(57)【要約】非ナイーブ型多能性幹細胞をＴＧＦβシグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へと変換／再プログラミングするための因子のカクテルを提供する。再プログラムする細胞を有効量の化合物と、細胞をＴＳＩナイーブ型ｉＰＳＣへと再プログラムするのに十分な期間接触することにより、非ナイーブ型ＰＳＣをＴＳＩナイーブ型ｉＰＳＣへと再プログラミングするための方法も提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離した多能性細胞の分化能を伸ばす細胞培養培地組成物であって、以下の群、
（１）サイトカイン、
（２）グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤、
（３）細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）１／２阻害剤、
（４）ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤、
（５）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び
（６）ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤
のそれぞれ由来のナイーブ型多能性（ＣＩＮＰ）の化学誘発因子を、非ナイーブ型細胞のＴＧＦβシグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型誘導多能性幹細胞（ＰＳＣ）への再プログラムに有効な量で、含む組成物。
【請求項２】
サイトカインが、ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ、“Ｌ”）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、カルジオトロフィン−１、ニューロポイエチン、及びカルジオトロフィン様サイトカイン因子１からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＧＳＫ阻害剤がＧＳＫ３阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＥＲＫ１／２阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド）；ＰＤ１９８３０６（Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４，５−トリフルオロ−２−［（４−ヨード−２−メチルフェニル）アミノ］−ベンズアミド）；ＳＬ３２７（α−［アミノ［（４−アミノフェニル）チオ］メチレン］−２−（トリフルオロメチル）ベンゼンアセトニトリル）；及びＵ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＧＳＫ阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１［６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル］；ＢＩＯ−アセトキシム；ＧＳＫ  ３Ｉ阻害剤ＸＶ；ＳＢ−２１６７６３；ＣＨＩＲ９９０２１トリヒドロクロリド；ＧＳＫ−３阻害剤ＩＸ［（（２Ｚ，３Ｅ）−６’−ブロモ−３−（ヒドロキシイミノ）−［２，３’−ビインドリニリデン］−２’−オン］；ＧＳＫ  ３ＩＸ［６−ブロモインジルビン−３’−オキシム］；ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＩ［３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］フェノール］；ＧＳＫ−３阻害剤ＸＶＩ［６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ）エチル−アミノ）−ニコチノニトリル］；ＳＢ−４１５２８６［３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン］；及びＢｉｏ［（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム］からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＪＮＫ阻害剤が、ＳＰ６００１２５（アントラ［１−９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン）；ＢＩ  ７８Ｄ３（４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−２，４−ジヒドロ−５−［（５−ニトロ−２−チアゾリル）チオ］−３Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−オン）；ＣＥＰ  １３４７（（９Ｓ，１０Ｒ，１２Ｒ）−５−１６−ビス［（エチルチオ）メチル］−２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−ヒドロキシ−９−メチル−１−オキソ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１０−カルボン酸メチルエステル）；及びＳＵ  ３３２７（−［（５−ニトロ−２−チアゾリル）チオ］−１，３，４チアジアゾール−２−アミン）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が、ＳＢ  ２０３５８０塩酸塩（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルフォニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン塩酸塩）；ＳＢ２０２１９０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］フェノール）；ＤＢＭ  １２８５二塩酸塩（Ｎ−シクロプロピル−４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ピペリジニル）−５−チアゾリル］−２−ピリミジンアミン二塩酸塩）；ＳＢ  ２３９０６３（トランス−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール）；ＳＫＦ  ８６００２二塩酸塩（６−（４−フルオロフェニル）−２，３−ジヒドロ−５−（４−ピリジニル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール二塩酸塩）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ＣＨＩＲ９９０２１；ＰＤ０３２５９０１；ｂＦＧＦ；ＳＰ６００１２５；ＳＢ２０３５８０及びＳＰ６００１２５を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
細胞培養培地を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
小分子量化合物が相対量で存在し、分化した細胞のナイーブ型多能性を誘導するための細胞培養培地へ入れるキットの、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ドナー細胞を、非ナイーブ型ＰＳＣをＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと再プログラムするのに有効な期間、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物と共に培養するステップを含む、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを産生する方法。
【請求項１２】
ドナー細胞が、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、多能性幹細胞、血液起源の細胞、胚起源の細胞、皮膚由来細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、実質細胞、神経系の細胞、及び結合組織細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ドナー細胞が、マウス胚性幹細胞、ヒト胚性幹細胞、及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ドナー細胞が４〜１４日の範囲の期間培養される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを単離するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣが、単一細胞として播種され、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞培養培地で細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１１〜１６に記載のいずれか１つの方法によって得られる、単離したＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ。
【請求項１８】
単離したＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ。
【請求項１９】
ＰＲＤＭ１４、ＫＬＦ５、ＺＦＰ４２（ＲＥＸ１）、ＬＩＦＲ、ＴＢＸ３、及びＮＡＮＯＧからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現が、ドナー細胞として同じ生物から単離された未処置の相当する細胞と比較した場合上方制御される、請求項１７又は１８に記載の細胞。
【請求項２０】
ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＳＳＥＡ−４からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現が、ドナー細胞として同じ生物から単離された未処置の相当する細胞と比較した場合上方制御される、請求項１７又は１８に記載の細胞。
【請求項２１】
ＳＳＥＡ−１の発現が、ドナー細胞として相当する生物から単離された未処置の相当する細胞と比較した場合下方制御される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
ＴＧＦβ１受容体阻害剤の存在下で対照と比較したＴＲＡ−１−８１−陽性細胞の割合の倍数変化によって測定した場合、少なくとも５日間ＴＧＦβ１受容体阻害剤の存在下で対照の培養後、細胞が多能性を維持する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の単離した細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を含む、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣの単離した集団。
【請求項２４】
注射、人工器官又は組織工学マトリックスの移植によって個体に投与するために製剤化された請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを含む治療用組成物。
【請求項２５】
請求項２０又は２１に記載の単離したＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ、並びに
（１）サイトカイン、
（２）グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤、
（３）細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）１／２阻害剤、
（４）ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤、
（５）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び
（６）ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤
を含む培養培地を含む細胞培養。
【請求項２６】
前記培養培地が、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回の継代の間、未分化及びナイーブ型多能性状態に効果的に維持する、請求項２５に記載の細胞培養。
【請求項２７】
前記ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣが、最大８ヵ月の培養後、培養で正常な核型を維持する、請求項２５に記載の細胞培養。
【請求項２８】
ａ）ドナー哺乳動物由来のＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを調製するステップ；ｂ）前記ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣをレシピエント哺乳動物の胚盤胞段階の受精卵へと移植するステップ；ｃ）非ヒト代理親哺乳動物の子宮で受精卵を発生し同産仔を得るステップ；及びｄ）同産仔から標的臓器を得るステップを含む、発生段階で標的臓器の発生の欠如と関連する異常を有するレシピエント非ヒト哺乳動物で臓器を産生する方法。
【請求項２９】
産生される臓器が、膵臓、腎臓、胸腺、及び毛髪からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
レシピエント哺乳動物が、Ｓｈａｌｌ１ノックアウトマウス、Ｐｄｘ１−Ｈｅｓ１トランスジェニックマウス、Ｐｄｘ１ノックアウト、及びヌードマウスからなる群から選択されるマウスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８の方法に従って産生した非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にはＴＧＦ−βシグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型誘導多能性幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）が２つの異なる安定な多能性状態であるナイーブ型及びプライム型多能性状態に分類できることがげっ歯類における研究により示めされている（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、４：４８７〜４９２（２００９））。ナイーブ型状態は、着床前のマウス胚盤胞胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）由来のマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）によって表され（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：１５４〜１５６（１９８１）；Ｂｒｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：５７０９〜５７１２（１９９７））、一方プライム型状態は着床後のマウスエピブラストから確立したマウスエピブラスト幹細胞（ｍＥｐｉＳＣ）に相当する（Ｔｅｓａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８：１９６〜１９９（２００７）；Ｂｒｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８：１９１〜１９５  ２００７）。さらに、ナイーブ型及びプライム型多能性幹細胞は、異なる遺伝子発現プロファイル及び異なるシグナル伝達経路を有し、それらの自己複製を支持する。例えば、ｍＥＳＣはＬＩＦシグナル伝達又は細胞外調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３）の組合せの阻害を必要とし、一方ｍＥｐｉＳＣは塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及びトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達に依存する（Ｔｅｓａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８：１９６〜１９９（２００７）；Ｙｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４５３：５１９〜５２３（２００８））。さらに、雌のｍＥＳＣは活性なＸ染色体状態を保持するが、雌のｍＥｐｉＥＳＣはＸ−不活性状態のままである。さらに、プライム型ＰＳＣは増殖速度が遅い扁平なコロニーを形成し、単一細胞継代には不応であるが、ナイーブ型ＰＳＣは急速に成長し、単一細胞継代により増殖することができる（Ｎｉｃｈｏｌｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、４：４８７〜４９（２００９））。最も重要なことには、プライム型多能性幹細胞と対照的に、ナイーブ型ＰＳＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏで明らかな分化系列コミットメントバイアスを保持せず、ｉｎ  ｖｉｖｏで高度なキメラ化を伴う初期の胚盤胞のＩＣＭへと再配置し（Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３０９：２５５〜２５６（１９８４）；Ｎｉｃｈｏｌｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、４：４８７〜４９（２００９））、キメラ動物モデルを作製するために重要なナイーブ型ＰＳＣを作出し、哺乳動物の遺伝子機能及び初期の発生を研究することができる。
【０００３】
異なるナイーブ型及びプライム型多能性状態はげっ歯類においてよく確立されているが、ヒト及びサルのＥＳＣなど従来の霊長類のＰＳＣ及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、遺伝子発現プロファイル、増殖に必要なシグナル伝達経路、及び単一細胞継代への不耐性に関して、着床後のマウスＥｐｉＳＣにより密接に類似している（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９２：７８４４〜７８４８（１９９５）；Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５〜１１４７（１９９８）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１３１：８６１〜８７２（２００７）；Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８：１９１７〜１９２０（２００７）；Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：５８７〜５９０（２００８））。したがって、霊長類のナイーブ型多能性状態を確立することができるかどうか及びどのように確立できるかは重要な課題のままである。近年の研究は、ＬＲＨ−１及びＲＡＲｇの異所性発現又は小分子の使用など、プライム型ＰＳＣの変換によって、又は体細胞の直接的な再プログラミングによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでナイーブ型ヒトＰＳＣを誘導することを報告した（Ｓｍａｇｇｈｅら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、８：ｅ５８６０１（２０１３）；Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、４：１６〜１９（２００９）；Ｂｕｅｃｋｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、６：５３５〜５４６（２０１０）；Ｈａｎｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０７：９２２２〜９２２７（２０１０）；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０８：１８２８３〜１８２８８（２０１１））。それにもかかわらず、げっ歯類のナイーブ型ＰＳＣの特徴の完全なセットが不在であることは、霊長類の安定なナイーブ型多能性状態の必要性を示している。最近、いくつかの報告が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで異なる安定な細胞外遺伝子非依存性ヒトナイーブ型多能性状態を確立した（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、５０４：２８２〜２８６（２０１３）；Ｃｈａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１３：６６３〜６７５（２０１３）；Ｗａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１１１：４４８４〜４４８９（２０１４）；Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１５（４）：４７１〜８７（２０１４））。さらに、いくつかの研究は、ＴＧＦβなど高価な成長因子を含む細胞培養で維持することができる多能性幹細胞を同定した。ヒトナイーブ型ＰＳＣの誘導はマウスと異なるシグナル伝達経路が必要なため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非ヒト霊長類、例えばアカゲザル由来のナイーブ型ＰＳＣを生成する方法又はいくつかの成長因子の必要性を排除する方法を使用するナイーブ型ＰＳＣの必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、トランスフォーミング成長因子シグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型誘導多能性幹細胞を提供することである。
【０００５】
また、本発明の目的は、非ナイーブ型ＰＳＣをＴＳＩナイーブ型誘導多能性幹細胞に変換する方法を提供することである。
【０００６】
さらに、本発明の目的は、ナイーブ型状態において、ＴＳＩナイーブ型誘導多能性幹細胞を維持する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
非ナイーブ型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞へと変換／再プログラムするために使用することができる因子／化合物のカクテルが同定され、以降カクテルと呼ぶ。カクテルは、ナイーブ型状態に化学的に誘導される、ＴＧＦ−βシグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型多能性幹細胞（すなわち、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ）を生成するために使用され、ナイーブ型状態に生成されたように細胞を維持する。化合物のカクテルは、本明細書において以下の化合物（（ナイーブ型多能性の化学誘発因子（ＣＩＮＰ））を有効量で、組み合わせて含み、非ナイーブ型ＰＳＣをＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと再プログラムする：（１）サイトカイン；（２）グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤；（３）ＥＲＫ１／２阻害剤；（４）ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ／ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＪＮＫ／ＭＡＰＫ）阻害剤（５）塩基性線維芽細胞成長因子及び（６）ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤。好ましい実施形態では、サイトカインは白血病抑制因子（ＬＩＦ）（“Ｌ”）であり；ＧＳＫ阻害剤はアミノピリミジン、化学名［６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル］を有するＣＨＩＲ９９０２１（“Ｃ”）であり；ＥＲＫ１／２阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり；ＪＮＫ阻害剤はＳＰ６００１２５（アントラ［１−９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン）であり；及びｐ３８阻害剤はＳＢ２０３５８０（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルフォニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン）である。この有効量の化合物のカクテルは非ナイーブ型多能性幹細胞をＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと再プログラムするために使用することができる。
【０００８】
本明細書に開示する化合物のカクテルを使用してドナー細胞を再プログラミングすることによって非ナイーブ型ＰＳＣをナイーブ型ＰＳＣへと誘導／再プログラミングする方法もまた提供する。再プログラムされる細胞（すなわち、ドナー細胞）は、細胞をＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと再プログラムするのに十分な期間カクテルと接触させる。いくつかの実施形態では、ドナー細胞は多能性幹細胞ではなく、ドナー細胞はまずプライム型誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へと変換される。この実施形態では、プライム型ｉＰＳＣは、最初は本明細書に開示の化合物のカクテルで、４〜１４日間の間、好ましくは７〜１０日間の間の期間培養する。好ましい実施形態では、細胞培養培地はＰＫＣ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＴＧＦＲ阻害剤又はＦＧＦＲ阻害剤を含まない。化合物のカクテルはＴＧＦβを含まないことがより好ましい。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを単離しそれらを生成するために使用する同じ化合物のカクテルを補った多能性幹細胞培養培地においてナイーブ型状態を維持する。
【０００９】
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣもまた提供する。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、少なくともＴＧＦβ１シグナル伝達非依存的な多能性を維持する能力のため同定される。本明細書に開示のように化合物のカクテルと接触する非ナイーブ型再プログラムＰＳＣ細胞は：（ｉ）形態（培養中のドーム形状のコロニーの形成に基づく）、（ｉｉ）以下の特徴：（ａ）ＴＧＦβ１非依存性の多能性の維持（ＴＧＦβ１受容体阻害剤の存在下で対照と比較したＴＲＡ−１−８１−陽性細胞の割合の倍数変化によって測定した場合）；（ｂ）３つの胚葉の組織へと分化する細胞の能力；（ｃ）ＰＲＤＭ１４、ＫＬＦ５、ＺＦＰ４２（ＲＥＸ１）、ＬＩＦＲ、ＴＢＸ３、及びＮＡＮＯＧなどのうちの１つ又は複数のナイーブ型状態関連転写産物の発現の上方制御、（ｄ）ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＳＳＥＡ−４などのうちの１つ又は複数の多能性マーカーの発現の上方制御；（ｅ）ＳＳＥＡ−１などのうちの１つ又は複数の多能性マーカーの下方制御；（ｆ）ｉｎ  ｖｉｖｏで種間キメラを形成する能力に基づく機能性、を含む特性に基づくＴＳＩナイーブ型ＰＳＣとして同定される。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、本明細書に開示のカクテルに曝露されていない細胞とは異なり、未処置細胞と比較した場合、少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ又はこれらの特性全てを保持する。上方制御又は下方制御は、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣが得られた対応する細胞において測定した因子のレベルを比較することにより決定される。
【００１０】
本明細書に開示のＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、少なくともそれらを生成するために使用される方法によって、すなわちそれらの起源によって、ヒト又はマウスＥＳＣ又はｉＰＳＣと区別できる。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣが、本明細書に記載のように、小分子の組合せにより非ナイーブ型ＰＳＣを処置することによって得られる場合、ＥＳＣが自然発生の細胞であり、例えば他方では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは自然発生ではない（対応する自然発生のＥＳＣには見出されない特徴の保持によって証明されるように）。
【００１１】
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、培養又は所望の型の細胞へと分化を誘導することができる。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ及びそれらの子孫は、細胞療法、動物モデル及び組織工学を含むがこれに限定されない多くの適用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、プレート後８日間の試験したシグナル伝達モジュレーターと基礎的な変換条件下で増えるナイーブ型ｉＰＳＣのコロニー数を示す棒グラフである。多能性の維持は、全コロニー中のＴＢＸ３及びＴＲＡ−１−８１のダブルポジティブコロニーの割合によって測定した。陰性対照：２ｉ／ＬＩＦ（白血病抑制因子）＋ｂＦＧＦ（ｎ＝３ウェル）。全ての値は、３ウェルの反復からの平均±ＳＥＭである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、プレート後５日間の試験したシグナル伝達モジュレーターと基礎的な変換条件下で増えるアカゲザルのナイーブ型ｉＰＳＣのコロニー数を示す棒グラフである。多能性の維持は、全コロニー中のＴＢＸ３又はＴＲＡ−１−８１のシングルポジティブコロニーの割合によって測定した。陰性対照：２ｉ／ＬＩＦ＋ｂＦＧＦ。全ての値は、３ウェルの反復からの平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、プレート後５日間の試験したシグナル伝達モジュレーターと基礎的な変換条件下で増えるアカゲザルのナイーブ型ｉＰＳＣのコロニー数を示す棒グラフである。多能性の維持は、全コロニー中のＴＢＸ３又はＴＲＡ−１−８１のシングルポジティブコロニーの割合によって測定した。陰性対照：２ｉ／ＬＩＦ＋ｂＦＧＦ。全ての値は、３ウェルの反復からの平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図２Ａ】図２Ａは、確立された、プライム型ｉＰＳＣ株のゲノムへと挿入したエピソームベクターの喪失の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。Ｆｉｂｒｏ−Ｄ６：６日間のエピソームベクター感染後の線維芽細胞；ＥＶｉＰＳ−１、２；エピソームベクター系によって確立された２つのプライム型ｉＰＳＣ株。全ての値は、３回の独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ナイーブ型ｉＰＳＣ（ＤＲＮ−１、ＤＲＮ−２、ＤＲＮ−３）、雌のナイーブ型ｉＰＳＣ（ＦＮ−１、ＦＮ−２、ＦＮ−３）及びエピソーム誘導ナイーブ型ｉＰＳＣ（ＥＶＮ−１、ＥＶＮ−２、ＥＶＮ−３）へと直接変換される、アカゲザルにおける多能性マーカー遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。（ＥＳ−７．５：アカゲザルＥＳ株）
【図２Ｃ】図２Ｃは、プライム型ｉＰＳＣ及びナイーブ型ｉＰＳＣの単一細胞継代後のコロニー再形成を示す図である。多能性の維持は、継代後５日のＴＲＡ−１−８１−陽性コロニーの数によって測定された（ｎ＝３ウェル）。Ｐ＜０．０００１（スチューデントのｔ検定）。全ての値は、３ウェルの複製からの平均±ＳＥＭである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ナイーブ型ｉＰＳＣにおける多能性の遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３：３つの独立に確立されたナイーブ型ｉＰＳＣ株；ＥＳ−７．５：アカゲザルＥＳＣ株）。
【図３Ａ】最適化した変換条件下で増えるナイーブ型ｉＰＳＣの、ＴＲＡ−１−８１＋ドーム型コロニーの倍数変化を示す図である（図３Ａ）。プライム型ｉＰＳＣは、ｈＥＳＣ培地で増やした（図３Ｂ）。試験したシグナル伝達モジュレーターは、１ｍＭ  ＪＡＫ阻害剤、１０ｍＭ  ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβＲ阻害剤）、２ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−ｂ１、及び２ｍＭ  ＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ阻害剤）である。多能性の維持は、対照（ナイーブ型ｉＰＳＣの最適化した変換条件）と比較したＴＲＡ−１−８１−陽性ドーム形状コロニー又は対照（プライム型ｉＰＳＣのｈＥＳＣ培地）と比較したＴＲＡ−１−８１−陽性コロニーの割合の倍数変化によって測定した。異なるカラムは個々の細胞株を表す（ｎ＝３の異なるウェル）。Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３：３つのナイーブ型ｉＰＳＣ株；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３：３つのプライム型ｉＰＳＣ株。全ての値は、３ウェルの複製からの平均±ＳＥＭである。
【図３Ｂ】最適化した変換条件下で増えるナイーブ型ｉＰＳＣの、ＴＲＡ−１−８１＋ドーム型コロニーの倍数変化を示す図である（図３Ａ）。プライム型ｉＰＳＣは、ｈＥＳＣ培地で増やした（図３Ｂ）。試験したシグナル伝達モジュレーターは、１ｍＭ  ＪＡＫ阻害剤、１０ｍＭ  ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβＲ阻害剤）、２ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−ｂ１、及び２ｍＭ  ＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ阻害剤）である。多能性の維持は、対照（ナイーブ型ｉＰＳＣの最適化した変換条件）と比較したＴＲＡ−１−８１−陽性ドーム形状コロニー又は対照（プライム型ｉＰＳＣのｈＥＳＣ培地）と比較したＴＲＡ−１−８１−陽性コロニーの割合の倍数変化によって測定した。異なるカラムは個々の細胞株を表す（ｎ＝３の異なるウェル）。Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３：３つのナイーブ型ｉＰＳＣ株；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３：３つのプライム型ｉＰＳＣ株。全ての値は、３ウェルの複製からの平均±ＳＥＭである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、最適化した変換条件下（２ｉ／ＬＩＦ＋ｂＦＧＦ＋ＳＰ６００１２５＋ＳＢ２０３５８０）で増えるアカゲザルのナイーブ型ｉＰＳＣのＴＲＡ−１−８１＋コロニー数の倍数変化を示す図である。異なる濃度のＬｙ２９４００２を５日間示したように試験した。多能性の維持を、ＴＲＡ−１−８１陽性ドーム形状コロニーの数によって測定した。全ての値は、３ウェルの複製からの平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、最適化した変換条件下（２ｉ／ＬＩＦ＋ｂＦＧＦ＋ＳＰ６００１２５＋ＳＢ２０３５８０）で増えるアカゲザルのナイーブ型ｉＰＳＣのＴＲＡ−１−８１＋ドーム型コロニー数の倍数変化を示す図である。さらに、２ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１単独及び２ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１と１０μＭ  ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ−βＲ阻害剤）を試験した。多能性の維持は、対照（２ｉ／ＬＩＦ＋ｂＦＧＦ＋ＳＰ６００１２５＋ＳＢ２０３５８０）と比較したＴＲＡ−１−８１陽性ドーム形状コロニーの倍数変化によって測定した。全ての値は、３ウェルの複製からの平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＸＩＳＴ発現のｑＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である（ＦＮ−１及びＦＮ−２：雌のナイーブ型ｉＰＳＣ株；ＦＰ−１及びＦＰ−２：雌のプライム型ｉＰＳＣ株；ＦＦ−１及びＦＦ−２；雌の線維芽細胞株；Ｎ１：雄のナイーブ型ｉＰＳＣ株；ＭＦ：雄の線維芽細胞株）。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、プライム型ｉＰＳＣにおけるＸＩＳＴの平均発現レベルと比較して示す（雌♯１及び♯２：２つの雌の細胞源；Ｎ：ナイーブ型；Ｐ：プライム型；Ｆ：線維芽細胞）。全ての値は、３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、階層的クラスタリングを使用してプライム型（Ｐ１、Ｐ２）及びナイーブ型ｉＰＳＣ（Ｎ１、Ｎ２、ＦＮ−１、ＦＮ−２）の全ゲノム発現プロファイル（ＲＮＡ−ｓｅｑ）において実施したクラスタリングを示す図である。
【図３Ｇ】図３Ｇは、サルのナイーブ型とプライム型ｉＰＳＣ間の上方及び下方制御されたシグナル伝達経路関連遺伝子カテゴリーを示すジーンオントロジー（ＧＯ）分析を示す図である。
【図３Ｈ】図３Ｈは、ナイーブ型及びプライム型ｉＰＳＣの典型的な多能性及び系列特異的マーカー遺伝子発現の定量的ＰＣＲバリデーションを示す図である。全ての値は、３つの独立した実験からの平均±ＳＤである。Ｐ＜０．０００１（スチューデントのｔ検定）。
【図３Ｉ】図３Ｉは、ナイーブ型及びプライム型ｉＰＳＣの典型的な多能性及び系列特異的マーカー遺伝子発現の定量的ＰＣＲバリデーションを示す図である。全ての値は、３つの独立した実験からの平均±ＳＤである。Ｐ＜０．０００１（スチューデントのｔ検定）。
【図３Ｊ】図３Ｊは、ナイーブ型及びプライム型ｉＰＳＣの典型的な多能性及び系列特異的マーカー遺伝子発現の定量的ＰＣＲバリデーションを示す図である。全ての値は、３つの独立した実験からの平均±ＳＤである。Ｐ＜０．０００１（スチューデントのｔ検定）。
【図４Ａ】図４Ａは、レトロウイルス誘導（ＯＫ−１、ＯＫ−２、ＯＫ−３）及びエピソームベクター誘導（ＥＶ−１、ＥＶ−２、ＥＶ−３）アカゲザルプライム型ｉＰＳＣにおける多能性マーカー遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。「Ｅｎｄｏ」は、内在性遺伝子発現を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、レトロウイルス誘導（ＯＫ−１、ＯＫ−２、ＯＫ−３）及びエピソームベクター誘導（ＥＶ−１、ＥＶ−２、ＥＶ−３）アカゲザルプライム型ｉＰＳＣにおける多能性マーカー遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。「Ｅｎｄｏ」は、内在性遺伝子発現を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、全ての外因性転写因子遺伝子の発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す棒グラフである。全ての値は、３つの独立した実験からの平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、用語「化学的に誘導した多能性幹細胞」（ｃｉＰＳＣ）は、多能性ではない細胞、つまり、１つ又は複数の形質導入遺伝子の発現によってではなく、化合物と非多能性細胞を接触させることによる、多能性又は分化した細胞由来の多能性細胞を指す。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「２ｉ」は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達を二重阻害するＥＳＣ培養培地、例えば２ｉを補ったＥＳＣ培養培地を指す（ＣＨＩＲ９９０２１及びＰＤ０３２５９０１）。
【００１５】
本明細書で使用する場合、用語「誘導多能性幹細胞」（ｉＰＳＣ）は、人工的に非多能性細胞に由来する多能性幹細胞の型である。ＣｉＰＳＣはｉＰＳＣであるが、それらは、多能性を付与するために遺伝子操作されていないという点で、いくつかのｉＰＳＣとは異なる。
【００１６】
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを指す場合、用語「単離した」又は「精製した」は、少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％ナイーブ型多能性細胞ではない細胞型を夾雑しない化学的にナイーブ型誘導したナイーブ型多能性幹細胞を意味する。単離したＴＳＩナイーブ型ＰＳＣはまた、可溶性の、自然発生の分子を実質的に含まない場合がある。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「培地」及び「培養培地」は、細胞培養環境を指す。培地は典型的には等張液であり、液体、ゼラチン状、又は半固体であってよく、例えば細胞接着又は支持のためのマトリックスを提供する。本明細書で使用する場合、培地は、細胞を培養するために必要な栄養学的な、化学的な、及び構造的な支持のための成分を含むことができる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、用語「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」（又は多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ））は、３つの胚葉である内胚葉（例えば、胃内部の膜、胃腸管、肺）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、又は外胚葉（例えば、表皮組織及び神経系）の任意に分化する能力を有する幹細胞を指す。多能性幹細胞は、可塑性でなく、より分化し、与えた臓器内の細胞のいくつかの型の１つになり得る。例えば、多能性血液幹細胞は赤血球前駆細胞、白血球又は血小板産生細胞に発生することができる。生体幹細胞は多能性幹細胞である。脂肪由来幹細胞は多能性である。
【００１９】
「多能性細胞」は、本明細書において「多能性幹細胞」と交換可能に使用される。
【００２０】
用語「小分子」は、２０００ダルトンより小さい、より好ましくは１５００ダルトンより小さい、最も好ましくは１０００ダルトンより小さい分子量を有する、有機又は有機金属化合物などの分子を指す。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「ＴＧＦβ−シグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型ＰＳＣ」は、「ナイーブ型」ＰＳＣである特徴が人工的に付与されるＰＳＣ、本明細書に開示の化合物のカクテルで非ナイーブ型ＰＳＣ細胞を培養することによる非ナイーブ型ＰＳＣ（ドナー細胞）を指し、ナイーブ型ＰＳＣへの変換／再プログラミングがＴＧＦβシグナル伝達非依存的である。ドナー細胞は非ＰＳＣ及びＰＳＣを含み、多能性を維持する能力はＴＧＦβシグナル伝達非依存性である。ＴＧＦβシグナル伝達非依存性は、少なくとも５日間、ＴＧＦβ１非依存的に培養した場合、ナイーブ型ＰＳＣの多能性を維持する能力によって決定される（ＴＧＦβ１受容体阻害剤の存在下で対照に対するＴＲＡ−１−８１−陽性細胞の割合の倍数変化によって測定した場合）。ナイーブ型ＰＳＣのＴＧＦβシグナル伝達非依存性を決定する例は、以下に更に記載するように「細胞培養」で提供される。
【００２２】
ＩＩ．組成物
非ナイーブ型多能性幹細胞をＴＧＦ−βシグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型ＰＳＣへと変換するための化合物のカクテルは、非ナイーブ型ＰＳＣをＴＧＦβシグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型ＰＳＣへと変換／再プログラムするため、及び培養中ナイーブ型状態に細胞を維持するために有効量の本明細書に開示の化合物を含む。化合物のカクテルは、好ましくはＰＫＣ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＴＧＦＲ阻害剤、又はＦＧＦＲ阻害剤を含まない。化合物のカクテルはＴＧＦβを含まないことがより好ましい。
【００２３】
本明細書に開示の組成物は、単離したＴＧＦ−β−シグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型ＰＳＣも含む。
Ａ．非ナイーブ型ＰＳＣをＴＧＦ−β−シグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型ＰＳＣへと再プログラミングするための化合物のカクテル
【００２４】
化合物のカクテルは、サイトカイン、小分子及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などのタンパク質因子を含む。最も好ましいカクテルは、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＬＩＦ、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）及びＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）、及びＳＰ６００１２５（１０μＭ）、及びＳＢ２０３５８０（１０μＭ）を含む。
【００２５】
１．サイトカイン
好ましいサイトカインは、ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）（“Ｌ）、インターロイキン６クラスサイトカインであり、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０、及びさらにより好ましくは１〜３０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用される。ｌＬ−６は、ニューロポイエチンの創立メンバーであり、構造的に関連するサイトカインのグループである、プロトタイプの４ヘリックスバンドルサイトカインであり、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、カルジオトロフィン−１、ニューロポイエチン、及びカルジオトロフィン様サイトカイン因子１（新しいニューロトロフィン１及びＢ細胞刺激因子−３としても公知）、及びＩＬ−６の２つのウイルス類似体を含む。サイトカインのインターロイキン６ファミリーのこれらのメンバーは、ＬＩＦについて開示したのと同等の濃度で本明細書に開示の組成物に使用することができる。
【００２６】
２．小分子
本明細書に開示の化学カクテルは、単独で又はタンパク質と組み合わせて２０００ダルトンより小さい、より好ましくは１５００ダルトンより小さい、最も好ましくは１０００ダルトンより小さい分子量を有する、有効量の小分子を含む。小分子は、９００ダルトンより小さい又は等しい、若しくは５００ダルトンより小さい又は等しい分子量を有し得る。より大きな分子は、化学的に誘導する再プログラミング、好ましくは本明細書で同定した小分子と同じ経路の標的化において使用することができる。
【００２７】
（ｉ）ＥＲＫ１／２阻害剤
好ましいＥＲＫ１／２阻害剤は、０．１〜５μＭ、好ましくは０．５と３の間、さらにより好ましくは１．５と１μＭの間の濃度範囲のＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド）である。例えば、カクテルは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５μＭの濃度でＰＤ０３２５９０１を含むことができる。しかし、他の有用な阻害剤は、限定されないが、ＰＤ１９８３０６（Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４，５−トリフルオロ−２−［（４−ヨード−２−メチルフェニル）アミノ］−ベンズアミド）；ＳＬ３２７（α−［アミノ［（４−アミノフェニル）チオ］メチレン］−２−（トリフルオロメチル）ベンゼンアセトニトリル）；及びＵ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン）を含む。
【００２８】
（ｉｉ）ＧＳＫ阻害剤
ＧＳＫ阻害剤は好ましくはＧＳＫ３を阻害し、好ましくはＧＳＫ３に選択的である。好適なＧＳＫ阻害剤は、アミノピリミジン、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１である。ＣＩＮＰ組成物は、０．０１〜２０μＭ、好ましくは１と３μＭの間、さらにより好ましくは１．５と３μＭの間の濃度範囲でＣＨＩＲ９９０２１を含む。例えば、ＣＩＮＰは、０．０１、０．０５、０．１、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、１０、２０μＭの濃度でＣＨＩＲ９９０２１を含み得る。当業者が必要な有効量に容易に合わせることができるように、これらの数値の間にある濃度を熟慮した。
【００２９】
しかし、他のＧＳＫ阻害剤が市販されており、本明細書に開示の組成物に使用することができる。例としては、限定されないが、ＢＩＯ−アセトキシム；ＧＳＫ  ３Ｉ阻害剤ＸＶ；ＳＢ−２１６７６３；ＣＨＩＲ９９０２１のヒドロクロリド塩であるＣＨＩＲ９９０２１トリヒドロクロリド；ＧＳＫ−３阻害剤ＩＸ［（（２Ｚ，３Ｅ）−６’−ブロモ−３−（ヒドロキシイミノ）−［２，３’−ビインドリニリデン］−２’−オン］；ＧＳＫ  ３ＩＸ［６−ブロモインジルビン−３’−オキシム］；ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＩ［３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］フェノール］；ＧＳＫ−３阻害剤ＸＶＩ［６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチル−アミノ）−ニコチノニトリル］；ＳＢ−４１５２８６［３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン］；及びＢｉｏ［（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム］が挙げられる。
【００３０】
非ナイーブ型細胞をＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと再プログラミングするためのカクテルに含むことができる有用な化合物の非限定的なリストを、それらの構造を含む表１に提供する。
【表１】
2017529876.tif 000002
2017529876.tif 000003
2017529876.tif 000004
【００３１】
（ｉｉｉ）ＪＮＫ阻害剤
好ましいＪＮＫ阻害剤は、１と１００μＭの間、好ましくは１〜５０μＭ、及びさらにより好ましくは１〜３０μＭの濃度範囲のＳＰ６００１２５（アントラ［１−９−ｃｄ］ピラゾール−６（２Ｈ）−オン）である。例えば、組成物のカクテルは、５、１０、１５、２０、２５、又は３０μＭのＳＰ６００１２５を含み得る。当業者が必要な有効量に容易に合わせることができるように、これらの数値の間にある濃度を熟慮した。
【００３２】
他の有用なＪＮＫ阻害剤は、限定されないが、ＢＩ  ７８Ｄ３（４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−２，４−ジヒドロ−５−［（５−ニトロ−２−チアゾリル）チオ］−３Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−オン）；ＣＥＰ  １３４７（（９Ｓ，１０Ｒ，１２Ｒ）−５−１６−ビス［（エチルチオ）メチル］−２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−ヒドロキシ−９−メチル−１−オキソ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１０−カルボン酸メチルエステル）；及びＳＵ  ３３２７（−［（５−ニトロ−２−チアゾリル）チオ］−１，３，４チアジアゾール−２−アミン）；ＡＥＧ３４８２（６−フェニルイミダゾ［２，１−ｂ］−１，３，４−チアジアゾール−２−スルホンアミド）を含む。
【００３３】
（ｉｖ）ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤
好ましいｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤は、１と１００μＭの間、好ましくは１〜５０μＭ、及びさらにより好ましくは１〜３０μＭの濃度範囲で使用されるＳＢ２０３５８０（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルフォニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン）である。例えば、組成物のカクテルは５、１０、１５、２０、２５、又は３０μＭのＳＢ２０３５８０を含み得る。他の有用なｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤は、限定されないが、ＳＢ  ２０３５８０塩酸塩（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルフォニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン塩酸塩）；ＳＢ２０２１９０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］フェノール）；ＤＢＭ  １２８５二塩酸塩（Ｎ−シクロプロピル−４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ピペリジニル）−５−チアゾリル］−２−ピリミジンアミン二塩酸塩）；ＳＢ  ２３９０６３（トランス−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール）；ＳＫＦ  ８６００２二塩酸塩（６−（４−フルオロフェニル）−２，３−ジヒドロ−５−（４−ピリジニル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール二塩酸塩）を含む。
【００３４】
３．タンパク質因子
組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などのタンパク質因子は、非ナイーブ型ＰＳＣをＴＳＩナイーブ型ＰＳＣに変換するためのプロトコールにおいて有効であることが実証されている。ｂＦＧＦは、１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。使用することができる他の因子はＦＧＦ１〜１８を含む。
【００３５】
Ｂ．誘導される細胞（ドナー細胞）
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、サルなど、例えば、アカゲザル、チンパンジー、ゴリラ、ヒヒなどの非ヒト霊長類から、いくつかの実施形態において得た多能性細胞、又は部分的に若しくは完全に分化した細胞を誘導／再プログラミングすることによって得た。他の実施形態では、しかしながら、誘導／再プログラムされた細胞はヒトから得られる。供給源は骨髄、線維芽細胞、胎児組織（例えば、胎児肝臓組織）、末梢血、臍帯血、膵臓、皮膚又は任意の臓器若しくは組織を含む。
【００３６】
好ましい実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、多能性細胞、例えば胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られる。ｉＰＳＣ誘導細胞は、遺伝子工学及び／又は純粋な化学的再プログラミングによって得られる。他の実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、胚盤胞から得られる。
【００３７】
ｉＰＳＣは化学的に誘導した線維芽細胞、組織脂肪幹細胞、神経幹細胞又は腸上皮由来の細胞から得られることが好ましい。いくつかの実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、化学的に誘導した新生児（例えば包皮）又は成人線維芽細胞から得られる。しかしながら、ｉＰＳＣは、限定されないが、多能性幹細胞、血液起源の細胞、胚起源の細胞、皮膚由来細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、実質細胞、神経系の細胞、及び結合組織細胞を含む、他の細胞型から得ることができる。
【００３８】
本明細書に開示の方法において使用することができる多能性細胞は、当技術分野で公知であり、記載されており、培養細胞を維持する方法を含む。
【００３９】
ドナー細胞は、適当な臓器又は組織を脱凝集することにより単離でき、当業者に公知の技術を使用する細胞源として寄与する。例えば、組織又は臓器は、機械的に脱凝集及び／又は消化酵素及び／又は隣接する細胞間の結合を弱めるキレート剤で処置することができ、組織は明らかな細胞破砕なく個々の細胞の懸濁液を形成するために分散することができる。酵素の解離は、組織を刻むステップ及び刻んだ組織をトリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、及び／又はヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ、ディスパーゼなどのうちの１つ又は複数の酵素で処置するステップによって達成することができる。機械的な破壊も、限定されないが、粉砕機、ブレンダー、ふるい、ホモジナイザー、圧力セル、又はインソネーター（ｉｎｓｏｎａｔｏｒ）の使用を含む、多くの方法によって達成することができる。
【００４０】
Ｃ．ＴＧＦ−β−シグナル伝達非依存性（ＴＳＩ）ナイーブ型ＰＳＣ
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、（ｉ）形態学的に、（ｉｉ）機能的に、特徴：（ａ）ＴＧＦβ１非依存性の多能性の維持（ＴＧＦβ１受容体阻害剤の存在下で対照と比較したＴＲＡ−１−８１−陽性細胞の割合の倍数変化によって測定した場合）；（ｂ）３つの胚葉の組織へと分化する細胞の能力；（ｃ）ＰＲＤＭ１４、ＫＬＦ５、ＺＦＰ４２（ＲＥＸ１）、ＬＩＦＲ、ＴＢＸ３、及びＮＡＮＯＧなどのうちの１つ又は複数のナイーブ型状態関連転写産物の発現の上方制御、（ｄ）ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＳＳＥＡ−４などのうちの１つ又は複数の多能性マーカーの発現の上方制御；（ｅ）ＳＳＥＡ−１などのうちの１つ又は複数の多能性マーカーの発現の下方制御；（ｆ）ｉｎ  ｖｉｖｏで種間キメラを形成する能力に基づいて同定することができる。
【００４１】
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣはドーム形状コロニーを形成する。したがって、ドーム形状コロニーの形成は、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを同定し、続いて本明細書に例示するように細胞培養することができる。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、当技術分野で公知の方法を使用して３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉のそれぞれから１つ又は複数の細胞／組織へと分化する能力を有する。
【００４２】
外胚葉は胚の外側の層を生成し、胚のエピブラストから形成する。外胚葉は表面の外胚葉、神経冠、及び神経管へと発生する。表面の外胚葉は、表皮、毛髪、爪、目のレンズ、皮脂腺、角膜、歯のエナメル、口及び鼻の上皮を発生する。外胚葉の神経冠は、末梢神経系、副腎髄質、メラニン形成細胞、顔の軟骨組織へと発生する。外胚葉の神経管は、脳、脊髄、下垂体後葉、運動神経、及び網膜へと発生する。
【００４３】
内胚葉はまず、扁平な細胞からなり、次いで円柱状になる。内胚葉は、口及び咽頭の一部並びに直腸の末端部分を除く消化管全体の上皮内層を形成する（外胚葉の退行によって裏打ちされる）。内胚葉はまた、肝臓及び膵臓のもの；耳管及び鼓膜の上皮；気管、気管支、及び肺の気室；膀胱及び尿道の部分；並びに甲状腺及び胸腺の濾胞内膜を含む消化管へ開く全ての腺の表層細胞も形成する。内胚葉は：胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱、気管の上皮部分、肺、咽頭、甲状腺、副甲状腺、及び腸を形成する。
【００４４】
中胚葉は、結合組織、筋肉（平滑及び横紋）、リンパ系、骨、漿膜、軟骨組織、脂肪組織、循環系、真皮、泌尿生殖器系、及び脊索を形成する。
【００４５】
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、未処置の相当するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養細胞又は他のＰＳＣとは、ＴＧＦβ１非依存性の多能性を維持する能力（ＴＧＦβ１受容体阻害剤の存在下で対照と比較したＴＲＡ−１−８１−陽性細胞の割合の倍数変化によって測定した場合）において、さらに区別することができる。例えば、他のＰＳＣとは対照的に、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣはＴＧＦβ１受容体阻害剤の存在下で少なくとも５日間培養後、多能性を維持することができる。ナイーブ型ＰＳＣのＴＧＦβシグナル伝達非依存性を決定する例は、「細胞培養」で提供される。簡潔に言うと、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、最適化した変換培地でのアカゲザルのナイーブ型ｉＰＳＣ培養に関して本明細書に開示のように培養される。最適化した変換培地は、補充培地にＴＧＦβ１受容体阻害剤、及びＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを捕い、実施例に記載のようにＴＲＡ−１−８１−陽性細胞を同定し、ＴＧＦβ１受容体阻害剤を捕わずに同様に培養したＴＳＩナイーブ型ＰＳＣと比較することができる。ナイーブ型細胞は、このアッセイにおいて対照と比較した場合、すなわち、ＴＲＡ−１−８１−陽性細胞が２倍より多く減少し、ナイーブ型ＰＳＣが本明細書に定義したようにＴＳＩナイーブ型ＰＳＣとして特徴づけられない場合、５０％より少ない、好ましくは４０％、３０％、２０％、１０％、５％若しくはそれ以下より少ないＴＲＡ−１−８１−陽性細胞の減少に基づいてＴＳＩナイーブ型ＰＳＣとして特徴づけられる。或いは、又はさらに、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、明白な分化及び未処置対照と比較した場合の処置した細胞から得られたコロニーにおけるＴＲＡ−１−８１発現の減少によって測定したように、Ｒｈｏ−関連の選択的阻害剤、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）、例えばＹ２７６３２［（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド＋＋＋二塩酸塩）］（１０μＭ）及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、例えばＧＯ６９８３［３−［１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン］（５μＭ）の存在下で多能性を維持することができない点で他のＰＳＣとは区別することができる。
【００４６】
ＩＩＩ．作製方法
Ａ．非ＰＳＣのＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへの再プログラミング
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、誘導／再プログラムされる細胞（本明細書ではドナー細胞）を本明細書に開示の化合物のカクテルを含有する培養培地に、細胞のＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへの再プログラミングをもたらすのに十分な期間接触させることにより産生される。
【００４７】
ドナー細胞は、細胞のＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへの再プログラミングを誘導及び／又は増強するのに有効な量で本明細書に開示のカクテルと接触する。当業者は、以下の例に概説した方法、又は当業者に公知の他の方法を使用することによって、完全な再プログラミングを提供するのに必要な本明細書に開示の化合物の濃度を容易に決定できる。好ましい実施形態では、ドナーは多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ｉＰＳＣは、遺伝子工学及び／又は純粋な化学的再プログラミングによって得られる細胞を含む。他の実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは胚盤胞（ｂｌａｃｔｏｃｙｔ）から得られる。
【００４８】
ドナー細胞が線維芽細胞などの多能性幹細胞ではない実施形態では、ドナー細胞はＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへの再プログラミングの前に、プライム型誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へと変換することができる。或いは、細胞は直接ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと変換することができる。非多能性幹細胞を誘導多能性幹細胞へと変換する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：５８７〜５９０（２００８）；Ｚｈａｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：４７５〜４７９（２００８）、Ｏｋｉｔａら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８：４０９〜４１２（２０１１））に記載されている。ｉＰＳＣは、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへの再プログラミング前２０〜４０日の間、好ましくは２５〜３５日の間の期間、ｉＰＳＣ用の培養培地で維持され（先に記載したように）、多能性の誘導へと続く（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：５８７〜５９０（２００８）；Ｚｈａｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：４７５〜４７９（２００８）、Ｏｋｉｔａら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８：４０９〜４１２（２０１１））。例えば、Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：５８７〜５９０（２００８）に記載のように、レトロウイルス因子含有再プログラミング因子（ＯＣＴ４、ＫＬ４）での線維芽細胞への形質導入後、そのように生成されたｉＰＳＣは実施例に記載のように、小分子を捕った幹細胞培養培地で、培地を２日ごとに交換しながら培養する。ｉＰＳＣコロニーは、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへの再プログラミングのためおよそ２０〜４０日、好ましくはおよそ２５〜３５日で選択し、ｉＰＳ用の培養条件下でフィーダー細胞上で維持する。ｉＰＳＣをＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと再プログラムするため、プライム型ｉＰＳＣを４と１４日の間、好ましくは７〜１０日の間の期間、最初は本明細書に開示の化合物のカクテルで培養する。
【００４９】
非多能性幹細胞上で直接変換、例えば、線維芽細胞をＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへ変換するため、細胞に、例えばＬｉｕら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、３：５８７〜５９０（２００８）に記載のように再プログラミング因子を含有するレトロウイルスベクターを感染させ、１５〜３５日、好ましくは１５と２０日の間、より好ましくは２０日間の範囲の期間、基礎培地（ＤＦ１２、２０％ＫＳＲ、塩基性線維芽細胞成長因子）で維持する。次いで、細胞培養培地を、７〜１０日の期間、非ナイーブ型ＰＳＣをＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと再プログラミングするための因子のカクテルを含有する細胞培養培地に交換する。
【００５０】
好ましい実施形態では、細胞をＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと再プログラミングするための細胞培養培地は、ＰＫＣ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ、ＮＯＴＣＨ阻害剤、ＴＧＦＲ阻害剤又はＦＧＦＲ阻害剤を含まない。化合物のカクテルはＴＧＦβを含まないことがより好ましい。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを単離し、それらの生成に使用する同じ化合物のカクテルを含む好適な幹細胞培養培地でナイーブ型状態に維持する。
【００５１】
生じた細胞は、（ｉ）形態学的に、（ｉｉ）機能的に、特徴：（ａ）例えば、本明細書に開示のように測定したＴＧＦβ１非依存性の多能性の維持（ＴＧＦβ１受容体阻害剤の存在下で対照と比較したＴＲＡ−１−８１−陽性細胞の割合の倍数変化によって測定した場合）；（ｂ）３つの胚葉の組織へと分化する細胞の能力；（ｃ）ＰＲＤＭ１４、ＫＬＦ５、ＺＦＰ４２（ＲＥＸ１）、ＬＩＦＲ、ＴＢＸ３、及びＮＡＮＯＧなどのうちの１つ又は複数のナイーブ型状態関連転写産物の発現の上方制御、（ｄ）ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＳＳＥＡ−４などのうちの１つ又は複数の多能性マーカーの発現の上方制御；（ｅ）ＳＳＥＡ−１など１つ又は複数の多能性マーカーの下方制御；（ｆ）ｉｎ  ｖｉｖｏで種間キメラを形成する能力に基づいて、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣとして同定される。
【００５２】
Ｂ．ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣの単離
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣの実質的に精製した集団は、例えば培養供給源からの抽出（例えば、密度勾配遠心及び／又はフローサイトメトリーを介して）により得ることができる。純度は任意の適切な方法によって測定できる。多能性細胞は、例えばフローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ分析）により、９９％〜１００％精製できる。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、例えば誘導多能性幹細胞のマーカー又はマーカーの組合せと結合する分子（例えば抗体、抗体誘導体、リガンド又はＦｃ−ペプチド融合分子）を使用し、それにより分子を結合する細胞をポジティブに選択すること（すなわち、ポジティブ選択）により単離できる。ポジティブ選択の方法の他の例は、所望の及び所望ではない細胞型の混合集合において所望の細胞型の成長を優先的に促進する方法を含む。或いは、所望の細胞型に存在しないが、所望ではない細胞型には存在するマーカーに結合する分子を使用することにより、そのようなマーカーを含有する所望ではない細胞は所望の細胞から除去することができる（すなわち、ネガティブ選択）。他のネガティブ選択の方法は、所望の及び所望ではない細胞型の混合集団において、所望ではない細胞型を優先的に死滅させ又は成長を阻害することを含む。したがって、ネガティブ選択、ポジティブ選択、又はそれらの組合せを使用することにより、幹細胞の濃縮集団を作製できる。
【００５３】
分離の手順は、抗体でコートした磁気ビーズ、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した細胞毒性剤、若しくはモノクローナル抗体と併せて使用したそのような薬剤、例えば補体及び細胞毒、並びに固体マトリックス（例えばプレート）に結合した抗体による「パニング」、又は他の便利な技術を使用する磁気分離を含み得る。精密な分離を提供する技術は、洗練の様々な程度、例えば、複数のカラーチャンネル、低角及び鈍角光散乱検出チャンネル（ｌｏｗ  ａｎｇｌｅ  ａｎｄ  ｏｂｔｕｓｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｃｈａｎｎｅｌ）、及びインピーダンスチャンネルを有し得る蛍光活性化細胞ソーターを含む。抗体は、直接分離を可能にする磁気ビーズ、支持体に結合するアビジン又はストレプトアビジンにより除去することができるビオチン、又は蛍光活性化細胞ソーターで使用することができる蛍光色素など、マーカーと結合し、特定の細胞型の分離を容易にし得る。誘導多能性幹細胞の生存能力に過度に有害ではない任意の技術が用いられ得る。一実施形態では、細胞は、マーカーに対する抗体（例えば、ＴＲＡ−１−８１抗体）とインキュベートし、マーカーに対してポジティブに染色された細胞を手動で選択し、継代培養した。
【００５４】
濃縮方法の組合せは、精製若しくは濃縮の時間又は効率を改善するために使用され得る。例えば、対象の細胞型を示さないマーカーを有する細胞を除去する濃縮工程後、細胞は、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）若しくは高い特異性を有する他の方法論によりさらに分離又は濃縮し得る。マルチカラー分析はＦＡＣＳと用いられ得る。細胞は、特定の抗原又はその欠損に関する染色のレベルに基づいて分離され得る。蛍光色素は、特定の抗原に特異的な抗体を標識するために使用され得る。そのような蛍光色素は、フィコビリンタンパク質、例えば、フィコエリスリン及びアロフィコシアニン、フルオレセイン、及びテキサスレッドを含む。
【００５５】
Ｃ．ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ（及びそれらの子孫）の培養及び保存
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、培養で増やし、後の回復及び使用のために保存することができる。細胞の培養又は幹細胞の混合培養が確立されると、組織の形成あり又はなしで、細胞増殖を招く条件下で細胞密度を示すように新しい培地に継代することにより、細胞の集団はｉｎ  ｖｉｔｒｏで有糸分裂的に増える。そのような培養方法は、例えば、分化を誘導する特定の成長因子（例えば、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ及び／又は他の成長因子）を欠く培養培地で細胞を継代することを含むことができる。培養細胞は、十分な細胞密度に達した場合、新しい培地に移すことができる。
【００５６】
好ましい実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを維持するための細胞培養培地は、例えば、ナイーブ型多能性の誘導に使用する、つまり本明細書に開示の化合物のカクテルを、非ナイーブ型多能性細胞をＴＳＩナイーブ型ＰＳＣへと再プログラムし、細胞をナイーブ型状態に維持するのに使用するのと同じ濃度の、本明細書に開示の化合物のカクテルを捕ったＮ２Ｂ２７培地である。例えば、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを維持するための細胞培養培地は、Ｎ２Ｂ２７培地（ＢＳＡなし）、５％ＫＳＲ（ノックアウト血清代替物）を捕ったＮ２Ｂ２７培地（ＢＳＡなし）であり得る。他の基本培地、例えば、２０％ＫＳＲを捕ったＤＦ１２培地を使用することもできる。これらの基本培地は、上記のように化合物のカクテルを捕う。本発明のいくつかの実施形態に従って、本明細書に開示の有効量の化合物のカクテルを含む細胞培養培地は、培養の２〜１００回を超える継代にわたりＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを未分化及びナイーブ型状態に維持することができる。例えば、カクテルは、培養の２回の継代、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回の継代、好ましくは１０回より多い継代、例えば培養の約２０回の継代、例えば、培養中少なくとも約２５回、約３０回、約３５回、約４０回、約４５回、約５０回、約５５回、約６０回、約６５回、約７０回、約７５回、及び約８０回の継代の間、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを未分化及びナイーブ型状態に維持することができる。好ましい実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、１０回より多く、例えば培養の約２０回の継代、例えば、培養中少なくとも約２５回、約３０回、約３５回、約４０回、約４５回、約５０回、約５５回、約６０回、約６５回、約７０回、約７５回、及び約８０回の継代の間、正常な核型を維持する。本明細書で例示するように、開示する化合物のカクテルは、単一細胞を継代した正常な核型のＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを培養で少なくとも８ヵ月間維持できる。
【００５７】
細胞は、Ｄｏｙｌｅら、（ｅｄｓ．）、１９９５、Ｃｅｌｌ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒに記載されるものなど、公知の方法に従って、保管のため凍結保存することができる。例えば、細胞は、１５〜２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、（５〜１０％グリセロールあり又はなし）を含有する培養培地など、「凍結培地」に、例えば約４〜１０×１０６個の細胞／ｍｌの密度で懸濁することができる。細胞をガラス又はプラスチックバイアルに分注し、次いでそれを密封し、プラグラム制御できる又は受動的な冷凍機の凍結チャンバーに移した。凍結の最適な速さは、経験的に決定し得る。例えば、融解熱による−１℃／分の温度変化を与える凍結プログラムを使用し得る。細胞を含有するバイアルが−８０℃に達すると、それらは液体窒素保管場所に移される。凍結保存細胞は１年間保存できる。
【００５８】
ＩＶ．使用方法
所望の細胞型又は形態を生じることができる容易に入手可能な幹細胞源の同定は、治療処置、組織工学及び研究に重要である。幹細胞の入手可能性は、移植、組織工学、血管新生の制御、脈管形成、臓器再生、動物モデル、細胞置換、又は細胞治療、並びに疾患の予防などに非常に有用である。そのような幹細胞は、遺伝子治療レジメンの一部として対象に遺伝子を導入するために使用することもできる。
【００５９】
Ａ．分化した体細胞の提供（再分化した細胞）
いったん確立されると、幹細胞の培養は、子孫細胞、例えば、新しい組織を産生することができる線維芽細胞を産生するのに使用され得る。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、例えば、上皮細胞、角化細胞、メラニン形成細胞、脂肪細胞を含む皮膚及び毛髪細胞、例えば筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、胚胞細胞などの骨、筋肉及び結合組織を形成する細胞、例えば肝細胞、腎臓細胞、副腎細胞、及び島細胞などの実質細胞、血液細胞、網膜細胞（及び、耳の毛髪細胞、又は舌の味覚突起を形成するものなど感覚認知に含まれる他の細胞）並びに神経を含む神経組織など、３つの胚葉のいずれかの細胞へと分化誘導され得る。
【００６０】
一実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、「外胚葉分化」培地に細胞を曝露することにより、外胚葉起源の細胞へと分化誘導される。別の実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、「中胚葉分化培地」に細胞を曝露することにより、中胚葉起源の細胞へと分化誘導される。さらに別の実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、「内胚葉培地」に細胞を曝露することにより、内胚葉起源の細胞へと分化誘導される。「内胚葉」、「中胚葉」、及び「外胚葉」培地の成分は、当業者に公知である。公知の細胞表面マーカーは、細胞が、細胞培養培地と一致する系列の細胞へと確かに分化することを確認するために使用できる。３つの胚葉の分化を確かめる最も一般的な許容されるマーカーは、内胚葉細胞に関してはアルファ胎児性タンパク質、中胚葉に関してはアルファ平滑筋アクチン、外胚葉に関してはベータ−ＩＩＩチューブリンの発現であり、これら全ては、これらの組織の発生の非常に初期に通常発現する。
【００６１】
幹細胞の線維芽細胞又は他の細胞型への分化、続いてそれらからの組織の産生は、特定の細胞外成長因子によって、又は幹細胞培養の培養条件（例えば、密度）の変更によって引き起こされ得る。所望の細胞型の細胞へと細胞の分化を誘導するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、細胞の環境に物質（例えば、成長因子、酵素、ホルモン又は他のシグナル分子）を添加することにより分化誘導され得る。分化の誘導に使用され得る因子の例としては、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、又はＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、例えばＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、又は造血幹細胞因子（Ｓｔｌ）が挙げられ、組織コミット細胞又は他の系列コミット細胞型との共培養は、幹細胞を特定の系列にコミットするように誘導する。
【００６２】
再分化した細胞は、培養で増やし、後に回復及び使用するために保管することができる。
【００６３】
Ｂ．細胞治療
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣの治療用途は、誘導多能性幹細胞、幹細胞集団、又はそれらの子孫を個体に移植し、がん、傷、腫瘍、傷害、ウイルス感染、糖尿病などから生じる疾患及び障害を含む様々な病理を処置することを含む。処置は、現在当技術分野で公知の任意の方法に従って、新しい組織を産生する細胞の使用、及びそのように産生された組織の使用を必要とすることがある。細胞は、移植、注入、又はそうでなければ組織損傷部位に直接投与することができ、それによりｉｎ  ｖｉｖｏで新しい組織が産生される。一実施形態では、投与は、遺伝的に改変したＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ又はそれらの子孫の投与を含む。
【００６４】
好ましい実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは自家細胞から得られ、すなわちドナー細胞は自家性である。しかし、細胞は異種細胞から得ることができる。一実施形態では、ドナー細胞は、レシピエントに遺伝的に関連するドナーから得られる。別の実施形態では、ドナー細胞はレシピエントに遺伝的に関連しないドナーから得られる。
【００６５】
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣが、レシピエント対象と比較して異種の（非自家性／同種）供給源に由来する場合、例えば免疫抑制剤シクロスポリン又はＦＫ５０６の投与など付随する免疫抑制療法が典型的には与えられる。しかし、ヒト誘導多能性幹細胞の未熟な状態により、そのような免疫抑制療法が必要ではない場合がある。したがって、一実施形態では、ヒト誘導多能性幹細胞は、免疫調節（例えば免疫抑制）療法の不在下でレシピエントに投与することができる。或いは、細胞は膜にカプセル化することができ、液体の交換を可能にするが、細胞／細胞接触を防ぐ。マイクロカプセル化細胞の移植は当技術分野で公知である。例えばＢａｌｌａｄｕｒら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、１１７：１８９〜９４、１９９５；及びＤｉｘｉｔら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１：２７５〜７９（１９９２）。
【００６６】
（ｉ）糖尿病
糖尿病（ＤＭ）は、膵臓が十分なインシュリンを産生しないため又は細胞が産生されるインシュリンに応答しないためのいずれかで、患者が高血糖である代謝疾患のグループである。インシュリン治療の有望な代替え案は、インシュリンが必要な患者への島細胞の供給である。Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３４３（４）：２３０〜８（２０００）は、ベータ細胞／島の移植は、糖尿病を有する患者に治療を提供することを実証した。多くのインシュリン型が市販されているが、これらの製剤は注射可能なように提供される。ヒト誘導多能性幹細胞は、糖尿病を予防又は治療するための島細胞の代替供給源を提供する。例えば、誘導多能性幹細胞は、単離され、膵臓細胞型へと分化し、対象に送達することができる。或いは、誘導多能性幹細胞は、対象の膵臓へと送達され、ｉｎ  ｖｉｖｏで島細胞へと分化することができる。したがって、細胞は、糖尿病の発症を予防又は治療するための移植に有用である。膵臓の島細胞の生存能力及び効能に影響を及ぼすことなくサイトカイン曝露後に炎症を減少する方法は、例えば、Ｎａｚｉｒｕｄｄｉｎらの米国特許第８６３７４９４号に開示される。
【００６７】
（ｉｉ）神経変性疾患
神経変性疾患は、外傷性又は虚血性脊髄損傷又は脳損傷など、疾患、遺伝性疾患又は損傷の結果として神経細胞の変性を含む状態により特徴づけられる。神経変性状態は、神経細胞の損傷又は変性を含む、任意の疾患又は障害又は症状又はそれらの原因若しくは効果を含む。神経変性状態は、限定されないが、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、カナバン病、コカイン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体病、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ニーマン・ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、脊髄癆、又は損傷した神経細胞と関連する任意の他の状態を含み得る。他の神経変性状態は、外傷性脊髄損傷、虚血性脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷、及び遺伝性疾患を含む又はそれによって引き起こされ得る。
【００６８】
特に、開示する方法は、細胞が神経変性状態を改善できるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やしたＮＳＣ、神経前駆細胞、又は神経前駆体を、それを必要とする対象に移植することを含む。増やした神経幹細胞の移植は、痙攣、硬直、発作、麻痺、又は任意の他の筋肉の運動亢進の症状を伴う様々な形態の脊髄症を患う対象において、歩行機能を改善するために使用することができる。異なる神経変性状態の治療のために神経細胞及び神経子孫細胞を増やす並びに移植する方法が、例えばＪｏｈｅらの米国特許第８２３６２９９号に開示されている。
【００６９】
（ｉｖ）がん治療
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ及びそれらの子孫の治療用途は、誘導多能性幹細胞、幹細胞集団、又それらの子孫を個体へと移植し、がんに関連する症状を処置及び／又は改善することを含む。例えば、一実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、患者の細胞を死滅、減少、又は損傷する化学療法を受けたがん患者に投与することができる。がんの典型的な幹細胞移植では、しばしば放射線療法と共に、非常に高用量の化学療法が使用され、全てのがん細胞を破壊することを試みる。この治療はまた、骨髄の幹細胞も死滅させる。治療後すぐに、幹細胞を与え、破壊されたものと置換する。
【００７０】
別の実施形態では、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、少なくとも１つのさらなる治療因子で形質導入又は形質転換することができる（脱分化因子に加えて）。例えば、いったんＴＳＩナイーブ型ＰＳＣが単離されると、細胞は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換され、次いで対象に移植又は投与することができ、又は所望の細胞型に分化し、対象に移植及び送達することができる。そのような条件下で、ポリヌクレオチドはポリペプチド産物の送達のため対象内で発現される。
【００７１】
（ｖ）組織工学
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ及びそれらの子孫は、当技術分野で公知の方法を使用して、組織工学構築物を作製するために使用され得る。組織工学構築物は、損傷した臓器又は組織の修復又は置換のための人工器官として含む様々な目的のために使用され得る。それらは、構築物の細胞によって分泌されるタンパク質若しくは他の分子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達系又は一般の薬物送達系としても機能し得る。組織工学構築物は、組織機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして又は様々な治療若しくは医薬の効果を試験するためのモデルとしての用途も見出される。最も一般的に使用される幹細胞の移植のための生体材料の足場は、Ｗｉｌｌｅｒｔｈ，Ｓ．Ｍ．及びＳａｋｉｙａｍａ−Ｅｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．、Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｊｕｌｙ  ０９、２００８）、ＳｔｅｍＢｏｏｋ，ｅｄ．Ｔｈｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ、ＳｔｅｍＢｏｏｋで概説されている。組織工学技術はしばしば、組織の成長を維持及び促進する適切な培養基質の選択を含む。一般に、これらの基質は三次元であり、対象の組織の所望の形状の足場を形成するために加工可能である。
【００７２】
米国特許第６９６２８１４号は、一般に組織工学構築物及び操作した天然の組織を産生するための方法を開示する。特定の例に関して、Ｖａｃａｎｔｉらの米国特許第７９１４５７９号は、組織工学の靭帯及び腱を開示する。米国特許第５７１６４０４号は、重合体マトリックスと組み合わせて移植した解離した筋肉細胞を使用する胸部組織の再構築又は増加のための方法及び組成物を開示する。米国特許第８７２８４９５号は、自家皮膚線維芽細胞を使用する軟骨組織の修復を開示する。Ｄｕａｉｌｉｂｉらによる米国特許出願公開第２００９００２９３２２号は、歯の代替物の作製に使用するための歯組織を形成するための幹細胞の使用を開示する。米国特許出願公開第２００６／００１９３２６号は、頭蓋内動脈瘤の治療のための細胞シード組織工学ポリマーを開示する。Ａｔａｌａによる米国特許出願公開第２００７／００５９２９３号は、損傷した臓器、例えば腎臓、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、膀胱、尿管、及び尿道と置換するために使用することができる組織工学構築物（及びそのような構築物を作製する方法）を開示する。
【００７３】
（ｖｉ）ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣから産生される細胞（子孫）
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、例えば上皮細胞、角化細胞、メラニン形成細胞、脂肪細胞を含む皮膚及び毛髪細胞、例えば筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、胚胞細胞などの骨、筋肉及び結合組織を形成する細胞、例えば幹細胞、腎臓細胞、副腎細胞、及び島細胞（例えば、アルファ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、及びベータ細胞）などの実質細胞、血液細胞（例えば、白血球、赤血球、マクロファージ、及びリンパ球）、網膜細胞（及び、耳の毛髪細胞又は舌の味覚突起を形成するものなど感覚認知に含まれる他の細胞）並びに神経を含む神経組織など、３つの胚葉のいずれかの細胞へと分化誘導され得る。
【００７４】
（ｖｉｉ）治療用組成物
ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、投与、送達、又は対象、組織若しくは細胞と接触するために製剤化し、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏで脱分化を促進することができる。さらなる因子、例えば成長因子、分化若しくは脱分化を誘導する他の因子、分泌産物、免疫調節剤、抗炎症剤、退行因子（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、神経支配、血管新生を促進する生物学的に活性な化合物又はリンパ性ネットワークの増強、及び薬物を組込むことができる。
【００７５】
誘導多能性細胞は、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣの集団若しくはＴＳＩナイーブ型ＰＳＣ子孫単独で、又は担体若しくは支持体構造上又は内に含む組成物の方法で患者に投与することができる。多くの実施形態では、担体は必要ない。細胞は、細胞が必要な部位上又は内に注射により投与することができる。これらの場合、細胞は、典型的には細胞培養培地を除去するために洗浄され、生理的緩衝液に懸濁される。
【００７６】
他の実施形態では、細胞は支持体構造と提供される、又は支持体上若しくは内に組込まれる。支持体構造は、メッシュ、固体支持体、足場、管、多孔質構造、及び／又はヒドロゲルであってよい。支持体構造は、全体又は部分的に生分解性又は非生分解性であってよい。支持体は、天然若しくは合成ポリマー、チタニウムなどの金属、骨若しくはヒドロキシアパタイト、又はセラミックから形成され得る。天然ポリマーは、コラーゲン、ヒアルロン酸、多糖類、及びグリコサミノグリカンを含む。合成ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びそれらのコポリマーなどのポリヒドロキシ酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリウレタン、ポリカルボン酸、及びポリエステルなどのポリヒドロキシアルカン酸を含む。これらは、移植片、管、メッシュ、又はヒドロゲルの形態であってよい。
【００７７】
固体支持体
支持体構造は目の粗い織布又は不織布メッシュであってよく、細胞はメッシュ内及びメッシュ上に播種される。構造は固体構造支持体を含み得る。支持体は管、例えば神経軸索の再成長のための神経管であってよい。支持体は、ステント又はバルブであってよい。支持体は、膝若しくは腰、又はその部分などの人工関節であってよく、多孔質構造への細胞の内殖及び／又は細胞の播種を可能にする有孔界面を有する。支持体構造の多くの他の型も可能である。例えば、支持体構造はスポンジ、泡、サンゴ、又は内部細孔を有する生体適合性無機構造、又は織り合わせたポリマー繊維のメッシュシートから形成することができる。これらの支持体構造は、公知の方法を使用して調製できる。
【００７８】
支持体構造は、ヒドロゲル−細胞混合物を形成及び支持する細孔状腔又は間隙を有する透水構造であってよい。例えば、支持体構造は、多孔質ポリマーメッシュ、天然若しくは合成スポンジ、又は金属又は骨若しくはヒドロキシアパタイトなどの材料から形成される支持体構造であってよい。支持体構造の多孔性は、栄養分が構造中に拡散でき、それにより効果的に内部の細胞に達し、細胞によって産生される老廃物は構造の外へ拡散できる。
【００７９】
支持体構造は、新しい組織が所望される空間に適合するように形成することができる。例えば、支持体構造は火傷した皮膚の領域の形状又は欠損した軟骨組織若しくは骨の部分に適合するように形成することができる。作製する材料に依存して、支持体構造は、切断、成形、鋳造、又は所望の形状を産生する任意の他の方法によって形成することができる。支持体は、以下に記載するように、支持体構造に細胞が播種され、又は支持体構造がヒドロゲル−細胞混合物で満たされる前若しくは後のいずれかに形成することができる。
【００８０】
好適なポリマーの例は、グリコリド及びラクチドの９０：１０コポリマーであるポリグラクチンであり、ＶＩＣＲＹＬ（商標）組み製の吸収性縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）として製造される。ポリマー繊維（ＶＩＣＲＹＬ（商標）など）は、フェルト状ポリマーシートへと編む又は圧縮することができ、次いで任意の所望の形状に切断できる。或いは、ポリマー繊維は鋳型に一緒に圧縮し、支持体構造に望ましい形状へとそれらを鋳造することができる。いくつかの場合、修正又は繊維メッシュにさらなる構造を付与するために成形されるように、さらなるポリマーをポリマー繊維へと添加することができる。例えば、ポリ乳酸溶液をポリグリコール酸繊維メッシュのこのシートに添加することができ、その組合せが一緒に成形され、多孔質支持体構造を形成することができる。ポリ乳酸はポリグリコール酸繊維の架橋に結合し、それによりこれらの個々の繊維をコーティング及び成形した繊維の形状を固定する。ポリ乳酸はまた、繊維間の空間も満たす。したがって、多孔性は支持体に導入されるポリ乳酸の量によって変わり得る。繊維メッシュを所望の形状に成形するのに必要な圧力は中程度であってよい。必要なのは、繊維が、ポリ乳酸の結合及びコーティング作用が効果を生じるのに十分長く決まった場所に固定されることだけである。
【００８１】
或いは、又はさらに、支持体構造は、当技術分野で公知の技術によって産生されるポリマー繊維若しくはポリマー構造の他の型を含むことができる。例えば、薄いポリマーフィルムはポリマー溶液から溶媒を蒸発させることによって得ることができる。これらのフィルムは、ポリマー溶液が所望の形状のレリーフパターンを有する鋳型から蒸発する場合、所望の形状へと鋳造することができる。ポリマーゲルは当技術分野で公知の圧縮成形技術を使用して、薄い、透水ポリマー構造も成形することができる。
ヒドロゲル
【００８２】
別の実施形態では、細胞をヒドロゲルと混合し、細胞−ヒドロゲル混合物を形成する。ヒドロゲルは、注射若しくはカテーテルによって、又は他の支持体構造の移植時に投与され得る。投与前、中、後に架橋が生じ得る。
【００８３】
Ｄ．動物モデル及び臓器再生
単離したＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣを所望の種（ドナー）から同じ又は異なる種の第二の動物（レシピエント）へと組込む動物モデルを生成するために使用できる。ドナー動物は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オラウータン、サル、マーモセットなどの哺乳動物であってよい。いくつかの好ましい実施形態では、動物モデルを提供するために使用するドナー哺乳動物はヒトであり、レシピエント哺乳動物はヒトではない。他の実施形態では、ドナー及びレシピエント動物はサイズが一致する。レシピエントは、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オラウータン、サル、マーモセット及びボノボなど、ヒト以外の任意の動物であってよい。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、ヒトではない哺乳動物における臓器再生に使用することができ；ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、発生段階の臓器の発生の欠如と関連する異常を有する哺乳動物において所望の臓器を産生するために使用することができる。
【００８４】
方法は、ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣをレシピエント非ヒト哺乳動物の胚盤胞段階の受精卵へと移植するステップ；当技術分野で公知の方法を使用して、同産仔を得るため非ヒト代理親哺乳動物の子宮で受精卵を発生するステップ及び同産仔から臓器を得るステップを含む。産生することができる臓器の例は、限定されないが、腎臓、心臓、膵臓、小脳、肺、甲状腺、毛髪、及び胸腺など、固定した形状を有する固体臓器を含む。レシピエント胚は、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オラウータン、サル、マーモセットなど、ヒト以外の任意の動物由来であってよい。
【００８５】
ヒト化マウスモデルを生成するための方法は、当技術分野で公知であり（米国特許出願公開第２０１１０２５８７１５号）、例えばＩｔｏら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、９：２０８〜２１４（２０１２）に概説されている。対象の臓器の発生と関連する異常を有し、臓器を再生するために使用することができるレシピエント胚の例は、発生段階における腎臓の発生の欠如と関連する異常を有するＳｈａｌｌ１ノックアウト動物（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２８：３１０５〜３１１５（２００１）；発生段階における膵臓の発生の欠如と関連する異常を有するＰｄｘ１ノックアウト動物（Ｏｆｆｉｅｌｄら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２：９８３〜９９５（１９９６）；発生段階における小脳の発生の欠如と関連する異常を有するＷｎｔ−１（ｉｎｔ−１）ノックアウト動物（ＭｃＭａｈｏｎら、Ｃｅｌｌ、６２：１０７３〜１０８５、（１９９０）；発生段階における肺及び甲状腺の発生の欠如と関連する異常を有するＴ／ｅｂｐノックアウト動物（Ｋｉｍｕｒａら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１０：６０〜６９、１９９６）を含み；又は線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体（ＦＧＦＲ）の細胞内ドメインの欠損を過剰発現し、腎臓及び肺などの複数の臓器の欠損を引き起こすドミナントネガティブ型トランスジェニック変異体動物モデル（Ｃｅｌｌｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１７：１６４２〜６５５、（１９９８））を使用できる。或いは、毛髪又は胸腺の産生にヌードマウスが使用できる。米国特許出願公開第２０１１０２５８７１５号に記載の「ファウンダー」動物も使用され得る。
【００８６】
Ｖ．キット
本明細書に開示の化学カクテルを含むキットを提供する。化学カクテルは上記の通りである。これらは、細胞培養培地への添加を促進する定義した濃度を有する形態であってよく、所望の濃度を生じる。キットは、所望の濃度範囲及びドナー細胞型に基づく投与時間を提供する指示書を含み得る。キットはまた、ナイーブ型多能性を誘導するため、ドナー細胞の培養用の化学カクテルと予備混合する細胞培養培地も含み得る。
【００８７】
本発明は以下の非限定的な例を参照してさらに理解される。
【実施例】
【００８８】
実験手順
プライム型ｉＰＳＣからのアカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣの生成
本研究に使用する成体のアカゲザル（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、♯９、♯２、♯１１、及び♯１２）は個々のケージで飼育した。全ての動物の手順は、中国軍医学会の実験動物センターによって承認され、アカゲザルの体細胞の使用は北京大学治験審査委員会によって認可された。線維芽細胞は、アカゲザルの耳の端から単離し、再プログラミン因子ＯＣＴ４及びＫＬＦ４を含有するレトロウイルスベクターを感染させた。小分子を捕った培地は２日ごとに交換した。プライム型ｉＰＳＣコロニーを、ウイルスの形質導入後およそ２５〜３５日で選択し、ヒトＥＳＣ培地で増やした（Ｄ／Ｆ１２＋２０％ノックアウト血清置換［ＫＳＲ］＋４ｎｇ／ｍｌ  ｂＥＧＦ）。ナイーブ型状態の変換のため、プライム型ｉＰＳＣコロニーをアクターゼによって解離し、フィーダー細胞上に再播種した。４ｎｇ／ｍｌ  ｂＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＬＩＦ、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）及びＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）、及びＳＰ６００１２５（１０μＭ）及びＳＢ２０３５８０（１０μＭ）を含む最適化した変換培地は毎日交換した。およそ７〜１０日で、ドーム形状のコロニーを選択し、次いで多能性及び分化の特徴のさらなる分析のため新鮮なフィーダー細胞上に移した。
【００８９】
（ａ）レトロウイルス感染及びアカゲザルプライム型ｉＰＳＣ生成
再プログラミング因子（ＯＣＴ４、ＫＬＦ４）を含有するレトロウイルスベクターは、先の報告に記載された（Ｌｉｕ  Ｈら、２００８）。レトロウイルスの産生、回収、及び感染も、記載されたように実施した（Ｌｉｕ  Ｈら、２００８及びＺｈａｏ，Ｙら、２００８）。小分子ＶＰＡ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６１６４５２（１μＭ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及びトラニルシプロミン（５μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）を捕った培地は２日ごとに交換した。アカゲザルプライム型ｉＰＳＣコロニーを、ウイルスの形質導入後およそ２５日目〜３０日目に選択し、アカゲザルプライム型ｉＰＳＣ用の培養条件下でフィーダー細胞上で維持した。
【００９０】
（ｂ）プライム型ｉＰＳＣからのアカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣの生成
アカゲザルプライム型ｉＰＳＣを、アクターゼによって単一細胞に解離し、フィーダー細胞上に再播種した。４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）及びＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を含む変換培地は、毎日交換した。およそ７日〜１０日目に、ドーム形状のコロニーを選択し、新鮮なフィーダー細胞上に移した。伝統的な２ｉ／ＬＩＦ条件−１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）及びＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）も試験し、陰性対照として提供した。
【００９１】
（ｃ）アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣのための変換条件の最適化
アカゲザルプライム型ｉＰＳＣを、アクターゼによって単一細胞に解離し、フィーダー細胞上に再播種した。４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）及びＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を含む基本培養培地は、毎日交換した。培養条件の最適化のために試験した小分子は、ＳＢ２０３５８０（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、ＳＰ６００１２５（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、Ｙ２７６３２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）及びＧＯ６９８３（５μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）である。８日間の処置後、細胞を固定し、ＴＲＡ−１−８１を免疫染色した。
【００９２】
アカゲザル線維芽細胞からのナイーブ型ｉＰＳＣの直接変換
再プログラミング因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４）を含有するレトロウイルスベクターは、記載された通りである（Ｌｉｕら、２００８）。基本培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ、１５％ＫＳＲ）は、感染後２日ごとに交換した。およそ２０日で、培地を、別の７〜１０日間、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＳＢ２０３５８０（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）及びＳＰ６００１２５（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）を含有する最適化した変換培地に交換した。次いで、ドーム形状のコロニーを選択し、新鮮なフィーダー細胞上に移した。
【００９３】
細胞培養
初代アカゲザル皮膚線維芽細胞を、２歳のアカゲザルの耳の端から単離した。線維芽細胞及び２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養した。Ｔｈｏｍｓｏｎらによって確立された（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ  Ａら、１９９５）アカゲザル胚性幹（ＥＳ）細胞（ＥＳ−７．５）、及びアカゲザルプライム型ｉＰＳＣを培養し、先に記載したように継代した（Ｌｉｕ  Ｈら、２００８）。アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣは、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＳＢ２０３５８０（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）及びＳＰ６００１２５（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）と８５％ノックアウトＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％ノックアウト血清置換（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（１００Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、０．１ｍＭ  ２−ＭＥを含む最適化した変換培地で培養した。アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣは、フィーダー細胞上でアクターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して４日ごとに単一細胞継代した。ＴＳＩナイーブ型ＰＳＣは、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２下、３７℃で、最適化した変換培地で培養し、培地は毎日交換した。
【００９４】
アカゲザルプライム型ｉＰＳＣ及びナイーブ型ｉＰＳＣのシグナル伝達分析
アカゲザルプライム型ｉＰＳＣは記載したように維持した（Ｌｉｕ  Ｈら、２００８）。アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣは、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＳＢ２０３５８０（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）及びＳＰ６００１２５（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）で最適化した培地で維持した。試験したシグナル伝達モジュレーターは、ＳＵ５４０２（２μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、Ｓｔａｔｔｉｃ（１μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）及びＴＧＦ−β１（２ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）である。５日間の処置後、細胞を固定し、ＴＲＡ−１−８１を免疫染色した。
【００９５】
アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）検出及び免疫蛍光法
ＡＬＰ活性を検出するため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で１５分間染色した。免疫蛍光法のため、一次抗体は、ＳＳＥＡ−１（１：５０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＳＳＥＡ−４（１：２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＴＲＡ−１−６０（１：５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＴＲＡ−１−８１（１：５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＮＡＮＯＧ（１：１００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＢＸ３（１：２００、Ａｂｃａｍ）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（１：２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＧＡＴＡ４（１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＯＣＴ４（１：２００、Ａｂｃａｍ）及びＳＯＸ２（１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対するものを含む。二次抗体は、ローダミン標識ロバ抗マウスＩｇＧ（１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ローダミン標識ロバ抗ウサギＩｇＧ（１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ローダミン標識ヤギ抗マウスＩｇＭ（１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びローダミン標識ロバ抗ヤギＩｇＧ（１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である。ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）は核染色のために使用した。
【００９６】
ＲＴ−ＰＣＲ及びゲノムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から単離し、製造業者の指示に従って、ＥａｓｙＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して逆転写した。異なる遺伝子のＰＣＲ増幅は、２×ＥａｓｙＴａｑ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して実施した。ゲノムＰＣＲに関しては、ゲノムＤＮＡはＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で抽出した。使用したプライマーは表２に列挙する。
【表２】
2017529876.tif 000005
2017529876.tif 000006
2017529876.tif 000007
2017529876.tif 000008
【００９７】
リアルタイムＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、培養細胞のウェル全体から全ＲＮＡを単離した。ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７３００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍでＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。データはデルタデルタＣｔ法を使用して分析した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーは、表２に列挙する。
【００９８】
奇形種形成
アカゲザルナイーブ型及びプライム型ｉＰＳＣを回収し、ＤＦ１２培地に再懸濁した。コンフルエントな６０ｍｍディッシュからの細胞を、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（中国）へと皮下注射した。アカゲザルプライム型ｉＰＳＣでは６〜８週間後、ナイーブ型ｉＰＳＣでは４〜５週間後に奇形種を形成した。奇形種は、次いでパラフィンに包埋し、ヘマトキシリン及びエオシン染色のために加工した。
【００９９】
核型分析
Ｇバンド染色体分析は、北京大学遺伝医学センターで実施した。
マウス胚顕微操作、全組織標本染色、及び画像化
ナイーブ型及びプライム型ｉＰＳＣ注入のため、細胞をトリプシン処理し、８細胞期の胚又はＩＣＲ二倍体のマウス胚のＥ３．５胚盤胞（１胚あたり６〜１０細胞）に微量注入した。およそ１５個の注入した胚を、交尾後２．５日の偽妊娠雌の各子宮角へと移した。Ａｂｃａｍの全組織標本染色手順に従って、抗ヒト核抗体（クローン２３５〜１、１：２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での全組織標本染色のため、Ｅ１０〜Ｅ１１発生段階で胚を切開した。全胚の薄切片標本画像化のため、胚をＥ１６発生段階で切開し、続いて包埋し、凍結し、薄片にし（１０ｍｍの薄い切片）、次いで抗ヒト核抗体とＧＡＴＡ４（１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、又はＯＣＴ４（１：２００、Ａｂｃａｍ）とＮＡＮＯＧ（１：２００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で共染色した。共焦点分析のため、マウントした胚及び薄切片標本をＵｌｔｒａＶＩＥＷ  ＶｏＸシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、Ａｎｄｏｒ’ｓ  Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＷＤスピニングディスク共焦点顕微鏡システム（Ａｎｄｏｒ）、又はＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏハイコンテンツスクリーニングシステム（ＭｏｌＤｅｖ）によって画像化した。
アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣの生成
【０１００】
初期の実験では、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４の過剰発現並びにマウスにおいてＯｃｔ４過剰発現のみで再プログラミングを促進することが報告されている（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２１：１９６〜２０４（２０１１））小分子の組合せの存在下で細胞を培養することにより、アカゲザルプライム型ｉＰＳＣ株をまず確立した。生じたプライム型ｉＰＳＣ株は、ヒトＥＳＣ培地でｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで多能性を伴って維持することができ（図４Ａ、図４Ｃ及びデータは示さない）、それらはマウスのナイーブ型多能性を維持する２ｉ／ＬＩＦ条件（２ｉ／ＬＩＦ）へと移した場合急速に分化し、多能性を失い（図１Ａ）、したがってげっ歯類のナイーブ型多能性を支持する信頼のある条件がサルでのナイーブ型多能性状態を確立するのに十分ではないことを示している。
【０１０１】
２ｉ／ＬＩＦの存在下でプライム型ｉＰＳＣをナイーブ型状態へと変換するため、いくつかの経路モジュレーターを試験した。ドーム形状のコロニーは、ｂＥＧＦを２ｉ／ＬＩＦ条件に添加した場合にのみ出現するマウスＥＳＣと形態学的に類似している。多能性マーカーＴＲＡ−１−８１及びＯＣＴ４のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色及び免疫染色は、ＴＲＡ−１−８１陽性ドーム形状コロニーが、２ｉ／ＬＩＦ条件での培養の５日後、ｂＥＧＦの存在下で保持されたことを示した（データは示さない）。注目すべきことに、これらの細胞コロニーは、ナイーブ型多能性の典型的なマーカー遺伝子であるＴＢＸ３（データは示さない）も発現する（Ｄｕｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４４：１１５６〜１１６０（２０１４）；Ｎｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０：１１８〜１２２（２００９））。これらの結果は、サルのプライム型ｉＰＳＣをナイーブ型状態へと変換する文脈内で、２ｉ／ＬＩＦ条件へのｂＥＧＦ添加の重要性を示しているが、変換効率は低い（全コロニーの８％〜１０％がＴＲＡ−１−８１／ＴＢＸ３ダブルポジティブ及びドーム形状である）（図１Ａ及びデータは示さない）。これらの変換したＴＲＡ−１−８１／ＴＢＸ３ダブルポジティブｉＰＳＣは、ナイーブ型ｉＰＳＣと同様に同定した。
アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣの変換条件の最適化
【０１０２】
どのようにｂＦＧＦが作用し、アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣを生成するかを理解するため、ｂＦＧＦの下流の主要な経路、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路を調べた。哺乳動物細胞において、少なくとも３つの特徴づけられたＭＡＰＫファミリーがある：古典的なＭＡＰＫ（ＥＲＫ）、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ／ストレス活性化タンパク質キナーゼ（ＪＮＫ／ＭＡＰＫ）、及びｐ３８キナーゼ（Ｚｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、１２：９〜１８（２００２））。これらのどれが主な役割を有するか同定するため、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８に特異的なアンタゴニストを先の変換条件下でそれぞれ又は組み合わせて試験した。ＰＤ０３２５９０１、古典的なＭＡＰＫ／ＥＲＫの阻害剤及び２ｉ／ＬＩＦ条件の不可欠な成分は、ＴＢＸ３／ＴＲＡ−１−８１ダブルポジティブなドーム形状のコロニーの変換及び維持に必須であった（データは示さない）。さらに、２つの他の分子、ＪＮＫｉのＳＰ６００１２５及びｐ３８ｉのＳＢ２０３５８０は、それぞれ、これらの変換条件下でのナイーブ型ＰＳＣの変換効率を大きく改善することができる（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）。これらの２つの阻害剤の組合せは、全コロニーの７５％まで、変換効率をさらに増強する（図１Ａ及びデータは示さない）。さらに、これらのコロニーを採取し、単一細胞を継代した場合、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞において、典型的なＡＬＰ陽性のドーム形状のコロニーが培養３日後に現れる。免疫染色によるさらなる同定により、これらのコロニーはＴＲＡ−１−８１陽性であることが示され、それらが多能性なままであることを示している（データは示さない）。
【０１０３】
変換条件を最適化するため、ヒトナイーブ型ＥＳＣ／ｉＰＳＣの生存及び維持に有益であると開示されているＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）及びＧＯ６９８３（ＰＫＣ阻害剤）もまた試験した（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、５０４：２８２〜２８６（２０１３））。しかし、本発明者らは、これら２つの化合物が、コロニーにおいて明白な分化を誘導し、ＴＲＡ−１−８１発現を減少することを見出し（データは示さない）、ヒト及びサルにおいてナイーブ型多能性を確立するためのシグナル伝達制御の異なる要求を意味している。
【０１０４】
最後に、ｂＦＧＦ及び２ｉ／ＬＩＦの存在下でのＳＰ６００１２５及びＳＢ２０３５８０の組合せを使用して、安定なＴＲＡ−１−８１／ＴＢＸ３ダブルポジティブなドーム形状のナイーブ型ｉＰＳＣが、プライム型ｉＰＳＣから高効率で（２ｉ／ｈＬＩＦ＋ｂＦＧＦのみより１０倍より高い）成功裏に確立された（図１Ａ）。注目すべきことに、この最適化した培養条件で、アカゲザル線維芽細胞は直接ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４の過剰発現により、ＴＲＡ−１−８１陽性のドーム形状のコロニーへと再プログラムされた（データは示さない）。この最適化した培養条件は、先に記載したように、エピソームベクターに基づく非ウイルス性の組込み法を使用するナイーブ型ｉＰＳＣを確立するためにも使用され（Ｏｋｉｔａら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８：４０９〜４１２（２０１１））（図２Ａ、図２Ｂ、及びデータは示さない）、ヒトナイーブ型誘導多能性幹細胞を確立した（データは示さない）。確立したナイーブ型ｉＰＳＣは、アクターゼを使用して４〜５日ごとに単一細胞継代することができ、早い成長速度を表す（図２Ｃ及びデータは示さない）。
【０１０５】
アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣの多能性の特徴
これらのナイーブ型ｉＰＳＣが確かに多能性であるかどうかの疑問には、ＲＴ−ＰＣＲを使用して取り組んだ。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ナイーブ型ｉＰＳＣが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＡＬＬ４、及びＮＡＮＯＧを含む内在性の多能性マーカー遺伝子を発現したことを示した（図２Ｂ及び２Ｄ）。ナイーブ型ｉＰＳＣの多能性の特徴を、免疫染色によりさらに調べた。特に、これらの細胞は、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＳＳＥＡ−４を含むが、ＳＳＥＡ−１を含まない、多能性特異的な表面マーカーに陽性に染色された（データは示さない）。さらに、ナイーブ型ｉＰＳＣは、ＭＩＸＬ１、ＣＤＸ２、ＺＩＣ１、ＨＡＮＤ１、ＥＯＭＥＳ、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＤＬＬ１、及びＺＮＦ５２１の下方制御を示した（データは示さない）。一方、これらの細胞は正常な核型（雄について４２、ＸＹ及び雌について４２、ＸＸ）を有し、ドーム形状の形態及び８ヵ月に渡る単一細胞継代のＡＬＰ活性を維持する（データは示さない）。最後に、ナイーブ型ｉＰＳＣの分化能を分析するため、３つの胚葉へと分化するそれらの能力を試験した。ナイーブ型ｉＰＳＣは、レシピエントマウスへの注入の４〜５週間後にｉｎ  ｖｉｖｏで検出された３つの胚葉全ての組織で奇形腫を形成した（データは示さない）。したがって、これらの結果は、アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣは多能性の特徴及び分化能を保持することを示している。
【０１０６】
アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣはプライム型ｉＰＳＣとは異なる特性を保持する
プライム型とナイーブ型ｉＰＳＣの間の違いをさらに調べるため、研究は、異なるシグナル伝達刺激又は阻害剤へのプライム型及びナイーブ型ｉＰＳＣの明白な応答パターンに注目した（Ｇｒｅｂｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、６：２１５〜２２６（２０１０）；Ｎｉｗａら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０：１１８〜１２２（２００９）；Ｖａｌｌｉｅｒら、Ｄｅｖ．、１３６：１３３９〜１３４９（２００９））。データは、マウス及びヒトナイーブ型ｉＰＳＣと同様に、ナイーブ型ｉＰＳＣの自己複製がＬＩＦシグナル伝達に依存することを示した。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３阻害剤に曝露した場合、ＴＲＡ−１−８１の発現が著しく減少してナイーブ型ｉＰＳＣは容易に分化したが、プライム型ｉＰＳＣはそれらの多能性の特性を維持した（図３Ａ及び３Ｂ）。重要なことに、ヒト細胞のように、ｂＦＧＦシグナル伝達がアカゲザルプライム型とナイーブ型ｉＰＳＣ両方の自己複製に必要であった。ＦＧＦＲ阻害剤ＳＵ５４０２の存在下で、ＴＲＡ−１−８１陽性コロニーは、プライム型又はナイーブ型ｉＰＳＣのいずれかによってほとんど形成されず、霊長類の多能性の制御におけるこの経路の役割を示している（図３Ａ及び図３Ｂ）。典型的なフォスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤であるＬｙ２９４００２は、濃度依存的な方法でナイーブ型変換過程を厳密に遮断することができ、ナイーブ型状態の確立において、ＦＧＦ下流のＰＩ３Ｋシグナル伝達の役割を示している（図３Ｃ）。興味深いことに、特異的及び選択的ＴＧＦβ−Ｒ１阻害剤ＳＢ４３１５４２の培養培地への添加は、アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣには効果を示さないが、プライム型ｉＰＳＣ自己複製には効果的であることを示し、アカゲザルプライム型ｉＰＳＣ及び報告されたヒトナイーブ型ｉＰＳＣとは違い（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、５０４：２８２〜２８６（２０１３）；Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１５（４）：４７１〜８７（２０１４））、ＴＧＦ−βシグナル伝達はサルのナイーブ型ｉＰＳＣ自己複製に必ずしも必要ではないことを示している。さらに、ＴＧＦ−βの培養培地への添加は、ナイーブ型ｉＰＳＣの自己複製に効果的であったが、プライム型ｉＰＳＣには効果的でなかった（図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｄ）。
【０１０７】
雌のナイーブ型ｉＰＳＣにおけるＸ染色体活性化状態を次に分析した。最適化条件によって誘導された雌のナイーブ型ｉＰＳＣは、核のＨ３Ｋ２７ｍｅ３フォーカスの欠損及びＸＩＳＴ発現レベルの劇的な下方制御によって示されるように、Ｘ染色体再活性化状態を保持した（図３Ｅ及びデータは示さない）。対照的に、雌のプライム型ｉＰＳＣは、体細胞のようにＨ３Ｋ２７ｍｅ３フォーカスの明らかな存在及びＸＩＳＴの高い発現レベルを有する、Ｘ染色体の不活性化状態を維持する（図３Ｅ及びデータは示さない）。したがって、これらの結果は、異なる種間のナイーブ型ＰＳＣにおいてＸ−活性化状態の保存を示している。
【０１０８】
次に、ナイーブ型とプライム型ｉＰＳＣ間の全体的な遺伝子発現パターンを、ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）分析によって比較した。ゲノム全体での遺伝子発現クラスタリングは、異なる遺伝子発現パターンによりナイーブ型ｉＰＳＣがプライム型ｉＰＳＣとは別にクラスター化されることを示した（図３Ｆ及びデータは示さない）。ジーンオントロジー（ＧＯ）ターム解析により、ナイーブ型とプライム型ｉＰＳＣ間の主な発生のシグナル伝達及び代謝に関連する遺伝子発現パターンの変化を明らかにした（図３Ｇ）。重要なことに、プライム型ｉＰＳＣと比較して、複数のナイーブ型状態関連転写産物、例えばＰＲＤＭ１４、ＫＬＦ５、ＺＦＰ４２（ＲＥＸ１）、ＬＩＦＲ、ＴＢＸ３、及びＮＡＮＯＧは、ナイーブ型ｉＰＳＣにおいて上方制御された（図３Ｆ、図３Ｇ、及び図Ｓ３Ｅ）。一方、ナイーブ型ｉＰＳＣは、ＨＯＸＡ２、ＭＥＩＳ１、及びＤＬＬ１を含む、系列特異的遺伝子の発現においても減少を示し、低レベルで発現するが、プライム型ｉＰＳＣではかなりのレベルで発現した（図３Ｈ、図３Ｉ、図３Ｊ）。まとめると、これらのデータは、アカゲザルにおいて、ナイーブ型ｉＰＳＣの遺伝子発現パターンがプライム型ｉＰＳＣとは異なることを示し、マウス及びヒトにおける先の研究と類似している（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、５０４：２８２〜２８６（２０１３）；Ｃｈａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１３：６６３〜６７５（２０１３）；Ｗａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１１１：４４８４〜４４８９（２０１４）；Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１５（４）：４７１〜８７（２０１４））。
【０１０９】
最後に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの種間キメラの生成におけるアカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣの能力を試験するため、ナイーブ型及びプライム型ｉＰＳＣを、８細胞期の胚又はＩＣＲマウスの胎生期３．５（Ｅ３．５）胚盤胞に微量注入し、Ｅ１０〜Ｅ１１発生段階まで発生させた（表３）。
【表３】
2017529876.tif 000009
【０１１０】
サルの細胞の核を特異的にマークできる抗ヒト核抗体（ｈＮＡ）の全組織標本免疫染色（データは示さない）をｉｎ  ｖｉｖｏでアカゲザルｉＰＳＣ由来細胞の存在を検出するために使用した。とりわけ、プライム型ｉＰＳＣと対照的に、ナイーブ型ｉＰＳＣとのキメラ胚が得られた（データは示さない）。特に、３つのナイーブ型ｉＰＳＣ株から生成された６つのキメラ胚のうち３つは、ナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞の広範な組込みを示した（データは示さない）。これらのナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞がキメラ胚の胚発生に寄与することができるかどうかさらに調べるため、Ｅ１６発生段階でのキメラ胚におけるナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞の分布を分析した。２つの独立したナイーブ型細胞株からの２つのＥ１６キメラ胚をさらに分析した。ナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞は、レシピエントマウスの多くの組織及び臓器、例えば腸、肝臓、心臓、及び脳へと組込まれた。ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧを含む多能性マーカーの発現は、キメラ胚のｈＮＡ＋細胞において検出できず（データは示さない）、ナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞の多能性の欠損を示している。興味深いことに、心臓領域におけるナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞の高度な組込みも観察された（データは示さない）。さらに、心臓特異的マーカーＧＡＴＡ４（ヒトとマウス両方のＧＡＴＡ４と反応するＧＡＴＡ４抗体で染色することによって検出した）はこの段階の心臓でほとんどのｈＨＡ＋細胞において発現し（データは示さない）（Ｋｕｏら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１１：１０４８〜１０６０（１９９７））、これらのナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞は、発生中の心臓へと組込まれた場合、心臓の運命に向かってさらに分化し得ることを意味している。合わせて、これらのデータは、アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞は種間キメラ胚を生成し、さらなる分化を伴うマウス初期胚へと再配置（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）することができた。
【０１１１】
考察
本研究は、アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣがプライム型ｉＰＳＣからの変換により又はサイトカインと小分子阻害剤の簡単な組合せによる線維芽細胞の転写因子駆動再プログラミングにより成功裏に生成できることの証明を提供する。さらに、この変換条件はまた、ナイーブ型ｉＰＳＣの自己複製回路の長期間安定な維持も可能にする。重要なことに、本明細書に開示の発見は、マウス胚への種間キメラ能を有するナイーブ型多能性が非ヒト霊長類に由来することができることを示す（データは示さない）。
【０１１２】
生成したアカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣは、それらをプライム型ｉＰＳＣ及び従来の霊長類のＥＳＣと区別する多くの細胞の特徴を保持する。アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣは単一細胞継代に耐え、安定なドーム形状の形態及び正常な核型で長期間繁殖することができる。これらの細胞はｂＦＧＦシグナル伝達非依存的にＬＩＦ及びＭＡＰＫに応答して、多能性の特徴を伴い自己複製する。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３核内フォーカスの欠損及びＸＩＳＴ転写の下方制御は、ナイーブ型ｉＰＳＣの前Ｘ不活性化状態を示した。さらに、これらの研究において確立されたサルのナイーブ型ｉＰＳＣはまた、マウスとヒト両方のナイーブ型多能性幹細胞と発現特性を共有する。例えば、ＮＡＮＯＧ及びＰＲＤＭ１４を含むナイーブ型状態関連遺伝子の上方制御が観察され、これがマウスのナイーブ型多能性状態を保護し、シグナル伝達経路及び細胞内のエピジェネティクスの二重制御により分化系列コミットメントを抑えるように働く（Ｓｉｌｖａら、Ｃｅｌｌ、１３８：７２２〜７３７（２００９）；Ｙａｍａｊｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１２：３６８〜３８２（２０１３）；Ｇｒａｂｏｌｅら、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．、１４：６２９〜６３７（２０１３））。この発見は、ＤＬＬ１及びＭＥＩＳ１などの系列特異的遺伝子の発現の減少と一致し（ｖａｎ  Ｅｓら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４：１０９９〜１１０４（２０１２）；Ｈｉｓａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２３：４５０〜４５９（２００４））、アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣのより未熟な状態を示している（図３Ｈ〜Ｊ）。したがって、サルの２つの多能性状態の完全に異なる表現型は、優れたモデルシステムを提供し、霊長類の多能性ネットワーク制御のメカニズムを調べることができる。
【０１１３】
本研究の別の重要な発見は、サルのナイーブ型ｉＰＳＣが、マウス胚に注入された場合、種間キメラを生成することができることである。このアッセイを使用し、ヒトナイーブ型ＰＳＣを評価したが、これらの細胞がそれらの多能性遺伝子発現を欠損する及びさらに分化しｉｎ  ｖｉｖｏでの組織に寄与できるかどうかはっきりしないままである（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、５０４：２８２〜２８６（２０１３）；Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１５（４）：４７１〜８７（２０１４））。ここで、全組織標本染色、全胚の薄切片、及び画像化を使用して、キメラサル−マウス胚においてアカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞の分布の概要を得た。抗ヒト核抗体の組織特異的マーカーとの共染色、及び全胚薄切片標本の多能性特異的マーカーの不在は、キメラ胚におけるナイーブ型ｉＰＳＣ由来細胞がさらに分化し、胚発生に寄与し得ることをさらに例示した。したがって、全胚分析は代替戦略を与え、ナイーブ型多能性のより厳密な証拠を提供する。
【０１１４】
これらの発見はまた、マウス、サル、及びヒト細胞のナイーブ型多能性状態を達成するための条件における、進化的な保存及びバリエーションも示す。まず、データはＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達が、サルだけでなく他の２種でもナイーブ型状態を支持することを示し、ナイーブ型多能性ネットワークの確立においてＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達の基本的な効果をしている、第二に、ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、及びｐ３８の３つの中心成分の拮抗作用（Ｚｈａｎｇ及びＬｉｕ、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、１２：９〜１８（２００２））は、これらの種のナイーブ型多能性状態を達成するために重要である。アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣはｂＦＧＦシグナル伝達に依拠し、自己複製を持続する。この発見は、ヒト細胞がナイーブ型多能性状態を獲得することに関してｂＦＧＦシグナル伝達の重要性及び緊要性を示す近年の報告と一致し（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、５０４：２８２〜２８６（２０１３）；Ｃｈａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１３：６６３〜６７５（２０１３）；Ｗａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１１１：４４８４〜４４８９（２０１４））、ｂＦＧＦシグナル伝達が、ヒトとサル両方の細胞のナイーブ型状態の維持に役割を果たすことを示している。対照的に、ｂＦＧＦシグナル伝達はマウスのナイーブ型多能性の維持にネガティブな効果を有し、これは異なる種の異なる遺伝的背景による可能性があり、これは以前の報告によって示唆されている（Ｈａｎｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０７：９２２２〜９２２７（２０１０））。ＭＡＰＫのように、ｂＦＧＦの下流は霊長類のナイーブ型ＰＳＣで抑制される必要があり、ＰＩ３ＫなどのｂＦＧＦの下流の他のシグナル伝達経路は、霊長類のナイーブ型多能性にポジティブな効果を発揮し得る（図３Ｃ及びデータは示さない）。さらに、変換過程の間にＴＧＦ−βシグナル伝達非依存性が明らかになった。これは、ＴＧＦ−βシグナル伝達の存在に依存するヒトナイーブ型ＰＳＣの他の報告とは対照的である（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、５０４：２８２〜２８６（２０１３）；Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１５（４）：４７１〜８７（２０１４）；米国特許出願公開第２０１４／０３１５３０１号）。
【０１１５】
全体として、アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣの生成は、２つの異なる多能性状態（ナイーブ型及びプライム型）が種を超えて保存されていることを示す。最も重要なことには、ナイーブ型多能性幹細胞の誘導におけるマウス、サル、及びヒト種間の類似性及び違いの発見は、ナイーブ型多能性の謎を明らかにすることを助け、他の種の確かなナイーブ型ＰＳＣを得るために有用であり得る。一方、アカゲザルナイーブ型ｉＰＳＣの誘導は前臨床研究及び疾患モデルへの適用のための役立つ細胞源も提供する。
【０１１６】
上記明細書において、本発明はそれらの特定の実施形態に関連して記載されているが、多くの詳細が例示の目的で述べられており、本発明のさらなる実施形態が可能であり、本明細書に記載の特定の詳細が本発明の基本原理から逸脱することなくかなり変化し得ることは当業者には明らかである。
【図１Ａ】
2017529876.tif 000010
【図１Ｂ】
2017529876.tif 000011
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2017529876.tif 000013
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2017529876.tif 000016
【図３Ａ】
2017529876.tif 000017
【図３Ｂ】
2017529876.tif 000018
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2017529876.tif 000020
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
2017529876.tif 000024
【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
2017529876000001.app
【国際調査報告】
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2017529876.tif 000031
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