(57)【要約】本願明細書は、試験試料中の1以上の分析種の存在を決定するための方法、開示の方法を実施するのに有用な材料、および開示の方法を実施するのに有用な試薬を含むキットを開示する。
2017519228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中の1以上の分析種の存在を決定するための方法であって、
a)試験試料から1以上の分析種を固相抽出すること、
b)塩基性pH、酸性pHまたは中性pHを有する溶出液で固相抽出からの1以上の分析種を溶出すること、
c)誘導体化剤で1以上の分析種をインサイチュ誘導体化することおよび
d)液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を用いて1以上の誘導体化分析種を検出すること
を含む方法。
【請求項２】
試料中の1以上の分析種の量を決定するための方法であって、1以上の分析種の少なくとも1つの誘導体化を可能にする条件下で誘導体化剤を含む溶出緩衝液で固相抽出からの1以上の分析種の少なくとも1つを溶出することを含む方法。
【請求項３】
1以上の分析種が、1級アミン、2級アミンまたはフェノール性ヒドロキシル基を有する化合物である、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
1以上の分析種が、カテコールアミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、性ホルモンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、カンナビノイドまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、甲状腺ホルモンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、オピエート、オピオイドまたはその誘導体もしくは代謝物の1つまたはアリールシクロヘキシルアミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、アンフェタミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つを含むモノアミン神経伝達物質である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
試料が、生体試料、土壌試料または食料の試料である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
誘導体化試薬が、ハロゲン化アシルである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ハロゲン化アシルが、塩化アシルである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
塩化アシルが、式II:
【化１】
2017519228.tif 000049
［式中、R1、R2、R3およびR4が、各々独立してH、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖C1-8アルキル、分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基、直鎖C1-8アルコキシ、分岐鎖C1-8アルコキシまたは環式C1-8アルコキシである］
で示される化合物である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
塩化アシルが、
【化２】
2017519228.tif 000050
［式中、縮合環系が、5〜7員の置換もしくは非置換縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、適宜ナフタレン、キノロン、イソキノリン、キナゾリン、ベンゾフラン、インドールもしくはベンゾイミダゾール、または4〜8員の縮合環を有する非芳香族性炭素環式もしくはヘテロ環式縮合環系、例えば3,4-ジヒドロ-1H-インデンもしくは3,4,ジヒドロ-2H-クロメンであり、ここで縮合環が、必要に応じてハロゲン原子、適宜フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖C1-8アルキル、分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基、直鎖C1-8アルコキシ、分岐鎖C1-8アルコキシまたは環式C1-8アルコキシの1以上で置換され得る］
で示される化合物の1つである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
塩化アシルが、
【化３】
2017519228.tif 000051
［式中、R1およびR2が、各々独立してH、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖C1-8アルキル、分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基、直鎖C1-8アルコキシ、分岐鎖C1-8アルコキシまたは環式C1-8アルコキシである］
で示される化合物の1つである、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
塩化アシルが、
【化４】
2017519228.tif 000052
で示される化合物の1つである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
塩化アシルが、式VII:
【化５】
2017519228.tif 000053
［式中、R1、R2、R3、R4およびR5が、各々独立してH、ハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖C1-8アルキル、分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基、直鎖C1-8アルコキシ、分岐鎖C1-8アルコキシまたは環式C1-8アルコキシである］
で示される化合物である、請求項7に記載の方法。
【請求項１３】
塩化アシルが、
【化６】
2017519228.tif 000054
［式中、縮合環系が、5〜7員の縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、または4〜8員の縮合環を有する非芳香族性炭素環式もしくはヘテロ環式縮合環系、例えば3,4-ジヒドロ-1H-インデンもしくは3,4,ジヒドロ-2H-クロメンであり得て、ここで縮合環が、必要に応じてハロゲン原子、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖C1-8アルキル、分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基、直鎖C1-8アルコキシ、分岐鎖C1-8アルコキシまたは環式C1-8アルコキシの1以上で置換され得る］
で示される化合物の1つである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
塩化アシルが、
【化７】
2017519228.tif 000055
で示される化合物である、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
塩化アシルが、式VIII:
【化８】
2017519228.tif 000056
［式中、R1、R2、R3、R4およびR5が、各々独立してH、ハロゲン原子、適宜フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖C1-8アルキル、分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基、直鎖C1-8アルコキシ、分岐鎖C1-8アルコキシまたは環式C1-8アルコキシである］
で示される化合物である、請求項7に記載の方法。
【請求項１６】
塩化アシルが、
【化９】
2017519228.tif 000057
［式中、縮合環系が、5〜7員の縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、または4〜8員の縮合環を有する非芳香族性炭素環式もしくはヘテロ環式縮合環系、例えば3,4-ジヒドロ-1H-インデンもしくは3,4,ジヒドロ-2H-クロメンであり得て、ここで縮合環が、必要に応じてハロゲン原子、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖C1-8アルキル、分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基、直鎖C1-8アルコキシ、分岐鎖C1-8アルコキシまたは環式C1-8アルコキシの1以上で置換され得る］
で示される化合物の1つである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
塩化アシルが、
【化１０】
2017519228.tif 000058
で示される化合物である、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
塩化アシルが、式IX:
【化１１】
2017519228.tif 000059
［式中、R1、R2、R3、R4およびR5が、各々独立して水素、ハロゲン原子、適宜フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖C1-8アルキル、分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基、直鎖C1-8アルコキシ、分岐鎖C1-8アルコキシまたは環式C1-8アルコキシである］
で示される化合物である、請求項7に記載の方法。
【請求項１９】
塩化アシルが、
【化１２】
2017519228.tif 000060
［式中、縮合環系が、5〜7員の縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、適宜ナフタレン、キノロン、イソキノリン、キナゾリン、ベンゾフラン、インドールもしくはベンゾイミダゾール、または4〜8員の縮合環を有する非芳香族性炭素環式もしくはヘテロ環式縮合環系、適宜3,4-ジヒドロ-1H-インデン、3,4,ジヒドロ-2H-クロメンであり得て、ここで縮合環が、必要に応じてハロゲン原子、適宜フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖C1-8アルキル、分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基、直鎖C1-8アルコキシ、分岐鎖C1-8アルコキシまたは環式C1-8アルコキシの1以上で置換され得る］
で示される化合物の1つである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
質量分析が、タンデム質量分析技術またはLC-MS/MS技術を含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
1以上の分析種の検出が、定性的または定量的である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
1以上の分析種の量を検出するための固相抽出キットであって、
a)固相抽出カラム、および
b)同一または別々の容器中に請求項6〜19のいずれか一項に記載の誘導体化試薬と一緒に高pHを有する溶出液
を含むキット。
【請求項２３】
SPEカラムが、弱カチオン交換カラム、強カチオン交換カラム、アニオン交換カラムおよび／または逆相カラムである、請求項22に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2014年5月30日出願の米国仮出願第62/005,676号の35 U.S.C. 119条(e)の優先権を主張し、該出願の内容全体は出典明示により本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００２】
特定の分析種（analyte）の検出のための早く、簡素化され、自動化された方法を得ることが必要とされている。医療状況において、該方法は、分析種、例えば薬物、ホルモン、シグナル化剤およびアミノ酸の検出を容易にする。農業および公衆衛生の状況において、抗生物質、農薬または他の夾雑物の残留レベルの検出は、我々が食べる食物および我々が飲む水の安全性に不可欠である。また、食物表示、例えば「ホルモンを含まない」または「有機」の基準の最近の変化は、農業分野での簡素化された試験の必要性を生じている。
【０００３】
カテコールアミンは、体の健康状態を維持するのに重要である必須ホルモンまたは神経伝達物質である。神経障害、例えばパーキンソン病またはアルツハイマー病は、しばしば血中のこれらの物質のレベルを変化させ得る。メタネフリン（カテコールアミンの誘導体）のレベルの増加は、ある特定の癌、例えば褐色細胞腫の発症を示し得る。同様に、メタネフリン類（メタネフリンおよびノルメタネフリン）、甲状腺ホルモン類（チロキシン T4、3,5,5'-トリヨードチロニン T3および3,3',5-トリヨードチロニン rT3）、エストロゲンホルモン類（エストロン、エステロール、エストラジオールおよびエストリオール）、デルタ-9-テトラヒドロカンナビノール（THC）その誘導体および代謝体などは、臨床医が患者の状態を決定するのに重要である多くの他の生物学的に興味深い分子マーカーの1つである。
【０００４】
伝統的にカテコールアミンの臨床的定量は、ラジオイムノアッセイ（RIA）によって実施された。近年、質量分析における技術進歩により、RIAから液体クロマトグラフィー質量分析（LCMS）への試験プラットフォームに段階的変化がある。しばしばLCMSベースアッセイは、早く、感度の良いおよび分析種特異的な読取を提供し、該読取はRIAアッセイが欠き得る。しかしながら、カテコールアミンは、酸化および分解されやすいため検出が困難である。また、カテコールアミン／メタネフリン定量の現在の技術は、しばしば不安定な抽出回収を有する複雑で厄介な抽出手順を含み、それ故にしばしば信頼性の低い結果を生じさせ、高い定量下限（LLOQ）、例えば＞10ng/mLのLLOQ範囲となる。また、既存の抽出工程は、誘導体化のための信頼できる試料を提供できない。
【０００５】
薬物は、非合法的および合法的薬物ならびにその代謝体または誘導体を含む。法医学または処方のためのこれらの化合物の検出は、非常に重要である。また、これらの薬物は、体液中で安定でないこともあり得て、それ故に検出は困難であり得る。いずれにしても、人の関与またはエラーの余地を最小限にする完全に自動化され単純化された検出／定量手順が大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の文書は、カテコールアミン類（ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン）、メタネフリン類（メタネフリンおよびノルメタネフリン）、甲状腺ホルモン類（T4、T3およびrT3）、エストロゲンホルモン類（エストロン、エストラジオール、エストリオール）、カンナビノイド類、例えばΔ-9-テトラヒドロカンナビノール（THC）、セロトニン、アミノ酸類、BPA、ならびに生体試料中の分子を含む多くの他の1級および2級アミンまたはフェノールのレベルを測定するために用いられ得る材料ならびに方法を提供する。所望の分析種は、タンデム質量分析技術を含む質量分析により選択的かつ高感度に検出および測定され得る。定量工程全体は、本明細書に記載のように、分析種を捕捉するための固相抽出を用いる試料調製工程、続いて分析種の化学誘導体化、その後LC-MS/MS技術による定量を含む。
【０００７】
この研究の間に、Fmocクロリドとの化学誘導体化での固相抽出とLC-MS/MSの組合せは血漿／血清試料中10pg/ml以下におけるカテコールアミンのレベルの分析種特異的で、高感度で、正確で、安定でおよび頑健な測定を提供することが発見された。メタネフリンおよび甲状腺ホルモンの定量方法はまた、同様の高感度および真度を有して開発された。
【０００８】
臨床現場に関連するレベルでのこれらの分析種の高感度かつ正確な測定は、特に1ミリリットル当たり低いピコグラムの範囲において、小試料サイズ（100μL以下の血漿／血清試料）において、自動化されるように容易に構成される単純な工程で、分析種特異的な結果を有して、他の分析技術、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）下でしばしば見られる分析種クロスオーバー無しで有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1Aおよび1Bは、内部標準100pg相当（図1A）およびカテコールアミン添加血漿（図1B）についてのクロマトグラムを示す例示的データを提供する。
【００１０】
【図２】図2Aおよび2Bは、10および100pg/mlの各カテコールアミンにおいて得られたデータを表す。
【００１１】
【図３】図3は、メタネフリン類についてのクロマトグラムを提供し：上はメタネフリン（659.210/268.400）であり、真ん中はノルメタネフリン（645.100/166.100）であり、下はメタネフリン（659.210/268.400）である。
【００１２】
【図４】図4A、4B、4C、4Dおよび4Eは、メタネフリンおよびノルメタネフリンにおける様々なシフトについてのスペクトルを提供する。
【００１３】
【図５】図5A、5B、5Cおよび5Dは、甲状腺ホルモンについての各シフトにおける様々なピーク：5ng/ml相当の血漿（図5A）、血漿ブランク（図5B）、血漿1ng/ml（図5C）および1ng/mlとの200μL BSA（図5D）を提供する。
【００１４】
【図６】図6A、6Bおよび6Cは、31.3pg/mlでのT3（図6A）、31.3pg/mLでのrT3（図6B）および31.3pg/mlでのT4（図6C）の甲状腺ホルモン各々についてのデータを提供する。
【００１５】
【図７】図7A、7Bおよび7Cは、1,000pg/ml（図7A）、100pg/ml（図7B）および10pg/ml（図7C）の尿中11-ノル-9-カルボキシ-デルタ-9-テトラヒドロカンナビノールの定量についての直線性データを提供する。
【００１６】
【図８】図8Aおよび8Bは、尿中の11-ノル-9-カルボキシ-デルタ-9-テトラヒドロカンナビノールの定量からの回収データ：1,000pg/rxnの標準の回収（図8A）および1,000pg/rxnの抽出されたスパイクの回収（図8B）を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本方法は、試料からの分析種の抽出、誘導体化および検出および／または定量の方法に関する。本方法は、分析種特異的で、頑健で、早く、高感度でおよび正確な結果を得るために、対象とする分析種の検出または定量と共に固相抽出（SPE）、化学誘導体化工程による試料の洗浄工程を用いる。対象とする分析種の誘導体化は、それが試料中に見られる他の生物学的因子と潜在的に重複し得る場合、分析種を領域から外へシフトさせる。したがって、検出中に、対象とする分析種の正確な定量を通常妨げる他の生物学的分子または夾雑物は、スペクトルの著しく異なる範囲で検出され（または完全に溶出され）、対象とする分析種の正確な定量を可能にする。該分析種検出は、例えば臨床、獣医、法医学および／または環境の現場において有用である。
【００１８】
本方法は、対象とする分析種の誘導体化、およびクロマトグラフィーおよび／または質量分析の少なくとも1つによる分析種の1以上の量の決定を含み得る。一の実施態様において、本方法はまた、生体試料からの分析種の固相抽出（SPE）を含み得る。一の態様において、カチオン交換ベースSPEが分析種を含むアミン捕捉のために用いられ得ることが推奨される。分析種を含む非アミンについて、逆相シリカ吸着剤ベースSPEは、リン脂質除去工程の有無にかかわらずタンパク質クラッシュ（crash）と用いられ得て、ここで該吸着剤は、C4-C18アルキル結合シリカ、フェニル結合シリカまたはビフェニル結合シリカであり得る。他の実施態様において、高pH（8≦pH≦14）を有する最終溶出緩衝液は、カチオン交換固相および適宜対象とする分析種を含むアミンのインサイチュ誘導体化からの分析種を含むアミンを溶出するために用いられ得て、検出および／または定量のための分析種の誘導体をきれいに調製する。
【００１９】
更なる実施態様において、分析種を含む非アミンは、非アルコール性、水混和性、有機性の溶媒、例えばアセトニトリル、DMF、アセトン、1,4-ジオキサン、THF、NMP、DMSOなどによってSPE吸着剤から溶出され得て、続いてpH緩衝条件下で分析種を直接誘導体化され得る。好ましい実施態様において、分析種を含むアミンの検出のための本方法は、カチオン交換SPE、カチオン交換吸着剤からのアミン分析種の高pH溶出、LC-MS/MSによる直接定量またはインサイチュ誘導体化を含み、その後対象とする分析種のLC-MSにより定量し；検出および／または定量のために生体試料から最初の分析種抽出へのインライン移行を可能にする。同様に、分析種を含む非アミンの検出のための好ましい実施態様について、本方法は、逆相ベースSPE、有機溶出後の高pH緩衝条件下での直接誘導体化を含み、その後LC-MS/MS定量により完了される。または別の一の実施態様において、アニオン交換ベースSPEは、カルボキシル官能基を有する分析種の検出のために用いられ得て、高pH溶出緩衝液を適切な有機溶媒、例えばアセトニトリル、DMF、アセトン、1,4-ジオキサン、THF、NMP、DMSOなどと混合し、続いてpH緩衝条件下で分析種を直接誘導体化する。
【００２０】
また、検出および／または定量アッセイのためのキットを提供する。該キットは、SPEカラム（カートリッジ）および誘導体化試薬を含み得る。適宜該キットはまた、SPEコンディショニング溶媒、ローディングバッファー、洗浄バッファーおよび溶離バッファーを別々にまたは一緒に、ならびにHPLCカラムを含み得る。
【００２１】
本方法は、多様な分析種の存在を検出し得る。分析種は、対象とする試料において見られる対象とする任意の化合物または組成物である。より具体的には、対象とする分析種は、1級および／または2級アミン基、および／またはフェノール部分を有する化合物である。本明細書に記載の分析種は、薬物（違法およびFDA承認）およびその誘導体もしくは代謝体、農薬およびその誘導体もしくは代謝体、環境夾雑物およびその誘導体もしくは代謝体、または生体化合物、例えば、ホルモンサイトカイン、シグナル化剤、アミノ酸、コレステロールもしくはその誘導体の1つ、脂肪酸または糖脂質およびその誘導体もしくは代謝体であり得る。
【００２２】
一の実施態様において、分析種は、モノアミン神経伝達物質またはその誘導体もしくは代謝物の1つである。モノアミンの例としては、カテコールアミン［ドーパミン（DA）、エピネフリン（EP）、ノルエピネフリン（NEP）］またはその誘導体または代謝物：メタネフリン[メタネフリン（MNE）、ノルメタネフリン（NMN）]、他の微量アミン3-メトキシチラミン（3-MT）、p-オクトパミン、シネフリン、チラミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、3,4-ジヒドロキシマンデル酸、ジヒドロキシフェニルエチレングリコール、DOPAL、DOPAC、ホモバニール酸、ヒドロキシチロスオール、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、MOPETまたはノルメタネフリン、バニリルマンデル酸、カテコール、ドーパ、ヒスタミン、セロトニン（5-HT）、3-ヨードチロナミン、ベータ-フェネチルアミン、N-メチルフェネチルアミン、トリプタミン、N-メチルトリプタミンが挙げられる。
【００２３】
別の一の実施態様において、分析種は、エストロン（E1）、エストラジオール（E2）、エストリオール（E3）およびエステトロール（E4）を含むエストロゲンである。
【００２４】
別の一の実施態様において、分析種は、ダイゼイン、ホルモノネチン、ゲニステイン、ビオカニンA、クメストロール、4'-メトキシクメストロール、レペンソール、トリホリオールまたは17-ベータ-エストラジオールを含む植物エストロゲンである。
【００２５】
別の一の実施態様において、分析種は、カンナビノイドまたはその誘導体もしくは代謝物の1つである。カンナビノイドまたはその誘導体もしくは代謝物の1つの例としては、カンナビゲロール型（CBG）カンナビノイド、例えば、カンナビゲロール、カンナビゲロールモノメチルエーテル、カンナビネロール酸A、カンナビゲロバリン、カンナビゲロール酸A、カンナビゲロール酸Aモノメチルエーテルおよびカンナビゲロバリン酸A；カンナビクロメン型（CBC）カンナビノイド、例えば、(±)-カンナビクロメン、(i)-カンナビクロメン酸A、(±)-カンナビバリクロメン、(±)-カンナビクロメバリンまたは(±)-カンナビクロメバリン酸A；カンナビジオール型（CBD）カンナビノイド、例えば、(-)-カンナビジオール、カンナビジオールモノメチルエーテル、カンナビジオール-C4、(-)-カンナビバリン、カンナビジオルコール、カンナビジオール酸、カンナビバリン酸；カンナビノジオール型（CBND）カンナビノイド、例えば、カンナビノジオールまたはカンナビノバリン；テトラヒドロカンナビノール型（THC）カンナビノイド、例えば、Δ9-テトラヒドロカンナビノール、A9-テトラヒドロカンナビノール-C4、A9-テトラヒドロカンナビバリン、Δ9-テトラヒドロカンナビオルコール、A9-テトラヒドロ-カンナビノール酸A、A9-テトラヒドロ-カンナビノール酸B、Δ9-テトラヒドロ-カンナビノール酸-C4A、A9-テトラヒドロ-カンナビノール酸-C4B、A9-テトラヒドロ-カンナビバリン酸A、A9-テトラヒドロ-カンナビオルコール酸A、A9-テトラヒドロ-カンナビオルコール酸B、(-)-A8-トランス-(6aR,10aR)-A8-テトラヒドロカンナビノール、(-)-A8-トランス-(6aR,10aR)-テトラヒドロカンナビノール酸A、(-)-(6aS,10aR)-A9-テトラヒドロカンナビノール；カンナビノール型（CBN）カンナビノイド、例えば、カンナビノール、カンナビノール-C4、カンナビバリン、カンナビノール-C2、カンナビオルコール、カンナビノール酸A、カンナビノールメチルエーテル；カンナビトリオール型（CBT）カンナビノイド、例えば、(-)-(9R,10R)-トランス-カンナビトリオール、(+)-(9S,10S)-カンナビトリオール、(±)-(9R,10S/9S,10R)-カンナビトリオール、(-)-(9R,10R)-トランス-10-O-エチル-カンナビトリオール、(±)-(9R,10R/9S,10S)-カンナビトリオール-C3、8,9-ジヒドロキシ-A6a(10a)-テトラヒドロカンナビノール、カンナビジオール酸Aカンナビトリオールエステル、(-)-(6aR,9S,10S,10aR)-9,10-ジヒドロキシ-ヘキサヒドロカンナビノール、(-)-6a,7,10a-トリヒドロキシ-A9-テトラヒドロカンナビノール、10-オキソ-A6a(10a)-テトラヒドロカンナビノール；カンナビエルソイン型（CBE）カンナビノイド、例えば、(5aS,6S,9R,9aR)-カンナビエルソイン、(5aS,6S,9R,9aR)-C3-カンナビエルソイン、(5aS,6S,9R,9aR)-カンナビエルソン酸A、(5aS,6S,9R,9aR)-カンナビエルソン酸B、(5aS,6S,9R,9aR)-C3-カンナビエルソン酸B、カンナビグレンドール-C3、デヒドロカンナビフランまたはカンナビフラン；イソカンナビノイド、例えば、(-)-A7-トランス-(1R,3R,6R)-イソテトラヒドロカンナビノール、(±)-Δ7-1,2-シス-(1R,3R,6S/1S,3S,6R-イソテトラヒドロカンナビバリンまたは(-)-A7-トランス-(1R,3R,6R)-イソテトラヒドロカンナビバリン；カンナビシクロール型（CBL）カンナビノイド、例えば、(±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-カンナビシクロール、(±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-カンナビシクロール酸Aまたは(±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-カンナビシクロバリ��；カンナビシトラン型（CBT）カンナビノイド、例えば、カンナビシトラン；ならびにカンナビクロマノン型（CBCN）カンナビノイド、例えば、カンナビクロマノン、カンナビクロマノン-C3またはカンナビクマロノンが挙げられる。
【００２６】
別の一の実施態様において、分析種は、甲状腺ホルモンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つである。甲状腺ホルモンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つの例としては、3,3',5-トリヨードチロニン（T3）、3,5,5'-トリヨードチロニン（rT3）およびチロキシン（T4）が挙げられる。
【００２７】
別の一の実施態様において、分析種は、オピエート、オピオイドまたはその誘導体もしくは代謝物の1つである。オピエートまたはオピオイドまたはその誘導体もしくは代謝物の1つの例としては、天然ベンジルイソキノリンアルカロイド（モルヒネおよびオリパビン）、半合成誘導体（ヒドロモルホンおよびオキシモルホン）ならびに合成オピオイド（例えば、ブプレノルフィン、エトルフィン、ペンタゾシン）が挙げられる。
【００２８】
別の一の実施態様において、分析種は、アリールシクロヘキシルアミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つである。アリールシクロヘキシルアミンの例としては、チレタミン、3-メトキセタミン（MXE）、メトキシケタミン、N-エチルノルケタミン（エトケタミン）が挙げられる。
【００２９】
別の一の実施態様において、分析種は、アンフェタミンである。アンフェタミンの例としては、アンフェタミン（それ自体）、メタンフェタミン、エフェドリン、カチノン、3,4-メチレンジオキシ-/V-メチルアンフェタミン（MDMA、「エクスタシー」）および2,5-ジメトキシ-4-メチルアンフェタミン（DOMまたは「STP」）が挙げられる。
【００３０】
別の一の実施態様において、分析種は、アミノ酸、人工アミノ酸または小ペプチドである。アミノ酸の例としては、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、GABA、トリプトファン、システイン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、プロリンおよびスレオニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
別の一の実施態様において、分析種は、ビスフェノールA（BPA）である。
【００３２】
本明細書の態様は、一部には試験試料を開示する。試験試料は、対象とする分析種を含み得る任意の試料を指す。試験試料は、生体試料、すなわち任意の生物源、例えば動物、植物、菌、微生物、細胞培養、器官培養などから得られた試料であり得る。この実施態様の態様において、生体試料は、全血試料、乾燥血液試料、血漿試料もしくは血清試料含む血液試料、唾液試料、涙液試料、精液試料、尿試料、脳脊髄液試料、胆汁試料、胚体液試料、組織試料、または生物源から得られ得るか、抽出され得るかもしくは単離され得るその他の試料を含む。該生体試料は、例えば医療または臨床現場において患者；すなわち、疾患もしくは病態の診断、予防または処置のための臨床現場においてそれ自体を提供する、生きているヒト、男性または女性から得られ得る。試料は、好ましくは患者、例えば血漿試料から得られる。血漿試料は、抗凝血剤を用いてまたは用いずに得られ得る。
【００３３】
該生体試料は、例えば獣医現場において、動物；すなわち、疾患もしくは病態の診断、予防または処置のための獣医現場においてそれ自体を提供する、ペット動物、家畜（farm animal）もしくは家畜（livestock）、魚または淡水、海洋もしくは海で生きている他の生物、雄または雌から得られ得る。試料は、好ましくは動物、例えば血漿試料から得られる。血漿試料は、抗凝血剤を用いてまたは用いずに得られ得る。
【００３４】
試験試料は、葉、花、茎、果実、種、スプラウト、樹皮または根などからの農業または環境現場において植物または任意の植物源から得られ得る。
【００３５】
試験試料は、法医学現場、農業現場、環境現場または考古学現場において死体、死んだ動物、死んだ植物、または以前に生きていた本体の残りから得られ得る。試験試料は、血液試料、乾燥血液試料、他の体液試料、他の乾燥した体液試料、またはヒト、動物もしくは植物の本体もしくは残りのいずれかから得られた体組織試料であり得る。
【００３６】
試験試料は、環境試料であり得る。環境試料は、泥、植物物質または流体源（例えば地下水、海洋または川など）から得られた試料である。泥（「土壌試料」としても知られる）は、農業領域または環境対象とする領域から得られ得て、粒子状物質の除去を含む抽出された分析種を有し得る。
【００３７】
試料は、任意の既知の手段により得られ得る。試料は、対象とする分析種の安定性を確保するために保護または前処理され得る。該保護は、化学的（例えば加水分解またはpH調整）または物理的（例えば冷凍または凍結）工程により達成され得る。試料が固体または組織であるとき、妨害成分から対象とする分析種を単離するために、それを粉砕、抽出、精製、ろ過また遠心分離し得る。または試料が液体であるとき、好ましくは、対象とする分析種および吸着剤の化学的性質に応じて、弱塩基性から中性、弱酸性の範囲にあるpHを有する；例えば10〜3、より好ましくは9〜4、より好ましくは8〜5、またはさらにより好ましくは7〜6の範囲にあるpHを有する溶液（または「ローディングバッファー」）にそれを溶解または懸濁させる。
【００３８】
任意に試料容量は、本明細書に記載の方法において有用であるのに十分な量である限り得られ得る。この実施態様の態様において、試料容量は、例えば、約10μL、約25μL、約50μL、約75μL、約100μL、約125μL、約150μL、約175μL、約200μL、約225μL、約250μL、約275μL、約300μL、約325μL、約350μL、約375μL、約400μL、約425μL、約450μL、約475μLまたは約500μLであり得る。この実施態様の他の態様において、試料容量は、例えば、少なくとも10μL、少なくとも25μL、少なくとも50μL、少なくとも75μL、少なくとも100μL、少なくとも125μL、少なくとも150μL、少なくとも175μL、少なくとも200μL、少なくとも225μL、少なくとも250μL、少なくとも275μL、少なくとも300μL、少なくとも325μL、少なくとも350μL、少なくとも375μL、少なくとも400μL、少なくとも425μL、少なくとも450μL、少なくとも475μLまたは少なくとも500μLであり得る。この実施態様のまた他の態様において、試料容量は、例えば、多くとも10μL、多くとも25μL、多くとも50μL、多くとも75μL、多くとも100μL、多くとも125μL、多くとも150μL、多くとも175μL、多くとも200μL、多くとも225μL、多くとも250μL、多くとも275μL、多くとも300μL、多くとも325μL、多くとも350μL、多くとも375μL、多くとも400μL、多くとも425μL、多くとも450μL、多くとも475μLまたは多くとも500μLであり得る。この実施態様のさらに他の態様において、試料容量は、例えば、約10μL〜多くとも約100μL、約10μL〜多くとも約200μL、約10μL〜多くとも約300μL、約10μL〜多くとも約400μL、約10μL〜多くとも約500μL、約10μL〜多くとも約600μL、約10μL〜多くとも約700μL、約10μL〜多くとも約800μL、約10μL〜多くとも約900μL、約10μL〜多くとも約1000μL、約50μL〜多くとも約100μL、約50μL〜多くとも約200μL、約50μL〜多くとも約300μL、約50μL〜多くとも約400μL、約50μL〜多くとも約500μL、約50μL〜多くとも約600μL、約50μL〜多くとも約700μL、約50μL〜多くとも約800μL、約50μL〜多くとも約900μL、約50μL〜多くとも約1000μL、約100μL〜多くとも約200μL、約100μL〜多くとも約300μL、約100μL〜多くとも約400μL、約100μL〜多くとも約500μL、約100μL〜多くとも約600μL、約100μL〜多くとも約700μL、約100μL〜多くとも約800μL、約100μL〜多くとも約900μLまたは約100μL〜多くとも約1000μLであり得る。
【００３９】
本明細書に記載の試験試料は、精製され得る。本明細書で用いる用語「精製された」、「精製」または「精製している」は、対象とする分析種以外の試料からすべての材料を除去することを指さない。代わりに精製は、対象とする分析種の検出を妨げる試料中の他の成分と比較して1以上の対象とする分析種の量を高める手順を指す。様々な手段による試料の精製は、1以上の妨害物質、例えば、質量分析による選択された分析種の選択された親または娘イオンの検出の検出を妨害してもしなくてもよい1以上の物質の相対的減少を可能にする。この用語が用いられるように相対的減少は、精製される材料中に対象とする分析種と存在する任意の物質が精製により完全に除去されることを必要としない。尿試料中のある分析種（特に薬物）を検出するとき、加水分解は、分析種の溶解性および抽出を妨げるグルコルニド結合を除去するために必要であり得る。この精製技術は、通常尿の酵素または酸加水分解により実施される。あるいは、リン脂質の除去の有無にかかわらず粒子状物質（例えば遠心分離またはろ過による）、タンパク質沈殿（適宜「タンパク質クラッシュ」法による）の除去は、有用な精製技術であり得る。
【００４０】
精製はまた、誘導体化反応に適した、利用可能な活性なアミノまたはフェノール性基を生成するかまたは作るために実施され得る。これらの方法は、エステルもしくはアミンの加水分解、または糖の酸加水分解を含む。
【００４１】
前処理による該精製は、限定されないが、固相抽出のための試料を調製するのに役立つ。
【００４２】
本明細書で用いる用語「固相抽出」または「SPE」は、化学的混合物が、溶液が通り抜けるかまたは周りを通る固体（すなわち固相）に対する溶液（すなわち移動相）に溶解または分散した成分の親和性の結果として成分に分離される工程を指す。ある場合、移動相が固相を通り抜けるかまたは周りを通るときに、移動相の所望でない成分は、移動相中の分析種の精製を生じる固相により保持され得る。他の場合、分析種は、固相により保持され得て、移動相が固相を通り抜けるかまたは周りを通ることを可能にする。これらの場合、さらに処理または分析するために保持された分析種を固相から溶離するためにその後第2の移動相が用いられる。
【００４３】
イオン交換抽出を用いるSPEは、試料から対象とする分析種を抽出するために適用される。該分析種は、ある特定の範囲の緩衝液のpH下でイオン化され得る。SPEは、分析種に依存した適切な特性の範囲で実施され得る。分析種、例えばモノアミン神経伝達物質、カテコールアミン、メタネフリン、アミノ酸、甲状腺ホルモンまたはカルボン酸は、SPEに基づくイオン交換抽出によって抽出、保持または精製され得る。より具体的には、強から弱カチオン交換が用いられ得る。カチオン交換を用いるSPEは、血漿試料から対象とする分析種を抽出する本方法において適用される一例である。ポリマー吸着剤に基づくジビニルベンゼン-（DVB-）を有する弱カチオン交換カートリッジは、特にカテコールアミンおよびメタネフリンのSPEとして例示される。SPEに基づく強カチオン交換抽出を用いるSPEはまた、より強力な溶出溶媒によってDVB-ベースポリマー吸着剤で充填されたSPEカートリッジで血漿試料からのカテコールアミンおよびメタネフリンを精製するために用いられ得る。さらに、シリカベースカルボン酸吸着剤はまた、血漿試料からカテコールアミンおよびメタネフリンを抽出するのに有用であり得る。
【００４４】
シリカまたは1以上のポリマーいずれかに基づく強カチオン交換（スルホン酸化学的性質）吸着剤はまた、SPE工程においてカテコールアミンおよびメタネフリンを抽出するのに有用であり得る。強カチオン交換吸着剤を有するSPEは、特に甲状腺ホルモン（T3/rT3/T4）のSPEとして例示される。アミノ酸分析種は、同様にポリマーベースまたはシリカベースいずれかの強カチオン交換吸着剤で抽出され得る。
【００４５】
アニオン交換ポリマーはまた、カルボン酸分析種、アミノ酸分析種、スルホン酸分析種またはホスホン酸分析種を抽出するために用いられ得る。
【００４６】
カテコールアミンおよびメタネフリンを抽出する本方法における使用のための対象とする特定のカラムとしては、CEREX（登録商標）PWCX、1mLカラム、10mg、96/Pk（カタログ番号6750-0101R）が挙げられる。甲状腺ホルモンについては、CEREX（登録商標）PSCX、1mLカラム、10mg、96/Pk（カタログ番号687-0101R）が適切である。
【００４７】
またさらに別の一実施態様において、逆相シリカベースSPEカラムまたはカートリッジは、分析種がアミノ基を有しない、例えばエストロゲンホルモン、カンナビノイドまたはフラボノイドとき、選択の分析種を抽出、精製または保持するために用いられ得る。このSPE／精製中に選択される吸着剤としては、アルキル結合シリカ（C4、C8、C12およびC18）、シアノ結合シリカ、フェニル結合シリカまたはビフェニル結合シリカが挙げられる。
【００４８】
カラムのサイズは範囲があり得るが、特に、カラム用量は、好ましくは50μL〜3000μLの範囲であり得て、100g〜50mgの吸着剤ロード量を有し得る。別の一の実施態様において、より好ましいカラムサイズは、100μL〜2000μLの範囲であり、1mg〜20mgの吸着剤ロード量を有する。別の一の実施態様において、より好ましいカラムサイズは、200μL〜1000μLの範囲であり、2mg〜10mgの吸着剤ロード量を有する。SPEカラム（カートリッジ）の形状およびサイズは、特定のプラットフォームに合わせて変更し得る。
【００４９】
吸着剤の粒子サイズは、さらに対象とする分析種の分離を助け得る。この実施態様の態様において、吸着剤の粒子サイズは、例えば、約0.5μm、約1μm、約5μm、約10μm、約15μm、約20μm、約25μm、約30μm、約35μm、約40μm、約45μm、約50μm、約55μm、約60μm、約65μm、約70μmまたは約75μmの平均直径を有し得る。この実施態様の他の態様において、吸着剤の粒子サイズは、例えば、少なくとも0.5μm、少なくとも1μm、少なくとも5μm、少なくとも10μm、少なくとも15μm、少なくとも20μm、少なくとも25μm、少なくとも30μm、少なくとも35μm、少なくとも40μm、少なくとも45μm、少なくとも50μm、少なくとも55μm、少なくとも60μm、少なくとも65μm、少なくとも70μmまたは少なくとも75μmの平均直径を有し得る。この実施態様のまた他の態様において、吸着剤の粒子サイズは、例えば、多くとも0.5μm、多くとも1μm、多くとも5μm、多くとも10μm、多くとも15μm、多くとも20μm、多くとも25μm、多くとも30μm、多くとも35μm、多くとも40μm、多くとも45μm、多くとも50μm、多くとも55μm、多くとも60μm、多くとも65μm、多くとも70μmまたは多くとも75μmの平均直径を有し得る。この実施態様のさらに他の態様において、吸着剤の粒子サイズは、例えば、約0.5μm〜約10μm、約0.5μm〜約20μm、約0.5μm〜約30μm、約0.5μm〜約40μm、約0.5μm〜約50μm、約0.5μm〜約60μm、約0.5μm〜約70μm、約0.5μm〜約80μm、約1μm〜約10μm、約1μm〜約20μm、約1μm〜約30μm、約1μm〜約40μm、約1μm〜約50μm、約1μm〜約60μm、約1μm〜約70μm、約1μm〜約80μm、約5μm〜約10μm、約5μm〜約20μm、約5μm〜約30μm、約5μm〜約40μm、約5μm〜約50μm、約5μm〜約60μm、約5μm〜約70μm、約5μm〜約80μm、約10μm〜約20μm、約10μm〜約30μm、約10μm〜約40μm、約10μm〜約50μm、約10μm〜約60μm、約10μm〜約70μmまたは約10μm〜約80μmの範囲の平均直径を有し得る。
【００５０】
試料は、ローディング溶媒またはローディングバッファーを有するSPEカラムにロードされ得る。ローディング溶媒は、脱イオン水、pH緩衝水溶液、有機溶媒、有機溶媒の混合物、有機溶媒と脱イオン水の混合物、有機溶媒と脱イオン水の混合物、または有機溶媒もしくは有機溶媒の混合物と混合したpH緩衝水溶液であり得る。pH緩衝水溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、酢酸緩衝液、典型的な生化学の実験室における別の一般的に用いられる緩衝液、またはリン酸緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、ギ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液もしくは酒石酸緩衝液のうちのいずれか2以上の混合物であり得るか、または弱塩基性から中性、弱酸性の範囲であるpHを有し得て；例えば10〜3、より好ましくは9〜4、より好ましくは8〜5、またはさらにより好ましくは7〜6の範囲のpHを有し、0.1mM〜100mM、より好ましくは0.5mM〜50mM、より好ましくは1mM〜25mM、またはより好ましくは5mM〜10mMの範囲の濃度である。有機溶媒は、アセトニトリル、アセトン、1,4-ジオキサン、DMF、テトラヒドロフラン（THF）、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸メチル、またはそれらの混合物から選択され得る。
【００５１】
SPEカラムに試料をロードする際に、流体は、重力、真空マニホールドを通して吸引する真空、または陽圧マニホールドを通して押す窒素もしくは不活性ガス（空気乾燥工程の有無にかかわらない）によって吸着剤を通過することができる。試料をロードしたカートリッジは、さらに溶媒で洗浄され得る。洗浄溶媒の選択は、脱イオン水、pH緩衝水溶液、有機溶媒、有機溶媒の混合物、または有機溶媒と緩衝液の混合物であり得る。有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ジエチルエーテル、アセトン、1,4-ジオキサン、THF、DMF、酢酸エチル、酢酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸メチル、または上記溶媒の混合物であり得る。
【００５２】
ロードおよび洗浄する際に、ロードされたカートリッジは、直接溶出液で処理され得るか、またはカートリッジを通過する乾燥窒素もしくは別の乾燥ガスの流れによって最初に乾燥され得る。
【００５３】
本明細書の態様は、一部には誘導体化剤を用いて対象とする分析種のインサイチュ誘導体化の方法を開示する。対象とする分析種は、分析種の誘導体を提供するために誘導体化試薬と反応する。この誘導体は、HPLC挙動の向上およびタンデムMS/MS感度の有意な向上を示す。例えば、LC-タンデムMS/MS技術を用いて血清試料からのカテコールアミン、メタネフリン、甲状腺ホルモン T3、rT3およびT4を定量するとき、本方法は、検出限界および／または定量感度の10倍近くまたはそれ以上の向上を予想外に提供する。
【００５４】
本明細書に記載の誘導体化試薬は、本明細書に記載の分析種に存在する1級もしくは2級アミノ、フェノール性ヒドロキシ基、1級アルコール（ヒドロキシル）基および／またはアリールもしくはアルキルチオール基と反応し得る化合物である。対象とする誘導体化剤は、限定されないが、式Iで示されるアシル化剤を含む。アシル化試薬は、塩化アシルまたは他のハロゲン化アシルを含み得る。誘導体化剤はまた、結合分析種の検出を助けるために比色反応において蛍光を発するかまたはそれに関与し得る。
【化１】
2017519228.tif 000003
【００５５】
一の実施態様において、誘導体化は、Fmocクロリドおよびそのバリアントを用いて実施される。単語「バリアント」は、本明細書においてFmocクロリドの変動を区別するために適用され、その例は、一部分には式IIで表される。Fmocクロリドの様々なバリアントが本方法による分析種の誘導体化に適切であることが解される。したがって、以下に述べられる特定の実施態様は、限定的なリストでない。
【００５６】
一の実施態様において、本方法は、式II:
【化２】
2017519228.tif 000004
［式中、各R1、R2、R3およびR4は、各々独立してH、ハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、低級アルキル（直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル）、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルコキシ基である］で示されるFmocクロリドを使用する。直鎖または分岐鎖C1-8アルキルの例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、環式プロピル、環式ペンチル、ヘキサン、ヘプチルおよびオクチルなどが挙げられる。
【００５７】
この実施態様の態様において、FMOCクロリド化合物は:
【化３】
2017519228.tif 000005
である。
【００５８】
Fmocクロリドの複数のバリアント（例えば上記スキーム1に表される）は、1のLCMSランにおいて複数の試料を同時に定量する機会を提供するために並行の誘導体化試薬パネルとして用いられ得る。
【００５９】
別の一の実施態様において、誘導体化試薬は、ベンジルカルボニルクロリド（CBZクロリド）またはそのバリアントであり得る（スキーム2）。バリアントは、フェニル環上に置換基を有するCBZクロリドまたは縮合環系を有する置換されたCBZクロリドであり、ここで各R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、各々独立してH、ハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、低級アルキル（直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル）、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル基である。直鎖または分岐鎖C1-8アルキルの例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、環式プロピル、環式ペンチル、ヘキサン、ヘプチルおよびオクチルなどが挙げられる。縮合環系は、5〜7員の縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、例えばナフタレン、ベンゾフランもしくはインドール、または4〜8員の縮合環を有する非芳香族性の総炭素環式もしくはヘテロ環式縮合環系、例えば3,4-ジヒドロ-1H-インデンもしくは3,4,ジヒドロ-2H-クロメンであり得る。縮合環は、必要に応じてハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、低級アルキル（直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル）、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルコキシ基の1以上で置換され得る。直鎖または分岐鎖C1-8アルキルの例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、環式プロピル、環式ペンチル、ヘキサン、ヘプチルおよびオクチルなどが挙げられる。
【化４】
2017519228.tif 000006
【００６０】
別の一の実施態様において、スキーム3に示すように、誘導体化試薬は、塩化ベンゾイルまたはそのバリアントであり得る。塩化ベンゾイルのバリアントは、フェニル環上に置換基を有する塩化ベンゾイルまたは縮合環系を有する置換された塩化ベンゾイルであり、ここで各R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、各々独立して水素、ハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、低級アルキル（直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル）、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル基である。直鎖または分岐鎖C1-8アルキルの例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、環式プロピル、環式ペンチル、ヘキサン、ヘプチルおよびオクチルなどが挙げられる。縮合環系は、5〜7員の縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、例えばナフタレン、ベンゾフランもしくはインドール、または非芳香族性の総炭素環式もしくはヘテロ環式4〜8員の縮合環系、例えば3,4-ジヒドロ-1H-インデンもしくは3,4,ジヒドロ-2H-クロメンであり得る。縮合環は、必要に応じてハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、低級アルキル（直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル）、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル基の1以上で置換され得る。直鎖または分岐鎖C1-8アルキルの例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、環式プロピル、環式ペンチル、ヘキサン、ヘプチルおよびオクチルなどが挙げられる。
【化５】
2017519228.tif 000007
【００６１】
誘導体化試薬の別の一実施態様は、スキーム4に示すようにベンゼンスルホニルクロリドおよびそのバリアントであり得る。ベンゼンスルホニルクロリドのバリアントは、ベンゼン環上に置換基を有するベンゼンスルホニルクロリドまたは縮合環系を有する置換されたベンゼンスルホニルクロリドであり得て、ここでR1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、各々独立して水素、ハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、低級アルキル（直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル）、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル基である。直鎖または分岐鎖C1-8アルキルの例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、環式プロピル、環式ペンチル、ヘキサン、ヘプチルおよびオクチルなどが挙げられる。縮合環系において、当該系は、5〜7員の縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、例えばナフタレン、ベンゾフランもしくはインドール、または4〜8員の縮合環を有する非芳香族性の総炭素環式もしくはヘテロ環式縮合環系、例えば3,4-ジヒドロ-1H-インデンもしくは3,4,ジヒドロ-2H-クロメンであり得る。縮合環は、必要に応じてハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、低級アルキル（直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル）、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル基の1以上で置換され得る。直鎖または分岐鎖C1-8アルキルの例としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、環式プロピル、環式ペンチル、ヘキサン、ヘプチルおよびオクチルなどが挙げられる。
【化６】
2017519228.tif 000008
【００６２】
アシル化試薬の別の一の実施態様において、それは、アシルブロミド、アシルフルオリド、4-ニトロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステル、アシルイミダゾール、ヒドロキシスクシミドエステル（OSu）、ヒドロキシスクシミドナトリウムスルホネートエステル（スルホ OSu）、ヒドロキシベンゾトリゾールエステル（OBt）またはヒドロキシル-アザ-ベンゾトリアゾールエステル（OAt）であり得る。活性化されたアシル試薬は、当業者が知る適切な前駆体および活性化試薬によって、誘導体化反応前に形成され得るか、または誘導体化中にインサイチュで形成され得る。スキーム5で提供されるアシル化試薬は、試薬の範囲の例であり、範囲の制限でない。
【化７】
2017519228.tif 000009
式中、Xは、Cl、Br、F、
【化８】
2017519228.tif 000010
のうちの1つである。該アシル化試薬はまた、適切な前駆体およびカップリング剤から誘導体化中にインサイチュで形成され得る。
スキーム5
【００６３】
特に、複数のアシル化試薬は、並行に複数の試料中の同じ分析種を誘導するために用いられ得て、その後、多重分析と呼ばれる1のLCMS定量工程に結合され得て、著しく機器の操作効率を改善し、LC用の溶媒を節約できる。これらのアシル化試薬は、上記のように、同じ化学分類または異なる化学分類からであり得る。
【００６４】
インサイチュ誘導体化は、溶出直前、溶出中、溶出直後、または溶出直前から溶出後まで継続して固相抽出カラムから実施される。溶出を高pH溶出液で実施する。本明細書で用いる「高pH」は、塩基性pHを有する溶出液を含む。この実施態様のある態様において、溶出液は、例えば、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約10.5、約11、約11.5、約12、約12.5または約13のpHを有する。この実施態様の他の態様において、溶出液は、例えば、少なくとも8、少なくとも8.5、少なくとも9、少なくとも9.5、少なくとも10、少なくとも10.5、少なくとも11、少なくとも11.5、少なくとも12、少なくとも12.5または少なくとも13のpHを有する。この実施態様のまた他の態様において、溶出液は、例えば、多くとも8、多くとも8.5、多くとも9、多くとも9.5、多くとも10、多くとも10.5、多くとも11、多くとも11.5、多くとも12、多くとも12.5または多くとも13のpHを有する。この実施態様のまた他の態様において、溶出液は、例えば、約8〜約9、約8〜約9.5、約8〜約10、約8〜約10.5、約8〜約11、約8〜約11.5、約8〜約12、約8〜約12.5、約8〜約13、約8.5〜約9、約8.5〜約9.5、約8.5〜約10、約8.5〜約10.5、約8.5〜約11、約8.5〜約11.5、約8.5〜約12、約8.5〜約12.5、約8.5〜約13、約9〜約9.5、約9〜約10、約9〜約10.5、約9〜約11、約9〜約11.5、約9〜約12、約9〜約12.5、約9〜約13、約9.5〜約10、約9.5〜約10.5、約9.5〜約11、約9.5〜約11.5、約9.5〜約12、約9.5〜約12.5、約9.5〜約13、約10〜約10.5、約10〜約11、約10〜約11.5、約10〜約12、約10〜約12.5、約10〜約13、約10.5〜約11、約10.5〜約11.5、約10.5〜約12、約10.5〜約12.5、約10.5〜約13、約11〜約11.5、約11〜約12、約11〜約12.5または約11〜約13の範囲のpHを有する。
【００６５】
別の一の実施態様において、溶出を低pH溶出液で実施する。本明細書で用いる「低pH」は、酸性pHを有する溶出液を含む。この実施態様のある態様において、溶出液は、例えば、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6または約6.5。この実施態様の他の態様において、溶出液は、のpHを有する、例えば、少なくとも2、少なくとも2.5、少なくとも3、少なくとも3.5、少なくとも4、少なくとも4.5、少なくとも5、少なくとも5.5、少なくとも6または少なくとも6.5のpHを有する。この実施態様のまた他の態様において、溶出液は、例えば、多くとも2、多くとも2.5、多くとも3、多くとも3.5、多くとも4、多くとも4.5、多くとも5、多くとも5.5、多くとも6または多くとも6.5のpHを有する。この実施態様のまた他の態様において、溶出液は、例えば、約2〜約3、約2〜約3.5、約2〜約4、約2〜約4.5、約2〜約5、約2〜約5.5、約2〜約6、約2〜約6.5、約2.5〜約3、約2.5〜約3.5、約2.5〜約4、約2.5〜約4.5、約2.5〜約5、約2.5〜約5.5、約2.5〜約6、約2.5〜約6.5、約3〜約3.5、約3〜約4、約3〜約4.5、約3〜約5、約3〜約5.5、約3〜約6、約3〜約6.5、約3.5〜約4、約3.5〜約4.5、約3.5〜約5、約3.5〜約5.5、約3.5〜約6、約3.5〜約6.5、約4〜約4.5、約4〜約5、約4〜約5.5、約4〜約6、約4〜約6.5、約4.5〜約5、約4.5〜約5.5、約4.5〜約6、約4.5〜約6.5、約5〜約5.5、約5〜約6、約5〜約6.5、約5.5〜約6、約5.5〜約6.5または約6〜約6.5の範囲のpHを有する。
【００６６】
別の一の実施態様において、溶出を中性pH溶出液で実施する。この実施態様のある態様において、溶出液は、例えば、約6.5、約7、約7.5または約8のpHを有する。の実施態様の別の一態様において、溶出液は、例えば、少なくとも6.5、少なくとも7、少なくとも7.5または少なくとも8のpHを有する。この実施態様のまた別の一態様において、溶出液は、例えば、多くとも6.5、多くとも7、多くとも7.5または多くとも8のpHを有する。この実施態様のまた他の態様において、溶出液は、例えば、約6.5〜約7、約6.5〜約7.5、約6.5〜約8、約7〜約7.5、約7〜約8または約7.5〜約8の範囲のpHを有する。
【００６７】
本明細書に記載の溶出液は、アルカリ性の緩衝能を有する任意の緩衝液を用いて緩衝化され得る。この実施態様の態様において、本明細書に記載の溶出液は、有機もしくは無機緩衝剤、例えば、POPSO、TEA、リン酸塩の1つまたは混合物を用いて緩衝化され得る。この実施態様の他の態様において、本明細書に記載の溶出液は、例えば炭酸水素トリアルキルアンモニウム、ホウ酸トリアルキルアンモニウム、炭酸トリアルキルアンモニウムまたはリン酸トリアルキルアンモニウムを含む、トリアルキル-アンモニウム緩衝液；例えば炭酸水素セシウム、ホウ酸セシウム、炭酸セシウム、水酸化セシウム、リン酸水素二セシウムまたはリン酸三セシウム；を含む、セシウム緩衝液；例えば炭酸水素カリウム、ホウ酸カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、リン酸水素二カリウムまたはリン酸三カリウムを含む、カリウム緩衝液；例えば炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、水酸化ナトリウムまたは四ホウ酸ナトリウムを含む、ナトリウム緩衝液；例えば炭酸水素テトラアルキルアンモニウム、ホウ酸テトラアルキルアンモニウム、炭酸テトラアルキルアンモニウムまたはリン酸テトラアルキルアンモニウムを含む、テトラアルキルアンモニウム緩衝液を例えば用いて、例えばアセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン（THF）、1,4-ジオキサン、ジメチルホルムアミド（DMF）、N-メチルピロリドン（NMP）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ヘキサメチルホスホルアミド（HMPA）、ジエチルエーテル、イソプロピルアルコール（IPA）、t-ブタノールまたは2-ブタノールなどの有機共溶媒の1以上を使用するかまたは使用しない水中に、水中の有機物の所望の割合、例えば5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％または95％において／未満／または超で、緩衝化され得る。
【００６８】
溶出液において用いられる緩衝液の量は、緩衝液のアルカリ性の緩衝能を有効に維持できる任意の濃度であり得る。この実施態様の態様において、緩衝液の有効濃度は、例えば、約1.0mM、約5.0mM、約10mM、約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、約200mM、約300mM、約400mM、約500mM、約600mM、約700mM、約800mM、約900mMまたは約1Mであり得る。この実施態様の他の態様において、緩衝液の有効濃度は、例えば、少なくとも1.0mM、少なくとも5.0mM、少なくとも10mM、少なくとも20mM、少なくとも30mM、少なくとも40mM、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mM、少なくとも200mM、少なくとも300mM、少なくとも400mM、少なくとも500mM、少なくとも600mM、少なくとも700mM、少なくとも800mM、少なくとも900mMまたは少なくとも1Mであり得る。この実施態様のまた他の態様において、緩衝液の有効濃度は、例えば、多くとも1.0mM、多くとも5.0mM、多くとも10mM、多くとも20mM、多くとも30mM、多くとも40mM、多くとも50mM、多くとも60mM、多くとも70mM、多くとも80mM、多くとも90mM、多くとも100mM、多くとも200mM、多くとも300mM、多くとも400mM、多くとも500mM、多くとも600mM、多くとも700mM、多くとも800mM、多くとも900mMまたは多くとも1Mであり得る。
【００６９】
この実施態様のさらに他の態様において、溶出緩衝液の有効濃度は、例えば、約0.1mM〜約10mM、約0.1mM〜約25mM、約0.1mM〜約50mM、約0.1mM〜約75mM、約0.1mM〜約100mM、約0.1mM〜約200mM、約0.1mM〜約300mM、約0.1mM〜約400mM、約0.1mM〜約500mM、約0.1mM〜約1000mM、約1mM〜約10mM、約1mM〜約25mM、約1mM〜約50mM、約1mM〜約75mM、約1mM〜約100mM、約1mM〜約200mM、約1mM〜約300mM、約1mM〜約400mM、約1mM〜約500mM、約1mM〜約1000mM、約5mM〜約25mM、約5mM〜約50mM、約5mM〜約75mM、約5mM〜約100mM、約5mM〜約200mM、約5mM〜約300mM、約5mM〜約400mM、約5mM〜約500mM、約5mM〜約1000mM、約10mM〜約25mM、約10mM〜約50mM、約10mM〜約75mM、約10mM〜約100mM、約10mM〜約200mM、約10mM〜約300mM、約10mM〜約400mM、約10mM〜約500mM、約10mM〜約1000mM、約25mM〜約50mM、約25mM〜約75mM、約25mM〜約100mM、約25mM〜約200mM、約25mM〜約300mM、約25mM〜約400mM、約25mM〜約500mM、約25mM〜約1000mM、約50mM〜約75mM、約50mM〜約100mM、約50mM〜約200mM、約50mM〜約300mM、約50mM〜約400mM、約50mM〜約500mM、約50mM〜約1000mM、約75mM〜約100mM、約75mM〜約200mM、約75mM〜約300mM、約75mM〜約400mM、約75mM〜約500mM、約75mM〜約1000mM、約100mM〜約150mM、約100mM〜約200mM、約100mM〜約300mM、約100mM〜約400mM、約100mM〜約500mM、約100mM〜約1000mM、約200mM〜約300mM、約200mM〜約400mM、約200mM〜約500mM、約200mM〜約1000mM、約250mM〜約300mM、約250mM〜約400mM、約250mM〜約500mMまたは約250mM〜約1000mMの範囲であり得る。別の一の実施態様において、溶出緩衝液の有効濃度は、約5mM〜約250mMの範囲であり得る。
【００７０】
本明細書に記載の溶出液は、本明細書に記載の誘導体化剤を含み得る。本明細書に記載の溶出液に加えられる誘導化剤の量は、それに続く検出のための対象とする分析種完全な誘導体化を可能にするのに十分なアクセス量である。インサイチュ誘導体化におけるような溶出工程前に溶出緩衝液と誘導体化試薬を混合し得て、溶出直前に溶出後誘導体化工程を形成するためにそれをまた溶離液に加えて得る。
【００７１】
一の実施態様において、分析種の同時溶出および誘導体化は、誘導体化剤を含む高pH溶出緩衝液を固体吸着剤支持体マトリックスと結合する分析種に適用することにより達成され得る。溶出液を適用する際に、その誘導体へ分析種を変換する誘導体化反応は生じ、その後、誘導体は、固体支持体マトリックスからの分析種の溶出と同時に吸着剤マトリックスから溶出される。
【００７２】
誘導体化反応は、分析種のアシル化に適した任意の条件下で実施され得る。一の実施態様において、誘導体化反応は、誘導体化剤の分析種への結合に適した温度下で実施される。この実施態様の態様において、誘導体化反応は、約0℃もしくは0℃超から約100℃もしくは100℃未満、より好ましくは約5℃〜約90℃、より好ましくは10℃〜80℃、より好ましくは15℃〜70℃、より好ましくは20℃〜60℃、より好ましくは20℃〜50℃の範囲の温度で実施され得る。
【００７３】
誘導体化反応は、誘導体化剤の分析種への結合に適した時間下で実施される。この実施態様の態様において、誘導体化反応は、1分〜約24時間、より好ましくは3分〜約5時間、より好ましくは5分〜60分、より好ましくは10分〜30分の範囲の時間実施される。
【００７４】
当然、温度の変化は、反応時間を変化させ得る。例えば、反応を例えば40℃に加熱する場合、反応時間は短縮され得る。
【００７５】
誘導体化反応は、緩衝剤の1以上を含む、緩衝液の添加によりクエンチされ得る。一の実施態様において、緩衝液は、アンモニウム緩衝液、例えばギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ホウ酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、硫酸水素アンモニウム、ビスアンモニウムホスフェートなどである。別の一の実施態様において、クエンチング試薬はまた、水、または水と有機溶媒、例えばアルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、グリコール、グリセロールなど、アセトニトリル、アセトン、エーテル、THF、1,4-ジオキサン、DMF、NMP、DMSOもしくはHMPAとの混合溶媒中、例えば1mM〜500mMの濃度範囲の緩衝化□-アミノ酸溶液、例えばグリシン、アラニン、緩衝化□-アラニンまたは緩衝化1級アミン溶液であり得る。クエンチング工程は、溶離液中に保持され得る任意の過剰な誘導体化試薬の多くを中和し、また反応混合物のpHを低下させることにより生成物を安定化させる。この実施態様の態様において、誘導体化分析種を含む溶離液のpHは、約4〜約9.5の範囲に低下され得る。
【００７６】
クエンチ後、誘導体化分析種を含む反応混合物は、対象とする分析種の存在について直接分析され得る。該分析は、本質的に定性的または定量的のいずれかであり得る。この実施態様の態様において、誘導体化分析種を含む溶離液は、例えばクロマトグラフィーおよび／または質量分析的検出を用いて、対象とする分析種の存在について直接分析され得る。
【００７７】
本明細書で用いる用語「クロマトグラフィー」は、固定相液体または固相の周りまたはその上を流れるときの化学成分の異なる分配の結果として液体またはガスに運ばれる化学混合物が成分に分離されるプロセスを指す。
【００７８】
本明細書で用いる用語「液体クロマトグラフィー」または「LC」は、流体が微粉物質のカラムを通って、またはキャピラリー通路を通って均一に浸出するときの、流動性溶液の1以上の成分の選択的遅延のプロセスを意味する。遅延はこの流体が固定相に対して移動するとき、1以上の固定相とバルク流体（すなわち移動相）間の混合物の成分の分配により生じる。「液体クロマトグラフィー」の例としては、逆相液体クロマトグラフィー（RPLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、超高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）および乱流液体クロマトグラフィー（TFLC）（高乱流液体クロマトグラフィー（HTLC）と知られることもある）、ハイスループット液体クロマトグラフィー、ナノフロー液体クロマトグラフィーまたはナノLCが挙げられる。
【００７９】
本明細書で用いる用語「高速液体クロマトグラフィー」または「HPLC」は、固定相、典型的に高密度充填カラムを通って加圧下で移動相を押し出すことにより分離度を増加させる、液体クロマトグラフィーを指す。
【００８０】
本明細書で用いる用語「乱流液体クロマトグラフィー」または「TFLC」（高乱流液体クロマトグラフィー（HTLC）またはハイスループット液体クロマトグラフィーと知られることもある）は、分離を実施するための基礎としてカラム充填を通してアッセイされる材料の乱流を利用するクロマトグラフィーの形態を指す。TFLCは、質量分析による分析の前に2つの名称のわからない薬物を含む試料の調製において適用されている。例えばZimmer et al., J Chromatogr. A 854: 23-35 (1999)参照；また、米国特許第5,968,367号、第5,919,368号、第5,795,469号および第5,772,874号参照、これらはさらにTFLCを説明している。当業者は「乱流」を理解する。流体がゆっくりおよび滑らかに流れるとき、該流れは「層流」と呼ばれる。例えば低流速でHPLCカラムを通り移動する流体は、層流である。層流において、流体の粒子の動きは規則正しく、一般に粒子は直線状に移動する。より速い速度では、水の完成は流体の摩擦力に打ち勝ち、乱流が生じる。不規則な境界と接しない流体は、摩擦により遅くなったかまたは不均一な表面により歪められたものを「超える」。流体が乱れて流れているとき、それは、流れが層流であるときより多くの「抗力」を有して渦巻いて（eddies and whirls (or vortices)）流れる。いつ流体の流れが層流または乱流となるかを決定するのに役立つ多くの参照文献が利用可能である（例えば、Turbulent Flow Analysis Measurement and Prediction, P. S. Bernard & J. M. Wallace, John Wiley & Sons, Inc., (2000); An Introduction to Turbulent Flow, Jean Mathieu & Julian Scott, Cambridge University Press (2001)）。
【００８１】
本明細書で用いる用語「ガスクロマトグラフィー」または「GC」は、試料混合物が液体または粒子状固体からなる固定相を含むカラムを通って移動する担体ガス（窒素またはヘリウムとして）の流れへ気化および注入され、固定相に対する化合物の親和性に従ってその成分化合物へ分離されるクロマトグラフィーを指す。
【００８２】
本明細書で用いる用語「大粒子カラム」または「抽出カラム」は、約50μmより大きい平均粒子直径を有するクロマトグラフィーカラムを指す。本明細書で用いる用語「約」は±10％を意味する。
【００８３】
本明細書で用いる用語「分析カラム」は、分析種の存在または量の決定を可能にするのに十分なカラムから溶出する試料中の材料の分離を達成するのに十分なクロマトグラフィープレートを有するクロマトグラフィーカラムを指す。該カラムは、しばしば「抽出カラム」と区別され、これは、更なる分析用の精製された試料を得るために保持された材料を保持されていない材料から分離または抽出する一般的な目的を有する。本明細書で用いる用語「約」は±10％を意味する。
【００８４】
HPLCを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的ゆっくりした層流技術に依存する。従来のHPLC分析は、カラムを通る試料の層流は、試料からの対象とする分析種の分析の基礎となるカラム充填に依存する。当業者は、該カラムにおける分離が分配プロセスであり、対象とする分析種での使用に適したHPLC機器およびカラムを選択し得ると理解するだろう。クロマトグラフィーカラムは、典型的には、化学部分の分離（すなわち分画）を促進するために媒体（すなわち充填材料）を含む。媒体は、微粒子を含み得る。粒子は、化学部分の分離を促進するために様々な化学部分と相互作用する結合表面を含む。1つの適切な結合表面は、疎水性表面結合、例えばアルキル結合、シアノ結合、ペンタフルオロフェニルプロピル（F5）表面、フェニル結合、またはビフェニル結合表面である。アルキル結合表面は、C-4、C-8、C-12またはC-18結合アルキル基を含み得る。好ましい実施態様において、カラムはC-18カラムである。クロマトグラフィーカラムは、固相抽出またはHTLCカラムから直接または間接的に試料を受け取るための入口、および分画試料を含む流出液を排出するための出口を含む。
【００８５】
ある特定の実施態様において、分析種は、対象とする分析種が可逆的にカラム充填材料により保持され、一方1以上の他の材料が保持されない条件下でカラムへ試料を適用することにより試料中に富化され得る。これらの実施態様において、第1の移動相条件は、対象とする分析種がカラムにより保持される場合使用され得て、そして第2の移動相条件は、一旦保持されない材料が洗浄されるとカラムから保持された材料を除去するために使用され得る。あるいは、分析種は、対象とする分析種が1以上の他の材料と比較して異なった速度で溶出する移動相条件下でカラムへ試料を適用することにより試料中に富化され得る。該手順は、試料の1以上の他の成分と比較して1以上の対象とする分析種の量を富化し得る。別の一の実施態様において、分析種の反応混合物は、ガードカラム上に所望の分析種生成物を保持するために弱溶剤とガードカラムにまずロードされ得て、その後、LC溶出溶媒は、分離および分析のために分析カラム上に物質を運ぶことである。
【００８６】
一の実施態様において、試料は、入口でLCカラムに適用され、溶媒または溶媒混合物とともに溶出され、出口で排出され得る。種々の溶媒モードが、対象とする分析種を溶出するために選択され得る。例えば、液体クロマトグラフィーは、グラジェントモード、アイソクラチックモードまたは多型（すなわち混合）モードを用いて実施され得る。クロマトグラフィーの間、材料の分離は、変数、例えば溶離液（「移動相」としても知られる）、溶出モード、グラジェント条件、温度などの選択により達成される。
【００８７】
一の好ましい実施態様において、HPLCは、疎水性カラムクロマトグラフィーシステムを用いて実施される。ある特定の好ましい実施態様において、C18分析カラム（例えば、TARGA（登録商標）C18、3μm 50x2.1、または等価物）が用いられる。ある特定の好ましい実施態様において、HPLCは、移動相としてHPLCグレードの、0.1％ギ酸を含む5.0mMギ酸アンモニウムおよびアセトニトリル中0.1％ギ酸を用いて実施される。
【００８８】
バルブおよび配管コネクタの慎重な選択により、2以上のクロマトグラフィーカラムは、材料が全く手動工程を必要とせずに1つから次へ通過するように必要に応じて接続され得る。好ましい実施態様において、バルブおよび配管は、必要な工程を実施するためにプログラムされたコンピューターにより制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムはまた、検出システム、例えばMSシステムにこのようなオンライン方式で接続される。したがって、オペレーターは、オートサンプラーに試料のトレーを置き得て、残りの操作は、コンピューター制御化で実施されて、選択されたすべての試料の精製および分析をもたらす。
【００８９】
いくつかの実施態様において、固相抽出は、質量分析前に対象とする誘導体化分析種の富化のためのハイスループットプラットフォームにおいて用いられ得る。該実施態様において、試料は、誘導体化分析種を捕捉するハイスループットSPEカートリッジまたはガードカラムを用いて抽出され、その後、質量分析（MS）分析前に分析HPLCカラム、例えばC-18カラム上に溶出され得る。これらのクロマトグラフィー手順に関与する工程が自動化方式につなげられ得るため、分析種の精製中のオペレーター関与の要求は最小化され得る。この特徴は、時間およびコストの節約をもたらし、オペレーターエラーの機会を排除または減少し得る。
【００９０】
直接定量は、定量のための抽出および誘導体化分析種の「インライン」または「オンライン」使用である。本明細書で用いる用語「オンライン」または「インライン」は、例えば「オンライン自動化方式」または「オンライン抽出」で用いるとき、オペレーターの介入を必要とせずに実施される手順を指す。対照的に、本明細書で用いる用語「オフライン」は、オペレーターの手動介入を必要とする手順を指す。したがって、試料を沈殿させ、その後上清を手動でオートサンプラーにロードする場合、沈殿およびローディング工程は、それに続く工程からオフラインである。当該方法の様々な実施態様において、1以上の工程は、オンライン自動化方式で実施され得る。
【００９１】
本明細書で用いる用語「試料注入」は、分析機器、例えば質量分析計に分割量の1の試料を導入することを指す。この導入は、直接または間接的に生じ得る。直接試料注入は、オンライン方式で質量分析計に接続されたHPLCカラムに分割量の試料を注入するにより達成され得る。
【００９２】
本明細書で用いる、質量分析による複数の分析種分析に関する「同じ試料注入」という用語は、2以上の異なる分析種の分子イオンが、同じ（すなわち同一の）試料注入からの異なる分析種の分子イオンを測定することにより本質的に同時に決定されることを意味する。
【００９３】
様々な実施態様において、試験試料に存在する対象とする分析種は、当業者に公知な任意の方法によりイオン化され得る。質量分析は質量分析計を用いて実施され、これは、分画試料をイオン化し、更なる分析のための荷電分子を作成するためのイオン源を含む。例えば試料のイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ESI）、光イオン化（photon ionaization）、大気圧化学イオン化（APCI）、光イオン化（photoionaization）、大気圧光イオン化（APPI）、高速原子衝撃（FAB）、液体二次イオン化（LSI）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（SELDI）、誘導結合プラズマ（ICP）およびパーティクルビームイオン化により実施され得る。当業者は、イオン化方法の選択は、測定される分析種、試料のタイプ、検出器のタイプ、正対負モードの選択などに基づいて決定され得ると理解するだろう。
【００９４】
本明細書で用いる用語「質量分析」または「MS」は、化合物をそれらの質量により同定する分析技術を指す。MSは、イオンをそれらの質量電荷比、または「m/z」に基づいてフィルター処理、検出および測定する方法を指す。MS技術は、一般的に(1)化合物をイオン化して荷電化合物を形成すること；および(2)荷電化合物の分子量を検出し、質量電荷比を算出することを含む。化合物は、任意の適切な手段によりイオン化および検出され得る。「質量分析計」は、一般的にイオン化装置およびイオン検出器を含む。一般的に、対象とする1以上の分子はイオン化され、その後、イオンは質量分析計に導入され、ここでイオンは、磁場と電場の組合せのために、質量（「m」）および電荷（「z」）に依存する空間中の経路に従う。例えば、米国特許第6,204,500号の名称「Mass Spectrometry From Surfaces」;第6,107,623号の名称「Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry」;第6,268,144号の名称「DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry」;第6,124,137号の名称「Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes」; Wright et al., Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999, 2:264-76；およびMerchant and Weinberger, Electrophoresis 2000, 21:1164-67参照。
【００９５】
本明細書で用いる用語「エレクトロスプレーイオン化」または「ESI」は、溶液が短い長さのキャピラリーチューブに沿って流されて、その末端に高い正電位または負電位がかけられる方法を指す。チューブの末端に到達する溶液は、溶媒蒸気中の極めて小さい溶媒の液滴のジェットまたはスプレーへ気化（噴霧）される。このミストは、蒸発チャンバーを通って流れ、これは濃縮を妨げ、溶媒蒸発を促進するために加熱され得る。液滴がより小さく得られるにつれて、電気的表面電荷密度は、自然な反発作用が電荷間でイオンおよび中性分子を放出させるような時間まで増加する。一の実施態様において、検出はESI後実施される。
【００９６】
本明細書で用いる用語「大気圧化学イオン化」または「APCI」は、ESIと同様である質量分析方法を指す；しかしながらAPCIは、大気圧でプラズマ内に生じるイオン-分子反応によりイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対向電極間の放電によって維持される。その後イオンは、典型的には、一連の差動的に汲まれるスキマーステージの使用により質量分析器に抽出される。乾燥し予熱されたN2ガスの向流は、溶媒の除去を改善するために用いられ得る。APCIにおける気相イオン化は、より低い極性種を分析するためのESIより効果的であり得る。
【００９７】
本明細書で用いる用語「大気圧光イオン化」または「APPI」は、分子Mの光イオン化のための機構が分子イオンM+を形成する光子吸収および電子放出である質量分析の形態を指す。光子エネルギーが典型的にイオン化電位のわずか上であるので、分子イオンは解離を受けにくい。多くの場合、クロマトグラフィーを必要とすることなく試料を分析することが可能であり、それ故にかなりの時間および費用を節約する。水蒸気またはプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンはHを抽出して、MH+を形成し得る。これは、Mが高いプロトン親和性を有する場合生じる傾向がある。これは、M+とMH+の合計が一定であるため定量の真度に影響を及ぼさない。プロトン性溶媒中の薬物化合物は、通常MH+として観察され、一方、非極性化合物、例えばナフタレンまたはテストステロンは、通常M+を形成する。例えば、Robb et al., Anal. Chem. 2000, 72(15): 3653-3659参照。
【００９８】
本明細書で用いる用語「脱離」は、液体表面からの分析種の移動および／または気相への分析種の侵入を指す。レーザー脱離熱脱離は、分析種を含む試料がレーザーパルスにより気相へ熱的に脱離される技術である。このレーザーは、金属床を有する特別に作られた96ウェルプレートの裏面に当たる。レーザーパルスは、当該床に当たり、熱が試料を気相に移動させる。その後、気相試料は、質量分析計へ引っ張って行かれる。
【００９９】
本明細書で用いる用語「選択的イオンモニタリング」は、比較的狭い質量範囲内、典型的には約1質量単位のイオンのみが検出される質量分析計のための検出モードである。
【０１００】
本明細書で用いる「複合反応モード」（「選択的反応モニタリング」として知られることもある）は、プリカーサーイオンおよび1以上の断片イオンが選択的に検出される質量分析計のための検出モードである。
【０１０１】
イオンは、いくつかの検出モードを用いて検出され得る。例えば、選択されたイオンは、すなわち選択的イオンモニタリングモード（SIM）を用いて、検出され得るか、またはイオンは、スキャンモード、例えば多重反応モニタリング（MRM）または選択的反応モニタリング（SRM）を用いて検出され得る。好ましくは、質量電荷比は四重極分析器を用いて決定される。例えば、「四重極」または「四重極イオントラップ」機器において、振動無線周波数電磁界中のイオンは、電極間でかけられるDC電位、RF信号の振幅、および質量電荷比に比例した力を受ける。電位および振幅は、特定の質量電荷比を有するイオンのみが四重極の全長を移動するが、すべての他のイオンが歪められるように選択され得る。したがって四重極機器は、機器へ注入されるイオンに対する「質量フィルター」および「質量検出器」の両方として働く。
【０１０２】
「タンデム質量分析」または「MS/MS」を使用することによりMS技術の分解能を向上させ得る。この技術において、対象とする分子から生じたプリカーサーイオン（親イオンとも呼ばれる）は、MS機器でフィルター処理され得て、その後プリカーサーイオンは断片化されて、1以上の断片イオン（娘イオンまたはプロダクトイオンとも呼ばれる）を得て、その後第2のMSフィルターおよび検出器（四重極）において分析される。プリカーサーイオンの慎重な選択により、ある特定の分析種により生成されるイオンのみが断片化チャンバーへ通過し、ここで不活性ガスとの原子の衝突が断片イオンを生成する。プリカーサーおよび断片イオンの両方が所与の一連のイオン化／断片化の条件下再生可能な方法で生成されるため、MS/MS技術は極めて強力な分析ツールを提供し得る。例えば、フィルター処理／断片化の組合せは、妨害物質を除去するために用いられ得て、特に複合試料、例えば生体試料において有用であり得る。
【０１０３】
質量分析計は、典型的に利用者にイオンスキャンを提供する；すなわち、特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的存在量は所与の範囲にわたる（例えば、API 5000についてm/z：5-1250）。分析アッセイの結果、すなわちマススペクトルは、当該技術分野で公知な多くの方法により原試料中の分析種の量と関連し得る。例えば、サンプリングおよび分析パラメーターを慎重に制御すれば、所与のイオンの相対的存在量は、相対的存在量を原分子の絶対量に変換する表と比較し得る。あるいは、分子標準が試料と実行され得て、標準曲線はこれら標準から生じたイオンに基づいて構築される。該標準曲線を用いて、所与のイオンの相対的存在量は、原分子の絶対量に変換され得る。ある特定の好ましい実施態様において、1以上の内部標準は、対象とする分析種の量を算出するための標準曲線を生成するために用いられ得る。該標準曲線を生成および使用する方法は、当該技術分野で周知であり、当業者は、適切な内部標準を選択することができる。例えば、同位体標識カテコールアミンは、内部標準として用いられ得る；ある特定の好ましい実施態様において、d6-エピネフリンおよび／またはd6-ノルエピネフリンおよび／またはd4-ドーパミンは、内部標準として用いられ得る。イオンの量を原分子の量に関連付けるための多くの他の方法が当業者に周知である。
【０１０４】
特に好ましい実施態様において、対象とする分析種は、次のようにMS/MSを用いて試料中定量される。まず、試料中の対象とする分析種の1以上をFMOC-Clまたはそのバリアントの存在下高pHで固相抽出カラムを通してフィルター処理し、それから溶出する。その後、得られた溶出液を液体クロマトグラフィー、好ましくはHPLCに供する。クロマトグラフィーカラムからの流出移動相は、MS/MS分析器の加熱ESIプローブおよびイオン化分析種に入る。イオン、例えばプリカーサーイオンは、機器のオリフィスを通過し、第1の四重極に入る。四重極1および3（Q1およびQ3）は、質量電荷比（m/z）に基づいてイオンの選択（すなわちQ1およびQ3それぞれにおける「プリカーサー」および「断片」イオンの選択）を可能にする質量フィルターである。四重極2（Q2）は、イオンが断片化されるコリジョンセルである。質量分析計（Q1）の第1の四重極は、対象とする分析種の質量電荷比を有する分子を選択する。正しい質量電荷比を有するプリカーサーイオンは、コリジョンチャンバー（Q2）へ入ることが可能であるが、他の質量電荷比を有する望まないイオンは、四重極の側面と衝突し、排除される。Q2に入るプリカーサーイオンは、中性アルゴンガスと衝突し、断片化する。このプロセスは、衝突活性解離（CAD）または衝突誘起解離（CID）と呼ばれる。生じた断片イオンは、断片イオンが選択されるが他のイオンは排除される四重極3（Q3）に入る。1つの試料の分析中、Q1および／またはQ3は、1のカテコールアミンに特異的な1以上のプリカーサーイオン／断片イオンペアの質量電荷比が選択され、続いてその後に第2のカテコールアミンに特異的な1以上のプリカーサーイオン／断片イオンペアの質量電荷比が選択され、適宜、続いてその後に第3のカテコールアミンなどに特異的な1以上のプリカーサーイオン／断片イオンペアの質量電荷比が選択されるように調節され得る。特に好ましい実施態様において、検出の順序は任意の順で生じるが、エピネフリンに特異的なプリカーサー／断片イオンペアの質量電荷比、ノルエピネフリンに特異的なプリカーサー／断片イオンペアの質量電荷比、ドーパミンに特異的なプリカーサー／断片イオンペアの質量電荷比、メタネフリンのプリカーサー／断片イオンペアの質量電荷比、およびノルメタネフリンのプリカーサー／断片イオンペアの質量電荷比は、1つの試料の分析中に検出される。
【０１０５】
当該方法は、ポジティブイオンまたはネガティブイオンモードいずれかにおいて実施されるMS/MSを含み得て、ポジティブイオンモードが好ましい。当該技術分野で周知の標準的な方法を用いて、当業者は、四重極3（Q3）における選択のために用いられ得る、対象とする分析種の特定のプリカーサーイオンの1以上の断片イオンを同定することができる。
【０１０６】
様々な実施態様において、対象とする分析種を検出および定量のために質量分析に供する。質量分析技術は、荷電イオンを発生させるために大気圧化学イオン化（APCI）またはエレクトロスプレーイオン化（ESI）を使用し得る。対象とする分析種は、移動相中にプロトン付加体またはプロトン化分子イオン、すなわち[M+H+]として存在し得る。豊富なアンモニウムイオンが移動相に存在するときは分子イオンとして、または対応するカチオンが移動相に存在するときは他のカチオン付加体として、アンモニウム付加体[M+NH4+]を分析種はまた示し得る。種々の付加体がまた可能であり、当業者により認識され得て、Aが付加体の場合一般的に[M+A+H]+により示される。付加体は、溶媒和されてもされなくてもよい。イオン化プロセス中、分子イオンは気相へ脱離され、その後分析および検出のために質量分析計に集められる。当業者に公知なように、APCIの詳細について米国特許第6,692,971号参照。
【０１０７】
MS分析は、1の質量分析計、例えば1の四重極質量分析計（MS）またはタンデム質量分析計、例えばトリプル四重極タンデム質量分析計（MS/MS）で行われ得る。タンデム質量分析モードにおいて、第1の質量フィルターまたは四重極（Q1）は、対象とする分析種および選択される内部標準の分子イオンの1以上を独立して選択するために調整され得る。分子イオン（プリカーサーイオン）は、断片またはプロダクトイオンを生成するために第2の四重極（Q2）において衝突誘起解離（CID）を受け得る。断片イオンは、Q3における第2の質量フィルターにおいて検出および分析され得る。このプロセスは、プロダクト最適化と称し得る。その後、第2の質量フィルターは、特定の分子イオンから生成される最も豊富なプロダクトイオンの1以上を選択的にモニターするために調整される。この技術は、多重反応モニタリング（MRM）と呼ばれる。
【０１０８】
プリカーサー-プロダクトイオンペアのMRMトランジションが例として次に示されるカテコールアミンについてモニターされ得るように、カテコールアミンのFmoc誘導体の分子イオン[M+NHV]を以下に示す：
【表１】
2017519228.tif 000011
【０１０９】
内部標準、例えば重水素化カテコールアミンは、本明細書に記載の方法に適用され得る。一の実施態様において、ドーパミン-d4を用いる。別の一の実施態様において、エピネフリン-d6を使用する。また別の一の実施態様において、ノルエピネフリン-d6を使用する。MRMトランジションペアを以下に示す：
【表２】
2017519228.tif 000012
【０１１０】
メタネフリンおよびノルメタネフリンのFmoc誘導体の分子イオン[M+NH4+]は、プリカーサー-プロダクトイオンペアのMRMトランジションで例として示される；
【表３】
2017519228.tif 000013
【０１１１】
内部標準、例えば重水素化メタネフリンは、本明細書に記載の方法に適用され得る。一の実施態様において、メタネフリン-d6を用いる。別の一の実施態様において、ノルメタネフリン-d6を使用する。MRMトランジションペアを以下に示す。
【０１１２】
プリカーサー-プロダクトイオンペアのMRMトランジションが例として次に示される甲状腺ホルモンについてモニターされ得るように、甲状腺ホルモンのFmoc誘導体の分子イオン[M+NHV]を以下に示す：
【表４】
2017519228.tif 000014
【０１１３】
プリカーサー-プロダクトイオンペアのMRMトランジションが例として次に示される甲状腺ホルモンについてモニターされ得るように、甲状腺ホルモンのFmoc誘導体の分子イオン[M+H+]を以下に示す：
【表５】
2017519228.tif 000015
【０１１４】
内部標準は、本明細書に記載の方法に適用され得る。一の実施態様において、3,3',5-トリヨード-L-チロニン-13C6（T3-13C6）を用いる。MRMトランジションペアを以下に示す。
【表６】
2017519228.tif 000016
【０１１５】
プリカーサー-プロダクトイオンペアのMRMトランジションが例として次に示されるTHCについてモニターされ得るように、THCのFmoc誘導体の分子イオン[M+NHV]を以下に示す：
【表７】
2017519228.tif 000017
【０１１６】
本明細書に記載の方法は、例えば真度、精度、検出限界（LOD）、定量限界（LOQ）、直線範囲、特異性、選択性、直線性、頑健性およびシステム適合性を含む、いくつかのパラメーターにより評価され得る。方法の真度は、分析法の正確さの指標、または方法の真度は、真値として認証または合意された値と実測値との間の一致性である。方法の精度は、手順が均質な試料の多数回採取に繰り返し適用されたときの試験結果間の一致の程度である。そのため、精度は、1）試験内変動性；2）日内変動性（併行精度）；および3）日間変動性（室内再現精度）；および4）室間変動性（室間再現精度）を評価する。変動係数（CV％）は、実測または理論平均値と比較して表される精度の定量的測度である。方法の検出限界（LOD）は、陰性コントロールまたはブランクと有意に異なるシグナルを生じる分析種の濃度を指し、バックグラウンドと区別し得る分析種の最低濃度を表す。
【０１１７】
定量限界（LOQ）は、許容レベルの真度および精度を有して測定できる試料中の分析種の最低および最高濃度である。定量の下限は、検出法がバックグラウンドから一貫して測定できる最低用量を指す。定量の上限は、シグナルの飽和が生じる前の検出法が一貫して測定できる最高用量である。方法の直線範囲は、定量の下限と上限との間のエリアである。直線範囲は、定量の上限から定量の下限を減じることにより算出される。本明細書で用いる用語「下方の漸近線についてのシグナル対ノイズ比」は、バックグラウンドシグナルで割った検出の下限での方法で検出されるシグナルを指す。本明細書で用いる用語「上方の漸近線についてのシグナル対ノイズ比」は、バックグラウンドシグナルで割った検出の上限での方法で検出されるシグナルを指す。
【０１１８】
本明細書で用いる、体液試料中の分析種の「量」は、一般的に、体液の容量中検出できる分析種の質量を反映する絶対値を指す。しかしながら、量はまた、別の分析種量と比較した相対量を企図する。例えば体液中の分析種の量は、通常存在する分析種のコントロールまたは正常なレベルより多い量であり得る。
【０１１９】
本方法およびキットは、対象とする分析種の定量または検出のために用いられ得る。
【０１２０】
本明細書の態様はまた、以下のように記載され得る：
1. 試験試料中の1以上の分析種の存在を決定するための方法であって、a)試験試料からの1以上の分析種の固相抽出、b)塩基性pH、酸性pHまたは中性pHを有する溶出液での固相抽出からの1以上の分析種の溶出、c)誘導体化剤での1以上の分析種のインサイチュ誘導体化、およびd)液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を用いて1以上の誘導体化分析種を検出することを含む方法。
【０１２１】
2. インサイチュ誘導体化およびLC-MS/MS検出により生体試料中の1以上の分析種の固相抽出（SPE）プロトコルを最適化するための方法。
【０１２２】
3. 1以上の分析種が、1級アミン、2級アミンまたはフェノール性ヒドロキシル基を有する化合物である、実施態様1または実施態様2に記載の方法。
【０１２３】
4. 1以上の分析種が、薬物、ホルモン、シグナル化剤、アミノ酸または農薬である、実施態様1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【０１２４】
5. 1以上の分析種が、カテコールアミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、性ホルモンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、カンナビノイドまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、甲状腺ホルモンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、オピエート、オピオイドまたはその誘導体もしくは代謝物の1つまたはアリールシクロヘキシルアミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つ、アンフェタミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つを含むモノアミン神経伝達物質である、実施態様1〜4のいずれか1つに記載の方法。
【０１２５】
6. カテコールアミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つが、カテコール、ドーパ、ドーパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、3-メトキシチラミン、p-オクトパミン、シネフリン、チラミン、3,4-ジヒドロキシベンジルアミン、3,4-ジヒドロキシマンデル酸、ジヒドロキシフェニルエチレングリコール、DOPAL、DOPAC、ホモバニール酸、ヒドロキシチロスオール、3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール、3-メトキシチラミン（3-MT）、MOPET、ノルメタネフリン、メタネフリンまたはバニリルマンデル酸である、実施態様1〜5のいずれか1つに記載の方法。
【０１２６】
7. モノアミン神経伝達物質が、ヒスタミン、トリプタミン、セロトニンまたはアグマチンである、実施態様5に記載の方法。
【０１２７】
8. 性ホルモンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つが、エストロゲンである、実施態様5に記載の方法。
【０１２８】
9. エストロゲンが、エストロン、エストラジオール、エストリオールまたはエステトロールである、実施態様8に記載の方法。
【０１２９】
10. カンナビノイドまたはその誘導体もしくは代謝物の1つが、カンナビゲロール型（CBG）カンナビノイド、カンナビクロメン型（CBC）カンナビノイド、カンナビジオール型（CBD）カンナビノイド、カンナビノジオール型（CBND）カンナビノイド、テトラヒドロカンナビノール型（THC）カンナビノイド、カンナビノール型（CBN）カンナビノイド、カンナビトリオール型（CBT）カンナビノイド、カンナビエルソイン型（CBE）カンナビノイド、イソカンナビノイド、カンナビシクロール型（CBL）カンナビノイド、カンナビシトラン型（CBT）カンナビノイドまたはカンナビクロマノン型（CBCN）カンナビノイドである、実施態様5に記載の方法。
【０１３０】
11. 甲状腺ホルモンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つが、3,3',5-トリヨードチロニン（T3）、3,3',5'-トリヨードチロニン（rT3）またはチロキシン（T4）である、実施態様5に記載の方法。
【０１３１】
12. オピエート、オピオイド、またはオピエートもしくはオピオイドの誘導体もしくは代謝体が、モルヒネ、オリパビン、モルフィノン、ヒドロモルホンまたはオキシモルホンである、実施態様5に記載の方法。
【０１３２】
13. オピエート、オピオイド、またはオピエートもしくはオピオイドの誘導体もしくは代謝体が、ベンジルイソキノリンアルカロイド、半合成ベンジルイソキノリンアルカロイド誘導体またはオピオイドである、実施態様5に記載の方法。
【０１３３】
14. アリールシクロヘキシルアミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つが、チレタミン、3-メトキセタミン（MXE）、メトキシケタミン、N-エチルノルケタミン（エトケタミン）、アンフェタミン、エフェドリンまたはメタンフェタミンである、実施態様5に記載の方法。
【０１３４】
15. アンフェタミンまたはその誘導体もしくは代謝物の1つが、アンフェタミン（それ自体）、メタンフェタミン、エフェドリン、カチノン、3,4-メチレンジオキシ-/V-メチルアンフェタミン（MDMA、「エクスタシー」）および2,5-ジメトキシ-4-メチルアンフェタミン（DOMまたは「STP」）である、実施態様5に記載の方法。
【０１３５】
16. 固相抽出が、イオン交換カラムまたはカートリッジで実施される、実施態様1または3〜15のいずれか1つに記載の方法。
【０１３６】
17. イオン交換カラムが、カチオン交換カラムである、実施態様16に記載の方法。
【０１３７】
18. カチオン交換カラムが、弱カチオン交換カラムである、実施態様17に記載の方法。
【０１３８】
19. カチオン交換カラムが、強カチオン交換カラムである、実施態様17に記載の方法。
【０１３９】
20. イオン交換カラムが、アニオン交換カラムである、実施態様16に記載の方法。
【０１４０】
21. 固相抽出が、逆相シリカカラムまたはカートリッジで実施される、実施態様1または3〜20のいずれか1つに記載の方法。
【０１４１】
22. 逆相シリカが、アルキル結合（C4、C8、C12またはC18）シリカ、シアノ結合シリカ、フェニル結合シリカまたはビフェニル結合シリカである、実施態様21に記載の方法。
【０１４２】
23. 試料が、生体試料、土壌試料または食料の試料である、実施態様1〜22のいずれか1つに記載の方法。
【０１４３】
24. 生体試料が、血液試料、唾液試料、涙液試料、尿試料または組織試料である、実施態様23に記載の方法。
【０１４４】
25. 血液試料が、全血試料、血漿試料または血清試料である、実施態様24に記載の方法。
【０１４５】
26. 塩基性pHが、約8超のpHである、実施態様1または3〜25のいずれか1つに記載の方法。
【０１４６】
27. 塩基性pHが、約8〜約13の範囲のpHである、実施態様26に記載の方法。
【０１４７】
28. 誘導体化試薬が、式I：
【化９】
2017519228.tif 000018
で示されるアシル化剤である、実施態様1〜27のいずれか1つに記載の方法。
【０１４８】
29. アシル化剤が、塩化アシルまたはハロゲン化アシルである、実施態様28に記載の方法。
【０１４９】
30. 塩化アシルが、式II
【化１０】
2017519228.tif 000019
で示されるFmocクロリドである、実施態様29に記載の方法。
【０１５０】
31. R1、R2、R3およびR4が、各々独立して、H、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルコキシ基である、実施態様30に記載の方法。
【０１５１】
32. FMOC化合物が、式III:
【化１１】
2017519228.tif 000020
で示され、式中、R1およびR2が、各々独立して、H、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルコキシ基である、実施態様31に記載の方法。
【０１５２】
32. Fmocクロリドが、
【化１２】
2017519228.tif 000021
で表される、実施態様31に記載の方法。
【０１５３】
33. 塩化アシルが、式VII：
【化１３】
2017519228.tif 000022
で示されるFmocクロリドである、実施態様29に記載の方法。
【０１５４】
34. R1、R2、R3、R4およびR5が、各々独立してH、ハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖もしくは分岐鎖、環式C1-8アルキルの構成要素、置換ビニル基、直鎖または分岐鎖C1-8アルコキシ基、または環式C1-8アルコキシ基の構成要素である、実施態様33に記載の方法。
【０１５５】
35. 式VIIが、
【化１４】
2017519228.tif 000023
で表され、式中、縮合環系が、5〜7員の置換もしくは非置換縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、適宜ナフタレン、キノロン、イソキノリン、キナゾリン、ベンゾフラン、インドールもしくはベンゾイミダゾール、または4〜8員の縮合環を有する非芳香族性炭素環式もしくはヘテロ環式縮合環系、例えば3,4-ジヒドロ-1H-インデンもしくは3,4-ジヒドロ-2H-クロメンであり、ここで縮合環は、必要に応じてハロゲン原子、適宜フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルコキシ基の1以上で置換され得る、実施態様33に記載の方法。
【０１５６】
36. 式VIIが、
【化１５】
2017519228.tif 000024
である、実施態様33に記載の方法。
【０１５７】
37. アシル化試薬が、
【化１６】
2017519228.tif 000025
で示され、式中、R1、R2、R3、R4およびR5が、各々独立してH、ハロゲン原子、適宜フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖もしくは分岐鎖C1-8アルキル、環式C1-8アルキル、置換ビニル基の構成要素、直鎖もしくは分岐鎖C1-8アルコキシ基、または環式C1-8アルコキシ基の構成要素である、実施態様29に記載の方法。
【０１５８】
39. 式VIIIが、
【化１７】
2017519228.tif 000026
で表され得て、式中、縮合環系が、5〜7員の縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、または4〜8員の縮合環を有する非芳香族性炭素環式もしくはヘテロ環式縮合環系、例えば3,4-ジヒドロ-1H-インデンもしくは3,4,ジヒドロ-2H-クロメンであり得て、ここで縮合環は、必要に応じてハロゲン原子、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルコキシ基の1以上で置換され得る、実施態様37に記載の方法。
【０１５９】
40. 式VIIIが、
【化１８】
2017519228.tif 000027
で示される塩化ベンゾイルである、実施態様37に記載の方法。
【０１６０】
41. アシル化試薬が、式IX:
【化１９】
2017519228.tif 000028
で示され、式中、R1、R2、R3、R4およびR5が、各々独立して、水素、ハロゲン原子、適宜フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルコキシ基である、実施態様29に記載の方法。
【０１６１】
43. 式IX：
【化２０】
2017519228.tif 000029
で示され、式中、縮合環系が、5〜7員の縮合環を有する総炭素環式もしくはヘテロ環式芳香族系、適宜ナフタレン、キノロン、イソキノリン、キナゾリン、ベンゾフラン、インドールもしくはベンゾイミダゾール、または4〜8員の縮合環を有する非芳香族性炭素環式もしくはヘテロ環式縮合環系、適宜3,4-ジヒドロ-1H-インデン、3,4,ジヒドロ-2H-クロメンであり得て、ここで縮合環は、必要に応じてハロゲン原子、適宜フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、シアノ基、アセチレン基、プロピレン基、ビニル基、直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルキル、置換ビニル基、または直鎖、分岐鎖もしくは環式C1-8アルコキシ基の1以上で置換され得る、実施態様41に記載の方法。
【０１６２】
44. Xが、Cl、Br、F、
【化２１】
2017519228.tif 000030
である、実施態様28に記載の方法。
【０１６３】
45. 質量分析が、タンデム質量分析技術を含む、実施態様1〜44のいずれか1つに記載の方法。
【０１６４】
46. 質量分析が、LC-MS/MS技術を含む、実施態様1〜45のいずれか1つに記載の方法。
【０１６５】
47. LC-MS/MS技術が、大気圧化学イオン化（APCI）またはエレクトロスプレーイオン化（ESI）技術を含む、実施態様46に記載の方法。
【０１６６】
48. LC-MS/MS技術が、多重反応モニタリング（MRM）または選択的反応モニタリング（SRM）、ポジティブイオンモードにおけるトリプル四重極質量分析計の使用を含む、実施態様46に記載の方法。
【０１６７】
49. LC-MS/MS技術が、プロダクト最適化のための所望の1以上の分析種のアシル化誘導体の[M+H]+、[M+NH4]+または[M+A+H]+に対応するプリカーサーイオンを選択するために調整されるQ1スキャンを含み、ここでAが、分子付加体、例えばアセトニトリルまたはH2Oである、実施態様48に記載の方法。
【０１６８】
50. 1以上の分析種が、ドーパミン、エピネフリンおよびノルエピネフリンの少なくとも1つであり、1以上の分析種のアシル化誘導体が、トリ-Fmocドーパミン（[M+H]=820または[M+NH4]=837）、トリ-Fmocエピネフリン（[M+H]=850または[M+NH4]=867）およびトリ-Fmocノルエピネフリン（[M+H]=836または[M+NH4]=853）である、実施態様49に記載の方法。
【０１６９】
51. 1以上の分析種が、メタネフリンおよびノルメタネフリンの少なくとも1つであり、1以上の分析種のアシル化誘導体が、ビス-Fmocメタネフリン（[M+H]=642または[M+NH4]=659）およびビス-Fmocノルメタネフリン（[M+H]=628または[M+NH4]=645）である、実施態様49に記載の方法。
【０１７０】
52. 1以上の分析種が、チロキシン（T4）、3,3',5-トリヨードチロイン（T3）および3,3',5'-トリヨードチロニン（rT3）の少なくとも1つであり、1以上の分析種のアシル化誘導体が、ビス-Fmoc T4（[M+H]=1222または[M+NH4]=1239）、ビス-Fmoc T3（[M+H]=1096または[M+NH4]=1113）およびビス-Fmoc rT3（[M+H]=1096または[M+NH4]=1113）である、実施態様49に記載の方法。
【０１７１】
53. 1以上の分析種が、δ-9-テトラヒドロカンナビノール（THC）および11-ノル-9-カルボキシル-d-9-テトラヒドロカンナビノール（9-カルボキシル-THC）の少なくとも1つであり、δ-9-テトラヒドロカンナビノール（THC）のアシル化誘導体が、Fmoc-THC（[M+H]=537または[M+NH4]=554）であり、11-ノル-9-カルボキシル-d-9-テトラヒドロカンナビノール（9-カルボキシル-THC）のアシル化誘導体が、Fmoc-9-カルボキシル-THC（[M+H]=567、[M+NH4]=584）である、実施態様49に記載の方法。
【０１７２】
54. 1以上の分析種の検出が、定性的または定量的である、実施態様1〜53のいずれか1つに記載の方法。
【０１７３】
55. 試料中の1以上の分析種の量を決定するための方法であって、1以上の分析種の少なくとも1つの誘導体化を可能にする条件下で、誘導体化剤を含む溶出緩衝液で固相抽出から1以上の分析種の少なくとも1つを溶出することを含む方法。
【０１７４】
56. 1以上の分析種の量を検出するための固相抽出キットであって、a)固相抽出カラム、およびb)同一または別々の容器中に誘導体化試薬と一緒に高pHを有する溶出液を含むキット。
【０１７５】
57. 誘導体化剤が、アシル化試薬である、実施態様56に記載のキット。
【０１７６】
58. アシル化剤が、塩化アシルまたはハロゲン化アシルである、実施態様57に記載のキット。
【０１７７】
59. 塩化アシルが、FMOC-Clまたはそのバリアントである、実施態様58に記載のキット。
【０１７８】
60. 塩化アシルが、CBZ-Clまたはそのバリアントである、実施態様58に記載のキット。
【０１７９】
61. 固相抽出カラムが、弱カチオン交換カラムである、実施態様56〜60のいずれか1つに記載のキット。
【０１８０】
62. 固相抽出カラムが、強カチオン交換カラムである、実施態様56〜60のいずれか1つに記載のキット。
【０１８１】
63. 固相抽出カラムが、逆相カラムである、実施態様56〜60のいずれか1つに記載のキット。
【０１８２】
64. 固相抽出カラムが、アニオン交換カラムである、実施態様56〜60のいずれか1つに記載のキット。
【実施例】
【０１８３】
以下の限定されない実施例は、開示される主題のより完全な理解を促進するためにのみ例示的目的のため提供される。これらの実施例は、分析種を検出するための方法および開示される方法を実施するのに必要な成分を含むキットに関係するものを含む、本明細書に記載の実施態様のいずれかを限定すると解釈されるべきでない。
【０１８４】
実施例1
血漿中のカテコールアミンの定量
血漿試料を人患者の血液から得た。試料を予冷したVacutainerに引き抜いた（血漿ナトリウムヘパリンおよびEDTA）。Vacutainerを5回転倒させ、遠心分離するまで冷却した。血漿を採取30分以内に冷却した遠心分離機で分離し、続いてすぐにプラスチックバイアル中で-20℃にて凍結させた。血漿を解凍し、固相抽出における使用の前に希釈した。ブランク、キャリブレーション試料および血漿試料に内部標準（例えば、ドーパミン-D4、エピネフリン-D6およびノルエピネフリン-D6）を添加した。既知量のカテコールアミン添加血漿溶液を用いて標準曲線を作成した。添加溶液を段階希釈し、その後同じ血漿試料から取った血漿に加えた。
【０１８５】
CEREX（登録商標）PWCX HP（1cc/10mg）カラム（カタログ番号675-0101R）をメタノール0.5ml、続いて10mMリン酸緩衝液pH6.8 0.5mlで調整した。別の10mMリン酸緩衝液pH6.8 0.5mlをカラムに加えた。その後、10mMリン酸緩衝液0.5mlを試料100μLと混合した。試料／緩衝液混合物を2〜3psiでカラムにロードした。カラムを2〜3psiにて脱イオン水1mlで洗浄し、続いて6psiにてアセトニトリル1mlで洗浄した。
【０１８６】
試料を溶出緩衝液0.5ml；水とアセトニトリルの溶液（H2O：アセトニトリル＝1：3）中の25mM K2CO3溶質中の4％w/v FMoc-Clでカラムから溶出させた。誘導体化反応を室温で12分間進行させた。誘導体化反応を10mMギ酸アンモニウム20μLで停止させた。ギ酸アンモニウム反応物から得られた溶液25μLをLC-MS/MS分析において注入される試料として直接用いた。
【０１８７】
LC-MS/MS分析について、ギ酸アンモニウム反応物から得られた溶液25μLをTARGA（登録商標）C18 3μm粒径 50x2.1mmの分析カラムへ自動的に注入した。2成分のHPLCグラジェントを分析カラムに供して、エピネフリン、ノルエピネフリンおよびドーパミンのFMoc誘導体を試料中に含まれる他の分析種から分離した。移動相Aは、0.1％ギ酸を有する5.0mM ギ酸アンモニウムpH3.0であり、移動相Bは、0.1％ギ酸を有するアセトニトリルである。HPLCグラジェントを35℃で流速500μL/分にて5分以上次のとおり行った：0.01分50％ B、3.0分100％ B、4.0分100％ B、4.5分50％ B、5.0分50％ B。
【０１８８】
Analyst Software Version 1.52（ABI-SCIEX、Toronto、Canada）により制御されるAPI 5000トリプル四重極質量分析計を用いてMS/MSを実施した。移動相からHPLC分析カラムを出る分析種は、MS/MS分析計の加熱したネブライザーインターフェースに流した。溶媒／分析種混合物をインターフェースの加熱したチューブ中で蒸気に変換した。噴霧された溶媒中の分析種を加熱したエレクトロスプレーイオン化源によりイオン化した。
【０１８９】
イオンは第1の四重極（Q1）に送られ、これは分析種の1つから生成された親イオンの質量電荷比を有するイオンを選択した。四重極2（Q2）に入るイオンは、コリジョンガスと衝突してイオン断片を生成し、これは更なる選択のために四重極3（Q3）に送られた。同時に、内部標準、ドーパミン-D4および／またはエピネフリン-D6および／またはノルエピネフリン-D6で、同位体希釈質量分析を用いる同じプロセスを実施した。同じ試料注入からの陽極性でのバリデーション中にエピネフリン、ノルエピネフリンおよびドーパミン（およびそれらの対応する内部標準）の検出および定量のために次の質量トランジションを用いた。
【表８】
2017519228.tif 000031
【０１９０】
誘導化カテコールアミンの構造を次に提供する（アンモニウム付加体）。
【化２２】
2017519228.tif 000032
【化２３】
2017519228.tif 000033
【０１９１】
表2は、1ng/mlカテコールアミン添加血漿試料からのカテコールアミン回収パーセントを表すデータを示す。図1Aおよび1Bは、内部標準相当（図1A）およびカテコールアミン添加血漿（図1B）についてクロマトグラムを示す例示的データを示す。
【表９】
2017519228.tif 000034
【０１９２】
表2により示されるように、FMOC-Cl誘導体化カテコールアミンでの抽出効率は非常に高かった。
【０１９３】
本検出方法の直線性を試験するとき、各対象とするカテコールアミン添加血漿試料の複製を試験した。
【表１０】
2017519228.tif 000035
【表１１】
2017519228.tif 000036
【０１９４】
図2Aおよび2Bは、10および100 pg/mlにおいて得られたデータを表す。しかしながら、2つの各血漿試料を用いてすべての濃度を読み取り、各試料を2回読み取った。表4に要約したデータは、血漿中のドーパミン、エピネフリンおよびノルエピネフリンの定量についての例示的な直線性回帰データを提供する。
【表１２】
2017519228.tif 000037
【０１９５】
実施例2 血漿中のメタネフリンの定量
メタネフリンの方法および実施例のデータ
血漿試料を人患者の血液から得た。試料を予冷したVacutainerに引き抜いた（血漿ナトリウムヘパリンおよびEDTA）。Vacutainerを5回転倒させ、遠心分離するまで冷却した。血漿を採取30分以内に冷却した遠心分離機で分離し、続いてすぐにプラスチックバイアル中で-20℃にて凍結させた。血漿を解凍し、固相抽出における使用の前に希釈した。ブランク、キャリブレーション試料および血漿試料に内部標準を添加した。既知量のメタネフリン添加血漿溶液を用いて標準曲線を作成した。添加溶液を段階希釈し、その後同じ血漿試料から取った血漿に加えた。
【０１９６】
CEREX（登録商標）PWCX、1cc 10mg、96/pk（カタログ番号675-0101R）をメタノール0.5ml、続いて10mMリン酸緩衝液pH6.8 0.5mlで調整した。10mMリン酸緩衝液0.5mlを試料と100μL混合した。別の10mMリン酸緩衝液pH6.8 0.5mlをカラムに加えた。試料／緩衝液混合物を2〜3psiでカラムにロードした。カラムを2〜3psiにて脱イオン水1mlで洗浄し、続いて6psiにてアセトニトリル1mlで洗浄した。試料を溶出緩衝液0.5ml；100mM K2C03：アセトニトリル（50：50）溶液中100mg/ml FMOC-Cl 20μLでカラムから溶出させた。誘導体化反応を室温で12分間進行させた。誘導体化反応を50mM NH4C03H：アセトニトリル（20：80）20μLで停止させた。ギ酸アンモニウム反応物から得られた溶液25μLをLC-MS/MS分析において注入される試料として直接用いた。
【０１９７】
LC-MS/MS分析について、ギ酸アンモニウム反応物から得られた溶液25μLをTARGA（登録商標）C18 3μm粒径 50x2.1mmの分析カラムへ自動的に注入した。2成分のHPLCグラジェントを分析カラムに供して、メタネフリンを試料中に含まれる他の分析種から分離した。移動相Aは、0.1％ギ酸を有する5.0mMギ酸アンモニウムpH3.0であり、移動相Bは、0.1％ギ酸を有するアセトニトリルである。HPLCグラジェントを35℃で流速500μL/分にて5分以上次のとおり行った：0.01分50％ B；3.0分100％ B、4.0分100％ B、4.5分50％ B、5.0分50％ B。
【０１９８】
Analyst Software Version 1.52（ABI-SCIEX、Toronto、Canada）により制御されるAPI 5000トリプル四重極質量分析計を用いてMS/MSを実施した。移動相からHPLC分析カラムを出る分析種は、MS/MS分析計の加熱したネブライザーインターフェースに流した。溶媒／分析種混合物をインターフェースの加熱したチューブ中で蒸気に変換した。噴霧された溶媒中の分析種を加熱したエレクトロスプレーイオン化源によりイオン化した。
【０１９９】
イオンは第1の四重極（Q1）に送られ、これは分析種の1つから生成された親イオンの質量電荷比を有するイオンを選択した。四重極2（Q2）に入るイオンは、アルゴンガスと衝突してイオン断片を生成し、これは更なる選択のために四重極3（Q3）に送られた。分析種の1つを示すイオンの測定後、第2の分析種からの親イオンの質量電荷比を有するイオンが選択されるようにQ1を調節した。これらのイオンをQ2においてアルゴンガスと衝突させ、イオン断片は更なる選択のためにQ3に送られた。同じ試料注入からの陽極性でのバリデーション中にメタネフリンの検出および定量のために次の質量トランジションを用いた。
【表１３】
2017519228.tif 000038
【表１４】
2017519228.tif 000039
【０２００】
また、図6により示されるように、回収パーセントは非常に高かった。図4A〜4Eは、メタネフリンについてのスペクトルを示す。
【０２０１】
実施例3 血漿中の甲状腺ホルモンの定量
甲状腺ホルモン（T3、rT3、T4）の方法および実施例のデータ
試料調製は、試料に甲状腺ホルモンおよび適切な内部標準を添加したことを除き、実施例1のように行った。
【０２０２】
CEREX（登録商標）PSCX 1cc 10mg（カタログ番号687-0101R、96/pk）カラムをメタノール1.0mL、続いて2％ギ酸（水溶液）1.0mLで調整した。2％ギ酸（aq.）中13％アセトニトリル0.5mLを試料200μLと混合した。2％ギ酸中13％アセトニトリル0.5mLをカラムに加えた。試料／緩衝液混合物を2〜3psiでカラムにロードした。カラムを3psiにて50％アセトニトリル（水溶液）1mlで洗浄し、続いて6psiにてアセトニトリル1mlで洗浄した。高圧の窒素気流を用いてカラムを30秒間乾燥した。カラムを3psiにて10mM炭酸カリウムpH11.9 1mlで洗浄した。
【０２０３】
試料を溶出緩衝液0.5ml［100mM炭酸カリウム（aq.、pH11.9）：アセトニトリル］でカラムから溶出させ、アセトニトリル中100mg/ml FMOC-Cl 20μLを溶出後加えた。誘導体化反応を室温で25分間を進行させた。誘導体化反応を50mM NH4CO3H（aq.）：アセトニトリル（20：80）20μLで停止させた。この反応混合物をさらに処理することなく直接用いた。
【化２４】
2017519228.tif 000040
【０２０４】
LC-MS/MS分析について、誘導体化反応混合物の溶液20μLをTARGA（登録商標）C18 3μm粒径 50x2.1mmの分析カラムに注入した。2成分のHPLCグラジェントを分析カラムに供して、甲状腺ホルモンを試料中に含まれる他の分析種から分離した。移動相Aは、20.0mMギ酸アンモニウムpH3.0であり、移動相Bは、0.1％ギ酸を有するアセトニトリルである。HPLCグラジェントを40℃で流速500μL/分にて5分以上次のとおり行った：0.01分60％ B；7.5分85％ B；7.6分95％ B；7.9分95％ B；8.0分60％ B；9.0分60％ B。
【０２０５】
Analyst Software Version 1.52（ABI-SCIEX、Toronto、Canada）により制御されるAPI 5000トリプル四重極質量分析計を用いてMS/MSを実施した。移動相からHPLC分析カラムを出る分析種は、MS/MS分析計の加熱したネブライザーインターフェースに流した。溶媒／分析種混合物をインターフェースの加熱したチューブ中で蒸気に変換した。噴霧された溶媒中の分析種を加熱したエレクトロスプレーイオン化源によりイオン化した。
【０２０６】
イオンは第1の四重極（Q1）に送られ、これは分析種の1つから生成された親イオンの質量電荷比を有するイオンを選択した。四重極2（Q2）に入るイオンは、アルゴンガスと衝突してイオン断片を生成し、これは更なる選択のために四重極3（Q3）に送られた。分析種の1つを示すイオンの測定後、第2の分析種からの親イオンの質量電荷比を有するイオンが選択されるようにQ1を調節した。これらのイオンをQ2においてアルゴンガスと衝突させ、イオン断片は更なる選択のためにQ3に送られた。同じ試料注入からの陽極性でのバリデーション中に甲状腺ホルモンの検出および定量のために次の質量トランジションを用いた。
【表１５】
2017519228.tif 000041
【表１６】
2017519228.tif 000042
【表１７】
2017519228.tif 000043
【０２０７】
図5A〜5Dおよび図6A〜6Cは、甲状腺ホルモンについての例示的スペクトルを提供する。表9は、甲状腺ホルモンの定量についての例示的な直線回帰データを提供する。
【表１８】
2017519228.tif 000044
【０２０８】
実施例4 誘導体化THC
本明細書に記載の方法をまたTHCにおいて実施した。以下のようにSPEカラムからの溶出中にTHCを誘導体化した：
【０２０９】
尿中11-ノル-9-カルボキシ-デルタ-9-テトラヒドロカンナビノールの定量
方法および実施例のデータ
尿の加水分解：尿試料（2mL）を15分間60℃でKOH（aq.、10M、100μL）と混合し、ISを加え、室温に放冷した。2分間2000rpmで遠心分離した。澄明な溶液を次の工程に進めた。
【０２１０】
固相抽出カラム［吸着剤で支持された狭い穴（10BPC - SAX、2.5mg）］をメタノール（0.5mL）および洗浄バッファー（H2O：アセトニトリル：NH40H＝85：15：1、0.5mL）で平衡にした。加水分解された尿試料（前の工程、0.5mL）を加え、窒素圧下で（＜15psi）2分間カラムに通した。続いてカラムを洗浄バッファー（H2O：アセトニトリル：NH4OH＝85：15：1、0.5mL）、メタノール（0.5mL）、酢酸エチルで洗浄し、その後、3分間30psiにて窒素気流下で乾燥した。その後、分析種を溶出緩衝液［ヘキサン：酢酸エチル：酢酸（氷）＝80：18：2、100μL］で溶出し、窒素流下で乾燥した（40℃）。
【０２１１】
再懸濁し、分析種をフルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（ACN中のFMOC-Cl、1.6mg/mL、50μL）で抽出し、ボルテックスし、その後、炭酸カリウム（aq.、100mM、50μL）を加え、ボルテックスした。25分間反応させ、その後、停止バッファー［NH4C03H（aq.、50mM）：アセトニトリル＝1：4、10μL］で停止させた。
【０２１２】
LC-MS/MS分析について、誘導体化反応混合物の溶液20μLをTARGA（登録商標）C18 3μm粒径 50x2.1mmの分析カラムに注入した。2成分のHPLCグラジェントを分析カラムに供して、甲状腺ホルモンを試料中に含まれる他の分析種から分離した。移動相Aは、20.0mMギ酸アンモニウムpH3.0であり、および移動相Bは、0.1％ギ酸を有するアセトニトリルである。HPLCグラジェントを40℃で流速500μL/分にて5分以上次のとおり行った：0.01分40％ B；3.0分90％ B；4.0分90％ B；4.1分40％ B；5.0分40％ B。
【０２１３】
Analyst Software Version 1.52（ABI-SCIEX、Toronto、Canada）により制御されるAPI 5000トリプル四重極質量分析計を用いてMS/MSを実施した。移動相からHPLC分析カラムを出る分析種は、MS/MS分析計の加熱したネブライザーインターフェースに流した。溶媒／分析種混合物をインターフェースの加熱したチューブ中で蒸気に変換した。噴霧された溶媒中の分析種を加熱したエレクトロスプレーイオン化源によりイオン化した。
【０２１４】
イオンは第1の四重極（Q1）に送られ、これは分析種の1つから生成された親イオンの質量電荷比を有するイオンを選択した。四重極2（Q2）に入るイオンは、アルゴンガスと衝突してイオン断片を生成し、これは更なる選択のために四重極3（Q3）に送られた。分析種の1つを示すイオンの測定後、第2の分析種からの親イオンの質量電荷比を有するイオンが選択されるようにQ1を調節した。これらのイオンをQ2においてアルゴンガスと衝突させ、イオン断片は更なる選択のためにQ3に送られた。同じ試料注入からの陽極性でのバリデーション中に甲状腺ホルモンの検出および定量のために次の質量トランジションを用いた。
【化２５】
2017519228.tif 000045
【表１９】
2017519228.tif 000046
【０２１５】
表11は、10〜1,000ng/反応における尿中の11-ノル-9-カルボキシ-デルタ-9-テトラヒドロカンナビノールについての二次直線回帰を示す。図7A〜7Cは、1000pg/ml、100pg/mlおよび10pg/mlにおける例示的直線性データのクロマトグラフを示す。
【表２０】
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【０２１６】
図8A（標準）および8B（抽出された試料）は、分析種の回収のクロマトグラムを示す。このデータをまた表12に反映する。
【表２１】
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【０２１７】
本明細書に示されるデータを考慮すると、当該プロセスが同時に次の利益を提供することは明らかである：短い試料の取り扱い時間、自動化互換性、酸化に対する誘導体化による化学的保護（これは抽出における高い回収をもたらす）；誘導体の高い親油性によるHPLC挙動の改善；および誘導体の高い分子量によるMS/MS感度の大きな改善、10pg/mLのLLOQを有し、すなわち定量感度において10倍超の改善。pHが上昇するに伴いカテコールアミンの安定性が低下し、脱離がアルカリ性媒質で極めて急速になるため、高pHの溶出の点でこれらの利益は予測されない。
【０２１８】
高MS感度の誘導体化の使用は、吸着剤、ローディングバッファー、洗浄液、最終溶出緩衝液の選択を含む固相抽出のプロセス、ならびに各工程のプロセスをスクリーニングし、最適化することを可能にすることも理解される。
【０２１９】
最後に、本明細書の態様は特定の実施態様を参照することにより強調されるが、当業者はこれらの開示された実施態様は本明細書に記載の主題の原理の単なる例示であると容易に認識するだろうことが理解される。したがって、開示される主題は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび／または試薬などに限定されないと理解されたい。そのため、開示される主題の様々な改良、変更または代替配置は、本明細書の精神から逸脱することなく本明細書の教示に従ってなされ得る。最後に、本明細書で用いられる用語は、特定の実施態様のみを記載する目的のためであり、請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。したがって、本発明は、示され記載されたものに厳密に限定されない。
【０２２０】
本発明を実施するために発明者らに公知なベストモードを含む、本発明のある特定の実施態様を本明細書に記載する。当然、これらの記載される実施態様における改変は、先の記載を読むと当業者に明白になるだろう。発明者は、当業者が必要に応じて該改変を使用することを予想し、発明者らは明確に本明細書に記載された以外に本発明が実施されることを企図する。したがって、本発明は、適用法により許容されるように請求の範囲に記載される主題のすべての改良物および均等物を含む。さらに、全ての可能なそれらの改変における上記実施態様の任意の組合せは、本明細書で他に断らないかまたは文脈から明らかに矛盾しない限り包含される。
【０２２１】
本発明の代替実施態様、要素または工程のグループ分けは、限定として解釈されるべきでない。各グループの構成要素は、個々にまたは本名所に記載の他のグループの構成要素との任意の組合せで言及および請求され得る。ことが予想される。グループの1以上の構成要素は、利便性および／または特許性グループに含まれ得るかまたはそれから削除され得る。任意のこのような包含または削除が生じるとき、本明細書は、変更されたグループを含み、それ故に請求の範囲で用いられるすべてのマーカッシュグループの記載を満たすといえる。
【０２２２】
他に断らない限り、明細書および請求の範囲で用いられる特徴、項目、量、パラメーター、プロパティー、用語などを表すすべての数字は、すべての例において用語「約」により修飾されると理解されるべきである。本明細書で用いる用語「約」は、限定された特徴、項目、量、パラメーター、プロパティーまたは用語が、記載された特徴、項目、量、パラメーター、プロパティーまたは用語の値の上下の±10％の範囲を包含することを意味する。したがって、反対するものと特に断らない限り、明細書および請求の範囲において示される数値パラメーターは、変化し得る近似値である。例えば、質量分析計が所与の分析種の質量を決定する際にわずかに変動し得るため、イオン質量またはイオン質量電荷比に関連した用語「約」は、+/-0.50原子質量単位を指す。
【０２２３】
少なくとも、発明の範囲への均等論の適用を制限する試みでなく、各数値表示は、少なくとも報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め技法を適用することによりと解釈されるべきである。
【０２２４】
実施態様または実施態様の態様への言及における用語「得る（ｍay）」または「できる（can）」の使用はまた、「得ない（may not）」または「できない（cannot）」の代替的意味を伴う。そのため、本明細書が実施態様または実施態様の態様が主題の一部として含み得るかまたは含むことができる場合、否定的な限定または排他的な条件はまた、実施態様または実施態様の態様が発明の主題の一部として含まれ得るかまたは含ま得ないことができない。同様の方法で、実施態様または実施態様の態様への言及における用語「適宜」は、このような実施態様または実施態様の態様が発明の主題の一部として含まれ得るかまたは発明の主題の一部として含まれ得ないことを意味する。このような否定的な限定または排他的な条件が適用されるかは、請求される主題に否定的な限定または排他的な条件が記載されているかに基づくだろう。
【０２２５】
本発明の広い範囲を示す数値範囲および値が近似値であるにもかかわらず、特定の例で示される数値範囲および値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、任意の数値範囲および値は、個々の試験測定で見られる標準偏差により必然的に生じる一定のエラーを本質的に含む。本明細書における値の数値範囲の記載は、単に、範囲に入る別々の数値について個々に言及する省略方法として働くことが意図する。本明細書で他に断らない限り、数値範囲の個々の値は、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組込まれる。
【０２２６】
本発明を記載する文脈において（特に請求の範囲の文脈において）用いられる用語「a」、「an」、「the」および同様の指示語は、本明細書で他に断らないかまたは文脈から明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方に及ぶと解される。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で他に断らないかまたは文脈から明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意のおよびすべての例、または例示的用語（例えば、「例えば」）の使用は、単により良く本発明を明らかにすることを意図し、別に請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書における用語は、本発明の実施に不可欠な任意の請求されていない要素を示すと解釈されるべきでない。
【０２２７】
本明細書に記載の特定の実施態様は、用語からなるまたは用語から本質的になるを用いて請求の範囲においてさらに限定され得る。請求の範囲で用いられるとき、出願されたかまたは補正ごとに追加されたときかにかかわらず、移行句「からなる」は、請求の範囲に記載されていない任意の要素、工程または成分を排除する。移行句「から本質的になる」は、特定される材料または工程ならびに基礎的および新規な特徴に実質的に影響しないものに請求の範囲を限定する。そのように請求される本発明の実施態様は、本質的または明示的に本明細書に記載され、可能になる。
【０２２８】
本明細書で引用および特定されたすべての特許、特許公報および他の刊行物は、例えば本発明と関連して用いられ得るだろう該刊行物に記載された方法および方法論を記載および開示する目的のために、出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。これらの刊行物は、本願出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。この点に関して、発明者らが、先の発明によりまたはその他の理由で、該開示よりも先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。これらの文書の内容に関する日付または表記に関するすべての記述は、出願人が利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関していかなる承認も構成しない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【国際調査報告】
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