(57)【要約】  本発明は、放射性医薬の調製のための安定化されたキットに関する。特に、本発明は、キットの配位子成分の安定化のための非水溶媒の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
注入可能な放射性医薬として用いるのに適した放射性標識された配位子を調製するためのキットであって、
ａ）非水性溶媒に溶けた配位子（前記配位子は放射性核種と結合することができ、前記溶媒はヘキサンからグリセリンまでの相対的極性範囲内のいずれか１つ以上の溶媒から選択される）；
ｂ）還元剤；
ｃ）緩衝溶液
を含み、成分ａ）、ｂ）、及びｃ）がそれぞれ凍結乾燥された形態である、キット。
【請求項２】
弱いキレート剤、抗酸化剤、可溶化剤、及び増量剤のいずれか１つ以上から選択される添加剤を含む成分ｄ）をさらに含み、成分ｄ）が凍結乾燥された形態である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記還元剤が、ＳｎＣｌ２又はＳｎＦ２又は酒石酸スズ、塩酸、及び水の混合物である、請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
緩衝剤が、リン酸塩、クエン酸、及び酢酸塩の緩衝溶液の１つ以上から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
弱いキレート剤が、ＤＴＰＡ、グルコヘプトネート、タートレート、及びメドロネートの１つ以上から選択される、請求項２に記載のキット。
【請求項６】
抗酸化剤が、ゲンチシン酸、アスコルビン酸、及びパラアミノ安息香酸の１つ以上から選択される、請求項２に記載のキット。
【請求項７】
可溶化剤が、ゼラチン又はシクロデキストリンあるいはそれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載のキット。
【請求項８】
増量剤が、マンニトール、イノシトール、グルコース、及びラクトースの１つ以上から選択される、請求項２に記載のキット。
【請求項９】
１つのバイアル瓶中に成分ａ）、ｂ）、ｃ）が含まれ、かつ任意選択により成分ｄ）が含まれていてもよい、請求項２〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
第一のバイアル瓶中に成分ｂ）、ｃ）が含まれ、かつ任意選択により成分ｄ）が含まれていてもよく、第二のバイアル瓶中に成分ａ）が含まれる、請求項２〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
配位子が、ＥＣＤＧ、ＥＣＤ、ＨＭＰＡＯ、ＭＡＧ３、及びＭＩＢＩ、あるいはそれらのアルカリ金属塩、あるいはそれらのアルカリ土類金属塩のいずれか１つから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
溶媒が、メタノール、エタノール、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、エーテル、テトラヒドロフラン、及びアセトニトリルの１つ以上から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
溶媒がメタノールである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
放射性核種が、99mTc、188Re、186Re、153Sm、166Ho、90Sr、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、153Gd、59Fe、52Fe、225Ac、212Bi、45Ti、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、195mPt、191mPt、193mPt、117mSn、103Pd、103mRh、89Zr、177Lu、169Er、44Sc、155Tb、140Nd、140Pr、198Au、103Ru、131Cs、223Ra、224Ra、及び62Znから選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
放射性核種が、99mTc、103Pd、103mRh、195mPt、193mPt、191Ptである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
放射性核種が99mTcである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
使用のための指示書をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、放射性医薬を調製するための安定化されたキットに関する。特にこの発明は、キットの配位子成分の安定化のための非水溶媒の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射性医薬は、応用において用いられるほとんどの放射性核種の短い半減期のために、制限された時間内に調製され、投与されなければならない。それは通常、ＧＭＰ条件下で製造されたキットから配合される。キットは、通常、放射性核種、例えば、９９ｍＴｃがそれに錯体化される適用可能な配位子、十分な量の還元剤、最適な放射性標識化条件に適したｐＨに調節するための緩衝剤、安定化剤、及び賦形剤を含む。キットは、安定性を高めて有効期間を長くする凍結乾燥すなわちフリーズドライの形態で調製される。キットは容易に輸送及び貯蔵されることができ、その後、そこに指示された放射性核種を用いて再構築されることができる。凍結乾燥されたキットは、放射性標識（labelling）を簡単にし、放射性標識のためのより安定な条件を確かなものにする。
【０００３】
凍結乾燥されたキット配合物が入手できることは、投与するための放射性医薬を容易に調製することに責任がある病院スタッフにとって有利であり、なぜなら、調製は放射性核種の添加と必要な場合には加熱する工程しか含まれないからである。これらの調製工程は、したがって、病院において責任のある人の能力の範囲内である。
【０００４】
放射性医薬の例は、９９ｍテクネチウム−エチレンジシステインデオキシグルコサミン（９９ｍＴｃ−ＥＣＤＧ）１である。９９ｍＴｃ−ＥＣＤＧは、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）／コンピューター断層撮影法（ＣＴ）（ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）の造影剤であり、これは、肺癌の原発病変を検出するその能力について、現在、米国において第３相臨床試験がされている１。９９ｍＴｃ−ＥＣＤＧの造影能力は、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）／ＣＴ造影剤である１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）と同程度であり、後者は冬眠心筋及び代謝的に活性な癌組織の検出のために広く（スキャンの９５％より多い）利用されている２。１８Ｆ−ＦＤＧに対する９９ｍＴｃ−ＥＣＤＧの有望な使用の背後にある主な推進力は、ＰＥＴ放射性トレーサーと比べてＳＰＥＣＴ放射性トレーサーを用いることに伴う顕著に低いコストと、肺癌造影において同じレベルの質及び効率を達成することにある３。
【０００５】
【化１】
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【０００６】
９９ｍＴｃ−ＥＣＤＧの作用機構は、２つのグルコサミン置換基を含むことの結果として、ヘキソサミン経路によって生じることが提案されている。グルコサミンは、ヘキソサミン生合成経路を通して細胞に入り、そのグルコサミン−６−ホスフェートの調節産物は、下流のインスリン活性化及びシグナルグリコシル化及び癌の増殖に介在する２。ヘキソサミン経路において、上方制御されたグルコース輸送体が、グルタミンの過剰発現を促進する（フルクトース−６−ホスフェートアミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ））。ホスホリル化グルコサミンは、ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）と結合して、ＵＤＰＮ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧＬｃＮＡｃ）を生成する。Ｏ−結合型タンパク質Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）トランスフェラーゼによる、核タンパク質及び細胞質タンパク質のセリン及びトレオニン残基のグリコシル化は、全ての多細胞真核生物に共通である。グリコシル化は、翻訳後修飾の一部であり、多数の核・細胞質タンパク質を修飾するようである。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性は、細胞内ＵＤＰ−ＧＬｃＮＡｃ及びＵＤＰ濃度を大きく受け入れ、次にこれはグルコース濃度及びその他の刺激に非常に敏感である。細胞の核内では、普遍的転写因子Ｓｐ１は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃによって高度に修飾されている。Ｓｐ１は、高血糖症又は上昇したグルコサミンに応答して高グリコシル化を受ける。Ｏ−ＧｌｃＮＡｃはヘキソサミン経路及び核活動に関与するので、それは癌における鑑別診断のための魅力的な造影剤になる。
【０００７】
刊行物に記載された合成についての文献の調査は、（文献［５］、［６］、［７］、及び［８］）は、ＥＣＤＧ３をどのように製造するかについてのいくつかの実験方法の概観をもたらす。残念なことに、これらの刊行物に記載された方法のいずれも、うまく再現可能ではなく、なぜならこれらの合成にはＥＣＤＧを水性媒体にさらすことが含まれ、水性媒体は無益なことが判明しており、それはＥＣＤＧが空気、光、水、及び温度に敏感であることが示されているからである９。ＥＣＤＧの合成は、この配位子の非常に不安定な性質を考えると、困難な課題であると説明されてきている９。ＥＣＤＧは造影剤としての使用が意図されているので、この材料は医薬グレードである必要があり、そのことは収率における実質的損失なしに、精製工程が行われる必要があることを意味している。これは、ＥＣＤＧの低い安定性によって、非常に困難であることが判明するであろう。
【０００８】
【化２】
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【０００９】
核医学の状況において放射性医薬として有用な９９ｍＴｃＥＣＤＧを作るという課題に折り合いをつける第二の因子は、キット配合物においてそれを提示することである。
【００１０】
水に不安定な配位子であるＥＣＤＧのキットの製造は、通常のキットの手順に水性相中での凍結乾燥工程を含むので問題があり、この工程では純粋な配位子活性医薬成分（ＡＰＩ）が、還元剤、添加剤、及び緩衝剤のそれぞれを少なくとも１つ含む水／生理食塩水に溶かされ、バイアル瓶に分配され、凍結乾燥される。病院では、生理食塩水中の９９ｍＴｃがそのキットに添加され、再構築される。９９ｍＴｃは次にＥＣＤＧ配位子にキレートされ、９９ｍＴｃ−ＥＣＤＧ放射性医薬が、注入のために準備される。本発明者は、ＥＣＤＧが水中でほとんど瞬時に壊れることを発見している。９９ｍＴｃ−ＥＣＤＧの場合のように、金属イオンがＥＣＤＧにキレートされた場合にのみ、水中で安定である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、簡単で、反復可能であり、安定な放射標識法を可能にし、診断、治療、又はその他のトレーサー用途に適している、安定な成分を含むキットシステムの必要性が存在する。さらに、規制当局の承認のために許容可能である放射化学的純度レベルで、かつ高い安定性、純度、及び収率を保ちながら、配位子を効果的に放射性標識することの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
［本発明のまとめ］
本発明の第一の側面によれば、放射性医薬を調製するためのキットを提供し、そのキットは、
ａ）非水性溶媒に溶けた配位子（この配位子は放射性核種と結合することができ、この溶媒はヘキサンからグリセリンまでの相対的極性範囲から選択される）；
ｂ）還元剤；
ｃ）緩衝溶液；
ｄ）及び任意選択により場合によっては添加剤、例えば、弱いキレート剤、抗酸化剤、可溶化剤、又は増量剤(bulking agent)
を含み、かつ成分ａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）はそれぞれ凍結乾燥された形態である。
【００１３】
本発明の好ましい態様では、還元剤はＳｎＣｌ２又はＳｎＦ２又は酒石酸スズ、塩酸、及び水の混合物であり、緩衝溶液は、リン酸塩又はクエン酸又は酢酸塩の緩衝溶液である。あるいは、緩衝剤は、リン酸塩、クエン酸、又は酢酸塩の緩衝溶液のいずれかの組み合わせである。
【００１４】
好ましくは、弱いキレート剤は、ＤＴＰＡ、グルコヘプトネート、タートレート（酒石酸）、メドロネート（メドロン酸）、又はいずれかの組み合わせから選択される。抗酸化剤は、ゲンチシン酸、アスコルビン酸、及びパラアミノ安息香酸、又はそれらの組み合わせから選択される。可溶化剤は、ゼラチン又はシクロデキストリンあるいはそれらの組み合わせから選択され、増量剤は、マンニトール、イノシトール、グルコース、及びラクトース、又はそれらの組み合わせから選択される。
【００１５】
成分ａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）は、一つのバイアル瓶中に含まれていてもよい。あるいは、成分ｂ）、ｃ）、及びｄ）が第一のバイアル瓶に含まれ、成分ａ）が第二のバイアル瓶に含まれている。
【００１６】
配位子は、ＥＣＤ、ＨＭＰＡＯ、ＭＡＧ３、及びＭＩＢＩ、あるいはそれらのアルカリ金属塩、あるいはそれらのアルカリ土類金属塩から選択される。好ましくは、配位子はＥＣＤＧ又はそのアルカリ金属塩である。溶媒は、メタノール、エタノール、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、エーテル、テトラヒドロフラン、及びアセトニトリル、又はそれらの組み合わせから選択される。好ましくは、溶媒は、メタノール又はエタノールから選択される。より好ましくは、溶媒はメタノールである。
【００１７】
金属放射性核種は、99mTc、188Re、186Re、153Sm、166Ho、90Sr、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、153Gd、59Fe、52Fe、225Ac、212Bi、45Ti、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、195mPt、191mPt、193mPt、117mSn、103Pd、103mRh、89Zr、177Lu、169Er、44Sc、155Tb、140Nd、140Pr、198Au、103Ru、131Cs、223Ra、224Ra、及び62Znから選択される。
【００１８】
好ましくは、放射性核種は、99mTc、103Pd、103mRh、195mPt、193mPt、191Ptである。より好ましくは、放射性核種は99mTcである。
【００１９】
キットは使用のための指示書をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、製造したＥＣＤＧのマススペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
キットは以下に従って調製した。
以下の溶液を、ＣＯ２又はＯ２が存在しないことを確実にするためにＡｒ（ｇ）条件下で調製した：
ａ）十分な量のＥＣＤＧ又はその塩を、ヘキサンからグリセリンまでの相対的極性範囲において、非水性溶媒に溶かす。
ｂ）最適な放射性標識化条件のために適切なｐＨにあるリン酸塩／クエン酸緩衝溶液。
ｃ）中性又は酸性媒体中のスズ塩の溶液（これは、酸化状態ＶＩＩからＩＶへのパーテクネテートイオン（９９ｍＴｃＯ４−）の還元剤として作用し、９９ｍＴｃが、配位子であるＥＣＤＧに結合するために化学的に反応性であることを確実にする）。
【００２２】
２つのバイアル瓶のキット配合物については、上述した溶液を用いる凍結乾燥手順は、以下を含む：
ａ）バイアル１：十分な体積のＥＣＤＧ溶液をバイアル１に入れ、凍結させ、次にＡｒ（ｇ）条件下で凍結乾燥させた。
ｂ）バイアル２：予め決めた体積の上記の調製したリン酸塩／クエン酸緩衝溶液を、Ａｒ（ｇ）を満たしたバイアル２に入れ、凍結させ、夜通し凍結乾燥させ、次に上記Ｓｎ溶液（６０〜１００μｇのＳｎ（ＩＩ））を添加し、Ａｒ（ｇ）条件下で凍結乾燥させた。
【００２３】
全てのバイアルは冷凍庫中で暗い条件下で貯蔵する。放射性標識プロトコルは、バイアル１の再構築又は溶解を伴い、バイアル１のバイアル２への添加後直ちに十分な９９ｍＴｃ活性の添加を続いて行う。反応混合物を限られた時間の間加熱して（６０〜８０℃）、放射性標識を確実に行う。ＴＬＣ及びＨＰＬＣによる品質管理は、＞９０％の放射性標識及び９５％より高い放射化学純度を記録すべきである。
【００２４】
１バイアル瓶のキット配合物については、上述した溶液を用いる凍結乾燥手順は以下を含む：
ａ）最初に、予め決めた体積の上記の調製したリン酸塩／クエン酸緩衝液を凍結させ、凍結乾燥させる。次に、Ｓｎ溶液（６０〜１００μｇのＳｎ（ＩＩ））を、Ａｒ（ｇ）で満たしたバイアルに入れ、凍結させ、次にＡｒ（ｇ）条件下で凍結乾燥させる。
ｂ）最後に、ａ）のその凍結乾燥させた物質の上で、純粋なＥＣＤＧを非水性溶媒中に溶かし、凍結させ、凍結乾燥させる。この放射性標識プロトコルは、十分な９９ｍＴｃ活性の添加によるだけの再構築を伴う。この反応混合物を限られた時間の間加熱して（６０〜８０℃）、放射性標識を確実に行う。ＴＬＣ及びＨＰＬＣでの品質管理は、＞９０％の放射性標識及び９５％より高い放射化学純度を記録すべきである。それはキットに加えられて、注入に直ぐに使用できるように再構築される。
【００２５】
キットの調製において、ＥＣＤＧは、本件出願人によって合成的に調製された。ＥＣＤＧを製造するために合成経路は、市販されているＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸から出発する５つの合成工程で首尾よく実施された。この合成経路は以下のように短くまとめることができる。
【００２６】
構造から見ると、９９ｍＴｃ−ＥＣＤＧは３つの構成部分からなると考えることができ、すなわち、（i）そのコアにあるＬ−エチレンジシステイン（ＥＣ）配位子、（ii）２つの、癌を標的にするＤ−グルコサミン基、及び（iii）９９ｍＴｃ放射性核種、である。ＥＣは、市販されているＬ−４−チアゾリジンカルボン酸［１０］のラジカル的に促進される二量化反応によって得ることができる。ＥＣのチオール及び二級アミン官能基が反応性部位であり、それぞれ、ベンジル（Ｂｎ）［１１］及びベンジルクロロホルメート（Ｃｂｚ）保護基によって有効かつ効果的に保護されることが示されている。２つのＤ−グルコサミン基は、反応剤であるエチルクロホルメートを用いることによる混合無水物カップリング反応によって、ＥＣの酸基と理論的には結合されることができる。ＥＣＤＧは、次に、ナトリウム／アンモニア溶液中での、カップリング反応生成物の全体的な脱保護によってもたらされうる［８］。この反応はフェニル酢酸アンモニウムで失活させてこれが２−プロパノールに可溶なフェニル酢酸ナトリウム塩を生成し、これが反応の副生成物からＥＣＤＧの十分な精製を可能にする。この合成されたＥＣＤＧは次に９９ｍＴｃで放射性標識され、必要なときに用いることできる。
【００２７】
Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸からのＥＣ４：
【化３】
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の合成は、文献［１０］が規定するまさにそのとおりに行って、所望する生成物を３８％の収率で得た。反応が完了に至ったら、アンモニアを迅速に蒸発させ（沸点は−３３℃である）、得られた残留物を水に溶かして、高い塩基性（ｐＨ＝１２．０）の溶液を得た。そうして、５Ｍ  ＨＣｌを添加して、塩基性化されたＥＣ配位子をプロトン化させ、その分子をその二塩酸塩として沈殿させ、これはｐＨ３．０〜２．０で達成される。出発物質であるＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸は酸性媒体に可溶性であり、溶液中に残り、したがって、この工程はＥＣ４の精製の最初の段階としての役割を果たす。沈殿したＥＣ４は、次にろ過され、沸騰しているエタノールからのこの未精製ＥＣ４の即時の再結晶と、それに続く高真空下でのその物質の乾燥が、粉末状白色固体として、純粋なＥＣ４をもたらすことを発見した。ＥＣ４のＮＭＲはＤ２Ｏ中で行い、（i）その二塩酸塩を中和し、（ii）チオール及び酸官能基を脱プロトン化させるために６．０当量のＫ２ＣＯ３の添加を必要とし、これがＥＣ４を可溶化させ、分析することを可能にする。ＥＣ４のプロトン及びカーボンＮＭＲデータは、測定した融点とともに、文献のデータに正確にしたがっていた。このデータもまた、ＥＣ４の純度が９９％より高いことを示した。
【００２８】
ＥＣ４は参考文献情報［１０］にしたがってベンジル化され、文献情報からの乖離は観察されなかった。この保護工程は、計画しているグルコサミンカップリング反応においてチオール基も反応し、したがって保護（マスク）されることが求められているので、必要である。しかし、ＥＣ−Ｂｎ５：
【化４】
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のプロトン又はカーボンＮＭＲデータについての利用可能な文献は存在しなかったので、分析のための溶媒系及び方法を決定しなければならかった。実験的に、ＥＣ−Ｂｎ５は、４．０当量のＫ２ＣＯ３の添加とともに６：４（ｖ／ｖ）比のＤ２Ｏ及び重水素化ＤＭＦの混合物中に完全に溶けることを発見した。Ｋ２ＣＯ３はＥＣ−Ｂｎ５の二塩酸塩の中和及びその２つの酸基の脱プロトン化をするのに役立つ。これが、ＥＣ−Ｂｎ５のＮＭＲデータが生じることを可能にしたし、この化合物について最初に報告されたプロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルとして役に立つ。そのプロトンＮＭＲスペクトルは親のＥＣ４化合物のものと非常に似ているが、４．６９ｐｐｍに一重線としてベンジルＣＨ２プロトンを含み、１０個の芳香族プロトンは多重線として７．１６ｐｐｍに現れる。カーボンＮＭＲスペクトルはプロトンＮＭＲスペクトルの観察と相互に関連づけられ、ＣＨ２カーボン原子は３５．９ｐｐｍに観察され、１２７．１ｐｐｍ、１２８．６ｐｐｍ、１２８．８ｐｐｍ、及び１３８．６ｐｐｍの一重線は芳香環から生じている。このデータは、予測される文献の範囲内で合致する測定された融点とともに、ベンジル保護が首尾よく達成されたことを裏付けている。
【００２９】
ＥＣ−Ｂｎ５の二級アミン基を、ベンジルクロロホルメート保護基で保護した。チオール基と同様に、これらの二級アミン基も、計画しているグルコサミンカップリング反応で反応し、したがって、キャッピングされることが必要である。ＥＣ−ＢｎのＣｂｚ保護は、最初に０℃で２時間行い、次に室温（ＲＴ）で１６時間行った。ジエチルエーテルで洗浄する工程が、未反応ＣｂｚＣｌを除去するために必要とされ、次に水性媒体をｐＨ３．０に酸性化してＥＣ−Ｂｎ−Ｃｂｚ６：
【化５】
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のカルボン酸基をプロトン化し、これによって白色固体として生成物の沈殿がもたらされた。大容積の有機溶媒中に生成物を溶かし、酸性化された溶液を酢酸エチルで抽出することにより、ＥＣ−Ｂｎ−Ｃｂｚ６が単離されることを可能にすることを発見した。分離とそれに続く有機相からの溶媒除去により、所望する生成物を非晶質固体として得た。このＥＣ−Ｂｎ−Ｃｂｚ６はその物質が痕跡量の溶媒又は水を全く含まないことを確実にするために、高真空下で徹底的に乾燥しなければならなかった。ＥＣ−Ｂｎ−Ｃｂｚ６生成物はシリカゲル上で急速に分解し、したがってさらに精製されることはできず、これは刊行物に記載されたデータ［１２］に反することがわかった。ＥＣ−Ｂｎ−Ｃｂｚ６のＮＭＲ分析のための溶媒系を決定することはできず、これも刊行物の情報に一致しておらず、刊行物情報はＣＤＣｌ３中のＮＭＲデータを示している。この生成物のＬＣ−ＭＳ分析も、ＭＳ測定にとって困難なことが知られているベンジル保護基のために首尾よくいかないことが判明した。したがって、未精製ＥＣ−Ｂｎ−Ｃｂｚ６は次の工程で直接用いた。
【００３０】
ＥＣ−Ｂｎ−Ｃｂｚ６とテトラアセチルグルコサミンのカップリング反応は、カップリング剤としてエチルクロロホルメート（クロロギ酸エチル）を用いて行った。反応条件及び後処理は従来技術で見いだされたものと同じやり方で行ったが、新しいカラム精製溶媒系を決定した。（１〜５）：（１０〜９０）：（１０〜８０）の範囲内の割合でのメタノール（ＭｅＯＨ）、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、及びヘキサンの３成分溶媒の組み合わせが、完全に保護されたＥＣＤＧ７が高い純度で単離されることを可能にすることを発見した。
【化６】
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【００３１】
最後の工程は、ＥＣＤＧ３を得るための、完全に保護されたＥＣＤＧ７のナトリウム／アンモニアで促進される全体的な脱保護だった。完全に保護されたＥＣＤＧ７を２０．０当量の金属ナトリウムと反応させて、アセテート、Ｃｂｚ、及びＢｎ保護基を完全に除去した。反応を次に、１２．０当量のフェニル酢酸アンモニウムの添加によって失活させ、これは副生成物としてフェニル酢酸ナトリウムの形成をもたらした。液体アンモニアをアルゴンガス雰囲気下で蒸発させたところで、２−プロパノールでの洗浄工程によってフェニル酢酸ナトリウムを反応混合物から除去した。フェニル酢酸ナトリウムは２−プロパノールに良く溶ける一方、ＥＣＤＧ３は溶けず、したがって、その有機媒体を不活性雰囲気下でろ過して、ＥＣＤＧ３をクリーム色の強い臭気の固体として得た。このＥＣＤＧ３を次にジエチルエーテルで洗い、次に光を遮って高真空下で１時間乾燥させた。このＥＤＣＧの同定及び純度はＭＳによって行い（図１）、ＥＣＤＧ３に必要なＭＳピークは５９１．１単位に観察された。ＥＤＣＧ３は、光の無いところで−２０℃にて、アルゴン下で貯蔵した。
【実施例】
【００３２】
例１−ダブルバイアルキット
凍結乾燥手順
ａ）水（脱酸素したもの）中の二塩基性リン酸ナトリウム（0.284 g, 0.002 mol）の溶液に、クエン酸（0.201 ｇ, 0.001 mol）を添加して、ｐＨ５．５のホスフェート／クエン酸緩衝溶液を得た。８５５μｌの調製したホスフェート／クエン酸緩衝溶液を第一のアルゴンで満たしたバイアルに入れて閉じ、凍結させた後、夜通し凍結乾燥させた。
ｂ）塩化スズ(II)二水和物溶液（0.01 g, 0.04 mmol）に塩酸（0.10 ml, 0.1 M）を添加し、水（脱酸素したもの）で１０ｍｌに希釈した。１００μｌのＳｎ溶液（= 60μgのSn(II)）を次にバイアル１に添加し、凍結させ、次に凍結乾燥させた。
ｃ）メタノール（1.5 ml）を、ＥＣＤＧ（10 mg, 0.017 mmol）を入れた、アルゴンで満たした第二のバイアルに添加した。このバイアルを液体窒素に浸けて溶媒を凍結させ、凍結乾燥させた。このバイアルは暗所かつ冷凍庫内に保たれるべきである。
【００３３】
全てのバイアルはＡｒで満たされ、ＣＯ２又はＯ２が存在しないことを確実にするべきであることに注意されたい。
【００３４】
放射性標識手順
ａ）凍結乾燥させたＥＣＤＧバイアルに３５５μｌのＨ２Ｏを添加する。
ｂ）凍結乾燥させた緩衝液／Ｓｎバイアルに移り、小さな磁気撹拌子を入れる。渦式撹拌（Vortex）して緩衝塩を溶かす。
ｃ）直ちに５００μｌのＴｃＯ４−（又は約40mCiの活性に等しい体積）を添加する。
ｄ）ホットプレート上に置き、７０℃で１５分間撹拌する。
ｅ）ＴＬＣ及びＨＰＬＣ−ＱＣを行う。
【００３５】
例２−１バイアルキット
凍結乾燥手順
ａ）水（脱酸素したもの）中の二塩基性リン酸ナトリウム（0.284 g, 0.002 mol）の溶液に、クエン酸（0.201 ｇ, 0.001 mol）を添加して、ｐＨ５．５のホスフェート／クエン酸緩衝溶液を得た。８５５μｌの調製したホスフェート／クエン酸緩衝溶液をアルゴンで満たした第一のバイアルに入れて閉じ、凍結させた後、夜通し凍結乾燥させた。
ｂ）塩化スズ(II)二水和物溶液（0.01 g, 0.04 mmol）に塩酸（0.10 ml, 0.1 M）を添加し、水（脱酸素したもの）で１０ｍｌに希釈した。１００μｌのＳｎ溶液（= 60μgのSn(II)）を次にバイアル１に添加し、凍結させ、次に凍結乾燥させた。
ｃ）メタノール（1.5 ml）を、ＥＣＤＧ（10 mg, 0.017 mmol）を入れた、アルゴンで満たした第二のバイアルに添加した。これを、Ｓｎ／緩衝液を含むバイアル１に定量的に移した。そのバイアルを液体窒素に浸し、溶媒を凍結させ、凍結乾燥させた。バイアルは暗所かつ冷凍庫内に保たれるべきである。
【００３６】
全てのバイアルはＡｒで満たされ、ＣＯ２又はＯ２が存在しないことを確実にするべきであることに注意されたい。
【００３７】
放射性標識手順
ａ）ＥＣＤＧ、Ｓｎ、及び緩衝剤を含むバイアルに、５００μｌのＴｃＯ４−（又は約40mCiの活性に等しい体積）を添加する。
ｂ）ホットプレート上に置き、７０℃で１５分間撹拌する。
ｃ）ＴＬＣ及びＨＰＬＣ−ＱＣを行う。
【００３８】
例３−ＥＣＤＧの合成
Ｌ，Ｌ−エチレンジシステイン・２ＨＣｌの合成
【化７】
2017505783.tif 000008
【００３９】
冷却コンデンサー（液体窒素を満たしたもの）、アルゴンガス注入口、及びオイルで満たした出口トラップを備えた２口丸底フラスコ中の液体アンモニア（150 ml）に、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸（30.0 g, 225 mmol）をゆっくり添加した。全てのＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸が完全に溶けるまで、その混合物を激しく撹拌し、次に清浄にした金属ナトリウム（8.00 g, 349 mmol, 1.50当量）を少しずつ１５分にわたって添加した。金属ナトリウムの添加が完了したら、深青色が観察され、この溶液を２０分間室温で撹拌した。次に、混合物が白色になり、全ての未反応の金属ナトリウムが失活するまで、スパチュラの先の部分で塩化アンモニウムを注意深く添加した。次にアンモニア溶媒が蒸発するようにさせておき、得られた反応残留物を水（200 ml）に溶かし、ｐＨを濃ＨＣｌで３．０に調節し、これが白色固体としてエチレンジシステインの二塩酸塩の沈殿物をもたらした。生成物を真空ろ過によって集め、沸騰エタノールから再結晶させ、高真空下で乾燥させて１４．７ｇ（38%）のエチレンジシステイン・２ＨＣｌ  ４を得た。
M.p.: 252-254℃（参考文献 251-253℃［１０］）；
1H NMR（400 MHz, D2O及び6.0当量のK2CO3）：
δH = 3.27 (2H, t, 2×CH-COOH), 2.70-3.00 (8H, m, 2×CH2-N及び2×CH2-SH（重なっている）, 2.62 (2H, m, 2×NH) 2。
13C NMR（400 MHz, D2O及び6.0当量のK2CO3）：
δC = 177.9 (COOH), 65.6 (CH-N), 44.8 (CH2-N), 26.8 (CH2-SH)。
【００４０】
Ｓ，Ｓ′−ジベンジルエチレンジシステイン・２ＨＣｌ  ５の合成
【化８】
2017505783.tif 000009
【００４１】
エチレンジシステイン・２ＨＣｌ  ４（2.0 g, 6.0 mmol）を室温で２Ｍ  ＮａＯＨ（30 ml）に溶かし、エタノール（40 ml）を添加し、得られた溶液を２０分間激しく撹拌した。ジオキサン（20 ml）中の塩化ベンジル（1.48 g, 11.7 mmol, 2.0当量）を上記エチレンジシステイン溶液に滴下により添加し、次に添加が終了した後さらに３０分間撹拌した。エタノール及びジオキサンを次に減圧下で除去し、次に得られた水性混合物のｐＨを５Ｍ  ＨＣｌでｐＨ３．０に酸性化した。これがＳ，Ｓ′−ジベンジルエチレンジシステインの塩酸塩５の沈殿物をもたらし、これを真空下でろ過し、真空下で乾燥させ、８５％（2.7 g）の収率だった。
M.p.:       227- 228°C（参考文献 251-253℃）； 
1H NMR（400 MHz, D2O/DMF（6:4 v/v比）及び4.0当量のK2CO3）：
δH = 7.16（10 H, m, 2×CH2-C6H5）, 3.68（4 H, s, 2×CH2-C6H5）, 3.14（2H, t, CH-COOH）, 2.44-2.85（10H, m, 2×CH2-N, 2×CH2-SH, 及び2×NH（重なっている））；
13C NMR（400 MHz, D2O/DMF（6:4 v/v比）及び4.0当量のK2CO3）：
δC = 179.5 (COOH), 138.6 (Ar-C), 128.0 (Ar-C), 128.6 (Ar-C), 127.1 (Ar-C), 62.7 (CH-N), 46.6 (CH2-N), 35.9 (CH2-C6H5), 34.4 (CH2-SH)。
【００４２】
完全に保護されたエチレンジシステインデオキシグルコサミン  ７の合成
Ｓ，Ｓ′−ジベンジルエチレンジシステイン５（6.0 g, 11.5 mmol）を１０％Ｋ２ＣＯ３溶液（150 ml）に溶かし、氷浴中で０℃に冷やした。ジオキサン（150 ml）中のベンジルクロロホルメートの混合物を次にその溶液に迅速に添加し、それを次に０℃で２時間撹拌した。冷却浴を次に取り除き、その混合物を室温（ＲＴ）で１６時間撹拌し、その後ジエチルエーテル（2×50 ml）で抽出した。水層を次に１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ３．０に注意深く酸性化し、これが白色化合物の沈殿をもたらした。酢酸エチル（200 ml）を添加し、沈殿した固体を、激しく撹拌しながらその有機層に溶かした。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。得られた透明な残留物を次に高真空下で乾燥させ、非晶質固体として、５．７５ｇ（70%収率）の未精製Ｎ，Ｎ′−ジベンジルオキシカルボニル−Ｓ，Ｓ′−ジベンジルエチレンジシステイン  ６を得た。この化合物は、精製に対して不安定であり、かつ試験したＮＭＲ溶媒に不溶性であり、その結果次の反応に直接使用した。
【化９】
2017505783.tif 000010
【００４３】
ＥＣ−Ｂｎ−ＣＢｚ  ６（1.34 g, 1.87 mmol）をトリエチルアミン（0.378 g, 3.74 mmol, 2.0当量）と共に無水クロロホルム（30 ml）に溶かし、その溶液をアルゴン雰囲気下にて塩化ナトリウム／氷スラリー冷却浴中で−１５℃に冷やした。エチルクロロホルメート（0.406 g, 3.74 mmol, 2.0当量）を滴下により添加し、得られた混合物をさらに１５分間撹拌した。この反応混合物に、無水クロロホルム（30 ml）中のテトラアセチルグルコサミン（1.58 g, 4.11 mmol, 2.2当量）及びトリエチルアミン（0.416 g, 4.11 mmol, 2.0当量）の溶液を添加し、一緒にした反応混合物を０℃で１時間、次に室温（ＲＴ）で１２時間撹拌した。その溶液を次に１Ｍ  ＨＣｌ（2×25 ml）、５％Ｋ２ＣＯ３溶液（2×25 ml）、Ｈ２Ｏ（50 ml）で続けて洗い、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル60; 移動相：MeOH/EtOAc/ヘキサン）によって精製して、白色結晶性固体として１．８０ｇ（70%収率）の完全に保護されたエチレンジシステインデオキシグルコサミン７を得た。
【化１０】
2017505783.tif 000011
1H NMR（400 MHz, CDCl3）：
δH = 8.62（2H, s,  2×NH）, 7.48-7.40（20 H, m, 2×OCH2-C6H5, 2×SCH2-C6H5）, 6.04（2H, d, テトラヒドロピランのアノメリックプロトン）, 5.45-5.20（6H, m, 2×OCH2-C6H5, 2×テトラヒドロピランの水素（重なっている））, 4.48-4.07（6 H, m, 2×CH-CONH, 4×テトラヒドロピランの水素（重なっている））, 3.72-3.48（12 H, 4×テトラヒドロピランの水素, 4×CH2-N-, 2×CH2-S-（重なっている））, 2.20-1.92（24 H, 8×OCH3)）。
【００４４】
エチレンジシステインデオキシグルコサミン３の合成
完全に保護されたエチレンジシステインデオキシグルコサミン  ７（1.00 g, 0.73 mmol）をアルゴン雰囲気下で液体アンモニア（100 ml）中に溶かし、清浄にした金属ナトリウム（0.334 g, 14.5 mmol, 20.0当量）を少しずつ添加した。反応混合物は深青色に変わり、室温（ＲＴ）で１５分間撹拌した後、未反応の金属ナトリウムを失活させるために少量のフェニル酢酸アンモニウムを添加した。生じた乳白色溶液をアルゴンガス流のもとで乾燥させて、強い臭気のあるクリーム色の固体を得た。その未精製生成物は光を遮って不活性雰囲気下で取り扱った。２−プロパノール（200 ml）をその物質に添加し、１０分間激しく撹拌した後、真空ろ過した。得られたクリーム色の沈殿物をジエチルエーテルで洗い、次に高真空下で２時間乾燥させて０．２３０ｇ（53%収率）のエチレンジシステインデオキシグルコサミン（ＥＣＤＧ）３のナトリウム塩を得た。生成物は、１Ｈ  ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、及びＭＳ分析によって確かめ、これは文献のデータと一致した。C20H38O12N4S2は590.665であることが必要であり、591.1と測定された。
【００４５】
参考文献
【表１】
2017505783.tif 000012
【図１】
2017505783.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月11日(2016.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性医薬キットの製造方法であって、以下の工程：
（ｉ）緩衝剤及び還元剤成分を含むバイアル瓶を準備する工程であって、前記バイアル瓶の内容物が凍結乾燥された形態で存在する工程；
（ｉｉ）前記バイアル瓶の凍結乾燥された内容物に、放射性核種と結合することができる配位子を添加する工程であって、ここで前記配位子がヘキサンからグリセリンまでの極性範囲内のいずれか１つ以上の溶媒から選択される非水性溶媒に溶けている工程；
（ｉｉｉ）不活性条件下で、前記の溶解している配位子を凍結乾燥させる工程、
を含む製造方法。
【請求項２】
放射性医薬キットの製造方法であって、以下の工程：
（ｉ）緩衝剤及び還元剤成分を含む第一のバイアル瓶を準備する工程であって、前記第一のバイアル瓶（バイアル１）の内容物が凍結乾燥された状態で存在する工程；
（ｉｉ）放射性核種と結合することができる配位子を含む第二のバイアル瓶を準備する工程であって、前記配位子がヘキサンからグリセリンまでの極性範囲内のいずれか１つ以上の溶媒から選択される非水性溶媒に溶けている工程；
（ｉｉｉ）不活性条件下で、第二のバイアル瓶（バイアル２）の溶解した配位子を凍結乾燥させる工程、
を含む製造方法。
【請求項３】
工程（ｉ）が、緩衝剤を含むバイアル瓶を準備する工程であって、前記緩衝剤が不活性条件下で凍結乾燥されている工程；前記の凍結乾燥された緩衝剤に還元剤が添加され、ここでバイアル瓶の内容物が不活性条件下で次にさらに凍結乾燥される工程、をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
工程（ｉ）が、還元剤を含むバイアル瓶を準備する工程であって、前記還元剤が不活性条件下で凍結乾燥されている工程；前記の凍結乾燥された還元剤に緩衝剤が添加され、ここでバイアル瓶の内容物が不活性条件下で次にさらに凍結乾燥される工程、をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
工程（ｉ）が、緩衝剤を含む第一のバイアル瓶を準備する工程であって、前記緩衝剤が不活性条件下で凍結乾燥されている工程；前記の凍結乾燥された緩衝剤に還元剤が添加され、ここで第一のバイアル瓶の内容物が不活性条件下で次にさらに凍結乾燥される工程、をさらに含む、請求項２に記載の製造方法。
【請求項６】
工程（ｉ）が、還元剤を含む第一のバイアル瓶を準備する工程であって、前記還元剤が不活性条件下で凍結乾燥されている工程；前記の凍結乾燥された還元剤に緩衝剤が添加され、ここで前記バイアル瓶の内容物が不活性条件下で次にさらに凍結乾燥される工程、をさらに含む、請求項２に記載の製造方法。
【請求項７】
工程（ｉ）の方法が、弱いキレート剤、抗酸化剤、可溶化剤、及び増量剤のいずれか１つ以上から選択される添加剤を準備する工程であって、これらの添加剤もまた凍結乾燥された形態で存在する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記還元剤が、凍結乾燥される前に、ＳｎＣｌ２又はＳｎＦ２又は酒石酸スズ、塩酸、及び水の混合物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
緩衝剤が、凍結乾燥される前に、リン酸塩、クエン酸、及び酢酸塩の緩衝溶液の１つ以上から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
弱いキレート剤が、ＤＴＰＡ、グルコヘプトネート、タートレート、及びメドロネートの１つ以上から選択される、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１１】
抗酸化剤が、ゲンチシン酸、アスコルビン酸、及びパラアミノ安息香酸の１つ以上から選択される、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１２】
可溶化剤が、ゼラチン又はシクロデキストリンあるいはそれらの組み合わせから選択される、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１３】
増量剤が、マンニトール、イノシトール、グルコース、及びラクトースの１つ以上から選択される、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１４】
配位子が、ＥＣＤＧ、ＥＣＤ、ＨＭＰＡＯ、ＭＡＧ３、及びＭＩＢＩ、あるいはそれらのアルカリ金属塩、あるいはそれらのアルカリ土類金属塩のいずれか１つから選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
溶媒が、メタノール、エタノール、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、エーテル、テトラヒドロフラン、及びアセトニトリルの１つ以上から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
溶媒がメタノールである、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
放射性核種が、99mTc、188Re、186Re、153Sm、166Ho、90Sr、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、153Gd、59Fe、52Fe、225Ac、212Bi、45Ti、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、195mPt、191mPt、193mPt、117mSn、103Pd、103mRh、89Zr、177Lu、169Er、44Sc、155Tb、140Nd、140Pr、198Au、103Ru、131Cs、223Ra、224Ra、及び62Znから選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１８】
放射性核種が、99mTc、103Pd、103mRh、195mPt、193mPt、191Ptである、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
放射性核種が99mTcである、請求項１８に記載の製造方法。
【国際調査報告】
2017505783.tif 000014
2017505783.tif 000015
2017505783.tif 000016