(57)【要約】  本発明は、タンパク質バイオマーカーなどの検体成分を迅速に特定及び定量するためのシステム、方法、装置、及びキットを提供する。本発明の多重化免疫アッセイでは、細胞可溶化液などの試料由来のバイオマーカーを捕捉及び保持させるため、複数の捕捉抗体を１つのビーズ又は複数のビーズに固定させる。特定の捕捉抗体を固定させたビーズは、細胞可溶化液から捕捉されたバイオマーカーを特定可能である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーを使用して、サンプルに対し多重化免疫アッセイを実施する方法であって、
（ａ）血液、血漿、又は細胞可溶化液を、ビーズに固定されている複数の捕捉抗体と接触させて、捕捉された複数の検体成分を生成することと（ここで、ビーズは、少なくとも１種の検体成分に特異的である）、
（ｂ）前記捕捉された複数の検体成分を、前記少なくとも１種の検体成分に特異的である少なくとも１種の検出抗体と接触させて、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成することと（ここで、前記少なくとも１種の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーを有する）、
（ｃ）前記検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、前記シグナル増幅対の第２のメンバーと接触させて、増幅されたシグナルを生成することと、
（ｄ）前記シグナル増幅対の前記第１及び第２のメンバーから生成された、前記増幅されたシグナルを検出することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ビーズが、蛍光色素又は検出可能なタグで標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引液（ＦＮＡ）、脳脊髄液、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種の検体成分が、少なくとも１種のシグナル伝達分子、サイトカイン、代謝産物、病理学的分子、又は自己抗体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種の検出抗体が、少なくとも２種の検出抗体であり、
（ｉ）促進部分により標識されており、活性化状態に依存しない複数の抗体と、
（ｉｉ）前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーにより標識されており、活性化状態に依存する複数の抗体と、
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記促進部分が、前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する酸化剤を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記検出抗体が、前記少なくとも１種の検体成分に特異的なシグナル増幅対の第１のメンバーで標識した複数の検出抗体である、検出抗体を１種含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記促進部分が、前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する酸化剤を生成する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記促進部分が、グルコースオキシダーゼである、請求項５又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化剤が、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、請求項６又は８に記載の方法。
【請求項１１】
前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーがペルオキシダーゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナル増幅対の前記第２のメンバーが、チラミド試薬である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記チラミド試薬が、蛍光色素分子により直接的に標識される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記チラミド試薬がビオチン−チラミドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅されたシグナルが、ペルオキシダーゼによりチラミドが酸化されて活性化チラミドが生成されることにより生じる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記活性化チラミドが直接検出される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記活性化チラミドが、前記シグナル検出剤の添加により検出される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記シグナル検出剤が、ストレプトアビジン標識されたフルオロフォアである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記シグナル検出剤が、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと発色剤とを組み合わせたものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記発色剤が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、ヒト疾患の診断検査として使用される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が、代謝疾患、脳及び認知疾患、胃腸疾患、又は癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、前立腺癌、及び胃癌からなる群から選択されるものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記代謝疾患が糖尿病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記脳及び認知疾患がアルツハイマー病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１種のシグナル伝達分子が、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）、ＬＫＢ１、トランスフォーミング増殖因子−β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、ＡＫＴ、アディポネクチン、レプチン、グルコース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４〜２３及び２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１種の自己抗体が、ＧＡＤ６５自己抗体、インスリノーマ抗原２（ＩＡ−２）自己抗体、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、亜鉛トランスポータータンパク質８（ＺｎＴ８）自己抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４〜２３及び２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種の病理学的分子が、タウ、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド、可溶性アミロイド前駆体タンパク質β（ｓＡＰＰβ）、ＶＩＬＩＰ−１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４〜２３及び２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１種のシグナル伝達分子が受容体型チロシンキナーゼである、請求項４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記受容体型チロシンキナーゼが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ−３、ＦＬＫ−２、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ、ＣＳＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種の受容体型チロシンキナーゼが、非受容体型チロシンキナーゼを更に含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅されたシグナルが、反応速度結合パラメータに関連付けられる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ビーズが複数のビーズである、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数のビーズが、各集団のそれぞれが他方と区別可能である少なくとも２種の集団を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ビーズの少なくとも２種の集団のそれぞれが、それぞれ異なる、少なくとも２種の各検体成分に特異的なものである、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]数多くの疾患の診断、予後診断、及び治療領域において、細胞抽出物中のタンパク質、シグナル分子、及びその他の検体成分の測定は重要である。このような疾患の観察及び管理には、タンパク質バイオマーカー類の発現レベル及び活性化レベルの測定が必要とされる。医者に正しい治療法を正しい時間及び正しい投与量で指示させることのできる、迅速で正確な、それでいて費用効率のよい検体成分の測定法が求められている。
【０００２】
[0002]バイオマーカーが特定されたならば、診断試験を使用してその有無を検証し、次に定量又は測定することができる。ある種の例では、臨床アプローチが用いられる。このアプローチでは、医療検査及び／又は治療を行うことができる、患者を治療する場所又は患者を治療する場所付近でアッセイが実施される。例えば、臨床現場としては、病院、患者の自宅、診療所、又は救急対応が求められる場所などが挙げられるがこれらに限定されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
[0003]医学的状態を迅速に診断すること、適切な治療を選択すること、又は臨床での投与量を最適化することに伴う効果は数多くの利点を有する。薬剤、投与量及び治療計画を個別化することは、すなわち、患者が現代医療の恩恵を受ける最良の機会を得ることを意味する。当該技術分野では、臨床サービスを使用して患者の臨床的な効果に関係するバイオマーカーを特定及び測定するための、新しい方法が必要とされている。本発明は、この必要性及びその他の必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]本発明は、フローサイトメトリーを使用する、生物学的な検体成分用の多重免疫アッセイを提供する。ある例では、捕捉抗体は、特定の発光波長を有する蛍光ビーズなどのビーズに担持される。対象とする特定の検体成分を標的とするべく、捕捉抗体が使用される。その後、捕捉した抗体を検出し、検出可能な、捕捉された検体成分を生成するため、第１の検出抗体が使用される。第２の検出抗体は、検出可能な検体成分と接触させるために使用される。増幅されたシグナルを検出することにより、検体成分の濃度及び／又は活性化レベルが測定される。
【０００５】
[0005]本発明の方法を使用すると、シグナル転写タンパク質、サイトカイン、増殖因子、タンパク質、及びその他の検体成分などの細胞産物を測定できる。本明細書に記載の方法及び装置は、１回のアッセイで複数の検体成分を識別するため、典型的には大きさ、蛍光強度の違い、又は発光により識別される、複数のビーズ集団を使用する。検体成分は、捕捉抗体を使用して捕捉される。捕捉された検体成分の量は、タンパク質の第２のエピトープに対する抗体により検出される。感度及び特異性を確実に向上させ、かつ、任意選択的に活性化レベルを測定するため、対象とする検体成分の第３のエピトープに対する第３の抗体を使用する。既知の濃度の検体成分を段階希釈して作成した標準曲線に対し、蛍光シグナルを比較することにより、サンプル中の対象とするタンパク質の濃度及び／又は活性を得ることができる。
【０００６】
[0006]一実施形態では、本発明は、フローサイトメーターを使用してサンプルに対し協調的酵素増強反応（ＣＥＥＲ）による免疫アッセイなどの多重化された免疫アッセイを実施するための、方法を提供し、当該方法は、
（ａ）血漿、血液、又は細胞抽出物細胞可溶化液を、ビーズに固定されている複数の捕捉抗体と接触させて、捕捉された複数の検体成分を生成することと（ここで、ビーズは、少なくとも１種の検体成分に特異的である）、
（ｂ）捕捉された複数の検体成分を、少なくとも１種の検体成分に特異的である少なくとも１種の検出抗体と接触させて、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成することと（ここで、少なくとも１種の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーを有する）、
（ｃ）検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバーと接触させて、増幅されたシグナルを生成することと、
（ｄ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された、増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【０００７】
[0007]いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、疾患の診断検査として使用される。いくつかの態様では、疾患は、代謝疾患、脳若しくは認知障害、胃腸疾患、又は癌である。
【０００８】
[0008]いくつかの態様では、代謝疾患は、前糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、その他の形態の糖尿病、及び糖尿病に関係する疾患を含む、糖尿病である。
【０００９】
[0009]いくつかの態様では、脳又は認知障害は、アルツハイマー病である。
【００１０】
[0010]いくつかの例では、癌は、乳癌、結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、前立腺癌、又は胃癌である。
【００１１】
[0011]いくつかの実施形態では、少なくとも１種の検体成分は、少なくとも１種のシグナル伝達分子、病的なタンパク質凝集体、又は自己抗体を含む。
【００１２】
[0012]本発明のこれらの及びその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより当業者にはより明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】[0013]本発明の一実施形態を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．序論
[0014]本発明は、タンパク質バイオマーカーなどの検体成分を迅速に特定及び定量するためのシステム、方法、装置、及びキットを提供する。本発明の多重化免疫アッセイでは、細胞可溶化液などの試料由来のバイオマーカーを捕捉及び保持させるため、複数の捕捉抗体を１つのビーズ又は複数のビーズに固定させる。特定の捕捉抗体を固定させたビーズは、細胞可溶化液から捕捉されたバイオマーカーを特定可能である。
【００１５】
[0015]本発明の使用により、代謝疾患、脳若しくは認知疾患、胃腸疾患、又は癌などの医学的状態の迅速かつ正確な診断、適切な治療法の特定、並びに治療量の最適化が可能になり、患者及び医療従事者に大きな利益がもたらされる。
【００１６】
[0016]有利な点として、本発明のシステム、方法、及びキットは、リアルタイム又はほとんどリアルタイムで診断検査が実施され得る臨床で提供可能であり、提供される検査は、本発明のシステムを使用していない同様の検査よりも効率的に実施され、診断及び予後検査を促進する。臨床（ＰＯＣ）診断検査は、診療所又は病院又はどこであろうと医療ケアが提供される場所などの、患者を治療する場所又は患者を治療する場所付近での検査である。アッセイ結果を得るまでの所用時間が短いことにより、リアルタイムのエビデンスベースの判断、患者の緊急治療、不必要な検査を最小限に抑える、副作用を最小限に抑える、及び著しい費用効果などの数多くの利点が提供される。
【００１７】
[0017]ある種の例では、本発明のシステム、方法、装置、方法、及びキットにより、中央検査室の外部、患者のすぐ近くでの臨床検査が実施可能になる。ある種の態様では、方法は、サンプル、すなわち、全血、血漿、血清、細針吸引液（ＦＮＡ）、又は脳脊髄液（ＣＳＦ）と、レディ・トゥ・ユーズ（ready-to-use）試薬と、使い捨てアッセイ試薬とを使用する。ある種の態様では、本発明の装置は、携帯式であり、かつ各個体サンプルの量（quantities）及び総量（amount）を使用する。
【００１８】
[0018]本発明の方法及び装置は、フローサイトメトリーを使用して、サイトカイン、ケモカイン、シグナル分子、増殖因子、及びリン酸化シグナルタンパク質などといった多様な可溶性及び細胞内タンパク質を測定するために使用できる。ある例では、少量（例えば、２５〜１００μＬ）のサンプルの多重化分析を使用して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は更には１２以上の検体成分を分析する。
ＩＩ．定義
【００１９】
[0019]本明細書で使用するとき、以下の用語は、別途記載のない限りそれらの用語による意味を有する。
【００２０】
[0020]用語「検体成分」は、対象とする任意の分子を包含し、典型的には、有無、量、及び／又はアイデンティティが特定される、ポリペプチドなどの高分子を包含する。ある種の例では、検体成分は、固体腫瘍の循環細胞又は脳脊髄液、末梢血、若しくは血清の細胞成分である。好ましくは、検体成分は、シグナル伝達分子、病理学的分子、又は自己抗体である。
【００２１】
[0021]用語「シグナル伝達分子」又は「シグナル伝達因子」は、細胞が、細胞外又は細胞内シグナルを変換する、すなわち典型的には、細胞内部の一連の生化学的反応に関与する応答を誘導することによりプロセスを実施するタンパク質及びその他の分子を包含する。シグナル伝達分子の例としては、ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ−４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ−１／ＦＬＴ−１、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−３／ＦＬＴ−４、ＦＬＴ−３／ＦＬＫ−２、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ  １〜４、ＨＧＦＲ１〜２、ＣＣＫ４、ＴＲＫ  Ａ〜Ｃ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１〜２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ  １〜２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１〜２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１〜３、ＲＴＫ１０６などの受容体型チロシンキナーゼ、及びｐ９５ＥｒｂＢ２などの受容体型チロシンキナーゼの切断型；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、及びＬＩＭＫなどの非受容体型チロシンキナーゼ；ＡＫＴ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、ＰＩ３Ｋ、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、ｐ５３、サイクリンＤ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ＰＤＫ、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、ＲＯＣＫ、ＩＰ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＰＴＥＮ、ＲＳＫ１〜３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７、及びパキシリンなどのチロシンキナーゼシグナル伝達カスケード要素；エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、ミネラロコルチコイド受容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体及びオーファン受容体などの核ホルモン受容体；それぞれ、ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−１（ＡＩＢ１）及び核受容体補助因子１（ＮＣＣＯＲ）などの、核受容体活性化補助因子及びリプレッサー；並びにそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。シグナル伝達分子の更なる例としては、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）、ＬＫＢ１、トランスフォーミング増殖因子−β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、ＡＫＴ、アディポネクチン、レプチン、グルコース、グリコーゲン、ＡＭＰ、及びＡＴＰが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
[0022]用語「病理学的分子」は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、及び同様の疾患を含む神経変性疾患などの疾患又は障害の病理に関係するタンパク質及びその他の分子を包含する。
【００２３】
[0023]用語「捕捉抗体」は、細胞抽出物などのサンプル中の、対象とする１種以上の検体成分に特異的な（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）、固定化された抗体を包含することを意図する。一実施形態では、捕捉抗体は、アレイ装置において、ビーズ（例えば、固体支持体）上に固定される。固体支持体上に何らかの様々なシグナル伝達分子を固定するのに好適な捕捉抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓ．）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、及びＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
【００２４】
[0024]本明細書で使用するとき、用語「検出抗体」は、所望により、サンプル中の対象とする１種以上の検体成分に特異的な（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）検出可能な標識を含む抗体を包含する。この用語は、対象とする１種以上の検体成分に特異的な抗体も包含し、この抗体は、検出可能な標識を含む別種の抗体により結合され得る。検出可能な標識の例としては、ビオチン／ストレプトアビジン標識、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）標識、化学反応性標識、蛍光標識、酵素標識、放射性標識、及びこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。様々なシグナル伝達分子のうちのいずれかの活性化状態及び／又は総量を検出するのに好適な検出抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓ．）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、ａｎｄ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。ある種の態様では、検出抗体は未標識である。
【００２５】
[0025]用語「活性化状態に依存する抗体」は、サンプル中の対象とする１種以上の検体成分の特定の活性化状態に特異的な（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）検出抗体を包含する。好ましい実施形態では、活性化状態に依存する抗体は、１種以上のシグナル伝達分子などの１種以上の検体成分のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体状態を検出する。いくつかの実施形態では、活性化状態に依存する抗体を使用して、受容体型チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーのメンバーのリン酸化、及び／又はＥＧＦＲファミリーメンバー同士のヘテロ二量体形成の検出を行う。活性化状態に依存する抗体による検出に好適な活性化状態（括弧内に掲載）の非限定例としては、ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ９５：切断型（Ｔｒ）−ＥｒｂＢ２、ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５：Ｔｒ−ｐ−ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ＥＲ（ｐ−ＥＲ（Ｓ１１８、Ｓ１６７）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＫＩＴ（ｐ−ＫＩＴ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲＩ（ｐ−ＨＧＦＲＩ）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲａ（ｐ−ＰＤＧＦＲａ）；ＰＤＧＦＲＰ（ｐ−ＰＤＧＦＲＰ）；ＶＥＧＦＲＩ（ｐ−ＶＥＧＦＲＩ、ＶＥＧＦＲＩ：ＰＬＣｇ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬＣｙ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：ヘパリン硫酸、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；Ｔｉｅ１（ｐ−Ｔｉｅ１）；Ｔｉｅ２（ｐ−Ｔｉｅ２）；ＥｐｈＡ（ｐ−ＥｐｈＡ）；ＥｐｈＢ（ｐ−ＥｐｈＢ）；ＮＦＫＢ及び／又はＩＫＢ（ｐ−ＩＫ（Ｓ３２）、ｐ−ＮＦＫＢ（Ｓ５３６）、ｐ−Ｐ６５：ＩＫＢａ）；Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ（Ｔ３０８、Ｓ４７３））；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｂａｄ（ｐ−Ｂａｄ（Ｓ１１２、Ｓ１３６）、Ｂａｄ：１４−３−３）；ｍＴｏｒ（ｐ−ｍＴｏｒ（Ｓ２４４８））；ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ２２９、Ｔ３８９））；Ｍｅｋ（ｐ−Ｍｅｋ（Ｓ２１７、Ｓ２２１））；Ｅｒｋ（ｐ−Ｅｒｋ（Ｔ２０２、Ｙ２０４））；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１（Ｔ３５７、Ｓ３６３））；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ（Ｔ１８３、Ｙ１８５））；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８（Ｔ１８０、Ｙ１８２））；Ｓｔａｔ３（ｐ−Ｓｔａｔ−３（Ｙ７０５、Ｓ７２７））；Ｆａｋ（ｐ−Ｆａｋ（Ｙ５７６））；Ｒｂ（ｐ−Ｒｂ（Ｓ２４９、Ｔ２５２、Ｓ７８０））；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３（５３９２、Ｓ２０））；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ（Ｓ１３３））；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ（Ｓ６３））；ｃＳｒｃ（ｐ−ｃＳｒｃ（Ｙ４１６））；パキシリン（ｐ−パキシリン（Ｙ１１８））；ＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ（Ｔ１７２、Ｔ１８３）；並びにｔａｕ（ｐ−ｔａｕ（Ｙ１８、Ｙ２９、Ｓ４６、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｔ２０５、Ｔ２１２、Ｓ２１４、Ｔ２１７、Ｔ２３１、Ｓ２３５、Ｓ２６２、Ｓ３５６、Ｓ３９６、Ｓ４００、Ｓ４０４、Ｓ４１２、Ｓ４２２、Ｓ４７０、Ｓ４９２、Ｓ４９８、Ｓ５１５、Ｓ５１６、Ｓ５１９、Ｔ５３４、Ｔ５４８、Ｓ５５２、Ｓ６２２、Ｓ６４１、Ｓ７１３、Ｓ７２１、Ｓ７２６、Ｔ７３９など）が挙げられる。
【００２６】
[0026]用語「活性化状態に依存しない抗体」は、活性化状態を問わずサンプル中の対象とする１種以上の検体成分に特異的な（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）検出抗体を包含する。例えば、活性化状態に依存しない抗体は、１種以上のシグナル伝達分子などの１種以上の検体成分のリン酸化及び非リン酸化形態の両方を検出することができる。
【００２７】
[0027]用語「インキュベートする」は、「接触させる」及び「曝露させる」と同意語であり、かつ別途記載のない限り何らかの具体的な時間又は温度を暗示するものではない。
【００２８】
[0028]本明細書で使用するとき、用語「希釈系列」は、濃度を漸減させた一連の特定のサンプル（例えば、細胞可溶化液）又は試薬（例えば、抗体）を包含することを意図する。希釈系列は、典型的には、初期濃度の一定量のサンプル又は試薬を、希釈剤（例えば、希釈緩衝液）と混合して、低濃度のサンプル又は試薬を生成するプロセスを、所望数の段階希釈を得るのに十分な回数だけ繰り返すことにより生成される。サンプル又は試薬を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、５００、又は１０００倍に段階希釈することで、サンプル又は試薬の濃度が少なくとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、１／１２、１／１３、１／１４、１／１５、１／１６、１／１７、１／１８、１／１９、１／２０、１／２５、１／３０、１／３５、１／４０、１／４５、又は１／５０に低下している希釈系列を生成することができる。例えば、初期濃度１ｍｇ／ｍＬの捕捉抗体試薬を二倍に段階希釈したものを含む希釈系列は、ある量の初期濃度の捕捉抗体を、同量の希釈緩衝液と混合して、濃度０．５ｍｇ／ｍＬの捕捉抗体を生成し、このプロセスを繰り返して０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、０．０３２５ｍｇ／ｍＬなどの濃度の捕捉抗体を得ることにより生成できる。
【００２９】
[0029]本明細書で使用するとき、用語「優れたダイナミックレンジ」は、わずか１個の細胞又は数千個もの細胞において特異的な検体成分を検出するアッセイ性能を指す。例えば、本明細書に記載の免疫アッセイは、捕捉抗体の濃度希釈系列を使用して、１〜１０，０００個（例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、又は１０，０００個）の細胞において、対象とする特定のシグナル伝達分子を有利に検出することから、優れたダイナミックレンジを保有する。
【００３０】
[0030]本明細書で使用するとき、用語「サンプル」は、患者から得られる何らかの生体標本を包含する。サンプルとしては、全血、血漿、血清、赤血球細胞、白血球細胞（例えば、末梢血単核細胞）、脳脊髄液、乳管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液（例えば、リンパ管の播種性腫瘍細胞）、骨髄穿刺液、唾液、尿、排泄物（すなわち、糞便）、痰、気管支洗浄液、涙、細針吸引液（例えば、乳輪周囲の無作為な細針吸引により採取）、何らかのその他の体液、腫瘍の細胞診（例えば、針生検）などの組織サンプル（例えば、腫瘍組織）、又はリンパ管（例えば、センチネルリンパ節生検）、及びこれらの細胞抽出物が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血、又は血漿、血清、又は細胞ペレットなどの分画成分である。その他の実施形態では、サンプルは、当該技術分野で既知の何らかの手法により、全血又はそれらの細胞画分由来の固形腫瘍循環細胞を単離することにより得られる。その他の実施形態では、サンプルは、例えば、胸部固形腫瘍由来のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルである。
【００３１】
[0031]「生検」は、診断又は予後評価のために組織サンプルを切除するプロセス、及び組織標本そのものを指す。本発明の方法及び組成物には、当該技術分野で既知の任意の生検法を使用することができる。使用する生検法は、概して、数ある因子の中でも、評価する組織、並びに腫瘍の大きさ及び種類（すなわち、固体又は懸濁（すなわち、血液又は腹水））に応じ変更されるであろう。代表的な生検法としては、切除生検、切開生検、針生検（例えば、針生検、細針吸引生検など）、外科生検、及び骨髄生検が挙げられる。生検法は、例えば、ハリソン内科学、Ｋａｓｐｅｒら編、第１６版、２００５年、第７０章、パートＶまでに議論されている。当業者であれば、所定の組織サンプルにおいて対象とする細胞を特定することのできる生検法を認識されるであろう。
【００３２】
[0032]用語「対象」又は「患者」又は「個体」は、典型的には、ヒトを包含するものの、その他の動物、例えば、その他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタ、及び同様の動物も包含され得る。
【００３３】
[0033]本発明は、臨床現場、すなわち検査室ベースの臨床化学検査が行われる場所で有用である。本明細書で使用するとき、臨床（ＰＯＣ）現場は、病院検査、ベッドサイド検査、緊急治療室、診療所、外来診療所、血液バンク、手術室、家庭、実験室又は養護施設での検査、遠隔検査、などの場所を意味する。サンプル、及び、臨床検査と同じ場所で行われる試験若しくはアッセイの結果が収集される、分析システム又は装置において実施される場合、特に有用である。しかしながら、本発明は、臨床検査施設以外の施設でも使用できることは理解されたい。
【００３４】
[0034]本明細書において、用語「代謝疾患」、「代謝障害」、及び「代謝症候群」は互換的に使用され、正常な代謝（例えば、代謝のバランス）に障害が生じることにより引き起こされる状態を指す。代謝は、食物を細胞レベルでエネルギーに変換するプロセスである。典型的には、代謝疾患は、血圧上昇、高血糖、腹部の過剰な体脂肪、インスリン抵抗性、耐糖能障害、及び／又は異常なコレステロール値により特徴づけられる。代謝疾患／障害の非限定例としては、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病前症、糖尿病の関連疾患、高インスリン血症、リソソーム蓄積症、ゴーシェ病、耐糖能障害、空腹時高血糖、インスリン抵抗性、及び脂質異常症が挙げられる。
【００３５】
[0035]用語「脳若しくは認知疾患」又は「脳若しくは認知障害」は主に、学習、記憶、知覚及び問題解決に影響を及ぼす神経疾患／障害及び／又は心の健康に関係する疾患／障害を指す。この用語には、せん妄、重度及び軽度の認知神経科学的障害、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、及びヒトの心の働きを低下させ、日常生活に悪影響を及ぼすことを特徴とするすべての既知の神経疾患／障害が包含される。
【００３６】
[0036]用語「癌」は、異常細胞の非制御的増殖を特徴とする疾患クラスのメンバーを包含することを意図する。この用語は、悪性、良性、軟組織、又は固体であることを特徴とするすべての既知の癌及び腫瘍性疾患、並びに遊走前及び遊走後の癌を含むすべてのステージ及び悪性度の癌を包含する。異なる種類の癌の例としては、乳癌；肺癌（例えば、非小細胞肺癌）；結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、及び胃癌；食道癌；胆嚢癌；肝癌；膵癌；虫垂癌；卵巣癌；腎臓癌（例えば、腎細胞癌）；中枢神経系の癌；皮膚癌；リンパ腫；絨毛癌；頭頸部癌；骨肉腫；及び血液癌が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で使用するとき、「腫瘍」は、１種以上の癌細胞を含む。
ＩＩＩ．実施形態
【００３７】
[0037]一実施形態では、本発明は、フローサイトメトリーを使用してサンプルに対し協調的酵素増強反応（ＣＥＥＲ）による免疫アッセイなどの多重化された免疫アッセイを実施するための、方法を提供し、当該方法は、
（ａ）血漿、血液、又は細胞可溶化液を、ビーズに固定されている複数の捕捉抗体と接触させて、捕捉された複数の検体成分を生成することと（ここで、ビーズは、少なくとも１種の検体成分に特異的である）、
（ｂ）捕捉された複数の検体成分を、少なくとも１種の検体成分に特異的である少なくとも１種の検出抗体と接触させて、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成することと（ここで、少なくとも１種の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーを有する）、
（ｃ）検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバーと接触させて、増幅されたシグナルを生成することと、
（ｄ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された、増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００３８】
[0038]ある例では、ビーズは、蛍光色素若しくは検出可能なタグにより標識され、又はそれらに組み込まれる。
【００３９】
[0039]いくつかの例では、サンプルは、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引液（ＦＮＡ）、脳脊髄液（ＣＳＦ）、又はこれらの組み合わせである。
【００４０】
[0040]ある例では、少なくとも１種の検体成分は、少なくとも１種のシグナル伝達分子、サイトカイン、代謝産物、病理学的な分子、又は自己抗体を含む。
【００４１】
[0041]別の実施形態では、検出抗体は、少なくとも２種の検出抗体、すなわち、
（ｉ）促進部分により標識されており、活性化状態に依存しない複数の抗体と、
（ｉｉ）シグナル増幅対の第１のメンバーにより標識されており、活性化状態に依存する複数の抗体と、を含む。
【００４２】
[0042]いくつかの態様では、促進部分は、シグナル増幅対の第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する酸化剤を生成する。ある種の例では、促進部分はグルコースオキシダーゼである。ある種の態様では、酸化剤は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。いくつかの態様では、シグナル増幅対の第１のメンバーはペルオキシダーゼである。ある種の例では、ペルオキシダーゼは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。いくつかの例では、チラミド試薬は、蛍光色素分子で直接標識されている。
【００４３】
[0043]いくつかの態様では、シグナル増幅対の第２のメンバーはチラミド製剤である。ある種の例では、チラミド剤はビオチン−チラミドである。
【００４４】
[0044]いくつかの実施形態では、増幅されたシグナルは、ビオチン−チラミドがペルオキシダーゼにより酸化されることにより生成され、活性化チラミドが生成される。いくつかの態様では、活性化チラミドが直接検出される。他の態様では、活性化チラミドは、シグナル検出剤の添加により検出される。いくつかの例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識された蛍光色素分子である。他の例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと、発色剤とを組み合わせたものである。いくつかの実施形態では、発色剤は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。
【００４５】
[0045]代替的な実施形態では、少なくとも１種の検出抗体は、少なくとも１種の検体成分に特異的なシグナル増幅対の第１のメンバーで標識した複数の検出抗体を含む。
【００４６】
[0046]いくつかの態様では、複数の検出抗体は、活性状態に依存する抗体である。いくつかの態様では、複数の検出抗体は、活性化状態に依存しない抗体である。
【００４７】
[0047]いくつかの態様では、複数の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバー、すなわちペルオキシダーゼにより標識されている。ある種の例では、ペルオキシダーゼは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。
【００４８】
[0048]グルコースオキシダーゼなどの促進部分は、抗体に固定させていない免疫アッセイに導入することができる。すなわち、当該促進部分をデキストランなどの基質に固定させることができる。複数のＧＯ部分をデキストランに固定させることができる。グルコースの存在下で、グルコースオキシダーゼは、シグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、ＨＲＰ）と反応する酸化剤を生じる。ある種の態様では、酸化剤は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。
【００４９】
[0049]いくつかの態様では、シグナル増幅対の第２のメンバーはチラミド製剤である。ある種の例では、チラミド剤はビオチン−チラミドである。
【００５０】
[0050]いくつかの実施形態では、増幅されたシグナルは、ビオチン−チラミドがペルオキシダーゼにより酸化されることにより生成され、活性化チラミドが生成される。いくつかの態様では、活性化チラミドが直接検出される。他の態様では、活性化チラミドは、シグナル検出剤の添加により検出される。いくつかの例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識された蛍光色素分子である。他の例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと、発色剤とを組み合わせたものである。いくつかの実施形態では、発色剤は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。
【００５１】
[0051]いくつかの態様では、方法は、ヒト疾患の診断検査として使用される。疾患としては、代謝疾患、脳及び認知疾患、胃腸疾患、又は癌が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５２】
[0052]癌としては、乳癌、結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、前立腺癌、又は胃癌が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
[0053]いくつかの態様では、代謝疾患は糖尿病である。
【００５４】
[0054]いくつかの態様では、脳又は認知疾患は、アルツハイマー病である。
【００５５】
[0055]いくつかの態様では、増幅されたシグナルは、反応速度結合パラメータに関連付けられる。
【００５６】
[0056]いくつかの態様では、ビーズは複数種のビーズである。例えば、複数種のビーズは、各集団のそれぞれが他方と区別可能である少なくとも２つのビーズ集団を有し得る。更に、ある種の態様では、少なくとも２つのビーズ集団のそれぞれは、それぞれ異なる、少なくとも２種の各検体成分に特異的なものである。
Ａ．検体成分
【００５７】
[0057]患者のサンプル中の、対象とする検体成分の有無、発現（例えば、総量）レベル、及び／又は活性（例えば、リン酸化）レベルは、本発明のシステム及び方法を使用して測定可能である。次に、患者が代謝疾患、胃腸疾患、脳及び認知疾患、癌、異常調節、又は機能障害を有しているのかを診断するために、この測定値を使用できる。
【００５８】
[0058]いくつかの例では、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３．ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ−３、ＦＬＫ−２、ＰＤＧＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ、ＣＳＦ−ＩＲ、ｃＭＥＴ、及びこれらの組み合わせなどのシグナル伝達分子のうちの１種以上の有無、発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性（例えば、リン酸化）レベルが、患者の癌、疾患、異常調節、又は機能障害を診断するのに使用される。
【００５９】
[0059]細胞抽出物における発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性（例えば、リン酸化）レベルについて調査することのできるシグナル伝達分子などの検体成分の非限定例としては、受容体型チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード構成要素、核内ホルモン受容体、核内受容体コアクチベーター、核内受容体リプレッサー、リガンド、受容体、シグナル伝達カスケード構成要素、及びこれらの組み合わせが挙げられる。検体成分の更なる例としては、自己抗体、神経変性分子、及び病理学的分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
[0060]一実施形態では、本発明の方法は、細胞抽出物中の、以下の検体成分：ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３．ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ−３、ＦＬＫ−２、ＰＤＧＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ、ＣＳＦ−ＩＲ、ｃＭＥＴ、及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１種以上の有無、発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性レベル（例えば、リン酸化レベル又は複合体形成）を測定することを含む。
【００６１】
[0061]他の例では、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）、ＬＫＢ１、トランスフォーミング増殖因子−β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、ＡＫＴ、アディポネクチン、レプチン、グルコース、その他のＡＭＰ修飾因子、及びこれらの組み合わせなどのシグナル伝達分子のうちの１種以上の有無、発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性（例えば、リン酸化）を使用して、患者の糖尿病を診断する。
【００６２】
[0062]他の例では、ＧＡＤ６５自己抗体、インスリノーマ抗原２（ＩＡ−２）自己抗体、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、亜鉛トランスポータータンパク質８（ＺｎＴ８）自己抗体、及びこれらの組み合わせなどの１種以上の自己抗体の有無及び／又は発現（例えば、総量）レベルを使用して、患者の糖尿病を診断する。
【００６３】
[0063]グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡＤ６５）は、神経細胞の酵素であり、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の合成に関与する。これまでに、ＧＡＤ６５自己抗体は、１型糖尿病に関係する自己免疫疾患のバイオマーカーとして使用できることが示されている（Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３３５：１３５７−６０（１９９０））。更に、１型糖尿病の予想には、ＧＡＤ６５、ＩＡ−２、ＩＡＡ、ＺｎＴ８自己抗体が提案されている（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｅｗｓ，３６（１０），Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１０；Ｂｉｎｇｌｅｙ，ＰＪ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｎｇｌｅｙ，ＰＪ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，９５（１）：２５−３３（２０１０））。
【００６４】
[0064]他の例では、タウ、アミロイドベータ（Ａβ）タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド（例えば、β−アミロイドタンパク質２８、β−アミロイドタンパク質４０、β−アミロイドタンパク質４２、β−アミロイドタンパク質４３、可溶性アミロイド前駆体タンパク質ベータ（ｓＡＰＰβ）、及び同様のタンパク質等）、何らかのＡβタンパク質断片、ＶＩＬＩＰ−１、及びこれらの組み合わせなどの１種以上の病理学的分子の有無、発現（例えば、総量）レベル及び／又は活性（例えば、リン酸化）レベルを使用して、患者のアルツハイマー病、異常調節又は機能障害を診断する。
【００６５】
[0065]更に他の例では、サンプル中の少なくとも１種のサイトカイン又は複数のサイトカインの有無又はレベルは、本発明に特に有用である。本明細書で使用するとき、用語「サイトカイン」は、免疫細胞により分泌され、免疫システムの機能範囲を制御する、様々なポリペプチド又はタンパク質を包含し、かつケモカインなどの低分子量のサイトカインも包含する。用語「サイトカイン」は、脂肪細胞により分泌され、例えば、体重の制御、血球新生、血管新生、創傷治癒、インスリン抵抗性、免疫応答、及び炎症応答において機能するサイトカイン群を含むアディポサイトカインも包含する。サイトカインは、疾患、調節不全、又は機能不全のバイオマーカーとして使用することもできる。
【００６６】
[0066]ある種の態様では、サンプル中の、ＴＮＦ−α、ＴＮＦに関連するアポトーシスの弱い誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、破骨細胞形成抑制因子（ＯＰＧ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、及びＩＬ−２７が挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも１種のサイトカインの有無及びレベルが、評価される。ある種の他の態様では、サンプル中の、例えば、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯ２、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯ３、ＣＸＣＬ４／ＰＦ−４、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１３／ＢＣＡ−１、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７／ＤＭＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−５、ＣＣＬ１６／ＬＥＣ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＭＩＰ−４、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＣＣＬ２１／ＳＬＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ１、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ２８／ＭＥＣ、ＣＬ１、ＣＬ２、及びＣＸ３ＣＬ１などの少なくとも１種のケモカインの有無又はレベルが評価される。
【００６７】
[0067]ある種の更なる態様では、サンプル中の、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１（ＰＡＩ−１）の活性又は総量、ビスファチン、及びレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）が挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも１種のアディポサイトカインの有無又はレベルが評価される。
【００６８】
[0068]他の例では、本発明の方法及びシステムを使用して、サンプル中の１種以上の増殖因子の有無又はレベルを評価できる。本明細書で使用するとき、用語「増殖因子」には、細胞の増殖及び／又は細胞の分化を刺激することのできる様々なペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が包含される。
【００６９】
[0069]ある種の態様では、サンプル中の、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ；ＳＥＲＰＩＮＦ１としても既知）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ；シュワン腫由来増殖因子（ＳＤＧＦ）としても既知）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ１−ＢＭＰ１５）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、β−神経増殖因子（β−ＮＧＦ）、神経栄養因子（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）など）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）が挙げられるがこれらに限定されない少なくとも１種の増殖因子の有無又はレベルが評価される。一態様では、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＥＤＦ、アンフィレギュリン（ＳＤＧＦ）、及び／又はＢＤＮＦの有無又はレベルが評価される。
【００７０】
[0070]更に、多様な反応速度結合パラメータを評価できる。例えば、かかるパラメータとしては、「結合反応速度」パラメータを挙げることができる（例えば、会合速度、ｋｏｎ；解離速度、ｋｏｆｆ；及び親和定数、Ｋａ）。これらのパラメータを使用して、例えば、受容体−リガンド相互作用、酵素−基質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、タンパク質−抗体相互作用、及びタンパク質−タンパク質相互作用などの、直接的な分子間相互作用を確認及び測定することができる。
【００７１】
[0071]特定の実施形態では、本発明は、多重アッセイにおいて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の検体成分の有無、発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性レベル（例えば、リン酸化レベル又は複合体形成）を測定することを含む。
【００７２】
[0072]ある種の実施形態では、本発明は、細胞抽出物中で、１種以上（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、又は５０以上）の更なる検体成分の発現レベル（例えば、総量）及び／又は活性レベル（例えば、リン酸化レベル又は複合体形成）を測定することを更に含む。いくつかの実施形態では、１種以上（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、又は５０以上）の追加の検体成分は、受容体型チロシンキナーゼ、非受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード構成要素、核内ホルモン受容体、核内受容体コアクチベーター、核内受容体リプレッサー、リガンド、受容体、シグナル伝達カスケード構成要素；１種以上の神経変性タンパク質；１種以上の病的なタンパク質凝集体；及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上のシグナル伝達分子を含む。
Ｂ．ビーズ／粒子
【００７３】
[0073]ある例では、本発明は、蛍光マイクロビーズなどの１種以上のビーズ集団を提供する。例えば、ある集団は蛍光染料を含むマイクロビーズ集団とし、別のマイクロビーズ集団はオーバーラップする又はオーバーラップしない蛍光染料を含むものとしてもよい。本明細書で使用するとき、用語「マイクロビーズ」、「ビーズ」、又は「粒子」は、フローサイトメーターなどの蛍光装置による測定に適した、実質上任意の形状を有する、任意の固体粒子を含むものとする。本明細書で使用するとき、「蛍光染料」により、所定の波長の電磁放射線により励起され、別の波長の光子を放出し得る染料、分子、複合体、又は粒子を含むものとする。蛍光染料をビーズに組み込むこともできる。
【００７４】
[0074]用語「蛍光染料」、「蛍光プローブ」、「蛍光分子」、「蛍光色素分子」、「蛍光色素」、「蛍光ナノ結晶」は、本明細書において蛍光染料を挙げる際に互換的に使用される。本明細書で使用するとき、「オーバーラップ」は、任意の所定の波長の光により励起されたときに、第１の蛍光染料が、第２の蛍光染料により放出されるものと同じ波長を有する光子をある程度放出することを意味する。非オーバーラップ染料は、第２の蛍光染料により放出されるものとは異なる波長の光子をある程度放出する。
【００７５】
[0075]多くの種類のビーズ及び染料が本発明への使用に適する。本発明のいくつかの実施形態では、マイクロビーズは商業的供給元から入手することができ、例えば、商業的供給元としては、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ（９０２５  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｒｉｖｅ、Ｆｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｄ、４６０３８−２８８６）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（５７９１  Ｖａｎ  Ａｌｌｅｎ  Ｗａｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ、９２００８）；Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｏｕｓｅ、Ｓｔｏｃｋ  Ｗｏｏｄ  Ｒｅｄｄｉｔｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ  Ｂ９６  ６ＳＴ、ＵＫ）；Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．（２７８４５  Ｉｒｍａ  Ｌｅｅ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｕｎｉｔ  １０１、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、Ｉｌｌ．６００４５）；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．（４００  Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｏａｄ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｐａ．１８９７６）；ＢＤ（１  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．、０７４１７）；ａｎｄ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、Ｃａｌｉｆが挙げられる。当業者であれば、本発明に適した他のビーズもご存知であろう。
【００７６】
[0076]ある種の好ましい実施形態では、多重検体成分は、同じサンプルから分析される。多重化は、入手可能なサンプル量がごく少量であるときに、分析可能なタンパク質数を最大化するのに特に有用である。例えば、ある例では、検体成分のうち１種以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は更には１２種以上が、少量（例えば、２５〜１００μＬ）のサンプルを使用する本発明の多重化分析を用い分析される。ある例では、ピコグラム量のタンパク質が、本発明の多重アッセイにおいて測定される。
【００７７】
[0077]ある例では、アレイのある集団におけるそれぞれの捕捉ビーズは、固有の蛍光強度又は固有の蛍光染料の発光を有し、かつ単一の検体成分に特異的な捕捉抗体により被覆される。異なるビーズの組み合わせをサンプル又は標準と混合する。次に、捕捉された検体成分を有するサンプルを、検体成分に特異的な少なくとも１種の検出抗体、又は少なくとも２種の検出抗体とインキュベートする。ある例では、検出抗体は、
（ｉ）促進部分により標識されており、活性化状態に依存しない複数の抗体と、
（ｉｉ）シグナル増幅対の第１のメンバーにより標識されており、活性化状態に依存する複数の抗体と、を含む。
【００７８】
[0078]いくつかの態様では、促進部分は、シグナル増幅対の第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する酸化剤を生成する。ある種の例では、促進部分はグルコースオキシダーゼである。ある種の態様では、酸化剤は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である。いくつかの態様では、シグナル増幅対の第１のメンバーはペルオキシダーゼである。ある種の例では、ペルオキシダーゼは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。
【００７９】
[0079]いくつかの態様では、シグナル増幅対の第２のメンバーはチラミド製剤である。ある種の例では、チラミド剤はビオチン−チラミドである。
【００８０】
[0080]いくつかの実施形態では、増幅されたシグナルは、ビオチン−チラミドがペルオキシダーゼにより酸化されることにより生成され、活性化チラミドが生成される。いくつかの態様では、活性化チラミドが直接検出される。他の態様では、活性化チラミドは、シグナル検出剤の添加により検出される。いくつかの例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識された蛍光色素分子である。他の例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと、発色剤とを組み合わせたものである。いくつかの実施形態では、発色剤は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。
【００８１】
[0081]上記のとおり、代替的な実施形態では、検出抗体は、少なくとも１種の検出抗体を含む。少なくとも１種の検出抗体は、少なくとも１種の検体成分に特異的なシグナル増幅対の第１のメンバーで（１種の）標識をした複数の検出抗体であり得る。
【００８２】
[0082]いくつかの態様では、複数の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバー、すなわちペルオキシダーゼにより標識されている。グルコースオキシダーゼなどの促進部分は、抗体に固定させていない免疫アッセイに導入することができる。すなわち、当該促進部分を、デキストランなどの基質に固定させることができる。ある例では、複数のＧＯ部分を固定させることができる。グルコースの存在下で、グルコースオキシダーゼは、シグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、ＨＲＰ）と反応する酸化剤を生じる。
【００８３】
[0083]いくつかの態様では、シグナル増幅対の第２のメンバーはチラミド製剤である。ある種の例では、チラミド剤はビオチン−チラミドである。増幅されたシグナルは、ビオチン−チラミドをペルオキシダーゼで酸化して活性化チラミドを生成することにより生じ得る。いくつかの態様では、活性化チラミドが直接検出される。他の態様では、活性化チラミドは、シグナル検出剤の添加により検出される。いくつかの例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識された蛍光色素分子である。他の例では、シグナル検出剤は、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと、発色剤とを組み合わせたものである。いくつかの実施形態では、発色剤は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。
【００８４】
[0084]アレイ分析ソフトウェアは、各ビーズ集団のそれぞれに対しゲーティングし、アレイにおける各検体成分について、蛍光色素分子の中央蛍光強度の測定又は識別を行う。
【００８５】
[0085]蛍光色素分子は、「小分子」蛍光色素、又は「タンパク質性蛍光色素（例えば、緑色蛍光タンパク質及びそれらのすべての変異体）のいずれかであってよい。いくつかの実施形態では、蛍光染料は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０を含むＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅであり得る。
【００８６】
[0086]本明細書に記載の多重免疫アッセイ法は、多様な市販の装置で実施することができる。多重ビーズアッセイは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｄａｋｏ−Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｄｉａｓｏｒｉｎ、Ｐａｒｔｅｃ、又はＬｕｍｉｎｅｘ  ｓｙｓｔｅｍｓの臨床的サイトメーターで実施することができる。
Ｃ．手術時の近接アッセイ
【００８７】
[0087]いくつかの実施形態では、循環細胞などといった細胞の細胞抽出物中の、対象とする活性化状態の特定の検体成分（例えば、シグナル伝達分子、例えば、ＡＭＰＫ修飾因子、又は病理学的分子、例えば、タウ、Ａβペプチド、など）を検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを備えた、フローサイトメーターを使用した多重ハイスループット近接（すなわち、３抗体）アッセイである。非限定例として、近接アッセイにおいて使用される３種の抗体は、（１）検体成分に特異的な捕捉抗体；（２）活性化形態の検体成分に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態に依存する抗体）；及び（３）検体成分の総量を検出する検出抗体（すなわち、活性状態に依存しない抗体）を含み得る。活性化状態に依存する抗体は、例えば、検体成分のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体状態を検出することのできるものである。活性化状態に依存する抗体は、概して、活性化及び非活性化形態の検体成分を両方検出することができる。
【００８８】
[0088]一実施形態では、近接アッセイは、
（ｉ）例えば、脳脊髄液由来の細胞抽出物を、タウタンパク質に対する捕捉抗体の複数の希釈系列とともにインキュベートして、複数の捕捉されたタウタンパク質を生じさせることと、
（ｉｉ）複数の捕捉されたタウタンパク質を、すべてのタウタンパク質に対する複数の抗体（例えば、活性化状態に依存しない抗体）と、リン酸化タウタンパク質に対する複数の抗体（例えば、活性化状態に依存する抗体）とを含む検出抗体と共にインキュベートして、複数の、検出可能な、捕捉された活性化タウ検体成分を生じさせることと［すべてのタウタンパク質に対する抗体は促進部分（例えば、グルコースオキシダーゼ）により標識され、リン酸化タウタンパク質に対する抗体はシグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）により標識され、かつ促進部分（例えば、グルコースオキシダーゼ）は、酸化剤を生成し、この酸化剤は、シグナル増幅対の第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する）］、
（ｉｉｉ）検出可能な、捕捉された複数の活性化タウ検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、ビオチン−チラミド）と共にインキュベートして、増幅されたシグナルを生成することと、
（ｉｖ）シグナル検出剤としてストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅを使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びビオチン−チラミドから生じた増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００８９】
[0089]好ましい実施形態では、近接アッセイは、（ｉ）細胞抽出物を、捕捉抗体の複数の段階希釈物とインキュベートして、複数の捕捉された検出成分を生成することと（ここで、捕捉抗体はビーズ上に存在する）、（ｉｉ）捕捉された複数の検体成分を、活性化状態に依存しない複数の抗体及び対応する検体成分に特異的な活性化状態に依存する複数の抗体を含む、検出抗体とインキュベートして、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成することと（ここで、活性化状態に依存しない抗体は、促進部分により標識されており、活性状態に依存する抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーで標識され、促進部分は、シグナル増幅対の第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する、酸化剤を生成する）、（ｉｉｉ）検出可能な、複数の検体成分を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅されたシグナルを生成することと、（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【００９０】
[0090]あるいは、活性化状態に依存する抗体を促進部分により標識することができ、活性化状態に依存しない抗体をシグナル増幅対の第１のメンバーにより標識することができる。
【００９１】
[0091]捕捉抗体、活性化状態に依存しない抗体、及び活性化状態に依存する抗体は、好ましくは、検体成分への結合において競合が最低限に抑えられるように（すなわち、すべての抗体は、それらの対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）選択されるのが好ましい。
【００９２】
[0092]いくつかの実施形態では、活性化状態に依存しない抗体は、検出可能な部分を更に含む。このような例では、検出可能な部分の量は、細胞抽出物中の１以上の検体成分の量に相当する。検出可能な部分の例としては、蛍光標識、化学反応性標識、酵素標識、放射性標識などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、検出可能な部分は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンインイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）ｆｌｕｏｒ（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などの蛍光色素分子である。当業界で周知の方法を使用して、検出可能な部分を、活性化状態に依存しない抗体に直接的に又は間接的に結合させることができる。
【００９３】
[0093]ある種の例では、活性化状態に依存しない抗体は、促進部分により直接的に標識される。当業界で周知の方法を使用して、促進部分を、活性化状態に依存しない抗体に結合させることができる。本発明で使用するのに好適な促進部分としては、酸化剤を生成することのできる任意の分子が挙げられ、この酸化剤は、促進部分に近接する（すなわち、空間的に近い又は近傍にある）別の分子にチャネリングし（すなわち、指向して）、かつ反応する（すなわち、結合する、結合される、又は一緒に複合体を形成する）ものである。促進部分の例としては、酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、又は、電子受容体として酸素分子（Ｏ２）が関与する酸化／還元反応を触媒する任意のその他の酵素、などの酵素、並びに光増感剤、例えば、メチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、スクアレート染料、フタロシアニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。酸化剤の非限定例としては、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素、及び酸化／還元反応において、酸素原子を伝達する、又は、電子を得る、任意のその他の化合物が挙げられる。好ましくは、好適な基質（例えば、グルコース、光など）の存在下で、促進部分（例えば、グルコースオキシダーゼ、光増感剤など）は、酸化剤（例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素など）を生じ、この酸化剤は、２つの部分が互いに近接したときに、シグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、保護基により保護されているハプテン、酵素阻害剤にチオエーテル結合させることにより不活性化させた酵素など）にチャネリングし、かつ反応する。
【００９４】
[0094]他のある種の例では、活性化状態に依存しない抗体は、活性化状態に依存しない抗体に複合させたオリゴヌクレオチドリンカーと、促進部分に複合させた相補的なオリゴヌクレオチドリンカーとの間のハイブリダイゼーションを介し、間接的に促進部分により標識される。当業界で周知の方法を使用して、オリゴヌクレオチドリンカーを、促進部分又は活性化状態に依存しない抗体に結合させることができる。いくつかの実施形態では、促進部分を複合させたオリゴヌクレオチドリンカーは、活性化状態に依存しない抗体を複合させたオリゴヌクレオチドリンカーと１００％の相補性を有する。その他の実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカー対は、例えば、厳密なハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション時に、少なくとも１、２、３、４、５、又は６以上のミスマッチ領域を有する。当業者であれば、異なる検体成分に特異的である、活性化状態に依存しない抗体を、同じオリゴヌクレオチドリンカー又は異なるオリゴヌクレオチドリンカーのいずれかに結合させることができることを認識されるであろう。
【００９５】
[0095]促進部分又は活性化状態に依存しない抗体に複合したオリゴヌクレオチドリンカーの長さは、変更することができる。概して、リンカー配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００ヌクレオチドの長さとすることができる。典型的には、カップリングのためにランダム核酸配列が生成される。非限定例として、連続する３つの異なるドメイン：スペーサードメイン；シグネチャードメイン；及び複合ドメイン、を有する、オリゴヌクレオチドリンカーのライブラリを設計することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドリンカーは、促進部分の機能を損なわずに、又はそれらを複合させる、活性化状態に依存しない抗体の機能を損なわずに、効率的に結合するよう設計する。
【００９６】
[0096]オリゴヌクレオチドリンカー配列は、様々なアッセイ条件下での任意の副次的な構造体の形成を防止又は最小限に抑えるよう設計することができる。典型的には、リンカー内部の各断片が、アッセイ法全体において関与するように、それらの融解温度を注意深くモニターする。概して、リンカー配列断片の溶解温度は、１〜１０℃である。既定のイオン濃度下で、溶解温度、二次構造、及びヘアピン構造を測定するためのコンピューターアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯ６．０）を使用して、各リンカー内の３つの異なるドメインのそれぞれを分析することができる。結合配列を、全体的に、構造特性、並びに、その他の複合オリゴヌクレオチドリンカー配列に対する類似性、例えば、厳密な条件下で相補的なオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするかについて分析することもできる。
【００９７】
[0097]オリゴヌクレオチドリンカーのスペーサー領域により、オリゴヌクレオチド架橋部分と複合ドメインが十分な距離を保つ。複合ドメインは、相補的なオリゴヌクレオチドリンカー配列により標識されている分子を、核酸ハイブリダイゼーションにより複合ドメインに結合させるよう機能する。核酸により介在されるハイブリダイゼーションは、抗体−検体成分（すなわち、抗原）複合体形成の前又は後のいずれかに実施することができ、より柔軟なアッセイフォーマットを提供する。多くの直接的に抗体を複合させる方法とは異なり、抗体又はその他の分子に対し比較的小さなオリゴヌクレオチドを結合させることで、標的検体成分に対する抗体の特異的親和性に対する影響、又は、複合分子の機能に対する影響が最小限に抑えられる。
【００９８】
[0098]いくつかの実施形態では、複雑な多重化タンパク質アッセイにおいて、オリゴヌクレオチドリンカーのシグネチャー配列ドメインを使用することができる。複数の抗体を、異なるシグネチャー配列を有するオリゴヌクレオチドリンカーと複合させることができる。多重免疫アッセイにおいて、適切なプローブで標識したレポーターオリゴヌクレオチド配列を使用して、多重アッセイフォーマットで抗体及びそれらの抗原の交差反応性を検出することができる。
【００９９】
[0099]幾つかの異なる方法を使用して、オリゴヌクレオチドリンカーを抗体又はその他の分子に複合させることができる。例えば、５’又は３’末端のいずれかにチオール基を備えるオリゴヌクレオチドリンカーを合成できる。チオール基は還元剤（例えば、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）により脱保護することができ、得られたリンカーは、脱塩スピンカラムを使用することで精製できる。これにより得られる脱保護されたオリゴヌクレオチドリンカーは、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性の架橋リンカーを使用して、抗体又はその他の種類のタンパク質の一級アミンに複合させることができる。あるいは、オリゴヌクレオチド上の５’リン酸基を、水溶性カルボジイミドＥＤＣにより処理して、リン酸エステルを形成させることができ、続いてアミン含有分子に結合させることができる。ある種の例では、３’リボース残基上のジオールをアルデヒド基へと酸化させた後、還元的アミノ化により、抗体又はその他の種類のタンパク質のアミノ基に複合させることができる。他のある種の例では、３’又は５’末端のいずれかにビオチン修飾を施し、ストレプトアビジン標識された分子に複合させることにより、オリゴヌクレオチドリンカーを合成できる。
【０１００】
[0100]オリゴヌクレオチドリンカーは、Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５（１９８７）；Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５４３３（１９９０）；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３：２６７７−２６８４（１９９５）；及びＷｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４：５９（１９９７）に記載のものなど、当業界で既知の多様な手法のいずれかを使用して合成することができる。概して、オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホルアミダイトなどの、一般的な核酸保護基及びカップリング基を使用する。オリゴヌクレオチド合成に好適な試薬、核酸脱保護法、及び核酸精製法は、当該技術分野において既知である。
【０１０１】
[0101]ある種の例では、活性化状態に依存する抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーにより直接的に標識される。当業界で周知の方法を使用して、シグナル増幅対のメンバーを、活性化状態に依存する抗体に結合させることができる。他のある種の例では、活性化状態に依存する抗体は、活性化状態に依存する抗体に複合させた結合対の第１メンバーと、シグナル増幅対の第１のメンバーに複合させた結合対の第２のメンバーとの結合を介し、シグナル増幅対の第１のメンバーにより間接的に標識される。当業界で周知の方法を使用して、結合対のメンバー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）を、シグナル増幅対のメンバー又は活性化状態に依存する抗体に結合させることができる。シグナル増幅対のメンバーの例としては、限定するものではないが、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨード酵素などが挙げられる。シグナル増幅対のメンバーのその他の例としては、保護基により保護されたハプテン、及び、酵素阻害剤に対するチオエーテル結合により不活性化させた酵素、などが挙げられる。
【０１０２】
[0102]近接チャネリングの一例では、促進部分はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。ＧＯをグルコースなどの基質と接触させると、酸化剤（すなわち、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））が生じる。複数のＧＯ部分がデキストラン分子に担持されてよい。ＨＲＰがＧＯの近接するチャネリング内に存在する場合、ＧＯにより生成されたＨ２Ｏ２はＨＲＰへチャネリングして、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体を形成し、この複合体は、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、ルミノール若しくはイソルミノールなどの化学発光基質、又は、チラミド（例えば、ビオチン−チラミド）、ホモバニリン酸、又は４−ヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光発生基質）の存在下で増幅されたシグナルを生成する。ビオチン−チラミドをシグナル増幅対の第２のメンバーとして使用するとき、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体が、チラミドを酸化して反応性チラミドラジカルを生成し、これが近くの求核性残基に共有結合する。
【０１０３】
[0103]図１は、２つの検出抗体（すなわち、活性化状態に依存しない抗体１０２、及び活性化状態に依存する抗体１０９）と、ビーズ１０１に担持されている捕捉抗体１０３とに検体成分が結合している、例示的な近接アッセイを示す。捕捉抗体１０３及び活性化状態に依存しない抗体１０２の各々は、活性状態に依存せずに検体成分１０６に結合する。活性化状態に依存する抗体１０９は、検体成分の活性状態に依存して、かかる成分に結合する（例えば、活性化状態に依存する抗体は、リン酸化残基を有する検体成分の活性形態にのみ結合する）。活性化状態に依存しない抗体は、促進部分（Ｍ１、１０４と表記）で標識され、活性化状態に依存する抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバー（Ｍ２、１０５と表記）で標識される。検体成分に対し両方の検出抗体が結合すると、シグナル増幅対の第１のメンバーに対し促進部分が十分近接し（点線１０７の内側の領域として示す）、促進部分により生成されたシグナルはシグナル増幅対の第１のメンバーにチャネリングして、検出可能なシグナル及び／又は増幅シグナルが生じる。近接チャネリングのための多様な方法が当業界で既知であり、かつ例えば、ＦＲＥＴ、時間分解蛍光−ＦＲＥＴ、及びＬＯＣＩなどを挙げることができる。本発明の方法に使用するとき、近接チャネリングの利点は、３種類の抗体のすべてが結合したこれらの検体成分についてのみ、単独で検出可能なシグナルが生成され、結果としてアッセイの特異性が向上し、バックグラウンドが低減され、検出が簡略化されるというものである。ある種の態様では、ビーズ１０１は、検体成分を結合していない他の捕捉抗体１１０、１２５、１２１、及び１１５を含む。
【０１０４】
[0104]活性化チラミドは直接検出され、あるいは例えば、ストレプトアビジン標識された蛍光色素分子、又は、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと発色剤とを組み合わせたもの、などのシグナル検出剤の添加により検出される。本発明で使用するのに好適なフルオロフォアの例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７など）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンインイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）ｆｌｕｏｒ（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが挙げられるがこれらに限定されない。当業界で周知の方法を使用して、ストレプトアビジン標識を、蛍光色素分子又はペルオキシダーゼに直接的に又は間接的に結合させることができる。本発明で使用するのに好適な発色剤の非限定例としては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンが挙げられる。
【０１０５】
[0105]近接チャネリングの別の例では、促進部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは複数のハプテンにより標識された大型分子であり、ここで、複数のハプテンは、特異的な結合パートナー（例えば、リガンド、抗体など）に対するハプテンの結合を防ぐ保護基により保護されている。例えば、保護されたビオチン、クマリン、及び／又はフルオレセイン分子により標識されたデキストラン分子をシグナル増幅対メンバーとすることができる。好適な保護基としては、フェノキシ保護基、アナリノ保護基、オレフィン保護基、チオエーテル保護基、及びセレノエーテル保護基が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の近接アッセイに好適なその他の光増感剤及び保護ハプテン分子は、米国特許第５，８０７，６７５号に記載される。光増感剤が光により励起されると、酸化剤（すなわち、一重項酸素）が生成される。ハプテン分子が、光増感剤に近接するチャネリング内に存在する場合、光増感剤により生成された一重項酸素は、ハプテンの保護基上のチオエーテルのもとにチャネリングされ、これと反応し、カルボニル基（ケトン又はアルデヒド）及びスルフィン酸を生成し、ハプテンから保護基を遊離させる。保護の外れたハプテンは、次に、シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、検出可能なシグナルを生成し得る、特異的な結合パートナー）に特異的に結合できる。例えば、ハプテンがビオチンであるとき、特異的な結合パートナーは標識されたストレプトアビジンであり得る。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰなどが挙げられる。未結合の試薬を洗浄し除去した後、酵素により検出可能な（例えば、蛍光、化学発光、発色など）基質を添加することにより、検出可能なシグナルを生成し、好適な方法及び当該技術分野で既知の計測手段により検出することができる。あるいは、チラミドシグナルの増幅により、検出可能なシグナルを増幅させて、活性化チラミドを直接的に検出することができ、あるいは上記のシグナル検出剤の添加により検出することができる。
【０１０６】
[0106]近接チャネリングの更に別の例では、促進部分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは酵素−阻害剤複合体である。酵素及び阻害剤（例えば、ホスホン酸標識されたデキストラン）は、開裂可能なリンカー（例えば、チオエーテル）によりともに結合される。光増感剤が光により励起されると、酸化剤（すなわち、一重項酸素）が生成される。酵素−阻害剤複合体が、光増感剤に近接するチャネル内に存在する場合、光増感剤により生成された一重項酸素は、開裂可能なリンカーのもとにチャネリングされ、これと反応し、酵素を活性化させることにより酵素から阻害剤を遊離させる。酵素基質を添加して、検出可能なシグナルを生成し、あるいは、増幅試薬を添加して増幅されたシグナルを生成する。
【０１０７】
[0107]近接チャネリングの更なる例では、促進部分がＨＲＰであり、シグナル増幅対の第１のメンバーは上記のとおり、保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体であり、保護基はｐ−アルコキシフェノールを含む。フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２の添加は、反応性フェニレンジイミンを生成し、この分子は保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体のもとにチャネリングし、かつｐ−アルコキシフェノール保護基と反応し、露出したハプテン又は反応性酵素を生成する。増幅されたシグナルは、上記（例えば、米国特許第５，５３２，１３８号及び同第５，４４５，９４４号）のとおりに生成及び検出される。
【０１０８】
[0108]別の実施形態では、本発明は、（ａ）ビーズ上に保持された複数の捕捉抗体の段階希釈物と、（ｂ）複数の検出抗体（例えば、活性化状態に依存しない抗体、及び活性化状態に依存する抗体）と、を含む、上記の近接アッセイを実施するためのキットを提供する。いくつかの例では、キットは、キットを使用して固形腫瘍の循環細胞の複数のシグナル伝達分子の活性化状態を検出する方法についての使用説明書を更に含有し得る。キットには、本発明の特異的な方法の実施のため、例えば、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅剤、促進部分のための基質、洗浄緩衝液などの上記の任意の追加の試薬を含有させてもよい。
Ｄ．２抗体アプローチ
【０１０９】
[0109]いくつかの実施形態では、本アッセイは、代謝疾患、又は脳の認知障害、神経疾患／障害及び／若しくは心の健康に関係する障害、又は癌に関係する対象とする検体成分など、細胞抽出物中の、対象とする活性化状態の特定の検体成分（例えば、シグナル伝達分子又は神経変性分子）を検出するためのものである。ある種の例では、固形腫瘍の循環細胞などの腫瘍細胞内部のものを検体成分とすることができる。非常に有利なことに、本発明は、優れたダイナミックレンジを備えた多重ハイスループット２抗体アッセイを提供する。非限定例として、アッセイにおいて使用される２抗体は、（１）検体成分に特異的な捕捉抗体、及び（２）活性形態の検体成分に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態に依存する抗体）を含み得る。活性化状態に依存する抗体は、例えば、検体成分のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体状態を検出することのできるものである。あるいは、検出抗体は、細胞抽出物中の検体成分の総量を検出する、活性化状態に依存しない抗体を含む。活性化状態に依存しない抗体は、概して、活性化及び非活性化形態の検体成分の両方を検出することができる。
【０１１０】
[0110]好ましい実施形態では、２抗体アッセイは、（ｉ）細胞抽出物を、捕捉抗体の複数の段階希釈物とインキュベートして、捕捉された複数の検体成分を生成することと、（ｉｉ）捕捉された複数の検体成分を、対応する検体成分に特異的な活性化状態に依存する抗体とインキュベートして、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成することと、（ｉｉｉ）検出可能な、複数の検体成分を、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして、増幅されたシグナルを生成することと、（ｉｖ）シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅されたシグナルを検出することと、を含む。
【０１１１】
[0111]本明細書に記載の２抗体アッセイは、典型的には、ビーズ表面に結合させた捕捉抗体の濃度の範囲で、複数の異なる捕捉抗体を含む、抗体ベースのアレイである。
【０１１２】
[0112]捕捉抗体及び検出抗体は、好ましくは、検体成分の結合において競合が最低限に抑えられるように選択される（すなわち、捕捉及び検出抗体は、それらの対応するシグナル伝達分子又は神経変性分子に同時に結合することができる）。
【０１１３】
[0113]一実施形態では、検出抗体は結合対の第１メンバー（例えば、ビオチン）を含み、シグナル増幅対の第１のメンバーは、結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。結合対のメンバーには、当業界で周知の方法を使用して、検出抗体又はシグナル増幅対の第１のメンバーを直接的に又は間接的に結合させることができる。ある種の例では、シグナル増幅対の第１のメンバーは、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨード酵素など）であり、及びシグナル増幅対の第２のメンバーは、チラミド製剤（例えば、ビオチン−チラミド）である。あるいは、シグナル増幅対の第１のメンバーを、検出抗体に直接結合させることができる。ある種の例では、チラミド剤のペルオキシダーゼ酸化により、増幅されたシグナルが生じ、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下で活性化チラミドが生成される。
【０１１４】
[0114]一態様では、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）はインサイチュで生成される。例えば、グルコースオキシダーゼなどの促進部分は、抗体に固定させていない免疫アッセイに導入することができる。すなわち、当該促進部分を、デキストランなどの基質に固定させることができる。複数のＧＯ部分をデキストランに固定させることができる。グルコースの存在下で、グルコースオキシダーゼは、シグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、ＨＲＰ）と反応する過酸化水素などの酸化剤を生じる。
【０１１５】
[0115]活性化チラミドは直接検出され、あるいは例えば、ストレプトアビジン標識された蛍光色素分子、又は、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと発色剤とを組み合わせたもの、などのシグナル検出剤の添加により検出される。本発明で使用するのに好適な蛍光色素分子の例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ｄｙｅ（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンインイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商標）ｆｌｕｏｒ（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などが挙げられるがこれらに限定されない。当業界で周知の方法を使用して、ストレプトアビジン標識を、蛍光色素分子又はペルオキシダーゼに直接的に又は間接的に結合させることができる。本発明で使用するのに好適な発色剤の非限定例としては、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンが挙げられる。
【０１１６】
[0116]別の実施形態では、本発明は、（ａ）マイクロキャリア上に保持された複数の捕捉抗体の段階希釈物と、（ｂ）複数の検出抗体（例えば、活性化状態に依存しない抗体、及び活性化状態に依存する抗体）と、を含む、上記の２抗体アッセイを実施するためのキットを提供する。いくつかの例では、キットは、本キットを使用して固形腫瘍の循環細胞に関係する複数のシグナル伝達分子の活性化状態を検出する方法についての使用説明書を更に含有し得る。キットには、本発明の特異的な方法を実施する観点から、上記のものの他に追加の試薬を含有させてもよく、例えば、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅剤、洗浄緩衝液などを含有させてもよい。
ＩＶ．実施例
実施例１．患者サンプルにおけるリン酸化ＨＥＲ２レベルを測定するためのフローサイトメトリーＣＥＥＲ
【０１１７】
[0117]本実施例は、ビーズに固定したＣＥＥＲ（登録商標）と、フローサイトメーターとを使用して、細胞可溶化液試料中の活性化型（リン酸化）ＨＥＲ２レベルを検出する方法を示す。
【０１１８】
[0118]細胞可溶化液は次のとおり調製する。ＨＥＲ２を過剰発現している細胞（すなわち、ＢＴ４７４細胞）を陽性対照サンプルとして使用し、患者のサンプルと並行して処理する。細針吸引サンプルなどの生物学的サンプルを患者から採取する。サンプルの細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを含有させたＲＩＰＡ緩衝液などの標準細胞溶解緩衝液を使用して溶解する。溶解反応は、氷上で３０分間、又は細胞を十分に溶解するまで実施できる。細胞を遠心分離し、更なる解析のため上清（細胞可溶化液）を用意する。
【０１１９】
[0119]ポリスチレンビーズ（例えば、約１０μｍ）をＨＥＲ２捕捉抗体で被覆する。陰性対照として、ＩｇＧを別の組のビーズ上に被覆する。被覆したビーズを５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１時間ブロッキングした。細胞可溶化サンプル（すなわち、細胞約７５個、７．５個、及び０．７５個に相当する溶解液）と被覆ビーズとを約８０分間インキュベートする。このときビーズを洗浄できる。検出抗体（例えば、４Ｇ１０−ＨＲＰ及びＨＥＲ２−ＡＢ４−ＧＯ）と被覆ビーズとを２０分間インキュベートする。抗体４Ｇ１０−ＨＲＰはホスホチロシンに特異的に結合し、抗体ＨＥＲ２−ＡＢ４−ＧＯはＨＥＲ２ポリペプチドを認識する。次にビーズを洗浄できる。その後、ビオチン−チラミド（ＢＴ−ｔｙｒ）を加え、ビーズと共に３０分間インキュベートする。この時点で、２とおり（１：５００及び１：１０００）のＢＴ−ｔｙｒ希釈液を試験することができる。次に、シグナル検出試薬ストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７を加え、５分間インキュベートする。得られる蛍光ビーズを検出し、標準フローサイトメーターを使用して定量する。
【０１２０】
[0120]測定される蛍光は、サンプル中の活性化型ＨＥＲ２のレベルに比例する。活性化型ＨＥＲ２レベルを使用して、患者が例えば、乳癌非小細胞肺癌、卵巣癌、胃癌、精巣胚細胞性癌、食道腫瘍、又は別の癌などの疾患を有するかを判断することができる。
実施例２．患者サンプルにおけるリン酸化タウレベル又は全タウレベルを測定するための、フローサイトメトリーによるＣＥＥＲ
【０１２１】
[0121]本例には、アルツハイマー病の疑いのある患者又はアルツハイマー病のリスクのある患者から得られた血清サンプル中のリン酸化タウレベルを測定する、本明細書に記載のフローサイトメトリーによるＣＥＥＲアッセイの使用方法を記載する。
【０１２２】
[0122]ビーズを抗体被覆する標準的なプロトコルを用い、リン酸化されていないタウを特異的に認識する抗タウ捕捉抗体をポリスチレンビーズに結合させる。結合したビーズを５％ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間ブロッキングする。患者の血清サンプルを、被覆ビーズと共に約８０分間インキュベートする。検出抗体は、例えば、非リン酸化タウに対するものでありグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）を結合した第１の抗体、及びリン酸化タウ又は全タウに対するものであり西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した第２の抗体など。検出抗体と結合ビーズとを２０分間インキュベートする。この手順ではこの時点でビーズを洗浄できる。次に、ビオチン−チラミドをビーズに加え、３０分間インキュベートする。次に、シグナル検出試薬のストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７とビーズとを５分間インキュベートする。得られる蛍光ビーズを、標準フローサイトメーターを使用して検出し、定量する。
【０１２３】
[0123]測定される蛍光は、サンプル中の活性化型タウのレベルに比例する。非ＡＤ対照と比較して、患者のサンプルのリン酸化されたタウのレベルが上昇した場合、次に、患者がＡＤであるのか、又はＡＤを発症するリスクがあるのかを判断する。表１は、フローサイトメトリー解析により検出された全タウ及び対応する蛍光値についての標準曲線を示す。上記のとおりＣＥＥＲ増幅工程を使用してシグナルを生成した。
【表１】
2017520769.tif 000003
【０１２４】
[0124]これまでに、理解を明瞭にするため、図示及び例示目的により本発明を程度詳細に記載したものの、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内である種の変更及び改変を実施できることを認識されるであろう。更に、本明細書に提供される各参照は、各参照が参照によりそれぞれ援用されている場合と同程度に、その全容が参照により援用される。
【図１】
2017520769.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月5日(2017.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルに対し多重化免疫アッセイを実施する方法であって、
（ａ）血液、血漿、又は細胞可溶化液を、ビーズに固定されている複数の捕捉抗体と接触させて、捕捉された複数の検体成分を生成することと（ここで、ビーズは、少なくとも１種の検体成分に特異的である）、
（ｂ）前記捕捉された複数の検体成分を、前記少なくとも１種の検体成分に特異的である少なくとも１種の検出抗体と接触させて、検出可能な、捕捉された複数の検体成分を生成することと（ここで、前記少なくとも１種の検出抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーを有する）、
（ｃ）前記検出可能な、捕捉された複数の検体成分を、前記シグナル増幅対の第２のメンバーと接触させて、増幅されたシグナルを生成することと、
（ｄ）前記シグナル増幅対の前記第１及び第２のメンバーから生成された、前記増幅されたシグナルを検出することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ビーズが、蛍光色素又は検出可能なタグで標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、全血、血清、血漿、尿、痰、気管支洗浄液、涙、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引液（ＦＮＡ）、脳脊髄液、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種の検体成分が、少なくとも１種のシグナル伝達分子、サイトカイン、代謝産物、病理学的分子、又は自己抗体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種の検出抗体が、少なくとも２種の検出抗体であり、
（ｉ）促進部分により標識されており、活性化状態に依存しない複数の抗体と、
（ｉｉ）前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーにより標識されており、活性化状態に依存する複数の抗体と、
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記促進部分が、前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する酸化剤を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記検出抗体が、前記少なくとも１種の検体成分に特異的なシグナル増幅対の第１のメンバーで標識した複数の検出抗体である、検出抗体を１種含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記促進部分が、前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーにチャネリングし、かつ反応する酸化剤を生成する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記促進部分が、グルコースオキシダーゼである、請求項５又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化剤が、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、請求項６又は８に記載の方法。
【請求項１１】
前記シグナル増幅対の前記第１のメンバーがペルオキシダーゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナル増幅対の前記第２のメンバーが、チラミド試薬である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記チラミド試薬が、蛍光色素分子により直接的に標識される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記チラミド試薬がビオチン−チラミドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅されたシグナルが、ペルオキシダーゼによりチラミドが酸化されて活性化チラミドが生成されることにより生じる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記活性化チラミドが直接検出される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記活性化チラミドが、前記シグナル検出剤の添加により検出される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記シグナル検出剤が、ストレプトアビジン標識されたフルオロフォアである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記シグナル検出剤が、ストレプトアビジン標識されたペルオキシダーゼと発色剤とを組み合わせたものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記発色剤が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、ヒト疾患の診断検査として使用される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が、代謝疾患、脳及び認知疾患、胃腸疾患、又は癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、前立腺癌、及び胃癌からなる群から選択されるものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記代謝疾患が糖尿病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記脳及び認知疾患がアルツハイマー病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１種のシグナル伝達分子が、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣＡＭＫＫ）、ＬＫＢ１、トランスフォーミング増殖因子−β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、ＡＫＴ、アディポネクチン、レプチン、グルコース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４〜２３及び２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１種の自己抗体が、ＧＡＤ６５自己抗体、インスリノーマ抗原２（ＩＡ−２）自己抗体、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、亜鉛トランスポータータンパク質８（ＺｎＴ８）自己抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４〜２３及び２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種の病理学的分子が、タウ、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド、可溶性アミロイド前駆体タンパク質β（ｓＡＰＰβ）、ＶＩＬＩＰ−１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４〜２３及び２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１種のシグナル伝達分子が受容体型チロシンキナーゼである、請求項４〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記受容体型チロシンキナーゼが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ−３、ＦＬＫ−２、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＩＮＳＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ、ＣＳＦ−１Ｒ、ｃＭＥＴ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種の受容体型チロシンキナーゼが、非受容体型チロシンキナーゼを更に含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅されたシグナルが、反応速度結合パラメータに関連付けられる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ビーズが複数のビーズである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数のビーズが、各集団のそれぞれが他方と区別可能である少なくとも２種の集団を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ビーズの少なくとも２種の集団のそれぞれが、それぞれ異なる、少なくとも２種の各検体成分に特異的なものである、請求項３５に記載の方法。
【国際調査報告】
2017520769.tif 000005
2017520769.tif 000006
2017520769.tif 000007
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