(57)【要約】  本発明は２つの要素又は構成要素を含むキット又はシステムに関する。第１の構成要素（ｉ）は少なくとも１つのプロトスペーサーを含む核酸配列を含む選択的構成要素である。第２の構成要素（ｉｉ）は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲアレイを含む少なくとも１つの感受性亢進構成要素を含む。ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーが細菌の病原性遺伝子内に含まれるプロトスペーサーを前記細菌の前記病原性遺伝子を特異的に不活性化するように標的にし、且つ前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーが前記（ｉ）の選択的構成要素内に含まれるプロトスペーサーを、前記選択的構成要素を特異的に不活性化するように標的にすることが留意されるべきである。さらに本発明は、病原性遺伝子の細菌間の水平伝播を干渉し、且つ細菌感染に起因する哺乳類対象の病的状況を予防する本発明の構成要素又はキットを使用する方法を提供する。【選択図】図６Ａ
2017536831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも１つのプロトスペーサーを含む核酸配列を含む少なくとも１つの選択的構成要素、並びに
（ｉｉ）少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイを含む少なくとも１つの感受性亢進構成要素
を含むキットであって、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーが、細菌の少なくとも１つの病原性遺伝子内に含まれるプロトスペーサーを、前記細菌の前記病原性遺伝子を特異的に不活性化するように標的にし、且つ前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーが前記（ｉ）の選択的構成要素内に含まれるプロトスペーサーを、前記選択的構成要素を特異的に不活性化するように標的にするキット。
【請求項２】
前記選択的構成要素が少なくとも１つの溶菌性バクテリオファージを含む請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記溶菌性バクテリオファージが、前記細菌病原性遺伝子内に含まれる少なくとも１つの核酸配列に少なくとも７０％の同一性をもつ少なくとも１つのプロトスペーサーを含む少なくとも１つの遺伝子改変バクテリオファージである請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記感受性亢進構成要素が少なくとも１つのｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１つの組み換えベクターを含み、前記ベクターが少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲアレイの核酸配列をさらに含む請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記ベクターが、前記溶菌性バクテリオファージ内に含まれる少なくとも１つの核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー及び前記少なくとも１つの病原性遺伝子内に含まれる核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーを含む少なくとも１つの遺伝子改変バクテリオファージであり、前記溶菌性ファージ及び前記病原性遺伝子の両方を標的にし、且つ不活化する請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記少なくとも１つの細菌病原性遺伝子が少なくとも１つの細菌内在性遺伝子である請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記少なくとも１つの細菌病原性遺伝子が少なくとも１つのエピクロモソーマル遺伝子である請求項１に記載のキット。
【請求項８】
少なくとも１つの前記病原性遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である請求項６及び７のいずれか１つに記載のキット。
【請求項９】
前記少なくとも１つの前記病原性遺伝子が少なくとも１つの病原性因子及び少なくとも１つの毒素をコードする遺伝子である請求項６及び７のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子が、ＣＴＸ−Ｍ−１５、ニューデリー・メタロβラクタマーゼ（ＮＤＭ）−１、２、５、６、基質特異性拡張型ベータラクタマーゼ耐性因子（ＥＳＢＬ因子）、ベータラクタマーゼ、及びテトラサイクリンＡ（ｔｅｔＡ）からなる群より選択される耐性因子をコードする請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーが、少なくとも１つのＣＴＸ−Ｍ−１５のプロトスペーサー、少なくとも１つのＮＤＭ−１、２、５、６のプロトスペーサー、少なくとも１つのＥＳＢＬ因子のプロトスペーサー、少なくとも１つのベータラクタマーゼのプロトスペーサー、少なくとも１つのｔｅｔＡのプロトスペーサー及び少なくとも１つのプロトスペーサーの溶菌性バクテリオファージの少なくとも１つを標的にする核酸配列を含む請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
少なくとも１つの前記ＣＴＸ−Ｍ−１５のプロトスペーサーが、配列番号４９、５０、及び５１のいずれか１つで表わされる核酸配列を含み、且つ少なくとも１つの前記ＮＤＭ−１のプロトスペーサーが、配列番号４６、４７、及び４８のいずれか１つで表わされる核酸配列を含む請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記遺伝子改変された溶菌性バクテリオファージが、（ａ）配列番号４９、５０、及び５１のいずれか１つで表わされる核酸配列を含む少なくとも１つのＣＴＸ−Ｍ−１５のプロトスペーサー、並びに（ｂ）配列番号４６、４７、及び４８のいずれか１つで表わされる核酸配列を含む少なくとも１つのＮＤＭ−１のプロトスペーサーの少なくとも１つを含む請求項３に記載のキット。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーが前記溶菌性バクテリオファージの必須遺伝子内に含まれる核酸配列を標的にする請求項５に記載のキット。
【請求項１５】
前記溶菌性バクテリオファージが少なくとも１つのＴ７様ウイルス及びＴ４様ウイルスである請求項６及び１４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１６】
前記Ｔ７様ウイルスが少なくとも１つの腸内細菌ファージＴ７である請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記バクテリオファージがラムダ溶原性バクテリオファージである請求項５に記載のキット。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのｃａｓ遺伝子が、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子の少なくとも１つである請求項１に記載のキット。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのｃａｓ遺伝子がＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子である請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのＩ−Ｅ型ｃａｓ遺伝子が、ｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃａｓ７、ｃａｓ５ｅ  ｃａｓ６、及びｃａｓ３遺伝子の少なくとも１つのある請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのｃａｓ遺伝子が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子である請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子がｃａｓ９遺伝子である請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記細菌が、少なくとも１つのエシェリキア・コリ、シュードモナス・エルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、クロストリジウム・ディフィシル、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、及びエンテロバクター属の複数種・エンテロバクター種のいずれかの株の少なくとも１つの細菌である請求項１に記載のキット。
【請求項２４】
前記細菌が、Ｏ１５７：Ｈ７、腸管付着性（ＥＡＥＣ）エシェリキア・コリ、腸管出血性（ＥＨＥＣ）エシェリキア・コリ、腸管侵入性（ＥＩＥＣ）エシェリキア・コリ、腸管病原性（ＥＰＥＣ）エシェリキア・コリ、毒素原性（ＥＴＥＣ）エシェリキア・コリ、及びびまん付着性（ＤＡＥＣ）エシェリキア・コリからなる群より選択される少なくとも１つのエシェリキア・コリ株である請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記溶原性バクテリオファージ及び前記溶菌性バクテリオファージの少なくとも１つが、スプレー剤、スティック、塗布剤、ゲル剤、クリーム、ウォッシュ、ワイプ、フォーム、石鹸、液剤、油、溶液、ローション剤、軟膏、又はペーストとして調合される請求項２及び４のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２６】
少なくとも１つの病原性遺伝子を含む遺伝要素の細菌間の水平伝播を干渉する方法であって、前記病原性遺伝子を内部にもつ細菌を含有する表面、物質、及び物品の少なくとも１つを、
（ｉ）少なくとも１つのプロトスペーサーを含む核酸配列を含む少なくとも１つの選択的構成要素、
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲアレイの少なくとも１つのスペーサーが細菌の少なくとも１つの病原性遺伝子内に含まれるプロトスペーサーを前記細菌の前記病原性遺伝子を特異的に不活性化するように標的にし、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーが前記（ｉ）の選択的構成要素内に含まれるプロトスペーサーを、前記選択的構成要素を特異的に不活性化するように標的にする、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲを含む少なくとも１つの感受性亢進構成要素、並びに
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）を含む少なくとも１つのキット
の少なくとも１つと接触させ、それによって前記病原性遺伝子を不活化し、且つその水平伝播を干渉する工程を含む方法。
【請求項２７】
前記キットが請求項２〜２５のいずれか一項で規定される通りである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
病原性遺伝子を含有する細菌の細菌感染に起因する哺乳類対象の病的状況を予防する方法であって、前記被験者の近くの表面、物質、及び物品の少なくとも１つを、
（ｉ）少なくとも１つのプロトスペーサーを含む核酸配列を含む少なくとも１つの選択的構成要素、
（ｉｉ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイの少なくとも１つのスペーサーが細菌の少なくとも１つの病原性遺伝子内に含まれるプロトスペーサーを前記細菌の前記病原性遺伝子を特異的に不活性化するように標的にし、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーが前記（ｉ）の選択的構成要素内に含まれるプロトスペーサーを、前記選択的構成要素を特異的に不活性化するように標的にする、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲを含む少なくとも１つの感受性亢進構成要素、並びに
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）を含む少なくとも１つのキット
の少なくとも１つと接触させ、それによって前記病原性遺伝子を標的にして不活化し、且つ前記病的状況を予防することを含む方法。
【請求項２９】
前記キットが請求項２〜２５のいずれか一項で規定される通りである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの表面、物質、及び物品を前記溶原性バクテリオファージと接触させること及びそれに続いて前記固体表面を前記溶菌性バクテリオファージと接触させることを含む請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明につながった研究は欧州連合第７次フレームワーク計画（ＥＰ７／２００７−２０１３）／ＥＲＣ助成契約第３３６０７９号の下で欧州研究機構から資金提供を受けてきた。
【０００２】
本発明は、特異的に細菌の遺伝子を標的にして削減する方法に関する。より具体的には、本発明は、細菌の病原性遺伝子を標的にして削減する改変ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）システムを用いるキット、システム、組成物、及び方法を提供する。
【０００３】
背景参考文献
１．Ｌｕ  ＴＫ  ＆  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＪＪ（２００９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６（１２）：４６２９−４６３４．
２．Ｍｅｒｒｉｌ  ＣＲ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２（６）：４８９−４９７．
３．Ｑｉｍｒｏｎ  Ｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３（５０）：１９０３９−１９０４４．４
４．Ｌａｎｇ  ＬＨ（２００６）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３１（５）：１３７０．
５．Ａｂｕｌａｄｚｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７４（２０）：６２３０−６２３８．
６．Ｈａｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｓｉ（２００３）Ｌｅｔｔ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；３７（４）：３１８−２３．
７．Ｑｉｍｒｏｎ  Ｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ８，８６５，１５８．
８．Ｇｏｍａａ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＭＢｉｏ  ５（１）：ｅ００９２８−００９１３．
９．Ｇａｒｎｅａｕ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６８（７３２０）：６７−７１．
１０．Ｃｉｔｏｒｉｋ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１１．Ｂｉｋａｒｄ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１２．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５（５８１９）：１７０９−１２．
１３．Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１（Ｐｔ  ８）：２５５１−６１．
１４．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：１８４３−１８４５．
１５．Ｙｏｓｅｆ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ４（１）：ｅ２８４９１．
１６．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５（５８１９）：１７０９−１７１２）．
１７．Ｈａｌｅ  ＣＲ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  １３９（５）：９４５−９５６．
１８．Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎ  ＪＮ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｔｈｅｒ  １１（３）：２９７−３０８．
１９．Ｂｏｕｃｈｅｒ  ＨＷ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ４８（１）：１−１２．
２０．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １１（３）：１８１−１９０．
２１．Ｈａｌｅ  ＣＲ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  １３９（５）：９４５−９５６．
２２．Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７（１２）：６６４０−６６４５．
２３．Ｙｏｓｅｆ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０（１２）：５５６９−５５７６．
２４．Ｓｈａｒａｎ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ４（２）：２０６−２２３．
２５．Ｙｕ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７（１１）：５９７８−５９８３．
２６．Ｙｏｓｅｆ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８（５０）：２０１３６−２０１４１．
２７．Ｋｉｒｏ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０（４８）：１９５４９−１９５５４．
２８．Ｂｕｓｈ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５：４５５−４７８．
２９．Ｂｒｏｕｎｓ  ＳＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１（５８９１）：９６０−９６４．
３０．Ｂａｂａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ２：１−１１．
３１．Ｅｄｇａｒ  Ｒ  ａｎｄ  Ｑｉｍｒｏｎ  Ｕ（２０１０）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９２（２３）：６２９１−６２９４．
本明細書において上記参考文献を承認することが、以下に開示される本発明の主題の特許性に何らかの形で関連することを意味すると推定されるべきではない。
【背景技術】
【０００４】
細菌は広範囲の抗生物質を克服するよう進化してきており、大部分の従来の抗生物質に対する耐性メカニズムがいくつかの細菌で特定されてきた。新しい抗生物質の加速する開発は細菌耐性のペースに圧倒されている。例えば、アメリカ合衆国では院内感染の７０％超は少なくとも１つの抗生物質に対して耐性がある細菌が関与し、日本ではスタフィロコッカス・アウレウスの臨床分離株の５０％超は多剤耐性である。
【０００５】
病原体の抗生物質耐性はヒトの健康に対する増大する懸念であり、生物的防除に再び関心が寄せられている。この療法は細菌の天敵であるファージを用いて病原体を死滅させる。しかし、主に組織への送達障壁及び細菌のファージに対する耐性に起因して、該療法は現在のところ実行可能ではない。生物的防除の利用に関する大きな懸念としては、脾臓／肝臓及び免疫系によるファージの中和、ファージの宿主の範囲が狭いこと、細菌のファージに対する耐性、並びにヒト及び動物での十分な薬物動態研究及び有効性研究が欠けていることなどが挙げられる。
【０００６】
幾つかの研究は遺伝的手段としてファージを用いて細菌の抗生物質に対する感受性を上げた。１つの研究はグラム陰性エシェリキア・コリのファージＭ１３を用いていくつかの遺伝子ネットワークを遺伝学工学的に標的にすることによって、抗生物質に対する細菌の感受性を上げた（１）。該研究では、Ｍ１３によって仲介される遺伝子標的でＳＯＳ応答を破壊することによりさまざまな抗生物質に対する細菌の感受性が数倍高くなることが示された。また、抗生物質と併用したファージ仲介遺伝子伝播が病原性エシェリキア・コリに感染したマウスの生存期間を延ばすことも示した。全体として該研究は、ファージＭ１３による伝播遺伝子により、細菌が弱められ、細菌が抗生物質によって死滅させられ易くなることを示した。最終結果は、ファージが病原体を直接的に死滅させるのに用いられる伝統的な生物的防除の実行に非常に似ている。
【０００７】
異なる方法では、食用食品、植物、及び家畜に存在している病原体「殺菌剤」としてファージを利用する。これらの製品の保存可能期間を延ばすことにくわえて、その処理は時とし起こる疾患のアウトブレイクを防ぐことを目的としている。しかし、この戦略の実行はいくつかの障壁を克服しなければければならない。大部分のファージ感染の特徴の１つはその宿主の範囲が狭いことである。ファージの大部分は１つの種の細菌にしか感染せず、いくつかのファージは種内のある特定の株に限られる（２）。この特徴は他の細菌集団を破壊することなく特異的な病原体を標的にすることを可能にするので一方においては利点でありうる（２）。他方では、未感染病原体が未処理のまま残ることになると考えられるので、この狭い宿主範囲は重大な欠点となりうる。ファージの宿主範囲を広げる１つの方法は新しい宿主に感染するファージ変異体を選ぶことである。多くの場合、新しい宿主に適応する選ばれた変異体はその元の宿主に対する感染力も維持するので、その範囲が拡張される（３）。この問題を部分的に克服するさらなる方法は、拡張された範囲の同一細菌種を標的にするようにファージの混合物を使用することである。そのような方法の成功例は、製品ＬｉｓｔＳｈｉｅｌｄ、ＥｃｏＳｈｉｅｌｄ、及びＳａｌｍｏＦｒｅｓｈの、それぞれリステリア・モノサイトゲネス、エシェリキア・コリ、及びサルモネラ・エンテリカに対するファージの混合物の使用であり、すべてＵＳ食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可されている（４）。これらのファージ混合物は、食品及び表面の標的にされた病原体を効果的に全滅させることが示されている（５）。そのうえ、これらの製品はすべて、米国ＦＤＡから「すぐに食べられる状態（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｅａｔ）」認可を与えられており、消費者製品及び表面上にファージを塗り広げることが安全であることを示している（４）。
【０００８】
ヨーロッパでは他のファージカクテルが食品添加物として認可されており、現在、ファージバイオテクノロジー会社によって開発中のものが多くある。それらの用途は、ファージは環境中に分散され、効率的にその環境中の病原体を標的にできることを示す。
【０００９】
抗生物質に対する病原体の耐性は深刻さを増している問題であり、新規抗菌剤に対する喫緊の必要性につながっている。残念ながら、新しい抗生物質の開発は数多くの障害に直面し、したがって病原体が認可抗生物質に対して再度感受性をもつことになる方法には極めて重要な優位性がある。
【００１０】
Ｌｕ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ（１）は、細菌が抗生物質により感受性をもつように細菌を弱める役割を果たす遺伝子改変バクテリオファージを教示する。Ｈａｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｓｉ（６）は、殺菌剤として遺伝子改変繊維状ファージを教示する。発明者らは、優性感受性耐性遺伝子（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）、例えば、３０Ｓリボソームサブユニットタンパク質Ｓ１２、ジャイレース、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット、及びチミジル酸シンターゼ、並びにくわえて亜テルル酸塩耐性遺伝子をコードする遺伝子改変バクテリオファージ並びに細菌の抗生物質に対する耐性を減らす際のそのバクテリオファージの使用を以前に記載した（７）。
【００１１】
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びその関連Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）は、ヒト、霊長類、齧歯動物、魚類、ハエ、虫、植物、酵母、細菌細胞、及びバクテリオファージのゲノムを正確に削除及び編集する効率的なツールを提供することによって分子生物学に変革をもたらした。また、最近ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは生きた動物において遺伝子疾患の表現型を矯正するのに使用されており、その利用が哺乳類におけるさまざまな治療方法に対して検討されている。それでもなお、抗生物質耐性遺伝子又は病原性細菌株の特有の集団を標的にするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの使用を示しているのは限られた研究のみである（８、１０、１１）。
【００１２】
ＣＲＩＳＰＲは短いリピートのクラスターを含み、同じくらいの大きさの非反復配列が（スペーサーと呼ばれる）散在した遺伝子システムである。該システムのさらなる構成要素としてはＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子及びリーダー配列が挙げられる。転写されたスペーサーはＣａｓタンパク質をプロトスペーサーと呼ばれる外来核酸内の相同配列に誘導し、続いてプロトスペーサーが切断される。このシステムは原核生物に豊富であり、コンピューター解析により、ＣＲＩＳＰＲは今日までに配列が決定されている細菌ゲノムの〜４０％及びアーキアゲノムの〜９０％に見られることが示されている。
【００１３】
ＣＲＩＳＰＲアレイ及びｃａｓ遺伝子は微生物種によって大きく異なる。直列反復配列は種の間で異なることが多く、配列の著しい相違はｃａｓ遺伝子でも見られる。リピート配列のサイズは２４〜４７ｂｐの間でさまざまであり、スペーサーのサイズは２６〜７２ｂｐでありうる。１つのアレイ当たりのリピートの数は２つから、現在の記録を保持するベルミネフロバクター・エイセニアエがもつ１つのアレイ当たり２４９個のリピートまである。ゲノムの多くは単一のＣＲＩＳＰＲ座をもつが、メタノカルドコックス・ヤンナスキイは１８の遺伝子座をもつ。最後に、いくつかのＣＲＩＳＰＲシステムでは６個のみ又はそれより少ないｃａｓ遺伝子が同定されているが、他は２０個を超えるｃａｓ遺伝子を伴う。このような多様性にもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲシステムの大部分でいくつかの特徴が保存されている。
【００１４】
ファージ感染に応えて細菌がファージゲノム配列に由来する新しいスペーサーを組み込み、ＣＲＩＳＰＲ媒介ファージ耐性をもたらすことがこれまでに示されている。その新しいリピート−スペーサーユニットはアレイのリーダー配列に近い端に付き、完全な耐性を与えるのにファージ配列と厳密に一致しなければならない（１００％同一性）。そのようなファージ由来スペーサーをファージ感受性ストレプトコッカス・サーモフィルス株のＣＲＩＳＰＲアレイに人工的に導入すると、該株はファージ耐性になった（１２）。
実際に、天然ＣＲＩＳＰＲアレイに見出されるスペーサーは、ファージ及び他の染色体外要素に由来することが多い（１３）。
【００１５】
Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８（１４）は、細菌性病原体の抗生物質耐性遺伝子及び病原性因子の拡散を妨げるＣＲＩＳＰＲアレイの操作を教示する。Ｇａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（９）は、ＣＲＩＳＰＲアレイは抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを切断することを教示する。
【００１６】
２つの最近の洗練された研究により、ファージ伝播可能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが病原体を特異的に死滅させる又は抗生物質に対して再び感受性をもたせることができることが示された（１０、１１）。また、これらの研究及び別の研究（８）はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは特異的な細菌集団を富化できることを示した。さらに、それらの研究は該システムを病原体に対して用いて感染した動物を効果的に治療しうることを示した。したがって、該システムは潜在的な抗菌剤として使用できることが示唆された。それにもかかわらず、これらの研究の結果から伝播可能なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの可能性が強調される一方で、該システムを直接的な抗微生物剤として使用するという概念は、さまざまな問題に苦しむ従来の生物的防除に似ている（１５）。ファージによって特異的なＤＮＡをこの病原体に送達することができるならば、溶菌性ファージで病原体を直接死滅させるのがより効率的であるという主張もありうる。そのうえ、抗生物質がこれらの感受性亢進病原体に対してカウンターセレクションする間に本明細書で提案するシステムを感染患者に使用して病原体に抗生物質に対する感受性を再びもたせることは、抗生物質によって選択される変異体を逃してしまうのでおそらく失敗する可能性が高いであろう。
【００１７】
よって、細菌の耐性遺伝子を特異的に標的にし、且つさらに抗生物質に対する耐性の水平伝播を削減する効率的な抗微生物方法を開発する必要性が差し迫っている。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の第１の態様は、２つの要素又は構成要素を含むキット又はシステムに関する。第１の構成要素（ｉ）は少なくとも１つのプロトスペーサーを含む核酸配列を含む選択構成要素である。第２の構成要素（ｉｉ）は少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイを含む少なくとも１つの感受性亢進構成要素を含み、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、細菌の病原性遺伝子内に含まれるプロトスペーサーを、前記細菌の前記病原性遺伝子を特異的に不活性化するように標的にし、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは前記（ｉ）の選択構成要素内に含まれるプロトスペーサーを、前記選択構成要素を特異的に不活性化するように標的にする。そのような不活性化は、前記溶原性ファージに感染した細菌を選択構成要素に対して非感受性にし、且つ耐性をもたせることが留意されるべきである。
【００１９】
本発明の第２の態様は、病原性遺伝子の細菌間の水平伝播を干渉する方法に関する。より具体的には、該方法は、そのような病原性遺伝子を内部にもつ細菌を含有する固体表面を、本発明の選択構成要素及び感受性亢進構成要素の少なくとも１つ又はそれを含むいずれのキット、具体的には本発明のキット又はシステムのいずれかと接触させる工程を含み、それによって病原性遺伝子を不活化し、その水平伝播を干渉する。
【００２０】
さらに、本発明は、本発明の選択構成要素及び感受性亢進構成要素の少なくとも１つ又はそれを含むいずれのキット、具体的には本発明において提供されるキット又はシステムのいずれかを用いて、病原性遺伝子を含有する細菌の細菌感染に起因する哺乳類対象の病的状況を予防する方法を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、改変ＣＲＩＳＰＲを含む遺伝子改変溶原性バクテリオファージに関する。さらになお、本発明は、本発明のプロトスペーサー、具体的には本発明に記載の溶菌性ファージのいずれかを含むいずれの遺伝子改変溶菌性バクテリオファージを包含する。
【００２２】
本明細書において使われる技術用語及び科学用語はすべて、別段特に規定がない限り本発明に係わる当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において記載されているものに類似する又は等価な方法及び材料は本発明の実施形態の実行又は試験に使用できるが、例示的な方法及び／又は材料を下に記載する。矛盾する場合には、定義も含めて特許明細書が優先することになる。くわえて、材料、方法、及び例は専ら例示であり、必ずしも限定することを目的としない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
添付の図面を参照して、本発明のいくつかの実施形態を単に例示の目的で本明細書に記載する。ここで図面に詳しく具体的に関連して、示される詳細は例として本発明の実施形態を例示的に考察する目的で示されていることが強調される。この点に関して、図面に伴う説明から、どのように本発明の実施形態が実行されうるかが当業者に明らかになる。
図面では：
【図１】図１．溶原化ファージの概略図  Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子：ｃａｓ３、ｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃａｓ７、ｃａｓ５、及びｃａｓ６ｅ（濃い色のバー）を、λ染色体（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００１４１６．１、配列番号３６）の１９０１４〜２７４８０位のヌクレオチドに代わって挿入し、対照溶原化ファージλｃａｓ（最下段）を得た。λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲファージ（最上段）は、ｃａｓ遺伝子にくわえて、遺伝子ｎｄｍ−１（配列番号３７、３８、３９でそれぞれ表わされるＮ１、Ｎ２、Ｎ３）及びｃｔｘ−Ｍ−１５（配列番号４０、４１、４２でそれぞれ表わされるＣ１、Ｃ２、Ｃ３）を標的にするスペーサーをもつＣＲＩＳＰＲアレイコードする。ＰＴ７、Ｔ７プロモーター。
【図２】図２Ａ〜２Ｄ．耐性プラスミドを内部にもつ細菌と比較した溶原菌の競合的適応  図２Ａは、λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲプロファージ及びｐＶｅｃプラスミドをコードする細菌の１：１の比での混合培養を示す。  図２Ｂは、λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲプロファージ及びｐＣＴＸプラスミドをコードする細菌の１：１の比での混合培養を示す。  図２Ｃは、λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲプロファージ及びｐＮＤＭプラスミドをコードする細菌の１：１の比での混合培養を示す。  図２Ｄは、λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲプロファージ及びｐＮＤＭ＊＋ｐＣＴＸプラスミドをコードする細菌の１：１の比での混合培養を示す。  パネルＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤの細菌はＬＢ中で３２℃にて１４時間共培養した。次いで細胞はＬＢに１／８００希釈され、３２℃でさらに１４時間増殖した。混合培養から試料を図に示されている時点で取り、カナマイシン又はストレプトマイシン又はストレプトマイシン＋ゲンタマイシン寒天プレートのいずれかにプレートし、溶原菌（カナマイシンｒ）とプラスミドを内部にもつ細菌（パネルＡ、Ｂ、Ｃについてはストレプトマイシンｒ又はパネルＤについてはストレプトマイシンｒ＋ゲンタマイシンｒ）を識別した。次いで、各株のＣＦＵ比は総耐性ＣＦＵのうちの各タイプの耐性ＣＦＵの数を計算することによって決定した。
【図３】図３．抗生物質耐性プラスミドの形質転換に対する溶原化効果  エシェリキア・コリＫ−１２は、λｃａｓ（薄い灰色バー）又はλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ（濃い灰色バー）で溶原化された。これらの溶原菌を対照（ｐＶＥＣ）、ｎｄｍ−１（ｐＮＤＭ）、又はｃｔｘ−Ｍ−１５（ｐＣＴＸ）をコードするプラスミドで形質転換し、ストレプトマイシンを補充した寒天プレートに播いた。バーは、培養液を連続希釈したものを播いた後に数えた１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数の、３回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
【図４】図４．溶原化による抗生物質耐性菌の感受性亢進  対照（ｐＶＥＣ）、ｎｄｍ−１（ｐＮＤＭ）、ｃｔｘ−Ｍ−１５（ｐＣＴＸ）、又はｎｄｍ−１＋ｃｔｘ−Ｍ−１５（ｐＮＤＭ＊／ｐＣＴＸ）をコードするプラスミドを内部にもつエシェリキア・コリＫ−１２を、λｃａｓ（薄い灰色バー）又はλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ（濃い灰色バー）で処理し、５μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び０．２％アラビノースを補充したＬＢプレートに播いた。次いでコロニー（各株２４個）を、ストレプトマイシン又はゲンタマイシンを含む又は含まない、５μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び０．２％アラビノースを補充したプレートに播種した。バーは、３回の独立した実験の、抗生物質のないプレートで増殖できるＣＦＵの総数のうちのストレプトマイシン又はゲンタマイシンを含むプレートで増殖できないＣＦＵとして記録したストレプトマイシン又はゲンタマイシン感受性細菌の％割合及び標準偏差を示す。
【図５】図５．溶菌性ファージからの保護に対する溶原化効果  エシェリキア・コリＫ−１２をλｃａｓ（薄い灰色バー）又はλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ（濃い灰色バー）で溶原化した。これらの溶原菌を、標的プロトスペーサーを欠く対照Ｔ７−ｇｐ８又はｎｄｍ−１の２つのプロトスペーサー（配列番号５５で表わされるＴ７−Ｎ１Ｎ２）若しくはｃｔｘ−Ｍ−１５の２つのプロトスペーサー（配列番号５６で表わされるＴ７−Ｃ２Ｃ１）若しくはそれぞれ１つずつのスペーサー（配列番号５７で表わされるＴ７−Ｎ１Ｃ１及び配列番号５８で表わされるＴ７−Ｃ２Ｎ２）をコードするＴ７ファージで感染した。バーは、ファージを連続希釈したものを播いた後に数えた１ｍｌ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数の、３回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃ．溶菌性ファージによる抗生物質感受性細菌の富化  図６Ａは、抗生物質感受性菌を富化する手順の概略図を示す。細菌培養液を溶原化ファージと混ぜ、培養中に溶原菌と非溶原菌の両方が生じる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは抗生物質耐性付与プラスミド及び溶菌性ファージ染色体を分解するので、溶原菌は抗生物質感受性で且つファージ耐性である。処理した培養を、溶原菌を選択的に死滅させ、且つ抗生物質感受性菌を富化する溶菌性ファージを含有する寒天に播種する。  図６Ｂ．ファージ耐性エシェリキア・コリの富化  対照（ｐＶＥＣ）、ｎｄｍ−１（ｐＮＤＭ）、ｃｔｘ−Ｍ−１５（ｐＣＴＸ）又はｎｄｍ−１＋ｃｔｘ−Ｍ−１５（ｐＮＤＭ＊／ｐＣＴＸ）をコードするプラスミドを内部にもつエシェリキア・コリＫ−１２を、λｃａｓ（薄い灰色バー）又はλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ（濃い灰色バー）で処理し、パネルＡに示されるスキームの通りにＴ７−Ｎ１Ｃ１（配列番号５７で表わされる）をコーティングしたプレートに播いた。バーは３回の独立した実験で計数される１ｍｌ当たりの生存ＣＰＦＵの数の平均及び標準偏差を示す。  図６Ｃ．抗生物質感受性エシェリキア・コリの富化  パネルＢに記載の各培養の生存コロニー（２０〜４８ＣＦＵ）をストレプトマイシン又はゲンタマイシンを含む又は含まないプレートに播種した。バーは、３回の独立した実験の、抗生物質のないプレートで増殖できるＣＦＵの総数のうちのストレプトマイシン又はゲンタマイシンを含むプレートで増殖できないＣＦＵとして記録したストレプトマイシン又はゲンタマイシン感受性細菌の％割合及び標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の発明者らはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて選択有利性を付与するとともに、遺伝子工学的手段として抗生物質に対する耐性又はいずれかの病原性を細菌に付与する特異的なＤＮＡを破壊する。近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは細菌の獲得免疫系として機能することが示されている（１６）。該システムの生体での役割は、外来ＤＮＡ又はＲＮＡを標的にすることによってファージによる攻撃及び望ましくないプラスミド複製から保護することである（１６〜１７）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ＣＲＩＳＰＲと呼ばれる独自のＤＮＡアレイ中の短い相同ＤＮＡ配列に基づいていずれのＤＮＡ分子も特異的に標的にするように合理的に設計できる（下記及び図１を参照）。ＣＲＩＳＰＲアレイの合理的な設計により、耐性決定因子をコードするいずれのＤＮＡ分子も標的可能になる。くわえて、もともとファージに対する防御機構として進化した該システムは、選ばれた溶菌性ファージから保護するように設計できる。これにより、本発明の発明者らは、細菌に有益である形質（すなわち、ファージ耐性を付与する遺伝子）を、薬剤耐性を失わせ、且つ耐性決定因子を削減するＤＮＡと遺伝的に結びつけることができる。この遺伝的な結びつきから、溶菌性ファージを選択仲介物質として用いることによって感受性亢進細菌集団が選択可能になる。いくつかの実施形態では、溶菌性ファージは、本発明の改変ＣＲＩＳＰＲアレイシステムの少なくとも１つのスペーサーと同一性を示す配列を含有するように改変される。そのような選択に使用される人工ファージは最終的には抗生物質感受性及びファージ耐性を結びつける。感受性亢進コンストラクトとともに溶菌性ファージに対する防御をもつ細菌が生存する一方で、他の細菌は溶菌性ファージ、具体的には本発明の発生した（ｅｎｇｅｎｄｅｒｅｄ）溶菌性ファージによって死滅させられることになる。組み込まれたコンストラクトは、既存の耐性遺伝子を能動的に完全消滅させ、且つこれらの遺伝子の病原体間の水平伝播を削減するよう設計される。感受性亢進構成要素がＣＲＩＳＰＲアレイであり、選択要素が溶菌性ファージである２つの要素を併せもつ本明細書で提案されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは薬剤耐性を失わせる遺伝的手段の構成要素のすべてを有する。
【００２５】
より具体的には、本発明は抗生物質耐性菌の新たに出現した脅威に対抗する、上記の至らない点を克服する特異的且つ効果的な技術を提供する。病原体を直接的に標的にするのに代わって、洗練された方法が本明細書において提供され、その方法は表面上又はヒトの生来の細菌叢中の病原体を感受性にし、特異的な感受性集団を富化し、よって結果的に感染患者における従来からの抗生物質の使用を可能にする。この技術では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、抗生物質に対する耐性を付与する特異的なＤＮＡを破壊し、同時に選択有利性を抗生物質感受性菌に付与するのに使用される。選択有利性は、未処理の細菌に対して選択することによる抗生物質感受性菌の集団の効率的な置換を可能にする。該方法は、処理した細菌を直接死滅させるのを目指すのではなく、むしろそれらの菌を抗生物質に対して感受性亢進し、未処理の細菌を死滅させることを目標にする点で従来のファージセラピーとは異なる。したがって、処理対するカウンターセレクションがない。選択有利性を利用することによって、処理の作用から逃れている細菌は選択因子によって死滅させられるので送達の効率が最大になる。この方法により、表面上又はヒト皮膚細菌叢中の病原体を感受性にし、同時にこれらの感受性亢進集団を富化することを発明者らは提案する。よって、これらの抗生物質感受性菌に感染した患者は、従来からの抗生物質で治療されることになるであろう。
【００２６】
したがって、本発明の第１の態様は少なくとも２つの要素又は構成要素を含むキット又はシステムに関する。第１の構成要素（ｉ）は少なくとも１つのプロトスペーサーを含む核酸配列を含む選択的構成要素である。第２の構成要素（ｉｉ）は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイを含む少なくとも１つの感受性亢進構成要素を含む。ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは細菌の病原性遺伝子を特異的に不活性化するように細菌の病原性遺伝子（細菌病原性遺伝子）内に含まれるプロトスペーサーを標的にすることが留意されるべきである。そのうえ、さらなる実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、（ｉ）の選択的構成要素を特異的に不活性化するように選択的構成要素内に含まれるプロトスペーサーを標的にする。より具体的な実施形態では、前記細菌の少なくとも１つの病原性遺伝子を標的にし、且つ非活性化するように、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの少なくとも１つのスペーサーは、本明細書において「プロトスペーサー」と呼ばれる、細菌の少なくとも１つの病原性遺伝子（又は前記遺伝子の一部）内に含まれる核酸配列に十分に相補的でありうる。
【００２７】
本明細書において「選択構成要素」は、細菌細胞の特有な集団、具体的には、本発明のｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲシステムをもつ細胞の集団、より具体的には、本発明の感受性亢進構成要素をもつ細菌細胞の集団を選択（ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ）、選択（ｃｈｏｏｓｉｎｇ）、選択（ｅｌｅｃｔｉｎｇ）、又は富化することを可能にし、それを促進し、それをもたらし、且つそれに作用する本発明のキットの要素又は構成要素を指す。選択的構成要素は、例えば、選ばれた所望の集団（具体的な実施形態では、本発明の感受性亢進構成要素をもついずれの集団又は細胞）だけが生存することを可能にし、且つ許容する条件をかけることによって所望の集団に選択有利性を提供する。
【００２８】
本明細書において「感受性亢進構成要素」は、ある物質、例えば抗生物質に対する前記要素又は構成要素をもつ生物の感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）若しくは感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の増加及び／又は耐性の減少を可能にする本発明のキットの要素を指す。より具体的な実施形態では、病原性細菌の遺伝子、例えば抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子又は毒性化合物をコードする遺伝子を特異的に標的にし、不活化及び／又は破壊することによって、本発明の感受性亢進構成要素は細胞の感受性亢進及びその耐性がより少なく感受性がより多い細胞への転換を可能にする。ある実施形態では、「標的にすること」は、要素若しくは対象体又は要素若しくは対象体の群を標的になること、それ又はそれらを選択（ｅｌｅｃｔ）又は選択（ｃｈｏｏｓｅ）して作用を受け、選択（ｅｌｅｃｔｅｄ）又は選択（ｃｈｏｓｅｎ）された対象体又は元素が攻撃、除去、分解、不活化、又は破壊されることとして理解されるべきである。
【００２９】
そのうえ、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの少なくとも１つのスペーサーは、選択的構成要素を標的にし、且つ不活性化するように、本発明のキットの選択的構成要素内に含まれる核酸配列（又はプロトスペーサー）に十分に相補的でありうる。「不活性化する」とは、選択的構成要素の作用を遅延させる、減少させる、阻害する、削減する、減衰させる、又は停止することを意味する。そのような不活性化は、前記感受性亢進要素を含む細菌を本発明のキットの選択的構成要素に対して非感受性にし、且つ耐性をもたせることが留意されるべきである。本明細書において十分な相補性とは、約１０％〜１００％のいずれの相補性、より具体的には、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％の相補性を示すことが理解されるべきである。
【００３０】
ある実施形態では、「相補性」は、それぞれ鍵と鍵穴原則に従う２つの構造体間の関係を指す。本質的に、相補性は２つのＤＮＡ又はＲＮＡ配列間で共有される特性であるのでＤＮＡ複製及び転写の基本原則であり、それらの配列が互いに逆平行の並べられたとき、配列中各のそれぞれの位置のヌクレオチド塩基は相補的であることになる（例えば、Ａ及びＴ又はＵ、Ｃ及びＧ）。
【００３１】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲコンストラクトを用いて細菌の遺伝子を下方制御する（例えば、削減する）キット及び方法に関する。より具体的には、本発明のキットの感受性亢進構成要素をもつ抗生物質感受性菌を含む細菌集団を富化するキット及び方法を本発明は提供する。
【００３２】
本発明の実施形態の少なくとも１つを詳細に説明する前に、本発明は必ずしも以下の説明に記載される詳細又は実施例で例示される詳細への適用に限定されないことが理解されるべきである。本発明は他の実施形態が可能であり、且つさまざまなやり方で実行又は実施されることができる。
【００３３】
本内容に関連して「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」（単数形は「細菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」）という用語は、いずれの種類の単細胞の微生物を指す。本明細書において「細菌」及び「微生物」という用語は互換可能である。本明細書においてこの用語は、その基本形状、具体的には、球形（球菌）、棒状（桿菌）、らせん状（らせん菌）、コンマ形（ビブリオ属）、又はコークスクリュー状（スピロヘータ属）に準じて一般的クラスに属する細菌、及び単細胞、対、鎖、又は群体として存在する細菌を包含する。
【００３４】
本明細書において「細菌」という用語は、いずれの単細胞又は単細胞の塊若しくは凝集体として存在する原核微生物を指すことが留意されるべきである。より具体的な実施形態では、「細菌」という用語は、具体的にグラム陽性生物、グラム陰性生物、又は抗酸生物を指す。グラム陽性菌は細胞鑑別のグラム染色法に用いられるクリスタルバイオレット染色剤を保持すると理解することができ、したがって顕微鏡下で紫色であるように見える。グラム陰性菌はクリスタルバイオレットを保持せず、確かな同定を可能にする。言い換えれば、本明細書において「細菌」という用語は、細胞膜外側細胞壁に厚いペプチドグリカン層をもつ細菌（グラム陽性）、及び内側細胞質細胞膜と細胞外膜との間に挟まれているその細胞壁の薄いペプチドグリカン層をもつ細菌（グラム陰性）に適用される。さらにこの用語は、厚いペプチドグリカン層の存在に起因してグラム陽性に染色されるが外側細胞膜ももつため、一層（ｍｏｎｏｄｅｒｍ）（グラム陽性）と二層（ｄｉｄｅｒｍ）（グラム陰性）細菌の過度期にある中間体として提案されている、デイノコッカス属などのいくつかの細菌に適用される。マイコバクテリウム属といった抗酸生物は、グラム染色法などの従来の方法で染色されないミコール酸と呼ばれる脂質物質を大量に細胞壁内に含有する。
【００３５】
上述のように、本発明のキットは、少なくとも２つの構成要素、感受性亢進構成要素をもつ細菌集団、つまり抗生物質に対して感受性がある集団又は耐性が減少若しくは削減された集団である細菌集団の富化及び選択を可能にする選択的構成要素を含みうる。
【００３６】
本発明の選択構成要素は、病原性細菌の遺伝子内に含まれる少なくとも１つのプロトスペーサーに少なくとも最小限の同一性（具体的には約７０％以上）示す少なくとも１つのプロトスペーサーをもつ若しくは含む、且つ／又は本発明の感受性亢進構成要素内に含まれる少なくとも１つのスペーサーによって認識されるいずれの遺伝要素又はベクターでありうることが理解されるべきである。そのような選択的構成要素は、細菌細胞を害しうる、死滅させうる、又は削減しうる毒性要素又はタンパク質をさらにコードするプラスミドでありうる。より具体的に、その必須要素を不活化すること、そうでなければ細菌の増殖のための必須構成要素を破壊することによって細菌を死滅させる遺伝子をコードするＤＮＡ注入エンティティ、例えば、そのような遺伝子をコードし、ファージ産物に由来する特殊なタンパク質機構によって注入されるＤＮＡであることもできる。
【００３７】
さらにいくつかの具体的な実施形態では、本発明のキットで用いられる選択的構成要素は少なくとも１つの溶菌性バクテリオファージを含みうる。より具体的な実施形態では、そのようなバクテリオファージは感受性亢進構成要素のスペーサーの標的として機能を果たす少なくとも１つのプロトスペーサーを含む核酸配列を含みうる。
【００３８】
バクテリオファージという用語は細菌などの原核生物に感染し複製するウイルスを意味する。「バクテリオファージ」という用語は「ファージ」という用語と同義語であることが留意されるべきである。ファージはＤＮＡ又はＲＮＡゲノムを被包するタンパク質からなり、ほんの少数の遺伝子又は数百個の遺伝子をコードして、それによって比較的単純又は精巧な構造をもつビリオンを作りうる。よって、バクテリオファージは生物圏で最も一般的で且つ多様なエンティティの１つである。ファージは、形態及び核酸のタイプ（ＤＮＡ又はＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖、線状又は環状）を考慮して国際ウイルス命名委員会（ＩＣＴＶ）に従って分類される。これまでに細菌及び／又はアーキア（以前は古細菌として分類されていた原核生物のドメイン）に感染する約１９のファージファミリーが認識されている。多くのバクテリオファージは特定の属又は種又は株の細胞に特異的である。
【００３９】
上で述べたように、ある具体的且つ非限定的な実施形態では、本発明のキットの選択構成要素として用いられるバクテリオファージは溶菌性バクテリオファージでありうる。溶菌性バクテリオファージは、溶原経路に入るよりむしろ、溶菌サイクルの完了によって溶菌経路に進むものである。溶菌性バクテリオファージは細胞膜の溶解、細胞の破壊、及び他の細胞に感染できる子孫バクテリオファージ粒子の放出につながるウイルス複製を経る。
【００４０】
ある実施形態では、本発明のキットの選択的構成要素の溶菌性バクテリオファージは、細菌病原性遺伝子内に含まれる少なくとも１つの核酸配列に少なくとも７０％の同一性をもつ少なくとも１つのプロトスペーサーを含む遺伝子改変バクテリオファージでありうる。より具体的な実施形態では、そのようなバクテリオファージは、細菌病原性遺伝子内に含まれる少なくとも１つの核酸配列に約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性をもつ少なくとも１つのプロトスペーサーを含みうる。
【００４１】
さらなる実施形態では、感受性亢進構成要素は、少なくとも１つのｃａｓタンパク質をコードする組換え核酸配列を含む少なくとも１つの組み換えベクター含みうる。ベクターは少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲアレイの核酸配列をさらに含みうることが留意されるべきである。そのようなベクターは、ある実施形態では、本明細書において記載されているＣＲＩＳＰＲシステムを含むいずれのプラスミド、コンストラクト、ファージミド、又は発生した（ｅｎｇｅｎｄｅｒｅｄ）バクテリオファージでありうる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡ」、「組換え核酸配列」、又は「組換え遺伝子」という用語は、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムの１つをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。
【００４３】
よって、いくつかの実施形態では、本発明の感受性亢進要素はｃａｓタンパク質及び本発明の少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲアレイを含むいずれのベクターでありうる。本明細書において「ベクター」又は「媒体」は、プラスミドなどのベクター、ファージミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡ断片、及び組み込みＤＮＡ断片の宿主ゲノムへの組み込みを可能にする他の媒体又は組み込まれない遺伝要素の発現を可能にする他の媒体を包含する。典型的には、ベクターは、所望の核酸配列、及び好適な宿主細胞で認識され、所望のスペーサーの翻訳をもたらす作動可能に連結された遺伝子調節要素を含有する自己複製ＤＮＡ又はＲＮＡコンストラクトである。一般に、遺伝子調節要素は、原核生物のプロモーター系又は真核生物のプロモーター発現調節系を含むことができる。そのような系は、転写プロモーター、ＲＮＡ発現のレベルを上げる転写エンハンサーを典型的に含む。ベクターは通常、ベクターが宿主細胞に依存せずに複製することを可能にする複製起点を含有する。さらにいくつかの代替的な実施例では、本発明で用いられる発現ベクターは、本発明の所望のＣＲＩＳＰＲシステムの細菌染色体への組み込みに必要な要素を含んでもよい。
【００４４】
したがって、制御及び調節要素という用語は、プロモーター、ターミネーター、及び他の発現制御要素を含む。そのような調節要素はＧｏｅｄｄｅｌ；［Ｇｏｅｄｄｅｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．  （１９９０）］に記載されている。例えば、それに作動可能に連結したときＤＮＡ配列の発現を制御する多様な発現制御配列のいずれかが、これらのベクターに用いられて本発明の方法を用いる所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をいて発現しうる。
【００４５】
ベクターは、適切な制限酵素切断部位、ベクター含有細胞選択用の抗生物質に対する耐性マーカー又は他のマーカーをさらに含みうる。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形であるが、等価な機能を果たし、且つ当該技術分野において公知である又は公知になるベクターの他の形が本明細書での使用に適応する。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８５  ａｎｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．及びＲｏｄｒｉｑｕｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ（１９８８）を参照されたく、該文献は参照により本願明細書に組み込まれる。
【００４６】
さらにいくつかの他の実施形態では、本発明の感受性亢進要素は本発明のＣＲＩＳＰＲシステムを含むファージミドでありうる。本明細書において「ファージミド」はファージパッケージング部位をもつように改変されたプラスミドであり、ファージタンパク質もコードしうる。ファージミドは一般に、少なくともファージパッケージング部位及び複製起点（ｏｒｉ）を含みうる。いくつかの実施形態では、本開示のファージミドは、ファージパッケージング部位及び／又はファージパッケージングに関与するタンパク質をさらにコードしうる。
【００４７】
さらになお、ある実施形態では、本発明の感受性亢進要素は遺伝子改変バクテリオファージでありうる。より具体的には、そのような遺伝子改変バクテリオファージは、前記溶菌性バクテリオファージ内に含まれる少なくとも１つの核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー及び前記少なくとも１つの病原性遺伝子内に含まれる核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー含みうる。そのように、本発明の感受性亢進構成要素は選択的構成要素として機能する溶菌性ファージ及び目的の病原性遺伝子の両方を標的にし、且つ／又は不活性化しうる。
【００４８】
より具体的に、本発明の発明者らは、溶菌性バクテリオファージ（選択的構成要素として）又は溶原性バクテリオファージ（感受性亢進構成要素として）、具体的には温度感受性溶原性バクテリオファージの使用を企図する。本明細書において「溶原性ファージ」は、特定の温度（例えば、３６℃以下、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５℃）ではファージは溶原性に有利に働く一方で、より高い温度ではファージの溶菌生産（ｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）が誘導される具体的な実施形態に関する。本明細書において上で述べたように、溶菌性ファージは溶菌サイクルを利用するファージである。溶菌サイクルは結果として感染した細胞及びその膜の崩壊をもたらす。溶菌性ファージサイクルと溶原性ファージサイクルの重要な違いは、溶菌性ファージでは、ウイルスＤＮＡは細菌細胞内で別個の分子として存在し、宿主細菌のＤＮＡとは別に複製することである。溶原性ファージサイクル中のウイルスＤＮＡの位置は宿主細胞内であり、したがって、どちらの場合も、ウイルス／ファージは宿主ＤＮＡ機構を利用して複製するが、溶菌性ファージサイクルではファージは宿主細胞とは別個の浮遊した分子である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、選択構成要素又は感受性亢進構成要素のいずれかとして本発明のキットに使用されるファージは、病原性タイプの細菌若しくは混合細菌集団中に病原性及び非病原性メンバーを有することができるタイプの細菌を選択的に感染するタイプのバクテリオファージ又は混合細菌集団中のさまざまなタイプの細菌の感染できるタイプのバクテリオファージでありうる。そのような混合細菌集団は病院環境表面に見られる。重要なことには、エンテロコッカス・フェシウム、スタフィロコッカス・アウレウス、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、及びエンテロバクター属の複数種（本明細書ではＥＳＫＡＰＥ生物又は細菌とも呼ばれる）などの少数の耐性病原体が、先進国及び開発途上国でともに最も大きい割合を占める院内感染の原因である。それらの病原体は大部分の院内感染を引き起こし、事実上抗生物質の効果を免れている（１８、１９）。よって、これらの種に対する効率的且つ有効な治療又はそれらの種のわずか少数に対するものでさえも、耐性病原体感染に起因する死亡及び経済的負担を大きく減らしうる。
【００５０】
よって、いくつかの実施形態では、本発明のキットに使用されるファージは、特定の細菌属、細菌種、又は細菌株に特異的なバクテリオファージでありうる。ある実施形態では、ファージは、エシェリキア・コリ、ストレプトコッカス属の複数の種、スタフィロコッカス属の複数の種、クロストリジウム属の複数の種、バチルス属の複数の種、サルモネラ属の複数の種、ヘリコバクター属の複数の種、ナイセリア属の複数の種（具体的には、ナイセリア・ゴノレア及びナイセリア・メニンギティディス）、又はシュードモナス・エルギノーサの少なくとも１つのメンバーでありうる細菌株に特異的でありうる。
【００５１】
このタイプのファージの非限定的な例はλｇｔ１１ファージでありうる。そのｃＩ遺伝子がｃＩ８５７対立遺伝子に変更された他のλファージは類似の増殖パターンを呈するのでそれらも企図される。好ましくは、ファージは少なくとも１ｋｂの外来ＤＮＡ、より好ましくは、少なくとも５  ｋｂの外来ＤＮＡの安定した挿入を許容するように選択される。別の実施形態によれば、ファージは最少遺伝子をもつ欠失変異体を含み、効率的に溶原化できる。
【００５２】
さらなる細菌に感染できるファージを同定することは当業者の範囲内である。細菌の感染に用いるファージはグラム陽性、グラム陰性菌、又は抗酸生物などに組み込むことができうる。
【００５３】
上で述べたように、いくつかの実施形態では、本発明のシステム又はキットの選択要素として機能する溶菌性ファージは遺伝子改変ファージでありうる。そのようなファージはプロトスペーサーである少なくとも１つの核酸配列を含むように遺伝子操作されうる。より具体的な実施形態では、そのようなプロトスペーサーは、少なくとも１つのプロトスペーサー、又は言い換えれば、細菌の病原性遺伝子又はそのいずれの断片、一部、若しくは部分内に含まれる核酸配列と少なくとも７０％の同一性を示しうる。
【００５４】
より具体的な実施形態では、本発明の感受性亢進構成要素に含まれるベクターは、（選択的構成要素として機能する）溶菌性バクテリオファージ内に含まれる核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー及び前記細菌病原性遺伝子内に含まれる核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーを含む遺伝子改変溶原性バクテリオファージでありうる。
【００５５】
さらに具体的な実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの少なくとも１つのスペーサーは、本発明の溶菌性遺伝子改変バクテリオファージ（選択的構成要素）内及び細菌の標的病原性遺伝子内にも含まれるプロトスペーサーである核酸配列に十分に相補的であるべきである。そのように、本発明の感受性亢進構成要素のＣＲＩＳＰＲアレイは溶菌性ファージ及び標的病原性遺伝子の両方を標的にし、不活性化する。
【００５６】
さらに他の具体的な実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによって標的にされる細菌の標的病原性遺伝子又はその遺伝子から転写されるいずれのＲＮＡは、細菌の内在性遺伝子でありうる。本明細書において「内在性遺伝子」は特有の生物、今回の場合では細菌に由来するＤＮＡを指し、したがって、その染色体ＤＮＡの一部でありうることが留意されるべきである。
【００５７】
他の実施形態によれば、細菌の標的病原性遺伝子はエピクロモソーマル（ｅｐｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）でありうる。いくつかの特定且つ非限定的な実施形態では、そのような非内在性遺伝子は水平伝播によって獲得されうる。本明細書において「エピクロモソーマル遺伝子」は、染色体外のＤＮＡとして独立して複製できるか、又はある実施形態では、宿主染色体に組み込まれうるかのいずれかである、細菌の遺伝物質、具体的にはＤＮＡのユニット、例えばプラスミドに関する。
【００５８】
いくつかの具体的な実施形態では、細菌の少なくとも１つの標的病原性遺伝子は病原性因子又は毒素をコードする遺伝子であることよって前記細菌を病原性にする。本明細書において「病原性の」という用語は、細菌性疾患又は感染症を引き起こすことができる細菌を意味する。いくつかの実施形態では病原性菌は、免疫系機能が低下していない、ヒト対象、又は例えば限定されないが、哺乳類、齧歯動物、鳥、魚、爬虫類、昆虫、若しくは植物を含む他のいずれの生物で細菌性疾患又は感染症を引き起こすものである。典型的には、病原性菌は「病原性因子」と呼ばれるある種特定のタンパク質を産生するようである。病原性菌は、１つ以上の健康な宿主の組織に正常にコロニーを作り、一般に、病原性因子を発現しない、又は病原性菌に比べて相対的に少量の病原性因子を発現するので、普通の治療環境下で死滅することが望ましくない細菌と識別される。上で論じたように、本開示はいくつかの実施形態では、病原性因子をコードする細菌のＤＮＡ配列を対象とする標的ＲＮＡをコードする配列を含むＣＲＩＳＰＲシステムを含む。そのような病原性因子としては、病原性の付着、保菌、浸潤、バイオフィルム形成に関与する細菌タンパク質、又は免疫応答阻害物質、又は毒素が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。病原性遺伝子の例としては、毒素（例えば、志賀毒素及びコレラ毒素）、溶血素、線毛及び非線毛（ａｆｉｍｂｒｉａｌ）アドヘシン、プロテアーゼ、リパーゼ、エンドヌクレアーゼ、エンドトキシン及びエクソトキシン、細胞毒性因子、ミクロシン及びコリシン、並びに当該技術分野において同定されているものをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。これら及び他の病原性因子をコードする多岐にわたる細菌タイプの細菌遺伝子の配列は当技術分野において公知である。病原性因子は、細菌染色体上、又は細菌内のプラスミド上、又は両方にコードされることができる。いくつかの実施形態では、病原性因子はスーパー抗原エンテロトキシン遺伝子などの細菌のスーパー抗原遺伝子によってコードされうる。その非限定的な例の１つはスタフィロコッカス・アウレウスＳｅｋ遺伝子である。スタフィロコッカス・アウレウスのさらなる病原性因子としては、α溶血素、β溶血素、γ溶血素、ロイコシジン、パントン・バレンタイン型ロイコシジン（ＰＶＬ）などの細胞溶解毒素；毒素性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）などのエクソトキシン；ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣｎ、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ＳＥＧ、ＳＥＨ、及びＳＥＩなどのエンテロトキシン；並びにＥＴＡ及びＥＴＢなどの表皮剥脱毒素が挙げられるが、これらに限定されない。他のタイプの細菌によって発現されるこれらの毒素すべてのホモログも病原性遺伝子標的として本明細書において企図される。
【００５９】
より具体的に、本明細書において「毒素」という用語は、細菌によって産生される物質を意味し、エクソトキシン又はエンドトキシンのいずれかに分類できる。エクソトキシンは産生され、能動的に分泌され、エンドトキシンは細菌の一部に残る。通常、エンドトキシンは細胞外膜の一部であり、細菌が免疫系によって死滅するまで放出されない。
【００６０】
本発明のいくつかの具体的且つ非限定的な実施形態によれば、細菌の病原性遺伝子は、ａｃｔＡ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００３２１０．１）、Ｔｅｍ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００９９８０）、Ｓｈｖ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００９６４８）、ｏｘａ−１（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＷ＿１３９４４０）、ｏｘａ−７（例としてジェンバンクアクセッション番号：Ｘ７５５６２）、ｐｓｅ−４（例としてジェンバンクアクセッション番号：Ｊ０５１６２）、ｃｔｘ−ｍ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０１０８７０）、ａｎｔ（３”）−Ｉａ（ａａｄＡ１）（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＤＱ４８９７１７）、ａｎｔ（２”）−Ｉａ（ａａｄＢ）ｂ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＤＱ１７６４５０）、ａａｃ（３）−ＩＩａ（ａａｃＣ２）（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０１０８８６）、ａａｃ（３）−ＩＶ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＤＱ２４１３８０）、ａｐｈ（３’）−Ｉａ（ａｐｈＡ１）（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００７６８２）、ａｐｈ（３’）−ＩＩａ（ａｐｈＡ２）（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０１０１７０）、ｔｅｔ（Ａ）（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００５３２７）、ｔｅｔ（Ｂ）（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＦＪ４１１０７６）、ｔｅｔ（Ｃ）（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０１０５５８）、ｔｅｔ（Ｄ）（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０１０５５８）、ｔｅｔ（Ｅ）（例としてジェンバンクアクセッション番号：Ｍ３４９３３）、ｔｅｔ（Ｙ）（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＡＢ０８９６０８）、ｃａｔＩ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００５７７３）、ｃａｔＩＩ  ＮＣ＿０１０１１９、ｃａｔＩＩＩ（例としてジェンバンクアクセッション番号：Ｘ０７８４８）、ｆｌｏＲ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００９１４０）、ｄｈｆｒＩ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００２５２５）、ｄｈｆｒＶ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０１０４８８）、ｄｈｆｒＶＩＩ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＤＱ３８８１２６）、ｄｈｆｒＩＸ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０１０４１０）、ｄｈｆｒＸＩＩＩ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０００９６２）、ｄｈｆｒＸＶ（例としてジェンバンクアクセッション番号：Ｚ８３３１１）、ｓｕＩＩ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０００９１３）、ｓｕＩＩＩ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０００９１３）、ｉｎｔｅｇｒｏｎ  ｃｌａｓｓ  １  ３’−ＣＳ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＡＪ８６７８１２）、ｖａｔ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿０１１７４２）、ｖａｔＣ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ０１５６２８）、ｖａｔＤ（例としてジェンバンクアクセッション番号：Ａ���３６８３０２）、ｖａｔＥ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００４５６６）、ｖｇａ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ１１７２５９）、ｖｇｂ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ１１７２５８）、及びｖｇｂＢ（例としてジェンバンクアクセッション番号：ＡＦ０１５６２８）からなる群より選択されうる。
【００６１】
上で述べたように、本発明のキットは、いずれの病原性細菌遺伝子、例えば、耐性を与えるいずれの遺伝子又は言い換えれば、抗菌剤に対する細菌の感受性を阻害、低減、抑制、又は減衰するいずれの遺伝子も特異的に標的にしうる。本明細書において「抗菌剤」という用語は、（殺菌性又は静菌性いずれかの）抗菌活性をもついずれのエンティティ、すなわち増殖を阻害し、且つ／又は細菌、例えばグラム陽性菌及びグラム陰性菌を死滅させる能力をもついずれのエンティティを指す。抗菌剤は、抗菌剤が不在の場合と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は７０％超え、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、又は３０％と７０％以上の間のいずれの整数の％の、増殖の阻害又は細菌の生存率の減少をもたらすいずれの薬剤でありうる。別の言い方をすれば、抗菌剤は、細菌などの微生物細胞の集団を、抗菌剤が不在の場合と比較して、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は７０％超え、又は３０％と７０％の間のいずれの整数の％だけ減少させるいずれの薬剤である。１つの実施形態では、抗菌剤は細菌細胞を特異的に標的にする薬剤である。別の実施形態では、抗菌剤は細菌細胞に特異的に発現される経路を変える（すなわち、阻害又は活性化又は増加する）。抗菌剤は、いずれの化学薬品、ペプチド（すなわち抗微生物ペプチド）、ペプチド模倣体、エンティティ若しくは部分、又はその混成物の類似体を含むことができ、例えば限定されないが、人工及び天然の非タンパク質様のエンティティが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗菌剤は化学的部分をもつ低分子である。例えば、化学的部分としては、非置換又は置換されたアルキル、マクロライド、レプトマイシン、及びその関連天然産物若しくはその類似体などの芳香族部分又はヘテロシクリル部分が挙げられる。抗菌剤は、所望の活性及び／又は特性をもつことが知られているいずれのエンティティであることができ、多様な化合物のライブラリから選択することができる。
【００６２】
上で述べたように、本発明のキット、システム、及び方法の感受性亢進要素は、抗生物質に対する耐性を与えるいずれの遺伝子も標的にしうる。本明細書で使用される場合、「耐性」という用語は、細菌細胞集団が特異的な抗生物質化合物に対して１００％耐性があることを示唆することを意味せず、抗生物質又はいずれのその誘導体に寛容である細菌を含む。より具体的に、「細菌耐性遺伝子」という用語は、約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％の抗生物質化合物からの保護を付与し、それによって前記抗生物質化合物に対するその感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）及び感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を失わせる遺伝子を指す。
【００６３】
よって、いくつかの実施形態では、細菌病原性遺伝子は、本明細書において上に記載されている抗菌化合物のいずれかに対する耐性を与えるいずれの遺伝子でありうる。
【００６４】
さらになお、他の実施形態では、細菌の少なくとも１つの標的病原性遺伝子は抗生物質耐性因子をコードする遺伝子でありうる。
【００６５】
本明細書において「抗生物質耐性遺伝子」という句は、例えば前記抗生物質化合物を破壊する酵素をコードすることによって、能動的に細胞外に出して抗生物質化合物が微生物に入るのを防ぐ表面タンパク質をコードすることによって、又は抗生物質の標的の変異形であることで抗生物質機能を阻止することによって、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を指す。
【００６６】
多様な細菌がもつ抗生物質耐性遺伝子は当該技術分野において公知であり、所望の場合、いずれの特定の細菌にお抗生物質耐性遺伝子の配列は決定できる。ある非限定的な実施形態では、本開示は、抗生物質耐性遺伝子を含む細菌のＤＮＡ配列を対象とする標的ＲＮＡをコードするスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲシステムを含む。いくつかの実施形態では、耐性遺伝子はペニシリン類の抗生物質の狭域ベータラクタム抗生物質に対する耐性を付与する。その他の実施形態では、耐性遺伝子は、メチシリン（例えば、メチシリン若しくはオキサシリン）、又はフルクロキサシリン、又はジクロキサシリン、又はこれらの抗生物質のいくつか若しくは全部に対する耐性を付与する。よって、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、日常会話的にもメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）として知られるようになっている菌中の抗生物質耐性遺伝子を選択的に標的にするのに好適である。ＭＲＳＡは臨床現場において、大部分又はすべてのペニシリンに対して非感受性であるか、又は感受性が低いスタフィロコッカス・アウレウスの株を指す。その他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムはバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＶＲＳＡ）におけるバンコマイシン耐性を標的にするのに好適である。ある実施形態では、バンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウスは、リネゾリド（ＺＹＶＯＸ（商標））、ダプトマイシン（ＣＵＢＩＣＩＮ（商標））、及びキヌプリスチン／ダルホプリスチン（ＳＹＥＲＣＩＤ（商標））の少なくとも１つに対する耐性もありうる。
【００６７】
さらなる抗生物質耐性遺伝子としては、ホスホマイシン耐性遺伝子ｆｏｓＢ、テトラサイクリン耐性遺伝子ｔｅｔＭ、カナマイシンヌクレオチド転移酵素ａａｄＤ、二機能性アミノグリコシド修飾酵素遺伝子ａａｃＡ−ａｐｈＤ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｃａｔ、ムピロシン耐性遺伝子ｉｌｅＳ２、バンコマイシン耐性遺伝子ｖａｎＸ、ｖａｎＲ、ｖａｎＨ、ｖｒａＥ、ｖｒａＤ、メチシリン耐性因子ｆｅｍＡ、ｆｍｔＡ、ｍｅｃｌ、ストレプトマイシンアデニリルトランスフェラーゼｓｐｃｌ、ｓｐｃ２、ａｎｔｌ、ａｎｔ２、ペクチノマイシンアデニルトランスフェラーゼｓｐｄ、ａｎｔ９、ａａｄＡ２、及び他のいずれの耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
いくつかの具体的な実施形態では、病原性遺伝子は、いずれのβ−ラクタム抗生物質化合に対する耐性を付与する遺伝子をコードする遺伝子でありうる。より具体的な実施形態では、そのような遺伝子は少なくとも１つのβ−ラクタマーゼコードしうる。本明細書で使用される場合、「β−ラクタマーゼ」という用語は、（β−ラクタム抗生物質などの）β−ラクタム含有分子又はそれらの誘導体などのβ−ラクタマーゼ基質の切断を触媒できるタンパク質を指す。
【００６９】
β−ラクタマーゼはそのアミノ酸配列に基づいて４つの分子クラス（Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）に分けられる。クラスＡ酵素は分子量が約２９ｋＤａであり、ペニシリンを優先的に加水分解する。クラスＡ酵素の例としては、ＲＴＥＭ及びスタフィロコッカス・アウレウスのβ−ラクタマーゼが挙げられる。クラスＢ酵素としては、他のクラスのβ−ラクタマーゼと比べて幅広い基質プロファイルをもつ金属酵素が挙げられる。クラスＣ酵素は分子量が約３９ｋＤａであり、例えば、グラム陰性菌の染色体セファロスポリナーゼが挙げられ、該酵素は従来からのさまざまな抗生物質及び新設計の抗生物質の両方に対するグラム陰性菌の耐性の原因である。くわえて、クラスＣ酵素には、Ｐ９９エンテロバクター・クロアカエのラクタマーゼも含まれ、該酵素は合衆国の病院においてこのエンテロバクター属の複数種が最も広く蔓延している細菌性因子の１つになっている原因である。クラスＤ酵素はセリン加水分解酵素であり、独自の基質プロファイルを示す。
【００７０】
上で述べたように、より具体的な実施形態では、本発明のキット及びシステムは、いずれかのβ−ラクタム抗生物質に対する耐性を付与しうるいずれの遺伝子も対象としうる。本明細書において「β−ラクタム」又は「β−ラクタム抗生物質」という用語は、その分子構造にβ−ラクタム環を含有するいずれの抗生物質を指す。
【００７１】
β−ラクタム抗生物質は、天然及び半合成ペニシリン、クラブラン酸、カルバペネム、ペニシリン誘導体（ペナム系）、セファロスポリン（セフェム系）、セファマイシン、及びモノバクタムなどのさまざまなクラスを含む抗生物質の幅広いグループであり、すなわち、その分子構造にβ−ラクタム環を含有するいずれの抗生物質である。β−ラクタム抗生物質は最も一般的に使用されている抗生物質グループである。厳密には抗生物質ではないが、多くの場合β−ラクタマーゼ阻害剤がこのグループに包含される。
【００７２】
β−ラクタム抗生物質は、新生ペプチドグリカン層の前駆体ＮＡＭ／ＮＡＧ−ペプチドサブユニット上のＤ−アラニル−Ｄ−アラニン末端アミノ酸残基の類似体である。β−ラクタム抗生物質とＤ−アラニル−Ｄ−アラニンとの構造的類似性が、新生ペプチドグリカン層の最終的な架橋（ペプチド転移）を妨げ、細胞壁合成を中断させる。
【００７３】
正常な状況では、ペプチドグリカン前駆体は細菌細胞壁を再構築するよう信号を送り、結果として自己溶解性細胞壁加水分解酵素の活性化の引き金となる。β−ラクタムによる架橋の阻害はペプチドグリカン前駆体の集積を生じさせ、それが新規のペプチドグリカンを産生することなく自己溶解性加水分解酵素による既存のペプチドグリカンの消化を誘発する。結果として、β−ラクタム抗生物質の殺菌作用がさらに高められる。
【００７４】
一般に、β−ラクタムはそのコア環構造に従って分類され、グループ分けされる。各グループはさまざまなカテゴリーに分けられうる。「ペナム系」という用語は、ペニシリン抗生物質のメンバーの中心となる骨組み、すなわち、チアゾリジン環を含有するβ−ラクタムを記述するのに使用される。ペニシリンは五員環についたβ−ラクタム環を含有し、環の１つの原子が硫黄であり、環は完全に飽和している。ペニシリンとしては、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリン、及びオキサシリンなどの狭域ペニシリンが挙げられうる。狭域ペニシリナーゼ耐性ペニシリンとしては、メチシリン、ジクロキサシリン、及びフルクロキサシリンが挙げられる。狭域β−ラクタマーゼ耐性ペニシリンとしてはテモシリンが挙げられうる。中程度のスペクトラムのペニシリンとしては、例えば、アモキシシリン及びアンピシリンが挙げられる。基質特異性拡張型ペニシリンとしては、アモキシシリン・クラブラン酸カリウム合剤（アモキシシリン＋クラブラン酸）が挙げられる。そして最後に、ペニシリングループには、基質特異性拡張型ペニシリン、例えば、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、及びピペラシリンも含まれる。
【００７５】
このクラスの他のメンバーとしては、ピバンピシリン、ヘタシリン、バカンピシリン、メタンピシリン、タランピシリン、エピシリン、カルベニシリン、カリンダシリン、チカルシリン、アズロシリン、ピペラシリン、メズロシリン、メシリナム、ピブメシリナム、スルベニシリン、クロメトシリン、プロカインベンジルペニシリン、アジドシリン、ペナメシリン、プロピシリン、フェネチシリン、クロキサシリン、及びナフシリンが挙げられる。
【００７６】
ピロリジン環を含有するβ−ラクタムはカルバペネムと呼ばれる。カルバペネムは飽和カルバペネムであるβ−ラクタム化合物である。カルバペネムは主に、カルバペネム抗生物質合成途中の生合成中間体として存在する。
【００７７】
カルバペネムはβ−ラクタマーゼに対する耐性を高める構造をもち、したがって最も広いスペクトラムのβ−ラクタム抗生物質とみなされている。カルバペネムは構造的にペニシリンに非常に類似するが、その構造の１位の硫黄原子が炭素原子で置換されており、故にグループの名前がカルバペネムである。カルバペネム抗生物質はもともと、天然由来のストレプトマイセス・カトレア生成物であるチエナマイシから得られた。カルバペネムグループには、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、及びＰＺ−６０１が含まれる。
【００７８】
２、３−ジヒドロチアゾール環を含有するβ−ラクタムはペネム系と呼ばれる。ペネム系は構造がカルバペネムに類似している。しかし、ペネム系が硫黄をもつところに、カルバペネムは別の炭素をもつ。天然のペネム系はなく、すべて合成的に作られる。ペネム系の例はファロペネムである。
【００７９】
３、６−ジヒドロ−２Ｈ−１、３−チアジン環を含有するβ−ラクタムはセフェム系と呼ばれる。セフェム系はβ−ラクタム抗生物質のサブグループであり、セファロスポリン及びセファマイシンを包含する。セファロスポリンは基質特異性拡張型半合成抗生物質であり、７−アミノセファロスポラン酸を共通してもつ。第一世代セファロスポリンはやはり中程度のスペクトラムとみなされ、例としてセファレキシン、セファロチン、及びセファゾリンが挙げられる。抗ヘモフィルス属活性を含む中程度のスペクトラムをもっていると考えられている第二世代セファロスポリンとしては、セファクロル、セフロキシム、及びセファマンドールが挙げられうる。抗嫌気性菌活性を含む中程度のスペクトラムを示す第二世代セファマイシンとしては、セフォテタン及びセフォキシチンが挙げられる。広域スペクトラムの活性をもつとみなされる第三世代セファロスポリンとしては、セフォタキシム及びセフポドキシムが挙げられる。
【００８０】
最後に、グラム陽菌及びβ−ラクタマーゼ安定性の対する活性が増強された、広域スペクトラムとみなされている第四世代セファロスポリンとしては、セフェピム及びセフピロムが挙げられる。セファロスポリン類としてはさらに、セファドロキシル、セフィキシム、セフプロジル、セファレキシン、セファロチン、セフロキシム、セファマンドール、セフェピム、及びセフピロムが挙げられうる。
【００８１】
セファマイシンはセファロスポリンに非常に似ており、時としてセファロスポリンとして分類される。セファロスポリンと同様に、セファマイシンはセフェム核（ｃｅｐｈｅｍ  ｎｕｃｌｅｕｓ）に基づいている。セファマイシンは当初ストレプトマイセス属によって産生されていたが、合成のものも製造されてきている。セファマイシンは７−アルファ位にメトキシ基をもち、セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾール、及びフロモキセフが挙げられる。
【００８２】
１、２、３、４−テトラヒドロピリジン環を含有するβ−ラクタムはカルバセフェムと呼ばれる。カルバセフェムは、セファロスポリン、セフェムの構造をもとに合成的に作られる抗生物質である。カルバセフェムはセフェムに類似するが、硫黄の代わりに炭素が置き換わっている。カルバセフェムの例はロラカルベフである。
【００８３】
モノバクタムはβ−ラクタム化合物であり、（大部分の他のβ−ラクタムが２つの環をもつのと対照的に）β−ラクタム環は１つのみであり、別の環に融合していない。モノバクタムはグラム陰性菌に対してのみ作用する。モノバクタムの他の例は、チゲモナム、ノカルディシンＡ、及びタブトキシンである。
【００８４】
３、６−ジヒドロ−２Ｈ−１、３−オキサジン環を含有するβ−ラクタムは、オキサセフェム又はクラバムと呼ばれる。オキサセフェムはセフェムに類似した分子であるが、硫黄の代わりに酸素が置き換わっている。よってそれらはオキサペナムとしても知られる。オキサペナムの例はクラブラン酸である。それらは合成的に作られる化合物であり、天然には見つかっていない。オキサセフェムの他の例はモキサラクタム及びフロモキセフが挙げられる。
【００８５】
β−ラクタム抗生物質の別のグループはβ−ラクタマーゼ阻害剤、例えば、クラブラン酸である。それらが示す抗菌活性はわずかであるが、それらはβ−ラクタム環を含有する。それらの唯一の目的はβ−ラクタマーゼに結合することによってβ−ラクタム抗生物質の不活性化を防ぐことであり、したがってそれらはβ−ラクタム抗生物質とともに共投与される。臨床に用いられるβ−ラクタマーゼ阻害剤としては、クラブラン酸及びそのカリウム塩（通常、アモキシシリン又はチカルシリンと組み合わせて）、スルバクタム、並びにタゾバクタムが挙げられる。
【００８６】
したがって、本発明のキットは、抗生物質耐性遺伝子を標的にして破壊することによって、本明細書において上に示された抗生物質化合物のいずれかに対する細胞集団の感受性亢進を導くことが理解されるべきである。よって、そのような感受性亢進は前記化合物に対する細菌の感受性を上げ、それによって必要とされる量の減少につながりうる有効性を高めることが理解されるべきである。本発明のキット及び本明細書において開示されている抗生物質化合物のいずれかとの併用治療も本発明によって企図される。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のキットは少なくとも１つの抗生物質化合物をさらに含みうる。より具体的な実施形態では、そのような化合物は、本発明によって開示されている抗生物質化合物のいずれかでありうる。
【００８７】
より具体的な実施形態では、本発明のキットの標的病原性遺伝子である抗生物質耐性因子又は遺伝子は、基質特異性拡張型ベータラクタマーゼ耐性因子（ＥＳＢＬ因子）、ＣＴＸ−Ｍ−１５、ベータラクタマーゼ、ニューデリー・メタロβラクタマーゼ（ＮＤＭ）−１，２，５，６  及びテトラサイクリンＡ（ｔｅｔＡ）のいずれか１つでありうる。
【００８８】
ニューデリー・メタロβラクタマーゼ（ＮＤＭ−１）は、細菌を現在使用されているすべてのβ−ラクタム抗生物質に対して耐性があるようにする酵素である。ＮＤＭ−１耐性スペクトラムは、抗生物質耐性細菌感染症の治療の中心であるカルバペネムファミリーの抗生物質を包含する。ＮＤＭ−１の遺伝子は、カルバペネマーゼと呼ばれるβ−ラクタマーゼ酵素をコードする大きな遺伝子ファミリーの１つのメンバーである。カルバペネマーゼを産生する細菌は治療が難しいことで有名である。重要なことには、ＮＤＭ−１の遺伝子は水平遺伝子伝播によって細菌の１つ株から別の株へ広がることができるので、容易に拡散しうる。ある具体的且つ非限定的な実施形態では、ＮＤＭ−１タンパク質はタンパク質＿ｉｄ  ＣＡＺ３９９４６．１のクレブシエラ・ニューモニエのメタロベータラクタマーゼ遺伝子ｂｌａＮＤＭ−１でありうる。いくつかの具体的な実施形態では、前記ＮＤＭ−１タンパク質は配列番号７５で表わされる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含みうる。さらにいくつかのさらなる具体的な実施形態では、本発明のＮＤＭ−１タンパク質は配列番号７４で表わされるアミノ酸配列を含みうる。
【００８９】
さらになお、本明細書においてＣＴＸ−Ｍ−１５は、エシェリキア・コリ、クレブシエラ・ニューモニエ、及びサルモネラ属の複数種で最初に記載され、他のエンテロバクター科、及びシュードモナス・エルギノーサを含むエンテロバクター科ではない種で急速に出現した広域スペクトラムのβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）のＣＴＸ−Ｍファミリー（セフォタキシマーゼ（ＣＴＸ−Ｍ−ａｓｅｓ））のメンバーである。このファミリーには、ＣＴＸ−Ｍ−３、ＣＴＸ−Ｍ−９、ＣＴＸ−Ｍ−１４、及びＣＴＸ−Ｍ−１５酵素が含まれる。いくつかの具体的な実施形態では、ＣＴＸ−Ｍ−１５が標的として使用され、本発明のキットは、タンパク質＿ｉｄ  ＡＡＬ０２１２７．１のエシェリキア・コリベータラクタマーゼＣＴＸ−Ｍ−１５でありうる。いくつかの具体的な実施形態では、前記ＣＴＸ−Ｍ−１５タンパク質は、配列番号７７で表わされる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含みうる。さらにいくつかのさらなる具体的な実施形態では、本発明のＣＴＸ−Ｍ−１５タンパク質は配列番号７６で表わされるアミノ酸配列を含みうる。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、本発明のキット又はシステムの感受性亢進要素のＣＲＩＳＰＲアレイの少なくとも１つのスペーサーは、ＣＴＸ−Ｍ−１５の少なくとも１つのプロトスペーサー、ＮＤＭ−１の少なくとも１つのプロトスペーサー、及び溶菌性ファージゲノム内に含まれる少なくとも１つの核酸配列の少なくとも１つを標的にする核酸配列を含みうる。
【００９１】
本明細書において先に記載された耐性付与遺伝子のいずれかの約１０〜約５０個のヌクレオチド、具体的には、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５６、４７、４８、４９、若しくは５０個のヌクレオチド、又はより具体的に、約３５個のヌクレオチドを含むいずれの配列、部分配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、又は断片が、プロトスペーサーとして、つまり、本発明の感受性亢進構成要素に対する、具体的には該要素内に含まれる特定のスペーサーに対する標的として用いられうることが理解されなければならない。いくつかの具体的な実施形態では、ＮＤＭ−１及びＣＴＸ−Ｍ−１５遺伝子の少なくとも１つ並びに具体的には配列番号７４及び７７のいずれか１つでそれぞれ表わされる核酸配列をもつ又は含むものの約１０〜約５０個のヌクレオチドを含むいずれの配列、部分配列、または断片が適切且つ効果的なプロトスペーサーとして用いられうる。いくつかの具体的な実施形態では、そのようなプロトスペーサーは少なくとも１つのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含みうる。さらなる具体的な実施形態では、そのようなＰＡＭ配列は、ＡＡＡ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＴ、ＣＡＧ、ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＴＡＡ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＧＧＧ、ＴＧＧ、ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＴＴ、ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧのいずれか１つでありうる。さらにいくつかの他の実施形態では、そのようなＰＡＭはＡＷＧであってよく、そこでは「Ｗ」は「Ａ」又は「Ｔ」のいずれか１つでありうる。さらになお、ある実施形態では、本発明のプロトスペーサーはプロトスペーサー配列の５’末端に前記ＰＡＭ配列の１つを最後に含みうる。
【００９２】
さらにいくつかの他の特定且つ非限定的な実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、具体的にはその感受性亢進構成要素は、ＣＴＸ−Ｍ−１５の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的にする少なくともスペーサーの少なくとも１つを含みうる。より具体的な実施形態では、そのようなプロトスペーサーは配列番号４９、５０、及び５１のいずれか１つで表わされる核酸配列（本明細書においてそれぞれＣ１、Ｃ２、及びＣ３とも呼ばれる）含みうる。ＮＤＭ−１の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的する少なくとも１つのスペーサー。具体的には、そのようなプロトスペーサーは、配列番号４６、４７、及び４８のいずれか１つで表わされる核酸配列（本明細書においてそれぞれＮ１、Ｎ２、及びＮ３とも呼ばれる）を含みうる。
【００９３】
さらになお、本発明のキットの選択的構成要素である遺伝子改変溶菌性ファージは、（ａ）ＣＴＸ−Ｍ−１５の少なくとも１つのプロトスペーサーの少なくとも１つの少なくとも１つのプロトスペーサーを含みうる。いくつかの具体的な実施形態では、そのようなプロトスペーサーは、配列番号４９、５０、及び５１のいずれか１つで表わされる核酸配列（本明細書においてそれぞれＣ１、Ｃ２、及びＣ３とも呼ばれる）を含みうる。さらにいくつかの他の実施形態では、遺伝子改変された溶菌性ファージは、くわえて又は代わりに、（ｂ）ＮＤＭ−１の少なくとも１つのプロトスペーサーを含みうる。より具体的な実施形態では、そのようなプロトスペーサーは、配列番号４６、４７、及び４８のいずれか１つで表わされる核酸配列（本明細書においてそれぞれＮ１、Ｎ２、及びＮ３とも呼ばれる）を含みうる。ある実施形態では、配列番号４６、４７、及び４８のいずれか１つで表わされる核酸配列を含むＮＤＭ−１のプロトスペーサーは、それぞれ配列番号３７、３８、及び３９で表わされるスペーサーによって標的にされうることが留意されるべきである。さらになお、配列番号４９、５０、及び５１のいずれか１つで表わされる核酸配列を含むＣＴＸ−Ｍ−１５のプロトスペーサーは、それぞれ配列番号４０、４１、及び４２で表わされるスペーサーによって標的にされうる。
【００９４】
ある実施形態では、本発明の選択構成要素は少なくとも１つの溶菌性ファージを含みうる。いくつかの実施形態では、本発明のそのような溶菌性ファージは、少なくとも１つのＴ７様ウイルス及びＴ４様ウイルスでありうる。さらなる具体的な実施形態では、本発明のキットによって使用される溶菌性ファージは、Ｔ７様ウイルス、具体的には少なくとも１つの腸内細菌ファージＴ７でありうる。バクテリオファージＴ７は溶菌生活環をもつＤＮＡウイルスである。こられのファージは、カウドウイルス目、ポドウイルス科、及びＴ７様ウイルス属に属する。
【００９５】
いずれの好適な溶菌性ファージが、本発明のキット、システム、及び方法によって使用されうることが理解されるべきである。１つの非限定的な例は、ミオウイルス科のメンバーであるファージでありうる。ミオウイルス科のメンバーは、首によって隔てられた頭部と尾部の特徴的な構造をもつ非エンベロープファージである。ミオウイルス科ゲノムは長さが約３３．６〜１７０Ｋｂの直鎖ＤＮＡであり、オペロンで転写される最高２００〜３００個のタンパク質をコードする。ミオウイルス科の大半が溶菌性ファージであり、溶原性になる（宿主細菌のゲノムに組み込まれるようになる又は細菌の細胞質中に環状レプリコンを形成するようになる）ために必要な遺伝子を欠くが、多くの溶原性の種が知られている。ミオウイルス科は４つの亜科に分けられており、それらのうち本発明の内容に最も関連するのはＴｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ亜科（Ｔｅｅｑｕａｔｒｏｖｉｒｉｎａｅとも、Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１１９８１３６）であり、とりわけ該亜科にＴ４様ウイルスファージが属する。
【００９６】
したがって、より具体的な実施形態では、溶菌性ファージは少なくとも１つの宿主ＤＮＡを分解するバクテリオファージ、例えばＴｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅファージのいずれかのメンバーでありうる。
【００９７】
Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅのメンバーは、短いスパイク及び６本の長い捩れた尾繊維をもつ基盤とともに、長さが約１１０ｎｍの首輪（ｃｏｌｌａｒ）を伴う中程度に細長い頭部及び長さが１１４ｎｍの尾部を特徴とする類似した形をもつ。この亜科は頭部形態に基づいて２つの属（すなわちＴ４様ウイルスとＳｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス）に分けられ、属内ではタンパク質の相同性に基づいて種が多くのグループに分けられている。完全なＴｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ系統は、Ｔ４様ウイルス属及びＳｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス属のファージを含む。
【００９８】
具体的には、本発明は、例えば、アシネトバクターファージ１３３、エロモナスファージ２５、エロモナスファージ３１、エロモナスファージ４４ＲＲ２．８ｔ、エロモナスファージ６５、エロモナスファージＡｅｈ１、腸内細菌ファージＳＶ１４、広義の腸内細菌ファージＴ４、広義のビブリオファージｎｔ−１、未分類Ｔ４様ウイルス種（国際ウイルス分類委員会ＩＣＴＶに準ずる）を含むＴ４様ウイルスバクテリオファージに関する。より具体的には、本発明は、腸内細菌ファージＣ１６、腸内細菌ファージＦＳアルファ、腸内細菌ファージＭＶ  ７２、腸内細菌ファージＭＶ  ＳＳ、腸内細菌ファージＭＶ１２、腸内細菌ファージＭＶ１３、腸内細菌ファージＭＶ１４、腸内細菌ファージＭＶ９、腸内細菌ファージＰＳＴ、腸内細菌ファージＴ２、腸内細菌ファージＴ４、腸内細菌ファージＴ６亜種を含む広義の腸内細菌ファージＴ４種由来のバクテリオファージに関し、且つアシネトバクターファージＡｃ４２、アシネトバクターファージＡｃｊ６１、アシネトバクターファージＡｃｊ９、アシネトバクターファージＺＺ１、エロモナスファージＡｅｓ００２、エロモナスファージＡｅｓ００７、エロモナスファージＡｅｓ０１２、エロモナスファージＡｅｓ１２０、エロモナスファージＡｅｓ１２３、エロモナスファージＡｅｓ１４４、エロモナスファージＡｅｓ１５１、エロモナスファージＡｅｓ５０８、エロモナスファージＡｅｓ５０９、エロモナスファージＡｅｓ５１２、エロモナスファージＡｅｓ５１６、エロモナスファージＡｅｓ５１７、エロモナスファージＣＣ２、エロモナスファージファイＡＳ４、エロモナスファージファイＡＳ５、エロモナスファージＰＸ２９、バークホルデリアファージ４２、シトロバクターファージＭｉｌｌｅｒ、クロノバクターファージｖＢ＿ＣｓａＭ＿ＧＡＰ１６１、シアノファージ２Ｂ０９６、シアノファージ２Ｂｎｐ、シアノファージ２Ｇｄｐ、シアノファージ４Ｂ０９２、シアノファージ４Ｂ０９ｐ、シアノファージ５Ｂｄ２、シアノファージ５Ｂｎｐ、シアノファージ６Ｂｎｐ、シアノファージ７Ｅ０２ｐ、シアノファージ７Ｇ０９ｐ、シアノファージ７Ｇｍｐ、シアノファージ８Ｂ０２６、シアノファージ８Ｂ０９２、シアノファージ８Ｇ０９２、シアノファージＰ−ＴＩＭ３、シアノファージＳ−ＴＩＭ４、腸内細菌ファージ１、腸内細菌ファージＡｃ３、腸内細菌ファージＡＲ１、腸内細菌ファージＢａｋｅｒ、腸内細菌ファージＢｐ７、腸内細菌ファージＣＣ３１、腸内細菌ファージＣＥＶ１、腸内細菌ファージＤＤ  ＶＩ、腸内細菌ファージＥＬＹ−１、腸内細菌ファージＧＥＣ−３Ｓ、腸内細菌ファージＨＸ０１、腸内細菌ファージＩＭＥ０８、腸内細菌ファージｉｍｅ０９、腸内細菌ファージＪＳ、腸内細菌ファージＪＳ１０、腸内細菌ファージＪＳ９８−Ｃ３、腸内細菌ファージＪＳＥ、腸内細菌ファージＫ３、腸内細菌ファージＫＣ６９、腸内細菌ファージＬＺ１、腸内細菌ファージＬＺ１０、腸内細菌ファージＬＺ２、腸内細菌ファージＬＺ３、腸内細菌ファージＬＺ４、腸内細菌ファージＬＺ５、腸内細菌ファージＬＺ６、腸内細菌ファージＬＺ７、腸内細菌ファージＬＺ８、腸内細菌ファージＬＺ９、腸内細菌ファージＭ１、腸内細菌ファージＭｉ、腸内細菌ファージＭＶ  ＢＳ、腸内細菌ファージｎｖｖ１、腸内細菌ファージＯｘ２、腸内細菌ファージＰｈｉ１、腸内細菌ファージＰｏｌ、腸内細菌ファージＲＢ１、腸内細菌ファージＲＢ１０、腸内細菌ファージＲＢ１４、腸内細菌ファージＲＢ１５、腸内細菌ファージＲＢ１６、腸内細菌ファージＲＢ１８、腸内細菌ファージＲＢ２、腸内細菌ファージＲＢ２１、腸内細菌ファージＲＢ２３、腸内細菌ファージＲＢ２５、腸内細菌ファージＲＢ２６、腸内細菌ファージＲＢ２７、腸内細菌ファージＲＢ３、腸内細菌ファージＲＢ３０、腸内細菌ファージＲＢ３２、腸内細菌ファージＲＢ３３、腸内細菌ファージＲＢ４２、腸内細菌ファージＲＢ４３、腸内細菌ファージＲＢ４９、腸内細菌ファージＲＢ５、腸内細菌ファージＲＢ５１、腸内細菌ファージＲＢ６、腸内細菌ファージＲＢ６１、腸内細菌ファージＲＢ６２、腸内細菌ファージＲＢ６８、腸内細菌ファージＲＢ６９、腸内細菌ファージＲＢ７０、腸内細菌ファージＲＢ８、腸内細菌ファージＲＢ９、腸内細菌ファージＳＣ１、腸内細菌ファージＳＣＩ、腸内細菌ファージＳＶ７６、腸内細菌ファージＴｕＩａ、腸内細菌ファージＴｕＩｂ、腸内細菌ファージＵ４、腸内細菌ファージＵ５、腸内細菌ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ−ＶＲ７、腸内細菌ファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＡＣＧ−Ｃ４０、エシェリヒアファージｅ１１／２、エシェリヒアファージＩＭＥ０８、エシェリヒアファージＬｗ１、エシェリヒアファージＬＺ、エシェリヒアファージＬＺ１、エシェリヒアファージＬＺ９、エシェリヒアファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＪＳ０９、エシェリヒアファージｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＰｈＡＰＥＣ２、エシェリヒアファージｗＶ７、クレブシエラファージＫＰ１５、クレブシエラファージＫＰ２７、ファージＬＺ、ファージＬＺ１１、プロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ２、プロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ４、サルモネラファージＳ１６、セラチアファージＰＳ２、シゲラファージＳｈｆｌ２、シゲラファージＳＰ１８、シノリゾビウムファージファイＭ１２、ステノトロホモナスファージＩＭＥ１３、ステノトロホモナスファージＳｍｐ１４、シネココックスファージメタＧ−ＭｂＣＭ１、シネココックスファージＳ−ＭｂＣＭ１００、シネココックスファージＳ−ＭｂＣＭ６、シネココックスファージＳ−ＭｂＣＭ７、シネココックスファージＳ−ＰＭ２、シネココックスファージＳ−ＲＳＭ４、シネココックスファージｓｙｎ９、及びエルシニアファージＰＳＴ亜種を含む未分類Ｔ４様ウイルス種由来のバクテリオファージに関する（国際ウイルス分類委員会ＩＣＴＶに準ずる）。
【００９９】
本発明の選択構成要素は、エシェリキア・コリに感染するいずれの溶菌性ファージも含みうることが理解されるべきである。さらにいくつかの他の実施形態では、そのような溶菌性ファージはいずれの病原性細菌を標的にするいずれのファージでもありうる。
【０１００】
上で述べたように、本発明の選択要素は、本明細書において先に記載された細菌を死滅させる因子及び少なくとも１つのプロトスペーサーをコードするＤＮＡ配列でありうる。さらにいくつかの他の具体的且つ非限定的な実施形態では、選択構成要素は少なくとも１つの溶菌性バクテリオファージ、具体的には遺伝子改変溶菌性ファージを含みうる。いくつかの具体的な実施形態では、そのような溶菌性ファージは少なくとも１つのＴ７バクテリオファージでありうる。いくつかの特定且つ非限定的な実施形態では、本発明のキットにおいて選択的構成要素として使用される溶菌性ファージは、配列番号４６で表わされる１つのＮＤＭ−１のプロトスペーサーＮ１及び配列番号４９で表わされるＣＴＸ−Ｍ−１５のプロトスペーサーＣ１を含むＴ７遺伝子改変されたファージでありうる。前記ファージは本明細書においてＴ７−Ｎ１Ｃ１と呼ばれる。いくつかの実施形態では、組換え又は遺伝子改変溶菌性ファージＴ７−Ｎ１Ｃ１は配列番号５７で表わされる核酸配列を含みうる。さらに別の実施形態では、本発明の選択要素は遺伝子改変溶菌性ファージ、具体的には、それぞれ配列番号４６及び４７で表わされる２つのＮＤＭ−１のプロトスペーサーＮ１及びＮ２を含むＴ７バクテリオファージでありうる。前記ファージは本明細書においてＴ７−Ｎ１Ｎ２と呼ばれる。いくつかの実施形態では、組換え又は遺伝子改変溶菌性ファージＴ７−Ｎ１Ｎ２は配列番号５５で表わされる核酸配列を含みうる。さらになお、本発明の選択要素は遺伝子改変溶菌性ファージ、具体的には、それぞれ配列番号５０及び４９で表わされる２つのＣＴＸ−Ｍ−１５のプロトスペーサー、例えばＣ２及びＣ１を含むＴ７バクテリオファージでありうる。前記ファージは本明細書においてＴ７−Ｃ２Ｃ１と呼ばれる。いくつかの実施形態では、組換え又は遺伝子改変溶菌性ファージＴ７−Ｃ２Ｃ１は配列番号５６で表わされる核酸配列を含みうる。さらに別の実施形態では、本発明の選択要素は遺伝子改変された溶菌性ファージ、具体的には、配列番号５０で表わされる１つのＣＴＸ−Ｍ−１５のプロトスペーサーＣ２及び配列番号４７で表わされるＮＤＭ−１のプロトスペーサーＮ２を含むＴ７バクテリオファージでありうる。前記ファージは本明細書においてＴ７−Ｃ２Ｎ２と呼ばれる。いくつかの実施形態では、組換え又は遺伝子改変溶菌性ファージＴ７−Ｃ２Ｎ２は配列番号５８で表わされる核酸配列を含みうる。
【０１０１】
いくつかの代替的な実施例では、本発明のキット又はシステムの選択構成要素は非改変ファージでありうる。故に、本発明の感受性亢進構成要素のＣＲＩＳＰＲアレイは、そのようなファージを標的にするように設計されるべきである。したがって、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーは前記溶菌性ファージの必須遺伝子内に含まれる核酸配列に十分に相補的でなければならない。
【０１０２】
よっていくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーは前記溶菌性ファージの必須遺伝子内に含まれる核酸配列を標的にする。いくつかの具体的な実施形態では、そのような溶菌性ファージはＴ７様ウイルス及びＴ４様ウイルスの少なくとも１つでありうる。より具体的な実施形態は腸内細菌ファージＴ７及び腸内細菌ファージＴ４の少なくとも１つに関する。より具体的な実施形態では、本発明のキット又はシステムの選択構成要素として使用される溶菌性ファージはＴ４及びＴ７の少なくとも１つでありうる。そのような具体的な場合では、ＣＲＩＳＰＲアレイはこれらのファージを標的にしてその核酸配列を認識するスペーサーを含みうる。
【０１０３】
いくつかの具体的且つ非限定的な実施形態では、そのようなスペーサーはＴ７バクテリオファージのプロトスペーサーを標的にするスペーサーを含みうる。より具体的な実施形態は、配列番号４３、４４、及び４５のいずれか１つを含むスペーサーに関する。さらにより具体的な実施形態では、そのようなスペーサーは、それぞれ配列番号５２、５３、及び５４のいずれか１つの核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にする。より具体的な実施形態では、これらのプロトスペーサーは本発明の溶菌性ファージ内に含まれる。
【０１０４】
本発明はそのさらなる態様として、本明細書において以前に記載されている遺伝子改変又は遺伝子操作溶菌性バクテリオファージのいずれか１つをさらに包含することが理解されるべきである。
【０１０５】
いくつかの実施形態によれば、本発明のキット又はシステムの感受性亢進構成要素のために使用されるバクテリオファージはラムダファージでありうる。より具体的な実施形態では、そのようなファージはラムダ溶原性ファージでありうる。
【０１０６】
より具体的な実施形態では、溶原性ファージの例は、配列番号３６で表わされる核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００１４１６．１）をもつラムダファージでありうる。
【０１０７】
例として、本発明のキット及びシステムに使用されるバクテリオファージとしては、溶菌性バクテリオファージ又は溶原性バクテリオファージにいずれかである、いずれの院内細菌に感染できるそれらのバクテリオファージが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
別の例として、バクテリオファージとしては、例えば限定されないが、プロテオバクテリア門、フィルミクテス門、及びバクテロイデス門のいずれか１つなどの細菌に感染できるバクテリオファージ（溶菌性又は溶原性）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０９】
さらなる例として、バクテリオファージとしては、以下の属に属する細菌に感染できるバクテリオファージが挙げられるが、それらに限定されない：エシェリキア・コリ、シュードモナス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、クレブシエラ属、アシネトバクター属、及びエンテロバクター属。
【０１１０】
また、他の微生物及び特に上に列挙されているＥＳＫＡＰＥ生物に感染する他の溶菌性ファージも、それらの生物を標的にするキットにおいて選択因子として使用されうる。選択因子は、ファージカプシドを通して又は他の方法によって注射される殺菌因子をコードするＤＮＡであることもできる。さらにいくつかの他の実施形態では、他の微生物及び特に上に列挙されているＥＳＫＡＰＥ生物に感染する他の溶原性ファージも、これらの生物を標的にするキットにおいて感受性亢進構成要素として使用されうる。より具体的には、いずれのバクテリオファージ、溶菌性ファージ又は溶原性バクテリオファージのいずれも、本発明の目的、具体的には本発明の選択構成要素及び感受性亢進構成要素として適用可能でありうることが理解されるべきである。特に関心があるのは、「ＥＳＫＡＰＥ」病原体のいずれかを特異的に標的にするバクテリオファージである。本明細書で使用される場合、これらの病原体としては、エンテロコッカス・フェシウム、スタフィロコッカス・アウレウス、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマニ、シュードモナス・エルギノーサ、及びエンテロバクター属が挙げられるが、これらに限定されない。ほんの数例を挙げれば、これらのバクテリオファージとしては、溶菌性または溶原性のどちらでも、スタフィロコッカス・アウレウスに特異的なバクテリオファージ、具体的には、ｖＢ＿Ｓａｕ  Ｍｙ  Ｄ１、ｖＢ＿Ｓａｕ  Ｍｙ  １１４０、ｖＢ＿ＳａｕＭ  １４２、Ｓｂ−１、ｖＢ＿ＳａｕＭ  ２３２、ｖＢ＿ＳａｕＳ  １７５、ｖＢ＿ＳａｕＭ  ５０、ｖＢ＿Ｓａｕ  ５１／１８、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．１、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．２、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．３、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．４、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．５、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．６、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．７、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．８、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．９、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．１０、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．１１の少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されない。さらにいくつかのさらなる実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエに特異的な溶菌性バクテリオファージ又は溶原性バクテリオファージも本発明に適用可能でありうる。より具体的な実施形態では、これらのファージとしては、ｖＢ＿Ｋｌｐ  １、ｖＢ＿Ｋｌｐ  ２、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．１、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．２、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｐ．３、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．４、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．５、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．６、ｖＢ＿Ｋｌｐ．７、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．８、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．９、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．１０、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｐ．１１、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｐ．１２、ｖＢ＿Ｋｌｐ．１３、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｐ．１４、ｖＢ＿Ｋｌｐ．１５、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．１６が挙げられうるが、これらに限定されない。さらになお、ある実施形態では、シュードモナス・エルギノーサに特異的なバクテリオファージが、本発明の選択構成要素及び／若しくは感受性亢進構成要素又はこれらの構成要素を用いるいずれのキット若しくは方法に適用可能でありうる。そのようなバクテリオファージの非限定的な例としては、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｓｈｉｓ  １、ｖＢ＿ＰｓａＭ  ＰＡＴ５、ｖＢ＿ＰｓａＰ  ＰＡＴ１４、ｖＢ＿ＰｓａＭ  ＰＡＴ１３、ｖＢ＿ＰｓａＭ  ＳＴ−１、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ��７、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４４  Ｋ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４４  Ｍ、ｖＢ＿Ｐｓａ  １６、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｓ−１、ｖＢ＿Ｐｓａ  ８−４０、ｖＢ＿Ｐｓａ  ３５  Ｋ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ４４、ｖＢ＿Ｐｓａ  １、ｖＢ＿Ｐｓａ  ９、ｖＢ＿Ｐｓａ  ６−１３１  Ｍ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ３７、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４５  Ｓ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４５  Ｍ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  １６  ＭＵ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４１、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４４  ＭＵ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４３、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  １１  Ｋ、ｖＢ＿Ｐｓａ  １６３８、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｓ−２、ｖＢ＿Ｐｓａ  ３５  ＣＴ  ｖＢ＿Ｐｓａ  ３５  Ｍ、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｓ．Ｃｈ．Ｌ、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｒ１、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＳＡＮ、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｌ２４、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｆ８、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ  −４、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ−２（８）、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ−１（１０）、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ−４−１６、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ−５、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｆ−２、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｂ−ＣＦ、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ７／３２、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ７／６３、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ５／３２、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ８／１６、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ１１／１、ｖＢ＿Ｐｓａ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ３、ｖＢ＿Ｐｓａ  ４、ｖＢ＿Ｐｓａ  ５、ｖＢ＿Ｐｓａ  ６、ｖＢ＿Ｐｓａ  ７、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｐ．１５、ｖＢ＿Ｐｓａ．１７、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ．１８、ｖＢ＿Ｐｓａ．２８、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ．２、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ  ３、ｖＢ＿Ｐｓａ．２３、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｐ．８、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ．ＰＳＴ７、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ．Ｃ５、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ．Ｄ１０３８が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、アシネトバクター・バウマニに特異的なバクテリオファージが本発明に適用可能でありうる。そのような溶菌性ファージ又は溶原性ファージとしては、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｂ３７、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｇ８６５、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｇ８６６、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｕ７、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｕ８、ｖＢ＿Ａｃｂ  １、ｖＢ＿Ａｃｂ  ２のいずれか１つが挙げられうる。さらにいくつかのさらなる実施形態では、エンテロバクター属に特異的なバクテリオファージが本発明のキット及び方法に使用されうる。具体的には、ｖＢ＿Ｅｂ  １、ｖＢ＿Ｅｂ  ２、ｖＢ＿Ｅｂ  ３、ｖＢ＿Ｅｂ  ４バクテリオファージのいずれか１つである。さらにいくつかのさらなる実施形態では、エンテロコッカス・フェカリス特異的バクテリオファージが使用されうる。いくつかの非限定的な例としては、ｖＢ＿Ｅｃ  １、ｖＢ＿Ｅｃ  ２、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．４、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．５バクテリオファージのいずれか１つが挙げられる。
【０１１１】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、バチルス・アンシラシスに特異的に感染するバクテリオファージ、例えば、ｖＢ＿ＢａＫ１、ｖＢ＿ＢａＫ２、ｖＢ＿ＢａＫ６、ｖＢ＿ＢａＫ７、ｖＢ＿ＢａＫ９、ｖＢ＿ＢａＫ１０、ｖＢ＿ＢａＫ１１、ｖＢ＿ＢａＫ１２、ｖＢ＿ＢａＧａ４、ｖＢ＿ＢａＧａ５、ｖＢ＿ＢａＧａ６も、本発明に適用可能でありうる。さらになお、ブルセラ・アボルタスに特異的なバクテリオファージ、例えば、Ｔｂ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＩＶ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  Ｖ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＶＩ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＶＩＩ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＶＩＩＩ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＩＸ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  Ｘ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＸＩＩ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １２（ｂ）、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＢＡ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ５４４、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １４１я、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １４１ｍ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １９я、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １９ｍ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ９、ブルセラ・カニスに特異的なバクテリオファージ、具体的にはｖＢ＿ＢｒｃＰ  １０６６、クロストリジウム・ペルフリンゲンスＡ．Ｂ．Ｃ．Ｄ．Ｅに特異的なバクテリオファージ、例えば、ｖＢ＿ＣｐＰＩ、ｖＢ＿ＣｐＩＩ、ｖＢ＿ＣｐＩＩＩ、ｖＢ＿ＣｐＩＶ、デスルホビブリオ・ブルガリスに特異的なバクテリオファージ、具体的には、ｖＢ＿ＤｖＲＣＨ１／Ｍ１、ｖＢ＿ＤｖＨ／Ｐ１５、ｖＢ＿ＤｖＨ／Ｍ１５、エンテロコッカス・フェカリスに特異的なもの、具体的には、ｖＢ＿Ｅｃ  １、ｖＢ＿Ｅｃ  ２、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．４、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．５、エシェリキア・コリに特異的なバクテリオファージ、具体的には、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．ｐｏｄ  ９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｐｏｄ  ４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｍｙ  ２、ＰｈＩ−１、ＰｈＩ−２、ＰｈＩ３、ＰｈＩ４、ＰｈＩ５、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ５、ＤＤＩＩ、ＤＤＶＩ、ＤＤＶＩＩ、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ７／２０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １１６１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ８９６３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １１／２４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １８、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ３／１４、ｖＢ＿Ｓａｕ  Ａ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｇ、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  Ｗ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＧＥ２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ８９６２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ９０／２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ５／２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １２／２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｈ、Ｔ３、Ｔ６、Ｔ７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １２１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ＢａＫ２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−１０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Φ８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ２０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ２７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ＭＹ、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２３、ｖＢ＿��ｓｃｈｃ  ２４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２６、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４６、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｍ．１、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｍ．２、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．３、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．４、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．５、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．６、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．７、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．８、サルモネラ・パラチフスに特異的なファージ、具体的には、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  １、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  ２、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  ３、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  ３ｂ、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｊｅｒｓｅｙ、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｂｅｅｃｌｅｓ、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｔａｕｎｔｏｎ、ｖＢ＿ＳＰＢ  ＤｉａｇＢ．Ａ．Ｏ．Ｒ、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｄｕｎｄｅｅ、ｖＢ＿ＳＰＢＤｉａｇＷｏｒｋｓｏｐ、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｅ、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｄ、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｆ、ｖＢ＿ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｈ、サルモネラ・チフィ・アブドミナリスに特異的  ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ａ、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｂ１、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｂ２、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ１、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ２、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ３、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ４、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ５、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ６、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ７、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ１、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ２、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ４、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ５、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ６、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ７、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ８、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｅ１、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｅ２、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｅ５、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｅ１０、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｆ１、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｆ２、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｆ５、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｇ、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｈ、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｊ１、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｊ２、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｋ、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｌ１、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｌ２、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｍ１、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｍ２、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｎ、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｏ、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｔ、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｖｉ１、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ２７、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ２８、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ３８、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ３９、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ４０、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ４２、ｖＢ＿Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ４６、サルモネラ・チフィリウム、具体的には、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｍｙ  １１、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｍｙ  ２８、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｓｈｉｓ  １３、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｍｙ  ７６０、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｓｈｉｓ  １、ＩＲＡ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  １６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  １７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  １８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  １９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  ２０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  ２１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  ２９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  ���１２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  Ｉ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＩＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＩＶ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  Ｖ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＶＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＶＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＶＩＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＩＸ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  Ｘ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩＶ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＶ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＶＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＶＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＶＩＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩＸ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＸ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＸＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６５、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｐ．１、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｐ．２、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｐ．３、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｐ．４、シゲラ・ソネイ、具体的には、ｖＢ＿Ｓｈｓ．Ｐｏｄ  ３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ７／２０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １１６１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ８９６３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ８９６２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＧＥ２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  Ｗ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｇ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ３／１４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １８、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１８８、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１８８  Γ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１８８  Ｙ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１８８  Ｘ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ５５１４、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｌ７−２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｌ７−４、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｌ７−５、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｌ７−１１、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｋ３、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＴｕＩ  Ａ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｏｘ２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＳＣＬ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｂａｋ  Ｃ２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ４／１１８８、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ８９６２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ８９６３、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＸＩＶ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１６、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １０６／８、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ２０、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ９０／２５、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ８７／２５、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １６／２５、ｖＢ＿Ｓｈｓ  ７、ｖＢ＿Ｓｈｓ  ３８、ｖＢ＿Ｓｈｓ  ９２、ｖＢ＿Ｓｈｓ  １３９１、ｖＢ＿Ｓｈｓ．Ｐ．１、ｖＢ＿Ｓｈｓ．Ｐ．２、ｖＢ＿Ｓｈｓ．Ｐ．３。いずれの病原性細菌、及び具体的には本明細書において開示されるいずれの病原性細菌に特異的ないずれのバクテリオファージは、溶菌性でも溶原性でも、本発明のキット及び方法又はそのいずれの構成要素、具体的には選択構成要素及び感受性亢進構成要素に適用可能でありうることがさらに理解されるべきである。
【０１１２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは外来ＤＮＡ又はＲＮＡを標的にすることによってファージによる攻撃や望ましくないプラスミド複製を防ぐために原核生物で進化してきた。（１６、２０、２１）。エシェリキア・コリＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、細菌ゲノム内のリピート配列の間に存在するスペーサーと呼ばれる短い相同ＤＮＡ配列に基づいてＤＮＡ分子を標的にする。これらのスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を外来ＤＮＡ内のプロトスペーサーと呼ばれる一致配列（及び／又は相補的配列）に導く。その後該配列は切断される。スペーサーは、例えば耐性遺伝子及び溶菌性ファージをコードするものなどのいずれのＤＮＡ配列を標的にするように合理的に設計されることができる。これにより、細菌に有益である形質（すなわち、ファージ耐性を付与する要素）を、薬剤耐性を失わせる形質（すなわち耐性遺伝子を削減する要素）と遺伝的に結びつけることができる。この遺伝的なつながりにより、溶菌性ファージを選択因子として用いることによって、感受性亢進細菌集団を選択することが可能になる。溶菌性ファージに対する防御と感受性亢進コンストラクトの両方をもつ細菌は処理された表面上で生き残り、一方でそれらの因子を欠く細菌は溶菌性ファージによって死滅させられる。本発明の組み込みコンストラクトは、既存の耐性遺伝子を活発に絶つだけでなく、細菌間の遺伝子の水平伝播を削減するように設計される。
【０１１３】
いくつかのさらなる実施形態では、溶原性バクテリオファージはＣＲＩＳＰＲリーダー配列をコードする核酸配列をさらに含む。
【０１１４】
上述のように、本発明のキットの感受性亢進構成要素は、少なくとも１つのＣａｓ遺伝子及びＣＲＩＳＰＲシステムを含みうる。ＣＲＩＳＰＲシステムに関して、当業者なら認識すると思われるように、天然のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座には、一般に「リピート」と呼ばれる短い反復配列を多く含む。リピートはクラスター内で生じ、単一のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座において最高で２４９個のリピートが特定されて、通常「スペーサー」と呼ばれる独自の介在配列が規則的に配置されている。典型的には、ＣＲＩＳＰＲリピートは長さが約２４〜４７塩基対（ｂｐ）とさまざまであり、部分的に回分配列をもつ。いくつかの実施形態では、本発明のキットの感受性亢進構成要素に含まれるＣＲＩＳＰＲリピートは、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０個以上の塩基対をもつリピートを含みうる。リピートは一般に、反復ユニット（１つのゲノム当たり最高で約２０個又はそれより多い）クラスター内に配置されている。スペーサーは２つのリピートの間に位置し、典型的には、各スペーサーは長さが約２０ｂｐ以下から７２ｂｐ以上である独自の配列をもつ。よって、ある実施形態では、本発明の感受性亢進構成要素に使用されるＣＲＩＳＰＲスペーサーはそれぞれ、２０〜７２個のヌクレオチド（ｎｔ）を含みうる。より具体的に、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、又は７２個以上である。多くのスペーサーは既知のファージ配列と同一であるか、又は高い相同性をもつ。リピート及びスペーサーにくわえて、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はリーダー配列、及び多くの場合、少なくとも１つの関連Ｃａｓ遺伝子、具体的には２〜６個又はそれ以上の関連Ｃａｓ遺伝子のセットも含む。典型的には、リーダー配列は最初のリピートの５’末端に直接隣接する最高で５５０ｂｐのＡＴリッチ配列である。新しいリピート−スペーサーユニットはほとんどの場合、リーダーと最初のリピートの間でＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に付加されると考えられている。
【０１１５】
上述のように、本発明のキット又はシステムの感受性亢進要素として用いられる改変溶原性ファージは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）アレイをｃａｓ遺伝子と一緒に含んでＣＲＩＳＰＲシステムを形成する。本明細書で使用される場合、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在直列反復配列（Ｓｐａｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られるＣＲＩＳＰＲアレイは、通常は特定の細菌種に特異的である、最近記述されたＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲアレイは、エシェリキア・コリで最初に確認された、散在短鎖配列反復（ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｅａｔ）（ＳＳＲ）の異なるクラスである。その後数年の間に、同様のＣＲＩＳＰＲアレイが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ハロフェラックス・メディテラネイ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ、サーモトガ・マリティマ、並びに他の細菌及びアーキアで見つかった。既知のＣＲＩＳＰＲシステムのいずれか、特に、本明細書において開示されているＣＲＩＳＰＲシステムにいずれかの使用を本発明は企図することが理解されるべきである。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲアレイポリヌクレオチド」という句は、相補的な遺伝子を下方制御（例えば、削減）できるように十分なＣＲＩＳＰＲリピートを含むＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１１７】
１つの実施形態によれば、ＣＲＩＳＰＲアレイポリヌクレオチドは、その間に１つのスペーサーをもつ少なくとも２つのリピートを含む。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の感受性亢進構成要素のＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、又はそれより多く、具体的には、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００個又はそれより多くのスペーサーを含みうる。さらに、本発明の感受性亢進構成要素のスペーサーは同一のスペーサーでも異なるスペーサーのいずれでもよいことが理解されるべきである。多くの実施形態では、これらのスペーサーは同一の的細菌病原性遺伝子を標的にしてもよく、異なる標的細菌病原性遺伝子を標的にしてもよい。さらにいくつかの他の実施形態では、そのようなスペーサーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、又はそれより多くの病原性細菌の遺伝子を標的にしうる。
【０１１８】
例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイポリヌクレオチドは、最初のＣＲＩＳＰＲリピートの最初のヌクレオチドで始まり、最後の（末端）リピートの最後のヌクレオチドで終わる、すべてのＣＲＩＳＰＲリピートを含む。
【０１１９】
さまざまなコンピューターソフトウェア及びウェブ資源が、ＣＲＩＳＰＲシステム、つまりＣＲＩＳＰＲアレイの解析及び同定に利用可能である。これらのツールとしては、ＰＩＬＥＲＣＲ、ＣＲＩＳＰＲ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ、及びＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒなどのＣＲＩＳＰＲ検出用ソフトウェア、ＣＲＩＳＰＲｄｂなどの前分析（ｐｒｅ−ａｎａｌｙｚｅｄ）ＣＲＩＳＰＲのオンラインリポジトリ、並びにＰｙｇｒａｍなどの微生物のゲノムのＣＲＩＳＰＲを閲覧するツールが挙げられる。
【０１２０】
配列が決定されている細菌ゲノム及びアーキアゲノムのそれぞれ約４０％及び９０％にＣＲＩＳＰＲシステムが見出されることが明らかになってきており、本発明の発明者は、すべてのそのようなＣＲＩＳＰＲシステムからのＣＲＩＳＰＲアレイの使用を企図する。
【０１２１】
１つの実施形態によれば、ＣＲＩＳＰＲアレイポリヌクレオチドは、目的遺伝子を下方制御（例えば削減）するように置き換えられるスペーサー（又は複数のスペーサー）とは別に、天然の（野生型）配列に１００％の相同性のある核酸配列を含む。
【０１２２】
別の実施形態によれば、ＣＲＩＳＰＲアレイポリヌクレオチドは、目的の遺伝子を下方制御するように置き換えられるスペーサー（又は複数のスペーサー）とは別に、天然の（野生型）配列に９９％の相同性のある核酸配列を含む。さらにいくつかの他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイポリヌクレオチドは、目的の遺伝子及び具体的にはそれによってコードされるＲＮＡを下方制御する又は削減するように置き換えられるスペーサー（又は複数のスペーサー）とは別に、天然の（野生型）配列に９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、又は５０％の相同性のある核酸配列を含む。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「スペーサー」という用語は、ＣＲＩＳＰＲアレイの複数の単鎖直列反復配列（すなわち、ＣＲＩＳＰＲリピート）の間に見出される非反復スペーサー配列を指す。いくつかの好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは２つの同一ＣＲＩＳＰＲリピートの間に位置する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２つのＣＲＩＳＰＲリピート間に位置するＤＮＡ伸長における配列解析によって同定される。
【０１２４】
いくつかの好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは回分配列であり、２つの同一の短鎖直列反復配列の間に自然に存在する。本発明のスペーサーは２つの同一リピート間又は非同一リピート間に位置又は存在しうることが留意されるべきである。
【０１２５】
「遺伝子の部分」又は「遺伝子内に含まれる核酸配列」という句は、遺伝子のコーディング領域又は非コーディング領域に由来する部分に関する。
【０１２６】
本明細書において、「十分に相補的な」という句は、遺伝子の発現を下方制御できるように十分に相補的であるスペーサーの配列を指す。
【０１２７】
本発明のこの態様の１つの実施形態によれば、遺伝子の部分及び具体的には前記遺伝子によってコードされるＲＮＡに十分に相補的である配列は、該遺伝子に少なくとも約７０、約７５、約８０、約８５、若しくは約９０％同一であり、又は該遺伝子に少なくとも約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、若しくは約９９％同一である。いくつかの好ましい実施形態では、配列は遺伝子に１００％相補的である。
【０１２８】
ＣＲＩＳＰＲシステムによってコードされる標的ＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）でありうる。ＣＲＩＳＰＲスペーサーによってコードされる標的ＲＮＡの配列は、本明細書において「プロトスペーサー」とも呼ばれる細菌の病原性遺伝子の標的配列を対象とする（すなわち、該配列と同一又は相補である断片ももつ）という要件による以外、特に制限されない。そのようなプロトスペーサーは、本発明の感受性亢進システム内に含まれるＣＲＩＳＰＲスペーサーによってコードされる標的ＲＮＡの配列に十分な相補性をもつ核酸配列を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ｎｔのスペーサー（標的）配列を含むか又は該配列から成り、その後に１９〜３６ｎｔのリピート配列が続く。具体的且つ非限定的な実施形態では、標的スペーサーは、代表的なスペーサー配列が本明細書において示されている遺伝子のいずれか１つを標的にする断片を含む又は該断片から成ることになる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムのスペーサーは標的ＲＮＡをコードしうることが留意されるべきである。「標的ＲＮＡ」は、それをコードするＣＲＩＳＰＲシステムの部分から転写されるとき、細菌染色体のＤＮＡ配列又は標的にされる細菌内のプラスミド上の配列と同一（ＲＮＡについてはＴがＵに置き換わることを除く）であるか又は該配列に相補的である（及びよって「標的にする」）、少なくともＲＮＡ配列の断片を含むＲＮＡである。本開示のＣＲＩＳＰＲシステムは２つ以上の標的ＲＮＡをコードすることができ、該標的ＲＮＡは細菌染色体若しくはプラスミドの１つ以上の配列又はその組み合わせを対象とすることができる。よって標的ＲＮＡの配列は、本発明の感受性亢進要素、具体的には本発明の遺伝子改変ファージがもつＣＲＩＳＰＲシステムによって何が標的にされるかを左右する。
【０１３１】
本発明の改変ＣＲＩＳＰＲアレイは、１つ以上のＣａｓタンパク質（すなわちｃａｓ遺伝子）をコードする核酸配列も含みうる。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「ｃａｓ遺伝子」という用語は、Ｃａｓタンパク質をコードする隣接ＣＲＩＳＰＲアレイに一般に結合する（ｃｏｕｐｌｅｄ）、結合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、又は近くにある（ｃｌｏｓｅ  ｔｏ）、又は近くにある（ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｃｉｎｉｔｙ  ｏｆ）遺伝子を指す。
【０１３３】
典型的には、ＣＲＩＳＰＲアレイはｃａｓ１〜ｃａｓ４と呼ばれる４つの遺伝子の近くに見出される。これらの遺伝子の最も一般的な配列はｃａｓ３−ｃａｓ４−ｃａｓ１−ｃａｓ２である。Ｃａｓ３タンパク質はヘリカーゼであると思われ、Ｃａｓ４はＲｅｃＢファミリーのエキソヌクレアーゼに似て、システインリッチモチーフを含有し、ＤＮＡとの結合を示唆している。ｃａｓ１遺伝子（ＮＣＢＩ  ＣＯＧｓ  データベースコード：ＣＯＧ１５１８）は、ＣＲＩＳＰＲシステムの全部に共通するマーカーとしての役割を果たす（パイロコッカス・アビシのＣＲＩＳＰＲシステム以外のすべてのＣＲＩＳＰＲシステムに連結する）ので特に注目に値する。ｃａｓ２はまだ特徴づけがされていない。ｃａｓ１〜４は典型的には、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に近接すること及び細菌種及びアーキア種にわたって幅広く分布することを特徴とする。すべてのｃａｓ１〜４遺伝子がすべてのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と結合するとは限らないが、それらの遺伝子は複数のサブタイプに見出される。
【０１３４】
くわえて、多くの細菌種には、ＣＲＩＳＰＲ構造体に結合する、本明細書においてｃａｓ  ＩＢ、ｃａｓ５、及びｃａｓ６と呼ばれる３つの遺伝子の別クラスターが存在する。いくつかの実施形態では、ｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃａｓ３、ｃａｓ４、ｃａｓ  ＩＢ、ｃａｓ５、並びに／又はｃａｓ６、その断片、変異体、ホモログ及び／若しくは誘導体から選択される。いくつかのさらなる実施形態では、２つ以上のｃａｓ遺伝子の組み合わせ、例えばいずれの好適な組み合わせが用いられる。
【０１３５】
いくつかの実施形態ではｃａｓ遺伝子はＤＮＡを含み、他の実施形態ではｃａｓはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では核酸はゲノムに由来し、他の実施形態では核酸は合成又は組換えによって作られる。いくつかの実施形態では、ｃａｓ遺伝子はセンス鎖であれ、アンチセンス鎖であれ、それらの組み合わせであれ、二本鎖又は一本鎖である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ４又はｃａｓ６などの、リーダー配列又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の５’末端にある最初のＣＲＩＳＰＲリピートに最も近いｃａｓ遺伝子であることが好ましい。
【０１３７】
所与の一連のｃａｓ遺伝子又はタンパク質は典型的には特定のＣＲＩＳＰＲアレイ内の所与の反復配列と結合することが理解されるであろう。よって、ｃａｓ遺伝子は所与のＤＮＡリピートに特異的であると思われる（すなわち、ｃａｓ遺伝子と反復配列は機能的なペアを形成する）。
【０１３８】
さらになお、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの主要な３つのタイプ：Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型を詳細に記載する。
【０１３９】
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、恐らくさまざまな組成物とカスケード（Ｃａｓｃａｄｅ）様複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子にくわえて、別々のヘリカーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼ活性をもつ大きなタンパク質をコードするｃａｓ３遺伝子を含有する。これらの複合体は、Ｃａｓタンパク質の大きなスーパーファミリーを形成し、少なくとも１つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ；フェレドキシンフォールドドメインとしても知られる）及び特徴的なグリシンリッチループを含有するｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＲＡＭＰｓ）に包含されてきた多くのタンパク質を含有する。ＲＡＭＰスーパーファミリーは、包括的な配列及び構造比較に基づいて大きなＣａｓ５及びＣａｓ６ファミリーを包含する。さらに、Ｃａｓ７（ＣＯＧ１８５７）タンパク質は別の異なるＲＡＭＰスーパーファミリー内の大きなファミリーである。
【０１４０】
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＤＮＡを標的にすると思われ、標的切断はＣａｓ３のＨＤヌクレアーゼドメインによって触媒される。数種のＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムではＣａｓ４のＲｅｃＢヌクレアーゼドメインはＣａｓ１に融合されているので、Ｃａｓ４はむしろ代わってスペーサー獲得における役割に担う可能性がありうる。いずれのＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、具体的には、Ｉ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ型のいずれか１つが本発明に適用可能でありうることが留意されるべきである。
【０１４１】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、「ＨＮＨ」型システム（ストレプトコッカス属様；ナイセリア・メニンギティディスＡ群血清型株Ｚ２４９１又はＣＡＳＳ４のＮｍｅｎｉサブタイプとしても知られ）を含み、そのシステムでは、遍在するＣａｓ１及びＣａｓ２にくわえて、単一で非常に大きなタンパク質であるＣａｓ９はｃｒＲＮＡを生成し、標的ＤＮＡを切断するのに十分であると思われる。Ｃａｓ９は少なくとも２つのヌクレアーゼドメイン、アミノ末端近くにＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン、及びタンパク質の中程にＨＮＨ（又はＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインを含有するが、これらのドメインの機能はまだ解明されていない。しかし、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは制限酵素に富み、エンドヌクレアーゼ活性をもつので、標的切断の役割を担っている可能性が高い。
【０１４２】
ＩＩ型システムは、トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ中のリピートの一部の二本鎖形成を伴う独特のメカニズムを通してｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを切断する。続いて、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセシング経路の最初の切断がこのリピート領域で起こる。この切断はＣａｓ９の存在下で、ハウスキーピング、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＩＩＩによって触媒される。さらになお、ＩＩ型システムはｃａｓ９、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃｓｎ２、及びｃａｓ４遺伝子の少なくとも１つを含むことが留意されるべきである。いずれのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、具体的には、ＩＩ−Ａ又はＢ型のいずれか１つが本発明に適用可能でありうることが理解されるべきである。
【０１４３】
ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ポリメラーゼ及び少なくともいくつかのＲＡＭＰがカスケード複合体に類似したスペーサー−リピート転写産物のプロセシングに関与すると思われるＲＡＭＰモジュール（ｍｏｄｕｌｅｓ）を含有する。ＩＩＩ型システムは、（Ｍｔｕｂｅ又はＣＡＳＳ６としても知られる）ＩＩＩ−Ａ型及び（ポリメラーゼ−ＲＡＭＰモジュールとしても知られる）ＩＩＩ−Ｂ型のサブタイプにさらに分けることができる。スタフィロコッカス・エピデルミデスに関して生体内で示されているように、ＩＩＩ−Ａ亜型システムはプラスミドを標的にでき、この亜型にコードされるポリメラーゼ様タンパク質（ＣＯＧ１３５３）のＨＤドメインが標的ＤＮＡの切断に関与しているようである。フリオサス種由来のＩＩＩ−Ｂ亜型システムについて示されているように、少なくともインビトロではＩＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムがＲＮＡを標的にできる有力な証拠がある。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに属するいずれのｃａｓ遺伝子、例えば、ｃａｓ６、ｃａｓ１０、ｃｓｍ２、ｃｓｍ３、ｃｓｍ４、ｃｓｍ５、ｃｓｍ６、ｃｍｒ１、ｃｍｒ３、ｃｍｒ４、ｃｍｒ５、ｃｍｒ６、ｃａｓ１、及びｃａｓ２のいずれか１つが本発明の目的に使用されうることが理解されるべきである。さらになお、ＩＩＩ−Ａ型またはＩＩＩ−Ｂ型システムのいずれか１つが、本発明のキット、構成要素、及び方法に使用されうる。特に関心があることには、内在性病原性遺伝子が本発明のキット及び方法によって標的にされる具体的な場合、ＩＩＩ−Ｂ型システムが使用されうる。
【０１４４】
３つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステムは、アーキア及び真正細菌の主要な系統のなかで明らかに不均一な分布を示す。特に、ＩＩ型システムはいまのところ真正細菌のみで見出され、一方でＩＩＩ型システムはアーキアでより多くみられる。
【０１４５】
典型的には、リピートクラスターの前に、種内では保存されているが種間では保存されていない、長さが数百塩基対のＡＴリッチ領域である「リーダー」配列がある。ＣＲＩＳＰＲ関連（「ｃａｓ」）遺伝子は、それらの遺伝子座に結合する一連の保存されたタンパク質コーディング遺伝子であり、通常、アレイの片側に存在する。数種のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のスペーサー配列の解析から、スペーサーがバクテリオファージ及びプラスミドなどの外来可動遺伝要素由来の配列に一致することが明らかになった。配列が決定されている細菌のゲノムの約４０％及び配列が決定されているアーキア（原核生物）のゲノムの約９０％が、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含有する。
【０１４６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ免疫系は自己免疫反応を避けるために自己と非自己を区別しなければならない。「Ｉ型及びＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム」では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有する外来ＤＮＡは分解の標的とされるが、宿主のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の潜在的な標的はＰＡＭを含有せず、それによってＲＮＡ誘導型干渉複合体から回避される。
【０１４７】
上で述べたように、ある実施形態では、本発明のキットの感受性亢進構成要素は少なくとも１つのｃａｓ遺伝子を含みうる。より具体的な実施形態では、そのようなｃａｓ遺伝子は、少なくとも１つのＩ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子でありうる。
【０１４８】
いくつかの具体的な実施形態では、そのような少なくとも１つのｃａｓ遺伝子はＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子でありうる。「Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ」システムは、Ｋ型エシェリキア・コリに生来そなわっているものを指す。該システムは、ファージ感染を阻害し、プラスミドを抜き、接合要素伝播を防ぎ、且つ細胞を死滅させることが示されている。このＣＲＩＳＰＲ機構は、特異的な細胞内ＤＮＡを誘導可能で且つ標的を定めた方法で、残りのＤＮＡを完全なまま残して分解するのに使用することができる。
【０１４９】
さらにいくつかの他の実施形態では、本発明の溶原性ファージ内に含まれる少なくとも１つのＩ−Ｅ型ｃａｓ遺伝子は、ｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃａｓ７、ｃａｓ５、ｃａｓ６ｅ、及びｃａｓ３遺伝子の少なくとも１つでありうる。ある実施形態では、ｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃａｓ７、ｃａｓ５、ｃａｓ６ｅ、及びｃａｓ３遺伝子の少なくとも１つにくわえて、本発明の感受性亢進構成要素はｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子の少なくとも１つをさらに含みうる。
【０１５０】
いくつかの具体的な実施形態では、本発明の感受性亢進構成要素のｃａｓ遺伝子はｃｓｅ１遺伝子を含む。より具体的な実施形態では、そのようなｃｓｅ１遺伝子は、タンパク質ｉｄ  ＡＡＣ７５８０２．１で表わされるエシェリキア・コリＫ−１２株ＭＧ１６５５亜株のＣｓｅ１タンパク質をコードする。より具体的な実施形態では、ｃｓｅ１遺伝子は配列番号６０で表わされる核酸配列を含みうる。より具体的な実施形態では、ｃｓｅ１遺伝子は、配列番号６７で表わされるアミノ酸配列を含むＣｓｅ１タンパク質をコードする。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の感受性亢進構成要素はｃｓｅ２遺伝子を含む。より具体的な実施形態では、そのようなＣｓｅ２タンパク質は、タンパク質ｉｄ  ＡＡＣ７５８０１．１で表わされるエシェリキア・コリＫ−１２株ＭＧ１６５５亜株でありうる。さらなる実施形態では、本発明に用いられるＣｓｅ２タンパク質は配列番号６１で表わされる核酸配列によってコードされうる。より特定の実施形態では、ｃｓｅ２タンパク質は配列番号６８で表わされるアミノ酸配列を含みうる。さらになお、ある実施形態では、本発明の感受性亢進構成要素はｃａｓ７を含みうる。より具体的な実施形態では、前記ｃａｓ７  タンパク質は、ｉｄ  ＡＡＣ７５８００．１のエシェリキア・コリＫ−１２株ＭＧ１６５５亜株Ｃａｓ７タンパク質でありうる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ７タンパク質は配列番号６２で表わされる核酸配列によってコードされる。一層さらなる実施形態は、配列番号６９で表わされるアミノ酸配列を含むＣａｓ７タンパク質に関する。
【０１５１】
さらになお、本発明の感受性亢進構成要素はｃａｓ５を含みうる。より具体的に、ｉｄ  ＡＡＣ７５７９９．２のエシェリキア・コリＫ−１２株ＭＧ１６５５亜株Ｃａｓ５タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ５タンパク質は配列番号６３で表わされる核酸配列によってコードされる。さらなる実施形態では、Ｃａｓ５タンパク質は配列番号７０で表わされるアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の感受性亢進構成要素はｃａｓ６ｅを含みうる。より具体的な実施形態では、Ｃａｓ６ｅタンパク質はｉｄ  ＡＡＣ７５７９８．１のエシェリキア・コリＫ−１２株ＭＧ１６５５亜株Ｃａｓ６ｅタンパク質でありうる。ある実施形態では、本発明で用いられるＣａｓ６ｅタンパク質は配列番号６４で表わされる核酸配列によってコードされうる。さらなる実施形態では、Ｃａｓ６ｅタンパク質は配列番号７１で表わされるアミノ酸配列を含みうる。いくつかのさらなる実施形態では、本発明の溶原性ファージはｃａｓ３遺伝子をさらに含む。より具体的な実施形態では、ｃａｓ３遺伝子はｉｄ  ＡＡＣ７５８０３．１のエシェリキア・コリＫ−１２株ＭＧ１６５５亜株Ｃａｓ３タンパク質をコードする。さらなる実施形態では、Ｃａｓ３タンパク質は配列番号６５で表わされる核酸配列によってコードされる。さらなる実施形態では、Ｃａｓ３タンパク質は配列番号７２で表わされるアミノ酸配列を含みうる。
【０１５３】
本発明のキット及び特に本発明によるその感受性亢進構成要素は、本明細書において以前に記載されているように使用されるｃａｓタンパク質に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％及び具体的には６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の配列相同性又は同一性をもつ、複数のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓタンパク質オーソログ又はホモログに適用されることが留意されるべきである。
【０１５４】
さまざまな種から候補オーソログ又は機能的ホモログを同定及び単離する周知の方法が多くあり、その大部分がヌクレオチド又はタンパク質レベルの配列類似性を利用する。次いで、単離された候補は、シークエンシング及びＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター）のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）などの慣例的なソフトウェアプログラム、ＤＮＡＳＴＡＲ（ウィスコンシン州マディソン）製のＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ）、又は他の方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）中のＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」及びＢｉｓｈｏｐ（ｅｄ．）「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ」第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）を用いる配列比較に供される。
【０１５５】
上で述べたように、ある実施形態では、本発明のキット、システム、及び方法によって用いられるＣＲＩＳＰＲカスケード遺伝子は、エシェリキア・コリＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関するものでありうる。それでもなお、上にも示されているように、他のいずれのＣＲＩＳＰＲシステムも本発明の目的に適用可能でありうることが理解されるべきである。
【０１５６】
よって、さらにいくつかのさらなる代替的な実施例では、本発明のキット及びシステムで使用される少なくとも１つのｃａｓ遺伝子は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム（ＩＩ−Ａ型又はＩＩ−Ｂ型のいずれか）の少なくとも１つのｃａｓ遺伝子でありうる。より具体的な実施形態では、本発明のキットによって使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子はｃａｓ９遺伝子でありうる。そのようなシステムはｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃｓｎ２、及びｃａｓ４遺伝子の少なくとも１つをさらに含みうることが理解されるべきである。
【０１５７】
Ｃａｓ９による２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断は「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」免疫系の顕著な特徴である。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ９は、ＲＮＡ：ＤＮＡ相補性を利用して配列特異的２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断の標的部位を識別するＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。標的にされるＤＮＡ配列は、短い回文配列リピートで分けられる一連のＢ３０〜４０ｂｐのスペーサーであるＣＲＩＳＰＲアレイによって特定される。アレイはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡとして転写され、Ｃａｓタンパク質複合体と結合してプロトスペーサーとして知られる相補的ＤＮＡ配列を標的にするより短いｃｒＲＮＡにプロセスされる。これらのプロトスペーサー標的は、標的認識に必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られるさらなる隣接配列ももたなければならない。結合した後、Ｃａｓタンパク質複合体はＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能して標的において両鎖を切断し、それに続いてＤＮＡ分解がエキソヌクレアーゼ活性によって起こる。
【０１５８】
いくつかの具体的な実施形態では、ストレプトコッカス・ピオゲネスＭ１  ＧＡＳのＣａｓ９、具体的にはタンパク質ｉｄ：ＡＡＫ３３９３６．１のＣａｓ９が本発明のキットに適用されうる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号６６で表わされる核酸配列によってコードされうる。さらなる具体的な実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号７３で表わされるアミノ酸配列を含みうる。上で述べたように、該方法の使用は少し改めればさらに拡大されうることが理解されるべきである。例えば、該システムは特異的なファージを標的にすることによってファージ溶原化及び形質導入を特異的に削減するように設計され、よって病原性遺伝子伝播の大きな源を減らしうる。この方法の別の変更は、可動要素上で伝播されるものよりもむしろ、染色体上の要素によってコードされる耐性遺伝子（本明細書において内在性遺伝子とも呼ぶ）を扱うことができる。そのようなケースでは、宿主を死滅させることになるのでＤＮＡを標的にすることは伝播されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓに対してカウンターセレクションすることになる。しかし、耐性要素の削減はＲＮＡを標的にするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、例えばＩＩＩ−Ｂ型システムを用いてやはり達成することができる。病原体を死滅させないので、ＲＮＡを標的にすることはコードされる遺伝子によって付与される耐性を削減することになり、送達されている溶原性ファージに対するカウンターセレクションを回避することになる。よって、遺伝子操作されたスペーサーの柔軟性及び使い易さは、さまざまな型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの利用可能性と併せて、該方法の多くの有用なバリエーションを可能にしうる。この点において、発明者らが高い頻度で使用されるＩＩ−Ａ亜型よりもむしろＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＩ−Ｅ亜型を使用したということは、所望の結果が別のサブタイプでも得られうることを示す。よって、いくつかの実施形態では、エピクロモソーマル又は染色体外病原性遺伝子を標的に対して、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＩ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ−Ａ型システムが使用されうる。しかし、内在性遺伝子又は染色体遺伝子である場合、ＩＩＩ−Ｂ型システムが、本発明の構成要素、キット、及び方法に適用可能でありうる。
【０１５９】
さらになお、ある具体的且つ非限定的な実施形態では、本発明の感受性亢進構成要素の遺伝子改変溶原性ファージラムダはＩＹＭＭＰｈ３と表わされるファージでありうる。さらにより具体的な実施形態では、そのような遺伝子改変ファージは配列番号５９で表わされる核酸配列を含みうる。
【０１６０】
本発明は、細菌性病原体の病原性遺伝子を標的にし、破壊する効率的なキット、システム、及び方法を提供する。より具体的に、そのような細菌又は細菌集団は抗生物質耐性菌でありうる。特に関心があるのは院内感染症に係わるいずれの細菌である。「院内感染症」という用語は病院内感染症を指し、具体的には、発症が表面などの病院環境及び／又は医療関係者に好発して起こる感染であり、入院中の患者に感染する。院内感染症は潜在的に抗生物質に対して耐性がある生物に起因する感染症である。院内感染症は罹病率及び死亡率に影響を及ぼし、大きな経済的負担を引き起こす。抗生物質に対する耐性のレベルが上がっていること及び病院入院患者の病気の重症度が高くなっていることを考慮すると、この問題は早急な解決が必要である。
【０１６１】
アメリカ合衆国で、疾病管理予防センターはあらゆるタイプの微生物に起因するおおよそ１７０万件の病院関連感染症あると推定した。グラム陰性菌による感染症は年間の患者の死亡の３分の２を占める推定されている。現在、グラム陰性菌クロストリジウム・ディフィシルは、合衆国及び欧州における院内下痢症の主因として認識されている。他の一般的な院内生物としては、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、バンコマイシン耐性腸球菌、耐性腸内細菌、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター属、及びステノトロホモナス・マルトフィリアが挙げられる。
【０１６２】
院内感染病原体は、グラム陽菌（スタフィロコッカス・アウレウス、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）、グラム陽性球菌（エンテロコッカス・フェカリス及びエンテロコッカス・フェシウム）、グラム陰性桿状生物（クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、エシェリキア・コリ、プロテウス・エルギノーサ、セラチア属の複数の種）、グラム陰性桿菌（エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ）、好気性グラム陰性球桿菌（アシネトバクター・バウマニ、ステノトロホモナス・マルトフィリア）、及びグラム陰性好気性桿菌（ステノトロホモナス・マルトフィリア、以前はシュードモナス・マルトフィリアとして知られていた）に細かく分けられうる。多くのなかでも、シュードモナス・エルギノーサは極めて重大な院内感染グラム陰性好気性桿状病原体である。
【０１６３】
本発明のいくつかの実施形態は、エシェリキア・コリ、シュードモナス・エルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、クロストリジウム・ディフィシル、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、及びエンテロバクター属の複数種（具体的にはＥＳＫＡＰＥ細菌）の少なくとも１つのいずれの株の細菌における病原性遺伝子を標的にして削減するのに使用する本発明のキット又はシステムに関する。
【０１６４】
より具体的な実施形態では、細菌は、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、クロストリジウム・ディフィシル、及びスタフィロコッカス・アウレウスのいずれか１つでありうる。
【０１６５】
さらなる実施形態では、本発明による本明細書において言及される細菌としては、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・シュードツベルクローシス、サルモネラ・チフィ、シュードモナス・エルギノーサ、ビブリオ・コレラエ、シゲラ・ソネイ、ボルデテラ・パータシス、プラスモディウム・ファルシパルム、クラミジア・トラコマチス、バチルス・アンシラシス、ヘリコバクター・ピロリ、及びリステリア・モノサイトゲネスが挙げられうる。
【０１６６】
他の特定の実施形態では、本発明のキット又はシステムは、いずれのエシェリキア・コリ株、具体的には、Ｏ１５７：Ｈ７、腸管付着性（ＥＡＥＣ）エシェリキア・コリ、腸管出血性（ＥＨＥＣ）エシェリキア・コリ、腸管侵入性（ＥＩＥＣ）エシェリキア・コリ、腸管病原性（ＥＰＥＣ）エシェリキア・コリ、毒素原性（ＥＴＥＣ）エシェリキア・コリ、及びびまん付着性（ＤＡＥＣ）エシェリキア・コリのいずれか１つで使用するのに特に適する。
【０１６７】
本発明のキット又はシステムのいずれのユニット又は構成要素又は要素は、いずれの組成物、調製物、又は装置に含まれるか存在しうることが理解されるべきである。
【０１６８】
さらになお、本発明によって使用されるいずれの組成物又は調製物は、少なくとも１つの本発明のキット、又は少なくとも１つのその要素、構成要素、若しくはユニットを含みうることが理解されるべきである。より具体的な実施形態では、キット又はそのいずれの要素若しくは構成要素、例えば、少なくとも１つの選択的構成要素及び少なくとも１つの感受性亢進構成要素は、いずれの好適な比率で存在しうる。例えば、約０．０００１〜１０，０００：０．０００１〜１０，０００である。より具体的には、０．０００１：１００００及び１００００：０．０００１である。ある実施形態では、異なる病原性遺伝子及び／又は異なる病原性細菌を対象にするキットのカクテルが使用されうる。いくつかの実施形態では、本開示は、細菌集団内の細菌の病原性細菌遺伝子を標的にする本発明の遺伝子改変ファージにＣＲＩＳＰＲシステムを含む。細菌集団は病原性及び非病原性メンバーを伴う１つのタイプの細菌を含むことができ、又は細菌集団は複数の細菌種を含むことができ、ある特定の種のみが集団に病原性及び非病原性メンバーをもつ。いくつかの実施形態では、混合細菌集団は少なくとも２つの異なる株又は種の細菌を含みうる。その他の実施形態では、混合細菌集団は２つの異なるタイプの細菌から最高で１０００又はそれ以上の異なるタイプまでの細菌を含みうる。本発明のキット及びシステムは病原性遺伝子を含む細菌のみを特異的に標的にし、いずれの同種又は異種性の細菌集団の前記病原性遺伝子の特異的で且つ標的化された削減をもたらしうる。
【０１６９】
本明細書で提示されている原理証明は、限られた対抗手段しか開発されてきていない、新たに出現している薬剤耐性病原体の脅威を減少させることに向けた一歩である。簡便な遺伝子工学を用いて、細菌は認可され且つ有用な抗生物質に対して感受性をもつことができることが示された。システムは病院環境表面の簡単な処理であり、手指消毒剤において、及びおそらくプロバイオティクス食品添加物として有用であり、病院環境表面及び医療関係者の正常な細菌叢に常在する病原体の耐性を失わせる。耐性病原体を選び抗生物質及び除菌剤とは対照的に、本明細書で提案する処理は感受性病原体を富化及び選択する。そのうえ、実施例に示されるように、該システムは耐性決定因子を水平に伝播又は受容できない病原体を富化することによって抗生物質に対する耐性の拡散を縮小しうる。富化された、感受性のある集団は、新たに導入された耐性病原体がそれらの生態的地位を上回ることによって定着するのを防ぎうる。
【０１７０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは目的のいずれの遺伝子を削減するようにプログラムできるので、該システムはいずれの抗生物質耐性遺伝子の伝播を制限するのにも使用されうる。
実際に、抗生物質耐性遺伝子の削減に必要なスペーサーの短い配列は、単一アレイでの数十のそのようなスペーサーの構築を可能にし、よって耐性が現われている膨大な数の抗生物質の使用を再び可能にする。また、選択に使用されることになるいくつかの溶菌性ファージに対する保護も同時にプログラムでき、よってこれらの溶菌性ファージから免れた非感受性亢進変異体の発生を低減することができる。そのうえ、該システムは病原性遺伝子をもつ溶原性ファージ又はいずれのプラスミド若しくはＤＮＡ要素を標的にするのに使用されうる。ＲＮＡを標的にするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いることによって、該システムは病原体自体によってコードされる病原性遺伝子を標的にすることさえできる。
【０１７１】
プラスミドＤＮＡ及び溶菌性ファージに対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの作用は十分に確立されている。それでもなお、病原体を抗生物質に対して感受性にし、且つ耐性決定因子の水平遺伝子伝播を減らすツールとしてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを臨床現場において使用することは新規である。本明細書において提供される原理証明は、溶原性ファージ病原体の大半にみつかり、適合性のあるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは多くの病原体で機能するはずであるので、さまざまな病原体−ファージ系に適用することができる。抗生物質及び生物的防除とは対照的に、本明細書で提案するシステムを広く使用することは、細菌を抗生物質に対してより耐性にするのではなく、より感受性にすることによって院内感染症の性質を変える可能性があることになる。
【０１７２】
本発明の発明者らは、上記溶原性バクテリオファージを、表面、例えば固体表面若しくは液体表面、又は固体担体、いずれの物質、又はいずれの物品上の細菌集団に感染させ、それらの上に存在する抗生物質非感受性細菌を抗生物質に対して感受性にすることを企図する。
【０１７３】
本発明の感受性亢進構成要素として機能を果たす溶原性バクテリオファージのカクテルは、表面、例えば、固体表面若しくは液体表面、又は固体担体、いずれの物質、又はいずれの物品に塗布されうる。各溶原性バクテリオファージは異なる宿主特異性をもち、ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーの抗生物質耐性遺伝子に対する相同配列をコードすることによってそれぞれはそれらの遺伝子を特異的に標的にするＣＲＩＳＰＲアレイをもつ。アレイをもつ細菌を選択及び富化するために、アレイは溶菌性ファージに対するスペーサーももち、よってこれらの薬剤から細菌を保護しうる。これらの溶菌性ファージは環境に噴霧され、病原体が感受性亢進ＣＲＩＳＰＲアレイを得るように選択圧をかけてうる。溶原性バクテリオファージは、細菌に毒性のある因子を発現するように改変されていないので、その宿主に対して殺菌性ではないことが理解されるであろう。
【０１７４】
次いで、富化された抗生物質感受性集団は、その生態的地位を上回ることによって新たに導入された耐性病原体の定着を干渉しうると推定される。本発明の方法は、ファージを使用して病原体を直接的に死滅させないという意味で従来の生物的防除と異なる。結果的に、使用ファージは溶菌性ファージに対する耐性を含むので、使用ファージに対する選択は無く、むしろ該ファージを内部にもつ病原体に対する選択がある。そのうえ、該方法患者体内でのファージの使用を避け、よって生物的防除の毒性に関する問題並びに脾臓及び免疫系によるファージ中和などの他の欠点を克服する。この処置の長期の使用は結果として、病院関係者の生来の細菌叢（皮膚、呼吸器、及び消化管）も置き換えて少ない耐性病原体をもつことになる。
【０１７５】
よって、ある実施形態では、本発明のキット又はシステムの感受性亢進構成要素として使用される溶原性バクテリオファージは、スプレー剤、スティック、塗布剤、ゲル剤、クリーム、ウォッシュ、ワイプ、フォーム、石鹸、油、溶液、ローション剤、軟膏、手指消毒剤、又はペーストとして調合されうることが理解されるべきである。
【０１７６】
さらに他の実施形態では、本発明のキット又はシステムの選択構成要素として使用される溶菌性バクテリオファージは、スプレー剤、スティック、塗布剤、ゲル剤、クリーム、ウォッシュ、液剤、ワイプ、フォーム、石鹸、油、溶液、ローション剤、軟膏、又はペーストとして調合されうる。
【０１７７】
ある実施形態では、本発明のキットの感受性亢進構成要素の溶原性バクテリオファージ及び本発明のキットの選択的構成要素として機能を果たす溶菌性バクテリオファージは同時に適用されてもよく、それぞれ順番に適用されてもよいことが留意されるべきである。代替的に、溶原性バクテリオファージ及び溶菌性バクテリオファージは連日適用されてもよい。これらの構成要素はそれぞれ、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、賦形剤、補助剤、及び／又は希釈剤を随意に含みうる、組成物、製剤、又は、媒体内に含まれうることがさらに留意されるべきである。さらに、慣用の手順に従って組成物は外用又は内服するように構成されることが理解されるべきである。必要に応じて、組成物は可溶化、又はその適用を容易にするいずれの化合物も含んでもよい。
【０１７８】
本発明の活性薬剤は、中性又は塩の形態として調合することができる。医薬的に許容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの遊離アミノ基とともに形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離カルボキシル基とともに形成される塩が挙げられる。
【０１７９】
さらになお、本発明のキット及びシステム及びそのいずれの構成要素は、好ましくは、１〜７日毎に、１日１回の投与又は１日複数回の投与として適用されうる。そのような適用は、１日に１回、２回、３回、４回、５回、若しくは６回行われてもよく、又は１日に１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、又はさらに１か月に１回でもよいことが具体的に企図される。本発明のキット又はそのいずれの構成要素の適用は、最長で１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、１か月、２か月、３か月、又はさらに長く続きうる。具体的には、適用は１日〜１か月続きうる。最も具体的には、適用は１日〜７日続きうる。さらにいくつかの他の実施形態では、本発明のキット及びシステム又はそのいずれの構成要素の適用は、日常的な手順、具体的には、例えば、病院環境における、表面、物品、又はいずれの物質を処理する日々の手順でありうる。
【０１８０】
本発明のキット及びシステム並びにそのいずれの構成要素の単回又は複数回の適用は、必要とされる量及び頻度に応じて適用される。いずれにしても、本発明のキット及びシステム並びにそのいずれの構成要素は、病原性細菌の遺伝子の水平伝播を効果的に防ぎ、最も重要なことに、前記病原性遺伝子を含む細菌に起因する哺乳類対象のいずれの病的障害を防ぐのに十分な量を与えるべきである。好ましくは、有効量は１度に適用されうるが、結果が達成されるまで定期的に適用されてもよい。
【０１８１】
病院の表面は細菌集団の複合混合物を含有し、そのいくつかはさまざまな種に属する耐性病原体である。表面に噴霧することは、これらの病原体を標的にする効果的な方法でありうる。ある実施形態では、噴霧される液体は溶原性ＣＲＩＳＰＲＣａｓをコードするファージ及び溶菌性ファージの両方を含有すべきである。送達は、病院内の石鹸又はその他の手指消毒剤に添加された液体の形でも行われうる。これらの送達方法は患者に組織の内部でのファージの使用を回避し、よって生物的防除の毒性に関する問題及び他の欠点を克服する。
【０１８２】
上で述べたように、この方法は病院環境表面及び医療関係者の皮膚細菌叢を標的にする手指消毒剤、石鹸、又は他の液体を処理するのに適用されうる。耐性病原体を選ぶ抗生物質及び消毒剤とは対照的に、本明細書で提案する処理は感受性病原体を富化及び選択する。具体的には、この方法は抗生物質に対する耐性が生死にかかわる状況である免疫機能が低下した患者が入院している医療部にさらに広めうる。耐性病原体を選ぶ抗生物質及び消毒剤とは対照的に、本明細書で提案する処理は感受性病原体を富化及び選択する。そのうえ、該システムは耐性決定因子を水平に受容又は伝播できない病原体を富化するので抗生物質に対する耐性の蔓延をさらに減らしうる。富化された、感受性のある集団は、新たに導入された耐性病原体がそれらの生態的地位を上回ることによって定着するのを防ぎうる。
【０１８３】
細菌細胞を、耐性を付与するプラスミドを標的にする特異的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓコンストラクトと接触させることは、複合細菌集団中の同一株内の抗生物質耐性病原体と抗生物質感受性病原体とを識別できることがさらに留意されるべきである。
【０１８４】
本発明の第２の態様は、病原性遺伝子の細菌間の水平伝播を干渉する方法に関する。より具体的には、該方法は、そのような病原性遺伝子を内部にもつ細菌を含有する固体表面を（ｉ）本発明に記載の少なくとも１つの選択的構成要素、（ｉｉ）本発明の少なくとも１つの感受性亢進構成要素、並びに（ｉｉｉ）少なくとも１つの（ｉ）及び（ｉｉ）を含むいずれのキットの少なくとも１つと接触させ、それによって病原性遺伝子を不活化し、その水平伝播を干渉する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明のキット又はシステムは本明細書において先に記載されたもののいずれかでありうる。
【０１８５】
よって本発明は、細菌集団内の病原性遺伝子の水平伝播を防止、低減、減衰、阻害、及び削減する方法を提供する。本明細書において「遺伝子の水平伝播（Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」（ＨＧＴ）は従来の生殖以外の方法で生物間の遺伝子の伝播を指す。遺伝子の水平伝播（ｌａｔｅｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＬＧＴ）とも呼ばれ、有性生殖又は無性生殖を介した親世代から子孫への遺伝子の伝達である垂直伝播と対照をなす。上で述べたように、水平遺伝子伝播は、細菌の抗生物質に対する耐性及び病原性の伝達の一番の理由である。この水平遺伝子伝播は多くの場合、溶原性バクテリオファージ及びプラスミドが係わる。１つの種の細菌の抗生物質に対する耐性の原因である遺伝子は、さまざまな機構を通して（例えばＦ線毛を介して）別の種の細菌で伝播されることができる。より具体的な実施形態では、本発明のキット及び方法によって干渉、阻害、削減、又は低減される水平伝播は、細菌接合の過程において細胞間のＤＮＡの伝播を可能にする接合線毛によって影響されるＨＧＴでありうる。より具体的には、線毛は典型的には直径が６〜７ｎｍである。接合の間、供与菌から現れる線毛は受容菌を捕捉し、それを近づけ、最終的には交配橋（ｍａｔｉｎｇ  ｂｒｉｄｇｅ）の形成を引き起こし、ドナーからレシピエントへのＤＮＡの伝播を可能にする直接接触及び制御細孔の形成を確立する。時に、伝播されたＤＮＡは（多くの場合プラスミドにコードされる）抗生物質耐性遺伝子から成る。さらに、本発明の方法及びキットは、病原性遺伝子の伝播、具体的には細胞間の水平伝播につながるいずれの経路又は機構を干渉しうることが理解されるべきである。さらに、本発明の方法は、形質導入、自然形質転換能（ｎａｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）、又はトランスポゾンのいずれかによって仲介されるＨＧＴを干渉するのに適用可能でありうることが留意されるべきである。
【０１８６】
本発明による水平伝播を干渉することは、細菌間の病原性遺伝子のいずれの伝播（例えば水平伝播）を、約１％〜９９．９％、具体的には、約１％〜約５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約５０％〜５５％、約５５％〜６０％、約６０％〜６５％、約６５％〜７０％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％、約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜９９％、又は約９９％〜９９．９％のいずれか１つだけ、削減、阻害、低減、抑制、減少、減衰、又は遅延のいずれかすることを包含しうることが理解されるべきである。
【０１８７】
より具体的な実施形態では、そのような干渉は、本発明のキット及び方法の不在下で起こる伝播と比べて、細菌病原性遺伝子の水平伝播の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％でありうる。
【０１８８】
さらに本発明は、病原性遺伝子を含有する細菌の細菌感染に起因する哺乳類対象の病的状況を予防する方法を提供する。該方法は、対象の近くの少なくとも１つの固体表面若しくは液体表面、物質、物品、又は担体を、（ｉ）本発明に記載の少なくとも１つの選択的構成要素、（ｉｉ）本発明の少なくとも１つの感受性亢進構成要素、並びに（ｉｉｉ）少なくとも１つの（ｉ）及び（ｉｉ）を含むいずれのキットの少なくとも１つと接触させ、それによって、そのような対象の環境に存在する細菌に含まれうる病原性遺伝子を標的にて不活化することを含む。そのように、本発明の方法は細菌のこれらの病原性遺伝子の不活性化につながり、それによって、少なくとも１つの完全なままの病原性遺伝子を発現している細菌に起因しうる病的状況を予防する。いくつかの実施形態では、本発明に記載のキットはいずれも、いずれの本発明の方法に使用されうる。
【０１８９】
いくつかの具体的な実施形態では、本発明の方法は、表面、具体的には、固体表面若しくは液体表面、物品、又は（具体的には、対象の近くの）いずれの物質を、本発明の感受性亢進構成要素である溶原性バクテリオファージと接触させる工程、それに続いて該固体表面を本発明のキット又はシステムの選択構成要素である溶菌性バクテリオファージと接触させる工程を伴う。
【０１９０】
本明細書において「接触させること」という用語は、細菌細胞と直接的又は間接的に接触するように本発明の溶原性バクテリオファージ（及び随意に溶菌性バクテリオファージ）を適切に配置することを指す。よって、本発明の溶原性バクテリオファージ（及び随意に溶菌性バクテリオファージ）を望ましい表面に適用すること及び／又は細菌細胞に直接適用することの両方を、本発明は企図する。
【０１９１】
表面を本発明のキット、及び具体的には溶原性バクテリオファージ（感受性亢進構成要素）及び溶菌性バクテリオファージ（選択的構成要素）と接触させることは、例えば、噴霧、展着、湿らせること（ｗｅｔｔｉｎｇ）、浸漬、浸し塗り（ｄｉｐｐｉｎｇ）、塗装、超音波溶接、溶接、結合形成、又は接着を含む当該技術分野において公知のいずれかの方法を用いて達成することができる。
【０１９２】
本発明は多様な表面を本発明のバクテリオファージと接触させること想定し、例えば、布、繊維、フォーム、フィルム、コンクリート、石材、ガラス、金属、プラスチック、ポリマーなどが挙げられる。
【０１９３】
特定の実施形態によれば、バクテリオファージは、病院、ホスピス、老人ホーム、又は他のそのような介護療養施設にある表面と接触する。
【０１９４】
保健に関連する他の表面としては、浄水、貯水、及び配水に係わるそれらの物品並びに食品加工に係わるそれらの物品の内面及び外面が挙げられる。よって本発明は、食品又は飲料工場内の固体表面を被覆すること想定する。
【０１９５】
また、保健に関連する表面としては、栄養、衛生、又は疾患予防をもたらすことに係わる家庭用品の内面及び外面を挙げることができる。よって、本発明のバクテリオファージは便器、カテーテル、経鼻胃管チューブ、人工呼吸器などを消毒するのにも使用されうる。
【０１９６】
その他の実施形態では、本発明のキットは処置を受ける対象の近くに適用されうる。「処置を受ける対象の近く」という表現は、本発明によるキットが抗生物質耐性遺伝子の水平伝播を防ぐために適用されうる前記対象を囲む外周に関する。したがって、理解される。「前記対象の近く」は、前記対象の最大で少なくとも約１センチメートル（ｃｍ）、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｍ、９ｍ、１０ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍ、４０ｃｍ、５０ｃｍ、６０ｃｍ、７０ｃｍ、８０ｃｍ、９０ｃｍ、１メートル（ｍ）、２ｍ、３ｍ、４ｍ、５ｍ、６ｍ、７ｍ、８ｍ、９ｍ、１０ｍ、１１ｍ、１２ｍ、１３ｍ、１４ｍ、１５ｍ、１６ｍ、１７ｍ、１８ｍ、１９ｍ、２０ｍ、３０ｍ、４０ｍ、又はさらに５０ｍの範囲内に存在するあらゆる対象を包含する。また、「前記対象の近く」という用語は、処置を受ける対象の前記範囲のそれらが置かれる前に本発明のキットが適用される対象体にも関する。
【０１９７】
１つの実施形態によれば、本発明のキット又はいずれの構成要素若しくはいずれのバクテリオファージは、固体表面に、１２時間毎、毎日、週に６回、週に５回、週に４回、週に３回、週に２回、又はさらに週に１回適用されうる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は本明細書において上で本発明によって規定されているキット及びシステムのいずれかを使用しうることが理解されるべきである。より具体的に、いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるキットの選択構成要素は、感受性亢進構成要素の少なくとも１つのスペーサーによって認識される少なくとも１つのプロトスペーサーを含むいずれのＤＮＡ配列及び少なくとも１つの毒性因子又はいずれの殺菌因子をコードする配列でありうる。さらにいくつかの他の実施形態では、選択的構成要素は少なくとも１つの溶菌性バクテリオファージを含みうる。いくつかの具体的な実施形態では、そのような溶菌性バクテリオファージは、前記細菌病原性遺伝子内に含まれる少なくとも１つの核酸配列に少なくとも７０％の同一性をもつ少なくとも１つのプロトスペーサーを含む少なくとも１つの遺伝子改変バクテリオファージでありうる。さらなる実施形態では、本発明の方法で使用されるキットの感受性亢進構成要素は、少なくとも１つのｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも１つの組み換えベクターを含みうる。そのようなベクターは、少なくとも１つの前記ＣＲＩＳＰＲアレイの核酸配列をさらに含みうる。
【０１９９】
さらになお、そのようなベクターは、前記溶菌性バクテリオファージ内に含まれる少なくとも１つの核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー及び前記少なくとも１つの病原性遺伝子内に含まれる核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーを含み、それによって、溶菌性ファージと前記病原性遺伝子の両方を標的にして不活化する少なくとも１つの遺伝子改変バクテリオファージでありうる。
【０２００】
ある実施形態では、標的細菌病原性遺伝子は少なくとも１つの細菌の内在性遺伝子又は代替的にエピクロモソーマル遺伝子でありうる。ある実施形態では、病原性遺伝子は抗生物質耐性遺伝子でありうる。代替的に、病原性遺伝子は少なくとも１つの病原性因子及び少なくとも１つの毒素をコードする遺伝子でありうる。ある実施形態では、本発明の方法で使用されるキットによって標的にされる抗生物質耐性遺伝子は、ＣＴＸ−Ｍ−１５、ニューデリー・メタロβラクタマーゼ（ＮＤＭ）−１、２、５、６、基質特異性拡張型ベータラクタマーゼ耐性因子（ＥＳＢＬ因子）、ベータラクタマーゼ、及びテトラサイクリンＡ（ｔｅｔＡ）からなる群より選択される耐性因子をコードしうる。より具体的な実施形態では、本発明の方法で使用されるキットの感受性亢進構成要素の少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーは、ＣＴＸ−Ｍ−１５の少なくとも１つのプロトスペーサー、ＮＤＭ−１、２、５、６の少なくとも１つのプロトスペーサー、ＥＳＢＬ因子の少なくとも１つのプロトスペーサー、ベータラクタマーゼの少なくとも１つのプロトスペーサー、ｔｅｔＡの少なくとも１つのプロトスペーサー、及び溶菌性バクテリオファージの少なくとも１つのプロトスペーサーの少なくとも１つを標的にする核酸配列を含みうる。
【０２０１】
より具体的に、少なくとも１つのＣＴＸ−Ｍ−１５のプロトスペーサーは、配列番号４９、５０、及び５１のいずれか１つで表わされる核酸配列を含みうる。少なくとも１つの前記ＮＤＭ−１のプロトスペーサーは、配列番号４６、４７、及び４８のいずれか１つで表わされる核酸配列を含みうる。
【０２０２】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法で使用されるキットの選択構成要素として用いられる遺伝子改変溶菌性バクテリオファージは、（ａ）配列番号４９、５０、及び５１のいずれか１つで表わされる核酸配列を含む少なくとも１つのＣＴＸ−Ｍ−１５のプロトスペーサー及び（ｂ）配列番号４６、４７、及び４８のいずれか１つで表わされる核酸配列を含む少なくとも１つのＮＤＭ−１のプロトスペーサーの少なくとも１つを含みうる。
【０２０３】
ある種特定で且つ代替的な実施例では、本発明の方法で使用されるキットの感受性亢進構成要素は、溶菌性バクテリオファージの必須遺伝子内に含まる核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーを含みうる。より具体的に、そのような溶菌性バクテリオファージは、少なくとも１つのＴ７様ウイルス及びＴ４様ウイルスでありうる。いくつかの具体的な実施形態では、そのようなＴ７様ウイルスは少なくとも１つの腸内細菌ファージＴ７でありうる。
【０２０４】
さらにいくつかの他の実施形態では、本発明の方法で使用されるキットの感受性亢進構成要素は、バクテリオファージ、具体的にはラムダ溶原性バクテリオファージを含みうる。さらになお、本発明の方法で使用されるキットの感受性亢進構成要素の少なくとも１つのｃａｓ遺伝子は、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つの、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子でありうる。
【０２０５】
いくつかの具体的な実施形態では、本発明の方法で使用されるキットの感受性亢進構成要素は、Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子を含みうる。より具体的な実施形態では、そのようなＩ−Ｅ型ｃａｓ遺伝子は、ｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃａｓ７、ｃａｓ５ｅ  ｃａｓ６、及びｃａｓ３遺伝子の少なくとも１つでありうる。いくつかの代替的な実施例では、本発明の方法で使用されるキットの感受性亢進構成要素の少なくとも１つのｃａｓ遺伝子は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子でありうる。より具体的な実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子はｃａｓ９遺伝子でありうる。さらに、本発明の方法及びキットは、エシェリキア・コリ、シュードモナス・エルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、クロストリジウム・ディフィシル、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、及びエンテロバクター属の複数種の少なくとも１つのいずれかの株の少なくとも１つの細菌を標的にしうることが留意されるべきである。より具体的な実施形態では、そのような細菌は、Ｏ１５７：Ｈ７、腸管付着性（ＥＡＥＣ）エシェリキア・コリ、腸管出血性（ＥＨＥＣ）エシェリキア・コリ、腸管侵入性（ＥＩＥＣ）エシェリキア・コリ、腸管病原性（ＥＰＥＣ）エシェリキア・コリ、毒素原性（ＥＴＥＣ）エシェリキア・コリ、及びびまん付着性（ＤＡＥＣ）エシェリキア・コリからなる群より選択される少なくとも１つのエシェリキア・コリ株でありうる。
【０２０６】
さらなる実施形態では、本発明の方法で使用されるキットの溶原性バクテリオファージ及び溶菌性バクテリオファージの少なくとも１つは、スプレー剤、スティック、塗布剤、ゲル剤、クリーム、ウォッシュ、ワイプ、フォーム、石鹸、液剤、油、溶液、ローション剤、軟膏、又はペーストとして調合されうる。
【０２０７】
本発明の別の態様は、遺伝子改変された、溶原性バクテリオファージに関する。より具体的には、溶原性バクテリオファージは少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲアレイを含みうる。より具体的な実施形態では、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲのスペーサーは、細菌の少なくとも１つの病原性遺伝子を標的にして不活性化するように、細菌の少なくとも１つの病原性遺伝子内に含まれる核酸配列（すなわち前記遺伝子の一部）に相補的である。さらに、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーアレイは、溶菌性ファージ標的にして不活性化するように、溶菌性バクテリオファージ内に含まれる核酸配列に十分に相補的であることが留意されるべきである。そのように、本発明の溶原性ファージに感染した細菌は溶菌性ファージに対して非感受性であり、且つ耐性がある。
【０２０８】
本発明の一層さらなる態様は、本発明に記載の遺伝子改変溶菌性ファージのいずれかに関する。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸配列」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、「核酸」（又は同様に核酸分子又はヌクレオチド）はまた、いずれのＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された断片、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片、一本鎖又は二本鎖のいずれも指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）、又は天然ヌクレオチドのアナログ（例えば、天然ヌクレオチドのアルプァ−エナンチオマー形態）、又は修飾ヌクレオチド、又はそのいずれの組み合わせである単量体から構成されることができる。本明細書においてこの用語は、ｃＤＮＡ、すなわち、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の作用によってＲＮＡ鋳型から作られる相補的ＤＮＡ又はコピーＤＮＡも包含する。
【０２１０】
これに関連して、「単離ポリヌクレオチド」は生物のゲノムから分離されている核酸分子である。例えば、本発明のキットで用いられるｃａｓ遺伝子又はそのいずれの誘導体若しくはホモログ、及び本発明のキットのＣＲＩＳＰＲスペーサー及びリピート内に含まれる配列をコードする、細胞のゲノムＤＮＡから分離されたＤＮＡ分子は、単離ＤＮＡ分子である。単離核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子はその種の染色体の完全ＤＮＡ分子より小さい。
【０２１１】
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡコンストラクト、具体的には、本発明のｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲシステム、又はそのいずれのバリアント、ホモログ、若しくは誘導体をコードするものに関する。本発明のコンストラクトは、プロモーター、調節及び制御要素、翻訳、発現、及び他のシグナルなどの、本発明の核酸配列に作動可能に連結されたさらなる要素をさらに含みうる。本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡ」又は「組換え遺伝子」という用語は、本発明のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。
【０２１２】
さらになお、本発明は、治療有効量の本発明のキット、随意に少なくとも１つの抗生物質化合物、具体的には本明細書において先に開示した抗生物質のいずれかと併用して、感染症を患う被験者に投与する工程を含む治療方法をさらに提供する。さらに、留意されるべきである。本発明のキット又はそのいずれの構成要素の適用は、感染性の病気又は疾患を罹患している対象のための補完治療レジメンを形成しうる。
【０２１３】
感染性の疾患に関連する障害においては、「治療」という用語は、前記感染性の疾患に関連する障害の強度又は頻度の削減、縮小、又は減少のうち１つ以上を指しうる。治療は、前記感染性に関連する障害、発生が始まるときに行われることもあり、又は、例えば１〜１４日毎の投与による継続して投与を行って前記疾患になりやすい個人における感染性の疾患の発生を予防する若しくは減少させることもある。
【０２１４】
「予防」という用語は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医により組織、系、動物、又はヒトにおいて防止されることが求められる生物学的又は医学的事象の発生、具体的には感染症に関連する障害の発生又は再発のリスクの防止又は低減を指す。「予防的に有効な量」という用語は、その目的を達成することになる医薬組成物の量を意味することを意図される。よって、特定の実施形態では、本発明の方法は予防、すなわち感染症に関連する状態の予防に特に有効である。よって、前記組成物を投与された対象は前記感染性の状態に関連する症状を経験する可能性が低い。過去にそれらを既に経験した対象で再発する可能性も低い。
【０２１５】
本明細書において言及される「寛解」という用語は、本発明による組成物及び方法によってもたらされる症状の軽減及び被験者の状態の改善に関し、前記改善は、細菌感染症に関連する病理過程の阻害、それらの程度の著しい減少、又は病気の対象の生理状態の改善という形で現れうる。
【０２１６】
「阻害する」という用語及びこの用語もすべての変形は、病理症状又は病理過程の進行及び増悪を制限すること又は抑えることを包含するのを意図され、前記病理過程症状又は過程は関連する。
【０２１７】
「削減する」という用語は、随意に下記の本発明の方法に従った、病理症状及び考えられる病理学的因果関係の実質的な根絶又は除去に関する。
【０２１８】
「遅延」、「発症を遅らせること」、「遅らせる」という用語及びそれらの変形は、病的障害又は感染症、及びそれらの症状の進行及び／又は増悪を遅くすること、本発明による治療の不在下よりも遅れて出現するようにそれらの進行、さらなる増悪、又は発症を減速させることを包含することを意図する。
【０２１９】
本明細書において「方法」という用語は、所与の課題を達成するやり方、手段、手法、及び手順を指し、例えば、公知又は公知のやり方、手段、手法、及び手順から化学、薬理学、生物学的製剤、生化学、及び医学分野の実務者によって容易に開発されるやり方、手段、手法、及び手順が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２２０】
本明細書において「治療すること」という用語は、疾患の進行を阻止すること、実質的に阻害すること、遅くすること、若しくは逆に向かわせること、疾患の臨床的若しくは審美的症状を実質的に改善すること、又は疾患の臨床的若しくは審美的症状の出現を実質的に予防することを含む。
【０２２１】
本明細書において「病気」、「障害」、「疾患」などは対象の健康に関して互換可能に使用され、そのような用語のそれぞれすべてに帰する意味をもつ。
【０２２２】
本発明はそれを必要としている対象又は患者の治療に関する。「患者」又は「それを必要としている対象」は、上記病原体に感染する可能性があり、本明細書に記載の防止的及び予防的キット、システム、及び方法が望まれるいずれの生物を意味し、例えば、ヒト、イヌ及びネコの対象、ウシ、サル、ウマ、及びネズミ対象、げっ歯類、飼育鳥類、水産養殖、魚、及びエキゾチックな観賞魚などの飼育哺乳類並びに非飼育哺乳類が挙げられる。治療を受ける対象はいずれの爬虫類又は動物園の動物でもありうることが理解されるべきである。より具体的には、本発明のキット及び方法は、哺乳類の病的状況の予防を意図されている。「哺乳類対象」は、本明細書で提案する治療が望まれるいずれの哺乳類を意味し、例えば、ヒト、ウマ、イヌ、及びネコ対象、最も具体的にはヒトが挙げられる。具体的には非ヒト対象の場合において、本発明の方法は、注射、飲料水、飼料、スプレー、強制経口投与を介した投与及びそれを必要としている対象の消化管への直接投与を用いて行われうることが留意されるべきである。
【０２２３】
さらになお、本発明は、前記細菌集団に本発明のキット及びそのいずれの構成要素を適用することによって、少なくとも１つの抗生物質化合物に対して細菌集団を感受性亢進する又は前記集団の感受性を上げる方法をさらに提供することが留意されるべきである。
【０２２４】
さらにいくつかのさらなる態様では、本発明は、本発明のキット及びそのいずれの構成要素を用いて少なくとも１つの抗生物質化合物に対する細菌又は細菌集団の耐性を予防又は低減する方法を提供する。
【０２２５】
さらに本発明は、前記細菌を含む表面上に本発明のキット又はそのいずれの構成要素を適用することによって病原性細菌のアウトブレイクを処理する方法を提供する。
【０２２６】
明確にするために別々の実施形態の文脈で記載されている本発明のある特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供されることもありうることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明のさまざまな特徴は、別々に又はいずれの好適な部分的組み合わせで又は他のいずれの本発明の記載実施形態に適するように提供されることもありうる。さまざまな実施形態と関連して記載されているある特徴は、実施形態がそれらの要素なしに実施可能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴とみなされるべきではない。
【０２２７】
本明細書において上で詳細に記載され、且つ下記の請求項で特許請求されている本発明のさまざまな実施形態及び態様が以下の例で実験的に裏付けられる。
【０２２８】
本明細書において用いられる科学用語及び技術用語はすべて、別段特に規定がない限り当該技術分野において一般的に使用される意味を有する。本明細書において与えられる定義は本明細書において頻繁に使用されるある用語の理解を促進するものであり、本開示の範囲を制限することを意味しない。
【０２２９】
本明細書において「約」という用語は±１０％を指す。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びそれらの活用形は、「含むが限定されないこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。「から本質的になる」という用語は、さらなる構成要素、工程、及び／又は部品が、特許請求されているシステム、キット、組成物、方法、又は構造の基本的且つ新規の特徴を実質的に変えない限り、組成物、方法、又は構造は、さらなる構成要素、工程、及び／又は部品を含みうることを意味する。
【０２３０】
本明細書において「約」という用語は、最大で１％、より具体的に５％、より具体的に１０％、より具体的に１５％、及び場合によっては最大で２０％まで、参照される値の上下に外れうる値を示し、ずれの範囲は、連続範囲を構成する整数値及び該当する場合、非整数値を含む。本明細書において「約」という用語は±１０％を指す。
【０２３１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びそれらの活用形は、「含むが限定されないこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。この用語は、「からなる」及び「から本質的になる」という用語を包含する。「から本質的になる」という句は、さらなる構成要素及び／又は工程が、特許請求されている組成物又は方法の基本的且つ新規の特徴を実質的に変えない限り、組成物又は方法は、さらなる構成要素及び／又は工程を含みうることを意味する。本明細書並びに後に続く実施例及び請求項の全体にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含することを意味するが、他のいずれの整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを意味しないことが理解されるであろう。
【０２３２】
本発明のさまざまな実施形態は範囲の形式で表わされることが留意されるべきである。範囲の形式での記載は便宜上且つ簡潔さのためだけであることが理解されるべきであり、本発明の範囲上の柔軟性のない限定と解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値だけでなく、可能性のある部分的な範囲すべてを具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的な範囲並びに範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは範囲の幅にかかわりなく当てはまる。数値の範囲が本明細書においてが示されるときはいつでも、示された範囲内の挙げられた数値（分数又は整数）いずれも含むことを意味する。第１の示された数字と第２の示された数字「に及ぶ／の間の範囲」及び第１の示された数字から第２の示された数字「に及ぶ／の範囲」という句は、本明細書において互換可能に使われ、第１及び第２の示された数字並びにその間のすべての分数及び整数を含むことを意味する。
【０２３３】
明確にするために別々の実施形態の文脈で記載されている本発明のある特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供されることもありうることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明のさまざまな特徴は、別々に又はいずれの好適な部分的組み合わせで又は他のいずれの本発明の記載実施形態に適するように提供されることもありうる。さまざまな実施形態と関連して記載されているある特徴は、実施形態がそれらの要素なしに実施可能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴とみなされるべきではない。
【０２３４】
本明細書において上で詳細に記載され、且つ下記の請求項で特許請求されている本発明のさまざまな実施形態及び態様が以下の例で実験的に裏付けられる。
【０２３５】
開示及び記載されて、本発明は本明細書において開示されている方法工程及び組成物は多少変化しうるので、特定の例、方法工程、及び組成物に限定されないことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の請求項及びその等価物によってのみ限定されることになるので、本明細書において使用される専門用語は特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【０２３６】
本明細書及び添付の請求項において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容から明らかでそうでないと指示がない限り、複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。
【０２３７】
以下の例は発明者らによって本発明の態様の実施の際に採用された手法の代表的なものである。これらの手法は本発明を実行するための好ましい実施形態の例示である一方で、本開示を踏まえて、多くの変更が本発明の趣旨及び意図される範囲を逸脱することなくなされうることを当業者なら理解するであろうことが理解されるべきである。
【実施例】
【０２３８】
次に、以下の例を参照して上記明細書とともに本発明のいくつかの実施形態を非限定的に説明する。
【０２３９】
全体として、本明細書で用いられる専門用語及び本発明で用いられる実験室における方法は、分子的、生化学的、微生物学的及び組み換えＤＮＡ技術を含む。そのような手法は文献で細部まで詳しく説明されている。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、及び同第５，２７２，０５７号に記載の方法論；”Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；”Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能な免疫アッセイは特許及び科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、及び同第５，２８１，５２１号を参照されたい；”Ｏｌ��ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）；並びに”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  （１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。これらはすべて、本明細書において完全に記載されているかのごとく参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は本文書全体にわたって提供される。該文献中の手順は当該技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。該文献に含まれる情報はすべて、参照により本願明細書に組み込まれる。
【０２４０】
実験手順
試薬、株、及びプラスミド
ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌイースト抽出物、及び５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）並びに寒天は、Ａｃｕｍｅｄｉａ製であった。２ＹＴ培地は、１．６％（ｗ／ｖ）バクト−トリプトン（Ａｃｕｍｅｄｉａ）、１％（ｗ／ｖ）バクト−イースト抽出物（Ａｃｕｍｅｄｉａ）、及び０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（Ａｃｕｍｅｄｉａ）を蒸留水中に含有した。抗生物質、リゾチーム、Ｌ−アラビノース、及びマルトースは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製であった。塩化ナトリウム及び硫酸マグネシウムはメルク製であった。制限酵素、ライゲーション酵素、及びＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼは、ニュー・イングランド・バイオラボ製であった。本研究で用いた細菌株、プラスミド、及びファージを表１に載せる。
【０２４１】
表１．細胞株、プラスミド、及びファージ
2017536831.tif 000003
【０２４２】
プラスミド構築
プラスミドは標準的な分子生物学手法を用いて構築した。ＤＮＡセグメントはＰＣＲによって増幅した。制限酵素によるＰＣＲ産物及びベクターの標準的な切断は製造業者の取扱説明書に従って行なった。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって合成されたｐＩＹＥＣ１プラスミドはＣＲＩＳＰＲアレイをコードし、該ＣＲＩＳＰＲアレイはＴ７プロモーターで転写され、以下をコードする：ｎｄｍ−１遺伝子を標的にする３つのスペーサー（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、スペーサーは配列番号３７、３８、３９で表わされ、それらに対応するプロトスペーサーは配列番号４６、４７、４８で表わされる）、ｃｔｘ−Ｍ−１５遺伝子を標的にする３つスペーサー（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、スペーサーは配列番号４０、４１、４２で表わされる。前記スペーサーは配列番号４９、５０、５１のいずれか１つの核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にする）、及びＴ４ファージゲノムを標的にする３つのスペーサー（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、スペーサーは配列番号４３、４４、４５で表わされる。前記スペーサーは、配列番号５２、５３、５４のいずれか１つの核酸配列を含むプロトスペーサーを標的にする）。ｐＩＹＥＣ２はクロラムフェニコール耐性マーカーもコードすること以外ｐＩＹＥＣ１と同様である。ｐＩＹＥＣ２を構築するには、オリゴヌクレオチドＩＹ３４４Ｆ及びＩＹ３４４Ｒを用いてｐＫＤ３（２２）のクロラムフェニコール耐性マーカーを増幅した。増幅したＤＮＡ及びｐＩＹＥＣ１をともにＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ライゲーションしてｐＩＹＥＣ２を得た。ｐＮＤＭ及びｐＣＴＸプラスミドを、ｎｄｍ−１又はｃｔｘ−Ｍ−１５をコードするＰＣＲ断片を、複製起点並びにｐＮＤＭにはオリゴヌクレオチドＩＹ２４６Ｆ及びＩＹ２４６Ｒ並びにｐＣＴＸにはＩＹ３４６Ｆ及びＩＹ３４６Ｒを用いてプラスミドｐＣａｓ１＋２（２３）から得られたｓｔｒｒマーカーを含有する別のＰＣＲ断片にライゲーションすることによって構築した。プラスミドｐＶＥＣは、無関係のＤＮＡ断片を複製起点及びプラスミドｐＣａｓ１＋２由来のｓｔｒｒマーカーにライゲーションすることによって構築した。プラスミドｐＴＲＸ１、ｐＴＲＸ２、ｐＴＲＸ３、ｐＴＲＸ４、及びｐＴＲＸ５は、プロトスペーサーをＴ７ゲノムに挿入するよう構築した（表１）。それらのプラスミドは、ｔｒｘＡを欠く宿主で増殖するＴ７様の正の選択マーカーであるｔｒｘＡ遺伝子を所望のプロトスペーサーに隣接してコードし、後にＴ７遺伝子の末尾部分１．３及びＴ７遺伝子の先頭部分１．４に対応するＤＮＡ配列の５０ｂｐ上流及び下流が続く。表２及び表３に示したプライマーを用いてフリッパーゼ認識標的部位に隣接するｔｒｘＡ遺伝子をコードするＴ７ファージをＰＣＲ増幅することによってプラスミドを構築した。結果として得られたＰＣＲ産物をプライマーＩＹ２６０Ｆ及びＩＹ２６０Ｒを用いるＰＣＲ様の鋳型として用いた（配列番号２４及び２５、表２）。最終ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）にライゲーションした。構築したプラスミドが所望の断片をコードすることをＤＮＡシークエンシングで確認した。
【０２４３】
表２．オリゴヌクレオチドプライマー
2017536831.tif 000004
【０２４４】
相同組換えに基づく遺伝子工学
短い相同性のある隣接末端を用いた相同組換えを以前に記載されている通りに（２４）実施した。Ｔ７制御下でのＣＲＩＳＰＲ干渉に必要な６つのｃａｓ遺伝子を挿入するために、発明者らは最初にＴ７プロモーターをエシェリキア・コリＫ−１２のｃａｓ３及びｃｓｅ１遺伝子の上流にクローニングした。ｐＳＩＭ６プラスミドを内部にもつエシェリキア・コリＲＥ１００１（表１）を一晩培養したものを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充した５０ｍＬの新鮮なＬＢに３２℃で１：１００希釈し、ＯＤ６００が０．４〜０．６に達するまで通気した。次いで培養物を組換え酵素の発現のために振盪水浴で４２℃にて１５分間熱誘導した後、氷水中で１０分間インキュベーションした。次いで培養物を４６００×ｇで４℃にて１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットを氷冷再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）で３回洗った。ペレットを２００μＬの氷冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、氷上に保持した。次に培養物を、ｃａｓ３（断片Ｔ７ｃａｓ３：：ｋａｎ）及びｃｓｅ１（断片Ｔ７ｃｓｅ１：：ｃｍ）遺伝子の元のプロモーターに隣接する５０ｂｐの配列に隣接するカナマイシン耐性マーカー又はクロラムフェニコール耐性マーカーのいずれかに融合したＴ７プロモーターをコードする〜５００ｎｇのＰＣＲ産物でエレクトロポレーションした。Ｔ７ｃａｓ３：：ｋａｎ断片は、プライマーＲＫ４１Ｆ及びＴ７プロモーターをその５’末端にコードするプライマーであるＲＫ４１Ｒ（表１）を用いることによってＢＷ２５１１３ΔｙｅｅＸ（表１）のＦＲＴ部位をコードするカナマイシン耐性遺伝子をＰＣＲ増幅することによって構築した。次いでＰＣＲ断片を、ｃａｓ３のすぐ横の５’領域に５０−ｂｐ相同性をコードするＲＫ４２Ｆ及びＲＫ４２Ｒ（表１）で増幅した。Ｔ７ｃｓｅ１：：ｃｍ断片は、プライマーＲＫ４３Ｆ及びＴ７プロモーターをその５’末端にコードするプライマーであるＲＫ４３Ｒ（表１）を用いることによってｐＫＤ３プラスミド（表１）のＦＲＴ部位をコードするクロラムフェニコール断片をＰＣＲ増幅することによって構築した。次いでｃｓｅ１のすぐ横の５’領域の５０−ｂｐ相同性をコードするＰＣＲ断片をＲＫ４４Ｆ及びＲＫ４４Ｒ（表１）を用いて増幅した。これらの断片のエレクトロポレーションは、０．２ｃｍキュベット中の５０μＬ分注量のエレクトロコンピテント細菌を用いて２５μＦ、２．５ｋＶ、及び２００Ωで実施した。エレクトロポレーション後、１ｍＬの２ＹＴ培地をキュベットに加え、続いて３２℃で３時間通気した。次いで、２５μｇ／ｍＬカナマイシン及び１７．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天プレートに培養物を播種し、３２℃で一晩インキュベーションした。組換えコロニーを２５μｇ／ｍＬカナマイシン及び１７．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールプレートにストリークし、４２℃でインキュベーションして温度感受性ｐＳＩＭ６プラスミドを削減した。単一のコロニーが所望の置換をコードしていることを、ＲＫ３３Ｒ及びＲＫ２９Ｒを用いてＤＮＡシークエンシングで確認した。Ｔ７プロモーター下にｃａｓ３及びｃｓｅ１をコードする操作されたカセット全体をＲＥ１００１株に形質導入し、両抗生物質マーカーを用いて選択して��Ｋ６４７１株を得た。
【０２４５】
ｃａｓ遺伝子を以前に記載のように（２５）削除した。簡単に記載すると、エシェリキア・コリＤＹ３７８をプライマーＩＹ８０Ｆ及びＩＹ８０Ｒ（表１及び表２）を用いてプラスミドｐＫＤ３を増幅することによって生成したＰＣＲ産物の約５００ｎｇを用いてエレクトロポレーションした。この増幅したＤＮＡは、一方の末端がｃａｓ３プロモーターの５０ｂｐの配列、もう一方の末端がＣＲＩＳＰＲリーダー配列の５０ｂｐに隣接するクロラムフェニコール耐性マーカーをコードする。所望の組換え体を、１７μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天プレートで選択した。次いで（２６）に記載のようにＰ１形質導入を用いて該削除をＩＹＢ５１０１に移し、ＩＹＢ５６６６を得た。
【０２４６】
Ｔ７プロモーター下のｃａｓ遺伝子をコードするλファージを構築するために、ＩＹＢ５２９７／ｐＳＩＭ６を一晩培養したものを、適切な抗生物質を含む２５ｍＬのＬＢ培地に５０倍に希釈し、３２℃で０．５のＯＤ６００まで増殖させた。次に培養物を、λプロファージ及びプラスミドの両方の組換え酵素を発現するために振盪水浴中で４２℃にてきっちり４分間熱誘導した。誘導された試料を直ちに氷スラリー上で冷やし、次いで４６００×ｇで４℃にて１０分間ペレットを生じさせた。ペレットを氷冷ｄｄＨ２Ｏで２回洗い、２００μＬの氷冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、エレクトロポレーションするまで氷上に保持した。エレクトロポレーションは、プライマーＩＹ３３３Ｆ及びＩＹ３３３Ｒを用いてＲＫ６４７１のゲノムＤＮＡを増幅することによって得たＰＣＲ産物をゲル精製したものの〜１６００ｎｇを用いて行った。２５μＬの分注量のエレクトロコンピテント細胞を、０．２ｃｍキュベット中の２５μＦ、２．５ｋＶ、及び２００Ωでの各エレクトロポレーションに使用した。エレクトロポレーション後、細菌を振盪水浴中で１ｍＬのＬＢに３２℃で１時間増殖させ、１７μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有する選択プレートに播種した。クロラムフェニコール耐性マーカーをプラスミドｐＣＰ２０（２４）によってコードされるフリッパーゼ組換え酵素を用いて除去し、クロラムフェニコール感受性コロニーを４２℃でファージ誘発に使用した。結果として得られたファージλｃａｓはＴ７プロモーターから転写され、６つのｃａｓ遺伝子をコードするがＣＲＩＳＰＲアレイを欠き、これを使用してＢＬ２１−ＡＩを溶原化してＩＹＢ５６１４を得た。改変ＣＲＩＳＰＲアレイを、プライマーＩＹ３４７Ｆ及びＩＹ３４７ＲでのｐＩＹＥＣ２の増幅から得たＰＣＲ断片を用いることによって上記のようにＩＹＢ５６１４／ｐＳＩＭ６に挿入した。結果として生じた株、ＩＹＢ５６５６は、Ｔ７プロモーターから転写され、６つのｃａｓ遺伝子並びにｎｄｍ−１、ｃｔｘ−Ｍ−１５、及びＴ４ファージゲノムに対するスペーサーをコードするＣＲＩＳＰＲアレイをコードするλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲを内部にもつ。
表３．細菌、ファージ、及びプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド及び鋳型
【０２４７】
2017536831.tif 000005
【０２４８】
バクテリオファージＴ７の相同組換え
プラスミドｐＴＲＸ１、ｐＴＲＸ２、ｐＴＲＸ３、ｐＴＲＸ４、及びｐＴＲＸ５を用いることによって（２９）に記載のように、所望のプロトスペーサーをコードするＴ７ファージを構築した。
【０２４９】
形質転換効率アッセイ
エシェリキア・コリＩＹＢ５６７０及びＩＹＢ５６７１を一晩培養したものを、２５μｇ／ｍＬカナマイシン及び１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充した１０ｍＬのＬＢ培地に１：５０で希釈し、３２℃で通気した。培養のＯＤ６００が０．２に達したとき、０．２％Ｌ−アラビノースを加え、培養がＯＤ６００が０．５〜０．６に達するまで３２℃でインキュベーションした。次いで細菌を４℃にて４６００×ｇで遠心分離し、上澄みを破棄し、細菌を１ｍＬの氷冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁し、１．５ｍＬチューブに移した。細胞を４℃にて１３０００×ｇで１分間遠沈した。さらなる洗浄ステップの後、細胞を２５０μＬの氷冷ｄｄＨ２Ｏに懸濁した。次に細菌細胞（５０μＬ）を氷冷した０．２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（バイオ・ラッド）中で１２ｎｇのｐＶＥＣ、ｐＮＤＭ、又はｐＣＴＸプラスミドと混ぜた。混合物にバイオ・ラッド・マイクロパルサー内で２００Ω、２５μＦ、及び１．８ｋＶにて電気パルスをかけた。パルスをかけてすぐに、０．２％Ｌ−アラビノースを含有する０．１ｍＬの２ＹＴブロス培地を加え、細胞を３２℃で１時間通気した。反応のさまざまな希釈を、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．２％Ｌ−アラビノースを補充したＬＢ寒天プレートにプレートした。プレートを３２℃で一晩インキュベーションした。選択プレートに出現したコロニーを数え、１ｍＬあたりのＣＦＵ数を適宜計算した。
【０２５０】
溶菌性ファージ増殖効率のアッセイ
エシェリキア・コリＩＹＢ５６７０及びＩＹＢ５６７１を一晩培養したものを、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを補充した１０ｍＬのＬＢ培地に１：５０で希釈し、３２℃で通気した。培養のＯＤ６００が０．２に達したとき、０．２％Ｌ−アラビノースを加え、培養をＯＤ６００が０．５〜０．６に達するまで３２℃でインキュベーションした。細菌を遠心分離によって採取し、ＯＤ６００が〜３まで濃縮した。１ｍＬの濃縮した培養ＩＹＢ５６７０及びＩＹＢ５６７１を０．２％Ｌ−アラビノースを補充した１０ｍＬの軟寒天と混ぜ、２５μｇのカナマイシン及び０．２％Ｌ−アラビノースを補充したＬＢ寒天プレート上に塗り広げた。寒天が固まった後、プレートを３２℃で４０分間インキュベーションした。１５μＬのファージ希釈液を軟寒天上にプレートし、乾燥させ、次いで３２℃で１５時間インキュベーションした。プラーク形成単位をいくつかの希釈について数え、その１ｍＬあたりの数を適宜計算した。
【０２５１】
溶原化
ｐＮＤＭ、ｐＣＴＸ、又は対照プラスミド（ｐＶＥＣ）を内部にもつＩＹＢ５６６６を一晩培養したものを、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び０．２％（ｗ／ｖ）マルトースを補充したＬＢ培地に１：５０希釈した。培養物をＯＤ６００が０．５まで増殖させ、次いで１３０００ｇで１分間遠心分離した。上澄みを捨て、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び０．２％（ｗ／ｖ）マルトースを補充したＬＢ培地にペレットを再懸濁した。１．５ｍＬチューブ中で、１０μＬの処理した培養物を１０μＬのファージλｃａｓ又はλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲと〜１０の感染多重度で混合し、室温にて３０分間インキュベーションした。次いで０．２％Ｌ−アラビノースを補充した６０μＬのＬＢ培地を加え、その後培養物を３２℃でさらに２．５時間通気した。次いで培養を１：１０希釈した後、８４μＬを５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び０．２％Ｌ−アラビノースを含有するＬＢプレート並びに５．５×１０５個のＴ７−Ｃ１Ｎ１ファージを含有する３ｍＬの軟寒天に塗り広げた。プレートを３２℃で３６時間インキュベーションした。プラスミド消失を決定するために、２０〜４８個の生存コロニーを０．１ｍＬのＬＢに再懸濁し、プレートレプリケーターを用いて懸濁液を、５μｇ／ｍＬテトラサイクリン及び０．２％Ｌ−アラビノースを補充した、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＬＢ寒天プレート又は含まないプレートに播いた。ストレプトマイシンの無い培地では増殖したがストレプトマイシンを有する培地では増殖しなかったものをストレプトマイシンに対して感受性があるコロニーと判断した。
【０２５２】
実施例１
λファージによるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム送達
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ファージ、プラスミド、又は他の寄生的な要素などの核酸の転移を制限するために細菌において進化してきた。これらのシステムは約３０ｂｐの短いリピートのアレイからなり、リピートにはスペーサーと呼ばれる同様のサイズの配列が隣接する（図１）。スペーサーは望ましくない核酸の分子「標識」としての機能を果たす。該システムが侵入ＤＮＡ分子のいずれかの部分と配列が同一であるスペーサーをコードする場合、そのＤＮＡ分子は細胞から削減されることになる（２６、２７）。その削減は、アラインメントを「感知」し、且つ侵入分子を標的にして破壊する特定のタンパク質によって行われる。最近、ＣＲＩＳＰＲアレイ近傍の単一遺伝子から成るＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムがエシェリキア・コリで機能していることが報告された（２７）。そのシステムはＣＲＩＳＰＲアレイ中のスペーサーと同一の配列をもつプラスミドを標的にすることが示された。
【０２５３】
本発明のシステムは２つの構成要素又は要素を含み、第１の構成要素は、病原性遺伝子、例えば、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子のＣＲＩＳＰＲ媒介不活性化を誘導するよう設計された溶原性ファージである感受性亢進要素である。したがって、抗生物質耐性遺伝子の不活性化は、細菌をそのような抗生物質に対して感受性があるようにする。本発明のシステムの第２の構成要素は、選択に用いられる溶菌性ファージである。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の感受性亢進構成要素の溶原性ファージのＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサーによって認識される病原性遺伝子のプロトスペーサーと同一なプロトスペーサーを含む遺伝子改変された溶菌性ファージを包含する。
【０２５４】
抗生物質耐性遺伝子をもつ細菌を感受性亢進するために、（図１の示されるように）ｎｄｍ−１及びｃｔｘ−Ｍ−１５遺伝子を標的にする伝播可能なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを最初に構築した。これらの遺伝子は、多くの場合耐性病原体に対して効果のある抗生物質の最終選択であるβ−ラクタム抗生物質、カルバペネムに対する耐性を付与する基質特異性拡張型β−ラクタマーゼをコードする（２８）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、エシェリキア・コリのＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣＲＩＳＰＲカスケード遺伝子（ｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃａｓ７、ｃａｓ５、及びｃａｓ６ｅ）並びにｃａｓ３を増幅した。ＰＣＲ産物は相同組換えによってλプロファージに導入された。これらの遺伝子は、標的にされるプロトスペーサーをコードするＤＮＡ分子を削減するのに十分なタンパク質をコードする（２９）。図１に図示されるように、耐性遺伝子ｎｄｍ−１及びｃｔｘ−Ｍ−１５の保存配列を標的にするスペーサーをコードするＣＲＩＳＰＲアレイはまた、同じ溶原菌のｃａｓ遺伝子のすぐ下流に導入された。次いでプロファージを誘導し、その子孫を用いてナイーブ型エシェリキア・コリ菌体を溶原化した。よって、遺伝子ｎｄｍ−１及びｃｔｘ−Ｍ−１５をコードするプラスミドを標的にして破壊するよう設計された改変ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、溶原化により細菌に伝播可能であった。
【０２５５】
溶原化された細菌は耐性プラスミドを内部にもつ細菌を打ち負かすことができ、伝播されたプロファージの遺伝的適応度コストが試験したプラスミドより小さいことを示した（図２）。
【０２５６】
実施例２
溶原化された細菌は形質転換を阻止する
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをコードするλファージ（λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ）又は陰性対照としてＣＲＩＳＰＲアレイを欠く同様のファージ（λｃａｓ）で溶原化されたナイーブ型エシェリキア・コリを形質転換受容可能にし、対照プラスミド又はｎｄｍ−１又はｃｔｘ−Ｍ−１５をコードするプラスミドで形質転換し、すべてストレプトマイシン耐性を付与した。形質転換効率はストレプトマイシン耐性を獲得したコロニーを数えることによって決定した。λｃａｓの溶原菌と比較して、λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲの溶原菌は対照プラスミドで同じくらい良好に形質転換された。対照的に、図３に示されるように、これらの溶原菌は標的にされたプラスミドでは約３桁劣った効率で形質転換された。これらの結果は、溶原化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは細菌に伝播でき、さらにこのシステムはプラスミド形質転換による抗生物質耐性要素の水平遺伝子伝播を特異的に妨げることを明らかに示す。
【０２５７】
溶原化が既に確立された耐性プラスミドも抜くことができることを示すために、発明者らは耐性菌を溶原化し、プラスミドの消失を判断した。プラスミドはλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲで溶原化された細菌から特異的に抜けたが、λｃａｓで溶原化された細菌からは抜けなかった（図４）。総合して、これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは溶原性ファージによって細菌に伝播して抗生物質に対する耐性要素の水平遺伝子伝播を特異的に防止できることを示す。
【０２５８】
実施例３
溶菌性バクテリオファージからの保護
感受性亢進ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの所望の特徴は、それを内部にもつ病原体に利点を同時に付与できることである。例えば、溶菌性ファージに対する耐性は、それに曝された感受性亢進病原体の選択及び富化を可能にするであろう。したがって、発明者らは次に、伝播されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムによって標的にされるｎｄｍ−１及びｃｔｘ−Ｍ−１５スペーサーと同一のプロトスペーサーをコードする溶菌性Ｔ７ファージを遺伝子組操作した。よって、これらの改変ファージは、耐性遺伝子と同時に標的にされることになるであろう。これらの類似したプロトスペーサーは、溶原菌がファージ耐性も失うことなく感受性亢進要素を失う可能性がないことを確実にするために意図的にクローニングした。くわえて、ファージの天然の配列よりもむしろ、合成プロトスペーサーを標的にすることは、溶原菌に野生型ファージに対する保護を与えず、よって自然生態系のバランスに干渉しない。ナイーブ型エシェリキア・コリをλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ又はλｃａｓで溶原化し、次いで細菌に改変Ｔ７ファージを感染させた。図５に明らかに示されるように、対照λｃａｓファージで溶原化した細菌と比較して、λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲで溶原化した細菌は対照Ｔ７−ｇｐ８ファージの増殖に抵抗しなかった。対照的に、これらの溶原菌は、ｎｄｍ−１（Ｔ７−Ｎ１−Ｎ２、配列番号５５）の２つのプロトスペーサー若しくはｃｔｘ−Ｍ−１５（Ｔ７−Ｃ２Ｃ１、配列番号５６）の２つのプロトスペーサーのいずれか、又はそれぞれ１つずつ（Ｔ７−Ｎ１Ｃ１、配列番号５７若しくはＴ７−Ｃ２Ｎ２、配列番号５８）をコードするＴ７ファージの増殖に少なくとも４桁強く抵抗した（図５）。これらの結果は、溶原化されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは細菌に伝播され、改変Ｔ７バクテリオファージから保護できること、よって抗生物質に対する病原体の感受性亢進を溶菌性ファージに対する耐性と結びつけることができることを示す。そのうえ、該システムは人工マッチングプロトスペーサーをコードするファージに対してのみ耐性を付与し、該システムは自然生態系の相互作用に干渉しないことを示す。
【０２５９】
実施例４
感受性亢進細菌の溶菌性ファージ選択
伝播されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムはプラスミド形質転換を防止し、且つ同時に溶原化された細菌を溶菌性ファージから保護した。これは溶原化が抗生物質耐性菌を感受性亢進するのに使用でき、感受性亢進細菌の集団が溶菌性ファージによって富化されうることを示す。病院環境表面又は皮膚細菌叢に適用されうる治療をシミュレーションするために、対照、ｃｔｘ−Ｍ−１５、又はｎｄｍ１をコードするプラスミドを内部にもつ細菌を次に増殖させた。
【０２６０】
次いで、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ）又は対照（λｃａｓ）ファージをコードする溶原化しているファージを培養に加えた。次いで、溶原化された細菌がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ媒介保護を有するＴ７−Ｎ１Ｃ１溶菌性ファージを含有する寒天プレートに培養物を塗った。一晩インキュベーションした後、生存コロニーを数えた（図６Ａ）。すべての培養において、対照λｃａｓ  ファージで処理したものと比較して、標的にするλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲファージで処理したコロニーの２０倍を超える多くが改変Ｔ７−Ｎ１Ｃ１ファージに耐性を示した（図６Ｂ）。λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ又はλｃａｓにいずれかで処理したファージ耐性コロニーを、ストレプトマイシンを含むプレート又はストレプトマイシンの無いプレートに播種して、抗生物質に対する耐性を付与するプラスミドの消失について試験した。予想通り、標的にされないプラスミド（ｐＶＥＣ）を内部にもつ培養物は、どちらのタイプの溶原化でもストレプトマイシン耐性のままであった。しかし、λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲで溶原化され、且つ標的にされたプラスミド（ｐＮＤＭ又はｐＣＴＸ）を内部にもつ細菌のすべてが同時にストレプトマイシンに対して感受性が高くなり、一方でλｃａｓで処理した細菌のすべてがその耐性を維持した（図６Ｃ）。そして最後に、同一細菌における多剤耐性も削減できることを示すために、発明者らは２つの異なる抗生物質耐性プラスミド（ｐＮＤＭ＊＋ｐＣＴＸ）を内部にもつ細菌を用いて上記手順を繰り返した。予想通り、この場合でも、λｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲで処理した細菌培養物は抗ファージスペーサーをもつので溶菌性ファージに耐性を示した（図６Ｂ）。溶菌性ファージ感染から生存し、且つλｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲで処理された細菌は両耐性プラスミドが抜け、一方でλｃａｓで処理された生存細菌は耐性プラスミドを維持した（図６Ｃ）。まとめると、これらの実験は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを送達する改変溶原性ファージが溶菌性ファージとともに使用して、複数の耐性決定因子の同時消失を促進し、それらの水平伝播を減らし、且つ両特徴を呈する細菌集団を富化できるという原理証明を提供する。まとめると、これらの実験は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを送達する改変溶原性ファージを溶菌性ファージとともに使用して、複数の耐性決定因子の消失を促進し、それらの水平伝播を減らし、且つ両特徴を呈する細菌集団を富化することが実行可能であることを示す。
【０２６１】
実施例５
生体内試験
次に本発明の発明者らは、該技術が薬剤耐性病原体によるマウスの感染症を減らすことができるかを試験する。病室をシミュレートするのにマウスケージを使用し、患者をシミュレートするのにマウスを用いる。ＥＳＢＬ耐性病原体をケージ全体にわたって塗り広げる。改変ファージがケージ内の薬剤感受性病原体集団を富化する効率は、感受性亢進ファージを噴霧し、その後溶菌性ファージ数日間を噴霧することによって評価する。次にマウスをこれらのケージ又は未処理のケージに入れる。細菌性疾患を発症するマウスは抗生物質で処置する。ファージ処理したケージのマウスは抗生物質で治癒するのに対し、対照ケージのマウスは細菌性疾患のため死ぬことが予想される。
【０２６２】
ＣＲＩＳＰＲシステムはファージによって水平伝播される志賀毒素及びコレラ毒素などの病原性因子を標的にでき、それによって病原体感染の重症度を軽減できることが留意されるべきである。くわえて、ＲＮＡ分子を標的にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ゲノムの耐性決定因子及び病原性因子を標的にするのに利用できる。細菌ゲノムは完全なままである一方で特異的な病原性遺伝子のみが発現停止するので、ＲＮＡを標的にするシステムはカウンターセレクションなしに使用することができる。これらの可能性が発明者らによって検討される。
【０２６３】
本発明をその具体的な実施形態とともに説明してきたが、多くの代替手段、変更、及び変形が当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、添付の請求項の趣旨及び広い範囲内にあるそのような代替手段、変更、及び変形をすべて包含することが意図される。
【０２６４】
本明細書で言及された刊行物、特許、及び特許出願はすべて、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が具体的かつ個別に参照により本願明細書に組み込まれると示されるように、同じ程度に参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。くわえて、本願におけるいずれの参考文献の引用又は確認は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であるという承認であるとみなされるべきでない。セクション見出しが使用されている場合は、それらの見出しは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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