍ）ｎ、（ＧｍＳｏＧｍＳｏＧｍ）ｎ（配列番号：２４）、（ＧＳＧＧＳｍ）ｎ（配列番号２５）、（ＧＳＧＳｍＧ）ｎ（配列番号２６）及び（ＧＧＧＳｍ）ｎ（配列番号：２７）ならびにこれらの組み合わせであり、ここでｍ、ｎ及びｏは少なくとも１つの整数からそれぞれ選択される）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマーならびに他の可動性リンカーを含む。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは比較的構造不定であり、したがって成分間のニュートラルなテザーとして機能することができる。例示の可動性リンカーは、ＧＧＳＧ（配列番号２８）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２９）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３０）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３１）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３２）及びＧＳＳＳＧ（配列番号３３）を含むが、これらに限定されない。
【０２２２】
本開示の特定の実施形態において、ＰＥＧは、１つ以上のＰＥＧ分子に共有結合する活性化されたリンカーを介してＩＬ−１５に共役化している。化学的に反応し、ペプチドの反応基へ共有結合できる状態の場合、リンカーは「活性化」されている。１つ以上のＰＥＧ分子を収納し、適切な反応条件でアミノ酸残基と共有結合を形成することができる場合、本開示は任意の活性化リンカーの使用を意図する。特定の態様で活性化リンカーは、他の結合部位上に高度に選択的な方法でαアミノ基に結合する（例えば、リシンのε−アミノ基またはヒスチジンのイミノ基）。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、活性化ＰＥＧは、式：（ＰＥＧ）ｂ−Ｌ’で表されることができて、ここでＰＥＧはエーテル結合を形成するためにリンカーの炭素原子に共有結合し、ｂは１〜９であり（すなわち、１〜９つのＰＥＧ分子がリンカーに結合できる）、Ｌ’はＩＬ−１５へのＰＥＧの共有結合を提供するために、例えばアミノ酸残基上のアミノ基またはイミノ基と反応することができる反応基（活性化部分）を含むことができる。他の実施形態では、活性化リンカー（Ｌ’）は式ＲＣＨＯのアルデヒドを含み、Ｒは直鎖または分枝鎖のＣ１−１１のアルキル基であり、ＩＬ−１５へ活性化リンカーとの共有結合後、リンカーは２〜１２つの炭素原子を含む。本開示は、プロピオンアルデヒドが代表的な活性化リンカーである、実施形態を想到する。ＰＥＧプロピオンアルデヒド（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ）は、米国特許第５，２５２，７１４号に記載されており、市販品として入手可能である（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ））。他の活性化ＰＥＧリンカーは、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から市販品として入手することができる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、２つ以上のＰＥＧ分子をＩＬ−１５に共有結合することは望ましく、適切な活性化分枝状リンカー（すなわち「多分岐」）が使用できる。２つ以上のＰＥＧ分子をＩＬ−１５のアミノ酸残基上のアミノ基（例えばＮ末端のαアミノ基）へ共有結合する任意の好適な分枝状ＰＥＧリンカーを、使用できる。特定の実施形態では、本開示で想到される分枝状リンカーは、２つまたは３つのＰＥＧ分子を含む。一例として、分枝状ＰＥＧリンカーは、加水分解的に安定であり、かつ活性化部分を含む直鎖状または分枝鎖状の脂肪族基（例えば、アルデヒド基）であり得て、それは上述したとおりアミノ酸残基のアミノ基と反応し、分枝状リンカーの脂肪族基は２〜１２つの炭素を含むことができる。いくつかの実施形態において、脂肪族基は、例えば３つの炭素原子のそれぞれに３つのＰＥＧ分子（すなわち、合計９つのＰＥＧ分子）及びｔ−ブチルの４番目の炭素上に反応性アルデヒド部分を含む、ｔ−ブチルであり得る。
【０２２５】
更なる例示の分枝状ＰＥＧリンカーは、米国特許第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第７，０５２，８６８号、及び同第５，９３２，４６２号に記載されている。当業者は、例えば反応性アルデヒド部分の付加により、分枝状ＰＥＧリンカーへの改変を作製することができる。使用のためにリンカーを調製する方法も、当該技術分野で既知であり、例えば上述の米国特許に記載されている。
【０２２６】
治療的及び予防的使用
本開示は、疾患、障害及び／もしくは状態ならびに／またはその症状の広い範囲の治療または予防における本明細書に記載のＩＬ−１５ポリペプチド（例えばＰＥＧ−ＩＬ−１５）の使用を想到する。特定の用途を以下に詳細に記載するが、本開示はそのように限定されないことを理解すべきである。更に、特定の疾患、障害及び状態の一般的なカテゴリーを以下に記載するが、疾患、障害及び状態のいくつかは、２つ以上のカテゴリーに属することができ、他のものは開示されたカテゴリーのいずれかに属さない可能性がある。
【０２２７】
下記で更に詳述するように、ＩＬ−１５は、免疫及び炎症性の機能（例えば自己免疫関連した障害（例えばリウマチ性関節炎）、サルコイドーシス、炎症性腸疾患及び移植拒否）、癌（例えば白血病、リンパ増殖症候群及び固形腫瘍）ならびに感染症（例えばＨＩＶ）と関連した疾患、障害及び状態で役割を果たすことを示した。［例えばＦｅｈｎｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ９７（１）（Ｊａｎ１，２００１）参照］。
【０２２８】
免疫及び炎症状態：いくつかの実施形態では、本開示は、免疫系の抑制及び免疫関連の疾患、障害及び状態の治療を想到する。本明細書で使用される場合「免疫疾患」、「免疫状態」、「免疫障害」、「炎症性状態」、「炎症性障害」、「炎症性疾患」などの用語は、広く任意の免疫または炎症性に関連する状態（例えば、病理学的炎症及び自己免疫疾患）を包含することを意味する。そのような状態はしばしば、他の疾患、障害及び状態に密接に関連している。一例として、「免疫状態」は、免疫系による根絶に抵抗する感染症（急性及び慢性）、腫瘍ならびに癌を含む、癌、腫瘍ならびに脈管形成などの増殖状態を意味することができる。
【０２２９】
野生型ＩＬ−１５とＩＬ−１５受容体複合体の間の相互作用の結果として通常起きる、細胞事象のうちの１つ以上を阻害するのに効果的な量の投与を介して免疫機能を抑制するために、本明細書に記載のＩＬ−１５ペプチドを使用することができる。あるいは本明細書に記載のＩＬ−１５ペプチドをコード化する核酸分子または本明細書に記載のＩＬ−１５ペプチドを発現する組み換え細胞を、投与できる。特定の実施形態において、ＩＬ−１５ペプチドは、ＩＬ−１５受容体複合体を野生型ＩＬ−１５に類似する親和性で結合するが、細胞内シグナル伝達を活性化することができない。ＩＬ−１５ペプチドが効果的に野生型ＩＬ−１５と競合して、ＩＬ−１５シグナル伝達に反応して通常関連する事象を阻害することは、有利である。
【０２３０】
例えば炎症性サイトカインによって引き起こされ得る免疫及び炎症に関連する疾患、障害及び状態の非限定的リストは、関節炎（例えばリウマチ性関節炎）、サルコイドーシス、腎不全、ループス、喘息、乾癬、大腸炎、膵炎、アレルギー、線維症、手術合併症（例えば、炎症性サイトカインが治癒を妨げる場合）、貧血、及び線維筋痛症を含む。慢性炎症と関連し得る他の疾患及び障害は、アルツハイマー病、うっ血性心不全、脳卒中、大動脈弁狭窄症、動脈硬化症、骨粗しょう症、パーキンソン病、感染症、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、アレルギー性接触性皮膚炎及び他の湿疹、全身性硬化症、移植ならびに多発性硬化症を含む。ＩＬ−１５分子が特に有効であり得る（例えば、現在の治療法が限界であるため）上述の疾患、障害及び状態は、より詳細に下記に記載される。
【０２３１】
本開示のＩＬ−１５ポリペプチドは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療及び予防に特に有効であり得る。ＩＢＤはクローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含み、その両者は消化管の任意の部分に影響を与えることができる突発性慢性疾患であり、それは多くの好ましくない影響に関連し、長期のＵＣを患う患者は大腸癌を発症するリスクが高い。現在のＩＢＤの治療は炎症症状を制御することを目的とし、一方で特定の薬剤（例えば、コルチコステロイド、アミノサリチル酸及び標準免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン及びメトトレキサート））は限られた成功をもたらし、長期的な治療は、肝臓障害（例えば、線維症または肝硬変）及び骨髄抑制を引き起こす可能性があり、患者はしばしばそのような治療に抵抗性となり得る。
【０２３２】
乾癬、一連の一般的な免疫媒介性の慢性皮膚疾患は、米国では４５０万人以上の人々に影響を与え、そのうち、１５０万人が中等度から重症度の疾患を有していると考えられる。更に乾癬患者の１０％以上が乾癬性関節炎を発症し、それは関節周囲の骨及び結合組織に損傷を与える。乾癬の根本的な生理学的理解の向上は、例えば疾患の炎症性性質の原因となるＴリンパ球及びサイトカインの活性を標的とする薬剤の導入をもたらした。そのような薬剤は、ＥＮＢＲＥＬ（エタネルセプト）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（インフリキシマブ）及びＨＵＭＩＲＡ（アダリムマブ））などのＴＮＦ−α阻害剤（関節リウマチ（ＲＡ）の治療でも使用される）、ならびにＡＭＥＶＩＶＥ（アレファセプト）、ＲＡＰＴＩＶＡ（エファリズマブ）などのＴ細胞阻害剤を含む。これらの薬剤のいくつかは特定の患者集団である程度有効ではあるが、いずれもすべての患者を効果的に治療するためには示されない。
【０２３３】
一般的に関節の膜ライニング（滑膜）の慢性炎症を特徴とするリウマチ性関節炎（ＲＡ）は、米国人口の約１％（約２１０万人）に影響を与えている。炎症過程におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−１を含むサイトカインの役割の更なる理解は、新種の疾患改変性の抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の開発及び導入が可能になった。薬剤（いくつかは他の治療法と重複する）としては、ＥＮＢＲＥＬ（エタネルセプト）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（インフリキシマブ）、ＨＵＭＩＲＡ（アダリムマブ）及びＫＩＮＥＲＥＴ（アナキンラ）が挙げられる。これらの薬剤のいくつかは症状を緩和し、構造的損傷の進行を阻害し、特定の患者集団における身体機能を改善するが、有効性の改善、作用の補完機構、及びより少ない／少ない重篤な有害作用を有する代替薬の必要性が依然として存在する。
【０２３４】
器官及び組織の移植の拒絶反応は、特定の状況でＩＬ−１５関連成分に関係することがわかった。拒絶反応は、自然免疫応答の要素と共に、細胞性免疫及び体液性免疫により媒介される適応性免疫反応である。異種の移植臓器及び組織は、拒絶反応機能の異なるバランスをしばしば有する。腎臓、心臓、骨髄、皮膚及び血液は、最も頻繁に移植拒絶反応に関与する器官及び組織である。移植拒絶反応の治療は、拒絶反応（例えば、超急性、急性または慢性）の医学的カテゴリーによって多くの場合決定する。免疫抑制療法は、移植拒絶反応を治療する主要な手段を構成する。治療は一般的に、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）により開始される。併用療法は通常、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン及びタクロリムス）及び抗増殖剤（例えば、アザチオプリン）の添加を伴う。特定の免疫構成要素に特有の抗体は、免疫抑制療法に加えることが可能であり、抗体治療は、モノクローナル抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、ダクリズマブ）及びモノクローナル抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）を含む。多くの状況で有用であるが、ＩＬ−１５関連剤などの代替の治療物が必要である。
【０２３５】
現在の治療が症状を軽減するまたは障害の進行を遅らせるだけなので、多発性硬化症（ＭＳ）、脳及び脊髄のミエリンの炎症及び瘢痕の多数の領域を含む、重篤な衰弱性の自己免疫疾患を患う対象は特に本明細書に記載のＩＬ−１５ポリペプチドによって助けられることができる。
【０２３６】
ＩＬ−１５の高い血清レベルは、Ｃ型肝炎により誘発された肝疾患の間ならびに肝硬変及び慢性肝炎において観察される。ＩＬ−１５レベルは、肝細胞癌を患っている対象で特に上昇する。
【０２３７】
同様にＩＬ−１５ポリペプチドは、アルツハイマー病（ＡＤ）、患者の思考、記憶、及び言語処理を著しく損なう脳障害；ならびにパーキンソン病（ＰＤ）、例えば異常運動、硬直及び震えにより特徴付けられるＣＮＳの進行性疾患；などの神経変性障害、ならびに真性糖尿病に罹患している対象に対して特に有益であり得る。これらの障害は進行性かつ衰弱性であり、何の治療剤も使用できない。
【０２３８】
癌及び関連状態。本開示により、本明細書に記載のＩＬ−１５分子（例えば、ペプチド）は、ＩＬ−１５受容体を発現する細胞の望ましくない増殖がある対象を治療するために用いることができる。あるいは本明細書に記載のＩＬ−１５ペプチドをコード化する核酸分子または本明細書に記載のＩＬ−１５ペプチドを発現する組み換え細胞を、投与できる。ＩＬ−１５が抗増殖効果を及ぼす根底にある作用機序の理解は本開示を実践するのに必要ではないが、細胞増殖は補体依存性細胞溶解または抗体依存性細胞毒性により阻害されることができる。
【０２３９】
本明細書に記載のＩＬ−１５ペプチドは、癌、例えば子宮、子宮頸部、乳房、前立腺、精巣、消化管（例えば、食道、咽頭、胃、小腸もしくは大腸、結腸、もしくは直腸）、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳（例えば、グリオーマ）、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）、造血系の癌や免疫系（例えば、脾臓または胸腺）の癌を含む、増殖性状態もしくは疾患を治療または予防するために使用することができる。本開示は例えば、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、休眠腫瘍、ウイルス誘発性癌（例えば、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮癌及びパピローマウイルス）、腺癌、リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ））、細胞腫、黒色腫、白血病、骨髄腫、肉腫、奇形癌、化学的に誘発された癌、転移、及び血管形成を含む、他の癌関連の疾患、障害もしくは状態を治療または予防する方法も提供する。
【０２４０】
特定の実施形態では、腫瘍または癌は、大腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、または白血病（例えばＨＴＬＶ−１介在性成人Ｔ細胞白血病）である。癌関連疾患、障害及び状態の用語（複数を含む）の使用は、癌に直接または間接的に関連し、例えば脈管形成及び異形成などの前癌性状態を含む、幅広い状態を指すことを意味する。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、本開示は、増殖性状態、癌、腫瘍もしくは前癌性状態を、ＩＬ−１５分子及び少なくとも１つの追加の治療薬または診断薬、例えば本明細書の他の箇所で記載したもので、治療するための方法を提供する。
【０２４２】
ウイルス性及び細菌性状態。ウイルス性及び細菌性疾患、障害ならびに状態におけるＩＬ−１５の役割への関心が高まっている。ＩＬ−１５がその受容体結合活性及び他の因子に応じて、促進効果及び抑制効果の両方を生成することを想定している。
【０２４３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関して、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２の作用を模倣するその能力によって２つの矛盾する効果を有する。１つの効果は有益な可能性がある免疫機能の強化であり、一方で他の効果は有害な可能性があるＨＩＶ複製の活性化である。これらの対向する効果は、他のウイルス性関連障害にも存在する。緊密な時間相関が、ＩＬ−１５レベルとウイルス量の変動の間に観察された。本開示は、ＩＬ−１５による治療が有益であり得る、任意のウイルス性疾患、障害及び／もしくは状態の治療または予防におけるＩＬ−１５ポリペプチドの使用を想到する。想到するウイルス性疾患、障害及び状態の例には、エプスタインバールウイルス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が含まれる。
【０２４４】
ＩＬ−１５は最近、特定の細菌性及び他の侵襲性感染症と関連している。一例として報告は、例えばサルモネラ菌及び熱帯熱マラリア原虫によって生じる感染症の前に組み換えＩＬ−１５を投与することは、生物に対する防御及びそのクリアランスを改善することを示す。
【０２４５】
医薬組成物
本開示のＩＬ−１５ポリペプチドは、対象に投与するのに適した組成物の形態であり得る。一般にそのような組成物は、ＩＬ−１５及び１つ以上の薬学的に許容されるもしくは生理学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む「医薬組成物」である。特定の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチドは治療的に許容される量で存在する。医薬組成物は本開示の方法で使用されることができ、すなわち例えば医薬組成物は、本明細書に記載される治療法及び予防法ならびに使用を実践するために、生体外でまたは生体内で対象に投与され得る。
【０２４６】
本開示の医薬組成物は意図される投与方法または投与経路に適合するように製剤化され得て、例示的な投与経路は本明細書に記載される。更に医薬組成物は、本開示により想定される疾患、障害及び状態を治療するまたは予防するために、本明細書に記載される、他の治療的に有効な薬剤または化合物と組み合わせて使用され得る。
【０２４７】
医薬組成物は通常、治療に有効な量の本開示により想定されるＩＬ−１５ポリペプチドと、１つ以上の薬学的及び生理学的に許容される製剤用薬剤とを含む。好適な薬学的に許容されるもしくは生理学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸及び重硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルもしくはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート）、乳化剤、懸濁剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、洗剤、緩衝剤、ビヒクル、希釈剤及び／または補助剤を含むが、これらに限定されない。例えば好適なビヒクルは、生理食塩溶液またはクエン酸緩衝生理食塩水であってよく、可能であれば一般的に非経口投与用の医薬組成物に他の材料が補充される。更なる例示的なビヒクルは、中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水である。当業者は、本明細書で想到する医薬組成物及び投与形態に使用することができる様々な緩衝剤を容易に認識するだろう。通常の緩衝剤は、薬学的に許容される弱酸、弱塩基またこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。一例として緩衝剤の成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸及びそれらの塩などの水溶性材料であり得る。許容される緩衝剤は、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、及びＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）を含む。
【０２４８】
医薬組成物が製剤化された後、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体または無水もしくは凍結乾燥された粉末として減菌バイアルに保管され得る。そのような製剤は、すぐに使用できる形態、使用前に再構成を必要とする凍結乾燥形態、使用前に希釈を必要とする液体形態、または他の許容される形態のいずれかで保管され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回使用容器（例えば、単回使用バイアル、アンプル、シリンジまたは自動注射器（例えば、ＥｐｉＰｅｎ（登録商標）に類似）で提供され、一方、多回使用容器（例えば、多回使用バイアル）は他の実施形態において提供される。任意の薬物送達装置は、ＩＬ−１５を送達するために使用されることができ、移植片（例えば、移植可能なポンプ）ならびにカテーテル系、スロー注入ポンプ及び装置を含み、そのすべては当業者に周知である。一般的に皮下または筋肉内に投与されるデポ剤注射も、定義された期間にわたり、本明細書に開示されるポリペプチドを放出するために利用され得る。デポ剤注射は通常固系または油系のいずれかであり、本明細書に記載される製剤成分のうちの少なくとも１つを一般的に含む。当業者は、デポ剤注射の可能な製剤及び使用に精通している。
【０２４９】
医薬組成物は、減菌の注射可能な水性または油性の懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、本明細書に記載されるそれらの好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を用いた、既知の技術分野に従い製剤化され得る。減菌の注射可能な調製物も、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液などの非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の減菌の注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。採用され得る許容される希釈剤、溶媒、及び分散媒質は、水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの好適な混合物を含む。更に減菌の固定油は、溶媒または懸濁媒質として常用される。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油を用いてもよい。更にオレイン酸などの脂肪酸は、注射可能物の調製に用途を見出す。特定の注射可能製剤の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含むことにより達成され得る。
【０２５０】
活性成分を含有する医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルション、硬カプセルもしくは軟カプセル、またはシロップ、溶液、ミクロビーズ、またはエリキシル剤として、経口使用に好適な形態であり得る。経口使用を目的とする医薬組成物は、医薬組成物の製造の分野に公知の任意の方法に従い調製されることができ、そのような組成物は、薬学的に優れたかつ美味の調製物を提供するために、例えば甘味剤、風味剤、着色剤及び防腐剤などの１つ以上の薬剤を含有することができる。錠剤、カプセルなどは、錠剤の製造に適する非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの希釈剤；例えばコーンスターチまたはアルギン酸などの顆粒剤及び崩壊剤；例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤；及び例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤であり得る。
【０２５１】
経口投与に適した錠剤、カプセルなどは、消化管における崩壊及び吸収を遅らせ、それによって持続作用を提供するための既知の技法によりコーティングされても、されなくてもよい。例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いてもよい。それらは当該技術分野に公知の技法によりコーティングされ、制御放出用の浸透性治療錠剤を形成することができる。追加の薬剤は、投与した組成物の送達を制御するために、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、もしくはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどの生分解性もしくは生体適合性粒子またはポリマー物質を含む。例えば経口剤は、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルもしくはポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルの使用により、それぞれ、コアセルベーション技法により、もしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル、またはコロイド薬物送達系に封入され得る。コロイド状分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロ球体、ミクロビーズ、及び脂質に基づく系を含んでおり、それは水中油型エマルション、ミセル、混合されたミセル及びリポソームを含む。上述の製剤を調製するための方法は当業者に明らかである。
【０２５２】
経口使用のための製剤は、活性成分が、不活性固形希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリン、または微結晶セルロースと混合される硬ゼラチンカプセルとして、あるいは活性成分が、水、または油性媒質、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合される軟ゼラチンカプセルとして、提示されてもよい。
【０２５３】
水性懸濁液は、その製造に適した賦形剤との混合物中に活性材料を含有する。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、及びアカシアガムであり、分散剤もしくは湿潤剤、例えば天然のホスファチド（例えば、レシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。水性懸濁液は、１つ以上の防腐剤も含み得る。
【０２５４】
油性懸濁液は、活性成分を植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油中に、または流動パラフィンなどの鉱物油中に懸濁させることによって製剤化され得る。油性懸濁液は、糊剤、例えば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含有し得る。上述のものなどの甘味剤及び風味剤は、美味の経口調製物を提供するために添加され得る。
【０２５５】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤及び１つまたはそれ以上の保存剤と混合した活性成分を提供し得る。好適な分散剤もしくは湿潤剤、及び懸濁剤は、本明細書において例示される。
【０２５６】
本開示の医薬組成物は、水中油型エマルションの形態でもよい。油相は、植物油、例えばオリーブ油もしくは落花生油、または鉱物油、例えば流動パラフィン、またはこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然起源のガム（例えば、アカシアガムもしくはトラガントガム）、天然起源のホスファチド（例えば、大豆、レシチン、及び脂肪酸由来のエステルまたは部分エステル）、ヘキシトール無水物（例えば、ソルビタンモノオレエート）、ならびに部分エステルとエチレンオキシドの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。
【０２５７】
製剤は、移植片、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ、及びミクロ封入された送達系を含む制御放出製剤などの、迅速な分解または身体からの排除に対して組成物を保護するための担体も含み得る。例えば、モノステアリン酸グリセリル、もしくはステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料が単独でまたは蝋との組み合わせを用いてもよい。
【０２５８】
本開示は、直腸投与用の坐剤の形態でのＩＬ−１５ポリペプチドの投与を想定する。坐剤は、薬物を、通常の温度では固体であるが、直腸温度で液体であり、従って薬物を放出するために直腸で融解する好適な非刺激性賦形剤と混合することにより調製され得る。そのような材料は、ココアバター及びポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されない。
【０２５９】
本開示により想定されるＩＬ−１５ポリペプチドは、現在既知の、また将来開発される任意の他の好適な薬学的組成物の形態（例えば、鼻または吸入用途のためのスプレー）であり得る。
【０２６０】
製剤中のポリペプチドまたはその断片の濃度は、広く変動し得（例えば、約０．１重量％未満、通常約２重量％または少なくとも２重量％〜２０重量％程度〜５０重量％以上）、主に、例えば選択される特定の投与形態による、流体量、粘度、及び対象に基づく要因に基づき、通常選択される。
【０２６１】
投与経路
本開示は、任意の適切な方法でＩＬ−１５分子及びその組成物の投与を想定する。好適な投与経路は、非経口（例えば筋肉内、静脈内、皮下（例えば注射または移植片）、腹腔内、大槽内、関節内、腹腔内、脳内（実質内）及び脳室内）、経口、経鼻、経膣、舌下、眼内、直腸内、局所（例えば経皮）、舌下ならびに吸入を含む。一般的に皮下または筋肉内投与されるデポ剤注射も、定義された期間にわたり、本明細書に開示されるＩＬ−１５分子を放出するために利用され得る。
【０２６２】
本開示の特定の実施形態は非経口投与を想到し、更なる特定の実施形態で非経口投与は皮下である。
【０２６３】
併用療法
本開示は、１つ以上の活性治療剤（例えばサイトカイン）または他の予防または治療法（例えば放射線）と併用した、ＩＬ−１５分子の使用を想定する。そのような併用療法では、様々な活性剤は、往々にして、異なる相補的な作用機序を有する。そのような併用療法は、薬剤のうちの１つ以上の用量減少を可能にし、それによって、薬剤のうちの１つ以上に関連する有害な作用を減少させる、または排除することにより特に有益である。更にそのような併用療法は、基礎疾患、障害または状態に対して相乗治療または予防作用を有し得る。
【０２６４】
本明細書で使用される「併用」とは、別個に投与され得る、例えば、別個に投与するために別個に製剤化される（例えば、キットに提供され得るような）療法、及び単一の製剤で一緒に投与され得る（すなわち、共製剤化）療法を含むことが意味される。
【０２６５】
特定の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチド及び１つ以上の活性治療薬または他の予防もしくは治療法は、順次投与される、または適用され、例えば１つの薬剤が１つまたは複数の他の薬剤の前に投与される。他の実施形態では、ＩＬ−１５ポリペプチド及び１つ以上の活性治療薬または他の予防もしくは治療法は、同時に投与され、例えば２つ以上の薬剤が同時にまたはほぼ同時に投与され、２つ以上の薬剤は、２つ以上の別個の製剤に存在するか、または単一製剤に組み合わされ得る（すなわち、共製剤化）。２つ以上の薬剤が順次にまたは同時に投与されるか否かに関わらず、それらは本開示の目的のために併用して投与されると考えられる。
【０２６６】
本開示のＩＬ−１５ポリペプチドは、状況下に適切な任意の様式で、少なくとも１つの他の（活性）薬剤と併用して使用され得る。一実施形態では、少なくとも１つの活性剤及び少なくとも１つの本開示のＩＬ−１５ポリペプチドを用いた治療は、一定の時間にわたり保持される。別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は削減される、または中断され（例えば、対象が安定しているとき）、一方本開示のＩＬ−１５ポリペプチドを用いた治療は一定の投薬レジメンで保持される。更なる実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は削減される、または中断され（例えば、対象が安定しているとき）、一方本開示のＩＬ−１５ポリペプチドを用いた治療は削減される（例えば、低用量、投薬頻度の減少、または処置レジメンの短縮）。更に別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は削減される、または中断され（例えば、対象が安定しているとき）、一方本開示のＩＬ−１５ポリペプチドを用いた処置は増加される（例えば、高用量、投薬頻度の増加、または処置レジメンの延長）。更に別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は保持され、本開示のＩＬ−１５ポリペプチドを用いた処置は削減される、または中断される（例えば、低用量、投薬頻度の減少、または処置レジメンの短縮）。更に別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた処置は保持され、本開示のＩＬ−１５ポリペプチドを用いた処置は削減される、または中断される（例えば、低用量、投薬頻度の減少、または処置レジメンの短縮）。
【０２６７】
免疫及び炎症状態。本開示は、ウイルス性疾患、障害及び状態、ならびにそれに関連する障害を、ＩＬ−１５分子及び少なくとも１つの追加の治療薬もしくは診断薬で治療する及び／または予防するための方法を提供する。
【０２６８】
併用療法において有用な治療薬の例としては、アスピリン、イブプロフェンならびに他のプロピオン酸誘導体（アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸及びチオキサプロフェン）などの非ステロイド系の抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、酢酸誘導体（インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナック、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フイロフェナック、イブフェナック、イソキセパック、オキシピナック、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、及びゾメピラク）、フェナム酸誘導体（フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸及びトルフェナム酸）、ビフェニルカルボン酸誘導体（ジフルニサル及びフルフェニサル）、オキシカム（イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム及びテノキシカム）、サリチル酸（アセチルサリチル酸、スルファサラジン）ならびにピラゾロン（アパゾン、ベンゾピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン）が挙げられるが、これらに限定されない。他の組み合わせは、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤が含まれる。
【０２６９】
組み合わせの他の活性薬剤は、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、またはヒドロコルチゾンなどのステロイドが含まれる。１つ以上のステロイドの悪影響は、必要なステロイド用量を漸減することによって低減することができるまたは除去できるので、そのような組み合わせは特に有利であり得る。
【０２７０】
例えば慢性関節リウマチの治療のために組み合わせて使うことができる活性薬剤の追加の例は、サイトカインを抑圧する抗炎症剤（複数を含む）（ＣＳＡＩＤ）、他のヒトサイトカインまたは成長因子、例えばＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦまたはＰＤＧＦの抗体または拮抗剤を含む。
【０２７１】
活性薬剤の特定の組み合わせは、自己免疫及びその後炎症カスケードの異なる時点で妨げることができて、ＴＮＦ拮抗剤（例えばキメラ、ヒト化またはヒトＴＮＦ抗体）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、抗ＴＮＦ抗体フラグメント（例えば、ＣＤＰ８７０）及び可溶なｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体（その誘導剤、ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥＮＢＲＥＬ）またはｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（ＬＥＮＥＲＣＥＰＴ）を含むことができ、可溶なＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）、更にはＴＮＦα−変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、同様にＩＬ−１阻害剤（例えば、インターロイキン−１−変換酵素阻害剤）も効果的であり得る。他の組み合わせは、インターロイキン１１、抗Ｐ７ｓ及びｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）を含む。本明細書に記載のＩＬ−１５ポリペプチドと組み合わせて有用な薬剤の他の例は、インターフェロン−β１ａ（ＡＶＯＮＥＸ）、インターフェロン−β１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ）、コパキソン、高圧酸素、静注用免疫グロブリン、クラブリビン、及び他のヒトサイトカインもしくは成長因子の抗体またはアンタゴニスト（例えば、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ８０に対する抗体）を含む。
【０２７２】
本開示は、上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を包含する。
【０２７３】
癌及び関連状態。本開示は、増殖性状態、癌、腫瘍もしくは前癌性疾患、障害もしくは状態を、ＩＬ−１５分子及び少なくとも１つの追加の治療薬もしくは診断薬で治療するならびに／または予防するための方法を提供する。
【０２７４】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル：ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチレンイミン；チオランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロノマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピュロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオンスタノール、メピチオステイン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトテイン、トリロステインなどの抗副腎抗体；フォリン酸などの葉酸補充液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デホファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルホルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピタモール；ニトラクリン；ペントスタチン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；シゾフィラン；シピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２′，２′′−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金及び白金配位錯体；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。化学療法剤は、抗エストロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節し、または阻害するように作用する、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、４（５）−イミダゾールを阻害するアロマターゼ、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、オナプリストン、及びトレミフェンを含む、抗ホルモン剤；及び、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；及び薬学的に許容される塩、酸または上記のいずれかの誘導体も含有する。特定の実施形態において、併用療法は、ホルモンまたは関連ホルモン剤の投与を含む。
【０２７５】
ＩＬ−１５ポリペプチドと組み合わせて用いることができる追加の治療法は、ＩＬ−１２、ＩＮＦαもしくは抗上皮成長因子受容体などのサイトカインもしくはサイトカインアンタゴニスト、放射線療法、他の腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体及び毒素の複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞療法）を含む。ワクチン（例えば、可溶性タンパク質として、またはタンパク質をコード化する核酸として）も、本明細書に提供される。
【０２７６】
本開示は、上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を包含する。
【０２７７】
ウイルス性及び細菌性状態。本開示は、ウイルス性疾患、障害及び状態、ならびにそれに関連する障害を、ＩＬ−１５分子及び少なくとも１つの追加の治療薬もしくは診断薬（例えば１つ以上の他の抗ウイルス薬及び／またはウイルス治療と関係のない１つ以上の薬剤）で治療する及び／または予防するための方法を提供する。
【０２７８】
このような併用療法は、ウイルス脱殻阻害剤（例えば、アマンタジン及びリマンチジン）；逆転写酵素阻害剤（例えば、アシクロビル、ジドブジン及びラミブジン）；インテグラーゼを標的とする薬剤；ウイルスＤＮＡへの転写因子の結合をブロックする薬剤；翻訳に影響を与える薬剤（例えば、アンチセンス分子）（例えば、ホミビルセン）；翻訳／リボザイム機能を調節する薬剤；プロテアーゼ阻害剤；ウイルス組み合わせ調節剤（例えば、リファンピシン）；ウイルス粒子（例えば、ザナミビル及びオセルタミビル）の放出を防止する薬剤を含む、様々なウイルスのライフサイクルステージを標的とし、異なる作用機構を有する抗ウイルス剤が含まれるが、これらに限定されない。特定のウイルス感染（例えば、ＨＩＶ）の治療及び／または予防は、しばしば、抗ウイルス剤の群（「カクテル」）を伴う。ＩＬ−１５ポリペプチドと組み合わせて使用するために意図される他の抗ウイルス薬としては、アバカビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビレルテット、シドフォビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エンドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、様々なインターフェロン（例えば、ペグインターフェロンα−２ａ）、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リトナビル、ピラミジン、サキナビル、スタブジン、テラプレビル、テノホビル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、及びザルシタビンを含むが、これらに限定されない。
【０２７９】
桿状のグラム陰性細菌のサルモネラ属のＩＬ−１５治療は、開発中のワクチンと組み合わせて最も効果的であると考えられる。熱帯熱マラリア原虫寄生虫の治療のための併用療法に関して、抗マラリア薬物（例えば、クロロキン）アルテミシニンがＩＬ−１５ペプチドとの併用療法で効果的であり得る。
【０２８０】
本開示は、上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を包含する。
【０２８１】
適用量
本開示のＩＬ−１５ポリペプチドは、例えば、投与の目標（例えば、所望される消散の程度）、対象の年齢、体重、性別ならびに健康及び身体状態、ならびに／または投与される製剤、投与経路、ならびにその疾患、障害、状態または症状に依存する量で対象に投与され得る。投薬レジメンは、投与される薬剤（複数を含む）に関連する任意の有害作用の存在、性質、及び程度を考慮に入れることができる。有効投与量及び投与レジメンは、例えば安全性及び用量漸増試験、インビボ研究（例えば、動物モデル）、及び当業者に公知の他の方法により容易に決定することができる。
【０２８２】
一般に投薬パラメータは、対象に不可逆的に有害であり得る量未満（最大許容量（ＭＴＤ））の投与量であり、対象に対して測定可能な作用を生成するために必要とされる量未満ではないことを必要とする。そのような量は、投与経路及び他の要因を考慮に入れる、例えばＡＤＭＥに関連する薬物動態及び薬力学パラメータにより決定される。
【０２８３】
有効量（ＥＤ）は、それを服用する対象のある一定の割合において、治療応答または所望の作用を生成する薬剤の用量または量である。薬剤の「５０％有効量」またはＥＤ５０は、それを投与される集団の５０％において、治療応答または所望の作用を生成する薬剤の用量または量である。ＥＤ５０は通常、薬剤の作用の妥当な予測の手段として使用されるが、臨床医がすべての関連要因を考慮に入れた、適切であると判断し得る用量とは限らない。したがっていくつかの場合では、有効量は計算されたＥＤ５０超であり、他の場合では有効量は計算されたＥＤ５０未満であり、また他の場合では有効量は計算されたＥＤ５０と同じである。
【０２８４】
更に本開示のＩＬ−１５分子の有効量は、対象に１つ以上の用量で投与されたとき、健康な対象に対して所望の結果を生成する量であり得る。例えば特定の障害を経験する対象に関して、有効量とは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または９０％超だけその障害の診断パラメータ、指標、マーカーなどを改善するものであり得て、１００％とは通常の対象によって示される診断パラメータ、指標、標識などとして定義される。本明細書に記載の疾患、障害または状態を治療するために必要なＩＬ−１５分子の量は、共役タンパク質のＩＬ−１５活性を基準にしており、それはは、当該技術分野において既知のＩＬ−１５活性アッセイによって決定され得る。
【０２８５】
ＩＬ−１５分子の治療に有効な量は、約０．０１〜約１００μｇタンパク質／ｋｇ体重／日、約０．１〜２０μｇタンパク質／ｋｇ体重／日、約０．５〜１０μｇタンパク質／ｋｇ体重／日、または約１〜４μｇタンパク質／ｋｇ体重／日の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５分子の治療に有効な量は、約１〜１６μｇタンパク質／ｋｇ体重／日の範囲であり得る。本開示は、例えば約５０〜８００μｇタンパク質／ｋｇ体重／日の送達するため連続注入することによるＩＬ−１５分子の投与を想到する。注入速度は、例えば副作用及び血液細胞数の評価に基づいて変えることができる。
【０２８６】
経口剤の投与に関して、組成物は、１．０〜１０００ミリグラムの活性成分、特に１．０、３．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０または１０００．０ミリグラムの活性成分を含有する、錠剤、カプセルなどの形態で提供され得る。
【０２８７】
特定の実施形態では、開示されるＩＬ−１５ポリペプチドの投与量は、「単位投与形態」で含有される。「単位投与形態」という語句は物理的に分離した単位を指し、各単位は、単独または１つ以上の追加の薬剤との併用のいずれかで、所望の作用を生成するのに十分な既定量の本開示のＩＬ−１５ポリペプチドを含有する。単位投与形態のパラメータは、達成される特定の薬剤及び作用に依存することが理解される。
【０２８８】
キット
本開示は、ＩＬ−１５及びその医薬組成物を含むキットも想定する。キットは一般的に、以下に記載される様々な成分を収容する物理構造の形態であり、例えば本明細書記載の方法を実施するに際に利用され得る。
【０２８９】
キットは、対象に投与するのに適した医薬組成物の形態であり得る、本明細書に開示されるＩＬ−１５ポリペプチドのうちの１つ以上を含み得る（例えば、減菌容器に提供される）。ＩＬ−１５ポリペプチドは、すぐに使用できる形態で、または例えば投与前に再構成または希釈を必要とする形態で提供され得る。ＩＬ−１５ポリペプチドがユーザによって再構成される必要がある形態であるとき、キットは緩衝液、薬学的に許容される賦形剤なども含み、ＩＬ−１５ポリペプチドと一緒にまたは別個にパッケージされ得る。併用療法が想定されるとき、キットは別個にいくつかの薬剤を含有する、またはそれらはキットに既に組み合わされてよい。キットの各成分は個々の容器内に密閉され得て、様々な容器のすべては単一のパッケージ内にあり得る。本開示のキットは、その中に収容された成分を適切に保持するのに必要な状態（例えば、冷却または凍結）に設計され得る。
【０２９０】
キットは、その中の成分についての情報及びそれらの使用説明書（例えば作用機序、薬物動態及び薬力学、有害作用、禁忌等を含む、活性成分の投薬パラメータ、臨床薬理）を特定することを含むラベルまたは添付文書を含み得る。ラベルまたは挿入物は、ロット番号及び使用期限などの製造情報を含み得る。ラベルまたは包装挿入物は、例えば成分を収容する物理構造に統合されるか、物理的構造内に別個に収容される、またはキットの成分（例えばアンプル、チューブまたはバイアル）に添付され得る。
【０２９１】
ラベルまたは挿入物は、ディスク（例えばハードディスク、カード、メモリディスク）、光学ディスク（ＣＤ−もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなど）、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープもしくは電気記憶媒体（ＲＡＭ及びＲＯＭなど）、もしくはこれらのハイブリッド（磁気／光学記憶媒体、ＦＬＡＳＨメディアもしくはメモリ型カードなど）などのコンピュータ可読媒体を更に含む、またはそれに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、実際の説明書は、キットに存在しないが、例えばインターネットを介して遠隔源から説明書を得るための手段が提供される。
【０２９２】
実験
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が実施された及びすべての実験が実施され得ることを示すようにも意図されていない。現在形で書かれた例示の記述は必ずしも実施されたものとは限らず、むしろ、説明は、本明細書に記述されたデータなどを生成するために実施できることと理解すべきであろう。使用される数字（例えば量、温度など）に関して正確さを保証するために努力がはらわれているが、いくつかの実験誤差及び偏差があることを考慮すべきであろう。
【０２９３】
特に指示のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏（℃）であり、及び圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【０２９４】
下記の標準的略号を使用する：ｂｐ＝塩基対（複数を含む）；ｋｂ＝キロ塩基（複数を含む）；ｐｌ＝ピコリットル（複数を含む）；ｓまたはｓｅｃ＝秒（複数を含む）；ｍｉｎ＝分（複数を含む）；ｈまたはｈｒ＝時間（複数を含む）；ａａ＝アミノ酸（複数を含む）；ｋｂ＝キロ塩基（複数を含む）；ｎｔ＝ヌクレオチド（複数を含む）；ｎｇ＝ナノグラム；μｇ＝マイクログラム；ｍｇ＝ミリグラム；ｇ＝グラム；ｋｇ＝キログラム；ｄｌまたはｄＬ＝デシリットル；μｌまたはμＬ＝マイクロリットル；ｍｌまたはｍＬ＝ミリリットル；ｌまたはＬ＝リットル；ｎＭ＝ナノモル濃度；μＭ＝マイクロモル濃度；ｍＭ＝ミリモル濃度；Ｍ＝モル濃度；ｋＤａ＝キロダルトン；ｉ．ｍ．＝筋肉内に；ｉ．ｐ．＝腹腔内に；ｓ．ｃ．＝経皮的に；ＱＤ＝日毎；ＢＩＤ＝１日に２回；ＱＷ＝週毎；ＱＭ＝月毎；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＢＷ＝体重；Ｕ＝ユニット；ｎｓ＝統計的に有意ではない；ＰＢＳ＝リン酸塩−生理食塩水緩衝液；ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応；ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培養液；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着アッセイ；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸；ＰＭＡ＝ホルボールミリステートアセテート；ｒｈＩＬ−１５＝組み換えヒトＩＬ−１５；ＬＰＳ＝リポ多糖体。
【０２９５】
材料及び方法
下記の一般的な材料及び方法を、以下の実施例で使用する。
【０２９６】
分子生物学での標準的方法は記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．参照、それは、細菌細胞及びＤＮＡ突然変異誘発のクローニング（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞及び酵母のクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合多糖及びタンパク質の発現（Ｖｏｌ．３）及び生物情報学（Ｖｏｌ．４）について記載する。
【０２９７】
科学文献には、免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化、ならびに化学分析、化学改変、翻訳後改変、融合タンパク質の産生、及びタンパク質のグリコシル化を含むタンパク質精製のための方法が記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｓ．１−２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ参照）。
【０２９８】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の産生、精製及びフラグメント化が下記に記載されている（例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的な技術が利用可能である（例えばＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹ参照）。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えばＳｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ参照）。例えば診断試薬としての使用のための、核酸プライマー及びプローブ、ポリペプチドならびに抗体を含む核酸を改変するのに適した蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）。
【０２９９】
免疫系の組織学の標準的な方法が記載されている（例えばＬｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照）。
【０３００】
免疫細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）の欠失は、抗体媒介性の消失により行うことができる。例えば２５０μｇのＣＤ４−またはＣＤ８−特異的抗体を毎週注射して、細胞欠失はＦＡＣＳ及びＩＨＣ分析を用いて確認できる。
【０３０１】
例えば、抗原性フラグメント、リーダー配列、タンパク質折り畳み、機能ドメイン、グリコシル化部位、及び配列アラインメントを決定するためのソフトウェアのパッケージ及びデータベースが利用可能である（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＤｅＣｙｐｈｅｒ（商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ，ＮＶ）参照）。
【０３０２】
免疫応答性Ｂａｌｂ／ＣまたはＢ細胞−欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ．（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手して、標準法に従い使用できる（例えば、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９（１１）：７０６７−７３ａｎｄ  Ｃｏｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４（６）：６８１−８９参照）。本開示により想到される実験作業に適した他のマウス株は当業者に既知であり、一般的にはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂから入手可能である。当業者は、本開示の作業でも使用され得るモデル及び細胞株（例えば、炎症のモデル）を熟知している。
【０３０３】
血清ＩＬ−１５濃度レベル及び曝露レベルは、当該技術分野で使用される標準的な方法により決定することができる。例えば血清曝露レベルのアッセイは、全血（約５０μＬ／マウス）をマウスの尻尾切断から毛細管に採取して、遠心分離により血清及び血液細胞を分離し、標準的なＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｔｅｍｓ）と技術により、ＩＬ−１５曝露レベルを決定することにより実施できる。あるいはまたは更に、下記に記載するＥＬＩＳＡ手順（または類似の手順）は、ムテインまたは改変したムテインの生体内半減期を決定するための手段として、ヒトＩＬ−１５の血清レベルを測定するように適合させることができる。
【０３０４】
ムテインの生成及び評価
ヒトＩＬ−１５発現ベクター、ｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ−ｈｕＩＬ１５の構成体。ヒトＩＬ−１５哺乳動物発現ベクターは、ＤＮＡテンプレートとしてｐＣＭＶ６−ＡＣ−ヒト−ＩＬ１５（Ｏｒｉｇｅｎｅ＃ＳＣ３０００９９；Ｇｅｎｂａｎｋ受託＃ＮＭ＿０００５７．２）を使用する、プラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１１７０８〜０３９；製造業者のプロトコルに従う）を使用するＰＣＲ、ならびにプライマー５’−ｔａｔａＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣ−３’（配列番号３４）及び５’−ｔａｔａＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＧＴＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧ−３’（配列番号３５）を介して、完全ヒトＩＬ−１５オープンリーディングフレームを増幅することにより構築した。得られたＰＣＲ反応物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ＃２８１０６）を用いて精製した。精製したヒトＩＬ−１５のＰＣＲフラグメント及び哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ（Ｂ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｖ９１０−２０）は、ｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ（Ｂ）消化に加えた子ウシ腸ホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で、３７℃、１時間、ＳｆｉＩ及びＡｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて消化処理した。消化されたＤＮＡフラグメントは、１００Ｖで１時間、１％アガロースゲル（Ｌｏｎｚａ＃５４８０３）上で培養し、その後切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃２８７０６）を用いて精製した。ヒトＩＬ−１５のＰＣＲフラグメントは、Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ結合キット（Ｒｏｃｈｅ＃１１６３５３７９００１）を用いてｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ（Ｂ）ベクターに連結し、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｃ４０４００６）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む寒天プレートに植えつけて、３７℃で一晩増殖させた。翌日、細菌コロニーを個別に採取し、２００ＲＰＭで振盪培養器中でＬＢ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む、３ｍＬの培養液に入れ、３７℃で８〜２０時間増殖させた。各培養物２ｍＬをその後２ｍＬの試験管に分取して、細胞を１０分間、卓上遠心分離機で６０００ＲＰＭでペレット化し、培養液を吸引して、ＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ＃２７１０６）を使用して細菌から分離して精製した。適切な発現ベクターを、ＤＮＡ配列決定法（ＭＣ  Ｌａｂ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を介して同定した。
【０３０５】
ムテインの発現ベクターの生成。ヒトＩＬ−１５ムテインの発現ベクターは、前述のヒトＩＬ−１５の哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ−ｈｕＩＬ−１５を、ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃２００５２４）を使用して、以下の分類の製造業者のプロトコルに従い変異させた。プライマーは常に推奨Ｔｍを満たすとは限らなかった。ＰＣＲ反応は、６〜７分の継続時間で１６〜１８ラウンド循環させた。４μＬのＤｐｎＩ処理反応は、前述のようにＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｃ４０４００６）に形質転換させた。ミニプレップ培養物３ｍＬを増殖させ、精製して、前述のように配列検証した。いくつかのムテインにおいて、４００ｍＬの培養物を増殖させ、精製した。簡単に説明すると、１つの細菌コロニーを４００ｍＬのＬＢ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン中に取り出し、２Ｌのバッフル付き三角フラスコ中の２００ＲＰＭで振盪培養器中で、３７℃、１２〜２０時間成長させた。次いで培養物を、遠心分離機（ＪＡ−１０ローター中のＢｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２５Ｔの６０００ＲＰＭ、２０分間）でペレット化し、培養液を吸引して、製造業者のプロトコルに従ってＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃１２３８１）を用いてＤＮＡを抽出した（最終ＤＮＡ濃度を増加させるために、ＤＮＡ沈殿法で行われる当業者に馴染みの種類をごくわずかに変更）。
【０３０６】
複数のアミノ酸の変化を必要とするムテインは、一度に１つの変異体を挿入することにより作製した。Ｎ−グリコシル化モチーフ、Ｎ−Ｘ−Ｓ及びＮ−Ｘ−Ｔの導入は、Ｘ≠Ｐ（プロリン）であるため、３つの変異体の導入を必要とすることがある。ムテインに使用する番号付け規則は、最初の位置として開始コドンを割り当て、したがって最初の４８残基（ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳＡＧＬＰＫＴＥＡ（配列番号３６））はシグナルペプチドを含み、成熟タンパク質の第一の残基はアスパラギン４９である。
【０３０７】
タンパク質トランスフェクションのプロトコル。すべてのヒトＩＬ−１５発現ベクター（野生型及びムテイン）は、過渡的にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｒ７００−０７）で発現させることができる。細胞は、Ｔ１７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｏｎｅ／ＣｅｌｌＳｔａｒ＃６６０１７５）中の５０ｍＬのＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１１９９５―０７３）＋１０％の特性決定したウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃ＳＨ３００７１．０３）＋１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１５１４０−１２２）で３７℃、５％ＣＯ２中で維持することができる。集密化したら、細胞を１０ｍＬのＰＢＳ＋５ｍＭのＥＤＴＡで分離して、細胞を追加の１０ｍＬの成長培養液で採取し、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ）を用いて１０００ＲＰＭでペレット化し、培養液を吸引し、細胞を新鮮な培養液で再懸濁し、その後４５ｍＬの成長培養液を含む３つのＴ１７５フラスコの間に分取することができる。
【０３０８】
すべての発現ベクターを、６ウェルプレートまたはＴ１７５フラスコにトランスフェクションすることができる。６ウェルプレートのトランスフェクションにおいて、Ｈｅｋ２９３ＦＴ細胞を集密化したＴ１７５フラスコから採取して、細胞を上述のとおり採取し、その後２０ｍＬの新鮮な増殖培養液に再懸濁させることができる。７００μＬの細胞懸濁液を、２ｍＬの新鮮な培養液を含む６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３５３０４６）の各ウェルに加えて、記載されているように一晩成長させることができる。翌日、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１３８８７９５）を用いて、次のプロトコルを使用してトランスフェクトすることができる。２５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭＩ血清低減培養液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃３１９８５−０８８）を２つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに分取して、その後、１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１３８８７９５）を１つのアリコートに加えて、４μｇのＤＮＡを他方に加えた。２つの溶液を室温で５分間別々に培養し、その後、２つの溶液を合わせて、更に３０分間室温で培養することによりトランスフェクション複合体を形成した。完全な５００μＬの混合物を、その後、６ウェルプレートの１つのウェルに滴下して添加し、４時間、培養器に戻した。それからトランスフェクション培養液を吸引し、ＤＭＥＭ＋ペニシリン／ストレプトマイシンで置き換えて、約３６時間増殖させた。馴化培養液を収集して、４℃で保存した。それから以下の点を除いて、上述のとおりＴ１７５−フラスコをトランスフェクトすることができる。４２〜４５ｍＬの増殖培養液入りのＴ１７５フラスコは、トランスフェクション前に９５％コンフルエンスまで増殖させて、１７５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を４．４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉに、及び７５〜１００μＬのＤＮＡを第２の４．４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉに加えることにより、トランスフェクション複合体を形成した。トランスフェクション複合体の吸引時に、５０ｍＬの培養液を各フラスコに加えた。
【０３０９】
モックトランスフェクションはｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ（Ｂ）発現ベクターが消失する、またはＤＮＡを含まず、上述したとおり調製した。
【０３１０】
ヒトＩＬ−１５検出ＥＬＩＳＡ。９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ＃４４２４０４）を、１００μＬ／ウェルで、ＰＢＳ＋１μｇ／ｍＬの抗ヒトＩＬ−１５抗体（例えばＡＴＣＣ  ＨＢ−１２０６２、クローンＭ１１１、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を４℃で一晩コーティングして、ＤＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（Ｔｅｋｎｏｖａ＃Ｐ０２９７）６×２００μＬで洗浄し、２００μＬ／ウェルで、ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社２９６０）を用いて、２時間、室温でロッキングプラトフォーム上でブロックして、上述のとおり洗浄してもよい。試料をＰＢＳ中で連続的に希釈し、そして１００μＬ／ウェルをアッセイプレートに加えてもよい。試料を、二重でまたは三重で用いてもよい。陽性対照として精製したヒトＩＬ−１５を添加し、一方モックトランスフェクションからの緩衝液または馴化培地を陰性対照として用い、両方を連続希釈できる。試料をロッキングプラットフォーム上で４℃で一晩培養し、次いで上述のとおり洗浄できる。１００μＬ／ウェルのＰＢＳ＋抗ヒトＩＬ−１５抗体（例えばａｂ７２１３；Ａｂｃａｍ）を各ウェルに加え、ロッキングプラットフォーム上で室温で１時間培養し、上述のとおりに洗浄して、その後、１００μＬ／ウェルのロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃７１１−０３５−１５２、１：１０，０００に希釈）を加えて、ロッキングプラットフォーム上で室温で更に１時間培養してもよい。上述のとおりプレートを洗浄して、１００μＬ／ウェルの１−Ｓｔｅｐ  ＵｌｔｒａＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ＃３４０２９）を用いて１〜５分間成長させ、その後、反応を１００μＬ／ウェルの停止溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＳＳ０４）で停止させてもよい。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ２プレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。
【０３１１】
別のＥＬＩＳＡ形式は、プレメイドキット（例えばヒトＩＬ−１５ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃Ｄ１５００、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の製造業者の推奨するプロトコルによる）を含むことができる。
【０３１２】
野性型ヒトＩＬ−１５及びムテインヒトＩＬ−１５の精製抗ヒトＩＬ−１５抗体（例えばＡＴＣＣ  ＨＢ−１２０６２、クローンＭ１１１、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃７１−５０００−１５ＡＦ、製造業者のプロトコルに従う）にカップリングして、ＰＢＳで平衡化することができる。Ｍ１１１−セファロースの５００μＬ〜１ｍＬを、ガラスＥｃｏｎｏ−カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）内に収容された馴化培地の１００ｍＬ毎に加えて、ロッキングプラットフォーム上で室温で１〜２時間培養できる。培地を重力流を介してカラムに通過させて、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１×洗浄して、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．９）で溶出し、１０％の量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）量で中和することができる。タンパク質は濃縮されて、緩衝液はＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルタ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ；５，０００ｋＤ分画分子量）を使用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）へ交換することができる。タンパク質濃度は２８０ｎｍの分光光度計で測定することができる。
【０３１３】
ＳＥＣ解析タンパク質１１００シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、タンパク質２０〜５０μｇを、ＴＳＫ３０００ｓｗカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，東京、日本）に注入して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化して、流速１ｍＬ／分で流すことができる。
【０３１４】
ＩＬ−１５のＰＥＧ化
ＰＥＧ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）は、ＮａＣｌ１００ｍＭで、ｐＨ４〜８の５０ｍＭリン酸塩中の濃度１０〜１００ｍｇ／ｍＬに希釈することができ、ヒトＩＬ−１５は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の濃度２〜１０ｍｇ／ｍＬに希釈することができる。最終反応混合物は、５〜５０ｍＭの最終濃度で、比率範囲１０：１〜２：１（ＰＰＡ  ＰＥＧ：ヒトＩＬ−１５）のＰＥＧ及びヒトＩＬ−１５、ならびにシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含むことができる。反応物を４℃〜２５℃で２〜４８時間インキュベートすることができる。所望のタンパク質種及び／または緩衝液交換を選択するために、ＰＥＧ化タンパク質はＳＥＣを介して分留することができる（上述したように）、またはＰＥＧ化反応混合物の非タンパク種の大部分及び／または緩衝液交換を除去するために、ＰＥＧ−ＩＬ−１５反応混合物は限外ろ過工程を受けさせることができる（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦシステムを、分子量５ｋＤａカットオフで、再生セルロース（ＰＬＣＧＣ）膜と共に使用できる）。
【０３１５】
ＩＬ−１５改変体の生物活性を判定するためのアッセイ
本開示は、本明細書に記載のＩＬ−１５分子の生物活性を判定するための当該技術分野で既知の任意のアッセイ及び方法の使用を想到する。本明細書に記載のアッセイは代表例であり、排他的ではない。
【０３１６】
ＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイＳｏｍａｎら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ３４８（１−２）：８３−９４（２００９Ａｕｇｕｓｔ３１））は、量的にＩＬ−１５生物活性を推定するための、可溶なＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いた、ＣＴＬＬ−２細胞の最適化したテトラゾリウム染料に基づく比色分析の細胞増殖アッセイを記載する。ＣＴＬＬ−２は、ＩＬ−２依存性ネズミ細胞株である。
【０３１７】
Ｓｏｍａｎらに記載されているものと実質的に類似しているＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイを、ＩＬ−１５生物活性を判定するために本明細書で使用した。簡単に説明するとＣＴＬＬ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−２１４、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ及び１０％Ｔ−ＳＴＩＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３５４１１５、Ｔｅｗｓｂｕｒｙ、ＭＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１８７５−０９３、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で培養した。細胞を、密度１０，０００細胞／ｍＬと１００，０００細胞／ｍＬの間で５％のＣＯ２を補充して３７℃に維持して、それらが対数増殖期で増殖したとき（通常凍結後２〜３週間；細胞生存度≧９５％）採取して、Ｔ−ＳＴＩＭのない２０ｍＬの増殖培地で４回洗浄した（１０００ｒｐ、５分の遠心分離）。次にＴ−ＳＴＩＭのない増殖培地の１００μＬ中の２５，０００細胞／ウェルを、きれいな９６ウェル組織培養プレートに小分けして、インキュベーターに戻す一方で、タンパク質を希釈した。ＩＬ−１５サンプルは、アッセイ培地中の最初の濃度８ｎｇ／ｍＬに希釈して、その後続いて２倍の希釈し、それから１００μＬを９６ウェル組織培養プレートのウェルに加えて、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーターに４８時間戻した。４８時間の培養時間後後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液を加えて（２０μＬ／ウェル）、懸濁液を更に１〜４時間、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。プレートを４９０ｎｍで読み取り、媒体入りウェルのバックグラウンド読み取りを試料ウェル容器読み出しから除去した。
【０３１８】
Ｍ０７ｅ細胞増殖アッセイＫａｎａｋｕｒａら（Ｂｌｏｏｄ７６（４）：７０６−１５（１９９０Ａｕｇｕｓｔ１５）；Ｃａｌｉｃｅｔｉら（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ７（７）：ｅ４１２４６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４１２４６（２０１２））；及びＺａｕｎｅｒら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２０：９０５−１３（Ｍａｙ１９９６））は、Ｍ０７ｅ、その増殖がＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦに依存する、ヒト白血病巨核球性細胞株を使用する細胞増殖アッセイを記載する。Ｍ０７ｅ細胞はＤＳＭＺから購入できる（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ１０４；Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０３１９】
Ｍ０７ｅ細胞株は、１０％ＦＢＳ、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）またはｒｈＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で培養でき、あるいは細胞は、５％ＦＣＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３を補充したＩＭＤＭで培養できる。ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｓｉｇｍａ）の組み込みを、Ｍ０７ｅ細胞の因子誘導増殖を定量するために用いてもよい。簡単に説明すると、Ｍ０７ｅ細胞の３つの小分けを、平底マイクロタイタープレート（１００μＬ／ウェル）で３７℃７２時間培養することができる。ＭＴＴは培養の最後の４時間に加えることができる（ＰＢＳ中のＭＴＴ５ｍｇ／ｍＬ溶液の１０μＬ）。７２時間で、１００μＬの酸イソプロパノール（イソプロパノール中の０．０４Ｎ  ＨＣｌ）をすべてのウェルに加えて、混合することができ、光学密度は５４０ｎｍでマイクロＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した。
【０３２０】
ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ。活性化した一次ヒトＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰＥＧ−ＩＬ−１５で処理するとき、ＩＦＮγ、グランザイムＢ、パーフォリン及びＴＮＦαを分泌する。以下のプロトコルは、例示のアッセイをこれらのサイトカインの産生のスクリーニングに提供するヒト一次末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、任意の標準的プロトコルに従い単離することができる（例えばＦｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ７．１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）参照）。ＰＢＭＣ２．５ｍＬ（細胞密度１０００万細胞／ｍＬ）は、ＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びペニシリン／ストレプトマイシンカクテル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する、完全ＲＰＭＩにより、またはＡＩＭ−Ｖ無血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１２０５５−０８３）で、５％ＣＯ２を含む加湿した３７℃のインキュベーターにおいて、任意の標準組織培養処理済み６−ウェルプレート（ＢＤ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で、ウェル毎に培養することができる。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞は、製造業者のプロトコルに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳ細胞分離技術を使用して単離できる（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）。Ｔ細胞は、２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３５２６、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ−２８抗体（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でコーティングして、及びＡＩＭ−Ｖ培地１ｍｌの３Ｅ６細胞／ウェルを添加することによって、活性化できる。細胞を記載したように３日間増殖させて、それから回収し、９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３５３０７２、コーニング、ＮＹ）に小分けした、密度２Ｅ６細胞／ｍＬの新鮮なＡＩＭ−Ｖ及び２５０μＬ／ウェルに再懸濁した。ヒトＰＥＧ−ＩＬ−１５を連続的に希釈して、最終濃度１μｇ／ｍＬ〜０．０１ｎｇ／ｍｌでウェルに加えることができる。細胞を５％ＣＯ２を含む加湿した３７℃の培養器中で３日間培養することができる。それから培地を回収し、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて製造者のプロトコルに従い（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡまたはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））、ＩＦＮγ、グランザイムＢ、パーフォリン及び／またはＴＮＦαのアッセイができる。
【０３２１】
ＮＫ細胞アッセイ。ヒトＮＫ細胞はＰＢＭＣ細胞から単離することができ（プロトコルは前述のとおり、完全ＲＰＭＩで培養）、製造業者のプロトコルに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳ細胞分離技術を使用して同じように単離できる（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ））。細胞は増殖されて培養され（Ｔ細胞で記載したように完全ＲＰＭＩ使用）、２５０μｌの完全ＲＰＭＩ中に５Ｅ５細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３５３０７２（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ））に植えつけた。成長の１〜３日後、媒体をＴ細胞に関して記載されているように分析できる。
【０３２２】
腫瘍モデル及び腫瘍分析
【０３２３】
任意の当該技術分野で認められた腫瘍モデル、アッセイなどは、種々の腫瘍で、本明細書に記載のＩＬ−１５分子の効果を評価するために使用することができる。下記に記載した腫瘍モデル及び腫瘍分析は、利用可能なものの代表である。
【０３２４】
同系マウス腫瘍細胞は、腫瘍接種当たり１０４、１０５または１０６細胞で、皮下注射するまたは皮内注射する。ＥＰ２乳癌、ＣＴ２６結腸癌、皮膚のＰＤＶ６扁平上皮癌、及び４Ｔ１乳癌モデルを用いることができる（例えば、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４２：４６１−４６５参照）。免疫適格Ｂａｌｂ／ＣまたはＢ細胞欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用することができる。ＰＥＧ−ｍＩＬ−１５を免疫適格マウスに投与することができ、一方、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１５治療はＢ細胞欠損マウスで行うことができる。腫瘍は、治療を開始する前に１００〜２５０ｍｍ３の大きさに到達させる。ＩＬ−１５、ＰＥＧ−ｍＩＬ−１５、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１５または緩衝対照を、腫瘍移植から離れた部位に皮下投与する。腫瘍成長は通常、電子カリパスを用いて週２回監視する。
【０３２５】
腫瘍組織及びリンパ器官は、多くの炎症マーカー用のｍＲＮＡの発現を測定するために、及びいくつかの炎症細胞マーカー用の免疫組織化学を行うために、様々なエンドポイントで採取した。組織を液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存する。原発腫瘍の成長は通常、電子カリパスを用いて週２回監視する。腫瘍体積は式（幅２×長さ／２）を用いて計算でき、長さは長い方の寸法である。腫瘍は、治療を開始する前に９０〜２５０ｍｍ３の大きさに到達させる。
【０３２６】
本発明を実行するために発明者が知る最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態が本明細書において説明される。前述の説明を読むことにより、開示される実施形態の変形は当業者に明らかとなり、当業者はそのような変形を適切に採用することができることが期待される。したがって本発明が本明細書に特別に記載したものとは別な方法で実践され、本発明が、適用法令に認められる、添付の請求項に記載される対象のすべての修正及び等価物を含むことが意図される。更に上記に示される要素の、それらのすべての可能な変形の任意の組み合わせも、本明細書中に特に記載されない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。
【０３２７】
本明細書に記述されるすべての刊行物、特許出願、受託番号、及び他の参照文献は、各個別の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているように、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2017536098.tif 000003
【図１Ｂ】
2017536098.tif 000004
【図１Ｃ】
2017536098.tif 000005
【図２Ａ】
2017536098.tif 000006
【図２Ｂ】
2017536098.tif 000007
【図２Ｃ】
2017536098.tif 000008
【図３】
2017536098.tif 000009
【図４Ａ】
2017536098.tif 000010
【図４Ｂ】
2017536098.tif 000011
【図５】
2017536098.tif 000012
【図６Ａ】
2017536098.tif 000013
【図６Ｂ】
2017536098.tif 000014
【配列表】
2017536098000001.app
【国際調査報告】
2017536098.tif 000015
2017536098.tif 000016
2017536098.tif 000017
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