(57)【要約】  生きた実質細胞、生きた角膜内皮細胞（ＣＥＣ）、および生きた角膜上皮細胞（ＣＥｐＣ）を別々に培養し、かつ細胞を別々のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込めるために、別々の実質層、ＣＥＣ層、およびＣＥｐＣ層を３Ｄバイオプリントすることにより、人工角膜が製造される。ＣＥＣ層が実質層の第１の側面に、かつＣＥｐＣ層が実質層の第２の側面に付着されて、人工角膜を画定する。【選択図】図３
2017529842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工角膜を製造する方法において、
生きた実質細胞を培養するステップと；
前記生きた実質細胞を第１のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込める実質層を３Ｄバイオプリントするステップと；
生きた角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を培養するステップと；
前記生きたＣＥＣを第２のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込めるＣＥＣ層を３Ｄバイオプリントするステップと；
生きた角膜上皮細胞（ＣＥｐＣ）を培養するステップと；
前記生きたＣＥｐＣを第３のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込めるＣＥｐＣ層を３Ｄバイオプリントするステップと；
前記ＣＥＣ層を前記実質層の第１の側面に、かつ前記ＣＥｐＣ層を前記実質層の第２の側面に付着させるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記培養ステップが同時に実行されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記ＣＥＣ層を３Ｄバイオプリントする前記ステップおよび前記ＣＥｐＣ層を３Ｄバイオプリントする前記ステップが同時に実行されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記ＣＥＣ層を前記実質層の前記第１の側面に付着させる前記ステップが、前記実質層および前記ＣＥＣ層を連続してプリントするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記ＣＥＣ層を前記実質層の前記第１の側面に付着させる前記ステップが、前記層のそれぞれの間にヒドロゲルの薄いフィルムを与え、かつＵＶ曝露を介して硬化させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記ＣＥｐＣ層を前記実質層の前記第２の側面に付着させる前記ステップが、前記層のそれぞれの間にヒドロゲルの薄いフィルムを与え、かつＵＶ曝露を介して硬化させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記ＣＥＣ層を３Ｄバイオプリントする前に、前記ＣＥＣをアクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンのプレポリマー溶液と混合するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記プレポリマー溶液がＭＡ−ＨＡをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、前記ＣＥｐＣ層を３Ｄバイオプリントする前に、前記ＣＥｐＣをアクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンのプレポリマー溶液と混合するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記プレポリマー溶液がＭＡ−ＨＡをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、前記実質層を３Ｄバイオプリントする前に、前記実質細胞をアクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンヒドロゲル中に閉じ込めるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記プレポリマー溶液がＭＡ−ＨＡをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記実質細胞がおよそ５００万個／ｍｌ〜２５００万個／ｍｌの実質細胞の範囲内の細胞密度で閉じ込められることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、生きたＣＥｐＣを培養する前記ステップが、ＬＳＣを培養し、かつ前記ＬＳＣをＣＥｐＣに分化させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記ＬＳＣが自己由来組織から得られることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、生きたＣＥＣを培養する前記ステップが、ヒトドナー由来のＣＥＣ祖先を培養し、かつ前記ＣＥＣ祖先をＣＥＣに分化させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法において、ＣＥＣ祖先が自己由来組織から得られることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法において、前記第１、第２および第３のヒドロゲルナノメッシュがＰＥＧＤＡを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
第１のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込められた生きた実質細胞を含む、３Ｄバイオプリントされた実質層であって、第１の側面および第２の側面を有する実質層と；
第２のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込められた生きた角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を含む、３ＤバイオプリントされたＣＥＣ層と；
第３のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込められた生きた角膜上皮細胞（ＣＥｐＣ）を含む、３ＤバイオプリントされたＣＥｐＣ層と
を含む層構造体
を含む人工角膜において、
前記ＣＥＣ層が前記実質層の前記第１の側面に付着され、および前記ＣＥｐＣ層が前記実質層の前記第２の側面に付着されていることを特徴とする人工角膜。
【請求項２０】
請求項１９に記載の人工角膜において、前記ＣＥＣ層および前記ＣＥｐＣ層のうちの１つ以上が、前記層の間に与えられ、かつＵＶ曝露を介して硬化されたヒドロゲルの薄いフィルムによって付着されていることを特徴とする人工角膜。
【請求項２１】
請求項１９に記載の人工角膜において、前記生きた実質細胞が、前記実質層をバイオプリントする前にヒドロゲル中に閉じ込められることを特徴とする人工角膜。
【請求項２２】
請求項２１に記載の人工角膜において、前記ヒドロゲルがアクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンを含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項２３】
請求項２０に記載の人工角膜において、前記ヒドロゲルがＭＡ−ＨＡをさらに含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項２４】
請求項１９に記載の人工角膜において、前記生きたＣＥＣが、前記ＣＥＣ層をバイオプリントする前にヒドロゲル中に閉じ込められることを特徴とする人工角膜。
【請求項２５】
請求項２４に記載の人工角膜において、前記ヒドロゲルがアクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンを含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項２６】
請求項２５に記載の人工角膜において、前記ヒドロゲルがＭＡ−ＨＡをさらに含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項２７】
請求項１９に記載の人工角膜において、前記生きたＣＥｐＣが、培養されかつ分化されたＬＳＣを含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項２７】
請求項１９に記載の人工角膜において、前記生きたＣＥｐＣが、前記ＣＥｐＣ層をバイオプリントする前にヒドロゲル中に閉じ込められることを特徴とする人工角膜。
【請求項２８】
請求項２７に記載の人工角膜において、前記ヒドロゲルがアクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンを含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項２９】
請求項２８に記載の人工角膜において、前記ヒドロゲルがＭＡ−ＨＡをさらに含むことを特徴とする人工角膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月２４日出願の米国仮特許出願第６２／０５４，９２４号明細書の優先権の利益を主張し、この出願はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、人工組織の３Ｄバイオプリンティングに関し、より詳細には、３Ｄバイオプリンティングを用いて作製された人工角膜に関する。
【背景技術】
【０００３】
角膜の１つまたは複数の層の疾患または損傷は、失明の原因となり得、一般的に角膜移植によって処置される。米国では毎年、およそ４０，０００人の患者が角膜移植手術を受けている。これらの患者の大多数は、移植用角膜をヒトドナーから入手している。手術の成功率は高いが、ドナー組織の供給は限られ、待機リストは長くなり得る。発展途上国では、ドナー組織の入手は一層困難である。さらに、ヒトドナー移植は、角膜失明の標準的な処置であるが、その固有の合併症および制限により、合成角膜代替物の開発が促進されてきた。既存の合成角膜は、以下にカテゴリ化することができる：１）完全合成人工器官（例えば人工角膜移植片（ｋｅｒａｔｏｐｒｏｓｔｈｅｓｅ））、および２）宿主組織の再生を可能にするヒドロゲル。
【０００４】
人工角膜移植片、すなわちＫｐｒｏは、最もよく知られている人工角膜であり、角膜の屈折機能を担うものである。Ｋｐｒｏは長年にわたり種々の形態で入手可能であるものの、透明な合成実質均等物（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）の製造、生体力学、およびヒトドナー角膜の再生能力は大きい課題のままである。さらに、人工角膜移植片の用途は、複雑な移植手順、ならびに感染症、カルシウム沈着、人工角膜移植片後膜（ｒｅｔｒｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）形成および緑内障を含む主な術後合併症によって妨げられる。場合によっては、その感染傾向のために、患者は生涯にわたる抗生物質治療を受けなければならない。結果として、人工角膜は、天然のドナー組織を繰り返し拒絶した患者、または他にそのような移植手術が望ましくない患者において最後の手段としてのみ用いられる。
【０００５】
第２のタイプの加工角膜は、合成ヒドロゲルベースの無細胞移植片であり、これは、宿主細胞を動員して、移植片の表面上に上皮層を増殖させて機能を回復させるように設計されるものである。このヒドロゲル移植片の多くは、有機組織に類似しており、弾性率が高く、所望の光学特性を有する。しかしながら、殆どの場合、機械的固定または生物学的固定に問題がある（移植されたスカフォールドの、宿主組織との一体化が極めて時間のかかるプロセスである）。この遅い時系変化は、高齢のかつ／または激しく負傷した患者において細胞再増殖活性が制限されることにより、さらに激化する。また、このヒドロゲル移植片の一部は、報告によると、移植後、長期間にわたって部分的に生物分解されて、透明性の低下および移植の不全の原因となった。無細胞移植片に関する一部の問題に対処する試みとして、細胞接着および分解性の調節に必須であると考えられているグルコサミノグリカンのヒドロゲルマトリックス中への組込みが挙げられる。
【０００６】
バイオナノテクノロジーの変革的用途の１つが、ヒトの組織および臓器の再構築および再生のための革命的アプローチをもたらすことである。この見込みは、ナノテクノロジーが生物学的関連において、ナノスケールでの細胞機構に対する制御の固有のモダリティを実現する強力な能力に基づいている。その特別な表面特性、亜細胞の長さスケール、および正確な指向性モジュラーアーキテクチャのために、ナノ構造およびその組織加工構築体内での組込みは、再生医療に関する新しいパラダイムを提供する。３Ｄバイオプリンティング  −  生体適合材料、細胞、タンパク質、および他の生体化合物を構築ブロックとして用いて、付加的な製造プロセスにより３Ｄ構造体を製造する  −  は、解剖学的に正確な移植用組織構築体の実現を加速することができる新しいアプローチを提供する。新進の技術の収集およびその相乗的な一体化  −  標準的な病態生理学を模倣する、ナノテクノロジーにより可能な３Ｄ組織モデルを提供することによる  −  により、再生医療の臨床能力を再定義することができるだけでなく、薬物発見および生物科学における基礎研究に利用可能なツールセットを一変させることもできる。
【発明の概要】
【０００７】
既存の人工角膜技術で経験される欠点を克服するアプローチは、拒絶に抵抗し、かつ宿主組織と容易に一体化される、細胞ベースの組織加工角膜代替物を提供することであろう。本発明は、そのようなアプローチに関する。
【０００８】
例示的な実施形態において、３Ｄバイオプリンティングプラットフォームを用いて、担細胞（ｃｅｌｌ−ｌａｄｅｎ）角膜代替物を製造する方法および系が提供される。そのような人工角膜は、角膜上皮の疾患を処置する既存の方法に関わる多くの合併症を回避する新たなアプローチを提供する。本発明の実施形態によれば、３Ｄバイオプリンタにより、プリントされたネットワーク内に細胞を閉じ込めることができ、組織構造体のライブプリンティングがマイクロメートルスケールおよびナノメートルスケールの分解能で可能となる。担細胞角膜代替物は、移植片が宿主組織と一体化する時間を短くすることができる。さらに、３Ｄプリンティングのデジタル的な（すなわち、カスタマイズ可能な）性質により、当業者は、形状および曲率を設計して患者特異的組織モデルを開発することができる。そのような３Ｄプリント角膜組織は、動物実験の必要性にとって代わるまたはそれを減らすための、臨床移植、ヒト眼表面の疾患モデリング（例えば、ドライアイ疾患について）、早期の薬物スクリーニングにおいて、および創傷治癒のための薬物効能試験において即座に利用されることになる。
【０００９】
例示的な実施形態によれば、生きた実質細胞、生きた角膜内皮細胞（ＣＥＣ）、および生きた角膜上皮細胞（ＣＥｐＣ）を別々に培養し、かつ生細胞を別々のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込めるために、別々の実質層、ＣＥＣ層、およびＣＥｐＣ層を３Ｄバイオプリントすることにより、人工角膜が製造される。ＣＥＣ層が実質層の第１の側面に、かつＣＥｐＣ層が実質層の第２の側面に付着されて、人工角膜を画定する。
【００１０】
本発明の一態様において、人工角膜を製造する方法は、生きた実質細胞を培養するステップと；生きた実質細胞を第１のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込める実質層を３Ｄバイオプリントするステップと；生きた角膜内皮細胞（ＣＥＣ）を培養するステップと；生きたＣＥＣを第２のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込めるＣＥＣ層を３Ｄバイオプリントするステップと；生きた角膜上皮細胞（ＣＥｐＣ）を培養するステップと；生きたＣＥｐＣを第３のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込めるＣＥｐＣ層を３Ｄバイオプリントするステップと；ＣＥＣ層を実質層の第１の側面に、かつＣＥｐＣ層を実質層の第２の側面に付着させるステップとを含む。一部の実施形態において、培養ステップは同時に実行される。ＣＥＣ層を３ＤバイオプリントするステップおよびＣＥｐＣ層を３Ｄバイオプリントするステップは同時に実行されてよい。実質層およびＣＥＣ層を連続してプリントすることにより、ＣＥＣ層は実質層の第１の側面に付着され得る。あるいは、層のそれぞれの間にヒドロゲルの薄いフィルムを与え、かつＵＶ曝露を介して硬化させることにより、ＣＥＣ層は実質層の第１の側面に付着され得る。層のそれぞれの間にヒドロゲルの薄いフィルムを与え、かつＵＶ曝露を介して硬化させることにより、ＣＥｐＣ層は実質層の第２の側面に付着され得る。好ましい実施形態において、ＣＥＣ層を３Ｄバイオプリントする前に、ＣＥＣは、アクリロイル−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−コラーゲンのプレポリマー溶液と混合される。プレポリマー溶液はメタクリレート−ヒアルロン酸（ＭＡ−ＨＡ）をさらに含んでよい。別の好ましい実施形態において、ＣＥｐＣ層を３Ｄバイオプリントする前に、ＣＥｐＣは、アクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンのプレポリマー溶液と混合される。プレポリマー溶液はＭＡ−ＨＡをさらに含んでよい。別の好ましい実施形態において、実質層を３Ｄバイオプリントする前に、実質細胞を、ＭＡ−ＨＡを含んでよいアクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンヒドロゲル中に閉じ込める。実質細胞は、およそ５００万個／ｍｌ〜２５００万個／ｍｌの実質細胞の範囲内の細胞密度で閉じ込められてよい。
【００１１】
一部の実施形態において、生きたＣＥｐＣは、輪部幹細胞（ＬＳＣ）から培養され、かつ分化される。ＬＳＣは自己由来組織から得られてよい。生きたＣＥＣは、ヒトドナー由来のＣＥＣ祖先から培養され、かつ分化されてよい。ＣＥＣ祖先は自己由来組織から得られてよい。
【００１２】
本発明の別の態様において、人工角膜は、第１のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込められた生きた実質細胞を含む、３Ｄバイオプリントされた実質層であって、第１の側面および第２の側面を有する実質層と；第２のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込められた生きたＣＥＣを含む、３ＤバイオプリントされたＣＥＣ層と；第３のヒドロゲルナノメッシュ中に閉じ込められた生きたＣＥｐＣを含む、３ＤバイオプリントされたＣＥｐＣ層とを含む層構造体を含み、ＣＥＣ層は実質層の第１の側面に付着され、およびＣＥｐＣ層は実質層の第２の側面に付着されている。人工角膜の一部の実施形態において、ＣＥＣ層およびＣＥｐＣ層のうちの１つ以上は、層の間に与えられ、かつＵＶ曝露を介して硬化されたヒドロゲルの薄いフィルムによって付着されている。
【００１３】
生きた実質細胞は、好ましくは、実質層をバイオプリントする前にヒドロゲル中に閉じ込められる。ヒドロゲルは、アクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンであってよく、かつＭＡ−ＨＡをさらに含んでよい。生きたＣＥＣはまた、ＣＥＣ層をバイオプリントする前にヒドロゲル中に閉じ込められる。ヒドロゲルは、アクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンであってよく、かつＭＡ−ＨＡをさらに含んでよい。生きたＣＥｐＣはまた、ＣＥｐＣ層をバイオプリントする前にヒドロゲル中に閉じ込められる。ヒドロゲルは、アクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲンであってよく、かつＭＡ−ＨＡをさらに含んでよい。生きたＣＥｐＣは、培養されかつ分化されたＬＳＣから得られてよい。
【００１４】
ナノテクノロジー、３Ｄバイオプリンティング、および再生医療の多くの専門分野にわたるドメインにおける新進の技術を統合することで、本発明者らは、角膜ドナー組織への現在の依存を除外し、かつ重篤なヒト角膜失明患者において普通であれば失われたであろう視野を回復させるための新たな戦略を提供することにより、臨床の状況を変える人工角膜を開発した。角膜の本来の解剖学的多層構造は、本発明者らの層ごとのナノメッシュ一体化３Ｄプリンティングアプローチの最初の利用に十分に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、３ｄＬＰプリンティング系の実施形態の概略図である。
【図２】図２は、３Ｄライブプリンティングを用いて生じた人工角膜の実施形態の、ヒト類似体と比較した概略図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従って人工角膜を製造する例示的なプロセスのフローチャートである。
【図４Ａ】図４Ａは、ゼラチンメタクリレート（ＧｅｌＭＡ）ベースのマトリックス上で培養したＬＳＣによる細胞移植後のウサギ角膜を示しており、上皮欠損のない典型的な角膜上皮組織構造、および滑らかで透明な角膜表面を示す。左側のパネルは、Ｈ＆Ｅ染色を示し、右側のパネルは、角膜の白色光の顕微鏡写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒト羊膜でカバーしたのみの剥皮角膜を示しており、上皮化生の組織構造および血管新生により不透明な角膜を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、移植３ヵ月後のウサギ角膜を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、３Ｄバイオプリンティングによって生じた種々のミクロ構造体を示す。図５Ａは、ＰＥＧＤＡを用いた、細孔サイズ２００μｍの多層ログパイルスカフォールドを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、３Ｄバイオプリンティングによって生じた種々のミクロ構造体を示す。図６Ｂは、ＧｅｌＭＡ中の３Ｄプリント血管様ミクロ構造体（スケールバー＝３０μｍ）を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、３Ｄバイオプリンティングによって生じた種々のミクロ構造体を示す。図６Ｃは、ＧｅｌＭＡスカフォールド内に閉じ込めた１０Ｔ１／２細胞を示す（スケールバー＝１ｍｍ）。
【図６】図６は、ＧｅｌＭＡヒドロゲルの例示的な合成スキームを示す。
【図７】図７は、３ｄＬＰ系を用いて生じたコンフルエントＣＥＣ層を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、組成が異なるヒドロゲルフィルムの光学特性の評価を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、組成が異なるヒドロゲルフィルムの光学特性の評価を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、組成が異なるヒドロゲルフィルムの光学特性の評価を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、移植後５日目の移植された角膜の透明性および機能性の緩やかな回復を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、移植後１０日目の移植された角膜の透明性および機能性の緩やかな回復を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、移植後１５日目の移植された角膜の透明性および機能性の緩やかな回復を示す。
【図１０】図１０は、本発明の実施形態に従う人工角膜を設計し、製造し、かつ移植するための例示的なプロセスのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ナノテクノロジー、３Ｄバイオプリンティング、および再生医療の多くの専門分野にわたるドメインにおける新進の技術を統合することで、本発明者らは、角膜ドナー組織への現在の依存を除外し、かつ重篤なヒト角膜失明患者において普通であれば失われたであろう視野を回復させるための新たな戦略を提供することにより、臨床の状況を変える人工角膜を開発した。本発明のアプローチは、ナノベースの３Ｄプリンティングを角膜再生に利用するものである。角膜の本来の解剖学的多層構造は、本発明者らの層ごとのナノメッシュ一体化３Ｄプリンティングアプローチの最初の利用に十分に適している。
【００１７】
３Ｄライブプリンティング（「３ｄＬＰ」）技術は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）投射および自動化ステージによる、一連の層の連続３Ｄプリンティングを利用する。類似の３Ｄプリンティング系が異なる用途について以前に開示されている（例えば、国際公開第２０１４／１９７６２２号パンフレットおよび国際公開第２０１２／０７１４７７号パンフレット参照。これらの出願は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００１８】
３Ｄヒドロゲルマトリックスを用いた人工角膜の製造は、デジタルマスク（すなわち「マスクレス」）投射プリンティングを利用する。そこでは、従来のコンピュータプロジェクタにおいて見られるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）が、選択されたポリマーに適した紫外線（ＵＶ）光源または他の光源を用いて、感光性液状プレポリマーを重合させて固めている。図１は、マスクレス投射プリンティング系２の例示的な実施例を示しており、これは「動的投射ステレオリソグラフィ」（ＤＰｓＬ）プラットフォームと呼ばれる。「マスクレス」アプローチ、すなわちデジタルマスクアプローチは、従来のフォトリソグラフィに用いられるような静的でより高価な物理学的マスクよりもむしろ、制御可能かつ互換可能な反射光パターンの使用を可能にする。系２は、ＵＶ光源６、パターンの作成を誘導する、スライスされた画像フロー生成のためのコンピュータコントローラ１０、およそ１００万個のマイクロミラーで構成され、動的マスクとしてプロジェクタ内に組み込まれているＤＭＤチップ１２、投射オプティクス１４、サンプル位置制御のための変換ステージ１６、および光硬化性プレポリマー材料１３の源を備える。ＤＭＤチップ１２は、小さいヒンジ上に取り付けられたコーティングされたアルミニウムマイクロ反射ミラーのアレイを作用させて、そのミラーを光源に向くように、または光源から離れるように傾かせて、投射表面上に明（「オン」）ピクセルまたは暗（「オフ」）ピクセルを生じさせることで、光を２つの状態［０、１］に切り換えることができ、２本のバイアス電極により、表面に対して＋１２°または−１２°の角度を形成するように傾かせることができる。このように、ＤＭＤ系は、最大１，０２４の濃淡の灰色にピクセルを反映して、非常に詳細なグレイスケール画像を生じさせることができる。
【００１９】
コンピュータコントローラ１０は、示されるように、所定の層についての所望の構造の画像８を表示することができ、かつ／またはマトリックスの所望のパラメータを表示することができる。クォーツウィンドウまたは他の光透過材料１５、スペーサ１８、およびベース１９が、全て変換ステージ１６上に支持されており、これらがプレポリマー溶液１３を含有するプリンティング容量または「バット」を画定する。付加的な溶液１３が、必要に応じて、シリンジポンプ（不図示）を用いてプリンティング容量中に導入されてよい。コントローラ１０によって生じるコマンドに基づいて、この系は、ＤＭＤチップ１２（１９２０×１０８０の分解能）を用いて、コリメートされたＵＶ光を空間的に調節して、カスタム定義された光学パターンを光硬化性プレポリマー溶液１３上に投射する。
【００２０】
３Ｄ構造体を生じさせるために、ＤＰｓＬ等の投射ステレオリソグラフィプラットフォームは、層ごとの製造手順を利用する。例示的なアプローチにおいて、３Ｄコンピュータレンダリング（ＣＡＤソフトまたはＣＴスキャンにより行われる）が、等間隔の一連の平面または層に分解される。説明のために、ある所望のメッシュ状構造の層を表す単純なハニカムパターンがコンピュータコントローラ１０のディスプレイ８上に表示されている。各層のパターンは、ＤＭＤチップ１２にインプットされて、ＵＶ光が光硬化性（プレポリマー）材料１３上に曝されると、ポリマー構造体１７が生じる。ある層がパターン化された後、コンピュータコントローラ１０は自動化ステージ１６を降ろし、所定高さのポリマー構造体１７を構築するために次のパターンが表示される。コンピュータコントローラ１０のプログラミングを介して、ユーザーは、ステージ速度、光強度、および構造体１７の高さを制御して、複雑な種々の構造体２０を製造することができる。単一のハニカム構造体が示されるが、パターンのあらゆる組合せが用いられて、互いに重なる様々なパターンの多層構造体が構築され得ることに留意されたい。
【００２１】
ＤＭＤチップに代わるものとして、ガルバノ光学スキャナまたはポリゴンスキャニングミラーが用いられてよい。これらの技術は両方とも、商業的に入手可能であり、高速共焦点走査顕微鏡への利用で知られている。本発明の系および方法との併用に適した走査機構の選択は、当技術分野における技術レベルの範囲内であろう。
【００２２】
例示的な実施形態によれば、細胞ベースの人工角膜を製造するプロセスは、３ステップ戦略に従う。図３を参照すると、ステップ３２において、本発明者らは、ナノメッシュが組み込まれた基底膜上でＣＥｐＣ（角膜上皮細胞）およびＣＥＣ（角膜内皮細胞）を増殖させるための培養条件を確立および最適化した。最適な培養条件を決定した後、本発明者らは、３Ｄライブプリンティングを用いて、本発明者らの３ｄＬＰ系に関する層ごとのスキームに従って３枚の角膜層をアセンブルした。ステップ３４において、実質細胞は、Ａｃ−Ｃｏｌヒドロゲル（７．５ｗｔ％プラス２５ｗｔ％ＰＥＧＤＡ）（アクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲン）中に、天然の角膜に類似するおよそ５００万個／ｍｌ〜２５００万個／ｍｌの実質細胞の範囲内の細胞密度で閉じ込められる。この層をプリントするための投射時間は、１秒〜５秒であってよい。ステップ３６において、３Ｄナノプリンティングを介して製造されたナノメッシュが実質層中に同時に組み込まれる。ステップ３２由来の最適化条件を用いて、ＣＥＣ層およびＣＥｐＣ層は、２つの平行したスキームを介して実質と共にアセンブルされる。ステップ３８およびステップ４０において、ＣＥＣは、Ａｃ−Ｃｏｌプレポリマー溶液（５ｗｔ％）と混合されて、３０秒間の光重合を介して実質層上にナノメッシュによりプリントされる。ステップ４２およびステップ４４において、類似のアプローチが用いられて、実質の他方の側にＣＥｐＣ層がプリントされてよい。ＣＥＣ層およびＣＥｐＣ層は、実質層の反対側に同時にプリントされる必要もなく、または連続してプリントされる必要もない。あるいは、ナノメッシュが組み込まれた各基底膜上にコンフルエント細胞層を既に有する予め発達したＣＥＣ層およびＣＥｐＣ層が、Ａｃ−Ｃｏｌの薄いフィルムを層の間に与え、かつＵＶ曝露を介して硬化することにより、実質に「接着」され得る（ステップ４６）。最終のプリント構築体は、残留する未重合のあらゆる溶液を除外するために、生理食塩水バッファで徹底的にリンスされて（示されないステップ）、移植まで培地中でさらに維持される。最後に、３Ｄプリント角膜は移植および機能的評価に備えられる。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例は、本発明の実施形態に用いられるステップの詳細を説明する。
【００２４】
実施例１：基底膜上で増殖するＣＥｐＣ、ＣＥＣ、および実質細胞
角膜上皮細胞（ＣＥＣ）は、輪部幹細胞または前駆細胞（ＬＳＣ）からの連続更新、およびＬＳＣまたは角膜上皮の欠損を経て、角膜が非透明な角質化された皮膚様の上皮へと変わり、失明の原因となる角膜表面疾患が引き起こされる。健常個体においてどの程度のＬＳＣが維持されかつ角膜上皮に分化するのか、および患者において何れの分子事象が欠けているのかは大部分が知られていない。
【００２５】
習慣的に、ＬＳＣの増殖拡張プロセスは、マウス３Ｔ３フィーダ細胞を必要とし、これは、動物産物由来の汚染のリスクを伴うことで、臨床的に生存能力のある３Ｄバイオプリント角膜を生じさせるのに適していない。この問題を克服するため、ウサギドナーおよびヒトドナー由来のＬＳＣを増殖させるための、フィーダ細胞フリーの既知組成インビトロ細胞培養系を開発して、ＬＳＣの均質集団の生成および拡張、ならびに以降の角膜上皮細胞（ＣＥｐＣ）への分化を可能にした。この培養系は、転写因子ｐ６３（腫瘍タンパク質６３）およびＰＡＸ６（対形成されたボックスタンパク質ＰＡＸ６）が、ＬＳＣを指定するように一緒に作用し、ＷＮＴ７Ａが、ＰＡＸ６を介して角膜上皮分化を制御するという判断に基づく。輪部幹細胞において、ＷＮＴ７Ａは、ＰＡＸ６の上流で作用して、その発現を、ＷＮＴタンパク質の受容体フリズルドホモログ５（ＦＺＤ５）を介して刺激する。ＷＮＴ７Ａは、発生のかつ病原性のＷＮＴシグナル伝達に関与する分泌モルフォゲンである。ＰＡＸ６は、種々の眼組織の運命および分化を制御する転写因子である。ＷＮＴ７ＡまたはＰＡＸ６のＲＮＡｉ媒介ノックダウンは、ヒト輪部幹細胞を角膜形態から皮膚上皮形態に移行するように誘導し、これは、一般的なヒト角膜疾患に密接に関係する致命的欠陥である。ＷＮＴ７Ａノックダウン細胞およびＰＡＸ６ノックダウン細胞はまた、野生型の輪部細胞よりも角膜ケラチン３（ＫＲＴ３；ＣＫ３）およびＫＲＴ１２の発現が低く、かつ皮膚上皮ＫＲＴ１およびＫＲＴ１０の発現が多かった。
【００２６】
特に、皮膚上皮幹細胞中へのＰＡＸ６の形質導入は、その細胞をＬＳＣ様細胞に変換するのに十分であり、ウサギ角膜損傷モデルにおいて眼に移植すると、この再プログラム化された細胞は、ＣＥＣを補充して、損傷を受けた角膜表面を修復することができる。このプロセスのさらなる詳細が、Ｎａｔｕｒｅにおいて公開されているレター、「ＷＮＴ７Ａ  ａｎｄ  ＰＡＸ６  ｄｅｆｉｎｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３４６５（２０１４年７月２日オンライン公開）に記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。ＬＳＣの増殖は、Ｐ６３およびＫ１９の発現によって特徴付けられ、有糸分裂マーカーＫｉ６７の陽性染色が高いパーセンテージであった。本発明者らは、階層化されたＣＥｐＣ層がボーマン膜に類似した基底膜において増殖する３Ｄ  ＬＳＣ分化系を確立した。小分子ＲＯＣＫインヒビタＹ２７６３２を用いて、ＬＳＣの、ＣＥｐＣへの分化を導いた。これは、ＣＥｐＣ特異的マーカーＫ３／Ｋ１２の強い発現によって明示される。
【００２７】
同時に、本発明者らは、ヒトドナー由来のＣＥＣ前駆細胞を増殖させるため、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含有する、フィーダ細胞フリーの既知組成細胞培養系を開発した。その後、このＣＥＣ前駆細胞をＣＥＣ祖先の均質集団に拡張し、続いてこれをＣＥＣに分化させた。本発明者らは、本来の解剖学的構造において存在する六角形状の形態を観察し、典型的なＣＥＣマーカーＺＯ−１の発現は強かった。
【００２８】
さらに、本発明者らは、ゼラチンメタクリレート（ＧｅｌＭＡ）ベースのマトリックス上で培養したＬＳＣを用いて、ヒトにおいて一般的な角膜疾患症状を模倣したウサギＬＳＣ欠損モデルで角膜上皮欠損を処置して修復することができる潜在性を試験した。この試験において、ウサギＧＦＰ標識ＬＳＣの移植片は、角膜特異的Ｋ３／１２の陽性染色を示す上皮細胞の連続シートを形成し、角膜表面全体の上皮欠損の修復に成功し、かつ角膜の澄明性および透明性を回復して５ヵ月超にわたり維持した。
【００２９】
図４Ａ〜図４Ｃは、これらの試験結果を示す。図４Ａは、ＧｅｌＭＡベースのマトリックス上で培養したＧＦＰ標識ＬＳＣによる細胞移植後のウサギ角膜を示しており、上皮欠損のない典型的な角膜上皮組織構造（左側のパネル：Ｈ＆Ｅ染色）、および滑らかで透明な角膜表面（右側のパネル：白色光の顕微鏡写真）が示される。図４Ｂは、ヒト羊膜でカバーしたのみの剥皮角膜を示す。左側のパネルは、上皮化生の組織構造を示しており、右側のパネルは、血管新生により不透明な角膜を示す。図４Ｃは、移植３ヵ月後の滑らかで透明なウサギ角膜を示す。ＧｅｌＭＡベースのマトリックス上で増殖した培養ＧＦＰ＋ＬＳＣを移植実験に用いて、レシピエント角膜上皮との一体化を示すためにＫ３／１２で共染色した。
【００３０】
角膜実質細胞もインビトロで培養して拡張した。この実質細胞は、フィブロネクチン、ＦＳＰ１、およびビメンチン等の線維芽細胞の類似マーカーを共有した。
【００３１】
実施例２：３Ｄバイオプリンティング
３Ｄバイオプリンティングプラットフォームは、１）天然由来の生体適合材料で構成される、複雑なユーザー定義の３Ｄ幾何構造を有し、２）ヒドロゲル内に閉じ込められる細胞の整合性がとれた３Ｄ分布を可能にし、３）細胞の生存率および増殖を支持し、かつ４）動的なマルチスケールの機械的細胞−スカフォールド相互作用を備える、担細胞ヒドロゲルスカフォールドを構築する迅速なバイオファブリケーションアプローチを提供する。重要なことに、この構築体は、複雑な３Ｄ幾何構造の制御および一体化を可能にすると同時に、閉じ込められた細胞の生理的に関連する内部３Ｄ分布を実現する。３Ｄスカフォールド内の生物学的因子の空間分布および時間的分布のそのような正確な制御により、本発明者らは、ナノメートル長のスケールにおける細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質との相互作用を評価することができる。最終的な目的は、進歩した臨床的に翻訳可能な生物模倣スカフォールドを生じさせることである。
【００３２】
３Ｄバイオプリンティングにより、同じ寸法および曲率の天然の角膜を用いて、患者の角膜を複製するように人工角膜を製造する。天然由来材料は、構築体内での細胞増殖を支持することができ、かつ構築体のより良好な一体化のために宿主細胞を動員することができる。３Ｄプリンティング技術の高い効率のために、１層あたり数秒あれば十分である。したがって、各層内で非常に均質な細胞分布を維持することが可能である。また、様々な細胞型の空間的所在を正確に制御することができ、これは、角膜機能にとって重要である。例えば、本発明者らは、およそ５ミクロンの、すなわち細胞よりも小さいフィーチャを製造することができる。この分解能により、本発明者らは、非常に小さい細胞集団の空間的所在を、たとえ単細胞であろうと制御することができる。異なる分解プロファイルの材料を用いることにより、本発明者らは、細胞移動を誘導することができるため、その時間的分布を制御することができる。構築体内で増殖因子をパターン化することにより、本発明者らは、細胞増殖／分化を調整し、かつ細胞分布を管理することもできる。
【００３３】
図５Ａ〜図５Ｃは、３Ｄバイオプリンティングによって生じた例示的なミクロ構造体を示す。図５Ａは、ＰＥＧＤＡを用いた細孔サイズ２００μｍの多層ログパイルスカフォールドを示し、図５ＢはＧｅｌＭＡ中の３Ｄプリント血管様ミクロ構造体（スケールバー＝３０μｍ）を示し、図５Ｃでは、カルセイン−ＡＭ／エチジウムホモダイマーＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイを介して評価して、ＧｅｌＭＡスカフォールド内に閉じ込めた１０Ｔ１／２細胞が、閉込め８時間後において生存能力があり、かつ増殖可能なままである（スケールバー＝１ｍｍ）ことを示す。
【００３４】
実施例３：角膜組織用の生体適合材料
角膜組織加工用の生体適合材料としてコラーゲンを広範囲にわたって用いた。なぜなら、角膜細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主成分を構成するからである。コラーゲンは、マトリックス成分として、保護層を形成する際に上皮細胞を支持すること、およびニューロンによる神経再支配を促進することが実証された。化学架橋生合成コラーゲンマトリックスは、第Ｉ相臨床試験において見込みが大きいことを示した。コラーゲンマトリックスの分解および機械的特性を調整するために、殆どの研究は化学架橋アプローチを用いたが、これらは大部分が細胞の閉込めと適合しない。アクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲン（Ａｃ−Ｃｏｌ）は、その生体適合性、光学特性、および光重合能のために、角膜組織加工に優れた代替物を提供する。予備試験を実行して、Ａｃ−Ｃｏｌ類似体であるＧｅｌＭＡ製の担実質細胞フィルムの光学特性を評価した。図６は、ＧｅｌＭＡヒドロゲルの例示的な合成スキームを示す。３ｄＬＰ系を用いてＧｅｌＭＡで製造した光学的に透明な角膜実質上に、ＣＥＣを播種して培養した。コンフルエントＣＥＣ細胞シートの形成後ですら、図７に示すように構築体の透明性は維持された。
【００３５】
ハイブリッドヒドロゲルの変化に富む組合せの光学透明性、および曝露時間に及ぼす影響の評価を実行した。図８Ａ〜図８Ｃは、製造した構造体を通して見たＵＣＳＤのロゴの光学透明性を各組合せについて比較した結果を示している。図８Ａは、７．５ｗｔ％ＧｅｌＭＡ（ゼラチンメタクリレート）に１ｗｔ％ＭＡ−ＨＡ（メタクリレート−ヒアルロン酸）（ＭＷ＝２００ＫＤａ）を加えた、ＵＶ曝露＝１分についての透明性の低下を示す。透明性の向上が、図８Ｂに示すように、７．５ｗｔ％ＧｅｌＭＡ、１ｗｔ％ＭＡ−ＨＡ（ＭＷ＝２００ＫＤａ）、および２．５％ＰＥＧＤＡ（ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート）（ＭＷ＝７００ＫＤａ）、ＵＶ曝露＝３０秒により達成された。さらに良好な透明性が、７．５ｗｔ％ＧｅｌＭＡ、２．５ｗｔ％ＭＡ−ＨＡ（ＭＷ＝２００ＫＤａ）、および２．５％ＰＥＧＤＡ（ＭＷ＝７００ＫＤａ）、ＵＶ曝露＝３０秒を用いて得られた。これらの結果は、ＭＡ−ＨＡ濃度が１ｗｔ％から２．５ｗｔ％に増大すると、透明性が増すことを示す。
【００３６】
いくつかの材料組成物を試験した。選択した殆どの材料の光学属性は非常に良好である。一例において、７．５ｗｔ％ＧｅｌＭＡまたはＡｃ−Ｃｏｌおよび２５ｗｔ％ＰＥＧＤＡプラス光開始剤として０．０７５ｗｔ％ＬＡＰ（リチウムフェニル−２，３，６−トリメチルベンゾイルホスフィナート）により、２８０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内でＰＢＳ溶液に匹敵する吸光度を示す透明膜が生じた。ＵＶ曝露時間は、このフィルムの透明性に影響を及ぼすようには思われない。ＭＡ−ＨＡに関して、７．５ｗｔ％ＧｅｌＭＡに２．５ｗｔ％ＭＡ−ＨＡおよび２．５％ＰＥＧＤＡを加えると、ＵＶ曝露の３０秒後に同様に優れた光学特性が実現される。
【００３７】
当技術分野において知られているように、殆どの光開始剤は細胞障害性であるからである。所望のフィルム特性を得るのと同時に細胞生存率を維持するような光開始剤のタイプおよび濃度の選択は、当技術分野における技術レベルの範囲内であろう。
【００３８】
実施例４：３Ｄプリント角膜の移植
３枚の角膜層を、先に記載したように、３Ｄライブプリンティングを用いて製造した。詳細には、ＰＥＧＤＡナノメッシュをアクリロイル−ＰＥＧ−コラーゲン中に組み込んで角膜実質を支持した。ＣＥｐＣ層およびＣＥＣ層を実質層の両側面上に構築した。生じたバイオプリント角膜をウサギレシピエントの眼上に移植した。
【００３９】
ニュージーランドホワイトウサギを塩酸キシラジン（２．５ｍｇ／ｍｌ）および塩酸ケタミン（３７．５ｍｇ／ｍｌ）の筋肉内注射で麻酔した。リバースボタン状の構造を有する角膜レシピエント実質ベッドを、フェムト秒レーザマシン（Ｚｅｉｓｓ）を用いてレシピエント眼内で作成した。バイオプリント角膜ドナー組織をボタン形状の構造体にカットして、調製したレシピエント実質ベッド上に適合させた。その後、表面をヒト羊膜（Ｂｉｏ−ｔｉｓｓｕｅ）によってカバーした。これをレシピエント結膜に１０．０  ＶＩＣＲＹＬ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）で固定した。図９Ａおよび図９Ｂはそれぞれ、移植後５日目および１０日目の透明性および機能性の緩やかな回復を示す。図９Ｃに示すように、緩やかな角膜浮腫の減少および角膜透明性の向上が移植後１５日目に観察され、角膜内皮の機能回復が示された。角膜表面上皮は滑らかで無傷であることが観察され、機能的なＣＥｐＣの移植が示された。
【００４０】
本明細書中に記載される実施形態によれば、３Ｄバイオプリンティング技術を用いて細胞を閉じ込めることができ、組織構造体のライブプリンティングがマイクロメートルおよびナノメートルの分解能で可能となる。担細胞角膜代替物は、移植片が宿主組織と一体化するのに必要とされる時間量を短縮することができる。また、３Ｄプリンティングのデジタル的な（すなわち、カスタマイズ可能な）性質により、形状および曲率を設計した患者特異的組織モデルの開発が可能になる。カスタマイズした形状および曲率を、患者固有の角膜に従って設計することができる。
【００４１】
当技術分野において知られている手順を用いて、患者に関する角膜トポグラフィ測定値を移植手順前に得ることができる。例えば、臨床診療において最も多く用いられている機器は、プラシド反射画像分析に基づいており、これは、角膜上に投射される多同心円の反射像の分析を用いて角膜測定光屈折範囲および表面曲率を得るものである。そのような試験によって生じた臨床データを用いて、コンピュータソフトウェアにより、患者特異的な角膜設計を生じさせることができ、これがその後、３Ｄプリンティングプラットフォームを用いて製造されることになる。層プリンティングアプローチによる層を用いることができる。場合によっては、非常に複雑な角膜幾何構造を生じさせるのに、例えば２０１５年９月１６日出願の国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５０５２２号明細書（この出願は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるような非線形３Ｄプリンティングスキームの利用が適し得る。
【００４２】
図１０は、本発明の実施形態に従う人工角膜の設計、製造、および移植のための例示的な手順を要約している。角膜の移植が医学的に必須であるという判定から始めて、ステップ５０において、患者の角膜の測定用の臨床測定器を用いてデータを生じさせる。コンピュータ設計ソフトウェアを用いて、ステップ５２において、患者の眼についての正確な寸法および所望の特性に至るように人工角膜を製造する３ｄＬＰプリンターを制御するための一連のプリンティングステップを展開する。患者特異的角膜をプリントするためのコンピュータ制御プログラムの作成と同時に、ステップ６０〜ステップ６７において、実質細胞およびＬＳＣを培養して、プレポリマー溶液中に混合した。患者自身の細胞の使用に限定されるものではないが、実質細胞、前駆ＣＥＣ、および／またはＬＳＣの源としての自己由来組織を用いると、免疫抑制のための考えられる要求を低減または除外するというさらなる利点を提供することができる。ステップ６３およびステップ６６においてそれぞれ、ＬＳＣはＣＥｐＣに分化され、ヒトドナー由来のＣＥＣ祖先はＣＥＣに分化される。ステップ６１、６４および６７において、培養した細胞をプレポリマー溶液中に各々混合する（フロー図は、ＣＥＣ層およびＣＥｐＣ層の形成前に実質層を調製することを示しているが、３つの層のうちの１つ以上を異なる時間に、例えば事前にプリントしてもよく、同時に、すなわち特定のシーケンスにとらわれずにプリントしてもよく、および先に記載するようにアセンブルすることに留意されたい）。ステップ５４において、培養した実質細胞、ＣＥＣ、およびＣＥｐＣを、先に記載するそれぞれの層中に組み込む。細胞を連続してプリントしてもよく、別々にプリントしてもよく、および別々にプリントした層からアセンブルして、角膜のＣＥＣ−実質−ＣＥｐＣ層構造体を画定する。欠損のある角膜を、ステップ５６において、当技術分野において知られている手順を用いて除去して、移植片を受け入れる実質ベッドを調製してから、ステップ５８において人工角膜を移植する。
【００４３】
本明細書中に記載される手順に従って製造した３Ｄプリント角膜組織は、動物実験の必要性にとって代わるまたはこれを減らすための、臨床移植、ヒト眼表面の疾患モデリング（例えば、ドライアイ疾患について）、早期の薬物スクリーニングにおいて、および創傷治癒のための薬物効能試験において、即座に利用されることになる。本技術は、一時的または永続的な角膜移植片の開発のための強力なベースを提供するものである。本明細書中に記載される実施形態は、容易に利用可能である複雑な加工組織をもたらすことができ、これは、天然のヒト対応物の機能性を再現し、かつ臨床での採用および新進の生医学研究に適している。
【００４４】
参考文献（参照によって本明細書に組み込まれる）
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【図１】
2017529842.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2017529842.tif 000014
【図８Ｂ】
2017529842.tif 000015
【図８Ｃ】
2017529842.tif 000016
【図９Ａ】
2017529842.tif 000017
【図９Ｂ】
2017529842.tif 000018
【図９Ｃ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
2017529842.tif 000021