(57)【要約】  式(I)の化合物。2017533925.tif 000028【選択図】図４Ａ
2017533925.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)
【化１】
2017533925.tif 000025
［式中、
R1は、ブトキシ又はメチルブトキシであり、
R2は、構造
【化２】
2017533925.tif 000026
(式中、
nは、5の値を有する整数であり;
Hetは、5個の炭素原子及び1個の窒素原子を含有する6員の飽和複素環であり、ここで、Hetは、複素環の4位の炭素において、-(CH2)n-部分に結合しており、
R3は、水素である)
を有する基である］
の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
R1が、1-メチルブトキシである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
R1が、(1S)-1-メチルブトキシである、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式(I)
［式中、
R1は、(1S)-1-メチルブトキシであり、
R2は、構造
【化３】
2017533925.tif 000027
(式中、
nは、5の値を有する整数であり;
Hetは、ピペリジンであり、ここで、Hetは、複素環の4位の炭素において、-(CH2)n-部分に結合しており、
R3は、水素である)
を有する基である］
の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
アレルギー性疾患又は他の炎症状態の治療において使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
アレルギー性疾患又は他の炎症状態の治療方法であって、それを必要としているヒト被験者に、治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物と、1種以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物、及び抗原又は抗原組成物を含む免疫原性組成物。
【請求項１０】
疾患の治療又は防止の方法であって、前記疾患にかかっているか、又はかかりやすいヒト被験者に、請求項５に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
疾患の治療又は防止用の、抗原又は抗原組成物を含む免疫原性組成物の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物の使用。
【請求項１２】
アレルギー性疾患若しくは他の炎症状態、感染症、又は癌の治療用の医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物の使用。
【請求項１３】
アレルギー性鼻炎又は喘息の治療用の医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物の使用。
【請求項１４】
アレルギー性鼻炎又は喘息の治療方法であって、それを必要としているヒト被験者に、治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物を含み、(a)少なくとも1種の他の治療上の活性薬剤、(b)薬学的に許容される希釈剤、及び(c)薬学的に許容される担体から選択される成分をさらに含む組成物。
【請求項１６】
治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物を含む組成物。
【請求項１７】
治療に使用する医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物の使用。
【請求項１８】
治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明の態様は、NIH契約番号HHSN272200900036Cに基づく米国政府の援助により実施されたものであり、米国政府は、本発明において一定の権利を有しうる。
【０００２】
関連特許及び特許出願の相互参照
これは特許協力条約出願であり、2014年11月13日に出願された米国仮特許出願第62/079,027号の利益を主張する。
【０００３】
本発明の背景
本発明は、化合物、それらの製造方法、それらを含有する組成物、並びにワクチンアジュバントとしての、及び様々な障害の治療における、それらの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
自然免疫システムは、生殖細胞系によりコードされた、限られた数のパターン認識受容体(Pattern-Recognition Receptor: PRR)（これらの受容体は、いくつかの重要な特徴を有する）を介して微生物を認識する。
【０００５】
トール様受容体（TLR）は、多くの分類の病原体に共通する高度に保存された微生物成分を検出する、構造的に関連するPRRのファミリーである。TLRは、免疫細胞上で発現され、活性化すると侵入する病原体を排除するための防御機構を動員する。ヒトにおいて同定された10種超の既知のTLRのうち、いくつかは細胞質区画に限定され、非自己核酸の検出に関与するようである（TLR3、7、8及び9）。例えばAkira et al., Nat Rev Immunol 2004, 4, 499-511; O'Neill, et al., Nat Rev Immunol 2013, 13, 453-460を参照されたい。
【０００６】
TLRの活性化は、炎症性サイトカイン/ケモカイン及びI型インターフェロン（IFNα/β）の発現を導く細胞内シグナル伝達経路を調節し、これは、抗原特異的体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の優先的増強につながりうる。
【０００７】
TLR7及びTLR8は、TLRサブグループ(TLR 3、7、8及び9)のメンバーであり、細胞のエンドソーム区画に局在する。TLR7は、ssRNAの認識による抗ウイルス防御において重要な役割を果たす(Diebold S. S. et al, Science, 2004: 303, 1529-1531; 及びLund J. M. et al, PNAS, 2004: 101, 5598-5603)。TLR7は、ヒトでは制限された発現プロファイルを有し、主にB細胞と形質細胞様樹状細胞(pDC)とにより発現され、それほど多くはないが単球によっても発現される。形質細胞様DCは、リンパ球由来樹状細胞の特異な集団（典型的に、末梢血単核細胞(PBMC)の0.2〜0.8％）であり、ウイルス感染に応答して高レベルのインターフェロンα(IFNα)とインターフェロンβ(IFNβ)を分泌する主要なタイプIのインターフェロン産生細胞である(Liu Y-J, Annu. Rev. Immunol., 2005: 23, 275-306)。
【０００８】
TLR7の小分子アゴニストは、動物及びヒトにおいてサイトカインを誘導できることが記載されている(Takeda K. et al, Annu. Rev. Immunol., 2003: 21, 335-76)。TLR7アゴニストとして、イミダゾキノリン化合物、例えば、イミキモド、及びレシキモド、オキソアデニン類似体、さらにヌクレオシド類似体、例えば、ロキソリビン(loxoribine)、7-チア-8-オキソグアノシン）が挙げられ、これらはインターフェロンαを誘導することが知られている。国際特許出願公開番号WO 2007/034882 (PCT/JP2006/318758;Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd./AstraZeneca Aktiebolag)は、医薬として有用なものとして確認された、特定のアデニン化合物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO 2007/034882
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Akira et al., Nat Rev Immunol 2004, 4, 499-511
【非特許文献２】O'Neill, et al., Nat Rev Immunol 2013, 13, 453-460
【非特許文献３】Diebold S. S. et al, Science, 2004: 303, 1529-1531
【非特許文献４】Lund J. M. et al, PNAS, 2004: 101, 5598-5603
【非特許文献５】Liu Y-J, Annu. Rev. Immunol., 2005: 23, 275-306
【非特許文献６】Takeda K. et al, Annu. Rev. Immunol., 2003: 21, 335-76
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特定のアデニン誘導体化合物は、ヒトインターフェロンの誘導物質であることが示されている。ヒトインターフェロンを誘導する化合物は、ワクチンアジュバントとして、並びに感染症、喘息、癌、炎症状態、及びアレルギー性疾患を含む、様々な障害の治療において有用でありうる。したがって、TLR7/8の選択性及び/又は効力、並びに高い相対的サイトカイン誘導を有する化合物を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の概要
第一の態様では、式(I)
【化１】
2017533925.tif 000003
［式中、
R1は、ブトキシ又はメチルブトキシであり、
R2は、構造
【化２】
2017533925.tif 000004
(式中、
nは、5の値を有する整数であり;
Hetは、5個の炭素原子及び1個の窒素原子を含有する6員の飽和複素環であり、ここで、Hetは、複素環の4位の炭素において、-(CH2)n-部分に結合しており、
R3は、水素である)
を有する基である］
の化合物、又はその薬学的に許容される塩が提供される。
【００１３】
本発明のさらなる態様では、R1は、1-メチルブトキシ及び(1S)-1-メチルブトキシから選択される。
【００１４】
本発明のさらなる態様では、R1は、1-メチルブトキシである。
【００１５】
本発明のさらなる態様では、R1は、(1S)-1-メチルブトキシである。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、式(I)
［式中、
R1は、(1S)-1-メチルブトキシであり、
R2は、構造
【化３】
2017533925.tif 000005
(式中、
nは、5の値を有する整数であり;
Hetは、ピペリジンであり、ここで、Hetは、複素環の4位の炭素において、-(CH2)n-部分に結合しており、
R3は、水素である)
を有する基である］
の化合物、又はその薬学的に許容される塩である。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩である。
【００１８】
本発明のさらなる態様として、治療に使用するための、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩が提供される。式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を治療に使用する場合、それは、活性治療剤として使用されることが理解されよう。
【００１９】
本発明のさらなる態様として、治療に使用するための、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩が提供される。化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を治療に使用する場合、それは、活性治療剤として使用されることが理解されよう。
【００２０】
したがって、アレルギー性疾患若しくは他の炎症状態、感染症、又は癌の治療において使用するための、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩もまた提供される。
【００２１】
したがって、アレルギー性疾患若しくは他の炎症状態、感染症、又は癌の治療において使用するための、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩もまた提供される。
【００２２】
したがって、アレルギー性鼻炎の治療において使用するための、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩もまた提供される。
【００２３】
また、アレルギー性鼻炎の治療において使用するための、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩も提供される。
【００２４】
したがって、喘息の治療において使用するための、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩もまた提供される。
【００２５】
したがって、喘息の治療において使用するための、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩もまた提供される。
【００２６】
さらに、抗原又は抗原組成物、及び式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含む免疫原性組成物が提供される。
【００２７】
さらに、抗原又は抗原組成物、及び化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を含む免疫原性組成物が提供される。
【００２８】
さらに、抗原又は抗原組成物、及び式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含むワクチン組成物が提供される。
【００２９】
さらに、抗原又は抗原組成物、及び化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を含むワクチン組成物が提供される。
【００３０】
さらに、疾患にかかっているか、又はかかりやすいヒト被験者に、抗原又は抗原組成物、及び式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含む免疫原性組成物を投与するステップを含む、疾患の治療又は防止の方法が提供される。
【００３１】
さらに、疾患にかかっているか、又はかかりやすいヒト被験者に、抗原又は抗原組成物、及び化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を含む免疫原性組成物を投与するステップを含む、疾患の治療又は防止の方法が提供される。
【００３２】
さらに、疾患にかかっているか、又はかかりやすい患者ヒト被験者に、抗原又は抗原組成物、及び式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含むワクチン組成物を投与するステップを含む、疾患の治療又は防止の方法が提供される。
【００３３】
さらに、疾患にかかっているか、又はかかりやすい患者ヒト被験者に、抗原又は抗原組成物、及び化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を含むワクチン組成物を投与するステップを含む、疾患の治療又は防止の方法が提供される。
【００３４】
さらに、疾患の治療又は防止用の、抗原又は抗原組成物を含む免疫原性組成物の製造のための、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００３５】
さらに、疾患の治療又は防止用の、抗原又は抗原組成物を含む免疫原性組成物の製造のための、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００３６】
さらに、疾患の治療又は防止用の、抗原又は抗原組成物を含むワクチン組成物の製造のための、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００３７】
さらに、疾患の治療又は防止用の、抗原又は抗原組成物を含むワクチン組成物の製造のための、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００３８】
さらに、アレルギー性疾患若しくは他の炎症状態、感染症、又は癌の治療用の医薬の製造のための、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００３９】
さらに、アレルギー性疾患若しくは他の炎症状態、感染症、又は癌の治療用の医薬の製造のための、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００４０】
さらに、アレルギー性鼻炎の治療用の医薬の製造のための、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００４１】
さらに、アレルギー性鼻炎の治療用の医薬の製造のための、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００４２】
さらに、喘息の治療用の医薬の製造のための、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００４３】
さらに、喘息の治療用の医薬の製造のための、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００４４】
さらに、アレルギー性疾患若しくは他の炎症状態、感染症、又は癌の治療方法であって、それを必要としているヒト被験者に、治療有効量の式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む方法が提供される。
【００４５】
さらに、アレルギー性疾患若しくは他の炎症状態、感染症、又は癌の治療方法であって、それを必要としているヒト被験者に、治療有効量の化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む方法が提供される。
【００４６】
さらに、アレルギー性鼻炎の治療方法であって、それを必要としているヒト被験者に、治療有効量の式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む方法が提供される。
【００４７】
さらに、アレルギー性鼻炎の治療方法であって、それを必要としているヒト被験者に、治療有効量の化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む方法が提供される。
【００４８】
さらに、喘息の治療方法であって、それを必要としているヒト被験者に、治療有効量の式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む方法が提供される。
【００４９】
さらに、喘息の治療方法であって、それを必要としているヒト被験者に、治療有効量の化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む方法が提供される。
【００５０】
本発明は、さらなる態様において、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を、少なくとも1種の他の治療上の活性薬剤とともに含む組み合わせ物を提供する。
【００５１】
本発明は、さらなる態様において、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を、少なくとも1種の他の治療上の活性薬剤とともに含む組み合わせ物を提供する。
【００５２】
さらに、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩と、1種以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体とを含む医薬組成物が提供される。
【００５３】
さらに、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩と、1種以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体とを含む医薬組成物が提供される。
【００５４】
また、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩と、1種以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体とを混合するステップを含む、医薬組成物の製造方法も提供される。
【００５５】
また、化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩と、1種以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体とを混合するステップを含む、医薬組成物の製造方法も提供される。
【００５６】
本発明の化合物、及びその塩は、本明細書に記載の方法により製造することができ、これは、本発明のさらなる態様を構成する。
【００５７】
したがって、式(I)の化合物、又は化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オンの製造方法であって、式(II)
【化４】
2017533925.tif 000006
［式中、R1及びR2は、式(I)の化合物について先に定義したとおりであり、R4は、C1〜6アルキルである］
の化合物を脱保護するステップ、及びその後、必要に応じて、1以上の次の任意のステップ：
(i) 必要な保護基を除去するステップ;
(ii) 生成された化合物の塩を製造するステップ;
を実施するステップを含む方法
が提供される。
【００５８】
さらに、式(I)の化合物、又は化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オンの製造方法であって、式(II)の化合物を別の式(IIP)の化合物に変換するステップ、及びその後、必要に応じて、1以上の次の任意のステップ：
(i) 必要な保護基を除去するステップ;
(ii) 生成された化合物の塩を製造するステップ;
を実施するステップを含む方法
が提供される。
【００５９】
さらなる実施形態では、式(I)の化合物、又は化合物6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オンは、式(IIP)
【化５】
2017533925.tif 000007
［式中、R1は、式(I)の化合物について先に定義したとおりであり、R4は、式(II)の化合物について先に定義したとおりであり、R2Pは、保護されたR2基であり、ここで、保護基は適切な保護基、例えばtert-ブトキシカルボニル(Boc)基又はカルボベンジルオキシ基である］
の化合物を脱保護するステップ、及びその後、必要に応じて、1以上の次の任意のステップ：
(i) 必要な保護基を除去するステップ;
(ii) 生成された化合物の塩を製造するステップ;
を実施するステップによっても製造することができる。
【００６０】
本発明は本明細書に記載される実施形態及び態様のあらゆる組み合わせを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】オキソアデニン化合物3a〜3gで24時間処理した（A）HEK293-hTLR7及び（B）HEK293-hTLR8の細胞のNFKB応答を図示し、（C）は、オキソアデニン3a〜3gについてのhTLR7及びhTLR8のEC50値を示す。グラフの円で囲まれた数字は、各化合物の炭素リンカーの長さを示す。
【図２】オキソアデニン化合物3a〜gによる刺激後において、(A)は、hPBMCにおけるTNFアルファ(α)誘導を示し、（B）は、mDCにおけるIL-6発現を示す。実験は、3人の異なる健康なドナーからのhPBMCにおいて3回実施した。円で囲まれた数字は各化合物の炭素リンカーの長さを示す。
【図３】オキソアデニン3a〜gによる刺激後のhPBMCにおけるIFNアルファ誘導を図示する。
【図４Ａ】オキソアデニン化合物3b、3f若しくは3x又はイミダゾキノリンCRX642で24時間処理した（A）HEK293-hTLR7の細胞からのNFkB応答を図示する。
【図４Ｂ】オキソアデニン化合物3b、3f若しくは3x又はイミダゾキノリンCRX642で24時間処理した（B）HEK293-hTLR8の細胞からのNFkB応答を図示する。
【図５】異なるオキソアデニン化合物（3b、3f、又は3x）、又はイミダゾキノリンCRX642、又はAGP化合物CRX601による刺激によるヒトPBMCからのTNFアルファ誘導を図示する。
【図６】異なるオキソアデニン化合物（3b、3f、又は3x）、又はAGP CRX601、又はCRX642（イミダゾキナリン）による刺激によるヒトPBMCにおけるIFN-アルファ誘導を図示する。
【図７】異なる用量における、異なるオキソアデニン（3b、3f、又は3x）による刺激による、ICS（Intracellular Cytokine Staining：細胞内サイトカイン染色）によって測定した、3人の異なるドナーからのpDCにおけるIFNアルファ誘導を示す。
【図８】図8Aは、異なるオキソアデニン（3b、3f、又は3x）、又はAGP CRX601（TLR4アゴニスト）、又はCRX642（イミダゾキナリン）によるヒトPBMCにおけるIL-12p70誘導を図示する。図8Bは、CRX601（TLR4アゴニスト）と組み合わせた異なるオキソアデニン（3b、3f、又は3x）、又はCRX601と組み合わせたCRX642（イミダゾキナリン）によるヒトPBMCにおけるIL-12p70誘導を図示する。
【図９】式（I）の化合物であるオキソアデニン化合物3xの合成を示すスキームIである。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明の詳細な説明
本明細書に記載されるのは、C9位がピペリジニルアルキル部分で置換され、C2ブトキシ又はメチルブトキシを含有するオキソアデニン化合物の合成である。ヒトTLR7又はヒトTLR8によりトランスフェクトされたHEK293細胞、及びヒトPBMCにおけるin vitro評価によって、hTLR7/8選択性/効力及びサイトカイン誘導が、炭素リンカーの長さを変えることによって調節できることが示された。さらに、C2-ブトキシの最初の炭素上にメチル基を導入する（メチルブトキシを提供する）と、TLR7及びTLR8の活性の両方が影響を受けることが判明した。
【００６３】
TLR7及びTLR9のオリゴヌクレオチドアゴニスト、並びにTLR7の低分子のプリンベースのアゴニストが、動物及びヒトにおいてこれらの細胞型からインターフェロンアルファを誘導しうることが記載されている(Takeda K. et al, Annu. Rev. Immunol., 2003: 21, 335-76)。TLR7アゴニストには、イミダゾキノリン化合物、例えばイミキモド及びレシキモド、オキソアデニン類似体、並びにヌクレオシド類似体、例えばロキソリビン及び7-チア-8-オキソグアノシン(これらは、インターフェロンアルファを誘導することが知られている)が含まれる。国際特許出願公開第WO2007/034882号（PCT/JP2006/318758;Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd./AstraZeneca Aktiebolag）は、医薬として有用なものとして確認された、特定のアデニン化合物を開示している。
【００６４】
WO 2010/018134(PCT/EP2009/060267)に記載されている特定のアデニン誘導体化合物は、ヒトインターフェロンの誘導物質であることが示されており、（特定の他の既知のヒトインターフェロンの誘導物質に関して）プロファイルが改善する、例えば効力が増強する可能性があり、腫瘍壊死因子アルファ（Tumor Necrosis Factor alpha)(TNFα）に関して、IFNαの選択性が増強する可能性がある。例えば、特定の化合物は、TNFα誘導に対して1000倍を超えるIFNα誘導の選択性を示す。ヒトインターフェロンを誘導する化合物は、ワクチンアジュバントとして有用でありうる。ヒトインターフェロンを誘導する化合物は、感染症、癌、炎症状態、及びアレルギー性疾患を含む、様々な障害の治療に有用でありうる。ヒトインターフェロンを誘導する化合物は、アレルギー性鼻炎又は喘息の治療に有用でありうる。
【００６５】
本発明は、当業者に知られており、且つ理解されている用語で説明される。参照しやすいように、用語を以下で定義する。しかしながら、特定の用語を定義することは、定義された用語が通常の意味と矛盾して用いられること、あるいは、定義されない任意の用語が不明確であること、又は一般に認められた通常の意味の範囲を超えて用いられること、を示すと考えるべきでない。それどころか、本明細書中で用いる全ての用語は、当業者が本発明の範囲を理解できる程度に本発明を説明するものと思われる。以下の定義は、定義される用語を明確にすることを意図するものであり、限定するものではない。
【００６６】
「アルキル」への言及は、8個以下の炭素原子、例えば6個以下の炭素原子、又は4個以下の炭素原子、又は2個以下の炭素原子、又は1個の炭素原子を含む対応するアルキルの直鎖状及び分岐鎖状の両方の脂肪族異性体への言及を含む。そのような「アルキル」への言及は、アルキル基が別の基、例えば、アルキルアミノ又はアルコキシ基の一部である場合にも当てはまる。そうしたアルキル基及びアルキル基を含む基の例はC1〜8アルキル、C1〜6アルキル、C1〜6アルキルアミノ、及びC1〜6アルコキシである。
【００６７】
「複素環」又は「ヘテロシクリル」についての言及は、5個の炭素原子と、少なくとも1個のヘテロ原子（ヘテロ原子は窒素、酸素、又は硫黄である）とを含む単環式飽和複素環式脂肪族環を指す。そうした複素環として、ピペリジン又はピペリジニルが挙げられ、ここで、環は5個の炭素原子と1個の窒素ヘテロ原子とを含有する。
【００６８】
式Iの化合物に関して本明細書において使用される場合、「炭素リンカー」は、-(CH2)n-部分を指し、あるいは「アルキルリンカー」と称されることもある。したがって、「5(個)-炭素」リンカーは、-(CH2)5-である。
【００６９】
本明細書全体にわたって、プリン骨格の一般的に受け入れられている原子の番号付けシステムを使用する:
【化６】
2017533925.tif 000008
【００７０】
以下の一覧は、本明細書で使用される特定の略語の定義を提供する。一覧は網羅的なものではなく、以下に定義されない略語の意味は、当業者に容易に明らかになるであろう。
DCM  ジクロロメタン
DMF  N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO  ジメチルスルホキシド
ELISA  酵素結合免疫吸着アッセイ(enzyme linked immunosorbent assay)
EtOAc  酢酸エチル
H  時間
HCl  塩酸
Et3N  トリエチルアミン
L  リットル
LCMS  液体クロマトグラフィー-質量分析(法)
Mins  分
MS  質量分析(法)
NFkB  核内因子カッパB(nuclear factor kappa B)
NMR  核磁気共鳴
ssNMR  固体核磁気共鳴
PBMC  末梢血単核細胞
PBS  リン酸緩衝生理食塩水
PRR  パターン認識受容体
RT  室温
Stripped  減圧下での溶媒の除去
TFA  トリフルオロ酢酸
TLR  トール様受容体
RT  室温
【００７１】
本明細書において、本発明の化合物への言及は、遊離塩基としての、又は塩、例えば、薬学的に許容される塩、としての、式(I)の化合物を意味すると理解すべきである。
【００７２】
式(I)の化合物の塩には、薬学的に許容される塩と、薬学的に許容されないが、式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩の製造に有用でありうる塩が含まれる。塩は特定の無機若しくは有機酸、又は特定の無機若しくは有機塩基から誘導することができる。
【００７３】
本発明は、その範囲内に、式(I)の化合物の塩の全ての可能な化学量論的及び非化学量論的形態を包含する。
【００７４】
塩の例としては、薬学的に許容される塩がある。薬学的に許容される塩には酸付加塩と塩基付加塩とが含まれる。適切な塩の概説については、例えばBerge et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977)を参照されたい。
【００７５】
式(I)の化合物の薬学的に許容される酸付加塩の例としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、及びフェニルスルホン酸塩が挙げられる。
【００７６】
薬学的に許容される塩基性塩(base salt)の例としては、アルカリ金属塩、例えばナトリウムやカリウムの塩、及びアルカリ土類金属塩、例えばカルシウムやマグネシウムの塩が挙げられる。
【００７７】
塩の形成は、当技術分野でよく知られた手法を用いて、例えば、溶液からの沈殿とその後の濾過、又は溶媒の蒸発により、行うことができる。
【００７８】
一般的には、薬学的に許容される酸付加塩は、式(I)の化合物と、適切な強酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、硫酸、p-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、又はナフタレンスルホン酸）とを、場合により有機溶媒のような適切な溶媒中で、反応させて塩を形成させることにより得られ、通常その塩は、例えば結晶化及び濾過により単離される。
【００７９】
理解されるように、多くの有機化合物は、溶媒(その溶媒中でそれらが反応したり、あるいはその溶媒からそれらが沈殿したり、又は結晶化したりする)との複合体を形成する可能性がある。こうした複合体は「溶媒和物」として知られている。例えば、水との複合体は「水和物」として公知である。沸点の高い溶媒及び/又は水素結合を形成する傾向の高い溶媒、例えば、水、エタノール、イソプロピルアルコール、及びN-メチルピロリジノンを用いて溶媒和物を形成することが可能である。溶媒和物の同定方法としては、限定するものではないが、NMR及び微量分析が挙げられる。本発明の化合物及び塩は、溶媒和物又は非溶媒和物の形態で存在しうる。本明細書中で用いる場合、「溶媒和物」という用語は、遊離塩基化合物とその任意の塩の双方の溶媒和物を包含する。
【００８０】
本発明の化合物のいくつかは、キラル原子及び/又は多重結合を含むことができ、それゆえ1以上の立体異性体として存在しうる。本発明は、個々の立体異性体であろうと、それらの混合物（ラセミ体を含む）であろうと、本発明の化合物のあらゆる立体異性体（光学異性体を含む）を包含する。どの立体異性体も、10重量％未満、例えば、5重量％未満、又は0.5重量％未満の任意の他の立体異性体を含むことができる。例えば、どの光学異性体も、10重量％未満、例えば、5重量％未満、又は0.5重量％未満のその鏡像異性体を含んでもよい。
【００８１】
本発明の化合物のいくつかは、互変異性体として存在することができる。当然のことながら、本発明は、個々の互変異性体であろうと、それらの混合物であろうと、存在する式に明確に示されていてもいなくても、本発明の化合物のあらゆる互変異性体を包含する。
【００８２】
本発明の化合物は、結晶形又は非晶形で存在することができる。さらに、本発明の化合物の一部の結晶形は多形として存在することができ、それらの全てが本発明の範囲内に含まれる。本発明の化合物の最も熱力学的に安定した多形体(1つ又は複数)が特に興味深いものである。
【００８３】
本発明の化合物の多形体は、X線粉末回折(XRPD)、赤外分光法(IR)、ラマン分光法、示差走査熱量測定(DSC)、熱重量分析(TGA)、及び固体核磁気共鳴(ssNMR)を含むがこれらに限らない、いくつかの慣用分析技術を用いて特性解析し、区別することができる。
【００８４】
前述のことから理解されるように、式(I)の化合物及びそれらの塩の水和物、異性体、及び多形体は、本発明の範囲内に含まれる。
【００８５】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩が有益な効果を奏する可能性がある疾患の例としては、アレルギー性疾患及び他の炎症性疾患（例えば、アレルギー性鼻炎及び喘息）、感染性疾患、並びに癌が挙げられる。式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、ワクチンアジュバントとしても使用できる可能性がある。
【００８６】
免疫反応のモジュレーターとして、式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、治療剤として、単独で又は他の化合物と組み合わせて、以下のような炎症性若しくはアレルギー性疾患を含むがそれらに限らない免疫介在疾患の治療及び/又は防止にも有用でありうる：例えば、喘息、アレルギー性鼻炎及び鼻結膜炎、食物アレルギー、過敏性肺疾患、好酸球性肺炎、遅延型過敏性疾患、アテローム性動脈硬化症、膵炎、胃炎、大腸炎、変形性関節炎、乾癬、サルコイドーシス、肺線維症、呼吸窮迫症候群、細気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎、嚢胞性線維症、光線性角化症、皮膚異形成、慢性蕁麻疹、湿疹及びあらゆるタイプの皮膚炎。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、疾患の防止(prevention)（又は予防(prophylaxis)）は、被験体が特定の疾患を発症する前に、被験体が疾患を発症する機会を減少させるために、又は被験体が疾患を発症した場合に疾患の重篤度を低減させるために、被験体において化合物、又は組成物を投与又は使用することを指す。したがって、防止又は予防は、治療される全ての被験体において疾患の発症を妨げない可能性もあるが、治療された被験体の群における疾患の発生又は重篤度は、未治療の被験体の対照群と比較して改善されるであろう。
【００８８】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩はさらに、気道ウイルス増悪及び扁桃腺炎を含むがこれらに限らない呼吸器感染症に対する反応の治療及び/又は防止にも有用でありうる。本化合物はまた、以下の疾患を含むがそれらに限らない自己免疫疾患の治療及び/又は防止にも有用でありうる：慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、強皮症、皮膚筋炎、糖尿病、移植片拒絶（移植片対宿主病を含む）、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限らない）。
【００８９】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩はさらに、以下のウイルスによって引き起こされる疾患を含むがそれらに限らない感染性疾患の治療に有用でありうる：肝炎ウイルス（例：B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、呼吸器系ウイルス（例：インフルエンザウイルス、RSウイルス(respiratory syncytial virus)、ライノウイルス、メタ肺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、SARS）、及び西ナイルウイルス。式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩はさらに、例えば細菌、菌類又は原生動物によって引き起こされる微生物感染症の治療にも有用でありうる。これらには、限定するものではないが、結核、細菌性肺炎、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、カンジダ症、ニューモシスチス症、ハンセン病、クラミジア症、クリプトコッカス症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、リーシュマニア症、マラリア、及びトリパノソーマ症が含まれる。
【００９０】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩はさらに、さまざまな癌の治療、特に免疫療法に応答することが知られている癌の治療にも有用でありうる。かかる癌としては、限定するものではないが、腎細胞癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌、黒色腫、白血病、リンパ腫及び卵巣癌が挙げられる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「被験体」は、哺乳動物被験体を含み、非霊長類の哺乳動物被験体、霊長類被験体、及びヒト被験体(ヒト被験者)を含む。本明細書中で使用される場合、疾患の治療法又は治療は、疾患に罹患している被験体の、疾患の症状を改善し、且つ/又は、予期される平均余命、又は無病生存期間を延長することができる、処置(action)を指す。本明細書での治療又は治療法への言及は、状態に応じて、被験体が疾患に罹患する又は疾患を発症するリスクを低減するための予防的治療にまで及びうる。
【００９２】
本明細書中に記載するとおり、式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、治療薬として有用である。
【００９３】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、都合のよい方法で投与するために製剤化することができる。
【００９４】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、例えば、経口、局所、吸入、鼻腔内、口腔、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、又は筋内）、又は直腸の投与のために製剤化されうる。一態様において、式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、経口投与用に製剤化される。さらなる態様では、式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、局所投与、例えば鼻腔内又は吸入の投与のために製剤化される。
【００９５】
経口投与用の錠剤及びカプセル剤は、以下のような慣用添加剤を含むことができる：結合剤、例えばシロップ、アラビアビム(acacia)、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプン糊、セルロース、若しくはポリビニルピロリドン; 充填剤、例えば乳糖、微結晶性セルロース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、若しくはソルビトール; 滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、若しくはシリカ; 崩壊剤、例えばジャガイモデンプン、クロスカルメロースナトリウム、若しくはグリコール酸デンプンナトリウム; 又は湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムなど。当技術分野でよく知られた方法により錠剤をコーティングしてもよい。
【００９６】
経口液体製剤は、例えば、水性若しくは油性の懸濁液剤、溶液剤、乳剤、シロップ剤又はエリキシル剤の形態にすることができ、また、水又は他の適切なビヒクルを用いて用時調製するための乾燥製品として提示することもできる。そのような液体製剤は以下のような慣用添加剤を含むことができる：懸濁化剤、例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース/糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、若しくは水添食用脂; 乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート、若しくはアラビアゴム; 非水性ビヒクル(食用油を含みうる)、例えばアーモンド油、分留ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコール、若しくはエチルアルコール; 又は防腐剤、例えばp-ヒドロキシ安息香酸メチル若しくはプロピル、若しくはソルビン酸。これらの製剤は、さらに、緩衝塩類、香味剤、着色剤、及び/又は甘味剤（例：マンニトール）を適宜含んでもよい。
【００９７】
経鼻投与用の組成物には、点滴により又は加圧ポンプにより鼻に投与される水性組成物が含まれる。適切な組成物は、そのために希釈剤又は担体として水を含む。肺又は鼻に投与するための組成物は、1種以上の添加剤、例えば1種以上の懸濁化剤、1種以上の防腐剤、1種以上の界面活性剤、1種以上の等張化剤、1種以上の共溶媒を含むことができ、また、組成物のpHを調整するための成分、例えば緩衝剤系を含むことができる。さらに、これらの組成物は、酸化防止剤、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び矯味剤のような他の添加剤を含んでもよい。組成物はまた、鼻又は他の気道領域にネブライゼーション（噴霧化）によって投与することもできる。
【００９８】
経鼻投与用の組成物は、式(I)の化合物(1つ又は複数)、又はその薬学的に許容される塩(1つ又は複数)を鼻腔（標的組織）の全域に送達することを可能にし、さらに、式(I)の化合物(1つ又は複数)、又はその薬学的に許容される塩(1つ又は複数)が、標的組織と接触したままで長期間とどまることを可能にするものである。経鼻投与用組成物の適切な投与方式は、患者が鼻腔をきれいにした後で鼻からゆっくり吸入することである。吸入中は、組成物を一方の鼻孔に投与して、その間他方の鼻孔を手で圧迫する。その後この手順を他方の鼻孔で繰り返す。一般には、上記の手順により鼻孔あたり1又は2回のスプレーを1日1、2又は3回、理想的には1日1回投与する。1日1回の投与に適する経鼻投与用組成物が特に興味深いものである。
【００９９】
懸濁化剤(1種又は複数種)は、もし含まれるならば、組成物の全重量に基づいて0.1〜5％(w/w)、例えば1.5％〜2.4％(w/w)の量で通常存在する。薬学的に許容される懸濁化剤の例としては、限定するものではないが、AVICEL(登録商標) (微結晶性セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム)、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ビーガム(veegum)、トラガカント、ベントナイト、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボポール、及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１００】
肺又は鼻に投与するための組成物は、1種以上の添加剤を含むことができ、1種以上の防腐剤を含めることによって微生物又は菌類による汚染及び繁殖から保護される。薬学的に許容される抗菌剤又は防腐剤の例としては、限定するものではないが、第4級アンモニウム化合物（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、塩化ラウラルコニウム、及び塩化ミリスチルピコリニウム)、水銀剤（例えば、硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、及びチメロサール）、アルコール剤（例えば、クロロブタノール、フェニルエチルアルコール、及びベンジルアルコール）、抗菌エステル（例えば、パラ-ヒドロキシ安息香酸のエステル）、キレート化剤、例えば、エデト酸ジナトリウム(EDTA)、並びに他の抗菌剤、例えば、クロルヘキシジン、クロロクレゾール、ソルビン酸及びその塩(例：ソルビン酸カリウム)、及びポリミキシンが挙げられる。薬学的に許容される抗菌剤又は防腐剤の例としては、限定するものではないが、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、プロピオン酸ナトリウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、及びブチルパラベンが挙げられる。防腐剤(1種又は複数種)は、もし含まれるならば、組成物の全重量に基づいて0.001〜1％(w/w)、例えば0.015％〜0.5％(w/w)の量で存在しうる。
【０１０１】
組成物（例えば、少なくとも1種の化合物が懸濁状態で存在する組成物）は、その組成物の水相への医薬粒子の溶解を促進するように機能する1種以上の界面活性剤を含むことができる。例えば、用いる界面活性剤の量は、混合中に起泡をおこさない量である。薬学的に許容される界面活性剤の例としては、脂肪族アルコール、エステル及びエーテル、例えばポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート（ポリソルベート80）、マクロゴールエーテル、及びポロキサマーが挙げられる。界面活性剤は、組成物の全重量に基づいて約0.01〜10％(w/w)、例えば0.01〜0.75％(w/w)、例えば約0.5％(w/w)の量で存在しうる。
【０１０２】
1種以上の等張化剤は、体液、例えば、鼻腔内の液体との等張性を達成するために加えられ、その結果、刺激性の程度が軽減される。薬学的に許容される等張化剤の例として、限定するものではないが、塩化ナトリウム、デキストロース、キシリトール、塩化カルシウム、グルコース、グリセリン、及びソルビトールが挙げられる。等張化剤は、もし存在するのであれば、組成物の全重量に基づいて0.1〜10％(w/w)、例えば4.5〜5.5％(w/w)、例えば約5.0％(w/w)の量で含めることができる。
【０１０３】
本発明の組成物は、適切な緩衝剤の添加により緩衝化することができ、かかる緩衝剤としては、例えばクエン酸ナトリウム、クエン酸、トロメタモール、リン酸塩、例えばリン酸二ナトリウム（例えば、12水和物、7水和物、2水和物、及び無水物）、又はリン酸ナトリウム、及びこれらの混合物がある。
【０１０４】
緩衝剤は、もし存在するのであれば、組成物の全重量に基づいて0.1〜5％(w/w)、例えば1〜3％(w/w)の量で含めることができる。
【０１０５】
矯味剤の例としては、スクラロース、スクロース、サッカリン又はその塩、フルクトース、デキストロース、グリセロール、コーンシロップ、アスパルテーム、アセスルファムK、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、グリチルリチン酸アンモニウム、タウマチン、ネオテーム(neotame)、マンニトール、メントール、ユーカリ油、ショウノウ、天然香味剤、人工香味剤、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０６】
1種以上の共溶媒は、医薬化合物(1つ又は複数)及び/又は他の添加剤の溶解を助けるために加えられうる。薬学的に許容される共溶媒の例としては、限定するものではないが、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、エタノール、ポリエチレングリコール（例えば、PEG300又はPEG400)、及びメタノールが挙げられる。一実施形態では、共溶媒がプロピレングリコールである。
【０１０７】
共溶媒(1種又は複数種)は、もし存在するのであれば、組成物の全重量に基づいて0.05〜30％(w/w)、例えば1〜25％(w/w)、例えば1〜10％(w/w)の量で含めることができる。
【０１０８】
吸入投与用の組成物には、水性、有機、若しくは水性/有機混合物、乾燥粉末、又は結晶性の組成物が含まれ、これらは、加圧ポンプ又は吸入器、例えば、貯蔵ドライパウダー吸入器、単位用量ドライパウダー吸入器、前計量型複数回用量ドライパウダー吸入器、鼻吸入器、又は加圧エアロゾル吸入器、ネブライザ、又はインサフレータによって気道に投与される。適切な組成物は、そのために希釈剤又は担体として水を含み、また、例えば緩衝剤、等張化剤などの慣用添加剤を含んでもよい。水性組成物はまた、鼻及び他の気道領域に、ネブライゼーション（噴霧化）によって投与することもできる。そうした組成物は、適切な液化噴射剤の使用により、加圧パック、例えば、定量吸入器から送達される水性溶液又は懸濁液又はエアロゾルでありうる。
【０１０９】
鼻に（例えば、鼻炎の治療のため）又は肺に局所投与するための組成物には、加圧ポンプにより鼻腔に送達される水性組成物、及び加圧エアロゾル組成物が含まれる。加圧せずに鼻腔への局所投与に適する組成物が特に興味深いものである。適切な組成物は、そのために希釈剤又は担体として水を含む。肺又は鼻投与用の水性組成物には、緩衝剤、等張化剤などの慣用添加剤を含めてもよい。水性組成物はまた、鼻に、ネブライゼーション（噴霧化）によって投与することもできる。
【０１１０】
流体ディスペンサは、一般に流体組成物を鼻腔に送達するために用いることができる。流体組成物は、水性でも非水性でもよいが、通常は水性である。そのような流体ディスペンサは、分注ノズル又は分注オリフィスを備えており、流体ディスペンサのポンプ機構にユーザーの力が加わると、そこから定量の流体組成物が分注される。そうした流体ディスペンサは、一般に複数回の計量した用量の流体組成物の貯蔵容器を備えており、それらの用量が連続ポンプ作動時に分注可能である。分注ノズル又はオリフィスは、鼻腔への流体組成物の噴霧分注のために、ユーザーの鼻孔に挿入するように構成することができる。上記タイプの流体ディスペンサは、国際特許出願公開番号WO 2005/044354 (Glaxo Group Limited)に記載され、説明されている。一実施形態では、その流体ディスペンサは、WO 2005/044354の図30〜40に示された一般的なタイプのものである。
【０１１１】
式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含む水性組成物はまた、国際特許出願公開番号WO2007/138084 (Glaxo Group Limited)において、例えばその図22〜46を参照して開示されるような、あるいはWO2011/098451(Glaxo Group Limited、GB0723418.0)において、例えばその図7〜32を参照して開示されるような、ポンプによって送達することもできる。そのポンプは、WO2011/098451の図1〜6に開示されるアクチュエータによって作動されうる。
【０１１２】
吸入により肺に局所送達するためのドライパウダー組成物は、例えば、吸入器又はインサフレータで用いるために、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジ、又は例えば積層アルミホイルのブリスターに入れて、提供することができる。パウダーブレンド組成物は、一般に、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩と、適切な粉末基剤（担体/希釈剤/賦形剤）、例えば単糖類、二糖類又は多糖類（例：乳糖、又はデンプン）との吸入用パウダーミックスを含む。ドライパウダー組成物はまた、薬物及び担体のほかに、さらなる添加剤（例えば、3成分剤(ternary agent)、例えば糖エステル、例えばセロビオースオクタアセテート、ステアリン酸カルシウム、又はステアリン酸マグネシウム）を含んでもよい。
【０１１３】
一実施形態において、吸入投与に適する組成物は、適切な吸入器具の内側に取り付けた医薬パック(1つ又は複数)に設けられた複数の密閉用量容器に組み入れることができる。それらの容器は、一つずつ、破れるか、剥がせるか、又は他のやり方で開くことができ、当技術分野で知られるように、その用量のドライパウダー組成物は、吸入器具のマウスピースで吸い込むことにより投与される。医薬パックは、さまざまな形状、例えば円板又は細長いストリップの形状をとることができる。代表的な吸入器具は、GlaxoSmithKline社から販売されているDISKHALER(商標)及びDISKUS(商標)である。
【０１１４】
ドライパウダー吸入組成物はまた、吸入器具内のバルク貯蔵容器に入れて供給することができ、その器具には、貯蔵容器から吸入チャネルに定量の組成物を計量するための計量機構が備わっており、計量された用量は、患者が吸入器具のマウスピースで吸い込むことにより吸入可能である。このタイプの市販器具の例は、TURBUHALER(商標)(AstraZeneca社)、TWISTHALER(商標)(Schering社)、及びCLICKHALER(商標)(Innovata社)である。
【０１１５】
ドライパウダー吸入組成物のさらなる送達方法は、定量の組成物をカプセルに入れて（カプセルあたり1回の用量を）提供することであり、そのカプセルは、一般には必要に応じて患者によって、吸入器具に投入される。その器具は、カプセルを破裂させるか、突き刺すか、又は他のやり方で開放する手段を備えており、結果として、患者が器具のマウスピースで吸い込むとき、用量を患者の肺に送り込むことができる。この種の器具の市販品の例として、ROTAHALER(商標)(GlaxoSmithKline社)及びHANDIHALER(商標)(Boehringer Ingelheim社)を挙げることができる。
【０１１６】
吸入に適する加圧エアロゾル組成物は、懸濁液又は溶液のいずれであってもよく、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩と、適切な噴射剤とを含むことができる。噴射剤は、例えば、フルオロカーボン若しくは水素含有クロロフルオロカーボン又はそれらの混合物、特にヒドロフルオロアルカン、とりわけ1,1,1,2-テトラフルオロエタン、1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロ-n-プロパン、又はそれらの混合物である。エアロゾル組成物は、場合により、当技術分野でよく知られた別の組成物用添加剤を含んでもよく、例えば、界面活性剤、例えばオレイン酸、レシチン、若しくはオリゴ乳酸、又はそれらの誘導体、例えばWO 94/21229及びWO 98/34596 (Minnesota Mining and Manufacturing Company)に記載されるもの、並びに共溶媒、例えばエタノールを含むことができる。加圧組成物は、一般にバルブ（例えば、定量バルブ）で閉じられ、マウスピースを備えたアクチュエータに内蔵される、キャニスタ（例えば、アルミ製キャニスタ）内に保持される。
【０１１７】
軟膏剤、クリーム剤及びゲル剤は、例えば、適切な増粘剤及び/又はゲル化剤及び/又は溶媒を添加した水性又は油性基剤を用いて製剤化することができる。こうして、そのような基剤は、例えば、水及び/又は油、例えば、液状パラフィン又は植物油、例えばラッカセイ油又はヒマシ油、あるいは溶媒、例えばポリエチレングリコールを含みうる。増粘剤及びゲル化剤は、基剤の性質に応じて使用することができ、軟パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、蜜蝋、カルボキシポリメチレン及びセルロース誘導体、及び/又はグリセリルモノステアレート及び/又は非イオン性乳化剤を含む。
【０１１８】
ローション剤は、水性又は油性基剤を用いて製剤化することができ、一般には1種以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、又は増粘剤をさらに含む。
【０１１９】
外用の粉末剤(powder)は、任意の適切な粉末基剤、例えばタルク、乳糖又はデンプンを用いて製剤化することができる。点滴剤は、1種以上の分散剤、可溶化剤、懸濁化剤又は防腐剤をも含む水性又は非水性基剤を用いて製剤化することができる。
【０１２０】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、例えば、活性成分を皮膚に送達するパッチ剤又は他の器具（例：加圧ガス器具）に構成することによって、経皮送達用に製剤化することができる。
【０１２１】
口腔投与用の組成物は、従来の方法で製剤化される錠剤又はロゼンジ剤の形態をとることができる。
【０１２２】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩はさらに、例えばカカオ脂又は他のグリセリドなどの慣用の座薬用基剤を含む、座薬としても製剤化することができる。
【０１２３】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩はさらに、ボーラス注射又は持続注入による非経口投与のために製剤化することができ、単位投薬形態で、例えばアンプル、バイアル、少量注入薬液、又はプレフィルドシリンジ(pre-filled syringes)として、あるいは防腐剤を添加した複数回用量容器(multidose containers)で提示される。かかる組成物は、水性若しくは非水性ビヒクル中の溶液、懸濁液又はエマルションのような形態をとることができ、酸化防止剤、緩衝剤、抗菌剤、及び/又は等張化剤などの処方用薬剤を含むことができる。あるいはまた、活性成分は、適切なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質フリーの水を用いて用時調製される粉末形態であってもよい。乾燥固体提示形態は、無菌粉末を個々の滅菌容器に無菌的に充填するか、又は無菌溶液を各容器に無菌的に充填して凍結乾燥することにより製造することができる。
【０１２４】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩はまた、アジュバントとしてワクチンと一緒に処方することができる。この種の組成物は、1種以上の抗体若しくは抗体フラグメント又は抗原成分（タンパク質、DNA、生きている若しくは死滅した細菌及び/又はウイルス、又はウイルス様粒子を含むが、これらに限らない）を、1種以上のアジュバント活性のある成分（アルミニウム塩、油性及び水性エマルション、熱ショックタンパク質、リピドA調製物及び誘導体、糖脂質、他のTLRアゴニスト、例えばCpG DNA又は類似物質、サイトカイン、例えば顆粒球単球コロニー刺激因子(GM-CSF)、又はインターロイキン-12(IL-12)又は類似物質を含むが、これらに限らない）とともに含むことができる。
【０１２５】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、単独で、又は他の治療薬と組み合わせて用いることができる。式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩、並びに他の薬学的に活性な薬剤(1種又は複数種)は、一緒に投与しても、又は別々に投与してもよく、別々に投与する場合は、投与を同時に行っても、又は任意の順序で連続して行ってもよい。式(I)の化合物(1つ又は複数)、又はその薬学的に許容される塩(1つ又は複数)、及び他の薬学的に活性な薬剤(1種又は複数種)の量、並びに相対的な投与タイミングは、所望の複合的治療効果が得られるように選択される。式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩と、他の治療薬との組み合わせの投与は、両方の化合物を含む単一の医薬組成物で、又は各組成物がいずれか一方の化合物を含む別個の医薬組成物で、同時に投与することにより組み合わせることができる。あるいはまた、その組み合わせを、別々に連続して投与してもよく、その場合には一方の治療薬を最初に投与して、他方を次に投与するか、又はその逆にする。こうした連続投与は、時間的に接近していても、又は離れていてもよい。
【０１２６】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、ウイルス感染の防止又は治療に有用な1種以上の薬剤と組み合わせて使用することができる。そのような薬剤の例には、限定するものではないが、以下が含まれる：ポリメラーゼ阻害剤、例えばWO 2004/037818-A1に開示されるもの、並びにWO 2004/037818及びWO 2006/045613に開示されるもの; JTK-003、JTK-019、NM-283、HCV-796、R-803、R1728、R1626、並びにWO 2006/018725、WO 2004/074270、WO 2003/095441、US2005/0176701、WO 2006/020082、WO 2005/080388、WO 2004/064925、WO 2004/065367、WO 2003/007945、WO 02/04425、WO 2005/014543、WO 2003/000254、EP 1065213、WO 01/47883、WO 2002/057287、WO 2002/057245に開示されるもの及び類似の薬剤; 複製阻害剤、例えばアシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビル、ラミブジン及び類似の薬剤; プロテアーゼ阻害剤、例えばHIVプロテアーゼ阻害剤のサキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ホスアンプレナビル、ブレカナビル、アタザナビル、チプラナビル、パリナビル、ラシナビル、及びHCVプロテアーゼ阻害剤のBILN2061、VX-950、SCH503034; 及び類似の薬剤; ヌクレオシド及びヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、例えばジドブジン、ジダノシン、ラミブジン、ザルシタビン、アバカビル、スタビジン、アデホビル、アデホビルジピボキシル、ホジブジン(fozivudine)、トドキシル(todoxil)、エムトリシタビン(emtricitabine)、アロブジン(alovudine)、アムドキソビル(amdoxovir)、エルブシタビン(elvucitabine)、及び類似の薬剤; 非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(例えばイムノカル(immunocal)、オルチプラズ(oltipraz)などの抗酸化活性を有する薬剤を含む)、例えばネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ(efavirenz)、ロビリデ(loviride)、イムノカル(immunocal)、オルチプラズ(oltipraz)、カプラビリン(capravirine)、TMC-278、TMC-125、エトラビリン(etravirine)、及び類似の薬剤; 侵入阻害剤、例えばエンフュービルタイド(enfuvirtide) (T-20)、T-1249、PRO-542、PRO-140、TNX-355、BMS-806、5-Helix及び類似の薬剤; インテグラーゼ阻害剤、例えばL-870、180及び類似の薬剤; 出芽阻害剤、例えばPA-344、及びPA-457、及び類似の薬剤; ケモカイン受容体阻害剤、例えばビクリビロック(vicriviroc) (Sch-C)、Sch-D、TAK779、マラビロック(maraviroc) (UK-427,857)、TAK449、並びにWO 02/74769、WO 2004/054974、WO 2004/055012、WO 2004/055010、WO 2004/055016、WO 2004/055011、及びWO 2004/054581に開示されるもの、及び類似の薬剤; ノイラミニダーゼ阻害剤、例えばCS-8958、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビル及び類似の薬剤; イオンチャネル遮断薬、例えばアマンタジン又はリマンタジン及び類似の薬剤; 並びに干渉RNA及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばISIS-14803及び類似の薬剤; 作用機序が確認されてない抗ウイルス剤、例えばWO 2005/105761、WO 2003/085375、WO 2006/122011に開示されるもの、リバビリン、及び類似の薬剤。式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩はさらに、ウイルス感染の防止又は治療に有用でありうる、例えば以下のような1種以上の他の薬剤と併用することもできる；免疫療法剤（例：インターフェロン又は他のサイトカイン/ケモカイン、サイトカイン/ケモカイン受容体モジュレーター、サイトカインアゴニスト又はアンタゴニスト、及び類似の薬剤）; 並びに治療用ワクチン、抗線維化剤、抗炎症剤、例えばコルチコステロイド又は非ステロイド系抗炎���薬(NSAID)及び類似の薬剤。
【０１２７】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患の防止又は治療に有用でありうる、例えば以下のような1種以上の他の薬剤と併用することができる；抗原免疫療法剤、抗ヒスタミン剤、ステロイド剤、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、気管支拡張剤(例：β2アゴニスト、アドレナリンアゴニスト(アドレナリン作動薬)、抗コリン薬、テオフィリン)、メトトレキセート、ロイコトリエンモジュレーター及び類似の薬剤; モノクローナル抗体療法剤、例えば抗-免疫グロブリンE(IgE)、抗-TNF、抗-IL-5、抗-IL-6、抗-IL-12、抗-IL-1及び類似の薬剤; 受容体療法剤、例えばエタネルセプト(entanercept)及び類似の薬剤; 抗原非特異的免疫療法剤（例：インターフェロン又は他のサイトカイン/ケモカイン、サイトカイン/ケモカイン受容体モジュレーター、サイトカインアゴニスト又はアンタゴニスト、TLRアゴニスト及び類似の薬剤）。
【０１２８】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、癌の防止又は治療に有用でありうる例えば以下のような1種以上の他の薬剤と併用することができる；化学療法剤、例えばアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、キナーゼ阻害剤及び類似の薬剤; モノクローナル抗体療法剤、例えばトラスツズマブ(trastuzumab)、ゲムツズマブ(gemtuzumab)及び他の類似の薬剤; 並びにホルモン療法剤、例えばタモキシフェン、ゴセレリン及び類似の薬剤。
【０１２９】
本発明による医薬組成物は、単独で、又は他の治療領域、例えば、胃腸疾患における少なくとも1種の他の治療薬と組み合わせて、使用することもできる。さらに、本発明による組成物は、遺伝子置換療法と組み合わせて用いることもできる。
【０１３０】
本発明は、さらなる態様において、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を少なくとも1種の他の治療活性薬とともに含む組み合わせを包含する。
【０１３１】
上記の組み合わせは、使用のために医薬組成物の形態で都合よく提示することができ、したがって、上記の組み合わせを、少なくとも1種の薬学的に許容される希釈剤又は担体とともに含む医薬組成物は、本発明のさらなる態様を表す。
【０１３２】
式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩の治療に有効な量(治療有効量)は、いくつかの要因に左右されうる。例えば、レシピエント被験体の種、年齢及び体重、治療を必要とする正確な病状及びその重症度、組成物の性質、並びに投与経路は全て、考慮されるべき要因である。治療有効量は、最終的に専門医師の判断により決定されるべきである。それでも、ヒトを治療するための本発明の化合物の有効量は、一般的に、0.0001〜100mg/kg(レシピエントの体重)/日の範囲内であるべきである。より一般的には、有効量は、0.001〜10mg/kg(体重)/日の範囲内であるべきである。こうして、70kgの成人について、1日あたりの実際の量の一例は、通常7〜700mgとなりうる。投与経路が経鼻及び吸入による場合、70kg成人の常用量は、1μg〜1mg/日の範囲内であるべきである。この量は、1日1回量として投与してもよいし、1日の合計量が同じになるように1日数回（例えば、2、3、4、5回又はそれ以上）の分割量(sub-dose)に分けて投与してもよい。式(I)の化合物の薬学的に許容される塩の有効量は、式(I)の化合物の有効量の比率として、又はその薬学的に許容される塩それ自体として決定することができる。同様の用量が、本明細書に記載の他の状態(疾患)の治療にも適している。
【０１３３】
式(I)の化合物、及びその薬学的に許容される塩は、任意の適切な頻度で、例えば、週に1〜7回投与することもできる。正確な投与レジメンは、当然のことながら、治療適応症、被験体の年齢及び状態、所定の投与経路などの要因によるだろう。
【０１３４】
医薬組成物は、単位用量あたり予め決められた量の活性成分を含む単位投薬形態で提示することができる。そうした単位は、非限定的な例として、治療される疾患、投与経路、患者の年齢、体重及び状態に応じて、0.5mg〜1gの式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を含有する。好適な単位投薬組成物は、本明細書中で上記したように、1日量又は分割量、あるいはその適切な一部の活性成分を含むものである。この種の医薬組成物は、製薬分野でよく知られた方法のいずれかにより製造することができる。
【０１３５】
こうしてさらに、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩と、1種以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体とを含む医薬組成物が提供される。
【０１３６】
また、式(I)の化合物、又はその薬学的に許容される塩と、1種以上の薬学的に許容される希釈剤又は担体とを混合するステップを含む、こうした医薬組成物の製造方法が提供される。
【０１３７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「含む」と、「含んでなる」や「含んでいる」などの変形語は、記載した整数若しくはステップ、又は整数のグループを含むことを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップのグループを除外することを意味するものではないことが理解されよう。
【０１３８】
オキソアデニン化合物、及びその塩の製造方法は、WO 2010/018134に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。式（I）の化合物を製造するための方法、及び6-アミノ-9-[5-(4-ピペリジニル)ペンチル]-2-[(1S)-1-メチルブチル]オキシ]-7,9-ジヒドロ-8H-プリン-8-オン、又はその薬学的に許容される塩を製造するための方法は、本明細書に記載されており、本発明のさらなる態様を構成する。
【実施例】
【０１３９】
実施例1：9位が置換されたオキソアデニンの合成
TLR7及びTLR8の活性化の場合、自然のウリジン及び/又はグアノシンに富むウイルスssRNAリガンドのいくつかの異なるクラスの低分子模倣体が同定されており、1H-イミダゾ[4,5-c]キノロン、及び8-ヒドロキシアデニンを含む。Heil, et al., Eur.J.Immunol. 2003, 33, 2987-2997、Hemmi, et al., Nat Immunol 2002, 3, 196-200、Lee, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2006, 103, 1828-1833、Gerster, et al., J.Med.Chem. 2005, 48, 3481-3491、Hirota, et al.,  J.Med.Chem. 2002, 45, 5419-5422を参照されたい。オキソアデニンの構造-活性関係の様々な評価がなされている。Isobe, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2003, 11, 3641-3647、Kurimoto, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2003, 11, 5501-5508、Kurimoto,et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2004, 12, 1091-1099、Isobe,et al., J.Med.Chem. 2006, 49, 2088-2095、Jin, et al.,  Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2006, 16, 4559-4563、Pryde, et al., R. Med.Chem.Commun. 2011, 2, 185-189、Kurimoto, et al., J.Med.Chem. 2010, 53, 2964-2972、Nakamura, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013, 23, 669-672、Weterings, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2009, 19, 2249-2251を参照されたい。
【０１４０】
本発明者らは、9位が非芳香族基で置換されたオキソアデニンについての構造-活性関係の研究に着手した。以前の研究では、いくつかの9-アルキル誘導体について検討しており、9位にアルキル（i-プロピル、ブチル、c-ペンチル、c-ヘキシル）を導入すると、活性が弱く、減少する結果になることを示唆していた(Hirota, et al.,  J.Med.Chem. 2002, 45, 5419-5422、Isobe, et al., J.Med.Chem. 2006, 49, 2088-2095)。本研究は、一連（一つのシリーズ）の7つの式Iのオキソアデニンの合成及び生物学的評価に焦点を当てた:
【０１４１】
【化７】
2017533925.tif 000009
(式中、R1は、n-ブトキシであり、R2は、ピペリジニルアルキル部分であり、ここで、炭素リンカーの長さは、0〜6個の炭素の範囲である):
【０１４２】
【化８】
2017533925.tif 000010
【０１４３】
これらの化合物（3a〜g）を、TLR7/8選択性及びサイトカイン誘導についてin vitroで評価した。化合物3aは炭素リンカーを有さず（n = 0）、3bは1つの炭素リンカーを有し（n = 1）、3cは2つの炭素リンカーを有し（n = 2）、3dは3つの炭素リンカーを有し（n = 3）、3eは4つの炭素リンカーを有し（n = 4）、3fは5つの炭素リンカーを有し（n = 5）、3gは6つの炭素リンカーを有する（n = 6）。
【０１４４】
9-ピペリジニルアルキルオキソアデニン3a〜gは、スキーム1に概説されるように、共通する後生的中間体(common advanced intermediate)(CAI)6を介して合成した(Tanji et al., Science 2013, 339, 1426-1429.)。CAI 6を、市販のジクロロプリン7から出発して、マルチ-10gmスケールにおいて、6ステップ(段階)で、> 50％の全体収率で、容易に調製した（スキーム2）。スキーム2では、ジクロロプリン7を、9-テトラヒドロピラニル誘導体として保護し、60℃で、イソプロパノール中の2MのNH3で処理することにより、6-位を置換し、2-クロロアデニン8を86％の収率で得た。100℃における8とn-ブタノール中のナトリウムtert-ブトキシドとの反応により、官能化されたアデニン9を85％の収率で得た。THP保護されたアデニン9を、8-臭素化、メトキシドによる臭素置換、及びトリフルオロ酢酸（TFA）によるTHP脱保護により、3ステップで、87％の全体収率で、CAI 6に変換した。ジメチルホルムアミド（DMF）中の炭酸カリウムの存在下における、CAI 6の様々なtert-ブチルオキシカルボニル（Boc）保護N-ピペリジニルブロミド5b〜gによるアルキル化、続いてBoc及びメチル基のジオキサン中の4NのHClによる酸性脱保護により、所望のオキソアデニン3b〜gを、41〜84％の収率で得た(スキーム1)。CAI 6のブロミド5aによるアルキル化は失敗し、代わりに、オキソアデニン3aを、70℃で、DIAD及びPPh3の存在下で、CAI 6とアルコール4aとのMitsunobu反応、続いて酸性脱保護によって38％の収率で調製した(スキーム1)。
【０１４５】
【化９】
2017533925.tif 000011
【０１４６】
化合物3aは炭素リンカーを有さず（n = 0）、3bは1つの炭素リンカーを有し（n = 1）、3cは2つの炭素リンカーを有し（n = 2）、3dは3つの炭素リンカーを有し（n = 3）、3eは4つの炭素リンカーを有し（n = 4）、3fは5つの炭素リンカーを有し（n = 5）、3gは6つの炭素リンカーを有していた（n = 6）。
【０１４７】
【化１０】
2017533925.tif 000012
【０１４８】
市販されていない場合は、ブロミド（5b〜d、f〜g）を、アッペル(Appel)条件（Ph3P/CBr4）を用いて、対応するアルコールの臭素化により、> 90％の収率で調製した。アルコール4f〜gは市販されておらず、ブロモピリジン8から、（i）10とアセチレンアルコール11f又は11gとのクロスカップリング、（ii）5% Rh/C触媒存在下における12f及び12gの水素による還元、並びに（iii）アミン基のBoc保護によって、3ステップで調製した(スキーム3):
【０１４９】
【化１１】
2017533925.tif 000013
【０１５０】
実施例2：オキソアデニン化合物3xの合成
式Iの別のオキソアデニン（化合物3x）を調製した:
【化１２】
2017533925.tif 000014
(式中、R1は、(1S)-1-メチルブトキシであり、R2は、ピペリジニルアルキル部分であり、ここで、炭素リンカーの長さは、5個の炭素である)。
【０１５１】
化合物3x:
【化１３】
2017533925.tif 000015
【０１５２】
また、オキソアデニン及びオキソアデニンの製造方法は、WO2010 / 018134に開示されており、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
オキソアデニン3xの合成を、スキーム4（さらに、図20も参照）に従い、下記の通りに実施した。中間体化合物1、2、40、41、42、及び43は、WO2010/018134にさらに記載されている（これらの中間体と同じ番号が、WO2010/018134で使用されているものと同様に、本明細書で使用される）。
【０１５４】
【化１４】
2017533925.tif 000016
【０１５５】
スキーム4に示すように、4-ブロモピリジン塩酸塩A（2.5g）を、1Nの水酸化ナトリウム（20ml）及び酢酸エチル（3×20ml）に分配した。有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮した。得られた油状物をTEA（2.6M）中に溶解し、窒素下で脱気した。4-ペンチン-1-オール(1.1当量)を添加し、続いて、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロリド（0.01当量）、及びヨウ化銅（I）（0.02当量）を添加し、反応混合物を、還流の状態で、20分間撹拌した。水性後処理(work-up)（酢酸エチル/水）及びシリカゲル上のクロマトグラフィー（グラジエント(勾配)0〜30％のヘプタン中の酢酸エチル）による精製によって、Bを82％の収率で得た。Bを酢酸（0.05M）中に溶解し、溶液を、H-CUBE（登録商標）連続フロー式水素化反応器（ThalesNano）（20％Pd(OH)2/Cカートリッジ、100バールH2、90℃、1mL/分）を使用して水素化した。
【０１５６】
水素化が完了したら、反応混合物を濃縮し、真空下で乾燥させた。得られた粗生成物をCH2Cl2（0.4M）中に溶解し、Et3N（1.5当量）及びジ-t-ブチルジカーボネート（1.2当量）と、室温で30分間反応させた。水性後処理（CH2Cl2/H2O）及びシリカゲル上のクロマトグラフィー（グラジエント0〜30％のヘプタン中の酢酸エチル）による精製の後に、Cを80％の収率で単離した: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) d 4.06 (s, 2H), 3.64 (t, 2H), 2.66 (t, 2H), 1.54-1.66 (m, 5H), 1.45 (s, 9H), 1.24-1.39 (m, 8H), 1.08 (m, 2H)。
【０１５７】
0℃で、CH2Cl2（0.45M）中のCの溶液に、CBr4（1.6当量）及びPPh3（1.2当量）をゆっくりと添加した（発熱反応）。5分後、反応混合物を室温まで温め、室温で45分間撹拌し、濃縮し、シリカゲル上のクロマトグラフィー（グラジエント0〜30％のヘプタン中の酢酸エチル）により直接精製して、Dを92％の収率で得た。
【０１５８】
DMF（0.25M）中の43の溶液に、K2CO3(325メッシュ、3.0当量)を添加し、反応混合物を数秒間超音波処理して、微細な懸濁液を得て、次いで60℃で1時間攪拌した。50℃に冷却後、D（1.2当量）を添加し、反応混合物を50℃で一晩撹拌した。室温に冷却し、水性後処理（酢酸エチル/水）した後、得られた粗生成物をシリカゲル上のクロマトグラフィー（グラジエント0〜10％のクロロホルム中のメタノール）により精製した。
【０１５９】
精製した生成物Eをメタノール（0.1M）中に溶解し、室温で、ジオキサン中の4N HCl（6.0当量）と1時間反応させた。反応混合物を濃縮し、真空下で乾燥させ、残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィー（0〜100%の、CHCl3/CH3OH/H2O 85/15/1.0中のCHCl3/CH3OH/H2O 90/10/0.5）により精製し、Fを64％の収率で得た（2ステップ）。1H NMR (400 MHz, CD3OD) ガンマ(gamma) 5.14 (m, 1H), 3.81 (t, 2H), 3.36/3.32 (m, 4H), 2.97(d of t, 2H), 1.92 (m, 2H), 1.75 (p, 2H), 1.72 (m, 1H), 1.57 (m, 2H)  1.5-1.3 (m,  14H), 0.95 (t, 3H); [M+H]+についてのポジティブ(positive) ES TOF-MS  計算値(calc) 391.28222、実測値(found) 391.0843。
【０１６０】
実施例3-スキーム4に示す中間体の製造
中間体化合物1、2、40、41、42、及び43(スキーム4及び図20を参照)は、WO2010/018134にさらに記載されており、これらの中間体と同じ番号が、WO2010/018134で使用されているものと同様に、本明細書で使用される。LCMSシステムA〜Dは、WO2010/018134に記載されているとおりである。
【０１６１】
中間体1: 2,6-ジクロロ-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン
【化１５】
2017533925.tif 000017
【０１６２】
2,6-ジクロロプリン(25.0g)(例えば、アルドリッチ(Aldrich)、英国から市販されている)に、酢酸エチル(260mL)を加え、続いてp-トルエンスルホン酸(0.253g)を加えた。混合物を50℃に加熱し、次いで3,4-ジヒドロ-2H-ピラン(16.8g)を加えた。次いで反応混合物を50℃で4時間加熱した。反応混合物を真空で蒸発させて、2,6-ジクロロ-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリンを黄色固体として得た(36.9g)。 
1H NMR (CDCl3):  δ8.35 (1H, s), 5.77 (1H, dd), 4.20 (1H, m), 3.79 (1H, m), 2.20-1.65 (6H, m)。
【０１６３】
中間体2: 2-クロロ-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン
【化１６】
2017533925.tif 000018
【０１６４】
2,6-ジクロロ-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン(36.9g)を、イソプロパノール中2Mアンモニア(250mL)と共に50℃で5時間加熱した。周囲温度で終夜置いた後、さらにイソプロパノール中2Mアンモニア(100mL)を加えて得られたケーキを粉砕し、反応が完結するまで反応混合物をさらに9時間加熱した。反応混合物に水(70mL)を加え、黄色固体を濾別した。固体をイソプロピルアルコール:水(5:1(容量/容量(v/v))、60mL)で洗浄し、次いで吸引下空気乾燥させて、最初の回収物を得た。終夜置いた後、濾液を再度濾過して沈殿物を単離し、両方の固体を真空で乾燥させた。最初の回収物は純品であり、第二の回収物は極少量の不純物を示した(孤立した幅広のシグナル3.5ppmが最初の回収物には見られなかった)が、他は同一であった。固体の最初の回収物(28.4g)、固体の第二の回収物(3.42g)。
1H NMR (CDCl3):  8.01 (1H, s), 5.98 (2H, 幅広 s), 5.70 (1H, dd), 4.16 (1H, m), 3.78 (1H, m), 2.15-1.60 (6H, mと重複)。
【０１６５】
中間体2（代替方法）: 2-クロロ-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン
【化１７】
2017533925.tif 000019
【０１６６】
乾燥酢酸エチル(200ml)中の2,6-ジクロロプリン(25g)(例えば、アルドリッチ(Aldrich)、英国から市販されている)の溶液に、p-トルエンスルホン酸1水和物(235mg)を加えた。反応物を50℃に加熱し、3,4-ジヒドロ-2H-ピラン(18.1ml)を一度に加えた。反応物を50℃で1時間撹拌させ、溶媒を減圧下で除去した。これにより黄色固体が得られた。イソプロパノール中の2.0Mアンモニア(460ml)中のこの固体(〜36g)の懸濁液を、冷却器を装着して、窒素下60℃で4時間加熱した。反応物を水(50ml)に注ぎ入れ、終夜冷却した。沈殿物を濾過し、回転蒸発器(60℃)で30分間乾燥させて、2-クロロ-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミンをオフホワイト固体として得た、31g(93%、2ステップ)。
(C10H12ClN5O)+のMS計算値=254、256
MS実測値(エレクトロスプレー):(M)+=254、256(3:1)
1H NMR ((CD3)2SO):  δ 8.43 (1H, s), 7.82 (2H, s), 5.55 (1H, dd), 4.00 (1H, m), 3.69 (1H, m), 2.21 (1H, m), 1.95 (2H, m), 1.74 (1H, m), 1.56 (2H, m).
【０１６７】
中間体40: 2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン
【化１８】
2017533925.tif 000020
【０１６８】
方法A
ナトリウムt-ブトキシド(48.5g、505mmol)を、(S)-2-ペンタノール(185ml)(例えば、ユーリッヒキラルソリューションズ(Julich Chiral Solutions)、ドイツより市販されている)に室温で少しずつ加え、均一になるまで撹拌した(反応は発熱であるので注意すること)。2-クロロ-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン(32g、126mmol)を加え、反応混合物を70℃で72時間加熱した。反応物を室温に冷却し、酢酸エチル(500ml)と水(500ml)との間で分配した。
【０１６９】
有機相を飽和塩化ナトリウム溶液(100ml)で洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、濾過し、蒸発させた。残渣をエーテルで摩砕し、固体物を濾過した。沈殿物をエーテルで再度洗浄し、濾液を合わせ、蒸発させた。粗製物(約30g)をDMSO:メタノール(1:1)中に溶解し、8カラム容量かけて、25〜65%アセトニトリル(+0.1%TFA)-水(+0.1%TFA)のグラジエントを用いる逆相(C18)カラム(330g)上でのクロマトグラフィーにより精製し、画分を飽和炭酸ナトリウム水溶液で直ちに中和した。適切な画分を合わせ、ジクロロメタンと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液との間で分配した。有機相を疎水性フリットに通すことにより乾燥させ、濾過し、蒸発させて、2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミンを淡クリーム色泡状物として得た(14.97g)。 
LCMS(システムB):tRET=2.21分;MH+306
【０１７０】
方法B
ナトリウムt-ブトキシド(206g、2.144mol)を、2リットルの丸底フラスコ中の(S)-2-ペンタノール(720ml、6.58mol)(例えば、ユーリッヒキラルソリューションズ(Julich Chiral Solutions)、ドイツより市販されている)に加えた。全てのナトリウムt-ブトキシドが溶解するまで、混合物を50℃で撹拌した。次いで2-フルオロ-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン(130g、548mmol)を5分かけて少しずつ加えた。
【０１７１】
3時間後、LCMS分析により、出発物が完全に消費されたことが示され、混合物を氷/水(3L)に注ぎ入れ、次いでメチルt-ブチルエーテルで抽出した。これにより乳濁液が形成され、セライトを通して混合物を濾過し、有機相を分離した。次いで水層を固体のNaClで処理し、次いでメチルt-ブチルエーテルで再度抽出した。有機抽出物を合わせ、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、次いで蒸発させて、2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミンを淡茶褐色ゴム状物として得た(158.59g)。
LCMS(システムD):tRET=2.65分;MH+306
【０１７２】
中間体41: 8-ブロモ-2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン
【化１９】
2017533925.tif 000021
【０１７３】
N-ブロモスクシンイミド(12.16g、68.3mmol)を、窒素雰囲気下、クロロホルム(80ml)中の2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン(14.9g、48.8mmol)の撹拌溶液に、<5℃で、5分かけて少しずつ加えた。反応混合物を<5℃で5時間撹拌し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液(80ml)で、次いで水(80ml)で洗浄した。泡状物をDCM(50ml)中に溶解し、水(50ml)で、次いでブライン(50ml)で洗浄した。合わせた水相をDCM(50ml)で洗浄した。合わせた有機層を疎水性フリットに通して乾燥させ、溶媒を真空で除去して、8-ブロモ-2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミンをオレンジ色泡状物として得た(18.5g)。
LCMS(システムD):tRET=3.06分;MH+384/386
【０１７４】
中間体42: 2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-8-(メチルオキシ)-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン
【化２０】
2017533925.tif 000022
【０１７５】
8-ブロモ-2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン(7.1g、18.48mmol)を無水メタノール(70ml)中に溶解し、メタノール(8ml)中のナトリウムメトキシドの溶液(25%)を窒素雰囲気下で滴下添加した。溶液を窒素雰囲気下、90℃で4時間加熱還流させた。さらにメタノール中のナトリウムメトキシド(25%溶液、3ml)を加え、反応物を60℃でさらに16時間撹拌した。更なる量のメタノール中のナトリウムメトキシド(25%溶液、5ml)を加え、反応物を90℃でさらに7時間撹拌した。溶媒を回転蒸発器上で除去し、粗生成物をEtOAc(75ml)と飽和塩化アンモニウム溶液(75ml)との間で分配した。有機層をブライン(75ml)で洗浄した。溶媒を回転蒸発器上で除去して、2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-8-(メチルオキシ)-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミンを淡オレンジ色泡状物として得た(6g)。
LCMS(システムD):tRET=3.08分;MH+336
【０１７６】
中間体43: 2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-8-(メチルオキシ)-9H-プリン-6-アミントリフルオロ酢酸塩
【化２１】
2017533925.tif 000023
【０１７７】
2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-8-(メチルオキシ)-9-(テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-アミン(6g、17.89mmol)をメタノール(50ml)中に溶解した。トリフルオロ酢酸(20.67ml、268mmol)を滴下添加し、混合物を窒素雰囲気下、2℃で72時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、得られた固体を酢酸エチルで洗浄し、濾過した。濾液を揮散させ、残渣を酢酸エチルで洗浄した。合わせた固体残渣を真空乾燥器中で2時間乾燥させて、2-{[(1S)-1-メチルブチル]オキシ}-8-(メチルオキシ)-9H-プリン-6-アミントリフルオロ酢酸塩をオフホワイトの固体として得た(5.3g)。 
LCMS(システムC):tRET=0.76分;MH+252
【０１７８】
オキソアデニンの製造における中間体として有用なさらなる化合物の調製、及びさらなるオキソアデニン化合物の調製は、WO2010/018134に記載されており、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
実施例4:凍結保存ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いるインターフェロン-アルファ誘導アッセイ
以下の方法を使用して、in vitro生物学的活性についてオキサデニン化合物を試験した。
【０１８０】
化合物の調製
化合物をDMSOに溶解した。DMSOを用いて連続2倍希釈液を調製し、0.25μlを384ウェルの透明Greinerポリプロピレンプレートに分注した。
【０１８１】
PBMCの調製
健康なヒトドナーから最大200mlの血液サンプルを採取した。Leucosepチューブに入れた15ml Ficollのグラジエントに25ml量の全血を重層し、1000gで20分間遠心した。血漿/histopaque界面にあるバンドの細胞を慎重に取り出し、PBSで2回洗浄した（400gで5分間遠心して回収した）。最終ペレットを凍結用媒体(90％加熱不活化血清、10％DMSO)中に再懸濁して4×107個/ml(cells/ml)の細胞濃度とした。その後、再懸濁した細胞を、速度制御フリーザーを用いて凍結保存（冷凍）し、−140℃で最大4ヶ月間貯蔵した。
【０１８２】
インキュベーション及びインターフェロン-アルファアッセイ
アッセイ直前に、凍結保存（冷凍）PBMCのバイアルを37℃の水浴で急速解凍した。細胞をトリパンブルーで1：10に希釈してカウントした。次にPBMCを増殖培地 [10％ウシ胎仔血清(invitrogen社)、ペニシリン＋ストレプトアビジン(Gibco社カタログ番号25030-024、1：50)、L-グルタミン2mM、及び1000単位/ml組換えヒトIFN-ガンマ(γ)(Preprotech社カタログ番号300-02)を含有するRPMI 1640]で1×106個/mlの密度に希釈し、50μl/ウェルを、0.25μlのDMSO又は0.25μlのDMSO中の試験化合物を加えたウェル(ポリプロピレンプレート中)に分注した。化合物の最高最終濃度は（高活性化合物についてカーブフィット(曲線適合)を得るため）通常50μM又は5μMとした。プレートを5％CO2、37℃で24時間インキュベートした。
【０１８３】
PBMC上清中のIFN-アルファを定量するためにマルチアイソフォーム・イムノアッセイを用いた。ヒトIFN-アルファに対するウサギポリクローナル抗体（カタログ番号31101、Stratech Scientific社）をアッセイ緩衝液（10％ウシ胎仔血清を含むRPMI 1640、Invitrogen社）で1：10000に希釈し、20μlをMSD (Meso-Scale Discovery、Gaithersburg、MD、USA)社のシングルスモールスポットGAR(ヤギ抗ウサギ抗体コーティング)ウェルプレートの各ウェルに加えた。そのプレートを激しく振とうしながら室温で1時間インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、20μlの細胞上清をプレートの各ウェルに添加した。その後プレートを激しく振とうしながら室温で1時間インキュベートした。IFN-アルファに対するモノクローナル抗体のペア（カタログ番号21100及び21112、Stratech Scientific社）をSULFO-TAG (商標)(MSD社)で標識し、アッセイ緩衝液で1：1000に希釈して、20μlをプレートの各ウェルに加えた。プレートを激しく振とうしながら室温で1時間さらにインキュベートした。PBSで3回洗浄した後、30μlの×2 T緩衝液(MSD社)を各ウェルに加えて、プレートをMSD Sector 6000プレートリーダーで読み取った。
【０１８４】
データは1μMのレシキモド(resiquimod) (n=16)及びDMSO (n=16)の内部プレート対照に対して標準化した。pEC50値は、試験化合物の2倍連続希釈11ポイントから、ActivityBaseソフトウェアのIRLS(反復再重み付け最小二乗法:iteratively reweighted least squares)を用いて4パラメータ・カーブフィットにより導いた。
【０１８５】
実施例5:新鮮なヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いるインターフェロン-アルファ及びTNF-アルファ誘導アッセイ
化合物の調製
化合物を、水中の2％グリセロール中に溶解し、10μMから開始して、5倍希釈で0.00013μMまで連続希釈する作業濃度にした。この化合物調製物を96ウェル平底プレートに10μlの容量で添加した。追加の10μlの培地をこれらのウェルに添加するか、又は共刺激が意図された場合には別の化合物調製物を添加した。
【０１８６】
PBMCの調製
ヒトドナーからの血液サンプルをヘパリン化した60ccシリンジに回収して、50mlの円錐培養管中で20mlのアリコートに分けた。次いで、全血アリコートを15mlのPBSで希釈し、次いで15mlのHISTOPAQUE（商標）の下に挿入した(underlay)。サンプルを800gで30分間連続的に遠心し、バフィーコート界面を注意深く取り出した。回収した細胞を1500rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのPBSに再懸濁した。細胞をプールし、PBS中でさらに2回洗浄して、サンプルから全てのHISTOPAQUE（商標）を取り出した。最後の洗浄後、合わせた細胞を、20mlの完全培地(10％v/vの加熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、100U/mlのペニシリンG、100μg/mlのストレプトマイシン、10mM L-グルタミンを補充したRPMI 1640)において培養し、Countess自動セルカウンター（Invitrogen, Life Technologies）を用いて計数し、最終濃度が2.8×106/mlになるように希釈した。この細胞懸濁液を、化合物調製物（上記参照）を含有する培養プレートに、180μlの容量で添加し、その結果、200μlの総ウェル容量になった。
【０１８７】
インキュベーション並びにインターフェロン-アルファ及びTNF-アルファのアッセイ
24時間のインキュベーション（37℃、95％空気、5％CO2）後、上清を慎重に取り出し、マルチプレックスキット(FLUOROKINE(商標)、R&D Systems [bio-techne]製のマルチプレックスキット、Minneapolis、MN)及びヒトIFNαVERIKINE（商標）ELISAキット（Pestka Biomedical Laboratories, Inc.、Piscataway、NJ）を使用して、サイトカイン/ケモカイン誘導についてアッセイした。
【０１８８】
実施例6:アトピーのボランティアから得た新鮮なヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いるアレルゲン誘導サイトカインアッセイ
アトピーのヒトドナーに由来する末梢血単核細胞(PBMC)をアレルゲン及び試験化合物と共培養することに基づくアッセイが開発された。5〜6日培養した後、細胞上清をさまざまなサイトカインについてアッセイした。
【０１８９】
化合物の調製
化合物をDMSOに溶解してから、増殖培地（100U/mlペニシリンG、100μg/mlストレプトマイシン、10mM L-グルタミンを補充したRPMI 1640培地）で連続希釈して、0.04％DMSOの存在下に4×所要濃度範囲を得た。各化合物は全ての濃度で3回反復してアッセイした。
【０１９０】
PBMCの調製
イネ科牧草Timothy grassに対してアレルギーがあることが分かっているボランティアから採取した脱線維素ヒト血液を2500rpmで15分間遠心した。上層の血清を回収して、56℃で30分間加熱不活化した（HI(加熱不活化)自己血清）。下層の細胞を50mlのPBS (+Ca +Mg)中に再懸濁し、25mlの希釈血液を、50mlチューブに入れた20mlのLYMPHOPREP(商標)の上に重層して、室温、2500rpmで、20分間遠心した。血清/LYMPHOPREP(商標)界面のバンドを慎重に取り出した。回収した細胞をPBSで洗浄し、HI-自己血清を含む増殖培地中に4×106/mlで再懸濁した。10μg/mlのTimothy grass抗原(Alk Abello社、Denmark)及び適切な濃度の試験化合物の存在下（全量200μl）の平底96ウェルプレートに、PBMCを0.4×106個/mlで播種した。
【０１９１】
インキュベーション及びサイトカインアッセイ
プレートを37℃、5％CO2で最大6日間インキュベートした。各ウェルから細胞培地を回収し、分析に先立って−20℃で保存した。上清中のサイトカイン及びケモカインは、ヒトTH1/Th2サイトカイン用のMESO SCALE DISCOVERY(商標)10スポットプレートを用いて検出した。
【０１９２】
実施例7:オキソアデニン3a〜3gのTLR7/8活性
オキソアデニン3a〜gのヒト（h）TLR7/8活性を、hTLR7又はhTLR8で、及びNFκB SEAP（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーターで、安定にトランスフェクトしたHEK293細胞を用いて、レポーター遺伝子アッセイによって評価した。
【０１９３】
ヒトTLR7又はTLR8、及びNFκB応答性SEAPレポーター遺伝子を発現するHEK293細胞は、InvivoGen（San Diego、CA）から入手した。これらの細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Invitrogen、Grand Island、NY）、10％ウシ胎児血清（FBS）（Sigma、St. Louis、Missouri）、及び選択抗生物質（Invitrogen及びInvivoGen）の培養培地中に維持した。安定にトランスフェクトされたHEK293細胞を96ウェル平底培養プレートに1E5/ウェルで播種し、200μMから開始して、2倍希釈で0.012μMまで連続希釈する（製剤条件がより低い開始濃度を必要としない限り）化合物の水性製剤の用量範囲で、24時間刺激した。培養上清を採取し、比色SEAP検出キットQUANTI-BLUE（InvivoGenの商標）を用いてNFκB活性化についてアッセイした。
【０１９４】
アッセイは、TLR7又はTLR8の特異的活性化後のNFκB媒介SEAP産生を測定した。オキソアデニン3a〜gのhTLR7及びhTLR8の特異性(specificity)及び効力（EC50）を図1A〜Cに示す。
【０１９５】
TLR7は、NFκB（炎症性サイトカインの誘導をもたらす）及びIRF7経路（IFN誘導をもたらす）の両方を介してシグナルを伝達し、HEKシステムは、TLR7シグナル伝達のNFκB側のみを測定するので、HEKアッセイは、TLR7を評価するのに最適ではないことに留意すべきである。オキソアデニン3aはhTLR7又はhTLR8に対して活性ではなかったが、他のオキソアデニン3b〜gは全て活性であった。リンカーの長さを1個の炭素よりも増加させると、hTLR7の効力が増加したが、このアッセイでは、炭素リンカーの長さとhTLR7の効力との線形相関は観察されなかった。5-炭素リンカーのオキソアデニン3fは、このシリーズの最も強力なhTLR7アゴニストであり、一方で、1-炭素リンカーのオキソアデニン3bは、このシリーズの最も強力なhTLR8アゴニストであり、hTLR8の効力は、より長い炭素リンカーでは有意に減少した(図1C参照)。
【０１９６】
より高い用量のオキソアデニン3e〜gによる刺激の後に観察されたhTLR8活性の喪失は、HEK293-hTLR8細胞における細胞毒性の可能性を示唆した。LIVE/DEAD(商標)fixable Aqua stainingを用いて、オキソアデニン3e〜gによるHEK293-hTLR8刺激後の潜在的な細胞死を評価した。有意な細胞毒性が、より高い用量のオキソアデニン3e〜gで観察された（データ示さず）。この細胞毒性は、より短い炭素リンカーであるオキソアデニン3b〜dによる24時間の刺激後には観察されなかった（データ示さず）。
【０１９７】
次に、オキソアデニン3e〜gによる24時間の刺激後のヒト末梢血単核細胞（hPBMC）におけるサイトカインの誘導を、サイトカインELISA及び細胞内サイトカイン染色（ICS）を用いて評価した。TNFαの誘導を図2Aに示す。炭素の長さの増加によるTNFα分泌の明らかな増加が観察され、5個の炭素リンカーにおいて、最大のTNFα分泌が観察された。
【０１９８】
さらに、ICSを用いて、別個の細胞サブセットの活性化状態及びサイトカイン寄与を評価した。骨髄系樹状細胞（mDC）において、同様のパターンが、IL-6（図2B）、TNFα及びIFNγの誘導を比較した場合に観察された。まとめると、これらのデータは、炭素リンカーが5個の炭素に増加するにつれて、炎症誘発性サイトカインが増加することを強く示唆している。6-炭素リンカーのオキソアデニン3gは、3fよりも少ないが、4-炭素リンカーであるオキソアデニン3eよりも多くのTNFαを誘導した。
【０１９９】
オキソアデニン3a〜gによる刺激の際のhPBMCからのIFNαの誘導もまた評価した。炭素リンカーの長さとhTLR7のED50値との間に観察される非線形の関係がHEK293システム（TLR7シグナル伝達のNFκB側を示す）においてオキソアデニン3a〜gにより得られたということから、hPBMCからのIFNα誘導が、これらの化合物のhTLR7活性をより忠実に代表すると予期された。IFNα発現の独特のパターンが、化合物3a〜gについて、観察された（図3）。
【０２００】
化合物3a〜gの各々は、不活性であったオキソアデニン3aを除いて、100μMの用量の範囲内でピークからベースまでの釣鐘形の用量応答曲線を示した。炭素リンカーの長さが増加したオキソアデニンは、最大のIFNα応答を得るために必要な用量がより低いことから示されるように、ますます強力なIFNα誘導物質であったが、より高いオキソアデニン濃度は、IFNαにおける用量応答の減少に関連した。同時に、同じ細胞培養上清中のTNFαレベルは用量依存的に増加した。pDCはIFNα分泌の> 90％を担う一次細胞型(primary cell type)であり、したがって、IFNαの活性化の大きさを制限するための制御性フィードバックループを介したTLR7-IRF7シグナル伝達経路の抑制、又は細胞型の特異的な活性化誘導細胞死（AICD）が、本研究で観察された独特のサイトカインパターンの原因である可能性がある。
【０２０１】
これらの仮説を評価するために、hPBMCを、様々な用量の3b（1-炭素リンカー）又は3f（5-炭素リンカー）で刺激し、細胞を、アネキシンV(Annexin-V)染色により活性化誘導アポトーシスについて評価した。3fは、pDCにおいてアネキシンV染色の用量依存的増加に関連したが、mDCにおいて関連しなかった。対照的に、3bの最高用量（10mM）のみは、pDC及びmDC両方のサブセットにおいてアネキシンV陽性細胞に関連した。この観測された細胞型の特異的アポトーシスは、用量依存的なIFNα及びTNFαの誘導曲線と相関した。
【０２０２】
IFNα誘導の際のpDCアポトーシスの効果をさらに確認するために、等モル量の3b及び3fによる共刺激をhPBMCにおいて評価した。予期される通り、高用量（〜0.3μM）の3f及び3bの併用では、3b単独と比較してIFNαピークが減少したが、一方で、低用量（〜0.003μM）の3f及び3bの併用では、3f単独によるIFNαピーク応答と変わらなかった（データ示さず）。概して、これらの結果は、炭素リンカーの1〜5個の炭素の増加により、pDCからのIFNα誘導の効力は増加するが、アポトーシスの用量閾値はmDCからのTNFα誘導をほとんど変化させずに低下することを実証する。
【０２０３】
要約すると、9位においてピペリジニルアルキル部分で置換された7つのオキソアデニン（3a〜3g）の構造-活性関係を研究した。hTLR7及びhTLR8の活性のためには、最低1-炭素リンカーが必要であった。このシリーズでは、5-炭素リンカーのオキソアデニンは、最も強力なhTLR7アゴニストであり、一方で、1-炭素リンカーは最も強力なhTLR8アゴニストであった。hPBMCにおける前炎症性サイトカイン及びIFNα誘導は、最大5個の炭素の炭素の長さの増加により増加し、5-炭素リンカーのオキソアデニンが最も強力なサイトカイン誘導物質であった。これらの結果は、軽度の構造改変を用いて、N-9に非芳香族基を有するオキソアデニンシリーズのhTLR7/8活性及びサイトカイン誘導を調節することが可能であることを示す。
【０２０４】
実施例8:化合物3xのTLR7及びTLR8の特異性及び効力
化合物3xは、研究した他のオキソアデニンと比較して、TLR7効力及びTLR7-バイアスアゴニスト活性が改善されていることが示されている。
【０２０５】
オキソアデニン3bに対して、化合物3f及び3xは、TLR7効力がそれぞれ50倍及び100倍高かった（図4A）が、TLR8活性は低かった（図4B）。C2置換基の影響は、3f及び3xを比較することにより理解できるように、C2-ブトキシ鎖の第1の炭素上に（S）-メチル基を導入することによって、TLR7及びTLR8の活性の両方が増加した。
【０２０６】
hPBMCにおけるサイトカイン誘導について評価した場合、化合物3f及び3xは、高い効力（より低いED50）及びTNF-アルファ応答を示した（図5）。他の前炎症性サイトカインについても同じ結果が観測された（データ示さず）。
【０２０７】
化合物3f及び3xのHEK293アッセイで見られる低いTLR7のED50に基づいて予期されるように、両方のオキソアデニンは、非常に低用量（〜1nMの範囲）でIFN-アルファを誘導した（図6）。
【０２０８】
図7は、ICSによって測定された、オキソアデニンによるIFN-アルファ誘導を示す。サイトカイン誘導を、IFN-アルファについて陽性である生存pDC細胞の全体に対する割合(percent of total)によって分析した。用いた用量は、360ピコモル、11ナノモル、330ナノモル、及び10マイクロモルであった。
【０２０９】
他のオキソアデニンにより以前に観察されたように（WO2010/018134参照）、IL12-p70におけるAGP CRX601との相乗効果は、イミダゾキノリン化合物CRX642（WO2010/048520; PCT/US2009/061867; US8,624,029参照）とCRX601との組み合わせと比較して、比較的低かった。しかしながら、化合物3x及び3fは、幅広い用量範囲にわたって、CRX601と相乗作用を示した（図8A及び8B）。
【０２１０】
上記のデータを表2にまとめる。化合物3xにおける、その低いTLR7のED50及び高い相対的IFN-アルファ及びIL-12p70誘導について注目されたい。
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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