(57)【要約】  本発明は、表皮を標的する活性物質を評価するモデルの開発に関する。本発明は、より具体的には、表皮で起こる細胞相互作用を再現するメラノサイトとケラチノサイトとの混合スフェロイドの製造、スフェロイド自体及びその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)１〜95容量/容量％の濃度の細胞外マトリクスタンパク質調製物と10mM以下の量のカルシウム、マンガン又はマグネシウムから選択される塩とを補充した培養培地に、ケラチノサイト及びメラノサイトを懸濁すること；
(ｂ)工程(ａ)で得られる混合物からスフェロイドを形成すること；
(ｃ)工程(ｂ)で得られるスフェロイドをインキュベートすること
を含んでなることを特徴とするケラチノサイトとメラノサイトとの混合スフェロイドを製造する方法。
【請求項２】
工程(ａ)の懸濁物が１メラノサイト/１ケラチノサイト〜１メラノサイト/40ケラチノサイトで調製されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ケラチノサイト及びメラノサイトが健常初代細胞であり、100〜5000細胞/スフェロイドの数で播種されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞外マトリクスタンパク質調製物がMatrigel(登録商標)であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
塩がカルシウムであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程(ｃ)のインキュベーションが１〜10日間継続されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
標識工程を更に含んでなることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
混合スフェロイドを洗浄する工程(ｄ)を含んでなることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で取得することができる、ケラチノサイトとメラノサイトとの混合スフェロイド。
【請求項１０】
100〜1000μmの角直径を有し、規則的形状であることを特徴とする請求項９に記載のスフェロイド。
【請求項１１】
中心塊を有することを特徴とする請求項９又は１０に記載のスフェロイド。
【請求項１２】
その構成成分の少なくとも１つが標識されていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載のスフェロイド。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のスフェロイドの、表皮で作用する化合物の活性を評価するための使用。
【請求項１４】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のスフェロイドの、メラニン産生及び/又はメラノソーム移行及び/又はメラニン形成に関与する遺伝子の発現に対する化合物の活性を試験するための使用。
【請求項１５】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のスフェロイドの、ケラチノサイトの分化に対する化合物の活性を試験するための使用。
【請求項１６】
(i)請求項９〜１２のいずれか１項に記載のスフェロイドを準備すること；
(ii)工程(i)で準備したスフェロイドを、試験する１又は２以上の分子と接触させて配置すること；
(iii)メラニン産生及び/又はメラノソーム移行及び/又はメラニン形成に関与する遺伝子の発現をモジュレートする分子を選択すること
を含んでなる、メラニン産生及び/又はメラノソーム移行及び/又はメラニン形成に関与する遺伝子の発現に対して作用することができる分子をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
(i)請求項９〜１２のいずれか１項に記載のスフェロイドを準備すること；
(ii)工程(i)で準備したスフェロイドを、試験する１又は２以上の分子と接触させて配置すること；
(iii)ケラチノサイトの分化をモジュレートする分子を選択すること
を含んでなる、ケラチノサイトの分化に対して作用することができる分子をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮を標的する活性物質を評価するためのモデルの開発に関する。より具体的には、本発明は、表皮で生じる細胞相互作用を再現する、メラノサイトとケラチノサイトとの混合スフェロイド(以下で、単に、混合スフェロイドとも呼ぶ)の製造、スフェロイド自体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は皮膚の最表層である。表皮は、主に、角質細胞と呼ばれる死細胞を生じて剥離により除去されるまで、増殖し分化するケラチノサイトから形成される。メラノサイトは、黒色色素の産生を担う特殊化細胞であり、表皮で基底層に位置する。メラノサイトが産生するメラニンは、メラノソームとして知られる小胞に蓄積し、多数の樹状突起を介してケラチノサイトに運ばれる。皮膚の着色は、メラニン形成として知られる、メラニン産生に至るプロセスの結果である。
表皮は幾つかの機能(具体的には、皮膚の着色、及び主に角質層がもたらす障壁機能を含む)を果たす。これら機能は活性物質によりモジュレートすることができる。
【０００３】
例えば、脱色素製品は、黒皮症又は日光黒子タイプの色素過剰疾患を治療する美容目的又は皮膚科学的目的で市販されている。最も知られた製品であるヒドロキノンは、多くの副作用を有し、現在、化粧品には禁じられている。ヒドロキノンに代替する可能性がある新たな化合物の証明には、脱色素作用の評価が可能である生物学的モデルの使用が必要となる。
現時点で、ケラチノサイトとメラノサイトとの共培養モデルがこの分野で最も広く用いられている。このモデルは、種々の観点での表皮生態のモニタリングを可能にするが、表皮の三次元微小環境に関する情報を提供しない。表皮でのこれら２つの細胞タイプの挙動をより容易に模倣する再構成皮膚モデルも存在する。しかし、再構成皮膚モデルは作製が非常に厄介であり、しかも分子スクリーニングでのルーチンの使用には高価すぎる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、迅速に作製でき、取扱いが容易である、新規活性物質の評価用の三次元表皮モデルを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この状況で、本出願人はケラチノサイトとメラノサイトとの混合細胞集団を含んでなるスフェロイドを開発した。
本発明は、第１には、
(ａ)好ましくは１〜95容量/容量％(培養培地の総容量に対する調製物の容量で表したパーセンテージ)の濃度、より好ましくは10〜75容量/容量％の濃度で含まれる細胞外マトリクスタンパク質調製物と、10mM以下の量、好ましくは0.1〜１mMのカルシウム、マンガン又はマグネシウムから選択される塩(好ましくは、カルシウム)とを補充した培養培地に、ケラチノサイトをメラノサイトと懸濁すること；
(ｂ)工程(ａ)で得られる混合物からスフェロイドを形成すること；
(ｃ)工程(ｂ)で得られるスフェロイドをインキュベートすること
を含んでなることを特徴とするケラチノサイトとメラノサイトとの混合スフェロイドを製造する方法に関する。
【０００６】
本発明の方法で使用することができる細胞(ケラチノサイト及びメラノサイト)は、スフェロイドの所望の用途に応じて、健常な細胞であってもよいし、罹患した細胞であってもよい；健常な細胞を用いる場合、細胞は、生検又は商業的供給源に由来する、NHEK(正常ヒト表皮ケラチノサイト)タイプの健常な初代ケラチノサイト及びNHEM(正常ヒト表皮メラノサイト)タイプの健常な初代メラノサイトであってもよい。本方法は１〜６のいずれのフォトタイプのメラノサイトを用いて実施することができる；意図した実験に最も適切なフォトタイプを選択することは、当業者の能力の範囲内である。
ケラチノサイト 対 メラノサイトの比は、本発明によるスフェロイドの製造に重要でない；しかし、表皮のものにできる限り近い比、すなわち、１メラノサイト/１ケラチノサイト〜１メラノサイト/40ケラチノサイトの比を用いることが好ましい；好ましくは、この比は、１メラノサイト/２ケラチノサイト〜１メラノサイト/５ケラチノサイトである。
【０００７】
スフェロイドの製造のために播種する細胞の総数は、重要でなく、播種する細胞の起源に応じて適応させる；例えば、健常な初代細胞から最適サイズのスフェロイドを得るためには、１つのスフェロイドにつき、100〜5000細胞、好ましくは2000〜3000細胞を播種することが好ましい。細胞は、好ましくは、96ウェルプレートに播種する。
細胞外マトリクスタンパク質調製物は、好ましくは、肉腫由来タンパク質抽出物の調製物、例えばCorning Life Sciencesが商品名Matrigel(登録商標)で販売する製品である。
【０００８】
工程(ｂ)は、好ましくは、遠心分離により、例えば50〜2200ｇにて30秒間〜15分間、好ましくは６分間の遠心分離により行う。
インキュベーション工程(ｃ)は、通例の条件下、すなわち35〜38℃の温度にて行う。１つの実施形態に従えば、この工程は、細胞外マトリクスタンパク質調製物(例えば、Matrigel(登録商標))を含有する培養培地において約１時間継続するインキュベーション、及びその後に塩を加えて(好ましくは少なくとも10時間)継続するインキュベーションを含んでなる。
例示として、工程(ｃ)でのインキュベーションは、所望するケラチノサイト分化の程度に応じて、１〜10日間、好ましくは２〜５日間継続してもよい。
本発明の１つの変形に従えば、スフェロイドのインキュベーションを、スフェロイドの中心でケラチノサイト変態(細胞の伸長、核の平坦化、ケラチンの蓄積)の開始が観察されるまで３日を超えて延ばす(図２〜４)。この特性を有するため、本モデルは、ケラチノサイトの分化勾配を再現するので、非常に興味深い。したがって、本混合スフェロイドは、皮膚を「裏返しに」模擬し(最も分化した細胞がスフェロイドの中心部に位置する)、皮膚の異なる階層に類似した構造を有する(図４)。
【０００９】
使用のために、本スフェロイドは、(例えばPBSで)洗浄して細胞外マトリクスタンパク質調製物を除去することができる；洗浄は、好ましくは、24時間〜168時間のインキュベーション後に行い、洗浄までの時間は、所望する混合スフェロイドの成熟度に依存する。
使用の前に、混合スフェロイドの培養培地に含まれる塩を除去することもできる。
したがって、１つの特定の実施形態によれば、本発明の方法は、混合スフェロイドを(好ましくはPBSで)洗浄する追加の工程(ｄ)を含んでなる。
本発明の方法の１つの利点は、サイズ及び細胞集団の特性が標準化された多数のスフェロイドの迅速な製造を可能とし、スクリーニングアッセイの直列的実施及び得られた結果の比較を可能にすることである。
実験の章に示す種々のスフェロイド製造の試みにより、本方法の本質的特性が証明された。例えば、塩及び/又は細胞外マトリクスタンパク質調製物(特に増殖因子も含む)が存在しない場合や、２つの細胞タイプの一方のみを含む単純なスフェロイドを製造し、その後に他方の細胞タイプの懸濁物を添加する場合には、スフェロイドは形成されない。
【００１０】
本発明はまた、本発明の製造方法を用いて得られたケラチノサイトとメラノサイトとの混合スフェロイドに関する；したがって、本発明によるケラチノサイトとメラノサイトとの混合スフェロイドは、前記方法を用いて製造することができる、１〜95容量/容量％(培養培地の総容量に対する調製物の容量で表したパーセンテージ)の濃度、好ましくは10〜75容量/容量％の濃度の細胞外マトリクスタンパク質調製物、及び、10mM以下の量、好ましくは0.1〜１mMの量のカルシウム、マグネシウム及びマンガンから選択される塩を含んでなってもよい；有利には、本スフェロイドは、100μm〜1000μmの角直径及び規則的形状を有する。好ましくは、本スフェロイドは、100細胞〜5000細胞、好ましくは2000〜3000細胞を含んでなる。
【００１１】
本発明は更に、ケラチノサイトの中心部での分化に対応する中心塊を有する混合スフェロイドに関する。
本発明の混合スフェロイドは、ケラチノサイト/ケラチノサイト相互作用、ケラチノサイト/メラノサイト相互作用を再現し、樹状突起が伸長し、メラノサイトがメラニンを産生する。したがって、本混合スフェロイドは、活性分子、特に皮膚科学的又は美容的に活性な分子の作用を評価するモデルとして用いることができる。
本発明の混合スフェロイドを用いて種々の試験を行った：メラニン産生を誘導することが知られている化合物(IBMX、3-イソブチル-1-メチルキサンチン)及びメラニン産生を阻害することが知られている化合物(PTU、プロピルチオウラシル)で本混合スフェロイドを処理した後、総タンパク質に対するメラニン量(分光光度法によるアッセイ)を評価した(実施例５及び図８を参照)。IBMXでの処理後に50％誘導の再現が観察された。このことにより、本スフェロイドモデルにおける参照分子としてのIBMXの使用の妥当性が示された。PTUでの処理はメラニン産生を阻害する。
【００１２】
この直接定量は定量的PCRアッセイで行った；この方法により多数の遺伝子の分析が可能となり、したがって本混合スフェロイドで試験した分子の作用機序が証明される。IBMXでの24時間の処理後、調べた全ての色素沈着遺伝子(TYR、MITF、PMEL及びTYRP1)が遺伝子レベルで誘導された(実施例６及び図９を参照)。色素沈着遺伝子の調節に関与し、機序の観点からIBMXに対する応答に直接関与するMITF因子が約５倍増大していた。メラニン合成遺伝子TYR及びTYRP1も誘導した。
これら結果により、参照処理後に、本発明の混合スフェロイドで産生されるメラニンの定量が可能であることが確証される。メラニン量は、メラニンアッセイにより直接定量可能であり、参照の色素沈着促進処理又は色素脱失処理後にモジュレーションが得られた。加えて、転写分析も可能であり、これにより、活性物質の評価が達成される。
【００１３】
したがって、本発明の混合スフェロイドは、色素沈着分子又は色素脱失分子の評価のためのモデルとして極めて興味深いものである。
しかし、このことは、本発明の混合スフェロイドが有用である唯一の適用ではない。なぜならば、定量的PCRは、色素沈着以外の目的(例えば、炎症、増殖、アポトーシスなど)に行うことができるからである。
この点について、本発明の混合スフェロイドで、その成分たるケラチノサイトの分化変化を定量する追加の試験を行った(実施例７を参照)；この追加試験は、ケラチノサイトの代謝に特異的な64遺伝子について、ゲノムチップを用いて行った。そのうちの15遺伝子はメラノサイトも発現する。３日間及び７日間の培養期間後に発現プロフィールを比較した(実施例７の表１を参照)。表皮の接着及び粘着に関与する幾つかの遺伝子が過剰発現した(CTNNA1、CDLN1、OCLN、EVPL、EPPK1及びPXN)。分化、特に角化膜の形成に関与する遺伝子もまた過剰発現した(AQP3、STPLC1及びTGM1)。これら２つの細胞プロフィールの重ね合わせにより、形態レベルでなされた観察が確証される。幾つかの炎症促進性サイトカイン(IL6、IL8及びTNFA)の発現増大に留意することも重要である。
【００１４】
或いは又は加えて、本混合スフェロイドを活性分子の作用を評価するモデルに用いるために、本混合スフェロイドは、経時的変化のモニタリングが可能となるようにその１又は２以上の構成成分を標識して製造するとき、又は試験すべき分子と接触して配置されるときに有用である(ただし、必須ではない)と証明される。標識は幾つかのタイプであり得る：スフェロイドの形成前に生存細胞を染色剤で標識するか、又はスフェロイド形成後にスフェロイド切片又は解離スフェロイド上で抗体で標識する。標識のタイプにより、行うべき分析が決まる。
本発明はまた、本発明の混合スフェロイドの、表皮で作用することができる活性物質を評価するための使用に関する。
【００１５】
上記のように、メラノサイトの機能性により、本混合スフェロイドは、製剤化若しくはカプセル化された分子及び/若しくは分子混合物の又は皮膚科学的若しくは美容的製品の色素沈着作用(阻害によるか刺激によるかにかかわらず)を評価するために選択されるモデルである；この評価を行うために、メラニン形成をモニターし分析しなければならない。このモニタリングは異なる幾つかのラインに沿って行うことができる：産生メラニン量のアッセイ、産生メラニンのケラチノサイトへの移行の定量；メラニン形成のモニタリングは、おそらくは、定量的PCRを用いる関連遺伝子の定量で達成される。
具体的には、メラニンのアッセイは、例えば実施例３に記載したようなプロトコルに従う測光法により行うことができる。
【００１６】
加えて又は或いは、色素沈着に対する或る分子の可能な作用の評価は、ケラチノサイトへのメラノソームの移行のリアルタイム分析により行なってもよい。これは、例えば実施例４に記載したような標識の使用、続く深部3D画像化によるスフェロイドの分析により達成することができる；この評価は、フローサイトメトリのような他の技法を用いて行うこともできる。
中心塊を含んでなる本発明の混合スフェロイドの使用は、角質化及び関連疾患(例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎など)についての研究に関してもよく、所与の動力学下での中心塊の厚さの測定及び/又はケラチノサイト分化に関与する遺伝子のトランスクリプトーム分析による、ケラチノサイト分化をモジュレートする分子のスクリーニングに用いることができる。
より一般的には、本発明の混合スフェロイドは、美容的、皮膚科学的又は癌腫学的に適用する観点から、角質形成、メラニン形成及び/又はメラニン移行の機能不全から生じる疾患又は病的状態を研究するため、並びに、そのような機能不全を修正することができる分子のスクリーニングに用いることができる
【００１７】
したがって、本発明は、特に、メラニン産生及び/若しくはメラノソームの移行に対して作用し並びに/又はメラニン形成に関与する遺伝子の発現をモジュレートすることができる分子をスクリーニングする方法であって、
(i)本発明の方法を用いて、好ましくは混合スフェロイドの洗浄工程(ｄ)を含んでなる本発明の方法を用いて、任意に標識されていてもよいスフェロイドを作製し；
(ii)工程(i)で作製したスフェロイドを１又は２以上の試験分子と接触状態で配置し；
(iii)メラニン量及び/又はメラノソームの移行及び/又はメラニン形成に関与する遺伝子の発現をモジュレートする分子を選択する
ことを含んでなる方法、或いは
ケラチノサイトの分化に作用することができる分子のスクリーニング方法であって、
(i)本発明に従うスフェロイド、例えば中心塊を有し及び/又は標識されたスフェロイドを準備し；
(ii)工程(i)で作製したスフェロイドを１又は２以上の試験分子と接触状態で配置し；
(iii)ケラチノサイトの分化をモジュレートする分子を選択する
ことを含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ａ．１ NHEM/４ NHEKの細胞比を有する、ケラチノサイト-メラノサイト混合スフェロイドを示す透過光下の画像。スケールバーは100μmを表す。Ｂ．10日間にわたる混合スフェロイドの体積変化を示すグラフ。
【図２】３日目(D3)の本発明のスフェロイドを示す画像Ａ．ケラチノサイトを証明するためにサイトケラチン５で標識。Ｂ．メラノサイトを証明するためNKIbeteb(Pmel17)で標識。Ｃ．細胞核のDAPI標識。Ｄ．増殖細胞のEdU標識。増殖細胞は混合スフェロイドの周縁部に観察される。Ｅ．異なる標識の重ね合わせ。スケールバーは100μmを表す。
【図３】７日目(D7)の本発明のスフェロイドを示す画像。Ａ．ケラチノサイトを証明するためにサイトケラチン５で標識。分化勾配に対応するCK5発現の勾配が観察される。ケラチノサイトの形態が分化勾配に応じて変化し、細胞が伸長することに気付く(矢印)。Ｂ．細胞核のDAPI標識。核の形態変化が観察される。分化勾配に伴い、核が伸長し(矢印)、最終的には喪失する。Ｃ．増殖細胞の核のEdU標識。増殖細胞は混合スフェロイドの周縁部に観察される。Ｄ．異なる標識の重ね合わせ。スケールバーは100μmを表す。
【図４】ケラチノサイトの分化。Ａ．表皮構成の概略図Ｂ．フォンタナ・マッソン染色した皮膚切片Ｃ．サイトケラチン５(灰色)及びEdU(増殖細胞の核)(白色)で標識した、D7の混合スフェロイドの断面の詳細。
【図５】種々のメラノサイト/ケラチノサイト比(１:20、１:５及び１:２)で作製した本発明のスフェロイドの画像。スケールバーは100μmを表す。
【図６−１】Ａ〜Ｅ：例えば実施例２に記載したようなスフェロイドを作製する種々の試みで得られた目的物を示す画像。
【図６−２】Ａ〜Ｅ：例えば実施例２に記載したようなスフェロイドを作製する種々の試みで得られた目的物を示す画像。
【図７】混合スフェロイドにおけるメラニン移行の可視化。Ａ．サイトケラチン５(濃灰色)及びNKIbeteb(Pmel17)(淡灰色)で標識した混合スフェロイドの切片の分析。詳細には、右側に二重標識細胞が観察される(矢印)。スケールバーは100μmを表す。Ｂ．ケラチノサイトをCellMask(濃灰色)で標識しメラノサイトをCFDA(淡灰色)で標識した全体スフェロイドの、SPIM画像化及びIMARISソフトウェアを用いる3D再構成による分析。詳細には、右側に二重標識細胞が観察される(矢印)。Ｃ．ケラチノサイトをサイトケラチン５標識(FL4)し、メラノサイトをCFDA標識(FL1)した分裂スフェロイドのフローサイトメトリによる分析。二重標識集団が観察される(点線に囲まれた集団)。
【図８】IBMX処理後の混合スフェロイドについてのメラニン濃度を表すヒストグラム(用いた溶媒コントロール及びPTUと比較)。
【図９】実施例６で説明したように定量した、本発明の混合スフェロイドの細胞の遺伝子発現を表すヒストグラム。IBMX処理に直接関与するMITF遺伝子の発現が増加する。MITFの制御下の遺伝子TYR、TYRP1及びPMELの発現もIBMX処理後に増加する。
【実施例】
【００１９】
実施例１−本発明のスフェロイドの製造
方法
細胞をトリプシン処理により脱着させ、計数して、10％ Matrigel(登録商標)及び１mMカルシウムを補充した培地中60,000細胞/mLでメラノサイトとケラチノサイトとの混合懸濁物を調製する。次いで、この懸濁物を、事前にポリHEMAでコーティングした96ウェルプレートに播種し、４℃で190ｇにて６分間遠心する。プレートを１時間37℃で５％ CO2にてインキュベートしてMatrigel(登録商標)を凝固させ、培養培地を各ウェルに加えてMatrigel(登録商標)に水分補給する。
【００２０】
実施例２−本発明のスフェロイドの特徴決定
こうして製造したスフェロイドは３日間の培養後に約250μmの直径を有し、10日間でその体積は２倍になる(図１)。
D3で、NucView(カスパーゼ３標識)を用いる標識法は、混合スフェロイド中でアポトーシスが生じないことを示す。EdU標識により、スフェロイド周縁部での細胞増幅が観察された。この細胞はサイトケラチン５でも標識されるので、ケラチノサイトに相当する(図２)。
数日間の培養後、スフェロイド中に中央塊が観察され、細胞の形態が変化する(図３)ことに留意すべきである；この中央塊は、ケラチノサイトの分化の結果である(図４)。
本発明のスフェロイドは、種々のメラノサイト/ケラチノサイト細胞比(１:20、１:５及び１:２)で製造した；図5A、5B及び5Cに示すように、全てのスフェロイドが満足できる特性を示した。
本発明の他のスフェロイドを、50％及び75％のMatrigel(登録商標)を用いて実施例１のように製造した；得られた混合スフェロイドも満足できる特性を示した；図5D、5E及び5Fは、それぞれ10％、50％及び75％ Matrigel(登録商標)を用いて製造したスフェロイドの写真である。
【００２１】
以下のスフェロイド製造条件も試験したが、スフェロイドを得ることはできなかった：
−  Matrigel(登録商標)なし及びカルシウムなしのNHEK培地中でのNHEM-NHEK混合懸濁物の遠心分離法；この方法では、細胞は集まるが、三次元構造を形成しない(図6A)；
−  Matrigel(登録商標)なしの、１mM CaCl2を補充したNHEK培地中又はF12＋SVF培地中でのNHEM-NHEK混合懸濁物の遠心分離法：この方法では、細胞は三次元構造を形成するが、細胞タイプごとに棲み分けしたままである。構造は球状でなく、スクリーニングの再現性が不十分である(図6B)；
−  Matrigel(登録商標)なしの、１mM CaCl2を補充したNHEK培地中又はF12＋SVF培地中でNHEKのみのスフェロイドとNHEM懸濁物とを用いる対面法；遠心分離法を用いてNHEKのみのスフェロイドを予め製造した：Matrigel(登録商標)なしのカルシウム含有培地又はF12＋SVF培地中での既製スフェロイドと細胞懸濁物との対面法では、細胞は三次元構造を形成するが、細胞タイプごとに棲み分けしたままである。構造は球状でなく、スクリーニングの再現性は不十分である(図6C)；
【００２２】
−  Matrigel(登録商標)なしの、１mM CaCl2を補充したNHEK培地中又はF12＋SVF培地中でNHEMのみのスフェロイドとNHEK懸濁物とを用いる対面法：遠心分離法を用いてNHEMのみのスフェロイドを予め製造した；Matrigel(登録商標)なしのカルシウム含有培地又はF12＋SVF培地中での既製スフェロイドと細胞懸濁物との対面法では、細胞は三次元構造を形成するが、細胞タイプごとに棲み分けしたままである。構造は球状でなく、スクリーニングの再現性は不十分である(図6D)；
−  １mM CaCl2を補充したMatrigel(登録商標)なしのNHEK培地中での単一スフェロイド(それぞれ、NHEMスフェロイド及びMHEKスフェロイド)の対面法；遠心分離法を用いて２つの単一スフェロイドを予め製造した；Matrigel(登録商標)なしのカルシウム含有培地中で各細胞タイプの２つのスフェロイドの対面法では、細胞は三次元構造を形成するが、細胞タイプごとに棲み分けしたままである。構造は球状でなく、スクリーニングの再現性は不十分である(図6E)；
−  Matrigel(登録商標)(10〜50％)を補充したか又はしないカルシウム不含NHEK培地中でのNHEM-NHEK混合懸濁物からの小滴法。Matrigel(登録商標)を含む条件は3D構造を形成しなかった；この方法では、細胞は三次元構造を形成するが、構造は球状でなく、スクリーニングの再現性は不十分である；
−  Matrigel(登録商標)(10〜50％)を含むカルシウム不含NHEK培地中でのNHEM-NHEK混合懸濁物の遠心分離法：この方法では、細胞は三次元構造を形成するが、細胞タイプごとに棲み分けしたままである。構造は球状でなく、スクリーニングの再現性は不十分である。
【００２３】
実施例３−測光法によるメラニンのアッセイプロトコル
細胞を、１Ｍ NaOH＋10％ DMSOの溶液中で溶解させ、30分間90℃にてインキュベートした。合成メラニンを用いて標準範囲を作成し、波長405nmで読み取った。
microBCAキットを供給業者の指示書に従って用いて、メラニンアッセイの溶解物について、総タンパク質のアッセイを行った。BSAを用いて標準範囲を作成し、波長605nmで読み取った。
結果は、メラニンアッセイと総タンパク質アッセイとの比で表す。
【００２４】
実施例４−本発明の混合スフェロイドの標識プロトコルの例
CFDA(カルボキシ-フルオレセインジアセテート；スクシンイミジルエステル)で事前に標識したメラノサイトを用いて実施例１に説明したように混合スフェロイドを製造した。こうして製造した混合スフェロイドをCellMaskで標識した。次いで、混合スフェロイドを洗浄し、ホルマリン中で固定し、脱水してベンジル-アルコールとベンジル-ベンゾエート(BaBb)との混合物中で透明化した。分析はライトシート画像法を用いて行った。
【００２５】
実施例５−IBMX及びPTUでの処理後の混合スフェロイドについてのメラニンアッセイ
播種の24時間後、本発明の混合スフェロイド(例えば、実施例１で製造したもの)を、PBSでの洗浄によるMatrigel(登録商標)の除去後、300μM IBMX又は500μM PTUで５日間処理した(４日目に処理を更新)。実施例３で説明したようにメラニンをアッセイした。
図８に示すように、得られた結果は、PTU処理が、溶媒(EtOH)コントロールと比較して、混合スフェロイド中のメラニン総量の減少をもたらし、IBMX処理が、溶媒コントロール(DMSO)と比較して、混合スフェロイド中のメラニン総量の増加を引き起こすことを示す。
【００２６】
実施例６−QPCRによる遺伝子発現の定量
播種の48時間後、本発明の混合スフェロイド(例えば、実施例１で製造したもの)を、PBSでの洗浄によるMatrigel(登録商標)の除去後、300μM IBMXで24時間処理した。24時間のIBMX処理後、スフェロイドを採集し、PBSで洗浄した。RNAを抽出し、cDNAに逆転写させた。次いで定量PCRを行い、遺伝子MITF、TYR、TYRP1及びPMELの発現を定量した。これら遺伝子の発現を、GAPDHハウスキーピング遺伝子の発現で規格化し、非処理コントロールと比較した。
得られた結果は、(IBMX処理に直接関与する)MITF遺伝子の発現が増大したことを示す。MITFの制御下の遺伝子TYR、TYRP1及びPMELの発現も、IBMX処理後に増大する(図９)。
【００２７】
実施例７−ゲノムチップを用いる遺伝子発現プロフィールの評価
３日間及び７日間の培養後、ゲノムチップを用い、下記に詳述するプロトコルに従って、スフェロイドの遺伝子発現プロフィールを評価した。
播種の３日後及び７日後に、実施例１に記載のように製造した本発明の混合スフェロイドを採集し、PBCで洗浄した。mRNAを抽出し、続いて逆転写させた。最後に、Fluidigmのプロトコルを適用するチップ(96遺伝子)に特異的な調製工程を行った。チップで用いる全てのプライマーの存在下で予備増幅工程を行った。次いで、各予備増幅cDNAサンプルを、96ウェルプレートに、リアルタイムPCRが可能なプレートレイアウトに従って、ミックスと共に堆積した。別の96ウェルプレートで併行して、各プライマー対をプレートレイアウトに従ってウェル中に配置した。次いで、各ミックスをチップのいずれかの側に堆積した。IFCコントローラにより２つのミックスの混合を行った後、チップをBioMark内に配置しリアルタイムPCRを行った。ケラチノサイトの代謝に特異的な64遺伝子についてゲノムチップを用いた。そのうちの15遺伝子はメラノサイトでも発現する。データ分析にはFluidigmソフトウェアを用いた。
【００２８】
得られた結果を下記表１に示す。表１は、表皮粘着及び分化に関与する幾つかの遺伝子が、図３に示すように、D3〜D7のスフェロイド発達後に過剰発現することを示す；炎症遺伝子もまた過剰発現する：
【表１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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