(57)【要約】  本発明は、生体触媒としてニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）およびアミダーゼ産生微生物を使用して、ニトリル化合物から副産物としてのアクリル酸の含有量がより少ないアミド化合物を産生する手段ならびに方法に関する。本発明の方法によって得られる水性アミド化合物およびアクリルアミドまたはポリアクリルアミドを含む組成物、ならびにニトリル化合物と接触させて前記ニトリル化合物をアミド化合物に変換する際に少なくとも４００のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を示す乾燥微生物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリル化合物からアミド化合物を産生する方法であって、ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）およびアミダーゼ産生微生物と接触させる工程を含み、前記微生物を、前記ニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理する、方法。
【請求項２】
参照微生物と比較して、前記微生物のＮＨａｓｅ活性対アミダーゼ活性の比が増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物のＮＨａｓｅ活性対アミダーゼ活性の比が、参照微生物と比較して少なくとも１．４、１．５、１．６または１．７倍に増加している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物のアミダーゼ活性対ＮＨａｓｅ活性の比が、参照微生物と比較して少なくとも０．７または０．６倍低下している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、少なくとも４００のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を示す、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ニトリル化合物からアミド化合物を産生する方法であって、
（ａ）ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程と、
（ｂ）ニトリル化合物を前記微生物と接触させる工程と
を含む、方法。
【請求項７】
工程ａ）が、前記微生物の前記ＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を増加させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記乾燥が、噴霧乾燥、凍結乾燥、熱乾燥、風乾、真空乾燥、流動床乾燥および／または噴霧造粒を介し、噴霧乾燥および凍結乾燥が好ましい、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記接触工程が、乾燥微生物を用いて行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触工程が、再構成された微生物を用いて行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、水性組成物に懸濁される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触工程が、粉末、顆粒、懸濁液、および／またはマトリックス結合微生物の形の微生物を用いて行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が細菌である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、ロドコッカス属、アスペルギルス属、アシドボラックス属、アグロバクテリウム属、バチルス属、ブラジリゾビウム属、バークホルデリア属、エシェリキア属、ゲオバチルス属、クレブシエラ属、メソリゾビウム属、モラクセラ属、パントエア属、シュードモナス属、根粒菌属、ロードシュードモナス属、セラチア属、アミコラトプシス属、アルトロバクター属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ノカルジア属、シュードノカルジア属、トリコデルマ属、ミロテシウム属、アウレオバシジウム属、カンジダ属、クリプトコックス属、デバリオミセス属、ゲオトリクム属、ハンセニアスポラ属、クルイウェロマイセス属、ピキア属、ロドトルラ属、コマモナス属（Ｃｏｍｏｍｏｎａｓ）およびピロコッカス属の群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物が、ロドコッカス属、シュードモナス属、エシェリキア属およびゲオバチルス属の群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、ロドコッカス・ロドクラウス、ロドコッカス・ピリジノボランス、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・エクイ、ロドコッカス・ルーバー、ロドコッカス・オパカス、アスペルギルス・ニガー、アシドボラックス・アベナエ、アシドボラックス・ファシリス、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、バチルス・サブチリス、バチルス・パリダス、バチルス・スミシー、バチルス  ｓｐ  ＢＲ４４９、ブラジリゾビウム・オリゴトロフィクム、ブラジリゾビウム・ジアゾエフィシエンス、ブラジリゾビウム・ジャポニクム、バークホルデリア・セノセパシア、バークホルデリア・グラディオリ、大腸菌、ゲオバチルス  ｓｐ．ＲＡＰｃ８、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・バリコラ、メソリゾビウム・シセリ、メソリゾビウム・オポテュニスタム、メソリゾビウム  ｓｐ．Ｆ２８、モラクセラ属、パントエア・エンドピュティカ、パントエア・アグロメランス、シュードモナス・クロロラフィス、シュードモナス・プチダ、リゾビウム属、ロドシュードモナス・パルストリス、セラチア・リクファシエンス、セラチア・マルセッセンス、アミコラトプシス属、アルトロバクター属、ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＣＨ１、ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＣＨ２、ブレビバクテリウム  ｓｐ．Ｒ３１２、ブレビバクテリウム・インペリアーレ、コリネバクテリウム・ニトリロフイラス、コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム、コリネバクテリウム・グルタニカム、コリネバクテリウム・ホフマンニイ、ミクロバクテリウム・インペリアーレ、ミクロバクテリウム・スメグマチス、ミクロコッカス・ルテウス、ノカルジア・グロベルラ、ノカルジア・ロドクラウス、シュードノカルジア・サーモフィラ、トリコデルマ属、ミロテシウム・バルカリア、アウレオバシジウム・プルランス、カンジダ・ファマタ、カンジダ・ギリエルモンディ、カンジダ・トロピカリス、クリプトコックス・フラバス、クリプトコックス  ｓｐ．ＵＦＭＧ−Ｙ２８、デバリオミセス・ハンセニイ、ゲオトリクム・カンジドゥム、ゲオトリクム  ｓｐ．ＪＲ１、ハンセニアスポラ属、クルイウェロマイセス・サーモトレランス、ピキア・クリュイベリ、ロドトルラ・グルチニス、コマモナス・テストステロニ、ピロコッカス・アビシ、ピロコッカス・フリオサス、ピロコッカス・ホリコシイ、ブレビバクテリウム・カセイ、もしくはノカルジア  ｓｐ．１６３の群から選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、ロドコッカス・ロドクラウスまたはロドコッカス・ピリジノボランスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物が、ロドコッカス・ロドクラウス（ＮＣＩＭＢ４１１６４）、ロドコッカス・ロドクラウス（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）またはロドコッカス・ロドクラウスＭ３３である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ニトリル化合物がアクリロニトリルである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記アミド化合物がアクリルアミドである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）乾燥工程によって前記生体触媒を前処理する工程と、
（ｂ）工程（ａ）において得た前記乾燥生体触媒を水溶液と混合して活性化混合物を得る活性化工程であり、前記活性化混合物が緩衝液を含む工程と、
（ｃ）反応混合物中で前記乾燥生体触媒を使用して前記ニトリル化合物を前記アミド化合物に変換する工程であり、前記反応混合物が工程（ｂ）の前記緩衝液を含む工程と
を含み、前記活性化混合物中の前記緩衝液のモル濃度対前記反応混合物中の前記緩衝液のモル濃度の比が、任意で変換の終了前に約２：１またはより高い、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を増加させた微生物を産生する方法であって、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程を含む、方法。
【請求項２３】
アミダーゼ活性を低下させた微生物を産生する方法であって、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程を含む、方法。
【請求項２４】
ニトリル化合物からアミド化合物を産生するときにアクリル酸の形成を減少させる方法であって、アクリロニトリルをＮＨａｓｅおよびアミダーゼ生産微生物と接触させる工程を含み、前記微生物が請求項１から２３のいずれか一項に定義されるものである、方法。
【請求項２５】
前記ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物が、乾燥前に固定化されない、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法によって得られる水性アミド化合物溶液。
【請求項２７】
アクリルアミドもしくはポリアクリルアミドならびにＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を含む組成物であって、前記微生物が少なくとも４００のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を示し、および／または参照微生物と比較した場合に、少なくとも１．７倍に増加しているＮＨａｓｅ活性対アミダーゼ活性の比を示す組成物。
【請求項２８】
ニトリル化合物からアミド化合物を産生するために、請求項１から２７のいずれか一項に定義されるＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を使用する方法。
【請求項２９】
ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を増加させる乾燥方法を使用する方法。
【請求項３０】
ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物のアミダーゼ活性を低下させる乾燥方法を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体触媒としてニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）およびアミダーゼ産生微生物を使用してニトリル化合物からアミド化合物を産生する方法であって、微生物を、前記ニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理する方法、ならびにニトリル化合物からアミド化合物を産生するためにそのような微生物を使用する方法に関する。加えて、本発明は、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ生産微生物によってニトリル化合物からアミド化合物を産生する場合にアクリル酸副産物の形成を減少させる方法ならびにそのような微生物のＮＨａｓｅ／アミダーゼを増加させるまたはアミダーゼ活性を低下させる乾燥方法を使用する方法を対象とする。本発明の方法によって得られる水性アミド化合物およびアクリルアミドまたはポリアクリルアミドを含む組成物、ならびにニトリル化合物と接触させて前記ニトリル化合物をアミド化合物に変換する際に少なくとも４００のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を示す乾燥微生物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
アクリルアミドのポリマーおよびコポリマーを形成するには、モノマーとしてアクリルアミドが使用される。これらの重合および共重合反応の場合、生物変換によって製造した水性アクリルアミド溶液を使用することができる。しかしながら、アクリルアミド溶液中の高いアクリル酸含有量が高いと、得られるアクリルアミドポリマーおよびコポリマーの性能が低下することが分かった。より具体的には、アクリル酸の存在はアクリルアミドポリマーおよびコポリマー材料の物理的特性を著しく損なう場合があり、これは水処理、製紙、油回収または採鉱など様々な適用において溶解度ならびに性能の低下を引き起こす。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）、ニトリルをアミドに加水分解する微生物酵素、の発見以来、アミド化合物の工業生産にはＮＨａｓｅ活性を有する微生物が集中的に使用されてきた。アミドの化学的合成と比較してより穏やかな反応条件のため、生体触媒としてのＮＨａｓｅ産生微生物の使用は、ますます増加傾向にある。
【０００４】
実際に、ＮＨａｓｅ産生微生物によるニトリル生物変換で最も周知されている商業的な例の１つは、アクリロニトリルからのアクリルアミドの製造である。
【０００５】
しかしながら、ＮＨａｓｅ産生微生物を生体触媒として使用する上での困難な問題は、酵素アミダーゼを介する副反応の存在である。ＮＨａｓｅは、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に加水分解する一方で、アミダーゼは、アミド化合物を対応するカルボン酸、特にアクリル酸へとさらに変換する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の根底にある技術的な問題は、生体触媒としてＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を使用するニトリル化合物からのアミド化合物の産生において副産物であるアクリル酸の形成により起こる問題を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この技術的な問題は、特許請求の範囲に反映され、明細書に記載され、以下の実施例および図に例示される実施形態を提供することによって解決される。
【０００８】
非常に驚いたことに、ニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）およびアミダーゼを産生し、生物変換の生体触媒としての機能を果たす微生物をニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理すると、ニトリル化合物のアミド化合物への生物変換における副産物であるカルボン酸の産生、特にアクリル酸の産生が大いに低下することを本発明者らは見出した。理論に束縛されるものではないが、そのような微生物が供される乾燥工程により、アミダーゼ活性が低下し、それによってＮＨａｓｅの活性によって産生されるアミドからのアクリル酸の産生を減少させ得るように見える。換言すれば、そのような乾燥微生物は、ＮＨａｓｅ活性がより高いＮＨａｓｅ活性とアミダーゼ活性の間の比を有すると思われ、すなわち、ＮＨａｓｅ活性対アミダーゼ活性の比は、１．０超、例えば、少なくとも１０超、５０超、１００超、２００超、３００超または４００超である。
【０００９】
実際に、添付の実施例に示す通り、後に微生物による生物変換に供されるニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理した微生物が、ＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性について最も高い値を有することは明らかである。設定条件がほぼ等量の生体触媒を含有したという事実（「設定条件におけるＮＨａｓｅ活性」に反映される、表１および２を参照のこと）を踏まえると、乾燥工程、すなわちニトリル化合物と接触させる前に生体触媒を乾燥工程に供する工程が、副産物アクリル酸の量に著しく影響することは明らかである。このことは、乾燥工程のため、そのような乾燥微生物は、副産物としてのアクリル酸の含有量がより少ないアミド化合物を産生する程度までアミダーゼ活性が減少することを意味し、これは最も外側の右列から明らかなである。要するに、反応パラメータは、異なる設定条件の間で等しく保たれているので、アクリル酸の量を減少させる改善が、乾燥工程によるものである可能性があることは明らかである。
【００１０】
したがって、本発明は、ニトリル化合物からアミド化合物を産生する方法であって、ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）およびアミダーゼ産生微生物と接触させる工程を含み、前記微生物を、前記ニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理する方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、ニトリル化合物からアミド化合物を産生する方法であって、（ａ）ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程と、（ｂ）ニトリル化合物を前記微生物と接触させる工程とを含む、方法を提供する。
【００１２】
さらにまた、本発明の驚くべき知見と合致して、アクリロニトリルをＮＨａｓｅおよびアミダーゼ生産微生物と接触させる工程を含むニトリル化合物からアミド化合物を産生するときにアクリル酸の形成を減少させる方法であって、前記微生物が本明細書に定義されるものである方法が、本明細書において提供される。
【００１３】
また、ＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を増加させた微生物を産生する方法であって、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程を含む、方法が提供される。
【００１４】
同様に、アミダーゼ活性を低下させた微生物を産生する方法であって、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程を含む、方法が、本明細書において提供される。
【００１５】
さらにまた、本発明は、ニトリル化合物からアミド化合物を産生するために、本明細書に定義されるＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を使用する方法を提供する。
【００１６】
同様に、本発明は、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を増加させる乾燥方法を使用する方法を提供する、または別法においてもしくは加えて、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物のアミダーゼ活性を低下させる乾燥方法を使用する方法を提供する。
【００１７】
本発明者らの知見と合致して、アミド溶液は、ニトリル化合物のアミド化合物への変換の副産物としてのアクリル酸の含有量がより少ないので、本発明は、本発明の方法によって得られる水性アミド化合物溶液を提供する。
【００１８】
さらに本発明者らの知見と合致して、アクリルアミドまたはポリアクリルアミドならびにＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を含む組成物であって、前記微生物が少なくとも４００のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を好ましくは示す組成物が、本明細書において提供される。
【００１９】
本発明を、いくつかの典型的な実施形態を参照して以下で詳述する。本発明の実施形態の完全な理解を提供するために、多数の具体的詳細が述べる。さらに本発明による方法、組成物または使用について単一の特徴を定義し、指定する場合、そのような定義および仕様は、本明細書に記述され、提供されている発明の方法、発明の組成物ならびに発明の使用の全てに適用される。
【００２０】
さらにまた、以下に述べる特定の詳細のうちいくつかまたは全てがなくても実施形態を実施できることは、当業者に明らかである。他の例において、本発明を不必要に不明瞭にしないために、周知のプロセス工程については詳述しなかった。
【００２１】
本発明の知見と合致して判明したように、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物は、ニトリル化合物をアミド化合物に変換することが可能であるが、他のそのようなＮＨａｓｅならびにアミダーゼ産生微生物とは対照的に、アミド化合物への生物変換に供されるべきニトリル化合物と接触させる前に前記微生物を乾燥工程によって前処理する場合、産生されるカルボン酸、特にアクリル酸がより少ない。特にアクリル酸は、アミドからポリアクリルアミドへのその後の重合反応において問題の原因になるので、そのような乾燥微生物のこの特性は有利である。したがって、微生物が少量／低濃度のカルボン酸、特にアクリル酸を含むアミド化合物を産生するようにＮＨａｓｅ活性は基本的に変わらないが、低いアミダーゼ活性を有する微生物の形で生体触媒を提供することは、本発明者らによる優れた功績である。注目すべきは、本発明者らが、ＮＨａｓｅならびにアミダーゼ産生微生物を遺伝子操作するもしくはそのような微生物を突然変異誘発剤などに供することなく、または（偶然に）天然に存在するそのような微生物のために過度のスクリーニングをすることなく、アミド化合物への生物変換の過程で前記微生物をニトリル化合物と接触させる前にＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥工程に供することを思慮深く観察することによってこの功績に達したことである。
【００２２】
したがって、本発明は、ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼ（ＮＨａｓｅ）およびアミダーゼ産生微生物と接触させる工程を含み、前記微生物を、前記ニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、ニトリル化合物からアミド化合物を産生する方法であって、（ａ）ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程と、（ｂ）ニトリル化合物を前記微生物と接触させる工程とを含む、方法を提供する。
【００２４】
さらにまた、本発明は、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼを産生することが可能な乾燥微生物であって、ＮＨａｓｅとアミダーゼ活性の間の比が、１．０超、例えば、少なくとも１０超、５０超、１００超、２００超、３００超または４００超であり、前記乾燥微生物を、アミド化合物に（生物）変換されるべきニトリル化合物と接触させる前に乾燥されない同じ微生物と比較して、副産物として非常に少ないアクリル酸を含むアミド化合物を産生することができる乾燥微生物を提供する。
【００２５】
用語「接触させる前に乾燥工程によって前処理する」は、本発明の方法およびそれを使用する方法のいずれかに適用する前に、微生物が、前記微生物を乾燥させる手段ならびに／または方法によって処理することを意味する。特に、微生物は、前記微生物によって（生物）変換されるべきニトリル化合物と接触させる前に乾燥させる。したがって、本発明の好ましい微生物は、前記乾燥微生物によってアミド化合物に（生物）変換されるべきニトリル化合物と接触させる（または接触させる）前に乾燥させる（乾燥工程に供する）。好ましくは、乾燥工程により、微生物の全質量の最大３０、２５、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５質量パーセンテージ（ｗ／ｗ％）の残留水分含量を有する微生物を得られる。そのため「微生物の全質量」は、微生物それ自身の質量に必ずしも限定されず、したがって（例えば、微生物を乾燥工程の前に水で洗浄した場合に当然考え得るが）その存在が微生物の培養および／または洗浄工程等によるものであり得る成分をさらに含むことができる。以下に述べることは、「微生物の全質量」は、（微生物に加えて）ＴＲＩＳ系緩衝液、食塩水系緩衝液等など、残存量の貯蔵緩衝液構成要素／塩類、および／または残存量の培地、成長培地、栄養液、発酵ブロス、例えば微生物を培養するために使用した発酵ブロス等、安定剤、添加物（例えば乾燥添加物）等をさらに含み得るということである。
【００２６】
用語「微生物」は、本明細書に使用される場合、「ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ産生微生物」あるいは「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」を包含する。本発明の文脈において微生物は、好ましくは細菌、真菌または酵母である。本発明の微生物は、前記微生物によるアミド化合物への生物変換に供されるニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって好ましくは前処理する。本発明の微生物は、乾燥される前に好ましくは固定化されない。本明細書では「固定化される」とは、支持体マトリックスに微生物を結合もしくは吸着させる、支持体マトリックス中に微生物を捕捉または封入することを含むがこれに限定されない当業者に公知の任意の固定技術のことを指す。
【００２７】
本発明の中で、「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」は、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換する生体触媒として使用される、またはそれ用である。前述の通り、そのような微生物は、アミド化合物への生物変換に供されるニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって好ましくは前処理する。結果として、そのような微生物は、アミド化合物に変換されるべきニトリル化合物と接触させる前に乾燥されない同じ微生物と比較して、副産物としてのアクリル酸の含有量が非常に少ないアミド化合物を産生することができる。
【００２８】
「ニトリル化合物」は、本発明の微生物によりＮＨａｓｅの作用によってアミド化合物に変換される。ニトリル化合物は−Ｃ≡Ｎ官能基を有する任意の有機化合物である。好ましいニトリル化合物は、アクリロニトリルである。本明細書に開示する方法においてメタクリロニトリル、アセトニトリルまたは３−シアノピリジンを使用することも想定される。
【００２９】
「アミド化合物」は、アミダーゼによってアミド化合物に変換される。アミド化合物は、官能基ＲｎＣ（Ｏ）ｘＮＲ’２を有し、式中ＲおよびＲ’とは、Ｈまたは有機基のことを指す。有機アミドについてｎ＝１、ｘ＝１である。アミド化合物の例は、アクリルアミドである。本発明の方法について想定されるアミド化合物のさらなる例は、メタクリルアミド、アセトアミドまたはニコチンアミドである。
【００３０】
本発明の中で、「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」は、酵素ＮＨａｓｅおよびアミダーゼを産生することができる任意の微生物であることができる。これに関して、微生物が、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼを天然にコードするかどうか、または前記酵素をコードするように遺伝子組換えされているかどうかは、本発明と関連性がない。さらにまた、生体触媒は、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼを天然にコードする、ならびにさらに遺伝子操作されている、例えば、ＮＨａｓｅの産生を増加させる、またはＮＨａｓｅの安定性および／もしくは輸送を増加させる、あるいはアミダーゼの産生を低下させる、またはアミダーゼの安定性および／もしくは輸送を増加させる、微生物であり得る。
【００３１】
本発明の文脈において、ＮＨａｓｅを天然にコードしていない「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」は、ＮＨａｓｅをコードする遺伝子を天然には含有しないが、例えばＮＨａｓｅをコードするポリヌクレオチドを含有するように操作されている遺伝子操作微生物であることができ（例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、または細胞内にポリヌクレオチドを移入もしくは挿入するのに適当な当技術分野において公知の他の方法による；参照Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）、したがって微生物は、ＮＨａｓｅ酵素を産生し、安定して維持することが可能になる。この目的のために、ＮＨａｓｅ遺伝子またはｍＲＮＡそれぞれの転写および翻訳を可能にするのに必要になり得る追加のポリヌクレオチドを挿入することがさらに必要となる場合がある。そのような追加のポリヌクレオチドは、とりわけ、プロモーター配列、または複製開始点もしくは他のプラスミド制御配列を含むことができる。この文脈において、ＮＨａｓｅをコードしている遺伝子を天然に含有しないが、例えばＮＨａｓｅをコードしているポリヌクレオチドを含有するように操作されているそのような遺伝子操作微生物は、原核または真核微生物であることができる。そのような原核微生物の例には、例えば、種の代表である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）がある。そのような真核微生物の例には、例えば、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がある。
【００３２】
同様に、アミダーゼを天然にコードしていない「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」は、アミダーゼをコードする遺伝子を天然には含有しないが、例えばアミダーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するように操作されている遺伝子操作微生物であることができ（例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、または細胞内にポリヌクレオチドを移入もしくは挿入するのに適当な当技術分野において公知の他の方法による；参照Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）、したがって微生物はアミダーゼ酵素を産生し、安定して維持することが可能になる。この目的のために、アミダーゼ遺伝子またはｍＲＮＡそれぞれの転写および翻訳を可能にするのに必要になり得る追加のポリヌクレオチドを挿入することがさらに必要となる場合がある。そのような追加のポリヌクレオチドは、とりわけ、プロモーター配列、または複製開始点もしくは他のプラスミド制御配列を含むことができる。この文脈において、アミダーゼをコードしている遺伝子を天然に含有しないが、例えばアミダーゼをコードしているポリヌクレオチドを含有するように操作されているそのような遺伝子操作微生物は、原核または真核微生物であることができる。そのような原核微生物の例には、例えば、種の代表である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）がある。そのような真核微生物の例には、例えば、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がある。
【００３３】
（天然にまたは非天然に）ＮＨａｓｅをコードする「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」は、一般にＮＨａｓｅを産生し、安定して維持することもできる。しかしながら、本発明によると、そのような微生物は、乾燥および／またはニトリル化合物と接触させたとき、微生物の培養（または発酵）の間にＮＨａｓｅだけを産生する（したがってその場合ＮＨａｓｅを含有する）可能性もある。そのような場合、微生物は、本明細書に記述し、提供した方法の間にＮＨａｓｅをもはや産生しないが、微生物が乾燥前に産生し、乾燥後にまだ含有しているＮＨａｓｅユニットだけで作用する可能性がある。当業者によって直ちに理解されるように、一部のＮＨａｓｅ分子が、微生物を離れ（例えば、微生物の溶解による）、溶液中で生体触媒として自由に作用できる可能性もある。
【００３４】
同様に、（天然にまたは非天然に）アミダーゼをコードする「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」は、一般にアミダーゼを産生し、安定して維持することもできる。しかしながら、本発明によると、そのような微生物は、乾燥および／またはニトリル化合物と接触させたとき、微生物の培養（または発酵）の間にアミダーゼだけを産生する（したがってその場合アミダーゼを含有する）可能性もある。そのような場合、微生物は、本明細書に記述し、提供した方法の間にアミダーゼをもはや産生しないが、微生物が乾燥前に産生し、乾燥後にまだ含有しているアミダーゼユニットだけで作用する可能性がある。
【００３５】
本発明の文脈において、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼを天然にコードしている「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」には、とりわけ、ロドコッカス属、アスペルギルス属、アシドボラックス属、アグロバクテリウム属、バチルス属、ブラジリゾビウム属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア属、エシェリキア属、ゲオバチルス属、クレブシエラ属、メソリゾビウム属、モラクセラ属、パントエア属、シュードモナス属、根粒菌属、ロードシュードモナス属、セラチア属、アミコラトプシス属、アルトロバクター属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ノカルジア属、シュードノカルジア属、トリコデルマ属、ミロテシウム属、アウレオバシジウム属、カンジダ属、クリプトコックス属、デバリオミセス属、ゲオトリクム属、ハンセニアスポラ属、クルイウェロマイセス属、ピキア属、ロドトルラ属、コマモナス属（Ｃｏｍｏｍｏｎａｓ）およびピロコッカス属の細菌がある。本発明の好ましい実施形態において、微生物は、ロドコッカス属、シュードモナス属、エシェリキア属およびゲオバチルス属の細菌から選択される。
【００３６】
特に、「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」には、とりわけ、以下の種、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス・ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アシドボラックス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・パリダス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス  ｓｐ  ＢＲ４４９、ブラジリゾビウム・オリゴトロフィクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ブラジリゾビウム・ジアゾエフィシエンス（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、ブラジリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・グラディオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ）、大腸菌、ゲオバチルス  ｓｐ．ＲＡＰｃ８、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クレブシエラ・バリコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）、メソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃｉｃｅｒｉ）、メソリゾビウム・オポテュニスタム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｕｍ）、メソリゾビウム  ｓｐ．Ｆ２８、モラクセラ属、パントエア・エンドピュティカ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、リゾビウム属、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アミコラトプシス属、アルトロバクター属、ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＣＨ１、ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＣＨ２、ブレビバクテリウム  ｓｐ．Ｒ３１２、ブレビバクテリウム・インペリアーレ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｐｅｒｉａｌｅ）、コリネバクテリウム・ニトリロフイラス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｉｔｒｉｌｏｐｈｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタニカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ホフマンニイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏｆｆｍａｎｉｉ）、ミクロバクテリウム・インペリアーレ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｐｅｒｉａｌｅ）、ミクロバクテリウム・スメグマチス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、ノカルジア・グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）、ノカルジア・ロドクラウス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、シュードノカルジア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ属、ミロテシウム・バルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）、アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、カンジダ・ファマタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコックス・フラバス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、クリプトコックス  ｓｐ．ＵＦＭＧ−Ｙ２８、デバリオミセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｉｉ）、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリクム  ｓｐ．ＪＲ１、ハンセニアスポラ属、クルイウェロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・クリュイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ブレビバクテリウム・カセイ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｓｅｉ）、またはノカルジア  ｓｐ．１６３がある。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」は、ロドコッカス・ロドクラウスまたはロドコッカス・ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）種の細菌である。これらの種の好ましい代表例は、ロドコッカス・ロドクラウス（ＮＣＩＭＢ４１１６４）、ロドコッカス・ロドクラウス（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）、ロドコッカス・ロドクラウスＭ８、およびロドコッカス・ロドクラウスＭ３３である。
【００３８】
本発明の文脈において、「ニトリルヒドラターゼ」（「ＮＨａｓｅ」）とは、ニトリルの対応するアミドへの水和を触媒する微生物酵素のことを指す（ＩＵＢＭＢ酵素命名法ＥＣ４．２．１．８４．）。しかしながら、本明細書では用語「ニトリルヒドラターゼ」および「ＮＨａｓｅ」は、修飾もしくは強化された酵素も包含し、その酵素は、例えば、ニトリル化合物（例えばアクリロニトリル）をアミド化合物（例えばアクリルアミド）へより速やかに変換することができる、またはより高い収率／時間比で産生することができる、あるいはニトリル化合物（例えばアクリロニトリル）のアミド化合物（例えばアクリルアミド）への変換（すなわち水和）を触媒可能な限りより安定している。
【００３９】
アクリロニトリルをアクリルアミドへ変換する所与の生体触媒（例えば「ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物」）の能力を決定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、本発明の文脈において、アクリロニトリルをアクリルアミドへ変換することができる所与の生体触媒の活性は、本発明の意味において以下の通りに決定することができる：最初に、細胞懸濁液、細胞溶解物、溶解した酵素粉末または推定されるニトリルヒドラターゼを含有する他の任意の試料１００μＬを、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液８７５μＬおよびアクリロニトリル２５μＬと１０００ｒｐｍのエッペンドルフチューブ振盪機で、２５℃で、１０分間反応させる。反応時間１０分後に、サンプルを抽出し、同体積の１．４％塩酸を添加することにより直ちに失活させることができる。サンプルを混合した後、１００００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって細胞を除去することができ、形成されたアクリルアミドの量は、ＨＰＬＣによって透明な上澄みを分析することによって決定される。本発明の文脈において酵素がニトリルヒドラターゼであることを確認するにはアクリルアミドの濃度を０．２５〜１．２５ｍｍｏｌ／Ｌにするものとし、したがって必要に応じてサンプルは希釈されなければならない、および変換を繰り返さなければならない。その後酵素活性は、ＨＰＬＣ分析から得られるアクリルアミド濃度を反応時間で割り、その時間は１０分間であり、この値をＨＰＬＣサンプルと元のサンプルの間の希釈係数と掛け算することによってアクリルアミドの濃度から導き出すことができる。５Ｕ／ｍｇ（乾燥細胞質量）超、好ましくは２５Ｕ／ｍｇ（乾燥細胞質量）超、より好ましくは、５０Ｕ／ｍｇ（乾燥細胞質量）超、最も好ましくは１００Ｕ／ｍｇ（乾燥細胞質量）超の活性は、機能的に発現しているニトリルヒドラターゼの存在を示し、本発明の文脈におけるニトリルヒドラターゼと考えられる。
【００４０】
本発明の文脈において、ニトリルヒドラターゼは、配列番号１のヌクレオチド配列（Ｒ．ロドクラウスのニトリルヒドラターゼのα−サブユニット：ＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＧＧＣＡＣＧＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴＣＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＧＣＡＡＧＴＧＧＣＴＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＧＣＧＴＣＡＴＴＧＧＧＣＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＧＧＣＧＧＴＣＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＣＧＣＡＴＣＡＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＧＴＧＣＴＡＴＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＡＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＴＣＣＣＧＡＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＡＣＣＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＧＣＴＣＡＡＧＣＧＣＧＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＣＧＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＧＡＡＡＴＣＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＣＧＧＡＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＴＴＧＧＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＧＡＴＧＡＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＴＡＡＴＧＣＧＣＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＧＴＡＴＧＡ）ならびに／または配列番号３のヌクレオチド配列（Ｒ．ロドクラウスのニトリルヒドラターゼのβ−サブユニット：ＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＡＴＡＣＧＧＡＣＣＧＧＴＣＣＣＣＴＡＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＡＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＧＧＡＣＣＣＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＴＧＣＡＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＣＧＣＧＧＴＴＣＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＣＧＡＴＧＧＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＴＣＡＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＡＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＡＣＧＴＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＣＧＧＴＡＣＡＣＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧＴＣＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＧＡＴＣＣＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣＧＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＧＣＧＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＧＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＡＣＣＣＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＧＡＡＡＴＡＴＧＴＧＣＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＣＧＣＣＴＡＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＣＴＣＧＣＣＣＧＣＴＣＴＡＣＡＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＣＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＧＡ��ＡＣＧＧＧＡＡＡＧＡＣＧＴＡＧＴＧＴＧＣＧＴＣＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＡＣＣＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＧＴＧＡ）と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、および最も好ましくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含むもしくはそれからなるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドであることができる、ただし、前記ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが、本明細書に記述され、例証されているアクリロニトリルのアクリルアミドへの水和を触媒することができる（すなわち、ニトリルヒドラターゼ活性を有する）場合に限る。また、本発明の文脈において、ニトリルヒドラターゼは、配列番号２のアミノ酸配列（Ｒ．ロドクラウスのニトリルヒドラターゼのα−サブユニット：ＶＳＥＨＶＮＫＹＴＥ  ＹＥＡＲＴＫＡＩＥＴ  ＬＬＹＥＲＧＬＩＴＰ  ＡＡＶＤＲＶＶＳＹＹ  ＥＮＥＩＧＰＭＧＧＡ  ＫＶＶＡＫＳＷＶＤＰ  ＥＹＲＫＷＬＥＥＤＡ  ＴＡＡＭＡＳＬＧＹＡ  ＧＥＱＡＨＱＩＳＡＶ  ＦＮＤＳＱＴＨＨＶＶ  ＶＣＴＬＣＳＣＹＰＷ  ＰＶＬＧＬＰＰＡＷＹ  ＫＳＭＥＹＲＳＲＶＶ  ＡＤＰＲＧＶＬＫＲＤ  ＦＧＦＤＩＰＤＥＶＥ  ＶＲＶＷＤＳＳＳＥＩ  ＲＹＩＶＩＰＥＲＰＡ  ＧＴＤＧＷＳＥＥＥＬ  ＴＫＬＶＳＲＤＳＭＩ  ＧＶＳＮＡＬＴＰＱＥ  ＶＩＶ）ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列（Ｒ．ロドクラウスのニトリルヒドラターゼのβ−サブユニット：ＭＤＧＩＨＤＴＧＧＭ  ＴＧＹＧＰＶＰＹＱＫ  ＤＥＰＦＦＨＹＥＷＥ  ＧＲＴＬＳＩＬＴＷＭ  ＨＬＫＧＩＳＷＷＤＫ  ＳＲＦＦＲＥＳＭＧＮ  ＥＮＹＶＮＥＩＲＮＳＹ  ＹＴＨＷＬＳＡＡＥ  ＲＩＬＶＡＤＫＩＩＴ  ＥＥＥＲＫＨＲＶＱＥ  ＩＬＥＧＲＹＴＤＲＫ  ＰＳＲＫＦＤＰＡＱＩ  ＥＫＡＩＥＲＬＨＥＰ  ＨＳＬＡＬＰＧＡＥＰ  ＳＦＳＬＧＤＫＩＫＶ  ＫＳＭＮＰＬＧＨＴＲ  ＣＰＫＹＶＲＮＫＩＧ  ＥＩＶＡＹＨＧＣＱＩ  ＹＰＥＳＳＳＡＧＬＧ  ＤＤＰＲＰＬＹＴＶＡ  ＦＳＡＱＥＬＷＧＤＤ  ＧＮＧＫＤＶＶＣＶＤ  ＬＷＥＰＹＬＩＳＡ）と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％および最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むもしくはそれからなるポリペプチドであることができる、ただし、前記ポリペプチドが、本明細書に記述され、例証されているアクリロニトリルのアクリルアミドへの水和を触媒することができる場合に限る。
【００４１】
２個以上の配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）の間の同一性のレベルは、当技術分野において公知の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ分析によって容易に決定することができる。一般に、本発明の文脈において、例えば、配列比較によって比較しようとする２個の配列（例えば、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）が、同一性の点で異なる場合、次に用語「同一性」とは、より短い配列および前記より短い配列に合致するより長い配列の一部のことを指すことができる。したがって、比較される配列が同じ長さでない場合、同一性の程度は、長い方の配列中にあるヌクレオチド残基と同一である短い方の配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージまたは短い方の配列中にあるヌクレオチド配列と同一である長い方の配列中のヌクレオチドのパーセンテージのいずれかを好ましくは指すことができる。この文脈において、当業者は、短い方の配列に合致する長い方の配列の一部を容易に決定する状況にある。さらにまた、本明細書では、核酸配列またはアミノ酸配列の同一性レベルとは、それぞれの配列の全長のことを指すことができ、好ましくは評価されたペアワイズであり、各ギャップは、１個のミスマッチとして計算される。配列比較のためのこれらの定義（例えば、「同一性」値の確立）は、本明細書に記述され、開示される全ての配列に適用されることとする。
【００４２】
さらに、本明細書では用語「同一性」は、対応する配列間に機能的および／または構造的等価性があることを意味する。本明細書に記述される特定の核酸／アミノ酸配列に対して所与の同一性レベルを有する核酸／アミノ酸配列は、これらの配列の誘導体／バリアントを表すことができ、それら誘導体／バリアントは、好ましくは、同じ生物学的機能を有する。誘導体／バリアントは、天然に存在する変形、例えば他の品種、種等、もしくは突然変異のいずれかに由来する配列であることができ、前記突然変異は、天然に生じた場合があり、または意図的な突然変異誘発によって作製された場合もある。さらにまた、変形は合成的に作製された配列であることができる。バリアントは、天然に存在するバリアントまたは合成的に作製されたバリアントもしくは組換えＤＮＡ技術によって作製されたバリアントであることができる。上記の核酸配列からの逸脱は、例えば、欠失、置換、付加、挿入および／または組換えによって作製することができた。用語「付加」とは、所与の配列の末端に少なくとも１個の核酸残基／アミノ酸を追加することを指すが、「挿入」とは、所与の配列の中に少なくとも１個の核酸残基／アミノ酸を差し込むことを指す。用語「欠失」とは、所与の配列において少なくとも１個の核酸残基またはアミノ酸残基を削除もしくは除去することを指す。用語「置換」とは、所与の配列において少なくとも１個の核酸残基／アミノ酸残基を置きかえることを指す。また、ここで使用されるこれらの定義は、必要な修正を加えて本明細書に提供され、記述される全ての配列に適用する。
【００４３】
一般に、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」または「核酸分子」は、同義に解釈される。一般に、核酸分子は、とりわけＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチドチオリン酸、置換リボオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ分子を含むことができる。さらにまた、用語「核酸分子」とは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのハイブリッドあるいは当技術分野において公知のその任意の修飾のことを指すことができる（例えば、修飾の例として米国特許第５，５２５，７１１号、第４，７１１，９５５号、第５，７９２，６０８号または欧州特許第３０２１７５号を参照のこと）。ポリヌクレオチド配列は、一本鎖もしくは二本鎖、線状もしくは環状、天然または合成であることができ、およびどんなサイズ制限もないことができる。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡもしくはそのようなＲＮＡをコードしているＤＮＡまたはキメロプラスト（Ｇａｍｐｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年、２８、４３３２〜４３３９頁）であることができる。前記ポリヌクレオチド配列は、ベクター、プラスミドまたはウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡの形であることができる。また、上記の核酸分子と相補的である核酸分子および本明細書に記述される核酸分子にハイブリダイズすることができる核酸分子について本明細書に記述される。本明細書に記述される核酸分子は、本発明の文脈において核酸分子の断片であることもできる。特に、そのような断片は機能的断片である。そのような機能的断片の例は、プライマーとしての機能を果たすことができる核酸分子である。
【００４４】
「アミダーゼ」とは、アミドのそれに対応するカルボン酸への加水分解を触媒する微生物酵素のことを指す（ＩＵＢＭＢ酵素命名法ＥＣ３．５．１．４．「アミダーゼ」）。本明細書においてアミダーゼとは、ＮＨａｓｅと同時発現され、ＮＨａｓｅによって産生されるアミドを対応するカルボン酸へとさらに変換するアミダーゼのことを好ましくは指す。本明細書では用語「アミダーゼ」は、そのような酵素がアミダーゼ活性をなお有する限り、修飾されたまたは能力が落ちた酵素も包含する。
【００４５】
理論に束縛されるものではないが、生体触媒（すなわち微生物）の乾燥は、アミダーゼの活性を低下させるとみられ、その際にＮＨａｓｅ活性はより低い程度で低下すると考えられるまたは変化しないままである。実際に、本発明者らは、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を、前記微生物による生物変換（アミド化合物へのニトリル化合物）に供されるべきニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理した場合、ＮＨａｓｅの活性がアミダーゼの活性より高いことを観察した。
【００４６】
上述の通り、微生物が、前記微生物によりアミド化合物へと変換されるべきニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理した場合、前記微生物が、前記ニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理されなかった同じ微生物と比較して、アクリル酸含有量がより少ないアミド化合物を産生できることが本発明者らによって観察された。
【００４７】
したがって、本発明の微生物は、少なくとも４００ユニットのＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を好ましくは有する。ＮＨａｓｅ活性は、本明細書で上に記載の通り好ましくは決定される。
【００４８】
また、本発明の知見によると、本発明の方法に記載の接触工程は、乾燥微生物を用いて行われる。一実施形態によると、本発明の方法に記載の接触工程は、再構成された微生物を用いて行われる。再構成された微生物は、懸濁された、すなわちスラリー中に存在する、または水もしくは生理的ｐＨを有する緩衝溶液などの水溶液、もしくは水性組成物に溶解された乾燥微生物である。後者は、グルコースなど１種類以上のさらなる成分を含有することができる。本明細書において再構成とは、微生物がニトリル化合物と接触させる前に乾燥微生物に水性組成物を添加することを指す。したがって、本明細書に記述される方法のいずれか１法において、接触工程は、水性組成物に懸濁した乾燥微生物を用いて行うことができる。そのような水性組成物には、水（例えば脱イオン水）および緩衝液（例えばリン酸緩衝液）があるが、これに限定されない。
【００４９】
上記から判断して、本発明の方法に記載の接触工程は、粉末、顆粒および／または懸濁液の形の微生物を用いて行われることが好ましい。接触工程を行うのにマトリックス結合微生物を使用することも可能である。
【００５０】
上で説明した通り、本明細書に記述される方法および使用にも適用される本発明の微生物のＮＨａｓｅ活性対アミダーゼ活性の比は、参照微生物と比較して増加している。
【００５１】
実際に、添付の実施例に示すように、後に前記微生物による生物変換に供されるニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理した微生物が、乾燥工程によって前処理されなかった微生物と比較して最も低いアクリル酸値を有することは明らかである。この知見は、非乾燥微生物が副産物としてより多くのアクリル酸を産生し、アクリル酸はアミド化合物のアクリル酸への変換から生じるので、乾燥微生物のアミダーゼ活性が減少しているまたは能力が落ちていると思われることを意味する。その結果、ＮＨａｓｅ活性は、（低下した）アミダーゼ活性と比較して増加している。実際に、乾燥工程により、そのような乾燥微生物は、副産物としてのアクリル酸の含有量がより少ないアミド化合物を産生する程度までアミダーゼ活性が減少し、これは表１および２の最も外側の右列から明らかである。要するに、実施例１および２に適用される反応パラメータは異なる設定条件間で等しく保たれているので、アクリル酸の量を減少させる改善が、乾燥工程によるものである可能性があることは明らかである。
【００５２】
本明細書において言及される場合、「参照微生物」として非乾燥生体触媒（すなわち微生物）を使用することができる。したがって、参照微生物とは、ニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理された本発明の微生物によってアミド化合物へと変換されるべき前記ニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理されなかったものである。例えば、適当な「参照微生物」は、本発明の方法において生体触媒として使用される微生物と同じ株の非乾燥微生物である。さらにまた、「参照微生物」は、乾燥前の、本発明の方法に使用される生体触媒（すなわち微生物）に対応することができる。この場合、本方法の乾燥工程ａ）の前後に生体触媒として使用される微生物のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性を決定し、両方のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性を比較して、乾燥が微生物のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性を増加させるかどうか決定することができる。さらに、ロドコッカス・ロドクラウス（ＮＣＩＭＢ４１１６４）を「参照微生物」として使用することができる。工程ａ）において実施される乾燥方法が、使用される微生物のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を増加させるかどうか決定するために、ロドコッカス・ロドクラウス（ＮＣＩＭＢ４１１６４）を、工程ａ）において実施される乾燥方法に追加的にまたは代わりに供することができる。ロドコッカス・ロドクラウス（ＮＣＩＭＢ４１１６４）のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比が、工程ａ）において実施される乾燥によって増加する場合、本発明の方法において生体触媒として使用される微生物のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比は、工程ａ）において実施される乾燥によって同様に低下すると仮定されなければならない。
【００５３】
本発明の中で、微生物は、微生物を乾燥させる工程と乾燥微生物をニトリル化合物と接触させる工程との間で好ましくは培養されない。
【００５４】
本明細書では、「培養する」は、微生物が培地に懸濁され、微生物が成長できる条件に保たれることを意味する。
【００５５】
微生物を乾燥させる工程と乾燥微生物をニトリル化合物と接触させる工程との間で、微生物は、微生物が乾燥前のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を回復することを阻害する条件に好ましくは保たれる。
【００５６】
ＮＨａｓｅ活性対アミダーゼ活性の比（ＮＨａｓｅ活性［ユニット］／アミダーゼ活性［ユニット］）の増加は、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４もしくは２．５またはそれ以上など、好ましくは少なくとも１．４倍もしくはより大きい。
【００５７】
同様に、アミダーゼ活性対ＮＨａｓｅ活性の比（アミダーゼ活性［ユニット］／ＮＨａｓｅ活性［ユニット］）の低下は、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２もしくは０．１またはより小さいなど、好ましくは少なくとも０．７倍もしくはより小さい。
【００５８】
本発明の知見によると、ニトリル化合物からアミド化合物を産生する方法であって、（ａ）ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程と、（ｂ）ニトリル化合物を前記微生物と接触させる工程とを含む、方法が提供される。
【００５９】
工程（ａ）は、理論に束縛されるものではないが、ＮＨａｓｅ活性対アミダーゼ活性の比（ＮＨａｓｅ活性［ユニット］／アミダーゼ活性［ユニット］）を増加させると仮定される。
【００６０】
ＮＨａｓｅ活性は、例えば本明細書で上に記載した当業者の一般知識にしたがって測定され、決定される。
【００６１】
同様に、アミダーゼ活性は、当業者の一般知識にしたがって測定され、決定され、例えばアミダーゼ活性は、アクリルアミド分解から遊離するアンモニアを６３０ｎｍで測定することによって室温でアッセイすることができる。
【００６２】
したがって、本明細書に記載の通り、生体触媒として利用される微生物の乾燥は、前記微生物のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を増加させる。好ましくは、乾燥は、噴霧乾燥、凍結乾燥、熱乾燥、風乾、真空乾燥、流動床乾燥および／または噴霧造粒を介する。これに関して、一般に噴霧または凍結乾燥に供した生体触媒を使用することにより、他の方法を使用して乾燥された微生物を利用するのと比較して、ニトリル化合物からアミド化合物を産生する間のアクリル酸形成の一層の減少が実現されるので、噴霧乾燥および凍結乾燥が好ましい。本明細書に記述される方法のいずれか１つにおいて、微生物の乾燥は、乾燥微生物をニトリル化合物と接触させる直前に実施することができる。別法として、微生物は、乾燥される工程と乾燥微生物をニトリル化合物と接触させる工程の間で貯蔵することができる。乾燥と接触工程の間で微生物を貯蔵する場合、乾燥微生物は、乾燥状態に保つことができ（すなわち、微生物は再構成されない）、凍結することができ、熱から保護することができ、水分から保護することができ、および／または培養しないことができる。
【００６３】
乾燥微生物をニトリル化合物と接触させる時に、乾燥微生物の形に特段の制限はない。乾燥微生物は、乾燥および／または噴霧乾燥もしくは凍結乾燥など本明細書に記述される乾燥方法のいずれかにより実現可能な乾燥産物の形であることができる。したがって、本明細書に記述される方法およびさらなる実施形態のいずれか１つにおいて、接触工程は、微生物の全質量の最大３０、２５、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５質量パーセンテージ（ｗ／ｗ％）の残留水分含量を有する微生物を用いて行うことができる。残留水分含量を決定する方法は、当業者によく知られている。例えば、本発明の文脈において、乾燥微生物のサンプルの残留水分含量は、熱重量分析によって決定することができる。熱重量分析の開始時に、サンプルの初期質量が決定される。サンプルは、次いで加熱され、水を気化させる。サンプル質量が一定になるまで加熱は続けられる。分析の終了時の一定質量と初期質量との差異は分析中に気化した水の量を表し、それによりサンプルの残留水分含量の算出が可能になる。熱重量分析によって残留水分含量を決定する場合、微生物のサンプルは、例えば、サンプル質量が一定になるまで、１３０℃で少なくとも３０秒間動作される「Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＨＢ４３−Ｓハロゲン水分分析器」により分析することができる。そのため「微生物の全質量」は、微生物それ自身の質量に必ずしも限定されず、したがって（例えば、微生物を乾燥工程の前に水で洗浄した場合に当然考え得るが）その存在が微生物の培養および／または洗浄工程等によるものであり得る成分をさらに含むことができる。以下に述べることは、「微生物の全質量」は、（微生物に加えて）ＴＲＩＳ系緩衝液、食塩水系緩衝液等など、残存量の貯蔵緩衝液構成要素／塩類、および／または残存量の培地、成長培地、栄養液、発酵ブロス、例えば微生物を培養するために使用した発酵ブロス等、安定剤、添加物（例えば乾燥添加物）等をさらに含み得るということである。
【００６４】
本発明は、本発明者らの知見と合致して、アミダーゼ活性を低下させた微生物を産生する方法であって、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程を含む、方法、並びにＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を増加させた微生物を産生する方法であって、ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を乾燥させる工程を含む、方法をさらに提供する。
【００６５】
上で説明した通り、アクリル酸は、アミド化合物のその後の重合における困難の原因になることが公知なので、本発明によって実現される主な目的は、副産物としてのアクリル酸の含有量がより少ないまたは減少している生物変換アミド化合物（ニトリル化合物から生物変換される）である。したがって、この功績は、ニトリル化合物からアミド化合物を産生する際にアクリル酸の形成を減少させる方法であって、アクリロニトリルをＮＨａｓｅおよびアミダーゼ生産微生物と接触させる工程を含み、前記微生物を、前記ニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理する、方法を提供することに反映される。特に、本発明者らは、本明細書に記載されたニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理された微生物を使用することにより、アクリル酸の形成を、参照方法と比較して少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、なおより好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％減少させ得ることを見出した。
【００６６】
本発明者らは、生物変換反応は、特に産業規模において、かなり簡単な方法で好ましくは行われるべきであるとさらに考えた。特に、本発明の生体触媒を含むＮＨａｓｅを使用するニトリル化合物のアミド化合物への生物変換に関して、本発明者らは、反応混合物中の緩衝液のモル濃度を比較的低く、好ましくはできるだけ低く保つことが、生物変換方法にとっていくつかの利点を有すると考えた。例えば、比較的多量の緩衝液が反応混合物中に存在する場合、それは結果的に比較的多量に廃液中に存在することになる。これは、緩衝液を廃液から再び除去しなければならないことになり、追加の技術的な労力および費用が生じることになることを意味する。加えて、産物、すなわちアミド溶液中の比較的大量の緩衝液の存在は、その後の反応工程、例えば、重合または共重合反応などに悪影響を与える場合がある。それゆえ、比較的大量の緩衝液が生物変換の反応混合物に添加される場合、緩衝液はさらなる反応工程の前にアミド溶液から分離されなければならなくなり、それが追加の技術的な労力および費用を伴うことになるか、または緩衝液が産物の品質の低下をもたらし得るかいずれかになる。結果的に、ニトリル化合物のアミド化合物への生物変換は、比較的少量の緩衝液の存在下で、水溶液中で好ましくは行われる。
【００６７】
ニトリル化合物のアミド化合物への生物変換のために反応混合物を調製する場合、本発明の方法、例えば、噴霧乾燥または凍結乾燥によって得られた乾燥生体触媒は、水に一般に懸濁することができ、次いで生体触媒を含有する前記水性混合物を、生物変換が実施される反応器へ移すことができ、そこで生体触媒は、水性混合物および対応するアミドへと変換されるべきニトリル化合物と接触させる。しかしながら、本発明者らは、本発明の乾燥生体触媒が非緩衝水溶液と混合されると、生体触媒を含有する水性混合物のｐＨが、わずかに酸性の範囲（例えばｐＨ５〜６．５）になることを驚くべきことに見出した。乾燥、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥の前に、湿った生体触媒は、中性のｐＨ（例えばｐＨ６．７〜７．５）を通常有する培地中にあるので、これは驚くべきである。さらに、生物変換の間の反応混合物は、むしろわずかに塩基性である。理論に束縛されるものではないが、生物変換の前に水溶液と混合した場合、乾燥工程の間にアンモニア（ＮＨ３）が培地から揮散し、それが乾燥生体触媒のわずかに酸性のｐＨをもたらすと考えられる。
【００６８】
これに関連して、本発明者らは、乾燥生体触媒の水性混合物の酸性ｐＨにより、ＮＨａｓｅの活性が減弱され、この減弱が不可逆的であり得ることを驚くべきことに発見し、これは生物変換が中性またはわずかに塩基性のｐＨを有する反応混合物中で行われたとしても、ＮＨａｓｅ活性が減弱したままになることを意味する。
【００６９】
本発明者らは様々な実験を行い、乾燥生体触媒が、生物変換の前に緩衝水溶液に懸濁することによって活性化されると、溶液は中性またはわずかに塩基性のｐＨ（例えばｐＨ６．６〜９）を有し、生体触媒のＮＨａｓｅ活性は実質的に増加することになることを見出した。活性化混合物（すなわち、生体触媒を含む緩衝水性混合物）を非緩衝水溶液へ移して、反応混合物を得たとしても、この高いＮＨａｓｅ活性は維持される。この増加したＮＨａｓｅ活性により、生物変換の全反応時間は、同量の生体触媒を噴霧乾燥後に緩衝液を含まない水に懸濁した生物変換の反応時間と比較して大きく短縮される。さらに、反応混合物に緩衝液を単純に添加しても、乾燥生体触媒が、反応混合物に添加される前に活性化として緩衝液に再懸濁された場合と同じ効果は得られない。本発明者らによってさらに行われた実験によると、発酵後に緩衝液を細胞懸濁液へ添加し、生体触媒を緩衝液と共に乾燥し、その後水または緩衝液に再懸濁した場合も、生体触媒のＮＨａｓｅ活性は実質的に増加した。
【００７０】
上で述べた通り、生体触媒の活性化は、緩衝液を含有する水溶液に乾燥生体触媒を懸濁することによって実行することができる。そのような活性化は、小規模、すなわち活性化に必要とされる反応体積が比較的小さい、で実行することができる。一方、ニトリル化合物のアミド化合物への生物変換が実行される反応混合物は、一般に比較的大きい体積を有する。反応混合物の体積と比較して小さい活性化混合物の体積のため、活性化混合物が、ニトリル化合物のアミド化合物への生物変換用の反応器へ移されると、緩衝液成分は反応混合物中で希釈される。しかし、活性化の間の緩衝液の有益な効果は、生物変換において保存される。前に述べた通り、ＮＨａｓｅ活性を向上させた結果として、生体触媒を使用するニトリル化合物のアミド化合物への生物変換は、同量の生体触媒を利用する場合より高い反応速度を示す。さらに、生体触媒の量は減少させることができ、それでも活性化工程を受けていない生体触媒、すなわち乾燥後に単に水に再懸濁した生体触媒を、量を減らさずに使用した場合の反応速度よりさらに高い反応速度を実現する。
【００７１】
したがって、本発明はまた、水性混合物中でニトリル化合物からアミド化合物を産生する方法であって、（ａ）乾燥工程によって生体触媒を前処理する工程と、（ｂ）本発明の乾燥生体触媒を水溶液と混合して活性化混合物を得る活性化工程であり、活性化混合物が緩衝液を含む活性化工程と；（ｃ）反応混合物中で本発明の生体触媒を使用してニトリル化合物をアミド化合物に変換する工程であり、反応混合物が工程（ｂ）の前記緩衝液を含む工程とを含み、活性化混合物中の緩衝液のモル濃度対反応混合物中の前記緩衝液のモル濃度の比が、約２：１またはより高い、方法に関する。特に、変換の終了前に活性化混合物中の緩衝液のモル濃度対反応混合物中の前記緩衝液のモル濃度の比は、約２：１またはより高い。本明細書に開示される方法のいずれか１つにおいて、変換の間に比が一定に維持される必要はない。比が約２：１またはより高い限り、比は、変換の間にむしろ変化することができる。例えば、比は、変換の間に増加することができる。これは、変換の間に反応物が反応混合物に添加される場合、反応物は反応混合物を希釈し、それにより反応混合物中の緩衝液濃度を低下させる事例であり得る。例えば、ニトリル化合物および／または水は、変換の間に反応物として反応混合物へ供給され得る。これは反応混合物の体積を増加させ、したがって、反応混合物中の緩衝液のモル濃度を低下させる。反応混合物中の緩衝液のモル濃度の低下の結果、活性化混合物中の緩衝液のモル濃度対反応混合物中の緩衝液のモル濃度の比は、増加する。したがって、この例から分かるように、モル比は、変換反応の過程で変化し得る。
【００７２】
活性化混合物中の緩衝液のモル濃度対反応混合物中の前記緩衝液のモル濃度の比は、約３：１またはより高く、好ましくは約４：１またはより高く、より好ましくは約５：１またはより高く、よりいっそう好ましくは約７：１またはより高く、なおより好ましくは約１０：１またはより高く、なおより好ましくは約２０：１またはより高く、なおより好ましくは約５０：１またはより高く、最も好ましくは約１００：１またはより高くなり得ることがさらに想定される。特に、これらの比は、変換の終了前に存在する。活性化混合物中の緩衝液のモル濃度および反応混合物中の緩衝液のモル濃度に関して、これらの濃度は、ｍｏｌ／Ｌ（１リットル当たりのモル数）で、両方とも表示される。活性化混合物中の緩衝液のモル濃度と反応混合物中の緩衝液のモル濃度の比を算出する場合、活性化混合物中の緩衝液のモル濃度および反応混合物中の緩衝液のモル濃度の両方を、ｍｏｌ／Ｌで得なければならない。活性化工程の後および生体触媒をニトリル化合物と接触させる前に、活性化混合物の緩衝液を少なくとも部分的に除去できることも本発明によって企図する。実例として、これは、活性化混合物の遠心分離に続けて上澄みを捨てることによって、任意に、それに続けて生体触媒を別の水溶液と接触させることによって、または別の実例として、濾過によって行うことができる。そのような事例において、生体触媒をニトリル化合物と接触させる際に、生体触媒（懸濁液）は、残留緩衝液を通常はなお含有することになる。生体触媒中に存在する残留緩衝液がより少ないほど、活性化混合物中の緩衝液のモル濃度対反応混合物中の前記緩衝液のモル濃度の比が、通常一層高くなり得ることは、当業者に理解されよう。
【００７３】
本明細書では乾燥生体触媒の文脈において用語「活性化」とは、乾燥生体触媒を水溶液と混合して、生体触媒および緩衝液を含む水性混合物を得ることを一般に指す。前記混合物は、本明細書において「活性化混合物」とも称される。本明細書に記述される方法のいずれか１つによると、活性化混合物は、緩衝液を水溶液と混合して緩衝水溶液を得て、その後緩衝水溶液に乾燥生体触媒を溶解または懸濁することによって調製できる。活性化混合物は、乾燥生体触媒を緩衝液成分、特に乾燥緩衝液成分と混合し、その後混合物に水を添加するまたは水に混合物を添加し、緩衝液成分を溶解させ、乾燥生体触媒を溶解もしくは再懸濁させることによって調製することもできる。
【００７４】
本明細書では用語「反応混合物」とは、生体触媒およびニトリル化合物ならびに／またはアミド化合物を含む水性混合物のことを指す。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する方法のいずれか１つによる反応混合物は、活性化工程を受けた生体触媒、水溶液、およびニトリル化合物を組み合わせることによって作ることができる。通常、生体触媒は、反応混合物中でニトリル化合物のアミド化合物への変換を触媒する。したがって、用語「反応混合物」とは、反応の開始時、すなわち水溶液中で生体触媒をニトリル化合物に初めて接触させるとき、ならびに水溶液、生体触媒およびアミドもしくはニトリル化合物が混合物中にまだ存在するが変換が停止または終了された後、を含めた変換プロセスの任意の時点において水、生体触媒、およびニトリルおよび／もしくはアミド化合物を含む混合物のことを通常は指す。
【００７５】
本明細書では用語「変換の終了前」とは、反応混合物におけるニトリルのアミドへの変換がまだ進行中である任意の時点のことを指す。通常、それは、反応混合物が存在し、変換がまだ終了または停止していない任意の時点のことを指す。
【００７６】
本明細書に開示する方法において、生体触媒が本発明の乾燥工程に供されて乾燥生体触媒を得る前に、緩衝液を生体触媒懸濁液または溶液に添加できることも考えられる。緩衝液が添加される前に、生体触媒を洗浄することもできる。乾燥工程の前に緩衝液を添加することによって、乾燥生体触媒は、乾燥工程の前に添加された乾燥緩衝液成分を含む。したがって、緩衝液を含む乾燥生体触媒を水溶液と接触させた場合、緩衝液成分は溶解し、生体触媒と共に活性化混合物を与える。さらに、本明細書に開示する方法において、生体触媒を乾燥工程に供して乾燥生体触媒を得る前に生体触媒を緩衝液で処理し、その後その乾燥生体触媒を緩衝溶液に溶解または再懸濁して活性化混合物を得ることができることも考えられる。
【００７７】
本明細書に開示する方法にしたがって生体触媒が緩衝液で活性化される場合、前記活性化は、長い期間を必要としない。好ましくは、生体触媒の前記活性化は、約１分間またはより長く、より好ましくは約５分間またはより長く、さらにより好ましくは約１０分間〜約１０時間、なおより好ましくは約２０分間〜約５時間、最も好ましくは約３０分間〜約２時間実施される。乾燥生体触媒を緩衝水溶液で処理して、活性化混合物を得る場合、前記活性化混合物は、生物変換に通常直接使用される、すなわち、水溶液およびニトリル化合物と直接混合して反応混合物を得る。一方、乾燥工程の前に生体触媒を緩衝溶液または緩衝塩で活性化する場合、前記活性された生体触媒を水溶液と合わせて活性化混合物を得て、前記活性化混合物を水溶液およびニトリル化合物とさらに混合し、それにより反応混合物を得る前に、乾燥生体触媒をその後数カ月間貯蔵することができる。本発明者らに見出された通り、前記生体触媒は、貯蔵期間中に活性を著しく失わない。これは、前記活性化バリアントのさらなる長所と見ることができる。
【００７８】
本明細書に開示する方法によって、活性化混合物に含まれる緩衝液が、約６〜約９の範囲、好ましくは約６．５〜約８のｐＫａを有することも考えられる。ここで、緩衝液は、１種類の成分を含むことができ、または２種類以上の緩衝液成分の混合物であることもできる。単一の成分が、２個以上のｐＫａ値を有し得ることも理解されよう。緩衝液が、約６〜約９の範囲のｐＫａを有する緩衝液成分を含む場合、緩衝液は約６〜約９の範囲のｐＫａを通常は有する。例えば、リン酸は、３種類のｐＫａ値、２．１、７．２および１２．７を有する。リン酸のｐＫａ値の１種類が、約６〜約９の範囲にあるので、リン酸を含む緩衝液は、約６〜約９の範囲のｐＫａを有する緩衝液であると理解され得る。
【００７９】
活性化混合物が、約６．６〜約９、好ましくは約６．６〜約８．８、より好ましくは約６．７〜約８．６、さらにより好ましくは約６．８〜約８．４、なおより好ましくは約６．９〜約８．２、最も好ましくは約７〜約８のｐＨ値を有することも想定される。
【００８０】
本発明によってさらに考えられることは、異なる緩衝液が、本明細書に開示される方法における使用、すなわち生体触媒のＮＨａｓｅ活性を増加させるのによく適していることである。緩衝液は、無機緩衝液または有機緩衝液を含むことが想定される。緩衝液が、非スルホン酸緩衝液またはカルボン酸緩衝液を含み得ることがさらに想定される。本発明において使用できる適当な緩衝液は、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）からなる群から選択される化合物ならびにその任意の組合せを含むことができる。特に、緩衝液は、リン酸緩衝液もしくはクエン酸緩衝液またはその組合せを含む。好ましくは、緩衝液はリン酸緩衝液である。
【００８１】
緩衝液は、活性化混合物中で約１０ｍＭ〜約１Ｍ、好ましくは約２０ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好ましくは約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、さらにより好ましくは約７０ｍＭ〜約１３０ｍＭ、最も好ましくは約８０ｍＭ〜約１２０ｍＭの濃度であることがさらに想定される。
【００８２】
反応混合物中の緩衝液濃度は、約１００ｍＭまたはより低い、好ましくは約５０ｍＭまたはより低い、より好ましくは約２０ｍＭまたはより低い、さらにより好ましくは約１０ｍＭまたはより低い、なおより好ましくは約５ｍＭ〜約１ｐＭ、なおより好ましくは約４ｍＭ〜約１ｐＭ、なおより好ましくは約３ｍＭ〜約１ｐＭ、なおより好ましくは約２ｍＭ〜約１ｐＭ、なおより好ましくは約１ｍＭ〜約１ｐＭ、なおより好ましくは約０．８ｍＭ〜約１ｐＭ、なおより好ましくは約０．５ｍＭ〜約１ｐＭ、なおより好ましくは約０．４ｍＭ〜約１ｐＭ、なおより好ましくは約０．３ｍＭ〜約１ｐＭ、なおより好ましくは約０．２ｍＭ〜約１ｐＭ、最も好ましくは約０．１ｍＭ〜約１ｐＭであることがさらに想定される。
【００８３】
活性化の温度は、約０℃〜約５０℃、好ましくは約１０℃〜約４０℃、より好ましくは約２０℃〜約３７℃の範囲であることも想定される。
【００８４】
しかしながら、本発明は、方法を包含するだけでなく、以下の使用も包含する。
【００８５】
ニトリル化合物からアミド化合物を産生するために、本明細書に記載されるＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を使用する方法。
【００８６】
ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物のＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比を増加させる乾燥方法を使用する方法。
【００８７】
ＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物のアミダーゼ活性を低下させる乾燥方法を使用する方法。
【００８８】
本発明の方法の文脈において本明細書に記述される実施形態および定義は、必要な修正を加えて本発明の使用に等しく適用可能である。
【００８９】
別の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる水性アミド化合物溶液を提供する。そのような水性アミド化合物溶液は、同じ生物、しかしながら、ニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理されなかった生物から得られる水性アミド化合物溶液と比較して減少したアクリル酸含有量によって好ましくは特徴づけられる。特に、そのような水性アミド化合物溶液のアクリル酸の濃度は、１５００ｐｐｍまたはより低い、好ましくは１２００ｐｐｍまたはより低い、より好ましくは１０００ｐｐｍまたはより低い、さらに好ましくは７５０ｐｐｍまたはより低い、さらにより好ましくは５００ｐｐｍまたはより低い、なおより好ましくは３００ｐｐｍまたはより低い、なおより好ましくは２００ｐｐｍまたはより低い、最も好ましくは１００ｐｐｍまたはより低く、ｐｐｍの表示は、それぞれ質量部分に関し、水性アミド化合物溶液の全質量をそれぞれ意味する。
【００９０】
さらにまた、本発明は、アクリルアミドもしくはポリアクリルアミドならびにＮＨａｓｅおよびアミダーゼ産生微生物を含み、前記微生物が少なくとも４００ユニットのＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性比および／または参照微生物と比較した場合に、少なくとも１．７倍に増加しているＮＨａｓｅ活性対アミダーゼ活性の比を示す組成物を提供する。
【００９１】
文脈によって別段に必要とされない限り、単数の用語は複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。本明細書ならびに添付の請求項において、文脈が別途明らかに指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「試薬」への言及は、１種類以上のそのような異なる試薬を含み、「方法」への言及は、当業者に公知の、本明細書に記述した方法を修飾または置換することができる同等の工程および方法への言及を含む。
【００９２】
本明細書では、複数の列挙した要素間の接続用語「および／または」は、個々および組み合わせた選択の両方を包含すると理解される。例えば、「および／または」によって２個の要素が結合される場合、第１の選択とは、第２を含まない第１の要素の適用性のことを指す。第２の選択とは、第１を含まない第２の要素の適用性のことを指す。第３の選択とは、第１および第２の要素同時の適用性のことを指す。これら選択のうちいずれか１個がその意味に該当し、したがって本明細書における用語「および／または」の要求を満たすと理解される。２個以上の選択の並列の適用性もその意味に該当し、したがって本明細書では用語「および／または」の要求を満たすと理解される。
【００９３】
別段に明記しない限り、一連の要素の前にある用語「少なくとも」は、その組におけるあらゆる要素のことを指すと理解されよう。当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、通常の実験法だけを使用して認識または確認し得るであろう。そのような等価物は、本発明に包含されるものとする。
【００９４】
この明細書および続く請求項の全体を通じて、文脈上別途必要とされない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を含むが、他の任意の整数もしくは工程あるいは整数もしくは工程の群を除外しないことを意味すると理解されよう。本明細書において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または本明細書において使用される場合、時には用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」と置換することができる。
【００９５】
本明細書に記載の通り、「好ましい実施形態」もしくは「好ましい態様」は、「本発明の好ましい実施形態」または「本発明の好ましい態様」を意味する。同様に、本明細書に記載の通り、「実施形態」、「別の実施形態」、「態様」、「別の態様」は、それぞれ「本発明の実施形態」、「本発明の別の実施形態」、「本発明の態様」および「本発明の別の態様」を意味する。
【００９６】
本明細書において別段の規定がない限り、本発明に関連して使用される科学的および技術的な用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明の方法および技術は、当業者に周知の従来の方法により一般に実行される。当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、通常の実験法だけを使用して認識または確認し得るであろう。そのような等価物は、本発明に包含されるものとする。
【００９７】
いくつかの文書が、本明細書の文の全体を通じて引用される。本明細書に引用される文書のそれぞれ（特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、指示等の全てを含む）は、前後を問わず、その全体を参照により本明細書に組み込む。本明細書における何ものも、本発明が先行発明によってそのような開示に先行する権利を持たないということの容認として解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】生体触媒として噴霧乾燥ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を適用するアクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換におけるアクリルアミド（ＡＣＭ、濃い灰色で表す）［％］およびアクリロニトリル（ＡＣＮ、淡い灰色で表す）［％］濃度のｗ／ｗ％での時間的経過。乾燥生体触媒を、噴霧乾燥後に水に再懸濁した。全量３．３６ｇの乾燥生体触媒（バッチＣｈ１０）を利用し、その乾燥生体触媒は、生物変換の開始前に測定して１１６ｋＵ／ｇのＮＨａｓｅ活性を有した。反応は、４Ｌ規模（Ｌ＝リットル）で、２６℃で行った。反応の開始時に、乾燥生体触媒２．４ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。反応器にＡＣＮを供給することにより生物変換開始後０時間〜１時間のＡＣＮ濃度を、２ｗ／ｗ％に維持した。生物変換の開始１時間後に、乾燥生体触媒０．９６ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。生物変換の開始後の１時間後に、アクリロニトリル１５５３ｇの全量を反応器に添加するまで、ＡＣＮ濃度を０．８ｗ／ｗ％に維持した。完全な変換（残留ＡＣＮ  １００ｐｐｍ未満）までの全反応時間は、１３．７８時間であった。
【図２】生体触媒として噴霧乾燥ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を適用するアクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換におけるアクリルアミド（ＡＣＭ、濃い灰色で表す）［％］およびアクリロニトリル（ＡＣＮ、淡い灰色で表す）［％］濃度のｗ／ｗ％での時間的経過。噴霧乾燥後に乾燥生体触媒を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３３ｍＬに再懸濁した。これは本明細書に開示する活性化工程に対応する。活性化工程は、１．０時間行った。全量３．３６ｇの乾燥生体触媒（バッチＣｈ１０）を利用し、その乾燥生体触媒は、生物変換の開始前に測定して１１６ｋＵ／ｇのＮＨａｓｅ活性を有した。反応は、４Ｌ規模（Ｌ＝リットル）で、２６℃で行った。反応の開始時に、乾燥生体触媒２．４ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。反応器にＡＣＮを供給することにより生物変換開始後０時間〜１時間のＡＣＮ濃度を、２ｗ／ｗ％に維持した。生物変換の開始１時間後に、乾燥生体触媒０．９６ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。生物変換の開始後の１時間後に、アクリロニトリル１５５３ｇの全量を反応器に添加するまで、ＡＣＮ濃度を０．８ｗ／ｗ％に維持した。完全な変換（残留ＡＣＮ  １００ｐｐｍ未満）までの全反応時間は、２．３１時間であった。
【図３】生体触媒として噴霧乾燥ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を適用するアクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換におけるアクリルアミド（ＡＣＭ、濃い灰色で表す）［％］およびアクリロニトリル（ＡＣＮ、淡い灰色で表す）［％］濃度のｗ／ｗ％での時間的経過。乾燥生体触媒を、噴霧乾燥後に水に再懸濁した。全量３．３６ｇの乾燥生体触媒（バッチＣｈ１０）を利用し、その乾燥生体触媒は、生物変換の開始前に測定して１１６ｋＵ／ｇのＮＨａｓｅ活性を有した。反応は、４Ｌ規模（Ｌ＝リットル）で、２６℃で行った。生体触媒添加の直前に、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３３ｍＬを反応器に添加した。これは図２に表した実験の活性化工程に使用した緩衝液の量に対応する。反応の開始時に、乾燥生体触媒２．４ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。反応器にＡＣＮを供給することにより生物変換開始後０時間〜１時間のＡＣＮ濃度を、２ｗ／ｗ％に維持した。生物変換の開始１時間後に、乾燥生体触媒０．９６ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。生物変換の開始後の１時間後に、アクリロニトリル１５５３ｇの全量を反応器に添加するまで、ＡＣＮ濃度を０．８ｗ／ｗ％に維持した。完全な変換（残留ＡＣＮ  １００ｐｐｍ未満）までの全反応時間は、１１．９８時間であった。
【図４】生体触媒として噴霧乾燥ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を適用するアクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換におけるアクリルアミド（ＡＣＭ、濃い灰色で表す）［％］およびアクリロニトリル（ＡＣＮ、淡い灰色で表す）［％］濃度のｗ／ｗ％での時間的経過。乾燥生体触媒を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍＬに再懸濁した。これは本明細書に開示する活性化工程に対応する。活性化工程は、０．５時間行った。乾燥生体触媒（バッチＣｈ１０）１．８ｇを利用し、その乾燥生体触媒は、生物変換の開始前に測定して１１６ｋＵ／ｇのＮＨａｓｅ活性を有した。反応は、４Ｌ規模（Ｌ＝リットル）で、２３℃で行った。反応の開始時に、乾燥生体触媒１．８ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。アクリロニトリル１５５３ｇの全量を反応器に添加するまで、反応器にＡＣＮを供給することにより生物変換開始後のＡＣＮ濃度を１ｗ／ｗ％に維持した。完全な変換（残留ＡＣＮ  １００ｐｐｍ未満）までの全反応時間は、７．１３時間であった。
【図５】生体触媒として噴霧乾燥ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を適用するアクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換におけるアクリルアミド（ＡＣＭ、濃い灰色で表す）［％］およびアクリロニトリル（ＡＣＮ、淡い灰色で表す）［％］濃度のｗ／ｗ％での時間的経過。乾燥生体触媒を、水に再懸濁した。全量１．２９ｇの乾燥生体触媒（バッチＶ３）を利用し、その乾燥生体触媒は、生物変換の開始前に測定して１７２ｋＵ／ｇのＮＨａｓｅ活性を有した。反応は、４Ｌ規模（Ｌ＝リットル）で、２６℃で行った。反応の開始時に、乾燥生体触媒０．９２ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。反応器にＡＣＮを供給することにより生物変換開始後０時間〜１時間のＡＣＮ濃度を、２ｗ／ｗ％に維持した。生物変換の開始１時間後に、乾燥生体触媒０．３７ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。生物変換の開始後の１時間後に、アクリロニトリル１５５３ｇの全量を反応器に添加するまで、ＡＣＮ濃度を０．８ｗ／ｗ％に維持した。２０時間後に完全な変換（残留ＡＣＮ  １００ｐｐｍ未満）に達しなかった。
【図６】生体触媒として噴霧乾燥ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を適用するアクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換におけるアクリルアミド（ＡＣＭ、濃い灰色で表す）［％］およびアクリロニトリル（ＡＣＮ、淡い灰色で表す）［％］濃度のｗ／ｗ％での時間的経過。乾燥生体触媒を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍＬに再懸濁した。これは活性化工程に対応する。活性化工程は、０．５時間行った。全量１．２９ｇの乾燥生体触媒（バッチＶ３）を利用し、その乾燥生体触媒は、生物変換の開始前に測定して１７２ｋＵ／ｇのＮＨａｓｅ活性を有した。反応は、４Ｌ規模（Ｌ＝リットル）で、２６℃で行った。反応の開始時に、乾燥生体触媒０．９２ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。反応器にＡＣＮを供給することにより生物変換開始後０時間〜１時間のＡＣＮ濃度を、２ｗ／ｗ％に維持した。生物変換の開始１時間後に、乾燥生体触媒０．３７ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。生物変換の開始後の１時間後に、アクリロニトリル１５５３ｇの全量を反応器に添加するまで、ＡＣＮ濃度を０．８ｗ／ｗ％に維持した。完全な変換（残留ＡＣＮ  １００ｐｐｍ未満）までの全反応時間は、４．４時間であった。
【図７】生体触媒として噴霧乾燥ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を適用するアクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換におけるアクリルアミド（ＡＣＭ、濃い灰色で表す）［％］およびアクリロニトリル（ＡＣＮ、淡い灰色で表す）［％］濃度のｗ／ｗ％での時間的経過。乾燥生体触媒を１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍＬに再懸濁した。これは活性化工程に対応する。活性化工程は、０．５時間行った。全量１．２９ｇの乾燥生体触媒（バッチＶ３）を利用し、その乾燥生体触媒は、生物変換の開始前に測定して１７２ｋＵ／ｇのＮＨａｓｅ活性を有した。反応は、４Ｌ規模（Ｌ＝リットル）で、２６℃で行った。反応の開始時に、乾燥生体触媒０．９２ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。反応器にＡＣＮを供給することにより生物変換開始後０時間〜１時間のＡＣＮ濃度を、２ｗ／ｗ％に維持した。生物変換の開始１時間後に、乾燥生体触媒０．３７ｇに相当する再懸濁した生体触媒を、反応器に添加した。生物変換の開始後の１時間後に、アクリロニトリル１５５３ｇの全量を反応器に添加するまで、ＡＣＮ濃度を０．８ｗ／ｗ％に維持した。完全な変換（残留ＡＣＮ  １００ｐｐｍ未満）までの全反応時間は、７．２５時間であった。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００９９】
以下の実施例は、本発明をここで定義されるどんな仕様または実施形態にも限定することなく本明細書に提供される本発明についてさらに記述し、例証する。
【０１００】
ニトリル化合物からのアミド化合物の産生に関して３件の実験を行った。産生用の接種原は、生体触媒を含有する発酵ブロス、前記生体触媒の濃縮物、噴霧乾燥生体触媒または凍結乾燥生体触媒のいずれかであった。濃縮物は、アミド化合物へと変換されるべき前記ニトリル化合物と接触させる前の乾燥工程による前処理の前の生体触媒の形である。濃縮は、例えば遠心分離によって液体発酵ブロスを減少させることにより発酵ブロスが濃縮されることを意味する。したがって、この実施例において使用される発酵ブロス、濃縮物および乾燥粉末は、同じ生体触媒を含有する。ＮＨａｓｅとアミダーゼとの活性比およびＮＨａｓｅ活性を、一般に公知の手法に沿って決定した。ほぼ同一のＮＨａｓｅ活性に反映されるように、設定条件におけるＮＨａｓｅ活性は、全ての設定条件が同量の生体触媒を含有することを意味している。それ故、条件は、発酵ブロス、濃縮物および乾燥粉末について同一であった。加えて、アクリル酸の濃度を決定した。これらのデータを、表１、以下および生物変換反応の終了に要約する。
【０１０１】
実験１
水およびＡＣＮ  ２０ｇを反応器に入れた。水＋生体触媒の全量が２４４７ｇになるように、水の量を調整した。生体触媒の異なる３種類の形を、独立したランに使用した：
（ｉ）ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を含有する発酵ブロス。水分含量：８８．２％（ｗ／ｗ）。
（ｉｉ）（ｉ）の発酵ブロスが遠心分離によって濃縮された濃縮物。水分含量：８３．５％（ｗ／ｗ）。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の濃縮物の噴霧乾燥によって得られる乾燥粉末。乾燥粉末の残留水分含量：８．０５％（ｗ／ｗ）。噴霧乾燥は、ガス吸気温度１１５℃およびガス排気温度６５℃で操作した。
【０１０２】
生体触媒を反応器に添加し、それにより反応を開始した。終了時に全体の反応バッチサイズが４０００ｇであるように、反応の間に、追加のアクリロニトリル１５３３ｇを添加した。反応の間、温度を２６℃で一定に保った。オンラインＦＴＩＲによってＡＣＮ濃度を測定し、全てのＡＣＮが反応に添加されるまで反応混合物中のＡＣＮ濃度が０．８±０．１％（ｗ／ｗ）で一定に保たれるように、ＡＣＮの添加の速度を調整した。変換によりＡＣＮ濃度が、１００ｐｐｍ未満に低下した後に反応を停止させた。反応の終了時に、どのランにおいてもアクリルアミド（ＡＣＭ）濃度は、５１％（ｗ／ｗ）以上であった。
【０１０３】
実験２
水およびＡＣＮ  ６０ｇを反応器に入れた。水＋生体触媒の全量が２４４７ｇになるように、水の量を調整した。生体触媒の異なる３種類の形を、独立したランに使用した：
（ｉ）ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を含有する発酵ブロス。水分含量：９１．８％（ｗ／ｗ）。
（ｉｉ）（ｉ）の発酵ブロスが遠心分離によって濃縮された濃縮物。水分含量：８５．３％（ｗ／ｗ）。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の濃縮物の噴霧乾燥によって得られる乾燥粉末。乾燥粉末の残留水分含量：６．８％（ｗ／ｗ）。噴霧乾燥は、ガス吸気温度１１５℃およびガス排気温度６０℃で操作した。
【０１０４】
生体触媒を反応器に添加し、それにより反応を開始した。終了時に全体の反応バッチサイズが４０００ｇであるように、反応の間に、追加のアクリロニトリル１４９３ｇを添加した。反応の間、温度を２６°Ｃで一定に保った。オンラインＦＴＩＲによってＡＣＮ濃度を測定し、反応混合物中のＡＣＮ濃度を制御するように、ＡＣＮの添加の速度を調整した。反応の最初の１時間の間、ＡＣＮ濃度を、２．０％±０．１５％（ｗ／ｗ）で一定に保ち、その後、全てのＡＣＮを反応に添加するまで０．８％±０．１５％（ｗ／ｗ）に一定に保った。変換によりＡＣＮ濃度が、１００ｐｐｍ未満に低下した後に反応を停止させた。反応の終了時に、どのランにおいてもＡＣＭ濃度は、５０％（ｗ／ｗ）以上であった。
【０１０５】
実験３
水およびＡＣＮ  ６０ｇを反応器に入れた。水＋生体触媒の全量が２４４７ｇになるように、水の量を調整した。生体触媒の異なる２種類の形を、独立したランに使用した：
（ｉ）ロドコッカス・ロドクラウスＮＣＩＭＢ４１１６４を含有する発酵ブロスが遠心分離によって濃縮された濃縮物。水分含量：８１％（ｗ／ｗ）。
（ｉｉ）（ｉ）の濃縮物の凍結乾燥によって得られる乾燥粉末。乾燥粉末の残留水分含量：６．８％（ｗ／ｗ）。
【０１０６】
生体触媒を反応器に添加し、それにより反応を開始した。終了時に全体の反応バッチサイズが４０００ｇであるように、反応の間に、追加のアクリロニトリル１４９３ｇを添加した。反応の間、温度を２６℃で一定に保った。オンラインＦＴＩＲによってＡＣＮ濃度を測定し、反応混合物中のＡＣＮ濃度を制御するように、ＡＣＮの添加の速度を調整した。反応の最初の１時間の間、ＡＣＮ濃度を、２．０％±０．１５％（ｗ／ｗ）で一定に保ち、その後、全てのＡＣＮを反応に添加するまで０．８％±０．１５％（ｗ／ｗ）に一定に保った。変換によりＡＣＮ濃度が、１００ｐｐｍ未満に低下した後に反応を停止させた。反応の終了時に、どのランにおいてもＡＣＭ濃度は、５０％（ｗ／ｗ）以上であった。
【０１０７】
【表１】
2017529847.tif 000002
【０１０８】
後に前記微生物による生物変換に供されるニトリル化合物と接触させる前に乾燥工程によって前処理された微生物が、ＮＨａｓｅ／アミダーゼ活性について最も高い値を有することは明らかである。各反応（設定条件）においてほとんど同量の生体触媒を使用した（利用した生体触媒形、すなわち、発酵／濃縮／噴霧乾燥／凍結乾燥の各ＮＨａｓｅ活性により決定した）という事実を踏まえると、乾燥工程、すなわちニトリル化合物と接触させる前に生体触媒を乾燥工程に供する工程が、副産物であるアクリル酸の量に著しく影響することは明らかである。このことは、乾燥工程のため、そのような乾燥微生物が、副産物としてのアクリル酸の含有量がより少ないアミド化合物を産生する程度までアミダーゼ活性が減少することを意味し、これは最も外側の右列から明らかである。要するに、反応パラメータは異なる設定条件間で等しく保たれているので、アクリル酸の量を減少させる改善が、乾燥工程によるものである可能性があることは明らかである。
【０１０９】
実験４
凍結乾燥粉末を、Ｃｈｒｉｓｔ  Ａｌｐｈａ  ２−４  ＬＳＣｐｌｕｓ実験室凍結乾燥器中での濃縮発酵ブロスの凍結乾燥によって得た。濃縮物は、最初に−２０℃で終夜凍結させ、その後乾燥させた。乾燥の間、棚温度は−２５℃であり、凝縮器温度は−８２℃であり、容器圧は０．２５ｍｂａｒであった。
【０１１０】
水およびＡＣＮ  １８ｇを反応器に入れた。水＋生体触媒の全量が１８３５ｇになるように、水の量を調整した。生体触媒の異なる２種類の形を、独立したランに使用した：
（ｉ）ロドコッカス・ロドクラウスＪ１を含有する発酵ブロス。水分含量：９６．１％（ｗ／ｗ）。
（ｉｉ）水分含量８３．６％（ｗ／ｗ）になるまでの遠心分離および濃縮物の凍結乾燥による（ｉ）の濃縮によって得た乾燥粉末。
【０１１１】
生体触媒を反応器に添加し、それにより反応を開始した。終了時に全体の反応バッチサイズが３０００ｇであるように、反応の間に、追加のアクリロニトリル１１４７ｇを添加した。反応の間、温度を２３℃で一定に保った。オンラインＦＴＩＲによってＡＣＮ濃度を測定し、全てのＡＣＮが反応に添加されるまで反応混合物中のＡＣＮ濃度が１．０±０．１％（ｗ／ｗ）で一定に保たれるように、ＡＣＮの添加の速度を調整した。変換によりＡＣＮ濃度が、１００ｐｐｍ未満に低下した後に、反応を停止させた。反応の終了時に、どのランにおいてもＡＣＭ濃度は、５１％（ｗ／ｗ）以上であった。
【０１１２】
実験５
反応の間、反応混合物中のＡＣＮ濃度を０．３±０．１％（ｗ／ｗ）に制御した以外は、上記の実験４のように実験を実行した。実験４〜５の結果を、下記表２に示す。
【０１１３】
【表２】
2017529847.tif 000003
【０１１４】
実験６
噴霧乾燥生体触媒の活性化
噴霧乾燥生体触媒を遠心管（ファルコン［登録商標］）中で計量し、本明細書に開示する活性化工程の緩衝液３０ｍＬに懸濁した。別途明記しない限り、前記緩衝液は、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０であった。生体触媒を、室温で０．５時間緩衝液処理した。次いで、バイオマス（生体触媒）懸濁液を反応器へ移し、さらに１時間インキュベートした。反応器へバイオマス懸濁液を添加した後に、遠心管を水ですすぎ、溶媒を反応器に同様に移した。水のこの量は、反応器中に計量する水を考慮した。
【０１１５】
実験７
生物変換の一般的手順
アクリロニトリルの水和は、冷却用外部循環ループを備えた撹拌槽型反応器（ｒｐｍ＝２５０、体積Ｖ＝４Ｌ）で一般に実施される。この目的のために、水２．４Ｌを、反応器および生体触媒に満たした。水に事前に懸濁したバイオマスを、ロドコッカス・ロドクラウスの噴霧乾燥細胞として添加した。本明細書に記載の通り、噴霧乾燥細胞は、本明細書に開示する活性化工程にしたがって緩衝液に直接懸濁することもできる。反応を開始するために、プロセス制御系を利用してアクリロニトリルを撹拌槽型反応器に投入した。一定濃度０．５〜５ｗ／ｗ％のアクリロニトリルを、プロセス制御装置（Ｌａｂｖｉｅｗ）と直接通信するオンラインフーリエ変換赤外線分析（ＦＴＩＲ）を使用して調整した。反応温度は、常に２０〜２９℃に保った。アクリロニトリル１５５３ｇを添加した後にアクリロニトリルの投入を停止した。残留アクリロニトリルの完全な変換後、すなわち残留ＡＣＮ濃度が、１００ｐｐｍ未満に達し、５２ｗ／ｗ％アクリルアミドが得られたら、反応を終えた。
【０１１６】
実験８
ＨＰＬＣによる、得られた水性アクリルアミド溶液中のアクリル酸、アクリルアミド、アクリル酸およびアクリロニトリルの濃度の決定
以下の条件を適用して、アクリルアミド、アクリル酸およびアクリロニトリルの含有量を決定した：
カラム：          Ａｑｕａ  Ｃ１８、２５０＊４．６ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
ガードカラム：    Ｃ１８  Ａｑｕａ
温度：            ４０℃
流速：            １．００ｍＬ／分
注入体積：        １．０μＬ
検出：            紫外線検出器、波長２１０ｎｍ
ストップタイム：  ８．０分
ポストタイム：    ０．０分
最大圧力：        ２５０ｂａｒ
溶離液Ａ：        １０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．５
溶離液Ｂ：        アセトニトリル
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
マトリックス：    発酵ブロス、生物変換混合物
サンプルは、０．２２μｍで濾過された
分析物：
【０１１９】
【表４】
2017529847.tif 000005
【０１２０】
実験９
アクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換反応にバッチＣｈ１０の噴霧乾燥ロドコッカス・ロドクラウス（ＮＣＩＭＢ４１１６４）を使用した。生物変換反応は、実験７の手順にしたがって実施した。
【０１２１】
ラン１（図１に表す）において、水に再懸濁した生体触媒３．３６ｇを使用した（生体触媒２．４ｇを生物変換の開始時に添加し、生体触媒０．９６ｇを１時間後に添加した）。ラン２（図２に表す）において、本発明にしたがって１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で活性化した生体触媒３．３６ｇを使用した（生体触媒２．４ｇを生物変換の開始時に添加し、生体触媒０．９６ｇを１時間後に添加した）。活性化は、実験６にしたがって行った。ラン３（図３に表す）において、水に再懸濁した生体触媒３．３６ｇを使用した（生体触媒２．４ｇを生物変換の開始時に添加し、生体触媒０．９６ｇを１時間後に添加した）が、ラン２の活性化工程において使用したのと同量のリン酸緩衝液を生体触媒の添加より前に反応器に直接添加した。ラン４（図４に表す）において、実験６にしたがって１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で緩衝液処理した生体触媒１．８ｇを使用した（生体触媒１．８ｇを生物変換の開始時に添加した）。結果を、以下の表に概説する。
【０１２２】
【表５】
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【０１２３】
ラン２（図２）から分かるように、リン酸緩衝液を使用する乾燥生体触媒の活性化は、全反応時間を１３．７８時間（ラン１、図１）から２．３１時間へ減少させる。ラン３（図３）は、乾燥生体触媒を活性化していない反応混合物へのリン酸緩衝液の添加は、ラン１と比較して反応時間に対してほとんど影響がないことを示す。ラン４（図４）は、乾燥生体触媒がリン酸緩衝液を使用して活性化された場合、生体触媒の量を３．３６ｇから１．８ｇへ減少させることができ、それでもなお全反応時間は、ラン１において非緩衝液処理生体触媒３．３６ｇを使用するよりなお短いことを実証する。
【０１２４】
実験１０
アクリロニトリルのアクリルアミドへの生物変換反応にバッチＶ３の噴霧乾燥ロドコッカス・ロドクラウス（ＮＣＩＭＢ４１１６４）を使用した。生物変換反応は、実験７の手順にしたがって実施した。
【０１２５】
ラン５（図５に表す）において、水に再懸濁した生体触媒１．２９ｇを使用した（生体触媒０．９２ｇを生物変換の開始時に添加し、生体触媒０．３７ｇを１時間後に添加した）。ラン６（図６に表す）において、本発明に開示されている通り１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で活性化した生体触媒１．２９ｇを使用した（生体触媒０．９２ｇを生物変換の開始時に添加し、生体触媒０．３７ｇを１時間後に添加した）。活性化は、実験６にしたがって行った。ラン７（図７に表す）において、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で活性化した生体触媒１．２９ｇを使用した（生体触媒０．９２ｇを生物変換の開始時に添加し、生体触媒０．３７ｇを１時間後に添加した）。結果を、以下の表に概説する。
【０１２６】
【表６】
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【０１２７】
ラン６ならびに７（図６および７）から分かるように、リン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）およびクエン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）によるバッチＶ３のロドコッカス・ロドクラウス（ＮＣＩＭＢ４１１６４）の活性化工程は両方とも、２０時間後における不完全な変換からそれぞれ４．３９時間および７．２５時間後での完全な変換へと全反応時間を劇的に減少させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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