(57)【要約】本開示は、全体として、ヒト、動物および植物における病原体の感染および侵入ならびに環境現場における病原体汚染の制御、ならびに当該制御に有用な薬剤ならびに天然および合成製剤ならびに抽出物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体の増殖または感染または侵入を阻害する方法であって、該病原体を、植物ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体と、カテリシジンペプチド、ヘアピンペプチド、ジスルフィド架橋が除去されたヘアピンペプチド、インドリシジン、合成ペプチドCP-29、およびシスタチン由来ペプチドからなる群より選択される非ディフェンシンペプチドとの組み合わせの有効量に接触させる工程を含み、該ディフェンシンと該ペプチドとの組み合わせが、該組み合わせで使用されるのと同じ個々の用量でそれぞれを単独で使用する場合と比較して相乗的である、前記方法。
【請求項２】
前記植物ディフェンシンが、透過性ディフェンシンである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記透過性ディフェンシンが、NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035およびHXL036からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記透過性ディフェンシンが、ナス科クラスIIディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体である、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記ディフェンシン変異体が、ナス科クラスIIディフェンシン由来の対応するループ1Bと置き換わっているクラスIディフェンシン由来のループ1Bを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
前記ディフェンシン変異体が、HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95およびHXP107からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記カテリシジンペプチドが、バクテネシン、LL-37、BMAP28、SMAP29、PMAP23、mCRAMP、RK-31およびKS-30からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘアピンペプチドが、Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、BWI-2c、BWI-2b、ルフィン（luffin）P1、MBP1、MiAMP2d、C2およびVhT1からなる群より選択されるα-ヘアピニンである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記ヘアピンペプチドが、アンドロクトニン、バクテネシン、ポリフェムシン（F12I)、ポリフェムシンI、ポリフェムシンII、タキプレシンII、ゴメシン、サナチン（thanatin）およびプロテグリンからなる群より選択されるβ-ヘアピンである、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記ジスルフィド架橋が除去されたペプチドが、Bac2AまたはEcAMP4Aである、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記シスタチン由来ペプチドが、SICys9N(67-92)、SICys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)およびCC7(71-104)からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記病原体が、真菌および微生物病原体からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記真菌生物が、アルテルナリア属（Alternaria spp）、アスペルギルス属（Aspergillus spp）、カンジダ属（Candida spp）、フザリウム属（Fusarium spp）、トリコフィトン属（Trichophyton spp）、クリプトコックス属（Cryptococcus spp）、ヒストプラズマ属（Histoplasma spp）、ミクロスポルム属（Microsporum spp）、ペニシリウム属（Penicillium spp）、ニューモシスチス属（Pneumocystis spp）、トリコスポロン属（Trichosporon spp）、スケドスポリウム属（Scedosporium spp）、ペシロミセス属（Paeciliomyces spp）、アクレモニウム属（Acremonium spp）、スタキボトリス属（Stachybotrys spp）、デマチアセウス属（Dermatiaceous）カビ、バーティシリウム属（Verticillium spp）、ピシウム属（Pythium spp）、リゾクトニア属（Rhizoctonia spp）、スクレロチニア属（Sclerotinia spp）、レプトスファエリア属（Leptosphaeria spp）、フィトフトラ属（Phytophthora spp）、コレトトリクム属（Colletotrichum spp）、セルコスポラ属（Cercospora spp）、アルテルナリア属およびサビキン目の菌種からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記真菌生物が、アブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アポフィソミセス・エレガンス（Apophysomyces elegans）、アクレモニウム・ストリクタム（Acremonium stricutm）、アルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata）、アルテルナリア・ブラシシコラ（Alternaria brassicicola）、アルテルナリア・マクロスポラ（Alternaria macrospora）、アルテルナリア・ラファニ（Alternaria raphani）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・パラシチカス（Aspergillus paraciticus）、バシジオボラス・ラナラム（Basidiobolus ranarum）、バイポラリス属（Bipolaris spp）、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・デュブリニエンシス（Candida dubliniensis）、カンジダ・ファマタ（Candida famata）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondii）、カンジダ・ハエムロニイ（Candida haemulonii）、カンジダ・ケフィール（Candida kefyr）、カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）、カンジダ・ルシタニアエ（Candida lusitaniae）、カンジダ・ノルベジェンシス（Candida norvegensis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・ビスワナシイ（Candida viswanathii）、セルコスポラ・ベチコラ（Cercospora beticola）、セルコスポラ・ゴッシィピナ（Cercospora gossypina）、セルコスポラ・ソジナ（Cercospora sojina）、セルコスポラ・ゼアエ・マイディス（Cercospora zeae maydis）、ケトミウム・アトロブルネウム（Chaetomium atrobrunneum）、クラドフィアロフォラ・バンチアナ（Cladophialophora bantiana）、コクリオボラス・ヘテロストロフス（Cochliobolus heterostrophus）、コクシディオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、コクシディオイデス・ポサダシイ（Coccidioides posadasii）、コレトトリクム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola）、コケロミセス・レクルバタス（Cokeromyces recurvatus）、コニディオボルス・コロナトゥス（Conidiobolus coronatus）、コニディオボルス・インコングルース（Conidiobolus incongruus）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、クリプトコックス・ガッティ（Cryptococcus gattii）、クリプトコックス・グルビイ（Cryptococcus grubii）、カニングハメラ・バーソレチアエ（Cunninghamella bertholletiae）、ダクチラリア・ガロパバム（Dactylaria gallopavum）、ディアポルセ・ファゼオロラム（Diaporthe phaseolorum）、エピデルモフィトン・フロッコーサム（Epidermophyton floccosum）、エリシフェ・グラミニス（Erysiphe graminis）（ブルメリア・グラミニス（Blumeria graminis））、エクセロヒルム・ロストラツム（Exserohilum rostratum）、エクセロヒルム・ツルシクム（Exserohilum turcicum）、フザリウム・アヴェナセウム（Fusarium avenaceum）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・オキシスポラムf種バシンフェクタム（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）（Fov）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・オキシスポラムf種ディアンティ（Fusarium oxysporum f. sp. dianthi）、フザリウム・オキシスポラムf種リコペルシシ（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）、フザリウム・シュードグラミネアラム（Fusarium pseudograminearum）、フザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticillioides）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・モニリフォルメ（Fusarium moniliforme）、ゲウマノミセス・グラニミス変種トリチシ（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、レプトスファエリア・マクランス（Leptosphaeria maculans）、マクロフォミナ・ファセオリナ（Macrophomina phaseolina）、ミクロスポルム・カニス（Microsporum canis）、ミクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、ムコール・インディカス（Mucor indicus）、ミコスファエレラ・ゼアエ（Mycosphaerella zeae）、ペシロミセス・バリオッティ（Paecilomyces variotii）、ペシロミセス・リラシヌス（Paecilomyces lilacinus）、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、シュードアレシェリア・ボイジイ（Pseudallescheria boydii）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）、フィアロフォラ・グレガタ（Phialophora gregata）、ファコプソラ・パキリジ（Phakopsora pachyrhizi）、フィトフトラ・ソジャエ（Phytophthora sojae）、フォーマ・エキシグア（Phoma exigua）、プクシニア・スケドナルディイ（Puccinia schedonnardii）、プクシニア・カカバタ（Puccinia cacabata）、フィマトトリコプシス・オムニボラ（Phymatotrichopsis omnivora）、プラスモディオフォラ・ブラシカエ（Plasmodiophora brassicae）、プクシニア・グラミニス（Puccinia graminis）、プクシニア・トリチシナ（Puccinia triticina）、プクシニア・ソルギ（Puccinia sorghi）、ラミクロリディウム・オボボイデウム（Ramichloridium obovoideum）、リゾクトニア・セレアリス（Rhizoctonia cerealis）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、リゾムコール・プシルス（Rhizomucor pusillus）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、サクセネア・バシフォルミス（Saksenaea vasiformis）、スクレロチニア・スクレロチオラム（Sclerotinia sclerotiorum）、セプトリア・トリチシ（Septoria tritici）、セプトリア・ノドラム（Septoria nodorum）、スケドスポリウム・アピオスペルムム（Scedosporium apiospermum）、スケドスポリウム・プロリフィカンス（Scedosporium prolificans）、スポロトリクス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）、ステノカルペラ（ディプロディア）マイディス（Stenocarpella (Diplodia) maydis）、シンセファラストラム・ラセモサム（Syncephalastrum racemosum）、ティエラビオプシス・バシコラ（Thielaviopsis basicola）、ティレティア・コントロバーサ（Tilletia controversa）、ティレティア・インディカ（Tilletia indica）、ティレティア・カリエス（Tilletia caries）、トリコフィトン・ルブラム（Trychophyton rubrum）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trychophyton mentagrophytes）、トリコフィトン・インタージギターレ（Trychophyton interdigitales）、トリコフィトン・トンズランス（Trychophyton tonsurans）、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii）、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon asahii）、トリコスポロン・インキン（Trichosporon inkin）、トリコスポロン・アステロイデス（Trichosporon asteroides）、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporon cutaneum）、トリコスポロン・ドメスティカム（Trichosporon domesticum）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon mucoides）、トリコスポロン・オボイデス（Trichosporon ovoides）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、トリコスポロン・ロウビエリ（Trichosporon loubieri）、トリコスポロン・ジャポニカム（Trichosporon japonicum）、ウスチラゴ・トリチシ（Ustilago tritici）、ウスチラゴ・ゼアエ（Ustilago zeae）、バーティシリウム・ダーリエ（Verticillium dahliae）およびワンギエラ・デルマチチジス（Wangiella dermatitidis）からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記ディフェンシンおよびペプチドが、ヒト、動物、植物または環境現場に局所適用される、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
植物ディフェンシンまたはその機能性合成もしくは天然誘導体もしくは変異体と、カテリシジンペプチド、ヘアピンペプチド、ジスルフィド架橋が除去されたヘアピンペプチド、インドリシジン、合成ペプチドCP-29およびシスタチン由来ペプチドからなる群より選択される非ディフェンシンペプチドとの組み合わせ、ならびに1つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む、製剤または細胞もしくは植物抽出物。
【請求項１７】
前記植物ディフェンシンが、透過性ディフェンシンである、請求項16に記載の製剤または細胞もしくは植物抽出物。
【請求項１８】
前記透過性ディフェンシンが、クラスIIナス科ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体である、請求項17に記載の製剤または細胞もしくは植物抽出物。
【請求項１９】
前記製剤が、ボディまたはヘアウォッシュである、請求項16に記載の製剤または細胞もしくは植物抽出物。
【請求項２０】
ヒトまたは動物対象の病原体の治療または予防のための医薬の製造における、請求項16〜19のいずれか一項に記載の製剤または細胞もしくは植物抽出物の使用。
【請求項２１】
病原体の増殖または感染または侵入を阻害する方法であって、該病原体を、NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035およびHXL036からなる群より選択される植物ディフェンシンまたはHXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95およびHXP107からなる群より選択されるディフェンシンの変異体もしくは誘導体と、カテリシジンペプチド、ヘアピンペプチド、ジスルフィド架橋が除去されたヘアピンペプチド、インドリシジン、合成ペプチドCP-29、シスタチン由来ペプチドおよびプロテイナーゼ阻害剤由来ペプチドからなる群より選択される非ディフェンシンペプチドとの組み合わせの有効量に接触させる工程を含み、該ディフェンシンと該ペプチドとの組み合わせが、該組み合わせで使用されるのと同じ個々の用量でそれぞれを単独で使用する場合と比較して相乗的である、前記方法。
【請求項２２】
トランスジェニック植物もしくはその子孫または植物の種子であって、異種ディフェンシンと、カテリシジンペプチド、ヘアピンペプチド、ジスルフィド架橋が除去されたヘアピンペプチド、インドリシジン、合成ペプチドCP-29およびシスタチン由来ペプチドからなる群より選択される非ディフェンシンペプチドとを発現し、該植物が、病原体に対する強化された抵抗性を示す、前記トランスジェニック植物もしくはその子孫または植物の種子。
【請求項２３】
前記ディフェンシンが、NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035およびHXL036から選択されるか、またはHXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95およびHXP107からなる群より選択されるディフェンシンの変異体もしくは誘導体である、請求項22に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２４】
前記カテリシジンペプチドが、バクテネシン、LL-37、BMAP28、SMAP29、PMAP23、mCRAMP、RK-31およびKS-30からなる群より選択される、請求項22に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２５】
前記ヘアピンペプチドが、Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、BWI-2c、BWI-2b、ルフィンP1、MBP1、MiAMP2d、C2およびVhT1からなる群より選択されるα-ヘアピニンである、請求項22に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２６】
前記ヘアピンペプチドが、アンドロクトニン、バクテネシン、ポリフェムシン（F12I)、ポリフェムシンI、ポリフェムシンII、タキプレシンII、ゴメシン、サナチンおよびプロテグリンからなる群より選択されるβ-ヘアピンである、請求項22に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２７】
前記ジスルフィド架橋が除去されたペプチドが、Bac2AまたはEcAMP4Aである、請求項22に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２８】
前記シスタチン由来ペプチドが、SICys9N(67-92)、SICys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)およびCC7(71-104)からなる群より選択される、請求項22に記載のトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願情報
本願は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2015年4月23日に出願された、「Agent and methods of treatment of pathogens」を表題とするオーストラリア仮特許出願第2014901470号に関連し、その優先権を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、全体として、ヒト、動物および植物における病原体の感染および侵入ならびに環境現場における病原体汚染の制御、ならびにそのために有用な薬剤ならびに天然および合成製剤および抽出物に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連分野の解説
本明細書において著者によって参照されている刊行物の書誌情報は、詳細な説明の最後にアルファベット順にまとめられている。
【０００４】
本明細書における任意の先行技術の参照は、この先行技術が任意の国において共通の一般知識の一部を形成していることの承認または何らかの形式の示唆ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【０００５】
病原体の感染および侵入は、ヒト、動物および植物において深刻な健康問題を引き起こし得る。
【０００６】
例えば、植物病原体、例えば真菌病原体に起因する作物損失は農業における大きな問題であり、これらの損失を抑えるための殺菌剤の適用に毎年数百万ドルが費やされている（Oerke and Dehne (2004) Crop Protection 23:275-285（非特許文献1））。
【０００７】
ヒト医学および獣医学においてならびに農業部門において化学的な殺病原体剤が成功を収めているが、病原体感染および侵入を制御するための化学品の継続利用には環境面および規制面のさまざまな懸念が存在する。これらの薬剤の利用の増加はまた、病原体種における耐性の発生に関する選択圧を提供する。これは、ヒトおよび動物における感染を治療するための抗生物質の広範な利用に関連して特に懸念されている。ヒト、動物および植物における病原体による感染および侵入の制御の代替メカニズムが必要とされていることは明らかである。この要望は、土壌ならびにヒト、動物および植物が暴露される他の環境サイトにおける病原体汚染の制御にも及んでいる。
【０００８】
ヒト、動物および植物は、病原体感染および侵入に対して一定の自然保護を提供する様々なシステムを進化させた。自然免疫機構は調査対象となった種との関係で研究されているが、異なる種にまたがるこれらのシステムの要素の使用についてはほとんど知られていない。植物において、これらの要素は、植物免疫の構成性および誘導性の両方の局面において大きな役割を果たす小さな、ジスルフィド豊富なタンパク質を含む。それらは、それらのシステイン配置に基づくファミリーに分類することができ、チオニン、スナキン（snakin）、ソーマチン様タンパク質、ヘベインおよびノッチン型タンパク質、脂質転移タンパク質、α-ヘアピニンおよびシクロチドならびにディフェンシンを含む。
【０００９】
植物ディフェンシンは、4〜5つのジスルフィド結合を有する小さな（45〜54アミノ酸）塩基性タンパク質である（Janssen et al. (2003) Biochemistry 42(27):8214-8222（非特許文献2））。それらは、3本鎖、逆平行のβ-シートが3つのジスルフィド結合によりα-ヘリックスにつながれシステイン安定化αβモチーフを形成する共通のジスルフィド結合パターンおよび共通の折りたたみ構造を共有している。第4のジスルフィド結合もNおよびC末端に加わり、それによって極めて安定な構造を形成する。抗細菌活性、タンパク質合成阻害ならびにα-アミラーゼおよびプロテアーゼ阻害を含む様々な機能がディフェンシンに起因している（Colilla et al. (1990) FEBS Lett 270(1-2);191-194（非特許文献3）; Bloch and Richardson (1991) FEBS Lett 279(1):101-104（非特許文献4））。植物ディフェンシンは、標的病原体に対する耐性を向上させるために、トランスジェニック植物において発現されている。例えば、アルファルファディフェンシン（MsDef1、以前はalfAFPとして知られていた）を発現するジャガイモは、非形質転換対照と比較して真菌病原体バーティシリウム・ダーリエ（Verticillium dahliae）に対して有意な耐性を示した（Gao et al. (2000) Nat Biotechnol 18(12):1307-1310（非特許文献5））。コメにおけるダリアディフェンシン（DmAMP1）の発現は、2つの主要なコメ病原体であるマグナポーセ・オリゼ（Magnaporthe oryzae）およびリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）に対する保護を提供するのに十分であった（Jha et al. (2009) Transgenic Res 18(1):59-69（非特許文献6））。
【００１０】
ディフェンシンの構造は、システイン残基間の領域として定義される7つの「ループ」からなる。ループ1は、第1のβ-ストランド（1A）および最初の2つの不変システイン残基間の、このβ-ストランドをα-ヘリックス（1B）に接続するフレキシブル領域の大部分を含む。ループ2、3および4の最初の部分（4A）はα-ヘリックスを構成し、残りのループ（4B-7）はβ-ストランド2および3ならびにそれらを接続するフレキシブル領域を構成する（van der Weerden et al. (2013) Cell Mol Life Sci 70(19): 3545-3570（非特許文献7））。
【００１１】
それらの保存された構造にもかかわらず、植物ディフェンシンは非常に低い配列同一性しか共有しておらず、完全に保存されているのは8つのシステイン残基だけである。これらのシステイン残基は、それらの存在、位置および接続性がディフェンシン間で保存されていることから、一般に「不変システイン残基」と呼ばれる。配列類似性に基づき、植物ディフェンシンは、異なるグループに分類され得る。各グループ内で、配列相同性は比較的高いが、グループ間のアミノ酸類似性は低い（van der Weerden et al. (2013) Cell Mol Life Sci 70(19): 3545-3570（非特許文献7））。
【００１２】
植物ディフェンシンには2つの大クラスが存在する。クラスIディフェンシンは、小胞体（ER）シグナル配列およびそれに続く成熟ディフェンシンドメインからなる。クラスIIディフェンシンは、約33アミノ酸のC末端プロドメインまたはプロペプチド（CTPP）を有するより大きな前駆体として産生される。今日までに同定されているクラスIIディフェンシンの大部分は、ナス科（Solanaceous）植物種において見出されている。
【００１３】
クラスIIナス科ディフェンシンは、花組織において発現される。それらは、観賞用タバコであるニコチアナ・アラタ（Nicotiana alata）の花において高濃度で発現されるNaD1を含む（Lay et al. (2003) Plant Physiol 131(3):1283-1293（非特許文献8））。このペプチドの抗真菌活性は、細胞壁への結合、細胞膜の透過および菌糸の細胞質へのこのペプチドの侵入（van der Weerden et al. (2008) J Biol Chem 283(21): 14445-14452（非特許文献9））ならびに活性酸素種の誘導（Hayes et al. (2014) Cell Mol Life Sci. February 2014, on line ISSN 1420-682X（非特許文献10））を伴う。
【００１４】
綿花におけるNaD1の発現は、真菌病原体フザリウム・オキシスポラムf種バシンフェクタム（Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum）およびバーティシリウム・ダーリエに対する耐性を強化する。フィールド条件下で、NaD1を発現する植物は、非形質転換対照植物と比較して2倍生存する可能性があり、ヘクタールあたりの綿量が倍増する。それにもかかわらず、NaD1発現植物にはなおも有意なレベルの疾患がみられた（Gaspar et al. (2014) J Exp Bot Feb 6 epub（非特許文献11））。
【００１５】
クラスIIナス科ディフェンシンは、様々な程度の対真菌活性を有する。いくつかのクラスIディフェンシンは、非常に低い抗真菌活性を示す。いくつかのディフェンシンに対する耐性の発生もまた、潜在的な問題である。これに対して、ヒトおよび動物病原体に対するディフェンシンの効果に関しては限られた研究しかなされていない。
【００１６】
非常に多様な配列を有するディフェンシンは、異なる作用機構を通じて作用する。細胞膜の透過は、多くのディフェンシンで観察される共通の特徴である。しかし、透過機構および細胞死におけるその役割は、異なるディフェンシン間で相違する。いくつかのディフェンシンは、高濃度で膜透過するが、完全な増殖阻害に必要とされる濃度ではそうならない。実際、有意な膜透過に必要とされるこれらのタンパク質の濃度は、増殖阻害に必要とされるものの約20倍である。これらのタンパク質は、増殖阻害に必要とされる濃度でわずかに膜透過するが、それは長時間（＞150分）の後である。これは、真菌の細胞死の後に起こると考えられる。米国特許出願第12/535,443号（特許文献1）に記載される細胞不透過性核酸SYTOX（商標）緑色アッセイは、透過率および透過度の尺度としてよく使用されている。
【００１７】
いくつかの他の植物ディフェンシンと異なり、植物ディフェンシンNaD1は、IC50に相当する濃度で有意に膜透過する。NaD1による真菌菌糸の透過は、15分以内に始まり、80分後にその最大に達する（van der Weerden et al. (2010) J Biol Chem 285(48):37513-37520（非特許文献12））。NaD1はまた、増殖阻害を引き起こさない低濃度で一定の膜透過を示す（van der Weerden et al. (2008) J Biol Chem 283(21):14445-14452（非特許文献9））。ディフェンシン間の透過キネティクスの違いは、そのタンパク質の作用機構の違いに起因すると考えられる。したがって、透過アッセイを使用する上で、適当なディフェンシンを選択する必要がある。
【００１８】
ヒト、動物および植物における病原体の感染および侵入をより効果的に管理するためのプロトコルを開発する必要がある。化学剤もしくは抗生物質の使用が少ないまたはその使用を必要としない病原体のこの制御を促進する能力は、結局のところ、環境汚染および結果として生じる発癌性への懸念を減らし、かつ抗生物質耐性を発生させる選択圧を減らすであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許出願第12/535,443号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Oerke and Dehne (2004) Crop Protection 23:275-285
【非特許文献２】Janssen et al. (2003) Biochemistry 42(27):8214-8222
【非特許文献３】Colilla et al. (1990) FEBS Lett 270(1-2);191-194
【非特許文献４】Bloch and Richardson (1991) FEBS Lett 279(1):101-104
【非特許文献５】Gao et al. (2000) Nat Biotechnol 18(12):1307-1310
【非特許文献６】Jha et al. (2009) Transgenic Res 18(1):59-69
【非特許文献７】van der Weerden et al. (2013) Cell Mol Life Sci 70(19): 3545-3570
【非特許文献８】Lay et al. (2003) Plant Physiol 131(3):1283-1293
【非特許文献９】van der Weerden et al. (2008) J Biol Chem 283(21): 14445-14452
【非特許文献１０】Hayes et al. (2014) Cell Mol Life Sci. February 2014, on line ISSN 1420-682X
【非特許文献１１】Gaspar et al. (2014) J Exp Bot Feb 6 epub
【非特許文献１２】van der Weerden et al. (2010) J Biol Chem 285(48):37513-37520
【発明の概要】
【００２１】
要旨
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号（SEQ ID NO）によって表される。SEQ ID NOは、数値的に、配列識別子<400>1（SEQ ID NO:1）、<400>2（SEQ ID NO:2）等に対応する。配列識別子の概要は、表1に提供されている。配列表は、特許請求の範囲の後に提供される。
【００２２】
本開示は、病原体の増殖、感染、侵入または汚染を阻害する方法であって、病原体を、植物ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体ならびに非ディフェンシンペプチドの組み合わせの有効量に接触させる工程を含み、ディフェンシンとペプチドの組み合わせが、当該組み合わせで使用されるのと同じ個々の用量でそれぞれを単独で使用する場合と比較して相乗的である方法を教示する。「非ディフェンシンペプチド」という表現は、植物ディフェンシン以外のペプチドを含む。この用語は、「非植物ディフェンシンペプチド」を包含する。いくつかの例において、このペプチドは、抗病原体特性を有する。他の例において、このペプチドは、抗病原体活性を有さないまたは最小限の抗病原体活性を有する。
【００２３】
1つの態様において、植物ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体は、透過性ディフェンシン、例えばいくつかのクラスIディフェンシンおよびナス科クラスIIディフェンシンである。例は、NaD1（Q8GTM0）、TPP3（AAA80496）、PhD1（Q8H6Q1）、PhD1A（SEQ ID NO:47）、PhD2（Q8H6Q0）、FST（p32026）、NoD173（SEQ ID NO:48）、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035およびHXL036を含む。1つの態様において、透過性ディフェンシンは、ディフェンシンの機能性天然または合成誘導体または変異体である。合成変異体の例は、クラスIディフェンシン由来のループ1Bがナス科クラスIIディフェンシン由来のループ1Bと置き換わっているものを含む。これらは、HXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95およびHXP107を含む。
【００２４】
非ディフェンシンペプチドは、α-ヘリカルペプチド（例えば、α-ヘリカルカテリシジンペプチド）、ジスルフィド架橋によって安定化されたヘアピンを形成するペプチド（例えば、α-ヘアピニンおよびβ-ヘアピン）、安定化ジスルフィド架橋が除去されたヘアピンペプチド（例えば、α-ヘアピニンおよびβ-ヘアピン）、拡張された立体構造を有するペプチド、特定のアミノ酸残基が豊富なペプチドならびに／またはプロテイナーゼ阻害剤由来のペプチドとして特徴付けられる4〜100アミノ酸残基ペプチドまたは0.4〜12kDペプチドを包含する。
【００２５】
α-ヘリカルペプチドの例は、ヒト由来または非ヒト霊長類もしくはげっ歯類、ブタ、ウシ、ヤギ動物由来のカテリシジンペプチド、例えばLL-37、BMAP28、SMAP29、PMAP23、mCRAMP、RK-31およびKS-30を含む。
【００２６】
α-ヘリカルペプチドの例は、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30およびCP-29を含む。
【００２７】
β-ヘアピンの例は、バクテネシン、プロテグリン、タキプレシン（例えば、タキプレシンII）、アンドロクトニン、ポリフェムシン（例えば、ポリフェムシン（F12I）、ポリフェムシンIおよびポリフェムシンII）、ゴメシン、サナチン（thanatin）およびブレベニンを含む。α-ヘアピニンの例は、Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、BWI-2c、BWI-2b、ルフィン（luffin）P1、MBP-1、MiAMP2d、C2およびVhT1を含む植物源由来のペプチドを含む。
【００２８】
システイン残基をアラニン残基またはセリン残基で置換することによってβ-ヘアピンまたはα-ヘアピニンのジスルフィド架橋が除去された合成ヘアピンペプチドの例は、Bac2AおよびEcAMP4Aを含む。
【００２９】
特定のアミノ酸が豊富なペプチドの例は、インドリシジンを含む。
【００３０】
拡張立体構造ペプチドの例は、Bac2A、EcAMP4Aおよびインドリシジンを含む。
【００３１】
プロテイナーゼ阻害剤由来のペプチドの例は、プロテイナーゼ阻害剤がシスタチンの場合、SICys9N（67-92）、SICys9N（77-110）、HvCPI6（75-99）およびCC7（71-104）を含む。
【００３２】
本発明に包含されないペプチドは、β-シートまたは混合型α-βペプチドであるヒトおよび植物ディフェンシンである。
【００３３】
本願において、驚くべきことに、植物ディフェンシンと非植物源由来のペプチドとの組み合わせがヒト、動物および植物に強化された抗病原体特性を付与することおよび環境現場（例えば土壌）を除染するために使用できることが決定された。
【００３４】
上記にもかかわらず、いくつかのα-ヘアピニンおよびβ-ヘアピンペプチドは、それら独自に、植物ディフェンシンとの組み合わせで使用される濃度よりも高い濃度で病原体に対する効能を示す。
【００３５】
病原体は、ヒト、動物および／または植物に影響する真菌または微生物であり得る。1つの態様において、病原体は、真菌病原体である。真菌病原体は、酵母およびサビキンを含む。
【００３６】
哺乳動物、例えばヒトを含む動物の真菌病原体は、アルテルナリア属（Alternaeria spp）、アスペルギルス属（Aspergillus spp）、カンジダ属（Candida spp）、フザリウム属（Fusarium spp）、トリコフィトン属（Trichophyton spp）、クリプトコックス属（Cryptococcus spp）、ヒストプラズマ属（Histoplasma spp)、ミクロスポルム属（Microsporum spp）、ペニシリウム属（Penicillium spp）、ニューモシスチス属（Pneumocystis spp）、トリコスポロン属（Trichosporon spp)、スケドスポリウム属（Scedosporium spp）、ペシロミセス属（Paeciliomyces spp）、アクレモニウム属（Acremonium spp）、スタキボトリス属（Stachybotrys spp）およびデマチアセウス（Dermatiaceous）カビの菌種を含む。哺乳動物および特にヒトを含む特定の動物の病原体は、アルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・パラシチカス（Aspergillus paraciticus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・デュブリニエンシス（Candida dubliniensis）、カンジダ・ファマタ（Candida famata）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondii）、カンジダ・ハエムロニイ（Candida haemulonii）、カンジダ・ケフィール（Candida kefyr）、カンジダ・クルーセイ（Candida krusei）、カンジダ・ルシタニアエ（Candida lusitaniae）、カンジダ・ノルベジェンシス（Candida norvegensis）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・ビスワナシイ（Candida viswanathii）、エピデルモフィトン・フロッコーサム（Epidermophyton floccosum）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・モニリフォルメ（Fusarium moniliforme）、トリコフィトン・ルブラム（Trychophyton rubrum）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trychophyton mentagrophytes）、トリコフィトン・インタージギターレ（Trychophyton interdigitales）、トリコフィトン・トンズランス（Trychophyton tonsurans）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、クリプトコックス・ガッティ（Cryptococcus gattii）、クリプトコックス・グルビイ（Cryptococcus grubii）、ミクロスポルム・カニス（Microsporum canis）、ミクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）、トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii）、トリコスポロン・アサヒ（Trichosporon asahii）、トリコスポロン・インキン（Trichosporon inkin）、トリコスポロン・アステロイデス（Trichosporon asteroides）、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporon cutaneum）、トリコスポロン・ドメスティカム（Trichosporon domesticum）、トリコスポロン・ムコイデス（Trichosporon mucoides）、トリコスポロン・オボイデス（Trichosporon ovoides）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、トリコスポロン・ロウビエリ（Trichosporon loubieri）、トリコスポロン・ジャポニカム（Trichosporon japonicum）、スケドスポリウム・アピオスペルムム（Scedosporium apiospermum）、スケドスポリウム・プロリフィカンス（Scedosporium prolificans）、ペシロミセス・バリオッティ（Paecilomyces variotii）、ペシロミセス・リラシヌス（Paecilomyces lilacinus）、アクレモニウム・ストリクタム（Acremonium stricutm）、クラドフィアロフォラ・バンチアナ（Cladophialophora bantiana）、ワンギエラ・デルマチチジス（Wangiella dermatitidis）、ラミクロリディウム・オボボイデウム（Ramichloridium obovoideum）、ケトミウム・アトロブルネウム（Chaetomium atrobrunneum）、ダクチラリア・ガロパバム（Dactylaria gallopavum）、バイポラリス属（Bipolaris spp）、エクセロヒルム・ロストラツム（Exserohilum rostratum）ならびにアブシジア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）、アポフィソミセス・エレガンス（Apophysomyces elegans）、ムコール・インディカス（Mucor indicus）、リゾムコール・プシルス（Rhizomucor pusillus）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、カニングハメラ・バーソレチアエ（Cunninghamella bertholletiae）、コケロミセス・レクルバタス（Cokeromyces recurvatus）、サクセネア・バシフォルミス（Saksenaea vasiformis）、シンセファラストラム・ラセモサム（Syncephalastrum racemosum）、バシジオボラス・ラナラム（Basidiobolus ranarum）、コニディオボルス・コロナトゥス（Conidiobolus coronatus）、コニディオボルス・インコングルース（Conidiobolus incongruus）、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）、コクシディオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、コクシディオイデス・ポサダシイ（Coccidioides posadasii）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、シュードアレシェリア・ボイジイ（Pseudallescheria boydii）およびスポロトリクス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）を含む。
【００３７】
主な作物の具体的な病原体は以下を含む：トウモロコシ：ギベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）（フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum））、コレトトリクム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola）、ステノカルペラ・メイジ（Stenocarpella maydi）（ディプロディア・マイディス（Diplodia maydis））、フザリウム・モニリフォルメ変種サブグルチナンス（Fusarium moniliforme var. subglutinans）、フザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticillioides）、バイポラリス・マイディス（Bipolaris maydis）O、T（コクリオボリス・ヘテロストロフス（Cochliobolis heterostrophus））、エクセロヒルム・ツルシクム（Exserohilum turcicum）I、IIおよびIII、セルコスポラ・ゼアエ・マイディス（Cercospora zeae maydis）、ピシウム・イレギュラレ（Pythium irregulare）、ピシウム・デバリアナム（Pythium debaryanum）、ピシウム・グラミニコラ（Pythium graminicola）、ピシウム・スプレンデンス（Pythium splendens）、ピシウム・ウルチマム（Pythium ultimum）、ピシウム・アファニダーマタム（Pythium aphanidermatum）、アスペルギルス属、アスペルギルス・フラバス、ヘルミンソスポリウム・カーボナム（Helminthosporium carbonum）I、IIおよびIII（コクリオボラス・カーボナム（Cochliobolus carbonum））、ヘルミンソスポリウム・ペジセラタム（Helminthosporium pedicellatum）、フィソダーマ・マイディス（Physoderma maydis）、フィロスチクタ・マイディス（Phyllosticta maydis）、カバチエラ・マイディス（Kabatiella maydis）、セルコスポラ・ソルギ（Cercospora sorghi）、ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、ウスチラゴ・ゼアエ（Ustilago zeae）、プクシニア・ソルギ（Puccinia sorghi）、プクシニア・ポリソラ（Puccinia polysora）、マクロフォミナ・ファセオリナ（Macrophomina phaseolina）、ペニシリウム・オキサリカム（Penicillium oxalicum）、ニグロスポラ・オリゼ（Nigrospora oryzae）、クラドスポリウム・ハーバリウム（Cladosporium herbarium）、カーブラリア・ルナタ（Curvularia lunata）、カーブラリア・イナエクアリス（Curvularia inaequalis）、カーブラリア・パレセンス（Curvularia pallescens）、トリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）、クラビセプス・ソルギ（Claviceps sorghi）、ディプロディア・マクロスポラ（Diplodia macrospora）、スクレロフソラ・マクロスポラ（Sclerophthora macrospora）、ペロノスクレロスポラ・ソルギ（Peronosclerospora sorghi）、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス（Peronosclerospora philippinensis）、ペロノスクレロスポラ・マイディス（Peronosclerospora maydis）、ペロノスクレロスポラ・サッカリ（Peronosclerospora sacchari）、スファセロセカ・レイリアナ（Sphacelotheca reiliana）、フィソペラ・ゼアエ（Physopella zeae）、セファロスポラム・マイディス（Cephalosporum maydis）、セファロスポラム・アクレモニウム（Cephalosporum acremonium）；ダイズ：フザリウム・バーグルリフォルメ（Fusarium virgululiforme）、フザリウム・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオラム（Sclerotinia sclerotiorum）、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ツクマニアエ（Fusarium tucumaniae）、ファコプソラ・パキリジ（Phakopsora pachyrhizi）、フィトフトラ・メガスペルマf種グリシネア（Phytophthora megasperma f.sp. glycinea）、フィトフトラ・ソジャエ（Phytophthora sojae）、マクロフォミナ・ファセオリナ、リゾクトニア・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオラム、ディアポルセ・ファゼオロラム変種ソジャエ（Diaporthe phaseolorum var. sojae）（フォモプシス・ソジャエ（Phomopsis sojae））、ディアポルセ・ファゼオロラム変種カウリボラ（Diaporthe phaseolorum var. caulivora）、スクレロチウム・ロルフシイ（Sclerotium rolfsii）、セルコスポラ・キクチイ（Cercospora kikuchii）、セルコスポラ・ソジナ（Cercospora sojina）、ペロノスポラ・マンシュリカ（Peronospora manshurica）、コレトトリクム・デマチウム（Colletotrichum dematium）（コレトトリクム・トランカタム（Colletotrichum truncatum））、コリネスポラ・カッシイコラ（Corynespora cassiicola）、セプトリア・グリシネス（Septoria glycines）、フィロスチクタ・ソジコラ（Phyllosticta sojicola）、アルテルナリア・アルテルナータ、ミクロスファエラ・ディフューザ（Microsphaera diffusa）、フザリウム・セミテクタム（Fusarium semitectum）、フィアロフォラ・グレガタ（Phialophora gregata）、グロメレラ・グリシネス（Glomerella glycines）、ピシウム・アファニダーマタム、ピシウム・ウルチマム（Pythium ultimum）、ピシウム・デバリアナム（Pythium debaryanum）；キャノーラ：アルブゴ・カンジダ（Albugo candida）、アルテルナリア・ブラシカエ（Alternaria brassicae）、レプトスファエリア・マクランス（Leptosphaeria maculans）、リゾクトニア・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオラム（Sclerotinia sclerotiorum）、ミコスファエレラ・ブラッシシコラ（Mycosphaerella brassicicola）、ピシウム・ウルチマム、ペロノスポラ・パラシチカ（Peronospora parasitica）、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・アベナセウム（Fusarium avenaceum）、フザリウム・ロセウム（Fusarium roseum）、アルテルナリア・アルテルナータ；綿花：フザリウム・オキシスポラムf種バシンフェクタム、バーティシリウム・ダーリエ、ティエラビオプシス・バシコラ（Thielaviopsis basicola）、アルテルナリア・マクロスポラ（Alternaria macrospora）、セルコスポラ・ゴッシィピナ（Cercospora gossypina）、フォーマ・エキシグア（Phoma exigua）（アスコキタ・ゴッシピイ（Ascochyta gossypii））、ピシウム属、リゾクトニア・ソラニ、プクシニア・スケダルディ（Puccinia scheddardii）、プクシニア・カカバタ（Puccinia cacabata）、フィマトトリコプシス・オムニボレ（Phymatotrichopsis omnivore）；キャノーラ：レプトスファエリア・マクランス、スクレロチニア・スクレロチオラム、アルテルナリア・ブラシカエ、アルテルナリア・ブラシシコラ、プラスモディオフォラ・ブラシカエ（Plasmodiophora brassicae）、リゾクトニア・ソラニ、フザリウム属、ピシウム属、フィトフトラ属、アルテルナリア属、ペロノスポラ・パラシチカ、ミコスファエレラ・カプセラエ（Mycosphaerella capsellae）（シュードセルコスポレラ・カプセラエ（Pseudocercosporella capsellae））、アルブゴ・カンジダ、フィトフトラ・メガスペルマ変種メガスペルマ、ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、エリシフェ・クルシフェララム（Erysiphe cruciferarum）；コムギ：コクリオボラス・サチバス（Cochliobolus sativus）、ドレクスレラ・ウィレガネンシス（Drechslera wirreganensis）、ミコスファエレラ・グラミニコラ(Mycosphaerella graminicola)、ファエオスファエリア・アベナリアf種トリチセア（Phaeosphaeria avenaria f.sp. triticea）、ファエオスファエリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）、ブルメリア・グラミニスf種トリチシ（Blumeria graminis f.sp. tritici）、ウロシスチス・アグロピリ（Urocystis agropyri）、アルテルナリア・アルテルナータ、クラドスポリウム・ハーバラム（Cladosporium herbarum）、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・アヴェナセウム、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・シュードグラミネアラム（Fusarium pseudograminearum）、ウスチラゴ・トリチシ（Ustilago tritici）、アスコキタ・トリチシ（Ascochyta tritici）、セファロスポリウム・グラミネウム（Cephalosporium gramineum）、コレトトリクム・グラミニコラ（Colletotrichum graminicola）、エリシフェ・グラミニスf種トリチシ（Erysiphe graminis f.sp. tritici）、プクシニア・グラミニスf種トリチシ（Puccinia graminis f.sp. tritici）、プクシニア・レコンジタf種トリチシ（Puccinia recondita f.sp. tritici）、プクシニア・ストリイフォルミス（Puccinia striiformis）、プクシニア・トリチシナ（Puccinia triticina）、スクレロフソラ・マクロスポラ（Sclerophthora macrospora）、ウロシスチス・アグロピリ、ピレノフォラ・トリチシ-レペンチス（Pyrenophora tritici-repentis）、ピレノフォラ・セメニペルダ（Pyrenophora semeniperda）、ファエオスファエリア・ノドラム、セプトリア・ノドラム（Septoria nodorum）、セプトリア・トリチシ（Septoria tritici）、セプトリア・アベナエ（Septoria avenae）、シュードセルコスポレラ・ハーポトリコイデス（Pseudocercosporella herpotrichoides）、リゾクトニア・ソラニ、リゾクトニア・セレアリス（Rhizoctonia cerealis）、ゲウマノミセス・グラニミス変種トリチシ（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、ピシウム属、ピシウム・アファニダーマタム、ピシウム・アルヘノマンネス（Pythium arrhenomannes）、ピシウム・グラミニコラ、ピシウム・ウルチマム、バイポラリス・ソロキニアナ（Bipolaris sorokiniana）、クラビセプス・パープレア（Claviceps purpurea）、タペシア・ヤルンダエ（Tapesia yallundae）、ティレティア・トリチシ（Tilletia tritici）、ティレティア・ラエビス（Tilletia laevis）、ティレティア・カリエス（Tilletia caries）、ティレティア・インディカ（Tilletia indica）、ウスチラゴ・トリチシ、ウォジュノヴィシア・グラミニス（Wojnowicia graminis）、コクリオボラス・サチバス；ソルガム：エクセロヒルム・ツルシクム（Exserohilum turcicum）、コレトトリクム・サブリネオラム（Colletotrichum sublineolum）、セルコスポラ・ソルギ、グロエオセルコスポラ・ソルギ（Gloeocercospora sorghi）、アスコキタ・ソルギナ（Ascochyta sorghina）、プクシニア・パープレア（Puccinia purpurea）、マクロフォミナ・ファセオリナ、ペルコニア・サーシナタ（Perconia circinata）、フザリウム・モニリフォルメ、アルテルナリア・アルテルナータ、バイポラリス・ソルギコラ（Bipolaris sorghicola）、ヘルミンソスポリウム・ソルギコラ（Helminthosporium sorghicola）、カーブラリア・ルナタ、フォーマ・インシジオーサ（Phoma insidiosa）、ラムリスポラ・ソルギ（Ramulispora sorghi）、ラムリスポラ・ソルギコラ（Ramulispora sorghicola）、フィラキャラ・サッカリ（Phyllachara saccari）、スポリソリウム・レイリアナム（Sporisorium reilianum）（スファセロセカ・レイリアナ）、スファセロセカ・クルエンタ（Sphacelotheca cruenta）、スポリソリウム・ソルギ（Sporisorium sorghi）、クラビセプス・ソルギ、リゾクトニア・ソラニ、アクレモニウム・ストリクタム、スクレロフソナ・マクロスポラ（Sclerophthona macrospora）、ペロノスクレロスポラ・ソル��、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス、スクレロスポラ・グラミニコラ（Sclerospora graminicola）、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・オキシスポラム、ピシウム・アルヘノマンネス、ピシウム・グラミニコラ；ヒマワリ：プラスモパラ・ハルステディイ（Plasmopara halstedii）、スクレロチニア・スクレロチオラム、セプトリア・ヘリアンシ（Septoria helianthi）、フォモプシス・ヘリアンシ（Phomopsis helianthi）、アルテルナリア・ヘリアンシ（Alternaria helianthi）、アルテルナリア・ジニアエ（Alternaria zinniae）、ボトリチス・シネレア、フォーマ・マクドナルディイ（Phoma macdonaldii）、マクロフォミナ・ファセオリナ（Macrophomina phaseolina）、エリシフェ・シコラセアラム（Erysiphe cichoracearum）、リゾプス・オリゼ、リゾプス・アリザス（Rhizopus arrhizus）、リゾプス・ストロニファー（Rhizopus stolonifer）、プクシニア・ヘリアンセ（Puccinia helianthe）、バーティシリウム・ダーリエ、セファロスポラム・アクレモニウム、フィトフトラ・クリプトゲア（Phytophthora cryptogea）、アルブゴ・トラゴポゴニス（Albugo tragopogonis）；アルファルファ：ピ
シウム・ウルチマム、ピシウム・イレギュラレ（Pythium irregulare）、ピシウム・スプレンデンス、ピシウム・デバリアナム、ピシウム・アファニダーマタム、フィトフトラ・メガスペルマ、ペロノスポラ・トリフォリオラム（Peronospora trifoliorum）、フォーマ・メディカギニス変種メディカギニス（Phoma medicaginis var. medicaginis）、セルコスポラ・メディカギニス（Cercospora medicaginis）、シュードペジザ・メディカギニス（Pseudopeziza medicaginis）、レプトトロチラ・メディカギニス（Leptotrochila medicaginis）、フザリウム・オキシスポラム、バーチリシウム・アルボ-アトラム（Verticillium albo-atrum）、アファノミセス・ユーテイシェス（Aphanomyces euteiches）、ステムフィリウム・ハーバラム（Stemphylium herbarum）、ステムフィリウム・アルファルファエ（Stemphylium alfalfae）、コレトトリクム・トリフォリイ（Colletotrichum trifolii）、レプトスファエルリナ・ブリオシアナ（Leptosphaerulina briosiana）、ウロミセス・ストリアタス（Uromyces striatus）、スクレロチニア・トリフォリオラム（Sclerotinia trifoliorum）、スタゴノスポラ・メリロチ（Stagonospora meliloti）、ステムフィリウム・ボトリオサム（Stemphylium botryosum）およびレプトトリチラ・メディカギニス（Leptotrichila medicaginis）。
【００３８】
ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドは、ヒト、動物もしくは植物に局所適用され得るまたはヒトもしくは動物に全身投与され得るまたはディフェンシンおよび／もしくは該ペプチドを産生するよう遺伝子操作された植物において一方もしくは両方が発現され得る。1つの態様においては、一方が植物内で発現され、他方が局所適用される。別の態様においては、一方または両方が遺伝子修飾された微生物において発現され、次いでこの微生物が植物種子に適用される。これは特に、植物の根および種子を真菌または微生物の侵入から保護する上で有用である。さらに別の態様において、土壌等の物質、またはドアのハンドルもしくはテーブル表面等の固体表面、または他の環境現場が、ディフェンシンおよびペプチドの併用により、現在のまたは潜在的な将来の病原体汚染に対して除染またはそれ以外の形式で洗浄される。
【００３９】
ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドの両方を含む製剤もしくは抽出物または各々がディフェンシンもしくはペプチドの一方を含む製剤もしくは抽出物の組み合わせが、本明細書でさらに教示されている。これらの製剤は、その後、使用前または使用中に組み合わされる。加えて、この抽出物は、ディフェンシンまたはペプチドの一方および抽出物に添加される他の成分を含み得る。したがって、例えばハーブ製剤およびナチュラルボディウォッシュおよびシャンプーの形態の植物抽出物および微生物抽出物が、本発明の一部を構成する。
【００４０】
ヒト、動物もしくは植物の病原体侵入の治療もしくは予防、または物質中もしくは物質上の病原体汚染の処置もしくは予防のための医薬の製造における植物ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドの使用が、本明細書で実現されている。ヒト、動物もしくは植物の病原体侵入の治療もしくは予防または物質中もしくは物質上の病原体汚染の処置もしくは予防において使用するための植物ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドもまた、本明細書で教示されている。
【００４１】
ヒト、動物もしくは植物の病原体侵入の治療もしくは予防、または物質中もしくは物質上の病原体汚染の処置もしくは予防のための医薬の製造におけるα-ヘアピニンまたはβ-ヘアピンの使用が、本明細書でさらに実現されている。ヒト、動物もしくは植物の病原体侵入の治療もしくは予防、または物質中もしくは物質上の病原体汚染の処置もしくは予防において使用するためのα-ヘアピニンまたはβ-ヘアピンもまた、本明細書で教示されている。この局面に関連して、α-ヘアピニンまたはβ-ヘアピンの濃度は、植物ディフェンシンと組み合わせて使用される場合の濃度よりも高い。
【００４２】
治療され得る植物は、作物用植物、観賞用植物、顕花植物、木、低木および草を含む。これに関して、本開示は、遺伝子修飾された（トランスジェニック）植物およびそれらの子孫に及ぶ。これらの植物は、そのいずれもがその植物において生来的に発現されないかあるいは非改変植物において必要レベルで発現されないディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドを発現するよう改変される。別の態様において、トランスジェニック植物は、非ディフェンシンペプチドを発現する。使用の際、ディフェンシンは、その植物に外部から供給される。ディフェンシンが外部供給される例において、その植物は生来的にもそのディフェンシンを産生する場合がある。治療され得る動物は、家畜、コンパニオン動物、研究試験動物および野生動物を含む。治療され得るヒトは、任意の年齢のヒトを含む。処置され得る物質は、土壌、環境サンプル、ドアのハンドルおよびテーブル表面を含む。
【００４３】
ディフェンシンおよび／または非ディフェンシンペプチドの一方もしくは他方または両方を発現するよう改変された単離された微生物が、本明細書でさらに企図されている。各々がディフェンシンおよびペプチドの一方もしくは他方または両方を産生する微生物の混合物を含む組成物が、本明細書でさらに教示されている。そのような組成物は、ヒト、動物および植物ならびに植物の種子および根をインサイチューで治療するのに有用である。あるいは、ディフェンシンおよび／またはペプチドは、植物抽出物または微生物抽出物を含む細胞抽出物として提供される。
【００４４】
各々が植物ディフェンシンもしくはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体または非ディフェンシンペプチドの少なくとも一方を含むコンパートメントを含むキットもまた、本明細書で教示されている。適当なディフェンシン、ペプチドおよび最適濃度を検出するためのアッセイもまた、本明細書で企図されている。キットはまた、ディフェンシンもしくは非ディフェンシンペプチドの一方もしくは他方もしくは両方を発現する遺伝子操作された微生物、または細胞抽出物を含み得る。
【００４５】
（表１）配列識別子の概要
2017519720.tif 000002
2017519720.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００４６】
いくつかの図面がカラー表示またはカラー物体を含んでいる。カラー写真は、請求により特許権者からまたは適当な特許庁から入手可能である。特許庁から入手する場合、手数料を請求されることがある。
【００４７】
【図１】図1は、NaD1、HXP4、HXL002、HXL007、HXL008およびDMAMP1で処置したフザリウム・オキシスポラムf種バシンフェクタム（Fov）への緑色核酸蛍光色素SYTOX green［商標］の相対的取り込みのグラフ表示である。表2も参照されたい。
【図２】図2は、NaD1、HXP4、HXL002、HXL007、HXL008、HXL009、HXL013、HXL021、ホルドチオニンおよびRSAFP2で処置したフザリウム・グラミネアラム（Fgr）への緑色核酸蛍光色素SYTOX green［商標］の相対的取り込みのグラフ表示である。表3も参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
本明細書を通じて、文脈がそうでないことを必要としていない限り、「含む（comprise）」という語または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」等の派生語は、言及されている要素もしくは成分もしくは方法の工程または要素もしくは成分もしくは方法の工程の群を含むが、任意の要素もしくは成分もしくは方法の工程または要素もしくは成分もしくは方法の工程の群を排除しないことを暗示しているものと理解されたい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「a」、「an」および「the」という単数形は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、複数の局面を含む。したがって、例えば、「ディフェンシン（a defensin）」という表現は、単一のディフェンシンおよび2つ以上のディフェンシンを含み；「薬剤（an agent）」という表現は、単一の薬剤および2つ以上の薬剤を含み；「本開示（the disclosure）」という表現は、本開示によって教示される単一および複数の局面を含む、等である。本明細書で教示および実現される局面は、「発明」という用語に包含される。すべてのそのような局面は、本発明の範囲内で実現される。
【００５０】
プロトコルは、ヒトおよび動物対象におけるならびに植物における病原体の感染および侵入の管理を容易にするならびに環境現場における病原体汚染を制御するために構築されている。このプロトコルは、植物ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体および非植物ディフェンシンペプチドの使用を含む。植物ディフェンシンおよびペプチドがヒトもしくは動物対象もしくは植物に感染する病原体に対する効果的な治療および予防プロトコルまたは環境サイトを汚染する病原体に対する効果的な処置および予防プロトコルを提供するよう相乗的に作用することが、本明細書に提示されている。ペプチドは、植物ディフェンシン以外であり、非ディフェンシンペプチドまたは非植物ディフェンシンペプチドと称される。さらに、1つの態様において、非ディフェンシンペプチドは、抗病原体特性を有する。別の態様において、ペプチドは、それ自体、抗病原体特性を有さないまたは最小限の抗病原体特性を有する。
【００５１】
したがって、病原体の増殖、感染、侵入または汚染を阻害する方法であって、病原体を、植物ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体および非植物ディフェンシンペプチドの組み合わせの有効量に接触させる工程を含み、ディフェンシンおよびペプチドの組み合わせがその組み合わせで使用されるのと同じ個々の用量でそれぞれを単独で使用する場合と比較して相乗的である方法が、本明細書で実現される。便宜上、ヒト、動物または植物対象は、「宿主」とも称され得る。ディフェンシンおよびペプチドはまた、各々「薬剤」とまたは集合的に「薬剤」と称される。
【００５２】
本発明にしたがい、特定のディフェンシンまたはペプチド単独の阻害効果は、いずれか単独で使用した場合と比較して両者を一緒に使用した場合に大くなる。Greco et al. (1995) Pharmacol Rev. 47:331-385は、2つの薬剤の併用が各々を単独でアッセイした場合の相加的効果よりも大きい活性を有することに基づいて相乗作用のカテゴリーを定義している。したがって、本明細書で採用される定義は、一緒に作用する2つの薬剤の併用効果が単独で作用する個々の薬剤の和よりも大きい限り、すべてのそのような状況を含む。さらに、薬剤の組み合わせは、一緒に作用するそれらの薬剤の併用効果が単独で作用する個々の成分の和よりも大きくなる、濃度を含むがこれに限定されない条件セットが存在する場合に、その用語が本明細書で意図するところの相乗的であるとみなされる。Richer (1987) Pestic Sci 19:309-315は、相乗作用の証明を行う数学的アプローチを記載している。このアプローチは、2つの阻害性薬剤XおよびYの併用下での阻害レベルの観測値（Io）と、それらの併用効果を測定するために使用されたのと同じそれぞれの濃度で別々に作用するXまたはYの各々から得られる相加的効果の期待値（Ee）を比較するためにリンペル式を使用する。相加的阻害率（％）Eeは、X + Y - XY/100として算出され、ここでXおよびYは阻害率（％）として表される。相乗作用は、Io > Eeの場合に存在する。非ディフェンシンペプチドは、それ自体が抗病原体特性を示す場合と示さない場合があり得ることに注意されたい。
【００５３】
相乗作用は、相乗作用スケールで表され得る。1つの態様において、14までの値、例えば0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14は、有意な相乗作用を表さず；15〜29の値、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29は、低い相乗作用を表し；30〜60の値、例えば30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59または60は、中程度の相乗作用を表し；60を超える値は、高い相乗作用を表す。「60を超える値」は、61、70、80、90および100ならびにその間の任意の値を含む61〜100を含む。
【００５４】
上記のように、「相乗効果」は、開示されるプロトコルにおいて2つ以上の薬剤が、単独で作用する各薬剤の個々の効果の和よりも大きな併用効果を生じる場合に見られる。これは、非ディフェンシンペプチドがそれ自体抗病原体特性を示さない場合を含む。この効果は、効能、安定性、速度および／または毒性レベルの1つまたは複数であり得る。本明細書に記載されるように、病原体増殖の阻害は、少なくとも1つの植物ディフェンシンおよび少なくとも1つのペプチドの併用下で測定された場合に、阻害が、それ以外では同一条件下の各薬剤、ディフェンシンおよびペプチド、の個々の特定濃度範囲の存在下で測定された阻害の和よりも大きいときに、相乗的とみなされる。相乗的とみなされるために、2つの薬剤のあらゆる濃度の組み合わせで相加的効果よりも大きな効果が観測される必要はないことが理解されるであろう。2つの薬剤の相乗効果は、特定の濃度の組み合わせの下で観測され、他では観測されないことがある。例えば、病原体への侵入が毒性を律速する場合、ディフェンシンの存在は、特にペプチドの濃度が阻害に関して非最適である場合にも、相乗作用をもたらし得る。1つの態様において、ディフェンシンおよびペプチドの一方または両方の濃度が非最適である。同様に、相乗作用は、一方または両方の成分が最大の観測可能な阻害を達成する高レベル（最大レベル）で存在する場合に、埋没し得る。ディフェンシン・非ディフェンシンペプチドの組み合わせの一般的なシステムは、従って、相乗作用がすべての条件下で観測されない場合でさえも相乗作用の可能性が存在するという理由で、「相乗的」と称される。植物ディフェンシンとペプチドの間の相乗作用は、少なくともいくつかの用量において、単独で作用するいずれかの成分によって得ることができるよりもより大きな病原体阻害を提供する。いくつかの例において、ディフェンシンまたはペプチドの一方は、他方と組み合わされるまで、特定の病原体に対して測定可能な効果を有さない。したがって、本発明は、化学的な殺病原体剤または抗生物質に対する依存性が低い、病原体侵入からの宿主の高い保護を提供する。これは、ヒトおよび動物の健康システムおよび植物栽培者に対する抑制された投入費用、病原体に対する広範囲の活性ならびに環境破壊または抗生物質耐性の拡散の可能性の減少を意味する。したがって、後者に関して、殺病原体剤耐性病原体株の発生の選択圧が大きく減少し、それによってそれらの薬剤の商業的寿命の延長ならびに耐性病原体の増殖の抑制および病原体の多耐性株の発生の可能性の減少が実現される。
【００５５】
「病原体阻害」は、対照と比較しての病原体増殖の減少（または生存力の喪失）によって測定される、病原体殺傷および病原体抑制の両活性を含む。病原体増殖は、その病原体に依存する当技術分野で公知の多くの異なる方法によって測定され得る。糸状菌の増殖を測定する広く使用されている方法は、例えば、適切な増殖培地中で胞子を発芽させ、測定可能な増殖を達成するのに十分な時間インキュベートし、そして指定インキュベート時間後に培養物中の増加した光学密度を測定することを要する。光学密度は、増殖が大きいほど上昇する。典型的に、真菌の増殖が、発病に必要となる。したがって、病原体増殖の阻害は、真菌疾患からの保護の適当な指標を提供する、すなわち、この指標が大きいほど保護が効果的である。細胞生存力は、比色色素、例えばMTT（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）もしくはレザズリン（7-ヒドロキシ-3H-フェノキサジン-3-オン 10-オキシド）に基づく市販のキットを用いてまたは細胞を寒天プレート上にプレーティングし出現したコロニー形成単位の数を数えることによって測定され得る。昆虫の阻害は、給餌試験を用いて容易に達成され得る。微生物活性は、固体寒天上でまたは液体培養物中で測定され得る。
【００５６】
本発明との関係で言う「感染の予防」は、ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチド剤の組み合わせで治療されたヒト、動物または植物宿主が病原体感染もしくは疾患症状もしくは上記のすべてを回避するまたはディフェンシンもしくはペプチドもしくは両方に暴露されなかった宿主と比較した場合に宿主・病原体相互作用の自然な結果として減少したもしくは最小限のもしくは低頻度の病原体感染もしくは疾患症状もしくは上記のすべてを示すことを意味する。すなわち、病原体は、疾患および／または関連する疾患症状を引き起こさないよう予防されるまたは減少する。感染および／または症状は、本明細書に教示されるプロトコルで治療されなかった宿主と比較して少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％もしくは80％またはそれ以上減少する。減少率は、宿主および病原体に適した任意の便利な手段によって決定され得る。
【００５７】
したがって、ディフェンシンおよびペプチド剤の組み合わされた作用は、他の阻害活性の中でも特に、病原体増殖、複製、感染および／もしくは維持を阻害すること、ならびに／または病原体感染もしくは侵入の症状の改善を誘導することである。
【００５８】
植物の保護（疾患耐性または減少）は、当技術分野で公知の方法によって評価され得る。Uknes et al. (1993) Molecular Plant Microbe Interaction 6:680-685; Gorlach et al., (1996) Plant Cell 8:629-643; Alexander et al. (1993) Proc Natl Acad Sci. USA 90:7327-7371を参照のこと。当業者は、植物病原体による植物感染および疾患を決定する方法が試験される病原体および植物に依存することを理解するであろう。ヒトおよび動物の保護（疾患の予防または治療）は、最初に、インビトロ研究アッセイ（例えば、病原体阻害アッセイ）を、その後に動物研究および最終的にはヒト臨床試験を用いて試験され得る。
【００５９】
「接触」は、ヒトもしくは動物対象への局所もしくは全身投与もしくは適用または植物内もしくは植物上での局所適用もしくは発現または環境サイトへの薬剤の組み合わせの導入後のディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドの組み合わせへの病原体の暴露を含む。接触は、生来的にディフェンシンもしくはペプチドを含むまたはディフェンシンもしくはペプチドの一方もしくは他方を産生するよう操作された植物または細胞抽出物を用いるものであり得る。植物抽出物は、ハーブ製剤および抽出物、例えばナチュラルボディウォッシュおよびシャンプーを含む。したがって、ディフェンシンおよびペプチドは、ヒトもしくは動物対象もしくは植物の表面領域に局所的に適用され得、またはそれらはヒトもしくは動物対象に全身投与され得、または一方もしくは他方もしくは両方がディフェンシンおよび／もしくはペプチドを産生するよう遺伝子修飾された植物において発現され得る。あるいは、植物に関連して、ディフェンシンまたはペプチドの一方が植物に局所適用され得、そしてディフェンシンまたはペプチドの他方がそのディフェンシンまたはペプチドを産生するよう遺伝子操作された植物によって発現され得る。あるいは、内因性ディフェンシンの発現レベルは、発現されるペプチドまたは外部から供給されるペプチドとの組み合わせで効果的であるよう十分なレベルまで引き上げられる。あるいは、ディフェンシンおよびペプチドは、環境サイト（例えば、土壌）または無生物物体（例えば、ドアのハンドル）の表面に散布される。1つの態様において、ディフェンシンは、その植物が同じディフェンシンを産生し得る場合でさえも、植物または植物の種子に外部から供給され得る。
【００６０】
代替の態様においては、微生物または植物細胞が、ディフェンシンおよびペプチドの一方もしくは他方または両方を発現するよう遺伝子操作される。そのような微生物もしくは微生物混合物または植物細胞もしくはその抽出物は、種皮組成物、根着色組成物および土壌に噴霧により適用され得るまたは土壌に混合され得る土壌除染組成物等として有用である。
【００６１】
1つの態様において、ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドは、例えば局所製剤、ヘアもしくはボディウォッシュ溶液、種皮製剤、根製剤、または適当な宿主への全身投与に適した製剤として、共に配合される。ディフェンシンおよび／またはペプチドの一方または両方を発現する微生物混合物も適用され得る。局所製剤は、水溶液、液体製剤、トニック、ウォッシュ、スプレー、ペイント、粉末、分散物、霧状製剤、ドゥーシェ、クリーム、軟膏、リップスティック、ゲル、スラッジ、ペースト、パッチ、含浸バンデージ等を含む。ディフェンシンまたはペプチドの一方または他方が添加された植物抽出物を含む、ディフェンシンおよびペプチドの一方もしくは他方または両方を含む植物抽出物もまた、本明細書で企図されている。
【００６２】
ヒトもしくは動物対象または植物中または上での病原体の増殖または侵入の阻害において使用するための、植物ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体および非ディフェンシンペプチドを含む製剤も、本明細書で実現されている。
【００６３】
病原体を含むまたは病原体により汚染される可能性を有する表面または物質もしくは他の環境現場における病原体の増殖または侵入の阻害において使用するための、植物ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体および非ディフェンシンペプチドを含む製剤が、本明細書でさらに実現されている。環境現場には、土壌、植物の根鉢を取り囲む環境、ならびに無生物物体の表面（例えば、ドアのハンドル、フロア表面およびテーブル表面）が含まれる。
【００６４】
1つの態様において、複数のコンパートメントを含む治療用キットであって、第1のコンパートメントが植物ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体を含み、第2のコンパートメントが非ディフェンシンペプチドを含み、任意で第3またはさらなるコンパートメントが賦形剤、担体または希釈剤を含み、使用の際に、第1および第2のコンパートメントの内容物が、病原体を含むまたは病原体による汚染の可能性を有するヒトもしくは動物対象または植物または表面または物質への適用前または適用中に混合されるキットが、本明細書に教示されている。このキットはまた、例えば使用前に再構成される凍結乾燥形態で、微生物を含み得る。微生物は、ディフェンシンおよび／またはペプチドの一方もしくは他方または両方を発現するよう操作される。あるいは、このキットは、ディフェンシンおよび／またはペプチドを含む細胞抽出物を含む。
【００６５】
相乗的に作用するよう組み合わせて使用される、病原体の増殖もしくは侵入または病原体による汚染の阻害において使用するためのディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体および非ディフェンシンペプチドが、本明細書に記載されかつ本明細書で実現されている。
【００６６】
「植物ディフェンシン」という表現は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、その機能性天然または合成誘導体または変異体を含む。本明細書で企図されている適当なディフェンシンの例は、透過性ディフェンシン、ナス科クラスIIディフェンシンおよびそれらの機能性天然または合成誘導体または変異体を含む。
【００６７】
本明細書で使用されるディフェンシンは、本明細書において、その供給源に依存して、「天然」ディフェンシン、「修飾」ディフェンシン、「変異型」ディフェンシン、「変異」ディフェンシンまたは「キメラ」ディフェンシンを表し得る。
【００６８】
1つの態様において、透過性ディフェンシンは、クラスIIナス科ディフェンシンである。1つの態様において、ディフェンシンは、ディフェンシンのN末端部分において、第1のβ-ストランド（β-ストランド1）およびα-ヘリックスの間のループ領域で修飾される。1つの態様において、ループ領域は、第2の不変システイン残基の6アミノ酸N末端またはその等価物を含む。この領域は、「ループ1B」と定義される。クラスIIナス科ディフェンシンは、成熟ドメインの比較的保存されたC末端部分によって他のディフェンシンと区別される。「クラスIIナス科ディフェンシン」という表現は、NaD1成熟ドメインのC末端部分、NaD1成熟ドメインにおける最C末端不変システインで終わり該システインを含む約20連続アミノ酸残基を含むNaD1のC末端部分（例えば、SEQ ID NO:1）に対して少なくとも70％のアミノ酸配列類似性を有する任意のディフェンシンを含む。「少なくとも70％」は、少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％を意味する。
【００６９】
1つの態様において、クラスIIナス科ディフェンシンのループ1Bアミノ酸配列は、一文字アミノ酸表記法を用いて言う、
X1がA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YもしくはVまたはその天然に存在する修飾型であり、
X2がA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YもしくはVまたはその天然に存在する修飾型であり、
X3がA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YもしくはVまたはその天然に存在する修飾型であり、
X4がA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YもしくはVまたはその天然に存在する修飾型であり、
X5がA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YもしくはVまたはその天然に存在する修飾型であり、および／または
X6がA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YもしくはVまたはその天然に存在する修飾型である、
配列X1X2X3X4X5X6（SEQ ID NO:2）に修飾され、ここでアミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、修飾の前のクラスIIナス科ディフェンシン由来のループ1Bのアミノ酸配列に対応しない。
【００７０】
1つの態様において、クラスIIナス科ディフェンシンのループ1B配列は、
X1がN、G、D、H、K、A、E、Q、T、P、L、M、SもしくはRであり、
X2がK、R、G、H、L、N、F、I、S、TもしくはYであり、
X3がW、Y、H、L、G、FもしくはPであり、
X4がP、K、S、R、H、T、E、V、N、Q、DもしくはGであり、
X5がS、K、Y、F、GもしくはHであり、および／または
X6がP、V、L、T、A、F、N、K、R、M、G、H、IもしくはYである、
である配列X1X2X3X4X5X6（SEQ ID NO:3）に修飾され、ここでアミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、修飾の前のクラスIIナス科ディフェンシン由来のループ1Bのアミノ酸配列に対応しない。
【００７１】
1つの態様において、クラスIIナス科ディフェンシンのループ1B配列は、
X1がN、H、Q、D、KもしくはEであり、
X2がR、H、T、KもしくはGであり、
X3がF、H、YもしくはWであり、
X4がP、K、SもしくはRであり、
X5がGもしくはFであり、および／または
X6がP、V、IもしくはNである、
である配列X1X2X3X4X5X6（SEQ ID NO:4）に修飾され、ここでアミノ酸配列X1X2X3X4X5X6は、修飾の前のクラスIIナス科ディフェンシン由来のループ1Bのアミノ酸配列に対応しない。
【００７２】
「X1X2X3X4X5X6」という表現は、ループ1B領域に対応する6個の連続するアミノ酸残基を意味する。
【００７３】
1つの態様において、人工的に作製されたまたは修飾されたディフェンシンは、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含む。この配列において、ループ1B領域は、
X1がL、F、S、I、A、H、Y、Q、D、KまたはGからなるリストから選択されるアミノ酸であり、
X2がS、V、F、I、K、L、A、P、N、T、R、HまたはGからなるリストから選択されるアミノ酸であり、
X3がA、F、W、N、I、S、Y、P、LまたはHからなるリストから選択されるアミノ酸であり、
X4がK、G、E、R、A、P、F、Q、VまたはSからなるリストから選択されるアミノ酸であり、
X5がM、G、K、D、S、Y、P、E、NまたはFからなるリストから選択されるアミノ酸であり、および
X6がV、T、M、S、W、A、P、G、E、K、L、H、IまたはNからなるリストから選択されるアミノ酸である、
X1X2X3X4X5X6と定義される。
【００７４】
1つの態様において、人工的に作製されたまたは修飾されたディフェンシンは、SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含む。この配列において、ループ1B領域は、
X1がN、H、Q、D、KまたはEからなるリストから選択されるアミノ酸であり、
X2がR、H、T、KまたはGからなるリストから選択されるアミノ酸であり、
X3がF、H、YまたはWからなるリストから選択されるアミノ酸であり、
X4がP、K、SまたはRからなるリストから選択されるアミノ酸であり、
X5がGまたはFからなるリストから選択されるアミノ酸であり、および
X6がP、V、IまたはNからなるリストから選択されるアミノ酸である、
X1X2X3X4X5X6と定義される。
【００７５】
クラスIIナス科ディフェンシンであるNaD1の場合、ループ1Bアミノ酸配列は、NTFPGI（SEQ ID NO:7）である。その結果、NTFPGIは、NがA、R、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YもしくはVまたはそれらの天然に存在する修飾型の一つによって置換され、TがA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、YもしくはVまたはそれらの天然に存在する修飾型の一つによって置換され、FがA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、P、S、T、W、YもしくはVまたはそれらの天然に存在する修飾型の一つによって置換され、PがA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、S、T、W、YもしくはVまたはそれらの天然に存在する修飾型の一つによって置換され、GがA、R、N、D、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YもしくはVまたはそれらの天然に存在する修飾型の一つによって置換され、および／またはIがA、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、YもしくはVの一つによって置換され、ただしループ1Bアミノ酸配列はNaD1由来のループ1Bに対応しないように修飾される。ループ1B配列は、単一のアミノ酸変化を有し得るまたは2もしくは3もしくは4もしくは5もしくは全6つのアミノ酸が変更され得る。
【００７６】
クラスIIナス科ディフェンシンは、ループ1B領域に対する任意の数のアミノ酸変化単独またはそれと他の変異との組み合わせによって修飾され得る。他の変異は、アミノ酸置換、付加および／または欠失を含む。ループ1B領域外の変異は、1〜約50の数であり得る。「変化」は、クラスIIナス科ディフェンシンのループ1B領域を置換するあるディフェンシン由来のループ1B領域の移植を含む。その供給源は、クラスIディフェンシンループ1Bまたは別のクラスIIディフェンシン由来のループ1Bであり得る。これらの局面は、少なくとも1つの植物または動物病原体に対する修飾されたディフェンシンおよびペプチドの併用の強化された抗病原体活性が維持されるという条件に基づく。1つの態様において、抗病原体活性は、活性のレベルもしくは範囲、安定性および／または透過性の観点で、修飾前のクラスIIディフェンシンに対して強化される。1つの態様において、抗病原体活性は、活性のレベルもしくは範囲、安定性および／または透過性の観点で、クラスIIディフェンシンの修飾前のペプチドに対して強化される。
【００７７】
したがって、抗病原体活性を有する変異型ディフェンシンを生成するようN末端部分のβ-ストランド1とα-ヘリックスの間のループ領域が単一または複数のアミノ酸置換、付加および／または欠失によって修飾された、修飾されたクラスIIナス科ディフェンシン骨格を含む人工的に作製されたディフェンシンの使用が、本発明に含まれる。1つの態様において、ループ領域は、第2の不変システイン残基のN末端側の6アミノ酸残基によって定義されるループ1Bである。任意のディフェンシンにおけるその等価領域が、本明細書で企図されている。
【００７８】
適当なディフェンシンの例は、NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001（SEQ ID NO:25）、HXL002（SEQ ID NO:26）、HXL004（SEQ ID NO:27）、HXL007（SEQ ID NO:28）、HXL008（SEQ ID NO:29）、HXL012（SEQ ID NO:32）、HXL013（SEQ ID NO:30）、HXL015（SEQ ID NO:31）、HXL035（SEQ ID NO:33）およびHXL036（SEQ ID NO:34）を含む。合成ディフェンシン変異体の例は、HXP4（SEQ ID NO:8）、HXP34（SEQ ID NO:15）およびHXP35（SEQ ID NO:16）を含む。変異型ディフェンシンの他の例は、HXP37（SEQ ID NO:17）、HXP58（SEQ ID NO:18）、HXP72（SEQ ID NO:19）、HXP91（SEQ ID NO:20）、HXP92（SEQ ID NO:21）、HXP95（SEQ ID NO:22）およびHXP107（SEQ ID NO:23）を含む。
【００７９】
病原体の増殖または侵入を阻害する方法であって、病原体を、NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035およびHXL036からなるリストから選択される植物ディフェンシンまたはHXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95およびHXP107からなるリストから選択されるディフェンシンの誘導体もしくは変異体ならびに抗病原体特性を有するペプチドの組み合わせの有効量に接触させる工程を含み、ディフェンシンおよびペプチドの組み合わせが、当該組み合わせで使用されるのと同じ個々の用量でそれぞれを単独で使用する場合と比較して相乗的である方法が、本明細書に教示されている。
【００８０】
「抗病原体特性を有するペプチド」という表現は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100アミノ酸残基長を含む4〜100個のアミノ酸残基または0.4〜12 kDサイズ、例えば0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12 kDのペプチドを含む。
【００８１】
上記ペプチドは、植物ディフェンシンペプチド以外のペプチドであり、α-ヘリカルペプチド（例えば、α-ヘリカルカテリシジンペプチド）、ジスルフィド架橋によって安定化されたヘアピン（例えば、α-ヘアピニンおよびβ-ヘアピン）を形成するペプチド、拡張された立体構造を有するペプチド、特定のアミノ酸残基が豊富なペプチドおよび／またはプロテイナーゼ阻害剤由来のペプチドであることで特徴づけられる4〜100アミノ酸残基ペプチドまたは0.4〜12 kDペプチドを含む。それは、それ自体が抗病原体活性を示すことも示さないこともある非植物ディフェンシンペプチドである。カテリシジンファミリーに属する抗菌ペプチドは、配列および構造の両方の点で極めて多様であり、α-ヘリカル、β-ヘアピンまたは拡張された立体構造を形成し得る。カテリシジンは、N末端プロ配列を有する前駆体タンパク質として発現される。およそ100アミノ酸のこの配列はまた、シスタチン様タンパク質であるカテリンにも関連する。このカテリン様ドメインは、成熟カテリシジンペプチドを放出するよう切断される。α-ヘアピニンは、10〜13アミノ酸によって隔てられた2つのCXXXCモチーフによって特徴づけられる小さな（33〜51アミノ酸）ペプチドである。α-ヘアピニンの構造は、各々が1つのCXXCモチーフを含む2つのアルファヘリカル領域と介在ループ領域によって特徴づけられる。安定なヘアピン構造を形成するよう、CXXXCモチーフ間で2つのジスルフィド結合が形成される。
【００８２】
α-ヘリカルペプチドの例は、ヒト由来または非ヒト霊長類もしくはげっ歯類、ブタ、ウシ、ヤギ動物由来のカテリシジンペプチド、例えばLL-37、BMAP28、SMAP29、PMAP23、mCRAMP、RK-31およびKS-30を含む。
【００８３】
α-ヘリカルペプチドの例は、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30およびCP-29を含む。
【００８４】
β-ヘアピンの例は、バクテネシン、プロテグリン、タキプレシン（例えば、タキプレシンII）、アンドロクトニン、ポリフェムシン（例えば、ポリフェムシン（F12I）、ポリフェムシンIおよびポリフェムシンII）、ゴメシン、サナチンおよびブレベニンを含む。α-ヘアピニンの例は、Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、BWI-2c、BWI-2b、ルフィンP1、MBP-1、MiAMP2d、C2およびVhT1を含む植物源由来のペプチドを含む。
【００８５】
拡張立体構造ペプチドの例は、インドリシジン、Bac2AおよびEcAMP4Aを含む。これらは、システイン残基をアラニン残基で置換することによってβ-ヘアピンまたはα-ヘアピニンのジスルフィド結合が除去された合成ヘアピンペプチド、例えばBac2AおよびEcAMP4Aを含む。
【００８６】
特定のアミノ酸が豊富なペプチドの例は、インドリシジンである。
【００８７】
プロテイナーゼ阻害剤由来のペプチドの例は、プロテイナーゼ阻害剤がシスタチンの場合、SICys9N(67-92)、SICys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)およびCC7(71-104)を含む。
【００８８】
いくつかのα-ヘアピニンおよびβ-ヘアピンペプチドは、植物ディフェンシンと組み合わせて使用される濃度よりも高い濃度で、それら自体が病原体に対する効能を示す。病原体の増殖または感染または侵入を阻害する方法であって、病原体を、植物ディフェンシンと組み合わせて使用される場合に増殖または感染または侵入を阻害するのに必要とされる濃度よりも高い濃度の有効量のα-ヘアピニンおよびβ-ヘアピンまたはそれらの機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体に接触させる工程を含む方法。1つの態様において、病原体は、本明細書で定義される真菌病原体である。1つの態様において、真菌病原体は、フザリム属、コレクトトリクム属、サッカロミセス属（Saccharomyces sp）、カンジダ属およびトリコフィトン属からなるリストから選択される。1つの態様において、真菌病原体は、フザリウム・グラミネアラム、コレトトリクム・グラミニコラ、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・アルビカンスおよびトリコフィトン・ルブラムである。α-ヘアピニンおよびβ-ヘアピンの例は、CilHPN_14F、OsaHPN_86B、SitHPN_100A、SbiHPN_104C、SbiHPN_104I、EcAMP1、アンドロクトニンおよびポリフェムシンIを含むがこれらに限定されない。
【００８９】
上記ペプチドはディフェンシンではなく、非ディフェンシンペプチドまたは非植物ディフェンシンペプチドと称される。それは、それ自体が抗病原体特性を示す場合または示さない場合がある。ペプチドは、標準的な商業的供給源から入手可能であり、化学的に合成されたペプチドを含む。
【００９０】
病原体の増殖または侵入を阻害する方法であって、病原体を、NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035およびHXL036からなるリストから選択される植物ディフェンシンまたはHXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95およびHXP107からなるリストから選択されるディフェンシンの変異体もしくは誘導体ならびにSit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)、CC7(71-104)、バクテネシン、Bac2A、インドリシジンおよびCP-29からなるリストから選択される非ディフェンシンペプチドの組み合わせの有効量に接触させる工程を含み、ディフェンシンおよびペプチドの組み合わせが、当該組み合わせで使用されるのと同じ個々の用量でそれぞれを単独で使用する場合と比較して相乗的である方法が、本明細書に教示されている。
【００９１】
上記のように、病原体は、真菌および微生物から選択される。
【００９２】
真菌病原体の増殖または侵入を阻害する方法であって、真菌病原体を、NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035およびHXL036からなるリストから選択される植物ディフェンシンまたはHXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95およびHXP107からなるリストから選択されるディフェンシンの変異体もしくは誘導体ならびにSit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)、CC7(71-104)、バクテネシン、Bac2A、インドリシジンおよびCP-29からなるリストから選択される非ディフェンシンペプチドの組み合わせの有効量に接触させる工程を含み、ディフェンシンおよびペプチドの組み合わせが、当該組み合わせで使用されるのと同じ個々の用量でそれぞれを単独で使用する場合と比較して相乗的である方法が、本明細書に教示されている。
【００９３】
微生物病原体の増殖または侵入を阻害する方法であって、微生物病原体を、NaD1、TPP3、PhD1、PhD1A、PhD2、FST、NoD173、HXL001、HXL002、HXL004、HXL007、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035およびHXL036からなるリストから選択される植物ディフェンシンまたはHXP4、HXP34、HXP35、HXP37、HXP58、HXP72、HXP91、HXP92、HXP95およびHXP107からなるリストから選択されるディフェンシンの変異体もしくは誘導体ならびにSit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F、LL-37、SMAP29、BMAP28、mCRAMP、RK-31、KS-30、EcAMP4A、BWI-2c、BWI-2b、MBP-1、MiAMP2d、C2、VhT1、SlCys9N(67-92)、SlCys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)、CC7(71-104)、バクテネシン、Bac2A、インドリシジンおよびCP-29からなるリストから選択される非ディフェンシンペプチドの組み合わせの有効量に接触させる工程を含み、ディフェンシンおよびペプチドの組み合わせが、当該組み合わせで使用されるのと同じ個々の用量でそれぞれを単独で使用する場合と比較して相乗的である方法が、本明細書に教示されている。
【００９４】
本発明の方法は、病原体が感染もしくは侵入した対象の治療もしくは予防または病原体を含む物質の除染において有用である。「対象」という用語は、任意の年齢のヒトまたは動物、例えば家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、ラマ、アルパカもしくは家禽（例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、キジ、クジャク））、コンパニオン動物（例えば、イヌもしくはネコ）、研究試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモットもしくはハムスター）または捕獲野生動物（例えば、カンガルー、タスマニアデビルもしくは野生ネコ科動物）を含む。「ヒト」または「動物」は、その一部分、例えば指、つま先、爪、目、耳、口、皮膚および頭皮を含む。
【００９５】
対象はまた、植物、例えば作物用植物、観賞用植物、顕花植物または特定の国もしくは地域に固有のまたは土着しているとみなされる植物（例えば、ユーカリ）を含む。「植物」という表現は、植物全体ならびに新芽、栄養器官／構造物（例えば、葉、茎および塊茎）、根、花および花器官／構造物（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄ずい、心皮、葯および胚珠）、種子（胚、内胚乳および種皮を含む）および果実（成熟子房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織等）および細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞等）およびそれらの子孫を含むがこれらに限定されないその一部分を含む。本発明のプロトコルを用いて保護することができる植物は、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ、トクサ、マツバラン、ヒカゲノカズラ、コケおよび多細胞性藻類を含む高等および下等植物を含む。治療することができる植物は、任意の維管束植物、例えばアルファルファ、リンゴ、シロイヌナズナ、バナナ、オオムギ、キャノーラ、トウゴマ、マメ、キク、クローバー、ココア、コーヒー、綿花、綿実、トウモロコシ（corn)（トウモロコシ(maize)）、ハマナ、クランベリー、キュウリ、デンドロビウム、ヤマノイモ、ユーカリ、ウシノケグサ、亜麻、グラジオラス、ユリ、亜麻仁、キビ、マスクメロン、カラシ、エンバク、アブラヤシ、ナタネ（oilseed rape）、パパイヤ、ピーナツ、パイナップル、観賞用植物、インゲンマメ、ジャガイモ、ナタネ（rapeseed）、コメ、ライムギ、ライグラス、ベニバナ、ゴマ、モロコシ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、イチゴ、タバコ、トマト、芝草、コムギおよび野菜作物、例えばレタス、セロリ、ブロッコリ、カリフラワー、ウリ、タマネギ（ニンニク、エシャロット、ニラネギおよびエゾネギを含む）；果樹および堅果樹、例えばリンゴ、ナシ、モモ、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ライム、アーモンド、ピーカン、ウォールナット、ヘーゼル；つる植物、例えばブドウ、キウィ、ホップ；低木果樹およびキイチゴ、例えばラズベリー；ブラックベリー、グースベリー；森林樹、例えばセイヨウトネリコ、マツ、モミ、カエデ、オーク、クリ、ポプラを含むがこれらに限定されない単子葉植物もしくは双子葉植物または裸子植物を含み、アルファルファ、キャノーラ、トウゴマ、トウモロコシ、綿花、ハマナ、亜麻、亜麻仁、カラシ、アブラヤシ、ナタネ、ピーナツ、ジャガイモ、コメ、ベニバナ、ゴマ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、タバコ、トマトおよびコムギが好ましい。治療することができる植物は、任意の作物用植物、例えば飼料作物、油料種子作物、穀類作物、果実作物、野菜作物、繊維作物、香辛料作物、堅果作物、芝作物、糖料作物、飲料作物および森林作物を含む。作物用植物は、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、綿花、アルファルファ、キャノーラ、サトウダイコン、コメ、ジャガイモ、トマト、タマネギ、マメまたはエンドウ植物であり得る。1つの局面において、「植物」という表現は、その子孫および他の後続物を含む。1つの態様において、植物種子は、ディフェンシンおよびペプチドの局所投与によりまたはディフェンシンおよび／もしくはペプチドの一方もしくは他方もしくは両方を発現する微生物の使用を通じて��菌または細菌感染または侵入から保護される。
【００９６】
上記のように、「病原体」という表現は、真菌および微生物を含む。「微生物」は、細菌を含む。「真菌」は、酵母およびサビ菌を含む。
【００９７】
「真菌」という表現は、ヒトもしくは動物対象または植物に感染するおよびそれ以外のそれらの病原体である真菌を含む。
【００９８】
哺乳動物、例えばヒトを含む動物の真菌病原体は、アルテルナリア属、アスペルギルス属、カンジダ属、フザリウム属、トリコフィトン属、クリプトコックス属、ヒストプラズマ属、ミクロスポルム属、ペニシリウム属、ニューモシスチス属、トリコスポロン属、スケドスポリウム属、ペシロミセス属、アクレモニウム属、スタキボトリス属およびデマチアセウスカビの菌種を含む。哺乳動物および特にヒトを含む特定の動物の病原体は、アルテルナリア・アルテルナータ、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・パラシチカス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・デュブリニエンシス、カンジダ・ファマタ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・ハエムロニイ、カンジダ・ケフィール、カンジダ・クルーセイ、カンジダ・ルシタニアエ、カンジダ・ノルベジェンシス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ビスワナシイ、エピデルモフィトン・フロッコーサム、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ソラニ、フザリウム・モニリフォルメ、トリコフィトン・ルブラム、トリコフィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・インタージギターレ、トリコフィトン・トンズランス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、クリプトコックス・ガッティ、クリプトコックス・グルビイ、ミクロスポルム・カニス、ミクロスポルム・ジプセウム、ペニシリウム・マルネッフェイ、トリコスポロン・ベイゲリ、トリコスポロン・アサヒ、トリコスポロン・インキン、トリコスポロン・アステロイデス、トリコスポロン・クタネウム、トリコスポロン・ドメスティカム、トリコスポロン・ムコイデス、トリコスポロン・オボイデス、トリコスポロン・プルランス、トリコスポロン・ロウビエリ、トリコスポロン・ジャポニカム、スケドスポリウム・アピオスペルムム、スケドスポリウム・プロリフィカンス、ペシロミセス・バリオッティ、ペシロミセス・リラシヌス、アクレモニウム・ストリクタム、クラドフィアロフォラ・バンチアナ、ワンギエラ・デルマチチジス、ラミクロリディウム・オボボイデウム、ケトミウム・アトロブルネウム、ダクチラリア・ガロパバム、バイポラリス属、エクセロヒルム・ロストラツムならびにアブシジア・コリムビフェラ、アポフィソミセス・エレガンス、ムコール・インディカス、リゾムコール・プシルス、リゾプス・オリゼ、カニングハメラ・バーソレチアエ、コケロミセス・レクルバタス、サクセネア・バシフォルミス、シンセファラストラム・ラセモサム、バシジオボラス・ラナラム、コニディオボルス・コロナトゥス、コニディオボルス・インコングルース、ブラストミセス・デルマチチジス、コクシディオイデス・イミチス、コクシディオイデス・ポサダシイ、ヒストプラズマ・カプスラーツム、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、シュードアレシェリア・ボイジイおよびスポロトリクス・シェンキイを含む。
【００９９】
主な作物の具体的な病原体は以下を含む：トウモロコシ：ギベレラ・ゼアエ（フザリウム・グラミネアラム）、コレトトリクム・グラミニコラ、ステノカルペラ・メイジ（ディプロディア・マイディス）、フザリウム・モニリフォルメ変種サブグルチナンス、フザリウム・バーティシリオイデス、バイポラリス・マイディスO、T（コクリオボリス・ヘテロストロフス）、エクセロヒルム・ツルシクムI、IIおよびIII、セルコスポラ・ゼアエ・マイディス、ピシウム・イレギュラレ、ピシウム・デバリアナム、ピシウム・グラミニコラ、ピシウム・スプレンデンス、ピシウム・ウルチマム、ピシウム・アファニダーマタム、アスペルギルス属、アスペルギルス・フラバス、ヘルミンソスポリウム・カーボナムI、IIおよびIII（コクリオボラス・カーボナム）、ヘルミンソスポリウム・ペジセラタム、フィソダーマ・マイディス、フィロスチクタ・マイディス、カバチエラ・マイディス、セルコスポラ・ソルギ、ウスチラゴ・マイディス、ウスチラゴ・ゼアエ、プクシニア・ソルギ、プクシニア・ポリソラ、マクロフォミナ・ファセオリナ、ペニシリウム・オキサリカム、ニグロスポラ・オリゼ、クラドスポリウム・ハーバリウム、カーブラリア・ルナタ、カーブラリア・イナエクアリス、カーブラリア・パレセンス、トリコダーマ・ビリデ、クラビセプス・ソルギ、ディプロディア・マクロスポラ、スクレロフソラ・マクロスポラ、ペロノスクレロスポラ・ソルギ、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス、ペロノスクレロスポラ・マイディス、ペロノスクレロスポラ・サッカリ、スファセロセカ・レイリアナ、フィソペラ・ゼアエ、セファロスポラム・マイディス、セファロスポラム・アクレモニウム；ダイズ：フザリウム・バーグルリフォルメ、フザリウム・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオラム、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ツクマニアエ、ファコプソラ・パキリジ、フィトフトラ・メガスペルマf種グリシネア、フィトフトラ・ソジャエ、マクロフォミナ・ファセオリナ、リゾクトニア・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオラム、ディアポルセ・ファゼオロラム変種ソジャエ（フォモプシス・ソジャエ）、ディアポルセ・ファゼオロラム変種カウリボラ、スクレロチウム・ロルフシイ、セルコスポラ・キクチイ、セルコスポラ・ソジナ、ペロノスポラ・マンシュリカ、コレトトリクム・デマチウム（コレトトリクム・トランカタム）、コリネスポラ・カッシイコラ、セプトリア・グリシネス、フィロスチクタ・ソジコラ、アルテルナリア・アルテルナータ、ミクロスファエラ・ディフューザ、フザリウム・セミテクタム、フィアロフォラ・グレガタ、グロメレラ・グリシネス、ピシウム・アファニダーマタム、ピシウム・ウルチマム、ピシウム・デバリアナム；キャノーラ：アルブゴ・カンジダ、アルテルナリア・ブラシカエ、レプトスファエリア・マクランス、リゾクトニア・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオラム、ミコスファエレラ・ブラッシシコラ、ピシウム・ウルチマム、ペロノスポラ・パラシチカ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・アヴェナセウム、フザリウム・ロセウム、アルテルナリア・アルテルナータ；綿花：フザリウム・オキシスポラムf種バシンフェクタム、バーテ��シリウム・ダーリエ、ティエラビオプシス・バシコラ、アルテルナリア・マクロスポラ、セルコスポラ・ゴッシィピナ、フォーマ・エキシグア（アスコキタ・ゴッシピイ）、ピシウム種リゾクトニア・ソラニ、プクシニア・スケダルディ、プクシニア・カカバタ、フィマトトリコプシス・オムニボレ；キャノーラ：レプトスファエリア・マクランス、スクレロチニア・スクレロチオラム、アルテルナリア・ブラシカエ、アルテルナリア・ブラシシコラ、プラスモディオフォラ・ブラシカエ、リゾクトニア・ソラニ、フザリウム属、ピシウム属、フィトフトラ属、アルテルナリア属、ペロノスポラ・パラシチカ、ミコスファエレラ・カプセラエ（シュードセルコスポレラ・カプセラエ）、アルブゴ・カンジダ、フィトフトラ・メガスペルマ変種メガスペルマ、ボトリチス・シネレア、エリシフェ・クルシフェララム；コムギ：コクリオボラス・サチバス、ドレクスレラ・ウィレガネンシス、ジモセプトリア・トリチシ（Zymoseptoria tritici）（ミコスファエレラ・グラミニコラ）、ファエオスファエリア・アベナリアf種トリチセア、ファエオスファエリア・ノドラム、ブルメリア・グラミニスf種トリチシ、ウロシスチス・アグロピリ、アルテルナリア・アルテルナータ、クラドスポリウム・ハーバリウム、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・アヴェナセウム、フザリウム・カルモラム、フザリウム・シュードグラミネアラム、ウスチラゴ・トリチシ、アスコキタ・トリチシ、セファロスポリウム・グラミネウム、コレトトリクム・グラミニコラ、エリシフェ・グラミニスf種トリチシ、プクシニア・グラミニスf種トリチシ、プクシニア・レコンジタf種トリチシ、プクシニア・ストリイフォルミス、プクシニア・トリチシナ、スクレロフソラ・マクロスポラ、ウロシスチス・アグロピリ、ピレノフォラ・トリチシ-レペンチス、ピレノフォラ・セメニペルダ、ファエオスファエリア・ノドラム、セプトリア・ノドラム、セプトリア・トリチシ、セプトリア・アベナエ、シュードセルコスポレラ・ハーポトリコイデス、リゾクトニア・ソラニ、リゾクトニア・セレアリス、ゲウマノミセス・グラニミス変種トリチシ、ピシウム属、ピシウム・アファニダーマタム、ピシウム・アルヘノマンネス、ピシウム・グラミニコラ、ピシウム・ウルチマム、バイポラリス・ソロキニアナ、クラビセプス・パープレア、タペシア・ヤルンダエ、ティレティア・トリチシ、ティレティア・ラエビス、ティレティア・カリエス、ティレティア・インディカ、ウスチラゴ・トリチシ、ウォジュノヴィシア・グラミニス、コクリオボラス・サチバス；ソルガム：エクセロヒルム・ツルシクム、コレトトリクム・サブリネオラム、セルコスポラ・ソルギ、グロエオセルコスポラ・ソルギ、アスコキタ・ソルギナ、プクシニア・パープレア、マクロフォミナ・ファセオリナ、ペルコニア・サーシナタ、フザリウム・モニリフォルメ、アルテルナリア・アルテルナータ、バイポラリス・ソルギコラ、ヘルミンソスポリウム・ソルギコラ、カーブラリア・ルナタ、フォーマ・インシジオーサ、ラムリスポラ・ソルギ、ラムリスポラ・ソルギコラ、フィラキャラ・サッカリ、スポリソリウム・レイリアナム（スファセロセカ・レイリアナ）、スファセロセカ・クルエンタ、スポリソリウム・ソルギ、クラビセプス・ソルギ、リゾクトニア・ソラニ、アクレモニウム・ストリクタム、スクレロフソナ・マクロスポラ、ペロノスクレロスポラ・ソルギ、ペロノスクレロスポラ・フィリピネンシス、スクレロスポラ・グラミニコラ、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・オキシスポラム、ピシウム・アルヘノマンネス、ピシウム・グラミニコラ；ヒマワリ：プラスモパラ・ハルステディイ、スクレロチニア・スクレロチオラム、セプトリア・ヘリアンシ、フォモプシス・ヘリアンシ、アルテルナリア・ヘリアンシ、アルテルナリア・ジニアエ、ボトリチス・シネレア、フォーマ・マクドナルディイ、マクロフォミナ・ファセオリナ、エリシフェ・シコラセアラム、リゾプス・オリゼ、リゾプス・アリザス、リゾプス・ストロニファー、プクシニア・ヘリアンセ、バーティシリウム・ダーリエ、セファロスポラム・アクレモニウム、フィトフトラ・クリプトゲア、アルブゴ・トラゴポゴニス；アルファルファ：ピシウム・ウルチマム、ピシウム・イレギュラレ、ピシウム・スプレンデンス、ピシウム・デバリアナム、ピシウム・アファニダーマタム、フィトフトラ・メガスペルマ、ペロノスポラ・トリフォリオラム、フォーマ・メディカギニス変種メディカギニス、セルコスポラ・メディカギニス、シュードペジザ・メディカギニス、レプトトロチラ・メディカギニス、フザリウム・オキシスポラム、バーチリシウム・アルボ-アトラム、アファノミセス・ユーテイシェス、ステムフィリウム・ハーバリウム、ステムフィリウム・アルファルファエ、コレトトリクム・トリフォリイ、レプトスファエルリナ・ブリオシアナ、ウロミセス・ストリアタス、スクレロチニア・トリフォリオラム、スタゴノスポラ・メリロチ、ステムフィリウム・ボトリオサムおよびレプトトリチラ・メディカギニス。
【０１００】
1つの態様において、トウモロコシの真菌病原体は、フザリウム・グラミネアラム、コレトトリクム・グラミニコラ、ステノカルペラ・マイディス、フザリウム・バーティシリオイデス、コクリオボリス・ヘテロストロフス、エクセロヒルム・ツルシクム、セルコスポラ・ゼアエ・マイディスを含む。
【０１０１】
1つの態様において、ダイズの真菌病原体は、フザリウム・バーグリフォルメ（Fusarium virguliforme）、フザリウム・ソラニ、スクレロチニア・スクレロチオラム、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・ツクマニアエ、ファコプソラ・パキリジを含む。
【０１０２】
1つの態様において、コムギの真菌病原体は、ジモセプトリア・トリチシ（Zymoseptoria tritici）、フザリウム・グラミネアラム、プクシニア・グラミニスf種トリチシ（Puccinia graminis f.sp. tritici）、プクシニア・レコンダイトf種トリチシ（Puccinia recondite f.sp. tritici）、ピレノフォラ・トリチシ-レペンチスを含む。
【０１０３】
「真菌」という表現は、卵菌、例えばピシウム属およびフィトフトラ属も含む。「真菌」という用語は、サビ菌も包含する。
【０１０４】
細菌病原体は、ザントモナス属（Xanthomonas spp）およびシュードモナス属（Pseudomonas spp）を含む。他の微生物は、フィトプラズマ属（Phytoplasma spp）およびスピロプラズマ属（Spiroplasma spp）を含む。他の微生物は、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属（Streptococcus spp）、サルモネラ属（Salmonella spp）、プロテウス属（Proteus spp）、大腸菌（E.coli）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium spp）およびマイコプラズマ属（Mycoplasma spp）を含む。
【０１０５】
本開示はさらに、ディフェンシンもしくはその誘導体もしくは変異体および／または非ディフェンシンペプチドをコードする核酸分子を教示する。この核酸分子は、単離された形態または植物細胞、微生物細胞および非ヒト動物細胞における使用に適した発現もしくは運搬ベクターを含むベクターの一部分であり得る。「ベクター」という表現は、PCT/AU02/00123に記載されるような多遺伝子発現ベクター（MGEV）を含む。
【０１０６】
後者の局面にしたがい、各ドメインが機能性タンパク質をコードし、各ドメインが隣のドメインにリンカーセグメントによって直線的配列で接続されており、ドメインおよびセグメントのすべてが同一リーディングフレーム内にあり、ドメインの少なくとも1つが透過性ディフェンシン、例えば本明細書に記載されるクラスIIナス科ディフェンシンまたはその修飾型である、2〜8個のドメインセグメントを有するポリヌクレオチドを含む多遺伝子発現ビヒクル（MGEV）が提供される。1つの態様において、少なくとも1つの他のドメインは、本明細書に記載される非ディフェンシンペプチドである。1つの態様において、少なくとも1つのドメインがディフェンシンであり、少なくとも1つの他のドメインが上記ペプチドである。
【０１０７】
ディフェンシンおよび／またはペプチドをコードする核酸配列は、適当な調節配列（プロモーター、ターミネーター、輸送ペプチド等）と共にDNAコンストラクトまたはベクターに組み込まれ得る。核酸はまた、異種プロモーターに機能的に連結され得る。いくつかの適用においては、ディフェンシンおよび／またはペプチドをコードする核酸配列は、ディフェンシンおよび／またはペプチド融合タンパク質を形成するよう別のタンパク質を発現するコード領域内に挿入され得、またはそのタンパク質に抗病原体活性を付与するようタンパク質のドメインを置換するために使用され得る。核酸配列は、構成性または（例えば環境条件、病原体の存在、化学物質の存在によって刺激される）誘導性プロモーターであり得る同種または異種プロモーターの制御下に置かれ得る。輸送ペプチドは、ディフェンシンに対して同種または異種であり得、所望のオルガネラまたは細胞外空間への分泌が行われるよう選択される。輸送ペプチドは、特定のディフェンシンに生来的に付随している場合がある。そのようなDNAコンストラクトは、コードされる修飾ディフェンシンまたはディフェンシンの活性部分を発現させることができる生物学的システムにクローニングまたは形質転換され得る。適当な生物学的システムは、微生物（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）発現システム、大腸菌、緑膿菌、植物内生菌、例えばクラビバクター・キシリ亜種シノドンチス（Clavibacter xyli subsp. cynodontis）（Cxc）；酵母；ウイルス；バクテリオファージ等）、培養細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞）および植物を含む。いくつかの例において、発現されたディフェンシンは、その後、使用のために抽出および単離される。他の例において、ディフェンシンおよび／またはペプチドの一方もしくは他方または両方を発現する微生物細胞が、植物にまたは根の周囲の領域にまたは種子に適用される。1つの態様において、ディフェンシンまたはペプチドの一方は微生物によって産生され、他方は局所適用される。1つの態様において、微生物の1つのタイプがディフェンシンおよびペプチドの両方を産生する。1つの態様において、2つの異なる微生物の各々が、ディフェンシンまたはペプチドの一方または他方を産生する。
【０１０８】
本明細書に教示されるディフェンシンおよびペプチドの組み合わせは、ヒト、動物または植物における病原体疾患または感染を撃退するためおよび環境現場の除染を促進するために有用である。したがって、本明細書は、病原体の治療、予防または除染のためのプロトコルを教示する。このプロトコルは、ヒト、獣医、園芸および／または農業用途を有する。本明細書に記載されるディフェンシンおよびペプチドの組み合わせに暴露することによって病原体を撃退するプロセスがさらに提供される。ディフェンシンおよび／またはペプチドの一方または両方は、組成物の形態で使用され得る。
【０１０９】
本明細書に教示される別の局面は、植物ディフェンシンまたはその機能性天然もしくは合成誘導体もしくは変異体および非植物ディフェンシンペプチドを、1つまたは複数の薬学的または獣医学的または園芸的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む組成物である。別の態様において、一方がディフェンシンを含み、他方が非ディフェンシンペプチドを含む、2つの組成物が使用される。1つの態様において、組成物は、スプレー、ミスト、マイクロもしくはナノ粒子、水溶液、ウォッシュ、トニック、分散物、霧状製剤、ドゥーシェ、リップスティック、スラッジ、粉末、クリーム、軟膏、ゲル、パッチ、含浸バンデージ、液体、製剤、ペイントまたは組成物の局所もしくは全身用形態を含むその他の適当な分散媒体の形態である。「全身用形態」は、経口、静脈内、末梢内、皮下、くも膜下、頭蓋内、膣または直腸投与に適した形態を含む。
【０１１０】
薬学的適用の場合、ディフェンシンおよび／またはペプチドは、哺乳動物感染を治療するため（例えば、酵母、例えばカンジダを撃退するため）の殺病原体剤または病原体抑制剤として使用され得る。有用な適用は、つま先、足、手、爪、目、耳、口および頭皮の真菌感染のための粉末、滴下剤および軟膏を含む。
【０１１１】
本開示にしたがうディフェンシンおよびペプチドは、保存剤として（例えば、食品添加物として）もしくは土壌もしくは成長培地調製プログラムの一部としてまたは非生物物体の表面、例えばドアのハンドルおよびテーブル表面の除染を補助するためにも使用され得る。
【０１１２】
農業適用の場合、修飾されたディフェンシンは、植物が生きている間のまたは収穫後の作物の保護のために作物の疾患耐性または疾患耐容性を改善するために使用され得る。ディフェンシンおよびペプチドの組み合わせに暴露された病原体の増殖、分裂、活性または感染もしくは侵入能が阻害される。修飾されたディフェンシンは、植物においてすでに確立している病原体を根絶し得るまた将来の病原体の攻撃から植物を保護し得る。
【０１１３】
ディフェンシンおよびペプチドへの植物病原体の暴露は、様々な方法で達成され得る、例えば、
（a）薬剤は、標準的な農業技術（例えば、噴霧）を用いて、植物の一部にまたは植物の根の周囲の土壌もしくは他の成長培地にまたは植え付け前の植物の種子に適用され得る。薬剤は、化学的に合成され得るまたは微生物もしくは植物もしくはディフェンシンおよび／もしくはペプチドの一方もしくは両方を発現するよう遺伝子修飾された微生物から抽出され得る。薬剤は、固体または液体希釈剤および任意で様々なアジュバント、例えば表面活性剤と共にディフェンシンおよびペプチドを含む組成物の形態で植物にまたは植物成長培地に適用され得る。固体組成物は、分散性の粉末、顆粒または粒子の形態であり得る。
（b）ディフェンシンおよび／またはペプチドを発現するよう遺伝子修飾された微生物を含む組成物が、植物または種子または植物を成長させる土壌に適用され得る。
（c）ディフェンシンおよび／またはペプチドを発現するよう遺伝子修飾された植物内生菌が、（例えば、種子治療プロセスを通じて）植物組織に導入され得る。植物内生菌は、植物宿主との非病原性内共生関係を構築する能力を有する微生物と定義される。植物内生菌により強化された植物保護の方法は、Crop Genetics International Corporationによる一連の特許出願に記載されている（例えば、国際出願公開番号WO90/13224、欧州特許公報番号EP-125468-B1、国際出願公開番号WO91/10363、国際出願公開番号WO87/03303）。植物内生菌は、農薬化合物を産生するよう遺伝子修飾され得る。国際特許出願公開番号WO94/16076（ZENECA Limited）は、植物由来抗真菌ペプチドを発現するよう遺伝子修飾された植物内生菌の使用を記載している。
（d）ペプチドが植物体内で発現されるよう、ディフェンシンおよび／またはペプチドをコードするDNAが植物ゲノムに導入され得る（DNAはcDNA、ゲノムDNAまたは標準的な核酸合成装置を用いて製造されたDNAであり得る）。
【０１１４】
本明細書に記載されるディフェンシンおよび／またはペプチドを含む組成物は、通常、担体、賦形剤、希釈剤、保存剤、安定化剤および／または固体もしくは液体添加物を含む。ディフェンシンおよび／またはペプチドの一方もしくは他方または両方を含む植物抽出物はまた、ボディウォッシュまたはシャンプー等の製剤において使用され得る。
【０１１５】
組成物は、意図される投与方法に依存して、様々な形態をとり得る。ヒトもしくは動物対象または植物に対しては、通常、しかし排他的にではなく、局所組成物が使用される。組成物を調製する際、有用な媒体、例えば水、グリコール、オイル、アルコール、保存剤および／または着色剤が使用され得る。組成物は、液体調製物、例えば懸濁物、エリキシルおよび溶液の形態をとり得る。担体、例えばデンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等も使用され得る。組成物はまた、粉末、カプセルおよび錠剤の形態であり得る。
【０１１６】
ディフェンシンおよびペプチドは、植物もしくはその一部に、種子にもしくは根系にもしくは根系の周囲の土壌もしくは培地にまたは哺乳動物、例えばヒトを含む動物の皮膚、毛髪もしくは毛皮に直接投与され得る。
【０１１７】
エアゾールまたはスプレーによって投与される場合、組成物は、農薬製剤および医薬製剤の分野において周知の技術にしたがい調製され、そしてベンジルアルコールもしくは他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティを向上させる吸収促進剤、フッ化炭素および／または当技術分野で公知の他の可溶化もしくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【０１１８】
ディフェンシンおよびペプチドの有効用量は、用いられる個々の組み合わせ、投与様式、治療する病原体および病原体侵入の重篤度によって異なり得る。したがって、ディフェンシンおよびペプチドを使用する投薬計画は、植物または対象のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療する状態の重篤度；投与経路；および用いられるその個々のディフェンシンを含む様々な要因にしたがって選択される。通常の技能を有する園芸家、医師、臨床医または獣医は、病原体侵入を防止する、対抗するまたはその進行を停止させるために必要とされるディフェンシンの有効量を容易に決定し処方することができる。徐放製剤もまた、本明細書で企図されている。
【０１１９】
ドラジェコアは、適当なコーティングと共に提供される。この目的で、任意でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液ならびに適当な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る濃縮糖溶液が使用され得る。識別のためまたは活性化合物の異なる組み合わせを特徴づけるために、染料または色素が錠剤またはドラジェ用コーティングに添加され得る。
【０１２０】
ディフェンシン・非ディフェンシンペプチド調製物は、ゼラチンから製造されるプッシュフィットカプセルならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールから製造される軟質密封カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、充填剤、例えばラクトース、結合剤、例えばデンプンおよび／または滑沢剤、例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウムおよび任意で安定化剤と共に活性成分を含み得る。軟質カプセルにおいて、活性化合物は、適当な液体、例えば脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定化剤が添加され得る。
【０１２１】
ディフェンシン・非ディフェンシンペプチド組成物またはそれをコードする発現ベクターはまた、別の抗病原体物質、例えば別のディフェンシンもしくは抗病原体タンパク質もしくはペプチド、または化学的殺病原体剤もしくはプロテイナーゼ阻害剤もしくはそれらの前駆体を含み得る。
【０１２２】
本明細書に教示される別の局面は、病原体が侵入した植物を治療するまたはそれを予防するためのプロトコルまたは方法であって、植物もしくはその一部分、例えば植物の種子または植物の周囲の土壌もしくは成長支援培地に、本明細書に記載される植物ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドを含む抗病原体有効量の組成物を、単独でまたは別の抗病原体剤と共に適用する工程を含むプロトコルまたは方法を含む。
【０１２３】
別の局面は、病原体が感染または侵入した哺乳動物、例えばヒト対象を含む動物を治療するまたはそれを予防するためのプロトコルまたは方法であって、対象に、本明細書に記載される植物ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドを含む抗病原体有効量の組成物を適用する工程を含むプロトコルまたは方法を提供する。
【０１２４】
別の局面は、病原体が侵入した環境現場を除染するためのプロトコルまたは方法であって、該部位に、本明細書に記載される植物ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドを含む抗病原体有効量の組成物を適用する工程を含むプロトコルまたは方法を提供する。
【０１２５】
別の態様においては、ディフェンシンおよび／またはペプチドの一方もしくは他方または両方を発現するよう遺伝子修飾された微生物が、植物、種子、根にまたはヒトもしくは動物に適用される。
【０１２６】
「適用する」という用語は、接触させることおよび暴露することを含む。
【０１２７】
さらなる態様においては、植物細胞が、様々な公知の方法（アグロバクテリウム（Agrobacterium）Tiプラスミド、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃等）にしたがい組み換えDNAコンストラクトで形質転換され得る。形質転換された細胞は、適当な場合、新しい核物質がゲノムに安定的に組み込まれた全植物に再生され得る。形質転換された単子葉植物および双子葉植物の両方がこの方法で入手され得るが、後者の方が通常より簡単に再生される。これらの一次形質転換体の子孫の一部は、抗病原体性ディフェンシン・ペプチド組み合わせをコードする組み換えDNAを受け継ぐ。
【０１２８】
本開示はさらに、病原体に対する改善された耐性を有し、植物ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドを発現する組み換えDNAを含む植物を提供する。そのような植物は、真菌を含む病原体に対する耐性を有するハイブリッドおよび株を作製する標準的な植物交雑育種において親として使用され得る。あるいは、該植物は、異種ディフェンシンを発現し得るまたは増大した内因性ディフェンシンを発現し得る。使用時、該ペプチドは、そのような植物に外部から供給される。代替法において、該植物は、該ペプチドを発現し、ディフェンシンは外部から供給される。したがって、本開示は、トランスジェニック植物およびそれらの子孫に及ぶ。さらに別の態様において、ディフェンシンおよび／またはペプチドは、標的に外部から供給される微生物によって発現される。ディフェンシンが植物または植物種子に局所適用される場合であっても、植物自体が生来的にそのディフェンシンを産生し得る。
【０１２９】
組み換えDNAは、形質転換によって植物またはその祖先に導入された、通常異種のDNAである。組み換えDNAは、病原体攻撃部位（例えば、葉）への送達のために発現されるディフェンシンおよびペプチドをコードする。
【０１３０】
ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドがトランスジェニック植物またはその子孫で発現される場合、病原体は、植物上の病原体攻撃の部位でまたはその部位から離れた場所で該ディフェンシンおよびペプチドに暴露される。1つの態様において、適当な遺伝子調節配列の使用により、ディフェンシンは、それが最も効果的なときおよび場所でインビボ産生され得る。例えば、ディフェンシンおよびペプチドは、それが通常は実質量で発現されないが、疾患耐性が重要となる植物の部分（例えば、葉）で産生され得る。
【０１３１】
生成され得る遺伝子修飾植物の例は、農作物、穀物、果実および野菜、例えばトウモロコシ（corn）、ダイズ、ソルガム、コムギ、オオムギ、トウモロコシ（maize）、綿花、キャノーラ、コメ、アバカ、アルファルファ、アーモンド、リンゴ、アスパラガス、バナナ、インゲンマメ、ブラックベリー、ソラマメ、キャノーラ、カシュー、キャッサバ、ヒヨコマメ、シトラス、ココナッツ、コーヒー、イチジク、亜麻、ブドウ、アメリカホドイモ、麻、ラベンダー、マッシュルーム、オリーブ、タマネギ、エンドウ、ピーナツ、セイヨウナシ、トウジンビエ、ジャガイモ、ナタネ、ライグラス、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートポテト、タロイモ、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、トリュフおよびヤムイモを含む。
【０１３２】
病原体は、植物上、植物中または植物近辺で増殖する任意の病原体であり得る。これに関連して、耐性は、野生型植物と比較して向上した病原体に対する耐容性を含む。耐性は、病原体の影響に対する耐容性の若干の増加（病原体が部分的に阻害される場合）から植物が病原体の存在によって影響を受けないようになる完全な耐性（病原体が高度に阻害されるまたは殺傷される場合）まで様々であり得る。特定の病原体に対する耐性レベルの向上またはより広い病原体に対する耐性は、両方ともに、耐性を改善し得る。改善された耐性を示すトランスジェニック植物（またはそれ由来の植物）は、植物の形質転換またはその後の交雑の後に選択される。
【０１３３】
本開示は、抗病原体活性を示す遺伝子修飾された植物またはその子孫を生成する方法であって、本明細書に記載される植物ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドをコードする核酸を、該ディフェンシンおよびペプチドが植物病原体に対する相乗的な保護効果を示すのに十分な発現レベルで発現する細胞を含む植物を作製する工程を含む方法を提供する。
【０１３４】
抗病原体特性を示す植物を生成する方法であって、植物ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドを発現する細胞を含む遺伝子修飾植物またはその子孫を作製する工程を含む方法が、本明細書に提供される。そのような植物は、病原体による抵抗を促進する危険が低い。
【０１３５】
上記ディフェンシンおよびペプチドは、例えばペプチドまたはタンパク質合成装置を用いる、1つまたは複数のアミノ酸残基の標準的な段階的付加を用いてそのアミノ酸配列に基づき製造され得る。あるいは、ディフェンシンおよびペプチドは、組み換え手段によって作製され得る。
【０１３６】
上記のように、ディフェンシンおよびペプチドの組み合わせは、改善されたまたは強化された抗病原体活性を示す。
【０１３７】
さらに別の局面は、ヒトもしくは動物対象上または内での病原体感染または侵入を減少または制御する方法であって、植物ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドの組み合わせを、ヒトまたは動物上の潜在的感染表面領域に局所適用する工程を含む方法を提供する。したがって、動物および特に哺乳動物、例えばヒトの抗病原体薬が、本明細書で企図されている。1つの態様において、この薬は、粉末、スプレー、噴霧物、ナノ粒子、ゲル、ペースト、含浸バンデージ、ペイント、エアロゾル、ドレンチまたはその他の液体の形態である。抗病原体製剤はまた、徐放組成物であり得る。この製剤は、感染した対象を治療するためにまたは予防薬として使用され得る。
【０１３８】
本明細書に開示される別の態様は、ペプチドの抗病原体活性を強化または誘導するディフェンシンを同定する方法である。従来的に、このアッセイは真菌細胞において行われているが、他の種の細胞も用いられ得る。この方法は、透過性指標化合物の真菌細胞への侵入を可能にするディフェンシンの能力を測定する工程を含む。適当な透過性指標化合物は、細胞内か細胞外かの位置が検出できるものである。通常の条件下で、指標化合物は細胞外にとどまり、細胞壁および膜を自由に通過しない。透過性ディフェンシンの存在下で、指標化合物は、2時間以内に特定の真菌の細胞内で検出され得る。試験されるディフェンシン（試験ディフェンシン）が、真菌と共に存在する場合に、指標化合物の細胞内量を増加させることによって特定の真菌の透過性を増加させることが見いだされるとき、そのディフェンシンは、それによって、そのディフェンシンとペプチドが真菌の存在下で組み合わされる場合に、ペプチドの抗真菌活性を強化または誘導するものと同定される。同一ディフェンシンが他の病原体、例えば微生物においてもペプチドの抗病原体特性を強化または誘導する有用であることも提案される。
【０１３９】
適当な透過性指標化合物は、核酸染色剤、例えば緑色核酸染色剤または青色核酸染色剤である。ペプチドの効能を強化するディフェンシンを同定する方法は、核酸染色剤の使用に限定されず、ディフェンシンを用いて試験した場合に同様の透過性データを生成する任意の透過性指標化合物の任意の使用によって実施され得る。相対透過性指数（RPI）は、本明細書において、定義された濃度のあるディフェンシンによって誘導される真菌株の透過の程度を、同一濃度のNaD1の1.0の値に対して示したものと定義される。相乗作用は、相乗作用スケールによって表現され得る。1つの態様において、14までの値、例えば0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14は、有意な相乗作用を表さず；15〜29の値、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29は、低い相乗作用を表し；30〜60の値、例えば30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59または60は、中程度の相乗作用を表し；60を超える値は、高い相乗作用を表す。「60を超える値」は、61、70、80、90および100ならびにその間の任意の値を含む61〜100を含む。
【０１４０】
記載される方法は、以下に記載される方法または当業者によって同等であると理解される改良法を用いて実施される。この方法の工程は、試験ディフェンシンの存在下、およびそれとは別に、対照として、その非存在下で、真菌と透過性指標化合物を組み合わせる工程、次いで試験ディフェンシンの存在下および非存在下での真菌中の透過性指標化合物の任意の検出可能な細胞内量を比較する工程を含む。試験ディフェンシンの存在の影響が、対照と比較しての細胞内指標化合物の量の増加が2時間以内に真菌中で検出されるというものである場合、試験ディフェンシンは、ディフェンシンおよび殺真菌剤を真菌の存在下で組み合わせた場合に非植物ディフェンシンペプチドの効能を増強し得るものと同定される。ここに記載される方法によって同定される植物ディフェンシンは、そのディフェンシンが抗真菌活性を有することが公知であるかどうかによらず、本明細書に開示されるような真菌疾患から植物を保護するシステムのディフェンシン成分として有用であることが理解されるであろう。
【０１４１】
透過性ディフェンシンが最適な透過を提供する濃度範囲と共に同定された後、それは、選択された病原体に対して異なるペプチドとの組み合わせを用いて試験される。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」は、「含む（including）」、「含む（containing）」または「により特徴づけられる」と同義語であり、そして包括的またはオープンエンド型であり、追加の不特定の要素または方法の工程を排除しない。本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素によって特定されていないあらゆる要素、工程または成分を排除する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない物質または工程を排除しない。本明細書における「含む（comprising）」という用語のあらゆる使用は、特に組成物の成分の記載またはデバイスの要素の記載において、言及されている成分または要素から本質的になるまたはそれらからなる組成物および方法を包含することが理解される。本明細書に例示的に記載されている本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または要素群、制限または制限群なしに適切に実施され得る。
【０１４３】
マーカッシュ群または他の群が本明細書で使用される場合、その群のすべての個々のメンバーならびにその群のすべての組み合わせおよび可能性のある下位的組み合わせが、個々に、その開示の中に含まれることが意図されている。
【０１４４】
本明細書で範囲について言及される場合、言及されている範囲内のすべての部分範囲および言及されている範囲内のすべての整数値が、各部分範囲および整数値が言及されているかのごとく、意図されていることが意図されている。
【実施例】
【０１４５】
ここからは、本明細書で開示され実現される局面を、以下の非限定的な実施例の中で説明する。
【０１４６】
方法
ピキア・パストリスからのディフェンシンの精製
単一のpPINK-ディフェンシンまたはpPIC9-ディフェンシンP.パストリス（PichiaPinkまたはGS115商標）株1コロニーを使用して、250mLフラスコ中25mLの（Invitrogen Pichia Expression Manualに記載される）BMG培地に接種し、それを30℃の振盪インキュベーター（140 rpm）内で2〜3日間インキュベートする。この培養物を使用して1Lバッフル付きフラスコ中200mLのBMGに接種し、それを一晩30℃の振盪インキュベーター（140 rpm）に設置する。この細胞を遠心分離（1,500 x g、10分間、4℃）によって収集し、5Lバッフル付きフラスコ中1LのBMM培地に再懸濁し、28℃の振盪インキュベーターにおいて3日間インキュベートする。この培養物を、t=24および48時間で、6mlの100％メタノールの添加を通じて誘導する。発現培地を遠心分離（6000 rpm、20分間）によって細胞から分離する。この培地を、100mMリン酸カリウム緩衝液、pH 6.0で事前平衡化されたSPセファロースカラム（1cm x 1cm、Amersham Biosciences）に適用する前にpH 3.0に調整する。次いでこのカラムを10カラム容積の100mMリン酸カリウム緩衝液、pH 6.0で洗浄し、結合したタンパク質を、500mMまたは1MのいずれかのNaClを含む10 x 10mLの100mMリン酸カリウム緩衝液で溶出する。少量の各画分（10μL）を、ドットブロットを用いて分析し、タンパク質含有画分をプールする。このタンパク質を、遠心分離カラムを用いて1mLに濃縮し、滅菌milli Q超純水を用いて5回洗浄する。ピキア発現ディフェンシンのタンパク質濃度を、タンパク質標準としてウシ血清アルブミン（BSA）を用いるビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイ（Pierce Chemical Co.）を用いて決定する。
【０１４７】
非ディフェンシンペプチド
非ディフェンシンペプチドの大部分は、商業的供給源から入手した。通常、これらのペプチドは、標準的なペプチド合成装置およびプロトコルを用いて化学的に合成される。
【０１４８】
EcAMP1を組み換え生産した。α-ヘアピニンEcAMP1の成熟ドメインをコードするDNAは、Genscriptから得た。このDNAを、Sac IIおよびSac Iを用いてpUC57ベクターから切り出し、Perfectprepキット（Eppendorf）を用いてアガロースゲルから抽出し、pHUEにライゲートし、その後にこれを使用してTOP10大腸菌細胞を形質転換した。プラスミドDNAを単離し、次いでこれを使用して大腸菌Rosetta-Gami B細胞を形質転換した。
【０１４９】
単一コロニーの大腸菌Rosetta-Gami Bを使用して、アンピシリン（0.1 mg/mL）、クロラムフェニコール（0.34 mg/mL）、テトラサイクリン（0.1 mg/mL）およびカナマイシン（0.015 mg/mL）を含む2YT培地（10mL、16 g/Lトリプトン、10g/L酵母エキス、5 g/L NaCl）に接種し、37℃で振盪しながら一晩増殖させた。この培養物を使用して、アンピシリン（0.1 mg/mL）、クロラムフェニコール（0.34 mg/mL）、テトラサイクリン（0.1 mg/mL）およびカナマイシン（0.015 mg/mL）を含む2YT培地（500 mL）に接種し、次いでこれを約1.0の光学密度（600nm）になるまで4時間増殖させた。次いでIPTGを添加し（0.5 mM終濃度）、培養物を16℃でさらに16時間増殖させた。細胞を遠心分離（4,000g、4℃、20分間）によって収集し、ネイティブ溶解緩衝液（細胞培養物1リットルあたり20 mL、100 mM Tris-Cl、1M NaCl、20 mM pH 8.0）に再懸濁し、そして-80℃で凍結させた。次いで細胞を解凍し、4℃で20分間、リゾチーム（25 mLの再懸濁細胞あたり5 mg）を用いて処理した。次いでDNase I（125μL、20％グリセロール中2 mg/mL、75 mM NaCl）およびMgCl2（125 μL、1M）を添加し、サンプルを揺動プラットフォーム上で、室温で40分間インキュベートした。次いでサンプルを氷上で2 x 30秒間超音波処理し（出力80％、Branson sonifier 450）、遠心分離（20,000g、4℃、30分間）した。次いでヘキサヒスチジンタグ付加されたユビキチン融合タンパク質（His6-Ub-EcAMP1）を、製造元の指示にしたがいNi-NTA樹脂（1.5 mL〜約25 mLネイティブタンパク質抽出物、Qiagen）を用いたネイティブ条件下での固定化金属親和性クロマトグラフィー（IMAC）によってタンパク質抽出物から精製した。組み換えタンパク質を、溶出緩衝液（100mM Tris-Cl、1M NaCl、500mMイミダゾールpH 8.0）を用いて溶出させた。イミダゾールは、溶出させたタンパク質を、50mM Tris Cl、100mM NaCl、pH 8.0で平衡化させた充填済みSephadex G50ゲル濾過カラム（PD-10、Amersham）に適用することによって除去した。
【０１５０】
ヘキサヒスチジンタグ付加ユビキチンを、脱ユビキチン化酵素6H.Usp2-cc（Cantanzariti et al. 2004）を用いて組み換えタンパク質から切断した。切断されたタグは、脱ユビキチン化プロテアーゼ阻害剤を用いる別のラウンドのIMACによって非結合タンパク質として除去した。次いでこれを逆相HPLCによってさらに精製した。
【０１５１】
透過アッセイ
フザリウム・オキシスポラムf種バシンフェクタム（Fov）またはフザリウム・グラミネアラム（Fgr）を、25℃で18時間、5 x 104胞子／mLの出発濃度から半強度PDB中で増殖させる。次いで菌糸懸濁物（90μL）を黒色96ウェルマイクロタイタープレートに移し、10分間、SYTOX（登録商標）グリーン（0.5μM）（緑色核酸蛍光色素）と共にインキュベートし、その後に10μLのペプチド溶液を添加して10μM（Fov）または5μM（Fgr）の最終タンパク質濃度にする。（透過を示す）SYTOXグリーンの取り込みを、488 nmおよび538 nmのそれぞれ励起および発光波長でマイクロタイタープレートリーダー（SpectraMax M5e；Molecular Devices）を用いて蛍光を測定することによって定量した。読み取りは、2時間の間、2分ごとに行う。透過アッセイの実施例の結果を図1および表2に示す。
【０１５２】
相対透過指数は、本明細書において、定義された濃度のディフェンシンによって誘導される真菌株の透過の程度を、同一濃度のNaD1の1.0の値に対して示したものと定義される。
【０１５３】
図1は、10μM NaD1、HXP4、HXL002、HXL007、HXL008およびDmAMP1を用いた処理後のFov菌糸へのSYTOXグリーンの相対的取り込みを示している。表2も参照のこと。ディフェンシンNaD1、HXP4、HXL002、HXL007およびHXL008は、Fov菌糸に透過することができ、ディフェンシンDmAMP1はできない。各ディフェンシンの相対透過指数が表2に示されている。本発明の目的上、Fovにおいて0.2より大きな相対透過指数を有するディフェンシンを、透過性とみなしている。
【０１５４】
図2は、5μM NaD1、HXP4、HXL001、HXL002、HXL004、HXL008、HXL009、HXL013、HXL021、ホルドチオニンおよびRsAFP2を用いた処理後のFgr菌糸へのSYTOXグリーンの相対的取り込みを示している。ディフェンシンNaD1、HXP4、HXL002、HXL004およびHXL008は、ディフェンシンHXL009、HXL021、ホルドチオニンおよびRsAFP2よりも有意に大きくFgr菌糸に透過する。各ディフェンシンの相対透過指数が表3に示されている。本発明の目的上、Fgrにおいて0.5より大きな相対透過指数を有するディフェンシンを、透過性とみなしている。
【０１５５】
トランスジェニック植物細胞および／または組織の作製
植物細胞および／または組織に異種DNAを導入しその存在に関して選択するための技術および試薬は、周知である。植物細胞において異種DNAの選択を可能にする遺伝子マーカーは周知であり、例えば、抗生物質、例えばカナマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシンまたはブレオマイシンに対する耐性を有する遺伝子がある。これらのマーカーは、対応する耐性遺伝子を有しているために適当な抗生物質を含む培地中で増殖する形質転換に成功した植物細胞の選択を可能にする。ほとんどの例において、植物細胞に挿入される異種DNAは、選択マーカー、例えば抗生物質耐性マーカーをコードする遺伝子を含むが、これは必須ではない。例示的な薬物耐性マーカーは、その発現がカナマイシン耐性をもたらす遺伝子、すなわちノパリンシンターゼプロモーターn5ネイマイシンホスホトランスフェラーゼIIおよびノパリンシンターゼ3'非翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。
【０１５６】
異種コード配列および転写終結配列に融合された誘導性プロモーターまたはキメラプロモーターを含む発現カセットを用いて植物細胞および／または組織を遺伝子操作するための技術は、アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子衝突または当技術分野で公知の他の技術により植物細胞または組織に導入されるものである。発現カセットはさらに、植物細胞内での異種DNAの選択を可能にするマーカー、例えば抗生物質、例えばカナマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシンまたはブレオマイシンに対する耐性を有する遺伝子を含むのが有利である。
【０１５７】
植物発現可能な遺伝子または他の関心対象のDNAを有するDNAコンストラクトは、任意の適当な方法により植物のゲノムに挿入され得る。そのような方法は、例えば、リポソーム、エレクトロポレーション、拡散、粒子衝突、マイクロインジェクション、遺伝子銃、遊離DNAの取り込みを向上させる化合物、例えばリン酸カルシウム共沈、ウイルスベクターおよび当技術分野で実践されている他の技術の使用を含み得る。適当な植物形質転換ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のTiプラスミド由来のもの、例えばHerrera-Estrella et al. (1983) EMBO J 2:987-995、Bevan et al. (1983) Nucleic Acids Res 11(2):369-385; Klee et al. (1985) Bio/Technology 3:637-642およびEPO公報120,516（Schilperoort et al. 欧州特許公開120,516）に記載されるものを含む。アグロバクテリウムのTiまたは根誘導（Ri）プラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、代替の方法も本発明のDNAコンストラクトを植物細胞に挿入するために使用され得る。
【０１５８】
関心対象のDNAを機能的に連結するベクターの選択は、当技術分野で周知のように、望まれる機能的特性、例えば複製、タンパク質発現および形質転換する宿主細胞に直接的に依存し、これらは組み換えDNA分子を構築する技術分野に内在する制限である。ベクターは、望ましくは、原核生物レプリコン、すなわち原核生物宿主細胞、例えば細菌宿主細胞に導入されたときに自律複製し、組み換えDNA分子を染色体外で維持する能力を有するDNA配列を含む。そのようなレプリコンは、当技術分野で周知である。加えて、原核生物レプリコンを含む好ましい態様はまた、形質転換細胞に導入されたときにその発現が細菌宿主細胞に選択的利益、例えば薬物耐性を付与する遺伝子を含む。典型的な細菌薬物耐性遺伝子は、他の選択剤の中でも特に、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼは、それが真核生物および原核生物細胞で発現されるという利点を有する。
【０１５９】
原核生物レプリコンを含むベクターはまた、典型的に、本発明の組み換えDNA分子の挿入のための従来的な制限部位を含む。そのようなベクタープラスミドの典型は、BioRad Laboratories（Richmond, CA）から入手可能なpUC8、pUC9、pBR322およびpBR329ならびにPharmacia（Piscataway, NJ）から入手可能なpPL、pKおよびK223ならびにStratagene（La Jolla, CA）から入手可能なpBLUESCRIPT tmand pBSである。本発明のベクターはまた、当技術分野で公知のラムダファージベクターまたはラムダZAPベクター（Stratagene La Jolla, CAから入手可能）であり得る。別のベクターは、例えば、pCMU（Nilsson et al. (1989) Cell 58:707）を含む。他の適当なベクターもまた、公知の方法にしたがい合成され得る、例えば、本明細書において様々な用途で使用されるベクターpCMU/KbおよびpCMUIIは、pCMUIVの改良型である（Nilsson et al. (1989)前出）。
【０１６０】
植物細胞中で組み換え核酸配列を発現させることができ、かつ宿主植物細胞内での安定的な組み込みを誘導することができる典型的な発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍誘導（Ti）プラスミド由来のベクターを含む。
【０１６１】
トランスジェニック植物は、好ましくは非武装化T-DNAベクターを用いる、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介DNA移入、エレクトロポレーション、直接DNA移入および粒子衝突を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の標準的手段によって作製され得る。DNAを単子葉植物および双子葉植物に導入するための技術は当技術分野で周知であり、そのような植物組織を培養し、それらの組織を再生する技術も同様である。
【０１６２】
相乗作用の分類
相乗作用は、2つのディフェンシンの組み合わせによってもたらされる真菌増殖阻害率の観測値（Io値：％）と、各ディフェンシン自体の真菌増殖阻害率（％）の和に基づく2つのディフェンシンの真菌増殖阻害率の期待値（％）（Richer et al. (1987)前出によって使用されるリンペル式にしたがい計算されるEe値）との間の差として分類される。差Io-Eeが相乗値である。15までの相乗値は、有意でない相乗作用を意味し、15〜30は、低レベルの相乗作用であり、30〜60は、中レベルの相乗作用であり、＞60は高レベルの相乗作用である。
【０１６３】
インプランタ（In planta）研究のためのバイオアッセイ法
C.グラミニコラ接種菌の調製
コレトトリクム・グラミニコラ（US単離菌Carroll-1A-99）は、トウモロコシ（Zea maize）（Pioneer Hi-Bred International, Inc. Johnston, Iowa, USA）から単離される。胞子は、V8寒天上でおよそ2〜3週間成長させた胞子形成培養物から単離される。C.グラミニコラ胞子は、滅菌水中でプレートの表面をこすり取り、そして化粧紙を通じた濾過によって胞子を菌糸物質から分離することによって回収される。ろ液中の胞子の濃度は、ヘマトサイトメーターを用いて測定される。
【０１６４】
F.グラミネアラム接種菌の調製
フザリウム・グラミネアラム単離菌（73B1A）は、トウモロコシ（Pioneer Hi-Bred International, Inc. Johnston, Iowa, USA）から単離される。胞子は、SNP寒天上でおよそ2〜3週間成長させた胞子形成培養物から単離される。F.グラミネアラム胞子は、滅菌水中でプレートの表面をこすり取ることによって回収される。胞子の濃度は、ヘマトサイトメーターを用いて測定される。
【０１６５】
トウモロコシ植物の接種
バイオアッセイのための植物を、デフラスキング（deflasking）後におよそ6〜12週間、温室中で成長させる。
【０１６６】
C.グラミニコラの接種
トウモロコシの葉鞘の反対の側に2.0mm長の2つの傷を作り、次いで1 x 106個のC.グラミニコラ胞子/mlをその上にかぶせる。次いで傷をGlad Press'n'Sealで3日間封鎖する。感染領域を、接種10日後にデジタル写真により測定する。
【０１６７】
F.グラミネアラムの接種
トウモロコシの葉鞘の反対の側に2.0mm長の2つの傷を作る。傷に、1 x 106個のF.グラミネアラム胞子/ml中に浸漬した6 mm径のペーパーディスクをかぶせる。次いで傷をGlad Press'n'Sealで3日間封鎖する。感染領域を、接種10日後にデジタル写真により測定する。
【０１６８】
トウモロコシ植物におけるトランスジェニック発現の分析
ELISA法
タンパク質抽出物：温室で成長させた植物から葉および葉鞘組織を切り出す。組織（50mg）を液体窒素中で凍結させ、ミキサーミル（Retsch MM300）において、3 x 15秒間、30s-1の周波数ですりつぶす。タンパク質抽出物を、重量あたり9倍量の2％ w/v不溶性PVPP（Polyclar）/PBS/0.05％ v/v Tween 20を添加し、20秒間ボルテックスすることによって生成する。サンプルを15分間遠心分離し（3,700 rpm）、上清を回収する。
【０１６９】
ELISAプレート（NuncMaxisorp ＃442404）を、PBS中100μL/ウェルの一次抗体（100 ng/ウェルの抗ディフェンシン抗体）と共にインキュベートする。プレートを加湿ボックス内、4℃で一晩インキュベートする。次いでそれらをPBS/0.05％ v/v Tween 20で2分間 x 4回洗浄する。プレートを、PBS中200μL/ウェルの3％ w/v BSA（Sigma A-7030: 98% w/v ELISA等級）でブロックし、25℃で2時間インキュベートする。次いでプレートをPBS/0.05％ v/v Tween 20で2分間 x 4回洗浄する。
【０１７０】
次いでトウモロコシ葉鞘または葉タンパク質抽出物（PBS/0.05％ v/v Tween 20で希釈した100μL/ウェル）をプレートに適用し、次いでこれを25℃で2時間インキュベートする。次いでプレートをPBS/0.05％ v/v Tween 20で2分間 x 4回洗浄し、次いでPBS中100μL/ウェルの二次抗体（例えば、75 ng/ウェルのビオチン標識ディフェンシン抗体）を適用する。ビオチン標識抗体は、EZ-link Sulfo-NHS-LC-ビオチニル化キット（Pierce）を用いて調製し；2 mLのプロテインA精製抗体および2 mgのビオチン試薬を使用する。プレートを25℃で1時間インキュベートし、次いでPBS/0.05％ v/v Tween 20で2分間 x 4回洗浄し、PBS中100μL/ウェルのNeutriAvidin HRP-コンジュゲート（Pierce #31001；1:1000希釈；0.1μL/ウェル）を適用する。このプレートを25℃で1時間インキュベートし、次いでPBS/0.05％ v/v Tween 20で2分間 x 2回、その後にH2Oで2分間 x 2回洗浄する。使用直前に、基質を、1つのImmunoPure OPDタブレット（Pierce ＃34006）を9mLのH2Oに溶解させ、次いで1mLのステーブルペルオキシドバッファー（stable peroxide buffer）（10X、Pierce ＃34062）を添加することによって調製する。この基質を100μL/ウェルで適用し、プレートを発色するまで25℃でインキュベートする（約9分間）。この反応を、50μLの2.5M硫酸を適用することによって停止する。490nmでの吸光度をプレートリーダー（Molecular Devices）で測定する。
【０１７１】
（表２）
2017519720.tif 000004
【０１７２】
（表３）
2017519720.tif 000005
【０１７３】
実施例1
インビトロでの透過性ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドの存在下における真菌病原体の増殖の阻害
ディフェンシンは、透過性ディフェンシンであるナス科クラスIIディフェンシン（NaD1）、人工変異型ディフェンシン（HXP4）およびクラスIディフェンシン（HXL001、HXL004、HXL008、HXL012、HXL013、HXL015、HXL035）を含む。これらを、カテリシジン（バクテネシン、BMAP28およびLL37）、合成変異型バクテネシン（Bac2A）、合成ペプチド（CP29）、α-ヘアピニンペプチド（Sit_HPN_100A、EcAMP1、Osa_HPN_86B、Sbi_HPN_104C、Sbi_HPN_104I、Cil_HPN_14F）、β-ヘアピンペプチド（アンドロクトニンおよびポリフェムシン（F12I）ならびにシスタチン由来ペプチド（SICys9N(67-92)、SICys9N(77-110)、HvCPI6(75-99)およびCC7(71-104)）と組み合わせる。
【０１７４】
フザリム・グラミネアラム（ギベレラ・ゼア）（Fgr、Pioneer Hybrid International (PHI)単離株73B1A）、フザリウム・オキシスポラムf種バシンフェクタム（Fov、綿花から単離されたオーストラリア単離株VCG01111；Farming Systems Institute, Department of Agriculture, Fisheries & Forestry, Queensland, Australia）、コレトトリクム・グラミニコラ（Cgr、PHI単離株Carroll-1A-9）、カンジダ・アルビカンス（単離株DAY185、Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Victoria, Australia）、クリプトコックス・ガッティ（単離株BAL11）、トリコフィトン・インタージギタレ、トリコフィトン・ルブラムおよびミクロスポルム・フルバム（Microsporum fulvum）（Women's and Children's Hospital, Adelaide, AustraliaのNational Mycology Reference Centre, South Australia Pathologyから得られる）の増殖に対する非ディフェンシンペプチドと併用する透過性ディフェンシンの阻害効果を、本質的にBroekaert et al. (1990) FEMS Microbiol Lett 69:55-59に記載されるようにして測定する。
【０１７５】
胞子は、合成貧栄養寒天（Fgr）、V8寒天（Cgr）、1/2強度ジャガイモデキストロース寒天（Fov）、酵母エキスペプトンデキストロース寒天（カンジダ・アルビカンス、クリプトコックス・ガッティ）または1/2強度サブローデキストロース寒天（トリコフィトン・インタージギタレ、トリコフィトン・ルブラム、ミクロスポルム・フルバム）上で増殖させた胞子形成真菌種から単離する。胞子を、1/2強度ジャガイモデキストロースブロス（PDB）を添加することによってプレートから取り出した。胞子濃度を、ヘマトサイトメーターを用いて測定する。
【０１７６】
抗真菌アッセイを、本質的に本明細書に記載されるように96ウェルマイクロタイタープレートにおいて行う。ウェルに10μLのフィルター滅菌済み（0.22μmシリンジフィルター、Millipore）ディフェンシン（各終濃度の10xストック）または水、10μLのフィルター滅菌済み（0.22μmシリンジフィルター、Millipore）非ディフェンシンペプチド（各終濃度の10xストック）または水および80μLの1/2強度PDB 1mLあたり5 x 104個の胞子を加える。このプレートを25℃（Fgr、Cgr、Fov）または30℃（C.アルビカンス、C.ガッチイ、T.インタージギタレ、T.ルブラム、M.フルバム）でインキュベートする。真菌増殖を、マイクロタイタープレートリーダー（SpectraMax Pro M2; Molecular Devices）を用いて595nmでの光学密度（A595）を測定することによってアッセイする。試験ディフェンシンの非存在下での真菌の光学密度（OD）が0.2のODに達するまで増殖を続ける。各試験を2回行う。
【０１７７】
相乗作用は、ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドの組み合わせによってもたらされる真菌増殖阻害率の観測値（Io値：％）と、ディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドの各々の独自の真菌増殖阻害率（％）の和に基づくディフェンシンおよび非ディフェンシンペプチドの真菌増殖阻害率の期待値（％）（Richer et al. (1987)前出によって使用されるリンペル式にしたがい計算されるEe値）との間の差として分類される。差Io-Eeが相乗値である。15までの相乗値は、有意でない相乗作用を意味し、15〜30は、低レベルの相乗作用であり、30〜60は、中レベルの相乗作用であり、＞60は高レベルの相乗作用である。相乗作用の計算は、表4〜12に示されており、表中、上記のように、Eeは、阻害率（％）として表されるリンペル式にしたがう相加的反応から予測された効果であり、Ioは、阻害率の観測値（％）である。相乗作用は、Io値がEe値よりも高い場合に存在する。結果が表4〜12に示されている。
【０１７８】
カンジダ・アルビカンスの相乗的阻害の結果を表4に示す。
【０１７９】
（表４）カンジダ・アルビカンス
2017519720.tif 000006
2017519720.tif 000007
【０１８０】
クリプトコックス・ガッティの相乗的阻害の結果を表5に示す。
【０１８１】
（表５）クリプトコックス・ガッティ
2017519720.tif 000008
【０１８２】
フザリウム・グラミネアラムの相乗的阻害の結果を表6に示す。
【０１８３】
（表６）フザリウム・グラミネアラム
2017519720.tif 000009
【０１８４】
トリコフィトン・インタージギタレの相乗的阻害の結果を表7に示す。
【０１８５】
（表７）トリコフィトン・インタージギタレ
2017519720.tif 000010
【０１８６】
ミクロスポルム・フルバムの相乗的阻害の結果を表8に示す。
【０１８７】
（表８）ミクロスポルム・フルバム
2017519720.tif 000011
【０１８８】
フザリウム・オキシスポラムf種バシンフェクタムの相乗的阻害の結果を表9に示す。
【０１８９】
（表９）フザリウム・オキシスポラムf種バシンフェクタム
2017519720.tif 000012
【０１９０】
コレトトリクム・グラミニコラの相乗的阻害の結果を表10に示す。
【０１９１】
（表１０）コレトトリクム・グラミニコラ
2017519720.tif 000013
【０１９２】
フザリウム・グラミネアラムの相乗的阻害の結果を表12に示す。
【０１９３】
（表１１）フザリウム・グラミネアラム
2017519720.tif 000014
【０１９４】
カンジダ・アルビカンスの相乗的阻害の結果を表12に示す。
【０１９５】
（表１２）カンジダ・アルビカンス
2017519720.tif 000015
【０１９６】
実施例2
α-ヘアピニンまたはβ-ヘアピンの存在下での真菌病原体の増殖の阻害
いくつかのα-ヘアピニンおよびβ-ヘアピンペプチドは、それら自体が、植物ディフェンシンと組み合わせて使用される濃度よりも高い濃度で病原体に対する効能を示す。組み合わせで使用される濃度で、α-ヘアピニンまたはβ-ヘアピンペプチドは、抗病原体活性を示さないまたは最小限の抗病原体活性しか示さない。その結果が表13に示されている。
【０１９７】
（表１３）IC50値
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Cgr-コレクトトリクム・グラミニコラ
Fgr-フザリウム・グラミネアラム
S.cer-サッカロミセス・セレビシエ
C.alb-カンジダ・アルビカンス
T.rub-トリコフィトン・ルブラム
【０１９８】
当業者は、本明細書に記載されている開示内容が詳細に記載されているもの以外の改変または変更も受け入れることができることを理解するであろう。本開示はすべてのそのような改変および変更を企図していることが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書中で言及されているまたは示されている工程、特徴、組成物および化合物のすべてを個別にまたは集合的に、ならびに上記工程または特徴または組成物または化合物の任意の2つ以上の任意およびすべての組み合わせを実現する。
【０１９９】
参考文献一覧
2017519720.tif 000017
2017519720.tif 000018
【図１】
2017519720.tif 000019
【図２】
2017519720.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月22日(2016.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2017519720.tif 000022
2017519720.tif 000023
2017519720.tif 000024
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