(57)【要約】  本発明は、ヘパロサン(HEP)ポリマーにコンジュゲートされた第IX因子ポリペプチド、それを製造するための方法及びかかるコンジュゲートの使用に関する。得られたコンジュゲートは、たとえば、出血障害、たとえば血友病Bの治療又は予防において使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第IX因子ポリペプチド、連結部分、及びヘパロサンポリマーを含むコンジュゲートであって、前記第IX因子ポリペプチド及び前記ヘパロサンポリマーを接続する前記連結部分が、以下のとおりXを含み、
[ヘパロサンポリマー]-[X]-[第IX因子ポリペプチド]
式中、Xが、以下の式1
【化１】
2017507136.tif 000047
の部分を前記第IX因子ポリペプチドと接続するシアル酸誘導体を含む、コンジュゲート。
【請求項２】
前記シアル酸誘導体が、以下の式2
【化２】
2017507136.tif 000048
のグリシルシアル酸であり、
前記式1の部分が、式2の末端-NH基に接続される、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
[ヘパロサンポリマー]-[X]-
が、以下の式3
【化３】
2017507136.tif 000049
(式中、nは、5〜450の整数である)に示す構造断片を含む、請求項1又は2に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
第IX因子ポリペプチド及びヘパロサンポリマーを含むコンジュゲートであって、前記ヘパロサンポリマーが5〜100kDaの範囲の分子量を有する、コンジュゲート。
【請求項５】
前記ヘパロサンポリマーが13〜60kDaの範囲の分子量を有する、請求項4に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記ヘパロサンポリマーが27〜40kDaの範囲の分子量を有する、請求項4に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記ヘパロサンポリマーの分子量が40kDa±10%である、請求項4に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項９】
第IX因子活性の回復のアッセイ間変動が523パーセント点未満である、aPTTアッセイにおける第IX因子ポリペプチドにコンジュゲートされたヘパロサンポリマーの使用。
【請求項１０】
第IX因子活性の回復のアッセイ間変動が115パーセント点以下である、請求項9に記載の第IX因子ポリペプチドにコンジュゲートされたヘパロサンポリマーの使用。
【請求項１１】
医薬としての使用のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
血友病Bの治療における使用のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
血友病Bの予防的処置における使用のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
ヘパロサンポリマーを第IX因子ポリペプチドとコンジュゲートする方法であって、
a)反応性アミンを含むヘパロサンポリマー[HEP-NH]を、活性化4-ホルミル安息香酸と反応させ、以下の式4
【化４】
2017507136.tif 000050
(式中、[HEP-NH]は、末端第一級アミンで官能化されたHEPポリマーである)の化合物を得る工程、
b)還元条件下で前記式4の化合物をCMP-活性化シアル酸誘導体と反応させる工程、及び
c)工程b)において得られる化合物を前記第IX因子ポリペプチド上のグリカンにコンジュゲートする工程
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法を使用して得られるコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固第IX因子とヘパロサンポリマーとのコンジュゲート及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
凝固障害に罹患した対象、たとえば血友病に罹患したヒトにおいて、たとえば凝固因子の非存在又は不十分な存在により、凝固カスケードの様々な段階が機能障害となる。凝固カスケードの一部のかかる機能障害は、不十分な血液凝固及び潜在的に生命を脅かす出血、又は内部器官、たとえば関節の損傷をもたらす。
【０００３】
血友病Bは、凝固第IX因子活性の欠損又は機能障害により引き起こされ、患者は第IX因子のオンデマンド投与により治療できる。
【０００４】
現在の推奨治療法は、従来のオンデマンド治療から予防へと移りつつある。現在の予防療法は、1週間に複数回の投与を必要とするが、最適な血漿レベル及び有効性のためには、1日1回の注射が優れていると考えられる。連日投与に伴う実用的及び経済的制約ゆえに、これは患者にとって理想的な解決策ではない。
【０００５】
凝固第IX因子は、血友病Bの治療における使用に有益な治療用ポリペプチドである。市販形態の第IX因子が今日使用されているとはいえ、改善した薬物動態を有する長期持続性第IX因子ポリペプチドの一般的な必要性が当技術分野において残っている。
【０００６】
患者への投与後の前記薬剤の血漿内半減期を延長するために、治療用ポリペプチド、たとえば第IX因子ポリペプチドを半減期延長部分と融合又はコンジュゲートすることができる。
【０００７】
たとえば親水性ポリマーの形態の半減期延長部分とペプチド又はポリペプチドとのコンジュゲーションは、酵素法の使用により実行できる。これらの方法は選択的である可能性があることから、タンパク質配列における特異的ペプチドコンセンサスモチーフの存在、又は翻訳後部分、たとえばグリカンの存在を必要とする。
【０００８】
血液凝固因子上のN-及びO-グリカンを修飾するための選択的酵素法が記述されてきた。たとえば、化学修飾シアル酸基質(Malmstrom、J Anal Bioanal Chem 2012; 403:1167〜1177頁)が記述されており、これらは、シアリルトランスフェラーゼST3GalIIIを使用してN-グリカン上の第VIIa因子(Stennicke, HR.ら  Thromb Haemost. 2008年11月; 100(5):920〜8頁)、及びST3GalIを使用して第VIII因子上のO-グリカン(Stennicke, HR.ら、Blood. 2013年3月14日;121(11):2108〜16頁)を糖PEG化するために使用できる。
【０００９】
たとえばUS2006040856は、インタクトなグリコシル連結基(intact glycosyl linking group)を介して結合される第IX因子とポリエチレングリコール(PEG)部分とのコンジュゲートに関し、この基はペプチドとPEG部分との間に挿入され、それらと共有結合される。
【００１０】
上述の方法に共通の特徴は、修飾シアル酸基質、グリシルシアル酸シチジン一リン酸(glycyl sialic acid cytidine monophosphate)(GSC)、及び半減期延長部分でのGSCの化学的アシル化の使用である。
【００１１】
たとえば、ニトロフェニル-又はN-ヒドロキシ-スクシンイミドエステルとして活性化されたPEGポリマーを、GSCのグリシルアミノ基上にアシル化し、糖タンパク質のN-及びO-グリカンに酵素的に転移できるPEG置換シアル酸基質を創出できる(WO2006127896、WO2007022512、US2006040856を参照のこと)。同様の仕方で、N-ヒドロキシ-スクシンイミド活性化エステル化学を使用して、脂肪酸をGSCのグリシルアミノ基上にアシル化できる(WO2011101277)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】US2006040856
【特許文献２】WO2006127896
【特許文献３】WO2007022512
【特許文献４】WO2011101277
【特許文献５】US5521070
【特許文献６】WO2007/135182
【特許文献７】US20100036001
【特許文献８】WO2006094810
【特許文献９】WO2011101267
【特許文献１０】WO03031464
【特許文献１１】WO2007056191
【特許文献１２】US8088604
【特許文献１３】WO2005014035
【特許文献１４】WO2008025856
【特許文献１５】US4837028
【特許文献１６】US4501728
【特許文献１７】US4975282
【特許文献１８】国際出願WO92/16640、1992年10月1日公開
【特許文献１９】US20090041744
【特許文献２０】US2010036001
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Malmstrom、J Anal Bioanal Chem 2012; 403:1167〜1177頁
【非特許文献２】Stennicke, HR.ら  Thromb Haemost. 2008年11月; 100(5):920〜8頁
【非特許文献３】Stennicke, HR.ら、Blood. 2013年3月14日;121(11):2108〜16頁
【非特許文献４】McGrawら(1985) PNAS、82:2847頁
【非特許文献５】Stennicke、Blood 2013;121(11):2108〜16頁
【非特許文献６】Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版  2013 309頁
【非特許文献７】Eur J Biochem 168、594〜602頁(1987)
【非特許文献８】Eur J Org Chem. 2000、1467〜1482頁
【非特許文献９】Dufner, G. Eur. J Org Chem 2000、1467〜1482頁
【非特許文献１０】Sismey-Ragatzら、2007 J Biol Chem
【非特許文献１１】JC. Gildersleeve、Bioconjug Chem. 2008年7月; 19(7): 1485〜1490頁
【非特許文献１２】Yasuhiro Kajiharaら、Chem Eur J 2011、17、7645〜7655頁
【非特許文献１３】Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、Easton、PA (1990)
【非特許文献１４】Kielyら(1976) Journal of Biological Chemistry 251、5490〜5495頁
【非特許文献１５】Glabeら(1980) Journal of Biological Chemistry 255、9236〜9242頁
【非特許文献１６】Nadanoら(1986) J Biol Chem 261: 11550〜11557頁
【非特許文献１７】Kanamoriら、J Biol Chem 265: 21811〜21819頁(1990)
【非特許文献１８】Bitter T、Muir HM. Anal Biochem 1962年10月;4:330〜4頁
【非特許文献１９】DeAngelis及びWhite、2002 J Biol Chem
【非特許文献２０】Sismey-Ragatzら、2007 J Biol Chem
【非特許文献２１】Nano Letters (2007) 7(8)、2207〜2210頁
【非特許文献２２】Fujiwara, K.ら(1988) J Immunol Meth 112、77〜83頁
【非特許文献２３】Poulsen, F及びJensen KB、J Biomol Screen 2007;12(2):240〜7頁
【非特許文献２４】Ostergaardら  Blood, 2011;118:2333〜41頁
【非特許文献２５】Leongら  J Thromb Haemost 2011;9 (Suppl 2):379頁(P-TU-223)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、本発明者らは、以前に公開された方法が、高度に官能化された半減期延長部分、たとえば炭水化物ポリマーを、GSCと結合するのに適さないことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明において、半減期延長ポリマーヘパロサンと第IX因子との間の新規コンジュゲートが、それらの使用及び製造方法とともに開示される。
【００１６】
新規ヘパロサン-第IX因子(HEP-FIX)ポリペプチドコンジュゲート及びそれらの調製が、本明細書に記載される。これらのコンジュゲートは、当技術分野において公知のいくつかの他のコンジュゲート、たとえばPEGベースコンジュゲートより優れた生物学的特性をもたらす。
【００１７】
本明細書に記載のコンジュゲートは、第IX因子(FIX)のインビボ半減期を延長させる、ヘパロサン(HEP)の形態の生分解性半減期延長部分により保護される。いくつかの実施形態において、本発明のHEP-FIXポリペプチドコンジュゲートは、非コンジュゲートFIXポリペプチドと比較して増加した循環半減期、又は非コンジュゲートFIXポリペプチドと比較して増加した機能的半減期を有する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、HEP-FIXポリペプチドコンジュゲートは、非コンジュゲートFIXポリペプチドと比較して増加した平均滞在時間、又は非コンジュゲートFIXポリペプチドと比較して増加した機能的平均滞在時間を有する。
【００１９】
更にいくつかの実施形態において、コンジュゲートは、aPTTアッセイにおいて、とりわけ類似のPEG化FIXバリアントと比較して、改善した性能を示す。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ポリマーの形態のHEPは、1.10未満又は1.05未満の多分散性指数(Mw/Mn)を有する。
【００２１】
一実施形態において、ポリマーは、およそ13からおよそ60kDaの間、たとえば38、41及び44kDaの平均サイズを有していてもよい。
【００２２】
また、本明細書に記載のHEP-FIXポリペプチドコンジュゲートは、改善した特性(たとえば安定性)を有するリンカーを使用して製造できる。かかる一実施形態において、HEP-FIXポリペプチドコンジュゲートが提供され、HEP部分は、安定的で異性体を持たないコンジュゲートが得られるようにFIXに連結される。かかる一実施形態において、HEPポリマーは、シアル酸誘導体、たとえばグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)に結合された4-メチルベンゾイルを含む化学リンカーを使用してFIXに連結される。
【００２３】
本明細書に記載のHEP-FIXポリペプチドコンジュゲートは、凝固障害の治療、特に血友病Bの予防的治療において特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ベンズアルデヒド基でのグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の官能化の図である。GSCを4-ホルミル安息香酸でアシル化し、続いて還元的アミノ化反応によりヘパロサン(HEP)-アミンと反応させる。
【図２】ベンズアルデヒド基でのヘパロサン(HEP)ポリマーの官能化及びそれに続く還元的アミノ化反応におけるグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)との反応の図である。
【図３】チオール基でのグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の官能化及びそれに続くマレイミド官能化ヘパロサン(HEP)ポリマーとの反応の図である。
【図４】ヘパロサン(HEP)-グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の図である。
【図５】4-メチルベンゾイルサブ連結(sublinkage)を介して第IX因子上の二分岐N-グリカン(位置N157又はN167)にコンジュゲートされたヘパロサン(HEP)-グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の図である。
【図６】F9-KOマウスにおける血漿中FIX濃度対時間の図である。濃度は、それぞれ時間に対する抗原ベースアッセイ(a)並びに凝固活性及び発色活性ベースアッセイ(b)及び(c)により測定した。F9-KOマウスに、27nmol/kg(1.5mg FIX/kg)のBeneFIX(登録商標)、40kDaのPEG-[N]-FIX及び60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)を静脈内投与した。結果は、片対数プロット、n=3における平均±SDである。
【図７】F9-KOマウスにおけるFIXの血漿中濃度対時間の図である。濃度は、抗原ベースアッセイ(図7a)及び発色活性ベースアッセイ(図7b)により測定した。マウスに、13から60kDaのHEPポリマーにコンジュゲートされた27nmol/kg(1.5mg FIX/kg)のFIXを静脈内投与した。「C」は、Cys-コンジュゲーションを指し、「N」は、N-グリカンコンジュゲーションを指す。結果は、片対数プロット、n=3における平均±SDである。
【図８】F9-KOマウスにおける尾静脈離断後、同等の強度で用量依存的且つ有意に失血が減少した60kDaのHEP-[C]-FIX E162C及びFIXの図である。F9-KOマウスに、出血誘発10分前に投与した。ED50は、FIX-HEP及びFIXについてそれぞれ、0.012mg/kg及び0.030mg/kgだった(p=0.38)。*及び***はそれぞれ、ビヒクルを受けた血友病対照群と比較したときの、p<0.05及び0.001での統計的有意差である。データは平均±SEMである。
【図９】F9-KOマウスにおける尾静脈離断後、同等の強度で用量依存的且つ有意に出血時間が減少した60kDaのHEP-[C]-FIX E162C(FIX-HEP)及びrFIXの図である。F9-KOマウスに、出血誘発10分前に投与した。ED50は、FIX-HEP及びFIXについてそれぞれ、0.009mg/kg及び0.024mg/kgだった(p=0.18)。*、**及び***はそれぞれ、ビヒクルを受けた血友病対照と比較したときの、p<0.05、0.01及び0.001での統計的有意差である。データは平均±SEMである。
【図１０】F9-KOマウスにおける尾静脈離断後、同等の強度で用量依存的且つ有意に失血が減少した40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXの図である。F9-KOマウスに、出血誘発10分前に投与した。ED50は、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXについてそれぞれ、0.032mg/kg及び0.027mg/kgだった(p=0.67)。***及び****はそれぞれ、ビヒクルを受けた血友病対照と比較したときの、p<0.001及び0.0001での統計的有意差である。データは平均±SEMである。
【図１１】添加されたヒトFIX欠損血漿における、発色活性に対するFIX活性の回復の図である。3つの濃度の化合物を、ヒトFIX除去血漿中に添加し、Biophen Hypen発色アッセイ及び一段階凝固アッセイにおいて5つの特定のaPTT試薬を使用して解析した。結果は、凝固活性として発色活性のパーセントで示され、平均+/-SD、n=3である。すべてのアッセイにおいて、活性を正常ヒト血漿標準物質(ILS社)に対して測定した。  化合物:  カラム1〜5:BeneFIX(登録商標)、カラム6〜10:27kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)、カラム11〜15:40kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)、カラム16〜20:40kDaのHEP-[N]-FIX、カラム21〜25:60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)、カラム26〜30:N9-GP。  aPTTベースアッセイのタイプ:  カラム1、6、11、16、21、26:Actin FS(登録商標)(Siemens社)、カラム2、7、12、17、22、27:Synthasil(登録商標)(ILS社)、カラム3、8、13、18、23、28:Synthafax(登録商標)(ILS社)、カラム4、9、14、19、24、29:APTT SP(ILS社)、カラム5、10、15、20、25、30:STA PTT(登録商標)(Stago社)。
【図１２】等しい用量のrFIXと比較したときの、40kDaのHEP-[N]-FIXの有意に延長された止血効果持続期間を示す図である。両方の化合物が、投与直後にF9-KOマウスにおいて尾静脈離断により引き起こされる失血を有意に減少させたが、投与72時間後でも、ビヒクル群(P=0.0028)及びrFIX処置群(P=0.022)と比較して、40kDaのHEP-[N]-FIXの効果は依然として有意だった。*、**及び***はそれぞれ、p<0.05、0.01及び0.0001での統計的有意差である。データは平均±SEMである。
【図１３】アシアロFIX糖タンパク質を、ST3GalIIIシアリルトランスフェラーゼの存在下でHEP-GSCと反応させる反応スキームの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
配列の簡単な説明
配列番号1は、ヒト第IX因子のアミノ酸配列である。
【００２６】
本発明は、新規ヘパロサン-第IX因子ポリペプチド(HEP-FIX)コンジュゲート及びそれらの調製に関する。これらのコンジュゲートは、当技術分野において公知の他のコンジュゲートより優れた生物学的特性をもたらす。
【００２７】
一般に血友病Bと呼ばれる第IX因子(FIX)欠損は、世界中でおよそ120,000人に影響を及ぼしている先天性出血障害であり、このうち、現在診断されているのは約27,000人であり、治療を受けているのは10,000人未満である。従来の治療は補充療法からなり、出血症状の予防又はオンデマンド治療として提供される。重症の血友病Bに罹患した人のための現在の治療は、通常2〜3回のBeneFIX(登録商標)(野生型rFIX)の予防注射/週である。
【００２８】
凝固障害に罹患した対象、たとえば血友病A及びBに罹患したヒトにおいて、凝固カスケードの様々な段階が、たとえば凝固因子の非存在又は不十分な存在により、機能障害となる。凝固カスケードの一部のかかる機能障害は、不十分な血液凝固及び潜在的に生命を脅かす出血、又は内部器官、たとえば関節の損傷をもたらす。血友病Bに罹患した個体は、凝固因子補充療法、たとえば外因性FIXを受けうる。しかしながら、かかる患者には、かかる外因性因子に対する中和抗体、いわゆる「阻害因子」が生じる危険があり、以前には効率的だった治療法が非効率的になる。更に、外因性凝固因子は静脈内投与しかできず、患者にとって大変不便且つ不快である。たとえば、乳幼児には、静脈へのアクセスを確保するため、静脈内カテーテルを胸部静脈内に外科的に挿入しなければならないかもしれない。このことで、彼らが細菌感染症を発症する大きな危険がある。したがって、特に血友病コミュニティにおいて、また凝固障害に罹患した対象一般において、依然として満たされていない多くの医学的需要が存在する。
【００２９】
先天性凝固低下障害(Congenital hypocoagulopathies)には、血友病Bが含まれる。前記血友病Bは、重症、中等症又は軽症であってもよい。血友病の臨床的重症度は、血中のFIXの機能単位の濃度により決定され、軽症、中等症、又は重症に分類される。重症血友病は、正常レベルの<1%に相当する<0.01U/mlの凝固因子レベルにより定義され、一方で、中等症及び軽症患者はそれぞれ、1〜5%及び>5%のレベルを有する。
【００３０】
FIX活性の先天性欠損は、X連鎖性出血障害である血友病Bの原因であり、およそ100000人に1人の男性に影響を及ぼしている。これらの血友病B患者は、現在は組換え又は血漿由来第IX因子での補充療法により治療される。
【００３１】
「阻害因子」(すなわち、FIXに対する同種抗体)を有する血友病Bは、部分的に先天性であり、部分的に後天性である凝固障害の非限定的な一例である。
【００３２】
後天性凝固障害の非限定的な一例は、ビタミンK欠乏症により引き起こされるセリンプロテアーゼ欠乏症であり、かかるビタミンK欠乏症は、ビタミンKアンタゴニスト、たとえばワルファリンの投与により引き起こされうる。後天性凝固障害はまた、重度の外傷の後に生じうる。「外傷死の3徴」としても知られるこうしたケースでは、それは、血液希釈(希釈性血小板減少症及び凝固因子の希釈)、低体温、凝固因子の消耗及び代謝異常(アシドーシス)により特徴づけられる。輸液療法及び線維素溶解の増加が、この状況を悪化させうる。前記出血は、身体の任意の一部からのものでありうる。
【００３３】
医原性凝固障害の非限定的な一例は、血栓塞栓性疾患を治療するために処方できる抗凝血薬、たとえばヘパリン、アスピリン、ワルファリン及び他の血小板凝集阻害剤の過量投与である。医原性凝固障害の第2の非限定的な一例は、過剰及び/又は不適当な輸液療法により誘導されるもの、たとえば輸血により誘導されうるものである。
【００３４】
本発明の一実施形態において、出血は、血友病Bと関連づけられる。別の一実施形態において、出血は、後天性阻害因子を有する血友病Bと関連づけられる。別の一実施形態において、出血は、血小板減少症と関連づけられる。別の一実施形態において、出血は、ヴォン・ヴィレブランド病と関連づけられる。別の一実施形態において、出血は、重症組織損傷と関連づけられる。別の一実施形態において、出血は、重症外傷と関連づけられる。別の一実施形態において、出血は、手術と関連づけられる。別の一実施形態において、出血は、出血性胃炎及び/又は腸炎と関連づけられる。別の一実施形態において、出血は、たとえば胎盤剥離における、多量子宮出血である。別の一実施形態において、出血は、機械的止血の可能性が限定的である器官において、たとえば頭蓋内、耳内又は眼内に生じる。別の一実施形態において、出血は、抗凝固療法と関連づけられる。
【００３５】
第IX因子
FIXは、第VII因子、プロトロンビン、第X因子、及びプロテインCと構造的類似性を有するビタミンK依存性凝固因子である。循環チモーゲン型は、N末端γ-カルボキシグルタミン酸リッチ(Gla)ドメイン、2つのEGFドメイン及びC末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む4つの別個のドメインに分けられる、415個のアミノ酸からなる。「野生型FIX」の一例は、配列番号1に示す完全長ヒトFIX分子である。
【００３６】
FIXの活性化は、いわゆる活性化ペプチドである35-aa断片を放出する、Arg145〜Ala146及びArg180〜Val181での制限タンパク質分解により生じる。活性化ペプチドは、高度にグリコシル化されており、2つのN結合(位置N157及びN167で)及び複数のO結合グリカンを含有する。活性化された第IX因子は、第IX(a)因子又はFIX(a)と呼ばれる。FIX(a)は、テナーゼ複合体の一部として、凝固中の適切なトロンビン形成を助けるために必要な第Xa因子のほとんどを生成することにより、止血において重要な役割を果たすトリプシン様セリンプロテアーゼである。「FIX(a)」には、様々な個体に存在し生じうる、FIX(a)の天然対立遺伝子変異体が含まれる。
【００３７】
特に指定しない限り、FIXドメインには、以下のアミノ酸残基が含まれる。すなわち、残基Tyr1から残基Lys43の領域であるGlaドメイン、残基Gln44から残基Leu84の領域であるEGF1、残基Asp85から残基Arg145の領域であるEGF2、残基Ala146から残基Arg180の領域である活性化ペプチド、及び残基Val181から残基Thr414の領域であるプロテアーゼドメイン。軽鎖は、Glaドメイン、EGF1及びEGF2を包含する領域を指し、一方で重鎖は、プロテアーゼドメインを指す。野生型ヒト凝固FIXの配列を下に挙げる。
YNSGKLγγFVQGNLγRγCMγγKCSFγγARγVFγNTγRTTγFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
【００３８】
γは、ガンマ-カルボキシル化Glu(「E」)を表す。完全にガンマ-カルボキシル化されたFIXにおいて、最初の12個のGlu残基がガンマ-カルボキシル化されるが、より少ないガンマ-カルボキシル化が生じる変異体が(とりわけ、組換えFIXの場合に)存在する。FIXには位置148で二形性が存在し、これはAla又はThrのいずれかでありうる(McGrawら(1985) PNAS、82:2847頁を参照のこと)。
【００３９】
本明細書において使用される「第IX因子」又は「FIX」は、凝固接触活性化経路(内因系凝固経路としても公知である)のメンバーであり、血液凝固に必須であるヒト血漿FIX糖タンパク質を指す。特に指定又は指示しない限り、FIXは、凝固においてその正常な役割を果たす任意の機能性ヒトFIXタンパク質分子を意味する。
【００４０】
本明細書において使用される「FIXアナログ」という用語は、FIXの1つ若しくは複数のアミノ酸が別のアミノ酸に置換されている、且つ/又は、FIXの1つ若しくは複数のアミノ酸が欠失している、且つ/又は、1つ若しくは複数のアミノ酸がFIXに挿入されている、且つ/又は、1つ若しくは複数のアミノ酸がFIXに付加されていることを除いて、配列番号1の配列を有するFIXを指示することが意図される。かかる付加は、親タンパク質のN末端若しくはC末端のいずれか又はそれらの両方において生じうる。この定義の範囲内の「アナログ(analogue)」又は「アナログ(analogues)」は、依然としてFIX活性をその活性型において有する。一実施形態において、変異体は、配列番号1の配列と少なくとも90%同一である。更なる一実施形態において、変異体は、配列番号1の配列と少なくとも95%同一である。本明細書において使用される特定の位置への任意の参照は、配列番号1における対応する位置を参照する。
【００４１】
本明細書において使用される「第IX因子ポリペプチド」又は「FIXポリペプチド」という用語は、限定することなしに、野生型ヒトFIX及びFIX(a)を、野生型ヒトFIXに対して実質的に同じ又は改善した生物学的活性を示すポリペプチドとともに包含する。これらのポリペプチドには、特に指示のない限り、化学修飾されたFIX又はFIXa、及び、ポリペプチドの生物活性を改変する特定のアミノ酸配列変更が導入されたFIX又はFIXaアナログが含まれるが、これに限定されない。また包含されるのは、改変アミノ酸配列を有するポリペプチド、たとえばヒトFIXに対するN末端アミノ酸欠失又は付加を含む改変N末端を有するポリペプチドである。また包含されるのは、改変アミノ酸配列を有するポリペプチド、たとえばヒトFIXに対するC末端アミノ酸欠失又は付加を含む改変C末端を有するポリペプチドである。
【００４２】
野生型FIXよりも実質的に同じ又はより良好な生物活性を示す、FIXのアナログ、変異体及び誘導体を含むFIXポリペプチドには、1つ又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失、又は置換により野生型FIXの配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。
【００４３】
本発明は、本明細書に記載の配列に決して限定されない。FIXアナログは、たとえば、第1の位置においてチロシンがアラニンに置き換えられるUS5521070、及びFIXにおける天然アミノ酸残基のうちの1つ又は複数がシステイン残基に置換されるWO2007/135182に開示される。前記参考文献は、ここにそれらの全体が参照により組み込まれる。したがって、FIXのアナログ及び変異体は、当技術分野において周知であり、本開示は、公知か又は将来開発若しくは発見されるアナログ又は変異体を包含する。
【００４４】
FIX又はFIX(a)は、血漿由来であっても、周知の製造及び精製方法を使用して組換えにより製造されてもよい。グリコシル化、ガンマ-カルボキシル化及び他の翻訳後修飾度合い及び位置は、選択された宿主細胞及びその成長条件に応じて変化してもよい。
【００４５】
組換えタンパク質を製造するための宿主細胞は、好ましくは、フォールディング及び翻訳後修飾、たとえばO及びNグリコシル化及び硫酸化(sulfatation)中に分子が適切に処理されることを保証するため、哺乳動物由来のものである。好適な宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、ベビーハムスター腎臓(BHK)、及びHEK293細胞株が含まれるが、これに限定されない。
【００４６】
いくつかの実施形態において、たとえばHEPにコンジュゲートされたFIXポリペプチドを含む配合物の形態の医薬組成物が、凝固障害に罹患した対象を治療するために使用され、前記凝固障害はたとえば血友病Bである。
【００４７】
いくつかの実施形態において、HEP-FIXコンジュゲートを含む組成物及び配合物が提供される。具体的な実施形態には、薬学的に許容される担体とともに配合される本明細書に記載のHEP-FIXコンジュゲートを含む医薬組成物が含まれる。
【００４８】
第IX因子等の凝固因子の治療的使用にとって主要な阻害要因は費用であり、特にこれらのタンパク質の有効量が高いことによる。一般的な用量は、250μgのタンパク質/kg体重である。
【００４９】
費用対効果のある糖ペプチド治療剤を提供する問題に対する一つの解決策は、より長いインビボ半減期を有するペプチドを提供することだった。たとえば、改善した薬物動態特性を有する糖ペプチド治療剤が、合成ポリマーをペプチド骨格に結合することにより製造される。ペプチドにコンジュゲートされた例示的ポリマーは、ポリ(エチレングリコール)(PEG)である。
【００５０】
FIXでの血友病Bの現在の治療には通常、たとえば抜歯又は手術前の頓用の注射で補足される、約週2回の注射が含まれる。FIXは、不活性チモーゲンとして循環し、出血が抑止されるべきときにのみ、活性型第IX(a)因子に変換される。したがって、たとえば週1回の注射に基づく予防的FIX治療を達成する一つの方法は、患者の血流におけるFIXの循環時間を増加させることである。この方法において、任意の時点で患者において正常な凝血条件を保証するために活性化される用意のある、一定レベルのチモーゲンFIXが常に存在すると考えられる。
【００５１】
或いは、側鎖又は側基と呼ばれる半減期延長部分は、生体適合性脂肪酸及びそれらの誘導体並びに親水性ポリマー、たとえばヒドロキシエチルデンプン、PEG、ヒアルロン酸及びHEPポリマーを含んでいてもよい。PEG化は長年、長時間作用性の薬物を生成するための好ましい半減期延長技術のうちの1つであり続けており、現在では複数のPEG-タンパク質コンジュゲートが市場に出ている。PEGポリマーは、それが結合されるタンパク質薬の活性を低下させる傾向を有している。これは、典型的には、溶液中でそれぞれの薬物結合パートナーに対するより低い薬物受容体親和性又はより低い結合親和性をもたらす。ほとんどの場合、タンパク質薬に結合された活性の低下は、PEGサイズ又はPEG基の数のいずれかと相関する。したがって、大きなPEG基の結合は、小さなPEG基の結合よりもかなり高い活性消失をもたらす。
【００５２】
PEGサイズ及びPEG数の活性調節効果に加えて、PEGは、止血において使用される標準アッセイに強力に干渉することが近年示された。たとえば、一段階凝固アッセイにおいて測定される糖PEG化FVIIIの比活性は、使用されるaPTT試薬に応じて変化する(Stennicke、Blood 2013;121(11):2108〜16頁)。
【００５３】
aPTT一段階FIX凝固アッセイの使用は、治療開始中の用量投与方式の個体最適化及びFIX予防のルーチンモニタリングのために使用される標準的手順である。一般に、aPTTアッセイは中央検査室で行われ、aPTT試薬の添加及び再石灰化により、患者から得られた血液の凝固が開始され、その後、凝固分析装置上で線維素凝塊形成の時間が測定される。このアッセイには、多くの市販のフォーマットが存在する。
【００５４】
PEGのアッセイ干渉特性は、前臨床開発において顕著な影響を有する場合があり、多成分一段階凝固アッセイにおける患者の血液凝固因子の正確な測定が必要な臨床的応用において特にそうである。
【００５５】
ヘパロサン
ヘパロサン(HEP)は、(-GlcUA-1,4-GlcNAc-1,4-)リピートを含む天然糖ポリマーである。それは、グリコサミノグリカン多糖ファミリーに属し、生理的pHで負に荷電したポリマーである。HEPは特定の細菌の莢膜に見出すことができるが、それはまた高等脊椎動物にも見出され、天然ポリマーであるヘパリン及びヘパラン硫酸の前駆体として役立つ。HEPは、リソソーム酵素、たとえばN-アセチル-a-D-グルコサミニダーゼ(NAGLU)及びβ-グルクロニダーゼ(GUSB)により分解できる。いくつかの実施形態は、式(-GlcUA-ベータ1,4-GlcNAc-アルファ1,4-)nのヘパロサンポリマーを提供する。HEPポリマーのサイズは、リピートの数nにより定義できる。前記リピートの数nは、たとえば、2から約5,000であってもよい。リピートの数は、たとえば、50から2,000単位、たとえば105単位、100から1,000単位、5から450又は200から700単位であってもよい。リピートの数は、200から250単位、500から550単位又は350から400単位であってもよい。これらの範囲の下限の任意のものが、HEPポリマーにおける単位の数の好適な範囲を形成するため、これらの範囲の任意の上限と組み合わされてもよい。
【００５６】
HEPポリマーのサイズはまた、その分子量によっても定義できる。分子量は、HEPポリマー分子の集団の平均分子量、たとえば質量平均分子量であってもよい。
【００５７】
HEPポリマーのサイズに関して本明細書に記載の分子量値は、実際には正確に挙げられたサイズでなくてもよい。HEPポリマー製造中のバッチごとの変動ゆえに、ある程度の変動が予想されるはずである。したがって、バッチごとの変動を包含するため、標的HEPポリマーサイズ近辺で約+/-10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%の変動が予想されるべきことが理解されるべきである。たとえば、40kDaのHEPポリマーサイズは、40kDa+/-10%を意味し、40kDaはたとえば実際には、38.8kDa又は41.5kDaを意味する場合があり、両方が40kDaの+/-10%である36から44kDaの範囲に収まる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、HEPポリマーは、500Daから1,000kDaの分子量を有する。他の実施形態において、ポリマーの分子量は、500Daから650kDa、5から750kDa、10から500kDa、15から550kDa、25から250kDa又は50から175kDaである。
【００５９】
いくつかの実施形態において、分子量は、FIXポリペプチドの活性とコンジュゲートの半減期との間の好適なバランスを達成するため、前述の範囲内の特定のレベルで選択される。たとえばHEPポリマーの分子量は、5から15kDa、15から25kDa、25から35kDa、35から45kDa、45から55kDa、55から65kDa、65から75kDa、75から85kDa、85から95kDa、95から105kDa、105から115kDa、115から125kDa、125から135kDa、135から145kDa、145から155kDa、155から165kDa又は165から175kDaから選択される範囲であってもよい。他の実施形態において、分子量は、500Daから21kDa、たとえば1kDaから15kDa、たとえば5から15kDa、たとえば8から17kDa、たとえば10から14kDa、たとえば約12kDaであってもよい。分子量は、20から35kDa、たとえば22から32kDa、たとえば25から30kDa、たとえば約27kDaであってもよい。分子量は、35から65kDa、たとえば40から60kDa、たとえば47から57kDa、たとえば50から55kDa、たとえば約52kDaであってもよい。分子量は、50から75kDa、たとえば60から70kDa、たとえば63から67kDa、たとえば約65kDaであってもよい。分子量は、75から125kDa、たとえば90から120kDa、たとえば95から115kDa、たとえば100から112kDa、たとえば106から110kDa、たとえば約108kDaであってもよい。分子量は、125から175kDa、たとえば140から165kDa、たとえば150から165kDa、たとえば155から160kDa、たとえば約157kDaであってもよい。分子量は、5から100kDa、たとえば13から60kDa、たとえば27から40kDaであってもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされるHEPポリマーは、13から65kDa、13から60kDa、13から55kDa、13から50kDa、13から49kDa、13から48kDa、13から47kDa、13から46kDa、13から45kDa、13から44kDa、13から43kDa、13から42kDa、13から41kDa、13から40kDa、13から39kDa、13から38kDa、13から37kDa、13から36kDa、13から35kDa、13から34kDa、13から33kDa、13から32kDa、13から31kDa、13から30kDa、13から29kDa、13から28kDa、13から27kDa、13から26kDa、13から25kDa、13から21kDa、25から55kDa、25から50kDa、25から45kDa、27から40kDa、27から41kDa、27から42kDa、27から43kDa、27から43kDa、27から44kDa、27から45kDa、27から60kDa、30から45kDa、36から44kDa及び38から42kDaから選択される範囲のサイズを有する。
【００６１】
これらの分子量の範囲の下限の任意のものが、本明細書に記載のHEPポリマーの分子量の好適な範囲を形成するため、これらの範囲からの任意の上限と組み合わされてもよい。
【００６２】
本明細書に記載のFIXポリペプチドコンジュゲートに関連して、側鎖におけるHEPの使用は、インビボ循環半減期を延長する非常に柔軟な方法を提示する。なぜなら、HEPサイズの範囲が、顕著に改善した半減期をもたらすからである。
【００６３】
HEPポリマーは、高質量濃度において高度に粘稠性になる。
【００６４】
HEPポリマーは、狭いサイズ分布(すなわち、単分散)又は広いサイズ分布(すなわち、多分散)を有していてもよい。多分散性のレベルは、式Mw/Mnに基づいて数値的に表現されてもよく、式中、Mw=質量平均分子量であり、Mn=数平均分子量である。理想的な単分散ポリマーのこの式を使用した多分散性値は、1である。好ましくは、HEPポリマーは単分散である。したがって、ポリマーは、約1の多分散性を有していてもよく、多分散性は、1.25未満、好ましくは1.20未満、好ましくは1.15未満、好ましくは1.10未満、好ましくは1.09未満、好ましくは1.08未満、好ましくは1.07未満、好ましくは1.06未満、好ましくは1.05未満であってもよい。HEPの分子量サイズ分布は、アガロースゲル上を泳動できる単分散サイズ標準(HA Lo-Ladder、Hyalose LLC社)との比較により測定できる。
【００６５】
或いは、HEPポリマーのサイズ分布は、高性能サイズ排除クロマトグラフィー-多角度レーザー光散乱(SEC-MALLS)により決定できる。かかる方法を、HEPポリマーの分子量及び多分散性を評価するために使用できる。ポリマーサイズは、酵素製造法において調節できる。UDP糖に対するHEPアクセプター鎖のモル比を制御することにより、所望の最終的なHEPポリマーサイズを選択することが可能である。
【００６６】
HEPポリマーは、同期的な酵素重合反応により調製できる(US20100036001)。この方法は、パスツレラ・ムルトシダ(Pasturella multocida)に由来するヘパランシンテターゼI(PmHS1)を使用し、これは、E.coliにおいてマルトース結合タンパク質融合コンストラクトとして発現させうる。精製MBP-PmHS1は、糖ヌクレオチドの等モル混合物(GlcNAc-UDP及びGlcUA-UDP)に添加されたとき、同期的な、化学量論的に制御された反応において、単分散ポリマーを生成可能である。三糖開始剤(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)を、反応を開始するために使用でき、ポリマー長は、プライマー:糖ヌクレオチド比により決定される。重合反応は、典型的には、約90%の糖ヌクレオチドが消費されるまで実施される。ポリマーは、陰イオン交換クロマトグラフィーにより反応混合物から単離され、続いて安定的な粉末へと凍結乾燥される。
【００６７】
HEP-FIXコンジュゲートを調製するための方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のFIXポリペプチドは、本明細書に記載のHEPポリマーにコンジュゲートされる。本明細書に記載の任意のFIXポリペプチドが、本明細書に記載の任意のHEPポリマーと組み合わされてもよい。
【００６８】
半減期延長部分、たとえば炭水化物ポリマーを糖タンパク質と結合するための通常の方法は、オキシム、ヒドラゾン又はヒドラジド結合形成を含む。WO2006094810は、ヒドロキシエチルデンプンポリマーを糖タンパク質、たとえばエリスロポエチンに結合するための方法を記載し、これは、活性化エステル化学を使用することに付随する問題を回避する。これらの方法において、ヒドロキシエチルデンプン及びエリスロポエチンは、炭水化物部分の上の過ヨウ素酸イオンで個別に酸化され、反応性カルボニル基が、ビス-ヒドロキシルアミン結合剤を使用して結合される。この方法は、オキシム結合を介してエリスロポエチンに結合されたヒドロキシエチルデンプンを創出する。
【００６９】
類似したオキシムベース結合方法が、炭水化物ポリマーをGSCに結合するために考えられる(WO2011101267を参照のこと)が、かかるオキシム結合は、シン及びアンチ異性体型の両方で存在することが知られているので、ポリマーとタンパク質との間の結合は、シン及びアンチ異性体の両方の組合せを含有すると考えられる。かかる異性体混合物は、長期反復投与のために使用されるタンパク質様薬剤において、通常は望ましくない。なぜなら、リンカー不均質性により、抗体生成の危険性が生じうるからである。
【００７０】
上述の方法は、更なる欠点を有する可能性がある。糖タンパク質の活性化に必要な酸化過程において、炭水化物残基の一部が化学的に切断されることから、炭水化物は最終コンジュゲートにおいてインタクトな形態で存在しないと考えられる。更に酸化過程は、生成物の不均質性をもたらす。なぜなら、酸化剤、すなわちほとんどの場合過ヨウ素酸イオンは、いずれのグリカン残基を酸化するかに関して非特異的だからである。最終薬物コンジュゲートにおける生成物の不均質性及び非インタクトなグリカン残基の存在の両方が、免疫原性の危険性をもたらしうる。
【００７１】
炭水化物ポリマーを糖タンパク質に結合することに代わる選択肢には、マレイミド化学の使用が含まれる(WO2006094810)。たとえば、炭水化物ポリマーは、標的タンパク質上のスルフヒドリル基と選択的に反応できるマレイミド基を伴って製造できる。このとき、この結合は環式スクシンイミド基を含有すると考えられる。
【００７２】
炭水化物ポリマー、たとえばHEPを、マレイミド基を介してチオ修飾GSC分子と結合し、シアリルトランスフェラーゼにより試薬を糖タンパク質上のインタクトなグリコシル基へと転移させ、そのことにより環式スクシンイミド基を含有する結合を創出することが可能である。しかしながら、スクシンイミドベース結合は、コンジュゲートが長期間水性溶液中に保存されるときに加水分解による開環を受けうるのであり(Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版  2013 309頁)、結合がインタクトなままでありうる一方で、開環反応は、最終コンジュゲートに、位置異性体及び立体異性体の形態の望ましくない不均質性を付加すると考えられる。
【００７３】
上述のことから、1)糖タンパク質のグリカン残基がインタクトな形態で保存され、2)インタクトなグリコシル残基と半減期延長部分との間のリンカー部分に不均質性が存在しないように、半減期延長部分を糖タンパク質に結合することが好ましい。
【００７４】
当技術分野において、半減期延長部分、たとえばHEPを、タンパク質グリカン、たとえばFIXポリペプチドグリカンとコンジュゲートする方法が必要とされており、化合物は、安定的で異性体を持たないコンジュゲートが得られるように結合される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、安定的で異性体を持たないリンカーが、HEPとFIXとのシアル酸ベースコンジュゲーションにおける使用のために提供され、HEPポリマーを、誘導体化のために適切な位置でシアル酸に結合できる。適切な部位は、当業者に公知か又はWO03031464(ここにその全体が参照により組み込まれる)から推定でき、PEGポリマーは、シアル酸シチジン一リン酸に複数の方法で結合される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、シアル酸ピラノース環の位置C4及びC5が、側鎖の位置C7、C8及びC9とともに、誘導体化の点として役立ちうる。誘導体化は、好ましくは、シアル酸の存在するヘテロ原子、たとえばヒドロキシル又はアミン基を伴うが、シアル酸上の適切な結合点を与える官能基変換もまた可能性の1つである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、シアル酸N-アセチルノイラミン酸の9-ヒドロキシ基を、当技術分野において公知の方法によりアミノ基に変換できる[Eur J Biochem 168、594〜602頁(1987)]。下に示す得られた9-デオキシ-アミノN-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸は、GSCの代替物として役立ちうる活性化シアル酸誘導体である。
【００７８】
【化１】
2017507136.tif 000002
【００７９】
いくつかの実施形態において、非アミン含有シアル酸、たとえばKDNとしても公知の2-ケト-3-デオキシノノン酸もまた、同じスキームに従い、9-アミノ誘導体化シアル酸に変換できる。
【００８０】
【化２】
2017507136.tif 000003
【００８１】
類似のスキームを、シアル酸ファミリーに属するより短いC8-糖アナログのために使用できる。したがって、より短いバージョンのシアル酸、たとえばKDOとしても公知の2-ケト-3-デオキシオクトネートを、8-デオキシ-8-アミノ-2-ケト-3-デオキシオクトネートシチジン一リン酸に変換でき、C9炭素原子を欠いていないシアル酸の代替物として使用できる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ノイラミン酸シチジン一リン酸を、本発明において使用できる。この物質は、Eur J Org Chem. 2000、1467〜1482頁に記載されているように調製できる。
【００８３】
【化３】
2017507136.tif 000004
【００８４】
いくつかの実施形態において、HEPとFIXとのグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)ベースコンジュゲーションにおける使用のための安定的で異性体を持たないリンカーが提供される。本発明において使用されるGSC出発物質は、化学的に合成できる(Dufner, G. Eur. J Org Chem 2000、1467〜1482頁)か、又はそれは、WO2007056191に記載の化学酵素的経路により得られうる。GSC構造を下に示す。
【００８５】
【化４】
2017507136.tif 000005
【００８６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、以下の構造:
【００８７】
【化５】
2017507136.tif 000006
【００８８】
を含むリンカーを含み、これは、本明細書において以降、サブリンカー又はサブ連結とも呼ばれ、HEP-アミンとGSCとを以下の方法のうちの1つで接続する。
【００８９】
【化６】
2017507136.tif 000007
【００９０】
したがって、強調されている4-メチルベンゾイルサブリンカーは、半減期延長部分を標的タンパク質と結合する完全な結合構造の一部を構成する。サブリンカーはかかるものとして、代替物、たとえばスクシンイミドベースリンカー(スルフヒドリル基とのマレイミド反応から調製される)と比較して安定的な構造である。なぜなら、後者のタイプの環式結合は、コンジュゲートが長期間水性溶液中に保存されるときに加水分解による開環を受ける傾向を有する(Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版  2013 309頁)。この場合の結合(たとえばHEPと糖タンパク質上のシアル酸との間のもの)がインタクトなままでありうるとしても、開環反応は、最終コンジュゲート組成物に位置異性体及び立体異性体の形態の不均質性を付加する。
【００９１】
したがって、本発明によるコンジュゲートに伴う利点の一つは、均質な組成物が得られること、すなわち、リンカー構造及び安定性による異性体形成の傾向が顕著に減少することである。別の利点は、本発明によるリンカー及びコンジュゲートを、単純なプロセス、好ましくは一段階プロセスで製造できることである。
【００９２】
異性体は、不均質な生成物をもたらし、ヒトにおける望まれない免疫応答の危険性を増加させうることから、望ましくない。
【００９３】
本明細書に記載の方法において使用される、HEPとGSCとの間に使用される4-メチルベンゾイルサブ連結は、立体異性体又は位置異性体を形成可能ではない。非限定的一実施形態において、図5は、本発明の4-メチルベンゾイルサブ連結を使用して、第IX因子上の二分岐N-グリカン(位置N157又はN167)にコンジュゲートされたHEPを示す。
【００９４】
官能性HEPポリマーの調製方法はUS20100036001に記載されており、これはたとえば、アルデヒド、アミン及びマレイミド官能化HEP試薬を挙げている。US20100036001は、完全に本明細書に記載されているものとして、ここにその全体が参照により組み込まれる。一定の範囲の他の官能修飾されたHEP誘導体が、類似の化学を使用して利用可能である。本発明のいくつかの実施形態において使用されるHEPポリマーは、最初はUS20100036001に記載の方法により還元末端において一級アミンハンドル(primary amine handle)とともに製造される。一級アミンハンドルを有するHEPポリマー(HEP-NH2)は、たとえば、Sismey-Ragatzら、2007 J Biol Chem及びUS8088604に記載のとおり調製できる。要約すると、E. coliマルトース結合タンパク質とPmHS1との融合が、還元末端において遊離アミンを有するヘパロサンオリゴ糖アクセプターを、UDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA前駆体を有するより長い鎖へと伸長させる触媒として使用される。アクセプターは反応を同期させるので、すべての鎖が同じ長さ(準単分散サイズ分布)であり、それはまた遊離アミン基に、それに続く修飾又はカップリング反応のための糖鎖を付与する。
【００９５】
US20100036001に従い調製されたアミン官能化HEPポリマー(すなわち、アミンハンドルを有するHEP)を、4-ホルミル安息香酸N-スクシンイミジルとの反応により、HEP-ベンズアルデヒドへと変換でき、続いて還元的アミノ化反応によりGSCのグリシルアミノ基とカップリングできる。得られたHEP-GSC生成物を、続いて、シアリルトランスフェラーゼを使用して糖タンパク質と酵素的にコンジュゲートできる。
【００９６】
たとえば、HEP上の前記アミンハンドルを、下のスキームによる4-ホルミル安息香酸N-スクシンイミジルとの反応により、ベンズアルデヒド官能基へと変換できる。
【００９７】
【化７】
2017507136.tif 000008
【００９８】
上のスキームにおけるHEPアミン(1)の4-ホルミルベンズアミド化合物(2)への変換は、4-ホルミル安息香酸のアシル活性型との反応により実施できる。
【００９９】
アシル活性化基としてN-ヒドロキシスクシンイミジルを選択できるが、数多くの他のアシル活性化基が当業者に公知である。非限定的な例には、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール-、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール-、ペンタフルオロフェニル-エステルが、ペプチド化学から知られているものとして含まれる。
【０１００】
ベンズアルデヒド官能基で修飾されたHEP試薬は、乾燥形態で冷凍(-80℃)保存されたとき、長期間安定に保つことができる。
【０１０１】
或いは、ベンズアルデヒド部分を、GSC化合物に結合し、そのことにより、アミン官能化HEP部分とのコンジュゲーションに好適なGSC-ベンズアルデヒド化合物を得ることができる。この合成経路を図1に示す。
【０１０２】
たとえば、GSCを、pH中性条件下で4-ホルミル安息香酸N-スクシンイミジルと反応させ、反応性アルデヒド基を含有するGSC化合物を提供することができる。次に、アルデヒド誘導体化GSC化合物(GSC-ベンズアルデヒド)を、HEP-アミン及び還元剤と反応させ、HEP-GSC試薬を形成することができる。
【０１０３】
上述の反応は、HEP-アミンをまず4-ホルミル安息香酸N-スクシンイミジルと反応させ、アルデヒド誘導体化HEPポリマーを形成し、これを続いて還元剤の存在下でGSCと直接反応させるというように、逆にすることができる。実際には、これはGSC-CHOの冗長なクロマトグラフィーの取扱いを排除する。この合成経路を図2に示す。
【０１０４】
したがって、いくつかの実施形態において、HEP-ベンズアルデヒドは、還元的アミノ化によりGSCとカップリングされる。
【０１０５】
還元的アミノ化は、以下のとおり進行する二段階反応である。最初に、アルデヒド成分とアミン成分(本実施形態においてはGSCのグリシルアミノ基)との間にイミン(シッフ塩基としても公知である)を形成する。次に、第2の工程でイミンをアミンへと還元する。還元剤は、形成されたイミンをアミン誘導体に選択的に還元するように選択される。
【０１０６】
数多くの好適な還元試薬を当業者は利用可能である。非限定的な例には、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)、ピリジンボラン錯体(BH3:Py)、ジメチルスルフィドボラン錯体(Me2S:BH3)及びピコリンボラン錯体が含まれる。
【０１０７】
炭水化物の還元末端(たとえばHEPポリマーの還元末端)への還元的アミノ化は可能であるとはいえ、それは一般に緩徐で非効率的な反応として記述されてきた[JC. Gildersleeve、Bioconjug Chem. 2008年7月; 19(7): 1485〜1490頁]。副反応、たとえば初期に形成されたイミンがケトアミンへと転位するアマドリ反応もまた可能であり、前に論じたとおり本文脈では望ましくない不均質性をもたらすと考えられる。
【０１０８】
芳香族アルデヒド、たとえばベンズアルデヒド誘導体は、かかる転位反応を形成可能ではない。なぜなら、イミンはエノール化できず、炭水化物由来のイミンで典型的に見出される必要な隣接ヒドロキシ基も欠くからである。したがって、芳香族アルデヒド、たとえばベンズアルデヒド誘導体は、異性体を持たないHEP-GSC試薬を生成するための還元的アミノ化反応において特に有用である。
【０１０９】
還元的アミノ化化学を早期に完了させるために、過量のGSC及び還元試薬が任意選択で使用される。反応が完了するとき、過剰な(反応しなかった)GSC試薬及び他の小分子成分、たとえば過剰な還元試薬は、続いて、透析、タンジェント流濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーにより除去される。
【０１１０】
シアリルトランスフェラーゼの天然基質であるSia-CMP及びGSC誘導体の両方が、荷電し高度に親水性の多官能性分子である。加えてそれらは、とりわけpHが6.0未満である場合、溶液中で長期間安定的ではない。かかる低pHでは、基質転移に必要なCMP活性化基が、酸触媒リン酸ジエステル加水分解により失われる(Yasuhiro Kajiharaら、Chem Eur J 2011、17、7645〜7655頁)。したがって、GSC及びSia-CMP誘導体の選択的修飾及び単離は、CMP-加水分解を回避するために、慎重なpH制御を、迅速で効率的な単離方法とともに必要とする。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、大きな半減期延長部分が、還元的アミノ化化学を使用してGSCにコンジュゲートされる。アリールアルデヒド、たとえばベンズアルデヒド修飾HEPポリマーが、このタイプの修飾にとって最適であると見出された。なぜならそれらは、還元的アミノ化条件下でGSCと効率的に反応できるからである。
【０１１２】
GSCは酸媒体において加水分解を受けうるので、HEP-ベンズアルデヒドのカップリング中にほぼ中性又は若干塩基性の環境を維持することが重要である。HEPポリマー及びGSCはどちらも高度に水溶性であることから、水性緩衝系は、pHをほぼ中性のレベルに維持することが好ましい。数多くの有機及び無機両方の緩衝液を使用できる。しかしながら、緩衝液成分は、好ましくは、還元的アミノ化条件下で反応性であるべきではない。このことは、たとえば、一級及びより低い程度で二級アミノ基を含有する有機緩衝系を排除する。本記述から情報を得て、当業者は、どの緩衝液が好適で、どれが好適でないかを知ると考えられる。好適な緩衝液のいくつかの例を、下の表1に示す。
【０１１３】
【表１】
2017507136.tif 000009
【０１１４】
この方法を適用することにより、HEP等の半減期延長部分で修飾されたGSC試薬は、異性体フリーの安定的な結合を有し、効率的に調製され、CMP活性化基の加水分解の可能性を最小化する単純なプロセスにおいて単離されうる。
【０１１５】
前記化合物のいずれかを互いに反応させることにより4-メチルベンゾイルサブリンカー部分を含むHEP-GSCコンジュゲートを創出できる。
【０１１６】
GSCはまた、チオブチロラクトンと反応させ、そのことによりチオール修飾GSC分子(GSC-SH)を創出してもよい。かかる試薬を、マレイミド官能化HEPポリマーと反応させ、HEP-GSC試薬を形成してもよい。この合成経路を図3に示す。得られた生成物は、スクシンイミドを含む結合構造を有する。
【０１１７】
【化８】
2017507136.tif 000010
【０１１８】
しかしながら、スクシンイミドベース(サブ)結合は、とりわけ修飾GSC試薬が長期間水性溶液中に保存されるときに加水分解による開環を受けうるのであり、結合がインタクトなままでありうる一方で、開環反応は、位置異性体及び立体異性体の形態の望ましくない不均質性を付加すると考えられる。
【０１１９】
糖コンジュゲーション(glycoconjugation)の方法
HEP-GSCコンジュゲートとポリペプチドとのコンジュゲーションは、ポリペプチド骨格の残基上に存在するグリカンを介して実施できる。この形態のコンジュゲーションはまた、糖コンジュゲーションと呼ばれる。
【０１２０】
システインアルキル化、リジンアシル化に基づくコンジュゲーション方法及びタンパク質骨格におけるアミノ酸を伴う類似のコンジュゲーションとは対照的に、グリカンを介したコンジュゲーションは、HEPポリマー等のより大きな構造を、生物活性による妨害を少なくして生物活性タンパク質に結合する有望な方法である。これはなぜなら、グリカンが高度に親水性であり、一般に、タンパク質表面とは逆方向に溶液中へと向く傾向にあり、タンパク質活性に重要な結合表面を自由にするからである。
【０１２１】
グリカンは、天然であってもよく、又はそれは、たとえば当技術分野において周知の方法を使用したN結合グリカンの挿入を介して挿入されてもよい。
【０１２２】
HEPポリマーの糖コンジュゲーションのための方法には、ガラクトースオキシダーゼベースコンジュゲーション(WO2005014035)及び過ヨウ素酸ベースコンジュゲーション(WO2008025856)が含まれる。シアリルトランスフェラーゼに基づく方法は、長年にわたり、FIX等の血液凝固因子上のN-グリカン又はO-グリカンを修飾するための穏やかで高度に選択的な方法とされてきた。
【０１２３】
GSCは、シアリルトランスフェラーゼの使用により糖タンパク質に転移させることができるシアル酸誘導体である。それは、置換基、たとえばグリシルアミノ基上のPEG又はHEPで選択的に修飾されうるのであり、それでもシアリルトランスフェラーゼを使用して糖タンパク質に酵素的に転移させることができる。GSCは、大規模な酵素過程により効率的に調製できる(WO2007056191)。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、FIXグリカン上の末端シアル酸は、シアリダーゼ処理により除去され、アシアロFIXを提供する。アシアロFIX及びHEPで修飾されたGSCはともに、シアリルトランスフェラーゼのための基質として作用すると考えられる。シアリルトランスフェラーゼ反応の生成物は、グリカン上のインタクトなグリコシル連結基を介してHEPが結合したHEP-FIXコンジュゲートである。
【０１２５】
シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、自然に活性化されたシアル酸(Sia)-CMP(シチジン一リン酸)化合物からシアル酸を、たとえばタンパク質上のガラクトシル部分へと転移させるグリコシルトランスフェラーゼの一種である。多くのシアリルトランスフェラーゼ(ST3GalIII、ST3GalI、ST6GalNAcI)が、C5アセトアミド基上においてとりわけ40kDaのPEG等の大きな基で修飾されたシアル酸-CMP(Sia-CMP)誘導体の転移を可能にする(WO03031464)。本発明で使用できる関連シアリルトランスフェラーゼの広範ではあるが非限定的なリストが、WO2006094810に開示されており、ここにその全体が参照により組み込まれる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、糖タンパク質上の末端シアル酸は、シアリダーゼ処理により除去され、アシアロ糖タンパク質を提供する。アシアロ糖タンパク質及び半減期延長部分で修飾されたGSCはともに、シアリルトランスフェラーゼのための基質として作用すると考えられる。反応の生成物は、インタクトなグリコシル連結基、この場合にはインタクトなシアル酸リンカー基を介して半減期延長部分が結合した糖タンパク質コンジュゲートである。アシアロFIX糖タンパク質をシアリルトランスフェラーゼの存在下でHEP-GSCと反応させる反応スキームを、図13に示す。
【０１２７】
HEP-FIXコンジュゲートの特性
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、様々な有利な生物学的特性を有する。たとえば、コンジュゲートは、好適な対照FIX分子と比較した以下の(非限定的)利点のうちの1つ又は複数を示しうる。
-  改善されたインビボでの循環半減期
-  改善されたインビボでの平均滞在時間
-  改善されたインビボでの生分解性
-  FIXノックアウトマウスにおける尾静脈離断(TVT)モデルにおける改善された出血時間及び失血
-  様々なaPTTベースアッセイにおける改善されたアッセイ間変動
【０１２８】
コンジュゲートは、本明細書に記載のFIXの任意の生物学的活性における改善を示してもよく、これは、本明細書に記載の任意のアッセイ又は方法、たとえばFIXの活性に関して下に記載の方法を使用して測定されてもよい。
【０１２９】
本発明のコンジュゲートが好適な対照FIX分子と比較されるときに、利点が見出されうる。対照分子は、たとえば、非コンジュゲートFIXポリペプチドであっても、コンジュゲートFIXポリペプチドであってもよい。コンジュゲート対照は、水溶性ポリマーにコンジュゲートされたFIXaポリペプチドであっても、タンパク質に化学的に結合されたFIXaポリペプチドであってもよい。コンジュゲートFIX対照は、目的のコンジュゲートにおけるHEP分子と同等のサイズの化学的部分(タンパク質又は水溶性ポリマーである)にコンジュゲートされたFIXポリペプチドであってもよい。水溶性ポリマーは、たとえば、PEG、分枝状PEG、デキストラン、ポリ(1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)又は2-メタクリロイルオキシ-2'-エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)でありうる。
【０１３０】
対照FIX分子におけるFIXポリペプチドは、好ましくは、目的のコンジュゲートに存在するのと同じFIXポリペプチドである。たとえば、対照FIX分子は、目的のコンジュゲートにおけるFIXポリペプチドと同じアミノ酸配列を有していてもよい。対照FIXは、目的のコンジュゲートにおけるFIXポリペプチドと同じグリコシル化パターンを有していてもよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、好適な対照と比較して、循環半減期、又は平均滞在時間に改善がある。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、野生型タンパク質分子と比較して改変された循環半減期、好ましくは増加した循環半減期を有する。循環半減期は、好ましくは、少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも35%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも45%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも125%、より好ましくは少なくとも150%、より好ましくは少なくとも175%、より好ましくは少なくとも200%、最も好ましくは少なくとも250%又は300%増加する。より一層好ましくは、かかる分子は、少なくとも400%、500%、600%、又は700%まで増加した循環半減期を有する。
【０１３３】
比較される活性がFIXの生物学的活性、たとえば、凝固活性又はタンパク質分解である場合、対照は、本発明のHEPコンジュゲートと同等のサイズの水溶性ポリマーにコンジュゲートされた好適なFIXポリペプチドでありうる。
【０１３４】
コンジュゲートは、HEPの付加により修飾されていないFIXに見出される生物学的活性のレベルを保持していなくてもよい。好ましくは、コンジュゲートは、可能な限り非コンジュゲートFIXの生物学的活性を保持する。たとえば、コンジュゲートは、非コンジュゲートFIX対照の生物学的活性の少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%を保持していてもよい。上で論じたとおり、対照は、コンジュゲートにおけるFIXポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するが、HEPを欠くFIX分子であってもよい。しかしながら、コンジュゲートは、好適な対照と比較して、生物学的活性の改善を示してもよい。ここでの生物学的活性は、本明細書に記載のFIXの任意の生物学的活性、たとえば凝固活性又はタンパク質分解活性であってもよい。
【０１３５】
本明細書に記載の好適な対照と比較して改善した生物学的活性は、生物学的活性における任意の測定可能又は統計的に有意な増加であってもよい。生物学的活性は、本明細書に記載のFIXの任意の生物学的活性、たとえば凝固活性、タンパク質分解活性、出血時間及び失血の減少であってもよい。増加は、たとえば、好適な対照における同じ活性と比較して、関係する生物学的活性における少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%以上の増加であってもよい。
【０１３６】
本明細書に記載のコンジュゲートの利点は、HEPポリマーが酵素的に生分解可能な点である。したがって、コンジュゲートは、好ましくは、インビボで酵素的に生分解可能である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、FIXに結合されたHEPポリマーを含むコンジュゲートは、異なるaPTTベース凝固アッセイを使用する際に、有意なアッセイ間変動を減少させるか、又は引き起こさない。
【０１３８】
組成物
別の一態様において、本発明は、本明細書に記載のコンジュゲートを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体とともに配合される1つ又は複数のコンジュゲートを含む。
【０１３９】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性である、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。
【０１４０】
好ましい薬学的に許容される担体には、水性担体又は希釈剤が含まれる。本発明の医薬組成物において用いることのできる好適な水性担体の例には、水、緩衝水及び生理食塩水が含まれる。他の担体の例には、エタノール、ポリオール(たとえばグリセロール、プロピレングリコール、PEG等)、及びそれらの好適な混合物、植物油、たとえばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、たとえばオレイン酸エチルが含まれる。たとえば、コーティング材料、たとえばレシチンの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持できる。多くの場合、組成物中に等張剤、たとえば、糖、多価アルコール、たとえばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいと考えられる。
【０１４１】
医薬組成物は、予防的及び/又は治療的処置のための非経口投与が主に意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口、すなわち、静脈内、皮下、若しくは筋肉内投与されるか、又はそれは、持続又は拍動性注入により投与されてもよい。非経口投与のための組成物は、本発明のFIXコンジュゲートを、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体と組み合わせて、好ましくはその中に溶解させて含む。様々な水性担体、たとえば水、緩衝水、0.9%生理食塩水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシン等を使用できる。本明細書に記載のFIXコンジュゲートはまた、傷害部位への送達又は標的化のためのリポソーム調製物中に配合できる。リポソーム調製物は一般に、たとえば、US4837028、US4501728及びUS4975282に記載されている。組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌できる。得られた水性溶液を、無菌条件下で使用のためにパッケージ又は濾過し、凍結乾燥でき、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性溶液と組み合わせられる。組成物は、生理条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、たとえばpH調整剤及び緩衝剤、等張性調整剤等、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含有していてもよい。
【０１４２】
これらの配合物中のFIXコンジュゲートの濃度は、広範に、すなわち、約0.5質量%未満、通常は約1質量%又は少なくとも約1質量%から、15又は20質量%まで変化する場合があり、選択された特定の投与方法に従って、主に流体体積、粘度等により選択されると考えられる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知か又は彼らにとって明らかであり、たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、Easton、PA (1990)により詳細に記載されている。
【０１４３】
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の秩序立った構造として製剤できる。
【０１４４】
組成物は、無菌であるべきであり、容易に注入可能な程度の流体であるべきである。組成物は、製造及び保存条件下で安定であるべきであり、微生物、たとえば細菌及び真菌の汚染作用に抗して保存されうる。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、それらは、活性剤と任意の追加の所望の成分との粉末を、以前に滅菌濾過したそれらの溶液からもたらす。
【０１４５】
微生物の活動の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合、組成物中に等張剤、たとえば、糖、塩化ナトリウム、又は多価アルコール、たとえばマンニトール及びソルビトールを含むことが好ましいと考えられる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる試剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物中に含めることによりもたらされうる。
【０１４６】
滅菌注射可能溶液は、本明細書に記載のコンジュゲートを必要な量で、上に挙げた成分の1つ又は組合せとともに適切な溶媒中に組み込むことにより調製でき、必要であれば、続けて滅菌濾過できる。一般に、分散液は、基本の分散媒体及び上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌担体中にコンジュゲートを組み込むことにより調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製方法は、真空乾燥、噴霧乾燥、噴霧凍結及び凍結乾燥を含んでいてもよく、それらは、活性成分(すなわち、HEPコンジュゲート)と任意の追加の所望の成分との粉末を、以前に滅菌濾過したそれらの溶液からもたらす。
【０１４７】
組成物は、投与の簡便さ及び用量の均一性のため、用量単位形態で配合されてもよい。本明細書において使用される用量単位形態は、治療される対象のための単回用量に合わせて物理的に区分された単位を指し、各単位は、所望の治療効果をもたらすよう算出された所定の量のコンジュゲートを含有する。請求項に記載され開示された本発明の用量単位形態の詳細は、(a)HEPコンジュゲートの固有特性及び達成されるべき特定の治療効果、並びに(b)対象における選択された病態の治療のためのかかる治療化合物を配合する技術分野に固有の制限により定められ、それらに直接左右される。
【０１４８】
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載のコンジュゲートに加えて、追加の活性成分を含んでいてもよい。たとえば、医薬組成物は、追加の治療剤又は予防剤を含んでいてもよい。たとえば、医薬組成物が、出血障害の治療における使用のために意図されている場合、それは、出血障害の症状を減少させることが意図された1つ又は複数の試剤を追加で含んでいてもよい。たとえば、組成物は、1つ又は複数の追加の凝固因子を含んでいてもよい。組成物は、患者の病態を改善することが意図された1つ又は複数の他の成分を含んでいてもよい。たとえば、組成物が、望ましくない出血に苦しむ患者、たとえば手術を受ける患者又は外傷を負っている患者の治療における使用のために意図されている場合、組成物は、1つ又は複数の鎮痛剤、麻酔剤、免疫抑制剤又は抗炎症剤を含んでいてもよい。
【０１４９】
組成物を、特定の方法における使用又は特定の経路による投与のために配合できる。本発明のコンジュゲート又は組成物は、非経口、腹腔内、髄腔内、静脈内、筋肉内、腟内、皮下、鼻腔内、直腸内又は脳内投与できる。
【０１５０】
本明細書に記載のHEP-FIXポリペプチドコンジュゲートの有利な特性は、ポリマーが約13から65kDaの範囲(特に13から55kDa、13から50kDa、13から45kDa、13から40kDa、25から55kDa、25から50kDa、25から45kDa、30から45kDa又は38から42kDa)のポリマーサイズを有し、このことが、インビボで有用な半減期又は平均滞在時間を可能にする一方で、液状溶液において好適な粘度も有しうる点である。
【０１５１】
コンジュゲートの使用
本明細書に記載のコンジュゲートは、それを必要とする個体に、FIXポリペプチドをその個体に送達するために投与されてもよい。個体は、FIXポリペプチドを必要とする任意の個体であってよい。
【０１５２】
本発明によるFIXポリペプチドコンジュゲートは、たとえば、凝固因子欠損(たとえば血友病B)又は凝固因子阻害因子により引き起こされうる出血障害を制御するために使用でき、又はそれらは、正常に機能する血液凝固カスケードを有する対象(凝固因子欠損又は任意の凝固因子に対する阻害因子がない)において生じる過度の出血を制御するために使用できる。
【０１５３】
計画的介入と関連する治療について、本発明のFIXポリペプチドコンジュゲートは、典型的には、介入を実施する前約24時間以内に、又は延長された半減期ゆえにもっと早期に投与され、その後7日間以上にわたって投与されると考えられる。投与は、本明細書に記載の様々な経路により実施できる。
【０１５４】
送達されるFIXポリペプチドの用量は、70kgの対象について、負荷用量及び維持用量として、病態の重症度に応じて、1日当たり約0.05mgから500mgのFIXポリペプチドコンジュゲート、好ましくは1日当たり約1mgから100mg、より好ましくは1日当たり約5mgから約75mgでありうる。好適な用量はまた、本発明の特定のコンジュゲートのために、そのコンジュゲートの特性、たとえばそのインビボ半減期又は平均滞在時間及びその生物学的活性に基づいて調整できる。たとえば、より長い半減期を有するコンジュゲートを、減少した用量で投与でき、且つ/又は野生型FIXと比較して減少した活性を有する組成物を増加した用量で投与できる。
【０１５５】
本発明のFIXポリペプチドコンジュゲートを含有する組成物を、予防的及び/又は治療的処置のために投与できる。治療的応用において、組成物は、疾患、たとえば上述の任意の出血障害にすでに罹患している対象に、疾患及びその合併症を治癒、緩和又は部分的抑止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。当業者には理解されると考えられるとおり、この目的のために有効な量は、疾患又は傷害の重症度並びに対象の体重及び一般的状態に依存すると考えられる。しかしながら、一般に有効送達量は、70kgの対象にとって1日当たり約0.05mgから約500mgまでの範囲のFIXポリペプチドコンジュゲートであると考えられ、1日当たり約1.0mgから約100mgの用量のコンジュゲートが送達され、より一般的には使用される。
【０１５６】
本明細書に記載のコンジュゲートは、一般的に、重症疾患又は傷害状態、すなわち、生命を脅かすか、又は潜在的に生命を脅かす状況において用いられてもよい。かかる場合には、外来性物質の最小化及びヒトにおいてヒトFIXポリペプチド変異体が免疫原性を一般的に欠いているという観点から、実質的に過量のこれらのFIXコンジュゲート組成物を投与することが、治療する医師により所望されると考えられるだろう。予防的適用において、本発明のFIXコンジュゲートを含有する組成物は、疾患状態又は傷害になりやすいか、又はさもなければその危険のある対象に、対象自身の凝固能力を増強するために投与される。かかる量は、「予防有効量」と定義される。予防的適用において、送達されるFIXポリペプチドコンジュゲートの正確な量はやはり、対象の健康状態及び体重に依存するが、用量は一般的に、70kgの対象について1日当たり約0.05mgから約500mg、より一般的には70kgの対象について1日当たり約1.0mgから約100mgの範囲である。
【０１５７】
組成物の単回又は複数回投与を、治療する医師により選択される用量レベル及びパターンで実施できる。毎日の維持レベルが必要な緊急の対象については、FIXポリペプチドコンジュゲートは、たとえば携帯ポンプシステムを使用した持続注入により投与できる。
【０１５８】
本発明のFIXコンジュゲートの局所送達、たとえば局所適用は、たとえば、噴霧、灌流、二重バルーンカテーテル、代用血管内に組み込まれたステント(stent)若しくはステント(stents)、バルーンカテーテルをコーティングするために使用されるヒドロゲル、又は他のよく確立された方法により実施できる。いずれにせよ、医薬組成物は、対象を有効に治療するのに十分な量のFIXポリペプチドコンジュゲートを提供すべきである。
【０１５９】
定義
特に定義しない限り、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、概して本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１６０】
本明細書において使用される「対象」という用語は、任意のヒト患者、又は非ヒト脊椎動物を含む。
【０１６１】
「治療」という用語は、それを必要とする任意のヒト又は他の脊椎動物対象の医学療法を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が前記ヒト又は他の脊椎動物の健康にとって有益であることを示すと考えられる暫定的又は最終的診断を下す医療従事者又は獣医により理学的検査を受けていることが期待される。前記治療のタイミング及び目的は、対象の健康の現状に従い、個体によって変化してもよい。したがって、前記治療は、予防的、緩和的、対症的及び/又は治癒的であってもよい。本発明の観点から、予防的、緩和的、対症的及び/又は治癒的治療は、本発明の別個の態様を表していてもよい。
【０１６２】
「凝固障害」という用語は、正常な凝固カスケードの任意の凝固促進性成分の任意の定性的又は定量的欠損、又は線維素溶解の任意の上方制御により引き起こされうる出血傾向の増加を指す。かかる凝固障害は、先天性及び/又は後天性及び/又は医原性でありうるのであり、当業者により同定される。
【０１６３】
「グリカン」という用語は、単一のアミノ酸残基に共有結合されたオリゴ糖構造全体を指す。グリカンは、通常はN結合又はO結合であり、たとえばグリカンは、アスパラギン残基(N結合グリコシル化)又はセリン若しくはトレオニン残基(O結合グリコシル化)に結合される。N結合オリゴ糖鎖は、多分岐、たとえば二、三、又は四分岐でありうるのであり、最も多くの場合、Man3-GlcNAc-GlcNAc-のコア構造を含有する。N-グリカン及びO-グリカンの両方が、タンパク質を生成する細胞によりタンパク質に結合される。細胞性N-グリコシル化機構は、新生タンパク質がリボソームから小胞体に移行するときに、アミノ酸鎖におけるコンセンサスモチーフ(N-X-S/Tモチーフ)を認識し、N-グリコシル化する[Kielyら(1976) Journal of Biological Chemistry 251、5490〜5495頁; Glabeら(1980) Journal of Biological Chemistry 255、9236〜9242頁]。いくつかの糖タンパク質は、ヒトにおいてインサイチューで生成されるとき、末端又は「キャッピング」シアル酸残基を有する、すなわち、各分岐の末端糖がa2->3又はa2->6結合を介してガラクトースに結合されたN-アセチルノイラミン酸であるグリカン構造を有する。他の糖タンパク質は、他の糖残基で末端をキャッピングされたグリカンを有する。しかしながら、他の状況において生成されたとき、糖タンパク質は、それらの分岐のうちの1つ又は複数に異なる末端構造を有する、たとえばガラクトースの代わりにN-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)残基を含有するか、又は末端N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基を含有するオリゴ糖鎖を含有しうる。
【０１６４】
本明細書においてペプチド薬を患者に投与する文脈で使用される「半減期」という用語は、患者における薬物の血漿中濃度が2分の1に減少するのに必要な時間を指す。
【０１６５】
「半減期延長部分」という用語は、数多くの治療用タンパク質/ペプチドのインビボ循環半減期を、これらのタンパク質/ペプチドにコンジュゲートされたときに増加させることができる、1つ又は複数の化学基を指す。半減期延長部分の例には、生体適合性脂肪酸及びそれらの誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、たとえばヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)並びにそれらの任意の組合せが含まれる。
【０１６６】
「第IX因子活性の回復」という用語は、aPTTアッセイにおいて、発色アッセイを使用して測定された活性のパーセントで測定された活性を指す。
【０１６７】
「シアル酸」という用語は、9-炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、N-アセチルノイラミン酸(2-ケト-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノース-1-オン酸)(多くの場合、Neu5Ac、NeuAc、NeuNAc、又はNANAと短縮される)である。ファミリーの第2のメンバーは、N-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5Gc又はNeuGc)であり、NeuNAcのN-アセチル基がヒドロキシル化されている。第3のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソニン酸(KDN)である[Nadanoら(1986) J Biol Chem 261: 11550〜11557頁; Kanamoriら、J Biol Chem 265: 21811〜21819頁(1990)]。また含まれるのが、9-置換シアル酸、たとえば9-O-C1〜C6アシル-Neu5Ac、たとえば9-O-ラクチルNeu5Ac又は9-O-アセチル-Neu5Acである。シアル化手順におけるシアル酸化合物の合成及び使用は、国際出願WO92/16640、1992年10月1日公開に開示されている。
【０１６８】
「シアル酸誘導体」という用語は、1つ又は複数の化学的部分で修飾された上に定義したシアル酸を指す。修飾基は、たとえばアルキル基、たとえばメチル基、アジド-及びフルオロ基、又は他の化学的部分を結合するためのハンドルとして機能することができる官能基、たとえばアミノ又はチオール基であってもよい。例には、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Ac及び9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acが含まれる。この用語はまた、1つ若しくは複数の官能基、たとえばカルボキシル基又は1つ若しくは複数のヒドロキシル基を欠くシアル酸を包含する。カルボキシル基がカルボキサミド基又はエステル基と置き換えられる誘導体もまた、この用語により包含される。この用語はまた、1つ又は複数のヒドロキシル基がカルボニル基に酸化されたシアル酸を指す。更にこの用語は、たとえば過ヨウ素酸イオンでの酸化処理後に、C9炭素原子又はC9〜C8炭素鎖の両方を欠くシアル酸を指す。
【０１６９】
グリシルシアル酸は、NeuNAcのN-アセチル基が、アミノアセチル基としても公知のグリシル基と置き換えられた、上の定義によるシアル酸誘導体である。グリシルシアル酸は、以下の構造で表せる。
【０１７０】
【化９】
2017507136.tif 000011
【０１７１】
「CMP-活性化」シアル酸又はシアル酸誘導体という用語は、シアル酸部分及びシチジン一リン酸(CMP)を含有する糖ヌクレオチドを指す。
【０１７２】
本記述において、「グリシルシアル酸シチジン一リン酸」という用語は、GSCを記述するために使用され、同じCMP活性化グリシルシアル酸の代替名と同義語である。代替名には、CMP-5'-グリシルシアル酸、シチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルノイラミン酸、シチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルシアル酸が含まれる。
【０１７３】
「インタクトなグリコシル連結基」という用語は、グリコシル部分に由来する連結基を指し、そこでは、ポリペプチドとHEP部分との間に挿入され、それらと共有結合された糖モノマーは、コンジュゲート形成中に、たとえばメタ過ヨウ素酸ナトリウムにより分解、たとえば酸化しない。「インタクトなグリコシル連結基」は、グリコシル単位の付加又は親糖構造からの1つ又は複数のグリコシル単位の除去により、天然オリゴ糖に由来しうる。
【０１７４】
「アシアロ糖タンパク質」という用語は、ガラクトース又はN-アセチルガラクトサミンの基底「層」から少なくとも1つのガラクトース又はN-アセチルガラクトサミン残基を露出させる(「露出ガラクトース残基」)、たとえばシアリダーゼでの処理又は化学的処理により、1つ又は複数の末端シアル酸残基が除去された糖タンパク質を含むことが意図される。
【０１７５】
構造式における点線は、開いた原子価結合(すなわち、構造を他の化学的部分と接続する結合)を意味する。
【０１７６】
更なる実施形態
一実施形態において、HEPにコンジュゲートされたFIXポリペプチドは、野生型FIXである。
【０１７７】
一実施形態において、HEPにコンジュゲートされたFIXポリペプチドは、野生型FIX(a)である。
【０１７８】
別の一実施形態において、HEPにコンジュゲートされたFIXポリペプチドは、野生型FIX又はFIX(a)と>95%の配列同一性を有するアナログ又は変異体である。
【０１７９】
一実施形態において、HEP-FIXポリペプチドコンジュゲートのFIXは、タンパク質分解活性が増加するように変異させられている。
【０１８０】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、5から15kDaの分子量を有する。
【０１８１】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、15から25kDaの分子量を有する。
【０１８２】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、25から35kDaの分子量を有する。
【０１８３】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、35から45kDaの分子量を有する。
【０１８４】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、45から55kDaの分子量を有する。
【０１８５】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、55から65kDaの分子量を有する。
【０１８６】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、13から60kDaの分子量を有する。
【０１８７】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、13から50kDaの分子量を有する。
【０１８８】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、13から45kDaの分子量を有する。
【０１８９】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、13から40kDaの分子量を有する。
【０１９０】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、13から35kDaの分子量を有する。
【０１９１】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、13から30kDaの分子量を有する。
【０１９２】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、13から25kDaの分子量を有する。
【０１９３】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、27から40kDaの分子量を有する。
【０１９４】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、27から41kDaの分子量を有する。
【０１９５】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、27から42kDaの分子量を有する。
【０１９６】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、27から43kDaの分子量を有する。
【０１９７】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、27から44kDaの分子量を有する。
【０１９８】
一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、27から45kDaの分子量を有する。
【０１９９】
一実施形態において、HEPポリマーは、約5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、175、180、190、又は200kDaのサイズを有する。
【０２００】
好ましい一実施形態において、FIXポリペプチドにコンジュゲートされたHEPポリマーは、40kDa+/-10%の分子量を有する。
【０２０１】
一実施形態において、末端アミンを有するHEPを製造するための高収率方法が開示される。
【０２０２】
一実施形態において、目的の化合物とのコンジュゲーションに好適な、ベンズアルデヒド部分で官能化されたGSC化合物が提供される。
【０２０３】
一実施形態において、ベンズアルデヒド部分がGSC化合物に結合され、そのことにより、アミン基で官能化されたHEPポリマーとのコンジュゲーションに好適なGSC-ベンズアルデヒド化合物がもたらされる(図1を参照のこと)。
【０２０４】
一実施形態において、4-ホルミル安息香酸がHEPポリマーと化学的にカップリングされ、続いて還元的アミノ化によりGSCとカップリングされる(図2を参照のこと)。
【０２０５】
好ましい一実施形態において、本発明は、4-メチルベンゾイルサブリンカーがHEP及びGSCと接続する、GSCベース試薬を提供する(図4を参照のこと)。
【０２０６】
一実施形態において、HEPポリマーは、4-メチルベンゾイル-GSCベースコンジュゲーションを使用して、FIXポリペプチドにコンジュゲートされる。
【０２０７】
一実施形態において、アミノ基を含むHEPポリマー部分を、4-ホルミル安息香酸と反応させ、続いて還元的アミノ化によりGSCのグリシルアミノ基とカップリングする。
【０２０８】
一実施形態において、反応性アミンを含むHEPポリマーは、ベンズアルデヒド部分で官能化されたGSC化合物にコンジュゲートされ、前記アミンを前記ベンズアルデヒド部分と反応させ、4-メチルベンゾイルサブ連結部分を含む、HEPとGSCとの間のリンカーをもたらす。
【０２０９】
別の一実施形態において、HEPポリマーは、反応性ベンズアルデヒドで官能化され、GSC化合物のグリシルアミン部分にコンジュゲートされ、前記ベンズアルデヒドをアミンと反応させ、4-メチルベンゾイルサブ連結部分を含む、HEPとGSCとの間のリンカーをもたらす。
【０２１０】
一実施形態において、HEP-GSCコンジュゲートは、FIXポリペプチドに更にコンジュゲートされ、HEPポリマーが4-メチルベンゾイルサブ連結部分を介して前記FIXポリペプチドに結合されたコンジュゲートをもたらす。
【０２１１】
一実施形態において、WO2007056191に従い調製されたGSCを、還元条件下でベンズアルデヒド部分を含むHEPポリマー部分と反応させる。
【０２１２】
一実施形態において、GSCとのカップリングに好適な様々なHEP-ベンズアルデヒド化合物が提供される。
【０２１３】
一実施形態において、HEPとGSCとの間のサブリンカーは、立体異性体又は位置異性体を形成可能でない。
【０２１４】
一実施形態において、HEPとGSCとの間のサブリンカーは、立体異性体又は位置異性体を形成可能でなく、したがって、ヒトにおいて免疫応答を生成する可能性が低い。
【０２１５】
一実施形態において、HEPポリマーは、4-メチルベンゾイル-GSCを含む化学リンカーを使用してFIXポリペプチドに結合される。
【０２１６】
一実施形態において、HEP-GSCは、FIXポリペプチドN-グリカンHEPコンジュゲートを調製するために使用される(図5を参照のこと)。
【０２１７】
一実施形態において、HEP-GSCは、ST3GalIIIを使用してFIXポリペプチドN-グリカンHEPコンジュゲートを調製するために使用される。
【０２１８】
一実施形態において、HEP-GSCは、ST3GalIを使用してFIXポリペプチドO-グリカンHEPコンジュゲートを調製するために使用される。
【０２１９】
一実施形態において、HEPポリマーは、FIX活性化ペプチド、たとえば配列番号1のN157又はN167上のN-グリカンに結合される。
【０２２０】
別の一実施形態において、HEPポリマーは、FIX活性化ペプチド上のO-グリカン、たとえば配列番号1の位置159、169又は172のO-グリカンに結合される。
【０２２１】
一実施形態において、選択されたHEPポリマーサイズは、インビボで有用な半減期を可能にする一方で、同時に、FIXaに適切なインビボ活性を維持する一方で、液状溶液中で好適な粘度も有する。
【０２２２】
一実施形態において、液状配合物中で好適な粘度を達するため、73kDa未満のHEPポリマーサイズが選択される。
【０２２３】
一実施形態において、液状配合物中で好適な粘度を達するため、52kDa未満のHEPポリマーサイズが選択される。
【０２２４】
一実施形態において、液状配合物中で好適な粘度を達するため、40kDa以下のHEPポリマーサイズが選択される。
【０２２５】
一実施形態において、本発明において使用されるCMP活性化シアル酸誘導体は、以下の構造により表される。
【０２２６】
【化１０】
2017507136.tif 000012
【０２２７】
式中、R1は、-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPrから選択され、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は独立に、-H、-NH2、-SH、-N3、-OH、-F又はグリシルアミド基、たとえば-NHC(O)CH2NH2から選択できる。
【０２２８】
一実施形態において、R1は、-COOHであり、R2は、Hであり、R3=R5=R6=R7=-OHであり、R4は、-NHC(O)CH2NH2であり、シアル酸誘導体は、CMP活性化されている。
【０２２９】
一実施形態において、CMP活性化シアル酸は、以下の構造を有するGSCである。
【０２３０】
【化１１】
2017507136.tif 000013
【０２３１】
一実施形態において、シアル酸誘導体は、CMP基の除去後にFIXポリペプチドグリカンと接続され、以下の構造を有する。
【０２３２】
【化１２】
2017507136.tif 000014
【０２３３】
式中、開いた原子価結合は、FIXとの結合を表し、
式中、R1は、-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPrから選択され、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は独立に、-H、-NH2、-SH、-N3、-OH、-F又はグリシルアミド基、たとえば-NHC(O)CH2NH2から選択できる。
【０２３４】
一実施形態において、HEPポリマーは、前記シアル酸誘導体のグリシルアミド基に接続される。
【０２３５】
以下は、本発明の態様の非限定的な列挙である。
【０２３６】
1.反応性アミンを有する半減期延長部分を反応性アミンを有するGSC部分と結合する方法であって、半減期延長部分上の反応性アミンを、まず活性化4-ホルミル安息香酸と反応させ、式A1
【０２３７】
【化１３】
2017507136.tif 000015
【０２３８】
の化合物を得て、
これを続いて還元条件下でGSC部分と反応させ、式A2
【０２３９】
【化１４】
2017507136.tif 000016
【０２４０】
に記載の化合物を得る、方法。
【０２４１】
2.反応性アミンを有する半減期延長部分を反応性アミンを有するGSC部分と結合する方法であって、GSC部分上の反応性アミンを、まず活性化4-ホルミル安息香酸と反応させ、式A3
【０２４２】
【化１５】
2017507136.tif 000017
【０２４３】
に記載の化合物を得て、
これを続いて還元条件下で半減期延長部分上の反応性アミンと反応させ、式A4
【０２４４】
【化１６】
2017507136.tif 000018
【０２４５】
に記載の化合物を得る、方法。
【０２４６】
3.半減期延長部分がヘパロサンポリマーである、態様1から3のいずれか一項に記載の方法。
【０２４７】
4.4-ホルミルベンゾイル基で修飾されたヘパロサンポリマー(AA1)
【０２４８】
【化１７】
2017507136.tif 000019
【０２４９】
を、還元剤の存在下でGSC(BB1)
【０２５０】
【化１８】
2017507136.tif 000020
【０２５１】
と反応させ、試薬(CC1)
【０２５２】
【化１９】
2017507136.tif 000021
【０２５３】
(式中、nは、5から450の整数である)を得る、態様1に記載の方法。
【０２５４】
5.GSCにコンジュゲートされた半減期延長部分を第IX因子ポリペプチドに酵素的にコンジュゲートしてコンジュゲートを得る引き続く工程を更に含み、ここで半減期延長部分が、4-メチルベンゾイルサブリンカーを含み、GSCのシチジン一リン酸基が欠失したリンカーを介してタンパク質に結合される、態様1から4のいずれか一項に記載の方法。
【０２５５】
6.態様1から5のいずれか一項に記載の方法により得られる生成物。
【０２５６】
本発明は、以下の非限定的実施形態により更に説明される。
【０２５７】
1.第IX因子ポリペプチド、連結部分、及びヘパロサンポリマーを含むコンジュゲートであって、第IX因子ポリペプチド及びヘパロサンポリマーを接続する連結部分が、以下で示されるようにXを含み、
[ヘパロサンポリマー]-[X]-[第IX因子ポリペプチド]
式中、Xが、以下の式E1
【０２５８】
【化２０】
2017507136.tif 000022
【０２５９】
に記載の部分を第IX因子ポリペプチドと接続するシアル酸誘導体を含む、コンジュゲート。
【０２６０】
2.シアル酸誘導体が、以下の式E2
【０２６１】
【化２１】
2017507136.tif 000023
【０２６２】
(式中、位置R1の基は、-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPrからなる群から選択され、位置R2、R3、R4、R5、R6及びR7の基は独立に、-H、-NH-、-NH2、-SH、-N3、-OH、-F又は-NHC(O)CH2NH-からなる群から選択できる)に記載のシアル酸誘導体である、実施形態1に記載のコンジュゲート。
【０２６３】
3.シアル酸誘導体が、以下の式E3
【０２６４】
【化２２】
2017507136.tif 000024
【０２６５】
に記載のグリシルシアル酸であり、
式1の部分が、式E3の末端-NHハンドルに接続される、実施形態2に記載のコンジュゲート。
【０２６６】
4.[ヘパロサンポリマー]-[X]-
が、以下の式E4
【０２６７】
【化２３】
2017507136.tif 000025
【０２６８】
(式中、nは、5から450の整数である)に示す構造断片を含む、実施形態1、2又は3に記載のコンジュゲート。
【０２６９】
5.第IX因子ポリペプチド及びヘパロサンポリマーを含むコンジュゲートであって、前記ヘパロサンポリマーが5から100kDaの範囲の分子量を有する、コンジュゲート。
【０２７０】
6.ヘパロサンポリマーが13から60kDaの範囲の分子量を有する、実施形態5に記載のコンジュゲート。
【０２７１】
7.ヘパロサンポリマーが27から40kDaの範囲の分子量を有する、実施形態5に記載のコンジュゲート。
【０２７２】
8.ヘパロサンポリマーの分子量が40kDa+/-10%、実施形態5に記載のコンジュゲート。
【０２７３】
9.実施形態1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【０２７４】
10.第IX因子活性の回復の変動が523パーセント点未満である、aPTTアッセイにおける第IX因子ポリペプチドにコンジュゲートされたヘパロサンポリマーの使用。
【０２７５】
11.第IX因子活性の回復の変動が115パーセント点以下である、実施形態10に記載の第IX因子ポリペプチドにコンジュゲートされたヘパロサンポリマーの使用。
【０２７６】
12.医薬としての使用のための、実施形態1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０２７７】
13.凝固障害の治療における使用のための、実施形態1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０２７８】
14.血友病Bの治療における使用のための、実施形態1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０２７９】
15.血友病Bの予防的治療における使用のための、実施形態1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【０２８０】
16.ヘパロサンポリマーを第IX因子ポリペプチドとコンジュゲートする方法であって、
a)反応性アミン[HEP-NH]を含むヘパロサンポリマーを、活性化4-ホルミル安息香酸と反応させ、以下の式E5
【０２８１】
【化２４】
2017507136.tif 000026
【０２８２】
(式中、[HEP-NH]は、末端一級アミンで官能化された任意のHEPポリマーを表す)の化合物を得る工程、
b)還元条件下で式5の化合物をCMP-活性化シアル酸誘導体と反応させる工程、
c)工程b)において得られる化合物を第IX因子ポリペプチド上のグリカンにコンジュゲートする工程
を含む、方法。
【０２８３】
17.工程b)において使用されたCMP活性化シアル酸誘導体が、以下の式E6
【０２８４】
【化２５】
2017507136.tif 000027
【０２８５】
(式中、位置R1の基は、-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPrからなる群から選択され、位置R2、R3、R4、R5、R6及びR7の基は独立に、-H、-NH-、-NH2、-SH、-N3、-OH、-F又はNHCOCNH2からなる群から選択できる)を有する、実施形態16に記載の方法。
【０２８６】
18.R4がNHCOCNH2である、実施形態16又は17に記載の方法。
【０２８７】
19.実施形態16、17又は18に記載の方法を使用して得られるコンジュゲート。
【０２８８】
本発明を、以下の実施例により更に例示するが、しかしながら、権利保護の範囲を限定するものとしてこれらを解釈すべきではない。上の説明及び以下の実施例において開示される特徴は、別々にでもそれらの任意の組合せでも、本発明をその多様な形態で実現する材料であってよい。
【実施例】
【０２８９】
実施例において使用される略語:
AUS:アルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)シアリダーゼ
CMP:シチジン一リン酸
EDTA:エチレンジアミンテトラ酢酸
Gla:ガンマ-カルボキシグルタミン酸
GlcUA:グルクロン酸
GlcNAc:N-アセチルグルコサミン
Grx2:グルタレドキシンII
GSC:グリシルシアル酸シチジン一リン酸
GSC-SH:[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸
GSH:グルタチオン
GSSG:グルタチオンジスルフィド
HEP:ヘパロサン
HEP-FIX:第IX因子ポリペプチドにコンジュゲートされたヘパロサン(FIX-HEPと互換的に使用される)
HEP-[C]-FIX(E162C):システインを介してFIX(E162C)にコンジュゲートされたヘパロサン
HEP-[N]-FIX:N-グリカンを介してFIXにコンジュゲートされたヘパロサン
HEP-GSC:GSC官能化ヘパロサンポリマー
HEP-NH2:アミン官能化ヘパロサンポリマー
HEPES:2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸
His:ヒスチジン
IV:静脈内
KO:ノックアウト
MRT:平均滞在時間
PABA:p-アミノベンズアミジン
PmHS1:パスツレラ・ムルトシダヘパロサンシンターゼI
pNA:パラニトロアニリン
SXa-11:第Xa因子発色性基質
UDP:ウリジン二リン酸
【０２９０】
(実施例1:定量方法)
本発明のコンジュゲートを、純度についてHPLCにより解析した。コンジュゲート定量のためにもHPLCを使用した。定量は、280nm波長吸収プロファイルを使用した、曲線下面積積分に基づくものだった。Wyeth Pharmaceuticals Inc.社により製造されたBeneFIX(登録商標)組換え凝固第IX因子を参照として使用した。Zorbax 300SB-C3カラム(4.6×50mm、3.5μm Agilent社、カタログ番号865973-909)を使用した。蛍光検出器(Ex 280nm、Em 348nm)を備えるAgilent 1100 Series HPLC上でカラムを操作した。カラム温度は30℃であり、5μgの試料を注入し、1.5ml/分の流速だった。カラムを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水(A)-アセトニトリル(B)溶媒系で溶出した。勾配プログラムは以下のとおりだった。すなわち、0分(25% B)、4分(25% B)、14分(46% B)、35分(52% B)、40分(90% B)、40.1分(25% B)。
【０２９１】
(実施例2:SDS-PAGE解析)
すべてInvitrogen社から入手したプレキャストNupage7%トリス-アセテートゲル、NuPageトリス-アセテートSDSランニングバッファー及びNuPage LDSサンプルバッファーを使用して、SDS PAGE解析を実施した。解析前に試料を変性させた(70℃で10分間)。HiMark HMW(Invitrogen社)を標準として使用した。電力装置を備えるXCell Surelock Complete(Invitrogen社)において、80分間、150V、120mAで電気泳動した。Invitrogen社製SimplyBlue SafeStainを使用してゲルを染色した。
【０２９２】
[実施例3:FIX(E162C)の選択的還元]
US20090041744においてFVIIa407Cについて記載されたのと同様に、グルタチオンベースのレドックス緩衝系を使用して、FIX(E162C)を還元した。非還元FIX(E162C)(10.5mg)を、0.5mM GSH、15μM GSSG、2.5mM p-アミノベンズアミジン及び2μM Grx2を含有する、総体積5.25mlの50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中で、23時間室温でインキュベートした。続いて、反応混合物を50mM Hepes、100mM NaClで44mlに希釈し、氷上で冷却し、4mlの100mM EDTA溶液を添加する一方で、pHを7.0に維持した。次に、内容物全体を、FIX(E162C)を捕捉するためにバッファーA(50mM Hepes、100mM NaCl、pH7.0)中で平衡化した2×5mlのHiTrap Q FFカラム(Amersham Biosciences社、GE Healthcare社)上にローディングした。非結合Grx2を除去するためのバッファーAでの洗浄後、FIX (E162C)をバッファーB(50mM Hepes、1M NaCl、10mM CaCl2、pH7.0)で一段階溶出した。溶出液中のFIX(E162C)の濃度は、HPLCにより決定した。次に、p-アミノベンズアミジン(20μlの水性0.5M溶液)を2mMの最終濃度まで添加した。7.95mgの単一システイン還元FIX(E162C)を、5mlの50mM Hepes、1M NaCl、10mM CaCl2、2mM p-アミノベンズアミジン、pH7.0中で単離した。
【０２９３】
{実施例4:60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)の合成}
50mM Hepes、1M NaCl、10mM CaCl2、2mM PABA、pH7.0(5ml)中の単一システイン還元FIX(E162C)の溶液(7.95mg)を、50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0(2.95ml)中に溶解された60kDaのHEP-マレイミド(55.3mg)に添加した。透明溶液をローラーミキサー上に置き、22時間、室温で穏やかに回転させた。次に、反応混合物を、Gla-ドメイン特異抗体で修飾されたFIX特異的アフィニティーカラム(CV=66ml、13.3mg FIXの総結合能を有する)上にローディングし、まず、2カラム容積のバッファーA(50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.4)で、次に、2カラム容積のバッファーB(50mM Hepes、100mM NaCl、10mM EDTA、pH7.4)で段階溶出した。FIX及び60kDaのHEP-FIXコンジュゲートを含有する画分を回収し、10mM His、100mM NaCl、pH7.5で事前に平衡化した2×5mlのHiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences社、GE Healthcare社)上に直接ローディングした。カラムを4カラム容積の10mM His、100mM NaCl、pH7.5で洗浄し、非結合物質を除去した。次に、溶出液をバッファーA(10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH=6.0)に変えた。未修飾FIX(E162C)を、5カラム容積の20%バッファーB(10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH=6.0)で溶出し、続いて60kDaのHEP-FIXを、5カラム容積の40%バッファーBで溶出した。コンジュゲートを含有する画分を組合せ、10kDaのカットオフでSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を使用して、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH=6.0に対して透析した。10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH=6.0の添加により、最終体積を0.3mg/mlに調整した。実施例2に記載のSDS-PAGE上で、コンジュゲートを純度について解析した。FIX標準に対するHPLC定量により決定されるコンジュゲートの収量は、3.75mg(47%)だった。
【０２９４】
{実施例5:38.8kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)の合成}
このコンジュゲートを、実施例1に記載のとおり調製される単一システイン還元FIX(E162C)(6.30mg)及び38.8kDaのHEP-マレイミド(18.9mg)を使用して実施例4に記載のとおり調製した。2.8mg(44%)の38.8kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)を、6.3mlの10mM His、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4(8μM、0.45mg/ml)中で単離した。
【０２９５】
{実施例6:27kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)の合成}
このコンジュゲートを、実施例1に記載のとおり調製される単一システイン還元FIX(E162C)(6.32mg)及び27kDaのHEP-マレイミド(10.2mg)を使用して実施例4に記載のとおり調製した。3.96mg(62%)の27kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)を、8.84mlの10mM His、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4(8μM、0.45mg/ml)中で単離した。
【０２９６】
{実施例7:13kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)の合成}
このコンジュゲートを、実施例1に記載のとおり調製される単一システイン還元FIX(E162C)(10.0mg)及び13kDaのHEP-マレイミド(10.0mg)を使用して実施例4と同様に調製した。2.3mg(23%)の13kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)を、5.10mlの10mM His、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4(8μM、0.45mg/ml)中で単離した。
【０２９７】
(実施例8:FIXの脱シアル化)
FIX(20.4mg)を、1.7mlの10mM ヒスチジン、3mM CaCl2、150mM NaCl pH6.2中のシアリダーゼ(アルスロバクター・ウレアファシエンス、140μl、0.3mg/ml、200U/ml)と、1時間、室温で反応させた。次に、反応混合物を50mM Hepes、100mM NaCl、pH7.0(20ml)で希釈し、氷上で冷却した。100mM EDTA溶液(3ml)を少量ずつ添加した。各添加後にpHを測定した。pHを5.5〜9.0以内に維持した。反応混合物を、伝導率を下げるためにMilliQ水で40mlに希釈し、バッファーA(50mM Hepes、100mM NaCl、pH7.0)で平衡化した2×5mlのHiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences社、GE Healthcare社)に適用した。アシアロFIXをバッファーB(50mM Hepes、1M NaCl、10mM CaCl2、pH7.0)で一段階溶出した。溶出液中のアシアロFIXの濃度は、HPLCにより決定した。17.2mgのアシアロFIXを、6mlの50mM Hepes、1M NaCl、10mM CaCl2、pH7.0(2.86mg/ml)中で単離した。
【０２９８】
{実施例9:[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸(GSC-SH)の合成}
【０２９９】
【化２６】
2017507136.tif 000028
【０３００】
グリシルシアル酸シチジン一リン酸(200mg、0.318mmol)を水(2ml)中に溶解させ、チオブチロラクトン(325mg、3.18mmol)を添加した。二相溶液を、穏やかに21時間、室温で混合した。次に、反応混合物を水(10ml)で希釈し、逆相HPLCカラム(C18、50mm×200mm)に適用した。カラムを50ml/分の流速で、水(A)、アセトニトリル(B)及び250mM炭酸水素アンモニウム(C)の以下の勾配系で溶出した。すなわち、0分(A:90%、B:0%、C:10%)、12分(A:90%、B:0%、C:10%)、48分(A:70%、B:20%、C:10%)。画分(20mlのサイズ)を回収し、LC-MSで解析した。純画分をプールし、ナトリウム形態のDowex 50W×2(100〜200メッシュ)樹脂のショートパッドを緩徐に通過させ、その後乾燥粉末へと凍結乾燥した。次に、260nmの吸光度及び参照物質としてグリシルシアル酸シチジン一リン酸を使用して、凍結乾燥粉末中の標題物質の含有量をHPLCにより決定した。HPLC解析のため、Waters X-Bridgeフェニルカラム(5μm 4.6mm×250mm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)を使用した。収量:61.6mg(26%)。LCMS:732.18(MH+)、427.14(MH+-CMP)。-80℃で保存したとき、化合物は長期間(>12ヶ月)安定だった。
【０３０１】
(実施例10:末端アミノエチルハンドルを有するヘパロサンポリマーの合成)
工程1:(2-Fmoc-アミノ)エチル2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルクロン酸メチルエステルの合成
【０３０２】
【化２７】
2017507136.tif 000029
【０３０３】
粉末分子篩(1.18g、4Å)を、磁気撹拌器を備える50ml丸底フラスコ中で110℃で一晩加熱し、アルゴンで洗い流し、室温に冷却させた。900mg(2.19mmol)のアセト-ブロモ-β-D-グルクロン酸メチルエステル及び748.5mg(2.64mmol、1.2当量)の2-(Fmoc-アミノ)エタノールをアルゴン下で添加し、続いて28mlのジクロロメタンを添加した。懸濁液を15分間、室温で撹拌し、次に、氷/NaClスラリー上で30分間冷却した。冷却プロセス中に白色の沈殿物が形成された。676.3mg(2.63mmol、1.2当量)のトリフルオロメタンスルホン酸銀(AgOTf)を3部で、約5分間にわたって添加した。20分後、氷浴を除去した。前述の白色の沈殿物が溶解し始める一方で、同時に灰色の沈殿物が形成され始めた。反応物を一晩、室温で撹拌し、次に、190μLのトリエチルアミン(2.63mmol、1.2当量)の添加により失活させた。薄いCelite 521パッド(厚さ約0.1〜0.2cm)で濾過し、続いて濾過ケーキを20mlのジクロロメタンで洗浄した後、組み合わされた濾物をジクロロメタンで150mlに希釈した。有機相を、5%NaHCO3(1×50mL)及び水(1×50mL)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾物を、ロータリーエバポレーター(≦40℃水浴)上で真空中で濃縮して乾燥させ、次に2mLのジクロロメタン中に再溶解させた。溶液を、VersaPakシリカゲルフラッシュカラム(23×110mm、23g)上に注入し、生成物をヘキサン中の50%酢酸エチルで溶出した。生成物含有画分を、TLC(酢酸エチル:ヘキサン、1:1)により同定し、ロータリーエバポレーター(≦40℃水浴)上で真空中で濃縮して乾燥させた。約10mLのジエチルエーテルでの得られた残留物の粉砕により、白色の結晶泡沫として標題物質がもたらされた。収量:293mg(0.49mmol、22.4%)。
【０３０４】
工程2:(2-Fmoc-アミノ)エチルβ-D-グルクロン酸ナトリウム塩の合成
【０３０５】
【化２８】
2017507136.tif 000030
【０３０６】
490mg(0.817mmol、1当量)の工程1で得られた(2-Fmoc-アミノ)エチル2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルクロン酸メチルエステルを、47.5mLのメタノール中に溶解させ、2.5mL(2.45mmol、3当量)の1M NaOH溶液を撹拌しながら緩徐に添加した。1-ブタノール:酢酸:水=1:1:1を溶出液として使用して、TLCにより反応をモニタリングした。TLCがメチルエステルの完全な消費を示した後、反応混合物のpHを、1N HClの添加によりpH8〜9まで低下させた。次に、204mg(2.45mmol、3当量)の固体NaHCO3を添加し、続いて241.7mg(0.899mmol、1.1当量)のFmoc-クロリドを添加した。TLC解析が反応の完了を示したとき、反応混合物を約150mLの水で希釈し、酢酸エチル(2×30mL)で2回抽出し、次に40℃水浴上で、真空中で約20mLまで濃縮し、一切の残留有機溶媒を除去した。溶液を、約5%(v:v)の含有量までの酢酸の添加により酸性化させ、5グラムStrata C-18E SPEチューブ(メタノール中で事前に湿らせ、製造者の指示に従い5%酢酸中で平衡化)を通過させた。樹脂を5%酢酸で洗浄し、生成物を10%トリス.HClを伴う90%メタノールの混合物、pH7.2(v:v)で溶出した。真空中(≦40℃水浴)で濃縮し乾燥した後、残留物を再溶解させ、pHを水酸化ナトリウムでpH7.2に調整した。この溶液を、下の(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸の合成において、更なる精製なしに、原液として直接使用した。
【０３０７】
工程3:(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸ナトリウム塩の合成
【０３０８】
【化２９】
2017507136.tif 000031
【０３０９】
工程2で得られた100.8mLの水中の380mgの(2-Fmoc-アミノ)エチルβ-D-グルクロン酸の溶液(0.83mmole、1当量)に、5.6mLの1M トリスHCl、pH7.2、5.6mLの100mM MnCl2、及び1.8gのUDP-GlcNAc(2.79mmole、3.4当量)を添加した。5.1mLのMBP-PmHS1酵素(15.47mg/mL、78.9mg)を約1分間にわたって緩徐に添加した後、TLC解析(1-ブタノール:酢酸:水=2:1:1)が出発物質のほぼ完全な変換を示すまで、反応物を室温で緩徐に撹拌した。2.8mL酢酸の添加により溶液を酸性化させ、消費されたMBP-PmHS1を沈殿させ、50mLの遠心ボトル内に移した。次に、溶液をJM-12ローター(約16,000×g)内で30分間、10,000rpmで、室温で遠心した。上清をデカントし、160mLのメタノールを添加した。4×25mLのペレットを、水:メタノール:酢酸=45:50:5(v:v:v)の溶液で抽出した。組み合わされた上清及び抽出物は、2gStrata-SAXチューブ[水:メタノール:酢酸=45:50:5(v:v:v)中で平衡化]を通過させ、一切のUDP及びUDP-GlcNAcを除去した(完全除去には、28グラムの樹脂を要した)。これらの条件下では、標的分子は保持されずに樹脂を通過する一方で、より高く荷電したUDP及びUDP-GlcNAcは保持された。組み合わされた溶出液を、真空中(水バッチ、≦40℃)で濃縮し、水中に再溶解させ、水酸化ナトリウムを使用してpHをpH7.2に調整した。この溶液を更なる精製なしに次の工程において直接使用した。
【０３１０】
工程4:(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸ジナトリウム塩の合成
【０３１１】
【化３０】
2017507136.tif 000032
【０３１２】
9mM (2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸、30mM UDP-GlcUA、50mM Tris.HCl、及び5mM MnCl2を含有する水性溶液(38ml)を、スピナーフラスコ内に入れた。約1分間にわたって、9.5mLのMBP-PmHS1を緩徐に撹拌しながら滴下添加した。反応混合物を一晩撹拌し、その後、TLC解析[溶出液:n-BuOH:AcOH:H2O=4:1:1(v:v:v)]は、出発物質の完全な変換を示した。反応混合物を1μmのグラスファイバーシリンジフィルターで濾過し、5グラムのC18-E SPEチューブ(製造者の指示に従い水で平衡化)を通過させた。樹脂を水で洗浄し、続いて標的分子を90%水性MeOH、1mMトリスHCl、pH7.2の混合物で溶出した。溶出液を真空中(水浴≦40℃)で濃縮し、次に25mLの10mMトリスHCl、pH7.2中に再溶解させ、0.2μmのSFCAシリンジフィルターで濾過した。標的分子を含有する濾物を、陰イオン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。2.6×13cmのQ Sepharose HPカラムを備え、Unicorn 5.11ソフトウェアで操作されるAkta Explorer 100を使用した。溶出のために2つの緩衝系(バッファーA:10mMトリスHCl、pH7.2及びバッファーB:10mMトリスHCl、pH7.2、1M NaCl)を使用した。0〜20%B勾配を175分間にわたって、10ml/分の流速で使用して標的分子を溶出した。10ml画分を回収した。生成物を含有する画分を組み合わせ、ロータリーエバポレーター上で真空中(水浴<40℃)で濃縮して乾燥させ、次の工程で更なる精製なしに使用した。
【０３１３】
工程5:(2-アミノエチル)4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸ジナトリウム塩の合成
【０３１４】
【化３１】
2017507136.tif 000033
【０３１５】
工程4に記載したようにして得られた(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸ジナトリウム塩を、4mLの水中に溶解させ、氷浴上で冷却した。4mLちょうどの体積のモルホリンを、撹拌しながら添加し、氷浴を除去した。UV 254nm検出を使用したTLC解析[n-BuOH:AcOH:H2O=3:1:1(v:v:v)]が出発物質の完全な消費を示すまで、室温で撹拌を継続した。1.5時間以内に反応は完了した。反応混合物を約50mLの水で希釈し、50mLのEtOAcで3回抽出した。標的分子を含有する水性相を、ロータリーエバポレーター上で真空中(水浴<40℃)で濃縮し、水と3回同時蒸発させた。残留物を10mLの水中に再溶解させ、水中で事前に平衡化された1グラムのSDB-L SPEカラムを通過させた。標的は、カラムに保持されず通過した。10mLの水でカラムを洗浄し、標的と組み合わされた画分を真空中で濃縮して乾燥させた(水浴、≦40℃)。得られた残留物を、1.5mLの1M NaOAc、pH7.5中に溶解させ、0.2μmのスピンフィルターで濾過し、溶出液として水を用いて、Sephadex G-10カラム(2×75cm、235mL)を通したサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。MALDI-TOF MS(マトリックス:5mg/mL ATT、50%アセトニトリル/0.05%トリフルオロ酢酸):636.83[M+Na+]により標題物質の構造を確認した。凍結乾燥後、標題物質を水中に溶解させ、水酸化ナトリウムの添加により得られた溶液のpHをpH7.0〜7.5に調整し、カルバゾールアッセイにより三糖含有量を決定した(Bitter T、Muir HM. Anal Biochem 1962年10月;4:330〜4頁)。得られた原液を分注し、必要になるまで-80℃で密閉容器中に保存した。
【０３１６】
(2-Fmoc-アミノ)エチルβ-D-グルクロン酸から開始される(2-アミノエチル)4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸の単離収量の全体は、210mg(0.34mmole、41%)だった。
【０３１７】
工程6:アミン末端を有するヘパロサン多糖の生成
【０３１８】
【化３２】
2017507136.tif 000034
【０３１９】
遊離アミン基(HEP-NH2)を有するヘパロサンポリマー誘導体を得るため、パスツレラ・ムルトシダヘパロサンシンターゼ1(PmHS1;DeAngelis及びWhite、2002 J Biol Chem)を、インビトロで平行してポリマー鎖を化学酵素的に合成するために使用した(Sismey-Ragatzら、2007 J Biol Chem及びUS8088604)。E. coliマルトース結合タンパク質とPmHS1との融合が、工程5で得られる(2-アミノエチル)4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸(HEP3-NH2)を、US2010036001に記載のとおり、UDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA前駆体並びにMnCl2触媒を使用して、より長いポリマー鎖へと伸長させるための触媒として使用された。
【０３２０】
工程7:末端ベンズアルデヒド官能基を有するヘパロサン多糖の生成
還元的アミノ化等を介して、標的薬物化合物上のアクセス可能なアミノ官能基とカップリングするためのヘパロサンポリマー誘導体を得るため、ヘパロサン-NH2を、N-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸とカップリングし、ベンズアルデヒド修飾ヘパロサンポリマーを形成した。一例において、基本的に、ジメチルスルホキシド中に溶解されたN-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸(Chem-Impex, Inc社)(205mL中11.94mg)を、380mLの1Mリン酸ナトリウム、pH7.0、2180mlの水、及び1040mLのジメチルスルホキシド中に溶解された、62.7gの43.8kDaヘパロサンポリマー-NH2の撹拌された溶液に緩徐に添加した。反応混合物を一晩室温で撹拌し、続いて室温でアルコール沈殿を行った。生成物を有するペレットを、3Lの500mM酢酸ナトリウム、pH6.8中に溶解させ、更に精製し、次にクロスフロー濾過により濃縮した。
【０３２１】
(実施例11:HEP-マレイミド及びHEP-ベンズアルデヒドポリマーの合成)
定義されたサイズのマレイミド及びアルデヒド官能化HEPポリマーを、2つの糖ヌクレオチドであるUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAを使用して、酵素的(PmHS1)重合反応により調製した。プライミング三糖である(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2を、反応を開始するために使用し、糖ヌクレオチドビルディングブロックが枯渇するまで重合させた。次に、末端アミン(プライマーに由来)を、好適な反応基、この場合には、遊離システイン及びチオGSC誘導体とのコンジュゲーションのために設計されたマレイミド官能基、又は、GSCとの還元的アミノ化化学のために設計されたベンズアルデヒド官能基のいずれかで官能化した。HEPポリマーのサイズは、糖ヌクレオチド:プライマー化学量論における変動により、前もって決定できる。この技術は、US2010/0036001に詳細に記載されている。
【０３２２】
HEP-ベンズアルデヒドは、水性中性溶液中でアミン官能化HEPポリマーを過量のN-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸と反応させる工程[Nano Letters (2007) 7(8)、2207〜2210頁]により調製できる。ベンズアルデヒド官能化ポリマーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はHPLCにより単離できる。
【０３２３】
HEP-マレイミドは、アミン官能化HEPポリマーを余剰のN-マレイミドブチリル-オキシスクシンイミドエステル(GMBS;Fujiwara, K.ら(1988) J Immunol Meth 112、77〜83頁)と反応させる工程により調製できる。
【０３２４】
ベンズアルデヒド又はマレイミド官能化ポリマーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はHPLCにより単離できる。末端一級アミン(HEP-NH2)で官能化された任意のHEPポリマーを、本実施例において使用できる。2つの選択肢を下に示す。
【０３２５】
【化３３】
2017507136.tif 000035
【０３２６】
更に、多糖の非還元末端における末端糖残基は、N-アセチルグルコサミン又はグルクロン酸のいずれかでありうる(上ではグルクロン酸が描かれている)。典型的には、重合反応において等モル量のUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAが使用された場合には、両者の混合物が期待される。
【０３２７】
(実施例12:スクシンイミドサブ連結を有する38.8kDaのHEP-GSC試薬の合成)
【０３２８】
【化３４】
2017507136.tif 000036
【０３２９】
(実施例12)(続き)
HEP試薬を、GSC-SH([(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸)をHEP-マレイミドと1:1モル比で以下のとおりカップリングすることにより調製した。すなわち、50mM Hepes、100mM NaCl、pH7.0(50μl)中に溶解されたGSC-SH(0.50mg)に対して、50mM Hepes、100mM NaCl、pH7.0(1350μl)中に溶解された26.38mgの38.8kDaのHEP-マレイミドが添加された。透明溶液を2時間、25℃で静置した。過剰なGSC-SHを、10kDaのカットオフでSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を使用して、透析により除去した。透析バッファーは、50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH=7.0だった。反応混合物を2回、2.5時間透析した。回収した物質をそのまま、GSC-SHとHEP-マレイミドとの間の定量的反応を仮定して、実施例14において使用した。この手順により製造されたHEP-GSC試薬は、スクシンイミド結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合されたHEPポリマーを含有すると考えられる。
【０３３０】
(実施例13:スクシンイミドサブ連結を有する60kDaのHEP-GSCの合成)
この分子を、60kDaのHEP-マレイミド及び[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸を使用して、上の38.8kDaのHEP-GSCについて記載したのと同様の仕方で調製した。
【０３３１】
(実施例14:スクシンイミドサブ連結を有する38.8kDaのHEP-[N]-FIXの合成)
38.8kDaのHEP-[N]-FIXを以下のとおり合成した。50mM Hepes、1M NaCl、10mM CaCl2、pH7.0(6ml)中のアシアロFIX(17.2mg)に、50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0(1.5ml)中の38.8kDaのHEP-GSC(実施例11からの26.38mg)を添加し、続いて、20mM Hepes、120mM NaCl、50%グリセロール、pH7.0(6ml)中のラットST3GalIII酵素(3.3mg、1.1単位/mg)を添加した。反応混合物を、17.5時間、32℃でインキュベートした。次に、50mM Hepes、150mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0(0.2ml)中の157mMのN-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸の溶液を添加し、反応物を32℃で、更に1時間インキュベートした。次に、実施例4に実質的に記載されているとおり、アフィニティー及び陰イオン交換クロマトグラフィーの組合せにより、38.8kDaのHEP-[N]-FIXを単離した。単離化合物を、10mM His、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4中に透析した。実施例2に記載のSDS-PAGE上で、コンジュゲートを純度について解析した。2.76mg(16%)の38.8kDaのHEP-[N]-FIXを、6.2mlの10mM His、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4(0.45mg/ml)中で単離した。
【０３３２】
(実施例15:スクシンイミドサブ連結を有する60kDaのHEP-[N]-FIXの合成)
このコンジュゲートを、実施例8に記載のとおり調製されたアシアロFIX(8.5mg)及び実施例13において調製された60kDaのHEP-GSC(30.0mg)を使用して、実施例14と同様に調製した。0.69mg(8%)の60kDaのHEP-[N]-FIXを、1.5mlの10mM His、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4(0.45mg/ml)中で単離した。
【０３３３】
(実施例16:4-メチルベンゾイルサブ連結を有する41.5kDaのHEP-GSC試薬の合成)
【０３３４】
【化３５】
2017507136.tif 000037
【０３３５】
(実施例16)(続き)
5.0mlの50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2バッファー、pH7.0中のグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)(20mg、32μmol)を、乾燥した41.5kDaのHEP-ベンズアルデヒド(99.7mg、2.5μmol、窒素定量)に直接添加した。混合物を、すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで穏やかに回転させた。以後の2時間の間、MilliQ水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの1M溶液を部単位(5×50μl)で添加し、48mMの最終濃度に達した。次に、過剰なGSCを透析により以下のとおり除去した。すなわち、総反応体積(5250μl)を、透析カセット(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette、カットオフ10kDa性能:3〜12mlを有するThermo Scientific社製品#66810)に移した。溶液を、2000mlの25mM Hepesバッファー(pH7.2)に対して2時間透析し、もう一度17時間、2000mlの25mM Hepesバッファー(pH7.2)に対して透析した。内部チャンバーからの過剰なGSCの完全な除去を、GSCを参照として使用して、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)でのHPLCにより検証した。内部チャンバー物質を回収し、凍結乾燥し、83%(窒素定量)の41.5kDaのHEP-GSCを白色の粉末として得た。この手順により製造されたHEP-GSC試薬は、4-メチルベンゾイル結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合されたHEPポリマーを含有する。
【０３３６】
(実施例17:4-メチルベンゾイルサブ連結を有する21kDaのHEP-GSC試薬の合成)
この分子を、21kDaのHEP-ベンズアルデヒド及びグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)を使用して、上の41.5kDaのHEP-GSCについて記載したのと同様の仕方で調製した。収量は、凍結乾燥後で78%だった。
【０３３７】
(実施例18:4-メチルベンゾイル結合を有する41.5kDaのHEP-[N]-FIXの合成)
1mlの10mM ヒスチジン、150mM NaCl、3mM CaCl2、pH6.0(反応バッファー)中のFIX(12.3mg)に、16.7μlの1:2000で反応バッファー中に希釈されたHis-シアリダーゼ(AUS)(希釈前1.33mg/ml、83U/mg)、240μg/ml反応混合物の最終濃度までST3GalIII(20mM Hepes、120mM NaCl、50%グリセロール、pH7.0中、1.4mg/ml)、99.3μlの41.5kDaのHEP-GSC(100mg/mlの濃度まで反応バッファー中に再構成された凍結乾燥化合物)を添加した。反応混合物のpHを、18μlの0.25M HClで6.0に調整した。反応混合物を18時間、25℃でインキュベートした。非コンジュゲートFIX、St3GalIII及びシアリダーゼを、10mM ヒスチジンバッファー、5mM CaCl2、150mM NaCl pH6.0で平衡化されたSource 30Qカラム上で、フロースルーモードで41.5kDaのHEP-[N]-FIXから分離した。41.5kDaのHEP-[N]-FIXを、0〜100%勾配の溶出バッファー(10mM ヒスチジン、5mM CaCl2、1M NaCl、pH6.0)で20カラム容積にわたって溶出した。N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸及びSt3GalIIIをそれぞれ、0.8mg/ml及び1μg/mlの最終濃度まで、溶出されたプールに添加し、反応混合物を25℃で3時間インキュベートした。次に、41.5kDaのHEP-[N]-FIXを、実質的に実施例4に記載されているとおりだが、異なるバッファーで、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。以下のバッファーを使用した。すなわち、バッファーA:50mM ヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH=6.2;バッファーB:50mM ヒスチジン、100mM NaCl、20mM EDTA、pH=6.2。単離化合物を、10mM His、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4中に透析した。0.926mg(7.5%)の41.5kDaのHEP-[N]-FIXを、6.0mlの10mM His、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4(0.15mg/ml)中で単離した。
【０３３８】
(実施例19:4-メチルベンゾイル結合を有する21kDaのHEP-[N]-FIXの合成)
この化合物を、アシアロFIX及び実施例16の21kDaのHEP-GSCを使用して、実施例18に記載されているのと同様の仕方で合成した。最終コンジュゲートは、4-メチルベンゾイル結合を介してFIXに結合されたHEPポリマーを含有する。
【０３３９】
(実施例20:4-メチルベンゾイル結合を有するノイラミン酸シチジン一リン酸ベースの41.5kDaのHEPコンジュゲートの合成)
【０３４０】
【化３６】
2017507136.tif 000038
【０３４１】
ノイラミン酸シチジン一リン酸は、Eur J Org Chem. 2000、1467〜1482頁に記載のとおり製造される。実施例16に記載のとおりHEP-アルデヒドとの反応が実施され、GSCをノイラミン酸シチジン一リン酸と置き換えた。50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2バッファー、pH7.0バッファー中に溶解したノイラミン酸シチジン一リン酸(32μmol)を、乾燥した41.5kDaのHEP-ベンズアルデヒド(2.5μmol)に直接添加した。混合物を、すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで穏やかに回転させる。以後の2時間の間、MilliQ水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの1M溶液を部単位で添加し、48mMの最終濃度に達する。次に、過剰なノイラミン酸シチジン一リン酸を、実施例16に記載のとおり、透析により除去する。内部チャンバーからのノイラミン酸シチジン一リン酸の完全な除去を、ノイラミン酸シチジン一リン酸を参照として使用して、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)でのHPLCにより検証する。次に、内部チャンバー物質を、回収して凍結乾燥した。この手順により製造された試薬は、4-メチルベンゾイル結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合されたHEPポリマーを含有する。
【０３４２】
(実施例21:4-メチルベンゾイル結合を有する9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸ベースHEPコンジュゲートの合成)
【０３４３】
【化３７】
2017507136.tif 000039
【０３４４】
9-デオキシ-アミノN-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸は、Eur J Biochem 168、594〜602頁(1987)に記載のとおり製造される。実施例15に記載のとおりHEP-アルデヒドとの反応が実施され、GSCを9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸と置き換える。50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2バッファー、pH7.0バッファー中に溶解した9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸(32μmol)を、乾燥した41.5kDaのHEP-ベンズアルデヒド(2.5μmol)に直接添加した。混合物を、すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで穏やかに回転させる。以後の2時間の間、MilliQ水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの1M溶液を部単位で添加し、48mMの最終濃度に達する。次に、過剰な9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸を、実施例16に記載のとおり、透析により除去する。内部チャンバーからの9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸の完全な除去を、9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸を参照として使用して、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)でのHPLCにより検証する。内部チャンバー物質を、回収して凍結乾燥した。この手順により製造された試薬は、4-メチルベンゾイル結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合されたHEPポリマーを含有し、アシアロFIX糖タンパク質との糖コンジュゲーションに好適である。
【０３４５】
(実施例22:4-メチルベンゾイル結合を有する2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸ベースHEPコンジュゲートの合成)
【０３４６】
【化３８】
2017507136.tif 000040
【０３４７】
実施例20及び21に示されているのと同様の仕方で、HEP-シアル酸シチジン一リン酸試薬を、シアル酸KDNから開始して製造できる。最初の9位のアミノ誘導体化は、Eur J Org Chem 2000、1467〜1482頁に記載のとおり実施される。実施例16に記載のとおりHEP-アルデヒドとの反応が実施され、GSCを9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸と置き換える。50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2バッファー、pH7.0バッファー中に溶解した9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸(32μmol)を、乾燥した41.5kDaのHEP-ベンズアルデヒド(2.5μmol)に直接添加した。混合物を、すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで穏やかに回転させる。以後の2時間の間、MilliQ水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの1M溶液を部単位で添加し、48mMの最終濃度に達する。次に、過剰な9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸を、実施例15に記載のとおり、透析により除去する。内部チャンバーからの9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸の完全な除去を、9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸を参照として使用して、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)でのHPLCにより検証する。内部チャンバー物質を、回収して凍結乾燥した。この手順により製造された試薬は、4-メチルベンゾイル結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合されたHEPポリマーを含有し、アシアロFIX糖タンパク質との糖コンジュゲーションに好適である。
【０３４８】
(実施例23:FIX欠損マウスにおけるrFIX及び40kDaのPEG-[N]-FIXと比較したIV投与された60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)の薬物動態)
rFIX[BeneFIX(登録商標)]、40kDaのPEG-[N]-FIX又は60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)の1.5mgFIX/kg当量である27nmol/kgのIV投与後に、45匹のFIX欠損マウス、F9(第9因子)ノックアウト(KO)マウス[元はD.W. Stafford(University of North Carolina)より得られたHBマウス(B6.129P2-F9tm1Dws)]薬物動態研究を実施した。用量を5ml/kgで尾静脈に投与し、投与0.08、0.25、0.5、1、4、7、17、24、30、42、48、54、72、78、96時間後に、1時点当たり3匹のマウスでマウス1匹当たり3つの血液試料を得るスパースサンプリングデザインにおいて、毛細ガラス管により眼窩静脈叢から血液を回収した。血液をクエン酸安定化し、pH7.4のHepes及びBSAバッファーで1:4に希釈し、5分間、4000RPMで遠心し、その後血漿を解析に送った。
【０３４９】
FIXの血漿中濃度を、抗原アッセイ(LOCI)、発色活性アッセイ及び凝固アッセイで決定したのであり、結果を図6に示し、薬物動態パラメータを表2に示す。
【０３５０】
hFIXについてのLOCIアッセイは、Poulsen, F及びJensen KB、J Biomol Screen 2007;12(2):240〜7頁により記述されているヒトインスリンLOCIとして実質的に構築される。要約すると、このアッセイは、ヒト血漿中のhFIXを定量するための広範な解析範囲を有するビーズベースサンドイッチ免疫アッセイである。試料を、ビオチン化抗FIX抗体及び抗FIX抗体で共有結合によりコーティングされたビーズの混合物とともにインキュベートしながら、二段階反応が実施される。これに続いて、ストレプトアビジンで共有結合によりコーティングされたビーズとともに30分間インキュベートされる。ビーズ内の化学発光反応から生成される光が定量された。FIX LOCIアッセイにおいて使用された抗体は、インハウスで製造されたNovo Nordiskモノクローナル抗FIX抗体及びLifeSpan BioSciences, Inc.社製のポリクローナルヤギ抗hFIX抗体(LS-B7226)であった。
【０３５１】
市販の発色アッセイキットは、Hypen Biophenからのものだった[Hyphen Biomed社(#221805)]。要約すると、試料からのFIXを、活性化第XI因子(FXIa)、Ca2+、リン脂質及び活性化第II因子(FIIa)の添加により、FIXaへと活性化させた。次に、Ca2+の存在下でFIXaを、供給された第VIII因子(FVIII)及びリン脂質と複合させた。テナーゼ複合体は、第X因子(FX)を第Xa因子(FXa)へと活性化させる。形成されたFXaはSXa-11と反応し、pNAが放出される。pNAは、405nmで光を吸収する。FIXを除いて、すべての試薬を余剰に添加した。したがって、試料中のFIXが多いほど、より多くのFXaが形成され、より多くのpNAが放出される。
【０３５２】
血漿試料中の凝固活性を、Ostergaardら  Blood, 2011;118:2333〜41頁に記載の一段階FIX凝固アッセイを使用して推定した。アッセイは、FIX活性依存的な線維素凝塊形成時間を測定する。要約すると、等量の試験試料、ヒトFIX欠損血漿、APTT試薬(Synthafax)、及びCaCl2(0.02M)を使用した。血漿試料を、HEPESバッファーを含有するBSA中で10又は20倍希釈した。定量の下限は、血漿試料(10倍希釈)中およそ70U/Lだった。機器及び試薬は、Instrumentation Laboratories社製だった。
【０３５３】
【表２】
2017507136.tif 000041
【０３５４】
平均血漿プロファイルは、60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)及び40kDaのPEG-[N]-FIXの薬物動態パラメータとともに、FIX欠損マウスにおいて同等である[図6及び表2]。60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)の半減期は、アッセイ及び最終除去段階における定量の下限(LLOQ:lower limit of quantification)を超えるデータ点の数に応じて、rFIXの半減期よりもおよそ2〜10倍長かった。60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)及び40kDaのPEG-[N]-FIXのクリアランスは、rFIXのクリアランスと比較して近似的に20の倍数で減少した。
【０３５５】
図6は、F9-KOマウスにおける血漿中rFIX及びFIXコンジュゲート濃度対時間を示す。濃度は、抗原ベースアッセイ(a)並びに凝固活性及び発色活性ベースアッセイ[それぞれ(b)及び(c)]対時間により測定した。結果は、片対数プロット、n=3における平均±SDである。
【０３５６】
(実施例24:FIX欠損マウスにおけるIV投与された13kDa-、21kDa-、27kDa-及び40kDaのHEP-FIXの薬物動態)
13kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)、21kDaのHEP-[N]-FIX、27kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)、40kDaのHEP-[N]-FIX及び40kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)の1.5mg FIX/kg当量の27nmol/kgのIV投与後に、75匹のFIX欠損マウス(F9-KOマウス)において薬物動態研究を実施した。実施例23に記載のとおり研究を実施した。抗原アッセイ(LOCI)(a)及び発色活性アッセイ(b)で血漿を解析したのであり、結果を図7に示し、薬物動態パラメータを表3{比較のため、実施例23のrFIX及び60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)(イタリック)に関するデータも含む}に示す。結果は、片対数プロット、n=3における平均±SDである。
【０３５７】
FIX変異体のクリアランスは、コンジュゲートされたHEPポリマーのサイズとともに減少するようだった。13から60kDaの間のサイズのHEPポリマーへのコンジュゲーションは、抗原アッセイで測定されたとおり、rFIXと比較して32から40時間の間で半減期を増加させた(表3を参照のこと)。
【０３５８】
【表３】
2017507136.tif 000042
【０３５９】
(実施例25:F9-KOマウスにおける60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)の用量反応)
F9-KO(第IX因子ノックアウト)マウス[元はD.W. Stafford(University of North Carolina)より得られたHBマウス(B6.129P2-F9tm1Dws)]の尾静脈離断(TVT)モデルにおいて、60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)及びFIX(Novo Nordisk A/S)の効果を比較した。要約すると、F9-KOマウスに、漸増用量の60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)、rFIX又はビヒクル(5ml/kgの20mM Hepes、150mM NaCl、0.5%BSA pH7.4)を投与し、10分後にテンプレートにガイドされた2.5mmの尾直径での左側尾静脈の離断により、出血を誘発した。尾を温暖な生理食塩水(37℃)中に浸漬し、60分間の出血の視覚的記録を可能にし、その後失血を、失われたヘモグロビンの量の分光光度測定により決定した。したがって、赤血球を5分間の4000×gでの遠心により単離した。上清を廃棄し、ヘモグロビン試薬(ABX Lysebio; ABX Diagnostics no. 906012、Triolab A/S社、Broendby、Denmark)で細胞を溶解した。5分間の4000×gでの遠心により細胞片を除去した。試料を550nmで読み取り、標準曲線からヘモグロビンの総量を決定した(HemoCueキャリブレーター707037、HemoCue社、Vedbaek、Denmark)。
【０３６０】
60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)は、有意且つ用量依存的に失血を減少させ、0.1mg/kgで標準化に達した(p<0.001、n=8)。これは、rFIXの効果と同等だった。したがって、60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)及びrFIXの強度は、60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)及びrFIXのそれぞれについて0.012及び0.03mg/kgの推定ED50と同等だった(p=0.38、図8、表4)。図8は、60kDaのHEP-[C]-FIX E162C(FIX-HEP)及びrFIXが、F9-KOマウスにおける尾静脈離断後、同等の強度で用量依存的且つ有意に失血をどれだけ減少させたかを示す。同様に、60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)及びrFIXの出血時間に対する効果は同等であり、有意で用量依存的な出血時間の短縮を伴い、2つの化合物のED50に有意差はなかった(それぞれ0.009及び0.024mg/kg、p=0.18、図9、表4)。図9は、60kDaのHEP-[C]-FIX E162C(FIX-HEP)及びrFIXが、F9-KOマウスにおける尾静脈離断後、同等の強度で用量依存的且つ有意に出血時間をどれだけ減少させたかを示す。F9-KOマウスに、出血誘発10分前に投与した。ED50は、FIX-HEP及びrFIXについてそれぞれ、0.009mg/kg及び0.024mg/kgだった(p=0.18)。*、**及び***はそれぞれ、ビヒクルを受けた血友病対照と比較したときの、p<0.05、0.01及び0.001での統計的有意差である。データは平均±SEMである。F9-KOマウスに、出血誘発10分前に投与した。ED50は、FIX-HEP及びrFIXについてそれぞれ、0.012mg/kg及び0.030mg/kgだった(p=0.38)。*及び***はそれぞれ、ビヒクルを受けた血友病対照群と比較したときの、p<0.05及び0.001での統計的有意差である。データは平均±SEMである。
【０３６１】
【表４】
2017507136.tif 000043
【０３６２】
(実施例26:F9-KOマウスにおける40kDaのHEP-[N]-FIXの用量反応)
F9-KO(第IX因子ノックアウト)マウス[元はD.W. Stafford(University of North Carolina)より得られた血友病Bマウス(B6.129P2-F9tm1Dws)]の尾静脈離断(TVT)モデルにおいて、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIX(Novo Nordisk A/S社)の効果を比較した。要約すると、F9-KOマウスに、漸増用量の40kDaのHEP-[N]-FIX、rFIX又はビヒクル(5ml/kgの10mM ヒスチジン、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4)を投与し、10分後にテンプレートにガイドされた2.5mmの尾直径での左側尾静脈の離断により、出血を誘発した。尾を温暖な生理食塩水(37℃)中に浸漬し、60分間の出血の視覚的記録を可能にし、その後失血を、失われたヘモグロビンの量の分光光度測定により決定した。したがって、赤血球を5分間の4000×gでの遠心により単離した。上清を廃棄し、ヘモグロビン試薬(ABX Lysebio; ABX Diagnostics no. 906012、Triolab A/S社、Broendby、Denmark)で細胞を溶解した。5分間の4000×gでの遠心により細胞片を除去した。試料を550nmで読み取り、標準曲線からヘモグロビンの総量を決定した(HemoCueキャリブレーター707037、HemoCue社、Vedbaek、Denmark)。
【０３６３】
40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXの両方が、有意且つ用量依存的に失血を減少させ、0.2mg/kgで完全な反応に達した。二元配置ANOVA解析により、化合物間の効果に有意差は観察されなかった(P=0.1924)が、用量の有意(P<0.0001)な効果は検出された。したがって、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXの強度は同等であり、0.032mg/kg及び0.027mg/kgのそれぞれの推定ED50値間に有意差はなかった(p=0.69、図10、表5)。
【０３６４】
図10は、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXが、F9-KOマウスにおける尾静脈離断後、同等の強度で用量依存的且つ有意に失血をどれだけ減少させたかを示す。
【０３６５】
F9-KOマウスに、出血誘発10分前に投与した。ED50は、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXについてそれぞれ、0.032mg/kg及び0.027mg/kgだった(p=0.67)。***及び****はそれぞれ、ビヒクルを受けた血友病対照と比較したときの、p<0.001及び0.0001での統計的有意差である。データは平均±SEMである。
【０３６６】
同様に、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXの出血時間に対する効果は同等だった。すなわち、二元配置ANOVAにより、化合物間の効果に有意差は観察されなかった(P=0.82)が、用量の有意(P<0.0001)な効果は検出された。したがって、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXについて、有意且つ用量依存的な出血時間の短縮が観察され、推定ED50に有意差はなかった(それぞれ0.028及び0.034mg/kg、p=0.57、表5)。
【０３６７】
【表５】
2017507136.tif 000044
【０３６８】
(実施例27:一段階凝固アッセイにおけるHEP-第IX因子コンジュゲートの性能)
タンパク質のPEG化は、一段階凝固アッセイにおいて、使用されるaPTT試薬に応じて凝固時間に影響する可能性があり[Leongら  J Thromb Haemost 2011;9 (Suppl 2):379頁(P-TU-223)]、N9-GP(ノナコグベータペゴル、糖PEG化組換えFIX)について、PEG化はかかるアッセイにおいて大きな変動をもたらす可能性がある。
【０３６９】
BeneFIX(登録商標)及びN9-GPと比較したHEP-FIXコンジュゲートの性能を、以下のとおり5つの異なる一段階凝固アッセイ及び二段階発色アッセイにおいて評価した。3つの濃度(それぞれ5、15及び45nM)の以下のFIX化合物を、ヒトFIX除去血漿(Affinity Biologicals社)中に添加した。すなわち、27kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)、40kDaのHEP-[N]-FIX、40kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)、60kDaのHEP-[C]-FIX(E162C)、N9-GP及びBeneFIX(登録商標)。添加された試料のFIX活性を、二段階発色アッセイ、Biophen Factor IXを、製造者の指示に従い使用して測定した(Hyphen Biomed社)。この結果を100%活性と定義した。なぜなら、発色アッセイはポリマー結合に対して中立的だからである。
【０３７０】
以下のaPTT試薬を使用した一段階凝固アッセイにおいて、同じ試料における凝固活性を測定した。すなわち、Dade Actin(登録商標)FS(Siemens社)、STA PTT(登録商標)(Stago社)、APTT SP(ILS社)、Synthafax(登録商標)(ILS社)、Synthasil(登録商標)(ILS)。要約すると、等量の試験試料、ヒトFIX欠損血漿、APTT試薬、及びCaCl2(0.02M)を使用した。アッセイは、ILS社製の凝固解析装置上で測定されたFIX活性依存的な線維素凝塊形成時間を測定する。国際血漿標準(NIBSC)に対して較正された正常ヒト血漿のプール(ILS社)をキャリブレーターとして使用した。測定された活性を、発色アッセイにおいて測定された活性と比較し、結果を発色活性のパーセンテージで示した。
【０３７１】
結果:一段階凝固アッセイにおけるHEP-FIXコンジュゲートの性能を、発色方法により定義される、添加されたヒト試料におけるFIX活性の回復を算出することにより評価した。結果を表6に列挙し、図11に示す。BeneFIX(登録商標)の性能は予想どおりだった。ある程度の変動が観察されたが、5つすべてのaPTT試薬でのFIX活性の回復は、89〜122%(すなわち33パーセント点)だった。他方、N9-GP活性の回復は大きな変動を示したのであり、回復は、使用された5つのaPTT試薬について30%から553%の範囲(すなわち、523パーセント点)だった。HEP-FIXコンジュゲート活性の回復は、32〜147%の範囲(すなわち、115パーセントポイント)であり、したがって、HEP-FIXコンジュゲートのアッセイ性能は、これら5つのaPTT試薬について、N9-GPのアッセイ性能と比較して改善した。アッセイ性能は、HEPポリマーの長さ、又はFIX上のポリマー結合点によっては大きく影響されなかった。表6及び図11は、添加されたヒトFIX欠損血漿における、発色活性に対するFIX活性の回復を示す。3つの濃度の化合物(それぞれ5、15及び45nM)を、ヒトFIX除去血漿中に添加し、Biophen Hypen発色アッセイ及び一段階凝固アッセイにおいて5つの特定のaPTT試薬を使用して解析した。結果は、凝固活性として発色活性のパーセントで示され、平均+/-SD、n=3である。すべてのアッセイにおいて、活性を正常ヒト血漿標準物質(ILS社)に対して測定した。
【０３７２】
【表６】
2017507136.tif 000045
【０３７３】
(実施例28:F9-KOマウスにおける40kDaのHEP-[N]-FIXの効果の持続時間)
F9-KO(第IX因子ノックアウト)マウス[元はD.W. Stafford(University of North Carolina)より得られた血友病Bマウス(B6.129P2-F9tm1Dws)]の尾静脈離断(TVT)モデルにおいて、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIX(Novo Nordisk A/S社)の効果の持続時間を比較した。要約すると、F9-KOマウスに、0.4mg/kg(およそ80IU/kg)の40kDaのHEP-[N]-FIX、等用量のrFIX又はビヒクル(5ml/kgの10mM ヒスチジン、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.005% Tween80、pH6.4)を投与した。出血を、投与後0、48、72、120又は168時間のいずれかの時点で、テンプレートにガイドされた2.5mmの尾直径での左側尾静脈の離断により誘導した。尾を温暖な生理食塩水(37℃)中に浸漬し、60分間の出血の視覚的記録を可能にし、その後失血を、失われたヘモグロビンの量の分光光度測定により決定した。したがって、赤血球を5分間の4000×gでの遠心により単離した。上清を廃棄し、ヘモグロビン試薬(ABX Lysebio; ABX Diagnostics no. 906012、Triolab A/S社、Broendby、Denmark)で細胞を溶解した。5分間の4000×gでの遠心により細胞片を除去した。試料を550nmで読み取り、標準曲線からヘモグロビンの総量を決定した(HemoCueキャリブレーター707037、HemoCue社、Vedbaek、Denmark)。
【０３７４】
失血に対する時間依存的効果が観察された(図12)。統計的解析を、多重比較についてのボンフェローニの補正を伴う一元配置ANOVAにより実施した(表7)。ビヒクル群と比較して、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXの両方が、投与0時間後の急性設定における失血を有意(P<0.0001)に減少させた。40k-HEP-[N]-FIXで処置された動物もまた、投与後48時間(P=0.0012)及び72時間(P=0.0028)でビヒクル動物よりも有意に出血が少なかった一方で、rFIXで処置された動物はそうではなかった。注入72時間後、出血反応は化合物間で有意に異なった(P=0.020)。投与168時間後には、両方の化合物の効果がもはや検出できなかった。
【０３７５】
同様に、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXの出血時間に対する効果が観察された(表7)。ビヒクル群と比較して、40kDaのHEP-[N]-FIX及びrFIXの両方が、投与0時間後の出血時間を有意(P<0.0001)に減少させ、40kDa-HEP-[N]-FIXは、投与後48時間(P=0.0060)及び72時間(P=0.0041)で出血時間を減少させた一方で、rFIXは減少させなかった。注入72時間後、出血時間は化合物間で有意に異なった(P=0.022)。投与168時間後には、両方の化合物の効果がもはや検出できなかった。
【０３７６】
したがって、40kDa-HEP-[N]-FIX及びrFIXが、投与直後に同等の止血効果を示したが、効果は、40kDa-HEP-[N]-FIXについて、同等の用量のrFIXについてよりも有意に長く持続した。
【０３７７】
本明細書では本発明のいくつかの特徴を例示し説明したが、当業者であれば多くの修正、置換、変更、及び等価物に想到すると予想される。したがって、添付の特許請求の範囲は、すべてのかかる修正及び変更を、本発明の真の趣旨内に収まるものとして包含することが意図されることが理解されるべきである。
【０３７８】
【表７】
2017507136.tif 000046
【図１】
2017507136.tif 000051
【図２】
2017507136.tif 000052
【図３】
2017507136.tif 000053
【図４】
2017507136.tif 000054
【図５】
2017507136.tif 000055
【図６】
2017507136.tif 000056
【図７】
2017507136.tif 000057
【図８】
2017507136.tif 000058
【図９】
2017507136.tif 000059
【図１０】
2017507136.tif 000060
【図１１】
2017507136.tif 000061
【図１２】
2017507136.tif 000062
【図１３】
2017507136.tif 000063
【配列表】
2017507136000001.app
【国際調査報告】
2017507136.tif 000064
2017507136.tif 000065
2017507136.tif 000066