(57)【要約】  本発明は、非ニュートン性液体培地において荷電物体を集中させるための方法に関する。前記方法は、−流動軸（１４）、流動軸に直交する第１の横断面、及び流動軸に直交する少なくとも１つの第２の横断面を有するチャネルに荷電物体を含むチャネルのサンプルを供給することであって、前記第２の断面の一寸法が、前記第１の断面の対応する寸法より小さいことと、−前記チャネルの一方向に流体力学的流動を印加し、一緒に反対方向に前記チャネルに電場を印加することであって、かくして第１の断面から第２の断面へと流動軸（１４）に沿ってチャネルにおいて荷電物体を移動させ、前記物体を停止させ、且つ前記第２の横断面の上流の少なくとも１つのエリアで前記物体を集中させることができるようにすることと、を含む。
2017529522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ニュートン性液体培地において荷電物体を集中させるためのプロセスであって、
流動軸、前記流動軸に直交する第１の横断面、及び前記流動軸に直交する少なくとも１つの第２の横断面を示すチャネルに荷電物体を含むサンプルを導入することであって、前記第２の断面の最小寸法が、前記第１の断面の対応する寸法より小さいことと、
前記チャネルの一方向に流体力学的流動を印加し、一緒に反対方向に前記チャネルに電場を印加することであって、前記第１の断面の流動軸に沿って前記チャネルにおける前記荷電物体を前記第２の断面へ移動させ、それらを停止させ、前記第２の横断面の上流の少なくとも１つのゾーンでそれらを集中させることができるようにすることと、
を含むプロセス。
【請求項２】
前記液体培地が、非荷電高分子を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記荷電高分子が、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド及びそれらの混合物から選択される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記非荷電高分子が、０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、より特に好ましくは１〜４重量％だけ集中部分に存在する、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記印加される電場が、１０Ｖ／ｍ〜１００００Ｖ／ｍ、好ましくは１００Ｖ／ｍ〜５０００Ｖ／ｍ、より特に好ましくは２００Ｖ／ｍ〜１０００Ｖ／ｍの値を有し、且つ／又は前記流体力学的流動が、１〜１００００μｍ／ｓ、好ましくは５〜５０００μｍ／ｓ、より特に好ましくは１０〜１０００μｍ／ｓの平均速度によって特徴づけられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記荷電物体の導入が、前記チャネルの導入ゾーンにおいて実行され、前記荷電物体の移動が、前記チャネルの導入ゾーンから検出ゾーンの方へ実行され、前記プロセスが、
前記検出ゾーンに到着する前記荷電物体の検出を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記荷電物体が、少なくとも２０塩基若しくは塩基対を含む一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子と、少なくとも１００のアミノ酸ユニットを含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と、高分子炭水化物又は他の高分子と、核細胞又は原核細胞と、ナノ物体又はナノ粒子と、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
液体培地における荷電物体を集中させるための装置であって、
流動軸（１４）を示すチャネル（１）であって、非ニュートン性液体培地で充填されるチャネル（１）と、
前記チャネル（１）における流体力学的流動（１３ａ、１３ｂ）の印加のための手段と、
前記チャネル（１）における電場（１０ａ、１０ｂ）の印加のための手段と、
を含み、
前記チャネル（１４）が、前記流動軸に直交する第１の横断面及び前記流動軸に直交する少なくとも１つの第２の横断面を示し、前記第２の断面の最小寸法が、前記第１の断面の対応する寸法より小さいことを特徴とする装置。
【請求項９】
前記チャネルが、下部壁、上部壁及び２つの側壁を呈する矩形断面の中空管の形状を有し、前記側壁が、少なくとも１つの狭窄部を局所的に形成することを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記第２の断面が、前記第１の断面の対応する寸法より少なくとも１０％か、２０％か、５０％か又は９５％だけ小さい最小寸法を示すことを特徴とする、請求項８又は９に記載の装置。
【請求項１１】
前記中空管の前記側壁が、前記流動軸（１４）に対して１０°〜６５°の角度を形成する部分をそれぞれ示すことを特徴とする、請求項９又は１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記チャネルが、少なくとも１つの狭窄部を示す毛細管であることを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【請求項１３】
前記毛細管が、正方形又は円形断面を示すことを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記毛細管が、前記流動軸（１４）に対して１０°〜６５°の角度を形成する部分を示すことを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液における荷電分子及び物体を集中させるためのプロセスに関し、且つまたこのプロセスの実装形態に適した装置に関する。本発明は、国際公開第２０１４／０２０２７１号パンフレットに説明されている、溶液における変形可能な分子の分離用の技術における発展の文脈内に入る。
【背景技術】
【０００２】
分子、特にＤＮＡ分子を集中させることができるようにする異なるプロセス及び装置が、先行技術において知られている。
【０００３】
これらのプロセス及び装置の中で、幾つか、特に米国特許第８  ７５３  ４９２号明細書、米国特許第８  ４４０  ０６３号明細書及び米国特許第８  ７８３  ４６６号明細書に説明されているものは、イオン選択性ナノチャネルを用いる。これらの技術は、非常に低い流量で、且つ或る塩分条件の下でのみ使用され得るという欠点を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第８７５３４９２号明細書
【特許文献２】米国特許第８４４００６３号明細書
【特許文献３】米国特許第８７８３４６６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、先行技術のプロセス及び装置の代替を提供することである。
【０００６】
特に、本発明の１つの目的は、塩分条件に関する制限なしに、サンプルの大規模解析に適している、より高い流量の荷電溶質分子又は一般的には物体を集中できるようにする技術を提供することである。
【０００７】
荷電溶解物体は、変形可能であり、且つ流体力学的流動などの機械的応力の影響下で変形できる超分子集合体、細胞又は細胞片などの分子又はより複雑な物体の形で存在することができる。好ましくは、変形能は、物体のヤング率によって測定され、ヤング率は、１０９Ｐａ以下、又は実施形態によれば１０８Ｐａ以下でなければならない。ヤング率は、機械的接触によって、例えば原子間力顕微鏡によって測定することができる。例として、ＤＮＡのヤング率は、典型的には約３００ＭＰａの値及び約０．１〜１００ｋＰａの哺乳類細胞の値を有する。荷電溶解物体はまた、変形不可能であってもよく、そのときは特に荷電ナノ粒子又はナノ物体の形で存在し得る。
【０００８】
本特許出願の文脈において、次のもの、即ち、少なくとも２０の（例えば少なくとも１０００の）塩基又は塩基対を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子と、少なくとも１００（例えば少なくとも２００）のアミノ酸ユニットを含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と、高分子炭水化物又は他の高分子と、核細胞又は原核細胞と、は、特に、変形可能な物体と見なされる。本発明がまた、ポリスチレンなどの発泡体からなるマイクロビーズなど、変形不可能な物体用に動作することが実証された。
【０００９】
本発明の別の目的は、幾つかの実施形態において、荷電分子又は物体を集中させること、及び混合物における異なる荷電分子又は物体を分離することの両方を可能にする技術を開示することである。
【００１０】
本発明の更に別の目的は、技術、即ち、その実装形態の手段が技術的に非常に単純である技術を説明することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの目的及びまた続いて明白になる他の目的は、本発明によって達成されるが、本発明は、液体培地において荷電物体を集中させるためのプロセスであって、
流動軸、流動軸に直交する第１の横断面、及び流動軸に直交する少なくとも１つの第２の横断面を示すチャネルに荷電物体を含むサンプルを導入することであって、第２の断面の最小寸法が、前記第１の断面の対応する寸法より小さいことと、
前記チャネルの一方向に流体力学的流動を印加し、一緒に反対方向に前記チャネルに電場を印加することであって、第１の断面の流動軸に沿ってチャネルにおける荷電物体を第２の断面の方へ移動させ、それらを停止させ、前記第２の横断面の上流の少なくとも１つのゾーンでそれらを集中させることができるようにすることと、
を含むプロセスに関する。
【００１２】
本発明によれば、第２の横断面は、所定の箇所で物体の移動を停止させ、且つこの箇所で物体を集中させるために、静水圧場及び電場を空間に変調できるようにする狭窄部を形成する。荷電分子又は物体の集中は、停止されたサンプルにおける荷電分子又は物体の集積に続いて前記箇所で実行される。
【００１３】
本発明は、最先端技術の欠点を克服できるようにする。特に、本発明は、塩分条件が何であっても、より高い流量で実行することができる。本発明は、最先端技術の方法よりも実行がより簡単且つ柔軟で、短い集中時間を要求する、荷電分子及び他の物体を集中させる方法を提供する。
【００１４】
液体培地は、非ニュートン性が好ましいことに留意されたい。本説明において、「ニュートン性流体」は、印加される機械的応力（表面積単位当たり流体に及ぼされる力）と、流体のシャーリング（即ち流体の速度勾配）との間に直線関係が存在する流体を意味すると理解される。従って、「非ニュートン性流体」は、ニュートン性流体ではない流体である。
【００１５】
例えば、本発明による非ニュートン性流体は、シャーリングに依存する粘性係数を有することができる（静止流体）又は弾性挙動を有することができる。実施形態によれば、流体は、粘弾性である。
【００１６】
好ましくは、液体培地は、周囲温度において１〜１００ｃＰ（センチポアズ）、好ましくは２〜２０ｃＰ、更により好ましくは２〜１０ｃＰの粘性を示す。別段の言及がなければ、この特許出願で言及される粘度値は、静粘度値である。実施形態によれば、液体培地は、好ましくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド及びそれらの混合から選択された非荷電高分子を含む。
【００１７】
用語「非荷電」は、問題の高分子が、上記の液体培地においてほぼゼロの全体的な静電荷を有することを意味する。例えば、水溶液におけるかかる高分子の存在は、液体を非ニュートン性（例えば、粘弾性）にすることを可能にする。
【００１８】
一実施形態によれば、非荷電高分子は、０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、より好ましくは１〜４重量％だけ集中部分に存在する。
【００１９】
好ましくは、非荷電高分子の集中は、臨界被覆集中（そこから高分子が接触する集中）以上である。
【００２０】
有利なことに、非荷電高分子は、１０〜１０００００ｋＤａ、好ましくは５０〜１００００ｋＤａ、より好ましくは１００〜１０００ｋＤａの（重量）平均分子量を示す。
【００２１】
本発明によるプロセスの好ましい代替形態によれば、印加される電場は、１０Ｖ／ｍ〜１００００Ｖ／ｍ、好ましくは１００Ｖ／ｍ〜５０００Ｖ／ｍ、より好ましくは２００Ｖ／ｍ〜１０００Ｖ／ｍの値を有し、且つ／又は流体力学的流動は、１〜１００００μｍ／ｓ、好ましくは５〜５０００のμｍ／ｓ、より好ましくは１０〜１０００μｍ／ｓの平均速度によって特徴づけられる。
【００２２】
同様に好ましくは、荷電物体の導入は、チャネルの導入ゾーンにおいて実行され、荷電物体の移動は、チャネルの導入ゾーンから検出ゾーンの方へ実行され、プロセスは、更に、
検出ゾーンに到着する荷電物体の検出を含む。
【００２３】
有利なことに、前記荷電物体は、少なくとも２０（例えば少なくとも１０００の）塩基若しくは塩基対を含む一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子と、少なくとも１００（例えば少なくとも２００）のアミノ酸ユニットを含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と、高分子炭水化物又は他の高分子と、核細胞又は原核細胞と、ナノ物体又はナノ粒子と、からなる群から選択される。
【００２４】
本発明はまた、液体培地における荷電物体を集中させるための装置であって、流動軸を示すチャネルであって、非ニュートン性液体培地で充填されるチャネルと、チャネルにおける流体力学的流動の印加のための手段と、チャネルにおける電場の印加のための手段と、を含み、前記チャネルが、流動軸に直交する第１の横断面及び流動軸に直交する少なくとも１つの第２の横断面を示し、前記第２の断面の最小寸法が、前記第１の断面の対応する寸法より小さいことを特徴とする装置に関する。
【００２５】
本発明の代替形態によれば、前記チャネルは、下部壁、上部壁及び２つの側壁を呈する矩形断面の中空管の形状を有し、前記側壁は、少なくとも１つの狭窄部を局所的に形成する。
【００２６】
好ましくは、前記第２の断面は、前記第１の断面の対応する寸法より少なくとも１０％か、２０％か、５０％か又は９５％だけ小さい最小寸法を示す。
【００２７】
有利なことに、前記中空管の前記側壁は、前記流動軸に対して１０°〜６５°の角度を形成する部分をそれぞれ示す。
【００２８】
別の代替形態によれば、前記チャネルは、少なくとも１つの狭窄部を示す毛細管の管腔である。
【００２９】
この場合に、前記毛細管は、正方形又は円形断面を示すのが好ましい。
【００３０】
有利なことに、前記毛細管は、前記流動軸に対して１０°〜６５°の角度を形成する部分を示す。
【００３１】
本発明及びまた本発明が示す様々な利点は、図面に関連して提示される本発明の実施形態の後続の説明によって、より容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明による装置を上面図に図表で表す。
【図２】図１の装置の（拡大された）断面Ａ−Ａを図表で表す。
【図３】図１及び２に表されたタイプの装置の狭窄部における第１の実施形態の電子顕微鏡上面図を表す。
【図４】図３に表された狭窄部の電子顕微鏡図を斜視図で表す。
【図５】図１及び２に表されたタイプの装置の狭窄部における第２の実施形態の光学顕微鏡上面図を表す。
【図６Ａ】（狭窄部の外側及び狭窄部における）チャネルの流体力場及び電気泳動力場を図表で表す。
【図６Ｂ】（狭窄部の外側及び狭窄部における）チャネルの流体力場及び電気泳動力場を図表で表す。
【図７Ａ】分子の電気泳動速度及び適用される流体力学速度、又は電場及びニュートン性若しくは非ニュートン性流体における流体の流動速度の関数として分子の停止ポイントを示すグラフを表す。
【図７Ｂ】分子の電気泳動速度及び適用される流体力学速度、又は電場及びニュートン性若しくは非ニュートン性流体における流体の流動速度の関数として分子の停止ポイントを示すグラフを表す。
【図７Ｃ】分子の電気泳動速度及び適用される流体力学速度、又は電場及びニュートン性若しくは非ニュートン性流体における流体の流動速度の関数として分子の停止ポイントを示すグラフを表す。
【図８】図１−４に関連して説明された装置タイプの装置によって分離及び集中される、サイズの異なる２つのＤＮＡ集団の蛍光顕微鏡写真を表す。
【図９】図１−４に関連して説明された装置タイプの装置によって分離及び集中される、サイズの異なる３つのＤＮＡ集団の蛍光顕微鏡写真を表す。
【図１０】図９に表されている文脈に現れるポイントの光強度を示すグラフである。
【図１１】図１−４に関連して説明された装置タイプの装置によって分離及び集中される異なるＤＮＡの蛍光顕微鏡写真を表す。
【図１２】図１１に表されている文脈に現れるポイントの光強度を示すグラフである。
【図１３】図１−４に関連して説明される装置タイプの装置によって集中される１００ｎｍの直径を備えたポリスチレンビーズの蛍光顕微鏡写真を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
図１−５を参照すると、本発明による装置は、ガラスの細片又は薄板とすることができる支持体１６と、それ自体は周知の方法で支持体１６上で密閉された、シリコンで作製できる凹部を示す構造１５（例えば、微細加工構造）と、を含む。例えば、膜堆積、フォトリソグラフィ、（化学又はプラズマ）エッチング、及び接着結合技術を用いることが可能である。膜堆積は、遠心分離によって、熱酸化によって、化学蒸着又は物理蒸着（ＣＶＤ及びＰＶＤ）によって、減圧ＣＶＤによって、プラズマ強化ＣＶＤによって、スパッタリングによって等で実行することができる。
【００３４】
構造１５（その凹部を備えた）及び支持体１６は、チャネル１を画定する。チャネル１は、概して、即ち、その長さの大部分にわたって、上部壁１ａ、下部壁１ｂ及び側壁１ｃによって画定された矩形断面の中空シリンダの形状を示す。シリンダの主軸は、チャネル１の流動軸１４である。この流動軸１４に直角に、チャネル１の第１の横断面が、ｈで示された高さ及びＬで示された幅によって画定される。高さｈは、横断面の最小寸法（それはまた、支持体１６と、構造１５の凹部の底部との間の距離である）に対応し、幅Ｌは、高さ方向に直交する方向における寸法に対応する。
【００３５】
一般に、使用時に、高さｈが、垂直面に相当するのに対して、幅Ｌ及び流動軸１４は、水平面にある。ｈの値は、集中される荷電分子又は物体のサイズの関数として選択することができる。
【００３６】
装置は、サンプル、即ち、その荷電分子又は物体を集中させることが望ましいサンプルの導入ゾーン９と、検出ゾーン８と、を更に含む。この場合に、サンプルの導入ゾーン９は、貯蔵所４に位置し、サンプルは、補助装置によって貯蔵所に注入される。
【００３７】
本発明によれば、チャネル１は、流動軸１４に直交する第２の横断面を画定する検出ゾーン８に、図３及び４又は５に表された狭窄部を示し、狭窄部の最小寸法は、好ましくは前記第１の断面の対応する寸法より少なくとも１０％か、２０％か、５０％か又は９５％だけ小さい。本発明によれば、狭窄部は、流動軸に沿った電場及び流体力学場の振幅を空間的に変調する効果を有する。
【００３８】
図３−５に関連して、前記狭窄部２の２つの代替形態の電子顕微鏡図が表されている。図３（上部の図）及び図４（斜視図）の代替形態によれば、チャネル１の側壁１ｃは、チャネルの軸１４と４５°の角度αを狭窄部に形成する。図５の代替形態によれば、チャネル１の側壁は、６５°の角度を狭窄部に形成する。狭窄部において、チャネルの幅は、２．５μｍに低減される。従って、本発明によれば、装置は、そのとき、シリコンに刳り抜かれた不変の高さのスパンであり、その幅は調整される。
【００３９】
使用時に、チャネル１は、電気泳動に適した溶液で充填され、それに対して、流体を非ニュートン性にできる成分が追加された。集中される荷電分子又は物体を含むサンプルが、導入ゾーン９において装置に導入される。
【００４０】
チャネル１における荷電分子又は物体の移動は、第１の貯蔵所４から第２の貯蔵所６の方へ流動軸１４に沿って実行される。これを行うために、流体力学的流動が、（特に第１の貯蔵所４及び第２の貯蔵所６の圧力制御手段１３ａ、１３ｂによって）チャネル１に生成される。
【００４１】
併せて、電場が、それぞれの貯蔵所４、６における電極１０ａ、１０ｂによってチャネル１に生成される。印加される流体力学的流動の反対方向に荷電分子又は物体を移動させる傾向があるこの電場は、集中される荷電分子又は物体に静電力を印加するのに適している。
【００４２】
図６Ａ（図の上部は上面図であり、下部は側面図である）に関し、検出ゾーン８に存在する狭窄部の外側における装置の使用中に、チャネル１の電気泳動力場１７は、（ｈ及びＬの寸法に対して無視できる特性長にわたって）チャネルの壁の直ぐ近くを除いて、チャネル１の流動軸１４（ｙ軸）の方向において、且つ高さｈ（ｚ軸）及び幅Ｌ（ｘ軸）に沿って、ほぼ均一である。流体力場１８に関連して、それは、（Ｌの寸法に対して無視できる特性長にわたって）チャネルの壁の直ぐ近くを除いて、流動軸１４（ｙ軸）の方向において、且つ幅Ｌ（ｘ軸）に沿って均一である。他方で、それは、高さｈ（ｚ軸）に沿っては、均一ではない。一般に、それは、ポアズイユの法則に特有の放物型のプロファイルを示す。チャネル１のアスペクト比Ｌ／ｈは、流体力場のこの構成を得るように選択される。これは、アスペクト比が、一般に、１以上か、１０以上か又は２０以上である理由となっている。高さｈに沿った流体力場１８の非均一性は、荷電分子又は物体を集中させることの有効性という影響を有する。
【００４３】
所望の流体力学的流動プロファイル（特に、所与の平均流量及び速度値によって特徴づけられる）は、入口貯蔵所と出口貯蔵所との間の圧力差を生成するために、それぞれの圧力制御手段１３ａ、１３ｂを作動させることによって得られる。例えば、導入ゾーン９から検出ゾーン８の方へと、集中される変形可能な荷電分子又は物体の移動をもたらす流体力学的流動を生成するために、貯蔵所４と貯蔵所６との間に圧力差が生成される。例えば、チャネルのジオメトリを考慮して、０．０１〜１０ｂａｒ、好ましくは０．０５〜４ｂａｒ、より好ましくは０．１〜１ｂａｒの圧力差が、所望の流体力学的流動プロファイルを得ることを可能にする。
【００４４】
図６Ｂは、狭窄部を含む検出ゾーンにおけるチャネルの上面図及び側面図を表す。図の上部は、チャネルの幅が、側壁１ｃの存在ゆえに流動軸に沿って減少するチャネルの上面図を表す。下部は、チャネルの側面図を表し、チャネルの高さは、狭窄部の存在によって変えられないままである。図の上部に関連し、（ｘ、ｙ）平面において、幅が減少する場合に電気泳動場の値が増加することが注目される。同様に、流体力学場プロファイルは、狭窄部ゾーンに沿った流体力学的流動の維持によって変化する。従って、チャネルの幅における変動は、電場の均一な値における変動、及び流動軸に沿った流体力学場プロファイルにおける変動を引き起こす。他方で、図の下部では、（ｙ、ｚ）平面において、流体力学場及び電気泳動場は、流動軸に沿って不変のままである。
【００４５】
従って、各分子は、検出ゾーンにおけるその位置の関数として、異なる流体力学場及び電気泳動場にさらされる。従って、各荷電分子又は物体の伝搬速度は、流動軸に沿った狭窄ゾーンにおけるその移動中に変化する。
【００４６】
本発明の根底にある原理は、図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに関連して説明される。
【００４７】
４８．５ｋｐｂを含むＤＮＡ分子を含むサンプルが、上記で説明された装置タイプだが狭窄部を示さない装置に導入され、問題の装置のチャネルは、２μｍの最小寸法を備えた断面を示す。この導入は、分子の不変の純流動を観察するために実行された。電気泳動速度（ｅｖ）及び流体力学速度（ｈｖ）の範囲は、装置に印加される電気泳動場及びまた静水圧差を変えることによって掃引される。ＤＮＡ分子が、図７Ａの曲線上で点線として表されている流体力学速度（ｈｖ）及び電気泳動速度（ｅｖ）の値の異なるペア用に停止されたことが実験的に分かった。この曲線の下では、分子の正の速度に対応する優勢な流体力学効果が存在するのに対して、この曲線の上では、全体的な負の速度に対応する電気泳動速度が優勢になり、分子は後退する。チャネルの狭窄部の本発明による利用は、図６Ｂ並びに図７Ｂ及び７Ｃに関連して説明されるように、異なる流体力学及び電気泳動速度値を掃引できるようにする、原点を通過して引かれる直線によってグラフ上に象徴化されている。
【００４８】
この直線が曲線を横切る箇所は、速度ゼロ（図７Ａにおいて円によって表されている）が、所与のタイプの荷電分子又は物体の一意の停止ゾーンに対応するポイントを組み合わせる。
【００４９】
更に、図７Ｂに関連して、次のことが分かった。即ち、異なるサイズ、つまり３ｋｂ、５ｋｂ、４８．５ｋｂのＤＮＡの様々なサンプル用に、流体の速度及び印加される電場の関数としての分子の停止パラメータを示す曲線が、異なり、且つ検討中のＤＮＡ分子のサイズに依存することが分かった。
【００５０】
従って、矢印によって表されているように、狭窄部内で異なる電気泳動及び流体力学速度値を掃引することによって、異なる箇所で異なるＤＮＡ分子を集中及び停止させることが可能である。
【００５１】
理論によって処理されることを望まず、発明者らは、非ニュートン性流体が存在する状態で、流体のシャーリングが、分子を壁の方にぴったりつける傾向を有する横方向力を介して、流体力学的流動と電気泳動移動度との間の非線形結合を生成することを考慮する。この横方向力は、ＤＮＡの応答曲線の弱い増加を説明する。流動速度が速ければ速いほど、分子を停止させるために必要な電場の強度は低い。更に、この力は、扱われるＤＮＡのサイズに依存する。何故なら、長鎖分子は、流動のより大きな動揺及び従って非ニュートン効果の増加を引き起こすからである。従って、流体を作動させるための所与のパラメータ（電場及び静水圧差）用に、パイプに沿って異なる位置で分子を停止させ得る分子の一連の停止ポイントが存在する。
【００５２】
従って、本発明による装置は、非ニュートン性流体が存在する状態で、（先行技術の装置のように）異なるサイズの荷電物体、たとえ同様の移動度の荷電物体さえ集中及び分離することを可能にする。
【００５３】
実証されるように、ニュートン性流体が存在する状態では、荷電物体を集中させることも分離させることも不可能である。
【００５４】
これは、次の理由による。即ち、ニュートン性流体において、電気泳動速度が、関係ｅｖ（ｙ）＝μＥ（ｙ）に線形的に依存し、この式で、μが、チェーンのサイズに依存しないＤＮＡの電気泳動移動度であり、流体力学速度が、分子の位置ｙに従って流体の平均速度と等しく、即ちｈｖ（ｙ）＝ｖ（ｙ）であり、ｙが、チャネルの流体の流動方向であるからである。従って、分子は、ｅｖ（ｙ）＝ｈｖ（ｙ）、即ちＥ（ｙ）＝１／μ・ｖ（ｙ）のときに停止される。従って、停止曲線は、図７Ｃに示されているように、非ニュートン性流体の場合に、原点を通る、且つ勾配１／μの直線である。
【００５５】
ここで、狭窄部によって引き起こされる可能性がある電場及び流体力学速度における変動が検討される。電場Ｅ及び流動速度ｖが、第１の近似に対して保存流束を有するので、
ｖ（ｙ）＝ＳＯ／Ｓ（ｙ）・ｖ０
Ｅ（ｙ）＝ＳＯ／Ｓ（ｙ）・Ｅ０
と考えてもよい。
これらの式で、Ｓ（ｙ）は、位置ｙの狭窄部におけるチャネルの断面である。Ｓ０、Ｅ０及びｖ０は、狭窄部によって引き起こされる動揺がない状態で、チャネルの断面、電場、及び狭窄部から遠く離れた流体速度の値を示す。
【００５６】
従って、狭窄部は、原点を通る直線上の電場／流動速度ペアの集合を掃引できるようにし、その勾配は、値Ｅ０／ｖ０を有し、Ｅ０は、チャネルに印加される電場であり、ｖ０は、狭窄部がない状態で、チャネルにおける流動速度である。
【００５７】
従って、分子を停止させることができるように、狭窄部が存在しないか又は存在する状態で、（Ｅ０／ｖ０）＝１／μなどの実験条件を適用することが必要である。他方で、この分子は、その速度が、チャネル全体にわたって不変且つゼロになるであろうから、集中され得るために流体において移動されなくてもよい。これは、次の理由による。即ち、同じ箇所に分子を集中させることができるために、分子の全体的な移動速度ｅｖ＝ｈｖが、停止ポイントでそれぞれを釣り合わす前に減少することが必要であるからである。その後、サンプルが、例えばＤＮＡ分子など、同様の移動度だが異なるサイズの幾つかの荷電分子又は物体含む場合に、適用される狭窄角度並びに流体力学場及び電気泳動場の値などのパラメータが適切に選択される場合に、流動軸に沿った異なる位置で異なる分子又は物体（これらの分子又は物体が非ニュートン性流体に溶解されている場合）を停止させ得ることが分かる。この場合に、本発明はまた、同様の移動度の荷電分子又は物体を分離できるようにする。検出手段は、図には表されていない。それらは、チャネル１に対向する支持体１６の側部の顕微鏡レンズ及びこれに接続された、ＣＤＤカメラなどの検出器を含むことができる。従って、個別の分子又は個別の荷電物体は、取得画像上で検出することができ、検出ゾーン８又はその一部において全体的な強度測定が、時間の関数として実行され得る。
【００５８】
測定値の解析及び取得データのプレゼンテーション用の手段は、この装置と組み合わせることができる。
【００５９】
装置はまた、例えば、上記で説明したものと類似の他のチャネル、貯蔵所及び／又は電極を含むラボオンチップに組み込むことができる。例えば、ラボオンチップは、本発明による分離装置に下流に結合された化学又は生化学反応装置を含むことができる。従って、本発明による集中プロセスの使用は、ラボオンチップにおいて実行された化学又は生化学反応からの生成物を分析できるようにする。
【００６０】
ラボオンチップはまた、集中される異なる荷電分子又は物体に対応する断片を収集するための手段を含むことができる。これらの収集手段は、検出ゾーン８の下流に設けることができる。代替として、それらは、検出ゾーン８に取って代わることができ、その場合に、装置は、単独の準備目的に使用される。
【００６１】
これらの収集手段は、前述の化学又は生化学反応装置と組み合わせて、又はそれらなしに設けることができる。
（実施例）
【００６２】
８０ｍＭのトリス塩酸、８０ｍＭのホウ酸、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、０．５μＭのジチオトレイトール、それらに追加された２重量％の３６０ｋＤａ  ＰＶＰからなる、ＤＮＡの電気泳動用の標準緩衝液が、異なるＤＮＡサンプルを希釈するために用いられた。上記のように、ＰＶＰの導入は、緩衝液を非ニュートン性にすることができるようにする。一般に、異なるサイズのＤＮＡの異なるサンプルは、核酸の１〜１０ｎｇ／μｌの比率で、この緩衝液において希釈された。
【００６３】
ＤＮＡ断片に存在する核酸は、４塩基対当たり１プローブの比率で、挿入剤（ＹＯＹＯ（Ｒ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてラベルづけすることによって、蛍光性にされる。
【００６４】
この分子集団を分離及び解析するために使用される装置は、図１に表されている通りである。チャネル１は、１００μｍの幅及び２μｍの高さを有する。第２の横断面としてもまた周知の狭窄部によって形成されるチャネルの最も狭いゾーンにおいて、チャネル１は、２μｍの幅及び２μｍの高さを有する。導入ゾーン９及び検出ゾーン８は、５ｍｍだけ分離される。サンプルを含まない２００μｌの緩衝液は、チャネル１の貯蔵所４及び６に置かれる。貯蔵所４から貯蔵所６への溶液の流動は、ＰＶＰで作製される表面の飽和を可能にするために、３０分間、圧力を調整することによって生成される。
【００６５】
実施例１：小さなサイズ及び大きなサイズを有する２つのタイプのＤＮＡを含むサンプル
この例において、本発明は、上記のように、緩衝液に存在する４８．５ｋｐｂを含むラムダＤＮＡ及び５．４ｋｐｂを含むＰｈｉＸ１７４ＤＮＡを分離及び集中させるために用いられる。
【００６６】
１００ｍｂａｒの全体的な圧力差及び４０Ｖの全体的な電圧差が、交差した流体力学的流動及び電気泳動流動、即ち流動軸に沿うがしかし対軸に沿って向けられた流動と共に用いられた。１分間待った後で、蛍光顕微鏡写真が撮られた。この写真は、図８に表されている。狭窄部によって、分子は、狭窄部の上流のゾーンで停止された。分子は、流体力学効果が、停止ポイントの前で優勢であり、それが、正の速度に帰着するので集まり、且つ分子は、逆に下流に移動する。次に、装置は、停止ポイントが分子のサイズに依存するので、コンセントレータ及びセパレータの両方を構成する。従って、図８において、ＰｈｉＸ１７４ＤＮＡ分子に対応する別の雲から分離されたラムダＤＮＡ分子に対応する雲が見られる。装置を１分間使用した後で、これらの２つの異なるＤＮＡを集中させるファクタ１０が取得された。このファクタは、流体力学的流動を増加させることによって更に改善することができる。
【００６７】
実施例２：３つのタイプのＤＮＡを含むサンプル
本発明はまた、１５ｋｂｐ、３５ｋｂｐ及び４９ｂｐの３つのタイプのＤＮＡを含むサンプルと共に用いられた。５０ｍｂａｒの全体的な圧力差及び７Ｖの全体的な電圧差が、交差した流体力学的流動及び電気泳動流動と共に用いられた。１００秒待った後で、蛍光顕微鏡写真が撮られた。この写真は、図９に表されている。３つのタイプのＤＮＡ分子の集中に対応する３つの雲の光強度が評価された。対応する結果は、図１０に表されたグラフにプロットされている。このグラフは、３つの分離及び集中されたＤＮＡタイプに対応する３つのピークＡ、Ｂ及びＣを示す。
【００６８】
実施例３：小さなサイズを有するＤＮＡを含むサンプル
本発明はまた、５００〜１００００塩基対を含む１ｋｐｂのＤＮＡラダー分子量ラベルで用いられた。
【００６９】
１００ｍｂａｒの全体的な圧力差及び４０Ｖの全体的な電圧差が、交差した流体力学的流動及び電気泳動流動と共に用いられた。
【００７０】
１７秒待った後で、蛍光顕微鏡写真が撮られた。この写真は、図１１に表されている。この図にプロットされたフレームに含まれるゾーンの光強度が測定された。対応する結果は、図１２に表されたグラフにプロットされている。これらの結果は、下部の目盛りに表されたものなど、ラベルを構成する異なるＤＮＡに対応する分離及び集中を示し、且つ本発明が、サイズの短いＤＮＡの用途に使用され得ることを含意する。
【００７１】
実施例４：マイクロビーズを含むサンプル
本発明はまた、１００ｎｍの直径を備えた蛍光ポリスチレンマイクロビーズ（ＦｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓＴＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むサンプルと共に用いられた。かかるマイクロビーズの変動能は、かなり低く、そのヤング率は、３ＧＰａ程度である。マイクロビーズは、上記の緩衝液及び２重量％の３６０ｋＤａ  ＰＶＰを含む溶液において希釈された。ＤＮＡの分離及び集中用の上記の装置と同じ装置が用いられた。この例において、上記の溶液など、ＴＢＥ及びＰＶＰに基づいた２００μｌの溶液が用いられた。１５０ｍｂａｒの全体的な圧力差及び４０Ｖの全体的な電圧差が、交差した流体力学的流動及び電気泳動流動と共に用いられた。１８秒待った後で、蛍光顕微鏡写真が撮られた。この写真は、図１３に表されている。マイクロビーズは、ＤＮＡ分子の場合ほど均質でないゾーンに集中される。ミクロスフェアの分布において観察された分散は、ＤＮＡ集団に関連して観察されたサンプルの非均一性によって説明することができ、その塩基対の数は、固定されている。従って、１０９Ｐａ以上のヤング率を備えた荷電物体の分離及び集中がまた可能であることが実証される。従って、本発明の適用の範囲は、ＤＮＡ分子の集中及び分離に限定されず、上記の荷電物体タイプにおける任意のタイプの荷電物体に延長することができる。
【００７２】
サンプルの組成並びに電気泳動場及び流体力学場の値に従って、幾つかの荷電分子又は幾つかの荷電物体が、チャネルの流動軸に沿って、それらの移動中に正の移動速度を維持することができることに留意されたい。従って、これらの分子は、狭窄部の上流で停止されず、下流で収集することができる。従って、本発明による装置はまた、分子をフィルタリングするための装置として用いることができる。
【００７３】
本明細書で表されている異なる実施形態及び実施例において、チャネルは、矩形断面の中空管の形状を有し、そのフェースの１つは、荷電分子又は物体の光検出を可能にするために透明である。
【００７４】
毛細管、即ち、例えばガラスなどの透明材料で作製された、好ましくは正方形又は円形断面の管構造の毛細管の管腔によって形成されたチャネルを検討することがまた可能である。
【００７５】
他の実施形態において、狭窄部が、流動軸に非線形的に近づく壁からなり得ることに更に留意されたい。
【図１】
2017529522.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図７Ａ】
2017529522.tif 000011
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
2017529522.tif 000014
【図９】
2017529522.tif 000015
【図１０】
2017529522.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年4月3日(2017.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液における荷電分子及び物体を集中させるためのプロセスに関し、且つまたこのプロセスの実装形態に適した装置に関する。本発明は、国際公開第２０１４／０２０２７１号パンフレットに説明されている、溶液における変形可能な分子の分離用の技術における発展の文脈内に入る。
【背景技術】
【０００２】
分子、特にＤＮＡ分子を集中させることができるようにする異なるプロセス及び装置が、先行技術において知られている。
【０００３】
これらのプロセス及び装置の中で、幾つか、特に米国特許第８  ７５３  ４９２号明細書、米国特許第８  ４４０  ０６３号明細書及び米国特許第８  ７８３  ４６６号明細書に説明されているものは、イオン選択性ナノチャネルを用いる。これらの技術は、非常に低い流量で、且つ或る塩分条件の下でのみ使用され得るという欠点を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第８７５３４９２号明細書
【特許文献２】米国特許第８４４００６３号明細書
【特許文献３】米国特許第８７８３４６６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、先行技術のプロセス及び装置の代替を提供することである。
【０００６】
特に、本発明の１つの目的は、塩分条件に関する制限なしに、サンプルの大規模解析に適している、より高い流量の荷電溶質分子又は一般的には物体を集中できるようにする技術を提供することである。
【０００７】
荷電溶解物体は、変形可能であり、且つ流体力学的流動などの機械的応力の影響下で変形できる超分子集合体、細胞又は細胞片などの分子又はより複雑な物体の形で存在することができる。好ましくは、変形能は、物体のヤング率によって測定され、ヤング率は、１０９Ｐａ以下、又は実施形態によれば１０８Ｐａ以下でなければならない。ヤング率は、機械的接触によって、例えば原子間力顕微鏡によって測定することができる。例として、ＤＮＡのヤング率は、典型的には約３００ＭＰａの値及び約０．１〜１００ｋＰａの哺乳類細胞の値を有する。荷電溶解物体はまた、変形不可能であってもよく、そのときは特に荷電ナノ粒子又はナノ物体の形で存在し得る。
【０００８】
本特許出願の文脈において、次のもの、即ち、少なくとも２０の（例えば少なくとも１０００の）塩基又は塩基対を含む一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子と、少なくとも１００（例えば少なくとも２００）のアミノ酸ユニットを含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と、高分子炭水化物又は他の高分子と、核細胞又は原核細胞と、は、特に、変形可能な物体と見なされる。本発明がまた、ポリスチレンなどの発泡体からなるマイクロビーズなど、変形不可能な物体用に動作することが実証された。
【０００９】
本発明の別の目的は、幾つかの実施形態において、荷電分子又は物体を集中させること、及び混合物における異なる荷電分子又は物体を分離することの両方を可能にする技術を開示することである。
【００１０】
本発明の更に別の目的は、技術、即ち、その実装形態の手段が技術的に非常に単純である技術を説明することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの目的及びまた続いて明白になる他の目的は、本発明によって達成されるが、本発明は、液体培地において荷電物体を集中させるためのプロセスであって、
流動軸、流動軸に直交する第１の横断面、及び流動軸に直交する少なくとも１つの第２の横断面を示すチャネルに荷電物体を含むサンプルを導入することであって、第２の断面の最小寸法が、前記第１の断面の対応する寸法より小さいことと、
前記チャネルの一方向に流体力学的流動を印加し、一緒に反対方向に前記チャネルに電場を印加することであって、第１の断面の流動軸に沿ってチャネルにおける荷電物体を第２の断面の方へ移動させ、それらを停止させ、前記第２の横断面の上流の少なくとも１つのゾーンでそれらを集中させることができるようにすることと、
を含むプロセスに関する。
【００１２】
本発明によれば、第２の横断面は、所定の箇所で物体の移動を停止させ、且つこの箇所で物体を集中させるために、静水圧場及び電場を空間に変調できるようにする狭窄部を形成する。荷電分子又は物体の集中は、停止されたサンプルにおける荷電分子又は物体の集積に続いて前記箇所で実行される。
【００１３】
本発明は、最先端技術の欠点を克服できるようにする。特に、本発明は、塩分条件が何であっても、より高い流量で実行することができる。本発明は、最先端技術の方法よりも実行がより簡単且つ柔軟で、短い集中時間を要求する、荷電分子及び他の物体を集中させる方法を提供する。
【００１４】
液体培地は、非ニュートン性が好ましいことに留意されたい。本説明において、「ニュートン性流体」は、印加される機械的応力（表面積単位当たり流体に及ぼされる力）と、流体のシャーリング（即ち流体の速度勾配）との間に直線関係が存在する流体を意味すると理解される。従って、「非ニュートン性流体」は、ニュートン性流体ではない流体である。
【００１５】
例えば、本発明による非ニュートン性流体は、シャーリングに依存する粘性係数を有することができる（静止流体）又は弾性挙動を有することができる。実施形態によれば、流体は、粘弾性である。
【００１６】
好ましくは、液体培地は、周囲温度において１〜１００ｃＰ（センチポアズ）、好ましくは２〜２０ｃＰ、更により好ましくは２〜１０ｃＰの粘性を示す。別段の言及がなければ、この特許出願で言及される粘度値は、静粘度値である。実施形態によれば、液体培地は、好ましくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド及びそれらの混合から選択された非荷電高分子を含む。
【００１７】
用語「非荷電」は、問題の高分子が、上記の液体培地においてほぼゼロの全体的な静電荷を有することを意味する。例えば、水溶液におけるかかる高分子の存在は、液体を非ニュートン性（例えば、粘弾性）にすることを可能にする。
【００１８】
一実施形態によれば、非荷電高分子は、０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、より好ましくは１〜４重量％だけ集中部分に存在する。
【００１９】
好ましくは、非荷電高分子の集中は、臨界被覆集中（そこから高分子が接触する集中）以上である。
【００２０】
有利なことに、非荷電高分子は、１０〜１０００００ｋＤａ、好ましくは５０〜１００００ｋＤａ、より好ましくは１００〜１０００ｋＤａの（重量）平均分子量を示す。
【００２１】
本発明によるプロセスの好ましい代替形態によれば、印加される電場は、１０Ｖ／ｍ〜１００００Ｖ／ｍ、好ましくは１００Ｖ／ｍ〜５０００Ｖ／ｍ、より好ましくは２００Ｖ／ｍ〜１０００Ｖ／ｍの値を有し、且つ／又は流体力学的流動は、１〜１００００μｍ／ｓ、好ましくは５〜５０００のμｍ／ｓ、より好ましくは１０〜１０００μｍ／ｓの平均速度によって特徴づけられる。
【００２２】
同様に好ましくは、荷電物体の導入は、チャネルの導入ゾーンにおいて実行され、荷電物体の移動は、チャネルの導入ゾーンから検出ゾーンの方へ実行され、プロセスは、更に、
検出ゾーンに到着する荷電物体の検出を含む。
【００２３】
有利なことに、前記荷電物体は、少なくとも２０（例えば少なくとも１０００の）塩基若しくは塩基対を含む一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子と、少なくとも１００（例えば少なくとも２００）のアミノ酸ユニットを含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と、高分子炭水化物又は他の高分子と、核細胞又は原核細胞と、ナノ物体又はナノ粒子と、からなる群から選択される。
【００２４】
本発明はまた、液体培地における荷電物体を集中させるための装置であって、流動軸を示すチャネルであって、非ニュートン性液体培地で充填されるチャネルと、チャネルにおける流体力学的流動の印加のための手段と、チャネルにおける電場の印加のための手段と、を含み、前記チャネルが、流動軸に直交する第１の横断面及び流動軸に直交する少なくとも１つの第２の横断面を示し、前記第２の断面の最小寸法が、前記第１の断面の対応する寸法より小さいことを特徴とする装置に関する。
【００２５】
本発明の代替形態によれば、前記チャネルは、下部壁、上部壁及び２つの側壁を呈する矩形断面の中空管の形状を有し、前記側壁は、少なくとも１つの狭窄部を局所的に形成する。
【００２６】
好ましくは、前記第２の断面は、前記第１の断面の対応する寸法より少なくとも１０％か、２０％か、５０％か又は９５％だけ小さい最小寸法を示す。
【００２７】
有利なことに、前記中空管の前記側壁は、前記流動軸に対して１０°〜６５°の角度を形成する部分をそれぞれ示す。
【００２８】
別の代替形態によれば、前記チャネルは、少なくとも１つの狭窄部を示す毛細管の管腔である。
【００２９】
この場合に、前記毛細管は、正方形又は円形断面を示すのが好ましい。
【００３０】
有利なことに、前記毛細管は、前記流動軸に対して１０°〜６５°の角度を形成する部分を示す。
【００３１】
本発明及びまた本発明が示す様々な利点は、図面に関連して提示される本発明の実施形態の後続の説明によって、より容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明による装置を上面図に図表で表す。
【図２】図１の装置の（拡大された）断面Ａ−Ａを図表で表す。
【図３】図１及び２に表されたタイプの装置の狭窄部における第１の実施形態の電子顕微鏡上面図を表す。
【図４】図３に表された狭窄部の電子顕微鏡図を斜視図で表す。
【図５】図１及び２に表されたタイプの装置の狭窄部における第２の実施形態の光学顕微鏡上面図を表す。
【図６Ａ】（狭窄部の外側及び狭窄部における）チャネルの流体力場及び電気泳動力場を図表で表す。
【図６Ｂ】（狭窄部の外側及び狭窄部における）チャネルの流体力場及び電気泳動力場を図表で表す。
【図７Ａ】分子の電気泳動速度及び適用される流体力学速度、又は電場及びニュートン性若しくは非ニュートン性流体における流体の流動速度の関数として分子の停止ポイントを示すグラフを表す。
【図７Ｂ】分子の電気泳動速度及び適用される流体力学速度、又は電場及びニュートン性若しくは非ニュートン性流体における流体の流動速度の関数として分子の停止ポイントを示すグラフを表す。
【図７Ｃ】分子の電気泳動速度及び適用される流体力学速度、又は電場及びニュートン性若しくは非ニュートン性流体における流体の流動速度の関数として分子の停止ポイントを示すグラフを表す。
【図８】図１−４に関連して説明された装置タイプの装置によって分離及び集中される、サイズの異なる２つのＤＮＡ集団の蛍光顕微鏡写真を表す。
【図９】図１−４に関連して説明された装置タイプの装置によって分離及び集中される、サイズの異なる３つのＤＮＡ集団の蛍光顕微鏡写真を表す。
【図１０】図９に表されている文脈に現れるポイントの光強度を示すグラフである。
【図１１】図１−４に関連して説明された装置タイプの装置によって分離及び集中される異なるＤＮＡの蛍光顕微鏡写真を表す。
【図１２】図１１に表されている文脈に現れるポイントの光強度を示すグラフである。
【図１３】図１−４に関連して説明される装置タイプの装置によって集中される１００ｎｍの直径を備えたポリスチレンビーズの蛍光顕微鏡写真を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
図１−５を参照すると、本発明による装置は、ガラスの細片又は薄板とすることができる支持体１６と、それ自体は周知の方法で支持体１６上で密閉された、シリコンで作製できる凹部を示す構造１５（例えば、微細加工構造）と、を含む。例えば、膜堆積、フォトリソグラフィ、（化学又はプラズマ）エッチング、及び接着結合技術を用いることが可能である。膜堆積は、遠心分離によって、熱酸化によって、化学蒸着又は物理蒸着（ＣＶＤ及びＰＶＤ）によって、減圧ＣＶＤによって、プラズマ強化ＣＶＤによって、スパッタリングによって等で実行することができる。
【００３４】
構造１５（その凹部を備えた）及び支持体１６は、チャネル１を画定する。チャネル１は、概して、即ち、その長さの大部分にわたって、上部壁１ａ、下部壁１ｂ及び側壁１ｃによって画定された矩形断面の中空シリンダの形状を示す。シリンダの主軸は、チャネル１の流動軸１４である。この流動軸１４に直角に、チャネル１の第１の横断面が、ｈで示された高さ及びＬで示された幅によって画定される。高さｈは、横断面の最小寸法（それはまた、支持体１６と、構造１５の凹部の底部との間の距離である）に対応し、幅Ｌは、高さ方向に直交する方向における寸法に対応する。
【００３５】
一般に、使用時に、高さｈが、垂直面に相当するのに対して、幅Ｌ及び流動軸１４は、水平面にある。ｈの値は、集中される荷電分子又は物体のサイズの関数として選択することができる。
【００３６】
装置は、サンプル、即ち、その荷電分子又は物体を集中させることが望ましいサンプルの導入ゾーン９と、検出ゾーン８と、を更に含む。この場合に、サンプルの導入ゾーン９は、貯蔵所４に位置し、サンプルは、補助装置によって貯蔵所に注入される。
【００３７】
本発明によれば、チャネル１は、流動軸１４に直交する第２の横断面を画定する検出ゾーン８に、図３及び４又は５に表された狭窄部を示し、狭窄部の最小寸法は、好ましくは前記第１の断面の対応する寸法より少なくとも１０％か、２０％か、５０％か又は９５％だけ小さい。本発明によれば、狭窄部は、流動軸に沿った電場及び流体力学場の振幅を空間的に変調する効果を有する。
【００３８】
図３−５に関連して、前記狭窄部２の２つの代替形態の電子顕微鏡図が表されている。図３（上部の図）及び図４（斜視図）の代替形態によれば、チャネル１の側壁１ｃは、チャネルの軸１４と４５°の角度αを狭窄部に形成する。図５の代替形態によれば、チャネル１の側壁は、６５°の角度を狭窄部に形成する。狭窄部において、チャネルの幅は、２．５μｍに低減される。従って、本発明によれば、装置は、そのとき、シリコンに刳り抜かれた不変の高さのスパンであり、その幅は調整される。
【００３９】
使用時に、チャネル１は、電気泳動に適した溶液で充填され、それに対して、流体を非ニュートン性にできる成分が追加された。集中される荷電分子又は物体を含むサンプルが、導入ゾーン９において装置に導入される。
【００４０】
チャネル１における荷電分子又は物体の移動は、第１の貯蔵所４から第２の貯蔵所６の方へ流動軸１４に沿って実行される。これを行うために、流体力学的流動が、（特に第１の貯蔵所４及び第２の貯蔵所６の圧力制御手段１３ａ、１３ｂによって）チャネル１に生成される。
【００４１】
併せて、電場が、それぞれの貯蔵所４、６における電極１０ａ、１０ｂによってチャネル１に生成される。印加される流体力学的流動の反対方向に荷電分子又は物体を移動させる傾向があるこの電場は、集中される荷電分子又は物体に静電力を印加するのに適している。
【００４２】
図６Ａ（図の上部は上面図であり、下部は側面図である）に関し、検出ゾーン８に存在する狭窄部の外側における装置の使用中に、チャネル１の電気泳動力場１７は、（ｈ及びＬの寸法に対して無視できる特性長にわたって）チャネルの壁の直ぐ近くを除いて、チャネル１の流動軸１４（ｙ軸）の方向において、且つ高さｈ（ｚ軸）及び幅Ｌ（ｘ軸）に沿って、ほぼ均一である。流体力場１８に関連して、それは、（Ｌの寸法に対して無視できる特性長にわたって）チャネルの壁の直ぐ近くを除いて、流動軸１４（ｙ軸）の方向において、且つ幅Ｌ（ｘ軸）に沿って均一である。他方で、それは、高さｈ（ｚ軸）に沿っては、均一ではない。一般に、それは、ポアズイユの法則に特有の放物型のプロファイルを示す。チャネル１のアスペクト比Ｌ／ｈは、流体力場のこの構成を得るように選択される。これは、アスペクト比が、一般に、１以上か、１０以上か又は２０以上である理由となっている。高さｈに沿った流体力場１８の非均一性は、荷電分子又は物体を集中させることの有効性という影響を有する。
【００４３】
所望の流体力学的流動プロファイル（特に、所与の平均流量及び速度値によって特徴づけられる）は、入口貯蔵所と出口貯蔵所との間の圧力差を生成するために、それぞれの圧力制御手段１３ａ、１３ｂを作動させることによって得られる。例えば、導入ゾーン９から検出ゾーン８の方へと、集中される変形可能な荷電分子又は物体の移動をもたらす流体力学的流動を生成するために、貯蔵所４と貯蔵所６との間に圧力差が生成される。例えば、チャネルのジオメトリを考慮して、０．０１〜１０ｂａｒ、好ましくは０．０５〜４ｂａｒ、より好ましくは０．１〜１ｂａｒの圧力差が、所望の流体力学的流動プロファイルを得ることを可能にする。
【００４４】
図６Ｂは、狭窄部を含む検出ゾーンにおけるチャネルの上面図及び側面図を表す。図の上部は、チャネルの幅が、側壁１ｃの存在ゆえに流動軸に沿って減少するチャネルの上面図を表す。下部は、チャネルの側面図を表し、チャネルの高さは、狭窄部の存在によって変えられないままである。図の上部に関連し、（ｘ、ｙ）平面において、幅が減少する場合に電気泳動場の値が増加することが注目される。同様に、流体力学場プロファイルは、狭窄部ゾーンに沿った流体力学的流動の維持によって変化する。従って、チャネルの幅における変動は、電場の均一な値における変動、及び流動軸に沿った流体力学場プロファイルにおける変動を引き起こす。他方で、図の下部では、（ｙ、ｚ）平面において、流体力学場及び電気泳動場は、流動軸に沿って不変のままである。
【００４５】
従って、各分子は、検出ゾーンにおけるその位置の関数として、異なる流体力学場及び電気泳動場にさらされる。従って、各荷電分子又は物体の伝搬速度は、流動軸に沿った狭窄ゾーンにおけるその移動中に変化する。
【００４６】
本発明の根底にある原理は、図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに関連して説明される。
【００４７】
４８．５ｋｐｂを含むＤＮＡ分子を含むサンプルが、上記で説明された装置タイプだが狭窄部を示さない装置に導入され、問題の装置のチャネルは、２μｍの最小寸法を備えた断面を示す。この導入は、分子の不変の純流動を観察するために実行された。電気泳動速度（ｅｖ）及び流体力学速度（ｈｖ）の範囲は、装置に印加される電気泳動場及びまた静水圧差を変えることによって掃引される。ＤＮＡ分子が、図７Ａの曲線上で点線として表されている流体力学速度（ｈｖ）及び電気泳動速度（ｅｖ）の値の異なるペア用に停止されたことが実験的に分かった。この曲線の下では、分子の正の速度に対応する優勢な流体力学効果が存在するのに対して、この曲線の上では、全体的な負の速度に対応する電気泳動速度が優勢になり、分子は後退する。チャネルの狭窄部の本発明による利用は、図６Ｂ並びに図７Ｂ及び７Ｃに関連して説明されるように、異なる流体力学及び電気泳動速度値を掃引できるようにする、原点を通過して引かれる直線によってグラフ上に象徴化されている。
【００４８】
速度がゼロのポイントを組み合わせる（図７Ａにおいて円によって表されている）この直線が曲線を横切る箇所は、所与のタイプの荷電分子又は物体の一意の停止ゾーンに対応する。
【００４９】
更に、図７Ｂに関連して、次のことが分かった。即ち、異なるサイズ、つまり３ｋｂ、５ｋｂ、４８．５ｋｂのＤＮＡの様々なサンプル用に、流体の速度及び印加される電場の関数としての分子の停止パラメータを示す曲線が、異なり、且つ検討中のＤＮＡ分子のサイズに依存することが分かった。
【００５０】
従って、矢印によって表されているように、狭窄部内で異なる電気泳動及び流体力学速度値を掃引することによって、異なる箇所で異なるＤＮＡ分子を集中及び停止させることが可能である。
【００５１】
理論によって処理されることを望まず、発明者らは、非ニュートン性流体が存在する状態で、流体のシャーリングが、分子を壁の方にぴったりつける傾向を有する横方向力を介して、流体力学的流動と電気泳動移動度との間の非線形結合を生成することを考慮する。この横方向力は、ＤＮＡの応答曲線の弱い増加を説明する。流動速度が速ければ速いほど、分子を停止させるために必要な電場の強度は低い。更に、この力は、扱われるＤＮＡのサイズに依存する。何故なら、長鎖分子は、流動のより大きな動揺及び従って非ニュートン効果の増加を引き起こすからである。従って、流体を作動させるための所与のパラメータ（電場及び静水圧差）用に、パイプに沿って異なる位置で分子を停止させ得る分子の一連の停止ポイントが存在する。
【００５２】
従って、本発明による装置は、非ニュートン性流体が存在する状態で、（先行技術の装置のように）異なるサイズの荷電物体、たとえ同様の移動度の荷電物体さえ集中及び分離することを可能にする。
【００５３】
実証されるように、ニュートン性流体が存在する状態では、荷電物体を集中させることも分離させることも不可能である。
【００５４】
これは、次の理由による。即ち、ニュートン性流体において、電気泳動速度が、関係ｅｖ（ｙ）＝μＥ（ｙ）に線形的に依存し、この式で、μが、チェーンのサイズに依存しないＤＮＡの電気泳動移動度であり、流体力学速度が、分子の位置ｙに従って流体の平均速度と等しく、即ちｈｖ（ｙ）＝ｖ（ｙ）であり、ｙが、チャネルの流体の流動方向であるからである。従って、分子は、ｅｖ（ｙ）＝ｈｖ（ｙ）、即ちＥ（ｙ）＝１／μ・ｖ（ｙ）のときに停止される。従って、停止曲線は、図７Ｃに示されているように、非ニュートン性流体の場合に、原点を通る、且つ勾配１／μの直線である。
【００５５】
ここで、狭窄部によって引き起こされる可能性がある電場及び流体力学速度における変動が検討される。電場Ｅ及び流動速度ｖが、第１の近似に対して保存流束を有するので、
ｖ（ｙ）＝ＳＯ／Ｓ（ｙ）・ｖ０
Ｅ（ｙ）＝ＳＯ／Ｓ（ｙ）・Ｅ０
と考えてもよい。
これらの式で、Ｓ（ｙ）は、位置ｙの狭窄部におけるチャネルの断面である。Ｓ０、Ｅ０及びｖ０は、狭窄部によって引き起こされる動揺がない状態で、チャネルの断面、電場、及び狭窄部から遠く離れた流体速度の値を示す。
【００５６】
従って、狭窄部は、原点を通る直線上の電場／流動速度ペアの集合を掃引できるようにし、その勾配は、値Ｅ０／ｖ０を有し、Ｅ０は、チャネルに印加される電場であり、ｖ０は、狭窄部がない状態で、チャネルにおける流動速度である。
【００５７】
従って、分子を停止させることができるように、狭窄部が存在しないか又は存在する状態で、（Ｅ０／ｖ０）＝１／μなどの実験条件を適用することが必要である。他方で、この分子は、その速度が、チャネル全体にわたって不変且つゼロになるであろうから、集中され得るために流体において移動されなくてもよい。これは、次の理由による。即ち、同じ箇所に分子を集中させることができるために、分子の全体的な移動速度ｅｖ＝ｈｖが、停止ポイントでそれぞれを釣り合わす前に減少することが必要であるからである。その後、サンプルが、例えばＤＮＡ分子など、同様の移動度だが異なるサイズの幾つかの荷電分子又は物体含む場合に、適用される狭窄角度並びに流体力学場及び電気泳動場の値などのパラメータが適切に選択される場合に、流動軸に沿った異なる位置で異なる分子又は物体（これらの分子又は物体が非ニュートン性流体に溶解されている場合）を停止させ得ることが分かる。この場合に、本発明はまた、同様の移動度の荷電分子又は物体を分離できるようにする。検出手段は、図には表されていない。それらは、チャネル１に対向する支持体１６の側部の顕微鏡レンズ及びこれに接続された、ＣＤＤカメラなどの検出器を含むことができる。従って、個別の荷電分子又は物体は、取得画像上で検出することができ、検出ゾーン８又はその一部において全体的な強度測定が、時間の関数として実行され得る。
【００５８】
測定値の解析及び取得データのプレゼンテーション用の手段は、この装置と組み合わせることができる。
【００５９】
装置はまた、例えば、上記で説明したものと類似の他のチャネル、貯蔵所及び／又は電極を含むラボオンチップに組み込むことができる。例えば、ラボオンチップは、本発明による分離装置に下流に結合された化学又は生化学反応装置を含むことができる。従って、本発明による集中プロセスの使用は、ラボオンチップにおいて実行された化学又は生化学反応からの生成物を分析できるようにする。
【００６０】
ラボオンチップはまた、集中される異なる荷電分子又は物体に対応する断片を収集するための手段を含むことができる。これらの収集手段は、検出ゾーン８の下流に設けることができる。代替として、それらは、検出ゾーン８に取って代わることができ、その場合に、装置は、単独の準備目的に使用される。
【００６１】
これらの収集手段は、前述の化学又は生化学反応装置と組み合わせて、又はそれらなしに設けることができる。
（実施例）
【００６２】
８０ｍＭのトリス塩酸、８０ｍＭのホウ酸、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、０．５μＭのジチオトレイトール、それらに追加された２重量％の３６０ｋＤａ  ＰＶＰからなる、ＤＮＡの電気泳動用の標準緩衝液が、異なるＤＮＡサンプルを希釈するために用いられた。上記のように、ＰＶＰの導入は、緩衝液を非ニュートン性にすることができるようにする。一般に、異なるサイズのＤＮＡの異なるサンプルは、核酸の１〜１０ｎｇ／μｌの比率で、この緩衝液において希釈された。
【００６３】
ＤＮＡ断片に存在する核酸は、４塩基対当たり１プローブの比率で、挿入剤（ＹＯＹＯ（Ｒ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてラベルづけすることによって、蛍光性にされる。
【００６４】
この分子集団を分離及び解析するために使用される装置は、図１に表されている通りである。チャネル１は、１００μｍの幅及び２μｍの高さを有する。第２の横断面としてもまた周知の狭窄部によって形成されるチャネルの最も狭いゾーンにおいて、チャネル１は、２μｍの幅及び２μｍの高さを有する。導入ゾーン９及び検出ゾーン８は、５ｍｍだけ分離される。サンプルを含まない２００μｌの緩衝液は、チャネル１の貯蔵所４及び６に置かれる。貯蔵所４から貯蔵所６への溶液の流動は、ＰＶＰで作製される表面の飽和を可能にするために、３０分間、圧力を調整することによって生成される。
【００６５】
実施例１：小さなサイズ及び大きなサイズを有する２つのタイプのＤＮＡを含むサンプル
この例において、本発明は、上記のように、緩衝液に存在する４８．５ｋｐｂを含むラムダＤＮＡ及び５．４ｋｐｂを含むＰｈｉＸ１７４ＤＮＡを分離及び集中させるために用いられる。
【００６６】
１００ｍｂａｒの全体的な圧力差及び４０Ｖの全体的な電圧差が、交差した流体力学的流動及び電気泳動流動、即ち流動軸に沿うがしかし対軸に沿って向けられた流動と共に用いられた。１分間待った後で、蛍光顕微鏡写真が撮られた。この写真は、図８に表されている。狭窄部によって、分子は、狭窄部の上流のゾーンで停止された。分子は、流体力学効果が、停止ポイントの前で優勢であり、それが、正の速度に帰着するので集まり、且つ分子は、逆に下流に移動する。次に、装置は、停止ポイントが分子のサイズに依存するので、コンセントレータ及びセパレータの両方を構成する。従って、図８において、ＰｈｉＸ１７４ＤＮＡ分子に対応する別の雲から分離されたラムダＤＮＡ分子に対応する雲が見られる。装置を１分間使用した後で、これらの２つの異なるＤＮＡを集中させるファクタ１０が取得された。このファクタは、流体力学的流動を増加させることによって更に改善することができる。
【００６７】
実施例２：３つのタイプのＤＮＡを含むサンプル
本発明はまた、１５ｋｂｐ、３５ｋｂｐ及び４９ｂｐの３つのタイプのＤＮＡを含むサンプルと共に用いられた。５０ｍｂａｒの全体的な圧力差及び７Ｖの全体的な電圧差が、交差した流体力学的流動及び電気泳動流動と共に用いられた。１００秒待った後で、蛍光顕微鏡写真が撮られた。この写真は、図９に表されている。３つのタイプのＤＮＡ分子の集中に対応する３つの雲の光強度が評価された。対応する結果は、図１０に表されたグラフにプロットされている。このグラフは、３つの分離及び集中されたＤＮＡタイプに対応する３つのピークＡ、Ｂ及びＣを示す。
【００６８】
実施例３：小さなサイズを有するＤＮＡを含むサンプル
本発明はまた、５００〜１００００塩基対を含む１ｋｐｂのＤＮＡラダー分子量ラベルで用いられた。
【００６９】
１００ｍｂａｒの全体的な圧力差及び４０Ｖの全体的な電圧差が、交差した流体力学的流動及び電気泳動流動と共に用いられた。
【００７０】
１７秒待った後で、蛍光顕微鏡写真が撮られた。この写真は、図１１に表されている。この図にプロットされたフレームに含まれるゾーンの光強度が測定された。対応する結果は、図１２に表されたグラフにプロットされている。これらの結果は、下部の目盛りに表されたものなど、ラベルを構成する異なるＤＮＡに対応する分離及び集中を示し、且つ本発明が、サイズの短いＤＮＡの用途に使用され得ることを含意する。
【００７１】
実施例４：マイクロビーズを含むサンプル
本発明はまた、１００ｎｍの直径を備えた蛍光ポリスチレンマイクロビーズ（ＦｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓＴＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むサンプルと共に用いられた。かかるマイクロビーズの変動能は、かなり低く、そのヤング率は、３ＧＰａ程度である。マイクロビーズは、上記の緩衝液及び２重量％の３６０ｋＤａ  ＰＶＰを含む溶液において希釈された。ＤＮＡの分離及び集中用の上記の装置と同じ装置が用いられた。この例において、上記の溶液など、ＴＢＥ及びＰＶＰに基づいた２００μｌの溶液が用いられた。１５０ｍｂａｒの全体的な圧力差及び４０Ｖの全体的な電圧差が、交差した流体力学的流動及び電気泳動流動と共に用いられた。１８秒待った後で、蛍光顕微鏡写真が撮られた。この写真は、図１３に表されている。マイクロビーズは、ＤＮＡ分子の場合ほど均質でないゾーンに集中される。ミクロスフェアの分布において観察された分散は、ＤＮＡ集団に関連して観察されたサンプルの非均一性によって説明することができ、その塩基対の数は、固定されている。従って、１０９Ｐａ以上のヤング率を備えた荷電物体の分離及び集中がまた可能であることが実証される。従って、本発明の適用の範囲は、ＤＮＡ分子の集中及び分離に限定されず、上記の荷電物体タイプにおける任意のタイプの荷電物体に延長することができる。
【００７２】
サンプルの組成並びに電気泳動場及び流体力学場の値に従って、幾つかの荷電分子又は幾つかの荷電物体が、チャネルの流動軸に沿って、それらの移動中に正の移動速度を維持することができることに留意されたい。従って、これらの分子は、狭窄部の上流で停止されず、下流で収集することができる。従って、本発明による装置はまた、分子をフィルタリングするための装置として用いることができる。
【００７３】
本明細書で表されている異なる実施形態及び実施例において、チャネルは、矩形断面の中空管の形状を有し、そのフェースの１つは、荷電分子又は物体の光検出を可能にするために透明である。
【００７４】
毛細管、即ち、例えばガラスなどの透明材料で作製された、好ましくは正方形又は円形断面の管構造の毛細管の管腔によって形成されたチャネルを検討することがまた可能である。
【００７５】
他の実施形態において、狭窄部が、流動軸に非線形的に近づく壁からなり得ることに更に留意されたい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ニュートン性液体培地において荷電物体を集中させるためのプロセスであって、
流動軸、前記流動軸に直交する第１の横断面、及び前記流動軸に直交する少なくとも１つの第２の横断面を示すチャネルに荷電物体を含むサンプルを導入することであって、前記第２の断面の最小寸法が、前記第１の断面の対応する寸法より小さいことと、
前記チャネルの一方向に流体力学的流動を印加し、一緒に反対方向に前記チャネルに電場を印加することであって、前記第１の断面の流動軸に沿って前記チャネルにおける前記荷電物体を前記第２の断面へ移動させ、それらを停止させ、前記第２の横断面の上流の少なくとも１つのゾーンでそれらを集中させることができるようにすることと、
を含むプロセス。
【請求項２】
前記液体培地が、非荷電高分子を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記非荷電高分子が、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド及びそれらの混合物から選択される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記非荷電高分子が、０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、より特に好ましくは１〜４重量％だけ集中部分に存在する、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記印加される電場が、１０Ｖ／ｍ〜１００００Ｖ／ｍ、好ましくは１００Ｖ／ｍ〜５０００Ｖ／ｍ、より特に好ましくは２００Ｖ／ｍ〜１０００Ｖ／ｍの値を有し、且つ／又は前記流体力学的流動が、１〜１００００μｍ／ｓ、好ましくは５〜５０００μｍ／ｓ、より特に好ましくは１０〜１０００μｍ／ｓの平均速度によって特徴づけられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記荷電物体の導入が、前記チャネルの導入ゾーンにおいて実行され、前記荷電物体の移動が、前記チャネルの導入ゾーンから検出ゾーンの方へ実行され、前記プロセスが、
前記検出ゾーンに到着する前記荷電物体の検出を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記荷電物体が、少なくとも２０塩基若しくは塩基対を含む一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子と、少なくとも１００のアミノ酸ユニットを含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と、高分子炭水化物又は他の高分子と、核細胞又は原核細胞と、ナノ物体又はナノ粒子と、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
液体培地における荷電物体を集中させるための装置であって、
流動軸（１４）を示すチャネル（１）であって、非ニュートン性液体培地で充填されるチャネル（１）と、
前記チャネル（１）における流体力学的流動（１３ａ、１３ｂ）の印加のための手段と、
前記チャネル（１）における電場（１０ａ、１０ｂ）の印加のための手段と、
を含み、
前記チャネル（１４）が、前記流動軸に直交する第１の横断面及び前記流動軸に直交する少なくとも１つの第２の横断面を示し、前記第２の断面の最小寸法が、前記第１の断面の対応する寸法より小さいことを特徴とする装置。
【請求項９】
前記チャネルが、下部壁、上部壁及び２つの側壁を呈する矩形断面の中空管の形状を有し、前記側壁が、少なくとも１つの狭窄部を局所的に形成することを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記第２の断面が、前記第１の断面の対応する寸法より少なくとも１０％か、２０％か、５０％か又は９５％だけ小さい最小寸法を示すことを特徴とする、請求項８又は９に記載の装置。
【請求項１１】
前記中空管の前記側壁が、前記流動軸（１４）に対して１０°〜６５°の角度を形成する部分をそれぞれ示すことを特徴とする、請求項９又は１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記チャネルが、少なくとも１つの狭窄部を示す毛細管の内腔であることを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【請求項１３】
前記毛細管が、正方形又は円形断面を示すことを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記毛細管が、前記流動軸（１４）に対して１０°〜６５°の角度を形成する部分を示すことを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の装置。
【国際調査報告】
2017529522.tif 000020
2017529522.tif 000021
2017529522.tif 000022
2017529522.tif 000023
2017529522.tif 000024
2017529522.tif 000025