(57)【要約】  対象の二つの標的の近接性をｉｎ  ｓｉｔｕで検出するための方法であり、検出可能な部分を有する切断可能な架橋成分にコンジュゲートした抗体と、切断不能な架橋成分にコンジュゲートした抗体とを特徴とする。架橋成分の各々は、特定の条件下で且つ標的が近接しているときに共有結合を形成するように適合された化学ライゲーション基を有する。共有結合の形成後、切断可能な架橋成分は抗体から切断することができ、検出可能な部分を切断不能な架橋成分へ効率的に移行させる。検出可能な部分の検出は、標的同士が近接していることを示す。本方法は発色性及び発蛍光性検出システムの両方に適合する。本方法は、同じスライド上に一又は複数の近接事象が検出されるアッセイを実施するために使用される。【選択図】図６
2017536548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中において第１の標的と第２の標的が近接していることを決定する方法であって：
第１の修飾結合分子を第１の標的に結合させ、第１の複合体を形成することであって、第１の修飾結合分子が、切断部位を含む切断可能な架橋成分と、検出可能な部分と、第１の化学ライゲーション基とを含み、切断部位は、検出可能な部分及び第１の化学ライゲーション基より第１の修飾結合分子に近接しており、第１の化学ライゲーション基は、切断可能な架橋成分の末端にあり、第１の化学ライゲーション基は生理的条件下で安定である、第１の修飾結合分子を第１の標的に結合させ、第１の複合体を形成すること；
第２の修飾結合分子を第２の標的に結合させ、第２の複合体を形成することであって、第２の修飾結合分子が、第２の化学ライゲーション基を含む切断不能な架橋成分を含み、第２の化学ライゲーション基は、切断不能な架橋成分の末端にあり、第２の化学ライゲーション基は生理的条件下で安定である、第２の修飾結合分子を第２の標的に結合させ、第２の複合体を形成すること；
第１の化学ライゲーション基を第２の化学ライゲーション基に共有結合させ、第１の標的と第２の標的とが近接しているところに共有結合単位を形成すること；
共有結合単位が第２の修飾結合分子に結合して第１の修飾結合分子には結合しないように、切断可能な架橋成分の切断部位を切断すること；
共有結合単位の一部ではない切断可能な架橋成分を除去すること；及び
検出可能な部分を可視化することであって、第１の標的と第２の標的は検出可能な部分が可視であるところで近接している、可視化すること
を含む方法。
【請求項２】
第１の標的と第２の標的とは、互いに約４０ｎｍ未満の距離にあるという意味で近接している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の標的と第２の標的とは、互いに約３０ｎｍ未満の距離にあるという意味で近接している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
自動染色装置を用いて実施される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１の修飾結合分子が第１の抗体を含み、第２の修飾結合分子が第２の抗体を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第１の修飾結合分子は第１の一次抗体及び第１の二次抗体を含み、第２の修飾結合分子は第２の一次抗体及び第２の二次抗体を含み、第１の二次抗体は第１の一次抗体に特異的に結合するが第２の一次抗体には特異的に結合せず、第２の二次抗体は第２の一次抗体に特異的に結合するが第１の一次抗体に特異的に結合せず、切断可能な架橋成分は第１の二次抗体に結合しており、切断不能な架橋成分は第２の二次抗体に結合している、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
切断部位が、ジスルフィド結合、ビシナルジオール、又はニトロフェニル誘導体を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
切断可能な架橋成分が、一つを超える検出可能な部分を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
検出可能な部分が、ハプテン、ペプチドタグ、又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能な部分が、オキサゾールハプテン、ピラゾールハプテン、チアゾールハプテン、ニトロアリールハプテン、ベンゾフランハプテン、トリテルペンハプテン、尿素ハプテン、チオウレアハプテン、ロテノイドハプテン、クマリンハプテン、シクロリグナンハプテン、ジニトロフェニルハプテン、ビオチンハプテン、ジゴキシゲニンハプテン、フルオレセインハプテン、及びローダミンハプテンから選択されるハプテンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドタグがＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｅタグ、又はＶＳＶタグである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
切断可能な架橋成分が足場をさらに含み、検出可能な部分が足場に結合している、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
足場が、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はポリマーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
足場がリジンを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
第１の化学ライゲーション基が、アジド
2017536548.tif 000012
、チオエステル
2017536548.tif 000013
、又はテトラゾール環
2017536548.tif 000014
、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
切断可能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｘ≧８である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第２の化学ライゲーション基が、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ハロゲン基が、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
切断不能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ｘ≧４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１の化学ライゲーション基を第２の化学ライゲーション基に共有結合させることが、試料を触媒、紫外線、及び／又は脱保護条件に接触させることを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
第１の化学ライゲーション基を第２の化学ライゲーション基に共有結合させることが、試料を銅（Ｉ）又はヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）に接触させることを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
第１の化学ライゲーション基を第２の化学ライゲーション基に共有結合させることが、ヒスゲン１，３−双極子付加環化反応を開始させることを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
切断可能な架橋成分の切断部位を切断することが、試料を還元剤、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、又は紫外線に接触させることを含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
切断可能な架橋成分の切断部位を切断することが、試料をジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）に接触させることを含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
第１の修飾結合分子が抗体−ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
第２の修飾結合分子が抗体−ＰＥＧ４−ＣＣＨを含む、請求項１又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
切断可能な架橋成分を除去することが、試料をバッファーで洗浄することを含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
検出可能な部分を可視化することが、試料を発色検出システムに接触させることを含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
発色検出システムがチラミドシグナルの増幅を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
検出可能な部分を可視化することが、試料を発蛍光性検出システムに接触させることを含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
発蛍光性検出システムがチラミド−フルオロフォアコンジュゲートを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
チラミド−フルオロフォアコンジュゲートがシアニン  ５−チラミドコンジュゲート（Ｃｙ５−Ｔｙｒ）を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１の修飾結合分子が二つ以上の切断可能な架橋成分を含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
第２の修飾結合分子が二つ以上の切断不能な架橋成分を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
化学ライゲーション基が二時間未満で共有結合単位を形成するように適合される、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
試料中において第２の標的に近接して位置する第１の標的を検出する方法であって：
第１の標的を、切断可能な架橋成分を含む第１のコンジュゲートで標識することであって、切断可能な架橋成分が、切断部位、検出可能な部分、及び第１の化学ライゲーション基を含む、第１の標的を標識すること、
第２の標的を、切断不能な架橋成分を含む第２のコンジュゲートで標識することであって、切断不能な架橋成分が第２の化学ライゲーション基を含む、第２の標的を標識すること、
第１の標的と第２の標的とが近接しているところに共有結合を形成できるように、第１の化学ライゲーション基又は第２の化学ライゲーション基を活性化すること、
検出可能な部分を第１の標的部位から切断すること、
試料を洗浄して結合していない検出可能な部分を除去すること；及び
検出可能な部分を可視的に検出すること
を含む方法。
【請求項３９】
第１の標的を標識することが、第１の一次抗体を第１の標的に結合させることを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第２の標的を標識することが、第２の一次抗体を第２の標的に結合させることを含む、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
第１の標的を標識することが、第１の一次抗体及び第１の二次抗体を標的に結合させることを含み、切断可能な架橋成分が第１の二次抗体に結合している、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
第２の標的を標識することが、第２の一次抗体及び第２の二次抗体を標的に結合させることを含み、切断不能な架橋成分が第２の二次抗体に結合している、請求項３８又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
第１のコンジュゲートが、第１の化学ライゲーション基に結合した検出可能な部分に切断可能な架橋成分を介して結合する抗体の構造を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
切断部位が、ジスルフィド結合、ビシナルジオール、ビシナルヒドロキシルアミン、又はニトロフェニル誘導体を含む、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
第１のコンジュゲートの切断可能な架橋成分が二つ以上の検出可能な部分を含む、請求項３８から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
検出可能な部分が、ペプチドタグ、又はオリゴヌクレオチド、ハプテン、又はフルオロフォアである、請求項３８から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
第１のコンジュゲートが、検出可能な部分の一又は複数が結合する足場を含む、請求項３８から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
足場が、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はポリマーを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
足場がリジンを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
第１の化学ライゲーション基が、アジド
2017536548.tif 000015
、チオエステル
2017536548.tif 000016
、又はテトラゾール環
2017536548.tif 000017
、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項３８から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
切断可能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項３８から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
ｘ≧８である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
第２の化学ライゲーション基が、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項３８から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
切断不能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項３８から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ｘ≧４である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
共有結合を形成できるように第１の化学ライゲーション基又は第２の化学ライゲーション基を活性化することが、試料を触媒、脱保護条件に接触させること、又は試料に光を照射することを含む、請求項３８から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
第１の化学ライゲーション基又は第２の化学ライゲーション基を活性化することが、試料を銅（Ｉ）又はヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）に接触させることを含む、請求項３８から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
第１の化学ライゲーション基又は第２の化学ライゲーション基を活性化することが、ヒスゲン１，３−双極子付加環化反応を開始させることを含む、請求項３８から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
検出可能な部分を第１の標的部位から切断することが、試料を還元剤、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、又は紫外線に接触させることを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項６０】
還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
第１の標的を標識することが、試料を、構造：抗体−ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３を有する第１のコンジュゲートに接触させることを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項６２】
第２の標的を標識することが、試料を、構造：抗体−ＰＥＧ４−ＣＣＨを有する第２のコンジュゲートに接触させることを含む、請求項３８又は６１に記載の方法。
【請求項６３】
試料中における第１の標的と第２の標的との近接性を検出するためのキットであって：
（ａ）第１の標的に結合させるための、切断可能な架橋成分を含む第１の修飾結合分子であって、切断可能な架橋成分が、切断部位、検出可能な部分、及び第１の化学ライゲーション基を含む、第１の修飾結合分子；及び
（ｂ）第２の標的に結合させるための、切断不能な架橋成分を含む第２の修飾結合分子であって、切断不能な架橋成分が第２の化学ライゲーション基を含む、第２の修飾結合分子
を含むキット。
【請求項６４】
第１及び第２の化学ライゲーション基が生理的条件下で安定である、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
共有結合単位を形成するために第１の化学ライゲーション基を第２の化学ライゲーション基に共有結合させるために有効な触媒をさらに含む、請求項６３又は６４に記載のキット。
【請求項６６】
切断可能な架橋成分の切断部位を切断するための触媒又は脱保護試薬をさらに含む、請求項６３から６５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６７】
検出可能な部分を可視化するシステムをさらに含む、請求項６３から６６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６８】
前記システムが発色システム又は蛍光システムを含む、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
第１の修飾結合分子が第１の抗体を含み、第２の修飾結合分子が第２の抗体を含む、請求項６３から６８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７０】
第１の修飾結合分子は第１の一次抗体及び第１の二次抗体を含み、第２の修飾結合分子は第２の一次抗体及び第２の二次抗体を含み、第１の二次抗体は第１の一次抗体に特異的であるが第２の一次抗体には特異的でなく、第２の二次抗体は第２の一次抗体に特異的であるが第１の一次抗体に特異的でなく、切断可能な架橋成分は第１の二次抗体に結合しており、切断不能な架橋成分は第２の二次抗体に結合している、請求項６３から６８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７１】
切断部位が、ジスルフィド結合、ビシナルジオール、ビシナルヒドロキシルアミン、又はニトロフェニル誘導体を含む、請求項６３から７０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７２】
切断可能な架橋成分が、一つを超える検出可能な部分を含む、請求項６３から７１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７３】
検出可能な部分が、ハプテン、ペプチドタグ、又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項６３から７２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７４】
切断可能な架橋成分が足場をさらに含み、検出可能な部分が足場に結合している、請求項６３から７３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７５】
足場がリジンを含む、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
第１の化学ライゲーション基が、アジド
2017536548.tif 000018
、チオエステル
2017536548.tif 000019
、又はテトラゾール環
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、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項６３から７５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７７】
切断可能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項６３から７６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７８】
第２の化学ライゲーション基が、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項６３から７７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７９】
切断不能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項６３から７８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８０】
触媒が銅（Ｉ）を含むか、又は脱保護試薬がヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）を含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項８１】
触媒が還元剤又は過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項８２】
還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む、請求項８１に記載のキット。
【請求項８３】
第１の修飾結合分子が抗体−ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３を含む、請求項６３に記載のキット。
【請求項８４】
第２の修飾結合分子が抗体−ＰＥＧ４−ＣＣＨを含む、請求項６３又は８３に記載のキット。
【請求項８５】
発色システムが、ビオチンにコンジュゲートした抗検出可能部分抗体を含む、請求項６８に記載のキット。
【請求項８６】
発色システムがストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）分子をさらに含む、請求項８５に記載のキット。
【請求項８７】
発色システムが、ＤＡＢ、過酸化水素、及び銅をさらに含む、請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
少なくとも一つの切断可能な架橋成分にコンジュゲートした抗体を含む組成物であって、切断可能な架橋成分が、切断部位と、検出可能な部分と、第１の化学ライゲーション基とを含み、切断部位は、検出可能な部分及び第１の化学ライゲーション基より抗体に近接しており、第１の化学ライゲーション基は、切断可能な架橋成分の末端又は末端近傍にあり、第１の化学ライゲーション基は生理的条件下で安定である、組成物。
【請求項８９】
抗体が少なくとも二つの切断可能な架橋成分とコンジュゲートしている、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
抗体が少なくとも三つの切断可能な架橋成分とコンジュゲートしている、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９１】
抗体が少なくとも四つの切断可能な架橋成分とコンジュゲートしている、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９２】
切断部位が、ジスルフィド結合、ジオール、又はニトロフェニル誘導体を含む、請求項８８から９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
切断可能な架橋成分が、一つを超える検出可能な部分を含む、請求項８８から９２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
検出可能な部分が、ハプテン、ペプチドタグ、又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項８８から９３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９５】
ペプチドタグが、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｅタグ、又はＶＳＶタグを含む、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
切断可能な架橋成分が足場をさらに含み、検出可能な部分が足場に結合している、請求項８８から９５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９７】
足場がリジンを含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項９８】
第１の化学ライゲーション基が、アジド
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、チオエステル
2017536548.tif 000022
、又はテトラゾール環
2017536548.tif 000023
、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項８８から９７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９９】
切断可能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項８８から９８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１００】
ｘ≧８である、請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０１】
少なくとも一つの切断不能な架橋成分とコンジュゲートした抗体を含む組成物であって、切断不能な架橋成分が第２の化学ライゲーション基を含み、第２の化学ライゲーション基が切断不能な架橋成分の末端又は末端近傍にあり、第２の化学ライゲーション基が生理的条件下で安定である、組成物。
【請求項１０２】
抗体が少なくとも二つの切断不能な架橋成分とコンジュゲートしている、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
抗体が少なくとも三つの切断不能な架橋成分とコンジュゲートしている、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０４】
抗体が少なくとも四つの切断不能な架橋成分とコンジュゲートしている、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０５】
第２の化学ライゲーション基が、アジド
2017536548.tif 000024
、チオエステル
2017536548.tif 000025
、テトラゾール環
2017536548.tif 000026
、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項１０１から１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０６】
切断不能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項１０１から１０５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０７】
ｘ≧４である、請求項１０６に記載の組成物。
【請求項１０８】
抗体−ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３を含む、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０９】
抗体−ＰＥＧ４−ＣＣＨを含む、請求項１０１又は１０８に記載の組成物。
【請求項１１０】
切断可能な架橋成分を含む組成物であって、切断可能な架橋成分が、切断部位と、検出可能な部分と、第１の化学ライゲーション基とを含み、切断部位は第１の末端又は末端近傍にあり、第１の化学ライゲーション基は第２の末端又は末端近傍にあり、第１の化学ライゲーション基は生理的条件下で安定である、組成物。
【請求項１１１】
切断部位が、ジスルフィド結合、ビシナルジオール、ビシナルヒドロキシルアミン、又はニトロフェニル誘導体を含む、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
切断可能な架橋成分が、一つを超える検出可能な部分を含む、請求項１１０又は１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
検出可能な部分が、ハプテン、ペプチドタグ、又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１０から１１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１４】
ペプチドタグが、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｅタグ、又はＶＳＶタグを含む、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１５】
切断可能な架橋成分が足場をさらに含み、検出可能な部分が足場に結合している、請求項１１０から１１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１６】
足場がリジンを含む、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１７】
第１の化学ライゲーション基が、アジド
2017536548.tif 000027
、チオエステル
2017536548.tif 000028
、又はテトラゾール環
2017536548.tif 000029
、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項１１０から１１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１８】
切断可能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１９】
ｘ≧８である、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２０】
切断不能な架橋成分を含む組成物であって、切断不能な架橋成分が、末端又は末端近傍に第２の化学ライゲーション基を含み、第２の化学ライゲーション基が生理的条件下で安定である、組成物。
【請求項１２１】
第２の化学ライゲーション基が、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基、又はアルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）を含む、請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２２】
切断不能な架橋成分が、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む、請求項１２０又は１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
ｘ≧４である、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３を含む、請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２５】
翻訳後修飾を有する標的タンパク質の試料中におけるｉｎ  ｓｉｔｕ検出法であって：
第１の修飾結合分子を標的タンパク質に結合させ、第１の複合体を形成することであって、第１の修飾結合分子が、切断部位を含む切断可能な架橋成分と、検出可能な部分と、第１の化学ライゲーション基とを含み、切断部位は、検出可能な部分及び第１の化学ライゲーション基より第１の修飾結合分子に近接しており、第１の化学ライゲーション基は切断可能な架橋成分の末端にあり、第１の化学ライゲーション基は生理的条件下で安定である、第１の修飾結合分子を標的タンパク質に結合させ、第１の複合体を形成すること；
第２の修飾結合分子を翻訳後修飾に結合させ、第２の複合体を形成することであって、第２の修飾結合分子が、第２の化学ライゲーション基を含む切断不能な架橋成分を含み、第２の化学ライゲーション基は切断不能な架橋成分の末端にあり、第２の化学ライゲーション基は生理的条件下で安定である、第２の修飾結合分子を翻訳後修飾に結合させ、第２の複合体を形成すること；
第１の化学ライゲーション基を第２の化学ライゲーション基に共有結合させ、共有結合単位を形成すること；
共有結合単位が第２の修飾結合分子に結合して第１の修飾結合分子には結合しないように、切断可能な架橋成分の切断部位を切断すること；
共有結合単位の一部ではない切断可能な架橋成分を除去すること；及び
検出可能な部分を可視化することであって、検出可能な部分の可視性により、翻訳後修飾を含む標的タンパク質の存在が示される、可視化すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はｉｎ  ｓｉｔｕ近接アッセイ（proximity assay）に関し、特に共有結合を形成する近接誘導化学ライゲーション反応とそれに続く検出可能なハプテンの移行を用いる近接アッセイに関する。本発明はまた、タンパク質−タンパク質相互作用、融合タンパク質、及びタンパク質の翻訳後修飾の検出を主題とする。
【背景技術】
【０００２】
近接アッセイは、二つの特定のタンパク質又はその部分が近接しているかどうか、例えば、互いに結合したタンパク質、融合タンパク質、及び／又は近接して位置するタンパク質を査定するために使用される。そのようなアッセイの一つは近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）として知られ、対象とする標的に結合した二つの抗体（異なる種で産生された）を特徴とする（Nature Methods 3, 995-1000 （2006）参照）。結合した特有のオリゴヌクレオチド鎖を有する種特異的二次抗体であるＰＬＡプローブは、次いで適当な一次抗体に結合される。標的が近接している場合、ＰＬＡプローブのオリゴヌクレオチド鎖は、新たなｓｓＤＮＡ及びＤＮＡリガーゼと相互作用することができ、循環されてローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により増幅させることができる。Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼのような高度に加工性のＤＮＡポリメラーゼが使用されるとき、円形のＤＮＡ鋳型は、数百から数千回分長く複製することができ、その結果数百ナノメートルから数ミクロンの長さのｓｓＤＮＡ分子を生成する（Angewandte Chemie International Edition, 2008, 47, 6330-6337参照）。増幅後、複製ＤＮＡは検出システムにより検出することができる。したがって、可視シグナルにより対象の標的が近くにあることが示される。このようなアッセイは、複数のＤＮＡ−抗体コンジュゲート、並びにＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼといった酵素の使用を特徴とする。このようなコンジュゲート及び酵素は高価であり、また適切に機能及び安定させるためにストリンジェントなアッセイ条件を必要とする。さらに、この手法は増幅されたＤＮＡ配列を生成し、これは検出が容易であるものの、検出された近接事象と共存したままではない可能性がある。
【０００３】
タンパク質−タンパク質相互作用を調べるための別のアッセイには二重結合剤（ＤＢ）アッセイが含まれ、これは可動性リンカーにより結合された速い解離速度動態を有する二つのＦａｂ断片からなる二重特異性の検出剤を利用する（Development of Bispecific Molecules for the In Situ Detection of Protein-Protein Interactions and Protein Phosphorylation, Chemistry & Biology 21, 1-12, March 20, 2014）。原則的に、二重結合剤は、速い解離速度動態を有するＦａｂ断片を含むため、Ｆａｂ断片の一方しかそのエピトープに結合していない場合、洗い流されてしまう（二重結合剤の両方のＦａｂ断片の同時協同的結合が二重結合剤の解離を防止し、陽性染色／可視性を達成する）。このような手法は、特定の結合キネティクスを有する特定のＦａｂ断片の開発を必要とし、そのため対象となる広範な標的に実施することは現実的でない。
【０００４】
別の手法では、Ｇｒｏｓｓｍａｎらにより、寄与プローブから近くの受容プローブへのレポーター基の移行により近接標的の核酸を検出するためのアッセイが記載されている。プローブは、標的核酸の相補的セグメントに隣接してアニールするように設計されている。プローブ対のアニーリング（近接した）は、反応（例えば、チオ交換反応など）が生じることを可能にし、これによりレポーター基（例えば、蛍光クエンチャー）の移行が容易になる（Grossman et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7119-7122参照）。
【０００５】
別の手法によれば、国際公開第２０１４／１３９９８０号（近接アッセイ及び近接アッセイを可能にするツールに関する開示のために、ここで言及したことによりその全体が包含される）に、近接アッセイを実施するためのビオチンリガーゼ基質及び酵素の使用が記載されている。この方法は、標的分子及び近接性の検出を提供するとともに、試料の細胞状況を維持する。大腸菌由来の酵素及びそのような酵素のためのアミノ酸基質といったペプチド基質などのビオチンリガーゼの使用により、ＦＦＰＥ試料においてタンパク質−タンパク質相互作用の感受性で特異的な検出が提供される。ビオチンリガーゼはビオチンの存在下において適切なペプチド基質を効率的にビオチン化することができ、反応は酵素がペプチド基質と物理的に接触するときにのみ起こるので、ビオチンリガーゼと基質は、それぞれ対象の標的を認識する二つの抗体に別々にコンジュゲートすることができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、標的の近接性を検出するための方法を主題とする。本発明は、ここにさらに包括的に記載するように、標的の近接性を検出するための方法を主題とし、この方法では、（ｉ）化学反応工程により、一対の修飾された特異的結合分子（例えば、近接しているときに外部の刺激を受けると共有結合（化学ライゲーション）を形成するように適合された、一方が切断可能な結合と検出可能な部分を含む架橋成分に、それぞれコンジュゲートした二つの抗体）の間に共有結合を形成し、（ｉｉ）続く／別個の切断工程により、検出可能な部分が対向する特異的結合分子へと最終的に移行するように、最初は検出可能な部分に結合していた架橋成分を切断する。検出可能な部分の検出は、近接性が不十分であるために化学結合の形成に関わっていない検出可能な部分は洗浄により試料から除去されるため、標的近接性を示す。
【０００７】
本発明の方法は、発色性及び発蛍光性の検出システムと適合性であり、手動で又は自動化システムにおいて実施可能である。本発明の方法は、ＤＮＡリガーゼ又はＤＮＡポリメラーゼといった酵素を特徴としないため、標的近接性の検出に関して感受性及びコストが比較的低い試薬と、アッセイ条件に関して柔軟性及び耐性が比較的高い試薬とを使用する。
【０００８】
重要なのは、本発明の特異的結合分子（例えば、抗体）が、一又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上）の架橋成分とコンジュゲートできることである。これは、複数の架橋成分が、強い（例えばより暗い）シグナルを提供しかつシグナルを達成する可能性を高めることができるため、有利でありうる。
【０００９】
本発明の用途は驚くほど多様である。例えば、本明細書の実施例により、本発明がタンパク質−タンパク質相互作用及び翻訳後修飾（ＰＴＭ）の状態を検出するために使用可能であることが実証される。したがって、タンパク質二量体化、タンパク質融合、会合、並びにリン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、及び／又は脂質付加などを含むＰＴＭといった、様々な近接する生物学的に重要な標的を検出するための手法が提供される。
【００１０】
本明細書に記載される任意の特徴又は特徴の組み合わせは、そのような組み合わせのいずれかに含まれる特徴が、文脈、本明細書、及び当業者の知識から明らかとなるように、相互に矛盾しない限りにおいて、本発明の範囲に含まれる。本発明の更なる利点及び態様は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【００１１】
例えば、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、第１の修飾結合分子を第１の標的に結合させて第１の複合体を形成すること、及び第２の修飾結合分子を第２の標的に結合させて第２の複合体を形成することを含む。
【００１２】
第１の修飾結合分子は一つの切断可能な架橋成分（又は一を超える切断可能な架橋成分）を含み、切断可能な架橋成分は、切断部位（例えば、ジスルフィド結合、ビシナルジオール、ビシナルヒドロキシルアミン、ニトロフェニル誘導体など）、検出可能な部分（例えば、１、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０など）、及び第１の化学ライゲーション基（例えば、アジド、チオエステル、テトラゾール環など）を含む。切断部位は、検出可能な部分及び第１の化学ライゲーション基より第１の修飾結合分子に近接している。第１の化学ライゲーション基は切断可能な架橋成分の末端に位置している。第１の化学ライゲーション基は生理的条件下において安定である。
【００１３】
第２の修飾結合分子は一つの切断不能な架橋成分（又は一つを超える切断不能な架橋成分）を含み、切断不能な架橋成分は第２の化学ライゲーション基（例えば、アルキン基、ハロゲン基（−Ｃｌ、−Ｂｒ，-Ｉなど）、アルケン基など）を含む。第２の化学ライゲーション基は切断不能な架橋成分の末端に位置している。第２の化学ライゲーション基は生理的条件下において安定である。化学ライゲーション基は、第１と第２の修飾結合分子間で交換可能である。
【００１４】
いくつかの実施態様では、第１の修飾結合分子は第１の抗体を含み、第２の修飾結合分子は第２の抗体を含む。いくつかの実施態様では、第１の修飾結合分子は第１の一次抗体及び第１の二次抗体を含み、第２の修飾結合分子は第２の一次抗体及び第２の二次抗体を含み；第１の二次抗体は第１の一次抗体に特異的であるが第２の一次抗体に特異的でなく、第２の二次抗体は第２の一次抗体に特異的であるが第１の一次抗体に特異的でなく；切断可能な架橋成分は第１の二次抗体に結合しており、切断不能な架橋成分は第２の二次抗体に結合している。
【００１５】
方法はさらに、第１の化学ライゲーション基を第２の化学ライゲーション基に共有結合させて共有結合単位を形成すること、共有結合単位が第２の修飾結合分子に結合するが第１の修飾結合分子には結合しないように切断可能な架橋成分の切断部位を切断すること、及び共有結合単位の一部ではない切断可能な架橋成分を除去（例えば、洗浄）すること、及び検出可能な部分を可視化（例えば、発色システム、蛍光システムなどにより）することを含む。
【００１６】
本発明の方法は、第１の一次抗体を第１の標的に結合させ、第２の一次抗体を第２の標的に結合させること；次いで第１の二次抗体を第１の一次抗体に結合させ、第２の二次抗体を第２の一次抗体に結合させることを含むことができ、この場合第１の二次抗体は第１の一次抗体に特異的であるが第２の一次抗体に特異的でなく、第２の二次抗体は第２の一次抗体に特異的であるが第１の一次抗体に特異的でない。第１の二次抗体は上述のような第１の修飾結合分子とすることができ、例えば、上述のような切断可能な架橋成分を含む。第２の二次抗体は上述のような第２の修飾結合分子とすることができ、例えば、上述のような切断不能な架橋成分を含む。方法はさらに、第１の化学ライゲーション基を一致する第２の化学ライゲーション基に共有結合させて共有結合単位を形成すること；共有結合単位が第２の二次抗体に結合するが第１の二次抗体には結合しないように切断可能な架橋成分の切断部位を切断すること；共有結合単位の一部ではない切断可能な架橋成分を除去すること；及び検出可能な部分を可視化することを含みうる。
【００１７】
いくつかの実施態様では、検出可能な部分が目に見えることにより、第１の標的と第２の標的との間の距離が６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２５ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、５ｎｍ以下などであることが示される。
【００１８】
本発明の方法は、手動で又は自動染色装置を用いて実施することができる。本発明の一態様は、試薬、及びアッセイを実施するためのキットが、自動染色装置上で使用可能であるように十分に安定していることである。例えば、試薬は、室温で１ヶ月を上回る貯蔵寿命を有するように構成されうる。
【００１９】
いくつかの実施態様では、検出可能な部分は、非内因性の化合物、ペプチドタグ，（例えば、ヘマグルチニン由来のＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｅタグ、ＶＳＶタグなど）又はオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、切断可能な架橋成分は、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む。いくつかの実施態様では、切断不能な架橋成分は、ｘポリエチレングリコール基（ＰＥＧｘ）（ｘ≧１）を含む。
【００２０】
いくつかの実施態様では、第１の化学ライゲーション基を第２の化学ライゲーション基に共有結合させる工程は、試料を触媒（例えば、Ｈｕｉｓｇｅｎ  １，３−双極子付加環化反応を開始させるための銅（Ｉ））、紫外線、又は脱保護条件（例えば、ヒドラジン（Ｎ２Ｈ４））と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、化学ライゲーション基は、二時間未満で共有結合単位を形成するように適合される。
【００２１】
いくつかの実施態様では、切断可能な架橋成分の切断部位を切断する工程は、試料を還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、又は紫外線と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、切断部位は、ジスルフィド結合、ビシナルジオール、ビシナルヒドロキシルアミン、又はニトロフェニル誘導体を含む。
【００２２】
本発明の一態様は、商業的に妥当且つ化学的にロバストな時間内にアッセイを実行可能なことである（例えば加水分解の悪影響及び熱劣化がアッセイの実施に大きな影響を与えないために十分に回数が少ないこと−時間短縮の主な理由はむしろ試験効率上昇のためである）。いくつかの実施態様では、化学ライゲーション基は、四時間、三時間、二時間、又は一時間未満で共有結合単位を形成するように適合される。
【００２３】
本発明は、標的近接性を検出するための組成物、例えば、本明細書に記載の方法に使用される組成物も主題とする。例えば、本発明は、本明細書に記載の、切断可能な架橋成分を含む組成物を主題とする。組成物はさらに、切断可能な架橋成分にコンジュゲートした抗体を含む。いくつかの実施態様では、抗体は少なくとも一つの切断可能な架橋成分にコンジュゲートする。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも二つの切断可能な架橋成分、少なくとも五つの切断可能な架橋成分、少なくとも十の切断可能な架橋成分、又は少なくとも十五の切断可能な架橋成分にコンジュゲートする。本発明は、本明細書に記載の、切断不能な架橋成分を含む組成物も主題とする。組成物はさらに、切断不能な架橋成分にコンジュゲートした抗体を含みうる。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも一つの切断不能な架橋成分にコンジュゲートする。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも二つの切断不能な架橋成分、少なくとも五つの切断不能な架橋成分、少なくとも十の切断不能な架橋成分、又は少なくとも十五の切断可能な架橋成分にコンジュゲートする。
【００２４】
開示される実施態様を実施するためのキットも開示される。例えば、本発明は、本明細書に記載の第１の修飾結合分子及び／又は第２の修飾結合分子を含むキットを主題とする。キットはさらに、第１の化学ライゲーション基を第２の化学ライゲーション基に共有結合させて共有結合谷を形成するために有効な触媒を含む。いくつかの実施態様では、化学ライゲーション基は、四時間、三時間、二時間、又は一時間未満で共有結合単位を形成するように適合される。いくつかの実施態様では、キットはさらに、切断可能な架橋成分の切断部位を切断するための試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットはさらに、検出可能な部分を可視化するシステムを含む。
【００２５】
いくつかの実施態様では、第１の標的は標的タンパク質を含み、第２の標的は翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、ユビキチン化など）を含む。したがって、本発明のアッセイは、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、グリコシル化、ユビキチン化など）を有する標的タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕでの検出のために使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Ａ−Ｃは、修飾された特異的結合部分の模式図である。図１Ａ及び図１Ｂは、特異的結合部分及び切断可能な架橋成分を模式的に示す。切断可能な架橋成分は、切断部位（切断可能なリンカー）、検出可能な部分（ハプテン）、及び化学ライゲーション基（ＣＬ）を含む。ハプテン（検出可能な部分）及び化学ライゲーション基は、直鎖状又は分枝状の構成でありうる。リンカーは、三つの機能性すべてにおいて使用することができる。切断可能なリンカーは、他の二つの基より特異的結合部分に近接している。図１Ｃは、特異的結合部分（例えば、抗体）及び切断不能な架橋成分を示す。切断可能な架橋成分は、リンカー及び化学ライゲーション基（ＣＬ）を含む。
【図２】化学ライゲーション反応性基（ＣＬ−ａ及びＣＬ−ｂ）の非限定的な例示的構造と、共有結合の形成のためのそれぞれの条件を示す。
【図３】本発明による近接アッセイに含まれる概念及び主な工程を示す模式図である。上部は、対象とする二つの標的が近接している系における近接アッセイを示す。下部は、対象とする二つの標的が近接していない系における近接アッセイを示す。本発明は、図３に記載される成分及び工程に限定されない。
【図４】切断可能な架橋成分を有する抗体を含む抗体コンジュゲートの非限定的実施例（上部）及び切断不能な架橋成分を含む抗体コンジュゲートの非限定的実施例（下部）を示す模式図である。
【図５】切断可能な架橋成分が足場を含み、検出可能な部分／ハプテンが足場に結合している別の切断可能な架橋成分（三機能性分子）を示す。
【図６】本発明のアッセイを用いた、リン酸化又はユビキチン化といったタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の検出を示す模式図である。
【図７】ＰＥＧ８リンカー、ジスルフィド結合、ハプテンなどのヘマグルチニンタグ（ＨＡタグ）、及びアジド基（Ｎ３）を含む切断可能な架橋成分を有するヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）のコンジュゲートＡの合成を示す模式図である。
【図８】図７のＧＡＲ−ＨＡペプチドコンジュゲートの精製を示す代表的なＳＥＣクロマトグラムである。
【図９】市販のＤＡＢ発色検出システムを用いるＩＨＣ法を使用した検出可能な部分／ハプテンＨＡタグの検出を示す顕微鏡写真である。
【図１０】検出可能な部分／ハプテンの検出のための近接アッセイとそれに続いて行われる免疫組織化学アッセイに使用される工程と、フルオロフォア−チラミド（チラミド）（Ｃｙ５−Ｔｙｒ）検出法を用いる別の検出法を示すフロー図である。
【図１１】コンジュゲートＡからのＨＡタグの完全な切断のための条件を決定するために使用される工程を示すフロー図である（実施例３）。
【図１２】Ａ−Ｄは、ｉｎ  ｓｉｔｕ切断に十分なＤＴＴの濃度を確立するために実施された実施例３に記載の、様々な濃度のジチオスレイトール（ＤＤＴ）、即ちＤＴＴなし（図１２Ａ）、５０ｍＭのＤＴＴ（図１２Ｂ）、７５ｍＭのＤＴＴ（図１２Ｃ）、及び１００ｍＭのＤＴＴ（２４分のＤＴＴインキュベーション、ハプテン−チラミド増幅（ＨＱ−Ｔｙｒ  ＡＭＰ）を使用）（図１２Ｄ）を用いたＫｉ６７のアッセイ後の、染色された扁桃腺組織スライドの顕微鏡写真である。
【図１３】Ａ及びＢは、切断可能な架橋成分を用いてＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）のアッセイが実施された染色された皮膚組織片を示す顕微鏡写真であり、実施例３に記載のように、ＤＴＴなし（図１３Ａ）、及び５０ｍＭのＤＴＴ（２４分のＤＴＴインキュベーション、ハプテン−チラミド増幅（ＨＱ−Ｔｙｒ  ＡＭＰ）を使用）（図１３Ｂ）を示す。
【図１４】Ａ−Ｃは、扁桃腺切片中におけるＣＤ２０の検出を示す顕微鏡写真であり、Ｃｕ（Ｉ）／Ｌ比の影響と付随する染色を示している。図１４Ａは１：５の比のＣｕ（Ｉ）／Ｌ比を、図１４Ｂは１：３のＣｕ（Ｉ）／Ｌ比を、及び図１４ＣはＣｕ（Ｉ）を加えていないコントロールを、それぞれ示している。ＧＡＭ−ＰＥＧ４−ＣＣＨのコンジュゲートに反応性アセチレン基を使用した（実施例３参照）。Ｃｕ（Ｉ）を加えたときにＣＤ２０の特異的検出が達成された。Ｃｕを省いたとき染色は観察できなかった。これは、ＧＡＭコンジュゲートにおける反応性アセチレンの機能性の存在を示す。
【図１５】Ａ及びＢは、Ｃｕ（Ｉ）を用いた場合（図１５Ａ）とＣｕ（Ｉ）を用いない場合（図１５Ｂ）の、市販のＤＡＢ発色検出を使用した正常な扁桃腺組織切片におけるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）／β−カテニン（β−ｃａｔ）の検出を示す顕微鏡写真である。
【図１６】Ａ−Ｄは、市販のハプテン−チラミド増幅（ＶＥＮＴＡＮＡ  ＯＰＴＩＶＩＥＷ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）による、正常な扁桃腺組織切片におけるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）／β−カテニン（β−ｃａｔ）の検出を示す顕微鏡写真であり、マウス抗β−ｃａｔを用いない近接アッセイ（図１６Ａ）、ウサギ抗Ｅ−ｃａｄを用いない近接アッセイ（図１６Ｂ）、Ｃｕ（Ｉ）を用いたウサギ抗Ｅ−ｃａｄ及びマウス抗β−ｃａｔ近接アッセイ（図１６Ｃ）、並びにＣｕ（Ｉ）を用いないウサギ抗Ｅ−ｃａｄ及びマウス抗β−ｃａｔ近接アッセイ（図１６Ｄ）を示す。
【図１７】Ａ−Ｄは、Ｃｕ（Ｉ）とＶＥＮＴＡＮＡ  ＯＰＴＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ及びＶＥＮＴＡＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔとを用いた場合の、正常な扁桃腺切片スライドにおけるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）及びｐ１２０−カテニン（ｐ１２０）の近接性を検出するためのアッセイ（図１７Ａ）と、Ｃｕ（Ｉ）を用いないネガティブコントロール（図１７Ｂ）を示す顕微鏡写真である。Ｃ及びＤは、本明細書に記載の近接アッセイ（図１７Ｃ）及びＣｕ（Ｉ）を用いない近接アッセイ（図１７Ｄ）により、正常な扁桃腺組織切片においてタンパク質の異なるエピトープに結合するマウス−抗Ｅｃａｄ及びウサギ−抗Ｅｃａｄ一次抗体を用いてＥ−カドヘリンが検出された切片の顕微鏡写真を示す。
【図１８】Ａ−Ｄは、増幅を伴うＶＥＮＴＡＮＡ  ＯＰＴＩＶＩＥＷ  ＤＡＢで染色された正常な皮膚組織切片におけるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）／β−カテニン（β−ｃａｔ）の検出を示す顕微鏡写真であり、図１８ＡはＥ−ｃａｄとβ−ｃａｔの間の近接アッセイを示しており、図１８ＢはＣｕ（Ｉ）を用いないコントロールである。図１８Ｃも、異なる皮膚切片におけるＥ−ｃａｄとβ−ｃａｔの間の近接アッセイを示し、図１８Ｄは、Ｃｕ（Ｉ）触媒を用いていない対応するネガティブコントロールである。
【図１９】Ａ−Ｃは、Ｃｙ５−Ｔｙｒ（青色＝ＤＡＰＩ、赤色＝Ｃｙ５、Ｅｃａｄ／β−ｃａｔについて）を用いた、正常な扁桃腺切片におけるＥｃａｄ／β−ｃａｔのフルオロフォア−チラミドに基づく検出を示す顕微鏡写真である。
【図２０】Ａ−Ｄは、増幅を伴うＶＥＮＴＡＮＡ  ＯＰＴＩＶＩＥＷ  ＤＡＢで染色された正常な扁桃腺組織切片におけるＣＤ１９／ＣＤ２１の近接アッセイを示す顕微鏡写真である（図２０Ａ）。図２０Ｂは、Ｃｕ（Ｉ）を用いていない図２０Ａのコントロールである。図２０Ｃは、正常な扁桃腺組織においてマウス−抗ＣＤ２１及びウサギ−抗ＣＤ２１一次抗体を使用することによるＣＤ２１の検出を示し、図２０Ｄは、Ｃｕ（Ｉ）を用いていない図２０Ｃのコントロールである。
【図２１】Ａ−Ｃは、リン酸化を検出するために抗ＨＥＲ２（クローン４Ｂ５）及び抗ｐ−Ｔｙｒ抗体を用いる、ＨＥＲ２リン酸化を検出するために使用される近接アッセイを示す顕微鏡写真である。組織は、ＤＡＢ発色検出を用いた３−ｉｎ−１の異種移植片スライドに基づいており、図２１Ａは抗ＨＥＲ２抗体のみを添加した場合を、図２１ＢはＣｕ（Ｉ）を用いる抗ＨＥＲ２（クローン４Ｂ５）及び抗ｐ−Ｔｙｒ抗体を使用した近接アッセイを、図２１ＣはＣｕ（Ｉ）を用いない図２１Ｂのコントロールを、それぞれ示している。
【図２２】本明細書に記載のアッセイを用いたタンパク質のユビキチン化の検出の模式図である。
【図２３】Ａ−Ｄは、ＭＣＦ−７異種移植片におけるプロゲステロン受容体（ＰＲ）のユビキチン化の検出を示す顕微鏡写真である。ＭＣＦ−７細胞はＰＲ陽性である。図２３Ａは、ＰＲとユビキチンの間の近接アッセイを示す。図２３Ｂは、Ｃｕ（Ｉ）触媒を用いない近接アッセイのコントロールである。図２３Ｃ及び図２３Ｄは、それぞれ市販のＶＥＮＴＡＮＡ  ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出を用いて検出されたＰＲ（図２３Ｃ）及びユビキチン（図２３Ｄ）の標準的なＩＨＣ検出である。
【図２４】Ａ−Ｄは、ＺＲ−７５５１異種移植片におけるプロゲステロン受容体（ＰＲ）のユビキチン化の検出を示す顕微鏡写真である。ＺＲ−７５１細胞はＰＲ陽性である。図２４Ａは、ＰＲとユビキチンの間の近接アッセイを示す。図２４Ｂは、Ｃｕ（Ｉ）触媒を用いない近接アッセイのコントロールである。図２４Ｃ及び図２４Ｄは、それぞれ市販のＶＥＮＴＡＮＡ  ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出を用いて検出されたＰＲ（図２４Ｃ）及びユビキチン（図２４Ｄ）の標準的なＩＨＣ検出である。
【図２５】Ａ−Ｄの顕微鏡写真では、図２５Ａは、（Ｂ）−（Ｄ）として画定された領域を示すことを除いて図２４Ａと同じ顕微鏡写真であり、それら領域の拡大図が図２５Ｂ〜図２５Ｄに示される。拡大図により、ユビキチン化されたＰＲの不均一性を容易に見ることができる。
【図２６】Ａ−Ｄは、Ｃａｌｕ−３異種移植片においてプロゲステロン受容体（ＰＲ）のユビキチン化が検出されないことを示す顕微鏡写真である。Ｃａｌｕ−３細胞はＰＲ陰性である。図２６Ａは、ＰＲとユビキチンとの近接アッセイに関するシグナルの欠如を示す。図２６Ｂは、Ｃｕ（Ｉ）触媒を用いない近接アッセイのコントロールである。図２６Ｃ及び図２６Ｄは、それぞれ市販のＶＥＮＴＡＮＡ  ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出を用いて検出されたＰＲ（図２６Ｃ）及びユビキチン（図２６Ｄ）の標準的なＩＨＣ検出である。
【図２７】Ａ−Ｃは、Ｃａｌｕ−３細胞におけるＨＥＲ２のユビキチン化の検出を示す顕微鏡写真である。Ｃａｌｕ−３細胞はＨＥＲ２陽性である。図２７Ａは、ＨＥＲ２とユビキチンとの近接アッセイを示す。図２７Ｂは、Ｃｕ（Ｉ）触媒を用いない近接アッセイのコントロールである。図２７Ｃは、図２７Ａの領域の拡大図である。ユビキチン化ＨＥＲ２は、Ｃａｌｕ−３細胞において検出される。
【図２８】Ａ−Ｄは、本発明の近接アッセイを用いたＭＬＨ１−ＰＭＳ２ヘテロダイマーの検出を示す顕微鏡写真である。図２８Ａは、ウサギ−抗ＰＭＳ２  ｍＡｂを用いた、ＨｅＬａ細胞の異種移植片におけるＰＭＳ２の標準的なＩＨＣを示す。図２８Ｂは、マウス−抗ＭＬＨ１  ｍＡｂを用いた、ＨｅＬａ細胞の異種移植片におけるＭＬＨ１のＩＨＣを示す。図２８Ｃは、ＭＬＨ１−ＰＭＳ２ヘテロダイマーの近接アッセイを示し、図２８Ｄは、Ｃｕ（Ｉ）触媒を用いない近接アッセイである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
I.用語
特に断らない限り、技術用語は一般的な使用法に従って使用される。分子生物学の共通用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 （ISBN 0-19-854287-9）; Kendrew et al. （eds.）, The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 （ISBN 0-632-02182-9）; and Robert A. Meyers （ed.）, Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 （ISBN 1-56081-569-8）に見ることができる。特に説明のない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示内容が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。単数形（ａ、ａｎ、及びｔｈｅ）には、文脈上矛盾しない限り複数の指示物が含まれる。同様に、「又は」という語は、文脈上矛盾しない限り「及び」を含むことを意図している。さらに、核酸又はポリペプチドについて与えられるすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズと、すべての分子量又は分子質量の値とは、おおよその値であり、説明のために提供されている。適切な方法及び材料が後述されるが、本明細書に記載されるものと同様又は等価な方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。
【００２８】
すべての刊行物、特許出願、特許、及び本明細書において言及される他の参考文献は、言及されることによりその全体、又は言及された文脈において関連する部分が本明細書に包含される。すべてのＧｅｎＢａｎｋ寄託番号は、２０１１年６月８日にデータベースに表示されていた状態で、言及されることにより本明細書に包含される。矛盾する場合、用語の説明を含め、本明細書は調整されるであろう。加えて、材料、方法、及び実施例は例示的なものであり、限定を目的としていない。
【００２９】
本開示の様々な実施態様の閲覧を容易にするために、特定の用語を以下のように説明する。
【００３０】
投与：対象に対し、薬剤、例えば、組成物を、任意の有効な経路により提供すること。投与の例示的経路には、限定されないが、経口、注入（例えば皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、及び静脈内）、舌下、直腸、経皮（例えば、局所）、鼻腔内、膣内及び吸入経路が含まれる。
【００３１】
薬剤：終了又は結果に到達するために有用ないずれかの物質又は物質のいずれかの組み合わせ；例えば、低減又はタンパク質−タンパク質相互作用の低減に有用な物質又は物質の組み合わせ。いくつかの実施態様では、薬剤は、治療剤、例えばがんの治療のための治療剤である。
【００３２】
抗体：抗原のエピトープ又はその断片に特異的に結合する少なくとも軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。抗体は、当技術分野において周知のインタクトな免疫グロブリン及びその変異体、例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）、及びジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）を含む。ｓｃＦｖタンパク質は、抗体の軽鎖可変領域及び抗体の重鎖可変領域がリンカーによって結合している融合タンパク質であり、ｄｓＦｖでは、鎖の会合を安定化させるためにジスルフィド結合を導入するように鎖が変異している。この用語には、遺伝的に操作された形態、例えばキメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）及びヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）も含まれる。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 （Pierce Chemical Co., Rockford, IL）; Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997も参照されたい。
【００３３】
本明細書において開示される抗体は、定義された一つの標的（又は二重特異性抗体の場合、複数の標的）に特異的に結合する。したがって、標的に特異的に結合する抗体は、標的に実質的に結合する抗体、例えば標的を発現する細胞又は組織である。言うまでもなく、特定の度合いの非特異的相互作用が抗体と非標的の間で生じることがある。
【００３４】
一般に、特異的結合により、抗体と抗原を保持するタンパク質又は細胞との間に、抗体と抗原を保持しないタンパク質又は細胞との間よりはるかに強い会合が生じる。特異的結合は一般に、エピトープを含むタンパク質又は標的エピトープを発現する細胞若しくは組織に対する結合抗体の量（単位時間当たりの）を、このエピトープを欠くタンパク質又は細胞若しくは組織と比較して、２倍、例えば５倍、１０倍、又は１００倍を上回る量に増大させる。このような条件下におけるタンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とする。様々なイムノアッセイの形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体又はその他のリガンドを選択するために適切である。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択するために常套的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用することのできるイムノアッセイの形式及び条件の説明については、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York （1988）を参照されたい。
【００３５】
生物学的試料：生物学的分子を含む生物学的標本であり、ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ及びｍｉｃｒｏＲＮＡを含む）、核酸、タンパク質、ペプチド、及び／又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施例では、生物学的試料は対象から得られる。他の実施例では、生物学的試料は細胞培養物であり、対象から得られた生物学的試料から増殖させた細胞培養物を含む。生物学的試料には、対象における疾患（例えば、がん）を検出するために有用なすべての臨床試料が含まれ、これには限定されないが、細胞、組織、及び体液、例えば血液、血液の派生物及び画分（例えば血清）；並びに生検又は外科的に除去された組織、例えば、固定されていない、凍結された、又はホルマリン若しくはパラフィン内において固定された組織が含まれる。特定の実施例では、生物学的試料は、腫瘍を有するか又は有すると疑われる対象；例えば、乳がん、卵巣がん、胃がん又は子宮がんを有するか又は有すると疑われる対象から得られる。いくつかの実施態様では、対象はカルシノーマを有するか又は有すると疑われる。
【００３６】
バッファー：バッファー溶液は、一般に、生物学的及び化学的系の正確なｐＨレベルを維持するために使用される。本明細書に開示される例示的実施態様の多くは、バッファー溶液の使用を含む。代表的な緩衝剤又はバッファー中に存在しうる塩には、限定されないが、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、酢酸カリウム、ＮＨ４−アセテート、カリウムグルタメート、ＮＨ４Ｃｌ、硫酸アンモニウム、ＭｇＣｌ２、酢酸マグネシウムなどが含まれる。一つのバッファー溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。別のバッファー溶液は、ビオチンリガーゼ反応バッファー（０．１Ｍ  ＫＣｌ、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５、０．１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３ｍＭ  ＡＴＰ、及び６０μＭ  ビオチン）である。緩衝剤の量は、典型的には約５から１５０ｍＭ、一般的には約１０から１００ｍＭ、及びさらに一般的には約２０から５０ｍＭの範囲であり、特定の好ましい実施態様では、緩衝剤は、約６．０から約９．５にわたるｐＨ、さらに一般的には室温で約６．５から約７．４のｐＨ範囲を提供するために十分な量で存在させる。緩衝媒体中に存在してよい他の薬剤には、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどが含まれる。
【００３７】
発色染色：発色基質は、長年にわたり免疫組織化学のために、最近ではｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、広く使用されている。発色検出は、単純で費用効率のよい検出方法を提供する。発色基質は伝統的に、適切な酵素により作用されたとき沈殿することにより機能する。即ち、伝統的な発色基質は、酵素と接触すると、可溶性試薬から非可溶性の有色沈殿物へと変換される。結果として得られる有色沈殿物は、処理又は可視化に特別な設備を必要としない。成功したＩＨＣ又はＩＳＨの発色基質はいくつかの性質を共有する。第１に、物質は有色物質として沈殿し、好ましくは極めて高いモル吸光係数を有する。酵素基質は高い溶解度と試薬安定性を有するが、沈殿した色素原生成物は、好ましくは水性及びアルコール溶液の両方において、極めて不溶性である。単一の酵素からのシグナルを短時間で高度に増幅させるために、酵素の代謝回転速度は極めて高くなければならない。現在までに同定されている、これら性質のすべてを正当に保持する発色基質は比較的少ない。米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９号及び米国特許出願第６１／９４３９４０号（２０１４年２月２４日出願の「ＱＵＩＮＯＮＥ  ＭＥＴＨＩＤＥ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＦＯＲＥ」）を参照することができ、これら特許文献は、発色染色に関する開示について、ここでの言及により本明細書にその全体が包含される。複数の市販の発色検出キットがＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能であり、本明細書において言及される（ＡＥＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ７６０−０２０；Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ７６０−０３１；ＯＰＴＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ７６０−７００；ｉＶＩＥＷ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ７６０−０９１；ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ７６０−５０１；ａｎｄ  ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ７６０−５００）。
【００３８】
コンジュゲート：例えば、共有結合又は非共有結合的相互作用により互いにカップリングした二つ以上の分子。
【００３９】
コンジュゲート、結合（ｊｏｉｎ）、結合（ｂｏｎｄ）、又は結合（ｌｉｎｋ）第１の分子を第２の分子に結合させること。これには、限定されないが、一つの分子を別の分子に共有結合させること、一つの分子を別の分子に非共有結合させること（例えば、静電結合）（例えば、米国特許第６９２１４９６号参照）、水素結合、ファンデルワールス力、及びこのような結合のすべての組み合わせが含まれる。
【００４０】
接触させる：例えば固体、液体又は気体の形態を直接会合させること。
【００４１】
コントロール：試験試料との比較のための、生物学的試料などの試料又は標準物質、例えば、一名の患者（又は複数名の患者）又は細胞培養物から得られる生物学的試料。いくつかの実施態様では、試験薬剤と共にインキュベートされない細胞培養物が、試験薬剤と共にインキュベートされる細胞培養物のコントロールとして機能する。いくつかの実施態様では、コントロールは、健常な一名の患者（又は複数名の患者）から得られる試料、例えば健常な乳房試料である（本明細書では「正常」コントロールとも呼ぶ）。いくつかの実施態様では、コントロールは、既存コントロール又は標準値（即ち以前に試験されたコントロール試料又はベースライン若しくは正常値を表わす試料の組）である。いくつかの実施態様では、コントロールは、複数の患者試料から得られる平均値（又は値の平均範囲）を表す標準値である。
【００４２】
カップリング：直接的又は間接的に、互いに結合した二つ以上の分子。第１の原子又は分子は、第２の原子又は分子に直接的に又は間接的にカップリングすることができる。二次抗体は、抗原に結合する一次抗体に結合すると、抗原に間接的にカップリングする。
【００４３】
検出：何かの生存、発生、存在、又は事実を同定すること。検出の一般的な方法は、当業者に既知であり、本明細書に開示されるプロトコール及び試薬で補われる。例えば、本明細書には、生物学的試料中において第２の標的に近接する第１の標的を検出する方法が含まれる。
【００４４】
ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋試料。
【００４５】
ハプテン：ハプテンは、分子、典型的には抗体と特異的に結合することのできる小分子であるが、通常は、担体分子との組み合わせを除き、実質的に免疫原性となりえない。ジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ローダミン、又はこれらの組み合わせといった多くのハプテンが既知であり、分析的手順に頻繁に使用されている。他のハプテンがＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（本出願人）により特に開発されており、これには、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリテルペン、尿素、チオウレア、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン、及びこれらの組み合わせから選択されるハプテンが含まれ、ハプテンの特定のハプテン例には、ベンゾフラザン、ニトロフェニル、４−（２−ヒドロキシフェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン−２（３Ｈ）−オン、及び３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルバミドが含まれる。複数の異なるハプテンは、高分子担体にカップリングすることができる。さらに、ハプテンのような化合物は、ＮＨＳ−ＰＥＧリンカーといったリンカーを用いて別の分子にカップリングすることができる。
【００４６】
免疫複合体：可溶性抗原への抗体の結合は免疫複合体を形成する。免疫複合体の形成は、当業者に既知の一般的な方法、例えば免疫組織化学、免疫沈降法、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法（即ち、ウェスタンブロット）、核磁気共鳴画像法、ＣＴスキャン、Ｘ線及びアフィニティークロマトグラフィーにより検出することができる。選択された抗体の免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化されうる。
【００４７】
リンカー：二つの成分は、結合により直接的に又はリンカーを通して間接的に、互いに結合されうる。リンカーは、二官能性（即ち、リンカーが各端部に一つの官能基を含む）でもよく、このような官能基は二つの成分を、共有結合的に又は非共有結合的にカップリングするために使用される。二つの官能基は同じ（即ち、ホモ二官能性リンカー）でも、異なっても（即ち、ヘテロ二官能性リンカー）でもよいが、より一般的にはヘテロ二官能性である。リンカーが用いられる場合、二つの成分の結合を可能にするが、成分の機能性を損なわない適切な官能基が選択される。対象のリンカーは、コンジュゲート中の成分に極めて広く依存しうる。多くの実施態様では、リンカーは、存在するときには生物学的に不活性である。
【００４８】
リンカーは、検出可能な部分及び／又は化学ライゲーション基及び／又は切断可能な架橋成分の切断部位を特異的結合分子に結合させるため（又は切断不能な架橋成分の化学ライゲーション基を特異的結合部分に結合させるため）に使用することができる。異なる長さのリンカーを選択することができる。リンカーが利用される場合、コンジュゲートの二つの成分の結合を可能にするが、それらの機能性を損なわないような基を選択することができる。このような末端官能基には、例として、限定されないが、アミン、アルコール、チオール、ヒドラジド、カルボニル反応性基（例えばアルデヒド、酸及びエステル）、ビニルケトン、エポキシド、イソシアネート、マレイミド）、環化付加反応能、ジスルフィド結合の形成能、金属又は光反応性基への結合能を有する官能基が含まれる。特定の例には、一級及び二級アミン、ヒドロキサム酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル炭酸塩、オキシカルボニルイミダゾル、ニトロフェニルエステル、トリフルオロエチルエステル、グリシジルエーテル、ビニルスルホン、及びマレイミドが含まれる。これらの基は、特異的結合部分及び他の望ましい化合物へのカップリングを容易にする。いくつかの実施態様では、リンカーは、少なくとも約２５ダルトン、少なくとも約５０ダルトン、少なくとも約１００ダルトン、又は少なくとも約５００ダルトンである（又はそれを上回る）。第１のクラスのリンカーは、脂肪族化合物、例えば一又は複数の不飽和部位を有する脂肪族炭化水素鎖又はアルキル鎖であってよい。鎖の長さは様々でよいが、通常実用上限は３０原子である。約３０炭素原子を上回る鎖長は、それよりも短い鎖長を有する化合物より有効性が低いことが分かっている。したがって、脂肪族鎖リンカーは、通常約１炭素原子から約３０炭素原子の鎖長を有する。しかしながら、当業者であれば、特定のリンカーが３０を上回る原子を有する場合も、コンジュゲートが望ましく機能し、したがってそのような鎖長が本発明の範囲内であることを理解するであろう。
【００４９】
いくつかの実施態様では、リンカーは、非分枝鎖に二つを超える炭素原子を有する、アミノ−又はメルカプト−炭化水素といった、反応性基により官能化された直鎖又は分枝アルキル鎖である。その例には、アミノアルキル、アミノアルケニル及びアミノアルキニル基が含まれる。或いは、リンカーは、１０−２０の炭素長のアルキル鎖であり、Ｓｉ−Ｃ直接結合により又はエステル、Ｓｉ−Ｏ−Ｃ、連鎖により結合することができる（Ｆｏｏｔｅの米国特許第５６６１０２８号参照、言及により本明細書に包含）。他のリンカーが、利用可能であり、当業者に既知である（例えば、米国特許第５３０６５１８号、４７１１９５５号及び５７０７８０４号；すべて言及により本明細書に包含する）。
【００５０】
第２のクラスのリンカーは、アルキレンオキシドを含む。アルキレンオキシドは、エチレングリコールのようなグリコールを参照することにより本明細書に表される。当業者であれば、酸素原子の数が増加するにつれて、化合物の親水性も上昇することを理解するであろう。したがって、本発明のリンカーは通常、式（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）ｎを有し、式中、ｎは約２から約２０、具体的には約２から約１０、さらに一般的には約４から約８（ＰＥＧ４からＰＥＧ８と表すことができる）である。
【００５１】
本発明の特定の開示実施態様を実施するために有用な、ヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーなどのリンカーは、本出願人の同時係属出願に記載されており、それには、“Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”、米国特許出願第１１／４１３，７７８号（２００６年４月２８日出願）；“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”、米国特許出願第１２／３８１６３８号（２００９年３月１３日出願）；及び“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，”米国特許出願第１２／６８７５６４号（２０１０年１月１４日出願）、及び米国特許第７６９５９２９号（それらすべてを言及したことにより本明細書に包含する）が含まれる。上記出願に開示されたリンカーは、特異的結合部分、ビオチンリガーゼ、ビオチンリガーゼ基質、シグナル生成部分及びハプテンを望ましいすべての組み合わせのいずれかに結合させて本発明の開示実施態様に使用されるコンジュゲートを形成するために使用することができる。
【００５２】
リンカーの他の例には、限定されないが、天然及び非天然ポリペプチド、糖（炭水化物）、ヘテロ原子を含みうる環状系又は非環状系を含むペプチドが含まれる。リンカー基は、金属イオンの存在が二つ以上のリガンドを配位して複合体を形成するように金属に結合するリガンドを含むことができる。別の実施態様では、リンカーは、互いに対する高い親和性を有する一対の分子である。このような高親和性分子には、例えば、ストレプトアビジンとビオチン、ヒスチジンとニッケル（Ｎｉ）、及びＧＳＴとグルタチオンが含まれる。
【００５３】
特定の例示的リンカーには：エチレングリコール、ポリアルキレングリコール、例えばＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ１８、ＰＥＧ１９、ＰＥＧ２０、１，４−ジアミノヘキサン、キシリレンジアミン、テレフタル酸、３，６−ジオキサオクタン二酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸、１，１’−エチレンビス（５−オキソ−３−ピロリジンカルボン酸）、４，４’−エチレンジピペリジン、スクシンイミジル−６−ピドラジノ−ニコチンアミド（Ｓ−ＨｙＮｉｃ、ＨｙＮｉｃ−ＮＨＳ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−ホルミルベンゾエート（Ｓ−４ＦＢ、４−ＦＢ−ＮＨＳ）、マレイミドＨｙＮｉｃ（ＭＨＰＨ）、マレイミド４ＦＢ（ＭＴＦＢ）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−オクタエチレングリコール］エステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ８−ＮＨＳ）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ）、４−ＦＢ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ、アジドベンゾイル  ヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロミオンアミド）、ビス−スルホスクシンイミジル  スベレート、アジプイミド酸ジメチル、ジスクシンイミジルタートレート、Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド  エステル、Ｎ−ヒドロキシ  スルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、及びスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド  エステル（ＳＰＤＰ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド  エステル（ＳＭＣＣ）などが含まれる。
【００５４】
化学リンカーの代わりに、融合タンパク質を構築してもよい（例えば、ペプチドは遺伝子レベルで特異的結合分子にカップリングすることができる）。
【００５５】
核酸：ホスホジエステル結合を介して結合したヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然に存在する構造変異体、及び天然に存在しないその合成アナログ）からなるポリマー、関連する天然に存在するその構造変異体、及び天然に存在しないその合成アナログ。したがって、この用語には、ヌクレオチドとそれらの間の連鎖が天然に存在しない合成アナログ、例えば、限定しないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−ｏ−メチル  リボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）などの合成アナログを含むヌクレオチドポリマーが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成することができる。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（即ち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表わされるとき、これには、「Ｔ」が「Ｕ」で置き換えられているＲＮＡ配列（即ち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含まれると理解されよう。
【００５６】
ヌクレオチド：この用語には、限定されないが、糖に結合した塩基、例えばピリミジン、プリン又はその合成アナログ、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）と同様に、アミノ酸に結合した塩基が含まれる。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中の一つの単位である。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド中の塩基の配列を指す。
【００５７】
本明細書では、ヌクレオチド配列を説明するために一般的な概念が使用される：一本鎖ヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖ヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’〜３’付加の方向は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と呼ばれ；そのＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’〜５’末端に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と呼ばれ；ＲＮＡと同じ配列を有し、コード化ＲＮＡ転写物の３’〜３’末端であるＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と呼ばれる。
【００５８】
オリゴヌクレオチド：長さ５〜１００ヌクレオチド塩基の線状ポリヌクレオチド配列。
【００５９】
近接：二つの分子／標的／エピトープの間の質的又は量的距離；例えば、組織試料中における二つのタンパク質の間の距離に言及する。いくつかの実施態様では、互いに近接する分子は、互いから約１００ｎｍ、約７５ｎｍ、約５０ｎｍ、約３５ｎｍ、約３０ｎｍ、約２５ｎｍ、約２０ｎｍ、約１５ｎｍ、約１０ｎｍ、約５ｎｍ又はそれ未満以内にある。近接は、機能的関係も提供しうる。例えば、二つの標的（例えば、二つのタンパク質）は、第１の標的が、第１の標的に結合する成分が第２の標的に結合する成分に結合するのに第２の標的から十分な距離にある場合、近接していると考慮される。近接の別の機能的定義は、二つのタンパク質の二量体化である。近接の別の機能的定義は、遺伝子転座に関連している。ゲノムの二つの部分は、それらが互いに隣接しているか、又は互いに５０００００ｂｐ以内、１０００００ｂｐ以内、５００００ｂｐ以内、２５０００ｂｐ以内、１００００ｂｐ以内、若しくは１０００ｂｐ以内にあるとき、近接していると考慮される。これは、転座（別の染色体への移動又は反転）により近接していない二つの部分と対照をなす。近接という用語は、生物学的に有意な相互作用を可能にする分子間の距離という機能的意味も含む。例えば、生物学的有意性を有する、タンパク質ダイマー中の二つのタンパク質間の距離を、近接しているということができる。
【００６０】
試料：開示される特定の実施態様は生物学的試料を利用する。生物学的試料は、典型的には、ヒトなどの対象となる哺乳動物被検体から得られる。試料は、生検、剖検及び病理学標本由来の組織を含むがこれらに限定されない任意の試料とすることができる。生物学的試料には、組織の切片、例えば、組織学的目的で採取された凍結切片も含まれる。生物学的試料には、細胞培養物又は細胞培養物の部分、例えば、被検体から採取された生物学的試料から増殖させた細胞培養物も含まれる。
【００６１】
生物学的試料は、当技術分野で既知の任意の方法を用いて被検体から得ることができる。例えば、組織試料は、治療の一形態として腫瘍切除を受けた乳がん患者から得ることができる。これら患者から、腫瘍組織及び周囲の非がん性組織の両方を得ることができる。いくつかの実施態様では、コントロールとして使用される非がん性組織試料は死体から得られる。いくつかの実施態様では、生物学的試料は生検により得られる。生検試料は、新鮮であるか、凍結されたもの、又は固定されたもの、例えばホルマリン固定及びパラフィン包埋されたものとすることができる。試料は、患者から、外科的に、抽出により（例えば皮下針又は他の種類の針により）、顕微解剖により、レーザー捕獲により、又は当技術分野で既知の他のいずれかの手段により、除去することができる。
【００６２】
（一又は複数の）特異的結合部位：特異的結合対のメンバー。特異的結合対は、実質的に他の分子に結合することなく互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、結合対の二つのメンバーのいずれかの生物学的試料内の他の分子との結合定数より少なくとも１０３大きい、１０４大きい、又は１０５大きい結合定数を有しうる）。本明細書に開示される例示的コンジュゲートを作製するために使用される特異的結合部分は、標的に対する必要な結合親和性を呈する限りにおいて、様々に異なる種類の分子のいずれでもよい。
【００６３】
特異的結合部分は、小分子も大分子も含みうる。小分子は、約５０から約１００００ダルトン、典型的には約５０から約５０００ダルトン、さらに典型的には約１００から約１０００ダルトンのサイズにわたるであろう。大分子は、典型的には約１００００ダルトンを上回る分子量を有するものである。小分子は、任意の分子、典型的には必須の親和性で標的に結合することのできる有機分子でありうる。小分子は、典型的には、例えば疎水性、親水性、静電性又は共有結合性の相互作用により、標的と相互作用することを可能にする一又は複数の官能基を含む。標的がタンパク質、脂質又は核酸である場合、小分子は、典型的には、水素結合、疎水性−疎水性相互作用、静電性相互作用などの構造的相互作用を可能にする官能基を含むであろう。小分子リガンドは、多くの場合、アミン、アミド、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基を含み、好ましくはこれら官能基の少なくとも二つを含む。
【００６４】
小分子は、多くの場合、環式及び／又は複素環式非芳香性構造、及び／又は上記官能基のうちの一又は複数で置換された芳香性若しくはポリ芳香性構造を含む。また、有用な小分子は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログ又はこれらの組み合わせを含む、生体分子に見出される構造を含む。
【００６５】
小分子は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む、広範なソースから得られる天然に存在する化合物又は合成化合物に由来するものでもよい。例えば、無作為化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの調製を含め、広範な有機化合物及び生体分子の無作為及び指向性合成のために多数の方法が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、利用可能であるか、又は容易に生成される。加えて、天然の又は合成により生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段により容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを生成するために使用することができる。既知の小分子に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向性又は無作為化学修飾を施して構造的アナログを生成してもよい。
【００６６】
したがって、小分子は、コンビナトリアル手段により生成される化合物のライブラリー、即ち化合物多様性コンビナトリアルライブラリーを含む、天然に存在する分子又は合成分子のライブラリーから得られる。このようなライブラリーから得られるとき、用いられる小分子は、利便性の高い結合親和性アッセイにおける標的について何らかの望ましい親和性を示しているであろう。コンビナトリアルライブラリー、並びにそれらの生成及びスクリーニングのための方法は、当技術分野で既知であり、米国特許第５７４１７１３号及び同第５７３４０１８号に記載されている（これら特許文献の開示内容を、ここで言及することにより本明細書に包含する）。特異的結合部分に関するさらなる情報は、本出願人による米国特許第７６９５９２９号により提供される（この特許文献も、言及することにより本明細書に包含する）。特異的結合部分は、大分子を含みうる。大分子の特異的結合部分として特に興味深いのは、抗体、並びにその結合断片及び誘導体又は模倣物である。したがって、特異的結合部分は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でありうる。また、組み換え又は合成により生成された抗体断片又は誘導体も興味深く、これは例えば一本鎖抗体若しくはｓｃＦｖｓ、又はキメラ抗体若しくはＣＤＲ移植抗体といった他の抗体誘導体であり、このような組換え又は合成により生成された抗体断片は、上記抗体の結合特性を保持する。本発明のこのような抗体断片、誘導体又は模倣物は、任意の組み換え法、例えば米国特許第５８５１８２９号及び同第５９６５３７１号に開示される方法を用いて容易に調製することができる（これら特許文献の開示内容を、ここで言及することにより本明細書包含する）。
【００６７】
やはり大分子の特異的結合部分として使用するのに適しているのは、ポリ核酸アプタマーである。ポリ核酸アプタマーは、受容体又は抗体とほぼ同じように、選択的にタンパク質に結合するＲＮＡオリゴヌクレオチド（Conrad et al., Methods Enzymol. （1996）, 267（Combinatorial Chemistry）, 336-367）、又は特異的なＤＮＡ標的配列に相補的なＤＮＡオリゴマーである。
【００６８】
抗体ベースのペプチド／ポリペプチド又はタンパク質ベースの結合ドメインに加えて、特異的結合部分は、レクチン、可溶型細胞表面受容体若しくはその誘導体、アフィボディ又はファージディスプレイ若しくはリボソームディスプレイ若しくは任意の種類のコンビナトリアルペプチド若しくはタンパク質ライブラリーから組み換えにより得られた任意のタンパク質若しくはペプチドでもよい。任意の特異的結合部分の組み合わせも使用できる。
【００６９】
重要なのは、特異的結合部分が、特異的結合部分のその標的に対する結合親和性に実質的に影響することなく、コンジュゲートの第２の成分又はリンカーに対するカップリングを可能にするものであるということである。
【００７０】
特異的結合部分の特定の例には、特異的に結合するタンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジン、及びプロテインＡ）が含まれる。（一又は複数の）特異的結合部分には、そのような特異的に結合するタンパク質によって結合される分子（又はその部分）も含まれる。
【００７１】
標的：その存在、位置及び／又は濃度が決定される又は決定されうる任意の分子。標的分子の例には、タンパク質及び、タンパク質に共有結合的に結合するハプテンのようなハプテンが含まれる。標的分子は、典型的には、特異的結合分子の一又は複数のコンジュゲート、並びに及び検出可能な標識を用いて検出される。特異的標的の例には、タンパク質、糖（炭水化物）、又は核酸分子が含まれる。標的核酸分子には、その近接性、再構成、増殖、欠失、検出、定量化、定性的検出、又はこれらの組み合わせが求められる分子が含まれる。例えば、標的は、核酸分子の規定領域又は特定の部分、例えばゲノムの一部分（例えば目的の遺伝子又は遺伝子を含有するＤＮＡ若しくはＲＮＡの一領域（或いはその一部））とすることができる。核酸分子は精製された形態でなくともよい。他の様々な核酸分子が標的核酸分子と共に存在してもよい。例えば、標的核酸分子は特異的核酸分子とすることができ（ＲＮＡ又はＤＮＡを含みうる）、その少なくとも一部の増殖（例えばゲノム配列又はＤＮＡ配列の一部）が目的とされる。いくつかの実施例では、標的核酸には、ウイルス核酸分子、又は細菌核酸分子、例えば大腸菌若しくはコレラ菌由来の核酸分子が含まれる。必要に応じて、当技術分野で既知の方法により、例えば市販の精製キットなどを用いることにより、標的核酸分子の精製又は単離を行うことができる。
【００７２】
チラミドシグナルの増幅：ペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）の触媒活性を利用してｉｎ  ｓｉｔｕで標的分子（例えばタンパク質又は核酸配列）の高密度標識を生成する酵素媒介検出法。ＴＳＡは、典型的には三つの工程を有する：（１）特異的結合メンバー（例えば、抗体）を標的へ結合させた後、第２のペルオキシダーゼ標識特異的結合メンバーを用いて特異的結合メンバーの二次検出を行う工程；（２）標識されたチラミド誘導体（例えば、ハプテン標識されたチラミド）の複数のコピーをペルオキシダーゼにより活性化する工程；及び（３）その結果得られた高度に反応性のチラミド基を、ペルオキシダーゼ−標的相互作用部位に近接する残基（例えば、タンパク質チロシン残基のフェノール部分）に共有結合させることにより、標的の近位にハプテンを堆積させる（拡散及び反応性媒介性）工程。ＴＳＡのいくつかの例では、これよりも多い又は少ない工程が用いられる；例えば、ＴＳＡ法はシグナルを増大させるために連続的に繰り返すことができる。ＴＳＡ実施方法及びＴＳＡを実施するための市販のキット及び試薬が利用可能である（例えば、VENTANA Amplification Kit, Cat. No. 760-080, AmpMap Detection Kit with TSATM, Cat. No. 760-121, Ventana Medical Systems、Tucson, AZ; Invitrogen; kit No. T-20911, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA参照）。いくつかの実施態様では、ＴＳＡは提供されたＰＴＤＭの一構成要素である。他の酵素触媒作用ハプテン又はシグナル伝達結合反応種を、利用可能であれば代替的に使用することができる。ＴＳＡの適切な条件並びにチラミドシグナル増幅のために使用される試薬及びキットが、当業者には既知である（例えば、Bobrow et al., J. Immuno. Meth., 125:279-285, 1989参照）。
【００７３】
〜に十分な条件下において：所望の活性を可能にする任意の環境を説明するために使用される文言。
【００７４】
ＩＩ．実施態様の記載
ここで図１〜２８を参照する。本発明は、対象とする二つの標的が近接しているかどうかを（ｉｎ  ｓｉｔｕで）検出するための近接アッセイ法を主題とする。本発明の方法は、共有結合の形成を特徴とする。本発明の方法は、発色性及び発蛍光性検出システムの両方に適合する。本発明の方法は手動で実施することができるか、又は方法を自動化することができる（例えば、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ  ＸＴ、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺといった自動染色装置を用いて）か、又はそれらを組み合わせることができる。例えば、アッセイは、自動化することができるが、ユーザが試薬を添加する一又は複数の手動工程を含むことができる。本発明をいずれかの理論又は機構に限定するものではないが、本発明の方法に用いられる構成要素のすべて又は殆どは、容易に入手可能且つ安価な一般的化学試薬である。さらに、アッセイに用いられるコンジュゲートの合成も、単純及び／又は高収率（抗体のハプテン標識同様）である。
【００７５】
本発明の方法は、複数の近接事象（例えば、二つ、三つ、四つなど）が同じスライド上に検出される多重アッセイを実施するために使用することもできる。また他の実施態様では、一又は複数の近接アッセイは、単一のアッセイで多重化することができる（例えば、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３ダイマーの近接アッセイを、ＥＲ、ＰＲ、Ｋｉ−６７タンパク質又はＨＥＲ２  ＤＩＳＨ遺伝子アッセイで多重化）。
【００７６】
本発明の方法は、切断可能な架橋成分（コンジュゲートＡ）とコンジュゲートした特異的結合部分（例えば、抗体）、並びに切断不能な架橋成分（コンジュゲートＢ）とコンジュゲートした他の特異的結合部分（例えば、抗体）の使用を特徴とする。切断可能な架橋成分は、検出可能な部分（例えば、ハプテン）と、切断部位及びその末端の又は末端近傍の化学ライゲーション基とを含む。切断不能な架橋成分は、その末端に又は末端近傍に化学ライゲーション基を含む。図３は、対象の標的に結合した一次抗体を特異的に認識して結合する例示的コンジュゲート（コンジュゲートＡ、コンジュゲートＢ）を示している。或いは、コンジュゲートは、対象の標的に直接結合することができる。例えば、コンジュゲートは、一次抗体を用いて作製されうる。同様に、コンジュゲートは、三次又は四次検出スタックに含まれてもよい。例示的コンジュゲートは、抗種抗体又は抗ハプテン抗体を含むことができる。コンジュゲートは、外部刺激（例えば、触媒又はＵＶ光、脱保護条件などの他のメカニズム）に供され、二つのコンジュゲート（コンジュゲートＡ、コンジュゲートＢ）が近接している場合には二つの抗体にコンジュゲートした架橋成分の間に、化学ライゲーション基を介して共有結合が形成される。その後、切断可能な架橋成分が切断部位で切断され、結合した架橋成分は切断不能な架橋成分を有する抗体にのみ結合している状態となる。洗浄工程に続き、検出可能な部分は、免疫組織化学システム又は蛍光システム（又は他の適切な検出システム）といった検出システムにより検出することができる。コンジュゲート（コンジュゲートＡ、コンジュゲートＢ）が近接していない場合、共有結合は二つの架橋成分間に形成されず、切断反応が生じると、切断可能な架橋成分（検出可能な部分を有する）は結合部分から切断され、洗浄工程後、検出システムでは検出不能となる。したがって、検出可能な部分の検出は、対象の二つの標的の近接性を示す。
【００７７】
いくつかの実施態様では、検出可能な部分の検出は、標的間の距離が４０ｎｍ以下であることを示す。いくつかの実施態様では、検出可能な部分の検出は、標的間の距離が３５ｎｍ以下であることを示す。いくつかの実施態様では、検出可能な部分の検出は、標的間の距離が３０ｎｍ以下であることを示す。いくつかの実施態様では、検出可能な部分の検出は、標的間の距離が２５ｎｍ以下であることを示す。いくつかの実施態様では、検出可能な部分の検出は、標的間の距離が１５ｎｍ以下であることを示す。いくつかの実施態様では、検出可能な部分の検出は、標的間の距離が１０ｎｍ以下であることを示す。いくつかの実施態様では、検出可能な部分の検出は、標的間の距離が５ｎｍ以下であることを示す。いくつかの実施態様では、検出可能な部分の検出は、標的間の距離が２ｎｍ以下であることを示す。本発明の一態様は、近接アッセイを用いて検出できる距離が、特定の標的の組のために調節できることである。例えば、リンカー又は架橋の長さを変化させることにより、検出スタックの手法を変更することにより（例えばコンジュゲートを一次、二次、三次、又は四次検出分子とする）、又は検出スタック内においてハプテン−チラミド増幅工程を使用することにより、本明細書の方法と試薬を用いて検出できる距離は特定用途のために必要に応じて変更することができる。
【００７８】
本発明において使用されるケミストリー（例えば、二つの架橋成分間における共有結合形成のために）は、生体直交性である（例えば、非摂動型でもなく又は生物学的系によっても摂動されない）。即ち、コンジュゲート間における共有結合を形成する条件は、天然でなく、したがって自然に又は非特異的に生じない。本発明は、本明細書に記載されるケミストリーに限定されない（Patterson et al., ACS Chemical Biology 2014, 9, 592-605, see also Xiang et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 2190-2193における生体直交性反応の他の例を参照のこと）。
【００７９】
例示的実施態様では、試料中において第２の標的に近接して位置する第１の標的を検出する方法は、切断可能な架橋成分を含む第１のコンジュゲートで第１の標的を標識することであって、切断可能な架橋成分が、切断部位、検出可能な部分、及び第１の化学ライゲーション基を含む、標識すること、切断不能な架橋成分を含む第２のコンジュゲートで第２の標的を標識することであって、切断不能な架橋成分が第２の化学ライゲーション基を含む、標識すること、第１の標的と第２の標的が近接しているところに共有結合が形成可能となるように第１の化学ライゲーション基又は第２の化学ライゲーション基を活性化すること、検出可能な部分を第１の標的部位から切断すること、試料を洗浄して未結合の検出可能な部分を除去すること、並びに検出可能な可視部分を検出することを含む。
【００８０】
コンジュゲートＡ及び切断可能な架橋成分
抗体などの分子は、少なくとも一つの切断可能な架橋成分で修飾される。図１Ａ及び図１Ｂは、切断可能な架橋成分の模式的構造を示す。切断可能な架橋成分は、切断部位、検出可能な部分／ハプテン、及び化学ライゲーション基（ＣＬ）を含む。切断部位は、検出可能な部分／ハプテン又は化学ライゲーション基より、抗体に近接して位置している。化学ライゲーション基は、切断可能な架橋成分の末端に又は末端近傍に位置している。
【００８１】
いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも二つの切断可能な架橋成分で修飾される。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも三つの切断可能な架橋成分で修飾される。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも四つの切断可能な架橋成分で修飾される。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも五つの切断可能な架橋成分で修飾される。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも１０（以上）の切断可能な架橋成分で修飾される。
【００８２】
切断可能な架橋成分の化学ライゲーション基（並びに切断不能な架橋成分の化学ライゲーション基）は、生体直交性、例えば不活性であり、生理的条件下で安定である。しかしながら、適切な条件下（外部刺激）では、二つの成分の化学ライゲーション基は容易に共有結合を形成する。
【００８３】
典型的には、外部刺激に際して、切断可能な架橋成分の化学ライゲーション基と切断不能な架橋成分の化学ライゲーション基とは三時間未満で共有結合を形成することができる。いくつかの実施態様では、外部刺激に際して、化学ライゲーション基は、二時間未満で共有結合を形成することができる。いくつかの実施態様では、外部刺激に際して、化学ライゲーション基は、一時間未満で共有結合を形成することができる。いくつかの実施態様では、外部刺激に際して、化学ライゲーション基は、３０分未満で共有結合を形成することができる。
【００８４】
化学ライゲーション基（ＣＬ）の非限定的な例を図２に示す。例えば、化学ライゲーション基は、アジド
2017536548.tif 000003
、チオエステル（式（Ｉ）参照）、窒素含有（例えば、テトラゾール）環（式（ＩＩ））、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、アルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）、ハロゲン基（例えば、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）、又はその他いずれかの適切な化学ライゲーション基を含みうる。また、図２は、二つの潜在的な化学ライゲーション基の間に共有結合の形成（図の右側に示される）を開始させうる条件（例えば、Ｃｕ（Ｉ）、光、ヒドラジン）を示している。
2017536548.tif 000004
【００８５】
他の実施態様では、化学ライゲーションは、酵素的に開始させることができる。例えば、チラミン又はキノンメチド前駆体を、近接する酵素と相互作用して反応性腫を形成する化学ライゲーション基として使用することができる。反応性種は、利用可能な反応性部分（例えば、アミン又はチオール基）との結合を形成して、チラミンと利用可能な反応性基との間に共有結合を形成する。
【００８６】
切断可能な架橋成分の切断部位は、いずれかの適切な切断部位を含みうる。一般に知られている切断部位には、限定されないが、ジスルフィド結合、ジオール、ニトロフェニル誘導体などが含まれる。ジスルフィド結合切断部位（Ｓ−Ｓ）を図４の模式図に示す（上部）。ジスルフィド結合切断部位は、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）など、又はこれらの組み合わせによって切断することができる。ジオール、具体的にはビシナルジオール、切断部位は、例えば、によって（ＮａＩＯ４によって）切断することができる。同様に、ビシナルヒドロキシルアミンは同様に切断することができる。ニトロフェニル−誘導体切断部位は、例えば、紫外線照射により切断することができる。本発明は、上記切断部位及び切断誘導因子／触媒に限定されない。
【００８７】
検出可能な部分（例えば、ハプテン）は、いずれかの適切な小分子の非内因性化合物、ペプチドタグ、オリゴヌクレオチドなどでよい。図４に示される分子は、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡタグ）ペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号１）を含む検出可能な部分を特徴とする。ここで、ＨＡペプチドは、切断部位（ジスルフィド結合）と化学ライゲーション基（アジド（Ｎ３））、ＣＬ−ａを接続するための足場としても機能する。パートナー抗体は、切断不能なＣＬ−ｂとしての末端アルキン基で修飾され、コンジュゲートＢを提供する。
【００８８】
他の分子を、検出可能な部分として使用してもよい。例えば、一般的に使用されるペプチドハプテンには、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号２）、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号３）、Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号４）、Ｅタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号５）、及びＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号６が含まれる。
【００８９】
本発明をいずれかの理論又は機構に限定するものではないが、ペプチドは、市販されており、三機能性分子内の足場としても機能しうるため、検出可能な部分／ハプテンとして使用することができる。図５は、足場としてリジンを有する切断可能な架橋成分（三機能性分子）の別の例を示す。
【００９０】
図７は、抗体及び切断可能な架橋成分を含むコンジュゲート（コンジュゲートＡ）の合成を示す。ＳＰＤＰ−ｄＰＥＧ８−ＮＨＳ  エステル（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、Ｌｔｄ．，Ｐｌａｉｎ  Ｃｉｔｙ，ＯＨ）（式（ＩＩＩ）参照）が、ヤギ抗ウサギ抗体にコンジュゲートされた。
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【００９１】
例えば、ＳＰＤＰ−ＰＥＧ８−ＮＨＳエステルの２０〜３０の等価物を用いて、少なくとも２時間のあいだ反応を室温に維持し、修飾された抗体を、ＺＥＢＡスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて精製し、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）で溶出した。次いで修飾された抗体を、ヘマグルチニン（ＨＡ）検出可能な部分及びアジド化学ライゲーション基を含む、ペプチドＣｙｓ−ＨＡ−Ｎ３（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）（式（ＩＶ）参照）の〜１０の等価物で処理し、室温で一晩インキュベートした。
2017536548.tif 000006
【００９２】
最後のコンジュゲートＧＡＲ−ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３（コンジュゲートＡ）は、ＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ａ）上においてＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより精製され、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．２）で溶出された。典型的なクロマトグラムを図８に示す。溶出の最後のピークは、Ｃｙｓ−ペプチドのＳＰＤＰ標識抗体へのコンジュゲーションの結果としての２−ピリジンチオン（Ｅ３４３ｎｍ〜８０００ｃｍ−１Ｍ−１）の存在を示す。図７のこのコンジュゲートＡは、ジスルフィドの切断可能な結合、ＨＡタグ検出可能部分、及びアジド化学ライゲーション基を含む。
【００９３】
修飾された特異的結合分子（コンジュゲートＡ、Ｂ）を構築するために様々な方法があり、本発明は本明細書に記載されるものに限定されない。いくつかの実施態様では、切断可能なリンカー（切断部位）は、ペプチドの抗体へのコンジュゲーションに際して形成される（ペプチドがＳＰＤＰ修飾された抗体にコンジュゲートしている図７参照）。或いは、抗体は、三つの機能性（切断可能なリンカー／切断部位、化学ライゲーション基、検出可能な部分）のすべてを既に含んでいる分子で直接修飾することができる（例えば、図５参照）。当業者は、様々な又は同時的な段階において分子に機能性が追加される別の合成メカニズムを使用することができるである。
【００９４】
コンジュゲートＢ及び切断不能な架橋成分
抗体などの分子は、切断不能な架橋成分で修飾される。図１Ｃは、切断不能な架橋成分（三機能性分子）の模式的構造を示している。切断不能な架橋成分は、その末端に又は末端近傍に化学ライゲーション基（ＣＬ）を含む。
【００９５】
いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも二つの切断不能な架橋成分で修飾される。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも三つの切断不能な架橋成分で修飾される。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも四つの切断不能な架橋成分で修飾される。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも五つの切断不能な架橋成分で修飾される。いくつかの実施態様では、抗体は、少なくとも１０（以上）の切断不能な架橋成分で修飾される。
【００９６】
上述のように、切断不能な架橋成分の化学ライゲーション基（並びに切断可能な架橋成分の化学ライゲーション基）は、生体直交性、例えば不活性であり、生理的条件下で安定である。しかしながら、適切な条件下（外部刺激）では、二つの架橋成分の化学ライゲーション基は容易に共有結合を形成する。
【００９７】
上述のように、化学ライゲーション基（ＣＬ）の非限定的な例が図２に示されている。例えば、化学ライゲーション基は、アジド
2017536548.tif 000007
、チオエステル（上記式（Ｉ）参照）、テトラゾール環（上記式（ＩＩ）参照）、アルキン基（ＲＣ≡ＣＨ）、ハロゲン基（−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）、アルケン基（ＲＣ＝ＣＨ２）、又は他のいずれかの適切な化学ライゲーション基を含みうる。また、図２は、二つの潜在的な化学ライゲーション基の間に共有結合の形成（図の右側に示される）を開始させうる条件（例えば、Ｃｕ（Ｉ）、光、ヒドラジン）を示している。図４の例（下部）は、化学ライゲーション基（ＣＬ−ｂ）として末端アルキン基を含む切断不能な結合成分で修飾された抗体を示す。
【００９８】
コンジュゲートＢ（抗体と切断不能な架橋成分を含む）の合成の非限定的な例について本明細書に記載する：ＰＢＳ中のヤギ抗マウス（ＧＡＭ）又はヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）を、アルキン−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）の１５〜３０の等価物で処理し（式（Ｖ）参照）、室温で少なくとも二時間インキュベートした。
2017536548.tif 000008
【００９９】
修飾された抗体は、ＺＥＢＡスピンカラムを用いて精製され、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．２）中で溶出されて、ＧＡＭ−ＰＥＧ４−ＣＣＨ  ｏｒ  ＧＡＲ−ＰＥＧ４−ＣＣＨを提供する。
【０１００】
上述のように、いずれかの適切な外部刺激を加えてコンジュゲートの化学ライゲーション基間に共有結合を確立することができる。例えば、いくつかの実施態様では、図４に示すコンジュゲートは銅（Ｉ）で処理され、それによりアルキンのアジドへのヒスゲン  １，３−双極子付加環化が触媒されて１，４−二置換−１，２，３−トリアゾールが形成される。いくつかの実施態様では、Ｃｕ（Ｉ）を用いる反応にリガンドが使用される。一例は、トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾールイルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又はＣｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ）（式（ＶＩ）参照）である。
2017536548.tif 000009
【０１０１】
本発明の抗体は、バックグラウンドシグナルを防止するために、互いに結合しないか、又は互いに凝集しないように選択される。
【０１０２】
本発明をいずれかの理論又は機構に限定するものではないが、切断可能なリンカーの設計により、アッセイの二つの主要な工程の分離が可能になる：化学ライゲーション基は、生理的条件下で安定であり、切断不能なリンカーのパートナー化学ライゲーション基と、適切な外部刺激の際にのみ反応する。また、切断部位は、後続の別個の工程の間に切断可能なリンカーの切断を可能にする。
【０１０３】
検出可能な部分
包括的ではないが、国際公開第２０１２０２４１８５号（言及によりその全体を本明細書に包含する）は、現在利用可能な色素原及びハプテンに関する開示を提供している。検出可能な標識の実施態様には、ハプテン、例えばピラゾール、特にニトロピラゾール；ニトロフェニル化合物；ベンゾフラザン；トリテルペン；尿素及びチオウレア、特にフェニル尿素、及び具体的にはフェニルチオウレア；ロテノン及びロテノン誘導体（本明細書ではロテノイドともいう）；オキサゾール及びチアゾール、特にオキサゾール及びチアゾールスルホンアミド；クマリン及びクマリン誘導体；ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体により例示される、シクロリグナン；並びにこれらの組み合わせが含まれる。ハプテンの実施態様及びその調製のための方法は、米国特許第７６９５９２９号（言及によりその全体を本明細書に包含する）に開示されている。
【０１０４】
例示的ハプテンには、限定されないが、ＢＤ（ベンゾジアゼピン）、ＢＦ（ベンゾフラザン）、ＤＡＢＳＹＬ（４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド）、ＤＣＣ（７−（ジエチルアミノ）クマリン−３−カルボン酸）、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、ＤＮＰ（ジニトロフェニル）、ＨＱ（３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルバミド）ＮＣＡ（ニトロケイ皮酸）、ＮＰ（ニトロピラゾール）、ＰＰＴ（ポドフィロトキシン）、Ｒｈｏｄ（ローダミン）、ＲＯＴ（ロテノン）、及びＴＳ（チアゾールスルホンアミド）が含まれる。他の適切なハプテンには、ビオチン及びフルオレセイン誘導体（ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、テキサスレッドなど）が含まれる。
【０１０５】
適切な発色団には、クマリン及びクマリン誘導体が含まれる。例示的なクマリンベースの発色団には、ＤＣＣ及び２，３，６，７−テトラヒドロ−１１−オキソ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−［１］ベンゾピラノ［６，７，８−ｉｊ］キノリジン−１０−カルボン酸が含まれる。使用に適した別のクラスの発色部分には、ジアゾ含有色素原、例えば、約４３６ｎｍのλｍａｘを有するＤＡＢＳＹＬ、及び約４２７ｎｍのλｍａｘを有するタートラジンが含まれる。
【０１０６】
また他の実施態様では、発色団は、トリアリールメタン化合物である。例示的トリアリールメタン発色団は以下のように提供される：
2017536548.tif 000010
【０１０７】
例示的なアニュレーテッド（annulated）発色団には、限定されないが：
2017536548.tif 000011
その他のローダミン誘導体、例えばテトラメチルローダミン（ＴＭＲ、ＴＡＭＲＡ、及び反応性イソチオシアネート誘導体を含む）、並びにジアリールローダミン誘導体、例えばＱＳＹ  ７、ＱＳＹ  ９、及びＱＳＹ  ２１染料が含まれる。
【０１０８】
他の例示的な検出可能標識には、レゾルフィン、ＤＡＢ；ＡＥＣ；ＣＮ；ＢＣＩＰ／ＮＢＴ；ファストレッド；ファストブルー；フクシン；ＮＢＴ；ＡＬＫ  ＧＯＬＤ；カスケードブルーアセチルアジド；Ｄａｐｏｘｙｌスルホン酸／カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹ−４０５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５スクシンイミジルエステル；カスケードイエロースクシンイミジルエステル；ピリジルオキサゾールスクシンイミジルエステル（ＰｙＭＰＯ）；Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅスクシンイミジルエステル；ＤＹ−４１５；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹＱ−４２５；６−ＦＡＭホスホラミダイト；Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ；ヨードアセトアミド；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０スクシンイミジルエステル；ダブシルスクシンイミジルエステル；ＮＢＤクロライド／フルオライド；ＱＳＹ  ３５スクシンイミジルエステル；ＤＹ−４８５ＸＬ；Ｃｙ２スクシンイミジルエステル；ＤＹ−４９０；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８カルボン酸スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ−４８０ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｃ５スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹＱ−５０５；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５１０ＸＬ；ＤＹ−４８１ＸＬ；６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン  スクシンイミジルエステル（ＪＯＥ）；ＤＹ−５２０ＸＬ；ＤＹ−５２１ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ  Ｃ３スクシンイミジルエステル；エリスロシンイソチオシアネート；５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン  スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２スクシンイミジルエステル；６−カルボキシ−２’，４，４’，５’７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン  スクシンイミジルエステル（ＨＥＸ）；ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５３０；ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹ−５５５；ＤＹＱ−１；ＤＹ−５５６；Ｃｙ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５４７；ＤＹ−５４９；ＤＹ−５５０；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５４８；ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８Ｃ３スクシンイミジルエステル；ローダミンレッド−Ｘスクシンイミジルエステル；ＱＳＹ  ７スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９Ｃ３スクシンイミジルエステル；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５９０；ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ−５９１；ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘスクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４スクシンイミジルエステ���；ＤＹ−５９４；カルボキシナフトフルオレセイン  スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６０５；ＤＹ−６１０；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６１５；ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０−Ｘスクシンイミジルエステル；ブリリアントブルー（ｅｒｉｏｇｌａｕｃｉｎｅ）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５スクシンイミジルエステル，；ＤＹ−６３４；ＤＹ−６３０；ＤＹ−６３１；ＤＹ−６３２；ＤＹ−６３３；ＤＹＱ−２；ＤＹ−６３６；ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５−Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹ−６３５；Ｃｙ５スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６４７；ＤＹ−６４８；ＤＹ−６５０；ＤＹ−６５４；ＤＹ−６５２；ＤＹ−６４９；ＤＹ−６５１；ＤＹＱ−６６０；ＤＹＱ−６６１；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０スクシンイミジルエステル；Ｃｙ５．５スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６７７；ＤＹ−６７５；ＤＹ−６７６；ＤＹ−６７８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０スクシンイミジルエステル；ＤＹ−６７９；ＤＹ−６８０；ＤＹ−６８２；ＤＹ−６８１；ＤＹＱ−３；ＤＹＱ−７００；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００スクシンイミジルエステル；ＤＹ−７０３；ＤＹ−７０１；ＤＹ−７０４；ＤＹ−７００；ＤＹ−７３０；ＤＹ−７３１；ＤＹ−７３２；ＤＹ−７３４；ＤＹ−７５０；Ｃｙ７スクシンイミジルエステル；ＤＹ−７４９；ＤＹＱ−４；及びＣｙ７．５スクシンイミジルエステルが含まれる。
【実施例】
【０１０９】
実施例１
実施例１は、本発明のアッセイに使用される抗体の非限定的な例を記載する。
【０１１０】
試薬抗ＨＡ抗体：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のマウスモノクローナル抗ＨＡ−ビオチン抗体（クローンＨＡ−７）（Ｂ９１８３−１００ＵＧ）。
【０１１１】
近接アッセイに使用される一次抗体：抗Ｅ−カドヘリンウサギモノクローナル抗体、クローンＥＰ７００Ｙ（Ｖｅｎｔａｎａ７６０−４４４０）、抗Ｅ−カドヘリンマウスモノクローナル抗体クローン３６（Ｖｅｎｔａｎａ７９０−４４９７）、抗ベータカテニンマウスモノクローナル抗体クローン１４（Ｖｅｎｔａｎａ７６０−４２４２）、抗ｐ１２０カテニンマウスモノクローナル抗体クローン９８（Ｖｅｎｔａｎａ７９０−４５１７）、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕウサギモノクローナル抗体クローン４Ｂ５（Ｖｅｎｔａｎａ７９０−２９９１）、抗ＰＲウサギモノクローナル抗体クローン１Ｅ２（Ｖｅｎｔａｎａ７９０−２２２３）、抗ＣＤ２１ウサギモノクローナル抗体クローンＥＰ３０９３（Ｖｅｎｔａｎａ７６０−４４３８）、抗ＣＤ２１マウスモノクローナル抗体クローン２Ｇ９（Ｖｅｎｔａｎａ７６０−４２４５）、抗ＰＭＳ２ウサギｍＡｂクローンＥＰＲ３９４７（Ｖｅｎｔａｎａ７６０−４５３１）、抗ＭＬＨ１マウスｍＡｂクローンＭ１（Ｖｅｎｔａｎａ７９０−４５３５）、抗ＣＤ１９マウスモノクローナル抗体クローンＬＥ−ＣＤ１９（ＧｅｎｅＴｅｘ，Ｉｎｃ．  Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、抗ホスホ−チロシンマウスｍＡｂクローンＰ−Ｔｙｒ−１００及び抗ユビキチンマウスｍＡｂクローンＰ４Ｄ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，Ａ）。
【０１１２】
実施例２
実施例２は、ＩＨＣを用いた、図７の分子（ＧＡＲ−ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３）中の検出可能な部分／ハプテンとしてのＨＡペプチドの存在の検出について記載する。扁桃腺組織中のＫｉ６７の検出を、抗Ｋｉ−６７（３０−９）ウサギモノクローナル抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  ７９０−４２８６）を一次抗体として、ＧＡＲ−ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３を二次抗体としてそれぞれ使用し、続いてｘＨＡ−ビオチン、ＳＡ−ＨＲＰ及びＤＡＢ染色（図９参照）を行うことにより実証した。標的の強力かつ特異的な染色が達成され、したがってＧＡＲコンジュゲート中においてハプテンとしてのＨＡタグの存在が確認される。
【０１１３】
実施例３
実施例３は、組織からＨＡタグを完全に切断するための条件を決定するための実験について記載する。
【０１１４】
この特定の実施例において、近接アッセイの読み出しは、ハプテンとしてのＨＡタグの検出に基づくため、非近接タンパク質に結合した抗体からＨＡタグを完全に切断する能力は、アッセイ全体の成功にとって重要である。残りの切断されないＨＡタグはバックグランドシグナルを生成しうる。これは、低発現近接事象にとって、又は増幅スキームが適合されるときに、重大な問題となりうる。この実施例によれば、ジスルフィドが切断可能なリンカーとして用いられ、したがって還元剤（例えば、ＤＴＴ又はＴＣＥＰ）を用いて切断される。完全な切断を達成するために十分な条件を決定するために、扁桃腺のＫｉ６７及び皮膚のＥ−カドヘリンといった既知の大量の標的の検出を、チラミド−ハプテン（例えば、ＨＱ）増幅と組み合わせて試験した。完全な切断が達成された場合（切断後に染色なし）、条件を十分と同定した。コンジュゲートの構造は修飾されていなかったため、これら条件は、この特定のコンジュゲートを用いる殆どのアッセイに適用可能と理解された。図１１は、完全な切断のための条件を決定するために使用されたスキームを示す。
【０１１５】
図１２Ａ〜図１２Ｄと図１３Ａ及び図１３Ｂに示すように、切断は、Ｋｉ−６７については７５ｍＭのＤＴＴ、及びＥ−カドヘリンについては５０ｍＭのＤＴＴによる処理で完了する（ＤＴＴ濃度は、添加された濃度の通常１／３または１／４である組織上の有効濃度ではなく、各スライドに添加される１００μＬ溶液である）。したがって、インキュベーション時間が２４分である場合の２０から２５ｍＭのＤＴＴ有効濃度が、本発明のアッセイ形式に十分であると決定される。
【０１１６】
実施例４
ＧＡＭ−ＰＥＧ４−ＣＣＨ中のアセチレン基の存在の確認
ここで図１４を参照する。ＧＡＭ−ＰＥＧ４−ＣＣＨのコンジュゲート中における反応性アセチレン基の存在を、ビオチン−ＰＥＧ７−Ｎ３（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）とのｉｎ  ｓｉｔｕクリック反応を実施することにより実証した。具体的には、ＦＦＰＥ扁桃腺切片を、ＥＺ  Ｐｒｅｐ溶液（Ｖｅｎｔａｎａ）によりまず脱パラフィンし、反応バッファーで洗浄した。マウス−抗ＣＤ２０一次抗体（クローンＬ２６，Ｖｅｎｔａｎａ７６０−２５３１）を切片に加え、３７℃で１６分インキュベートした。反応バッファーでの洗浄後、１０μｇ／ｍｌのＧＡＭ−ＰＥＧ４−ＣＣＨを１００μＬ加え、３７℃で１６分インキュベートし、続いて完全洗浄した。次いで、切片に対し、二つの異なるリガンド（ＴＨＰＴＡ）濃度で、１ｍＭのビオチン−ＰＥＧ７−Ｎ３、０．６ｍＭのＣｕＳＯ４、２０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム１００μＬを加えた。室温で３２分のインキュベーション後、スライドを完全に洗浄した。ビオチンの検出は、ＳＡ−ＨＲＰ及びＤＡＢ色素原を用いることにより達成された。添付図面に示すように、ＣＤ２０の特異的検出は、Ｃｕを加えたときにのみ達成された。Ｃｕを省いたときには染色はまったく観察できなかった。この結果は、ＧＡＭコンジュゲート中における反応性アセチレンの機能性の存在を示すものであった。図１４Ａ〜図１４Ｃは、扁桃腺切片におけるＣＤ２０の検出を示す顕微鏡写真であり、Ｃｕ（Ｉ）／Ｌ比の影響とそれに伴う染色を示している。図１４Ａは１：５の比のＣｕ（Ｉ）／Ｌ比を、図１４Ｂは１：３のＣｕ（Ｉ）／Ｌ比を、及び図１４ＣはＣｕ（Ｉ）を加えていないコントロールを、それぞれ示している。ＧＡＭ−ＰＥＧ４−ＣＣＨのコンジュゲート中に反応性アセチレン基を使用した（実施例３参照）。Ｃｕ（Ｉ）を加えたときにＣＤ２０の特異的検出が達成された。Ｃｕを省いたときに染色は観察されなかった。これは、ＧＡＭコンジュゲート中における反応性アセチレンの機能性の存在を示す。
【０１１７】
実施例５
実施例５は、本発明の方法を用いた実験について記載する。
【０１１８】
近接アッセイの実験手順
特に断らない限り、他のソースが明記されていないすべての抗体、及びＩＨＣ試薬は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ；“Ｖｅｎｔａｎａ”）から入手したものであった。ＩＨＣ染色は、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ自動スライド処理システム（Ｖｅｎｔａｎａ）において実施した。すべての  ＩＨＣ染色について、ＦＦＰＥ切片を、ＥＺ  Ｐｒｅｐ溶液（Ｖｅｎｔａｎａ）によりまず脱パラフィンし、反応バッファーで洗浄した。抗原検索を、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  １（Ｖｅｎｔａｎａ）（１００℃；９２分）において実行し、１ｘ反応バッファー（Ｖｅｎｔａｎａ）再度で再度洗浄した。対象の標的に対する一次抗体をスライドに加え、３７Ｃで３２分インキュベートした（試験した抗体対の結果を参照）。反応バッファーで完全に洗浄した後、ＧＡＲ−ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３及びＧＡＭ−ＰＥＧ４−ＣＣＨの二次抗体コンジュゲート（それぞれ０μｇ／ｍＬで１００μＬ）をスライドに加え、３７℃で３２分インキュベートした。スライドを反応バッファーと水で洗浄した後、１００μＬのＨＥＰＥＳバッファー（０．１５Ｍ、ｐＨ７．４）を滴下によりスライドに加えた。アジド−アセチレンのクリック反応を開始させるために、１００μＬのＣｕ（Ｉ）触媒溶液をスライド上に加えた。Ｃｕ（Ｉ）溶液の一実施例は、０．６ｍＭのＣｕＳＯ４、３ｍＭのＴＨＰＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）、４０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）及び４ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを含むものであった（新規に作製されて、スライドに添加する直前にＣｕＳＯ４に添加された）。クリック反応を３２分間進行させて、スライドを反応バッファーで完全に洗浄した。次に、５０〜７５ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）又はＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μＬをスライドに添加し、２４分間インキュベートした。ＤＴＴ又はＴＣＥＰ溶液の濃度は、標的の存在量に依存する。標的が高度に発現される場合には、ＧＡＲ−ＰＥＧ８−ＳＳ−ＨＡ−Ｎ３におけるジスルフィド結合の完全な切断を確実にするためにより高いＤＴＴ又はＴＣＥＰ濃度が必要であった。洗浄後、近接誘導性のハプテン移行の結果としてのＨＡタグの存在を、抗ＨＡ抗体の付加により精査した。本明細書に示される実施例では、ビオチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ９１８３）で標識したマウスモノクローナル抗ＨＡ  抗体（クローンＨＡ−７）を使用した。１００マイクロリットルの抗ＨＡ−ビオチンを２μｇ／ｍＬで各スライドに添加した後、洗浄し、１００μＬのストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）コンジュゲート（Ｖｅｎｔａｎａ）を加えた。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ＤＡＢの即時使用可能溶液、Ｈ２Ｏ２及びＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ）の銅を用いた発色に基づく検出を使用し、続いてヘマトキシリン  ＩＩ及びＢｌｕｉｎｇ（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いた対比染色を行った。別法として、ＳＡ−ＨＲＰの添加後に、シアニン  ５−チラミド  コンジュゲート（Ｃｙ５−Ｔｙｒ）による検出が行われた。Ｐｅ��ｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）社のＴＳＡＴＭ  Ｐｌｕｓシアニン５  Ｓｙｓｔｅｍキットを使用した。１：５０の１Ｘ  Ｐｌｕｓ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｉｌｕｅｎｔ中シアニン５チラミド１００マイクロリットルを各スライドに加え、１６分間インキュベートした。スライドを、ＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  ＨａｒｄＳｅｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ−１５００、ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、ＩＮＣ．  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）にマウントした。Ｏｌｙｍｐｕｃ  ＢＸ３−ＣＢＨ顕微鏡を用いて蛍光画像を取得した。
【０１１９】
検出を増強するため、チラミドにカップリングした非内因性ハプテン３−ヒドロキシ−２−キノキサリン（ＨＱ）を用いる、ＯＰＴＩＶＩＥＷ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ  ８６０−０９９）用いたチラミドシグナル増幅スキームを採用した。８分間のＴＳＡ反応及び過剰な試薬の除去後、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ＨＱ抗体を加え、１６分間インキュベートした。最後に、１２分間の反応によりＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて検出を達成した。ＤＡＢ染色を、標準の明視野顕微鏡により検査する。図１０は、上述のＩＨＣ手順の主要な工程のフロー図である。
【０１２０】
結果
Ｅ−カドヘリン／β−カテニン／ｐ１２０−カテニン複合体の検出
Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）／β−カテニン（β−ｃａｔ）／ｐ１２０−カテニン（ｐ１２０）の複合体（Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2005, 6, 622-634）は、近接アッセイの実証のための容易に到達可能なモデルを提供する。一次抗体の利用可能性に基づいて、三対の標的：Ｅ−ｃａｄ／β−ｃａｔ、Ｅ−ｃａｄ／ｐ１２０及びＥ−ｃａｄ  Ｍｓ／Ｒｂ一次抗体を試験した。二種類のネガティブコントロール：一次抗体の一つを省いたもの、又はＣｕ（Ｉ）触媒を省いたものをさらに使用した。加えて、アッセイは、アッセイの普遍性を示すために、扁桃腺及び皮膚の組織切片の両方に実施された。結果を図１６〜１９に示す。図１６Ａ〜図１６Ｄには、市販のハプテン−チラミド増幅（ＶＥＮＴＡＮＡ  ＯＰＴＩＶＩＥＷ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いた正常な扁桃腺組織切片中におけるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）／β−カテニン（β−ｃａｔ）の検出を示す顕微鏡写真が示されている。図１６Ａは、マウス抗β−ｃａｔを省略したアッセイを、図１６Ｂは、ウサギ抗Ｅ−ｃａｄを省略したアッセイを、図１６Ｃは、Ｃｕ（Ｉ）を用いたウサギ抗Ｅ−ｃａｄ及びマウス抗β−ｃａｔ近接アッセイを、図１６Ｄは、Ｃｕ（Ｉ）を用いないウサギ抗Ｅ−ｃａｄ及びマウス抗β−ｃａｔ近接アッセイを、それぞれ示している。
【０１２１】
図１７Ａ〜図１７Ｄは顕微鏡写真を示し、図１７Ａは、Ｃｕ（Ｉ）とＶＥＮＴＡＮＡ  ＯＰＴＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ及びＶＥＮＴＡＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いた、正常な扁桃腺切片スライドにおけるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）及びｐ１２０−カテニン（ｐ１２０）の近接性を検出するためのアッセイを、図１７Ｂは、Ｃｕ（Ｉ）を含めないネガティブコントロールを、それぞれ示している。図１７Ｃ〜図１７Ｄは、本明細書に記載の近接アッセイ（図１７Ｃ）及びＣｕ（Ｉ）を用いない近接アッセイ（図１７Ｄ）により、正常な扁桃腺組織切片中のタンパク質の異なるエピトープに結合するマウス−抗Ｅｃａｄ及びウサギ−抗Ｅｃａｄ一次抗体を用いてＥ−カドヘリンを検出した切片の顕微鏡写真を示す。図１８Ａ〜図１８Ｄは、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＯＰＴＩＶＩＥＷ  ＤＡＢにより染色して増幅させた、正常な皮膚組織切片中におけるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）／β−カテニン（β−ｃａｔ）の検出を示す顕微鏡写真を示す。図１８Ａは、Ｅ−ｃａｄとβ−ｃａｔ間の近接アッセイを示し、図１８Ｂは、Ｃｕ（Ｉ）を除いたコントロールである。図１８Ｃも、異なる皮膚切片におけるＥ−ｃａｄとβ−ｃａｔの近接アッセイを示し、図１８Ｄは、Ｃｕ（Ｉ）触媒を用いていない対応するネガティブコントロールである。
【０１２２】
図１９Ａ〜Ｃは、Ｃｙ５−Ｔｙｒ（青色＝ＤＡＰＩ、赤色＝Ｃｙ５、Ｅｃａｄ／β−ｃａｔについて）を用いた、正常な扁桃腺切片におけるＥｃａｄ／β−ｃａｔのフルオロフォア−チラミドに基づく検出を示す顕微鏡写真である。
【０１２３】
すべてのアッセイにおいて、すべての必要成分（一次抗体とＣｕ（Ｉ）触媒の両方）が存在するときにのみ、陽性染色が達成される。一次抗体の一つ又はＣｕ（Ｉ）触媒が省略される場合、陽性染色は得られない。これらの結果は、ＦＦＰＥ組織に関するアッセイの実施可能性及び特異性を明確に実証するものである。さらに、検出は、発色性又は発蛍光性シグナルにより達成することができ、これは方法の柔軟性を示唆するものである。
【０１２４】
ＣＤ１９／ＣＤ２１複合体の検出
方法の一般性をさらに示すために、扁桃腺におけるＣＤ１９／ＣＤ２１複合体の検出が実施される。ＣＤ１９は、プロＢ細胞から血漿−細胞段階に発現されるＢ細胞特異的膜貫通糖タンパク質である。成熟Ｂ細胞上において、ＣＤ１９は三つの異なる分子と結合し、ＣＤ２１（２型補体受容体）、ＣＤ８１（抗原プロセシング１のトランスポーター）及びＬＥＵ１３（インターフェロン誘導膜貫通タンパク質１）を含む四量体複合体を形成する（Nature Reviews Immunology 2, 354-363, 2002）。結果は、図２０Ａ〜図２０Ｄに示される顕微鏡写真であり、図２０Ａにおいて、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＯＰＴＩＶＩＥＷ  ＤＡＢで染色し増殖させた正常な扁桃腺組織切片におけるＣＤ１９／ＣＤ２１の近接アッセイが示される  。図２０Ｂは、Ｃｕ（Ｉ）を用いていない図２０Ａのコントロールである。図２０Ｃは、正常な扁桃腺組織においてマウス−抗ＣＤ２１及びウサギ−抗ＣＤ２１一次抗体を使用することによるＣＤ２１の検出を示し、図２０Ｄは、Ｃｕ（Ｉ）を用いていない図２０Ｃのコントロールである。ここでも、特異的染色は、必要な抗体及びＣｕ（Ｉ）触媒のすべてが適用されたときにのみ達成される。
【０１２５】
実施例６
実施例６は、本発明の方法を用いた実験について記載する。本発明は、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、及び／又は脂質付加などの様々な翻訳後修飾状態を検出するために用いることができる。実施例４は、タンパク質のリン酸化及びユビキチン化を検出するための、本発明の方法を用いた実験について記載する。
【０１２６】
ＨＥＲ２リン酸化の検出の結果はＣａｌｕ３異種移植片であり、図２１Ａ〜図２１Ｃに示されている。シグナルは、抗ＨＥＲ２と抗チロシンリン酸化抗体（ｐ−Ｔｙｒ）の両方が適用されたときにのみ検出され、抗ｐ−Ｔｙｒ又はＣｕ（Ｉ）触媒が省略されるとき、シグナルは検出されない。
【０１２７】
本発明をいずれかの理論又は機構に限定するものではないが、ユビキチン修飾を含む特異的タンパク質を検出するために特異的抗体を産生させることは不可能と考えられる。抗体を生成するためにリン酸化アミノ酸ン残基を有するペプチドを免疫原として容易に使用することのできるリン酸化タンパク質の検出とは異なり、ユビキチンは８．５ｋＤａのタンパク質であり、したがって特定のユビキチン化タンパク質のための抗体を生成することは極めて困難である。しかしながら、ユビキチン自体に対する抗体は、広く利用可能であり（例えば、完全長ユビキチンを免疫原として用いることにより生成される）、対象の特異的タンパク質に対する抗体と対にすることにより、本発明の近接アッセイ法を用いたユビキチン化タンパク質の検出のための方法が提供される。
【０１２８】
図２２〜図２７は、ユビキチン化タンパク質（例えば、ＰＲ、ＨＥＲ２）を検出するためのアッセイに関する。図２２に示すように、タンパク質自体に特異的な抗体が、ユビキチンに特異的な抗体と組み合わせて使用される。二つの標的が近接している場合（例えば、タンパク質がユビキチン化されている）、架橋成分間に共有結合が形成されうる（外部刺激、例えば、触媒などに続いて）。次いで架橋成分を第１の抗体から切断することができ、その後共有結合した架橋成分が検出システム（例えば、発色検出システム）を用いて検出可能である。図２３〜図２６のアッセイのために、マウス抗ユビキチン（クローンＰ４Ｄ１）ｍＡｂが汎抗ユビキチン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）として使用され、ウサギ−抗ＰＲ（クローン１Ｅ２、Ｖｅｎｔａｎａ  ｃａｔａｌｏｇ  ＃７９０−２２２３）が抗ＰＲ抗体として、それぞれ使用された。
【０１２９】
図２３〜図２６に示すように、陽性のシグナルは、必要な抗体及びＣｕ（Ｉ）のすべてが適用された場合にのみ検出される。興味深いことに、シグナルは不均質に現れ、このことは、不均一性情報が失われるウェスタンブロットのような「こすりつけて結合させる（ｇｒｉｎｄ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ）」方法を凌駕する本発明のｉｎ  ｓｉｔｕ近接アッセイに特有の利点を示唆するものである。加えて、陽性染色はすべての細胞に観察されるわけではなく、このことは、ＰＲとユビキチンの核共存（標準のＩＨＣにおいて示されるように）が近接シグナルを生成するために十分でないとき、本発明の方法が極めて高度に距離ストリンジェントであることを示唆している。さらに、染色は、すべて細胞核に局在しており、これは標的の天然の発現パターンと一致する。図２７のアッセイのために、ウサギ−抗ＨＥＲ２（クローン４Ｂ５、Ｖｅｎｔａｎａ  ｃａｔａｌｏｇ  ＃７９０−２９９１）が抗ＨＥＲ２抗体として使用された。また、陽性シグナルは、ＨＥＲ２発現が陽性であるＣａｌｕ３異種移植片においてのみ観察される。
【０１３０】
実施例７
実施例７は、本発明の近接アッセイを用いたＭＬＨ１−ＰＭＳ２ヘテロダイマーの検出について記載する。図２８Ａは、ウサギ−抗ＰＭＳ２  ｍＡｂ（クローンＥＰＲ３９４７、Ｖｅｎｔａｎａ  ７６０−４５３１）を用いたＨｅＬａ細胞異種移植片におけるＰＭＳ２のＩＨＣの結果を示す。予測された核染色が見える。図２８Ｂは、マウス−抗ＭＬＨ１  ｍＡｂ（クローンＭ１、Ｖｅｎｔａｎａ  ７９０−４５３５）を用いたＨｅＬａ細胞異種移植片におけるＭＬＨ１のＩＨＣの結果を示す。予測された核染色が確認される。図２８Ｃは、Ｃｕ（Ｉ）触媒を用いた本発明の方法を使用するＭＬＨ１−ＰＭＳ２ヘテロ二量体の近接アッセイの結果を示している。核局在化及びシグナルの不均一性に注目されたい。図２８Ｄは、Ｃｕ（Ｉ）触媒を加えないで本発明の方法を使用するＭＬＨ１−ＰＭＳ２ヘテロ二量体の近接アッセイの結果を示している。結果は、本発明の特異性及び一般性をさらに実証するものである。
【０１３１】
本明細書において使用される用語「約」は、参照数の±１０％を指す。本明細書に記載されるもの以外に、上記説明から当業者には本発明の種々の修正例が明らかである。このような修正例も、特許請求の範囲に含まれることが意図される。本明細書に引用される各参照文献は、言及されたことにより内容の全体が本明細書に包含される。
【０１３２】
本発明の好ましい実施形態を示して説明したが、当業者には、それらに特許請求の範囲を超えない修正が可能であることを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項に記載される参照番号は、例示及び特許庁による閲覧を容易にすることを目的としているにすぎず、いかなる意味でも限定的でない。いくつかの実施態様では、本特許出願に提示される図面は、角度、寸法比などを含めて縮尺通りに描画されている。いくつかの実施態様では、図面は代表例を示しているに過ぎず、請求項は図面の寸法により限定されない。いくつかの実施態様では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という文言を用いる本明細書における本発明の記載は、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」と記載される実施態様を含み、したがって「〜からなる」という文言を用いる本発明の一又は複数の実施態様を特許請求するための記載要件は満たされている。
【０１３３】
特許請求の範囲において引用される参照番号は、本特許出願の審査を容易にすることのみを目的とし、かつ例示的なものであり、いかなる意味でも特許請求の範囲を図面内に対応する参照番号を有する特定の特徴に限定することを意図していない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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