(57)【要約】  膣内製剤であって、該製剤の１０〜２０ｗ／ｗ％の量のカルボン酸と、３０℃〜３８℃の融解温度を有する油性基剤と、１０μｇ〜６００μｇのＧｎＲＨ量と等価量のＧｎＲＨまたはその類似体と、を含む、膣内製剤が提供される。本製剤を使用して、反芻動物において排卵を誘発する方法もまた提供される。【選択図】  図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膣内製剤であって、
ａ）１０〜２０％（ｗ／ｗ）のカルボン酸と、
ｂ）約３０℃〜３８℃の融解温度を有する油性基剤と、
ｃ）１０μｇ〜６００μｇのＧｎＲＨ量と等価量のＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体と、を含む、膣内製剤。
【請求項２】
前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体が、１４０〜５５０μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項３】
前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体が、１４０〜５００μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項４】
前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体が、１４０〜３００μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項５】
前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体が、１４０〜２００μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項６】
前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体が、２００〜５００μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項７】
前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体が、２００〜４００μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項８】
前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体が、２００〜３００μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項９】
前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体が、２８０〜５５０μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項１０】
前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体が、２８０〜５００μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項１１】
前記ＧｎＲＨまたはその前記類似体が、メスの反芻動物に筋肉内投与されるとき、前記ＧｎＲＨまたはその前記類似体のＥＤ７０の１４０％〜２５０％の量で存在する、請求項１に記載の膣内製剤。
【請求項１２】
前記メスの反芻動物が、ウシ、ヒツジ、またはヤギである、請求項１１に記載の膣内製剤。
【請求項１３】
前記メスの反芻動物が、ウシである、請求項１２に記載の膣内製剤。
【請求項１４】
前記ＧｎＲＨまたはその前記類似体が、膣内投与されるとき、ＥＤ７０以上の用量で存在する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の膣内製剤。
【請求項１５】
前記カルボン酸が、クエン酸、コハク酸、酒石酸、グリコール酸、アスコルビン酸、乳酸、アスパラギン酸、エデト酸二カリウム、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の膣内製剤。
【請求項１６】
前記カルボン酸が、クエン酸である、請求項１５に記載の膣内製剤。
【請求項１７】
前記カルボン酸が、前記製剤の１２〜１５ｗ／ｗ％の量で存在する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の膣内製剤。
【請求項１８】
前記油性基剤が、３０未満のヒドロキシル価（ＯＨＶ）を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の膣内製剤。
【請求項１９】
前記油性製剤が、１〜２０のＯＨＶを有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の膣内製剤。
【請求項２０】
前記油性製剤が、５〜１５のＯＨＶを有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の膣内製剤。
【請求項２１】
メスの反芻動物において排卵を誘発する方法であって、前記メスの反芻動物に、請求項１〜１０及び１４〜２０のいずれか１項に記載の膣内製剤を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記反芻動物が、ウシである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の膣内製剤を生産する方法であって、
ａ）前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体を前記カルボン酸と混和することと、
ｂ）前記ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体及び前記カルボン酸を粉砕することと、
ｃ）前記粉砕されたＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体及び前記粉砕されたカルボン酸を、前記油性基剤中に分散させることと、を含む、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法に従って生産された、膣内製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反芻動物における排卵調整の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳牛管理は、最適な実績及び経済的収量のための効率的な繁殖計画を必要とする。牛乳生産は、妊娠し、出産し、授乳する、管理下の雌ウシに依存する。出産後、雌ウシは、２００日間にわたって搾乳することができる。しかしながら、出産から約１５０日後、牛乳生産は、典型的には急速に減少する。故に、出産−授乳周期における出産と次の妊娠との間の期間を減少させることは、牛乳生産、つまり酪農管理に対する雌ウシ価値を増加させる。更に、雌ウシの酪農的価値は、典型的には最初の出産から３６ヶ月後に急速に減少する。この時間中に雌ウシが有する妊娠の回数を増加させることは、飼料費用、一般費用、及び他の費用の観点から、動物への投資に対する収益を最大化する。
【０００３】
高い牛乳収量及び繁殖性の目標は、同時に達成するのが困難であり得る。高い牛乳収量は、繁殖性に直接関わる、発情期の持続期間の減少、発情期の兆候のない排卵、及び無排卵状態をもたらし、基本的な生殖管理道具、つまり発情期検出後の人工授精（ＡＩ）の効率的な実行をより困難にする。生殖管理の効率は、発情周期及び排卵を調整し、制御するホルモンの使用によって増加させることができる。雌ウシの発情周期は、例えば、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロスタグランジンＦ２ａ、エストロゲン、プロゲステロン、及びこれらのホルモンのいくつかの合成類似体によって操作することができる。
【０００４】
ＯＶＳＹＮＣＨ（登録商標）処置計画は、雌ウシの発情周期を調整するための３連注射連隊（ｔｈｒｅｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ−ｒｅｇｉｍｅｎｔ）である。ＧｎＲＨは、いかなる段階の繁殖周期にある雌ウシにも注射される。ＧｎＲＨはＬＨを刺激し、それが古い卵胞の排卵及び新しい卵胞の成長を刺激する。プロスタグランジンによる第２の注射は、ＧｎＲＨ注射の７日後に与えられ、（雌ウシが排卵するのを防ぐ）あらゆる活性黄体の退化をもたらす。２日後、第２のＧｎＲＨの注射を与え、第１のＧｎＲＨ注射によって刺激された卵胞から、卵子を放出、すなわち排卵させる。授精の最適な時間は第３の注射の１６時間後であるが、雌ウシは２４時間繁殖性であり続ける。ＯＶＳＹＮＣＨ（登録商標）処置計画は、同時に処置された雌ウシ間の排卵の同期化を可能にする。しかしながら、ＯＶＳＹＮＣＨ（登録商標）処置計画は、比較的な正確なスケジュールで各雌ウシを４回処置することを必要とし、処置費用を増加させ、多数の動物の処置を困難または実行不可能にする。ＧｎＲＨの比較的高い費用及び膣内投与されたＧｎＲＨの比較的低い生物学的利用能によって、ＯＶＳＹＮＣＨ（登録商標）処置計画を修正するための努力は困難なものとなっている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、反芻動物における排卵調整の分野に関する。
特定の実施形態において、１０〜２０ｗ／ｗ％の量のカルボン酸と、３０℃〜３８℃の融解温度を有する油性基剤と、約１０μｇ〜６００μｇのＧｎＲＨと等価量のＧｎＲＨまたはその類似体と、を含む、膣内製剤が提供される。
【０００６】
特定の実施形態において、ＧｎＲＨまたはその類似体は、１４０〜５５０μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または１４０〜５００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または１４０〜３００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または１４０〜２５０μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または１４０〜２００ｕｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２００〜５００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２００〜４００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２００〜３００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２８０〜５５０μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２８０〜５００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２８０〜４００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で存在する。
【０００７】
特定の実施形態において、ＧｎＲＨまたはその類似体は、メスの反芻動物に筋肉内投与されるとき、ＧｎＲＨまたはその類似体のＥＤ７０の１４０％〜２５０％の量で存在する。
【０００８】
特定の実施形態において、カルボン酸は、クエン酸、コハク酸、酒石酸、グリコール酸、アスコルビン酸、乳酸、アスパラギン酸、エデト酸二カリウム、またはこれらの組み合わせである。油性基剤は、３０未満、好ましくは２０未満、より好ましくは１５未満、例えば５〜１５のヒドロキシル価（ＯＨＶ）を有し得る。
【０００９】
特定の実施形態において、メスの反芻動物は、ウシ、ヤギ、またはヒツジである。
特定の態様において、ＧｎＲＨまたはその類似体をカルボン酸と混和することと、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体及びカルボン酸を粉砕することと、粉砕されたＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体及び粉砕されたカルボン酸を、油性基剤中に分散させることとによって、上述の実施形態のうちのいずれかに従う製剤を作製する方法が提供される。
【００１０】
別の態様において、先行する実施形態のいずれかに従う製剤を膣内投与することによる、発情間期の反芻動物において排卵を誘発する方法が提供される。特定の態様において、膣内製剤は、プロスタグランジンＦ２α、ならびに有効用量のプロスタグランジン及び別の有効用量のＧｎＲＨまたはその類似体のいずれかもまた含む、複数構成成分製剤の一部として提供される。特定の態様において、複数構成成分製剤は、プロスタグランジンＦ２αの放出の６〜１０日前、例えば、７日前、８日前、または９日前に、別の有効用量のＧｎＲＨまたはその類似体を放出するように構成された膣内デバイス内にある。膣内デバイスはまた、プロスタグランジンＦ２αの放出の約２日後に、本明細書に記載する製剤を放出するように構成されてもよい。特定の態様において、他の有効用量のＧｎＲＨまたはその類似体は、上述の膣内製剤と同一であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１ａ及び１ｂは、ゴナドレリン酢酸塩（膣内）で処置した動物のＡＵＣの最小二乗平均（＋／−標準誤差）を図示する。
【図１Ｂ】図１ａ及び１ｂは、ゴナドレリン酢酸塩（膣内）で処置した動物のＡＵＣの最小二乗平均（＋／−標準誤差）を図示する。
【図２Ａ】図２ａ及び２ｂは、ゴナドレリン塩酸塩（膣内）で処置した動物のＡＵＣの最小二乗平均（＋／−標準誤差）を図示する。
【図２Ｂ】図２ａ及び２ｂは、ゴナドレリン塩酸塩（膣内）で処置した動物のＡＵＣの最小二乗平均（＋／−標準誤差）を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本発明をより良く理解するために、以下の非限定的な定義を提供する。
「ＧｎＲＨ」という用語は、反芻動物において天然に存在するＧｎＲＨ形態を指す。ＧｎＲＨの例としては、非限定的に、ウシＧｎＲＨ、ヤギＧｎＲＨ、ヒツジＧｎＲＨ、及びこれらの塩が挙げられる。ＧｎＲＨは、配列番号１のアミノ酸配列（ピロ−ＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧ−ＮＨ２）を有するデカペプチドである。一般に、ＧｎＲＨの酢酸塩、酢酸塩水和物、及び／または塩酸塩が使用される。
【００１３】
ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体に適用される場合、「ＥＤ７０」という用語は、発情周期の発情間期の段階にある反芻動物に投与されたとき、ウシ反芻動物のうちの７０％において排卵を引き起こす、ＧｎＲＨまたは該当する場合はＧｎＲＨの類似体の用量を指す。
【００１４】
特定のＧｎＲＨの量「と等価量のＧｎＲＨ類似体の量」という用語は、類似体の効力に対するＧｎＲＨ量の比率を指す。例えば、ＧｎＲＨよりも５０倍強力な２ｎｇのＧｎＲＨ類似体は、１００ｎｇのＧｎＲＨと等価である。
【００１５】
製剤
本明細書に開示される製剤は、反芻動物、例えばウシ種及びヒツジ種に対するＧｎＲＨの膣内投与に有用である。驚くべきかつ予期せぬことに、発明者らは、本明細書に開示される製剤が、筋肉内投与時に得られる生物学的利用能に接近する（例えば、約７０〜７５％の）ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体の生物学的利用能を提供することを発見した。本明細書に開示される製剤を使用して得られるＧｎＲＨの効率的な膣内送達は、増加した経済性のＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体の膣内送達を提供する。更に、本明細書に開示される製剤は、反芻動物における発情周期同期化及び排卵誘発のための「ワンタッチ」プロトコル、すなわち、単回投与のホルモンのみを必要とするプロトコルの設計を可能にする。
【００１６】
ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体の増加した生物学的利用能を提供する製剤は、カルボン酸及び油性基剤と組み合わせたＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体を含む。ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体は、典型的には１０〜６００μｇのＧｎＲＨ量と等価量で存在する。特定の実施形態において、本発明の製剤は、１４０〜６００μｇのＧｎＲＨ量と等価量のＧｎＲＨまたはその類似体の範囲ＧｎＲＨまたはその類似体を含有する。特定の例において、膣内製剤において有効な量のＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体は、筋肉内投与されたときに有効であることが知られているＧｎＲＨの量に基づき、膣内製剤の投与及び筋肉内投与後に得られるそれぞれのＧｎＲＨ生物学的利用能について調節され得る。ウシの場合、例えば、特定のＧｎＲＨ製品は、１頭の動物当たり１００〜２００μｇのＧｎＲＨの筋肉内投与を推奨する。ＧｎＲＨの筋肉内投与時に得られる生物学的利用能の７５％の生物学的利用能を提供する膣内ＧｎＲＨ製剤について、本製剤は、約１３３〜２６６μｇのＧｎＲＨの等価物を含むであろう。故に、そのような製剤は、例えば、膣内投与される１頭の動物当たり１４０μｇを提供し得る。
【００１７】
製剤中に存在するＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体の量は、動物の群に膣内投与されたとき、好ましくは同期的排卵を引き起こす。故に、理論によって拘束されるものではないが、本膣内製剤は、メスの反芻動物に筋肉内投与されるとき、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体のＥＤ７０の１４０％〜３００％の量のＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体を含み得る。例えば、ＧｎＲＨまたはそのＧｎＲＨ類似体は、メスの反芻動物に筋肉内投与されるとき、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体のＥＤ７０の１４０％〜２７５％、１４０％〜２５０％、１４０％〜２００％、１８０〜２５０％、または２００％〜２２０％のＧｎＲＨ量と等価量で存在し得る。
【００１８】
ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体は、１４０〜５５０μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または１４０〜５００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または１４０〜３００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または１４０〜２５０μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または１４０〜２００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２００〜５００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２００〜４００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２００〜３００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２８０〜５５０μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２８０〜５００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で、または２８０〜４００μｇのＧｎＲＨの量と等価量で存在し得る。
【００１９】
膣内ＧｎＲＨ製剤は、ＧｎＲＨ及び／または１つ以上のＧｎＲＨ塩及び／または１つ以上のＧｎＲＨ類似体を含んでもよい。ＧｎＲＨ塩としては、例えば、非限定的にＧｎＲＨ塩酸塩、ＧｎＲＨ酢酸塩、ＧｎＲＨ酢酸塩四水和物が挙げられる。ＧｎＲＨ類似体としては、例えば、非限定的にロイプロリド（ｐｙｒＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ、配列番号２）、ブセレリン（ｐｙｒＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（Ｔｂｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ、配列番号３）、デスロレリン（ｐｙｒＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ、配列番号４）、及びフェルチレリン（ｐｙｒＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ、配列番号５）、ならびにこれらの類似体の塩及び／または水和物が挙げられる。好ましいＧｎＲＨ類似体は、ブセレリンである。ブセレリンの好ましい用量は、ＧｎＲＨ量の１０％に等しい量である。
【００２０】
ＧｎＲＨ類似体は、当該技術分野において周知である。ＧｎＲＨ類似体の排卵誘発活性は、Ｐｕｂｍｅｄデータベースなどの公的に入手可能な情報源において明確に文書化されている。更に、ＧｎＲＨ類似体の排卵誘発活性を決定するための好適なモデルが開発されている。ＧｎＲＨ類似体及びそれらの排卵誘発活性の更なる例は、Ｄｕｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９７８  ８１（２）：３８２−３９０、Ｆｕｊｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ１９７４  ５７（４）：１２４８−１２５６、Ｄｕｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １９７８  ２１（１０）：１０１８−１０２４、Ｆｕｊｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ１９７２  ４９（３）：８６３−８６９に開示されている。故に、対象となるＧｎＲＨ類似体（複数可）の排卵誘発活性を決定するのに、通例の実験以上のものが必要とされることはない。
【００２１】
複数の油性基剤が、本明細書に記載されるＧｎＲＨ膣内製剤に好適である。一般に、油性基剤は、モノグリスデリド（ｔｒｉｇｌｙｃｄｅｒｉｄｅ）と、ジグリスデリドと、トリグリスデリドとの混合物を含有する。モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドの相対量、ならびに脂肪酸尾部の長さは、ＯＨＶ値（遊離ヒドロキシル基の含有量）に影響を与える。換言すると、ＯＨＶ値は、油性基剤中のモノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドの相対量についての特定の情報を提供する。特定の実施形態において、油性基剤は、３０未満のＯＨＶ値を有する。故に、異なる実施形態において、ＯＨＶ値は、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、または５未満である。いくつかの実施形態において、油性基剤のＯＨＶ値は、約５〜約１５である。
【００２２】
油性基剤の例は、ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）シリーズの坐剤である。ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｈ１５坐剤のＯＨＶ値は、５〜１５である。Ｈシリーズは、最大１５のヒドロキシル値を有する硬質脂肪である。それらは、主にトリグリセリドから成り、最大１５％のジグリセリド、及び１％以下のモノグリセリドの割合を有する。それらは、融解温度と凝固温度との間の非常に小さな差を特徴とし、後硬化現象へのわずかな傾向（最大１．５℃）を有するにすぎない。
【００２３】
ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｗシリーズの製品は、２０〜５０のヒドロキシル値（ＯＨＶ）を有する硬質脂肪である。それらは、トリグリセリド（６５〜８０％）と、ジグリセリド（１０〜３５％）と、モノグリセリド（１〜５％）との混合物から成る。それらの組成の結果として、これらのＷＩＴＥＰＳＯＬ等級品は、融解点と凝固点との間のより大きな差を有し、それらは、衝撃冷却に対する感受性が低く（より弾性）、より緩徐に凝固し、かつ自動機械及び小規模機器の両方によって容易に加工され得る。部分グリセリド含有量はまた、固体の沈降も緩徐にし、吸収がそれほど容易ではない活性化合物の吸収も促進する。
【００２４】
特定の態様において、油性基剤は、３０未満のＯＨＶ値を有する。故に、ＯＨＶ値は、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、または５未満であり得る。いくつかの態様において、油性基剤のＯＨＶ値は、約５〜約１５である。
【００２５】
油性基剤はまた、反芻動物の体温未満の融解温度も有する。油性基剤の融解温度はまた、例えば、３０℃〜４０℃、例えば、３０．５〜３２．５℃、３２．５〜３４．５℃、３４．５〜３６．５℃、３６．５〜３８．５℃、及び３８．５〜４０℃の範囲内であり得る。
【００２６】
様々なカルボン酸が、本明細書に記載されるＧｎＲＨ膣内製剤に好適である。非限定的に、例示的なカルボン酸としては、クエン酸、コハク酸、酒石酸、グリコール酸、アスコルビン酸、乳酸、アスパラギン酸、エデト酸二カリウム、またはこれらの組み合わせが挙げられる。一般に、ＧｎＲＨ膣内製剤は、約８〜２０ｗ／ｗ％（例えば、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％）のカルボン酸を含有する。
【００２７】
ＧｎＲＨ膣内製剤は、固体形態のＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体及び固体形態のカルボン酸を、油性基剤中に分散させることによって調製され得る。ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体及び／またはカルボン酸は、油性基剤中への分散前に粒径を小さくするために加工（例えば、粉砕）され得る。
【００２８】
ウシにおける排卵の同期化のためのプロトコルは、非限定的に、１つ以上のウシＧｎＲＨまたはそのＧｎＲＨ類似体（「ＧｎＲＨ−１」と称される）を投与することと、その後５〜９日間以内にウシプロスタグランジンＦ２ａを投与することと、プロスタグランジン投与の約３０〜７２時間後に、続けて第２の用量のＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体（「ＧｎＲＨ−２」と称される）をウシに投与することと、によってもたらされ得る。理論によって拘束されるものではないが、ＧｎＲＨ−１投与は、処置した動物のうちの大部分において、卵胞波出現及び卵胞成長パターンを標準化する主席卵胞の排卵または黄体形成を誘発する。（主席卵胞の排卵を誘発する）ＧｎＲＨ−２投与。記載するＧｎＲＨ膣内製剤は、ＧｎＲＨ−１投与及び／またはＧｎＲＨ−２投与のいずれかまたは両方に好適である。
【００２９】
本明細書に記載するＧｎＲＨ膣内製剤は、複数構成成分組成物の一部分として使用され得る。そのような複数構成成分は、同期化構成成分と、プロスタグランジン構成成分と、排卵誘発構成成分とを含み得る。故に、本明細書に記載するＧｎＲＨ膣内製剤は、同期化構成成分、排卵誘発構成成分、または同期化構成成分及び排卵誘発構成成分の両方としての使用に好適である。複数構成成分組成物は、開業医によって所望される場合、処置を送達するように構成された膣内デバイス内に充填され得る。膣内送達デバイスは、例えば、まず同期化構成成分、プロスタグランジン構成成分（同期化構成成分が送達されてから６〜１０日後）、及び排卵誘発構成成分（プロスタグランジン構成成分が送達されてから３０〜７２時間後）ように構成され得る。
【００３０】
特定の態様において、ＧｎＲＨ膣内製剤は、複数構成成分組成物のうちの同期化構成成分及び排卵誘発構成成分の両方として使用される。プロスタグランジン構成成分は、同期化構成成分の約７日後に送達され、排卵誘発構成成分は、プロスタグランジン構成成分の３０〜７２時間後に送達される。
【００３１】
複数構成成分組成物は、異なる構成成分の定時送達のために構成されたデバイス内部から有利に投与され得る。そのようなデバイスは、例えば、１つ以上の貯蔵部及びプログラム可能な処理ユニットを含有し得る。それぞれの貯蔵部は、同期化構成成分と、排卵誘発構成成分と、プロスタグランジン構成成分とを含有し得る。所定の時間に、プログラム可能な処理ユニットは、デバイスの貯蔵部から反芻動物の膣内へと、適切な構成成分の放出をもたらす。プログラム可能な処理ユニットは、貯蔵部の壁を破裂させ、例えば、電力、機械力、または浸透力を通してデバイスから貯蔵部の含有物を押し出すことによって、そのような放出をもたらす。
【００３２】
全てのこれらの刊行物は、個々の各刊行物が参照によって組み込まれるものとして具体的かつ個々に示される場合と同一の程度まで、参照によって本明細書に完全に組み込まれる。
【００３３】
本明細書では、本発明を特定の実施形態を参照しながら記載しているものの、これらの実施形態は単に本発明の原理及び用途を例示するにすぎないことが理解される。したがって、例示的な実施形態には多数の修正が成され得ること、及び以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに他の配置が考案され得ることが理解される。
【００３４】
本発明を、非限定的な実施例において更に説明する。
【実施例】
【００３５】
実施例１：膣内ゴナドレリン酢酸塩の生物学的利用能
材料及び方法
動物及び処置
動物は、授乳する成体ホルスタイン種牛であった。それらは１〜３回の出産回数があり、分娩から最小５０日後であり、妊娠はしていなかった。これらの動物は、砂床を有する現代式フリーストール酪農施設に収容された群であり、それらは、１日２回搾乳された。試験開始前に、一方向処置構造を有する無作為完備型ブロック設計に従って４つの処置群のうちの１つに動物を割り当て、それらを体重（５００〜８３４ｋｇの範囲）に従ってブロック化した。処置１（Ｔ０１）「陽性対照」（ｎ＝４）は、ＰＢＳ中、２２０μｇのゴナドレリン酢酸塩（２００μｇ等価量（「ｅｑ」）のゴナドレリン）を筋肉内（ＩＭ）投与によって受け、処置２（Ｔ０２）は、４０ｍｇのクエン酸と混合された４４０６μｇのゴナドレリン酢酸塩（４０００μｇ等価量のゴナドレリン）を粉末として膣内（ＩＶｇ）に受け、処置３（Ｔ０３）は、４０ｍｇのクエン酸がペレット中に圧縮された４４０６μｇのゴナドレリン酢酸塩を膣内に受け、処置４（Ｔ０４）は、４０ｍｇのクエン酸がワックス様マトリクス（ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｈ−１５）中に分散した４４０６μｇのゴナドレリン酢酸塩を膣内に受けた。全ての処置を、Ｚｏｅｔｉｓ  ＩＡＣＵＣ承認の動物使用プロトコルの下で投与した。
【００３６】
製剤
処置１は、２５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に溶解した１．３７ｍｇのゴナドレリン酢酸塩から成っていた。結果として得られる５５μｇ／ｍＬの溶液は、５０μｇ／ｍＬのゴナドレリンと等価である。この溶液を、０．２２μｍのフィルタを通して濾過することによって滅菌した。この溶液のうちの４ｍＬを投与して、２００μｇのゴナドレリンの合計用量を達成した。処置２は、４００ｍｇのクエン酸と混合し、次いで粉砕して、より小さく、より均一な粒径を達成した４４０６μｇのゴナドレリン酢酸塩から成っていた。これを、４０００μｇのゴナドレリンと等価である遊離粉末として投与した。処置３は、３２０ｍｇのクエン酸、９６０ｍｇのラクトース、９６０ｍｇの微結晶、１６０ｍｇのクロスポビドン、及び６ｍｇのステアリン酸マグネシウムと混合した４４０６μｇのゴナドレリン酢酸塩から成っていた。次いで、この混合物を粉砕して、より小さく、より均一な粒径を達成し、３０５ｍｇの混合物をペレット形態へと圧縮して、各用量を作製した。各ペレットは、４０００μｇのゴナドレリンと等価である４４０６μｇのゴナドレリン酢酸塩を含有した。処置４は、４４０６μｇのゴナドレリン酢酸塩を４０ｍｇのクエン酸と混合することによって作製した坐剤から成っていた。この混合物を粉砕して、より小さく、より均一な粒径を達成し、次いで、それを、２ｍＬのプラスチック管中、６０℃で融解した２６０ｍｇのＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｈ１５中に分与した。この懸濁液をボルテックスして、均一性を確保した。次いで、それを冷却させて、４０００μｇのゴナドレリンと等価の用量を含有する固体坐剤を形成した。
【００３７】
実験設計
試験開始前に動物を検査して、それらが臨床的に健康であり、跛行が存在せず、正常な生殖器系を有することを確実にした。牛乳をスクリーニングして、体細胞数が７５０，０００個の細胞／ｍＬ未満であり、分房が乳腺炎を有しないことを確実にした。体重を集めて、処置に対して動物を無作為化した。授乳産業を代表する特別配合された基礎飼料割当を与え、食餌の説明を試験データ内に文書化した。水を適宜提供した。発情期は、この試験開始前には同期化していなかった。全ての処置を、同日に与えた。処置１を、各動物の肩領域内に筋肉内急速投与として与えた。処置２を、改変ウマ子宮内ピペットによって、膣内への急速投与として与えた。処置３及び４を、改変ヤギ経口投薬銃によって、膣内への急速投与として与えた。投薬前、ならびに投与の０．３３、０．７５、１、１．５、２、４、７、１２、及び２４時間後に血液試料を収集した。これらの試料から血漿を単離し、ＧｎＲＨ分析のために処理した。
【００３８】
血漿ＧｎＲＨ
プロテアーゼ阻害剤としての役割を果たす０．６ｍＬの３ｍＭバシトラシンを含有する、事前に冷却したＫ２ＥＤＴＡ管中に血液を収集した後、管を少なくとも５回上下反転させることによって試料を混合した。次いで、試料を氷上に置き、収集から１５分以内に４℃で遠心分離した。次いで、０．６ｍＬの血漿を２．０ｍＬのメタノールに添加し、試料を６０秒間ボルテックスした。試料を−２０℃で凍結し、以前に説明されたＲＩＡ（Ｎｅｔｔ，Ｔ．Ｍ．，Ａ．Ｍ．Ａｋｂａｒ，Ｗ．Ｒ．Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｔ．Ｈｅｄｌｕｎｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄ．Ｎｉｓｗｅｎｄｅｒ．１９７３．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧｎＲＨ）ｉｎ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３６：８８０−８８５）による分析のためにＥｎｄｏｌｙｔｉｃｓ，ＬＬＣへと輸送した。
【００３９】
結果
群平均血漿ゴナドレリン濃度
表１に実証するように、４４００μｇの膣内用量を受けた動物（Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、筋肉内用量の２０倍）は、０．２２ｍｇの筋肉内用量を受けた動物（Ｔ０１）よりも高い群平均血漿ゴナドレリン濃度を達成した。膣内用量を受けた処置（Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４）のうち、Ｔ０４が、最も高い平均血漿濃度を経験した。Ｔ０２膣内投与及びＴ０４膣内投与の平均ゴナドレリン濃度は、それぞれ投与の１２時間及び７時間後について、筋肉内Ｔ０１投与よりも高かった。平均ゴナドレリン濃度は、投与の約４５分後から投与の７時間後まで、Ｔ０３膣内投与について、Ｔ０１膣内投与よりも高かった。血漿ゴナドレリン濃度は、Ｔ０４において最も高く、Ｔ０２、次いでＴ０３及びＴ０１がそれぞれ続いた（全ての処置についてｎ＝４）。処置２、Ｔ０３、及びＴ０４は、Ｔ０１に投与された用量よりも２０倍高い用量を受けた。用量投与から２４時間後までに、全ての処置の血漿ゴナドレリンレベルは定量限界未満であった。
【００４０】
【表１】
2017519769.tif 000003
【００４１】
Ｔ０１：ＰＢＳ中、２２０μｇのゴナドレリン酢酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０２：４４００μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（粉末）（４０００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０３：４４００μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（ペレット）（４０００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０４：ワックス（坐剤）中、４４００μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（４０００μｇ等価量のゴナドレリン）
ＢＬＱ−定量限界未満
群平均薬物動態パラメータ
表２に示すように、２０倍高い用量のために予想された通り、４４００μｇの膣内用量を受けた動物（Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４）は、２２０μｇの筋肉内用量を受けた動物（Ｔ０１）よりも高い平均Ｃｍａｘ及び平均ＡＵＣ（曝露）を達成した。
【００４２】
最も高い平均Ｃｍａｘは、Ｔ０４（膣内）によって達成され、これは、Ｔ０１筋肉内用量の平均Ｃｍａｘよりも約１５倍高く、（用量正規化後の）筋肉内用量の７５％の相対Ｃｍａｘを表した。Ｔ０２及びＴ０３の平均Ｃｍａｘ値は、Ｔ０１よりもそれぞれ約９倍及び５倍高かった。群平均Ｃｍａｘ対筋肉内Ｃｍａｘの比率としてのＣｍａｘは、Ｔ０４において最も大きく、Ｔ０２、Ｔ０３、次いでＴ０１がそれぞれ続いた（全ての処置についてｎ＝４）。群平均ＡＵＣ対筋肉内ＡＵＣの比率としての生物学的利用能（Ｆ）及びＡＵＣは、Ｔ０２において最も大きく、Ｔ０４、Ｔ０３、次いでＴ０１がそれぞれ続いた。処置２、Ｔ０３、及びＴ０４は、Ｔ０１に投与された用量よりも２０倍高い用量を受けた。
【００４３】
（筋肉内用量に対する）膣内生物学的利用能は、Ｔ０２、Ｔ０３、及びＴ０４について、それぞれ９２％、４２％、及び７２％であった。ゴナドレリンまたはその類似体の生理活性を決定する際には、Ｃｍａｘ及びＴｍａｘがより妥当であり得るものの、膣内生物学的利用能は、Ｔ０２において最も大きかった。
【００４４】
Ｔ０１の筋肉内投与は、膣内処置のうちのいずれよりも早いＴｍａｘ（２０分）をもたらした。膣内投与のうち、Ｔ０４は、約２６分で最も早いＴｍａｘを呈し、Ｔ０２及びＴ０３は、それぞれ約３７分及び９０分に、それらのそれぞれのＴｍａｘに達した。
【００４５】
【表２】
2017519769.tif 000004
【００４６】
Ｔ０１：ＰＢＳ中、２２０μｇのゴナドレリン酢酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０２：４４００μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（粉末）（４０００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０３：４４００μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（ペレット）（４０００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０４：ワックス（坐剤）中、４４００μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（４０００μｇ等価量のゴナドレリン）Ｆ＝筋肉内用量に対する膣内生物学的利用能
実施例２：ゴナドレリン酢酸塩の膣内投与の用量直線性
材料及び方法
動物及び処置
動物は、授乳する成体ホルスタイン種牛であった。それらは１〜３回の出産回数があり、分娩から最小５０日後であり、妊娠はしていなかった。これらの動物は、砂床を有する現代式フリーストール酪農施設に収容された群であり、それらは、１日２回搾乳された。試験開始前に、一方向処置構造を有する無作為完備型ブロック設計に従って４つの処置のうちの１つに動物を割り当て、それらを体重（５１８〜７８２ｋｇの範囲）に従ってブロック化した。処置１「陽性対照」（ｎ＝４）は、ＰＢＳ中、２２０μｇのゴナドレリン酢酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）を筋肉内（ＩＭ）投与によって受け、処置２は、４０ｍｇのクエン酸がワックス様マトリクス（ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｈ−１５）中に分散した２２０μｇのゴナドレリン酢酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）を膣内に受け、処置３は、４０ｍｇのクエン酸がワックス様マトリクス（ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｈ−１５）中に分散した４４０μｇのゴナドレリン酢酸塩（４００μｇ等価量のゴナドレリン）を膣内に受け、処置４は、４０ｍｇのクエン酸がワックス様マトリクス（ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｈ−１５）中に分散した８８０μｇのゴナドレリン酢酸塩（８００μｇ等価量のゴナドレリン）を膣内に受けた。全ての処置を、Ｚｏｅｔｉｓ  ＩＡＣＵＣ承認の動物使用プロトコルの下で投与した。
【００４７】
製剤
処置１は、２５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に溶解した１．３７ｍｇのゴナドレリン酢酸塩から成っていた。結果として得られる５５μｇ／ｍＬの溶液は、５０μｇ／ｍＬのゴナドレリンと等価である。この溶液を、０．２２μｍのフィルタを通して濾過することによって滅菌した。この溶液のうちの４ｍＬを投与して、２００μｇのゴナドレリンの合計用量を達成した。処置２〜４は、それぞれ２２０μｇ、４４０μｇ、または８８０μｇのゴナドレリン酢酸塩を、４０ｍｇのクエン酸と混合することによって作製した坐剤から成っていた。この混合物を粉砕して、より小さく、より均一な粒径を達成し、次いで、それを、２ｍＬのプラスチック管中、６０℃で融解した２６０ｍｇのＷｉｔｅｐｓｏｌ（登録商標）Ｈ１５中に分与した。この懸濁液をボルテックスして、均一性を確保した。次いで、それを冷却させて、それぞれ２００μｇ、４００μｇ、または８００μｇのゴナドレリンと等価の用量を含有する固体坐剤を形成した。
【００４８】
実験設計
試験開始前に動物を検査して、それらが健康であり、跛行が存在せず、正常な生殖器系を有することを確実にした。牛乳をスクリーニングして、体細胞数が７５０，０００個の細胞／ｍＬ未満であり、分房が乳腺炎を有しないことを確実にした。体重を集めて、処置に対して動物を無作為化した。授乳産業を代表する特別配合された基礎飼料割当を与え、食餌の説明を試験データ内に文書化した。水を適宜提供した。発情期は、この試験開始前には同期化していなかった。全ての処置を、同日に与えた。処置１を、各動物の肩領域内に筋肉内急速投与として与えた。処置２、３、及び４を、改変ヤギ経口投薬銃によって、膣内への急速投与として与えた。投薬前、ならびに投与の０．１６７、０．３３、０．７５、１、１．５、２、４、及び７時間後に血液試料を収集した。血漿を単離し、ＧｎＲＨ分析のために処理した。
【００４９】
血漿ＧｎＲＨ
プロテアーゼ阻害剤としての役割を果たす０．６ｍＬの３ｍＭバシトラシンを含有する、事前に冷却したＫ２  ＥＤＴＡ管中に血液を収集した後、管を少なくとも５回上下反転させることによって試料を混合した。次いで、試料を氷上に置き、収集から１５分以内に４℃で遠心分離した。次いで、０．６ｍＬの血漿を２．０ｍＬのメタノールに添加し、試料を６０秒間ボルテックスした。試料を−２０℃で凍結し、以前に説明されたＲＩＡ（Ｎｅｔｔ，Ｔ．Ｍ．，Ａ．Ｍ．Ａｋｂａｒ，Ｗ．Ｒ．Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｔ．Ｈｅｄｌｕｎｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄ．Ｎｉｓｗｅｎｄｅｒ．１９７３．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧｎＲＨ）ｉｎ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３６：８８０−８８５）による分析のためにＥｎｄｏｌｙｔｉｃｓ，ＬＬＣへと輸送した。
【００５０】
結果
逆変換された群平均血漿ゴナドレリン濃度
表３に示すように、４４０μｇ及び８８０μｇでの膣内用量を受けた動物（それぞれＴ０３及びＴ０４）は、２２０μｇの筋肉内用量を受けた動物（Ｔ０１）よりも高いピーク群平均血漿ゴナドレリン濃度を達成した。膣内処置（Ｔ０２、Ｔ０３、及びＴ０４）によって実証されたピーク血漿濃度は、Ｔ０１の投与によって達成された最高血漿濃度よりも後（それぞれ０．７５時間対０．３３３時間）に達成された。Ｔ０１及びＴ０２の動物は等価用量のゴナドレリン酢酸塩を受けた一方で、膣内経路の投与（Ｔ０２）の血漿濃度は、決してＩＭ投与（Ｔ０１）後に呈された血漿レベルと同一のレベルには達しなかった。血漿ゴナドレリン濃度は、Ｔ０４において最も高く、Ｔ０３、次いでＴ０１及びＴ０２がそれぞれ続いた（全ての処置についてｎ＝４）。用量投与から４時間後までに、全ての処置の血漿ゴナドレリンレベルは定量限界未満であった。
【００５１】
【表３】
2017519769.tif 000005
【００５２】
Ｔ０１：ＰＢＳ中、２２０μｇのゴナドレリン酢酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０２：ワックス（坐剤）中、２２０μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０３：ワックス（坐剤）中、４４０μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（４００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０４：ワックス（坐剤）中、８８０μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（８００μｇ等価量のゴナドレリン）
ＢＬＱ−定量限界未満（＜１．９ｐｇ／ｍＬ）
群平均薬物動態パラメータ
表４に示すように、４４０μｇ及び８８０μｇの膣内用量を受けた動物（Ｔ０３及びＴ０４）は、２２０μｇの筋肉内用量（Ｔ０１）または膣内用量（Ｔ０２）のいずれかを受けた動物よりも高い平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣレベルを達成した。膣内投与を受けた動物の中で、最も高い平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣはＴ０４によって達成され、ＣｍａｘはＴ０１筋肉内投与のＣｍａｘよりも約１．８倍高く、ＡＵＣは約２．３倍高かった。その後には処置３が続き、平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣはＴ０１のそれとおよそ等しかった。２２０μｇの筋肉内用量（Ｔ０１）と等価である膣内投与（Ｔ０２）は、それぞれ筋肉内用量の約４３％及び４９％であるＣｍａｘ及びＡＵＣをもたらした。予想通り、ゴナドレリンの筋肉内投与（Ｔ０１）は、投与の約２０分後に他のいずれの処置のＴｍａｘよりも早いＴｍａｘをもたらした。膣内投与のうち、Ｔ０４が、約３６分後に２番目に早いＴｍａｘを呈し、Ｔ０２、次いでＴ０３が、約４５分後にそれらのそれぞれのＴｍａｘに達した。
【００５３】
【表４】
2017519769.tif 000006
【００５４】
Ｔ０１：ＰＢＳ中、２２０μｇのゴナドレリン酢酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０２：ワックス（坐剤）中、２２０μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０３：ワックス（坐剤）中、４４０μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（４００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０４：ワックス（坐剤）中、８８０μｇのゴナドレリン酢酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（８００μｇ等価量のゴナドレリン）
用量比例性
図１Ａ及び１Ｂに示すように、クエン酸及びＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｈ１５と組み合わせたゴナドレリン酢酸塩の製剤は、膣内投与されるとき、用量比例的なＣｍａｘ及びＡＵＣを提供するであろう。この比例性は、ゴナドレリン酢酸塩の筋肉内投与後に観察されるゴナドレリンの血漿濃度と類似するゴナドレリンの血漿濃度を達成するのに必要とされる膣内用量の推定を可能にする。不適合度についての検定は、（Ｃｍａｘについて）０．６９１２のｐ値及び（ＡＵＣについて）０．９６８６のｐ値をもたらし、これらはともに０．１レベルで有意でなかった。
【００５５】
実施例３．ゴナドレリン塩酸塩の膣内投与の用量直線性
材料及び方法
動物及び処置
動物は、授乳する成体ホルスタイン種牛であった。それらは１〜３回の出産回数があり、分娩から最小５０日後であり、妊娠はしていなかった。これらの動物は、砂床を有する現代式フリーストール酪農施設に収容された群であり、それらは、１日２回搾乳された。試験開始前に、一方向処置構造を有する無作為完備型ブロック設計に従って４つの処置のうちの１つに動物を割り当て、それらを体重（５３９〜７８１ｋｇの範囲）に従ってブロック化した。処置１（Ｔ０１）「陽性対照」（ｎ＝４）は、ＰＢＳ中、２１２．３μｇのゴナドレリン塩酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）を筋肉内（ＩＭ）投与によって受け、処置２（Ｔ０２）は、４０ｍｇのクエン酸がワックス様マトリクス（ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｈ−１５）中に分散した２１２．３μｇのゴナドレリン塩酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）を膣内に受け、処置３（Ｔ０３）は、４０ｍｇのクエン酸がワックス様マトリクス（ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｈ−１５）中に分散した４２４．６μｇのゴナドレリン塩酸塩（４００μｇ等価量のゴナドレリン）を膣内に受け、処置４（Ｔ０４）は、４０ｍｇのクエン酸がワックス様マトリクス（ＷＩＴＥＰＳＯＬ（登録商標）Ｈ−１５）中に分散した８４９．２μｇのゴナドレリン塩酸塩（８００μｇ等価量のゴナドレリン）を膣内に受けた。全ての処置を、Ｚｏｅｔｉｓ  ＩＡＣＵＣ承認の動物使用プロトコルの下で実施した。
【００５６】
製剤
Ｔ０１は、２５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中に溶解した１．３７ｍｇのゴナドレリン塩酸塩から成っていた。結果として得られる５３．１μｇ／ｍＬの溶液は、５０μｇ／ｍＬのゴナドレリンと等価である。この溶液を、０．２２μｍのフィルタを通して濾過することによって滅菌した。この溶液のうちの４ｍＬを投与して、２００μｇのゴナドレリンの合計用量を達成した。Ｔ０２、Ｔ０３、及びＴ０４は、それぞれ２１２．３μｇ、４２４．６μｇ、または８４９．２μｇのゴナドレリン塩酸塩を、４０ｍｇのクエン酸と混合することによって作製した坐剤から成っていた。この混合物を粉砕して、より小さく、より均一な粒径を達成し、次いで、それを、２ｍＬのプラスチック管中、６０℃で融解した２６０ｍｇのＷｉｔｅｐｓｏｌ（登録商標）Ｈ１５中に分与した。この懸濁液をボルテックスして、均一性を確保した。次いで、それを冷却させて、それぞれ２００μｇ、４００μｇ、または８００μｇのゴナドレリンと等価の用量を含有する固体坐剤を形成した。
【００５７】
実験設計
試験開始前に動物を検査して、それらが健康であり、跛行が存在せず、正常な生殖器系を有することを確実にした。牛乳をスクリーニングして、体細胞数が７５０，０００個の細胞／ｍＬ未満であり、分房が乳腺炎を有しないことを確実にした。体重を集めて、処置に対して動物を無作為化した。授乳産業を代表する特別配合された基礎飼料割当を与え、食餌の説明を試験データ内に文書化した。水を適宜提供した。発情期は、この試験開始前には同期化していなかった。全ての処置を、同日に与えた。Ｔ０１を、各動物の肩領域内に筋肉内急速投与として与えた。Ｔ０２、Ｔ０３、及びＴ０４を、改変ヤギ経口投薬銃によって、膣内への急速投与として与えた。投薬前、ならびに投与の０．１６７、０．３３、０．７５、１、１．５、２、４、及び７時間後に血液試料を収集した。血漿を単離し、ＧｎＲＨ分析のために処理した。
【００５８】
血漿ＧｎＲＨ
プロテアーゼ阻害剤としての役割を果たす０．６ｍＬの３ｍＭバシトラシンを含有する、事前に冷却したＫ２  ＥＤＴＡ管中に血液を収集した後、管を少なくとも５回上下反転させることによって試料を混合した。次いで、試料を氷上に置き、収集から１５分以内に４℃で遠心分離した。次いで、０．６ｍＬの血漿を２．０ｍＬのメタノールに添加し、試料を６０秒間ボルテックスした。試料を−２０℃で凍結し、以前に説明されたＲＩＡ（Ｎｅｔｔ，Ｔ．Ｍ．，Ａ．Ｍ．Ａｋｂａｒ，Ｗ．Ｒ．Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ｔ．Ｈｅｄｌｕｎｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄ．Ｎｉｓｗｅｎｄｅｒ．１９７３．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧｎＲＨ）ｉｎ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３６：８８０−８８５）による分析のためにＥｎｄｏｌｙｔｉｃｓ，ＬＬＣへと輸送した。
【００５９】
結果
逆変換された群平均血漿ゴナドレリン濃度
表５に示すように、８４９．２μｇの膣内用量を受けた動物（Ｔ０４）は、２１２．３μｇの筋肉内用量を受けた動物（Ｔ０１）の約７９％であるピーク群平均血漿ゴナドレリン濃度を達成した。Ｔ０２及びＴ０３によって実証された最高血漿濃度は、それぞれＴ０１の約２０％及び４６％であった。Ｔ０１及びＴ０２の動物は等価用量のゴナドレリン塩酸塩を受けた一方で、用量を膣内に投与した動物（Ｔ０２）の濃度は、決して用量を筋肉内に投与した動物（Ｔ０１）の濃度には達しなかった。膣内用量のゴナドレリン塩酸塩を受けた全ての処置（Ｔ０２、Ｔ０３、及びＴ０４）はまた、筋肉内経路の投与を介してゴナドレリン塩酸塩を受けた動物（Ｔ０１）よりも後のゴナドレリンのピーク血漿濃度も実証した。用量投与から４時間後までに、全ての処置の血漿ゴナドレリンレベルは定量限界未満であった。
【００６０】
【表５】
2017519769.tif 000007
【００６１】
Ｔ０１：ＰＢＳ中、２１２．３μｇのゴナドレリン塩酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０２：ワックス（坐剤）中、２１２．３μｇのゴナドレリン塩酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０３：ワックス（坐剤）中、４２４．６μｇのゴナドレリン塩酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（４００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０４：ワックス（坐剤）中、８４９．２μｇのゴナドレリン塩酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（８００μｇ等価量のゴナドレリン）
ＢＬＱ−定量限界未満（＜１．９ｐｇ／ｍＬ）
群平均薬物動態パラメータ
表６に示すように、８４９．２μｇの膣内用量を受けた動物（Ｔ０４）は、２１２．３μｇの筋肉内用量（Ｔ０１）または膣内用量（Ｔ０２）のいずれかを受けた動物よりも高い平均ＡＵＣレベルを達成した。膣内投与を受けた動物の中で、最も高い平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣはＴ０４によって達成され、ＣｍａｘはＴ０１筋肉内投与の約８５％であり、ＡＵＣは約１．５倍高かった。その後にはＴ０３が続き、平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣはＴ０１のおよそ半分であった。２１２．３μｇの筋肉内用量（Ｔ０１）と等価である膣内投与（Ｔ０２）は、それぞれ筋肉内用量の約２１％及び３２％であるＣｍａｘ及びＡＵＣをもたらした。予想通り、ゴナドレリンの筋肉内投与（Ｔ０１）は、投与の約１３分後に他のいずれの処置のＴｍａｘよりも早いＴｍａｘをもたらした。膣内投与のうち、Ｔ０２が、約３２分後に２番目に早いＴｍａｘを呈し、Ｔ０３及びＴ０４が、約３９分後にそれらのそれぞれのＴｍａｘに達した。
【００６２】
【表６】
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【００６３】
Ｔ０１：ＰＢＳ中、２１２．３μｇのゴナドレリン塩酸塩（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０２：ワックス（坐剤）中、２１２．３μｇのゴナドレリン塩酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（２００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０３：ワックス（坐剤）中、４２４．６μｇのゴナドレリン塩酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（４００μｇ等価量のゴナドレリン）
Ｔ０４：ワックス（坐剤）中、８４９．２μｇのゴナドレリン塩酸塩＋４０ｍｇのクエン酸（８００μｇ等価量のゴナドレリン）
用量比例性
図２Ａ及び２Ｂに示すように、クエン酸及びＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｈ１５と組み合わせたゴナドレリン塩酸塩の製剤は、膣内投与されるとき、用量比例的なＣｍａｘ及びＡＵＣを提供するであろう。この比例性は、ゴナドレリン塩酸塩の筋肉内投与後に観察されるゴナドレリンの血漿濃度と類似するゴナドレリンの血漿濃度を達成するのに必要とされる膣内用量の推定を可能にする。不適合度についての検定は、（Ｃｍａｘについて）０．８３７９のｐ値及び（ＡＵＣについて）０．９６１６のｐ値をもたらし、これらはともに０．１レベルで有意でなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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