(57)【要約】血管の新生又は成長を抑制する融合タンパク質、そのコード配列、該コード配列を含むベクター、宿主細胞、医薬組成物及び前記融合タンパク質の用途を提供する。本発明で提供する融合タンパク質は熱的安定性が高く、発酵過程におけるタンパク質重合体の形成率を顕著に低下させ、タンパク質の純度と収率を顕著に向上させ、優れた生物活性を有する。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＶＥＧＦ受容体断片とヒト免疫グロブリンＦｃ断片とからなり、前記ＶＥＧＦ受容体断片のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示される、ことを特徴とする血管の新生又は成長を抑制する融合タンパク質。
【請求項２】
前記ヒト免疫グロブリンＦｃ断片は、ＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ及びＩｇＧ４  Ｆｃ断片からなる群から選択される少なくとも１種であり、ＩｇＧ１  Ｆｃのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示され、ＩｇＧ２  Ｆｃのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示され、ＩｇＧ３  Ｆｃのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で示され、ＩｇＧ４  Ｆｃのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で示されることが好ましい、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合タンパク質は、
アミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示されるＫＨ０２、
アミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で示されるＫＨ０３、又は、
アミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で示されるＫＨ０４である
ことを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ヌクレオチド配列であって、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質をコードし、前記ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で示される配列であることが好ましい、ことを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質を発現する発現ベクター又は宿主細胞であって、請求項４に記載のヌクレオチド配列を含み、前記発現ベクターは真核細胞発現ベクター又はウイルス発現ベクターであることが好ましく、さらに、前記真核細胞発現ベクターは哺乳動物細胞発現ベクターであり、前記ウイルス発現ベクターはアデノ随伴ウイルス又はアデノウイルスベクターであることが好ましく、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞又はその亜株、又は２９３細胞又はその亜株であることが好ましい、ことを特徴とする発現ベクター又は宿主細胞。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質を製造する方法であって、請求項５に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクションし、融合タンパク質の表現を行うことを含む、ことを特徴とする方法。
【請求項７】
医薬組成物であって、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質と、薬学的に許容されるベクター又は賦形剤と、を含み、前記医薬組成物の製剤の形態は、注射剤、注射用凍結乾燥粉末又は眼用ゲルであることが好ましい、ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質の血管の新生又は成長による疾患を治療する医薬品の製造における用途であって、前記血管の新生又は成長による疾患は、腫瘍又は眼部の血管新生による疾患であることが好ましく、さらに、前記眼部の血管新生による疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症又は脈絡網膜症であることが好ましい、ことを特徴とする用途。
【請求項９】
血管の新生又は成長による疾患を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質又は請求項７に記載の医薬組成物を、必要とする患者に投与することを含み、前記血管新生又は成長による疾患は、腫瘍又は眼部の血管新生による疾患であることが好ましく、さらに、前記眼部の血管新生による疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症又は脈絡網膜症であることが好ましい、ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学分野に属し、具体的には血管の新生又は成長を抑制する融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の生理的条件下で、血管の生成は複数の要素によって厳密に調節される過程であり、有機体の正常な機能を修復及び維持するのに重要な役割を果たす。しかしながら、腫瘍内部の血管が急成長することは、臨床においてよく見られる現象の一つである。大量の動物モデル及び人体臨床試験から分かるように、腫瘍内の新生血管の形成を遮断することにより、腫瘍の成長を効果的に阻止し、腫瘍細胞の死を誘発することができるため、腫瘍に対する治療作用を達成できる。そのため、現在、血管の新生を抑制することは、抗腫瘍新薬研究において重要な動向の一つになっている。例えば、Ａｖａｓｔｉｎのような血管の新生を阻害する高分子医薬品は、既に米国ＦＤＡの市販許可を取得しており、また、さらに多くの医薬品は異なる臨床前と臨床研究段階にある。なお、血管新生を抑制する治療新薬は、加齢黄斑変性症（Ａｇｅ‐ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＡＭＤと略称される）、糖尿病性網膜症、関節炎などのような複数種類の血管新生に関わる疾患に対しても、広範及び重要な役割を果たしている。
【０００３】
血管新生は複数種類の生物学的活性因子によって調節される複雑な過程であり、そのうちの一つの重要な段階とは、内皮細胞表面の受容体が複数種類の増殖因子と結合することによって活性化された後に、細胞内のチロシンリン酸化されたシグナル伝達システムによって内皮細胞の活動を制御し、それにより血管新生を促すことである。複数種類の増殖因子において、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦと略称される）は、血管新生を制御する最も重要な因子であり、血管形成を誘導且つ促進する役割が最も強く、最も特異な血管増殖因子であり、ほとんどすべての人体腫瘍において過剰発現され、抗がん研究における一つの重要な分子標的である。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞表面に、ＶＥＧＦＲ‐１（Ｆｌｔ‐１とも称される）及びＶＥＧＦＲ‐２（ＫＤＲ又はＦｌｋ‐１とも称される）を含む複数種類の受容体を有し、それらの細胞外の部分はいずれも７つのＶＥＧＦと結合可能な免疫グロブリン様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ７）によって構成され、細胞内の部分はいずれもチロシンキナーゼ基を含む。受容体がＶＥＧＦによって活性化された後に、細胞内のチロシンキナーゼ基がリン酸化され、一連のシグナル伝達が引き起こされ、最後に血管新生が誘発される。ＶＥＧＦシグナル伝達が血管新生に対して重要であるため、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体を遮断することによって血管新生への抑制を達成することは、重要な抗がんの役割を有し、また、網膜血管症などを含む血管新生に関わる他の疾患に対しても重要な治療作用を有する。
【０００４】
融合タンパク質医薬品の安定性は、生物学的応用に対して重要な影響力を有し、医薬品の品質の向上と医薬品の工業的生産でのキーポイントでもある。タンパク質は、ある物理と化学の要因の作用下でその特定の空間的な立体配座が変更され、それによりその物理的と化学的な性質が変化されて生物活性が失われており、このような現象はタンパク質の変性と言われている。変性作用とは、タンパク質が物理的又は化学的な要因の影響を受けて、その分子の内部構造と性質が変更されることである。タンパク質の熱的安定性の検出によって、タンパク質の変性を効果的に確定できるため、タンパク質医薬品の研究開発でのタンパク質の安定性の検出に用いられ、主に蛍光が発射されるように、紫外線励起光をタンパク質サンプルへ照射している。タンパク質から発射される蛍光の波長と光の強度が、その構造の変化に一々対応するため、それを基に、タンパク質サンプルの変性温度Ｔｍを正確に検出できる。また、紫外線励起光と静的光散乱（Ｓｔａｔｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）技術を同時に応用してタンパク質の凝集状況を検出すると、タンパク質サンプルの凝集と非凝集状態での光の強度が非常に顕著な変化を有するため、タンパク質サンプルの凝集温度Ｔａｇｇ（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｎｓｅｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を正確に検出でき、タンパク質の変性温度Ｔｍと凝集温度Ｔａｇｇはバイオタンパク質分子の安定性を効果的に表現できる。
【０００５】
バイオの高分子医薬品開発過程における制約要素は、薬効、医薬品の安定性、医薬品の工業化生産可能性などを含み、治療効果が明確で、安定性が高く、血管の新生又は成長を抑制する医薬品を求めることは非常に必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の説明
本発明は、治療効果が明確で、安定性が高く、血管の新生又は成長を抑制する融合タンパク質を提供することを目的とし、該融合タンパク質はＶＥＧＦシグナル伝達を遮断することにより、血管の新生又は成長を抑制する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決手段を提供する。
本発明の一態様によれば、血管の新生又は成長を抑制する融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は、ヒトＶＥＧＦ受容体断片とヒト免疫グロブリンＦｃ断片とからなり、前記ＶＥＧＦ受容体断片のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示される。
【０００８】
さらなる実施形態において、前記融合タンパク質のヒト免疫グロブリンＦｃ断片は、配列ＩｇＧ１  Ｆｃ（アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７である）、ＩｇＧ２  Ｆｃ（アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である）、ＩｇＧ３  Ｆｃ（アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９である）及びＩｇＧ４  Ｆｃ（アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０である）からなる群から選択される少なくとも１種である。
【０００９】
よりさらなる実施形態において、本発明の融合タンパク質は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示されるアミノ酸であるＫＨ０２、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で示されるアミノ酸であるＫＨ０３、又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で示されるアミノ酸であるＫＨ０４である。
【００１０】
別の一態様によれば、本発明は前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供し、前記ヌクレオチド配列は、
融合タンパク質ＫＨ０２をコードし、ヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示されるｋｈ０２、
融合タンパク質ＫＨ０３をコードし、ヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示されるｋｈ０３、又は
融合タンパク質ＫＨ０４をコードし、ヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で示されるｋｈ０４であることが好ましい。
【００１１】
別の一態様によれば、本発明は、前記融合タンパク質を発現する発現ベクター又は宿主細胞を提供し、前記発現ベクターは上記融合タンパク質のヌクレオチド配列を含む。前記発現ベクターは組み換え真核細胞発現ベクターであってもよく、哺乳動物細胞発現ベクターであることが好ましい。また、組み換えウイルス発現ベクターであってもよく、アデノ随伴ウイルス又はアデノウイルスベクターであることが好ましい。前記発現ベクターは形質転換された宿主細胞においてコピーされて発現されることができ、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞又はその亜株、又は２９３細胞又はその亜株であることが好ましい。
【００１２】
別の一態様によれば、本発明は、上記発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクションさせ、融合タンパク質の発現を行うことを含む、前記融合タンパク質を製造する方法を提供する。
【００１３】
別の一態様によれば、本発明は、本発明の融合タンパク質と、薬学的に許容されるベクター又は賦形剤と、を含む医薬組成物を提供し、前記ベクター又は賦形剤は、当該分野において一般的に使用されるベクター又は賦形剤である。前記医薬組成物の製剤の形態は、注射剤、注射用凍結乾燥粉末又は眼科用ゲルであることが好ましく、当該分野の周知の方法を用いて前記製剤を製造することができる。
【００１４】
別の一態様によれば、本発明は、上記融合タンパク質の血管の新生又は成長による疾患を治療する医薬品の製造での用途を提供し、前記血管の新生又は成長による疾患は、腫瘍又は眼部の血管新生による疾患であることが好ましく、前記眼部の血管新生による疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、脈絡網膜症などであることが好ましい。
【００１５】
別の一態様によれば、本発明は、血管の新生又は成長による疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、必要とする患者に、本発明の融合タンパク質又は医薬組成物を投与することを含み、前記疾患は、腫瘍又は眼部の血管新生による疾患であることが好ましく、前記眼部の血管新生による疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、脈絡網膜症などであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の融合タンパク質は熱的安定性が高く、発酵過程においてそのタンパク質重合体の形成率を大幅に低下させ、タンパク質の純度と収率を大幅に向上させ、同時に本発明の融合タンパク質は優れた生物学的活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の熱変性傾向性の検出結果図であり、図におけるグラフはタンパク分子の固有蛍光ピークが温度上昇にしたがって上昇する状況を示し、ここで、縦軸ＢＣＭ（ｎｍ）は固有蛍光ピークであり、横軸は温度である。
【図２】図２は、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の熱凝集傾向性の検出結果図であり、図におけるグラフはタンパク分子の静的光散乱強度が温度上昇にしたがって変化する状況を示し、ここで、縦軸ＳＬＳ  ａｔ  ２６６ｎｍは静的光散乱強度であり、横軸は温度である。
【図３】図３は、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質による、ＶＥＧＦによって誘発されるＨＵＶＥＣ細胞増殖を抑制する作用を示す結果図であり、ここで、横軸は融合タンパク質の濃度であり、縦軸はＣＣＫ‐８法によって細胞活性を検出する吸光度値である。
【図４】図４は、ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質による、ＶＥＧＦによって誘発されるＨＵＶＥＣ細胞移動を抑制する作用を示す結果図であり、ここで、横軸は融合タンパク質とＶＥＧＦのモル濃度比であり、縦軸は総移動に占める百分率（％総移動率＝（Ｆｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ‐Ｆｂａｓａｌ）／（Ｆｔｏｔａｌ‐Ｆｂａｓａｌ）であり、Ｆｂａｓａｌは培地グループの蛍光平均値を示し、ＦｔｏｔａｌはＶＥＧＦグループの蛍光平均値を示し、Ｆｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎは異なるモル比の融合タンパク質とＶＥＧＦグループの蛍光平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は本発明を説明するものに過ぎず、本発明に対して如何なる限定を行うものではないことは、理解すべきことである。当業者が本明細書の示唆を基に、本発明の実施に対して行った如何なる変形は、すべて請求の範囲内に収まる。
【００１９】
配列に関する説明
ヒトＶＥＧＦ受容体断片１：アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２である。
【００２０】
ヒトＶＥＧＦ受容体断片２：アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である。
ヒトＶＥＧＦ受容体断片３：アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５であり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６である。
【００２１】
融合タンパク質ＫＨ０１：アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２であり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１である。
融合タンパク質ＫＨ０２：アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４であり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３である。
【００２２】
融合タンパク質ＫＨ０３：アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６であり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５である。
融合タンパク質ＫＨ０４：アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８であり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７である。
【００２３】
融合タンパク質ＫＨ０５：アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０であり、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９である。
【実施例】
【００２４】
実施例１：融合タンパク質の製造
材料又は試薬
ＰＣＲキット（５×緩衝液、ｄＮＴＰ及びＰｈｕｓｉｏｎ酵素を含む）：Ｍ０５３０Ｌ、ＮＥＢ社製
アガロースゲル電気泳動：ＩＱ３００、ＧＥ社製
緩衝液４（ｌｏｔ：０１０１２０１）：ＮＥＢ社製
ＡｖｒＩＩ：Ｒ０１７４Ｌ、ＮＥＢ社製
ＢｓｔＺ１７Ｉ：Ｒ０５９４Ｌ、ＮＥＢ社製
ＰＣＲ生成物精製キット：ＱＩＡＧＥＮ社製、ＣＡＴ：２８１０６
１０×Ｔ４緩衝液：Ｂ０２０２Ｓ、ＮＥＢ社製
Ｔ４ＤＮＡ結合酵素：Ｍ０２０２Ｌ、ＮＥＢ社製
Ｔｏｐ１０大腸菌：ＣＢ１０４、ＴＩＡＮＧＥＮ社製
２ＹＴ（ＡＭＰ）プレート培地：上海鋭聰実験室設備有限会社製
ＦｒｅｅｄｏｍＴＭＣＨＯ‐ＳＴＭＫｉｔキット：Ａ１３６９６‐０１、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製
Ｃｌｏｎｅ  Ｐｉｘ  ＦＬ：Ｇｅｎｅｔｉｘ社製
ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａアガロースアフィニティークロマトグラフカラム：ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａ  ＨＰ、５×１ｍｌ、ＧＥ社製
ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４）：ＳＤ１１７‐５００ｍｌ、上海生物工程有限会社製
ＦｏｒｔｅＢｉｏバイオ分子間相互作用装置：Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅ、Ｐａｌｌ社製
タンパク質の熱的安定性解析計：Ｏｐｔｉｍ２、Ａｖａｃｔａ社製、
ＶＥＧＦ：Ｒ＆Ｄ社製
ＮＨＳ‐ＬＣＬＣ‐Ｂｉｏｔｉｎ：Ｔｈｅｒｍｏ社製
１、融合タンパク質コード配列を含むプラスミドの構築
１．１  遺伝子とプライマーの合成
北京ジーンウィズ会社（北京金唯智公司）によって合成断片１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）と２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）及びプライマーＰ１〜Ｐ１０（配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜３２で示される）を合成し、合成断片１と２をプラスミドベクターｐＵＣ１９（北京ジーンウィズ会社）に組み換える。合成断片１はヒトＶＥＧＦ受容体断片をコードするヌクレオチド配列とシグナルペプチド配列を含み、合成断片２はヒトＩｇＧ１  ＦＣのコード配列を含む。合成断片１と２は各融合タンパク質を構築するテンプレートとして、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲ方法によって本発明の融合タンパク質のコード配列を構築する。
【００２５】
１．２  融合タンパク質のコード配列の取得
各融合タンパク質のコード配列に対して二つの部分に分けて増幅を行い、第１の部分はヒトＶＥＧＦ受容体断片であり、第２の部分はヒトＩｇＧ１  ＦＣ断片である。各部分はそれぞれの特異的なプライマーを通じて応じる標的断片を取得し、そしてオーバーラップＰＣＲの方法を通じてヒトＶＥＧＦ受容体断片をヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片に接合させ、最終的に全遺伝子配列を取得する。第１、第２の二つの部分の増幅ＰＣＲ反応系はいずれも以下の通りである（全容積が５０μｌである）。５×緩衝液が１０μｌ、ｄＮＴＰが２μｌ、特異的フォワード及びリバース（ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ）のプライマーがそれぞれ１μｌ、テンプレート（上記合成断片１又は合成断片２）が１μｌ、Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素（ＰＣＲフィディリティー酵素）が０．５μｌであり、最後に容積が５０μｌになるまで再蒸留水を追加する。反応条件は、以下の通りである。９８℃でサイクル前の初期変性（Ｉｎｉｔｉａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）を３０ｓ行い、９８℃で１０ｓと、６８℃で２ｍｉｎとを一つのサイクルとして合計１０サイクルを行い、９８℃で１０ｓと、５５℃で３０ｓと、７２℃で５０ｓとを一つのサイクルとして合計３０サイクルを行い、最後に７２℃で５ｍｉｎ行う。具体的な実施形態は、以下の通りである。ｋｈ０２において、第１の部分のプライマー対はＰ１とＰ６であり、テンプレートは合成遺伝子１であり、第２の部分のプライマー対はＰ５とＰ２であり、テンプレートは合成遺伝子２である。ｋｈ０３において、第１の部分のプライマー対はＰ１とＰ８であり、テンプレートは合成遺伝子１であり、第２の部分のプライマー対はＰ７とＰ２であり、テンプレートは合成遺伝子２である。ｋｈ０４において、第１の部分のプライマー対はＰ１とＰ１０であり、テンプレートは合成遺伝子１であり、第２の部分のプライマー対はＰ９とＰ２であり、テンプレートは合成遺伝子２である。タンパク質ＫＨ０１のコード配列（ｋｈ０１）において、第１の部分のプライマー対はＰ１とＰ４であり、テンプレートは合成遺伝子１であり、第２の部分のプライマー対はＰ３とＰ２であり、テンプレートは合成遺伝子２である。遺伝子産物はアガロースゲル電気泳動によって検出される。合計で８つの関連断片が取得され、それはそれぞれｋｈ０１‐Ｑ、ｋｈ０１‐Ｈ、ｋｈ０２‐Ｑ、ｋｈ０２‐Ｈ、ｋｈ０３‐Ｑ、ｋｈ０３‐Ｈ、ｋｈ０４‐Ｑ及びｋｈ０４‐Ｈである。オーバーラップＰＣＲ反応系はいずれも以下の通りである（全容積が５０μｌである）。５×緩衝液が１０μｌ、ｄＮＴＰが２μｌ、テンプレートである上記のそれぞれ増幅に対応する第１と第２断片がそれぞれ１μｌ（例えば、ｋｈ０１全長を増幅するとき、対応するｋｈ０１‐Ｑとｋｈ０１‐Ｈの回収されたＰＣＲ生成物をそれぞれ１μｌ使用する）、フォワード及びリバースのプライマーがそれぞれ１μｌ（Ｐ１、Ｐ２）、Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素が０．５μｌであり、最後に容積が５０μｌになるまで再蒸留水を追加する。反応条件は、以下の通りで有る。９８℃でサイクル前の初期変性を３０ｓ行い、９８℃で１０ｓと、５５℃で３０ｓと、７２℃で５０ｓとを一つのサイクルとして合計３０サイクルを行い、最後に７２℃で５ｍｉｎ行う。遺伝���産物はアガロースゲル電気泳動（ＩＱ３００、ＧＥ社製品）によって検出される。合計で４つの遺伝子断片が取得され、それはそれぞれｋｈ０１‐１（応じる排列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１であり、ＰＣＲ増幅産物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に比べて、シグナルペプチドのコード配列が更に追加されている）、ｋｈ０２‐１（応じる配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３であり、ＰＣＲ増幅産物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に比べて、シグナルペプチドのコード配列が更に追加されている）、ｋｈ０３‐１（応じる配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５であり、ＰＣＲ増幅産物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に比べて、シグナルペプチドのコード配列が更に追加されている））、ｋｈ０４‐１（応じる配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７であり、ＰＣＲ増幅産物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に比べて、シグナルペプチドコード配列が更に追加されている）と名付けられる。電気泳動検出により取得された増幅断片のサイズは、予想したものと一致する。
【００２６】
１．３  ベクターと遺伝子断片の酵素消化（Ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）処理
ｐＣＨＯ１．０プラスミド（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入され、商品番号はＡ１３６９６‐０１である）、ｋｈ０１‐１、ｋｈ０２‐１、ｋｈ０３‐１、ｋｈ０４‐１増幅断片に対してそれぞれ二重酵素消化処理を行い、酵素消化系は、１．５ｍｌ  ＥＰ管にそれぞれ、ｐＣＨＯ１．０プラスミド又はｋｈ０１‐１、ｋｈ０２‐１、ｋｈ０３‐１、ｋｈ０４‐１増幅断片を４０μｌ、１０×緩衝液４（ＮＥＢ）を１０μｌ、ＡｖｒＩＩ（Ｒ０１７４Ｌ、ＮＥＢ）及びＢｓｔＺ１７Ｉ（Ｒ０５９４Ｌ、ＮＥＢ会社製品）をそれぞれ５μｌ、滅菌水を４５μｌ投入し、均一に混合した後に３７℃で５ｈ反応させ、ＰＣＲ生成物精製キット（ＣＡＴ：２８１０６、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収する。
【００２７】
１．４  組み換えプラスミドの結合形質転換
Ｔ４ＤＮＡ結合酵素の作用下で、同じく酵素消化された後に回収されたｐＣＨＯ１．０断片（ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉ酵素消化大断片であって、約１３ｋｂである）をｋｈ０１‐１、ｋｈ０２‐１、ｋｈ０３‐１、ｋｈ０４‐１（ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉ酵素消化）断片に結合させる。結合反応系は以下のとおりである。１．５ｍｌ  ＥＰ管にそれぞれｐＣＨＯ１．０断片（ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉ）を２μｌ、ｋｈ０１‐１、ｋｈ０２‐１、ｋｈ０３‐１、ｋｈ０４‐１（ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉ酵素消化）断片を６μｌ、１０×Ｔ４緩衝液（Ｂ０２０２Ｓ、ＮＥＢ）を１μｌ、Ｔ４  ＤＮＡ結合酵素（Ｍ０２０２Ｌ、ＮＥＢ）を１μｌ投入し、均一に混合した後に室温（２０℃程度）で４ｈ以上反応させ、結合生成物をＴｏｐ１０大腸菌（ＣＢ１０４、ＴＩＡＮＧＥＮ）のコンピテント細胞に形質転換させ、２ＹＴ（ＡＭＰ）プレート培地（上海鋭聰実験室設備有限会社製品）に塗布した後に、３７℃で一晩静置させ、プレートにそれぞれ番号ｋｈ０１、ｋｈ０２、ｋｈ０３、ｋｈ０４を付ける。
【００２８】
１．５  組み換えプラスミドのコロニーＰＣＲスクリーニング
ｋｈ０１、ｋｈ０２、ｋｈ０３、ｋｈ０４プレートからそれぞれ複数の組み換え単一コロニーを選択して、３７℃で３〜５ｈ静置培養する。培養後にＰＣＲテンプレートとし、それぞれＰＣＲスクリーニング判定を行う。菌液ＰＣＲ増幅反応系は以下の通りである（全容積２０μＬ）。２×Ｔａｑ  ＨＳ（Ｒ０１３Ａ、ＴＡＫＡＴＡ）が１０μｌ、菌液テンプレートが２μｌ、フォワード及びリバースのプライマー（Ｐ１とＰ２）がそれぞれ１μｌ（最終濃度０．３μｍｏｌ／Ｌ）であり、最後に２０μＬになるまで再蒸留水を追加する。反応条件は、以下の通りである。９４℃で３ｍｉｎ行い、９４℃で６０ｓと、５３℃で６０ｓと、７２℃で１２０ｓとを一つのサイクルとして合計３０サイクルを行い、最後に７２℃で５０ｍｉｎ行う。結果から分かるように、全てのコロニーはいずれも１．６Ｋｂｐ程度の標的ストリップを増幅することができ、いずれも陽性クローンである。
【００２９】
１．６  組み換えプラスミドの酵素消化判定
コロニーＰＣＲによって正しく判定されたコロニーを接種した後に、プラスミドを抽出して酵素消化判定を行う。先ず組み換え菌のプラスミドを抽出し、その後に酵素消化解析を行い、酵素消化系は、１．５ｍｌ  ＥＰ管にプラスミドを２μｌ、１０×緩衝液４を１μｌ、ＡｖｒＩＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉをそれぞれ１μｌ投入し、容積が１０μｌになるまで滅菌水を追加し、均一に混合した後に３７℃で４ｈ反応させる。アガロースゲル電気泳動解析による結果として、いずれも１．６Ｋｂ程度の標的ストリップを酵素消化させることができ、選択されたクローンはいずれも陽性クローンである。
【００３０】
１．７  組み換えプラスミドの配列測定の判定
コロニーＰＣＲと酵素消化によって正しく判定されたコロニーを蘇州ジーンウィズ生物科技有限会社に送って配列測定の判定を行った。配列測定の結果は予想したものと一致する。発現プラスミドを保存して使用に備え、配列測定に成功したクローンに以下のように番号を付ける。ｋｈ０１‐１に番号６１０を付け、ｋｈ０２‐１に番号７１１を付け、ｋｈ０３‐１に番号８１２を付け、ｋｈ０４‐１に番号９１５を付ける。
【００３１】
２、プラスミドトランスフェクション及び細胞スクリーニング
ＦｒｅｅｄｏｍＴＭＣＨＯ‐ＳＴＭＫｉｔ試薬キット（Ａ１３６９６‐０１、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）における宿主細胞ＣＨＯ‐Ｓを採用し、説明書の通りにプラスミドトランスフェクションを行う。本試験は、６１０、９１５、８１２、７１１という４種類のプラスミドをそれぞれトランスフェクションし、プラスミドがトランスフェクションされた細胞を振とうフラスコにそれぞれ置いて培養し、培地はＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入される）であり、培養条件は３７℃、８％ＣＯ２、１１０ｒｐｍ／ｍｉｎであり、４８ｈ培養し、細胞計数器によって細胞の生存率と細胞の数を検出する。
【００３２】
トランスフェクションしてから４８ｈ後に２つのステップの加圧スクリーニングを行った。１０Ｐ／１００Ｍ、２０Ｐ／２００Ｍ（Ｐ＝１０μｇ／ｍＬピューロマイシン、Ｍ＝ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ））；３０Ｐ／５００Ｍ、５０Ｐ／１０００Ｍであり、培地はＣＤ‐ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地であり、一次スクリーニング細胞、即ち６１０、９１５、８１２、７１１（即ち、上記の対応するプラスミドをそれぞれ含む）が取得される。引き続き単クローン細胞のスクリーニングを行い、接種する生細胞の密度は５００個／ｍＬであり、４８ｈトランスフェクションした後に取得された一次スクリーニング細胞組を一つずつ８つの６ウェルプレートに接種し、細胞培養ボックス内にて一週間培養する。蛍光顕微鏡で各ウェルプレートにおけるクローン細胞の成長状況を観察し、Ｃｌｏｎｅ  Ｐｉｘ  ＦＬ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を採用して単クローン細胞を選択し、タンパク質の発現量及び純度を検出することによりクローンを最適に選択して培養を逐次にスケールアップして培養する。
【００３３】
３、タンパク質の発現、精製及び判定
高収率のクローン細胞を選択し、９６ウェルプレートから２４ウェルプレートまでスケールアップして成長させた後に、６ウェルプレートまでスケールアップして成長させ、その後に、５０ｍＬ振とうフラスコまでスケールアップして成長させる。
【００３４】
４〜６日培養した細胞培養上清液を収集し、遠心分離して細胞残屑を除去し、上清液を０．４５μｍろ過膜で濾過し、ｐＨを７．４に調節し、Ｈｉｔｒａｐタンパク質Ａアフィニティー分離カラム（ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａ  ＨＰ、５×１ｍｌ、ＧＥ）によって融合タンパク質を精製し、カラムの体積の５倍の脱イオン水を用いてカラムを洗い流し、カラムの体積の５倍のＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４である）（ＳＤ１１７‐５００ｍｌ、上海生物工程有限会社製）を用いてカラムを中性化させ、サンプルを入れて、流れ出す液を収集して検出し、１０倍の体積のＰＢＳ緩衝液の希釈液（０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸塩、ｐＨ７．４である）を用いて洗浄してタンパク質の不純物を除去し、その後に、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３）を用いて標的タンパク質をカラムから溶出させて、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって検出された複数のタンパク質の純度がいずれも９０％以上であるようにする。
【００３５】
実施例２  タンパク質の純度及び発現収率の分析
ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ技術を採用し、発酵液のタンパク質純度を検出して分析し、他にＦｏｒｔｅＢｉｏバイオ分子間相互作用装置（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅ、Ｐａｌｌ社製）を採用して実施例１における各タンパク質の発現量を検出した結果、表１に示すように、融合タンパク質ＫＨ０２〜ＫＨ０４の発現量と純度はいずれもＫＨ０１タンパク質より優れ、融合タンパク質ＫＨ０２の純度及び収率が最も優れ、培養の９日目になっても、栄養物を添加しないという条件下で、タンパク質の純度は依然として８０％以上を維持することができる。
【００３６】
【表１】
2017505118.tif 000002
【００３７】
実施例３  ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の熱的安定性検出
（１）ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の熱変性傾向性分析
タンパク分子が熱を受けるときに、その空間の立体配座にはアンフォールディングが発生され、芳香族塩基を有する疎水性アミノ酸残基（例えば、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）は継続的に外部に露出される。検出された芳香族塩基の固有蛍光強度（ＩＦ）はタンパク分子のアンフォールディング程度を表すことができる。タンパク分子のアンフォールディング過程において、その固有螢光団の蛍光スペクトルに変化が発生され、天然構造（正常に折り畳む）のタンパク質は低い固有蛍光強度を有し、ピークは３３０ｎｍ付近で現れ、変性タンパク質の固有蛍光強度は大幅に増加され、ピークは３５０ｎｍ付近に移動される。タンパク分子の固有蛍光強度の変化及びピークの移動程度を分析することにより熱変性中点温度（Ｈａｌｆ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）Ｔｍ値を算出することができ、タンパク質サンプル構造の熱変性傾向性を間接的に表現する。
【００３８】
タンパク質熱安定性分析器（Ｏｐｔｉｍ２、Ａｖａｃｔａ社製）を用いてＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の熱変性傾向性を検出する。約１５μｌの検出しようとするサンプル（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２、純度が９０％を上回る）を取って、Ｏｐｔｉｍ２サンプル反応管に投入し、温度走査範囲を２５℃〜９５℃に設定し、それぞれの温度ポイントで６０ｓインキュベートし、Ｏｐｔｉｍ２解析用ソフトウェアを用いてデータを処理した結果、図１及び表２に示すように、実施例１で発現された一連の融合タンパク質において、ＫＨ０２の変性温度が相対的に最も高く、その熱変性傾向性が相対的に最も低いことを示し、即ち、そのタンパク質の熱的安定性も相対的に最も高いことが明らかである。
【００３９】
【表２】
2017505118.tif 000003
【００４０】
（２）ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の熱凝集傾向性解析
紫外線でタンパク分子を照射すると、光散乱を発生することができ、静的光散乱強度は一定の範囲内でタンパク分子のサイズ（１０〜６００ＫＤ）とリニア関係になる。光散乱ＳＣＳ（Ｓｔａｔｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）強度を検出することによって、タンパク分子サイズの変化を表すことができ、そのタンパク質に発生した凝集開始温度Ｔａｇｇを算出することにより、タンパク質サンプルの凝集傾向性を間接的に表現することができる。
【００４１】
タンパク質熱安定性分析器（Ｏｐｔｉｍ２、Ａｖａｃｔａ社製）を用いてＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の熱凝集傾向性を検出する。約１５μｌの検出しようとするサンプル（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２、純度が９０％を超える）を取って、Ｏｐｔｉｍ２サンプル反応管に投入し、温度走査範囲を２５℃〜９５℃に設定し、それぞれの温度ポイントで６０ｓインキュベートし、Ｏｐｔｉｍ２解析用ソフトウェアを利用してデータを処理し、実験結果は、図２及び表３に示すように、温度の増加にしたがって、融合タンパク質サンプルの静的光散乱強度は連続的に増加する。そのうち、ＫＨ０２の凝集開始温度Ｔａｇｇ値は相対的に最も高く、これはその熱凝集傾向性が相対的に最も低いことを示す。
【００４２】
【表３】
2017505118.tif 000004
【００４３】
実施例４  ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質の生物学的活性検出
（１）ＨＵＶＥＣ細胞増殖
成長が良好であるヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ会社）を９６培養ウェルプレートに接種し、３×１０３細胞／ウェル、１００μｌ／ウェル、３７℃、５％ＣＯ２にて２０ｈ培養し、２％のウシ胎仔血清を含有するＥＣＭ培地（内皮細胞培地、商品番号１００１、ＳｃｉｅｎＣＥｌｌ会社）を用いて異なるモル濃度（０．００２３、０．００７、０．０２３、０．０６５、０．１９、０．５７、１．７、５、１５、４５、１３５ｎＭ）のＶＥＧＦ受容体融合タンパク質を調製し、４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ会社）とそれぞれ均一に混合し、２ｈインキュベートする。また、ＨＵＶＥＣ細胞が接種された９６ウェルプレートに加え、１００μｌ／ウェル、各グループの実験は３回独立に行い、続いて５％ＣＯ２で９６ｈインキュベートし、ＣＣＫ‐８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ会社）を投入して、ＥＣ５０で本発明の抑制作用を表示する。結果として、図３及び表４に示すように、本発明のＶＥＧＦ融合タンパク質はいずれもＶＥＧＦによって誘発されるＨＵＶＥＣ細胞増殖作用を効果的に抑制することができ、本発明のＶＥＧＦ受容体融合タンパク質はＶＥＧＦを良く抑制する生物学的活性を有することが明らかである。
【００４４】
【表４】
2017505118.tif 000005
【００４５】
（２）ＨＵＶＥＣ細胞移動
改良型のＢｏｙｄｅｎチャンバー（ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋＴＭ  Ｂｉｏｃｏａｔ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ、ＢＤ会社）を用いて本発明の融合タンパク質のＨＵＶＥＣ細胞移動作用を検出する。成長状態が良好であるＨＵＶＥＣ細胞を３×１０５細胞／ｍｌ密度でＢｏｙｄｅｎチャンバーの上層コンパートメントに接種し、７５μｌ／ウェルであり、２％ウシ胎仔血清を含有するＥＣＭ基礎培地（商品番号１００１、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ会社）を用いて異なるモル濃度（１３３３３ｎＭ、４４４４ｎＭ、１４８１ｎＭ、４９４ｎＭ、１６４．５ｎＭ、５４．８ｎＭ、１８．３ｎＭ、６．１ｎＭ）のＶＥＧＦ受容体融合タンパク質を調製し、５００ｐＭのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ会社）とそれぞれ均一に混合し、２ｈインキュベートした後にＢｏｙｄｅｎチャンバー下層コンパートメントに投入し、２２５μｌ／ウェルであり、チャンバー全体を３７℃、５％ＣＯ２の環境として、その環境下で続いて２０〜２４ｈインキュベートする。下層コンパートメントでの培地を除去し、ＨＢＳＳ緩衝液（ハンクス平衡塩類溶液）を用いて調製された最終濃度が５μｇ／ｍｌである蛍光染料Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ａｎａｓｐｅｃ社製）を投入し、３７℃と５％ＣＯ２の環境下で遮光して９０ｍｉｎインキュベートした後に、多機能マイクロプレートリーダーにより蛍光値を測定し、励起波長は４９４ｎｍであり、検出波長は５１７ｎｍである。細胞の相対移動度を算出する。実験結果は図４に示すように、本発明の前記ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質がＶＥＧＦによって誘発されるＨＵＶＥＣ細胞移動作用を抑制することはほぼ同じであり、本発明の融合タンパク質ＫＨ０２がＶＥＧＦを抑制する高い生物活性を有することが再度実証される。
【００４６】
実施例５  ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質とＶＥＧＦ結合の親和性検出
バイオ膜干渉技術（Ｂｉｏｌｙａｙｅｒ‐Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）を用いて、ＦｏｒｔｅＢｉｏバイオ分子間相互作用装置（ＯｃｔｅｔＱＫｅ、Ｐａｌｌ会社）によってヒトＶＥＧＦ受容体融合タンパク質とヒトＶＥＧＦ結合の親和力を検出する。ヒトＶＥＧＦ（商品番号２９３‐ＶＥ‐０１０、Ｒ＆Ｄ会社）とＮＨＳ‐ＬＣＬＣ‐ビオチン（商品番号：２１３３８、Ｔｈｅｒｍｏ会社）をモル比１：３で均一に混合し、室温で１ｈ置いた後に残りのＮＨＳ‐ＬＣＬＣ‐ビオチンを除去し、最終の標識生成物５０μｇ／ｍｌビオチン‐ｈＶＥＧＦを取得し、サンプルを投入することにより５０μｇ／ｍｌビオチン‐ｈＶＥＧＦをストレプトアビジンセンサーに結合させ、サンプル希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％ポリソルベート‐２０、０．００３％ＮａＮ３）を用いて異なる濃度（濃度がそれぞれ６００ｎＭ、２００ｎＭ、６６．７ｎＭ、２２．２ｎＭ、７．４ｎＭ、２．４６ｎＭ、０．８２ｎＭである）の試験サンプルを調製し、サンプル希釈緩衝液をブランクコントロールとする。動力学解析モードによってｈＶＥＧＦと受容体融合タンパク質の結合動力学パラメーターの検出を行う。実験結果は表５に示すように、実施例１で発現されたＶＥＧＦ受容体融合タンパク質はいずれも、ヒトＶＥＧＦと顕著な結合を有し、そのうち、ＫＨ０２のＫＤ値は約０．３３ｎＭであり、特にＶＥＧＦとの結合複合体の動的解離速度はその他の融合タンパク質より遅く、その結合親和力が比較的に最も高いことを示すことが明らかである。
【００４７】
【表５】
2017505118.tif 000006
【００４８】
実施例６  融合タンパク質の親和力実験
１．1  実験用試薬
【００４９】
【表６】
2017505118.tif 000007
【００５０】
【表７】
2017505118.tif 000008
【００５１】
１．２実験方法
１）試薬の調製
ｉ．１０×ＰＢＳ緩衝液：ＮａＣｌ  ８０．ｌｇ、ＫＣｌ  ２．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２．０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４‐１２Ｈ２Ｏ  ２９．０ｇ、純水を投入して溶解させ、１０００ｍｌに定容する。
【００５２】
ｉｉ．１×ＰＢＳ緩衝液：１０×ＰＢＳ緩衝液１００ｍｌに純水８５０ｍｌを投入して溶解させ、ｐＨを７．２〜７．４に調整し、最終的に１０００ｍｌに定容する。
ｉｉｉ．炭酸塩緩衝液：Ｎａ２ＣＯ３  １．５９ｇ、ＮａＨＣＯ３  ２．９３ｇ、１０００ｍｌ超純水に溶解させ、ｐＨを９．６〜９．８に調整し、室温で保存し、使用前に０．２２μｍ口径のフィルターで濾過することが必要である。
【００５３】
ｉｖ．ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）について、４℃で保存する。
ｖ．洗浄バッファー：０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０含有の１×ＰＢＳである。
【００５４】
ｖｉ．ブロッキング溶液とサンプル希釈液：１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有の１×ＰＢＳである。
ｖｉｉ．停止液（２ＮＨ２ＳＯ４）：濃硫酸２７．８ｍｌをゆっくり４７２．２ｍｌの純水に投入するが、濃硫酸が腐食性の強い液体であるため、投入する時ガラス棒で継続的に攪拌し、使用するときに防護に注意しなければならない。
【００５５】
ｖｉｉｉ．ｒｈＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ、２９３‐ＶＥ、規格は５０μｇ／本である）貯蔵液：３ｍｌの１×ＰＢＳを０．２２μｍウェル径のフィルターで濾過する。1本の開封されていないｒｈＶＥＧＦ１６５を取って、先ず８００μｌの既に濾過されたＰＢＳを投入し、ボトル内に目視できる固体物質が溶解した後に、２００μｌの既に濾過されたＰＢＳを追加する。室温で１０分間放置し、ｒｈＶＥＧＦ１６５を十分溶解させる。溶解された後のｒｈＶＥＧＦ１６５の貯蔵液の濃度は５０μｇ／ｍｌであり、貯蔵液を２５μｌ／本により分けて包装し、‐２０℃に放置して６ヶ月保存することができる。
【００５６】
ｉｘ．ヒトＩｇＧ‐Ｆｃ抗体ＨＲＰ検出抗体（ＢＥＴＨＹＬＡ８０‐１０４Ｐ）：濃度１ｍｇ／ｍｌ、４℃で保存する。
２）プレートのコーティング
２０μｌのｒｈＶＥＧＦ１６５貯蔵液を７９８０μｌの炭酸塩緩衝液に投入し、均一に混合した後にコーティング液Ａとなり、濃度は１２５ｎｇ／ｍｌであり、また２５００μｌコーティング液Ａを２５００μｌ炭酸塩緩衝液に投入し、均一に混合した後にコーティング液Ｂとなる。先ずコーティング液Ａによりマイクロプレートの１〜６列をコーティングし、またコーティング液Ｂによりマイクロプレートの７〜１２列をコーティングし、コーティングの量は１００μｌ／ウェルであり、封止剤で密封し、室温で一晩インキュベートする。
【００５７】
３）プレートの洗浄
プレートを洗浄するプロセスは、２５０μｌ洗浄バッファー／ウェルにより、１２０秒／回浸漬し、３回洗浄する。洗浄後のウェル内液体を、清潔なペーパーパッド上に明らかな水の跡が無くなるまでペーパーパッドに打つ。
【００５８】
４）プレートのブロッキング
８チャネルピペットでブロッキング溶液３００μｌ／ウェルを添加してブロッキングする。封止剤でプレートを密封し、３７℃で２ｈインキュベートする。
【００５９】
５）サンプルの添加
サンプル（融合タンパク質ＫＨ０２、ＫＨ０５）の開始タンパク質濃度に基づき、先ず１６００ｎｇ／ｍｌまでにそれぞれ希釈し、１６００ｎｇ／ｍｌのサンプルが少なくとも８００μｌに残ることを保証し、また繰り返して２００μｌのサンプルに６００μｌの希釈液を投入するという方式により、４倍ずつ希釈して８つの異なる濃度（１６００ｎｇ／ｍｌを含む）を取得する。
【００６０】
６）サンプルの投入
上記のようにプレートを洗浄し、サンプルをマイクロプレートにそれぞれ順次に投入し、１００μｌ／ウェルであり、封止剤で密封する。サンプルを投入することは高濃度から低濃度まで順次に行い、各サンプルの実験は独立に二回行う。サンプルを投入した後に、３７℃で１ｈインキュベートする。
【００６１】
７）検出抗体の投入
上記のようにプレートを洗浄し、ヒトＩｇＧ‐Ｆｃ抗体ＨＲＰ０．５μｌを取って１０ｍｌのブロッキング溶液に投入して希釈し、且つ均一に混合し、希釈後の検出抗体を１００μｌ／ウェルに従ってウェルに投入し、３７℃で１ｈインキュベートする。
【００６２】
８）発色
上記のようにプレートを洗浄し、ＴＭＢ発色液を１００μｌ／ウェルに従ってウェルに投入し、室温で遮光して５ｍｉｎ発色させる。
【００６３】
９）終了と読み取り
５０μｌ／ウェル停止液を投入して、反応を停止させ、マイクロプレートをマイクロプレートリーダーに配置して４５０ｎｍ波長条件下で数値を読み取る。
【００６４】
１．３  親和力の検出結果
【００６５】
【表８】
2017505118.tif 000009
【００６６】
表８の親和力検出結果から分かるように、ＫＨ０２が高温１０日を経過した後の親和力は依然として許容される範囲（２２‐８４ｐＭ）内であり、ＫＨ０５が高温１０日を経過した後の親和力は許容される範囲を明らかに超えている。よって、活性方面においてＫＨ０２の安定性がＫＨ０５より優れる。
【００６７】
実施例７  高温純度検出実験
１．１  実験用試薬及び装置
【００６８】
【表９】
2017505118.tif 000010
【００６９】
【表１０】
2017505118.tif 000011
【００７０】
１．２  実験方法
１）試薬の調製
ｉ．ＰＢＳ移動相：７．１６ｇのＮａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、８．７７ｇのＮａＣｌ及び４２．２ｇのＡｒｇを取り、８００ｍｌの超純水に溶解させ、ＨＣｌを用いてｐＨ７．２に調節し、１０００ｍｌに定容し、Φ０．２２μｍろ過膜を使用して濾過する。
【００７１】
ｉｉ．クロマトグラフィーカラムの保護液（０．０５％ＮａＮ３）：０．５ｇのＮａＮ３を取り、１０００ｍｌの超純水に溶解させ、Φ０．２２μｍろ過膜を使用して濾過する。
【００７２】
ｉｉｉ．超純水：Φ０．２２μｍろ過膜を使用して濾過する。
２）サンプルの製造
各サンプル（ＫＨ０２、ＫＨ０５）の濃度がいずれも１ｍｇ／ｍｌであるため、各サンプルを取って直接に加える。
【００７３】
３）クロマトグラフ分析の条件
移動相は、ＰＢＳ移動相である。
クロマトグラフィーカラムは、ＴＳＫ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ（５μｍ、  ７．８＊３００ｍｍ）である。
【００７４】
カラム温度が２５℃であり、流速が０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長が２８０ｎｍ、サンプル量が５０μｌである。
１．３  実験結果
【００７５】
【表１１】
2017505118.tif 000012
【００７６】
表１１から分かるように、ＫＨ０５が高温で第５日目でその純度は既に５４％程度まで降下し、１０日目にはサンプル純度は僅か２５％であり、ＫＨ０２が高温で５日目の降下は顕著でなく、高温１０日目においても、そのサンプルの純度は未だ６５％以上に達する。
【図１】
2017505118.tif 000013
【図２】
2017505118.tif 000014
【図３】
2017505118.tif 000015
【図４】
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【配列表】
2017505118000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月30日(2016.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
別の一態様によれば、本発明は前記融合タンパク質をコードするヌクレオチドを提供し、前記ヌクレオチドは、
融合タンパク質ＫＨ０２をコードし、ヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示されるｋｈ０２、
融合タンパク質ＫＨ０３をコードし、ヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示されるｋｈ０３、又は
融合タンパク質ＫＨ０４をコードし、ヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で示されるｋｈ０４であることが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
別の一態様によれば、本発明は、上記融合タンパク質を含む、血管の新生又は成長による疾患を治療する医薬品を提供し、前記血管の新生又は成長による疾患は、腫瘍又は眼部の血管新生による疾患であることが好ましく、前記眼部の血管新生による疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、脈絡網膜症などであることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
別の一態様によれば、本発明は、人間以外の生物の血管の新生又は成長による疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、必要とする患者に、本発明の融合タンパク質又は医薬組成物を投与することを含み、前記疾患は、腫瘍又は眼部の血管新生による疾患であることが好ましく、前記眼部の血管新生による疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、脈絡網膜症などであることが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
実施例１：融合タンパク質の製造
材料又は試薬
ＰＣＲキット（５×緩衝液、ｄＮＴＰ及びＰｈｕｓｉｏｎ酵素を含む）：Ｍ０５３０Ｌ、ＮＥＢ社製
アガロースゲル電気泳動：ＩＱ３００、ＧＥ社製
緩衝液４（ｌｏｔ：０１０１２０１）：ＮＥＢ社製
ＡｖｒＩＩ：Ｒ０１７４Ｌ、ＮＥＢ社製
ＢｓｔＺ１７Ｉ：Ｒ０５９４Ｌ、ＮＥＢ社製
ＰＣＲ生成物精製キット：ＱＩＡＧＥＮ社製、ＣＡＴ：２８１０６
１０×Ｔ４緩衝液：Ｂ０２０２Ｓ、ＮＥＢ社製
Ｔ４ＤＮＡ結合酵素：Ｍ０２０２Ｌ、ＮＥＢ社製
Ｔｏｐ１０大腸菌：ＣＢ１０４、ＴＩＡＮＧＥＮ社製
２ＹＴ（Ｋａｎ）プレート培地：上海鋭聰実験室設備有限会社製
ＦｒｅｅｄｏｍＴＭＣＨＯ‐ＳＴＭＫｉｔキット：Ａ１３６９６‐０１、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製
Ｃｌｏｎｅ  Ｐｉｘ  ＦＬ：Ｇｅｎｅｔｉｘ社製
ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａアガロースアフィニティークロマトグラフカラム：ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａ  ＨＰ、５×１ｍｌ、ＧＥ社製
ＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４）：ＳＤ１１７‐５００ｍｌ、上海生物工程有限会社製
ＦｏｒｔｅＢｉｏバイオ分子間相互作用装置：Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅ、Ｐａｌｌ社製
タンパク質の熱的安定性解析計：Ｏｐｔｉｍ２、Ａｖａｃｔａ社製、
ＶＥＧＦ：Ｒ＆Ｄ社製
ＮＨＳ‐ＬＣＬＣ‐Ｂｉｏｔｉｎ：Ｔｈｅｒｍｏ社製
１、融合タンパク質コード配列を含むプラスミドの構築
１．１  遺伝子とプライマーの合成
北京ジーンウィズ会社（北京金唯智公司）によって合成断片１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）と２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）及びプライマーＰ１〜Ｐ１０（配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜３２で示される）を合成し、合成断片１と２をプラスミドベクターｐＵＣ１９（北京ジーンウィズ会社）に組み換える。合成断片１はヒトＶＥＧＦ受容体断片をコードするヌクレオチド配列とシグナルペプチド配列を含み、合成断片２はヒトＩｇＧ１  ＦＣのコード配列を含む。合成断片１と２は各融合タンパク質を構築するテンプレートとして、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲ方法によって本発明の融合タンパク質のコード配列を構築する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
１．４  組み換えプラスミドの結合形質転換
Ｔ４ＤＮＡ結合酵素の作用下で、同じく酵素消化された後に回収されたｐＣＨＯ１．０断片（ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉ酵素消化大断片であって、約１３ｋｂである）をｋｈ０１‐１、ｋｈ０２‐１、ｋｈ０３‐１、ｋｈ０４‐１（ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉ酵素消化）断片に結合させる。結合反応系は以下のとおりである。１．５ｍｌ  ＥＰ管にそれぞれｐＣＨＯ１．０断片（ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉ）を２μｌ、ｋｈ０１‐１、ｋｈ０２‐１、ｋｈ０３‐１、ｋｈ０４‐１（ＡｖｒＩＩとＢｓｔＺ１７Ｉ酵素消化）断片を６μｌ、１０×Ｔ４緩衝液（Ｂ０２０２Ｓ、ＮＥＢ）を１μｌ、Ｔ４  ＤＮＡ結合酵素（Ｍ０２０２Ｌ、ＮＥＢ）を１μｌ投入し、均一に混合した後に室温（２０℃程度）で４ｈ以上反応させ、結合生成物をＴｏｐ１０大腸菌（ＣＢ１０４、ＴＩＡＮＧＥＮ）のコンピテント細胞に形質転換させ、２ＹＴ（Ｋａｎ）プレート培地（上海鋭聰実験室設備有限会社製品）に塗布した後に、３７℃で一晩静置させ、プレートにそれぞれ番号ｋｈ０１、ｋｈ０２、ｋｈ０３、ｋｈ０４を付ける。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＶＥＧＦ受容体断片とヒト免疫グロブリンＦｃ断片とからなり、前記ＶＥＧＦ受容体断片のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示される、ことを特徴とする血管の新生又は成長を抑制する融合タンパク質。
【請求項２】
前記ヒト免疫グロブリンＦｃ断片は、ＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、ＩｇＧ３  Ｆｃ及びＩｇＧ４  Ｆｃ断片からなる群から選択される少なくとも１種であり、ＩｇＧ１  Ｆｃのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示され、ＩｇＧ２  Ｆｃのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示され、ＩｇＧ３  Ｆｃのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で示され、ＩｇＧ４  Ｆｃのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で示されることが好ましい、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合タンパク質は、
アミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示されるＫＨ０２、
アミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で示されるＫＨ０３、又は、
アミノ酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で示されるＫＨ０４である
ことを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ヌクレオチドであって、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質をコードし、前記ヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で示される、ことを特徴とするヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質を発現する発現ベクター又は宿主細胞であって、請求項４に記載のヌクレオチド配列を含み、前記発現ベクターは真核細胞発現ベクター又はウイルス発現ベクターであることが好ましく、さらに、前記真核細胞発現ベクターは哺乳動物細胞発現ベクターであり、前記ウイルス発現ベクターはアデノ随伴ウイルス又はアデノウイルスベクターであることが好ましく、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞又はその亜株、又は２９３細胞又はその亜株であることが好ましい、ことを特徴とする発現ベクター又は宿主細胞。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質を製造する方法であって、請求項５に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクションし、融合タンパク質の表現を行うことを含む、ことを特徴とする方法。
【請求項７】
医薬組成物であって、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質と、薬学的に許容されるベクター又は賦形剤と、を含み、前記医薬組成物の製剤の形態は、注射剤、注射用凍結乾燥粉末又は眼用ゲルであることが好ましい、ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、血管の新生又は成長による疾患を治療する医薬品であって、前記血管の新生又は成長による疾患は、腫瘍又は眼部の血管新生による疾患であることが好ましく、さらに、前記眼部の血管新生による疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症又は脈絡網膜症であることが好ましい、ことを特徴とする医薬品。
【請求項９】
人間以外の生物の血管の新生又は成長による疾患を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質又は請求項７に記載の医薬組成物を、必要とする患者に投与することを含み、前記血管新生又は成長による疾患は、腫瘍又は眼部の血管新生による疾患であることが好ましく、さらに、前記眼部の血管新生による疾患は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症又は脈絡網膜症であることが好ましい、ことを特徴とする方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月13日(2016.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2017505118000001.app
【国際調査報告】
2017505118.tif 000049
2017505118.tif 000050
2017505118.tif 000051
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2017505118.tif 000053
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