(57)【要約】  本発明はヒトにおける免疫療法のための組成物及び方法を提供する。本発明はT細胞において発現され、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79αβヘテロ二量体と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含むB細胞受容体様複合体を含む。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じヒト又はヒト化B細胞受容体に由来し、複合体中で単一単位を形成する。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激シグナル伝達ドメインと組み合わせて含む。シグナル伝達領域はCD79αβヘテロ二量体と融合する。さらに、本発明のB細胞受容体様複合体は、細胞傷害性T細胞と標的の細胞との間の橋渡しとして標的化分子を使用することができる。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外抗原認識ドメインと、
膜貫通ドメインと、
CD79タンパク質又はその機能的等価物と、
T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域と、
を含むB細胞受容体様複合体であって、前記細胞外抗原認識ドメイン及び前記膜貫通ドメインが同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、
前記シグナル伝達領域がT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含み、該シグナル伝達領域が前記CD79タンパク質と融合する、B細胞受容体様複合体。
【請求項２】
請求項1に記載のB細胞受容体様複合体を共にコードする1つ又は複数の単離核酸配列。
【請求項３】
前記CD79タンパク質がCD79αタンパク質、CD79βタンパク質、CD79αホモ二量体、CD79βホモ二量体、CD79αβヘテロ二量体又はそれらの任意の機能的等価物からなる、請求項1に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項４】
前記T細胞シグナル伝達ドメイン、前記共刺激ドメイン又はその両方が前記CD79タンパク質の一方又は両方のモノマーと融合する、請求項1に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項５】
前記細胞外抗原認識ドメイン及び前記膜貫通ドメインが、単一のヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質を形成する、請求項1に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項６】
前記細胞外抗原認識ドメインが表面抗原に結合する、請求項1に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項７】
前記細胞外抗原認識ドメインが、標的化分子上で提示される普遍的エピトープに結合する、請求項1に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項８】
前記標的化分子がタンパク質スキャフォールドである、請求項7に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項９】
前記標的化分子がscFv分子、Darpin分子、Nanobody分子、Alphabody分子、Centyrin分子、Affibody分子、重鎖単独抗体、又は任意の他のタンパク質スキャフォールドプラットホームに由来する分子からなる群から選択される、請求項7又は8に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項１０】
前記標的化分子が表面抗原に結合する、請求項7〜9のいずれか一項に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項１１】
前記表面抗原が固形腫瘍又は血液系腫瘍と関連する、請求項6又は10に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項１２】
前記T細胞シグナル伝達ドメインが、T細胞活性化をもたらす1つ又は複数のITAMモチーフを含有する、請求項1に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項１３】
前記共刺激ドメインがCD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、ICOS、リンパ球機能関連抗原（LFA-1）、CD2、CD7、NKG2C、GITR、CD137、HVEM、TIM1、ガレクチン-9、CD83と特異的に結合するリガンド、及びそれらの任意の組合せから選択される共刺激分子の細胞内ドメインの1つ又は複数のフラグメントを含む、請求項1に記載のB細胞受容体様複合体。
【請求項１４】
請求項1又は3〜13のいずれか一項に記載のB細胞受容体様複合体を含む改変細胞。
【請求項１５】
T細胞である、請求項14に記載の改変細胞。
【請求項１６】
請求項1又は3〜13のいずれか一項に記載のB細胞受容体様複合体をコードする核酸配列を含む1つ又は複数のベクター。
【請求項１７】
請求項2に記載の核酸配列を含む、請求項16に記載の1つ又は複数のベクター。
【請求項１８】
請求項16又は17に記載の1つ又は複数のベクターを含む改変細胞。
【請求項１９】
請求項14、15又は18のいずれか一項に記載の改変細胞を生成する方法であって、請求項16若しくは17に記載の1つ若しくは複数のベクター又は請求項2に記載の1つ若しくは複数の核酸配列を細胞に導入する、方法。
【請求項２０】
請求項16若しくは17に記載の1つ若しくは複数のベクター又は請求項2に記載の1つ若しくは複数の核酸配列を、ウイルス遺伝子送達技術によって細胞に導入する、請求項19に記載の改変細胞を生成する方法。
【請求項２１】
請求項16若しくは17に記載の1つ若しくは複数のベクター又は請求項2に記載の1つ若しくは複数の核酸配列を、非ウイルス遺伝子送達技術によって細胞に導入する、請求項19に記載の改変細胞を生成する方法。
【請求項２２】
請求項14、15又は18のいずれか一項に記載の改変細胞を含む医薬組成物。
【請求項２３】
薬剤として使用される、請求項14、15若しくは18のいずれか一項に記載の改変細胞又は請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
癌の治療において使用される、請求項14、15若しくは18のいずれか一項に記載の改変細胞又は請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
哺乳動物において標的細胞集団又は組織に対するT細胞性免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物に有効数の請求項14、15若しくは18のいずれか一項に記載の改変細胞又は有効量の請求項22に記載の医薬組成物を投与し、それにより前記哺乳動物においてT細胞性免疫応答を刺激することを含む、方法。
【請求項２６】
哺乳動物において抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、哺乳動物に有効数の請求項14、15若しくは18のいずれか一項に記載の改変細胞又は有効量の請求項22に記載の医薬組成物を投与し、それにより前記哺乳動物において抗腫瘍免疫をもたらすことを含む、方法。
【請求項２７】
抗原の異常発現と関連する疾患、障害又は病態を有する哺乳動物を治療する方法であって、哺乳動物に有効数の請求項14、15若しくは18のいずれか一項に記載の改変細胞又は有効量の請求項22に記載の医薬組成物を投与し、それにより前記哺乳動物を治療することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はT細胞ベースの免疫療法薬及び該療法薬を免疫療法、例えば癌の治療に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、非感染組織に対する免疫病理を最小限に抑えながら多数の病原体を根絶するように設計されている。免疫療法は疾患、特に癌を治療するためにヒト免疫系の力を利用しようとする新たな治療法である。対象における細胞免疫応答を増強する免疫療法の一方法は、養子細胞移入（ACT）と呼ばれる一種の細胞療法である。ACTは対象からの免疫細胞の取出し、ex vivo操作（すなわち細胞の活性化、精製及び／又は増加）及びその後の得られる細胞産物の同じ対象への再注入を含む細胞療法である。養子T細胞療法は、腫瘍関連抗原に由来するペプチドを提示する悪性細胞を認識し、破壊するCD8+T細胞の能力を探求する強力な癌治療法である。しかしながら、養子T細胞療法は概して、患者における既存の腫瘍反応性CD8+ T細胞のアベイラビリティに依存する。
【０００３】
癌患者における既存の腫瘍反応性T細胞に対する依存性を克服するために、腫瘍反応性受容体をコードする遺伝子を患者由来T細胞に導入することを目的とする遺伝子療法が開発されている。かかる遺伝子療法に利用される受容体には、従来のTCRαβ及びTCRγδ遺伝子だけでなく、通常はT細胞によって認識されない構造、例えば規定の腫瘍細胞表面抗原の標的化を可能にする「デザイナー」受容体も含まれる。腫瘍表面の抗原の標的化は抗原結合部分、最も一般的にはモノクローナル抗体の抗原結合部位に由来する一本鎖可変フラグメント（scFv）と、膜貫通ドメイン及びT細胞活性化ドメインとの融合によって可能となる。この人工免疫受容体はT細胞の表面で発現され、その標的抗原への抗原結合ドメインの結合によりT細胞エフェクター機能を誘発する。現在、これらのタイプの人工リンパ球シグナル伝達受容体は一般にキメラ抗原受容体（CAR）と称される。
【０００４】
キメラ抗原受容体T細胞（CAR-T細胞）には、或る特定の癌患者における非常に有望な臨床的利益が示されている。典型的なCAR-T細胞構築物は、CD8又はCD28に由来するもののようなフレキシブルな膜貫通ドメインと融合し、4-1BB等の共刺激分子の活性化ドメインからなるエンドドメインと融合し、CD3ζに由来するもののようなチロシンベースの活性化モチーフと融合した、scFvフォーマットの抗腫瘍標的抗体の重鎖（VH）及び軽鎖（VL）ドメインからなるエクトドメインからなる（非特許文献1）。かかる構築物を発現するT細胞は、腫瘍関連抗原を発現する癌細胞をMHCとは独立して認識し、破壊することができる。近年、膜近傍位置のシグナル伝達ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインを保有するものとは異なるポリペプチド（複数の場合もある）上に存在する多重鎖CAR概念が導入されている（特許文献1）。この多重鎖CAR概念はよりフレキシブルなCARの構成をもたらすが、その細胞外リガンド結合ドメインは依然として異なるタンパク質の融合部位を含有するキメラである。固形腫瘍及び造血器悪性腫瘍の両方を有する患者における目覚ましい臨床前研究及び初期臨床研究にもかかわらず（非特許文献1）、現在CAR-T細胞の一般化臨床用途を妨げる多数の制限があり、大きな臨床的利益を達成するために克服すべき幾つかの課題が残っている。
【０００５】
最も重要なことには、現在用いられているCAR設計は免疫原性であることが示されている。この免疫原性は以下の2つの独立した要素によって引き起こされる可能性がある：1）完全ヒト又はヒト化ではない細胞外抗原認識ドメインの使用、及び2）異なるタンパク質に由来するタンパク質ドメイン同士の融合。これは、例えばCAR修飾T細胞の持続性を妨げることによって、治療効果を脅かし得る不要な免疫応答を導く可能性がある。2つの異なるタンパク質の融合はいわゆるネオエピトープ（neo-epitopes）を生じ得ることが知られている。これらのネオエピトープは不要な免疫反応を引き起こす可能性がある（非特許文献1）。キメラ（マウス／ヒト）治療抗体薬の使用により、患者がマウス由来配列に対して反応し、いわゆるヒト抗マウス抗体（HAMA）応答を生じ得ることも十分に立証されている（非特許文献1、非特許文献2）。治療利益の制限に加えて、これにより軽度の発疹から致死的な合併症に及ぶアレルギー反応と同様の症状が生じる可能性がある。これらのCAR-T細胞の既知の欠点のために、研究者らはCAR-T細胞機能を改善し、副作用を低減するようにCAR-T細胞を修飾する取組みを続けているが、これまで上述の問題は解決されていない。
【０００６】
MHCとは独立して、CAR-T細胞の欠点を伴わずに、標的関連抗原を発現する標的細胞を認識する解決策の一つは、T細胞中の免疫グロブリン（Ig）抗原受容体（B細胞受容体とも呼ばれる）の使用である。非特許文献3では、Bリンパ球のIg抗原受容体を、B29（CD79β）の存在下でのトランスフェクションによってJurkat T細胞株において機能的に再構成している。対応する特許出願（特許文献2）では、IgM免疫グロブリン及びB29タンパク質の両方をコードする発現配列、そのフラグメント又は誘導体を含むDNA構築物が開示されている。これらの報告では、T細胞の表面へのIgMの輸送にはIg重鎖及び軽鎖とCD79βとの共発現が必要であったとしか示されていない。さらに、最小限のIgM受容体の活性化は、Jurkat T細胞株においてのみ、また標的細胞との接触後ではなくモノクローナル抗体との直接インキュベーション後にのみ示されている。
【０００７】
このため当該技術分野では、免疫原性ネオエピトープを生じ得る細胞外融合部位を含まない、ヒト又はヒト化T細胞関連抗体構築物を用いた免疫療法のための組成物及び方法の改善の明確な必要性がある。本発明はこの満たされていない要求に対処するものである。
【０００８】
参照による引用
本明細書中の全ての刊行物、特許及び特許出願は個々の刊行物、特許又は特許出願が各々具体的かつ個別に引用することにより本明細書の一部をなすと示されているのと同じ程度に、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書中の用語と引用される参照文献中の用語との抵触の場合は、本明細書中の用語が優先される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第2014039523号
【特許文献２】国際公開第9318161号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Sadelain et al. Cancer Discovery 2013; 3(4): 388-398
【非特許文献２】Maus et al. Cancer Immunol Res 2013; 1(1): 26-31
【非特許文献３】Costa et al. (J. Exp. Med. 1992; 175: 1669-1676)
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、T細胞活性化を制御するヒト又はヒト化B細胞受容体様複合体系を用いた、癌を含むが、これに限定されない疾患の治療のための組成物及び方法に関する。特に、B細胞受容体様複合体はヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来する細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインを、CD79タンパク質又はその機能的等価物及びシグナル伝達領域と組み合わせて含む。このシグナル伝達領域はT細胞受容体シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含む。本発明については通例、シグナル伝達領域はCD79タンパク質と融合する。B細胞受容体様複合体は、多くの異なる腫瘍標的化分子と協調して作用することができる。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインが同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一単位を付加的に形成することから、細胞外融合部位は受容体のエクトドメイン中に存在せず、したがって抗体媒介性免疫認識中のこれらの構築物による不要かつ有害な免疫原性／免疫応答が回避される。加えて、この複合体のキメラ部分は、細胞内のCD79タンパク質及びシグナル伝達領域が互いに融合する部位にのみ位置する。
【００１２】
本発明は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む単離B細胞受容体様複合体、すなわち単離B細胞受容体様タンパク質を提供する。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一のヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質を形成する。本発明については通例、ヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質はCD79タンパク質及びシグナル伝達領域と組み合わせられる。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを含む。また、本発明については通例、シグナル伝達領域はCD79タンパク質と融合する。本明細書で使用されるCD79タンパク質はCD79αタンパク質（配列番号1）、CD79βタンパク質（配列番号2）、CD79αホモ二量体、CD79βホモ二量体、CD79αβヘテロ二量体又はそれらの任意の機能的等価物からなるものであり得る。一実施の形態では、CD79タンパク質はCD79αタンパク質又はその任意の機能的等価物、特にCD79αタンパク質からなる。別の実施の形態では、CD79タンパク質はCD79βタンパク質又はその任意の機能的等価物、特にCD79βタンパク質からなる。別の実施の形態では、CD79タンパク質はCD79αβヘテロ二量体又はその任意の機能的等価物、特にCD79αβヘテロ二量体からなる。
【００１３】
本発明はB細胞受容体様複合体をコードする1つ又は複数の単離核酸配列を更に提供し、該B細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一単位を形成する。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含み、該シグナル伝達領域はCD79タンパク質と融合する。本明細書で使用されるCD79タンパク質はCD79αタンパク質、CD79βタンパク質、CD79αホモ二量体、CD79βホモ二量体、CD79αβヘテロ二量体又はそれらの任意の機能的等価物からなり、以上に言及されるような種々の実施の形態を含み得る。
【００１４】
本発明の一実施の形態では、シグナル伝達領域はCD79タンパク質又はその機能的等価物の一方又は両方のモノマーと融合する。一実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインは互いに融合することにより、シグナル伝達領域を構成する。また更なる実施の形態では、上記の融合したT細胞シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はその両方がCD79タンパク質の一方又は両方のモノマーと更に融合する。
【００１５】
本発明の種々の実施の形態において、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは複合体中で単一単位を形成する。本発明の特定の実施の形態では、複合体中のB細胞受容体タンパク質の細胞外抗原認識ドメインは表面抗原に結合する。別の実施の形態では、B細胞受容体様複合体の細胞外抗原認識ドメインは、標的化分子上に提示される普遍的エピトープに結合する。
【００１６】
本発明の一実施の形態では、標的化分子はタンパク質スキャフォールドであり、別の実施の形態では、標的化分子はscFv分子、Darpin分子、Nanobody分子、Alphabody分子、Centyrin分子、Affibody分子、重鎖単独抗体（heavy chainonly antibodies：重鎖抗体）、又は任意の他のタンパク質スキャフォールドプラットホームに由来する分子からなる群から選択される。一実施の形態では、標的化分子は表面抗原に結合する。別の特定の実施の形態では、表面抗原は固形腫瘍又は血液系腫瘍と関連する。
【００１７】
本発明の別の態様は、B細胞受容体の細胞外抗原認識ドメインが指向性を有する表面抗原が、宿主において免疫応答を誘発する腫瘍細胞中で産生される抗原性物質又は物質の組合せであるという概念に基づくものである。既知の腫瘍抗原としては、CD19、CD20、CD22、HER1、HER2、HER3、ROR1、メソテリン、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR及びMAGE-A3 TCRが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明については通例、ヒト又はヒト化B細胞受容体はCD79タンパク質又はその機能的等価物及びシグナル伝達領域と組み合わせられ、該シグナル伝達領域は、存在するCD79タンパク質の一方又は両方のモノマーと融合する。一実施の形態では、シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含む。T細胞シグナル伝達ドメインは、T細胞活性化をもたらす1つ又は多数のITAMモチーフを含有する。特定の実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメインはCD3ζ、CD3ε、CD3δ、CD3γ及び他のCD3様配列からなる分子の群から選択される。一実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメインはCD3ζドメイン又はその任意の機能的等価物、特にCD3ζドメイン（配列番号3）からなる。別の実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメインはCD3εドメイン又はその任意の機能的等価物、特にCD3εドメインからなる。別の実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメインはCD3δドメイン又はその任意の機能的等価物、特にCD3δドメインからなる。別の実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメインはCD3γドメイン又はそれらの任意の機能的等価物、特にCD3γドメインからなる。別の実施の形態では、共刺激シグナル伝達領域はCD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、NKG2C、GITR、CD137、HVEM、SLAM、TIM1、ガレクチン-9、CD83と特異的に結合するリガンド、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるが、これらに限定されない共刺激分子の細胞内ドメインの1つ又は複数のフラグメントを含む。特定の実施の形態では、共刺激シグナル伝達領域はCD28（配列番号4）、4-1BB（配列番号6）及びそれらの組合せから選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む。
【００１９】
本発明はまた、B細胞受容体様複合体（すなわちB細胞受容体様タンパク質）を含む改変細胞を提供し、該B細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一のヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質を形成する。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含み、該シグナル伝達領域はCD79タンパク質又はその機能的等価物と融合する。本明細書で使用されるCD79タンパク質はCD79αタンパク質、CD79βタンパク質、CD79αβヘテロ二量体又はそれらの任意の機能的等価物からなり、以上に言及されるような種々の実施の形態を含む。別の実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインは互いに融合する。一実施の形態では、上記細胞は本発明の種々の実施の形態によるB細胞受容体様複合体をコードする核酸配列を含む。
【００２０】
共刺激ドメインは完全ヒト又はヒト化であり得る。共刺激ドメインは完全タンパク質の一部であってもよい。場合によっては、共刺激ドメインは完全タンパク質の機能的フラグメントであってもよい。共刺激ドメインは非ヒトであってもよい。
【００２１】
別の実施の形態では、B細胞受容体様複合体を含む改変細胞はT細胞である。したがって、本発明の目的は、本発明の種々の実施の形態によるB細胞受容体様複合体を発現するT細胞を提供することである。上記複合体を発現するT細胞は更にT-BCR細胞と称される。
【００２２】
T細胞へのB細胞受容体様複合体の組込みにより、広範なB細胞受容体の抗原活性化に起因するT細胞による細胞毒性の誘発が可能となる。本発明の細胞を用いることで、B細胞受容体様複合体上の抗原の結合は、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域の存在により細胞傷害性T細胞をもたらす。このシグナル伝達領域は、B細胞受容体様複合体中でT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含む。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインがヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、単一のヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質を形成することから、細胞外融合部位がエクトドメイン中に存在せず、それにより抗体媒介性免疫認識中のこれらの構築物による不要かつ有害な免疫応答が回避される。加えて、この複合体のキメラ部分は細胞内のCD79タンパク質及びシグナル伝達領域が互いに融合する部位にのみ位置する。
【００２３】
本発明の別の態様は、B細胞受容体様複合体をコードする核酸配列を含む1つ又は複数のベクターを含み、該B細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一単位を形成する。特定の実施の形態では、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは単一のヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質を形成する。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含み、該シグナル伝達領域はCD79タンパク質又はその機能的等価物と融合する。別の実施の形態では、上記ベクターは本発明の種々の実施の形態によるB細胞受容体様複合体をコードする核酸配列を含む。1つ又は複数のベクターを1つの細胞に導入することができる。
【００２４】
本発明は、本発明の種々の実施の形態によるB細胞受容体様複合体を含む改変T細胞を生成する方法を更に提供する。一実施の形態では、上記方法は、本発明の種々の実施の形態による1つ若しくは複数のベクター又は1つ若しくは複数の核酸配列をT細胞又はT細胞集団に導入することを含む。上記ベクター（複数の場合もある）はB細胞受容体様複合体をコードする核酸配列を含み、該B細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。別の実施の形態では、上記方法は上記1つ若しくは複数のベクター又は上記1つ若しくは複数の核酸配列を非ウイルス遺伝子送達技術によって細胞に導入することを含む。更に別の実施の形態では、上記方法は上記1つ若しくは複数のベクター又は上記1つ若しくは複数の核酸配列をウイルス遺伝子送達技術によって細胞に導入することを含む。
【００２５】
さらに、本発明の種々の実施の形態によるB細胞受容体様複合体を含む改変T細胞を含む医薬組成物が開示される。
【００２６】
本発明は、薬剤として使用される本発明の種々の実施の形態による改変T細胞又は上記医薬組成物を更に開示する。更に別の実施の形態では、上記改変細胞又は上記医薬組成物は癌の治療に使用される。
【００２７】
本発明は、所望のB細胞受容体様複合体を安定発現するように遺伝子操作された改変T細胞を使用する方法を更に提供する。本発明の種々の実施の形態によるB細胞受容体様複合体を発現する改変T細胞は、本明細書でT-BCR細胞と称される。一態様では、哺乳動物において標的細胞集団又は組織に対するT細胞性免疫応答を刺激する方法が提供される。一実施の形態では、この方法は哺乳動物にB細胞受容体様複合体を発現するように遺伝子操作された有効数の改変細胞を、標的化分子と組み合わせて又は組み合わせずに投与することを含み、該B細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一単位を形成する。本発明については通例、ヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質はシグナル伝達領域と融合したCD79タンパク質と組み合わせられる。CD79タンパク質はCD79αタンパク質、CD79βタンパク質、CD79αβヘテロ二量体又はそれらの任意の機能的等価物からなり、以上に言及されるような種々の実施の形態を含み得る。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含み、該シグナル伝達領域はCD79タンパク質と融合する。特定の実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はその両方が、存在するCD79タンパク質の一方又は両方のモノマーと融合する。加えて、B細胞受容体の細胞外抗原認識ドメインは標的細胞集団又は標的化分子を認識するように選択され、該細胞外抗原認識ドメイン又は標的化分子は表面抗原に結合し、それにより哺乳動物においてT細胞性免疫応答が刺激される。
【００２８】
別の態様では、本発明は哺乳動物において抗腫瘍免疫をもたらす方法も提供する。一実施の形態では、この方法は哺乳動物に本発明の種々の実施の形態によるB細胞受容体様複合体を発現するように遺伝子操作された有効数の改変細胞を、標的化分子と組み合わせて又はと組み合わせずに投与することを含む。一実施の形態では、B細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一単位を形成する。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含み、該シグナル伝達領域はCD79タンパク質と融合する。CD79タンパク質はCD79αタンパク質、CD79βタンパク質、CD79αホモ二量体、CD79βホモ二量体、CD79αβヘテロ二量体又はそれらの任意の機能的等価物のいずれかであり、以上に言及されるような種々の実施の形態を含む。別の実施の形態では、共刺激ドメイン及びT細胞シグナル伝達ドメインは互いに、またCD79タンパク質と融合する。特定の実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はその両方が、存在するCD79タンパク質の一方又は両方のモノマーと融合する。加えて、B細胞受容体の細胞外抗原認識ドメインは標的細胞集団又は標的化分子を認識するように選択され、該細胞外抗原認識ドメイン又は該標的化分子は表面抗原に結合し、それにより哺乳動物において抗腫瘍免疫がもたらされる。
【００２９】
更に別の態様では、本発明は抗原の異常発現と関連する疾患、障害又は病態を有する哺乳動物を治療する方法も提供する。この方法は哺乳動物に本発明の種々の実施の形態によるB細胞受容体様複合体を発現するように遺伝子操作された有効数の改変細胞を、標的化分子と組み合わせて又は組み合わせずに投与することを含む。一実施の形態では、B細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインはヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一単位を形成する。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含み、該シグナル伝達領域はCD79と融合する。CD79タンパク質はCD79αタンパク質、CD79βタンパク質、CD79αホモ二量体、CD79βホモ二量体、CD79αβヘテロ二量体又はそれらの任意の機能的等価物からなり、以上に言及されるような種々の実施の形態を含む。別の実施の形態では、シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含み、該T細胞シグナル伝達ドメイン及び該共刺激ドメインは互いに、またCD79タンパク質と融合する。特定の実施の形態では、T細胞シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はその両方が、存在するCD79タンパク質の一方又は両方のモノマーと融合する。加えて、B細胞受容体の細胞外抗原認識ドメインは標的細胞集団又は標的化分子を認識するように選択され、該細胞外抗原認識ドメイン又は該標的化分子は1つ又は複数の表面抗原と結合し、それにより哺乳動物が治療される。この方法の一実施の形態では、細胞は自己T細胞であり得る。
【００３０】
本発明の番号付き（Numbered）実施の形態は以下の通りである：
1.
細胞外抗原認識ドメインと、
膜貫通ドメインと、
CD79タンパク質又はその機能的等価物と、
T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域と、
を含むB細胞受容体様複合体であって、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインが同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、
シグナル伝達領域がT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含み、該シグナル伝達領域がCD79タンパク質と融合する、B細胞受容体様複合体。
2.  番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体を共にコードする1つ又は複数の単離核酸配列。
3.  CD79タンパク質がCD79αタンパク質、CD79βタンパク質、CD79αホモ二量体、CD79βホモ二量体、CD79αβヘテロ二量体又はそれらの任意の機能的等価物からなる、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
4.  T細胞シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はその両方がCD79タンパク質の一方又は両方のモノマーと融合する、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
5.  細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインが、単一のヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質を形成する、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
6.  細胞外抗原認識ドメインが少なくとも1つの免疫グロブリン鎖を含む、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
7.  免疫グロブリン鎖が可変重鎖を含む、番号付き実施の形態6に記載のB細胞受容体様複合体。
8.  免疫グロブリン鎖が可変軽鎖を含む、番号付き実施の形態6又は7に記載のB細胞受容体様複合体。
9.  細胞外抗原認識ドメインが少なくとも1つの可変重鎖と、少なくとも1つの可変軽鎖とを含む、番号付き実施の形態6〜8に記載のB細胞受容体様複合体。
10.  可変重鎖及び可変軽鎖がIgA、IgG、IgM、IgD、IgE又はそれらの任意の組合せを含む、番号付き実施の形態5〜9に記載のB細胞受容体様複合体。
11.  単一ポリペプチドである、番号付き実施の形態1〜10に記載のB細胞受容体様複合体。
12.  2つ以上の異なるポリペプチドを含む、番号付き実施の形態1〜10に記載のB細胞受容体様複合体。
13.  細胞外抗原認識ドメインが表面抗原に結合する、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
14.  細胞外抗原認識ドメインが、標的化分子上で提示される普遍的エピトープに結合する、番号付き実施の形態13に記載のB細胞受容体様複合体。
15.  標的化分子がタンパク質スキャフォールドである、番号付き実施の形態14に記載のB細胞受容体様複合体。
16.  標的化分子がscFv分子、Darpin分子、Nanobody分子、Alphabody分子、Centyrin分子、Affibody分子、重鎖単独抗体、又は任意の他のタンパク質スキャフォールドプラットホームに由来する分子からなる群から選択される、番号付き実施の形態14又は15に記載のB細胞受容体様複合体。
17.  標的化分子が表面抗原に結合する、番号付き実施の形態14〜16のいずれか1つに記載のB細胞受容体様複合体。
18.  表面抗原が細胞と関連する、番号付き実施の形態13又は17に記載のB細胞受容体様複合体。
19.  細胞が固形腫瘍細胞又は血液系腫瘍細胞である、番号付き実施の形態18に記載のB細胞受容体様複合体。
20.  細胞外抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメインがCD79タンパク質又はその機能的等価物と相互作用する、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
21.  細胞外抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメインがシグナル伝達領域と相互作用する、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
22.  細胞外抗原結合ドメイン及び膜貫通ドメインが、CD79タンパク質又はその機能的等価物及びシグナル伝達領域と相互作用する、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
23.  T細胞シグナル伝達ドメインが、T細胞活性化をもたらす1つ又は複数のITAMモチーフを含有する、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
24.  T細胞シグナル伝達ドメインがTCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD5、CD22、CD66d又はそれらの任意の組合せである、番号付き実施の形態23に記載のB細胞受容体様複合体。
25.  共刺激ドメインがCD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、ICOS、リンパ球機能関連抗原（LFA-1）、CD2、CD7、NKG2C、GITR、CD137、HVEM、TIM1、ガレクチン-9、CD83と特異的に結合するリガンド、及びそれらの任意の組合せから選択される共刺激分子の細胞内ドメインの1つ又は複数のフラグメントを含む、番号付き実施の形態1に記載のB細胞受容体様複合体。
26.  共刺激ドメインがCD28の細胞内ドメインの1つ又は複数のフラグメントを含む、番号付き実施の形態25に記載のB細胞受容体様複合体。
27.  番号付き実施の形態1又は3〜26のいずれか1つに記載のB細胞受容体様複合体を含む改変細胞。
28.  T細胞である、番号付き実施の形態27に記載の改変細胞。
29.  T細胞がエフェクターT細胞（TEFF）、エフェクターメモリーT細胞（TEM）、セントラルメモリーT細胞（TCM）、Tメモリー幹細胞（TSCM）、ナイーブT細胞（TN）、又はCD4+ T細胞若しくはCD8+ T細胞である、番号付き実施の形態28に記載の改変細胞。
30.  改変細胞が初代細胞である、番号付き実施の形態28又は29に記載の細胞。
31.  番号付き実施の形態1又は3〜26のいずれか1つに記載のB細胞受容体様複合体をコードする核酸配列を含む1つ又は複数のベクター。
32.  番号付き実施の形態2に記載の核酸配列を含む、番号付き実施の形態31に記載の1つ又は複数のベクター。
33.  番号付き実施の形態31又は32に記載の1つ又は複数のベクターを含む改変細胞。
34.  細胞又は細胞集団を番号付き実施の形態31又は32に記載の1つ又は複数のベクターでトランスフェクトすることを含む、番号付き実施の形態27〜30又は33のいずれか1つに記載の改変細胞を生成する方法。
35.  番号付き実施の形態27〜30又は33のいずれか1つに記載の改変細胞を含む医薬組成物。
36.  薬剤として使用される、番号付き実施の形態27〜30若しくは33のいずれか1つに記載の改変細胞又は番号付き実施の形態35に記載の医薬組成物。
37.  癌の治療において使用される、番号付き実施の形態27〜30若しくは33のいずれか1つに記載の改変細胞又は番号付き実施の形態35に記載の医薬組成物。
38.  哺乳動物において標的細胞集団又は組織に対するT細胞性免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物に有効数の番号付き実施の形態27〜30若しくは33のいずれか1つに記載の改変細胞又は有効量の番号付き実施の形態35に記載の医薬組成物を投与し、それにより哺乳動物においてT細胞性免疫応答を刺激することを含む、方法。
39.  哺乳動物において抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、哺乳動物に有効数の番号付き実施の形態27〜30若しくは33のいずれか1つに記載の改変細胞又は有効量の番号付き実施の形態35に記載の医薬組成物を投与し、それにより哺乳動物において抗腫瘍免疫をもたらすことを含む、方法。
40.  抗原の異常発現と関連する疾患、障害又は病態を有する哺乳動物を治療する方法であって、哺乳動物に有効数の番号付き実施の形態27〜30若しくは33のいずれか1つに記載の改変細胞又は有効量の番号付き実施の形態に記載の医薬組成物を投与し、それにより哺乳動物を治療することを含む、方法。
【００３１】
代替的に表すと、本発明は以下を提供する：
1.  細胞外抗原認識ドメインと、B細胞膜貫通ドメインと、少なくとも1つの膜貫通シグナル伝達タンパク質と、シグナル伝達ドメインと融合する少なくとも1つのT細胞共刺激ドメインとを含む少なくとも1つの外因性B細胞受容体様複合体を含む、改変細胞。
2.  上記細胞外抗原認識ドメインが少なくとも1つのB細胞受容体（BCR）細胞外結合ドメインを含む、番号付き実施の形態1に記載の改変細胞。
3.  上記細胞外抗原認識ドメインが少なくとも1つの免疫グロブリン鎖を含む、番号付き実施の形態2に記載の改変細胞。
4.  上記免疫グロブリン鎖が可変重鎖を含む、番号付き実施の形態3に記載の改変細胞。
5.  上記免疫グロブリン鎖が可変軽鎖を含む、番号付き実施の形態3又は4に記載の改変細胞。
6.  上記細胞外抗原認識ドメインが少なくとも1つの可変重鎖及び少なくとも1つの可変軽鎖を含む、番号付き実施の形態1〜5のいずれか1つに記載の改変細胞。
7.  上記可変重鎖及び可変軽鎖がIgA、IgG、IgM、IgD、IgE又はそれらの任意の組合せを含む、番号付き実施の形態1〜6のいずれか1つに記載の改変細胞。
8.  上記B細胞受容体様複合体が単一ポリペプチドである、番号付き実施の形態1〜7のいずれか1つに記載の改変細胞。
9.  上記B細胞受容体様複合体が2つ以上の異なるポリペプチドを含む、番号付き実施の形態1〜8のいずれか1つに記載の改変細胞。
10.  上記改変（engineering）細胞が標的に結合する、番号付き実施の形態1〜9のいずれか1つに記載の改変細胞。
11.  上記標的が細胞である、番号付き実施の形態10に記載の改変細胞。
12.  上記細胞が抗原を有する、番号付き実施の形態11に記載の改変細胞。
13.  上記抗原が2つ以上のエピトープを有する、番号付き実施の形態12に記載の改変細胞。
14.  癌性細胞に結合する、番号付き実施の形態1〜13のいずれか1つに記載の改変細胞。
15.  上記標的が標的化分子である、番号付き実施の形態10に記載の改変細胞。
16.  標的化分子がタンパク質スキャフォールドである、番号付き実施の形態15に記載の改変細胞。
17.  標的化分子がscFv分子、Darpin分子、Nanobody分子、Alphabody分子、Centyrin分子、Affibody分子、重鎖単独抗体、又は任意の他のタンパク質スキャフォールドプラットホームに由来する分子からなる群から選択される、番号付き実施の形態15に記載の改変細胞。
18.  標的化分子が表面抗原に結合する、番号付き実施の形態15〜17のいずれか1つに記載の改変細胞。
19.  上記B細胞受容体様複合体がヒト化である、番号付き実施の形態1〜18のいずれか1つに記載の改変細胞。
20.  上記B細胞受容体様複合体が完全ヒトである、番号付き実施の形態1〜18のいずれか1つに記載の改変細胞。
21.  上記細胞外抗原認識ドメインが膜貫通シグナル伝達複合体と相互作用する、番号付き実施の形態1〜20のいずれか1つに記載の改変細胞。
22.  上記相互作用により上記膜貫通シグナル伝達複合体が活性化される、番号付き実施の形態21に記載の改変細胞。
23.  上記少なくとも1つの膜貫通シグナル伝達タンパク質がCD79α鎖及びCD79β鎖複合体である、番号付き実施の形態1〜22のいずれか1つに記載の改変細胞。
24.  上記少なくとも1つの膜貫通シグナル伝達タンパク質が、上記CD79α鎖及びCD79β鎖複合体の構造的等価物又は機能的等価物である、番号付き実施の形態1〜23のいずれか1つに記載の改変細胞。
25.  上記CD79α鎖及びCD79βが各々独立して上記少なくとも1つのシグナル伝達ドメインと融合する、番号付き実施の形態23又は24に記載の改変細胞。
26.  上記シグナル伝達ドメインが1つ又は複数の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を有する、番号付き実施の形態1〜25のいずれか1つに記載の改変細胞。
27.  上記シグナル伝達ドメインがTCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d又はそれらの任意の組合せである、番号付き実施の形態1〜26のいずれか1つに記載の改変細胞。
28.  上記少なくとも1つのT細胞共刺激ドメインがCD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、ICOS、リンパ球機能関連抗原（LFA-1）、CD2、CD7、NKG2C、GITR、CD137、HVEM、TIM1、ガレクチン-9、CD83と特異的に結合するリガンド、及びそれらの任意の組合せから選択される、番号付き実施の形態1〜27のいずれか1つに記載の改変細胞。
29.  免疫細胞である、番号付き実施の形態1〜28のいずれか1つに記載の改変細胞。
30.  T細胞である、番号付き実施の形態1〜29のいずれか1つに記載の改変細胞。
31.  エフェクターT細胞（TEFF）、エフェクターメモリーT細胞（TEM）、セントラルメモリーT細胞（TCM）、Tメモリー幹細胞（TSCM）、ナイーブT細胞（TN）、又はCD4+ T細胞若しくはCD8+ T細胞である、番号付き実施の形態1〜30のいずれか1つに記載の改変細胞。
32.  初代細胞である、番号付き実施の形態1〜31のいずれか1つに記載の改変細胞。
33.  医薬組成物に配合される、番号付き実施の形態1〜32のいずれか1つに記載の改変細胞。
34.  医薬組成物に配合され、それを必要とする対象の治療に使用される、番号付き実施の形態1〜33のいずれか1つに記載の改変細胞。
35.  改変細胞を作製する方法であって、
細胞に細胞外抗原認識ドメインと、B細胞膜貫通ドメインと、少なくとも1つの膜貫通シグナル伝達ドメインと、シグナル伝達ドメインと融合する少なくとも1つのT細胞共刺激ドメインとを含む改変B細胞受容体様複合体をコードする1つ又は複数のポリ核酸を導入することを含む、方法。
36.  細胞外抗原認識ドメインと、B細胞膜貫通ドメインと、少なくとも1つの膜貫通シグナル伝達タンパク質と、シグナル伝達ドメインと融合する少なくとも1つのT細胞共刺激ドメインとをコードする上記ポリ核酸を、上記細胞に1つ又は複数のベクターを用いて導入する、番号付き実施の形態35に記載の方法。
37.  細胞外抗原認識ドメインと、B細胞膜貫通ドメインと、少なくとも1つの膜貫通シグナル伝達タンパク質と、シグナル伝達ドメインと融合する少なくとも1つのT細胞共刺激ドメインとをコードする上記ポリ核酸を、上記細胞に非ウイルス法を用いて導入する、番号付き実施の形態35又は36に記載の方法。
38.  番号付き実施の形態1〜34のいずれか1つに記載の上記改変細胞を含む医薬組成物。
39.  治療を必要とする対象において病態を治療する方法であって、該対象に治療有効量の番号付き実施の形態38に記載の上記医薬組成物を投与することを含む、方法。
40.  上記治療を必要とする対象が癌を患っている、番号付き実施の形態39に記載の方法。
41.  少なくとも1つの外因性B細胞受容体様複合体をコードする1つ又は複数のポリ核酸であって、
a）細胞外抗原認識ドメインをコードする少なくとも1つの配列と、
b）B細胞膜貫通ドメインをコードする少なくとも1つの配列と、
c）膜貫通シグナル伝達タンパク質をコードする少なくとも1つの配列と、
d）シグナル伝達ドメインを含むT細胞共刺激ドメインをコードする少なくとも1つの配列と、
を含む、1つ又は複数のポリ核酸。
42.  細胞外抗原認識ドメインをコードする上記配列が少なくとも1つの免疫グロブリン鎖配列を含む、番号付き実施の形態41に記載の1つ又は複数のポリ核酸。
43.  上記免疫グロブリン鎖が可変重鎖を含む、番号付き実施の形態42に記載の1つ又は複数のポリ核酸。
44.  上記細胞外抗原認識ドメインが少なくとも1つの可変重鎖及び少なくとも1つの可変軽鎖を含む、番号付き実施の形態42又は43に記載の1つ又は複数のポリ核酸。
45.  上記可変重鎖及び可変軽鎖がIgA、IgG、IgM、IgD、IgE又はそれらの任意の組合せを含む、番号付き実施の形態42〜44のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
46.  上記B細胞受容体様複合体が単一のポリペプチドである、番号付き実施の形態42〜45のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
47.  上記B細胞受容体様複合体が2つ以上の異なるポリペプチドを含む、番号付き実施の形態42〜46のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
48.  上記B細胞受容体様複合体が部分配列を含む、番号付き実施の形態42〜47のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
49.  上記B細胞受容体様複合体をコードする上記配列がヒト化である、番号付き実施の形態42〜48のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
50.  上記B細胞受容体様複合体をコードする上記配列が完全ヒトである、番号付き実施の形態42〜49のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
51.  膜貫通シグナル伝達タンパク質をコードする上記配列がCD79配列を含む、番号付き実施の形態42〜50のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
52.  膜貫通シグナル伝達タンパク質をコードする上記配列がCD79α鎖及びCD79β鎖を含む、番号付き実施の形態42〜51のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
53.  上記シグナル伝達ドメイン配列が1つ又は複数の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）配列を含む、番号付き実施の形態42〜52のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
54.  上記シグナル伝達ドメインがTCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d又はそれらの任意の組合せである、番号付き実施の形態42〜53のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
55.  上記少なくとも1つのT細胞共刺激ドメインがCD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、ICOS、リンパ球機能関連抗原（LFA-1）、CD2、CD7、NKG2C、GITR、CD137、HVEM、TIM1、ガレクチン-9、CD83と特異的に結合するリガンド、及びそれらの任意の組合せから選択される、番号付き実施の形態42〜54のいずれか1つに記載の1つ又は複数のポリ核酸。
【００３２】
ここで図面を具体的に参照するが、示される項目は例示であり、本発明の種々の実施形態の説明的な論考のみを目的とすることが強調される。これらの図面は、本発明の原理及び概念的態様の最も有用かつ簡単な説明であると考えられるものを提供するために提示される。この点で、本発明の基礎的理解に必要とされるよりも詳細な本発明の構造細部を示そうとはしていない。この説明は、図面と共に本発明の幾つかの形態を実際に具体化し得る方法を当業者に明らかとするものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】B細胞受容体様複合体の概略図である。代表的なB細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じB細胞受容体に由来し、複合体中で単一単位を形成する。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含む。シグナル伝達領域はCD79タンパク質と融合する。
【図２】CD79/CD28/CD3複合体を発現するために用いられる構築物のタンパク質配列を示す図である。
【図３】CD20特異的B細胞受容体様複合体を含む導入遺伝子の概略図である。
【図４】一次ヒトT細胞におけるCD20特異的T-BCRの発現を示す図である。（A）pMP71-CD79αβ-IRES-GFP及びpMP71-CD20mAb-IRES-Katushkaをそれぞれ用いてレトロウイルスによって修飾された一次ヒトT細胞におけるGFP及びKathuska蛍光分子の発現レベル。FACSプロットは生CD8+ T細胞を示す。（B）一次ヒトT細胞の表面上のヒトIgGの発現。ヒストグラムは（A）中のFACSプロットの種々の象限においてgG発現を示す。
【図５−１】CD20特異的T-BCRで修飾された一次ヒトT細胞によるB細胞リンパ腫細胞の認識を示す図である。T-BCR複合体の種々の変異体で修飾されたヒトT細胞をRaji B細胞株の存在下で培養し、細胞内及び分泌IFN-γレベルを、T-BCR受容体によって媒介されるT細胞活性化のマーカーとして定量化した。（A）Raji B細胞株による刺激後の、T-BCR複合体の種々の変異体で修飾されたT細胞によるIFN-γの細胞内発現。FACSプロットは単一の生CD79αβ-IRES-GFP修飾細胞を示す。
【図５−２】（B）（A）のFACSプロットから算出される生CD79αβ+ T細胞の総数に占めるCD8+ IFN-γ+ T細胞の割合。（C）Raji B細胞株による刺激後の、T-BCR受容体複合体の種々の変異体で修飾されたT細胞の培養上清中のIFN-γ濃度。
【図６】様々なT-BCR複合体に用いられる種々の導入遺伝子の概略図である。
【図７】CD79/4-1BB/CD3複合体を発現するために用いられる構築物のタンパク質配列を示す図である。タンパク質配列は配列番号9として示される。
【図８】CD79/4-1BB/CD28/CD3複合体を発現するために用いられる構築物のタンパク質配列を示す図である。タンパク質配列は配列番号10として示される。
【図９】CD79野生型複合体を発現するために用いられる構築物のタンパク質配列を示す図である。タンパク質配列は配列番号11として示される。
【図１０】一次ヒトT細胞におけるCD28及び4-1BB由来シグナル伝達ドメインを用いたCD20特異的T-BCRの腫瘍認識を示す図である。一次T細胞をpB:CD79_CD28CD3ζ_PURO、pB:CD79_4-1BBCD3ζ_PURO、pB:CD79CD28CD3ζ/4-1BBCD3ζ_PURO又はpB:CD79WT_PUROと組み合わせたpB:CD20mAb_NEOを用いてレトロウイルスによって改変した。導入遺伝子の導入後に、T細胞をジェネティシン及びピューロマイシンの存在下で培養し、急速増加プロトコル（REP）を用いて増加させた。2週間の増加後に、T細胞を腫瘍細胞と共に37℃で24時間共培養し、IFNγ分泌をELISPOT（A）又はELISA（B）によって測定した。使用される腫瘍細胞はK562（慢性骨髄性白血病；CD19-、CD20-）、Daudi（B細胞リンパ腫；CD19++、CD20++）、Raji（B細胞リンパ腫；CD19++、CD20++）及びRPMI8226/S（多発性骨髄腫；CD19-、CD20-/+）であった。A.  エフェクター及び標的細胞を1:3のE:T比でインキュベートし、T細胞15000個当たりのIFNγスポットを三連の平均（+SEM）として示す。B.  エフェクター及び標的細胞を1:1のE:T比で、三連インキュベートし、上清を採取し、プールし、IFNγ産生をELISAによって測定した。
【図１１】一次ヒトT細胞におけるCD19特異的T-BCRの腫瘍認識を示す図である。一次T細胞を、pB:CD79_CD28CD3ζ_PURO又はpB:CD79WT_PUROと組み合わせたpB:CD19mAb_NEOを用いてレトロウイルスによって改変した。導入遺伝子の導入後に、T細胞をジェネティシン及びピューロマイシンの存在下で培養し、急速増加プロトコル（REP）を用いて増加させた。2週間の増加後に、T細胞を腫瘍細胞と共に37℃で24時間共培養し、IFNγ分泌をELISPOT（A）又はELISA（B）によって測定した。腫瘍細胞及びアッセイは図10の凡例中に記載される通りである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、ヒト又はヒト化B細胞様受容体複合体を用いた癌を含むが、これに限定されない疾患の免疫療法のための組成物及び方法に関する（図1）。このB細胞様受容体複合体はヒト又はヒト化B細胞受容体構築物を利用するものである。本発明については通例、ヒト又はヒト化B細胞受容体はCD79タンパク質又はその機能的等価物、及びT細胞活性化を制御するシグナル伝達領域と組み合わせられる。
【００３５】
定義
参照数値及び本明細書で使用されるその文法的同義語（grammatical equivalents）に関連する「約」という用語及びその文法的同義語は、その値よりプラス又はマイナス10 %の値の範囲を含み得る。例えば、「約10」という量は9〜11の量を含む。参照数値に関連する「約」という用語は、その値よりプラス又はマイナス10 %、9 %、8 %、7 %、6 %、5 %、4 %、3 %、2 %又は1 %の値の範囲も含み得る。
【００３６】
本明細書で使用される「活性化」という用語及びその文法的同義語は、休止状態から活性状態への細胞の移行のプロセスを指すことができる。このプロセスは抗原に対する応答、移動及び／又は機能的に活性な状態への表現型若しくは遺伝子の変化を含み得る。例えば、「活性化」という用語はT細胞活性化の段階的プロセスを指すことができる。或る特定の場合では、T細胞は完全に活性化されるために少なくとも2つのシグナルを必要とする可能性がある。第1のシグナルは抗原-MHC複合体によるTCRの係合後に生じ、第2のシグナルは共刺激分子の係合によって生じ得る。場合によっては、in vitroでは抗CD3が第1のシグナルを模倣し、抗CD28が第2のシグナルを模倣し得る。例えば、改変T細胞はBCRの発現によって活性化することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「隣接する」という用語及びその文法的同義語は、参照対象のすぐ隣を指すことができる。例えば、ヌクレオチド配列との関連での「隣接する」という用語は、間に任意のヌクレオチドが存在しないことを意味し得る。例えば、ポリヌクレオチドBに隣接するポリヌクレオチドAは、AとBとの間に任意のヌクレオチドが存在しないABを意味し得る。
【００３８】
本明細書で使用される「抗原」又は「Ag」という用語及びそれらの文法的同義語は、免疫応答を引き起こす分子を指すことができる。この免疫応答は抗体産生若しくは特定の免疫適格細胞の活性化のいずれか、又はその両方を伴い得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質又はペプチドを含む任意の巨大分子又は高分子複合体が抗原として機能を果たし得ることを理解するであろう。例えば、腫瘍細胞抗原はBCRによって認識され得る。
【００３９】
本明細書で使用される「免疫グロブリン」又は「Ig」という用語及びそれらの文法的同義語は、抗体として機能するタンパク質の群を指すことができる。B細胞によって発現される抗体は、B細胞受容体又は抗原受容体と称されることもある。このタンパク質群に含まれる5つの成員はIgA、IgG、IgM、IgD及びIgEであり、IgGが最も一般的な循環抗体である。IgGは凝集、補体結合及び他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌及びウイルスに対する防御に重要である。免疫グロブリンは任意のクラスの一部又は異なるクラスのキメラであってもよい。免疫グロブリンは例えば、IgA及びIgGの一部分を含有していてもよい。免疫グロブリンは完全ヒト、ヒト化又は非ヒトであり得る。
【００４０】
本明細書で使用される「自己」という用語及びその文法的同義語は、同じ生物（being）に由来することを指すことができる。例えば、サンプル（例えば細胞）を取り出し、処理し、その後に同じ対象（例えば患者）に戻すことができる。自己プロセスは、ドナー及びレシピエントが異なる対象である同種プロセスとは区別される。
【００４１】
本明細書で使用される「B細胞受容体」という用語は、抗原と特異的に結合し、B細胞の表面に付着する免疫グロブリン分子又は抗体を指す。抗体は細胞から分泌された可溶性形態及びB細胞の表面に付着し、B細胞受容体と称される膜結合形態という2つの物理的形態で生じ得る。B細胞受容体はB細胞の表面に見ることができ、B細胞の活性化及びその後の形質細胞又はメモリーB細胞のいずれかへのそれらの分化を促進する。抗体は天然源又は組み換え源に由来する無傷免疫グロブリンであってもよく、無傷免疫グロブリンの免疫活性部分であってもよい。B細胞受容体はヒト又は非ヒトであり得る。
【００４２】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語及びその文法的同義語は抗体、B細胞、T細胞又は改変細胞によって認識され得る抗原の一部を指すことができる。例えば、エピトープはBCRによって認識される癌エピトープであってもよい。抗原内の多数のエピトープも認識され得る。エピトープは突然変異していてもよい。
【００４３】
本明細書で使用される「改変された」という用語及びその文法的同義語（equivalents）は核酸、例えば生物のゲノム内の核酸の1つ又は複数の変化を指すことができる。「改変された」という用語は遺伝子の変化、付加及び／又は欠失を指すことができる。改変細胞は付加、欠失及び／又は変化した遺伝子を有する細胞を指すこともできる。
【００４４】
本明細書で使用される「機能」という用語及びその文法的同義語は、意図する目的をもたらす、有する又は果たす能力を指すことができる。「機能的」という用語はベースラインから100 %の正常機能までの任意のパーセントを含み得る。例えば、「機能的」は正常機能の5 %、25 %、50 %、75 %及び／又は最大100%を有することを含み得る。
【００４５】
本明細書で使用される「機能的等価物」という用語及びその文法的同義語は、その意図する目的（その正常機能を下回る、同じ又は上回る）を果たすタンパク質又はタンパク質のフラグメントを指すことができる。例えば、CD3タンパク質又はCD79タンパク質は、CD79タンパク質、CD3タンパク質又は該タンパク質のフラグメントのいずれかと実質的に同一の配列を有するタンパク質を含む、それらが由来するCD3タンパク質又はCD79タンパク質のいずれかと実質的に同等の輸送及び／又はシグナル伝達活性を示すことができる。
【００４６】
本明細書で使用される「融合した」という用語及びその文法的同義語は、2つのタンパク質又はフラグメントの接合を指すことができる。例えば、「融合した」は融合後に互いに隣接するような2つの実体の接合を指すことができる。「融合した」は、互いに接触せず、例えば1塩基〜1000塩基（ポリヌクレオチド中）又は1アミノ酸〜350アミノ酸（ポリペプチド中）離れた2つの実体の接合を指すこともできる。
【００４７】
本明細書で使用される「ヒト化B細胞受容体」という用語及びその文法的同義語は、タンパク質配列がヒトにおいて自然に生じる抗体変異体とのそれらの類似性を増大するように修飾された、非ヒト種に由来するB細胞受容体又は抗体を指すことができる。例えば、ヒト化B細胞受容体は、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、Fc領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも1つの、通例2つの可変ドメイン（Fab、Fab'、F（ab'）2、Fabc、Fv）の全てを含み得る。本発明のヒト化免疫グロブリン分子は、ヒト化免疫グロブリン分子を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物から単離することができる。ヒト化免疫グロブリン又は抗体は、遺伝子変換動物における遺伝子変換及び体細胞超変異によって更に多様化した免疫グロブリン（Ig）及び抗体を含み得る。
【００４８】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」及び「オリゴヌクレオチド」という用語並びにそれらの文法的同義語は場合によっては区別なく使用することができ、線状又は環状配置、また一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指すことができる。本開示の目的上、これらの用語は長さに関して限定されるものと解釈すべきではない。この用語は天然のヌクレオチドの類似体、並びに塩基、糖及び／又はリン酸部分（例えばホスホロチオエート骨格）が修飾されたヌクレオチドも包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対合特異性を有し得る。すなわち、Aの類似体はTと塩基対合することができる。この用語は成熟タンパク質のフラグメント及びその修飾体又は誘導体、例えばかかるポリ核酸のグリコシル化型、シグナルペプチドをコードするポリ核酸、同等の生物活性を有する切断型ポリ核酸等を指すこともできる。
【００４９】
本明細書で使用される「表現型」という用語及びその文法的同義語は生物の観察可能な特徴又は形質、例えばその形態、発生、生化学的又は生理的特性、フェノロジー（phenology）、挙動及び挙動の結果の組合せ（composite）を指すことができる。文脈に応じて、「表現型」という用語は、場合によっては集団の観察可能な特徴又は形質の組合せを指すこともできる。
【００５０】
本明細書で使用される「レシピエント」という用語及びそれらの文法的同義語は、ヒト又は非ヒト動物を指すことができる。レシピエントは治療が必要なもの（in need thereof）であってもよい。
【００５１】
本明細書で使用される「実質的に同一の」という用語及びその文法的同義語は、生物学的機能を破壊しない配列位置にある、アミノ酸又は核酸分子の1つ若しくは複数の保存的置換又は1つ若しくは複数の非保存的置換、欠失又は挿入によって参照配列と異なるアミノ酸又はヌクレオチド配列である配列を指すことができる。かかる配列は、例えばAlign Program（Myers andMiller, CABIOS, 1989, 4:11-17）又はFASTAを用いて比較に使用される配列とアミノ酸又はヌクレオチドレベルで最適にアラインメントした場合に少なくとも50 %、55 %、60 %、65 %、75 %、80 %、85 %、90 %若しくは95 %、又は更には96 %、97 %、98 %若しくは99 %同一であり得る。ポリペプチドについては、比較配列の長さは少なくとも2アミノ酸、5アミノ酸、10アミノ酸若しくは15アミノ酸、又は少なくとも20アミノ酸、25アミノ酸若しくは30アミノ酸であり得る。比較配列の長さは少なくとも35アミノ酸、40アミノ酸若しくは50アミノ酸、又は60アミノ酸、80アミノ酸若しくは100アミノ酸超であり得る。核酸分子については、比較配列の長さは少なくとも5ヌクレオチド、10ヌクレオチド、15ヌクレオチド、20ヌクレオチド若しくは25ヌクレオチド、又は少なくとも30ヌクレオチド、40ヌクレオチド若しくは50ヌクレオチドであり得る。代替的な実施形態では、比較配列の長さは少なくとも60ヌクレオチド、70ヌクレオチド、80ヌクレオチド若しくは90ヌクレオチド、又は100ヌクレオチド、200ヌクレオチド若しくは500ヌクレオチド超であり得る。配列同一性は、公開されている配列分析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group, University of WisconsinBiotechnology Center（1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）の配列分析ソフトウェアパッケージ、又はアメリカ国立医学図書館から入手可能なBLASTソフトウェア、又は本明細書に記載されるもの）を用いて容易に測定することができる。有用なソフトウェアの例としては、プログラムPile-up及びPretty Boxが挙げられる。かかるソフトウェアにより、同様の配列を様々な置換、欠失、置換及び他の修飾に相同度を割り当てることによってマッチングする。代替的又は付加的に、2つの核酸配列は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合に「実質的に同一」であり得る。幾つかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は例えば、65℃の温度で0.5 M NaHPO4（pH7.2）、7 % SDS、1 mM EDTA及び1 % BSA（フラクションV）を含有する緩衝液中、又は42℃の温度で48 %ホルムアミド、4.8×SSC、0.2 M Tris-Cl（pH7.6）、1×デンハート液、10 %硫酸デキストラン及び0.1 % SDSを含有する緩衝液中（これらは高ストリンジェンシーノーザン又はサザンハイブリダイゼーションの典型的な条件である）で少なくとも500ヌクレオチド長のDNAプローブを用いて行われるハイブリダイゼーションと同等のハイブリダイゼーションを可能にする条件である。ハイブリダイゼーションは約20分間〜30分間、又は約2時間〜6時間、又は約10時間〜15時間、又は24時間以上にわたって行うことができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは分子生物学者によって日常的に行われる多数の技法、例えば高ストリンジェンシーPCR、DNAシークエンシング、一本鎖立体配座多型分析及びin situハイブリダイゼーションの成功のために信頼される。ノーザン及びサザンハイブリダイゼーションとは対照的に、これらの技法は通常は比較的短いプローブ（例えば、通常はPCR又はシークエンシングについては約16ヌクレオチド以上、in situハイブリダイゼーションについては約40ヌクレオチド以上）を用いて行われる。これらの技法に用いられる高ストリンジェンシー条件は分子生物学の当業者に既知であり、それらの例は例えば、Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 1998（引用することにより本明細書の一部をなす）に見ることができる。比較配列の長さは少なくとも60ヌクレオチド、70ヌクレオチド、80ヌクレオチド若しくは90ヌクレオチド、又は100ヌクレオチド、200ヌクレオチド若しくは500ヌクレオチド超であってもよい。実質的に同一の配列はヒト又は非ヒト配列を指すことができる。
【００５２】
本明細書で使用される「T細胞活性化」又は「T細胞誘発」という用語及びその文法的同義語は検出可能な細胞増殖、サイトカイン産生及び／又は検出可能なエフェクター機能、例えばシグナル伝達経路タンパク質のリン酸化を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態を指すことができる。本発明においては、「完全T細胞活性化」はT細胞細胞毒性の誘発と同様である。T細胞活性化は当該技術分野で既知の様々なアッセイを用いて測定することができる。上記アッセイはサイトカイン分泌を測定するELISA、ELISPOT、細胞内サイトカイン発現（CD107）を測定するフローサイトメトリーアッセイ、増殖を測定するフローサイトメトリーアッセイ、及び標的細胞の除去を決定する細胞毒性アッセイ（51Cr放出アッセイ）であり得る。上記アッセイでは通例、対照と比較した改変細胞の相対的活性化を決定するために改変細胞（T-BCR）との比較に対照（非改変細胞）が使用される。付加的に、上記アッセイでは標的抗原を発現しない標的細胞と共にインキュベートした又は接触させた改変細胞を比較することができる。例えば、比較はCD19を発現しない標的細胞と共にインキュベートしたCD19 T-BCR細胞であり得る。
【００５３】
本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語及びその文法的同義語は、生物に移入される遺伝子又は遺伝物質を指すことができる。例えば、導入遺伝子は生物に導入される遺伝子を含有するDNAのストレッチ又はセグメントであり得る。導入遺伝子を生物に移入する場合、その生物はトランスジェニック生物と称される。導入遺伝子は、トランスジェニック生物においてRNA又はポリペプチド（例えばタンパク質）を産生するその能力を保持し得る。導入遺伝子は異なる核酸、例えばRNA又はDNAから構成されていてもよい。導入遺伝子は改変B細胞受容体様複合体、例えばBCR導入遺伝子をコードし得る。導入遺伝子はシグナル伝達ドメインを含み得る。
【００５４】
概要
治療用途での細胞及び核酸の遺伝子操作に有用な組成物及び方法が本明細書に開示される。全体を通して記載される組成物及び方法には、腫瘍特異的BCR発現のための核酸媒介遺伝子工学プロセスを使用することができる。効果的な養子細胞移入ベースの免疫療法（ACT）は癌（例えば転移性癌）患者の治療に有用であり得る。例えば、自己末梢血リンパ球（PBL）は非ウイルス又はウイルス方法を用いて癌細胞上の独自抗原を認識するB細胞受容体（BCR）を発現するように修飾され、開示の組成物及び方法に使用することができる。本発明は、ヒト又はヒト化B細胞様受容体複合体を用いた、癌を含むが、これに限定されない疾患の免疫療法のための組成物及び方法に関する（図1）。このB細胞様受容体複合体はヒト又はヒト化B細胞受容体構築物を利用するものである。本発明については通例、ヒト又はヒト化B細胞受容体はCD79タンパク質又はその機能的等価物、及びT細胞活性化を制御するシグナル伝達領域と組み合わせられる。
【００５５】
本発明のB細胞受容体様複合体は、ヒト又はヒト化B細胞受容体に由来する細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とから構成され得る。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含む。通例、シグナル伝達領域はCD79タンパク質と融合する。さらに、本発明の幾つかの実施形態では、本発明のB細胞様受容体複合体は細胞傷害性T細胞と標的の細胞との間の橋渡しとして標的化分子を利用する。
【００５６】
本発明は従来のCARとは以下の2つの重要な特徴の点で異なる：（1）細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインが同じヒト又はヒト化B細胞受容体に由来し、単一のB細胞受容体を形成する、並びに（2）シグナル伝達領域がCD79タンパク質と融合する。
【００５７】
典型的なCARの細胞外ドメイン又はエクトドメインは、モノクローナル抗体の抗原結合部位に由来する一本鎖可変フラグメント（scFv）からなり、それによりVH及びVLドメインを連結する。scFvはフレキシブルな膜貫通ドメインに続いて、CD3ζに由来するようなチロシンベースの活性化モチーフを含み得る1つ又は複数のエンドドメインに連結される。いわゆる第二世代及び第三世代CARにおいては、T細胞の生存及び増殖を増強する働きをするCD28及びCD137（4-1BB）等の共刺激分子に由来する付加的な活性化ドメインが含まれている。異なるタンパク質に由来するタンパク質ドメインの融合のために、治療効果を脅かし得る不要な免疫応答がこれらのCAR構築物を使用する場合に生じる可能性がある。対照的に、本発明では、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一単位を付加的に形成する。結果として、これらの構築物のエクトドメイン中に融合部位は存在せず、それにより不要かつ有害な免疫応答が回避される。さらに、T細胞活性化をもたらす共刺激分子と組み合わせて1つ又は複数のITAMモチーフを含むシグナル伝達領域は、B細胞受容体とは連結せず、CD79タンパク質と融合する。
【００５８】
本発明のB細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とから構成される。一実施形態では、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは完全ヒトであってもよい。他の場合では、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインはヒト化であってもよい。他の場合では、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは非ヒトであってもよい。本発明については通例、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは同じヒト又はヒト化B細胞受容体タンパク質に由来し、複合体中で単一単位を形成する。
【００５９】
本発明では、B細胞受容体様複合体は、同じヒト又はヒト化B細胞受容体に由来する細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインは、完全ヒト又はヒト化B細胞受容体又は免疫グロブリンを形成する。上記のように、本発明については通例、完全免疫グロブリン又はB細胞受容体が複合体中で単一単位を形成する。このことは現在のCAR構築物と比較して重要な違いである。現在利用可能なCARでは、完全ヒトでないことが多い細胞外抗原認識ドメインが、異なるタンパク質の膜貫通ドメインと融合する。これによりネオエピトープの形成に起因する不要な免疫応答が導かれ、治療効果が脅かされ得る。対照的に、本発明では、B細胞受容体様複合体は1つの単一ヒト又はヒト化タンパク質を形成する細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインを含み、それにより毒性反応及びアレルギー反応が回避される。
【００６０】
場合によっては、B細胞受容体様複合体は細胞表面免疫グロブリンを含有し得る。細胞表面免疫グロブリンは上記B細胞受容体様複合体の結合領域であってもよい。結合領域には重鎖及び軽鎖を利用することができる。重鎖及び軽鎖はIgA、IgG、IgM、IgD、IgE又はそれらの任意の組合せに由来し得る。重鎖及び軽鎖はIgA、IgG、IgM、IgD、IgE又はそれらの任意の組合せの部分フラグメントに由来していてもよい。場合によっては、IgA、IgG、IgM、IgD又はIgEのサブクラスを使用することができる。
【００６１】
場合によっては、自然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれVH及びVL）の可変ドメインは概して、4つの保存フレームワーク領域（FR）及び3つの超可変領域（HVR）を含む各々のドメインと同様の構造を有する（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)を参照されたい）。単一のVH又はVLドメインは抗原結合特異性をもたらすのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、VH又はVLドメインを用いて、或るライブラリの相補的なVL又はVHドメインをそれぞれスクリーニングするための抗原に結合する抗体から単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)、Clarkson et al., Nature 352:624-628(1991)を参照されたい。
【００６２】
場合によっては、免疫グロブリンのクラスはその重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指すことができる。IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMという免疫グロブリンの5つの主要クラスが存在し、これらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ぶことができる。本発明の免疫グロブリンは本明細書に記載される任意のクラス又はサブクラスであり得る。本発明の免疫グロブリンは本明細書に記載される任意のクラス又はサブクラスの部分フラグメントであってもよい。本発明の免疫グロブリンは本明細書に記載される免疫グロブリンのクラス又はサブクラスのキメラであってもよい。
【００６３】
場合によっては、上記細胞表面免疫グロブリンの変異体が本明細書に含まれる。変異体は、機能的に等価な残基のアミノ酸置換及び／又は細胞外免疫グロブリンドメインの機能性を高める突然変異を含み得るポリペプチド配列をコードすることができる核酸配列である遺伝コードの縮退を可能にする核酸配列を指すことができる。場合によっては、上記細胞外ドメインの機能性として、シグナル伝達が可能なBCRの形成を挙げることができるが、これに限定されない。遺伝コードの縮退が可能になることにより、本発明は免疫グロブリンの細胞外ポリペプチド配列に対して少なくとも50 %以上の配列同一性を有する配列を包含する。
【００６４】
本発明の一実施形態では、B細胞受容体様複合体は標的細胞又は組織上に提示される表面抗原に直接結合する。特定の実施形態では、表面抗原は腫瘍関連抗原とも呼ばれる腫瘍抗原であり得る。特に、B細胞受容体様複合体は抗原のエピトープに直接結合する。より特には、上記エピトープは腫瘍細胞エピトープであり得る。かかる腫瘍細胞エピトープは突然変異によって生じる腫瘍の抗原、共通腫瘍特異的抗原、分化抗原及び腫瘍中で過剰発現される抗原等の広範な腫瘍抗原に由来し得る。腫瘍関連抗原は宿主によって通常は発現されない抗原であってもよく、通常宿主によって発現される分子の突然変異、切断、ミスフォールド若しくは他の形での異常な発現であっても、通常発現されるが、異常に高いレベルで発現される分子と同一であっても、又は異常な状況若しくは環境で発現されていてもよい。腫瘍関連抗原は、例えばタンパク質若しくはタンパク質フラグメント、複合糖質、ガングリオシド、ハプテン、核酸、他の生体分子又はそれらの任意の組合せであり得る。腫瘍抗原は、腫瘍細胞において産生されることにより宿主において誘発される免疫応答を誘発する抗原である。新生抗原も腫瘍抗原とみなされる。新生抗原は、発現タンパク質における腫瘍特異的突然変異によって生じる腫瘍抗原の群である。既知の腫瘍抗原としては、CD19、CD20、CD22、HER-1、HER-2、HER-3、ROR-1、メソテリン、CD33/IL-3Ra、c-Met、PSMA、PSCA、gp100、WT1、CD22、CD171、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE-A3TCRが挙げられるが、これらに限定されない。本発明では、腫瘍抗原は利用可能な腫瘍抗原及びその任意の組合せの群から選択される。
【００６５】
別の実施形態では、B細胞受容体様複合体は細胞傷害性T-BCR細胞と標的の細胞との間の橋渡しとして標的化分子を利用する。標的化分子はB細胞受容体様複合体の細胞外抗原認識ドメインによって認識される分子である。したがって、上記の例では、B細胞受容体様複合体は標的化分子上に提示される普遍的エピトープに結合する。標的化分子自体が標的細胞又は組織上に提示される抗原を認識する。例示的な腫瘍標的化分子はscFv分子、Darpin分子、Nanobody分子、Alpha body分子、Centyrin分子、Affibody分子、重鎖単独抗体又は任意の他のスキャフォールドプラットホームに由来する分子である。scFv分子は一本鎖可変フラグメントである。scFv分子は、10アミノ酸〜25アミノ酸の短リンカーペプチドで接続された免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。DARPinは、通例高度に特異的かつ高親和性の標的タンパク質結合を示す遺伝子改変抗体模倣タンパク質である。DARPinは天然のアンキリンタンパク質に由来し、これらのタンパク質の少なくとも3つ、通常は4つ又は5つの反復モチーフからなる。Nanobody又は単一ドメイン抗体は、単一のモノマー可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。これらは特異的抗原に特異的に結合することが可能である。Centyrinは抗体可変ドメインに対して構造的相同性を有する小さく単純な高度に安定した単一ドメインタンパク質である。Affibody（商標）分子は、mAb及び抗体フラグメントを上回る優れた特徴を有する新規の抗体模倣物の群である。重鎖単独抗体は2つの重鎖（VH）のみからなり、2つの軽鎖（VL）を欠く抗体である。これらの重鎖単独抗体はVHドメインしか有しないにもかかわらず、抗原に依然として結合することができる。
【００６６】
上記B細胞受容体様複合体のシグナル伝達領域は、B細胞受容体様複合体が挿入されたT細胞の正常エフェクター機能の少なくとも1つの活性化に関与する。本発明では、B細胞受容体様複合体のシグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含む。シグナル伝達領域はCD79タンパク質又はその機能的等価物と融合する。CD79タンパク質はCD79αタンパク質、CD79βタンパク質、CD79αホモ二量体、CD79βホモ二量体、CD79αβヘテロ二量体又はそれらの任意の機能的等価物からなる。本発明の一実施形態では、シグナル伝達領域はCD79タンパク質又はその機能的等価物の一方又は両方のモノマーと融合する。別の実施形態では、T細胞シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインは互いに融合し、それによりシグナル伝達領域を構成する。また更なる実施形態では、上記の融合したT細胞シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はその両方はCD79タンパク質の一方又は両方のモノマーと更に融合する。
【００６７】
上記のように、本発明については通例、従来技術から知られていることとは異なり、B細胞受容体はシグナル伝達領域と融合するCD79タンパク質と複合体を形成する。CD79はB細胞受容体（BCR）のシグナル伝達成分として機能する膜貫通タンパク質である。BCRは表面免疫グロブリン（sIg）と称される抗原特異的成分を含む多量体複合体である。sIgは、BCR複合体の発現及び機能に必要とされる2つの他のタンパク質CD79α（Ig-α）及びCD79β（Ig-β）と非共有的に会合する。ジスルフィド結合によって安定化したヘテロ二量体であるCD79α及びCD79βは、invivoでのB細胞の発生及び活性の調節に関与するBCRの主要成分を含む。B細胞受容体の結合の際に、CD79α及びCD79βはITAM領域のチロシン残基、並びにCD79αのセリン及びトレオニン残基上でリン酸化される。CD79βは、おそらくはCD79αをリン酸化するキナーゼを動員するか、又はCD79αに結合し、それを脱リン酸化から保護するタンパク質を動員することによってCD79αのリン酸化を増強する。活性CD79αは次に、BCRシグナル伝達に関与する下流のシグナル伝達経路を刺激する。本明細書で使用される場合、CD79膜貫通タンパク質は主に、ヒトB細胞抗原受容体複合体関連タンパク質としても知られるヒトCD79及びそのアイソフォームに対して指向性を有し、ヒトCD79α及びそのアイソフォームのアミノ酸配列はSwissProtエントリP11912から既知であり、ヒトCD79β及びそのアイソフォームのアミノ酸配列はSwissProtエントリP40259から既知である。本明細書で使用されるCD79が上述のSwissProtエントリに開示されるヒトCD79及びそのアイソフォームに限定されず、それらの任意の機能的等価物を含むことが意図されることが当業者に明らかである。「CD79又はその機能的等価物」という用語は、Campbell et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(9)、Vasile et al., Mol Immunol 1994, 31(6)に記載されるように、B細胞受容体のシグナル伝達成分としてのそれらの機能を保持する上述の全ての変異体及びそのアイソフォームを意味する。CD79の機能的等価物はフラグメント、部分又はCD79を含むより大きなタンパク質であり得る。CD79タンパク質サブユニットを、本発明において完全CD79タンパク質に代替して使用することができる。CD79サブユニットであるCD79α及びCD79βはジスルフィド結合によって安定化したヘテロ二量体を形成することができる。場合によっては、CD79の機能的等価物にCD79α及びCD79βの一方又はその両方が置き換えられ、ジスルフィド結合によって安定化したヘテロ二量体を形成し得る。場合によっては、CD79、CD79α及びCD79βの個々の成分は独立して機能的等価物と複合することができる。例えば、機能的等価物はCD79βの機能的等価物と複合したCD79αを含み得る。例えば、機能的等価物はCD79αの機能的等価物と複合したCD79βを含み得る。
【００６８】
上記のように、CD79タンパク質に加えて、B細胞受容体様複合体は本発明の種々の実施形態において、細胞外抗原認識ドメイン及び膜貫通ドメインを含み、B細胞受容体又は免疫グロブリンと、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。シグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含む。上記のように、本発明については通例、シグナル伝達領域はCD79タンパク質と融合する。
【００６９】
本B細胞受容体様複合体の特徴の1つは、CD79タンパク質又はその機能的等価物とのシグナル伝達領域の融合である。典型的なシグナル伝達領域はT細胞シグナル伝達ドメインを共刺激ドメインと組み合わせて含む。結果として、現在の従来技術とは異なり、抗原認識後のB細胞受容体様複合体によるシグナル伝達は、腫瘍細胞毒性を引き起こすT細胞の完全活性化をもたらす。
【００７０】
本発明では、T細胞シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例としては、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3ζ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79α、CD79β及びCD66dに由来するものが挙げられる。幾つかの実施形態では、T細胞シグナル伝達ドメインはCD3ζ、CD3ε、CD3δ、CD3γ及び他のCD3様配列からなる分子の群から選択され、その機能的等価物を含む。
【００７１】
1つ又は複数のITAMモチーフを含有するT細胞シグナル伝達ドメインの一例は、T細胞受容体T3ζ鎖又はCD247としても知られるCD3ζドメイン（配列番号3）である。このドメインはT細胞受容体-CD3複合体の一部であり、T細胞の一次エフェクター活性化による抗原認識と幾つかの細胞内シグナル伝達経路との連結に重要な役割を果たす。本明細書で使用される場合、CD3ζは実質的に同一の配列を有するタンパク質を含む、SwissprotエントリP20963から既知のヒトCD3ζ及びそのアイソフォームに対して主に指向性を有する。B細胞受容体様複合体の一部として、繰り返すが、完全T細胞受容体T3ζ鎖は必要とされず、それらの任意の機能的等価物を含む、T細胞受容体T3ζ鎖のシグナル伝達ドメインを含むその任意の誘導体が本発明の方法に好適である。
【００７２】
B細胞受容体様複合体のシグナル伝達領域中の共刺激シグナル伝達ドメインに関して、B細胞受容体様複合体は、幾つかの考え得る共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計することができる。当該技術分野で既知であるように、ナイーブT細胞ではT細胞受容体の単なる係合は、細胞傷害性T細胞へのT細胞の完全活性化を誘導するのに十分でない。完全な生産的なT細胞活性化は第2の共刺激シグナルを必要とする。T細胞活性化の共刺激をもたらすことが報告されている幾つかの受容体としては、CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）及び4-1BBが挙げられるが、これらに限定されない。これらの共刺激分子によって利用されるシグナル伝達経路は、一次T細胞受容体活性化シグナルと相乗的に作用するという共通の特性を有する。本発明のB細胞受容体様複合体では、抗原提示細胞は共刺激に必要とされる対抗受容体分子を欠く場合がある。その結果として、完全な共刺激受容体の代わりに、B細胞受容体様複合体は該受容体の共刺激シグナル伝達領域、特に該共刺激シグナル伝達領域の細胞内ドメインを含む。本発明の方法に好適な共刺激分子の考え得る例としては、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、NKG2C、GITR、CD137、HVEM、TIM1、ガレクチン-9、CD83と特異的に結合するリガンド、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインが挙げられる。これらの共刺激シグナル伝達領域は、本発明では1つ又は複数のITAMモチーフ、例えばCD3ζシグナル伝達ドメイン（配列番号3）に由来する一次エフェクター活性化シグナルと相乗的なシグナルをもたらし、T細胞の活性化の要件を満たすことができる。共刺激ドメインは完全ヒト又はヒト化であり得る。共刺激ドメインは完全タンパク質の一部であってもよい。場合によっては、共刺激ドメインは完全タンパク質の機能的フラグメントであり得る。共刺激ドメインは非ヒトであってもよい。
【００７３】
本発明については通例、B細胞受容体様複合体への共刺激ドメインの付加により、改変T-BCR細胞の有効性及び耐久性を高めることができる。
【００７４】
非修飾T細胞では、少なくとも2つのシグナルが完全T細胞活性化に必要である。シグナル1はMHCとの関連での抗原認識及び結合に由来し、シグナル2は共刺激分子の同時係合から生じる。T細胞活性化はT細胞増殖、サイトカイン産生、生存及び細胞毒性をもたらし得る。現在のB細胞受容体様複合体の細胞内部分では、共刺激配列はT細胞シグナル伝達配列と連続して置かれる。MHCとは独立したB細胞受容体の細胞外ドメインによる抗原認識の際に、活性化シグナル及び共刺激シグナルの両方がT細胞に送達され、完全T細胞活性化が生じる。本発明のB細胞受容体様複合体においては、B細胞受容体（免疫グロブリン）の細胞外抗原認識ドメインと抗原との係合による、T細胞シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインの同時係合が完全T細胞活性化をもたらす。本明細書で使用される「T細胞活性化」又は「T細胞誘発」は検出可能な細胞増殖、サイトカイン産生及び／又は検出可能なエフェクター機能を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態を指す。本発明においては、「完全T細胞活性化」はT細胞細胞毒性の誘発と同様である。
【００７５】
望ましいB細胞受容体様複合体を発現するようなT細胞の遺伝子操作の前又は後に、T-BCR細胞を概して、例えば米国特許第6352694号、同第6534055号に記載される方法を用いて活性化及び増加させることができる。概して、本発明のT細胞は、1つ又は複数のITAMモチーフ（例えばCD3ζ）を刺激する作用物質及び共刺激分子を刺激するリガンドが付着した表面と接触させることによって増加させる。特に、T-BCR細胞集団は例えば抗CD3抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることによって刺激することができる。T-BCR細胞の表面上の補助分子の共刺激については、補助分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T-BCR細胞の集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させることができる。さらに、T細胞活性化はT-BCR細胞（エフェクター細胞）とT細胞を活性化する標的細胞とを接触させることによって実験的に誘導することができる。標的細胞は概して、T細胞中で発現されるT-BCR複合体が指向性を有する標的（例えばCD19又はCD20）を自然に発現する腫瘍細胞である。これらの標的細胞はRaji B細胞リンパ腫細胞株、Daudi Bリンパ芽球細胞株又はK562骨髄性白血病細胞株を含む群から選択されるが、これらに限定されない。陰性対照細胞も概して使用される。エフェクター細胞によるT細胞活性化は、51クロム放出アッセイ（細胞媒介性細胞毒性）、増殖アッセイ、細胞毒性アッセイ、及び活性化T細胞によって産生される細胞内又は分泌サイトカインの定量化（例えばIFN-γ ELISPOT）を用いて機能的にモニタリングすることができる。当業者に既知の他の方法を用いてT細胞活性化を評価することもできる。
【００７６】
本発明は、本発明の種々の実施形態によるB細胞受容体様複合体（すなわちB細胞受容体様タンパク質）を含む改変細胞も提供する。別の実施形態では、B細胞受容体様複合体を含む改変細胞はT細胞である。加えて、本発明は概して、所望のB細胞受容体様複合体を安定発現するように遺伝子操作された改変T細胞の使用に関する。したがって、本発明の目的は、本発明の種々の実施形態によるB細胞受容体様複合体を発現する改変T細胞を提供することである。本発明の種々の実施形態によるB細胞受容体様複合体を発現するT細胞は本明細書でT-BCR細胞と称される。一実施形態では、当業者に既知のウイルス又は非ウイルス遺伝子送達法がT-BCR細胞の生成に用いられる。1つ又は複数のベクターを1つのT細胞に導入することができる。本発明のT-BCR細胞はin vivoで複製し、持続的な腫瘍制御をもたらし得る長期持続性を生じることが可能である。
【００７７】
本発明は、本発明の種々の実施形態によるB細胞受容体様複合体を含む改変T細胞を生成する方法を更に提供する。上記方法は、本発明の種々の実施形態による1つ若しくは複数のベクター又は1つ若しくは複数の核酸配列をT細胞又はT細胞集団に導入することを含む。上記ベクターはB細胞受容体様複合体をコードする核酸配列を含み、該B細胞受容体様複合体は細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、CD79タンパク質又はその機能的等価物と、T細胞活性化を制御するシグナル伝達領域とを含む。別の実施形態では、上記方法は上記1つ若しくは複数のベクター又は上記1つ若しくは複数の核酸配列を非ウイルス遺伝子送達技術によって細胞に導入することを含む。更に別の実施形態では、上記方法は上記1つ若しくは複数のベクター又は上記1つ若しくは複数の核酸配列をウイルス遺伝子送達技術によって細胞に導入することを含む。ウイルス遺伝子送達又は非ウイルス遺伝子送達のプロセスは、当業者に既知の任意の簡便な方法によって行うことができる。
【００７８】
多数のウイルスベースの系が哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達系のための簡便なプラットホームをもたらす。選択遺伝子を当該技術分野で既知の技法を用いてベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。レンチウイルス等のレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期の安定した組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にするため、長期遺伝子移入を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは、非増殖細胞に形質導入し得るという点でネズミ白血病ウイルス等のオンコレトロウイルスに由来するベクターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターは低い免疫原性という追加の利点も有する。
【００７９】
本発明のT細胞の増加及び遺伝子操作の前に、T細胞の供給源を対象から得る。T細胞はPBMC、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。本発明の或る特定の実施形態では、T細胞をFicoll（商標）分離等の当業者に既知の様々な技法を用いて対象から回収された血液単位から得ることができる。一実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は通例、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって回収した細胞を洗浄して血漿画分を除去し、その後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液又は培地に入れる。特定の実施形態では、改変細胞はT細胞であり得る。改変細胞はエフェクター（TEFF）、エフェクターメモリー（TEM）、セントラルメモリー（TCM）、Tメモリー幹（TSCM）、ナイーブ（TN）、又はCD4+若しくはCD8+であってもよい。T細胞はバルク集団から選択されていてもよく、例えばT細胞を全血から選択する。T細胞はバルク集団から増加させることもできる。T細胞は特定の集団及び表現型に偏っていてもよい。改変細胞はex vivoで増加させることもできる。改変細胞は医薬組成物に配合することができる。改変細胞を医薬組成物に配合し、それを必要とする対象を治療するために使用することができる。改変細胞はそれを必要とする対象に対して自己であってもよい。改変細胞はそれを必要とする対象に対して同種であってもよい。改変細胞は適正製造基準（GMP）に準拠した試薬であってもよい。改変細胞は、それを必要とする対象を治療する併用療法の一部であってもよい。改変細胞はヒト細胞であってもよい。治療される対象はヒトであってもよい。
【００８０】
好適な細胞を得る方法は細胞を選別することを含み得る。場合によっては、細胞は細胞を選択することができるマーカーを含み得る。例えば、かかるマーカーはGFP、耐性遺伝子、細胞表面マーカー、内因性タグを含み得る。細胞は任意の内因性マーカーを用いて選択することができる。好適な細胞は任意の技術を用いて選択又は選別することができる。かかる技術はフローサイトメトリー及び／又は磁気カラムを含み得る。次いで、選択細胞を対象に注入することができる。選択細胞は大量に増加させることもできる。選択細胞を注入前に増加させることもできる。
【００８１】
ベクターを個々の患者から外植された細胞（例えばリンパ球、T細胞、骨髄穿刺液、組織生検）等の細胞にex vivoで送達し、続いて細胞を、通常はベクターが組み込まれた細胞の選択後に患者に再移植することができる。選択の前又は後に細胞を増加させることができる。
【００８２】
ex vivo細胞トランスフェクションを診断、研究又は遺伝子療法に（例えばトランスフェクト細胞の宿主生物への再注入によって）用いることもできる。場合によっては、細胞を対象生物から単離し、核酸（例えば遺伝子又はDNA）でトランスフェクトし、対象生物（例えば患者）に再注入して戻す。
【００８３】
さらに、本実施形態は、本発明の種々の実施形態によるB細胞受容体様複合体を含む1つ又は複数の改変細胞を含む医薬組成物も提供する。一実施形態では、改変細胞又は該改変細胞を含む医薬組成物が薬剤として使用される。別の実施形態では、上記改変細胞又は上記医薬組成物が癌の治療に使用される。
【００８４】
レシピエントに改変細胞を含む1つ又は複数の細胞を移植することを含む、レシピエントにおいて疾患（例えば癌）を治療する方法が本明細書に記載される。本明細書に開示される方法は癌、心血管疾患、肺疾患、肝疾患、皮膚疾患又は神経疾患を含むが、これらに限定されない疾患の治療又は予防に用いることができる。
【００８５】
一実施形態では、本発明は癌を有する又は癌の危険性がある患者の治療のためのリンパ球注入を用いたB細胞受容体様複合体を発現する改変T細胞の投与に関する。自己リンパ球注入を治療に用いるのが好ましい。治療を必要とする患者から自己末梢血単球（PBMC）を回収し、T細胞を活性化し、本明細書に記載され、当該技術分野で既知の方法を用いて増加させた後、患者に注入して戻す。T-BCR細胞の集団を対象への投与のために当業者に既知の技法を用いて配合することができる。代替的には、同種リンパ球注入を用いてもよい。
【００８６】
場合によっては、改変T細胞の集団を対象への投与のために当業者に既知の技法を用いて配合することができる。T-BCR細胞の集団を含む配合物は薬学的に許容可能な賦形剤（複数の場合もある）を含み得る。配合物中に含まれる賦形剤は、例えば使用されるT細胞の亜集団及び投与方法に応じて異なる目的を有する。一般に使用される賦形剤の例としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用蒸留水、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び保存料、等張化剤、充填剤並びに滑沢剤が挙げられる。T-BCR細胞の集団を含む配合物は通例、動物血清等の任意の非ヒト成分の非存在下で調製及び培養される。
【００８７】
配合物は1つのT-BCR細胞の集団、又は2つ以上、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、6つ若しくはそれ以上のT-BCR細胞の集団を含み得る。T-BCR細胞の集団（複数の場合もある）を含む配合物は、当業者に既知の方法及び技法を用いて対象に投与することができる。例示的な方法としては、静脈注射が挙げられるが、これに限定されない。他の方法としては、限定されるものではないが、腫瘍内、皮内、皮下（s.c.、s.q.、sub-Q、Hypo）、筋肉内（i.m.）、腹腔内（i.p.）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液嚢内（滑液域）、頭蓋内、髄腔内及びくも膜下（髄液）が挙げられる。配合物の非経口注射又は注入に有用な任意の既知のデバイスを、かかる投与を達成するために使用することができる。対象に投与されるT-BCR細胞の集団（複数の場合もある）を含む配合物は、特定の適応症又は疾患の治療及び／又は予防に効果的な数のT-BCR細胞を含む。これにより、本発明の方法を実施する場合に治療上効果的なT-BCR細胞の集団が対象に投与される。概して、約1×104個〜約1×1010個のT-BCR細胞を含む配合物が投与される。大抵の場合、配合物は約1×105個〜約1×109個のT-BCR細胞、約5×105個〜約5×108個のT-BCR細胞又は約1×106個〜約1×107個のT-BCR細胞を含む。しかしながら、対象に投与されるT-BCR細胞の数は癌の位置、原因、同一性、程度及び重症度、治療される個体の年齢及び状態等に応じて大きく異なる。医師により使用に適切な投与量が最終的に決定される。
【００８８】
腫瘍標的化分子はT-BCR細胞の投与前、又は投与と同時に、又は投与後に対象に投与される。腫瘍標的化分子は腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原への会合によって対象中の標的細胞に結合する。
【００８９】
腫瘍標的化分子は、当業者に既知の技法を用いて対象への投与のために配合することができる。腫瘍標的化分子の配合物は薬学的に許容可能な賦形剤（複数の場合もある）を含み得る。一般に使用される賦形剤の例としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用蒸留水、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び保存料、等張化剤、充填剤並びに滑沢剤が挙げられる。
【００９０】
腫瘍標的化分子は、当業者に既知の方法及び技法を用いて対象に投与することができる。例示的な方法としては、静脈内注射、腹腔内注射及び腫瘍内注射が挙げられるが、これらに限定されない。他の方法としては、限定されるものではないが、皮内、皮下（s.c.、s.q.、sub-Q、Hypo）、筋肉内（i.m.）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液嚢内（滑液域）、頭蓋内、髄腔内及びくも膜下（髄液）が挙げられる。配合物の非経口注射又は注入に有用な任意の既知のデバイスを、かかる投与を達成するために使用することができる。
【００９１】
腫瘍標的化分子を含む配合物は、特定の適応症又は疾患の治療及び／又は予防に効果的な量で対象に投与される。概して、少なくとも約0.1 mg/kg〜約100 mg/kg（体重）の腫瘍標的化分子を含む配合物が治療を必要とする対象に投与される。大抵の場合、投与量は投与経路、症状等を考慮して、1日当たり約1 mg/kg〜約100mg/kg（体重）の標識タンパク質である。医師により使用に適切な投与量が決定される。
【００９２】
一実施形態では、B細胞受容体様複合体はT細胞性免疫応答を刺激するために使用される。T細胞性免疫応答はT細胞の活性化を伴う免疫応答である。活性化された抗原特異的細胞傷害性T細胞は、それらの表面上に外来抗原のエピトープを提示する標的細胞、例えば腫瘍抗原を提示する癌細胞においてアポトーシスを誘導することが可能である。別の実施形態では、B細胞受容体様複合体は哺乳動物において抗腫瘍免疫をもたらすために使用される。T細胞性免疫応答に起因して対象は抗腫瘍免疫を生じる。
【００９３】
本発明は、治療を必要とする対象に、癌細胞に結合する腫瘍標的化分子の1つ又は複数の配合物を投与することと、腫瘍標的化分子に結合し、癌細胞死を誘導する1つ又は複数の治療上効果的なT-BCR細胞の集団を投与することとを含む、癌を有する対象を治療する方法に関する。本発明の別の実施形態は、治療を必要とする対象に癌細胞に結合し、それにより癌細胞死を誘導する1つ又は複数の治療上効果的なT-BCR細胞の集団を投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法に関する。
【００９４】
T-BCR細胞及び腫瘍標的化分子と組み合わせたT-BCR細胞を含む両方の配合物の投与頻度は、治療対象の疾患、T-BCR細胞及び腫瘍標的化分子を含む要素並びに投与方法を含む因子に応じて異なる。各々の配合物は独立して1日4回、3回、2回又は1回、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、週1回、8日毎、9日毎、10日毎、2週間に1回、月1回及び2ヶ月に1回投与することができる。
【００９５】
治療期間は治療対象の疾患に基づき、主治医によって最善に決定される。しかしながら、数日間、数週間又は数ヶ月間にわたる治療の継続が企図される。
【００９６】
「癌」という用語は広く解釈されることを意図し、異常細胞の急速な無制限の成長を特徴とする疾患として定義される。癌細胞は局所的に、又は血流及びリンパ系を介して身体の他の部分に転移し得る。例としては、腺癌、扁平上皮細胞癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、及び皮膚、乳房、前立腺、膀胱、膣、子宮頸部、子宮、卵巣、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、肺、気管、気管支、結腸、小腸、胃、食道、胆嚢の癌を含むが、これらに限定されない癌；軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、並びに骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織の癌を含むが、これらに限定されない肉腫；成熟B細胞新生物、例えば慢性リンパ球性白血病（leukemia）／小リンパ球性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ腫及び形質細胞新生物、成熟T細胞及びナチュラルキラー（NK）細胞新生物、例えばT細胞前リンパ球性白血病、T細胞大型顆粒リンパ球性白血病、侵攻性NK細胞白血病及び成人T細胞白血病／リンパ腫、ホジキンリンパ腫、並びに免疫不全関連リンパ増殖性障害を含むが、これらに限定されないリンパ腫及び白血病；精巣癌及び卵巣癌を含むが、これらに限定されない胚細胞腫瘍；肝芽腫、髄芽腫（medulloblastoma）、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫（pleuropulmonaryblastoma）及び網膜芽腫を含むが、これらに限定されない芽細胞腫が挙げられる。この用語は良性腫瘍も包含する。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「自己」という用語は、その後それが再導入される同じ個体に由来する任意の物質を指すことが意図される。
【００９８】
本明細書に開示される改変細胞又は該改変細胞の1つ又は複数を含む医薬組成物は、化学療法剤、細胞毒性／抗新生物剤又は抗血管新生剤を含む別の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。
【実施例】
【００９９】
以下の実験例を参照して本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提示され、他に指定のない限り限定を意図するものではない。このため、本発明は何ら以下の実施例に限定されると解釈すべきではなく、むしろ本明細書に提示される教示の結果として明らかとなるあらゆる変形形態を包含すると解釈すべきである。
【０１００】
更に説明することなく、当業者は前述の説明及び以下の説明的な実施例を用いて本発明の化合物を作製及び利用し、特許請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例（working examples）は本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであり、本開示の残りの部分を何ら限定すると解釈されるものではない。
【０１０１】
実施例1：T-BCRを用いたCD20特異的T細胞の生成及び機能的特性化
本実施例では、CD20特異的B細胞受容体様複合体の生成及びヒトT細胞におけるその機能的発現を実証する。特に、CD20に対する膜結合IgG1アイソタイプ抗体と、CD28/CD3ζシグナル伝達ドメインを両方のタンパク質鎖上に保有するCD79αβヘテロ二量体とを含むCD20特異的T-BCRを設計し、機能的に評価した。
【０１０２】
T-BCR導入遺伝子カセットの設計
T-BCR複合体は膜結合抗体と、CD28/CD3ζシグナル伝達ドメインを両方のタンパク質鎖上に保有するCD79αβヘテロ二量体とを含む。膜に結合した所与の抗体を発現するために、免疫グロブリン（Ig）重鎖中の任意の潜在的分泌シグナル（CH-S）を、利用抗体のアイソタイプに対応する膜貫通ドメイン（M領域）に置き換えた。Ig重鎖及びIg軽鎖の両方がリーダーペプチドで修飾される。CH-S、M領域及びリーダーペプチドは例えばIMGTデータベース（http://www.imgt.org/）から検索することができる。CD79αβヘテロ二量体の配列は、NCBIタンパク質データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）等のタンパク質データベースから検索することができる。
【０１０３】
T細胞活性を制御する細胞内シグナル伝達ドメインを、それぞれの膜貫通ドメイン後でCD79α、CD79β又はその両方の分子と融合する。
【０１０４】
例えばCD79αβタンパク質又はIg重鎖及び軽鎖の二シストロン性又は多シストロン性遺伝子発現を達成するために、以前に記載されているような内部リボソーム進入部位（internal ribosomal entry side）（IRES）又は2Aペプチド配列等の遺伝子要素を使用することができる。
【０１０５】
本実施例では、CD28/CD3ζシグナル伝達ドメインをCD79α及びCD79βの両方と融合した。CD79α及びCD79βの両方をP2Aペプチド配列と融合した。得られるこの複合体のタンパク質配列を図2及び配列番号5に示す。
【０１０６】
CD20特異的抗体リツキシマブの可変セグメントを公開データベースから得て、Ig定常ドメインと融合した。
【０１０７】
タンパク質配列を、発現に必要な全ての要素を保有するコドン最適化遺伝子配列（例えばコザック配列）から発現した。T細胞のゲノムへの導入遺伝子組込みの評定を容易にするために、eGFP及びKatushka蛍光色素をコードする遺伝子を付加的に保有するレトロウイルスベクターを使用した。これらの蛍光色素を内部リボソーム進入部位（IRES）から発現させた。導入遺伝子の概略図を図3に提示する。
【０１０８】
T細胞におけるT-BCR複合体の発現
上記で論考されるT-BCR成分のコドン最適化合成遺伝子を商業的供給業者から入手し、T細胞の形質導入に好適なpMP71レトロウイルス発現ベクターにクローニングした。
【０１０９】
レトロウイルス産生のために、好適なパッケージング細胞（FLYRD18細胞）を、10 cm培養皿に培養皿1枚当たり1.2×106細胞でプレーティングした。24時間後、トランスフェクション試薬（例えばPromegaのFuGENE 9又はRoche DiagnosticsのX-treme gene 9）を用いて細胞を10 μgのレトロウイルスベクターDNAでトランスフェクトした。
【０１１０】
CD20特異的T細胞を生成するために、図3に示されるT-BCRを含む両方の構築物をヒトドナーT細胞に導入した。一次ヒトT細胞をヒト末梢血単核細胞（PBMC）から単離し、活性化した。特に、ヒトT細胞増殖ビーズ（expander beads）（Life Technologies）を使用してPBMC物質からCD3+細胞を選択し、1ウェル当たり1.5×106個のCD3+細胞を100 IU/mlrh-IL-2及び5 ng/ml rh-IL-15を含む24ウェルプレート（Peprotech）において活性化した。48時間後に、0.2×106個〜0.5×106個の活性化CD3+細胞を、0.5 mlの採取したレトロウイルス上清並びにrh-IL-2（最終100 IU/ml）及びrh-IL-15（最終5 ng/ml）を添加した0.5 mlの培地に再懸濁し、レトロネクチン（タカラバイオ株式会社）をコーティングしたプレートに移した。プレートを430 gで90分間遠心分離した。
【０１１１】
T細胞の形質導入効率を72時間の時点でフローサイトメトリーによって決定した。特に、膜結合CD20抗体及びCD79αβヘテロ二量体の発現レベルを、フローサイトメトリーによるKatushka及びeGFP発現レベルのそれぞれの評定によって測定した。図4A及び図4Bに示されるように、CD20特異的T-BCR複合体によるT細胞の形質導入効率は、eGFP（CD79αβヘテロ二量体）及びKatushka（CD20）の両方を発現するヒトT細胞の画分によって表されるように26 %であった。
【０１１２】
CD20特異的T-BCR複合体を発現するT細胞の機能的特性化
続いて、ヒトB細胞株を認識するCD20 T-BCR発現T細胞の能力及びその後のそれらの活性化を試験した。概して、T-BCR複合体を発現するT細胞の活性化は同種抗原（例えばCD20）による刺激後のIFN-γ（又は同等のサイトカイン）産生によって測定することができる。
【０１１３】
1×105個のT-BCR形質導入T細胞を、T-BCRの同種抗原を発現する1×105個のRaji細胞と共に（本実施例では、CD20+細胞をCD20 T-BCRと共に）インキュベートした。1 μl/ml Golgiplug（BDBiosciences）の存在下、37℃で16時間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、CD3、CD8（どちらもBDBiosciences）に対する抗体及び好適な生／死（life/dead）染料（IR染料、Life Technologies）で染色した。続いて、IFN-γの細胞内レベルを、単一細胞ベースでCytofix/Cytopermキット（BD Biosciences）及びIFN-γに対する抗体（BD Biosciences）を用いるフローサイトメトリーによって、製造業者のガイドラインに従って決定した。データをヒトCD79α、CD79β及びIg重鎖又は軽鎖に対する抗体（全てBD Biosciences製）によって測定されるようなT-BCR Td CD8+T細胞の頻度によるIFN-γ+CD8+ T細胞の割合の補正によって正規化した。図5A及び図5Bに表されるように、Raji細胞とのCD20特異的T-BCR発現T細胞（CD20+及びCD79-CD28/CD3ζ+）のインキュベーションにより、CD20をCD79野生型と共にのみ発現するT細胞又はCD79-CD28/CD3ζのみを発現し、CD20抗体を発現しないT細胞と比較して、T細胞における細胞内IFN-γレベルの顕著な増大がもたらされた。
【０１１４】
さらに、種々のT-BCRの変異体を形質導入し、Raji細胞で刺激したT細胞の培養上清におけるIFN-γレベルを、Cytometric Beasアレイアッセイ（Life Technologies）を用いて測定した。図5Cに示されるように、CD20特異的T-BCR形質導入T細胞は、CD20をCD79野生型と共にのみ発現するT細胞又はCD79-CD28/CD3ζのみを発現し、CD20抗体CD20 mAbを発現しないか若しくはCD79-CD28/CD3ζのみを発現するT細胞と比較して顕著に多くのIFN-γを分泌した。
【０１１５】
まとめると、これらのデータ（data）から、CD20特異的T-BCR複合体がヒトT細胞において機能的に発現されることが示される。
【０１１６】
実施例2：種々のT-BCR複合体の設計及び機能的特性化
実施例2では、様々な細胞外抗原認識ドメインとシグナル伝達領域中の様々な共刺激分子とを含む種々のT-BCR複合体の機能性を評価した。特に、CD20又はCD19細胞外抗原認識ドメインと、シグナル伝達領域中の共刺激分子としてCD28及び／又は4-1BBとを含む様々なT-BCR複合体の設計及び機能性を評価する。
【０１１７】
下記の全てのアッセイについて、エフェクター細胞、標的細胞及び陰性対照細胞を使用する。エフェクター細胞は概して、T-BCR複合体導入遺伝子を形質導入したT細胞を指す。標的細胞は概して、T-BCR複合体が指向性を有する標的（抗原）を自然に発現する腫瘍細胞である。陰性対照細胞は概して、T-BCR複合体が結合し得る標的（抗原）を発現しない細胞である。
【０１１８】
細胞及び細胞株
Daudi、K562、Raij及びPhoenix-Ampho細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。RPMI8226/S-luc（RPMI-Luc）はAnton Martens（University Medical Center Utrecht, TheNetherlands）の好意により提供され、Phoenix-ampho細胞はDMEM+1% Pen/Strep（Invitrogen）+10 %FCS（Bodinco）中で培養し、他の全ての細胞株はRPMI+1% Pen/Strep+10 % FCS中で培養した。PBMCはSanquin Blood Bank（Amsterdam, TheNetherlands）又はInstitute for Transfusion Medicine and Immunohematology（Frankfurt, Germany）から入手したバフィーコートから単離した。
【０１１９】
レトロウイルスベクター中のT-BCR遺伝子カセットの構築
本実施例において評価される種々のT-BCR複合体のための様々な構築物を図6に提示する。対応する種々の構築物のタンパク質配列を図2、図7、図8及び図9、並びに配列番号5〜配列番号13に表す。
【０１２０】
T細胞のレトロウイルス形質導入
T-BCR及びCD79構築物を、以前に記載されているようにαβT細胞に形質導入した（3）。簡潔に述べると、パッケージング細胞（phoenix-ampho）を、FugeneHD試薬（Promega, Madison, Wisconsin, USA）を用いてヘルパー構築物gag-pol（pHIT60）、env（pCOLT-GALV）でトランスフェクトした（4）。加えて、BCR-T細胞については、CD79α-P2A-CD79β-IRES-ネオマイシン（neomycine）若しくはIg重鎖-P2A-Ig軽鎖-IRES-ピューロマイシン（puromycine）（pBulletベクター）、又はCD79α-P2A-CD79β-IRES-GFP若しくはIgG重鎖-P2A-IgG軽鎖-IRES-Katusha（pMP71）のいずれかを含有する2つのレトロウイルスベクターを添加した。ヒトPBMCをαCD3（30 ng/ml）（OrthocloneOKT（商標）3、Janssen-Cilag, Tilburg, The Netherlands）及びIL-2（50 IU/ml）（Proleukin（商標）、Novartis, Arnhem, The Netherlands）を用いて予め活性化し、ウイルス上清を用いて50 IU/ml IL-2及び6 μg/mlポリブレン（Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands）の存在下で48時間以内に、2回形質導入した。形質導入T細胞をαCD3/CD28 Dynabeads（0.5×106個のビーズ／106個の細胞）（Life Technologies, Carlsbad,California, USA）及びIL-2（50 IU/ml）による刺激によって増加させ、pBulletレトロウイルス系の場合には、800 μg/mlジェネティシン（Gibco, Karlsruhe, Germany）及び5 μg/mlピューロマイシン（Sigma-Aldrich）を用いて選択した。次に、T-BCR形質導入T細胞を以前に記載されている急速増加プロトコル（REP）に基づいて増加させた。
【０１２１】
フローサイトメトリー
様々な構築物によるT細胞の形質導入効率を評価するために、フローサイトメトリー分析を行った。フローサイトメトリーに使用される抗体としては、抗CD4-FITC（クローンRPA-T4）、抗CD8-PerCP.Cy5.5（クローンRPA-T8、どちらもBD Biosciences, San Jose, USA）及び抗CD79β-PE（クローンZL9-3、SantaCruz）が挙げられる。IgGの発現をタンパク質L-ビオチン、続いてストレプトアビジン-PE又はヤギ-抗ヒト-IgG-PE（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA）で染色することによって分析した。サンプルを、FACS LSRII又はFACS CantoでFACSdivaソフトウェア（BD Biosciences）を用いて分析した。
【０１２２】
細胞毒性アッセイ
形質導入T細胞の潜在的細胞毒性効果を評価するために、種々の細胞毒性アッセイを行う。
【０１２３】
細胞媒介性細胞毒性についての51クロム放出アッセイでは、標的細胞を100 μCu 51Crで一晩標識し、30:1〜0.3:1で変化させる5つの異なるエフェクター対標的比（E:T）の形質導入T細胞と共に4時間〜5時間インキュベートする。特異的溶解の割合を以下のように算出する：（実験的cpm−基礎cpm）／（最大cpm−基礎cpm）×100（最大溶解は5 % tritonの存在下で決定し、基礎溶解はエフェクター細胞の非存在下で決定した）。
【０１２４】
別の細胞毒性アッセイでは、陰性対照細胞を1.5×106細胞/mLの濃度で培地に懸濁し、蛍光色素5-（及び-6）-（（（4-クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン（CMTMR）（Invitrogen）を5 μMの濃度で添加する。細胞を混合した後、37℃で30分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、細胞毒性培地に懸濁する。次に、陰性対照細胞を37℃で60分間インキュベートする。次いで、細胞を2回洗浄し、細胞毒性培地に懸濁する。
【０１２５】
標的細胞をPBS+0.1 % BSAに1×106細胞/mLで懸濁する。蛍光色素カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）（Invitrogen）を、この細胞懸濁液に1 μMの濃度で添加する。細胞を37℃で10分間インキュベートする。インキュベーションの後、細胞懸濁液の容量に等しい容量のFBSを添加することによって標識化反応を停止させ、細胞を室温で2分間インキュベートする。細胞を洗浄し、細胞毒性（cytotoxicity）培地に懸濁する。
【０１２６】
続いて、エフェクター改変T細胞を洗浄し、5×106細胞/mLで細胞毒性培地に懸濁する。全ての実験で、T-BCR構築物を形質導入したエフェクターT細胞の細胞毒性を、陰性対照BCRTを形質導入した又は形質導入していない、同じ患者に由来する陰性対照エフェクターT細胞の細胞毒性と比較する。エフェクターT細胞及び陰性対照エフェクターT細胞については、培養物を以下のT細胞：標的細胞比：10:1、3:1及び1:1で滅菌5 mL容の試験管（BD Biosciences）中に二連で準備する。標的細胞は常にCLL患者に由来する50000個のPBMCとした。各々の培養物は50000個の陰性対照細胞も含有する。加えて、標的細胞＋陰性対照細胞のみを含有する試験管を準備する。培養物を37℃で4時間インキュベートする。インキュベーションの直後に、7AAD（7-アミノアクチノマイシンD）（BD Pharmingen）を製造業者によって推奨されるように添加し、フローサイトメトリー取得をBD FacsCanto II（BD Biosciences）を用いて行った。分析はFlowJo（Treestar, Inc. Ashland, OR）を用いて行った。分析を7AAD陰性（生）細胞でゲーティングし、生標的細胞及び生陰性対照細胞の割合を各々のT細胞＋標的細胞培養物について決定する。各々のT細胞＋標的細胞培養物について、生標的細胞のパーセントを生陰性対照細胞のパーセントで除算することによって標的細胞の生存率を決定する。標的細胞の補正生存率は、各々のT細胞＋標的細胞培養物中の標的細胞の生存率を、標的細胞及び陰性対照細胞のみを含有し、任意のエフェクターT細胞を含まない試験管内の標的細胞のパーセント：陰性対照細胞のパーセントの比率で除算することによって算出した。この補正では初期細胞数の変動及び自発的標的細胞死を考慮することが必要である。細胞毒性は標的細胞の細胞毒性のパーセント＝100−標的細胞の補正生存率として算出した。全てのエフェクター：標的比について、細胞毒性を二連で決定し、結果を平均した。
【０１２７】
増殖アッセイ
標的細胞への曝露後の改変T細胞の増殖を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル希釈アッセイ（Hudecek M, Lupo-Stanghellini MT, Kosasih PL,Sommermeyer D, Jensen MC, Rader C et al. Receptor affinity and extracellulardomain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigenreceptor T cells. Clin Cancer Res 2013; 19: 3153-3164）によって決定する。
【０１２８】
形質導入の1週間後に、対照及び改変Tリンパ球を1.5μmol/Lカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE；Invitrogen）で標識し、照射腫瘍標的（CD19陽性及び陰性系列：NALM-6及びCEM）と共に5:1のエフェクター対標的（E:T）比でプレーティングする。CFSE希釈物を、共培養の4日目にCD4+及びCD8+ T細胞についてフローサイトメトリーによって測定する。
【０１２９】
T細胞活性化アッセイ
a）ELISPOT
エフェクター細胞との接触後に種々のT-BCR複合体を発現する形質導入T細胞の活性化を、分泌IFN-γレベルの測定によって評価した。IFN-γ ELISPOTを、抗hu IFN-γ mAb1-D1K（I）及びmAb7-B6-1（II）（Mabtech-Hamburg, Germany）を用い、ELISA-ready-go!キット（eBioscience, San Diego, CA, USA）を用いて製造業者により推奨される手順に従って行った。エフェクター及び標的細胞（E:T 1:1）を37℃で24時間インキュベートした後、上清を採取し、IFN-γの産生について分析した。概して、T細胞エフェクターサイトカイン（例えばIFN-γ、IL-2、TNF-α）の存在をELISA、サイトカインビーズアレイ又は同等の方法によって定量化する。
【０１３０】
b）CD107
さらに、CD107アッセイを用いてT細胞における細胞内IFN-γレベルを評価する。形質導入T細胞を、エフェクター細胞と共にCD107a-PE抗体及びGolgistopの存在下、37℃で4時間〜5時間インキュベートする。次に、細胞を採取し、抗CD8抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析する。CD107発現により抗原発現腫瘍細胞と共にインキュベートしたエフェクター集団における活性化が実証されるだろうが、抗原陰性標的と共にインキュベートした対照細胞及びエフェクター細胞はCD107発現が低いか又は有しないと思われる。
【０１３１】
c）ELISA
加えて、ELISAアッセイを利用してT細胞活性化を決定した。腫瘍標的細胞を洗浄し、IL-2を含まないT細胞培地に1 mL当たり1×106細胞で懸濁した。各標的細胞型の10万個の標的細胞を、96ウェル丸底プレート（Corning）の2つのウェルの各々に添加した。エフェクターT細胞培養物（BCR-T及び対照T細胞）を洗浄し、IL-2を含まないT細胞培地に1 mL当たり1×106細胞で懸濁した。10万個のエフェクターT細胞を、96ウェルプレートの指定のウェル内の標的細胞と合わせた。対照として、T細胞単独を含有するウェルを調製した。プレートを37℃で18時間〜20時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、標準方法（Pierce, Rockford, IL）を用いてIFNγ ELISAアッセイを行った。
【０１３２】
統計分析
差を指定の統計的検定を用いてGraphPad Prism（GraphPadSoftware Inc., La Jolla, CA, USA）で分析する。
【０１３３】
結果
一次T細胞をpB:CD79_CD28CD3ζ_PURO、pB:CD79_4-1BBCD3ζ_PURO、pB:CD79CD28CD3ζ/4-1BBCD3ζ_PURO又はpB:CD79WT_PUROと組み合わせたpB:CD20mAb_NEOを用いてレトロウイルスによって改変した。導入遺伝子の導入に続いて、T細胞をジェネティシン及びピューロマイシンの存在下で培養し、急速増加プロトコル（REP）を用いて増加させた。改変T細胞の増加の2週間後に、これらを種々のタイプの腫瘍細胞（K562（慢性骨髄性白血病；CD19-、CD20-）、Daudi（B細胞リンパ腫；CD19++、CD20++）、Raji（B細胞リンパ腫；CD19++、CD20++）及びRPMI8226/S（多発性骨髄腫；CD19-、CD20-/+））と共に37℃で24時間共培養し、IFNγ分泌をELISPOT又はELISAによって測定した（図10A及び図10B）。改変T細胞とDaudi細胞及びRaji細胞との共培養により、CD20-BCRT-CD79/CD28/CD3ζ、CD20-BCRT-CD79/4-1BB/CD3ζ、CD20-BCRT-CD79/4-1BB/CD28/CD3ζ複合体を発現するように改変した改変T細胞ではIFNγ分泌が増大したが、CD20-BCRTCD79野生型複合体を発現するように改変されたT細胞では増大しなかった。重要なことには、T-BCR複合体への多数の異なる共刺激ドメインの組入れによりT細胞活性化がもたらされた。加えて、低いCD20発現（RMPI8226/S）を有する標的細胞は、CD28と4-1BBとの組合せを含むT-BCR複合体を発現するT細胞によって認識された。これにより、異なる共刺激ドメインの組合せがT細胞の活性化閾値を低減し、その感受性を高めることが示され得る。
【０１３４】
さらに、一次T細胞を、pB:CD79_CD28CD3ζ_PURO又はpB:CD79WT_PUROと組み合わせたpB:CD19mAb_NEOを用いてレトロウイルスによって改変した。導入遺伝子の導入に続いて、T細胞をジェネティシン及びピューロマイシンの存在下で培養し、急速増加プロトコル（REP）を用いて増加させた。増加の2週間後に、T細胞を上記に挙げた腫瘍細胞と共に37℃で24時間共培養し、IFNγ分泌をELISPOT又はELISAによって測定した（図11A及び図11B）。改変T細胞とDaudi細胞及びRaji細胞との共培養により、CD19-BCRT-CD79/CD28/CD3ζ複合体を発現するように改変した改変T細胞ではIFNγ分泌が増大したが、CD19-BCRT CD79野生型複合体を発現するように改変したT細胞では増大しなかった。
【０１３５】
実施例3：CD19又はCD20特異的T-BCR T細胞のin vivo評価
CD19又はCD20特異的T-BCR T細胞の治療可能性を、Daudi又はRaji B細胞リンパ腫マウスモデルにおいて評価する。
【０１３６】
RAG2-/-/γc-/--BALB/Cマウス又はNOD/SCIDマウスを繁殖させ、特定病原体除去（SPF）飼育器に収容した。実験はInstitutional Guidelinesに従って行う。107個のCD19特異的T-BCRで形質導入した、CD19若しくはCD20特異的T-BCRで形質導入した又はモックで形質導入したT細胞を、0.5×106個のDaudi-Luc又はRaji-FFLuc Bリンパ腫細胞と同時に尾静脈を介してi.v.注射した。代替的には、CD19又はCD20特異的T-BCRで形質導入した又はモックで形質導入したT細胞を腫瘍細胞注射後2日目、5日目又は10日目にi.v.注射する。任意に、マウスに形質導入T細胞による1回目の注射の5日後に形質導入T細胞の2回目の注射を行う。マウスにIFA中の0.6×106 IUのIL-2を1日目及び実験終了まで21日毎にs.c.で与える。腫瘍を生物発光イメージングによってin vivoで可視化する。この目的で、マウスをイソフルラン、続いて25 mg/ml Beetleルシフェリン（Promega）のi.p.注射（100 μl）によって麻酔する。生物発光画像は、Photo Visionソフトウェアによって制御され、M3Visionソフトウェアによって分析される第三世代冷却GaAs増感電荷結合素子カメラ（全てPhoton Imager；Biospace Laboratory, Paris, France）を用いて取得する。血液、骨髄、脾臓及び肝臓からのサンプルを2回目の注射の12時間後に回収し、移入T細胞及び腫瘍細胞の存在をフローサイトメトリーによって評価する。
【０１３７】
実施例4：CD19又はCD20特異的T-BCR T細胞の臨床グレード増加
多数の改変T細胞を生成するために、急速増加プロトコル（REP）を用いて細胞の増殖を誘導した。REPに使用する前にT細胞をOKT3、抗CD28及びIL-2と培養し始め、上記に詳述されるように培養開始後2日目及び3日目に形質導入した。細胞を75cm2フラスコ中、37℃及び5 % CO2で培養した。培養が保たれる残りの時間にわたって2日毎に細胞を計数し、300 IU/mLのIL-2を含む新鮮T細胞培地に0.5×106細胞/mLの濃度で懸濁した。
【０１３８】
実施例5：T-BCR細胞の臨床試験
T-BCR細胞の臨床的有効性及び安全性を決定するために、CD19特異的T-BCR T細胞を臨床試験設定で評価する。それを必要とするCD19+癌を有する対象が第1相用量漸増試験に参加する。
【０１３９】
抗CD19 T-BCR改変細胞が、それを必要とする対象から得られる全末梢血単核細胞（PBMC）に抗CD3モノクローナル抗体（OKT3）を直接添加することによって産生され、インターロイキン-2（IL-2）を含有する培養培地に懸濁する。抗CD19 T-BCR細胞が、実施例1に記載されるように0日目に末梢血単核細胞（PBMC）を抗CD3抗体OKT3で活性化し、2日目にT細胞をレトロウイルスによって形質導入することによって産生された。使い捨てWAVEバイオリアクターシステムを利用して形質導入し、IL-2中で形質導入T-BCR細胞を大量に増加させる。T-BCR T細胞は体重1 kg当たりのCD3+ T-BCR陽性細胞の数として投与する。T-BCR陽性T細胞の割合をフローサイトメトリーによって決定し、治療される対象において標的用量を達成するために注入される細胞の総数の算出に用いる。抗CD19 T-BCR細胞の注入を受けた対象からの正常CD19+ B細胞の長期的根絶により、T-BCR細胞の強力な抗原特異的活性が実証される。
【０１４０】
安全性評定は患者が療法を受けている間は毎週、その後更に12週間にわたって4週間毎に行う。血液学的毒性をIWCLL 2008基準に従って療法の最初のサイクル中に格付けし、療法との考え得る、推定される又は不明な関係によって以下の有害事象のいずれか1つとして規定する：透析を必要とするグレード3超の腫瘍崩壊症候群若しくはグレード3の腫瘍崩壊症候群、7日間以上続くグレード4以上の倦怠感、任意の他のグレード3以上の非血液学的毒性（3日間の最大限の制吐／電解質置換療法の非存在下での嘔気、嘔吐、電解質異常又は肝機能異常を除外する）、前治療を有する患者ANC＞1×109における7日間以上続くグレード4の好中球減少症（ANC＜0.5×109）、又は3日間超にわたって続く任意の他のグレード3以上の血液学的毒性（リンパ球減少症を除外する）。
【０１４１】
応答を物理的試験及び臨床検査データ、並びにCLLのコンピューター断層撮影（CT）スキャンデータを含むIWCLL 2008ガイドライン、並びにSLLについての2007 International WorkingGroup Response Criteriaに従って決定する。応答をサイクル2の1日目、サイクル2の終了時、並びにサイクル2の終了の4週間後、8週間後及び12週間後に評価する。
【符号の説明】
【０１４２】
図面訳
図1
IgH C-region +TM-Domain  IgH C領域＋TMドメイン
Signalingdomain(s)  シグナル伝達ドメイン（複数の場合もある）
図2
Leader-Peptide  リーダーペプチド
CD79alpha  CD79α
CD3 zeta  CD3ζ
P2A peptidesequence  P2Aペプチド配列
CD79beta  CD79β
図3
Stop  停止
Ig heavy  Ig重鎖
Ig light  Ig軽鎖
図4
% of max  最大に対する%
Anti-human IgG  抗ヒトIgG
図5
Raji cells (Bcell lymphoma)  Raji細胞（B細胞リンパ腫）
anti-CD8  抗CD8
anti-IFNγ  抗IFNγ
wildtype  野生型
T cells alone  T細胞単独
Raji cells  Raji細胞
Percent CD8+IFNg+ (of total live, CD79ab+)  CD8+ IFNg+のパーセント（総生CD79ab+に対する）
図6
Ig heavy  Ig重鎖
Ig light  Ig軽鎖
Stop  停止
図7
Leader-Peptide  リーダーペプチド
CD79alpha  CD79α
CD3 zeta  CD3ζ
P2A peptidesequence  P2Aペプチド配列
CD79beta  CD79β
図8
Leader-Peptide  リーダーペプチド
CD79alpha  CD79α
CD3 zeta  CD3ζ
P2A peptidesequence  P2Aペプチド配列
CD79beta  CD79β
図9
Leader-Peptide  リーダーペプチド
CD79alpha  CD79α
CD79alphawild-type (cytoplasmic)  CD79α野生型（細胞質）
P2A peptidesequence  P2Aペプチド配列
CD79beta  CD79β
CD79betawild-type (cytoplasmic)  CD79β野生型（細胞質）
図10
Target cells  標的細胞
IFN spots/15000cells  15000細胞当たりのIFNスポット
T cells only  T細胞のみ
IFN production  IFN産生
図11
Target cells  標的細胞
IFN spots/15000cells  15000細胞当たりのIFNスポット
T cells only  T細胞のみ
IFN production  IFN産生
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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