(57)【要約】  本発明は、タンパク質凝集と関連する疾患を治療及び/又は予防する方法であって、RNAを安定化することによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を阻止するステップ、又は除去されたRNAを効果的に置き換えることによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を解消する(reverse)するステップを含む、方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質凝集と関連する疾患を治療及び/又は予防する方法であって、RNAを安定化することによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を阻止するステップ、又は除去されたRNAを効果的に置き換えることによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を解消するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記RNAが、細胞におけるイオンバランスを変更することによって安定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記RNAが、RNA、DNA又はLNAを添加することによって効果的に置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記RNAがリボソームRNAである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記RNA、DNA又はLNAが、G-四重鎖構造(G4)を含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記RNAが、オルトバナジン酸ナトリウム、又はその誘導体、構造模倣体若しくは修飾型によって効果的に置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患が、II型糖尿病、癌、封入体筋炎/ミオパチー、甲状腺髄様癌、心房アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射限局性アミロイドーシス、大動脈内アミロイドーシス、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、逆まつ毛を伴う角膜アミロイドーシス、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、皮膚苔癬アミロイドーシス、非神経病系アミロイドーシス、又は神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患(MND)、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、アミロイドーシス側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性英国認知症、家族性デンマーク認知症及びプリオン病である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質凝集と関連する疾患を診断する方法であって、被験体に由来するサンプル中の有効なRNAのレベルを決定するステップを含み、対照被験体に由来する同等のサンプルと比較して減少した有効なRNAは、被験体が、タンパク質凝集と関連する疾患を有するか又はその危険性があることを示す、方法。
【請求項９】
被験体がタンパク質凝集と関連する疾患を発症する危険性があるかどうかを決定する方法であって、被験体に由来するサンプル中の有効なRNAのレベルを決定するステップを含み、対照被験体に由来する同等のサンプルと比較して減少した有効なRNAは、被験体が、タンパク質凝集と関連する疾患を有するか又はその危険性があることを示す、方法。
【請求項１０】
前記RNAがリボソームRNAである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記RNAがG-四重鎖構造を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
有効なRNAの減少が、RNA分解に起因する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、血清、血漿、脳脊髄液サンプル、又は組織サンプル、例えば、脳、膵臓若しくは筋肉サンプルである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患が、II型糖尿病、癌、封入体筋炎/ミオパチー、甲状腺髄様癌、心房アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射限局性アミロイドーシス、大動脈内アミロイドーシス、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、逆まつ毛を伴う角膜アミロイドーシス、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、皮膚苔癬アミロイドーシス、非神経病系アミロイドーシス、又は神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患(MND)、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、アミロイドーシス側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性英国認知症、家族性デンマーク認知症及びプリオン病である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質凝集と関連する疾患の動物モデルであって、タンパク質凝集が該動物における細胞中のRNAの除去によって誘導される、動物モデル。
【請求項１６】
前記RNAがリボソームRNAである、請求項１５に記載の動物モデル。
【請求項１７】
前記RNAが、RNA分解を誘導することによって除去される、請求項１５又は請求項１６に記載の動物モデル。
【請求項１８】
前記RNA分解が、RNAリボヌクレアーゼを投与すること、又はRNAリボヌクレアーゼの発現若しくは活性を増加させることによって引き起こされる、請求項１７に記載の動物モデル。
【請求項１９】
前記リボヌクレアーゼが、RNase A、RNase T1、及び/又はRNase 1fを含む、請求項１８に記載の動物モデル。
【請求項２０】
RNAの有効な量が、アンチセンスRNA又はsiRNAの投与によって低減される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の動物モデル。
【請求項２１】
RNAの有効な量が、RNA発現における低減を誘導することによって低減される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の動物モデル。
【請求項２２】
タンパク質凝集と関連する疾患の動物モデルであって、タンパク質凝集がリボヌクレオシドバナジル及び/又は二価イオンを用いて誘導される、動物モデル。
【請求項２３】
細胞又は細胞溶解物における複数のタンパク質の凝集を開始させるための、リボヌクレオシドバナジルの使用。
【請求項２４】
複数のタンパク質における少なくとも1つのタンパク質が、タンパク質凝集と関連する疾患の発症機序に関与する、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記疾患が、II型糖尿病、封入体筋炎/ミオパチー、又は神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患(MND)、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、及びプリオン病である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記複数のタンパク質が、アミロイド-β、MAPT、SCNA、TARDBP、FUS、HTT、PrP、ニューロフィラメント(NF-H)及びα-シヌクレインのうちの少なくとも1つを含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
タンパク質のフォールディングを促進するin vitro方法であって、フォールディングを促進するために、フォールドされていない又は部分的にフォールドされたタンパク質を、RNA又はゲノムDNAと接触させるステップを含む、方法。
【請求項２８】
単離された細胞において実施される、請求項２７に記載の方法であって、場合により、単離された細胞は、単離された細菌細胞又は単離された哺乳動物細胞である、方法。
【請求項２９】
フォールドされていない又は部分的に未フォールドのタンパク質のin vitroフォールディングを促進するための、RNA又はDNAの使用。
【請求項３０】
前記RNA又はゲノムDNAが、G-四重鎖構造を含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項３１】
前記タンパク質が、膜貫通タンパク質である、請求項２７、２８若しくは３０に記載の方法、又は請求項２９若しくは３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記タンパク質が、治療用タンパク質又は生物学的試薬である、請求項２７、２８若しくは３０に記載の方法、又は請求項２９若しくは３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記タンパク質が、酵素、抗体、タンパク質リガンド、受容体、構造タンパク質又は補因子である、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質凝集と関連する疾患を治療及び/又は予防する方法であって、RNAを安定化することによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を阻止するステップ、又は除去されたRNAを効果的に置き換えることによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を解消する(reverse)するステップを含む、方法に関する。本発明はまた、疾患を診断するか、又は被験体がタンパク質凝集と関連する疾患を発症する危険性があるかどうかを決定する方法に関する。本発明はまた、タンパク質凝集と関連する疾患に対する動物モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
不溶性凝集体へのタンパク質の集合は、多くの神経変性疾患、例えばアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)及びプリオン病を含めたいくつかの疾患の特徴である。しかし、タンパク質凝集は、中枢神経系(CNS)に制限されているわけでは決してなく、II型糖尿病及び封入体筋炎/ミオパチーほど多様な疾患においても生じる。
【０００３】
関連する神経変性疾患のそれぞれは、特定の脳領域における変性を有する、ニューロンの選択的脆弱性、並びにニューロン、他の細胞における若しくは細胞外における異常タンパク質の沈着を伴う。これらの神経変性疾患が、タンパク質凝集及び封入体形成を含めた共通の細胞性及び分子的機構を有することがますます認識されている。凝集体は、β-シートコンフォメーションを有し得るミスフォールドしたタンパク質を含有する繊維から通常構成され、異常タンパク質が沈着している細胞と変性する細胞との間に完全ではないが部分的な重複がある。
【０００４】
各疾患は特定のタンパク質の凝集と主に関連しているが、かなりの重複があり、同じタンパク質が様々な疾患にわたって凝集することが見出され得る。例えば、ADは凝集したアミロイド-β及びタウ(tau)タンパク質と主に関連し、PDはユビキチンに結合したタンパク質α-シヌクレインを含む凝集体と関連し、HDは変異体ハンチンチンと関連する。しかし、α-シヌクレイン凝集体はPDの不変の特徴であるが、それらはADにおいても生じることが報告されている。同様に、TDP-43凝集は、ALS及び前頭側頭型認知症と関連しているが、ADの多く(30〜50％)の症例とも関連している。
【０００５】
タンパク質凝集体と神経変性疾患との十分に報告された関連にもかかわらず、凝集体の生成をもたらす原因機構はわかっていない。タンパク質凝集体の生成及びそれらが関連するその後の神経変性障害に関与するプロセスの理解が乏しいために、治癒的な治療戦略はない。タンパク質凝集と関連するいずれかの神経変性疾患に対する治癒的な治療はいまのところない。そのため、現在の治療戦略は、緩和ケアに焦点を当てており、できるだけ長く症状の出現を抑制することを目的としている。
【０００６】
ほとんどの神経変性障害において、家族性突然変異は極めて稀であり、症例の大部分は家族歴なしに生じる。タンパク質凝集を研究するための現在の方法は、細胞又はモデル生物における、家族性疾患原因突然変異を有することが多い、組換えタンパク質のin vitroでの使用又はタンパク質の強制的発現に大いに依存している。これらの方法は単一タンパク質の研究には十分かもしれないが、それらは、特定の疾患と関連する全てのタンパク質の凝集をほとんど再現しない。例えば、ADのトランスジェニック動物モデル(突然変異したAPP及び/又はPSEN1若しくはPSEN2の導入遺伝子発現)は、アミロイド-β凝集を示すが、タウ凝集を実証せず、したがって、ヒトADの特徴の1つを欠く。現在、タウ凝集を再現するために、ヒトADには見出されていない突然変異をMAPT遺伝子に導入しなければならない。いくつかの薬物、例えばADに対する薬物は、疾患の動物モデルにおいて有効性を実証しているという事実にもかかわらず、神経変性疾患を標的とする薬物の失敗率は高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、代替療法、及びタンパク質凝集と関連する疾患を治療するための方法に対するニーズがある。また、上記の欠点と関連しないタンパク質凝集と関連する疾患の代替モデルに対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、内因性RNAが、凝集体のない状態に細胞性タンパク質を維持する役割を有し、RNAの除去がタンパク質凝集を引き起こすという重要な知見を行った。
【０００９】
本発明者らは、ポリアニオン性分子、例えばRNA及びゲノムDNAを使用して、RNA除去によって凝集されたタンパク質をリフォールドできることをさらに決定している。
【００１０】
第一の態様では、本発明は、タンパク質凝集と関連する疾患を治療及び/又は予防する方法であって、RNAを安定化することによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を阻止するステップ、又は除去されたRNAを効果的に置き換えることによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を解消するステップを含む、方法に関する。
【００１１】
RNAは、細胞におけるイオンバランスを変更することによって安定化されてよい。
【００１２】
RNAは、RNA、DNA又はLNAを添加することによって効果的に置き換えられてよい。RNAはリボソームRNAであってよい。DNAはゲノムDNAであってよい。
【００１３】
RNA、DNA(例えばゲノムDNA)又はLNAは、G-四重鎖構造(G4)を含んでよい。
【００１４】
RNAは、オルトバナジン酸ナトリウム、又はその誘導体、構造模倣体若しくは修飾型によって効果的に置き換えられてよい。
【００１５】
疾患は、II型糖尿病、癌、封入体筋炎/ミオパチー、甲状腺髄様癌、心房アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射限局性アミロイドーシス、大動脈内アミロイドーシス、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、逆まつ毛を伴う角膜アミロイドーシス、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、皮膚苔癬アミロイドーシス、非神経病系アミロイドーシス、又は神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患(MND)、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、アミロイドーシス側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性英国認知症、家族性デンマーク認知症及びプリオン病であってよい。
【００１６】
第二の態様では、本発明は、タンパク質凝集と関連する疾患を診断する方法であって、被験体に由来するサンプル中の有効なRNAのレベルを決定するステップを含み、対照被験体に由来する同等のサンプルと比較して減少した有効なRNAは、被験体が、タンパク質凝集と関連する疾患を有するか又はその危険性があることを示す、方法に関する。
【００１７】
第三の態様では、本発明は、被験体がタンパク質凝集と関連する疾患を発症する危険性があるかどうかを決定する方法であって、被験体に由来するサンプル中の有効なRNAのレベルを決定するステップを含み、対照被験体に由来する同等のサンプルと比較して減少した有効なRNAは、被験体が、タンパク質凝集と関連する疾患を有するか又はその危険性があることを示す、方法に関する。
【００１８】
RNAはリボソームRNAであってよい。RNAはG-四重鎖構造を含んでよい。
【００１９】
有効なRNAの減少は、RNA分解に起因してよい。
【００２０】
サンプルは、血清、血漿、脳脊髄液サンプル、又は組織サンプル、例えば、脳、膵臓若しくは筋肉サンプルであってよい。
【００２１】
疾患は、II型糖尿病、癌、封入体筋炎/ミオパチー、甲状腺髄様癌、心房アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、下垂体プロラクチノーマ、注射限局性アミロイドーシス、大動脈内アミロイドーシス、遺伝性格子状角膜ジストロフィー、逆まつ毛を伴う角膜アミロイドーシス、白内障、石灰化上皮性歯原性腫瘍、肺胞蛋白症、皮膚苔癬アミロイドーシス、非神経病系アミロイドーシス、又は神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患(MND)、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、アミロイドーシス側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性英国認知症、家族性デンマーク認知症及びプリオン病、又は加齢黄斑変性若しくは網膜色素変性であってよい。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、タンパク質凝集と関連する疾患の動物モデルであって、タンパク質凝集が該動物における細胞中のRNAの除去によって誘導される、動物モデルに関する。
【００２３】
RNAはリボソームRNAであってよい。RNAはG四重鎖構造を含んでよい。
【００２４】
RNAは、RNA分解を誘導することによって除去されてよい。RNA分解は、RNAリボヌクレアーゼを投与すること、又はRNAリボヌクレアーゼの発現若しくは活性を増加させることによって引き起こされてよい。
【００２５】
リボヌクレアーゼは、RNase A、RNase T1、及び/又はRNase 1fを含んでよい。
【００２６】
RNAの有効な量は、アンチセンスRNA又はsiRNAの投与によって低減されてよい。
【００２７】
RNAの有効な量は、RNA発現における低減を誘導することによって低減されてよい。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、タンパク質凝集と関連する疾患の動物モデルであって、タンパク質凝集がリボヌクレオシドバナジル及び/又は二価イオンを用いて誘導される、動物モデルを提供する。一実施形態では、二価イオンは、Mg2+、Ca2+又はZn2+を含む。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、細胞又は細胞溶解物における複数のタンパク質の凝集を開始させるための、リボヌクレオシドバナジルの使用を提供する。
【００３０】
複数のタンパク質における少なくとも1つのタンパク質は、タンパク質凝集と関連する疾患の発症機序に関与してよい。疾患は、II型糖尿病、封入体筋炎/ミオパチー、又は神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患(MND)、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、及びプリオン病であってよい。
【００３１】
複数のタンパク質は、アミロイド-β、MAPT、SCNA、TARDBP、FUS、HTT、PrP、ニューロフィラメント(NF-H)及びα-シヌクレインのうちの少なくとも1つを含んでよい。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、in vitroでタンパク質のフォールディングを促進する方法であって、フォールディングを促進するために、フォールドされていない又は部分的にフォールドされたタンパク質を、RNA又はDNA(例えば、ゲノムDNA)と接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、フォールドされていない又は部分的に未フォールドのタンパク質のin vitroフォールディングを促進するための、RNA又はDNA(例えば、ゲノムDNA)の使用を提供する。
【００３４】
RNA又はDNA(例えば、ゲノムDNA)は、G-四重鎖構造を含んでよい。タンパク質は、治療用タンパク質又は生物学的試薬、例えば、酵素、抗体、タンパク質リガンド、受容体、構造タンパク質又は補因子であってよい。タンパク質は、膜貫通タンパク質であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】RNAse処理後のRNAゲル電気泳動。ヒト神経細胞溶解物を様々な濃度のRNAseで処理し、残ったRNAをアガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。
【図２Ａ】様々な酵素による処理後のタンパク質凝集。ヒトニューロン(A)に由来する細胞溶解物を、表示された酵素で37℃にて1時間処理した。凝集したタンパク質を遠心分離によって回収し、クマシーSDS-PAGEによって解析した。
【図２Ｂ】様々な酵素による処理後のタンパク質凝集。マウス大脳皮質(B)に由来する細胞溶解物を、表示された酵素で37℃にて1時間処理した。凝集したタンパク質を遠心分離によって回収し、クマシーSDS-PAGEによって解析した。
【図３】選択したタンパク質の凝集に対する、異なるRNaseの作用。ヒトニューロンに由来する溶解物を、表示されたリボヌクレアーゼで37℃にて1時間処理し、凝集したタンパク質をウエスタンブロット解析に使用した。
【図４】タンパク質リフォールディング及び凝集。Jurkat細胞溶解物をRNAse A/T1で処理し、凝集タンパク質を遠心分離によって回収した。ペレット化したタンパク質をグアニジン塩酸塩中で変性させ、全Jurkat RNA(+)又は水(-)と混合した。次いで、混合物をTBSに対して一晩透析した。SDS-PAGEのために各サンプル(全体)から一定分量を取り、凝集タンパク質を遠心分離によって回収した(ペレット)。次いで、上清(sup)をRNAse A/T1又はビヒクル(Ve-)で処理し、凝集タンパク質を遠心分離によって回収した(ペレット)。全てのサンプルをSDS-PAGEで分離し、タンパク質をクマシーで染色した。
【図５】凝集のプリオン様増殖。ハンチンチン(HTT)、FUS及びTARDBP凝集のウエスタンブロット解析。Jurkat細胞溶解物を固定化RNAse A(ストレプトアビジン磁気ビーズに結合したビオチン化RNAse A)又はVe-(ストレプトアビジンビーズ)で37℃で15分間処理した。処理後、溶解物の10％を非処理溶解物と混合し、37℃で1時間インキュベートした。凝集タンパク質を遠心分離によって単離し、SDS中で可溶化し、SDS-PAGEゲルで分離した。ブロットを、表示したタンパク質に対する抗体でプローブした。RNAse処理サンプルに見られる凝集の増加は、凝集の増殖、例えば非処理サンプル中のネイティブタンパク質の動員、に起因する可能性がある。
【図６Ａ−Ｂ】RNAの除去はタンパク質沈殿を引き起こす。(a) 一般的実験手順を描写する略図である。細胞を含まない可溶性溶解物をリボヌクレアーゼによって37℃で1時間処理し、次いで、遠心分離して、凝集したタンパク質(ペレット)及び可溶性タンパク質(上清)を分離する。(b) SDS-PAGEで分離したタンパク質のクマシー染色。ヒトニューロン(b)に由来する細胞溶解物を、増加させた濃度の、RNAse A及びRNAse T1(A/T1)の混合物によって37℃で1時間処理した。凝集タンパク質を遠心分離によってペレット化し、SDS中で可溶化した。各サンプルに由来する等体積をSDS-PAGEで分離し、タンパク質をクマシー染色で染色した。各実験は異なる細胞及び組織調製物について少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図６Ｃ−Ｄ】RNAの除去はタンパク質沈殿を引き起こす。(c) SDS-PAGEで分離したタンパク質のクマシー染色。マウス皮質(c)に由来する細胞溶解物を、増加させた濃度の、RNAse A及びRNAse T1(A/T1)の混合物によって37℃で1時間処理した。凝集タンパク質を遠心分離によってペレット化し、SDS中で可溶化した。各サンプルに由来する等体積をSDS-PAGEで分離し、タンパク質をクマシー染色で染色した。(d) 異なるリボヌクレアーゼ又はDNAse Iとともにインキュベートした後のタンパク質凝集の解析。全てのゲルをクマシーで染色した。各実験は異なる細胞及び組織調製物について少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図６Ｅ−Ｆ】RNAの除去はタンパク質沈殿を引き起こす。(e) RNAse A及びRNAse A阻害剤(RNasin)による細胞溶解物の同時処理後のタンパク質凝集の評価。(f) RNAseによって又はアルカリによって加水分解したRNAの添加後のタンパク質凝集の検討。全てのゲルをクマシーで染色した。各実験は異なる細胞及び組織調製物について少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図７Ａ】RNAseによって沈殿したタンパク質のコンピューター解析。(a) 位置(上)又は分子機能(下)による上位5個の遺伝子オントロジークラス。
【図７Ｂ】RNAseによって沈殿したタンパク質のコンピューター解析。(b) RNAseによって凝集したタンパク質(赤)又はタンパク質の無作為セット(青)における予測低複雑度領域又は非構造領域(上の図)の割合の累積分布。
【図８Ａ−Ｂ】RNAの分解は、神経変性疾患と関連するタンパク質の沈殿を誘導する。(a) タンパク質凝集のウエスタンブロット検出。ヒト神経細胞溶解物をRNAse A/T1混合物の非存在下(Ve-)又は存在下(RNAse A/T1)で37℃にて1時間インキュベートした。凝集タンパク質を遠心分離によって回収し(ペレット)、可溶性タンパク質を上清に回収した(Sup)。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、メンブレンに転写し、表示した抗体でプローブした。(b) GFP-Aβ又はGFPを発現するHEK293細胞に由来する溶解物中の可溶性タンパク質及び沈殿したタンパク質のウエスタンブロット解析。全ての実験は少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図８Ｃ−Ｄ】RNAの分解は、神経変性疾患と関連するタンパク質の沈殿を誘導する。(c) RNAse Aの阻害は表示したタンパク質の沈殿を減少させる。1×濃度によって示されるRNaseinの量は、添加したRNAse Aの約50％を阻害する(製造業者のデータに基づいて)。(d) マウス皮質から調製した溶解物に由来する、RNAseによって沈殿したタンパク質のウエスタンブロット解析。全ての実験は少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図８Ｅ−Ｆ】RNAの分解は、神経変性疾患と関連するタンパク質の沈殿を誘導する。(e) RNAseによって凝集したタンパク質が6Mグアニジン塩酸塩中で可溶化され、次いで、RNAの存在下又は非存在下でリフォールドが可能となるリフォールディングアッセイの略図。次いで、可溶性タンパク質及び凝集したタンパク質を遠心分離によって分離し、可溶性画分をRNAse A/T1又はビヒクルで処理し、タンパク質再凝集を誘導する。(f) 全RNAの存在(+)又は非存在(-)下でリフォールディング後の可溶性(Sup 1)及び凝集した(Pel 1)タンパク質の全体的タンパク質プロファイルを示すクマシー染色ゲル。凝集タンパク質の除去後、可溶性画分(Sup 1)をRNAse A/T1(A/T1)又はビヒクル(Ve-)で処理し、タンパク質再凝集(Pel2)を調べた。RNAse又はビヒクルによる処理後に可溶性のままでいるタンパク質は、Sup 2で表示されるレーンに観察される。星印(*)は添加したRNAse Aを示す。全ての実験は少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図８Ｇ】RNAの分解は、神経変性疾患と関連するタンパク質の沈殿を誘導する。(g) 全RNAの存在又は非存在下でリフォールディング後の表示されるタンパク質のウエスタンブロット解析。全ての実験は少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図８Ｈ】RNAの分解は、神経変性疾患と関連するタンパク質の沈殿を誘導する。(h) 全ヒトRNA(hRNA)、全大腸菌(E.coli)RNA、酵母tRNA、ヒトゲノムDNA(gDNA)、又はヘパリンの、RNAseによって凝集したタンパク質をリフォールドさせる能力の評価。全てのサンプルを、表示した核酸又はヘパリンの同量(質量において)で処理した。全ての実験は少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図９Ａ】リボソームRNAは、RNAseによって凝集したタンパク質のin vitroでの可溶化に必要である。(a) プリオンタンパク質(PrP)に対する抗体又は非特異的IgG抗体(IgG)を用いて架橋した細胞から免疫沈降(IP)した後の共沈殿したRNAのゲル電気泳動解析。全RNA(レーン1)を参照としてロードし、様々なリボソームRNA種を右に表示する。全ての実験は少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図９Ｂ】リボソームRNAは、RNAseによって凝集したタンパク質のin vitroでの可溶化に必要である。(b) 全ヒトRNAの存在下でリフォールドした表示されるタンパク質の免疫沈降後に得られたcDNAクローンのアライメントを描写する図形表示。全ての実験は少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図９Ｃ−Ｄ】リボソームRNAは、RNAseによって凝集したタンパク質のin vitroでの可溶化に必要である。(c) RNAseによって凝集したタンパク質を可溶化する能力を評価するための、d及びeで使用したRNAサンプル(1μg)のPAGE-尿素ゲル-解析。(d) cに示される様々なRNAサンプルの、ハンチンチン(HTT)、ニューロフィラメント重鎖(NF-H)、又はPrPをリフォールドする能力の評価。全ての実験は少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図９Ｅ】リボソームRNAは、RNAseによって凝集したタンパク質のin vitroでの可溶化に必要である。(e) dと同じ実験であるが、クマシー染色により、リフォールディング後の全体的タンパク質プロファイルを調べた実験。全ての実験は少なくとも2回実施し、高い再現性を得た。
【図１０】予め加水分解したRNAの添加後のタンパク質凝集。ヒトニューロンに由来する溶解物を、増加させた量の、RNAse A又はNaOHで加水分解したRNAで処理し、凝集タンパク質をウエスタンブロットによって解析した。
【図１１】予測及び非予測G-四重鎖形成オリゴのタンパク質可溶化効果。ヒトニューロン由来の、RNAseによって凝集したタンパク質を、6Mグアニジン塩酸塩に可溶化し、示されたオリゴと混合した。透析によりグアニジン塩酸塩を除去した後、凝集タンパク質を遠心分離によって回収し、定量した。Ve-はTE緩衝液を表し、18S 1129は18SリボソームRNAに由来する予測G-四重鎖形成配列を表す。4G無し 1129は、18S 1129と同じヌクレオチドを含有するが、G四重鎖を形成するとは予測されない順序にある。
【図１２】オルトバナジン酸ナトリウムによるRNAse媒介タンパク質凝集の阻害。ヒトニューロンに由来する溶解物を、一定量のRNA A/T1(0.1μg/100μgタンパク質)及び増加させた濃度のオルトバナジン酸ナトリウムで37℃にて1時間処理した。凝集タンパク質を遠心分離によって回収し、ペレット中のタンパク質の量を決定した。
【図１３】リボヌクレオシドバナジル(VA)はタンパク質凝集を引き起こす。マウス皮質由来の溶解物をビヒクル(Ve-)又はVA(10mM)で37℃にて1時間処理した。凝集タンパク質を遠心分離によって回収し、SDS-PAGEゲル電気泳動によって解析し、クマシーで染色した。
【図１４】ゲノムDNAはRNAseによって凝集したタンパク質をリフォールドさせる。RNAseによって凝集したタンパク質を6Mグアニジン塩酸塩に可溶化し、ビヒクル(Ve-、TE緩衝液)、全ヒトRNA又はヒトゲノムDNAと混合した。グアニジン塩酸塩を透析により除去し、凝集タンパク質を遠心分離により回収し(P1)、BCAアッセイ(Therma Scientific)を用いて定量した。
【図１５Ａ−Ｂ】ヒト全RNAでリフォールドされたRNAse凝集タンパク質のATP加水分解活性。(A) リフォールディング後のATP捕捉タンパク質の解析。(B) ヒトニューロンに由来するRNAse凝集タンパク質を6Mグアニジン塩酸塩に可溶化し、RNAと混合した。グアニジン塩酸塩を除去した後、可溶性タンパク質を、ADPアッセイ(Promega)を用いて、RANse A/T1の存在下(+)又は非存在下(-)においてATP加水分解活性について評価した。データは任意単位(AU)で表される。*p<0.05。
【図１５Ｃ】ヒト全RNAでリフォールドされたRNAse凝集タンパク質のATP加水分解活性。(C) Jurkat T細胞由来のRNAse凝集タンパク質を6Mグアニジン塩酸塩に可溶化し、RNAと混合した。グアニジン塩酸塩を除去した後、可溶性タンパク質を、ADPアッセイ(Promega)を用いて、RANse A/T1の存在下(+)又は非存在下(-)においてATP加水分解活性について評価した。データは任意単位(AU)で表される。*p<0.05、**p<0.01。
【図１６Ａ−Ｂ】二価イオンはタンパク質凝集を引き起こす。(A) 様々な濃度の二価イオン(Mg2+、Ca2+、及びZn2+)で処理したJurkat T細胞から細胞溶解物を調製し、凝集タンパク質を遠心分離により回収し、ゲル電気泳動及びクマシーブルー染色によって解析した。Ve-=ビヒクル。(B) 様々な濃度のMg2+又はRNAse A/T1混合物で処理した全Jurkat RNAでリフォールドされたJurkatタンパク質。凝集タンパク質を遠心分離により回収し、超音波処理により2％SDS/8M尿素に可溶化し、BCAアッセイ(Pierce)を用いてタンパク質の量を決定した。
【図１６Ｃ】二価イオンはタンパク質凝集を引き起こす。(C) (D)と同じであるが、タンパク質は全RNAの代わりにゲノムDNAでリフォールドされた。
【図１７】合成RNA断片によるタンパク質のリフォールディング。Jurkat T細胞由来の凝集タンパク質をGuHClに可溶化し、ヒトAluSx反復のコンセンサス配列に由来するRNAの合成断片でリフォードした。比較のために全RNA及びゲノムDNA(gDNA)を含める。合成AluSx転写産物は、全RNAと同じくらい、タンパク質のリフォールディングに有効である。ペレット1はリフォールディング後の凝集タンパク質を表し、ペレット2はペレット1の後の可溶性画分をRNAse A/T1混合物で処理したときの凝集タンパク質を表す。タンパク質をSDS-PAGEによって解析し、クマシーブルーで染色する。
【図１８】オルトバナジン酸ナトリウムは、リフォールディング後のタンパク質凝集の防止においてRNA/DNAを模倣することができる。Jurkat T細胞由来の凝集タンパク質をGuHClに可溶化し、増加する濃度のオルトバナジン酸ナトリウムの存在下でリフォールドさせた。凝集タンパク質を遠心分離によって回収し、超音波処理により2％SDS/8M尿素に可溶化し、BCAアッセイ(Pierce)を用いてタンパク質の量を決定した。
【図１９】オルトバナジン酸ナトリウム及び(NH4)[VO(O2)2(phen)]*2H2Oのタンパク質凝集効果の比較。Jurkat T細胞から調製した細胞溶解物を、様々な濃度のオルトバナジン酸ナトリウム又は(NH4)[VO(O2)2(phen)]*2H2O(Comp 6)で処理した。凝集タンパク質を遠心分離によって回収し、BCA法(Pierce)を用いてタンパク質の量を決定した。
【図２０】様々なゲノム領域に注釈付けされたピークの割合。タンパク質を、予め断片化したゲノムDNAと一緒にリフォードさせ、Aβ又はプリオンタンパク質(PrP)に対する抗体を用いたChIPに使用した。あるいは、全ての可溶性タンパク質及び結合DNAを、ニトロセルロース膜への結合によって捕捉した(全て)。これらのサンプルから単離されたDNAを用いて、次世代シーケンシングのためのライブラリーを調製し、Illuminaプラットフォーム上で配列決定した。ピークは、Aβ又はPrPからの読み取り密度をIgG対照と比較することによって同定した。「全て」のサンプルについては、タンパク質結合DNAを、DNAのみのインプット(タンパク質無し)からニトロセルロース膜上に保持されたDNAと比較することによって、ピークを同定した。この図は、最も一般的な領域における注釈付けされたピークの割合を示す。TSS=転写開始部位、TTS=転写終結部位。
【図２１Ａ−Ｃ】Aβピークにおける予測モチーフ。MEME-ChIPを用いて、可溶性Aβと結合したRNAの結合領域(ピーク)におけるモチーフを予測した。モチーフは+鎖を表し、DNAモチーフとして表示される。逆相補的モチーフは、示された順方向モチーフと同様にタンパク質と結合している可能性が高い。モチーフのRNA型を生成するために、「T」は「U」に変更される。上位5つの最も重要なモチーフのみが示される。
【図２１Ｄ−Ｅ】図２１Ａ−Ｃの続きである。
【図２２Ａ】NFHピークにおける予測モチーフ。MEME-ChIPを用いて、可溶性ニューロフィラメント重鎖(NFH)と結合したRNAの結合領域(ピーク)におけるモチーフを予測した。モチーフ(A〜E)は+鎖を表し、DNAモチーフとして表示される。逆相補的モチーフは、示された順方向モチーフと同様にタンパク質と結合している可能性が高い。モチーフのRNA型を生成するために、「T」は「U」に変更される。上位5つの最も重要なモチーフのみが示される。
【図２２Ｂ−Ｄ】図２２Ａの続きである。
【図２２Ｅ】図２２Ｂ−Ｄの続きである。
【図２３Ａ−Ｂ】PrPピークにおける予測モチーフ。MEME-ChIPを用いて、可溶性プリオンタンパク質(PrP)に結合したRNAの結合領域(ピーク)におけるモチーフを予測した。モチーフ(A〜E)は+鎖を表し、DNAモチーフとして表示される。逆相補的モチーフは、示された順方向モチーフと同様にタンパク質と結合している可能性が高い。モチーフのRNA型を生成するために、「T」は「U」に変更される。上位5つの最も重要なモチーフのみが示される。
【図２３Ｃ−Ｅ】図２３Ａ−Ｂの続きである。
【図２４Ａ−Ｃ】タウピークにおける予測モチーフ。MEME-ChIPを用いて、可溶性タウ(MAPT)に結合したRNAの結合領域(ピーク)におけるモチーフを予測した。モチーフ(A〜E)は+鎖を表し、DNAモチーフとして表示される。逆相補的モチーフは、示された順方向モチーフと同様にタンパク質と結合している可能性が高い。モチーフのRNA型を生成するために、「T」は「U」に変更される。上位5つの最も重要なモチーフのみが示される。
【図２４Ｄ−Ｅ】図２４Ａ−Ｃの続きである。
【図２５Ａ】リフォールドされたタンパク質に結合したDNAにおける予測モチーフ(全て)。リフォールドされ、ニトロセルロース膜への結合によって捕捉された可溶性タンパク質に結合したDNAの結合領域(ピーク)におけるモチーフを、MEME-ChIPを使用して予測した。モチーフは+鎖を表し、DNAモチーフとして表示される。逆相補的モチーフは、示された順方向モチーフと同様にタンパク質と結合している可能性が高い。モチーフのRNA型を生成するために、「T」は「U」に変更される。上位5つの最も重要なモチーフのみが示される。
【図２５Ｂ−Ｄ】図２５Ａの続きである。
【図２５Ｅ】図２５Ｂ−Ｄの続きである。
【図２６Ａ−Ｂ】可溶性Aβに結合したDNAにおける予測モチーフ。リフォールドされ、ChIPによって捕捉された可溶性Aβと結合したDNAの結合領域(ピーク)におけるモチーフを、MEME-ChIPを用いて予測した。モチーフは+鎖を表し、DNAモチーフとして表示される。逆相補的モチーフは、示された順方向モチーフと同様にタンパク質と結合している可能性が高い。モチーフのRNA型を生成するために、「T」は「U」に変更される。上位5つの最も重要なモチーフのみが示される。
【図２６Ｃ−Ｅ】図２６Ａ−Ｂの続きである。
【図２７Ａ−Ｃ】可溶性PrPに結合したDNAにおける予測モチーフ。リフォールドされ、ChIPによって捕捉された可溶性プリオンタンパク質(PrP)と結合したDNAの結合領域(ピーク)におけるモチーフを、MEME-ChIPを用いて予測した。モチーフは+鎖を表し、DNAモチーフとして表示される。逆相補的モチーフは、示された順方向モチーフと同様にタンパク質と結合している可能性が高い。モチーフのRNA型を生成するために、「T」は「U」に変更される。上位5つの最も重要なモチーフのみが示される。
【図２７Ｄ−Ｅ】図２７Ａ−Ｃの続きである。
【図２８】同定されたモチーフの合成オリゴマーは、リフォールディング後の凝集の防止においてゲノムDNAを模倣する。Jurkat T細胞から調製した細胞溶解物を、様々な濃度の二本鎖型のモチーフ1及び対照1(A)、又はモチーフ2及び対照2(B)で処理した。凝集タンパク質を遠心分離によって回収し、超音波処理により2％SDS/8M尿素に可溶化し、BCAアッセイ(Pierce)を用いてタンパク質の量を決定した。15μgのゲノムDNA(gDNA)を参照として含める。モチーフ及び対照の配列を表7に示す。データは、ビヒクル(Ve-)で行ったリフォールディングに対して正規化した。uM及びugはそれぞれμM及びμgを指す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明者らは、細胞又は細胞溶解物におけるRNA除去がタンパク質凝集を開始させ、ポリアニオン性分子、例えばRNA及びDNA(例えばゲノムDNA)を使用して、RNA除去によって凝集されたタンパク質をリフォールドさせることができることを示した。
【００３７】
本発明は、タンパク質凝集と関連する疾患を治療及び/又は予防する方法であって、RNAを安定化することによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を阻止するステップ、又は除去されたRNAを効果的に置き換えることによってRNA除去と関連するタンパク質凝集を解消する(reverse)するステップを含む、方法に関する。
【００３８】
RNA除去
用語「RNA除去」は、本明細書で定義される場合、無傷のRNA分子の全体量を低減するか、又はネイティブな(変化していない)構造を有するRNAの全体量を低減することを意味する。用語「RNA除去」はまた、本明細書で定義される場合、RNA-タンパク質相互作用の破壊又は除去を指してもよい。
【００３９】
RNA除去は、ネイティブな(変化していない)構造を有するRNAの全体量の減少によって生じ得る(すなわち、RNA構造完全性の喪失)。RNAの構造は、例えば、細胞内の二価イオン(例えば、Mg2+、Ca2+、又はZn2+)のレベルの変化(例えば、低減)、又は、RNA分子と結合している二価イオンのレベルの変化(例えば、低減)によって、変化し得る。RNA除去は、RNA分子の二次構造の喪失、又は三次若しくは四次構造の喪失を包含し得る。
【００４０】
RNA除去は、RNA分解であってよく、又はRNA分解を含んでよい。
【００４１】
用語「分解」は、その従来の意味で本明細書において使用され、RNAの破壊に関する。RNAの破壊は、隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合の切断を介したRNA分子の一次構造の破壊によって達成され得る。
【００４２】
RNAの安定化
RNA構造的完全性(例えば、RNA二次構造)は、いくつかの要因、例えば、細胞内の及び/又はRNA分子と結合している二価イオン(例えば、Mg2+、Ca2+、又はZn2+)のレベルに依存する。
【００４３】
本発明の方法は、細胞におけるイオンバランスを変更することによって、被験体における細胞中のRNAを安定化することを含み得る。このような安定化は、細胞内のRNA構造の維持を可能とし、したがって、タンパク質凝集を低減する。本明細書で使用される場合、「RNAを安定化すること」はまた、RNA-タンパク質相互作用の安定化を指し得る。
【００４４】
細胞の細胞内イオンバランスは、イオンチャンネルブロッカー(アンタゴニスト)及び/又はアクチベーター(アゴニスト)の投与によって、変更され得る。例えば、細胞内カルシウムレベルは、フルナリジン又はフルスピリレン(共にCaチャンネルブロッカー)によって変更され得る。カリウムは、例えば、ジアゾキシド、ミノキシジル、若しくはニコランジル(全てアクチベーター)又はアミオダロン(Kチャネルブロッカー)の投与によって変更され得る。増加した細胞内ナトリウムは、α-ポンピリドトキシンの投与によって達成され得るか、又はキニジン、リドカイン若しくはエンカイニドの投与によって減少され得る。銅及び亜鉛のレベルは、クリオキノール若しくはその誘導体、PBT2(Prana Biotechnology化合物)の使用によって低減され得る。
【００４５】
除去されたRNAの置換
本発明者らは、RNAの除去によって誘導されたタンパク質凝集が、ポリアニオン性分子の添加によって解消され得ることを示した。これらの分子は、RNAの除去時に凝集したタンパク質のリフォールディングを誘導することができ、したがって、除去されたRNAを効果的に置き換えることができる。
【００４６】
本発明の文脈において、RNAは、非凝集状態でタンパク質を維持、保存若しくは持続するか、又はRNA除去によって以前に凝集したタンパク質のリフォールディングを促進する能力を有する分子によって効果的に置き換えられてよい。
【００４７】
RNAは、ポリアニオン性分子、例えば核酸、例えばRNA、「ロックド核酸」(LNA)、又はDNA(例えば、ゲノムDNA["gDNA"])によって効果的に置き換えられてよい。
【００４８】
核酸はRNAであってもよい。RNAは、一本鎖又は二本鎖であり得る。RNAは、「ロックド核酸」(LNA)を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなってよい。RNAは、「ペプチド核酸」(PNA)を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなってよい。RNAは、タンパク質コード化RNA又は非タンパク質コード化RNA(例えば、リボソームRNA、トランスファーRNA、又は反復RNA)であってよい。
【００４９】
タンパク質フォールディングの促進においてRNAを置換することができ、したがって、除去されたRNAを効果的に置き換えることができる分子は、本明細書の実施例のセクションに記載のRNAse誘発タンパク質凝集及びリフォールディングアッセイを用いて容易に決定することができる。
【００５０】
一実施形態では、RNAは、核酸アプタマー、例えば、RNAアプタマー又はDNAアプタマーによって効果的に置き換えられる。したがって、一実施形態では、用語「核酸」にはアプタマーが含まれる。アプタマーは、高い親和性で特定の分子標的に結合することができる一本鎖核酸であり得る。
【００５１】
ロックド核酸(LNA)
LNAヌクレオチドのリボース部分は、2'酸素と4'炭素を接続する追加の架橋を用いて修飾される。架橋は、3'-エンド(ノース(North))コンフォメーションでリボースを「ロック」し、このロックされたリボースコンフォメーションは、塩基の積層及び骨格の予備組織化を増強する。
【００５２】
本発明の方法において使用されるLNAは、LNAヌクレオチド(複数可)を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなってよい。
【００５３】
リボソームRNA
RNAはリボソームRNAであってよい。
【００５４】
リボソームリボ核酸(rRNA)はリボソームのRNA成分であり、全ての生物におけるタンパク質合成に不可欠である。それは、約60質量％のrRNA及び40質量％のタンパク質であるリボソーム内の主要な材料を構成する。リボソームは、2種の主なrRNA及び50種以上のタンパク質を含有する。大リボソームサブユニット中のrRNAは、リボザイムとして作用し、ペプチド結合形成を触媒する。
【００５５】
大部分の真核細胞は、小リボソームサブユニット中に18S rRNAを含み、一方、大リボソームサブユニットは、3つのrRNA種(5S、5.8S及び28S)を含有する。
【００５６】
リボソームRNA又はrRNAという用語は、他の種類の転写産物に見られるrRNA様配列を含む。多くの真核細胞mRNAは、センス及びアンチセンスの両配向で存在する28S及び18S rRNAのセグメントに類似する配列を含有する(Mauro and Edelman (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:422-427)。
【００５７】
本発明において、除去されるRNAは、タンパク質凝集と関連する疾患を治療及び/又は予防するために、rRNA又はその構造模倣体によって効果的に置き換えられてよい。
【００５８】
rRNAは、リボソームRNAであってよく、それを含んでよく、又はそれから本質的になってよい。
【００５９】
rRNAは、18S及び/又は28S rRNAであってよく、それを含んでよく、又はそれから本質的になってよい。
【００６０】
rRNAは、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％のリボソームRNAを含んでよい。増加するRNAは、rRNAからなってよい(すなわち、有効に100％のrRNAであってよい)。
【００６１】
DNA
用語「DNA」は、ゲノムDNA、並びに合成の若しくは天然に存在しないDNAを含む。DNAは、反復DNA要素、例えばLINE(長鎖散在反復配列(Long Interspersed Nuclear Element))及びSINE(短鎖散在反復配列(Short Interspersed Nuclear Element))であってよい。
【００６２】
ゲノムDNA(gDNA)は、プラスミドなどの染色体外DNAとは対照的に、染色体DNAを指す。
【００６３】
G-四重鎖構造
RNA、LNA又はDNA(例えば、gDNA)は、G-四重鎖(G-quadruple/G-quadruplex)構造(複数可)を形成することが可能であってよい。
【００６４】
G-四重鎖(G-テトラドとしても知られている)は、グアニンに富み、4本鎖構造を形成することができる核酸配列である。4つのグアニン塩基は、フーグスティーン水素結合を介して結合して、グアニンテトラドと呼ばれる四角い平面構造を形成することができ、2つ以上のグアニンテトラドが互いの上に積み重なり、G-四重鎖を形成することができる。四重鎖構造は、テトラドの各対の間の中央チャネルに存在するカチオン、特にカリウムの存在によってさらに安定化される。
【００６５】
G4四重鎖を形成することができる広範な配列及びモチーフは、例えば、Maizels N ＆ Gray LT(2013)(The G4 Genome. PLoS Genet 9(4): e1003468. doi:10.1371/journal.pgen.1003468)に記載されるように、当技術分野で公知である。
【００６６】
G-四重線は、分子内、二分子又は四分子であり得る。テトラドを形成する鎖の方向又は鎖の部分に応じて、構造は平行又は反平行と記載され得る。
【００６７】
オルトバナジン酸ナトリウム
除去されたRNAは、細胞におけるタンパク質フォールディングの促進においてRNAを置換することができる分子を提供するか、又はその量を増加させることによって置き換えられてよい。このような分子の例は、オルトバナジン酸ナトリウム又はその誘導体、構造模倣体若しくは修飾型である。
【００６８】
オルトバナジン酸ナトリウム(Na3VO4)は四面体VO43-を含有する。これは、タンパク質チロシンホスファターゼ、アルカリホスファターゼ及び多くのATPaseの阻害剤であり、リン酸アナログとして作用する可能性が最も高い。VO43-イオンは、ほとんどのタンパク質チロシンホスファターゼの活性部位に可逆的に結合する。
【００６９】
本発明者らは、オルトバナジン酸ナトリウムが、RNA除去によって誘導されるタンパク質凝集を阻害できることを実証した。
【００７０】
オルトバナジン酸ナトリウムの誘導体、構造模倣体及び修飾型の例としては、四面体VO43-イオンを含む他の化合物、例えばオルトバナジン酸カリウムが挙げられる。バナジウム錯体の例としてはまた、アンモニウム(2,6-ピリジンジカルボン酸)ジオキソバナデート(NH4[V(O2)(ジピック])、ビス(マルトラート)オキソバナジウム(BMOV)、ビス(N',N'-ジメチルビグアニダート)オキソバナジウム(VO(metf)2・H2O)、カリウムオキサラートオキソジペルオキソバナデート(K3[VO(O2)2(ox)]・2H2O)、アンモニウム(2,2'-ビピリジン)オキソジペルオキソバナデート((NH4)[VO(O2)2(bipy)]・4H2O)、及びアンモニウム(1,10-フェナントロリン)オキソジペルオキソバナデート((NH4)[VO(O2)2(phen)]・2H2O)が挙げられる。
【００７１】
医薬組成物
RNA、LNA若しくはDNA(例えば、gDNA)又はオルトバナジン酸ナトリウム(又はその構造模倣体)は、医薬組成物の形態でそれを必要とする被験体に投与され得る。
【００７２】
このように、RNA、LNA若しくはDNA(例えば、gDNA)又はオルトバナジン酸ナトリウムは、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントと共に投与され得る。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な医薬実務に関して選択され得る。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として(又はそれに加えて)、任意の好適な結合剤(複数可)、滑沢剤(複数可)、懸濁剤(複数可)、コーティング剤(複数可)、可溶化剤(複数可)、及び他の担体薬剤を含み得る。
【００７３】
典型的には、医師は、個々の被験体に最も適した実際の投与量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重及び応答によって変化する。投与量は、タンパク質凝集を低減及び/又は防止するのに十分であるようなものである。
【００７４】
治療及び/又は予防
タンパク質凝集と関連する疾患の予防方法は、疾患の原因を防止する若しくは減じるための、又は疾患と関連する少なくとも1つの症状の発症を軽減若しくは防止するための、疾患にまだ罹患していない、及び/又は疾患の症状を示していない被験体に対する方法の予防的実施に関する。被験体は、タンパク質凝集と関連する疾患の素因を有し得るか、又はその発症の危険性があると考えられ得る。
【００７５】
タンパク質凝集と関連する疾患の治療方法は、この方法の治療的実施に関する。本明細書において、疾患と関連する少なくとも1つの症状を軽減、低減若しくは改善し、及び/又は疾患の進行を減速、低減、若しくは阻止するために、RNAは安定化されるか、又は除去されたRNAは既存の疾患若しくは状態を有する被験体の細胞において効果的に置き換えられる。
【００７６】
使用
本発明は、タンパク質凝集体の存在と関連する疾患の治療及び/又は予防に使用するための、RNA、LNA、DNA(例えばgDNA)、オルトバナジン酸ナトリウム又はその構造模倣体を提供する。
【００７７】
RNA、LNA、gDNA又はオルトバナジン酸ナトリウム又はその構造模倣体は、本明細書に記載の方法に使用するためのものであってよい。
【００７８】
タンパク質
用語「タンパク質」は、通常の意味で使用され、典型的には隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合によって、互いに接続された一連の残基、典型的にはL-アミノ酸を意味する。用語「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、ペプチド又はポリペプチドと同義である。
【００７９】
タンパク質凝集
用語「タンパク質凝集」は、ミスフォールドしたタンパク質が、細胞内又は細胞外のいずれかで、蓄積して一緒に塊になる生物学的現象を指す。ミスフォールドしたタンパク質は、フォールドしていないタンパク質の露出した疎水性部分が、他のフォールドしていない又はミスフォールドしたタンパク質の露出した疎水性パッチと相互作用し、自発的にタンパク質凝集をもたらすため、凝集体を形成し得る。ミスフォールドしたタンパク質の凝集体への形成は、プラーク形成と呼ばれ得る。
【００８０】
本発明は、RNAを安定化し、又は細胞において除去されたRNAを効果的に置き換え、それによって、それらのネイティブな構造の維持にRNAの存在を必要とするタンパク質の凝集体の形成を低減することによって、タンパク質凝集と関連する疾患を予防及び/又は治療する方法を提供する。
【００８１】
いくつかの突然変異は、ミスフォールディング及び凝集に特に感受性のあるタンパク質をもたらす。本発明の方法において、タンパク質は、1つ以上のそのような誘因となる突然変異を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００８２】
タンパク質の1つ以上は、凝集後にユビキチン化されてよい。タンパク質のユビキチン化は、以下に記載される疾患のうちのいくつかの特徴である。
【００８３】
被験体
被験体は、タンパク質凝集と関連する疾患、例えば以下に記載される疾患に罹患しているか、又はその危険性がある任意の個体であってよい。
【００８４】
被験体は、哺乳動物であってよい。例えば、被験体は、霊長類、マウス、ラット、モルモット又はウサギであってよい。
【００８５】
被験体は、ヒトであってよい。
【００８６】
疾患
本発明の方法によって治療及び/又は予防する疾患は、タンパク質凝集体の存在と関連する任意の疾患であってよい。Chiti et al., Annu. Rev. Biochem. 2006. 75:333-66に記載されるように、広範なこのような疾患が当技術分野で公知である。
【００８７】
成熟タンパク質凝集体及び未成熟タンパク質凝集体の両方は、細胞に対して毒性であり得る。未成熟凝集体の疎水性パッチは、細胞の他の成分と相互作用し、それらを損傷し得るが、一方、成熟凝集体は細胞膜を破壊し、それらを透過性にし得る。
【００８８】
タンパク質凝集体の形成は様々な疾患と関連し、タンパク質凝集体のその後の毒性は疾患の発症機序に機構的に関与し得る。
【００８９】
本発明の方法は、タンパク質凝集と関連する疾患を治療及び/又は予防するために使用される。
【００９０】
いくつかの疾患はタンパク質凝集体の形成と関連しており、それらとしては、限定されないが、様々な神経変性疾患、例えばアルツハイマー病(AD)、運動ニューロン疾患(MND)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、前頭側頭型認知症及びプリオン病が挙げられる。さらに、タンパク質凝集は、II型糖尿病及び封入体筋炎/ミオパチーほど多様な他の疾患において生じ得る。
【００９１】
神経変性疾患は、ニューロンの死を含めた、ニューロンの構造又は機能の進行性喪失を特徴とする疾患を指す。多くの同定された病態生理学的特徴、特にタンパク質凝集体の出現及びニューロンの死は、神経変性疾患の間で類似し得る。
【００９２】
本発明の方法は、神経細胞においてタンパク質凝集のレベルを低減するために使用され得る。用語「神経細胞」は、中枢神経系の細胞を指す。特に、神経細胞は、変性が神経変性疾患において生じる中枢神経系の領域と関連し得る。
【００９３】
ADは、認知症の最もよくある形態であり、65歳を超える人に一般に診断されるが、より一般的ではない早発型ADはずっと早期に生じ得る。ADは、大脳皮質及び特定の皮質下領域におけるニューロン及びシナプスの喪失を特徴とする。この喪失は、側頭葉及び頭頂葉、並びに前頭皮質及び帯状回の部分における変性を含めた、罹患領域の全体的萎縮をもたらす。ベータ-アミロイドペプチド及び他の細胞性物質を含むアミロイドプラークは、ニューロンの外側及び周囲に存在し得るが、一方、過剰リン酸化された微小管結合タンパク質タウの凝集体を含む神経原線維変化は、細胞内に存在し得る。レビー小体もADにおいて生じ得る。ADの症例の大部分は散発性であり、このことは、それらが遺伝的に受け継がれないことを意味するが、いくつかの遺伝子は危険因子として作用し得る。一方、症例の約0.1％は、常染色体優性遺伝の家族性形態であり、通常65歳より以前に発症する。疾患のこの形態は早発型家族性ADとして知られている。
【００９４】
ADを予防及び/又は治療するために、本発明の方法は、Aβ、MAPT及び/又はSNCAの凝集を低減し得る。
【００９５】
本発明の方法は、MAPT凝集を低減し、また、MAPTの過剰リン酸化を低減し得る。MAPTの過剰リン酸化は、AD及び他のタウパチー(taupathy)の特徴である。
【００９６】
MNDは、急速に進行性の衰弱(weakness)、筋萎縮及び線維束性攣縮及び筋肉の痙性を特徴とする。MNDの病態生理学的特徴は、脳の運動皮質、脳幹及び脊髄における上位運動ニューロン及び下位運動ニューロンの両方の喪失を含み得る。それらの破壊の前に、運動ニューロンは、それらの細胞体及び軸索中にタンパク質凝集体を発達させ、それはユビキチンを含有し、一般に、ALS関連タンパク質: SOD1、TAR DNA結合タンパク質(TARDBP)又はFUSのうちの1つを取り込み得る。MND症例の約5％のみが該疾患の家族歴と関連するが、いくつかの遺伝子における突然変異が様々な種類のMNDとリンクしている。これらの遺伝子の例としては、限定されないが、SOD1、ALS2、FUS、ANG及びTARDBPが挙げられる。
【００９７】
PDは、黒質、より具体的には中脳の緻密部の前側部分におけるドーパミン生成細胞の喪失を特徴とする。該疾患の経過の初期には、最も明らかな症状は運動に関連しており、震え、硬直、運動の緩慢、及び歩行困難を含む。その後、認知及び行動の問題が生じ、認知症が該疾患の進行期に一般的に生じ得る。他の症状としては、感覚、睡眠及び感情の問題がある。ドーパミン生成細胞の喪失は、ニューロン中に蓄積し、レビー小体を形成する、ユビキチンに結合したα-シヌクレインを含むタンパク質凝集体の形成に起因して生じ得る。病理学的知見に基づく該疾患の分類であるBraak病期分類によれば、レビー小体は、最初に嗅球、延髄及び橋被蓋に現れ、この段階の個体は無症候性である。疾患が進行するにつれ、その後、レビー小体は黒質、中脳及び基底前脳の領域において発達し、最終段階では新皮質において発達する。
【００９８】
本発明の方法は、SNCAの凝集を低減し、SNCAの過剰リン酸化を低減し得る。SNCAのリン酸化は、PDと関連している。
【００９９】
HDは、筋肉の協調性に影響を及ぼし、認知低下及び精神医学的兆候をもたらす。該疾患は、CAGトリヌクレオチド反復が閾値レベルを超えて拡大するようになる、ハンチンチン(HTT)遺伝子における常染色体優性突然変異によって引き起こされ得る。CAG反復は成熟ハンチンチン(Htt)タンパク質においてポリグルタミン鎖をコードし、この鎖は個体間で長さが異なり得る。しかし、ポリグルタミン鎖がある長さを超えて伸長すると、それは、必要に応じてフォールドすることができない変異体ハンチンチン(mHtt)タンパク質の形成を引き起こす。このミスフォールディングは、ミスフォールドしたmHttを含むタンパク質凝集体の形成をもたらす。
【０１００】
前頭側頭型認知症は、時間とともに側頭葉の変性へと進行し得る、脳の前頭葉の進行性悪化に起因し得る。前頭側頭型認知症は、罹患細胞に対して細胞内又は細胞外におけるタンパク質凝集体の形成と関連し得る。タンパク質凝集体は、タウ、TARDBP及びFUSを含み得る。
【０１０１】
プリオン病は、主要なタンパク質(PrP)などのプリオンタンパク質によって伝播する感染性疾患のクラスであり、クロイツフェルト・ヤコブ病、新たな変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(nvCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症及びクールーを含む。それらは、凝集体へと形成するミスフォールドしたプリオンタンパク質によって引き起こされ、脳細胞の喪失をもたらす。該疾患は、健常なヒト又は動物が該疾患を保有するヒト又は動物に由来する組織を摂取した場合に伝播する。
【０１０２】
II型糖尿病は、インスリン抵抗性及び相対的インスリン欠乏の関連における高血糖を特徴とする代謝障害である。それは、心血管疾患のリスクの増加、下肢切断の必要性の増加、失明、腎不全及び認知症を含めた、いくつかの合併症と関連する。II型糖尿病は、膵臓細胞の喪失及びインスリン生産のレベルの低下をもたらす、膵臓における膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)からなるアミロイドタンパク質凝集体の形成と関連し得る。
【０１０３】
封入体ミオパチーは炎症性筋疾患であり、腕及び肢の筋肉において最も明らかな、遠位筋及び近位筋の両方のゆっくり進行する衰弱及び萎縮を特徴とする。それは、アミロイド-β、リン酸化タウタンパク質、及びAD患者の脳にも蓄積される少なくとも20種の他のタンパク質を含む、筋線維におけるタンパク質凝集体の形成と関連し得る。
【０１０４】
診断
さらなる態様において、本発明は、タンパク質凝集と関連する疾患を診断する方法に関する。本発明はまた、被験体がタンパク質凝集と関連する疾患を発症する危険性があるかどうかを決定する方法を提供する。
【０１０５】
上記方法のそれぞれは、被験体に由来するサンプル中の有効なRNAのレベルを決定するステップを含む。
【０１０６】
サンプル中の有効なRNAのレベルは、タンパク質のフォールディングを維持及び/又は促進する(すなわち、タンパク質凝集体のレベルを阻止及び/又は低減する)ことができるRNAのレベルを指す。
【０１０７】
有効なRNAのレベルは、より少ない量/総量のRNA、RNA完全性の喪失のため、又はRNA上の特異的転写後修飾(例えば、メチル化)の沈着若しくは除去のために、サンプル中で低減され得る。
【０１０８】
完全性の喪失は、サンプル中にネイティブな(変化していない)構造を有するRNAの総量の減少を指す。RNAの構造は、例えば、細胞内の二価イオン(例えば、Mg2+、Ca2+、又はZn2+)のレベルの変化(例えば、低減)によって、又はRNA分子と関連する二価イオンのレベルの低減によって、変化し得る。
【０１０９】
有効なRNAのレベルの低減又は減少は、RNA分解によって引き起こされ得る。
【０１１０】
サンプルは、血清、血漿、脳脊髄液サンプル、又は組織サンプル、例えば、脳、膵臓若しくは筋肉サンプルであってもよい。
【０１１１】
RNAは、ヒトの血液、白血球、脳脊髄液(CSF)、血漿、血清、又は生検(例えば、脳)から単離され得る。キット及び試薬、例えば、Trizol LS(Life Technologies)又はQIAamp RNA Blood Mini Kit(Qiagen)は、これらの供給源からRNAを単離するために市販されている。
【０１１２】
RNAの量は、定量的PCR(q-PCR)、ノーザンブロット又は特異的相補的プローブ(例えば、それらの標的に結合した場合にのみ蛍光を発する分子ビーコン)によって決定され得る。RNAの完全性は、ノーザンブロット及び/又は相補的プローブによって決定され得る。メチル化RNAは、バイサルファイト配列決定、特異的8-OHG抗体(例えば、Neurochem Res (2006) 31:705-710)を用いた免疫沈降による酸化RNA(8-OHG)と続くq-PCR又はアンチセンス分子プローブ(例えばLNA)によって同定され得る。他の修飾は、質量分析によって決定することができる。
【０１１３】
サンプル中の有効なRNAのレベルは、対照との比較によって決定される。
【０１１４】
「対照」への言及は、技術データの正確な解釈を容易にするために当業者が使用するデータを広く含む。したがって、「対照レベル」は「参照レベル」と交換可能である。例示的な例では、有効なRNAのレベルは、被験体が特定の部位においてタンパク質凝集と関連する状態を有すると診断されているコホート及び被験体が特定の部位においてタンパク質凝集と関連する状態を有さないと予め決定されているコホートから選択された対照被験体の1つ以上のコホート(集団/群)における有効なRNAのそれぞれのレベルと比較される。
【０１１５】
対照が、特定の部位においてタンパク質凝集と関連する状態を有さないことが予め決定されているコホートに由来する場合、試験サンプルにおける以下の決定は、タンパク質凝集と関連する疾患を示し得る: 対照レベルよりも2、3、5、10、100、若しくは1000倍少ないRNAの量、対照サンプルと比較したRNA分解レベルの増加(すなわち、2、3、5、10、100若しくは1000倍大きい)又はより低いレベルのRNA完全性(すなわち、2、3、5、10、100若しくは1000倍低い)、対照サンプルと比較した特異的転写後修飾のレベル若しくはRNAの転写後修飾の組み合わせの差異。
【０１１６】
対照が、特定の部位においてタンパク質凝集と関連する状態を有すると診断されているコホートに由来する場合、試験サンプルにおける以下の決定は、タンパク質凝集と関連する疾患を示し得る: 対照レベルの1、2、5、10又は20％以内のRNAの量、対照サンプルと同様の(すなわち、対照レベルの1、2、5、10又は20％以内の)試験サンプル中のRNA分解又はRNA完全性のレベル、対照サンプルと比較した特異的転写後修飾のレベル又はRNAの転写後修飾の組み合わせの類似性。
【０１１７】
特定の部位における有効なRNAの所与のレベル又は状態(すなわち、完全性又は修飾状態)の検出のための対照又は参照レベルは、データベースに保存されてよく、被験体に対して実施される方法の結果を解釈するために使用されてよい。
【０１１８】
動物モデル
さらなる態様において、本発明は、タンパク質凝集と関連する疾患に対する動物モデルであって、タンパク質凝集が、動物における細胞内のRNAの除去によって誘導される、動物モデルに関する。
【０１１９】
RNAは、リボソームRNAであってよい。
【０１２０】
用語「RNA除去」は、本明細書で定義される場合、無傷のRNA分子の全体量を低減するか、又は動物における細胞内でネイティブな(変化していない)構造を有するRNAの全体量を低減することを意味する。
【０１２１】
RNA除去は、RNA分解であってよく、又はRNA分解を含んでよい。
【０１２２】
用語「分解」は、その従来の意味で本明細書において使用され、細胞又は細胞溶解物内のRNAの破壊に関する。RNAの破壊は、隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合の切断を介したRNA分子の一次構造の破壊によって達成され得る。
【０１２３】
RNAの分解は、リボヌクレアーゼの使用によって達成され得る。リボヌクレアーゼ(RNase)は、RNA分子の、より小さな成分への分解を触媒するヌクレアーゼの種類である。RNaseは、具体的な酵素に応じて一本鎖又は二本鎖RNAのいずれかを分解することができ、それらの作用機序によって、エンドリボヌクレアーゼ及びエキソリボヌクレアーゼに分類されると一般に定義される。
【０１２４】
エキソリボヌクレアーゼは、RNA分子の5'末端又は3'末端のいずれかから末端ヌクレオチドを除去することによってRNAを分解する酵素である。5'末端からヌクレオチドを除去する酵素は5'-3'エキソリボヌクレアーゼと称され、3'末端からヌクレオチドを除去する酵素は3'-5'エキソリボヌクレアーゼと称される。エキソリボヌクレアーゼの例としては、限定されないが、RNase R、RNase II、Rrp44、RNase D、RNase T、PM/Scl-100、オリゴリボヌクレアーゼ、RNase BN、PNPase、PM/Scl-75、RNase PH、RRP4、エキソリボヌクレアーゼI及びエキソリボヌクレアーゼIIが挙げられる。
【０１２５】
エンドリボヌクレアーゼは、RNA分子中の隣接するヌクレオチド(該ヌクレオチドのいずれもRNA分子の末端ヌクレオチドではない)の間のホスホジエステル結合を切断する酵素である。エンドリボヌクレアーゼの例としては、限定されないが、RNase III、RNase A、RNase T1、RNase 1f、RNase H、RNase V1が挙げられ、並びにRNase P及びRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)のような、RNAとのタンパク質の複合体も挙げられる。
【０１２６】
RNA除去は、リボヌクレアーゼの投与、又はリボヌクレアーゼの発現若しくは活性を増加させることを含み得る。
【０１２７】
リボヌクレアーゼはRNase A、RNase T1及び/又はRNase 1fであってよい。
【０１２８】
あるいは、RNA除去はRNAの構造を変化させることを含んでよい。これは、RNAの、タンパク質を可溶化する能力を低減する。RNAの構造は、RNAフォールディングに重要な二価イオン、例えばMg2+、Ca2+、若しくはZn2+の濃度を変化させることによって(例えば除去することによって)変更し得る。EDTAなどの薬剤を使用して、二価イオンを除去し、リボソームを解離させるために予め使用することができる。
【０１２９】
RNAの除去は、アンチセンスRNA又は短鎖阻害RNA(siRNA)の動物への投与によって達成されてもよい。
【０１３０】
RNAの除去は、動物中の細胞においてRNA発現の低減を誘導することによって達成されてもよい。
【０１３１】
動物は、哺乳動物であってよい。例えば、動物は、霊長類、マウス、ラット、モルモット又はウサギであってよい。
【０１３２】
RNAの有効量の低減後に凝集するタンパク質は、以下から選択され得る: アミロイド-β、MAPT、SCNA、TARDBP、FUS、HTT、PrP、ニューロフィラメント(NF-H)、及びα-シヌクレイン。
【０１３３】
RNAの除去は、複数のタンパク質の同時凝集を引き起こし得る。複数のタンパク質は、一緒に凝集し、複数のタンパク質の種類からなる凝集体を形成してよい。
【０１３４】
「複数」は、RNA除去が、少なくとも2種のタンパク質、例えば、3、4、5、6、7、8又は9種のタンパク質の凝集を引き起こすことを示す。
【０１３５】
複数は、以下のタンパク質の2、3、4、5、6、7、8種又は全てを含んでよい: アミロイド-β、MAPT、SCNA、TARDBP、FUS、HTT、PrP、ニューロフィラメント(NF-H)及びα-シヌクレイン。
【０１３６】
リボヌクレオシドバナジル
本発明は、細胞又は細胞溶解物において複数のタンパク質の凝集を開始させるための、リボヌクレオシドバナジルの使用にさらに関する。
【０１３７】
バナジルリボヌクレオシドは、リボヌクレアーゼの低分子量阻害剤である。それは、RNA精製及び操作の間、RNAseの移行状態アナログ阻害剤として使用される。本発明者らは、細胞溶解物に添加された場合、それが実質的なタンパク質凝集を引き起こすことを驚くべきことに示した。
【０１３８】
本発明はまた、タンパク質凝集と関連する疾患の動物モデルも提供し、その動物では、タンパク質凝集が、リボヌクレオシドバナジル及び/又は二価イオンを用いて誘導される。
【０１３９】
動物モデルは、本明細書に定義される動物であってよい。
【０１４０】
IN VITROリフォールディング
本発明者らは、in vitroにおいてRNAでリフォールドされたタンパク質が、活性ATP加水分解で実証されたように、機能的になることを示した。
【０１４１】
このように、一態様では、本発明は、タンパク質のフォールディングを促進するin vitro方法であって、フォールディングを促進するために、フォールドされていない又は部分的にフォールドされたタンパク質を、RNA又はDNA(例えばゲノムDNA)と接触させるステップを含む、方法に関する。
【０１４２】
一態様では、本発明は、タンパク質のフォールディングを促進するin vitro方法であって、フォールディングを促進するために、フォールドされていない又は部分的にフォールドされたタンパク質を、核酸、例えば、RNA、DNA(例えばゲノムDNA)若しくはLNAと、又はオルトバナジン酸ナトリウム、又はその誘導体、構造模倣体、若しくは修飾型と接触させるステップを含む、方法に関する。
【０１４３】
別の態様では、本発明は、タンパク質のフォールディングを促進する方法であって、フォールディングを促進するために、フォールドされていない又は部分的にフォールドされたタンパク質を、核酸、例えば、RNA、DNA(例えばゲノムDNA)若しくはLNAと、又はオルトバナジン酸ナトリウム、又はその誘導体、構造模倣体、若しくは修飾型と接触させるステップを含み、単離された細胞において実施される、方法に関する。一実施形態では、単離された細胞は、細菌細胞(例えば大腸菌(E. coli)細胞)である。一実施形態では、単離された細胞は、真核細胞(例えば、酵母細胞、又は哺乳動物若しくはゼブラフィッシュなどの動物から単離された動物細胞)である; 一実施形態では、単離された細胞は、哺乳動物細胞である。
【０１４４】
用語「フォールドされていない」及び「部分的にフォールドされた」は、ネイティブな構造を有さないタンパク質を指す(すなわち、RNA構造の完全性の喪失)。特に、これらの用語は、機能性タンパク質を生成するのに必要な二次及び三次構造を有さないペプチドを指す。
【０１４５】
「フォールディングを促進する」とは、タンパク質が必要な二次及び三次構造を形成し、したがって機能的であることを意味する。タンパク質の生産的フォールディングは、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができ、それは、フォールドされるタンパク質の具体的な機能に依存して変化する。
【０１４６】
本発明は、フォールドされていない又は部分的に未フォールドのタンパク質、例えば治療用タンパク質又は生物学的試薬、例えば酵素、抗体、タンパク質リガンド、受容体、構造タンパク質若しくは補因子のin vitroフォールディングを促進するための、RNA又はDNA(例えば、ゲノムDNA)の使用をさらに提供する。
【０１４７】
RNA又はDNA(例えば、ゲノムDNA)は、G-四重鎖構造を含み得る。
【０１４８】
上記の方法又は使用は、機能的にフォールドされた膜貫通タンパク質を提供するために使用され得る。
【０１４９】
用語「膜貫通タンパク質」は、膜全体をわたる膜タンパク質を指す。膜貫通タンパク質の例としては、α-ヘリックス膜貫通タンパク質、例えばGタンパク質共役受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
これらのタンパク質は、通常、凝集する傾向があるため生産するのが非常に困難であり、この事実は、タンパク質データバンク(PDB)にほとんど表示されていないことに反映される。しかし、膜貫通タンパク質は、最もドラッガブル(druggable)で需要の多い標的の1つを表す。これらの標的に対する薬物のスクリーニングは、例えば、イオンチャネルが異所的に発現される細胞ベースのアッセイによってしばしば達成される。しかし、これらのアッセイの細胞性は、それらを高価で煩雑にする。正確にフォールドされた膜貫通タンパク質の製造は、薬物スクリーニングアッセイにとって重要な利点であるが、この領域外の潜在的な用途も有する。
【０１５１】
上記方法又は使用は、酵素、抗体、タンパク質リガンド、受容体、構造タンパク質又は補因子などの機能的にフォールドされた治療用タンパク質又は生物学的試薬を提供するために使用され得る。
【実施例】
【０１５２】
本発明は、実施例によってここにさらに記載されるが、それは、当業者が本発明を実施するのを補助するために役立つことが意図され、本発明の範囲を限定することは決して意図されない。
【０１５３】
[実施例1]
タンパク質のRNase媒介沈殿
ヒトニューロン及びマウス大脳皮質から調製された溶解物をRNAse A及びT1で処理し、沈殿したタンパク質を解析した。RNase処理は、ヒトニューロン及びマウス脳の両方からいくつかのタンパク質の濃度依存的沈殿を引き起こした(図6b及びc)。インプット、及びRNaseによって沈殿したサンプルから同量のタンパク質のタンパク質プロファイルを比較することによって、沈殿したタンパク質の多くが、インプットと比較して富化されたことが示された。インプット及び上清の間で検出可能な差異は観察されなかった。さらに、RNase媒介消化の完了時のRNAの解析により、回収されたRNAの量及びサイズの分布が、RNase濃度の増加とともに減少したことが示された(図1)。
【０１５４】
[実施例2]
RNaseの供給源の影響の決定
様々な異なるRNaseを用いて凝集作用を試験した。一本鎖特異的RNaseの供給源はタンパク質沈殿の全体的効率に重要ではないことが示され、RNase A、RNase T1及びRNase 1fのそれぞれが、RNase/T1混合物と類似の効率を示した(図2及び6d)。しかし、二本鎖RNAに特異的なRNase V1、又はDNase Iでの消化は、タンパク質沈殿を引き起こすことができなかった(図2)。EDTAを緩衝液から除き、Mg2+で置き換えた場合にのみ、RNAse V1はタンパク質沈殿を引き起こし(図6d)、RNAse V1の二価イオンに対する要求性と一致した。しかし、DNAse Iは両条件下でタンパク質沈殿を引き起こすことができなかった(図6d)。リボヌクレアーゼ阻害剤をRNAse Aと一緒に溶解物に添加した場合に、バックグラウンドを超えたタンパク質は沈殿しなかった(図6e)。さらに、リボヌクレアーゼ分解産物がタンパク質沈殿に関与していないことを確実にするために、単離したRNAを固定化したRNAse Aで又はアルカリ加水分解によって消化し、次いで、消化物(RNAse A無し)を細胞溶解物に添加した。酵素的又は化学的に分解したRNAの添加によって、バックグラウンドを超えたタンパク質は沈殿しなかった(図6f)。まとめると、これらの実験は、沈殿したタンパク質の溶解性が、無傷の細胞性RNAに依存することを示す。 
【０１５５】
[実施例3]
RNA除去によって沈殿したタンパク質の同定
ヒトニューロンにおいてRNA除去によって沈殿されるタンパク質を同定するために、沈殿したタンパク質を、SDS-PAGEによって2つの独立した実験から分離し、その後、タンデム質量分析(LC-MS/MS)解析を行った。両サンプルに共通した1600種を超えるタンパク質が同定され、75％を超える重複を示した(図7a)。データセットの遺伝子オントロジー解析により、第一に、サイトゾルタンパク質及びリボ核タンパク質複合体の過剰提示、並びに第二に、タンパク質-タンパク質相互作用(60％、982)、ヌクレオチド結合(26％、438)、RNA結合(13％、214)、及び構造リボソームタンパク質(95)に関与するタンパク質の顕著な過剰提示が示される(図7b)。沈殿したタンパク質の間に明らかな配列又は構造類似性はない。いくつかのRNA結合タンパク質における非構造化、低複雑度領域は、タンパク質凝集を媒介し、ストレス顆粒への動員に必要であることが以前に示唆されている(Kato et al (2012) Cell 149, 753-767)。これらの研究において同定されたタンパク質のいくつかはまた、RNA除去後に凝集するが(以下の表1を参照)、非構造(US)領域及び低複雑度(LC)領域の両方は、データセット中に有意に不十分に提示され(under-represented)(図2c、USについてp=2.9×10-18及びLCについてp=7.2×10-5)、このことは、タンパク質の大部分が球状であることを示し、この知見は、球状タンパク質がより凝集しやすい領域を有するという考えと一致している。
【０１５６】
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【０１５７】
[実施例4]
神経変性疾患と関連したタンパク質の沈殿の決定
ハンチンチン(HTT)、TDP-43、hnRNPA2B1及びhnRNPA1を含めた、神経変性疾患と関連するいくつかの凝集しやすいタンパク質が、沈殿したタンパク質のリストにあったので、ウエスタンブロットを使用して、これらの障害と関連する他の凝集しやすいタンパク質の溶解性を調べた。アミロイド-β、タウ(MAPT)、α-シヌクレイン(SNCA)、TARDBP(TDP-43)、FUS、HTT、プリオンタンパク質(PrP)、HNRNPA1、アクチン(いくつかの神経変性疾患において平野小体中に凝集して見出される)、及びニューロフィラメント重鎖(NF-H)を含めた、調べた全てのタンパク質は、ヒトニューロン溶解物のRNAse A/T1処理時に選択的に沈殿した(図8a)。例えばPrP、α-シヌクレイン、HTT及びアミロイド-βは全て、RNase処理後の可溶性画分中において検出未満であった(図8a)。
【０１５８】
本発明者らはまた、ヒトニューロン由来の、RNAse処理した溶解物のペレット中の約40kDaのAβ免疫反応性バンドを検出した(図8a)。このバンドの分子量は予想より大きいため(Aβ単量体は約4kDaに移動する)、GFPに融合したAβを発現するHEK293細胞から調製した細胞溶解物中のAβの凝集も調べた。内因性Aβと類似して(図8a)、GFPタグ化AβはRNAの除去時にのみ凝集した(図8b)。GFP自体について凝集は観察されなかった(図8b)。次いで、神経変性に直接関係しないがRNAse処理によって沈殿する2種のタンパク質の溶解性を調べた; リボソームタンパク質RPL7及びヘテロ核リボヌクレオタンパク質D(HNRNPD)、並びに対照としてポリA結合タンパク質(PABP、豊富なタンパク質であるが質量分析によって同定されない)。これらのうち、RLP7及びHNRNPDはRNA消化によって沈殿したが、PABPの溶解性は影響を受けなかった(図8a)。類似の結果が、マウス皮質から調製した組織溶解物を用いて得られた(図8c)。添加したRNAse活性をRNasinで阻害することにより、HTT、NF-H、TDP-43、及びPrPの沈殿がなくなり(図8d)、全体的タンパク質プロファイルについて観察された阻害を裏付けた(図6eを参照)。同様に、in vitroで分解されたRNAの添加は、HTT、NF-H、FUS、TDP-43、及びPrPの沈殿を引き起こさなかった(図10)。まとめると、これらの実験は、神経変性障害と関連する多くのタンパク質が、細胞を含まない溶解物中のそれらの溶解性についてRNAに依存することを示す。
【０１５９】
[実施例5]
RNase A又はRNase T1のいずれかで処理した後に沈殿したタンパク質の特徴付け
RNase A又はT1のいずれかで消化後のタンパク質の凝集を解析した。これらのRNaseの両者は一本鎖RNAを切断するが、特異性が異なり、RNase AはC及びUの後で切断し、一方、RNase T1はGの後で切断する。TARDBP、HTT及びPrPはRNase Aによって最も効率的に沈殿したが、FUSはRNase T1によって最も効率的に沈殿した(図3)。
【０１６０】
[実施例6]
RNA媒介タンパク質リフォールディング
RNA媒介タンパク質リフォールディングを調べるために、RNA除去後に形成された凝集タンパク質を、変性させ、次いで、RNAで処理してリフォールディングを誘導した(図8e)。これらのデータは、RNAの除去後に凝集するタンパク質が、in vitroで効率的にリフォールドすることができるが、RNAの存在下でのみできることを示す(図4及び8f及びg)。しかし、RNAはそれらの最初のフォールディングに必要であるだけでなく、継続的溶解性にも必要である。なぜならば、リフォールディング後のRNAの分解は、プロセスを逆転し、タンパク質の再凝集を引き起こしたからである(図4、8f及び8g)。
【０１６１】
[実施例7]
他のポリアニオンの、タンパク質をリフォールドさせる能力の調査
タンパク質をリフォールドさせる能力がヒトRNAに特異的であるのか、又は他のポリアニオン、例えば全大腸菌RNA、酵母tRNA、ヒトゲノムDNA(gDNA)及びヘパリンの共通の特性であるのかを調べた。大腸菌RNAはタンパク質凝集を効率的に阻止したが、酵母tRNAもヘパリンも、全ヒトRNAの可溶化能力の代わりになることはできなかった(図8h)。驚くべきことに、ヒトゲノムDNAの添加は、タンパク質の可溶化において全ヒトRNAとほとんど同じくらい効率的であった(図8h)。しかし、ヒトRNA又は大腸菌RNAの存在下でリフォールドしたタンパク質のみがRNAse処理時に再凝集した(図8h、Pel 2)。上記実験は、細胞溶解物中のタンパク質が、凝集体のない状態についてRNAに依存し、DNAに依存しないことを明らかに示していることから(図6d)、ゲノムDNAの、リフォールディングを促進する能力は予想外である。
【０１６２】
正しいフォールディングは、タンパク質の適切な機能に必要である。リフォールドされたタンパク質が、機能的であり、RNAによって単に可溶化されだけではないかどうかを調べるために、RNAseによって凝集したタンパク質の大部分を占め(256/1659)、とりわけ、キナーゼ(例えば、GSK3b)、ATPase(例えば、アクチン)及びヘリカーゼを含む、ATP結合タンパク質の活性を評価した。ATPに結合する能力は保存された構造モチーフ(しばしばウォーカー(Walker)モチーフと呼ばれる)及びリン酸結合構造特性に依存するため、本発明者らは、ATPに結合する能力がRNAの存在下又は非存在下でリフォールディング後に回復したかどうかを最初に調べた。適切なフォールディングのためのRNAの要求性と一致して、RNAでリフォールドされたタンパク質のみがATPに結合することができ、対照的に、RNAなしでリフォールドされたタンパク質はATPに結合しなかった(図15A)。ATP捕捉タンパク質の質量分析解析は、ATP結合タンパク質の明らかな富化を示し、最初の特徴付けで同定された約15％(256/1659)と比較して、同定されたタンパク質の40％超(58/144)がATP結合として注釈付けされた。ほとんど全てのATP捕捉タンパク質(130/140)は、最初の質量分析解析において同定され(上記参照)、このことは、一貫したタンパク質セットがその溶解性のためにRNAを必要とするという考えを強化する。RNAによってリフォールドされたタンパク質は、RNAなしでリフォールドされたタンパク質(その活性はベースラインに近かった)よりも100倍多くのATPを加水分解した(図15B)。RNAse A/T1の添加によるRNAの同時除去は、RNAでリフォールドされたタンパク質のATP加水分解活性を有意に妨げたが、ビヒクルでリフォールドされたタンパク質には影響を及ぼさなかった(図15B)。Jurkat細胞由来のRNAse凝集タンパク質でも同様の結果が得られた(図15C)。このことは、RNAが、本発明者らの混合物中のATP結合及び加水分解タンパク質の機能的フォールディング及び活性に必要であることを示す。
【０１６３】
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【０１６４】
[実施例8]
どの種類のRNAがタンパク質溶解性の維持に関与したかの調査
どの種類のRNAがタンパク質溶解性の維持に関与したかを同定するために、ホルムアルデヒド架橋細胞に由来するPrPのRNA免疫沈降を使用した。従来のRNA結合ドメインを欠いているために、PrPを選択した。PrP沈殿RNAのゲル電気泳動解析は、リボソームRNA(rRNA、28S及び18S)に由来する頑強なシグナルを示し、一方、非特異的IgG抗体によってどのサイズのRNAも沈殿しなかった(図9a)。このことは、PrPが細胞中でrRNAと結合していることを示唆する。この相互作用を確かめるために、全RNAの存在下でリフォールドしたPrPの可溶性画分について免疫沈降を繰り返した。なぜならば、この画分中のいずれのRNAもPrP可溶化に必要なRNA(複数可)を含有するはずだからである。cDNAへの変換及びクローニング後、20個のPrPクローンのうち18個がrRNAに由来したが、対照的に、20個のうち4個のクローンのみ(20％)がIgGサンプルにおいてrRNAに由来した(図9b)。したがって、可溶性PrPはin vivo及びin vitroの両方でrRNAと結合する。リフォールディング後にNF-Hと結合するRNAも免疫沈降し、PrPと類似して、配列決定したクローンの45％(9/20)がrRNAに由来した(図9b)。全てのサンプルについて、rRNAに由来しないクローンは固有の転写産物に由来し、したがって、富化は示されなかった(データ示さず)。
【０１６５】
rRNAがPrP及びNF-Hの可溶性状態を維持できることを確かめるために、次に、凝集したタンパク質を、rRNAに富むRNAの存在下、又はrRNAを部分的に枯渇させたRNAの存在下でリフォールドさせた(図9c)。リボソームRNAに対する要求性と一致して、rRNAは、PrP及びNF-Hを効率的に再可溶化したが、rRNAを枯渇させた同量のRNAで処理したPrP及びNF-Hは沈殿した(図9d)。さらに、リフォールディング前の、rRNAの限定的化学的断片化(図9c)は、PrP及びNF-Hの可溶化を効率的に阻止した(図9d)。まとめると、これらの知見は、無傷のrRNAが、これらのタンパク質の効率的再可溶化に必要であることを示す。興味深いことに、rRNAに富むRNAの存在下でのリフォールディング後には、遠心分離後に目に見えるペレットは検出できなかった(データ示さず)。このことは、いくつかのタンパク質が、rRNAと結合することによって可溶性状態で維持されたことを示唆した。このことを確かめるために、実験を繰り返し、全体的タンパク質プロファイルをゲル電気泳動によって解析した。PrP及びNF-Hと類似して(図9e)、RNAseによって沈殿したタンパク質の大部分は、HTTを含めて、rRNAの存在下で効率的にリフォールドされたが、重要なことに、断片化したrRNA、又はrRNAを枯渇させたRNAサンプルでリフォールドさせた場合には、効率的にリフォールドされなかった(図9d、e)。RNAの限定的断片化がタンパク質の可溶化を阻止するという事実は、それらが特定のRNA配列と主に結合しないことを示唆している。なぜならば、断片化したrRNA中に同じ配列が、無傷のrRNAにおけるのと同様のレベルで存在するからである(図9c)。むしろ、そのことは、rRNAの構造がタンパク質の可溶化に重要であることを示唆しており、この考えは、二本鎖RNAに特異的なリボヌクレアーゼであるRNAse V1による、細胞溶解物に由来するタンパク質の効率的沈殿によっても支持される(図6d)。この構造的要求性はまた、ゲノムDNAによる凝集タンパク質の効率的可溶化を説明でき(図8h)、このゲノムDNAは、A-フォームにおいて二本鎖RNAと構造的に類似している。
【０１６６】
[実施例9]
プリオン様拡大
上に説明したように、最近の証拠は、神経変性疾患におけるタンパク質凝集体が、プリオン様機構によって自己増殖(すなわち拡大)する能力を有することを示唆している。このことを試験するため、タンパク質凝集をRNA除去によってサンプルにおいて開始させ、次いで、このサンプルの画分を非処理溶解物と混合した。凝集タンパク質を遠心分離によって単離し、SDS中で可溶化し、SDS-PAGEゲルで分離し、抗体によってプローブした。結果を図5に示す。凝集の増加がRNAse処理サンプルにおいて見られ、これは、凝集の増殖、例えば非処理サンプル中のネイティブなタンパク質の動員に起因すると考えられる。
【０１６７】
[実施例10]
G-四重鎖構造
DNAとRNAの両方は、G-四重鎖、G4と呼ばれる特定の構造を形成することができる(Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, pp5482-5515)。本発明者らは、ヒトリボソームRNAに由来する予測されたG4形成ssDNAオリゴ(表2)を合成し、本明細書に記載のリフォールディングアッセイにおいてそれを試験した。データは、このオリゴがタンパク質を可溶化できることを示す; 一方、同じヌクレオチドを有するが非G4許容順序のオリゴは、はるかに効率が悪い(図11、表2)。
【０１６８】
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【０１６９】
[実施例11]
オルトバナジン酸ナトリウムはRNAse媒介タンパク質凝集を阻害する
オルトバナジン酸ナトリウム(SO)は、タンパク質ホスファターゼを阻害するために主に使用される小分子である。RNAseと共に細胞又は組織溶解物に添加すると、それは、タンパク質の、例えばTDP-43及びハンチンチンの、凝集を完全に阻害することができる(図12a及び12b)。
【０１７０】
SOの添加はまた、バックグラウンドタンパク凝集を防止し、これは内在性リボヌクレアーゼによって引き起こされることを、本発明者らの以前のデータが示す。
【０１７１】
[実施例13]
リボヌクレオシドバナジル誘導タンパク質凝集
リボヌクレオシドバナジル(RV)は、RNA精製及び操作中にRNAseの移行状態アナログ阻害剤として使用される分子である。しかし、外因性RNAseの非存在下で溶解物に添加すると、それは、実質的なタンパク質凝集を引き起こす(図13)。
【０１７２】
したがって、RVは、タンパク質凝集を誘導するための代替方法を提供する。
【０１７３】
材料及び方法
酵素
RNAse T1、RNAse V1、RNAse A/T1カクテル、及びDNAse IはLife Technologyから入手した。RNAse AはSigmaから入手した。
【０１７４】
細胞培養
ニューロンは、塩基性FGFを6日間除去することによってヒト神経幹細胞から分化させた。細胞の大部分(>95％)は、Map2-及びβ III-チューブリン-陽性細胞へと6日以内に分化する。Jurkat T細胞を10％ FCS(Life Technologies)及び1×Pen/Strep(Life Technologies)を補充したRPMI(Life Technologies)中で維持した。
【０１７５】
ニューロン及びマウス皮質に由来する、細胞を含まない溶解物
分化させた神経幹細胞をトリプシン(0.5％ Life Technologies)によって剥離させ、10％ FCS(Life Technology)を有するRPMI培地中に回収した。細胞を遠心分離によってペレット化し、氷冷したPBS中で2回洗浄し、その後、溶解緩衝液1[20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、3mM EDTA, 1％ Triton X-100、0.5％ Na-デオキシコール酸塩、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)、1mM DTT]又は溶解緩衝液2[20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1％ Triton X-100、0.5％ Na-デオキシコール酸塩、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)、1mM DTT]のいずれかの、細胞ペレットの4容量中で溶解させた。ほとんどの実験を溶解緩衝液1で実施し、但し、RNAse V1処理を行った場合(図1e)には、溶解緩衝液2を使用した。溶解した細胞を、氷上で5秒間最大設定で超音波処理し(Bioruptor、Diagenode)、+4℃にて30分間、21,000×gで遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、タンパク質濃度をBCAキット(Thermo Fisher)を用いて製造業者の説明書に従って決定した。溶解物を溶解緩衝液1又は2中で2〜4μg/μlに希釈し、以下に記載されるように処理した。
【０１７６】
16〜21日齢のC56BLマウスに由来する皮質を、室温で切断し、ろ紙上で転がして、大部分の髄膜を取り除き、ドライアイス上ですぐに凍結し、使用するまで-80℃で保存した。組織を氷上で解凍し、1mlピペットチップを用いて冷PBS中で破壊した。破壊した組織を、PBS中で3回洗浄し、その後、溶解緩衝液1中で溶解し、ヒトニューロンについて記載されたように調製した。
【０１７７】
リボヌクレアーゼ処理及び沈殿したタンパク質の単離
典型的には、2〜4μg/μlの細胞溶解物200〜400μgを、表示した量のリボヌクレアーゼ、DNAse I、又はビヒクル(20mM Tris-HCl pH7.5中の50％ グリセロール)と混合し、37℃にて1時間インキュベートした。次いで、サンプルを+4℃にて15分間、21,000×gで遠心分離し、上清を取り出し、解析のために取っておいた。ペレットを室温にて500μl RIPA緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、0.5％ Na-デオキシコール酸塩、0.1％ SDS、1％ Triton X-100)中で2回洗浄し、室温にて5分間の超音波処理(Bioruptor、Diagenode)によって20mM Tris-HCl pH7.5、2％ SDS、8M 尿素中で溶解させた。SDS-PAGE解析用のサンプルを、DTTを最終濃度100mMまで補充した4×LDSローディング緩衝液(Life Technologies)と混合し、70℃にて10分間加熱し、その後、SDS-PAGEゲル(Life Technologies)にロードした。
【０１７８】
RNAse Aの固定化
1μg/μlのRNAse A 100μgを、トシル基活性化磁気ビーズ(Life Technologies)と、製造業者の説明書に従って37℃にて20時間カップリングさせた。クエンチング及び洗浄後、カップリングしたRNAse Aを、PBS中の0.1％ BSAに再懸濁し、使用するまで+4℃で保存した。RiboGreenキット(Life Technologies)を用いて酵母tRNAに対して決定したところ、約50％の活性がカップリング後に残っていた。
【０１７９】
RNAse Aの阻害及び予め加水分解したRNAの添加
RNAse A阻害: 200μgの溶解物を、0.1μlのRNAse A(約3mg/ml)、及び表示のように濃度を増加させたRNasin(Promega)と混合した。RNAの加水分解: TE緩衝液(10mM Tris-HCl pH7.5、1mM EDTA)中の40μgの全RNAを、10μlの固定化RNAse Aと37℃にて1時間インキュベートした。RNAse Aを磁気分離によって除去し、加水分解したRNAを120U RNasein(Promega)と混合し、使用するまで氷上で維持した。あるいは、0.1M NaOH中の40μgの全RNAを、85℃にて1時間インキュベートし、次いで、1M Tris-HCl pH7.0を用いてpH7.5に調整した。次いで、RNAse Aによって消化された及びNaOHによって加水分解されたRNAを、上に記載したように調製した200μgのニューロン溶解物に添加し、37℃にて1時間インキュベートした。沈殿したタンパク質及び可溶性タンパク質を前述のように回収し、SDS-PAGEによって解析した。
【０１８０】
Aβのクローニング及び沈殿
ヒトAβ1-40を、全長APP(Origen、#RC209575)からPCR増幅し、pEGFP-C3(Clontech)のXho I及びBam HI部位にクローニングし、GFPのC末端にインフレームで融合したAβを作製した。24ウェルプレート中にウェル1つあたり細胞0.2×106個の密度で播種したHEK293細胞を、Fugene HD(Promega)を用いてAβ-GFP又は空ベクターでトランスフェクトした。各ウェルについて、本発明者らは、30μlのOptiMEM(Life Technologies)の全量中に0.6μgのDNA及び2μlのFugene HDを使用した。細胞をトランスフェクションの48時間後に回収し、PBS中で洗浄し、次いで、-80℃で保存するか、又は直接使用した。解凍した又は新鮮な細胞を、上に記載したように80μlの溶解緩衝液1中で溶解させ、RNAse A/T1で処理した。凝集したタンパク質を遠心分離によって回収し、サンプルを、上に記載したように処理し、SDS-PAGEによって解析した。
【０１８１】
RNA媒介リフォールディング
タンパク質を、RNAse A/T1処理及び遠心分離によってニューロン溶解物から単離した。ペレット化したタンパク質を、50μlの変性緩衝液(20mM Tris-HCl pH7.5、6M グアニジン塩酸塩、1％ Triton X-100、20mM DTT)中で溶解させ、室温にて5分間超音波処理した。タンパク質濃度をBCAキット(ThermoFisher)を用いて決定し、変性緩衝液中で0.4μg/μlに希釈した。20〜50μgの可溶化タンパク質を、TE緩衝液中の、0.5×(μgにおいて)のRNAと混合し、6〜8.000kDaカットオフメンブレン(Spectrum Lab)を備えた透析チューブ(以下を参照)に移した。透析を、600mlのPBS緩衝液に対して4℃にて一晩実施し、その後、PBSを新鮮なPBS(400ml)と交換し、容器を水浴中に置き、37℃にて1時間維持した。透析したサンプルを1.5mlチューブに移し、体積をPBSで100〜200μlに調整した。この7.5〜10％をインプットとして取った。沈殿したタンパク質(Pel 1)を、+4℃にて10分間、21,000×gでの遠心分離によってペレット化し、RIPA緩衝液中で2回洗浄し、前述のようにSDS-PAGE用に処理した。上清の7.5〜10％を取っておき(Sup 1)、残りの体積を、0.5μlのビヒクル若しくは0.5μlのRNAse A/T1を補充した2本の新しいチューブに分けるか、又は全サンプルを1本のチューブに入れ、0.5μlのRNAse A/T1で処理した。全てのサンプルを37℃にて1時間インキュベートし、前述のように遠心分離した。ペレット化したタンパク質(P2)を前述のように洗浄し、SDS/尿素中に溶解させ、超音波処理した。各画分の等体積をSDS-PAGEゲルで分離し、次いで、クマシーで染色するか、又はウエスタンブロット解析用にメンブレンに転写した。
【０１８２】
ATP結合及び加水分解
ヒトニューロン又はJurkat細胞からの100μgのRNAse凝集タンパク質を、上記のように50μgの全RNA又はVe(TE緩衝液)でリフォールドさせた。透析後、サンプルをPBSで250μlに調整し、2,000×gで15分間遠心分離した。ATP結合タンパク質の捕捉を、30μlのアミノフェニル-ATP-又は裸のアガロースビーズ(Jena Bioscience)を製造業者のプロトコールに従って用いて、この混合物の75μlに対して実施した。溶出は、DTT(100mM最終濃度)を補充した20μlの1×LDSローディング緩衝液(Life Technologies)中で2回連続10分間インキュベートすることによって行った。溶出したサンプルの4分の1を4〜12％NuPageゲル(Life Technologies)で分離し、ゲルをクマシーブルー(ProtoBlue、National Diagnostics)で染色した。2つの独立し反復からの残りの溶出液を4〜12％のNuPageに約1cm電気泳動し、ゲルの上部片を切除し、下記のように質量分析解析のために調製した。ATP加水分解を測定するために、本発明者らは、製造業者の説明書に従ってADP-Glo(商標)キナーゼアッセイ(Promega)を使用した。手短に述べると、5μlのリフォールドされたタンパク質を、白色96ウェルプレート(Santa Cruz Biotechnology)中で、ATP(最終濃度100μM)及び0.1μlのRNAse A/T1混合物又はビヒクル(20mM Tris-HCl pH7.5中の50％グリセロール)(全ては15μlの全量中で1×PBS、5mM MgCl2、2mM DTTで希釈された)と混合し、室温で1.5時間インキュベートした。15μlのADP-Glo試薬の添加、続く室温で1時間のインキュベートによって、非加水分解ATPを除去した。30μlのキナーゼ検出試薬の添加によってADPをATPに戻し、Victor2 Multilabelプレートリーダー(Wallac)を用いて室温で1.5時間インキュベートした後に放射光を定量した。全てのサンプルを2連で試験し、データを3回の独立した反復の平均として示した。統計分析は、Excel(マイクロソフト)で利用可能なスチューデントt検定(平均に対する2サンプル検定)で行った。
【０１８３】
透析チューブ
透析チューブを、1.5ml微小遠心チューブ(Crystal Clear、StarLab)の蓋に3mmの穴を開けることによって作製した。次いで、チューブを上端から1cmで切断し、新しい無傷の蓋を底に挿入した。サンプル添加後、チューブを透析膜で密封し、穴を開けた蓋をかぶせた。これにより、一端が、膜によって隔てられた周囲の溶液と接触している、透析チューブが作製される。穴の開いた方を下に向けて、チューブを透析溶液中に置いた。
【０１８４】
SDS-PAGE及びウエスタンブロット解析
加熱したサンプルを、MOPS又はMES緩衝液中、4〜12％ Bis-Trisゲル(Life Technology)で分離し、0.2μmニトロセルロース若しくは0.45μm PVDFメンブレン(両者ともGE Healthcare)に、氷上で45Vにて2時間転写するか、あるいは、製造業者のプロトコールに従って、クマシー(ProtoBlue、National Diagnostics)染色のために直接使用した。転写後、ウエスタンブロット用のメンブレンを、TBS-T(50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、0.05％ Tween-20)中の5％ミルク中で室温にて1時間ブロッキングし、同じ溶液又はTBS-T/5％ BSA中の一次抗体と+4℃にて一晩インキュベートした。次いで、メンブレンをTBS-T中で4×5分洗浄し、5％ミルク/TBS-T中のHRPコンジュゲート二次抗体とRTにて1時間インキュベートした。次いで、メンブレンを前述のように洗浄し、ECL Prime(GE Healthcare)中で5分間インキュベートし、その後、フィルム(ThermoFisher)に露出させた。使用した一次抗体: TDP-43(New England Biolabs、NEB、#G400)、HTT(NEB、#D7F7)、FUS(SantaCruz、#sc-47711)、SNCA(NEB、#D37A6)、MAPT(NEB、#Tau46)、PrP(Proteintech、#12555-1-AP)、NF-H(Covance、#SMI-32R)、A□6E10(Covance、#SIG-39320)、ACTB(Sigma、#A2228)、RPL7(Abcam、#ab72550)、PABP(Abcam、#ab21060)。PrP(1:2000)、ACTB(1:4000)、NF-H(1:4000)、FUS(1:100)及びRPL7(1:2000)を除いて、全ての一次抗体は1:1000希釈で使用した。二次抗体として、本発明者らは、ロバ抗ウサギHRP(#NA934V)又はヒツジ抗マウスHRP(#NXA931)を両者ともGE Healthcareから入手し、5％ ミルク-TBS-T中に1:50,000希釈して使用した。
【０１８５】
RNA単離及び解析
RNAを、細胞溶解物及び精製したリボソームからTrizol LS(Life Technologies)を用いて製造業者の説明書に従って単離した。リボソームをJurkat T細胞から単離した。rRNAを枯渇させたRNAを、(リボソームのペレット化及び水中の5倍希釈後)上清の上部3分の2から酸フェノール(Life Technologies)、その後のEtOH沈殿を用いて単離した。無傷細胞からのRNAを、Isol-RNA溶解試薬(5 PRIME)を用いて製造業者の説明書に従って単離した。全てのRNAサンプルをTE(10mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA)中に溶解させた。RNAを1.5％ アガロース又は6％ PAGE/8M 尿素ゲル電気泳動によって解析し、臭化エチジウムで可視化した。rRNAを断片化するために、10mM ZnCl2、10mM Tris-HCl pH7.0中の50〜100μgのRNAを、7分間70℃にてインキュベートし、1:50容量の0.5M EDTAと混合し、次いで、EtOH沈殿させた。全てのリフォールディング実験を、ヒトニューロン又はJurkat T細胞から新たに調製したRNAを用いて実施した。可溶化タンパク質との混合前に、RNAサンプルを65℃にて5分間加熱し、次いで、少なくとも3時間氷上で冷却し、その後使用した。
【０１８６】
質量分析解析
100mM DTTを補充した1×LDSローディング緩衝液(Life Technologies)中の、RNAseによって沈殿したタンパク質30μgを、MOPSランニング緩衝液中の4〜12％ Bis-Trisゲルで分離した。クマシー染色後、各ゲルレーンを10個の等しいゲルスライスに分割し、1mmの立方体に切断した。ゲルバンドを脱染し、5mM TCEP(Pierce)で還元し、50mM クロロアセトアミド(Sigma)でアルキル化し、次いで、トリプシン(Promega)で16時間消化した。サンプルを自家製C18カラムを用いて脱塩し、次いで、Central Proteomics Facility(University of Oxford, UK)にてQExactive質量分析計(Thermo、Hemel Hempstead)を用いて解析した。データをMascot(MatrixScience、London)を用いて解析し、検索をUniProtヒトデータベースに対して実施した。60以上のMascotスコアを有し、2つの固有のペプチド配列を有するタンパク質は、確信を持って同定されたとみなした。
【０１８７】
RNAseによって沈殿したタンパク質のコンピューター解析
それぞれMascotスコア≧60を有する、両MSサンプルに共通のタンパク質を、リストにまとめて、さらなる解析に使用した。30個以上の連続アミノ酸の低複雑度領域を、以下のパラメーター: [30][3.2][3.55]を使用したSEG(REF)を用いて同定した。非構造領域を、以下のパラメーター: AAウィンドウ30、ジョイン(join)2、閾値1.75を使用したDisEMBL(REF)を用いて同定した。結果を、順列(permutation)分析によって得られた結果と比較した。一回の分析あたり合計で1,000個の順列を実施した。ヒトタンパク質の完全なセット(2013年7月にアクセスしたhttp://www.uniprot.org/downloads)から取り出したタンパク質(n=1,603)の無作為セットからなる順列を、全てSEG及びDisEMBLを用いて解析した。低複雑度領域及び非構造領域の割合の累積分布を、RNAseによって沈殿したタンパク質から得られた結果と比較した。
【０１８８】
RNA免疫沈降及び配列決定
14×106個のJurkat T細胞の分子架橋を、PBS中の0.1％ ホルムアルデヒドを用いて室温にて10分間で達成した。反応を1:10容量の1.5M グリシンの添加によって停止し、その後、氷上で10分間インキュベートした。架橋された細胞を冷PBS中で2回洗浄し、50mM Tris-HCl pH7.5、250mM スクロース、250mM KCl、5mM MgCl2、0.7％ NP-40中で氷上で15分間溶解させた。核を遠心分離(800×g、+4℃にて10分間)によってペレット化し、廃棄した。次いで、上清を+4℃にて20分間、21,000×gでさらに遠心分離し、次いで、新しいチューブに移した。上清を0.5M KClに調整し、免疫沈降に使用した。溶解物を、0.3μgのPrP(Proteintech、#12555-1-AP)又はウサギIgG(Sigma)抗体と+4℃にて一晩回転させながらインキュベートし、次いで、5μlの予め洗浄したプロテインAダイナビーズ(Life Technologies)と混合し、室温にて30分間インキュベートした。ビーズをPBSで5回洗浄し、最終濃度0.5MまでNaClを補充したPBSで2回洗浄した。サンプルを、50μlの20mM Tris-HCl、300mM NaCl、1％ SDS中で5分間65℃にて溶出させ、上清を、1μlのプロテイナーゼK(Merck)を補充した20mM Tris-HCl pH7.0、300mM NaClで300□lに希釈した。サンプルを65℃にて20分間インキュベートすることによって、架橋を解消させ、RNAを酸フェノール pH4.5(Life Technologies)中での抽出によって単離し、エタノール沈殿させた。沈殿したRNAをTE中で溶解させ、6％ PAGE/8M 尿素ゲルで解析し、臭化エチジウムで可視化した。クローニング用のRNA-IPを、抗PrP(Proteintech、#12555-1-AP)、NF-H(Covance、#SMI-32)又はウサギIgG(Sigma)を用いて上に記載したように全RNAの存在下でリフォールドしたタンパク質について実施した。サンプルを+4℃にて2時間回転させながらインキュベートし、次いで、5μlの洗浄したプロテインAビーズ(PrP)又は5μlのヤギ-抗マウスIgG磁気ビーズ(Life Technologies)(NF-H及びIgG)のいずれかと混合し、室温にて30分間回転させた。ビーズをPBS中で5回洗浄し、0.5MまでNaClを補充したPBS中で1回洗浄した。サンプルを1％ SDS中で溶出させ、上に記載したように、RNAを酸フェノールで抽出し、エタノール沈殿させた。沈殿したRNAを二本鎖cDNAに変換し、Illumina TrueSeqキットを用いて、最初の断片化を行わなかったことを除いて製造業者の説明書に従ってPCR増幅した。増幅したcDNAをSma I切断pUC 19ベクター(NEB)に平滑末端ライゲーションし、大腸菌(NEB、DHA5a)に形質転換し、配列決定用に単一コロニー由来のプラスミドを調製した。配列決定したクローンをBLATソフトウェアを用いてマッピングした。96超の同一性のパーセンテージを有する最長マッチのみを各クローンについて考慮した。
【０１８９】
オルトバナジン酸ナトリウム: RNAse誘導タンパク質凝集に及ぼす影響
上記のようにして、細胞又は組織溶解物を調製した。次いで、溶解物(2μg/μlにて200μg)をRNAse A及びT1(A/T1)の混合物で処理し、濃度を増加させたオルトバナジン酸ナトリウムと37℃で1時間インキュベートする。凝集したタンパク質を、4℃で20分間の遠心分離(21,000×g)により単離し、500μlのRIPA緩衝液中で2回洗浄し、次いで、室温で5分間超音波処理することにより12μlの6Mグアニジン塩酸塩、20mM Tris-HCl pH7.5中で溶解させた。次いで、この溶液5μl中のタンパク質の量を、BCAキット(Thermo Scientific)を製造者のプロトコールに従って用いて決定した。データは、凝集したタンパク質(P1)の量/インプット中のタンパク質の量の割合として任意単位(AU)で表され、平均±s.d、n=2を表す。活性化(煮沸及びpH調整)及び非活性化SOの両方が同様の結果を与えた。この実験を、50μMのSO及び増加させた濃度のRNAse A/T1で繰り返した。あるいは、凝集タンパク質を、超音波処理によって2％SDS、8M 尿素、50mM Tris-HCl pH7.5中で溶解し、ウエスタンブロットによって解析した。
【０１９０】
リボヌクレオシドバナジル: タンパク質凝集に及ぼす影響
溶解物を上記のように調製し、10μMのリボヌクレオシドバナジル(New England Biolabs)と共にインキュベートした。凝集したタンパク質を上記のように単離し、SDS-PAGE及びウエスタンブロッティングによって解析した。
【０１９１】
[実施例14]
2017530937.tif 000006
2017530937.tif 000007
【０１９２】
データは、異なるサンプル中のピークの大部分がコーディング(エキソン)、イントロン及び反復領域に位置することを示す。反復領域におけるピークの大部分は、LINE、SINE及び単純な繰り返し要素である。プリオンタンパク質(PrP)と関連するピークは、より高い割合が繰り返しに由来する点で他とは異なり、コーディング領域におけるピークの同時減少を有する。
【０１９３】
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【０１９４】
可溶性Aβ、ニューロフィラメント重鎖(NFH)、プリオンタンパク質(PrP)及びタウ(MAPT)と結合する配列決定されたRNAから、MEME-ChIPプログラムスイートを用いて予測されたモチーフ。モチーフ1〜56はAβ由来であり、モチーフ57〜82はNFH由来であり、モチーフ83〜141はPrP由来であり、モチーフ142〜172はタウ由来である。モチーフはDNAとして順方向に表示される。逆相補的モチーフは、示された順方向モチーフと同様にタンパク質と結合している可能性が高い。RNAモチーフは、「U」の代わりに「T」を用いることによって生成される。非A、T、G、C命名は、ヌクレオチド命名法に関するIUPAC-IUB推奨に従う。
【０１９５】
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【０１９６】
可溶性Aβ、プリオンタンパク質(PrP)、又はリフォールドタンパク質の混合物と結合する配列決定されたDNAから、MEME-ChIPプログラムスイートを用いて予測されたモチーフ。モチーフ1〜138はAβ由来であり、モチーフ139〜421はPrP由来であり、モチーフ422〜768は全ての可溶性タンパク質由来である。最後のカテゴリー「全ての可溶性タンパク質」は、ゲノムDNAでリフォールドされた凝集タンパク質を指し、次いで、凝集タンパク質の除去後、これらのタンパク質はニトロセルロース膜への結合によって捕捉された。核酸がニトロセルロース膜に非常に弱い結合を示すため、単離されたDNAの大部分はタンパク質と結合している。モチーフはDNAとして順方向に表示される。逆相補的モチーフは、示された順方向モチーフと同様にタンパク質と結合している可能性が高い。非A、T、G、C命名は、ヌクレオチド命名法に関するIUPAC-IUB推奨に従う。
【０１９７】
2017530937.tif 000015
【０１９８】
さらなる材料及び方法(実施例14に関する)
RNA-IP及び配列決定2
「RNA免疫沈降及び配列決定」に記載されているのと同じ手順に従った。簡単に述べると、ヒトニューロン由来の凝集タンパク質を、記載のようにJurkat T細胞由来の予め断片化した全RNAでリフォールドさせ、可溶性タンパク質を、Aβ(クローン4G8、＃9220-02、Signet)、PrP(Proteintech、＃12555-1-AP)、NFH(Covance、＃SMI-32)、タウ(Sigma、＃T9450)、又はGFP(Abcam)に対する抗体を用いた免疫沈降に供した。抗体は、前述のように捕捉及び洗浄し、6Mグアニジンチオシアネートの添加によってビーズから溶出させた。メーカー推奨(Life Technologies)に従ってTrizol LS抽出によって溶出液からRNAを単離し、水に溶解した。Illumina(登録商標)(NEB)用のNEBNext(登録商標)Ultra(商標)Directional RNA Library Prep Kitを使用して、各サンプルから同体積を用いてIlluminaシーケンシングライブラリーを作製した。ライブラリーをNextSeqプラットフォーム上で配列決定した。2つの独立した実験をそれぞれのIPについて行った。
【０１９９】
ChIP-seq
ヒトニューロン由来の凝集タンパク質を、記載のようにJurkat T細胞由来の予め断片化したゲノムDNAでリフォールドさせ、可溶性タンパク質を、Aβ(クローン4G8、＃9220-02、Signet)、PrP(Proteintech、＃12555-1-AP)又はマウス/ウサギIgG(Sigma)に対する抗体を用いた免疫沈降に供した。抗体は、前述のように捕捉及び洗浄し、1％SDSの添加によりビーズから溶出させた。あるいは、可溶性リフォールドタンパク質をニトロセルロース膜(0.2μm孔径、GE Healthcare)に通し、次いで洗浄し、1％SDSで溶出させた。対照として、タンパク質を含まないゲノムDNAをニトロセルロース膜に通した。免疫沈降又は膜捕捉手順のいずれかからのDNAを、フェノール抽出によって溶出液から単離し、水に溶解した。Illumina(登録商標)(NEB)用のNEBNext(登録商標)ChIP-Seq Library Prep Master Mix Setを使用して、各サンプルから同体積を用いてIlluminaシークエンシングライブラリーを作製した。ライブラリーをMiSeqプラットフォーム上で配列決定した。2つの独立した実験をそれぞれのIP/フィルターについて行った。
【０２００】
DNA又はRNAの断片化
上記RNA-IP及び配列決定2に使用した全RNAを、30mM Mg2+を含有する溶液中、95℃で9分間インキュベートすることによって断片化した。次いで、これに最終濃度50mMまでEDTAを補充し、RNAをAgencourt XPビーズで単離し、1×TE緩衝液で溶出した。この手順により、150ntの平均断片長が得られた。Bioruptor(Diagenode)を用いた超音波処理によりゲノムDNAを断片化した。断片化後の平均断片長は250bpであった。
【０２０１】
バイオインフォマティクス分析
RNA-IP実験からの読み取りを、デフォルト設定のStarソフトウェアを用いてヒトゲノム(hg19)にアラインさせた。様々なゲノム領域にマッピングされた読み取りの割合は、HTSeqを用いて決定した。結合部位/ピークは、MACS2ソフトウェアを用いて2つの生物学的複製を組み合わせ、重複を許可することによって決定した。ピーク富化は、GFP免疫沈降からの読み取りに対して決定した。MEME-ChIPソフトウェアスイート(http://meme-suite.org/tools/meme-chip)を使用して、MACS2によって同定されたピークを中心とする300bpの断片サイズを用いて、富化されたモチーフを予測した。
【０２０２】
ChIP-seq実験からの読み取りを、Bowtie2を用いてヒトゲノム(hg19)にアラインさせた。結合部位/ピークは、重複することなく、MACS2ソフトウェアを用いて2つの生物学的複製を組み合わせることによって決定した。ピーク富化は、IgG免疫沈降又はニトロセルロースフィルターからの読み取り(タンパク質が存在しない)に対して決定した。MEME-ChIPソフトウェアスイートを使用して、MACS2によって同定されたピークを中心とする300bpの断片サイズを用いて、富化されたモチーフを予測した。様々なゲノム領域への注釈付けは、Homerソフトウェアスイートを用いて実施した。
【０２０３】
二価イオン
Jurkat T細胞溶解物を記載のように調製し、様々な量の二価イオン(MgCl2、CaCl2又はZnCl2)を補充し、続いて37℃で1時間インキュベートした。凝集タンパク質を記載のように単離し、PierceのBCAキットを用いて定量した。あるいは、凝集タンパク質をJurkat T細胞からのゲノムDNA又は全RNAでリフォールドさせ、可溶性画分に様々な濃度のMgCl2を補充し、37℃で1時間インキュベートした。凝集タンパク質を記載のように単離し、PierceのBCAキットを用いて定量した。
【０２０４】
小分子又は合成DNA/RNAによるタンパク質のリフォールディング
2段階リフォールディングプロトコールを用いて、小分子又は合成DNA若しくはRNAの可溶化作用を試験した。簡単に述べると、凝集した又は組換えタンパク質を、6M GuHCl、100mM DTT、3mM EDTA、20mM Tris-HCl pH7.4、1％Triton X-100中で1〜5μg/μlに溶解及び希釈した。この6μlを氷上でチューブに添加し、54μlの100mM Tris-HCl pH7.4(SO及びComp6)又はTE(DNA及びRNA)中に希釈した、様々な量のオルトバナジン酸ナトリウム(SO)、(NH4)[VO(O2)2(phen)]*2H2O(Comp 6)、又はDNA若しくはRNAを添加した。チューブをボルテックスで混合し、氷上で5分間インキュベートした。次いで、540μlのTris-HCl(pH7.4)を添加し、チューブをボルテックスにより再度混合し、氷上で10分間インキュベートした。この手順は、1:100の最終希釈をもたらし、GuHClの濃度を60mMまで低下させる。次いで、チューブを1000rpmで振とうしながら37℃で1時間インキュベートした。凝集した及び可溶性タンパク質を分離し、前述のように分析した。合成DNA又はRNAを95℃で2分間熱変性させた後、氷上で冷却し、タンパク質に添加した。
【０２０５】
合成DNA又はRNAの生成
ヒトAluSx SINE反復のコンセンサス配列をRepbase(http://www.girinst.org/repbase/)から入手し、二本鎖DNAオリゴマーとして合成した。この断片を、Apa I及びNhe Iを用いてベクターを開くことにより、MSCに導入したNhe I部位を含む改変pCR IIベクター(Life Technologies)にクローニングした。単離されたプラスミドを配列確認し、Nhe I開裂により線状化し、製造業者の説明書に従って、NEBからのHiScribe(商標)T7高収量RNA合成キットを使用したT7媒介性RNA転写のために使用した。インキュベーション後、サンプルをDNAse Iで37℃で15分間処理し、RNAをAgencourt XPビーズで単離した。同定されたモチーフ及び対照に基づいて、合成DNAオリゴマーをIntegrated DNA Technologiesによって合成し、最終濃度が100μMになるように水に溶解した。コンセンサスAluSx反復の配列は以下の通りである:
2017530937.tif 000016
RNAとして転写された場合:
2017530937.tif 000017
【０２０６】
組換えTDP-43の生産及び単離
野生型ヒトTDP-43をcDNAから増幅し、C末端Hisタグとインフレームで細菌発現ベクターにクローニングした。単一クローンをOD600が0.6になるまでLB培地で培養し、その時点でIPTG(最終濃度0.5mM)を添加してTDP-43発現を誘導した。培養物を18℃に一晩置いた。細菌を遠心分離によって集め、HisタグTDP-43を、供給されたGuHCl溶解溶液を用いて、製造業者の説明書に従ってQiagenのNi-NTA Spin Columns Kitを用いて精製した。単離されたタンパク質の純度は、SDS-PAGE電気泳動及びクマシーブルー染色によって決定した。組換えTDP-43をBCAキット(Pierce)を用いて定量した。
【０２０７】
上の明細書中に記載された全ての文献は参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、記載された本発明の方法及び系の様々な改変及び変更が当業者には明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求の範囲に記載した発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、分子生物学、タンパク質凝集又は関連分野の当業者に明らかな本発明を実施するための記載された様式の様々な改変が、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2017530937.tif 000018
【図２Ａ】
2017530937.tif 000019
【図２Ｂ】
2017530937.tif 000020
【図３】
2017530937.tif 000021
【図４】
2017530937.tif 000022
【図５】
2017530937.tif 000023
【図６Ａ−Ｂ】
2017530937.tif 000024
【図６Ｃ−Ｄ】
2017530937.tif 000025
【図６Ｅ−Ｆ】
2017530937.tif 000026
【図７Ａ】
2017530937.tif 000027
【図７Ｂ】
2017530937.tif 000028
【図８Ａ−Ｂ】
2017530937.tif 000029
【図８Ｃ−Ｄ】
2017530937.tif 000030
【図８Ｅ−Ｆ】
2017530937.tif 000031
【図８Ｇ】
2017530937.tif 000032
【図８Ｈ】
2017530937.tif 000033
【図９Ａ】
2017530937.tif 000034
【図９Ｂ】
2017530937.tif 000035
【図９Ｃ−Ｄ】
2017530937.tif 000036
【図９Ｅ】
2017530937.tif 000037
【図１０】
2017530937.tif 000038
【図１１】
2017530937.tif 000039
【図１２】
2017530937.tif 000040
【図１３】
2017530937.tif 000041
【図１４】
2017530937.tif 000042
【図１５Ａ−Ｂ】
2017530937.tif 000043
【図１５Ｃ】
2017530937.tif 000044
【図１６Ａ−Ｂ】
2017530937.tif 000045
【図１６Ｃ】
2017530937.tif 000046
【図１７】
2017530937.tif 000047
【図１８】
2017530937.tif 000048
【図１９】
2017530937.tif 000049
【図２０】
2017530937.tif 000050
【図２１Ａ−Ｃ】
2017530937.tif 000051
【図２１Ｄ−Ｅ】
2017530937.tif 000052
【図２２Ａ】
2017530937.tif 000053
【図２２Ｂ−Ｄ】
2017530937.tif 000054
【図２２Ｅ】
2017530937.tif 000055
【図２３Ａ−Ｂ】
2017530937.tif 000056
【図２３Ｃ−Ｅ】
2017530937.tif 000057
【図２４Ａ−Ｃ】
2017530937.tif 000058
【図２４Ｄ−Ｅ】
2017530937.tif 000059
【図２５Ａ】
2017530937.tif 000060
【図２５Ｂ−Ｄ】
2017530937.tif 000061
【図２５Ｅ】
2017530937.tif 000062
【図２６Ａ−Ｂ】
2017530937.tif 000063
【図２６Ｃ−Ｅ】
2017530937.tif 000064
【図２７Ａ−Ｃ】
2017530937.tif 000065
【図２７Ｄ−Ｅ】
2017530937.tif 000066
【図２８】
2017530937.tif 000067
【配列表】
2017530937000001.app
【国際調査報告】
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2017530937.tif 000069
2017530937.tif 000070
2017530937.tif 000071
2017530937.tif 000072
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