(57)【要約】  Ｇタンパク質の活性を評価するのに有用な共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）ベースバイオセンサーまたはタンパク質断片補体アッセイ（ＰＣＡ）ベースバイオセンサーについて記載する。これらのバイオセンサーは、Ｇβγ二量体と結合するためのＧαサブユニットとＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）の間の競合に基づいている。これらのバイオセンサーは、適切なＲＥＴまたはＰＣＡ標識に融合した（１）βγＩＰ及び（２）ＧβまたはＧγタンパク質；ＧＰＣＲ；または原形質膜標的化ドメインを含む。Ｇタンパク質の選好及びＧＰＣＲの活性化プロファイルなどの、Ｇタンパク質活性を調節する薬剤の同定またはＧＰＣＲシグナル伝達／調節の特徴付けを含む、様々な用途にそのようなバイオセンサーを使用する方法についても記載する。【選択図】図１Ａ
2017536104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）、または（Ｂ）で定義される要素を含む、Ｇタンパク質活性を検出するためのバイオセンサーシステムであって、
（Ａ）
（ａ）共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）ドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び
融合Ｇβタンパク質または融合Ｇγタンパク質を含む第２の成分、前記Ｇβタンパク質または前記Ｇγタンパク質は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
を含む、（ｉ）第１のバイオセンサー、
（ｉ）で定義される前記第１及び第２の成分；及び
組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
を含む、（ｉｉ）第２のバイオセンサー、または
（Ｂ）
（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
融合Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）を含む第２の成分、前記ＧＰＣＲは、そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している
を含む、（ｉ）バイオセンサー
を含む、前記バイオセンサーシステム。
【請求項２】
前記Ｇγタンパク質が、前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第２の断片に融合している、請求項１に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項３】
前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第２の断片が、前記ＧβまたはＧγタンパク質のＮ末端で融合している、請求項１または２に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項４】
前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片が、前記βγＩＰのＣ末端で融合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項５】
前記βγＩＰが、前記ＲＥＴアクセプター及び前記Ｇβタンパク質に融合しており、Ｇγタンパク質またはＧＰＣＲが、前記ＲＥＴドナーに融合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項６】
前記ＲＥＴドナーが、生物発光タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項７】
前記生物発光タンパク質が、ルシフェラーゼである、請求項６に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項８】
前記ルシフェラーゼが、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼである、請求項７に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項９】
前記ＲＥＴアクセプターが、蛍光タンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１０】
前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰである、請求項９に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１１】
前記βγＩＰが、前記第１の断片に融合しており、及び前記Ｇβタンパク質、Ｇγタンパク質またはＧＰＣＲが、前記第２の断片に融合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１２】
前記レポータータンパク質が、生物発光タンパク質である、請求項１１に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１３】
前記生物発光タンパク質が、ルシフェラーゼである、請求項１２に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１４】
前記ルシフェラーゼが、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼである、請求項１３に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１５】
前記第１の断片が、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼの約１〜１１０残基を含み、及び前記第２の断片が、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼの約１１１〜３１１残基を含む、請求項１４に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１６】
前記第１の成分が、前記βγＩＰまたは前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片に融合した原形質膜（ＰＭ）標的化部分をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１７】
前記ＰＭ標的化部分が、前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片のＣ末端で融合している、請求項１６に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１８】
前記ＰＭ標的化部分が、プレニル化モチーフを含む、請求項１６または１７に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項１９】
前記プレニル化モチーフが、ヒトＫＲＡＳスプライス変異体ｂのプレニル化モチーフである、請求項１６に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２０】
前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号３７）を含む、請求項１９に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２１】
（ｉ）前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片と（ｉｉ）前記ＰＭ標的化部分の間にフレキシブルリンカーをさらに含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２２】
前記フレキシブルリンカーが、約５０〜約５００アミノ酸に対応する長さを有する、請求項２１に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２３】
前記フレキシブルリンカーが、約２００アミノ酸に対応する長さを有する、請求項２２に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２４】
前記組換えＧαタンパク質が、ヒトＧαｑ、Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｔ−ｃｏｎｅ、Ｇαｔ−ｒｏｄ、Ｇαｔ−ｇｕｓｔ、Ｇαｚ、ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｏｌｆ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、及びＧα１５／Ｇα１６タンパク質、またはそれらの無差別または非選択的Ｇα変異体である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２５】
前記βγＩＰが、ＧＲＫ２またはＧＲＫ３である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２６】
（ｉ）前記第２の成分が融合Ｇβタンパク質を含む場合、前記第１及び第２のバイオセンサーは、組換えＧγタンパク質をさらに含み、または（ｉｉ）前記第２の成分が融合Ｇγタンパク質を含む場合、前記第１及び第２のバイオセンサーは、組換えＧβタンパク質をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２７】
（Ａ）で定義される前記バイオセンサーシステムが、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２８】
（Ｂ）で定義される前記バイオセンサーシステムが、組換えＧβタンパク質及び／または組換えＧγタンパク質をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項２９】
前記第１のバイオセンサーが、第１の細胞中に存在し、前記第２のバイオセンサーが、第２の細胞中に存在する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項３０】
（Ａ）で定義される前記バイオセンサーシステムにおいて、前記第１のバイオセンサーが、第１の膜調製物中に存在し、及び前記第２のバイオセンサーが、第２の膜調製物中に存在する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項３１】
（Ａ）で定義される前記バイオセンサーシステムが、複数の第２のバイオセンサーを含み、前記第２のバイオセンサーの各々が、異なる組換えＧαタンパク質を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項３２】
前記異なる組換えＧαタンパク質が、以下のＧαタンパク質：Ｇαｑ、Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｔ−ｃｏｎｅ、Ｇαｔ−ｒｏｄ、Ｇαｔ−ｇｕｓｔ、Ｇαｚ、ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｏｌｆ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、及びＧα１５／Ｇα１６の少なくとも２つである、請求項３１に記載のバイオセンサーシステム。
【請求項３３】
請求項１〜２６のいずれか１項で定義される前記第１、第２、及び第３の成分をコードする配列を含む、核酸。
【請求項３４】
Ｇγタンパク質またはＧβタンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項３３に記載の核酸。
【請求項３５】
１つ以上の翻訳調節配列をさらに含む、請求項３３または３４に記載の核酸。
【請求項３６】
前記１つ以上の翻訳調節配列が、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）である、請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
Ｇタンパク質活性を検出するためのバイオセンサーであって、
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び
（ｉｉ）融合原形質膜（ＰＭ）標的化部分を含む第２の成分、前記ＰＭ標的化部分は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
を含み、
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している、前記バイオセンサー。
【請求項３８】
前記ＰＭ標的化部分が、ＰＭタンパク質または前記ＰＭに局在化するその断片である、請求項３７に記載のバイオセンサー。
【請求項３９】
前記ＰＭタンパク質またはその断片が、（ａ）パルミトイル化、ミリストイル化、及び／またはプレニル化シグナル配列、及び／または（ｂ）多塩基性配列を含む、請求項３８に記載のバイオセンサー。
【請求項４０】
前記多塩基性配列及びプレニル化シグナル配列が、ヒトＫＲＡＳスプライス変異体ｂ由来である、請求項３９に記載のバイオセンサー。
【請求項４１】
前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号３７）を含む、請求項４０に記載のバイオセンサー。
【請求項４２】
前記バイオセンサーが、組換えＧαタンパク質を含む第３の成分をさらに含む、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項４３】
前記組換えＧαタンパク質が、Ｇｑファミリーである、請求項４２に記載のバイオセンサー。
【請求項４４】
前記組換えＧαタンパク質が、ＧαｑまたはＧα１１である、請求項４３に記載のバイオセンサー。
【請求項４５】
試験薬剤がＧＰＣＲの活性を調節するかどうかの決定方法であって、
（１）（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）で定義される要素を含むバイオセンサーを提供すること：
（Ａ）
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
（ｉｉ）融合Ｇβタンパク質または融合Ｇγタンパク質を含む第２の成分、前記Ｇβタンパク質または前記Ｇγタンパク質は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している、
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；及び
（ｉｖ）前記ＧＰＣＲを含む第４の成分；
（Ｂ）
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
（ｉｉ）そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合した前記ＧＰＣＲを含む第２の成分；
（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；または
（Ｃ）
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
（ｉｉ）融合原形質膜（ＰＭ）標的化部分を含む第２の成分、前記ＰＭ標的化部分は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；及び
（ｉｖ）前記ＧＰＣＲを含む第４の成分；及び
（２）前記試験薬剤の存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること；
前記薬剤の存在下において測定されたより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を増加させることを示し、前記薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を阻害することを示す
を含む、前記方法。
【請求項４６】
前記バイオセンサーが、請求項２〜３２及び３８〜４４で定義される特徴の１つ以上を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
Ｇαタンパク質がＧＰＣＲアゴニストによって活性化されるかどうかの決定方法であって、
（ａ）請求項１〜３２のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステムの前記第１及び第２のバイオセンサー中で前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること、及び
（ｂ）前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルに基づいて、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されるかどうかを同定すること；
前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルのより高い増加は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されることを示し、前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルの同様のまたはより低い増加、または減少は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されないことを示す
を含む、前記方法。
【請求項４８】
Ｇαタンパク質がＧＰＣＲアゴニストによって活性化されるかどうかの決定方法であって、
（ａ）以下の（ｉ）、及び（ｉｉ）を含む第１のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること：
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び
（ｉｉ）融合Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）を含む第２の成分、前記ＧＰＣＲは、そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ｂ）以下の（ｉ）、及び（ｉｉ）を含む第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること：
（ｉ）（ａ）で定義される前記第１及び第２の成分；及び
（ｉｉ）前記Ｇαタンパク質の組換え形態を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルのより高い増加は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されることを示し、前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルの同様のまたはより低い増加、または減少は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されないことを示す
を含む、前記方法。
【請求項４９】
前記バイオセンサーが、請求項３８〜４４で定義される特徴の１つ以上を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
（３）以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）中の前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること
（ａ）請求項１〜３１のいずれか１項に記載の要素（Ａ）で定義される第２のバイオセンサー（複数可）、
（ｂ）請求項１〜３１のいずれか１項に記載の要素（Ｂ）で定義されるバイオセンサー、または
（ｃ）請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のバイオセンサー、
試験薬剤の存在下及び不在下において、及びＧＰＣＲアゴニストの存在下において、前記組換えＧαタンパク質は、前記ＧＰＣＲにカップリングしている；及び
（４）前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターであるかどうかを決定すること；
前記試験薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターであることを示し、前記試験薬剤の存在下において測定された同様のまたはより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターではないことを示す
をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
試験薬剤が目的Ｇαタンパク質のインヒビターであるかどうかの決定方法であって、
（１）
（ａ）請求項１〜３２のいずれか１項に記載の要素（Ａ）で定義される第２のバイオセンサー（複数可）、
（ｂ）請求項１〜３２のいずれか１項に記載の要素（Ｂ）で定義されるバイオセンサー、または
（ｃ）請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のバイオセンサー
をＧＰＣＲアゴニストと接触させること、前記組換えＧαタンパク質は、前記目的Ｇαタンパク質に対応する；
（２）前記試験薬剤の存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること；及び
（ｃ）前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターであるかどうかを決定すること
前記試験薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質のインヒビターであることを示し、前記試験薬剤の存在下において測定された同様のまたはより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質のインヒビターではないことを示す
を含む、前記方法。
【請求項５２】
試験薬剤が目的Ｇαタンパク質活性化因子であるかどうかの決定方法であって、
（１）
（ａ）請求項１〜３２のいずれか１項に記載の要素（Ａ）で定義される第２のバイオセンサー（複数可）、
（ｂ）請求項１〜３２のいずれか１項に記載の要素（Ｂ）で定義されるバイオセンサー、または
（ｃ）請求項４２〜４４のいずれか１項に記載のバイオセンサー
をＧＰＣＲアンタゴニストと接触させること、前記組換えＧαタンパク質は、前記目的Ｇαタンパク質に対応する；
（２）前記試験薬剤の存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること；及び
（３）前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質活性化因子であるかどうかを決定すること、
前記試験薬剤の存在下において測定されたより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質活性化因子であることを示し、前記試験薬剤の存在下において測定された同様のまたはより低いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質活性化因子ではないことを示す
を含む、前記方法。
【請求項５３】
前記ＲＥＴドナーが、生物発光タンパク質であり、前記方法が、前記バイオセンサーを前記ドナー生物発光タンパク質の基質で接触させることをさらに含む、請求項４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記基質が、ルシフェリンである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ルシフェリンが、セレンテラジンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記セレンテラジンが、セレンテラジン４００Ａである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記バイオセンサーが、ＲＥＴドナー及びＲＥＴアクセプターを含み、前記方法が、（ｉ）前記ＲＥＴドナーが発したシグナルを測定すること、及び（ｉｉ）［ＲＥＴアクセプターシグナル／ＲＥＴドナーシグナル］の比を決定することをさらに含む、請求項４５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
ヒトＧαｑタンパク質の残基６７及び／または残基７５に対応する位置で突然変異を含む、突然変異Ｇαポリペプチド。
【請求項５９】
前記突然変異が置換である、請求項５８に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【請求項６０】
前記突然変異が、ヒトＧαｑタンパク質の残基６７に対応する位置である、請求項５８または５９に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【請求項６１】
前記突然変異が、非芳香族残基の置換である、請求項６０に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【請求項６２】
非芳香族残基がシステインである、請求項６１に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【請求項６３】
前記突然変異が、ヒトＧαｑタンパク質の残基７５に対応する位置である、請求項５８または５９に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【請求項６４】
前記突然変異が、非芳香族残基の置換である、請求項６３に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【請求項６５】
前記非芳香族残基がグリシンである、請求項６４に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【請求項６６】
請求項５８〜６５のいずれか１項に記載の突然変異Ｇαポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
【請求項６７】
請求項６６に記載の核酸を含む、プラスミドまたはベクター。
【請求項６８】
請求項６５に記載の核酸または請求項６７に記載のプラスミドを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月１４日に出願された米国特許仮出願番号第６２／０６３，６２２号の利益を主張し、その内容全体を参照によって本願明細書に引用したものとする。
【０００２】
本開示は、Ｇタンパク質活性化を監視することに関し、より詳細には、Ｇタンパク質活性化を検出するためのシグナル伝達バイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００３】
３つのサブユニットα、β、及びγからなるヘテロ三量体Ｇタンパク質は、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）によって提供された情報を種々の細胞内エフェクターに中継する。刺激が無い場合には、Ｇタンパク質のαサブユニットは、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）分子と複合体を形成している。リガンドによるレセプターの活性化に伴う立体配座の変化は、ＧＤＰ分子のＧＴＰ（グアノシン三リン酸）へのリン酸化を促進する。ＧＴＰ結合Ｇαサブユニットは、Ｇβγサブユニットから解離した後、それらは双方とも、下流エフェクターと相互作用し、それらの活性を調節するのに利用できる。従って、Ｇタンパク質活性化は、Ｇβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を用いて、Ｇβγとの相互作用を介してそれらの下流エフェクターを分析することによって評価することができる。ＧαサブユニットによるＧＤＰへのＧＴＰ加水分解後、Ｇβγに対するＧα親和性は回復し、３つのサブユニットは再会合して、不活性ヘテロ三量体Ｇタンパク質を形成し、エフェクターの関与、従って、シグナル伝達が終了する（Ｇｉｌｍａｎ，１９８７）。
【０００４】
ＧＰＣＲによるＧタンパク質の古典的な活性化に加えて、他のタンパク質は、これらのヘテロ三量体Ｇタンパク質、例えば、Ｇタンパク質シグナル伝達（ＲＧＳ）の調節因子、Ｇタンパク質シグナル伝達（ＡＧＳ）の活性化因子の活性、及びコリンエステラーゼ８タンパク質（Ｒｉｃ−８）のインヒビターへの耐性を調節することもできる。これらの非正準的シグナル伝達経路のいくつかでは、ＧＰＣＲによって古典的に発揮されたグアニン交換因子（ＧＥＦ）活性は、例えば、Ｒｉｃ−８などの別のタンパク質に置き換えられる（Ｂｏｕｌａｒａｎ  ａｎｄ  Ｋｅｈｒｌ，２０１４）。
【０００５】
レセプターの脱感作への役割について最初に特徴付けられたＧタンパク質共役型レセプターキナーゼ（ＧＲＫ）２及び３は、Ｇβγサブユニットとの相互作用を介して関与したエフェクターでもある。ＧＲＫ２及びＧＲＫ３は、活性化したＧＴＰ結合Ｇαサブユニットから解離する際にＧタンパク質のＧβγサブユニットと相互作用するプレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン含有（Ｐｉｔｃｈｅｒ，Ｉｎｇｌｅｓｅら，１９９２）（Ｔｏｕｈａｒａ，Ｉｎｇｌｅｓｅら，１９９４）。その結果、ＧＲＫ２及びＧＲＫ３などの、Ｇβγ（βγＩＰ）と相互作用するタンパク質を使用して、ＧＰＣＲまたは他のＧタンパク質活性化因子によるＧタンパク質活性化を直接研究することができる。
【０００６】
いくつかのアプローチは、創薬業界において、ＧＰＣＲの活性化、従って、レセプターによるＧタンパク質の関与を評価するために現在使用されており、例えば、Ｇタンパク質によるＧＴＰγＳ取り込みに基づいたカルシウム動員アッセイまたは放射性分析である。カルシウム動員アッセイは、下流のＧｑ活性化で発生しているシグナル伝達事象を測定し、改変Ｇαサブユニットの使用により共役した場合にのみ、ＧｉまたはＧｓ共役レセプターに適用することができる。ＧＴＰγＳ取り込みアッセイの場合では、種々のヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化は、放射性ＧＴＰγ３５Ｓを用いて細胞膜上で直接測定し、生きた細胞で行うことはできない。
【０００７】
Ｇタンパク質活性化因子またはＧαサブユニットを改変することなく、生きた細胞中でのＧタンパク質の活性化は、今までのところ研究が行われていない。さらに、公知の方法は、同じ検出パートナーを用いて全ての異なるＧタンパク質を研究するには適切ではない。そのようなアッセイは、Ｇタンパク質カップリングプロファイルの特徴付けを可能にし、かつ、例えば、スクリーニングアッセイ及び構造−活性の相関研究に使用されるシグナル伝達特性を定義して新規化合物の同定を容易にすることによって、異なる段階の創薬プロセスで特に有用であろう。これは、処方された全ての薬剤の２６％がＧＰＣＲを介して作用するため、薬剤標的としてＧタンパク質活性化因子の重要性を考えると特に当てはまる（Ｇａｒｌａｎｄ  ２０１３）。Ｇタンパク質活性化因子を標的化する新規の治療活性分子の開発を支援するのにいくつかのアプローチが利用可能であるが、新規薬剤の発見は、それらの化合物の正確な作用機序に利用できる情報が不足していることで制限されることが多い。
【０００８】
従って、Ｇタンパク質の活性化を評価する新規のツール及びアッセイが求められている。
【０００９】
本説明は、多くの文書を指し、その内容全体を参照によって本明細書に引用したものとする。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、以下の項目１〜６８を提供する：
１．（Ａ）、または（Ｂ）で定義される要素を含む、Ｇタンパク質活性を検出するためのバイオセンサーシステムであって、
（Ａ）
（ａ）共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）ドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び
融合Ｇβタンパク質または融合Ｇγタンパク質を含む第２の成分、前記Ｇβタンパク質または前記Ｇγタンパク質は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
を含む、（ｉ）第１のバイオセンサー、
（ｉ）で定義される前記第１及び第２の成分；及び
組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
を含む、（ｉｉ）第２のバイオセンサー、または
（Ｂ）
（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
融合Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）を含む第２の成分、前記ＧＰＣＲは、そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している
を含む、（ｉ）バイオセンサー
を含む、前記バイオセンサーシステム。
【００１１】
２．前記Ｇγタンパク質が、前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第２の断片に融合している、項目１に記載のバイオセンサーシステム。
【００１２】
３．前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第２の断片が、前記ＧβまたはＧγタンパク質のＮ末端で融合している、項目１または２に記載のバイオセンサーシステム。
【００１３】
４．前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片が、前記βγＩＰのＣ末端で融合している、項目１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００１４】
５．前記βγＩＰが、前記ＲＥＴアクセプター及び前記Ｇβタンパク質に融合しており、Ｇγタンパク質またはＧＰＣＲが、前記ＲＥＴドナーに融合している、項目１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００１５】
６．前記ＲＥＴドナーが、生物発光タンパク質である、項目１〜５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００１６】
７．前記生物発光タンパク質が、ルシフェラーゼである、項目６に記載のバイオセンサーシステム。
【００１７】
８．前記ルシフェラーゼが、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼである、項目７に記載のバイオセンサーシステム。
【００１８】
９．前記ＲＥＴアクセプターが、蛍光タンパク質である、項目１〜８のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００１９】
１０．前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰである、項目９に記載のバイオセンサーシステム。
【００２０】
１１．前記βγＩＰが、前記第１の断片に融合しており、及び前記Ｇβタンパク質、Ｇγタンパク質またはＧＰＣＲが、前記第２の断片に融合している、項目１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００２１】
１２．前記レポータータンパク質が、生物発光タンパク質である、項目１１に記載のバイオセンサーシステム。
【００２２】
１３．前記生物発光タンパク質が、ルシフェラーゼである、項目１２に記載のバイオセンサーシステム。
【００２３】
１４．前記ルシフェラーゼが、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼである、項目１３に記載のバイオセンサーシステム。
【００２４】
１５．前記第１の断片が、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼの約１〜１１０残基を含み、及び前記第２の断片が、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼの約１１１〜３１１残基を含む、項目１４に記載のバイオセンサーシステム。
【００２５】
１６．前記第１の成分が、前記βγＩＰまたは前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片に融合した原形質膜（ＰＭ）標的化部分をさらに含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００２６】
１７．前記ＰＭ標的化部分が、前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片のＣ末端で融合している、項目１６に記載のバイオセンサーシステム。
【００２７】
１８．前記ＰＭ標的化部分が、プレニル化モチーフを含む、項目１６または１７に記載のバイオセンサーシステム。
【００２８】
１９．前記プレニル化モチーフが、ヒトＫＲＡＳスプライス変異体ｂのプレニル化モチーフである、項目１６に記載のバイオセンサーシステム。
【００２９】
２０．前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号３７）を含む、項目１９に記載のバイオセンサーシステム。
【００３０】
２１．（ｉ）前記ＲＥＴドナー、ＲＥＴアクセプター、または第１の断片と（ｉｉ）前記ＰＭ標的化部分の間にフレキシブルリンカーをさらに含む、項目１６〜２０のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００３１】
２２．前記フレキシブルリンカーが、約５０〜約５００アミノ酸に対応する長さを有する、項目２１に記載のバイオセンサーシステム。
【００３２】
２３．前記フレキシブルリンカーが、約２００アミノ酸に対応する長さを有する、項目２２に記載のバイオセンサーシステム。
【００３３】
２４．前記組換えＧαタンパク質が、ヒトＧαｑ、Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｔ−ｃｏｎｅ、Ｇαｔ−ｒｏｄ、Ｇαｔ−ｇｕｓｔ、Ｇαｚ、ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｏｌｆ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、及びＧα１５／Ｇα１６タンパク質、またはそれらの無差別または非選択的Ｇα変異体、例えば、本明細書に記載されるヒトＧαｑタンパク質の残基６６、６７、及び／または７５に対応する位置で突然変異を含む突然変異Ｇαポリペプチドである、項目１〜２３のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００３４】
２５．前記βγＩＰが、ＧＲＫ２またはＧＲＫ３である、項目１〜２４のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００３５】
２６．（ｉ）前記第２の成分が融合Ｇβタンパク質を含む場合、前記第１及び第２のバイオセンサーは、組換えＧγタンパク質をさらに含み、または（ｉｉ）前記第２の成分が融合Ｇγタンパク質を含む場合、前記第１及び第２のバイオセンサーは、組換えＧβタンパク質をさらに含む、項目１〜２５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００３６】
２７．（Ａ）で定義される前記バイオセンサーシステムが、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）をさらに含む、項目１〜２５のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００３７】
２８．（Ｂ）で定義される前記バイオセンサーシステムが、組換えＧβタンパク質及び／または組換えＧγタンパク質をさらに含む、項目１〜２７のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００３８】
２９．前記第１のバイオセンサーが、第１の細胞中に存在し、前記第２のバイオセンサーが、第２の細胞中に存在する、項目１〜２８のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００３９】
３０．（Ａ）で定義される前記バイオセンサーシステムにおいて、前記第１のバイオセンサーが、第１の膜調製物中に存在し、及び前記第２のバイオセンサーが、第２の膜調製物中に存在する、項目１〜２８のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００４０】
３１．（Ａ）で定義される前記バイオセンサーシステムが、複数の第２のバイオセンサーを含み、前記第２のバイオセンサーの各々が、異なる組換えＧαタンパク質を含む、項目１〜３０のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステム。
【００４１】
３２．前記異なる組換えＧαタンパク質が、以下のＧαタンパク質：Ｇαｑ、Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｔ−ｃｏｎｅ、Ｇαｔ−ｒｏｄ、Ｇαｔ−ｇｕｓｔ、Ｇαｚ、ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｏｌｆ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、及びＧα１５／Ｇα１６の少なくとも２つである、項目３１に記載のバイオセンサーシステム。
【００４２】
３３．項目１〜２６のいずれか１項で定義される第１、第２、及び第３の成分をコードする配列を含む、核酸。
【００４３】
３４．Ｇγタンパク質またはＧβタンパク質をコードする配列をさらに含む、項目３３に記載の核酸。
【００４４】
３５．１つ以上の翻訳調節配列をさらに含む、項目３３または３４に記載の核酸。
【００４５】
３６．前記１つ以上の翻訳調節配列が、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）である、項目３５に記載の核酸。
【００４６】
３７．Ｇタンパク質活性を検出するためのバイオセンサーであって、
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び
（ｉｉ）融合原形質膜（ＰＭ）標的化部分を含む第２の成分、前記ＰＭ標的化部分は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
を含み、
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している、前記バイオセンサー。
【００４７】
３８．前記ＰＭ標的化部分が、ＰＭタンパク質または前記ＰＭに局在化するその断片である、項目３７に記載のバイオセンサー。
【００４８】
３９．前記ＰＭタンパク質またはその断片が、（ａ）パルミトイル化、ミリストイル化、及び／またはプレニル化シグナル配列、及び／または（ｂ）多塩基性配列を含む、項目３８に記載のバイオセンサー。
【００４９】
４０．前記多塩基性配列及びプレニル化シグナル配列が、ヒトＫＲＡＳスプライス変異体ｂ由来である、項目３９に記載のバイオセンサー。
【００５０】
４１．前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号３７）を含む、項目４０に記載のバイオセンサー。
【００５１】
４２．前記バイオセンサーが、組換えＧαタンパク質を含む第３の成分をさらに含む、項目３７〜４１のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【００５２】
４３．前記組換えＧαタンパク質が、Ｇｑファミリーである、項目４２に記載のバイオセンサー。
【００５３】
４４．前記組換えＧαタンパク質が、ＧαｑまたはＧα１１である、項目４３に記載のバイオセンサー。
【００５４】
４５．試験薬剤がＧＰＣＲの活性を調節するかどうかの決定方法であって、
（１）（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）で定義される要素を含むバイオセンサーを提供すること：
（Ａ）
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
（ｉｉ）融合Ｇβタンパク質または融合Ｇγタンパク質を含む第２の成分、前記Ｇβタンパク質または前記Ｇγタンパク質は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している、
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；及び
（ｉｖ）前記ＧＰＣＲを含む第４の成分；
（Ｂ）
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
（ｉｉ）そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合した前記ＧＰＣＲを含む第２の成分；
（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；または
（Ｃ）
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；
（ｉｉ）融合原形質膜（ＰＭ）標的化部分を含む第２の成分、前記ＰＭ標的化部分は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；及び
（ｉｖ）前記ＧＰＣＲを含む第４の成分；及び
（２）前記試験薬剤の存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること；
前記薬剤の存在下において測定されたより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を増加させることを示し、前記薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を阻害することを示す
を含む、前記方法。
【００５５】
４６．前記バイオセンサーが、項目２〜３２及び３８〜４４で定義される特徴の１つ以上を含む、項目４４に記載の方法。
【００５６】
４７．Ｇαタンパク質がＧＰＣＲアゴニストによって活性化されるかどうかの決定方法であって、
（ａ）項目１〜３２のいずれか１項に記載のバイオセンサーシステムの前記第１及び第２のバイオセンサー中で前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること、及び
（ｂ）前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルに基づいて、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されるかどうかを同定すること；
前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルのより高い増加は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されることを示し、前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルの同様のまたはより低い増加、または減少は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されないことを示す
を含む、前記方法。
【００５７】
４８．Ｇαタンパク質がＧＰＣＲアゴニストによって活性化されるかどうかの決定方法であって、
（ａ）以下の（ｉ）、及び（ｉｉ）を含む第１のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること：
（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び
（ｉｉ）融合Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）を含む第２の成分、前記ＧＰＣＲは、そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
（ｂ）以下の（ｉ）、及び（ｉｉ）を含む第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること：
（ｉ）（ａ）で定義される前記第１及び第２の成分；及び
（ｉｉ）前記Ｇαタンパク質の組換え形態を含む第３の成分；
（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；
前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルのより高い増加は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されることを示し、前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルの同様のまたはより低い増加、または減少は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されないことを示す
を含む、前記方法。
【００５８】
４９．前記バイオセンサーが、項目３８〜４４で定義される特徴の１つ以上を含む、項目４７に記載の方法。
【００５９】
５０．（３）以下の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）中の前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること
（ａ）項目１〜３１のいずれか１項に記載の要素（Ａ）で定義される第２のバイオセンサー（複数可）、
（ｂ）項目１〜３１のいずれか１項に記載の要素（Ｂ）で定義されるバイオセンサー、または
（ｃ）項目４２〜４４のいずれか１項に記載のバイオセンサー、
試験薬剤の存在下及び不在下において、及びＧＰＣＲアゴニストの存在下において、前記組換えＧαタンパク質は、前記ＧＰＣＲにカップリングしている；及び
（４）前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターであるかどうかを決定すること；
前記試験薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターであることを示し、前記試験薬剤の存在下において測定された同様のまたはより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターではないことを示す
をさらに含む、項目４５に記載の方法。
【００６０】
５１．試験薬剤が目的Ｇαタンパク質のインヒビターであるかどうかの決定方法であって、
（１）
（ａ）項目１〜３２のいずれか１項に記載の要素（Ａ）で定義される第２のバイオセンサー（複数可）、
（ｂ）項目１〜３２のいずれか１項に記載の要素（Ｂ）で定義されるバイオセンサー、または
（ｃ）項目４２〜４４のいずれか１項に記載のバイオセンサー
をＧＰＣＲアゴニストと接触させること、前記組換えＧαタンパク質は、前記目的Ｇαタンパク質に対応する；
（２）前記試験薬剤の存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること；及び
（ｃ）前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターであるかどうかを決定すること
前記試験薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質のインヒビターであることを示し、前記試験薬剤の存在下において測定された同様のまたはより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質のインヒビターではないことを示す
を含む、前記方法。
【００６１】
５２．試験薬剤が目的Ｇαタンパク質活性化因子であるかどうかの決定方法であって、
（１）
（ａ）項目１〜３２のいずれか１項に記載の要素（Ａ）で定義される第２のバイオセンサー（複数可）、
（ｂ）項目１〜３２のいずれか１項に記載の要素（Ｂ）で定義されるバイオセンサー、または
（ｃ）項目４２〜４４のいずれか１項に記載のバイオセンサー
をＧＰＣＲアンタゴニストと接触させること、前記組換えＧαタンパク質は、前記目的Ｇαタンパク質に対応する；
（２）前記試験薬剤の存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること；及び
（３）前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質活性化因子であるかどうかを決定すること、
前記試験薬剤の存在下において測定されたより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質活性化因子であることを示し、前記試験薬剤の存在下において測定された同様のまたはより低いシグナルは、前記試験薬剤が前記目的Ｇαタンパク質活性化因子ではないことを示す
を含む、前記方法。
【００６２】
５３．前記ＲＥＴドナーが、生物発光タンパク質であり、前記方法が、前記バイオセンサーを前記ドナー生物発光タンパク質の基質で接触させることをさらに含む、項目４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【００６３】
５４．前記基質が、ルシフェリンである、項目５３に記載の方法。
【００６４】
５５．前記ルシフェリンが、セレンテラジンである、項目５４に記載の方法。
【００６５】
５６．前記セレンテラジンが、セレンテラジン４００Ａである、項目５５に記載の方法。
【００６６】
５７．前記バイオセンサーが、ＲＥＴドナー及びＲＥＴアクセプターを含み、前記方法が、（ｉ）前記ＲＥＴドナーが発したシグナルを測定すること、及び（ｉｉ）［ＲＥＴアクセプターシグナル／ＲＥＴドナーシグナル］の比を決定することをさらに含む、項目４５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【００６７】
５８．ヒトＧαｑタンパク質の残基６７及び／または残基７５に対応する位置で突然変異を含む、突然変異Ｇαポリペプチド。
【００６８】
５９．前記突然変異が置換である、項目５８に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【００６９】
６０．前記突然変異が、ヒトＧαｑタンパク質の残基６７に対応する位置である、項目５８または５９に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【００７０】
６１．前記突然変異が、非芳香族残基の置換である、項目６０に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【００７１】
６２．非芳香族残基がシステインである、項目６１に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【００７２】
６３．前記突然変異が、ヒトＧαｑタンパク質の残基７５に対応する位置である、項目５８または５９に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【００７３】
６４．前記突然変異が、非芳香族残基の置換である、項目６３に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【００７４】
６５．前記非芳香族残基がグリシンである、項目６４に記載の突然変異Ｇαポリペプチド。
【００７５】
６６．項目５８〜６５のいずれか１項に記載の突然変異Ｇαポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
【００７６】
６７．項目６６に記載の核酸を含む、プラスミドまたはベクター。
【００７７】
６８．項目６５に記載の核酸または項目６７に記載のプラスミドを含む、細胞。
【００７８】
本発明の他の目的、利点、及び特徴は、添付図面を参照しながら、例としてのみ提示された特定の実施形態についての以下の非限定的な説明を読めば、より明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、Ｇタンパク質活性化因子の一例としてＧＰＣＲを用いて、Ｇタンパク質活性化のためのβγＩＰベースバイオセンサーの使用の基礎をなす原理を示す概略図を示す。アッセイは、Ｇβγ二量体と結合するためのＧαサブユニットとβγＩＰの間の競合に基づいている。不活性形態である間には、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニットは、Ｇβγ二量体と堅く結合している。レセプターとリガンド結合する際に、Ｇαサブユニットは、ＧＤＰ結合形態からＧＴＰ結合形態に切り替わり、Ｇβγサブユニットからの解離をもたらし、βγＩＰが遊離Ｇβγサブユニットに補充される。従って、βγＩＰとＧβγの間の相互作用は、レセプターを刺激する際の特定のＧタンパク質活性化を反映している。様々な検出方法、例えば、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）アプローチ（図１Ａ）、またはタンパク質相補性（ＰＣ）アッセイ（図１Ｂ）を使用して、βγＩＰとＧβγの間の相互作用を評価することができる。共鳴エネルギー転移アプローチでは、βγＩＰ及びＧβγをエネルギードナー及びアクセプターで標識し、Ｇタンパク質を活性化する際に、ＲＥＴシグナルの増加が観察される。タンパク質相補性アッセイの場合では、βγＩＰ及びＧβγは、蛍光タンパク質もしくは発光酵素の断片に融合し、Ｇタンパク質活性化後、２つの断片の相補性は、蛍光シグナルまたは酵素活性の増加をもたらす。図１Ｃは、Ｇタンパク質活性化のβγＩＰベースバイオセンサーの結果の理論的なシナリオ及び対応する解釈を示す。検出方法の一例としてＢＲＥＴを用いた３つの異なるシナリオを図１Ｃに示す。シナリオ１（左）では、細胞は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニット以外はバイオセンサーの全ての成分で形質移入する。αサブユニットの欠如により、過剰なＧβγサブユニットが、基底状態でβγＩＰとの相互作用を引き起こす。シナリオ２（中央）では、バイオセンサーの全ての成分を形質移入するが、過剰発現するＧαサブユニット（Ｇα１）は、目的レセプターと機能的に共役しない。シナリオ３（右）は、その全ての成分が目的レセプターの適正なＧαサブユニット（Ｇα２）と共に発現される場合のバイオセンサーの典型的な反応を示す。この場合、レセプター活性化は、ＢＲＥＴシグナルの増加をもたらし、これは、特異的Ｇαサブユニットに予め共役したＲＬｕｃ標識ＧβγサブユニットへのＧＦＰ標識βγＩＰの補充によって引き起こされる。
【図１Ｂ】上記説明に同じ。
【図１Ｃ】上記説明に同じ。
【図２Ａ】βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーの最適化のために試験した異なる構築物のいくつかを提示する。図２Ａでは、ＧＲＫ２／３の構造を提示する。ＧＲＫ２／３は、異なる機能ドメインであり、カルモジュリン結合ドメイン（ＣＡＭ）、本明細書に記載されたＤ１１０Ａ置換によって不活性化され得るＲＧＳ（Ｇタンパク質シグナル伝達の調節因子）ドメイン、本明細書に記載されたＫ２２０Ｒ置換によって不活性化され得るそのキナーゼ活性の触媒ドメイン、ＰＩＰ２及びヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧβサブユニットと結合するプレクストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン）である。これらの相互作用は、原形質膜へのＧＲＫ転座及びその活性化を促進する。ＧＲＫ（セリン６７０及び６８５）のＣ末端部分のリン酸化は、その活性を調節すると報告されている。ＧＲＫ２及びＧＲＫ３に対する４つの異なるＧＦＰ標識構築物を試験した。そのうちの２つは、完全ＧＲＫコード配列に基づき、２つは、Ｃ末端ＰＨドメイン／Ｇβ結合ドメインに基づき、ＧＦＰは、ＧＲＫのＮ末端またはＣ末端部分のいずれかである。Ｇβ及びＧγサブユニットの双方は、ＢＲＥＴ標識との融合として試験し、ＧＲＫ／Ｇβγ相互作用を監視するのに使用することができる。
【図２Ｂ】図２Ｂ及び図２Ｃは、４つの異なるＧＲＫ構築物（図２Ａ）の異なる比率（滴定）と、Ｇα１５のβ１ＡＲ活性化について得られた反応（図２Ｂ）、及びＧα１１のトロンボキサンＡ２レセプター（ＴＰαＲ）媒介性活性化について得られた反応（図２Ｃ）との試験を示す。アクセプターに対するＢＲＥＴドナーの滴定は、レセプター及びＧα（図２Ｂではβ１ＡＲ／Ｇα１５、図２ＣではＴＰαＲ／Ｇα１１）、Ｇβ１、ＲｌｕｃＩＩ−Ｇγ５（９６ウェルプレートのウェル当たり０．５ｎｇ）をコードする構築物と、及びＧＦＰ１０で標識された可変量（最大７５ｎｇ／ウェル）のＧＲＫ２構築物とで形質移入したＨＥＫ２９３細胞上で行った。細胞をビヒクルまたはアゴニスト（β１ＡＲ及びＴＰαＲをそれぞれ発現する細胞について、１μＭのイソプロテレノール及び１００ｎＭのＵ−４６６１９）で１５分間処理した。ＢＲＥＴ比は、ＲｌｕｃＩＩ構築物発現（生物発光で評価）に対するＧＦＰ構築物発現（蛍光で評価）の関数で報告された。そのＣ末端にてＢＲＥＴドナー（ＧＦＰ）で標識された全長ＧＲＫは、より広範囲のドナー対アクセプター比にわたって、ＢＲＥＴシグナルの振幅及び反応の安定性について最良の動的ウィンドウを与えていることが、これらの結果により示される。
【図２Ｃ】上記説明に同じ。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、βγＩＰベースバイオセンサーを用いた、ＴＰαＲのＧタンパク質活性化プロファイルを示す。図３Ａ：ＧＲＫ２−ＧＦＰ、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、Ｇβ１、及び示されたＧαと共にＴＰαＲを一過性発現しているＨＥＫ２９３細胞を、ＢＲＥＴ測定前に１００ｎＭのＵ−４６６１９またはビヒクルに１５分間曝した。模擬条件は、いずれのＧαサブユニット過剰発現がないものである。図３Ｂ：図３Ａのアゴニスト処理細胞について得られたＢＲＥＴ値は、ビヒクルで処理した対応する細胞で得られたＢＲＥＴ値のパーセンテージとして表わした。模擬条件を使用して、陽性反応の閾値を決定する。図３Ｃ：ＧＲＫ２−ＧＦＰ／Ｒｌｕｃ−Ｇγ５／Ｇβ１バイオセンサーを用いた、ＴＰαＲのＧαｑ、Ｇα１３、Ｇα１４、Ｇα１５、ＧαｑＧ６６Ｋ、及びＧαｑＹ６７Ｃ活性化についてのアゴニストＵ−４６６１９を用いた用量反応曲線。
【図３Ｂ】上記説明に同じ。
【図３Ｃ】上記説明に同じ。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｊは、βγＩＰベースバイオセンサーを用いた、ドーパミンＤ２レセプター（Ｄ２Ｒ）、α１Ｂ−アドレナリンレセプター（α１ＢＡＲ）、及びα２ｃ−アドレナリンレセプター（α２ｃＡＲ）のＧタンパク質活性化プロファイルを示す。ＧＲＫ２−ＧＦＰ、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、Ｇβ１、及び示されたＧαと共にＤ２Ｒ（図４Ａ及び４Ｂ）、α１ＢＡＲ（図４Ｃ及び４Ｄ）、またはα２ＣＡＲ（図４Ｅ及び４Ｆ）を一過性発現しているＨＥＫ２９３細胞を、ＢＲＥＴ測定前に１５分間、以下のアゴニスト、ロチゴチン（図４Ａ及び４Ｂ）、フェニルエピネフリン（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ）、またはエピネフリン（図４Ｅ）で刺激した。図４Ａ、４Ｃ及び４Ｅ：データは、ビヒクル処理細胞で得られたＢＲＥＴシグナルのパーセンテージとして表わす。いずれのＧαサブユニット過剰発現がない模擬条件を使用して、陽性反応の閾値を決定した。図４Ａ、４Ｃ及び４Ｅに提示したように、ＧαｑＹ６７Ｃなどの、無差別の活性化特性を有するＧタンパク質を使用して、レセプター活性化を監視することができた（図１４で位置及び周辺配列を参照されたい）。Ｇαのこれらの無差別突然変異体をレセプター活性化の陽性対照として使用することができ、これは、アンタゴニストの特徴付けまたは孤児レセプターアゴニストのスクリーニングに有用であり得る。図４Ｂは、ＧＲＫ２−ＧＦＰ／Ｒｌｕｃ−Ｇγ５／Ｇβ１バイオセンサーを用いて、選択されたＧαタンパク質（Ｇαｉ１及び４つの無差別Ｇαｑ突然変異体：Ｇ６６Ｋ、Ｇ６６Ｄ、Ｙ６７Ｃ及びＦ７５Ｇ）によるロチゴチン、Ｄ２Ｒアゴニストの用量反応曲線である。図４Ｄでは、用量反応曲線は、ＧＲＫ２−ＧＦＰ／Ｒｌｕｃ−Ｇγ５／Ｇβ１バイオセンサーを用いて、α１ＢＡＲ及び選択されたＧαタンパク質（Ｇα１１及びＧαｑ）によるフェニレフリン、α−アドレナリンアゴニストについて提示される。図４Ｅでは、Ｇαｚ活性化の用量反応曲線は、α２ＣＡＲ、Ｇαｚ、ＧＲＫ２−ＧＦＰ、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧβ１を発現しているＨＥＫ２９３細胞から異なるアドレナリンアゴニスト：エピネフリン、ノルエピネフリン、フェニレフリン、及びイソプロテレノールについて得られた。図４Ｆは、２つの異なるα２ＣＡＲアゴニスト、エピネフリン及びフェニレフリンを用いた、α２ＣＡＲのＧタンパク質活性化プロファイルを示す。βγＩＰベースバイオセンサーを使用して、異なるレセプター及びリガンドのＧタンパク質活性化及び薬理学的プロファイルを確立することができることを、これらの結果は示している。図４Ｇ〜４Ｊでは、エピネフリン／α２ＣＡＲで促進されたＧαｚ活性化の用量反応曲線は、種々の組み合わせのＧβγサブユニットで得られた。α２ＣＡＲ、Ｇαｚ、ＧＲＫ２−ＧＦＰ、異なるＲｌｕｃ標識Ｇγ（図４Ｇ及び４Ｈ）、及びＧβ（図４ＧではＧβ１、図４ＨではＧβ３の短い変異体（Ｇβ３ｓｈ））をコードする構築物でＨＥＫ２９３細胞を形質移入した。図４Ｉ及び４Ｊでは、α２ＣＡＲ、Ｇαｚ、ＧＲＫ２−ＧＦＰ、Ｒｌｕｃ標識Ｇγ（図４ＩではＧγ１、図４ＪではＧγ５）、及び異なるＧβをコードする構築物で細胞を形質移入した。Ｇβ及びＧγサブユニットの双方の組み合わせが、Ｇタンパク質活性化の別個の薬理学的プロファイルをもたらし得ることを、これらの結果は示している。これらの差は、一部は、特異的集合のＧαサブユニットだけでなく、種々の組み合わせ及びレベルのＧβ及びＧγサブユニットも発現している異なる細胞及び組織で観察された別個の薬理学的プロファイルに関連している。βγＩＰベースバイオセンサーが、これらの差を研究し、より良く理解するのに有用であり得ることを、これらの結果は示している。
【図４Ｂ】上記説明に同じ。
【図４Ｃ】上記説明に同じ。
【図４Ｄ】上記説明に同じ。
【図４Ｅ】上記説明に同じ。
【図４Ｆ】上記説明に同じ。
【図４Ｇ】上記説明に同じ。
【図４Ｈ】上記説明に同じ。
【図４Ｉ】上記説明に同じ。
【図４Ｊ】上記説明に同じ。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、βγＩＰベースバイオセンサーを使用して、Ｇタンパク質調節因子選択性及び作用モードを特徴付けて、妥当性を確認することができることを示す。図５Ａ及び５Ｂは、ＰＴＸ（Ｇαｉ／Ｇαｏ阻害薬）によるＧαｉ１、及びＵｂｏ−Ｑｉｃ（Ｇαｑインヒビターの類似体：ＹＭ−２５４８９０）によるＧαｑの選択的阻害を示す。Ｇβ１、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧＲＫ２−ＧＦＰと共にＴＰαＲ及びＧαｑ（図５Ａ）、またはＤ２Ｒ及びＧαｉ１（図５Ｂ）を発現しているＨＥＫ２９３細胞をＰＴＸ、Ｕｂｏ−Ｑｉｃ、またはビヒクル（対照）で前処理した後、Ｕ−４６６１９（図５Ａ）またはロチゴチン（図５Ｂ）の濃度を増加させて１５分間曝し、ＢＲＥＴシグナルを記録した。図５Ｃでは、ＴＰαＲ媒介性Ｇタンパク質活性化を使用して、Ｕｂｏ−Ｑｉｃインヒビター選択性の妥当性を確認した。ＴＰαＲ、及びバイオセンサーＧＲＫ２−ＧＦＰ／Ｒｌｕｃ−Ｇγ５／Ｇβ１＋示されたＧαサブユニットを共発現している細胞をＵｂｏ−Ｑｉｃで前処理し、ビヒクルまたはアゴニスト：Ｕ−４６６１９（１００ｎＭ）のいずれかに曝した。Ｇαｑファミリー（Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４及びＧα１５）から、Ｇα１５のみが、Ｕｂｏ−Ｑｉｃに非感受性であることを、これらの結果は示している。Ｇα１２及びＧα１３タンパク質も、Ｕｂｏ−Ｑｉｃに非感受性である。図５Ｄでは、βγＩＰベースバイオセンサーを使用して、突然変異体Ｇαｑ活性化のＵｂｏ−Ｑｉｃ感受性を明らかにした。Ｇαｑ置換を６７位で導入した（図１４を参照）。Ｕｂｏ−Ｑｉｃ阻害に耐性があるチロシン残基の置換のみ（Ｙ６７Ｃ、Ｙ６７Ｇ、Ｙ６７Ｓ、及びＹ６７Ｌ）が無差別特性も示し、これは、この残基がＧタンパク質活性化を制御するのに重要でもあり得ることを示した。Ｐｈｅ７５残基のグリシンへの置換は、活性化（図５Ｄ）の部分的なＵｂｏ−Ｑｉｃ媒介性阻害のみをもたらし、無差別表現型（図４Ａを参照）ももたらした。
【図５Ｂ】上記説明に同じ。
【図５Ｃ】上記説明に同じ。
【図５Ｄ】上記説明に同じ。
【図６Ａ】図６Ａ及び６Ｂは、レセプター活性化時のβγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサー反応の動態を示す。図６Ａ：Ｇαｉ１、Ｇβ１、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧＲＫ２−ＧＦＰと共にＤ２Ｒを一過性発現しているＨＥＫ２９３細胞を１μＭのロチゴチンまたはビヒクルに曝した一方、ＢＲＥＴ測定を一定間隔で行った。図６Ｂ：Ｇα１１、Ｇβ１、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧＲＫ２−ＧＦＰと共にＴＰαＲを一過性発現しているＨＥＫ２９３細胞を１００ｎＭのＵ−４６６１９またはビヒクル曝した一方、ＢＲＥＴ測定を一定間隔で行った。いずれの場合も、アゴニスト及びビヒクルを測定３０秒後に細胞に添加した。
【図６Ｂ】上記説明に同じ。
【図７Ａ】図７Ａ及び７Ｂは、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーのＺ’因子評価を示す。Ｇβ１、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧＲＫ２−ＧＦＰと共にＤ２Ｒ及びＧαｉ１（図７Ａ）またはＴＰαＲ及びＧα１１（図７Ｂ）を一過性発現しているＨＥＫ２９３細胞を１μＭのロチゴチン（図７Ａ）、１００ｎＭのＵ−４６６１９（図７Ｂ）、またはビヒクル（図７Ａ、７Ｂ）のいずれかに１５分間曝した。９６ウェルプレートの個々のウェルごとにＢＲＥＴ比を表す。これらの代表的な実験のＺ’因子は、Ｄ２Ｒ（図７Ａ）及びＴＰαＲ（図７Ｂ）についてそれぞれ０．７９及び０．８９で評価した。
【図７Ｂ】上記説明に同じ。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーによるリガンドプロファイリングを示す。図８Ａ：１μＭのアンジオテンシンＩＩでＢＲＥＴ測定前に１５分間刺激した、Ｇβ１、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、ＧＲＫ２−ＧＦＰ、及び示されたＧαと共にアンジオテンシンＩＩ型１レセプター（ＡＴ１Ｒ）を一過性発現しているＨＥＫ２９３細胞のＧタンパク質活性化プロファイルである。図８Ｂ：Ｇαｑ、Ｇα１１、及びＧα１２のアンジオテンシンＩＩ類似体（１μＭ）の飽和濃度のＧタンパク質活性化プロファイルである。図８Ａ及び８Ｂの結果は、ビヒクル処理細胞で得られたＢＲＥＴシグナルのパーセンテージとして表わし、いずれのＧαサブユニット過剰発現がない模擬条件を使用して、陽性反応の閾値を決定した。図８Ｃ：ＧＲＫ２−ＧＦＰ／Ｒｌｕｃ−Ｇγ５／Ｇβ１バイオセンサーを用いたＧαｑ及びＧα１２の活性化についてＡｎｇＩＩ及びＤＶＧリガンドを用いて得られた用量反応曲線である。データは、各Ｇタンパク質について得られたＡｎｇＩＩ反応の％として表わす。
【図８Ｂ】上記説明に同じ。
【図８Ｃ】上記説明に同じ。
【図９Ａ】図９Ａ及び９Ｂは、βγＩＰベースバイオセンサーによるＧタンパク質活性化を評価するためのタンパク質相補性ベース検出方法；Ｒｌｕｃタンパク質相補性アッセイ（Ｒｌｕｃ−ＰＣＡ）を示す。図９Ａ：１００ｎＭのＵ−４６６１９またはビヒクルで１０分間刺激した、ＴＰαＲ、ＧＲＫ２−ＲｌｕｃＦ１、ＲｌｕｃＦ２−Ｇγ５、Ｇβ１、及びＧα１１サブユニットで形質移入したＨＥＫ２９３細胞について得られたＺ’因子である。発光値は、９６ウェルプレートの個々のウェルごとに表わす。この代表的な実験のＺ’因子は、０．５３で評価した。図９Ｂ：ＧＲＫ２−ＲｌｕｃＦ１／ＲｌｕｃＦ２−Ｇγ５／Ｇβ１バイオセンサーを用いたＧα１１の活性化についてアゴニストＵ−４６６１９を用いた用量反応曲線である。
【図９Ｂ】上記説明に同じ。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、Ｇタンパク質活性化を評価するためにβγＩＰとしてＧＲＫ３の使用を示す。図１０Ａ：Ｇαｉ１、Ｇβ１、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧＲＫ２−ＧＦＰ（黒い丸）またはＧＲＫ３−ＧＦＰ（白い三角）と共にＤ２Ｒを一過性発現しているＨＥＫ２９３細胞から得られた用量反応曲線である。該ＨＥＫ２９３細胞をアゴニストロチゴチンの濃度を増加させてＢＲＥＴ測定前に１５分間曝した。図１０Ｂ：Ｄ２Ｒ、Ｇαｉ１、Ｇβ１、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧＲＫ３−ＧＦＰで形質移入したＨＥＫ２９３細胞のＧＲＫ３ベースバイオセンサー反応の動態である。該ＨＥＫ２９３細胞を１μＭのロチゴチンまたはビヒクルで曝した一方、ＢＲＥＴ測定を一定間隔で行った。アゴニスト及びビヒクルを測定３０秒後に細胞に注入した。図１０Ｃ：Ｄ２Ｒ、Ｇαｉ１、Ｇβ１、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧＲＫ３−ＧＦＰで形質移入したＨＥＫ２９３細胞のＧＲＫ３ベースバイオセンサーのＺ’因子評価である。該ＨＥＫ２９３細胞は、１μＭのロチゴチンまたはビヒクルのいずれかに１５分間曝した。ＢＲＥＴ比を９６ウェルプレートの個々のウェルごとに表わす。この代表的な実験のＺ’因子は、０．７１で評価した。
【図１０Ｂ】上記説明に同じ。
【図１０Ｃ】上記説明に同じ。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｄは、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーをコードする多シストロン性ベクターを用いて行った実験の結果を示す。図１１Ａ：以下タンパク質：ＧＲＫ２−ＧＦＰ、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧβ１をコードする多シストロン性構築物を示す概略図である。ＴＰαＲ、Ｇα（Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、またはＧα１５／１６のいずれか；模擬条件はＧα無しであった）をコードする構築物と、及びＧＦＰ標識ＷＴ  ＧＲＫ２またはＧＲＫ２のＲＧＳ死突然変異体（Ｄ１１０Ａ）をコードする多シストロン性構築物（図１１Ａに記載）とで共形質移入したＨＥＫ２９３細胞のＧタンパク質活性化プロファイルを図１１Ｂに提示する。そのアゴニスト（１００ｎＭのＵ４６６１９）によるＴＰαＲ活性化は、両方の多シストロン性構築物とも同様の結果及びプロファイルをもたらし、機能性ＲＧＳドメインはＧＲＫ２補充に不可欠ではないことを示した。図１１Ｃ：図１１Ａに記載した多シストロン性構築物（ＷＴ  ＧＲＫ２を有する）ＴＰαＲのＧα１１活性化についてアゴニストＵ−４６６１９を用いた用量反応曲線である。図１１Ｄでは、Ｚ’因子は、図１１Ｃと同様に形質移入し、１００ｎＭのＵ−４６６１９またはビヒクルで１５分間刺激したＨＥＫ２９３細胞について得られた。ＢＲＥＴ比を９６ウェルプレートの個々のウェルごとに表わす。この代表的な実験のＺ’因子は、０．８０で評価した。
【図１１Ｂ】上記説明に同じ。
【図１１Ｃ】上記説明に同じ。
【図１１Ｄ】上記説明に同じ。
【図１２Ａ】図１２Ａ及び１２Ｂは、膜に固定されたβγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーを示す。図１２Ａ：膜固定ＧＲＫ２（ＧＲＫ２−膜）ベースバイオセンサー及びＧＲＫ２−ＧＦＰ−膜をコードする関連ＤＮＡ構築物の使用の基礎をなす原理を示す概略図である。図１２Ｂ：膜調製物は、Ｇα１１の不在下または存在下で、１００ｎＭのＵ−４６６１９またはビヒクルで１５分間刺激した、ＴＰαＲ、Ｇβ１、ＲｌｕｃＩＩ−Ｇγ５、ＧＲＫ２−ＧＦＰ、またはＧＲＫ２−ＧＦＰ−膜で形質移入したＨＥＫ２９３細胞から得られた。次いで、ＢＲＥＴ実験をこれらの膜調製物で行った。データは、ビヒクル処理細胞で得られたＢＲＥＴシグナルのパーセンテージとして表わす。
【図１２Ｂ】上記説明に同じ。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｃは、ＧＲＫ２機能（ＲＧＳ及び触媒）またはリン酸化によるその調節に影響を及ぼすと報告された置換は、活性化Ｇタンパク質への補充を防がず、著しく促進もしないことを示す。図１３Ａでは、ＴＰαＲ、Ｇαｑ、Ｇβ１、ＲｌｕｃＩＩ−Ｇγ５、及びＧＲＫ２−ＧＦＰの変異体（ＷＴ＝黒四角、ＲＧＳが死んだＤ１１０Ａ突然変異体＝白丸、及び触媒的に死んだＫ２２０Ｒ突然変異体＝白三角）を共発現しているＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ４６６１９の用量を増加させながら刺激した。図１１Ｂ及び１３Ａに示すように、機能性ＲＧＳドメインは、バイオセンサーで検出したＧαｑ反応を必要としない（促進もしない）。ＧＲＫ２の触媒的に死んだ突然変異体は、２つの構成でこのバイオセンサー（図１３Ａ及び１３Ｃ）と共に使用することもできる：Ｇタンパク質活性化は、遊離Ｇβ１／ＲｌｕｃＩＩ−Ｇγ５とのＧＲＫ２−ＧＦＰ相互作用（図１３Ａ）、及び遊離Ｇβ１／ＧＦＰ１０−Ｇγ５とのＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＫ２相互作用（図１３Ｃ）からＢＲＥＴの増加として測定した。これらの突然変異体を使用することで、機能性キナーゼを過剰発現する副作用を最小限にし、これは、ＲＧＳドメインを介してＰＬＣのＧαｑ媒介性活性化を阻害することが知られている。そのような突然変異体の使用は、センサーの多重化を介した多数のシグナル伝達経路または異なるアッセイを監視することを必要とする用途において有利であり得る。図１３Ｂでは、ＨＥＫ２９３細胞は、図１３Ａと同様ではあるが、ＷＴ  ＧＲＫ２（黒四角）、または、そのＣ末端結合ドメインのリン酸化を防止する（Ｓ６７０Ａ＝白三角、Ｓ６７６Ａ＝白菱形、及びＳ６８５Ａ＝白丸）かまたは模倣する（Ｓ６７０Ｄ＝黒三角、Ｓ６７６Ｄ＝黒菱形、及びＳ６８５Ｄ＝黒丸）突然変異体のいずれかで形質移入した。ＥＲＫ、ＰＫＡ、及びＣＤＫ２−シクリンＡによるこれらのセリン残基上のＧＲＫ２のリン酸化は、その活性を調節することが知られている（Ｃｏｎｇら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６，１５１９２−１５１９９；Ｐｉｔｃｈｅｒら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，３４５３１−３４５３４；Ｐｅｎｅｌａら、ＰＮＡＳ，１０７（３）：１１１８−１１２３；Ｃｈｏｕｄｈａｒｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００９  ３６（２）：３２６−３９）。しかしながら、図１３Ｂに提示される結果は、ＧβγへのＧＲＫ２補充が、異なるシグナル伝達事象による調節に非感受性であり得る証拠を提供している。図１３Ｃでは、ＴＰαＲ、Ｇαｑ、Ｇβ１、ＧＦＰ−Ｇγ５、及びＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＫ２の変異体（ＷＴ＝黒四角、及び触媒的に死んだＫ２２０Ｒ突然変異体＝白三角）を共発現しているＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ４６６１９の用量を増加させながら刺激した。ＧＲＫ２のＮ末端（図１３Ｃ）またはＣ末端（図１３Ａ）のいずれかに標識を有するＢＲＥＴドナー及びアクセプターの両方の構成は、同様の結果をもたらし、バイオセンサーの構成が柔軟である証拠を提供している。
【図１３Ｂ】上記説明に同じ。
【図１３Ｃ】上記説明に同じ。
【図１４】ヒトＧタンパク質αサブユニット（配列番号１−１７）と、無差別カップリング特性をもたらす置換との配列アラインメントを示す。ヘテロ三量体Ｇタンパク質のヒトＧαサブユニットは、ＤＩＡＬＩＧＮツール（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｂｉｓｅｒｖ．ｔｅｃｈｆａｋ．ｕｎｉ−ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ．ｄｅ／ｄｉａｌｉｇｎ／ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ．ｈｔｍｌ）を用いて位置合わせし、Ｂｏｘｓｈａｄｅツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＢＯＸ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を用いてフォーマット化し、リンカー１と中心が合っている領域を提示する。Ｇαサブユニットを通じて高い保存を示す残基は、黒色及び灰色の背景で識別する。二次構造予測からのリンカー１及びαヘリックスも識別する。
【図１５Ａ】ＲＥＴアクセプター（Ａ）で標識されたβγＩＰ（ＧＲＫ）と、そのＣ末端にてＲＥＴドナー（Ｄ）で標識されたＧＰＣＲとを含むバイオセンサーを示す概略図を示す。アッセイは、ＧＰＣＲのＣ末端部分と結合しているＧβγ二量体と結合するためのＧαサブユニットとβγＩＰの間の競合にも基づいている。不活性形態である間には、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニットは、Ｇβγ二量体と堅く結合している。ＧＰＣＲとリガンド結合する際に、ＧαはＧβγサブユニットから解離し、βγＩＰを遊離Ｇβγサブユニットに補充させ、ＧＰＣＲに結合したＲＥＴドナーにＲＥＴアクセプターを近接させることによって、ＢＲＥＴシグナルを誘発／増加させる。図１５Ｂ及び１５Ｃは、図１５Ａに記載したバイオセンサーで得られたＧタンパク質活性化の用量反応曲線を示す。ＴＰαＲ−ＲｌｕｃＩＩ、異なるＧα（Ｇαｑ＝黒四角、Ｇα１１＝黒三角、Ｇα１４＝黒菱形、及びＧα１２＝白丸）、Ｇβ１、Ｇγ５、及びＷＴ  ＧＲＫ２−ＧＦＰ（図１５Ｂ）または突然変異体Ｄ１１０Ａ  ＧＲＫ２−ＧＦＰ（図１５Ｃ）のいずれかを共発現しているＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ４６６１９の用量を増加させながら刺激した。用量反応曲線は、図１５Ｂ及び１５Ｃと同様のプロファイルを示し、図１１Ｂ及び１３Ａと同様ではあるが、異なるバイオセンサー構成を有しており、活性化Ｇタンパク質にβγＩＰを補充するのに機能性ＲＧＳは必要とされないことを示している。
【図１５Ｂ】上記説明に同じ。
【図１５Ｃ】上記説明に同じ。
【図１６Ａ】ＲＥＴドナー（Ｄ）で標識されたβγＩＰ（ＧＲＫ）と、アンカー配列（例えば、ＣＡＡＸドメイン）を標的化する原形質膜で標識された原形質膜マーカー：ＲＥＴアクセプター（Ａ）とを含むバイオセンサーを示す概略図を示す。アッセイは、原形質膜でＧβγ二量体と結合するためのＧαサブユニットとβγＩＰの間の競合にも基づいている。不活性形態である間には、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニットは、Ｇβγ二量体と堅く結合している。ＧＰＣＲとリガンド結合する際に、ＧαはＧβγサブユニットから解離し、βγＩＰを遊離Ｇβγサブユニットに補充させ、原形質膜で、ＲＥＴドナー（βγＩＰ−Ｄ）及びアクセプター（原形質膜マーカー、Ａ−ＣＡＡＸ）の密度の増加をもたらすことによって、ＢＲＥＴシグナルを誘発／増加させる。図１６Ｂは、図１６Ａに記載したバイオセンサーで得られたＧタンパク質活性化の用量反応曲線を示す。ＴＰαＲ、異なるＧα（Ｇαｑ＝黒四角、Ｇα１１＝黒三角、模擬条件（Ｇα無し）＝白丸）、Ｇβ１、Ｇγ５、ＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＫ２、及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを共発現しているＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ４６６１９の用量を増加させながら刺激した。図１６Ｂの用量反応曲線は、図３Ｃ、９Ｂ、及び１１Ｃで得られたものと同様であるが、異なる構成のバイオセンサーである。図１６Ｃでは、Ｚ’因子は、図１６Ｂと同様に形質移入し、１００ｎＭのＵ−４６６１９またはビヒクルで１５分間刺激したＨＥＫ２９３細胞について得られた。ＢＲＥＴ比を９６ウェルプレートの個々のウェルごとに表わす。この代表的な実験のＺ’因子は、０．８９で評価した。
【図１６Ｂ】上記説明に同じ。
【図１６Ｃ】上記説明に同じ。
【図１７Ａ】Ｄ１１０位、Ｋ２２０Ｒ位、Ｓ６７０位、Ｓ６７６位、及びＳ６８５位（本明細書に記載された構築物のいくつかで突然変異した）を太字、推定ＰＨドメインに下線を引き、本明細書に記載された構築物のいくつかで使用されたそのＣ末端部分（ＧＲＫ２  Ｃ末端、配列番号５０）をイタリック体にした、ヒトＧＲＫ２（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す。
【図１７Ｂ】推定ＰＨドメインに下線を引き、本明細書に記載された構築物のいくつかで使用されたそのＣ末端部分のアミノ酸配列（ＧＲＫ３  Ｃ末端、配列番号５１）イタリック体にした、ヒトＧＲＫ３（配列番号１９）のアミノ酸配列を示す。
【図１７Ｃ】推定ＰＨドメインに下線を引いた、ＰＬＥＫＨＧ２（配列番号２０）のアミノ酸配列を示す。
【図１７Ｄ】本明細書に記載された実験で使用したＧＦＰ１０（配列番号３８）のアミノ酸配列を示す。
【図１７Ｅ】本明細書に記載された実験で使用したレニラ・レニホルミスＧＦＰ（ｒＧＦＰ、配列番号４６）のアミノ酸配列を示す。
【図１７Ｆ】本明細書に記載された実験で使用したＲＬｕｃＩＩ（配列番号３９）のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
本明細書で使用されている遺伝学、分子生物学、生化学、及び核酸化学の用語及び記号は、当該技術分野の標準的専門書及び教科書の記載に従うものとする：例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第２版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｇａｉｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）；などである。全ての用語は、該当技術分野で確立された典型的な意味を持つと理解すべきである。
【００８１】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書で使用する場合、当該冠詞の文法的な対象の１つまたは２つ以上（即ち、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。本明細書を通して、文脈により他に必要とされない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言明されたステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を含意し、任意の他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の除外を含意しないことが理解されるであろう。
【００８２】
本明細書に記載された研究では、本発明者らは、βγＩＰ競合ベースバイオセンサーを使用して、レセプター及び／またはＧαサブユニットの改変を必要としないでＧタンパク質活性化を監視することができることを示している。競合に基づいているため、全ての異なるＧタンパク質を研究し、共形質移入したＧαサブユニットに基づいてＧタンパク質活性化／カップリングプロファイルを確立するために単一バイオセンサーが必要とされる。Ｇタンパク質活性化プロファイルは、レセプター及び薬剤標的を特徴付けるために重要であるだけでなく、治療効果や副作用の減少と関連付けたバイアスシグナル伝達特性を有するＧＰＣＲリガンドを同定し、特徴付け、最適化する創薬プロセスに有用でもあり得る。
【００８３】
本開示は、Ｇαタンパク質サブユニットまたはＧタンパク質活性化因子（例えば、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）、Ｇタンパク質シグナル伝達（ＡＧＳ）の活性化因子、Ｇタンパク質シグナル伝達の調節因子、または他の化学的または生物学的物質）のいずれかを改変することなく、Ｇタンパク質活性化を監視するための万能バイオセンサーに関する。より具体的には、本開示は、種々のヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化を監視するためのＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）の使用に関する。本明細書で開示されたシグナル伝達バイオセンサーにより、Ｇタンパク質活性を標的化するリガンド（アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、アロステリック調節因子など）を同定するための大規模なスクリーニングアッセイ及び構造−活性の相関研究に使用できる高感度な定量分析が可能になることが有利である。さらに、本明細書で開示されたバイオセンサーは、Ｇタンパク質活性化プロファイルを評価するためのツールを表し、どの特異的Ｇタンパク質が刺激時に活性化されるかを対処することによって化合物プロファイリングが可能になる。
【００８４】
図１に示すように、本開示の実施形態によるシステムは、Ｇβγ二量体と結合するためのＧαサブユニットとβγＩＰの間の競合に基づいている。不活性形態である間には、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニットは、Ｇβγ二量体と堅く結合している。レセプターとリガンド結合する際に、Ｇαサブユニットは、ＧＤＰ結合形態からＧＴＰ結合形態に切り替わり、Ｇβγサブユニットからの解離をもたらし、βγＩＰが遊離Ｇβγサブユニットに補充される。従って、βγＩＰとＧβγの間の相互作用は、レセプターを刺激する際の特定のＧタンパク質活性化を反映している。
【００８５】
本発明者らは、相補的ＢＲＥＴアクセプター（例えば、ｒＧＦＰ）で標識された原形質膜標的化部分を用いて、原形質膜（ＧＰＣＲに結合したＧβγ複合体と相互作用する）にてＢＲＥＴドナー（例えば、ＲＬｕｃ）で標識されたβγＩＰ（例えば、ＧＲＫ）の補充／局在化を測定するバイオセンサーを用いて、Ｇタンパク質活性化を監視することが可能であることを示している。原形質膜でのβγＩＰの濃度／密度の増加（Ｇβγ複合体へのβγＩＰの補充の間接的測定）は、ＢＲＥＴシグナルの増加によって検出される。
【００８６】
本発明者らは、ＢＲＥＴドナー（例えば、ＲＬｕｃ）で標識されたβγＩＰ（例えば、ＧＲＫ）の、相補的ＢＲＥＴアクセプター（例えば、ｒＧＦＰ）で標識されたＧＰＣＲへの補充を測定するバイオセンサーを用いて、Ｇタンパク質活性化を監視することが可能であることもさらに示している（図１５）。
【００８７】
この文脈において、本開示は、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーと、活性化因子によって促進される特異的Ｇタンパク質の活性化を評価するためにそのようなバイオセンサーを使用するシステムとに関する。本システムは、Ｇタンパク質活性化因子；Ｇαタンパク質；及び本明細書に記載されたバイオセンサーを含む。本開示はさらに、本明細書で開示されたシステムを用いて、Ｇタンパク質活性化を検出するための方法に関する。
【００８８】
従って、本開示は、Ｇタンパク質活性を検出するためのバイオセンサーシステムに関し、前記バイオセンサーシステムは、（Ａ）、または（Ｂ）で定義される要素を含む：
（Ａ）
（ａ）共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）ドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び融合Ｇβタンパク質または融合Ｇγタンパク質を含む第２の成分、前記Ｇβタンパク質または前記Ｇγタンパク質は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；を含む、（ｉ）第１のバイオセンサー、
（ｉ）で定義される前記第１及び第２の成分；及び組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；を含む、（ｉｉ）第２のバイオセンサー、または
（Ｂ）
（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；融合Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）を含む第２の成分、前記ＧＰＣＲは、そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している、を含む、（ｉ）バイオセンサー。
【００８９】
従って、本開示は、（１）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；（２）融合Ｇβタンパク質または融合Ｇγタンパク質を含む第２の成分、前記Ｇβタンパク質または前記Ｇγタンパク質は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；（３）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分、前記組換えＧαタンパク質は、無差別または非選択的Ｇαタンパク質、例えば、例えば、本明細書に記載されるヒトＧαｑの残基６６、６７、及び／または７５に対応する位置で突然変異を含むＧαタンパク質である、を含むバイオセンサーに関する。実施形態では、バイオセンサーは、ＧＰＣＲ（天然または組換え）、好ましくは、孤児ＧＰＣＲをさらに含む。
【００９０】
実施形態では、上記に定義されたバイオセンサーは、組換えＧβタンパク質、及び／または組換えＧγタンパク質をさらに含む。さらなる実施形態では、上記に定義されたバイオセンサーは、組換えＧβタンパク質、及び組換えＧγタンパク質をさらに含む。実施形態では、上記に定義されたバイオセンサーは、ＧＰＣＲをさらに含み、さらなる実施形態では、組換えＧＰＣＲをさらに含む。
【００９１】
別の態様では、従って、本開示は、（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；及び（ｉｉ）融合原形質膜（ＰＭ）標的化部分を含む第２の成分、前記ＰＭ標的化部分は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している、を含むバイオセンサーに関する。
【００９２】
非限定的な一実施形態では、本明細書に記載されたバイオセンサーの活性は、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）、例えば、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）、または蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）；タンパク質相補性アッセイまたはタンパク質−断片補体アッセイ（ＰＣＡ）、例えば、酵素断片相補性（ＥＦＣ）、または二分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）などから選択された技術に基づいて検出可能である（図１を参照）。そのような技術は、当該技術分野で公知であり、バイオセンサーのＣ末端、Ｎ末端、またはバイオセンサーのタンパク質要素内で融合し得る標識／部分を採用する。
【００９３】
共鳴エネルギー転移アプローチでは、βγＩＰ及びＧβγを、エネルギードナー及びアクセプターで標識し、Ｇタンパク質を活性化する際に、ＲＥＴシグナルの増加が観察される。タンパク質相補性アッセイの場合では、βγＩＰ及びＧβγを、蛍光タンパク質もしくは発光酵素などのレポータータンパク質の断片で標識し、Ｇタンパク質活性化後、２つの断片の相補性は、レポータータンパク質シグナル、例えば、蛍光シグナルまたは酵素活性の増加をもたらす。
【００９４】
共鳴エネルギー転移（ＲＥＴと略す）は、重複発光／吸収スペクトルを有する２つの発色団の間のエネルギー転移を記述するメカニズムである。２つの発色団（「ドナー」及び「アクセプター」）が互いに短い距離（例えば、１０〜１００オングストローム）内にあり、それらの遷移双極子が適切に配向している場合、ドナー発色団は、非放射性双極子−双極子カップリングを介してその励起状態エネルギーをアクセプター発色団に転移することができる。ＲＥＴの１つの型は、ドナー生物発光団（ルシフェラーゼなどの生物発光酵素）とアクセプターフルオロフォア（例えば、ＧＦＰまたはＹＦＰ）との間のエネルギーの非放射性転移に基づいている生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）である。ＲＥＴの別の型は、励起ドナーフルオロフォアから隣接アクセプターフルオロフォアへのエネルギーの転移を伴う蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）である。例えば、ＧＦＰの２つの色変異体であるＣＦＰ及びＹＦＰは、それぞれ、ドナー及びアクセプターとして使用することができる。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「蛍光タンパク質」は、適切な波長で励起した際に蛍光になる任意のタンパク質を指す。ほぼ全ての可視光線スペクトルに及ぶ蛍光発光スペクトルプロファイルを特色にする広範囲の蛍光タンパク質が開発されている。緑色蛍光タンパク質の非限定例としては、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ１０、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、及びＴ−Ｓａｐｐｈｉｒｅが挙げられる。青色蛍光タンパク質の非限定例としては、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、及びｍＴａｇＢＦＰが挙げられる。シアン蛍光タンパク質の非限定例としては、ＥＣＦＰ、ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、及びｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）が挙げられる。黄色蛍光タンパク質の非限定例としては、ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＶｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、及びｍＢａｎａｎａが挙げられる。橙色蛍光タンパク質の非限定例としては、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、及びｍＴａｎｇｅｒｉｎｅが挙げられる。赤色蛍光タンパク質の非限定例としては、ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、及びＡＱ１４３が挙げられる。
【００９６】
本発明の文脈で使用される「重複」は、ドナー蛍光タンパク質もしくは発光酵素（例えば、ルシフェラーゼ）から発せられた光を、通常は約１０〜１００Å（約１〜１０ｎｍ）内に近接して配置されたフルオロフォア（アクセプター蛍光タンパク質）を励起することが可能な波長にする能力を指す。従って、ドナー蛍光または発光タンパク質及びアクセプター蛍光タンパク質は、第１及び第２の成分が（即ち、複合体の形態で、または原形質膜などの同じ細胞区画で）近接している場合、バイオセンサーの第１の成分に付着したドナー蛍光または発光タンパク質からバイオセンサーの第２の成分に付着したアクセプター蛍光タンパク質にエネルギーを転移することができるように選択される。そのようなエネルギー転移は、「蛍光（またはＦｏｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー転移」または「ＦＲＥＴ」（ドナータンパク質が蛍光タンパク質である場合）、または「生物発光共鳴エネルギー転移」または」ＢＲＥＴ」（ドナータンパク質が生物発光タンパク質である場合）と一般に呼ばれる。従って、ドナー蛍光または発光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質との任意の組み合わせは、上の基準を満たす限りは本発明に従って使用することができる。そのような組み合わせは、典型的には、ＦＲＥＴ対またはＢＲＥＴ対と呼ばれる。ＢＲＥＴアッセイに使用される適切なフルオロフォアの選択は、当業者に知られている。一実施形態では、フルオロフォアとしては、緑色蛍光タンパク質−野生型（ＧＦＰ−ｗｔ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｔｏｐａｚ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫｅｉｍａ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｔｓａｐｐｈｉｒｅ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、緑色蛍光タンパク質−２（ＧＦＰ２）、ｒｅｎｉｌｌＧＦＰ（ｒＧＦＰ）、及び緑色蛍光タンパク質−１０（ＧＦＰ１０）、またはそれらの変異体が挙げられる。４００ｎｍに近い励起ピークを有する蛍光タンパク質は、特に適している。フルオロフォアのより具体的な例としては、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、及びＧＦＰ１０が挙げられる。ＦＲＥＴ対の代表的な例としては、ＢＦＰ／ＣＦＰ、ＢＦＰ／ＧＦＰ、ＢＦＰ／ＹＦＰ、ＢＦＰ／ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ／ＧＦＰ、ＣＦＰ／ＹＦＰ、ＣＦＰ／ｍＶｅｎｕｓ、ＧＦＰ／ＹＦＰ、ＧＦＰ２／ＹＦＰ、ＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ、ＴａｇＢＦＰ／ＴａｇＧＦＰ２、ＴａｇＧＦＰ２／ＴａｇＲＦＰなど（例えば、Ｍｕｌｌｅｒら、Ｆｒｏｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，４：４１３，２０１３を参照されたい）が挙げられる。ＢＲＥＴ対の代表的な例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）／ＧＦＰ、Ｌｕｃ／Ｖｅｎｕｓ、Ｌｕｃ／Ｔｏｐａｚ、Ｌｕｃ／ＧＦＰ−１０、Ｌｕｃ／ＧＦＰ−２、Ｌｕｃ／ＹＦＰ、Ｌｕｃ／ｒＧＦＰ、などが挙げられる。
【００９７】
本明細書で使用される場合、用語「ルシフェラーゼ」は、生物発光で使用され、発光タンパク質とは異なる酸化酵素のクラスを指す。一例は、ホタルフォチナス・ピラリス（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ）由来のホタルルシフェラーゼ（ＥＣ１．１３．１２．７）である。また、レニラ・レニホルミス（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＡＡ２９８０４）由来のルシフェラーゼ及びその変異体（例えば、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼの安定変異体、例えば、ＲｌｕｃＩＩ（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＡＶ５２８７７．１）、Ｒｌｕｃ８（ＧＥＮＢＡＮＫ：ＥＦ４４６１３６．１）ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ、ＧＥＮＢＡＮＫ：ＡＡＧ５４０９５．１）、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））を含むいくつかの他の種由来のいくつかの組換えルシフェラーゼが市販されている。ルシフェリンなどのルシフェラーゼ基質を代謝することができる限りは、任意のルシフェラーゼを本発明に従って使用することができる。ルシフェリンは、ルシフェラーゼの存在下において酸化され、オキシルシフェリンと、光の形態のエネルギーとを生成する発光ヘテロ環状化合物のクラスである。ルシフェリンの非限定例としては、Ｄ−ルシフェリン、イミダゾピラジノンベース化合物、例えば、セレンテラジン（セレンテラジン４００Ａ（ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ（商標））、セレンテラジンＨ及びｅ−セレンテラジン誘導体、例えば、メトキシｅ−セレンテラジン（ＮａｎｏＬｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）から得たＰｒｏｌｕｍｅ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ  Ｉ）、ＶｉｖｉＲｅｎ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）から得た）、ラチアルシフェリン（（Ｅ）−２−メチル−４−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキサ−１−イル）−１−ブテン−１−オールギ酸塩）、細菌性ルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリンなどが挙げられる。ルシフェラーゼ基質は、わずかに異なる発光スペクトルを有し得るため、アクセプターへの最適なエネルギー転移に有利に働くように選択される。実施形態では、ルシフェラーゼは、野生型（または天然）ウミシイタケ由来ルシフェラーゼである。実施形態では、ルシフェラーゼは、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼＲｌｕｃ８の安定変異体である。別の実施形態では、ルシフェラーゼは、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）である。特定の実施形態では、ルシフェラーゼは、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼＩＩ（ＲｌｕｃＩＩ）であり、ルシフェリンは、セレンテラジン４００Ａである。
【００９８】
実施形態では、以下のＢＲＥＴ構成の１つを本明細書に記載されたバイオセンサー及び方法で使用する：セレンテラジン−ｈ（ｃｏｅｌ−ｈ）、及びＹＦＰ（ＹＦＰ）またはウミシイタケ由来のＧＦＰ（ｒＧＦＰ）を含むＢＲＥＴ１；セレンテラジン−４００ａ（ｃｏｅｌ−４００ａ）、及びＵＶ励起（ｕｖＧＦＰ）またはウミシイタケ由来のＧＦＰ（ｒＧＦＰ）を含むＢＲＥＴ２；または、ｃｏｅｌ−ｈまたはｖ−セレンテラジン（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）から得た）、及び単量体オレンジＦＰ（ｍＯｒａｎｇｅ）を含むＢＲＥＴ３。さらなる実施形態では、ＲＬｕｃＩＩを上述のＢＲＥＴ構成で使用する。別の実施形態では、以下のＢＲＥＴ構成の１つを本明細書に記載されたバイオセンサー及び方法で使用する：ＲｌｕｃＩＩ／ｃｏｅｌ−４００ａ／強化青色（ＥＢ）ＦＰ２、ＲｌｕｃＩＩ／ｃｏｅｌ−４００ａ／スーパーシアン蛍光タンパク質（ＳＣＦＰ３Ａ）、ＲｌｕｃＩＩ／ｃｏｅｌ−４００ａ／ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、またはＲｌｕｃＩＩ／ｃｏｅｌ−４００ａ／ＧＦＰ１０。実施形態では、ＢＲＥＴドナーは、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ（例えば、ＲＬｕｃＩＩ）であり、ＢＲＥＴアクセプターは、ウミシイタケ由来ＧＦＰ（例えば、レニラ・レニホルミスＧＦＰ）である。
【００９９】
ＰＣＡでは、タンパク質（例えば、βγＩＰ及びＧβ／Ｇγ、またはＧＰＣＲ）の各々は、不完全レポータータンパク質の断片と共有結合しており、βγＩＰとＧβ／Ｇγの間の相互作用により、レポータータンパク質の断片を十分に近接させて、その活性を測定することができる機能性レポータータンパク質を形成することができる。２つの部分に分割し、非共有的に再構成することができる任意のタンパク質を、ＰＣＡベースバイオセンサーで使用してもよい。用語「レポータータンパク質」は、（例えば、蛍光、分光法、光度分析などによって）容易に検出することができ、使用するシステムに通常（内因的に）存在しないタンパク質を指す。ＰＣＡで使用される典型的なレポータータンパク質としては、酵素（その活性は適切な基質を用いて測定できる）、例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、または、比色または蛍光シグナルを生じるタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ）、ＧＦＰ、及びそれらの変異体が挙げられる。
【０１００】
非限定的な別の実施形態では、ＲＥＴまたはＰＣＡ標識は、（ｉ）βγＩＰ及びＧβタンパク質、または（ｉｉ）βγＩＰ及びＧγタンパク質上に位置する。さらに非限定的な実施形態では、βγＩＰ及びＧβまたはＧγサブユニットは、それらのＮ末端、Ｃ末端、または、タンパク質内の任意の内部領域で標識される。一実施形態では、βγＩＰ及びＧβまたはＧγサブユニットは、それらのＮ末端またはＣ末端で標識される。非限定的な一実施形態では、βγＩＰ及びＧβまたはＧγサブユニットに付加された本明細書に記載されたＰＣＡ標識は、限定されることなく、蛍光タンパク質もしくは発光酵素の一部を含むフルオロフォア、ルシフェラーゼ、またはそれらの断片であってもよい。
【０１０１】
「ＧＰＣＲ」は、全長天然ＧＰＣＲ分子、並びに突然変異体／変異体ＧＰＣＲ分子を指す。ＧＰＣＲのリストは、参照によって本明細書に組み込まれるＦｏｏｒｄら（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５７，２７９−２８８に示されており、ＧＰＣＲの更新リストは、ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢデータベースで入手可能である（Ｈａｒｍａｒ  ＡＪら、（２００９）ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢ：Ｇタンパク質共役型レセプター及びイオンチャネルのＩＵＰＨＡＲデータベース．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６８０−Ｄ６８５；Ｓｈａｒｍａｎ  ＪＬら、（２０１３）ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢ：更新されたデータベース内容及び新規特徴．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１（Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１０８３−８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＳＰＨ，Ｂｅｎｓｏｎ  ＨＥ，Ｆａｃｃｅｎｄａ  Ｅ，Ｐａｗｓｏｎ  ＡＪ，Ｓｈａｒｍａｎ  ＪＬ，Ｓｐｅｄｄｉｎｇ  Ｍ，Ｐｅｔｅｒｓ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｈａｒｍａｒ  ＡＪ，ＣＧＴＰ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓ．（２０１３）Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ２０１３／１４：Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７０：１４５９−１５８１）。実施形態では、ＧＰＣＲは、孤児ＧＰＣＲである。用語「孤児ＧＰＣＲ」は、本明細書で使用する場合、他の同定されたＧＰＣＲと類似の構造を有するが、その内因性リガンドはまだ同定されていない見掛けのレセプターを指す。ＧＰＣＲ孤児レセプターは、「ＧＰＲ」の名称の後に数字、例えば、ＧＰＲ１で与えられることが多い。孤児ＧＰＣＲの更新リストは、上述のＩＵＰＨＡＲ−ＤＢデータベースで入手可能である。
【０１０２】
実施形態では、ＧＰＣＲは、そのＣ末端でＲＥＴドナーまたはＲＥＴアクセプター、さらなる実施形態では、ルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）などのＲＥＴドナーに融合している。
【０１０３】
用語「組換え」は、本明細書で使用する場合、組換え核酸分子、即ち、分子生物学／遺伝子工学技術によって調製された核酸、例えば、（細胞によって自然に発現されるタンパク質とは対照的に）タンパク質をコードする核酸（例えば、ベクター中に存在）で細胞（またはその子孫）を形質移入／形質導入後に発現されるタンパク質から発現されるタンパク質分子を指す。
【０１０４】
用語「変異体（または突然変異体）」は、本明細書で使用する場合、対応する天然タンパク質に構造（アミノ酸配列）及び生物学的活性が実質的に類似のタンパク質を指す。変異体は、天然タンパク質の１つ以上のドメインを含む断片、並びに天然タンパク質またはその断片を含む融合タンパク質を含む。変異体は、特定の所望の特徴を有する、例えば、１つ以上のリガンドなどへの結合を構成的に活性に、不活性に、変更したタンパク質を生成するために、天然タンパク質に対して１つ以上の突然変異（置換、欠失、挿入）を含み得る。配列中の単一アミノ酸またはヌクレオチドまたはごく一部のアミノ酸またはヌクレオチドを変化、付加、または削除する個々の置換、欠失、または付加は、「保存的に修飾された変異体」を生成し、その変化は、アミノ酸を化学的に類似のアミノ酸への置換をもたらす。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。そのような保存的に修飾された変異体はさらに、本発明の多型変異体及び対立遺伝子を排除しない。
【０１０５】
「相同性」または「同一性」及び「相同」または「同一」は、２つのポリペプチドまたは２つの核酸分子の間の配列及び／または構造的類似性を指す。相同性／同一性は、位置合わせした配列中の各位置を比較することによって決定することができる。核酸またはアミノ酸配列の間の相同性／同一性の程度は、配列が共有する位置で同一または適合するヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。この用語を本明細書で使用する場合、２つの配列が実質的に同一であり、配列の機能的活性が保存される場合、核酸配列は、別の配列に相同である（本明細書で使用する場合、用語「相同」は、進化的関連性を推論しない）。２つの核酸配列を（許容されるギャップに）最適に位置合わせした時に、少なくとも約５０％の配列類似性または同一性を共有する場合には、またはこれらの配列が特定の機能性モチーフを共有する場合には、２つの核酸配列は、「実質的に同一」であると考えられる。別の実施形態では、最適に位置合わせされた実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であってもよい。本明細書で使用される場合、配列間の相同性／同一性の所与のパーセンテージは、最適に位置合わせされた配列における配列同一性の程度を示す。「非関連」または「非相同性」配列は、本明細書に記載された任意の配列と４０％未満の同一性、好ましくは約２５％未満の同一性を共有する。
【０１０６】
非限定的な一実施形態では、システムは、生きた細胞、膜調製物、または両方を含む。本明細書で定義されたシステムは、限定されないが、膜調製物及び前記βγＩＰは、膜標的化リンカー、例えば、原形質膜（ＰＭ）標的化ドメイン含有タンパク質／ペプチドリンカー（例えば、原形質膜固定シグナルペプチド）を介して膜に連結している。この原形質膜標的化ドメインは、これに限定されないが、パルミトイル化、ミリストイル化、またはプレニル化修飾（ＫＲＡＳからの膜固定シグナルとして、例えば（Ｈａｎｃｏｃｋ  ２００３））などのペプチド鎖と共有結合した脂質基、膜貫通ドメイン、または多塩基性領域（例えば、ＧＲＫ５に存在するものとして）が挙げられる。
【０１０７】
実施形態では、ＰＭ標的化部分は、ＣＡＡＸモチーフを含む（Ｃはシステイン残基であり、ＡＡは２つの脂肪族残基であり、Ｘは任意のアミノ酸を表す。ＣＡＡＸモチーフは、それらの翻訳後修飾を指向するＣ末端に特定のアミノ酸配列を有するタンパク質の群として定義される「ＣＡＡＸタンパク質」に見られる。ＣＡＡＸタンパク質は、プレラミンＡ、ラミンＢ１及びラミンＢ２などの核ラミン（中間径フィラメント）、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、及びＣｄｃ４２などのＲａｓ及び多数のＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）、いくつかのタンパク質キナーゼ及びホスファターゼなどを含む広範囲の分子を包含する（例えば、Ｇａｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．２００９；１（３）：３１２-３２５を参照されたい）。タンパク質を原形質膜または核膜へ移動させて、異なる機能を発揮させる前に、Ｃ末端の終わりにＣＡＡＸモチーフまたはボックスを有するタンパク質は、典型的には、プレニル化プロセスを必要とする。実施形態では、ＣＡＡＸボックスは、ヒトＲＡＳファミリータンパク質、例えば、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、Ｒａｌ−Ａ、ＫＲＡＳ４Ａ、またはＫＲＡＳ４Ｂから導かれる。ＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ４Ａ、またはＫＲＡＳ４ｂの最後のＣ末端残基（超可変領域またはＨＶＲとも呼ばれる）は、推定最小原形質膜を標的化する領域をイタリック体で、ＣＡＡＸボックスに下線を引いて以下に示す（例えば、Ａｈｅａｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：３９−５１、Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１２を参照されたい）：
【表１】
2017536104.tif 000003
。実施形態では、膜標的化部分は、上記の配列の最後の４残基を含む。さらなる実施形態では、膜標的化部分は、上記の配列の最後の１０残基を含む。実施形態では、膜標的化部分は、ＣＡＡＸタンパク質、例えば、ヒトＲＡＳファミリータンパク質のＣ末端部分（例えば、最後の約１０〜３０または１５〜２５アミノ酸）、例えば、ヒトＲＡＳファミリータンパク質の最後の約１０〜３０、１５〜２５、または２０アミノ酸を含む。
【０１０８】
実施形態では、ＰＭ標的化部分は、ＫＲＡＳ４Ｂからの配列ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号３７）を含む。別の実施形態では、ＰＭ標的化部分は、ｈＲａｓからの原形質膜標的化パルミトイル化配列と、Ｒａｌ−Ａ／Ｒａｌ１からのプレニル化シグナル配列（配列：ＣＭＳＣＫＣＣＩＬ、配列番号４５）とを含む。
【０１０９】
いくつかのタンパク質は、Ｒａｓ小ＧＴＰアーゼ、ホスファターゼＰＴＥＮ、非レセプター型チロシンキナーゼＳｒｃ、アクチン調節因子ＷＡＳＰ及びＭＡＲＣＫＳなどのＰＭ、及びＧＲＫ５などのＧタンパク質共役型レセプターキナーゼ（ＧＲＫ）を標的化する非脂質性の多塩基性ドメインも含有する。実施形態では、多塩基性ドメインは、ＧＲＫ５からであり、配列ＳＰＫＫＧＬＬＱＲＬＦＫＲＱＨＱＮＮＳＫＳ（配列番号４６）を含む。実施形態では、ＰＭ標的化部分は、ＲＥＴドナーまたはアクセプター、さらなる実施形態では、ＧＦＰなどのＲＥＴアクセプター（例えば、ｒＧＦＰ）のＣ末端で融合している。別の実施形態では、ＰＭ標的化部分は、ＲＥＴドナーまたはアクセプター、さらなる実施形態では、ＧＦＰなどのＲＥＴアクセプター（例えば、ｒＧＦＰ）のＣ末端で融合しており、ＲＥＴドナーまたはアクセプターは、そのＮ末端で、ＧＲＫタンパク質などのβγＩＰ、またはそのＧβγ相互作用断片／変異体に融合している。
【０１１０】
本開示によれば、Ｇタンパク質活性化因子としては、限定されないが、これらのヘテロ三量体Ｇタンパク質、例えば、Ｇタンパク質シグナル伝達（ＲＧＳ）の調節因子、Ｇタンパク質シグナル伝達（ＡＧＳ）の活性化因子、及びコリンエステラーゼ８タンパク質（Ｒｉｃ−８）のインヒビターへの耐性などの活性を調節することもできるＧＰＣＲ及び他のタンパク質によるＧタンパク質の古典的活性化が挙げられる。これらの非正準的シグナル伝達経路のいくつかでは、ＧＰＣＲによって古典的に発揮されたグアニン交換因子（ＧＥＦ）活性は、例えば、Ｒｉｃ−８などの別のタンパク質に置き換えられる（Ｂｏｕｌａｒａｎ  ａｎｄ  Ｋｅｈｒｌ，２０１４）。
【０１１１】
一実施形態では、Ｇタンパク質活性化因子は、ＧＰＣＲファミリーのメンバーである。
【０１１２】
本明細書で定義されたＧαタンパク質サブユニットとしては、限定されないが、１７個の異なる公知のアイソフォーム、それらのスプライス変異体、及び任意の突然変異Ｇαタンパク質、例えば、非選択的／無差別Ｇαをもたらすものが挙げられる。非限定的な一実施形態では、本明細書に記載されたＧαタンパク質は、Ｇαｑ、Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｔ−ｃｏｎｅ、Ｇαｔ−ｒｏｄ、Ｇαｔ−ｇｕｓｔ、Ｇαｚ、ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｏｌｆ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、及びＧα１５／１６（ＧＮＡ１５に指定）を含む天然哺乳類Ｇαタンパク質、これらのアイソフォームのスプライス変異体、並びにそれらの機能的変異体のいずれかから選択される。実施形態では、Ｇαタンパク質サブユニットは、Ｇｉファミリーである。実施形態では、Ｇαタンパク質サブユニットは、Ｇｓファミリーである。実施形態では、Ｇαタンパク質サブユニットは、Ｇｑファミリーである。実施形態では、Ｇαタンパク質サブユニットは、Ｇ１２／１３ファミリーである。実施形態では、Ｇαタンパク質は、無差別または非選択的Ｇαタンパク質である。さらなる実施形態では、Ｇαタンパク質は、以下の位置、Ｇ６６、Ｙ６７、Ｆ７５のいずれか及びそれらの任意の組み合わせで置換を有する、または他のＧαサブタイプで等価の保存置換を有する突然変異Ｇαタンパク質（例えば、Ｇαｑタンパク質）であり、（即ち、「無差別」Ｇαタンパク質とも一般に呼ばれる特異的Ｇαタンパク質へのこれらのレセプターの優先的に天然のカップリングから独立してＧＰＣＲと相互作用することができる）孤児レセプターを含む、任意のＧＰＣＲによって活性化される非選択的Ｇαタンパク質をもたらし、これらも本開示に含まれる。実施形態では、本明細書に記載されたバイオセンサー／方法で使用される組換えＧαタンパク質は、無差別Ｇαタンパク質であり、ＧＰＣＲは、孤児ＧＰＣＲである。
【０１１３】
別の態様では、本開示は、ヒトＧαｑタンパク質の残基６７及び／または残基７５に対応する位置で突然変異を含む突然変異Ｇαポリペプチドに関する。前記突然変異は、挿入、欠失、または置換、例えば、非保存的置換であってもよい。図１４は、本発明に従って突然変異し得る代表的なｈＧαタンパク質の配列のアラインメントを開示し、Ｇαｑの６７及び７５に対応する位置は矢印で示される。当業者には、特定のＧαにおけるＧαｑの６７及び７５に対応する位置のＮ末端残基数に応じて、残基の番号付けは変化することが理解されるであろう。例えば、ｈＧα１４では、残基６７位に対応するＧαｑは、残基６３（Ｙ）である。同様に、ｈＧα１２では、残基の６７位に対応するＧαｑは、残基８５（Ｆ）である。従って、本発明は、例えば、６３位で突然変異（例えば、非芳香族残基の置換）を含む突然変異Ｇα１４ポリペプチドと、Ｇαｑの６７位での突然変異に対応する８５位で突然変異（例えば、非芳香族残基の置換）を含む突然変異Ｇα１２ポリペプチドとを包含する。ヒトＧαｑタンパク質の残基６７及び／または残基７５に対応する１つ以上の位置で突然変異を含む任意の突然変異Ｇαポリペプチドについても本開示で包含される。
【０１１４】
実施形態では、本発明は、配列番号１〜１７に記載の配列のいずれかを含む突然変異Ｇαポリペプチドに関し、ヒトＧαｑタンパク質の残基６７及び／または残基７５に対応する残基が突然変異する。実施形態では、突然変異は、ヒトＧαｑタンパク質の残基６７に対応する位置である。実施形態では、突然変異は、残基６７に対応する位置であり、非芳香族残基、さらなる実施形態では、システインの置換である。別の実施形態では、突然変異は、ヒトＧαｑタンパク質の残基７５に対応する位置であり、非芳香族残基の置換である。さらなる実施形態では、非芳香族残基は、グリシンである。そのような突然変異Ｇαポリペプチドは、本明細書に記載されたバイオセンサー及び／または方法のいずれかで使用してもよい。非限定的な一実施形態では、突然変異Ｇαｑタンパク質は、以下の置換、ＧαｑＧ６６Ｋ、ＧαｑＹ６７Ｃ、及びＧαｑＦ７５Ｇの１つを含み、これは、非選択的Ｇαタンパク質をもたらす。
【０１１５】
別の態様では、本開示は、上記に定義された突然変異Ｇαポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関する。別の態様では、本開示は、上記に定義された核酸を含むプラスミドまたはベクターに関する。別の態様では、本開示は、上記に定義された核酸またはベクターを含む細胞（宿主細胞）に関する。別の態様では、本発明は、本明細書で定義された突然変異Ｇαポリペプチドをコードする核酸を含むキットを提供する。実施形態では、細胞は、本明細書で定義された突然変異Ｇαポリペプチドをコードする核酸で形質移入または形質転換されている。本発明はさらに、例えば、当該技術分野で周知の培地及び試薬を用いて、本明細書で定義された突然変異Ｇαポリペプチドを発現するための、上述のものなどの組換え発現システム、ベクター、及び細胞を提供する。細胞は、上記に定義された突然変異Ｇαポリペプチドを発現することができる任意の細胞であってもよい。タンパク質を発現するための適当な宿主細胞及び方法は、当該技術分野で周知である。上記に定義された突然変異Ｇαポリペプチドを発現することができる任意の細胞を使用してもよい。例えば、真核生物宿主細胞、例えば、哺乳類細胞を使用してもよい（例えば、マウス、ラット、及びハムスター細胞株などのげっ歯細胞、ヒト細胞／細胞株）。別の実施形態では、上述の細胞は、ヒト細胞株、例えば、胚腎臓細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）である。
【０１１６】
実施形態では、本明細書に記載されたＧβタンパク質は、Ｇβ１、Ｇβ２、Ｇβ３（例えば、Ｇβ３の短い変異体、Ｇβ３ｓｈ）、Ｇβ４及びＧβ５（Ｇβ５−ＳまたはＧβ５−Ｌ）、これらのアイソフォームのスプライス変異体、及びそれらの機能的変異体を含む公知のＧβタンパク質のいずれかから選択される。さらなる実施形態では、Ｇβタンパク質は、Ｇβ１である。別の実施形態では、Ｇβタンパク質は、Ｇβ３である。さらなる実施形態では、Ｇβタンパク質（例えば、Ｇβ１）は、ＧＦＰなどのＢＲＥＴアクセプターでＮ末端的に標識される。
【０１１７】
実施形態では、本明細書に記載されたＧγタンパク質は、Ｇγ１、Ｇγ２、Ｇγ３、Ｇγ４、Ｇγ５、Ｇγ７、Ｇγ８、Ｇγ９、Ｇγ１０、Ｇγ１１、Ｇγ１２、及びＧγ１３、並びにそれらの機能的変異体を含む公知のヒトＧγタンパク質のいずれかから選択される。さらなる実施形態では、Ｇγタンパク質は、Ｇγ５である。さらなる実施形態では、Ｇγタンパク質（例えば、Ｇγ５）は、ルシフェラーゼなどのＢＲＥＴドナーでＮ末端的に標識される。別の実施形態では、Ｇγタンパク質（例えば、Ｇγ５）は、ＧＦＰなどのＢＲＥＴアクセプターでＮ末端的に標識される。別の実施形態では、Ｇγタンパク質（例えば、Ｇγ５）は、ＰＣＡ相溶性レポータータンパク質、例えば、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ）の第１のドメインでＮ末端的に標識される。
【０１１８】
実施形態では、本明細書に記載されたβγＩＰは、Ｇαβγヘテロ三量体が解離する際にＧβγ二量体と相互作用し、Ｇタンパク質共役型レセプターキナーゼ（ＧＲＫ）タンパク質（ＧＲＫ２またはＧＲＫ３）などのプレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン含有タンパク質、または、ＧＲＫタンパク質のＣ末端プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン（即ち、Ｇβγ二量体と相互作用する能力を維持する）を含むその機能的断片、プレクストリン相同ドメイン含有ファミリーＧ（ＲｈｏＧｅｆドメインを有する）メンバー２（ＰＬＥＫＨＧ２）である。ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、及びＰＬＥＫＨＧ２のアミノ酸配列を図１７Ａ〜Ｃに示し、ＰＨドメインに下線を引いている。非限定的な一実施形態では、Ｇβγ二量体と相互作用する能力を維持する、本明細書に記載されたＧＲＫタンパク質（ＧＲＫ２またはＧＲＫ３）またはその断片（例えば、ＧＲＫのＣ末端プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、例えば、配列番号５０または５１に記載の配列を含むＣ末端断片を含む）は、フルオロフォアなどのＢＲＥＴアクセプターでＣ末端的に標識される。実施形態では、βγＩＰは、ＧＲＫ２、またはＧＲＫ３、またはその変異体／断片であり、ＧＦＰなどのＢＲＥＴアクセプターでＣ末端的に融合される。別の実施形態では、βγＩＰは、Ｇタンパク質シグナル伝達（ＲＧＳ）ドメインの調節因子を不活性化する突然変異を含むＧＲＫタンパク質の変異体（「ＲＧＳ死」変異体）である。さらなる実施形態では、ＧＲＫタンパク質の「ＲＧＳ死」変異体は、ＧＲＫ２残基Ｄ１１０に対応する位置で突然変異、例えば、ＤからＡ置換を含む。天然のヒトＧＲＫ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託Ｐ２５０９８）及びＧＲＫ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託Ｐ３５６２６）のＲＧＳドメインは、残基約５４〜１７５に広がる。別の実施形態では、βγＩＰは、そのキナーゼドメインを不活性化する突然変異を含むＧＲＫタンパク質の変異体（「キナーゼ死」変異体）である。さらなる実施形態では、ＧＲＫタンパク質の「キナーゼ死」変異体は、ＧＲＫ２残基Ｋ２２０に対応する位置で突然変異（例えば、非保存的置換）、例えば、ＫからＤ置換を含む。ＧＲＫ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託Ｐ２５０９８）及びＧＲＫ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託Ｐ３５６２６）のキナーゼドメインは、残基約１９１〜４５３に広がる。別の実施形態では、βγＩＰは、そのＣ末端ドメインに、例えば、最後の３０個のＣ末端残基内に、突然変異を含むＧＲＫタンパク質の変異体である。さらなる実施形態では、突然変異は、Ｃ末端ドメイン内に配置されたセリン残基であり、より詳細には、天然タンパク質においてリン酸化されてもよいセリンである。さらなる実施形態では、突然変異（例えば、非保存的置換）は、ＧＲＫ２の残基Ｓ６７０、Ｓ６７６、及び／またはＳ６８５に対応する位置であり、例えば、ＳからＡ置換及び／またはＳからＤ置換である。
【０１１９】
実施形態では、本明細書に記載された融合分子のドメインは、（例えば、ペプチド結合を介して）直接的に、または、適切なリンカー部分、例えば、１つ以上のアミノ酸のリンカーまたは別の型の化学リンカー（例えば、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、ＰＥＧなど）を介して「間接的」にのいずれかで共有結合してもよい。実施形態では、１つ以上のさらなるドメイン（複数可）を、上記に定義されたドメインの前（Ｎ末端）、間、または後（Ｃ末端）に挿入してもよい。実施形態では、融合分子のドメインは、ペプチド結合を介して共有結合される。別の実施形態では、融合分子の成分の１つ以上は、ペプチドリンカーを介して連結する。リンカーは、標識化合物内のＢＲＥＴ／ＦＲＥＴ標識発色団の所望の配座、例えば、ＢＲＥＴ／ＦＲＥＴ対中の発色団間の分離をもたらすために採用してもよい。リンカーは、Ｃ末端、Ｎ末端、または中間位置で結合してもよい。一実施形態では、リンカーは、長さが２〜３０アミノ酸、例えば、約５〜約２０〜２５アミノ酸の範囲のペプチドリンカーである。組成物及びリンカーの各々の長さは、柔軟性及び水溶解度などの種々の所望の特性に応じて選択してもよい。例えば、ペプチドリンカーは、限定されないが、グリシンを含む比較的小さいアミノ酸残基を含んでもよく；小アミノ酸残基は、立体的な嵩高さを減少させ、ペプチドリンカーの柔軟性を増加させてもよい。ペプチドリンカーは、限定されないが、セリンを含む極性アミノ酸を含んでもよい。極性アミノ酸残基は、ペプチドリンカー水溶解度を増加させ得る。さらに、Ｇｌｏｂｐｌｏｔ  ２．３（Ｌｉｎｄｉｎｇら、ＧｌｏｂＰｌｏｔ：ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｇｌｏｂｕｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２００３−Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１３，３７０１−８）などのプログラムを使用して、不規則性及び球状性の程度、従って、それらの柔軟性の程度の判断の一助になり得る。実施形態では、ペプチドリンカーは、以下の実施例で開示されたアミノ酸配列の１つ以上を含む。
【０１２０】
非限定的な一実施形態では、図１２Ａに示すように、本明細書に記載された組換えβγＩＰベース構築物は、フルオロフォア、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質もしくは発光酵素の一部を含むその断片で標識されたβγＩＰ、リンカー、好ましくはフレキシブルポリペプチドリンカー、及びβγＩＰを膜に連結するための原形質膜（ＰＭ）固定／標的化ドメインまたはシグナルを含む。実施形態では、フレキシブルリンカーは、約５０〜約１０００、９００、８００、７００、６００、または５００アミノ酸のランダムアミノ酸配列の長さに対応する長さ、例えば、約１００〜約５００、４００、または３００アミノ酸の長さ、好ましくは約２００〜４００、２００〜３００、または約２００アミノ酸の長さを有する。さらなる実施形態では、フレキシブルリンカーは、約５０〜約１０００、９００、８００、７００、６００、または５００アミノ酸、例えば、約１００〜約５００、４００、または３００アミノ酸の長さ、好ましくは約２００〜４００、２００〜３００、または２００アミノ酸の長さのランダムアミノ酸配列を含む。フレキシブルアミノ酸リンカー、より具体的には、最小の球状性と最大の不規則性を有するリンカーを設計する方法は、当該技術分野で公知である。これは、例えば、上述のＧｌｏｂｐｌｏｔプログラムを用いて達成してもよい。配列をさらに最適化して、推定凝集ホットスポット、局在化ドメイン、及び／または相互作用モチーフ及びリン酸化モチーフを排除してもよい。実施形態では、フレキシブルリンカーは、ＢＲＥＴドナーまたはアクセプター（例えば、ＲｌｕｃまたはＧＦＰ）と原形質膜標的化ドメインとの間に配置される。さらなる実施形態では、構築物は、以下の構成：βγＩＰ（例えば、ＧＲＫ２）−ＢＲＥＴアクセプター（例えば、ＧＦＰ）−フレキシブルリンカー−ＰＭ  標的化ドメイン（例えば、ＣＡＡＸドメイン）を有する。
【０１２１】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＣＲと；以下のもの：Ｇαｑ、Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｔ−ｃｏｎｅ、Ｇαｔ−ｒｏｄ、Ｇαｔ−ｇｕｓｔ、Ｇαｚ、ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｏｌｆ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、及びＧα１５／１６から選択されたＧαタンパク質、及び本明細書に記載される突然変異した非選択的Ｇαタンパク質と；フルオロフォア、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質もしくは発光酵素の一部を含むその断片で標識された、ＧＲＫのＣ末端プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含むＧＲＫタンパク質（ＧＲＫ２またはＧＲＫ３）またはその断片、Ｇβタンパク質、及びＧγタンパク質、ここで、Ｇβタンパク質またはＧγタンパク質は、フルオロフォア、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質もしくは発光酵素の一部を含むその断片で標識される、を含むシグナル伝達バイオセンサーと、を含むシステムに関する。
【０１２２】
一実施形態では、本開示は、ＧＰＣＲと；以下のもの：Ｇαｑ、Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｔ−ｃｏｎｅ、Ｇαｔ−ｒｏｄ、Ｇαｔ−ｇｕｓｔ、Ｇαｚ、ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｏｌｆ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、及びＧα１５／１６から選択されたＧαタンパク質、及びＧαｑの位置のいずれかに対応する位置：Ｇ６６、Ｙ６７、及び／またはＦ７５で置換を有する突然変異Ｇαタンパク質と；フルオロフォア、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質もしくは発光酵素の一部を含むその断片で標識された、ＧＲＫのＣ末端プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含むＧＲＫタンパク質（ＧＲＫ２またはＧＲＫ３）またはその断片、Ｇβ１タンパク質、及びＧγ５タンパク質、ここで、Ｇβタンパク質またはＧγタンパク質は、フルオロフォア、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質もしくは発光酵素の一部を含むその断片で標識される、を含むシグナル伝達バイオセンサーと、を含むシステムに関する。
【０１２３】
別の広範な非限定的な態様によれば、本開示は、リガンドのシグナル伝達サインを特徴付けるための、Ｇタンパク質活性の活性化因子；Ｇαタンパク質；及び本明細書に記載されるバイオセンサーまたはシステムを含むシステムに関する。
【０１２４】
本開示は、限定されないが、本開示で定義されるタンパク質をコードするＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ウイルスまたはプラスミドであり得る核酸配列を含むシステムにも関する。実施形態では、本開示は、本明細書に記載されたバイオセンサーの１つ以上のタンパク質成分（例えば、融合タンパク質）をコードする配列を含む核酸にも関する。実施形態では、核酸は、（ｉ）βγＩＰ、（ｉｉ）第１のフルオロフォア、生物発光タンパク質、または蛍光タンパク質もしくは生物発光タンパク質の一部を含むその断片；（ｉｉｉ）Ｇγタンパク質；（ｉｖ）第２のフルオロフォア、生物発光タンパク質、または蛍光タンパク質もしくは生物発光タンパク質の一部を含むその断片、及び（ｖ）Ｇβタンパク質をコードする配列を含む。さらなる実施形態では、核酸は、バイオセンサーの成分の間に配置された１つ以上のリンカーをコードする１つ以上の配列をさらに含む。さらなる実施形態では、核酸は、プロモーター、エンハンサー、及び／または他の調節配列などの１つ以上の転写調節配列（複数可）、及び／または翻訳調節に関与する１つ以上の配列、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列（複数可）をさらに含む。
【０１２５】
実施形態では、核酸は、ベクター／プラスミド、さらなる実施形態では、発現ベクター／プラスミドに存在する。そのようなベクターは、１つ以上の転写調節配列（複数可）に作動可能に連結された、本明細書に記載されたバイオセンサーの上記に定義された成分（例えば、融合タンパク質）をコードすることができる核酸配列を含む。
【０１２６】
用語「ベクター」は、それらに連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターの１つの型は、エピソーム、即ち、染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それらに連結された核酸の自己複製及び／または発現が可能なものである。本明細書中では、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することが可能なベクターを、「発現ベクター」と称する。本発明の組換え発現ベクターは、当業者に公知の標準技術によって構築され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに見られる。ＤＮＡの断片を結紮するために種々の戦略を利用することができ、その選択は、ＤＮＡ断片の末端の性質に依存し、当業者によって容易に判断することができる。本発明のベクターは、細菌性細胞及び宿主細胞中のベクター繁殖及び選択を容易にするための他の配列要素も含有し得る。さらに、本発明のベクターは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位のヌクレオチドの配列を含んでもよい。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子などのコード配列は、当業者に周知である。
【０１２７】
本発明の核酸配列を含む組換え発現ベクターを、定義された組換え発現ベクターからタンパク質コード領域を発現することができる生きた細胞を含み得る細胞（宿主細胞）に導入してもよい。生きた細胞は、生きた組織内の培養細胞及び細胞の両方を含み得る。従って、本発明は、本発明の組換え発現ベクターを含有する宿主細胞も提供する。用語「細胞」、「宿主細胞」、及び「組換え宿主細胞」は、本明細書で交換可能に使用される。そのような用語は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫または可能性のある子孫のことも指す。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して、ある特定の修飾が継代において生じ得ることから、そのような子孫は、実際には親細胞とは同一ではないかもしれないが、本明細書においては用語の範囲内に含まれる。
【０１２８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術または形質移入技術を介して細胞中に導入することができる。用語「形質転換」及び「形質移入」は、宿主細胞中に外来性核酸を導入するための技術を指し、リン酸カルシウム共沈殿または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介性形質移入、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及びウイルス媒介性形質移入が挙げられる。宿主細胞を形質転換または形質移入するための適当な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））、及び他の実験マニュアルにおいて見出すことができる。「転写調節配列／要素」は、作動可能に連結されたタンパク質コード配列の転写を誘導または制御する開始及び終結シグナル、エンハンサー、及びプロモーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナルなどのＤＮＡ配列を指す一般用語である。第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係で配置された場合に、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は近接しており、また２つのタンパク質コード領域が接合することが必要な場合にはリーディングフレーム内にある。しかしながら、プロモーターから数キロベース離れており、且つ、イントロン配列が種々の長さである場合にエンハンサーは一般的に機能するので、一部のポリヌクレオチド要素は、作動可能に連結されているが隣接していない場合がある。
【０１２９】
実施形態では、図１１Ａに示すように、核酸またはベクターは、本明細書に記載されたバイオセンサー（即ち、多シストロン性構築物）の２つ以上の成分（融合タンパク質）をコードする。実施形態では、多シストロン性構築物（例えば、ＤＮＡ、ベクター）は、βγＩＰ及びＧγタンパク質をコードする核酸配列を含み、各々は、Ｇβタンパク質に加えて、適切なフルオロフォア、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質もしくは発光酵素の一部を含むその断片で標識される。この多シストロン性構築物を、目的のＧαタンパク質サブユニット及びＧタンパク質活性化因子をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子と共形質移入することによって、本発明のシステムを再現することができる。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、本明細書で定義された核酸及び／またはベクターを含むキットを提供する。
【０１３１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されたバイオセンサーのいずれかのタンパク質成分（例えば、融合タンパク質、組換えタンパク質）のいずれかを含むかまたは発現している細胞（例えば、宿主細胞）も提供する。実施形態では、細胞は、本明細書で定義された突然変異Ｇαポリペプチドをコードする核酸で形質移入または形質転換されている。本発明はさらに、例えば、当該技術分野で周知の培地及び試薬を用いて、本明細書で定義された突然変異Ｇαポリペプチドを発現するための、上述のものなどの組換え発現システム、ベクター、及び細胞を提供する。細胞は、上記に定義された突然変異Ｇαポリペプチドを発現することができる任意の細胞であってもよい。タンパク質を発現するための適当な宿主細胞及び方法は、当該技術分野で周知である。上記に定義された突然変異Ｇαポリペプチドを発現することができる任意の細胞を使用してもよい。例えば、真核生物宿主細胞、例えば、哺乳類細胞を使用してもよい（例えば、マウス、ラット、及びハムスター細胞株などのげっ歯細胞、ヒト細胞／細胞株）。別の実施形態では、上述の細胞は、ヒト細胞株、例えば、胚腎臓細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）である。別の態様では、本開示は、本明細書に記載されたバイオセンサーのいずれかのタンパク質成分（例えば、融合タンパク質、組換えタンパク質）のいずれか、さらなる実施形態では、膜に固定された融合タンパク質を含むかまたは発現している膜調製物も提供する。
【０１３２】
本開示はさらに、第１の条件と第２の条件の間のＧβγサブユニットへのＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）の補充における調節を評価するための方法に関し、前記方法は、本明細書で定義されたバイオセンサーを提供すること；前記第１及び第２の条件でＢＲＥＴアクセプターシグナルを測定すること；を含み、前記第１及び第２の条件間のＢＲＥＴシグナルの差は、第１の条件及び第２の条件間のＧβγサブユニットへのＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）の補充における調節を示す。実施形態では、第１の条件は、試験薬剤の存在であり、第２の条件は、試験薬剤の不在であり、ＢＲＥＴシグナルの差は、試験薬剤がＧβγサブユニットへのＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）の補充を調節（増加または減少）することを示している。ＧβγサブユニットへのＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）の補充は、ＧＰＣＲ及び／またはＧタンパク質活性化の読み出しとして使用してもよい。
【０１３３】
本開示はさらに、本明細書に記載されたシステムを含むＧタンパク質活性化を検出するための方法に関し、前記方法は、１）前記システムを、Ｇタンパク質を活性化する化合物と接触させること、及び２）バイオセンサーのシグナルを測定することによってＧタンパク質の活性化を検出することを含む。方法は、３）シグナル伝達バイオセンサーのシグナルからＧタンパク質機能性カップリング情報を導出する工程と、４）情報を処理して、Ｇタンパク質活性化因子のＧタンパク質活性化プロファイル及び化合物のシグナル伝達サインを決定する工程とをさらに含み得る。各々のバイオセンサーが異なる組換えＧαタンパク質を含む複数のバイオセンサーを含むバイオセンサーシステムを使用することで、図３Ａ及び３Ｂに例示したように、任意のＧＰＣＲ及び／またはＧＰＣＲリガンドのＧタンパク質カップリングプロファイルを決定することが可能である。
【０１３４】
用語「化合物」、「薬剤」、「試験化合物」、または「試験薬剤」は、本発明の方法／バイオセンサーによってスクリーニングすることができ、且つ、合成または天然化合物のライブラリーを含む多様な源から得ることができる任意の分子（例えば、薬剤候補）を指す。例えば、多くの手段が、ランダム化オリゴペプチドの発現を含む、多様な有機化合物及び生体分子のランダム及び指向性合成に利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが利用可能であり、または容易に生成される。さらに、天然のまたは合成的に生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的、及び生化学的手段を通じて容易に修飾される。
【０１３５】
本開示はさらに、試験薬剤がＧＰＣＲの活性を調節するかどうかの決定方法に関し、前記方法は、本明細書に記載されたバイオセンサーの１つにおける前記試験薬剤の存在下及び不在下において、ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定することを含み、前記薬剤の存在下において測定されたより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を増加させることを示し、前記薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を阻害することを示す。実施形態では、本方法は、
（１）（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）で定義される要素を含むバイオセンサーを提供すること：
（Ａ）（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；（ｉｉ）融合Ｇβタンパク質または融合Ｇγタンパク質を含む第２の成分、前記Ｇβタンパク質または前記Ｇγタンパク質は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している、（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧβまたはＧγタンパク質は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；及び（ｉｖ）前記ＧＰＣＲを含む第４の成分；
（Ｂ）（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；（ｉｉ）そのＣ末端で（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合した前記ＧＰＣＲを含む第２の成分；（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＧＰＣＲは、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；または
（Ｃ）（ｉ）（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）レポータータンパク質の第１の断片に融合したＧβγ相互作用タンパク質（βγＩＰ）を含む第１の成分；（ｉｉ）融合原形質膜（ＰＭ）標的化部分を含む第２の成分、前記ＰＭ標的化部分は、（ａ）ＲＥＴドナー；（ｂ）ＲＥＴアクセプター、または（ｃ）前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；（ａ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴドナーに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴアクセプターに融合しており；（ｂ）前記βγＩＰが前記ＲＥＴアクセプターに融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記ＲＥＴドナーに融合しており；及び（ｃ）前記βγＩＰが前記レポータータンパク質の第１の断片に融合している場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記レポータータンパク質の第２の断片に融合している；（ｉｉｉ）組換えＧαタンパク質を含む第３の成分；及び（ｉｖ）前記ＧＰＣＲを含む第４の成分；及び
（２）前記試験薬剤の存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること；前記薬剤の存在下において測定されたより高いシグナルは、前記試験薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を増加させることを示し、前記薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、前記薬剤が前記ＧＰＣＲの活性を阻害することを示す、を含む。
【０１３６】
実施形態では、上述の方法は、
（３）試験薬剤の存在下及び不在下において、及びＧＰＣＲアゴニストの存在下において、本明細書で定義されたバイオセンサー（複数可）で、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること、組換えＧαタンパク質は、ＧＰＣＲにカップリングしている（即ち、ＧＰＣＲにカップリングまたは活性化されることが知られている）；及び
（４）前記試験薬剤が前記Ｇαタンパク質のインヒビターであるかどうかを決定すること；試験薬剤の存在下において測定されたより低いシグナルは、試験薬剤がＧαタンパク質のインヒビターであることを示し、試験薬剤の存在下において測定された同様のまたはより高いシグナルは、試験薬剤がＧαタンパク質のインヒビターではないことを示す、をさらに含む。
【０１３７】
実施形態では、用語「より高いシグナル」または「より低いシグナル」は、本明細書で使用する場合、試験薬剤の存在下において測定された参照シグナルと比較して少なくとも１０、２０、３０、４０、４５または５０％高い（または低い）シグナルを指す。別の実施形態では、「より高いシグナル」または「より低いシグナル」は、例えば、複数のサンプルで得られた結果を組み合わせることによって、試験薬剤の不在下と比較して存在下において測定されたシグナルにおける統計学的な有意差（適切な統計分析を用いて決定される）を示すことによって決定される。異なるデータセット間の有意差を決定するための統計分析（ＡＮＯＶＡ、スチューデントのｔ検定、カイ２乗検定など）は、当該技術分野で公知であり、そのような分析は、適切なコンピュータープログラムを用いて行ってもよい。
【０１３８】
本開示はさらに、ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されたＧαタンパク質（複数可）（アゴニストのＧタンパク質プロファイリング／サイン）を同定する方法に関し、前記方法は、（ｉ）本明細書で定義された複数のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること、バイオセンサーの各々は、異なる組換えＧαタンパク質を含む；（ｉｉ）前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されたＧαタンパク質（複数可）を同定すること；を含み、組換えＧαタンパク質を発現していない対応するバイオセンサーに対して、組換えＧαタンパク質を含むバイオセンサー中のＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルのより高い増加は、Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されることを示し、組換えＧαタンパク質を発現していない対応するバイオセンサーに対して、組換えＧαタンパク質を含むバイオセンサー中のＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルの同様のまたはより低い増加または減少は、Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されないことを示す。実施形態では、方法は、（ａ）本明細書で定義されたバイオセンサーシステムの第１及び複数の第２のバイオセンサー中で前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下及び不在下において、前記ＲＥＴアクセプターまたはレポータータンパク質が発したシグナルを測定すること、及び（ｂ）前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されたＧαタンパク質（複数可）を同定すること；を含み、前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中のＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルのより高い増加は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されることを示し、前記第１のバイオセンサーに対して前記第２のバイオセンサー中の前記ＧＰＣＲアゴニストの存在下において測定されたシグナルの同様のまたはより低い増加、または減少は、前記Ｇαタンパク質が前記ＧＰＣＲアゴニストによって活性化されないことを示す。
【０１３９】
陽性対照及び陰性対照は、本明細書に記載された方法／アッセイで使用してもよい。対照及び試験サンプルは、統計学的に有意な結果を得るために複数回行ってもよい。
【０１４０】
実施形態では、上述の方法は、高スループット方法（高スループットスクリーニング、ＨＴＳ）である。用語「高スループットスクリーニング」（ＨＴＳ）は、本明細書で使用する場合、多数の化合物（数百、数千）の標的分子に対する結合活性または生物学的活性を迅速且つ並行してスクリーニングすることができる方法を指す。そのようなＨＴＳ方法は、典型的には、いくつかのウェル、例えば、３８４、１５３６、または３４５６ウェルを有するマイクロタイタープレートで行う。ＨＴＳでは、読み出しシグナルを高い感受性、精度、及び再現性で検出することが重要である。
【０１４１】
ＢＲＥＴシグナルを測定する方法及びデバイスは、当該技術分野で周知である。ＢＲＥＴシグナルは、例えば、ＢＲＥＴアクセプターシグナル（光強度）の強度を決定すること、及び／または、ＢＲＥＴドナー（ＢＲＥＴ比）が発したシグナルまたは光強度に対するＢＲＥＴアクセプターが発したシグナルまたは光強度の比率を算出することによって測定してもよい。ＢＲＥＴシグナルは、ＢＲＥＴドナー及び／またはＢＲＥＴアクセプター発光を検出するための適切なフィルターセットを備えたマイクロプレートリーダーまたはマイクロスコープを用いて測定してもよい。
【０１４２】
本明細書に記載された特徴または実施形態の任意の組み合わせ／副組み合わせは、本明細書に記載されたバイオセンサー、システム、及び／または方法で提示または使用してもよいことを理解すべきである。
【０１４３】
実施形態では、本明細書に記載されたバイオセンサー、システム、及び／または方法は、以下の実施例及び添付図面に記載した構築物／融合タンパク質及び／または組換えタンパク質、例えば、Ｒｌｕｃ−Ｇγ１〜Ｇγ１３、ＧＲＫ−ＧＦＰ、ＧＲＫ−ＲｌｕｃＦ１、ＲｌｕｃＦ２−Ｇγ５、ＧＲＫ２−ＧＦＰ−膜、Ｒｌｕｃ−ＧＲＫ２、ＧＦＰ−Ｇγ５、ＧＦＰ−ＣＡＡＸ、またはＧＰＣＲ−Ｒｌｕｃの１つ以上を含む。
【実施例】
【０１４４】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明される。
【０１４５】
実施例１：材料及び方法
試薬．アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ；［Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ］、配列番号４９）、ポリ−オルニチン、ポリ−Ｄ−リジン、イソプロテレノール、ロチゴチン、エピネフリン、ノルエピネフリン、フェニレフリン、及び百日咳毒素は、Ｓｉｇｍａ（登録商標）社製であった。ｕ４６６１９は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（登録商標）（アンナーバー、ミシガン州）社製であった。［Ｓａｒ１、Ｉｌｅ８］−ＡｎｇＩＩ（ＳＩ）、及び［Ａｓｐ１，Ｖａｌ５、Ｇｌｙ８］−ＡｎｇＩＩ（ＤＶＧ）［Ｓａｒ１−Ｖａｌ５−Ｄ−Ｐｈｅ８］ＡｎｇＩＩ（ＳＶｄＦ）、及び［Ｓａｒ１−Ｄ−Ａｌａ８］ＡｎｇＩＩは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅ（カナダ、ケベック州）で合成した。ＵＢＯ−Ｑｉｃ（Ｌ−トレオニン，（３Ｒ）−Ｎ−アセチル−３−ヒドロキシ−Ｌ−ロイシル−（ａＲ）−ａ−ヒドロキシベンゼンプロパノイル−２，３−イデヒドロ−Ｎ−メチルアラニル−Ｌ−アラニル−Ｎ−メチル−Ｌ−アラニル−（３Ｒ）−３−［［（２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オキソ−２−［（１−オキソプロピル）アミノ］ペンチル］オキシ］−Ｌ−ロイシル−Ｎ，Ｏ−ジメチル−，（７→１）−ラクトン（９ＣＩ））は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｎｎ（ドイツ）から入手した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）、及び他の細胞培養試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から購入した。セレンテラジン４００ａ、セレンテラジンＨ及びＰｒｏｌｕｍｅ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ  Ｉは、Ｇｏｌｄｂｉｏ（登録商標）、Ｂｉｏｔｉｕｍ（登録商標）、またはＮａｎｏｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのいずれかから購入した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；２５ｋＤａ直鎖）は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）（ウォリントン、米国ペンシルベニア州）から購入した。サケ精子ＤＮＡは、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）から購入した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）社製であった。制限酵素及びＴ４  ＤＮＡリガーゼは、ＮＥＢ（登録商標）から入手した。突然変異誘発及びＰＣＲ用途のためのオリゴヌクレオチドは、ＢｉｏＣｏｒｐ  ＤＮＡ（登録商標）で合成した。
【０１４６】
発現ベクター：レセプター及びＧタンパク質。ＡＴ１Ｒをコードするプラスミドは、Ｓｔｅｐｈａｎｅ  Ｌａｐｏｒｔｅ（マギル大学、モントリオール、カナダ）からの寛大な贈り物であった。Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、Ｇα１５／１６、ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｚ、Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇβ１、ＴＰαＲ、Ｄ２Ｒ及びα１ＢＡＲは、ｃＤＮＡリソースセンター（ｃＤＮＡ．ｏｒｇ）から入手した。突然変異体Ｇαタンパク質をコードするプラスミド、例えば、ＧαｑＧ６６Ｋ、ＧαｑＹ６７Ｃ、及びＧαｑＦ７５Ｇは、表Ｉに示すプライマーを用いて、Ｇαｑ野生型タンパク質コード配列の部位特異的突然変異誘発（ＰＣＲオーバーラップ）によって得た。ＰＣＲ断片をＡｃｃ６５Ｉ＋ＸｈｏＩ制限酵素で消化し、Ａｃｃ６５Ｉ＋ＸｈｏＩで消化したｐＣＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）社製、カールズバッド、カリフォルニア）でクローニングした。ＤＮＡシークエンシングを用いて、異なる構築物の妥当性を確認し、変性プライマーから生成された特定の置換を同定した。
【表２】
2017536104.tif 000004
【０１４７】
発現ベクター：バイオセンサー構築物。Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧＦＰ−Ｇγ：融合タンパク質Ｒｌｕｃ−Ｇγ１〜Ｇγ１３及びＧＦＰ１０−Ｇγ５をコードするプラスミドは、Ｇγコード配列のＰＣＲ増幅によって得た後、そのＮ末端で、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（リンカー配列：ＧＳＡＧＴ、配列番号３３）中のヒト化ウミシイタケ由来ルシフェラーゼＩＩ（ｈＲｌｕｃＩＩ）配列（先に報告されている（Ｌｅｄｕｃ、Ｂｒｅｔｏｎら、２００９）ｈＲｌｕｃの変異体、配列番号３９）、またはＧＦＰ１０（先に報告されている（Ｍｅｒｃｉｅｒ、Ｓａｌａｈｐｏｕｒら、２００２、配列番号３８）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の変異形態）にフレームで融合させた。ＧＲＫ２−ＧＦＰ、及びＧＲＫ３−ＧＦＰ：ＧＲＫ２−ＧＦＰ、ＧＲＫ３−ＧＦＰ、ＧＲＫ２  Ｃ末端（配列番号５０）−ＧＦＰ、ＧＲＫ３  Ｃ末端（配列番号５１）−ＧＦＰをＧＲＫ２及びＧＲＫ３のＰＣＲ増幅によって生成した後、それらのＣ末端で、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ（＋）ベクター中のＧＦＰ１０中のＧＦＰ１０に融合し、１１アミノ酸残基のリンカーをＧＲＫ及びＧＦＰ１０タンパク質の間に生成した（リンカー配列：ＧＳＡＧＴＧＫＬＰＡＴ、配列番号３４）。ＧＦＰ−ＧＲＫ２及びＧＦＰ−ＧＲＫ３：ＧＲＫ２−ＧＦＰ、ＧＦＰ−ＧＲＫ２  Ｃ末端（配列番号５０）、ＧＦＰ−ＧＲＫ３  Ｃ末端（配列番号５１）をＧＲＫ２及びＧＲＫ３のＰＣＲ増幅によって生成した後、それらのＮ末端で、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ（＋）ベクター中のＧＦＰ１０（配列番号３８）に融合し、７アミノ酸残基リンカーをＧＲＫ及びＧＦＰ１０タンパク質の間に生成した（リンカー配列：ＧＳＡＧＴＧＧ、配列番号５２）。ＧＦＰ−及びＲｌｕｃＩＩ標識ＧＲＫ２突然変異体は、同様の手順を用いてＰＣＲ特異的突然変異誘発によって生成した。ＧＲＫ２−Ｒｌｕｃ  Ｆ１及びＲｌｕｃ  Ｆ２−Ｇγ５：ＧＲＫ２−Ｒｌｕｃ  Ｆ１は、配列番号３９（Ｒｌｕｃ  Ｆ１）に記載のヒト化ウミシイタケ由来ルシフェラーゼＩＩ配列から残基１〜１１０のコード配列のＰＣＲ増幅によって得た。次に、これをｐｃＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ（＋）ベクター中のＧＲＫ２タンパク質のＣ末端に融合し、１８アミノ酸リンカーをＲｌｕｃ断片及びＧＲＫ２の間に生成した（リンカー配列：ＧＳＡＧＷＧＫＬＧＳＡＧＳＧＳＡＧＳ、配列番号３５）。Ｒｌｕｃ  Ｆ２−Ｇγ５は、配列番号３９に記載のヒト化ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ配列（Ｒｌｕｃ  Ｆ２）から残基１１１〜３１１のコード配列のＰＣＲ増幅によって得た。次に、これをｐｃＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ（＋）ベクター中のＧγ５タンパク質のＮ末端のフレームに融合し、１１アミノ酸残基リンカーをＲｌｕｃ断片及びＧγ５の間に生成した（リンカー配列：ＧＳＡＧＴＧＳＡＧＴＴ、配列番号３６）。ＧＲＫ２−ＧＦＰ−膜：ＧＲＫ２−ＧＦＰと、ヒトＫＲＡＳタンパク質（プレニル化モチーフ：ＣＡＡＸ）の膜固定シグナル後の２００アミノ酸残基フレキシブルリンカーとの間の融合タンパク質をコードするＧＲＫ２−ＧＦＰ−膜構築物（Ｈａｎｃｏｃｋ  ２００３）は、以下のように生成した。まず、予測された不規則構造を有するリンカーを２０００残基のランダム配列から作製した。この配列から、最小の���状性と最大の不規則指数を有する２００残基のセグメントは、凝集ホットスポット、推定局在化、相互作用モチーフ及びリン酸化モチーフを排除した後に選択した。この２００−アミノ酸フレキシブルリンカー（配列番号５３）を直接合成した後、ＰＣＲ増幅を用いて、ヒトＫＲＡＳタンパク質スプライス変異体ｂ（アミノ酸配列：ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ、配列番号３７）の膜固定シグナルのＮ末端で、フレームで融合した。次に、ＫＲＡＳプレニル化シグナル後のフレキシブルリンカーをＧＲＫ２−ＧＦＰタンパク質のＣ末端でＧＲＫ２−ＧＦＰ  ｐｃＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ（＋）ベクターにサブクローニングした。ポリシストロニックバイオセンサーベクター：ＧＲＫ２−ＧＦＰ、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧβ１をコードする多シストロン性ベクターは、ＷＴ及びＤ１１０Ａ突然変異体ＧＲＫ２−ＧＦＰ１０融合タンパク質をｐＬＶＸベクターにまずサブクローニングことによって開発した。次に、ＩＲＥＳ−Ｇβ１のｐｃＤＮＡ３．１  Ｒｌｕｃ−Ｇγ５へのサブクローニングを行い、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｒｌｕｃ−Ｇγ５−ＩＲＥＳ−Ｇβ１を得た。最後に、２つの構築物を組み立て、ＧＲＫ２−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｒｌｕｃ−Ｇγ５−ＩＲＥＳ−Ｇβ１を含有するｐＬＶＸベクターを生成した。ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ：融合タンパク質ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸをコードするプラスミドを、リンカー（配列：ＧＳＡＧＴＭＡＳＮＮＴＡＳＧ、配列番号４７）をコードするリバースプライマーとＫＲＡＳスプライス変異体ｂ：−ＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（命名：ＣＡＡＸ、配列番号３７）からの原形質膜標的化多塩基性配列及びプレニル化シグナル配列とを有するｒＧＦＰコード配列（配列番号４６）のＰＣＲ増幅によって得た。ＣＡＡＸ原形質膜標的化配列は、ｒＧＦＰコード配列のＣ末端でフレーム内である。ＰＣＲ断片をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにサブクローニングした。ＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＫ２：ＧＲＫ２  ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、リンカー：ＧＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号４８）を有するｐＩＲＥＳｈｙｇ３発現ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（登録商標）社製）中のそのＮ末端でＲｌｕｃＩＩと共にサブクローニングした。
【０１４８】
細胞培養及び形質移入。ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞は、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃にて、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。実験２日前に、ＨＥＫ２９３細胞を、形質移入剤（ＰＥＩ／ＤＮＡが３対１の比率）としてポリ−エチレンイミン２５ｋＤａ直鎖（ＰＥＩ）を用いて示されたプラスミドで形質移入した後（Ｈａｍｄａｎ、Ｒｏｃｈｄｉら、２００７）、（生きた細胞におけるＢＲＥＴ及びＰＣＡアッセイでは）ウェル当たり３５，０００細胞の密度でポリ−Ｌ−オルニチンヒドロブロミドまたはポリ−Ｄ−リジンで前処理した９６ウェルプレート、または（膜調製物上のＢＲＥＴアッセイでは）ウェル当たり１，０００，０００細胞の密度で６ウェルプレート中にて直接播種した。
【０１４９】
生きた細胞におけるＢＲＥＴアッセイ。９６ウェルプレート中で播種した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、タイロード緩衝液（組成物：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．９ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１．９ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．５ｍＭグルコース及び１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）を添加した。次いで、細胞を異なるリガンドまたはビヒクルで示された回数処理した。Ｒｌｕｃ基質、セレンテラジン４００ａを２．５μＭの最終濃度で添加し、細胞をさらに５分間さらにインキュベートした。次いで、以下のフィルター：４００ｎｍ±７０ｎｍ（エネルギードナー）及び５１５ｎｍ±２０ｎｍ（エネルギーレセプター）を備えたＭｉｔｈｒａｓ（商標）ＬＢ９４０マルチモードマイクロプレートリーダーまたはＴＲＩＳＴＡＲ（登録商標）ＬＢ９４２マルチモードマイクロプレートリーダーを用いて、ＢＲＥＴ値を収集した。Ｒｌｕｃが発した光（４００ｎｍ）に対するＧＦＰが発した光（５１５ｎｍ）の比率を算出することによって、ＢＲＥＴ値を決定した。活性化％（基底の％として刺激）を決定するため、ＢＲＥＴ値は、アゴニスト処理細胞について得られ、ビヒクルで処理した対応する細胞で得られたＢＲＥＴ値のパーセンテージとして表わした。
【０１５０】
ＲｌｕｃＩＩ標識レセプターへのＧＲＫ２−ＧＦＰ転座に対するＢＲＥＴアッセイ（図１５Ｂ及び１５Ｃ）：１００ｎｇのＨＡ−ＴＰαＲ−ＲｌｕｃＩＩ、７５０ｎｇのＧＲＫ２−ＧＦＰ１０（図１５ＢではＷＴまたは図１５ＣではＤ１１０Ａ突然変異体）、１００ｎｇの示されたＧα、１００ｎｇのＷＴ  Ｇβ１、及び１００ｎｇのＷＴ  Ｇγ５、及びＰＥＩ：ＤＮＡが３：１の比でのＰＥＩをＨＥＫ２９３ＳＬの懸濁液（３５０，０００細胞／ｍｌ）に添加する。細胞をポリ−Ｄ−リジン前処理プレート（９６ウェルプレートのウェル当たり１００μｌの細胞／ＰＥＩ／ＤＮＡ懸濁液）上で播種した。形質移入４８時間後、細胞を洗浄し、３７℃で６０分間タイロード＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２中で前インキュベートした。細胞を図１５Ｂ及び１５Ｃでは異なる用量のＵ−４６６１９に３７℃にて合計で１５分間曝した。次に、セレンテラジン４００ａを、２．５μＭの最終濃度で、刺激の最後の５分以内に添加した。ＢＲＥＴは、Ｔｒｉｓｔａｒ（登録商標）マイクロプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を用いて３７℃で測定した。
【０１５１】
ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）で標識したＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＫ２転座に対するＢＲＥＴアッセイ（図１６Ｂ及び１６Ｃ）：１００ｎｇのＨＡ−ＴＰαＲ、２０ｎｇのＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＫ２、１００ｎｇの示されたＧα、１００ｎｇのＷＴ  Ｇβ１、１００ｎｇのＷＴ  Ｇγ５、４００ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）、１８０ｎｇのｓｓＤＮＡ、及びＰＥＩ：ＤＮＡが３：１の比でのＰＥＩをＨＥＫ２９３ＳＬの懸濁液（３５０，０００細胞／ｍｌ）に添加する。細胞をポリ−Ｄ−リジン前処理プレート（９６ウェルプレートのウェル当たり１００μｌの細胞／ＰＥＩ／ＤＮＡ懸濁液）上で播種した。形質移入４８時間後、細胞を洗浄し、３７℃で６０分間タイロード＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２中で前インキュベートした。細胞を図１６Ｂでは異なる用量のＵ−４６６１９に合計で１５分間曝し、またはＺ’因子の決定（図１６Ｃ）では、ビヒクルまたは１００ｎＭ  Ｕ４６６１９のいずれかを３７℃で９６ウェルプレートの半分のウェルに添加した。次に、セレンテラジン４００ａを、２．５μＭの最終濃度で、刺激の最後の５分以内に添加した。ＢＲＥＴは、Ｔｒｉｓｔａｒ（登録商標）マイクロプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を用いて３７℃で測定した。Ｚ’因子の決定は上述のように得た。
【０１５２】
Ｇタンパク質インヒビター。ＢＲＥＴアッセイは、細胞を１００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素で３７℃にて一晩、または、１００ｎＭのＵｂｏ−Ｑｉｃで３７℃にて２０分間前処理した以外は、上述のように行った。
【０１５３】
動態実験。ＢＲＥＴアッセイは、リガンド及びビヒクルをＢＲＥＴ測定の３０秒後に細胞に注入しながら、ＢＲＥＴ読み取りをセレンテラジン添加５分後に一定間隔で収集した以外は、上述のように行った。
【０１５４】
Ｚ’因子決定。ＨＥＫ２９３細胞は、示された構築物（図７Ａ、７Ｂ、９Ａ、１０Ｃ、１１Ｄ、及び１６Ｃの説明を参照）で述べたように形質移入した。ＢＲＥＴアッセイは、上述のように行い、９６ウェルプレートの半分は示されたアゴニストで処理し、プレートの残りの半分は対応するビヒクルで処理した。Ｚ’因子は、Ｚｈａｎｇら、（Ｚｈａｎｇ、Ｃｈｕｎｇら、１９９９）に記載されるように算出した。０．４〜１のＺ’因子は、ロバストアッセイと見なす。
【０１５５】
ＲｌｕｃＩＩ断片を用いたタンパク質相補性アッセイ。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、タイロード緩衝液を添加した。次に、細胞を、Ｒｌｕｃ基質、セレンテラジン４００ａで、２．５μＭの最終濃度で３７℃にて３０分間前処理した。異なるリガンドまたはビヒクルをさらに１０分間添加した。次に、任意のフィルターが無いＭｉｔｈｒａｓ（商標）ＬＢ９４０マルチモードマイクロプレートリーダーを用いて発光値を収集した。
【０１５６】
膜調製物上のＢＲＥＴアッセイ。６ウェルプレートに播種した細胞を収集し、溶解緩衝液（組成物：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２７％スクロース、１５μＭ  ＧＤＰ、２μＭ  ＧＴＰ、１０μｇ／ｍｌベンズアミジン、５μｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター及び５μｇ／ｍｌロイペプチン）中で再懸濁し、ポリトロン均質化を施した。遠心分離工程後、膜ペレットを５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５μＭ  ＧＤＰ、及び１５μＭ  ＧＴＰを補充したタイロード緩衝液中で再懸濁した。次に、ウェル当たり４００μｇの膜を用いて、ＢＲＥＴ実験を上述のように行った。
【０１５７】
ＢＲＥＴ滴定（図２Ｂ及び２Ｃ）：μｇ  ＤＮＡ対μｌ  ＰＥＩ１ｍｇ／ｍｌの比が１μｇ：３μｌに等しいＰＥＩを用いて、ＨＥＫ２９３細胞を一過性形質移入した。９６ウェルプレートのウェル当たりの形質移入したＤＮＡは、以下の通りである：図２Ａ及び２Ｂでは：４０ｎｇのＨＡ−ＴＰαＲまたはＨＡ−β１ＡＲ、０．５ｎｇのＲｌｕｃＩＩ−Ｇγ５、１０ｎｇのＧα１１またはＧα１５、構築物をコードする１０ｎｇのＧβ１、及びＧＦＰ１０で標識された増加量（最大７５ｎｇ）のＧＲＫ２構築物。ＢＲＥＴアッセイを形質移入２日後に行った；細胞をＰＢＳで１回洗浄し、タイロード緩衝液中に置いた。細胞を室温で合計１５分間、ビヒクルまたはアゴニスト薬、１００ｎＭ  Ｕ−４６６１９（図２Ｂ）、または１μＭイソプロテレノール（図２Ａ）で処理した。次に、Ｒｌｕｃ基質Ｃｏｅｌ−４００ａを、２．５μＭの最終濃度で、刺激の最後の５分以内に添加した。次に、Ｍｉｔｈｒａｓ（登録商標）ＬＢ９４０マルチモードマイクロプレートリーダーを用いて、ＢＲＥＴ値を収集し、ＲｌｕｃＩＩが発した光に対するレセプターが発した光の比率を算出することによって決定した。滴定曲線（図２Ｂ及び２Ｃ）は、ＲｌｕｃＩＩ構築物発現（生物発光で評価）に対するＧＦＰ構築物発現（蛍光で評価）の関数で得られたＢＲＥＴ比を表わす。
【０１５８】
実施例２：結果
ＧＰＣＲによる特異的Ｇタンパク質の活性化を研究するため、アッセイは、Ｇβγサブユニットと結合するためのＧαサブユニットとβγＩＰの間の競合に基づいて開発した。図１Ａ及び１Ｂに示すように、レセプター活性化の不在下では、Ｇαサブユニットは、Ｇβγ二量体と堅く結合しており、βγＩＰとの会合を防ぐ。レセプター刺激後、ＧＴＰ結合Ｇαは、Ｇβγ複合体から解離した後、βγＩＰと自由に相互作用する。従って、βγＩＰとＧβγの間の相互作用は、Ｇタンパク質活性化を反映する。βγＩＰ及びＧβγ（各々を検出システムの２つの成分の１つで標識した）を共発現することによって、様々なサブタイプの非標識Ｇαで、活性化後の所与のレセプターのカップリングプロファイルを決定することが可能にされている。以下に示すように、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）アプローチ（図１Ａ：生物発光（ＢＲＥＴ）、または蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ））；または図１Ｂ：タンパク質相補性（ＰＣ）アッセイなどの様々な検出方法を使用して、βγＩＰとＧβγの間の相互作用を評価してもよい。
【０１５９】
ＲＥＴを検出方法の一例とすると、Ｇタンパク質活性化のβγＩＰベースバイオセンサーを解釈するための可能なシナリオ及び対応する結果を図１Ｃに示す。２つのＲＥＴパートナーβγＩＰ−Ａ及びＧβγ−Ｄで共形質移入した任意のＧαサブユニットが無い場合には、基底ＲＥＴシグナルは、βγＩＰとＧβγ二量体の間の構成的相互作用により比較的高い。この場合、レセプター刺激後に測定したＲＥＴシグナルの調節は、内因性Ｇαサブユニットの活性化を反映している（模擬またはＧα条件）。Ｇαサブユニットの共発現は、βγＩＰ−ＡとＧβγ−Ｄの間の基底相互作用を防ぎ、記録した基底ＲＥＴ反応の減少をもたらす（＋Ｇα１及び＋Ｇα２条件では白バー）。（例えば、適切なＧＰＣＲリガンドで）レセプターを刺激すると、レセプターが他のバイオセンサー成分（黒バー、＋Ｇα２条件）と共発現した特異的Ｇαサブユニットと関与する（即ち、共役する）場合に限って、模擬条件と比較してＲＥＴシグナルの調節における有意な増加が観察される。しかしながら、過剰発現したＧαサブユニットがレセプターに機能的に共役していない場合、ＢＲＥＴシグナルの有意な変化は、レセプターを刺激する際（黒バー、＋Ｇα１条件）に検出されない。
【０１６０】
図２Ａ〜２Ｃは、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーの最適化のために試験した異なる構築物のいくつかを提示する。ＧＲＫ２及びＧＲＫ３に対する４つの異なるＧＦＰ標識構築物を試験した。そのうちの２つは、完全ＧＲＫコード配列に基づき、２つは、Ｃ末端ＰＨドメイン／Ｇβ結合ドメインに基づき、ＧＦＰは、ＧＲＫのＮ末端またはＣ末端部分のいずれかである（図２Ａ）。図２Ｂ及び２Ｃに提示される結果は、全てのＧＲＫ２構成物／構築物が検出可能なＢＲＥＴ反応（従って、バイオセンサーで使用され得る）を起こし、そのＣ末端にてＢＲＥＴアクセプター（例えば、ＧＦＰ）で標識された全長ＧＲＫは、より広範囲のドナー対アクセプター比にわたって、ＢＲＥＴシグナルの振幅及び反応の安定性について最良の動的ウィンドウを与えていることを示している。ＧＦＰ標識ＧＲＫ３構築物を用いて同様の結果が得られた。
【０１６１】
βγＩＰを用いてＧタンパク質活性化を監視する実現可能性を評価するため、遊離Ｇβγ二量体と特異的に相互作用するＧＲＫ２タンパク質を代表的なβγＩＰとして選択し、そのＣ末端にてエネルギーレセプターＧＦＰ１０（ＧＦＰ）で標識することで、Ｇβγとの相互作用の読み出しとしてＢＲＥＴを使用することができる。ＧＲＫ２−ＧＦＰ融合タンパク質は、Ｎ末端にてエネルギードナーウミシイタケ由来ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）で標識されたＧγ５サブユニット、並びに非標識のＧβ１及びＧαサブユニットと共発現した。バイオセンサー成分（ＧＲＫ２−ＧＦＰ及びＲｌｕｃ−Ｇγ５）Ｇβ１、及び種々のＧαに加えて、細胞は、原型的なＧＰＣＲの一例として選択したトロンボキサンＡ２レセプター（ＴＰαＲ）で共形質移入した。図３Ａに示す実験では、ＴＰαＲのＧタンパク質カップリングプロファイルは、種々のＧαタンパク質、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、Ｇα１５、ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｚ、Ｇαｓ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、及びＧαｉ３を共発現している細胞をＴＰαＲアゴニストＵ−４６６１９（エンドペルオキシドプロスタグランジンＰＧＨ２の安定な合成類似体）で刺激し、Ｇα過剰発現（模擬条件、左バー）の不在下で得られた結果と比較することによって決定した。Ｇα共形質移入が無い場合には、記録されたＢＲＥＴシグナルは、比較的高く、Ｕ−４６６１９で刺激した際に僅かに調節し、内因性Ｇαタンパク質の活性化を反映した。特異的Ｇαタンパク質を共発現する際に、ＢＲＥＴシグナルのアゴニスト誘発調節は、模擬条件またはＧαｉファミリーのＧαサブユニットを過剰発現している細胞と比較して、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４、及びＧα１５／１６を過剰発現している細胞で有意に高く、Ｇαｑ及びＧα１２ファミリーのＧタンパク質の活性化に共役しているが、Ｇαｉファミリーのものには共役していないことを示している（図３Ｂ）。
【０１６２】
野生型（天然）Ｇαタンパク質に加えて、３つのＧαｑ突然変異体（ＧαｑＧ６６Ｋ、ＧαｑＹ６７Ｃ及びＧαｑＦ７５Ｇは、ＴＰαＲで試験したＧタンパク質のパネルでも使用した。Ｇαｑタンパク質の６６位でのグリシン残基の荷電残基（例えば、ＧｑＧ６６Ｋ）への置換は、非Ｇαｑ共役レセプターによっても活性化することができるため、無差別カップリング特性を有するＧαｑタンパク質突然変異体が得られるものとして前述されている（Ｈｅｙｄｏｒｎ、Ｗａｒｄら、２００４）。図３Ａ及び３Ｂから分かるように、上述のＧαｑＧ６６Ｋ突然変異体、並びに本明細書に記載された新規のＧαｑＹ６７Ｃ及びＧαｑＦ７５Ｇは、ＴＰαＲによって活性化された。これらの無差別Ｇαタンパク質（またはこれらの位置で等価の突然変異を有する任意のＧαタンパク質、図１４を参照）は、βγベースバイオセンサーアッセイにおけるＧＰＣＲ活性化の陽性対照として使用してもよく、それらのカップリング選好について限られた情報しか入手できないレセプター、例えば、孤児レセプターで特に有用である。次に、Ｕ−４６６１９の用量反応曲線について、Ｇαｑ、Ｇα１３、Ｇα１４、Ｇα１５／１６、ＧαｑＧ６６Ｋ、及びＧαｑＹ６７Ｃを選択した（図３Ｃ）。興味深いことに、Ｇ１３の０．５ｎＭからＧα１５／１６の６．６ｎＭの範囲の効力を測定し、βγＩＰベースバイオセンサーアッセイが、所与のレセプター／リガンド対に関与した各Ｇタンパク質に関連した活性化の特定の効力を検出することができるという妥当性を確認した。
【０１６３】
βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーを使用して、種々のＧＰＣＲのＧタンパク質活性化の特異性を明らかにすることができることをさらに示すために、ドーパミンＤ２レセプター（Ｄ２Ｒ）、及びα１Ｂアドレナリンレセプター（α１ＢＡＲ）の各々は、ＧＲＫ２−ＧＦＰ、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、Ｇβ１、及び種々のＧαを共発現し、それらの原型的なアゴニスト；Ｄ２Ｒにはロチゴチン、及びα１ＢＡＲにはフェニルエピネフリンで刺激した。図４Ａ及び４Ｃに示すように、各レセプターは、ＴＰαＲで観察されたもの（図３Ａ及び３Ｂ）とは異なる特定のＧタンパク質活性化プロファイルを示し；Ｄ２Ｒは、Ｇαｉファミリーメンバー（ＧαｏＡ、ＧαｏＢ、Ｇαｚ、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、及びＧαｉ３）にだけ共役しているが、α１ＢＡＲは、Ｇαｑファミリーメンバー（Ｇαｑ、Ｇα１１、及びＧα１５／１６）に独占的に共役している。無差別Ｇαｑ突然変異体ＧαｑＹ６７Ｃは、２つのレセプターによって活性化された（図４Ａ及び４Ｃ）。用量反応曲線は、Ｄ２Ｒ（Ｇαｉ１及びＧαｑＹ６７Ｃ）、及びα１ＢＡＲ（Ｇαｑ及びＧα１１）によって活性化されたＧタンパク質のいくつかについて得られた（図４Ｂ及び４Ｄ）。図４Ｅでは、Ｇαｚ活性化の用量反応曲線は、α２ＣＡＲ、Ｇαｚ、ＧＲＫ２−ＧＦＰ、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧβ１を発現しているＨＥＫ２９３細胞から異なるアドレナリンアゴニスト：エピネフリン、ノルエピネフリン、フェニレフリン、及びイソプロテレノールについて得られた。βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーを使用して、ＧＰＣＲのＧタンパク質選好及び活性化／薬理学的プロファイル、並びに、それらの同族レセプターを介して種々のＧタンパク質を活性化する所与のリガンドの効力及び効果に対処するための薬理学的ツールを確立し得ることをこれらの結果は示している。図４Ｆ〜４Ｊに示すように、別個のＧタンパク質活性化プロファイルは、Ｇβ及びＧγサブユニットの種々の組み合わせについて得られた。Ｇβ及びＧγサブユニットの双方の組み合わせが、Ｇタンパク質活性化の別個の薬理学的プロファイルをもたらし得ることを結果は示している。これらの差は、少なくとも一部は、特異的集合のＧαサブユニットだけでなく、種々の組み合わせ及びレベルのＧβ及びＧγサブユニットも発現している異なる細胞及び組織で観察された別個の薬理学的プロファイルに関連している。
【０１６４】
Ｇタンパク質活性のインヒビター、例えば、百日咳毒素（ＰＴＸ）及びＵｂｏ−Ｑｉｃ（環状デプシペプチドＹＭ−２５４８９０に構造的に関連する）（それぞれ、Ｇαｉ及びＧαｑ活性化を選択的に遮断する）は、レセプターのカップリング特性を特徴付けるためにＧＰＣＲの分野で広く使用されている（Ｔａｋａｓａｋｉ、Ｓａｉｔｏら、２００４）。βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーを用いて、これらの選択的Ｇタンパク質インヒビターで実験を行い、得られたＢＲＥＴシグナルの特異性について実証した。Ｇαｑ活性化に共役するＴＰαＲでは、アゴニスト刺激後にβγＩＰベースバイオセンサーを用いて測定したＢＲＥＴ反応は、Ｕｂｏ−Ｑｉｃ前処理時に完全に消失したが、ＰＴＸ前処理は、この反応に全く影響を及ぼさなかった（図５Ａ）。これに対し、Ｇαｉ共役型レセプターＤ２Ｒでは、ＰＴＸ前処理は、アゴニスト培養後に検出されたバイオセンサーＢＲＥＴ反応を著しく減少させたが、ＧｑインヒビターＵｂｏ−Ｑｉｃによる前処理は、記録されたＢＲＥＴシグナルに検出可能な効果を有しなかった（図５Ｂ）。また、ＴＰαＲ媒介性Ｇタンパク質活性化を使用して、Ｕｂｏ−Ｑｉｃインヒビター選択性の妥当性を確認した。図５Ｃに提示される結果は、Ｇαｑファミリー（Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４、及びＧα１５／１６）から、Ｇα１５／１６のみが、Ｕｂｏ−Ｑｉｃに非感受性であることを示している。また、Ｇα１２及びＧα１３タンパク質は、Ｕｂｏ−Ｑｉｃに非感受性である。最後に、βγＩＰベースバイオセンサーを使用して、（６７位または７５位での−図１４を参照）突然変異体Ｇαｑ活性化のＵｂｏ−Ｑｉｃ感受性を明らかにした。６７位でのチロシン残基の置換（Ｙ６７Ｃ、Ｙ６７Ｇ、Ｙ６７Ｓ、及びＹ６７Ｌ）は、Ｕｂｏ−Ｑｉｃへの耐性及び無差別特性をもたらした。これは、この残基がＧタンパク質活性化を制御するのに重要であり得、Ｐｈｅ７５残基の（無差別表現型と会合している−図４Ａを参照）グリシンへの置換が、活性化（図５Ｄ）の部分的なＵｂｏ−Ｑｉｃ媒介性阻害をもたらすことを示した。従って、種々のＧタンパク質について記録されたＢＲＥＴシグナルの特異性を確認することに加えて、Ｇタンパク質の新規の選択的インヒビターを同定／開発するためのツールとして、本明細書に記載されたβγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーを使用することを、これらの結果は支持している。
【０１６５】
βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーをさらに特徴付けるために、Ｇαｉ１（図６Ａ）及びＧα１１（図６Ｂ）活性化の動態を、それぞれ、Ｄ２Ｒ及びＴＰαＲのアゴニスト処理後に決定した。図６Ａ及び６Ｂに示すように、活性化の同様の動態が、２つの異なるレセプター及びＧタンパク質について得られ、最大の反応はリガンド付加のおおよそ３０秒後に到達し、プラトー状態が最初の刺激後少なくとも３０分間続いた。この持続反応は、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）へのアッセイ適応に特に適している。
【０１６６】
アッセイのロバスト性を評価するため、典型的なＧαｉ−（Ｄ２Ｒ、図７Ａ）及びＧαｑ−（ＴＰαＲ、図７Ｂ）共役レセプターを介したＧタンパク質活性化のＺ’因子を決定した。アッセイは、Ｄ２Ｒ／Ｇαｉ１（図７Ａ）及びＴＰαＲ／Ｇα１１（図７Ｂ）について、それぞれ、０．７９及び０．８９のＺ’因子で特にロバストである。このアッセイのロバスト性は、スクリーニング用途、特に、ＨＴＳ用途の要件と適合する。
【０１６７】
レセプターのＧタンパク質プロファイリング及びＨＴＳにおけるβγベースバイオセンサーの上述の用途の可能性に加えて、リガンドの特徴付けは、このＧタンパク質活性化バイオセンサーの別の用途を表す。ＧＰＣＲは、異なるリガンドによる活性化時に異なるＧタンパク質及びシグナル伝達経路に優先的に関与することができ、この現象は、ＧＰＣＲのリガンドバイアスシグナル伝達として知られる（Ｇａｌａｎｄｒｉｎ，Ｏｌｉｇｎｙ−Ｌｏｎｇｐｒｅら、２００７）（Ｋｅｎａｋｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  ２０１３）。本明細書に記載されたバイオセンサーは、同じＲＥＴパートナーを用いて全てのＧタンパク質サブタイプの活性を評価することができるため、リガンドプロファイリング実験を行うのに特に適している。代表的な例として、アンジオテンシンＩＩ型１レセプター（ＡＴ１Ｒ）の異なるリガンドを、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーを用いてプロファイリングした（図８Ａ〜８Ｃ）。第１セットの実験を行い、その天然リガンドであるアンジオテンシンＩＩを用いてレセプターのカップリング特性を決定した。図８Ａに示すように、ＡＴ１Ｒは、タンパク質のＧαｑ−、Ｇα１２−、及びＧαｉ−ファミリーのいくつかのメンバーに共役している。次に、アンジオテンシンＩＩの異なる類似体によるＡＴ１Ｒを活性化した後にさらに特徴付けるために、Ｇαｑ、Ｇα１１、及びＧα１２を選択した。図８Ｂ及び８Ｃに示すように、これらのアンジオテンシンＩＩ由来ペプチドは、異なるＧタンパク質を種々の程度で刺激し、特異的Ｇタンパク質の方へのいくつかのリガンドの潜在的バイアスを明らかにした。例えば、ＤＶＧペプチドは、アンジオテンシンＩＩ反応に対して、ＧαｑよりもＧα１２活性化のより良い効果を示した（図８Ｃ）。
【０１６８】
次に、ＲＥＴベースアッセイの代わりに、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）を使用して、βγＩＰとＧβγサブユニットの間の相互作用を評価できるかどうかについて評価した（図１Ｂ）。二分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）または酵素断片相補性（ＥＦＣ）などのＰＣＡは、２つのタンパク質パートナーの間の相互作用を検出することができるため、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーと両立できる。ＥＦＣベースアッセイ、より詳細には、ＲｌｕｃベースＥＦＣアッセイ（Ｓｔｅｆａｎ、Ａｑｕｉｎら、２００７）を使用できるかどうか判断するため、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーでは、２つの融合タンパク質を生成した：Ｃ末端におけるＲｌｕｃのＮ末端部分で標識されたＧＲＫ２（ＧＲＫ２−Ｒｌｕｃ  Ｆ１）、及びＧγ５のＮ末端におけるＲｌｕｃの相補的Ｃ末端部分（Ｒｌｕｃ  Ｆ２−Ｇγ５）。ＧＲＫ２と遊離Ｇβγサブユニットの間の相互作用が生じると（Ｇタンパク質活性化後）、２つの相補的Ｒｌｕｃ断片が再会合し、ＲＬｕｃ基質セレンテラジンの存在下で発光を測定することができる。ＧＲＫ２−Ｒｌｕｃ  Ｆ１、Ｒｌｕｃ  Ｆ２−Ｇγ５、Ｇβ１、及びＧα１１と共にＴＰαＲを共発現している細胞を用いて概念実証を行った。Ｕ−４６６１９で刺激した後にロバストな発光シグナルを測定し、０．５３のＺ’因子（図９Ａ）及び８．４ｎＭのＥＣ５０（図９Ｂ）を有するＧ１１タンパク質活性化が明らかになり、本明細書に記載されたβγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーにおいてＰＣＡを使用され得るという妥当性を確認した。
【０１６９】
次に、ＧＲＫ２（例えば、ＧＲＫ３）以外のβγＩＰを使用して、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーにおけるＧタンパク質活性化を監視することができるかどうか評価した。融合タンパク質をＧＲＫ３とエネルギーレセプターＧＦＰの間で生成し、得られたＧＲＫ３−ＧＦＰをＲｌｕｃ−Ｇγ５、Ｇβ１、Ｇαｉ１、及びＤ２Ｒと共発現させて、ドーパミンの用量反応曲線を得た。図１０Ａで分かるように、ＧＲＫ２またはＧＲＫ３ベースバイオセンサー（ＧＲＫ２では９６ｐＭ、ＧＲＫ３では５６ｐＭ）を用いて、同様の効力が観察した。ＧＲＫ３ベースバイオセンサーの活性化の動態は、ＧＲＫ２ベースバイオセンサーを用いて得られたもの（図６Ａ及び６Ｂ）とも同様であり、最大の反応はおおよそ３０秒で到達し、プラトー状態が少なくとも数分間続いた（図１０Ｂ）。最後に、Ｚ’因子もＧＲＫ３ベースバイオセンサーで生成した。Ｄ２Ｒ及びＧαｉ１を用いて、０．７１のＺ’因子がＧＲＫ３−バイオセンサーで得られ、アッセイのロバスト性を確認した（図１０Ｃ）。まとめると、異なるβγＩＰをβγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーで使用して、Ｇタンパク質活性化を評価することができることを、これらのデータは示している。
【０１７０】
βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーの使用を簡単にするため、ＧＲＫ２−ＧＦＰ、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及びＧβ１をコードする多シストロン性ベクターを開発した（図１１Ａ）。これにより、バイオセンサーの成分が単一構築物から固定比率で発現され、実験間の変動性を最小限にできることが保証される。図１１Ｄに示すように、０．８のＺ’因子は、ＴＰαＲ及びＧα１１をコードするプラスミドで共形質移入した多シストロン性構築物を用いて得られた。この結果は、個々のバイオセンサー成分をコードするプラスミドで形質移入した細胞で得られたＺ’因子（図７Ｂ：Ｚ’＝０．８９）と同程度である。この多シストロン性ベクターを用いて、用量反応曲線実験も行い、Ｕ−４６６１９で刺激したＴＰαＲについて４．３ｎＭのＥＣ５０値が得られ（図１１Ｃ）、Ｒｌｕｃ−ＰＣＡベースＧＲＫ２バイオセンサーで使用した同じレセプター／リガンド対で測定した８．４ｎＭのＥＣ５０に同様であった（図９Ｂ）。これらの結果により、バイオセンサーの異なる成分を多シストロン性ベクター中で発現している妥当性が確認され、ただ一つの選択マーカーを有する安定な細胞株を確立するために有利に使用することができるため、実験手順を簡素化し、再現性を改善させる可能性がある（例えば、実験間の変動性を最小限にする）。
【０１７１】
βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーの別の変異体を開発した。ここで、ＧＲＫ２タンパク質は、原形質膜（ＰＭ）で連結している（図１２Ａ）。この構築物は、膜調製物上のインビトロ実験がスクリーニング用途などの全細胞実験に好ましいいくつかの特定用途に有用であり得る。このアプローチの妥当性を確認するため、ＴＰαＲ、Ｇα１１、Ｇβ１、Ｒｌｕｃ−Ｇγ５、及び上で使用したＧＲＫ２−ＧＦＰ（図１２ＢではＧＲＫ２  ｗｔ）の細胞質型または原形質膜固定ＧＲＫ２−ＧＦＰ（ＧＲＫ２−膜）のいずれかを発現している膜調製物上でＢＲＥＴ実験を行った。ｗｔ  ＧＲＫ２（図１２Ｂ）と比較して膜連結ＧＲＫ２ではＢＲＥＴシグナルの良好な調節が観察され、リガンド刺激時には最低限度のＢＲＥＴ増加しか検出されなかった。これらの結果により、膜調製物上のＧタンパク質活性化を測定するためにＰＭ固定βγＩＰの使用の妥当性が確認された。
【０１７２】
図１３Ａ〜１３Ｃに示す結果は、ＲＧＳドメインにおけるＤ１１０Ａ置換（ＲＧＳが死んだ突然変異体）、触媒ドメインにおけるＫ２２０Ｒ置換（触媒死突然変異体）、またはリン酸化によるその調節（Ｓ６７０Ａ、Ｓ６７６Ａ、及びＳ６８５Ａ置換、または、それぞれ、ＥＲＫ、ＰＫＡ、及びＣＤＫ２−シクリンＡによるＧＲＫ２のＣ末端結合ドメインのリン酸化を防いで模倣し、βγＩＰベースのＧタンパク質活性化バイオセンサーを用いて評価した場合に活性化Ｇタンパク質への補充を防ぎもしないし、著しく促進もしないＳ６７０Ｄ、Ｓ６７６Ｄ、及びＳ６８５Ｄ置換）などのＧＲＫ２機能に影響を及ぼすと報告されている突然変異を示す。上述の突然変異を含むＧＲＫ２変異体は、天然ＧＲＫ２（図１３Ａ〜１３Ｃ）と同様の程度まで補充されるため、ＧβγへのＧＲＫ２補充が異なるシグナル伝達事象による調節に非感受性であり得るという証拠を提供している。アンジオテンシンＩＩによるＡＴ１Ｒの活性化後にＧＲＫ２  Ｄ１１０Ａ突然変異体で同様の結果が得られた。
【０１７３】
Ｇβγサブユニットと結合するためのＧαサブユニットとβγＩＰの間の競合を測定するための別のバイオセンサーを開発した；図１５Ａは、そのようなバイオセンサーの構成及び原理を示す。バイオセンサーは、ＲＥＴドナーまたはアクセプター（ＲＥＴアクセプター（Ａ）を示す）で標識されたβγＩＰ（ＧＲＫ）と、そのＣ末端にてＲＥＴドナーまたはアクセプター（ＲＥＴドナー（Ｄ）を示す）で標識されたＧＰＣＲとを含む。不活性形態である間には、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニットは、Ｇβγ二量体と堅く結合している。ＧＰＣＲとリガンド（Ｌ）結合する際に、ＧαはＧβγサブユニットから解離し、βγＩＰを遊離Ｇβγサブユニットに補充させ、ＧＰＣＲに結合したＢＲＥＴドナーにＢＲＥＴアクセプターを近接させることによって、ＢＲＥＴシグナルを誘発／増加させる。図１５Ｂ及び１５Ｃは、野生型ＧＲＫ２（図１５Ａ）またはＲＧＳが死んだＧＲＫ２突然変異体（Ｄ１１０Ａ）（図１５Ｂ）を含む図１５Ａによるバイオセンサーで得られたＧタンパク質活性化の用量反応曲線を示す。用量反応曲線は、図１５Ｂ及び１５Ｃと同様のプロファイルを示し、図１１Ｂ及び１３Ａに提示される結果を確認し、且つ、異なるバイオセンサー構成を使用して、活性化Ｇタンパク質にβγＩＰを補充するのに機能性ＲＧＳは必要とされないことを示している。
【０１７４】
Ｇβγサブユニットと結合するためのＧαサブユニットとβγＩＰの間の競合を測定するための別のバイオセンサーを開発した；図１６Ａは、そのようなバイオセンサーの構成及び原理を示す。バイオセンサーは、ＲＥＴドナーまたはアクセプター（ＲＥＴドナー（Ｄ）を示す）で標識されたβγＩＰ（ＧＲＫ）と、ＲＥＴドナーまたはアクセプター（ＲＥＴアクセプター（Ａ）を示す）で標識された原形質膜（ＰＭ）標的化ドメインとを含む。不活性形態である間には、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニットは、Ｇβγ二量体と堅く結合している。ＧＰＣＲとリガンド（Ｌ）結合する際に、ＧαはＧβγサブユニットから解離し、βγＩＰを、ＰＭで配置される遊離Ｇβγサブユニットに補充させ、ＰＭに固定したＲＥＴアクセプターＡにＲＥＴドナーＤを近接させることによって、ＢＲＥＴシグナルを誘発／増加させる。図１６Ｂは、図１６Ａによるバイオセンサーで得られたＧタンパク質活性化の用量反応曲線を示す。ＴＰαＲ、異なるＧα（Ｇαｑ＝黒四角、Ｇα１１＝黒三角、模擬条件（Ｇα無し）＝白丸）、Ｇβ１、Ｇγ５、ＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＫ２、及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを共発現しているＨＥＫ２９３細胞を使用して、Ｕ４６６１９の用量を増加させながら刺激した。図１６Ｂの用量反応曲線は、異なる構成（図３Ｃ、９Ｂ、及び１１Ｃ）を有するバイオセンサーで得られたものと同様であり、ＰＭでβγＩＰ補充を測定するバイオセンサーが、ＰＭに固定されている遊離ＧβγサブユニットへのβγＩＰ補充を「間接的」に評価するのに適しているという証拠を提供している。
【０１７５】
本発明がその特定の実施形態によって上述されたが、添付の特許請求の範囲で定義された表題発明の精神及び性質から逸脱することなく修正することができる。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、制限のない用語として使用され、「含むが制限されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」という表現と実質的に等しい。単数形態「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が異なるように明確に指示していなければ、対応する複数の局面を含む。
【０１７６】
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８．   Ｋｅｎａｋｉｎ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ａ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  （２０１３）．  “Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｉａｓ  ｉｎ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ．”  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １２（３）：  ２０５−２１６．
９．   Ｌｅｄｕｃ，  Ｍ．，  Ｂ．  Ｂｒｅｔｏｎ，  Ｃ．  Ｇａｌｅｓ，  Ｃ．  Ｌｅ  Ｇｏｕｉｌｌ，  Ｍ．  Ｂｏｕｖｉｅｒ，  Ｓ．  Ｃｈｅｍｔｏｂ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｈｅｖｅｋｅｒ  （２００９）．  “Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  ＥＰ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ．”  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３３１（１）：  ２９７−３０７．
１０． Ｍｅｒｃｉｅｒ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ａ．  Ｓａｌａｈｐｏｕｒ，  Ｓ．  Ａｎｇｅｒｓ，  Ａ．  Ｂｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｂｏｕｖｉｅｒ  （２００２）．  “Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ  １  ａｎｄ  ｂｅｔａ  ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏ−ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：  ４４９２５−４４９３１．
１１． Ｐｉｔｃｈｅｒ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｊ．  Ｉｎｇｌｅｓｅ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｊ．  Ｌ．  Ａｒｒｉｚａ，  Ｐ．  Ｊ．  Ｃａｓｅｙ，  Ｃ．  Ｋｉｍ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｂｅｎｏｖｉｃ，  Ｍ．  Ｍ．  Ｋｗａｔｒａ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｃａｒｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｊ．  Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ  （１９９２）．  “Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ｇａｍｍａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｏ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７（５０７４）：  １２６４−１２６７．
１２． Ｓｔｅｆａｎ，  Ｅ．，  Ｓ．  Ａｑｕｉｎ，  Ｎ．  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｃ．  Ｒ．  Ｌａｎｄｒｙ，  Ｂ．  Ｎｙｆｅｌｅｒ，  Ｍ．  Ｂｏｕｖｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｗ．  Ｍｉｃｈｎｉｃｋ  （２００７）．  “Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４（４３）：  １６９１６−１６９２１．
１３． Ｔａｋａｓａｋｉ，  Ｊ．，  Ｔ．  Ｓａｉｔｏ，  Ｍ．  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｔ．  Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｙ．  Ｍｏｒｉｔａｎｉ，  Ｋ．  Ｈａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋｏｂｏｒｉ  （２００４）．  “Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｇａｌｐｈａｑ／１１−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（４６）：  ４７４３８−４７４４５．
１４． Ｔｏｕｈａｒａ，  Ｋ．，  Ｊ．  Ｉｎｇｌｅｓｅ，  Ｊ．  Ａ．  Ｐｉｔｃｈｅｒ，  Ｇ．  Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｊ．  Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ  （１９９４）．  “Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｔａ  ｇａｍｍａ−ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｔｏ  ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎｓ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９（１４）：  １０２１７−１０２２０．
１５． Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｔ．  Ｄ．  Ｃｈｕｎｇ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｒ．  Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  （１９９９）．  “Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ．”  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ４（２）：  ６７−７３．
１６． Ｃｏｎｇら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７６，  １５１９２−１５１９９．  
１７． Ｐｉｔｃｈｅｒら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７４，  ３４５３１−３４５３４．  
１８． Ｐｅｎｅｌａら、ＰＮＡＳ，  １０７（３）：  １１１８−１１２３．
１９． Ｃｈｏｕｄｈａｒｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２００９  ３６（２）：  ３２６−３９．
２０． Ｌｉｎｄｉｎｇら、  ＧｌｏｂＰｌｏｔ：  ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｇｌｏｂｕｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２００３  −  Ｖｏｌ．  ３１，  Ｎｏ．１３，  ３７０１−８．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図７Ａ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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