(57)【要約】β１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグ化合物であって、β１−ＡＤＲアゴニスト化合物を放出するようにｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解可能であり、β１−ＡＤＲアゴニスト化合物に比べてより大きな親油性およびＣＮＳバイオアベイラビリティをプロドラッグ化合物に付与する基を含有する、プロドラッグ化合物。本発明は、アルツハイマー病、ダウン症候群、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、または自閉症を有するヒトにおける認知および社会的認識を改善する方法を提供し、前記認知および社会的認識を改善するのに十分な量の、β１アドレナリン作動性受容体アゴニストもしくはそのプロドラッグ化合物、または両方、またはいずれかもしくは両方の薬学的に許容される塩である、少なくとも１つの化合物を投与することを伴う。
2017505826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグ化合物であって、前記プロドラッグ化合物は、対応するβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物を放出するようにｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解可能であり、そして前記対応するβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物に比べてより大きな親油性およびＣＮＳバイオアベイラビリティを前記プロドラッグ化合物に付与する少なくとも１つの基を含有する、プロドラッグ化合物。
【請求項２】
βアレスチン経路よりもｃＡＭＰ経路を刺激する、請求項１に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項３】
１０−４Ｍから１０−１０Ｍの範囲の同じ濃度でβアレスチン経路より少なくとも５０％多くｃＡＭＰシグナリングカスケードを刺激する、請求項１に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項４】
ｃＡＭＰシグナリング経路のレベルの２０％を超えないレベルでβアレスチンを刺激する、請求項１に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項５】
ｃｌｏｇＰ値＞＋１．０を有する、請求項１に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項６】
前記β１−ＡＤＲアゴニスト化合物のｃｌｏｇＰ値より少なくとも＋１．５０高いｃｌｏｇＰ値を有する、請求項５に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項７】
キサモテロールプロドラッグである、請求項５に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項８】
ラセミ化合物である、請求項７に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項９】
（Ｓ）−化合物である、請求項７に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項１０】
（Ｒ）−化合物である、請求項７に記載のプロドラッグ。
【請求項１１】
下流のＣＲＥＢ経路をさらに活性化する、請求項１に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項１２】
前記キサモテロールプロドラッグが、アシル基、カルバメート基、またはオキソアゾリジニル基に結合している末端のフェニルヒドロキシル基および／または２級ヒドロキシ基を有するキサモテロールを含み、前記アシル基、前記カルバメート基、または前記オキソアゾリジニル基はｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解可能である、請求項７に記載のプロドラッグ化合物。
【請求項１３】
前記キサモテロールプロドラッグが、それぞれＲ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−基および／またはＲ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−基によってアシル化されている前記末端のフェニルヒドロキシル基および／またはその２級ヒドロキシ基を有するアシル化キサモテロールであり、式中、Ｒ１およびＲ２は同じでもよく、または異なっていてもよく、かつ直鎖状、分枝状、もしくは環状、またはこれらの組合せである各々炭素原子５から３０個の親油性基であり、これらは、非置換であるか、または１から４個の低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、もしくはハロ基により任意選択で置換されており、前記環状基はヘテロ原子０、１、または２個を含有する５員または６員環であり、前記ヘテロ原子は−Ｏ−もしくは−Ｎ−またはそれらの両方であり、前記環状基は飽和または不飽和である、請求項１２に記載のプロドラッグ。
【請求項１４】
Ｒ１および／またはＲ２における環状環が、ピロール、フラン、イミジゾリジン（ｉｍｉｄｉｚｏｌｉｄｉｎｅ）、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、またはピランを含み、これらは各々非置換であるか、または任意選択で置換されている、請求項１３に記載のプロドラッグ。
【請求項１５】
Ｒ１および／Ｒ２がアミノ酸ラジカルを含有する、請求項１３に記載のプロドラッグ。
【請求項１６】
前記ハロがフルオロである、請求項１３に記載のプロドラッグ。
【請求項１７】
社会的記憶を含めた認知を改善するのに有効な量の、請求項１に記載の１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグを投与するステップを伴う、ヒトにおけるＤＳを処置する方法。
【請求項１８】
前記β１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグがキサモテロールプロドラッグである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与するステップが皮下注射による、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
社会的記憶を含めた認知を改善するのに有効な量の、請求項１に記載の１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグを投与するステップを伴う、ヒトにおけるＡＤを処置する方法。
【請求項２１】
前記β１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグがキサモテロールプロドラッグである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与するステップが皮下注射による、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
認知を改善し、そして多動性を低減するのに有効な量の、請求項１に記載の１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグを投与するステップを伴う、ヒトにおけるＡＤＤまたはＡＤＨＤを処置する方法。
【請求項２４】
前記β１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグがキサモテロールプロドラッグである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記投与するステップが皮下注射による、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
社会的記憶を含めた認知を改善するのに有効な量の、請求項１に記載の１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグを投与するステップを伴う、ヒトにおける自閉症を処置する方法。
【請求項２７】
前記β１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグがキサモテロールプロドラッグである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与するステップが皮下注射による、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
治療的使用のための１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグを選択する方法であって：
ａ）対応するβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物に比べて増強されたｃｌｏｇＰ値を有する１つまたは複数のプロドラッグ化合物を選択するステップ、
ｂ）ステップａ）からの選択したプロドラッグ化合物を、一式のＡＤＭＥ試験に供し、前記プロドラッグ化合物についてのＳＰＲ値を決定するステップ、
ｃ）ステップｂ）からの１つまたは複数のプロドラッグ化合物を選択し、前記プロドラッグ化合物をｉｎ  ｖｉｖｏの生体分布および薬物動態学的評価に供するステップ、
ｄ）ステップｃ）からの１つまたは複数のプロドラッグ化合物を前臨床動物モデル研究のために選択するステップ、および
ｅ）さらなる開発および治療的使用のために、ステップａ）〜ｄ）の全てにおいて選択された各化合物についてのＴＰＰを生成するステップ
を含む、方法。
【請求項３０】
選択される前記１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグが、キサモテロールプロドラッグである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグ、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
水性ベースの溶液の形態である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
懸濁物の形態である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記β１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグがキサモテロールプロドラッグである、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記キサモテロールプロドラッグが（Ｒ）−エナンチオマープロドラッグである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記キサモテロールプロドラッグが（Ｓ）−エナンチオマープロドラッグである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府により資金供与を受けた研究または開発に関する声明
本発明に至った研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅｓ（ＮＩＮＤＳ）からの契約ＮＳ０６９３７５−０１Ａ１によって少なくとも部分的に資金を供与されたので、連邦政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害、状態、および疾患は、現代社会において増え続ける問題である。ＡＤは単独で世界中で少なくとも２４００万人の人が罹患し、その有病率は、人口の高齢化および診断率の上昇の両方のため、指数関数的に増加すると予想される。現在入手できる、ＦＤＡによって認可されている、コリンエステラーゼ阻害薬およびメマンチンなどのＡＤの薬物療法は、症状の軽減を提供するにすぎない。ＡＤは現在、依然として不治である。疑いなく、ＡＤに対する効果的な治療法がないことは、疾患の発症および進行に関与する数多くの複雑な要因に起因し得る。例えば、ＡＤの発症および進行は、ニューロンおよびシナプスの喪失、様々な神経伝達物質系の変質、アミロイド斑および神経原線維変化の蓄積、ならびにＡＤの様々な段階に観察されるアミロイド斑を取り囲む活性化小グリア細胞および反応性星状細胞の存在によって証明される慢性炎症を特徴とする。この数多くの症状は、ＡＤを有するヒトに対する効果的な治療法の開発に関与する複雑な困難を強調するものであり、ＡＤの病理の様々な主要な標的ポイントを同時に変調することが、ＡＤに対する最も包括的な治療法を表し得ることを示す。
【０００３】
顔を認識できないこと（社会的認識）は、アルツハイマー病（ＡＤ）を含めたいくつかの神経学的障害の規定されるエンドフェノタイプである。しかし、この症状の根底となる原因は依然として分かっていない。いくつかの研究は、社会的認識におけるオキシトシンおよびバソプレッシンの役割を強調しており、自閉症患者ではオキシトシンが低レベルであることが顔認識の欠陥の一因であり得ることを示している。しかし、ＡＤ患者の死後研究では、海馬以外の中枢のバソプレッシンおよびオキシトシン濃度の違いを示すことができず、海馬では正常患者よりもレベルが高いと思われる。これは、オキシトシンレベルの変動がＡＤの社会的認識における欠陥の根底にあるわけではないことを指摘し、本発明者らの、社会的認識の一因となる神経回路の理解が不完全であることを指し示している。加えて、ヒトによるオキシトシン使用の長期の効果は知られておらず、有害であることが判明する可能性が十分にある。
【０００４】
ＡＤの十分に規定された病理学上の顕著な特徴は、脳におけるノルアドレナリン（ＮＡ）の主な供給源である青斑核におけるニューロンの変性である。この変性は、後続のＮＡの低減、およびアドレナリン作動性受容体の活性化の低減に関連する。アドレナリン作動性受容体は、様々な細胞内シグナリング経路によるＮＡの特徴的な作用を媒介し、学習および記憶の過程において重要な役割を果たす。最近、βアドレナリン作動性系、特にβ１アドレナリン作動性受容体（β１−ＡＤＲ）の認知機能における寄与が注目されている。例えば、β−ＡＤＲに対するＮＡの作用は、抑制性のシナプス機能を変調する。他の研究は、β１選択的アンタゴニストであるベタキソロールが、野生型マウスおよびラットにおいて空間ナビゲーションの想起不足を生じ、ＮＡ欠損を有するマウスに観察される想起不足はβ１部分アゴニストであるキサモテロールによりレスキューされ得ることを示している。これらの結果は、β１−ＡＤＲによって媒介されるＮＡ作動性神経伝達が、ＮＡ作動性変性を特徴とする神経学的障害において観察される認知欠損に、決定的に関与し得ることを指摘している。
【０００５】
残念なことに、アルツハイマー病の根底となる、神経の、および最終的に分子上の原因の理解が現在不完全であることが、アルツハイマー病に対する効果的な治療法がない一因であった。認知および社会的認識／社会的記憶の両方を改善するのに効果的な治療法は、自閉症に対する有用な治療法でもある。同様に、本発明は、認知および社会的行動の両方を改善するための手段を提供するため、本発明はＡＤＤおよびＡＤＨＤの両方を処置する方法も提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、アルツハイマー病、ダウン症候群、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、または自閉症を有するヒトにおける認知および社会的認識を改善する方法を提供し、前記認知および社会的認識を改善するのに十分な量の、β１アドレナリン作動性受容体アゴニストもしくはそのプロドラッグ化合物、または両方、またはいずれかもしくは両方の薬学的に許容される塩である、少なくとも１つの化合物を投与することを伴う。
【０００７】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解されるとβ１アドレナリン作動性受容体アゴニストを放出する多数のプロドラッグのβ１アドレナリン作動性受容体アゴニスト化合物、およびそれを含有する組成物も提供する。β１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグは、β１−ＡＤＲアゴニスト化合物に比べて、親油性およびＣＮＳのバイオアベイラビリティが改善されている。
【０００８】
本発明は、キラル中心を有するβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物のＲ−およびＳ−エナンチオマー化合物（このような化合物のラセミ混合物の代わりに別々に用いることができる）、ならびにこれらエナンチオマー化合物を作成するための方法をさらに提供する。
【０００９】
本発明は、アルツハイマー病、ダウン症候群、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、および／または自閉症を表すヒトにおける、社会的記憶および他の認知形質を改善するための方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】図１は、アルツハイマー病のＡＰＰマウスモデルは、社会的認識の障害、およびＭｅＡにおけるβ１−ＡＤＲ発現の上方制御を特徴とすることを示す図である。左に実験の模式図を示す。（Ａ）野生型（ＷＴ；ｎ＝１１）およびＡＰＰ（ｎ＝９）のマウス（Ｍｉｅ）は両方とも、不慣れなＣ５７Ｂｌ／６侵入者であるマウスを含有するカップを空のカップよりも探索し、正常の社交性を示した（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００１）：（Ｂ）しかし、ＷＴは慣れた侵入者よりも新規なＣ５６Ｂ１／６侵入者に対する好みを示したが（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＜０．００６７）、ＡＰＰマウスはこの好みを表さず（対応のあるｔ検定によりｐ＝０．２７８０）、社会的認識の欠陥が指摘された。社会的認識におけるこの欠陥は、非社会的匂い認識における欠陥に関連しない。（Ｃ）ＷＴ（ｎ＝７）およびＡＰＰ（ｎ＝８）マウスは両方とも、空のチューブよりヘプタノール溶液を含有するチューブの匂いを多く嗅いだ（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＜０．０１）；（Ｄ）同様に、ＷＴおよびＡＰＰマウスは両方とも、慣れた匂い（ヘプタノール単独）よりも新規なアルコール臭（ヘプタノール：オクタノール溶液）を含有するチューブに対する好みを示し（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＝０．００６２および＊＊＊ｐ＝０．０００１）、両遺伝子型とも慣れた非社会的な匂いを記憶することができることが指摘された。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。
【図１−２】図１は、アルツハイマー病のＡＰＰマウスモデルは、社会的認識の障害、およびＭｅＡにおけるβ１−ＡＤＲ発現の上方制御を特徴とすることを示す図である。左に実験の模式図を示す。（Ａ）野生型（ＷＴ；ｎ＝１１）およびＡＰＰ（ｎ＝９）のマウスは両方とも、不慣れなＣ５７Ｂｌ／６侵入者であるマウスを含有するカップを空のカップよりも探索し、正常の社交性を示した（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００１）：（Ｂ）しかし、ＷＴは慣れた侵入者よりも新規なＣ５６Ｂ１／６侵入者に対する好みを示したが（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＜０．００６７）、ＡＰＰマウスはこの好みを表さず（対応のあるｔ検定によりｐ＝０．２７８０）、社会的認識の欠陥が指摘された。社会的認識におけるこの欠陥は、非社会的匂い認識における欠陥に関連しない。（Ｃ）ＷＴ（ｎ＝７）およびＡＰＰ（ｎ＝８）マウスは両方とも、空のチューブよりヘプタノール溶液を含有するチューブの匂いを多く嗅いだ（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＜０．０１）；（Ｄ）同様に、ＷＴおよびＡＰＰマウスは両方とも、慣れた匂い（ヘプタノール単独）よりも新規なアルコール臭（ヘプタノール：オクタノール溶液）を含有するチューブに対する好みを示し（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＝０．００６２および＊＊＊ｐ＝０．０００１）、両遺伝子型とも慣れた非社会的な匂いを記憶することができることが指摘された。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。
【図２−１】図２は、β１−ＡＤＲの活性化が社会的認識に必要であることを示す図である。左は、社会的認識を評価するためにしたがった実験デザインの代表図である。β１−ＡＤＲを、０．０１から１ｍｇ／ｋｇまでの範囲の様々な用量のベタキソロールで遮断しても（１群あたりｎ＝８）社会的学習に影響を及ぼさなかったが、社会的認識を障害した。（Ａ）ベタキソロールまたはビヒクルを注射したマウスは全て、空のカップよりも不慣れなＣ５７Ｂｌ／６マウスを含有するカップを好んだ（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）しかし、ベタキソロール０．１または１ｍｇ／ｋｇを注射したマウスは、慣れた侵入者よりも新規なＣ５６Ｂ１／６侵入者のマウスに対する好みを示さず（対応のあるｔ検定によりｎｓ）、社会的認識の障害が指摘された一方、ビヒクルまたはベタキソロール０．０１ｍｇ／ｋｇを注射したマウスはこの好みを示した（対応のあるｔ検定によりそれぞれ＊＊ｐ＝０．００３および０．００８）；ベタキソロールは非社会的匂い（ｏｒｄｅｒ）認識を障害しなかった；（Ｃ）非社会的匂い認識の試験において、ベタキソロールは、空のチューブよりもヘプタノール溶液を含有するチューブに対するマウスの好みに影響を及ぼさず（対応のあるｔ検定によりビヒクルｎ＝７＊＊＊ｐ＝０．０００４；ベタキソロールｎ＝７＊＊ｐ＝０．００１６）、（Ｄ）マウスが慣れた匂い（ヘプタノール）対新しいが同様の匂い（ヘプタノール：オクタノールの溶液）の間を識別する能力に影響を及ぼさなかった（対応のあるｔ検定によりビヒクル＊＊ｐ＝０．０１９；ベタキソロール＊＊ｐ＝０．００１５）。（Ｅ）社会的認識試験の前にキサモテロール（３ｍｇ／ｋｇ）を全身注射しても、空のカップよりも不慣れな侵入者に対するＷＴ（ｎ＝１０）およびＡＰＰ（ｎ＝１０）マウスの好みに影響を及ぼさなかったが（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００１）；（Ｆ）以前にＡＰＰマウスに観察された社会的認識欠陥をレスキューした（図１Ｂを参照されたい）；キサモテロールを注射したＷＴ対照の同腹仔（ｎ＝１０）同様、キサモテロールを注射したＡＰＰマウス（ｎ＝１０）は慣れた侵入者より新規な侵入者に対する好みを示した（対応のあるｔ検定によりＷＴ；＊ｐ＝０．０１９８；ＡＰＰ：＊＊＊ｐ＝０．０００１）。
【図２−２】図２は、β１−ＡＤＲの活性化が社会的認識に必要であることを示す図である。左は、社会的認識を評価するためにしたがった実験デザインの代表図である。β１−ＡＤＲを、０．０１から１ｍｇ／ｋｇまでの範囲の様々な用量のベタキソロールで遮断しても（１群あたりｎ＝８）社会的学習に影響を及ぼさなかったが、社会的認識を障害した。（Ａ）ベタキソロールまたはビヒクルを注射したマウスは全て、空のカップよりも不慣れなＣ５７Ｂｌ／６マウスを含有するカップを好んだ（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）しかし、ベタキソロール０．１または１ｍｇ／ｋｇを注射したマウスは、慣れた侵入者よりも新規なＣ５６Ｂ１／６侵入者のマウスに対する好みを示さず（対応のあるｔ検定によりｎｓ）、社会的認識の障害が指摘された一方、ビヒクルまたはベタキソロール０．０１ｍｇ／ｋｇを注射したマウスはこの好みを示した（対応のあるｔ検定によりそれぞれ＊＊ｐ＝０．００３および０．００８）；ベタキソロールは非社会的匂い認識を障害しなかった；（Ｃ）非社会的匂い認識の試験において、ベタキソロールは、空のチューブよりもヘプタノール溶液を含有するチューブに対するマウスの好みに影響を及ぼさず（対応のあるｔ検定によりビヒクルｎ＝７＊＊＊ｐ＝０．０００４；ベタキソロールｎ＝７＊＊ｐ＝０．００１６）、（Ｄ）マウスが慣れた匂い（ヘプタノール）対新しいが同様の匂い（ヘプタノール：オクタノールの溶液）の間を識別する能力に影響を及ぼさなかった（対応のあるｔ検定によりビヒクル＊＊ｐ＝０．０１９；ベタキソロール＊＊ｐ＝０．００１５）。（Ｅ）社会的認識試験の前にキサモテロール（３ｍｇ／ｋｇ）を全身注射しても、空のカップよりも不慣れな侵入者に対するＷＴ（ｎ＝１０）およびＡＰＰ（ｎ＝１０）マウスの好みに影響を及ぼさなかったが（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００１）；（Ｆ）以前にＡＰＰマウスに観察された社会的認識欠陥をレスキューした（図１Ｂを参照されたい）；キサモテロールを注射したＷＴ対照の同腹仔（ｎ＝１０）同様、キサモテロールを注射したＡＰＰマウス（ｎ＝１０）は慣れた侵入者より新規な侵入者に対する好みを示した（対応のあるｔ検定によりＷＴ；＊ｐ＝０．０１９８；ＡＰＰ：＊＊＊ｐ＝０．０００１）。
【図２−３】図２は、β１−ＡＤＲの活性化が社会的認識に必要であることを示す図である。左は、社会的認識を評価するためにしたがった実験デザインの代表図である。β１−ＡＤＲを、０．０１から１ｍｇ／ｋｇまでの範囲の様々な用量のベタキソロールで遮断しても（１群あたりｎ＝８）社会的学習に影響を及ぼさなかったが、社会的認識を障害した。（Ａ）ベタキソロールまたはビヒクルを注射したマウスは全て、空のカップよりも不慣れなＣ５７Ｂｌ／６マウスを含有するカップを好んだ（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）しかし、ベタキソロール０．１または１ｍｇ／ｋｇを注射したマウスは、慣れた侵入者よりも新規なＣ５６Ｂ１／６侵入者のマウスに対する好みを示さず（対応のあるｔ検定によりｎｓ）、社会的認識の障害が指摘された一方、ビヒクルまたはベタキソロール０．０１ｍｇ／ｋｇを注射したマウスはこの好みを示した（対応のあるｔ検定によりそれぞれ＊＊ｐ＝０．００３および０．００８）；ベタキソロールは非社会的匂い認識を障害しなかった；（Ｃ）非社会的匂い認識の試験において、ベタキソロールは、空のチューブよりもヘプタノール溶液を含有するチューブに対するマウスの好みに影響を及ぼさず（対応のあるｔ検定によりビヒクルｎ＝７＊＊＊ｐ＝０．０００４；ベタキソロールｎ＝７＊＊ｐ＝０．００１６）、（Ｄ）マウスが慣れた匂い（ヘプタノール）対新しいが同様の匂い（ヘプタノール：オクタノールの溶液）の間を識別する能力に影響を及ぼさなかった（対応のあるｔ検定によりビヒクル＊＊ｐ＝０．０１９；ベタキソロール＊＊ｐ＝０．００１５）。（Ｅ）社会的認識試験の前にキサモテロール（３ｍｇ／ｋｇ）を全身注射しても、空のカップよりも不慣れな侵入者に対するＷＴ（ｎ＝１０）およびＡＰＰ（ｎ＝１０）マウスの好みに影響を及ぼさなかったが（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００１）；（Ｆ）以前にＡＰＰマウスに観察された社会的認識欠陥をレスキューした（図１Ｂを参照されたい）；キサモテロールを注射したＷＴ対照の同腹仔（ｎ＝１０）同様、キサモテロールを注射したＡＰＰマウス（ｎ＝１０）は慣れた侵入者より新規な侵入者に対する好みを示した（対応のあるｔ検定によりＷＴ；＊ｐ＝０．０１９８；ＡＰＰ：＊＊＊ｐ＝０．０００１）。
【図３−１】図３は、β１−ＡＤＲの活性化が社会的手がかりの獲得に必要であることを示す図である。（Ａ）３チャンバー試験において試験したβ１−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝１７）は、対照マウス（ＦＶＢマウスｎ＝１６）同様（＊＊＊ｐ＜０．０００２）、空のカップよりも不慣れな侵入者を含有するカップに対する好みを示す（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。しかし、β１−ＡＤＲ  ＫＯマウスは、慣れた侵入者より新規な侵入者を認識することができなかったが、ＷＴ対照はこの識別を行った（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＝０．００５）。（Ｂ）β２−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝８）は、対照のＦＶＢマウス（ｎ＝８；＊＊＊ｐ＜０．０００１）、またはベタキソロール３ｍｇ／ｋｇで処置したβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝８；＊＊ｐ＝０．００１）同様、空のカップより不慣れな侵入者を含有するカップに対する好みを示す（＊＊＊ｐ＝０．０００２）。ＦＶＢ対照およびβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスの両方とも、慣れた侵入者よりも新規な侵入者に対する好みを示し（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＝０．０００４）、β２−ＡＤＲを欠くマウスでも正常の社会的認識能力があることが指摘され、加えて、ベタキソロールはβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスにおける社会的認識能力を効果的に障害し（対応のあるｔ検定によりｎｓ）、社会的認識に対するベタキソロールの効果はβ２−ＡＤＲによって変調されないことが示唆される。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。（Ｃ）試験の想起段階の３０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）しても社会的認識を障害せず、ビヒクル注射したマウスおよびベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）の両方とも、慣れた侵入者より新規な侵入者を好んだ（対応のあるｔ検定により、それぞれ＊＊ｐ＝０．００２３および＊ｐ＝０．０１３６）。（Ｄ）試験の学習段階の２０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）すると、短期の社会的認識を障害し、ベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）は慣れた侵入者より新規な侵入者を好まず（対応のあるｔ検定によりｐ＝０．３８８９、ｎｓ）、社会的認識の欠陥が指摘されたが、ビヒクル注射したマウス（ｎ＝８）はこの好みを示した（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＝０．０００７）。（Ｅ）試験の学習段階の２０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）すると、長期の社会的記憶を障害し、学習段階の２４時間後、ベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）はこの好みを示した（＊ｐ＝０．０１１９）。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。
【図３−２】図３は、β１−ＡＤＲの活性化が社会的手がかりの獲得に必要であることを示す図である。（Ａ）３チャンバー試験において試験したβ１−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝１７）は、対照マウス（ＦＶＢマウスｎ＝１６）同様（＊＊＊ｐ＜０．０００２）、空のカップよりも不慣れな侵入者を含有するカップに対する好みを示す（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。しかし、β１−ＡＤＲ  ＫＯマウスは、慣れた侵入者より新規な侵入者を認識することができなかったが、ＷＴ対照はこの識別を行った（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＝０．００５）。（Ｂ）β２−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝８）は、対照のＦＶＢマウス（ｎ＝８；＊＊＊ｐ＜０．０００１）、またはベタキソロール３ｍｇ／ｋｇで処置したβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝８；＊＊ｐ＝０．００１）同様、空のカップより不慣れな侵入者を含有するカップに対する好みを示す（＊＊＊ｐ＝０．０００２）。ＦＶＢ対照およびβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスの両方とも、慣れた侵入者よりも新規な侵入者に対する好みを示し（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＝０．０００４）、β２−ＡＤＲを欠くマウスでも正常の社会的認識能力があることが指摘され、加えて、ベタキソロールはβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスにおける社会的認識能力を効果的に障害し（対応のあるｔ検定によりｎｓ）、社会的認識に対するベタキソロールの効果はβ２−ＡＤＲによって変調されないことが示唆される。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。（Ｃ）試験の想起段階の３０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）しても社会的認識を障害せず、ビヒクル注射したマウスおよびベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）の両方とも、慣れた侵入者より新規な侵入者を好んだ（対応のあるｔ検定により、それぞれ＊＊ｐ＝０．００２３および＊ｐ＝０．０１３６）。（Ｄ）試験の学習段階の２０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）すると、短期の社会的認識を障害し、ベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）は慣れた侵入者より新規な侵入者を好まず（対応のあるｔ検定によりｐ＝０．３８８９、ｎｓ）、社会的認識の欠陥が指摘されたが、ビヒクル注射したマウス（ｎ＝８）はこの好みを示した（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＝０．０００７）。（Ｅ）試験の学習段階の２０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）すると、長期の社会的記憶を障害し、学習段階の２４時間後、ベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）はこの好みを示した（＊ｐ＝０．０１１９）。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。
【図３−３】図３は、β１−ＡＤＲの活性化が社会的手がかりの獲得に必要であることを示す図である。（Ａ）３チャンバー試験において試験したβ１−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝１７）は、対照マウス（ＦＶＢマウスｎ＝１６）同様（＊＊＊ｐ＜０．０００２）、空のカップよりも不慣れな侵入者を含有するカップに対する好みを示す（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。しかし、β１−ＡＤＲ  ＫＯマウスは、慣れた侵入者より新規な侵入者を認識することができなかったが、ＷＴ対照はこの識別を行った（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＝０．００５）。（Ｂ）β２−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝８）は、対照のＦＶＢマウス（ｎ＝８；＊＊＊ｐ＜０．０００１）、またはベタキソロール３ｍｇ／ｋｇで処置したβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝８；＊＊ｐ＝０．００１）同様、空のカップより不慣れな侵入者を含有するカップに対する好みを示す（＊＊＊ｐ＝０．０００２）。ＦＶＢ対照およびβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスの両方とも、慣れた侵入者よりも新規な侵入者に対する好みを示し（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＝０．０００４）、β２−ＡＤＲを欠くマウスでも正常の社会的認識能力があることが指摘され、加えて、ベタキソロールはβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスにおける社会的認識能力を効果的に障害し（対応のあるｔ検定によりｎｓ）、社会的認識に対するベタキソロールの効果はβ２−ＡＤＲによって変調されないことが示唆される。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。（Ｃ）試験の想起段階の３０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）しても社会的認識を障害せず、ビヒクル注射したマウスおよびベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）の両方とも、慣れた侵入者より新規な侵入者を好んだ（対応のあるｔ検定により、それぞれ＊＊ｐ＝０．００２３および＊ｐ＝０．０１３６）。（Ｄ）試験の学習段階の２０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）すると、短期の社会的認識を障害し、ベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）は慣れた侵入者より新規な侵入者を好まず（対応のあるｔ検定によりｐ＝０．３８８９、ｎｓ）、社会的認識の欠陥が指摘されたが、ビヒクル注射したマウス（ｎ＝８）はこの好みを示した（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＝０．０００７）。（Ｅ）試験の学習段階の２０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）すると、長期の社会的記憶を障害し、学習段階の２４時間後、ベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）はこの好みを示した（＊ｐ＝０．０１１９）。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。
【図３−４】図３は、β１−ＡＤＲの活性化が社会的手がかりの獲得に必要であることを示す図である。（Ａ）３チャンバー試験において試験したβ１−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝１７）は、対照マウス（ＦＶＢマウスｎ＝１６）同様（＊＊＊ｐ＜０．０００２）、空のカップよりも不慣れな侵入者を含有するカップに対する好みを示す（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。しかし、β１−ＡＤＲ  ＫＯマウスは、慣れた侵入者より新規な侵入者を認識することができなかったが、ＷＴ対照はこの識別を行った（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＝０．００５）。（Ｂ）β２−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝８）は、対照のＦＶＢマウス（ｎ＝８；＊＊＊ｐ＜０．０００１）、またはベタキソロール３ｍｇ／ｋｇで処置したβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウス（ｎ＝８；＊＊ｐ＝０．００１）同様、空のカップより不慣れな侵入者を含有するカップに対する好みを示す（＊＊＊ｐ＝０．０００２）。ＦＶＢ対照およびβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスの両方とも、慣れた侵入者よりも新規な侵入者に対する好みを示し（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＝０．０００４）、β２−ＡＤＲを欠くマウスでも正常の社会的認識能力があることが指摘され、加えて、ベタキソロールはβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスにおける社会的認識能力を効果的に障害し（対応のあるｔ検定によりｎｓ）、社会的認識に対するベタキソロールの効果はβ２−ＡＤＲによって変調されないことが示唆される。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。（Ｃ）試験の想起段階の３０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）しても社会的認識を障害せず、ビヒクル注射したマウスおよびベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）の両方とも、慣れた侵入者より新規な侵入者を好んだ（対応のあるｔ検定により、それぞれ＊＊ｐ＝０．００２３および＊ｐ＝０．０１３６）。（Ｄ）試験の学習段階の２０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）すると、短期の社会的認識を障害し、ベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）は慣れた侵入者より新規な侵入者を好まず（対応のあるｔ検定によりｐ＝０．３８８９、ｎｓ）、社会的認識の欠陥が指摘されたが、ビヒクル注射したマウス（ｎ＝８）はこの好みを示した（対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＝０．０００７）。（Ｅ）試験の学習段階の２０分前にベタキソロールを全身注射（１ｍｇ／ｋｇ）すると、長期の社会的記憶を障害し、学習段階の２４時間後、ベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝８）はこの好みを示した（＊ｐ＝０．０１１９）。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。
【図４】図４は、内側扁桃体（ＭｅＡ）におけるβ１−ＡＤＲの活性化は、社会的認識に必要であることを示す図である。（Ａ）社会的認識課題における試験前にベタキソロールを注射（１ｍｇ／ｋｇ）すると、ＭｅＡにおけるｃ−Ｆｏｓ陽性細胞数を低減した（ビヒクル注射したマウスｎ＝４、ベタキソロールを注射したマウスｎ＝４；ｔ検定により＊＊ｐ＝０．００７６）。（Ｂ）冠状切片の模式図は、ＭｅＡにおける注射を示す。（Ｃ）マウスのＭｅＡにビヒクル（ｎ＝５）またはベタキソロール３０ｎｍｏｌｅ（ｎ＝５）のいずれかを注射した。ベタキソロールは、社会的学習に影響を及ぼさずにマウスにおける社会的認識を障害した。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。スケールバー、５０μｍ。（Ｄ）マウスのＭｅＡに、ビヒクル（ｎ＝４）またはＰＫＡインヒビター（２．７５ｎｍｏｌｅ  ｎ＝５）のいずれかを注射した。ＰＫＡ阻害は、空のカップよりも不慣れな同種に対するマウスの好み（ｐｒｅｓｅｎｃｅ）に影響を及ぼさなかったが（対応のあるｔ検定により、ビヒクル処置したマウス：＊ｐ＝０．０４７、およびＰＫＡインヒビターで処置したマウス：＊ｐ＝０．０２）、マウスが新しい同種と慣れた同種との間を認識する能力を障害した（対応のあるｔ検定により、ビヒクル処置したマウス＊ｐ＝０．０３１、およびＰＫＡインヒビターで処置したマウス：ｎｓ）。
【図５】図５は、ＣＲＥＢリン酸化が社会的認識に必要であることを示す図である。（Ａ）社会性獲得（ｓｏｃｉａｌ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）（ＳＡ）前（ベースライン）（ｎ＝６）、社会性獲得直後３分（ｎ＝６）または５分（Ｎ＝５）、および５分の社会性獲得１０分後（ｎ＝６）、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのＭｅＡ抽出物に対して行ったｐＣＲＥＢのウエスタンブロット分析。ｐＣＲＥＢ発現は、ベースライン値と比べた場合、社会的学習５分後に有意に増大し（＊，一元配置ＡＮＯＶＡの後、事後検定（（＊＊，ｐ＝０．０３３３）））、社会的学習完了１０分後に低減した（＊＊，一元配置ＡＮＯＶＡの後、事後検定（（＊＊ｐ＝０．０３３３））。相対的光学密度をＣＲＥＢに対して正規化する。（Ｂ）社会的学習６０分前にベタキソロール（１ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（１群あたりｎ＝５）を全身注射し、社会的相互作用の５分後に安楽死させた、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのＭｅＡ抽出物に対して行ったｐＣＲＥＢのウエスタンブロット分析。ｐＣＲＥＢ発現は、ベタキソロールの注射で有意に低減した（ｔ検定により＊ｐ＝０．０１１３）。（Ｃ）安楽死５分前（Ｎ＝６）、１５分前（ｎ＝６）、および３０分前（ｎ＝５）にβ１−ＡＤＲ部分アゴニストであるキサモテロール（３ｍｇ／ｋｇ）を全身注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスのＭｅＡ抽出物に対して行ったｐＣＲＥＢのウエスタンブロット分析。ｐＣＲＥＢ発現は、ベースラインに比べて、注射５分後に増大した（ｎ＝５）（＊，一元配置ＡＮＯＶＡの後、事後検定（＊ｐ＝０．０４１５））。相対的光学密度をＣＲＥＢに対して正規化する。（Ｄ）社会的学習前にキサモテロール（ｎ＝４ＡＰＰ、ｎ＝５ＷＴ）またはビヒクル（ｎ＝４ＡＰＰ、ｎ＝４ＷＴ）を注射したＡＰＰマウスおよびＷＴ対照の内側扁桃体の核画分のウエスタンブロット分析は、核のｐＣＲＥＢのレベルはＡＰＰマウスにおいてより低く（＊，一元配置ＡＮＯＶＡの後、事後検定）、キサモテロールを注射した群において有意に高かった（＊＊，一元配置ＡＮＯＶＡの後、事後検定（＊＊，ｐ＝０．０１１））。相対的光学密度をヒストンＨ３に対して正規化する。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。
【図６】図６は、β１−ＡＤＲをベタキソロール（１ｍｇ／ｋｇ）でブロックすると、非社会的匂い認識および物体認識と無関係に、社会的認識を障害することを示す図である。（Ａ）３チャンバー社会的認識試験において、試験の学習段階の前にベタキソロールを全身注射しても、空のカップよりも、カップ中の不慣れな侵入者に対するマウスの好みを変更しなかった（対応のあるｔ検定により、ビヒクル注射したマウスｎ＝１０＊＊＊ｐ＝０．０００５；対応のあるｔ検定により、ベタキソロールを注射したマウスｎ＝１０＊＊ｐ＝０．００１５）。しかし、ベタキソロールは社会的認識を障害し：ベタキソロールを注射したマウスは慣れた侵入者より新規な侵入者に対する好みを示さなかったが（対応のあるｔ検定によりｐ＝０．７１２７）、ビヒクル注射したマウスはこの好みを示した（対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＝０．００８２）。（Ｂ）ベタキソロールは非社会的な匂い認識を障害せず：非社会的な匂いの馴化、脱馴化、および認識の試験において、ビヒクル注射したマウス（ｎ＝１０）およびベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝１０）の両方を、非社会的な匂い（水およびバニラ）に３連続曝露の経過にわたって馴化し、新しい匂いを提示した場合に脱馴化した（水の馴化：ビヒクル＊＊＊ｐ＜０．０００１；ベタキソロールτττｐ＜０．００１；水の馴化：ビヒクル＊＊ｐ＝０．００１１；ベタキソロールτττｐ＜０．００１；バニラの馴化：ビヒクル＊＊＊ｐ＝０．０００１；ベタキソロールτττｐ＝０．００２９）。バニラ臭を３回目に提示したときに嗅ぐ時間に対して、ミント臭を提示したときに嗅ぐ時間が長いことによって指摘される通り、マウスは全て、以前に提示された匂い（バニラ）と新しい匂い（ミント）の間を識別することもできた（ビヒクル＊＊ｐ＝０．００２５；ベタキソロールττｐ＝０．００１７）。（ＣおよびＤ）マウスが、新しい匂いまたは物体よりも慣れた匂いまたは物体をそれぞれ認識する能力は、ベタキソロールによる影響を受けなかった。ビヒクル注射したマウス（ｎ＝１０対応のあるｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００１）およびベタキソロールを注射したマウス（ｎ＝１０対応のあるｔ検定により＊＊ｐ＝０．００１５）は両方とも、物体認識試験において、慣れた匂いまたは物体よりも新しい匂いまたは物体を好んだ。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。
【図７】（Ａ）ｃ−Ｆｏｓ発現は、社会的認識９０分後、ＭｅＡにおいて誘発される。対照マウス（ｎ＝４）および社会的認識課題に曝したマウス（ｎ＝＄）において、ｃ−Ｆｏｓ陽性細胞の定量を、不偏立体解析方法（ｎｏｎ−ｂｉａｓｅｄ  ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて行った（ｔ検定により＊ｐ−０．０３０３）。（Ｂ）ｃ−Ｆｏｓ発現は、社会的認識後、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）では誘発されなかった。ｃ−Ｆｏｓ陽性細胞の定量を、対照マウス（ｎ＝４）および社会的認識課題に曝したマウス（ｎ＝４）において、不偏立体解析方法を用いて行った（マンホイットニー検定によりｐ＝０．４８５７）。（Ｃ）社会的認識課題における試験前にベタキソロールを注射しても、社会的記憶に関与せずβ１−ＡＤＲの乏しい脳領域である視床における、ｃ−Ｆｏｓ陽性細胞（ＰＶ）の数に影響を及ぼさなかった（ビヒクル注射したマウス（ｍｉｃ）ｎ＝４；ベタキソロールを注射したマウスｎ＝４；マンホイットニー検定によりｐ＝０．８５７１）。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。スケールバー、１００μｍ（拡大した四角）および２００μｍ。
【図８】図８は、対照マウスおよびＡＰＰマウス（１群あたりｎ＝４）の内側扁桃体からの全組織ホモジネートに対して行ったｐＣＲＥＢのウエスタンブロット分析を示し、ｐＣＲＥＢレベルがＡＰＰマウスにおいて有意に高かった（＊，マンホイットニー検定によりｐ＝０．０２８６）ことを示す図である。相対的光学密度をＣＲＥＢに対して正規化する。データは平均値±ＳＥＭとして表したものである。
【図９】図９は、β１−ＡＤＲアゴニスト化合物（またはそれらのプロドラッグもしくは誘導体）の、例えば、ＡＤに対する治療薬などとしての作業モデルを示す図である。β１−ＡＤＲの活性化は、認知機能の回復に加えて、独特な疾患修飾効果を提供することができる。
【図１０】図１０は、ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、および自閉症を処置するための治療用化合物としての、個々の化合物およびそれらのプロドラッグの、有効性を決定するために用いる方法を示す図である。
【図１１】図１１は、キサモテロールはβ１−ＡＤＲアゴニストとしてｃＡＭＰシグナリングを刺激するが（Ａ）、βアレスチン経路に対して効果がない（Ｂ）、キサモテロールの薬理学を示す図である。対照的に、イソプレナリンはｃＡＭＰおよびβアレスチン経路の両方を活性化する。
【図１２】図１２は、コンテクスト記憶（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  ｍｅｍｏｒｙ）の障害をもたらす、単一用量（１ｍｇ／ｋｇ）のβ１−ＡＤＲアンタゴニストであるベタキソロールで処置したＣ５７ＢＩ／６マウスを示す図である。
【図１３】図１３は、Ｔｈｙ１−ＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスに観察される、社会的記憶（Ａ）および作業記憶（Ｂ）における欠陥は、キサモテロールを短期的に皮下投薬することによりレスキューされることを示す図である。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１．Ｎｏｎ−ｔｇ：非トランスジェニック）。
【図１４】図１４は、Ｔｈｙ１−ＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋（Ｔｇ）マウスの内側扁桃体におけるβ１−ＡＤＲ発現の上方制御が、ＤＡＢ染色により検出されることを示す図である。（＊ｐ＜０．０５；Ｎｏｎ−Ｔｇ＝非トランスジェニック）。
【図１５】図１５は、５ＸＦＡＤマウスにおけるキサモテロールの長期的な投薬の効果を示す図である：（Ａ）陳述記憶における欠陥（識別比はチャンスレベル（ｃｈａｎｃｅ  ｌｅｖｅｌ）を有意に超えない）は、キサモテロール処置によりレスキューされる。（ＢおよびＣ）モリスの水迷路における成績（逃避の潜伏期−Ｂおよび接触走性における時間−Ｃ）は処置で改善される。Ｎｓ：チャンスレベルを有意でなく超える；＊ｐ＝０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．００１。キサモテロールの長期的投薬は、小グリア細胞およびＡβプラークのクリアランスの活性化を増大した。（Ｄ）上列、抗Ｉｂａ１抗体（活性化された小グリア細胞に対する）；下列、６Ｅ１０抗アミロイドＡＢ抗体：で染色した５０μｍ冠状切片に対するＤＡＢ染色。
【図１６】図１６は、キサモテロールでの長期的処置（３ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ、３か月）は、心臓切片のマッソントリクローム染色法により測定した、心筋構造における変化を生じなかったことを示す図である（Ａ）。キサモテロール／ビヒクルで３か月間処置した野生型マウスは、心筋線維症（Ｂ）、および左心室対右心室（ＬＶ／ＲＶ）比（Ｃ）における有意差を示さなかった。キサモテロール／ビヒクルで３か月間処置した野生型マウスは、心血管機能における有意差を示さなかった（Ｄ）。体血圧（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）：ｓｙｓＢＰ；拡張期血圧：ｄｉａｓｔＢＰ；心拍数；駆出率：ＥＦ；短縮率：ＦＳ；心臓重量／体重：ＨＷ／ＢＷ（ｎ＝３）。
【図１７】図１７は、キサモテロールの構造、ならびにＲ１およびＲ２と指定される基の付加での構造上の修飾のためのいくつかの位置を示す図である。Ｒ１およびＲ２の例として、アシル、カルバミル、およびオキソアゾリジル（ｏｘｏａｚｏｌｉｄｙｌ）がある。加えて、キサモテロール分子において、−ＮＨ−基を誘導体化することによって加水分解可能なプロドラッグを形成してもよい。例えば、その全体が本明細書に援用される、Ｕ．Ｓ．８，８６５，９２０に記載される通り、−ＮＨ−基をアシル化してもよい。本発明において、構造上の修飾を形成するために用いられる基を用いて、キサモテロールおよび他のβ１−ＡＤＲアゴニストのプロドラッグを形成し、この修飾によりプロドラッグはより親油性になり、ＣＮＳバイオアベイラビリティはβ１−ＡＤＲアゴニストよりも大きい。
【図１８】図１８は、キサモテロールの親油性プロドラッグ（１〜４）およびこれらのＣｌｏｇＰ値の例を示す図である。この図ではＲ１およびＲ２の両方が用いられているが、Ｒ１またはＲ２いずれかの単独を有するプロドラッグが企図される。
【図１９】図１９は、Ｒ１のみを用いる、本発明によるキサモテロールの特定の例示的なプロドラッグを示す図である。これら２つの例ではＲ２は用いられない。
【図２０】図２０は、ＡＤの前臨床動物モデルにおいてプロドラッグを試験するための模式図を示す図である。
【図２１】図２１は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルであるＴｈｙ１−ｈＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋系統トランスジェニックマウスにおける、キサモテロールの行動効果を示す図である。（Ａ）は、キサモテロールでの長期的処置は、これらトランスジェニックマウスにおける多動性表現型の用量依存的な逆転を生じることを示す。（Ｂ）は、キサモテロールでの長期的処置は、恐怖条件付け試験によって決定される認知機能における用量依存的な改善を生じることを示す。これは、ＡＤＤおよびＡＤＨＤの処置におけるプロドラッグの潜在的な有用性を実証するものである。
【図２２−１】図２２は、キサモテロールプロドラッグはｃＡＭＰシグナリング経路を活性化せず、プロドラッグはｉｎ  ｖｉｖｏでキサモテロールに変換されることを示す図である。（Ａ）は、キサモテロール、ならびに２つのプロドラッグである（ＡＴ−００１）および（ＡＴ−００２）の分子構造、ならびにｃＡＭＰシグナリング経路に対するこれらの薬理学的効果を示す。（Ｂ）は、２つのプロドラッグを経口注入した後の、キサモテロールならびにＡＴ−００１（上）およびＡＴ−００２（下）の血漿濃度対時間プロファイルを示す。キサモテロールの血漿レベルは、プロドラッグがｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解されてキサモテロールを生成するのに必要とされる時間、およびキサモテロールを生成する程度を反映する。両方のプロドラッグに対して、投薬は経口的に行った。
【図２２−２】図２２は、キサモテロールプロドラッグはｃＡＭＰシグナリング経路を活性化せず、プロドラッグはｉｎ  ｖｉｖｏでキサモテロールに変換されることを示す図である。（Ａ）は、キサモテロール、ならびに２つのプロドラッグである（ＡＴ−００１）および（ＡＴ−００２）の分子構造、ならびにｃＡＭＰシグナリング経路に対するこれらの薬理学的効果を示す。（Ｂ）は、２つのプロドラッグを経口注入した後の、キサモテロールならびにＡＴ−００１（上）およびＡＴ−００２（下）の血漿濃度対時間プロファイルを示す。キサモテロールの血漿レベルは、プロドラッグがｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解されてキサモテロールを生成するのに必要とされる時間、およびキサモテロールを生成する程度を反映する。両方のプロドラッグに対して、投薬は経口的に行った。
【図２３】図２３は、Ｓ−エナンチオマーはβ１−ＡＤＲアゴニズムにおいてＲ−エナンチオマーより約５００倍強力であるため、キサモテロールのＲ−およびＳ−エナンチオマーは明確に異なる薬理学的活性を有することを示す図である。キサモテロール（Ｒ，Ｓ）、キサモテロール（Ｓ）、およびキサモテロール（Ｒ）についてのＥＣ５０（ｎＭ）値はそれぞれ、１１．６、２１．２、および１１９００である。これらは、キサモテロール（ラセミ体）、ならびにキサモテロールのＲ−およびＳ−エナンチオマーについての濃度−応答曲線である。
【図２４】図２４は、ＡＴ−００２での皮下（ｓｕｂＱ）投薬により、ｉｎ  ｖｉｖｏの加水分解からキサモテロールの高血漿レベルがもたらされる、迅速性を示す図である。ｓｕｂＱ注射はおそらく、キサモテロールの親油性プロドラッグを投与して高血漿レベルのキサモテロールを達成する、最も速く、最も効果的な手段である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、いくつかの根本的な発見に基づく。第１に、本発明者らは、β１−ノルアドレナリン作動性シグナリングは社会的認識の認知機能を制御し、ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、および／または自閉症などの神経変性疾患を処置するための治療標的として用いることができることを発見した。
【００１２】
第２に、本発明者らは、Ｔｈｙ１−ｈＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスは社会的認識の欠陥を表すことも発見した。本発明者らはまた、選択的β１−ＡＤＲアンタゴニストであるベタキソロールで処置したＷＴマウスは、β１−ＡＤＲ発現性細胞におけるｃ−Ｆｏｓ活性化の低減、およびＭｅＡにおけるｐＣＲＥＢレベルの低減に関連する社会的認識の欠陥を表すことも発見した。加えて、ＰＫＡインヒビターをＭｅＡに直接注射すると、同様の社会的認識の欠陥をまねくことが観察された。
【００１３】
第３に、本発明者らは、キサモテロールなどのβ１−アドレナリン作動性受容体アゴニストは、核のｐＣＲＥＢのレベルを増大することにより、Ｔｈｙ１−ｈＡＰＰＬｏｎｄ  Ｓｗｅ＋マウスの社会的認識の欠陥などをレスキューすることを発見した。
【００１４】
第４に、本発明者らは、アゴニストによってβ１−ＡＤＲを活性化すると多動性を低減または阻害することも発見し、よって注意欠陥障害（ＡＤＤ）および／または注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を処置する方法を提供する。
【００１５】
第５に、本発明者らは、β１−ＡＤＲをアゴニスト的に刺激すると社会的記憶を増強するためのメカニズムをもたらし、これはＤＳおよび／または自閉症で生じる、社会的記憶における観察できる低下を処置するための有利な方法であることも発見した。実際、本発明者らは、β１−ＡＤＲの活性化は社会的認識に必要であることを発見した。
【００１６】
第６に、本発明者らは、親油性の増強を有するキサモテロールの様々なプロドラッグは、本明細書に開示する使用のためにバイオアベイラビリティの増大を提供することを発見した。
【００１７】
第７に、本発明者らは、キサモテロールの様々なプロドラッグのＲ−エナンチオマーとＳ−エナンチオマーとの間の活性における違いを有利に用いて、認知の改善の増強および多動性の逆転を生じる高β１−ＡＤＲアゴニスト活性を有するエナンチオマーを提供することができることも発見した。
【００１８】
第８に、本発明者らは、キサモテロールのＲ−またはＳ−いずれかのエナンチオマープロドラッグを調製するためのエナンチオ選択的合成、およびラセミ体の（ｒａｃｅｍｃ）キサモテロールまたはそのプロドラッグを調製するための合成手順をさらに発見した。
【００１９】
本発明は、一部には、あらゆるβ１−ＡＤＲアゴニストの親油性のプロドラッグに関する。しかし、キサモテロールの親油性のプロドラッグが特に有利である。キサモテロールは、式：
ＨＯ−Ｐｈｅ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ＊ＨＯＨ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−モルホリン
を有し、式中、Ｐｈｅはフェニルであり、末端のＯＨおよびＯＣＨ２は相互にパラであり、モルホリンはモルホリン環であり、＊はキラル炭素を意味する。−Ｃ（＝Ｏ）−はカルボニル基を表す。キサモテロールの構造表現は、図１７における上の式を参照されたい。
【００２０】
一般的に、キサモテロールの親油性化合物は、加水分解可能な基が両方とも親油性であり、分子全体の親油性を増強し、この加水分解可能な基がｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解可能であるならば、加水分解可能な基を、フェニル環に結合している末端の−ＯＨ基に、またはキラル炭素に結合しているヒドロキシ基に、または両方に共有結合することにより調製される。このような加水分解可能な基の非限定的な例として、アシル、カルバメートエステル、およびオキソアゾリジン基がある。一般的に、これらの基は全て、実質上、末端のフェニルヒドロキシル基に対する、またはキラル炭素に結合しているヒドロキシ基に対する、または両方に対する親油性のブロッキング基として用いることができ、これらの基はｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解可能であり、ラセミ体の、または（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−エナンチオマーのいずれかとして遊離のキサモテロールを放出する。これらの同じ基をまた、ノルアドレナリン、イソプレナリン、またはドブタミンなどのあらゆるβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物の末端のヒドロキシ基でエステルを形成するのに用いて、例えば、親油性を改善し、よってバイオアベイラビリティおよびＣＮＳアベイラビリティを改善してもよい。ノルアドレナリンおよびイソプレナリンの両方とも、末端のフェニルヒドロキシ基を２個、および２級ヒドロキシ基を１個有する。ドブタミンは末端のフェニルヒドロキシ基を３個有するが、２級ヒドロキシ基がない。よって、キサモテロールに対して以下に記載する方法は、例えば、ノルアドレナリン、イソプレナリン、およびドブタミンなどのあらゆる他のβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物との使用を特に企図するものである。
【００２１】
ＮＡ系は、最も過小評価されているが重要な、ＡＤにおける神経薬理学的標的を表す。ＡＤ患者からの死後の脳は、脳におけるＮＡの主な供給源である青斑核（ＬＣ）の、進行性かつ広範な変性を示す。ＮＡの皮質レベルの低下、ならびにアドレナリン作動性受容体（ＡＤＲ）およびＮＡトランスポーターの発現の変化などの生化学的変化も、ヒトＡＤ患者およびＡＤマウスモデルの両方において記載されている。重要なのは、ＮＡの病理が、ＡＤのいくつかの主要な側面に相関することが見出されたことである。さらに、ＮＡには、学習および記憶に関連する皮質回路およびシナプス機能に対して、十分に確立された効果がある。
【００２２】
ＮＡニューロンの低下は、認知症の重症度と正に相関することが示されており、神経毒素であるＮ−［２−クロロエチル］−Ｎ−エチル−２−ブロモベンジルアミンを用いたＬＣの化学的アブレーションは、ＡＤのトランスジェニックマウスモデルにおける認知欠陥を増悪することが示された。さらに、ＮＡ系の機能不全は、ボクサー痴呆、軽度認知障害、ウェルニッケ−コルサコフ症候群、およびダウン症候群を含めた記憶障害を特徴とする他の疾患において関係づけられた。ＬＣニューロン変性およびＮＡ欠損は、アミロイド斑および神経原線維変化の組織負荷を含めた、ＡＤのいくつかの病理学的特徴に強力に相関することも示された。実際、ＮＡ欠損とＡＤの神経病理学的特徴との間の相関は、炎症性応答におけるＮＡ欠損の重要な役割によって説明することができる。例えば、ＮＡは小グリア細胞を活性化することができ、小グリア細胞は、βアミロイドペプチド（Ａβ）を分解するタンパク分解酵素の分泌、およびＡβのエンドサイトーシスの媒介の両方による神経保護機能を有し得ることが示された。
【００２３】
本発明者らは、β１−ＡＤＲが社会的認識および記憶において重要な役割を果たし、よってアルツハイマー病などの神経変性障害のためこれらの形質における不全症を有するヒトにおける、認知および社会的認識／社会的記憶を改善することを意図する治療法において利用することができることを発見した。本発明者らは、薬理学的ツールおよび分子ツールを用いてＡＤのＴｈｙ１−ＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ（ＡＰＰ）マウスモデルにおける社会的認識／記憶を調査し、ＡＰＰマウスに観察される社会的認識の欠陥は、ＭｅＡにおけるβ１−ＡＤＲシグナリングにおける異常に関連することを示した。ＡＰＰマウスにおけるβ１−ＡＤＲの薬理学的活性化およびｐＣＲＥＢレベルの回復は、ＡＤのこのモデルにおいて別の方法で検出される社会的記憶の欠陥をレスキューする。本発明者らの結果は、ＭｅＡにおけるβ１−ＡＤＲおよびＣＲＥＢのリン酸化は、正常な脳機能下の社会的学習に不可欠なシグナリングカスケードであることを初めて実証するものである。
【００２４】
多くの異なる化合物、およびこれらの化合物の組合せ、およびこれらの薬理学的に許容される塩は、本発明によるβ１−ＡＤＲアゴニストとしての使用が明白に企図される。
【００２５】
例えば、キサモテロール、イソプレナリン、ドブタミン、およびドパミン、またはこれらの塩などの化合物をβ１−ＡＤＲアゴニストとして用いてもよい。加えて、プロドラッグ−誘導体、またはプロドラッグ−化合物、例えば、分子のヒドロキシル基の官能基化によるアシル誘導体またはアミド誘導体、およびこれらの塩も用いることができる。しかし、特に興味深いのは、アシル化された末端のフェニルヒドロキシル基を有するキサモテロールのプロドラッグ化合物、ならびにキサモテロールのこれらのプロドラッグ化合物のＲ−およびＳ−エナンチオマーである。これらの化合物をさらに、以下により詳しく記載する。
【００２６】
用語の定義：
以下に示す語は本明細書を通して用いるものであり、以下に規定する意味を有する。
【００２７】
神経変性障害：一般通念および知見により、ヒトを含めた哺乳動物のクラスに予想される通常または典型的な認知または社会的記憶または社会的記憶を表す、ヒトを含めた正常または対照の哺乳動物に比べて認知または社会的認識または社会的記憶の低下を表す状態、障害、または疾患を表す、ヒトを含めた哺乳動物に引き起こされるあらゆる神経変性性の状態、障害、または疾患を意味する。このような状態、障害、または疾患の非限定的な例として、アルツハイマー病（ＡＤ）、および／または自閉症がある。
【００２８】
社会的認識：非ヒト哺乳動物の場合は確立された試験により、および行動または発語によって指摘されるヒトによる顔面認識により測定される、ヒトを含めた他の哺乳動物を認識する、ヒトを含めた哺乳動物の能力を意味する。
【００２９】
ＭｅＡ：内側扁桃体を意味する。
【００３０】
ＰＫＡ：一ファミリーの酵素であるプロテインキナーゼＡを意味する。
【００３１】
ＣＲＥＢ：ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）と呼ばれるある種のＤＮＡ配列に結合する細胞転写因子である、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質を意味する。その転写がＣＲＥＢによって制御される遺伝子には、例えば、ｃ−ｆｏｓ、ニューロトロフィンＢＤＮＦ、および多くの神経ペプチド、例えばソマトスタチンが含まれる。
【００３２】
ｃＡＭＰ：環状アデノシン−３’，５’−一リン酸を意味する。ｃＡＭＰ依存的経路は、アデニル酸シクラーゼ経路を意味する。
【００３３】
ベータ−１ＡＤＲまたはβ１−ＡＤＲ：β１−アドレナリン作動性受容体を意味する。
【００３４】
ベータ−１ＡＤＲアゴニストまたはβ１−ＡＤＲアゴニスト：β１−ＡＤＲに対して完全または部分的いずれかのアゴニズムを表す、あらゆる化合物または薬学的に許容されるその塩を意味する。このような化合物の例には、キサモテロール、イソプレナリン（イソプロテレノールとしても知られる）、ドブタミン、ノルアドレナリン、またはドパミンが含まれる。
【００３５】
プロドラッグ−化合物：ｉｎ  ｖｉｖｏの化学的または酵素的な変換を受けて活性な化合物または親薬物を放出する、化学修飾されたバージョンの薬理学的に活性な化合物を意味する。より具体的に、化学的または酵素的な変換を受けやすい機能的部分が薬理学的に活性な化合物に付着して、薬物の標的化を改善する。例えば、β１−ＡＤＲ親（すなわち誘導体化されていない）化合物のヒドロキシル基から官能基化されたアシル誘導体またはアミド誘導体を、プロドラッグ誘導体または化合物の例として記載することができる。アシル部分またはアミド部分を親化合物に付加することにより、親化合物のバイオアベイラビリティを、誘導体化されていない親化合物に比べて改善することができる。本明細書における「誘導体」との用語は、「プロドラッグ化合物」と交換可能に用いられる。アシル化された末端のフェニルヒドロキシル基または２級ヒドロキシ基または両方を有するキサモテロールのプロドラッグ化合物が、本発明に特に有利であり、この場合、アシル基のＲ１またはＲ２基は、両方に対する炭素の合計５から３０個、好ましくは９または１０から３０個であってよい。Ｒ１およびＲ２の両方をさらに、以下により詳しく規定する。本明細書で用いる「誘導体化された」との用語は、対応するβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物から、Ｒ１またはＲ２基を含有するプロドラッグのβ１−ＡＤＲ化合物の形成を意味する。
【００３６】
塩：有機酸および無機酸両方の付加塩を含めた、薬学的に許容される塩を意味する。有機酸塩の例には、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、ヘミフマル酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、安息香酸塩、およびアジピン酸塩が含まれる。無機酸塩の例には、例えば、塩酸塩、臭素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩が含まれる。
ｃｌｏｇＰ：オクタノール／水の分配係数として溶解性またはむしろ疎水性の差の尺度である、算出されたｌｏｇＰを意味する。一般的に、−０．５０など、ｌｏｇＰが負の値であれば、生体吸収が不十分であり、バイオアベイラビリティが低いことを示す。１．００など、ｌｏｇＰが正の値であれば、生体吸収が良好で、バイオアベイラビリティが良好であることを示す。本発明は、リードまたは親のβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物に比べて親油性の増強を有する、β１−ＡＤＲアゴニスト化合物誘導体またはプロドラッグの調製および使用を特に開示し、一般的に、誘導体またはプロドラッグに対するｃｌｏｇＰ値は、リード化合物または親化合物に対するｃｌｏｇＰ値より、少なくとも＋０．５０、好ましくは少なくとも＋１．００ｌｏｇＰ値大きい。ｃｌｏｇＰの差が少なくとも＋１．５０ｌｏｇＰ値であるのがより好ましい。ｃｌｏｇＰ値は高いほどよい。
【００３７】
本発明は、β１−ＡＤＲアゴニスト化合物、およびそのプロドラッグまたは誘導体を提供する。β１−ＡＤＲアゴニスト化合物の具体的な例には、イソプレナリン、ドブタミン、ノルアドレナリン、ドパミン、およびキサモテロールなどが含まれる。これらβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物の様々なプロドラッグには、例えば、これらアゴニスト分子の末端のフェニルヒドロキシル基または２級ヒドロキシ基が誘導体化されてそれぞれＲ１またはＲ２基を形成する化合物が含まれ、これらの基は、例えば、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−低級アルキル、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−アミノアルキル、または−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−フェニル、または−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−置換フェニルであってよい。これらのアゴニスト分子が２級ヒドロキシル基も有する場合、これらの基が誘導体化されてＲ２基を形成してもよく、この場合Ｒ２はＲ１に対して規定する通りであってよい。Ｒ１およびＲ２の両方に対して、低級アルキルは、直鎖または分枝鎖アルキルであってよいＣ１〜Ｃ６アルキルを意味する。アミノアルキルは−ＮＨ−アルキルを意味し、アルキルはＣ１〜Ｃ６直鎖または分枝鎖アルキルを意味する。フェニルは自己規定的であり、置換フェニルは、１つまたは複数の低級アルキル、ハロ、またはヒドロキシル基で置換されているフェニルを意味する。ここで低級アルキルは、直鎖または分枝鎖であってよいＣ１〜Ｃ６アルキルを意味する。誘導体化は親のβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物の親油性を増大する目的であるため、本明細書における「誘導体」との用語は「プロドラッグ」と交換可能に用いられることが再び留意される。「親」との用語は、誘導体化前のβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物または「リード化合物」を単に意味する。一般式Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−のアシル化された末端のフェニルヒドロキシル基を有するキサモテロールのプロドラッグ化合物が特に有利であり、式中、Ｒは、プロドラッグ分子全体の親油性をキサモテロールに比べて改善する親油性基であり、Ｒは、非置換、または１から４個の低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、もしくはハロで任意選択で置換されている、直鎖状、分枝状、または環状、またはこれらの組合せである炭素原子５から３０個を有し、環状基は、ヘテロ原子０、１、または２個を含有する５員または６員環であり、前記ヘテロ原子は、−Ｏ−または−Ｎ−または両方であり、前記環状基は飽和され、または不飽和である。５員または６員環は例えば、ピロール、フラン、イミジゾリン（ｉｍｉｄｉｚｏｌｉｎｅ）、イミダゾール、ピラゾリジン、ピラゾール、ピリジン、またはピランであってよく、これらは記載する通り、非置換、または１から４個の低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、もしくはハロにより任意選択で置換されていてよい。ハロは、クロロまたはフルオロであってよいが、フルオロが好ましい。「低級」との用語は、本明細書の全ての構造上の定義および式において、例えば、低級アルキルまたは低級アルコキシなど、Ｃ１〜Ｃ６を意味する。プロドラッグ化合物内で結合される、ピロール、フラン、イミジゾリン、イミダゾール、ピラゾリジン、ピラゾール、ピリジン、およびピラン環は、もちろんピロリル、フラニル、イミジゾリニル（ｉｍｉｄｉｚｏｌｉｎｙ��）、イミダゾリル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、ピリジニル、およびピラニルである。
【００３８】
便宜上、β１−ＡＤＲアゴニスト化合物のプロドラッグを形成するのに用いられるＲ１およびＲ２基は、Ｒ１が、末端のフェニルヒドロキシ基に付着している加水分解可能な基を意味し、Ｒ２が、図１７の下の構造に示す２級ヒドロキシ基に付着している加水分解可能な基を意味するよう、本出願を通して一貫して呼ばれる。
【００３９】
ＫＯ：ノックアウト（マウス）を意味する。
【００４０】
短期記憶：短期間の保存からの主要な、またはアクティブな記憶を意味し、ときに作業記憶と呼ばれる。
【００４１】
長期記憶：持続的に保存される情報を意味し、必要に応じて作業記憶と呼ぶこともできる。ヒトでは、長期記憶は、陳述記憶（意識上利用できる全ての記憶を含む）、ならびに手続記憶（身体の動き、および環境中で物体をどのように用いるかの記憶を伴う）に分けられる。陳述記憶は、具体的な事象に対するエピソード記憶、および世界に関する知識に対する意味記憶にさらに分けることができる。
【００４２】
社会的記憶：短期記憶に由来しても、または長期記憶に由来しても、作業記憶から、名前、顔、または物理的位置の認識を想起する能力を意味する。
【００４３】
生物可逆的：薬理学的に活性な薬剤のプロドラッグまたは誘導体を、加水分解（酵素により、またはｐＨ／酸化還元によりのいずれかであってよい）などにより、ｉｎ  ｖｉｖｏの変換を介して元の活性な化合物に容易に変換して戻すことができることを意味する。本明細書で用いる、生物可逆的および／または加水分解可能との用語は、他を凌ぐ一つのメカニズムを意味するものではない。
【００４４】
自閉症（または自閉症の）スペクトラム障害（ＡＳＤ）：重大な社会的な、コミュニケーションの、および行動の難題を引き起こし得る一群の発育障害を意味する。ＡＳＤは、症状の性質、症状が開始する時期、および症状の重症度など、様々なヒトに異なる方法で影響を及ぼす。例えば、ＡＳＤの症状には、測定される知能（ＩＱ）は変動するが、社会化および言語コミュニケーションの能力不十分、ならびに繰返し行動の症状発現が含まれ得る。様々な程度の知覚感受性も存在し得る。
【００４５】
ＡＮＯＶＡ：分散分析を意味する。
【００４６】
ＡＤＤ：注意欠陥障害を意味する。
【００４７】
ＡＤＨＤ：注意欠陥多動性障害を意味する。
【００４８】
ＡＤＭＥ：吸収、分布、代謝、および排泄を意味する。
【００４９】
ノルアドレナリン（ＮＡ）系およびβ１−ＡＤＲ化合物およびこれらの親油性誘導体
本発明は、ＮＡ欠損は、シナプス機能不全などのＡＤの複数の病理学的特徴、および認知症状に関連するという認識に、少なくとも部分的に基づくものである。本発明は、ＮＡ伝達を増大する薬理学的変調により、例えば現在の方法よりも、ＡＤを処置するのにより包括的な、かつより包括的な取組みを提供することができるという発見に部分的に基づく。図９は、β１−ＡＤＲの活性化が、認知機能の回復に加えて両方のＡＤ疾患修飾効果を提供する、本明細書に開示する取組みを説明するものである。
【００５０】
具体的に、図９において、β１−ＡＤＲによりＮＡシグナリングを回復すると、介在ニューロンにおける脱分極の制御および認知機能に必要な神経伝達の下流の変調に必要な、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを増大することにより、ＡＤに関連する認知低下がレスキューされる。β１−ＡＤＲの活性化は、小グリア細胞活性に対するその効果によりＡβ病理に対する神経保護的な潜在性を付与することによって、付加的な利点を提供する。さらに、β１−ＡＤＲ活性化によるｃＡＭＰの増大は、サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の放出を阻害することにより、細胞およびシナプスの喪失を軽減し、可能な神経炎症を軽減する。
【００５１】
さらに、ＡＤを処置するための治療標的としてβ１−ＡＤＲを用いることに加えて、本発明は、心機能に対する不要な末梢効果を最小に維持しながら、中枢神経系におけるβ１−ＡＤＲの下流のシグナリングカスケードの標的化も特に開示する。本発明にしたがって調製したプロドラッグの評価において用いるための詳しい模式図を、図１０に示す。模式図に示す手順により、末梢効果が最小で親油性が改善されたため脳分布が改善された、β１−ＡＤＲアゴニスト誘導体の同定およびさらなる開発の両方が可能になる。これは、β１−ＡＤＲ化合物の、合成された生物可逆的な、すなわち加水分解可能な誘導体の、ライブラリまたはカタログの調製も提供する。本明細書で用いる「生物可逆的な」との用語は、このβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物のプロドラッグから親のβ１−ＡＤＲ化合物を放出するようにｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解可能であることを意味する。
【００５２】
合成したプロドラッグは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの吸収、分布、代謝、および排泄などの一式の試験（集合的にＡＤＭＥ試験として知られる）に供され、ＡＤＭＥの性質に基づいて構造−性質相関（ＳＰＲ）が開発される。これらの試験または評価は反復的に行われ、得られたＳＰＲは、そのプロドラッグの形成と組み合わされて、さらなるプロドラッグ化合物のデザイン、ならびにさらに新しい合成β１−ＡＤＲアゴニスト化合物を導くのに用いられる。有望なＡＤＭＥの性質を表す、誘導体化されたβ１−ＡＤＲ化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ生体分布および薬物動態学的研究に進められる。最も好ましいＡＤＭＥおよび薬物動態学的（ＰＫ）性質を有する２つの化合物が、ＡＤに対する前臨床モデルにおいて試験される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方のＰＫ性質、ならびに前臨床動物モデル研究から得たｉｎ  ｖｉｖｏの有効性に対するデータを含有する、標的産物プロファイル（ＴＰＰ）が、これらの試験に供されるβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物の各誘導体に調製される。
【００５３】
加えて、β１−ＡＤＲに対するアゴニスト効果を表す、公知のβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物または他のリガンドを文献から得、上記に示す試験に供するために誘導体化してもよい。ＴＰＰはまた、包括的なカタログまたはライブラリを形成するために、これらの誘導体用に調製される。
【００５４】
キサモテロール
あらゆるβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物、またはβ１−ＡＤＲに対してアゴニスト効果を表すリガンドを誘導体化に用いることができ、キサモテロールは、ＡＤの処置において用いられるいくつかの特徴的な薬理学的性質を表すことが見出されている。第１に、本発明者らは、キサモテロールはｃＡＭＰカスケードを選択的に活性化する一方で、βアレスチンシグナリング経路に対して最小の活性しか表さないことを発見した。図８は、キサモテロールのこの薬理を説明するものである。キサモテロールは、β１−ＡＤＲに対するアゴニストとして、ｃＡＭＰシグナリングを刺激して、アゴニストであるイソプレナリンに対して最大応答の約６０％を誘発することが注目される（Ａ）。一方、キサモテロールは、ｃＡＭＰおよびβアレスチン経路の両方を活性化する無差別のイソプレナリンとは対照的に、βアレスチン経路に対して効果がない（Ｂ）。βアレスチンは、心機能の制御における役割を有するβ２−ＡＤＲに対するシグナル伝達を制御するタンパク質のファミリーである。
【００５５】
βアレスチンシグナリング活性を欠くなどのキサモテロールの機能上の選択性には、一貫した、かつ持続的な有効性という、第２に重要な意味がある。より具体的に、アゴニスト治療法の治療上の有用性はしばしば、βアレスチンシグナリング依存的受容体の脱感作によって媒介される、耐性およびタキフィラキシーの発生により制限される。実際、ラット心室を用いた動物研究は、キサモテロールを長期間投与してもβ１−ＡＤＲ密度またはアデニル酸シクラーゼ共役効率の低減を誘発しないことを示した。
【００５６】
キサモテロールの第３に重要な性質は、密接に関係のある受容体β２−ＡＤＲを凌ぐβ１−ＡＤＲに対する亜型の選択性である。β１−ＡＤＲはアデニル酸シクラーゼに普遍的に共役し、アデニル酸シクラーゼの活性化はＣＲＥＢリン酸化のレベルの上昇をまねく。したがって、β１−ＡＤＲを活性化すると、ＣＲＥＢ依存的記憶欠陥をレスキューすることが予想される。よって、キサモテロールの亜型の選択性は、特に、β１−ＡＤＲを介して認知機能を増強し、β２−ＡＤＲとの相互作用を回避することが予想される。
【００５７】
キサモテロールの第４に重要な性質は、本発明者らが実証する通り、キサモテロールがＢＢＢを通過し、中枢神経系に到達し、そこでＣＲＥＢリン酸化の増大を誘発し、認知機能促進（ｐｒｏ−ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ）効果を媒介することである。下記の表１および図９を参照されたい。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
図８は、マウスにキサモテロール３ｍｇ／ｋｇをｓ．ｃ．注射した、マウスの脳におけるｐＣＲＥＢ発現に対するキサモテロールの効果は、１５分後に脳中ｐＣＲＥＢの有意な増大を誘発することを説明するものである。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００６０】
上記のデータは全て、キサモテロールは、例えば、ＡＤの処置に対して著しい治療価値があることを示す。よって、例えば、キサモテロールの薬物動態学的性質およびＣＮＳアベイラビリティを増強するためにキサモテロールを誘導体化すると、ＡＤを処置するためのさらにより強力な化合物がもたらされる。
【００６１】
最後に、キサモテロールのさらなる利点は、キサモテロールは、いかなる重大な副作用もなく、ヒトに良好に耐容されることである。
【００６２】
キサモテロールでの実験
以前に、本発明者らは、選択的β１−ＡＤＲアンタゴニストであるベタキソロールの注射は、野生型（ＷＴ）動物における社会的記憶およびコンテクスト記憶を障害することを示した。とりわけ、社会的認識およびコンテクスト記憶は、単一用量のベタキソロール１ｍｇ／ｋｇで処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて障害されるようになった。β１−ＡＤＲ  ＫＯマウスは社会的認識の障害を有する一方、これらの対照の同腹仔またはβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスは、正常にふるまった  実験により観察されるチャンスレベル（ゼロ）に対して、＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００６３】
社会的記憶およびコンテクスト記憶の他に、Ｙ迷路試験に対するベタキソロールでの研究も、空間記憶におけるβ１−ＡＤＲの重要な役割を実証した。加えて、β１−ＡＤＲ  ＫＯマウスは、社会的記憶およびコンテクスト記憶の障害を表すが、β２−ＡＤＲ  ＫＯマウスの記憶機能は正常である。
【００６４】
まとめると、これらの結果は、様々な形態の認知機能におけるβ１−ＡＤＲの本質的な役割を示すものであり、β１−ＡＤＲシグナリングの回復は、ＡＤにおける認知機能を改善する治療戦略を提供することを示す。
【００６５】
さらに、本発明者らは、キサモテロール３ｍｇ／ｋｇを短期的に皮下（ｓ．Ｃ．）注射すると、ＡＤのＴｈｙ１−ＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスモデルにおける作業記憶および社会的認識の欠陥をレスキューすることを実証した。重要なことに、β１−ＡＤＲの制御されない発現が、内側扁桃体など、Ｔｈｙ１−ＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスの特定の脳領域に観察された。β１−ＡＤＲの発現の増大は、ＮＡに対するシナプス後発現が、ＬＣの変性にかかわらず依然として機能的であり、ＮＡシグナリングの障害を、ＡＤＭＥおよびバイオアベイラビリティの改善を有するβ１−ＡＤＲアゴニストおよびその親油性誘導体で回復することができることを示す。ＡＤの５ｘＦＡＤマウスモデルにおいて、キサモテロールの長期的経口投薬の認知障害に対する効果も観察された。とりわけ、３か月にわたるキサモテロール６ｍｇ／ｋｇの毎日経口用量は、５ｘＦＡＤマウスに観察される陳述記憶および空間記憶の欠陥をレスキューする。
【００６６】
β１−ＡＤＲ活性化に起因する副作用はない
予備研究において、心臓組織の組織学的検査は、キサモテロールで長期的に処置しても（３ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．、３か月間）、心線維症を誘発しないことを示した。同様に、キサモテロールで処置した野生型マウス（３ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．、３か月間）は、血圧（ＢＰ）、心拍数（ＨＲ）、駆出率（ＥＦ）、短縮率（ＦＳ）、および心臓重量：体重比により測定した心機能における病理学的変化を発症しなかった。さらに、心不全を有するヒトにおける臨床試験は、いかなる重症の副作用もなく、キサモテロールでの長期的処置の有効性（１日２回２００ｍｇ、２〜１２か月間）を示した。これは、例えば、ＡＤに対するキサモテロールでの長期的処置は、ヒトの心機能に対する正当性のない副作用に関係しないことを示すものである。
【００６７】
本発明を、ある種の非限定的な例によってさらに例示する：
【実施例】
【００６８】
材料と方法
動物。Ｃ５７Ｂｌ／６成体マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、＃０００６６４）、β２−ＡＤＲ（ノックアウト）ＫＯマウス（Ｄｒ．ＲＧ  Ｇｉｆｆａｒｄによって提供）、β１−ＡＤＲ  ＫＯマウス（Ｄｒ．Ｄ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎによって提供）、およびこれらに年齢をマッチさせた対照（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからのＦＶＢ／ＮＪマウス、＃００１８００）、およびＴｈｙ１−ｈＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウス（ＡＰＰ）、ＡＤのモデルを用いた。実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより承認されたプロトコールにしたがい、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに基づいて行った。
【００６９】
行動試験。社会的認識を、異なる２つの試験：Ｎａｄｌｅｒらによって開発された３チャンバー社会的試験、およびＭａｃｂｅｔｈらによって開発されたインホームケージ社会的識別課題（ｉｎ−ｈｏｍｅ  ｃａｇｅ  ｓｏｃｉａｌ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｔａｓｋ）において試験した。社会的認識と、非社会的匂い／物体の認識との間を区別するために、非社会的匂い識別試験（嗅覚馴化／脱馴化および嗅覚認識試験）、ならびに物体認識試験を用いた。
【００７０】
薬物処置。β１−ＡＤＲ部分アゴニストであるキサモテロール、β１−ＡＤＲアンタゴニストであるベタキソロール、およびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）インヒビターであるＰＫＩ  １４−２２アミド、ミリストイル化（Ｔｏｃｒｉｓ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いた。キサモテロールは皮下注射した（３ｍｇ／ｋｇ）。ベタキソロールは、皮下注射（１ｍｇ／ｋｇ）またはＭｅＡに注射（３０ｎｍｏｌｅ／片側）した。ＰＫＩ  １４−２２アミドを、３０％アセトニトリルに溶解し、ＭｅＡに注射（２．７５ｎｍｏｌｅ／片側）した。
【００７１】
分子分析。免疫組織化学を用いて、ｃ−Ｆｏｓ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、およびβ１−ＡＤＲを評価した。染色した細胞の定量分析を、Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓにしたがって様々な脳領域において行った。不偏立体解析方法（ｕｎｂｉａｓｅｄ−ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて細胞の計数を達成した。陽性細胞の合計数を、ＳｔｅｒｅｏＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウエア（ＭＢＦ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ、ＶＴ、ＵＳＡ）を用いて光学的分離方法（ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ）で定量した。誤差係数の平均値≦０．１０を得るために、計数の判定基準を決定した。ｐＣＲＥＢの分析はウエスタンブロットにより行った。
【００７２】
統計。Ｐｒｉｓｍ５．０１ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてデータを分析した。行動試験および薬理学的試験には１群あたり動物最低５匹、免疫組織化学およびウエスタンブロットには１群あたり動物３から４匹を用いた。
【００７３】
結果
社会的認識およびβ１−ノルアドレナリン作動性神経伝達は、アルツハイマー病のマウスモデルにおいて障害される
齧歯動物では、社会的認識は、以前に会った同種に比べて、会ったことのない同種を調査する時間の量がより多いことによって測定することができる。本発明者らは、ＡＰＰマウスが以前に会った同種を認識する能力を最初に調査した。ＡＰＰマウスは、空のカップより不慣れな侵入者に対する好みを示したが（図１Ａ）、慣れたものより新規な侵入者に対する好みを実証することができず、社会的認識の欠陥が指摘された（図１Ｂ）。この欠陥は、嗅覚能力における、または非社会的な匂いの間を識別する欠陥に関連しなかった（図１Ｃおよび１Ｄ）。
【００７４】
本発明者らは、次いで、β１−ＡＤＲの発現における異常がＡＰＰマウスに存在するか否かを試験し、対照の同腹仔に比べてＡＰＰマウスのＭｅＡに有意に多数のβ１−ＡＤＲ発現性細胞を示した。本発明者らは初めて、ＡＤのＡＰＰマウスモデルは、以前に会った個体を認識することができず、ＭｅＡにおけるβ１−ノルアドレナリン作動性回路（社会的記憶に重要であることが知られている領域である）が異常であるという、ＡＤに特徴的な重要な１症状を再現することを示した。
【００７５】
β１−ＡＤＲおよびその下流のシグナリングは、社会的手がかりの学習に不可欠である
本発明者らは、次いで、ＡＰＰマウスにおけるβ１−ノルアドレナリン作動性神経伝達の異常が社会的記憶の欠陥の一因となり得るか否かを決定するために、社会的認識におけるβ１−ＡＤＲの潜在的な寄与を調査した。本発明者らは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、様々な用量の選択的β１−ＡＤＲアンタゴニストであるベタキソロール（０．０１、０．１、および１ｍｇ／ｋｇ）を短期的に皮下注射した後、以前に会った同種を認識する能力を評価した。ベタキソロールは、空のカップより不慣れな侵入者に対する好みに影響を及ぼさなかったが、ベタキソロール０．１および１ｍｇ／ｋｇは、マウスが２つの同種を探索するのに費やす合計時間に影響を及ぼさず、新規な同種と慣れた同種との間を区別することができないという結果をもたらした（一元配置のＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．１５３）（図２Ａおよび２Ｂ）。この所見は、やはり社会的認識を評価する様々な行動パラダイムである３チャンバー試験において再現された。本発明者らは、次いで、β１−ＡＤＲを遮断すると、全体的な嗅覚能力および識別に影響を及ぼさずに社会的手がかりの認識に影響を及ぼすことを実証した（図２Ｃおよび２Ｄ）。これらの結果は、匂いの馴化／脱馴化のパラダイムにおいて確認された。最後に、本発明者らは、慣れた物体を思い出す能力は、ベタキソロールまたはビヒクルを注射したマウスにおいて差がなかったことを観察した。
【００７６】
これらの結果は、β１−ＡＤＲの活性化が、マウスにおける社会的学習および社会的認識に必要であることを示唆している。本発明者らは、よって、ＡＰＰマウスに観察されるβ１−ＡＤＲ発現レベルの異常は社会的認識の欠陥の一因となり、ＡＰＰマウスにおいてβ１−ＡＤＲの機能を回復すると、社会的認識の欠陥がレスキューされることを提唱する。β１−ＡＤＲ部分アゴニストであるキサモテロールをＡＰＰマウスに社会的学習前に注射すると、以前に観察された欠陥がレスキューされた（図２Ｅおよび２Ｆ）。
【００７７】
本発明者らの薬理学的データは、β１−ＡＤＲが社会的認識に必要であることを示す。しかし、特定の受容体に対する薬物の選択性はしばしば議論の的となる。ベタキソロールが、β１−ＡＤＲ、および社会的認識におけるβ１−ＡＤＲ（β２−ＡＤＲと比べて）を特異的に標的化することを確認するために、本発明者らは、β１−ＡＤＲ  ＫＯマウスおよびβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスの両方ならびにそれらのＦＶＢ対照における社会的認識能力を試験した。マウスは全て、空のカップより不慣れな侵入者を有するカップに対する好みを示した。次いで、β１−ＡＤＲ  ＫＯマウスは社会的認識の障害を有するが（図３Ａ）、β２−ＡＤＲ  ＫＯマウスは課題を正確に行う（図３Ｂ）。加えて、社会的学習前にβ２−ＡＤＲ  ＫＯマウスにベタキソロールを注射すると、社会的認識の障害をもたらした（図３Ｂ）。これは、ベタキソロールによって誘発される社会的認識の欠陥は、β２−ＡＤＲではなくβ１−ＡＤＲに依存的であり、β１−ＡＤＲは社会的認識に不可欠であることを示唆している。
【００７８】
本発明者らは、次に、β１−ＡＤＲの活性化は、社会的手がかりの獲得（社会的学習）の間に重要であるか、またはこの情報の想起の間に重要であるかを評価した。本発明者らは、ベタキソロールを、試験の学習段階の２０分前または試験の想起段階の３０分前のいずれかに注射した。学習段階の間にβ１−ＡＤＲを阻害すると、社会的認識の欠陥をもたらしたが（図３Ｃ）、試験の想起段階の間にβ１−ＡＤＲを阻害しても、社会的認識を障害しなかった（図３Ｄ）。本発明者らは、次いで、長期の社会的認識の試験の学習段階前にベタキソロールを注射することにより、β１−ＡＤＲが社会的手がかりの学習に重要であることを確認した。学習前にベタキソロールを注射し、２４時間後に試験したマウスは社会的認識の障害を示したが、ビヒクルを注射したマウスの社会的認識はインタクトであった（図３Ｅ）。まとめると、これらのデータは、β１−ＡＤＲは、社会的認識に必要である社会的手がかりの学習に重要であることを強調する。
【００７９】
内側扁桃体におけるβ１−ＡＤＲは社会的認識に不可欠である
社会的認識に関与する脳領域はすでに規定されている。その中に、外側中隔（ｌａｔｅｒａｌ  ｓｅｐｔｕｍ）、前前頭皮質、およびＭｅＡがある。本発明者らは最初に、ＭｅＡが社会的認識に重要であることを確認した。本発明者らは、ｃ−Ｆｏｓをニューロン活動性のマーカーとして用い、社会的学習後のＣ５７Ｂｌ／６マウスの群におけるその発現を、社会的学習および社会的認識両方の後のマウスの群と比較した。不偏立体解析計数により、社会的認識後、扁桃体基底外側部ではなくＭｅＡにおけるより高レベルのｃ−Ｆｏｓ発現が明らかになり、社会的手がかりの処理にＭｅＡが重要であることが確認された。本発明者らは、次いで、ベタキソロール注射後、ＭｅＡにおけるｃ−Ｆｏｓ発現が、社会的認識後に有意に低減した（ビヒクル注射に対して）ことを観察した（図４Ａ）。本発明者らは、視床の室傍核（β１−ＡＤＲにおいて発現が不十分であり、社会的認識によって優先的に活性化されない）ではこのような効果を観察しなかったことから、この低減は、ＭｅＡなどの社会的認識の間に活性化される領域に特異的であった。本発明者らは、ベタキソロールにより誘発されるＭｅＡにおけるｃ−Ｆｏｓの低発現は、β１−ＡＤＲ発現性細胞におけるｃ−Ｆｏｓの低発現に関連することも観察し、二重免疫染色は、ｃ−Ｆｏｓを発現するβ１−ＡＤＲ細胞のパーセントは、ビヒクルを注射したマウスに比べてベタキソロールを注射したマウスにおいて有意に低減することを示した（図４Ｂ）。
【００８０】
ＭｅＡにおけるβ１−ＡＤＲの社会的認識に対する役割をさらに確認するために、ベタキソロールを、社会的学習前のＣ５７Ｂｌ／６マウスのＭｅＡ（図４Ｃ）に直接注射した。ＭｅＡにおいてベタキソロールで処置したマウスは、慣れた同種を認識することができなかった（図４Ｄ）。本発明者らの結果は、ＭｅＡは社会的認識に重要な構造であり、ＭｅＡにおけるβ１−ＡＤＲの活性化はマウスの社会的学習および社会的認識に必要であることを実証するものであった。
【００８１】
β１−ＡＤＲは、Ｇｓヘテロ三量体Ｇタンパク質と会合しているＧタンパク質共役受容体である。したがって、β１−ＡＤＲの下流のシグナリング経路の１つは、ｃＡＭＰ／ＰＫＡカスケードの活性化を伴い、ｃＡＭＰ応答エレメント結合性（ＣＲＥＢ）リン酸化をもたらす。本発明者らは、よって、β１−ＡＤＲの下流の経路をベタキソロールによって遮断すると、社会的学習および社会的認識が障害されるか否かを分析した。本発明者らは最初に、社会的学習前のＣ５７Ｂｌ／６マウスのＭｅＡにＰＫＡインヒビターを注射して、ＰＫＡ／ＣＲＥＢ／ｐＣＲＥＢカスケードの遮断が社会的認識に影響を及ぼすか否かを決定した。本発明者らは、ＰＫＡのブロッキングは、社会的学習の間、空のカップより不慣れな侵入者に対する好みに影響を及ぼさずに、マウスが慣れた同種を認識する能力を障害することを観察した（図４Ｅ）。これらの結果は、ＰＫＡ活性が、社会的学習および社会的認識に必要であることを示す。本発明者らの結果をまとめると、ベタキソロールまたはＰＫＡインヒビターによる、ＭｅＡにおけるβ１−ＡＤＲシグナリング経路の阻害は、社会的認識の欠陥をもたらすことが示される。
【００８２】
β１−ＡＤＲはＣＲＥＢリン酸化を変調する
周知のＰＫＡの下流の１標的はＣＲＥＢリン酸化であるため、本発明者らは、社会的学習におけるｐＣＲＥＢの可能な役割を評価することを目標とし、本発明者らは一連の実験を行った：本発明者らは最初に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける社会的手がかりの学習はＭｅＡにおけるｐＣＲＥＢの強力な増大を誘発することを観察し、この増大は社会的学習の開始後５分かかり、１０分後にベースラインに戻った（図５Ａ）。本発明者らは、次いで、β１−ＡＤＲの薬理学的変調は、社会的学習の状況において、ＭｅＡにおけるＣＲＥＢリン酸化に影響を及ぼすか否かを試験した。本発明者らは、社会的学習前にベタキソロール１ｍｇ／ｋｇを短期的に全身注射することによりβ１−ＡＤＲを遮断すると、社会的学習後のｐＣＲＥＢの誘発を阻害する（図５Ｂ）一方、β１−ＡＤＲを部分アゴニストであるキサモテロール３ｍｇ／ｋｇで活性化するとｐＣＲＥＢを増大する（図５Ｃ）ことを示した。現在のデータにより、本発明者らは、β１−ＡＤＲの下流のＰＫＡ／ｐＣＲＥＢカスケードの活性化は、社会的学習および社会的認識を媒介することを示す。
【００８３】
ＡＰＰマウスにおけるキサモテロールの社会的記憶に対するレスキュー効果が、ｐＣＲＥＢのレベルの修飾に関連するか否かを評価するために、本発明者らは、キサモテロールの注射および社会的学習の後、ＡＰＰマウスおよびＷＴ同腹仔のＭｅＡにおけるｐＣＲＥＢのレベルを測定した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて以前に見出された通り（図５Ｃ）、キサモテロールは、ＷＴ動物における社会的学習後のｐＣＲＥＢの増大を誘発した。しかし、ＡＰＰマウスには有意な増大はなかった。アルツハイマー病では、いくつかのリン酸化されたタンパク質および転写因子が（核に対して）細胞質中に優先的に位置し、よって学習および記憶に重要な遺伝子の発現を誘発するのに非効率的であることが報告された。よって、本発明者らは、ＡＰＰマウスの核におけるｐＣＲＥＢ（効果的なｐＣＲＥＢ）のレベルがキサモテロールによる影響を受けるか否かを決定した。本発明者らは、キサモテロールが、ＡＰＰマウスのＭｅＡの核画分におけるｐＣＲＥＢのレベルを増大することを観察した（図５Ｄ）。これは、部分アゴニストであるキサモテロールを用いてＡＤのマウスモデルにおけるβ１−ＡＤＲを活性化すると、社会的認識の改善をまねくことを指摘し、これはＭｅＡにおける核のｐＣＲＥＢのレベルの増大に関連する。
【００８４】
ＡＤなどの多くの神経学的障害は、社会的記憶および社会的認識における欠陥を特徴とする。この特定の症状の原因は未だ十分に規定されておらず、その結果、この不能化する欠陥をレスキューするための処置は現在存在しない。本発明者らは次に、社会的学習および社会的認識に関与する分子経路を同定し、ＡＤのモデルにおいてこのカスケードにおける病理学的変化を示した。本発明者らは、Ｔｈｙ１−ｈＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスのＭｅＡにおいて、β１−ノルアドレナリン作動性系における重大な異常を見出した。具体的に、本発明者らはβ１−ＡＤＲ、およびその下流のＰＫＡ／ｐＣＲＥＢシグナリングカスケードを、社会的学習および社会的認識の主要なモジュレータとして同定した。さらに、本発明者らは、β１−ＡＤＲの選択的部分アゴニストはこの選択的欠陥を回復することができることを示し、ＡＤにおける社会的機能を改善し、または回復するための可能な取組みを強調した。
【００８５】
本発明者らは、Ｔｈｙ１−ｈＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスは、非社会的な嗅覚の手がかりに対して正常な認識を実証するのにかかわらず、社会的認識の欠陥を表すことを報告した。嗅覚刺激に対する選択的注意を促進することにより、嗅球レベルで、ノルアドレナリンが、中立の、かつ社会的嗅覚情報の処理に重要であることを示したとしても、本発明者らの結果は、嗅球の下流の独立した２つの経路が社会的および非社会的な手がかりに対する記憶を制御することを示す。初めて、本発明者らは、社会的な、または中立の嗅覚の手がかりを学習する前にβ１−ＡＤＲを遮断すると、非社会的嗅覚認識に影響を及ぼさずに社会的認識の障害をまねくことを示している。加えて、本発明者らの結果は、β１−ＡＤＲ経路は、社会的手がかりの学習に必要であるが、これらの追想に必要ではないことを示す。
【００８６】
ＭｅＡは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方において、社会的および性的行動の制御に必要な感覚情報の処理に関与することが知られていた。多くの齧歯動物の研究により、社会的認識に対するＭｅＡの中心的役割が示されたが、本発明者らの結果は、社会的認識に対するＭｅＡにおけるβ１−ＡＤＲノルアドレナリン作動性神経伝達の重要性を実証し、Ｔｈｙ１−ｈＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスのこの脳領域における受容体／シグナリングカスケードの異常な発現が、社会的認識の欠陥の一因となり得ることを示唆している。
【００８７】
本発明者らのデータは、ＭｅＡにおけるβ１−ＡＤＲは、ＰＫＡ／ＣＲＥＢリン酸化−シグナリングカスケードを活性化することによって社会的学習を制御することを示す。実際、社会的学習前にＭｅＡにおけるＰＫＡを薬理学的に阻害すると、社会的認識を障害する。本発明者らは、社会的認識の欠陥を誘発する選択的アンタゴニストでβ１−ＡＤＲを遮断すると、ＭｅＡにおけるＣＲＥＢリン酸化の重大な低減をもたらすことも実証している。これらの結果は、マウスにおけるＰＫＡ／ｐＣＲＥＢカスケードと社会的学習との間に直接的な関連があることを示す。一般的に、ｐＣＲＥＢは、長期記憶に必要とされる遺伝子発現およびタンパク質合成に対する効果が知られているため、短期記憶よりむしろ長期記憶に必要であることが想定される。最近、Ｓｕｚｕｋｉらは、ＢＤＮＦの高発現をまねくＣＲＥＢ活性を上方制御すると、マウスにおける社会的および非社会的な短期記憶が増強されることを実証した。ここで、本発明者らは、同様の現象が、β１−ＡＤＲの活性化の結果として生じつつあることを示唆する。社会的学習はノルアドレナリンの放出を誘発し、ノルアドレナリンはＭｅＡにおいてβ１−ＡＤＲを活性化し、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ／ｐＣＲＥＢシグナリングカスケードの活性化をまねく。本発明者らは、β１−ＡＤＲおよびその下流のシグナリングの活性化は、社会的手がかりの学習に必要であることを示した。
【００８８】
β１−ＡＤＲ部分アゴニストであるキサモテロールでの処置は、ＡＰＰマウスの社会的認識の欠陥はレスキューするが、ＡＰＰマウスのｐＣＲＥＢの合計レベルには影響を及ぼさず、しかし核のｐＣＲＥＢレベルは著しく増大した。本発明者らは、よって、ＡＰＰマウスに観察される社会的認識の欠陥は、不適当なレベルの核のｐＣＲＥＢの欠如によってむしろ説明されることを示唆する。細胞系では、Ａβが高レベルのｐＣＲＥＢおよび核トランスロケーションの欠如を引き起こすことが示された。本発明者らは、よって、キサモテロールでのβ１−ＡＤＲの活性化が、ＡＰＰマウスのＭｅＡにおけるｐＣＲＥＢの核のレベルに影響を及ぼし、さらなる社会的認識に必要とされる社会的手がかりの処理を可能にするメカニズムを活性化することを示唆している。
【００８９】
本発明者らの所見は、β１−ＡＤＲが、ＡＤにおける社会的記憶および他の認知欠陥を改善するための治療標的として用いることができることを示す。しかし、ノルアドレナリン作動性系は心血管機能において著しく関与するため、本明細書に開示する治療法において用いるためのさらなる化合物を同定する場合、安全性およびトランスレーショナル研究を用いてこの取組みの安全性および有効性を確実にしてもよい。さらなる化合物の目的は、アドレナリン作動性系の正のＣＮＳ効果は増強する一方で心血管効果は最小にするために、全身的な活性が最小でＣＮＳ透過性が高い分子を開発することである。
【００９０】
ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、および自閉症に対する治療法において用いるためのβ１−ＡＤＲプロドラッグおよび誘導体の同定および評価
本発明の化合物および組成物の投与における社会的記憶および他の認知欠陥の増強を考慮すると、これらの化合物および組成物を用いて、ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、および自閉症を表すヒトにおいて社会的記憶および他の認知形質を増強することができることが明確に企図される。ＮＡの病理が、ヒト患者およびマウスモデルの両方におけるＡＤの複数の病理学的特徴に関連することが分かっていることを考慮すると、本発明に対する重要な１つのベースは、ＮＡ伝達を増大することで、単一のシグナリング経路を標的化する化合物を用いた従来の取組みよりも幅広く、より効果的な治療取組みを提供することができるという認識である。具体的に、本発明は、介在ニューロンにおける脱分極の制御、および認知機能に必要とされる神経伝達の下流の変調に必要な、ｃＡＭＰ応答エレメント結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のレベルを増大することにより、ＡＤに関連する認知低下をレスキューするために、β１−ＡＤＲのアゴニスト的な刺激によるＮＡシグナリングの回復を伴う。
【００９１】
よって、本発明者らは、ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、および自閉症を処置するための化合物および組成物の両方、ならびにこれらの疾患を処置し、これらの症状を軽減する方法を、本明細書において提供する。
【００９２】
本明細書に開示する例示的な化合物以外の、ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＤ、およびＡＤＨＤ、および自閉症の処置において用いるためのさらなる化合物を選択するための指針
本発明は、心機能に対して最小の末梢効果を表すか、または末梢効果が存在しない、β１−ＡＤＲアゴニスト（部分または完全）およびこれらのプロドラッグの同定において用いる、プロセスおよび指針も提供する。全体のプロセスを図１０に示す。このプロセスの別の全体の目的は、脳分布が改善され、末梢効果が最小の、β１−ＡＤＲアゴニスト（部分または完全）、およびこれらのプロドラッグ、より詳しくはキサモテロールプロドラッグの同定である。この手順の結果の１つは、拡張されたライブラリの、生物可逆的であるβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグ、特にキサモテロールプロドラッグの生成である。以下の手順を用いて、拡張されたライブラリの、生物可逆的である、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏで加水分解可能なβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグ、およびさらに新しい、合成のβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物を生成する。
【００９３】
１．ステップ１：候補のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグ化合物を、好ましいｃｌｏｇＰの推定値に基づいて選択し、化合物を一式のｉｎ  ｖｉｔｒｏの吸収、分布、代謝、および排泄（ＡＤＭＥ）試験に供する。この最初の試験に選択した化合物は、最初からデザインされたものでもよく、または関連する文献を検索した結果であってもよい。例えば、図１７〜１９に全般的に示す、アシル化キサモテロール化合物などのキサモテロールプロドラッグは、公知のアシル化反応を用いて調製される。キサモテロールプロドラッグは、ラセミ体（ラセミ混合物）として、またはエナンチオ選択的合成により（Ｒ）−および（Ｓ）−エナンチオマーとして調製することができる。
【００９４】
２）ステップ２：試験した化合物に対する構造特性相関（ＳＰＲ）を、化合物のＡＤＭＥの性質に基づいて開発し、吸収、分布、代謝、および排泄の各々を公知の方法によって決定する。
【００９５】
３）ステップ３：ステップ２から好ましいＡＤＭＥの性質を表す化合物を、ｉｎ  ｖｉｖｏの生体分布および薬物動態学的（ＰＫ）研究に進める。最も好ましいＡＤＭＥ、生体分布、およびＰＫの性質を有する化合物を２つ、前臨床動物モデル研究において試験するために選択する。
【００９６】
４）ステップ４：動物モデル研究からのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの全データを含有する、標的産物プロファイル（ＴＰＰ）を、ステップ１〜３を通して進行する各化合物に対して生成する。
【００９７】
５）ステップ５：次いで、ＴＰＰを、さらなる薬物開発を導くための戦略的計画ツールとして用いる。
【００９８】
上記に記載した通り、上記に記載する５つのステップを図１０にも示す。
【００９９】
キサモテロール
キサモテロールは、それから様々なプロドラッグが生成される、有利で好ましいβ１−ＡＤＲリード化合物である。これにはいくつかの理由がある。第１に、本発明者らが得た結果は、キサモテロールが、ｃＡＭＰカスケードを選択的に活性化する一方で、βアレスチンシグナリング経路に対する最小の活性を維持することを示す。図９を参照されたい。β１−ＡＤＲ活性化の下流のシグナリング経路の中で、ｃＡＭＰシグナリングカスケードは、シナプスの機能、神経伝達、および認知機能において主要な役割を果たすことが示された。
【０１００】
第２に、β１−ＡＤＲの活性化を介したβアレスチン媒介性シグナリングは様々な心臓のプロセスに関与するため、キサモテロールが、心機能に対する作用または効果は最小にすぎず、認知機能に関与するシグナリング経路を特異的に標的化することができるのは極めて有利である。
【０１０１】
第３に、キサモテロールによるβアレスチンシグナリング活性の機能的な回避には、耐性およびタキフィラキシーの発症によりアゴニスト治療法に対する制限を回避するという、さらなる利点がある。具体的に、βアレスチンは、受容体の脱感作および下方制御に関与する。アゴニスト治療において生じる耐性の増大は、βアレスチンシグナリング依存的な受容体脱感作によって媒介される。この問題は、β１−ＡＤＲリード化合物としてキサモテロールを用いることにより、大幅に最小化される。
【０１０２】
第４に、β１−ＡＤＲはアデニル酸シクラーゼに普遍的に共役し、ＣＲＥＢリン酸化のレベルを増大するため、キサモテロールは、密接に関係のある受容体であるβ２−ＡＤＲよりもβ１−ＡＤＲに対する亜型選択性を考慮すると有利である。したがって、β１−ＡＤＲの活性化には、ＣＲＥＢ依存的記憶欠陥をレスキューする能力がある。一方、β２−ＡＤＲは、ＡＣ阻害性Ｇタンパク質Ｇｉ／ｏに共役し、β１−ＡＤＲのシグナリングおよび認知作用に対抗することができる。よって、リード化合物としてのキサモテロールの亜型選択性は重要である。キサモテロールはまた、血液脳関門を通過し、中枢神経系に到達し、そこでＣＲＥＢリン酸化の増大および認知機能促進効果の媒介を誘発する。上記の表１および図９を参照されたい。よって、キサモテロールは、リードアゴニスト化合物として、バイオアベイラビリティなどの性質の増強を有する多数のキサモテロールプロドラッグの調製に有利である。
【０１０３】
化合物の選択の例：
上記に概要した選択手順ステップの全体的な目的は、治療的有用性が最大であるが、全身または末梢の副作用が最小であるβ１−ＡＤＲプロドラッグ、特にキサモテロールプロドラッグを提供することである。上記に記載した全般的なステップ（１〜５）を、次に、以下により詳しく記載する。
【０１０４】
ステップ１：プロドラッグとして、キサモテロールなど、β１−ＡＤＲアゴニスト化合物の構造類似体のデザインおよび合成
キサモテロールなどのリード化合物またはアゴニスト化合物に酵素的または非酵素的に変換することができる、キサモテロールなどのβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物の生物可逆的誘導体の注目されるライブラリを産生する。ＣＮＳバイオアベイラビリティを改善し、ＢＢＢ透過を増強するために、様々な戦略を用いることができ、別々の研究に分けてもよい。さらに、キサモテロールなどの多くのβ１−ＡＤＲ化合物はラセミ混合物であり、これらのエナンチオマー構成成分に分割することができ、以下に記載するリード化合物として別々に評価してもよいことが明確に認識される。β１−ＡＤＲラセミ混合物を、ガスクロマトグラフィーおよび向流抽出などの様々な公知の方法を用いて分割してもよい。例えば、ＥＰ  ０  ６６３  ８９７（１９９７年）を参照されたい。代替において、キサモテロールおよびキサモテロールプロドラッグの（Ｒ）−および（Ｓ）−両方のエナンチオマー化合物を、エナンチオ選択的に合成してもよい。本発明による以下の実施例のスキーム１に提供するエナンチオ選択的合成も参照されたい。ラセミ体のキサモテロールおよびキサモテロールプロドラッグを合成するための一手順を、本発明により実施例のスキーム２において、やはり提供する。これらの手順を用いて、キサモテロールプロドラッグだけでなく、例えば、ノルアドレナリン、イソプレナリン、またはドブタミンなどの他のβ１−ＡＤＲアゴニストも含めた、本明細書に開示するあらゆるプロドラッグを調製することができる。
【０１０５】
さらに、構造類似体の調製において、反応の進行をＬＣＭＳによって分析し、純度９０％未満の化合物はＨＰＬＣによって精製する。生成化合物は全て１Ｈおよび１３ＣＮＭＲにより特徴付ける。確証した化合物をＤＭＳＯ中に溶解し、５０ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液として−２５℃で貯蔵する。
【０１０６】
例えば、研究１において、リード化合物またはアゴニスト化合物の親油性の改善が目的であり、これはリード化合物の構造を修飾することにより得られる。キサモテロールの吸収は乏しく、バイオアベイラビリティは低いため（ｌｏｇＰの計算値（ｃｌｏｇＰ）は−０．６２で、極めて親水性である）、構造類似体を調製して親油性を改善する。これを行うために、例えば、エステル、カルバメート、およびオキサゾリジンなどの酵素的に不安定な基を、キサモテロールのヒドロキシル基および／またはアミノ基に共有結合性に連結する。キサモテロールの具体的な親油性プロドラッグの例を、図１７〜１９に示す。末端のフェニルヒドロキシル基のアシル化により形成されたキサモテロールプロドラッグが特に有利である。以下は、キサモテロールプロドラッグの調製を示すいくつかのスキーム、とりわけ、キサモテロールプロドラッグのＲ−およびＳ−エナンチオマーのエナンチオ選択的合成である。ｃＡＭＰアッセイに用いるバイオセンサーおよびプロトコールも記載する。
【０１０７】
キサモテロールのエナンチオマーの方法および合成
ｃＡＭＰアッセイ
ｃＡＭＰアッセイでは、ｃＡＭＰ結合性モチーフを含有する、修飾型のホタルのルシフェラーゼを利用する、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ｃＡＭＰバイオセンサー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。ｃＡＭＰが結合すると、修飾型のＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ｃＡＭＰバイオセンサーはコンフォメーション変化を受け、酵素の補足をもたらし、ルシフェラーゼ基質が反応した後、発光の読取りを提供する。β１−アドレナリン作動性受容体（β−ＡＤＲ）媒介性の応答を定量するために、β１−ＡＤＲを安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いた。簡潔に述べると、細胞を、透明９４ウエル培養プレート中１ウエルあたり細胞２．０×１０４個の密度でプレーティングし、ウシ胎児血清１０％を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。プレーティング２４時間後、細胞にｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）−２０Ｆ  ｃＡＭＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）プラスミドを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、５％ＣＯ２中、３７℃に維持した。４８時間後、細胞を平衡培地（ＣＯ２非依存性培地、３％ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）ｃＡＭＰ試薬）中、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション２時間後、ＣＯ２非依存性培地中に調製した試験化合物を加え、発光シグナルにおける変化を、プレートリーダー（ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてプレートの底部から２０分間測定した。機能的応答を、化合物添加前のベースの発光値と化合物添加後のピーク発光値との間の差を算出することによって定量した。結果を、３０μＭイソプロテレノールのパーセント値として表した。
【０１０８】
以下は、ラセミ体のキサモテロール、ならびに（Ｒ）−および（Ｓ）−キサモテロールの調製手順の非限定的な例として、いくつかの反応スキームおよび関連する実験手順である。
【０１０９】
（実施例）
【０１１０】
【化１】
2017505826.tif 000004
【０１１１】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（モルホリン−４−カルボキサミド）エチルカルバメート（１０）：
ｔｅｒｔ−ブチル２−アミノエチルカルバメート８（５０ｇ、３１２．０９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２中溶液３００ｍＬに、ＣＨ２Ｃｌ２２００ｍＬ中トリエチルアミン（９４．７４ｇ、９３６．３ｍｍｏｌ）およびモルホリン−４−カルボニルクロリド９（４６．７ｇ、３１２．０９ｍｍｏｌ）を０℃で滴下添加した。反応混合物を室温に温め、周囲温度で一夜撹拌した。反応混合物をＴＬＣによりモニタリングした。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、通常の精密検査を行った。残渣をシリカゲルカラムにより精製して（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１）、白色固体としてｔｅｒｔ−ブチル２−（モルホリン−４−カルボキサミド）エチルカルバメート１０（７５ｇ、８７．９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲは構造と一致した。
【０１１２】
Ｎ−（２−アミノエチル）モルホリン−４−カルボキサミド（４）：
ｔｅｒｔ−ブチル２−（モルホリン−４−カルボキサミド）エチルカルバメート３（７５ｇ、２７４．３９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２中溶液５００ｍＬを、０℃で、ＴＦＡ（１５６．０ｇ、１．３７ｍｏｌ）で滴下処理した。反応混合物を１．５時間撹拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、６Ｍ  ＮａＯＨを加えてｐＨ８に調整した。この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、引き続き通常の精密検査を行って、黄色油状物としてＮ−（２−アミノエチル）モルホリン−４−カルボキサミド４（４３ｇ、９１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲは構造と一致した。遊離塩基のいくらかを４−（Ｎ−ベータ−アミノエチルカルバモイル）モルホリン硫酸水素塩（ｍｐ．１６８〜１６９℃）に変換した。
【０１１３】
（Ｓ）−２−（（４−（ベンジルオキシ）フェノキシ）メチル）オキシラン（１３ａ）：
４−（ベンジルオキシ）フェノール、１１（５０ｇ、２４９．７１ｍｍｏｌ）および（Ｒ）−２−（クロロメチル）オキシラン、１２ａ（６９．３１ｇ、７４９．１４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ５００ｍＬ中混合物にＣｓＦ（１１３．７９ｇ、７４９．１４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃で３日間撹拌した。次いで、得られた反応混合物を、水（１Ｌ）とＥｔＯＡｃ（２Ｌ）との間で分配した。有機層を水（各９００ｍＬ）およびブラインで３回洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で脱水させた。有機抽出物を減圧下で濃縮し、シリカカラム（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ、４：１）によって精製して、白色固体として（Ｓ）−２−（（４−（ベンジルオキシ）フェノキシ）メチル）オキシラン、１３ａ（４７ｇ、７３．４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲは構造と一致した。
【０１１４】
（Ｓ）−Ｎ−（２−（３−（４−（ベンジルオキシ）フェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルアミノ）エチル）モルホリン−４−カルボキサミド（１４ａ）：
プロパン−２−オール１２０ｍＬ中Ｎ−（２−アミノエチル）モルホリン−４−カルボキサミド、４（３０ｇ、１０４．１１ｍｍｏｌ）の混合物を、（Ｓ）−２−（（４−（ベンジルオキシ）フェノキシ）メチル）オキシラン、１３ａ（１９．７２ｇ、１５６．６６ｍｍｏｌ）のプロパン−２−オール２３０ｍＬ中溶液に、５０℃未満で５時間かけて徐々に加えた。次いで、反応混合物を室温に冷やし、ＥｔＯＡｃで徹底的に抽出した。有機層を、水（３００ｍＬ）、ブラインで洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で脱水させた。ＥｔＯｃ抽出物を減圧下で濃縮し、シリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ、１０：１）により精製して、白色固体として（Ｓ）−Ｎ−（２−（３−（４−（ベンジルオキシ）フェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルアミノ）エチル）モルホリン−４−カルボキサミド、１４ａ（２０．８ｇ、６３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲは構造と一致した。
【０１１５】
（Ｓ）−キサモテロール（７ａ）：
酢酸２ｍＬを含有するＥｔＯＨ２００ｍＬ中（Ｓ）−Ｎ−（２−（３−（４−（ベンジルオキシ）フェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルアミノ）エチル）モルホリン−４−カルボキサミド、１４ａ（２０ｇ、４６．５６ｍｍｏｌ）の混合物にＰｄ（ＯＨ）２／Ｃ（５ｇ）を加えた。得られた反応混合物を、一夜５５ｐｓｉで水素付加に供した。ろ過によって触媒を除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＨに溶解し、フマル酸でヘミフマル酸塩に変換した。ヘミフマル酸塩をＥｔＯＨで再結晶して、オフホワイト固体として（Ｓ）−キサモテロール、７ａ（１２．３ｇ、９１．７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲは構造と一致した。
【０１１６】
（Ｒ）−２−（（４−（ベンジルオキシ）フェノキシ）メチル）オキシラン（１３ｂ）：
この化合物を、１３ａに記載した手順にしたがって、１１（８ｇ、４１．９５ｍｍｏｌ）から調製して、白色固体の（Ｒ）−２−（（４−（ベンジルオキシ）フェノキシ）メチル）オキシラン、１３ｂ（６．３ｇ、２４．６ｍｍｏｌ、６１％）を得た。
【０１１７】
（Ｒ）−Ｎ−（２−（３−（４−（ベンジルオキシ）フェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルアミノ）エチル）モルホリン−４−カルボキサミド（１４ｂ）：
化合物１４ｂを、７ａ  ６．３ｇ（２４．６ｍｍｏｌ）および４（１２．７７ｇ（７３．８０ｍｍｏｌ）から１４ａの調製について記載した手順にしたがって調製し、１４ｂ  ３ｇ（６．９８ｍｍｏｌ、３０％）を得た。
【０１１８】
（Ｒ）−キサモテロール（７ｂ）：
１４ｂ  ３ｇ（６．９８ｍｍｏｌ）を、上記に記載した手順にしたがって（Ｒ）−キサモテロール（７ｂ）に変換して、ヘミフマル酸塩としてオフホワイト固体の７ｂ  ２．５ｇ（６．８ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【０１１９】
【化２】
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【０１２０】
ラセミ体キサモテロールの調製：
Ｎ−フェノキシカルボニルモルホリン（３）：
モルホリン２（４．３５ｇ）およびクロロギ酸フェニル１（６．３５ｇ）を、２０分の間に、０℃に維持したトルエン（１０ｍｌ）、水（５ｍｌ）、および水酸化ナトリウム（２ｇ）の撹拌混合物に、別々に、かつ同時に滴下添加する。混合物をさらに２時間撹拌し、温度を２０℃に上げる。トルエン溶液を分離し、水溶液をトルエンで２回抽出し、トルエン溶液を合わせて水で洗浄し、乾燥させ、減圧下で蒸発乾固する。残渣を石油エーテル（沸点６０〜８０℃）から結晶化し、よって融点４６．５〜４７．５℃のＮ−フェノキシカルボニルモルホリン（３）を得る。
【０１２１】
４−（Ｎ−ベータアミノエチルカルバモイル）モルホリン硫酸水素塩（４）：
上記の化合物３（１１ｇ）およびエチレンジアミン（２７．８ｇ）の混合物を実験室温度で３日間撹拌し、過剰のエチレンジアミンを減圧下、蒸発により除去する。残渣をメタノールに溶解し、溶液を５℃に冷却し、溶液のｐＨが２になるまで濃硫酸を加える。フィルターエイド（セライト、１０ｇ）を加え、混合物を１時間撹拌し、次いでろ過する。ろ液を減圧下で蒸発乾固し、残渣を酢酸エチルと撹拌する。混合物をろ過し、よって、固体残渣として４−（Ｎ−ベータ−アミノエチルカルバモイル）モルホリン硫酸水素塩（４）、融点１６８〜１６９℃を得る。
【０１２２】
１−ｐ−ベンジルオキシフェノキシ−３−（ベータ−モルホリノカーボンアミドエチル）アミノ−２−プロパノール塩酸塩（６）：
１−ｐ−ベンジルオキシフェノキシ−２，３−エポキシプロパン５（１１．５ｇ）のイソプロパノール（６ｍｌ）中懸濁物を、４−（Ｎ−ベータアミノエチルカルバモイル）モルホリン硫酸水素塩４（１２．７ｇ）、水酸化カリウム（７．０ｇ）、およびイソプロパノール（１０ｍｌ）の混合物を撹拌しているものに加え、混合物を４５℃で１時間撹拌し、次いで減圧下で蒸発乾固する。残渣の油を水と撹拌し、混合物をろ過し、固体残渣をアセトンに溶解する。プロパノール中塩化水素３０％溶液を、混合物のｐＨが２未満になるまで加え、混合物をろ過する。
【０１２３】
固体残渣を水から結晶化し、よって、１−ｐ−ベンジルオキシフェノキシ−３−（ベータ−モルホリノカーボンアミドエチル）アミノ−２−プロパノール塩酸塩６（４．９ｇ）を得る。
【０１２４】
キサモテロール（７ｃ）：（１−ｐ−ヒドロキシフェノキシ−３−ベータ−（モルホリノカーボンアミド）エチル−アミノ−２−プロパノールフマル酸水素塩）：
上記の化合物６の、エタノール（２０ｍｌ）および酢酸（２０ｍｌ）の混合物中溶液を、実験室の温度および圧力で、水素雰囲気中、水素２５０ｍｌが吸収されるまで、３０％パラジウム炭素触媒（０．１ｇ）と振盪する。混合物をろ過し、ろ液を減圧下で蒸発乾固し、残渣をフマル酸（１．２５ｇ）のエタノール（１５ｍｌ）中熱溶液に加える。混合物を５℃で１２時間維持し、次いでろ過し、固体残渣を熱エタノールで洗浄し、次いで乾燥させる。よって、１−ｐ−ヒドロキシフェノキシ−３−ベータ−（モルホリノカーボンアミド）エチル−アミノ−２−プロパノールフマル酸水素塩（７ｃ）、ｍ．ｐ．１６８〜１６９℃（分解物を含む）を得る。その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第４，１４３，１４０号を参照されたい。
【０１２５】
研究２において、リード化合物のＣＮＳバイオアベイラビリティを改善するために、脳の微小血管における特異的なキャリアを標的化する。この戦略には、脳への薬物送達を増強する一方で、他の末梢器官に対する曝露および毒性を低減する目的がある。具体的に、キサモテロールを、キャリアまたはトランスポーターが薬物を脳に特異的に送達するための基材などとコンジュゲートするために、ＧＬＵＴ−１、ＬＡＴ−１、およびコリントランスポーターなど、ＢＢＢ上に発現される内在性のキャリアまたはトランスポーターが用いられる。標的化されるキサモテロールプロドラッグの例を図１７に示す。
【０１２６】
研究３において、エナンチオマーのプロドラッグの性質を評価するために、ラセミ体のプロドラッグ化合物のエナンチオマー分離を行う。上記に記載した通り、β１−ＡＤＲのラセミ体のリード化合物またはプロドラッグ化合物の混合物のエナンチオマーへの分割を、ガスクロマトグラフィー、向流抽出、および同様にα−メトキシ−α−トリフルオロメチル−フェニル酢酸を用いたＭｏｓｈｅｒのエステル化を用いたキラル分割など、あらゆる公知の手順により行うことができる。Ｍｏｓｈｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４巻（９号）：２５４３〜２５４９頁（１９６９年）を参照されたい。
【０１２７】
実際、本発明者らは、キサモテロールのＲ−およびＳ−エナンチオマーは、実質的に異なる薬理学的活性を表すことを発見した。例えば、図２３は、キサモテロールのラセミ体（Ｒ，Ｓ）および（Ｓ）−エナンチオマーは、ナノモル濃度範囲のＥＣ５０値（ｖａｌｉｅｓ）と同様の効力でｃＡＭＰ蓄積を刺激し、すなわち、（Ｒ，Ｓ）−キサモテロールはＥＣ５０＝１１．６ｎＭであり、（Ｓ−）−キサモテロールはＥＣ５０＝２１．２ｎＭであることを明白に示す。対照的に、（Ｒ）−キサモテロールは、１１９００ｎＭのＥＣ５０でｃＡＭＰ蓄積を刺激した。これは、（Ｓ）−キサモテロールは、β１−ＡＤＲを介したｃＡＭＰ蓄積の刺激において、（Ｒ）−キサモテロールよりも約５００倍強力であることを示す。しかし、本発明は、キサモテロールプロドラッグの（Ｒ）−および（Ｓ）−エナンチオマーを生成するエナンチオ選択的方法を提供するが、一般にノルアドレナリン、イソプレナリン、およびドブタミンなどの、β１−ＡＤＲアゴニストのこのようなエナンチオマーも提供する。
【０１２８】
ステップ２：好ましい薬物動態学的性質および改善されたＣＮＳバイオアベイラビリティを有するプロドラッグ化合物の選択
このステップで選択された化合物のプロドラッグは、一般的に、脳に到達する前の生物学的媒体または組織における安定性、ＢＢＢを横切る経細胞透過に好ましい物理化学的性質を表すか、または能動輸送ではＢＢＢにおいて発現される受容体もしくはトランスポーターによって認識される構造を有し、かつ親化合物もしくはリード化合物に容易に戻って変換されなければならない。キサモテロールの代謝はヒトとマウスとの間で類似するため、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをｉｎ  ｖｉｖｏのＰＫ研究に用いる。
【０１２９】
研究１において、キサモテロールの類似体などのβ１−ＡＤＲプロドラッグ化合物の生物安定性、および親薬物へのｉｎ  ｖｉｔｒｏの変換を評価する。例えば、キサモテロールの類似体を、攪拌機の水浴中３７℃において、マウス血液、肝臓Ｓ９画分、脳ホモジネート、および等張リン酸バッファーとインキュベートする。１００μｌのアリコートを、時間ゼロ、および薬物添加３時間後まで３０分ごとに抜き取る。回収した試料を直ちに遠心分離し、上清を注意深く除去し、分析まで−８０℃で貯蔵する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行って、例えば上清中の、インタクトなプロドラッグおよびキサモテロールの量を決定する。代謝半減期および生体変換も決定する。
【０１３０】
研究２において、キサモテロールの類似体などのβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグのＣＮＳ透過を、傍細胞の低透過性、十分に発達した密着結合、および流出トランスポーターの発現を含めたＢＢＢの多くの特徴を示す、非接触同時培養（ｎｏｎｃｏｎｔａｃｔ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）モデルを用いて評価する。ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）およびヒト星状細胞（ＨＡ）を、細孔性半透膜を有するトランスウエルプレートを用いて同時培養する。ＨＢＭＥＣを、フィブロネクチンをコーティングした半透明膜インサート上に接種し、３〜４日間、単層の分極を確立させる。形成した内皮細胞の層が、系を先端側コンパートメントと基底外側コンパートメントとに分離し、試験化合物の投与およびサンプリングがモデルのいずれの側上でも行えるようになる。ＨＡをキャリアプレートの底部上に接種する。実際の実験日、培地を全て除去し、インサートを、リン酸緩衝食塩水を含有する新たな２４ウエルプレートに再配置する。試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、１μＭの濃度でドナーコンパートメントに加える。化合物がレシピエント側上に出現する速度を決定するために、薬物添加５、１５、３０、６０、９０、および１２０分後に試料をレシピエント側から回収する。チャンバーをまたがって一定の体積を維持するために、各サンプリング後、等量のリン酸緩衝食塩水をレシピエントチャンバーに加える。回収した試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析する。先端側から基底外側への見かけの透過性（ＰａｐｐＡＢ）、見かけの基底外側から先端側（ＰａｐｐＢＡ）、および流出率（ＰａｐｐＢＡ／ＰａｐｐＡＢ）を決定する。試験した各薬物または薬物のプロドラッグを、各膜に対して複数の時間点に、４つの異なる膜の最小値にわたり試験する。
【０１３１】
研究３において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究で有望な物理化学的性質を表すキサモテロール類似体などのプロドラッグを、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰＫ研究に進める。例えば、キサモテロールを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、３ｍｇ／ｋｇの単一用量として、静脈内または皮下のいずれかで投与する。プロドラッグに対して、キサモテロール３ｍｇ／ｋｇに等しい用量を投与する。マウスは、薬物投与３、１５、３０、６０、１２０、２４０、および３６０分後に安楽死させる。心穿刺によって血液を抜き取り、ヘパリン処理したチューブに回収する。遠心分離によって直ちに血漿を分離し、アッセイまで−８０℃で貯蔵する。組織分布研究では、脳、心臓、腎臓、肝臓、および脾臓からの組織試料を、薬物投与６０および１２０分後に回収する。組織試料を、０．９％食塩水を用いて１：２の比にホモジナイズする。ホモジネートを分析まで−８０℃で貯蔵する。血漿および組織試料からのキサモテロールの濃度を、公知の方法を用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析する。Ｆａｉｚｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ、２０１２年、２巻（２号）：１４２〜１５４頁を参照されたい。
【０１３２】
血漿、脳中のキサモテロールおよびその類似体の濃度を、非コンパートメント（ｎｏｎ−ｏｍｐｐａｒｔｍｅｎｔａｌ）方法により分析して、薬物動態学的パラメータを決定する。最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、最大濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、および曲線下面積（ＡＵＣ）を含めたプロドラッグのＰＫパラメータを決定し、キサモテロールのＰＫパラメータと比較する。これらの結果により、キサモテロール類似体に対するＢＢＢ透過性指数が得られる。
【０１３３】
統計学的分析
全ての化合物（リードおよびプロドラッグ／類似体化合物）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物安定性、生体変換、およびＢＢＢ透過試験を用いてスクリーニングする。改善されたＣＮＳバイオアベイラビリティを表す潜在性を示す化合物だけに、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰＫ研究を受けさせる。ＰＫデータ分析はＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウエアを用いて行う。スチューデントのｔ検定を用い、Ｐｒｉｓｍ３．０プログラム（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、プロドラッグと親またはリード薬物との間のパラメータの統計学的有意性を検出する。ｐ＜０．０５のレベルの差を有意であると考える。
【０１３４】
ステップ３：認知症状に対するプロドラッグの効果の評価
本ステップにおいてＡＤのＴｈｙ１−ＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスモデルを用いるが、このマウスモデルは、認知欠陥、成熟βアミロイド斑、およびシナプスの変性を呈する。Ｔｈｙ１−ＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスを、６月齢で開始して４か月間、皮下に埋め込んだ浸透圧ポンプを用いて、キサモテロールおよび少なくとも２つのプロドラッグの長期的な投薬で処置する。図２０は、以下に記載する研究１および２でのスキームを示す。
【０１３５】
研究１において、マウスの認知効果に対するキサモテロールおよびそのプロドラッグでの長期的処置の効果を試験する。この研究は、キサモテロールなどのβ１−ＡＤＲアゴニストおよびこれらのプロドラッグの、作業記憶（Ｙ迷路試験を用いて）、社会的記憶（社会的新規性試験（ｓｏｃｉａｌ  ｎｏｖｅｌｔｙ  ｔｅｓｔ）を用いて）、およびコンテクスト記憶（恐怖条件付け試験を用いて）に対する効果の研究を伴う。Ｔｈｙ１−ＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスは、６月齢で、作業記憶（Ｙ迷路試験）、社会的認識、およびコンテクスト記憶（恐怖条件付け試験）の障害を表し、ＡＤのマウスモデルである。具体的に、キサモテロールなどのβ１−ＡＤＲアゴニストおよびこれらのプロドラッグでの長期的処置を試験して、ＡＤに対するマウスモデルに観察される認知欠陥のレスキューにおける各々の効果を評価する。これら特定のマウスおよびｎｏｎ−Ｔｇ（非トランスジェニック）マウスは６月齢であり、次いで、上記および図２０に示す３つの行動試験において試験する。行動試験後、マウスを屠殺し、脳組織を研究のために収集する。得た値をベースラインとして用いる。他のコホートのマウスには、キサモテロールプロドラッグを含めたβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグを、ｓ．ｃ浸透圧ポンプを用いて投与する。これらのコホートを、投薬開始後２か月（マウス８月齢）および４か月（マウス１０月齢）時に、特定した３つの認知課題において試験する。１遺伝子型あたり、１処置あたり、および１時間点あたり、マウス１２匹（ｎ＝１２）を用いる。行動試験後、以下の研究２における脳組織分析のためにマウスを屠殺する。脳を矢状方向に切断し、脳の半分を使用するまで−８０℃で凍結し、もう半分を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に一夜配置し、処理するまでスクロース中４℃に維持する。
【０１３６】
研究２において、キサモテロールを含めたβ１−ＡＤＲアゴニストおよびそのプロドラッグでの長期的処置の結果を試験して、どの化合物が、ＡＤに関連する病理学的変化を低減するかを決定する（ＡＤのＴｈｙ１−ＡＰＰＬｏｎｄ／Ｓｗｅ＋マウスモデルは、シナプス構造異常、ならびに高レベルのＡβ４２およびプラーク数を表す）。この研究では、試験したプロドラッグが、ＡＤのマウスモデルに示されるシナプス構造における病理学的改変を改善する程度を評価する。さらに、サンドイッチＥＬＩＳＡを、前シナプス小胞タンパク質、シナプトフィジン、前シナプス膜タンパク質ＳＮＰＡ−２５（２５ｋＤａシナプトソーム関連タンパク質）、および後シナプス足場タンパク質ＰＳＤ−９５（後シナプス膜肥厚９５）に対して行う。プラークレベルの低下も評価し、Ａβ４０およびＡβ４２の定量をＥＬＩＳＡによって行う。免疫組織化学試験をまた、抗Ａβ抗体を用いて矢状方向の脳切片に対して行い、様々な脳領域におけるプラークのサイズ、数、および負荷の分析をまた、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて行う。
【０１３７】
また、小グリア細胞の遊走および食作用活性におけるＮＡの関与に基づき、キサモテロールプロドラッグを含めた様々なβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグでの長期的処置は、神経炎症性プロセスに影響を及ぼすか否かも決定する。
【０１３８】
Ｉｂａ１抗体での免疫組織化学および不偏立体解析計数を用いて、小グリア細胞の活性化も定量する。ＴＮＦ−αならびにインターロイキン−１（ＩＬ−１）および６（ＩＬ−６）などの神経炎症性メディエータを、ＥＬＩＳＡによって評価する。処置群あたり動物６から８匹を分析する。
【０１３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏの統計学的分析
ｉｎ  ｖｉｖｏの有効性研究は全て、結果の信頼性を保証するために、遺伝子型および処置の両方に対し盲検にした実験者によって行う。データは全て、シャピロ−ウィルク検定で正規性に対して試験し、群間の比較に好適なパラメトリックまたはノンパラメトリック検定を用いる。データは全て、ＡＮＯＶＡ（パラメトリック）またはクルスカル−ワリス検定（ノンパラメトリック）、引き続き事後検定を用いて分析する。分析は全てＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて行う。
【０１４０】
本発明は、よって、いくつかの本発明の態様を提供し、これらの態様は全て同じ発明の一部または区分である。
【０１４１】
第１に、本発明は、生物可逆的なβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグを提供し、このプロドラッグは親薬物に生体変換された後、β１−ＡＤＲをアゴニスト的に刺激し、対応するβ１−ＡＤＲアゴニストに比べて親油性およびＣＮＳバイオアベイラビリティは改善されている。生物可逆的なβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグがやはり、βアレスチン経路を刺激するよりもｃＡＭＰ経路を刺激し、引き続き対応するβ１−ＡＤＲアゴニストに生体変換されるのが好ましい。具体的に、β１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグ化合物が、生体変換後、１０−４から１０−１０Ｍの範囲の同じ濃度でｃＡＭＰ経路を刺激するよりも５０％以下でβアレスチン経路を刺激すれば、最も好ましい。βアレスチン経路が、２０％以下刺激されるとさらにより好ましく、βアレスチン経路の刺激が全くなければ最も好ましい。
【０１４２】
生物可逆的なβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグが、生体変換後、下流のＣＲＥＢ経路を刺激するのも好ましい。
【０１４３】
これらの化合物は、注射可能な形態の組成物として処方され得る。例えば、化合物を、無菌食塩水溶液またはデキストロース食塩水溶液に溶解してもよい。よって、溶液を、静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下（ｓ．ｃ．）に注射することができる。しかし、本発明のβ１−ＡＤＲプロドラッグは、点鼻薬、鼻スワブ、もしくは乾燥粉末吸入器、もしくは全身的鼻腔内送達のいずれかによる吸入によって、またはさらに経口的になど、あらゆる投与手段によって投与することができる。
【０１４４】
第２に、本発明は、ヒトにおけるＤＳを処置する方法を提供し、上記に記載した１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグの、社会的記憶を含めた認知を改善するのに有効な量の投与を伴う。
【０１４５】
第３に、本発明は、ヒトにおけるＡＤを処置する方法を提供し、上記に記載した１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグの、社会的記憶を含めた認知を改善するのに有効な量の投与を伴う。
【０１４６】
第４に、本発明は、ヒトにおける自閉症を処置する方法を提供し、上記に記載した１つまたは複数のβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグの、社会的記憶を含めた認知を改善するのに有効な量の投与を伴う。
【０１４７】
本発明の化合物および組成物は、ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、および自閉症の処置において有利に用いることができる。これらの疾患または状態は全て、社会的記憶を含めた認知における改善の恩恵を受ける。
【０１４８】
第５に、本発明は、治療的使用のためのβ１−ＡＤＲアゴニストプロドラッグを選択する方法も提供し、これは以下のステップを伴う：
ａ）対応するβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物に比べて増強されたｃｌｏｇＰ値を有する１つまたは複数のプロドラッグ化合物を選択するステップ、
ｂ）ステップａ）から選択したプロドラッグ化合物を一式のＡＤＭＥ試験に供し、プロドラッグ化合物についてのＳＰＲを決定するステップ、
ｃ）ステップｂ）から１つまたは複数のプロドラッグ化合物を選択し、前記プロドラッグ化合物をｉｎ  ｖｉｖｏの生体分布および薬物動態学的（ＰＫ）評価に供するステップ、
ｄ）ステップｃ）から、前臨床動物モデル研究に１つまたは複数のプロドラッグ化合物を選択するステップ、ならびに
ｅ）治療的使用のためのさらなる開発のために、ステップａ）〜ｄ）の全てから選択された各プロドラッグ化合物についてのＴＰＰを生成するステップ。
【０１４９】
β１−ＡＤＲプロドラッグの合成
一般的に、本発明のβ１−ＡＤＲプロドラッグは、少なくとも０、好ましくは＞１．０のｃｌｏｇＰ値を有するものが選択される。しかし、プロドラッグが、＞２．０およびそれ超、例えば、３．０〜５．０などのｃｌｏｇＰ値を有することがより好ましい。
【０１５０】
本発明のβ１−ＡＤＲプロドラッグは、対応するβ１−ＡＤＲ親化合物またはリード化合物の、置換基のヒドロキシル基からエステル化合物を、および／または置換基のアミン基からアミド基を形成することによって調製される。例えば、キサモテロールのエステルおよび／またはアミドは、キサモテロールのヒドロキシル基をエステル化することにより形成され、キサモテロールのアミドは、キサモテロールのアミン基をアミド化することにより形成される。周知の化学反応を用いて、β１−ＡＤＲ化合物のエステルおよびアミドの両方を調製して、対応するβ１−ＡＤＲプロドラッグを形成してもよい。さらに、β１−ＡＤＲ化合物上の１つもしくは複数のヒドロキシル基をエステル化してもよく、かつ／またはβ１−ＡＤＲ化合物上の１つもしくは複数のアミン基をアミド化してもよい。例えば、キサモテロールは、２個の遊離ヒドロキシル基および２個の内部の遊離アミノ基（−ＮＨ−）を有する。一般的に、キサモテロールの末端のフェニルヒドロキシ基もしくは２級ヒドロキシ基のいずれか、または両方をエステル化するのが有利である。より好ましいエステル化方法はアシル化である。
【０１５１】
すなわち、あらゆるβ１−ＡＤＲアゴニスト化合物に対して、その上の１つまたは複数の遊離のヒドロキシル基を、一般式：−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒのエステルを形成させることによって誘導体化する。
【０１５２】
プロドラッグを調製するための例示的な合成スキームを以下に示す：
【０１５３】
【化３】
2017505826.tif 000006
【０１５４】
注：上記スキームにおける化合物７は、（Ｓ）−エナンチオマー、すなわち、（Ｓ）−オキシラン−２−イルメチル３−ニトロベンゼンスルホネートである。
【０１５５】
２，２−ジメチルオクタン酸（２ａ）：
イソ酪酸（２．０ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）を、０℃の窒素雰囲気下、ＬＤＡ（７．６ｍＬ）の溶液に滴下添加した。この溶液を１５分間撹拌した。この温度の溶液に１−ヨードヘキサン（４．８ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、反応混合物を水５０ｍＬで処理し、３Ｎ  ＨＣｌでｐＨおよそ３に調整した。得られた混合物を酢酸エチルで数回抽出した。有機層を分離し、乾燥させ、減圧下で蒸発させて、無色油状物として２，２−ジメチルオクタン酸（２．４８ｇ、６３．４％）を得、これをさらに精製せずに用いた。
【０１５６】
２，２−ジメチルヘキサン酸（２ｂ）：
上記に記載した手順を用いて、２，２−ジメチルヘキサン酸（２ａ）を調製して、無色油状物（２ｇ、１３．８７ｍｍｏｌ、６１％）を得た。
【０１５７】
４−（ベンジルオキシ）フェニル２，２−ジメチルオクタノエート（５ａ）：
２，２−ジメチルオクタン酸２ａ（２．４８ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）中溶液に、塩化オキサリル（３．６６ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）を０℃で滴下添加した。得られた溶液を窒素雰囲気下で２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で蒸発させて、不安定な中間体として２，２−ジメチルオクタノイルクロリド（３ａ）を得、これをさらに精製せずに用いた。トリエチルアミン（２．９１ｇ、２８．７６ｍｍｏｌ）を、上記で得た２，２−ジメチルオクタノイルクロリド（３ａ）の溶液に滴下添加し、次いで、０℃で、４−（ベンジルオキシ）フェノール４（３．２ｇ、１５．９８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン１５ｍＬ中溶液で処理した。ジメチルホルムアミドを数滴、溶液に加えた。添加後、得られた溶液を室温で１５時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をジクロロメタンで徹底的に抽出した。有機層を、水（１５０ｍＬ）、ブラインで洗浄し、乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１０：１）を用いて精製して、無色油状物として４−（ベンジルオキシ）フェニル２，２−ジメチルオクタノエート５ａ（２．４９ｇ、４９％）を得た。
【０１５８】
４−（ベンジルオキシ）フェニル２，２−ジメチルヘキサノエート（５ｂ）：
５ａに対して上記に記載した手順を用いて、４−（ベンジルオキシ）フェニル２，２−ジメチルヘキサノエート（５ｂ）２．２５ｇを調製した。
【０１５９】
４−ヒドロキシフェニル２，２−ジメチルオクタノエート（６ａ）：
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中４−（ベンジルオキシ）フェニル２，２−ジメチルオクタノエート５ａ（２．４９ｇ、７．０２ｍｍｏｌ）およびＰｄ／Ｃ（５００ｍｇ）を、水素下で１５時間撹拌した。混合物をセライトのパッドを通してろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１０：１）を用いて精製して、白色固体として４−ヒドロキシフェニル２，２−ジメチルオクタノエート６ａ（１．８６ｇ、１００％）を得た。
【０１６０】
４−ヒドロキシフェニル２，２−ジメチルヘキサノエート（ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｅａａｎｏａｔｅ）（６ｂ）：
４−ヒドロキシフェニル２，２−ジメチルヘキサノエート（６ｂ）３ｇ（１２．７ｍｍｏｌ、９９％）を上記に記載した手順を用いて５ｂ  ４ｇから調製し、そのまま次のステップにおいて用いた。
【０１６１】
（Ｓ）−４−（オキシラン−２−イルメトキシ）フェニル２，２−ジメチルオクタノエート（８ａ）：
４−ヒドロキシフェニル２，２−ジメチルオクタノエート６ａ（３．２ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中溶液に、窒素雰囲気下、ＮａＨ（０．３２ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）をポーションごとに加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、（Ｓ）−オキシラン−２−イルメチル３−ニトロベンゼンスルホネート７（３．４５ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。得られた混合物を室温で１５時間撹拌し、次いで、水１００ｍＬで希釈し、ジクロロメタンで徹底的に抽出した。有機層を、水、ブラインで洗浄し、次いで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝５：１）を用いて精製して、無色油状物として（Ｓ）−４−（オキシラン−２−イルメトキシ）フェニル２，２−ジメチルオクタノエート８ａ（３．０４ｇ、７８％）を得た。
【０１６２】
（Ｓ）−４−（オキシラン−２−イルメトキシ）フェニル２，２−ジメチルヘキサノエート（８ｂ）：
上記に記載した手順を用いて、６ｂ  ３ｇから、白色固体として（Ｓ）−４−（オキシラン−２−イルメトキシ）フェニル２，２−ジメチルヘキサノエート（８ｂ）２ｇ（６．８４ｍｍｏｌ、５４％）を調製した。
【０１６３】
（Ｓ）−キサモテロールの２，２−ジメチルオクタノエートエステル（１０ａ）：
（Ｓ）−４−（オキシラン−２−イルメトキシ）フェニル−２，２−ジメチルオクタノエート８ａ（３．０７ｇ、９．６ｍｍｏｌ）およびＮ−（２−アミノエチル）モルホリン−４−カルボキサミド９（４．９８ｇ、２８．８ｍｍｏｌ）を、イソプロピルアルコール（１００ｍＬ）中、５０℃で１５時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧下で蒸発させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１０：１）を用いて精製して、無色油状物として（Ｓ）−キサモテロールの２，２−ジメチルオクタノエートエステル１０ａ（２．１ｇ、４４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲは構造と一致した。
【０１６４】
エタノール（１５ｍＬ）中フマル酸（０．１８ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を、エタノール（１５ｍＬ）中１０ａ（１．５ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に滴下添加した。得られた溶液を室温で５時間撹拌した。混合物を減圧下でろ過した。沈殿物をエタノール（１０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させた。残渣を蒸留水（１０ｍＬ）に溶解し、−７８℃の真空下で乾燥させてエタノール残渣を除去した。白色固体としてヘミフマル酸塩１０ａ（１．０８ｇ、６４％）を得た。
【０１６５】
（Ｓ）−キサモテロールの２，２−ジメチルヘキサノエートエステル（１０ｂ）：
この化合物１０ｂを、上記に１０ａについて記載した手順にしたがって調製し、ヘミフマル酸塩に変換して、所望の産物０．９９５ｇ（１．９０ｍｍｏｌ、２８％）を得た。
【０１６６】
加えて、アミンに対する加水分解的に分解可能なカルバメート誘導体を、両方ともその全体が本明細書に援用される、米国特許第５，４６６，８１１号および第７，９８８，９５６号に記載されている通りに用いてもよい。具体的に、米国特許第５，４６６，８１１号は、１級アミンおよび２級アミンの両方から生物可逆的な中性プロドラッグを生成するための、オキソジオキソレニルメチルカルバメートの使用を開示している。
【０１６７】
一般的に、β１−ＡＤＲアゴニスト化合物のヒドロキシル基および／またはアミン基のいずれかまたは両方のあらゆる誘導体化は、生成されるプロドラッグのｃｌｏｇＰ値が０を超え、好ましくは１．０を超え、最も好ましくは２．０を超えるのであれば許容される。しかし、上記に記載した通り、アシル化された末端のフェニルヒドロキシル基を有するキサモテロールプロドラッグを用いるのが特に有利である。このような化合物は、図１７の下の構造式に示す一般式を有する。
【０１６８】
さらに、Ｒ１−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−基のＲ１部分および／またはＲ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−基のＲ２部分（図１７に位置を記載する）は各々、炭素原子５から３０個までの親油性基であり、これらは非置換でもよく、または低級アルキル、低級アルコキシ、もしくはハロ、好ましくはフルオロで任意選択で置換されていてもよい直鎖状、分枝状、または環状基であってよい。本出願で用いる「低級」との用語は、Ｃ１〜Ｃ６を意味する。しかし、環状化合物も、図１９（上の図）に示す通り任意選択で置換されていてよいフェニル環、またはやはり図１９（下の図）に示すものなどの複素環など、炭素原子５から３０個の親油性基に包含することができる。アシル基の１級鎖または主鎖（ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｒ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ）のＲ１および／またはＲ２部分が炭素原子８、９、または１０から３０個であるのが好ましい。１級鎖または主鎖の炭素原子の数の範囲には、いかなる側鎖の炭素原子も含まれない。「側鎖」に対する「１級鎖または主鎖」との用語は、本明細書において、標準のＩＵＰＡＣ呼称命名法により決定される。よって、例えば、２−メチルペンタンでは、１級鎖または主鎖はペンタン（Ｃ５）であり、側鎖はメチル（Ｃ１）である。
【０１６９】
環状化合物のＲ１および／またはＲ２部分は、一般的に、−Ｏ−もしくは−Ｎ−などのヘテロ原子を含有せず、またはヘテロ原子１もしくは２個を有する５員または６員環であってよい。さらに、ヘテロ原子を含有しない環は、飽和もしくは不飽和のいずれかであってよく、芳香環でもよい。ヘテロ原子は−Ｏ−または−Ｎ−でもよい。例示的な環系には、例えば、ピロール、フラン、イミジゾリン（ｉｍｉｄｉｚｏｌｉｎｅ）、イミダゾール、ピラゾリジン、ピラゾール、ピリジン、またはピランが含まれ、これらは非置換、または１〜４個の低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシル、もしくはハロ基、特にフルオロにより任意選択で置換されている。このような化合物は全て、上記のスキーム１および２を参照することにより、所望の対応するアシル化キサモテロールプロドラッグを調製するためのアシル化する好適な化合物を用いて、末端のフェニルヒドロキシ基のアシル化を伴う周知の手順によって合成することができる。
【０１７０】
上記のスキーム３を参照することにより、化合物２＞化合物３＞化合物５＞化合物６＞化合物８、および最終的に化合物１０に対する類似の反応を用いて、あらゆる親油性のアシル基をキサモテロールに付着させてもよいと見ることができる。すなわち、スキーム３を一般的に用いて：
Ｘ−ＯＨ＞Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｘ
［式中、Ｘはキサモテロールであり、Ｒは親油性基である］
に変換してもよい。
【０１７１】
注：上記の単純化した反応において、特定のＲ１および／またはＲ２よりむしろ、一般的なＲを用いるが、示したメカニズムは完全に両方を表す。
【０１７２】
例えば、キサモテロールの２級ヒドロキシ基を、一般的にエステル化、具体的にアシル化するための公知のエステル化反応を用いて、図１７に示すＲ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−基を形成してもよい。例えば、両方ともその全体が本明細書に援用される、米国特許第３，２７８，５８５号および第８，６６９，３１１号を参照されたい。
【０１７３】
類似して、上記のスキーム１、２、および３に記載する反応を用いて、他のβ１−ＡＤＲアゴニストのプロドラッグを調製してもよい。
【０１７４】
スキーム３の式１０に対応する親油性Ｒ基（式中、代わりにＲ基はＲ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｘとしてキサモテロールの分子に直接付着している）の特定の例は以下の通りである：
Ｒは、非置換、または任意選択で置換されている、直鎖状、または分枝状アルキルであってよく、これは、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９もしくはＣ３０であるか、またはこれら同じＣ５〜Ｃ３０アルキル基の各々は非置換、または任意選択で置換されている、分枝状または環状基、例えば、シクロペンチル、もしくはシクロヘキシル、または直鎖状、分枝状、もしくは環状基の組合せであってよい。さらに、これらの直鎖状、分枝状、または環状基は、キサモテロールの分子を、例えばフェニルもしくはピラニルなどの環系と連結する１級鎖または主鎖における１つまたは複数の介在性の−Ｏ−または−Ｎ−基を有することができる。
【０１７５】
さらに、例えば、安息香酸エステルまたはピラニルエステルなど（これらの環は非置換でもよく、または１から５個の低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、もしくはハロ基により置換されていてもよい）、Ｒ１およびＲ２の両方のいずれかに対する環含有置換基を含めた、図１７および１８に例示するＲ１およびＲ２基の両方を有する化合物が特に企図される。
【０１７６】
加えて、Ｒ１および／またはＲ２基は、ヘテロ原子と環との間に間欠性の連結配列を含有していてもよい。例えば、Ｒ１および／またはＲ２は各々、例えば、
フェニルアラニル−オキソ−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、
ピラニル−（ＣＨ２）ｍ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−
であってよく、式中、ｍは炭素原子１〜２０個、好ましくは炭素原子１〜１０個である。この場合、−（ＣＨ２）−基は「リンカー」である。
【０１７７】
さらに、Ｒ１および／またはＲ２基にアミノ酸を含有する化合物が特に企図される。例えば、図１９の上の化合物は、キサモテロールの末端のフェニルヒドロキシ基に対してオキシエチルカルボニル基によって架橋されているフェニルアラニル基を含有する。あらゆるアミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸を、このような化合物におけるフェニルアラニンの代わりに用いることができる。例えば、アラニン、アスパラギン酸、イソロイシン、スレオニン、およびバリンなどのアミノ酸を言及することができる。
【０１７８】
本発明のプロドラッグ化合物は全て、これらのスキームとの類似性を必要とする、必要なあらゆる修飾を有する、上記のスキーム１、２、または３を参照することにより調製することができる。さらに、必要とされるあらゆる修飾を、周知の反応を用いて行ってもよい。
【０１７９】
用いるβ１−ＡＤＲプロドラッグ化合物の量の範囲
一般的に、ＡＤ、ＤＳ、または自閉症を処置するために、１つまたは複数のβ１−ＡＤＲプロドラッグ化合物を、臨床使用のためのヒトの、または前臨床試験もしくは薬物スクリーニングのための動物の、体重１ｋｇあたり約１から２０ｍｇの量を投与する。より好ましくは、ヒトおよび動物両方の体重１ｋｇあたり約２から１０ｍｇを投与する。さらに、投与は、ヒトには処置する医師、および動物には実験科学者（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ）または獣医師の自由裁量で、複数回であってよい。本明細書で用いる「約」は±２５％を意味する。よって、「約１」は０．７５から１．２５までを意味する。
【０１８０】
上記に記載した通り、β１−ＡＤＲプロドラッグは、無菌食塩水またはデキストロース５％−食塩水（Ｄ５Ｓ）の薬学的に許容される溶液中の溶液の形態において、ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．のいずれかによって投与する。しかし、親油性が非常に増強された、すなわち水溶性が低い、β１−ＡＤＲプロドラッグでは、様々な公知の懸濁物を用いることができる。その全体が本明細書に援用される、米国特許第５，６７９，１３８号を参照されたい。経口または鼻腔内などの他の投与方法を用いてもよい。経口投与は、懸濁剤、錠剤、またはカプセル剤で行うことができる。鼻腔内投与は、公知の方法を用いて、乾燥粉末吸入器、ミスト吸入器を用いて、または液滴もしくはスワブによって行うことができる。
【０１８１】
認知および社会的記憶の改善のための試験
ＡＤ、ＤＳ、ＡＤＤ、ＡＤＨＤ、および自閉症を有するヒトにおける認知および社会的記憶の改善のための試験を、観察を含めた公知の診断方法を用いて行う。例えば、マウスに対する試験は、本明細書上記に記載した公知の試験を用いて行うことができる。
【０１８２】
ＡＤを有するヒトに対して、試験は、Ｆｏｌｓｔｅｉｎ試験（簡易精神状態テスト（ｍｉｎｉ−ｍｅｎｔａｌ  ｓｔａｔｅ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）としても知られる）を用いて行うことができる。この試験は、精神障害に対してスクリーニングするための質問票を利用するものであり、Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓにより出版されている。試験されるカテゴリーには、例えば、時間および場所の見当識、注意および計算、追想、言語認識、反復、ならびに複雑な命令に従う能力が含まれる。試験される個体を、各カテゴリーに対する点数の可能な最大数中、各カテゴリーにおいて与えられる点数によって格付けする。
【０１８３】
ＤＳを有するヒトでは、試験は通常、Ａｒｉｚｏｎａ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｔｅｓｔ  Ｂａｔｔｅｒｙで行う。Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｄｅｖ．  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ、２０１０年９月１日；２巻（３号）：１４９〜１６４頁を参照されたい。
【０１８４】
自閉症スペクトラム障害を有するヒトでは、試験は通常、Ｓｏｃｉａｌ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｓｋｉｌｌｓ  Ｔｅｓｔで行う。Ｊ．  Ｉｎｔｅｌｌ．  Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ、２００８年３月；１２巻（１号）：４９〜５７頁を参照されたい。本発明の化合物および組成物は、全範囲の自閉症スペクトラム障害を表す個体を処置するのに用いると有利であり得ることが、本明細書において明確に認められている。
【０１８５】
合成例
その全体が本明細書に援用される、米国特許第４，１４３，１４０号からのキサモテロールフマル酸塩の調製。
【０１８６】
１−ｐ−ベンジルオキシフェノキシ−２，３−エポキシプロパン（１１．５ｇ）のイソプロパノール（６ｍｌ）中懸濁物を、４−（Ｎ−β−アミノエチルカルバモイル）モルホリン硫酸水素塩（１２．７ｇ）、水酸化カリウム（７．０ｇ）、およびイソプロパノール（１０ｍｌ）の撹拌混合物へ加え、混合物を４５℃で１時間撹拌し、次いで、減圧下で蒸発乾固する。残渣の油を水と撹拌し、混合物をろ過し、固体残渣をアセトンに溶解する。混合物のｐＨが２未満になるまでプロパノール中塩化水素の３０％溶液を加え、混合物をろ過する。固体残渣を水から結晶化し、よって、１−ｐ−ベンジルオキシフェノキシ−３−（β−モルホリノカーボンアミドエチル）アミノ−２−プロパノール塩酸塩（４．９ｇ）を得る。
【０１８７】
上記の化合物のエタノール（２０ｍｌ）および酢酸（２０ｍｌ）の混合物中溶液を、水素雰囲気中、実験室の温度および圧力で、水素２５０ｍｌが吸収されるまで、３０％パラジウム炭素触媒（０．１ｇ）と一緒に振盪する。混合物をろ過し、ろ液を減圧下で蒸発乾固し、残渣を、フマル酸（１．２５ｇ）のエタノール（１５ｍｌ）中熱溶液に加える。混合物を１２時間、５℃に維持し、次いでろ過し、固体残渣を熱エタノールで洗浄し、次いで乾燥させる。よって、１−ｐ−ヒドロキシフェノキシ−３−β−（モルホリノカーボンアミド）エチル−アミノ−２−プロパノールフマル酸水素塩、ｍ．ｐ．１６８〜１６９℃を得る（分解物を含む）。
【０１８８】
出発材料として用いる４−（Ｎ−β−アミノエチルカルバモイル）モルホリン硫酸水素塩は、以下の通りに得ることができる：
モルホリン（４．３５ｇ）およびクロロギ酸フェニル（６．３５ｇ）を、０℃に維持したトルエン（１０ｍｌ）、水（５ｍｌ）、および水酸化ナトリウム（２ｇ）の撹拌混合物へ、別々に、かつ同時に、２０分の間、滴下添加する。混合物をさらに２時間撹拌し、温度を２０℃まで上げる。トルエン溶液を分離し、水溶液をトルエンで２回抽出し、トルエン溶液を合わせ、水で洗浄し、乾燥させ、減圧下で蒸発乾固する。残渣を石油エーテル（ｂ．ｐ．６０〜８０℃）から結晶化させ、Ｎ−フェノキシカルボニルモルホリン、ｍ．ｐ．４６．５〜４７．５℃を得る。この化合物（１１ｇ）およびエチレンジアミン（２７．８ｇ）の混合物を、実験室温度で３日間撹拌し、過剰のエチレンジアミンを減圧下で蒸発させることによって除去する。残渣をメタノールに溶解し、溶液を５℃に冷却し、溶液のｐＨが２になるまで濃硫酸を加える。フィルターエイド（セライト、１０ｇ）を加え、混合物を１時間撹拌し、次いでろ過する。ろ液を減圧下で蒸発乾固し、残渣を酢酸エチルと撹拌する。混合物をろ過し、よって、固体残渣として４−（Ｎ−β−アミノエチルカルバモイル）モルホリン硫酸水素塩、ｍ．ｐ．１６８〜１６９℃を得る。上記の調製において、化学量論的にフマル酸の代わりにあらゆる有機酸または無機酸を用いて、キサモテロールの対応する塩を調製してもよい。
【０１８９】
本発明を記載してきたが、上記に記載した実施形態に対して、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、多くの慣例的な変化および修飾を行うことができることが理解される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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