(57)【要約】クラスター増幅の向上のためのパターン化されたフローセル表面における、一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリーなどの核酸のリコンビナーゼ媒介性増幅の向上のためのリコンビナーゼ、並びにそれを使用する方法及びキットが本明細書で提供される。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％同一のアミノ酸配列を含む組換えＵｖｓＸであって、ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と機能的に同等である位置にアミノ酸置換変異を含む、組換えＵｖｓＸ。
【請求項２】
前記置換変異が、荷電した残基に対する変異を含む、請求項１に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項３】
前記置換変異が塩基性残基に対する変異を含む、請求項１に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項４】
前記置換変異がＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６Ｌｙｓに相同な変異を含む、請求項１に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項５】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＨｉｓ６３と機能的に同等である位置にさらに置換変異を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項６】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な置換変異を含む、請求項５に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項７】
Ｃ末端における１つ又は複数のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端における１つ又は複数のアスパラギン酸残基の付加、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される変異をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項８】
Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、エロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ３２、ビブリオファージｎｔ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３及びＲｂ４９から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項９】
Ｔ２、Ｒｂ１４、エロモナスファージ２５、ｐｈｉ−１、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、ファージＲｂ３及びファージＬＺ２から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項１０】
配列番号２及び２２〜３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、組換えＵｖｓＸ。
【請求項１１】
配列番号３〜５のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む半保存的ドメインに対する置換変異を含む組換えＵｖｓＸであって、前記置換変異が、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ以外の任意の残基に対する位置７における置換から選択される変異を含む、組換えＵｖｓＸ。
【請求項１２】
前記変異が、荷電した残基に対する変異を含む、請求項１１に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項１３】
前記変異がＬｙｓに対する位置７における置換を含む、請求項１１に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項１４】
配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列を含む半保存的ドメインに対する置換変異を含む組換えＵｖｓＸであって、前記置換変異が、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ以外の任意の残基に対する位置１２における置換から選択される変異を含む、組換えＵｖｓＸ。
【請求項１５】
前記変異が、荷電した残基に対する変異を含む、請求項１４に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項１６】
前記変異がＬｙｓに対する位置１２における置換を含む、請求項１４に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項１７】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＨｉｓ６３と機能的に同等である位置に置換変異をさらに含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項１８】
ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な置換変異を含む、請求項１７に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項１９】
Ｃ末端における１つ又は複数のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端における１つ又は複数のアスパラギン酸残基の付加、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される変異をさらに含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項２０】
Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、エロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ３２、ビブリオファージｎｔ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３及びＲｂ４９から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項２１】
Ｔ２、Ｒｂ１４、エロモナスファージ２５、ｐｈｉ−１、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、ファージＲｂ３及びファージＬＺ２から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸ。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸをコードする核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
標的核酸分子を増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、（ａ）請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸを第１及び第２の核酸プライマーと接触させて、第１及び第２の核タンパク質プライマーを形成するステップであり、前記核酸プライマーがその３’末端に一本鎖領域を含む、ステップと、（ｂ）前記第１及び前記第２の核タンパク質プライマーを前記標的核酸分子に接触させ、それによって、前記第１鎖の第１の部分において第１の二本鎖構造を形成し、前記第２鎖の第２の部分において第２の二本鎖構造を形成し、その結果、前記第１の核酸プライマーと前記第２の核酸プライマーの３’末端が同じ二本鎖の鋳型核酸分子上で互いに向かい合うステップと、（ｃ）１種又は複数のポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓを使用して前記第１及び第２の核酸プライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸並びに第１及び第２の核酸置換鎖を生成するステップと、（ｄ）所望の程度の増幅に達するまで（ｂ）及び（ｃ）を繰り返して反応を続けるステップとを含む、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２６】
前記標的核酸分子が二本鎖核酸を含む、請求項２５に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２７】
前記標的核酸分子が一本鎖のアダプター領域を含む、請求項２５に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２８】
リコンビナーゼローディングタンパク質の存在下で行われる、請求項２５に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２９】
前記リコンビナーゼローディングタンパク質が、Ｔ４  ＵｖｓＹ、大腸菌ｒｅｃＯ、大腸菌ｒｅｃＲ及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項２８に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３０】
ｇｐ３２、大腸菌ＳＳＢタンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２タンパク質及びこれらの誘導体から成る群から選択される一本鎖安定化剤の存在下で行われる、請求項２５に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３１】
ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリスチレン、フィコール、デキストラン、ＰＶＰ及びアルブミンを含む群から選択される密集化剤の存在下で行われ、その結果、前記密集化剤が増幅を促進する、請求項２５に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３２】
増幅部位のアレイ上で行われる、請求項２５に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３３】
各増幅部位が、前記標的核酸を増幅するための複数の増幅プライマーを含む、請求項３２に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３４】
増幅部位の前記アレイが、表面にフィーチャーのアレイを含む、請求項３２に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３５】
前記フィーチャーが、不連続であり且つ前記増幅プライマーを欠く前記表面の介在領域によって分離している、請求項３４に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３６】
増幅部位の前記アレイが、溶液中にビーズを含む又は表面上にビーズを含む、請求項３２に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３７】
増幅部位の前記アレイがエマルジョンを含む、請求項３２に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３８】
等温で行われる、請求項２５に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項３９】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換えＵｖｓＸ並びに以下の１つ又は複数：
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、
ＤＮＡポリメラーゼ、
ｄＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓとｄｄＮＴＰｓの混合物、
密集化剤、
緩衝液、
還元剤、
ＡＴＰ又はＡＴＰ類似体、
リコンビナーゼローディングタンパク質、
第１のプライマー及び任意選択で第２のプライマー
を含む、リコンビナーゼポリメラーゼ反応を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
リコンビナーゼ酵素は、リコンビナーゼ媒介性核酸増幅に有用である。例えば、リコンビナーゼ酵素は、ポリメラーゼによるＤＮＡ複製を可能にするＤＮＡ標的へのオリゴヌクレオチドの標的化を促進することができる。特性が向上した改変リコンビナーゼの必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００２】
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、９８Ｋｂのサイズである、２０１４年９月２６日に作成されたＩＰ１２６４．ＴＸＴと題するファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットでの情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
リコンビナーゼ媒介性核酸増幅の向上のためのリコンビナーゼが本明細書で提供される。本発明者らは、驚くべきことに、パターン化されたフローセル表面への核酸シーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）の特徴が実質的に向上した、ある種の改変リコンビナーゼを同定した。ある種の実施形態では、改変リコンビナーゼは、クラスター増幅の向上のために、パターン化されたフローセル表面へのＰＣＲフリーライブラリー、例えば一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリーのシーディングを向上させる。
【０００４】
ある種の実施形態では、リコンビナーゼは組換えＵｖｓＸであり、ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と機能的に同等である位置にアミノ酸置換変異を含む。野生型ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。ある種の実施形態では、組換えＵｖｓＸは、配列番号１と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％同一のアミノ酸を含み、且つＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と機能的に同等である位置にアミノ酸置換変異を含む、アミノ酸配列を含む。ある種の実施形態では、置換変異は荷電した残基に対する変異を含む。ある種の実施形態では、置換変異は塩基性残基に対する変異を含む。ある種の実施形態では、置換変異はＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６Ｌｙｓに相同な変異を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、上記の変異に加えて、組換えＵｖｓＸは、ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＨｉｓ６３と機能的に同等である位置に置換変異をさらに含むことができる。例えば、ある種の実施形態では、組換えＵｖｓＸは、ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な置換変異を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、上記の変異のいずれかに加えて、組換えＵｖｓＸは、Ｃ末端における１つ又は複数のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端における１つ又は複数のアスパラギン酸残基の付加、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される変異をさらに含むことができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、組換えＵｖｓＸは、Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ファージ１３３、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ３２、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ファージｎｔ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３及びＲｂ４９から成る群から選択されるミオウイルス科（ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）のファージに由来する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、組換えＵｖｓＸは、Ｔ２、Ｒｂ１４、エロモナスファージ２５、ｐｈｉ−１、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、ファージＲｂ３及びファージＬＺ２から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する。
【０００９】
配列番号２及び２２〜３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む組換えＵｖｓＸも本明細書で提供される。ある種の実施形態では、組換えＵｖｓＸは、配列番号２及び２２〜３５のうちのいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％同一のアミノ酸を含み、且つＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と機能的に同等である位置にアミノ酸置換変異を含む、アミノ酸配列を含む。
【００１０】
配列番号３〜５のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む半保存的ドメインに対する置換変異を含む組換えＵｖｓＸも本明細書で提供され、ここでは、置換変異は、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ以外の任意の残基に対する位置７における置換から選択される変異を含む。ある種の実施形態では、組換えＵｖｓＸは、配列番号３〜５のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む半保存的ドメインを含むリコンビナーゼに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％同一のアミノ酸を含み、ここでは、組換えＵｖｓＸは、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ以外の任意の残基に対する位置７における置換から選択される置換変異を含む。ある種の実施形態では、変異は荷電した残基に対する変異を含む。ある種の実施形態では、変異は塩基性残基に対する変異を含む。ある種の実施形態では、変異はＬｙｓに対する位置７における置換を含む。
【００１１】
配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列を含む半保存的ドメインに対する置換変異を含む組換えＵｖｓＸも本明細書で提供され、ここでは、置換変異は、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ以外の任意の残基に対する位置１２における置換から選択される変異を含む。ある種の実施形態では、組換えＵｖｓＸは、配列番号６又は７のいずれかのアミノ酸配列を含む半保存的ドメインを含むリコンビナーゼに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％同一のアミノ酸を含み、ここでは、組換えＵｖｓＸは、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ以外の任意の残基に対する位置１２における置換から選択される置換変異を含む。ある種の実施形態では、変異は荷電した残基に対する変異を含む。ある種の実施形態では、変異は塩基性残基に対する変異を含む。ある種の実施形態では、変異はＬｙｓに対する位置１２における置換を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、上記の変異に加えて、組換えＵｖｓＸは、ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＨｉｓ６３と機能的に同等である位置に置換変異をさらに含むことができる。例えば、ある種の実施形態では、組換えＵｖｓＸは、ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な置換変異を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、上記の変異のいずれかに加えて、組換えＵｖｓＸは、Ｃ末端における１つ又は複数のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端における１つ又は複数のアスパラギン酸残基の付加、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される変異をさらに含むことができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、組換えＵｖｓＸは、Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、エロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ３２、ビブリオファージｎｔ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３及びＲｂ４９から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、組換えＵｖｓＸは、Ｔ２、Ｒｂ１４、エロモナスファージ２５、ｐｈｉ−１、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、ファージＲｂ３及びファージＬＺ２から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する。
【００１６】
任意の上記実施形態で定義された組換えＵｖｓＸをコードする核酸分子も本明細書で提供される。上記の核酸分子を含む発現ベクターも本明細書で提供される。上記のベクターを含む宿主細胞も本明細書で提供される。
【００１７】
標的核酸分子を増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、（ａ）上記実施形態のいずれかの組換えＵｖｓＸを第１及び第２の核酸プライマーと接触させて、第１及び第２の核タンパク質プライマーを形成するステップであり、上記核酸プライマーがその３’末端に一本鎖領域を含む、ステップと、（ｂ）第１及び第２の核タンパク質プライマーを上記標的核酸分子に接触させ、それによって、上記第１鎖の第１の部分において第１の二本鎖構造を形成し、上記第２鎖の第２の部分において第２の二本鎖構造を形成し、その結果、上記第１の核酸プライマーと上記第２の核酸プライマーの３’末端が同じ二本鎖の鋳型核酸分子上で互いに向かい合うステップと、（ｃ）１種又は複数のポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓを使用して上記第１及び第２の核酸プライマーの３’末端を伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸並びに第１及び第２の核酸置換鎖を生成するステップと、（ｄ）所望の程度の増幅に達するまで（ｂ）及び（ｃ）を繰り返して反応を続けるステップとを含む、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法も本明細書で提供される。
【００１８】
方法のある種の実施形態では、標的核酸分子は二本鎖核酸を含む。ある種の実施形態では、標的核酸分子は一本鎖核酸を含む。例えば、いくつかの実施形態では、標的核酸は一本鎖のアダプター領域を含む。ある種の実施形態では、方法は、リコンビナーゼローディングタンパク質の存在下で行われる。例えば、リコンビナーゼローディングタンパク質は、Ｔ４  ＵｖｓＹ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｅｃＯ、大腸菌ｒｅｃＲ及びこれらの組み合わせから成る群から選択され得る。ある種の実施形態では、方法は、ｇｐ３２、大腸菌ＳＳＢタンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２タンパク質及びこれらの誘導体から成る群から選択される一本鎖安定化剤の存在下で行われる。ある種の実施形態では、方法は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリスチレン、フィコール、デキストラン、ＰＶＰ及びアルブミンを含む群から選択される密集化剤の存在下で行われ、その結果、密集化剤が増幅を促進する。
【００１９】
ある種の実施形態では、方法は増幅部位のアレイ上で行われる。ある種の実施形態では、各増幅部位は、標的核酸を増幅するための複数の増幅プライマーを含む。ある種の実施形態では、増幅部位のアレイは表面にフィーチャーのアレイを含む。例えば、フィーチャーは不連続でもよく、増幅プライマーを欠く表面の介在領域によって分離していてもよい。ある種の実施形態では、増幅部位のアレイは溶液中にビーズを含む又は表面上にビーズを含む。ある種の実施形態では、増幅部位のアレイはエマルジョンを含む。ある種の実施形態では、方法は等温で行われる。
【００２０】
リコンビナーゼポリメラーゼ反応を行うためのキットも本明細書で提供される。ある種の実施形態では、キットは、任意の上記実施形態で定義された組換えＵｖｓＸ並びに以下の１つ又は複数（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質；ＤＮＡポリメラーゼ；ｄＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓとｄｄＮＴＰｓの混合物；密集化剤；緩衝液；還元剤；ＡＴＰ又はＡＴＰ類似体；リコンビナーゼローディングタンパク質；第１のプライマー及び任意選択で第２のプライマー）を含むことができる。
【００２１】
１つ又は複数の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載される。他の特色、目的及び利点は、説明及び図面並びに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】米国特許出願公開第２００９／００２９４２１に組み込まれている資料においても示されている、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）ファージＴ４（Ｔ４）（配列番号８）、腸内細菌ファージＴ６（Ｔ６）（配列番号９）、アシネトバクターファージ１３３（ファージ１３３）（配列番号１０）、腸内細菌ファージＲＢ６９（Ｒｂ６９）（配列番号１１）、エロモナスファージＡｅｈ１（Ａｅｈ１）（配列番号１２）、エロモナスファージ６５（Ａｅ６５）（配列番号１３）、ビブリオファージＫＶＰ４０（Ｋｖｐ４０）（配列番号１４）、腸内細菌ファージＲＢ４３（Ｒｂ４３）（配列番号１５）、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＰ−ＳＳＭ２（ＰＳＳＭ２）（配列番号１６）及びプロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ４（ＰＳＳＭ４）（配列番号１７）由来のＵｖｓＸのアミノ酸配列のアライメントを示す概略図である。ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と位置的及び／又は機能的に同等である残基を強調し、三角形の記号で示した。
【図１Ｂ】米国特許出願公開第２００９／００２９４２１に組み込まれている資料においても示されている、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）ファージＴ４（Ｔ４）（配列番号８）、腸内細菌ファージＴ６（Ｔ６）（配列番号９）、アシネトバクターファージ１３３（ファージ１３３）（配列番号１０）、腸内細菌ファージＲＢ６９（Ｒｂ６９）（配列番号１１）、エロモナスファージＡｅｈ１（Ａｅｈ１）（配列番号１２）、エロモナスファージ６５（Ａｅ６５）（配列番号１３）、ビブリオファージＫＶＰ４０（Ｋｖｐ４０）（配列番号１４）、腸内細菌ファージＲＢ４３（Ｒｂ４３）（配列番号１５）、プロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＰ−ＳＳＭ２（ＰＳＳＭ２）（配列番号１６）及びプロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ４（ＰＳＳＭ４）（配列番号１７）由来のＵｖｓＸのアミノ酸配列のアライメントを示す概略図である。ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と位置的及び／又は機能的に同等である残基を強調し、三角形の記号で示した。
【図２】腸内細菌ファージＲＢ４９（ＲＢ４９）（配列番号１）及び腸内細菌ファージＴ４（Ｔ４）（配列番号８）由来のＵｖｓＸのアミノ酸配列のアライメントを示す概略図である。ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と位置的及び／又は機能的に同等である残基を強調し、三角形の記号で示した。
【図３Ａ】Ｔ４  ＵｖｓＸ配合物を使用して、パターン化されたフローセルにシーディングされたＰＣＲフリーライブラリーのクラスター画像のスクリーンショットを示す図である。
【図３Ｂ】ＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋリコンビナーゼを含む液体配合物を使用して、パターン化されたフローセルにシーディングされたＰＣＲフリーライブラリーのクラスター画像のスクリーンショットを示す図である。
【図４Ａ】Ｔ４  ＵｖｓＸ配合物を使用して、パターン化されたフローセルにシーディングされた一本鎖（ｓｓＤＮＡ）のＰＣＲフリーライブラリーのクラスター画像のスクリーンショットを示す図である。
【図４Ｂ】ＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋリコンビナーゼを含む液体配合物を使用して、パターン化されたフローセルにシーディングされた一本鎖のＰＣＲフリーライブラリーのクラスター画像のスクリーンショットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
リコンビナーゼ媒介性核酸増幅の向上のためのリコンビナーゼが本明細書で提供される。本発明者らは、驚くべきことに、パターン化されたフローセル表面への核酸シーディングの特徴が実質的に向上した、ある種の改変リコンビナーゼを同定した。
【００２４】
以下でより詳細に記載されているように、本発明者らは、驚くべきことに、リコンビナーゼの１つ又は複数の残基への１つ又は複数の変異が、パターン化されたフローセル表面へのＤＮＡライブラリー、例えば一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリーなどのシーディングを非常に大きく向上させ、これがクラスター増幅を向上させることを発見した。
【００２５】
ある種の実施形態では、置換変異は、荷電した側鎖を有する残基に対する変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、荷電したアミノ酸は正に荷電したアミノ酸残基である。用語「正に荷電したアミノ酸」は、側鎖のｐＫａ値が７を超える親水性アミノ酸、すなわち、塩基性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、ヒドロニウムイオンとの結合の結果、生理的ｐＨで正電荷の側鎖を典型的には有する。天然に存在する（遺伝的にコードされる）塩基性アミノ酸としては、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が挙げられ、一方で、非天然（遺伝的にコードされていない又は非標準的）塩基性アミノ酸としては、例えば、オルニチン、２，３，−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、２，５，６−トリアミノヘキサン酸、２−アミノ−４−グアニジノブタン酸及びホモアルギニンが挙げられる。用語「負に荷電したアミノ酸」は、キラリティーにかかわらず、Ｃ末端のカルボキシル基に加えて、少なくとも１つのさらなる負に荷電した基、例えば、カルボキシル基、リン酸基、ホスホネート基、スルホネート基などを含む、天然又は非天然のアミノ酸を指す。
【００２６】
組換えＵｖｓＸの半保存的ドメインに対する置換変異を含む組換えＵｖｓＸも本明細書で提供される。本明細書で使用する場合、用語「半保存的ドメイン」は、様々な種の間で完全に保存されている又は少なくとも部分的に保存されている、組換えＵｖｓＸの一部を指す。驚くべきことに、半保存的ドメイン中の１つ又は複数の残基の変異が、特に一本鎖の鋳型核酸の存在下で、リコンビナーゼ活性に影響を及ぼし、その結果、リコンビナーゼ媒介性増幅反応のシーディング及び／又は増幅を増強することが発見された。以下の実施例の項目に記載されているように、こうした変異リコンビナーゼは、パターン化されたフローセル表面へのＰＣＲフリーライブラリー、例えば一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリーのシーディングの性能が向上しており、その結果、クラスター増幅を向上させる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、半保存的ドメインは、配列番号３〜７のうちのいずれかに示される配列を有するアミノ酸を有する。配列番号３〜７は、様々な種の間で半保存的なドメイン中の残基に対応する。配列番号３は、配列番号８として本明細書に示されるＴ４  ＵｖｓＸのアミノ酸配列の残基２５１〜２５８に対応する。半保存的ドメインにおける様々な種の間での保存を示すアライメントは、図１Ａ、図１Ｂ及び図２に示される。図１Ａ及び図１Ｂに示されるＵｖｓＸの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの受託番号ＮＰ＿０４９６５６（Ｔ４）、ＹＰ＿００４３００６４７（ファージ１３３）；ＮＰ＿８６１７３４（ＲＢ６９）；ＮＰ＿９４３８９４．１（Ａｅｈ１）；ＹＰ＿００４３００８５８（Ａｅ６５）；ＮＰ＿８９９２５６（ＫＶＰ４０）；ＹＰ＿２３９０１３（ＲＢ４３）；ＹＰ＿２１４４１７（Ｐ−ＳＳＭ２）；ＹＰ＿２１４７０８（Ｐ−ＳＳＭ４）から、及び米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号（Ｔ６）から得た。図２は、腸内細菌ファージＲＢ４９（ＲＢ４９）（配列番号１）及び腸内細菌ファージＴ４（Ｔ４）（配列番号８）由来のＵｖｓＸのアミノ酸配列のアライメントを示す概略図である。ＲＢ４９のＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と位置的及び／又は機能的に同等である残基を強調し、三角形で示した。図２に示されるＵｖｓＸの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの受託番号ＮＰ＿８９１５９５（ＲＢ４９）及びＮＰ＿０４９６５６（Ｔ４）から得た。
【００２８】
驚くべきことに、半保存的ドメイン中の１つ又は複数の残基に対する変異が、特に一本鎖の鋳型核酸の存在下で、リコンビナーゼ活性を増大し、その結果、リコンビナーゼ媒介性増幅反応のシーディング及び／又は増幅を増強することが発見された。以下の実施例の項目に記載されているように、こうした変異リコンビナーゼは、パターン化されたフローセル表面へのＰＣＲフリーライブラリー、例えば一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリーのシーディングの性能が向上しており、その結果、クラスター増幅を向上させる。例えば、本明細書で提供する組換えＵｖｓＸのいくつかの実施形態では、置換変異は、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ以外の任意の残基に対する、配列番号３〜５のうちのいずれかの位置７における変異を含む。ある種の実施形態では、組換えＵｖｓＸは、Ｌｙｓに対する、配列番号３〜５のうちのいずれかの位置７における変異を含む。本明細書で提供する組換えＵｖｓＸのいくつかの実施形態では、置換変異は、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ以外の任意の残基に対する、配列番号６又は７のいずれかの位置１２における変異を含む。ある種の実施形態では、組換えＵｖｓＸは、Ｌｙｓに対する、配列番号６又は７のいずれかの位置１２における変異を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、リコンビナーゼはＵｖｓＸタンパク質である。例えば、ミオウイルス科のファージに由来するＵｖｓＸ又はＵｖｓＸ様リコンビナーゼなどのファージリコンビナーゼ、例えば、Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、エロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ３２、ビブリオファージｎｔ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３及びＲｂ４９などを含めた任意のファージリコンビナーゼを、本明細書で提供する実施形態で使用することができる。ある種の実施形態では、リコンビナーゼは、ミオウイルス科のファージに由来するＵｖｓＸ又はＵｖｓＸ様リコンビナーゼ、例えば、Ｔ２、Ｒｂ１４、エロモナスファージ２５、ｐｈｉ−１、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、ファージＲｂ３及びファージＬＺ２などである。他のリコンビナーゼタンパク質を本明細書で提供する実施形態で使用することができることが、当業者には容易に明らかになる。適切なリコンビナーゼタンパク質は、以下でより詳細に説明されるように、当技術分野で知られている多くの方法のいくつか、例えばＢＬＡＳＴアライメンなどを使用して、ＵｖｓＸに対する相同性によって特定することができる。
【００３０】
「機能的に同等」は、全く異なるリコンビナーゼを使用する研究の場合には、コントロールのリコンビナーゼが、酵素において同じ機能的役割を有する他のリコンビナーゼのアミノ酸位置で生じると考えられるアミノ酸置換を含むことを意味する。一例を挙げると、Ｔ４  ＵｖｓＸにおけるフェニルアラニンからリジンへの位置２５７での変異（Ｆ２５７Ｋ）は、ＲＢ４９  ＵｖｓＸにおけるプロリンからリジンへの位置２５６での置換（Ｐ２５６Ｋ）と機能的に同等であると考えられる。
【００３１】
一般に、２つ以上の異なるリコンビナーゼにおける機能的に同等な置換変異は、リコンビナーゼのアミノ酸配列中の相同なアミノ酸位置で生じる。したがって、用語「機能的に同等」の本明細書での使用は、変異アミノ酸の特定の機能が知られているかどうかにかかわらず、所与の変異と「位置的に同等」又は「相同」である変異も包含する。配列アラインメント及び／又は分子モデリングに基づいて、２つ以上の異なるリコンビナーゼのアミノ酸配列の位置的に同等又は相同なアミノ酸残基を同定することが可能である。位置的に同等及び／又は機能的に同等な残基を同定するための配列アラインメントの例は図１Ａ及び図１Ｂに示されており、これは、米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号に組み込まれている資料においても示されている、腸内細菌ファージＴ４（Ｔ４）（配列番号８）、腸内細菌ファージＴ６（Ｔ６）（配列番号９）、アシネトバクターファージ１３３（ファージ１３３）（配列番号１０）、腸内細菌ファージＲＢ６９（Ｒｂ６９）（配列番号１１）、エロモナスファージＡｅｈ１（Ａｅｈ１）（配列番号１２）、エロモナスファージ６５（Ａｅ６５）（配列番号１３）、ビブリオファージＫＶＰ４０（Ｋｖｐ４０）（配列番号１４）、腸内細菌ファージＲＢ４３（Ｒｂ４３）（配列番号１５）、プロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ２（ＰＳＳＭ２）（配列番号１６）及びプロクロロコッカスファージＰ−ＳＳＭ４（ＰＳＳＭ４）（配列番号１７）由来のＵｖｓＸのアミノ酸配列のアライメントを示す。図１Ａ及び図１Ｂに示されるＵｖｓＸ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの受託番号ＮＰ＿０４９６５６（Ｔ４）、ＹＰ＿００４３００６４７（ファージ１３３）；ＮＰ＿８６１７３４（ＲＢ６９）；ＮＰ＿９４３８９４．１（Ａｅｈ１）；ＹＰ＿００４３００８５８（Ａｅ６５）；ＮＰ＿８９９２５６（ＫＶＰ４０）；ＹＰ＿２３９０１３（ＲＢ４３）；ＹＰ＿２１４４１７（Ｐ−ＳＳＭ２）；ＹＰ＿２１４７０８（Ｐ−ＳＳＭ４）から、及び米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号（Ｔ６）から得た。
【００３２】
図２は、腸内細菌ファージＲＢ４９（ＲＢ４９）（配列番号１）及び腸内細菌ファージＴ４（Ｔ４）（配列番号８）由来のＵｖｓＸのアミノ酸配列のアライメントを示す概略図である。ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と位置的及び／又は機能的に同等である残基を強調し、三角形で示した。図２に示されるＵｖｓＸの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの受託番号ＮＰ＿８９１５９５（ＲＢ４９）及びＮＰ＿０４９６５６（Ｔ４）から得た。
【００３３】
位置的に同等及び／又は機能的に同等な残基は、多くの他のＵｖｓＸ配列の１つ又は複数について、それらの配列をＴ４及びＲＢ４９などの参照配列と整列させることによって決定することができる。非限定例として、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＳ−ＰＭ２、腸内細菌ファージＲＢ３２、ビブリオファージｎｔ−１、腸内細菌ファージＲＢ１６のＵｖｓＸ配列は、配列番号１８〜２１として示され、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの受託番号ＹＰ＿１９５１６９．１、ＹＰ＿８０２９８２．１、ＹＰ＿００８１２５２０７．１、ＹＰ＿００３８５８３３６．１から得られ、例えばＴ４  ＵｖｓＸ（配列番号８）及びＲＢ４９  ＵｖｓＸ（配列番号１）などの参照ＵｖｓＸ配列と整列させることができ、位置的に同等及び／又は機能的に同等な残基が特定される。例として、以下の表に示す残基が、ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＰｒｏ２５６と位置的に同等及び／又は機能的に同等であるとして同定される。同様のアプローチに従って、他のＵｖｓＸ  タンパク質に関する位置的に同等及び／又は機能的に同等な位置を確かめることができることを当業者ならば容易に認識する。
【表１】
2017529093.tif 000003
【００３４】
上記の組換えＵｖｓＸタンパク質は、リコンビナーゼの活性、安定性又は任意の他の望ましい特性の１つ又は複数の態様を増強することが知られているさらなる置換変異を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＵｖｓＸは、上記の変異のいずれかに加えて、当該技術分野で知られており且つその全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号の開示によって例示されているような、ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列の機能的に同等な位置Ｈｉｓ６３に置換変異をさらに含むことができる。例えば、ある種の実施形態では、組換えＵｖｓＸは、ＲＢ４９  ＵｖｓＸのアミノ酸配列のＨｉｓ６３Ｓｅｒと相同な置換変異を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、上記の変異のいずれかに加えて、組換えＵｖｓＸは、野生型リコンビナーゼと比べて、さらなる置換、欠失及び／又は付加変異を含むことができる。当該技術分野で知られており且つ２００９／００２９４２１に組み込まれている資料において例示されているような、１つ又は複数の位置での様々な置換変異のうちのいずれかを作製することができる。例えば、いくつかの実施形態では、上記の変異に加えて、組換えＵｖｓＸは、Ｃ末端における１つ又は複数のグルタミン酸残基の付加、Ｃ末端における１つ又は複数のアスパラギン酸残基の付加、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される変異をさらに含むことができる。
【００３６】
リコンビナーの変異体化
例えば、リコンビナーゼモデル及びモデル予測に従って、又はランダム若しくは半ランダムな変異アプローチを使用して、例えば、リコンビナーゼを改変して変異株を生成するために、任意選択で、様々な種類の変異誘発が本開示で使用される。一般に、リコンビナーゼ変異体を作製するために、利用可能な任意の変異誘発方法を使用することができる。そのような変異誘発方法は、任意選択で、目的の１種又は複数の活性（例えば、増強されたシーディング及び／又は固体支持体上での増幅）について変異体核酸及びポリペプチドを選択すること含む。使用することができる方法としては、限定されないが、部位特異的点変異誘発、ランダム点変異誘発、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え（ＤＮＡシャッフリング及びコンビナトリアルオーバーラップＰＣＲ）、ウラシル含有鋳型を使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップを有する二本鎖ＤＮＡを使用する変異誘発、点ミスマッチ修復、修復欠損性宿主系統を使用する変異誘発、制限選択及び制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、縮重ＰＣＲ、二本鎖切断修復並びに当業者に知られている多くの他のものが挙げられる。変異のための出発リコンビナーゼは、例えばその全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００２９４２１号で特定されたものなどの利用可能なリコンビナーゼ変異体を含めた、本明細書で言及されるもののうちのいずれかでもよい。
【００３７】
任意選択で、変異誘発は、天然に存在するリコンビナーゼ分子からの既知の情報又は既知の改変若しくは変異リコンビナーゼ（例えば、先の参考文献で言及されている既存の変異型リコンビナーゼを使用する）の既知の情報、例えば、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造及び／又は上記のものなどに導かれ得る。しかし、別の部類の実施形態では、改変は、本質的にランダムであり得る（例えば、古典的ＤＮＡシャッフリング又は「ファミリー」ＤＮＡシャッフリングと同様。例えば、Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）”ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８〜２９１を参照されたい）。
【００３８】
変異型式に関するさらなる情報は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０００（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（２０１１年まで増補）（“Ａｕｓｕｂｅｌ”））及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）（“Ｉｎｎｉｓ”）に見出される。以下の刊行物及びその中で引用されている参考文献は、変異型式に関するさらなる詳細を提供する：Ａｒｎｏｌｄ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０〜４５５（１９９３）；Ｂａｓｓら、Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０〜２４５（１９８８）；Ｂｏｒｄｏ及びＡｒｇｏｓ（１９９１）Ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  “Ｓａｆｅ”Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ２１７：７２１〜７２９；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ＆Ｓｈｏｒｔｌｅ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３〜１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１〜４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１〜７（１９８６）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２〜４０３（１９８７）；Ｄａｌｅら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９〜３７４（１９９６）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｆｒｉｔｚら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ��−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７〜６９９９（１９８８）；Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ‘ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５〜３３１６（１９８５）；Ｈａｙｅｓ（２００２）Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ＰＮＡＳ  ９９（２５）１５９２６〜１５９３１；Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｆ．及びＬｉｌｌｅｙ、Ｄ．Ｍ．Ｊ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ））（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ、Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８〜４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７〜３８２（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１〜９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ＆Ｆｒｉｔｚ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０〜３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ、Ｃｅｌｌ  ３８：８７９〜８８７（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｌｉｎｇら、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７〜１７８（１９９７）；Ｌｏｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３、３０６７〜８（１９９５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃ���ｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７１７７〜７１８１（１９８６）；Ｎａｋａｍａｙｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９〜９６９８（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒら、Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９〜１３０１（１９８４）；Ｓａｋａｍａｒ及びＫｈｏｒａｎａ、Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１〜６３７２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｙ−Ｔ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１〜８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３〜８１４；Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９：４５６〜４６０（２００１）；Ｓｍｉｔｈ、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３〜４６２（１９８５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８〜５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９〜３５０（１９８７）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０、３８９〜９１（１９９４）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９〜８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５〜８７８７（１９８５）；Ｗｅｌｌｓら、Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５〜４２３（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら、Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５〜３２３（１９８５）；Ｚｏｌｌｅｒ＆Ｓｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ＆Ｓｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８〜５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ＆Ｓｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９〜３５０（１９８７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）“Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８；Ｇｉｂｂｓら（２００１）“Ｄｅｇｅｎｅ
ｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ（ＤＯＧＳ）：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”Ｇｅｎｅ  ２７１：１３〜２０；並びにＨｉｒａｇａ及びＡｒｎｏｌｄ（２００３）”Ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３０：２８７〜２９６。上記の方法の多くに関するさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５４巻に見出すことができ、これは、様々な変異誘発方法にともなうトラブルシューティング問題についての有用なコントロールも記載している。
【００３９】
組換えリコンビナーゼの作製及び単離
一般に、本明細書で提供するリコンビナーゼをコードする核酸は、クローニング、組換え、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅及び／又は他の利用可能な方法によって作製することができる。本明細書で提供するリコンビナーゼをコードする発現ベクターを発現させるために、様々な組換え方法を使用することができる。組換え核酸の作製、発現及び発現産物の単離のための方法は本技術分野でよく知られており、説明されている。いくつかの例示的な変異及び変異の組み合わせ並びに望ましい変異を設計するためのストラテジーが、本明細書に記載される。
【００４０】
変異、組換え及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの核酸操作方法（クローニング、発現、ＰＣＲなどを含める）についてのさらなる有用な参考文献としては、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５２巻Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｋａｕｆｍａｎら（２００３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｅｓｋｅ（編）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（Ｋａｕｆｍａｎ）；及びＴｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｒａｌｐｈ  Ｒａｐｌｅｙ（編）（２０００）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ（Ｒａｐｌｅｙ）；Ｃｈｅｎら（編）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１９２巻）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；及びＶｉｌｊｏｅｎら（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＩＳＢＮ１４０２０３４０３２が挙げられる。
【００４１】
さらに、プラスミド又は他の関連する核酸を細胞から精製するための大量のキットが市販されている（例えば、両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈのイージープレップ（ＥａｓｙＰｒｅｐ）（商標）、フレキシプレップ（ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ）（商標）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのスタラタクリーン（ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ）（商標）；及びＱｉａｇｅｎのキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）（商標）を参照されたい）。任意の単離核酸及び／又は精製核酸は、他の核酸を生成するためにさらに処理すること、細胞にトランスフェクトするのに使用すること、発現させるために生物体を感染させるための関連したベクターに組み込むことなどができる。典型的なクローニングベクターは、転写ターミネーター及び翻訳ターミネーター、転写開始配列及び翻訳開始配列並びに特定の標的核酸の発現を調節するのに有用なプロモーターを含む。ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物又は原核生物又は両方でカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）及び原核生物系及び真核生物系の両方に対する選抜マーカーを含む一般的な発現カセットを任意選択で含む。ベクターは、原核生物、真核生物又は両方における複製及び組み込みに適する。
【００４２】
例えば、（例えばその後の核酸単離用の）細胞の単離及び培養についての他の有用な参考文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びこれに引用されている参考文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）並びにＡｔｌａｓ及びＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａが挙げられる。
【００４３】
本明細書に開示される組換えリコンビナーゼをコードする核酸は、本明細書で提供される実施形態の特色でもある。特定のアミノ酸は複数のコドンにコードされ得、ある種の翻訳システム（例えば、原核細胞又は真核細胞）はコドンバイアスを示すことが多く、例えば、異なる生物体は同じアミノ酸をコードするいくつかの同義コドンのうちの１つを好むことが多い。したがって、本明細書で提供される核酸は、任意選択で「コドン最適化」され、これは、リコンビナーゼを発現させるために用いられる特定の翻訳システムに好まれるコドンを含むように核酸が合成されることを意味する。例えば、細菌細胞（又はさらに細菌特定の系統）でリコンビナーゼを発現させることが望ましい場合は、リコンビナーゼの効率的な発現のために、細菌細胞のゲノムで最も多く見られるコドンを含むように核酸を合成することができる。真核細胞でリコンビナーゼを発現させることが望ましい場合も同様のストラテジーを用いることができ、例えば、核酸は真核細胞に好まれるコドンを含むことができる。
【００４４】
様々なタンパク質単離及び検出方法が知られており、例えば本明細書で提供される組換えリコンビナーゼを発現する細胞の組換え培養物からリコンビナーゼを単離するのに使用することができる。様々なタンパク質単離法及び検出方法が当技術分野でよく知られており、例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ、Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ第３版Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；並びにＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ；並びにこれらで引用されている参考文献に示されるものなどが挙げられる。タンパク質の精製及び検出方法に関するさらなる詳細は、Ｓａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）に見出すことができる。
【００４５】
使用方法
本明細書で提供される改変リコンビナーゼは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）技法などのリコンビナーゼ媒介性増幅方法で使用することができる。簡潔に言えば、標的核酸をリコンビナーゼ及び標的核酸分子に対して特異的な一本鎖核酸プライマーに接触させることによって、ＲＰＡが開始され得る。次いで、ポリメラーゼ、例えばｄＮＴＰｓの存在下で鎖置換ができるポリメラーゼによって、ハイブリダイズしたプライマーが伸長され、二本鎖標的核酸分子及び核酸分子の置換鎖が生成され得る。核酸分子の置換鎖に対するプライマーのリコンビナーゼ媒介性標的化及びプライマーの伸長によって、二本鎖核酸分子を生成することにより、さらなる増幅が起こり得る。ＲＰＡ方法は、例えば、リコンビナーゼローディング因子、特定の鎖置換ポリメラーゼ及び頑強なエネルギー再生システムとの上記の成分の組み合わせによって、調整され得る。本開示の組換えＵｖｓＸタンパク質を用いる使用に容易に適合させることができる例示的なＲＰＡの方法、システム及び成分は、例えば、米国特許第８，０７１，３０８号、第７，３９９，５９０号、第７，４８５，４２８号、第７，２７０，９８１号、第８，０３０，０００号、第７，６６６，５９８号、第７，７６３，４２７号、第８，０１７，３９９号、第８，０６２，８５０号及び第７，４３５，５６１号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、排除増幅（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＥｘＡｍｐ）とも呼ばれるキネティック排除増幅（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＫＥＡ）を使用して、等温増幅を実施することができる。本開示の核酸ライブラリーは、キネティック排除を活用する方法して作製することができる。キネティック排除は、プロセスが、別の事象又はプロセスが起こるのを効果的に排除するのに十分なほど速い速度で起こる場合に起こり得る。核酸アレイの作製を例に挙げると、アレイの部位が溶液からの標的核酸でランダムにシーディングされる場合、増幅プロセスで標的核酸のコピーが生成されて、各シーディング部位をいっぱいに満たす。本開示のキネティック排除方法によれば、シーディング及び増幅プロセスは、増幅速度がシーディング速度を超える条件下で同時に進行し得る。したがって、第１の標的核酸がシーディングされた部位でコピーが作製される比較的速い速度によって、第２の核酸が増幅のためにその部位にシーディングされるのを効果的に排除される。キネティック排除増幅方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０３３８０４２号の開示に詳細に記載されているように行うことができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、増幅された標的核酸は完全に二本鎖である。いくつかの実施形態では、増幅された標的核酸は二本鎖核酸領域を含み、一本鎖核酸を有する領域も含む。ある種の実施形態では、標的核酸は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は約４０より多くの塩基から成る領域の一本鎖配列をライブラリーフラグメントの各端に有する１つ又は複数のフォーク型アダプターを含む。フォーク型アダプターの設計及び使用は、米国特許第７，７４２，４６３号及び第８，５６３，７４８号により詳細に記載されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４８】
キネティック排除は、標的核酸の第１のコピーを作製するための比較的遅い速度対標的核酸の又は第１のコピーのその後のコピーを作製するための比較的速い速度を活用することができる。前の段落の例では、キネティック排除は、標的核酸シーディングの比較的遅い速度（例えば、比較的遅い拡散又は輸送）対核酸シードのコピーで部位を満たすための増幅が起こる比較的速い速度によって起こる。別の例示的実施形態では、キネティック排除は、部位にシーディングされた標的核酸の第１のコピーの形成の遅れ（例えば、遅れた活性化又は遅い活性化）対部位を満たすためにその後のコピーが行われる比較的速い速度によって起こり得る。この例では、個々の部位は、いくつかの異なる標的核酸でシーディングされた可能性がある（例えば、増幅より前に、いくつかの標的核酸が各部位に存在し得る）。しかし、任意の所与の標的核酸に対する第１のコピーの形成はランダムに活性化され得、その結果、第１のコピーの形成の平均速度は、その後のコピーが生成される速度と比較して比較的遅い。この場合、個々の部位がいくつかの異なる標的核酸でシーディングされた可能性があるが、キネティック排除によって、そうした標的核酸のうちの１種だけを増幅することが可能になる。より具体的には、第１の標的核酸が増幅のために一旦活性化されると、部位は、そのコピーで急速にいっぱいに満たされ、それによって、第２の標的核酸のコピーがその部位で作製されるのが防止される。
【００４９】
増幅試薬は、増幅産物形成を促進し、ある場合には増幅産物形成速度を増大させる、さらなる成分を含むことができる。例えばＵｖｓＸなどのリコンビナーゼは、反復的な侵入／伸長を可能にすることによって増幅産物形成を促進することができる。より具体的には、リコンビナーゼは、ポリメラーゼが標的核酸に侵入すること及び増幅産物形成に対する鋳型として標的核酸を使用してポリメラーゼがプライマーを伸長することを促進することができる。このプロセスは、侵入／伸長の各ラウンドから生成される増幅産物がその後のラウンドの鋳型として働く連鎖反応として反復され得る。このプロセスは、変性サイクル（例えば、熱変性又は化学的変性による）が必要とされないので、標準的なＰＣＲよりも速く起こり得る。したがって、リコンビナーゼ促進性増幅を等温で行うことができる。増幅を促進するために、リコンビナーゼ促進性増幅試薬中にＡＴＰ又は他のヌクレオチド（又は、ある場合にはそれらの非加水分解性類似体）を含むことが一般に望ましい。リコンビナーゼと一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質の混合物は、ＳＳＢがさらに増幅を促進することができるので、特に有用である。リコンビナーゼ促進性増幅のための例示的配合物としては、ＴｗｉｓｔＤＸ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）がＴｗｉｓｔＡｍｐキットとして商業的に販売しているものが挙げられる。リコンビナーゼ促進性増幅試薬の有用な成分及び反応条件は米国特許第５，２２３，４１４号及び米国特許第７，３９９，５９０号に示されており、これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５０】
配列比較、同一性及び相同性
用語「同一」又は「同一性パーセント」は、２つ以上の核酸配列又はポリペプチド配列の文脈において、最大一致について比較し、整列させた場合、以下に記載の配列比較アルゴリズムのうちの１つ（若しくは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を使用して、又は目視検査によって測定した際に、同一であるか特定のパーセンテージの同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。
【００５１】
フレーズ「実質的に同一の」は、２つの核酸又はポリペプチド（例えば、リコンビナーゼをコードするＤＮＡ又はリコンビナーゼのアミノ酸配列）の文脈において、最大一致について比較し、整列させた場合、配列比較アルゴリズムを使用して、又は目視検査によって測定した際に、少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。そのような「実質的に同一の」配列は、実際の祖先と関係なく「相同」であると典型的には考えられる。「実質的な同一性」は、少なくとも約５０残基の長さの配列領域にわたって存在することが好ましく、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在することがより好ましく、配列が、比較される２つの配列の少なくとも約１５０残基にわたって又は全長にわたって実質的に同一であることが最も好ましい。
【００５２】
タンパク質及び／又はタンパク質配列は、共通の祖先タンパク質又は祖先タンパク質配列から天然に又は人工的に生じる場合は「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は、祖先核酸又は祖先核酸配列から天然に又は人工的に生じる場合は相同である。相同性は、一般に、２つ以上の核酸若しくはタンパク質（又はそれらの配列）の間の配列類似性から推測される。相同性を確立するのに有用な、配列間の類似性の正確なパーセンテージは、問題の核酸及びタンパク質によって異なるが、５０、１００、１５０又はそれ以上の残基にわたってわずか２５％配列類似性が相同性を確立するのに日常的に使用される。より高いレベルの配列類似性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％又はそれ以上も相同性を確立するのに使用することができる。配列類似性パーセンテージを決定する方法（例えば、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）が本明細書に記載され、一般に利用可能である。
【００５３】
配列比較及び相同性決定については、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。次いで、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、配列比較アルゴリズムが、参照配列と比較して、試験配列（複数可）について配列同一性パーセントを計算する。
【００５４】
比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局地的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって、又は目視検査によって行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、２００４まで増補を一般に参照されたい）。
【００５５】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、第１に、クエリ配列中の長さＷの短い文字列を同定することによって高スコア配列対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒｓ）（ＨＳＰ）を同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させたときに、いくつかの陽性値の閾値スコアＴとマッチするかこれを満たす。Ｔは、隣接文字列スコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記を参照）。これらの最初の隣接文字列ヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして働く。次いで、文字列ヒットは、累積アライメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチする残基対に対するリウォードスコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコア行列を使用して累積スコアが計算される。各方向における文字列ヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下する場合；１つ若しくは複数の陰性スコア残基アライメントの蓄積により、累積スコアが０以下になる場合；又はいずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、文字列長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較をデフォルトで使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、文字列長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトで使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）。
【００５６】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムで提供される１つの類似性尺度は、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間のマッチが偶然起こるであろう確率の指標を与える。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると考えられる。
【００５７】
改変リコンビナーゼをコードする核酸
本明細書で提供される改変リコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子が本明細書でさらに提供される。アミノ酸配列、好ましくはリコンビナーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列も知られている変異体バージョンのリコンビナーゼである、任意の所与の改変リコンビナーゼについては、分子生物学の基本原理に従って、変異体をコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。例えば、ＲＢ４９  ＵｖｓＸリコンビナーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列が知られているとすれば、標準的な遺伝暗号を使用して、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する、任意の所与の変異体バージョンのＲＢ４９  ＵｖｓＸをコードするヌクレオチド配列を推定することが可能である。同様に、変異体バージョンの他のリコンビナーゼ、例えば、Ｔ４、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、エロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ３２、ビブリオファージｎｔ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、Ｔ２、Ｒｂ１４、エロモナスファージ２５、ｐｈｉ−１、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、ファージＲｂ３及びファージＬＺ２などについて、ヌクレオチド配列を容易に得ることができる。次いで、当技術分野で知られている標準的な分子生物学的技法を使用して、必要とされるヌクレオチド配列を有する核酸分子を構築することができる。
【００５８】
本明細書で提供する実施形態によれば、定義される核酸は、同一の核酸だけでなく、特に、保存的アミノ酸置換における縮重コードによる同義コドン（同じアミノ酸残基を指定する異なるコドン）をもたらす置換を含めた、いかなる軽微な塩基変動も含む。用語「核酸配列」は、塩基変動に関連してもたらされる任意の一本鎖配列に対する相補的配列も含む。
【００５９】
本明細書に記載の核酸分子はまた、有利なことに、それがコードするリコンビナーゼタンパク質を適切な宿主中で発現させるのに適した発現ベクターに含まれ得る。上記細胞のその後の形質転換及び形質転換細胞その後の選抜に適した発現ベクターへのクローニングしたＤＮＡの組み込みは、その全体が参照により組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで示されるように、当業者によく知られている。
【００６０】
そのような発現ベクターは、ＤＮＡフラグメントの発現をもたらすことができる調節配列、例えばプロモーター領域に作動可能に連結された、本明細書で提供される実施形態による核酸を有するベクターを含む。用語「作動可能に連結された」は、記載される成分がその意図された様式で機能することを可能にする関係にある、並置を指す。そのようなベクターで適切な宿主細胞を形質転換して、本明細書で提供される実施形態によるタンパク質を発現させることができる。
【００６１】
核酸分子は、成熟タンパク質をコードしてもよく、成熟タンパク質を形成するために後に宿主細胞によって切断されるプレタンパク質上のリーダー配列をコードするものを含めた、プロ配列を有するタンパク質をコードしてもよい。ベクターは、例えば、複製開始点、及び任意選択で上記ヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び任意選択でプロモーターの調節因子とともに提供されるプラスミドベクター、ウイルスベクター又はファージベクターであり得る。ベクターは、例えば抗生物質耐性遺伝子などの１種又は複数の選抜マーカーを含むことができる。
【００６２】
発現に必要とされる調節エレメントとしては、ＲＮＡポリメラーゼに結合するための及び転写開始の適切なレベルを指示するためのプロモーター配列が挙げられ、さらにリボソーム結合のための翻訳開始配列も挙げられる。例えば、細菌性発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーター、並びに翻訳開始のためのシャイン−ダルガルノ配列及び開始コドンＡＵＧを含むことができる。同様に、真核性発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する異種又は同種のプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ及びリボソーム脱離のための終止コドンを含むことができる。そのようなベクターは市販品として入手することができ、又は当技術分野でよく知られている方法によって記載されている配列から組み立てることができる。
【００６３】
ベクターにエンハンサー配列を含めることによって、リコンビナーゼをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写を最適化することができる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写レベルを増大させる、ＤＮＡのシス作用エレメントである。ベクターは、一般に、選抜マーカーに加えて複製開始点も含む。
【実施例】
【００６４】
実施例１
本実施例は、クラスター増幅の向上の、パターン化されたフローセル表面へのＰＣＲフリーライブラリーのシーディング方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、上記で示された変異を含むＵｖｓＸ、例えば、Ｐｒｏ２５６Ｌｙｓを含むＲＢ４９  ＵｖｓＸ変異体（配列番号２として本明細書に示され、「ＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋ」と本明細書で言及される）を含むシーディング配合物を使用する。驚くべきことに、これを使用するリコンビナーゼ媒介性増幅が、パターン化されたフローセル表面への一本鎖アダプター領域を有するＰＣＲライブラリーのシーディングを実質的に向上させることが発見された。別の実施形態では、本発明の方法は、ＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋリコンビナーゼとともに比較的高濃度のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｅＢｓｕポリメラーゼ）を含むシーディング配合物を使用する。
【００６５】
パターン化されたフローセル表面へのＰＣＲフリーライブラリーのシーディングにおけるＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋ配合物の有効性を評価するために、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＤＮＡ  ＰＣＲフリー試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．）を使用してＰＣＲフリーライブラリーを生成した。ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ライブラリー調製キットを使用して生成したＰＣＲフリーライブラリーは、ライブラリーフラグメントの各端に約４０塩基の一本鎖配列領域を有するフォーク型アダプターを有する。
【００６６】
図３Ａは、Ｔ４  ＵｖｓＸリコンビナーゼ（配列番号８として本明細書に示され、「Ｔ４  ＵｖｓＸ」と本明細書で言及される）を含む標準的な配合物を使用して、パターン化されたフローセルにシーディングされたＰＣＲフリーライブラリーのクラスター画像のスクリーンショット１００を示す。図３Ｂは、ＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋリコンビナーゼを含む液体配合物を使用して、パターン化されたフローセルにシーディングされたＰＣＲフリーライブラリーのクラスター画像のスクリーンショット１５０を示す。本実施例では、ライブラリーをＴ４  ＵｖｓＸ配合物又はＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋ配合物と混合して１００ｐＭの終濃度にし、フローセル上に流し、ｃＢｏｔ上で３８℃でインキュベートした。１時間インキュベーションしてから、温度を２０℃に下げ、フローセルをＨＴ２洗浄緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で洗浄した。クラスターを、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／０．１Ｍアスコルビン酸ナトリウム中に１：５，０００希釈したサイバー（ＳＹＢＲ）（登録商標）グリーン（Ｇｒｅｅｎ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、蛍光顕微鏡で画像化した。図３Ａを参照すると、標準的な配合物（例えば、Ｔ４  ＵｖｓＸ）を用いた、パターン化されたフローセルへのＰＣＲフリーライブラリーのシーディングによって生成されたクラスターの密度は、比較的低密度である。図３Ｂを参照すると、ＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋリコンビナーゼを含む配合物を使用した、パターン化されたフローセルへのＰＣＲフリーライブラリーのシーディングによって生成されたクラスターの密度は、実質的に向上する。
【００６７】
図４Ａは、標準的なＴ４  ＵｖｓＸ配合物を使用して、パターン化されたフローセルにシーディングされた一本鎖（ｓｓＤＮＡ）のＰＣＲフリーライブラリーのクラスター画像のスクリーンショット２００を示す。図４Ｂは、ＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋリコンビナーゼを含む液体配合物を使用して、パターン化されたフローセルにシーディングされた一本鎖のＰＣＲフリーライブラリーのクラスター画像のスクリーンショット２５０を示す。本実施例では、ＮａＯＨを使用して二本鎖のＰＣＲフリーライブラリーを変性させ、続いて、パターン化されたフローセルに５０ｐＭの濃度でシーディングした。図４Ａを参照すると、標準的な配合物（例えば、Ｔ４  ＵｖｓＸ）を用いた、パターン化されたフローセルへのｓｓＤＮＡのＰＣＲフリーＤＮＡライブラリーのシーディングによって生成されたクラスターの密度は、比較的低密度である。図４Ｂを参照すると、ＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋリコンビナーゼを含む配合物を使用した、パターン化されたフローセルへのｓｓＤＮＡのＰＣＲフリーライブラリーのシーディングによって生成されたクラスターの密度は、実質的に向上する。
【００６８】
実施例２
ＲＢ４９  Ｐ２５６Ｋ変異体を使用した、増幅の向上
本実施例は、本明細書に記載のＰ２５６Ｋ変異を有するリコンビナーゼとこの変異を有さないリコンビナーゼの間の増幅能力の比較を記載する。本実施例において、「コントロール」のＲＢ４９  ＵｖｓＸ（配列番号１に示す）は、Ｈ６３Ｓ変異をさらに含む。Ｐ２５６Ｋ変異体は、配列番号２で本明細書に記載されるように、位置２５６にＬｙｓ残基を有するようにコントロールをさらに変異させることによって生成した。
【００６９】
パターン化されたフローセルへのＰＣＲフリーライブラリーのクラスタリングは、コントロール又はＰ２５６Ｋ変異体のいずれかを使用して、実施例１で上述するようにｃＢｏｔ上で行った。次いで、ＨｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．）でシークエンシングを行い、シークエンシング結果を解析して、典型的には、以前のシークエンシングデータにおいて十分に示されていない様々な領域のコール可能性（ｃａｌｌａｂｉｌｉｔｙ）を決定した。
【００７０】
コール可能性は、一塩基多型（ＳＮＰ）が正確にコールされる部位の割合の尺度である。理想的には、この値は、特定のタイプの領域（すなわち、高ＧＣなど）内の１００％の部位でＳＮＰが正確にコールされることを意味する、（１００％に対する）１である。カバー度は、カバー度＞ｎを有する部位の割合の尺度であり、ｎは、典型的には３０×（すなわち、ヒトゲノムに対する標準的なカバー度）である。フォスミドプロモーターは、１００遺伝子のプロモーターのセットであり、これは、以前のシークエンシングデータにおいて十分に示されないと確認された。このプロモーターはフォスミドベクターにクローニングされた。高ＧＣ領域は、ＧＣ含量が７５％以上（Ｎ５０（Ｇ＋Ｃ≧０．７５）１００  Ｎ５０）である少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義することができる。巨大ＧＣ領域は、ＧＣ含量が８５％以上（Ｎ５０（Ｇ＋Ｃ≧０．８５）１００  Ｎ５０）である少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義することができる。低ＧＣ領域は、ＧＣ含量が４０％以下（Ｎ５０（Ｇ＋Ｃ≧０．４０）１００  Ｎ５０）である少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義することができる。高ＡＴ領域は、約５０ｋ領域にダウンサンプリングされる、ＡＴ含量が７５％以上（Ｎ５０（Ａ＋Ｔ≧０．７５）１００  Ｎ５０）である少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義することができる。巨大ＡＴ領域は、約５０ｋ領域にダウンサンプリングされる、ＡＴ含量が８５％（Ｎ５０（Ａ＋Ｔ≧０．８５）１００  Ｎ５０）以上少なくとも１００ｂｐを有する領域と定義することができる。ＡＴジヌクレオチド反復領域は、ＡＴＡＴ反復の長いストレッチを含む領域と定義することができる。
【００７１】
コントロール対Ｐ２５６Ｋ変異体についてのコール可能性データの比較は、Ｐ２５６Ｋ変異体が、コントロールのものと比較して、フォスミドプロモーター領域、高ＧＣ、巨大ＧＣ、低ＧＣ、高ＡＴ、巨大ＡＴ及びＡＴジヌクレオチド反復領域の１つ又は複数のコール可能性において予想外且つ有意な向上を示すことを実証する。
【００７２】
実施例３
Ｐ２５６Ｋに相同な変異を有する変異体を使用した、増幅の向上
実施例２で上述した能力比較を、他のリコンビナーゼについて繰り返した。本実施例では、「コントロール」リコンビナーゼは、以下の表の「コントロール」の列に示されるように、ＲＢ４９のＨ６３Ｓに相同な変異を含むように野生型リコンビナーゼを改変することによって生成した。「Ｐ２５６Ｋホモログ」変異体は、以下の表の「Ｐ２５６Ｋホモログ」の列に示されるように、ＲＢ４９のＰ２５６Ｋに相同な変異を有するようにコントロールをさらに改変することによって生成した。
【００７３】
例えば、Ｔ６  ＵｖｓＸについては、コントロールは、Ｈ６６Ｓ変異を有するように野生型Ｔ６  ＵｖｓＸ（配列番号９）を改変することによって生成した。Ｐ２５６Ｋホモログは、Ｈ６６ＳとＦ２５９Ｋの両方の変異を有するようにさらに改変した。
【表２】
2017529093.tif 000004
【００７４】
コントロール又はＰ２５６Ｋ変異体のいずれかを使用して、パターン化されたフローセルへのＰＣＲフリーライブラリーのクラスタリングを実施例１で上述するようにｃＢｏｔ上で行った。次いで、実施例２で上述するように、ＨｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．）でシークエンシングを行い、シークエンシング結果を解析して、典型的には、以前のシークエンシングデータにおいて十分に示されていない、様々な領域のコール可能性を決定した。
【００７５】
コントロール対Ｐ２５６Ｋホモログ変異体についてのコール可能性データの比較は、Ｐ２５６Ｋホモログ変異体が、コントロールのものと比較して、フォスミドプロモーター領域、高ＧＣ、巨大ＧＣ、低ＧＣ、高ＡＴ、巨大ＡＴ及びＡＴジヌクレオチド反復領域の１つ又は複数のコール可能性において予想外且つ有意な向上を示すことを実証する。
【００７６】
本出願の全体を通して、様々な刊行物、特許及び／又は特許出願を参照してきた。これらの刊行物の開示全体が、本出願において参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語は、列挙される要素を含むだけでなく、任意のさらなる要素もさらに包含する、オープンエンドであることが本明細書で意図される。
【００７８】
いくつかの実施形態を記載してきた。それにもかかわらず、様々な改変を行うことができることを理解されたい。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１Ａ】
2017529093.tif 000005
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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