(57)【要約】  本発明は、骨髄腫を有する患者を同定するステップと、患者に相乗的な有効量の欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３及びプロテアソーム阻害剤を投与するステップとを含む、骨髄腫を治療する方法を含む。
2017507128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、がんを治療する方法。
がんを有する患者を同定するステップ；及び
前記患者に有効量の欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３及びプロテアソーム阻害剤を投与するステップ；
【請求項２】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３が静脈内又は腹腔内経路で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
がんが薬剤耐性の骨髄腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
がんが多剤耐性の骨髄腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
がんが、進行した難治性骨髄腫がんの骨髄腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３の量が、心臓又は腎臓毒性を低減するのに十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３が、配列番号３を有する核酸ベクターとして提供され、配列番号４として発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３が、配列番号４を有するポリペプチドとして提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３が、細胞に侵入すると前記欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３を発現する発現ベクター中の核酸として提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３と、プロテアソーム阻害剤との組合せが相乗的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３と、プロテアソーム阻害剤との組合せが、骨破壊の阻害又は骨形成の増加の少なくとも１つを引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガレート、サリノスポラミドＡ、エポキソミシン、ラクタシスチン、ＭＧ１３２、ＯＮＸ０９１２、ＣＥＰ−１８７７０、及びＭＬＮ９７０８から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
プロテアソーム阻害剤がカルフィルゾミブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
がんが、血液がん、固形腫瘍、又は肉腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
がんが、乳がん、大腸がん、結腸直腸癌、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、胆嚢癌、胃癌、食道がん、消化管間質性腫瘍、膵がん、胚細胞性腫瘍、肥満細胞腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、中皮腫、肥満細胞腫、精巣がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、肉腫、骨肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、基底細胞癌、皮膚がん、骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ガレクチン−３が、Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
以下のステップを含む、がんを治療する方法。
がんを有する患者を同定するステップ；及び
前記患者に有効量の欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３及びプロテアソーム阻害剤を、プロテアソーム阻害剤に関連する心臓又は腎臓毒性を生じることなく投与するステップ；
【請求項１８】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３が、静脈内又は腹腔内経路で投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
がんが薬剤耐性の骨髄腫である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
がんが多剤耐性の骨髄腫である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３が、配列番号３を有する核酸ベクターとして提供され、配列番号４として発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３が、配列番号４を有するポリペプチドとして提供される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３が、細胞に侵入する際に前記欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３を発現する発現ベクター中の核酸として提供される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３と、カルフィルゾミブとの組合せが相乗的である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３と、カルフィルゾミブとの組合せが、骨破壊の阻害又は骨形成の増加の少なくとも１つを引き起こす、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガレート、サリノスポラミドＡ、エポキソミシン、ラクタシスチン、ＭＧ１３２、ＯＮＸ０９１２、ＣＥＰ−１８７７０、及びＭＬＮ９７０８から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
プロテアソーム阻害剤がカルフィルゾミブである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
がんが、血液がん、固形腫瘍、又は肉腫である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
ガレクチン−３が、Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
がんが、乳がん、大腸がん、結腸直腸癌、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、胆嚢癌、胃癌、食道がん、消化管間質性腫瘍、膵がん、胚細胞性腫瘍、肥満細胞腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、中皮腫、肥満細胞腫、精巣がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、肉腫、骨肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、基底細胞癌、皮膚がん、骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
以下のステップを含む、骨髄腫の治療に有用であると考えられる候補薬剤を評価する臨床試験を実施する方法。
ａ）一組の患者由来の骨髄腫を有する疑いがある組織から測定するステップ；
ｂ）前記患者の第１のサブセットに候補薬剤を、前記患者の第２のサブセットにプラセボを、プロテアソーム阻害剤に関連する心臓又は腎臓毒性を生じることなく投与するステップであって、候補物質が欠損型又はドミナントネガティブ型ガレクチン−３及びプロテアソーム阻害剤の少なくとも１つである、ステップ；
ｃ）前記候補薬剤又は前記プラセボの投与後にステップａ）を繰り返すステップ；及び
ｄ）患者の前記第２のサブセットで生じたいかなる低減と比較しても統計的に有意である、骨髄腫細胞の数又は増殖の少なくとも１つを前記候補薬剤が低減するかどうかを決定するステップであって、統計的に有意な低減が、前記候補薬剤がプロテアソーム阻害剤に関連する心臓又は腎臓毒性を生じることなく前記骨髄腫を治療するのに有用であることを示す、ステップ；
【請求項３２】
Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤を含むタンパク質。
【請求項３３】
Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項３２に記載のタンパク質。
【請求項３４】
Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤をコードする核酸。
【請求項３５】
Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３６】
Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤を含む宿主細胞。
【請求項３７】
Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤を発現する、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤を宿主細胞で発現させるステップを含む、タンパク質を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に骨髄腫治療の分野、より詳細には骨髄腫及び固形腫瘍療法におけるプロテアソーム阻害剤と併せたガレクチン−３Ｍの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、その背景は骨髄腫と関連して記載される。
【０００３】
ガレクチンは、β−ガラクトース含有糖複合体に結合するＳ型レクチンである。１９７５年に動物細胞において最初のガレクチンが発見されて以来、１５種の哺乳類ガレクチンが単離されている。それらのガレクチンは、細胞接着、増殖の調節、アポトーシス、腫瘍発生及び進行など、様々な生物学的プロセスを調節する。がんにおけるガレクチンの複数の役割を報告する証拠が蓄積しつつある。その中でも、ガレクチン−３は、接着、増殖、及び転移など、腫瘍進行の多くの特性に関与しているため魅力的な標的である。
【０００４】
Jarvis, et al.に発行された米国特許第６，７７０，６２２号明細書は、がんの治療において使用するためのＮ末端欠損ガレクチン−３を対象とする。手短に言えば、この特許は薬学的に許容される担体において有効量のＮ末端欠損ガレクチン−３を有する組成物を教示する。また、本発明は、そのような治療を必要とする患者に、薬学的に許容される担体において有効量のＮ末端欠損ガレクチン−３を投与することによる、がんを治療する方法も提供する。マウスモデル系における乳がん細胞の治療を示すデータを提供する。
【０００５】
本発明者らによる、国際公開第２０１２１３５５２８Ａ２号は、ヒトがんのための組合せ療法におけるガレクチン−３Ｃの使用を対象とし、ガレクチン−３Ｃはプロテアソーム阻害剤と組み合わせて使用され、その組合せはその個々の成分の予期される相加的な効果よりも大きな薬理活性を有する。本発明の他の実施形態は、プロテアソーム阻害剤に対して生じる耐性を低減若しくは克服する、又はより低い用量での治療有効性を増大させることによりプロテアソーム阻害剤による有害な副作用を低減することができる、ガレクチン−３Ｃとプロテアソーム阻害剤の新規の相乗的な組成物を提供する。
【０００６】
他の研究者らは、化学療法薬ボルテゾミブと併せたガレクチン−３Ｃの使用を含む、多発性骨髄腫を治療するためにガレクチン−３Ｃを使用したことを示す結果を発表している（Mirandola, L., Y. Yu, K. Chui, M.R. Jenkins, E. Cobos, C.M. John, and M. Chiriva-Internati. 2011. Galectin- 3C inhibits tumor growth and increases the anticancer activity of bortezomib in a murine model of human multiple myeloma. PLoS One 6:e21811）。
【０００７】
多発性骨髄腫（ＭＭ，Multiple myeloma）は、腎不全及び骨格破壊を含む末端器官損傷をもたらす腫瘍性形質細胞障害である。ＭＭの治療は、複雑であり、標準的な細胞毒性剤、自家及び同種骨髄幹細胞移植、免疫調節剤、並びにプロテアソーム阻害剤の使用を含む、様々な手法を利用する。カルフィルゾミブは、著しい抗骨髄腫及び抗破骨細胞形成特性を有する新しいプロテアソーム阻害剤であり、最近ＭＭ患者の治療に承認されている。残念なことに、カルフィルゾミブは、腎不全及び心不全を含む重大な毒性とも関係している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，７７０，６２２号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１２１３５５２８Ａ２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Mirandola, L., Y. Yu, K. Chui, M.R. Jenkins, E. Cobos, C.M. John, and M. Chiriva-Internati. 2011. Galectin- 3C inhibits tumor growth and increases the anticancer activity of bortezomib in a murine model of human multiple myeloma. PLoS One 6:e21811
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、ガレクチン−３阻害が異種移植片インビボモデルにおいて有意な抗骨髄腫効果をもたらすことを以前に示している。本発明は、インビトロでのＭＭ細胞増殖及び遊走を妨げるだけでなく、この疾患のインビボ同系モデルにおけるＭＭ細胞の増殖遅延とも関係する新しいガレクチン−３阻害剤、Ｇａｌ３Ｍを使用する。Ｇａｌ３Ｍとカルフィルゾミブの組合せは、相加的な抗骨髄腫効果を有するだけでなく、カルフィルゾミブ誘導性損傷に対する心腎の保護とも関係することが見出された。さらに、この組合せの使用は、インビボモデルにおいて最終的な骨破壊の阻害及び骨形成の増加をもたらした。したがって、ＭＭ及びその他の固形腫瘍の治療においてこの新規の組合せを使用した場合、多様で有益な効果が見出された。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、がんを有する患者を同定するステップと、有効量の欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３（truncated, dominant negative form of Galectin-3）及びプロテアソーム阻害剤を患者に投与するステップとを含む、がんを治療する方法を含む。一態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３は、静脈内又は腹腔内経路で投与される。他の態様では、がんは薬剤耐性の骨髄腫である。他の態様では、がんは多剤耐性の骨髄腫である。他の態様では、がんは進行した難治性骨髄腫がんの骨髄腫である。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３の量は、心臓又は腎臓毒性を低減するのに十分である。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３は、配列番号３を有する核酸ベクターとして提供され、配列番号４として発現する。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３は配列番号４を有するポリペプチドとして提供される。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３は、細胞に侵入する際に欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３を発現する発現ベクター中の核酸として提供される。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３とプロテアソーム阻害剤の組合せは相乗的である。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３とプロテアソーム阻害剤の組合せは、骨破壊の阻害又は骨形成の増加の少なくとも１つを引き起こす。他の態様では、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガレート、サリノスポラミドＡ、エポキソミシン、ラクタシスチン、ＭＧ１３２、ＯＮＸ０９１２、ＣＥＰ−１８７７０、及びＭＬＮ９７０８から選択される。他の態様では、プロテアソーム阻害剤はカルフィルゾミブである。他の態様では、がんは、血液がん、固形腫瘍、又は肉腫である。他の態様では、がんは、乳がん、大腸がん、結腸直腸癌、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、胆嚢癌、胃癌、食道がん、消化管間質性腫瘍、膵がん、胚細胞性腫瘍、肥満細胞腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、中皮腫、肥満細胞腫、精巣がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、肉腫、骨肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、基底細胞癌、皮膚がん、骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ，acute myelocytic leukemia）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ，acute lymphocytic leukemia）、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ，chronic lymphocytic leukemia）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ，chronic myelogenous leukemia）から選択される。他の態様では、ガレクチン−３はＰ１１３、Ｌ１１４及びＹ１１８の変異を有する。
【００１２】
本発明の他の実施形態は、がんを有する患者を同定するステップと、患者に有効量の欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３及びプロテアソーム阻害剤を、プロテアソーム阻害剤に関連する心臓又は腎臓毒性を生じることなく投与するステップとを含む、がんを治療する方法を含む。一態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３は、静脈内又は腹腔内経路で投与される。他の態様では、がんは薬剤耐性の骨髄腫である。他の態様では、がんは多剤耐性の骨髄腫である。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３は、配列番号３を有する核酸ベクターとして提供され、配列番号４として発現する。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３は配列番号４を有するポリペプチドとして提供される。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３は、細胞に侵入する際に欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３を発現する発現ベクター中の核酸として提供される。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３とカルフィルゾミブの組合せは相乗的である。他の態様では、欠損ドミナントネガティブ型ガレクチン−３とカルフィルゾミブの組合せは、骨破壊の阻害又は骨形成の増加の少なくとも１つを引き起こす。他の態様では、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガレート、サリノスポラミドＡ、エポキソミシン、ラクタシスチン、ＭＧ１３２、ＯＮＸ０９１２、ＣＥＰ−１８７７０、及びＭＬＮ９７０８から選択される。他の態様では、プロテアソーム阻害剤はカルフィルゾミブである。他の態様では、がんは、血液がん、固形腫瘍、又は肉腫である。他の態様では、ガレクチン−３はＰ１１３、Ｌ１１４及びＹ１１８の変異を有する。他の態様では、がんは、乳がん、大腸がん、結腸直腸癌、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肝臓がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、胆嚢癌、胃癌、食道がん、消化管間質性腫瘍、膵がん、胚細胞性腫瘍、肥満細胞腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、中皮腫、肥満細胞腫、精巣がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、肉腫、骨肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、基底細胞癌、皮膚がん、骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から選択される。
【００１３】
本発明のさらに他の実施形態は、骨髄腫の治療に有用であると考えられる候補薬剤を評価する臨床試験を実施する方法であって、（ａ）一組の患者由来の骨髄腫を有する疑いがある組織から測定するステップと；（ｂ）患者の第１のサブセットに候補薬剤を、患者の第２のサブセットにプラセボを、プロテアソーム阻害剤に関連する心臓又は腎臓毒性を生じることなく投与するステップであって、候補物質が欠損型又はドミナントネガティブ型ガレクチン−３及びプロテアソーム阻害剤の少なくとも１つである、ステップと；（ｃ）候補薬剤又はプラセボの投与後にステップａ）を繰り返すステップと；（ｄ）患者の第２のサブセットで生じるいかなる低減と比較しても統計的に有意である、骨髄腫細胞の数又は増殖の少なくとも１つを候補薬剤が低減するかどうかを決定するステップであって、統計的に有意な低減が、候補薬剤がプロテアソーム阻害剤に関連する心臓又は腎臓毒性を生じることなく骨髄腫を治療するのに有用であることを示す、ステップとを含む方法を含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤を含むタンパク質を含む。一態様では、タンパク質は、Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤をコードする核酸を含む。一態様では、核酸は、Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤を含む宿主細胞を含む。一態様では、宿主細胞は、Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤を発現する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、Ｐ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８の変異を有するガレクチン−３と９５％同一である配列を有するガレクチン−３阻害剤を宿主細胞内で発現させるステップを含むタンパク質を作製する方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の特性と利点のより完全な理解のため、ここで添付の図面と共に本発明の詳細な説明を参照する。
【図１Ａ−１Ｃ】５ＴＧＭ１細胞の特徴を示す図である。５ＴＧＭ１細胞は、ＲＮＡ（図１Ａ、ＲＴ−ＰＣＲ）とタンパク質（図１Ｂ、ウェスタンブロット）レベル両方でのガレクチン−３の高い発現を示す。ＣＴＡ  ＳＰ１７発現はＭＭ細胞のマーカーとして試験した。結果は、免疫蛍光法によりさらに確かめた（図１Ｃ）。図は、同様の結果を有する少なくとも３回の実験の代表である。
【図２Ａ−２Ｂ】カルフィルゾミブとガレクチン３Ｍの組合せが５ＴＧＭ１細胞においてこれら２つの薬剤の効果を増強することを示す図である。細胞をＣａｒｆ（１０ｎＭ）、Ｇａｌ３Ｍ（１０μｇ／ｍｌ）、及びＣａｒｆ＋Ｇａｌ３Ｍで処理した。結果は、５ＴＧＭ１の増殖（ａ）、走化性（ｂ）、及び侵入（ｃ）能力がＣａｒｆとＧａｌ３Ｍの存在下で有意に阻害されたことを示している。さらに、これら２つの薬剤の組合せは、これらのがん関連プロセス全てにおいて、相乗効果を有する。実験は３重に行い、３回繰り返した。エラーバーは±ＳＤを表す。統計的分析は、一元配置分散分析及びテューキーの事後検定（Turkey post-test）で実施した（＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図３Ａ−３Ｂ】カルフィルゾミブとＧａｌ３Ｍの組合せが、インビボでの腫瘍増殖においてこれらの薬剤の効果を増強することを示す図である。図３Ａは、腫瘍細胞生着及び増殖の指標として、ＩｇＧ２の血清レベルにおける治療の効果を示す。血清中のＳＰ１７レベルは、腫瘍増殖のマーカーとして使用された（図３Ｂ）。統計的分析は、両側ｔ検定、二元配置分散分析、及びボンフェローニの事後検定で実施した（＊＝ｐ＜０．５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図４Ａ−４Ｂ】カルフィルゾミブ、Ｇａｌ３Ｍ、及びＣａｒｆ＋Ｇａｌ３Ｍの腎臓毒性における効果を示す図である。図４Ａは、形態学的評価のため、５ＴＧＭ１マウス由来の腎臓の切片において実施したエオシン／ヘマトキシリン染色を示す。全ての試料を、アポトーシスの指標として活性型カスパーゼ３についても染色した（図４Ｂ）。代表的な写真は、４０倍の倍率で撮った。カルフィルゾミブは、最少と最大用量の両方で腎臓毒性があることを示したが、一方でＧａｌ３Ｍは、非毒性であるだけでなく、カルフィルゾミブでの治療による副作用から両器官において保護効果も有する。
【図５Ａ−５Ｂ】カルフィルゾミブ、Ｇａｌ３Ｍ、及びＣａｒｆ＋Ｇａｌ３Ｍの心臓毒性における効果を示す図である。図５Ａは、形態学的評価のため、５ＴＧＭ１マウス由来の腎臓の切片において実施したエオシン／ヘマトキシリン染色を示す。全ての試料を、アポトーシスの指標として活性型カスパーゼ３についても染色した（図５Ｂ）。代表的な写真は、４０倍の倍率で撮った。カルフィルゾミブは、最少と最大用量の両方で腎臓毒性があることを示したが、一方でＧａｌ３Ｍは、非毒性であるだけでなく、カルフィルゾミブでの治療による副作用から両器官において保護効果も有する。
【図６】インビトロでの５ＴＧＭ１による破骨細胞形成における、Ｃａｒｆ、Ｇａｌ３Ｍ、及びそれらの組合せの効果を示す図である。Ｒａｗ２６４．７細胞を５ＴＧＭ１細胞と共培養し、５日間処理した（図６  上のパネル）。ＴＲＡＰ染色及び多核細胞の数（図６  下のパネル）。ＣａｒｆとＧａｌ３Ｍの組合せは、破骨細胞発生におけるＧａｌ３Ｍの副作用を回復することができる。エラーバーは、３回の独立した実験から算出された標準偏差を表す。統計的分析は、一元配置分散分析及びテューキーの事後検定で実施した（＊＝ｐ＜０．５）。
【図７】ＭＭに関係する骨格破壊における異なる治療の効果を示す図である。図７の左上のパネルは、Ｘ線画像から算出した骨密度ＢＭＤを示す。ＲＯＩ１は、大腿骨の近位端付近の小柱領域を表す。ＲＯＩ２は、大腿骨の遠位端付近の小柱領域を表す。ＲＯＩ３は、脛骨の近位端付近の小柱領域を表す。カルフィルゾミブは、骨吸収におけるガレクチン３Ｍの副作用を回復することができ、実際、Ｃａｒｆとガレクチン３Ｍの組合せは５ＴＧＭ１マウスの骨格吸収の低減を引き起こす。統計的分析は、二元配置分散分析及びボンフェローニの事後検定で実施した（＊＝ｐ＜０．５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。下のパネルは、オステオカルシン（Osteoclacin）（Ｂ）及びカテプシンＫ（Ｃ）について脱灰骨におけるＩＨＣ分析によりさらに検証した結果を示す。図は少なくとも５つの切片の代表である。
【図８】Ｇａｌ３Ｍ及びカルフィルゾミブを用いたマウスの肺がん研究についてのフローチャートである。
【図９】処置なし及び１１２又は２２４μｇのカルフィルゾミブでの腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【図１０】処置なし並びに１１２又は２２４μｇのカルフィルゾミブ及びＸＭでの腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【図１１】処置なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独（１１２又は２２４μｇ）、及びカルフィルゾミブ１１２又は２２４μｇ＋ＸＭでの固形腫瘍の処置を示すグラフである。
【図１２】処置なし及びＸＭを用いた処置での腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【図１３】治療なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独、及びカルフィルゾミブ＋ＸＭの毒性を比較するグラフである。
【図１４】処置なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独、及びカルフィルゾミブ＋ＸＭでの固形腫瘍における細胞のアポトーシスマーカーカスパーゼ３のウェスタンブロットを示す図である。
【図１５】左のパネルでは、処理なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独、及びカルフィルゾミブ＋ＸＭでの生存率（左のパネル）、右のパネルでは、処理なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独、及びカルフィルゾミブ＋ＸＭの毒性を示す２つのグラフである。
【図１６】５ｇｔｍマウスにおけるＳｐ１７の逆転写酵素ＰＣＲを示す図である。レーン１  ５ｇｔｍ１細胞、レーン２  ＲＴなし、レーン３  鋳型なし、レーン５  骨、及びレーン５  脾臓。
【図１７】腫瘍及び肺組織におけるＡＫＡＰ−４発現に関するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１８】提供されるＸＭの量に応じて、列挙した細胞株の発現を示す５つのグラフである。
【図１９】提供されるＸＭに応じて、様々な細胞株のＡＴＰ含有％の用量反応曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用は以下に詳細に述べるが、本発明は、多種多様な特定の文脈において、具体化できる多くの適応可能な発明の概念を提供することを理解すべきである。本明細書において述べる特定の実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法の単なる例示であり、本発明の範囲を定めない。
【００２０】
本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書に定義した用語は、本発明に関する分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」などの用語は、単数の実体のみを指すことを意図せず、特定の例を例示のために使用することができる一般的なクラスを含む。本明細書における用語は、本発明の特定の実施形態を記載するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説した以外に本発明を定めない。
【００２１】
用語、化合物「の投与」又は「を投与すること」は、これらに限定されるものではないが、錠剤、カプセル、シロップ、懸濁液などの経口投与剤形、ＩＶ、ＩＭ、又はＩＰなどの注射用投与剤形、クリーム、ゼリー、粉末、又はこう薬などの経皮的な投与剤形、頬側の投与剤形、吸入粉末、スプレー、懸濁液など、及び肛門坐剤を含む、治療上有用な形態及び治療上有用な量で、個体の体に導入することができる形態で、治療を必要とする個体に本発明の化合物を提供することを意味すると理解されるべきである。
【００２２】
用語「有効量」又は「治療有効量」は、研究者、獣医、医師、又はその他の臨床医によって求められている組織、系、動物、又はヒトの生物学的又は医学的応答を引き出す対象化合物の量を意味する。本明細書で使用されるように、用語「治療」は、特に疾患又は障害の症状を明示する患者における、言及した状態の治療を指す。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「治療」又は「治療する」は、本発明の化合物のいずれかの投与を意味し、（１）疾患の病理又は総体症状を経験している若しくは表している動物における疾患を阻害すること（すなわち、病理及び／又は総体症状のさらなる発生を抑えること）、又は（２）疾患の病理又は総体症状を経験している若しくは表している動物における疾患を改善すること（すなわち、病理及び／又は総体症状を回復させること）を含む。用語「制御する」は、制御される状態の重症度を予防する、治療する、根絶する、改善する、又は別の方法で低減することを含む。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される」成分は、過度の有害な副作用（毒性、刺激、及びアレルギー反応など）なく、ヒト及び／又は動物で使用するのに好適なものであり、合理的な利点／リスク比に見合っている。
【００２５】
多発性骨髄腫は、骨髄（ＢＭ，bone marrow）における腫瘍性の形質細胞（ＰＣ，plasma cell）のクローン増殖によって特徴づけられる、悪性の形質細胞障害である。ＭＭは、全てのがんの１％、全ての悪性血液疾患の約１０％を占める（Rajkumar, S.V. 2012. Multiple myeloma: 2012 update on diagnosis, risk-stratification, and management.  Am J Hematol 87:78-88）。その治療における最近の進歩にもかかわらず、骨髄腫は不治なままであり、生存期間中央値は診断後５年である（Zeng, 2013）。
【００２６】
破骨細胞形成及び骨芽細胞形成は、疾患の特徴である腫瘍病巣に近接した領域において、破骨細胞の活性化の増加及び骨形成の抑制を伴う、ＭＭにおいて明らかに崩壊した精密に編成されたプロセスである。ＭＭ細胞とＢＭ微小環境の間のこれらの相互作用は、骨格破壊、ＭＭ細胞増殖、及び薬剤耐性の発生をもたらす「悪循環」を確立する（Colombo, M., L. Mirandola, N. Platonova, L. Apicella, A. Basile, A.J. Figueroa, E. Cobos, M. Chiriva- Internati, and R. Chiaramonte. 2013. Notch-directed microenvironment reprogramming in myeloma: a single path to multiple outcomes. Leukemia 27:1009-1018）。
【００２７】
カルフィルゾミブ（キプロリス（商標）、Onyx Pharmaceuticals社, South San Francisco, CA）は、再発難治性多発性骨髄腫（ＲＲＭＭ，relapsed or refractory multiple myeloma）の単剤治療として、米国食品医薬品局（ＦＤＡ，Food and Drug Administration）によって最近承認された、新しい選択的及び不可逆的なプロテアソーム阻害剤である。カルフィルゾミブは、治療した患者のおよそ１５％で療法の中止をもたらす潜在的に重大な腎臓及び心臓の副作用と関係している（Redic, K. 2013. Carfilzomib: a novel agent for multiple myeloma. J Pharm Pharmacol 65:1095-1106.   Saini, N., and A. Mahindra. 2013. Therapeutic strategies for the treatment of multiple myeloma. Discov Med 15:251-258）。実際、カルフィルゾミブで処置した患者において心不全が報告されており、これらの事象のいくつかは致死的転帰をもたらす。カルフィルゾミブ臨床試験に関わるＭＭ患者のおよそ６０％が、登録時においてある程度の腎機能障害を示したため、この重要な薬剤を使用する場合、毒性の減少及び器官保護をもたらし得る慎重な患者の選択及び戦略の必要性が明らかである（Redic, K. 2013. Carfilzomib: a novel agent for multiple myeloma. J Pharm Pharmacol 65:1095-1106.   Saini, N., and A. Mahindra. 2013. Therapeutic strategies for the treatment of multiple myeloma. Discov Med 15:251-258）。
【００２８】
本発明者らは、以前に、インビトロ及びインビボにおいてＭＭ増殖を阻害するガレクチン３Ｃ、ガレクチン−３のドミナントネガティブ型阻害剤の能力を実証している（Mirandola, L., Y. Yu, K. Chui, M.R. Jenkins, E. Cobos, C.M. John, and M. Chiriva-Internati. 2011. Galectin- 3C inhibits tumor growth and increases the anticancer activity of bortezomib in a murine model of human multiple myeloma. PLoS One 6:e21811）。ガレクチン−３Ｃ単独及びボルテゾミブとの組合せは、ヒトＭＭの異種移植片マウスモデルにおけるＭＭ増殖の９０％超の増殖阻害をもたらした。重要なことに、ガレクチン−３は抗破骨細胞形成効果を有すると考えられ（Li, Y.J., A. Kukita, J. Teramachi, K. Nagata, Z. Wu, A. Akamine, and T. Kukita. 2009. A possible suppressive role of galectin-3 in upregulated osteoclastogenesis accompanying adjuvant-induced arthritis in rats. Lab Invest 89:26-37）、ヒトにおける心機能障害（Ahmad, T., and G.M. Felker. 2012. Galectin-3 in heart failure: more answers or more questions? J Am Heart Assoc 1:e004374）と腎線維症（Kolatsi-Joannou, M., K.L. Price, P.J. Winyard, and D.A. Long. 2011. Modified citrus pectin reduces galectin-3 expression and disease severity in experimental acute kidney injury. PLoS One 6:e18683）の両方の媒体である。本発明者らは、ＭＭにおいてカルフィルゾミブとガレクチン−３阻害剤を組み合わせて、それらの併せた抗骨髄腫効果を評価した。
【００２９】
本発明は、ＭＭのマウス同系モデル５ＴＧＭ１において、単独及びカルフィルゾミブとの組合せで、新しくより効果的なガレクチン−３のドミナント阻害剤、ガレクチン−３Ｍ（Ｇａｌ３Ｍ）の効果を示す。
【００３０】
ガレクチン−３は、染色体１４、遺伝子座ｑ２１−ｑ２２に位置し、ｃＤＮＡ配列：
GAGTATTTGA GGCTCGGAGC CACCGCCCCG CCGGCGCCCG CAGCACCTCC TCGCCAGCAG
CCGTCCGGAG CCAGCCAACG AGCGGAAAAT GGCAGACAAT TTTTCGCTCC ATGATGCGTT
ATCTGGGTCT GGAAACCCAA ACCCTCAAGG ATGGCCTGGC GCATGGGGGA ACCAGCCTGC
TGGGGCAGGG GGCTACCCAG GGGCTTCCTA TCCTGGGGCC TACCCCGGGC AGGCACCCCC
AGGGGCTTAT CCTGGACAGG CACCTCCAGG CGCCTACCCT GGAGCACCTG GAGCTTATCC
CGGAGCACCT GCACCTGGAG TCTACCCAGG GCCACCCAGC GGCCCTGGGG CCTACCCATC
TTCTGGACAG CCAAGTGCCA CCGGAGCCTA CCCTGCCACT GGCCCCTATG GCGCCCCTGC
TGGGCCACTG ATTGTGCCTT ATAACCTGCC TTTGCCTGGG GGAGTGGTGC CTCGCATGCT
GATAACAATT CTGGGCACGG TGAAGCCCAA TGCAAACAGA ATTGCTTTAG ATTTCCAAAG
AGGGAATGAT GTTGCCTTCC ACTTTAACCC ACGCTTCAAT GAGAACAACA GGAGAGTCAT
TGTTTGCACT TACATGTGTA AAGGTTTCAT GTTCACTGTG AGTGAAAATT TTTACATTCA
TCAATATCCC TCTTGTAAGT CATCTACTTA ATAAATATTA CAGTGAATTA CCTGTCTCAA
TATGTCAAAA AAAAAAAAAA AAAA（配列番号１）
を有する、単一遺伝子ＬＧＡＬＳ３によりコードされる。
【００３１】
ガレクチン−３は、アミノ酸配列：
MADNFSLHDA LSGSGNPNPQ GWPGAWGNQP AGAGGYPGAS YPGAYPGQAP PGAYPGQAPP
GAYPGAPGAY PGAPAPGVYP GPPSGPGAYP SSGQPSATGA YPATGPYGAP AGPLIVPYNL
PLPGGVVPRM LITILGTVKP NANRIALDFQ RGNDVAFHFN PRFNENNRRV IVCNTKLDNN
WGREERQSVF PFESGKPFKI QVLVEPDHFK VAVNDAHLLQ YNHRVKKLNE ISKLGISGDI
DLTSASYTMI（配列番号２）
を有する。
【００３２】
ガレクチン−３Ｃは、ｃＤＮＡ配列：
AGCAGCCGTC CGGAGCCAGC CAACGAGCGG AAAATGGCAG ACAATTTTTC GCTCCATGAT
GCGTTATCTG GGTCTGGAAA CCCAAACCCT CAAGGATGGC CTGGCGCATG GGGGAACCAG 
CCTGCTGGGG CAGGGGGCTA CCCAGGGGCT TCCTATCCTG GGGCCTACCC CGGGCAGGCA 
CCCCCAGGGG CTTATCCTGG ACAGGCACCT CCAGGCGCCT ACCATGGAGC ACCTGGAGCT 
TATCCCGGAG CACCTGCACC TGGAGTCTAC CCAGGGCCAC CCAGCGGCCC TGGGGCCTAC 
CCATCTTCTG GACAGCCAAG TGCCCCCGGA GCCTACCCTG CCACTGGCCC CTATGGCGCC
CCTGCTGGGC CACTGATTGT GCCTTATAAC CTGCCTTTGC CTGGGGGAGT GGTGCCTCGC 
ATGCTCATAA CAATTCTGGG CACGGTGAAG CCCAATGCAA ACAGAATTGC TTTAGATTTC 
CAAAGAGGGA ATGATGTTGC CTTCCACTTT AACCCACGCT TCAATGAGAA CAACAGGAGA 
GTCATTGTTT GCAATACAAA GCTGGATAAT AACTGGGGAA GGGAAGAAAG ACAGTCGGTT 
TTCCCATTTG AAAGTGGGAA ACCATTCAAA ATACAAGTAC TGGTTGAACC TGACCACTTC
AAGGTTGCAG TGAATGATGC TCACTTGTTG CAGTACAATC ATCGGGTTAA AAAACTCAAT 
GAAATCAGCA AACTGGGAAT TTCTGGTGAC ATAGACCTCA CCAGTGCTTC ATATACCATG 
ATATAATCTG AAAGGGGCAG ATTAAAAAAA AAAA（配列番号３）
を有する。
【００３３】
ガレクチン−３Ｃは、アミノ酸配列：
MADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYHGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSAPGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMI（配列番号４）
を有する。
【００３４】
５ＴＧＭ１細胞株におけるＳＰ１７及びガレクチン−３の発現。ＲＴ−ＰＣＲ（図１Ａ）及びウェスタンブロット（図１Ｂ）は、ＳＰ１７（ＭＭ細胞におけるバイオマーカーとして使用したがん精巣抗原）及びガレクチン−３が、５ＴＧＭ１細胞においてｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで発現することを実証する。５ＴＧＭ１細胞による両分子の発現は、免疫蛍光分析（図１Ｃ、左の２パネル）及び共局在（図１Ｃ、右の２パネル）によりさらに確かめた。
【００３５】
Ｇａｌ３Ｍ及びカルフィルゾミブは、５ＴＧＭ１細胞増殖及び遊走を阻害した。生存率及び走化性アッセイの結果は、カルフィルゾミブ＋Ｇａｌ３Ｍでの二重処置が、それぞれの単一化合物の５ＴＧＭ１細胞増殖及び遊走を阻害する能力を増強することを実証した。併用治療は、いずれかの治療単独により引き起こされる２０〜４０％の増殖阻害と比較して、およそ８５％の細胞増殖阻害と関係した（図２Ａ及び２Ｂ）。走化性刺激に応答して遊走する５ＴＧＭ１細胞の能力は、いずれかの薬剤で観察される４０％阻害と比較して、およそ６５％阻害された（図２Ｂ）。
【００３６】
カルフィルゾミブ、Ｇａｌ３Ｍ、及びこれら２つの化合物の組合せの効果は、ＭＭの５ＴＧＭ１同系マウスモデルを用いてインビボで評価した（図３Ａ及び３Ｂ）。マウスに５ＴＧＭ１細胞を注射し、１４日目までにＩｇＧ２ｂレベルが増加し、ＭＭ細胞増殖、生着、及びＢＭホーミングを示した。マウスを１４日目にＣａｒｆ（１０ｎＭ）、Ｇａｌ３Ｍ（１０μｇ／ｍｌ）、又はＣａｒｆ＋Ｇａｌ３Ｍ（同じ投与量）の組合せで処置し、未処置のＭＭ保持マウスと比較して、２１及び２８日目の全ての処置群においてＩｇＧ２ｂレベルの減少が明らかであった（Ｃａｒｆ処置マウスにおいて１４％及び３６％減少、Ｇａｌ３Ｍ処置マウスにおいて１１％及び３２％減少、並びに組合せで処置したマウスでは２４％及び６０％減少）（図３Ａ）。Ｃａｒｆ＋Ｇａｌ３Ｍの組合せは、いずれかの薬剤単独と比較してＩｇＧ２ｂレベルの相加的な阻害効果と関係した（図３Ａ）。Ｃａｒｆ又はＧａｌ３Ｍいずれかでの処置はまた、未処置マウスと比較して、ＳＰ１７レベルの減少をもたらした（図３Ｂ）。２８日目のＳＰ１７血清レベルもまた、Ｃａｒｆを用いないＧａｌ３Ｍと比較してＣａｒｆ＋Ｇａｌ３Ｍの組合せで処置したマウスにおいて低かった（Ｃａｒｆ＋Ｇａｌ３Ｍ処置で４３％減少、Ｃａｒｆで３７％減少、及びＧａｌ３Ｍで２９％減少）。
【００３７】
Ｇａｌ３Ｍは、カルフィルゾミブの副作用から腎臓及び心臓を保護した。Ｇａｌ３Ｍが、腎臓及び心臓におけるカルフィルゾミブの毒作用を阻害できるかどうかを評価するため、我々はヘマトキシリン及びエオシン染色でこれらの組織の形態を評価し（図４Ａ、腎臓及び図５Ａ、心臓）、活性型カスパーゼ３の特異的染色でアポトーシス細胞の存在を評価した（図４Ｂ、腎臓及び図５Ｂ、心臓）。組織学的分析は、Ｇａｌ３Ｍが、調べた器官においてネクローシス又はアポトーシスの増加と関係しないことを示した。一方、カルフィルゾミブ治療は、細胞構造の変化及びカスパーゼ−３活性化と関係した。カルフィルゾミブ−Ｇａｌ３Ｍの組合せでの治療が保護効果をもたらすことが、活性型カスパーゼ−３染色細胞数の減少により証明された。
【００３８】
ＭＭによる破骨細胞形成におけるカルフィルゾミブ及びＧａｌ３Ｍの効果を調べるため、５ＴＧＭ１  ＭＭ細胞株を、５μＭカルフィルゾミブ、１０μＭ  Ｇａｌ３Ｍ、又はその組合せ有り又は無しで、７日間、Ｒａｗ２６４．７細胞と共培養した。５ＴＧＭ１細胞は、ＴＲＡＰ＋／多核Ｒａｗ２６４．７細胞の形成を誘導し（図６）、これはカルフィルゾミブにより阻害され（５５％減少）、Ｇａｌ３Ｍにより増強された（１６％増加）。カルフィルゾミブ−Ｇａｌ３Ｍの組合せ治療は、対照共培養と比較して破骨細胞形成を減少させることができ（９％減少）、カルフィルゾミブがＧａｌ３Ｍの破骨細胞形成促進（pro-osteaoclastogenic）効果を妨げることができることを示している。
【００３９】
カルフィルゾミブとＧａｌ３Ｍの組合せは、インビボでの骨格破壊を阻害する。骨量密度分析は、対照（腫瘍なし）及び５ＴＧＭ１マウスのＸ線画像上で、以前に報告されている通り実施した（Mc Manus MM, 2011）。近位（ＲＯＩ１）及び遠位（ＲＯＩ２）大腿骨端及び脛骨（ＲＯＩ３）の密度を分析した。図７の様々なパネルは、Ｃａｒｆ単独で処置したマウスにおけるＢＭＤの増加（ＲＯＩ１  ２８％増加；ＲＯＩ２  １９％増加；ＲＯＩ３  １２％増加）及びＧａｌ３Ｍで処置したマウスにおける減少（ＲＯＩ１  ３％減少；ＲＯＩ２  ４％減少；ＲＯＩ３  １６％減少）を示す。Ｃａｒｆ／Ｇａｌ３Ｍの組合せでの処置後、腫瘍を有する未処置マウスと比較して、ＢＭＤの有意な増加（ＲＯＩ１  １０％増加；ＲＯＩ２  ２％増加；ＲＯＩ３  ８％増加）が見られた（図７）。これらのデータは、Ｇａｌ３Ｍの破骨細胞形成促進効果を妨げ、骨格破壊から骨を保護するＣａｒｆの能力をさらに確証する。
【００４０】
図７はまた、ＢＭＤ分析を検証するために実施した脱灰骨におけるオステオカルシン（骨芽細胞マーカー、Ｂ）及びカテプシンＫ（破骨細胞マーカー、Ｃ）のＩＨＣ分析を示す。実際、Ｃａｒｆで処置したマウスは、オステオカルシン陽性細胞の増加及びカテプシンＫ陽性細胞の減少を示し、Ｃａｒｆ誘導性の破骨細胞形成の障害及び骨芽細胞活性の増強を確証する。一方、Ｇａｌ３Ｍは、オステオカルシン陽性の減少及びカテプシンＫ陽性細胞の増加を引き起こし、この化合物の破骨細胞形成促進効果を支持する。併用治療は、Ｃａｒｆがこの効果を遮断することができ、カテプシンＫ陽性細胞の減少及びオステオカルシン陽性細胞集団の増加をもたらすことを示す。
【００４１】
ＭＭは全ての悪性血液疾患の１０％を占め（Rajkumar, S.V. 2012. Multiple myeloma: 2012 update on diagnosis, risk-stratification, and management.  Am J Hematol 87:78-88）、その発生率は母集団の加齢によって一定に増加している（Palumbo, A., and F. Gay. 2009. How to treat elderly patients with multiple myeloma: combination of therapy or sequencing. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 566-577）。
【００４２】
過去１０年では、免疫調節薬及びプロテアソーム阻害剤は生存期間中央値を５年に延ばしてきた（Rajkumar, S.V. 2012. Multiple myeloma: 2012 update on diagnosis, risk-stratification, and management.  Am J Hematol 87:78-88）。残念なことに、その有効性にもかかわらず、両薬剤群は深刻な副作用を有する。カルフィルゾミブは、再発難治性ＭＭの単剤治療として最近承認された新しい不可逆的なプロテアソーム阻害剤である。その有効性にもかかわらず、カルフィルゾミブは、治療した患者のおよそ１５％で療法の中止をもたらす重大な腎臓及び心臓の副作用と関係している（Redic, K. 2013. Carfilzomib: a novel agent for multiple myeloma. J Pharm Pharmacol 65:1095-1106.   Saini, N., and A. Mahindra. 2013. Therapeutic strategies for the treatment of multiple myeloma. Discov Med 15:251-258）。実際、カルフィルゾミブで処置した患者において心不全が報告されており、これらの事象のいくつかは致死的転帰をもたらす。カルフィルゾミブ臨床試験に関わるＭＭ患者のおよそ６０％が、登録時においてある程度の腎機能障害を示したため、この重要な薬剤を使用する場合、毒性の低減及び器官保護をもたらし得る慎重な患者の選択及び戦略の必要性が明らかである（Redic, K. 2013. Carfilzomib: a novel agent for multiple myeloma. J Pharm Pharmacol 65:1095-1106.   Saini, N., and A. Mahindra. 2013. Therapeutic strategies for the treatment of multiple myeloma. Discov Med 15:251-258）。
【００４３】
ガレクチン−３は、細胞増殖、アポトーシスの阻害、細胞接着、化学誘引を含むＭＭにおけるいくつかの生物学的プロセスに関与することが示されている。我々は、以前に、インビトロ及びインビボにおいてＭＭ増殖を阻害するガレクチン３Ｃ、ガレクチン−３のドミナントネガティブ型阻害剤の能力を実証している（Mirandola, L., Y. Yu, K. Chui, M.R. Jenkins, E. Cobos, C.M. John, and M. Chiriva-Internati. 2011. Galectin- 3C inhibits tumor growth and increases the anticancer activity of bortezomib in a murine model of human multiple myeloma. PLoS One 6:e21811）。ガレクチン−３Ｃ単独及びボルテゾミブとの組合せは、異種移植片マウスモデルにおけるＭＭ増殖の９０％超の増殖阻害をもたらした。重要なことに、ガレクチン−３は抗破骨細胞形成効果を有すると考えられ（Li, Y.J., A. Kukita, J. Teramachi, K. Nagata, Z. Wu, A. Akamine, and T. Kukita. 2009. A possible suppressive role of galectin-3 in upregulated osteoclastogenesis accompanying adjuvant-induced arthritis in rats. Lab Invest 89:26-37）、ヒトにおける心機能障害（Ahmad, T., and G.M. Felker. 2012. Galectin-3 in heart failure: more answers or more questions? J Am Heart Assoc 1:e004374）と腎線維症（Kolatsi-Joannou, M., K.L. Price, P.J. Winyard, and D.A. Long. 2011. Modified citrus pectin reduces galectin-3 expression and disease severity in experimental acute kidney injury. PLoS One 6:e18683）の両方の媒体である。したがって、ＭＭにおいてカルフィルゾミブとガレクチン−３阻害剤を組み合わせることの重要性は、ガレクチン−３阻害と関係する破骨細胞形成効果の中和、並びにガレクチン−３阻害によって与えられ得る潜在的な心腎保護をもたらす、それらの明らかな相加的な抗骨髄腫効果、カルフィルゾミブの破骨細胞形成を阻害する能力（Hurchla, M.A., A. Garcia-Gomez, M.C. Hornick, E.M. Ocio, A. Li, J.F. Blanco, L. Collins, C.J. Kirk, D. Piwnica- Worms, R. Vij, M.H. Tomasson, A. Pandiella, J.F. San Miguel, M. Garayoa, and K.N. Weilbaecher. 2013. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia 27:430-440）を含むいくつかの観察に基づいて正当化される。
【００４４】
本研究は、ＭＭの同系マウスモデル、５ＴＧＭ１を使用し、ガレクチン−３Ｍ（Ｇａｌ３Ｍ）という名の新しいガレクチン−３阻害剤と組み合わせたカルフィルゾミブの効果を評価した。５ＴＧＭ１細胞は、本発明者らの以前の研究で使用したヒトＭＭ細胞株に類似しており、高レベルのガレクチン−３及びがん精巣抗原ＳＰ１７を発現することが見出された。本明細書において、５ＴＧＭ１細胞は、それらの増殖及び遊走能力においてカルフィルゾミブとＧａｌ３Ｍの阻害効果に感受性であったことが示される。驚くべきことに、カルフィルゾミブとＧａｌ３Ｍの組合せでの５ＴＧＭ１細胞の処理は、これら２つの細胞内プロセスにおける相加的な阻害効果をもたらした。これらの有望な結果により、我々はこれらの処理のインビボでの効果を評価するように促された。５ＴＧＭ１細胞を、同系マウスモデルに注射し、マウス血清中のＩｇＧ２ｂ及びＳＰ１７レベルを分析した。１４日後、ＩｇＧ２ｂ及びＳＰ１７レベルの有意な増加は、５ＴＧＭ１注射マウスにおけるＭＭ細胞の生着及びＢＭホーミングにおいて検出した。マウスは、次いで、カルフィルゾミブ、Ｇａｌ３Ｍ、その組合せ又は処置なしのいずれかで処置し、各群において注射後２１及び２８日目にＩｇＧ２ｂ及びＳＰ１７の血清レベルを決定した。このインビボモデルを用いるこれらの結果は、本発明者らのインビトロでのデータを確証した。驚くべきことに、カルフィルゾミブ＋Ｇａｌ３Ｍでの併用処置は、ＭＭ細胞負荷の２つのマーカー、ＩｇＧ２ｂ及びＳＰ１７レベルの減少において、いずれかの薬剤単独より効果的であった。これらの結果は、カルフィルゾミブ及びＧａｌ３Ｍを用いる場合、強力な付加的抗骨髄腫効果を支持する。
【００４５】
それらの抗骨髄腫効果の評価に加えて、本発明者らは、このマウスＭＭモデルにおけるカルフィルゾミブ及びＧａｌ３Ｍの心腎への効果を評価した。カスパーゼ−３活性化を検出する形態学的分析及びＩＨＣ（組織損傷及びアポトーシスの指標として）により、カルフィルゾミブ処置が、腎臓及び心臓組織損傷と関係する形態学的変化、並びにアポトーシス経路の活性化と関係することが明らかになった。Ｇａｌ３Ｍ処置は、いかなる明らかな組織損傷とも関係せず、カルフィルゾミブへの添加により、カルフィルゾミブ誘導性の毒性から腎臓と心臓の両方を保護することができた。これらの発見は、ＭＭ増殖の阻害剤としてだけでなく、カルフィルゾミブ媒介性器官損傷に対する保護剤としても、Ｇａｌ３Ｍの潜在的な使用を実証する。
【００４６】
骨破壊は、ＭＭに関係する最も一般的な合併症の１つであり、高カルシウム血症、全身性骨粗しょう症、骨痛、及び骨折をもたらす。ＢＭ微小環境とＭＭ細胞の間のこの相互作用もまた、増強された増殖及び生存能力、並びに薬剤耐性を有するＭＭクローンの担体の発生をもたらす（Colombo, M., L. Mirandola, N. Platonova, L. Apicella, A. Basile, A.J. Figueroa, E. Cobos, M. Chiriva- Internati, and R. Chiaramonte. 2013. Notch-directed microenvironment reprogramming in myeloma: a single path to multiple outcomes. Leukemia 27:1009-1018）。ＭＭ細胞はＢＭ微小環境と相互作用し、破骨細胞分化の増加及び骨芽細胞形成の阻害を引き起こし、骨吸収及び骨溶解を支持する。ガレクチン−３は破骨細胞形成を阻害することが示されているため（Li, Y.J., A. Kukita, J. Teramachi, K. Nagata, Z. Wu, A. Akamine, and T. Kukita. 2009. A possible suppressive role of galectin-3 in upregulated osteoclastogenesis accompanying adjuvant-induced arthritis in rats. Lab Invest 89:26-37）、ＭＭにおけるガレクチン−３阻害剤の使用は、この疾患における骨破壊を増強及び加速させ得る。したがって、カルフィルゾミブの抗破骨細胞形成及び骨芽細胞形成促進特性（Hurchla, M.A., A. Garcia-Gomez, M.C. Hornick, E.M. Ocio, A. Li, J.F. Blanco, L. Collins, C.J. Kirk, D. Piwnica- Worms, R. Vij, M.H. Tomasson, A. Pandiella, J.F. San Miguel, M. Garayoa, and K.N. Weilbaecher. 2013. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia 27:430-440）が、Ｇａｌ３Ｍによるガレクチン−３遮断の骨格への効果を制限できるかどうかも評価した。本発明は、インビトロとインビボの両方でのカルフィルゾミブ（骨芽細胞活性の増加）及びＧａｌ３Ｍ（破骨細胞活性の増加）治療の骨格への効果を示した。これらの結果はまた、Ｇａｌ３Ｍと組み合わせたカルフィルゾミブの使用が、破骨細胞形成環境（mileu）よりも骨芽細胞形成環境と関係し、インビボでの骨形成をもたらすことを実証した。
【００４７】
本研究は、有効な抗骨髄腫剤として、単独で又はカルフィルゾミブと組み合わせてガレクチン−３阻害剤、Ｇａｌ３Ｍの使用を実証する。カルフィルゾミブと組み合わせたＧａｌ３Ｍの使用は、重大な相加的な抗骨髄腫活性をもたらしただけでなく、カルフィルゾミブ関連毒性に対する器官保護とも関係した。重要なことに、カルフィルゾミブ治療は、Ｇａｌ３Ｍにより遮断されたガレクチン−３の破骨細胞形成効果を中和及び克服することができた。まとめると、これらの結果は、インビボで関連するＭＭにおいてカルフィルゾミブと一緒にＧａｌ３Ｍを使用することにより、相加的な抗骨髄腫効果、心臓がもたらされたことを示す。このようにして、Ｇａｌ３Ｍとカルフィルゾミブの組合せは、進行したＭＭを有する患者の治療に使用できる。
【００４８】
細胞株及び処理。マウスＭＭ細胞株５ＴＧＭ１は、Prof. Oyajobi Babatunde（Departments of Cellular & Structural Biology and Medicine, UTHSCSA, San Antonio, TX, USA）からの親切な贈り物であった。細胞は、１０％Ｖ／Ｖの熱失活したＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンカリウム、及び１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンを補った完全ＩＭＤＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で維持した。マクロファージ／単核球細胞株Ｒａｗ２６４．７細胞株は、Professor Raffaella Chiaramonte（Dept. of Health Sciences, Universita degli Studi di Milano, Italy）の親切な贈り物であった。細胞は、１０％の熱失活したウシ胎仔血清（PAA Laboratories, Inc.社）を補った完全ＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２雰囲気で維持した。カルフィルゾミブは、Onyx Pharmaceuticals, Inc.社、South San Francisco、CAから購入した。
【００４９】
Ｇａｌ３Ｍの組換え発現ベクターの構築。鋳型ｃＤＮＡはgenescopesから購入し、ガレクチン−３変異導入用のプライマー対はガレクチン−３タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計した。プライマーは、３つの異なる変異をＰ１１３、Ｌ１１４、及びＹ１１８に挿入するために設計した。配列は以下の通りであった：フォワード；5'GGATCCGCAGTGATTGTGCCTAATAACCT3'（配列番号５）、リバース；5'AAGCTTTATCATGGTATATGAAGCACTGGTG-3'（配列番号６）。増幅した断片はｐＱＥ３０ベクターに挿入した。
【００５０】
タンパク質生成。Ｍ１５大腸菌（E. coli）細胞に形質転換したpQE30/Gal3Mプラスミドの使用によりＧａｌ３Ｍタンパク質を生成した。培養物が増殖し、Ｏ．Ｄ．が０．６に達すると、ＩＰＴＧ（１μＭ）をプロモーター誘導物質として添加した。大腸菌細胞の増殖に続き、タンパク質をQiagen Ni-NTA Fast Start Kitにより精製した。
【００５１】
免疫蛍光法。免疫蛍光分析のため、細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでコートした滅菌カバースライド上で増殖させ、ＰＢＳ中２％Ｗ／Ｖのパラホルムアルデヒドにより、室温（ＲＴ，room temperature）で５分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳ中２％Ｖ／ＶのＦＢＳで３０分間ブロッキングし、ガレクチン−３又はｓｐ１７抗体（１：１００、Kiromic LLC社, Lubbock, TX, USA）を用いて室温で１時間インキュベートした。スライドを洗浄し、ＦＩＴＣ共役抗マウス二次抗体（１：１０００、Becton Dickinson社）を用いて室温で１時間暗所にてインキュベートした。ＤＡＰＩ対比染色後、スライドをマウントし、OlympusX71倒立顕微鏡を用いて６０倍の倍率で写真を撮った。
【００５２】
タンパク質抽出及びウェスタンブロット。タンパク質を抽出するため、Ｍ−ＰＥＲタンパク質抽出緩衝液（Pierce/Thermo社, Rockford, IL, USA）２ｍｌと４０ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich社）を混合して調製した細胞溶解緩衝液中で５ＴＧＭ１細胞を可溶化液にした。細胞懸濁液を新しいチューブに移し、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。抽出物を、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離により清澄化し、Ｍ−ＰＥＲ、ＬＤＳ緩衝液（Invitrogen社, Carlsbad, CA, USA）、及び還元剤、２−メルカプトエタノールを用いて、最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌタンパク質に希釈し、次いで７０℃で１０分間加熱した。タンパク質を、４〜１２％のビス（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，Bis(2-hydroxyethyl)-amino-tris(hydroxymethyl)-methane）ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen社）上で分離し、次いで、０．２μｍのニトロセルロース膜上に電気的に転写させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中ですすいだ後、ブロットを無タンパク質のブロッキング緩衝液（Pierce/Thermo社）中、４℃で一晩保存した。次いで、ブロットは、ブロッキング緩衝液中で１：２００に希釈した抗ＳＰ１７抗体（Kiromic LLC社, Lubbock, TX, USA）又は抗ガレクチン−３抗体（Kiromic LLC社, Lubbock, TX, USA）を用いて室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した後、ブロットは、ブロッキング緩衝液中で１：２０００に希釈したビオチン共役抗ラットＩｇＧを用いて室温で１時間インキュベートした。５回の洗浄の後、ブロットは、ブロッキング緩衝液中で１：１０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジンを用いて室温で２０分間インキュベートし、次いで３、３９、５、５９−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，tetramethylbenzidine）と膜強化剤（KPL社, Mandel Scientific, Guelph, Canada）で現像した。画像は、デジタルカメラで撮り、デジタル的に増強した（Adobe PhotoShop又はImageJ）。
【００５３】
細胞生存率アッセイ。５ＴＧＭ１細胞をカルフィルゾミブ、Ｇａｌ３Ｍ、又はこれら２つの薬剤の組合せで４８時間処理し、次いで細胞生存率をViaLight Plus Cell Proliferation and Cytotoxicity BioAssay Kit（Lonza社）によって、製造業者の指示に従って評価した。
【００５４】
走化性アッセイ。５ＴＧＭ１細胞（４×１０５／ウェル）を８μｍの２４ウェルトランズウェル（商標）インサート（Corning Costar社, NY, USA）の上のチャンバーにおいて１００μＬの無血清培地中にプレートした。１０％のＦＢＳを含有する完全細胞培養培地（６００μＬ）を下のチャンバーに添加した。細胞をＧａｌ３Ｍ（１０μｇ／ｍｌ）、カルフィルゾミブ（１０ｎＭ）、又はカルフィルゾミブ＋Ｇａｌ３Ｍ（同じ投与量）で４時間処理し、下のチャンバー中の５ＴＧＭ１細胞を固定しカウントした。
【００５５】
ＲＡＷ２６４．７細胞からの破骨細胞分化。共培養実験のため、Ｒａｗ２６４．７細胞と５ＴＧＭ１細胞を１×１０４個の細胞／ウェルの密度（約８×１０３個のＲａｗ２６４．７及び２×１０３個のＵ２６６）で、６ウェルプレートに撒き、カルフィルゾミブ、Ｇａｌ３Ｍ、又はカルフィルゾミブ＋Ｇａｌ３Ｍの存在／非存在下で培養した。５〜７日後、細胞をクエン酸−アセトン溶液で培養プレート上に固定し、ＴＲＡＰ（Sigma-Aldrich社）染色した。Olympus顕微鏡を用いて、３個以上の核の存在により、光学顕微鏡下で破骨細胞が同定され、数えられた。
【００５６】
５ＴＧＭ１同系マウスモデルにおけるＧａｌ３Ｍ及びカルフィルゾミブの試験。５ＴＧＭ１細胞はＰＢＳ（Sigma-Aldrich社）で１回洗浄し、カウントした。１０７個の５ＴＧＭ１細胞を含有する懸濁液を、２０匹のＣ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスにＩ．Ｖ．により注射し、５匹の非注射マウスを陰性対照として使用した。腫瘍の生着は、１週間に１度血清中のＩｇＧ２ｂを試験することにより評価した。１４日後、注射したマウスはランダムに４つの群に分けた（５匹のマウス／群）。対照群＃１にはＰＢＳのみを注射し、群＃２にはＧａｌ３Ｍ（１００μｇ／マウス）を投与し、群＃３にはカルフィルゾミブ（１１２μｇ／マウス）を投与し、群＃４にはカルフィルゾミブ（１１２μｇ／マウス）＋Ｇａｌ３Ｍ（１００μｇ／マウス）を投与した。腫瘍増殖における治療効果を、血清中のＩｇＧ２ｂ及びＳＰ１７レベルを試験することにより評価した。２８日後に麻酔をかけた動物を安楽死させ、動物全身及び切開した器官において剖検を行った。
【００５７】
Ｓｐ１７及びＩｇＧ２ｂのＥＬＩＳＡ。マウス血清におけるＳＰ１７及びＩｇＧ２ｂのレベルを以下のようにダイレクトＥＬＩＳＡによって測定した。平底の９６ウェルポリカーボネートプレートを、カーボネートコーティング緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５）中で１：２５に希釈した血清１００μＬ／ウェルで、４℃で一晩コートした。次いで、１％Ｗ／ＶのＢＳＡを補ったＰＢＳにより、室温で１時間ブロッキング後、プレートをマウス抗マウスＳｐ１７又はＩｇＧ２ｂ一次抗体（ＰＢＳ中１：５００、１００μＬ／ウェル、Santa Cruz Biotechnology社）と、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを０．０２５％Ｖ／ＶのＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、抗マウスＨＲＰ標識二次抗体（ＰＢＳ中１：１０，０００、Abcam社, Cambridge, MA, USA）と、室温で１時間インキュベートした。プレートを０．０２５％Ｖ／ＶのＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、ＴＭＢ比色基質（Thermo Fisher Scientific社, Waltham, MA, USA）を添加し、５分後、Victor 2 multimodal microplate reader（PerkinElmer社, Billerica, MA, USA）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（０．１ｓ）。全ての試料は、３重に行った。
【００５８】
骨量密度分析。Ｘ線画像は、IVIS Lumina Series III pre-clinical In Vivo Imaging System（Perkin Elmer社, USA）を用いて安楽死の日に撮り、骨量密度分析（ＢＭＤ）を以前に記載されているように実施した（Mc Manus MM, 2011）。
【００５９】
免疫組織化学。破骨細胞（抗カテプシンＫ抗体、Abcam社）、骨芽細胞（抗オステオカルシン抗体、Abcam社）、及びアポトーシス（抗活性型カセパーゼ３抗体、Cell Signaling Technologies社）のマーカーの免疫組織化学分析をパラフィン包埋切片において行った。処置した及び対照マウス由来の心臓及び腎臓を、ホルマリン中で固定し、エタノール中で脱水し、パラフィンで包埋し、次いで３．５μｍの厚さの切片にカットした。骨切片については、ホルマリン固定に続き、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８）により脱灰、及びエタノール中で脱水し、大腿骨はパラフィンに入れ、次いで、５μｍの厚さの切片にカットした。キシレンで脱パラフィン及び再水和（１００％〜９５％〜７０％〜５０％エタノールスケール）後、スライドを蒸留水中に１０分間置き、次いで、クエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中９８℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋５％Ｖ／ＶのＦＢＳでブロッキング（室温で２時間）後、抗カテプシンＫ、ステオカルシン、及び活性型カスパーゼ−３抗体を添加し（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中で１：４００に希釈）、４℃で一晩インキュベートさせた。切片をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で２回すすぎ、次いで内因性のペルオキシダーゼをＰＢＳ中１％Ｈ２Ｏ２で１５分間ブロッキングした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２分間、３回すすいだ後、スライドを二次抗体（１：１０００、ヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ、Abcam社）と室温で１時間インキュベートした。１×ＤＡＢ溶液（Cell Signaling Technologies社）で５分間インキュベートした後に染色は明示され、続いて蒸留水中で１０分間インキュベートした。ヘマトキシリンを対比染色した切片の写真はOlympus顕微鏡を用いて撮られた。
【００６０】
ヘマトキシリン／エオシン染色。形態学的分析のため、心臓及び腎臓のパラフィン包埋切片のヘマトキシリン（Sigma Aldrich社, USA）及びエオシン（Sigma Aldrich社, USA）染色を実施した。スライドを、パーマウント封入剤（Fisher Scientifics社）を用いてマウントし、画像を光学顕微鏡（Olympus社）下で観察した。
【００６１】
統計的分析。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±９５％信頼区間（Ｃ．Ｉ．，confidence interval）として表す。両側スチューデントのｔ検定を用いて、正規分布値の平均を比較した。分散の分析を二元配置分散分析及びボンフェローニの事後検定によって実施した。
【００６２】
本発明のガレクチン−３Ｍは、Ｎ末端ドメインを欠き、多量体化せず、さらにＣＲＤ領域にいくつかの変異が存在することで、細胞−細胞及び細胞−マトリックス相互作用での親和性を増加する。
【００６３】
図８は、Ｇａｌ３Ｍ及びカルフィルゾミブを用いたマウスの肺がん研究についてのフローチャートである。
【００６４】
図９は、処置なし及び１１２又は２２４μｇのカルフィルゾミブでの腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【００６５】
図１０は、処置なし並びに１１２又は２２４μｇのカルフィルゾミブ及びＸＭでの腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【００６６】
図１１は、処置なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独（１１２又は２２４μｇ）、及びカルフィルゾミブ１１２又は２２４μｇ＋ＸＭでの固形腫瘍の処置を示すグラフである。腫瘍サイズの測定。ＬＬＣ注射の１４日後、マウスは一週間に３回、２日間連続で、ＸＭ及びカルフィルゾミブ（１１２μｇ及び２２４μｇ）で処置した。結果は、ＸＭ及びカルフィルゾミブが腫瘍増殖を阻害したことを示す。
【００６７】
図１２は、処置なし及びＸＭを用いた処置での腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【００６８】
図１３は、治療なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独、及びカルフィルゾミブ＋ＸＭの毒性を比較するグラフである。
【００６９】
図１４は、処置なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独、及びカルフィルゾミブ＋ＸＭでの固形腫瘍における細胞のアポトーシスマーカーカスパーゼ３のウェスタンブロットである。３６日後、マウスを屠殺し、ウェスタンブロット用に器官を回収した。カルフィルゾミブは、腎臓、肝臓、肺、脾臓、及び心臓などの、マウス器官におけるアポトーシスを増加した。ＸＭは、カルフィルゾミブにより誘導されたアポトーシスを低減した。対照及びＸＭ群では、ほとんどアポトーシスが見られなかった。
【００７０】
図１５は、左のパネルでは、処理なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独、及びカルフィルゾミブ＋ＸＭでの生存率（左のパネル）、右のパネルでは、処理なし、ＸＭ単独、カルフィルゾミブ単独、及びカルフィルゾミブ＋ＸＭの毒性を示す２つのグラフを示す。
【００７１】
図１６は、５ｇｔｍマウスにおけるＳｐ１７の逆転写酵素ＰＣＲである。レーン１  ５ｇｔｍ１細胞、レーン２  ＲＴなし、レーン３  鋳型なし、レーン５  骨、及びレーン５  脾臓。
【００７２】
図１７は、腫瘍及び肺組織におけるＡＫＡＰ−４発現に関するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。ウェルを、腫瘍及び肺組織の可溶化液でコートした。結果は、ＸＭ及びカルフィルゾミブでの治療が、肺がん（腫瘍）に効果を有することを示す。
【００７３】
図１８は、提供されるＸＭの量に応じて、列挙した細胞株の発現を示す５つのグラフを示す。
【００７４】
図１９は、提供されるＸＭに応じて、様々な細胞株のＡＴＰ含有％の用量反応曲線を示す。
【００７５】
本明細書において議論した実施形態は、本発明のいかなる方法、キット、試薬、又は組成物に関しても実行することができると考えられ、逆もまた同じである。さらに、本発明の組成物は本発明の方法を成し遂げるために使用することができる。
【００７６】
本明細書に記載される特定の実施形態は、例示のために示され、本発明の限定としてではないことが理解される。本発明の主要な特性は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な実施形態において用いることができる。当業者は、ただの日常の実験を用いて、本明細書に記載の特定の手順の多くの等価物を認識する又は確かめることができる。そのような等価物は、本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲によってカバーされる。
【００７７】
本明細書に述べた、全ての出版物及び特許出願は、本発明が属する当業者の技術のレベルを示している。全ての出版物及び特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的に及び個々に示されるのと同程度に、本明細書に参照により組み込まれる。
【００７８】
特許請求の範囲及び／又は明細書中で用語「含む（comprising）」と併せて使用した場合、単語「１つの（a）」又は「１つの（an）」の使用は、「１つの（one）」を意味し得るが、「１又は２以上」「少なくとも１つ」及び「１又は１より大きい」の意味とも一致する。特許請求の範囲中の用語「又は」の使用は、代替物のみ又は代替物が相互に排他的であることを指すとはっきりと示されない限り「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本出願を通して、用語「約」は、値がデバイスのエラーの固有の変動を含むことを示すために使用され、本方法は、研究対象中に存在する値又は変動を決定するために用いられる。
【００７９】
本明細書及び特許請求の範囲（複数可）において使用されるように、単語「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」など、「含む」の任意の形態）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」など、「有する」の任意の形態）、「含む（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」など、含むの任意の形態）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」など、含有する任意の形態）は、包括的であり又は制限がなく、さらなる列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書において提供される任意の組成物及び方法の実施形態において、「含む（comprising）」は「から本質的になる（consisting essentially of）」又は「からなる（consisting of）」で置き換えることができる。本明細書で使用されるように、句「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特定の整数（複数可）又はステップ、並びに請求した本発明の特徴又は機能に実質的に影響しないものを必要とする。本明細書で使用されるように、用語「からなる（consisting）」は、列挙した整数の存在（例えば、特性、要素、特徴、性質、方法／プロセスステップ、又は制限）又は整数の群（例えば、特性（複数可）、要素（複数可）、特徴（複数可）、性質（複数可）、方法／プロセスステップ、又は制限（複数可））のみを示すために使用される。
【００８０】
本明細書で使用されるように、用語「又はそれらの組合せ」は、用語の前に列挙した項目の全ての並べ替え及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、また特定の文脈において順序が重要な場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことを意図する。この例に続いて、例えばＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなど、１又は２以上の項目又は用語の繰り返しを含有する組合せが明確に含まれる。文脈からそうでないことが明らかでない限り、通常いかなる組合せにおいても項目又は用語の数に制限はないことを当技術者は理解する。
【００８１】
本明細書で使用されるように、およその単語、例えば、制限することなく、「約」、「実質的な」、又は「実質的には」は、そのように修飾された場合、必ずしも絶対でも完全でもないと理解されるが、当業者が、条件が存在すると指定することを正当化するのに十分に近いと考えられる条件を指す。記載を変え得る程度は、いかに大きな変化を設定することができるか、及び当業者に、改変した特性が改変していない特性の必要な特徴及び能力を依然として有するとなおも認識させるかによる。先の議論の対象であるが、一般に、「約」など、およその単語によって修飾された本明細書における数値は、少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２、又は１５％述べた値から変動し得る。
【００８２】
本明細書において開示及び請求された組成物及び／又は方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験なく作製及び実行できる。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記載されているが、変形形態が本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物及び／又は方法並びに方法のステップ又はステップの順序に適用できることが当業者には明らかである。当業者に明らかな全てのそのような類似の代替物及び改変物は、添付の特許請求の範囲により定義したように本発明の精神、範囲及び概念内にあると考えられる。
【００８３】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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