(57)【要約】ヒトｉＰＳ細胞を培養物中で樹立又は維持するための方法及び組成物を提供する。方法は、ヒトｉＰＳ細胞を作製するための低オスモル濃度培地の使用、又はヒトｉＰＳ細胞を維持するための低オスモル濃度培地の使用を含む。低オスモル濃度培地中で培養されたヒトｉＰＳ細胞に対して標的化された遺伝子改変を行うための方法もまた含まれる。組成物は、本明細書で定義された低オスモル濃度培地を使用して培養かつ維持されたヒトｉＰＳ細胞を含む。
2017536811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団と、
（ｂ）基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地と、を含むインビトロ培養物であって、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、インビトロ培養物。
【請求項２】
基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で作製又は維持されたヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団であって、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、集団。
【請求項３】
前記ｈｉＰＳＣは、
（ａ）ナイーブ型若しくはナイーブ様ｈｉＰＳＣを含むか、
（ｂ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現するか、
（ｃ）密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、
（ｄ）内胚葉性、外胚葉性、若しくは中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができるか、
（ｅ）約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有するか、又は、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせである、請求項１に記載のインビトロ培養物又は請求項２に記載の集団。
【請求項４】
前記ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する、請求項１若しくは３に記載のインビトロ培養物又は請求項２若しくは３に記載の集団。
【請求項５】
前記多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、アリカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３又は４に記載のインビトロ培養物又は集団。
【請求項６】
前記ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導される、請求項１及び３〜５のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜５のいずれか一項に記載の集団。
【請求項７】
前記形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する、請求項６に記載のインビトロ培養物又は集団。
【請求項８】
前記形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む、請求項６又は７に記載のインビトロ培養物又は集団。
【請求項９】
前記形質転換細胞は、前記低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、該高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は集団。
【請求項１０】
前記高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項９に記載のインビトロ培養物又は集団。
【請求項１１】
（ａ）前記形質転換細胞が、ナイーブ型若しくはナイーブ様状態の特徴を発現するまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｂ）前記形質転換細胞が、約２か月の期間にわたって前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｃ）前記形質転換細胞が、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、又は、
（ｄ）それらの組み合わせである、請求項９又は１０に記載のインビトロ培養物又は集団。
【請求項１２】
前記基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１及び３〜１１のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜１１のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１３】
前記基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１及び３〜１２のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜１２のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１４】
前記基本培地は、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む、請求項１及び３〜１３のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜１３のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１５】
前記低オスモル濃度培地は、約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１及び３〜１４のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜１４のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１６】
前記低オスモル濃度培地は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２３５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１及び３〜１５のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜１５のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１７】
前記低オスモル濃度培地は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１及び３〜１６のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜１６のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１８】
（ａ）前記サプリメントが、
（ｉ）Ｆ−１２培地、
（ｉｉ）Ｎ２サプリメント、
（ｉｉｉ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、
（ｉｖ）Ｂ−２７サプリメント、
（ｖ）Ｌ−グルタミン、
（ｖｉ）２−メルカプトエタノール、若しくは、
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを含むか、
（ｂ）前記ＬＩＦポリペプチドが、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドであるか、
（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１を含むか、
（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１を含むか、又は、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせである、請求項１及び３〜１７いずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜１７のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１９】
前記低オスモル濃度培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む、請求項１及び３〜１８のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜１８のいずれか一項に記載の集団。
【請求項２０】
前記低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む、請求項１及び３〜１９のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜１９のいずれか一項に記載の集団。
【請求項２１】
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない、請求項１及び３〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜２０のいずれか一項に記載の集団。
【請求項２２】
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメントを含まない、請求項１及び３〜２１のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜２１のいずれか一項に記載の集団。
【請求項２３】
前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＮｕＦＦフィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、請求項１及び３〜２２のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜２２のいずれか一項に記載の集団。
【請求項２４】
前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とすることができ、かつ継代培養することができる、請求項１及び３〜２３のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は請求項２〜２３のいずれか一項に記載の集団。
【請求項２５】
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、請求項２４に記載のインビトロ培養物又は集団。
【請求項２６】
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）前記１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ型若しくはナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、請求項２４又は２５に記載のインビトロ培養物又は集団。
【請求項２７】
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は集団。
【請求項２８】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を作製するための方法であって、該方法は、多能性状態を発現するように形質転換された非多様性細胞の集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地でインビトロ培養することを含み、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
【請求項２９】
前記方法は、ナイーブ型又はナイーブ様ｈｉＰＳＣの集団を増加させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
インビトロ培養物中のヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を維持するための方法であって、該方法は、該ｈｉＰＳＣの集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養することを含み、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
【請求項３１】
前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とすることができ、かつ継代培養することができる、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ型若しくはナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）該ｈｉＰＳＣ中に、該標的ゲノム遺伝子座における５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した挿入核酸を含むターゲッティングベクターを導入することと、
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該挿入核酸を、ゲノム中に含む、遺伝子改変ｈｉＰＳＣを特定することと、を含み、
該ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
【請求項３６】
前記ターゲッティングベクターは、大型ターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記５’及び３’ホモロジーアームの総量は、少なくとも１０ｋｂである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
導入ステップ（ａ）は、前記ターゲッティングベクターと前記ｈｉＰＳＣ内の前記標的ゲノム遺伝子座との間の相同的組み換えを促進するヌクレアーゼ剤を導入することを更に含む、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的化された遺伝子改変は、
（ａ）内因性ヒト核酸配列の欠失、
（ｂ）外因性核酸配列の挿入、又は、
（ｃ）該外因性核酸配列による該内因性ヒト核酸配列の置き換えを含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記外因性核酸配列は、
（ａ）前記内因性ヒト核酸配列と相同な又はオーソロガスである核酸配列、
（ｂ）キメラ核酸配列、
（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接した条件付き対立遺伝子、及び
（ｄ）前記ｈｉＰＳＣ内で活性なプロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子のうちの１つ又は２つ以上を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）該ｈｉＰＳＣ中に、該標的ゲノム遺伝子座における認識部位で１つ又は２つ以上の切れ目又は二本鎖切断を誘導する１種又は２種以上のヌクレアーゼ剤を導入することと、
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座において、ゲノム中に改変を含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含み、
該ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
【請求項４１】
ステップ（ａ）の前に、前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液にされ、かつ継代培養される、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ型若しくはナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヌクレアーゼ剤は、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
（ｃ）メガヌクレアーゼ、又は、
（ｄ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び、ゲノム標的配列を認識するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、を含む、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的化された遺伝子改変は、二対立遺伝子改変である、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｈｉＰＳＣは、
（ａ）ナイーブ型若しくはナイーブ様ｈｉＰＳＣを含むか、
（ｂ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現するか、
（ｃ）密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、
（ｄ）内胚葉性、外胚葉性、若しくは中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができるか、
（ｅ）約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有するか、又は、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせである、請求項２８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する、請求項２８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、アリカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導される、請求項３０〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する、請求項２８、２９、及び５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む、請求項２８、２９、５１、及び５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記形質転換細胞は、前記低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、該高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含む、請求項２８、２９、及び５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
（ａ）前記形質転換細胞が、ナイーブ型若しくはナイーブ様状態の特徴を発現するまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｂ）前記形質転換細胞が、約２か月の期間にわたって前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｃ）前記形質転換細胞が、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、又は、
（ｄ）それらの組み合わせである、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を示す、請求項２８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項２８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記基本培地は、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む、請求項２８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記低オスモル濃度培地は、約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２４０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項２８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記低オスモル濃度培地は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２３５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項２８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記低オスモル濃度培地は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項２８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）前記サプリメントが、
（ｉ）Ｆ−１２培地、
（ｉｉ）Ｎ２サプリメント、
（ｉｉｉ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、
（ｉｖ）Ｂ−２７サプリメント、
（ｖ）Ｌ−グルタミン、
（ｖｉ）２−メルカプトエタノール、若しくは、
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを含むか、
（ｂ）前記ＬＩＦポリペプチドが、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドであるか、
（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１を含むか、
（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１を含むか、又は、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせである、請求項２８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記低オスモル濃度培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む、請求項２８〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む、請求項２８〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない、請求項２８〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメントを含まない、請求項２８〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＮｕＦＦフィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、請求項２８〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
請求項２８、２９、３１〜３４、４８〜５０、及び５２〜６８のいずれか一項に記載の方法によって作製される、ｈｉＰＳＣ。
【請求項７０】
請求項３５〜６８のいずれか一項に記載の方法によって作製される、改変ｈｉＰＳＣ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１４年１０月１５日出願の米国特許出願第６２／０６４，３８４号の利益を主張する。
【０００２】
（ＥＦＳ  ＷＥＢ経由でテキストファイルとして提出された配列表の参照）
配列表の正式なコピーは、２０１５年１０月１４日に作成され、かつ７５７バイトのサイズを有する、ファイル名「４６９５８７ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ」のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出され、かつ本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、多能性のナイーブ状態又はプライム状態を示すことができる（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００９）Ｖｏｌ．４（６），ｐｐ．４８７〜４９２）。プライム型ヒトｉＰＳ細胞は、着床後胚盤葉上層細胞の特徴に類似した特徴を発現し、系譜特異化及び分化が行われる。その一方で、ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞は、着床前胚の内部細胞塊の胚幹（ＥＳ）細胞の特徴に類似した特徴を発現する。いくつかの点では、ナイーブ型ｉＰＳ細胞は、系譜特異化が行われていないため、プライム型細胞に比べてより多能性である。ナイーブ状態又はプライム状態のヒトｉＰＳを維持するために、様々な培養条件が使用され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎｉｃｈｏｌｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００９）Ｖｏｌ．４（６），ｐｐ．４８７〜４９２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を作製するための方法を提供する。そのような方法は、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞の集団をインビトロ培養することを含み、低オスモル濃度培地は、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、この培地は、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。そのような方法はまた、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞の集団をインビトロ培養することを含んでもよく、低オスモル濃度培地は、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【０００６】
インビトロ培養物中のｈｉＰＳＣの集団を維持するための方法が更に提供され、本方法は、ｈｉＰＳＣの集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養することを含み、低オスモル濃度培地は、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、この培地は、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。そのような方法はまた、ｈｉＰＳＣの集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養することを含んでもよく、低オスモル濃度培地は、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【０００７】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、ナイーブ型又はナイーブ様（naive-looking）ｈｉＰＳＣを含む。いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、ナイーブ様ｈｉＰＳＣを含む。
【０００８】
いくつかの方法では、本方法は、ナイーブ型又はナイーブ様ｈｉＰＳＣの集団を増加させる。いくつかの方法では、本方法は、ナイーブ様ｈｉＰＳＣの集団を増加させる。
【０００９】
いくつかの方法では、形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する。いくつかの方法では、形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む。
【００１０】
いくつかの方法では、基本培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いくつかの方法では、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００１１】
いくつかの方法では、基本培地は、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む。
【００１２】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００１３】
いくつかの方法では、サプリメントは、（ａ）Ｆ−１２培地、（ｂ）Ｎ２サプリメント、（ｃ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、（ｄ）Ｂ−２７サプリメント、（ｅ）Ｌ−グルタミン、（ｆ）２−メルカプトエタノール、又は（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の組み合わせを含む。
【００１４】
いくつかの方法では、ＬＩＦポリペプチドは、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドである。いくつかの方法では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。いくつかの方法では、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１を含む。いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む。
【００１５】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む。
【００１６】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない。いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない。
【００１７】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣ又は形質転換細胞は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）フィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ（商標）上で培養される。
【００１８】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、１つ又は２つ以上の多能性マーカーを発現する。いくつかの方法では、１つ又は２つ以上の多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、アルカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する。
【００１９】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示す。
【００２０】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とすることができ、かつ継代培養することができる。いくつかの方法では、酵素的解離は、トリプシンを使用して実施される。いくつかの方法では、酵素的解離は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の非存在下で実施してもよい。いくつかの方法では、継代培養ｈｉＰＳＣは、１つ又は２つ以上の多能性マーカーを発現し続ける。いくつかの方法では、継代培養ｈｉＰＳＣは、ナイーブ型又はナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示す。いくつかの方法では、継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する。
【００２１】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、内胚葉性、外胚葉性、又は中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができる。
【００２２】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有する。
【００２３】
いくつかの方法では、形質転換細胞は、低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含む。任意選択的に、高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００２４】
いくつかの方法では、形質転換細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態の特徴を発現するまで高オスモル濃度培地で最初に培養される。いくつかの方法では、形質転換細胞は、約２か月の期間にわたって高オスモル濃度培地で最初に培養される。いくつかの方法では、形質転換細胞は、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで高オスモル濃度培地で最初に培養される。
【００２５】
上記方法のいずれかによって作製されたｈｉＰＳＣを、更に提供する。
【００２６】
（ａ）標的ゲノム遺伝子座における５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した挿入核酸を含むターゲッティングベクターをｈｉＰＳＣに導入することと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた挿入核酸を、ゲノム内に有する遺伝子改変ｈｉＰＳＣを特定することと、を含む、ｈｉＰＳＣ内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法が更に提供され、ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、低オスモル濃度培地は、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、この培地は、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。そのような方法はまた、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した挿入核酸を含むターゲッティングベクターをｈｉＰＳＣに導入することと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた挿入核酸を、ゲノム内に有する遺伝子改変ｈｉＰＳＣを特定することと、を含んでもよく、ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、低オスモル濃度培地は、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いくつかの方法では、ターゲッティングベクターは、大型ターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、５’及び３’ホモロジーアームの総量は、少なくとも１０ｋｂである。いくつかの方法では、導入ステップ（ａ）は、ターゲッティングベクターとｈｉＰＳＣ内の標的ゲノム遺伝子座との間の相同組み換えを促進するヌクレアーゼ剤を導入することを更に含む。いくつかの方法では、標的化された遺伝子改変は、（ａ）内因性ヒト核酸配列の欠失、（ｂ）外因性核酸配列の挿入、又は（ｃ）外因性核酸配列による内因性ヒト核酸配列の置き換えを含む。いくつかの方法では、外因性核酸配列は、（ａ）内因性ヒト核酸配列と相同な又はオーソロガスである核酸配列、（ｂ）キメラ核酸配列、（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接した条件付き対立遺伝子、及び（ｄ）ｈｉＰＳＣ内で活性なプロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子のうちの１つ又は２つ以上を含む。
【００２７】
ｈｉＰＳＣ内の標的ゲノム遺伝子座を改変するためのそのような方法はまた、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における認識部位で１つ又は２つ以上の切れ目又は二本鎖切断を誘導する１種又は２種以上のヌクレアーゼ剤をｈｉＰＳＣに導入することと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座において、ゲノム中に改変を含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含んでもよく、ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、低オスモル濃度培地は、（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、この培地は、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。そのような方法はまた、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における認識部位で１つ又は２つ以上の切れ目又は二本鎖切断を誘導する１種又は２種以上のヌクレアーゼ剤をｈｉＰＳＣに導入することと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座において、ゲノム中に改変を含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含んでもよく、ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、低オスモル濃度培地は、（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００２８】
ｈｉＰＳＣ内の標的ゲノム遺伝子座を改変するためのそのような方法のいずれかにおいて、ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とすることができ、かつステップ（ａ）の前に継代培養することができる。任意選択的に、酵素的解離は、トリプシンを使用して実施される。任意選択的に、酵素的解離は、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施される。いくつかの方法では、継代培養ｈｉＰＳＣは、１つ又は２つ以上の多能性マーカーを発現し続ける。いくつかの方法では、継代培養ｈｉＰＳＣは、ナイーブ型又はナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示す。いくつかの方法では、継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する。
【００２９】
いくつかの方法では、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。いくつかの方法では、ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。いくつかの方法では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び、ゲノム標的配列を認識するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、を含む。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
【００３０】
いくつかの方法では、標的化された遺伝子改変は、二対立遺伝子改変である。
【００３１】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、ナイーブ型又はナイーブ様ｈｉＰＳＣを含む。いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、ナイーブ様ｈｉＰＳＣを含む。いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、１つ又は２つ以上の多能性マーカーを発現する。任意選択的に、多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、アルカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示す。いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、内胚葉性、外胚葉性、又は中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができる。いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有する。いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する。
【００３２】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導される。任意選択的に、形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する。任意選択的に、形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む。いくつかの方法では、形質転換細胞は、低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含む。任意選択的に、高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いくつかの方法では、形質転換細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態の特徴を発現するまで高オスモル濃度培地で最初に培養される。いくつかの方法では、形質転換細胞は、約２か月の期間にわたって高オスモル濃度培地で最初に培養される。いくつかの方法では、形質転換細胞は、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで高オスモル濃度培地で最初に培養される。
【００３３】
いくつかの方法では、基本培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いくつかの方法では、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００３４】
いくつかの方法では、基本培地は、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む。
【００３５】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００３６】
いくつかの方法では、サプリメントは、（ｉ）Ｆ−１２培地、（ｉｉ）Ｎ２サプリメント、（ｉｉｉ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、（ｉｖ）Ｂ−２７サプリメント、（ｖ）Ｌ−グルタミン、（ｖｉ）２−メルカプトエタノール、又は（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを含む。いくつかの方法では、ＬＩＦポリペプチドは、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドである。いくつかの方法では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。いくつかの方法では、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１を含む。
【００３７】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む。
【００３８】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む。
【００３９】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない。いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメントを含まない。
【００４０】
いくつかの方法では、ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＮｕＦＦフィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される。
【００４１】
上記方法のいずれかによって作製された改変ｈｉＰＳＣが、更に提供される。
【００４２】
（ａ）ｈｉＰＳＣの集団と（ｂ）基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地とを含むインビトロ培養物が更に提供され、低オスモル濃度培地は、（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、この培地は、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。そのようなインビトロ培養物はまた、（ａ）ｈｉＰＳＣの集団と（ｂ）基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地とを含んでもよく、低オスモル濃度培地は、（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００４３】
基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で作製されるか、又は維持されるｈｉＰＳＣの集団が更に提供され、低オスモル濃度培地は、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、この培地は、約１７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。そのようなｈｉＰＳＣの集団はまた、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で作製されるか、又は維持されてもよく、低オスモル濃度培地は、（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００４４】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣは、ナイーブ型又はナイーブ様ｈｉＰＳＣを含む。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣは、ナイーブ様ｈｉＰＳＣを含む。
【００４５】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導される。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む。
【００４６】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、基本培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００４７】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、基本培地は、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む。
【００４８】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、低オスモル濃度培地は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００４９】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、サプリメントは、（ａ）Ｆ−１２培地、（ｂ）Ｎ２サプリメント、（ｃ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、（ｄ）Ｂ−２７サプリメント、（ｅ）Ｌ−グルタミン、（ｆ）２−メルカプトエタノール、又は（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の組み合わせを含む。
【００５０】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ＬＩＦポリペプチドは、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドである。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１を含む。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、低オスモル濃度培地は、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む。
【００５１】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む。
【００５２】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、低オスモル濃度培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない。
【００５３】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣ又は形質転換細胞は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）フィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ（商標）上で培養される。
【００５４】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣは、１つ又は２つ以上の多能性マーカーを発現する。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、１つ又は２つ以上の多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、アルカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する。
【００５５】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣは、密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示す。
【００５６】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とすることができ、かつ継代培養することができる。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、酵素的解離は、トリプシンを使用して実施される。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、酵素的解離は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の非存在下で実施してもよい。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、継代培養ｈｉＰＳＣは、１つ又は２つ以上の多能性マーカーを発現し続ける。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、継代培養ｈｉＰＳＣは、ナイーブ型又はナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示す。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する。
【００５７】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣは、内胚葉性、外胚葉性、又は中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができる。
【００５８】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、ｈｉＰＳＣは、約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有する。
【００５９】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、形質転換細胞は、低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含む。任意選択的に、高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００６０】
いくつかの集団又はインビトロ培養物では、形質転換細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態の特徴を発現するまで高オスモル濃度培地で最初に培養される。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、形質転換細胞は、約２か月の期間にわたって高オスモル濃度培地で最初に培養される。いくつかの集団又はインビトロ培養物では、形質転換細胞は、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで高オスモル濃度培地で最初に培養される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒトｉＰＳ細胞においてＬＴＶＥＣ及びガイドＲＮＡを使用するマウスＡｄａｍ６ａ及びマウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子座を含む核酸によるヒトＡＤＡＭ６遺伝子座の一部の置き換えを概略的に示す図である。ガイドＲＮＡの標的部位は、矢印によって示されている。
【図２Ａ】２ｉ培地で８日間にわたって培養されたヒトｉＰＳ細胞によって示された形態を示す図である。
【図２Ｂ】２ｉ培地で１２日間にわたって培養されたヒトｉＰＳ細胞によって示された形態を示す図である。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地又は低オスモル濃度ＶＧ２ｉ培地で６日間にわたって培養されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示す図である。図３Ａ及び図３Ｂは、ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地（図３Ａ）又はＶＧ２ｉ培地（図３Ｂ）で６日間にわたって培養されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示す図である。図３Ｃ及び図３Ｄは、ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地（図３Ｃ）又はＶＧ２ｉ培地（図３Ｄ）で６日間にわたって、新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）フィーダー細胞上で培養されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示す図である。
【図４Ａ】アルカリホスファターゼで染色済みの、ＶＧ２ｉ培地で培養したリプログラムされたヒトｉＰＳ細胞を示す図である。
【図４Ｂ】ＮＡＮＯＧの発現に対して免疫染色済みの、ＶＧ２ｉ培地で培養したリプログラムされたヒトｉＰＳ細胞を示す図である。
【図４Ｃ】ＮＡＮＯＧの発現に対して免疫染色済みの、ＶＧ２ｉ培地で培養したリプログラムされたヒトｉＰＳ細胞を示す図である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、ＶＧ２ｉ培地で培養したリプログラムされたヒトｉＰＳ細胞の酵素的解離及び継代培養を例示する図である。図５Ａは、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下でトリプシンによる酵素的解離の前の、ＶＧ２ｉ培地で培養したリプログラムされたヒトｉＰＳ細胞を示す図である。図５Ｂは、継代培養後１日目のＶＧ２ｉ培地で培養したヒトｉＰＳ細胞を示す図である。図５Ｃは、継代培養後４日目のＶＧ２ｉ培地で培養したヒトｉＰＳ細胞を示す図である。
【図６Ａ】トリプシンによる解離で単個細胞浮遊液を生じてから１０回継代における２つの異なるヒトｉＰＳ細胞クローン由来の細胞の核型を示す図である。
【図６Ｂ】トリプシンによる解離で単個細胞浮遊液を生じてから１０回継代における２つの異なるヒトｉＰＳ細胞クローン由来の細胞の核型を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
（配列の簡単な説明）
（配列番号１）  ＡＤＡＭ６  ｇＲＮＡを含む核酸配列である。
（配列番号２）  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に対する標的配列の核酸配列である。
【００６３】
定義
本明細書で互換的に使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、コード及び非コードアミノ酸、並びに化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。それらの用語はまた、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなど、修飾されているポリマーを含む。
【００６４】
本明細書で互換的に使用される用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの類似体若しくは改変バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。それらは、プリン塩基、ピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにポリマーを含む。
【００６５】
「コドン最適化」は、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子中でより頻繁に、又は最も頻繁に使用されるコドンと置換することによって、特定の宿主細胞中の発現の強化のために核酸配列を改変する工程を概ね含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ヒト細胞中でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。これらの表は、多くの方法で適用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現に対する特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムもまた、入手可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
【００６６】
「操作可能な連結」又は「操作可能に連結」されていることは、両方の構成要素が正常に機能し、かつ構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぼされる機能を媒介することができる可能性を可能にするような、２つ以上の構成要素（例えば、プロモーター及び別の配列要素）の並置を含む。例えば、プロモーターが、１つ又は２つ以上の転写調節因子の存在又は非存在に応答して、コード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結され得る。
【００６７】
核酸の「相補性」は、そのヌクレオ塩基の基の配向によって、核酸の１つの鎖中のヌクレオチド配列が、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡ中の相補的塩基は、一般的には、ＴとＡ及びＧとＣである。ＲＮＡ中では、それらは、一般的には、ＧとＣ及びＡとＵである。相補性は、完全又は実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性は、この２つの核酸が、二重鎖中の全ての塩基がワトソン−クリック対合によって相補的塩基に結合される二重鎖を形成することができることを意味する。「実質的な」又は「十分な」相補性は、１つの鎖中の配列が対向する鎖中の配列に全面的及び／又は完全に相補的ではないが、２つの鎖上の塩基間で十分な結合が生じて、一組のハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度及び温度）下で、安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。そのような条件は、配列及びハイブリダイズ鎖のＴｍを予測するための標準的な数学的計算を使用することによって、又は常法を用いたＴｍの経験的決定によって予測され得る。Ｔｍは、２つの核酸鎖間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性した温度を含む。Ｔｍ未満の温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成に有利に働く一方で、Ｔｍを超える温度では、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解又は分離に有利に働く。Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することによって、１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中で既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸に対して推定されてもよいが、他の既知のＴｍ計算は、核酸構造特徴を考慮に入れる。
【００６８】
「ハイブリダイゼーション条件」は、１つの核酸鎖が、ハイブリダイゼーション複合体を生み出すために、相補鎖相互作用及び水素結合によって第２の核酸鎖に結合する、累積的な環境を含む。そのような条件は、核酸を含有する水性又は有機溶液の化学構成成分及びそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、並びに混合物の温度を含む。インキュベーション時間の長さ又は反応チャンバの寸法などの他の要因が環境に寄与し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．１．９０〜１．９１，９．４７〜９．５１，１１．４７〜１１．５７（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照されたい。
【００６９】
ハイブリダイゼーションは、塩基間のミスマッチの可能性はあるものの、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とする。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は、当該技術分野において周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対する融解温度（Ｔｍ）の値は大きくなる。短区間の相補性（例えば、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２２個以下、２０個以下、又は１８個以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションに関して、ミスマッチの位置は重要になる（上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１１．７〜１１．８を参照されたい）。一般的には、ハイブリダイズ可能な核酸に対する長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸に対する例示的な最小長は、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチドを含む。更に、温度及び洗浄溶液塩濃度は、相補性の領域の長さ及び相補性の程度などの要因に従って、必要に応じて調整されてもよい。
【００７０】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列に１００％相補的である必要はない。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つ又は２つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的化される標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を含んでもよい。例えば、２０個中１８個のヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズする、ｇＲＮＡは、９０％の相補性を表す。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドが散在又は点在していてもよく、互いに、又は相補的ヌクレオチドに接触している必要はない。
【００７１】
核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性百分率は、当該技術分野において既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９〜６５６）を使用して、又は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２〜４８９）を使用するデフォルト設定を用いる、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を使用して、規定どおりに決定することができる。
【００７２】
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列との関連での「配列同一性」又は「同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたって最大限に一致するようにアラインメントされたときに同じである２つの配列中の残基を参照する。配列同一性の割合がタンパク質に関して使用されるとき、同一ではない残基部分は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なることが認識され、この保存的アミノ酸置換において、アミノ酸残基は、同様の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換の点で異なるとき、配列同一性の百分率は、置換の保存性を補正するように上方調節されてもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると称される。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。一般的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチよりもむしろ部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより、配列同一性の割合を増加させることを伴う。したがって、例えば、同一アミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換は、ゼロ〜１のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））で実装されるように計算される。
【００７３】
「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定された値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、基準配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。割合は、同一核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることによって計算される。
【００７４】
特に指示がない限り、配列同一性／類似性の値は、以下のパラメータ、すなわち、５０のＧＡＰ重み及び３の長さ重み並びにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用するヌクレオチド配列に対する％同一性及び％類似性、８のＧＡＰ重み及び２の長さ重み並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用するアミノ酸配列に対する％同一性及び％類似性、又はそれらの任意の同等のプログラムを用いるＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、当該の任意の２つの配列に関して、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０によって生成された対応するアラインメントと比較したとき、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基マッチ及び同一の配列同一性の百分率を有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを含む。
【００７５】
１つ又は２つ以上の列挙された要素を「備える」又は「含む」組成物又は方法は、特に列挙されていない他の要素を含んでもよい。例えば、あるタンパク質を「備える」又は「含む」組成物は、そのタンパク質を単独で、又は他の成分と組み合わせて含有してもよい。
【００７６】
値の範囲の指定は、その範囲内の、又はその範囲を画定する全ての整数、及びその範囲内の整数によって定義される全ての部分範囲を含む。
【００７７】
用語「約」は、特定の値がある程度の割合で変動してもよいことを意味する。いくつかの実施例では、この割合は、特定の値の１、２、３、４、８、又は１０％であってもよい。
【００７８】
単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「１つの細胞（a  cell）」又は「少なくとも１つの細胞（at  least  one  cell）」は、これらの混合物を含む複数の細胞を含むことができる。
【００７９】
Ａ．ヒト誘導多能性幹細胞の作製及び維持のための低オスモル濃度培地
細胞培養培地は、本発明の方法及び組成物で使用するために提供される。一実施形態では、この培地は、ヒトｉＰＳ細胞の集団を作製するために好適である。別の実施形態では、この培地は、ヒトｉＰＳ細胞を培養物中で維持するために好適である。いくつかの実施形態では、ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様である。
【００８０】
本明細書において提供される培地は、少なくとも基本培地、サプリメント、白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、及び分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤を含む。「基本培地（base  medium）」又は「（複数の）基本培地（base  media）」は、例えば、培養物における多能性細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）の増殖又は維持に（サプリメントを添加して）使用するために好適な当該分野で既知の基本培地（例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ））を含む。基本培地は、細胞を培養物中で維持するために使用されるとき、当該技術分野において既知の多くのサプリメントが、一般的には補充される。
【００８１】
本発明の培地は、低オスモル濃度培地である。一実施例では、オスモル濃度は、約１７５〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇである。別の実施例では、培地のオスモル濃度は、約１８０〜２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２００〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２２０〜２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、又は約２２５〜２３５ｍＯｓｍである。特定の実施形態では、培地のオスモル濃度は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００８２】
本発明に提供される基本培地は、サプリメントが添加された低オスモル濃度基本培地である。本発明の基本培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、様々な形態（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎ  ＤＭＥＭ、カタログ番号１１９７１−０２５）、及びＫＯ−ＤＭＥＭ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎカタログ番号１０８２９−０１８）として市販されている低塩ＤＭＥＭを含む、ヒトｉＰＳ細胞を培養物中で維持するために一般的に使用される基本培地とは異なる。
【００８３】
本明細書で提供される基本培地は、低オスモル濃度培地であるが、低オスモル濃度に限定されない特徴を示す。例えば、表１に示したＤＭＥＭ処方は、本明細書で提供されるように塩化ナトリウム及び／又は炭酸水素ナトリウムの濃度を変化させることによって、本発明の目的ために好適であるようにすることができ、この処方は、標準ＤＭＥＭ基本培地又は表１に示される低塩ＤＭＥＭ基本培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ）と比較して異なるオスモル濃度をもたらすこととなる。
【００８４】
【表１】
2017536811.tif 000003
【００８５】
本発明の基本培地は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）などのアルカリ金属とハライドとの塩を含んでもよい。基本培地におけるＮａＣｌの例示的な濃度には、５０±５ｍＭ又は約３ｍｇ／ｍＬが挙げられる。基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地におけるアルカリ金属とハライドとの塩の濃度は、例えば、約１００、９０、８０、７０、６０、又は５０ｍＭ以下であってもよい。例えば、基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地は、約５０〜１１０、６０〜１０５、７０〜９５、８０〜９０、９０ｍＭ、又は８５ｍＭのアルカリ金属とハライドとの塩の濃度を有してもよい。あるいは、アルカリ金属とハライドとの塩の濃度は、例えば、５０±５ｍＭ、８７±５ｍＭ、１１０±５ｍＭ、約３ｍｇ／ｍＬ、約５．１ｍｇ／ｍＬ、又は約６．４ｍｇ／ｍＬであってもよい。
【００８６】
別の実施形態では、基本培地は、炭酸の塩の濃度を示す。炭酸の塩は、ナトリウム塩であってもよい。そのような例では、ナトリウム塩は、炭酸水素ナトリウムであってもよい。特定の実施形態では、炭酸水素ナトリウムは、約２６±５ｍＭ又は約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で基本培地中に存在する。基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地における炭酸の塩の濃度は、例えば、約４５、４０、３５、３０、２５、又は２０ｍＭ以下であってもよい。例えば、基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地は、約１０〜４０、１８〜４４、１７〜３０、１８〜２６、１３〜２５、２０〜３０、２５〜２６、１８、又は２６ｍＭの基本培地における炭酸の塩の濃度を有してもよい。あるいは、炭酸の塩の濃度は、例えば、１８±５ｍＭ、２６±５ｍＭ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、又は約２．２ｍｇ／ｍＬであってもよい。
【００８７】
基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地におけるアルカリ金属とハライドとの塩及び炭酸の塩の濃度の合計は、例えば、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、又は８０ｍＭ以下であってもよい。例えば、基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地は、約８０〜１４０、８５〜１３０、９０〜１２０、９５〜１２０、１００〜１２０、又は１１５ｍＭのアルカリ金属とハライドとの塩及び炭酸の塩の濃度の合計を有してもよい。
【００８８】
基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地におけるアルカリ金属とハライドとの塩及び炭酸の塩のモル比は、例えば、２．５より大きくてもよい。例えば、基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地は、約２．６〜４．０、２．８〜３．８、３．０〜３．６、３．２〜３．４、３．３〜３．５、又は３．４のアルカリ金属とハライドとの塩及び炭酸の塩のモル比を有してもよい。
【００８９】
更に別の実施形態では、基本培地は、低オスモル濃度基本培地である。基本培地のオスモル濃度は、約１７５〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１８０〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約１９０〜２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ、又は約１９５〜２０５ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内であってもよい。基本培地の例示的なオスモル濃度は、２００、２１４、２１６、又は２１８ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。特定の実施例では、基本培地のオスモル濃度は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇである。オスモル濃度は、細胞が異なる濃度のＣＯ２で培養されるときに決定されてもよい。いくつかの実施例では、細胞は、３％ＣＯ２又は５％ＣＯ２で培養される。基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地のオスモル濃度は、例えば、約３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７５、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、又は２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であってもよい。例えば、基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地は、約２００〜３２９、２１８〜３２２、２４０〜３２０、２５０〜３１０、２７５〜２９５、又は２６０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有してもよい。例えば、基本培地又は基本培地とサプリメントとを含む培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６１ｍＯｓｍ／ｋｇ、又は約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有してもよい。あるいは、オスモル濃度は、２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇ、２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇ、又は３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。
【００９０】
基本培地のオスモル濃度は、例えば、約１３０〜２７０、１４０〜２６０、１５０〜２５０、１６０〜２４０、１７０〜２３０、１８０〜２２０、１９０〜２１０、１９５〜２０５、又は２００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。あるいは、基本培地のオスモル濃度は、例えば、約２００±７０、２００±６０、２００±５０、２００±４０、２００±３５、２００±３０、２００±２５、２００±２０、２００±１５、２００±１０、２００±５、又は２００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。あるいは、基本培地のオスモル濃度は、例えば、約１３０〜１４０、約１４０〜１５０、約１５０〜１６０、約１６０〜１７０、約１７０〜１８０、約１８０〜１９０、約１９０〜２００、約２００〜２１０、約２１０〜２２０、約２２０〜２３０、約２３０〜２４０、約２４０〜２５０、約２５０〜２６０、約２６０〜２７０、約２７０〜２８０、約２８０〜２９０、約２９０〜３００、約３００〜３１０、約３１０〜３２０、又は約３２０〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。あるいは、基本培地のオスモル濃度は、例えば、約３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、又は１３０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満であってもよい。
【００９１】
基本培地とサプリメントとを含む培地のオスモル濃度は、例えば、約２０５〜２６０、２１５〜２５０、２２５〜２４０、２３０〜２３５、又は２３３ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。あるいは、基本培地とサプリメントとを含む培地のオスモル濃度は、例えば、約２３３±２７、２３３±２５、２３３±２０、２３３±１５、２３３±１０、２３３±５、又は２３３ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。あるいは、基本培地とサプリメントとを含む培地のオスモル濃度は、例えば、約２００〜２０５、２０５〜２１０、２１０〜２１５、２１５〜２２０、２２０〜２２５、２２５〜２３０、２３０〜２３５、２３５〜２４０、２４０〜２４５、２４５〜２５０、２５０〜２５５、又は２５５〜２６０ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。あるいは、基本培地とサプリメントとを含む培地のオスモル濃度は、例えば、２６０、２５５、２５０、２４５、２４０、２３５、２３０、２２５、２２０、２１５、２１０、２０５、又は２００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満であってもよい。
【００９２】
いくつかの低オスモル濃度培地では、基本培地は、約８７±５ｍＭのＮａＣｌ及び約２６±５ｍＭの炭酸塩を含む。例えば、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含んでもよく、かつ約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有してもよい。
【００９３】
いくつかの低オスモル濃度培地では、基本培地は、約５０±５ｍＭのＮａＣｌ及び約２６±５ｍＭの炭酸塩を含む。例えば、基本培地は、約３．０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含んでもよく、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有してもよい。好ましい実施形態では、基本培地は、３．０ｍｇ／ｍＬの濃度のＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度の炭酸水素ナトリウムを含み、かつ２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００９４】
低オスモル濃度培地の他の例は、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１／１５６７２３号、米国特許出願公開第２０１１／０３０７９６８号、及び米国特許出願公開第２０１５／００６７９０１号に記載されている。
【００９５】
本発明の基本培地と共に処方されるサプリメントは、本明細書において開示されたヒトｉＰＳ細胞の集団の作製、維持、及び増加のために好適である。そのようなサプリメントは、本開示において「サプリメント」又は「＋サプリメント」として示される。用語「サプリメント」又は語句「＋サプリメント」は、表１に記載された基本培地の構成成分に添加される１種又は２種以上の追加要素を含む。例えば、サプリメントは、Ｆ−１２（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２（登録商標）サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、１００Ｘ溶液）、ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、５０Ｘ溶液）、Ｌ−グルタミン、グルコース、２−メルカプトエタノール、白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチド、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせを、制限することなく、含んでもよい。サプリメントはまた、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、（複数の）抗生物質、ペニシリン及びストレプトマイシン（すなわち、ペンストレップ）、ピルビン酸塩（例えば、ピルビン酸ナトリウム）、並びに非必須アミノ酸（例えば、ＭＥＭ  ＭＥＡＡ）を含んでもよい。
【００９６】
特定の実施形態では、ＬＩＦポリペプチドは、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドである。いくつかの実施例では、ｈＬＩＦポリペプチドは、約１〜１０００単位／ｍＬ、約２０〜８００単位／ｍＬ、約５０〜５００単位／ｍＬ、約７５〜２５０単位／ｍＬ、又は約１００単位／ｍＬの濃度で使用される。
【００９７】
培地は、例えば、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含んでもよい。例えば、培地は、ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤からなる阻害剤を含んでもよい。
【００９８】
別の特定の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。いくつかの実施例では、ＣＨＩＲ９９０２１は、約０．１〜１０μＭ、約１〜５μＭ、約２〜４μＭ、又は約３μＭの濃度で使用される。
【００９９】
別の特定の実施形態では、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１を含む。いくつかの実施例では、ＰＤ０３２５９０１は、約０．１〜５μＭ、約０．２〜１μＭ、約０．３〜０．７μＭ、又は約０．５μＭの濃度で使用される。
【０１００】
例示的な培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１の、本明細書に記載された低オスモル濃度培地を含む。
【０１０１】
別の特定の実施形態では、培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、別名ＦＧＦ２又はＦＧＦ−βともいう）を含んでもよいし、又は含まなくてもよい。好ましくは、本発明の培地は、ｂＦＧＦを含まない。
【０１０２】
培地は、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）サプリメント、ｂＦＧＦサプリメント、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤（例えば、ＳＰ６００１２５）、ｐ３８分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８）阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）、ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２）、及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤（例えば、Ｇｏ６９８３）のうちの１種又は２種以上を含んでもよいし、又は含まなくてもよい。培地は、フォルスコリンを含んでもよいし、又は含まなくてもよい。例えば、いくつかの培地は、ＴＧＦ−β１サプリメント、ｂＦＧＦサプリメント、ＪＮＫ阻害剤（例えば、ＳＰ６００１２５）、ｐ３８阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２）、及びＰＫＣ阻害剤（例えば、Ｇｏ６９８３）のうちの１種又は２種以上を含まない。いくつかの培地は、ｐ３８阻害剤及びＪＮＫ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない。いくつかの培地は、ｂＦＧＦサプリメント又はＴＧＦ−β１サプリメントを含まない。いくつかの培地は、ＴＧＦ−β１サプリメントを含まない。いくつかの培地は、ＴＧＦ−β１サプリメント、ｂＦＧＦサプリメント、ＪＮＫ阻害剤（例えば、ＳＰ６００１２５）、ｐ３８阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２）、及びＰＫＣ阻害剤（例えば、Ｇｏ６９８３）のうちのいずれか１種を含まない。いくつかの培地は、フォルスコリンを含まない。
【０１０３】
Ｂ．ヒト誘導多能性幹細胞
ヒトｉＰＳ細胞の集団を作製するための方法及び組成物を、本明細書で提供する。ヒトｉＰＳ細胞を培養物中で維持するための方法及び組成物を、更に提供する。培養物中で作製されるか、又は維持されるヒトｉＰＳ細胞もまた、提供する。
【０１０４】
用語「多能性細胞」又は「多能性幹細胞」は、２つ以上の分化細胞型に進化する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性細胞は、例えば、哺乳類胚性幹（ＥＳ細胞）細胞又は哺乳類誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよい。多能性細胞の例は、ヒトｉＰＳ細胞を含む。
【０１０５】
用語「胚性幹細胞」又は「ＥＳ細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊から誘導され、好適な条件下でインビトロ培養物中で維持することができる、胚由来の分化全能性又は多能性幹細胞を意味する。ＥＳ細胞は、３種類の脊椎動物胚葉、例えば、内胚葉、外胚葉、又は中胚葉のうちのいずれかの細胞に分化することができる。ＥＳ細胞はまた、好適なインビトロ培養条件下で無限に増殖する能力によって特徴付けられる。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）Ｖｏｌ．２８２（５３９１），ｐｐ．１１４５〜１１４７）を参照されたい。
【０１０６】
用語「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」は、分化した成人細胞から直接誘導することができる多能性幹細胞を含む。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリー転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５）、Ｍｙｃファミリー転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、クルッペル様ファミリー（ＫＬＦ）転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、並びに／又は、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及び／若しくはＧｉｌｓ１などの関連転写因子を含んでもよい、非多能性細胞内にリプログラミング因子の特定の一群を導入することによって発生させることができる。ヒトｉＰＳ細胞はまた、例えば、ｍｉＲＮＡ、転写因子の作用を模倣する低分子、又は系譜特異化剤の使用によって発生させてもよい。ヒトｉＰＳ細胞は、３種類の脊椎動物胚葉、例えば、内胚葉、外胚葉、又は中胚葉のうちのいずれかの細胞に分化する能力によって特徴付けられる。ヒトｉＰＳ細胞はまた、好適なインビトロ培養条件下で無限に増殖する能力によっても特徴付けられる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ（Ｃｅｌｌ（２００６）Ｖｏｌ．１２６（４），ｐｐ．６６３〜６７６）を参照されたい。
【０１０７】
用語「ナイーブ型」及び「プライム型」は、ヒトｉＰＳ細胞の異なる多能性状態を特定する。用語「ナイーブ様」は、ナイーブ型多能性細胞の１つ又は２つ以上の特徴を示す多能性状態を発現している細胞を特定する。ナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞はまた、「ナイーブ類似（naive-like）」ヒトｉＰＳ細胞と称してもよい。用語「ナイーブ様」及び「ナイーブ類似」は、同等であることが意図される。いくつかの実施形態では、ナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態などの、ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞の１つ又は２つ以上の形態的特徴を示す。いくつかの実施形態では、ナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、本明細書に記載された１つ又は２つ以上の多能性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ナイーブ型又はナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞である。他の実施形態では、ナイーブ型又はナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞である。
【０１０８】
ナイーブ型及びプライム型ｉＰＳ細胞の特徴は、当該技術分野において記載されている。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（２００９）Ｖｏｌ．４（６），ｐｐ．４８７〜４９２）を参照されたい。ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞は、着床前胚の内部細胞塊のＥＳ細胞の多能性状態に類似した多能性状態を示す。そのようなナイーブ型細胞は、系譜特異化及び方向付けに対してプライム化されていない。メスナイーブ型ｉＰＳ細胞は、２本の活性なＸ染色体によって特徴付けられる。培養物では、ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞の自己再生は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）及び他の阻害剤に依存する。培養されたナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞は、円形ドーム形状のコロニーによって特徴付けられるクローン形態及び頂底極性の欠如を示す。培養されたナイーブ型細胞は、本明細書の他の部分に記載されたように、１つ又は２つ以上の多能性マーカーを更に示すことができる。適切な条件下で、培養物中のナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞の倍加時間は、１６〜２４時間であってもよい。
【０１０９】
プライム型ヒトｉＰＳ細胞は、着床後胚盤葉上層細胞の多能性状態と類似した多能性状態を発現する。そのような細胞は、系譜特異化及び方向付けに対してプライム化されている。メスプライム型ｉＰＳ細胞は、１本の活性なＸ染色体及び１本の不活性なＸ染色体によって特徴付けられる。培養物では、プライム型ヒトｉＰＳ細胞の自己再生は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及びアクチビンに依存する。培養されたプライム型ヒトｉＰＳ細胞は、上皮単層によって特徴付けられるクローン形態を示し、かつ頂底極性を示す。適切な条件下で、培養物中のプライム型ヒトｉＰＳ細胞の倍加時間は、２４時間以上であってもよい。
【０１１０】
一実施形態では、ヒトｉＰＳ細胞は、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導されてもよい。そのような形質転換細胞は、例えば、多能性を誘導するリプログラミング遺伝子を発現するように形質転換済みの細胞を含む。多能性状態は、例えば、本明細書に記載した１つ又は２つ以上の多能性マーカーの発現を含んでもよい。（ヒト包皮線維芽細胞などの）そのような細胞は、当該技術分野で既知の任意の手段よって、リプログラミング遺伝子、又は対象となる任意の追加遺伝子を発現するように形質転換されてもよい。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ（Ｃｅｌｌ（２００６）Ｖｏｌ．１２６（４），ｐｐ．６６３〜６７６）を参照されたい。例えば、それらの遺伝子は、１つ又は２つ以上のプラスミド、レンチウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターを使用して細胞内に導入してもよい。場合によっては、ベクターは、ゲノム内に融合され、リプログラミングの完了後に除去することができる。特定の実施形態では、非多能性細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子によって形質転換される。いくつかの実施例では、形質転換細胞は、プライム型ヒトｉＰＳ細胞を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された低オスモル濃度培地で培養されるヒトｉＰＳ細胞は、１つ又は２つ以上の表現型、遺伝子発現プロフィール、又はナイーブ状態に特徴的なマーカーを発現する。一実施例では、ヒトｉＰＳ細胞は、１つ又は２つ以上の多能性マーカーを発現し、その発現は、ナイーブ状態を示す。そのような多能性マーカーは、アルカリホスファターゼ、ＮＡＮＯＧ、５Ｔ４、ＡＢＣＧ２、アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＢ、Ｅ−カドヘリン、Ｃｂｘ２、ＣＤ９、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ１１７／ｃ−ｋｉｔ、ＣＤＸ２、ＣＨＤ１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、ＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＥＲＲβ／ＮＲ３Ｂ２、ＥＳＧＰ、Ｆ−ｂｏｘタンパク質１５／ＦＢＸＯ１５、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦｏｘＤ３、ＧＢＸ２、ＧＣＮＦ／ＮＲ６Ａ１、ＧＤＦ−３、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、インテグリンα６／ＣＤ４９ｆ、インテグリンα６β１、インテグリンα６β４、インテグリンβ１／ＣＤ２９、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、Ｌ１ＴＤ１、Ｌｅｆｔｙ、Ｌｅｆｔｙ−１、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、ＬＩＮ−２８Ａ、ＬＩＮ−２８Ｂ、ＬＩＮ−４１、ｃＭａｆ、ｃＭｙｃ、Ｏｃｔ−３／４、Ｏｃｔ−４Ａ、ポドカリキシン、Ｒｅｘ−１／ＺＦＰ４２、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＳＴＡＴ３、Ｓｔｅｌｌａ／Ｄｐｐａ３、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＥＲＴ、ＴＥＸ１９、ＴＥＸ１９．１、ＴＨＡＰ１１、ＴＲＡ−１−６０（Ｒ）、ＴＲＯＰ−２、ＵＴＦ１、及び／又はＺＩＣ３を含んでもよい。特定の実施例では、発現された多能性マーカーは、アルカリホスファターゼ、ＮＡＮＯＧ、又はその両方である。
【０１１２】
別の実施形態では、本明細書に記載された低オスモル濃度培地で培養されるヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ状態を示す形態的特徴を示す。例示的な形態は、培養物中の密集したドーム形状のコロニーを有する細胞によって特徴付けられる。
【０１１３】
本明細書に記載された低オスモル濃度培地で培養されるヒトｉＰＳ細胞は、正常核型を有することができる。正常核型は、その種の通常の特徴を示すすべての染色体が存在し、かつ著しく変異していない核型、又は染色体分染分析によって検出可能な、いかなる目視できる数的異常若しくは構造的染色体異常もない細胞の状態を含む。本明細書に記載された低オスモル濃度培地で培養されるヒトｉＰＳ細胞は、例えば、本明細書に記載された低オスモル濃度培地で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００回継代後に、正常核型を有することができる。
【０１１４】
別の実施形態では、本明細書に記載された低オスモル濃度培地で培養されるヒトｉＰＳ細胞は、機械的に又は酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とし、継代し、かつ／又は継代培養することができる。本明細書に記載された低オスモル濃度培地で培養されるそのようなヒトｉＰＳ細胞は、正常核型を有することができ、かつ、機械的に又は酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とし、継代し、かつ／又は継代培養した後に、正常核型を維持することができる。例えば、本明細書に記載された低オスモル濃度培地で培養されるそのようなヒトｉＰＳ細胞は、正常核型を有することができ、かつ、機械的に又は酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とし、本明細書の他の部分に記載された方法を使用して標的ゲノム遺伝子座において改変し、かつ継代培養した後に、正常核型を維持することができる。一実施例では、酵素的解離は、トリプシンを使用して実施してもよい。
【０１１５】
本発明の低オスモル濃度培地で培養されるとき、ヒトｉＰＳ細胞は、単個細胞浮遊液への解離が促進されることによって、より高い形質転換効率を提供することができる。培養物中のヒトｉＰＳ細胞を維持するために一般的に使用される他の種類の培地（例えば、ｍＴｅＳＲ（商標）培地又は２ｉ培地）により、ヒトｉＰＳ細胞の解離は、機械的に、又はトリプシンよりも刺激性が少ないコラゲナーゼなどの酵素によって実施する必要がある。この実施が細胞集団に、例えば、培養物中で遺伝子異常をもたらす恐れのある所望しない選択圧を与えることが立証済みのため、ヒトｉＰＳ細胞を単一細胞として継代することは概ね推奨されない。ヒトｉＰＳ細胞は、細胞剥離及び解離の際にアポトーシスしやすく、完全解離後に重度の細胞死を一般的に受ける。あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ２５（６）：６８１〜６８６を参照されたい。したがって、ヒトｉＰＳ細胞の解離は、継代時にコロニーの崩壊を最小限にし、かつ単個細胞浮遊液を生成しない試薬又は方法により一般的に実施される。その結果として、細胞は、効果的に又は完全に解離されない。しかし、完全解離は、特に所望の標的化された改変を生み出す相同組み換えを受けるコロニーなどの比較的稀なコロニーを単離する試みのとき、遺伝子導入又は標的化された遺伝子改変の発生に続くクローン単離などの操作手順にとって重要である場合がある。対照的に、本発明の低オスモル濃度培地により、トリプシンは、細胞を解離させるために使用することができ、促進された解離は、形質転換効率の増加をもたらす。例えば、そのような解離は、例えばエレクトロポレーションを介して又は本明細書の他の部分に記載された標的化された遺伝子改変を行うための方法を使用して、ターゲッティングを行うときに、より高いターゲッティング効率をもたらす単個細胞浮遊液を作製することができる。更に、培養物中のヒトｉＰＳ細胞を維持するために一般的に使用される他の種類の培地（例えば、ｍＴｅＳＲ（商標）培地又は２ｉ培地）による場合と異なり、本発明の低オスモル濃度培地（好ましくはｂＦＧＦを含まない低オスモル濃度培地）によって培養されるヒトｉＰＳ細胞の酵素的解離は、そのような細胞の継代に一般的に必要な１種又は２種以上の阻害剤の非存在下で実施することができる。除外してもよい例示的な阻害剤は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である。ＲＯＣＫ阻害剤は、プロアポトーシス過程の活性化を阻害するためにヒトｉＰＳ細胞を継代するときに一般的に必要である。特に、ＲＯＣＫ阻害剤の添加は、細胞生存率を増加させることが報告されているため、ヒトｉＰＳ細胞の単個細胞浮遊液をプレート培養するときに一般的に推奨されている。Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  ２５（６）：６８１〜６８６を参照されたい。しかし、本明細書に開示された低オスモル濃度培地を使用するとき、そのようなＲＯＣＫ阻害剤は、単個細胞浮遊液として継代するときであっても不要である。そのような単個細胞浮遊液は、本明細書に開示された低オスモル濃度培地を使用するとき、トリプシン処理及び再プレート培養に続いて多能性及び正常核型を維持することができる。
【０１１６】
更なる実施形態では、本明細書に記載された低オスモル濃度培地で培養される継代培養ヒトｉＰＳ細胞は、酵素的解離及び継代培養後にナイーブ型又はナイーブ様状態を維持することができる。本明細書に記載された低オスモル濃度培地で培養される継代培養ヒトｉＰＳ細胞は、単個細胞浮遊液として継代されたとき、かつ／又は本明細書の他の部分に記載された方法を使用して標的ゲノム遺伝子座で改変されたときであっても、酵素的解離及び継代培養後にナイーブ型又はナイーブ様状態を維持することができる。いくつかの実施例では、継代培養ヒトｉＰＳ細胞は、密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示し続けてもよい。継代培養ヒトｉＰＳ細胞はまた、本明細書に記載されたように１つ又は多能性マーカーを発現するように継続してもよい。
【０１１７】
Ｃ．ヒト誘導多能性幹細胞の集団の作製及び維持の方法
ヒトｉＰＳ細胞をインビトロ培養物中で作製するための方法及び組成物を提供する。ヒトｉＰＳ細胞をインビトロ培養物中で維持するための方法及び組成物を更に提供する。
【０１１８】
用語「作製すること」は、細胞がナイーブ型又はナイーブ様状態、すなわち、ナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞の１つ又は２つ以上の特徴を発現するように、細胞表現型、遺伝子発現、又はその両方における変化を誘導する好適な条件下で、本明細書に記載された１つ又は２つ以上のリプログラミング因子を発現させるように形質転換された非多能性細胞を培養すること、を含む。ナイーブ型又はナイーブ様状態は、特定の培養条件、例えば、本明細書に記載された低オスモル濃度培地における培養、に応答して発現されてもよい。いくつかの実施例では、ナイーブ型又はナイーブ様状態を発現する細胞の割合は、培養物中の細胞のうちの少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、及び最大１００％までである。
【０１１９】
一実施形態では、本方法は、ナイーブ型又はナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞の集団用のインビトロ培養物を改良する。そのような実施形態では、ナイーブ型又はナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態を発現しない細胞よりも優先的に培養物中で増殖することができる。別の実施形態では、ナイーブ型又はナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞は、酵素的に解離させ、ナイーブ型又はナイーブ様ヒトｉＰＳ細胞が増加した集団を生み出すために継代培養された培養物から選択されてもよい。
【０１２０】
一実施形態では、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態の発現を誘導するために好適な本明細書で提供される培地中で、少なくとも１、２、５、７、１０、１４、２１、若しくは２８日の期間、あるいは培養物中においてナイーブ型又はナイーブ様状態の発現を誘導するために十分な時間の任意の期間にわたって、インビトロ培養される。形質転換細胞は、少なくとも１、２、３、又は４週間にわたって本発明の培地で培養してもよい。場合により、形質転換細胞は、１〜４週間にわたって培養される。ナイーブ型又はナイーブ様状態の発現は、形態的特徴又は本明細書の他の部分に記載されたナイーブ型又はナイーブ様状態に特徴的な多能性マーカーの発現の観察によって判定されてもよい。
【０１２１】
一実施形態では、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態の特徴を発現するまで本発明の低オスモル濃度培地で培養される。次いで、細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態を維持するように本発明の培地中で培養されてもよい。別の実施形態では、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、本発明の低オスモル濃度培地中で培養する前に高オスモル濃度培地中で最初に培養される。そのような高オスモル濃度培地は、本発明の低オスモル濃度培地よりも高いオスモル濃度を示し、かつｂＦＧＦを含む。高オスモル濃度培地のオスモル濃度は、例えば、約３００〜３８０、３１０〜３７０、３２０〜３６０、３３０〜３５０、又は３４０ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。あるいは、高オスモル濃度培地のオスモル濃度は、例えば、３４０±７０、３４０±６０、３４０±５０、３４０±４０、３４０±３０、３４０±２０、又は３４０±１０ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。例えば、高オスモル濃度培地のオスモル濃度は、約２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０、３１０〜３２０、３２０〜３３０、３３０〜３４０、３４０〜３５０、３５０〜３６０、３６０〜３７０、３７０〜３８０、３８０〜３９０、３９０〜４００、又は４００〜４１０ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。あるいは、高オスモル濃度培地のオスモル濃度は、少なくとも約２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、又は４１０ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。いくつかの高オスモル濃度培地は、ウシ血清アルブミン、ｂＦＧＦ、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、塩化リチウム、ピペコリン酸、及びγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のうちの１種又は２種以上を含む。高オスモル濃度培地の例には、ｍＴｅＳＲ（商標）培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態の特徴を発現し始めるまでｂＦＧＦを含む高オスモル濃度培地中で最初に培養されてもよく、その時点で、細胞は、本発明の低オスモル濃度培地中で培養される。一実施例では、細胞は、ｂＦＧＦを含む高オスモル濃度培地中で、少なくとも１、２、５、１０、３０、６０、若しくは９０日の期間、又は１、２、４、８、若しくは１２週の期間、又は１日〜３か月の期間にわたって培養されてもよい。ｂＦＧＦを含む高オスモル濃度培地における培養の例示的な期間は、２か月である。
【０１２３】
他の実施形態では、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示し始めるまでｂＦＧＦを含む高オスモル濃度培地中で最初に培養されてもよく、その時点で、細胞は、本発明の低オスモル濃度培地中で培養される。そのような実施形態では、三次元細胞集塊を示す細胞を、選択し、（例えば、トリプシンによって）解離され、本明細書に記載された低オスモル濃度培地中の新しい培養物に移動させてもよい。
【０１２４】
用語「維持する」、「維持すること」、及び「維持」は、本明細書に記載されたヒトｉＰＳ細胞の特徴又は表現型のうちの少なくとも１つ又は２つ以上の保持を含む。そのような特徴は、ナイーブ型細胞の多能性全能性、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、及び／又は他の機能的特徴を維持することを含んでもよい。用語「維持する」、「維持すること」、及び「維持」はまた、細胞の増殖、及び／又は培養されているナイーブ型細胞の数の増加を包含してもよい。本用語は、細胞がプライム型又は非多能性状態に転換しないように防ぐ培養条件を含む。本用語は、細胞が分裂して数を増加し続ける場合と、そうでない場合とがあるが、細胞が多能性及び／又はナイーブ型のままであることを可能にする培養条件を更に含む。
【０１２５】
一実施形態では、ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ型又はナイーブ様状態のそのような細胞を維持するために好適な本明細書で提供される培地中でインビトロ培養される。特定の実施例では、ヒトｉＰＳ細胞は、好適な培地中で、１、２、５、７、１０、１４、２１、若しくは２８日の期間、又は約２週、約３週、約４週、若しくはそれを超える期間にわたって、培養された細胞がナイーブ型又はナイーブ様状態を維持している限り培養されてもよい。細胞は、少なくとも１、２、３、又は４週間にわたって培養してもよい。場合により、細胞は、１〜４週間にわたって培養される。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、培養物中の細胞の増殖、細胞の遺伝子改変、及び／又は細胞の継代培養に十分な任意の期間にわたって維持することができる。
【０１２６】
別の実施形態では、ヒトｉＰＳ細胞又は多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞は、インビトロ培養物に好適な基盤又はフィーダー細胞層上で培養されてもよい。特定の実施例では、細胞は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で培養される。別の実施例では、細胞は、新生児ヒト包皮線維芽細胞（ＮｕＦＦ）フィーダー細胞上で培養される。別の実施例では、細胞は、ＧＥＬＴＲＥＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で培養される。別の実施例では、細胞は、ビトロネクチン（例えば、ＶＩＴＲＯＮＥＣＴＩＮ  ＸＦ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））上で培養される。
【０１２７】
更なる実施形態では、本発明の低オスモル濃度培地中で培養されるヒトｉＰＳ細胞の倍加時間は、プライム型ｉＰＳ細胞又は多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞と比較して低減される。特定の実施例では、本発明のヒトｉＰＳ細胞の倍加時間は、約１６〜２４時間である。
【０１２８】
Ｄ．遺伝子改変及び標的化された遺伝子改変を行う方法
いくつかの実施形態では、ヒトｉＰＳ細胞を作製かつ維持する方法は、ヒトｉＰＳ細胞に遺伝子改変を導入することを含む。同様に、本発明は、遺伝子改変を含むヒトｉＰＳ細胞を提供する。
【０１２９】
特定の実施形態では、遺伝子改変は、１つ又は２つ以上の内因性核酸の改変、１つ又は２つ以上の内因性核酸の置換、異種核酸による内因性核酸の置き換え、ノックアウト、又はノックインを含む。具体的な実施例では、遺伝子改変は、大型ターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）をヒトｉＰＳ細胞又は多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞に導入することによって導入される。そのような実施例では、ＬＴＶＥＣは、細胞のゲノム内に挿入されることとなるＤＮＡを含んでもよい。
【０１３０】
ヒトｉＰＳ細胞において標的化された遺伝子改変を行うための様々な方法が、使用されてもよい。例えば、ヒトｉＰＳ細胞におけるタンパク質のレベル及び／又は活性を改変させる標的化された遺伝子改変を行うための様々な方法が、使用されてもよい。例えば、ある場合には、標的化された遺伝子改変は、相同組み換え（ＨＲ）イベントを介して標的化された遺伝子改変を発生させることとなる系を採用する。相同組み換え修復（Homology-directed  repair、ＨＤＲ）又はＨＲは、ヌクレオチド配列相同性を必要とする場合がある核酸修復の様式を含み、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとするために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の転送をもたらす。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、そのような転送は、切断された標的とドナーとの間で形成するヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修復、及び／又は標的の一部になることとなる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される合成依存性鎖アニーリング、及び／又は関連するプロセスに関与してもよい。場合によっては、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドの複製、又はドナーポリヌクレオチドの複製の一部分は、標的ＤＮＡ内に組み込まれる。他の場合には、細胞は、標的化されたゲノム位置において一本鎖又は二本鎖切断を発生させるヌクレアーゼ剤を使用して改変されてもよい。一本鎖又は二本鎖切断は、次いで、非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）によって修復される。ＮＨＥＪは、相同性テンプレートを必要とせずに、切断末端を互いに直接連結反応させることによる核酸における二重鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる不連続配列の連結反応は、多くの場合、二重鎖切断部位の近くに欠失、挿入、又は転位をもたらす恐れがある。そのような系は、例えば、標的化された機能喪失型遺伝子改変を発生させることにおいて用途を見出す。例えば、ターゲッティングプラスミド又は大型ターゲッティングベクターの使用を含む、そのような標的化された遺伝子改変を発生させるための非限定的な方法は、本明細書の別の部分で詳細に考察される。それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０〜９１８，Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１〜９，及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０〜５３２もまた参照されたい。
【０１３１】
具体的な実施形態では、対象となる任意のポリヌクレオチドの標的化された遺伝子改変は、多能性細胞（すなわち、ヒトｉＰＳ細胞）が本明細書に記載された培養培地中で維持されている間に生じてもよいことが理解される。あるいは、対象となる任意のポリヌクレオチドの標的化された遺伝子改変は、多能性細胞（すなわち、ヒトｉＰＳ細胞）が異なる培養培地中で維持され、続いて本明細書に開示された低オスモル濃度培養培地に移される間に生じてもよい。
【０１３２】
概して、タンパク質のレベル及び／又は活性は、タンパク質のタンパク質レベル及び／又は活性レベルが、タンパク質の発現及び／又は活性を変異させるように遺伝子改変されていない又は突然変異していない適切な対照細胞中のタンパク質レベルよりも統計的に高い又は低い場合、改変される。具体的な実施形態では、タンパク質の濃度及び／又は活性は、タンパク質のレベル及び／又は活性の改変を有するように改変されていない対照細胞に対して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％変異する。
【０１３３】
「対象細胞」は、本明細書に開示される遺伝子改変などの遺伝子改変がもたらされている細胞か、又はそのように変異させた細胞の子孫であり、かつその変異を含む細胞である。「対照」又は「対照細胞」は、対象細胞の表現型の変化を測定するための基準点を提供する。一実施形態では、対照細胞は、それが改変された活性をもたらす遺伝子改変又は突然変異を欠くことを除いて、タンパク質活性が減少した細胞と可能な限り厳密に一致している（例えば、個々の細胞は、同じ細胞株に由来してもよい）。他の場合には、対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、すなわち、対象細胞をもたらした遺伝子変異の出発材料と同じ遺伝子型、（ｂ）出発物質と同じ遺伝子型であるがヌル構築物により（すなわち、マーカー遺伝子を含む構築物など、対象となる形質に対する効果が知られていない構築物により）遺伝子改変された細胞、（ｃ）対象細胞の非遺伝子改変子孫である細胞（すなわち、対照細胞及び対象細胞は、同じ細胞株に由来する）、（ｄ）対象細胞と遺伝学的に同一であるが対象となる遺伝子の発現を誘導するであろう条件又は刺激にさらされていない細胞、又は（ｅ）遺伝子改変が対象となるポリヌクレオチドの発現に変異をもたらさない条件下で、対象細胞自体を含んでもよい。
【０１３４】
ポリペプチドの発現レベルは、例えば、細胞若しくは生物中のポリペプチドのレベルについて分析することによって直接測定されてもよいし、又は、例えば、ポリペプチドの活性を測定することによって間接的に測定されてもよい。
【０１３５】
他の場合には、標的化された遺伝子改変を有する細胞は、サザンブロット解析、ＤＮＡ配列決定法、ＰＣＲ解析、又は表現型解析を含むが、これらに限定されない方法を使用して選択される。次いで、そのような細胞は、本明細書に記載された様々な方法及び組成物において採用される。
【０１３６】
標的化された遺伝子改変は、対象となるポリヌクレオチドに対する標的化された変異を含んでもよい。そのような標的化された改変には、１つ又は２つ以上のヌクレオチドの付加、１つ又は２つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ又は２つ以上のヌクレオチドの置換、対象となるポリヌクレオチド若しくはその一部分のノックアウト、対象となるポリヌクレオチド若しくはその一部分のノックイン、異種核酸配列による内因性核酸配列の置き換え、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１００、５００個又はそれを超える数のヌクレオチド、又は少なくとも１０ｋｂ〜５００ｋｂ以上が、標的化されたゲノム改変を形成するように変化されている。
【０１３７】
他の実施形態では、ポリペプチドの活性及び／又はレベルは、ポリペプチドのレベル又は活性を変異させるポリヌクレオチドを細胞中に導入することによって改変される。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を、メッセンジャーＲＮＡの翻訳を変異させることによって直接改変してもよいし、又はタンパク質をコードする遺伝子の転写若しくは翻訳を変異させるポリペプチドをコードすることによって間接的に改変してもよい。他の実施形態では、ポリペプチドの活性は、標的化されたポリペプチドの活性を変異させるポリペプチドをコードする配列を細胞中に導入することによって改変される。
【０１３８】
一実施形態では、ヒトｉＰＳ細胞は、タンパク質の活性及び／又はレベルを改変する条件付き対立遺伝子を含んでもよい。「条件付き対立遺伝子」は、所望の発達時間において、かつ／又は所望の対象となる組織内で、タンパク質のレベル及び／又は活性の改変を有するように設計された、改変遺伝子を含む。改変されたレベル及び／又は活性は、条件付き対立遺伝子を生じさせる改変を欠く対照細胞と比較され得、又は所望の発達時点における改変された活性の場合、先行する時点及び／若しくは後続する時点と比較され得、又は所望の組織の場合、全ての組織の平均活性量と比較され得る。一実施形態では、条件付き対立遺伝子は、所望の発達時点において、かつ／又は特定の組織中で、スイッチをオフ又はオンにすることができる遺伝子の条件付きヌル対立遺伝子を含む。
【０１３９】
非限定的な実施形態では、条件付き対立遺伝子は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号に記載されたように、多機能性対立遺伝子である。具体的な実施形態では、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関するセンス配向における作動配列、及びセンス配向又はアンチセンス配向における薬剤選択カセット（ＤＳＣ）、（ｂ）アンチセンス方向において、対象となるヌクレオチド配列（ＮＳＩ）及び反転モジュールによる条件（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロン及びジーントラップ様可逆モジュールを利用。例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。）、並びに、（ｃ）第１のリコンビナーゼへの暴露時に組み換わり、（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き、かつ（ｉｉ）センス配向においてＮＳＩを含み、アンチセンス配向においてＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する、組み換え可能単位、を含む。
【０１４０】
本発明は、細胞中の染色体上の標的ゲノム遺伝子座の改変を可能にする。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ヌクレアーゼ剤の非存在下で、又はそれと組み合わせてターゲッティングベクターを採用することによって、染色体上のゲノム遺伝子座の標的化を可能にする。
【０１４１】
標的化された遺伝子改変を行うための方法は、例えば、ターゲッティングベクター（例えば、ＬＴＶＥＣ）を単独か、又は本明細書の他の部分に記載されたように１種又は２種以上のヌクレアーゼとの組み合わせのいずれか一方で使用することを含んでもよい。例えば、あらゆる目的のためにそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７５号、同第２０１５／０１５９１７４号、同第２０１４／０３１０８２８号、同第２０１４／０３０９４８７号、及び同第２０１３／０３０９６７０号を参照されたい。同様に、標的化された遺伝子改変を行うための方法は、１種又は２種以上のヌクレアーゼを単独か、又はターゲティングベクターとの組み合わせのいずれか一方で使用することを含んでもよい。
【０１４２】
例えば、ヒトｉＰＳ細胞内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法が提供され、本方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座における又はその付近の認識部位で１つ又は２つ以上の切れ目又は二本鎖切断を誘導する１種又は２種以上のヌクレアーゼ剤を細胞に導入することと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座において、ゲノム中に改変を含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む。そのような方法は、標的ゲノム遺伝子座の破壊をもたらす場合がある。内因性核酸配列の破壊は、例えば、ヌクレアーゼによって開裂された二本鎖切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）介在ＤＮＡ修復によって修復されるとき、核酸配列の挿入又は欠失を含む突然変異対立遺伝子を発生させる修復をもたらす場合があり、それによってそのゲノム遺伝子座の破壊を引き起こす。破壊の例には、調節要素（例えば、プロモーター又はエンハンサー）の変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、切断突然変異、ヌル突然変異、又は（例えば、フレームシフト突然変異を引き起こす）少数のヌクレオチドの挿入若しくは欠失が挙げられる。破壊は、不活性化（すなわち、機能の喪失）又は対立遺伝子の喪失をもたらす場合がある。
【０１４３】
ヒトｉＰＳ細胞内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための他の方法は、（ａ）５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した挿入核酸を含むターゲッティングベクターを細胞に導入することと、（ｂ）標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた挿入核酸を、ゲノム内に有する少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む。
【０１４４】
ヒトｉＰＳ細胞内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための他の方法は、（ａ）細胞内に（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、標的化ゲノム遺伝子座の範囲内の認識部位において切れ目又は二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤、及び（ｉｉ）認識部位に十分に近接して位置する５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した挿入核酸を含むターゲッティングベクターを導入することと、（ｃ）標的化ゲノム遺伝子座において改変（例えば、挿入核酸の組み込み）を含む少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む。そのような方法は、様々な種類の標的化された遺伝子改変をもたらすことができる。そのような標的化された改変には、例えば、１つ又は２つ以上のヌクレオチドの付加、１つ又は２つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ又は２つ以上のヌクレオチドの置換、点突然変異、対象となるポリヌクレオチド若しくはその一部分のノックアウト、対象となるポリヌクレオチド若しくはその一部分のノックイン、異種、外因性、若しくはオーソロガス核酸配列による内因性核酸配列の置き換え、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせが含まれていてもよい。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０個、又はそれを超える数のヌクレオチドは、標的化されたゲノム改変を形成するように変化されてもよい。欠失、挿入、又は置き換えは、本明細書の他の部分に記載されたように、任意のサイズであってもよい。
【０１４５】
ａ．ヌクレアーゼ剤及びヌクレアーゼ剤の認識部位
用語「ヌクレアーゼ剤の認識部位」は、切れ目又は二本鎖切断がヌクレアーゼ剤によって誘発されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤の認識部位は、細胞に対して内因性（若しくは天然）であってもよく、又は認識部位は、細胞に対して外因性であってもよい。具体的な実施形態では、認識部位は、細胞に対して外因性であり、それにより、細胞のゲノム中で自然発生的ではない。なお更なる実施形態では、認識部位は、細胞に対して、かつ標的遺伝子座に位置付けられることが望まれる対象となるポリヌクレオチドに対して外因性である。更なる実施形態では、外因性又は内因性認識部位は、宿主細胞のゲノム中で一度のみ存在する。具体的な実施形態では、ゲノム内で一度のみ生じる内因性又は天然部位が特定される。次いで、そのような部位は、内因性認識部位において切れ目又は二本鎖切断を生じさせるヌクレアーゼ剤を設計するために使用されてもよい。
【０１４６】
認識部位の長さは、変動してもよく、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対については約３０〜３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮに対して約１５〜１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）については約３６ｂｐ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡについては約２０ｂｐである認識部位を含む。
【０１４７】
一実施形態では、ヌクレアーゼ剤の各単量体は、少なくとも９ヌクレオチドの認識部位を認識する。他の実施形態では、認識部位は、約９〜約１２ヌクレオチド長、約１２〜約１５ヌクレオチド長、約１５〜約１８ヌクレオチド長、又は約１８〜約２１ヌクレオチド長、及びそのような部分範囲の任意の組み合わせ（例えば、９〜１８ヌクレオチド）である。所与のヌクレアーゼ剤が認識部位と結合し、その結合部位を開裂することができるか、あるいはヌクレアーゼ剤が認識部位とは異なる配列と結合することができることが認識される。更に、認識部位という用語は、切れ目／開裂部位がヌクレアーゼ剤結合部位の内側又は外側にあるかどうかにかかわらず、ヌクレアーゼ剤結合部位及び切れ目／開裂部位の両方を含む。別の変化形において、ヌクレアーゼ剤による開裂は、互いにすぐ反対側のヌクレオチド位置で生じて、平滑末端切断を生じさせ得るか、又は他の場合において、切断が段違いであり、５’突出若しくは３’突出のいずれかであってもよい、「付着末端」とも呼ばれる一本鎖突出を生じさせ得る。
【０１４８】
所望の認識部位への切れ目又は二本鎖切断を誘発する任意のヌクレアーゼ剤が、本明細書に開示される方法及び組成物で使用されてもよい。自然発生的又は天然ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤が所望の認識部位での切れ目又は二本鎖切断を誘発する限り採用され得る。あるいは、改変又は操作されたヌクレアーゼ剤が採用され得る。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、所望の認識部位での切れ目又は二本鎖切断を特異的に認識及び誘発するようにその天然の形態から操作される（改変される、又は誘導される）ヌクレアーゼを含む。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の自然発生的なヌクレアーゼ剤由来であってもよく、又は人工的に作られるか、若しくは合成されてもよい。ヌクレアーゼ剤の改変は、タンパク質開裂剤中の１つのアミノ酸、又は核酸開裂剤中の１つのヌクレオチドほどわずかであってもよい。いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、認識部位での切れ目又は二本鎖切断を誘発し、この認識部位は、天然（操作されていない又は改変されていない）ヌクレアーゼ剤によって認識されたであろう配列ではなかった。認識部位又は他のＤＮＡで切れ目又は二本鎖切断を生じさせることは、本明細書において、認識部位又は他のＤＮＡを「切断」又は「開裂」することと称され得る。
【０１４９】
例示的な認識部位の活性変異体及びフラグメントもまた提供される。そのような活性変異体は、所与の認識部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える配列同一性を含むことができ、活性変異体は、生物活性を保持し、したがって、配列特異的様式でヌクレアーゼ剤によって認識かつ開裂されることが可能である。ヌクレアーゼ剤による認識部位の二本鎖切断を測定するためのアッセイは、当該技術分野において既知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲ  ａｓｓａｙ，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０１０，４７６：２９５−３０７）。
【０１５０】
ヌクレアーゼ剤の認識部位は、標的遺伝子座の中又は近くのいかなる場所に位置付けられてもよい。認識部位は、遺伝子のコード部位の範囲内、又は遺伝子の発現に影響する調節領域の範囲内に位置してもよい。ヌクレアーゼ剤の認識部位は、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、又は任意の非タンパク質コード領域の中に位置してもよい。具体的な実施形態では、認識部位は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内に位置付けられる。そのような位置は、選択マーカーのコード領域内、又は選択マーカーの発現に影響を及ぼす調節領域内に位置してもよい。したがって、ヌクレアーゼ剤の認識部位は、選択マーカー、プロモーター、エンハンサー、調節領域、又は選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの任意の非タンパク質コード領域のイントロン内に位置してもよい。具体的な実施形態では、認識部位における切れ目又は二本鎖切断は、選択マーカーの活性を妨害する。機能的な選択マーカーの存在又は非存在についてアッセイするための方法は、既知である。
【０１５１】
一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核又は真核生物のゲノム中の特定の標的配列において二本鎖切断を行うために使用され得る、配列特異的ヌクレアーゼの種類である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然の、若しくは操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、又はその機能部を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合させることによって作られる。独特のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、潜在的に任意の所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計を可能にする。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特異的なＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる。すべてが参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０７９４３０号、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ  １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ  ＆  Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  １：４２８〜４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７〜７６１、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１４３〜１４８を参照されたい。
【０１５２】
好適なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、米国特許出願第２０１１／０２３９３１５（Ａ１）号、同第２０１１／０２６９２３４（Ａ１）号、同第２０１１／０１４５９４０（Ａ１）号、同第２００３／０２３２４１０（Ａ１）号、同第２００５／０２０８４８９（Ａ１）号、同第２００５／００２６１５７（Ａ１）号、同第２００５／００６４４７４（Ａ１）号、同第２００６／０１８８９８７（Ａ１）号、及び同第２００６／００６３２３１（Ａ１）号に開示される（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。様々な実施形態では、例えば、対象となる遺伝子座又は対象となるゲノム遺伝子座において、標的核酸配列中、又はその近くで切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、標的核酸配列は、ターゲッティングベクターによって改変される配列にあるか、又はその近くにある。本明細書で提供される様々な方法及び組成物と共に使用するのに好適なＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載されるようなターゲッティングベクターによって改変される標的核酸配列において、又はその近くで結合するように特異的に設計されるＴＡＬヌクレアーゼが含まれる。
【０１５３】
一実施形態では、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、１２〜２５ＴＡＬ反復を含み、各ＴＡＬ反復は、１ｂｐのサブサイトと結合する。いくつかのＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの高度可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３〜３５のＴＡＬ反復を含む。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、独立ヌクレアーゼに操作可能に連結されたＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。一実施形態では、独立ヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインと、第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインとを含み、第１及び第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに操作可能に連結され、第１及び第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインは、約６ｂｐ〜約４０ｂｐの開裂部位によって隔てられた標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量体化して、標的配列において二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作製する。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインと、第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインとを含んでもよく、第１及び第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに操作可能に連結され、第１及び第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２〜２０ｂｐ）のスペーサー配列によって隔てられた標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは、標的配列において二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作るように二量体化する。
【０１５４】
本明細書に開示される様々な方法及び組成物で採用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を更に含むことができる。一実施形態では、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは、３ｂｐのサブサイトに結合する。他の実施形態では、ＺＦＮは、独立ヌクレアーゼに操作可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。一実施形態では、独立エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮと第２のＺＦＮとを含み、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに操作可能に連結され、第１及び第２のＺＦＮは、約６〜約４０ｂｐの開裂部位によって隔てられた標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量体化して、二本鎖切断を行う。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮと第２のＺＦＮとを含み、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結し、第１及び第２のＺＦＮは、約５〜７ｂｐのスペーサーによって隔てられた標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは、標的配列において二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作るように二量体化する。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６０２４６５６７号、同第２００８０１８２３３２号、同第２００２００８１６１４号、同第２００３００２１７７６号、国際公開第２００２／０５７３０８（Ａ２）号、米国特許出願公開第２０１３０１２３４８４号、同第２０１００２９１０４８号、及び国際公開第２０１１／０１７２９３（Ａ２）号を参照されたい。
【０１５５】
更に別の実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づく４つのファミリーに分類されており、このファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、及びＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、それらの長い認識部位、及びそれらのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型性に対する耐性が注目すべき点である。メガヌクレアーゼのドメイン、構造、及び機能は、既知であり、例えば、Ｇｕｈａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８：１９９〜２４８、Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：９６０〜９、Ｊｕｒｉｃａ  ａｎｄ  Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５５：１３０４〜２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３８：４９〜９５、及びＭｏｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：７６４を参照されたい。いくつかの実施例では、自然発生的変異体、及び／又は操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件、及び／又は部位特異性の認識を改変するための方法、並びに活性度をスクリーニングするための方法は、既知であり、例えば、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：２９５２〜６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：８９５〜９０５、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３３４：９９３〜１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：３８７０〜９、Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４２：３１〜４１、Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：４７９１〜８００、Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅ１５４、国際公開第２００５１０５９８９号、同第２００３０７８６１９号、同第２００６０９７８５４号、同第２００６０９７８５３号、同第２００６０９７７８４号、及び同第２００４０３１３４６号を参照されたい。
【０１５６】
本明細書で使用してもよい任意のメガヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、又はこれらの任意の活性変異体若しくはフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
一実施形態では、メガヌクレアーゼは、１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。一実施形態では、メガヌクレアーゼは、ゲノム中の１つの完全にマッチした標的配列を認識する。一実施形態では、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、ホーミングヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、及びＩ−Ｄｍｏｌから選択される。
【０１５８】
ヌクレアーゼ剤は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む、制限エンドヌクレアーゼを更に含んでもよい。Ｉ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的認識部位を認識するが、典型的には、ヌクレアーゼ結合部位からの可変位置において開裂し、それは、開裂部位（認識部位）から離れた数百もの塩基対であってもよい。ＩＩ型系において、制限活性は、任意のメチラーゼ活性とは無関係であり、開裂は、一般的には、結合部位内、又はその近くの特定の部位において生じる。ほとんどのＩＩ型酵素が回文配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は、非回文認識部位を認識し、かつ認識部位の外側で開裂し、ＩＩｂ型酵素は、認識部位の外側の両方の部位で２回配列を切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称認識部位を認識し、片側で、かつ認識部位から約１〜２０ヌクレオチドの画定された距離において開裂する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的化する。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：４１８〜２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：１８０５〜１２、及びＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）ｉｎ  Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  ＩＩ，ｐｐ．７６１〜７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ））で更に記載かつ分類されている。
【０１５９】
様々な方法及び組成物において採用されるヌクレアーゼ剤はまた、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系又はそのような系の構成成分を含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与するか、又はその活性を誘導する、転写物及び他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型系であってもよい。本明細書に開示される方法及び組成物は、核酸の部位特異的な開裂のためのＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を採用する。
【０１６０】
本明細書に開示される方法で使用されるいくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、非自然発生的である。「非自然発生的」な系は、系の１つ又は２つ以上の構成成分がそれらの自然発生的な状態から変異若しくは突然変異されること、それらが本質的に自然に関連する少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないこと、又はそれらが自然に関連していない少なくとも１つの他の構成成分と関連していることなど、人の手の関与を示すいかなるものをも含む。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、一緒に自然発生しないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む、非自然発生的ＣＲＩＳＰＲ複合体を採用する。
【０１６１】
Ｃａｓタンパク質は、概して、少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを含む。そのようなドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、以下でより詳細に記載される）と相互作用することができる。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量化ドメイン、及び他のドメインを含んでもよい。ヌクレアーゼドメインは、核酸開裂のための触媒活性を有する。開裂は、核酸分子の共有結合の切断を含む。開裂は、平滑末端又は互い違いの末端を生じさせることができ、それは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【０１６２】
Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１若しくはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、並びにこれらの相同体又は改変バージョンが挙げられる。
【０１６３】
場合によっては、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来である。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であってもよいし、又はＣａｓ９タンパク質から誘導されてもよい。Ｃａｓ９タンパク質は、一般的には、保存構造を有する４つの主要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス属、ノカルジオプシス・ダソンビレイ、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランギウム・ロセウム、ストレプトスポランギウム・ロセウム、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードミコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、イグジォバクテリウム・シビリカム、ラクトバチラス・デルブリッキー、ラクトバチラス・サリバリウス、ミクロシラ・マリナ、バークホルデリア・バクテリウム、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナス属、クロコスファエラ・ワトソニイ、シアノセイス属、ミクロキスティス・エルギノーサ、シネココックス属、アセトハロビウム・アラビティカム、アンモニフェツクス・デゲンシイ、カルディセルロシルプター・ベシー、カンジデイタス・デサルホルディス、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノスム、マリノバクター属、ニトロソコッカス・ハロフィルス、ニトロソコッカス・ワトソニイ、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクター・ラセミファー、メタノハロビウム・エベスチガータム、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストック属、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ属、リングビア属、ミクロコレウス・クソノプラステス、オスキラトリア属、ペトロトガ・モビリス、サーモシフォ・アフリカヌス、又はアカリオクロリス・マリナ由来であってもよい。Ｃａｓ９タンパク質は、黄色ブドウ球菌由来であってもよい。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのその他の例には、参照よりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３１８３３号に記載されたＣａｓ９ファミリーメンバーが挙げられる。特定の実施例では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９タンパク質であるか、又はそれから誘導される。化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースでアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２にて参照のこと。
【０１６４】
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、自然に発生するもの）、改変Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質変異体）、又は野生型若しくは改変Ｃａｓタンパク質のフラグメントであってもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型又は改変Ｃａｓタンパク質の活性変異体又はフラグメントであってもよい。活性変異体又はフラグメントは、野生型若しくは改変Ｃａｓタンパク質又はこれらの一部分に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える配列同一性を含むことができ、活性変異体は、所望の開裂部位において切断する能力を保持し、したがって、切れ目誘導又は二本鎖切断誘導活性を保持する。切れ目誘導又は二本鎖切断誘導活性に対するアッセイは既知であり、概して、開裂部位を含有するＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性及び特異性を測定する。
【０１６５】
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、及び／又は酵素活性を増加又は減少させるように改変され得る。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性など、タンパク質の任意の他の活性又は特性を変化させるように改変され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ又は２つ以上のヌクレアーゼドメインは、改変、欠失、若しくは不活性化され得るか、あるいはＣａｓタンパク質は、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するために、又はＣａｓタンパク質の活性を最適化（例えば、強化若しくは低減）するために切断され得る。
【０１６６】
いくつかのＣａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２個のヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含んでもよい。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインはそれぞれ、ＤＮＡ中で二本鎖切断を行うために、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断することができる。例えば、参照によりその全体が組み込まれるＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６〜８２１を参照されたい。
【０１６７】
ヌクレアーゼドメインのうちの一方又は両方は、それらがもはや機能的ではないか、又はヌクレアーゼ活性が低減しているように、欠失又は突然変異されてもよい。ヌクレアーゼドメインのうちの一方が欠失する又は突然変異する場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ニッカーゼと称してもよく、二本鎖切断ではなく、二本鎖ＤＮＡ内の標的配列において一本鎖切断を発生させることができる（すなわち、相補鎖又は非相補鎖を開裂することができるが、両方ではない）。ヌクレアーゼドメインの両方が欠失されるか又は突然変異される場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を開裂する能力が低下することとなる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の一例は、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおける（Ｃａｓ９の位置１０におけるアスパラギン酸からアラニンへの）Ｄ１０Ａ突然変異である。同様に、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおける（アミノ酸位置８３９におけるヒスチジンからアラニンへの）Ｈ９３９Ａ又は（アミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニンへの）Ｈ８４０Ａは、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例は、Ｓ．サーモフィルス由来のＣａｓ９への対応する突然変異を含む。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：９２７５〜９２８２及び国際公開第２０１３／１４１６８０号を参照されたい。そのような突然変異は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性突然変異誘発、又は全遺伝子合成などの公知の方法を使用して発生させてもよい。ニッカーゼを作る他の突然変異の例は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１７６７７２（Ａ１）号及び同第２０１３／１４２５７８（Ａ１）号に見出すことができる。
【０１６８】
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質であってもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、開裂ドメイン、後成的改変ドメイン、転写活性化ドメイン、転写抑制因子ドメインと融合され得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／０８９２９０号を参照されたい。Ｃａｓタンパク質はまた、増加又は減少した安定性を提供する異種ポリペプチドと融合されてもよい。融合ドメイン又は異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内に内部的に位置されてもよい。
【０１６９】
Ｃａｓ融合タンパク質の一例は、細胞内局在性を提供する異種ポリペプチドと融合されたＣａｓタンパク質である。そのような配列は、例えば、核を標的化するためのＳＶ４０  ＮＬＳなどの核局在シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的化するためのミトコンドリア局在シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含んでもよい。例えば、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１〜５１０５を参照されたい。そのような細胞内局在シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどの場所に位置してもよい。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸の区間を含むことができ、一分配列又は二分配列であってもよい。
【０１７０】
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインを含んでもよい。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列から誘導されてもよい。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／０８９２９０号を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置してもよい。
【０１７１】
Ｃａｓタンパク質はまた、蛍光タンパク質、精製タグ、又はエピトープタグなど、追跡又は精製を容易にするための異種ポリペプチドを含んでもよい。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−単量体、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮａＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＢ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
【０１７２】
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供されてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供されてもよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＲ））又はＤＮＡなど、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供されてもよい。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞又は生物（すなわち、ヒト細胞）中のタンパク質への効率的な翻訳のために最適化されたコドンであってもよい。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞内に導入されるとき、Ｃａｓタンパク質は、細胞内で一時的に、条件付きで、又は構成的に発現されてもよい。
【０１７３】
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノム中に安定して組み込まれ、かつ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されてもよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに操作可能に連結されてもよい。発現構築物には、遺伝子又は他の対象となる核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を誘導することができ、かつそのような対象となる核酸配列を標的細胞に導入することができる、任意の核酸構築物が挙げられる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸インサートを含むターゲッティングベクター及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内にあってもよい。あるいは、その核酸は、核酸インサートを含むターゲッティングベクター及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別個のベクター又はプラスミド内にあってもよい。発現構築物において使用してもよいプロモーターは、例えば、ヒトｉＰＳ細胞又はナイーブ状態を発現するように形質転換された非多能性細胞中で活性であってもよい。このようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであってもよい。
【０１７４】
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質と結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子を含む。ガイドＲＮＡは、２つの部分、すなわち「ＤＮＡ標的化セグメント」と「タンパク質結合セグメント」とを含んでもよい。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの隣接区間など、分子のセグメント、セクション、又は領域を含む。いくつかのｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子、すなわち「アクチベーターＲＮＡ」と「ターゲッターＲＮＡ」とを含む。他のｇＲＮＡは、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれ得る、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）である。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１７６７７２（Ａ１）号、同第２０１４／０６５５９６（Ａ１）号、同第２０１４／０８９２９０（Ａ１）号、同第２０１４／０９３６２２（Ａ２）号、同第２０１４／０９９７５０（Ａ２）号、同第２０１３１４２５７８（Ａ１）号、及び同第２０１４／１３１８３３（Ａ１）号を参照されたい。用語「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」は、二重分子ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
【０１７５】
例示的な二分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」又は「ターゲッターＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ反復」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」又は「アクチベーターＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「足場」）分子とを含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）、及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドの区間の両方を含む。
【０１７６】
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他方の半分を形成するヌクレオチドの区間を含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドの区間は、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドの区間に相補的であり、かつそれとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言える。
【０１７７】
ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡは、標的化配列にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡターゲッティングセグメントを追加的に提供する。細胞内での改変のために使用される場合、所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計されてもよい。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＭａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３〜８２６、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６〜８２１、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７〜２２９、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３〜２３９、及びＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９〜８２３を参照されたい。
【０１７８】
所与のｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントは、ハイブリダイゼーションを介して、配列特異的な様式で標的ＤＮＡと相互作用する（すなわち、塩基対合）。したがって、ＤＮＡターゲッティングセグメントのヌクレオチド配列は異なってもよく、かつｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。対象となるｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントは、標的ＤＮＡの任意の所望の配列にハイブリダイズするように改変されてもよい。自然発生的ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９系及び生物によって異なるが、多くの場合、２１〜４６ヌクレオチド長の２つの直列反復（ＤＲ）が隣接した、２１〜７２ヌクレオチド長のターゲッティングセグメントを含有する（例えば、国際公開第２０１４／１３１８３３を参照されたい）。化膿レンサ球菌では、ＤＲは、３６ヌクレオチド長であり、ターゲッティングセグメントは、３０ヌクレオチド長である。３’位置のＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズし、このｔｒａｃｒＲＮＡが次いでＣａｓ９タンパク質と結合する。
【０１７９】
ＤＮＡターゲッティングセグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド長を有してもよい。例えば、ＤＮＡターゲッティングセグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、又は約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有してもよい。あるいは、ＤＮＡターゲッティングセグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有してもよい。
【０１８０】
標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）に相補的であるＤＮＡターゲッティングセグメントのヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有してもよい。例えば、ＤＮＡターゲッティング配列（すなわち、標的ＤＮＡ内の標的配列に相補的であるＤＮＡターゲッティングセグメント内の配列）は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、又は少なくとも約４０ｎｔの長さを有してもよい。あるいは、ＤＮＡターゲッティング配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有してもよい。場合によっては、ＤＮＡターゲッティング配列は、約２０ｎｔの長さを有してもよい。
【０１８１】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長のｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び異なる長さであってもよい。それらは、一次転写産物又は処理された形態を含んでもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、若しくは二分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全部若しくは一部分（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５以上、若しくはそれを超えるヌクレオチド）を含んでもよいし、又はそれからなっていてもよい。化膿レンサ球菌由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、及び６５ヌクレオチドバージョンが挙げられる。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２〜６０７、国際公開第２０１４／０９３６６１３号を参照されたい。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、及び＋８５バージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大で＋ｎ個のヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい。
【０１８２】
ＤＮＡターゲッティング配列と標的ＤＮＡ内の標的配列との間の相補性百分率は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であってもよい。場合によっては、ＤＮＡターゲッティング配列と標的ＤＮＡ内の標的配列との間の相補性百分率は、約２０個の隣接ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。一実施例では、ＤＮＡターゲッティング配列と標的ＤＮＡ内の標的配列との間の相補性百分率は、標的ＤＮＡの相補鎖内の標的配列の５’末端における１４個の隣接ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％まで下がる。そのような場合、ＤＮＡターゲッティング配列は、１４ヌクレオチド長であると見なしてもよい。別の実施例では、ＤＮＡターゲッティング配列と標的ＤＮＡ内の標的配列との間の相補性百分率は、標的ＤＮＡの相補鎖内の標的配列の５’末端における７個の隣接ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％まで下がる。そのような場合、ＤＮＡターゲッティング配列は、７ヌクレオチド長であると見なしてもよい。
【０１８３】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つの区間を含んでもよい。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象となるｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、ＤＮＡターゲッティングセグメントを介して、結合したＣａｓタンパク質を、標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。
【０１８４】
ガイドＲＮＡは、追加の所望の特性（例えば、改変された又は調節された安定性、細胞内ターゲッティング、蛍光ラベルによる追跡、タンパク質又はタンパク質複合体に対する結合部位など）を提供する改変又は配列を含んでもよい。そのような改変の例には、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化鎖（すなわち、３’ポリ（Ａ）鎖）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節された接近性を可能にすること）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖（すなわち、ヘアピン型）を形成する配列、細胞内部位（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に対してＲＮＡを標的化する改変又は配列、追跡用に提供される改変又は配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部位への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写アクチベーター、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含むＤＮＡに作用するタンパク質）との結合部位を提供する改変又は配列、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１８５】
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供されてもよい。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）として、又は１つの分子（ｓｇＲＮＡ）としてのいずれかのＲＮＡの形態で、並びに任意選択的に、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態で提供されてもよい。ｇＲＮＡはまた、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）又は別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別々のＤＮＡ分子として提供されてもよい。
【０１８６】
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡが細胞内に導入されるとき、ｇＲＮＡは、細胞において一時的に、条件に応じて、又は構成的、に発現されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノム中に安定して組み込まれ、かつ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されてもよい。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに操作可能に連結されてもよい。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、核酸インサートを含むターゲッティングベクター及び／又はＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクター内にあってもよい。あるいは、そのＤＮＡは、核酸インサートを含むターゲッティングベクター及び／又はＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別個のベクター又はプラスミド内にあってもよい。そのようなプロモーターは、例えば、ヒトｉＰＳ細胞又は多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞中で活性であってもよい。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであってもよい。場合によっては、プロモーターは、ヒトＵ６プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。
【０１８７】
あるいは、ｇＲＮＡは、様々な他の方法によって調製されてもよい。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製されてもよい（例えば、国際公開第２０１４／０８９２９０号及び同第２０１４／０６５５９６号を参照されたい）。ガイドＲＮＡはまた、化学合成によって調製された、合成的に生み出された分子であってもよい。
【０１８８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に対する標的配列は、結合のための十分な条件が存在する場合には、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列を含む。例えば、標的配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計される配列を含み、標的配列とＤＮＡターゲッティング配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、ただしハイブリダイゼーションを引き起こし、かつＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するために十分な相補性があることを条件とする。標的配列はまた、以下でより詳細に記載される、Ｃａｓタンパク質のための開裂部位も含む。標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含んでもよく、それは、例えば、細胞の核若しくは細胞質内に、又はミトコンドリア若しくは葉緑体などの細胞のオルガネラ内に位置してもよい。
【０１８９】
標的ＤＮＡ内の標的配列は、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡによって標的化され得る（すなわち、それによって結合され得る、又はそれとハイブリダイズし得る、又はそれに相補的であり得る）。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件は、細胞中に通常存在する生理学的条件を含む。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）を参照されたい）。Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と呼んでもよく、「相補鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」又は「テンプレート鎖」と呼んでもよい。
【０１９０】
Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列の内側又は外側の部位で核酸を開裂することができる。「開裂部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断又は二本鎖切断を生じさせる核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列にハイブリダイズされ、かつＣａｓタンパク質と複合体を形成されたｇＲＮＡを含む）は、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列中、又はその近くで（例えば、そこから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれを超える塩基対以内で）、一方又は両方の鎖の開裂をもたらしてもよい。開裂部位が、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列の外側にある場合、開裂部位は、なおも「標的配列」内にあると見なされる。開裂部位は、核酸の一方のみの鎖又は両方の鎖上にあってもよい。開裂部位は、核酸の両方の鎖上の同じ位置にあってもよく（平滑末端を生じさせる）、又はそれぞれの鎖上の異なる部位にあってもよい（互い違いの末端を生じさせる）。互い違いの末端は、例えば、それぞれの鎖上の異なる開裂部位で一本鎖破断を産生する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって産生されてもよい。例えば、突出配列が作られるように、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上で一本鎖切断を引き起こしてもよく、第２のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第２の鎖上で一本鎖切断を引き起こしてもよい。場合によっては、第１の鎖上のニッカーゼの標的配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、又は１，０００塩基対だけ、第２の鎖上のニッカーゼの標的配列から隔てられている。
【０１９１】
Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの部位特異的開裂は、標的ＤＮＡ中の（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性、及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で生じてもよい。ＰＡＭは、標的配列に隣接してもよい。任意選択的に、標的配列は、ＰＡＭによって３’末端で隣接されてもよい。例えば、Ｃａｓ９の開裂部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０又は約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流又は下流であってもよい。場合によっては、（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９又は密接に関係のあるＣａｓ９が使用されるとき）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＸＧＧ−３’（ここで、Ｘは、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、Ｘは、標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列の３’直近である）であってもよい。このため、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＹ−３’（ここで、Ｙは、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、Ｙは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の５’直近である）であろう。いくつかのそのような場合では、Ｘ及びＹは、相同的であってもよく、Ｘ−Ｙ塩基対は、任意の塩基対（例えば、Ｘ＝ＣかつＹ＝Ｇ、Ｘ＝ＧかつＹ＝Ｃ、Ｘ＝ＡかつＹ＝Ｔ、Ｘ＝ＴかつＹ＝Ａ）であってもよい。
【０１９２】
標的配列の例は、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントに相補的なＤＮＡ配列、又はＰＡＭ配列に加えたそのようなＤＮＡ配列を含む。標的配列の一例は、ＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧ（ＧＮ１−２０ＧＧ、配列番号２）のヌクレオチド配列を含む。他の標的配列は、５’Ｇ及び３’ＧＧを含む、配列番号２の４〜２２ヌクレオチド長を有してもよい。更に他の標的配列は、配列番号２の１４〜２０ヌクレオチド長を有してもよい。
【０１９３】
標的配列は、細胞に対して内因性又は外因性の任意の核酸配列であってもよい。標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列若しくは非コード配列（例えば、調節配列又はジャンクＤＮＡ）であってもよいし、又は両方を含んでもよい。
【０１９４】
ヌクレアーゼ剤の活性変異体及びフラグメント（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）もまた提供される。そのような活性変異体は、天然ヌクレアーゼ剤に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える配列同一性を含んでもよく、活性変異体は、所望の認識部位において切断する能力を保持し、したがって、切れ目又は二本鎖切断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ剤のいずれも、天然エンドヌクレアーゼ配列から改変され、かつ天然ヌクレアーゼ剤によって認識されなかった認識部位における切れ目又は二本鎖切断を認識及び誘導するように設計され得る。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、対応する天然ヌクレアーゼ剤認識部位とは異なる認識部位において切れ目又は二本鎖切断を誘導する特異性を有する。切れ目又は二本鎖切断誘導活性に対するアッセイは既知であり、概して、認識部位を含有するＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性及び特異性を測定する。
【０１９５】
ヌクレアーゼ剤は、当該技術分野において既知の任意の手段によって多能性細胞に導入されてもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞に直接導入されてもよい。あるいは、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されてもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されるとき、ヌクレアーゼ剤は、細胞内で一次的に、条件付きで、又は構成的に発現されてもよい。したがって、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセット中に含有され、かつ条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターに操作可能に連結されてもよい。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入される。
【０１９６】
特定の実施形態では、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、多能性細胞のゲノム中に安定して組み込まれ、かつ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。他の実施形態では、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが核酸インサートを含む同じターゲッティングベクター内にある一方で、他の場合には、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、核酸インサートを含むターゲッティングベクターとは別個のベクター又はプラスミド内にある。
【０１９７】
ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を通じて多能性細胞に提供されるとき、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ剤をコードする自然発生的ポリヌクレオチド配列と比較して、対象となる細胞中でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変されてもよい。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、自然発生的ポリヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞中でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変されてもよい。
【０１９８】
ｂ．選択マーカー
染色体上の標的ゲノム遺伝子座を改変することを提供する本明細書に開示される方法及び組成物において、様々な選択マーカーが使用されてもよい。そのようなマーカーとしては、本明細書の他の部分で開示され、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ブラスチサイジン、ネオマイシン、又はピューロマイシンなどの抗生物質への耐性を付与する選択マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、ヒトｉＰＳ細胞又はナイーブ状態を発現するように形質転換された非多能性細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。
【０１９９】
ｃ．標的ゲノム遺伝子座
染色体上の標的遺伝子座への少なくとも１つの核酸インサートの組み込みを可能にする、様々な方法及び組成物が提供される。「染色体上の標的ゲノム遺伝子座」は、核酸インサートを組み込むことを望む染色体上のＤＮＡの任意のセグメント又は領域を含む。標的化された染色体上の標的遺伝子座は、ヒトｉＰＳ細胞又は多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞起源であってもよく、あるいは、細胞の染色体内に組み込まれたＤＮＡの異種又は外因性セグメントを含んでもよい。ＤＮＡのそのような異種又は外因性セグメントは、導入遺伝子、発現カセット、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、又はゲノムＤＮＡの異種若しくは外因性領域を含むことができる。染色体上の標的ゲノム遺伝子座は、例えば、認識部位、選択マーカー、以前に組み込まれた核酸インサート、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド、プロモーターなどの、標的化されたゲノム組み込みシステムのいずれかを含んでもよい。あるいは、染色体上の標的遺伝子座は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体内、又は、適切な宿主細胞内に含まれる操作された任意の他のゲノム領域に位置させてもよい。したがって、具体的な実施形態では、染色体上の標的化されたゲノム遺伝子座は、ヒト細胞由来の天然ゲノム配列、又は非ヒト哺乳動物、非ヒト細胞、げっ歯動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）、家畜哺乳動物若しくは農業用哺乳動物、若しくは任意の他の対象となる生物、又はこれらの組み合わせ由来の異種若しくは外因性ゲノム核酸配列を含んでもよい。
【０２００】
ｄ．ターゲッティングベクター及び核酸インサート
上記で概説されたように、本明細書に提供される方法及び組成物は、単独で、又はヌクレアーゼ剤と組み合わせてターゲッティングベクターを採用する。「相同組み換え」は、従来、相同性の領域内の交差部位における２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡフラグメントの交換を指すために使用される。
【０２０１】
ｉ．核酸インサート
１つ又は２つ以上の別個の核酸インサートを、本明細書に開示した方法に採用してもよく、別個のターゲッティングベクターを介して、又は同じターゲッティングベクター上で細胞内に導入してもよい。核酸インサートは、ゲノム標的遺伝子座において組み込まれることとなるＤＮＡのセグメントを含む。標的遺伝子座における核酸インサートの組み込みは、標的遺伝子座への対象となる核酸配列の追加、標的遺伝子座における対象となる核酸配列の欠失、及び／又は標的遺伝子座における対象となる核酸配列の置き換えをもたらすことができる。
【０２０２】
核酸インサート又は置き換えられる標的遺伝子座における対応する核酸は、コード領域、イントロン、エクソン、非翻訳領域、調節領域、プロモーター、エンハンサー、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。更に、核酸インサート又は置き換えられる標的遺伝子座における対応する核酸は、例えば、１０〜１００ヌクレオチド長、１００〜５００ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド〜１ｋｂ長、１ｋｂ〜１．５ｋｂヌクレオチド長、１．５ｋｂ〜２ｋｂヌクレオチド長、２ｋｂ〜２．５ｋｂヌクレオチド長、２．５ｋｂ〜３ｋｂヌクレオチド長、３ｋｂ〜５ｋｂヌクレオチド長、５ｋｂ〜８ｋｂヌクレオチド長、８ｋｂ〜１０ｋｂヌクレオチド長、又はそれを超える長さを含む、任意の所望の長さであってもよい。他の場合には、長さは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂであってもよい。更に他の場合には、長さは、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、若しくは９００ヌクレオチド、又は少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ以上であってもよい。
【０２０３】
いくつかのターゲッティングベクターでは、核酸インサートは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってもよい。あるいは、核酸インサートは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂであってもよい。
【０２０４】
場合によっては、標的遺伝子座における核酸の置き換えは、約１ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２ｋｂ〜約２０ｋｂ、又は約０．５ｋｂ〜約３Ｍｂに及ぶ標的配列の欠失をもたらす。場合によっては、欠失の及ぶ範囲は、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとの合計の長さよりも広い。
【０２０５】
場合によっては、標的配列の欠失の及ぶ範囲は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約２．８Ｍｂ、約２．８Ｍｂ〜約３Ｍｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及ぶ。
【０２０６】
他の場合には、核酸インサート又は置き換えられる標的遺伝子座における対応する核酸は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。
【０２０７】
核酸インサートは、ゲノムＤＮＡ又は任意の他の種類のＤＮＡを含んでもよい。例えば、核酸インサートは、原核生物、真核生物、酵母、鳥類（例えばニワトリ）、非ヒト哺乳動物、げっ歯動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）、家畜用哺乳動物、農業用哺乳動物、又は他の任意の対象となる生物由来であってもよい。一実施例では、挿入ポリヌクレオチドは、任意のヒト又は非ヒトゲノム遺伝子座を含んでもよい。
【０２０８】
核酸インサート及び／又は標的遺伝子座における核酸は、調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、若しくは転写リプレッサー結合要素）などのコード配列又は非コード配列を含んでもよい。例えば、核酸インサートは、内因性遺伝子の少なくとも１つのエクソンのノックイン対立遺伝子、又は内因性遺伝子全体のノックイン対立遺伝子（すなわち、「遺伝子スワップノックイン」）を含んでもよい。
【０２０９】
核酸インサートはまた、条件付き対立遺伝子を含んでもよい。条件付き対立遺伝子は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号に記載されたように、多機能性対立遺伝子であってもよい。例えば、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関するセンス配向における作動配列、（ｂ）センス配向又はアンチセンス配向における薬剤選択カセット（ＤＳＣ）、（ｃ）逆向きの配向における、アンチセンス配向における対象となるヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、及び（ｄ）反転モジュールによる条件（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロン及びジーントラップ様可逆モジュールを利用）、を含んでもよい。例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの暴露時に組み換わり、（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き、かつ（ｉｉ）センス配向においてＮＳＩを含み、アンチセンス配向においてＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する、組み換え可能単位を更に含んでもよい。米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。
【０２１０】
いくつかの核酸インサートは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。選択マーカーは、選択カセット内に含まれてもよい。そのような選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、若しくは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的化された細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されてもよい。
【０２１１】
いくつかのターゲッティングベクターでは、核酸インサートは、レポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、及びそれらの組み合わせである。そのようなレポーター遺伝子は、標的化された細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されてもよい。
【０２１２】
いくつかのターゲッティングベクターでは、核酸インサートは、１つ又は２つ以上の発現カセット又は欠失カセットを含む。所与の発現カセットは、発現に影響を及ぼす様々な調節成分と共に、対象となるヌクレオチド配列、選択マーカーをコードする核酸、及び／又はレポーター遺伝子を含んでもよい。含まれてもよい選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の部分で詳細に考察される。
【０２１３】
いくつかのターゲッティングベクターでは、挿入核酸は、部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸を含む。挿入核酸全体に、そのような部位特異的組み換え標的配列が隣接してもよい一方で、挿入核酸内の任意の領域又は個々の対象となるポリヌクレオチドにもまた、そのような部位が隣接してもよい。挿入核酸又は挿入核酸中の任意の対象となるポリヌクレオチドが隣接してもよい部位特異的組み換え標的配列としては、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、及びこれらの組み合わせが挙げることができる。一実施例では、部位特異的組み換え部位は、挿入核酸内に含まれる選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接する。標的化された遺伝子座における挿入核酸の組み込みに続いて、部位特異的組換え部位間の配列は、除去されてもよい。
【０２１４】
ｉｉ．ターゲッティングベクター
ターゲッティングベクターは、標的ゲノム遺伝子座内に核酸インサートを導入するために、かつ核酸インサート及び核酸インサートが隣接したホモロジーアームを含むために、採用されてもよい。ターゲッティングベクターは、直線形状又は円形形状であってもよく、かつ一本鎖又は二本鎖であってもよい。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書において５’及び３’（すなわち、上流及び下流）ホモロジーアームと称される。この用語は、ターゲッティングベクター内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関する。５’及び３’ホモロジーアームは、本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と称される、標的化された遺伝子座内の領域に対応する。
【０２１５】
ホモロジーアーム及び標的配列は、２つの領域が相同組み換え反応の基質として相互に機能するために十分な配列同一性を有するとき、相互に「対応する」又は「対応している」という。用語「相同性」は、対応する配列に対して同一であるか、又は配列同一性を共有するかのいずれかであるＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列とターゲッティングベクター上で見出される対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組み換えが生じることを可能にする任意の程度の配列同一性であってもよい。例えば、ターゲッティングベクターのホモロジーアーム（又はそのフラグメント）及び標的配列（又はそのフラグメント）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組み換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性であってもよい。更に、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の相同性の対応領域は、開裂された認識部位における相同組み換えを促進するために十分である任意の長さであってもよい。例えば、所与のホモロジーアーム及び／又は対応する標的配列は、（例えば、本明細書の他の部分に記載のＬＴＶＥＣベクターにおいて記載された）約５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、５〜２０ｋｂ、５〜２５ｋｂ、５〜３０ｋｂ、５〜３５ｋｂ、５〜４０ｋｂ、５〜４５ｋｂ、５〜５０ｋｂ、５〜５５ｋｂ、５〜６０ｋｂ、５〜６５ｋｂ、５〜７０ｋｂ、５〜７５ｋｂ、５〜８０ｋｂ、５〜８５ｋｂ、５〜９０ｋｂ、５〜９５ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１００〜２００ｋｂ、若しくは２００〜３００ｋｂ、又はそれを超える対応する相同性の領域を含んでもよく、その結果、ホモロジーアームは、細胞のゲノム内の対応する標的配列と相同組み換えを行うために十分な相同性を有する。
【０２１６】
ホモロジーアームは、細胞起源の遺伝子座（例えば、標的化された遺伝子座）に対応してもよいし、あるいは、ホモロジーアームは、例えば、導入遺伝子、発現カセット、又はＤＮＡの異種若しくは外因性の領域を含む、細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡの異種若しくは外因性のセグメントの領域に対応してもよい。あるいは、ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体の領域、又は適当な宿主細胞に含まれる任意の他の操作された領域に対応してもよい。なお更に、ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、又はＰ１ファージライブラリーの領域に対応してもよいし、又はそれから誘導されてもよい。特定の場合には、ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、ヒトｉＰＳ細胞又はナイーブ状態を発現するように形質転換された非多能性細胞が起源か、異種、又は外因性の遺伝子座に対応する。場合によっては、ホモロジーアームは、ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導される切れ目若しくは二本鎖切断が存在しなければ、従来法を用いてターゲッティングできないか、又は、誤って若しくは顕著に低い効率でのみターゲッティングされる恐れがある、細胞内の遺伝子座に対応する。場合によっては、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡから誘導される。
【０２１７】
いくつかのターゲッティングベクターでは、５’及び３’ホモロジーアームは、セーフハーバー遺伝子座に対応する。組み込まれた外因性ＤＮＡと宿主ゲノムとの間の相互作用は、組み込みの信頼性及び安全性を限定する場合があり、標的化された遺伝子改変に起因しないが、むしろ周辺の内因性遺伝子に対する組み込みの意図しない効果に起因する顕性表現効果を引き起こす場合がある。例えば、無作為に挿入された導入遺伝子は、その発現を信頼できない、かつ予測できないようにしている位置効果及びサイレンシングの影響下にある場合がある。同様に、染色体遺伝子座内への外因性ＤＮＡの組み込みは、周辺の内因性遺伝子及びクロマチンに影響する場合があり、それによって細胞挙動及び表現型を変異させる。セーフハーバー遺伝子座は、導入遺伝子又は他の外因性核酸インサートが細胞挙動及び表現型を顕著に変異させることなく、対象となるすべての組織内で安定かつ確実に発現することができる染色体遺伝子座を含む。例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １２：５１〜５８を参照されたい。例えば、セーフハーバー遺伝子座は、外因性ＤＮＡが内因性遺伝子の構造又は発現に悪影響を及ぼすことなく予測可能な方法で組み込みかつ機能することができる染色体遺伝子座を含んでもよい。セーフハーバー遺伝子座は、例えば、必須ではない、欠失可能な、若しくは顕性表現影響なしに破壊することができる遺伝子内の遺伝子座などの遺伝子外領域又は遺伝子内領域を含んでもよい。
【０２１８】
例えば、ヒトでのＲｏｓａ２６遺伝子座及びその等価物は、すべての組織内でオープンクロマチン構造を与え、胚発生の過程で、かつ成人で普遍的に発現される。Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：３７８９〜３７９４を参照されたい。加えて、Ｒｏｓａ２６遺伝子座は、高い効率で標的化することができ、Ｒｏｓａ２６遺伝子の破壊は、顕性表現型を生じない。好適な遺伝子座の別の例は、Ｃｈ２５ｈ遺伝子座である。
【０２１９】
ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、対応する標的部位との相同組み換えイベントを促進するために十分な任意の長さであってもよく、例えば、少なくとも５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、５〜２０ｋｂ、５〜２５ｋｂ、５〜３０ｋｂ、５〜３５ｋｂ、５〜４０ｋｂ、５〜４５ｋｂ、５〜５０ｋｂ、５〜５５ｋｂ、５〜６０ｋｂ、５〜６５ｋｂ、５〜７０ｋｂ、５〜７５ｋｂ、５〜８０ｋｂ、５〜８５ｋｂ、５〜９０ｋｂ、５〜９５ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１００〜２００ｋｂ、若しくは２００〜３００ｋｂの長さ、又はそれを超える。以下で更に詳細に説明されるように、大型ターゲッティングベクターは、より長い長さのターゲッティングアームを採用してもよい。
【０２２０】
ヌクレアーゼ剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）は、標的遺伝子座の改変を補助するためにターゲッティングベクターと組み合わせて採用されてもよい。そのようなヌクレアーゼ剤は、ターゲッティングベクターと標的遺伝子座との間の相同組み換えを促進してもよい。ヌクレアーゼ剤がターゲッティングベクターと組み合わせて採用されるとき、ターゲッティングベクターは、ヌクレアーゼ開裂部位における切れ目又は二本鎖切断の際に標的配列とホモロジーアームとの間の相同組み換えイベントの発生を促進するように、ヌクレアーゼ開裂部位に十分に近接して位置する５’及び３’標的配列に対応する５’及び３’ホモロジーアームを含んでもよい。用語「ヌクレアーゼ開裂部位」は、切れ目又は二本鎖切断がヌクレアーゼ剤によって生じるＤＮＡ配列を含む（例えば、Ｃａｓ９開裂部位）。ターゲッティングベクターの５’及び３’ホモロジーアームに対応する標的化された遺伝子座内の標的配列は、距離が認識部位における切れ目又は二本鎖切断の際に５’及び３’標的配列とホモロジーアームとの間の相同組み換えイベントの発生を促進するようなものであるとき、ヌクレアーゼ開裂部位に「十分に近接して位置」する。したがって、具体的な場合には、ターゲッティングベクターの５’及び／又は３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、所与の認識部位の少なくとも１ヌクレオチド以内であるか、又は所与の認識部位の少なくとも１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂの範囲内である。場合によっては、ヌクレアーゼ開裂部位は、標的配列のうちの少なくとも片側又は両側に直接隣接する。
【０２２１】
ターゲッティングベクターのホモロジーアームに対応する標的配列とヌクレアーゼ開裂部位との位置関係は、変動してもよい。例えば、標的配列は、ヌクレアーゼ開裂部位に対して５’に位置してもよく、標的配列は、認識部位に対して３’に位置してもよく、又は、標的配列は、ヌクレアーゼ開裂部位に隣接してもよい。
【０２２２】
（例えば、大型ターゲッティングベクターを含む）ターゲッティングベクターとヌクレアーゼ剤との併用は、ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、標的化効率の向上をもたらす場合がある。例えば、ターゲッティングベクターがヌクレアーゼ剤と併用されるとき、ターゲッティングベクターの標的化効率性は、ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも１０倍向上し得る。
【０２２３】
ｉｉｉ．大型ターゲッティングベクター
いくつかのターゲッティングベクターは、「大型ターゲッティングベクター」又は「ＬＴＶＥＣ」であり、細胞内で相同組み換えを実施することを意図した他の手法により一般的に使用される核酸配列よりも大きな核酸配列に相当し、かつそれらから誘導されるホモロジーアームを含むターゲッティングベクターを含む。ＬＴＶＥＣを使用する標的化された遺伝子改変を起こす例は、例えば、あらゆる目的のためにそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０８８６４３号、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７５号、同第２０１５／０１５９１７４号、同第２０１４／０３１０８２８号、同第２０１４／０３０９４８７号、及び同２０１３−０３０９６７０号を参照されたい。ＬＴＶＥＣはまた、細胞内で相同組み換えを実施することを意図した他の手法により一般的に使用される核酸配列よりも大きな核酸配列を有する核酸インサートを含むターゲッティングベクターも含む。例えば、ＬＴＶＥＣは、それらのサイズ制限のため、従来のプラスミド系ターゲッティングベクターで対処することができない大型遺伝子座の改変を可能にする。例えば、標的化された遺伝子座は、ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導される切れ目若しくは二本鎖切断が存在しなければ、従来法を用いてターゲッティングできないか、又は、誤って若しくは顕著に低い効率でのみターゲッティングされる恐れがある、細胞の遺伝子座であってもよい（すなわち、５’及び３’ホモロジーアームは、細胞の遺伝子座に対応してもよい）。
【０２２４】
ＬＴＶＥＣの例には、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）から誘導されるベクターが挙げられる。ＬＴＶＥＣの非限定的な例及びこれらを作製するための方法は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，２５１号、米国特許第６，５９６，５４１号、米国特許第７，１０５，３４８号、及び国際公開第２００２／０３６７８９号（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５号）に記載されている。ＬＴＶＥＣは、直線形状又は円形形状であってもよい。
【０２２５】
ＬＴＶＥＣは、例えば、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂを含む任意の長さであってもよい。あるいは、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。ＬＴＶＥＣのサイズは、従来のアッセイ、例えばサザンブロッティング及びロングレンジ（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲによるターゲッティングイベントのスクリーニングを可能とするにはあまりに大きい恐れがある。
【０２２６】
場合によっては、ＬＴＶＥＣは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂに及ぶ核酸インサートを含む。他の場合には、核酸インサートは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂに及んでもよい。
【０２２７】
いくつかのＬＴＶＥＣでは、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとの合計は、少なくとも１０ｋｂである。他のＬＴＶＥＣでは、上流ホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂに及び、かつ／又は下流ホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂに及ぶ。上流及び下流ホモロジーアームの合計は、例えば、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってもよい。
【０２２８】
場合によっては、ＬＴＶＥＣ及び核酸インサートは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの標的遺伝子座における欠失を可能にするように設計されている。あるいは、欠失は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。
【０２２９】
他の場合には、ＬＴＶＥＣ及び核酸インサートは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂに及ぶ外因性核酸配列の標的遺伝子座内への挿入を可能にするように設計されている。あるいは、挿入は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。
【０２３０】
更に他の場合には、核酸インサート及び／又は欠失される内因性遺伝子座の領域は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、若しくは９００ヌクレオチド、又は少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ以上である。
【０２３１】
ｉｖ．相同組み換えによって染色体の認識部位近くに核酸インサートを組み込む方法
いくつかの実施例では、多能性細胞中の染色体上の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法は、（ａ）染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）細胞中に、５’及び３’標的配列に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸インサートを含む、第１のターゲッティングベクターを導入することと、（ｃ）染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた第１の核酸インサートをゲノム中に含む少なくとも１つの細胞を特定することと、を含み得る。本明細書の他の部分で詳細に考察されるように、具体的な実施形態では、ターゲッティングベクターの第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームの合計は、約４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂであるか、又は、少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも１０ｋｂかつ１５０ｋｂ未満である。具体的な実施形態では、ＬＴＶＥＣが採用される。非限定的な一実施形態では、そのような方法は、本明細書に提供される培養培地を採用して実施される。
【０２３２】
他の実施例では、多能性細胞中の染色体上の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法は、（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）細胞中に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、第１の認識部位において切れ目又は二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤、及び（ｉｉ）第１の認識部位に十分に近接して位置する５’及び３’標的配列に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した第１の核酸インサートを含む、第１のターゲッティングベクターを導入することと、（ｃ）染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた第１の核酸インサートをゲノム中に含む少なくとも１つの細胞を特定することと、を含み得る。本明細書の他の部分で詳細に考察されるように、具体的な実施形態では、ターゲッティングベクターの第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームの合計は、約４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂであるか、又は、少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも１０ｋｂかつ１５０ｋｂ未満である。具体的な実施形態では、ＬＴＶＥＣが採用される。非限定的な一実施形態では、そのような方法は、本明細書に提供される培養培地を採用して実施される。
【０２３３】
様々な方法はまた、ゲノム標的遺伝子座において組み込まれた核酸インサートを有する多能性細胞を特定するために採用されてもよい。ゲノム標的遺伝子座における核酸インサートの挿入は、「対立遺伝子の改変」をもたらす。用語「対立遺伝子の改変」又は「ＭＯＡ」は、ゲノム中の（複数の）遺伝子又は（複数の）染色体遺伝子座の１つの対立遺伝子の正確なＤＮＡ配列の改変を含む。「対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）」の例には、単一ヌクレオチドほどの小さい欠失、置換、若しくは挿入、又は対象となる（複数の）遺伝子又は（複数の）染色体遺伝子座に及ぶ何キロベースもの欠失、並びにこれらの２つの最末端間のありとあらゆる可能な改変が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
様々な実施形態では、標的化された改変の特定を促進するために、ハイスループット定量的アッセイ、すなわち、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイが採用される。本明細書に記載されたＭＯＡアッセイは、遺伝子改変後に、親染色体中の改変された（複数の）対立遺伝子の大規模スクリーニングを可能にする。ＭＯＡアッセイは、定量的ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ））を含む様々な解析手法で実施してもよいが、これに限定されない。例えば、リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマープローブセットと、標的化されていない基準遺伝子座を認識する第２のプライマープローブセットとを含む。加えて、プライマープローブセットは、増幅配列を認識する蛍光プローブを含む。定量的アッセイはまた、蛍光媒介ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、（複数の）固定化プローブへの定量的ハイブリダイゼーション、Ｉｎｖａｄｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ＭＭＰアッセイ（登録商標）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、及びＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられるが、これらに限定されない、様々な解析手法を介して実施されてもよい。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１４４６５５号を参照されたい。
【０２３５】
様々な実施形態では、切れ目又は二本鎖切断の存在下で、標的ゲノム遺伝子座におけるターゲッティングベクター（例えば、ＬＴＶＥＣ）の標的化効率性は、切れ目又は二本鎖切断の非存在下（例えば、対象となるゲノム遺伝子座において同じターゲッティングベクター、並びに同じホモロジーアーム及び対応する標的部位を使用するが、切れ目又は二本鎖切断を行う追加されたヌクレアーゼ剤の非存在下で使用する）よりも少なくとも約２倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約４倍高い。
【０２３６】
上記の様々な方法は、連続的に繰り返すことにより、染色体上の所与の標的化された遺伝子座への任意の数の核酸インサートの標的組み込みが可能となる。したがって、様々な方法は、染色体上の標的遺伝子座に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の核酸インサートの挿入を提供する。特定の実施形態では、そのような連続的なタイリング方法は、染色体上の標的化されたゲノム遺伝子座内への、動物細胞又は哺乳類細胞（すなわち、ヒト、非ヒト、げっ歯動物、マウス、サル、ラット、ハムスター、家畜哺乳動物、又は農業用動物）由来の大きいゲノム領域の再構成を可能にする。そのような場合、コード及び非コード領域の両方を含むゲノム領域の導入及び再構成は、所与の領域の複雑性が、少なくとも部分的に、コード領域、非コード領域、及び天然ゲノム領域内に見出されるコピー数多型を保持することによって維持されることを可能にする。したがって、様々な方法が、例えば、ヒトｉＰＳ細胞又は多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞内で「異種」又は「外因性」ゲノム領域を生成するための方法を提供する。
【０２３７】
ｖ．対象となるポリヌクレオチド
対象となる任意のポリヌクレオチドは、様々な核酸インサート内に含まれてもよく、それにより染色体上の標的遺伝子座に組み込まれてもよい。本明細書に開示される方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６個、又はそれを超える対象となるポリヌクレオチドが標的化されたゲノム遺伝子座に組み込まれることを可能にする。
【０２３８】
核酸インサートの範囲内の対象となるポリヌクレオチドは、染色体上の標的ゲノム遺伝子座に組み込まれたとき、１つ又は２つ以上の遺伝子改変を多能性細胞に導入することができる。遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失、及び／又は標的ゲノム遺伝子座への外因性若しくは異種若しくはオーソロガスポリヌクレオチドの付加を含むことができる。一実施形態では、遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座における、内因性核酸配列の、対象となる外因性ポリヌクレオチドとの置き換えを含む。したがって、本明細書で提供される方法は、染色体上の標的ゲノム遺伝子座中のノックアウト、欠失、挿入、置き換え（「ノックイン」）、点突然変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせを含む、遺伝子改変の発生を可能にする。そのような改変は、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、又は任意の後続の核酸インサートの組み込み後に生じてもよい。
【０２３９】
核酸インサート内の、かつ／又は標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される多能性細胞を起源とする若しくは多能性細胞と相同な配列を含んでもよく、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞に対して異種であってもよく、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞に対して外因性であってもよく、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞に対してオーソロガスであってもよく、又は、対象となるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが導入される細胞と異なる種由来であってもよい。配列に関した「相同な」は、細胞起源の配列を含む。配列に関した「異種」は、外来種に由来するか、又は同じ種由来である場合、意図的な人間の介入によって組成物及び／又はゲノム遺伝子座内でその天然の形態から実質的に改変される配列を含む。配列に関した「外因性の」は、外来種に起源を有する配列を含む。「オルソロガス」は、別の種（すなわち種変異体）において既知の参照配列と機能的に同等の、ある種からのポリヌクレオチドを含む。対象となるポリヌクレオチドは、非ヒト、げっ歯動物、ハムスター、マウス、ラット、ヒト、サル、鳥類、農業用哺乳動物、又は非農業用哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない、対象となる任意の生物由来であってもよい。対象となるポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、調節領域、又はゲノムＤＮＡを更に含むことができる。したがって、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び／又は後続の任意の核酸インサートは、そのような配列を含むことができる。
【０２４０】
一実施形態では、核酸インサート内の、かつ／又は染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、ヒト核酸と相同である。なお更なる実施形態では、標的遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、ゲノム核酸のフラグメントである。一実施形態では、ゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸、非ヒト核酸、げっ歯動物核酸、ラット核酸、ハムスター核酸、サル核酸、農業用哺乳動物核酸、若しくは非農業用哺乳動物核酸、又はこれらの組み合わせである。
【０２４１】
一実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、上記のように、約５００ヌクレオチド〜約２００ｋｂの範囲に及んでもよい。対象となるポリヌクレオチドは、約５００ヌクレオチド〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってもよい。
【０２４２】
核酸インサート内の、かつ／又は染色体上の標的ゲノム遺伝子座において挿入された対象となるポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、ｍｉＲＮＡをコードすることができ、長い非コードＲＮＡをコードすることができ、又は、対象となるポリヌクレオチドは、例えば、調節配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写リプレッサー結合配列を含む、対象となる任意の調節領域若しくは非コード領域、又は非タンパク質コード配列の欠失を含んでもよいが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。加えて、核酸インサート内の、かつ／又は染色体上の標的ゲノム遺伝子座において挿入された対象となるポリヌクレオチドは、神経系、骨格系、消化器系、循環系、筋系、呼吸器系、心臓血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系、又はそれらの組み合わせにおいて発現するタンパク質をコードしてもよい。
【０２４３】
核酸インサート内の、かつ／又は染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、コーディング配列内に遺伝子改変を有してもよい。そのような遺伝子改変には、コード配列の欠失突然変異又は２つのコード配列の融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４４】
核酸インサート内の、かつ／又は染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、突然変異タンパク質は、変異した結合特徴、変異した局所化、変異した発現、及び／又は変異した発現パターンを特徴とする。一実施形態では、核酸インサート内の、かつ／又は染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、少なくとも１つの疾病対立遺伝子を含む。そのような場合、疾病対立遺伝子は、優性対立遺伝子であってもよく、又は疾病対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。更に、疾病対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含んでもよい。突然変異タンパク質をコードする対象となるポリヌクレオチドは、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、げっ歯動物、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳動物、又は家畜哺乳動物の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない、任意の生物由来であってもよい。
【０２４５】
核酸インサート内の、かつ／又は染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドはまた、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写リプレッサー結合配列、又は転写ターミネーター配列を含む、調節配列を含んでもよい。具体的な実施形態では、核酸インサート内の、かつ／又は染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、非タンパク質コーディング配列の欠失を有するが、タンパク質コード配列の欠失は有さないヌクレオチドを含む。一実施形態では、非タンパク質コード配列の欠失は、調節配列の欠失を含む。別の実施形態では、調節要素の欠失は、プロモーター配列の欠失を含む。一実施形態では、調節要素の欠失は、エンハンサー配列の欠失を含む。そのような対象となるポリヌクレオチドは、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、げっ歯動物、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳動物、又は家畜哺乳動物の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない、任意の生物由来であってもよい。
【０２４６】
上記又は下記で引用したすべての特許申請、ウェブサイト、他の出版物、アクセッション番号などは、それぞれの個別の項目が参照によって組み込まれることを具体的かつ個別に示唆するかのように、同じ程度まで、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。異なるバージョンの配列が異なる時点でアクセッション番号と関連付けられる場合、本出願の有効申請日におけるアクセッション番号と関連付けられたバージョンが有意である。有効な申請日は、実際の出願日又は該当する場合、アクセッション番号に関連する優先出願の出願日のうち早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの出版物、ウェブサイトなどが異なる時点で公開される場合、別に指示がない限り、本出願の有効出願日の直前に公開されたバージョンが有意である。本発明のいかなる特徴、工程、要素、実施形態、又は態様も、別に特に指示しない限り、任意の他のものと組み合わせて使用してもよい。上記の説明及び関連する図面中に示される教示の利益を得れば、本方法及び組成物が関連する技術分野の当業者は、本明細書に記載される方法及び組成物の多くの修正形態及び他の実施形態に想到するであろう。したがって、本方法及び組成物が開示された特定の実施形態に限定されないものであること、並びに修正形態及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解されよう。特定の用語が本明細書で採用されるが、それらは、限定目的ではなく一般的かつ説明的な意味でのみ使用される。
【０２４７】
記載された発明は、本発明の趣旨又は基本的特性から逸脱することなく他の特定の形態で具体化されてもよく、その結果、参照は、本発明の範囲を示唆するように、前述の明細書に対してではなく、添付の特許請求の範囲に対して行われるものとする。
【０２４８】
以下の実施例は、限定としてではなく例示として提供される。
【実施例】
【０２４９】
実施例１．ヒトｉＰＳ細胞の樹立
本実施例は、非多能性ヒト細胞由来のヒトｉＰＳ細胞の樹立を説明する。サンプルプロトコルを、表２に示す。ＣＭ７プロモーターに操作可能に結合された４種類のリプログラミング因子（ｈＯｃｔ４、ｈＳｏｘ２、ｈＫＬＦ−４、ｈＭＹＣ）をコードする遺伝子を含むｐｉｇｇｙＢａｃ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ベクター（ＰＢ−６００Ａ＿ＣＡＧＧＧＳ  Ｂｓｔ  ＸＩ（０．６４μｇ／μＬ）及びＰＢ−２００（０．９９μｇ／μＬ）を、ＲＥＤ及びＢＬＵＥ  ＧｅｎｅＩｎ（商標）トランスフェクション試薬（ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）を使用して新生児ヒト包皮線維芽細胞内に導入した。トランスフェクト細胞を、ベクターの取り込み及びリプログラミング因子の発現を可能にするようにＥ７培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＮｕＦＦ１フィーダー細胞上でインキュベートした。Ｅ７培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＮａＨＣＯ３、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及びＦＧＦ−２を含んでいた。
【０２５０】
ピューロマイシン選択は、Ｅ７培地において２μｇ／ｍＬのピューロマイシンを使用するトランスフェクション後、１０日目に開始した。２１日目に、コロニーを、選択し、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＮａＨＣＯ３、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、グルタチオン、Ｌ−グルタミン、明確な脂質、チアミン、微量元素Ｂ及びＣ、β−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピペコリン酸、塩化リチウム、並びにＧＡＢＡを含んだｍＴｅＳＲ（商標）培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のｍＴｅＳＲ（商標）１培地）中で培養した。ｍＴｅＳＲ（商標）培地及びＥ７培地の構成成分の比較は、表３に示した。２９〜５７日目に、細胞を、増殖させ、６ウェルプレート内で約５０％コンフルエントに達するまでｍＴｅＳＲ（商標）培地中で継代した。６５〜７３日目に、増殖及び継代は、ｍＴｅＳＲ（商標）培地及びＧｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して継続した。７６日目に、培地を、ナイーブ型又はナイーブ様ｈｉＰＳＣを含む細胞の更なる増殖、継代、及び維持のために、低オスモル濃度ＶＧ２ｉ培地に変更した。上記方法の継代のタイミングは、細胞形態によって判定した。
【０２５１】
【表２】
2017536811.tif 000004
【０２５２】
【表３】
2017536811.tif 000005
【０２５３】
実施例２．ヒトｉＰＳ細胞におけるＬＴＶＥＣターゲッティング
本実施例は、ヒトｉＰＳ細胞におけるＬＴＶＥＣターゲッティングの使用を説明する。図１に示したように、エレクトロポレーションによってＶＧ２ｉ培地中で増殖させたヒトｉＰＳ細胞内に、以下の核酸分子、（１）ＬＴＶＥＣ（０．６７μｇ）、（２）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするプラスミド（５μｇ）、及び（３）ＣＲＩＳＰＲ単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするプラスミド（１０μｇ）を導入した。サンプルの１つの群では、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡは、除外した。具体的には、３×１０６個の細胞を、７００Ｖの電圧、２５μＦの静電容量、及び４００オームの抵抗でエレクトロポレーションした。ＬＴＶＥＣは、欠失が意図されたヒトＡＤＡＭ６遺伝子座の４．１ｋｂの配列が隣接するゲノム領域から誘導されたゲノムＤＮＡの３４ｋｂ及び１０５ｋｂを含むホモロジーアームが隣接したマウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子を含む１６．７ｋｂの核酸を含んだ。ＬＴＶＥＣはまた、抗生物質（ハイグロマイシン）に対する耐性を付与する酵素の発現を誘導する薬剤選択カセットを担持した。使用されたヒトＡＤＡＭ６  ｇＲＮＡは、以下の配列、ＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＴ（配列番号１）であった。
【０２５４】
ＬＴＶＥＣを取り込み、そのゲノム中にＬＴＶＥＣを組み込んだ細胞は、抗生物質を含む増殖培地中で増殖することができ、ＧＥＬＴＲＥＸ（商標）で覆った組織培養皿上にコロニーを形成することができた。ＬＴＶＥＣ分子と比べて５００〜１，０００倍多いＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コード核酸分子を導入したため、ＬＴＶＥＣ含有薬剤耐性コロニーのほとんどはまた、少なくとも一時的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分を含んだ。薬剤耐性コロニーを取り出し、正しく標的化された対立遺伝子を有するクローンを特定するために、ｌｏｓｓ−ｏｆ−ａｌｌｅｌｅ法（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２〜６６０、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５〜３０７）によってスクリーニングした。
【０２５５】
ＡＤＡＭ６遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９支援ＬＴＶＥＣターゲッティングの結果は、表４に示した。
【０２５６】
【表４】
2017536811.tif 000006
【０２５７】
ＬＴＶＥＣのみをヒトｉＰＳ細胞内に導入したとき、３．１％のターゲッティング効率が観察された。対照的に、ＡＤＡＭ６  ｇＲＮＡによってガイドされるＣａｓ９とＬＴＶＥＣとの組み合わせは、７．３％のターゲッティング効率をもたらした。
【０２５８】
実施例３．ヒトｉＰＳ細胞の形態に対する低オスモル濃度培地の効果
本実施例は、培養物中のヒトｉＰＳ細胞の多能性状態に対する塩濃度、イオン強度、及び／又はオスモル濃度の効果を説明する。ヒトｉＰＳ細胞を、表５に記載した培地（１００単位／ｍＬの最終ｈＬＩＦ濃度、３μＭの最終ＣＨＩＲ９９０２１濃度、０．５μＭの最終ＰＤ０３２５９０１濃度）又はｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地においてＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はＧＥＬＴＲＥＸ（商標）上で培養した。
【０２５９】
【表５】
2017536811.tif 000007
【０２６０】
【表６】
2017536811.tif 000008
【０２６１】
使用した基本培地がＤＭＥＭであったとき、この培地を、２ｉ培地と称した。使用した基本培地がＶＧ−ＤＭＥＭであったとき、この低オスモル濃度培地を、ＶＧ２ｉ培地と称した。ＶＧ２ｉ培地のオスモル濃度（２３３ｍＯｓｍ／ｋｇ）は、従来の２ｉ培地のオスモル濃度（２６１ｍＯｓｍ／ｋｇ）よりも低い。表６には、これらの培地のオスモル濃度並びに異なる基本培地のオスモル濃度及び培地構成成分を示す。
【０２６２】
図２に示したように、２ｉ培地中のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で８日（図２Ａ）又は１２日（図２Ｂ）の期間にわたって培養されたヒトｉＰＳ細胞は、プライム状態のｉＰＳ細胞の形態的特徴、特に上皮単層での増殖及び頂底極性の出現を示した。
【０２６３】
ｍＴｅＳＲ（商標）培地及びＶＧ２ｉ培地は、ヒトｉＰＳ細胞の形態及び多能性状態に対する効果について更に評価した。本研究では、ヒトｉＰＳ細胞を、ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地（図３Ａ及び図３Ｃ）中で又はＶＧ２ｉ培地（図３Ｂ及び図３Ｄ）中で６日の期間にわたってＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はＮｕＦＦフィーダー細胞上で培養した。ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地中でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はＮｕＦＦフィーダー細胞上で培養したとき、ヒトｉＰＳ細胞は、プライム型多能性状態の形態的特徴、特に上皮単層での増殖及び頂底極性の出現を示した。ｍＴｅＳＲ（商標）−ｈＬＩＦ培地中で培養されたいくつかの細胞は、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示し始めた。対照的に、ＶＧ２ｉ培地中でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はＮｕＦＦフィーダー細胞上で培養したとき、ヒトｉＰＳ細胞は、ナイーブ型多能性状態の形態的特徴、特に円形のドーム形状のコロニーでの増殖及び頂底極性の欠如を示した。
【０２６４】
実施例４．ヒトｉＰＳ細胞における多能性マーカーの発現に対する低オスモル濃度培地の効果
本実施例は、プライム状態からナイーブ状態へリプログラミング済みのヒトｉＰＳ細胞における多能性マーカーの発現に対する塩濃度、イオン強度、及び／又はオスモル濃度の効果を説明する。ＶＧ２ｉ培地中でＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）基質上での２４日培養に続いて、リプログラムされたナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞を、アルカリホスファターゼ又はＮＡＮＯＧの発現のために染色した。リプログラムされた細胞は、ナイーブ型多能性状態を示唆するアルカリホスファターゼ（図４Ａ）及びＮＡＮＯＧ（図４Ｂ及び図４Ｃ）の両方を強く発現したことが観察された。
【０２６５】
実施例５．ヒトｉＰＳ細胞の酵素的解離及び継代培養に対する低オスモル濃度培地の効果
本実施例では、低オスモル濃度ＶＧ２ｉ培地を使用してナイーブ状態にリプログラムされたヒトｉＰＳ細胞を、トリプシンを使用して酵素的に解離させて単個細胞浮遊液を生じさせた（図５Ａ）。細胞浮遊液は、ＶＧ２ｉ培地中での継代培養用の新しいＧＥＬＴＲＥＸ（商標）で覆ったプレート上に継代した。１日後（図５Ｂ）及び４日後（図５Ｃ）に、継代培養細胞は、ナイーブ型多能性状態の細胞の形態的特徴を示し続けたことが観察された。特に、細胞は、円形ドーム形状コロニーとして増殖し、頂底極性を示さなかった。酵素的解離は、プロアポトーシス過程の活性化を防止するために一般的に必要なＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施できたことに、注目すべきである。これは、プロアポトーシス過程が、酵素的解離及び本明細書で特定された条件下で培養されたナイーブ型ヒトｉＰＳ細胞における継代培養の間に、それほど強くは活性化されないことを示唆する。加えて、ＶＧ２ｉ培地中で培養され、トリプシンによる酵素的解離後に単一細胞として継代されたヒトｉＰＳ細胞は、正常核型を維持する。異なるクローンから誘導され、トリプシンによる解離で単個細胞浮遊液を生じた後に作製された、２個の１０回継代のヒトｉＰＳ細胞は、核型分析され、両方とも正常な４６ＸＹ核型を有した（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【０２６６】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
（ａ）ｈｉＰＳＣの集団と、
（ｂ）基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地と、を含むインビトロ培養物であって、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、インビトロ培養物。
（項目２）
基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で作製又は維持されたｈｉＰＳＣの集団であって、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、集団。
（項目３）
前記ｈｉＰＳＣは、
（ａ）ナイーブ型若しくはナイーブ様ｈｉＰＳＣを含むか、
（ｂ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現するか、
（ｃ）密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、
（ｄ）内胚葉性、外胚葉性、若しくは中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができるか、
（ｅ）約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有するか、又は、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせである、項目１に記載のインビトロ培養物又は項目２に記載の集団。
（項目４）
前記ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する、項目１若しくは３に記載のインビトロ培養物又は項目２若しくは３に記載の集団。
（項目５）
前記多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、アリカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む、項目３又は４に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項目６）
前記ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導される、項目１及び３〜５のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜５のいずれか一項に記載の集団。
（項目７）
前記形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する、項目６に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項目８）
前記形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む、項目６又は７に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項目９）
前記形質転換細胞は、前記低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、該高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含む、項目６〜８のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項目１０）
前記高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目９に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項目１１）
（ａ）前記形質転換細胞が、ナイーブ型若しくはナイーブ様状態の特徴を発現するまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｂ）前記形質転換細胞が、約２か月の期間にわたって前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｃ）前記形質転換細胞が、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、又は、
（ｄ）それらの組み合わせである、項目９又は１０に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項目１２）
前記基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目１及び３〜１１のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜１１のいずれか一項に記載の集団。
（項目１３）
前記基本培地は、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む、項目１及び３〜１２のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜１２のいずれか一項に記載の集団。
（項目１４）
前記低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目１及び３〜１３のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜１３のいずれか一項に記載の集団。
（項目１５）
前記低オスモル濃度培地は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目１及び３〜１４のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜１４のいずれか一項に記載の集団。
（項目１６）
（ａ）前記サプリメントが、
（ｉ）Ｆ−１２培地、
（ｉｉ）Ｎ２サプリメント、
（ｉｉｉ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、
（ｉｖ）Ｂ−２７サプリメント、
（ｖ）Ｌ−グルタミン、
（ｖｉ）２−メルカプトエタノール、若しくは、
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを含むか、
（ｂ）前記ＬＩＦポリペプチドが、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドであるか、
（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１を含むか、
（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１を含むか、又は、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせである、項目１及び３〜１５のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜１５のいずれか一項に記載の集団。
（項目１７）
前記低オスモル濃度培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む、項目１及び３〜１６のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜１６のいずれか一項に記載の集団。
（項目１８）
前記低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む、項目１及び３〜１７のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜１７のいずれか一項に記載の集団。
（項目１９）
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない、項目１及び３〜１８のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜１８のいずれか一項に記載の集団。
（項目２０）
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメントを含まない、項目１及び３〜１９のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜１９のいずれか一項に記載の集団。
（項目２１）
前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＮｕＦＦフィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、項目１及び３〜２０のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜２０のいずれか一項に記載の集団。
（項目２２）
前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とすることができ、かつ継代培養することができる、項目１及び３〜２１のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は項目２〜２１のいずれか一項に記載の集団。
（項目２３）
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項目２２に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項目２４）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）前記１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ型若しくはナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項目２２又は２３に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項目２５）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、項目２２〜２４のいずれか一項に記載のインビトロ培養物又は集団。
（項目２６）
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の集団を作製するための方法であって、該方法は、多能性状態を発現するように形質転換された非多様性細胞の集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地でインビトロ培養することを含み、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
（項目２７）
前記方法は、ナイーブ型又はナイーブ様ｈｉＰＳＣの集団を増加させる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
インビトロ培養物中のｈｉＰＳＣの集団を維持するための方法であって、該方法は、該ｈｉＰＳＣの集団を基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養することを含み、該低オスモル濃度培地は、
（ａ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｂ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｃ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
（項目２９）
前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液とすることができ、かつ継代培養することができる、項目２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ型若しくはナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項目２９又は３０に記載の方法。
（項目３２）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、項目２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
ｈｉＰＳＣ内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）該ｈｉＰＳＣ中に、該標的ゲノム遺伝子座における５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’ホモロジーアームが隣接した挿入核酸を含む、ターゲッティングベクターを導入することと、
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該挿入核酸を、ゲノム中に含む、遺伝子改変ｈｉＰＳＣを特定することと、を含み、
該ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
（項目３４）
前記ターゲッティングベクターは、大型ターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）であり、前記５’及び３’ホモロジーアームの総量は、少なくとも１０ｋｂである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
導入ステップ（ａ）は、前記ターゲッティングベクターと前記ｈｉＰＳＣ内の前記標的ゲノム遺伝子座との間の相同的組み換えを促進するヌクレアーゼ剤を導入することを更に含む、項目３３又は３４に記載の方法。
（項目３６）
前記標的化された遺伝子改変は、
（ａ）内因性ヒト核酸配列の欠失、
（ｂ）外因性核酸配列の挿入、又は、
（ｃ）該外因性核酸配列による該内因性ヒト核酸配列の置き換えを含む、項目３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記外因性核酸配列は、
（ａ）前記内因性ヒト核酸配列と相同な又はオーソロガスである核酸配列、
（ｂ）キメラ核酸配列、
（ｃ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接した条件付き対立遺伝子、及び
（ｄ）前記ｈｉＰＳＣ内で活性なプロモーターと作動可能に連結されたレポーター遺伝子のうちの１つ又は２つ以上を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
ｈｉＰＳＣ内の標的ゲノム遺伝子座を改変するための方法であって、
（ａ）該ｈｉＰＳＣ中に、該標的ゲノム遺伝子座における認識部位で１つ又は２つ以上の切れ目又は二本鎖切断を誘導する１種又は２種以上のヌクレアーゼ剤を導入することと、
（ｂ）該標的ゲノム遺伝子座において、ゲノム中に改変を含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含み、
該ｈｉＰＳＣは、基本培地及びサプリメントを含む低オスモル濃度培地で培養され、該低オスモル濃度培地は、
（ｉ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）ポリペプチドと、
（ｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
（ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤と、を含み、
該基本培地は、約１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、方法。
（項目３９）
ステップ（ａ）の前に、前記ｈｉＰＳＣは、酵素的に解離させて単個細胞浮遊液にされ、かつ継代培養される、項目３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記酵素的解離は、
（ａ）トリプシンを使用して実施されるか、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施されるか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、
（ａ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現し続けるか、
（ｂ）ナイーブ型若しくはナイーブ様状態を維持し、かつ密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、又は、
（ｃ）それらの組み合わせである、項目３９又は４０に記載の方法。
（項目４２）
前記継代培養ｈｉＰＳＣは、正常核型を維持する、項目３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記ヌクレアーゼ剤は、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
（ｃ）メガヌクレアーゼ、又は、
（ｄ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び、ゲノム標的配列を認識するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、を含む、項目３５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記標的化された遺伝子改変は、二対立遺伝子改変である、項目３３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ｈｉＰＳＣは、
（ａ）ナイーブ型若しくはナイーブ様ｈｉＰＳＣを含むか、
（ｂ）１つ若しくは２つ以上の多能性マーカーを発現するか、
（ｃ）密集したドーム形状のコロニーによって特徴付けられる形態を示すか、
（ｄ）内胚葉性、外胚葉性、若しくは中胚葉性胚葉のうちのいずれか１つの細胞に分化することができるか、
（ｅ）約１６時間〜約２４時間の倍加時間を有するか、又は、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせである、項目２６〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記ｈｉＰＳＣは、正常核型を有する、項目２６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記多能性マーカーは、ＮＡＮＯＧ、アリカリホスファターゼ、又はそれらの組み合わせを含む、項目４６又は４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ｈｉＰＳＣは、多能性状態を発現するように形質転換された非多能性細胞から誘導される、項目２８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記形質転換細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、又はそれらの任意の組み合わせを含むリプログラミング遺伝子を発現する、項目２６、２７、及び４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記形質転換細胞は、プライム型ｈｉＰＳＣを含む、項目２６、２７、４９、及び５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記形質転換細胞は、前記低オスモル濃度培地で培養される前に高オスモル濃度培地で最初に培養され、該高オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦを含む、項目２６、２７、及び４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記高オスモル濃度培地は、少なくとも約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
（ａ）前記形質転換細胞が、ナイーブ型若しくはナイーブ様状態の特徴を発現するまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｂ）前記形質転換細胞が、約２か月の期間にわたって前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、
（ｃ）前記形質転換細胞が、三次元細胞集塊によって特徴付けられる形態を示すまで前記高オスモル濃度培地で最初に培養されるか、又は、
（ｄ）それらの組み合わせである、項目５２又は５３に記載の方法。
（項目５５）
前記基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを含み、かつ約２００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目２６〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記基本培地は、約４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む、項目２６〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目２６〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記低オスモル濃度培地は、約２３３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、項目２６〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
（ａ）前記サプリメントが、
（ｉ）Ｆ−１２培地、
（ｉｉ）Ｎ２サプリメント、
（ｉｉｉ）ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、
（ｉｖ）Ｂ−２７サプリメント、
（ｖ）Ｌ−グルタミン、
（ｖｉ）２−メルカプトエタノール、若しくは、
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の任意の組み合わせを含むか、
（ｂ）前記ＬＩＦポリペプチドが、ヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）ポリペプチドであるか、
（ｃ）前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１を含むか、
（ｄ）前記ＭＥＫ阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１を含むか、又は、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせである、項目２６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記低オスモル濃度培地は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤及びＭＥＫ阻害剤から本質的になる阻害剤を含む、項目２６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記低オスモル濃度培地は、約２４．７５％（ｖ／ｖ）の基本培地、約２４．７５％（ｖ／ｖ）のＦ−１２培地、約０．５％（ｖ／ｖ）のＮ２サプリメント、約４９％（ｖ／ｖ）のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ培地、約１％（ｖ／ｖ）のＢ−２７サプリメント、約２ｍＭのＬ−グルタミン、約０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１００単位／ｍＬのｈＬＩＦ、約３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び約０．５μＭのＰＤ０３２５９０１を含む、項目２６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメント、ＴＧＦ−β１サプリメント、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤のうちの１種又は２種以上を含まない、項目２６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記低オスモル濃度培地は、ｂＦＧＦサプリメントを含まない、項目２６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記ｈｉＰＳＣは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ、ＮｕＦＦフィーダー細胞、又はＧＥＬＴＲＥＸ上で培養される、項目２６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
項目２６、２７、２９〜３２、４６〜４８、及び５０〜６４のいずれか一項に記載の方法によって作製される、ｈｉＰＳＣ。
（項目６６）
項目３３〜６４のいずれか一項に記載の方法によって作製される、改変ｈｉＰＳＣ。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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