(57)【要約】【課題】ステビオール配糖体の分離、単離及び特徴付けのための方法を提供する。【解決手段】ステビア  レバウディアナ植物の抽出物からのステビオール配糖体の２種以上の組み合わせの分離、単離及び特徴付けのための包括的な方法並びに甘味組成物におけるそれらの使用が開示される。ステビア  レバウディアナからのステビオール配糖体の２種以上の組み合わせが特徴付けられる。該ステビオール配糖体の２種以上の組み合わせは、甘味増強剤、香味増強剤並びに食品、飲料、化粧品及び医薬品における甘味料として使用され得る。ステビオール配糖体の２種以上の組み合わせの単離方法もまた開示される。【選択図】図１
2017507141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオール配糖体の２種以上の組み合わせを製造するための方法であって：
ａ）熱水を用いるステビア葉の抽出
ｂ）粗抽出物の浄化、及び
ｃ）クロマトグラフィーによるステビオール配糖体の２種以上の組み合わせの分離
を含む方法。
【請求項２】
前記ステビア葉が乾燥されていない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記浄化が、遠心分離により遂行される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記浄化が、ろ過により遂行される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ろ過は半透膜を用いる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分離が、連続クロマトグラフィーにより遂行される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記分離が、エタノールと水を用いる勾配溶離により遂行される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記分離が、異なる温度の勾配における水を用いる勾配溶離により遂行される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分離が、約２０℃ないし約９０℃の間の温度における水の勾配により遂行される請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離が、約３０℃ないし約６０℃の間の温度における水を用いる勾配溶離により遂行される請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ステビア  レバウディアナからの抽出物であって、前記抽出物はレバウジオシドＡ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｉ又はＤの２種以上を含む抽出物。
【請求項１２】
ステビア  レバウディアナからの統合されたクロマトグラフィー画分であって、前記統合されたクロマトグラフィー画分は、レバウジオシドＡ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｉ又はＤの２種以上を含む画分。
【請求項１３】
レバウジオシドＡ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｉ又はＤの２種以上を添加する工程を含む、食品の製造方法。
【請求項１４】
フラクタルデザインが用いられる請求項６記載の方法。
【請求項１５】
複数の取出しバルブ組立（部品）が用いられる請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
ステビア植物の育種子孫の選択を最適化するための方法であって、ステビオール配糖体の２種以上の組み合わせの望ましいレベルを好む育種子孫を同定することを含む方法。
【請求項１７】
前記ステビオール配糖体の２種以上の組み合わせは、レバウジオシドＡの分子量と同じであるか又はこれより大きな分子量を有するステビオール配糖体からなる群より選択されるステビオール配糖体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ステビオール配糖体の２種以上の組み合わせは、レバウジオシドＤ、Ｉ、Ｏ、Ｍ及びＮからなる群より選択されるステビオール配糖体を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年２月１８日に出願された米国の仮出願第６１／９４１，０１８号からの優先権を主張し、その内容は、それらの全てを参照することによりここに組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、ステビア  レバウディアナ植物の抽出物からステビオール配糖体の分離、単離及び評価のための包括的な方法並びに甘味組成物におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
近年、砂糖代替物は、高−砂糖の食品及び飲料の消費と連動する多くの疾患の認知に起因して、ますます注目を集めている。しかしながら、ズルチン、シクラミン酸ナトリウム及びサッカリンのような多くの人工甘味料は、それらの安全性における懸念に起因して、幾つかの国において禁止されるか又は制限された。従って、天然由来のノンカロリー甘味料は、ますます人気が出てきている。
【０００４】
ステビア  レバウディアナ  ベルトニーは、南アメリカの特定地域原産のキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ））の多年生低木である。該植物の葉は、砂糖のおよそ１５０ないし４５０倍甘いジテルペン配糖体を１０ないし２０％含む。該葉は、地元の茶及び薬を甘くするためにパラグアイ及びブラジルにおいて数百年の間、伝統的に使用されてきた。
【０００５】
典型的な行為は、１年の暖かい季節の間に植物を育て、その後、該植物の花の咲く前に収穫することである。Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｍｉｄｍｏｒｅ及びＡｎｄｒｅｗ  Ｈ．Ｒａｎｋは、１年当りの複数の作物（多毛作）は、ブラジル、パラグアイ、インド又はインドネシアのような暖かい気候の土地において可能であることを報告する（“Ａ  ｎｅｗ  ｒｕｒａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ  −Ｓｔｅｖｉａ−  ｔｏ  ｒｅｐｌａｃｅ  ｉｍｐｏｒｔｅｄ
ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ．ｔｈｅ  Ｒｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのレポート，２００２年８月；  ＲＩＲＤＣウェブ公開番号Ｗ０２／０２２，ＲＩＲＤＣプロジェクト番号ＵＣＱ−１６Ａ）。“商業的な収穫量の図表は、一般用語、例えば、１，６００−２，０００ｋｇ乾燥葉／ｈａ／年しか報告していない。実験的な収穫量は、１年に複数の収穫を伴うシステムがより高い収穫量を与えるであろうことを示唆する。”この収穫量は乾燥植物の質量を言及し、収穫当たりのヘクタール当たりのステビオール配糖体の最適化を言及するものではない。改良された分析方法を利用すること及びヘクタール当たりのステビオール配糖体の改善された収穫量のために選択された植物の良好な農業発展により並びに与えられた地理的地域内で時差収穫を用いて植物の成熟を調節することにより、収穫期当たりの収穫後のステビオール配糖体の収穫量における改善が成し遂げられ得る。
【０００６】
Ｍｉｄｍｏｒｅ及びＲａｎｋは以下を報告し続けている“通常の手順は、全作物を緑で収穫し、それを乾燥施設：天日乾燥又は（人工）乾燥窯、に運ぶことである。植物含水量を約８０％ないし１０％に減少するために、低い湿度を用いる切断された植物の薄層の天日乾燥は、かなり急速（９−１０時間）であり得る［１１６］。キルン乾燥は２日間を要し得る［３７］。急速乾燥は‘より良い品質’の乾燥葉を与える可能性がある。もし切断
された植物材料が急速に乾燥されない場合、葉の品質は酸化により劣化され得、３日後にステビオシド含有量の１／３までが失われ得る［１１６］。強制乾燥の間の高温がまた、含有量の損失を導き得る。緑の乾燥葉の色が望ましく、そして良好な質を表す。”我々は、収穫をずらすことにより及びいかなる乾燥工程も受けていない湿った（即ち、新鮮な、未乾燥の）葉の抽出処理に時期を合せることにより、この実施における改善を可能とした。この改善は、乾燥中の配糖体の損失を減少すること及び乾燥機の必要性を無くすことによる加工費の節約の二重の利点を与える。
【０００７】
乾燥されたステビア葉は、約５％ないし９％の水分、１０％ないし２０％のタンパク質、３５％ないし６２％の炭水化物、３％ないし５％の脂肪（主に、パルミチン酸、リノレン酸及びリノール酸）、７％ないし１３％の灰分及び、スパチュレノール、β−ピネン、β−カリオフィレン及び酸化カリオフィレンを含む幾つかの揮発性成分を含むと報告されている。ステビアは、シュウ酸も豊富である（Ｗoｌｗｅｒ−Ｒｉｅｃｋ  Ｕ．、Ｔｈｅ
Ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  （Ｂｅｒｔｏｎｉ），  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．２０１２年，６０巻，８８６−８９５頁参照）。これらの成分は、除去されないか又は実質的に低レベルまで減少されない場合、甘味料の風味芳香に影響し得る。結果として、それぞれの高純度のステビア甘味料の単離は、生成物を好適な味及び質にするために、種々の樹脂を用いる処理、有機溶媒を使用する分離及び結晶化を含む広範な加工を必要とする。
【０００８】
現在のところ、明確な甘味特性を有する２３０を超えるステビア種が存在する。該植物は自然の亜熱帯から寒冷地帯までの広範な条件下でうまく成長する。ステビオール配糖体の組成物は、方向付けられた植物育種により変更され得る。生来の植物種は主要なステビオール配糖体としてステビオシドを有するのに対して、現品種は増加されたレバウジオシドＡ含有量のために選択されるが、それはステビオシドよりも優れた品質の甘味料であると考えられている。ステビア  レバウディアナは、強力な甘味と知覚特性もまた特徴とする多くの他のステビオール配糖体を産生するが、幾つかの場合において、多くの他の天然由来の強力な甘味料のそれらよりも優れている。ステビオール配糖体は、ヒトの消化器系内でエネルギーのために代謝されず、糖がどこで使用されてもカロリーを付加すること無く食品を甘くするために使用され得る。それらは、糖尿病食及び低カロリー食のために好適である。
【０００９】
上述の配糖体は通常のアグリコンであるステビオールと、Ｃ13位とＣ19位に、数及びタイプの異なる炭化水素残基（それぞれ図１中におけるＲ２とＲ１）とを有する。ステビアの葉は、ステビオール配糖体を１０ないし２０％（乾燥質量に基づいて）まで蓄積し得る。天然のステビア葉中に見出される主要な配糖体は。レバウジオシドＡ（２−１０％）、ステビオシド（２−１０％）及びレバウジオシドＣ（１−２％）である。レバウジオシドＢ、Ｄ、Ｅ及びＦ、ステビオールビオサイド並びにルブソサイドのような他の配糖体がまた、低レベル（１％未満）で見出される。更なる他の配糖体が最近、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．（２０１０年）５７巻：１９９−２０９頁においてＯｈｔａ等により報告されている。
【００１０】
２種の主要な配糖体−ステビオシド及びレバウジオシドＡは、広範囲に研究され、市販の高甘味度甘味料としてのそれらの適合性の観点で特徴付けられる。例えば、炭酸飲料における安定性研究は、それらの熱及びｐＨ安定性を確認している。Ｃｈａｎｇ  Ｓ．Ｓ．等、（１９８３年）Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ
ａｎｄ  Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ａ  ｉｎ  ｃａｒｂｏｎａｔｅｄ  ｂｅｖｅｒａｇｅｓ．  Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．３１巻：４０９−４１２頁。高度に精製された状態においてさえ、これらのステビオール配糖体は、依然として、例えば、苦み
、甘い後味、甘草風味等に起因する望ましくない味を有する。ステビア甘味料の成功を収める商業化のための主な障害の１つは、これらの望ましくない味の特性である。ステビオール配糖体の濃度が増加するにつれて、これらの風味感がより目立つようになることが示されている（Ｐｒａｋａｓｈ等、（２００８年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｅｂｉａｎａ（登録商標），  ａ  ｎａｔｕｒａｌ，ｎｏｎ−ｃａｌｏｒｉｃ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４６巻，Ｓ７５−Ｓ８２頁）。
【００１１】
レバウジオシドＡは、最小の渋み、最小の苦さ及び最小のしつこい後味を示し、よって、既知のステビオール配糖体と比較して、好ましい感覚的特性を有する（Ｔａｎａｋａ  Ｏ．（１９８７年）Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔａｓｔｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ
ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ．Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６９巻：６７５−６８３頁；
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｋ．Ｃ．（１９８９年）Ｓｔｅｖｉａ：  ｓｔｅｐｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ．Ｉｎ：Ｇｒｅｎｂｙ  Ｔ．Ｈ．編．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ，３巻．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ．１−４３頁）。
【００１２】
Ｗａｎｇの米国特許出願公開第２０１３３４７１４０号は、高含有量のレバウジオシドＡを有するステビア植物の育種方法を開示する。
【００１３】
米国特許第ＰＰ２３，１６４及びＰＰ２３，７２８号は、ＡＫＨＬＩ及びＡＫＨＬ４という名前のステビアの品種を開示する。該品種は高いレバウジオシドＡの含有量を有する。
【００１４】
水又は有機溶媒を使用するステビア  レバウディアナ植物からの甘味配糖体の抽出及び精製のための方法が、例えば、米国特許第４，３６１，６９７号；米国特許第４，０８２，８５８号；米国特許第４，８９２，９３８号；米国特許第５，９７２，１２０号；米国特許第５，９６２，６７８号；米国特許第７，８３８，０４４号及び米国特許第７，８６２，８４５号中に開示されている。
【００１５】
Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ及びＡｈｍｅｄ（米国特許第４，３６１，６９７号）並びにＭｏｒｉｔａ等（米国特許第４，０８２，８５８号）は、ステビオール配糖体のシリカクロマトグラフィーを開示する。Ｇｉｏｖｅｎａｔｔｏ（米国特許第４，８９２，９３８号）は、ステビア甘味料の粗抽出物を浄化するために水酸化カルシウムを使用し、続いてろ過又は遠心分離を使用する。この沈殿物は強酸性のイオン交換樹脂及び、続いて、弱塩基性のイオン交換樹脂で処理され、ろ過され、乾燥される。Ｍａｇｏｍｅｔ等（米国特許第７８６２８４５号）はまた、カルシウム塩を用いる粗抽出物の処理、粗スラリーのろ過、それに続くメタノール−水混合物からのレバウジオシドＡの結晶化による、部分的に精製されたステビオール配糖体の単離も教示する。Ａｂｅｌｙａｎ等（米国特許第７，８３８，０４４号）は、ペクチナーゼの存在下におけるステビア  レバウディアナ  ベルトニーからの甘味配糖体の抽出、該抽出物をシクロデキストリン及びベントナイト及びイオン交換樹脂と接触させることによる精製、それに続く、エタノールからの結晶化及び再結晶を教示する。Ｋｕｔｏｗｙ等（米国特許第５，９７２，１２０号）は、垂直抽出カラムにおけるステビア  レバウディアナ（ベルトニー）からの甘味化合物の抽出方法、それに続く、該抽出物を浄化するための前処理工程としての精密ろ過、その後の限外ろ過、それに続くナノろ過を使用することによる、ろ過による精製を開示する。Ｐａｙｚａｎｔ等（米国特許第５，９６２，６７８号）は、ステビア  レバウディアナから抽出された甘味配糖体から不純物を除去するために２種のイオン交換カラムを使用し、メタノールを使用して第二のカラムから甘味配糖体を溶出し、溶液を冷却してステビオシドを結晶化する。該ろ液は更に濃縮及び冷却されてレバウジオシドＡを析出する。
【００１６】
米国特許第４，６１２，９４２号は、レバウジオシドＤを含むジテルペン配糖体及びそれらの食品、医薬組成物、口腔衛生組成物、チューイング組成物及び喫煙組成物における使用を開示する。
【００１７】
新規の炭水化物残基がＣ13及びＣ19位で初期分子に結合されている場合、これらの望ましくない特性の幾つかが、ステビオール配糖体を分子間トランスグルコシル化の反応に付すことにより減少され得るか又は除去され得ることが確定された。これらの位置における炭水化物残基の数に依存して、化合物の味の質及び効力は変化する。表１は、どのようにして甘さの質と強度を配糖体の数と位置により変化させるのかを説明する。グルコース部分（表中、Ｇｌｕｃ又はＧとして示される）は、β−グリコシド結合により結合される。プルラナーゼ、イソマルターゼ（Ｌｏｂｏｖ  Ｓ．Ｖ．等（１９９１年）、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔ  ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：２９５９−２９６５頁）、β−ガラクトシダーゼ（Ｋｉｔａｈａｔａ  Ｓ．等（１９８９年）、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｕｂｕｓｏｓｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：２９２３−２９２８頁）及びデキストラン  サッカラーゼ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．等（１９９４年）、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｙｌ−ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ  ｂｙ  α−１，６−ｔｒａｎｓｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｄｅｘｔｒａｎａｓｅ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：１６５７−１６６１頁）は、それぞれ、プルラン、マルトース、ラクトース及び部分的に加水分解されたデンプンと一緒にトランスグリコシル化酵素として、ステビオール配糖体コアにおける糖質部分をα−結合したグルコース単位で直線的に延長するための配糖体残基の供与体として使用されてきた。
【００１８】
ステビオール配糖体のトランスグルコシル化はまた、バチルス  ステアロサーモフィラスにより産生されるシクロデキストリン  グルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）の作用によっても達成された（米国特許第４，２１９，５７１号及び米国特許第７，８０７，２０６号）。結果として、α−１，４−グリコシル誘導体は、１０迄の重合度で形成された。グリコシル誘導体の味覚特性及び甘味力が、付加的なグリコシル誘導体の数、即ち、α−１，４−グリコシル鎖の重合度に大きく依存することが示された。α−１，４−グリコシル残基の数における増加は、甘味の質を改善するものの、同時に、甘味のレベルを減少する（Ｔａｎａｋａ、１９８７年）。
【００１９】
多くのグリコシルステビア生成物が、明確な機能特性を持たず、そして、該生成物中のステビオール配糖体の含有量を減少させ、更には甘味強度を減少する、２０％迄の残余のデキストリンを含むことも注意すべきである。
【００２０】
従って、高純度のステビア配糖体の簡単で且つ効率的な製造方法を開発することが必要である。
【００２１】
Ｗｕｘｉ  Ｋｉｎｇｂｏｏｎ  Ｓｔｅｖｉａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔ  Ｔｒａｄｅ  Ｃｏ．
Ｌｔｄ．の中国特許出願公開第１０３０１２５１６号は、水中にステビア葉を浸漬する工程；限外ろ過溶液を得るための粗ろ過及び限外ろ過の工程；該限外ろ過溶液をナノミクロガードカラムに導入する工程；及び、ナノミクロガードカラムにおけるアルコール分解の少なくとも２工程を含むステビオシドの製造方法を開示する。
【００２２】
Ｌｉａｏｎｉｎｇ  Ｑｉａｎｑｉａｎ  Ｂｉｏｌｏｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．の中国特許出願公開第１０２１２７１２９号は、ステビア葉を機械的に破砕する工程；該
ステビア葉をろ過する工程；超音波抽出を行う工程；凝集の工程；吸着の工程；エタノール溶出を介する分析の工程；脱塩及び脱色の工程；濃縮の工程；及び、噴霧乾燥の工程を含むステビア抽出物の製造方法を開示する。
【００２３】
Ｎｉｎｇｂｏ  Ｇｒｅｅｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．の中国特許出願公開第１０２４０６１１３号は、粉砕されたステビア葉を水で抽出する工程；マクロ多孔性樹脂カラムに該ろ液を通過させる工程；及び、レバウジオシドＡ／レバウジオシドＤ含有量を検出するＨＰＬＣ分析を使用する、アルコール性溶媒で溶出する工程を含むレバウジオシドＡ／レバウジオシドＤ配合物の製造方法を開示する。
【００２４】
Ｅ．Ｐ．Ｃ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．の米国特許出願公開第２０１３００７１５３７号は、レバウジオシドＢの塩形態を含むステビアをベースとする甘味料の組成物を開示する。
【００２５】
Ｃａｒｇｉｌｌ，  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄの米国特許出願公開第２０１４０２４３５１４号は、マクロ多孔性の中性多孔性樹脂の使用を含む、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ又はそれらの混合物の少なくとも１つを含む強化組成物の製造方法を開示する。
【００２６】
Ｃａｒｇｉｌｌ，  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄの米国特許出願公開第２０１３０３０９３８９号は、特定量のレバウジオシドＢ及びレバウジオシドＤを含む組成物を開示する。
【００２７】
ＬＧＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの米国特許出願公開第２０１４０００４２４８号は、特定のパラメーターを有する多孔性吸着カラムの使用を含む、少なくとも１つの、ステビオバイオサイド抽出物、レバウジオシドＢ抽出物及びレバウジオシドＤ抽出物を含む天然の甘味料組成物の製造方法を開示する。Ｍａｒｋｏｓｙａｎの米国特許出願公開第２０１３００７１３３９号は、高度に精製されたステビオール配糖体、特に、レバウジオシドＤの製造方法を開示する。
【００２８】
Ｍａｒｋｏｓｙａｎの米国特許出願公開第２０１５００１７２８４号は、少なくとも７５％のレバウジオシドＭを含むレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの結晶組成物を開示する。
【００２９】
Ｍａｒｋｏｓｙａｎの米国特許出願公開第２０１３００７１３３９号は、ステビオール配糖体を吸着し得る吸着剤樹脂で充填された連続的に結合されたカラムの使用を含むステビオール配糖体の精製方法を開示する。
【００３０】
ＰｕｒｅＣｉｒｃｌｅ  Ｓｄｎ  Ｂｈｄの米国特許出願公開第８，２９９，２２４号は、ステビアの抽出物を供給する工程；該抽出物を有機溶媒の第一水性溶液中に溶解して結果としてステビオール配糖体の第一混合物を生じる工程であって、該有機溶媒は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール及びそれらの混合物からなる群より選択され、該有機溶媒は７５ないし９９体積％である工程；第一混合物において結晶化を誘導する工程；該混合物をろ過して第一沈殿物と第一ろ液を得る工程；第一沈殿物を有機溶媒の第二水性溶液中に溶解して結果として第二混合物を生じる工程であって、該有機溶媒は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール及びそれらの混合物からなる群より選択され、該有機溶媒は７０ないし８０体積％である工程；第二混合物において結晶化を誘導する工程；該混合物をろ過して第二沈殿物と第二ろ液を得る工程；第二沈殿物を有機溶媒の第三水性溶液中に溶解して結果として第三混合物を生じる工程であって、該有機溶媒は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール及びそれらの混合物からなる群より選択され、該有機溶媒は１０ないし８０体積％である工程；第三混合物において結晶化を誘導する工程；及び、該混合物をろ過して第三沈
殿物と第三ろ液を得る工程；を含み、それにより、前記第三沈殿物を乾燥乾燥することで精製されたレバウジオシドＤを生じる、ステビア抽出物からレバウジオシドＤを精製する方法を開示する。
【００３１】
ＥＰＣ  Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．の米国特許出願公開第２０１４０３３５２５３号、米国特許出願公開第２０１４０３３５２５４号、米国特許出願公開第２０１４０３３５２６４号及び米国特許出願公開第２０１４０３３５２６５号は、精製されたレバウジオシドＤの増加量を含む非天然のレバウジオシドＤ組成物を開示するが、ここで、レバウジオシドＤの増加量が、精製されたレバウジオシドＤとして該組成物に添加される。
【００３２】
Ｔａｔｅ  ＆  Ｌｙｌｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  ＬＬＣの米国特許出願公開第２０１２０２６９９５４号は、レバウジオシドＢを含むステビア抽出物を開示する。
【００３３】
Ｌｅｅ等の米国特許出願公開第２０１１０２５６５８８号は、レバウジオシドＡがステビア  レバウディアナ  ベルトニーの葉から製造される場合に、副生成物をリサイクルすることにより高収率で製造されるレバウジオシドＡの製造方法を開示する。
【００３４】
Ｍｏｒｉｔａ等の米国特許出願公開第２０１１０１８３０５６号は、ここで開示される構造を有する単離されたステビオール配糖体を開示する。該参考文献は、ステビオシド又はレバウジオシドＡよりも多くのグリコシド部分が存在する構造を有するステビオール配糖体が、ステビア甘味料の味覚に微細な改善を提供し得ることを開示する。
【００３５】
ＰｕｒｅＣｉｒｃｌｅ  Ｓｄｎ  Ｂｈｄの米国特許第８，５２０，５２７号は、水中のステビアバイオマスを浸漬して可溶性成分を除去する工程；アルカリ溶液中の水−不溶性ステビアバイオマスを培養してパルプを製造する工程；及び、微結晶性セルロースを含むステビア食品成分を達成するための更なる加工工程を含むステビア食品成分の製造方法を開示する。
【００３６】
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｏｆ  Ｉｒｅｌａｎｄの米国特許第８，３３７，９２８号は、少なくともステビオール配糖体甘味料及びアニス酸を含む飲料製品を開示する。
【００３７】
ＰｕｒｅＣｉｒｃｌｅ  ＵＳＡの米国特許第８，３１８，４５９号及び米国特許第８，２５７，９４８号は、グルコース残基の源としてのデンプンを使用する高度に精製されたグルコシルステビア組成物の製造方法を開示する。
【００３８】
ＰｕｒｅＣｉｒｃｌｅ  Ｓｄｎ  Ｂｈｄの米国特許第８，２９９，２２４号は、レバウジオシドＤのステビア抽出物からの精製方法を開示する。
【００３９】
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｏｆ  Ｉｒｅｌａｎｄの米国特許第８，２７７，８６２号は、レバウジオシドＡ、エリトリトール及び酸成分を含む飲料製品を開示する。
【００４０】
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｏｆ  Ｉｒｅｌａｎｄの米国特許第８，２７７，８６２号は、ステビオール配糖体甘味料及び酸成分を含む飲料製品を開示する。
【００４１】
ＰｅｐｓｉＣｏ，  Ｉｎｃ．の米国特許第７，９６４，２３２号は、式１の中の環外二
重結合が５員環内の環内の位置に移動されたステビオール配糖体の異性体を開示する。
【００４２】
Ｖｉｎｅｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅの米国特許第７，９２７，８５１号は、ａ）ｅｎｔ−カウレン酸を産生する植物又は植物細胞を選択する工程；ｂ）ｅｎｔ−カウレン酸  １３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、及び１種以上のグルコース分子のステビオール又はグルコシル−ステビオールへの付加を触媒する１種以上のグルコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１種以上の他のヌクレオチド配列で、該植物又は植物細胞を形質転換する工程；及びｃ）該細胞中にｅｎｔ−カウレン酸  １３−ヒドロキシラーゼ及び前記１以上のグルコシルトランスフェラーゼを有するポリペプチドを発現して、ｅｎｔ−カウレン酸を１種以上のステビオール配糖体に転換する工程を含む、植物又は植物細胞中におけるステビオール配糖体の製造方法を開示する。
【００４３】
Ｏｈｔａ等のＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｅｖｉｏｌ
ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ｍｏｒｉｔａ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．、５７巻、１９９−２０９頁（２０１０年）は、Ｓ．レバウディアナ  ベルトニーの選択及び育種により提供された、Ｓ．レバウディアナ  モリタの葉から抽出されたステビオール配糖体の構造を開示する。
【００４４】
ＺｉｍｍｅｒｍａｎのＴａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｋｎｏｗｎ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｓｔｅｖｉｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｏｐｏｓａｌｓ，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２０１１年、２５巻  、５７５−１５８２頁は、１２種の以前は未知であったステビオール配糖体を同定するためのタンデム質量分析の使用を開示する。
【００４５】
Ｂｒａｎｄｌｅ等の（２００２年）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０巻：６１３−６２２頁；Ｒｉｃｈｍａｎ等の（１９９９年）、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９巻（４）、４１１−４２１頁；及びＲｉｃｈｍａｎ等の（２００５年）、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４１巻、５５−６７頁は、ステビオールの産生のための代謝経路及びステビオールの種々のステビオール配糖体への転換を開示する。
【００４６】
既存の方法は、初期抽出物からのステビオール配糖体の単離及び精製に取り組み、そして、残余の溶液の更なる処理又はそれぞれの若しくは集合的な微量化合物の精製のための方法は示していない。よって、ステビア  レバウディアナ植物からの抽出生成物の包括的な処理のための効率的及び経済的方法の必要性が残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４７】
【非特許文献１】Ａ  ｎｅｗ  ｒｕｒａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ  −Ｓｔｅｖｉａ−  ｔｏ  ｒｅｐｌａｃｅ  ｉｍｐｏｒｔｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ．ｔｈｅ  Ｒｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのレポート，２００２年８月；  ＲＩＲＤＣウェブ公開番号Ｗ０２／０２２，ＲＩＲＤＣプロジェクト番号ＵＣＱ−１６Ａ
【非特許文献２】Ｗoｌｗｅｒ−Ｒｉｅｃｋ  Ｕ．、Ｔｈｅ  Ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  （Ｂｅｒｔｏｎｉ），  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．２０１２年，６０巻，８８６−８９５頁
【非特許文献３】Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．（２０１０年）５７巻：１９９−２０９頁Ｃｈａｎｇ  Ｓ．Ｓ．等、（１９８３年）Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ  ａｎｄ  Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ａ  ｉｎ  ｃａｒｂｏｎａｔｅｄ  ｂｅｖｅｒａｇｅｓ．  Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．３１巻：４０９−４１２頁
【非特許文献４】Ｐｒａｋａｓｈ等、（２００８年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｅｂｉａｎａ（登録商標），  ａ  ｎａｔｕｒａｌ，ｎｏｎ−ｃａｌｏｒｉｃ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４６巻，Ｓ７５−Ｓ８２頁
【非特許文献５】Ｔａｎａｋａ  Ｏ．（１９８７年）Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔａｓｔｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ．Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６９巻：６７５−６８３頁
【非特許文献６】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｋ．Ｃ．（１９８９年）Ｓｔｅｖｉａ：  ｓｔｅｐｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ．Ｉｎ：Ｇｒｅｎｂｙ  Ｔ．Ｈ．編．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ，３巻．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ．１−４３頁
【非特許文献７】Ｌｏｂｏｖ  Ｓ．Ｖ．等（１９９１年）、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｗｅｅｔ  ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：２９５９−２９６５頁
【非特許文献８】Ｋｉｔａｈａｔａ  Ｓ．等（１９８９年）、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｕｂｕｓｏｓｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：２９２３−２９２８頁
【非特許文献９】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．等（１９９４年）、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｙｌ−ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ  ｂｙ  α−１，６−ｔｒａｎｓｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｄｅｘｔｒａｎａｓｅ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：１６５７−１６６１頁
【非特許文献１０】太田等のＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｅｖｉｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ｍｏｒｉｔａ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．、５７巻、１９９−２０９頁（２０１０年）
【非特許文献１１】ＺｉｍｍｅｒｍａｎのＴａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｋｎｏｗｎ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｓｔｅｖｉｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｏｐｏｓａｌｓ，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２０１１年、２５巻  、５７５−１５８２頁
【非特許文献１２】Ｂｒａｎｄｌｅ等の（２００２年）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０巻：６１３−６２２頁
【非特許文献１３】Ｒｉｃｈｍａｎ等の（１９９９年）、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９巻（４）、４１１−４２１頁
【非特許文献１４】Ｒｉｃｈｍａｎ等の（２００５年）、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４１巻、５５−６７頁
【特許文献】
【００４８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３３４７１４０号
【特許文献２】米国特許第ＰＰ２３，１６４号
【特許文献３】米国特許第ＰＰ２３，７２８号
【特許文献４】米国特許第４，３６１，６９７号
【特許文献５】米国特許第４，０８２，８５８号
【特許文献６】米国特許第４，８９２，９３８号
【特許文献７】米国特許第５，９７２，１２０号
【特許文献８】米国特許第５，９６２，６７８号
【特許文献９】米国特許第７，８３８，０４４号
【特許文献１０】米国特許第７，８６２，８４５号
【特許文献１１】米国特許第４，６１２，９４２号
【特許文献１２】米国特許第４，２１９，５７１号
【特許文献１３】米国特許第７，８０７，２０６号
【特許文献１４】中国特許出願公開第１０３０１２５１６号
【特許文献１５】中国特許出願公開第１０２１２７１２９号
【特許文献１６】中国特許出願公開第１０２４０６１１３号
【特許文献１７】米国特許出願公開第２０１３００７１５３７号
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１４０２４３５１４号
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１３０３０９３８９号
【特許文献２０】米国特許出願公開第２０１４０００４２４８号
【特許文献２１】米国特許出願公開第２０１３００７１３３９号
【特許文献２２】米国特許出願公開第２０１５００１７２８４号
【特許文献２３】米国特許出願公開第８，２９９，２２４号
【特許文献２４】米国特許出願公開第２０１４０３３５２５３号
【特許文献２５】米国特許出願公開第２０１４０３３５２５４号
【特許文献２６】米国特許出願公開第２０１４０３３５２６４号
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１４０３３５２６５号
【特許文献２８】米国特許出願公開第２０１２０２６９９５４号
【特許文献２９】米国特許出願公開第２０１１０２５６５８８号
【特許文献３０】米国特許出願公開第２０１１０１８３０５６号
【特許文献３１】米国特許第８，５２０，５２７号
【特許文献３２】米国特許第８，３３７，９２８号
【特許文献３３】米国特許第８，３１８，４５９号
【特許文献３４】米国特許第８，２５７，９４８号
【特許文献３５】米国特許第８，２７７，８６２号
【特許文献３６】米国特許第７，９６４，２３２号
【特許文献３７】米国特許第７，９２７，８５１号
【発明の概要】
【００４９】
本発明は、ステビア  レバウディアナ植物からの２種以上の微量のステビオール配糖体（及び、特に、乾燥葉質量の１％未満で天然に存在するもの）の分離、単離、特徴付け及び使用のための包括的な方法に関する。
【００５０】
１態様に従って、ステビア抽出物からの２種以上のステビオール配糖体の組み合わせの分離、単離及び特徴付けの効率的な方法が提供され、よって、廃棄物を最小限に抑える。
【００５１】
単独又は他の甘味料及び／又は他の成分との組み合わせにおける、２種以上のステビオール配糖体の組み合わせは、飲料、菓子、パン、クッキー、チューインガム、医薬品等のような食用で噛み砕ける組成物におけるノンカロリー甘味料として有用である。
【００５２】
１態様に従って、本方法は以下を含む：
１．特定された１組のステビオール配糖体の生産に最適化するための育種計画の報告手段としての、２種以上の微量のステビオール配糖体（乾燥葉質量の５％未満で存在する）の組み合わせの同定及び定量のためのクロマトグラフィー法の使用、それは甘味料として現在商業的には使用されていない、
【００５３】
２．約９００ｇ／モルより大きな分子量の２種以上の微量のステビオール配糖体の回収を最適化し及び以降の加工工程の必要性を最小化するための、新鮮な葉又は貯蔵のために乾燥されたステビア葉の段階的な抽出を含む抽出方法、
【００５４】
３．約９００ｇ／モルより大きな分子量の２種以上のステビオール配糖体、好ましくは、それらの全てが、それぞれ乾燥葉質量に基づき５％未満のレベルで生じる、レバウジオシドＤ、Ｉ、Ｏ、Ｍ及び／又はＮの収集物を単離するためのクロマトグラフィーの使用、
【００５５】
４．定温で又は溶離溶媒を用いる温度勾配で２種以上の溶媒を使用する勾配溶離を含むステビオール配糖体Ｄ、Ｉ、Ｏ、Ｍ及び／又はＮの単離において結晶化の必要性を回避する方法、
【００５６】
５．ステビオール配糖体、好ましくは、それぞれ乾燥葉質量に基づき５％未満のレベルで生じる、レバウジオシドＤ、Ｉ、Ｏ、Ｍ及び／又はＮの２種以上の組み合わせの甘味料としての使用、
【００５７】
６．２種以上のステビオール配糖体は、単独で、或いは、主要なステビオール配糖体の約２５％未満、主要なステビオール配糖体の約１５％未満、主要なステビオール配糖体の約１０％未満、主要なステビオール配糖体の約５％未満、の量における、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤを含むが、これらに限定されない、より主要なステビオール配糖体との組み合わせで使用され得る。Ｏｈｔａ等（２０１０年）から得られる表９は、Ｓ．レバウディアナ  モリタ及びＳ．レバウディアナ  ベルトニーの葉からのステビオール配糖体の相対量を提供する。
【００５８】
Ｏｕｔｏｔｅｃ，Ｅｓｐｏｏ，ＦｉｎｌａｎｄによるＳｅｐＴｏｒ技術のような連続向流イオン交換及び吸着は、不純物を除去するために用いられ得る技術である。連続クロマトグラフィーは、連続クロマトグラフィーにおいて用いられる複数のカラムが、混合物及び溶出溶媒のための供給点並びに混合物中のより速い又はより遅い溶出成分のための取り出し点を次第に前進させることを可能にするために、まるでそれらが単一カラムであるものの、カラム間に複数の供給点及び排出点を有するカラムのように作動することにおいて、慣用の（単一又は複数のカラム）固定された固体相のクロマトグラフィーとは異なる。この作動様式は、各成分のカラム部分が溶出成分又は流速に関して自立的に作動することを可能にする。連続分離方法の疑似物が、”Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ”におけるＪｏｈａｎ
Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎにより及び複数カラム（ＭＣ）システムにおける溶媒勾配（ＳＧ）の使用のための”Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：  Ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ＭＣＳＧＰ．”  （２００９）におけるＮｉｋｌａｓ  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎにより記載されている。“調製用（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ”（Ｐ）は、商業的製造スケールまでの、分析目的よりも大きなスケールで分離をもたらすことに関する。糖の連続クロマトグラフィー分離の適用は、甜菜糖精製業において充分に開発され、“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ
ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｇａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６１  （２００４）  ５０９−５１３において、Ｂｕｂｎｉｋ及び共同著者等により記載されている。連続分離方法の適用は、行われた分離のタイプに合わせてカスタマイズされなければならない。例えば、高純度レバウジオシドＡの単離のための分離戦略は、他のステビオール配糖体のカスタム混合物のためのシステムの操作とは異なるだろう。現在までに、連続分離方法は、レバウジオシドＡ、Ｄ、Ｉ、Ｏ、Ｍ及びＮから選択される少なくとも２種のステビオール配糖体を含むカスタムステビオール配糖体混合
物の単離に用いられていない。
【００５９】
連続クロマトグラフィーにおける別の重要な差異は、複数カラムシステム中に存在する分離される物質の持続性インベントリー（ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）の使用であるが、それは、システム中で連続して循環される。このインベントリーは、それぞれの成分のインベントリーを調整して所望の組成物に有利に働くようにすることにより、分離を補助することにおいて有利に用いられる。例えば、供給混合物が一連の所望の成分（例えば、３−５％のレバウジオシドＡ、Ｄ、Ｉ、Ｏ、Ｍ及びＮ）を低レベルでしか有さず、しかしレバウジオシドＡの優性部分（＞２０％）を有する場合、カラムは、最初に、主に優性成分を取り出し、一方、少量成分がカラム中にインベントリーを維持することを可能とすることにより操作され得る。このことは、供給物中の少量成分が、所望の（少量）成分に富んだ流れの取り出しを可能とする他の成分のカラム在庫中に良好に溶解することを可能とする。
【００６０】
各カラムを独立して操作する能力は、分離システムへの２種以上の投入物（例えば、加工供給物、溶離液Ａ及び溶離液Ｂ）及び取り出しの流速が互いに異なる２種以上の取り出し物（例えば、生成物１、生成物２、生成物３等）を含む分離において非常に重要である。カラムフローバランスは、
【数１】
2017507141.tif 000003
として計算され、ここで、Ｆin(feed)は、加工供給物又は溶出溶媒であり得、Ｆout(Product) は、取出した生成物である。
【００６１】
擬似移動床
製造において、擬似移動床（ＳＭＢ）法は、クロマトグラフィー分離を実施するための高度に工学的な方法である。それは、単純な（バッチ）クロマトグラフィーを使用して得られ得るよりも低いコストで、１種以上の他の化学化合物から１つの化学化合物又は１クラスの化学化合物を分離して、かなりの量の精製又は濃縮された物質を提供するために使用される。それは、単純なカラム精製により実行できないあらゆる分離又は精製が提供できるわけではない。該方法はどちらかというと複雑である。それがクロマトグラフィー分離にもたらす利点は、劇的に削減されたコストで高度に精製された多量の物質の製造を可能とすることである。コスト削減は、少量のクロマトグラフィー分離媒体固定相の使用、製造の連続及び高い速度並びに削減された溶媒及びエネルギー必要量の結果としてもたらされる。この改善された経済性は、固定相を無限に伸ばすために使用され及び該方法に対して非常に高い溶質負荷を可能にするバルブ−及び−カラム配列によりもたらされる。
【００６２】
生産クロマトグラフィーの慣用の移動床技術において、供給物の注入と被験物質の回収は、擬似的で且つ連続であるが、連続的に移動する床の実際的な困難性のため、擬似移動床技術が提案された。床を移動する代わりの擬似移動床技術において、供給物注入口、溶媒又は溶離液の注入口並びに所望の生成物の排出口及び望ましくない生成物の排出口の位置は連続的に移動し、固体粒子の連続流及び固体粒子の方向と逆の液体の連続流を伴って、移動床の印象を与える。
【００６３】
連続クロマトグラフィー分離の別の形態は、環状クロマトグラフィーである。公開された総説において、Ｆｒａｎｋ  Ｈｉｌｂｒｉｇ及びＲｕｔｈ  Ｆｒｅｉｔａｇ（“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｎｎｕｌａｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７９０（２００３年）１−１５頁）は以下を報告する“連続環状クロマトグラフィー（ＣＡＣ）の原理は数十年間知られていた。ＣＡＣは連続クロマトグラフィー様式であるが、それはそれ自身が多成分混合物並びに２成分混合物の分離に役立つ。ＣＡＣにおいて、移動及び固定相は、逆流様式で移動するが、
それは、典型的な一次元のバッチカラム分離の連続的な二次元のバッチカラム分離への転換を可能とする。線形勾配の溶出を除いて、現在において全てのクロマトグラフィー様式は、ＣＡＣに用いられている。”。Ｅａｒｌｉｅｒ，Ｂａｒｔ及び共同著者等（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ，ｍａｎｎｉｔｏｌ  ａｎｄ  ｓｏｒｂｉｔｏｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ３５、（１９９６年）、４５９−４７１頁）は、該方法を単純な糖の分離に用いているが、この方法はステビオール配糖体の分離のために用いられてこなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、表示された位置（Ｒ１及びＲ２）がグリコシル化されたステビオール配糖体のアグリコン構造を示す。
【図２】図２はステビオール配糖体の組織化を示す。
【図３】図３はどのように主観的な味覚特性及び甘さが、ステビオール配糖体の分子サイズにより予測され得るかを示すチャートである。
【図４】図４は、興味があるステビオール配糖体の質量スペクトルを示す。
【図５】図５は、興味があるステビオール配糖体の質量スペクトルを示す。
【図６】図６は、本発明に従って使用され得る抽出及び精製工程を示す。
【図７】図７は、本発明に従う疑似移動床クロマトグラフィーの使用を示す。
【００６５】
本発明は、以下の図、詳細な説明及び実施例を参照することにより、より十分に理解され得る。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明の詳細な説明
当業者が、この中の記載に基づいて、本発明を最大限に利用すると考えられる。以下に示す特定の態様は、単なる例示として解釈されるものであり、如何なる方法であれ本開示の残余権を限定するものとして解釈されるものではない。
【００６７】
特段の規定がない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明に属する当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。同様に、ここに記述された全ての公開物、特許出願、特許及び他の参照文献は、参照として組み込まれる。ここで使用されるように、全てのパーセントは、特に特定されない限り、質量によるものである。加えて、ここに示された全ての範囲は、２つの終点の間の値のあらゆる組み合わせを包括的に含むことを意味する。
【００６８】
定義
用語“風味感（ｆｒａｖｏｒ  ｎｏｔｅｓ）”により、典型的には味により検出される繊細な官能的特徴又は摂取後に鼻を通って発散する間に経験する匂い（鼻後方の臭覚）が意図される。
【００６９】
用語“ステビオール”により、ジテルペン化合物、ヒドロキシ−エント（ｅｎｔ）−カウラ−１６−エン−１３−オール−オイック酸が意図されるが、それは、エント−カウラ−１６−エン−１９−オイック酸である、“エント−カウレノン酸”と呼ばれる化合物のヒドロキシル化された形態である。
【００７０】
用語“ステビオール配糖体”により、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、ズルコシド、ルブソシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及び１９−Ｏ−β−グルコ
ピラノシル−ステビオールを含むが、これらに限定されない、アグリコンステビオールのあらゆる配糖体が意図される。
【００７１】
合成甘味料の例は、スクラロース、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、アリテーム、サッカリン、ネオヘスペリジン  ジヒドロカルコン合成誘導体、シクラメート、ネオテーム、ズルチン、スオサン、Ｎ−［Ｎ−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）プロピル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン  １−メチルエステル（アドバンテーム（Ａｄｖａｎｔａｍｅ））、Ｎ−［Ｎ−［３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−３−メチルブチル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン  １−メチルエステル、Ｎ−［Ｎ−［３−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）プロピル］−Ｌ−α−アスパルチル］−Ｌ−フェニルアラニン  １−メチルエステル、それらの塩等を含む。
【００７２】
天然の高甘味度甘味料の例は、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、ステビオールビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシド、幾つかのモグロシド（例えば、モグロシドＶ）、ブラゼイン、ネオヘスペリジン  ジヒドロカルコン（ＮＨＤＣ）、グルチルリチン酸及びその塩、ソーマチン、ペリラルチン、ペルナンヅルシン、ムクロジオシド、バイユノシド、フロミソシド−Ｉ、ジメチル−ヘキサヒドロフルオレン−ジカルボン酸、アブルソシド、ペリアンドリン、カルノシフルオシド、シクロカリオシド、プテロカリオシド、ポリポドシドＡ、ブラジリン、ヘルナンズルチン、フィロズルシン、グリシフィリン、フロリジン、トリロバチン、ジヒドロフラボノール、ジヒドロケルセチン−３−アセテート、ネロアスティリビン、トランス−シンナムアルデヒド、モナチン及びその塩、セリゲアインＡ、ヘマトキシリン、モネリン、オスラジン、プテロカリオシドＡ、プテロカリオシドＢ、マビンリン、ペンタジン、ミラクリン、クルクリン、ネオクリン、クロロゲン酸、ミナリン、シアメノシド等を含む。
【００７３】
好適な“熱安定性の高甘味度甘味料”は、化学化合物又は化合物の混合物を含むが、それは、ここに参照として組み込まれる英国特許第１，５４３，１６７号中に記載された試験方法に従って測定されるように、少なくとも５倍スクロースよりも甘い甘みを引き出す。典型的には、そのような甘味料は、約４０℃で約１時間加熱した後に、実質的に分解がない。そのような好適な甘味料の例は、スクラロース、ネオテーム、サッカリン、アセスルファムＫ、シクラメート、ネオヘスペリジンＤＣ、ステビア、ソーマチン、ブラゼイン、アスパルテーム及びその混合物を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
ステビアは、植物ステビア  レバウディアナからのノンカロリーの天然甘味料である。該植物は、ステビオール配糖体と総称される多数の甘味化合物を作るが、それはステビアをスクロースよりも３００倍まで甘くする。これらの配糖体は、該植物から水及び当業者に周知の他の溶媒で抽出され得る。これらは熱安定性及びｐＨ安定性であり、醗酵せず、そして血糖反応を誘導しない。
【００７５】
時々、１３−［（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−カウラ−１６−エン−オイック酸  β−Ｄ−グルコピラノシルエステルと呼ばれるステビオシド及びレバウジオシドＡは、ステビア  レバウディアナ（エウパトリウム  レバウディアナム）葉から抽出及び精製された、ジテルペン誘導ステビオールの例示的な配糖体である。これらの配糖体は、スクロースの約１００ないし約５００倍の、高甘味度甘味料であるが、金属感及び苦味感（ｂｉｔｔｅｒ  ｎｏｔｅｓ）を有する。それらは、低カロリー又はカロリーを抑えた食品及び飲料の広い範囲において使用され得る。
【００７６】
他の甘味配糖体はまた、ステビア  レバウディアナからも抽出され得る。これらは、種
々の程度の甘味を有する。ここで使用されるように“ステビア抽出物”は、ステビア植物から抽出された甘味配糖体を意味する。
【００７７】
ステビア抽出物中に見られる配糖体である、レバウジオシドＡは、最小の後味を有すると一般的に考えられている。苦い及び甘草様として多く記載されてきたこの後味は、全ての現在のステビア−甘味生成物中に存在する。そのような配合物は、典型的には、膨大な希釈又は味覚−マスキング法を必要とする。
【００７８】
甘味料組成物を含む全ての高甘味度甘味料のように、ステビアを含む甘味料組成物は典型的に、使用者の適用物中への計量及び分散に役立つ増量剤を伴って提供されてきた。これらの中で、記載又は使用されるものは、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及び他の繊維、マルトデキストリン及びエリトリトールを含む。エリトリトールは、ある程度の苦味を軽減できるため、特にポピュラーである。
【００７９】
Ｃａｔａｎｉ等の米国特許出願公開第２０１２０２０１９５２号及び２０１２０２０１９４０は、少なくとも１つの植物をベースとする天然の高甘味度甘味化合物を含む粗混合物を水蒸気蒸留すること及び該粗混合物をろ過することを含む天然の甘味組成物の製造方法を開示する。
【００８０】
Ｃａｔａｎｉ等の米国特許出願公開第２０１００２８５２０１号は、スクラロース及びステビアの精製された抽出物を含む相乗的な甘味組成物を開示するが、ここで、ステビアの精製された抽出物は、レバウジオシド及びズルコシドを含む。
【００８１】
Ｃａｔａｎｉ等の米国特許出願公開第２００９００１７１８５号は、ステビア抽出物及び単純な糖からなるカロリーを抑えた甘味組成物を開示する。該参照文献は、該ステビア抽出物が、全てのステビオール配糖体に比して、約８０質量％ないし約９５質量％のレベルのレバウジオシドＡを有し得ること及び該単純な糖がスクロース、フルクトース又はグルコースであり得ることを開示する。
【００８２】
Ｃａｔａｎｉ等の米国特許出願公開第２００９０００４３５５号は、エリトルトール及びステビア抽出物を含む甘味組成物を開示する。
【００８３】
本発明は、約９６６ｇ／モルないし約１４３６ｇ／モルの範囲の分子量及びステビオール配糖体の２５％未満のレバウジオシドＡ、より好ましくは、ステビオール配糖体の２５％未満のレバウジオシドＡ、より好ましくは、ステビオール配糖体の１５％未満のレバウジオシドＡ、より好ましくは、ステビオール配糖体の１０％未満のレバウジオシドＡ、より好ましくは、ステビオール配糖体の５％未満のレバウジオシドＡを有するステビア  レバウディアナ植物抽出物からの２種以上の甘味配糖体の組み合わせの分離、単離、及び特徴付けのための方法を提供する。
【００８４】
本発明の利点は、この後に与えられる詳細な説明からより明確になるだろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲内の種々の変化物及び変更物は、この詳細な説明から当業者に対して明らかになるため、詳細な説明及び特定の例は、本発明の好ましい態様を示すものの、例としてのみ与えられる。
【００８５】
ステビア中に存在する甘味配糖体の中で、ステビオシド、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＣのみが、＜８０％純度で適度なコスト及び＞８０％純度で高いコストで入手可能である。商業用製品の最も高い純度は、通常９７％より高い。今後、用語“高度に精製された”は、乾燥質量に基づいて少なくとも約９０％ないし約１００％のステビオール配糖体を含むステビオール配糖体組成物を言及する。市場において、レバウジオシドＡに匹
敵する味覚の質及び強度を有する２種のステビア成分である、高度に精製されたレバウジオシドＢ又はレバウジオシドＤの商業的な量は存在していない。同様によい味の甘味料である、レバウジオシドＥ及びＦは分析標準として少ない量で入手可能である。レバウジオシドＤに匹敵するか又は多い分子量の天然由来のステビオール配糖体の商業的使用はなされてこなかった。本発明は、そのような大きな分子量の成分の組成物及びその組成物を取得する低コストの方法を規定しようとするものであり、それは、それらを甘味剤として集合的に使用することにより、ステビア  レバウディアナにおける成分の低濃度を相殺する。
【００８６】
約９００ｇ／モルより大きな分子量を有するステビア抽出物からの２種以上の甘味配糖体の組み合わせの包括的な分離、単離及び／又は特徴付けのための効率的及び経済的な方法のための必要性が存在する。商業的使用のために開発された個々のステビオール配糖体は、味の質及び甘味の時間的プロファイルの観点から制限を有する。単離された天然由来及び人口の甘味料の特徴及び制限は、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２年），３：３５３−３８０頁（Ｎｏｎ−Ｃａｌｏｒｉｃ  Ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ，  Ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ，  ａｎｄ  Ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）において、Ｇｒａｎｔ  Ｅ．ＤｕＢｏｉｓ及びＩｎｄｒａ  Ｐｒａｋａｓｈにより記載されている。本発明は、ステビアからの２種以上の分子の組み合わせの分離、単離及び／又は、特徴付けに有利になる個々の甘味成分の単離の構想を控える。
【実施例】
【００８７】
既知のステビオール配糖体は、糖（配糖体）の置換様式に基づいて順序付けられ得る。このことは、種々の配合物中において非常に低いレベルではあるものの、存在し得る欠けているか又は今までのところ未確認のステビオール配糖体の予測を可能にする。ステビオール配糖体の組織化は図２中で説明される。
【００８８】
ステビオール配糖体の甘味の質及び強度は、ステビオールアグリコンにおけるグリコシル化の程度と相関することが見出されている。以下の図３は、どのように主観的な味覚の質及び甘味が分子量により予測され得るかを説明し、しかしながらレバウジオシドＢのような例外が生じ得ることを説明する。この化合物は、甘味の質及び強度の特定において、例えＲ１においてグリコシル化が欠落していたとしても、Ｒ２における特定の配糖体構造の重要性の説明に役立ち得る。
【００８９】
甘味の質及び強度はまた、グルコース以外の単糖の存在により影響される。よって、分子中におけるラムノース（Ｒｈ）の存在は、ズルコシドＡ又はレバウジオシドＣにおけるように、それぞれステビオシド又はレバウジオシドＡのような、同数のグルコースのみの単糖で置換されたステビオール配糖体に比して、より低い甘味の質及び強度を結果として生じる。
【００９０】
【表１】
2017507141.tif 000004
【００９１】
ステビオール配糖体はそれぞれ、分子構造だけでなく、それらの味覚特性においても異なる。通常、ステビオシドはスクロースよりも約１１０ないし約２７０倍甘く、レバウジオシドＡは約１５０ないし３２０倍、レバウジオシドＣはスクロースよりも約４０ないし約６０倍甘いことが見出されている。ズルコシドＡはスクロースよりも約３０倍甘い。甘味強度は、温度及びキャリア媒体の粘度で多少変わることが知られている。
【００９２】
幾つかのステビオール配糖体が現在知られている一方で、全ての甘味の質及び強度が評価されているわけではない。同様に、多くの方法が単離するために用いられ及び甘味料としての個々のステビオール配糖体が利用されている一方で、現在の知識は、ステビオール配糖体ブレンドの甘味特徴、特に、自然に見出された以外の割合における、又は、他の甘味料と組み合わせた場合の味覚特徴の、カロリー又はノンカロリーの、高強度であるか又はグルコース、フルクトース又はスクロースのような単純な単糖及び二糖とより釣り合った甘味特徴の予測を可能とするわけではない。
【００９３】
分析方法
ステビオール配糖体の慣用の分析方法は、他の甘くない植物抽出成分からステビオール配糖体を分離するために二溶媒の勾配を必要とする。その結果として、溶離液における屈折率変化を使用する検出器は有用でない。典型的には、紫外線（ＵＶ）検出器が、弱いＵＶ発色団を含むステビオール配糖体を評価するために用いられる。選択された波長において大きなモル吸光係数を有する成分は、質量ベースにおいてより高い濃度で存在していたとしても遥かに弱いシグナルしか生じない低い吸光係数を有する成分よりも、より隆起して見えるため、この方法は、興味ある成分の検出を分かり難くする強力な発色団を有する成分の存在のために、粗抽出物を評価することの有用性が限定される。質量ベースの検出のための屈折率（ＲＩ）に対する別の代替手段は、蒸発光散乱（ＥＬＳ）及び荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を含む。ＴＨＥＲＭＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｂｙ  ＨＰＬＣ  ｗｉｔｈ  ＵＶ  ａｎｄ  ＥＬＳ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  ２４１（２０１２年））は、どのようにＥＬＳが、卓上用の甘味料配合物におけるレバウジオ
シドＡ及びステビオシドの含有量の測定におけるＵＶ検出を超えて有利に存在し得るかを教示する。しかしながら、われわれの経験において、ＥＬＳは、別の近接して溶出する主成分の存在により微量成分の濃度の測定における使用が制限され得る。Ｈ．Ｙ．Ｅｏｍ等（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １２１７（２０１０年）４３４７−４３５４頁）は、ミシマサイコ（ブプレウラム  ファルカタム  Ｌ．：Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ  ｆａｌｃａｔｕｍ  Ｌ．）（せり科）の根由来のサポニンの検出が、ＥＬＳを用いるよりもＣＡＤを用いる方が感度が高いことを教示する。我々は、荷電化粒子検出器、ＥＳＲ（登録商標），Ｉｎｃ．，チェルムスフォード、マサチューセッツ州を使用することが、ステビア  レバウディアナの粗抽出物中のステビオール配糖体の良好な定量化を可能とするが、その配合物は、強力なＵＶ吸収を有するタンパク質及び他の植物成分に富んでおり、同様に、低レベルの興味ある成分を検出器に“見えなく”し得る多糖又は他のステビオール配糖体のより多い量の存在下にある。
【００９４】
効果的な検出器の特定は、粗配合物中の興味ある成分の効果的な定量化のためのシステムの一部分のみである。該システムの別の部分は、分離を遂行するための溶媒システム（移動相）及び固体担体（固定相）の特定である。移動及び固定相の好適な組み合わせの成功する開発は、事前に予測可能ではない試行錯誤の経験的な過程である。我々は、興味あるステビオール配糖体を分離するのに有用な溶媒勾配を発見するために、種々の勾配システム移動相システムを試み、それにより、質量スペクトルによりそれらの特定を可能とし、ＣＡＤにより定量化を可能とする。該勾配は、レバウジオシドＤの近傍のような特定のピーク領域の周囲のより大きな分解能を可能とするために調整され得る。
【００９５】
クロマトグラフィー分析方法
固定相：フェノメネックス  キネテックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ）Ｃ−１８、１５０×４．６、２．６μｍ；カラム温度：５５℃；
注入体積は１０μＬ。
移動相（ＭＰＡ及びＭＰＢ；流速：０．３５ｍＬ／分）：
ＭＰＡ：水中の０．１％蟻酸
ＭＰＢ：アセトニトリル中の０．１％蟻酸
【表２】
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【表３】
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図４も参照。
【００９６】
既知であるように、該勾配は、ステビオール配糖体の質量スペクトルの特定を可能とするように、より速い分離（０−２分  ８０％  ＭＰＡ，２０％  ＭＰＢ；２−３５分  ８０ないし０％  ＭＰＡ，２０％ないし１００％  ＭＰＢ，３５．０１−４０分  ８０％  ＭＰＡ，２０％  ＭＰＢ．流速  ０．３５ｍＬ／分；注入体積：５μＬ）のために修正され得る。実施例が図５において提供される。
【表４】
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【００９７】
農業開発に対する分析方法の統合
我々は、ステビオール配糖体含有量に基づいて、ステビア植物の特定の育種子孫の選定を最適化するための戦略を開発した。在来のステビアが主なステビオール配糖体として優位にステビオシドを含むことは歴史的に周知であるが、しかし、選択的な育種はＡが優位である子孫の開発に有利に働く。我々は、我々の新規な分析を、レバウジオシドＤ、又は、レバウジオシドＡ（Ｍｏｌ．Ｗｔ．９６６ｇ／モル）の分子量と等しいか又は大きい分子量（Ｍｏｌ．Ｗｔ．）を有する他の所望のステビオール配糖体、とりわけ、数ある中でも、それ以降に新規な育種子孫中に生じることが見出され得るレバウジオシドＩ、Ｏ、Ｍ、Ｎに更に有利に働く育種子孫の特定を可能とするために適用した。
【００９８】
結晶化を用いない所望のステビオール配糖体の分離
我々は更に、ステビオール配糖体の分析的分離から得られた見識を、結晶化により１成分（典型的には、レバウジオシドＡ）を単離又は精製する必要性を回避する新規な方法に進展させた。我々は更に、結晶化の必要なく興味あるステビオール配糖体を分離するための、食品等級のエタノール（グレイン・アルコール）及び水を使用する溶媒システムを開発した。
【００９９】
実施例：
粗抽出物は、２０８．６ｇの乾燥葉を９５℃で２時間、熱水抽出（３Ｌ）に付すことにより製造された。該抽出物は、４０℃未満において真空下で濃縮され、遠心分離により浄化され、デカントされ、冷却され及び凍結乾燥により乾燥されて、７６．５ｇの乾燥粗抽出物が得られた。該粗抽出物の１部（１００ｇ、約１．７ｇの固体を含む）は、以下のような水  エタノール勾配を使用する調製スケールの逆相カラム（ＲｅｄｉＳｅｐＣ１８、３６０ｇ）で直接分画された：
【表５】
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溶出点は、２５ないし３０分間の範囲内であるレバウジオシドＡ及びＤの基準試料で事前にマークされ、画分は、一定間隔で、その範囲を超えて広範に収集され、ＨＰＬＣ組成物に基づいて貯留及び乾燥された。総量６２８ｍｇのステビオール配糖体が回収された。その試料の１８ｍｇは、約２３％のレバウジオシドＤ、２１％のレバウジオシドＮ及びＭ、１．４％の未同定のステビオール配糖体、２％のレバウジオシドＡ及び約１６％の他の既知のステビオール配糖体を含んで回収された。該固体は、オフホワイトないしベージュの外観を有し、雑味のない（ｃｌｅａｎ）甘味を有した。生成物は、更なる加工又は精製無しに甘味剤としての使用に好適である。
【０１００】
実施例：
粗抽出物は、２０８．６ｇの乾燥葉を９５℃で２時間、熱水抽出（３Ｌ）に付すことにより製造された。該抽出物は、４０℃未満において真空下で濃縮され、遠心分離により浄化され、デカントされ、冷却され及び凍結乾燥により乾燥されて、７６．５ｇの乾燥粗抽出物が得られた。該粗抽出物の１部（１００ｇ、約１．７ｇの固体を含む）は、以下のような水  エタノール勾配を使用する調製スケールの逆相カラム（ＲｅｄｉＳｅｐＣ１８、３６０ｇ）で直接分画された：
【表６】
2017507141.tif 000009
【表７】
2017507141.tif 000010
溶出点は、約２５ないし３０分間の範囲内であるレバウジオシドＡ及びＤの基準試料で事前にマークされ、画分は、一定間隔で、その範囲を超えて広範に収集され、ＨＰＬＣ組成物に基づいて貯留及び乾燥された。総量６２８ｍｇのステビオール配糖体が回収された。その試料の１８ｍｇは、約２３％のレバウジオシドＤ、２１％のレバウジオシドＮ及びＭ、１．４％の未同定のステビオール配糖体、２％のレバウジオシドＡ及び約１６％の、少量で存在する幾つかの他の既知のステビオール配糖体を含んで回収された。該固体は、オフホワイトないし淡茶色の外観を有し、雑味のない（ｃｌｅａｎ）甘味を有した。生成物は、更なる加工又は精製無しに甘味剤としての使用に好適である。
【０１０１】
この発明に従って得られるステビオール配糖体は、食品、飲料、医薬組成物、化粧品、チューインガム、卓上製品、シリアル、乳製品、歯磨き粉及び他の口腔組成物等中に高甘味度の天然甘味料として組み込まれ得る。上記の実施例は、使用され得る代表的な比率を示す。
【０１０２】
加えて、該ステビオール配糖体は、飲料、食品及び人の飲食専用の製品だけでなく、改善された特徴を有する動物飼料の甘味料としても使用され得る。
【０１０３】
食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、チューインガムの製造の間に、混合、混練、溶解、酸洗、透過、パーコレーション、散水、噴霧、注入及び他の方法のような慣用の方法を使用し得る。
【０１０４】
この発明において得られる甘味料は、乾燥形態又は液体形態で使用され得る。それは、食品製品の熱処理の前又は後に添加され得る。該甘味料の量は、使用の目的に依存する。それは、単独で又は他の化合物との組み合わせにおいて添加され得る。
【表８】
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【表９】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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