(57)【要約】逆相遠心分離を用いた、調製物、および濃縮ミトコンドリア調製物を生成する方法が開示される。この方法は、閉鎖底管を遠心分離するステップを含み、前記閉鎖底管は、回転軸に近位の管の部分のミトコンドリア懸濁液を含む重相、および回転軸に遠位の管の部分の軽相を含む。遠心分離は、懸濁液が重層と軽層との間の界面で濃縮ミトコンドリア層を形成することをもたらし、この界面の流体は回収されて、濃縮ミトコンドリア調製物を生成する。濃縮ミトコンドリア調製物は、体外受精用途を含む様々な用途に使用することができる。
2017536839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
濃縮ミトコンドリア調製物を生成するための方法であって、
（ａ）閉鎖底管を遠心分離するステップであって、前記閉鎖底管が、
（ｉ）回転軸に近位の前記管の部分のミトコンドリア懸濁液を含む重相、
（ｉｉ）回転軸に遠位の前記管の部分の軽相、および
（ｉｉｉ）前記重相と前記軽相との間の相界面
を含み、前記閉鎖底管が、前記ミトコンドリア懸濁液中のミトコンドリアが前記軽相と前記重相との間の前記界面に前記重相中の濃縮ミトコンドリア層を形成するのに十分なスピードおよび時間で、前記軽相および前記重相の反転をもたらすことなく、遠心分離される、ステップと、
（ｂ）前記濃縮ミトコンドリア層の少なくとも一部を含む所定の体積の流体を回収して、前記濃縮ミトコンドリア調製物を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
濃縮ミトコンドリア調製物を生成するための方法であって、
（ａ）ミトコンドリア懸濁液を含む所定の体積の第１の流体を開放底管に引き入れるステップと、
（ｂ）所定の体積の第２の流体を前記管に引き入れるステップであって、前記第２の流体が、前記第１の流体より濃くなく、これにより前記管の一部分の前記第１の流体およびミトコンドリア懸濁液を含む重相、前記管の別の部分の前記第２の流体を含む軽相、ならびに前記重相と前記軽相との間の相界面を形成する、ステップと、
（ｃ）前記軽相に近位の前記管の末端を密閉して、閉鎖底管を形成するステップと、
（ｄ）前記閉鎖底管を、前記密閉した末端を回転軸に対して遠位に、遠心分離機に入れるステップと、
（ｅ）前記ミトコンドリア懸濁液中のミトコンドリアが前記軽相と前記重相との間の前記界面に前記重相中の濃縮ミトコンドリア層を形成するのに十分なスピードおよび時間で、前記軽相および前記重相の反転をもたらすことなく、前記閉鎖底管を遠心分離するステップと、
（ｆ）前記濃縮ミトコンドリア層の少なくとも一部を含む所定の体積の流体を回収するステップであって、前記濃縮ミトコンドリア調製物を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項３】
前記第２の流体が前記管に引き入れられる前に、前記第１の流体が前記管に引き入れられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記重相が、水性相である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記重相が、細胞の化学的、機械的、または音波による溶解、続く遠心分離により得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記軽相が、有機相である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記軽相が、生体適合性油を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記軽相の生体適合性油が、鉱油、パラフィン油、軽油、細胞培養油、およびＩＣＳＩ油からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記濃縮ミトコンドリア調製物が、１ピコリットル当たり少なくとも１個のミトコンドリアの濃度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記濃縮ミトコンドリア調製物が、１ピコリットル当たり１〜１０，０００個のミトコンドリアのミトコンドリア濃度を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記管が、１μｍ未満の前記重相と前記軽相との間の前記界面の内径を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記管が、１０，０００Ｇ未満の速度で遠心分離される、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記管が、７，５００〜１２，５００×Ｇの速度で遠心分離される、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記所定の体積の前記第２の流体を前記開放底管に引き入れた後、前記軽相に近位の前記管の部分を、前記軽相を含む部分を横切って熱融着して、閉鎖底管を形成する、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記管が、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、塩化ポリビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびナイロンからなる群から選択される材料を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記濃縮ミトコンドリア調製物中の前記ミトコンドリアの少なくとも９０％が、機能的である、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
１ピコリットル当たり少なくとも１個のミトコンドリアを含む溶液を含む、濃縮ミトコンドリア調製物。
【請求項１８】
前記溶液が、１ピコリットル当たり１〜１０，０００個のミトコンドリアを含む、請求項１７に記載の濃縮ミトコンドリア調製物。
【請求項１９】
所定の体積の生体適合性油をさらに含む、請求項１７に記載の濃縮ミトコンドリア調製物。
【請求項２０】
前記ミトコンドリアの少なくとも９０％が、機能的である、請求項１７に記載の濃縮ミトコンドリア調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１４年１２月８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／０８９，１１８号に基づく利益を主張しており、この仮特許出願の内容は、その全体が参考として援用される。
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物細胞からのミトコンドリアの回収、ミトコンドリアの濃縮、および濃縮ミトコンドリア調製物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
ミトコンドリアは、ほとんどの真核細胞で見られる膜結合細胞小器官である。ミトコンドリアは、直径が０．５μｍ〜１．０μｍの範囲にある。ミトコンドリアは、ほとんどの細胞内事象にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形態でエネルギーを提供する。また、ミトコンドリアはまた、イオンホメオスタシス、プログラム化細胞死、および適応熱産生で重要な機能を有する。ミトコンドリア機能障害は、いくつかの病態生理学的プロセス、例えば加齢、神経変性疾患、糖尿病、肥満、および不妊に関係付けられている。加齢は、特に非複製細胞、例えば成熟卵母細胞におけるミトコンドリア機能の低下と関連付けられ、ミトコンドリア機能の低下は、高齢女性における受胎能の減退の１つの原因と考えられている。
【０００３】
細胞ＤＮＡのほとんどは細胞核に含有されているが、ミトコンドリアはそれ自体の独立したゲノムを有する。加えて、核染色体ＤＮＡとは異なり、各ミトコンドリアに複数コピーのミトコンドリアゲノムがあり、体細胞内の１つの細胞小器官当たり、平均５つのｍｔＤＮＡゲノムがある。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、呼吸および酸化的リン酸化に関連するポリペプチドのための１３個の遺伝子を含む、３７個の遺伝子をコードする母性遺伝二重鎖環状ゲノムである。ヒト分裂中期の卵母細胞は、１００，０００〜２００，０００個のミトコンドリアを有すると見積もられている。Ｔｚｅｎｇら、（２００４年）、Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．、８２巻（Ｓ２）、Ｓ５３。真核生物核ＤＮＡとは異なり、ｍｔＤＮＡは、非コードイントロンおよびヒストンを欠き、ミトコンドリアのマトリックス内の高濃度の活性酸素種（ＲＯＳ）およびフリーラジカルによる損傷をより受けやすい。ＲＯＳへの長期持続曝露の結果として、卵母細胞ミトコンドリアは、ｍｔＤＮＡ変異および欠損を蓄積する。加齢と共に、ミトコンドリアゲノムのＲＯＳへの曝露が増大し、これはミトコンドリア機能を損ない、卵母細胞におけるエネルギー使用可能性の低下をもたらす。
【０００４】
加齢卵母細胞で生殖結果を改善するために、ミトコンドリア濃縮物を卵母細胞に注入してミトコンドリア機能を向上させ、これにより受精率を増大させ、かつ／または胚発生を増強する試みが行われてきた。例えば、若齢マウスの卵母細胞からのミトコンドリアが、高齢の成熟卵母細胞に移された。Ｐｅｒｅｚら、（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３巻、５００〜１頁。しかしながら、非自家性細胞からのミトコンドリア移植は、ミトコンドリアのヘテロプラスミー（すなわち、同じ細胞内の異なるミトコンドリアゲノム）および異常なマウス表現型をもたらした。ヒトでの、若齢ドナーの卵子から、高齢患者からの低質の卵母細胞への卵細胞質移植（すなわち、ミトコンドリアを含む卵母細胞の細胞質の移植）を行う試みは、このアプローチがその子孫でミトコンドリアのヘテロプラスミーをもたらしたために、中止された。Ｂｒｅｎｎｅｒら、（２００１年）、Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．、７４巻、５７３〜８頁；Ｂａｒｒｉｔら、（２００１年）、Ｈｕｍ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、１６巻、５１３〜１６頁。自家性細胞から卵母細胞へのミトコンドリア移植は、ドナーおよびレシピエントｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーの問題を避けるであろう。
【０００５】
先行技術のミトコンドリア回収方法は、より低濃度のミトコンドリアを有するミトコンドリア調製物、ならびに／またはあまり精製されていないミトコンドリアの調製物、ならびに／または例えば、ミトコンドリア外膜の完全性が破壊され、および／もしくはミトコンドリアの呼吸および／もしくはエネルギー生成機能が部分的に損失した、高割合の損傷ミトコンドリアを生成した。それゆえ、当技術分野では、高割合の機能的ミトコンドリアを有する濃縮ミトコンドリア調製物を調製するためのより優れた方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｚｅｎｇら、（２００４年）、Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．、８２巻（Ｓ２）、Ｓ５３
【非特許文献２】Ｐｅｒｅｚら、（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３巻、５００〜１頁
【非特許文献３】Ｂｒｅｎｎｅｒら、（２００１年）、Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．、７４巻、５７３〜８頁
【非特許文献４】Ｂａｒｒｉｔら、（２００１年）、Ｈｕｍ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、１６巻、５１３〜１６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、部分的には、染料、発色団、発蛍光団、または他の物理的、化学的もしくは代謝的マーカーを使用することなく、ミトコンドリアを回収および濃縮する方法の発見に依存する。特に、本方法は逆相遠心分離を利用し、ここでミトコンドリア含有重相は回転軸の近位に残り、軽相は遠位に残り、相境界の濃縮ミトコンドリア調製物の回収を可能にする。ミトコンドリア調製物は、濃縮の程度および高いミトコンドリア機能により特徴付けられ、これは先行技術に優る。
【０００８】
濃縮ミトコンドリア調製物は、体外受精のための卵母細胞へのミトコンドリア移植のための使用（「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ」（商標）またはＡＵＧＭＥＮＴ（商標）、ＯｖａＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含む、様々な用途に使用することができる。ＡＵＧＭＥＮＴ（商標）プロセスは、哺乳動物雌性生殖幹細胞もしくは卵原幹細胞（ＯＳＣ）からのミトコンドリア、またはＯＳＣの子孫から得たミトコンドリアを含む組成物を自家性卵母細胞に移植し、それによりＩＶＦまたは人工授精のための卵母細胞を調製することを含む。ＡＵＧＭＥＮＴ（商標）プロセスは、２０１２年４月１３日出願のＷＯ２０１２／１４２５００、表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ」に記載されており、当該出願はその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００９】
一態様では、本開示は、濃縮ミトコンドリア調製物を生成するための方法であって、
（ａ）（ｉ）回転軸に近位の管の部分のミトコンドリア懸濁液を含む重相、
（ｉｉ）回転軸に遠位の管の部分の軽相、および
（ｉｉｉ）重相と軽相との間の相界面
を含む、閉鎖底管を遠心分離するステップを含む方法に関する。これらの方法において、閉鎖底管は、ミトコンドリア懸濁液中のミトコンドリアが軽相と重相との間の界面に重相中の濃縮ミトコンドリア層を形成するのに十分なスピードおよび時間で、軽相および重相の反転をもたらすことなく、遠心分離される。この方法は、（ｂ）濃縮ミトコンドリア層の少なくとも一部を含む所定の体積の流体を回収して、濃縮ミトコンドリア調製物を生成するステップをさらに含む。
【００１０】
別の態様では、本開示は、（ａ）ミトコンドリア懸濁液を含む所定の体積の第１の流体を開放底管に引き入れるステップを含む、濃縮ミトコンドリア調製物を生成するための方法に関する。この方法は、（ｂ）所定の体積の第２の流体を管に引き入れるステップであって、第２の流体が、第１の流体より濃くなく、これにより管の一部分の第１の流体およびミトコンドリア懸濁液を含む重相、管の別の部分の第２の流体を含む軽相、ならびに重相と軽相との間の相界面を形成する、ステップをさらに含む。この方法は、（ｃ）軽相に近位の管の末端を密閉して、閉鎖底管を形成するステップと、（ｄ）閉鎖底管を、密閉した末端を回転軸に対して遠位に、遠心分離機に入れるステップとをさらに含む。この方法は、（ｅ）ミトコンドリア懸濁液中のミトコンドリアが軽相と重相との間の界面に重相中の濃縮ミトコンドリア層を形成するのに十分なスピードおよび時間で、軽相および重相の反転をもたらすことなく、閉鎖底管を遠心分離するステップをさらに含む。この方法は、（ｆ）濃縮ミトコンドリア層の少なくとも一部を含む所定の体積の流体を回収して、濃縮ミトコンドリア調製物を生成するステップをさらに含む。
【００１１】
一部の実施形態では、開示される方法において、第２の流体が管に引き入れられる前に、第１の流体が管に引き入れられる。
【００１２】
一部の実施形態では、開示される方法において、重相は、水性相である。
【００１３】
一部の実施形態では、開示される方法において、重相は、細胞の化学的、機械的、または音波による溶解、続く遠心分離により得られる。
【００１４】
一部の実施形態では、開示される方法において、軽相は、有機相である。
【００１５】
一部の実施形態では、開示される方法において、軽相は、生体適合性油を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、開示される方法において、軽相の生体適合性油は、鉱油、パラフィン油、軽油、細胞培養油、およびＩＣＳＩ油からなる群から選択される。
【００１７】
一部の実施形態では、開示される方法において、濃縮ミトコンドリア調製物は、１ピコリットル当たり少なくとも１個のミトコンドリアの濃度を有する。
【００１８】
一部の実施形態では、開示される方法において、濃縮ミトコンドリア調製物は、１ピコリットル当たり１〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり１００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり１５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり２００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり２５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり３００〜１００，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり４００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり４５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり５００〜１０，０００個のミトコンドリアのミトコンドリア濃度を有する。
【００１９】
一部の実施形態では、開示される方法において、管は、１μｍ未満の重相と軽相との間の界面の内径を有する。
【００２０】
一部の実施形態では、開示される方法において、管は、１０，０００Ｇ未満の速度で遠心分離される。
【００２１】
一部の実施形態では、開示される方法において、管は、７，５００〜１２，５００×Ｇの速度で遠心分離される。
【００２２】
一部の実施形態では、開示される方法において、所定の体積の第２の流体を開放底管に引き入れた後、軽相に近位の管の部分を、軽相を含む部分を横切って熱融着して、閉鎖底管を形成する。
【００２３】
一部の実施形態では、開示される方法において、管は、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、塩化ポリビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびナイロンからなる群から選択される材料を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、開示される方法において、濃縮ミトコンドリア調製物中のミトコンドリアの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％％が、機能的である。
【００２５】
別の態様では、本開示は、１ピコリットル当たり少なくとも１個のミトコンドリアを含む溶液を含む濃縮ミトコンドリア調製物に関する。
【００２６】
一部の実施形態では、開示される調製物で、溶液は、１ピコリットル当たり１〜１０，０００個のミトコンドリアを含む。一部の実施形態では、開示される調製物で、溶液は、１ピコリットル当たり１〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり１００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり１５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり２００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり２５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり３００〜１００，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり４００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり４５０〜１０，０００個のミトコンドリア、および１ピコリットル当たり５００〜１０，０００個のミトコンドリアを含む。
【００２７】
一部の実施形態では、開示される調製物で、調製物は、所定の体積の生体適合性油をさらに含む。
【００２８】
一部の実施形態では、開示される調製物で、ミトコンドリアの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％が機能的である。
【００２９】
本開示のこれらおよび他の態様および実施形態は例示であり、以下に説明する。他のシステム、プロセス、および特徴は、以下の図面および詳細な説明を考察すれば、当業者には明らかとなる。全てのかかる追加のシステム、プロセス、および特徴は、本明細書に含まれ、本発明の範囲内であり、付属の特許請求の範囲により保護されることが意図される。
【００３０】
以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定することを意味しない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、濃縮ミトコンドリア調製物を生成するための方法の一部の実施形態を示す模式図である。
【００３２】
【図２】図２は、濃縮ミトコンドリア調製物を生成するための方法の他の実施形態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（詳細な説明）
本開示は、哺乳動物細胞からのミトコンドリアの回収、ミトコンドリアの濃縮、および濃縮ミトコンドリア調製物の使用に関する。
【００３４】
（定義）
本明細書で使用する全ての科学用語および技術用語は、以下に別に定義されない限り、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有することが意図される。本明細書で使用される技術についての参照は、本分野で通常理解される技術を指すことが意図され、それらの技術に対する変形もしくは均等物の置換物または当業者に明らかな後に発展した技術を含む。加えて、より明らか、かつ簡潔に本発明の主題を説明するために、明細書および付属の特許請求の範囲で使用されるある特定の用語について以下の定義を示す。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、遠心分離についての「逆相」という用語は、より濃くない、またはより軽い流体相が回転軸に遠位の遠心分離管の部分（「底部」）にあり、より濃い、またはより重い流体が回転軸に近位の遠心分離管の部分（「上部」）にあることを意味する。より濃い、または重い相は典型的には遠心分離後、管の遠位部分にあるので、軽相が遠位末端にあり、重相が近位末端にある場合、これらの相は「逆」と呼ばれる。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「重相」という用語は、遠心分離管中の他方の相より単位体積当たり、より濃い、またはより重い、同じ管中の流体層を指す。「重い」および「より濃い」という用語は、本明細書で互換的に使用される。２つの流体相での遠心分離で、重相は多くの場合、水性であるが、必ずしもそうではない。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「軽相」という用語は、遠心分離管中の他方の相より単位体積当たり、より濃くない、またはより軽い、同じ管中の流体層を指す。「より濃くない」および「より軽い」という用語は、本明細書で互換的に使用される。２つの流体相での遠心分離で、軽相は多くの場合、有機性（例えば油）であるが、必ずしもそうではない。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「水性相」という用語は、水が主要溶媒であるが、水と混和性の他の極性成分が存在し得る、流体相を指す。また、水性相は、様々な溶質および懸濁粒子を含むことができる。とりわけ、本発明では、水性相はミトコンドリアを含み得る。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「有機相」という用語は、実質的に非極性の有機分子が主要溶媒であるが、主要有機溶媒と混和性である他の非極性成分が存在し得る、流体相を指す。また、有機相は、様々な溶質および懸濁粒子を含むことができる。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「閉鎖底管」という用語は、流体を受容し、遠心分離の間それらを保持することができる任意の容器を意味する。閉鎖底管は、様々な形状を有することができ、遠心分離管、試験管、試料管、密閉管、バイアル、キュベット、密閉ピペットなどを含む、様々な用語で呼ぶことができる。閉鎖底管は、開放底管の一末端を密閉することにより、例えば管の一末端を施栓すること、圧着すること、または熱融着することにより生成してもよい。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「体外受精」という用語および「ＩＶＦ」という略語は、卵母細胞が女性の体外で受精する任意の補助生殖技術を指す。ＩＶＦは、透明帯の除去を伴うか、または伴わない、ペトリ皿またはウェルを有するプレートなどの容器内で卵母細胞を精子と混合して、受精を可能にする手順、および卵母細胞への卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）を含む手順を含む。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「生体適合性」および「薬学的に許容される」という用語は、物質が、哺乳動物に投与される場合、それが存在する濃度で生きている細胞または細胞小器官に対して非毒性であり、生理学的に忍容され、重度のアレルギー、発熱性反応、または同様の所望されない反応を生成しないことを意味する。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「担体」という用語は、化合物が共に投与される希釈剤、アジュバント、添加剤、またはビヒクルを指す。生体適合性担体または薬学的に許容される担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物、または合成起源の油を含む油、例えば鉱油、植物油などである場合がある。水または他の水性溶液、生理食塩水、水性デキストロース、およびグリセロール溶液は、特に注射溶液のための担体として使用することができる。好適な担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、ＥＷ  Ｍａｒｔｉｎ（編）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ．で説明されている。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」という用語は、引用される数量の１０パーセント（１０％）内を意味する。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「増大した」または「減少した」という用語は、参照する状態に対して、それぞれ、少なくとも１０％多い、または少ないことを意味する。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、文脈が明らかに別に示さない限り、「ａ」という用語は、１つまたは複数を意味する。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、文脈が明らかに別に示さない限り、「または」という用語は、および／または（ａｎｄ／ｏｒ）を含み、いずれか／または（ｅｉｔｈｅｒ／ｏｒ）に限定されないことを意味する。
【００４８】
（一般論）
本発明は、部分的には、ミトコンドリアを回収および濃縮するための方法の開発による。一部の実施形態では、この方法は、より大きな百分率のミトコンドリアを損傷または損失したいくつかの先行技術方法よりも多くの無傷の生存可能なミトコンドリアを有する濃縮ミトコンドリア調製物の生成を提供する。加えて、一部の実施形態では、方法は、ミトコンドリア濃度が先行技術で達成される濃度よりも大きいミトコンドリア調製物の生成を提供する。加えて、この方法は、例えば、発色団、発蛍光団、抗体、または他の検出可能および選択可能マーカーでミトコンドリアをタグ付けすることなく、濃縮ミトコンドリア調製物の生成を提供する。加えて、この方法は、発色団、発蛍光団、抗体、または他の検出可能および選択可能マーカーなどの分子タグを実質的に含まない濃縮ミトコンドリア調製物の生成を提供する。
【００４９】
（逆相遠心分離）
本発明は、濃縮ミトコンドリア調製物を生成するために逆相遠心分離を使用する。本発明の方法は、管の上部（すなわち、回転軸に近位の管の部分）のミトコンドリア懸濁液を含む重相、管の底部（すなわち、回転軸に遠位の管の部分）の軽相、および重相と軽相との間の相界面が存在する、閉鎖底管の遠心分離を含む。
【００５０】
管を、ミトコンドリア懸濁液中のミトコンドリアが、軽相と重相との間の界面で重相中の濃縮ミトコンドリア層を形成するのに十分なスピードおよび時間で遠心分離する。しかしながら、遠心分離のスピードおよび時間は、軽相および重相の、それらの通常の構成（すなわち、底部の重相および上部の軽相）への反転を防ぐために制御されなければならない。当業者に明らかなように、相反転の可能性は、遠心分離スピード（すなわち、Ｇ力の増大）、遠心分離時間の増大、遠心分離管直径の増大、ならびに重相および軽相の密度差の増大と共に増大する。スピード、時間、直径、および密度の適切な組合せの決定は、ルーチン実験のみを必要とするにすぎない。
【００５１】
細胞全体から濃縮ミトコンドリア調製物を生成する全体的なプロセスでは、相対遠心力（ＲＣＦ）または遠心分離「スピード」の様々な異なる値を使用することができる。例えば、細胞全体の沈降では、ＲＣＦ値は、５００〜１，５００Ｇの範囲内であってもよい。溶解後、５００〜１，５００Ｇの範囲内のＲＣＦでの第１の沈降を、ミトコンドリアを沈降させることなく、より大きな細胞小器官または膜断片を沈降させるために使用してもよい。上清を取り出した後、上清を再び遠心分離し、このときは５，０００〜１２，５００Ｇ（例えば７，０００〜１０，０００Ｇ）の範囲内のＲＣＦで、ペレット中にミトコンドリアを含む粗画分を生成することができる。ペレットを再懸濁し、５，０００〜１２，５００Ｇの範囲内のＲＣＦで複数回沈降させて、ミトコンドリアペレットの純度を改善することができる。最後に、逆相遠心分離のために、ミトコンドリアペレットを重相中に再懸濁し、７，５００〜１２，５００Ｇ（例えば１０，０００Ｇ）の範囲内のＲＣＦで再び遠心分離して、相境界に濃縮ミトコンドリアペレットを生成することができる。
【００５２】
遠心分離後、濃縮ミトコンドリア層の少なくとも一部を含む、所定の体積の流体を回収して、濃縮ミトコンドリア調製物を生成する。この層は、例えば重相と軽相との間の界面のミトコンドリア層をピペッティングにより回収することができる。ミトコンドリア層のみを回収することが好ましいが、少量の軽相を回収することは、ある特定の用途には許容される。例えば、以下に記載するように、ＩＶＦ治療と関連する卵母細胞へのミトコンドリア移植を含む用途では、濃縮ミトコンドリア調製物を、プレートまたは皿上に置き、蒸発を防ぐために有機流体層（例えばＩＣＳＩ油）で被覆する場合がある。したがって、かかる用途では、少量の軽相流体は、重相流体から分離し、被覆有機流体に溶け込む可能性が高い。
【００５３】
一部の実施形態では、閉鎖底管は、遠心分離のための逆相の調製の間に形成される。したがって、一部の実施形態では、本発明の方法は、ミトコンドリア懸濁液を含む所定の体積の第１の流体を開放底管に引き入れるステップと、その後、所定の体積の第２の流体を管に引き入れるステップとを含む。第１および第２の流体は、それぞれ、管の一部分の第１の流体およびミトコンドリア懸濁液を含む重相、ならびに管の別の部分の第２の流体を含む軽相を形成し、重相と軽相との間の相界面を画定する。軽相に近接する管の末端は、その後、閉鎖底管を形成するように密閉される。一部の実施形態では、管は、軽相を横切って密閉される（すなわち、軽相の一部分が管から排除されるように、密閉を軽相内に創出する）。
【００５４】
次いで、このようにして形成した閉鎖底管を、閉鎖末端を回転軸に対して遠位に、遠心分離機に入れてもよく、上記に説明するように遠心分離して、濃縮ミトコンドリア層を生成してもよい。濃縮ミトコンドリア調製物は、その後、上記に説明するように、濃縮ミトコンドリア層を回収することにより得られる。
【００５５】
（ミトコンドリア懸濁液および重相流体）
ミトコンドリア懸濁液は、本分野で公知の任意の標準の手段により調製することができる。例えば、細胞全体（例えば新たに得た細胞、または解凍した凍結細胞）を化学的または機械的に溶解して、細胞質を放出させてもよく、粗溶解物はミトコンドリア懸濁液とみなすことができる。しかしながら、好ましくは、粗溶解物は、調製物を精製するためにさらに加工され、その後、本発明の逆相遠心分離を使用する。
【００５６】
ミトコンドリア単離の先行技術方法は、例えばＴｚｅｎｇら、（２００４年）、Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．、８２巻（Ｓ２）、Ｓ５３；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、（２００７年）、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．、１４巻、６１６〜６２４頁；およびＳｈｕｆａｒｏら、（２０１２年）、Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．、９８巻（１号）、１６６〜７２頁で見ることができる。これらの方法は、第１のミトコンドリア懸濁液を生成するために使用することができ、その後、本発明の逆相遠心分離法を適用することができる。あるいは、ミトコンドリア懸濁液は、実質的に以下の実施例に記載の通り調製することができる。
【００５７】
一部の実施形態では、ミトコンドリア懸濁液は、水性懸濁液である。一部の実施形態では、水性懸濁液は、例えばマウス胚試験（ＭＥＡ）に合格した注射用水（ＷＦＩ）により生成される非発熱性、高純度等級水（例えばＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）もしくは均等物（例えばＷａｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａ．Ｒ．Ｔ．）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＳＡ、  Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）または他の生体適合性もしくは薬学的に許容される担体（例えばデキストロース、ショ糖、グリセロール、クエン酸塩）を含む。
【００５８】
一部の実施形態では、ミトコンドリア懸濁液は、単離された卵原幹細胞（ＯＳＣ）から生成される。ＯＳＣは、例えばＷＯ２００５／１２１３２１、米国特許第７，９５５，８４６号、および同第８，６５２，８４０号に記載の通り得ることができる。
【００５９】
（遠心分離管）
本発明の遠心分離管は、遠心分離の間の相の反転を防ぐのに十分に小さい内径を有する任意の閉鎖底管であってもよい。一部の実施形態では、閉鎖底管は、（重相および軽相をロードする前または後に）一末端で密閉した、ピペットもしくはマイクロピペットまたは回収管である。
【００６０】
管は、少なくとも１μｌ、５μｌ、１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、４０μｌ、または５０μｌの液体体積を保持することができ、最大１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、５００μｌ、またはそれ超のより大きな体積を保持してもよい。
【００６１】
一部の実施形態では、管は、１μｍ、１０μｍ、２０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、または１００μｍ、最大１５０μｍ、もしくはそれ超の（相境界で測定した）内径を有する。一部の実施形態では、（相境界で測定した）内径は、２５〜２５０μｍ、５０〜１５０μｍ、または７５〜１００μｍである。内径は一定である必要はないこと、および先細管が本発明における使用に企図されること（例えば以下の実施例に記載する８０μｍ  Ｆｌｅｘｉｐｅｔ（登録商標）マイクロピペット（Ｃｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＩＮ））に留意されたい。
【００６２】
管は、ガラス、プラスチック、および／または任意の半可撓性管材料から作製することができる。本明細書で使用されるとき、「プラスチック」という用語は、重合により生成され、形状およびフィルムに成型するか、押出すか、またはキャスティングすることができる、様々な合成または半合成有機固体のいずれかを意味する。プラスチック材料として、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、塩化ポリビニル（ＰＶＣ）、塩化ポリビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびナイロンを含む様々なものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、例えば閉鎖底管は、ポリカーボネートピペット（例えばＦｌｅｘｉｐｅｔ（登録商標）マイクロピペット、Ｃｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＩＮ）またはガラスピペット（例えばＤｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｒｏｏｍａｌｌ、ＰＡ）の底を密閉することにより形成される。
【００６３】
一部の実施形態では、閉鎖底管を、１つまたは複数の他の管、スリーブ、ストロー状のもの、ホルダー、またはアダプター（例えば遠心分離管）内に置いて、遠心分離機のローターアセンブリ内でそれを保持および／または保護してもよい。
【００６４】
（軽相流体）
軽相が重相と相境界を形成することができ、この重相が使用される遠心分離スピードでミトコンドリアが軽相に入ることを防ぐという必要条件で、本発明の軽相流体は、様々な有機化合物の１つまたは複数を含んでもよい。一部の実施形態では、軽相流体は、鉱油（例えばＣＡＳ  ８０４２−４７−５、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；ＳＡＧＥ  Ｍｅｄｉａ  Ｏｉｌ  ｆｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、カタログ番号ＡＲＴ−４００８、ＯＲＩＧＩＯ  Ａ／Ｓ、Ｍａｌｏｖ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、軽油、パラフィン油、および米国ＦＤＡにより販売承認（例えば５１０（ｋ）受理）を受けた任意の他の体外受精（ＩＶＦ）培養油（例えばＩＣＳＩ油）を含むが、これらに限定されない、１つまたは複数の生体適合性油を含む。単独または組合せで使用することができる、等張溶液より高い重量オスモル濃度を有する他の有機流体として、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）溶液、ショ糖およびショ糖ポリマー（例えばＦｉｃｏｌｌ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）溶液、コロイドシリカ粒子（例えばＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）溶液などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
一部の実施形態では、軽相流体は、２５０ＯｓＭを超える重量オスモル濃度を有する。
【００６６】
（濃縮ミトコンドリア調製物）
別の態様では、本発明は、本発明の方法に従って生成される濃縮ミトコンドリア調製物を提供する。一部の実施形態では、濃縮ミトコンドリア調製物中のミトコンドリアは、１ピコリットル当たり少なくとも１個のミトコンドリアの濃度を有する。一部の実施形態では、開示される調製物で、溶液は、１ピコリットル当たり１〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり１００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり１５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり２００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり２５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり３００〜１００，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり４００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり４５０〜１０，０００個のミトコンドリア、および１ピコリットル当たり５００〜１０，０００個のミトコンドリアを含む。一部の実施形態では、濃縮ミトコンドリア調製物中のミトコンドリアの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％が、機能的である。
【００６７】
「機能的ミトコンドリア」は、生物学的に活性なミトコンドリアを指す。濃縮ミトコンドリア調製物中の機能的ミトコンドリアのパーセントは、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）ＡＴＰアッセイ、チトクロームＣ放出測定、呼吸速度の測定によるもの、および／または目視検査によるものを含む、本分野で公知の方法を用いることにより決定することができる。一部の実施形態では、ミトコンドリア分析は、機能的ミトコンドリアのパーセントを決定するために濃縮ミトコンドリア層上で行われる。
【００６８】
目視検査は、遠視野蛍光顕微鏡の使用を含むことができ、様々な顕微鏡技術および特異的蛍光プローブを、ミトコンドリアを染色するために使用してもよく、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の使用、ナノスコピーまたは超解像度蛍光、高解像度電子顕微鏡、および電子顕微鏡トモグラフィーが挙げられる。Ｍａｒｉｎ−Ｇａｒｃｉａ、（２０１３年）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ＵＳ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００６９】
ミトコンドリア機能を査定するための様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏアプローチとして、分光光度酵素アッセイ、ＡＴＰ生成の生物発光測定、および酸素消費のポーラログラフ測定が挙げられる。電気泳動技術は、ミトコンドリア機能を査定するために使用することができる。例えば、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および続くウェスタン免疫ブロッティングは、ミトコンドリアタンパク質の含有量を分析するために使用することができる。特異性および感度が高い免疫検出法は、電気泳動技術の使用を高める。ミトコンドリアタンパク質に対する様々な特異的抗体は、免疫細胞化学分析およびウェスタン免疫ブロット分析の両方で使用することができる。これらの抗体は、ＡＴＰ合成酵素サブユニット、チトクロームｃおよびチトクロームｃ酸化酵素、ＰＧＣ−１、ならびにｍｔＴＦＡを含む。
【００７０】
以下の実施例は、本発明を実施する一部の好ましい様式を例示するが、請求される発明の範囲を限定するとは意図されない。代替の材料および方法は、同様の結果を得るために利用することができる。
【実施例】
【００７１】
（実施例１）
（ミトコンドリア懸濁液の生成）
（組織解離）
凍結した卵巣生検からの組織を、ミトコンドリア源として使用した。本分野で公知の組織解離手順を行った。細胞ソーティングを除いて、全てのステップは、本分野で周知の適切な無菌技術を用いて、バイオセーフティキャビネット内で行った。
【００７２】
３枚の４ウェルプレートを得た。４ウェルプレートの各々で、ウェルのうちの３つは「１」、「２」、および「３」と表示した。材料源１つにつき、１枚のプレートを指定した。１０００μＬマイクロピペットを用いて、以下の表中の体積当たり、凍結保存媒体および保持媒体を、各プレートの各ウェルに添加し、ピペッティングで３〜５回上下させることにより穏やかに混合した。
【表１】
2017536839.tif 000003
【００７３】
以下の材料を調製した。１瓶の３．６３６ＫＵ／ｍＬ  ＤＮＡＳＥ  Ｉ；１瓶の４００Ｕ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＭＴＦ  Ｃ／Ｔキットからの２０００ＭＴＦ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）；および１瓶の１ｍｇ／ｍＬサーモリシン（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＭＴＦ  Ｃ／Ｔキットから；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）。「ＢＳＳ／ＤＮＡＳＥ／Ｌｉｂｅｒａｓｅ溶液」と表示したＣ管を、以下の表の明細を用いて調製した。
【表２】
2017536839.tif 000004
【００７４】
管を、さらなる使用まで３７±１℃の水浴に入れた。ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含まない１０ｍＬのＨＢＳＳの溶液を、５０ｍＬ円錐管に一定分量入れ、さらなる使用まで３７±１℃の水浴に入れた。
【００７５】
適切な数のバイアルを、液体窒素中に沈めた。全ての組織バイアルを、周囲温度で６０秒間空気解凍することにより同時に解凍した。６０秒間の空気解凍後、バイアルを３７．０℃±１．０℃の水浴中で１２０秒間同時にインキュベートした。バイアルを消毒した。滅菌鉗子を用いて、組織材料源の各片を、バイアルから事前に調製した４ウェル培養プレートの各々のウェル番号１に移した。１片の組織を各プレートに入れ、媒体中に完全に沈め、材料源を各表示したウェル番号１中で１０分間保持した。材料源を各表示したウェル番号１から各表示したウェル番号２に移し、媒体中に完全に沈め、表示したウェル番号２の各々の中で１０分間保持した。材料源を各表示したウェル番号２から各表示したウェル番号３に移し、媒体中に完全に沈め、各表示したウェル番号３中で５分間保持した。材料源の全ての片を、ＨＢＳＳ／ＤＮＡＳＥ／Ｌｉｂｅｒａｓｅ溶液を含有するＣ管に移した。
【００７６】
Ｃ管を組織解離機（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ＤＥ）に移し、組織を製造業者の指示に従って解離した。
【００７７】
（細胞ソーティング手順）
卵巣組織試料から高百分率の機能的ミトコンドリアを含む細胞を得るために、ＶＡＳＡタンパク質に対する抗体を、卵巣生検組織中に存在する他の細胞から、卵原幹細胞（ＯＳＣ）をソートするために使用した。
【００７８】
ガラス製５ｍＬセロロジカルピペットを用いて、解離細胞混合物を、５０ｍＬ円錐管上に置いた７０μｍセルストレーナーに移した。Ｃ管を、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含まない４ｍＬの温めたＨＢＳＳですすいだ。すすぎ量をストレーナーに通した。次に、５０ｍＬ円錐管からの６．７５ｍＬの細胞懸濁液を、「濾過細胞１／２（Ｆｉｌｔｅｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  １  ｏｆ  ２）」と表示した１５ｍＬ円錐管に移し、等体積を「濾過細胞２／２（Ｆｉｌｔｅｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ２  ｏｆ  ２）」と表示した１５ｍＬ円錐管に入れた。管を、１２００相対遠心力（ＲＣＦ）で周囲温度（範囲：１８．０〜２２．０℃）にてブレーキをオフ（０）にして１０分間遠心分離した。上清の大部分を取り出し、「第１の上清」と表示した５０ｍＬ円錐管に移した。残留の量（およそ５００μＬ）を各管からマイクロピペットで取り出した。
【００７９】
濾過細胞１／２中のペレットを、２５０μＬの２％ブロック溶液を用いて再懸濁した。細胞懸濁液を、濾過細胞２／２の管中のペレットに移した。濾過細胞１／２の管を、２５０μＬの２％ブロック溶液を用いてすすいだ。すすぎ量を、濾過細胞１／２の管に移し、ペレットを再懸濁した。細胞懸濁液の見える塊を観察した。塊がピペッティング後に見えた場合、細胞を必要に応じて再濾過した。
【００８０】
第２の濾過細胞の管中の体積を測定し、記録した。２４０μＬ体積の１％洗浄溶液を、「細胞カウント」と表示した１．５ｍＬ微量遠心管に添加した。細胞懸濁液を再懸濁し、１０μＬの細胞を１．５ｍＬの細胞カウントの管に移した。
【００８１】
細胞ソーティングを、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて行った。５００μＬ体積の１％洗浄溶液を、ラインを清浄化するために使用した。細胞カウントの管を、試料ローダーに入れ、試料をおよそ２分間得た。細胞数を本分野で公知の方法を用いて計算した。全細胞数が７×１０６細胞より多い場合、試料を半分に分けるためのステップを行い、試料の半分を凍結保存し、残りの試料を染色し、細胞ソーティングに使用した（以下を参照のこと）。全細胞数が７×１０６細胞より少ないか、またはこれと等しい場合、細胞を２％ブロック溶液と共に室温で２０分間インキュベートした。
【００８２】
一次抗体の一定分量を解凍し、２００×ｇ（ＲＣＦ）で周囲温度（２０℃±２．０℃）にてブレーキを高（９）に設定して１分間遠心分離して、量がバイアルの底に含有されていることを確実にした。再懸濁した細胞ペレット（「第１のペレット」）から２μＬの体積を取り出し、「陰性対照」と表示した新しい１５ｍＬ円錐管に移した。５ｍＬ体積の１％洗浄溶液を、陰性対照の管に添加した。
【００８３】
計算した体積の抗体を、第１のペレット管に添加し、十分に混合した。管を暗条件で室温にて１５分間インキュベートした。５ｍｌ体積の１％洗浄溶液を、「抗体標識」細胞と表示した１５ｍｌ管に添加した。抗体標識細胞および陰性対照を、両方とも１２００×ｇ（ＲＣＦ）で周囲温度（２０．０℃±２．０℃）にてブレーキを高（９）に設定して５分間遠心分離した。
【００８４】
「抗体標識細胞第１の上清」および「陰性対照上清」を含有する管を調製した。マイクロピペットを用いて、抗体標識細胞を含有する１５ｍＬ円錐管から上清を取り出し、適切に表示した１５ｍＬ円錐管に移した。抗体標識細胞を、３７５μＬの１％洗浄溶液を用いて再懸濁した。細胞懸濁液を、「抗体染色細胞」と表示した１．５ｍＬ微量遠心管に移した。抗体染色細胞を再懸濁した。細胞懸濁液を観察し、塊が見える場合、細胞を必要に応じてストレーナーを用いて再濾過した。
【００８５】
マイクロピペットを用いて、陰性対照の円錐管から上清を取り出し、適切に表示した１５ｍＬ円錐管に移した。陰性対照の管中の細胞ペレットを、５００μＬの１％洗浄溶液を用いて再懸濁し、陰性対照と表示した１．５ｍＬ微量遠心管に移した。
【００８６】
５００μＬ体積の１％洗浄緩衝液を、「ＶＡＳＡ＋細胞」と表示した新しい１５ｍＬ円錐管に一定分量入れた。５００μＬ体積の１％洗浄緩衝液を、「すすぎ２」と表示した別の１５ｍＬ円錐管に一定分量入れた。「陰性対照」、「抗体染色細胞」、「すすぎ２」、および「ＶＡＳＡ＋細胞」の管を、細胞ソーティングに使用した。
【００８７】
細胞ソーティングを、Ｓｏｎｙ  ＦＡＣＳ機を用いて、事象限界が１０，０００になるように記録規則範囲を設定して、行った。２つの空の１５ｍＬ円錐管を、ソート回収ホルダーに入れ、左右のソートゲートを「細胞」に設定した。停止限界を５００事象に設定した。陰性対照細胞を再懸濁し、試料ローディング領域にロードした。試料圧力を変えることにより、事象速度を１秒当たり２００〜２０００事象を達成するように調節した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７検出器設定で少しの調節を行い、事象が１０２〜１０３であることを確実にした。細胞ゲートを、後方散乱（ＢＳＣ）対前方散乱（ＦＳＣ）プロットで事象のおよそ９０％を包含するように調節した。ＶＡＳＡ＋ゲート（陽性染色細胞を反映する）を、非染色集団のいずれも含まないように必要に応じて調節した。
【００８８】
陰性対照試料を、試料管ホルダーから取り出し、置いておいた。必要に応じて、チップ整列およびソート較正を再び行い、続いてプローブおよび試料ライン滅菌を行った。１５ｍＬ円錐管を取り出し、ＶＡＳＡ＋の管を１％洗浄溶液と共に、ソートチャンバーの左ソーティング位置に挿入した。記録規則範囲を、事象カウントが２，０００であり、試料停止状態が「記録」であるように設定した。ゲートを各々、「全事象」に設定した。１読み取り当たり１５００〜２０００カウントを維持するように圧力を変動させた。すすぎ２の管を試料管ホルダー上にロードし、ラインを洗浄溶液で清浄化した。抗体染色細胞の管を再懸濁し、試料管ホルダー上にロードした。抗体染色細胞を得、事象を登録した。点プロット（ＡＦ６４７対ＢＳＣ）を観察することにより、事象がＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７検出器内であることを確認した。データ取得を確認した。抗体染色細胞をローディング領域から取り出し、光から保護した領域で保存した。
【００８９】
染色細胞集団を評価した。特異的および非特異的染色細胞集団を表す集団は、点プロット（ＡＦ６４７対ＢＳＣ）で見られた。陽性集団が見られることを確実にするように調節を行った。ＶＡＳＡ＋ゲートを、ソート前試料ゲートの主要なより高い強度の染色細胞集団を包含するようにＸ軸（ＡＦ６４７）に沿って移動させた。
【００９０】
記録規則事象限界を、１０，０００，０００に変えた。ソート限界を０（停止限界なし）に変え、ソート様式を「Ｙｉｅｌｄ」に変えた。左側のソートゲートをＶＡＳＡ＋ゲートとして選択した。ＶＡＳＡ＋細胞の管が回収ホルダーの左側に置かれていることを確認した。ラインを「すすぎ２」洗浄溶液で清浄化した。抗体染色細胞の管中の細胞を再懸濁し、管を試料管ホルダー上にロードし、試料管が完全に使い尽くされるまで細胞をソートした。ソート中、事象速度を１秒当たり２００〜２０００事象で維持するように、圧力を調節した。ソートしたＶＡＳＡ＋画分を含有する１５ｍＬ  ＦＡＣＳ管を取り出し、体積を測定した。１５ｍＬ管の側面を、１０００μＬの１％洗浄溶液ですすいだ。
【００９１】
ＯＳＣ凍結を以下のステップを用いて行った。凍結保存コントローラー（Ｃｒｙｓａｌｙｓ（商標）ＰＴＣ−９５００、Ｂｉｏｓｔａｓｙｓ，Ｉｎｃ．、ＮＶ）を、凍結保存チャンバーに接続した。被覆した凍結チャンバーを、液体窒素浴の中に入れた。容積を増大させるために、液体窒素が凍結チャンバーの上部からおよそ３ｃｍになるまで、追加の液体窒素をゆっくりと添加した。プログラムは以下の設定を有した：１８℃で開始；１℃／分の速度で低下して、−８０℃の最終温度；−８０℃で１０分間保持；−８０℃で作動シグナル終了。
【００９２】
ソートしたＶＡＳＡ＋細胞画分を、１２００ＲＣＦで５℃（範囲：２〜８℃）にてブレーキを中（５）に設定して１０分間ソートした。組織試料を細胞ソーティング前に分割した場合、ソート前の卵巣細胞を含有する凍結バイアルを２〜８℃保存から得、ＶＡＳＡ＋細胞と共に遠心分離した。上清を取り出し、細胞ペレットを５００μＬの冷却した凍結保存媒体で再懸濁した。１０００μＬマイクロピペットを用いて、１５ｍＬ円錐管からの上清を取り出し、「第１のＶＡＳＡ＋上清」と表示した１５ｍＬ円錐管に移した。残りの量を、ペレットをかき乱すことなく、２００μＬピペットを用いて取り出した。ペレットを５００μＬの冷却した凍結保存媒体中に再懸濁し、細胞懸濁液を凍結バイアルに移した。凍結バイアルを凍結チャンバーに入れた。プログラム終了後、凍結バイアルを、液体窒素で満たしたデュワー中で保存した。
【００９３】
（ミトコンドリア単離手順）
ミトコンドリア濃縮手順を以下のように行った。２０ｍＬ体積の１×単離緩衝液を、以下の表で列挙する明細に基づいて調製した。
【表３】
2017536839.tif 000005
【００９４】
構成成分を５０ｍＬ円錐管に添加し、混合し、２〜３ｍＬを別々の円錐管に一定分量入れて、再懸濁し、すすいだ。管を「１×単離緩衝液」と表示し、冷蔵庫または金属保温ビーズ（Ｌａｂ  Ａｒｍｏｒ（商標）Ｂｅａｄｓ、Ｌａｂ  Ａｒｍｏｒ  ＬＬＣ、Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ、ＯＲ）中で保存した。同様に、「ＨＢＳＳ中の１％ＨＳＡ」の管を調製した。１０ｍＬ体積のＨＢＳＳ中の１％ＨＳＡを調製し、２〜３ｍＬを別々の円錐管に一定分量入れて、再懸濁し、すすいだ。管を「ＨＢＳＳ中の１％ＨＳＡ」と表示し、冷蔵庫または金属保温ビーズ中で保存した。
【００９５】
ソートしたＶＡＳＡ＋画分を含有するヒトＯＳＣの凍結保存バイアルを、２Ｌデュワーフラスコに移し、バイアルを液体窒素中に沈めた。バイアルを周囲温度で６０秒間空気解凍した。６０秒間の空気解凍後、バイアルを３７．０℃±１．０℃の水浴中で１２０秒間インキュベートした。１０００μＬマイクロピペットを用いて、バイアルからの全量を、「解凍したＶＡＳＡ＋画分」と表示した１．５ｍＬ微量遠心管にゆっくりと移した。凍結バイアルを、１０００μＬ血清学ピペットを用いて５００μＬのＨＢＳＳ中の１％ＨＳＡですすぎ、すすぎ分を１．５ｍＬ微量遠心管に移した。ＶＡＳＡ＋画分ペレットを１２００×Ｇ（ＲＣＦ）で５．０℃（範囲：２．０〜８．０℃）にてブレーキを高（９）に設定して１０分間遠心分離した。スピンの完了に際して、管をバイオ安全キャビネットに移した。
【００９６】
１０００μＬマイクロピペットを用いて、１．５ｍＬ微量遠心管からの上清を慎重に取り出し、「第１のＶＡＳＡ＋上清」と表示した１５ｍＬ円錐管に移した。残りの量を、ペレットをかき乱すことなく取り出した。ペレットを１５０μＬの冷却した１×単離緩衝液中に穏やかに再懸濁し、再懸濁した。細胞懸濁液を含有する１．５ｍＬ微量遠心管を、ベンチトップ冷却モジュール（ＭｉｎｉＦｒｉｄｇｅ  ＩＩ（商標）、Ｂｏｅｋｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｅａｓｔｅｒｖｉｌｌｅ、ＰＡ）または金属保温ビーズの中に入れた。
【００９７】
１×単離緩衝液の１７〜１８ｍＬの一定分量を、２０ｍＬシリンジを用いて得、シリンジを移送ライン−カニューレアセンブリに取り付けた。カニューレを１×単離緩衝液中に沈めた。カニューレを１×単離緩衝液中に沈めたまま維持しながら、シリンジアセンブリをシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）上にロードした。第２の空の２０ｍＬシリンジを得、ポンプのバランスをとるために、およそ５ｍＬの空気を引いた。ポンプを用いて、シリンジ中の残りの緩衝液を１×単離緩衝液容器に追い出した。ポンプを用いて、以下のポンプパラメータで、１．５ｍＬの冷却した１×単離緩衝液をシリンジ内へと引き抜いた。
ポンプ様式：引き抜き、
流速（μＬ／秒）：最大７５、
プログラムされた体積（μＬ）：１５００、および
直径／シリンジサイズ：２０．０５ｍｍ／２０ｃｃ。
【００９８】
ポンププログラムを、以下の表に列挙するパラメータで選択した。
【表４】
2017536839.tif 000006
【００９９】
カニューレを、管の底に接触するように細胞懸濁液の中に入れた。細胞が管の底に沈着した場合、細胞懸濁液を必要に応じて２００μＬピペットで穏やかに混合した。ポンプを開始して、細胞懸濁液をシリンジ内へと引き抜いた。カニューレを、清浄かつ冷却した１．５ｍＬ微量遠心管に移した。
【０１００】
第２のポンププログラムを、以下の表に列挙するパラメータで選択した。
【表５】
2017536839.tif 000007
【０１０１】
ポンププログラムが終了すると、シリンジをポンプから除去し、移送配管から外した。カニューレ（まだ移送配管に接続されている）は、冷却した１．５ｍＬ微量遠心管内に残した。シリンジ、配管、およびカニューレを適切に捨てた。
【０１０２】
両方の１．５ｍＬ微量遠心管は、およそ等体積の溶解物を有した。２つの溶解物の管（「溶解物１」および「溶解物２」）を、８００×Ｇ（ＲＣＦ）で５．０℃（範囲２．０〜８．０℃）にてブレーキを中（５）に設定して１０分間遠心分離した。２００μＬピペットを用いて、「溶解物２」の管からの等体積の上清を、「上清１」および「上清２」と表示した管に移した。２つの上清の管を、７０００×ｇ（ＲＣＦ）で５±３℃（範囲：２〜８℃）にてブレーキを中（５）に設定して３０分間遠心分離した。スピンの完了に際して、１０００μＬピペットを用いて、上清を両方の管から取り出し、「ミト高速スピン上清１」と表示した１５ｍＬ円錐管に移した。残留の上清を、２００μＬピペット先端を用いて、ペレットをかき乱すことなく取り出した。ペレットを、１００μＬの冷却した１×単離緩衝液を有する上清１の管中で２００μＬピペットを用いて穏やかに再懸濁した。同じピペット先端を用いて、懸濁液を上清２の管に移した。上清１の管を１００μＬの冷却した１×単離緩衝液で５〜１０回すすぎ、溶液を上清２の管に移した。上清２の管中のペレットを再懸濁し、空の上清１の管を捨てた。上清２の管を、７０００×ｇ（ＲＣＦ）で５．０℃（範囲：２．０〜８．０℃）にてブレーキを中（５）に設定して３０分間遠心分離した。その管を、「ミト高速スピン上清２」と再表示した。ペレットが管の壁に接着しなかった場合、および／または上清が除去されなかった場合、追加の遠心分離を行った。上清２の管を、可能な場合、７００×ｇ（ＲＣＦ）で５．０℃（範囲：２．０〜８．０℃）にてブレーキを中（５）に設定して１０分間遠心分離した。２００μＬピペットを用いて、上清を「ミト高速スピン上清３」と表示した管に穏やかに取り出した。
【０１０３】
２０μＬマイクロピペットを用いて、ペレットを６μＬの冷却した呼吸緩衝液中に穏やかに再懸濁した。ペレットをすすぐために、緩衝液をピペッティングで５〜１０回上下させた。微量遠心管中の体積を測定し、「ミトコンドリア懸濁液」と表示した冷却した０．５ｍＬ凍結バイアルに移した。１μＬ体積の懸濁液を０．５ｍＬ凍結バイアルに移し、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析を行った。ｑＰＣＲ分析により、単離したＯＳＣからのミトコンドリアの存在を確認した。
【０１０４】
（実施例２）
（濃縮ミトコンドリア調製物）
（材料および設備）
実施例１で記載されたように、ミトコンドリア溶液は、卵前駆細胞または女性生殖系列幹細胞としても知られる単離したＯＳＣからの抽出により得た自家性ミトコンドリア調合物であった。ミトコンドリア溶液を、さらなる加工まで５℃±３℃で保持した。
【０１０５】
本明細書で説明する方法を用いて生成した濃縮ミトコンドリア調製物を、ＡＵＧＭＥＮＴ（商標）療法およびＩＶＦ法を含むがこれに限定されない、様々な用途に使用した。ＩＶＦ施設は、ＩＶＦプロセス全体を通して施設特有の標準ＩＶＦ設備、材料、および試薬を使用した。以下の表のものを含むがこれに限定されない追加の材料は、ＯｖａＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．により供給された。
【表６】
2017536839.tif 000008
臨床プロセッシングおよびＡＵＧＭＥＮＴ（商標）プロセッシングでの使用のための材料および設備は、本分野で公知である。
【０１０６】
（逆の（水性）重層および（有機性）軽層を有するミトコンドリア調製物）
ミトコンドリア溶液をロードした管を調製した。一部の実施形態では、管はプラスチック管である。１０μｌピペットを用いて、実施例１で調製したミトコンドリア溶液を、およそ３０回吸引し、引き抜いて、バイアル中の溶液を再懸濁した。ピペットを用いて、２μｌのミトコンドリア懸濁液を取り出し、空の卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）プレート上に分配した。ミトコンドリア懸濁液を含有するバイアルを５℃±３℃で維持した。図１で示されるように、分与した２μｌのミトコンドリア懸濁液１２０を、管１１０として示される、８０μｍ可撓性マイクロピペット（８０μｍ  Ｆｌｅｘｉｐｅｔ（登録商標）、Ｃｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＩＮ）にロードした。一部の実施形態では、可撓性マイクロピペットのサイズは、５０μｍ〜１４０μｍの範囲にある。一部の実施形態では、ガラス、半可撓性管材料、およびプラスチックを含む、様々なピペット材料を使用することができる。図１中の層１２０は、管の近位部分のミトコンドリア懸濁液を含有する水性層である。
【０１０７】
次に、約１ｃｍの有機性軽相を、管１１０に引き入れた。図１中の層１３０は、管の遠位部分の有機流体を含有する軽相である。この実施例では、有機流体は生体適合性油、詳細にはＩＣＳＩ油であった。他の実施形態では、有機流体は、上記に説明するように、鉱油、パラフィン油、軽油、ＩＶＦ培養鉱油、ＰＶＰ溶液、またはショ糖溶液などであってもよい。図１で示すように、一部の実施形態では、充填した８０μｍ管の軽相末端を、密閉１４０により示すように、末端開放管が閉鎖底管になるように熱融着した。熱融着は必要に応じて繰り返し、密閉の完全性を顕微鏡観察により検証した。遠心分離機への滑り嵌めを確実にするために、より大きな管１５０（例えば６００μｍ  Ｆｌｅｘｉｐｅｔ）を管１１０（例えば８０μｍ  Ｆｌｅｘｉｐｅｔ）の熱融着末端上に滑らせた。管１１０（例えば８０μｍ  Ｆｌｅｘｉｐｅｔ）の末端を超えて延在する、より大きな管１５０の過剰の長さを除去し、これは切断された管１６０により示される。管１６０を「凍結保存ストロー」１７０内に滑り込ませて、より大きな管１６０がストローのクッション材１８０（例えば綿栓）に接触するようにした。管１１０中のミトコンドリア懸濁液を含むアセンブリ全体を含有する、凍結保存ストロー１７０を、４℃の微量遠心機に入れた。閉鎖底管１１０の口径（ｂｏｒｅ）は、水性層１２０および有機層１３０の反転を防ぐか、または減少させる。他の実施形態では、図２で示すように、水性層１２０および有機層１３０を有する管１１０を、遠心分離機に滑り嵌めする適切なサイズの管２１０に嵌合させる。
【０１０８】
本分野で公知の普遍的予防策をこれらの手順で使用した。これらの予防策は、全てのヒト血液、ある特定の体液、ならびにヒト起源の新鮮な組織および細胞を、それらがＨＩＶ、ＨＢＶ、および／または他の血液由来病原体に感染していることが知られているかのように取り扱う、感染制御法である。
【０１０９】
（ミトコンドリア遠心分離）
例えば図１の管１７０および図２の管２１０として示す、ミトコンドリア調製物の管を、１０，０００×Ｇで４℃にて２０分間遠心分離して、重相１２０と軽相１３０との間の界面に濃縮ミトコンドリア層を生成した。一部の実施形態では、管を１０，０００Ｇ未満の速度で遠心分離する。一部の実施形態では、管を１，０００〜５，０００Ｇ、２，５００〜７，５００Ｇ、５，０００〜１０，０００、または７，５００〜１２，５００Ｇの速度で遠心分離する。一部の実施形態では、遠心分離のＲＣＦ値は、より短い遠心分離時間、例えば１〜２分間、２〜４分間、５〜１０分間、または１０〜１５分間を可能にする。逆に、より低いＲＣＦ値は、より長い遠心分離時間を要する場合がある。
【０１１０】
遠心分離のスピードおよび時間は、水性層および油層の反転を伴わない、濃縮ミトコンドリア層の形成を可能にした。１０，０００Ｇでの２０分間の遠心分離完了後、ストローを遠心分離機から除去し、管１１０をストロー１７０および切断管１６０から滑り出した。濃縮ミトコンドリア層を、ＩＣＳＩプレートに入れ、ＩＣＳＩ油で覆った。濃縮ミトコンドリア層を、ＡＵＧＭＥＮＴ（商標）療法での使用のために５℃±３℃の温度で維持した。これらのステップを繰り返して、追加の濃縮ミトコンドリア層を生成した。
【０１１１】
一部の実施形態では、濃縮ミトコンドリア調製物を、本分野で公知の方法を用いてＩＣＳＩを行うために使用した。ＩＣＳＩを、各減数第２分裂中期卵母細胞の微量注入の間に、およそ１ｐＬの濃縮ミトコンドリア調製物を添加することにより行った。一部の実施形態では、ＩＣＳＩを、各減数第２分裂中期卵母細胞の微量注入の間に、およそ１〜３ｐＬの濃縮ミトコンドリアの添加で現場経験を用いて行った。ＩＣＳＩのために、使用した濃縮ミトコンドリア調製物ペレットは、１０ｎＬ〜５００ｎＬに及んだ。一部の実施形態では、濃縮ミトコンドリア調製物は、１ピコリットル当たり１〜１０，０００個のミトコンドリアのミトコンドリア濃度を有する。一部の実施形態では、開示される調製物で、溶液は、１ピコリットル当たり１〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり１００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり１５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり２００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり２５０〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり３００〜１００，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり４００〜１０，０００個のミトコンドリア、１ピコリットル当たり４５０〜１０，０００個のミトコンドリア、および１ピコリットル当たり５００〜１０，０００個のミトコンドリアを含む。一部の実施形態では、管１１０は、１μｍ未満の水性層と有機層との間の界面の内径を有する。一部の実施形態では、濃縮ミトコンドリア調製物中のミトコンドリアの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％が、ｑＰＣＲにより決定されるように、機能的に回復している。本明細書で議論するように、一部の実施形態では、濃縮ミトコンドリア調製物を、ＩＣＳＩおよびＡＵＧＭＥＮＴ療法を含む、様々な受胎方法で使用する。
【０１１２】
（均等物）
本発明は、その好ましい実施形態を参照して具体的に示され、説明されたが、形態および詳細の様々な変化が、付属の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、その中でなされ得ることが当業者により理解される。当業者は、単なるルーチン実験を用いるだけで、本明細書で具体的に説明する本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、または確認することができる。かかる均等物は、付属の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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