(57)【要約】タンパク質調製物を第一級アミン、第二級アミンまたはその両方を有する表面と接触させることにより、タンパク質調製物におけるウイルスおよびウイルスＤＮＡのレベルの低下を促進する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質の酸性調製物中のウイルスおよびウイルスＤＮＡのレベルを低下させるための方法であって、前記所望のタンパク質の前記酸性調製物を第一級アミン、第二級アミンまたはその両方を有する表面と接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
前記接触させるステップ中の作用ｐＨは、（ａ）約２．０〜約４．０、（ｂ）約２．２５〜約３．７５、（ｃ）約２．５〜約３．５、（ｄ）約２．７５〜約３．２５、（ｅ）約３．５〜約３．７５および（ｆ）約３．２５〜約３．５からなる群から選択される範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触させるステップ中の塩濃度は、（ａ）約０．０〜約０．５Ｍ、（ｂ）約０．０５〜約０．３Ｍ、（ｃ）約０．１〜約０．２Ｍからなる群から選択される範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記接触させるステップの持続期間は、（ａ）約１５〜約１２０分、（ｂ）約３０〜約６０分、（ｃ）約３０分未満の０でない量、（ｄ）約１５分未満の０でない量、（ｅ）約１０分未満の０でない量、（ｆ）約５分未満の０でない量、（ｇ）約２分未満の０でない量、（ｈ）約１分未満の０でない量および（ｉ）前記第一級アミンを有する表面を収容する装置に前記調製物を通すのに必要な時間からなる群から選択される範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記表面はエチレンジアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチルアミントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタミンおよびポリアリルアミンからなる群から選択される１つまたは複数の部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記表面は粒子、膜、モノリス、ヒドロゲル被覆骨格構造体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つの形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させるステップは、（ａ）第一級または第二級アミンを有する粒子を前記調製物中に分散するステップ、（ｂ）前記第一級アミンを有する表面と流体接触する装置に前記調製物を通すステップ、（ｃ）前記第一級アミンを有する表面と流体接触している装置に前記調製物を再循環させるステップ、およびそれらのステップの組み合わせからなる群から選択される操作により行われる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示された実施形態は、精製対象の所望のタンパク質を含む調製物中のウイルスおよびウイルスポリヌクレオチドを減少させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一部のウイルス種は、高酸性ｐＨなど極端な条件への曝露によって不活化することが知られている。これらには、大部分の種の脂質エンベロープウイルスが含まれる。ウイルス種の中には、こうした不活化に対して耐性を持つことが知られているものもある。これらには、タンパク質外被（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏａｔ）ウイルスとも呼ばれる多くの非脂質エンベロープウイルス種が含まれる。
【０００３】
混入ウイルス種の除去を含むタンパク質の精製には、陰イオン交換クロマトグラフィーが一般に使用される。こうした用途に使用されるアニオン交換体は、第四級アミンイオン交換体であることが多い。これらの用途は中性〜ややアルカリ性のｐＨで行われる。第四級アミンイオン交換体は一般に、そうした条件下で最も強力なウイルス結合を支持するものであり（非特許文献１）、ウイルスの除去と同時に、混入する宿主細胞タンパク質の除去に、そうした条件が必要とされるためである（非特許文献２）。中性〜アルカリ性の作用ｐＨでのウイルスおよび宿主細胞タンパク質の除去には、第一級アミンを用いたアニオン交換体も記載されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃ．カーティス（Ｃｕｒｔｉｓ）ら著、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．）、第８４巻（２００３年）１７９〜１８５
【非特許文献２】Ｐ．ガニョン（Ｇａｇｎｏｎ）著、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＡ（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ）第１２２１巻（２０１２年）ｐ．５７〜７０
【非特許文献３】Ｗ．リオーダン（Ｒｉｏｒｄａｎ）ら著、バイオテクノロジー・プログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．）第２５巻（２００９年）１６９５〜１７０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、所望のタンパク質の酸性調製物中のウイルスおよびウイルスＤＮＡのレベルを低下させるための方法であって、所望のタンパク質の酸性調製物を第一級アミン、第二級アミンまたはその両方を有する表面と接触させるステップを含む方法である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
低ｐＨ調製物を、低ｐＨ処理中またはその後に、第一級および／または第二級アミンを有する固体表面と接触させることにより、所望のタンパク質を含む調製物からのウイルスおよびウイルスＤＮＡの除去の改良のための方法を提供する。本明細書で使用する場合、「低ｐＨ」処理とは、ウイルス不活化処理の一環として十分に低いｐＨ、すなわち、少なくとも１つのウイルスを不活化するのに十分に低いｐＨをいう。したがって、ｐＨ範囲の上限は、典型的には約４．０以下である。このためいくつかの実施形態では、低ｐＨは、たとえば約１．０〜約４．０、またはいくつかの実施形態では約２．０〜約４．０もしくは約２．０〜約３．８にわたってもよい。当業者であれば、規制基準に適合するようにｐＨを選択してもよいことを理解するであろう。典型的な場合には、規制限度の上限ｐＨは約３．８であってもよい。いくつかの実施形態では、所望のタンパク質の酸性調製物中のウイルスおよびウイルスＤＮＡのレベルを低下させるための方法であって、所望のタンパク質の酸性調製物を第一級アミン、第二級アミンまたはその両方を有する表面と接触させるステップを含む方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、接触させるステップ中の作用ｐＨは、（ａ）約２．０〜約４．０、（ｂ）約２．２５〜約３．７５、（ｃ）約２．５〜約３．５、（ｄ）約２．７５〜約３．２５、（ｅ）約３．５〜約３．７５および（ｆ）約３．２５〜約３．５、ならびにそれらの範囲の間の中間の範囲または中間の個々の値からなる群から選択される範囲にある。
【０００８】
いくつかの実施形態では、接触させるステップ中の塩濃度は、（ａ）約０．０、すなわち０でない値から約０．５Ｍまで、（ｂ）約０．０５〜約０．３Ｍ、および（ｃ）約０．１〜約０．２Ｍからなる群から選択される範囲である。塩濃度は、これらの記載された範囲の間の任意の中間の範囲または中間の個々の値であってもよい。
【０００９】
いくつかの実施形態では、接触させるステップの持続期間は、（ａ）約１５〜約１２０分、（ｂ）約３０〜約６０分、（ｃ）約３０分未満の０でない量、（ｄ）約１５分未満の０でない量、（ｅ）約１０分未満の０でない量、（ｆ）約５分未満の０でない量、（ｇ）約２分未満の０でない量、（ｈ）約１分未満の０でない量、および（ｉ）第一級アミンを有する表面を収容する装置に調製物を通すのに必要な時間からなる群から選択される範囲にある。
【００１０】
いくつかの実施形態では、表面は、エチレンジアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチルアミントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタミン、ポリアルキルアミンからなる群から選択される１つまたは複数の部分を含む。いくつかの実施形態では、表面は任意の第一級アミン、第二級アミンまたはそれらの組み合わせを含んでもよい。表面は、支持体の表面に付着させた任意の直鎖または分岐第一級モノアミンフラグメントに由来しても、あるいはその形態を取ってもよい。例示的な第一級アミン部分として、以下に限定されるものではないが、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、イソ−ブチルアミン、ヘキシルアミンの任意の異性体、ヘプチルアミンの任意の異性体、オクチルアミン、ノニルアミンの任意の異性体、デシルアミンの任意の異性体に基づくフラグメント、またはそれらの混合物もしくは組み合わせが挙げられる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ジアミンフラグメントを利用してもよい。好適なジアミンとして、以下に限定されるものではないが、下記のジアミンが挙げられる。
Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＮＨ２
式中、Ｒは約１および約２０の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐アルキル基またはアルケニル基、約１および約２０の炭素原子を有するシクロアルケニル基、約１および約２０の炭素原子を有するアルキルシクロアルケニル基、約１〜約２０の炭素原子を有するアルカレニル基、約１および約２０の炭素原子を有するアラルケニル基もしくは同種のもの、またはそれらの混合物もしくは組み合わせである。Ｒ基は、酸素、窒素、フッ素および／または塩素など炭素および水素以外の原子をさらに含んでもよい。
【００１２】
好適な表面アミン部分は、以下に限定されるものではないが、アルキルジアミン、シクロアルキルジアミン、アルカシクロアルキルジアミン、アラルキルジアミン、アリールジアミン、アルカリルジアミンおよび同種のもの、ならびにそれらのアナログを含むジアミンおよびトリアミンに基づいてもよく、その場合１つまたは複数の炭素原子が窒素原子、酸素原子またはそれらの混合物で置換されていてもよく、酸素原子はカルボキシ部分、ヒドロキシ部分および／もしくはエーテル部分を形成し、窒素原子は第三級アミン部分および／もしくはアミド部分を形成し、ならびに／または、１つもしくは複数の水素原子はフッ素原子、塩素原子またはそれらの混合物で置換されていてもよく、２〜約２０の炭素原子、約３〜約１５の炭素原子および約４〜約１０の炭素原子を含む。例示的なアルキルジアミンとして、以下に限定されるものではないが、１，２−ジアミノエタン（１，２−エチレンジアミン）、１，２−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノプロパン、１，２−ジアミノブタン、１，３−ジアミノブタン、１，４−ジアミノブタン、１，２−ジアミノペンタン、１，３−ジアミノペンタン、１，４−ジアミノペンタン、１，５−ジアミノペンタン、および類似の高級ジアミノアルカン、ヘキサメチレンジアミン、アミノメチルシクロペンチルアミン、１，２−シクロペンタンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、１，２−ジアミノベンゼン、リジン（または他のジアミンアミノ酸）、１，２−ジアミノベンゼン、１，４−ジアミンベンゼン、１，２−ジフェニル−１，２−エタンジアミン、フェニレンジアミン、２−ヒドロキシプロピレンジアミン、ヒダントイン、Ｎ，Ｎ−ビス（ジヒドロキシエチル）エチレンジアミン、ヘキサヒドロトリアジン、アミノエチルピペラジン（ＡＥＰ）もしくは同種のもの、またはそれらの混合物もしくは組み合わせが挙げられる。本組成物の製造に満足に使用することができる他の脂肪族ジアミンおよびトリアミンの例としては、１，４−ジアミノシクロヘキサンおよびビス−ヘキサメチレントリアミンが挙げられる。前述の実施形態のすべてにおいて、支持体の表面上にアミンを提示することは、窒素自体を含むフラグメントのいずれかの任意の原子への結合により達成することができる。いくつかの実施形態では、第二級アミンを利用してもよい。こうした第二級アミンは、別の直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ２０フラグメントを含んでもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態では、表面は、粒子、膜、モノリス、ヒドロゲル被覆骨格構造体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つの形態である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、接触させるステップは、（ａ）第一級および／または第二級アミンを有する粒子を調製物中に分散するステップ、（ｂ）表面と流体接触する装置に調製物を通すステップ、（ｃ）表面と流体接触している装置に調製物を再循環させるステップ、および（ｄ）これらのステップの組み合わせからなる群から選択される操作により行われる。
【００１５】
固体表面上の第一級および／または第二級アミンに対するウイルス結合は、陰イオン交換クロマトグラフィーの許容されている法則から抜け出ることが意外にも発見された。結合したウイルスまたはウイルスポリヌクレオチドを、第一級アミンを有する表面から溶出するのに必要な塩の濃度により測定される結合強度は、ｐＨの低下に応じて増加し、場合によってはｐＨ８で同じ表面上の結合と比較して２倍超、ｐＨ８で第四級の交換体の結合と比較して５倍超、ｐＨ６で第四級の交換体の結合と比較しておよそ１０倍増加する。結合は、ｐＨ値が低くなると徐々に強くなるため、ｐＨ３では、第一級および／または第二級アミンを有する表面からＤＮＡを除去するには、５Ｍまでのグアニジンが必要とされる。同時に、実験データから、約１５０ｋＤａより小さい分子量を有するペプチドおよびタンパク質の保持はｐＨ８と比較して向上しないことにより、大部分の調製物における所望のタンパク質が、ウイルスおよびウイルスＤＮＡの保持が向上する条件下で、第一級および／または第二級アミンを有する表面に結合しないウインドウが生じることが示される。実験データにより、これは、低ｐＨによる処理で著しく不活化することがないＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ：Ｈｅｐａｔｉｔｕｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）およびマウス微小ウイルス（ＭＶＭ：Ｍｉｎｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ）など非脂質エンベロープウイルスを７００倍超低下させることに換算されることが示される。第四級アニオン交換体によるウイルス、ＤＮＡおよびタンパク質などの溶質の保持は、溶質の電気陽性が強く（および／または電気陰性が弱く）なる結果、ｐＨの低下と共に減少するため、これは予想外である。このため一般に、陰イオン交換クロマトグラフィーは、酸性ｐＨでの、特にウイルス不活化に通常使用される条件など強酸性のｐＨ値でのウイルス除去には役に立たないと理解される。任意の特定の理論に帰するわけではないが、第一級および／または第二級アミンを有する表面上のウイルスおよびウイルスＤＮＡの反対挙動には、水素結合が介在している可能性がある。水素結合は静電気成分に関与することが知られており、その寄与はイオン交換挙動と一致することが示唆される傾向にあるので、これは予想外である。それでも、選択的水素供与体−受容体、たとえばソルビトールとの競合実験のデータからは水素結合が示される。この挙動は、１８〜７８ｋＤａの範囲の大きさのタンパク質についてｐＨ８と比較してｐＨ６で保持が実質的に増加することを示す；ｐＨの低下と結合の増加に大きさの相関関係がないことを示す；および保持が約ｐＨ６で最も強くなり、ｐＨが低下すると弱くなり、ｐＨ４〜５で失われることを示す（米国特許第６，０９０，２８８号）当該技術分野において公知の結果と複数の点で異なり、反対であるため、さらに予想外である。本明細書に開示された方法を支持する実験データから、約６６ｋＤａのタンパク質の保持の実質的な向上がない一方、大きさと向上との間に強い相関関係があり、約１ＭＤａ以上に近付く大きさを有する溶質の保持は６未満のｐＨ値で、特にｐＨ値４未満で引き続き強くなることが示されており、これらすべては必要な実現要因である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、作用ｐＨは、所望のタンパク質がその臨床的有効性または安全性に影響し得る永久的損傷を受けずに許容できる最低ｐＨまで、ｐＨ５もしくはそれ未満、または４もしくはそれ未満、または３．９もしくはそれ未満、または３．８もしくはそれ未満、または３．７もしくはそれ未満、または３．６もしくはそれ未満、または３．５もしくはそれ未満、または３．４もしくはそれ未満、または３．３もしくはそれ未満、または３．３もしくはそれ未満、または３．２もしくはそれ未満、または３．１もしくはそれ未満、または３．０もしくはそれ未満など６未満であってもよい。いくつかの実施形態では、許容可能なｐＨは２．５もしくはそれ未満、または２．０もしくはそれ未満、または約１．０であってもよい。許容可能な最低ｐＨは、所望の各生成物に特有なものであり、大まかな一般論として表現できないと理解される。いくつかの実施形態では、脂質エンベロープウイルス種でも不活化には、４未満のｐＨが必要とされるため、最大ｐＨは約４以下である。いくつかの実施形態では、ｐＨは３．２５〜３．７５であろう。
【００１７】
いくつかの実施形態では、調製物は塩を有していなくてもよい。いくつかの実施形態では、調製物は１つまたは複数の種の塩を含んでもよく、そうした塩の濃度は、０．０１Ｍまでの、０．０５Ｍまでの、０．１Ｍまでの、０．２Ｍまでの、０．３Ｍまでの、０．４Ｍまでの、０．５Ｍまでの、またはより高く、場合によっては１．０Ｍまでの０でない量である。そうしたいくつかの実施形態では、塩の種は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）であってもよい。いくつかの実施形態では、塩の存在は第一級アミンを有する表面によるウイルス除去に対して無視できる程度の作用を有し得る一方、いくつかの実施形態では、塩の存在は、第一級アミンを有する表面により達成されるウイルス除去の程度を低下させ得る。いくつかの実施形態では、塩の存在はウイルス不活化を促進する、あるいは所望のタンパク質の安定性を高めるまたは所望のタンパク質の溶解性を低下させることがある。こうした作用は、所望のタンパク質の種ごとに判定することができる。いくつかの実施形態では、表記の範囲内での塩濃度の上昇は、低ｐＨでの処理によってのみ達成される不活化の程度よりも、第一級アミンを有する表面によりウイルス除去が促進される程度を限定することもあるが、除去の程度は依然として著しいものである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、調製物は、ウイルス不活化を促進することを意図した要素、たとえばエタクリジン、メチレンブルー、ダウノマイシン、ドキソルビシン、クロルヘキシジン、アレキシジン、塩化ベンザルコニウム、トリス（２−アミノエチル）アミン、トリ（Ｎ−ブチル）ホスフェート、界面活性剤、キレート化剤またはそうした要素の組み合わせを含んでもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第一級アミンを有する表面はさらに、第二級アミン基など他の種の電気陽性化学部分を含んでもよい。他の実施形態では、第一級アミンを有する表面はさらに、第三級または第四級アミン基など他の種の電気陽性化学部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第一級アミンを有する表面はさらに、２種以上の電気陽性化学部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第一級アミンを有する表面はさらに、第二級および第三級アミン；第二級および第四級アミン；第三級および第四級アミン；第二級、第三級および第四級アミンからなる電気陽性化学部分の組み合わせを任意の相対的比率で含んでもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、第一級アミンを含む化学種はトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）であってもよい。他の実施形態では、第一級アミンを含む化学種はエチレンジアミンであってもよい。他の実施形態では、第一級アミンを含む化学種はポリアリルアミンでも、または別の高分子第一級アミンでもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、第一級アミンを有する表面は、それが全体として静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用、π−π結合および金属配位相互作用に従事することを可能にする化学元素を含んでもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第一級アミンを有する表面は、第一級アミンと反対の電荷を有する元素を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第一級アミンを有する表面は、無電荷であるか平衡比率の負電荷および正電荷を含むかのいずれかまたは両方によって、電気的中性の元素を含んでもよい。
【００２３】
複数の表面が存在するいくつかの実施形態では、それぞれの表面は、同じ第一級アミンを含む種を有してもよい。複数の表面が存在するいくつかの実施形態では、それぞれの表面は、異なる第一級アミンを含む種を有してもよい。複数の表面が存在するいくつかの実施形態では、それぞれの表面の一部は第一級アミン以外の種を有してもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第一級アミンを有する固体表面は、粒子、膜、モノリス、巨大網状骨格上のヒドロゲルの物理的形状であってもよい。そうしたいくつかの実施形態では、複数の粒子、または複数の膜、または複数の他の物理的形状、または異なる物理的形状の組み合わせなど複数の物理的単位が存在してもよい。そうしたいくつかの実施形態では、複数の粒子をカラムに充填してもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態では、複数の第一級アミンの表面は、所望のタンパク質を含む調製物中に懸濁してもよい。そうしたいくつかの実施形態では、懸濁された表面は、処理後に沈降、または濾過、または浮選、または磁場における捕捉、または反対電荷表面上での捕捉、または他の任意の都合のよい手段により除去することができる。いくつかの実施形態では、所望のタンパク質を含む調製物は、ウイルス不活化のための低ｐＨ処理が名目上完了した後、１つまたは複数の第一級アミンを有する流体接触表面を含む装置内に流してもよい。いくつかの実施形態では、所望のタンパク質調製物は、１つまたは複数の第一級アミンの流体接触表面を含む装置を通して、低ｐＨ処理の全持続期間までの期間、連続的に再循環してもよい。いくつかの実施形態では、所望のタンパク質調製物は、前述の接触様式の任意の組み合わせにより、１つまたは複数の第一級アミン結合表面と接触させてもよい。
【００２６】
本開示方法の重要な要素を説明する一実施形態では、ＩｇＧモノクローナル抗体など部分的に精製された所望のタンパク質を含む調製物をｐＨ３．５に滴定し、そのｐＨで６０分間維持する。エチレンジアミンを有するように修飾された表面を有するモノリスを、抗体調製物と名目上同じｐＨおよび塩条件に平衡化する。次いで調製物をモノリスに流す。モノリスは任意に、所望のタンパク質の回収を最大化するためｐＨ３．５の洗浄緩衝液でリンスしてもよい。次いでモノリスは任意に廃棄しても、または再生させてもよい。
【００２７】
本開示方法の重要な要素を説明する別の実施形態では、部分的に精製された抗体を含む調製物をｐＨ３．５に滴定する。エチレンジアミンを有するように修飾された表面を有するモノリスを、抗体調製物と名目上同じｐＨおよび塩条件に平衡化する。次いで所望のタンパク質が６０分間または他の何らかの特定の時間間隔でｐＨ３．５に曝されるまで、調製物をモノリスに再循環させる。
【００２８】
本開示方法の重要な要素を説明する別の実施形態では、部分的に精製された抗体を含む調製物をｐＨ３．５に滴定する。ポリアリルアミンを有するように修飾された表面を有する膜吸着材を、抗体調製物と名目上同じｐＨおよび塩条件に平衡化する。次いで調製物を６０分の期間膜に再循環させる。密接に関連する実施形態では、抗体調製物をｐＨ３．５で６０分間インキュベートし、次いでシングルパスで膜吸着材に流す。
【００２９】
本開示方法の重要な要素を説明する別の実施形態では、部分的に精製された抗体を含む調製物をｐＨ３．５に滴定する。エチレンジアミン、またはポリアリルアミン、または他の第一級アミンを含むリガンドを有するように修飾された表面を有する粒子を、抗体調製物と名目上同じｐＨおよび塩条件に平衡化する。粒子を撹拌により６０分の期間懸濁状態で維持し、その後粒子を沈降または濾過または他の任意の都合のよい方法により除去する。粒子は任意に、所望のタンパク質の回収を最大化するため、ｐＨ３．５の洗浄緩衝液でリンスしてもよい。密接に関連する実施形態では、抗体調製物をｐＨ３．５で６０分間インキュベートし、次いでエチレンジアミン、ポリアリルアミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、または他の第一級アミンを含むリガンドを有する粒子を充填したカラムに通す。
【００３０】
本明細書の実施形態をより容易に理解できるように、下記の用語を定義する。他の定義は、詳細な説明を通じて記載される。
【００３１】
「アミン」は、有機ラジカルとの、多くの場合、メチル基またはエチル基などの炭化水素との、１つまたは複数の水素原子の置換によりアンモニアから誘導される有機化合物と定義される。「第一級アミン」では、１個の水素原子が有機ラジカルで置換されている。「第二級アミン」では、２個の水素が有機ラジカルで置換されている。「第三級アミン」では、３個の水素が有機ラジカルで置換されている。「第四級アミン」では、３個の水素が有機ラジカルで置換されており、第四の有機ラジカルが置換のないアミン上に存在する電子対に置き換わっている。第一級アミンを含む化合物は、他の種類のアミンまたは非アミン種を含んでもよい。
【００３２】
「水素結合」は、１つには、１つの分子のプロトンと、もう１つの分子の電気陰性原子との間の静電引力に、１つには共有結合性相互作用に起因する２つの分子間の弱い結合と定義される。
【００３３】
「ウイルス」または「ビリオン」とは、超顕微鏡的（直径およそ２０〜３００ｎｍ）で代謝的に不活性な感染病原体をいい、生きている宿主、主に細菌、植物および動物の細胞内でのみ複製し、ＲＮＡまたはＤＮＡコアと、タンパク質外被と、より複雑なタイプの場合、１つまたは２つの脂質層を含む周囲のエンベロープとからなる。例として、以下に限定されるものではないが、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス、（−）ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ  ＲＴウイルスおよびｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス；アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ノロウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄａｎｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルスおよびバクテリオファージが挙げられる。ウイルスという用語は、遺伝子治療のベクターとして使用される、ワクチンとして使用される、および抗生物質の代替品としてのウイルス粒子を含むものと理解される。ウイルスという用語はまた、いわゆる偽ウイルス粒子も含むものと理解され、偽ウイルス粒子は、防御免疫を発現するその能力を保存しつつ、感染を引き起こすその能力を除去するように組換えにより改変されたウイルス粒子ということもでき、さらに異なるウイルスの種が、両方に感染した宿主内で遺伝子を一方から他方に自然に伝達する異種指向性ウイルス種ということもできる。
【００３４】
「ウイルス不活化」とは、その複製能力を停止するようにウイルスを損傷させるプロセスをいう。この目的のためには、加熱が一般に使用され、さらに化学薬品または高酸性もしくは高アルカリ性条件などの極端な化学環境への曝露、あるいは特に有機溶媒への曝露も使用される。
【００３５】
「ウイルス除去」とは、調製物からウイルスを除去するプロセスをいう。こうした除去は、濾過装置の空隙がウイルスの通過を妨げる濾過、またはウイルスの大きさにより、ウイルスがより小さなタンパク質から分画されるサイズ排除クロマトグラフィーなど物理的方法によるものであってもよい。除去はまた、イオン交換、親和性、疎水性相互作用もしくはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、または他のクロマトグラフィー法などのクロマトグラフィー表面など相補的表面とのウイルスの化学結合によるものであってもよい。
【００３６】
「ウイルスの減少」とは、不活化および除去による調製物からの全体的なウイルス量の減少をいう。
【００３７】
「ウイルスポリヌクレオチド」とは、ウイルスの遺伝子材料、ある例ではＤＮＡ、場合によってはＲＮＡをいう。
【００３８】
ある種の実施形態では、本開示方法は、ウイルスの減少を促進するための上述の一般的な例を変更せずに適用してもよい。不活化溶液のｐＨは、第一級アミンを有する固体材料を考慮することなく、可能な最高度のウイルス不活化を達成するように選択すべきである。ｐＨ４より低い値から約ｐＨ３の値であってもよい、目的の産物を永久的に損傷しない、ウイルスを不活化することが分かっているｐＨ値の有効範囲内であれば、固体材料は、実質的に正味のウイルス低下を促進すると予想され得る。曝露時間も、第一級アミンを有する固体材料に関係なく選択してもよい。曝露温度も、第一級アミンを有する固体材料に関係なく選択してもよい。抗ウイルス要素の添加は考慮してもよいが、しかしながら、その個別および全体の影響を評価するため、いくつかの変動要素を点検することが賢明であろう。非イオン添加剤、両性イオン添加剤または正電荷を帯びた添加剤は、第一級アミンを有する固体材料がウイルスまたはウイルスＤＮＡを保持する能力を大きく妨害することなく、許容されると予想され得る。電気陰性の添加剤は、第一級アミンを有する固体材料へのウイルス結合に干渉する傾向があり得る。塩などの導電性添加剤は、第一級アミンを有する固体材料がウイルスに結合する能力を限定する可能性があるけれども、一般に、およそ生理的導電率以下を生じる塩濃度は、十分に許容され、いくつかの実施形態では、生理的導電率の２倍または３倍の塩濃度でもなお、第一級アミンを有する固体材料は、全体としてウイルスの減少の相当な促進を発揮することができる。第一級アミンを有する固体材料がウイルスを減少させる能力を、添加剤が低下させ得る程度を判定するには、様々なレベルの添加剤で単純な実験を行うことができる。所与の変動要素のセットに最適な条件を特定するため統計学的に妥当な多くのデータを得るのに必要とされる試験数を最小限に抑えるには、実験計画法（ＤｏＥ：Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）と呼ばれる技法が、当該技術分野において広く知られている。一般的な事柄として、第一級アミンを有する固体材料に関係なく、最も効果的なウイルス不活化を支持する条件は、第一級アミンを有する固体材料と組み合わせて、全体としてウイルスの最大の減少を支持する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本開示方法は、ウイルスの減少を促進すると同時にＤＮＡおよび／または混入タンパク質の除去を促進する。実験データから、これがウイルスの減少と同じ化学的機構により起こり、意外にもｐＨの低下と共に高まることが示される。そうしたいくつかの実施形態では、たとえば第一級アミンを有する表面に結合するのがまさに所望の産物である場合、ウイルスの最高の減少に都合がよい実際に即した最低の塩濃度を利用すると有利であり得る。他の実施形態では、たとえば所望のタンパク質が第一級アミンを有する表面に引き付けられる場合、所望の産物の減少を防止する、および結合した所望のタンパク質がウイルス結合能に干渉するのを防止するという二重の目的で塩濃度を高めることが必要であるかもしれない。そうしたいくつかの実施形態では、塩濃度の上昇は一般に、所望のタンパク質の減少および／またはウイルス結合への所望のタンパク質の干渉を防止するのに必要とされる以上に高くするべきでない。所望のタンパク質種は各々、異なる特性を示すため、塩が必要かどうかを判定するのに、およびその最小有効濃度を判定するのに実験が必要とされることがあることが理解される。単純な実験により有効濃度を判定することは、当業者の能力の範囲内である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ウイルスの減少にはどれが最も効果的な接触および最高の性能を与えるかを判定するため、第一級アミンを有する表面と様々な形態および組成の装置とを評価することが有益になる。一般的な事柄として、膜はモノリスより流れ抵抗が少ないけれども、モノリスの方がウイルス結合能が高い。所望のタンパク質調製物に懸濁した多孔質粒子は一般に、ウイルスおよび荷電粒子間の分子距離が大きいため、性能が不十分であり、ウイルス結合反応速度が遅いという難点がある。多孔質粒子を充填したカラムは、懸濁粒子より反応速度は速いものの、膜およびモノリスに比較してやはり遅く、依然として低性能という難点があるが、それでも多孔質粒子は、ウイルスの減少の相当の促進を達成し得る。
【実施例】
【００４１】
実施例１
エチレンジアミンを有するモノリス（ＣＩＭ  ＥＤＡ、ＢＩＡセパレーションズ（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ））のｐＨに応じたＤＮＡ結合。サケ精子由来のゲノムＤＮＡをウイルスＤＮＡの代替として使用した。別の実験でＥＤＡモノリスをｐＨ８．０〜３．５の範囲の緩衝液で平衡化した。５０ｍＭのトリス、ｐＨ８に懸濁したＤＮＡをモノリスに通液した。非結合サンプル要素を排除するための洗浄ステップ後、ＮａＣｌまたはグアニジンの直線グラジエントでＤＮＡを溶出した。どちらの場合も結果は、ｐＨ４から保持の強度の不釣り合いな増加を示す。実験結果を下記表１に示す。
【００４２】
【表１】
2017519734.tif 000002
【００４３】
実施例２
第一級アミンを有する表面上のＤＮＡ保持の向上と第四級アミンを有する表面上の保持の低下。サケ精子由来のゲノムＤＮＡをウイルスＤＮＡの代替として使用した。第一級アミンを有するモノリス（ＣＩＭ  ＥＤＡ、ＢＩＡセパレーションズ）上と第四級アミンを有するモノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡセパレーションズ）上とのＤＮＡの保持をｐＨ８、７および６で評価した。ＤＮＡはＱＡからｐＨ８．０では０．６ＭのＮａＣｌで溶出し、ｐＨ７．０では０．５５ＭのＮａＣｌに低下し、ｐＨ６．０では０．４７ＭのＮａＣｌにさらに低下した。ＤＮＡはＥＤＡからｐＨ８．０では０．８３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０では１．１１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０では１．８ＭのＮａＣｌで溶出した。これらの結果は、第一級アミンを有する表面上の保持は、ｐＨの動向と反対であり、かつ第四級アミンを有する表面で観察されるより劇的にはるかに大きいということを浮き彫りにする。
【００４４】
実施例３
第一級アミンを有する表面上のウイルス保持の向上と第四級アミンを有する表面上の保持の低下。バクテリオファージＭ１３を試験ウイルスとして使用した。第一級アミンを有するモノリス（ＣＩＭ  ＥＤＡ、ＢＩＡセパレーションズ）上と第四級アミンを有するモノリス（ＣＩＭ  ＱＡ、ＢＩＡセパレーションズ）上とのＤＮＡの保持をｐＨ８、７および６にて評価した。ＤＮＡはＱＡからｐＨ８．０では０．７ＭのＮａＣｌで溶出し、ｐＨ７．０では０．６１ＭのＮａＣｌに低下し、ｐＨ６．０では０．５３ＭのＮａＣｌにさらに低下した。ＤＮＡはＥＤＡからｐＨ８．０では１．０２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０では１．４７ＭのＮａＣｌ、およびｐＨ６．０では２．５ＭのＮａＣｌで溶出した。これらの結果は、第一級アミンを有する表面上保持は、ｐＨの動向と反対であり、かつ第四級アミンを有する表面で観察されるより劇的に大きいということを浮き彫りにする。
【００４５】
実施例４
第一級アミンを有するモノリスを用いたマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）の減少の促進。ＭＶＭを含むウイルス細胞培養物をｐＨ３．５に６０分間曝した。ＭＶＭは、これらの条件により不活化されないことが知られている。固形物を濾過により除去し、濾液を、ｐＨ３．５に平衡化したＥＤＡモノリスに通液した。ＭＶＭ含有量は、２．８５ｌｏｇ１０倍低下した。これは、ウイルスの減少の約７００倍の向上に相当し、特に、とりわけＭＶＭなどのレトロウイルス種を含む非エンベロープウイルス種の除去を促進する本開示方法の能力を浮き彫りにする。
【００４６】
実施例５
第一級アミンを有するモノリスを用いた、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の減少の促進。ＨＡＶを含むウイルス細胞培養物をｐＨ３．５に６０分間曝した。ＨＡＶは、これらの条件により不活化されないことが知られている。固形物を濾過により除去し、濾液を、ｐＨ３．５に平衡化したＥＤＡモノリスに通液した。ＭＶＭ含有量は、２．８５ｌｏｇ１０倍低下した。これは、ウイルスの減少の約７００倍の向上に相当し、非エンベロープウイルス種の除去を促進する本開示方法の能力を浮き彫りにする。
【００４７】
本開示方法がさらに、ウイルス、特に非脂質エンベロープウイルスの精製にも使用され得、低ｐＨの結合が、精製と共に脂質エンベロープウイルスを不活化する第２の利益となり得ることは、当業者に明らかであろう。同じ理由で、本開示方法はさらに、脂質エンベロープウイルスが混入している可能性がある調製物からのＤＮＡの単離にも使用され得ることも同様に明らかであろう。どちらの場合も、標的産物の保持をその大きさに応じて大きく向上させる本開示方法の能力は、タンパク質などのより小さな混入物の排除にも都合がよい。
【００４８】
本明細書に引用する参考文献はすべて、１つ１つの刊行物または特許または特許出願について、それらの全体をあらゆる目的において援用するために具体的に個々に示しているかのように、それらの全体をあらゆる目的において援用する。援用する刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲で、本明細書は、そうした任意の矛盾する材料に取って代わるおよび／または優先する。
【００４９】
本明細書および特許請求の範囲に記載された成分、クロマトグラフィー条件などの量を表す数字はすべて、あらゆる場合において、「約」という語で修飾されているものと理解すべきである。したがって、異なる記載がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、本実施形態が得ようとする所望の性能によって変動してもよい近似値である。
【００５０】
当業者に明らかなように、本明細書における実施形態の多くの修正および変形は、その精神および範囲から逸脱しない範囲でなし得る。本明細書に記載の特定の実施形態は、例示を提供するものに過ぎず、いかなる意味でも限定を意図するものではない。本明細書および例は、単なる例示と見なされることを意図しており、実施形態の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲により示される。
【国際調査報告】
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