(57)【要約】  ＡＴ２Ｒの新規ポリペプチドアゴニスト、ならびに該アゴニストを含む医薬組成物、不十分なＡＴ２Ｒ活性もしくは過剰なＡＴ１Ｒ活性を特徴とする疾患、病態、または障害の処置におけるそれらの使用方法、および研究目的での実験室用試薬としてのそれらの使用方法を開示する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴ２Ｒタンパク質を発現する細胞において、ＡＴ２Ｒタンパク質を活性化する方法であって、
式：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６、
式中：
Ａ１は、Ｌｙｓであり
Ａ２は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり
Ａ３は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり
Ａ４は、Ｌｙｓであり
Ａ５は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり、そして
Ａ６は、Ｔｒｐである、
に相当するアミノ酸配列を含むＡＴ２Ｒアゴニストの有効量を該細胞に提供することを含む、前記方法。
【請求項２】
ＡＴ２Ｒタンパク質を発現する細胞において、ＡＴ１Ｒタンパク質を阻害する方法であって、
式：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６、
式中：
Ａ１は、Ｌｙｓであり
Ａ２は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり
Ａ３は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり
Ａ４は、Ｌｙｓであり
Ａ５は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり、そして
Ａ６は、Ｔｒｐである、
に相当するアミノ酸配列を含むＡＴ２Ｒアゴニストの有効量を該細胞に提供することを含む、前記方法。
【請求項３】
ＡＴ２Ｒの活性化不足、またはＭＴＯＲ、ＮＨＥ６、ＥｒｂＢ３、一酸化窒素合成酵素、ＭＣＬ−１、およびプロスタグランジン１２−ＩＰから成る群より選択されるＡＴ２Ｒの下流エフェクターの不十分な活性もしくは産生、を特徴とする病態の処置を必要とする哺乳動物にアゴニストを投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
病態が、糖尿病、ＥｒｂＢ３の機能不全に関与するがん、および高血圧から成る群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＡＴ２Ｒアゴニストを、自閉症、ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋ジストロフィー、およびハンチントン病から成る群より選択される神経学的病態の処置を必要とする哺乳動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＡＴ２Ｒアゴニストを、脊髄損傷、外傷性脳損傷、および脳病変から成る群より選択される損傷の処置を必要とする哺乳動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＡＴ２Ｒアゴニストを、レニン−アンジオテンシン系の調節不全を特徴とする病態の処置を必要とする哺乳動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
病態が、高血圧、腎障害、腎疾患、心血管疾患、およびメタボリックシンドロームから成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＡＴ２Ｒアゴニストを、ｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳されて薬物を産生するｍＲＮＡを導入することにより投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＴ２Ｒアゴニストを、ＡＴ１Ｒの過剰活性化を特徴とする病態の処置を必要とする哺乳動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
病態が、腎障害、高血圧、およびメタボリックシンドロームから成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アゴニストを、実験室での研究用にＡＴ２Ｒ受容体を活性化するための試薬として用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
アゴニストを、ＡＴ２Ｒ活性化因子によって活性化または発現され得るｍｉＲＮＡまたはタンパク質の活性化不足を特徴とする病態の処置を必要とする哺乳動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アゴニストを、ＡＴ２Ｒの発現不足を特徴とする病態の処置を必要とする哺乳動物に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
さらなる安定性のためにアゴニストをペグ化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
アゴニストを、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現して該アゴニストを産生する遺伝子配列または単離核酸を、ウイルスベクターを介して細胞に導入することにより投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
アゴニストを、Ｄ１様受容体のＡＴ２Ｒ介在活性化を刺激してマイクロ流体シミュレーション系におけるナトリウム排出を調節するための試薬として用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
アゴニストを、実験室での研究用にＡＴ１受容体の選択的阻害を可能にするための試薬として用いる、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
アゴニストを、ｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳されて該アゴニストを産生するｍＲＮＡを導入することにより投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
さらなる安定性のためにアゴニストをペグ化する、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
アゴニストを、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現して該アゴニストを産生する遺伝子配列または単離核酸を、ウイルスベクターを介して細胞に導入することにより投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
アゴニストを、糖尿病およびメタボリックシンドロームのような高血糖を特徴とする病態に対して投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
式：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６、
式中：
Ａ１は、Ｌｙｓであり
Ａ２は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり
Ａ３は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり
Ａ４は、Ｌｙｓであり
Ａ５は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり、そして
Ａ６は、Ｔｒｐである、
に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２５】
式：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６、
式中：
Ａ１は、Ｌｙｓであり
Ａ２は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり
Ａ３は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり
Ａ４は、Ｌｙｓであり
Ａ５は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり、そして
Ａ６は、Ｔｒｐである、
に相当するアミノ酸配列から本質的に成るポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
式：Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６、
式中：
Ａ１は、Ｌｙｓであり
Ａ２は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり
Ａ３は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり
Ａ４は、Ｌｙｓであり
Ａ５は、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり、そして
Ａ６は、Ｔｒｐである、
に相当するアミノ酸配列から成るポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２７】
ポリペプチドが、ＡＴ２Ｒ受容体を発現する細胞に投与したときにＡＴ２Ｒアゴニスト活性を有する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
Ａ２がＰｒｏである場合、Ａ５は３Ｈｙｐまたは４Ｈｙｐであり；あるいは
Ａ５がＰｒｏである場合、Ａ２は３Ｈｙｐまたは４Ｈｙｐである、
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
凍結乾燥されている、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
医薬的に許容されるキャリヤーをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、分子生物学および生化学、とりわけ、アンジオテンシンＩＩ  ２型受容体（ＡＴ２Ｒ）の活性を調節するための医薬の開発に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
[0002]アンジオテンシンＩＩ  ２型受容体ＡＴ２Ｒは、レニン−アンジオテンシン系（ＲＡＳ）の抗炎症性／血管拡張性ブランチのメンバーである。ＡＴ２Ｒ活性化は心血管疾患および卒中を改善し、がんを弱力化し、神経保護的役割を果たす（１〜１７）。
【０００３】
[0003]ＡＴ２Ｒは、７つの膜貫通ドメインを形成する３６３アミノ酸の配列を含む膜貫通受容体タンパク質である。ＡＴ２Ｒの３次元構造はまだ解明されていないが、５つの潜在的グリコシル化部位と、リガンド−タンパク質相互作用に重要な保存リシン残基（Ｌｙｓ１９９またはＫ１９９）を含有する。ＡＴ２Ｒは、第２細胞内ループに潜在的タンパク質キナーゼＣリン酸化部位も含有する（１８）。
【０００４】
[0004]ＡＴ２Ｒは、タンパク質のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに属する。ＡＴ２Ｒ活性化は、さまざまなタンパク質ホスファターゼ（例えば、ＳＨＰ１、ＭＫＰ１、およびＰＰ２Ａ）を刺激し、がん細胞増殖を阻害する。ブラジキニン／一酸化窒素／ｃＧＭＰ経路およびプロスタグランジンＩ２−ＩＰ受容体経路のＡＴ２Ｒ介在活性化は、その血管拡張作用に寄与する（１９〜２３）。しかしながら、ＡＴ２Ｒによって活性化されるシグナル伝達機序の多くは、Ｇタンパク質に依存しておらず、ＡＴ２Ｒと他の細胞タンパク質の直接的相互作用に関与している。ＡＴ２Ｒは、そのＣ末端細胞質ドメイン（ＣＣＤ）を介して、ニューロン分化、血管再構築、および腫瘍抑制に関与するＡＴ２Ｒ−相互作用タンパク質（ＡＴＩＰ）のファミリーと相互作用する（２４）。ＡＴ２Ｒは、その第３細胞内ループ（ＩＣＬ）およびＣＣＤを介してＥｒｂＢファミリー受容体およびＮａ＋／Ｈ＋交換輸送体ＮＨＥ６と相互作用し、ＡＴ２Ｒの第３ＩＣＬは、アンジオテンシンＩＩ  １型受容体（ＡＴ１Ｒ）のシグナル伝達の弱力化に関与することが示されている（２５、２６）。ＡＴ２Ｒ介在アポトーシスも第３ＩＣＬを必要とする（２７、２８）。興味深いことに、ＣＣＤの欠失はアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）に対するＡＴ２Ｒの親和性を低下させるが、ペプチドリガンドＣＧＰ４２１１２Ａに対する親和性を高め、ＡｎｇＩＩ誘発性のｃＧＭＰ還元を促進させる（２９、３０）。これらの観察は、ＡＴ２Ｒのシグナル伝達における第３ＩＣＬおよびＣＣＤの役割を強調するものである。
【０００５】
[0005]ＡＴ２Ｒ下方制御はパーキンソン病（ＰＤ）に見られる（３１）。ＰＤにおけるＡＴ２Ｒの役割について知られていることは多くはないが、ＡＴ２Ｒ活性化が中脳前駆体からのドーパミン作動性ニューロンの分化をもたらすことが知られている（３２）。これに加えて、ＡＴ２Ｒ活性化は培養中脳ドーパミン作動性ニューロンに対し神経保護的であるが、ＡＴ２Ｒアンタゴニストの使用は神経保護効果を排除する（３３）。
【０００６】
[0006]Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら（１９８８）およびＵｎｇｅｒら（１９８８）からの初期の研究は、生化学的および薬理学的アプローチを用いて、脳内のレニン−アンジオテンシン系の存在を立証した（３４、３５）。さまざまな成分（例えば、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、ＡｎｇＩＩ、およびＡｎｇＩＩ受容体）が、体液と電解質のバランスの調節および動脈圧の調節に関与する脳の部位（３６、３７）、ならびに認知、挙動、および移動に関与する構造に見いだされる。興味深いことに、これらの成分のすべて、とりわけＡＴ２Ｒは、胎児期の間に高度に発現する。これは、それらが発育中に重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。胎仔および新生仔ラットで行われた研究に基づいてＮｕｙｔらによって報告されているように、ＡＴ２Ｒ  ｍＲＮＡは、視床下部外側野の分化初期に（例えば、胎生１３日目という初期に）出現したが、さまざまな発育中／分化中の脳構造に出現したのは一時的であった（３８）。ほとんどの領域において、ＡＴ２Ｒ  ｍＲＮＡ発現の個体発生は、さまざまな領域自体（成熟ニューロンにおいてＡＴ２Ｒ発現が劇的に減少する、小脳、下オリーブ複合体、ならびに舌、口周囲、および顎の筋肉の神経を支配する延髄運動核のような）の成熟および分化と高度に相関している。
【０００７】
[0007]細胞株で行った研究から、発育中のＡＴ２Ｒの活性化は、神経突起伸長、ニューロン移動、ニューロンの生死のバランス、ならびにシナプス結合の確立および維持に関与すると思われる。成体ラットにおいて、ＡＴ２Ｒは、延髄（自律的機能を制御する）、隔壁および扁桃（不安様行動に関連する）、視床（感覚認知に関連する）、上丘（視覚的情報に応答した眼球運動を制御し、パーキンソン病におけるまばたきの過興奮に関連する）、ならびに視床下核および小脳（運動機能の学習に関連する領域）において、高レベルで見いだされた（３９、４０、４１）。
【０００８】
[0008]Ｂｏｔｔａｒｉらによると、ＡＴ２Ｒは、ニューロンに見いだされるが、星状細胞またはグリア細胞には見られない。成人の脳の限られた領域におけるＡＴ２Ｒの存在および胎児における（多くの分化中の構造および核における）その広範な分布は、それぞれニューロン機能およびニューロン発達における役割を示している（４２）。したがって、ニューロン起源の細胞およびニューロン再生のモデルを用いて、ＡＴ２Ｒはアポトーシスおよび細胞分化の調節に関与することが見いだされた。発育中の多くの構造におけるその一時的発現は別として、ＡＴ２Ｒの発現は細胞障害後の脳で増大し、これは、ＡＴ２Ｒがニューロンの創傷治癒において役割を果たすことを示している。ＡＴ２Ｒは、神経再生においてもっとも重要なニューロン分化に加えて、再生および再構築中の重要なプロセスである造血細胞の分化も刺激する（３１）。
【０００９】
[0009]虚血性障害は、血小板、マクロファージ、および白血球などのいくつかの造血細胞の浸潤を特徴とする（４３）。顕著には、ＡＴ２Ｒは、ヒト単球から樹状細胞への分化を誘発する能力を有しており（４４）、保護効果の可能性を示している。ＡＴ２Ｒのこの保護効果は、ＡＴ２Ｒ発現が欠失している造血細胞を有するマウスにおいてより多くの虚血性障害が見いだされたという観察結果によって確認される（４５）。これらの所見は、造血細胞におけるＡＴ２Ｒの発現および活性化が、脳損傷後の有益な作用の一部であることを示している（４６）。
【００１０】
[0010]腎ドーパミンＤ１様受容体（Ｄ１Ｒ）およびＡＴ２Ｒは、ＡＴ１Ｒが介在する尿細管ナトリウム再吸収に拮抗する、重要なナトリウム排泄増加性受容体である。一側性腎摘出されたナトリウム負荷スプレーグ−ドーリーラットにおいて、高選択性Ｄ１Ｒアゴニストであるフェノルドパムを腎間質に直接注入すると、ＡＴ２Ｒ特異性アンタゴニストＰＤ−１２３３１９または微小管重合阻害剤ノコダゾールによって消失するが、アクチン重合阻害剤サイトカラシンＤによっては消失しない、ナトリウム排泄増加性応答を誘発した。この結果は、Ｄ１Ｒによって誘発されるナトリウム排泄増加には、アデニルシクラーゼ／ｃＡＭＰシグナル伝達経路を包含する微小管依存性の様式での、腎近位尿細管細胞の頂端膜へのＡＴ２Ｒ補充が必要であることを示している。これらの研究は、腎Ｄ１ＲおよびＡＴ２Ｒが同時に作用してｉｎ  ｖｉｖｏでのナトリウム排出を促進する機序に関する新規洞察を提供する（４７）。
【００１１】
[0011]ＡＴ２Ｒアゴニストである化合物２１（Ｃ２１）で１次ニューロンを処理すると、軸索可塑性の促進ならびに神経保護的および抗アポトーシス的機序により、実験的脊髄損傷の機能回復を改善させた（４８）。
【００１２】
[0012]ＡＴ２Ｒはタンパク質のＧＰＣＲファミリーに属しているが、そのシグナル伝達機序は非定型的であり、理解しにくいままである。活性化ＡＴ２Ｒは、ブラジキニン（ＢＫ）／一酸化窒素／ｃＧＭＰの血管拡張カスケードを誘発し、さまざまなタンパク質ホスファターゼ（例えば、ＳＨＰ１、ＭＫＰ１、およびＰＰ２Ａ）を刺激し、がん細胞増殖を阻害する（１９〜２３）。ＡＴ２Ｒは、ニューロン分化、血管再構築、およびＣＣＤによる腫瘍抑制に関与するＡＴ２受容体相互作用タンパク質（ＡＴＩＰ）のファミリーと相互作用もする（４９、５０）。ＡＴ１受容体遮断薬（ＡＲＢ）による長期的処置は、通常は心血管組織においてＡＴ１Ｒと共発現するＡＴ２ＲへのＡｎｇＩＩの再誘導をもたらし、増大したＡＴ２Ｒ活性化および増強したＡＴ１Ｒ−ＡＴ２Ｒクロストークを生じさせることができる。ＡＴ２Ｒノックアウトマウスにおいて、ＡＲＢは、急性期梗塞後再構築を弱力化することができなかった。これは、ＡＲＢの心臓保護作用にＡＴ２Ｒが必要であることを示している（１７）。
【００１３】
[0013]ＡＴ２Ｒの心臓保護作用は、中程度に心臓特異的なＡＴ２Ｒ過剰発現が虚血性傷害から心臓を保護するという事実によって強調される（１６）。
[0014]心血管疾患（ＣＶＤ）の発生に寄与する炎症カスケードは、罹患率の著しい上昇がきっかけとなって、ここ１０年の間に急速に解明されてきている。これを秩序だって説明すると、すべての１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）致死率のほぼ７０％は該病態に起因する（５１）。炎症性ＡＴ１Ｒの活性化増大は、心血管疾患および高血圧に見られる（３）。一般に、ＡＴ１Ｒの活性化増大は、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−６などの炎症性およびがん誘発性（pro-cancerous）タンパク質を上方制御する（５２、５３、５４）。
【００１４】
[0015]糖尿病性腎障害は、特定のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）の基礎レベル増加を特徴としているため、実験的処置は、これら同マーカーの調節に焦点が当てられている。多数の研究により、血清および尿中のサイトカインレベルが、該疾患の進行と正に相関することが示された。腎障害の病因にとりわけ関連して、ＩＬ−６のような分子は、それぞれ血管内皮細胞の透過性および基底膜肥厚の進行の改変に関与することが確認されている（５５）。
【００１５】
[0016]ＲＡＳの長期活性化は、全身的および局所的にＡｎｇＩＩを上昇させる。その後、ＡｎｇＩＩはＡＴ１Ｒに結合し、筋収縮、塩および水の保持、線維症、多くの代謝性疾患の根底にある肥大症および過形成症、ならびに不良な心血管および腎予後を促進するシグナル伝達経路を誘発する。ＲＡＳの遮断は、レニン、ＡＣＥ、またはＡＴ１Ｒシグナル伝達の阻害を介して複数レベルで行うことができる（１、２、５、９）。これらのレベルのすべてにおいて効果的なＲＡＳ遮断薬が開発されており、現在、ＲＡＳの過剰活性化を遮断するために、そして糖尿病を含むＲＡＳ関連代謝性疾患からの保護を提供するために使用されている（２）。
【００１６】
[0017]しかしながら、心・腎エンドポイントを用いた２型糖尿病におけるアリスキレン試験（ＡＬＴＩＴＵＤＥ）、ならびにテルミサルタン単独およびラミプリルとの併用の長期継続大規模エンドポイント試験（ＯＮＴＡＲＧＥＴ）などの無作為化臨床試験からの証拠は、末端器官障害を伴う公知の血管疾患または糖尿病を有する患者の重篤な転帰の防止において、２重のＲＡＳ阻害が単剤療法と比較して有益でなかったことを示している（５６〜５８）。ＲＡＳ不活性化と腎疾患との関連性を裏付ける臨床上の証拠およびＲＡＳに関する基本的研究は、多くの組織におけるＲＡＳ活性化およびＲＡＳの適応的／保護的役割を微調整する、複雑な自己調節シグナル伝達ループを明らかにし始めている（９）。この背景において、ＡｎｇＩＩは、ＡＴ２Ｒを活性化する場合、血管拡張性／心血管保護的／抗炎症性効果を示す。
【００１７】
[0018]ミトコンドリアも局所アンジオテンシン系（ＭＡＳ）を発現する。重要なことには、ミトコンドリアの内膜に位置するＡＴ２Ｒは、ミトコンドリア呼吸の介在に重要な役割を果たす。老化の過程で、ミトコンドリアのＡＴ２Ｒ発現は減少する一方、炎症性ＡＴ１Ｒの発現は増大することが知られている（６２）。老化におけるＭＡＳの重大な役割は、この系がアルツハイマー病（ＡＤ）の発症において役割を果たすことを示している。さらなる裏付けでは、アミロイドβは、ＡＴ２Ｒ受容体のオリゴマー化増加および機能喪失をもたらすことが示されており、これが疾患の発生機序に寄与すると考えられている（６３、６４）。
【００１８】
[0019]ＡＴ１Ｒ遮断薬（ＡＲＢ）は、老化に関連するミトコンドリア機能障害を低減し、高血圧によって誘発される腎臓でのミトコンドリア機能障害を弱め、急性虚血の状況における心臓のミトコンドリア機能障害を防ぐことが報告されている（６２、６５）。ＡＲＢによるＡＴ１Ｒの阻害によって、理論上は、より多くのＡｎｇＩＩがＡＴ２Ｒに結合して活性化することが可能になる。したがって、拮抗するＡＴ２Ｒ系の上昇により、ミトコンドリア機能の追加的な改善がもたらされる。ＡＴ１Ｒの崩壊は、ミトコンドリア数の増加と、腎臓における生存促進性遺伝子のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）およびサーチュイン３（Ｓｉｒｔ３）の上方制御に関連して、マウスにおける寿命の顕著な延長をもたらした（６６）。これらの遺伝子のうち、Ｓｉｒｔ３はＡＤ介在ストレスを調節することが知られている（６７）。
【００１９】
[0020]ＮＨＥ６は、認知および記憶を改善することが知られている、ミトコンドリアの内膜に位置するミトコンドリアタンパク質であり、ＮＨＥ６遺伝子の変異は、自閉症およびクリスチャンソン症候群などさまざまな神経障害と関係している（６８〜７０）。ＡＴ２Ｒは、その第３ＩＣＬを介してＮＨＥ６と相互作用することが示されている。ＡＴ２ＲはＡＴ１Ｒが介在するＮＨＥ６のトレオニン／チロシンのリン酸化を阻害する（７１〜７３）。これは、ＡＴ１Ｒ介在リン酸化が、ＡＴ２Ｒ−ＮＨＥ６相互作用によって妨げられる分解のタグであることを示している。
【００２０】
[0021]ＭＣＬ−１（骨髄性白血病細胞分化タンパク質）は、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーであるタンパク質である（７４）。選択的スプライシングに基づき、ＭＣＬ−１の２つの別個の多様体、すなわち長い形態および２つのより短いアイソフォームが存在する。長い形態（ＭＣＬ−１Ｌ）は３１２残基を含有するが、短いアイソフォーム（ＭＣＬ−１Ｓ）は２７１残基であり、４１残基の差はＣ末端に生じている。ＭＣＬ−１Ｌは、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３などＢｃｌ−２ファミリーに見いだされる標準ドメインと、膜貫通ドメインを含有する。対照的に、ＭＣＬ−１ＳはＢＨ３ドメインのみを含有する。この選択的スプライシングは、ＭＣＬ−１ＬおよびＭＣＬ−１Ｓに、２つの大きく異なる生物学的機能をもたらす。具体的には、ＭＣＬ−１Ｌは抗アポトーシス性であることが知られているが、ＭＣＬ−１Ｓは、完全に対照的に、アポトーシス促進性である（７５、７６）。ＭＣＬ−１ＳのＧＨ３様ドメイン領域は、ＭＣＬ−１Ｌと結合して２量体化することができる（７７）。この相互作用はＭＣＬ−１の生物学的活性を阻害するため、ＭＣＬ−１ＳはＭＣＬ−１Ｌのアンタゴニストである。
【発明の概要】
【００２１】
[0022]本発明は、少なくとも部分的に、アンジオテンシン２  ＩＩ型受容体（ＡＴ２Ｒ）に結合し、これにより該受容体を活性化する、特異的な小アゴニストのクラスの同定に基づいている。該アゴニストは、とりわけ、不十分なＡＴ２Ｒ活性または過剰なＡＴ１Ｒ活性を特徴とする疾患、病態、または障害に関する調査、診断、および処置の方法において、調査、診断、および治療用試薬として有用である。本発明のＡＴ２Ｒアゴニストは、一般的配列Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６［Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり；Ａ３はＬｅｕまたはＩｌｅであり；Ａ４はＬｙｓであり、Ａ５はＰｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり、Ａ６はＴｒｐである］を有する６個のアミノ酸残基を含むポリペプチド（またはポリペプチド誘導体もしくは類似体）である。したがって、本発明のＡＴ２Ｒアゴニストとしては、以下の配列のいずれかを含むか、いずれかから成るか、本質的にいずれかから成るポリペプチド（またはポリペプチド誘導体もしくは類似体）が挙げられる：Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；およびＬｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ。いくつかの態様では、Ａ２がＰｒｏである場合、Ａ５は３Ｈｙｐまたは４Ｈｙｐである。いくつかの態様では、Ａ５がＰｒｏである場合、Ａ２は３Ｈｙｐまたは４Ｈｙｐである。
【００２２】
[0023]したがって、１つの観点では、本発明は、凍結乾燥形態であるかまたは医薬的に許容されるキャリヤーと組み合わされていてもよい、試薬グレードを含めたＡＴ２Ｒアゴニスト組成物、およびＡＴ２Ｒアゴニストを含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
[0024]他の観点では、本発明は、本発明のＡＴ２Ｒアゴニスト組成物を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏの哺乳動物細胞でＡＴ２Ｒを活性化するための方法を提供する。いくつかの態様では、該方法は、受容体活性化の下流作用（例えば、標的哺乳動物に対するラパマイシン（ＭＴＯＲ）、ＮＨＥ６、ＥｒｂＢ３、一酸化窒素合成酵素活性、ＭＣＬ−１、およびプロスタグランジン１２−ＩＰの作用）の特徴付けおよび／または定量のための対照として用いられる。ＡＴ２Ｒアゴニスト試薬組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、他の化合物または薬剤候補による処理に応答したＡＴ２Ｒの活性化またはＡＴ１Ｒの不活性化の対照として、または競合的もしくは非競合的阻害剤として、用いることもできる。
【００２４】
[0025]他の観点では、本発明は、不十分なＡＴ２Ｒ活性または過剰なＡＴ１Ｒ活性を特徴とする任意の疾患、病態、または障害と診断されているか、それらのリスクにあるか、あるいはそれらの処置を必要としている被験者の処置方法を提供する。該方法は、医薬的に許容されるキャリヤー中の治療的に有効な量の本発明のＡＴ２Ｒアゴニストを、それを必要としている患者に投与することを包含する。同様に、本発明は、不十分なＡＴ２Ｒ活性または過剰なＡＴ１Ｒ活性を特徴とするか、ＡＴ２Ｒシグナル伝達の下流にある経路の不十分な活性を特徴とする、任意の疾患、病態、または障害（例えば、不十分なＭＴＯＲ、ＮＨＥ６、ＥｒｂＢ３、一酸化窒素合成酵素、ＭＣＬ−１、またはプロスタグランジン１２−ＩＰの活性または産生を特徴とする疾患、病態、または障害）と診断されているか、それらのリスクにあるか、あるいはそれらの処置を必要としている被験者を処置するための医薬の調製または製造に用いるための、本発明のＡＴ２Ｒアゴニストを提供する。本発明の方法および医薬によって処理するのに適した疾患、病態、または障害としては、限定されるものではないが、（ａ）ＡＴ１Ｒの過剰活性化またはＡＴ２Ｒの活性化不足に起因する慢性炎症；（ｂ）少なくとも１つのＭＣＬ−１アイソフォームの血中レベルを増大させることが示されている疾患、病態、または障害、（ｃ）ＡＴ１Ｒが介在する高血圧、（ｄ）ＡＴ２Ｒが介在する高血圧および／または心血管疾患、（ｅ）限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、および加齢に伴う知能低下を含めたＡＴ２Ｒが介在する神経変性障害、（ｆ）神経損傷（例えば、脊髄損傷、卒中、虚血再潅流損傷）、（ｇ）がん、（ｈ）子癇前症、（ｉ）糖尿病合併症（例えば、網膜症、膵臓細胞死、メタボリックシンドローム）、（ｊ）炎症が介在する腎障害、（ｋ）炎症が介在する肝疾患（例えば、肝がん、肝機能不全）、（ｌ）炎症が介在する心血管疾患（例えば、心筋の虚血および損傷、心筋線維症、心臓発作）、（ｍ）膵炎、（ｎ）筋肉量不足（例えば、疾病またはがんの処置に起因する筋肉消耗）、（ｏ）ＡＴ１Ｒが介在するＮＨＥ６分解、（ｐ）不十分なミトコンドリア活性、ならびに（ｑ）不十分なＭＴＯＲ、ＮＨＥ６、ＥｒｂＢ３、一酸化窒素合成酵素、ＭＣＬ−１、またはプロスタグランジン１２−ＩＰの活性または産生を特徴とする疾患、病態、または障害が挙げられる。
【００２５】
[0026]以下の図面は本発明の態様を例示するものであり、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】[0027]図１は、ＮＰ−６ＡＫアゴニストが、雌マウスＨＬ−１心筋細胞およびヒトＣＡＶＳＭＣにおいてＭＣＬ−１発現を増大させることを示している。部分的アゴニストであるＣＧＰは、ＭＣＬ−１を増大させることができなかった。ＡＴ２ＲアンタゴニストであるＰＤを添加すると、ＮＰ−６ＡＫが介在するＭＣＬ−１の上方制御が妨げられ、この作用がＡＴ２Ｒを介したものであることを示している。
【図２】[0028]図２は、ＮＰ−６ＡＫアゴニストを抗ＭＣＬ−１抗体および核染色ＤＡＰＩと一緒に用いた処理（２４時間）に付したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の免疫蛍光染色を示している。ｎ≧８０、対照と比較して＊ｐ＜０．０１。ＮＰ−６ＡＫアゴニストは、ＭＣＬ−１の上方制御に関して対照より有効であった。
【図３】[0029]図３は、ＮＰ−６ＡＫアゴニストが神経突起伸長を促進し、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてラパマイシンが介在する抑制を覆すことを示している。
【図４】[0030]図４は、ＮＰ−６ＡＫアゴニストが、栄養枯渇で試験したときに、培養液中の正常なマウス１次胚皮質ニューロンに神経保護を提供することを実証した、ｅｘ  ｖｉｖｏ組織での試験からのデータを示している。栄養枯渇に関しては、１次皮質ニューロン（１４日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養）を、３００ｎｍのＮＰ−６ＡＫアゴニストを含むかまたは含まないグルコース不含ロック培地で培養した。ＮＰ−６ＡＫアゴニストで処理した細胞は、陰性対照と比較して６０％活性が増大しており（ｐ＜０．０５）、血清飢餓および神経保護条件下で細胞生存率の上昇を示した過去のデータが裏付けられた。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
[0031]ＡＴ２Ｒ活性化は、高血圧、糖尿病、がん、および各種神経変性疾患を含めたさまざまな疾患状態で抑制される。ＡＴ２Ｒの抑制は、代謝性疾患（例えば、心血管および腎臓の疾患、２型糖尿病）およびがんの主要原因であるＡＴ１Ｒの活性の増大を招く。したがって、本発明は、そのような障害の特徴付けおよび処置に用いることができる新規クラスの実験室用試薬および治療用ポリペプチドを提供する。
参考文献および定義
[0032]本明細書中で参照する特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立している。本明細書中で引用する発行済み米国特許、係属中の米国出願、公開された外国特許および出願、ならびに、タンパク質およびヌクレオチドのデータベース配列を含む参考文献は、各々が具体的かつ個別に援用されると示されているのと同程度に、本明細書に援用される。
【００２８】
[0033]本明細書中で用いる場合、「約」または「およそ」という用語は、挙げた数量の２０％以内であることを意味する。
[0034]本明細書中で用いる場合、「１つの（a）」という用語は１以上を意味する。
【００２９】
[0035]本明細書中で用いる場合、「増大した」または「低減した」という用語は、本発明のアゴニストによる処理以前と比較して、それぞれ少なくとも１０％多いかまたは少ないことを意味する。
【００３０】
[0036]本明細書中で用いる場合、「医薬組成物」は、活性作用物質および医薬的に許容されるキャリヤーを包含する。
[0037]本明細書中で用いる場合、「医薬的に許容される」という語は、生理学的に容認することができ、哺乳動物に投与したときに典型的には重篤なアレルギー反応、発熱反応、または同様の望ましくない反応を引き起こさない、分子の実体および組成を表す。
【００３１】
[0038]本明細書中で用いる場合、「キャリヤー」という用語は、化合物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを表す。そのような医薬キャリヤーは、水、および石油、動物、植物、または合成由来の、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含めた油などの、滅菌した液体であり得る。水または他の水溶液、生理食塩水、水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、キャリヤー、とりわけ注射可能な溶液のためのキャリヤーとして採用することができる。適した医薬キャリヤーは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている（６１）。
ＡＴ２Ｒ活性のポリペプチドモジュレーター
[0039]本発明は、一般的配列Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６を有する６個のアミノ酸残基を含むポリペプチド（またはポリペプチド誘導体もしくは類似体）である新規クラスのアゴニストを提供するものであり、式中、Ａ１はＬｙｓであり；Ａ２はＰｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり；Ａ３はＬｅｕまたはＩｌｅであり；Ａ４はＬｙｓであり、Ａ５はＰｒｏ、３Ｈｙｐ、または４Ｈｙｐであり、Ａ６はＴｒｐである。この新規クラスをＮＰ−６ＡＫアゴニストと称する。少なくとも１つの位置にＨｙｐがある配列は、安定性が増大するため好ましい可能性がある。医薬用試薬として用いるためのこれらアゴニストの他の誘導体または類似体は、血流中での安定性を増大させる化学修飾を包含し得る。
【００３２】
[0040]１つの可能な修飾は、追加的な安定性のための非天然ペプチド結合の形成、または残基の異なる原子への側鎖原子の結合である。そのような化学的作用の例は、Ｈｏｏｋらに挙げられている（６０）。筆者らは、側鎖がβ炭素に結合したβアミノ酸について記載しているが、天然アミノ酸側鎖はα炭素に結合している。さまざまな研究により、これら「βペプチド」は、天然ペプチドと比較して、非特異的ペプチターゼによって分解されにくいことが示されている。追加的な安定性のために天然ペプチドを修飾するような化学構造、例えば、側鎖が窒素に結合したペプトイドを用いることが可能であろう。
【００３３】
[0041]本発明のポリペプチドの他の安定化方法は、不活性水溶性ポリマーとの共有結合的または非共有結合的な結合である。全身投与したときに、治療的組成物は循環から迅速に除去されることが多く、したがって、比較的存続期間が短い薬理活性をもたらす可能性がある。このため、治療効果を持続させるためには、比較的高用量の生物活性化合物の頻回注射が必要であり得る。安定性または半減期の望ましい増大を有するコンジュゲートをもたらす任意の水溶性（例えば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍＬ）不活性ポリマーが、本発明での使用に適している。非タンパク質性ポリマーがとりわけ好ましい。ポリマーは、好ましくは親水性合成ポリマー、例えば、ポリビニルポリマー（例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドン）、ポリアルキレンエーテル（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））；ポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（プルロニック））；ポリメタクリレート；またはカルボマーである。しかしながら、単糖モノマーであるＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコース、およびノイラミン酸を含む分枝または非分枝多糖、例えば、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、あるいは糖アルコールのポリマー、例えば、ポリソルビトールおよびポリマンニトール、ヘパリンまたはヘパランなどの天然ポリマーも有用である。ポリマーの分子量は、約１００００〜５０００００ダルトン（Ｄ）の範囲にあることができ、典型的には、約２００００Ｄ、約３００００Ｄ、約４００００Ｄ、または約５００００Ｄであることができる。
【００３４】
[0042]ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー、またはモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、またはポリプロリンなどの水溶性ポリマーの共有結合により修飾された化合物は、静注後、対応する非修飾化合物よりも実質的に長い血中半減期を示すことが知られている。そのような修飾は、水溶液中での組成物の溶解度を増大させ、凝集を低減し、化合物の物理的または化学的安定性を増大させ、組成物の免疫原性および反応性を低減することもできる。
【００３５】
[0043]本発明のアゴニスト組成物へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の結合は、とりわけ有用である。これは、ＰＥＧが、哺乳動物において非常に低い毒性を示し、アゴニスト組成物の免疫原性または抗原性を低減することができるためである。タンパク質との直接反応に適したＰＥＧの多数の活性化形態が解説されている。タンパク質アミノ基との反応に有用なＰＥＧ試薬としては、カルボン酸またはカルボネート誘導体の活性エステル、とりわけ、脱離基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、イミダゾール、または１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホネートであるものが挙げられる。マレイミドまたはハロアセチル基を含有するＰＥＧ誘導体は、タンパク質を含まないスルフヒドリル基の修飾に有用な試薬である。同様に、アミノヒドラジンまたはヒドラジド基を含有するＰＥＧ試薬は、タンパク質中の炭水化物基の過ヨウ素酸酸化により発生するアルデヒドとの反応に有用である。
【００３６】
[0044]ポリペプチドに対する、またはポリペプチドを産生することができる細胞に対する宿主免疫反応を低減または防止するために、本発明のアゴニスト組成物をマイクロカプセル化デバイスに送達してもよい。本発明のポリペプチドまたは組成物は、リポソームのように、膜に送達してマイクロカプセル化することもできる。例として、ＰＥＧのようなポリマーは、該アゴニスト組成物のポリペプチド中の１以上の反応性アミノ酸残基、例えば、アミノ末端アミノ酸のαアミノ基、リシン側鎖のεアミノ基、システイン側鎖のスルフヒドリル基、アスパルチルおよびグルタミル側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基、チロシン側鎖、または特定のアスパラギン、セリンもしくはトレオニン残基に結合しているグリコシル鎖の活性化誘導体に、好都合に結合することができる。
【００３７】
[0045]本発明のポリペプチドアゴニストの他の修飾方法は、Ｎ末端またはＣ末端にシグナル配列を加えることである。「シグナル配列」という用語は、本明細書中で用いる場合、細胞中のタンパク質輸送を誘導する任意の短ペプチドを表す。シグナル配列は、例えば、ポリペプチドの分泌、または細胞内区画内での局在化を誘導することができる。シグナル配列は、細胞膜の全体にわたるペプチドの配向性もしばしば決定する。１つの例は、分泌および膜貫通タンパク質を小胞体（ＥＲ）に誘導する約２０アミノ酸のＮ−末端配列である（例えば、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８５），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９−１０５参照）。シグナル配列は、１以上の特異的プロテアーゼ認識部位を包含するように操作することもでき、これにより、該シグナル配列は、輸送後に内因性プロテアーゼによって除去されるようになる。
ＡＴ２Ｒアゴニスト試薬
[0046]上記したＡＴ２Ｒの多くの作用に起因して、実験室試験におけるＡＴ２Ｒの活性化は非常に興味深い。したがって、１つの観点では、本発明は、実験室での研究のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ試薬としてのＡＴ２Ｒアゴニストを提供する。
【００３８】
[0047]したがって、ＡＴ２Ｒに対するＮＰ−６ＡＫアゴニストは、受容体活性化の下流作用、例えば、標的哺乳動物に対するラパマイシン（ＭＴＯＲ）、ＮＨＥ６、ＥｒｂＢ３、一酸化窒素合成酵素の作用の特徴付けおよび定量のための対照として有用である。
【００３９】
[0048]例えば、ＡＴ２ＲおよびＭＴＯＲを発現するＣＨＯ細胞を、ＮＰ−６ＡＫアゴニストおよびインスリンで処理して、ＭＴＯＲおよびＡＴ２Ｒの両方を活性化する。ＡＴ２Ｒは、ＭＴＯＲが介在するリボソームタンパク質Ｓ６（ＲＰＳ６）のリン酸化反応を抑制する。ウェスタンブロッティングを用いて、アゴニストＮＰ−６ＡＫによるＡＴ２Ｒ活性化に応答して少なくとも１０％低減しているＲＰＳ６リン酸化反応状態を決定することができる。その後、同じ細胞株を異なるＡＴ２Ｒアゴニスト候補で処理して、該アゴニスト候補の効力を評価することができ、または、同じ細胞株を本発明のＡＴ２ＲアゴニストおよびＡＴ２Ｒアンタゴニスト候補（例えば、ＥＭＡ３００、Ｓｍｉｔｈら（２０１３）、Ｐａｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４（１０）：１５５７−６８；ＰＤ１２３３１９、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら（２００８）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９（７）：３４５２）の両方で処理して、アンタゴニスト候補の効力および作用機序（すなわち、競合的、非競合的）を評価することができる。
【００４０】
[0049]ＮＰ−６ＡＫアゴニストは、少なくとも１つ、いくつかの態様では３つすべてのＭＣＬ−１アイソフォームの発現レベルを増大させる。
処置方法
[0050]ＡＴ１Ｒが介在する炎症性応答、またはＡＴ２Ｒの活性化不足に起因する炎症性応答、および／またはそれらに起因する症状を処置するために、ＮＰ−６ＡＫアゴニストを、病変細胞への活性作用物質の送達を可能にする任意の経路により投与する。いくつかの態様では、投与は皮下、筋肉内、腹腔内投与であるが、吸入、動脈内、静脈内、皮内、局所、経口、非経口、心室内、または頭蓋内投与によることもできる。あるいは、活性作用物質は、任意の適した手段により全身にまたは病変細胞に局所的に送達することができる。
【００４１】
[0051]本発明の治療的処置では、治療的に有効な量の医薬組成物を哺乳動物患者に投与する。本明細書中で用いる場合、「治療的に有効な量」という用語は、患者の活動、機能、および応答における臨床的に重要な測定基準または欠損を、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％低減し、もっとも好ましくは実質的に排除または防止するのに十分な量を意味する。具体的には、治療的に有効な量は、以下のうち１つ以上を引き起こす：低減したＡＴ１Ｒ活性化、増大したＡＴ２Ｒ活性化；低減したコルチゾールレベル；安定化したインスリンレベル；低減した炎症性サイトカイン、低減した炎症性インターロイキン、ドーパミン作動性ニューロンの増大した機能、低減した反応性酸素種、低減した粘液産生、あるいは、本明細書中で検討した他の任意の関連マーカー、または嚢胞性線維症（ＣＦ）、糖尿病、代謝性Ｘ症候群；高血糖、自閉症、アルツハイマー病、炎症、もしくはがんに関連することが当業者に公知の他の任意の関連マーカーの低減または増大。治療の頻度および投与量は、当該技術分野で周知の標準的な用量反応技術を用いて、一般的な医師または獣医師によって漸増することができる。
医薬配合物
[0052]局所投与または化粧用途に適したローションなどの液体形態は、適した水性または非水性ビヒクルを、緩衝剤、懸濁化剤および分配剤、増粘剤、浸透促進剤などと一緒に包含することができる。クリームまたはペーストなどのような固体形態は、例えば、基材として以下の成分のいずれか、水、油、アルコール、またはグリースを、界面活性剤、ポリエチレングリコールなどのポリマー、増粘剤、固形分などと一緒に包含することができる。液体または固体配合物は、リポソーム、ミクロソーム、マイクロスポンジなどのような向上した送達技術を包含することができる。
【００４２】
[0053]液体、半固体、および固体局所組成物の上記成分は、代表的なものに過ぎない。他の材料および処理技術などは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８５、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イーストンの第８部に記載されており、これを本明細書中に援用する。
【００４３】
[0054]医薬組成物を経皮投与する場合、それらは、典型的には液体溶液またはゲルとして利用される。これらの状況では、本発明のアゴニストの濃度は、組成物の約０．１％〜約２０％、好ましくは約０．１％〜約１０％の範囲であり、残余は、アルコールなどのような水性混合ビヒクルまたは非水性ビヒクル、懸濁化剤、ゲル化剤、界面活性剤などである。適したそのような材料の例を以下に記載する。
【００４４】
[0055]本発明のアゴニスト含有組成物は、徐放性経皮形態でまたは経皮的徐放性薬物送達システムから投与することもできる。代表的な徐放性材料に関する説明は、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに包含されている材料に見いだすことができる。
【００４５】
[0056]全身投与用のアゴニスト組成物としては、経口投与用組成物、すなわち液体および固体、ならびに注射用組成物が挙げられる。
[0057]経口投与用組成物は、バルクの液体溶液もしくは懸濁液、またはバルクの粉末の形態をとることができる。しかしながら、より一般的には、該組成物は、正確な投薬を促進するために、単位剤形の形で存在する。「単位剤形」という用語は、ヒト被験者および他の哺乳動物のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を表し、各単位は、適した医薬用溶媒と共同して望ましい治療効果をもたらすように計算して予め決定された分量の活性材料を含有する。典型的な単位剤形としては、液体組成物のプロファイルされ予め測定されているアンプルもしくはシリンジ、または、固体組成物の場合は、丸剤、錠剤、カプセルなどが挙げられる。１つの態様によれば、本発明のアゴニスト組成物は、通常は微量成分であり（約０．０１〜約２０重量％、または好ましくは約０．１〜約１．５重量％）、残余は、さまざまなビヒクルまたはキャリヤーと、所望の剤形を形成するのに有用な加工助剤である。
【００４６】
[0058]経口投与に適した液体形態は、適した水性または非水性ビヒクルを、緩衝剤、懸濁化剤および分配剤、着色剤、着香剤などと一緒に包含することができる。固体形態は、例えば、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物、例えば、微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどのバインダー；デンプンもしくはラクトースなどの溶媒、アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはハッカ、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの着香料を包含することができる。
【００４７】
[0059]他の態様によれば、注射可能な組成物は、典型的には、注射可能な滅菌生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水、または当該技術分野で公知の他の注射可能なキャリヤーに基づいている。そのような組成物中の本発明の化合物は、典型的には約０．１〜３０重量％の微量成分であり、残余は注射可能なキャリヤーなどである。
【００４８】
[0060]経口投与可能な組成物または注射可能な組成物のための上記成分は、代表的なものに過ぎない。他の材料および処理技術などは、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの一部に解説されている。
【実施例】
【００４９】
[0061]配列Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；Ｌｙｓ−３Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐ；およびＬｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−４Ｈｙｐ−Ｔｒｐを含むか、該配列から成るか、または該配列から本質的に成るポリペプチドを包含する本発明のＮＰ−６ＡＫアゴニストを、さまざまな細胞に基づく系で試験して、ＡＴ２Ｒアゴニスト活性および本明細書に記載の方法の有用性を実証した。
【００５０】
[0062]したがって、配列Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐを含むＮＰ−６ＡＫアゴニストは、ＡＴ２Ｒ活性化を介して作用することにより、マウスＨＬ−１心筋細胞およびヒト血管平滑筋細胞の全体にわたり細胞生存を促進させた。細胞生存は、細胞の生存、接着、および増殖に対するさまざまな処理の効果を定量的に決定するためにＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅＴＭ  リアルタイム細胞アナライザー（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ  ＢＶ、ルースデン、オランダ）を用いて、細胞指数（ＣＩ）を測定することにより評価した。ＮＰ−６ＡＫアゴニスト（３００ｎＭ）で処理した細胞株は、ＡＴ２Ｒの部分的アゴニストであるＣＧＰ４２１１２Ａ（３００ｎＭ）（シグマ−アルドリッチＣｏ．ＬＬＣ、ミズーリ州セントルイス）で処理したものに比べ、著しく良好な生存および多くの増殖を実証した。ＣＧＰ４２１１２ＡおよびＮＰ−６ＡＫアゴニスト（３００ｎＭ）は、血清飢餓ＨＬ−１細胞のＣＩを、ＣＧＰ４２１１２Ａ（≧１４％）、ＮＰ−６ＡＫ（≧２５％）の順で増大させた。ＣＩの増大は、ＡＴ２Ｒ活性化の直接的効果である。これは、ＡＴ２ＲアンタゴニストであるＰＤ１２３３１９（シグマ−アルドリッチＣｏ．ＬＬＣ、ミズーリ州セントルイス）の添加により確認された。このアンタゴニストの存在下では、ＮＰ−６ＡＫアゴニストを用いて通常なら観察される細胞生存が存在しなかった。
【００５１】
[0063]ＮＰ−６ＡＫアゴニストは、いくつかの細胞株の全体にわたりＡＴ２Ｒを選択的に活性化することにより、ＭＣＬ−１を上方制御した。この効果は、血清飢餓および／または毒性条件下の心筋細胞、ヒト血管平滑筋細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）、およびＰＣ−１２神経細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）で観察された。濃度３００ｎＭのＮＰ−６ＡＫアゴニストと一緒にインキュベートすると、心筋細胞は４５％高いＭＣＬ−１発現を示し、ヒト血管平滑筋細胞は２２％高いＭＣＬ−１発現を示した（図１）。これらの細胞株のいずれかをＰＤ１２３３１９などのＡＴ２Ｒアンタゴニストで前処理すると、ＭＣＬ−１の上方制御は観察されず、ＭＣＬ−１の上方制御にはＡＴ２ＲのＮＰ−６ＡＫ活性化が必要であることを示唆していた。ＮＰ−６ＡＫアゴニストで処理した細胞は、ＣＧＰ４２１１２Ａなどの部分的アゴニストで処理したものと比較して、より高いＭＣＬ−１上方制御をもたらした。
【００５２】
[0064]ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株は、ドーパミン作動性およびアドレナリン作動性受容体の両方を有する神経細胞株である。この細胞株をラパマイシンで処理すると、ＭＣＬ−１発現は低減した。ラパマイシンによる処理後にこの細胞株にＮＰ−６ＡＫアゴニストを加えると、ＭＣＬ−１発現を回復させることができた。ＮＰ−６ＡＫアゴニストのみを３００ｎＭの濃度で加えると、これらの細胞はＭＣＬ−１発現において２倍の増大を示した。図２参照。
【００５３】
[0065]血清飢餓は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞およびＰＣ−１２細胞の生存を低下させた。これらの細胞株をＮＰ−６ＡＫアゴニストで処理すると、それらはより高い生存率を有し、増大したＭＣＬ−１発現および神経突起伸長を示した。図３参照。ＰＣ−１２細胞をＡＴ２ＲアンタゴニストのＰＤ１２３３１９で処理すると、ＮＰ−６ＡＫアゴニストの保護効果が失われ、ＮＰ−６ＡＫアゴニストの直接的作用がＡＴ２Ｒ活性化を介していることを示していた。この細胞株を３００ｎＭのＮＰ−６ＡＫアゴニストで処理すると、ＡＴ２Ｒ  ＡｎｇＩＩの天然リガンド（３００ｎＭ）での処理と比較して、３０％を超える細胞生存度の増大がもたらされた。３００ｎＭのＣＧＰ４２１１２Ａでの処理と比較して、ＮＰ−６ＡＫアゴニストで処理した細胞は、７０％をこえる生存の増大を示した。ＡｎｇＩＩまたはＣＧＰ４２１１２Ａでの処理は、細胞をＡＴ２ＲアンタゴニストのＰＤ１２３３１９で処理したときに得られた結果と比較して、より有害であった。ＮＰ−６ＡＫアゴニストによるＡＴ２Ｒ活性化は細胞生存を促進するが、他のリガンドによるＡＴ２Ｒ活性化は細胞生存に有害である。これらの結果は、ＭＴＳ細胞増殖アッセイ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ミルピタス）を用いて評価した。
【００５４】
[0066]ｅｘ  ｖｉｖｏのニューロンを得て、さまざまな条件にてＮＰ−６ＡＫアゴニストで処理して神経保護特性を評価した。培養液中の正常なマウス１次胚皮質ニューロン（１４日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養）を、グルコース不含ロック培地で培養することにより、栄養枯渇で試験した（Ｓｃｈｎａｐｆら（１９９０））。その後、これらの培養物に３００ｎＭのＮＰ−６ＡＫアゴニストを添加するかまたはＮＰ−６ＡＫアゴニストを添加しなかった。３００ｎＭのＮＰ−６ＡＫアゴニストを添加した培養物は、陰性対照と比較して、６０％増大した活性（ｐ＜０．０５）を示した。図４参照。
【００５５】
[0067]心血管疾患の徴候を示す糖尿病動物モデルであるＺｕｃｋｅｒ  Ｏｂｅｓｅ（ＺＯ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウィルミントン）を、ＮＰ−６ＡＫアゴニストの皮下注射により２週間処置し（０．９ｍｇ／ｋｇ／日の用量）、血液マーカーおよび心臓の構造的パラメーターなど心血管の健康に関するいくつかのマーカーについて評価した。対照は、生理食塩水を与えられたＺＯラットであった。空腹時の血漿および尿の分析結果は、ＮＰ−６ＡＫアゴニストを与えられた動物が、低減したトリグリセリド（約５０％）、尿タンパク（約６８％）、低減した尿Ｎ−アセチル−β−Ａ−グルコサミニダーゼ（約６０％）、および平均で１２％増大したＨＤＬを有することを実証した。Ｖｅｖｏ（登録商標）２１００プラットフォーム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、オンタリオ州トロント、カナダ）を用いて実施した心エコー検査は、ＮＰ−６ＡＫアゴニストで処置した動物では、心内膜の円周方向ストレイン（短軸図）を包含する構造的心臓パラメーター、心筋性能指数（ＭＰＩ）（ｐ≦０．００５）、および主要な心臓現象の有力な予測因子であるＥ／Ｅ’比（ｐ≦０．００２）が改善されていたことを示した。表１参照。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
[0068]本発明を、特にこれらの好ましい態様に関連して詳細に記載してきたが、他の態様でも同じ結果を得ることができる。本発明の変動および修正は当業者には明らかであり、そのような修正および等価物は添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。本明細書で引用するすべての文献、明細書、特許、および公表物の開示内容全体を、本明細書に援用する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017536415.tif 000009
2017536415.tif 000010
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