(57)【要約】本発明は、ＰＳＭＡ活性の調節によって疾患を処置する方法を提供する。そのような調節は、例えば、がん腫瘍代謝、酸素添加、血管新生、および転移の変化をもたらすことが可能である。本発明は、ＰＳＭＡが複雑なシグナル伝達カスケードにおけるその役割を通じて、がんの進行、新脈管形成、および新生血管形成に影響を及ぼすことができるという認識を包含する。本発明は、とりわけ、ＰＳＭＡ活性の調節によってがんの発生、進行、転移、および血管新生を含むがこれらに限定されないがんを処置する方法を提供する。
2017533900.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを処置するまたは予防する方法であって、
ＰＳＭＡ阻害剤を受けたことがあるという点で化学療法薬に感受性を示す患者に、治療有効量の該化学療法薬を投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
化学療法剤を用いた療法を施すことによりがんを処置するまたは予防する方法における改善であって、
該療法の開始の前に、それと同時に、またはその後に、患者にＰＳＭＡ阻害剤を投与すること
を含む、改善。
【請求項３】
前記化学療法薬の投与の前に、治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を前記患者に投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化学療法薬の投与と同時に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を前記患者に投与するステップを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
がんを処置するまたは予防する方法であって、難治性がんに罹患しているまたは罹患しやすい被験体に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項６】
前記がんがアンドロゲン受容体阻害剤またはホルモン除去を用いた処置に不応性である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記がんが化学療法薬を用いた処置に不応性である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
がんを処置するまたは予防する方法であって、
１）高レベルのＰＳＭＡにより特徴付けられるがんに罹患しているまたは罹患しやすい患者を同定するステップと、
２）治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与するステップ
とを含む、方法。
【請求項９】
高レベルのＰＳＭＡが、前記患者の検査組織試料中のＰＳＭＡの濃度が、該患者の健康な組織試料由来のＰＳＭＡの濃度よりも高い場合に示される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
高レベルのＰＳＭＡが、前記患者の検査組織試料中のＰＳＭＡの濃度が、該患者集団のＰＳＭＡの正常な濃度よりも高い場合に示される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＳＭＡ阻害剤の投与と同時にまたはそれに続いて、治療有効量の化学療法薬を投与するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
患者において化学療法薬に対する抵抗性を減少させるための方法であって、
前記化学療法薬の投与と同時にまたはその前に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与すること
を含む方法。
【請求項１３】
腫瘍細胞を化学療法薬に対して感受性にするための方法であって、該腫瘍細胞をＰＳＭＡ阻害剤で処置することを含む、方法。
【請求項１４】
化学療法薬が、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、微小管活性化合物、細胞分化過程を誘導する化合物、タンパク質キナーゼ活性または脂質キナーゼ活性を標的にする／減少させる化合物およびさらなる抗脈管形成化合物、タンパク質ホスファターゼまたは脂質ホスファターゼの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、抗アンドロゲン薬、プロテアソーム阻害剤、ならびにＭＥＫ阻害剤からなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学療法薬がドキソルビシン、タキソール、ＡＺＤ６２４４、ＢＥＺ２３５、ラパチニブ、ベルケイド、およびエンザルタミドから選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、がん細胞遊走を阻害する方法。
【請求項１７】
がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、新生血管形成を阻害する方法。
【請求項１８】
前記新生血管形成が腫瘍新生血管形成である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記がんが扁平上皮がん（例えば、上皮性扁平上皮がん）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺がん、骨がん、腹膜のがん、食道がん、目のがん、皮膚がん、消化器がんを含む胃がん、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、胆嚢がん、ヘパトーマ、喉頭がん、口腔がん、脳がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんもしくは子宮がん、唾液腺癌、腎臓がん、神経内分泌がん、前立腺がん、膣がん、外陰がん、精巣がん、甲状腺がん、尿道がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部がんからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記がんが乳がん、肺がん、または結腸がんである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記がんが固形腫瘍を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記固形腫瘍が前立腺腫瘍または肉腫腫瘍以外のものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＳＭＡ阻害剤が単独では細胞傷害性効果を引き起こさない濃度で使用される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＳＭＡ阻害剤が腫瘍増殖を単独では遅くするがそれを逆転することはない濃度で使用される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤ががんの転移拡散を阻害するまたは減少させるのに効果的な量である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＳＭＡ阻害剤が（ＲＳ）−２−ＰＭＰＡ、（Ｒ）−２−ＰＭＰＡ、（Ｓ）−２−ＰＭＰＡ、（ＲＳ）−ＧＰＩ５２３２、（Ｓ）−ＧＰＩ５２３２、ＲＳ）−２−ＭＭＰＡ、（Ｒ）−２−ＭＭＰＡ、（Ｓ）−２−ＭＭＰＡ、ＰＢＤＡ、（Ｒ，Ｒ）／（Ｓ，Ｓ）−ＰＢＤＡ、（Ｓ，Ｓ）／（Ｒ，Ｒ）−ＰＢＤＡ、ｍｅｓｏ−ＰＢＤＡ、（Ｓ）−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）−（Ｓ）−Ｇｌｕ、（Ｒ）−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）−（Ｒ）−Ｇｌｕ、（Ｒ）−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）−（Ｓ）−Ｇｌｕ、［１１Ｃ］ＤＣＭＣ、［１２５Ｉ］ＤＣＩＴ、ＶＡ−０３３、ＺＪ４３、ＺＪ１１、ＺＪ１７、ＺＪ３８、ＣＴＴ５４、ＴＧ９７、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＡＨ２−ＴＧ９７、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ（４）−ＣＴＴ−５４、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ（４）−ＣＴＴ−５４．２、ペメトレキセド、メトトレキセート、偽不可逆阻害剤ペプチド模倣薬、ステロイド由来ホスホロアミド酸阻害剤、アルファボディ、ＤＡＲＰｉｎ、およびその組合せからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＳＭＡ阻害剤が２−ＰＭＰＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者において該がんを処置する方法であって、
ｉ）患者の腫瘍に存在するＰＳＭＡの量を決定するステップと、
ｉｉ）該患者に適切な化学療法薬を投与するステップと
を含み、高レベルのＰＳＭＡが、該患者を、レベルを高めた化学療法で処置するべきであることを示している、方法。
【請求項２９】
がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者においてがんを処置する方法であって、
ａ）化学療法剤を用いた治療を受けており、
ｂ）高いレベルのＰＳＭＡを示している
患者に、用量を高めた該化学療法剤を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項３０】
レベルを高めた化学療法が、前記患者に投与されている１つまたは複数の化学療法薬の濃度を増加させることを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
レベルを高めた化学療法が、前記患者に１つまたは複数の追加の化学療法薬を投与することを含む、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
高レベルのＰＳＭＡが、患者が約１〜５ｐｇ／ｍＬ、約５ｐｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約２０ｐｇ／ｍＬ、約３０ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約７５ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約１５０ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約２５０ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、または約１０００ｐｇ／ｍＬを超えるＰＳＭＡレベルを有する場合に示される、請求項８、２８、２９、３０、または３１に記載の方法。
【請求項３３】
高レベルのＰＳＭＡが、検出可能な葉酸基質と一緒にインキュベートされた発現された前立腺分泌物の試料が、体積に対して正規化されて、５０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、または２００よりも大きな蛍光ラジアンスを示す場合に示される、請求項８、２８、２９、３０、または３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記患者にアンドロゲン受容体阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、またはその組合せを投与することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、共に２０１４年１０月１０日に出願された米国仮出願第６２／０６２，７１０号および第６２／０６２，７１４号の優先権を主張し、それらの全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
前立腺がんは男性において最も頻繁に診断されるがんの１つであり、肺がんに次ぐがん関連死の最も一般的な原因である。前立腺がんを発症するリスクは、年齢と共に、特に５０歳を超える男性で劇的に増加する。この３０年間を特徴付けてきた老年人口および平均寿命の増加により、合衆国の前立腺がんの発症率は男性６人に１人に近づいている。
【０００３】
前立腺がんの早期診断および処置の成功は大きな臨床上の課題であり続けている。前立腺病変を正確に検出する新たな技術は別として、前立腺発癌、転移、および薬剤耐性における重要な分子カスケードを理解することは新たな治療薬の開発および介入戦略に重大な意味を持つ。分子的前立腺がんの顕著な特徴は、ほぼすべての前立腺新形成の細胞膜での膜貫通型糖タンパク質前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の異常発現である。前立腺がんおよびその酵素活性に関するＰＳＭＡの発現プロファイルによれば、ＰＳＭＡは前立腺がんで重要な役割を果たす可能性があり、薬理学的介入を受けやすいことが示唆されている。ＰＳＭＡレベルとＰＳＭＡの酵素活性を調節できることは、ＰＳＭＡが媒介するがんならびに他の疾患および状態の処置に有用であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＰＳＭＡが複雑なシグナル伝達カスケードでのその役割を通じて、がんの進行、新脈管形成、および新生血管形成に影響を及ぼすことが可能であるという認識を包含している。本発明は、とりわけ、ＰＳＭＡ活性の調節による、がんの発生、進行、転移、および血管新生を含むがこれらに限定されないがんを処置する方法を提供する。本発明は、ＰＳＭＡ活性は細胞質カルシウムレベルを調節することが可能であるという認識も包含する。そのような調節は腫瘍代謝、酸素添加、血管新生、および転移の変化をもたらすことが可能である。したがって、本発明の一態様によれば、ＰＳＭＡは治療の新規成分として利用することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一部の実施形態では、本発明は、がんを処置するまたは予防する方法であって、ＰＳＭＡ阻害剤を受けたことがあるという点で化学療法薬に感受性を示す患者に、治療有効量の化学療法薬を投与することを含む、方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、がんを処置するまたは予防する方法であって、難治性がんに罹患しているまたは罹患しやすい被験体に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、がんを処置するまたは予防する方法であって、ｉ）高レベルのＰＳＭＡにより特徴付けられるがんに罹患しているまたは罹患しやすい患者を同定するステップ、およびｉｉ）治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０００６】
ある特定の実施形態では、本発明は、化学療法薬の投与と同時にまたはその前に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、患者における化学療法薬に対する抵抗性を減少させるための方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞を化学療法薬に対して感受性にするための方法であって、腫瘍細胞をＰＳＭＡ阻害剤で処置することを含む、方法を提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、本発明は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、がん細胞遊走を阻害する方法を提供する。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本発明は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、新生血管形成を阻害する方法を提供する。ある特定の実施形態では、新生血管形成は腫瘍新生血管形成である。
【０００９】
ある特定の実施形態では、本発明は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者においてがんを処置する方法であって、ｉ）患者の腫瘍に存在するＰＳＭＡの量を決定するステップと、ｉｉ）患者に適切な化学療法薬を投与するステップを含み、高レベルのＰＳＭＡが患者を、レベルを高めた化学療法（elevated  level  of  chemotherapy）で処置するべきであることを示している、方法を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者においてがんを処置する方法であって、ａ）化学療法薬を用いた治療を受けており、ｂ）高いレベルのＰＳＭＡを示す患者に、上昇させた用量の化学療法薬を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１１】
定義
本明細書で使用される用語「投与」とは、被験体への組成物の投与を指す。投与はいかなる適切な経路によってもよい。例えば、一部の実施形態では、投与は気管支（気管支滴下によるを含む）、頬側、経腸、皮内（interdermal）、動脈内、皮内（intradermal）、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、粘膜、経鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所的、気管（気管内注入によるを含む）、経皮、膣、および硝子体であってよい。
【００１２】
本明細書で使用される用語「新脈管形成」とは、既存の血管から新しい毛細血管の促進または発生を指し、多くの場合、特定の器官もしくは組織と、または腫瘍と関連のある血管新生の増加をもたらす。
【００１３】
本明細書で使用される用語「がん」および「がん性の」とは、未制御の細胞増殖または分裂により特徴付けられる、被験体の生理的、組織学的、または遺伝的状態を指すかまたはこれを記述する。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍である。一部の実施形態では、がんは肉腫、メラノーマ、芽細胞腫、または癌である。一部の実施形態では、がんは扁平上皮がん（例えば、上皮性扁平上皮がん）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺がん、骨がん、腹膜のがん、食道がん、目のがん、皮膚がん、消化器がんを含む胃がん（gastric  or  stomach  cancer）、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、胆嚢がん、ヘパトーマ、喉頭がん、口腔がん、脳がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんもしくは子宮がん、唾液腺癌、腎臓がん（kidney  or  renal  cancer）、神経内分泌がん、前立腺がん、膣がん、外陰がん、精巣がん、甲状腺がん、尿道がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部がんである。
【００１４】
本明細書で使用される用語「化学療法薬」とは、細胞増殖抑制機能および／または細胞致死性機能を有し、がんおよび／または新生血管形成の処置または予防に有用である薬剤を指す。一部の実施形態では、そのような化学療法薬には、抗増殖性抗体、トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；微小管活性化合物；細胞分化過程を誘導する化合物；タンパク質キナーゼ活性または脂質キナーゼ活性を標的にする／減少させる化合物およびさらなる抗脈管形成化合物；タンパク質ホスファターゼまたは脂質ホスファターゼの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物；抗アンドロゲン薬；プロテアソーム阻害剤；Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ製のＡＲＲＹ１４２８８６、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ製のＡＺＤ６２４４、Ｐｆｉｚｅｒ製のＰＤ１８１４６１などのＭＥＫ阻害剤、ならびにロイコボリンが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、化学療法薬は、ＤＮＡ挿入剤（intercalator）（ドキソルビシンおよびその誘導体）、有糸分裂阻害剤（タキソールおよびその誘導体）、ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＡＺＤ６２４４など）、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ＢＥＺ２３５など）、ＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、ＢＫＭ１２０、ＧＤＣ−０９４１、ＣＡＬ−１０１、ＰＩ−１０３、ＸＬ１４７、ＺＳＴＫ４７４、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ４５８、ＰＦ−０４６９１５０２、ＡＺＤ６４８２、アピトリシブ（Apitolisib）、ＧＳＫ２６３６７７１、コパンリシブ）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、エベロリムス、ＡＺＤ８０５５）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２阻害剤（例えば、ラパチニブなど）、２０Ｓプロテアソーム阻害剤／ＲＯＳアップレギュレーター（例えば、ベルケイド）、ＡＲアンタゴニスト（例えば、ビカルタミド、ガレテロン（galeterone）、フルタミド、酢酸シプロテロン、スピロノラクトン）、またはＡＲ阻害剤（例えば、エンザルタミド、抗アンドロゲン薬、ＡＲＮ−５０９、Ｓ７０４０、アビラテロン）から選択される。
【００１５】
本明細書で使用される用語「抗増殖性抗体」には、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、トラスツズマブ−ＤＭ１、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、ＰＲＯ６４５５３（抗ＣＤ４０）、イピリムマブ（ＭＤＸ−１０１、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、および２Ｃ４抗体が含まれるがこれらに限定されない。抗体とは、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多特異性抗体、および所望の生物活性を示す限り抗体断片のことである。そのような抗増殖性抗体には抗体薬物コンジュゲートが含まれ、放射性粒子または他の化学療法薬、例えば、アド−トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））を含むことができる。
【００１６】
本明細書で使用される用語「抗アンドロゲン薬」は、アンドロゲンホルモンの生物学的効果を阻害することができる任意の物質に関し、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（商標））を含むがこれに限定されない。
【００１７】
本明細書で使用される用語「トポイソメラーゼＩ阻害剤」には、トポテカン、ギマテカン、イリノテカン、カンプトテシアンおよびその類似物、９−ニトロカンプトテシン、ならびに巨大分子カンプトテシンコンジュゲートＰＮＵ−１６６１４８が含まれるがこれらに限定されない。イリノテカンは、例えば、市販されている通りの形態で、例えば、商標Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（商標）の下で投与することが可能である。トポテカンは商品名Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（商標）の下で市販されている。
【００１８】
本明細書で使用される用語「トポイソメラーゼＩＩ阻害剤」には、ドキソルビシン（Ｃａｅｌｙｘ（商標）などのリポソーム製剤を含む）、ドキソルビシン誘導体、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、およびネモルビシン（nemorubicin）などのアントラサイクリン、アントラキノン類のミトキサントロンおよびロソキサントロン、ならびにポドフィロトキシン（podophillotoxines）類のエトポシドおよびテニポシドが含まれるがこれらに限定されない。エトポシドは商品名Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（商標）の下で市販されている。テニポシドは商品名ＶＭ２６−ブリストルの下で市販されている。ドキソルビシンは商品名Ａｃｒｉｂｌａｓｔｉｎ（商標）またはＡｄｒｉａｍｙｃｉｎ（商標）の下で市販されている。エピルビシンは商品名Ｆａｒｍｏｒｕｂｉｃｉｎ（商標）の下で市販されている。イダルビシンは商品名Ｚａｖｅｄｏｓ（商標）の下で市販されている。ミトキサントロンは商品名Ｎｏｖａｎｔｒｏｎ（商標）の下で市販されている。
【００１９】
用語「微小管活性剤」は、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン；ビンブラスチンまたは硫酸ビンブラスチン、ビンクリスチンまたは硫酸ビンクリスチン、ビンフルニン、およびビノレルビンなどのビンカアルカロイド；ディスコデルモライド；コルヒチン（cochicine）ならびにエポチロンおよびその誘導体を含むがこれらに限定されない、微小管安定化、微小管不安定化化合物および微小管重合阻害剤に関する。パクリタキセルは商品名Ｔａｘｏｌ（商標）およびＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の下で市販されている。ドセタキセルは商品名Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）の下で市販されている。硫酸ビンブラスチンは商品名Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ  Ｒ．Ｐ（商標）の下で市販されている。硫酸ビンクリスチンは商品名Ｆａｒｍｉｓｔｉｎ（商標）の下で市販されている。
【００２０】
本明細書で使用される用語「タンパク質キナーゼ活性または脂質キナーゼ活性を標的にする／減少させる化合物」または「タンパク質ホスファターゼ活性または脂質ホスファターゼ活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物」または「さらなる抗脈管形成化合物」には、タンパク質チロシンキナーゼならびに／またはセリンおよび／またはトレオニンキナーゼ阻害剤または脂質キナーゼ阻害剤、例えば、ａ）血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、例えば、ＰＤＧＦＲの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、特に、イマチニブ、ＳＵ１０１、ＳＵ６６６８、およびＧＦＢ−１１１などのＮ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体などのＰＤＧＦ受容体を阻害する化合物；ｂ）線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物；ｃ）インスリン様増殖因子受容体Ｉ（ＩＧＦ−ＩＲ）の活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、例えば、ＩＧＦ−ＩＲの活性を標的にする、減少させる、もしくは阻害する化合物、特に、ＩＧＦ−Ｉ受容体のキナーゼ活性を阻害する化合物、またはＩＧＦ−Ｉ受容体の細胞外ドメインもしくはその増殖因子を標的にする抗体；ｄ）Ｔｒｋ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的にする、減少させる、もしくは阻害する化合物、またはエフリンＢ４阻害剤；ｅ）ＡｘＩ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物；ｆ）Ｒｅｔ受容体チロシンキナーゼの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物；ｇ）イマチニブなどの、Ｋｉｔ／ＳＣＦＲ受容体チロシンキナーゼの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物；ｈ）ＰＤＧＦＲファミリーの一部であるＣ−ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、例えば、ｃ−Ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、特に、イマチニブなどのｃ−Ｋｉｔ受容体を阻害する化合物；ｉ）ｃ−Ａｂｌファミリーのメンバー、その遺伝子融合産物（例えば、ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼ）および変異体の活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、例えば、ｃ−Ａｂｌファミリーメンバーおよびその遺伝子融合産物の活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、例えば、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えば、イマチニブもしくはニロチニブ（ＡＭＮ１０７）；ＰＤ１８０９７０；ＡＧ９５７；ＮＳＣ６８０４１０；ＰａｒｋｅＤａｖｉｓ製のＰＤ１７３９５５；またはダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）；ｊ）タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびセリン／トレオニンキナーゼのＲａｆファミリーのメンバー、ＭＥＫ、ＳＲＣ、ＪＡＫ、ＦＡＫ、ＰＤＫ１、ＰＫＢ／Ａｋｔ、およびＲａｓ／ＭＡＰＫファミリーメンバーのメンバー、ならびに／またはミドスタウリンなどのスタウロスポリン誘導体を含むサイクリン依存性キナーゼファミリー（ＣＤＫ）のメンバーの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物；さらなる化合物の例にはＵＣＮ−０１、サフィンゴール、ＢＡＹ４３−９００６、ブリオスタチン１、ペリフォシン；ルルモフォシン（llmofosine）；ＲＯ３１８２２０およびＲＯ３２０４３２；ＧＯ６９７６；ｌｓｉｓ３５２１；ＬＹ３３３５３１／ＬＹ３７９１９６；イソキノリン（isochinoline）化合物；ＦＴＩ；ＰＤ１８４３５２またはＱＡＮ６９７（ＰＩ３Ｋ阻害剤）またはＡＴ７５１９（ＣＤＫ阻害剤）が含まれる；ｋ）タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、例えば、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物にはイマチニブメシル酸塩（Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標））またはチルホスチンＡ２３／ＲＧ−５０８１０；ＡＧ９９；チルホスチンＡＧ２１３；チルホスチンＡＧ１７４８；チルホスチンＡＧ４９０；チルホスチンＢ４４；チルホスチンＢ４４（＋）鏡像異性体；チルホスチンＡＧ５５５；ＡＧ４９４；チルホスチンＡＧ５５６、ＡＧ９５７などのチルホスチンおよびアダフォスチン（４−｛［（２，５−ジヒドロキシフェニル）メチル］アミノ｝−安息香酸アダマンチルエステル；ＮＳＣ６８０４１０、アダフォスチン）が含まれる；ｌ）受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子ファミリー（ホモまたはヘテロ二量体としてのＥＧＦＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４）およびその変異体の活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、例えば、上皮増殖因子受容体ファミリーの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物は、特に、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４などのＥＧＦ受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーを阻害するまたはＥＧＦもしくはＥＧＦ関連リガンドに結合する化合物、タンパク質、または抗体、ＣＰ３５８７７４、ＺＤ１８３９、ＺＭ１０５１８０；トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））、イレッサ、タルセバ、ＯＳＩ−７７４、Ｃｌ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、ＧＷ−２０１６、Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３またはＥ７．６．３、および７Ｈ−ピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体である；ならびにｍ）ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、例えば、ｃ−Ｍｅｔの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、特に、ｃ−Ｍｅｔ受容体のキナーゼ活性を阻害する化合物、またはｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインを標的にするもしくはＨＧＦに結合する抗体が含まれるがこれらに限定されない。
【００２１】
用語「ｍＴＯＲ阻害剤」は、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）を阻害し抗増殖活性を有する化合物、例えば、シロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標））、エベロリムス（Ｃｅｒｔｉｃａｎ（商標））、ＣＣＩ−７７９、ＡＺＤ８０５５、ＢＥＺ２３５、テムシロリムス、ＫＵ−００６３７９４、ＰＰ２４２、リダフォロリムス、ＩＮＫ１２７、ＸＬ７６５、トリン１、トリン２、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−３５４、ＡＺＤ２０１４、Ｐａｌｏｍｉｄ５２９、ＷＡＹ−６００、およびＡＢＴ５７８に関する。
【００２２】
本明細書で使用される用語「プロテアソーム阻害剤」とは、プロテアソームの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物を指す。プロテアソームの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物には、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（商標））およびＭＬＮ３４１が含まれるがこれらに限定されない。
【００２３】
本明細書で使用される用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とは、生物（例えば、動物、植物、および／または微生物）内ではなく、人工環境において、例えば、試験管または反応容器において、細胞培養等において起こる事象を指す。
【００２４】
本明細書で使用される用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは生物（例えば、動物、植物、および／または微生物）内で起こる事象を指す。
【００２５】
本明細書で使用される用語「転移」とは、腫瘍細胞の循環系内への侵入およびそこでの生存、血管外遊走、ならびに最終的に第２の器官または組織における遠隔腫瘍の確立を指す。
【００２６】
本明細書で使用される用語「新生血管形成」とは、通常は血管を含有しない組織における、特に、循環が疾患または外傷により損なわれている組織における新しい血管の形成を指す。そのような疾患または外傷の非限定的例には、腫瘍、糖尿病性網膜症、関節炎、および乾癬が含まれる。
【００２７】
本明細書で使用される用語「患者」、「被験体」または「検査被験体（test  subject）」とは、ＰＳＭＡの阻害剤を、例えば、実験、診断、予防、および／または治療目的で本発明に従って単独でまたは化学療法薬と組み合わせて投与する任意の生物を指す。典型的な被験体には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳動物；昆虫；虫；等）が含まれる。一部の実施形態では、被験体は疾患、障害、および／または状態（例えば、がん、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）に罹患している場合があり、および／または罹患しやすい場合がある。
【００２８】
疾患、障害、または状態に「罹患している」個人は、その疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状または特徴を有すると診断されているおよび／またはそれを示すもしくはそれを示したことがある。
【００２９】
疾患、障害、または状態に「罹患しやすい」個人は、その疾患、障害、または状態を発症するリスクがある。一部の実施形態では、疾患、障害、または状態に罹患しやすい個人は、その疾患、障害、または状態のいかなる症状も示さない。一部の実施形態では、疾患、障害、または状態に罹患しやすい個人は、その疾患、障害、および／または状態を有すると診断されたことがない。一部の実施形態では、疾患、障害、または状態に罹患しやすい個人は、その疾患、障害、または状態の発症と関連のある状態にさらされたことがある個人である。一部の実施形態では、疾患、障害、および／または状態を発症するリスクは集団ベースのリスクである（例えば、アレルギー等に罹患している個人のファミリーメンバー）。
【００３０】
本明細書で使用される用語「治療有効量」とは、治療レジメンの一部として投与された場合に所望の生物学的応答を誘発する物質（例えば、治療薬、組成物、および／または製剤）の量を意味する。一部の実施形態では、物質の治療有効量は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているまたは罹患しやすい被験体に投与した場合に、その疾患、障害、および／または状態を処置する、診断する、予防する、および／またはその発病を遅らせるのに十分な量である。当業者であれば認識するように、物質の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される物質、標的細胞または組織、等のような要因に応じて変化し得る。例えば、疾患、障害、および／または状態を処置するための製剤中の組成物の有効量は、その疾患、障害、および／または状態を軽減する、改善する、緩和する、阻害する、予防する、その発病を遅らせる、その重症度を低減するおよび／またはその１つもしくは複数の症状もしくは顕著な特徴の発生率を減少させる量である。一部の実施形態では、治療有効量は単一用量で投与される、一部の実施形態では、治療有効量を送達するためには複数単位用量が必要である。
【００３１】
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置」、または「処置すること」とは、疾患、障害、および／または状態を部分的にまたは完全に軽減する、改善する、緩和する、阻害する、予防する、その発病を遅らせる、その重症度を低減するおよび／またはその１つもしくは複数の症状もしくは顕著な特徴の発生率を減少させるのに使用される任意の方法を指す。処置は疾患、障害、および／または状態の徴候を示していない被験体に施すことができる。一部の実施形態では、処置は疾患、障害、および／または状態の初期の徴候のみを示す被験体に、例えば、その疾患、障害、および／または状態と関連のある病態を発症するリスクを減らす目的で施すことができる。
【００３２】
本明細書で使用される用語「腫瘍」とは、過剰で異常な細胞分裂から生じる異常な組織塊または細胞の集合を指す。これらは良性（がん性ではない）または悪性（がん性である）の場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＰＳＭＡが前立腺がん細胞においてカルシウムホメオスタシスを調節するのに果たす役割を示す。
【００３４】
【図２】図２は、前立腺がん細胞の細胞膜でのＰＳＭＡとｍＧｌｕＲ１／５の共局在を示す。
【００３５】
【図３−１】図３は、ＰＳＭＡの酵素活性がいくつかのカルシウム依存性シグナル伝達エフェクターのリン酸化を上方調節することが可能であることを示す。
【図３−２】図３は、ＰＳＭＡの酵素活性がいくつかのカルシウム依存性シグナル伝達エフェクターのリン酸化を上方調節することが可能であることを示す。
【００３６】
【図４】図４は、発がんに関与している多くの細胞成分のリン酸化を調節することにおけるＰＳＭＡの重要性を示す。
【００３７】
【図５】図５は、ＰＳＭＡが前立腺がんの進展の一因になっている例となる機構を示す。
【００３８】
【図６】図６は、新脈管形成および腫瘍酸素添加に対するＰＳＭＡ活性の効果を示す。
【００３９】
【図７】図７は、ＰＳＭＡ活性の阻害によるいくつかの化学療法薬の細胞傷害性の増加を示す。
【００４０】
【図８】図８は、ＰＳＭＡが、活性酸素種の細胞内レベルを増加させる化学療法薬に対する抵抗性で役割を果たすことを示す。
【００４１】
【図９】図９は、ＰＳＭＡの阻害を通じて腫瘍増殖は減少し動物生存は増加することを示す。図９ａは、ビヒクル（黒線）または２−ＰＭＰＡ（薄い灰色）で処置された無腫瘍動物の百分率を示す。図９ｂは、ビヒクルで処置され（黒）、ＰＳＭＡの発現が減少している（ＬＮＣａＰ−ＫＤ、薄い黒）、または高（薄い灰色）および低（灰色）用量の２−ＰＭＰＡで処置された動物の全生存を示す。
【００４２】
【図１０】図１０は、ＰＳＭＡレベルと化学療法への応答の間の相関を示す。
【００４３】
【図１１】図１１は、その発現がＰＳＭＡ発現および活性により上方調節される遺伝子の同定を示す。
【００４４】
【図１２】図１２は、ＰＳＭＡ発現レベルとｍＴＯＲ経路の活性化との相関を示す。
【００４５】
【図１３】図１３は、腫瘍増殖および進行をもたらす種々の細胞過程を調節するのにＰＳＭＡが果たす役割を示すモデルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
ＰＳＭＡは前立腺がんおよび大半の固形腫瘍の新生血管（neovasculature）において見出される膜貫通型グルタミン酸カルボキシペプチダーゼであるが、健康な前立腺および正常な血管には存在しない。ＰＳＭＡの発現は疾患期および生化学的再発と相関しており疾患状態のバイオマーカーとして使用することが可能である。一部の実施形態では、本発明は、ＰＳＭＡの発現の解析および／またはＰＳＭＡの酵素活性の阻害を通じてがんまたはがんの進行を処置するまたは予防する方法を提供する。
【００４７】
本発明は、ＰＳＭＡの発現は多くの薬物に対する抵抗性を与えるが、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害すれば細胞をこれらの化学療法薬に対して感受性にする（sensitize）という認識を包含する。ＰＳＭＡ発現は腫瘍を組合せ療法に対して抵抗性にすることも可能であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＳＭＡを阻害すれば腫瘍体積を小さくし腫瘍増殖を遅くすることが可能である。したがって、本発明の一態様は、がんを処置するまたは予防する方法であって、難治性がんに罹患しているまたは罹患しやすい被験体に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を化学療法薬の投与と同時にまたはその前に投与することを通じて、患者において化学療法薬に対する抵抗性を減らすまたは腫瘍細胞を化学療法薬に対して感受性にするための方法を提供する。
【００４８】
本開示は、腫瘍の増殖および化学療法薬に対するその感受性（susceptibility）を調節するうえでのＰＳＭＡの役割ならびに患者の腫瘍上でのＰＳＭＡの発現レベルを化学療法薬に対する感受性および／またはＰＳＭＡ阻害の必要性を評価するための診断薬としてどのように利用することが可能であるかを詳しく述べる。したがって、本発明の一部の実施形態は、がんを処置するまたは予防する方法であって、高レベルのＰＳＭＡにより特徴付けられるがんに罹患しているまたは罹患しやすい患者が同定され治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与される、方法を提供する。
【００４９】
新生血管形成は、腫瘍のサイズが増加する能力において決定的なステップである。転移はがんの進行の重要な顕著な特徴である。後に続く実施例において詳述されるように、ＰＳＭＡ活性はこれらの機能の両方に関連している。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することによりがん細胞遊走および／または新生血管形成を阻害する方法を提供する。
【００５０】
ＰＳＭＡの酵素活性を阻害すれば、細胞の主要エネルギー源を酸化的リン酸化から好気的解糖に転換しつつ、プロスタグランジンおよびＶＥＧＦ同様に転移エフェクターのレベルが低下する。さらに、ＰＳＭＡを阻害すれば、典型的なアンドロゲン受容体標的前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のレベルが上方調節される。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、これは少なくとも部分的には、前立腺がんにおいてアンドロゲン受容体（ＡＲ）経路をネガティブに調節するＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を活性化するＰＳＭＡの能力に起因する可能性があると考えられる。ＰＳＭＡはその酵素活性を通じてＰＩ３ＫおよびＡｋｔに関与する下流シグナル伝達を活性化する。その結果、ＡＲ経路の活性および出力は、ＰＳＡレベルの形態で測定した場合、減少する。あるいは、ＰＳＭＡの酵素活性が阻害されると、ＡＲに対するＰＩ３ＫおよびＡｋｔによる抑制が減少し、これによりＡＲシグナル伝達が増加し、高くなったＰＳＡ濃度に反映される。
【００５１】
いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、本開示は、ＰＳＭＡが、その酵素活性ならびにＮＡＡＧおよび葉酸を含む（ポリ）グルタミン酸化された基質を処理する能力を通じて、代謝調節型グルタミン酸受容体グループＩを活性化し、これが下流シグナル伝達カスケードを開始させ、細胞質カルシウムレベルを増加させることを実証している。放出されたカルシウムが種々のシグナル伝達エフェクターをさらに活性化し、代謝を変え、腫瘍および転移のためのその環境を刺激する。図１３を参照されたい。
【００５２】
いかなるＰＳＭＡ阻害剤も本発明に従って使用することが可能である。ＰＳＭＡ阻害剤は当技術分野では公知であり、例えば、（ＲＳ）−２−ＰＭＰＡ、（Ｒ）−２−ＰＭＰＡ、（Ｓ）−２−ＰＭＰＡ、（ＲＳ）−ＧＰＩ５２３２、（Ｓ）−ＧＰＩ５２３２、ＲＳ）−２−ＭＭＰＡ、（Ｒ）−２−ＭＭＰＡ、（Ｓ）−２−ＭＭＰＡ、ＰＢＤＡ、（Ｒ，Ｒ）／（Ｓ，Ｓ）−ＰＢＤＡ、（Ｓ，Ｓ）／（Ｒ，Ｒ）−ＰＢＤＡ、ｍｅｓｏ−ＰＢＤＡ、（Ｓ）−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）−（Ｓ）−Ｇｌｕ、（Ｒ）−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）−（Ｒ）−Ｇｌｕ、（Ｒ）−Ｇｌｕ−Ｃ（Ｏ）−（Ｓ）−Ｇｌｕ、［１１Ｃ］ＤＣＭＣ、［１２５Ｉ］ＤＣＩＴ、ＶＡ−０３３、ＺＪ４３、ＺＪ１１、ＺＪ１７、ＺＪ３８（Zhou  J、Neale  JH、Pomper  MG、Kozikowski  AP.  Nat  Rev  Drug  Discov.２００５年１２月；４巻（１２号）：１０１５〜２６頁）；ＣＴＴ５４（Kasten  B.  B.ら、Bioorg  Med  Chem  Lett.２０１３年１月１５日；２３巻（２号）：５６５〜８頁）；ＴＧ９７およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＡＨ２−ＴＧ９７（Martin  S.  E.ら、Bioconjug  Chem.２０１４年９月１５日）；ＤＢＣＯ−ＰＥＧ（４）−ＣＴＴ−５４、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ（４）−ＣＴＴ−５４．２（Nedrow-Byersら、Prostate、２０１３年）；ベータＮＡＡＧ（Yourick  D.  L.ら、Brain  Res.２００３年１１月２１日；９９１巻（１〜２号）：５６〜６４頁）；ペメトレキセド、メトトレキセート（Fulton  M.  D.およびBerkman  C.  E.、Pacific  Northwest  Research  Symposium、２０１１年、chemistry.oregonstate.edu/organic/symposium/archive/2011/abstracts2011/abs_fulton.pdfから回収）；偽不可逆阻害剤ペプチド模倣薬（Liu  T.ら、Biochemistry.２００８年１２月２日；４７巻（４８号）：１２６５８〜６０頁）；およびステロイド由来ホスホロアミド酸阻害剤（Wu  L.  Y.ら、Biochemistry.２００８年１２月２日；４７巻（４８号）：１２６５８〜６０頁）である。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤は本段落で引用された参考文献のいずれかにおいて記載されるＰＳＭＡ阻害剤であり、参考文献それぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤は２−ＰＭＰＡまたはその類似物である。
【００５３】
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤はアルファボディ（alphabody）（すなわち、目的の標的に対して高親和性を有するように調整することができるポリペプチド）である。アルファボディの産生および選択は当技術分野では公知であり、その例は国際公開第２０１２０９３１７２号に記載されており、該特許文献の全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５４】
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤はＤＡＲＰｉｎ（すなわち、特異的高親和性標的結合を有する設計されたアンキリンリピートタンパク質）である。ＤＡＲＰｉｎは当技術分野では公知であり、例えば、Binzら（Nat  Biotechnol.２００４年５月；２２巻（５号）：５７５〜８２頁）ならびにStumppおよびAmstutz（Curr  Opin  Drug  Discov  Devel.２００７年３月；１０巻（２号）：１５３〜９頁）により記載されており、該文献のそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５５】
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤は競合的阻害剤として作用することが可能である。他の実施形態では、阻害剤は非競合的阻害剤またはアロステリック阻害剤でもよい。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤またはその部分は蛍光基または放射性同位元素などの、しかしこれらに限定されない有用な検出可能な剤にコンジュゲートすることができる。
【００５６】
がんの処置
ＰＳＭＡはグルタミン酸カルボキシペプチダーゼとしての酵素活性を有する。この酵素活性は、葉酸のグルタミル誘導体およびＮ−アセチルアスパルチルグルタメート（ＮＡＡＧ）などの基質からのグルタミン酸の加水分解切断および遊離に関与している。ＰＳＭＡの酵素活性により遊離されたグルタミン酸は代謝調節型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）を活性化することが可能であり、その受容体のいくつかはＰＳＭＡと共局在化しているのが見出されている（ｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５）。これらの受容体の活性化の１つの成分は、イノシトール３リン酸形成を通じた細胞質カルシウム濃度の増加である。メラノーマなどのいくつかのがんはｍＧｌｕＲ２およびｍＧｌｕＲ３を過剰発現しており、ＰＳＭＡはこれらの受容体の活性化を通じて役割を果たす可能性がある。
【００５７】
細胞内カルシウムの増加により多数の細胞キナーゼが活性化され、下流シグナル伝達を広くもたらすことが可能である。これらのキナーゼはマスターキナーゼカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼＩＩ（ＣＡＭＫＫ２）およびｍＴＯＲＣ２を含むことが可能であるが、これらに限定されない。後に続く実施例では、ＰＳＭＡの酵素活性はＣＡＭＫＫ２を活性化することが可能であり、これがＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、Ｓｒｃ、およびｐ２７を含むがこれらに限定されない下流キナーゼを活性化することが示唆される。本発明は、ＰＳＭＡがＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、およびＷＮＫ１などの他のキナーゼの活性化を調節するという認識も包含する。これらのキナーゼは細胞ホメオスタシスに対して著しい影響を及ぼすので、該キナーゼの活性化は腫瘍発生およびがんの進行に決定的な意味を持つ他の経路の中でも細胞周期調節およびシグナル伝達に関与している複数の細胞過程を調節することが可能である。実際、本明細書で開示される研究によれば、ＰＳＭＡの活性は前立腺がんの発生および進展に関係があることが示されており、ＰＳＭＡを効果的に阻害する初期の治療的介入は、大きな臨床的可能性があり生存を増加させる可能性があることが示唆される。一部の実施形態では、提供される方法には、これらのキナーゼのうちの１つまたは複数の阻害剤とＰＳＭＡ阻害剤を組み合わせた共投与が含まれる。そのような阻害剤は当技術分野では公知でありおよび／または本明細書に記載されている。一部の実施形態では、ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ５の阻害剤は、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＷＰ１０６６、Ｓｔａｔｔｉｃ、Ｓ３Ｉ−２０１、ＨＯ−３８６７、またはニフロキサジドから選択される。ある特定の実施形態では、ＷＮＫ１の阻害剤はＰＰ１またはＰＰ２から選択され（Yagiら、Biochemistry.２００９年１１月３日；４８巻（４３号）：１０２５５〜６６頁を参照）、該文献の全内容は参照により組み込まれる。
【００５８】
現在の化学療法の標準治療は成功することがあるが、この療法は腫瘍抵抗性ももたらすことがある。化学療法抵抗性の機構には、腫瘍への薬物の接近に関する物質、注入速度および送達経路ならびに薬物代謝および流出または排泄を含む機構が含まれるがこれらに限定されない。ＰＳＭＡの活性により影響される細胞ホメオスタシスおよびシグナル伝達の変化は、化学療法薬に対する腫瘍細胞の感受性（sensitivity）にも影響を及ぼすことが可能である。本明細書に開示される所見は、ＰＳＭＡ活性の阻害剤と組み合わせて使用した場合ある種の化学療法薬の細胞傷害性が増加することを示している。
【００５９】
これらの所見を考慮すると、本発明のある特定の実施形態は、がんを処置するまたは予防する方法であって、ＰＳＭＡ阻害剤を受けたことがあるという点で化学療法薬に感受性を示す患者に、治療有効量の化学療法薬を投与することによりがんを処置するまたは予防する、方法に関する。一部の実施形態では、本方法は化学療法薬の投与の前に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を患者に投与するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は化学療法薬の投与と同時に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を患者に投与するステップを含む。
【００６０】
本発明は、がんを処置するまたは予防する方法であって、治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を難治性がんに罹患しているまたは罹患しやすい被験体に投与することを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、がんは去勢抵抗性前立腺がんである。一部の実施形態では、がんはアンドロゲン受容体阻害剤またはホルモン除去を用いた処置に対して不応性である。一部の実施形態では、がんは本明細書で定義される化学療法剤に不応性である。
【００６１】
一部の実施形態では、本発明は、化学療法薬の投与と同時にまたはその前に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、患者における化学療法薬に対する抵抗性を減少させるための方法を提供する。
【００６２】
ＰＳＭＡ発現は前立腺新形成および他の固形腫瘍の顕著な特徴なので、本発明の実施形態は、高レベルのＰＳＭＡにより特徴付けられるがんに罹患しているまたは罹患しやすい患者を同定する方法を提供する。ＰＳＭＡのレベルは、組織学、生検、血清学、および医療用画像化を含むがこれらに限定されない多数の検査により決定することが可能である。一部の実施形態では、ＰＳＭＡのレベルは放射標識されたトレーサー、例えば、そのようなトレーサーを含む抗体を使用して決定することが可能である。ある特定の実施形態では、ＰＳＭＡのレベルは色素標識されたトレーサーを使用して決定することが可能である。一部の実施形態では、ＰＳＭＡのレベルは、ＰＳＭＡと、抗体または小分子などのしかしこれらに限定されない放射標識されたトレーサーまたは蛍光トレーサーとの結合により決定することが可能である。
【００６３】
追加の実施形態では、画像化はナノ粒子の使用を通じて達成することが可能である。一部の実施形態では、そのようなナノ粒子は金属、金属様物質、または非金属で構成されている。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは任意選択で１つまたは複数の被覆層、表面会合実体（surface-associated  entity）および／または１ドーパント実体を含むことができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、安定化実体、ターゲティング実体、等のような１つまたは複数の表面会合実体を有することができる。一部の実施形態では、そのような表面会合実体は層中にあるまたは層に構成されている。一部の実施形態では、そのような実体はコアに会合しているまたは結合している。一部の実施形態では、そのような実体は層に会合しているまたは結合している。一部の実施形態では、ナノ粒子はターゲティング部分またはドーパントと層になった医療用同位元素に結合している。一部の実施形態では、そのようなナノ粒子はＰＳＭＡ阻害剤またはその部分を含む。一部の実施形態では、そのようなターゲティング部分は抗体または小分子である。一部の実施形態では、ドーパントは蛍光色素（例えば、近赤外（例えば、金属増強）蛍光剤、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ４８８、などのような２−光子蛍光剤、等）、レーザーポンピング材料（例えば、希土類金属ベースの化合物および／または遷移金属ベースの化合物の群由来の材料からなるがこれらに限定されない）、希土類金属光音響活性色素および／または遷移金属光音響活性色素からなるがこれらに限定されない発光化合物、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性剤、アップコンバージョン材料（例えば、希土類金属および／または遷移金属の群由来の材料からなる）、「スローライト」誘導材料（例えば、プラセオジムベースの化合物）、超音波（ＵＳ）剤、ならびにその任意の組合せである（米国特許第５，３０６，４０３号、米国特許第６，００２，４７１号、および米国特許第６，１７４，６７７号参照。該特許文献のそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ＰＳＭＡのレベルは組織ホモジネートから決定される。一部の実施形態では、ＰＳＭＡのレベルは細胞膜アッセイから決定される。
【００６４】
ＰＳＭＡレベルは後に続く実施例に記載されているグルタミン酸アッセイを使用して測定することもできる。一部の実施形態では、アッセイは、葉酸（プテロイル−Ｌ−グルタミン酸）がＰＳＭＡによる切断を受けやすく、グルタミン酸をＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルタミン酸アッセイの基質として提供する市販のＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルタミン酸アッセイの修正を含む。発現された前立腺分泌物は葉酸およびＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルタミン酸試薬と一緒にインキュベートされる。次に、ＰＳＭＡ含有試料は、蛍光リーダーで定量可能な陽性蛍光を示す。一部の実施形態では、ＰＳＭＡによる切断を受けやすいアミド結合を介してルシフェリンにコンジュゲートされたグルタミン酸を含む。発現された前立腺分泌物はグルタミン酸剤（glutmate  agent）、プラスＡＴＰおよび関連補因子と一緒にインキュベートされる。次に、ＰＳＭＡ含有試料は、ルミノメーターで定量可能な陽性発光を示す。
【００６５】
一部の実施形態では、がんの種類および／または候補処置レジメンを確かめるために患者のＰＳＭＡレベルをアッセイするのが有用である。一部の実施形態では、本発明は、がんを処置するまたは予防する方法であって、高レベルのＰＳＭＡにより特徴付けられるがんに罹患しているまたは罹患しやすい患者を同定し、治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＰＳＭＡ阻害剤の投与と同時にまたはそれに続いて治療有効量の化学療法薬を投与するステップをさらに含む。
【００６６】
本明細書で使用されるように、用語「高レベルのＰＳＭＡ」とは、ｉ）患者の検査組織試料中のＰＳＭＡの濃度が、患者の健康な組織試料由来のＰＳＭＡの濃度よりも高い場合、またはｉｉ）患者の検査組織試料中のＰＳＭＡの濃度が、患者集団のＰＳＭＡの正常濃度よりも高い場合のことを指す。一部の実施形態では、健康な組織試料は健康な前立腺組織または良性の前立腺過形成由来の組織である。一部の実施形態では、高レベルのＰＳＭＡとは、患者の検査組織試料中のＰＳＭＡの濃度が、患者の健康な組織中のＰＳＭＡの濃度の、または患者集団のＰＳＭＡの正常濃度の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍である場合である。
【００６７】
一部の実施形態では、高レベルのＰＳＭＡは患者が約１〜５ｐｇ／ｍＬを超えるＰＳＭＡレベルを有する場合に示される。一部の実施形態では、高レベルのＰＳＭＡは患者が約５ｐｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約２０ｐｇ／ｍＬ、約３０ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約７５ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約１５０ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約２５０ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、または約１０００ｐｇ／ｍＬを超えるＰＳＭＡレベルを有する場合に示される。一部の実施形態では、高レベルのＰＳＭＡは患者が約１２５ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２２５ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２７５ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約３２５ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ、約３７５ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ、または約５００ｎｇ／ｍＬを超えるＰＳＭＡレベルを有する場合に示される。
【００６８】
一部の実施形態では、高レベルのＰＳＭＡは、葉酸−Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルタミン酸試薬（例えば、後に続く実施例に記載されている）と一緒にインキュベートされた発現された前立腺分泌物の試料が、体積に対して正規化されて、５０よりも大きな蛍光または発光ラジアンスを示す場合に示される。一部の実施形態では、高レベルのＰＳＭＡは、葉酸−Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルタミン酸試薬と一緒にインキュベートされた発現された前立腺分泌物の試料が、体積に対して正規化されて、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、または２００よりも大きな発光ラジアンスを示す場合に示される。
【００６９】
一部の実施形態では、高レベルのＰＳＭＡは、活性化可能な薬剤（例えば、後に続く実施例に記載されている）と一緒にインキュベートされた発現された前立腺分泌物の試料が、体積に対して正規化されて、５０よりも大きな発光ラジアンスを示す場合に示される。一部の実施形態では、高レベルのＰＳＭＡは、活性化可能な薬剤と一緒にインキュベートされた発現された前立腺分泌物の試料が、体積に対して正規化されて、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、または２００よりも大きな発光ラジアンスを示す場合に示される。
【００７０】
患者処置に加えて、本発明の方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏでも同様に使用することができる。一部の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞を化学療法薬に対して感受性にするための方法であって、腫瘍細胞をＰＳＭＡ阻害剤で処置することを含む、方法を提供する。
【００７１】
本発明の提供される方法では、化学療法薬は本明細書に定義されている通りである。一部の実施形態では、化学療法薬は、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、微小管活性化合物、細胞分化過程を誘導する化合物、タンパク質キナーゼ活性または脂質キナーゼ活性を標的にする／減少させる化合物およびさらなる抗脈管形成化合物、タンパク質ホスファターゼまたは脂質ホスファターゼの活性を標的にする、減少させる、または阻害する化合物、抗アンドロゲン、プロテアソーム阻害剤、またはＭＥＫ阻害剤から選択される。一部の実施形態では、化学療法薬はドキソルビシン、タキソール、ＡＺＤ６２４４、ＢＥＺ２３５、ラパチニブ、ベルケイド、およびエンザルタミドから選択される。
【００７２】
一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤の効果的濃度は、１〜１００ｎＭ、１〜５００ｎＭ、１〜１０００ｎＭ、１〜１００ｕＭ、１〜５００ｕＭ、１〜１０００ｕＭ、１〜５ｍＭ、２〜６ｍＭ、３〜７ｍＭ、４〜８ｍＭ、５〜９ｍＭの範囲であり得、ＰＳＭＡ阻害剤だけの濃度では細胞傷害性ではない。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤の効果的濃度は、１〜１０００ｍｇ／ｍ２、１〜１０ｍｇ／ｍ２、１１〜５０ｍｇ／ｍ２、５１〜１００ｍｇ／ｍ２、１０１〜５００ｍｇ／ｍ２、または５０１〜１０００ｍｇ／ｍ２の範囲であり得る。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤は、単独で腫瘍増殖を遅くするがそれを逆転することはない濃度で使用される。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤の治療有効量は、がんの転移拡散を阻害するまたは減少させるのに効果的な量である。
【００７３】
上に開示され本明細書で提供される方法では、がんは本明細書に定義される任意のがんであり得る。一部の実施形態では、がんは前立腺のがんである。一部の実施形態では、がんは乳がん、肺がん、または結腸がんである。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍を含む。一部の実施形態では、固形腫瘍は前立腺腫瘍または肉腫腫瘍以外のものである。
【００７４】
一部の実施形態では、処置されるがんは、化学療法薬、アンドロゲン受容体阻害剤、またはホルモン除去の形態を用いた処置に抵抗性である。
【００７５】
新生血管形成および転移の処置
新生血管形成は、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、および腫瘍増殖を含むがこれらに限定されないいくつかの障害の進行および病態形成における重要な要因である。がんでは、新しい血管の形成により腫瘍細胞は分裂し、最終的には元の腫瘍を離れて身体の他の場所に新たなフォーカスを形成するまたは転移することが可能になる。
【００７６】
ＰＳＭＡ活性による細胞内でのシグナル伝達の調節は新生血管形成の過程と既に関係づけられている。特に、ＰＳＭＡは、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）および接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）の調節を通じてインテグリンシグナル伝達および細胞骨格動力学を調節することが実証されている（Conwayら、２００６年）。さらに、本開示の例はＰＳＭＡ発現と同時のＶＥＧＦ−Ａの増加を示しており、結果によればＰＳＭＡの阻害が腫瘍血管新生の低下および腫瘍酸素添加の低下を引き起こしたことが示されている。これらの結果により、腫瘍が増殖し転移する能力におけるＰＳＭＡの重要性がさらに実証されている。
【００７７】
したがって、本発明のある特定の実施形態は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む、がん細胞遊走を阻害する方法を提供する。
【００７８】
一部の実施形態では、本発明は、その病態形成が新生血管形成を含む疾患に罹患している患者への投与を含む、新生血管形成を阻害する方法を提供する。さらなる実施形態は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者に治療有効量のＰＳＭＡ阻害剤を投与することを含む新生血管形成を阻害する方法を提供する。追加の実施形態は、腫瘍が非限定的例として癌、リンパ腫、芽細胞腫、および肉腫である、新生血管形成を阻害するための方法を提供する。さらなる実施形態は、腫瘍が乳房、肺または結腸を含むがこれらに限定されない組織の固形腫瘍である、新生血管形成を阻害することを提供する。
【００７９】
一部の抗脈管形成処置は大部分が単独療法としてはがんに対して無効であったが、従来の化学療法と併用して共投与されると、従来の化学療法単独と比べた場合、改善された結果を提供することが見出されていた。この逆説的な効果は、脈管構造が「異常」からより「正常な」表現型に変化する、抗脈管形成処置による腫瘍脈管構造の正常化によって説明することが可能である。腫瘍における「異常な」表現型は、処置に対する抵抗性を促進することもある低酸素および栄養分欠乏により特徴付けられることが多い。これらの血管の正常化により、外因的に投与される治療薬の送達および効力が改善されうる。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、腫瘍新生血管上に位置するＰＳＭＡは血管透過性亢進を促進することにより異常な脈管構造表現型を促進することが可能であると考えられる。したがって、一部の実施形態では、本発明はＰＳＭＡ阻害剤の投与により腫瘍脈管構造を正常化する方法を提供する。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤と化学療法薬の共投与により、腫瘍脈管構造の正常化を介してがんの処置の改善をもたらす。
【００８０】
一部の実施形態では、提供される方法には、ＰＳＭＡ阻害剤が腫瘍増殖を単独では遅くするがそれを逆転することはない濃度で使用される、疾患に罹患している患者を処置することが含まれる。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ阻害剤の治療有効量は、がんの転移拡散を阻害するまたは減少させるのに効果的な量である。
【００８１】
追加の実施形態は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者においてがんを処置する方法であって、患者の腫瘍に存在するＰＳＭＡの量を決定し、患者に、適した化学療法薬を投与するステップを含み、高レベルのＰＳＭＡが患者を、レベルを高めた化学療法で処置するべきであることを示している、方法を提供する。追加の実施形態は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者においてがんを処置する方法であって、患者の腫瘍に存在するＰＳＭＡの量を決定し、患者に適した化学療法薬を投与するステップを含み、約１〜５ｐｇ／ｍＬを超えるＰＳＭＡレベルが患者を、レベルを高めた化学療法で処置するべきであることを示している、方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、がんに罹患しているまたは罹患しやすい患者においてがんを処置する方法であって、ａ）化学療法剤を用いた治療を受けている；およびｂ）約１〜５ｐｇ／ｍＬを超えるＰＳＭＡのレベルを示している患者に用量を高めた（elevated  dose  of）化学療法剤を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００８２】
一部の実施形態では、約１〜５ｐｇ／ｍＬ、約５ｐｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約２０ｐｇ／ｍＬ、約３０ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約７５ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約１５０ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約２５０ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、または約１０００ｐｇ／ｍＬを超えるＰＳＭＡレベルは、患者を、レベルを高めた化学療法で処置するべきであることを示している。
【００８３】
一部の実施形態では、約１２５ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２２５ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２７５ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約３２５ｎｇ／ｍＬ、約３５０ｎｇ／ｍＬ、約３７５ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ、または約５００ｎｇ／ｍＬを超えるＰＳＭＡレベルは、患者を、レベルを高めた化学療法で処置するべきであることを示している。
【００８４】
一部の実施形態では、上および本明細書に記載される葉酸−Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルタミン酸アッセイにおいて高レベルのＰＳＭＡが示される場合、患者はレベルを高めた化学療法で処置するべきである。
【００８５】
一部の実施形態では、上および本明細書に記載される活性化可能な薬剤アッセイにおいて高レベルのＰＳＭＡが示される場合、患者はレベルを高めた化学療法で処置するべきである。
【００８６】
一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、患者に投与される１つまたは複数の化学療法薬の濃度を増加させることを含む。
【００８７】
ある特定の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量よりも多い用量である。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約１０〜２００％の増加を表す。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約１０〜１００％の増加を表す。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約２０〜１００％の増加を表す。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約３０〜１００％の増加を表す。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約４０〜１００％の増加を表す。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約５０〜１００％の増加を表す。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約６０〜１００％の増加を表す。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約７５〜１００％の増加を表す。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約１００〜２００％の増加を表す。
【００８８】
一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約１〜１０倍である。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約２〜１０倍である。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約２〜５倍である。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、以前投与された用量、推奨される用量、または承認された用量の約１〜５倍である。
【００８９】
一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、患者に１つまたは複数の追加の化学療法薬を投与することを含む。一部の実施形態では、追加の化学療法薬は、ミトキサントロン、プレドニゾン、ドセタキセル、デキサメタゾン、エストラムスチン（estremustine）、ワルファリン、カバジタキセル、エストラムスチンエトポシド、エンザルタミド、およびＢＥＺ２３５からなる群から選択される。一部の実施形態では、レベルを高めた化学療法は、化学療法薬の組合せを投与することを含む。一部の実施形態では、化学療法薬の組合せは、ミトキサントロンとプレドニゾン、ドセタキセルとプレドニゾン、ドセタキセルとデキサメタゾン、エストラムスチンとワルファリン、ドセタキセルとカバジタキセル、エストラムスチンとエトポシド、またはエンザルタミドとＢＥＺ２３５を含む。
【００９０】
一部の実施形態では、以前投与された用量は患者の腫瘍に存在するＰＳＭＡの量を決定する前に患者に以前投与された用量である。一部の実施形態では、推奨される用量は、医師または他の医療従事者により推奨されたまたは処方された用量である。ある特定の実施形態では、承認された用量は、化学療法薬について合衆国食品医薬局により承認された用量である。
【実施例】
【００９１】
（実施例１）
材料および方法
細胞培養
細胞株をすべてＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、供給者のガイドラインに従って増殖させた。ＬＮＣａＰ細胞およびＰＣ３細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１％）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）およびピルビン酸ナトリウム（１％）を補充した１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ  １６４０培地において増殖させた。ＰＳＭＡを発現する形質導入されたＰＣ３細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）およびピューロマイシン（６μｇ／ｍＬ）を補充した１０％ウシ胎仔血清含有Ｆ１２Ｋ培地で増殖させた。ＰＳＭＡがノックダウンされている形質導入されたＬＮＣａＰ細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１％）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、ピルビン酸ナトリウム（１％）、およびピューロマイシン（３μｇ／ｍＬ）を補充した１０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ  １６４０培地において増殖させた。
【００９２】
ｈＰＭＳＡ
ＰＳＭＡをＰＣ３細胞内に形質導入するため、アンピシリン選択下でヒトＰＳＭＡ遺伝子を含有するＳＦＧバックボーンプラスミドを細胞内にトランスフェクトした。形質導入が成功した細胞をピューロマイシンに対する耐性に基づいて選択した。ＬＮＣａＰ細胞からＰＳＭＡをノックダウンするため、ｓｈＲＮＡクローズ（close）ＲＬＧＨ−ＤＵ５３９９１を使用した（Ｔｒａｎｓｏｍｉｃ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）。
【００９３】
細胞質カルシウム定量
細胞を９６ウェルプレート上にウェル当たり１０，０００の密度で播種し、一晩増殖させた。カルシウム感知色素Ｆｌｕｏ４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｌｒｓｂａｄ、ＣＡ）の負荷を製造業者の指示に従って実施した。指示された場合、細胞を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）でカルシウムレベルを測定する直前に、タプシガルジン（１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｌキスカル酸（１１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、３，５−ＤＨＰＧ（０．６７ｍＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、Ｌ−ＡＰ３（１２５μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、Ｕ７３１２２（５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、および２−ＰＭＰＡ（１００μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）で処置した。
【００９４】
カイノームプロファイリング
ＣＡＭＫＫ２、ＡＭＰＫαおよびＡＫＴ抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から購入した。細胞をコンフルエンスまで増殖させ２−ＰＭＰＡ（５μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）で４８時間処置した。目的のタンパク質のリン酸化状態を、等電点電気泳動装置（ＮａｎｏＰｒｏ１０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて決定し、試料を供給者のガイドラインに従って調製し解析した。重要なタンパク質の部位特異的リン酸化の決定を、ヒト蛍光体−キナーゼアレイ（ＡＲＹ００３、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて、製品説明書に従って実施した。
【００９５】
シグナル出力評価
遺伝子発現アレイを、Ｕ１３３Ａ  ２．０遺伝子アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）上でＴＲＩｚｏｌベースのＲＮＡ抽出後に実施した。アンドロゲン受容体（ＡＲ）経路の出力を、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のレベルを測定することにより評価した。機能的ＡＲ経路を有するＬＮＣａＰ細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、コンフルエンスまで増殖させた。次に細胞を２−ＰＭＰＡ（５μＭ）で４８時間処置し、続いてＤＥＬＦＩＡ  ＰＳＡアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて分泌されたＰＳＡについて培養培地をスクリーニングした。一酸化窒素シンターゼ活性に起因する一酸化窒素のレベルおよび全分泌されたプロスタグランジンの濃度を、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）から購入した対応するキットを用いて定量した。シグナル伝達変化に起因するエネルギー生産の変化を、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）製のＮＡＤアッセイおよびＢｉｏｖｉｓｉｏｎ（Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）製のＳｔａｙＢｒｉｔｅ  ＡＴＰキットを使用して、細胞内ＮＡＤ＋およびＡＴＰレベルの定量を通じて決定した。
【００９６】
ＰＳＭＡおよびｍＧｌｕＲ１／５についての免疫染色
ＬＮＣａＰ細胞をウェル当たり１，０００細胞の密度で４ウェルチャンバースライド上に播種した。一晩の増殖後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、続いてＰＳＭＡの細胞外モチーフを検出するのにマウスＪ５９１抗体を用いて、Ｉ型ｍＧｌｕＲについてはウサギポリクローナル抗体（ｍＧｌｕＲ１／５抗体、ＮＢ３００−１２６、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）を用いて連続染色した。核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて染色した。スライドを、Ｌｅｉｃａ直立共焦点ＳＰ５顕微鏡を用いて画像化した。
【００９７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ代謝変化の画像化
オス胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）にＬＮＣａＰ異種移植片を移植した（１００μＬマトリゲル中３００万細胞）。異種移植片の移植の直後に、毎日２−ＰＭＰＡでマウスを静脈内処置した（０．４ｍＭ、１００μＬ後眼窩注射）。腫瘍血管新生および酸素添加を、Ｖｅｖｏ  ＬＡＺＲ小動物光音響画像化プラットホーム（Ｖｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、処置開始１５日後に評価した。
【００９８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学療法
細胞を９６ウェルフォーマット（ウェル当たり２，５００細胞）に播種し、４８時間増殖させた。次に細胞を、以下の薬物：ドキソルビシン、タキソール、ＡＺＤ６２４４、ＢＥＺ２３５、ラパチニブ、およびベルケイド（すべてＳｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸより購入）を最終濃度２００ｎＭで用いて処置した。併用療法では、細胞を２−ＰＭＰＡ（５μＭ最終濃度）で処置した。薬物の存在下で一晩インキュベートした後、アラマーブルー法を供給者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｌｒｓｂａｄ、ＣＡ）のガイドラインに従って用いて細胞生存率を決定した。
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ化学療法
オス胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）のそれぞれの側腹部にＬＮＣａＰ異種移植片を移植した（１００μＬマトリゲル中３００万細胞）。異種移植片の移植の直後に、毎日２−ＰＭＰＡでマウスを静脈内処置した（０．４ｍＭ、１００μＬ後眼窩注射）。腫瘍体積をマイクロキャリパーで腫瘍を測定することにより評価した。併用療法を、ＬＮＣａＰ異種移植片を有するオス胸腺欠損ヌードマウスを用いて実施し、腫瘍検出後毎日処置した。エンザルタミド（０．１５ｍＭ）、２−ＰＭＰＡ（３ｍＭ）または両方の化合物（０．１５ｍＭのエンザルタミドと３ｍＭの２−ＰＭＰＡ）のいずれかを受ける動物を用いて、化学療法を静脈内（１００μＬ後眼窩注射）により施した。ＰＣ３−ＰＳＭＡ異種移植片（１００μＬマトリゲル中３００万細胞）を有するオス胸腺欠損ヌードマウスを、ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＡＺＤ８０５５とＸＬ１８４の組合せ（ＡＺＤ８０５５  ０．４ｍＭとＸＬ１８４  ８μＭ  １００μＬ後眼窩注射）のいずれかで処置した。
【０１００】
ヒト前立腺がん試料の解析
生化学再発転移データをｃＢＩＯポータル（www.cbioportal.org）を通じて入手し、検索データをデータ表示ソフトウェアＰｒｉｓｍ上にプロットした。前立腺切除術を受けた患者由来の前立腺がん生検を、ＭＳＫＣＣから研究施設のガイドラインに従って入手した。試料を処理してグラススライド組織マイクロアレイ上に置き、次に、標準免疫組織化学プロトコルを使用して、抗ＰＳＭＡ抗体（ＤＡＣＯ）、抗ＰＴＥＮ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または抗４ＥＢＰ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で染色した。画像化およびスコアリングは、本研究とは関連のない独立した病理学者により実施された。次に、病理学結果を、統計学的評価およびパターン識別のための主成分分析を通じてＭａｔＬａｂ上で処理した。ＰＳＭＡ  ＰＥＴ画像化を、前立腺切除術前の前立腺がん患者において、研究施設の手順に従い６８Ｇａ−ＰＳＭＡ特異的薬剤を使用してＴＵＭで実施した。原発腫瘍由来の生検を処理し、試料をガラススライドに沈着させ、これを標準免疫蛍光顕微鏡法ワークフローに従って、抗ＰＳＭＡ抗体（ＤＡＫＯ）および抗ｐＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で染色した。
【０１０１】
遺伝子セットエンリッチメント解析（Gene  Set  Enrichment  Analysis）は、ｃＢＩＯポータル（www.cbioportal.org）を通じて入手した患者データおよび遺伝子マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）解析後発明者らにより収集された細胞株データに関して、ブロード研究所（www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）を通じて提供されるソフトウェアパッケージを使用して実施された。
【０１０２】
（実施例２）
前立腺がんにおけるカルシウムホメオスタシスでのＰＳＭＡの役割
前立腺がん細胞株におけるカルシウムホメオスタシスに対するＰＳＭＡ発現の効果を、蛍光定量的Ｆｌｕｏ４アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を供給者の指示に従って使用して評価した。プレートを４９０ｎｍで励起し、蛍光発光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて５２０ｎｍでモニターした。結果によれば、ＰＳＭＡ発現細胞のほうが高い細胞質カルシウム濃度を有していることが示された。ＬＮＣａＰ−ｗｔおよびＰＣ３−ｈＰＳＭＡヒト前立腺がん細胞によるなどのＰＳＭＡの発現は、ＰＣ３−ｗｔなどのＰＳＭＡ発現を欠く細胞と比べた場合、より高い細胞質カルシウムレベルをもたらす（図１ａ）。細胞質中でのカルシウム蓄積を調べるため、細胞を、プレートリーダーを用いた測定を行う直前にタプシガルジン（１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）で処置した。研究によれば、ＰＳＭＡ発現細胞はＰＣ３−ｗｔ細胞よりタプシガルジンへの感受性が強く、このためその細胞質ではカルシウムが有意に集積していることが明らかになった（図１ｂ）。さらに、本発明者らは、ＰＳＭＡがその酵素活性を通じてｍＧｌｕＲグループＩ受容体を介してカルシウムシグナル伝達を促進するのかどうかを調べた。細胞を、カルシウム測定を行う直前に、Ｌキスカル酸（１１０μＭ；ｍＧｌｕＲ  Ｉアゴニスト、Ｔｏｃｒｉｓ）、Ｌ−ＡＰ３（１２５μＭ；ｍＧｌｕＲ  Ｉアンタゴニスト、Ｔｏｃｒｉｓ）またはＰＳＭＡ阻害剤（１００μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）で処置した。ＰＳＭＡ発現細胞では、ＰＳＭＡを阻害するとｍＧｌｕＲ  Ｉの阻害のようにカルシウムレベルを低下させたために、カルシウムレベルがＰＳＭＡの酵素活性およびｍＧｌｕＲ  Ｉにより調節されていることを見出した（図１ｃ）。さらに、本発明者らは、（Ｓ）−３，５−ＤＨＰＧ（０．６７ｍＭ；ｍＧｌｕＲ  Ｉアゴニスト、Ｔｏｃｒｉｓ）およびホスホリパーゼＣ阻害剤Ｕ７３１２２（５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を使用して、ＰＳＭＡ阻害によりホスホリパーゼＣの阻害のようにカルシウムレベルを低下させることを見出し、このことから、ＰＳＭＡがその酵素機能を通じてｍＧｌｕＲ  Ｉを活性化し、ホスホリパーゼＣの活性化およびカルシウムシグナル伝達の阻害をもたらすことが示された（図１ｄ）。
【０１０３】
（実施例３）
ＰＳＭＡはＧｌｕＲと共局在する
ＰＳＭＡは、前立腺がん細胞の細胞膜にｍＧｌｕＲ１／５と共局在している。ＬＮＣａＰ細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｊ５９１ＰＳＭＡ抗体およびｍＧｌｕＲ１／５に対するポリクローナル抗体で染色した（図２）。ＬＮＣａＰ細胞をウェル当たり１，０００細胞の密度で４ウェルチャンバースライド上に播種した。一晩の増殖後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、続いてＰＳＭＡの細胞外モチーフを検出するのにマウスＪ５９１抗体を用いて、Ｉ型ｍＧｌｕＲについてはウサギポリクローナル抗体（ｍＧｌｕＲ１／５抗体、ＮＢ３００−１２６、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）を用いて連続染色した。核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて染色した。スライドを、Ｌｅｉｃａ直立共焦点ＳＰ５顕微鏡を用いて画像化した。
【０１０４】
（実施例４）
ＰＳＭＡの酵素活性はいくつかのカルシウム依存性シグナル伝達エフェクターのリン酸化を上方調節する
カルシウム依存性下流エフェクターのリン酸化状態を分析した。代謝調節型グルタミン酸受容体とその関連Ｇタンパク質が活性化されると下流エフェクターをリン酸化することができるので、ＰＳＭＡ発現と関連する重要なタンパク質のリン酸化レベルを調べた。標的タンパク質の等電点変化に基づいて全体的なリン酸化状態を決定することが可能である、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ製のＮａｎｏＰｒｏ  ｓｙｓｔｅｍを使用した。ＮａｎｏＰｒｏ溶解緩衝液を用いた細胞の溶解に続いて、供給者のガイドラインに従って試料を調製した。使用した抗体をすべてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入し、標的タンパク質の全タンパク質レベルを検出した。ＰＳＭＡ発現細胞のほうがキナーゼＣＡＭＫＫ２のリン酸化が高く（図３ａ）、ＰＳＭＡ陰性細胞（ＰＣ３−ｗｔ）ではリン酸化レベルはかなり低い。ＰＳＭＡ阻害剤（５μＭ）で４８時間処置するとこれらの細胞においてはＣＡＭＫＫ２のリン酸化が減少し、ＰＳＭＡを欠く細胞では全く効果はなかった（図３ｂ）。同様に、ＣＡＭＫＫ２の下流標的であるＡＭＰＫα（図３ｃ）および重要なキナーゼＡＫＴ（図３ｄ）のリン酸化は阻害剤での処置後ＰＳＭＡ陽性細胞では損なわれており、ＰＳＭＡがその酵素活性を通じて主要なシグナル伝達経路を調節していることを示している。Ｇタンパク質活性化ＰＩ３ＫまたはＰＡＫをリン酸化するカルシウム活性化ｍＴＯＲＣ２がＡｋｔのリン酸化を引き起こすことが可能であることは既に示されている。グラフはすべて平均±平均値の標準誤差を示す。
【０１０５】
ヒト前立腺がん試料から収集したデータは、主要なシグナル伝達経路の調節におけるＰＳＭＡの役割を確かめるのに役立つ。ＰＳＭＡの発現レベル（「ＦＯＬＨ１」）は前立腺がん患者においてもっと速い生化学的発生および転移に関連していることが実証されている（図３ｅ）。さらに、８０試料組織マイクロアレイの主要成分分析によれば、ＰＳＭＡ発現とＡＫＴおよびｍＴＯＲの下流にある４ＥＢＰ１のリン酸化の間の相関が示された（図３ｆ）。マウスモデルで見出されたように、ＰＥＴを通じてＰＳＭＡ陽性であった患者はＰＳＭＡ陰性個体よりも高いリン酸化ＡＫＴを有していた。さらに、前立腺がん患者において、遺伝子セットエンリッチメント解析に基づけば、ＰＳＭＡの発現はｍＴＯＲ経路の活性化と相関している（図１２）。
【０１０６】
これらのデータによれば、前立腺がんでは、ＰＳＭＡの酵素活性が多くの決定的なシグナル伝達エフェクターのリン酸化を調節していることが示されており、発がん性シグナル伝達におけるその主要な役割が示され、前立腺がんにおける独特な治療機会が示唆される。
【０１０７】
（実施例５）
ＰＳＭＡは複雑な多成分プロ発がん性レパートリーを組織化する
ＰＳＭＡ阻害がいくつかの重要なキナーゼのリン酸化に影響を及ぼしたことを考慮して、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のヒトカイノームプロファイリングアレイを利用して他のキナーゼがこのタンパク質によって調節されているというさらに広い見解を得た。ＬＮＣａＰ−ｗｔ細胞をＰＳＭＡ阻害剤（４８時間、５μＭ）の存在下で増殖させ、ＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞をピューロマイシン誘導選択下で増殖させた。対照細胞には、完全ＲＰＭＩ培地において４８時間増殖させたＬＮＣａＰ−ｗｔ細胞およびＰＣ３−ｗｔ細胞が含まれた。細胞をアレイプロトコルに従って溶解し、処理して、アレイを供給者のガイドラインに従って実施した。アレイの膜の画像化を化学発光基質とＨＲＰコンジュゲート検出抗体の存在下でフィルム露出後に実施し、暗室で処理した。結果によれば、ＰＳＭＡを阻害するとＴＯＲ、ｐ２７、およびＳｒｃを含む多くのタンパク質のリン酸化に影響を及ぼし、ＰＣ３細胞においてＰＳＭＡが発現されるとこれらのタンパク質のリン酸化が増加することが示された（図４ａ）。多くの重要なエフェクターのリン酸化はＰＳＭＡ阻害剤でＬＮＣａＰ−ｗｔ細胞を処置すると減少し、ＰＣ３細胞によるＰＳＭＡの発現（ＰＣ３−ｈＰＳＭＡ）によりこれらのタンパク質のリン酸化は相反して上方調節された。
【０１０８】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ  ２．０遺伝子アレイを使用するゲノム解析によれば、複数の遺伝子がＰＳＭＡを発現しているＰＣ３細胞において上方調節されていることが示された（図４ｂ）。オンラインのＤＡＶＩＤ機能予測プラットホームを使用してその機能に基づいてこれらの遺伝子を分類すると、ＰＳＭＡ発現ＰＣ３細胞において上方調節されている遺伝子の多くがシグナル伝達、代謝、および新脈管形成に関与していることが明らかになった。ＰＳＭＡヌル細胞は、細胞周期調節およびシグナル伝達に関与している遺伝子のより高いｍＲＮＡレベルを有している（図４ｃ）。最も目覚ましい所見の１つは、ＰＩＧＦのレベルに影響を及ぼすことのないＰＳＭＡ発現細胞におけるＶＥＧＦ−Ａの発現の上方調節であった。ＰＣ３細胞においてＰＳＭＡが発現されると（ＰＣ３−ＰＳＭＡ）、ＰＩＧＦのレベルに影響を及ぼすことなく転移促進性（pro-metastatic）／新脈管形成エフェクターＶＥＧＦ−Ａのレベルが上方調節された。これにより、前立腺がん新脈管形成および一般的な腫瘍新生血管形成におけるＰＳＭＡの役割が実証されている（図４ｄ）。これらのデータは、ＰＳＭＡがＰＣａ発生および進展に対して発揮する多面的効果を示し、ＰＳＭＡを効果的に阻害する初期の治療的介入は大きな臨床的潜在力があり生存を増加させる可能性があることが示唆される。
【０１０９】
（実施例６）
ＰＳＭＡは前立腺がんの進展の一因となる
ＰＳＭＡはＡｋｔリン酸化を調節するので、ＰＳＭＡの阻害およびそれに続くＡｋｔ活性の下方調節がアンドロゲン受容体（ＡＲ）経路の状態に影響を及ぼすのかどうかを調べた。機能的アンドロゲン受容体（ＡＲ）を有するＬＮＣａＰ−ｗｔ細胞をＰＭＳＡ阻害剤（５μＭ）の存在下で４８時間増殖させ、ＰＳＡレベルはＡＲ経路により調節されているので、細胞の培養培地をＰＳＡについてスクリーニングした（ＤＥＬＦＩＡ  ＰＳＡ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。結果によれば、ＰＳＭＡが阻害されると、Ａｋｔ媒介負のフィードバックの除去を介したＡＲシグナル伝達カスケードの過剰活性化のためにＰＳＡレベルが増加することが示された（図５ａ）。ＰＳＭＡを阻害してもＰＳＡのｍＲＮＡレベルに影響しなかった。
【０１１０】
Ａｋｔは細胞代謝にも関与しているので、ＰＣ３細胞においてＰＳＭＡが発現すればその代謝経路が変化するかどうかをＮＡＤ＋およびＡＴＰのレベルを測定することによって決定した。ＮＡＤ＋測定では、分光光度アッセイをＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入し、ＡＴＰ定量をＢｉｏｖｉｓｉｏｎ製のＳｔａｙＢｒｉｔｅ  ＡＴＰアッセイを用いて実施した。アッセイをすべて対応する供給者のプロトコルに従って実施した。ＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞は、ＮＡＤ＋とＡＴＰの両方がＰＳＭＡ陰性細胞（ＰＣ３−ｗｔ）よりも高いレベルであり、ＰＳＭＡ発現が前立腺がん生体エネルギー（bioenergetics）を変化させ、エネルギー生産を好気的解糖から酸化的リン酸化に変化させることによりＡＴＰ生成を増加させることが示された（図５ｂ）。
【０１１１】
さらに、ＡｋｔとＣａ＋２の両方がこれらの過程を調節しているので、ＰＳＭＡ阻害が一酸化窒素シンターゼの活性およびプロスタグランジンのレベルに影響を及ぼすのかどうかを調べた。一酸化窒素シンターゼの活性をＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製のキットを用いて試料の全ニトレートレベルを定量することにより評価し、細胞培地に分泌される全プロスタグランジンのレベルを、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製の全プロスタグランジンキットを用いて測定した。ＰＳＭＡの阻害を、ＰＳＭＡ阻害剤（５μＭ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２で４８時間実施した。試料をすべてキットの指示に従って調製し、その結果はＰＳＭＡを阻害すればニトレートとプロスタグランジンレベルが減少することを示した。ＰＳＭＡを阻害すると一酸化窒素シンターゼ活性が減少し、ニトレートレベルが低くなっていることに反映された。阻害剤を用いて処置しても、ＰＳＭＡを発現しないＰＣ３−ｗｔ細胞においてニトレート濃度に影響しなかった。分泌されたプロスタグランジンの全レベルは、ＬＮＣａＰとＰＣ３−ＰＳＭＡ細胞をＰＳＭＡ阻害剤で処置した後は減少し、ＰＳＭＡを欠く細胞（ＰＣ３−ｗｔ）とは対照的であった（図５ｃ〜ｄ）。これらのデータによれば、ＰＳＭＡはＡＲ経路を負に調節し前立腺がんの代謝を、進展した病巣および転移病巣で遭遇する酸化的リン酸化に変えることが示される。ＰＳＭＡは強力な脈管形成エフェクター、炎症エフェクター、および転移性エフェクターのレベルも調節し、これが前立腺がんの進展の一因となり効果的な処置を弱める。
【０１１２】
（実施例７）
ＰＳＭＡはｉｎ  ｖｉｖｏで新脈管形成および腫瘍酸素添加に影響を及ぼす
ＬＮＣａＰ−ｗｔ異種移植片をその側腹部に移植され、異種移植片が移植されると毎日生理食塩水またはＰＳＭＡ阻害剤（２−ＰＭＰＡ、０．４ｍＭ、１００μＬ後眼窩注射）で処置されたオス胸腺欠損ヌードマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、ＰＳＭＡを阻害すると、オキシヘモグロビンおよびデオキシヘモグロビンの異なる光吸収特性に基づくＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓの光音響システムを使用して評価される腫瘍血管新生が低下し、腫瘍酸素添加も低下することが示された。この研究で使用された腫瘍はほぼ同じサイズであった。阻害剤で処置された動物は腫瘍の全ヘモグロビンレベルが低くなっており、ＰＳＭＡが腫瘍血管新生において役割を果たすことを示している（図６ａ〜ｂ）。腫瘍血管新生に加えて、ＰＳＭＡを阻害すると腫瘍の代謝プログラミングが影響を受け、酸素消費量が低下した（図６ｃ）。
【０１１３】
（実施例８）
ＰＳＭＡの酵素活性を阻害すると多くの化学療法薬の細胞傷害性が改善される
ＰＳＭＡが複数の標的のリン酸化状態に影響を及ぼすことを考慮して、ＰＳＭＡを阻害すると診療所においてまたは臨床試験下で使用される種々の化学療法薬に対する抵抗性を相殺することが可能かどうかを調べた。ＬＮＣａＰ細胞とＰＣＳ３−ＰＳＭＡ細胞を９６ウェルフォーマットにウェル当たり２，５００細胞の密度で播種し、４８時間増殖後、細胞を、薬物（ドキソルビシン（アドリアマイシン；ＤＮＡ挿入剤）、タキソール（パクリタキセル；微小管安定化剤）、ＡＺＤ６２４４（セルメチニブ；ＭＥＫ１＆ＥＲＫ１／２阻害剤）、ＢＥＺ２３５（ダクトリシブ（Dactolisib）；ＰＩ３Ｋ＆ｍＴＯＲ阻害剤）、ラパチニブ（ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２阻害剤）、またはベルケイド（ボルテゾミブ；２０Ｓプロテアソーム阻害剤）、１×ＰＢＳ中２００ｎＭ最終濃度）を用いて、または薬物（２００ｎＭ最終濃度）および２−ＰＭＰＡ（５μＭ最終濃度）を用いて処置した。一晩のインキュベーション後、細胞生存率を、アラマーブルー法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、供給者のプロトコルに従って蛍光定量的に評価した。ＰＳＭＡを阻害すると、ＰＳＭＡ発現細胞ではすべての化学療法薬の毒性が増強され、ＰＳＭＡを欠くＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ−ＫＤ）はその親細胞株（ＬＮＣａＰ）よりも、すべての薬物に対して感受性であった。ＰＣ３−ｗｔ細胞は、ベルケイド以外のすべての薬物について、ＰＳＭＡ発現ＰＣ３細胞（ＰＣ３−ＰＳＭＡ）と類似する細胞傷害性プロファイルを有していた。これは、ＰＣ３−ｗｔ細胞をベルケイドに対してより感受性にしている、これら２つの細胞株間の異なる酸化ストレス負荷に起因する可能性がある（図７ａ〜ｄ）。ＰＳＭＡ阻害剤だけでは本研究の時間経過では細胞傷害性効果を引き起こさなかった。これらのデータから、ＰＳＭＡが前立腺がんに化学療法抵抗性および生存優位性を与えていることが確かめられる。
【０１１４】
（実施例９）
ＰＳＭＡの発現は活性酸素種の細胞内レベルを増加させる化学療法に対する抵抗性を与える
（Ａ）ＰＳＭＡ発現細胞（ＬＮＣａＰ−ＰＳＭＡ＋ｖｅ）および（Ｂ）ＰＳＭＡ−陰性細胞（ＰＳＭＡ発現がｓｈＲＮＡでノックダウンされているＬＮＣａＰ−ＰＳＭＡ−ｖｅ）の細胞生存率を蛍光ベースのアラマーブルー法（λｅｘ＝５６５ｎｍおよびλｅｍ＝５８５ｎｍ）を介して決定した。細胞生存率を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＲＯＳ生成薬物エレスクロモル（Elesclomol）（２５０ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のいずれかと一緒の薬物投与の４８時間後に評価した。ＰＳＭＡの酵素活性を阻害すれば（ＣおよびＤ）薬物耐性が抑制され、細胞は細胞死を起こしやすくなる。選択的ＰＳＭＡ阻害剤（２−ＰＭＰＡ、２５０ｎＭ）で処置した（Ｃ）ＰＳＭＡ発現細胞および（Ｄ）ＰＳＭＡ陰性細胞の細胞生存率。細胞を４８時間処置し、細胞生存率を、アラマーブルー法を用いて決定した（平均±ＳＤ、ｎ＝４）（図８）。
【０１１５】
（実施例１０）
ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＳＭＡを阻害すると腫瘍増殖が妨害され生存が改善される
側腹部にＬＮＣａＰ異種移植片を有するオス胸腺欠損ヌードマウスの毎日処置を使用して、腫瘍増殖を調べた。それぞれの動物の側腹部に１００μＬマトリゲル中３，０００，０００細胞を注射し、動物を２−ＰＭＰＡ（０．４ｍＭ、１００μＬ後眼窩注射）で直ちに処置した。マイクロキャリパーを用いて腫瘍を測定することにより、腫瘍体積を評価した。結果によれば、ＰＳＭＡを阻害しても腫瘍の発生に影響を及ぼすことはないが（図９ａ）、腫瘍が小さくなって増殖が遅くなり動物の生存を延ばす（図９ｂ）ことが示された。異なる研究では、ＬＮＣａＰ異種移植片を有するオス胸腺欠損ヌードマウスを、エンザルタミド（０．１５ｍＭ、１００μＬ後眼窩注射）、２−ＰＭＰＡ（３ｍＭ、１００μＬ後眼窩注射）または両方（０．１５ｍＭのエンザルタミドと３ｍＭの２−ＰＭＰＡ、１００μＬ後眼窩注射）のいずれかを用いて腫瘍検出後毎日処置した。ＰＳＭＡ阻害剤（２−ＰＭＰＡ）とＡＲアンタゴニスト（エンザルタミド）を用いた併用処置では腫瘍増殖が遅くなり腫瘍退縮が早くなっており、ＰＳＭＡを阻害すれば疾患の初期中に重要な治療的介入枠を提供する可能性があることが示唆された（図９ｃ〜ｄ）。
【０１１６】
（実施例１１）
ＰＳＭＡレベルはｉｎ  ｖｉｖｏでの不十分な化学療法応答と相関している
ＰＳＭＡはＡｋｔを通じてｍＴＯＲおよび脈管形成シグナル伝達を上方調節するので、ｍＴＯＲおよび脈管形成経路の阻害を通じた腫瘍療法応答を調べた。ＰＣ３−ＰＳＭＡ異種移植片を、高または低ＰＳＭＡレベルを有する細胞を使用して、オス胸腺欠損ヌードマウスに移植した（マトリゲル中側腹部当たり３，０００，０００細胞、１００μＬ皮下）。すべてのマウスがその側腹部に腫瘍を発症した後、処置過程が開始され、一日おきにマウスをビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＡＺＤ８０５５とＸＬ１８４の組合せ（ＡＺＤ８０５５  ０．４ｍＭとＸＬ１８４  ８μＭ  １００μＬ後眼窩注射；腫瘍の大きさはキャリパーで測定した）のいずれかで処置した。研究の終了時、薬物で処置されＰＳＭＡレベルが低かったマウスは腫瘍縮退を示し、ＰＳＭＡレベルがより高かった異種移植片を有する対応物とは対照的であった（図１０ａ〜ｂ）。
【０１１７】
（実施例１２）
ＰＳＭＡ発現および活性のためにその遺伝子発現が上方調節されている遺伝子の同定
細胞過程のファミリーへの遺伝子の分類により、ＰＳＭＡ発現が前立腺がんにおけるシグナル伝達エフェクターの発現を上方調節することも示される。ＬＮＣａＰ  ｗｔ：ＰＳＭＡ陽性、ＬＮＣａＰ  ＫＤ：ＰＳＭＡ陰性、ＰＣ３  ｗｔ：ＰＳＭＡ陰性、ＰＣ３−ＰＳＭＡ：ＰＳＭＡ陽性（図１１）。
【０１１８】
（実施例１３）
前立腺がんにおけるＰＳＭＡの役割
これらの所見は、その酵素活性と、ＮＡＡＧおよびフォレートを含む（ポリ）グルタミン酸化基質を処理する能力を通じて、ＰＳＭＡは代謝調節型グルタミン酸受容体グループＩを活性化し、これが下流シグナル伝達カスケードを開始して、細胞質カルシウムレベルを増加させることを実証している。放出されたカルシウムは種々のシグナル伝達エフェクターをさらに活性化して、代謝を変化させ、腫瘍と転移のためのその環境を刺激する（図１３）。
【０１１９】
（実施例１４）
臨床試料中のＰＳＭＡレベルを定量するための修正Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルタミン酸アッセイ
葉酸はアミド結合を介してグルタミン酸に連結されたプテロイル（pteroyl）部分からなるために、修正ＰＳＭＡ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルタミン酸／グルタミン酸オキシダーゼアッセイキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）はグルタミン酸の代わりに葉酸を利用する。ＰＳＭＡの存在下で、アミド結合は切断されて、プテロイル基とグルタミン酸を遊離し、グルタミン酸はＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイのグルタミン酸オキシダーゼにより酸化されてαケトグルタル酸、アンモニア、および過酸化水素を生成する。シグナル増強では、アミノ基転位反応が起こり、Ｌグルタミン酸トランスアミナーゼがαケトグルタル酸をグルタミン酸に転換する。収集された後、ＥＰＳ尿試料は直ちに使用されるまたは−８０℃で保存することが可能である。ＰＳＭＡ定量では、これらの試料を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中、室温で葉酸基質（２ｍＭ）と一緒に２４時間プレインキュベートした。全タンパク質濃度の調整をこの緩衝液での希釈を通じて実施した。このアッセイでは、組換えＰＳＭＡ（４ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、および１００ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からなる陽性対照を使用した。陽性対照に、シグナル正規化およびその後のＰＳＭＡ定量を可能にするために、２ｍＭの葉酸基質を補充した。２４時間のインキュベーション終了時、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルタミン酸アッセイを実施し、試料に、１×反応緩衝液中０．２５Ｕ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ、０．０８Ｕ／ｍＬ  Ｌグルタミン酸オキシダーゼ、０．５Ｕ／ｍＬ  Ｌグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、および２００μＭ  Ｌアラニンを含有する１００μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充した。結果は蛍光を検出することができるマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、ならびに小動物画像化システム（ＩＶＩＳ２００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて得られた。
【０１２０】
（実施例１５）
臨床試料中のＰＳＭＡレベルを定量するための活性化可能な薬剤
ＰＳＭＡ活性化可能な薬剤はアミド結合を介してルシフェリンにコンジュゲートされたグルタミン酸基質からなる。ＰＳＭＡの存在下で、アミド結合は切断され、グルタミン酸とルシフェリンを遊離し、これはルシフェラーゼにより検出することが可能である。収集された後は、ＥＰＳ尿試料は直ちに使用されるまたは−８０℃で保存することが可能である。ＰＳＭＡ定量では、これらの試料を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中、室温でグルタミン酸−ルシフェリン基質（２ｍＭ）と一緒に２４時間プレインキュベートした。全タンパク質濃度の調整をこの緩衝液での希釈を通じて実施した。このアッセイでは、組換えＰＳＭＡ（４ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、および１００ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からなる陽性対照を使用した。陽性対照に、シグナル正規化およびその後のＰＳＭＡ定量を可能にするために、２ｍＭのグルタミン酸−ルシフェリン基質を補充した。２４時間のインキュベーション終了時、ルシフェラーゼ酵素アッセイを実施し、試料に、生物発光緩衝液［４０ｍＭのトリス酢酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、３．４５ｍＭのＡＴＰ、０．２ＭのＮａＣｌ、５．７ｍＭのＭｇＳＯ４、および０．７６ｍＭの補酵素Ａ（ｐＨ７．６）］中２ｎＭのホタルルシフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を補充した。結果は発光を検出することができるマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、ならびに小動物画像化システム（ＩＶＩＳ２００、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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