(57)【要約】  本発明は、バイオ燃料の製造方法に関し、当該方法は：リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中でアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌を培養する工程を含み、当該細菌の培養により、バイオ燃料が製造される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ燃料の製造方法であって：
リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中でアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌を培養する工程、
を含み、当該細菌の培養により、バイオ燃料が製造される、製造方法。
【請求項２】
前記増殖培地が、リン酸塩を１０ｇ／リットル以上含有する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記増殖培地が、リン酸塩を１３ｇ／リットル以上含有する、請求項１又は２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４】
前記増殖培地が、リン酸塩を１０〜３０ｇ／リットル含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記増殖培地が、窒素の外部的供給源を含有しない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記増殖培地が、炭素の外部的供給源を含有しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記増殖培地がグリセロールを含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記増殖培地のｐＨが４〜７である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記細菌が、１５℃〜３０℃の温度で培養される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記細菌が、ＯＤ６００が０．７５〜１．００に達するまで培養される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記細菌が、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１８０８のＦＪ１株である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
更に、増殖培地からバイオ燃料を分離する第一の工程を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
更に、分離したバイオ燃料を酸性化する工程を含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
更に、バイオ燃料を分離する第二の工程を含む、請求項１２又は１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
更に、バイオ燃料を脱水する工程を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
更に、バイオ燃料から１つ以上の個別の成分を抽出する工程を含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
更に、バイオ燃料又はその１つ以上の個別の成分を、化学的に改変する、又は処理する工程を含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
更に、バイオ燃料に、その１つ以上の個別の成分に、又は化学的に改変又は処理されたバイオ燃料又はその１つ以上の個別の成分に、１つ以上の添加物を添加する工程を含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
更に、バイオ燃料から、アルコール、エステル又はモノテルペンを抽出する工程を含む、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の製造方法であって、バイオ燃料を製造するための方法であって：
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１８９８のアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌ＦＪ１株を、２〜１００ｇ／リットルのリン酸塩を含有する増殖培地中で培養する工程、ここで当該細菌の培養により、バイオ燃料が製造される；
当該増殖培地からバイオ燃料を分離する工程；
を含む、製造方法。
【請求項２１】
１つ以上の以下の工程：
１）バイオ燃料の特定の成分を分離する工程；
２）バイオ燃料を濾過する工程；
３）バイオ燃料を、バイオエタノール又はガソリン等の他の燃料と混合する工程；
４）バイオ燃料を化学的に改変する工程；
５）バイオ燃料の特定のフラクションを蒸留する工程；及び
６）バイオ燃料を脱水する工程；
を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２２】
バイオ燃料を製造する方法であって：
リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中で培養したアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌の無細胞抽出物を含有する水性媒体を提供する工程、ここで当該水性媒体中でバイオ燃料が製造される；及び
任意で当該水性媒体からバイオ燃料を分離する工程；
を含む、製造方法。
【請求項２３】
リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中で培養したアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌の無細胞抽出物を含有する水性媒体。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法によって製造されたバイオ燃料。
【請求項２５】
請求項２４のバイオ燃料又はその成分の使用。
【請求項２６】
添加物としての、請求項２４のバイオ燃料又はその成分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定条件下でアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）微生物を培養することによる、光再生可能燃料を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料の消費及び温室効果ガスの排出に関して議論が高まっている。全世界の化石燃料への依存を低下させる一つの方法は、再生可能な供給源からのバイオ燃料の開発であった。バイオ燃料、例えばバイオガソリン、バイオディーゼル、及びバイオエタノール等は、よりクリーンで環境的にフレンドリーな化石燃料の代替と見做されている。
【０００３】
バイオ燃料は温室効果ガスの排出の減少を助け得るが、それらは問題が無いわけではない。議論の的になる側面の一つは、「燃料のための食糧」問題であり、エネルギー作物の需要が、穀物商品の価格を押し上げると認識されている。もう一つの深刻な難点は、熱帯雨林等の生態学的に繊細な生態系に対するダメージであり、大豆やパームヤシ等のエネルギー作物の植栽により大規模な破壊が引き起こされている。
【０００４】
バイオ燃料産業は、これらの問題を軽減するために、第二世代及び第三世代のバイオ燃料に転換しつつある。微生物による燃料の生産及び廃棄物の使用は、重要な研究領域である。
【０００５】
二酸化炭素を燃料分子に変換することは、公知である。二酸化炭素は、化学的に、電気化学的に、そして微生物によって直接又は間接的に、変換され得る。
【０００６】
ＷＯ２０１３／０１１２９２は、二酸化炭素を固定して蟻酸を生産し、続いて骨格に連続的に炭素原子を付加して長鎖脂肪族カルボン酸を生産することにより長鎖脂肪族カルボン酸を生産することが出来る微生物を記載している。この文献は、受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８（ブダペスト条約の規定の下、２０１１年１月１２日にＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．  （Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，  Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，  Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ，  ＡＢ２１  ９ＹＡ）によって寄託された）のアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）ＦＪ１という特定の株を記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
驚くべきことに、ＷＯ２０１３／０１１２９２に記載のアセトバクター・ロバニエンシス株は、リン酸塩に富む増殖計画によって増殖させると、アルコール、エステル及びモノテルペン等、異なる範囲の産物を生産し得ることが見出された。これは、そのような増殖条件下では、代謝の切り替えが起こるためと考えられる。この微生物がそのような産物を生産し得ることは、従来知られていなかった。従って、本発明は、ＷＯ２０１３／０１１２９２に記載の微生物を用いてバイオ燃料を製造する方法に関する。ＷＯ２０１３／０１１２９２の開示は、その全てが本明細書中に援用される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第一の側面において、本発明は、バイオ燃料の製造方法を提供し、当該方法は：リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中でアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌を培養する工程を含み、当該細菌の培養により、バイオ燃料が製造される。
【０００９】
アセトバクター・ロバニエンシス細菌は、リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中で培養される。１ｇ／リットルは、増殖培地中のリン酸含有化合物の量ではなく、増殖培地中のリン酸イオン（ＰＯ４３−）の量である。例えば、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の相対分子量は１３６である。このリン酸塩部分の相対分子量は９５である。従って、１００リットルの水に１３６ｇのＫＨ２ＰＯ４を添加すると、水の中には１．３６ｇ／リットルのＫＨ２ＰＯ４が存在するが、リン酸塩は０．９５ｇ／リットル存在することになる。
【００１０】
幾つかの態様において、増殖培地は好ましくは２ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は３ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は４ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は５ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は６ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は７ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は８ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は９ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は１０ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は１１ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は１２ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。好ましい態様において、増殖培地は１３ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は１４ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。
【００１１】
幾つかの態様において、増殖培地は１５０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は１００ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は８０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。様々な態様において、増殖培地は７０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は６０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は５０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は４５ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は４０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は３５ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は３０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は２５ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は２０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は１５ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。
【００１２】
幾つかの態様において、増殖培地は１〜１５０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は２〜１００ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は３〜８０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。様々な態様において、増殖培地は４〜７０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は５〜６０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は６〜５０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は７〜４５ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は８〜４０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は９〜３５ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は１０〜３０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は１１〜２５ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は１２〜２０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は１３〜１５ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。
【００１３】
増殖培地は、アセトバクター・ロバニエンシス細菌が成長し、増殖し、バイオ燃料を生産することを可能とする、任意の適切な増殖培地であっても良い。増殖培地は、前記細菌が成長及び増殖出来る様々な成分／栄養素を含有し得る。増殖培地は、以下の添加物の１つ以上を含有し得る：カリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、銅塩、コバルト塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、カルシウム塩、モリブデン塩、塩化物、硫化物、モリブデン酸塩、炭酸塩。これらの添加物は、一般に、０．０１〜２ｇ／リットルの濃度で増殖培地中に存在する。
【００１４】
幾つかの態様において、増殖培地は、下記表に示す１つ以上の添加物を含有し得る。
【表１】
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【００１５】
特定の態様において、増殖培地は、下記の成分を含有する。
【表２】
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【００１６】
好ましくは、増殖培地は、窒素の外部的供給源を含有しない。前記細菌は大気から増殖培地中に溶存する窒素を固定できるため、外部からの窒素の供給を必要としない。
【００１７】
前記細菌は、二酸化炭素を固定し得る。故に、増殖培地は、大気から増殖培地中に溶存する二酸化炭素の他に炭素の外部的供給源を必要としない。しかしながら、幾つかの態様において、前記細菌の培養前又は培養中、増殖培地中に二酸化炭素を通気して、増殖培地中に溶存している二酸化炭素の量を増大し得る。前記細菌は、炭素の唯一の供給源として、二酸化炭素を使用し得る。
【００１８】
幾つかの態様において、炭素の追加的な供給源として、グリセロールが増殖培地中に添加される。好ましくは、これは、前記細菌の成長及び増殖の開始後になされる。
【００１９】
増殖培地のｐＨは、３．５〜９であり得る。好ましくは、増殖培地のｐＨは、４〜７である。特定の態様において、増殖培地のｐＨは、約４．５である。
【００２０】
増殖培地は、好ましくは、栄養素／添加物が水に溶けるように、水性である。
【００２１】
前記細菌は、一般に、０℃〜６０℃の温度で培養される。好ましくは、前記細菌は、１０℃〜４０℃の温度で培養される。幾つかの態様において、前記細菌は、１５℃〜３０℃の温度で培養される。
【００２２】
前記細菌は、一般に、６００ｎｍで測定した光学密度（ＯＤ６００）が０．７５〜１．００に達するまで培養される。
【００２３】
培養の過程で、培養の体積を増大させるために、追加の増殖培地で培養物が希釈され得る。従って、バイオ燃料の抽出を要する場合、培養物の最終的な光学密度が０．７５〜１．００となるべきである。
【００２４】
前記細菌は、１２〜３６時間培養され得る。幾つかの態様において、前記細菌は、１８〜３０時間培養され得る。
【００２５】
バイオ燃料は、アセトバクター・ロバニエンシス細菌を培養することによって製造される。当該細菌は、バイオ燃料を生産し得る任意の適切なアセトバクター・ロバニエンシス細菌であってもよい。これは、ＦＪ１株（受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８）及びＦＪ１に由来し、又は関連する近縁の株を含む。「由来する」とは、ＦＪ１を改変又は突然変異させて作製した更なる細菌であることを意味する。例えば、ＦＪ１に遺伝子を挿入し、又は遺伝子を除去して作製される。ＦＪ１に由来する細菌は、機能的にＦＪ１と同等であり、バイオ燃料を生産し得るべきである。更に、当該由来する細菌は、ＦＪ１と同一の条件下で増殖し得るべきである。好ましくは、前記細菌は、受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８のＦＪ１株である。細菌は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析等、当業者に周知の方法によって、アセトバクター・ロバニエンシス細菌と同定されたものであってもよい。
【００２６】
前記細菌は、増殖しながらバイオ燃料を生産するため、当該細菌の培養が完了すると、増殖培地中にバイオ燃料が存在しているはずである。バイオ燃料は、必要に応じて抽出されてもよい。
【００２７】
「バイオ燃料」は、燃料として使用出来、燃焼させるとエネルギーを放出する、可燃性分子を意味する。本発明の方法によって製造されるバイオ燃料は、揮発性アルコール、エステル及びモノテルペンを含む。
【００２８】
前記方法は、更に、増殖培地からバイオ燃料を分離する工程を含む。これは、第一の分離工程で行われ得る。これは、任意の適切な方法で行われ、当業者にとって多くの方法が自明である。
【００２９】
例えば、バイオ燃料は、蒸留によって分離されてもよく、蒸留は、標準的な蒸留、分別蒸留（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）、真空蒸留、添加溶剤（ｅｎｔｒａｉｎｅｒ）を用いた蒸留、溶媒抽出に続く蒸留による回収、及び連続蒸留を含む。他の分離方法として、膜かん流、電気化学分離、又は臨界二酸化炭素の使用を含む。
【００３０】
サイドアームコンデンサーのように、１気圧で蒸留が行われる（真空蒸留等減圧下ではなく）場合、バイオ燃料は、蒸留物の最初の１０％中に含有され得る。一般に、この最初の蒸留物は、９５℃〜１００℃、特に約９８℃の温度で回収され得る。典型的には、バイオ燃料は、共沸混合物（ａｚｅｏｔｒｏｐｅ）の一部として回収される。
【００３１】
バイオ燃料を分離した後、当該バイオ燃料に酸を加えて酸性化され得る。適切な酸として、塩酸及び硫酸を含む。ｐＨは５以下、又は好ましくは４．５以下に下げられ得る。これは、蒸留物Ａ中に形成されている共沸混合物を「破壊」し、バイオ燃料の軽いフラクションを放出させることで、更なる分離工程を補助する。
【００３２】
第二の分離工程は、存在している他の何らかの産物からバイオ燃料を更に分離／精製するために行われ得る。この第二の分離は、任意の適切な方法を使用して実施され得る。例えば、バイオ燃料は、蒸留を用いて分離されてもよく、当該蒸留は、標準的な蒸留、分別蒸留（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）、真空蒸留、添加溶剤（ｅｎｔｒａｉｎｅｒ）を用いた蒸留、溶媒抽出に続く蒸留による回収、及び連続蒸留を含む。他の分離方法として、膜かん流、電気化学分離、又は臨界二酸化炭素の使用を含む。
【００３３】
分別カラムのように、１気圧で蒸留が行われる（真空蒸留等減圧下ではなく）場合、バイオ燃料は、７０℃〜９０℃、典型的には約８５℃の温度で蒸留される。これは、通常は最初のフラクションである。
【００３４】
分離後、バイオ燃料は脱水されて、水の一部が除去されてもよい。これは、限定されないが、塩化物塩（カルシウム又はナトリウム）等の薬剤、又は分子篩３Ａ等を用いて行われ得る。
【００３５】
そして、バイオ燃料は、必要に応じ、所望の特定の成分を分離するため、又はバイオ燃料の特性を改変するために、更に処理され得る。例えば前記方法は、任意で、以下：
１）バイオ燃料の特定の成分を分離する工程；
２）バイオ燃料を濾過する工程；
３）バイオ燃料を、バイオエタノール又はガソリン等の他の燃料と混合する工程；
４）バイオ燃料を化学的に改変する工程；及び
５）バイオ燃料の特定のフラクションを蒸留する工程；  
の１つ以上を任意で含み得る。
【００３６】
特定の態様において、本発明は、バイオ燃料を製造する方法を提供し、当該方法は：
受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８のアセトバクター・ロバニエンシス株ＦＪ１を、１０〜３０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する増殖培地中で培養する工程、当該細菌の培養により、バイオ燃料が製造される；及び
増殖培地からバイオ燃料を分離する工程；
を含む。
【００３７】
この態様において、リン酸塩の濃度は、１０〜３０ｇ／リットルと記載されている。しかしながら、この具体的な態様において、上記の任意のリン酸塩濃度が用いられ得る。例えば、リン酸塩濃度は、１ｇ／リットル以上、１３〜１５ｇ／リットル、又はそれらの間のいずれかの態様であってもよい。
【００３８】
前記細菌によって生産される産物は、複数の揮発性アルコール、エステル、及びモノテルペンを含有する。これらの分子は、バイオ燃料としての機能を有する。
【００３９】
前記細菌によって生産される所望の化合物は、アルコール、例えばエタノール、ブタノール、ペンタノール及び４−メチルペンタノール等である。エタノール等のアルコールは、ガソリンの代替物として、又はガソリンとの混合に使用される。ガソリンのエネルギー密度は３２ＭＪ／ｌであり、エタノールのエネルギー密度は２１ＭＪ／ｌである。ペンタノールの異性体は、エネルギー密度が２８ＭＪ／Ｌであり、水に対する親和性がより低いので、エタノールと比較して優位である。
【００４０】
従って、前記方法は、バイオ燃料からアルコールを分離する工程を含み得る。これは、任意の適切な方法、例えば蒸留等によって行われても良く、そのような方法は当業者にとって自明である。
【００４１】
酢酸ブチル等の様々なエステル分子も生産される。酢酸ブチルは、オクタン価向上剤であるガソリン添加物として知られている。この分子も、潜在的な再生可能バイオ燃料添加物である。
【００４２】
従って、前記方法は、バイオ燃料からエステル分子を分離する工程を含み得る。これは、任意の適切な方法、例えば蒸留等によって行われても良く、そのような方法は当業者にとって自明である。
【００４３】
前記細菌によって生産される更なる所望の化合物は、α−テルピネオール、γ−テルピネオール、γ−テルピネン、Ｄ−リモネン、及びユーカリプトール等のモノテルペンである。モノテルペンは、ガソリンの代替分子として、また接触水素化を経てジェット燃料やロケット燃料として、優れた性質を示す、Ｃ１０イソプレノイドである。イソプレノイド及びその水素化産物は、公知の燃料である。
【００４４】
従って、前記方法は、バイオ燃料からモノテルペンを分離する工程を含み得る。これは、任意の適切な方法、例えば蒸留等によって行われても良く、そのような方法は当業者にとって自明である。
【００４５】
前記モノテルペンは、水素化等の更なる処理に供され得る。
【００４６】
本発明は、上記方法によって製造されたバイオ燃料も提供する。
【００４７】
更に、本発明は、前記バイオ燃料又はその成分の、上記のような添加物等としての使用を提供する。
【００４８】
バイオ燃料の生産に関与する酵素は、細菌の細胞外に存在すると考えられている。これらの酵素は、細菌の細胞の存在に拘らず機能する。従って、本発明の他の態様において、バイオ燃料を製造する方法が提供され、当該方法は、リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中で培養したアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌の無細胞抽出物を含有する水性媒体を提供する工程を含み、ここで当該水性媒体中でバイオ燃料が製造される。
【００４９】
バイオ燃料の分離等、上記の本発明の第一の側面の方法における工程は、本発明のこの側面に等しく適用される。
【００５０】
前記媒体は、酵素系が媒体中に生産されるのに十分な時間、その中で前記細菌を培養することによって製造され得る。この無細胞抽出物は、培養後に、超遠心分離の反復等により、媒体から細菌細胞を除去することによって調製され得る。
【００５１】
本発明の更なる側面において、１ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する増殖培地中で培養されたアセトバクター・ロバニエンシス細菌の無細胞抽出物を含有する水性媒体が提供される。
【００５２】
詳細な説明
本発明は、例示のみを目的とする下記図面を参照して、詳細に説明され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１（高レベルのリン酸塩の存在下、二酸化炭素を添加して増殖させた）によるバイオ燃料の製造、及びその後の回収を示すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
概観
高濃度のリン酸塩の存在下、任意で窒素及び炭素の外部的供給源の非存在下、アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１は、様々な代謝物のセットを生産する。
【００５５】
特定の理論に拘泥することを望まないが、高レベルのリン酸塩の存在下で、プロピオン酸ヒドロキシルサイクルを介した二酸化炭素固定に切り替わる、代謝スイッチが存在すると考えられている（Ｔａｂｉｔａ，  Ｆ．Ｊ．，  ＰＮＡＳ  （２００９），  １０６，  ２１０１５−２１０１６；  Ｓｔｒａｕｓｓ，  Ｇ．  Ａｎｄ  Ｆｕｃｈｓ．  Ｇ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （１９９３），  ２１５，  ６３３−６４３）。加えて、ニトロゲナーゼ酵素型複合体を介した窒素固定は、ヒドロゲナーゼ酵素により利用され、生物の酸化還元系を調整する、水素の生産をもたらす（Ｔａｍａｇｎｉｎｉ  Ｐ．，  Ａｘｅｌｓｓｅｎ  Ｒ．，  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  Ｐ．，  Ｏｘｅｌｆｅｌｔ  Ｆ．，  Ｗｅｎｓｃｈｉｅｒｓ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｂｌａｄ  Ｐ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００２），  ６６，  １１−２０）。炭素及び窒素の同化は他の生物においても示されているが（Ｌｅｖｉｃａｎ  Ｇ．，  Ｕｇａｌｄｅ  Ｊ．Ａ．，  Ｅｈｒｅｎｆｅｌｄ  Ｍ．，    Ｍａａｓｓ  Ａ．，  ａｎｄ  Ｐａｒａｄａ  Ｐ．，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  （２００８），  ５８１，  １１８６；  Ｄｕｂｂｓ  Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｔａｂｉｔａ  Ｆ．Ｒ．，  Ｆｅｍｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  （２００４），  ２８，  ３５３−３５６；  ＭｃＫｉｎｌａｙ  Ｊ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ｃ．Ｓ．，  ＰＮＡＳ  （２０１０），  １０７３，  １−７）、ニトロゲナーゼ系を介した酸化還元リサイクル機構としての二酸化炭素固定の使用は、非紅色硫黄細菌等の酸素非発生型光栄養細菌においてのみ従来示されており、当該細菌は、Ｃａｌｖｉｎ  Ｂｅｎｓｏｎ  Ｂａｓｈａｍサイクルを介して、二酸化炭素を還元する。アセトバクター種は、この効果を利用することが出来る。
【００５６】
バイオ燃料を製造するプロセス
アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１（受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８）は、最小塩培地中で増殖し、当該培地において、窒素源は除外され、リン酸塩の濃度は増大されている。この培地の組成を下記表に示す。
表１：アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１の増殖に用いる最小塩培地の組成
【表３】
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【００５７】
前記培地を水に溶解し、濾過する。使用する水は、蒸留水や水道水であってもよい。この微生物は、非滅菌条件下で増殖出来、オートクレーブや他の適切な方法による、培地や設備の更なる滅菌を要しない。
【００５８】
前記微生物は、撹拌フラスコや他の適切な容器中の２リットル量の培地中に播種され、Ａ６００が０．７５〜１．００となるまで増殖させられる。２リットルの培養培地は、新鮮な培地で１０リットルに希釈され、再びＡ６００が０．７５〜１．００となるまで増殖させられる。この培養培地の体積は、培養物の分割を繰り返すことにより、所望の体積にまで増大させられる。
【００５９】
使用済みの細菌培地は、最長１２ヶ月の期間に渡り保管出来る。
【００６０】
使用済みの細菌培地は蒸留されて、図１に示す一般プロセスを使用して、所望の産物が回収される。
【００６１】
標準的な蒸留セットは、フラスコ、マントルヒーターを採用し、分別カラム及びコンデンサーを有する蒸留頭部を有する場合もある。しかしながら、真空蒸留、添加溶剤（ｅｎｔｒａｉｎｅｒ）を用いた蒸留、溶媒抽出に続く蒸留による回収、及び連続蒸留等の、他の蒸留方法も適用され得る。膜かん流、電気化学的分離、又は臨界二酸化炭素の使用による回収等の、代謝物を回収する他の手順が採用されてもよい。
【００６２】
蒸留されたバイオ燃料は、酸性化され得る。これは、バイオ燃料成分の更なる分離を補助し得る。例えば、酸性化は、エステルのカルボン酸及びアルコールへの変換を触媒するのに使用され得る。その後、アルコールは分離され得る（他の成分の存在下、又は非存在下）。例えば、約８４℃でいずれのエタノールも蒸留できる。
【００６３】
個々の産物は、質量分析器を使用して同定出来、試料の供給源及び種類に依存して、誘導体化を要し得る。誘導体化が必要な試料において、材料は適切な溶媒中に抽出され、ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミド）及びＴＭＳ（トリメチルシリル）で処理される。装置は、典型的には温度８０度で注入され、最高３００℃に達するまで、１分間に７℃ずつ上昇させられる。カラムは、この温度で５分間維持される。ピークを同定するために、通常のライブラリー検索が使用される。
【実施例】
【００６４】
実施例１：窒素の外部的添加無し、炭素供給源が二酸化炭素のみの、生物の増殖
当該生物は、高レベルのリン酸塩の存在下で典型的には７２時間の増殖サイクルを有し、２０℃で細胞乾燥重量０．０７ｇ／ｌ／ｈを達成する。
【００６５】
実施例２：単純な二段階の蒸留プロセスによるバイオ燃料の製造
バイオ燃料は、単純な二段階の蒸留プロセスを用いて回収出来る。
【００６６】
１．使用済みの細菌培地を、分別カラム無しサイドアームコンデンサー付きの単純な蒸留ポット中で蒸留する。バイオ燃料のフラクションとして、最初の１０％の蒸留物を回収する。これを「蒸留物Ａ」とする。
【００６７】
２．蒸留物Ａのプールされたフラクションを、１０リットル反応フラスコ及びパックされた分別カラムを採用する蒸留カラム中で再蒸留する。蒸留に先立ち、蒸留物Ａのプールされたフラクションは、適切な鉱酸を用いて酸性化される。蒸留物Ｂにおいて、エタノール及び他の揮発性フラクションを含む最初の５％は、７５℃〜８５℃で分離される（フラクション１）。このフラクションがバイオ燃料である。そしてこの産物が更に必要に応じ処理又は分離され、又は独立燃料（ｓｔａｎｄ  ａｌｏｎｅ  ｆｕｅｌ）として使用される。
【００６８】
バイオ燃料に添加物が添加されてもよい。抗酸化剤、含酸素添加剤（ｏｘｙｇｅｎａｔｅ）、熱安定性改善剤、安定化剤、低温流動性改善剤、燃焼改善剤、抗発泡添加物、抗煙添加物、腐食防止剤、潤滑改善剤、凍結防止剤、インジェクター清浄添加物、発煙抑制剤、抵抗減少添加剤、金属不活性剤、分散剤、界面活性剤、解乳化剤、色素、マーカー、静的散逸剤（ｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｓｉｐａｔｅｒ）、殺生物剤、セタン価向上剤等の添加物が、燃料の種類に応じて要求され得る。
【００６９】
「独立（ｓｔａｎｄ  ａｌｏｎｅ）」燃料は、７０〜８５℃で回収された粗フラクション（フラクション１）を意味し、更に別個の成分に分離せずに使用され得る。当該燃料は、発電機、ヒーター、バーナー、複合熱動力機関（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｅａｔ  ａｎｄ  ｐｏｗｅｒ  ｅｎｇｉｎｅ）、ガソリン機関等の内燃機関等において使用され得て、使用の前に、許容されるレベルまで水分が減少させられる。
【００７０】
フラクション１は、光、熱及び調理用の燃焼バイオエタノール等の、単純な燃焼材として現在使用されている。この燃料は、限定されないが、分割する場合の産物の安定性を改善するために、酢酸カルシウム等のゲル化剤と混合され得る。この燃料は、複合熱動力機関、発電機、及びガソリン機関等の他の内燃機関等のより繊細な様々な機関に使用するために、上記のような添加剤と組み合わせて使用され得る。
【００７１】
フラクション１は、更に、分別蒸留や減圧下での蒸留により分離して、そのアルコールフラクションが取得される。アルコールフラクションは、ペンタノール及び４−メチルペンタノールを含有する。このフラクションは、燃料としての利用に適した添加物と組み合わせて燃料として使用され、又はガソリンと組み合わせて混合燃料として使用され得る。
【００７２】
フラクション１は、更に、分別蒸留や減圧下での蒸留により分離して、そのエステルフラクションが取得される。エステルフラクションは、酢酸ブチルからなる。酢酸ブチルは、ガソリン等の公知の燃料、脂肪酸メチルエステル等の再生可能燃料、及び水素化イソプレノイドのいずれかと組み合わせてオクタン価向上剤として使用され、又はフラクション１の別個の成分と組み合わせて使用され得る。
【００７３】
フラクション１は、更に、分別蒸留や減圧下での蒸留により分離して、そのイソプレン又はモノテルペンフラクションが取得される。このフラクションは、更に水素化されて、液体ミサイル、ジェット、ガソリン及びディーゼルエンジンに適切な種類の燃料が製造される。水素化は、プラチナ、パラジウム又はＲａｎｅｙニッケル等の適切な触媒の存在下、水素ガスによって実施される。水素化反応を実施するのに、様々な高温高圧条件が利用される。あるいは、触媒として５−エチル−メチルフラビン過塩素酸塩の存在下でヒドラジンを使用して、モノテルペンフラクションが還元され得る。あるいは、水素化アルミニウムリチウム等の触媒が、還元の実施に採用され得る。モノテルペン成分は、分離後、又は粗フラクションの状態で還元され得る。上記のような添加物が、特定の種類の燃料に適した様々な組み合わせで使用され得る。例えば、ガソリン燃料はオクタン価向上剤が必要であるのに対し、ディーゼル型燃料は、セタン価向上剤が必要である。
【００７４】
上記方法によって製造されたバイオ燃料の例の性質を、下記表に示す。
【表４】
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【図１】
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【国際調査報告】
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