(57)【要約】ヒトアデノウイルス血清型２６またはヒトアデノウイルス血清型３５に由来する複製型組み換えアデノウイルスベクターが説明されている。この複製型組み換えアデノウイルスベクターの複製能は、対応する野生型アデノウイルスの複製能と比較して減弱されている。この複製型組み換えアデノウイルスベクターを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの異種遺伝子の安定した発現に使用することができる。更に説明されているのは、この組み換えアデノウイルスベクターを使用して対象中で免疫応答を誘導するためのおよび免疫原性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に対するワクチンを対象に接種するための組成物および方法である。
2017507672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）異種核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター、
（ｂ）機能するＥ１コード領域、
（ｃ）Ｅ３コード領域での欠失、および
（ｄ）Ｅ４コード領域での欠失であり、ただし、Ｅ４オープンリーディングフレーム６／７が欠失していない、Ｅ４コード領域での欠失
を有する組み換えアデノウイルスゲノムを含む複製型組み換えアデノウイルスベクターであって、
前記アデノウイルスゲノムがヒトアデノウイルス血清型２６または３５のゲノムである、複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項２】
前記異種核酸配列が、左側のＩＴＲと前記機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置している、請求項１に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項３】
前記異種核酸配列が免疫原性ポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項４】
前記異種核酸配列がＨＩＶ抗原をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項５】
前記異種核酸配列がモザイクＨＩＶ抗原をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記異種核酸配列が、配列番号４８または配列番号５０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記ベクターが凍結乾燥されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項８】
前記ベクターの複製能が、野生型ヒトアデノウイルス血清型２６または３５それぞれの複製能と比較して少なくとも約８０倍減弱されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項９】
（ａ）配列番号４８または配列番号５０のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター、
（ｂ）配列番号１４〜１６のアミノ酸配列をコードする、機能するＥ１コード領域、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ３コード領域、および
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ４コード領域
を有する組み換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含む複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
前記異種核酸配列が、左側のＩＴＲと前記機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置している、請求項９に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
ａ．前記プロモーターが、配列番号５１のヌクレオチド配列を有するＣＭＶプロモーターであり、前記異種核酸配列が配列番号４７または配列番号４９のヌクレオチド配列を含む、
ｂ．前記機能するＥ１コード領域が配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、
ｃ．前記部分的に欠失したＥ３コード領域が配列番号５のヌクレオチド配列からなる、および
ｄ．前記部分的に欠失したＥ４コード領域が配列番号２３のヌクレオチド配列からなる、
請求項９または１０に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１３】
対象への経口投与用に製剤化されている請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
腸溶コーティングカプセルである請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクターを、前記組み換えアデノウイルスゲノムの複製および細胞中でのアデノウイルス粒子のパッケージングに十分な条件下で前記細胞中に導入すること、ならびに
前記アデノウイルス粒子を回収すること
を含む、複製型アデノウイルス粒子を産生する方法。
【請求項１６】
対象中で免疫応答を発生させる方法であって、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物の免疫学的に有効な量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記組成物を前記対象に経口投与する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
感染に対するワクチンを対象に接種する方法であって、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物の免疫学的に有効な量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１９】
ＨＩＶ感染に対するワクチンをヒト対象に接種する方法であって、薬学的に許容される担体と、複製型組み換えアデノウイルスベクターであり、
（ａ）配列番号４８または配列番号５０のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター、
（ｂ）配列番号１４〜１６のアミノ酸配列をコードする、機能するＥ１コード領域、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ３コード領域、および
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ４コード領域
を有する組み換え血清型２６アデノウイルスゲノムを含み、
前記異種核酸配列が、左側のＩＴＲと前記機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置している、複製型組み換えアデノウイルスベクターとを含む組成物の免疫学的に有効な量を前記対象に経口投与することを含む、方法。
【請求項２０】
ａ．前記プロモーターが、配列番号５１のヌクレオチド配列を有するＣＭＶプロモーターであり、前記異種核酸配列が、配列番号４７または配列番号４９のヌクレオチド配列を含む、
ｂ．前記機能するＥ１コード領域が配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、
ｃ．前記部分的に欠失したＥ３コード領域が配列番号５のヌクレオチド配列からなる、および
ｄ．前記部分的に欠失したＥ４コード領域が配列番号２３のヌクレオチド配列からなる、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象中での免疫応答の発生用の、または感染に対するワクチンのヒト対象への接種用の、好ましくはＨＩＶ感染に対するワクチンのヒト対象への接種用の請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／９４６，０９１号明細書に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を受ける権利を有しており、この明細書全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、複製型組み換えアデノウイルスベクターに関する。具体的には、本発明は、ＨＩＶ感染に対して免疫応答を誘発するためにまたは防御免疫を発生させるために使用され得る、ヒトアデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）または血清型３５（Ａｄ３５）に由来する複製型組み換えアデノウイルスベクターを提供する。
【背景技術】
【０００３】
世界中で数百万人もの人々がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に襲われており、抗レトロウイルス処置が広く行き渡った時代でさえもＨＩＶの予防は非常に高い優先度であり続けている。米国では、疾病管理センター（ＣＤＣ）が、全てのＨＩＶ陽性の米国居住者の内、約５分の１が彼らの状態に気付いておらず、この少ない割合が、毎年の新たな感染の半分を伝播する原因であると推定している［２］。世界的には、迅速な診断および処置の格差がはるかに大きい。２０１０年末には世界中で推定３４００万人もの人々がＨＩＶと共に生きており、２００１年から１７％増加している。新たなＨＩＶ感染の大部分はサハラ以南のアフリカで発生し続けているが、ＣＤＣは、米国での２００８〜２０１１年のＨＩＶ感染の年間発生率が毎年４０，０００例超の新たな感染により約１５〜１６例／１００，０００人で安定したままであると推定した。そのため、ＨＩＶ感染を予防するであろうまたは腸ＣＤ４プールの破壊［３］および高リスクの伝播［４］の両方を含む診断前のＨＩＶ感染の初期の影響を鈍らせるであろう安全で強力なＨＩＶワクチンを発見することが緊急で地球規模の衛生優先度である。
【０００４】
生減弱化ワクチン（例えば、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染を予防するための、生減弱化ＳＩＶをベースとするワクチン）が、ある特定のウイルス性疾患に対してヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で非常に有効であると証明されている。残念ながら、生減弱化ＨＩＶに関連する安全上のリスクに起因して、そのような戦略はＨＩＶヒトワクチンに適用不能である。
【０００５】
生減弱化ウイルスワクチンの代わりとして、複製不能な組み換えウイルスベクターの使用が、ワクチンおよびその他のタイプの遺伝子治療を目的として調査されている。具体的には、複製不能な組み換えアデノウイルスベクター（特にアデノウイルス血清型２および５（Ａｄ２およびＡｄ５））が、ワクチン接種等の遺伝子送達用途を目的として大規模に研究されている。そのような複製不能Ａｄ５ベクターをベースとするワクチンは様々な動物モデルで防御免疫応答を誘発することが分かっているが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびその他の病原体を目的とする、組み換えＡｄ５ベクターをベースとするワクチンの有用性は、ヒト個体群では、Ａｄ５に特異的な中和抗体（ＮＡｂ）の高い血清有病率により限定される可能性が高い［１７］。例えば、世界的規模での４，３８１例の対象の血清免学的研究では、Ａｄ５  ＮＡｂ力価はほぼ普遍であり、サハラ以南のアフリカでは高い力価であり、大部分の個体が＞２００のＡｄ５  ＮＡｂ力価を示すことが観察された［１４］。
【０００６】
Ａｄ５がヒトにおいて高い血清有病率を有するにもかかわらず、組み換えＡｄ５ベクターをベースとするワクチンに基づくワクチンを使用して、いくつかのＨＩＶ−１ワクチン有効性試験が行われている。この研究は、ＨＶＴＮ  ５０２／ＳＴＥＰ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｄ５）、ＨＶＴＮ  ５０３／Ｐｈａｍｂｉｌｉ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｄ５）およびＨＶＴＮ  ５０５（ＮＩＨ  ＶＲＣ  ＤＮＡ／Ａｄ５）ＨＩＶ−１のワクチン有効性試験を含む。しかしながら、これら３種のＨＩＶ−１ワクチン有効性試験（非複製型のＡｄ５ワクチンおよびＤＮＡ／Ａｄ５ワクチンを利用する）は全て、ＨＩＶ−１感染に対して有効性を示さなかった。更に、ＳＴＥＰ研究からのＭｅｒｃｋ  Ａｄ５ワクチンが接種された人では、偽薬と比較してＨＩＶ−１感染が増加する傾向が観測された。ＨＩＶワクチン用のアデノウイルス血清型５等の複製不能なベクターによるこれまでの経験は期待外れであり、いくつかの有効性試験において有効性を示すことに失敗している［５〜８］。
【０００７】
従って、Ａｄ５ベクターの安全性に関する懸念、特にＳＴＥＰ研究からのＡｄ５ベクターに関する懸念［８、１０］から、ウイルスワクチンベクターとしての別の血清型由来の生物学的に実質的に異なるＡｄベクターが調査されている［１１〜１３］。Ａｄ５に代わるアデノウイルス血清型の一例は、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）である。Ａｄ２６は、ヒトでは比較的珍しいウイルスである非エンベロープ型ＤＮＡウイルスである。Ａｄ２６が任意のその他の種で複製するかは不明である。異なる個体群におけるアデノウイルスに関する多くの調査は、アデノウイルスは極めて希に単離され、単離される場合であっても、症状をほとんど伴わないことを示している。実験的接種も同様に、重篤な感染の証拠をほとんど示さなかった。例えば［１４、２７〜４３」を参照されたい。そのため、観察研究からは、Ａｄ２６が健康的な成人で臨床症状を引き起こすという証拠はなく、Ａｄ２６チャレンジ研究からの実験データも、腸内Ａｄ２６感染が症状を生じないことを示唆した［４４］。
【０００８】
少なくとも受容体利用、ｉｎ  ｖｉｖｏでの親和性、樹状細胞との相互作用、先天性の免疫プロファイル、適応性のある免疫表現型およびアカゲザルにおけるＳＩＶに対する防御効果に関して、Ａｄ２６は、Ａｄ５とは生物学的に非常に異なることが証明されている［１１、１２、１５、１９〜２２］。さらに、ヒトにおける非複製型Ａｄ２６ベクターの安全性および免疫原性が実証されている（臨床試験．Ｇｏｖ  ＮＣＴ０１２１５１４９）。さらに、Ａｄ５とＡｄ３５との間には、ヒトにおけるより低い血清有病率およびより低い中和抗体力価等のＡｄ５とＡｄ３５との間の多くの有益な生物学的差異も存在する。
【０００９】
複製不能なＡｄ２６が、ＧＬＰ毒性研究および有害効果の有意なパターンがない３つのフェーズＩの臨床試験で試験されている。複製型ウイルスベクターは、感染サイクルの設定であるウイルスの多重コピー（後にその他の細胞に感染する可能性がある）を生成する可能性があることから、遺伝子治療および関連する用途（ワクチン接種等）には複製不能なウイルスベクターが好ましいが、複製不能なウイルスベクターの使用には、いくつかの起こりうる欠点が存在する。複製不能なウイルスベクターの１つの起こりうる欠点は、ベクターの投与後に、ウイルスベクターから宿主へと送達される標的遺伝子の発現が減少する可能性があるということである。宿主中で複製することができないことから、または増殖することができないことから、このウイルスベクターは、その後に遺伝子発現を増大させるために使用され得る新たなコピーを全く生成し得えず、ウイルスベクターの再投与が必要である。同じアデノウイルス血清型を宿主に再投与する場合、この宿主は、その特定のアデノウイルス血清型に対する中和抗体を生成する場合があり、血清型に特異的な抗アデノウイルス応答が発生する。そのような血清型に特異的な抗アデノウイルス応答は、ウイルスベクターの効果的な再投与を妨げる場合があり、これにより、ウイルスベクターのワクチンまたは遺伝子送達ビヒクルとして効果が低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、複製不能な組み換えウイルスベクターに関連する、ある特定の不具合を克服するワクチンベクターとして使用され得る新規の組み換えウイルスベクターが当分野で必要とされている。具体的には、ＨＩＶ感染等の感染性疾患に対するワクチンベクターとして使用される新規の組み換えウイルスベクターが必要とされている。そのようなワクチンは好ましくは投与され易く、持続性であり、有害効果は最小であるだろう。ＨＩＶワクチンの場合、好ましくは、ＨＩＶワクチンは更に、最も頻度が高いタイプ等の流行しているタイプのＨＩＶの伝播の広範囲な多様性に対して効果的であるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ヒトアデノウイルス血清型２６または血清型３５のゲノムに由来する組み換えアデノウイルスゲノムを含む複製型組み換えアデノウイルスベクターを提供することにより、この要求を満たす。具体的には、本発明は、例えばＨＩＶ感染に対して、対象中で免疫応答を誘発するためにまたは防御免疫を発生させるために使用され得る複製型組み換えアデノウイルスベクターを提供する。
【００１２】
ある一般的態様では、本発明は、
（ａ）異種核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター、
（ｂ）機能するＥ１コード領域、
（ｃ）Ｅ３コード領域での欠失、および
（ｄ）Ｅ４コード領域での欠失であり、ただし、Ｅ４オープンリーディングフレーム６／７が欠失していない、Ｅ４コード領域での欠失
を有する組み換えアデノウイルスゲノムを含む複製型組み換えアデノウイルスベクターであって、
アデノウイルスゲノムがヒトアデノウイルス血清型２６または３５のゲノムである、複製型組み換えアデノウイルスベクターを提供する。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、異種核酸配列は、複製型組み換えアデノウイルスベクターの左側の逆位末端反復（ＩＴＲ）と、機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置している。
【００１４】
本発明のある実施形態では、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む。異種核酸配列はＨＩＶ抗原をコードすることができ、好ましくはＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物、ｐｏｌ遺伝子産物および／またはｅｎｖ遺伝子産物の配列に由来するＨＩＶ抗原をコードすることができ、より好ましくはモザイクＨＩＶ抗原をコードすることができる。特定の実施形態では、異種核酸配列は、配列番号４８または配列番号５０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。より特定の実施形態では、異種核酸配列は、配列番号４７または配列番号４９のヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
本発明の実施形態では、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、配列番号１４、１５および１６のアミノ酸配列をコードする、機能するＥ１コード領域を含む。特定の実施形態では、機能するＥ１コード領域は配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本発明の一実施形態では、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、部分的に欠失したＥ３コード領域を含み、部分的に欠失したＥ３コード領域は、配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、部分的に欠失したＥ３コード領域は配列番号５のヌクレオチド配列からなる。
【００１７】
本発明の一実施形態では、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、部分的に欠失したＥ４コード領域を含み、部分的に欠失したＥ４コード領域は、配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる。特定の実施形態では、部分的に欠失したＥ４コード領域は配列番号２３のヌクレオチド配列からなる。
【００１８】
本発明の一実施形態では、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、異種核酸配列に作動可能に連結されているＣＭＶプロモーターを含む。特定の実施形態では、ＣＭＶプロモーターは配列番号５１のヌクレオチド配列を有する。
【００１９】
本発明の実施形態によれば、本発明の複製型組み換えアデノウイルスベクターの複製能は、野生型ヒトアデノウイルス血清型２６または血清型３５の複製能と比較して減弱されている。特定の実施形態では、本発明の複製型組み換えアデノウイルスベクターの複製能は、野生型ヒトアデノウイルス血清型２６または３５の複製能と比較して少なくとも約８０倍〜１００倍減弱されている。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号４８または配列番号５０のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター、
（ｂ）配列番号１４、１５および１６のアミノ酸配列をコードする、機能するＥ１コード領域、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ３コード領域、ならびに
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ４コード領域
を有する組み換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含む複製型組み換えアデノウイルスベクターを提供する。
【００２１】
本発明のある実施形態では、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、左側のＩＴＲと、配列番号１４、１５および１６のアミノ酸配列をコードする、機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置している異種核酸配列を含む。
【００２２】
本発明の別の特定の実施形態では、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、
（ａ）配列番号４７または配列番号４９のヌクレオチド配列を含む異種核酸配列に作動可能に連結されている配列番号５１のヌクレオチド配列を有するＣＭＶプロモーター、
（ｂ）配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、機能するＥ１コード領域、
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ３コード領域、および
（ｄ）配列番号２３のヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ４コード領域
を有する組み換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含み、
異種核酸配列は、左側のＩＴＲと、機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置している。
【００２３】
別の一般的態様では、本発明は、本発明のある実施形態に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供し、好ましくは、このベクターは単離されている。一実施形態では、本発明の組成物は、対象への経口投与用に製剤化されている。別の実施形態では、本発明の組成物は腸溶コーティングカプセルである。
【００２４】
更に別の一般的態様では、本発明は、複製型アデノウイルス粒子を産生する方法を提供する。この方法は、本発明のある実施形態に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターを、このベクターの組み換えアデノウイルスゲノムの複製および細胞中でのアデノウイルス粒子のパッケージングに十分な条件下で細胞中に導入すること、ならびにアデノウイルス粒子を回収することを含む。
【００２５】
本発明のその他の一般的態様は、薬学的に許容される担体と、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターとを含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与することを含む、対象中で免疫応答を発生させる方法および感染に対するワクチンを対象に接種する方法に関する。好ましくは、この組成物を対象に経口投与する。
【００２６】
本発明の実施形態によれば、ヒト対象中で免疫応答を発生させる方法またはＨＩＶ感染に対するワクチンをヒト対象に接種する方法は、薬学的に許容される担体と、組み換え血清型２６アデノウイルスゲノムを含む複製型組み換えアデノウイルスベクターとを含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に経口投与することを含む。
【００２７】
ヒト対象中で免疫応答を発生させる方法またはＨＩＶ感染に対するワクチンをヒト対象に接種する方法の一実施形態では、対象に投与される組成物は、
（ａ）配列番号４８または配列番号５０のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター、
（ｂ）配列番号１４、１５および１６のアミノ酸配列をコードする、機能するＥ１コード領域、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ３コード領域、ならびに
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ４コード領域
を有する組み換え血清型２６アデノウイルスゲノムを含む複製型組み換えアデノウイルスベクターを含む。
【００２８】
好ましくは、本発明のある実施形態に係るヒト対象中で免疫応答を発生させる方法またはＨＩＶ感染に対するワクチンをヒト対象に接種する方法では、異種核酸配列は、左側のＩＴＲと、機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置している。
【００２９】
ヒト対象中で免疫応答を発生させる方法またはＨＩＶ感染に対するワクチンをヒト対象に接種する方法の別の実施形態では、対象に投与される組成物は、
（ａ）配列番号４７または配列番号４９のヌクレオチド配列を含む異種核酸配列に作動可能に連結されている配列番号５１のヌクレオチド配列を有するＣＭＶプロモーター、
（ｂ）配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、機能するＥ１コード領域、
（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ３コード領域、および
（ｄ）配列番号２３のヌクレオチド配列からなる、部分的に欠失したＥ４コード領域
を有する組み換え血清型２６アデノウイルスゲノムを含む複製型組み換えアデノウイルスベクターであって、
異種核酸配列が、左側のＩＴＲと、機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置している、複製型組み換えアデノウイルスベクターを含む。
【００３０】
本発明はまた、対象中での免疫応答の発生用のまたは感染に対するワクチンの対象への接種用の本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターにも関する。本明細書に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターのいずれかを、対象中での免疫応答の発生または感染に対するワクチンの対象への接種で使用することができる。好ましくは、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターは、ヒト対象中での免疫応答の発生用である、またはＨＩＶ感染に対するワクチンのヒト対象への接種用である。
【００３１】
上述の概要および下記の本発明の詳細な説明は、添付した図面と共に読む場合により良く理解されるだろう。本発明は図面に示される明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】野生型アデノウイルスゲノム、複製不能な組み換えアデノウイルスベクターのゲノム、本発明のある実施形態に係る、導入遺伝子カセットの後方にＥ１コード領域を含む複製可能な組み換えアデノウイルスベクターのゲノム、およびゲノムまたは本発明の別の実施形態に係る、導入遺伝子カセットの前方にＥ１コード領域を含む複製可能な組み換えアデノウイルスベクターを示す概略図である。
【図２】本発明の実施形態に係る複製型組み換えＡｄ２６ベクターの生成で使用され得るアダプターＡｄ２６プラスミドベクターを構築するためのクローニング戦略を示す概略図であり、このプラスミドベクター（ｐＡｄＡｐｔ２６．Ｅ１ａｔｇ．空、配列番号３）はＡｄ２６ゲノムの一部を含むように設計されており、導入遺伝子カセットの下流に位置するＥ１コード領域を含む。
【図３】本発明の実施形態に係る複製型組み換えＡｄ２６ベクターを生成するためのアダプターＡｄ２６プラスミドベクターおよびコスミドベクターを示す概略図である。（図３Ａ）Ｅ１コード領域（Ｅ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂ  １９Ｋタンパク質およびＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質をコードする）の上流でクローニングされた導入遺伝子カセット中に、モザイクＨＩＶ抗原Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖをコードする異種核酸配列を含むアダプターＡｄ２６プラスミドベクター（ＡｄＡｐｔ２６．２６Ｅ１．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ、配列番号７２）。（図３Ｂ）部分的に欠失したＥ３コード領域（Ｅ３−１２．２Ｋ）と、Ｅ４オープンリーディングフレーム６／７（Ｅ４Ｏｒｆ６／７）を除いて全てのＥ４オープンリーディングフレームが欠失している部分的に欠失したＥ４コード領域と、Ａ２６ゲノムの残りの部分とを含むコスミドベクター（ｐＷｅＡｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．ｄＥ４．２６ＯＲＦ６、配列番号２）。（図３Ａ）に示されるアダプターＡｄ２６プラスミドベクターおよびコスミドベクター（図３Ｂ）は、本発明の実施形態に係る複製型組み換えＡｄ２６ベクターを生成するために、宿主細胞中での相同組み換えを容易にする核酸配列の重複領域（それぞれ「コスミドとの重複」および「アダプターとの重複」と示す）を含む。
【図４】本発明のある実施形態に係る複製型組み換えＡｄ２６ベクターｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖの１回目の精製からのプラークのＰＣＲおよびウェスタンブロット分析からのゲル画像を示す写真である。レーンの上部において、「＋」は陽性コントールを示し、「−」およびＥは陰性コントールを示し、残りのレーンは、試験したプラークの識別番号で標識されており、図４Ａおよび図４Ｂにおいて、「Ｍ」は１ｋｂサイズのマーカー（ＮＥＢ、数字はｋｂでのサイズを示す、０．３ｋｂ、０．５ｋｂ、０．７ｋｂ、１．０ｋｂ、１．５ｋｂ、２．０ｋｂ、２，５ｋｂ、３．０ｋｂ、４．０ｋｂ、５．０ｋｂ、６．０ｋｂ、８．０ｋｂおよび１０．０ｋｂ）を表し、図４Ｃにおいて、「Ｍ」はＭａｇｉｃマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、数字はｋＤでのサイズを示す）を表す。（図４Ａ）プライマーＣＭＶ．ｆｗｄ（Ａｄ２６＿１）（配列番号７３）およびＥ１．ｒｅｖ（Ａｄ２６＿７）（配列番号７４）を使用するＰＣＲによる導入遺伝子領域の完全性の評価（ＰＣＲ産物の予想されるサイズ：３．３ｋｂ）。（図４Ｂ）プライマー  ポリＡ．ｆｗｄ（Ａｄ２６＿８）（配列番号７５）およびＡｄ２６．ｐＩＸ．ｒｅｖ（Ａｄ２６＿９）（配列番号７６）を使用するＥ１コード領域（ＰＣＲ産物の予想されるサイズ：３ｋｂ）の、プライマーＡｄ２６．Ｅ３．ｆｗｄ（Ａｄ２６＿３）（配列番号７７）およびＡｄ２６．Ｅ３．ｒｅｖ（Ａｄ２６＿４）（配列番号７８）を使用するＥ３コード領域（ＰＣＲ産物の予想されるサイズ：０．５ｋｂ）の、ならびにＥ４コード領域（プライマーＡｄ２６．Ｅ４．ｆｗｄ（Ａｄ２６＿５）（配列番号７９）およびＡｄＥ４．ｒｅｖ（Ａｄ２６＿６）（配列番号８０））（ＰＣＲ産物の予想されるサイズ：１．５ｋｂ）の、同一のＰＣＲ。（図４Ｃ）一次抗体抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０（カタログＮｏ．ＮＥＡ−９３０１、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）および二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（カタログＮｏ．１７０−６５１６、Ｂｉｏｒａｄ）を使用するウェスタンブロットによるＭｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ発現（１４０ｋＤａ）の分析。
【図５】本発明の実施形態に係る複製型組み換えＡｄ２６ベクターｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖの２回目の精製からのプラークのＰＣＲおよびウェスタンブロット分析からの画像を示す写真である。レーンの上部において、「＋」は陽性コントールを示し、「−」は陰性コントールを示し、「Ｕ」は非感染Ａ５４９細胞を示し、残りのレーンは、試験したプラークの識別番号で標識されている。「Ｍ」は、図５Ａおよび図５Ｂでは１ｋｂマーカー（ＮＥＢ、数字はｋｂでのサイズを示す）を示し、図５ＣではＭａｇｉｃマーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、数字はｋＤの量を示す）を示す。（図５Ａ）Ｅ１コード領域（プライマー  ポリＡ．ｆｗｄ（Ａｄ２６＿８）（配列番号７５）およびＡｄ２６．ｐＩＸ．ｒｅｖ（Ａｄ２６＿９）（配列番号７６））、Ｅ３コード領域（プライマーＡｄ２６．Ｅ３．ｆｗｄ（Ａｄ２６＿３）（配列番号７７）およびＡｄ２５．Ｅ３．ｒｅｖ（Ａｄ２６＿４）（配列番号７８）ならびにＥ４コード領域（プライマーＡｄ２６．Ｅ４．ｆｗｄ（Ａｄ２６＿５）（配列番号７９）およびＡｄ２６．Ｅ４．ｒｅｖ（Ａｄ２６＿６）（配列番号８０）のＰＣＲ分析。（図５Ｂ）プライマーＣＭＶ．ｆｗｄ（Ａｄ２６＿１）（配列番号７３）およびＡｄ２６＿１０（配列番号８１）を使用する、導入遺伝子領域の完全性に関するＰＣＲ分析。（図５Ｃ）一次抗体抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０（カタログＮｏ．ＮＥＡ−９３０１、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）および二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（カタログＮｏ．１７０−６５１６、Ｂｉｏｒａｄ）を使用する、モザイクＨＩＶ抗原（Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ）のタンパク質発現に関するウェスタンブロット分析。
【図６】様々な細胞株における、（ｉ）Ｅ３コード領域での欠失および導入遺伝子の欠如（ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．空）、（ｉｉ）Ｅ３コード領域およびＥ４コード領域での欠失ならびに導入遺伝子の欠如（ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．空）、（ｉｉｉ）Ｅ３コード領域での欠失および導入遺伝子の含有（ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ）、（ｉｖ）Ｅ３コード領域およびＥ４コード領域での欠失ならびに導入遺伝子の含有（ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ）、ならびに（ｖ）野生型Ａｄ２６（Ａｄ２６．ＷＴ）のいずれかを含む、本発明の実施形態に係る複製型組み換えＡｄ２６ベクターの細胞変性効果（ＣＰＥ）の割合として報告するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製および感染力を比較するグラフであり、複製および感染力を、複製不能な組み換えＡｄ２６ベクターである非ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．空（Ｅ１コード領域での欠失、Ｅ３コード領域での欠失、導入遺伝子無し）および非ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ（Ｅ１コード領域での欠失、Ｅ３コード領域での欠失、導入遺伝子の含有）とも比較した。（図６Ａ）Ａ５４９細胞（ヒト、非補完型（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ））におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力。（図６Ｂ）ＨｕＴｕ８０細胞（ヒト、非補完型）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力。（図６Ｃ）ＰＥＲ．５５Ｋ細胞（ヒト、補完型）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力。
【図７】ヒト細胞株およびアカゲザル細胞株における、本発明の実施形態に係る複製型組み換えＡｄ２６ベクターの細胞変性効果（ＣＰＥ）の割合として報告するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製および感染力を比較するグラフである。（図７Ａ）Ａｄ２６．ＷＴ，ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．空および複製不能なベクター非ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．空のＡ５４９細胞（ヒト、非補完型）およびＰＥＲ．５５Ｋ（ヒト、補完型）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力。（図７Ｂ）Ａｄ２６．ＷＴ、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．空、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ、およびアカゲザルに由来する複製可能なサルＡｄベクター（ｒｃＳＡｄ．ＳＩＶｇａｇ）のアカゲザル腎細胞（ＭＫ−２細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力。複製可能なサルＡｄベクターｒｃＳＡｄＳＩＶｇａｇをアスタリスク（＊）で標識する。
【図８】細胞培養物中での２代継代後のヒト細胞株における、本発明の実施形態に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターの細胞変性効果（ＣＰＥ）の割合として報告するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製および感染力を示すグラフである。（図８Ａ）１回目の再感染後および２回目の再感染後のＡ５４９（ヒト、非補完型）細胞におけるＡｄ２６．ＷＴ、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．空、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．空、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．Ｍｏｓ１ＥｎｖおよびｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力。（図８Ｂ）１回目の再感染後のおよび２回目の再感染後のＨｕＴｕ８０（ヒト、非補完型）細胞におけるＡｄ２６．ＷＴ、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．空、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．空、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．Ｍｏｓ１ＥｎｖおよびｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力。（図８Ｃ）１０００のＭＯＩで各ベクターに感染させた培養物から完全なＣＰＥで回収されたＡｄ２６．ＷＴ、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．空およびｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖの溶解物に関するウイルス価の比較。Ａ５４９細胞およびＰＥＲ．５５Ｋ細胞の両方でプラークアッセイを実施することにより、感染したＡ５４９細胞またはＨｕＴｕ８０細胞のいずれかからの溶解物を比較した。
【図９】複製型組み換えＡｄ２６ベクターｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１ＥｎｖおよびインフルエンザＨ５を発現するＡｄ４ベースのベクター（ｒｃＡｄ４．Ｈ５）（フェーズ１の臨床試験において安全であり免疫原性であると既に証明されている）の細胞変性効果（ＣＰＥ）の割合として報告するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製および感染力を比較するグラフであり、複製および感染力を、野生型Ａｄ２６（Ａｄ２６．ＷＴ）ベクターおよび野生型Ａｄ４（Ａｄ４．ＷＴ）ベクターとも比較した。複製型組み換えＡｄ２６ベクターｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖを矢印で示す。（図９Ａ）Ａ５４９細胞（ヒト、非補完型）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力、（図９Ｂ）ＨｕＴｕ８０細胞（ヒト、非補完型）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力、および（図９Ｃ）ＰＥＲ．５５Ｋ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力。
【図１０】Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける本発明の実施形態に係る各複製型組み換えｒｃＡｄ２６ベクター（ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１ＥＮＶ、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ２ＥＮＶ、ｒｃＡｄ２６Ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌ、ｒｃＡｄ２６Ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ）の免疫原性を評価するために使用したＩＦＮ・−ＥＬＩＳＰＯＴの結果を示すグラフであり、結果を、１０６個の脾細胞当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告する。
【図１１】Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける、凍結乾燥させたｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖベクター（１０８個または１０９個のウイルス粒子を注射した）の免疫原性ならびにＨＩＶクレードＣエンベロープタンパク質およびモザイクエンベロープタンパク質に対する結合抗体力価を示すグラフである。（図１１Ａ）Ｍｏｓ１ＥＮペプチドプールおよびＨＩＶ  ＰＴＥ  Ｅｎｖペプチドプールを使用するＩＦＮ・−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定したマウス免疫原性。（図１１Ｂ）ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖベクターの投与前および免疫付与から２８日後にＥＬＩＳＡにより測定した、ＨＩＶ−１クレードＣエンベロープおよびモザイクＥｎｖに対する結合抗体力価。
【図１２】複製不能な組み換えＡｄ２６ベクター（Ａｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ）（Ｅ１コード領域中の欠失により複製不能にした）または本発明に係る複製可能な組み換えＡｄ２６ベクター（ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ）のどちらか（両方のベクターともモザイクＨＩＶ抗原Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖをコードする核酸配列を含む）による筋肉内（ＩＭ）免疫付与または鼻腔内（ＩＮ）免疫付与から０日後、７日後、１４日後、２１日後および２８日後に採取したマウスの血清、口腔スワブおよび直腸スワブに対して実施したＲＴ−ＰＣＲからの結果を示す表であり、結果をコピー／ｍＬで報告し、コントロールサンプルに５．０４×１０６コピー／ｍＬのプラスミドＤＮＡを添加し、「＊＊」はサンプルを採取しなかったことを示す。
【図１３】ＥＬＩＳＡにより測定した、複製不能な組み換えＡｄ２６ベクター（Ａｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ）および複製可能な組み換えＡｄ２６ベクター（ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ）によるＩＭ免疫付与後のまたはＩＮ免疫付与後のマウスの血清における結合抗体力価を示すグラフである。（図１３Ａ）ＨＩＶ−１クレードＣエンベロープタンパク質に対する結合抗体力価。（図１３Ｂ）モザイクＥｎｖタンパク質に対する結合抗体力価。
【図１４】ＩＦＮ・−ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した、筋肉内（ＩＭ）投与したまたは鼻腔内（ＩＮ）投与した複製不能な組み換えＡｄ２６ベクター（Ａｄ２６．Ｍｏｓ１ＥＮＶ）または本発明に係る複製可能な組み換えＡｄ２６ベクター（ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１ＥＮＶ）のどちらかによる免疫付与から４週後のＢａｌｂ／Ｃマウスにおけるペプチドプールに対する応答を示すグラフであり、試験した各レジメンに関して、ペプチドプールは左側から右側へＭｏｓ１  Ｅｎｖ、Ｍｏｓ２  Ｅｎｖ、ＰＴＥ  Ｅｎｖ１、ＰＴＥ  Ｅｎｖ２およびＰＴＥ  Ｅｎｖ  ３である。
【図１５】非ヒト霊長類（インド起源のアカゲザルであるマカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  Ｍｕｌａｔｔａ））における複製可能なＡｄ２６−ＳＩＶＧａｇ（Ｅ１コード領域を含む、「Ｅ１（＋）」）ベクターおよび複製不能なＡｄ２６−ＳＩＶＧａｇ（Ｅ１コード領域が欠如している、「Ｅ１（−）」）ベクターの免疫原性および複製を示す図である。（図１５Ａ）１０６個の末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告する、免疫応答を測定するためのＩＦＮ・−ＥＬＩＳＰＯＴの結果。試験した各ベクターに関して、０週、２週、２４週、２６週および３２週に関するデータを左側から右側にそれぞれ示す。（図１５Ｂ）ウイルス複製を評価するためのＲＴ−ＰＣＲ結果。複製不能なＡｄ２６．ＳＩＶｇａｇベクターを投与したサル４１５−０８、４２１−０８および４５１−０８、ならびに複製可能なＡｄ２６．ＳＩＶｇａｇベクターを投与したサル４２７−０８、４２９−０８および４３２−０８。ＲＴ−ＰＣＲ結果をコピー／ｍＬとして報告し、コントロールサンプルに５．０４×１０６コピー／ｍＬのプラスミドＤＮＡを添加する。
【図１６】Ｅ１コード領域の前方およびＥ１コード領域の後方に導入遺伝子カセットを含む本発明の実施形態に係る複製型組み換えＡｄ３５ベクターの生成に使用され得る組み換えＡｄ３５アダプタープラミドベクターの構築に使用されるクローニング戦略を示す概略図である。（図１６Ａ）導入遺伝子カセットの下流に位置するＥ１コード領域を含む複製型組み換えＡｄ３５ベクターｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．空（Ａｄ３５ゲノムの一部を含むように設計されている）のクローニング。（図１６Ｂ）導入遺伝子カセットの上流に位置するＥ１コード領域を含む複製型組み換えＡｄ３５ベクターｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．空（配列番号２６）（Ａｄ３５ゲノムの一部を含むように設計されている）のクローニング。
【図１７】導入遺伝子領域のＰＣＲ分析により組み換えアデノウイルスベクターの安定性を評価するアガロースゲル画像を示す写真であり、ＰＣＲによりスクリーニングしたベクターとして、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．Ｍｏｓ１ＨＩＶＥｎｖ（「ｄＥ３」、Ｅ３コード領域での欠失を含む）、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１ＨＩＶＥｎｖ（Ｅ３コード領域およびＥ４コード領域の両方での欠失を含む「ｄＥ３．ｄＥ４」）、ならびに陽性コントロールとしてのＡｄＡｐｔ２６．Ｅ１Ｍｏｓ１ＨＩＶｅｎｖ（ｐＡｄＡｐｔ２６の導入遺伝子カセット中にクローニングしたＭｏｓ１ＨＩＶＥｎｖに関するコード配列を有する「＋」Ａｄ２６アダプタープラスミド−図２を参照されたい）が挙げられ、生成後のウイルスの５代継代（１、２、３、４および５と標識する）を、プライマーＣＭＶ．ｆｗｄ（Ａｄ２６＿１）（配列番号７３）およびＥ１．ｒｅｖ（Ａｄ２６＿７）（配列番号７４）を使用するＰＣＲでスクリーニングし、予想されるＰＣＲ産物のサイズは３．３ｋｂであった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
背景技術においておよび本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文および特許が引用されており、または記載されており、これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書に含まれている文献、行為、材料、装置、物品等の議論は、本発明に関する文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容のいずれかまたは全てが、開示されているまたは特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを承認するものではない。
【００３４】
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用する、ある特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。本明細書で引用されている全ての特許、公開されている特許出願および公報は、まるで本明細書に完全に記載されているかのように参照により援用される。本明細書で使用する場合および添付した特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に規定しない限り複数の言及を含むことに留意しなければならない。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の実施形態に係る組成物または複製型組み換えアデノウイルスベクターが投与され得るまたは投与されるあらゆる動物を意味しており、好ましくは哺乳動物を意味しており、最も好ましくはヒトを意味する。用語「哺乳動物」は本明細書で使用する場合、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例として、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ネズミ、ウサギ、モルモット、サル、ヒト等が挙げられるがこれらに限定されず、より好ましくはヒトが挙げられるがこれに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「Ａｄ」と略される用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス科のウイルスを意味する。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡを含む中程度のサイズ（９０〜１００ｎｍ）の非エンベロープ正二十面体ウイルスである。用語「アデノウイルス科」は、アタデノウイルス（Ａｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属、アビアデノウイルス（Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属、イクタデノウイルス（Ｉｃｈｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属、マストアデノウイルス（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属およびシアデノウイルス（Ｓｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）属のアデノウイルスをまとめて意味する。「アデノウイルス」として、ヒトアデノウイルス種、ウシアデノウイルス種、ヒツジアデノウイルス種、ウマアデノウイルス種、イヌアデノウイルス種、ブタアデノウイルス種、ネズミアデノウイルス種およびサルアデノウイルス種が挙げられるがこれらに限定されない。ヒトアデノウイルス（即ち、ヒトに感染することができるアデノウイルス）を、Ａ〜Ｇの亜属または種に分類することができる。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「ヒトアデノウイルス」は、亜属Ａ〜Ｇおよびこれらの個々の血清型の全てのヒトアデノウイルスをまとめて意味する。
【００３８】
用語「アデノウイルス血清型」は、少なくとも１種の血清型特異的エピトープの発現により定義されるおよび同定されるウイルス属の個々のメンバーを意味する。現在、ヒト感染を引き起こす可能性がある６０種を超える既知の免疫学的に異なる種類のアデノウイルスが存在しており、これらのアデノウイルスとして、ヒトアデノウイルス血清型１、２、３、４、４ａ、５、６、７、７ａ、７ｄ、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｐ、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４ａ、３５、３５ｐ、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８および５１が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
好ましくは、本発明に従って使用されるアデノウイルスは、配列番号１の野生型ゲノムを有するアデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）または配列番号２７の野生型ゲノムを有するアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）に由来する。アデノウイルス２６は亜群Ｄの一員であり、アデノウイルス３５は亜群Ｂの一員である。
【００４０】
アデノウイルスゲノムの様々な領域がマッピングされており、当業者に理解されている（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６７  ａｎｄ  ６８，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｆｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照されたい）。様々なアデノウイルス血清型のゲノム配列およびアデノウイルスゲノムの特定のコード領域のヌクレオチド配列が当分野で既知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋおよびＮＣＢＩからアクセス可能である。一般に、アデノウイルスゲノムは複製に必須の遺伝子（この遺伝子の機能が複製に必要である）を含み、例えばアデノウイルスの初期領域（例えばＥ１領域、Ｅ２領域およびＥ４領域）ならびに後期領域（例えばＬ１〜Ｌ５領域）によりコードされる。アデノウイルスゲノムはまた、ウイルスのパッケージングに関与する遺伝子（例えばＩｖａ２遺伝子）ならびにウイルス関連ＲＮＡ（例えばＶＡ−ＲＮＡ１および／またはＶＲ−ＲＮＡ−２）も含む。
【００４１】
用語「逆位末端反復配列」または「ＩＴＲ」は、アデノウイルスに関する用語の一般的用法を意味しており、全てのＩＴＲ配列および機能的に等価であるこれらの変形を含む。ＩＴＲは、５’末端上で直鎖のアデノウイルスゲノムに隣接する配列（モチーフ）（「左側のＩＴＲ」または「ｌＩＴＲ」）と３’末端上で直鎖のアデノウイルスゲノムに隣接する配列（モチーフ）（「右側のＩＴＲ」または「ｒＩＴＲ］）とのセットであり、アデノウイルスゲノムの複製に必要である。異なる血清型のアデノウイルス間のＩＴＲ配列内には、高度な配列保存が存在する。本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターは、任意の既知のアデノウイルスＩＴＲ配列を含むことができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「初期遺伝子１コード領域」または「Ｅ１コード領域」は、感染後に最初に転写される、およびウイルスゲノムの複製にとって重要であることが分かっている３種のヒトアデノウイルスＥ１タンパク質（即ち、Ｅ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質）をコードする、ヒトアデノウイルスゲノム中の完全長の核酸配列を意味する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「初期遺伝子３コード領域」または「Ｅ３コード領域」は、７種のヒトアデノウイルスＥ３タンパク質（即ち、Ｅ３  １３．２Ｋ、Ｅ３  ＣＲ１−アルファ、Ｅ３  １９Ｋ、Ｅ３  ＣＲ１−ベータ、Ｅ３  ＣＲ１−ガンマ、Ｅ３  ＲＩＤ−ベータおよびＥ３  １４．７Ｋ）をコードする、ヒトアデノウイルスゲノム中の完全長の核酸配列を意味する。ほとんどのＥ３タンパク質は免疫調節機能を有する。ヒトアデノウイルスＥ３コード領域は、組織培養におけるウイルス複製に必須ではない。しかしながら、いくつかのＥ３タンパク質は宿主免疫防御の回避に関与する場合があり、Ｅ３コード領域の一部または全ての欠失により、動物モデルにおいてより強力な炎症誘発性応答が誘発され得る（Ｓｐａｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２４３１−２４３９）。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「初期遺伝子４コード領域」または「Ｅ４コード領域」は、少なくとも５種のヒトアデノウイルスＥ４タンパク質（即ち、Ｅ４  ｏｒｆ１、Ｅ４  ｏｒｆ２、Ｅ４  ｏｒｆ３、Ｅ４  ｏｒｆ４およびＥ４  ｏｒｆ６／７）をコードするヒトアデノウイルスゲノム中の完全長の核酸配列を意味する。Ｅ４コード領域が欠如しているアデノウイルスベクターは、全ての環境下での導入遺伝子発現の送達および長期保持において有効ではない場合がある（Ｌｅｐｐａｒｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９７），７８，２１３１−２１３８．）。
【００４５】
用語「欠失している」および「欠失」は、アデノウイルスゲノムのＥ３コード領域またはＥ４コード領域等のコード領域の核酸配列に関して本明細書で使用する場合、完全長の野生型ヌクレオチド配列から少なくとも１個のヌクレオチドが省略されていることを意味する。欠失は、約１個、１０個、５０個、１００個、２００個または更に５００個のヌクレオチドよりも大きい可能性がある。アデノウイルスゲノムの関連するコード領域（ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）での欠失は、コード領域の約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９９％または更に大きい可能性がある。あるいは、全コード領域が欠失する可能性があり、このことは、関連するコード領域の全てのヌクレオチドが省略されていることを意味する。「部分的（ｐａｒｔｉａｌｌｙ）に欠失している」または「部分的（ｐａｒｔｌｙ）に欠失している」コード領域は、全コード領域よりも短いコード領域の一部のヌクレオチドが省略されていることを意味する。
【００４６】
本明細書で使用する場合、核酸配列、アミノ酸配列および抗原の文脈における用語「異種」は、外来性であるおよび個々のアデノウイルスと関連して天然では見出されない核酸配列、アミノ酸配列および抗原を意味する。「異種核酸配列」はあらゆる導入遺伝子であることができる。本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」は、天然（細胞）または合成（例えばベクター中で遺伝的に操作されている、即ち組み換えＤＮＡ）のどちからである、一方の供給源から単離されて別の供給源に移されるあらゆる遺伝子または遺伝物質を広く意味する。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「導入遺伝子カセット」は、核酸ベクターにおいてプロモーターおよび多重クローニング部位を含む領域を意味する。この導入遺伝子カセットは、異種核酸配列を多重クローニング部位にクローニングしてプロモーター領域の制御下に置くことができるように設計されている。導入遺伝子カセットは、導入遺伝子または異種核酸配列を含む必要は必ずしもなく、導入遺伝子または異種核酸配列が欠如していることを意味する「空」であることができる。当業者は、導入遺伝子カセットが追加の遺伝子調節因子（例えば転写終結シグナル等）を含むことができることを認識するだろう。
【００４８】
用語「組み換えアデノウイルス」は、従来の組み換えＤＮＡ技法によってゲノムが改変されているアデノウイルスを意味する。本明細書で使用する場合、用語「組み換えアデノウイルスベクター」は、アデノウイルスゲノムに由来するヌクレオチド配列と任意選択的な１種または複数種の異種核酸配列とを含むベクター構築物を意味する。本発明の実施形態によれば、組み換えアデノウイルスベクターは、この組み換えアデノウイルスベクターが複製可能ではあるが、対応する野生型アデノウイルスの複製効率と比較して複製効率が減弱されるように改変されているアデノウイルスヌクレオチド配列を含む。この実施形態に従って、アデノウイルスゲノム中において１種または複数種の変異を導入することにより、例えばアデノウイルスタンパク質の１箇所または複数箇所のコード領域中において欠失を導入することにより、変異したアデノウイルスゲノムを含むように組み換えアデノウイルスベクターを操作することができる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「複製型組み換えアデノウイルスベクター」および「複製可能な組み換えアデノウイルスベクター」は、非補完型細胞への導入時に複製することができるまたは増殖することができる組み換えアデノウイルスベクターを意味する。本発明の特定の一実施形態では、「複製型組み換えアデノウイルスベクター」または「複製可能な組み換えアデノウイルスベクター」は、非補完型ヒト細胞への導入時に複製することができるまたは増殖することができる。用語「複製する」および「増殖する」は互換的に使用され、アデノウイルスベクターの複製する能力または増殖する能力を意味する。これらの用語は当分野で十分に理解されている。ウイルスベクターの増殖または複製を、当分野で標準的なおよび本明細書で説明されているアッセイ（例えばバーストアッセイまたはプラークアッセイ）を使用して測定することができる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「複製能」は、組み換えアデノウイルスベクターの非補完型細胞中で複製するまたは増殖する相対能力を意味する。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「非補完型細胞」は、ｉｎ  ｔｒａｎｓで特定の遺伝子要素（例えば遺伝子産物、タンパク質等）を供給しない細胞を意味する。機能するウイルス遺伝子産物の内の１種または複数種がベクターによって発現され得ないように、特定のウイルス遺伝子産物のコード領域がベクター上で完全にまたは部分的に欠失した組み換えアデノウイルスベクターに言及する場合、非補完型宿主細胞は、欠失している、機能する遺伝子産物をｉｎ  ｔｒａｎｓで供給しない細胞を特に意味する。例えば、組み換えアデノウイルスベクターを産生するためにアデノウイルスゲノムのＥ１遺伝子が欠失している場合、機能するＥ１遺伝子をｉｎ  ｔｒａｎｓで供給しない細胞は非補完型宿主細胞と見なされることになる。本発明の実施形態によれば、非補完型細胞はヒト細胞である。非補完型ヒト細胞の例として、ＨｕＴｕ８０細胞（十二指腸癌、ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−４０）およびＡ５４９細胞（肺がん、ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−１８５）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「複製欠損」「複製不能な」および「非複製型」は、組み換えアデノウイルスベクター関して使用される場合に、非補完型細胞中でのゲノム含有カプシドの複製および形成に必要な特定の遺伝情報が欠如している組み換えアデノウイルスゲノムを含む組み換えベクターを意味するように完全に意図されている。複製に必要なウイルス遺伝子要素の欠損が別の供給源（例えば補完宿主細胞）により供給される場合を除いて、複製欠損の、複製不能なおよび非複製型の組み換えベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのどちらかの生理的条件下において複製することができない。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結されている」は最も広く合理的な文脈で解釈すべきであり、機能的関係でのポリヌクレオチド要素の連結を意味する。核酸配列は、この核酸配列が別の核酸配列との機能的関係に置かれている場合に「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーターは、このプロモーターがコード配列の転写に影響を及ぼす場合に、このコード配列に作動可能に連結されている。
【００５４】
用語「プロモーター」は、この従来の意味で使用され、作動可能に連結されているヌクレオチド配列の転写を開始するヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは、転写するヌクレオチド配列付近で同じ鎖上に位置する。プロモーターは、天然に存在してもよいし合成でもよい。用いるベクターがウイルスベクターである場合、プロモーターは、ウイルスに対して内因性であることができる、またはその他の供給源に由来することができる。
【００５５】
用語「減弱化されている」および「減弱化」は、対応する野生型アデノウイルスと比較して組み換えアデノウイルスベクターの病原性および複製能が低下していることを意味する。一実施形態では、減弱化は、哺乳動物（例えばヒト）細胞中での複製を予防することを意味する。別の実施形態では、減弱化は、ウイルスの複製能を低下することを意味するが、この複製能を除去することは意味せず、その結果、ウイルスは、哺乳動物細胞中で複製することがきるが、対応する野生型ウイルスと比較して程度が低い。更に別の実施形態では、減弱化は、疾患（例えばウイルス感染）を引き起こすことができないことを意味する、または疾患を引き起こすが野生型ウイルスと比べて程度が低いことを意味する。減弱化を、当分野で既知の様々な方法を使用して達成することができる。例えば、哺乳動物中での、卵中でのまたは組織培養物中でのウイルスの連続継代により、病原性および複製能の低下をもたらす可能性がある様々な変異が獲得される可能性がある。減弱化を、ウイルスのゲノムからの核酸配列の完全なまたは部分的な欠失により達成することもでき、例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１コード領域、Ｅ３コード領域またはＥ４コード領域の完全なまたな部分的な欠失により達成することもできる。ウイルスの減弱化を当分野で既知の任意の方法により測定することができ、例えば、細胞に感染するのに必要なウイルス価、ＲＴ−ＰＣＲ、または最大の細胞変性効果（ＣＰＥ）を達成するのに必要な時間により測定することができる。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「感染」は、疾患原因因子（ｄｉｓｅａｓｅ  ｃａｕｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の宿主への侵入を意味する。疾患原因因子は、宿主への侵入およびこの宿主内での複製または増殖が可能である場合に「感染性」であると見なされる。感染因子の例として、ウイルス（例えばＨＩＶ）およびある特定の種のアデノウイルス、プリオン、細菌、真菌、原生動物等が挙げられる。
【００５７】
ある一般的態様では、本発明は、組み換えアデノウイルスゲノムを含む複製型組み換えアデノウイルスベクターを提供する。本発明の実施形態によれば、複製型組み換えアデノウイルスベクターは複製可能であり、このことは、複製型組み換えアデノウイルスベクターが非補完型ヒト細胞中で複製することができることを意味する。このことは、ワクチンに使用されている多くのその他の既知の組み換えアデノウイルスベクターとは対照的であり、このその他の既知の組み換えアデノウイルスベクターは典型的には複製不能であり、そのため、非補完型ヒト細胞中で複製することができない、または増殖することができない。
【００５８】
非補完型細胞中における本発明の実施形態に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターの複製能は、他の点では同一の野生型アデノウイルスの複製能と比較して減弱されている、または低下している。本発明の実施形態によれば、野生型アデノウイルスに対する複製型組み換えアデノウイルスベクターの複製能の減弱は、対応する野生型アデノウイルスの複製能と比べて２倍〜１００倍低い可能性がある。例えば、この組み換えアデノウイルスベクターの複製能を、この複製型組み換えアデノウイルスベクターが由来する野生型アデノウイルスの複製能と比べて２倍、５倍、１０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍または１０００倍低下させることができる。好ましくは、この組み換えアデノウイルスベクターの複製能は、この複製型組み換えアデノウイルスベクターが由来する野生型アデノウイルスの複製能と比べて約５０倍低く、より好ましくは約８０倍〜約１００倍低い。
【００５９】
本発明の実施形態によれば、複製型組み換えアデノウイルスベクターは組み換えアデノウイルスゲノムを含む。この組み換えアデノウイルスベクターは、（ａ）異種核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター、（ｂ）機能するＥ１コード領域、（ｃ）Ｅ３コード領域での欠失、および（ｄ）Ｅ４コード領域での欠失であって、ただし、Ｅ４オープンリーディングフレーム６／７が欠失していない、Ｅ４コード領域での欠失を含む。例えば図１を参照されたい。この図１は、野生型アデノウイルスゲノムおよびＥ１コード領域が欠如している非複製型組み換えアデノウイルスベクターと比較して本発明のある実施形態に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターを示す概略図である。この組み換えアデノウイルスゲノムにおいて、Ｅ３コード領域およびＥ４コード領域を欠失し、または部分的に欠失し、機能するＥ１コード領域を保持することにより、このベクターの複製能が野生型と比較して減弱されたが、この組み換えアデノウイルスベクターは依然として複製可能であった。例えば図６を参照されたい。
【００６０】
本発明の実施形態によれば、組み換えアデノウイルスゲノムは、ヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムまたはヒトアデノウイルス血清型３５のゲノムに由来し、好ましくはヒトアデノウイルス血清型２６に由来する。
【００６１】
本発明の一実施形態では、配列番号１のヌクレオチド配列を有するゲノム等の野生型ヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムは、Ｅ１コード領域（配列番号１３）、Ｅ３コード領域（配列番号４）およびＥ４コード領域（配列番号１７）を特に含む。Ｅ１コード領域は３種のタンパク質、即ちＥ１Ａタンパク質（配列番号１４）、Ｅ１Ｂ  １９Ｋタンパク質（配列番号１５）およびＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質（配列番号１６）をコードする。Ｅ３コード領域は７種のタンパク質、即ちＥ３  １３．２Ｋ（配列番号６）、Ｅ３  ＣＲ１−アルファ（配列番号７）、Ｅ３  １９Ｋ（配列番号８）、Ｅ３  ＣＲ１−ベータ（配列番号９）、Ｅ３  ＣＲ１−ガンマ（配列番号１０）、Ｅ３  ＲＩＤ−ベータ（配列番号１１）およびＥ３  １４．７Ｋ（配列番号１２）をコードする。Ｅ４コード領域は５種のタンパク質、即ちＥ４  ＯＲＦ１（配列番号１８）、Ｅ４  ＯＲＦ２（配列番号１９）、Ｅ４  ＯＲＦ３（配列番号２０）、Ｅ４  ＯＲＦ４（配列番号２１）およびＥ４  ＯＲＦ６／７（配列番号２２）をコードする。
【００６２】
同様に、本発明の別の実施形態では、配列番号２４のヌクレオチド配列を有するゲノム等の野生型ヒドアデノウイルス血清型３５のゲノムは、Ｅ１コード領域（配列番号３６）、Ｅ３コード領域（配列番号２７）およびＥ４コード領域（配列番号４０）を特に含む。Ｅ１コード領域は３種のタンパク質、即ちＥ１Ａタンパク質（配列番号３７）、Ｅ１Ｂ  １９Ｋタンパク質（配列番号３８）およびＥ１Ｂ  ５５Ｋタンパク質（配列番号３９）をコードする。Ｅ３コード領域は７種のタンパク質、即ちＥ３  １３．２Ｋ（配列番号２９）、Ｅ３  ＣＲ１−アルファ（配列番号３０）、Ｅ３  １９Ｋ（配列番号３１）、Ｅ３  ＣＲ１−ベータ（配列番号３２）、Ｅ３  ＣＲ１−ガンマ（配列番号３３）、Ｅ３  ＲＩＤ−ベータ（配列番号３４）およびＥ３  １４．７Ｋ（配列番号３５）をコードする。Ｅ４コード領域は５種のタンパク質、即ちＥ４  ＯＲＦ１（配列番号４２）、Ｅ４  ＯＲＦ２（配列番号４３）、Ｅ４  ＯＲＦ３（配列番号４４）、Ｅ４  ＯＲＦ４（配列番号４５）およびＥ４  ＯＲＦ６／７（配列番号４６）をコードする。
【００６３】
Ａｄ２６ゲノムまたはＡｄ３５ゲノムからのＥ１コード領域の欠失により組み換えアデノウイルスゲノムは複製不能になり、このことは、このウイルスが非補完型細胞中で複製することができないことを意味する。そのため、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターは、機能するＥ１コード領域を含む。
【００６４】
用語「機能するＥ１コード領域」は、ウイルス複製に十分な活性型のＥ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードする、アデノウイルスベクター上の核酸配列を包含することを意味する。本発明の実施形態によれば、組み換えアデノウイルスベクターを、機能するＥ１コード領域が、この組み換えウイルスベクター内において野生型アデノウイルスゲノム中のＥ１コード領域の位置とは異なる位置に転移されるように操作することができる。
【００６５】
本発明の一実施形態では、「機能するＥ１コード領域」は、活性型のＥ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質をコードし、これらはそれぞれ、野生型ヒトアデノウイルスのＥ１Ａタンパク質、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質それぞれと実質的に同一の活性を有する。
【００６６】
本発明の一実施形態では、Ａｄ２６複製型組み換えアデノウイルスベクターの機能するＥ１コード領域は、Ａｄ２６  Ｅ１Ａタンパク質（配列番号１４）、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質（配列番号１５）およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質（配列番号１６）をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の特定の実施形態では、Ａｄ２６複製型組み換えアデノウイルスベクターの機能するＥ１コード領域は配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
本発明の別の特定の実施形態では、Ａｄ３５複製型組み換えアデノウイルスベクターの機能するＥ１コード領域は、Ａｄ３５  Ｅ１Ａタンパク質（配列番号３７）、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質（配列番号３８）およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質（配列番号３９）をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の特定の実施形態では、Ａｄ３５複製型組み換えアデノウイルスベクターの機能するＥ１コード領域は、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、左側のＩＴＲと、機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置する異種核酸配列を含む。核酸配列のリンカー領域により、異種核酸配列と左側のＩＴＲまたはＥ１コード領域の５’末端とを任意選択的に分離させることができる。驚いたことに、本発明者らは、機能するＥ１コード領域を異種核酸の前方ではなく後方に置くことにより、ベクターの安定性および異種核酸配列の発現の両方が増加することを発見し、この増加は予期せぬ結果であった。
【００６９】
本発明の実施形態によれば、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、Ｅ３コード領域での欠失を含む。Ｅ３コード領域での欠失は例えば、複製型組み換えアデノウイルスベクターが、部分的に欠失したＥ３コード領域を含むように部分的欠失であることができる。
【００７０】
特定の実施形態によれば、部分的に欠失したＥ３コード領域において、Ｅ３  １２．５Ｋタンパク質産物をコードする核酸配列を除くＥ３コード領域の全核酸配列が欠失している。組み換えアデノウイルスベクターが組み換えＡｄ２６ゲノムを含む場合、部分的に欠失したＥ３コード領域は、一実施形態では配列番号６のアミノ酸配列をコードし、特定の実施形態では配列番号５のヌクレオチド配列からなる。組み換えアデノウイルスベクターが組み換えＡｄ３５ゲノムを含む場合、部分的に欠失したＥ３コード領域は、一実施形態では配列番号２９のアミノ酸配列をコードし、特定の実施形態では配列番号２８のヌクレオチド配列からなる。
【００７１】
本発明のある特定の実施形態では、組み換えアデノウイルスベクターのＥ３コード領域を完全に欠失させることができる。本発明の実施形態によれば、Ｅ３コード領域が完全に欠失している組み換えアデノウイルスベクターは複製可能であり、即ち非補完型細胞中で複製することができる。
【００７２】
本発明の実施形態によれば、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、Ｅ４オープンリーディングフレーム６／７を除くＥ４コード領域での欠失を含む。特定の実施形態によれば、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、オープンリーディングフレーム６／７を除いて全てのＥ４オープンリーディングフレームが欠失している、部分的に欠失したＥ４コード領域を含む。そのため、特定の実施形態では、組み換えアデノウイルスベクターが組み換えＡｄ２６ゲノムを含む場合、部分的に欠失したＥ４コード領域は配列番号２２のアミノ酸配列をコードし、配列番号２３のヌクレオチド配列からなる。別の特定の実施形態では、組み換えアデノウイルスベクターが組み換えＡｄ３５ゲノムを含む場合、部分的に欠失したＥ４コード領域は配列番号４１のアミノ酸をコードし、配列番号４６のヌクレオチド配列からなる。
【００７３】
驚いたことに、本発明者らは、Ｅ３コード領域の少なくとも部分的な欠失に加えて、Ｅ４コード領域の部分的欠失により、Ｅ３コード領域が欠失しておりＥ４コード領域が部分的に欠失していない組み換え複製型アデノウイルスベクターと比較して安定性が増加した組み換え複製型アデノウイルスベクターが生成されることを発見した。例えば図１７を参照されたい。図１７の実験では、組み換えアデノウイルスベクターの導入遺伝子の安定性を、ウイルスの５代継代後の導入遺伝子のＰＣＲにより確認した。Ｅ３コード領域およびＥ４コード領域の両方が部分的に欠失した組み換え複製型アデノウイルスベクターは、導入遺伝子領域のＰＣＲ分析で確認した場合にウイルス生成後の５代継代全てで安定性を示したが、Ｅ３コード領域のみの部分的欠失は、最初の感染後の継代全てで分子量がより低い弱いバンドを示しており、このことは、導入遺伝子の安定性の低下を示す。
【００７４】
驚いたことに、本発明者らは、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターの複製能が減弱されていることも発見した。本発明者らが知る限りにおいて、Ｅ１Ｂ−１９Ｋタンパク質およびＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質の両方を含むＥ１コード領域を含む複製型アデノウイルスベクターの減弱はこれまで実証されていない。更に、本発明者らが知る限りにおいて、複製型Ａｄ２６ベクターまたは複製型Ａｄ３５ベクターの減弱はこれまで実証されていない。組み換えアデノウイルスベクターの構築により、安定性が保存されているにもかかわらず複製能が減弱されることになることを予測するアプリオリな理由はない。この減弱および安定性の達成は、臨床的な、規制上のおよび製造上の観点から実用的価値を有する。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態によれば、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、左側のＩＴＲとＥ１コード領域の５’末端（即ちＥ１コード領域の上流）との間に位置する異種核酸配列を含む。本発明で使用する異種核酸配列は、あらゆる導入遺伝子を含むことができ、この導入遺伝子として、遺伝子治療に有用な核酸配列、治療上活性なタンパク質または免疫原性ポリペプチド（例えば抗原）をコードする核酸配列、および潜在的な治療効果を有する、遺伝的に操作されたもしくは計算的に設計されたタンパク質配列もしくはペプチド配列（例えばモザイク抗原もしくはモザイクタンパク質）をコードする合成核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７６】
本発明の実施形態によれば、異種核酸配列は、免疫原性ポリペプチドまたは免疫源をコードする。一実施形態では、免疫原性ポリペプチドまたは免疫源は、細菌性疾患、原生動物性疾患、真菌性疾患およびウイルス性疾患が挙げられるがこれらに限定されない病原性疾患または感染からの対象（例えばヒト）の保護に適したあらゆるポリペプチドまたはタンパク質である。別の実施形態では、免疫源または免疫原性ペプチドは、対象中での免疫応答（例えば体液性のおよび／または細胞媒介性の応答）の誘発が可能なあらゆるタンパク質またはポリペプチドである。更に別の実施形態では、免疫源または免疫原性ペプチドは、対象へのワクチンの接種に使用することができるあらゆるタンパク質またはポリペプチドであり、即ち、対象中で疾患または感染に対する免疫を発生させるのに使用することができるあらゆるタンパク質またはポリペプチドである。更に別の実施形態では、免疫原性ペプチドは、免疫応答を誘発することができるまたは対象中で疾患もしくは感染に対する免疫を発生させることができる抗原もしくはこの一部または複数種の抗原もしくはこれらの一部の組合せである。
【００７７】
好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、宿主中で防御免疫応答を上昇させることが可能であり、例えば、ウイルス性の疾患もしくは感染に対する免疫応答を誘発させることが可能である、および／または対象中で、ウイルス性の疾患もしくは感染から対象を保護する、ウイルス性の疾患もしくは感染に対する免疫を発生させる（即ちワクチン接種）。例えば、この免疫源は、オルトミクソウイルス免疫源（例えば、インフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質遺伝子等のインフルエンザウイルス免疫源、またはウマインフルエンザウイルス免疫源）、またはレンチウイルス免疫源（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫源、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫源、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫源、例えばＨＩＶもしくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶのマトリクス／カプシドおよびＨＩＶもしくはＳＩＶのｇａｇ遺伝子産物、ｐｏｌ遺伝子産物およびｅｎｖ遺伝子産物）であることができる。この免疫源はまた、アレナウイルス免疫源（例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質遺伝子およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質遺伝子等のラッサ熱ウイルス免疫源）、ポックスウイルス免疫源（例えば、ワクシニアＬ１遺伝子もしくはワクシニアＬ８遺伝子等のワクシニア）、フラビウイルス免疫源（例えば、黄熱ウイルス免疫源もしくは日本脳炎ウイルス免疫源）、フィロウイルス免疫源（例えば、ＮＰ遺伝子およびＧＰ遺伝子等のエボラウイルス免疫源もしくはマールブルグウイルス免疫源）、ブンヤウイルス免疫源（例えば、ＲＶＦＶウイルス、ＣＣＨＦウイルスおよびＳＦＳウイルス）、またはコロナウイルス免疫源（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質遺伝子等の感染性ヒトコロナウイルス免疫源、もしくはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫源、もしくはトリ伝染性気管支炎ウイルス免疫源）であることもできる。免疫源は更に、ポリオ免疫源、ヘルペス免疫源（例えば、ＣＭＶ免疫源、ＥＢＶ免疫源、ＨＳＶ免疫源）、パピローマウイルス（例えばＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８）免疫源、呼吸器合胞体ウイルス免疫源（例えばＦタンパク質またはＧタンパク質）、流行性耳下腺炎免疫源、麻疹免疫源、風疹免疫源、ジフテリア毒素またはその他のジフテリア免疫源、百日咳免疫源、肝炎（例えばＡ型肝炎もしくはＢ型肝炎）免疫源、または本開示を考慮して当分野で既知のあらゆるその他のワクチン免疫源であることができる。
【００７８】
好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を誘発する、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫を発生させる。ＨＩＶは、ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）およびＨＩＶ２型（ＨＩＶ−２）である２種の主要な型に分類される。ＨＩＶ−１は、ＨＩＶウイルスの最も一般的な株であり、ＨＩＶ−２と比べて病原性が高いことが知られている。ＨＩＶは本明細書で使用する場合、ＨＩＶ１型、ＨＩＶ２型およびこれらの亜型を広く意味する。好ましい実施形態では、免疫原性ポリププチドは、ＨＩＶ−１に対する免疫を発生させる、またはＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘発する。
【００７９】
本発明の実施形態によれば、異種核酸配列は、ＨＩＶ抗原である免疫原性ポリペプチドをコードすることができる。このＨＩＶ抗原はＨＩＶ−１抗原またはＨＩＶ−２抗原であることができる。ＨＩＶ抗原の例として、ｇａｇ遺伝子産物、ｐｏｌ遺伝子産物およびｅｎｖ遺伝子産物が挙げられるがこれらに限定されず、これらは構造タンパク質および必須酵素をコードする。ｇａｇ遺伝子産物、ｐｏｌ遺伝子産物およびｅｎｖ遺伝子産物はポリタンパク質として合成され、多様なその他のタンパク質産物へと更にプロセシングされる。ｇａｇ遺伝子の一次タンパク質産物は、ウイルスの構造タンパク質であるｇａｇポリタンパク質であり、ＭＡタンパク質産物、ＣＡタンパク質産物、ＳＰ１タンパク質産物、ＮＣタンパク質産物、ＳＰ２タンパク質産物およびＰ６タンパク質産物へと更にプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子はウイルス酵素（Ｐｏｌ、ポリメラーゼ）をコードし、一次タンパク質産物は、ＲＴタンパク質産物、ＲＮａｓａｅ  Ｈタンパク質産物、ＩＮタンパク質産物およびＰＲタンパク質産物へと更にプロセシングされる。ｅｎｖ遺伝子は構造タンパク質をコードし、ビリオンエンベロープの糖タンパク質を特にコードする。ｅｎｖ遺伝子の一次タンパク質産物はｇｐ１６０であり、このｇｐ１６０はｇｐ１２０およびｇｐ４１へと更にプロセシングされる。ＨＩＶ抗原のその他の例として、遺伝子調節タンパク質ＴａｔおよびＲｅｖ；アクセサリータンパク質Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＶｐｕ；カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質およびｐ２４ウイルスタンパク質が挙げられる。本発明に係る異種核酸配列は、あらゆるＨＩＶ抗原をコードすることができ、ｇａｇ遺伝子産物、ｅｎｖ遺伝子産物および／もしくはｐｏｌ遺伝子産物またはこれらの一部を好ましくはコードする。
【００８０】
好ましい実施形態によれば、異種核酸配列は、ＨＩＶのＧａｇ抗原、Ｅｎｖ抗原もしくはＰｏｌ抗原またはこれらの任意の部分もしくは組み合わせを含む免疫原性ポリペプチドをコードし、より好ましくは、ＨＩＶ−１のＧａｇ抗原、Ｅｎｖ抗原もしくはＰｏｌ抗原またはこれらの任意の部分もしくは組み合わせをコードする。
【００８１】
別の好ましい実施形態によれば、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターは、モザイクＨＩＶ抗原をコードする異種核酸配列を含む。本明細書で使用する場合、「モザイク抗原」は、天然配列の断片を含む組み換えタンパク質を意味しており、この組み換えタンパク質は、複数種の天然に生じる抗原性決定基または免疫原性決定基に対する免疫応答の誘発が可能である。「モザイク抗原」のアミノ酸配列を計算的に生成することができ、遺伝的アルゴリズムを使用して最適化することができる。モザイク抗原は天然抗原に類似するが、天然配列で見出される潜在的エピトープ（より好ましくはＴ細胞エピトープ）のカバー範囲が増加するように最適化されており、それにより、免疫応答の広さおよびカバー範囲が改善される。用語「モザイク抗原」は、ＨＩＶに関して使用される場合、ＨＩＶ免疫源の天然配列の断片を含む組み換えタンパク質を意味する。
【００８２】
好ましくは、本発明の実施形態に係るモザイクＨＩＶ抗原は、ＨＩＶのＧａｇポリペプチド配列、Ｐｏｌポリペプチド配列および／またはＥｎｖポリペプチド配列の内の１種または複数種からの複数種の免疫原性断片を含むモザイク抗原であり、好ましくはＨＩＶ−１のＧａｇポリペプチド配列、Ｐｏｌポリペプチド配列および／またはＥｎｖポリペプチド配列の内の１種または複数種からの複数種の免疫原性断片を含むモザイク抗原である。
【００８３】
本発明の実施形態によれば、モザイクＨＩＶ抗原は、流行しているＨＩＶ株で見出されるエピトープ（より好ましくはＴ細胞エピトープ）のカバー範囲を増加させるために、より多岐にわたる免疫原性配列を含むように最適化されている。
【００８４】
一実施形態では、本発明に係るモザイクＨＩＶ抗原は、１種または複数種のＨＩＶの型または亜型からの（好ましくはＨＩＶ−１の１種または複数種の亜型からの）Ｇａｇポリペプチド、ＰｏｌポリペプチドおよびＥｎｖポリペプチドの内の１種に由来する複数種の免疫原性配列を有するモザイクＨＩＶ抗原である。例えば、モザイクＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物の配列に由来する複数種の免疫原性配列を有するモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ抗原、ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物の配列に由来する複数種の免疫原性配列を有するモザイクＨＩＶ  Ｐｏｌ抗原、またはＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子産物の配列に由来する複数種の免疫原性配列を有するモザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原であることができる。
【００８５】
別の実施形態では、本発明に係るモザイクＨＩＶ抗原は、１種または複数種のＨＩＶの型または亜型からの（好ましくはＨＩＶ−１の１種または複数種の亜型からの）Ｇａｇポリペプチド配列、Ｐｏｌポリペプチド配列およびＥｎｖポリペプチド配列の内の２種に由来する免疫原性配列の組み合わせを含む。例証的で非限定的な例として、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子産物およびｐｏｌ遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ−Ｐｏｌ抗原、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子産物およびｇａｇ遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ−Ｇａｇ抗原、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物およびｐｏｌ遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ抗原、ならびにＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物およびｅｎｖ遺伝子産物の配列に由来するエピトープを有するモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｅｎｖ抗原が挙げられる。
【００８６】
更に別の実施形態では、本発明に係るモザイクＨＩＶ抗原は、１種または複数種のＨＩＶの型または亜型からの（好ましくはＨＩＶ−１の１種または複数種の亜型からの）Ｇａｇポリペプチド配列、Ｐｏｌポリペプチド配列およびＥｎｖポリペプチド配列の３種全てに由来する免疫原性配列の組み合わせを含む。
【００８７】
好ましくは、モザイクＨＩＶ抗原は、モザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原またはモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ抗原である。
【００８８】
本発明の特定の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を含むモザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原（以降、「Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ」と称する）である。本発明のより特定の実施形態では、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスの異種核酸配列は配列番号４７のヌクレオチド配列を含む。
【００８９】
本発明の別の特定の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸配列を含むモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ抗原（以降、「Ｍｏｓ１−ＨＩＶＧａｇＰｏｌ」と称する）である。本発明のより特定の実施形態では、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスで使用される異種核酸配列は、配列番号４９のヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
本発明のその他の実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列を含むモザイクＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原（以降、「Ｍｏｓ２−ＨＩＶＥｎｖ」と称する）または配列番号７１のアミノ酸配列を含むモザイクＨＩＶ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ抗原（以降、「Ｍｏｓ２−ＧａｇＰｏｌ」と称する）である。本発明のより特性の実施形態では、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスで使用される異種核酸配列は、配列番号７０または配列番号７２のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００９１】
天然ＨＩＶ配列を使用するこれまでのワクチンにより誘発されたＴ細胞応答の研究により、流行している多種多様な株と比較して、ＨＩＶ上のエピトープを認識する幅が比較的制限されることが分かっている。例えば、ＳＴＥＰ試験では、Ｇａｇタンパク質、Ｐｏｌタンパク質およびＮｅｆタンパク質それぞれにつき中央値で約１〜２個のエピトープが各個人により認識されたが、この数が、参加者が曝されていた可能性があるＨＩＶのプールにおけるエピトープの頻度に関して補正される場合には、この数は大幅に低いであろう［５２］。従って、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターにおけるモザイクＨＩＶ抗原の使用により、好ましくはＨＩＶ−１のＧａｇポリペプチド配列、Ｐｏｌポリペプチド配列およびＥｎｖポリペプチド配列の内の１種または複数種からの複数種の免疫原性断片を含むＨＩＶ−１抗原の使用により、エピトープの認識の幅が増加し、世界的規模でのＨＩＶ−１ウイルスの多様性の免疫学的なカバー範囲が最適化される［５３〜５５］。
【００９２】
本発明の実施形態によれば、プロモーターは、異種拡散配列に作動可能に連結されている。このプロモーターは、哺乳動物細胞内またはヒト細胞内等の真核細胞内で異種拡散配列の発現を指示し、好ましくは非補完型ヒト細胞内で異種拡散配列の発現を指示する。このプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘発性プロモーター等の哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーターであることができる。構成的哺乳動物プロモーターとして、下記の遺伝子のプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ｂ−アクチンプロモーターおよびその他の構成的プロモーター。誘発性哺乳動物プロモーターとして、環境刺激（例えば栄養素（例えば糖、アミノ酸）、温度変化、ｐＨ等）の存在下で強く誘発されるプロモーターが挙げられるがこれに限定されない。真核細胞中で機能する例示的なウイルスプロモーターとして、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えばＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスおよびその他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するプロモーターならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。このプロモーターは、ある特定の細胞型中でのみ活性を有する組織特異的プロモーターであることができる。組織特異的プロモーターの例として、上皮組織に特異的なプロモーター（例えば、Ｅ−カドヘリン遺伝子のプロモーターまたは上皮細胞中で特異的に発現されるその他の遺伝子のプロモーター）が挙げられる。本発明で使用され得るその他のプロモーターは、本開示を考慮して当業者に既知である。
【００９３】
好ましくは、このプロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。特定の実施形態では、このプロモーターは、配列番号５１の核酸配列を有するＣＭＶプロモーターである。
【００９４】
このプロモーターに加えて、本組み換えベクターは、異種遺伝子の発現を調節するために、その他の調節配列を含むこともできる。そのような調節配列の例として、エンハンサー、上流調節ドメイン、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、翻訳調節配列、リボソーム結合部位および翻訳終結配列等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９５】
従って、本発明は、複製可能であり（図６、図７および図８を参照されたい）、そのため複製不能なベクターに関係する、ある特定の不具合を克服することができる新規のアデノウイルスベクター構築物を提供する。本発明に係る組み換えアデノウイルスベクターは複製可能であり、野生型アデノウイルスと比べて効率は低いが非補完型ヒト細胞中で増殖することができ、そのため、感染した非補完型ヒト細胞中での導入遺伝子発現を増幅させる。従って、導入遺伝子発現は、最初に感染するウイルス中に存在する組み換えアデノウイルスベクターからだけでなく、非補完型宿主細胞内でウイルスゲノムの複製により生じる組み換えアデノウイルスベクターの更なるコピーからも起こる。このことは、全ての導入遺伝子発現が、感染に使用されたウイルス粒子中に存在する組み換えベクターに由来する、Ｅ１欠損アデノウイルスベクター等の複製欠損性の組み換えアデノウイルスベクターとは対照的である。
【００９６】
本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターを、本開示を考慮して当分野で既知のあらゆる方法により産生することができる。本発明の核酸配列および本発明を実施するために使用されるその他の核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはこれらの複合型であるかどうかにかかわらず、様々な供給源から単離され得る、遺伝的に操作され得る、増幅され得る、および／または組み換えにより発現され得る。哺乳動物細胞、細菌、酵母、昆虫または植物系等の任意の組み換え発現系または増殖系を使用することができる。
【００９７】
あるいは、例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８、Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１、Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４、Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０、Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６、Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０、Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９、Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９、米国特許第４，４５８，０６６号明細書に記載されているように、公知の化学合成技法により、これらの核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。次いで、相補鎖を合成し、この相補鎖を適切な条件下で一緒にアニーリングさせることにより、または適切なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することにより、二本鎖ＤＮＡ断片を得ることができる。
【００９８】
核酸の操作のための技法（例えば配列中での変異の生成、配列の一部の欠失、サブクローニング、標識プローブ、配列決定、ハイブリダイゼーション等）が科学文献および特許文献に詳しく記載されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい。
【００９９】
核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチド等を、当業者に公知の多数の一般的な手段のいずれかで分析することができる、および定量化することができる。この手段として、例えば、分析的生化学的方法、例えばＮＭＲ、電子顕微鏡、分光光度測定、Ｘ線撮影、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および超拡散クロマトグラフィー（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）；様々な免疫学的方法、例えば液体またはゲル沈降反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイノムアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ、免疫蛍光アッセイ；様々な定量化アッセイ、例えばプラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイ、フォーカス形成アッセイ；核酸およびタンパク質の分析技法、例えばサザン分析、ノーザン分析、ウェスタンブロット分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、その他の核酸または標的またはシグナルの増幅方法、放射標識、シンチレーション計数、およびアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
【０１００】
ウイルスベクター構築物を生成する方法および複製する方法が科学文献および特許文献で公知であり、例えば米国特許第５，９８１，２２５号明細書、米国特許第５，９２２，５７６号明細書、米国特許第５，８８０，１０２号明細書、Ｇｒａｈａｍ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２０７−２２０を参照されたい。また、一般的方法に関して例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｔｉｊｓｓｅｎを参照されたい。細胞培養物中でのウイルスゲノムの遺伝子操作、形質転換および感染の技法、ウイルスの操作および単離の技法、Ａｄ複製可能な細胞株およびＡｄ複製の許容条件等が公知であり、科学文献および特許文献に記載されており、例えばＫｒｏｕｇｌｉａｋ（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１５７５−１５８６、Ｇｏｒｚｉｇｌｉａ（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６０４８−６０５５、Ｃｏｔｅ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５９：５６７−５７５、Ｈａｒｔｉｇａｎ−Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７８３５−７８４１、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、米国特許第５，８８０，１０２号明細書、米国特許第５，８８２，８７７号明細書、米国特許第５，８９１，６９０号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第５，９８１，２２５号明細書、米国特許第５，９８５，８４６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第５，９５５，２８１号明細書を参照されたい。
【０１０１】
例えば、組み換えアデノウイルスベクターを、様々な既知の手順により、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの相同組み換え法により（例えばＨｅ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：２５０９−２５１４、Ａｏｋｉ（１９９９）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５：２２４−２３１、Ｓｏｕｚａ（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：５０２−５０８、米国特許第５，９１９，６７６号を参照されたい）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの直接ライゲーション法により（例えばＭｉｚｕｇｕｃｈｉ（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２５７７−２５８３を参照されたい）、または環状アデノウイルスＤＮＡを使用することにより（例えばＴａｓｈｉｒｏ（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１８４５−１８５２を参照されたい）生成することができる。別の技法として、例えばＣｈａｒｔｉｅｒ（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：４８０５−４８１０に記載の方法のような細菌組み換え系を利用して、変更された配列を細菌のクローンに挿入することができる。この系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での単純な遺伝子組み換え法に加えて、Ａｄゲノムの完全長コピーを含む細菌プラスミドを使用する。これにより、原核発現ベクター中でのまたは真核発現ベクター中でのＡｄゲノムの任意の部分の操作およびその後のＡｄゲノムの完全長コピーへの挿入が可能になる。完全長Ａｄ染色体を、置換する領域中において制限酵素で一回切断する。細菌を、この線状化分子で共形質転換する。相同組み換えにより、細菌細胞中において組み換え能力を持つ環状分子が得られる。変更されたＡｄ配列の存在を、ＰＣＲおよびサザンブロッティングにより確認することができる。
【０１０２】
好ましくは、宿主細胞中での相同組み換えにより本発明の組み換えアデノウイルスベクターが得られ、この相同組み換えは、配列相同性の領域を含む２種の線状化プラスミドの間で起こる。この方法では、プラスミド／コスミドベクター系を使用することができる（図２）。このプラスミドはアデノウイルスゲノムの一部を含み、左側のＩＴＲにおいてゲノム左側の末端から始まりｐＩＸコード領域内の部位までである。このプラスミドは、プロモーターを含む導入遺伝子カセットと、この導入遺伝子カセット中のプロモーターの制御下での異種核酸配列の挿入用の多重クローニング部位（ＭＣＳ）とを含む。当業者は、導入遺伝子カセットが、この導入遺伝子カセットから異種核酸配列の発現、安定性等を制御するためにその他の調節因子を含むことができ、例えばポリアデニル化（ポリＡ）転写終結シグナル等のシグナル配列を含むことができることを認識するだろう。アダプタープラスミドはまた、本発明の実施形態に係るＥ１コード領域も含み、このＥ１コード領域は導入遺伝子カセットの下流に存在する。アダプタープラスミドの３’末端は、相同組み換えを容易にするためにコスミドベクター配列の一部と相同であるおよび好ましくは約２．０〜２．５ｋｂである核酸配列を含む。コスミドベクターは、Ｅ３コード領域およびＥ４コード領域等の、ｐＩＸコード領域内の部位から右側のＩＴＲにわたるアデノウイルスゲノムの残りの大部分を含む。アダプタープラスミドと相同の領域はコスミドベクターの５’末端に存在し、ｐＩＸ配列を含む。
【０１０３】
本開示を考慮して当分野で既知のあらゆる方法を使用して、例えば、プラスミドおよびコスミドの相同組み換え前にＥ３コード領域を完全にまたは部分的に欠失させ、Ｅ４コード領域およびアダプタープラスミドのＭＣＳにクローニングされた異種核酸配列を部分的に欠失させることにより、アデノウイルス配列を操作して組み換えアデノウイルスベクターを得ることができる。
【０１０４】
本開示を考慮して、任意のプラスミド／コスミド系を使用して組み換えアデノウイルスベクターを生成することができる。コスミドは、ＬａｍｄａファージＣｏｓ配列を含む市販のハイブリッドプラスミドである。コスミドでは大きいＤＮＡ断片（最大で約５０ｋｂ）の安定した挿入が可能になるのに対して、このサイズのＤＮＡ断片を保有するその他のプラスミドでは不安定になる可能性がある。本開示を考慮して当分野で既知の方法を使用して、アデノウイルス２６またはアデノウイルス３５のゲノムをプラスミド／コスミド中にクローニングすることができる。ｐＡｄＡｐｔ２６プラスミドまたはｐＡｄＡｐｔ３５プラスミド等のアデノウイルスプラスミド／コスミドは、アデノウイルス２６またはアデノウイルス３５のゲノムの各バックボーン中への異種核酸配列の挿入を可能にする。アデノウイルスプラスミド／コスミドはまた、目的のＡｄ遺伝子の増幅または操作のためのテンプレートまたは供給源としても機能する。本発明に従って、組み換えアデノウイルスベクターを、プラスミドベクターによる適切な細胞型の共トランスフェクト時の相同組み換えにより産生することができ、この組み換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの一部、異種核酸配列が挿入された導入遺伝子カセット、および残りのアデノウイルスゲノムを含むコスミドベクターを含む。共トランスフェクションを当分野で既知の任意の方法により実施することができ、例えば、ＤＥＡＥデキストラン法（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐａｇａｎｏ、１９６８）、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３）、マイクロインジェクション、リポフェクション（リポソームトランスフェクション）、電気穿孔等により実施することができる。
【０１０５】
共トランスフェクションで使用するプラスミドおよびコスミドの量は、個々のプラスミドおよびコスミドの構築物、細胞型に応じて異なることができ、典型的には１０６個の細胞当たり約０．２〜１０・ｇのＤＮＡの範囲である。例えば、１：３（例えば２μｇのプラスミド：６μｇのコスミド）のプラスミド：コスミド比を使用することができるが、共トランスフェクションを最適化するために、必要に応じて、このプラスミド：コスミドの比率を調節することができる。プラスミドおよびコスミドを、例えば制限酵素消化により、トランスフェクション前に線状化する。トランスフェクションに適した細胞として、アデノウイルス感染を許容するあらゆる細胞株が挙げられ、この細胞株として、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３−Ｄ２２細胞、Ａ５４９細胞、ＨｕＴｕ８０細胞、ＨＣＴ−１５細胞、ＩＧＲＯＶ−１細胞、Ｕ８７細胞、Ｗ１６２細胞、ＰＥＲ．５５Ｋ細胞およびＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  １−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９，１９０９−１９１７，１９９８）またはこれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、プラスミド／コスミドのトランスフェクションおよびその後の組み換えアデノウイルスベクターの生成にＰＥＲ．Ｃ６細胞を使用する。
【０１０６】
トランスフェクトした細胞を、当分野で既知の任意の適切な容器中で培養することができる。例えば、バイオジェネレータ中でまたはバイオリアクタ中で細胞を増殖させることができる、および感染した細胞を培養することができる。通常、「バイオジェネレータ」または「バイオリアクタ」は、撹拌システム、ＣＯ２ガス流を注入するための装置および酸素添加装置を含む、体積が０．５リットル以上の培養タンク（概してステンレス鋼またはガラスで製造されている）を意味する。典型的には、バイオジェネレータの内部パラメータ（例えば、ｐＨ、溶存酸素、温度、タンク圧）または培養物のある特定の物理化学パラメータ（例として、グルコースもしくはグルタミンの消費量、または乳酸塩およびアンモニウムイオンの生成量）を測定するプローブが装備されている。ｐＨプローブ、酸素プローブおよび温度プローブは、これらのパラメータを持続的に制御するバイオプロセッサに接続されている。その他の実施形態では、この容器は、スピナーフラスコ、ローラーボトル、振盪フラスコ、または機械的に撹拌する撹拌子を備えたフラスコである。
【０１０７】
細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生まで細胞を継代させることができる、もしくはインキュベートすることができる、またはウイルス含有細胞を凍結させて保存し、その後に細胞の再感染もしくはウイルス単離に使用することができる。本開示を考慮して当分野で既知の任意の方法により、例えばプラークからの精製により、組み換えアデノウイルスベクターを単離することができる、および精製することができる。単離して精製した組み換えアデノウイルスベクターを液状で保存することができ、例えば水性緩衝液中で保存することができる、および凍結させることができる、または凍結乾燥させて乾燥状態で保存することができる。
【０１０８】
本発明はまた、複製型アデノウイルスベクターを産生する方法も提供する。本発明の実施形態によれば、本方法は、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターを、組み換えアデノウイルスゲノムの複製に十分な条件下で細胞中に導入すること、この細胞中でアデノウイルス粒子をパッケージングすることを含む。その後、細胞からアデノウイルス粒子を回収することができる。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、「ウイルス粒子」または「ビリオン」は、タンパク質の外被中にまたは殻中に封入されたウイルスゲノムを意味する。ウイルス粒子は本質的には、ウイルスゲノムの不活性な運搬体である。ウイルス粒子は、ウイルスに特異的な成分から細胞内で構築され、例えば感染により、細胞から細胞へとウイルスゲノムを運ぶ。ウイルス粒子自体は増殖不能または複製不能であり、そのため、ウイルスゲノムの運搬体として機能する。「アデノウイルス粒子」は具体的には、野生型アデノウイルスゲノム、組み換えアデノウイルスゲノムまたは組み換えアデノウイルスベクターを含むウイルス粒子を意味する。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、アデノウイルス粒子の産生に関する用語「回収する」は、ウイルス粒子の産生に使用した細胞からの組み換えウイルス粒子の集合体の単離を意味する。ウイルス含有細胞から、細胞の増殖培地から、またはこの両方からウイルス粒子を回収することができる。粒子の産生に使用した細胞からウイルス粒子を回収するために、この細胞を溶解させて粒子を遊離させる。その後、この粒子を、当分野で既知の方法および本明細書に記載の方法のいずれかに従って精製することができる。
【０１１１】
アデノウイルスベクターの増殖に適した任意の細胞株を、本開示を考慮してアデノウイルス粒子を産生する方法で使用することができ、この細胞株として、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＥＫ２９３細胞が挙げられるがこれらに限定されない。産生されたアデノウイルス粒子を細胞培養上清から回収することができる、または（例えば、化学的手段、凍結／解凍、浸透圧衝撃、機械的衝撃、超音波処理等による）溶解後の細胞から回収することができる。宿主細胞ＤＮＡを、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）等のＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅ処理により分解することができる。プラーク精製を連続して繰り返すことにより、ウイルス粒子を単離することができる。回収したウイルス粒子を、本開示を考慮して当分野で既知の任意の適切な技法（例えば、クロマトグラフ法、塩化セシウム勾配またはスクロース勾配に基づく超遠心分離）を使用して精製することができる。
【０１１２】
あるいは、組み換えアデノウイルスベクターが導入されたウイルス含有細胞を、アデノウイルス粒子の回収前に凍結させることができる。この細胞を使用して、新たなバッチの細胞を増殖させて組み換えアデノウイルス粒子を産生することができる、またはこの細胞を保存し、その後にこの細胞からアデノウイルス粒子を回収することができる。
【０１１３】
別の一般的態様では、本発明は、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。好ましくは、複製型組み換えアデノウイルスベクターは単離されている。組み換えアデノウイルスを含む医薬組成物またはワクチンは、アジュバント、添加剤および担体を含むことができることが認識されるだろう。
【０１１４】
本発明の実施形態によれば、組成物はワクチンであることができる。本明細書で使用する場合、用語「ワクチン」は、特定の疾患に対する能動的獲得免疫（ａｃｔｉｖｅ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を発生させることができる本発明の複製型組み換えアデノウイルスベクターを含む組成物を意味する。好ましい実施形態では、ワクチンは、ＨＩＶ感染に対する能動的獲得免疫を発生させることができる本発明の複製型組み換えアデノウイルスベクターを含む組成物である。
【０１１５】
本発明の組成物を対象への投与に適した任意の成分で製剤化して、投与を容易にすることができ、および効能を高めることができ、この投与として、経口（腸内）投与および非経口注射が挙げられるがこれらに限定されない。非経口注射として、静脈内注射または静脈内点滴、動脈内注射、皮下注射、筋肉内注射および関節内注射が挙げられる。本発明の組成物をその他の投与経路用に製剤化することもでき、その他の投与経路として、経粘膜、眼内、直腸、長時間作用型埋め込み（ｌｏｎｇ  ａｃｔｉｎｇ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、舌下投与、舌下、門脈循環をバイパスする口腔粘膜から、吸入または鼻腔内が挙げられる。
【０１１６】
好ましい実施形態では、組成物を経口投与用に製剤化することができる。経口投与に適した組成物として、粉末、カプセル、カプレット、ジェルキャップ、顆粒および錠剤が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい一実施形態では、経口投与用に、腸溶コーティングされているカプセルまたは錠剤を製剤化する。更なる詳細を、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”１９９０，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ中に見出すことができる。別の好ましい実施形態では、組成物を、液体製剤として、筋肉内または皮下等の注射用に製剤化する。注射に適した組成物として、溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。
【０１１７】
経口ワクチン組成物は、活性成分を約１０％〜約９５％含み、好ましくは約２５％〜約７０％含む溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態で摂取され得る。全身性免疫と組み合わせて粘膜免疫（この粘膜免疫は、気道および消化管に感染する病原体に対する防御において重要な役割を果たす）を上昇させるために、経口ワクチン接種および／または経鼻ワクチン接種が好ましい場合がある。経口用製剤に含有され得る添加剤として、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、スクロース、ヒスチジン、グリシン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、炭酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。アルコール、界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の追加の成分を経口用組成物に含有させることもできる。
【０１１８】
薬学的に許容される担体として、結合剤、崩壊剤、膨張剤、懸濁化剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味料、防腐剤、色素、可溶化剤およびコーティング等の１種または複数種の添加剤を挙げることができる。担体は、投与に望まれる製剤の形態に応じて多種多様な形態を取ることができる。液体の注射用製剤の場合、例えば懸濁液および溶液の場合、適切な担体および添加剤として、水、グリコール、油、アルコール、防腐剤、着色剤等が挙げられる。固体の経口剤の場合、例えば粉末、カプセル、カプレット、ジェルキャップおよび錠剤の場合、適切な担体および添加剤として、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等が挙げられる。鼻腔用スプレー／吸入用混合物の場合、水溶液／水性懸濁液は、適切な担体および添加剤として、水、グリコール、油、皮膚軟化薬、安定剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、香味料等を含むことができる。
【０１１９】
当分野で標準的な方法により、回収したばかりのウイルス培養物からワクチン組成物を調製することができる。例えば、ウイルスの増殖を標準的な技法（細胞変性効果の観察、免疫蛍光ベースのアッセイまたはその他の抗体ベースのアッセイ）によりモニタリングし、十分に高いウイルス価が達成された場合に回収する。ワクチン製剤中の含有前に、従来の方法により、ウイルスのストックを更に濃縮することができる、または凍結乾燥させることができる。Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉ−Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖ．７  Ｎｏ．５，ｐｐ．２６−３０．に記載の方法等のその他の方法を用いることもできる。
【０１２０】
本発明の実施形態によれば、固体製剤または液体製剤のどちらかとしての投与用の製剤化前に、組み換えアデノウイルスベクターを凍結乾燥させることができる。本発明者らは、本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターの設計により、ベクターの安定性が増加し、ウイルス粒子／プラーク形成単位（ｖｐ／ＰＦＵ）力価が減衰することなくまたは免疫原性が低下することなくベクターが凍結乾燥を生き延びることが可能になることを発見した（図１１）。凍結乾燥したベクターをカプセルにパッケージして、経口投与用の固体製剤を得ることができる。凍結乾燥したベクターを適切な緩衝液中に再懸濁して、非経口投与用の液体製剤を得ることもできる。
【０１２１】
本発明の実施形態によれば、投与用の組成物は、薬学的に許容される担体（例えば水性担体）による緩衝溶液（例えば緩衝生理食塩水等）を通常は含むことができる。この組成物はまた、生理学的状態に近づくために、ｐＨ調整剤および緩衝剤等の薬学的に許容される物質を必要に応じて含むことができる。
【０１２２】
従って、凍結乾燥形態の本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターの安定性により、このベクターをカプセル、錠剤および経口投与に適したその他の固体製剤へとパッケージすることが可能になる。そのため、本発明の組成物は投与が容易であり、対象への単純で効率的な送達が可能になる。
【０１２３】
本発明のある実施形態によれば、本組成物は、精製された組み換えベクター、例えばｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ２Ｅｎｖ、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌおよび／またはｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ；緩衝液、例えばＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液；１種または複数種の塩、例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２；非イオン界面活性剤、例えばポリソルベート（例えばＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０またはＴｗｅｅｎ８０）；増量剤、例えばラクトース、スクロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）；ならびに１種または複数種の追加の成分、例えばＥＤＴＡ、ヒスチジン、乳酸塩、マンニトール、エタノール等を含むカプセルである。本組成物は６．０および８．０のｐＨで緩衝化されており、好ましくは６．５〜７．５のｐＨで緩衝化されており、より好ましくは７．０〜７．４のｐＨで緩衝化されている。特定の実施形態では、本組成物は腸溶コーティングされている。本組成物を冷凍保存することができ、例えば−６５℃未満の温度で冷凍保存することができる。
【０１２４】
別の一般的態様では、本発明は、対象中で免疫応答を発生させる方法を提供する。本発明の実施形態によれば、この方法は、本発明の複製型組み換えアデノウイルスベクターと薬学的に許容される担体とを含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与することを含む。本明細書に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクターおよびこの組成物の内のいずれかを、本発明に係る対象中で免疫応答を発生させる方法にて使用することができる。
【０１２５】
本発明はまた、対象（例えばヒト）にワクチンを接種する方法にも関する。ワクチンを接種する方法は、感染（例えば、細菌性疾患、原虫性疾患、真菌性疾患およびウイルス性疾患等）に対してであることができ、好ましくはウイルス性疾患に対してであり、より好ましくはＨＩＶ感染に対してである。本発明に係るワクチンを接種する方法は、薬学的に許容される担体および複製型組み換えアデノウイルスベクターを含む組成物の免疫学的に有効な量を対象に投与することを含む。本明細書に記載の複製型組み換えアデノウイルスベクターおよびこの組成物の内のいずれかを、本発明に係るワクチンを接種する方法にて使用することができる。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、「ＨＩＶ感染」は、ＨＩＶウイルスの宿主生物（例えば宿主生物の細胞および組織）中への侵入を特に意味する。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「ワクチンを接種する」または「ワクチン接種」は、対象（例えばヒト）中で疾患または（細菌、ウイルス等の）感染に対する免疫応答または免疫を発生させることを意味する。本発明の実施形態によれば、本発明の組成物を投与して、ＨＩＶ感染に対するワクチンを対象に接種する。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「免疫学的に有効な量」は、対象中で所望の免疫効果または免疫応答を誘発するのに十分な組成物の量を意味する。一実施形態では、免疫学的に有効な量は、対象中で免疫応答を誘発するのに十分な量を意味する。別の実施形態では、免疫学的に有効な量は、対象中で免疫を発生させるのに十分な量を意味しており、例えば、ウイルス感染等の疾患に対する保護効果を発生させるのに十分な量を意味する。免疫学的に有効な量は、様々な因子によって異なる可能性があり、例えば、対象の身体的状態、年齢、体重、健康状態等；投与経路、例えば経口または非経口；具体的な用途、免疫応答を誘発させるかまたは防御免疫を発生させるか；投与する具体的な複製型組み換えアデノウイルスベクター；本複製型組み換えアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原、および免疫が望ましい具体的な疾患、例えばウイルス感染よって異なる可能性がある。当業者は、免疫学的に有効な量を、本開示を考慮して容易に決定することができる。
【０１２９】
一般的な指針として、免疫学的に有効な量は、約１０８個のウイルス粒子〜約１０１２個のウイルス粒子の範囲であることができ、例えば、１０８個、１０９個、１０１０個、１０１１個または１０１２個のウイルス粒子であることができる。免疫学的に有効な量を、単一種の組成物で投与することでき、または複数種の組成物（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種の組成物（例えば錠剤もしくはカプセル）で投与することができ、複数種のカプセルの投与により、対象に、合計で免疫学的に有効な量が投与される。いわゆるプライムブーストレジメンで、免疫学的に有効な量を対象に投与し、続いて別の用量の免疫学的に有効な量を同じ対象に投与することも可能である。このプライムブーストレジメは、ワクチン分野の当業者に公知である。必要に応じて、このレジメンに更なるブースター投与を任意選択的に追加することができる。
【０１３０】
好ましい実施形態によれば、免疫応答を発生させる方法またはワクチンを接種する方法では、ヒト対象に本発明に係る組成物を経口で投与し、好ましくは固体組成物（錠剤、カプセル等）として投与する。しかしながら、一部の実施形態では、液体製剤の注射により（例えば筋肉注射により）組成物を投与する。
【０１３１】
本発明の実施形態によれば、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、ＨＩＶ感染に対する免疫応答を誘発する。免疫応答は、細胞性応答または体液性応答であることができる。一般に、細胞性応答はＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を意味しており、体液性応答は抗体の産生および活性を意味する。より具体的には、細胞性免疫応答は、宿主ＣＤ８＋Ｔ細胞がＨＩＶの複製を制限することおよびＨＩＶに感染した細胞を死滅させることを可能にする応答を含み、そのため、感染の初期段階中にＨＩＶ感染の最初の局所的な粘膜病巣の勢いが弱められる、またはこの粘膜病巣が除去される。
【０１３２】
動物生体またはヒト生体での投与時に抗ＨＩＶ免疫応答を誘発させるまたは刺激する能力を、当分野で標準的である様々なアッセイを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで評価することできる。免疫応答の発現および活性化を評価するのに利用することができる技法の概要に関して、例えばＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２  ａｎｄ  １９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ｅｄ  Ｊ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を参照されたい。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するもの等の活性化されたエフェクタ細胞により分泌されるサイトカインプロファイルの測定（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴによるＩＬ−１０産生細胞またはＩＦＮガンマ産生細胞の定量化）により、免疫エフェクタ細胞の活性化状態の測定（例えば、古典的な［３Ｈ］チミジン取り込みによるＴ細胞増殖アッセイ）により、感作対象の抗原特異的Ｔリンパ球（例えば、細胞毒性アッセイにおけるペプチド特異的溶解）をアッセイすることにより、細胞性免疫の測定を実施することができる。
【０１３３】
体液性応答を刺激する能力を、抗体結合および／または結合の競合により測定することができる（例えばＨａｒｌｏｗ，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。例えば、免疫原を供給する組成物の投与に応答して産生される抗体の力価を、ＥＬＩＳＡにより測定することができる。抗原の投与に応答して産生される抗体を分泌する細胞の数を確認するおよび数えることを目的とする体液性免疫応答の評価にＥＬＩＳＰＯＴを使用することもできる。
【０１３４】
本発明の実施形態によれば、対象への投与時に、複製型組み換えアデノウイルスベクターは免疫原性ポリペプチドを発現する。本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドのいずれかが組み換えウイルスベクターによりコードされ得、本発明の方法で対象に投与され得る。発現された免疫原性ポリペプチドは対象の免疫系に提示され、それにより、免疫を発生させるのに必要な応答が誘発される、または、疾患もしくは感染を処置するためのもしくは予防するための免疫応答が誘発される。例えば、この応答は、免疫原性ポリペプチドに特異的な抗体の産生であることができる。
【０１３５】
好ましくは、対象への投与時に、複製型組み換えアデノウイルスベクターはモザイクＨＩＶ抗原を発現する。本発明に係るモザイクＨＩＶ抗原の対象の免疫系への提示により、発現されたモザイクＨＩＶ抗原の配列組成に応じて、ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子産物、ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物および／またはＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子産物に特異的な抗体等のＨＩＶに特異的な抗体の産生を誘発することができる。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態によれば、対象中で免疫応答を発生させる方法または対象にワクチンを接種する方法では、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、配列番号４８（Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ）または配列番号５０（Ｍｏｓ１−ＨＩＶＧａｇＰｏｌ）のアミノ酸配列を含むモザイクＨＩＶ抗原をコードする。本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターはまた、配列番号６９（Ｍｏｓ２−ＨＩＶＥｎｖ）または配列番号７１（Ｍｏｓ２−ＧａｇＰｏｌ）のアミノ酸配列を含むモザイクＨＩＶ抗原もコードすることができる。
【０１３７】
本発明の実施形態によれば、複製型組み換えアデノウイルスベクターを含む組成物を、ＨＩＶ感染前にまたはＨＩＶ感染の発症後に対象に投与することができる。ＨＩＶ感染前に投与する場合、例えば対象へのワクチン接種の場合、対象に防御免疫を発生させる免疫応答を誘発することができ、対象は、あらゆる将来のＨＩＶ感染に対して効果的に免疫付与される。ＨＩＶ感染の発症後に投与する場合、例えばＨＩＶに感染した細胞を破壊することにより、ＨＩＶウイルスの複製を防ぐことにより、および／またはＨＩＶウイルスの細胞中へのウイルス侵入を抑制することにより、ＨＩＶ感染を処置する免疫応答を誘発することができる。
【０１３８】
本発明の組成物を、様々な剤形および投与レジメンで投与することができる。投与頻度、投与様式および免疫学的に有効な量等の適切な投与レジメンは、患者の個々の条件（例えば、年齢、健康状態、様子）、投与のタイミング（例えば、感染前または感染の発症後）等によって異なるだろう、およびこれらの影響を受ける可能性がある。当業者は、本開示を考慮して適切な投与レジメンを容易に決定することができるだろう。例えば、対象にワクチンの接種する方法では、組成物を、最初の用量および２回目の用量である２回の用量で投与することでき、この投与では、２回目の用量を、最初の投与から数日後に、数週間後にまたは数ヶ月後に投与する。別の非限定的で例示的な例として、免疫応答を発生させる方法では、毎日のまたは毎週の投与レジメンを確立することができ、この投与レジメンでは、決定された免疫学的に有効の量の組成物が、一定期間にわたり（例えば数週間または数ヶ月にわたり）１日に１回または１週間に１回で投与される。投与レジメンを、対象の応答（例えば状態の改善または悪化）によって適切に調整することができる。
【０１３９】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明の複製型組み換えアデノウイルスベクターは、複製不能な非経口（注射可能な）ワクチンとは部位および細胞表現型が異なる免疫応答を誘発することができると仮定される。このことは、一つにはこの組み換えアデノウイルスベクターの凍結乾燥に対する安定性に起因すると考えられ、これにより、この組み換えベクターを固体組成物として経口投与することが可能になる。具体的には、本発明の複製型組み換えアデノウイルスベクターは、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）中で強力な免疫応答を誘発すると思われ、この腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）は、ＨＩＶ感染およびＣＤ４＋細胞の破壊の初期標的である［５６］。そのため、複製型組み換えアデノウイルスベクターは、最初の侵入時のＨＩＶ複製を防ぐまたは制限することにより機能することができる。
【０１４０】
本発明の下記の実施例は本発明の性質を更に説明するためである。下記の実施例は本発明を限定せず、本発明の範囲は添付した特許請求の範囲によって決定されるべきであることを理解しなければならない。
【実施例】
【０１４１】
実施例１：導入遺伝子カセットの後方にＥ１コード領域を有する空Ａｄ２６アダプタープラスミド（ｐＡｄＡｐｔ２６．Ｅ１ａｔｇ．空）のクローニング。
空Ａｄ２６組み換えベクターｐＡｄＡｐ２６．Ｅ１ａｔｇ．空（配列番号３）を、図２に示すように構築した。ｐＡｄＡｐｔ２６．Ｅ１ａｔｇ．空ベクターは、導入遺伝子カセットの後方にＥ１コード領域を含む。「空」とは、このベクターが異種核酸配列または導入遺伝子を含まないが、目的の任意の異種核酸配列を、ＣＭＶプロモーターの制御下でおよびＥ１コード領域の上流で、ｐＡｄＡｐｔ２６．Ｅ１ａｔｇ．空ベクターの導入遺伝子カセットの多重クローニング部位に挿入することができることを示す。
【０１４２】
「ＰＣＲ断片Ａ」および「ＰＣＲ断片Ｂ」の作製
２種のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を構成した。第１のＰＣＲは、野生型アデノウイルスベクターゲノム（「Ａｄ２６ＷＴ」）からＥ１コード領域を増幅させるためであり、このＰＣＲを、下記のプライマー対を使用して実施した：フォワードプライマーＡｄ２６ＷＴ．４６３．ＭｌｕＩ．ｆｗｄ  ５’−ＣＡＣＡＧＡＣＧＣＧＴＡＴＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＧＣＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡ−３’（配列番号５４）およびリバースプライマーＡｄ２６ＷＴ．ＸｈｏＩ．ｒｅｖ  ５’−ＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号５５）。フォワードプライマーを、Ｅ１コード領域の先頭にＭｌｕＩ部位を導入するように設計し、リバースプライマーを、Ａｄ２６ウイルスゲノムのｐＩＸ領域中の既存のＸｈｏＩと重複するように設計した。これにより、ＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位で挟まれたＰＣＲ産物（「ＰＣＲ断片Ａ」）を得た。
【０１４３】
第２のＰＣＲは、ｐＡｄＡｐｔ２６ベクター（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｒａｒｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００７）８１（９），４６５４−４６６３）由来の導入遺伝子カセットの一部を増幅させるためであり、このＰＣＲを、下記のプライマー対を使用して実施した：フォワードプライマーＡｄＡｐｔ２６．ＮｄｅＩ．ｆｗｄプライマー５’−ＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣ−３’（配列番号５２）およびリバースプライマーＡｄＡｐｔ２６．ＭｌｕＩ．ｒｅｖ  ５’−ＣＧＡＴＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号５３）。フォワードプライマーを、ｐＡｄＡｐｔ２６ベクターのＣＭＶプロモーター中の既存のＮｄｅＩ部位と重複するように設計し、リバースプライマーを、ポリＡ配列の直後にＭｌｕＩ部位を導入するように設計した。これにより、ＮｄｅＩ部位およびＭｌｕＩ部位で挟まれたＰＣＲ産物（「ＰＣＲ断片Ｂ」）を得た。
【０１４４】
ＡｄＡｐｔ２６．Ｅ１ａｔｇ．空（導入遺伝子カセットの後方に置かれたＥ１領域）のクローニング
ＰＣＲ断片ＡをＮｄｅＩおよびＭｌｕＩで消化し、ＰＣＲ断片ＢをＭｌｕＩおよびＸｈｏＩで消化した。ｐＡｄＡｐｔ２６ベクターをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。全ての断片をゲル精製した。これらの消化された断片で三重ライゲーションを構成し、クローンを制限酵素分析によりスクリーニングし、配列決定してｐＡｄＡｐｔ２６．２６Ｅ１．空を確認した。
【０１４５】
実施例２：モザイクＨＩＶ抗原をコードする異種核酸配列を含むＡｄ２６アダプタープラスミド（ｐＡｄＡｐｔ２６．２６Ｅ１．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ）のクローニング。
ＣＭＢプロモーターの制御下で導入遺伝子カセット中にクローニングしたモザイクＨＩＶ抗原Ｍｏｓ１ＨＩＶＥｎｖ（配列番号４８）をコードする異種核酸配列を含むＡｄ２６アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ２６．２６Ｅ１．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ（図３Ａ）を、下記のように構築した。
【０１４６】
細菌バックボーン中にＭｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ導入遺伝子（配列番号４７）を含むＧｅｎｅＡＲＴ（登録商標）により合成的に生成したプラスミドからＭｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖを消化した。この導入遺伝子配列を挟むＫｐｎＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を設計した。ｐＡｄＡｐｔ２６．２６Ｅ１．空をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化した。精製後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して両方のＤＮＡ断片を互いに連結させた。クローンを配列決定して完全性を検証した。
【０１４７】
実施例３：Ａｄ２６コスミドベクター（ｐＷｅ．Ａｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３ｄＥ４２６ｏｒｆ６）のクローニング。
部分的に欠失したＡｄ２６  Ｅ３コード領域（配列番号５）および部分的に欠失したＡｄ２６  Ｅ４コード領域（配列番号２２）を含むＡｄ２６コスミドベクターｐＷｅ．Ａｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３ｄＥ４２６ｏｒｆ６（配列番号２）（図３Ｂ）を、下記のように構築した。
【０１４８】
ｐＷｅ／Ａｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．２６ｏｒｆ６  Ａｄ２６コスミド（天然Ａｄ２６Ｅ４ｏｒｆ６を含むＡｄ２６コスミド）のクローニング
最初に、コスミドベクターｐＷｅ／Ａｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００７、上記を参照）中に存在するアデノウイルス血清型５のＥ４ｏｒｆ６領域（Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６）を、アデノウイルス２６の天然Ｅ４ｏｒｆ６領域（Ａｄ２６Ｅ４ｏｒｆ６）で置換した。Ａｄ２６繊維タンパク質コード領域中に存在するＥｃｏＲＩ部位からＡｄ２６のＥ４ｏｒｆ３中のＭｌｕＩ部位までのＰＣＲ断片を生成した。Ａｄ２６  ＷＴをＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用し、下記のプライマー対を使用した：フォワードプライマーＡｄ２６．Ｅ４ｏｒｆ６．ｆｗｄ  ５’−ＣＴＡＴＴＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡ−３’（配列番号５６）およびリバースプライマーＡｄ２６．Ｅ４ｏｒｆ６．ｒｅｖ  ５’−ＣＴＴＡＴＧＣＴＧＧＡＴＧＴＡＣＧＣＧＴＡＧＡＧ−３’（配列番号５７）。このＰＣＲ断片を、（ＥｃｏＲＩで消化し、ＭｌｕＩで部分的に消化した）ｐＷｅ／Ａｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドに連結し、それにより、Ａｄ５ｏｒｆ６部分を置換してｐＷｅ／Ａｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．２６ｏｒｆ６を得た。
【０１４９】
ｐＷｅ／Ａｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．ｄＥ４．２６ｏｒｆ６（部分的に欠失したＥ３コード領域および部分的に欠失したＥ４コード領域を含むＡｄ２６コスミドベクター）のクローニング
２種のＰＣＲ断片を生成した。下記のプライマー対を使用して、Ａｄ２６繊維タンパク質コード領域中のＥｃｏＲＩ部位で始まりＥ４ｏｒｆ６領域の先頭（このＥ４ｏｒｆ６の先頭でＭｌｕＩ部位が設計されている）までの第１を生成した：フォワードプライマーＡｄ２６．ｄＥ４．ＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ．ｆｗｄ  ５’−ＧＡＣＴＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＡ−３’（配列番号５８）およびリバースプライマーＡｄ２６．ｄＥ４．ＥｃｏＲＩ−ＭｌｕＩ．ｒｅｖ  ５’−ＴＡＴＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＡＣＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴ−３’（配列番号５９）。ｐＢｒ／Ａｄ２６．ｄＥ３．２６ｏｒｆ６（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００７、上記を参照）をテンプレートとして使用した。
【０１５０】
下記のプライマー対を使用して、ＭｌｕＩ部位が設計されているＥ４ｏｒｆ１の先頭で始まりＳｒｆＩ部位までの第２のＰＣＲ断片を生成した：フォワードプライマーＡｄ２６．ｄＥ４．ＭｌｕＩ−ＳｒｆＩ．ｆｗｄ  ５’−ＴＡＴＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＣＴＣＡＧＣＣＣＧＣＴＴＡＣＣＡＧＴＡＧＡ−３’（配列番号６０）およびリバースプライマーＡｄ２６．ｄＥ４．ＭｌｕＩ−ＳｒｆＩ．ｒｅｖ  ５’−ＧＣＧＴＣＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡ−３’（配列番号６１）。ｐＢｒ／Ａｄ２６．ｄＥ３．２６ｏｒｆ６をテンプレートとして使用した。
【０１５１】
生成した両方のＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＭｌｕＩまたはＭｌｕＩ／ＳｒｆＩで消化した。ｐＢｒ／Ａｄ２６．ｄＥ３．２６ｏｒｆ６をＥｃｏＲＩ／ＳｒｆＩで消化した。Ｅ４ｏｒｆ６とＡｄ５のＥ４ｏｒｆ６との交換前では、このプラスミドには、その天然のＡｄ２６  Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子が依然として存在した。ＥｃｏＲＩ／ＭｌｕＩで消化されたＰＣＲ断片およびＭｌｕＩ／ＳｒｆＩで消化されたＰＣＲ断片を、三重ライゲーションにより、消化されたｐＢｒ／Ａｄ２６．ｄＥ３．２６ｏｒｆ６に連結させ、Ｅ４ｏｒｆ１からＥ４ｏｒｆ４が欠失しているｐＢｒ／Ａｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．２６ｏｒｆ６を生成した。
【０１５２】
最後に、ｐＢｒ／Ａｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．２６ｏｒｆ６プラスミドおよびｐＢｒ／Ａｄ２６．ＳｆｉＩ（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、上記を参照）プラスミドをＳｒｆＩおよびＰａｃＩで消化し、ＰａｃＩで消化したｐＷｅコスミドバックバックボーンに連結させてｐＷｅ／Ａｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．ｄＥ４．２６ｏｒｆ６コスミドベクターを得た。
【０１５３】
実施例４：複製型組み換えアデノウイルス２６ベクターｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖの産生。
最初に、実施例２で得たアダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ２６．２６Ｅ１．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖおよび実施例３で得たコスミドベクターｐＷｅ．Ａｄ２６．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３ｄＥ４２６ｏｒｆ６（図３）を洗浄し、増幅させて、このプラスミドおよびコスミドがあらゆる動物成分を含まないことを確認した。このプラスミドをカオトロピック塩で洗浄し、このカオトロピック塩は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキットのＮＴ緩衝液中に存在する。この洗浄済プラスミドをＭｅｇａＸ  ＤＨ１０Ｂ細菌中に電気穿孔し、その後、ＭｅｇａＸ  ＤＨ１０Ｂ細菌を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む動物成分フリーＬＢ寒天培地上で増殖させた。電気穿孔後、１個の単一コロニーを単離し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む動物成分フリーＬＢ寒天培地上で画線を実施した。この画線を再度繰り返した。２回目の画線後、３個のコロニーを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む動物成分フリーＬＢブロス中で増殖させ、その後、ミニプレップ分析で試験した。１個の培養物を選択し、マキシプレップ培養液（この場合も５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む動物成分フリーＬＢブロスを使用する）への接種に使用した。その後、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌのＥｎｄｏｔｏｘｉｎフリーマキシプレップキットを使用してプラスミドを単離した。このキットに含まれるＲＮＡｓｅは動物起源であることから、このＲＮＡｓｅを使用しなかった。代わりに、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）と呼ばれる真菌に由来するＲｏｃｈｅのＲＮＡｓｅ  Ｔ１を使用した。ｐＡｄＡｐｔ２６．２６Ｅ１．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖプラスミドおよびｐＷｅ／Ａｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．２６ｏｒｆ６コスミドベクターの完全性を制限酵素分析で確認した。
【０１５４】
ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ複製型組み換えベクターを、一過性遺伝子導入により生成した。１μｇの線形化プラスミドｐＡｄＡｐｔ２６．２６Ｅ１．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖと５μｇの線形化コスミドｐＷｅ／Ａｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．２６ｏｒｆ６とを混合して、遺伝子導入用のＤＮＡ溶液を生成した。
【０１５５】
ウイルスを救出するために、このＤＮＡ混合物にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００ＣＤを１μｇ：２．５μｌのＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００ＣＤの比率で添加し、３０〜４０分にわたり室温でインキュベートした。遺伝子導入の１日前にＰＥＲ．Ｃ６細胞をＴ２５フラスコ中に播種し、ＤＭＥＭで洗浄し、この細胞上で、３７℃および１０％ＣＯ２にて４時間にわたり遺伝子導入用混合物をインキュベートした。４時間後、遺伝子導入用混合物を取り除き、培養培地を添加した。２日にわたる３７℃および１０％ＣＯ２でのインキュベーション後、遺伝子導入した細胞をＴ７５フラスコに移し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生するまでインキュベートした。
【０１５６】
ＣＰＥの発生が完全なＣＰＥに達しなかったことから、全ての粗物質を回収して−２０℃で保存し、その後、Ｔ７５フラスコ中に播種したＰＥＲ．Ｃ６の再感染に使用した。再感染プロセスにより完全なＣＰＥを得て、全ての粗物質を回収して−２０℃で保存した。この物質を使用して、最初のプラーク精製を実施した。合計で１２個のプラークを最高希釈液から選び取り、２４ウェルプレート中に播種したＰＥＲ．Ｃ６細胞上で増殖させた。増殖させたプラークを、校正ポリメラーゼＰｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログＮｏ．Ｍ７７４５）ならびにプライマーセットＡｄ２６−１（配列番号７３）およびＡｄ２６−７（配列番号７４）を使用するＰＣＲにより、導入遺伝子領域の完全性に関して試験した（図４を参照されたい）。ＰＣＲ産物は、ＣＭＶプロモーター、ポリＡ配列、Ｅ１Ａタンパク質のコード領域の先頭を含み、予想されるサイズは３．３ｋｂである。ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖベクターのＰＣＲから得た導入遺伝子領域配列とＰＣＲ産物用の参照配列（配列番号９３）とのアラインメントにより、配列を分析した。
【０１５７】
プラーク３を優先し、２回目のプラーク精製にかけた。２回目から、最高希釈液からの２０個のプラークを選択した。合計で１２個のプラークを、ＭＷ２４プレートフォーマット中に播種したＰＥＲ．Ｃ６細胞上で増殖させて分析した。更なるプラーク精製での導入遺伝子領域の完全性を、校正ポリメラーゼＰｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログＮｏ．Ｍ７７４５）と、より特異的な産物のバンドがもたらされることからＡｄ２６−１およびＡｄ２６−７ではなく導入遺伝子領域プライマーＡｄ２６−１（配列番号７３）およびＡｄ２６−１０（配列番号８１）（それぞれＣＭＢプロモーターにおよびＥ１コード領域に位置する）とを使用するＰＣＲで分析した（図５を参照されたい）。ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖベクターの得られた導入遺伝子領域配列のアラインメントを、Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ参照配列（配列番号９３）と比較した。
【０１５８】
得られた結果に基づいて、プラーク番号３（図５Ｂ、レーン２を参照されたい）を選択して次に進んだ。その後、ウイルスを増殖させ、３段階の凍結／解凍サイクルおよび２段階の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）遠心分離法により、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖベクターを細胞ペレットから精製した。宿主細胞ＤＮＡをＢｅｎｚｏｎａｓｅ処理により分解した。ベクターをクライオバイアル中に等分し、液体窒素で急速凍結させ、−８０℃で保存した。
【０１５９】
実施例５：ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１  ＨＩＶＥｎｖ組み換えアデノウイルスベクターのキャラクタリゼーション。
ウイルスの感染力価の測定。
精製したｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖのウイルス粒子（ｖｐ）量（ｖｐ／ｍＬ）を、１％ＳＤＳの存在下での２６０ｎｍにおける光学密度を測定することにより、分光光度法を使用して最初に測定した。あるいは、ＨＰＬＣも使用してｖｐ／ｍＬを測定した。９１１細胞を使用するＴＣＩＤ５０アッセイまたはプラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイにより、感染粒子量を測定した。ＰＦＵアッセイの場合、１日目に、２９３細胞またはＰＥＲ．５５Ｋ細胞等のアデノウイルス増殖を許容する細胞を、６ウェルプレート中にウェル当たり８．５×１０５個の細胞の密度で播種した。０日目に、細胞を、精製したアデノウイルスベクターの対数希釈液で感染させ、その後、２４時間の感染期間後に寒天で覆った。１４日目に、複数のプラークが重複していないようにプラークが十分に離れているウェル中のプラークを計数した。プラーク形成単位当たりのウイルス粒子（ｖｐ／ＰＦＵ）を下記のように算出した。
１４日目のプラークの数／希釈液＝ＰＦＵ／ｍｌ
プレート上で計数した全ての希釈液の平均を算出した。
（平均ＰＦＵ／ｍｌ）／ウイルス力価（ｖｐ／ｍｌ）＝ｖｐ／ＰＦＵ
【０１６０】
導入遺伝子のＰＣＲおよび配列分析
導入遺伝子およびＰＣＲ配列分析を、上記実施例４に記載したように実施した。
【０１６１】
導入遺伝子の発現
Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖモザイクＨＩＶ抗原をコードする導入遺伝子の発現レベルをウェスタンブロット分析により測定した。得ている精製済ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１ＨＩＶＥｎｖベクターを、感染多重度を増加させて（ＭＯＩ：細胞当たり１０００ｖｐ、２５００ｖｐ、５０００ｖｐ、１００００ｖｐ、２５０００ｖｐおよび５００００ｖｐ）Ａ５４９細胞に感染させた。インキュベーションの３日後に、感染したＡ５４９細胞と１例の非感染コントロールサンプルとから溶解物を調製した。ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１ＨＩＶＥｎｖに関するＭｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ発現を、一次抗体抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログＮｏ．ＮＥＡ−９３０１）および二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログＮｏ．１７０−６５１６）を使用するウェスタンブロット分析で確認した。
【０１６２】
純度の測定
ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖの純度を、アデノウイルス粒子を分解させるおよびｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１ＨＩＶＥｎｖベクターを構成する個々のタンパク質を分離させる変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。４種の異なるｖｐ量（５×１０８ｖｐ、１×１０９ｖｐ、３×１０９ｖｐおよび６×１０９ｖｐ）を、様々な濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（０．５μｇ、０．１μｇ、０．０５μｇおよび０．０１μｇ）で分析した。
【０１６３】
観測したタンパク質のバンドのサイズを、Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  Ｍａｒｋｅｒの泳動パターンと比較した。明白なサイズを使用して、ゲル上のバンドを具体的なタンパク質へと推定的に割り当てた。インスタントブルー染色（ｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ、カタログＮｏ．１９４−ＩＳＢ１Ｌ）後、ゲルをスキャンし、バンドの強度をＧｅｌ  Ｐｒｏ６．０ソフトウェアで測定した。ＢＳＡを、既知の濃度の内部マーカーとして使用した。目に見えるバンドが既知のアデノウイルス関連タンパク質（１１８ｋＤ：ヘキソン、６０ｋＤ：ペントンベース、５９ｋＤ：ｐＩＩＩａ（マイナー（ｍｉｎｏｒ）カプシドタンパク質）、４５ｋＤ：ｐＶ（マイナーコアタンパク質）、２６ｋＤ：ｐＶＩ（マイナーカプシドタンパク質）、２０ｋＤ：ｐＶＩＩ（コアタンパク質）に相当することから、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖに関して観測したタンパク質のバンドパターンは、アデノウイルスに関して予想される通りであった。予想されないまたは未知のバンドを検出しなかった。
【０１６４】
実施例６：様々な細胞株におけるＡｄ２６ベクターのＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの感染力および増殖。
複製可能なＡＤ２６ベクター（ｒｃＡｄ２６）の感染力および増殖キネティクスを分析した。具体的には、Ｅ３／Ｅ４の欠失およびＭｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ導入遺伝子の挿入を、細胞を感染させるのに必要なウイルス力価と複製可能なＡｄ２６ベクターの最大の細胞変性効果（ＣＰＥ）を達成するまでの時間とで定義される減弱化に関して評価した。
【０１６５】
試験したｒｃＡｄ２６ベクターを下記の表１に示し、下記の細胞株において、これらのベクターそれぞれの感染力および増殖キネティクスを野生型Ａｄ２６（Ａｄ２６．ＷＴ）と比較した：Ａ５４９（ヒト上皮肺癌細胞株、ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−１８５、バージニア州、マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ））、ＨｕＴｕ８０（ヒト十二指腸腺がん細胞株、ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−４０）およびＰＥＲ．５５Ｋ（Ａｄ  Ｅ１領域を補完するヒト上皮細胞株［１２］）。Ｅ１領域を導入遺伝子カセットの後方で複製不能なＡｄ２６に戻すことにより、ｒｃＡｄ２６ベクターを複製可能にした。比較したベクターのバージョンでは、Ｅ３領域の一部が欠失しており、またはＥ３領域およびＥ４領域の両方の一部が欠失しており、Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ導入遺伝子を有した、または有していなかった。比較のために、野生型Ａｄ２６の複製不能バージョンも試験した。
【０１６６】
【表１】
2017507672.tif 000003
【０１６７】
感染の前日に６ウェルプレート中にＡ５４９細胞、ＨｕＴｕ８０細胞またはＰＥＲ．５５Ｋ細胞を最初に播種することにより、感染力アッセイを実施した。翌日、細胞を様々な感染多重度（ＭＯＩ）（１０００、３３３、１００、３３、１０および０）にてＡｄ２６ベクターで感染させた。次いで、感染後６日目まで、培養物をモニタリングし、観測した細胞変性効果（ＣＰＥ）の割合を毎日数量化して評価した。ベクターおよび細胞株の各組み合わせを３種の複製実験で試験した。試験した細胞株それぞれのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力実験の結果を図６に示す。
【０１６８】
全てのｒｃＡｄ２６ベクターに関して、非補完型のＡ５４９細胞（図６Ａ）およびＨｕＴｕ８０細胞（図６Ｂ）の両方における野生型Ａｄ２６と比較して、これらの細胞株においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製能が有意に低下した（単層を感染させるのにより高い力価を必要とし、最大のＣＰＥをもたらすのにより長くかかった）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製能の低下は段階的に起きており、部分的なＥ３欠失のみを含むベクターではわずかに低下するだけであり、次いで、Ｅ３およびＥ４の両方が部分的に欠失した場合により低下するようになった。Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖをコードする導入遺伝子を含むベクターで複製能が最も低下し、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ（部分的なＥ３／Ｅ４欠失およびＭｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖのコーディング）での複製能の低下が最も顕著であった。野生型Ａｄ２６と比較して同じウイルス増殖を達成するためには、約１００倍超のウイルスが必要であった。予想したように、非複製型Ａｄ２６ベクターは、Ａ５４９細胞株またはＨｕＴｕ８０細胞株のいずれでも複製しなかった。
【０１６９】
コントロールとして、Ｅ１を補完するＰＥＲ．５５Ｋ細胞中でのベクター増殖を評価した。このデータから、ＰＥＲ．５５Ｋ細胞を感染させた場合に野生型と比較して様々なＡｄ２６ベクター間の増殖に有意な差異はないことが実証された（図６Ｃ）。
【０１７０】
これらの実験の結果は、複製型組み換えｒｃＡｄ２６ベクターは、Ａ５４９細胞株およびＨｕＴｕ８０細胞株の感染で使用した場合に、野生型Ａｄ２６と比較して、感染力価を有意に低下させ、完全なＣＰＥを達成するまでの時間を延ばしたが、ＰＥＲ．５５Ｋ細胞の感染で使用した場合には増殖が低減しなかったことを示す。非補完型細胞における複製型組み換えｒｃＡｄ２６ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製能の低下は、Ｅ３コード領域およびＥ４コード領域の両方の部分的欠失でおよびベクターが導入遺伝子を含む場合に（例えば、Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖをコードする核酸配列を含む場合に）最も顕著であった。ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖベクターの複製能は、野生型Ａｄ２６の複製能と比べて少なくとも１００倍低かった。この複製能の低下（即ち減弱化）は、その他のアデノウイルスベクターではこれまで観測されておらず、このベクター構築物の構造に基づいて予想することは不可能であった。
【０１７１】
実施例７：ヒト細胞株およびアカゲザル細胞株における複製型組み換えＡｄ２６ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力および増殖の比較。
複製型組み換えＡｄ２６ベクターｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．空および複製不能なＡｄ２６ベクター非ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．空（両方とも上記表１に記載されている）の感染力および増殖キネティクスを、Ａ５４９細胞およびＰＥＲ．５５Ｋ細胞で分析した。様々なＭＯＩ（１０００、１００または１０）で細胞を感染させることにより、上記実施例６に記載したように感染力アッセイを実施した。野生型Ａｄ２６（Ａｄ２６．ＷＴ）をコントロールとして試験した。結果をＣＰＥの割合として報告し、図７Ａに示す。
【０１７２】
複製型組み換えＡｄ２６ベクターであるｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．空およびｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖの感染力および増殖キネティクスをＭＫ−２細胞（アカゲザルの腎細胞株）で分析した。コントロールに関して、Ａｄ２６．ＷＴ、およびアカゲザルに由来する複製可能なサルＡｄベクター（ｒｃＳＡｄ．ＳＩＶｇａｇ）を試験した。また、１０００、３３３および１００のＭＯＩで細胞を感染させることにより、上記実施例６に記載したように感染力アッセイを実施した。この結果をＣＰＥの割合として報告し、図７Ｂに示す。
【０１７３】
上記実験の結果から、予想したように、試験した野生型Ａｄ２６および複製型組み換えＡｄ２６ベクターがＡ５４９細胞中において効率よく増殖したが、複製不能なＡｄ２６ベクターは増殖しなかったことが実証される（図７Ａ）。更に、予想したように、３種のベクター全てが、アデノウイルスＥ１タンパク質を補完する細胞株であるＰＥＲ．５５Ｋ細胞中において良好に増殖した。加えて、これらの結果から、これらのベクターはいずれもアカゲザル細胞株ＭＫ２中において複製しなかったが、複製可能なサルＡｄベクターがＭＫ−２細胞中において良好に増殖した（図７Ｂ）ことから、複製型組み換えＡｄ２６ベクターの複製が種特異的であることが裏付けられる。
【０１７４】
実施例８：複数代の細胞継代後の複製型組み換えｒｃＡｄ２６ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力および増殖。
上記実施例６および７で観測したＣＰＥが、組み換えＡｄ２６ベクターが確かに複製型ウイルスであることを示したことを立証するために、複製型組み換えｒｃＡｄ２６ベクターであるｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．空、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．空、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．Ｍｏｓ１ＥｎｖおよびｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ（表１）の複製キネティクスを、Ａ５４９細胞培養物中におけるまたはＨｕＴｕ８０細胞培養物中におけるウイルスの２代の更なる継代の間中で比較した。
【０１７５】
ピペット操作で細胞および上清の両方を回収することにより、初代細胞培養物を完全なＣＰＥで回収し、−２０℃で凍結させた。その後、解凍した後に遠心分離で各溶解物を清澄化させることにより、再感染を実施した。細胞を再感染させるために、１００μＬの各細胞溶解物を、前日に６ウェルプレート中にウェル当たり８．５×１０５個の細胞で播種している細胞に添加した。次いで、感染後６日にわたり培養物をモニタリングしてＣＰＥの割合を毎日数量化して評価し、完全なＣＰＥの日に、感染した細胞溶解物を回収した。アデノウイルスの連続希釈で、前日にウェル当たり８．５×１０５個の細胞の濃度で６ウェルプレート中に播種しているＰＥＲ．５５Ｋ細胞またはＡ５４９細胞のいずれかを感染させることにより、ＰＦＵアッセイを実施した。翌日、寒天重層を加え、感染後７日目および１４日目にプラークを計数した。全ての連続希釈を二重で行った。
【０１７６】
この結果を図８Ａ〜図８Ｂに示し、この結果から、Ａ５４９細胞株およびＨｕＴｕ８０細胞株の両方において、試験した全ての複製可能な組み換えｒｃＡｄ２６ベクターが２代の継代の間中、良好に複製したことが実証され、このことにより、いくつかのその他の効果（例えば非特異的な細胞溶解）ではなく、観測したＣＰＥがベクターの複製を反映したことが裏付けられる。
【０１７７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力アッセイにおいて完全なＣＰＥで回収した溶解物のウイルス価を測定するために、上記と同じサンプルを使用してプラーク形成単位（ＰＦＵアッセイを実施した。１０００ＭＯＩの各ベクターに感染させたＡ５４９細胞培養物およびＨｕＴｕ８０細胞培養物から完全なＣＰＥで溶解物を回収し、次いで、Ａ５４９細胞（非補完型Ｅ１細胞）を使用してウイルス価を評価した。ＰＥＲ．５５Ｋ細胞（Ｅ１を補完する細胞）による実験をコントロールとして実施した。
【０１７８】
図８Ｃに示すＰＦＵアッセイの結果から、力価がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力アッセイで得た結果を密接に模倣しており、減弱化が段階的に起きていることが分かる。より具体的には、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．空ベクターは野生型Ａｄ２６と比べて１．９ｌｏｇ低いＰＦＵ価を有し、Ｍｏｓ１Ｅｎｖ導入遺伝子の付加により（ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ）、力価は野生型ウイルスと比べて２．７ｌｏｇ低下した。この効果はＨｕＴｕ８０細胞からの溶解物で更に顕著であり、この溶解物では、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．空ベクターは野生型Ａｄ２６と比べて２．２ｌｏｇ低い力価を有し、導入遺伝子の付加により、力価は野生型ウイルスと比べて４．４ｌｏｇ低下した。ＰＥＲ．５５Ｋ細胞によるコントロール実験では、予想したように、試験したベクターの間に有意な差異を観測しなかった。
【０１７９】
実施例９：複製型組み換えＡｄ２６ベクターと複製型組み換えＡｄ４ベクターとのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力の比較。
Ａ５４９細胞、ＨｕＴｕ８０細胞およびＰＥＲ．５５Ｋ細胞における、ｒｃＡｄ２６．ｄＥ３．ｄＥ４．Ｍｏｓ１Ｅｎｖベクターの感染力と、Ｈ１Ｎ１由来の血球凝集素タンパク質であるインフルエンザＨ５を発現する複製型組み換えアデノウイルス４（Ａｄ４）ベースのベクター（ｒｃＡｄ４．Ｈ５）の感染力とを比較するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染力アッセイを使用して実験を実施した。ＰａｘＶａｘにより開発されたｒｃＡｄ４．Ｈ５ベクターは、フェーズ１の臨床試験において安全であり免疫原性であると既に証明されている［１、５９］。ｒｃＡｄ４．Ｈ５ベクターおよび野生型Ａｄ４（Ａｄ４．ＷＴ）ベクターをＰａｘＶａｘ（カリフォルニア州、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ））から得た。野生型Ａｄ２６（Ａｄ２６．ＷＴ）もコントロールとして試験した。様々なＭＯＩ（１００−、３３３、１００、３３および１０）を使用して、上記実施例６により詳細に記載したように実験を行った。
【０１８０】
試験した各細胞株に関して結果を図９に示す：Ａ５４９（図９Ａ）、ＨｕＴｕ８０（図９Ｂ）およびＰＥＲ．５５Ｋ（図９Ｃ）。これらの結果から、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖベクターは、Ａ５４９細胞の感染から３日後に、ｒｃＡｄ４．Ｈ５と比較して９１倍低下した複製能を示し（図９Ａ、ｐ＜０．０００１）、ＨｕＴｕ８０細胞の感染から３日後に、ｒｃＡｄ４．Ｈ５と比べて７２．５倍低下した複製能を示した（図９Ｂ、ｐ＝０．００９）ことが分かる。予想したように、試験した全てのベクターはＰＥＲ．５５Ｋ細胞中において良好に増殖した（図９Ｃ）。
【０１８１】
実施例１０：複製型組み換えｒｃＡｄ２６ベクターのマウス免疫原性および感染力。
マウス中において、異なるモザイクＨＩＶ抗原を発現する本発明に係る下記の複製型組み換えＡｄ２６ベクターの免疫原性を評価した：ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ２Ｅｎｖ、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１ＧａｇＰｏｌおよびｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ２ＧａｇＰｏｌ。
【０１８２】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に、ＰＢＳ中の精製済アデノウイルスｒｃＡｄ２６ベクターの１０９個のウイルス粒子（ｖｐ）（５０・Ｌの注射液）を筋肉内（ＩＭ）注射した。免疫付与から２８日後にマウスを屠殺し、脾臓を摘出した。ＩＦＮ−・ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで脾細胞を評価することにより免疫原性を測定した。９６ウェルマルチスクリーンプレート中において、脾細胞を、ｒｃＡｄ２６ベクター中のモザイクＨＩＶ−１のＧａｇ配列、Ｐｏｌ配列またはＥｎｖ配列と一致する重複ペプチドプールで刺激した。各ペプチドプールを、対応するモザイク抗原の全アミノ酸配列をカバーする１１個のアミノ酸が重複する１５個のアミノ酸の長さのペプチドで構成した。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、標識を付して現像し、スポット形成細胞を可視化した。注射したベクターから発現されたモザイクタンパク質に応答した細胞は、ＩＦＮ−・の排出によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激後にウェル中にスポットとしてｉｎ  ｖｉｖｏで現れ、この細胞に、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよび色原体を使用して、標識を付して可視化した。
【０１８３】
この結果を１０６個の脾細胞当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表し、データを図１０にプロットする。この結果から、試験した全てのｒｃＡｄ２６ベクターが、こられそれぞれのペプチドプールに対する免疫応答をＢａｌｂ／ｃマウス中で発生させることが実証された。
【０１８４】
実施例１１：凍結乾燥したｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖのマウス免疫原性および感染力。
本発明に係る複製型組み換えアデノウイルスベクターであるｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖの凍結乾燥のマウス免疫原性および感染力への影響を試験した。異なる緩衝液を使用して、２つのバッチのｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖを凍結乾燥させた。各凍結乾燥バッチのサンプル（Ｌｙｏ＃２およびＬｙｏ＃３と標識した）をリン酸緩衝生理食塩水中で再構成し、０．２２ｕｍの無菌フィルタに通してろ過した。分光光度測定によりウイルス粒子濃度（ｖｐ）を測定し、ｖｐ／ＰＦＵ結果を下記表２に示すように算出した。
【０１８５】
【表２】
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【０１８６】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に、再構成したＬｙｏ  ＃２  ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖベクターまたは再構成したＬｙｏ  ＃３  ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖベクターのどちらかの１０８個のｖｐまたは１０９個のｖｐのＩＭ注射により免疫を付与した。コントロールとして、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖの非凍結乾燥バッチを試験した。免疫付与から２８日後、マウスを屠殺し、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ構築物中のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ配列と一致する重複ＨＩＶ−１エンベロープペプチドプールおよびその他のＨＩＶ−１エンベロープペプチドプールを使用するＩＦＮ−・ＥＬＩＳＰＯＴで脾細胞を評価した。
【０１８７】
モザイクペプチドプールＭｏｓ１Ｅｎｖ（２種のサブプール：Ｍｏｓ１Ｅｎｖ１およびＭｏｓ１Ｅｎｖ２に分割した）を、モザイクＥｎｖタンパク質Ｍｏｓ１ＥＮＶ（配列番号４８）の全アミノ酸配列をカバーする１１個のアミノ酸が重複する１５個のアミノ酸の長さのペプチドで構成した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから得た潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）エンベロープペプチドプール（ＨＩＶ  ＰＴＥ  Ｅｎｖ、３種のサブプール：ＨＩＶ  ＰＴＥ  Ｅｎｖ１、ＨＩＶ  ＰＴＥ  Ｅｎｖ２、ＨＩＶ  ＰＴＥ  Ｅｎｖ３に分割した）は、潜在的なＴ細胞決定基である天然に生じる９個のアミノ酸配列を含む１５個のアミノ酸の長さのペプチドで構成されており、公平な方法で捕獲されている。ＰＴＥペプチドパネルは、世界中で流行しているＨＩＶ−１株のＨＩＶ−１の配列に埋め込まれている、最も頻度が高い潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）の発現を可能にするように設計されている。上記実施例７に記載したのと同じ方法でＩＦＮ−・ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、この結果を図１１Ａに示す。投与前および免疫付与から２８日後にＨＩＶ−１クレードＣエンベロープ結合抗体ＥＬＩＳＡおよびＭｏｓ１ＨＩＶＥｎｖ結合抗体ＥＬＩＳＡを実施して、抗体の誘導を測定した。この結果を図１１Ｂに示す。
【０１８８】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイの結果は、凍結乾燥させて再構成したｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖが感染性のままであることを示す。従って、ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖベクターの免疫応答を誘発する能力は、ベクターの凍結乾燥の影響を受けない。
【０１８９】
実施例１２：マウス中における、複製不能なＡｄ２６アデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの複製と、複製可能なｒｃＡｄ２６アデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの複製との比較。
筋肉内（ＩＭ）注射（５０・ｌ／四頭筋）または鼻腔内（ＩＮ）（２５・ｌ／鼻孔）により１０１０個のｖｐでＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）に免疫を付与することにより、マウス中における複製不能なＡｄ２６組み換えアデノウイルスベクター（Ａｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの複製と複製可能なｒｃＡｄ２６組み換えアデノウイルスベクター（ｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ）のｉｎ  ｖｉｖｏでの複製とを比較した。複製不能なＡｄ２６．Ｍｏｓ１ＥｎｖベクターはＥ１欠失を含んだ（複製不能な組み換えＡｄ２６ベクターの概略図に関して図１を参照されたい）。
【０１９０】
０日（ｄ）目（０週目）、７日目（１週目）、１４日目（２週目）、２１日目（３週目）および２８日目（４週目）に、免疫付与したマウスから血清、直腸スワブおよび口腔スワブを採取した。サンプルに対するＲＴ−ＰＣＲを実施してウイルス排出を確認した。プライマーはＡｄ２６のヘキソン領域を対象とし、特に超可変領域を標的としてその他の血清型との交差反応を防いだ。プライマーをＴａｑｍａｎプローブと組み合わせて使用した。使用したプライマーは、Ａｄ２６．ＲＴ．ｆｗｄ  ５’−ＴＧＣＴＴＡＣＴＴＴＧＡＣＧＴＣＣＣＴＧ−３’（配列番号８６）およびＡｄ２６．ＲＴ．ｒｅｖ  ５’−ＡＣＴＧＴＴＡＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣ−３’（配列番号８７）であった。使用したプローブは、Ａｄ２６．ＲＴプローブ５’−ＴＴＧＴＡＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣ−３’（配列番号８８）であった。ＲＴ−ＰＣＲの結果を図１２に示し、コピー／ｍＬとして報告する。コントロールサンプルに５．０４×１０６コピー／ｍＬのプラスミドＤＮＡを添加した。アッセイの感度は１０００コピー／ｍＬである。この結果は、ウイルス排出の証拠がなかったことを示す。
【０１９１】
全ての時点（０日目、７日目、１４日目、２１日目および２８日目）で、採取した血清サンプルに対するＥＬＩＳＡも実施し、ＨＩＶクレードＣエンベロープ結合抗体力価（図１３Ａ）およびモザイクＥｎｖ結合抗体力価（図１３Ｂ）を測定した。この結果は、複製不能なＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖおよび複製可能なｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖの両方がＨＩＶクレードＣエンベロープ結合抗体力価およびモザイクエンベロープ結合抗体力価を誘導したことを示す。
【０１９２】
２８日目に脾細胞を採取し、ＩＦＮ・ＥＬＩＳＰＯＴを実施して、実施例６および１０に記載されているのと同じ方法で免疫原性を測定した（図１４）。各レジメン（即ち、ベクターおよび投与経路）に関して試験したペプチドプールは、Ｍｏｓ１  Ｅｎｖ、Ｍｏｓ２  Ｅｎｖ、ＰＴＥ  Ｅｎｖ１、ＰＴＥ  Ｅｎｖ２およびＰＴＥ  Ｅｎｖ３であった。結果を、１０６個の脾細胞当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告する。
【０１９３】
安全性のデータは収集しなかったが、研究の間中、全ての群においてマウスは全て健康で良好のように見えることに留意した。心的状態および外見への悪影響を観測しなかった。
【０１９４】
ＥＬＩＳＡ実験およびＥＬＩＳＰＯＴ実験の結果から、複製可能なｒｃＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ組み換えアデノウイルスベクターおよび複製不能なＡｄ２６．Ｍｏｓ１Ｅｎｖ組み換えアデノウイルスベクターの両方がマウスにおいて免疫原性であったことが分かる。ＨＩＶ特異的抗体応答は、ＩＭ投与またはＩＮ投与のいずれかで与えた複製型ベクターおよび非複製型ベクターで類似していた（図１３）。Ｔ細胞応答は、ベクターをＩＭ投与で与えた場合に非常に大きかった（図１４）。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、予想したように、マウス中でのベクターの複製の証拠がないことを示した。なぜならば、アデノウイルスに関する種の障壁が存在するからである。
【０１９５】
実施例１３：非ヒト霊長類におけるｒｃＡｄ２６．ＳＩＶｇａｇの免疫原性および複製。
０週目および２４週目に、複製可能なＡｄ２６−ＳＩＶＧａｇベクター（Ｅ１コード領域を含む）を有する１０１１個のｖｐおよび複製不能なＡｄ２６−ＳＩＶＧａｇベクター（Ｅ１コード領域を欠いている）を有する１０１１個のｖｐの筋肉内（ＩＭ）注射により、非ヒト霊長類であるインド起源のアカゲザル（マカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  Ｍｕｌａｔｔａ））（Ｎ＝３／群）に免疫を付与した。０週目、２週目、２４週目、２６週目および３２週目に、１１個のアミノ酸が重複する１５個のアミノ酸ペプチドからなり、全Ｇａｇ配列をカバーするＧａｇペプチドプール（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから得た）を使用してＩＦＮ・−ＥＬＩＳＰＯＴを実施し、免疫応答を測定した。上記実施例１２に記載したように、−１週目、１週目、４週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目および１６週目に血清のＲＴ−ＰＣＲを行い、ウイルス複製を調べた。上記実施例６および１０〜１１に記載したようにＲＴ−ＰＣＲおよびＩＦＮ・−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、結果を図１５に示す。
【０１９６】
これらの結果から、複製可能なＡｄ２６．ＳＩＶＧａｇベクターおよび複製不能なＡｄ２６．ＳＩＶＧａｇの両方が非ヒト霊長類において免疫原性であることが実証される。非ヒト霊長類中において複製可能なベクターが複製するというＲＴ−ＰＣＲによる証拠はなかった。マウスにおける上記実施例１２に記載の実験と同様に、および実施例７（図７）で実証されているように、アデノウイルスベクターは、種の障壁に起因して非ヒト霊長類中では複製しないであろうと予想された。
【０１９７】
実施例１４：導入遺伝子カセットの後方にＥ１コード領域を有する、導入遺伝子を欠いているＡｄ３５アダプタープラスミド（ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．空）のクローニング。
空Ａｄ３５組み換えベクターｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．空を、図１６Ａに示すように構築した。ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．空ベクターは、導入遺伝子カセットの後方にＥ１コード領域を含む。「空」とは、このベクターが異種核酸配列または導入遺伝子を含まないが、目的の任意の異種核酸配列を、ＣＭＶプロモーターの制御下でおよびＥ１コード領域の上流で、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．空ベクターの導入遺伝子カセットの多重クローニング部位に挿入することができることを示す。例えば、モザイク抗原Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖをコードする核酸配列をｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．空の導入遺伝子カセットの多重クローニング部位にクローニングして、Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ遺伝子がＥ１コード領域の前方に位置するＡｄ３５組み換えベクターｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ（配列番号８４）を得ることができる。
【０１９８】
「ＰＣＲ断片Ａ」および「ＰＣＲ断片Ｂ」の作製
２種のＰＣＲを実施して、導入遺伝子カセットの後方にＥ１領域をクローニングした。第１のＰＣＲは、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵから導入遺伝子カセットを増幅させるためであり、このＰＣＲを、ＣＭＶプロモーター中の既存のＮｄｅＩ部位と重複するフォワードプライマーと、ポリＡ領域と重複するＭｌｕＩを含むように設計されているリバースプライマーとを使用して実施した。使用したフォワードプライマーは、配列５’−ＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣ−３’（配列番号８９）を有するＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．ＮｄｅＩ．ｆｗｄであり、使用したリバースプライマーは、配列５−ＣＧＡＴＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号９０）を有するＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．ＭｌｕＩ．ｒｅｖであった。この反応からＰＣＲ断片Ａを得た。図１６Ａの概略的に標識された「ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ  ＰＣＲ断片Ａ」を参照されたい。
【０１９９】
第２のＰＣＲは、野生型アデノウイルスベクターゲノム（「Ａｄ３５ＷＴ」）からＥ１コード領域を増幅させるためであり、このＰＣＲを、Ａｄ３５ＷＴ配列のヌクレオチド４６４で始まるＭｌｕＩ部位を含むように設計されているフォワードプライマーを使用して実施した。リバースプライマーを、ｐＩＸ領域中の既存のＡｌｅＩ部位と重複するように設計した。使用したフォワードプライマーは、配列５’−ＣＡＣＡＧＡＣＧＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＣＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＡＣＣＴＣ−３’（配列番号９１）を有するＡｄ３５ＷＴ．４６４．ＭｌｕＩ．ｆｗｄであり、使用したリバースプライマーは、配列５’−ＧＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＡＡ−３’（配列番号９２）を有するＡｄ３５ＷＴ．ＡｌｅＩ．ｒｅｖであった。この反応からＰＣＲ断片Ｂを得た。図１６Ａの概略的に標識された「Ａｄ３５ＷＴ  ＰＣＲ断片Ｂ」を参照されたい。
【０２００】
ｐＡｄａｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．空（導入遺伝子カセットの後方のＥ１領域）のクローニング
ＰＣＲ断片ＡをＮｄｅＩおよびＭｌｕＩで消化した。ＰＣＲ断片ＢをＭｌｕＩおよびＡｌｅＩで消化した。ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．空をＮｄｅＩおよびＡｌｅＩで消化した。消化物をゲル精製し、三重ライゲーションで互いに連結させてｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．空を得た。
【０２０１】
実施例１５：導入遺伝子カセットの前方にＥ１コード領域を有する、導入遺伝子を欠いているＡｄ３５アダプタープラスミド（ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．空）のクローニング。
空Ａｄ３５組み換えベクターｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．空（配列番号２６）を、図１６Ｂに示すように構築した。ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．空ベクターは、導入遺伝子カセットの前方にＥ１コード領域を含む。「空」とは、このベクターが異種核酸配列または導入遺伝子を含まないが、目的の任意の異種核酸配列を、ＣＭＶプロモーターの制御下でおよびＥ１コード領域の下流で、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．空ベクターの導入遺伝子カセットの多重クローニング部位に挿入することができることを示す。例えば、モザイク抗原Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖをコードする核酸配列をｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．空の導入遺伝子カセットの多重クローニング部位にクローニングして、Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ遺伝子がＥ１コード領域の後方に位置するＡｄ３５組み換えベクターｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．Ｍｏｓ１−ＨＩＶＥｎｖ（配列番号８５）を得ることができる。
【０２０２】
Ｅ１遺伝子中のＰａｃＩ部位の変異
Ａｄ３５野生型Ｅ１コード領域はＰａｃＩ制限酵素部位を含む。ＰａｃＩ部位を不活性化するために、部位特異的な変異生成を実施した。全プラスミドをカバーするＰＣＲにおいて、フォワードプライマーとしてｒｃＡｄ３５．Ｅ１ｍｕｔ．ｆｗｄ  ５’−ＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＧＧＧＡＡＡＴＧＣＣＡ−３’（配列番号６４）を使用し、リバースプライマーとしてｒｃＡｄ３５．Ｅ１ｍｕｔ．ｒｅｖ  ５’−ＴＧＧＣＡＴＴＴＣＣＣＴＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣ−３’（配列番号６５）を使用し、テンプレートとして（実施例１４で得た）ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１．ａｔｇ．空を使用して、１つの塩基対をＴからＣへと変更することにより、ＰａｃＩ部位を不活性化させた。ＰＣＲの完了後、ＰＣＲミックスをＤｐｎＩ酵素で消化してｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１．ａｔｇ．空テンプレートＤＮＡを除去した。消化されたＰＣＲミックスの小アリコートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換させ、変異したＰａｃＩ部位を含むクローンを、制限酵素分析および配列決定によりスクリーニングした。
【０２０３】
ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．空（導入遺伝子カセットの前方のＥ１領域）のクローニング
導入遺伝子カセットの前方にＥ１領域をクローニングするために、テンプレートとしてｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ａｔｇ．空を使用してＰＣＲを実施した。使用したフォワードプライマーは、ポリＡ配列の直後のＥ１領域の先頭（Ａｄ３５ＷＴのｎｔ４６４）に位置しており、リバースプライマーは、ｐＩＸの前方のＥ１領域の後尾（Ａｄ３５ＷＴのｎｔ３４８３）に位置する。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方が、それらの中に設計されたＡｖｒＩＩ部位を有した。プライマーの配列は下記の通りであった：３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．ＡｖｒＩＩ．ｆｗｄ  ５’−ＡＴＡＡＣＡＣＣＴＡＧＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＡＣＣＴＣ−３’（配列番号８２）および３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．ＡｖｒＩＩ．ｒｅｖ  ５’−ＡＴＡＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＴＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴ−３’（配列番号８３）。
【０２０４】
ＰＣＲ産物およびｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵの両方をＡｖｒＩＩで消化した後、ＰＣＲ産物およびｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵを互いに連結して、Ｅ１コード領域中に変異したＰａｃＩ部位も含むｐＡｄＡＰｔ３５ＢＳＵ．Ｅ１ｂｔｇ．空を得た。制限酵素分析および配列決定により、クローンのスクリーニングを行った。
【０２０５】
実施例１６：Ａｄ３５コスミドベクター（ｐＷｅ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．ｄＥ３．３５ｏｒｆ６）のクローニング。
完全コスミドｐＷｅ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．ｄＥ３．３５ｏｒｆ６ベクター（配列番号２５）のクローニング。
下記のプライマー対を使用するＰＣＲを行い、各末端上にＮｏｔＩ部位を有するｐＷｅコスミドバックボーンを得た：フォワードプライマーｐＷｅ．ＮｏｔＩ．ｆｗｄ  ５’−ＡＡＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＴＣＣＡＴＴＣＣＧＡＣＡＧＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号６６）およびリバースプライマーｐＷｅ．ＮｏｔＩ．ｒｅｖ  ５’−ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＧ（配列番号６７）。プライマー中に５’ＮｏｔＩ部位を設計した。ｐＷｅ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ＥｃｏＲＶプラスミドおよびｐＢｒ／Ａｄ３５．ｄＥ３．ｄＥ４．３５ｏｒｆ６プラスミドの両方をＮｏｔＩおよびＲｓｒＩＩで消化してゲル精製した（両方のプラスミドの説明に関してＶｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００３）７７（１５）８２６３−７１を参照されたい）。３点ライゲーションを行い、完全長のｐＷｅ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．ｄＥ４．３５ｏｒｆ６コスミドベクター（配列番号２５）を得て、このｐＷｅ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．ｄＥ４．３５ｏｒｆ６コスミドベクターを消化および配列決定によりスクリーニングした。
【０２０６】
本実施例では、Ｅ１を導入遺伝子カセットの前方および後方の両方にクローニングした。ｒｃＡｄ３５ベクターに関して、Ｅ１を導入遺伝子カセットの下流に配置した場合にはｒｃＡｄ３５ベクターにある程度の不安定性が存在するが、Ｅ１を導入遺伝子カセットの上流に配置した場合にはこの不安定性が見られないことを観測した。
【０２０７】
従って、本発明の好ましい実施形態では、異種核酸配列は、左側のＩＴＲと、機能するＥ１コード領域の５’末端との間に位置している。即ち、機能するＥ１コード領域が異種核酸配列の上流に設置されている。
【０２０８】
実施例１７：非感染成人におけるＨＩＶ−１用の複製型組み換えＡｄ２６ベクター経口ワクチンの安全性および免疫原性に関する臨床試験。
複製型組み換えｒｃＡｄ２６．ＭＯＳ１．ＨＩＶＥｎｖワクチンベクターを、ランダム化比較二重盲検フェーズ１臨床試験において単回経口投与で投与した場合のＨＩＶ−１の未感染の成人における安全性およびＨＩＶ−１に対する免疫原性に関して試験した。本試験の目的として、ワクチンの安全性および忍容性を評価すること、直腸分泌物中でのおよび口腔咽頭分泌物中でのウイルス排出を確認すること、ならびにワクチンベクターの４種の増加する投与量により誘発される体液性免疫応答および細胞性免疫応答を評価することが挙げられる。
【０２０９】
試験対象集団は、１８〜４０歳の健康な男性および女性を含む。ワクチンを、経口投与用の腸溶コーティングカプセルとして製剤化する。試験参加者を４つの群に分け、それぞれに、下記の異なる投与量のｒｃＡｄ２６．ＭＯＳ１．ＨＩＶＥｎｖワクチンを投与する：１０８個のウイルス粒子（「ｖｐ」）／プラセボカプセル、１０９個のｖｐ／プラセボカプセル、１０１０個のｖｐ／プラセボカプセルまたは１０１１個のｖｐ／プラセボカプセル。プラセボを投与する試験参加者に、スクロース含有カプセルを投与する。ワクチンは複製可能であることから、ワクチン投与の２日前から試験参加者を隔離棟に収容し、ワクチン接種後少なくとも９日間まで収容し続ける。本試験を約１２ヶ月にわたり続ける。
【０２１０】
試験参加者から直腸スワブおよび咽頭スワブを得てウイルス排出を評価する。具体的には、ＰＣＲおよびアデノウイルス培養により、ｒｃＡｄ２６．ＭＯＳ１．ＨＩＶＥｎｖの存在に関して直腸スワブおよび咽頭スワブを分析する。Ａｄ２６ベクターおよびＥｎｖインサートの両方に関してリアルタイム（ｒｔ）ＰＣＲを実施し、ベクターおよびインサートを定量化する、ならびにワクチンの安定性を評価する。アデノウイルス培養を実施して感染性ウイルスの存在を評価する。陽性培養物の血清型判定を更に実施し、ウイルスがｒｃＡｄ２６．ＭＯＳ１．ＨＩＶＥｎｖであることを確認する。
【０２１１】
免疫付与後の様々な時点で各試験参加者から血液サンプルを得て、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の評価等のＨＩＶに関連する免疫原性の評価を行う。血液サンプルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により定量化したＨＩＶ−１  Ｅｎｖに結合する抗体の量に関してアッセイし、ウイルス中和アッセイにより定量化したＨＩＶ−１に対する中和抗体の量に関してアッセイし、ＩＦＮ−・ＥＬＩＳＰＯＴにより定量化したＨＩＶ−１特異的Ｔリンパ球応答の大きさに関してアッセイする。血液サンプルを、予備的なＤＮＡおよびＲＮＡマイクロアレイならびに大規模配列決定アッセイにも使用することができる。
【０２１２】
全身性応答および粘膜性応答の更なる免疫原性評価として、ＨＩＶ−１特異的抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイおよび細胞媒介性ウイルス抑制（ＡＤＣＶＩ）アッセイ、Ａｄ２６特異的抗体の測定（例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＶＩ等）、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ、ＨＩＶ−１のＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞媒介性抑制のフローサイトメトリー、Ｔリンパ球の増殖能、Ｂ細胞レパートリー分析、遺伝子発現プロファイリングおよびエピトープマッピングを挙げることができる。
【０２１３】
加えて、直腸ガーゼ芯（ｒｅｃｔａｌ  ｗｉｃｋ）で試験参加者から直腸粘膜分泌物を採取し、ＨＩＶ−１  ＥｎｖおよびＡｄ２６に対する潜在的な粘膜免疫を評価する。そのような試験として、ＥＬＩＳＡによるＡｄ２６特異的抗体およびＨＩＶ−１特異的抗体の測定、ならびに直鎖ペプチドマイクロアレイによる、Ｅｎｖペプチドに対する抗体エピトープマッピングを挙げることができる。
【０２１４】
志願者の家族接触者（即ち、試験参加者と同じ住居を共有する個人）へのｒｃＡｄ２６．ＭＯＳ１．ＨＩＶＥｎｖの伝播の可能性を評価する。試験参加者の家族接触者に週に１回接触し、ワクチンベクターの伝播に関連している可能性がある疾病の存在に関して評価する。
【０２１５】
この研究の間中、あらゆる有害事象の発生に関しても参加者をモニタリングする。
【０２１６】
参考文献
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５．Ｆｌｙｎｎ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈａｓｅ  ３  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １２０  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００５．１９１（５）：ｐ．６５４−６５．
６．Ｐｉｔｉｓｕｔｔｉｔｈｕｍ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １２０  ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｍｏｎｇ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｄｒｕｇ  ｕｓｅｒｓ  ｉｎ  Ｂａｎｇｋｏｋ，Ｔｈａｉｌａｎｄ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００６．１９４（１２）：ｐ．１６６１−７１．
７．Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＶＴＮ  ５０３／Ｐｈａｍｂｉｌｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｃｌａｄｅ−Ｂ−ｂａｓｅｄ  ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ：ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｅｓｔ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｐｈａｓｅ  ２ｂ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２０１１．１１（７）：ｐ．５０７−１５．
８．Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎｅ（ｔｈｅ  Ｓｔｅｐ  Ｓｔｕｄｙ）：ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｔｅｓｔ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，２００８．３７２（９６５３）：ｐ．１８８１−９３．
９．Ｒｅｒｋｓ−Ｎｇａｒｍ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＡＬＶＡＣ  ａｎｄ  ＡＩＤＳＶＡＸ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈａｉｌａｎｄ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００９．３６１（２３）：ｐ．２２０９−２０．
１０．ＭｃＥｌｒａｔｈ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  Ｓｔｅｐ  Ｓｔｕｄｙ：ａ  ｃａｓｅ−ｃｏｈｏｒｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ，２００８．３７２（９６５３）：ｐ．１８９４−９０５．
１１．Ａｂｂｉｎｋ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｒａｒｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（９）：ｐ．４６５４−６３．
１２．Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００３．７７（１５）：ｐ．８２６３−７１．
１３．Ｆａｒｉｎａ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（２３）：ｐ．１１６０３−１３．
１４．Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｅｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ５，２６，３５，ａｎｄ  ４８  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１１．２９：ｐ．５２０３−５２０９．
１５．Ｍａｓｔ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ（Ａｄ）ｔｙｐｅ−５，ｔｙｐｅ−６，ｔｙｐｅ−２６  ａｎｄ  ｔｙｐｅ−３６  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  Ａｄ５  ｔｉｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＨＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｒｉａｌｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１０．２８（４）：ｐ．９５０−７．
１６．Ｃｈｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｒｅｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２０１０．８４（２０）：ｐ．１０５２２−３２．
１７．Ｔｈｏｒｎｅｒ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒｓ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂ−Ｓａｈａｒａｎ  Ａｆｒｉｃａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６．４４（１０）：ｐ．３７８１−３．
１８．Ｓｐｒａｎｇｅｒｓ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３．４１（１１）：ｐ．５０４６−５２．
１９．Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ｈｅｘｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｌｉｖｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｃｅｌｌ，２００８．１３２（３）：ｐ．３９７−４０９．
２０．Ｌｉｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００８．８２（１０）：ｐ．４８４４−５２．
２１．Ｌｉｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｎ  ＳＩＶ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｂｙ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００９．４５７（７２２５）：ｐ．８７−９１．
２２．Ｌｏｒｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｅｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１７９（３）：ｐ．１７２１−９．
２３．ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ，Ｂａｒｏｕｃｈ．ｅｔ  ａｌ．
２４．Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，．ｉｎ  ＡＩＤＳ  Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９．Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ．
２５．Ｋｕｓｃｈｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｐｈａｓｅ  ３，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅ，ｏｒａｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ４  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ７  ｖａｃｃｉｎｅ，ｉｎ  Ｕ．Ｓ．ｍｉｌｉｔａｒｙ  ｒｅｃｒｕｉｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１３．３１（２８）：ｐ．２９６３−７１．
２６．Ｍａｓｏｐｕｓｔ，Ｄ．ａｎｄ  Ｌ．Ｊ．Ｐｉｃｋｅｒ，Ｈｉｄｄｅｎ  ｍｅｍｏｒｉｅｓ：ｆｒｏｎｔｌｉｎｅ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２．１８８（１２）：ｐ．５８１１−７．
２７．Ｂｅｌｌ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｌｌｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｎｕｒｓｅｒｙ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｔ  ｊｕｎｉｏｒ  ｖｉｌｌａｇｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ，１９６１．７４：ｐ．２６７−２９２．
２８．Ｒｈｅｅ，Ｅ．Ｇ．ａｎｄ  Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｉｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｇ．Ｌ．Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，ａｎｄ  Ｒ．Ｄｏｌｉｎ，Ｅｄｉｔｏｒｓ．２０１０，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．
２９．Ｂｒａｎｄｔ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  １８，０００  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｉｌｌｎｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，１９６９．９０（６）：ｐ．４８４−５００．
３０．Ｆｏｘ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ  ｗａｔｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍ：ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｔａｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．ＶＩ．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ｖｉｒｕｓ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ，ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｌｌｎｅｓｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，１９６９．８９（１）：ｐ．２５−５０．
３１．Ｆｏｘ，Ｊ．Ｐ．，Ｃ．Ｅ．Ｈａｌｌ，ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．Ｃｏｏｎｅｙ，Ｔｈｅ  Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｗａｔｃｈ．ＶＩＩ．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，１９７７．１０５（４）：ｐ．３６２−８６．
３２．Ｎｏｅｌ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｆａｅｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｃｋ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８９−１９９２．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ，１９９４．４３（１）：ｐ．８４−９０．
３３．Ｆａｄｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ｓｅａｓｏｎａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ．Ｃｌｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒ（Ｐｈｉｌａ），２０１１．５０（６）：ｐ．４８３−７．
３４．Ａｂｂａｓ，Ｋ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｅａｔｅｒ  Ｔｏｒｏｎｔｏ  ａｒｅａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ｄｕｒｉｎｇ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００８  ｔｏ  Ａｐｒｉｌ  ２０１０．Ｖｉｒｏｌ  Ｊ，２０１３．１０：ｐ．１５．
３５．Ｄｉａｒｒｈｅａ：Ｗｈｙ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｒｅ  ｓｔｉｌｌ  ｄｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｗｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｏｎｅ，２００９，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｃｈｉｄｌｒｅｎ’ｓ  Ｆｕｎｄ（ＵＮＩＣＥＦ）／Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．
３６．Ｒａｍａｎｉ，Ｓ．ａｎｄ  Ｇ．Ｋａｎｇ，Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｗｏｒｌｄ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００９．２２（５）：ｐ．４７７−８２．
３７．Ｋｏｔｌｏｆｆ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｒｄｅｎ  ａｎｄ  ａｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｉａｒｒｈｏｅａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  ｙｏｕｎｇ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ（ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｎｔｅｒｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ，ＧＥＭＳ）：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ，２０１３．３８２（９８８８）：ｐ．２０９−２２．
３８．Ｍａｇｗａｌｉｖｈａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｄ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｆｅｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｕｒｂａｎ  Ｋｅｎｙａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ，２０１０．８２（１）：ｐ．７７−８４．
３９．Ｌｉｕ，Ｌ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，［Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｄｕｒｉｎｇ  ２０１０  ｉｎ  Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ］．Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｅｒ  Ｋｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ，２０１２．５０（６）：ｐ．４５０−４．
４０．Ｏｕｙａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ａｇｅ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｉｎ  Ｔｉａｎｊｉｎ，Ｃｈｉｎａ．Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ，２０１２．１５７（５）：ｐ．８８１−７．
４１．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２．５６（８）：ｐ．５２３−８．
４２．Ｅｓｐｉｎｏｌａ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｏｗｅｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｇｕａｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ，２０１２．５３（４）：ｐ．３６７−９．
４３．Ｍａｓｔ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ（Ａｄ）ｔｙｐｅ−５，ｔｙｐｅ−６，ｔｙｐｅ−２６  ａｎｄ  ｔｙｐｅ−３６  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  Ａｄ５  ｔｉｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＨＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｒｉａｌｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１０．２８：ｐ．９５０−９５７．
４４．Ｋａｓｅｌ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅｓ  ２６  ａｎｄ  ２７：ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ，ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｇ，１９６３．７７：ｐ．２６５−８２．４５．Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＡＩＤＳ：ａ  ｐｌｅｔｈｏｒａ  ｏｆ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｎｅｗ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｓｕｂｇｅｎｕｓ  Ｄ（ｔｙｐｅｓ  ４３−４７）．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１９８８．１５８（４）：ｐ．８０４−１３．
４６．Ｋｈｏｏ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１９９５．１７２（３）：ｐ．６２９−３７．
４７．Ｃｕｒｌｉｎ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌｏｗｅｒ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎ  ｍｅｎ  ｗｈｏ  ｈａｖｅ  ｓｅｘ  ｗｉｔｈ  ｍｅｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１０．５（６）：ｐ．ｅ１１３２１．
４８．Ｄｕｂｂｅｒｋｅ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｕｔｅ  ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ，２００６．１２（３）：ｐ．２３５−４０．
４９．Ｋｏｎｅｒｕ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．ＪＡＭＡ，１９８７．２５８（４）：ｐ．４８９−９２．
５０．Ｖｅｎａｒｄ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａｎ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｉｎ  ａ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｕｎｉｔ  ｓｈｏｗｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ａｒｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ．Ｊ  Ｈｏｓｐ  Ｉｎｆｅｃｔ，２０００．４４（１）：ｐ．７１−４．
５１．Ａｌ  Ｑｕｒａｓｈｉ，Ｙ．Ｍ．，Ｍ．Ｇｕｉｖｅｒ，ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ，２０１１．８３（１１）：ｐ．１９５１−８．
５２．Ｊａｎｅｓ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎａｄｅｑｕａｔｅｌｙ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ  ＨＩＶ−１  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｒ  ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２．７（８）：ｐ．ｅ４３３９６．
５３．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ｇｌｏｂａｌ  ＨＩＶ−１  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２００７．１３（１）：ｐ．１００−６．
５４．Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｓａｉｃ  ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｒｅａｄｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｐｔｈ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２０１０．１６（３）：ｐ．３１９−２３．
５５．Ｓａｎｔｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｓａｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ＨＩＶ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｎ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２０１０．１６（３）：ｐ．３２４−８．
５６．Ｌｉ，Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９．３２３（５９２２）：ｐ．１７２６−９．
５７．Ｂａｄｅｎ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＩＰＣＡＶＤ  ００１）．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２０１３．２０７（２）：ｐ．２４０−７．
５８．Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ（ＩＰＣＡＶＤ  ００１）．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２０１３．２０７（２）：ｐ．２４８−５６．
５９．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ４  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈ５  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ７：ｅ３１１７７．
【０２１７】
上記に記載の実施形態に対して、この広い発明概念から逸脱することなく変更を加えることができることが当業者に理解されるだろう。従って、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定されるのではなく、添付した特許請求の範囲によって画定される本発明の趣旨および範囲に含まれる変形例をカバーすることが意図されていると理解される。
【図１】
2017507672.tif 000005
【図２】
2017507672.tif 000006
【図３】
2017507672.tif 000007
【図４】
2017507672.tif 000008
【図５】
2017507672.tif 000009
【図６Ａ】
2017507672.tif 000010
【図６Ｂ】
2017507672.tif 000011
【図６Ｃ】
2017507672.tif 000012
【図７Ａ】
2017507672.tif 000013
【図７Ｂ】
2017507672.tif 000014
【図８Ａ】
2017507672.tif 000015
【図８Ｂ】
2017507672.tif 000016
【図８Ｃ】
2017507672.tif 000017
【図９Ａ】
2017507672.tif 000018
【図９Ｂ】
2017507672.tif 000019
【図９Ｃ】
2017507672.tif 000020
【図１０】
2017507672.tif 000021
【図１１Ａ】
2017507672.tif 000022
【図１１Ｂ】
2017507672.tif 000023
【図１２】
2017507672.tif 000024
【図１３Ａ】
2017507672.tif 000025
【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
2017507672.tif 000030
【図１６Ｂ】
2017507672.tif 000031
【図１７】
2017507672.tif 000032
【配列表】
2017507672000001.app
【国際調査報告】
2017507672.tif 000033
2017507672.tif 000034
2017507672.tif 000035
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