(57)【要約】ＣＤ３イプシロンおよびＲＯＲ１に対する二特異性抗体は、卵巣がんの処置における使用に有用である。この二特異性抗体は、抗ＣＤ３ε抗体の１つのＦａｂ断片（ＣＤ３  Ｆａｂ）と、抗ＲＯＲ１抗体の１つまたは２つのＦａｂ断片（ＲＯＲ１  Ｆａｂ）と、０または１つのＦｃ断片とを含み得る。この二特異性抗体は、二価であり得、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含み得、またはこの二特異性抗体は、三価であり得、ＲＯＲ１に特異的に結合する二価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の一価Ｆａｂ断片とを含み得る。
2017536341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣がんの処置における使用のための、２つの標的、ヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（さらにまた、「ＲＯＲ１」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体。
【請求項２】
初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、１ｎＭの濃度で、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とする、請求項１に記載の二特異性抗体。
【請求項３】
細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用し、１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合の際における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する、請求項２のいずれかに記載の二特異性抗体。
【請求項４】
抗ＣＤ３ε抗体の１つのＦａｂ断片（ＣＤ３  Ｆａｂ）と、抗ＲＯＲ１抗体の１つまたは２つのＦａｂ断片（ＲＯＲ１  Ｆａｂ）と、０または１つのＦｃ断片とからなることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項５】
二価であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項６】
三価であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する二価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の一価Ｆａｂ断片とを含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項７】
構築物、
ａ）ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ、
ｂ）ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ、
ｃ）Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ、および
ｄ）ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ
の群から選択されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項８】
構築物が、
ａ）構成ブロック、配列番号３０（２×）、３１、３２、および３３からなる構築物（図１Ａ）
ｂ）構成ブロック、配列番号３０、３１、３３、および３６からなる構築物（図１Ｂ）
ｃ）構成ブロック、配列番号３０（２×）、３３、および３５からなる構築物（図１Ｃ）、
ｄ）構成ブロック、配列番号３０、３３、および３４からなる構築物（図１Ｄ）
の群から選択されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項９】
配列番号３１、３３、３４、３５内の抗ＣＤ３ε抗体配列ＶＨおよびＶＬが、配列番号２１および２２のそれぞれのＣＨ１およびＣＬ配列により置きかえられていることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項１０】
Ｆｃドメインを含むことを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項１１】
ａ）前記標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、
ｂ）前記標的のうちの他の一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と
を含み、可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置きかえられている
ことを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項１２】
前記抗ＣＤ３抗体の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置きかえられていることを特徴とする、請求項１１に記載の二特異性抗体。
【請求項１３】
ヒトＣＤ３εに特異的に結合する抗体部分が、
ａ）配列番号１２、１３および１４のＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変重鎖ドメインＶＨと、配列番号１５、１６および１７のＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むか、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５のＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変重鎖ドメインＶＨと、配列番号２６、２７および２８のＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として可変ドメインＶＬとを含む
ことを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項１４】
ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分が、配列番号７、８および９のＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変重鎖ドメインＶＨと、配列番号３、４および５のＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項１５】
さらに、前記第１の抗体の第２のＦａｂ断片（「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」）を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の二特異性抗体。
【請求項１６】
抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＣＤＲ配列を含むことを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項１７】
抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＶＨおよびＶＬ配列を含むか、または抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬ配列を含む抗体であることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項１８】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、前記Ｆａｂ断片が、
ａ）配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むか、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項１９】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する前記抗体部分が、
前記可変ドメインが、
ａ）配列番号１０および１１（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の可変ドメインであるか、または、
ｂ）配列番号２１および２２（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の可変ドメインである
ことを特徴とすることを特徴とする、請求項１から１８のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項２０】
ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する前記Ｆａｂ断片が、重鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号９のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨを含むことと、軽鎖ＣＤＲ、配列番号３のＣＤＲ１Ｌ、配列番号４のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬを含むこととを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ１）ことを特徴とする、請求項１から１９のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項２１】
ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する前記Ｆａｂ断片が、配列番号１０のＶＨと配列番号１１のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１）ことを特徴とする、請求項１から２０のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項２２】
ヒトＣＤ３εに特異的に結合する前記抗体部分内で、
ａ）配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、前記可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、前記可変ドメインＶＬが置きかえられること、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、前記可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、前記可変ドメインＶＬが置きかえられることを特徴とする、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、前記二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、前記変更が、
ａ）前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）前記二特異性抗体内の前記第１のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第２のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第２のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記第１のＣＨ３ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンによるアミノ酸置換および／または置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことを特徴とする、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂの抗体であり、前記抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片内にＣＬ／ＣＨ１クロスオーバーを含むことを特徴とする、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂの抗体であり、Ｐｒｏ３２９のグリシンによるアミノ酸置換ならびにＬｅｕ２３４のアラニンによる置換およびＬｅｕ２３５のアラニンによる置換を伴うヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートを含むことを特徴とする、請求項２４または２５に記載の抗体。
【請求項２７】
２つの標的、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（ＲＯＲ１）に特異的に結合することを特徴とし、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、１ｎＭの濃度で、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とする、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
２つの標的、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（ＲＯＲ１）に特異的に結合することを特徴とし、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用し、１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合の際における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
マウスにおける、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、１２時間より長い、好ましくは、３日間またはそれより長い消失半減期を特徴とする、請求項１から２８に記載の抗体。
【請求項３０】
ＲＯＲ１陽性卵巣がん細胞系ＰＡ−１および／またはＣＯＬＯ−７０４への結合についてのＥＣ５０値であって、３０ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、１５ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とする、請求項１から２９に記載の抗体。
【請求項３１】
ヒトＴ細胞の存在下における、ＲＯＲ１発現卵巣がん細胞ＰＡ−１および／またはＣＯＬＯ−７０４のリダイレクトされた殺滅を、１０ｎＭ未満、好ましくは、１ｎＭ、好ましくは、０．０５ｎＭ、好ましくは、０．０２ｎＭ、好ましくは、０．００２ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力を特徴とする、請求項１から３０に記載の抗体。
【請求項３２】
標準的な製剤緩衝液中、３７℃で、好ましくは、４０℃で、１０日間、好ましくは、最長２週間、好ましくは、最長４週間保存された前記抗体が、高分子量（ＨＭＷ）分子種および／または低分子量（ＬＭＷ）分子種および／または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−８０℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、１０％を超える変化（Δ）、好ましくは、５％を超える変化（Δ）を結果としてもたらさないことを特徴とする、請求項１から３１に記載の抗体。
【請求項３３】
卵巣がんの処置における使用のための請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３４】
卵巣がんの処置における使用のための医薬としての使用のための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体、または請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ＲＯＲ１陽性卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体、または請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体、または請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
卵巣がんの処置のため、およびＲＯＲ１を発現する卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体、または請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
卵巣がんを患う患者における卵巣がんの処置のための、２つの標的、ヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（さらにまた、「ＲＯＲ１」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体の使用。
【請求項３９】
卵巣がんを患う患者において卵巣がんを処置する方法であって、前記患者に治療有効量の二特異性抗体を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣がんの処置における使用のための、ＣＤ３εおよびＲＯＲ１に対する二特異性抗体、そのような医薬および処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＲＯＲ１（同義語：チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１、ＥＣ＝２．７．１０．１、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ０１９７３）はチロシン−プロテインキナーゼ受容体である。この受容体は、Masiakowski  P、Carroll  R.D.、J.  Biol.  Chem.  ２６７巻：２６１８１〜２６１９０頁（１９９２年）「A  novel  family  of  cell  surface  receptors  with  tyrosine  kinase-like  domain」において記載されている。ＷＯ９２１８１４９およびＷＯ９５２７０６０では、Ｒｔｋ−２としてＲＯＲ−１、およびＲＯＲ−１に対する抗体について言及されている。ＷＯ２００２０８７６１８では、がんの増殖および分化を、増殖因子受容体を選択的に阻害することによって制御する方法について言及されている。このような受容体は、Ｒｏｒ１またはＲｏｒ２でありうる。ＷＯ２００５１００６０５では、乳がんに対する治療標的としてのＲＯＲ１、ならびに、ＲＯＲ１、ＲＯＲ１の細胞外領域（Ｍ１〜Ｖ４０６）およびＲＯＲ１断片Ｑ７３〜Ｖ１３９、Ｅ１６５〜Ｉ２９９、Ｋ３１２〜Ｃ３９１に特異的に結合する抗ＲＯＲ１抗体について言及されている。ＷＯ２００７０５１０７７は、抗ＲＯＲ１抗体およびリンパ腫細胞検出におけるその使用に関する。ＷＯ２００８１０３８４９でも抗ＲＯＲ１抗体について言及されている。Rabbani、Blood（ASH  Annual  Meeting  Abstracts）２０１０年１１６巻：要約９１６）には、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の処置のための抗ＲＯＲ１抗体の使用が開示されている。Ｒａｂｂａｎｉは、抗ＲＯＲ１である、細胞外ドメインに対する抗体、ＣＲＤ領域（Ｗｎｔタンパク質のリガンド結合性部位）に対する抗体およびクリングルドメインに対する抗体を使用した。Daneshmanesh  AHら、Int.  J.  Cancer、１２３巻（２００８年）１１９０〜１１９５頁は、細胞外ドメイン断片ＷＮＩＳＳＥＬＮＫＤＳＹＬＴＬ（配列番号１８）に結合する抗ＲＯＲ１抗体および細胞内ドメイン断片ＫＳＱＫＰＹＫＩＤＳＫＱＡＳ（配列番号２０）に結合する抗ＲＯＲ１抗体に関する。ＣＬＬの処置のための、このような抗体の使用に関しても言及されている。
【０００３】
Zhang  H.ら、SCIENTIFIC  REPORTS、４巻：５８１１頁、DOI：10.1038/srep05811（２０１４年７月２４日）では、ＲＯＲ１タンパク質の発現がヒト卵巣がんにおける臨床転帰不良と相関することが報告されている。
【０００４】
ＷＯ２０１１１５９８４７は、リンパ腫または腺癌のようなＲＯＲ１がんの処置のための、生物活性分子とのコンジュゲートとしての抗ＲＯＲ１抗体に関する。ＷＯ２００８０７６８６８、ＷＯ２００８１０３８４９、ＷＯ２０１００８０６９、ＷＯ２０１０１２４１８８、ＷＯ２０１１０７９９０２、ＷＯ２０１１０５４００７、ＷＯ２０１１１５９８４７、ＷＯ２０１２０７６０６６、ＷＯ２０１２０７６７２７、ＷＯ２０１２０４５０８５、およびＷＯ２０１２０９７３１３もＲＯＲ１結合性分子または抗ＲＯＲ１抗体に関する。ＷＯ２０１２０７５１５８は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２の配列、および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号６の配列、およびそれぞれのＣＤＲとして配列番号３、４、５、７、８、９の配列を含む抗ＲＯＲ１抗体に関する。この抗体は、さらに、ＭＡＢ１とも称される。
【０００５】
ＷＯ２００５０４０４１３は、ＲＯＲ１を含めた受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤を同定および／または検証するためのスクリーニング方法を対象とする。
【０００６】
ＷＯ２００８０３６４４９、ＷＯ２０１１０１４６５９およびＷＯ２０１１０５０２６２では、１つの標的がＲＯＲ１でありうる二特異性抗体について言及されている。ＷＯ２００７１４６９６８では、エフェクター機能を有する多価単鎖結合性タンパク質について言及されており、ＲＯＲ１およびＣＤ３が可能性のある標的として言及されている。ＷＯ２０１１０５４００７は、ＲＯＲ１の細胞外ドメインに結合するアフィニティー試薬を投与する、がんの処置方法を対象とする。ＣＤ３との二特異性抗体も言及されている。ＷＯ２０１４０３１１７４では、ＲＯＲ１の２つの異なるエピトープに特異的な二特異性抗体について言及されている。好ましい抗体Ｄ１０は、ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１上皮乳腺癌において、３７℃で強力に内部化する。YangおよびBaskar  PLos  ONE  ６巻（２０１１年）ｅ２１０１８頁では、ＷＯ２０１２０７５１５８と同じく、抗ＲＯＲ１抗体Ｒ１２についても言及されている。Rebagay  R.ら、Frontiers  in  Oncology（２０１２年）７巻、論文番号３４、１〜８頁では、ＲＯＲが、医薬の標的であり、また、細胞傷害作用薬剤を、細胞表面上に標的を発現する細胞中に送達するための手段であることが言及されている。Rebagayは、ＢｉＴＥなどの二特異性抗体についても言及している。Rebagayによると、強力な内部化は、武装抗体、すなわち抗体薬物コンジュゲートに有利である。D.  MEZZANZANICAら、INTERNATIONAL  JOURNAL  OF  CANCER、４１巻（１９８８年）６０９〜６１５頁では、ＭＯｖ１８（ヒト卵巣癌細胞に特異的な、あまり内部化しない抗体）および抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３またはＴＲ６６）からなる二特異性抗体によってＣＴＬを再ターゲティングすることによる治療的手法が調査されている。M.HUDECEKら、BLOOD、１１６巻（２０１０年）、４５３２〜４５４１頁では、ＲＯＲ１がＢ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）およびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）により発現されることが言及されている。このような細胞は、マウス抗ＲＯＲ１抗体２Ａ２由来のｓｃＦｖをトランスフェクトし発現させた活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞によってターゲティングされうる。このような細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に有用である。Baskar  S.ら、mAbs  ４：３巻（２０１２年）３４９〜３６１頁は、ＰＥ３８毒素とコンジュゲートしたｓｃＦｖ  ２Ａ２抗ＲＯＲ１を含む免疫毒素ＢＴ−１を用いて悪性Ｂ細胞をターゲティングすることに関する。この免疫毒素は、部分的に内部化し、アポトーシスを誘導する。ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５７１９９は、ＣＤ３およびＲＯＲ１に対する二特異性抗体に関する。ＥＰ１４１８８３７８は、ＣＤ３およびＲＯＲ１に対する二特異性抗体の電荷変異体に関する。
【０００７】
Ｔリンパ球のＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ゼータ（ζ）、およびイータ（η）と標識されるＣＤ３の不変サブユニットと共に、細胞表面において共発現する、ＴＣＲアルファ（α）／ベータ（β）ヘテロ二量体またはＴＣＲガンマ（γ）／デルタ（δ）ヘテロ二量体からなる。ヒトＣＤ３εは、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されている。最先端技術において記載されている抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４（Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁）である。ＳＰ３４は、霊長動物ＣＤ３およびヒトＣＤ３のいずれとも反応する。ＳＰ３４は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（登録商標）から入手可能である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ−１（ＷＯ２００００４１４７４を参照されたい）である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ−３（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＧｖＨＤについてのフェーズＩ／ＩＩ試験において使用された；Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年））である。
【０００８】
最近では、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの、例えば、融合によって、多種多様な組換え二特異性抗体フォーマットが開発されている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁を参照されたい）。可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１を、互いに置きかえた二特異性抗体については、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２において記載されている。
【０００９】
誤対合副生成物の問題を回避する手法であって、「ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」として公知である手法は、接触界面を修飾するように、突然変異を、ＣＨ３ドメインへと導入することにより、２つの異なる抗体重鎖の対合を強いることを目的とする（Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，  Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，  Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ;およびＷＯ１９９６０２７０１１、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁；Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２７０巻（１９９７年）、２６〜３５頁、ＥＰ  １８７０４５９Ａ１、Ｘｉｅ，Ｚ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８６巻（２００５年）、９５〜１０１頁、ＷＯ２０１２１１６９２７、ＷＯ２０１０１４５７９２、ＷＯ２００９０８０２５４）。ＷＯ２００６０９３７９４は、ヘテロ二量体のタンパク質結合性組成物に関する。ＷＯ１９９９３７７９１は、多目的の抗体誘導体について記載している。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻（１９９８年）、２８０２〜２８０８頁は、可変領域ドメイン交換の、ＩｇＧの機能的特性に対する影響に言及している。
【００１０】
ＷＯ２０１３０２３６２は、ヘテロ二量体化されたポリペプチドに関する。ＷＯ２０１３１２７３３は、ヘテロ二量体のＦｃ領域を含むポリペプチドに関する。ＷＯ２０１２１３１５５５は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。ＥＰ２６４７７０７は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。ＷＯ２００９０８０２５１、ＷＯ２００９０８０２５２、ＷＯ２００９０８０２５３、ＷＯ２００９０８０２５４、およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁は、ドメインのクロスオーバーを伴う、二特異性の二価ＩｇＧ抗体に関する。
【００１１】
卵巣がんは、米国における婦人科がんによる死亡の主な原因であり、また、女性において、最も一般的ながんの第７位であり、最も一般的ながんによる死亡の原因の第８位である。２０１４年に米国において予測される卵巣がんの新規症例は、推定２１，９８０件であり、卵巣がんに関連する死亡は、１４，２７０件である。世界的には、ほぼ２２５，０００名の女性が卵巣がんと診断され、１４０，０００名超がこの疾患により死亡すると思われる（Cancer  Facts  &  Figures  2014；http://www.cancer.org）。卵巣がんの発生率は年齢と共に上昇し、７０代で有病率が最も高い。卵巣がんと診断される女性の約半分が６３歳またはそれ超である。卵巣がんは、通常、予後が比較的不良である。限局性の段階で診断された場合には５年生存率が９２％であるが、この段階で検出されるのは全症例の１５％に過ぎない。大多数の症例（６１％）は、疾患が既に転移した後に診断される。遠隔転移の診断を受けた女性については、５年生存率は２７％である。過去２０年にわたる外科手術および化学療法の進歩にも拘らず、卵巣がんの患者における全生存の改善に関してはわずかな進展しか得られていない。進行卵巣がんを有する大多数の女性は第一選択の化学療法に応答するが、ほとんどの応答は長続きしない。患者の８０％超に、第一選択の処置後に疾患が再発し、５０％超が、診断されてから５年以内に再発疾患により死亡する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ）。標的療法は、薬物または他の物質を使用してがん細胞を同定および攻撃するが、正常細胞にはほとんど損傷を与えない、より新しい型のがん治療である。卵巣がんにおいて最も研究されている標的療法薬はベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））である。ベバシズマブは、進行卵巣がんの成長を縮小するまたは遅くすることが研究において示されている。ベバシズマブが、化学療法と共にもたらされた場合により一層良好に働くかどうかを検討するための試験では、腫瘍の縮小（または腫瘍の成長の阻止）については良好な結果が示されているが、女性の寿命を延ばすことへの補助は未だ示されていない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒ）。
【００１２】
したがって、卵巣がんの処置のための、さらなる手法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００９／０８０２５４号
【特許文献２】国際公開第２００６／０９３７９４号
【特許文献３】国際公開第１９９９／３７７９１号
【特許文献４】国際公開第２０１３／０２３６２号
【特許文献５】国際公開第２０１３／１２７３３号
【特許文献６】国際公開第２０１２／１３１５５５号
【特許文献７】欧州特許出願公開第２６４７７０７号明細書
【特許文献８】国際公開第２００９／０８０２５１号
【特許文献９】国際公開第２００９／０８０２５２号
【特許文献１０】国際公開第２００９／０８０２５３号
【特許文献１１】国際公開第２００９／０８０２５４号
【特許文献１２】欧州特許出願公開第１８７０４５９号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ  Ｐ、Ｃａｒｒｏｌｌ  Ｒ．Ｄ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７巻：２６１８１〜２６１９０頁（１９９２年）「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ」
【非特許文献２】Ｒａｂｂａｎｉ、Ｂｌｏｏｄ（ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）２０１０年１１６巻：要約９１６
【非特許文献３】Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈ  ＡＨら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、１２３巻（２００８年）１１９０〜１１９５頁
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇ  Ｈ．ら、ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＲＥＰＯＲＴＳ、４巻：５８１１頁、ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０５８１１（２０１４年７月２４日）
【非特許文献５】ＹａｎｇおよびＢａｓｋａｒ  ＰＬｏｓ  ＯＮＥ  ６巻（２０１１年）ｅ２１０１８頁
【非特許文献６】Ｒｅｂａｇａｙ  Ｒ．ら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１２年）７巻、論文番号３４、１〜８頁
【非特許文献７】Ｄ．  ＭＥＺＺＡＮＺＡＮＩＣＡら、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＡＮＣＥＲ、４１巻（１９８８年）６０９〜６１５頁
【非特許文献８】Ｍ．ＨＵＤＥＣＥＫら、ＢＬＯＯＤ、１１６巻（２０１０年）、４５３２〜４５４１頁
【非特許文献９】Ｂａｓｋａｒ  Ｓ．ら、ｍＡｂｓ  ４：３巻（２０１２年）３４９〜３６１頁
【非特許文献１０】Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁
【非特許文献１１】Ａｎａｓｅｔｔｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年）
【非特許文献１２】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁
【非特許文献１３】Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ＡＭら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁
【非特許文献１４】Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２７０巻（１９９７年）、２６〜３５頁
【非特許文献１５】Ｘｉｅ，Ｚ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８６巻（２００５年）、９５〜１０１頁
【非特許文献１６】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻（１９９８年）、２８０２〜２８０８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、卵巣がんの処置における使用のための、２つの標的、ヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（さらにまた、「ＲＯＲ１」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体に関する。処置は、卵巣がんを患う患者において行われる。
【００１６】
本発明は、卵巣がんを患う患者における卵巣がんの処置のための、２つの標的、ヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（さらにまた、「ＲＯＲ１」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体の使用に関する。
【００１７】
本発明は、卵巣がんを患う患者において卵巣がんを処置する方法であって、治療有効量の、２つの標的、ヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（さらにまた、「ＲＯＲ１」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体を投与するステップを含む方法に関する。
【００１８】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体の１つのＦａｂ断片（ＣＤ３  Ｆａｂ）と、抗ＲＯＲ１抗体の１つまたは２つのＦａｂ断片（ＲＯＲ１  Ｆａｂ）と、０または１つのＦｃ断片とからなることを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、三価であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する二価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の一価Ｆａｂ断片とを含むことを特徴とすることが好ましい。
【００１９】
ＣＤ３  Ｆａｂの軽鎖および重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置きかえられていることが好ましい（ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂ）。ＣＤ３  Ｆａｂは、Ｎ末端において、ＲＯＲ１  ＦａｂのＣ末端に連結されている。ＣＤ３  ＦａｂのＶＨドメインは、Ｎ末端において、ＲＯＲ１  ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端に連結されていることが好ましい。Ｆｃパートは、そのヒンジ領域を介して、それぞれのＦａｂのＣ末端に連結されている。本発明に従って使用される二特異性抗体は、構築物、
ａ）ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ、
ｂ）ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ、
ｃ）Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ、および
ｄ）ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ
の群から選択されることが好ましい。
【００２０】
好ましい構築物は、ＣＤ３  Ｆａｂとして、ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂを含む。構築物ｂ）およびｄ）の２つのＲＯＲ１  Ｆａｂは、同じ抗ＲＯＲ１抗体に由来し、少なくとも、同じＣＤＲまたは同じＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬドメインを含む。
【００２１】
好ましい二特異性抗体を図１に示す。
【００２２】
構築物は、配列番号３０〜３６の構成ブロックから構成される。したがって、本発明は、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、および３６のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド、それぞれの核酸、および構築物の調製のためのそれらの使用を含む。
【００２３】
本発明はさらに、
ａ）構成ブロック、配列番号３０（２×）、３１、３２、および３３からなる構築物（図１Ａ）
ｂ）構成ブロック、配列番号３０、３１、３３、および３６からなる構築物（図１Ｂ）
ｃ）構成ブロック、配列番号３０（２×）、３３、および３５からなる構築物（図１Ｃ）
ｄ）構成ブロック、配列番号３０、３３、および３４からなる構築物（図１Ｄ）
の群から選択される構築物にも関する。
【００２４】
さらなる実施形態では、配列番号３１、３３、３４、３５内のＣＤ３  Ｍａｂ配列（ＶＨおよび／またはＶＬ）が、配列番号２１および２２のそれぞれのＶＨおよび／またはＶＬ配列により置きかえられている。
【００２５】
本発明は、２つの標的、ヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（さらにまた、「ＲＯＲ１」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体であって、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用し、１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される二特異性抗体のＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合の際における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する、二特異性抗体に関する。
【００２６】
あるいは、二特異性抗体は、Ｆａｂの代わりに、同じドメインからなる単鎖を含みうる。このような場合では、可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置きかえられていない。
【００２７】
本発明のさらに好ましい実施形態では、二特異性抗体は、単鎖抗体である。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、二特異性抗体は、単一のポリペプチド鎖上に２つの抗体可変ドメインを含み、二特異性抗体の第１の部分は、１つの抗体可変ドメインからなり、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによりヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することが可能であり、二特異性抗体の第２の部分は、ＲＯＲ１に特異的に結合することが可能である。第２の部分は、抗ＲＯＲ１抗体可変ドメインを１つ含むことが好ましい。第２の部分は、抗ＲＯＲ１抗体可変ドメインを２つ含むことが好ましい。前記第１の部分は、ヒトＣＤ３εに特異的に結合することが好ましい。
【００２９】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価抗体であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。二価抗体は、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価抗体であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体は、Ｆａｂ断片、好ましくは、ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂであることが好ましい。このような二価抗体は、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、三価抗体であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する二価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体は、Ｆａｂ断片または好ましくは、ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂであることが好ましい。三価抗体は、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないものであれば、好ましい。
【００３０】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、３７℃で２４時間の間、内部化しないことを特徴とすることが好ましい。
【００３１】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの間の濃度で使用した場合、内部化しないことが好ましい。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、表面プラズモン共鳴を使用してＫｄ値により決定される、ＲＯＲ１とＣＤ３のアフィニティー比が５０００：１〜５：１である、本発明に従って使用される抗体である。このような抗体は、悪性細胞への結合がＴ細胞よりも強力であるので、好都合である。Ｋｄ値は、ＣＤ３抗体については約１００ｎＭであり、ＲＯＲ１抗体については約５０ｐＭ〜５０ｎＭであることが好ましい。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＣＤ３−Ｆａｂ」とも称する）と、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」とも称する）と、Ｆｃパートとからなり、ＣＤ３−ＦａｂおよびＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている（図１Ｅ）。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、ＣＤ３−ＦａｂおよびＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている１つのＣＤ３−Ｆａｂと、１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、前記Ｆｃパートと、Ｃ末端によりＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結された第２のＲＯＲ１−Ｆａｂとからなる。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含む（図１Ａ）。ＲＯＲ１−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＲＯＲ１−Ｆａｂを含む二特異性抗体であって、ＣＤ３−Ｆａｂが、ＣＬ／ＣＨ１クロスオーバーを含む二特異性抗体がとりわけ好ましい（図１Ａ）。両方のＲＯＲ１−ＦａｂがＣＤＲとして抗体ＭＡＢ１のＣＤＲ、またはＶＨ／ＶＬとして、ＭＡＢ１のＶＨ／ＶＬを含むことが、とりわけ好ましい。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、２つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、Ｆｃパートとからなり、ＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域およびそのＣ末端により１つのＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂへと連結されている。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含む（図１Ｆ）。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、そのＣ末端を介して前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された１つのＣＤ３−Ｆａｂと、そのＣ末端によりＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＲＯＲ１−Ｆａｂとからなる。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含む（図１Ｂ）。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従って使用される抗体は、そのＣ末端を介して前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、そのＣ末端によりＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂとからなる。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含む（図１Ｇ）。
【００３８】
Ｆａｂ断片は、最先端技術に従う、適切なリンカーの使用により、一緒に化学的に連結される。適切なリンカーは、例えば、ＵＳ２０１４０２４２０７９に記載される。（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）２（配列番号１９）リンカーを使用することが好ましい（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ  ＤＫら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ.、１９９４年８月、７巻（８号）：１０２７〜３３頁；およびMack  M.ら、PNAS、１９９５年７月１８日、９２巻、１５号、７０２１〜７０２５頁）。２つのＦａｂ断片の間の連結は、重鎖の間で実施する。したがって、第１のＦａｂ断片のＣＨ１のＣ末端を、第２のＦａｂ断片のＶＨのＮ末端（クロスオーバーなし）、またはＶＬ（クロスオーバー）へと連結する。Ｆａｂ断片とＦｃパートとの間の連結は、ＣＨ１とＣＨ２との間の連結として実施する。
【００３９】
ＲＯＲ１に特異的に結合する、抗体の第１および第２のＦａｂ断片は、同じ抗体に由来することが好ましく、ＣＤＲ配列、可変ドメイン配列ＶＨおよびＶＬ、ならびに／または定常ドメイン配列ＣＨ１およびＣＬが同一であることが好ましい。ＲＯＲ１に特異的に結合する、抗体の第１および第２のＦａｂ断片のアミノ酸配列は、同一であることが好ましい。ＲＯＲ１抗体は、抗体ＭＡＢ１のＣＤＲ配列を含む抗体、抗体ＭＡＢ１のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体、または抗体ＭＡＢ１のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬ配列を含む抗体であることが好ましい。
【００４０】
二特異性抗体は、Ｆａｂ断片およびＦｃパートとして、抗ＣＤ３抗体の１つを超えないＦａｂ断片、抗ＲＯＲ１抗体の２つを超えないＦａｂ断片、および１つを超えないＦｃパート、好ましくは、ヒトＦｃパートを含むことが好ましい。抗ＲＯＲ１抗体の第２のＦａｂ断片は、そのＣ末端を介して、抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片のＮ末端、またはＦｃパートのヒンジ領域のいずれかへと連結されていることが好ましい。連結は、ＲＯＲ１−ＦａｂのＣＨ１とＣＤ３−ＦａｂのＶＨとの間で実施する（ＣＬ／ＣＨ１クロスオーバー）ことが好ましい。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態では、本発明に従う二特異性抗体は、
ａ）構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂの二特異性抗体であり、
ｂ）抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片内に、ＣＬ／ＣＨ１クロスオーバーを含み、
ｃ）ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートを含み、
ｄ）Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンによる置換ならびにＬｅｕ２３４のアラニンによる置換およびＬｅｕ２３５のアラニンによる置換を含む。
【００４２】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号１２、１３、および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号１５、１６、および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることが好ましい。ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分は、可変ドメインが、配列番号１０および１１（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の可変ドメインであることを特徴とすることが好ましい。
【００４３】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号２３、２４、および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号２６、２７、および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることが好ましい。ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分は、可変ドメインが、配列番号２１および２２（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３）の可変ドメインであることを特徴とすることが好ましい。
【００４４】
ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する、抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号９のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨを含むことと、軽鎖ＣＤＲ、配列番号３のＣＤＲ１Ｌ、配列番号４のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬを含むこととを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ１）ことが好ましい。
【００４５】
ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号６のＶＨと配列番号２のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１）ことが好ましい。
【００４６】
本発明はさらに、それぞれの重鎖および軽鎖セットをコードする核酸セットにも関する。
【００４７】
ＩｇＧ１サブクラスの定常重領域ＣＨ２／ＣＨ３を含む本発明に従って使用される二特異性抗体は、ＦｃＲおよびＣ１ｑへの結合を回避し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを最小化するように、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ２３９Ｇ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、Ｔ細胞をリダイレクションし／活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびＦｃＲを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
【００４８】
本発明に従って使用される抗体は、配列番号３７の（Ｎ末端からＣ末端へ）ＶＨ（ＲＯＲ１）−ＣＨ１（ＲＯＲ１）−ＶＨ（ＣＤ３）−ＣＬ（ＣＤ３）−ＣＨ２−ＣＨ３からなる抗体の重鎖のほか、それぞれのコード核酸も含むことが好ましい。これらのポリペプチドおよびそれぞれの核酸は、本発明に従って使用される二特異性抗体を作製するために有用である。
【００４９】
本発明に従って使用される二特異性抗体のＣＤＲの外部におけるアミノ酸（ａａ）交換（「電荷変異体」とさらに言及される）は、ＲＯＲ１への結合などの生物学的特性を変化させずに、作製／精製の大幅な改善をもたらす。アミノ酸交換（電荷変異体）を導入することにより、軽鎖ＬＣの誤対合および作製時における副産物の形成が有意に低減され、したがって、精製が容易になる。
【００５０】
本発明は、２つの標的、ヒトＣＤ３ε、およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する、内部化しない二特異性抗体の使用に関することが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、１ｎＭの濃度で、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用し、１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とすることが好ましく、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される二特異性抗体の、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合時における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する。
【００５１】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価抗体であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。二価抗体は、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、二価抗体であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体は、Ｆａｂ断片、好ましくは、ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂであることが好ましい。このような二価抗体は、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従って使用される二特異性抗体は、三価抗体であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する二価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体は、Ｆａｂ断片または好ましくは、ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂであることが好ましい。三価抗体は、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないものであれば、好ましい。
【００５２】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、３７℃で２４時間の間、内部化しないことが好ましい。
【００５３】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの間の濃度で使用した場合、内部化しないことが好ましい。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態は、表面プラズモン共鳴を使用してＫｄ値により決定される、ＲＯＲ１とＣＤ３のアフィニティー比が５０００：１〜５：１である、本発明に従って使用される抗体である。このような抗体は、悪性細胞への結合がＴ細胞よりも強力であるので、好都合である。Ｋｄ値は、ＣＤ３抗体については約１００ｎＭであり、ＲＯＲ１抗体については約５０ｐＭ〜５０ｎＭであることが好ましい。
【００５５】
ＣＤ３に特異的に結合する抗体部分は、ヒト化されていることを特徴とすることが好ましい。本発明に従うＣＤ３  Ｍａｂは、抗体Ｈ２Ｃ（ＷＯ２００８１１９５６７において記載されている）および／もしくは抗体ＣＨ２５２７（ＷＯ２０１３０２６８３９において記載されている）と同じＣＤ３εのエピトープに結合するか、または好ましくは抗体Ｈ２ＣもしくはＣＨ２５２７であることが好ましい。
【００５６】
ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、それぞれの可変軽鎖ＣＤＲとして配列番号３、４、５のＣＤＲを含み、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が、それぞれの可変重鎖ＣＤＲとして配列番号７、８、９のＣＤＲを含むことを特徴とすることが好ましい。ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２の配列と少なくとも９０％同一である配列、および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号６の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むことを特徴とすることが好ましい。ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２の配列、および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号６の配列を含むことを特徴とすることが好ましい。ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分は、ヒト化されていることを特徴とすることが好ましい。本発明に従って使用されるＲＯＲ１  Ｍａｂは、上で記載したＭａｂと同じＲＯＲ１のエピトープに結合することが好ましい。
【００５７】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、宿主細胞を、それぞれの抗体または断片をコードする核酸分子を含む１つまたは複数のベクターで形質転換するステップと、宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップとによって生成される。
【００５８】
本発明に従って使用される二特異性抗体を調製するための方法は、
ａ）宿主細胞を、本発明に従って使用される抗体の重鎖および軽鎖のセットをコードする核酸分子を含む１つまたは複数のベクターで形質転換するステップと、
ｂ）宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含むことが好ましい。
【００５９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従って使用される抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞である。
【００６０】
本発明のさらなる実施形態は、第１の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターと、第２の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターとを含む宿主細胞であって、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置きかえられている宿主細胞である。
【００６１】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、このような抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００６２】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、医薬としての使用のための、本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。本発明のさらなる好ましい実施形態は、ＲＯＲ１陽性卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。ＲＯＲ１は、ヒト卵巣がんにおいて、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで発現される（Zhang  H.ら、Scientific  Reports、４巻：５８１１頁、DOI:  10.1038/srep05811（２０１４年７月２４日）。本発明のさらなる実施形態は、ＲＯＲ１を発現する卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。本発明の好ましい実施形態は、卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。
【００６３】
本発明のさらなる実施形態は、このような処置のための、本発明に従う抗体または本発明に従う医薬組成物の使用である。
【００６４】
本発明に従う抗体または医薬組成物は、週１回または週２回、好ましくは、皮下投与によって（例えば、好ましくは、週１回または週２回、０．１〜１０ｍｇ／ｍ２の用量範囲で）投与することが好ましい。本発明に従う抗体は、細胞傷害作用活性が優れているので、Ｔ細胞二特異性ではない（すなわち、１つのアーム上のＣＤ３に結合しない）従来の単一特異性抗体または従来の二特異性抗体と比較して、より小さな大きさの臨床的用量範囲で投与することができる。本発明に従う抗体に関して、皮下投与が臨床状況において好ましいことが想定される（例えば、週１回または週２回、０．１〜１０ｍｇ／ｍ２の用量範囲で）。本発明に従う抗体は、週に少なくとも１回または２回の投与を可能にする、およそ数日の半減期で消失する。本発明に従う抗体の別の利点は、分子量（すなわち、およそ１５０〜２００ｋＤａ）が腎臓での濾過のサイズ限界（５０〜７０ｋＤａ）よりも大きいことである。この分子量は、長い消失半減期を可能とし、週１回または週２回の皮下投与を可能とする。
【００６５】
本発明に従う抗体は、１ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量で、週２回または週に１回、静脈内（ｉ．ｖ．）、または皮下（ｓ．ｃ.）、または腹腔内（ｉ．ｐ．）投与され、好ましくは、０．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ.またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ.またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは、０．０５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ.またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは、５μｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ.またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、ＲＯＲ１発現卵巣腫瘍細胞系（例えば、ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、ＳＷ−６２６）（好ましくはＰＡ−１および／またはＣＯＬＯ−７０４）を用いた異種移植モデルにおいて、７０％を超え、好ましくは８５％を超え、好ましくは１００％に近い腫瘍成長の阻害を示すことにより特徴付けられることが好ましい。
【００６６】
本発明に従う抗体は、マウス、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、１２時間より長い、好ましくは、３日間またはそれより長い消失半減期により特徴付けられることが好ましい。
【００６７】
本発明に従う抗体は、ＲＯＲ１陽性卵巣がん細胞系（例えば、ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、ＳＷ−６２６）、好ましくは、ＰＡ−１および／またはＣＯＬＯ−７０４への結合についてのＥＣ５０値であって、３０ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、１５ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とすることが好ましい。
【００６８】
本発明に従う抗体は、ヒトＴ細胞の存在下における、ＲＯＲ１を発現する卵巣腫瘍細胞（例えば、ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、ＳＷ−６２６）、好ましくは、ＰＡ−１および／またはＣＯＬＯ−７０４のリダイレクトされた殺滅を、１０ｎＭ未満、好ましくは、１ｎＭ、好ましくは、０．０５ｎＭ、好ましくは、０．０２ｎＭ、好ましくは、０．００２ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力によって特徴付けられることが好ましい。
【００６９】
本発明に従う抗体は、標準的な製剤緩衝液中、３７℃で、好ましくは、４０℃で、１０日間、好ましくは、最長２週間、好ましくは、最長４週間、保存された前記抗体が、高分子量（ＨＭＷ）分子種および／または低分子量（ＬＭＷ）分子種および／または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−８０℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、１０％を超える変化（Δ）、好ましくは、５％を超える変化（Δ）を結果としてもたらさないことを特徴とすることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜Ｇ。Ｆａｂ断片（ＣＤ３およびＲＯＲ１に対して特異的である）を含む、（１Ａ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｂ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｃ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｄ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｄ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｆ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｇ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１として明記される好ましい二特異性抗体。Ｆａｂ  ＣＤ３は、ＬＣ誤対合および副産物（ｓｉｄｅ−ｐｒｏｄｕｃｔ）を低減するように、ＣＨ１−ＣＬクロスオーバーＬＣを含むことが好ましい。Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＲＯＲ１は、可撓性のリンカーにより、互いに連結される。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ａ〜Ｇ。Ｆａｂ断片（ＣＤ３およびＲＯＲ１に対して特異的である）を含む、（１Ａ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｂ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｃ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｄ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｄ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｆ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｇ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１として明記される好ましい二特異性抗体。Ｆａｂ  ＣＤ３は、ＬＣ誤対合および副産物（ｓｉｄｅ−ｐｒｏｄｕｃｔ）を低減するように、ＣＨ１−ＣＬクロスオーバーＬＣを含むことが好ましい。Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＲＯＲ１は、可撓性のリンカーにより、互いに連結される。
【図１Ｅ−Ｇ】図１Ａ〜Ｇ。Ｆａｂ断片（ＣＤ３およびＲＯＲ１に対して特異的である）を含む、（１Ａ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｂ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｃ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｄ）Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｄ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｆ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｇ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１として明記される好ましい二特異性抗体。Ｆａｂ  ＣＤ３は、ＬＣ誤対合および副産物（ｓｉｄｅ−ｐｒｏｄｕｃｔ）を低減するように、ＣＨ１−ＣＬクロスオーバーＬＣを含むことが好ましい。Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＲＯＲ１は、可撓性のリンカーにより、互いに連結される。
【００７１】
【図２】抗体濃度の関数として、蛍光強度シグナル中央値の増大によって測定される、ＲＯＲ１  ＩｇＧ（ＲＯＲ１  Ｍａｂ１、白抜き記号）および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（ＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢ、塗りつぶし記号）の、卵巣がん細胞系ＳＫ−ＯＶ−３（Ａ）およびＰＡ−１（Ｂ）への結合。ＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞系およびＰＡ−１卵巣がん細胞系の両方で試験した、ＣＤ３だけに結合し、ＲＯＲ１に結合しない対照ＴＣＢでは、シグナルは観察されなかった（ＡおよびＢ；塗りつぶし丸）。
【００７２】
【図３】抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への結合。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞においてＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢ（四角）および対照ＴＣＢ（丸）の濃度依存的結合が観察され、これにより、どちらのＴＣＢ抗体もＴ細胞上のＣＤ３に結合することが確認される。
【００７３】
【図４】卵巣がん標的細胞の存在下での、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によるＴ細胞の活性化マーカーの上方調節。活性化マーカーの発現を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団に対してゲーティングした場合の蛍光強度中央値を測定することにより決定した。ＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３標的細胞の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）において観察された、ＣＤ６９早期活性化マーカーの濃度依存的な増大を誘導したのに対し、対照ＴＣＢ（三角形）は、Ｔ細胞の活性化を少しも誘導しなかった。臨床的に関与性の濃度である１ｎＭのＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢにおいて、４８時間のインキュベーション後、最大２５％の活性化ＣＤ４  Ｔ細胞および２０％の活性化ＣＤ８  Ｔ細胞が既に存在していた。
【００７４】
【図５ＡＢ】異なるレベルの、表面ＲＯＲ１：発現が高度なＰＡ−１（Ａ）、発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５（Ｃ）、および発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３（Ｄ）を用いた、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＯＲ１陽性卵巣がん標的細胞の殺滅。ＰＢＭＣ、１０：標的細胞、１のエフェクター細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞の特異的な細胞傷害作用（腫瘍溶解）をＬＤＨ放出によって測定した（４８時間培養）。０．５ｐＭから５０ｎＭまでの増大する濃度で、濃度依存的な応答が見られた。ＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が高度なＰＡ−１卵巣がん細胞（Ａ）、ＲＯＲ１の発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４卵巣がん細胞（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５卵巣がん細胞（Ｃ）、ならびにＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞（Ｄ）の腫瘍細胞溶解の濃度依存的な増大を誘導した。対照的に、ＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ（Ａ、Ｂ、Ｃ；丸）は、臨床的に関与性の濃度（すなわち、最大１０ｎＭ）において腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。代表的な実験を示す。
【図５ＣＤ】異なるレベルの、表面ＲＯＲ１：発現が高度なＰＡ−１（Ａ）、発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５（Ｃ）、および発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３（Ｄ）を用いた、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＯＲ１陽性卵巣がん標的細胞の殺滅。ＰＢＭＣ、１０：標的細胞、１のエフェクター細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞の特異的な細胞傷害作用（腫瘍溶解）をＬＤＨ放出によって測定した（４８時間培養）。０．５ｐＭから５０ｎＭまでの増大する濃度で、濃度依存的な応答が見られた。ＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が高度なＰＡ−１卵巣がん細胞（Ａ）、ＲＯＲ１の発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４卵巣がん細胞（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５卵巣がん細胞（Ｃ）、ならびにＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞（Ｄ）の腫瘍細胞溶解の濃度依存的な増大を誘導した。対照的に、ＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ（Ａ、Ｂ、Ｃ；丸）は、臨床的に関与性の濃度（すなわち、最大１０ｎＭ）において腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。代表的な実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
（発明の詳細な説明）
本明細書で使用される「ＲＯＲ１」という用語は、チロシン−プロテインキナーゼ受容体である、ヒトＲＯＲ１（同義語：チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１、ＥＣ＝２．７．１０．１、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ０１９７３）に関する。ＲＯＲ１の細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔに従い、アミノ酸３０〜４０６からなる。本明細書で使用される「ＲＯＲ１に対する抗体、抗ＲＯＲ１抗体またはＲＯＲ１  Ｍａｂ」という用語は、ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する抗体に関する。この抗体は、ＲＯＲ１の細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸Ｍ１〜Ｖ４０６）に特異的に結合する。この抗体は、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン（配列番号１のアミノ酸Ｑ７３〜Ｖ１３９）、ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン（配列番号１のアミノ酸Ｅ１６５〜Ｉ２９９）、またはクリングルドメイン（配列番号１のアミノ酸Ｋ３１２〜Ｃ３９１）である、細胞外ドメインの断片に特異的に結合する。これらの断片は、ＷＯ２００５１００６０５において言及されている。この抗体は、ＲＯＲ１の細胞外ドメイン断片ＷＮＩＳＳＥＬＮＫＤＳＹＬＴＬ（配列番号１８）に特異的に結合することがさらに好ましい。この断片は、Daneshmanesh  AHら、Int.  J.  Cancer、１２３巻（２００８年）１１９０〜１１９５頁において言及されている。
【００７６】
本明細書で使用される「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されているヒトＣＤ３εに関する。「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに結合する抗体に関する。抗体は、配列番号１２、１３、および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号１５、１６、および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号１０（ＶＨ）および配列番号１１（ＶＬ）の可変ドメインを含むことが好ましい。抗体は、配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号２１（ＶＨ）および配列番号２２（ＶＬ）の可変ドメインを含むことが好ましい。
【００７７】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、ＣＤ３の代わりに、異なる標的に特異的に結合することができ、これも、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによりヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することが可能である。
【００７８】
「ＣＤ３またはＲＯＲ１に特異的に結合すること」とは、抗体が、ＣＤ３またはＲＯＲ１のターゲティングにおいて治療剤として有用であるように、ＣＤ３またはＲＯＲ１（標的）に、十分なアフィニティーで結合することが可能な抗体を指す。一部の実施形態では、抗ＣＤ３またはＲＯＲ１抗体が、無関係なＣＤ３以外またはＲＯＲ１以外のタンパク質に結合する程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定される場合、抗体のＣＤ３またはＲＯＲ１への結合の約１０分の１、好ましくは、１００分の１未満である。ＣＤ３またはＲＯＲ１に結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１０−８Ｍまたはそれ未満、好ましくは、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、好ましくは、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍであることが好ましい。本発明に従う二特異性抗体は、異なる種に由来するＲＯＲ１の間で保存されているＲＯＲ１のエピトープおよび／または異なる種に由来するＣＤ３の間、好ましくは、ヒトおよびカニクイザルの間で保存されているＣＤ３のエピトープに結合することが好ましい。「ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合する二特異性抗体」または「本発明に従う抗体」とは、両方の標的への結合についてのそれぞれの定義を指す。ＲＯＲ１（またはＣＤ３またはＲＯＲ１およびＣＤ３）に特異的に結合する抗体は、他のヒト抗原に結合しない。したがって、ＥＬＩＳＡでは、このような無関係な標的についてのＯＤ値は、特異的なアッセイの検出限界のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満、好ましくは、１．５ｐＭと等しいかもしくはそれ未満、またはＲＯＲ１をプレートに結合させていないか、もしくはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしていない対照試料のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満である。
【００７９】
本発明に従う抗体は、プレートに結合させたＲＯＲ１を使用する、ヒトＲＯＲ１への結合についてのＥＬＩＳＡにより解析する。このアッセイでは、好ましくは、１．５ｎＭの量のプレートに結合させたＲＯＲ１と、好ましくは、１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の濃度の抗ＲＯＲ１抗体を使用する。そのＲＯＲ１結合が、ＲＯＲ１をプレートに結合させていないか、または本発明に従うＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしていない対照試料のＯＤ値よりも少なくとも２０％高い本発明に従う抗体は、「ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒトＲＯＲ１に結合する」抗体である。
【００８０】
本明細書で使用される「内部化しない、本発明に従う抗体」という用語は、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用して、および１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とするＭＦＩ低減特性を有する、本発明に従う二特異性抗体を意味し、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減せず、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する。本発明に従う二特異性抗体は、ＲＯＲ１陽性Ｂ−ＣＬＬ細胞において内部化しない、したがって、前記抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１陽性Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合は、本明細書に記載の細胞ベースのアッセイにおいて、前記抗体を３７℃で２時間インキュベートしたした場合に、５０％を超えて低減せず、好ましくは、３０％を超えて低減しない。
【００８１】
本発明に従う二特異性抗体はまた、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用して、および１ｎＭの抗体濃度で、３７℃で２時間の間に、フローサイトメトリーにより測定される、３７℃で０時間から２時間までの内部化による平均蛍光強度の低減（ΔＭＦＩ）が、同じ濃度および実験条件における、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２の配列および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号６の配列を含むヒトＩｇＧ１カッパ（κ）型の抗ＲＯＲ１二価抗体のΔＭＦＩの、１２０％〜０％の間、好ましくは、１００％〜０％であることも好ましい。
【００８２】
抗ＲＯＲ１抗体を含むＴ細胞二特異性抗体を使用する治療では、上で定義した通り、腫瘍細胞とＴ細胞の間の安定な免疫シナプスおよび有効なＴ細胞媒介性のリダイレクトされた細胞傷害作用を容易にするために、抗体は内部化しないことが好ましい。
【００８３】
本明細書で使用される、「前記抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１陽性細胞への内部化」を反映する「平均蛍光強度の低減」（ΔＭＦＩ）、または「ＭＦＩ低減」という用語は、式ΔＭＦＩ＝１００−１００×［（ＭＦＩ実験値−ＭＦＩバックグラウンド）／（ＭＦＩ最大−ＭＦＩバックグラウンド）］を使用することにより、各ＲＯＲ１抗体について、非特異的なヒトＩｇＧ対照（ＭＦＩバックグラウンド）および氷上で維持されたＲＯＲ１抗体（ＭＦＩ最大）と比較して計算されるＭＦＩ低減の百分率を指す。ＭＦＩ実験値は、３７℃で２時間のインキュベーション後の前記ＲＯＲ１抗体で測定されるＭＦＩである。１０μＭのエンドサイトーシス阻害剤フェニルアルシンオキシドによって少なくとも７５％遮断および反転されるＭＦＩ低減は、例えば、抗体内部化によって引き起こされるのに対し、フェニルアルシンオキシドにより遮断されないＭＦＩ低減は、抗体解離によって引き起こされる。内部化する抗ＲＯＲ１抗体は最先端技術において公知である（Baskarら、Clin.  Cancer  Res.、１４巻（２号）：３９６〜４０４頁（２００８年））。
【００８４】
本発明に従う二特異性抗体は、３μＭのフェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）の存在下で２時間の時点のＭＦＩ値の、ＰＡＯの非存在下における２時間の時点のＭＦＩ値と比較した増大が、３０％を超えない、好ましくは、２０％を超えない、好ましくは、１０％を超えない、さらには、０時間におけるＭＦＩ値の検出レベルを超えないことを特徴とすることが好ましい。
【００８５】
本明細書で使用される「標的」という用語は、ＲＯＲ１またはＣＤ３のいずれかを意味する。「第１の標的および第２の標的」という用語は、第１の標的としてのＣＤ３、および第２の標的としてのＲＯＲ１を意味するか、または、第１の標的としてのＲＯＲ１、および第２の標的としてのＣＤ３を意味する。
【００８６】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体を指す。抗体は、「軽鎖」（ＬＣ）および「重鎖」（ＨＣ）の２つの対（本明細書では、このような軽鎖（ＬＣ）／重鎖対を、ＬＣ／ＨＣと略記する）からなる。このような抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（抗体クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ）、任意選択で重鎖定常ドメインＣＨ４（抗体クラス：ＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む。可変ドメインＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられる超可変領域であって、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられる、より保存的な領域を散在させた、超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並べられる、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の「定常ドメイン」は、抗体の、標的への結合に直接は関与しないが、多様なエフェクター機能を呈示する。
【００８７】
本明細書で使用される「抗体の軽鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＶＬ−ＣＬと略記される、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「クロスオーバー軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」とは、ＶＬドメインを、それぞれのＶＨドメインで置きかえた軽鎖である。本明細書で使用される「抗体の重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「クロスオーバー重鎖（ＶＬ−ＣＨ１）」とは、ＶＨドメインを、それぞれのＶＬドメインで置きかえた重鎖である。
【００８８】
ヘテロ二量体化を強化する、ＣＨ３修飾のためのいくつかの手法であって、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２０５８７６８、ＷＯ２０１３１５７９５４、ＷＯ２０１３０９６２９１において十分に記載されている手法が存在する。このような手法のいずれにおいても、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインの両方を、各ＣＨ３ドメイン（またはそれを含む重鎖）がもはや、それ自身とホモ二量体化することができず、操作された相補的な他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化することを強いられるように（第１のＣＨ３ドメインと、第２のＣＨ３ドメインとが、ヘテロ二量体化し、２つの第１のＣＨ３ドメインまたは２つの第２のＣＨ３ドメインの間でホモ二量体が形成されないように）相補的な形で操作することが典型的である。重鎖のヘテロ二量体化を改善するためのこれらの異なる手法は、本発明に従う抗体内で、重鎖−軽鎖修飾（１つの結合性アーム内のＣＨ１およびＶＨの交換／置きかえ）と組み合わせた異なる代替法であって、軽鎖の誤対合を低減する代替法として想定されている。
【００８９】
本発明の好ましい一実施形態では（本発明に従う抗体が、重鎖内にＣＨ３ドメインを含む場合には）、本発明に従う前記多特異性抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻（１９９６年）、６１７〜６２１頁；およびＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁；ＷＯ９８／０５０４３１において、いくつかの例と共に、詳細に記載されている、「ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」技術により変更することができる。この方法では、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増大させるように、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を変更する。２つのＣＨ３ドメイン（２つの重鎖の）の各々を「ノブ」としうる一方で、他は「ホール」となる。
【００９０】
こうして、本発明の一実施形態では、本発明に従う前記抗体は（各重鎖内にＣＨ３ドメインを含み）、ａ）抗体の第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインおよびｂ）抗体の第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、本発明に従う抗体の形成を促進するように変更されていることもさらに特徴とし、前記変更は、
ｉ）本発明に従う抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｉｉ）本発明に従う抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする。
【００９１】
より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されることが好ましい。
【００９２】
本発明の一態様では、両方のＣＨ３ドメインは、両方のＣＨ３ドメインの間でジスルフィド架橋が形成されうるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入により、さらに変更されている。
【００９３】
ヘテロ二量体化を強化する、ＣＨ３修飾のための他の技法も、本発明の代替法として想定されており、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４、ＷＯ２０１３／１５７９５３、ＷＯ２０１３／０９６２９１において記載されている。
【００９４】
一実施形態では、本発明に従う抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体であり、ＷＯ２０１０／１２９３０４において記載されているヘテロ二量体化法を、代替的に使用することができる。
【００９５】
「抗体」という用語は、例えば、それらの特徴的な特性が保持されている限りにおいて、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および遺伝子操作抗体（変異体または突然変異体の抗体）を含む。とりわけ、組換えヒト抗体またはヒト化抗体としての、ヒト抗体またはヒト化抗体が、とりわけ、好ましい。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指す。
【００９６】
二特異性抗体に関して本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、二特異性抗体が、ＣＤ３およびＲＯＲ１結合剤として、言及されているような結合剤だけを含むことを意味する。したがって、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含む本発明に従う二特異性抗体は、ＣＤ３およびＲＯＲ１結合に関しては、ＣＤ３に対する結合力価は１だけであり、ＲＯＲ１に対する力価は１だけであり、したがって、二価である。ＲＯＲ１に特異的に結合する二価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含む本発明に従う二特異性抗体は、ＲＯＲ１結合に関しては結合力価が２であり、ＣＤ３結合に関しては力価が１であり、したがって、三価である。ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体は、そのＣ末端において、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体の１つの可変鎖のＮ末端と共有結合していることが好ましい。
【００９７】
本明細書で使用される「抗体のＦａｂ断片」とは、抗原に結合する抗体の断片である。抗体のＦａｂ断片は、２つのドメイン対からなる。野生型抗体では、抗体のＦａｂ断片は、重鎖（ＣＨ１、およびＶＨ）および軽鎖（ＣＬおよびＶＬ）の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。本発明に従えば、このようなドメイン対はまた、クロスオーバーのために、ＶＨ−ＣＬおよびＶＬ−ＣＨ１でもありうる。野生型抗体では、かつ、本発明に従えば、Ｆａｂ断片の重鎖および軽鎖のドメイン対のドメインは、化学的に一緒に連結されてはおらず、したがって、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ではない。本発明に従う「クロスオーバー」とは、好ましくは、１つのＦａｂドメイン内で、ＶＬとＶＨとが、互いに置きかえられていることを意味する。「Ｆａｂ断片」という用語は、Ｆａｂ’断片のようなヒンジ領域の一部または全部も包含する。本明細書で使用される場合、「Ｆ（ａｂ）２断片」とは、Ｆｃパートを有することが好ましい、二価の単一特異性抗体断片を指す。
【００９８】
本発明中で使用される「ＲＯＲ１  Ｆａｂ」という用語は、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を指す。抗ＲＯＲ１抗体Ｆａｂ断片（ＲＯＲ１  Ｆａｂ）内の可変領域または定常領域のいずれかの交換に起因して、このようなＲＯＲ１  Ｆａｂは、「ＲＯＲ１  ｃｒｏｓｓ  Ｆａｂ」または「クロスオーバーＲＯＲ１  Ｆａｂ断片」と称される。本発明に従って、ＲＯＲ１  Ｆａｂは、ＲＯＲ１  ｃｒｏｓｓＦａｂではない。「接続されている」とは、Ｆａｂ断片が、ペプチド結合により、直接、または１つもしくは複数のペプチドリンカーを介してのいずれかで連結されていることが好ましいことを意味する。本発明中で使用される「ＣＤ３  Ｆａｂ」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を指す。ＣＤ３  Ｆａｂは、そのＮ末端において、ＲＯＲ１  ＦａｂのＣ末端に連結されている。ＣＤ３  Ｆａｂ内の可変領域または定常領域のいずれかの交換に起因して、このようなＣＤ３  Ｆａｂは、「ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂ」または「クロスオーバーＣＤ３  Ｆａｂ断片」と称される。本発明に従って、ＣＤ３  Ｆａｂは、ｃｒｏｓｓＦａｂであることが好ましい。
【００９９】
本発明中で使用される「ペプチドリンカー」という用語は、合成起源のものであることが好ましいアミノ酸配列を有するペプチドを指す。本発明に従うこれらのペプチドリンカーを使用して、Ｆａｂ断片のうちの１つを他のＦａｂ断片のＣ末端またはＮ末端に接続して本発明に従う多特異性抗体を形成する。前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さ、好ましくは、５〜１００アミノ酸の長さ、より好ましくは、１０〜５０アミノ酸の長さのアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎまたは（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリンであり（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５または６、およびｍ＝０、１、２または３）または（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４または５およびｍ＝０、１、２または３）、好ましくは、ｘ＝４およびｎ＝２または３、より好ましくは、ｘ＝４、ｎ＝２である。さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（その一部）を含みうる。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１９）である。
【０１００】
ギリシャ文字：α、δ、ε、γ、およびμで示される、５種類の哺乳動物抗体重鎖が存在する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。存在する重鎖の種類は、抗体のクラスを規定し、これらの鎖は、それぞれ、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、およびＩｇＭ抗体において見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ  ＲＡ、Ｐｆｌａｎｚｅｒ  ＲＧ（２００２年）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、４版、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。別個の重鎖は、サイズおよび組成が異なり、αおよびγが、約４５０アミノ酸を含有するのに対し、μおよびεは、約５５０アミノ酸を有する。各重鎖は、２つの領域である、定常領域および可変領域を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体では、同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、α、およびδは、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（一列の）と、可撓性を付加するためのヒンジ領域とから構成される定常領域を有し（Ｗｏｏｆ  Ｊ、Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４巻（２００４年）、８９〜９９頁）、重鎖μおよびεは、４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４から構成される定常領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞により産生される抗体内では異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンにより産生される全ての抗体では同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸の長さであり、単一の抗体ドメインから構成される。哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と呼ばれる、２種類の軽鎖しか存在しない。軽鎖は、２つの連続ドメイン：１つの定常ドメインＣＬと、１つの可変ドメインＶＬとを有する。軽鎖のおおよその長さは、２１１〜２１７アミノ酸である。
【０１０１】
本発明に従って使用される「二特異性抗体」は、任意の適切なフォーマットを有しうる。二特異性フォーマットは、例えば、Kontermann  RE、mAbs、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁、Mueller  D.およびKontermann  RE.BioDrugs（２０１０年）、２４巻、２号、８９〜９８頁）に開示されている。このような二特異性抗体は、例えば、Ｆａｂ、ＩｇＧおよびＩｇＧ様分子、ダイアボディ、単鎖ＦＶ（ｓｃＦＶ）、ＤＡＲＰｉｎｓ−、ｔａｎｄＡｂ、ＤＡＲＴ、ナノボディ、トリプルボディ（ｔｒｉｐｌｅ  ｂｏｄｙ）、トリプルヘッド（ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅａｄ）、ＣＨ３融合タンパク質に基づきうる。Ｆｃパートを含む本発明に従って使用される二特異性抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＥ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２、好ましくは、ＩｇＧ１）の抗体であることが可能であり、これによって、本発明に従って使用される二特異性二価抗体が由来する両方の抗体は、同じサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４など、好ましくは、ＩｇＧ１）、好ましくは、同じアロタイプ（例えば、白色人種）のＦｃパートを有する。
【０１０２】
「抗体のＦｃパート」とは、当業者に周知であり、パパインによる抗体の切断に基づき規定される用語である。Ｆｃパートを含む本発明に従って使用される抗体は、Ｆｃパートとして、好ましくは、ヒト由来のＦｃパート、好ましくは、ヒト定常領域の他の全てのパートも含有する。抗体のＦｃパートは、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化、およびＦｃ受容体への結合に直接関与する。抗体の、補体系に対する影響は、ある特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃパート内の、規定された結合性部位により引き起こされる。このような結合性部位は、最先端技術において公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，ＴＪ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、１２７巻（１９８１年）、２５５５〜２５６０頁；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．、およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻（１９７９年）、９０７〜９１７頁；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８８巻（１９８０年）、３３８〜３４４頁；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７巻（２０００年）、９９５〜１００４頁；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４巻（２０００年）、４１７８〜４１８４頁；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５巻（２００１年）、１２１６１〜１２１６８頁；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６巻（１９９５年）、３１９〜３２４頁；ならびにＥＰ０３０７４３４により記載されている。このような結合性部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け（下記を参照されたい））である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体が通例、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化させず、Ｃ１ｑに結合せず、Ｃ３を活性化させない。Ｆｃパートは、ヒトＦｃパートであることが好ましい。Ｆｃパートは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートであることが好ましい。本発明に従って使用される抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９の、グリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに／または置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、好ましくは、Ｐｒｏ３２９のグリシンによる置換、ならびに置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことが好ましい。
【０１０３】
ＩｇＧ１サブクラスの定常重領域ＣＨ２／ＣＨ３を含む本発明に従って使用される二特異性抗体は、ＦｃＲおよびＣ１ｑ結合を回避し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを最小化するように、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ２３９Ｇ（Ｋａｂａｔに従う番号付け）を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、Ｔ細胞をリダイレクションし／活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびＦｃＲを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
【０１０４】
本発明に従って使用される抗体は、Ｆｃパートとして、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃ変異体であって、位置Ｐｒｏ３２９におけるアミノ酸置換と、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含み、残基が、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従い、番号付けされ、前記抗体が、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに対するアフィニティーの低減を呈示し、前記抗体により誘導されるＡＤＣＣが、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されるＦｃ変異体を含むことが好ましい。具体的な実施形態では、本発明に従って使用される抗体内の野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９を、グリシンもしくはアルギニン、またはＦｃのプロリン３２９と、ＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ）残基Ｔｒｐ８７およびＴｉｐ１１０との間で形成される、Ｆｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻、２６７〜２７３頁（２０００年７月２０日））を破壊するのに十分な程度に大型のアミノ酸残基で置換する。本発明のさらなる態様では、Ｆｃ変異体内の、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ（ロイシン２３４が、アラニンにより置換されていることを示す）およびＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅである。このようなＦｃ変異体については、ＷＯ２０１２１３０８３１において、詳細に記載されている。
【０１０５】
本発明に従って使用される抗体の定常重鎖は、ヒトＩｇＧ１型のものであることが好ましく、定常軽鎖は、ヒトラムダ（λ）型、またはカッパ（κ）型、好ましくは、ヒトカッパ（κ）型のものであることが好ましい。
【０１０６】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指す。
【０１０７】
「キメラ抗体」という用語は、１つの供給源または種に由来する可変領域、すなわち、結合性領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体であって、通例、組換えＤＮＡ技法により調製される抗体を指す。マウス可変領域と、ヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される、「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から修飾するか、または変化させた形態である。このようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも称する。キメラ抗体とは、免疫グロブリンの可変領域をコードするＤＮＡセグメントと免疫グロブリンの定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む、発現した免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知の従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技法を伴う。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻（１９８４年）、６８５１〜６８５５頁；米国特許第５，２０２，２３８号、および同第５，２０４，２４４号を参照されたい。
【０１０８】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのＣＤＲと比較して特異性が異なる、免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾された抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域へとグラフトして、「ヒト化抗体」を調製する。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻（１９８８年）、３２３〜３２７頁；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻（１９８５年）、２６８〜２７０頁を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上で言及した標的を認識する配列を表すＣＤＲに対応する。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から、さらに修飾するか、または変化させた形態である。
【０１０９】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。最先端技術では、ヒト抗体が周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．およびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５巻（２００１年）、３６８〜３７４頁）。ヒト抗体はまた、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の完全なレパートリーまたはセレクションを産生することが可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）によって作製することもできる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖細胞系列突然変異マウスへの移入は、標的による感作時における、ヒト抗体の産生を結果としてもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻（１９９３年）、２５５１〜２５５５頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻（１９９３年）、２５５〜２５８頁；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９３年）、３３〜４０頁を参照されたい）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２７巻（１９９２年）、３８１〜３８８頁；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２２巻（１９９１年）、５８１〜５９７頁）で作製することもできる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらによる技法はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である（Coleら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１９９１年）、８６〜９５頁）。本発明に従って使用されるキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及した通り、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語はまた、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃＲへの結合に関する特性を作出するように、例えば、「クラススイッチング」、すなわち、Ｆｃパートの変化または突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への突然変異、および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）により、定常領域において修飾される抗体も含む。
【０１１０】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ＮＳＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞へとトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体など、組換え手段により調製するか、発現させるか、創出するか、または単離した、全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、可変領域および定常領域を、再配列された形態で有する。本発明に従って使用される組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞超変異に供されている。こうして、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これらと類縁であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内で、天然には存在しえない配列である。
【０１１１】
本明細書で使用される「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変領域）は、抗体の、標的への結合に直接関与する、軽鎖および重鎖の対の各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般的構造を有し、各ドメインは、その配列が、広く保存され、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続されている、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを取り、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成しうる。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域により、それらの三次元構造に保たれ、他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に、標的結合性部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に従って使用される抗体の結合特異性／アフィニティーにおいて、特に重要な役割を果たし、したがって、本発明のさらなる目的を提供する。
【０１１２】
本明細書で使用される場合の「超可変領域」または「抗体の標的結合性部分」という用語は、標的への結合の一因となる、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域または「ＦＲ」領域とは、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各鎖上のＣＤＲは、このようなフレームワークアミノ酸により隔てられている。とりわけ、重鎖のＣＤＲ３は、標的への結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１年）による標準的な規定に従い、決定する。
【０１１３】
本明細書で使用される「標的」または「標的分子」という用語は互換的に使用され、ヒトＲＯＲ１およびヒトＣＤ３εを指す。
【０１１４】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な、任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど、化学的に活性な表面分子の群を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴および／または特異的な電荷特徴を有しうる。エピトープとは、抗体が結合する、標的の領域である。
【０１１５】
一般に、第１の標的に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードする２つのベクターと、第２の標的に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードするさらなる２つのベクターが存在する。２つのベクターのうちの一方は、それぞれの軽鎖をコードし、２つのベクターの他方は、それぞれの重鎖をコードする。しかし、本発明に従って使用される二特異性抗体を調製するための代替法では、第１の標的に特異的に結合する抗体の重鎖および軽鎖をコードするただ１つの第１のベクターおよび第２の標的に特異的に結合する抗体の重鎖および軽鎖をコードするただ１つの第２のベクターを宿主細胞の形質転換に使用することができる。
【０１１６】
本明細書で使用される「核酸または核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【０１１７】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのこのような呼称は、子孫細胞を含む。こうして、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、初代対象細胞、およびこれに由来する培養物であって、継代数に関わらない培養物を含む。また、全ての子孫細胞は、意図的なまたは偶発的な突然変異のために、ＤＮＡ含量が正確に同一でない可能性があることも理解される。元の形質転換細胞内でスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する、変異体の子孫細胞も含まれる。顕著に異なる呼称が意図される場合、文脈から明らかであろう。
【０１１８】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、ベクター／核酸の、宿主細胞への移入のプロセスを指す。透過しにくい細胞壁バリアを伴わない細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは、例えば、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｈ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻（１９７８年）、５４６頁以降により記載されている、リン酸カルシウム沈殿法により実行する。しかし、また、核注射によるまたはプロトプラスト融合によるなど、ＤＮＡを細胞へと導入するための他の方法も使用することができる。原核細胞または実質的な細胞壁の構築を含有する細胞を使用する場合、例えば、トランスフェクションの１つの方法は、Ｃｏｈｅｎ  ＳＮら、ＰＮＡＳ、１９７２年、６９巻（８号）：２１１０〜２１１４頁により記載されている通り、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
【０１１９】
最先端技術では、形質転換を使用する、抗体の組換え産生が周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ.、１７巻（１９９９年）、１８３〜２０２頁；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ.、８巻（１９９６年）、２７１〜２８２頁；Ｋａｕｆｍａｎ，ＲＪ．、ＭｏＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.、１６巻（２０００年）、１５１〜１６１頁；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．ら、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、４８巻（１９９８年）、８７０〜８８０頁による総説論文；ならびにＵＳ６３３１４１５およびＵＳ４８１６５６７において記載されている。
【０１２０】
本明細書で使用される「発現」とは、核酸をｍＲＮＡへと転写するプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（転写物ともまた称する）を、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳するプロセスを指す。転写物と、コードされたポリペプチドとを、遺伝子産物と総称する。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞内の発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【０１２１】
「ベクター」とは、核酸分子、特に、自己複製型核酸分子であって、挿入された核酸分子を、宿主細胞内および／または宿主細胞間に移入する核酸分子である。用語は、主にＤＮＡまたはＲＮＡの、細胞への挿入（例えば、染色体の組込み）のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、記載される機能のうちの１つを超える機能を提供するベクターも含まれる。
【０１２２】
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞へと導入されると、ポリペプチドへと転写および翻訳されるポリヌクレオチドである。「発現系」とは通例、所望の発現産物をもたらすように機能しうる発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を指す。
【０１２３】
本発明に従って使用される二特異性抗体は、組換え手段により作製することが好ましい。このような方法は、最先端技術において広く公知であり、原核細胞内および真核細胞内のタンパク質の発現であって、その後における抗体ポリペプチドの単離と、通例、薬学的に許容される純度までの精製とを伴う発現を含む。タンパク質を発現させるためには、標準的な方法により、軽鎖および重鎖またはこれらの断片をコードする核酸を、発現ベクターへと挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核または真核宿主細胞内で実施し、抗体は、細胞（上清または溶解の後における細胞）から回収する。二特異性抗体は、全細胞で、細胞溶解物中、または部分的に精製もしくは実質的に純粋形態で存在しうる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞構成要素または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質、を消失させるために実施する。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）を参照されたい。
【０１２４】
ＮＳ０細胞内の発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２巻（２０００年）、１０９〜１２３頁；およびＢａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ.、７３巻（２００１年）、２６１〜２７０頁により記載されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、３０巻（２００２年）、Ｅ９頁により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻（１９８９年）、３８３３〜３８３７頁；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻（１９９２年）、４２８５〜４２８９頁；およびＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０４巻（１９９７年）、７７〜８７頁により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０巻（１９９９年）、７１〜８３頁；ならびにＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９４巻（１９９６年）、１９１〜１９９頁により記載されている。
【０１２５】
原核細胞に適する制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択で、オペレーター配列およびリボソーム結合性部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを活用することが公知である。
【０１２６】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されているか；プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されているか；またはリボソーム結合性部位は、翻訳を容易とするように位置づけられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続であり、分泌リーダーの場合、リーディングフレーム内で連続であることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続でなくともよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の慣行に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【０１２７】
二特異性抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、従来の手順を使用して、たやすく単離され、シークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡの供給源として用いることができる。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクターへと挿入することができ、次いで、宿主細胞内で組換えモノクローナル抗体の合成を得るように、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞であって、トランスフェクトしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトする。
【０１２８】
二特異性抗体のアミノ酸配列の変異体（または突然変異体）は、適切なヌクレオチド変化を、抗体ＤＮＡへと導入することにより、またはヌクレオチドの合成により調製する。このような修飾は、実施しうるが、例えば、上で記載した通り、非常に限定的な範囲内に限られる。例えば、修飾は、ＩｇＧアイソタイプおよび標的への結合など、上述の抗体特徴を変更しないが、組換え作製の収率、タンパク質の安定性を改善する、または精製を容易とすることが可能である。
【０１２９】
Ｔ細胞二特異性（ＴＣＢ）結合剤は、細胞の殺滅（例えば、ピコモル未満の範囲または低ピコモル範囲の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０；Dreierら、Int  J  Cancer、２００２年）において、非常に高度な、濃度／腫瘍細胞受容体占有度依存的効力を有するが、Ｔ細胞二特異性結合剤（ＴＣＢ）は、従来の単一特異性抗体よりはるかに低用量で施されている。例えば、ブリナツモマブ（ＣＤ１９×ＣＤ３）は、急性リンパ性白血病の処置のための、５〜１５μｇ／ｍ２／日（すなわち、わずか、０．０３５〜０．１０５ｍｇ／ｍ２／週）、または非ホジキンリンパ腫の処置のための、６０μｇ／ｍ２／日の連続静脈内投与で施され、これらの投与時における血清濃度は、０．５〜４ｎｇ／ｍｌの範囲である（Klingerら、Blood、２０１２年、Toppら、J  Clin  Oncol、２０１１年、Goebelerら、Ann  Oncol、２０１１年）。ブリナツモマブの消失半減期は非常に短いので、臨床投与は、患者の体に携行するポンプを介した持続注入による。本発明に従って使用される抗体の消失半減期はより長いので、本発明に従う抗体では、皮下投与が可能であり、臨床状況において好ましいことが想定される（週１回または週２回、０．１〜１０ｍｇ／ｍ２の用量範囲が好ましく、さらにより低い用量が好ましい）。これらの低濃度／用量／受容体占有度であってもなお、ＴＣＢは、無視できない有害事象を引き起こしうる（Klingerら、Blood、２０１２年）。本発明の抗体の薬物動態的特性の改善は、有害事象を潜在的に低減する１つの尺度である。
【０１３０】
原理上は、ＣＤ３およびＲＯＲ１に対する二特異性抗体を最先端技術において公知の全てのフォーマットで作製することが可能である。最近では、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの、例えば、融合によって、多種多様な組換え二特異性抗体フォーマットが開発されている（例えば、Kontermann  RE、mAbs、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁を参照されたい）。可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１を、互いに置きかえた二特異性抗体については、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２において記載されている。抗体フォーマットならびに二特異性抗体および多特異性抗体のフォーマットはまた、ペップボディ（ｐｅｐｂｏｄｙ）（ＷＯ２００２４４２１５）、新規抗原受容体（「ＮＡＲ」）（ＷＯ２００３０１４１６１）、ダイアボディ−ダイアボディ二量体「ＴａｎｄＡｂ」（ＷＯ２００３０４８２０９）、ポリアルキレンオキシド改変ｓｃＦｖ（ＵＳ７１５０８７２）、ヒト化ウサギ抗体（ＷＯ２００５０１６９５０）、合成免疫グロブリンドメイン（ＷＯ２００６０７２６２０）、共有結合性ダイアボディ（ＷＯ２００６１１３６６５）、フレキシボディ（ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）（ＷＯ２００３０２５０１８）、ドメイン抗体、ｄＡｂ（ＷＯ２００４０５８８２２）、ワクシボディ（ｖａｃｃｉｂｏｄｙ）、（ＷＯ２００４０７６４８９）、新世界霊長類フレームワークを有する抗体（ＷＯ２００７０１９６２０）、切断可能なリンカーを用いた抗体−薬物コンジュゲート（ＷＯ２００９１１７５３１）、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体（ＷＯ２０１００６３７８５）、ＩｇＧ４様ＣＨ３ドメインを有する二特異性抗体（ＷＯ２００８１１９３５３）、ラクダ科動物抗体（ＵＳ６８３８２５４）、ナノボディ（ＵＳ７６５５７５９）、ＣＡＴダイアボディ（ＵＳ５８３７２４２）、標的抗原およびＣＤ３を対象とする二特異性ｓｃＦｖ２（ＵＳ７２３５６４１）、ｓＩｇＡ  Ｐｌ抗体（ＵＳ６３０３３４１）、ミニボディ（ＵＳ５８３７８２１）、ＩｇＮＡＲ（ＵＳ２００９１４８４３８）、ヒンジおよびＦｃ領域が改変された抗体（ＵＳ２００８２２７９５８、ＵＳ２００８０１８１８９０）、三官能性抗体（ＵＳ５２７３７４３）、トリオマブ（ＵＳ６５５１５９２）、トロイボディ（ｔｒｏｙｂｏｄｙ）（ＵＳ６２９４６５４）である。
【０１３１】
本発明に従って使用される抗体は、週１回または週２回、ｓ．ｃ.投与することができる。
【０１３２】
本発明に従って使用される二特異性三価抗体は、効力に対する利点、有効性および安全性に対する予測可能性を有する。
【０１３３】
ＲＯＲ１に対して二価性を有し、ＣＤ３に対して一価性を有する、本発明に従って使用される抗体は、悪性細胞上の腫瘍標的ＲＯＲ１への結合に、循環中のＴ細胞上のＣＤ３εへの結合よりも有利であり、ＣＤ３シンクを回避し、したがって、腫瘍における薬物曝露が増大する。
【０１３４】
以下の例、配列表、および図は、本発明の理解の一助とするために提示するものであり、本発明の真の範囲は、付属の特許請求の範囲で記される。本発明の精神から逸脱することなく、記される手順に改変を施しうることが理解される。
【０１３５】
配列表
【化１】
2017536341.tif 000003
【０１３６】
以下の、本発明に従って使用される抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢを制作するためには、上で記載した表で言及した、それぞれの構築物／配列番号が必要とされる：
ＲＯＲ１−ＴＣＢ（２＋１）、Ｆｃ含有：３０（２×）、３１、３２、および３３（図１Ａ）
ＲＯＲ１−ＴＣＢ（１＋１）、Ｆｃ含有：３０、３１、３３、および３６（図１Ｂ）
ＲＯＲ１−ＴＣＢ（２＋１）、Ｆｃ非含有：配列番号３０（２×）、３３、および３５（図１Ｃ）
ＲＯＲ１−ＴＣＢ（１＋１）、Ｆｃ非含有：配列番号３０、３３、および３４（図１Ｄ）
【０１３７】
以下では、本発明の具体的な実施形態を列挙する。
実施形態１．卵巣がんの処置における使用のための、２つの標的、ヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（さらにまた、「ＲＯＲ１」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体。
【０１３８】
実施形態２．  初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、１ｎＭの濃度で、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とする、実施形態１に従う二特異性抗体。
【０１３９】
実施形態３．  細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用し、１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合の際における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する、実施形態２のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１４０】
実施形態４．  抗ＣＤ３ε抗体の１つのＦａｂ断片（ＣＤ３  Ｆａｂ）と、抗ＲＯＲ１抗体の１つまたは２つのＦａｂ断片（ＲＯＲ１  Ｆａｂ）と、０または１つのＦｃ断片とからなることを特徴とする、実施形態１から３のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１４１】
実施形態５．  二価であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とする、実施形態１から４のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１４２】
実施形態６．  三価であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する二価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の一価Ｆａｂ断片とを含むことを特徴とする、実施形態１から５のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１４３】
実施形態７．  構築物、
ａ）ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ、
ｂ）ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ、
ｃ）Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ、および
ｄ）ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂ
の群から選択されることを特徴とする、実施形態１から６のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１４４】
実施形態８．  構築物が、
ａ）構成ブロック、配列番号３０（２×）、３１、３２、および３３からなる構築物、
ｂ）構成ブロック、配列番号３０、３１、３３、および３６からなる構築物、
ｃ）構成ブロック、配列番号３０（２×）、３３、および３５からなる構築物、
ｄ）構成ブロック、配列番号３０、３３、および３４からなる構築物
の群から選択されることを特徴とする、実施形態１から７のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１４５】
実施形態９．  配列番号３１、３３、３４、３５、３７、３９内の抗ＣＤ３ε抗体配列ＶＨおよびＶＬが、配列番号２１および２２のそれぞれのＶＨおよびＶＬ配列により置きかえられていることを特徴とする、実施形態１から８のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１４６】
実施形態１０．  Ｆｃドメインを含むことを特徴とする、実施形態１から９のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１４７】
実施形態１１．  ａ）前記標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と、
ｂ）前記標的のうちの他の一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖と
を含み、可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置きかえられている
ことを特徴とする、実施形態１から１０のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１４８】
実施形態１２．  前記抗ＣＤ３抗体の可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置きかえられていることを特徴とする、実施形態１１に従う二特異性抗体。
【０１４９】
実施形態１３．  ヒトＣＤ３εに特異的に結合する抗体部分が、
ａ）配列番号１２、１３および１４のＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変重鎖ドメインＶＨと、配列番号１５、１６および１７のＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むか、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５のＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変重鎖ドメインＶＨと、配列番号２６、２７および２８のＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として可変ドメインＶＬとを含む
ことを特徴とする、実施形態１から１２のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１５０】
実施形態１４．  ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分が、配列番号７、８および９のＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変重鎖ドメインＶＨと、配列番号３、４および５のＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることを特徴とする、実施形態１から１３のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１５１】
実施形態１５．  さらに、前記第１の抗体の第２のＦａｂ断片（「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」）を含むことを特徴とする、実施形態１４に従う二特異性抗体。
【０１５２】
実施形態１６．  ＣＤ３に特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＣＤ３−Ｆａｂ」とも称する）と、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」とも称する）と、Ｆｃパートとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されており、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態１から１５のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１５３】
実施形態１７．  前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている、１つのＣＤ３−Ｆａｂと、１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、Ｆｃパートと、そのＣ末端により前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結された第２のＲＯＲ１−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含み、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含む（図１Ａ）ことを特徴とする、実施形態１から１６のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１５４】
実施形態１８．  ＲＯＲ１−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＲＯＲ１−Ｆａｂからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、ＣＬ／ＣＨ１クロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態１から１７のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１５５】
実施形態１９．  それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている２つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、Ｆｃパートと、そのＣ末端により１つのＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されているＣＤ３−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含む（図１Ｆ）ことを特徴とする、実施形態１から１８のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１５６】
実施形態２０．  そのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された、１つのＣＤ３−Ｆａｂと、そのＣ末端により、前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＲＯＲ１−Ｆａｂとからなる（図１Ｂ）ことを特徴とする、実施形態１から１９のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１５７】
実施形態２１．  そのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された、１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、そのＣ末端により、前記ＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂとからなる（図１Ｇ）ことを特徴とする、実施形態１から２０のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１５８】
実施形態２２．  抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＣＤＲ配列を含むことを特徴とする、実施形態１から２１のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１５９】
実施形態２３．  抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＶＨおよびＶＬ配列を含むか、または抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬ配列を含む抗体であることを特徴とする、実施形態１から２２のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６０】
実施形態２４．  ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、前記Ｆａｂ断片が、
ａ）配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むか、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることを特徴とする、実施形態１から２３のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６１】
実施形態２５．  ヒトＣＤ３に特異的に結合する前記抗体部分が、
前記可変ドメインが、
ａ）配列番号１０および１１（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の可変ドメインであるか、または、
ｂ）配列番号２１および２２（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の可変ドメインである
ことを特徴とすることを特徴とする、実施形態１から２４のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６２】
実施形態２６．  ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する前記Ｆａｂ断片が、重鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号９のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨを含むことと、軽鎖ＣＤＲ、配列番号３のＣＤＲ１Ｌ、配列番号４のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬを含むこととを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ１）ことを特徴とする、実施形態１から２５のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６３】
実施形態２７．  ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する前記Ｆａｂ断片が、配列番号１０のＶＨと配列番号１１のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１）ことを特徴とする、実施形態１から２６のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６４】
実施形態２８．  ヒトＣＤ３εに特異的に結合する前記抗体部分内で、
ａ）配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、前記可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、前記可変ドメインＶＬが置きかえられること、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、前記可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、前記可変ドメインＶＬが置きかえられることを特徴とする、実施形態２７に従う抗体。
【０１６５】
実施形態２９．  一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、前記二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、前記変更が、
ａ）前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）前記二特異性抗体内の前記第１のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第２のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第２のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記第１のＣＨ３ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする、実施形態１から２８のいずれか一つに従う抗体。
【０１６６】
実施形態３０．  ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンによるアミノ酸置換および／または置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことを特徴とする、実施形態１から２９のいずれか一つに従う抗体。
【０１６７】
実施形態３１．  構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂの抗体であり、前記抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片内にＣＬ／ＣＨ１クロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態３０に従う抗体。
【０１６８】
実施形態３２．  構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂの抗体であり、Ｐｒｏ３２９のグリシンによるアミノ酸置換ならびにＬｅｕ２３４のアラニンによる置換およびＬｅｕ２３５のアラニンによる置換を伴うヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートを含むことを特徴とする、実施形態３０または３１に従う抗体。
【０１６９】
実施形態３３．  ２つの標的、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（ＲＯＲ１）に特異的に結合することを特徴とし、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、１ｎＭの濃度で、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とする、実施形態１から３２のいずれか一つに従う抗体。
【０１７０】
実施形態３４．  ２つの標的、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（ＲＯＲ１）に特異的に結合することを特徴とし、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用し、１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合の際における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する、実施形態１から３３のいずれか一つに従う抗体。
【０１７１】
実施形態３５．  実施形態１から３４に従う抗体は、マウスにおける、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、１２時間より長い、好ましくは、３日間またはそれより長い消失半減期を特徴とする。
【０１７２】
実施形態３６．  実施形態１から３５に従う抗体は、ＲＯＲ１陽性卵巣がん細胞系（例えば、ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、ＳＷ−６２６、好ましくはＰＡ−１および／またはＣＯＬＯ−７０４）への結合についてのＥＣ５０値であって、３０ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、１５ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とする。
【０１７３】
実施形態３７．  実施形態１から３６に従う抗体は、ヒトＴ細胞の存在下における、ＲＯＲ１発現卵巣がん細胞（例えば、ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、ＳＷ−６２６、好ましくはＰＡ−１および／またはＣＯＬＯ−７０４）のリダイレクトされた殺滅を、１０ｎＭ未満、好ましくは、１ｎＭ、好ましくは、０．０５ｎＭ、好ましくは、０．０２ｎＭ、好ましくは、０．００２ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力を特徴とする。
【０１７４】
実施形態３８．  実施形態１から３７に記載の抗体は、標準的な製剤緩衝液中、３７℃で、好ましくは、４０℃で、１０日間、好ましくは、最長２週間、好ましくは、最長４週間保存された前記抗体が、高分子量（ＨＭＷ）分子種および／または低分子量（ＬＭＷ）分子種および／または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−８０℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、１０％を超える変化（Δ）、好ましくは、５％を超える変化（Δ）を結果としてもたらさないことを特徴とする。
【０１７５】
実施形態３９．  卵巣がんの処置における使用のための実施形態１から３８のいずれか一つに従う抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０１７６】
実施形態４０．  卵巣がんの処置における使用のための医薬としての使用のための、実施形態１から３８のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３９に従う医薬組成物。
【０１７７】
実施形態３９．  ＲＯＲ１陽性卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、実施形態１から３８のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３９に従う医薬組成物。
【０１７８】
実施形態４０．  卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、実施形態１から３８のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３９に従う医薬組成物。
【０１７９】
実施形態４１．  卵巣がんの処置のため、およびＲＯＲ１を発現する卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、実施形態１から３８のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３９に従う医薬組成物。
【０１８０】
実施形態４２．卵巣がんを患う患者における卵巣がんの処置のための、実施形態１から３８のいずれか一つに従う二特異性抗体または実施形態３９に記載の医薬組成物の使用。
【０１８１】
実施形態４３．卵巣がんを患う患者において卵巣がんを処置する方法であって、前記患者に、治療有効量の、実施形態１から３８のいずれか一つに従う二特異性抗体または実施形態３９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【０１８２】
材料および一般的方法
組換えＤＮＡ技法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年において記載されている、標準的方法を使用して、ＤＮＡを取り扱う。分子生物学的試薬は、製造元の指示書に従い使用する。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２において与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、（１９９１年）に従い番号付けされ、言及される。
【０１８３】
遺伝子の合成
ａ）所望の遺伝子セグメントは、化学合成により制作されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた、６００〜１８００ｂｐ長の遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによりアセンブルし、その後、指し示される制限部位、例えば、Ｋｐｎｌ／ＳａｄまたはＡｓｃｌ／Ｐａｃｌを介して、ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベースのｐＧＡ４クローニングベクターへとクローニングする。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。遺伝子合成断片は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で提供されている仕様に従い、注文する。
ｂ）要請される場合、所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用するＰＣＲにより作出するか、またはＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、自動式遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から合成する。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントは、標準的な発現ベクターまたはさらなる解析のためのシークエンシングベクターへとクローニングする。プラスミドＤＮＡは、市販されているプラスミド精製キットを使用して、形質転換された細菌から精製する。プラスミド濃度を、ＵＶ分光法により決定する。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認する。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能とする、適切な制限部位によりデザインする。要請される場合、タンパク質コード遺伝子は、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列によりデザインする。
【０１８４】
ＤＮＡの配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖シークエンシングにより決定する。
【０１８５】
ＤＮＡおよびタンパク質の配列解析ならびに配列データの管理
Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）ソフトウェアパッケージバーション９．２を、配列のマッピング、解析、注釈づけ、および例示のために使用する。
【０１８６】
発現ベクター
ａ）下で記載される抗体鎖を含む融合遺伝子は、ＰＣＲおよび／または遺伝子合成により作出し、対応する核酸セグメントの接続であって、例えば、それぞれのベクター内で固有の制限部位を使用する接続によって、公知の組換え方法および技法によりアセンブルする。サブクローニングされた核酸配列は、ＤＮＡシークエンシングにより検証する。一過性トランスフェクションのためには、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からのプラスミド調製により、より大量のプラスミドを調製する。
【０１８７】
ｂ）抗ＲＯＲ１抗体の発現ベクターを作出するために、重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、哺乳動物細胞系内の発現に最適化された、それぞれの汎用レシピエント発現ベクターへとあらかじめ挿入された、ヒトＩｇＧ１定常重鎖またはｈｕｍ  ＩｇＧ１定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングする。抗体の発現は、ＣＭＶエンハンサーおよびＭＰＳＶプロモーターに続いて、５’ＵＴＲ、イントロン、およびＩｇカッパＭＡＲエレメントを含むキメラＭＰＳＶプロモーターにより駆動する。転写は、ＣＤＳの３’末端における合成ポリＡシグナル配列により終結させる。全てのベクターは、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列を保有する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ発現細胞内のエピソームのプラスミド複製のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列も含有する。
【０１８８】
ｃ）ＲＯＲ１×ＣＤ３二特異性抗体ベクターを作出するために、ＩｇＧ１由来の二特異性分子は、少なくとも、２つの顕著に異なる抗原性決定基ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合することが可能な、２つの抗原結合性部分からなる。抗原結合性部分は、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖から構成されるＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片のうちの少なくとも１つは、ＣＨ１とＣＬを交換した、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」断片であった。Ｆａｂ断片内のＣＨ１とＣＬの交換により、特異性の異なるＦａｂ断片が、同一のドメインの並びを有さないことを確保する。二特異性分子のデザインは、両方の抗原性決定基に対して一価（１＋１）でありうるか、またはＣＤ３に対して一価、ＲＯＲ１に対して二価でありえ、この場合、１つのＦａｂ断片を内側のＣｒｏｓｓＦａｂのＮ末端と融合する（２＋１）。二特異性分子は、Ｆｃパートを、分子が長い半減期を有するような順序で含有した。構築物の概略表示を図１に示し、構築物の好ましい配列を配列番号３０〜３６に示す。分子は、ポリマーを使用して、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを共トランスフェクトすることにより作製する。１＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、１：１：１：１の比（「Ｆｃ（ノブ）ベクター」：「軽鎖ベクター」：「軽鎖  ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」：「重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」）でトランスフェクトする。２＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１の比（「Ｆｃ（ノブ）ベクター」：「軽鎖ベクター」：「軽鎖  ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」：「重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」）でトランスフェクトする。
【０１８９】
細胞培養技法
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．、およびＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．において記載されている、標準的な細胞培養技法を使用する。
【０１９０】
ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ系）内の一過性発現
二特異性抗体は、懸濁液中で培養される、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターのポリマーベースの一過性共トランスフェクションにより発現させる。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種する。最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離する（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させる。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１μｇのＤＮＡ（重鎖：修飾重鎖：軽鎖：修飾軽鎖の比＝１：１：２：１）を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製する。０．２７μＬのポリマー溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置する。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡ／ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置く。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸、および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加する。２４時間後、７０μＬのフィード溶液を、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加する。７日後、または細胞の生存率が、７０％と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、１つまたは２つの仕上げステップにより精製する。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用する。組換え抗ＢＣＭＡヒト抗体および二特異性抗体は、懸濁液中で、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用して、共トランスフェクトをすることにより作製する。細胞には、フォーマットに応じて、２つまたは４つのベクターをトランスフェクトする。ヒトＩｇＧ１では、一方のプラスミドにより、重鎖をコードし、他方のプラスミドにより、軽鎖をコードした。二特異性抗体では、４つのプラスミドを共トランスフェクトする。これらのうちの２つにより、２つの異なる重鎖をコードし、他の２つにより、２つの異なる軽鎖をコードした。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｆ１７  Ｍｅｄｉｕｍ中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種する。
【０１９１】
タンパク質の決定
抗体濃度の決定は、０．１％の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により行う。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｄａｔａ）により計算する。
【０１９２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の指示書に従い使用する。特に、１０％または４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔランニングバッファー添加剤を伴う）、またはＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用する。
【０１９３】
タンパク質の精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製
アフィニティーステップのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５  ６ＣＶで平衡化させたプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させる。所望の抗体を伴う画分を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（１：１０）で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮する。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛ける。
【０１９４】
カチオン交換クロマトグラフィーによる精製
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、１：１０に希釈し、カチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へとロードする。それぞれ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、ｐＨ５．０、および２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、２回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８．５を使用する勾配により溶出させる。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛ける。
【０１９５】
解析用サイズ除外クロマトグラフィーによる精製
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Ｔｗｅｅｎ２０を伴うかまたは伴わない、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０と共に、ＸＫ１６／６０  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入する。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過する。
【０１９６】
純度および単量体含量の測定
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ６．７による緩衝液中で、ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ））のそれぞれにより決定する。
【０１９７】
ＬＣ−ＭＳ解析による分子量の確認
脱グリコシル化
分子の均質の調製を確認するために、最終タンパク質溶液を、ＬＣ−ＭＳ解析により解析する。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、ＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）で処理する。したがって、２Ｍのトリス２μｌを、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとする２０μｇのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のｐＨを、ｐＨ７．０へと調整する。０．８μｇのＰＮＧａｓｅＦを、添加し、３７℃で１２時間インキュベートする。
【０１９８】
ＬＣ−ＭＳ解析−オンライン検出
ＬＣ−ＭＳ法は、ＴＯＦ  ６４４１質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）へとカップリングさせた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００上で実施する。クロマトグラフィーによる分離は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅカラム；ＲＰ１０００−８（粒子サイズを８μｍとする、４．６×２５０ｍｍ；カタログ番号７１９５１０）上で実施する。溶離液Ａは、水中に５％のアセトニトリル、および０．０５％（ｖ／ｖ）のギ酸であり、溶離液Ｂは、９５％のアセトニトリル、５％の水、および０．０５％のギ酸である。流量は、１ｍｌ／分であり、分離は、４０℃で実施し、前に記載した処理により、６μｇ（１５μｌ）のタンパク質試料を得る（表２）。
【０１９９】
【表２】
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【０２００】
最初の４分間の間、質量分析計を塩汚染から保護するように、溶出液を、廃棄物へと方向づける。ＥＳＩ源は、乾燥ガス流量を１２ｌ／分とし、温度を３５０℃とし、噴霧器圧力を６０ｐｓｉとして動作させる。ＭＳスペクトルは、陽イオンモードにおいて、３８０Ｖのフラグメンター電圧および７００〜３２００ｍ／ｚの質量範囲を使用して取得する。ＭＳデータは、計器ソフトウェアにより、４〜１７分間にわたり取得する。
【０２０１】
ＰＢＭＣからの初代ヒト汎Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーから収集した採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製する。卵巣がん患者の血液から単離されたヒトＰＢＣＭは、地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、収集する。略述すると、血液を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）にわたり、注意深く層化させる。４５０×ｇ、室温で３０分間遠心分離の後（ブレーキをオフに切り替える）、ＰＢＭＣを含有する相間部の上方の血漿部分を廃棄する。ＰＢＭＣを、新しい５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブへと移し、チューブを、ＰＢＳで、５０ｍｌの総容量まで満たす。混合物を、４００×ｇ、室温で１０分間遠心分離する（ブレーキをオンに切り替える）。上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを、滅菌ＰＢＳで２回洗浄する（３５０×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離ステップ）。結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、１０％のＦＣＳ、および１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で保存する。
【０２０２】
ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０９１−１５６）を使用して実施する。略述すると、細胞ペレットを、細胞１０００万個当たり４０μｌの低温緩衝液（滅菌濾過された、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ）中で希釈し、細胞１０００万個当たり１０μｌのビオチン−抗体カクテルと共に、４℃で１０分間インキュベートする。細胞１０００万個当たり３０μｌの低温緩衝液および２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、混合物を、４℃でさらに１５分間インキュベートする。現行容量の１０〜２０倍容量を添加することにより、細胞を洗浄し、その後、３００×ｇで１０分間遠心分離ステップにかける。最大１億個の細胞を、５００μｌの緩衝液中に再懸濁させる。標識されていないヒト汎Ｔ細胞の磁気による分離は、製造元の指示書に従い、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０４２−４０１）を使用して実施する。結果として得られるＴ細胞集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、ＡＩＭ−Ｖ培地中で保存する（２４時間より長くない）。
【０２０３】
ＰＢＭＣからの初代ヒトナイーブＴ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーもしくは卵巣がん患者に由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製する。卵巣がん患者の血液から単離されたヒトＰＢＣＭは、地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、収集する。ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（型番１３０−０９３−２４４）製のＮａｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して実施するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最後の単離ステップは省略する（初代ヒト汎Ｔ細胞の単離についての記載もまた参照されたい）。
【実施例】
【０２０４】
（実施例１）
抗ＲＯＲ１抗体の作出
配列番号２〜９のＲＯＲ１抗体（ＭＡＢ１）のＶＨおよびＶＬ領域のタンパク質配列は、ＷＯ２０１２／０７５１５８において記載されている。略述すると、上で記載した配列をコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって繋ぎ合わせて、それぞれ抗ＲＯＲ１抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするｃＤＮＡを合成する。
【０２０５】
抗ＲＯＲ１抗体の発現ベクターを作出するために、重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、哺乳動物細胞系内の発現に最適化された、それぞれの汎用レシピエント発現ベクターにあらかじめ挿入されたヒトＩｇＧ１定常重鎖またはｈｕｍ  ＩｇＧ１定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体の発現は、ＣＭＶエンハンサーおよびＭＰＳＶプロモーターに続いて、５’ＵＴＲ、イントロン、およびＩｇカッパＭＡＲエレメントを含むキメラＭＰＳＶプロモーターにより駆動した。転写は、ＣＤＳの３’末端における合成ポリＡシグナル配列により終結させた。全てのベクターは、タンパク質を、真核細胞において分泌にターゲティングするリーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列を保有する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ発現細胞内での、エピソームとしてのプラスミド複製のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列も含有する。
【０２０６】
ＲＯＲ１抗体を、懸濁液中で培養したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞において、それぞれの哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用して、一過性の共トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ培地中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離した（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させた。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１μｇのＤＮＡ（重鎖：軽鎖の比＝１：１）を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製した。０．２７μＬのポリマー含有溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置した。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡ／ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器に移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置いた。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。２４時間後、７０μＬのフィード溶液を、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。７日後、または細胞生存率が、７０％と等しいか、またはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、１つまたは２つの仕上げステップにより精製した。要請される場合は、さらなる仕上げステップを使用した。ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用してトランスフェクトすることにより、懸濁液中で組換え抗ＲＯＲ１ヒト抗体を生成した。細胞に２つのベクターをトランスフェクトした。ヒトＩｇＧ１については、一方のプラスミドが重鎖をコードするものであり、他方のプラスミドが軽鎖をコードするものであった。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＦ１７  Ｍｅｄｉｕｍ中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。
【０２０７】
（実施例２）
細胞表面におけるＲＯＲ１の発現のレベルが異なるヒト卵巣がん細胞系
１）卵巣奇形癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＰＡ−１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＲＬ−１５７２）から入手する。ＰＡ−１細胞系を、１０％ウシ胎仔血清（熱不活化）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１５００ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを補充したＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００３）中で培養する。
【０２０８】
２）卵巣の粘液性嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＭＣＡＳは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ；カタログ番号ＪＣＲＢ０２４０）から入手する。ＭＣＡＳ細胞系は、２０％のＦＢＳを伴うＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ中で成長させる。
【０２０９】
３）卵巣嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＥＦＯ−２１は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ；カタログ番号ＡＣＣ２３５）から入手する。ＥＦＯ−２１細胞系は、８０％のＲＰＭＩ１６４０、２０％の熱不活化ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム中で培養する。
【０２１０】
４）卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＣＯＬＯ−７０４は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ；カタログ番号ＡＣＣ１９８）から入手する。ＣＯＬＯ−７０４細胞系を９０％のＲＰＭＩ１６４０および１０％の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２１１】
５）グレードＩＩＩ腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＳＷ−６２６は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＨＴＢ−７８）から入手する。ＳＷ−６２６細胞系は、ＡＴＣＣにより配合されたＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号３０−２００８）および１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２１２】
６）未分化癌（腹水）に由来するヒト卵巣がん細胞系ＫＵＲＡＭＯＣＨＩは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ；カタログ番号ＪＣＲＢ００９８）から入手する。ＫＵＲＡＭＯＣＨＩ細胞系は、１０％のウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２１３】
７）卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶＳＡＨＯは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ；カタログ番号ＪＣＲＢ１０４６）から入手する。ＯＶＳＡＨＯ細胞系は、１０％ウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２１４】
８）卵巣嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＳＮＵ−１１９は、Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ；カタログ番号００１１９）から入手する。ＳＮＵ−１１９細胞系は、５２．５％のＲＰＭＩ１６４０培地、４０％のウシ胎仔血清および７．５％のＤＭＳＯ中で培養する。
【０２１５】
９）上皮性−類内膜癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＣＯＶ３６２は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号０７０７１９１０）から入手する。ＣＯＶ３６２細胞系は、ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２１６】
１０）卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶＣＡＲ−４は、ＥＺ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＥＺＴ−ＯＶＣ４−１）から入手する。ＯＶＣＡＲ−４細胞系は、１０％ウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２１７】
１１）上皮性−類内膜癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＣＯＶ３１８は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号０７０７１９０３）から入手する。ＣＯＶ３１８細胞系は、ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２１８】
１２）未分化癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＴＹＫ−ｎｕは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ；カタログ番号ＪＣＲＢ０２３４．０）から入手する。ＴＹＫ−ｎｕ細胞系は、１０％のウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２１９】
１３）卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶＫＡＴＥは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ；カタログ番号ＪＣＲＢ１０４４）から入手する。ＯＶＫＡＴＥ細胞系は、１０％のウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２２０】
１４）腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＣＡＯＶ−４は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＨＴＢ−７６）から入手する。ＣＡＯＶ−４細胞系は、ＡＴＣＣにより配合されたＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号３０−２００８）および２０％のウシ胎仔血清中で培養する。
【０２２１】
１５）卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＡＷ２８は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号８５１０１６０１）から入手する。ＯＡＷ２８細胞系は、ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＮａＰ）、２０ＩＵ／ｌのウシインスリンおよび１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２２２】
１６）腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＣＡＯＶ−３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＨＴＢ−７５）から入手する。ＣＡＯＶ−３細胞系は、ＡＴＣＣにより配合されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号３０−２００２）および１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２２３】
１７）卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系５９Ｍは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号８９０８１８０２）から入手する。５９Ｍ細胞系は、ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＮａＰ）、２０ＩＵ／ｌのウシインスリンおよび１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２２４】
１８）卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＮＣＯ−ＤＧ−１は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ；カタログ番号ＡＣＣ５０７）から入手する。ＯＮＣＯ−ＤＧ−１細胞系は、９０％のＲＰＭＩ１６４０および１０％の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２２５】
１９）卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＨＴＢ−１６１）から入手する。ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３細胞系は、ＡＴＣＣにより配合されたＲＰＭＩ−１６４０  Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号３０−２００１）、０．０１ｍｇ／ｍＬのウシインスリンおよび２０％のウシ胎仔血清中で培養する。
【０２２６】
２０）卵巣明細胞癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＥＳ−２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＲＬ−１９７８）から入手する。ＥＳ−２細胞系を、ＡＴＣＣにより配合されたＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（カタログ番号３０−２００７）および１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２２７】
２１）卵巣上皮性−漿液性癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＣＯＶ−５０４は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号０７０７１９０２）から入手する。ＣＯＶ−５０４細胞系は、ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２２８】
２２）卵巣明細胞癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶ−９０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＲＬ−１１７３２）から入手する。ＯＶ−９０細胞系は、最終濃度１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含有するＭＣＤＢ  １０５培地と最終濃度２．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、および１５％のウシ胎仔血清を含有するＭｅｄｉｕｍ  １９９の１：１混合物中で培養する。
【０２２９】
２３）卵巣粘液性嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＲＭＵＧ−Ｓは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ；カタログ番号ＩＦＯ５０３２０）から入手する。ＲＭＵＧ−Ｓ細胞系は、１０％のウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２３０】
２４）卵巣上皮性−粘液性癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＣＯＶ−６４４は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号０７０７１９０８）から入手する。ＣＯＶ−６４４細胞系は、ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２３１】
２５）卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＳＮＵ−８４０は、Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ；カタログ番号００８４０）から入手する。ＳＮＵ−８４０細胞系は、５２．５％のＲＰＭＩ１６４０培地、４０％のウシ胎仔血清および７．５％のＤＭＳＯ中で培養する。
【０２３２】
２６）卵巣明細胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶＩＳＥは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ；カタログ番号ＪＣＲＢ１０４３）から入手する。ＯＶＩＳＥ細胞系は、１０％のウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２３３】
２７）卵巣嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＡＷ４２は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号８５０７３１０２）から入手する。ＯＡＷ４２細胞系は、ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＮａＰ）、２０ＩＵ／ｌのウシインスリンおよび１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２３４】
２８）卵巣明細胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶＴＯＫＯは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ；カタログ番号ＪＣＲＢ１０４８）から入手する。ＯＶＴＯＫＯ細胞系は、１０％のウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２３５】
２９）卵巣明細胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶＭＡＮＡは、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ；カタログ番号ＪＣＲＢ１０４５）から入手する。ＯＶＭＡＮＡ細胞系は、１０％のウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２３６】
３０）卵巣顆粒膜腫瘍に由来するヒト卵巣がん細胞系ＣＯＶ−４３４は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号０７０７１９０９）から入手する。ＣＯＶ−４３４細胞系は、ＤＭＥＭ、２ｍＭのグルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２３７】
３１）卵巣嚢胞腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶ５６は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号９６０２０７５９）から入手する。ＯＶ５６細胞系は、ＤＭＥＭ：ＨＡＭＳ  Ｆ１２（１：１）、２ｍＭのグルタミン、５％ウシ胎仔血清、０．５ｕｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンおよび１０ｕｇ／ｍｌのインスリン中で培養する。
【０２３８】
３２）卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＳＫ−ＯＶ−３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＨＴＢ−７７）から入手する。ＳＫ−ＯＶ−３細胞系を、ＡＴＣＣにより配合されたＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（カタログ番号３０−２００７）および１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２３９】
３３）卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系Ａ２７８０は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；カタログ番号９３１１２５１９）から入手する。Ａ２７８０細胞系は、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのグルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２４０】
３４）卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＩＧＲＯＶ−１は、ＥＺ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＥＺＴ−ＩＧＲＯ−１）から入手する。ＩＧＲＯＶ−１細胞系は、１０％ウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０２４１】
３５）卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＴＯＶ−２１Ｇは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＲＬ−１１７３０）から入手する。ＴＯＶ−２１Ｇ細胞系は、最終濃度１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含有するＭＣＤＢ  １０５培地と最終濃度２．２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムおよび１５％のウシ胎仔血清を含有するＭｅｄｉｕｍ  １９９の１：１混合物中で培養する。
【０２４２】
３６）卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶＣＡＲ−５は、ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＮＣＩ−６０ヒトがん細胞系パネルから入手する。ＯＶＣＡＲ−５細胞系を９０％のＲＰＭＩ１６４０および１０％の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養する。
【０２４３】
（実施例３）
ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体の、ＲＯＲ１陽性ヒト卵巣がん細胞系への結合（フローサイトメトリーにより検出される）
ａ）ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、ＳＷ−６２６、ＫＵＲＡＭＯＣＨＩ、ＯＶＳＡＨＯ、ＳＮＵ−１１９、ＣＯＶ３６２、ＯＶＣＡＲ−４、ＣＯＶ３１８、ＴＹＫ−ｎｕ、ＯＶＫＡＴＥ、ＣＡＯＶ−４、ＯＡＷ２８、ＣＡＯＶ−３、５９Ｍ、ＯＮＣＯ−ＤＧ−１、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−５、ＥＳ−２、ＣＯＶ−５０４、ＯＶ−９０、ＲＭＵＧ−Ｓ、ＣＯＶ−６４４、ＳＮＵ−８４０、ＯＶＩＳＥ、ＯＡＷ４２、ＯＶＴＯＫＯ、ＯＶＭＡＮＡ、ＣＯＶ−４３４、ＯＶ５６、ＳＫ−ＯＶ−３、Ａ２７８０、ＩＧＲＯＶ−１、および／またはＴＯＶ−２１Ｇを含めたヒト卵巣がん細胞系におけるＲＯＲ１の発現レベルを、フローサイトメトリーにより測定する。略述すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率についてカウントし、９６ウェル丸底プレートのウェル当たり細胞５０，０００個で再懸濁させ、Ａｌｅｘａ４８８で標識された抗ヒトＲＯＲ１抗体と共に４℃で３０分間インキュベートする。全てのＲＯＲ１およびアイソタイプ対照抗体を滴定し、０．０１〜１００ｎＭの間の最終濃度範囲で解析する。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−６０６−００８）と共に、４℃でさらに３０分間インキュベートする。インキュベーション時間の終了時に、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイス上で解析する。次いで、ＲＯＲ１の発現を蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として定量化し、ＭＦＩをＲＯＲ１抗体濃度の関数として示すグラフをプロットする。次いで、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してＥＣ５０値を測定する。表２．１は、Ｍａｂ１抗ＲＯＲ１抗体の、ＲＯＲ１陽性ＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞系およびＰＡ−１卵巣がん細胞系への結合についてのＥＣ５０を示す。ＲＯＲ１  Ｍａｂ１のＳＫ−ＯＶ−３に対する結合について計算されるＥＣ５０は推定値であり、実際よりも低く見積もられる可能性がある。Ｍａｂ１抗ＲＯＲ１抗体は、ＰＡ−１細胞系（高レベルのＲＯＲ１を発現することが後で見出された）に、ＳＫ−ＯＶ−３（低レベルのＲＯＲ１を発現することが後で見出された）に対するよりも大きな効力で結合する。図２は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞（Ａ、白抜きの四角）およびＰＡ−１細胞（Ｂ、白抜きの三角形）におけるＭＦＩの増大をＲＯＲ１  Ｍａｂ２  ＩｇＧの濃度の関数として示す。最大強度は、１０μｇ／ｍＬの抗体濃度で、ＰＡ−１細胞において、ＳＫ−ＯＶ−３細胞に対しておよそ３倍に達することができた。
【０２４４】
【表２．１】
2017536341.tif 000005
【０２４５】
ｂ）ヒト卵巣がん細胞ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、ＳＷ−６２６、ＫＵＲＡＭＯＣＨＩ、ＯＶＳＡＨＯ、ＳＮＵ−１１９、ＣＯＶ３６２、ＯＶＣＡＲ−４、ＣＯＶ３１８、ＴＹＫ−ｎｕ、ＯＶＫＡＴＥ、ＣＡＯＶ−４、ＯＡＷ２８、ＣＡＯＶ−３、５９Ｍ、ＯＮＣＯ−ＤＧ−１、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−５、ＥＳ−２、ＣＯＶ−５０４、ＯＶ−９０、ＲＭＵＧ−Ｓ、ＣＯＶ−６４４、ＳＮＵ−８４０、ＯＶＩＳＥ、ＯＡＷ４２、ＯＶＴＯＫＯ、ＯＶＭＡＮＡ、ＣＯＶ−４３４、ＯＶ５６、ＳＫ−ＯＶ−３、Ａ２７８０、ＩＧＲＯＶ−１および／またはＴＯＶ−２１Ｇの細胞表面上の、ＲＯＲ１抗原のコピー数を決定するために、Ｑｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ）法を使用する。卵巣腫瘍細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し（１００μｌ／ウェル；３５０×ｇで５分間）、細胞１００万個／ｍｌに調整する。５０μｌ（＝細胞５０万個）の細胞懸濁液を、示されている通り、９６丸底ウェルプレートの各ウェルに移す。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ）中で、２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで（または飽和濃度に）希釈された、５０μｌのマウス抗ヒトＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３５７８０２）、またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４０１５０１）を添加し、暗所内、４℃で３０分間、染色を実施する。次に、１００μｌのＳｅｔ−ｕｐ  ＢｅａｄｓまたはＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓを、別々のウェルに添加し、細胞ならびにビーズを、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄する。細胞およびビーズを、Ｑｉｆｉｋｉｔにより提供されている、フルオレセインコンジュゲート抗マウス二次抗体（飽和濃度の）を含有する、２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させる。細胞およびビーズを、暗所内、４℃で４５分間染色する。細胞を１回洗浄し、全ての試料を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させる。試料を、マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイスまたはＣｅｌｌＱＵＥＳＴを使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター）上で解析する。
【０２４６】
表２．２に示される通り、ＲＯＲ１抗原のコピー数／結合性部位を５つのヒト卵巣がん細胞系（ＥＳ−２、ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−５、ＣＯＬＯ−７０４およびＰＡ−１）において測定し、発現のレベルは異なった。ＥＳ−２細胞は、ヒトＲＯＲ１の抗原コピーを少しも発現しなかったのに対し、ＳＫＯＶ−３細胞は、低レベルのヒトＲＯＲ１、ＯＶＣＡＲ−５を発現し、ＣＯＬＯ−７０４細胞は、中程度のレベルのヒトＲＯＲ１を発現し、ＰＡ−１細胞は、高レベルのヒトＲＯＲ１を発現した。
【０２４７】
ＲＯＲ１の発現の結果に基づいて、ＲＯＲ１の発現レベルが高度、中程度および／または低度であるヒト卵巣がん細胞系を選択し、リダイレクトされたＴ細胞による細胞傷害作用アッセイにおいて腫瘍標的細胞として使用する。
【０２４８】
【表２．２】
2017536341.tif 000006
【０２４９】
（実施例４）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の作出
（実施例４．１）
抗ＣＤ３抗体の作出
以下のＶＨおよびＶＬ領域のタンパク質配列を使用して、ヒトおよびカニクイザル交差反応性ＣＤ３ε抗体を作出した。
【０２５０】
ＣＨ２５２７＿ＶＨ（配列番号２１）：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＨ２５２７＿ＶＬ（配列番号２２）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＦＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０２５１】
略述すると、上で記載した配列をコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲにより繋ぎ合わせて、それぞれ抗ＣＤ３抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするｃＤＮＡを合成した。
【０２５２】
抗ＣＤ３抗体ＣＨ２５２７（配列番号２１〜２８）を使用して、以下の実施例において使用するＴ細胞二特異性抗体を作出した。
【０２５３】
（実施例４．２）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性１＋１フォーマット：ＲＯＲ１に対して一価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）ｘ（Ｆａｂ）抗体の作出
１＋１の１アームフォーマット（すなわち、ＲＯＲ１に対して一価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）×（Ｆａｂ）抗体）の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、実施例１で作出された抗ＲＯＲ１抗体を用いて作製した。実施例１に記載されている、対応する抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ１抗体の完全Ｆａｂ（重鎖ＶＨドメインおよび重鎖ＣＨ１ドメインに加えた、軽鎖ＶＬドメインおよび軽鎖ＣＬドメイン）をコードするｃＤＮＡ、ならびに実施例４．１に記載されている抗ＣＤ３  ＶＨおよび抗ＣＤ３  ＶＬのｃＤＮＡを、出発材料として使用した。各二特異性抗体には、対応する抗ＲＯＲ１抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上で記載した抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖を含む、４つのタンパク質鎖が関与した。
【０２５４】
ＲＯＲ１×ＣＤ３二特異性抗体ベクターを作出するために、ＩｇＧ１由来の二特異性分子は、少なくとも、２つの顕著に異なる抗原性決定基ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合することが可能な、２つの抗原結合性部分を含む。抗原結合性部分は、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖から構成されるＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片のうちの少なくとも１つは、Ｆａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖の定常ドメインを交換した、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」断片である。Ｆａｂ断片内の重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインとの交換により、特異性の異なるＦａｂ断片が、同一のドメインの並びを有さず、結果として、軽鎖を相互交換しないことを確保する。二特異性分子のデザインは、両方の抗原性決定基に対して一価（１＋１）でありうるか、またはＣＤ３に対して一価、ＲＯＲ１に対して二価でありえ、この場合、１つのＦａｂ断片を内側のＣｒｏｓｓＦａｂのＮ末端と融合する（２＋１）。構築物の概略表示を図１に示す。構築物の配列を配列番号３０〜３６に示す。これらの分子は、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用してトランスフェクトすることによって作製する。１＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、１：１：１：１の比（「Ｆｃ（ノブ）ベクター」：「軽鎖ベクター」：「軽鎖ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」：「重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」）でトランスフェクトする。
【０２５５】
以下のＦｃ含有抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ（１＋１）を制作するためには、配列表（表１）で言及した、それぞれの構築物／配列番号が必要とされる：
ＲＯＲ１−ＴＣＢ（１＋１）、Ｆｃ含有：配列番号３０、３１、３３、および３６（図１Ｂ）
【０２５６】
（実施例４．３）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性２＋１フォーマット：ＲＯＲ１に対して二価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）２×（Ｆａｂ）抗体の作出
２＋１フォーマットによる抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体、すなわち、ＲＯＲ１に対して二価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）２×（Ｆａｂ）抗体は、腫瘍標的ＲＯＲ１に優先的に結合し、ＣＤ３抗体シンクを回避し、したがって、腫瘍に焦点を当てた薬物曝露の確率がより高いので、効力に対する利点、有効性および安全性に対する予測可能性を有し得る。
【０２５７】
２＋１フォーマットの抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体（すなわち、ＲＯＲ１に対して二価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）２×（Ｆａｂ）抗体を、実施例１において作出した抗ＲＯＲ１抗体を用いて作製する。実施例１に記載されている、対応する抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ１抗体の完全Ｆａｂ（重鎖ＶＨドメインおよび重鎖ＣＨ１ドメインに加えた、軽鎖ＶＬドメインおよび軽鎖ＣＬドメイン）をコードするｃＤＮＡ、ならびに実施例４．１に記載されている抗ＣＤ３  ＶＨおよび抗ＣＤ３  ＶＬのｃＤＮＡを、出発材料として使用した。各二特異性抗体には、対応する抗ＲＯＲ１抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上で記載した抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖を含む、４つのタンパク質鎖が含まれる。
【０２５８】
ＲＯＲ１×ＣＤ３二特異性抗体ベクターを作出するために、ＩｇＧ１由来の二特異性分子は、少なくとも、２つの顕著に異なる抗原性決定基ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合することが可能な、２つの抗原結合性部分からなる。抗原結合性部分は、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖を含むＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片のうちの少なくとも１つは、Ｆａｂ重鎖と、Ｆａｂ軽鎖の定常ドメインを交換した、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」断片である。Ｆａｂ断片内の重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインとの交換により、特異性の異なるＦａｂ断片が、同一のドメインの並びを有さず、結果として、軽鎖を相互交換しないことを確保する。二特異性分子のデザインは、両方の抗原性決定基に対して一価（１＋１）でありうるか、またはＣＤ３に対して一価、ＲＯＲ１に対して二価でありえ、この場合、１つのＦａｂ断片を内側のＣｒｏｓｓＦａｂのＮ末端と融合する（２＋１）。構築物の概略表示を図１に示す；構築物の配列を配列番号３０〜３６に示す。これらの分子は、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーを使用して共トランスフェクトすることによって作製する。２＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１の比（「Ｆｃ（ノブ）ベクター」：「軽鎖ベクター」：「軽鎖ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」：「重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」）でトランスフェクトする。
【０２５９】
以下の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ（２＋１）を制作するためには、配列表（表１）で言及した、それぞれの構築物／配列番号が必要とされる：
ＲＯＲ１−ＴＣＢ（２＋１）、Ｆｃ含有：配列番号３０（２×）、３１、３２、および３３（図１Ａ）
【０２６０】
（実施例４．４）
電荷変異体を伴うかまたは伴わない、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の作製および精製
二特異性抗体を作製するために、二特異性抗体を、懸濁液中で培養される、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性のポリマーベースの共トランスフェクションにより発現させる。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地中に、生細胞１５０万個で／ｍＬで播種する。最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離する（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させる。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１μｇのＤＮＡ（重鎖：修飾重鎖：軽鎖：修飾軽鎖の比＝１：１：２：１）を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製する。０．２７μＬのポリマー溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置する。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡ／ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置く。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸、および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加する。２４時間後、７０μＬのフィード溶液を、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加する。７日後、または細胞の生存率が、７０％と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離する。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、１つまたは２つの仕上げステップにより精製する。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用する。
【０２６１】
アフィニティーステップのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５  ６ＣＶで平衡化させたプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させる。所望の抗体を伴う画分を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（１：１０）で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮する。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛ける。
【０２６２】
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、１：１０に希釈し、カチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へとロードする。それぞれ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、ｐＨ５．０、および２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、２回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８．５を使用する勾配により溶出させる。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛ける。
【０２６３】
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Ｔｗｅｅｎ２０を伴うかまたは伴わない、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０と共に、ＸＫ１６／６０  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入する。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過する。
【０２６４】
抗体濃度の決定は、０．１％の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により行う。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｄａｔａ）により計算する。
【０２６５】
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ６．７による緩衝液中で、ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ））のそれぞれにより決定する。
【０２６６】
最終タンパク質調製物の分子量を検証し、最終タンパク質溶液中の分子が均質になるように調製されたことを確認するために、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用する。脱グリコシル化ステップをまず実施する。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、ＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）で処理する。したがって、２Ｍのトリス２μｌを、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとする２０μｇのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のｐＨを、ｐＨ７．０へと調整する。０．８μｇのＰＮＧａｓｅＦを、添加し、３７℃で１２時間インキュベートする。次いで、ＬＣ−ＭＳオンライン検出を実施する。ＬＣ−ＭＳ法は、ＴＯＦ  ６４４１質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）へとカップリングさせた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００上で実施する。クロマトグラフィーによる分離は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅカラム；ＲＰ１０００−８（粒子サイズを８μｍとする、４．６×２５０ｍｍ；カタログ番号７１９５１０）上で実施する。溶離液Ａは、水中に５％のアセトニトリル、および０．０５％（ｖ／ｖ）のギ酸であり、溶離液Ｂは、９５％のアセトニトリル、５％の水、および０．０５％のギ酸である。流量は、１ｍｌ／分であった。分離は、４０℃で実施し、前に記載した処理により、６μｇ（１５μｌ）のタンパク質試料を得る（表３）。
【０２６７】
【表３】
2017536341.tif 000007
【０２６８】
最初の４分間の間、質量分析計を塩汚染から保護するように、溶出液を、廃棄物へと方向づける。ＥＳＩ源は、乾燥ガス流量を１２ｌ／分とし、温度を３５０℃とし、噴霧器圧力を６０ｐｓｉとして動作させた。ＭＳスペクトルは、陽イオンモードにおいて、３８０Ｖのフラグメンター電圧および７００〜３２００ｍ／ｚの質量範囲を使用して取得する。ＭＳデータは、計器ソフトウェアにより、４〜１７分間にわたり取得する。
【０２６９】
（実施例５）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、卵巣がん細胞およびＴ細胞への結合（フローサイトメトリーにより測定される通り）
実施例４において作出した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、フローサイトメトリーにより、ヒト卵巣がん細胞系ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、および／またはＳＷ−６２６およびヒト白血病性Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）上に発現するヒトＣＤ３へのそれらの結合について解析する。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を１０％のウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ中で培養する。略述すると、培養細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して細胞生存率を査定する。次いで、生細胞を、０．１％のＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個に調整する。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートに、ウェルごとに、さらにアリコート分割する。細胞を含有するウェルに、３０μｌの、Ａｌｅｘａ４８８で標識された抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体または対応するＩｇＧ対照を添加して、１ｎＭ〜５００ｎＭ（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞）、または０．１ｎＭ〜１００ｎＭ（ヒト卵巣がん細胞）の最終濃度を得た。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体および対照ＩｇＧは同じモル濃度で使用する。４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１５０μｌ／ウェルの、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、次いで、細胞を、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析する。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、ヒト卵巣がん細胞およびＴ細胞への結合を査定し、蛍光強度中央値を、ヒト卵巣がん細胞またはＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のいずれかをゲーティングして決定し、ヒストグラムおよびドットプロットにプロットする。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−６０６−００８）と共に、４℃でさらに３０分間インキュベートする。次いで、細胞を、Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析する。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体についての蛍光強度中央値を抗体濃度の関数としてプロットする。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３抗体のヒト卵巣がん細胞への結合についてのＥＣ５０値（最大結合の５０％に達するのに要請される抗体の濃度を示す）を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定する。図２に示される通り、抗体濃度の関数として、蛍光強度シグナル中央値の増大によって測定される通り、ＲＯＲ１  Ｍａｂ１  ＩｇＧ（白抜きの四角）およびＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢ（塗りつぶし四角）の、ＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞系（Ａ）およびＰＡ−１ヒト卵巣がん細胞系（Ｂ）における濃度依存的結合が見られた。このような陽性シグナルは、ＣＤ３だけに結合し、ＲＯＲ１に結合しない対照ＴＣＢをＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞系およびＰＡ−１卵巣がん細胞系の両方で試験した場合には観察されなかった（ＡおよびＢ；塗りつぶし丸）。図３に示される通り、ＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢｃｖおよび対照ＴＣＢの、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞における濃度依存的結合が見られ、これにより、両方のＴＣＢ抗体が、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合することが確認される。
【０２７０】
（実施例６）
卵巣がん細胞の存在下における、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体との会合時のＴ細胞の活性化（フローサイトメトリー）
実施例４において作出した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体をまた、ＲＯＲ１陽性ヒト卵巣がん細胞系ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、および／またはＳＷ−６２６の存在下における、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の、早期活性化マーカーＣＤ６９および／または後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現を査定することにより、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞の活性化を誘導するそれらの潜在性についても解析した。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して、細胞２５，０００個／ウェルの密度でプレーティングする。細胞を、一晩放置して接着させる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製する。採取したての血液を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に、層状に載せる。遠心分離の後（室温、４５０×ｇで３０分間）、ＰＢＭＣを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを、新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳを満たす。混合物を遠心分離し（室温、４００×ｇで１０分間）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄する（３５０×ｇで１０分間の遠心分離ステップ）。結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、さらなる使用まで（２４時間を超えない）、細胞系供給元（実施例２を参照されたい）に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、５％のＣＯ２、３７℃で保存する。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体によって誘導されるＴ細胞の活性化を調査するために、ヒト卵巣がん細胞を示されている濃度の二特異性抗体に曝露する（０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲、三連で）。次いで、ＰＢＭＣを、ヒト卵巣がん標的細胞に、最終的なエフェクターと標的の比（Ｅ：Ｔ）比、１０：１で添加する。５％のＣＯ２、３７℃で２４〜４８時間のインキュベーション後に、Ｔ細胞の活性化を評価する。インキュベーション期間後、細胞を、遠心分離により（３５０×ｇで５分間）ウェルから収集し、ペレット化し、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄する。ヒトＣＤ４（マウスＩｇＧ１、Ｋ；クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（マウスＩｇＧ１、Ｋ；クローンＨｉｔ８ａ；ＢＤ型番５５５６３５）、ＣＤ６９（マウスＩｇＧ１；クローンＬ７８；ＢＤ型番３４０５６０）およびＣＤ２５（マウスＩｇＧ１、Ｋ；クローンＭ−Ａ２５１；ＢＤ型番５５５４３４）に対する、選択された蛍光色素コンジュゲート抗体によるエフェクター細胞の表面染色を、光から保護して、ＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、製造元のプロトコールに従って、４℃で３０分間実施する。細胞を、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液で２回洗浄し、次いで、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再���濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析する。ＣＤ６９活性化マーカーまたはＣＤ２５活性化マーカーの発現を、ヒストグラムまたはドットプロットに示される通り、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団をゲーティングした場合の蛍光強度中央値を測定することによって決定する。図４に示される通り、ＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３標的細胞の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）において観察された、ＣＤ６９早期活性化マーカーの濃度依存的な増大を誘導したのに対し、対照ＴＣＢ（三角形）は、Ｔ細胞の活性化を少しも誘導しなかった。臨床的に関与性の濃度である１ｎＭのＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢにおいて、４８時間のインキュベーション後、最大２５％の活性化ＣＤ４  Ｔ細胞および２０％の活性化ＣＤ８  Ｔ細胞が既に存在していた。
【０２７１】
（実施例７）
ヒト卵巣がん細胞の細胞溶解（ＬＤＨ放出アッセイ）
実施例４において作出した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、ヒト卵巣がん細胞におけるＴ細胞媒介性細胞傷害作用の誘導について解析する。ヒト卵巣がん細胞系ＰＡ−１、ＭＣＡＳ、ＥＦＯ−２１、ＣＯＬＯ−７０４、および／またはＳＷ−６２６。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して、細胞２５，０００個／ウェルの密度でプレーティングする。細胞を、一晩放置して接着させる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製する。採取したての血液を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に、層状に載せる。遠心分離の後（室温、４５０×ｇで３０分間）、ＰＢＭＣを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを、新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳを満たす。混合物を遠心分離し（室温、４００×ｇで１０分間）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄する（３５０×ｇで１０分間の遠心分離ステップ）。結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、さらなる使用まで（２４時間を超えない）、細胞系供給元（実施例２を参照されたい）の示唆に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、５％のＣＯ２、３７℃で保存する。殺滅アッセイのために、抗体を、示されている濃度で添加する（０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲、三連で）。ＰＢＭＣを、ヒト卵巣がん標的細胞に最終的なエフェクターと標的の比（Ｅ：Ｔ）比、１０：１で添加する。５％のＣＯ２、３７℃で２４〜４８時間のインキュベーション後、アポトーシス性／壊死性細胞により細胞の上清中に放出されるＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１  ６４４  ７９３  ００１）により、製造元の指示書に従い、標的細胞による殺滅を評価する。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴う、標的細胞のインキュベーションによって実現される。最小溶解（＝０％）は、エフェクター細胞を伴い、二特異性構築物を伴わずに共インキュベートされた標的細胞を指す。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度反応曲線において、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットする。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、ＬＤＨ放出の５０％を結果としてもたらすＴ細胞二特異性抗体の濃度として決定した。図５に示される通り、ＲＯＲ１  Ｍａｂ１−ＴＣＢ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が高度なＰＡ−１卵巣がん細胞（Ａ）、ＲＯＲ１の発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５（Ｃ）卵巣がん細胞およびＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞（Ｄ）の腫瘍細胞溶解の濃度依存的な増大を誘導した。対照的に、ＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ（Ａ、Ｂ、Ｃ；丸）は、臨床的に関与性の濃度（すなわち、最大１０ｎＭ）において腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。代表的な実験を示す。
【０２７２】
【表９】
2017536341.tif 000008
【図１Ａ−Ｂ】
2017536341.tif 000009
【図１Ｃ−Ｄ】
2017536341.tif 000010
【図１Ｅ−Ｇ】
2017536341.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
2017536341.tif 000014
【図５ＡＢ】
2017536341.tif 000015
【図５ＣＤ】
2017536341.tif 000016
【配列表】
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【国際調査報告】
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2017536341.tif 000018
2017536341.tif 000019