(57)【要約】本明細書では、ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質、ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を含む医薬組成物、及びＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を使用した治療方法を開示する。本出願は異種アミノ酸配列と融合されたＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質を含む融合タンパク質を開示する。前記融合タンパク質は血清リン酸濃度を調節するが、血清１，２５ＶｉｔＤ濃度を実質的に調節しない。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質は、異種アミノ酸配列にリンカーを介して融合される。本発明は、本明細書で開示する核酸を含むベクター、及び本発明のタンパク質をコードするベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞も包含する。2017517272.tif 000016
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種アミノ酸配列と融合された線維芽細胞増殖因子２３  ｃテール（ＦＧＦ２３  ｃテール）タンパク質を含む、融合タンパク質であって、血清リン酸濃度を調節するが、血清１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（１，２５ＶｉｔＤ）濃度を実質的に調節しない、前記融合タンパク質。
【請求項２】
二量体化ドメインを更に含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示す配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質が、リンカーを介して異種アミノ酸配列と融合される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーが、
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から選択される配列を含むペプチドリンカーである、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記異種アミノ酸配列が、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記Ｆｃドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｆｃドメインが、前記ドメインのエフェクター機能を変更するように改変されている、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｆｃドメインが、残基２４２、２４３及び２４５でアミノ酸置換を含むように改変され、位置２４２の該置換アミノ酸がアラニンであり、位置２４３の該置換アミノ酸がアラニンであり、かつ位置２４５の該置換アミノ酸がアラニンである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記Ｆｃドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示すアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記Ｆｃドメインが、融合タンパク質の半減期を延長するために改変される、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示すアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示す核酸配列を含む、単離核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸または請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を産生する方法であって、前記核酸によってコードされるタンパク質が発現する条件下で、請求項２０に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記タンパク質を単離することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示すアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含む、ＦＧＦ２３  ｃテール  Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１〜１５または２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＦＧＦ２３とＦＧＦＲ／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される疾患または障害の治療方法。
【請求項２５】
前記疾患または障害が腎臓リン酸消耗障害である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患または障害が、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発性骨軟化症（ＴＩＯ）、繊維性骨異形成症（ＦＤ）及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＧＦ２３とＦＧＦＲ／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される疾患または障害の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１５または２３のいずれか一項に記載のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の使用。
【請求項２８】
前記疾患または障害が腎臓リン酸消耗疾患または障害である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記疾患または障害が、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発性骨軟化症（ＴＩＯ）、繊維性骨異形成症（ＦＤ）及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
それを必要とする患者での、ＦＧＦ２３とＦＧＦＲ／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される疾患または障害の治療のための、請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３１】
前記疾患または障害が腎臓リン酸消耗疾患または障害である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記疾患または障害が、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発性骨軟化症（ＴＩＯ）、繊維性骨異形成症（ＦＤ）及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群から選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療方法であって、請求項１〜１５または２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１５または２３のいずれか一項に記載のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の使用。
【請求項３５】
それを必要とする患者での、左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療のための、請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年３月２８日出願の米国特許仮出願第６１／９７２，０８１号に対する優先利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は組換えＦＧＦ２３融合タンパク質に関する。本発明は更に、このような融合タンパク質を含む組成物、及びＦＧＦ２３またはその断片によって媒介される疾患または障害の治療へのこれら融合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）は、ミネラルイオンのホメオスタシス及びビタミンＤ代謝に関する内分泌調節因子であり、主に骨内の骨細胞によって発現される（Ｙｕ及びＷｈｉｔｅ，（２００５）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６：２２１−２３２、Ｒａｚｚａｑｕｅ，（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ５：６１１−６１９、Ｑｕａｒｌｅｓ，（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ８：２７６−２８６）。ＦＧＦ２３濃度の上昇は低リン血症を引き起こす（Ｌａｒｓｓｏｎら，（２００４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４５（７）：３０８７−９４、Ｂａｉ，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（１１）：９８４３−９、Ｂａｉ，（２００４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１４５（１１）：５２６９−７９、Ｓｈｉｍａｄａ，（２００４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１３（４）：５６１−８、Ｓｈｉｍａｄａら，（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９８（１１）：６５００−５）。また、複数の低リン血症性の疾患でＦＧＦ２３濃度が上昇する。
【０００４】
現在まで、ＦＧＦ２３に関して最もよく理解されている機能は、血清リン酸及び１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５ＶｉｔＤ）の濃度を低下させることである（Ｒａｚｚａｑｕｅ，（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ５：６１１−６１９、Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，（２０１０）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．６１：９１−１０４、Ｑｕａｒｌｅｓ，（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ８：２７６−２８６）。通常状態下で、ＦＧＦ２３は、血清リン酸または１，２５ＶｉｔＤの増加に応答して濃度が上昇する典型的なフィードバックループで作用する。機構的に、ＦＧＦ２３は腎近位尿細管のナトリウム依存性リン酸トランスポーターのダウンレギュレーションによりリン酸を調節し（Ｓｈｉｍａｄａ，（２００４）、Ｇａｔｔｉｎｅｎｉ，（２００９）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９７（２）：Ｆ２８２−９１）、それによって腎臓のリン酸排泄を増加させる。１，２５ＶｉｔＤの抑制は、ビタミンＤの生合成及び分解を担う酵素の調節により達成される（Ｌａｒｓｓｏｎ，（２００４）、Ｂａｉ，（２００３）、Ｂａｉ，（２００４）、Ｓｈｉｍａｄａ，（２００４））。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）同様、ＦＧＦ２３は、腎臓のカルシウム再吸収も促進し（Ａｎｄｒｕｋｈｏｖａら，（２０１４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３３：２２９−２４６）、更に未同定の機構によってＰＴＨを調節する（Ｋｒａｊｉｓｎｉｋら，（２００７）Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９５：１２５−１３１、Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，（２０１０）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．６１：９１−１０４）。
【０００５】
ＦＧＦ２３によって媒介されるリン酸及び１，２５ＶｉｔＤ両方の経路調節は、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体によるシグナル伝達に依存している（Ｌｉ，（２０１１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．３００（３）：Ｅ５０８−１７、Ｇａｔｔｉｎｅｎｉ，（２０１１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０１（２）：Ｆ３７１−７、Ｇａｔｔｉｎｅｎｉ，（２００９）、Ｋｕｒｏｓｕ，（（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１（１０）：６１２０−３、Ｕｒａｋａｗａ，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ．４４４（７１２０）：７７０−４）。ＦＧＦ２３は、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）単独に対する結合親和性に劣り、ＫＤの範囲は２００〜７００ｎＭである。しかしながら、共受容体のα−Ｋｌｏｔｈｏの存在により、ＦＧＦ２３の結合は高親和性に変化する。例示として、ＦＧＦ２３−ＦＧＦＲ１ｃ間では６４８ｎＭであった親和性が、ＦＧＦ２３−ＦＧＦＲ１ｃ／αＫｌｏｔｈｏ間では２７ｎＭの親和性へと変化する（Ｇｏｅｔｚ，（２０１２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７（３４）：２９１３４−４６）。ＦＧＦＲが哺乳動物の組織内に遍在して発現するのに対して、αＫｌｏｔｈｏの発現は特定の組織に限定される。この限定的なαＫｌｏｔｈｏの発現パターンにより、ＦＧＦ２３を標的とする器官特異性が生じる。マウスの遺伝子ノックアウト研究から、ＦＧＦＲ１ｃ／αＫｌｏｔｈｏ及びＦＧＦＲ４／αＫｌｏｔｈｏ複合体は、程度の差はあるもののＦＧＦ２３のリン酸尿作用を媒介し（Ｇａｔｔｉｎｅｎｉら，（２００９）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９７：Ｆ２８２−Ｆ２９１、Ｇａｔｔｉｎｅｎｉら，（２０１４）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０６：Ｆ３５１−Ｆ３５８）、及びＦＧＦＲ３ｃ／αＫｌｏｔｈｏ及びＦＧＦＲ４／αＫｌｏｔｈｏ複合体は、これに限らないが、主にビタミンＤ代謝に対するＦＧＦ２３の効果を媒介する（Ｌｉら，（２０１１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３００：Ｅ５０８−Ｅ５１７、Ｇａｔｔｉｎｅｎｉら，（２０１１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０１：Ｆ３７１−Ｆ３７７）ことが明らかとなった。
【０００６】
上記のように、ＦＧＦ２３は、リン酸濃度の主要な調節因子である。実際、ＦＧＦ２３欠乏及び過剰発現は異なった病態である高リン血症及び低リン血症をそれぞれ引き起こし、それぞれ軟組織石灰化及び骨軟化症として発症する。ＦＧＦ２３経路の治療的な標的化には、１つの病態が別の病態と置き換わらないように部分的な阻害を必要とする。慢性腎臓病に関連した副甲状腺機能亢進症をＦＧＦ２３中和抗体により治療した最近の臨床前研究にて、有効性と安全性のバランスをとることの困難さが実証された（Ｓｈａｌｈｏｕｂ，（２０１２）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２２（７）：２５４３−５３）。この研究では、大動脈石灰化による死亡率の増加を代償とした場合のみ有効性が達成された。このような治療の有効性は、ミネラル障害の増加に起因して制限されるという結論が得られた。
【０００７】
全世界で約２０，０００人に１人が罹患する、最も一般的なリン酸消耗疾患であるＸ染色体連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）の場合、ＦＧＦ２３が上昇する（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，（２０１１）Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２６（７）：１３８１−１３８８）。この疾患は、低い血清リン酸、低リン血症に伴う不適切に低いレベルの１，２５ＶｉｔＤ、及び骨石灰化不全という特徴を有する。ＸＬＨと診断される小児には、通常、特徴的な下肢湾曲表現型の外観が見られ、診断された小児は、「骨軟化」の結果、歩行開始時に体重を支えることができない。疾患の他の症状には、成人期まで続く発育遅延、骨変形、骨折及び骨痛を含む。多くの患者は、幼年期に複数回の侵襲手術を受ける。これら患者に対する現在の標準的な治療は、リン酸及びカルシトリオール（活性型ＶｉｔＤ）の服用を患者に義務づけるものである（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，（２０１１）Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２６（７）：１３８１−１３８８、Ｌｉｎｇｌａｒｔら，（２０１４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ  １４：Ｒ１３−Ｒ３０）。標準身長にするための試みとして、小児によっては成長ホルモンも同時に投与されるが、これは場合により骨変形を悪化させるだけである。
【０００８】
患者間の疾患異質性により、患者ごとに個別化された投薬レジメンを与える必要がある。骨改善を促進するためにはリン酸が与えられるが、この経路の継続的な活性化は副甲状腺機能亢進症を招く。副甲状腺機能亢進症の抑制のためにはカルシトリオールが与えられるが、血清リン酸カルシウム生成物の増加を招き、次いで潜在的に重篤かつ不可逆的な症状である組織の石灰化を引き起こす可能性がある。加えて、経口治療は許容性が十分ではなく、その結果、成人患者の大多数は治療の中止を選択するが、これは偽骨折及び骨痛の増加を招き得る選択肢である。ＸＬＨ患者が、より作因的であり、効能性及び安全性の高い治療を必要としていることは明らかである。現在の標準的な治療に関する重大な問題は、それが病因、即ちＦＧＦ２３濃度の上昇を治療するものではないということである（Ｌａｒｓｓｏｎ，（２００４）、Ｂａｉ，（２００３）、Ｂａｉ，（２００４）、Ｓｈｉｍａｄａ，（２００４）、Ｓｈｉｍａｄａ，（２００１））。
【０００９】
リン酸代謝障害の長期治療のための、ＦＧＦ２３経路の長期的な部分阻害は長年にわたり必要とされ続けている。本発明はこの要求を満たすものである。
【発明の概要】
【００１０】
本出願は異種アミノ酸配列と融合されたＦＧＦ−２３  ｃテールタンパク質を含む融合タンパク質を開示する。前記融合タンパク質は血清リン酸濃度を調節するが、血清１，２５ＶｉｔＤ濃度を実質的に調節しない。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−２３  ｃテールタンパク質は、異種アミノ酸配列にリンカーを介して融合される。例示的実施形態では、リンカーは、
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から選択して良い。
【００１１】
更なる実施形態では、融合タンパク質の異種アミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含んで良い。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｆｃ領域を改変して領域のエフェクター機能を変更した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含んでも良い。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質から選択して良い。
【００１３】
本出願はまた、本明細書で開示する改変されたＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質と、薬学的に許容される剤とを含む医薬組成物についても開示する。
【００１４】
本出願はまた、本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質をコードする単離核酸についても開示する。ある特定の実施形態では、単離核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のヌクレオチド配列を含む。本発明は、本明細書で開示する核酸を含むベクター、及び本発明のタンパク質をコードするベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞も包含する。
【００１５】
本出願はまた、本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬組成物を、必要とする患者に投与することを含む、ＦＧＦ２３とＦＧＦＲ／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される疾患または障害の治療方法についても開示する。ＦＧＦ２３媒介性障害は、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発性骨軟化症（ＴＩＯ）、繊維性骨異形成症（ＦＤ）及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群から選択される障害を含む低リン血症性障害であり得る。
【００１６】
本出願はまた、ＦＧＦ２３とＦＧＦＲ／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される疾患または障害の治療のための薬剤製造における、本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質の使用、ならびに治療を必要とする患者へのＦＧＦ２３とＦＧＦＲ／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される疾患または障害の治療に使用するためのＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質及びその医薬組成物の使用についても開示する。ＦＧＦ２３媒介性障害は、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発性骨軟化症（ＴＩＯ）、繊維性骨異形成症（ＦＤ）及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群から選択される障害を含む低リン血症性障害であり得る。
【００１７】
本出願はまた、本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質の、左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療方法での使用についても開示し、これには本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。本出願は、左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療のための薬剤製造における、本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質の使用、ならびに左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療に使用するためのＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質及びその医薬組成物の使用についても開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
前述の概要ならびに以下の発明に関する詳細な説明は、添付図面と併せて読むとより深い理解が得られるであろう。本発明を例示するために、現時点で好適である実施形態を図面に示している。ただし、本発明は、示された通りの正確な配置及び手段に限定されないと解すべきである。
【００１９】
図面の説明は以下の通りである：
【図１】ＳＰＲによって測定された、エフェクターのないＦｃのＣ末端に融合されたＦＧＦ２３  ｃテールが、ＦＧＦＲ１ｃ／ａ−Ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体へのＦＧＦ２３の結合を競合的に阻害する能力を示すグラフである。
【図２】パネルＡ及びＢを含む、ＦＧＦ２３  ｃテール融合コンストラクトであるＦＧＦ２３  ｃテール−ＦＣ１のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルの画像である。図２Ａは、ＦＧＦ２３−ｃテール−ＦＣ１精製物（８μｇ量）のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を示す。図２Ｂは、ＦＧＦ２３−ｃテール−ＦＣ１精製物（２μｇ量）のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を示す。このＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルは、非還元条件及び還元条件の両方を表し、試験材料の純度ならびにジスルフィド結合による二量体の分子性質を明瞭化する。二量体は、変性状態のゲル中でジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理して完全にモノマーに還元できる。
【図３】ＦＧＦ２３  ｃテール−ＦＣ１に対して実施したサイズ排除クロマトグラフィ分析の結果を示すグラフである。ＦＧＦ２３  ｃテール−ＦＣ１の単量体と比較して、オリゴマー種の比率が低い点に注目されたい。
【図４】パネルＡ及びＢを含む、ＦＧＦ２３  ｃテール−ＦＣ１のインタクト質量分析を示すグラフである。図４Ａは、還元条件下でのＥＳＩ  ＴＯＦによるインタクト質量分析を示す。図４Ｂは、還元条件及びＰＧＮａｓｅＦ処理下でのＥＳＩ  ＴＯＦによるインタクト質量分析を示す。
【図５】長さ７０アミノ酸及び６９アミノ酸の、切り詰めＦＧＦ２３  ｃテールペプチドと比較した、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドの競合的結合を示す、パネルＡ、Ｂ及びＣを含む図である。
【図６】Ｅｇｒ１ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用した、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質による、ＨＥＫ２９３−αＫｌｏｔｈｏ細胞中のＦＧＦ２３シグナル伝達の阻害を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含むグラフである。図６Ａは、ＦＧＦ２３を媒介して誘導されるＥｇｒ１−ルシフェラーゼ活性の、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる用量依存的な阻害を示す（アッセイ最適化後）。図６Ｂは、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃでの用量阻害応答曲線及びこの曲線から導出されるＩＣ５０値を示す。図６Ｃは、ＦＧＦ２３  ｃテール−ＦｃまたはコンジュゲートされていないＦＧＦ２３  ｃテールペプチドによる、ＦＧＦ２３を媒介して誘発されるＥｇｒ１−ルシフェラーゼ活性の用量依存的な阻害を示す（アッセイ最適化より前）。図６Ｄは、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ及びコンジュゲートされていないＦＧＦ２３  ｃテールペプチドでの用量阻害応答曲線及びこの曲線から導出されるＩＣ５０値を示す。
【図７】ＦＧＦ２３  ｃテール−ＦｃまたはコンジュゲートされていないＦＧＦ２３  ｃテールペプチドによる、ＨＥＫ２９３−αＫｌｏｔｈｏ細胞へのＦＧＦ２３結合の用量依存的な阻害を示すグラフである。平均蛍光強度を、ＦＧＦ２３結合の競合因子、即ちＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合物またはコンジュゲートされていないＦＧＦ２３  ｃテールペプチドの濃度に対してプロットしている。
【図８】野生型ラットの５回目の投薬後２４時間に実施した血清の化学分析を示す、パネルＡ及びＢを含むグラフである。図８Ａは、リン酸の平均血清濃度を示す。図８Ｂは、１，２５ＶｉｔＤの平均血清濃度を示す。
【図９】ＨＹＰマウスをマウスＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質で７週間処置した後の、リン酸の血清濃度及び腎臓分画排泄率、ならびに腎臓のＮａＰｉ２Ａ  ｍＲＮＡ発現を示す、パネルＡ、Ｂ及びＣを含むグラフである。血清リン酸濃度を図９Ａに示す。リン酸の分画排泄率（ＦＥＰＨＯＳＨ（（血清クレアチニン／血清リン）／（尿クレアチニン／尿リン）の比率））を図９Ｂに示す。図９Ｃは、ＱＰＣＲによって測定したＢ２ミクログロブリンに対するＮａＰｉ２Ａ発現を示す。
【図１０】ＨＹＰマウスをマウスＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質で７週間処置した後の、１，２５ＶｉｔＤ及びカルシウムの血清濃度、ならびにカルシウムの腎臓分画排泄率を示す、パネルＡ、Ｂ及びＣを含むグラフである。血清１，２５ＶｉｔＤ濃度を図１０Ａに示す。血清カルシウム濃度を図１０Ｂに示し、カルシウムの分画排泄率（ＦＥＣＡ（（血清クレアチニン／血清カルシウム）／（尿クレアチニン／尿カルシウム）の比率））を図１０Ｃに示す。
【図１１】Ｈｙｐ動物にリン酸緩衝液、３ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ、１０ｍｇ／ｋｇのマウスＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを７週間投薬した後の、及び野生型マウスをリン酸緩衝液で処置した後の、腎組織の石灰化の欠如を示す、パネルＡ〜Ｄを含む画像である。各画像は、Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ−ｒａｙによる撮影のような、エクスビボで画像化された左腎を視覚化した画像である。図１１Ａは野生型対照マウスを表す。図１１ＢはＨＹＰ対照マウスを表す。図１１Ｃは、３ｍｇ／ｋｇのマウスＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。図１１Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇのマウスＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。
【図１２】同齢の対照Ｈｙｐ及び野生型マウスと比較した、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを用いて処置したＨｙｐマウスの、合計７週間の投薬後の骨密度及び骨塩量を示す、パネルＡ及びＢを含むグラフである。ＰＩＸＩＭＵＳによって評価した骨密度を図１２Ａに示す。骨塩量を図１２Ｂに示す。
【図１３】１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを用いて処置したＨｙｐ動物の、合計７週間の投薬後の骨石灰化及び構造の改善を示す、パネルＡ〜Ｄを含む画像である。図１３は、エクスビボでμＣＴにより撮影した、大腿骨遠位骨幹端の海綿骨を視覚化した画像を示す。図１３Ａは野生型対照マウスを表す。図１３ＢはＨＹＰマウスを表す。図１３Ｃは、３ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。図１３Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。
【図１４】１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを用いて処置したＨｙｐ動物の、合計７週間の投薬後の骨石灰化及び構造の改善を示す、パネルＡ〜Ｄを含む画像である。図１４は、μＣＴを使用した３次元空間充填の分析により視覚化した骨質を表す。図１４Ａは野生型対照マウスを表す。図１４ＢはＨＹＰマウスを表す。図１４Ｃは、３ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。図１４Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。
【図１５】ｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを用いた７週間の投薬処置後の骨構造の用量応答的改善を示す、パネルＡ〜Ｄを含む画像である。脛骨の骨端軟骨のヘマトキシリンエオジン染色により、骨構造を表す。図１５Ａは野生型対照マウスを表す。図１５ＢはＨＹＰマウスを表す。図１５Ｃは、３ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。図１５Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。
【図１６】Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓサル及びラット中でのｈｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの血清濃度を時間関数として示す、パネルＡ及びＢを含むグラフである。図１６Ａは、３ｍｇ／ｋｇのｈｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを用いて処置したオスのＣｙｎｏｍｏｌｇｕｓサル中でのｈｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの静脈投与後の平均血清濃度を示す。図１６Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを用いて処置したメスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット中でのｈｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの皮下投与後の平均血清濃度を示す。
【図１７】αＫｌｏｔｈｏを異所性発現しているＢａＦ３細胞及びＦＧＦ２３の同族ＦＧＦＲでの競合的結合の予備実験結果を示す、パネルＡ及びＢを含むグラフである。図１７Ａは、ＦＧＦＲ１ｃ及びαＫｌｏｔｈｏを発現しているＢａＦ３細胞とＦＧＦ２３との結合の、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチド及びＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃそれぞれによる用量依存的阻害を示す。図１７Ｂは、ＦＧＦＲ４及びαＫｌｏｔｈｏを発現しているＢａＦ３細胞とＦＧＦ２３との結合の、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチド及びＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃそれぞれによる用量依存的阻害を示す。ＢａＦ３−ＦＧＦＲ４／αＫｌｏｔｈｏ細胞とのＦＧＦ２３結合の阻害に関しては、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃは、コンジュゲートされていないＦＧＦ２３  ｃテールペプチドよりも強力でない点に注意されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本出願は、安定性の大幅な改善、半減期の増加、全長ＦＧＦ２３タンパク質の活性の部分的阻害、血清１，２５ＶｉｔＤ濃度の調節と対照的な血清リン酸濃度の選択的な調節を含め、特性が改善されたＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を開示する。
【００２１】
定義及び一般技術
本明細書において別段の規定がない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。更に、文脈による別段の必要性がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。一般に、本明細書に記載する、細胞培養及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質化学及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法と、これらの技術とは、当技術分野において周知であり、一般的に用いられている。
【００２２】
本発明の方法及び技術は、別段の指示がない限り、一般的に、当技術分野において周知である従来方法に従って、かつ本明細書の全体にわたり引用及び考察される様々な一般的な参考文献及び更に具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｄ  ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。酵素反応及び精製技術は、製造者の仕様に従って、当技術分野において一般的に行われるように、または本明細書に記載されるように実施される。本明細書に記載する、分析化学、合成有機化学、ならびに医化学及び薬化学に関連して用いられる命名法と、これらの実験手順及び実験技術とは、当技術分野において周知であり、一般的に用いられている。化学合成、化学分析、薬剤の調製、製剤化、及び送達、ならびに患者の治療には標準技術を使用する。
【００２３】
以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有するものと理解される。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用途「ＦＧＦ２３  ｃテール」、「ｃテール」、または「ＦＧＦ２３  ｃ末端ペプチド」は、ＦＧＦ２３のタンパク質分解切断後に生成される、７２のアミノ酸ｃ末端ペプチドまたはその断片を指す。本発明のＦＧＦ２３  ｃテールは、２６〜７２個のアミノ酸を含むペプチドを含み得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語「ビタミンＤ」は、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３のすべての形態を包含することを意味する。一実施形態では、分析物は２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール）である。本明細書で使用される場合、用語「１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３」、「１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール」または「１，２５ＶｉｔＤ」は、ビタミンＤのホルモン活性形態を指すことを意味する。
【００２６】
用語「ポリペプチド」は、ネイティブのまたは人工のタンパク質、タンパク質断片及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドはモノマーでもポリマーでも良い。
【００２７】
用語「単離タンパク質」、「単離ポリペプチド」または「単離抗体」は、その起源または由来源によって、以下の１〜４を有する：（１）ネイティブ状態のときに付随している天然に付随する成分を伴わない、（２）同種に由来する他のタンパク質を含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）自然には生じない、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。したがって、化学的に合成されるペプチド、即ち天然に発生する細胞と異なる細胞系において合成されるペプチドは、その天然に付随する成分から「単離される」ことになる。タンパク質は、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して単離することにより、天然に付随する成分を実質的に含まないようにすることもできる。
【００２８】
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約６０〜７５％が単一種のポリペプチドを呈しているとき、「実質的に純粋な」、「実質的に均質な」、または「実質的に精製された」状態である。ポリペプチドまたはタンパク質は、モノマーであっても多量体であっても良い。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は通常、タンパク質試料の重量のうち、約５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％または９０重量％を占め、より一般的には約９５％、好ましくは９９％超の純度である。タンパク質の純度または均質性は、当該技術分野で周知の多数の手段、例えばタンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動後に、当該技術分野で周知の染色試薬でゲルを染色して、単一のポリペプチドバンドを視覚化することによって示すことができる。ある種の目的には、ＨＰＬＣまたは他の当該技術分野で周知の精製手段を用いて高い解像度を得ることができる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、アミノ酸配列残基が、天然に存在する全長配列中の対応位置と同一であるポリペプチドを指す。また、本発明による断片は、切り詰め、例えば、ポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の除去により作製することができる。最大１０、最大２０、最大３０、最大４０以上のアミノ酸を、この方法でＮ末端及び／またはＣ末端から除去することができる。断片は１つ以上の内部欠失によって生じる場合もある。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長である。他の実施形態では、断片は、少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０、または少なくとも７０、８０、９０、１００、１５０、または２００アミノ酸長である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「二量体化ドメイン」は、本明細書に記載するＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の実施形態の自発的な二量体化が可能であるタンパク質ドメインを指す。自発的な二量体化が可能である二量体化ドメインとして、ロイシンジッパー、ジンクフィンガードメインまたはシステインノットドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
ある種の実施形態では、タンパク質またはその一部のアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、または（４）その他の物理化学的若しくは機能的特性を付与または改変するものである。例えば、通常存在する配列内で、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）を行うことができる。
【００３２】
保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特徴を実質的に変更することはない。技術分野で認識されたポリペプチドの二次構造及び三次構造の例は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））、及びＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５  （１９９１）に記載されている。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「結合親和性（ＫＤ）」は、特定の抗原−抗体またはタンパク質−受容体の相互作用の解離速度を指すことを意図する。ＫＤは会合速度、即ち「オンレート（ｋｏｎ）」に対する、解離速度（「オフレート（ｋｏｆｆ）とも称する）の比である。したがって、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）で表される。ＫＤが小さいほど結合親和性が強いことになる。したがって、１μＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比較して結合親和性が弱いことを示す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分確立した方法を使用して判定することができる。抗体のＫＤを判定するための一方法は、一般にＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴を使用することによるものである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「表面プラズモン共鳴」（ＳＰＲ）は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫにより買収された旧社名Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）製）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムの生体特異的相互作用の分析が可能である光学現象を指す。詳細な説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｕ．ら、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６（１９９３）、Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｕ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７（１９９１）、Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１（１９９５）、及びＪｏｈｎｓｓｏｎ  Ｂ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７（１９９１）を参照されたい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、２０の天然に存在するアミノ酸及びその省略形は、従来の使用法に従う。参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドである、長さが少なくとも１０塩基のポリマー形態のヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変形態を意味する。この用語は、一本鎖及び二本鎖の形態を含む。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「単離ポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源のポリヌクレオチド、またはこれらのいくつかの組合せを意味し、「単離ポリヌクレオチド」は、その起源または由来源によって、以下の１〜３を有する：（１）「単離ポリヌクレオチド」が天然において見出されるポリヌクレオチドの全て若しくは一部と会合していない、（２）天然において単離ポリヌクレオチドが連結されていないポリヌクレオチドに動作可能に連結されている、または（３）天然において、より大きい配列の一部として存在しないものである。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するヌクレオチド、ならびに天然に存在するオリゴヌクレオチド連結及び天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結によって共に連結された修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜６０塩基、及び最も好ましくは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０〜４０塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、例えば、プライマー及びプローブ用に一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子突然変異体の構築に使用するために二本鎖であっても良い。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドであっても、アンチセンスオリゴヌクレオチドであっても良い。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾された、または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で参照される用語「オリゴヌクレオチド連結」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＬａＰｌａｎｃｈｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）、Ｓｔｅｃら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４）、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）、Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）、Ｚｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））、米国特許第５，１５１，５１０号、Ｕｈｌｍａｎｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、検出用の標識を含むことができる。
【００４０】
「動作可能に連結した」配列は、対象とする遺伝子と連続した発現制御配列と、対象とする遺伝子を制御するためにトランスで、または一定距離を置いて作用する発現制御配列の両方を含む。本明細書で使用される場合、用語「発現制御配列」は、これらが連結されているコード配列の発現及びプロセシングを行うのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、適切な転写開始配列、転写終止配列、転写プロモーター配列、及び転写エンハンサー配列、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を亢進させる配列（即ち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を亢進させる配列、ならびに望まれる場合、タンパク質分泌を亢進させる配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物体に応じて異なり、原核生物では、このような制御配列は、一般にプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終止配列を含み、真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーター及び転写終止配列を含む。用語「制御配列」は、最小限、その存在が発現及びプロセシングに必須である全ての成分を含むことが意図されており、存在すると有利である追加の成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列も含むことができる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、これが連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミド、即ち、その中に追加のＤＮＡセグメントを連結できる環状二本鎖ＤＮＡループである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、この場合、追加のＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノム中に連結することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、これらが導入されている宿主細胞内で自律複製をすることができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他の実施形態では、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞内に導入した後、宿主細胞のゲノム内に組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製できる。更に、ある種のベクターは、これらが動作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。本明細書でこのようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、外因性核酸及び／または組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。「組換え宿主細胞」及び「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味すると理解するべきである。突然変異または環境の影響によって、後続世代である種の改変が起こる場合があるため、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される場合、このような子孫も用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００４３】
本明細書で参照される用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能に、かつ特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及びこれらの断片は、非特異的核酸への容易に感知できる量の検出可能な結合を最小にするハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー」または「高度にストリンジェントな」条件を使用することによって、当該技術分野で既知であり、本明細書で考察する選択的なハイブリダイゼーション条件を実現することができる。「高ストリンジェンシー」または「高度にストリンジェントな」条件の一例は、１つのポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドとのインキュベーションにおいて、４２℃のハイブリダイゼーション温度で、１２〜１６時間、６×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、５０％のホルムアミド、５ｘデンハルト試薬、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬの変性断片化サケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション緩衝液中で、メンブレンなどの固体表面に一方のポリヌクレオチドを付着させ、その後１×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳの洗浄緩衝液を使用して、５５℃で２回洗浄する場合である。Ｓａｍｂｒｏｏｋらの上記文献、ｐｐ．９．５０−９．５５も参照されたい。
【００４４】
核酸配列との関連で、用語「パーセント配列同一性」は、第１の連続した配列が第２の連続した配列と、最大限に対応するように比較及び整列させた場合の残基の百分率を意味する。配列同一性を比較する長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常では少なくとも約２４ヌクレオチド、一般的に少なくとも約２８ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８、またはそれ以上のヌクレオチドのストレッチに及ぶ場合がある。ヌクレオチド配列同一性の測定に使用できる、当該技術分野で既知のいくつかの異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができ、これらは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓｃｏｎｓｉｎによるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０のプログラムである。例えば、プログラムＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡによって、クエリー配列と探索配列との間の最適なオーバーラップ領域のアライメント及びパーセント配列同一性が得られる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５−２１９（２０００）、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７−２５８（１９９６）、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７６：７１−８４（１９９８））。別段の指定のない限り、個々のプログラムまたはアルゴリズムでデフォルトのパラメータが使用される。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１で提供されている、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトのパラメータ（ワード長６及びスコアリングマトリックスに関するＮＯＰＡＭ因子）で使用して、またはＧａｐをそのデフォルトのパラメータで使用して判定できる。
【００４５】
ヌクレオチド配列への言及は、別段の指定のない限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補配列と共に、その相補鎖を包含すると理解するべきである。
【００４６】
用語「パーセント配列同一性」は、比較される残基の数に対する同一残基の数の百分率として表される比を意味する。
【００４７】
用語「実質的な類似性」または「実質的な配列類似性」は、１つの核酸またはその断片を参照する場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列されるとき、上記で述べたＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを意味する。
【００４８】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な同一性」は、２つのペプチド配列が、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって、そのプログラムで供給されるデフォルトのギャップ重みを使用して最適に整列される場合、少なくとも７０％、７５％、８０％、または８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。ある種の実施形態では、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換に差がある。
【００４９】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変更しない。２つ以上のアミノ酸配列が互いの保存的置換に差がある場合、パーセント配列同一性を上方調整し、置換の保存的性質に合わせて補正する場合がある。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７−３１（１９９４）を参照されたい。類似した化学的性質を持つ側鎖を有するアミノ酸群の例として、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、２）脂肪族ヒドロキシ側鎖：セリン及びトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン及びヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００５０】
あるいは、用語が本明細書で同じ意味で用いられる場合、保存的な置換または交換は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５（１９９２）に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」交換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。
【００５１】
ポリペプチドについての配列同一性は通常、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めた様々な置換、欠失及び他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して配列を照合する。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを搭載しており、これらをプログラムに指定されたデフォルトのパラメータと共に使用すると、生物の異なる種に由来する相同ポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド間、または野生型タンパク質とその変異体間の配列相同性または配列同一性を判定することができる。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照されたい。ポリペプチド配列も、ＦＡＳＴＡを使用して、デフォルトの、または推奨されるパラメータを使用して比較することができる（ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照）。（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＷＩの）ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）によって、クエリー配列と探索配列との間の最適なオーバーラップ領域のアライメント及びパーセント配列同一性が得られる（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５−２１９（２０００））。本発明の配列を様々な生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好適なアルゴリズムは、プログラムと共に供給されるデフォルトのパラメータを使用する、コンピュータプログラムのＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０），Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（１９９７）を参照されたい。
【００５２】
相同性を比較するポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常は少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、及び好ましくは約３５残基超である。多数の異なる生物からの配列を含むデータベースを探索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
【００５３】
用語「効力」は生物活性の測定値であり、ＩＣ５０、即ち活性がタンパク質によって媒介される細胞内の生物活性のうち、５０％を阻害するために必要なタンパク質の有効濃度で示すことができる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」または「治療有効量」は、所望の治療結果を（用量及び期間及び投与手段で）得るために必要な量を指す。有効量は、治療上の利点を対象に与えるのに必要な活性薬剤の少なくとも最小量であるが、毒性量より少ない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、１，２５ＶｉｔＤの血清中濃度を参照するとき、用語「実質的に調節する」は、基準値と比較して、少なくとも２倍の血清中濃度の増加、または少なくとも２分の１の血清中濃度の減少を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、リン酸の血清中濃度を参照するとき、用語「調節する」は、基準の低リン血症レベルを上回る、統計的に有意な血清中濃度の増加を指す。
【００５７】
本明細書で本発明のポリペプチドの生物活性について使用される場合、用語「阻害する」または「中和する」は、例えば、これに限定されないが、生物活性を含めた阻害されるものの進行または重症度を実質的に拮抗、妨害、予防、抑制、遅延、撹乱、排除、停止、減少または逆転させるポリペプチドの能力を意味する。
【００５８】
ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、用語「競合する」は、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドの結合と十分に類似する様式でリガンドに結合することにより、第１のポリペプチドとその同族リガンドとの結合の結果が、第２のポリペプチドの非存在下での第１のポリペプチドの結合と比較して、第２のポリペプチドの存在下で検出可能な程度に減少することを意味する。あるいは、第２のポリペプチドとそのリガンドとの結合がまた、第１のポリペプチドの存在下で検出可能に減少してもよいが、実際にはその必要はない。すなわち、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドが第１のポリペプチドとそれぞれのリガンドとの結合を阻害しなければ、第２のポリペプチドとそのリガンドとの結合を阻害することができる。しかしながら、それぞれのポリペプチドが、他のポリペプチドとその同族リガンドとの結合を、同じ、より高い、またはより低い程度であるかに関わらず検出可能に阻害する場合は、ポリペプチドは、それぞれのリガンド（複数可）の結合に対して互いに「交差競合する」と言われる。ポリペプチドの競合及び交差競合はいずれも、本発明に包含される。このような競合または交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、配座変化、または共通のリガンド若しくはその一部との結合など）に関わらず、本明細書で示す教示に基づいて、このような競合及び／または交差競合ポリペプチドを包含し、本明細書で開示する方法に有用であり得ることを当業者は理解されよう。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ＩｇＧ」は、認識済みの免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体クラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトの場合、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。マウスの場合、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。本明細書で「免疫グロブリン（Ｉｇ）」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１種以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンは抗体を含むが、これに限定されない。免疫グロブリンは、これらに限定されないが、完全長抗体、抗体断片及び個々の免疫グロブリンドメインを含めた多数の構造形態を有し得る。本明細書で「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、タンパク質構造の当業者によって確認された、別個の構造実体として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。Ｉｇドメインは通常、特徴的な折り畳みトポロジーを有する。ＩｇＧクラスの抗体にある既知のＩｇドメインは、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、Ｃγ１とＣγ２の間のヒンジ領域を含むＣγドメインを共に含む、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３の重鎖定常ドメイン、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びヒトの場合にカッパ（Ｃκ）またはラムダ（Ｃλ）軽鎖定常ドメインを含む軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）である。
【００６０】
当技術分野において既知のように、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する際に使用される。「Ｆｃ領域」（「結晶性断片」領域または「テール」領域としても知られる）は、ネイティブ配列のＦｃ領域であっても、変異Ｆｃ領域であっても良い。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端に及ぶと規定されている。本発明で述べる全ての重鎖定常領域のアミノ酸位置に関しては、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８−８５に最初に記載されたＥＵインデックスに従って付番する。これには、最初にヒトＩｇＧ１を配列決定した、骨髄腫タンパク質ＥＵのアミノ酸配列が記載されている。ＥｄｅｌｍａｎらのＥＵインデックスは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１にも定められている。したがって、「Ｋａｂａｔの定めるＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」は、Ｋａｂａｔ  １９９１に定めるＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体に基づくアミノ酸残基の付番方式を指す。
【００６１】
免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。通常、「Ｆｃポリペプチド」は、この用語が本明細書で使用される場合、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、通常はＣＨ１ドメイン全体を含まないが、ヒンジドメインの少なくとも一部は含み得る。当該技術分野において既知のように、Ｆｃ領域は二量体または単量体の形態で存在することができる。
【００６２】
当該技術分野において使用されるとき、「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を表す。好適なＦｃＲは、ネイティブ配列のヒトＦｃＲである。更に、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）を結合するものであり、対立遺伝子変異体及びこれらの受容体の代替的スプライシング形態を含めた、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、主にそれらの細胞質ドメインが異なる類似したアミノ酸配列を有する。ＦｃＲについては、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２、Ｃａｐｅｌら，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５−３４、及びｄｅ  Ｈａａｓら，１９９５，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１に概説されている。「ＦｃＲ」は新生児受容体、ＦｃＲｎも含み、これは母体ＩｇＧの胎児への輸送を担う（Ｇｕｙｅｒら、１９７６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７、及びＫｉｍら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４９）。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と組み合わされたときに、成分が生物活性を維持することが可能であり、対象の免疫系に不活性である任意の材料を含む。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００を参照）。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」は、別段の指定がない限り、このような用語が該当する障害若しくは疾患、またはこのような障害若しくは疾患の１種以上の症状を後退、緩和、進行の阻害、進行の遅延、開始の遅延、または予防することを意味する。本明細書で使用される場合、用語「治療」は、別段の指定がない限り、上記の「治療する」に定義された治療行為を指す。用語「治療する」は、対象のアジュバント及びネオアジュバント療法も含む。疑義を避けるため、本明細書で「治療」に言及するとき、治癒的、緩和的及び予防的治療への言及を含む。
【００６５】
ＦＧＦ２３タンパク質
ＦＧＦ２３は、１７６ＲＸＸＲ１７９モチーフでの部位特異的なタンパク質分解切断によってインビボで失活され、Ｃ末端（ｃテール）及びＮ末端断片を産生する（Ｓｈｉｍａｄａ，（２００２）、Ｗｈｉｔｅ，（（２００１）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．６０（６））：２０７９−８６、Ｇｏｅｔｚら，（２００７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２７（９）：３４１７−２８、Ｇｏｅｔｚら，（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：４０７−４１２）。ＦＧＦＲ／αＫｌｏｔｈｏの二元複合体に対するＦＧＦ２３結合部位を含むＣ末端タンパク分解断片（ＦＧＦ２３  ｃテール）は、二元受容体複合体に対する結合を完全長ＦＧＦ２３と有効に競合できるが、完全長リガンドとは対照的に、受容体の活性化は誘発しない（Ｇｏｅｔｚら，（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：４０７−４１２）。したがって、タンパク質分解切断により、２つの機構、即ち二元受容体複合体に対する結合部位をＦＧＦ２３から除去すること、及びＦＧＦ２３に対する内因性の競合的拮抗薬を生成することによってＦＧＦ２３は失活する。ただし、７２ａａ  ｃテールペプチドの半減期は極めて短く、概算の半減期は１０分である（Ｇｏｅｔｚら，（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：４０７−４１２）。
【００６６】
表１は、種々のＦＧＦ２３及びＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質の完全な配列を示している。
【００６７】
（表１）ＦＧＦ２３及びＦＧＦ２３  ｃテール配列
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【００６８】
ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質
本出願は、実質的に改善された有用な特徴を有するＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を開示する。このような融合タンパク質は、例えば、ＦＧＦ２３活性の拮抗薬として使用することができる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ＦＧＦ２３  ｃテール融合ポリペプチド」、「ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質」または「ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ」は、本明細書に記載するＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質のいずれかのＮ末端またはＣ末端での１種以上のアミノ酸残基（例えば異種タンパク質またはペプチド）の融合を指す。したがって、用語「融合タンパク質」は、２種以上のタンパク質に由来するアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを指す。融合タンパク質は、別々のタンパク質に由来するアミノ酸部分間に、アミノ酸のリンカー領域を含むこともできる。
【００７０】
異種ペプチド及びポリペプチドとして、ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質の同定及び／または単離を可能にするエピトープ（例えば、ＦＬＡＧ）またはタグ配列（例えば、Ｈｉｓ６及びこれに類するもの）；膜貫通受容体タンパク質またはその一部分、例えば細胞外ドメインまたは細胞内の膜貫通ドメイン；膜貫通受容体タンパク質と結合するリガンドまたはその一部分；触媒活性である酵素またはその一部分；オリゴマー化を亢進するポリペプチドまたはペプチド、例えばロイシンジッパードメイン；安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド、例えば免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃドメイン）；ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質に対して親水性優位、または疎水性優位の融合対を形成するように設計された、２つ以上（例えば、２、５、１０、１５、２０、２５など）の天然に存在する、または天然に存在しない電荷及び／または非電荷アミノ酸（例えば、セリン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸）の組み合わせを含む半減期延長配列；機能性若しくは非機能性抗体、またはその重鎖若しくは軽鎖；本発明のＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質と異なる活性、例えば治療活性を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質は、ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに異種配列を融合することにより作製することができる。本明細書に記載したように、異種配列は、アミノ酸配列であっても、非アミノ酸含有ポリマーであっても良い。異種配列は、ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質に化学的に融合することも、単一のポリヌクレオチドからの組換え発現によって直接融合することも、あるいはリンカーまたはアダプター分子を介して連結することもできる。ペプチドリンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基（またはｍｅｒ）、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、または９残基（またはｍｅｒ）、好ましくは１０〜５０アミノ酸残基（またはｍｅｒ）、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０残基（またはｍｅｒ）、及びより好ましくは１５〜３５のアミノ酸残基（またはｍｅｒ）であり得る。リンカーまたはアダプター分子は、融合部分を分離できるように、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる切断部位を持つように設計することもできる。
【００７２】
ａ）リンカー
本発明の融合タンパク質を形成するときに、リンカーを使用できるが、これは必須ではない。リンカーは、ペプチド結合、即ち、ペプチドリンカーによって共に連結されたアミノ酸を構成できる。本発明のいくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１〜２０またはそれ以上のアミノ酸から構成され、この場合のアミノ酸は２０の天然に存在するアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アミノ酸グリシン、セリン及びグルタミン酸から選択される。いくつかの実施形態では、好適なリンカーとして、
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が挙げられる。５つのアミノ酸残基からなるリンカーが、本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質で機能することが見出されているが、本発明はいかなる長さまたは組成のリンカーも企図する。例示的なリンカーを表２に示す。
【００７３】
（表２）リンカー配列
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【００７４】
本明細書に記載するリンカーは例示であり、はるかに長いリンカー、他の残基を含むリンカーも本発明によって企図される。
【００７５】
ｂ）Ｆｃタンパク質
本発明のいくつかの実施形態では、ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質は、Ｆｃドメイン、例えばヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、抗原と結合する可変ドメイン（通称「Ｆａｂ」）と、特にエフェクター機能、例えば食細胞による補体活性化及び攻撃に関与する定常ドメイン（通称「Ｆｃ」）という２つの機能的に独立した部分を含む。Ｆｃは長い血清半減期を有しており（Ｃａｐｏｎら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１）、その結果、Ｆｃドメインが治療的タンパク質と結合されると、半減期の延長をもたらすか、あるいはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合及び治療的なタンパク質に望まれるその他の特性のようなエフェクター機能を組み込むことができる。
【００７６】
薬物動態のインビボ分析は、野生型ヒトＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質の半減期が短いことを示した。したがって、ＦＧＦ２３  ｃテールの半減期を延長するために、Ｆｃ配列を本明細書に開示するＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質に融合した。本願で例示されるＦｃ改変体の一部を下表３に示し、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質のコンストラクトの一部を下表４に示す。
【００７７】
（表３）ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列
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【００７８】
（表４）ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質
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【００７９】
得られたＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、プロテインＡのアフィニティーカラムを用いて精製することができる。Ｆｃ領域と融合されたペプチド及びタンパク質は、融合されていない対応物よりもインビボで実質的により長い半減期を呈することが見出された。また、Ｆｃ領域との融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在しているＦｃ領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃであり得る。一実施例では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３である。Ｆｃ領域は、エフェクター機能を低減するための改変などの特定の性質を改善するための変更（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、または循環時間（半減期）の増加などの治療的な性質を改善するための改変も可能である。
【００８０】
ｃ）血清リン酸及び１，２５ＶｉｔＤに対する効果
本発明のＦＧＦ２３融合タンパク質は、１，２５ＶｉｔＤ血清濃度を実質的に変化させる、または変化をもたらすことなく血清リン酸濃度を調節する。
【００８１】
ＦＧＦ２３とＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ及びＦＧＦＲ４／α−Ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体との結合は、シグナル伝達経路の活性化により、リン酸及び１，２５Ｄの両方を調節する。共免疫沈降実験において、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドは、ＦＧＦ２３と３つのＦＧＦＲ／αＫｌｏｔｈｏ同族複合体との各結合に対して、完全長ＦＧＦ２３と効果的に競合できることが示された（Ｇｏｅｔｚら、（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：４０７−４１２）。これは、ＦＧＦ２３  ｃテール領域が、ＦＧＦＲ／αＫｌｏｔｈｏの同族複合体とＦＧＦ２３との結合を媒介することと一致する。ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる血清リン酸及び１，２５ＶｉｔＤの特異的な調節についての１つの説明として、融合分子が、ＦＧＦ２３とＦＧＦＲ／αＫｌｏｔｈｏ同族複合体とは、異なる結合親和性を有することが考えられる。ＦＧＦ２３及びＦＧＦ２３  ｃテールと種々の受容体複合体との結合接点は、現在まで決定されていないが、本発明者らは、ＦＧＦ２３  ｃテールとＦｃとの融合が、特異的な受容体複合体との結合を妨害し、おそらくは立体障害が特異的な受容体結合を担うものと推測する。
【００８２】
一実施形態では、ＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質は、二量体化ドメインを含む異種タンパク質と融合される。別の実施形態では、本発明のＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質は、二量体を形成しないモノマーのＦＧＦ２３  ｃテールタンパク質またはＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、血清１，２５ＶｉｔＤ濃度を実質的に調節することなく、血清リン酸濃度を調節する。
【００８３】
別の実施形態では、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドと異種タンパク質との融合により、２つのＦＧＦ２３  ｃテールペプチドドメインが互いに近接してアンカーされる。
【００８４】
血清リン酸カルシウム生成物の増加は、潜在的に重篤かつ不可逆的な症状である軟組織の石灰化を引き起こす場合がある。１，２５ＶｉｔＤは、リン酸及びカルシウム両方の腸での再吸収を亢進する。したがって、１，２５ＶｉｔＤ濃度の増加は、リン酸カルシウム生成物の増加を亢進し、軟組織の石灰化に対するリスクを高める可能性がある。血清１，２５ＶｉｔＤ濃度を実質的に調節せずに、血清リン酸濃度を調節することで、血清１，２５ＶｉｔＤの顕著な増加をもたらす治療よりも、軟組織の石灰化に対するリスクが低下する可能性がある。
【００８５】
医薬組成物
ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を含む医薬組成物は、本発明の範囲内であり、特性の亢進を呈するいくつかの融合タンパク質の同定という観点から具体的に企図される。このような医薬組成物は、治療有効量のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を、投与様式との適合性に応じて選択される薬学的に、または生理学的に許容される製剤化剤と混合して含むことができる。許容される製剤化剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であることが好ましい。
【００８６】
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌、安定性、溶解速度若しくは放出速度、吸着、または浸透性を変更、持続、または保護するための製剤化剤（複数可）を含有して良い。好適な製剤化剤として、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌物質、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、メチオニンまたは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（例えばホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩またはその他の有機酸）、充填剤（例えばマンニトールまたはグリシン）、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）、充填材、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物（例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン）、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン））、着色剤、香味剤、及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩成形対イオン（例えばナトリウム）防腐剤（例えば塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルへキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えばグリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えばマンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えばプルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０若しくはポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール）、安定性増進剤（例えばスクロースまたはソルビトール）、等張性増進剤（例えばアルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム若しくは塩化カリウム、またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤及び／または薬学的補助剤が含まれるが、これらに限定されない（例えば、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）及び同文献の後続版を参照）。
【００８７】
最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、及び所望の用量に応じて、当業者によって決定される（例えば、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照）。このような組成物は、ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
【００８８】
医薬組成物中の主なビヒクルまたは担体は、本質的に水性であっても非水性であっても良い。例えば、注射用の好適なビヒクルまたは担体は、水、生理的食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得、場合により、非経口投与用組成物で一般的な他の材料が補充される。中性の緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、更に別の例示的なビヒクルである。他の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ６．０〜８．５のヒスチジンまたはトリス緩衝液を含み、これらはソルビトールまたは好適な代替物を更に含み得る。本発明の一実施形態では、水性溶液の形態で、望ましい度合いの純度を有する選択された組成物を任意の製剤化剤（上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合することによって、保存用のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質組成物を調製することができる。
【００８９】
非経口送達用の医薬組成物を選択することができる。あるいは、吸入用または、経口などの消化管経由の送達用の組成物を選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術分野の範囲内である。製剤成分は、投与の部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝剤を用いて、生理学的ｐＨまたはそれよりわずかに低いｐＨ、通常は約６〜約８のｐＨ範囲内に組成物を維持する。
【００９０】
非経口投与が企図される場合、本発明で使用する治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を含む、パイロジェンフリーの、非経口的に許容される水性溶液の形態であり得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質が適切に保存された無菌の等張溶液として製剤化される、無菌蒸留水である。更に別の調製物は、産物の制御放出または持続放出に備え、後で産物をデポ注射を介して送達できる、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの剤に、所望の分子の製剤を内包することができる。ヒアルロン酸もまた使用可能であり、これは循環中の持続期間を亢進する効果を有し得る。所望の分子を導入する他の好適な手段として、埋め込み型薬物送達装置がある。
【００９１】
一実施形態では、医薬品組成物を、吸入用に製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。吸入溶液は、エアロゾル送達のための噴射剤と共に製剤化することもできる。更に別の実施形態では、溶液を霧状にすることができる。経肺投与は、化学修飾されたタンパク質の経肺送達について記載した、国際公開第ＷＯ９４／２００６９号に詳細に記載されている。
【００９２】
ある種の製剤には経口投与できることも企図される。本発明の一実施形態では、この様式で投与される製剤は、錠剤及びカプセルなどの固体剤形の調合に通例用いられる担体を含んでも、含まなくても製剤化することができる。例えば、生物学的利用能が最大になり、前全身性分解が最小になる胃腸管の地点で、製剤の活性部分が放出されるように、カプセルを設計することができる。吸収を促進するために、追加の薬剤を含むことができる。また、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も用いることができる。
【００９３】
別の医薬組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物に、有効量のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を含むことができる。錠剤を、滅菌水または他の適切なビヒクルに溶解することにより、単位用量型で溶液を調製することもできる。好適な賦形剤として、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、あるいはデンプン、ゼラチン、またはアカシアなどの結合剤、あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの滑沢剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
追加の医薬組成物は当業者に明らかであり、これには、持続送達または制御送達製剤中、ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を内包する製剤が含まれる。多様な他の持続送達または制御送達、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子または多孔ビーズ及び蓄積注射を製剤化する技術もまた、当業者に知られている（例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微小粒子の制御放出について記載している、国際公開第ＷＯ９３／１５７２２号、マイクロスフェア／微小粒子の調製及び使用について述べている、Ｗｉｓｃｈｋｅ＆Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，２００８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３６４：２９８−３２７及びＦｒｅｉｂｅｒｇ＆Ｚｈｕ，２００４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２８２：１−１８を参照）。本明細書に記載するヒドロゲルは、持続送達または制御送達製剤の一例である。
【００９５】
持続放出製剤の追加例として、成型物品、例えば、フィルムまたは微小カプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第００５８，４８１号）、Ｌ-グルタミン酸とガンマエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７-５６）、ポリ（２-ヒドロキシエチル-メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７-２７７及びＬａｎｇｅｒら，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８-１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら，上記）、またはポリ-Ｄ（-）-３-ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０１３３，９８８号）が含まれ得る。持続放出性組成物にはまた、当該技術分野で既知のいくつかの方法のいずれによっても調製可能なリポソームも含むことができる。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８２：３６８８−９２、及び欧州特許第００３６，６７６号、同第００８８，０４６号、同第０１４３，９４９号を参照されたい。
【００９６】
インビボ投与に用いられる医薬組成物は通常、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥及び復元の前にまたはその後のいずれかに実施することができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中で保存することができる。更に、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する点滴静注バッグまたはバイアル中に入れられる。非経口組成物は、非経口的に許容される希釈液（例えば、生理食塩水及び５％デキストロース）内で希釈することができる。
【００９７】
いったん製剤化された医薬組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中で保存することができる。このような製剤は、すぐ使用できる形態でも、投与前に復元を要する（例えば、凍結乾燥した）形態でも保存することができる。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、単回用量投与単位を生成するためのキットに関する。キットはそれぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器及び水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。本発明の範囲内には、単一チャンバ及び多チャンバの事前充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ及びデュアルチャンバシリンジ）を搭載するキットも含まれる。
【００９９】
一実施形態では、本発明は、復元後、注射溶液となる粉末注射薬として製剤化される、ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【０１００】
治療剤に適した投与レジメンの選択は、その実体の血清または組織の代謝回転率、症状のレベル、実体の免疫原性及び生物マトリックス中の標的細胞の接近可能性を含めた、いくつかの因子に依存する。ある種の実施形態では、投与レジメンは、許容されるレベルの副作用と整合する範囲で、患者に送達される治療剤の量を最大化する。したがって、送達される生物製剤の量は、治療対象の個々の実体及び重症度に部分的に依存する。抗体、Ｆｃ融合治療タンパク質、サイトカイン、及び低分子の適切な用量を選択する際の指針が利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ，１９９６，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ、Ｋｒｅｓｉｎａ（編），１９９１，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｂａｃｈ（編），１９９３，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｂａｅｒｔら，２００３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８、Ｍｉｌｇｒｏｍら、１９９９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３、Ｓｌａｍｏｎら、２００１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２、Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら、２０００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９、Ｇｈｏｓｈら、２００３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２、Ｌｉｐｓｋｙら，２０００，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照）。
【０１０１】
適切な用量は、例えば、治療に影響する若しくは治療に影響すると予測されることが当技術分野で既知であるか若しくは疑われるパラメータまたは因子を用いて、臨床医により決定される。一般に、用量は最適用量よりも若干少ない量で開始し、その後、何らかの負の副作用と比較して、所望の効果または最適な効果が達成されるまで少量ずつ増加させる。重要な診断尺度には、例えば、血清リン酸の増加またはリン酸排泄の減少などの症状に関するものが含まれる。
【０１０２】
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性がなく、個々の患者、組成物、及び投与様式について所望の治療応答を達成するために有効である活性成分の量が得られるように変更しても良い。選択される用量レベルは、用いられる本開示の個々の組成物、またはそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる個々の化合物の排出速度、治療の持続期間、用いられる個々の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／または材料、治療対象の患者の年齢、性別、体重、症状、全身健康状態及び以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の因子を含めた、様々な薬物動態因子に依存する。
【０１０３】
本開示のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を含む組成物は、連続注入により、または例えば、１日、１週間、週に１〜７回、若しくは１月の間隔で投与することにより与えることができる。用量は、静脈内、皮下、局所、経口、鼻内、直腸、筋肉内、脳内に、または吸入により与えて良い。具体的な用量プロトコルは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または用量頻度を含むものである。合計週用量は、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも１μｇ／ｋｇ、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇであっても良い（例えば、Ｙａｎｇら、２００３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４、Ｈｅｒｏｌｄら、２００２，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８、Ｌｉｕら、１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６、Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら，２００３，Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４を参照）。用量は、少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、または少なくとも１００μｇであって良い。対象に投与される用量は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回以上の回数であって良い。
【０１０４】
本開示の治療用ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の場合、患者に投与される用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者体重）であって良い。用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ（患者体重）であっても良い。
【０１０５】
本開示の治療用タンパク質の用量は、キログラム（ｋｇ）単位の患者体重に、ｍｇ／ｋｇ単位の投与用量を掛けたものを使用して算出することができる。本開示のタンパク質の用量は、１５０μｇ／ｋｇ以下、１２５μｇ／ｋｇ以下、１００μｇ／ｋｇ以下、９５μｇ／ｋｇ以下、９０μｇ／ｋｇ以下、８５μｇ／ｋｇ以下、８０μｇ／ｋｇ以下、７５μｇ／ｋｇ以下、７０μｇ／ｋｇ以下、６５μｇ／ｋｇ以下、６０μｇ／ｋｇ以下、５５μｇ／ｋｇ以下、５０μｇ／ｋｇ以下、４５μｇ／ｋｇ以下、４０μｇ／ｋｇ以下、３５μｇ／ｋｇ以下、３０μｇ／ｋｇ以下、２５μｇ／ｋｇ以下、２０μｇ／ｋｇ以下、１５μｇ／ｋｇ以下、１０μｇ／ｋｇ以下、５μｇ／ｋｇ以下、２．５μｇ／ｋｇ以下、２μｇ／ｋｇ以下、１．５μｇ／ｋｇ以下、１μｇ／ｋｇ以下、０．５μｇ／ｋｇ以下、または０．１μｇ／ｋｇ以下（患者体重）であって良い。
【０１０６】
本開示の治療用タンパク質の単位用量は、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１５ｍｇ、０．１ｍｇ〜１２ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜８ｍｇ、０．１ｍｇ〜７ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．２５〜１５ｍｇ、０．２５〜１２ｍｇ、０．２５〜１０ｍｇ、０．２５〜８ｍｇ、０．２５ｍｇ〜７ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜８ｍｇ、１ｍｇ〜７ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、または１ｍｇ〜２．５ｍｇであって良い。
【０１０７】
本開示の治療用タンパク質の用量は、対象中で少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬ  ／ｍＬ、または少なくとも４００μｇ／ｍＬ  ／ｍＬの血清力価を達成し得る。あるいは、本開示の抗体の用量は、対象中で少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬ、または少なくとも４００μｇ／ｍＬの血清力価を達成し得る。
【０１０８】
本開示の治療用タンパク質の投薬は反復しても、投与期間を少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２か月、７５日、３か月、または少なくとも６か月空けても良い。
【０１０９】
個々の患者にとっての有効量は、治療対象の状態、患者の全体的な健康状態、投与方法の経路及び投与用量、ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変更しても良い（Ｍａｙｎａｒｄら、１９９６，Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＩａ．；Ｄｅｎｔ，２００１，Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）。
【０１１０】
投与経路は、例えば、局所若しくは皮膚適用、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病変内投与による注射若しくは注入、または持続放出系若しくはインプラントによるものであって良い（例えば、Ｓｉｄｍａｎら、１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６、Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７、Ｌａｎｇｅｒら、１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５、Ｅｐｓｔｅｉｎら，１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２、Ｈｗａｎｇら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４、米国特許第６，３５０４６６及び同第６，３１６，０２４号を参照）。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤及び注射部位での疼痛を緩和するためのリドカインなどの局所麻酔剤を含んでも良い。加えて、例えば、吸入器または噴霧器、及びエアロゾル化剤を含む製剤の使用により、経肺投与を用いることもできる。例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、及び同第４，８８０，０７８号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６、及びＷＯ９９／６６９０３を参照されたい。一実施形態では、本開示の操作された抗体若しくは操作された抗体コンジュゲート、併用療法または組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（商標）肺薬物送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を用いて投与する。
【０１１１】
投薬頻度は、使用する製剤中でのＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の薬物動態学パラメータに依存することになる。通常は、臨床医は、所望の効果を達成する用量に到達するまで、組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投与として、または長期にわたる２回以上の投与として（同じまたは異なる所望の分子量で）、または埋め込み装置若しくはカテーテルによる連続注入として投与することができる。適切な用量の更なる改良が、当業者により定期的になされており、これは当業者によって定期的に実施される作業の範囲内である。適切な用量は、適切な用量-応答データを使用して確認することができる。
【０１１２】
医薬組成物の投与経路は、例えば、経口的；皮下、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋内、眼内、動脈内、門脈内若しくは病巣内経路による注射；持続放出系によるもの（これの注射も可能）；または埋め込み装置によるものなどの既知の方法に準拠する。望ましい場合、ボーラス注射によって、または注入により連続的に、または埋め込み装置によって組成物を投与することができる。
【０１１３】
代替的にまたは付加的に、所望する分子を吸収または被包した、膜、スポンジまたは他の適切な材料の埋め込みによって、組成物を局所的に投与することができる。埋め込み装置が使用される場合、この装置を、任意の好適な組織または臓器内に埋め込むことができ、所望の分子を分散、徐放性ボーラス投与または連続投与によって送達できる。例えば、本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質などの薬物を、薬物濃度を長期間にわたり所望の治療的に有効なレベルに維持できるように所定の速度で送達するために、様々な異なる手法を用いることができる。一実施例では、ゼラチン（例えば、ウシゼラチン、ヒトゼラチンまたは他由来のゼラチン）、または天然に存在する若しくは合成的に生成されたポリマーなどのポリマーを含むヒドロゲルを用いることができる。ヒドロゲルには、５、１０、１５または２０％など、任意の比率のポリマー（例えば、ゼラチン）を用いることができる。適切な濃度の選択は、所望される治療プロファイル及び治療的な分子の薬物動態学的プロファイルなど、様々な要因に依存し得る。
【０１１４】
ヒドロゲルに組み込むことができるポリマーの例として、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド−コ−ポリプロピレンオキシド、コポリエチレンオキシドのブロックコポリマーまたはランダムコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリジノン）、ポリ（アミノ酸）、デキストラン、へパリン、多糖類、ポリエーテルなどが挙げられる。
【０１１５】
ヒドロゲル製剤を生成するときに考慮され得る別の要因は、ヒドロゲル及び架橋剤の架橋度である。一実施形態では、無水メタクリル酸が関与するメタクリル化反応を経て、架橋を達成することができる。架橋度が高いことが望ましい場合もあれば、架橋度が低いことが好ましい場合もある。場合によっては、架橋度が高いと、より長い持続放出性が得られる。架橋度が高いと、ヒドロゲルが硬くなり、薬物が送達される期間が長くなり得る。架橋剤（例えば、無水メタクリル酸）に対して任意の比率でポリマーを用いて、所望の特性を有するヒドロゲルを生成することができる。例えば、架橋剤に対するポリマー比は、例えば、８：１、１６：１、２４：１または３２：１であり得る。例えば、ヒドロゲルポリマーがゼラチンで、架橋剤がメタクリレートである場合、無水メタクリル酸：ゼラチンの比を８：１、１６：１、２４：１または３２：１で用いることができる。
【０１１６】
治療方法
ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質及びＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質を含む医薬組成物を使用して、ＦＧＦ２３媒介性またはＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体媒介性の調節により、リン酸及びカルシウムなどのミネラルイオン、ならびに１，２５ＶｉｔＤを調節することができる。したがって、本発明のタンパク質は、ＦＧＦ２３活性の阻害に使用できるため、ＦＧＦ２３とＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される、様々な疾患または障害の治療に使用することができる。加えて、本発明は、ＦＧＦ２３媒介性またはＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体媒介性の障害の治療または予防に使用される薬剤の製造に、本開示のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質、またはその医薬組成物を使用するために提供する。別の実施形態では、本発明は、α−Ｋｌｏｔｈｏに依存しない、または別の共受容体を利用するＦＧＦ２３媒介性の障害の治療または予防に使用される薬剤の製造に、本開示のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質またはその医薬組成物を使用するために提供する。治療が可能な、ＦＧＦ２３媒介性またはＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体媒介性障害の例として、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発性骨軟化症（ＴＩＯ）、繊維性骨異形成症（ＦＤ）及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
本発明のタンパク質またはその医薬組成物は、左心室肥大及び副甲状腺機能亢進症を含めた疾患または障害の治療方法にも使用して良い。本発明はまた、左心室肥大及び副甲状腺機能亢進症を含めた疾患または障害の治療または予防に使用される薬剤の製造に、本開示のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質、またはその医薬組成物を使用するために提供する。
【０１１８】
本発明のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質は、腎臓のリン酸保持を亢進するため、ＦＧＦ２３が低リン血症の主因ではなく、代償機構としてのダウンレギュレーションがされない低リン血症の症状に治療的に使用して良い。本発明の融合タンパク質によって治療できる低リン血症としては、特に、リフィーディング症候群、糖尿病ケトアシドーシス、喘息増悪及び慢性閉塞性肺疾患、ならびに臓器移植（特に腎臓）からの回復が挙げられる（Ｇａａｓｂｅｅｋら、"Ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ：Ａｎ  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｉｔｓ  Ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，"Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  １１８（１０）：１０９４−１１０１  （２００５）、Ｍｉｌｌｅｒら，"Ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，"Ａｍ  Ｊ  Ｅｍｅｒｇ  Ｍｅｄ  １８（４）：４５７−４６１  （２０００）、Ｍａｒｉｎｅｌｌａ  Ｍ  Ａ．，"Ｒｅｆｅｅｄｉｎｇ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  Ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ，"Ｊ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２０（３）：１５５−１５９（２００５））。適用時には、本明細書に記載するＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質またはその医薬組成物を治療有効量で、それを必要とする患者に投与することにより、ＦＧＦ２３とＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との間の相互作用により媒介される障害または症状を治療することができる。本明細書に記載したように、投与は、静脈注射、腹腔内注射、筋肉注射または錠剤若しくは液体製剤の形態での経口投与などにより実施することができる。ほとんどの場合、望ましい用量は本明細書に記載したように臨床医により決定することができ、この用量はＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の治療的有効量を表し得る。治療的有効量が、とりわけ投与計画、投与剤の単位用量、組成物が他の治療剤と組み合わせて投与されるかどうか、及びレシピエントの健康状態に依存することは当業者にとって明らかであろう。本明細書で使用される場合、用語「治療的有効量」は、治療される疾患または障害の症状の緩和を含む、研究者、医師またはその他の臨床医が要求する、組織系、動物またはヒトでの生物学的または医学的反応を誘発するＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の量を意味する。
【０１１９】
例示的実施形態
本発明を以下の実験的実施例を参照して更に詳細に説明する。これら実施例は、例示のみを目的として提供するものであり、別段の指定のない限り、限定的であることを意図しない。したがって、本発明は、いかなる場合も以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に示す教示の結果として明らかにされる一部及び全ての変更を包含すると解釈されるべきである。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：Ｆｃ−ＦＧＦ２３融合タンパク質のクローニング及び発現
本実施例は、本明細書に記載するＦｃ−ＦＧＦ２３融合タンパク質の生成及び発現について示す。
【０１２１】
ヒトＦｃ−ＦＧＦ２３融合タンパク質のコード配列を、リーダーペプチド、ヒトＩｇＧ１のヒンジ部、ヒトＩｇＧ１を突然変異させたエフェクターのない変異ＣＨ２−ＣＨ３領域、単一のＧＧＧＧＳリンカー、それに続くヒト野生型ＦＧＦ２３のＣ末端７２アミノ酸を含むように設計した。これを表５に示す。Ｆｃ−ＦＧＦ２３融合タンパク質前駆体の予測されるアミノ酸配列及び成熟型の分泌産物をそれぞれ表５に示す。
【０１２２】
ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質に要求される特性の１つは、ＦＧＦ２３とＦＧＦ２３受容体／α−Ｋｌｏｔｈｏ共受容体複合体との結合を競合的に阻害することであるため、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのネイティブＦｃの機能は通常、好ましくない。米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号にＷｉｎｔｅｒらにより記載されている一連の突然変異を使用して、Ｌｅｕ２４２、Ｌｅｕ２４３及びＧｌｙ２４５の位置（Ｋａｂａｔの抗体付番によれば、それぞれ２３４、２３５及び２３７（表４及び５を参照））をアラニンに変異させることによって、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃからエフェクター機能を遺伝子操作した。ＬＬＧＬからＡＡＧＡへのこうした突然変異により、Ｆｃ媒介性の細胞欠失を含めた、Ｆｃエフェクター機能の低減が予測される。米国特許第５，６２４，８２１号及び５，６４８，２６０号を参照されたい。
【０１２３】
この配列は、商用供給業者（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ  ＮＪ）により同質遺伝子（ｓｙｎｇｅｎｅ）として構築され、独自の哺乳動物発現ベクターに再クローニングされた。このコンストラクトを独自のＣＨＯ細胞株にトランスフェクトして、安定なトランスフェクタントのプールを選択した。選択後、トランスフェクトされたプールを初期濃度１Ｅ６／ｍＬで１Ｌにし、産生工程を開始した。日毎の供給計画を使用し、通常力価が６〜９００ｍｇ／Ｌの融合タンパク質を用いて、１４〜１６日の産生工程を実施した。上清を遠心分離により回収し、精製前に無菌濾過した。
【０１２４】
（表５）ヒトＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質コンストラクト
2017517272.tif 000010
【０１２５】
マウスのオルソログをヒトＦｃ融合と類似した方法で設計した。同質遺伝子はヒトと同じリーダーペプチド配列、続いてマウスＩｇＧ１のヒンジ部、エフェクターのないマウスＦｃ、ＧＧＧＧＳリンカー、続いてマウスＦＧＦ２３のカルボキシ末端７２アミノ酸から構成される。コード領域のＤＮＡ配列、Ｆｃ−ＦＧＦ２３タンパク質前駆体の予測されるアミノ酸配列、及び予測される成熟型産物を表６に示す。同質遺伝子を、ヒトコンストラクトに従ってＧｅｎｅｗｉｚ（Ｇｅｎｅｗｉｚ、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ  ＮＪ）により合成し、ヒトと同様の独自ベクター主鎖にサブクローニングした。後に、ＣＨＯ細胞で産生された材料に製品品質上の問題があったことが判明し、代替マウスの融合タンパク質を、製造業者のプロトコルに従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３ファミリーの細胞、試薬及び培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）を使用して、ヒト胚腎細胞株ＨＥＫ２９３を使用した大規模な一過性トランスフェクションにより産生した。
【０１２６】
（表６）マウスＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質コンストラクト
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【０１２７】
実施例２：ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドとＩｇＧ１  ＦｃとのＣ末端融合
Ｃ末端またはＮ末端のいずれかで種々のＰＥＧ部分をＦＧＦ２３  ｃテールペプチドにコンジュゲートすると、ペプチドの阻害活性が抹消または大幅に低減されたため、ＰＥＧ化は実行可能性のない選択肢であった。対照的に、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドとエフェクターのないヒトＦｃとの融合は、ペプチドの阻害活性に有意な影響を及ぼさなかった。興味深いことには、ＳＰＲによる競合的結合アッセイでは、従来的でないＣ末端融合が、Ｎ末端融合よりも大きな阻害力価を示した（図１）。加えて、Ｃ末端及びＮ末端でのＦｃ融合物の力価はほぼ同等であったが、精製収率はＣ末端融合において有意に高かった。
【０１２８】
実施例３：Ｆｃ−ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の精製及び性質決定
本実施例は、上記実施例１に記載の実験から得た融合タンパク質の精製及び性質決定について示す。
【０１２９】
ヒトＦＧＦ２３−ＦｃをプロテインＡアフィニティ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ＰＡ、１７−５４３８）及びセラミックヒドロキシアパタイト（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ、４０μｍ、ＢｉｏＲａｄ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ、１５７−４０００）クロマトグラフィにより精製した。予備製剤の分析は、ＨＢＳ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）及びＴＭＳ緩衝液（１．２ｍｇ／ｍＬのトリス、４０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ｐＨ７．５）にて５ｍｇ／ｍＬ及び５０〜６５ｍｇ／ｍＬで実施した。ＴＭＳ緩衝液にて、５０ｍｇ／ｍＬ濃度のとき、材料は最も安定した。
【０１３０】
マウスＦＧＦ２３−Ｆｃは、プロテインＡアフィニティ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−５４３８）及び分取ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ、ＧＥ、２８−９８９３）によって精製した。最終的なプールを、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５にて約５ｍｇ／ｍＬに製剤化した。
【０１３１】
ＦＧＦ２３−Ｆｃの全ロットを、紫外線吸光度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ分析、インタクト質量分析、及びエンドトキシンによって性質決定した。
【０１３２】
２８０ｎｍ及び３２０ｎｍの吸光度は、Ｉｍｐｌｅｎ  Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、８及び２μｇ量のタンパク質を添加したトリス−グリシンゲルを使用して、還元条件及び非還元条件にて実施した。製造業者の推奨に従って、ゲルを２００Ｖで４０分間、泳動させ、クマシーＧ２５０を用いて検出した。図２Ａ及び２ＢにＳＤＳゲルを示す。
【０１３３】
図３は、２０ｍＭのリン酸塩、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２の移動相のＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−ｓ３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、部品番号００Ｈ−２１４６−Ｋ０）にて実施したＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す。約２５μｇのＦＧＦ２３−Ｆｃ融合タンパク質を事前に平衡化したカラムに加えた。カラムを１ｍＬ／ｍｉｎで２５分間、作動した。図４は、ＥＳＩ  ＴＯＦ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した、インタクト質量分析を示すグラフを表す。ＰＮＧａｓｅＦ処理あり及び処理なしの還元後の試料を分析した。エンドトキシンレベルは、簡易型Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ装置（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ）を使用して測定した。
【０１３４】
約１１グラムの精製済みＨｕＦＧＦ２３−Ｆｃ材料を、２ｘ約２０Ｌの安定なＣＨＯのウェーブ培養により産生し、５７％の収率を得た。最終材料（ＵＦ後ＨＡ）は、ＳＥＣ分析により９８．２％のモノマーであり、０．２ＥＵ／ｍｇであると判定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、最終材料は、この精製工程を使用した対象種の約７４％であり、先の小規模ロットと一致することが判定された。インタクト質量分析は、還元及びＮ結合グリカンの除去処理後の種が、主に３４２３１、３４３０２Ｄａ及び３４４３０Ｄａであることを示した。質量分析により見出された分子量と、予測された質量３３，７４５Ｄａとの差は、Ｏ結合グリコシル化された小型の切り詰め種である可能性が高い。この質量プロファイルは先のロットと一致する。
【０１３５】
実施例４：Ｃ末端ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの切り詰め
Ｃ末端ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ及びＮ末端ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの両方の分子的性質決定から、切り詰めの形跡は示したが、切り詰めの存在は試料内で不均質であった。Ｎ末端の切り詰めは、切り詰めが発生した分子の活性を損なうことが予測された。Ｃ末端融合物の切り詰めの不均質性を図４に示す。ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドのＣ末端からの最初の２〜３ａａの欠失がペプチドの阻害力価に影響を及ぼすかどうかを評価するために、α−Ｋｌｏｔｈｏを過剰発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞を用いて競合的結合アッセイを実施した。ＨＥＫ２９３細胞は、ＦＧＦ２３の同族ＦＧＦＲを含めた、内因的にいくつかのＦＧＦＲを発現するヒト細胞胚腎細胞である（Ｋｕｒｏｓｕら、（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６１２０−６１２３、Ｙａｍａｚａｋｉら、（２０１０）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１１：１２１０−１２２１）。これら細胞のα−Ｋｌｏｔｈｏの異所性発現は、ＦＧＦ２３の強力な結合、及びシグナル伝達を可能にしている（Ｋｕｒｏｓｕら、（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６１２０−６１２３）。７２ａａ  ＦＧＦ２３  ｃテールによるＨＥＫ２９３−Ｋｌｏｔｈｏ細胞の前処理（合成ペプチド形態及びＦｃ融合形態の両方）は、フローサイトメトリーで評価したように、準飽和量のＦＧＦ２３とこの細胞との結合能を用量応答様式で阻害する。ＦＧＦ２３タンパク質（本明細書に記載のヒト及びマウス両方）を、マウスミエローマ細胞株（ＮＳ０）を使用して産生した。７２、７０若しくは６９ａａ（ペプチド）または６９及び６７ａａ（Ｆｃ融合）のＦＧＦ２３  ｃテールで構成された、合成ＦＧＦ２３  ｃテールペプチド及びＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質を生成した。図５に示すように、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合物のＦＧＦ２３  ｃテールペプチド成分を２〜３ａａ単位でＣ末端から切り詰めても、融合タンパク質の競合的結合活性に影響を与えなかった。質量分析は、６９または６７ａａのＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合物の生成が、分子の付加的な刈り込みを阻止することを示している（表７）。したがって、こうした融合タンパク質を、ＸＬＨ治療の潜在的治療法として使用することもできる。
【０１３６】
（表７）切り詰められたＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合物の質量分析
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【０１３７】
実施例５：ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の阻害力価
本実施例は、細胞ベースのアッセイでのヒト７２ａａ  ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合物の阻害力価について示す。
【０１３８】
７２ａａ  ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドの半減期を延長する操作が、ペプチドの阻害力価を弱めたかどうかを判定するため、ＦＧＦ２３を媒介した転写因子Ｅｇｒ１（既知のＦＧＦシグナル伝達の下流媒介物）の誘導をＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質が阻害する能力を評価した。α−Ｋｌｏｔｈｏ及びＥｇｒ１ルシフェラーゼレポーターの両方を安定的に発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞を、準飽和量の組換えＦＧＦ２３を用いて細胞を刺激する前に、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを徐々に増量して前処理した。その後、ルシフェラーゼレポーターアッセイで細胞を評価した。この結果を図６Ａ〜６Ｄに示す。図６Ｃ及び６Ｄに示すように、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃは、ルシフェラーゼ活性を用量依存的様式で阻害し、ＩＣ５０は２０１．６ｎＭであった。対照的に、非コンジュゲートＦＧＦ２３  ｃテールペプチドは、このアッセイにおいて、８１．９ｎＭのＩＣ５０でＦＧＦ２３のシグナル伝達を阻害した。図６Ａ及び６Ｂに示した追加の結果からわかるように、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃは用量依存的様式でルシフェラーゼ活性を阻害し、生じたＩＣ５０は２１．５ｎＭであった（分析最適化の後）。データは、エフェクター機能を欠くヒトＦｃ分子へのＦＧＦ２３  ｃテールのＣ末端融合が、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドのＦＧＦ２３阻害力価を実質的に低減しないことを示している。
【０１３９】
競合的阻害が受容体結合のレベルで発生したことを立証するために、フローサイトメトリー及びαＫｌｏｔｈｏを異所性発現しているＨＥＫ２９３細胞を使用して、細胞ベースの結合競争性実験を実施した。上記のように、ＨＥＫ２９３細胞は、ＦＧＦ２３の同族ＦＧＦＲを含めた、いくつかのＦＧＦＲを内因的に発現している（Ｋｕｒｏｓｕら，（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：６１２０−６１２３、Ｙａｍａｚａｋｉら，（２０１０）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１１：１２１０−１２２１）。準飽和量のＦＧＦ２３とＨＥＫ２９３−αＫｌｏｔｈｏ細胞との結合を、量の増加するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合または非コンジュゲートＦＧＦ２３  ｃテールペプチドの非存在下または存在下で評価した。このアッセイで使用した各濃度の結合競合因子で得られた平均蛍光（ＰＥ）強度をプロットすることにより、２つの競合因子それぞれによるＦＧＦ２３結合の阻害を定量化した。ＩＣ５０値は、得られた阻害結合曲線（図７）から導出した。このデータは、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合分子が、非コンジュゲートＦＧＦ２３  ｃテールペプチド同様、受容体結合のレベルでＦＧＦ２３を阻害していることを示す。
【０１４０】
実施例６：ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる血清リン及び１，２５ＶｉｔＤの調節
本実施例は、野生型マウスでのヒトＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの、血清リン及び１，２５ＶｉｔＤに対する効果について示す。
【０１４１】
１０、３０、及び１００ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを、２週間にわたって週２回、健康なマウスに注入した。１５日目、最後の投薬から２４時間後に、血清中のリン及び１，２５ＶｉｔＤの濃度を測定した。ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる処置は、ビヒクルによる処置と比較して、血清リンの用量依存的増加を引き起こした（図８Ａ）。対照的に、また予想外に、血清１，２５ＶｉｔＤ濃度は、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる処置に応答して変化せず、この調査で使用した最も高用量のＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃに対する応答も変化しなかった（図８Ｂ）。このデータは、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ分子によって、血清１，２５ＶｉｔＤ濃度を変化させずに、または変化を導かずに、インビボのリン酸経路の調節が生じる根拠を示している。特に、１，２５ＶｉｔＤはＦＧＦ２３遺伝子発現の既知の強力な誘発因子であり、他のＦＧＦ２３拮抗剤、例えばＦＧＦ２３抗体による治療下での１，２５ＶｉｔＤの増加は、既にＦＧＦ２３濃度の上昇を有する疾患状態にあって、更にＦＧＦ２３が累積するという悪循環を招く。
【０１４２】
実施例７：ＮａＰｉ２Ａ発現の制御を介した、Ｈｙｐマウスのリン酸濃度調節
本実施例は、ＮａＰｉ２Ａ発現の制御を介した、Ｈｙｐマウス中のリン酸濃度に対するマウスＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの治療効果について示す。
【０１４３】
実施例６は、本発明のＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質が野生型状況でリン酸化経路を調節できることを実証する。しかしながら、ＸＬＨ治療の療法としてＦＧＦ２３  ｃテールを使用するためには、ＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質は、骨質に影響を与えるだけの強力な方法でリン酸濃度を調節できなければならない。Ｈｙｐマウスを使用した７週間の調査を完了して、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる治療が低リン血症を改善し、軟組織の石灰化を生じずに骨の健全性を向上させ得るかどうかを評価した。ヒト疾患と同様、Ｈｙｐマウスも、Ｘ染色体（ＰＨＥＸ）に位置するエンドペプチダーゼ、即ち骨に発現したエンドペプチダーゼと相同するリン調節遺伝子の突然変異により、ＦＧＦ２３のレベルが上昇した。（Ｓｉｔａｒａ，（２００４）Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．Ｎｏｖ：２３（７）：４２１−３２、Ｌｉｕ，（２００６）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２９１（１）：Ｅ３８−４９）。この調査では、動物の活性成長期を含む、５〜１２週齢のマウスに週２回皮下注射した。調査終了後、血清及び尿化学、骨の健全性及び軟組織の石灰化を評価した。特筆すべき点として、ヒトＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質は齧歯動物に交差反応するものの、データ解析を損ない得る免疫原性を調査期間にわたって回避するために、この調査では代替分子を使用した。
【０１４４】
ヒト系の全てに対してマウス系の全てをそれぞれ使用した場合、代替分子は、インビトロでヒト分子と同様の力価を示した。ヒト及びマウスコンストラクトの力価は、ＳＰＲ及び細胞生存率アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ）を使用して、両方の競合的阻害によって判定した。具体的には、Ｋｉの導出のため、完全長ＦＧＦ２３を、量の増加するＦＧＦ２３  ｃテールコンストラクトと組み合わせた、所定量の事前に形成された受容体複合体と共にチップ上に浮遊させてＢｉａｃｏｒｅ  Ｃｈｉｐに結合させた。実験は、種に特異的な方法で実施した。これは、全ての成分がマウスまたはヒトいずれかの単一種からのものであったことを意味する。機能性実験のために、ＢＡＦ３細胞を操作して、ＦＧＦＲ１ｃ及びα−Ｋｌｏｔｈｏを安定的に発現した。ＢＡＦ３細胞は、増殖の際にＩＬ−３に依存する。しかしながら、ＦＧＦＲ１ｃ及びα−Ｋｌｏｔｈｏの発現時に、ＩＬ−３細胞が非存在であっても、ＦＧＦ２３を添加すると生存率を維持することができる。ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの添加は、これに関連するＦＧＦ２３を、ＩＣ５０の算出が可能である用量依存的様式で阻害する。ここでも、種に特異的な方法で調査を実施した。表８に示すように、Ｋｉ及びＩＣ５０の両方は、種を越えて同等である。
【０１４５】
（表８）ヒト及びマウスＦＧＦ２３  ｃテール融合タンパク質の同等の効力
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【０１４６】
５２日目、投薬後２４時間の処置では血清リン酸に上昇傾向が見られ、実施例６と一致した（図９Ａ）。特筆すべきことに、血清リンは高投与量でのみ調節され、この時点では野生型動物のレベルに到達しなかった。リン酸排泄は用量応答的であり、１０ｍｇ／ｋｇの処置群で正常化が生じた（図９Ｂ）。このデータは、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃが疾患状況でのリン酸濃度に影響を及ぼし、またこの時点で血清リンを上回る影響をリン酸排泄に及ぼすことを示している。
【０１４７】
ＦＧＦ２３は、腎臓内に位置するナトリウム輸送体のダウンレギュレーションを介してリン酸濃度を調節し、それによりリン酸排泄を増加させる（Ｓｈｉｍａｄａ，２００４；Ｇａｔｔｉｎｅｎｉ，２００９）。どのような作用機序によってＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃがリン酸濃度を調節したかを確認するために、ＮａＰｉ２ａの発現を、ＱＰＣＲを使用して、調査終了後の動物の腎臓の全ＲＮＡからのＢ２ミクログロブリンについて評価した。図９Ｃに示すように、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃでの処置で、ＮａＰｉ２ａ発現の用量依存的な増加が見られた。これらの結果は、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃがインビボにおいて既知の標的でのＦＧＦ２３機能を拮抗することを実証しており、これは適切な標的と結合する機構的な根拠を示す。
【０１４８】
実施例８：血清１，２５ＶｉｔＤ及びカルシウムの調節
本実施例は、Ｈｙｐマウスでの１，２５ＶｉｔＤ及びカルシウムの血清濃度に対する、マウスＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの治療的効果について示す。
【０１４９】
１，２５ＶｉｔＤ濃度は通常、腎臓の１α−ヒドロキシラーゼ（１αＯＨ）の発現増加による低リン血症によって増加する（Ｂｅｒｇｗｉｔｚ，２０１０）。ＦＧＦ２３循環が上昇すると、１αＯＨ発現の減少により腎臓中の１，２５ＶｉｔＤ形成が阻害されるため、この代償性応答は抑制される。したがって、血清ＦＧＦ２３が持続的に上昇したＨｙｐ動物では、低リン血症であるにもかかわらず、１，２５ＶｉｔＤ濃度は低い（「不適切に」低い）ままである。Ｈｙｐマウスでの、抗ＦＧＦ２３抗体カクテル、またはＦＧＦＲ若しくはＭＡＰＫ経路に対する小分子状阻害剤を使用した、ＦＧＦ２３経路の阻害は、投薬後の１，２５ＶｉｔＤ濃度を強力に増加させる（Ａｏｎｏ，（２００９）Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２００９  Ｎｏｖ；２４（１１）：１８７９−８８、Ｗｏｈｒｌｅら（２０１３）Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２８（４）：８９９−９１１、Ｚｈａｎｇら，（２０１２）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１５３（４）：１８０６−１６）。対照的に、また予想外に、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃにて７週間治療したＨｙｐマウスでは、これら調査で使用された最も高容量であっても血清１，２５ＶｉｔＤ濃度は変化しなかった（図１０Ａ）。他のＦＧＦ２３阻害剤の調査と同様、同じ処置後２４時間の時点で１，２５ＶｉｔＤ濃度を測定した。このデータは、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる健康な動物の処置に応答した血清１，２５ＶｉｔＤ濃度変化が見られなかったこと（実施例６）と一致しており、いずれもが血清１，２５ＶｉｔＤを増加に導く、ＦＧＦ２３経路の他の阻害剤とは、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃが異なることを示している。
【０１５０】
ＨｙｐマウスのＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる７週間の処置後、血清カルシウム濃度及び腎臓のカルシウム排泄も測定した。図１０Ｂ及び１０Ｃに示すように、腎臓のカルシウム排泄は増加したにもかかわらず、血清カルシウムは正常範囲内を維持した。カルシウム排泄の増加は、ＦＧＦ２３の持つ腎臓のカルシウム保持作用をＦＧＦ２３ｃテール−Ｆｃ融合分子が拮抗する作用（Ａｎｄｒｕｋｈｏｖａら，ＥＭＢＯ（２０１４）３３：ｐｐ．２２９−２４６）の反映である可能性が高いが、腎臓のカルシウム損失を相殺し、正常カルシウム値を維持する機構は解明されていない。重要なことに、他のＦＧＦ２３拮抗剤、即ち抗ＦＧＦ２３抗体によるＨｙｐマウスの治療は、高カルシウム血症（Ａｏｎｏ，２００９）を招き、これは（未処置のＨｙｐマウスと比較した）血清リン濃度の増加と合わせ、軟組織の石灰化に対するリスク及びそれによる安全性リスクを呈する。ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ分子は、高カルシウム血症をもたらさないため、この点に関して負うリスクを少なくすることができる。これと一致して、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを用いた慢性治療後のマウスには、最も高い処置用量でさえも軟組織の石灰化は観察されなかった（以下の実施例９を参照）。
【０１５１】
実施例９：腎組織の石灰化の欠如
ｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを用いて長期的に処置されたＨｙｐマウスに軟組織の石灰化がない例を示す。
【０１５２】
７週間の調査期間にわたり、野生型対照と比較した、処置された及び処置されていないＨｙｐ動物の腎石灰化をＦａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ−ｒａｙを使用して評価した。３群のＨｙｐマウスにそれぞれ、リン酸緩衝生理食塩水、３ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ及び１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃを投薬した。野生型マウスには、リン酸緩衝液を投薬した。１６日目及び５２日目に予定通り剖検した後、ＭＸ−２０デジタルＸ線撮影装置（Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ−ｒａｙ  ＬＬＣ、Ｗｈｅｅｌｉｎｇ  ＩＬ）を使用して左腎をＸ線撮影した。本調査に登録されたマウスの腎臓には、採用された系統及び／または投薬レジメンに関係なく、可視のカルシウム化はなかった（図１１Ａ〜Ｄ）。
【０１５３】
実施例１０：海綿骨及び骨塩量及び骨組織構造の改善
本実施例は、海綿骨及び骨塩量に対するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質の効果について示す。
【０１５４】
リンは、成長板での類骨基質及び軟骨基質の石灰化に重要な役割を果たす。ＸＬＨのような低リン血症の症状では、骨基質が損なわれる（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，２０１１）。７週間の調査期間にわたり、野生型対照と比較した、処置された及び処置されていないＨｙｐ動物の骨質をいくつかの放射線医学の技法を使用して評価した。
【０１５５】
ＰＩＸＩＭｕｓは、生存動物での骨密度／骨塩量の測定に使用される自動化濃度計であり、骨パラメータの定量的評価が可能である。公開データ（Ｅｉｃｈｅｒ，（１９７６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．７３（１２）：４６６７−７１、Ｍｅｙｅｒ，（１９８０）Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．１２８）：３５１−９）と一致して、Ｈｙｐマウスは、同齢の野生型マウスとの比較で、骨塩量（ＢＭＣ）及び骨密度（ＢＭＤ）が有意に低い、ならびにある程度大きな骨を有しているにもかかわらず骨容積が小さいなどの、いくつかの骨格異常を示す。同時にこれらのパラメータは、最終的に骨強度を損なうことになる骨石灰化不全の強い徴候である。本調査全般で、３ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる処置ではＢＭＣ及びＢＭＤの改善傾向を示すと同時に、１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃによる処置では有意な改善をもたらした（表９）。重要なことに、群内の個々の動物は挙動が類似していた（図１２Ａ及び１２Ｂ）。このデータは、１０ｍｇ／ｋｇの処置された動物で臨床化学の調節が亢進したことと一致するものであり、骨石灰化の改善を示す根拠となっている。
【０１５６】
（表９）Ｄ５０の骨パラメータ
2017517272.tif 000014
＊ｐ＜０．０１
【０１５７】
より直接的に骨質を評価するために、エクスビボでマイクロＣＴを実施して、遠位大腿骨幹端の海綿骨を撮影した。海綿骨は血管新生性及び代謝性が高く、したがって再構築を評価するのに適している。図１３Ａは野生型マウスを表す。図１３ＢはＨｙｐマウスを表す。図１３Ｃは、３ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。図１３Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。予想されるように、野生型対照マウスは、Ｈｙｐ対照動物よりも、大腿骨遠位骨幹端にはるかに多くの海綿骨を有した。処置によって、明白な用量応答的増加が見られたことは明らかである。骨は通常、骨幹に沈着するが、海綿骨の増加は骨化が発生する骨端で最も明白である。
【０１５８】
３次元マイクロＣＴ（図１４Ｂ）によって視覚化されているように、くるぶし関節全体にわたって見られる、広域にわたる波形の骨面、多数の骨小腔及び成長板の間隙によっても、Ｈｙｐ対照動物の骨質不良を立証することができる。調査５０日目に、野生型動物の成長板は閉鎖されたが、Ｈｙｐ対照の方は開いたままであった（図１４Ａ及び１４Ｂ）。１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール融合で処置された動物は、骨面の回復を示し、研究の過程で病理的な裂孔は有意に減少した（図１４Ｄ）。加えて、１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合による処置で、骨端成長板の閉鎖が発生した（図１４Ｄ）。他のデータと一致して、３ｍｇ／ｋｇ群の動物は調節の改善を示したが、この動物群では成長板が開いたままであった（図１４Ｃ）。
【０１５９】
脛骨の骨端軟骨の骨構造の組織学的分析も評価した。骨端軟骨は骨伸長を担う骨の一部であり、骨幹端と骨端とを離間する領域を構成し、そこで長骨の成長が発生する。図１５Ａは野生型マウスを表す。図１５ＢはＨｙｐマウスを表す。図１５Ｃは、３ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。図１５Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃで処置されたＨｙｐマウスを示す。図１５Ａ〜Ｄに示すように、Ｈｙｐ対照動物は、軟骨及び石灰化不全の骨を広域に有した。対照的に、野生型マウスは、軟骨の薄層に続いて骨化のゾーンを有した。両方の処置群の構造に顕著な改善があり、用量依存的様式で軟骨が石灰化した骨に置き換えられている。
【０１６０】
同時にこのデータは、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質が、７週間でＨｙｐ動物の有意な骨改善を媒介できることを立証している。
【０１６１】
実施例１１：ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドの半減期の延長
本実施例は、本発明のＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期の延長について示す。
【０１６２】
翻訳後修飾されていない、ヒト野生型７２アミノ酸ＦＧＦ２３  ｃテールペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＦＧＦ２３１８０〜２５１）は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで短い推定半減期を有している（Ｇｏｅｔｚら、ＰＮＡＳ  １０７、ｐ４０７  ２０１０）。サル及びヒトでの、このペプチド及び翻訳後修飾を有するペプチドの半減期は、現時点で未知である。Ｋｈｏｓｒａｖｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ＆Ｍｅｔａｂｏｌ（２００７）９２：２３７４−２３７７を参照されたい。ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃの循環半減期を決定すると共に、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドとＦｃ分子とのコンジュゲートがペプチドの半減期を延長することを確認するために、ＨｕＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）の単回注射を、Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットならびにＣｙｎｏｍｏｌｇｕｓサルに投与し、融合分子の血漿濃度を一連の注射後の時点で測定した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。市販の試薬（Ａｂｃａｍ）を含むＥＬＩＳＡ法を使用して血漿を分析した。サルでのｈｕＦＧＦ２３−Ｆｃの半減期は、３ｍｇ／ｋｇの静脈内投薬後、８４．５時間であり、ラットの半減期は１０ｍｇ／ｋｇのＳＣ投薬後、１０４時間であった。
【０１６３】
実施例１２：Ｆｃ−ＦＧＦ２３融合タンパク質の結合性質
現在まで、ＦＧＦ２３の同族受容体複合体にわたるＦＧＦ２３  ｃテールペプチドの結合親和性及びそれ自体の結合性質は、十分に定義されていない。この情報がない限り、Ｆｃ分子に対する融合がＦＧＦ２３  ｃテールペプチドの本質的な結合性質に影響を及ぼすかどうか、また何らかの潜在的な変化が様々なＦＧＦＲ／αＫｌｏｔｈｏ受容体複合体にわたって一貫しているかどうかを予測することは困難だった。これらの問題に対処するために、ＢＡＦ３細胞（内因性のＦＧＦＲまたはＫｌｏｔｈｏを発現しないマウスプロＢ細胞株）を操作して、異なる受容体複合体を発現させ、これら細胞株にわたって組換えヒトＦＧＦ２３の結合を評価した。上記のように、ＦＧＦ２３タンパク質（本明細書に記載のヒト及びマウス両方）を、マウスミエローマ細胞株（ＮＳ０）を使用して産生した。続いて、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドまたはＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃのいずれかが、ＦＧＦ２３結合を競合的に阻害する能力を評価した。これらの実験から得た第１の予備的結果を、図１７Ａ〜１７Ｂに示している。
【０１６４】
ＦＧＦ２３  ｃテールペプチド及びＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃは、ＦＧＦＲ１ｃ／αＫｌｏｔｈｏを発現するように操作されたＢＡＦ３株への結合に対して、ＦＧＦ２３と競合する類似した能力を有した（図１７Ａ）。対照的に、ＦＧＦＲ４／αＫｌｏｔｈｏを発現するように操作されたＢＡＦ３細胞とＦＧＦ２３結合との阻害に関しては、ＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃは、コンジュゲートされていないＦＧＦ２３  ｃテールペプチドよりも強力でないことが認められた（図１７Ｂ）。このデータは、ＦＧＦ２３  ｃテールペプチドの本質的な結合性質の変化、特にＦＧＦＲ４／αＫｌｏｔｈｏ複合体に対する結合性質の変化が、ペプチドとＦｃ分子とのコンジュゲートにより引き起こされたことを意味する。このような変化を証明するには、ＦＧＦＲ、αＫｌｏｔｈｏ及びＦＧＦ２３の二元／三元複合体の結晶構造の特定を待たねばならないが、それが予測不能であることは確かである。
【０１６５】
開示された教示は、様々な適用、方法、キット及び組成物について記載されているが、本明細書に記載の教示及び以下の特許請求の範囲に記載の発明を逸脱することなく、種々な改変及び変更を行い得ることが理解されよう。前述の実施例は、開示された教示を詳細に例示するために提供されるものであり、本明細書で提示される教示の範囲を限定することを意図としない。本教示はこれら例示的な実施形態に関して記載されているが、過度な実験をすることなく、これら例示的な実施形態の多くの変型及び変更が可能であることを当業者は容易に理解されよう。このような変型及び変更は全て、現時点の教示の範囲内である。
【０１６６】
特許、特許出願、論文、教科書など及びそれらに引用された参考文献を含め、本明細書中に引用された全ての参考文献は、それらがまだ組み込まれていない場合には、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。組み込まれた文献及び同様の資料の１つまたは複数が、限定するものではないが、定義された用語、用語の用法、記載された技術などを含めて、本出願と異なるまたは矛盾する場合には、本出願が優先する。
【０１６７】
前述の説明及び実施例は、本発明のある特定の実施形態を詳述するものであり、本発明者らが企図する最良の形態を記載している。しかしながら、前述の事項が明細書中でいかに詳述されていても、本発明は多くの方法で実施でき、本発明は添付の特許請求の範囲及びそのあらゆる同等物に従って解釈すべきであることが理解されるであろう。
【図１】
2017517272.tif 000017
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2017517272.tif 000023
【図６Ａ】
2017517272.tif 000024
【図６Ｂ】
2017517272.tif 000025
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2017517272.tif 000027
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2017517272.tif 000031
【図１１】
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【図１２】
2017517272.tif 000033
【図１３】
2017517272.tif 000034
【図１４】
2017517272.tif 000035
【図１５】
2017517272.tif 000036
【図１６Ａ】
2017517272.tif 000037
【図１６Ｂ】
2017517272.tif 000038
【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年1月20日(2017.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本出願はまた、本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質の、左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療方法での使用についても開示し、これには本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。本出願は、左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療のための薬剤製造における、本明細書で開示するＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質の使用、ならびに左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療に使用するためのＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質及びその医薬組成物の使用についても開示する。
[本発明1001]
異種アミノ酸配列と融合された線維芽細胞増殖因子23  ｃテール（ＦＧＦ23  ｃテール）タンパク質を含む、融合タンパク質であって、血清リン酸濃度を調節するが、血清1，25−ジヒドロキシコレカルシフェロール（1，25ＶｉｔＤ）濃度を実質的に調節しない、前記融合タンパク質。
[本発明1002]
二量体化ドメインを更に含む、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1003]
前記ＦＧＦ23  ｃテールタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：4、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：5、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：6またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：7に示す配列を含む、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1004]
前記ＦＧＦ23  ｃテールタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2に示す配列を含む、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1005]
前記ＦＧＦ23  ｃテールタンパク質が、リンカーを介して異種アミノ酸配列と融合される、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1006]
前記リンカーが、
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から選択される配列を含むペプチドリンカーである、本発明1005の融合タンパク質。
[本発明1007]
前記リンカーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：12に示すアミノ酸配列を含む、本発明1006の融合タンパク質。
[本発明1008]
前記異種アミノ酸配列が、ヒトＩｇＧ1  Ｆｃドメインを含む、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1009]
前記Ｆｃドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：13に示すアミノ酸配列を含む、本発明1008の融合タンパク質。
[本発明1010]
前記Ｆｃドメインが、前記ドメインのエフェクター機能を変更するように改変されている、本発明1008の融合タンパク質。
[本発明1011]
前記Ｆｃドメインが、残基242、243及び245でアミノ酸置換を含むように改変され、位置242の該置換アミノ酸がアラニンであり、位置243の該置換アミノ酸がアラニンであり、かつ位置245の該置換アミノ酸がアラニンである、本発明1010の融合タンパク質。
[本発明1012]
前記Ｆｃドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：14に示すアミノ酸配列を含む、本発明1011の融合タンパク質。
[本発明1013]
前記Ｆｃドメインが、融合タンパク質の半減期を延長するために改変される、本発明1008の融合タンパク質。
[本発明1014]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：15、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：16、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：17、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：18、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：19またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：20に示す配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1015]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：14に示すアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
[本発明1016]
本発明1001〜1015のいずれかの融合タンパク質と、薬学的に許容される剤とを含む、医薬組成物。
[本発明1017]
本発明1001〜1015のいずれかの融合タンパク質をコードする単離核酸。
[本発明1018]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：22に示す核酸配列を含む、単離核酸。
[本発明1019]
本発明1018の核酸を含むベクター。
[本発明1020]
本発明1018の核酸または本発明1019のベクターを含む宿主細胞。
[本発明1021]
ＦＧＦ23  ｃテール融合タンパク質を産生する方法であって、前記核酸によってコードされるタンパク質が発現する条件下で、本発明1020の宿主細胞を増殖させることを含む、前記方法。
[本発明1022]
前記タンパク質を単離することを更に含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：15に示すアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含む、ＦＧＦ23  ｃテール  Ｆｃ融合タンパク質。
[本発明1024]
本発明1001〜1015または1023のいずれかの融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＦＧＦ23とＦＧＦＲ／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される疾患または障害の治療方法。
[本発明1025]
前記疾患または障害が腎臓リン酸消耗障害である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記疾患または障害が、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発性骨軟化症（ＴＩＯ）、繊維性骨異形成症（ＦＤ）及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群から選択される、本発明1024の方法。
[本発明1027]
ＦＧＦ23とＦＧＦＲ／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される疾患または障害の治療のための薬剤の製造における、本発明1001〜1015または1023のいずれかのＦＧＦ23  ｃテール融合タンパク質の使用。
[本発明1028]
前記疾患または障害が腎臓リン酸消耗疾患または障害である、本発明1027の使用。
[本発明1029]
前記疾患または障害が、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発性骨軟化症（ＴＩＯ）、繊維性骨異形成症（ＦＤ）及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群から選択される、本発明1027の使用。
[本発明1030]
それを必要とする患者での、ＦＧＦ23とＦＧＦＲ／α−Ｋｌｏｔｈｏ複合体との相互作用によって媒介される疾患または障害の治療のための、本発明1016の医薬組成物の使用。
[本発明1031]
前記疾患または障害が腎臓リン酸消耗疾患または障害である、本発明1030の使用。
[本発明1032]
前記疾患または障害が、常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）、Ｘ染色体連鎖性低リン血症性くる病（ＸＬＨ）、腫瘍誘発性骨軟化症（ＴＩＯ）、繊維性骨異形成症（ＦＤ）及び慢性腎臓病（ＣＫＤ）からなる群から選択される、本発明1030の使用。
[本発明1033]
左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療方法であって、本発明1001〜1015または1023のいずれかの融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
[本発明1034]
左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療のための薬剤の製造における、本発明1001〜1015または1023のいずれかのＦＧＦ23  ｃテール融合タンパク質の使用。
[本発明1035]
それを必要とする患者での、左心室肥大または副甲状腺機能亢進症の治療のための、本発明1016の医薬組成物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
（表６）マウスＦＧＦ２３  ｃテール−Ｆｃ融合タンパク質コンストラクト
2017517272.tif 000041
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017517272000001.app
【国際調査報告】
2017517272.tif 000042