(57)【要約】本発明は、創傷治癒および組織再生のための組成物および方法を含む。本発明の組成物は羊膜粉末を含む。本発明の組成物は羊膜粉末および足場を含む。本発明の方法は、本発明の組成物を対象に適用して創傷治癒および組織再生を誘導する段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質の量を含む、羊膜粉末組成物。
【請求項２】
前記総タンパク質が50 mg/g〜250 mg/gの範囲内である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチンの量を含む、羊膜粉末組成物。
【請求項４】
前記エラスチンが5 mg/g〜60 mg/gの範囲内である、請求項2に記載の組成物。
【請求項５】
10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲンの量を含む、羊膜粉末組成物。
【請求項６】
前記コラーゲンが10 mg/g〜600 mg/gの範囲内である、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンの量を含む、羊膜粉末組成物。
【請求項８】
前記グリコサミノグリカンが0.5 mg/g〜2 mg/gの範囲内である、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
30 μg/g〜1000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)の量を含む、羊膜粉末組成物。
【請求項１０】
前記トロンボスポンジン-1 (TSP-1)が50 μg/g〜400 μg/gの範囲内である、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)の量を含む、羊膜粉末組成物。
【請求項１２】
前記ペントラキシン3 (PTX-3)が1 μg/g〜20 μg/gの範囲内である、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
1.5 ng/g未満の腫瘍壊死因子刺激遺伝子6 (TSG-6)の量を含む、羊膜粉末組成物。
【請求項１４】
前記TSG-6が1.0 ng/g未満である、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチンの量をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】
10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲンの量をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１７】
0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンの量をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１８】
30 μg/g〜1000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)の量をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１９】
0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)の量をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項２０】
1.5 ng/g未満のTSG-6の量をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項２１】
10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲンの量をさらに含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項２２】
0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンの量をさらに含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項２３】
30 μg/g〜1000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)の量をさらに含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項２４】
0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)の量をさらに含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項２５】
1.5 ng/g未満のTSG-6の量をさらに含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項２６】
0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンの量をさらに含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項２７】
30 μg/g〜1000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)の量をさらに含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項２８】
0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)の量をさらに含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項２９】
1.5 ng/g未満のTSG-6の量をさらに含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項３０】
30 μg/g〜1000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)の量をさらに含む、請求項7に記載の組成物。
【請求項３１】
0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)の量をさらに含む、請求項7に記載の組成物。
【請求項３２】
1.5 ng/g未満のTSG-6の量をさらに含む、請求項7に記載の組成物。
【請求項３３】
0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)の量をさらに含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項３４】
1.5 ng/g未満のTSG-6の量をさらに含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項３５】
1.5 ng/g未満のTSG-6の量をさらに含む、請求項11に記載の組成物。
【請求項３６】
30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、および0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンを含む、羊膜粉末組成物。
【請求項３７】
30 μg/g〜1,000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)の量をさらに含む、請求項36に記載の組成物。
【請求項３８】
0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)の量をさらに含む、請求項36に記載の組成物。
【請求項３９】
1.5 ng/g未満の腫瘍壊死因子刺激遺伝子6 (TSG-6)の量をさらに含む、請求項36に記載の組成物。
【請求項４０】
30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカン、30 μg/g〜1,000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)、0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)、および1.5 ng/g未満の腫瘍壊死因子刺激遺伝子6 (TSG-6)を含む、羊膜粉末組成物。
【請求項４１】
足場をさらに含む、請求項1、3、5、7、9、11、13、36、または40のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記足場がヒドロゲルである、請求項41に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ヒドロゲルがPEGDMalを含む、請求項41に記載の組成物。
【請求項４４】
前記足場が、ヒアルロナン、キトサン、アルギネート、コラーゲン、デキストラン、ペクチン、カラギナン、ポリリジン、ゼラチン、およびアガロースからなる群より選択される少なくとも1つのバイオポリマーを含む、請求項41に記載の組成物。
【請求項４５】
前記足場が、(メタ)クリレート-オリゴラクチド-PEO-オリゴラクチド-(メタ)クリレート、ポリ(エチレングリコール) (PEO)、ポリ(プロピレングリコール) (PPO)、PEO-PPO-PEOコポリマー(プルロニック)、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(N-ビニルピロリドン)、PL(G)A-PEO-PL(G)Aコポリマー、ポリ(エチレンイミン)、およびポリ(エチルグリコール)ジアクリレートからなる群より選択される少なくとも1つの合成ポリマーを含む、請求項41に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項1、3、5、7、9、11、13、36、40、41、または43のいずれか一項に記載の羊膜粉末組成物を対象における処置部位に投与する段階を含む、該対象における創傷治癒および組織再生を誘導する方法。
【請求項４７】
i. ヒドロゲル前駆体材料の所定量を含有する、第1の区画; ならびに
ii. 羊膜粉末を含む組成物のおよび架橋剤を含む組成物の所定量を含有する、第2の区画
を含む、対象において創傷治癒および組織再生を誘導するためのキットパック。
【請求項４８】
i. ヒドロゲル前駆体材料のおよび羊膜粉末を含む組成物の所定量を含有する、第1の区画; ならびに
ii. 架橋剤を含む組成物の所定量を含有する、第2の区画
を含む、対象において創傷治癒および組織再生を誘導するためのキットパック。
【請求項４９】
羊膜粉末の、水溶性材料でコーティングされたヒドロゲル前駆体材料の、および架橋剤の所定量を含み、該羊膜粉末、該水溶性材料でコーティングされたヒドロゲル前駆体材料、および該架橋剤が完全に乾燥されている、対象において創傷治癒および組織再生を誘導するためのキットパック。
【請求項５０】
羊膜粉末の、ヒドロゲル前駆体材料の、および水溶性材料でコーティングされた架橋剤の所定量を含み、該羊膜粉末、該ヒドロゲル前駆体材料、および該水溶性材料でコーティングされた架橋剤が完全に乾燥されている、対象において創傷治癒および組織再生を誘導するためのキットパック。
【請求項５１】
前記水溶性材料がゼラチンである、請求項49または50に記載のキットパック。
【請求項５２】
羊膜粉末の、ヒドロゲル前駆体材料の、および架橋剤の所定量を含み、該ヒドロゲル前駆体材料および該架橋剤が、pH＜7を有する溶液から完全に乾燥されている、対象において創傷治癒および組織再生を誘導するためのキットパック。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国特許法第119条(e)の下、2014年10月2日付で出願された米国仮特許出願第62/058,969号の優先権を主張するものであり、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
広範囲の火傷および全層の皮膚創傷は、たとえ処置されたとしても、患者に計り知れない影響を与えうる。毎年米国では推定500,000件の火傷が処置されている(Cherry et al., 2008, Natl. Health Stat. Report: 1-39（非特許文献1）; Pitts et al., 2008, Natl. Health Stat. Report: 1-38（非特許文献2）)。火傷の全死亡率は1998〜2007年の間で4.9%であり、火傷処置の医療費は年間20億ドルに迫る(Miller et al., 2008, J. Burn Car. Res., 29: 862-871（非特許文献3）)。世界的には、この統計値は年間1100万件の傷害まで増加する(Peck, 2011, Burns, 37: 1087-1100（非特許文献4）)。火傷に加えて、全層の慢性創傷は大きな患者基部を構成し、処置の技術的進歩にもかかわらず、治癒率は50%の成功率に満たないままである(Kurd et al., 2009, Wound Repair Regen., 17: 318-325（非特許文献5）)。これらの非治癒性の慢性創傷は、米国において年間700万人に影響を及ぼすと推定されており、年間費用は250億ドルに迫る(Sen et al., 2009, Wound Repair Regen., 17: 763-771（非特許文献6）)。これらのタイプの傷害のいずれかに苦しんでいる患者は、完全な閉鎖および創傷の保護をもたらす迅速な処置から恩恵を受ける。特に、遅延処置を受ける火傷患者は、多くの場合、長期のマイナスの生理的影響をもたらしうる広範な瘢痕になりやすい。
【０００３】
創傷治癒の処置における代表的な存在は、自家分層皮膚移植である。これには、患者の二次手術部位から皮膚片を切除すること、傷または火傷に移植片を再適用することを伴う。この処置はほどほどの臨床転帰をもたらすが、創傷が広範である場合、ドナー部位の数およびサイズには限界がある。同種移植片はさらなる選択肢であり、移植片の免疫拒絶を予防するための免疫抑制薬の必要性を伴う。したがって、これらの制限が非細胞性皮膚代用品の開発に至ったが、この非細胞性皮膚代用品は、ほとんどの場合、ポリマー足場から構成され、生産するには費用がかかり、比較的不良な審美的転帰をもたらす。
【０００４】
したがって、高い臨床効率を有する創傷治癒および再生医療製品が当技術分野において必要とされている。本発明は、満たされていないこの要求を満たすものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cherry et al., 2008, Natl. Health Stat. Report: 1-39
【非特許文献２】Pitts et al., 2008, Natl. Health Stat. Report: 1-38
【非特許文献３】Miller et al., 2008, J. Burn Car. Res., 29: 862-871
【非特許文献４】Peck, 2011, Burns, 37: 1087-1100
【非特許文献５】Kurd et al., 2009, Wound Repair Regen., 17: 318-325
【非特許文献６】Sen et al., 2009, Wound Repair Regen., 17: 763-771
【発明の概要】
【０００６】
本発明は全体として、創傷治癒および組織再生を誘導するための組成物および方法に関する。
【０００７】
1つの局面において、本発明は羊膜粉末を含む組成物を含む。ある種の態様において、本発明の羊膜粉末は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質の量を含む。他の態様において、羊膜粉末は、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチンの量をさらに含む。さらに他の態様において、羊膜粉末は、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲンの量をさらに含む。さらに他の態様において、羊膜粉末は、0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンの量をさらに含む。さらに他の態様において、羊膜粉末は、30 μg/g〜1000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)の量をさらに含む。さらに他の態様において、羊膜粉末は、0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)の量をさらに含む。さらに他の態様において、羊膜粉末は、1.5 ng/g未満の腫瘍壊死因子刺激遺伝子6 (TSG-6)の量をさらに含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は、足場および羊膜粉末を含む、組成物を含む。ある種の態様において、足場は、羊膜粉末がヒドロゲル内に組み入れられている、ヒドロゲルである。他の態様において、羊膜粉末は、ヒアルロン酸(HA)に基づくヒドロゲル内に組み入れられている。さらに他の態様において、足場は、ヒアルロナン、キトサン、アルギネート、コラーゲン、デキストラン、ペクチン、カラギナン、ポリリジン、ゼラチン、およびアガロースからなる群より選択される少なくとも1つのバイオポリマーを含む。さらに他の態様において、足場は、(メタ)クリレート-オリゴラクチド-PEO-オリゴラクチド-(メタ)クリレート、ポリ(エチレングリコール) (PEO)、ポリ(プロピレングリコール) (PPO)、PEO-PPO-PEOコポリマー(プルロニック)、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(N-ビニルピロリドン)、PL(G)A-PEO-PL(G)Aコポリマー、ポリ(エチレンイミン)、およびポリ(エチルグリコール)ジアクリレートからなる群より選択される少なくとも1つの合成ポリマーを含む。
【０００９】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の組成物を対象における処置部位に投与する段階を含む、対象における創傷治癒および組織再生を誘導する方法を含む。ある種の態様において、組成物は対象における創傷に直接適用される。他の態様において、組成物はエアロゾルスプレイ、ゲル、クリーム、または軟膏として適用される。
【００１０】
さらに別の局面において、本発明は、対象において創傷治癒および組織再生を誘導するためのキットパックを含む。ある種の態様において、キットパックは、ヒドロゲル前駆体材料の所定量を含有する、第1の区画、ならびに、羊膜粉末を含む組成物のおよび架橋剤を含む組成物の所定量を含有する、第2の区画を含む。他の態様において、キットパックは、ヒドロゲル前駆体材料のおよび羊膜粉末を含む組成物の所定量を含有する、第1の区画、ならびに、架橋剤を含む組成物の所定量を含有する、第2の区画を含む。さらに他の態様において、キットパックは、羊膜粉末の、水溶性材料でコーティングされたヒドロゲル前駆体材料の、および架橋剤の所定量を含み、羊膜粉末、水溶性材料でコーティングされたヒドロゲル前駆体材料、および架橋剤は完全に乾燥されている。さらに他の態様において、キットパックは、羊膜粉末の、ヒドロゲル前駆体材料の、および水溶性材料でコーティングされた架橋剤の所定量を含み、羊膜粉末、ヒドロゲル前駆体材料、および水溶性材料でコーティングされた架橋剤は完全に乾燥されている。さらに他の態様において、キットパックは、羊膜粉末の、ヒドロゲル前駆体材料の、および架橋剤の所定量を含み、ヒドロゲル前駆体材料および架橋剤はpH＜7を有する溶液から完全に乾燥されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的のため、図面には、現在好ましい態様が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示される態様の正確な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。
【図１】研究における動物の準備、創傷作製、処置実施、および保護包帯に関与する段階を示す。
【図２】画像化および組織採取の段階を示す一連の画像である。パネルA〜Cは組織採取の段階を示す。パネルDおよびEはエクスビボ分析を示す。
【図３】画像分析の方法論を示す。パネルAは、各時点で刺青(紫色)により定義される領域によって測定された収縮を示す。収縮率は、創傷収縮中に生じる形状変化の測定値である。パネルBは、開放創(赤色)、未熟上皮(黄色)、および成熟上皮(緑色)の領域を測定することによって判定された創傷閉鎖および上皮化を示す。
【図４】異なる処置下の異なる時点でのブタ1の創傷を示す一連の画像である。
【図５】異なる処置下の異なる時点でのブタ2の創傷を示す一連の画像である。
【図６】異なる処置下の異なる時点でのブタ3の創傷を示す一連の画像である。
【図７】異なる処置下の異なる時点でのブタ4の創傷を示す一連の画像である。
【図８】異なる処置下の異なる時点でのブタ5の創傷を示す一連の画像である。
【図９】異なる処置下の異なる時点でのブタ6の創傷を示す一連の画像である。
【図１０】異なる処置下の異なる時点での創傷領域の変化を示すグラフである。
【図１１】異なる処置下の異なる時点での創傷収縮の変化を示すグラフである。
【図１２】異なる処置下の異なる時点での収縮率の変化を示すグラフである。
【図１３】異なる処置下の異なる時点での上皮化の変化を示すグラフである。
【図１４】治癒中の創傷領域の各個々の成分の組み合わせを示す一連のグラフである。創傷サイズ(赤色)、上皮化(緑色)、および収縮領域(青色)が示されている。製品は最良の治癒(上)から最悪の治癒(下)までランク付けされている。
【図１５】ブタ1〜3に対するヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色組織像を示す一連の画像である。
【図１６】ブタ4〜6に対するヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色組織像を示す一連の画像である。
【図１７】組織のペンタクロム染色を示す一連の画像である。
【図１８】偏光によって調べられた組織のシリウスレッド染色を示す一連の画像である。
【図１９】ムチン/GAGを視覚化するための組織のアルシアンブルー染色を示す一連の画像である。
【図２０】ムチン/GAGを視覚化するための組織の鉄コロイド染色を示す一連の画像である。この染色は、アルシアンブルー染色よりも特異的であり、初期所見を支持した。
【図２１】DAPI核対比染色(青色)とともにI型コラーゲン(赤色)およびIII型コラーゲン(緑色)の免疫染色を示す一連の画像である。
【図２２】ヘマトキシリン核対比染色(青色)とともに好中球の免疫染色(茶色)を示す一連の画像である。
【図２３】パネルAが異なる処置下での非治癒創傷の炎症マーカーIL1αを示し; パネルBが異なる処置下での非治癒創傷の炎症マーカーIL1βを示し; かつパネルCが異なる処置下での非治癒創傷の炎症マーカーIP10を示す3つのグラフのセットである。
【図２４】パネルAが異なる処置下での単球関連炎症マーカーMCP-1を示し; パネルBが異なる処置下での単球関連炎症マーカーMIP1βを示し; かつパネルCが異なる処置下での単球関連炎症マーカーIL8を示す3つのグラフのセットである。
【図２５】パネルAが異なる処置下での治癒創傷の抗炎症マーカーIL5を示し; パネルBが異なる処置下での治癒創傷の抗炎症マーカーIL4を示し; かつパネルCが異なる処置下での治癒創傷の抗炎症マーカーIL2を示す3つのグラフのセットである。
【図２６】本明細書に記述の羊膜粉末(AMP)対Tseng (US 2007/0071740 A1; 以後「Tseng製品」)からの経時的な累積タンパク質放出を示すグラフである。
【図２７】チオール化成分を多官能性架橋剤(架橋剤)から分離して保持する二重チャンバシリンジ中に、二部ヒアルロン酸(HA)ヒドロゲルを装填できることを示す画像である。
【図２８】2つのヒドロゲルからの累積タンパク質放出を示すグラフである。一方は、マレイミド官能基を有するポリ(エチレングリコール)に基づく架橋剤(PEGDMal)を含み; 他方はポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)を含む。
【図２９】PEGDMalおよびPEGDAによって作製されたヒドロゲルの膨潤特性を示すグラフである。
【図３０】研究における4つのサンプルの画像のセットである。粉末は創傷に直接適用され、続いて滅菌生理食塩水1 mLが適用された。ヒドロゲルは二部シリンジシステム中で調製され、単独でか、羊膜粉末の上に積層されるか、または粉末と予め混合されシリンジの各チャンバに充填されるかのいずれかで、創傷へ直接架橋された。
【図３１】ヒドロゲルが二部シリンジシステム中でどのように調製されたかを示す画像である。
【図３２】経時的に異なる処置下で創傷がどのように治癒するかを示す一連の画像である(ブタ7)。
【図３３】経時的に異なる処置下で創傷がどのように治癒するかを示す一連の画像である(ブタ8)。
【図３４】経時的に異なる処置下で創傷がどのように治癒するかを示す一連の画像である(ブタ9)。
【図３５】経時的に創傷閉鎖を示すグラフである。
【図３６】異なる処置下での経時的な創傷収縮の変化を示すグラフである。
【図３７】異なる処置下での経時的な創傷収縮率の変化を示すグラフである。
【図３８】異なる処置下での経時的な当初の創傷サイズに対する割合の変化を示すグラフである。
【図３９】異なる処置下での経時的な収縮した創傷サイズに対する割合を示すグラフである。
【図４０】創傷治癒結果の比較を示す。パネルAは、創傷を未処置のまま放置した場合の治癒中の創傷領域の創傷サイズ(赤色)、上皮化(緑色)、および収縮領域(青色)の組み合わせを示す。パネルBは、創傷をヒドロゲルで処置した場合の治癒中の創傷領域の創傷サイズ(赤色)、上皮化(緑色)、および収縮領域(青色)の組み合わせを示す。パネルCは、創傷をヒドロゲル下に積層された羊膜粉末で処置した場合の治癒中の創傷領域の創傷サイズ(赤色)、上皮化(緑色)、および収縮領域(青色)の組み合わせを示す。パネルDは、創傷を羊膜粉末で処置した場合の治癒中の創傷領域の創傷サイズ(赤色)、上皮化(緑色)、および収縮領域(青色)の組み合わせを示す。パネルEは、創傷を、ヒドロゲルと混合された羊膜粉末で処置した場合の治癒中の創傷領域の創傷サイズ(赤色)、上皮化(緑色)、および収縮領域(青色)の組み合わせを示す。
【図４１】ブタ7、8、および9に対する代表的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色組織像を示す一連の画像である。
【図４２】異なる処置下での組織の代表的なペンタクロム染色を示す一連の画像である。
【図４３】偏光によって見られた組織の代表的なシリウスレッド染色を示す一連の画像である。
【図４４】再生皮膚の機械的特性を測定するための圧縮試験を示す模式図である。
【図４５】ブタ皮膚を再生するための代表的な非線形応力ひずみ曲線を示すグラフである。圧縮強度(赤色矢印)、勾配が圧縮のためのヤング率を与える弾性領域(緑色線)、および降伏点、これらを上回ると、材料が損傷して塑性的に作用する(青色矢印)。
【図４６】皮膚圧縮強度に及ぼす羊膜粉末の効果を示す。パネルAは、5つの実験条件からの再生皮膚サンプルの最大圧縮強度を示す。パネルBは、羊膜粉末を有しないかつ羊膜粉末を有するコンパイルされた群の最大圧縮強度を示す(p＜0.05)。
【図４７】皮膚ヤング率に及ぼす羊膜粉末の効果を示す。パネルAは、5つの実験条件からの再生皮膚サンプルのヤング率を示す。パネルBは、5つの実験条件下の弾性限界での応力を示す。
【図４８】創傷収縮の比較結果を示す。パネルAは、インビボ試験1における未処置群および羊膜粉末処置群の間の創傷収縮を示す。パネルBは、インビボ試験2における未処置群および羊膜粉末処置群の間の創傷収縮を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明は全体として、創傷治癒および組織再生を誘導するための組成物および方法に関する。1つの態様において、本発明は、羊膜粉末を含む組成物を含む。
【００１３】
1つの態様において、本発明の組成物は無細胞であり、それにより、それが投与される対象における潜在的な炎症反応を最小限に抑える。本発明の創傷治癒製品は、細胞成分を必要とせずに高い臨床効率を有するが、それでも本発明の創傷治癒製品は、細胞処置に関する生物活性を保持する。
【００１４】
1つの態様において、本発明は、羊膜含有組成物を対象に適用して創傷治癒を誘導する方法を含む。例えば、1つの態様において、組成物は対象における創傷に直接適用される。ある種の態様において、組成物はエアロゾルスプレイ、ゲル、クリーム、または軟膏として適用される。
【００１５】
1つの態様において、本発明は、羊膜に基づく足場を含む。1つの態様において、足場は、羊膜粉末がヒドロゲル内に組み入れられている、ヒドロゲルである。別の態様において、本発明の羊膜に基づく足場は、組織再生を増強する。さらに別の態様において、本発明の羊膜に基づく足場は、組織収縮を減少させる。さらに別の態様において、羊膜に基づく足場は、再生組織における血管の発達を増強する。
【００１６】
1つの態様において、本発明は、対象に羊膜に基づく足場を投与する段階を含む、対象における組織再生を促進する方法を含む。
【００１７】
別の態様において、羊膜粉末は、ヒアルロン酸(HA)に基づくヒドロゲル内に組み入れられている。
【００１８】
定義
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において記述されたものと同様または同等のいかなる方法および材料も本発明の実践または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料を記述する。
【００１９】
本明細書において用いられる場合、以下の用語の各々は、この項において関連する意味を有する。
【００２０】
「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)をいうように本明細書において用いられる。例として、「1つの要素(an element)」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００２１】
量、時間的継続などのような測定可能な値をいうときに本明細書において用いられる「約」とは、規定値から±20%または±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%、なおより好ましくは±0.1%のバラツキを包含することが意図されるが、そのようなバラツキは、開示された方法を実施するのに適切なためである。
【００２２】
本明細書において用いられる場合、「AMNIOGRAFT(登録商標)」という用語は、Bio-Tissue, Incによって販売されている羊膜同種移植片をいう。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、「羊膜に基づく足場」という用語は、羊膜粉末または羊膜溶液と併せて使用できる足場をいう。例えば、そのような足場は、使用前に羊膜粉末と混合することができ、または創傷に既に適用されている羊膜粉末または羊膜溶液の上部のそのような創傷に適用することができる。
【００２４】
本明細書において用いられる場合、「羊膜粉末組成物」という用語は、羊膜粉末を含む組成物をいう。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「生体適合性」とは、哺乳動物に移植された場合、哺乳動物において有害反応を誘発しない任意の材料をいう。生体適合性材料は、個体に導入された場合、その個体に有毒でも有害でもなく、哺乳動物における材料の免疫学的拒絶も誘導しない。
【００２６】
本明細書において用いられる「脱細胞化された」または「脱細胞化」という用語は、細胞および組織内容物を除去し、インタクトな無細胞基盤構造を残した、生体構造(例えば、臓器または臓器の一部)をいう。腎臓のような臓器は、さまざまな特殊組織から構成される。特殊化した臓器組織構造、または柔組織は、臓器に関連した特定の機能を提供する。臓器の支持線維ネットワークは支質である。大部分の臓器は、特殊組織を支持する非特殊結合組織から構成される間質フレームワークを有する。脱細胞化のプロセスは、特殊組織を除去し、結合組織の複雑な三次元ネットワークを残す。結合組織基盤構造は主としてコラーゲンから構成される。脱細胞化構造は、異なる細胞集団を注入できる生体適合性基材を含む。脱細胞化された生体構造は、硬質または半硬質であってよく、その形状を変化させる能力を有する。本発明の局面において有用な脱細胞化臓器の例としては、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道、軟骨、骨、脳、脊髄、末梢神経が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００２７】
「〜に由来する」という用語は、特殊化した供給源に由来することを意味するように本明細書において用いられる。
【００２８】
「疾患」は、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されないと、動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００２９】
対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持できるものの、障害のない場合よりも動物の健康状態が好ましくない、健康状態である。障害は、未処置のまま放置されても、必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
【００３０】
化合物の「有効量」または「治療有効量」は、化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物のその量である。送達ビヒクルの「有効量」は、化合物を効果的に結合または送達するのに十分なその量である。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、「静電紡糸パッチ(Electrospun Patch)」という用語は、羊膜が含まれていない羊膜由来材料を有する静電紡糸デキストランをいう。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、「内因性」とは、生物、細胞または系由来の、またはそれらの内部で産生された、任意の材料をいう。
【００３３】
「外因性」とは、生物、細胞または系の外部から導入された、またはそれらの外部で産生された、任意の材料をいう。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「細胞外マトリックス組成物」は、可溶性画分および不溶性画分の両方またはその任意の部分を含む。不溶性画分は、支持体または足場に沈着している分泌されたECMタンパク質および生物学的成分を含む。可溶性画分は、細胞が培養され、細胞が活性剤を分泌した培地を含み/いい、足場に沈着していないそれらのタンパク質および生物学的成分を含む。両方の画分を集め、任意でさらに加工処理し、本明細書において記述される種々の用途において個別にまたは組み合わせて用いられうる。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、「ゲル」という用語は、それ自体が特定の液体に不溶性であるものの、大量の液体を吸収かつ保持して安定な、多くの場合には柔軟な、そして成形しやすい、しかし常に、程度の差はあれ形状保持力のある、構造を形成できる三次元ポリマー構造をいう。液体が水である場合、ゲルはヒドロゲルといわれる。明示的に別段の定めをした場合を除き、「ゲル」という用語は、水以外の液体を吸収したポリマー構造および水を吸収したポリマー構造の両方をいうように本出願の全体を通じて用いられ、ポリマー構造が単に「ゲル」または「ヒドロゲル」であるかどうかは、文脈から当業者には容易に明らかであろう。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、「移植片」は、典型的には欠陥を置き換える、修正する、またはそれ以外の方法で克服するため、個体に移植される細胞、組織、または臓器をいう。移植片は足場をさらに含みうる。組織または臓器は、同じ個体に由来する細胞からなりうる。この移植片は、本明細書では以下の互換的な用語により言及される: 「自家移植片」、「自己移植体」、「自己移植組織」、および「自己移植片」。同じ種の遺伝的に異なる個体由来の細胞を含む移植片は、本明細書では以下の互換的な用語により言及される: 「同種移植片」、「同種異系移植体」、「同種異系移植組織」および「同種異系移植片」。個体からその一卵性双生児への移植片は、本明細書において「同質移植片」、「同系移植体」、「同系移植組織」、または「同系移植片」といわれる。「異種移植片」、「異種移植体」、または「異種移植組織」は、異なる種のある個体から別の個体への移植片をいう。
【００３７】
本明細書において用いられる場合、「GRAFTJACKET(登録商標)」は、Wright Medical Technology, Incによって販売される足場をいう。これは、I型、III型、IV型およびVII型コラーゲン、エラスチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、ラミニン、テネイシン、ならびに線維芽細胞増殖因子を含めて生体基質成分を含む。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「増殖因子」は、ピコグラム/ml〜ミリグラム/mlレベルの濃度の、成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン3、インターロイキン6、インターロイキン7、マクロファージコロニー刺激因子、c-kitリガンド/幹細胞因子、オステオプロテゲリンリガンド、インスリン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、神経増殖因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来増殖因子(PDGF)、形質転換増殖因子(TGF-β)、肝細胞増殖因子(HGF)、および骨形成タンパク質を含むが、これらに限定されない以下の非限定的な因子を含むよう意図される。
【００３９】
本明細書において用いられる場合、「ヒドロゲル前駆体材料」という用語は、前駆体材料を架橋剤と反応させることによってヒドロゲルを作製するために用いられる、親水性バイオポリマーもしくは合成ポリマー、またはそれらの混合物をいう。親水性バイオポリマーもしくは合成ポリマーは、架橋反応をより良好に促進するように修飾されうる。修飾の1つの非限定的な例は、チオール化(例えば、チオール官能基を組み入れること)である。
【００４０】
本明細書において用いられる「ネイティブ細胞」は、胎盤膜に生来、常在または内在する細胞、すなわち、胎盤膜に外因的に添加されていない細胞を意味する。
【００４１】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書において互換的に用いられ、インビトロであれインサイチューであれ、本明細書において記述される方法に適している、任意の動物、またはその細胞をいう。ある種の非限定的な態様において、患者、対象または個体は哺乳動物であり、他の態様において、哺乳動物はヒトである。
【００４２】
「増殖」は、類似の形態の、特に細胞の複製または増殖をいうように本明細書において用いられる。すなわち、増殖は、より多数の細胞の産生を包含し、とりわけ、単に細胞の数をカウントすること、細胞への3H-チミジンの取り込みを測定することなどによって測定されうる。
【００４３】
「細胞周期の進行または細胞周期を通じた進行」は、細胞が有糸分裂および/もしくは減数分裂の準備をする、かつ/または有糸分裂および/もしくは減数分裂に進入するプロセスをいうように本明細書において用いられる。細胞周期を通じた進行には、G1期、S期、G2期およびM期を通じた進行が含まれる。
【００４４】
本明細書において用いられる場合、「足場」は、細胞の接着および増殖に適した表面を提供する生体適合性材料を含む、構造をいう。足場は、機械的安定性および支持をさらに提供しうる。足場は、増殖細胞の集団によって仮定される三次元形状または形態に影響を及ぼすかまたは境界を定めるように、特定の形状または形態でありうる。そのような形状または形態は、フィルム(例えば、第3次元よりも実質的に大きい2次元を有する形状)、リボン、コード、シート、フラットディスク、シリンダー、球体、3次元アモルファス形状などを含むが、これらに限定されることはない。足場の1つの非限定的な例は、ヒドロゲルである。
【００４５】
「治療的」処置は、病状の徴候を示す対象に、それらの徴候を軽減または排除する目的で投与される処置である。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、「疾患または障害を処置すること」は、疾患または障害の症状が患者によって経験される頻度を減少させることを意味する。疾患および障害は、本明細書において互換的に用いられる。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「組織工学」は、組織の置換または再構築で用いるためにエクスビボで組織を作製するプロセスをいう。組織工学は、生物工学によって作られた材料および技術とともに、細胞、遺伝子、または他の生物学的構成要素の組み込みによる組織および臓器の修復または置換へのアプローチを包含する「再生医療」の一例である。
【００４８】
本明細書において用いられる場合、「組織移植」および「組織再構築」という用語は両方とも、肺欠損または軟部組織欠損のような、組織欠損を処置または緩和するために移植片を個体に移植することをいう。
【００４９】
「トランスプラント」は、移植される、生体適合性格子またはドナー組織、臓器、もしくは細胞をいう。トランスプラントの例としては、皮膚細胞または組織、骨髄、ならびに心臓、膵臓、腎臓、肺および肝臓のような固形臓器が挙げられうるが、これらに限定されることはない。
【００５０】
本明細書において用いられる「創傷」という用語は、火傷を含む、外科手術および外傷によって生じたもの、およびアテローム性動脈硬化症、血管疾患または糖尿病のような、慢性の医学的状態からの損傷を含めて、全てのタイプの組織損傷をいう。本明細書において記述される組成物は、内部および外部組織への創傷を含む、全てのタイプの創傷の処置に有用である。創傷包帯材は、皮膚の3つの層(すなわち、表皮、真皮および皮下層)に影響を与える創傷のさまざまな病因を処置することを意図している。
【００５１】
範囲: 本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を範囲の形式で提示することができる。範囲の形式の記述は、単に簡便にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、可能な全ての部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記述は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００５２】
組成物
本発明は、創傷治癒および組織再生の用途で用いるための羊膜粉末を含む羊膜組成物を含む。羊膜(amniotic membrane)、または羊膜(amnion)は、羊膜嚢の壁を形成する薄い組織である。妊娠中、羊膜は発達中の胚を取り囲み、保護する。羊膜は、厚い基底膜および無血管間質基質を含む。
【００５３】
1つの局面において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質の量を含む。適切には、その量は40 mg/g〜450 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は50 mg/g〜400 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は50 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は60 mg/g〜350 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は70 mg/g〜300 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は80 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は90 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は100 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は110 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は120 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は130 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は140 mg/g〜250 mg/gの範囲内である。
【００５４】
別の局面において、組成物は、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチンの量を含む。適切には、その量は5 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は10 mg/g〜95 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は15 mg/g〜90 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は20 mg/g〜85 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は25 mg/g〜80 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は30 mg/g〜75 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は35 mg/g〜70 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は40 mg/g〜65 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は40 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は40 mg/g〜55 mg/gの範囲内である。
【００５５】
さらに別の局面において、組成物は、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲンの量を含む。適切には、その量は10 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は50 mg/g〜750 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は100 mg/g〜700 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は150 mg/g〜650 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は200 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は250 mg/g〜550 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は300 mg/g〜500 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は350 mg/g〜450 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は400 mg/g〜550 mg/gの範囲内である。
【００５６】
さらに別の局面において、組成物は、0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンの量を含む。適切には、その量は0.2 mg/g〜3.5 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は0.3 mg/g〜3.0 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は0.4 mg/g〜2.5 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は0.5 mg/g〜2.0 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は0.6 mg/g〜1.8 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は0.7 mg/g〜1.5 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は0.8 mg/g〜1.4 mg/gの範囲内であり; 適切には、その量は0.9 mg/g〜1.3 mg/gの範囲内である。
【００５７】
さらに別の局面において、組成物は、30 μg/g〜1000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)の量を含む。適切には、その量は50 μg/g〜950 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は50 μg/g〜400 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は75 μg/g〜900 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は100 μg/g〜850 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は125 μg/g〜800 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は150 μg/g〜750 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は175 μg/g〜700 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は200 μg/g〜650 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は225 μg/g〜600 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は250 μg/g〜550 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は275 μg/g〜500 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は300 μg/g〜450 μg/gの範囲内である。
【００５８】
さらに別の局面において、組成物は、0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)の量を含む。適切には、その量は1 μg/g〜45 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は1 μg/g〜40 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は2 μg/g〜40 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は3 μg/g〜35 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は4 μg/g〜40 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は5 μg/g〜35 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は6 μg/g〜30 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は7 μg/g〜25 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は8 μg/g〜25 μg/gの範囲内である。適切には、その量は9 μg/g〜20 μg/gの範囲内であり; 適切には、その量は10 μg/g〜15 μg/gの範囲内である。
【００５９】
さらに別の局面において、組成物は、1.5 ng/g未満の腫瘍壊死因子刺激遺伝子6 (TSG-6)の量を含む。適切には、TSG-6の量は1.3 ng/g未満であり; 適切には、TSG-6の量は1.1 ng/g未満であり; 適切には、TSG-6の量は1.0 ng/g未満であり; 適切には、TSG-6の量は0.7 ng/g未満であり; 適切には、TSG-6の量は0.5 ng/g未満であり; 適切には、TSG-6の量は0.3 ng/g未満であり; 適切には、TSG-6の量は0.1 ng/g未満である。
【００６０】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、および4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチンを含む。適切には、総タンパク質の量は50 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、かつエラスチンは5 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり; 適切には、総タンパク質の量は100 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、かつエラスチンは20 mg/g〜60 mg/gの範囲内である。
【００６１】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、および10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲンを含む。適切には、総タンパク質の量は50 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、かつコラーゲンは10 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり; 適切には、総タンパク質の量は100 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、かつコラーゲンは100 mg/g〜600 mg/gの範囲内である。
【００６２】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、および0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンを含む。適切には、総タンパク質の量は50 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜4 mg/gの範囲内であり; 適切には、総タンパク質の量は100 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜2 mg/gの範囲内である。
【００６３】
ある種の態様において、組成物は、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、および0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンを含む。適切には、コラーゲンの量は10 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜4 mg/gの範囲内であり; 適切には、コラーゲンの量は100 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜2 mg/gの範囲内である。
【００６４】
ある種の態様において、組成物は、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、および4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチンを含む。適切には、コラーゲンの量は10 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつエラスチンは5 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり; 適切には、コラーゲンの量は100 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつエラスチンは20 mg/g〜60 mg/gの範囲内である。
【００６５】
ある種の態様において、組成物は、0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカン、および4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン含む。適切には、グリコサミノグリカンの量は0.5 mg/g〜4 mg/gの範囲内であり、かつエラスチンは5 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり; 適切には、グリコサミノグリカンの量は0.5 mg/g〜2 mg/gの範囲内であり、かつエラスチンは20 mg/g〜60 mg/gの範囲内である。
【００６６】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、および10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲンを含む。適切には、総タンパク質の量は50 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、エラスチンは5 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり、かつコラーゲンは10 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり; 適切には、総タンパク質の量は100 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、エラスチンは20 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり、かつコラーゲンは100 mg/g〜600 mg/gの範囲内である。
【００６７】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、および0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンを含む。適切には、総タンパク質の量は50 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、エラスチンは5 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜4 mg/gの範囲内であり; 適切には、総タンパク質の量は100 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、エラスチンは20 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜2 mg/gの範囲内である。
【００６８】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、および0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンを含む。適切には、総タンパク質の量は50 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、コラーゲンは10 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜4 mg/gの範囲内であり; 適切には、総タンパク質の量は100 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、コラーゲンは100 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜2 mg/gの範囲内である。
【００６９】
ある種の態様において、組成物は、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、および0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンを含む。適切には、エラスチンの量は5 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり、コラーゲンは10 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜4 mg/gの範囲内であり; 適切には、エラスチンの量は20 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり、コラーゲンは100 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜2 mg/gの範囲内である。
【００７０】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、および0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカンを含む。適切には、総タンパク質の量は50 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、エラスチンは5 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり、コラーゲンは10 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜4 mg/gの範囲内であり; 適切には、総タンパク質の量は100 mg/g〜250 mg/gの範囲内であり、エラスチンは20 mg/g〜60 mg/gの範囲内であり、コラーゲンは100 mg/g〜600 mg/gの範囲内であり、かつグリコサミノグリカンは0.5 mg/g〜2 mg/gの範囲内である。
【００７１】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカン、および30 μg/g〜1,000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)を含む。
【００７２】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカン、および0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)を含む。
【００７３】
ある種の態様において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカン、および1.5 ng/g未満の腫瘍壊死因子刺激遺伝子6 (TSG-6)を含む。
【００７４】
さらに別の局面において、組成物は、30 mg/g〜500 mg/gの範囲内の総タンパク質、4 mg/g〜100 mg/gの範囲内のエラスチン、10 mg/g〜800 mg/gの範囲内のコラーゲン、0.1 mg/g〜5 mg/gの範囲内のグリコサミノグリカン、30 μg/g〜1,000 μg/gの範囲内のトロンボスポンジン-1 (TSP-1)、0.1 μg/g〜50 μg/gの範囲内のペントラキシン3 (PTX-3)、および1.5 ng/g未満の腫瘍壊死因子刺激遺伝子6 (TSG-6)を含む。
【００７５】
羊膜粉末および羊膜粉末を含む組成物を調製する方法は、2013年9月10日付で出願されたPCT/US13/58940に開示されており、この開示はその全体が本明細書に組み入れられる。
【００７６】
本発明はまた、羊膜粉末を含む薬学的組成物を含む。本明細書の他の箇所に記述されているように、本発明は、羊膜が創傷治癒および組織再生を増強するという知見に基づいている。製剤は、さらなる成分、例えば、従来の賦形剤、すなわち、創傷または処置部位への投与に適した薬学的に許容される有機または無機担体物質との混合物として利用されうる。薬学的組成物は、滅菌され、所望により補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝液に影響を及ぼすための塩、着色剤および/または芳香物質などと混合されうる。それらはまた、所望により他の活性剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わされてもよい。
【００７７】
本明細書において用いられる場合、「さらなる成分」には、以下のうちの1つまたは複数が含まれるが、それらに限定されることはない: 賦形剤; 表面活性剤; 分散剤; 不活性希釈剤; 造粒剤および崩壊剤; 結合剤; 滑沢剤; 着色剤; 保存剤; ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物; 水性のビヒクルおよび溶媒; 油性のビヒクルおよび溶媒; 懸濁化剤; 分散剤または湿潤剤; 乳化剤、粘滑剤; 緩衝液; 塩; 増粘剤; 充填剤; 乳化剤; 酸化防止剤; 抗生物質; 抗真菌剤; 安定化剤; ならびに薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料。本発明の薬学的組成物中に含まれうる他の「さらなる成分」は、当技術分野において公知であり、かつ例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Genaro, ed. (1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA)に記述されている。
【００７８】
本発明の組成物は、該組成物の総重量の約0.005%〜2.0%の保存剤を含みうる。保存剤は、環境中の汚染物質に対する曝露の場合に損傷を防止するために用いられる。本発明によって有用な保存剤の例としては、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるものが挙げられるが、これらに限定されることはない。特に好ましい保存剤は、約0.5%〜2.0%のベンジルアルコールと0.05%〜0.5%のソルビン酸との組み合わせである。
【００７９】
1つの態様において、組成物は、羊膜粉末の1つまたは複数の成分の分解を阻害する酸化防止剤およびキレート剤を含む。いくつかの化合物に好ましい酸化防止剤は、好ましい範囲が組成物の総重量の約0.01重量%〜0.3重量%のBHT、BHA、α-トコフェロールおよびアスコルビン酸、より好ましくは0.03重量%〜0.1重量%の範囲のBHTである。好ましくは、キレート剤は組成物の総重量の0.01重量%〜0.5重量%の量で存在する。特に好ましいキレート剤には、組成物の総重量の約0.01重量%〜0.20重量%の重量範囲、より好ましくは0.02重量%〜0.10重量%の範囲のエデト酸塩(例えば、エデト酸二ナトリウム)およびクエン酸が含まれる。キレート剤は、製剤の有効期間に不利益でありうる組成物中の金属イオンをキレート化するために有用である。BHTおよびエデト酸二ナトリウムはそれぞれ、いくつかの化合物に特に好ましい酸化防止剤およびキレート剤であるが、当業者に公知である他の適切かつ同等な酸化防止剤およびキレート剤でそれを置き換えてもよい。
【００８０】
本発明の薬学的組成物はまた、水中油型乳剤または油中水型乳剤の形態で調製、包装または販売されてもよい。油相はオリーブ油もしくはラッカセイ油のような植物油、流動パラフィンのような鉱物油、またはこれらの組み合わせでありうる。そのような組成物は、アカシアゴムまたはトラガカントゴムのような天然ゴム、大豆またはレシチンホスファチドのような天然ホスファチド、ソルビタンオレイン酸モノエステルのような、脂肪酸と無水ヘキシトールとの組み合わせから導出されるエステルまたは部分エステル、およびポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルのような、そのような部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物のような1つまたは複数の乳化剤をさらに含みうる。これらの乳剤はまた、例えば、甘味剤または香味剤を含むさらなる成分を含有してもよい。
【００８１】
材料を化学組成物に含浸するかまたは材料を化学組成物でコーティングするための方法には、当技術分野において公知であり、化学組成物を表面上に付着または結合させる方法、材料の合成(すなわち例えば生理学的に分解可能な材料による)中に化学組成物を材料の構造中に組み入れる方法、および水性または油性の溶液または懸濁液を吸収性材料中に、後続の乾燥ありまたはなしで、吸収させる方法が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００８２】
ある場合には、本発明の組成物の1つの利点は、それが不規則で深い創傷を満たす能力を有することである。したがって、1つの態様において、薬学的組成物は、創傷にまたは組織再生を必要とする部位に局所適用されうる。
【００８３】
局所投与に適した製剤には塗布薬、ローション、水中油型または油中水型乳剤、例えばクリーム、軟膏またはペースト、および溶液または懸濁液のような液体または半液体調製物が含まれるが、これらに限定されることはない。局所投与可能な製剤は、例えば、約1%〜約10% (w/w)の活性成分を含みうるが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限度と同程度に高くてもよい。局所投与用製剤は、本明細書において記述されるさらなる成分の1つまたは複数をさらに含みうる。
【００８４】
浸透促進剤が用いられてもよい。これらの材料は、皮膚を通じた薬物の浸透率を増大させる。当技術分野における典型的な促進剤にはエタノール、モノラウリン酸グリセロール、PGML (モノラウリン酸ポリエチレングリコール)、ジメチルスルホキシドなどが含まれる。他の促進剤にはオレイン酸、オレイルアルコール、エトキシジグリコール、ラウロカプラム、アルカンカルボン酸、ジメチルスルホキシド、極性脂質またはN-メチル-2-ピロリドンが含まれる。
【００８５】
本発明のいくつかの組成物の局所送達のために許容される1つのビヒクルは、リポソームを含有しうる。リポソームの組成およびそれらの使用は、当技術分野において公知である(例えば、米国特許第6,323,219号を参照のこと)。
【００８６】
代替の態様において、局所投与に適した製剤は、補助剤、酸化防止剤、キレート剤、界面活性剤、発泡剤、湿潤剤、乳化剤、増粘剤、緩衝剤、保存剤などのような他の成分と任意で組み合わされてもよい。別の態様において、浸透または透過促進剤が組成物に含まれ、浸透促進剤を欠く組成物に対して角質層中へのおよび角質層を通じた羊膜成分の経皮透過を改善させる上で有効である。オレイン酸、オレイルアルコール、エトキシジグリコール、ラウロカプラム、アルカンカルボン酸、ジメチルスルホキシド、極性脂質またはN-メチル-2-ピロリドンを含む、さまざまな浸透促進剤が当業者に知られている。別の局面において、組成物は、角質層の構造の無秩序を増大させるように機能し、したがって角質層を通じた輸送の増大を可能にする、ハイドロトロープ剤をさらに含みうる。イソプロピルアルコール、プロピレングリコールまたはキシレンスルホン酸ナトリウムのような、さまざまなハイドロトロープ剤が当業者に知られている。
【００８７】
局所投与に適した製剤は、所望の変化に影響を与えるのに有効な量で適用されるべきである。本明細書において用いられる場合、「有効な量」とは、変化が望まれる皮膚表面の領域を覆うのに十分な量を意味するものとする。活性化合物は組成物の約0.0001重量%〜約15重量%の量で存在すべきである。より好ましくは、活性化合物は組成物の約0.0005%〜約5%の量で存在すべきであり; 最も好ましくは、活性化合物は組成物の約0.001%〜約1%の量で存在すべきである。そのような化合物は合成由来でも天然由来でもよい。
【００８８】
別の態様において、羊膜粉末を含む薬学的組成物は、包帯または包帯材に適用されてもよく、これを次いで対象の創傷または処置部位に適用する。例えば、1つの態様において、包帯材は、羊膜粉末を含む液体溶液または液体懸濁液に浸漬される。別の態様において、羊膜粉末を含む軟膏が包帯材または包帯の表面に適用される。
【００８９】
別の態様において、薬学的組成物は、羊膜粉末(amniotic membrane powered)を含むエアロゾル化または微粒化された溶液または懸濁液を含む。そのようなエアロゾル化、またはエアロゾル化製剤は、分散時に、約0.1〜約200ナノメートルの範囲の平均粒径または液滴サイズを有することが好ましく、本明細書において記述される1つまたは複数のさらなる成分をさらに含みうる。本明細書において記述される製剤の例は網羅的なものではなく、本発明が、本明細書において記述されていないが、当業者に知られているこれらのおよび他の製剤のさらなる改変を含むものと理解される。
【００９０】
羊膜に基づく足場
本発明は、創傷治癒および組織再生において有用な羊膜に基づく足場を含む。例えば、1つの態様において、羊膜粉末は足場内に組み入れられる。いくつかの例では、羊膜粉末は、足場の表面に適用されるか、または足場とその場で混合される。1つの態様において、足場が羊膜粉末の上部で創傷領域に適用されるか、または足場および羊膜粉末を含む組成物が創傷領域に適用される。例えば、足場がヒドロゲルである場合、ヒドロゲルは、直接羊膜粉末の上部で創傷領域に適用されるか、または羊膜粉末を含む組成物が創傷領域に適用される。本発明の足場は、当技術分野において公知の任意のタイプのものでありうる。そのような足場の非限定的な例としては、ヒドロゲル、静電紡糸足場、フォーム、メッシュ、シート、パッチ、およびスポンジが挙げられる。
【００９１】
1つの態様において、足場は、適切な粘度、分子量、および他の望ましい特性を有する、グリコサミノグリカン(GAG)またはグルコサミノグリカンを含めて、任意の多糖類を含みうる。グリコサミノグリカンは、反復二糖単位を有する非分枝多糖鎖を含み、そのうちの1つが常にアミノ糖である任意のグリカン(すなわち、多糖類)をいう。クラスとしてのこれらの化合物は、高い負電荷を保有し、強親水性であり、一般にムコ多糖類と呼ばれる。この多糖類の群には、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸が含まれる。これらのGAGは、主に細胞表面上におよび細胞外マトリックス中に見られる。グルコサミノグリカンとはまた、アルコール性ヒドロキシル基がアミノ基または硫酸基またはリン酸基のような他の官能基で置換された主に単糖類誘導体を含む任意のグリカン(すなわち、多糖類)も意図する。グルコサミノグリカンの例は、一般にキトサンといわれるポリ-N-アセチルグルコサミノグリカンである。本発明において有用でありうる例示的な多糖類としては、デキストラン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、アガロース、カラギナン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、キチン、キトサンおよびヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸またはケラタン硫酸のような種々の硫酸化多糖類が挙げられる。明確にするために、足場はそれ自体がヒドロゲルでありうるが、足場は必ずしもヒドロゲルである必要はない。
【００９２】
(a) ヒドロゲル
1つの態様において、本発明は、ヒドロゲルおよび羊膜粉末を含む組成物を含む。ヒドロゲルは、一般に、多量の流体を吸収することができ、平衡状態では、典型的には60〜99%の流体と1〜40%のポリマーのみで構成される。いくつかの場合には、ヒドロゲルの含水率は約99%である。他の場合には、ヒドロゲルの含水率は約70〜90%である。ヒドロゲルは、架橋ポリマーネットワークの固有の生体適合性のために特に有用である(Hill-West, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5967-5971)。ヒドロゲルの生体適合性は、親水性および多量の生体液を吸収する能力に起因しうる(Brannon-Peppas. Preparation and Characterization of Cross-linked Hydrophilic Networks in Absorbent Polymer Technology、Brannon-Peppas and Harland, Eds. 1990, Elsevier: Amsterdam, pp 45-66; Peppas and Mikos. Preparation Methods and Structure of Hydrogels in Hydrogels in Medicine and Pharmacy, Peppas, Ed. 1986, CRC Press: Boca Raton, Fla., pp 1-27)。ヒドロゲルは、親水性バイオポリマーもしくは合成ポリマーまたはその両方を架橋することにより調製されうる。言い換えれば、ヒドロゲルは、親水性バイオポリマーもしくは合成ポリマーまたはその両方である前駆体材料と、架橋剤とを反応させることにより調製される。親水性バイオポリマーの物理的または化学的架橋から形成されるヒドロゲルの例としては、ヒアルロナン、キトサン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、デキストラン、ペクチン、カラギナン、ポリリジン、ゼラチン、またはアガロースが挙げられるが、これらに限定されることはない(W. E. Hennink and C. F. van Nostrum, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 54, 13-36およびA. S. Hoffman, 2002, Adv. Drug Del. Rev. 43, 3-12を参照のこと)。これらの材料は、直鎖状または分枝状の多糖類またはポリペプチドでできた高分子量主鎖からなる。化学的または物理的架橋性合成ポリマーに基づくヒドロゲルの例としては、(メタ)クリレート-オリゴラクチド-PEO-オリゴラクチド-(メタ)クリレート、ポリ(エチレングリコール) (PEO)、ポリ(プロピレングリコール) (PPO)、PEO-PPO-PEOコポリマー(プルロニック)、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(N-ビニルピロリドン)、PL(G)A-PEO-PL(G)Aコポリマー、ポリ(エチレンイミン)などが挙げられるが、これらに限定されることはない(A. S Hoffman, 2002 Adv. Drug Del. Rev, 43, 3-12を参照のこと)。
【００９３】
本発明においてヒドロゲルを作製するために使用できる当技術分野において公知の多くのタイプの架橋剤が存在する(Fei, et al., 2000, Journal of Applied Polymer Science, 78: 278-283; Hennink, et al., 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 13-36; Janik, et al., 2008, Nuclear Instruments & Methods in Physics Research Section B-Beam Interactions with Materials and Atoms, 208: 374-379; Liu, et al., 2005, Radiation Physics and Chemistry 72: 635-638; Nagasawa, et al., 2004, Carbohydrate Polymers, 58: 109-113; Onuki, et al, 2008, International Journal of Pharmaceutics, 349: 47-52; Shen, et al., 2006, Polymer Bulletin, 56: 137-143; Shu, et al., 2004, Biomaterials, 25: 1339-1348)。ある種の態様において、ヒドロゲルを作製するために1つまたは複数の架橋剤が用いられうる。そのような架橋剤には、グルタルアルデヒド、エポキシド(例えば、ビス-オキシラン)、酸化デキストラン、p-アジドベンゾイルヒドラジド、N-[α-マレイミドアセトキシ]スクシンイミドエステル、p-アジドフェニルグリオキサール一水和物、ビス-[β-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド、ビス[スルホスクシンイミジル]スベレート、ジチオビス[スクシンイミジルプロピオネート、ジスクシンイミジルスベレート、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)、PEGDMalおよび当業者に知られている他の二官能性架橋試薬が含まれうるが、これらに限定されることはない。ヒドロゲルの機械的特性が架橋時間および架橋剤の量によって大きく影響されることは、当業者によって理解されているはずである。1つの態様において、架橋剤はポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)であり; 別の態様において、架橋剤は、マレイミド官能基を有するポリ(エチレングリコール)に基づいた架橋剤(PEGDMal)である。
【００９４】
1つの態様において、ヒドロゲルは、少なくとも1つのバイオポリマーを含む。他の態様において、ヒドロゲル足場は、少なくとも2つのバイオポリマーをさらに含む。さらに他の態様において、ヒドロゲル足場は、少なくとも1つのバイオポリマーおよび少なくとも1つの合成ポリマーをさらに含む。1つの態様において、本発明のヒドロゲルは、ヒアルロン酸、ゼラチンおよびPEGDMalを含む。
【００９５】
1つの態様において、本発明のヒドロゲルの成分は修飾される。例えば、1つの態様において、単量体が無水メタクリル酸(MA)で修飾されうる。別の態様において、単量体またはヒドロゲル前駆体材料がチオール化されうる(例えば、チオール官能基の組み入れ)。
【００９６】
本発明において使用できるヒドロゲルおよびその調製方法は、2013年9月10日付で出願された特許出願PCT/US13/58940に開示されており、これはその全体が本明細書に組み入れられる。
【００９７】
ヒドロゲルは、天然生存細胞外マトリックスによく似ている(Ratner and Hoffman. Synthetic Hydrogels for Biomedical Applications in Hydrogels for Medical and Related Applications, Andrade, Ed. 1976, American Chemical Society: Washington, D. C, pp 1-36)。ヒドロゲルはまた、PLA、PLGA、またはPGAポリマーを組み入れることによってインビボで分解可能にもされうる。さらに、ヒドロゲルは、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、または例えば、細胞接着および増殖を促進しうる表面修飾のためのRGDで修飾されうる(Heungsoo Shin, 2003, Biomaterials 24: 4353-4364; Hwang et al, 2006 Tissue Eng. 12: 2695-706)。実際、分子量、ブロック構造、分解可能な結合、および架橋様式を改変することは、即時ヒドロゲルの強度、弾性、および分解特性に影響を与えうる(Nguyen and West, 2002, Biomaterials 23(22): 4307-14; Ifkovits and Burkick, 2007, Tissue Eng. 13(10): 2369-85)。
【００９８】
ヒドロゲルはまた、種々のタンパク質(例えば、コラーゲン)または治療剤のような化合物を共有結合させるための官能基で修飾されうる。マトリックスに結合されうる治療剤には、鎮痛剤、麻酔剤、抗真菌剤、抗生物質、抗炎症剤、駆虫剤、解毒剤、制吐剤、抗ヒスタミン剤、抗高血圧剤、抗マラリア剤、抗菌剤、抗精神病剤、解熱剤、防腐剤、抗関節炎剤、抗結核薬、鎮咳薬、抗ウイルス薬、心臓作用薬、下剤、化学療法剤、着色または蛍光造影剤、コルチコイド(ステロイドのような)、抗うつ剤、抑制剤、利尿薬、酵素、去痰薬、ホルモン、催眠剤、ミネラル、栄養補給剤、副交感神経作用剤、カリウム補給剤、放射線増感剤、放射性同位体、鎮静剤、スルホンアミド、刺激剤、交感神経様作用剤、精神安定剤、尿中抗感染薬、血管収縮剤、血管拡張剤、ビタミン、キサンチン誘導体などが含まれるが、これらに限定されることはない。治療剤は、他の小有機分子、天然に単離された実体もしくはその類似体、有機金属剤、キレート化金属もしくは金属塩、ペプチドに基づく薬物、またはペプチドもしくは非ペプチド受容体標的化剤もしくは結合剤であってもよい。治療剤のマトリックスへの結合は、プロテアーゼ感受性リンカーまたは他の生分解性結合を介するものでありうることが企図される。ヒドロゲルマトリックスに組み入れられうる分子には、ビタミンおよび他の栄養補助剤; 糖タンパク質(例えば、コラーゲン); フィブロネクチン; ペプチドおよびタンパク質; 炭水化物(単炭水化物および/または複合炭水化物の両方); プロテオグリカン; 抗原; オリゴヌクレオチド(センスおよび/またはアンチセンスDNAおよび/またはRNA); 抗体(例えば、感染性物質、腫瘍、薬物またはホルモンに対する抗体); ならびに遺伝子治療試薬が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００９９】
本発明の安定化された架橋ヒドロゲルマトリックスは、1つまたは複数の増強剤の添加によってさらに安定化され、増強されうる。「増強剤」または「安定化剤」とは、さらなる安定性または機能的利点を提供することによってヒドロゲルマトリックスを増強する、高分子量成分に加えて、ヒドロゲルマトリックスに添加される任意の化合物を意図する。高分子量成分と混合され、ヒドロゲルマトリックス内に分散される適切な増強剤には、先に論じた熱可逆性マトリックスに関連して先に記述した多くの添加剤が含まれる。増強剤は、架橋されたヒドロゲルマトリックス中に組み入れられた場合に、さらなる安定性または機能的利点を提供することによってヒドロゲルマトリックスを増強する任意の化合物、特に極性化合物を含みうる。
【０１００】
安定化された架橋ヒドロゲルマトリックスで用いるのに好ましい増強剤には、極性アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、完全(intact)コラーゲン、およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはその塩のような、二価陽イオンキレート剤が含まれる。極性アミノ酸は、チロシン、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含むことが意図される。好ましい極性アミノ酸は、L-システイン、L-グルタミン酸、L-リジンおよびL-アルギニンである。各特定の好ましい増強剤の適切な濃度は、熱可逆性ヒドロゲルマトリックスに関連して上記したものと同じである。極性アミノ酸、EDTAおよびそれらの混合物は、好ましい増強剤である。増強剤は、高分子量成分の架橋前または架橋中にマトリックス組成物に添加されうる。
【０１０１】
増強剤は、マトリックス内で促進する固有の特性のために、安定化された架橋生物活性ヒドロゲルマトリックスにおいて特に重要である。ヒドロゲルマトリックスは、以降に記述されるさらなる態様によってさらに明らかになる固有の生物活性を示す。固有の生物活性は、増強および強化極性アミノ酸の存在下で架橋した巨大分子の独特の立体化学、ならびに他の増強剤の機能であると考えられている。
【０１０２】
1つの態様において、羊膜粉末がヒドロゲルに組み入れられる。例えば、ゲルのゲル化または重合の前に、羊膜粉末がヒドロゲル溶液に添加されるか、またはヒドロゲル溶液と混合されうる。羊膜粉末は、所望の効果を生み出すのに望ましい任意の量でヒドロゲル溶液に添加されうる。1つの態様において、羊膜粉末の有効量を創傷に直接適用し、次いでヒドロゲルを羊膜粉末の上部に適用する。いくつかの態様において、ヒドロゲルは、ヒドロゲル中へのおよびヒドロゲル全体への羊膜成分の拡散を可能にする。
【０１０３】
(b) 足場を形成するための方法
本発明で使用できる足場を調製する方法は、2013年9月10日付で出願された特許出願PCT/US13/58940に開示されており、これはその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１０４】
治療法
1つの適用において、本発明は、本発明の組成物を用いて患者における創傷の閉鎖を促進する方法を含む。1つの態様において、本発明の方法は、臨床的および個人的な創傷ケアおよび軟部組織再生に有用である。本方法によれば、羊膜粉末を含む組成物が創傷に移入される。本方法は、外部(例えば、表面)創傷および内部創傷の両方の閉鎖を促進する。本発明の方法が閉鎖を促進するのに有用な創傷には、擦過傷、裂離創、胸部創傷(blowing wound)、火傷創傷、挫傷、銃創、切創、開放創、穿通創、貫通創、刺創、串線創、刺し傷、外科創傷、皮下創傷または接線創傷が含まれるが、これらに限定されることはない。本方法は、創傷の完全な治癒または閉鎖を達成する必要はない; 本方法は、任意の程度の創傷閉鎖を促進する働きをすれば十分である。この点で、本方法は、単独で、または創傷組織を治癒するための他の方法の補助として利用されうる。
【０１０５】
1つの態様において、羊膜粉末を含む組成物は、対象の創傷または処置部位に直接適用される。本明細書の他の箇所に記述されているように、羊膜粉末は、局所軟膏、クリーム、エアロゾルスプレイなどを含む薬学的製剤に組み入れられうる。
【０１０６】
本発明の1つの局面において、本方法は、本明細書の他の箇所に記述された羊膜に基づく足場を、外皮創傷用の創傷包帯材または移植片として用いることを含む。臨床の場では、足場は、外傷、火傷、潰瘍、擦過傷、裂傷、外科手術または他の損傷から生じる創傷を処置するために用いられうる。外科医は、これらの足場を用いて、創傷領域を覆って保護することができ、喪失または損傷した皮膚組織を一時的に置換することができ、損傷領域に新しい組織発生および創傷治癒を導くことができる。臨床の場では、いくつかの態様において、足場は、縫合糸、接着剤または表面を覆う包帯を用いて創傷領域に固定されてもよい。足場は、創傷のサイズに合わせて切断されてもよく、または創傷の縁に重なるようにしてもよい。場合によっては、足場は、深い創傷によって形成された空洞の中に浸透するように成形されてもよい。
【０１０７】
1つの態様において、ヒドロゲルは、創傷または処置部位に流動可能な状態で適用される。場合によっては、ヒドロゲルは、創傷または処置部位で重合する。1つの態様において、ヒドロゲルは、例えばPEGDMalを通じて、使用前に瞬時に重合するように誘導される。別の態様において、ヒドロゲルは、一方のチャンバが架橋剤を含み、他方がバイオポリマーもしくは合成ポリマーまたはその両方を含む、二重チャンバシリンジなどを用いて瞬間的に処置部位に形成される。別の態様において、羊膜粉末を含む組成物をそのような創傷に適用した直後に、ヒドロゲルを創傷に適用する。
【０１０８】
本発明の別の局面において、本方法は、対象において創傷治癒および組織再生を誘導するためのキットパックを含む。このパックは、2つの区画を隔てるための隔壁などを有する2つの区画を有している。言い換えれば、このパックは1つの筐体(enclosure)と、この筐体を2つの区画に隔てる1つの隔壁とを有する。1つの態様において、2つの区画は同じサイズである。さらに別の態様において、2つの区画はサイズが異なる。さらに別の態様において、一方の区画が他方の区画を囲む。1つの態様において、パックの一方の区画は、ヒドロゲル前駆体材料の所定量を含有し; 他方の区画は、架橋剤を含む組成物のおよび羊膜粉末を含む組成物の所定量を含有する。別の態様において、パックの一方の区画は、羊膜粉末を含む組成物のおよびヒドロゲル前駆体材料の所定量を含有し、他方の区画は、架橋剤を含む組成物を含有する。さらに別の態様において、一方の区画は、水和ヒドロゲル前駆体材料のおよび羊膜粉末を含む組成物の所定量を含有し; 他方の区画は、架橋剤を含む組成物を含有する。
【０１０９】
隔壁は、通常の取り扱い中に区画間の密閉を維持するために十分に強くなければならない。同時に、隔壁は使用時に破裂の手段に敏感でなければならない。隔壁の破裂は、パックを中間部で把持し、両端部から急速に引っ張ったり押したりすることによって達成される。あるいは、隔壁は、区画を押しつぶすこと、捻じること、プランジャを押すこと、激しく振ること、またはこねることによって破裂させることができる。隔壁が破裂すると、一方の区画中の羊膜粉末が、その中のまたはその場で形成されたヒドロゲルと混合されうる。
【０１１０】
あるいは、隔壁は、使用の直前に隔壁を開くためにパックの外側に制御を備えたバルブのように機能する。この場合、隔壁を破裂させる必要はない。
【０１１１】
別の態様において、パックは1つの区画を有する。そのような区画は、羊膜粉末の、水溶性材料でコーティングされたヒドロゲル前駆体材料の、および架橋剤の所定量を含む。これらの成分は全て、水溶性材料でコーティングされたヒドロゲル前駆体材料が架橋剤と反応しないように乾燥形態である。使用の直前に、コーティングを溶解するパック中に水を加える。曝露されたヒドロゲル前駆体材料は、その後、架橋剤と反応してヒドロゲルを形成する。1つの非限定的な例において、水溶性コーティング材料はゼラチンである。
【０１１２】
さらに別の態様において、パックは1つの区画を有する。そのような区画は、羊膜粉末の、ヒドロゲル前駆体材料の、および水溶性材料でコーティングされた架橋剤の所定量を含む。これらの成分は全て、水溶性材料でコーティングされた架橋剤とヒドロゲル前駆体材料が反応しないような乾燥形態である。使用の直前に、コーティングを溶解するパック中に水を加える。曝露された架橋剤は、その後、ヒドロゲル前駆体材料と反応してヒドロゲルを形成する。1つの非限定的な例において、水溶性コーティング材料はゼラチンである。
【０１１３】
さらに別の態様において、パックはまた、1つの区画を有する。この区画は、羊膜粉末の、ヒドロゲル前駆体材料の、および架橋剤の所定量を含む。ヒドロゲル前駆体材料および架橋剤は、7未満のpHを有する溶液から乾燥される。ある種の態様において、pHは0.1〜6.5の範囲にある。1つの例において、pHは6; または5; または4; または3; または2; または1である。使用の直前に、塩基性の水をパックに加えて、得られた溶液を約pH = 7に中和し、するとすぐに、ヒドロゲル前駆体材料および架橋剤が反応して、ヒドロゲルを形成する。
【０１１４】
さらに別の態様において、パックは真空密閉され、乾燥剤材料をさらに含む。
【０１１５】
キットパックは、貯蔵時間の増加、適切な貯蔵温度の維持、生物活性成分の維持のために有益であり、ヒドロゲルの形成および対象への製品の適用のための都合のよいタイミングを提供するために有益である。
【０１１６】
1つの態様において、筐体は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルアルミニウム、アルミめっきを施したポリマーフィルム、および本発明に適した他の従来のプラスチックまたは他の包装材料で作製されている。
【０１１７】
1つの態様において、隔壁は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルアルミニウム、アルミめっきを施したポリマーフィルム、ゼラチン、および本発明に適した他の従来のプラスチックまたは他の包装材料で作製されている。
【０１１８】
1つの態様において、キットパックは、隔壁などが破裂したことを示す指示薬を有する。1つの例では、指示薬はpH依存性色素(フェノールレッドのような)である。混合するとpHが7で平衡化し、適正な色を生ずる。
【実施例】
【０１１９】
実験例
本発明をこれから以下の実施例に関連して記述する。これらの実施例は例示のみを目的として提供されており、本発明は決してこれらの実施例に限定されるものではなく、むしろ本明細書において提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【０１２０】
羊膜粉末を調製する一般的手法
提供されたヒト胎盤を回収し、さらに使用するまで4℃で保存した。羊膜(無血管/内)を絨毛膜(血管/外)から手作業で切断した。存在していたいかなる血栓も除去した。その膜を滅菌生理食塩水500〜1000 mLで洗浄した。
【０１２１】
無菌のハサミおよび鉗子を用いて、羊膜を約5×5 cmの小片に切断した。次いで、羊膜小片を無菌の500 mL容器に移入し、滅菌生理食塩水100 mLで5回洗浄した。次いで、小片を500 mLの滅菌水で洗浄した。
【０１２２】
羊膜小片を50 mL管に移入した。移入中、各小片からできるだけ多くの水分を除去するために、小片を500 mL容器の縁に沿って引きずった。各50 mL管を最大25 mLまで満たした。羊膜小片を含有する50 mL管をその後、-80℃に12〜24時間保持した。
【０１２３】
50 mL管の蓋を取り外し、管をパラフィルムで覆った。パラフィルムにいくつかの小さな穴を開けた。管を予冷したガラス凍結乾燥容器に入れ、48〜72時間凍結乾燥した。
【０１２４】
SPEX(登録商標) SAMPLEPREP(登録商標)8970凍結機/粉砕機に液体窒素を満たした。凍結乾燥した羊膜小片を凍結機/粉砕機チャンバに入れた。膜小片を冷却5分、粉砕5分の3サイクルの間に粉砕した。この粉末を次に、1メガラドで1時間γ線照射し、その後、さらに使用するまで小分けして-80℃で保存した。
【０１２５】
比較実験
本発明の羊膜粉末(以後「AMP」)と、Tseng, et al., US 2007/0071740 A1に記述されている羊膜由来品(以後「Tseng製品」)との間で比較研究が行われた。
【０１２６】
AMPの調製の段階:
1. 提供されたヒト胎盤を回収する。使用するまで4℃で保存する。
2. 羊膜(無血管/内)を絨毛膜(血管/外)から手作業で切断する。
3. いかなる血栓も除去し、膜を滅菌生理食塩水500〜1000 mLで洗浄する。
4. 無菌のハサミおよび鉗子を用いて、羊膜を約5×5 cmの小片に切断する。
5. 羊膜小片を無菌の500 mL容器に移入し、滅菌生理食塩水100 mLで5回洗浄する。
6. 滅菌水500 mLによる洗浄を行う。
7. 羊膜小片を50 mL管に移入し、500 mL容器の縁に沿って引きずることにより各小片からできるだけ多くの水分を除去する。
8. 各50 mL管を最大25 mLまで満たす。
9. 羊膜小片を含有する50 mL管を-80℃中に12〜24時間置く。
10. 50 mL管から蓋を取り外し、管をパラフィルムで覆う。パラフィルムにいくつかの小さな穴を開ける。
11. 管を予冷したガラス凍結乾燥容器に入れ、24〜48時間凍結乾燥する。
12. Spex Sampleprep 6870凍結機/粉砕機に液体窒素を満たす。
13. 凍結乾燥した羊膜小片を凍結機/粉砕機チャンバに入れ、3サイクル×冷却5分、粉砕5分の間に粉砕する。
14. 粉末の重さを量り、-80℃で保存する。
【０１２７】
Tsengの調製の段階(US 2007/0071740 A1.の特許請求の範囲および段落[0095]に基づく)
1. 胎盤を回収し、市販の-80℃冷凍庫中で凍結する(貯蔵は48時間から7日間に及びうる)。
2. 胎盤を4℃(冷蔵庫)の環境に24時間移す。
3. 通常の生理食塩溶液の添加有りまたは無しで4時間室温に移動する。
4. 融解した胎盤から羊膜材料を分離する。
5. HBSS (Invitrogen Cat#14175)中で洗浄し、滅菌遠心分離管に入れ、4℃で5000 rpmで5分間遠心分離する。
6. 液体を取り出し、羊膜材料の重さを量る。
段階7および8は任意だが、実施した。
7. Biopulverizerのバレルに収まるように、羊膜を小片にスライスする。
8. 液体窒素中で凍結し、粉砕して微粉とし、重さを量る。
9. プロテアーゼ阻害剤(プロテアーゼ阻害剤カクテルP8340, Sigma、および1 mM PMSF補充)、ならびにホスファターゼ阻害剤(50 mMフッ化ナトリウムおよび0.2 mMバナジウム酸ナトリウム)を含有する冷1×PBS緩衝液pH 7.4を調製する。
10. 緩衝液を1:1 (mL/g)で粉末に添加する。
11. 氷上に保持し、Tissue Tearor (Biospec製品)で5回、各1分間、2分間の冷却間隔でホモジナイズする。
12. これらの水溶性抽出物は、「総」羊膜抽出物(AME)と称される。
13. さらなる分析のために総AMEを保存する。
【０１２８】
初回観察
Tsengに開示されたプロトコールは、複数かつ長期の凍結/融解段階を伴い、長時間4℃または室温での羊膜材料の貯蔵をもたらす。比較して、AMPはできるだけ迅速に単離され、-80℃で直ちに凍結され、その後、凍結乾燥によって保存される。この方法論は、製品の高感度かつ潜在的に生物活性な成分の保存を確実にする。AMPは安定であり、室温で粉末状態を維持する。Tseng製品は、段階8で液体窒素から粉末を除去した後に一時的に粉末のようであるにすぎない。この段階の後、粉末はすぐに液体スラリーへ「融解」する。さらに、反復的かつ徹底的な洗浄段階の欠如によって、血液および他の生物学的混入物質が混入した製品となり、結果的に最終製品は赤色に見えるが、AMPは外観が白色/ベージュである。
【０１２９】
アッセイ法
全てのアッセイ法は、重量で同量の生成物を用いて行った。最終的なTseng製品は、1 g/mLのTseng 「粉末」を含む液体形態である。それゆえ、適切な容量のTseng製品を用いてAMPの重量に適合させた。用いられたアッセイ法には、全タンパク質、コラーゲン、エラスチンおよびGAGを測定するための比色アッセイ法(PIERCE(登録商標)/SIRCOL(登録商標))、TSG-6、PTX-3およびTSP-1を測定するためのQUANTIKINE(登録商標) ELISAキット(R&D systems, MyBiosource)が含まれた。リアルタイムPCRを行って、遺伝子発現を測定した。7日間にわたるAMPおよびTseng製品からのタンパク質放出を評価した(図26)。各材料25 mgを微量遠心分離管に入れ、その上にPBS最大200 uLを載せた。毎日、管を6000 rpmで5分間遠心分離して、不溶性物質と上清を分離した。上清を回収し、後で分析するために凍結させ、新鮮PBS 200 uLを各管に再び加えた。振盪機上37℃でインキュベーションを行った。全てのアッセイ法は、羊膜製品(n = 3)ごとに3つの別々の羊膜単離物に対し形成され、比色アッセイ法およびプレートに基づくELISA法の標準曲線を生成するために使われた陽性対照標準物質を用いて行われた。TSG-6 ELISAを除き全てのアッセイ法には、示唆された出発材料の最大重量を用いた。
【０１３０】
TSG-6の評価では、示唆された出発材料の最大重量を用いた最初の試みは、検出可能な限界よりも低い成分を有する全試験サンプルという結果に終わった。第2のアッセイ法は、示唆された最大出発材料の2倍を用いて行ったところ、Tseng製品は、低いが、しかし検出可能なTSG-6を有していた。TSG-6はAMPでは検出できなかった。アッセイウェルにおける空間限界のために出発材料の容量をさらに増加させることは不可能であった。
【０１３１】
結果
各組成物中の成分の平均量の要約を以下の表1に列挙する。この結果から、AMP中の全タンパク質の量はTseng製品中のそれよりも約10倍高いこと; AMP中のエラスチンの量はTseng製品中のそれよりも約15倍高いこと; およびAMP中のコラーゲンの量はTseng製品中のそれよりも約100倍高いことが実証される。AMP中のグリコサミノグリカンの量は約1 mg/gであるが、Tseng製品中に検出可能なグリコサミノグリカンは存在しなかった。
【０１３２】
RT-PCRの結果から、両方のサンプルが、増幅されうるインタクトなRNA (GAPDH)を含むことが実証されたが; しかしながらTSG-6遺伝子の発現は検出されなかった。
【０１３３】
RNAおよびDNAの除去は、任意の段階: AMPに水を添加して溶液を作製する段階; 溶液にRNaseおよびDNaseを添加する段階; 適切な反応条件下でインキュベートし、次いで得られた溶液を凍結乾燥させる段階において達成することができる。
【０１３４】
得られた累積放出曲線(図26)から、Tseng製品と比較して、AMPから放出されたタンパク質の量の有意な増加が実証された。これらの差異は、全ての時点で有意であった(p＜0.001)。
【０１３５】
これらのアッセイ法の各々の結果を表1に要約する。
【０１３６】
（表１）
2017530153.tif 000002
【０１３７】
インビボ研究1
研究/方法の概要
動物:
6頭の特定病原体未感染(SPF)のヨークシャーブタを購入し、必要な2週間順応させた。研究の開始時に、ブタはおよそ40〜50 kgの重さがあった。この研究は、Wake Forest大学の学内動物飼育使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により審査および承認された(A13-015-Amnion製品 ブタでの創傷治癒用)。
【０１３８】
サドル訓練:
手術の前に、動物はプラスチック製のサドルに耐えるように訓練された。動物クラッカは、気晴らしとしておよびヒトとの接触へのインセンティブとして提供された。最初に、動物をプラスチックの匂いに順応させた。順応させたら、サドルを一定期間監督の下で動物の上に置き、サドルを無期限に着用しても動物が快適になるまで徐々に時間を増やしていった。動物がプラスチックに完全に慣れてくるまで、サドルとの時間を徐々に増加させた。このプロセスは通常2〜3週間かかる(当初の2週間の期間の一部になることもある)。
【０１３９】
全層創傷:
動物を鎮静させ、ケタミン、キシラジン、アセプロマジンの組み合わせで麻酔し、気管内チューブを介して吸入イソフルランを用い麻酔下に維持した。麻酔された豚の背中を、シェービングにより脱毛した。動物を固定し、仰臥位に置いた。動物には、4×4 cmの8つの刺青を背部に入れて、切除創の領域を示した。背部皮膚を水と石鹸で洗浄し、β-ヨウ素および70%アルコールで滅菌した。欠損の作製のため、胸部および腰部に沿う背中中央の全層皮膚4×4 cmを切除することにより、皮膚創傷8領域を作製した。創傷縁に沿って外科用ブレードを用いて皮筋層に切り込みを入れ、覆っている皮膚を切除した(図1)。
【０１４０】
創傷処置:
引き続いて、創傷領域を、製造業者の説明書にしたがって市販の製品で、または本発明の羊膜由来品で同様に処置した。追加の群は処置を受けなかった。6つの実験的選択肢を8つの皮膚欠損にわたって配し、創傷位置の差異を制御し、各製品の計8適用をもたらした。6頭のブタを2ラウンドの実験で処置し、ここで第1ラウンドの安楽死後に第2ラウンドの処置を開始した。各実験ラウンドは30日間継続し、その間に創傷を毎週2回、(1) 創傷サイズ、再上皮化および閉鎖の文章化、ならびに(2) 洗浄、抗生物質の投与、および再び包帯することのために検査した。
【０１４１】
ヒドロゲル調製:
このインビボ研究1において用いた羊膜ヒドロゲルは、以下の段階によって調製された。
1. IRGACURE(登録商標) 2959光開始剤(4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル-(2-プロピル)ケトン, Sigma St. Louis, MO)を滅菌水に溶解して0.05% w/vの溶液を作製した。HEPRASIL(登録商標)(チオール化かつヘパリン化HA誘導体)およびGELIN-S (登録商標) (チオール化ゼラチン)を水に溶解して2% w/vの溶液を作製した。PEGDA架橋剤であるEXTRALINK(登録商標)を水に溶解して4% w/vの溶液を作製した。
2. HEPRASIL(登録商標)、GELIN-S(登録商標)およびEXTRALINK(登録商標)溶液を次に、2:2:1の体積比で混合する。
注記: 得られた溶液は、15〜30分間にわたってマイケル型付加チオールアクリレート反応によって自発的に架橋する。このタイプの架橋は、製造業者によって記述された通常の架橋方法である。この時間枠は、創傷ケアのために効率的に実施するには遅すぎる。代わりに、以下の架橋方法を用いる。
3. 3つの成分を一緒に混合し、ボルテックスし、液体として所望の標的領域に適用し、UV光(365 nm, 18 w/cm2)を照射して、より迅速なチオール-エン段階的架橋反応を開始する。
【０１４２】
群:
1. 未処置対照。
2. AMNIOGRAFT(登録商標) (Bio-Tissue, Inc)。
3. GRAFTJACKET(登録商標) (Wright medical Technology, Inc.)。
4. 本発明において記述される手法にしたがって作製された羊膜粉末。
5. 羊膜ヒドロゲル。
6. 静電紡糸パッチ。
【０１４３】
（表２）創傷配分
2017530153.tif 000003
【０１４４】
包帯法:
処置適用後および予定した包帯交換の場合、創傷領域は、創傷実験プロトコールにしたがって、創傷の上に保護バリアが残っていることを確実とするのに役立つ包帯材料によって覆われた。この材料には局所の抗生物質クリーム、TEGADERM(登録商標) (3M Company)、ギプス包帯パッド、粘着性のある包帯材、メリヤス編み、保護プラスチック製サドル、および最後に包帯を所定の位置に保持するための特別にデザインされたジャケットが含まれた。サドルの縁は、ブタの首を保護するために、サドルの前部に沿って多孔質の外科用テープで覆われた。4本のVELCRO(登録商標)ストラップを用いて、ブタにサドルを固定するための手段としてサドル上に伸縮性ストラップを配置した。
【０１４５】
安楽死:
処置後30日の時点で、研究を終了し、創傷領域を採取した。ケタミン、キシラジン、およびアセプロマジンを用いて動物を鎮静させた。その後、動物を剖検室に運んだ。静脈注射によりビュータナシア(beuthanasia)の致死的過量を投薬した。各動物由来の創傷は、組織学および免疫組織化学のために2つ、創傷治癒バイオマーカーのPCR分析のために1つ、ならびにタンパク質アッセイ法のために1つの、4分の1×4つに分けられた(図2)。
【０１４６】
画像分析:
収縮は、ソフトウェアImageJを用いて、刺青された正方形内の領域を測定することにより各時点で測定され、当初の刺青のサイズと比べて表示された。以前の研究では、収縮した創傷を記述するための追加手段として創傷収縮率が使われてきた。先に論じられた創傷収縮領域の測定に加えて、創傷収縮率は、創傷が最初の正方形の創傷から形状を変化させた程度を記述する。再上皮化によって治癒する創傷は、通常、わずかに対称的に収縮しながら初期の正方形の形状を維持する。しかしながら、収縮性の高い創傷は、通常、創傷の縁から収縮し、星形の創傷を生じる。創傷閉鎖および上皮化は、ImageJを用いることで測定し、開放創、成熟および未熟上皮の領域を決定した。この領域は、治癒創の色および質感によって同定することができる。一般に開放創は暗赤色で光沢があり、未熟上皮は薄い赤色で不透明/艶なしであり(薄い表皮被覆のため)、成熟上皮は白色/ピンク色かつ不透明/艶なしであった。これらの構成要素を、当初の創傷サイズに対する個々の測定値として測定し表示し、経時的な創傷治癒への全構成要素の寄与を実証するために組み合わせた(図3)。
【０１４７】
組織学およびIHC:
(1) H&E染色
(2) コラーゲン、ムチン/GAG、エラスチンおよび成熟線維のペンタクロム染色
(3) 成熟および未成熟コラーゲンのシリウスレッド染色
(4) ムチン/GAGのアルシアンブルー染色
(5) ムチン/GAGの鉄コロイド
(6) I型コラーゲンおよびIII型コラーゲンの免疫組織化学
(7) 免疫組織化学 好中球浸潤
【０１４８】
創傷治癒バイオマーカー:
非治癒創傷の炎症マーカー(IL1α、IL1β、およびIP-10)、単球関連炎症マーカー(MCP-1、MIP-1βおよびIL-8)、ならびに治癒創傷の抗炎症マーカー(IL2、IL-4、およびIL-5)を含む、治癒ならびに非治癒創傷のバイオマーカーについて定量的PCRを行った。これらのマーカーは、ヒト患者での創面切除の必要性または創傷治癒の予測でのその成功によって選択された。全ての処置由来の遺伝子発現は、正常な健常皮膚と比べて表示された。
【０１４９】
バイオマーカーは、刊行物: Hawksworth, J.S. et al. Inflammatory biomarkers in combat wound healing. Ann Surg 250, 1002-1007 (2009)におけるデータに基づいて選択された。
【０１５０】
タンパク質分析:
採取した組織の4分の1に対応する皮膚切片からタンパク質を単離した。
【０１５１】
結果
一般的な観察結果:
全ての外科的手技は、合併症なしに行われた。均一なサイズと深さで創傷が作製されたが、正方形の皮膚切片の除去後に皮膚のいくらかの「たるみ」が観察された。創傷処置製品は一般に投与するのが容易であった。AMNIOGRAFT(登録商標)は、薄くて壊れやすい製品の性質と、裏紙からの除去が困難なため、適用するのが最も困難であった。この製品では、何度も起きた、それ自体で巻き上げられたリ、または折り畳まれたりしないことを確実とするために4回の手間を必要とした。GRAFTJACKET(登録商標)はその厚さによって投与するのが容易であったが、しかしこの製品のサイズはかなり差があって、位置決めと縫合は困難であった。静電紡糸パッチは、中間の厚さと剛性で投与するのが「パッチタイプ」の3製品のうち最も容易であった。静電紡糸パッチ製品では、受け取った最後の4つのパッチ(ラウンド2の動物に適用された)で特に、かなりのバラツキが観察された。これらのパッチには一貫性のない着色の領域があり、半乾燥液体と類似した暗色斑があった。羊膜ヒドロゲル(Amnion Hydrogel)は一人で適用し易く、創傷との接触も必要としなかった。片手だけでシリンジにより羊膜液を適用し、UV光を創傷表面より約5 cm上方に保持した。予想通り、液体は創傷内で急速にゲルを形成し、10〜15秒で創傷領域全体を満たした。羊膜粉末(Amnion Powder)は投与するのが最も容易な製品であった。測定された粉末用量は、創傷の上で管を穏やかに叩き、その後、滅菌生理食塩水1 mLを適用して粉末を湿らすことによって均等にばらまいた。下記のインビボ研究2では、粉末を適用前に生理食塩水1 mLに懸濁させ、次いで3頭のブタに対し液体として創傷に直接適用した。いずれの測定パラメータについても、各送達方法の間で差異は検出されなかった。
【０１５２】
画像分析:
時点(0日目、4日目、7日目、11日目、14日目、18日目、21日目、24日目、および28日目)ごとにデジタル写真を撮影し、8個の創傷のそれぞれについて編集した(図4〜9)。注記: 創傷治癒の配分は、上記の表2に記述されている。処置の選択肢は、比較を容易にするため動物ごとに同じ順序で維持される。各ブタに対する下2つの処置は、そのブタに対し2つの処置選択肢を繰り返したものである。
【０１５３】
創傷閉鎖:
創傷閉鎖は、創傷治癒の成功と相関する。創傷閉鎖率が高いほど、治癒転帰はより良好になる。創傷閉鎖を各時点について測定し、当初の創傷領域と比べて存在する創傷の割合として表した(図10)。図10中のグラフは、羊膜ヒドロゲルが創傷閉鎖に最良の性能であり; 羊膜粉末が2番目に最良の性能であり; 未処置(Untreated)、静電紡糸パッチおよびAMNIOGRAFT(登録商標)が真ん中であり、GRAFTJACKET(登録商標)が最悪の性能であることを実証している。平均創傷サイズは17.6 cm2であり、処置またはブタの間に有意差はなかった。この領域は、切開創傷後の皮膚の垂れ下がりのため刺青をした最初の16 cm2の領域よりわずかに大きかった。この小さな差異は処置実施に影響を与えなかった。創傷処置後の即時の時点では、創傷の伸張/垂れ下がりによる未処置創傷、GRAFTJACKET(登録商標)、AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチ処置創傷の創傷領域の初期増加があった。これは、これらの処置の適用が創傷領域を直ちに安定化させないことを示唆している。対照的に、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末処置創傷は、創傷サイズの有意な増加を示さなかった。ヒドロゲルは創傷領域の安定化において役割を果たす可能性が高いが、これは羊膜粉末群における効果を説明するものではない。初期の時点でこれらの群について観察された早期の造粒開始は、この所見を説明しうる。羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末処置群は、0日目からの創傷領域の一貫した減少を示し、他の全群では4〜7日目以降減少した。GRAFTJACKET(登録商標)処置した領域は、創傷閉鎖の速度が最も遅く、創傷内に硬い、かさぶた様の構造を形成し、閉鎖を妨げた。経時的に、この製品は分解または乾燥して、創傷から脱落し、研究の終了時までに約50%の閉鎖を容易にした。AMNIOGRAFT(登録商標)処置創傷は、わずかに遅延した創傷閉鎖率を有するようであったが、14日目までに、未処置創傷および静電紡糸パッチ処置創傷と同様の創傷閉鎖(およそ50%)を示した。これらの3製品は創傷閉鎖を促進し続け、その結果として研究終了時の創傷領域は約10%になった。羊膜粉末処置した創傷は、14日目以降のAMNIOGRAFT(登録商標)処置創傷、未処置創傷および静電紡糸パッチ処置創傷と比べて創傷閉鎖の改善が、創傷閉鎖10〜15%の加速を有するこれらの製品に匹敵することを示した。羊膜ヒドロゲル処置した創傷は、11日目と24日目の間に羊膜粉末で処置した創傷よりも良好に機能し、14日目に25%の創傷領域を示した。28日目までに、羊膜粉末処置群も羊膜ヒドロゲル処置群もともに、ほぼ100%の創傷閉鎖を示し、これは最低最善性能の製品と比べて10%の改善であり、最低性能の製品と比べて50%の改善であった。
【０１５４】
創傷収縮:
創傷収縮は、創傷治癒の有効性と相関する。収縮率が高いほど、治癒転帰はそれだけ悪くなる。刺青内の領域を測定し、当初の刺青領域に対する領域の割合として測定値を表すことにより、各時点について創傷収縮を測定した(図11)。図11中のグラフは未処置および静電紡糸パッチが最も収縮しており; 羊膜ヒドロゲルおよびAMNIOGRAFT(登録商標)が中度に収縮し; 羊膜粉末は羊膜ヒドロゲルおよびAMNIOGRAFT(登録商標)よりも収縮が少なく; GRAFTJACKET(登録商標)は収縮が最低限であることを実証している。
【０１５５】
創傷閉鎖データの場合と同様に、最初の7日間にわたる創傷/刺青領域の初期増加が観察された。これにより、約10%の負の初期収縮率が得られた。未処置創傷および静電紡糸パッチ処置創傷は、最大の収縮を示し、4日目と11日目の間に急速な収縮が起こり、当初の刺青領域の約40%に達した。最終の時点で、これらの製品は50〜60%の収縮を示した。これらの測定は、研究全体の所見と一致しており、ここでこれらの処置はほぼすべての時点で創傷を有意に収縮させるように見えた。
【０１５６】
製品の次の群分類は、羊膜ヒドロゲルおよびAMNIOGRAFT(登録商標)処置創傷であり、これは未処置創傷および静電紡糸パッチ処置創傷と同様の傾向を示したが、しかし収縮の増加の遅延と、もっと短くあまり急速ではない収縮期間が7日目と11日目との間にあり、20〜30%の収縮に達した。最終の時点で、これらの製品は35〜45%の収縮を示した。羊膜粉末は、11日目までに約10%の収縮、および28日目までに30%の収縮を有し、これらの製品よりも良好に機能した。
【０１５７】
GRAFTJACKET(登録商標)で処置した創傷は、ほとんどの時点で最小の収縮量を有していた。しかしながら、これは、創傷の閉鎖も収縮も妨げた、この製品により形成された硬い、かさぶた様の構造によるものである。
【０１５８】
創傷収縮比:
この現象を測定するために、全ての時点にわたっていくつかの創傷測定を行った(図12)。2つの左側創傷角の間の中心点に対する創傷左縁の距離を測定し、これらの角の間の全距離の比として表した。この比率は、創傷の形状変化の量を近似的に説明する。参考までに、正方形の非収縮創傷は0に近い比率を有し、高度に収縮した「星形」状の創傷は0.2に近い比率を有した。収縮データを確認すると、未処置創傷および静電紡糸パッチ処置創傷の比率は、28日間で約0.2に増加した。羊膜粉末、羊膜ヒドロゲルおよびAMNIOGRAFT(登録商標)処置創傷は全て、それほどではないにせよ増加したが、GRAFTJACKET(登録商標)処置創傷は、収縮率の中程度の増加しかなかった。
【０１５９】
創傷上皮化:
創傷上皮化は創傷治癒の成功と相関する。上皮化率が高いほど、創傷治癒が良好である。上皮化は、色(成熟: 白色、未成熟: ピンク色)および創傷領域とは異なった、艶のないように見える上皮コーティングの存在によって定義される成熟および未熟上皮により全ての時点で測定した。図13中のグラフは、最大量の上皮化を示す羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末処置創傷を図解する。全ての組織は初めに、刺青線の内側に切開創が作製されていたため、ある程度の上皮化があった。この最初の領域は、全ての処置およびブタに対して一貫していた。未処置創傷、静電紡糸パッチおよびGRAFTJACKET(登録商標)処置創傷は全て、最小限の創傷上皮化を示し、非常に遅い上皮化開始(14日目の時点でおよそ2〜3%)および研究終了時に低い総上皮化(およそ5〜7%)を示した。AMNIOGRAFT(登録商標)処置創傷は、平均レベルの創傷上皮化を示し、初期上皮化がより遅く(14日目に5%)、研究の終了時に約10%であった。羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷は、全創傷上皮化に最良の性能であり、迅速な初期上皮化を示し、14日目までに約8〜10%および研究終了までに12%に達した。これらの群は、すべての時点で他の全ての処置よりも有意に良好であった。
【０１６０】
創傷領域、収縮、および上皮化の複合分析:
重要な情報は創傷治癒機構の個々の成分を分析することから得られるが、治癒の質を正確に表示するものが得られるのは、治癒中の創傷の全体像を見ることによるのみである。これを達成するために、創傷領域の割合に分類した各時点での総創傷領域を、収縮割合および上皮化割合で表す(図14)。
【０１６１】
これら3つの測定された構成要素が経時的な治癒創傷を完全に描写することにより、各処置に対する収縮および上皮化の競合機構が観察されうる。各処置のランク付けは、小さい創傷領域、最小の収縮、および大部分の上皮化のように最良の治癒の基準で行った。最悪の治癒の基準は、大きい創傷領域、最大の収縮、および最小の上皮化であった。図14中のグラフは、羊膜粉末および羊膜ヒドロゲルが他の製品と比べて有意に少ない創傷、少ない収縮、および多くの上皮化を有していたことを実証する。
【０１６２】
これらのデータから、収縮は創傷領域の減少をもたらしうるだけでなく、外観の欠損、瘢痕化および機能喪失を招きもするため、創傷治癒のタイプおよび質の重要性が強調される。この理由で、再上皮化による創傷閉鎖が最も望ましい。というのは、これは最適な美容的および機能的転帰を伴って、皮膚バリアの迅速な回復をもたらすからである。GRAFTJACKET(登録商標)処置創傷は最小限の収縮を示したが、それらはまた、上皮化をほとんど示さず、持続的な開放創域を生じた。この理由で、GRAFTJACKET(登録商標)は試験した製品の最後にランク付けされた。AMNIOGRAFT(登録商標)、静電紡糸パッチ処置創傷、および未処置創傷は、次善性能の製品に分類され、AMNIOGRAFT(登録商標)は、約50%の収縮および50%の上皮化によって推進されたより速い創傷閉鎖速度を有する。静電紡糸パッチ処置創傷および未処置創傷は、AMNIOGRAFT(登録商標)と比べて類似した創傷閉鎖の速度および程度を有していたが、しかしこの閉鎖の大部分は収縮によって推進された。羊膜粉末および羊膜ヒドロゲルは、これらの基準を用いて最良の性能の製品であり、上皮化の増加および最小限の収縮によって推進された、創傷の最も迅速かつ完全な閉鎖を有していた。
【０１６３】
組織学的分析
ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片を用いて、創傷の各々の一般的な構造および組成を評価かつ比較した。ブタ1〜3からの代表的画像を図15に示し、ブタ4〜6からの代表的画像を図16に示す。健常ブタ皮膚を、この分析の対照として用いた。ブタ1〜3からの創傷の分析により、大部分の創傷はGRAFTJACKET(登録商標)を除きある程度の表皮被覆を有することが明らかにされた。GRAFTJACKET (登録商標)で処置した創傷は一般に、真皮露出部、または深さの一定しないかさぶた様組織による被覆を有していた。未処置創傷、AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチ処置創傷は、一貫性のない被覆率、より薄い表皮を有するようであり、真皮領域への顕著な上皮「指状」突起(表皮突起(rete peg))を欠いていた。羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷の表皮は、被覆率、厚さおよび表皮突起の存在に関して健常皮膚と同様に見えた。健常な皮膚の真皮は、色が薄いピンク色の、組織化された大きな線維からなり、組織化されていない、薄い、紫色の線維が最小限しかなかった。GRAFTJACKET(登録商標)処置創傷は、炎症細胞および線維細胞の出現を伴い多くの小細胞を含むようであった。これは、創傷表面の太い線維組織に移行した。未処置創傷および静電紡糸パッチ処置創傷は、真皮線維の組織化を全く示さず、組織化されていない小さな、紫色の線維から完全になっていた。AMNIOGRAFT(登録商標)処置創傷には真皮内にいくつかの組織化されていない大きなピンク色の線維があったが、これは創傷間で、および同様に、個々の創傷内で一貫性がなく、いくつかの領域は小さな紫色の、組織化されていない線維によって支配されていた。羊膜ヒドロゲルで処置した創傷は、組織化されていない線維がわずかに多いだけで、健常な皮膚に最も類似しているように見えた。羊膜粉末で処置した創傷は、大きなピンク色の線維の存在が健常な皮膚といくぶん類似しているように見えたが、しかしこれらの線維の組織化は群間で一貫性がなかった。
【０１６４】
ブタ4〜6は、ブタ1〜3と非常に類似した組織学的外観を有していた。この分析から、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷は、規則的な表皮突起のある非常に成熟して見える表皮を有することが確認された。未処置創傷のなかには一貫した表皮を持たないものがあり、静電紡糸パッチ処置創傷のなかには、より厚い表皮被覆を示すが、表皮突起のないものがあった。AMNIOGRAFT(登録商標)およびGRAFTJACKET(登録商標)で処置した創傷は、最初の3頭のブタと一致していた。羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷はともに、色が薄いピンク色の、高度に組織化された線維があって、組織化されていない小さな線維が最小限しかなく、健常な皮膚の真皮と非常によく似た真皮を有するようであった。未処置創傷、AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチ処置創傷の真皮は、ブタ1〜3について観察されたものと類似しているようであった。全体として、組織学的に、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷は、健常な皮膚に最も類似して見えたようである。未処置創傷、AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチ処置創傷は全て、正常な治癒に向かって進行しているようであったが、しかし未熟な表皮および組織化されていない真皮を有していた。Grafjacketで処置した創傷は炎症性のようであり、発達中の表皮または真皮の兆候を示さなかった。
【０１６５】
ペンタクロム染色:
創傷の細胞外マトリックス(ECM)組成の概要を説明するために、ペンタクロム染色を行った。ペンタクロムは、複数のECM成分を同時に同定できる染色剤である。ペンタクロム染色はコラーゲンを黄色で、成熟線維を赤色で、ムチンおよびグリコサミノグリカン(GAG)を青色/緑色で、ならびに核および弾性線維を黒色で示す。図17は、6つの処置群および健常な皮膚の代表的画像を示す。この研究では、コラーゲンおよびムチン/ GAGの重複/近接が、組織の緑色の着色を生じた。健常な皮膚は、太い成熟コラーゲン線維(赤色)ならびにコラーゲンおよびムチン/GAGに対する陽性の黄色および緑色の染色からなる真皮を有していた。黒色のエラスチンまたは紫色の炎症性もしくは線維性の細胞浸潤はほとんど観察されなかった。未処置およびGRAFTJACKET(登録商標)処置組織は、赤色、緑色または黄色の染色がほとんど観察できない、主に高密度に充填された核を示した。これは、これらの領域が、浸潤性炎症細胞および線維芽細胞から構成される顆粒状組織からなりうることを示唆している。AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチで処置した創傷組織は、コラーゲンおよびムチン/GAGを示すが、赤色に染色されたフィブロイド/筋肉をほとんど示さず、正常な成熟真皮構造の欠如を示す。羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷は、コラーゲン、ムチンおよびGAGの黄色/緑色のバックグラウンド上に中間量の厚い成熟コラーゲン線維(赤色)を有する健常な皮膚と非常に類似して見えた。これは、これらの組織が健常な皮膚と同様の組成であるが、わずかに成熟していないコラーゲン線維、およびより多くのムチン/ GAGを含むことを示唆している。
【０１６６】
未成熟および成熟コラーゲンのシリウスレッド染色:
シリウスレッド染色では、偏光下で見た場合、未成熟コラーゲンと成熟コラーゲンとが区別される。未成熟な組織化されていないコラーゲンが緑色に染まり、成熟な組織化されたコラーゲンが黄色/オレンジ色に染まる。図18は、6つの処置群および健常な皮膚の代表的画像を示す。健常な皮膚は、緑色とオレンジ色の両方の強い染色を呈し、より小さなコラーゲン線維が混在した、より大きな成熟コラーゲン線維の組織化ネットワークを示した。GRAFTJACKET(登録商標)で処置した創傷は、かさぶた領域内を除いて、緑色染色をほとんど示さなかった。逆に、オレンジ色に染色された成熟コラーゲンについては陽性染色が存在した。しかしながら、それは、組織全体にわたって散発的に配置された小さな領域に局在していた。静電紡糸パッチで処置した創傷は、オレンジ色に染色されたコラーゲンが少なかったが、依然として観察可能であった。しかし、静電紡糸パッチ群では、より高い緑色-オレンジ色比が認められ、より遅いECM再生を示すものであった。未処置およびAMNIOGRAFT(登録商標)処置群は、オレンジ色の染色をほとんどまたは全く示さず、ほとんど緑色に見え、より遅いECM再生を示した。羊膜ヒドロゲルで処置した創傷は、健常な皮膚と同様に見え、オレンジ色および緑色の同様の分布を示した。羊膜粉末で処置した創傷は、オレンジ色に染色された、組織化された成熟コラーゲンをわずかにしか含まないようであるが、顕著な染色強度および分布を示した。
【０１６７】
要約すると、羊膜ヒドロゲルで処置した創傷および羊膜粉末で処置した創傷は、健常な皮膚と比べて成熟コラーゲン(赤色)および未成熟コラーゲン(緑色)について同様の組織立った染色を示した。静電紡糸パッチはまた、未成熟なコラーゲンについていくらかの染色を示したが、組織化された成熟コラーゲンはほとんどなかった。未処置およびGRAFTJACKET(登録商標)は、組織化されたコラーゲン構造について陽性染色されなかった。
【０１６８】
ムチンおよびGAGのアルシアンブルーおよび鉄コロイド染色:
アルシアンブルーはムチンおよびGAGを青色に、核をピンク色/赤色に染色する。図19は、6つの処置群および健常な皮膚の代表的画像を示す。羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷は、健常な皮膚と比べてアルシアンブルー染色の類似の局在および強度を示したが、GRAFTJACKET(登録商標)はかさぶた領域の下に強い染色を示した。残念なことに、非特異的なバックグラウンド染色は、この染色の解釈を困難にした。
【０１６９】
ムチンおよびGAGを視覚化する代替方法として、鉄コロイド染色を用いた。鉄コロイドはカルボキシル化および硫酸化ムチンおよびGAGを青色に、細胞質をピンク色/赤色に染色する。さらに、真皮組織の組織化を示す真皮の濃い赤色の染色は、健常な皮膚において非常に明白である。図20は、6つの処置群および健常な皮膚の代表的画像を示す。GRAFTJACKET(登録商標)処置創傷は、青色の染色をかさぶた中に、およびかさぶた下ではランダムな様式に示した。未処置組織、AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチ処置組織は、欠損したまたは最低限の、拡散した青色染色を示した。羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末処置創傷は、健常な皮膚、特に表皮の真下の青色染色と比べて、青色染色の同様の局在および強度を示した。同様の暗赤色の染色が、健常な皮膚でよりも程度は低いが、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末群でも観察された。この赤色の染色は、静電紡糸パッチ処置群では少なかったが、未処置、AMNIOGRAFT(登録商標)およびGRAFTJACKET(登録商標)処置群では、この赤色の染色がほとんどないかまたは全くないのが観察された。
【０１７０】
コラーゲン免疫組織化学的染色:
I型コラーゲン(赤色)およびIII型コラーゲン(緑色)の免疫組織化学染色を、DAPI細胞核対比染色(青色)とともに蛍光抗体で行った(図21)。6つの処置群および健常皮膚対照から得られた染色組織切片により、組織学的染色と組み合わせた場合、再生組織および細胞外マトリックスの質に対する洞察を与えるさまざまな相対レベルの蛍光染色が示された。蛍光画像を捕捉するために用いられたカメラ露光時間(サンプル全体で一定に保たれた)では、健常な皮膚において、ともに存在していたが、比較的弱いI型およびIII型コラーゲン染色が観察された。GRAFTJACKET(登録商標)処置群は、他の全ての群よりも顕著に異なる組織形態を呈した。これらの創傷において観察される重度のかさぶた形成のため、組織化されていない強力なIII型コラーゲンの線および核が密集した領域としてのかさぶたが観察された。かさぶたの下では、III型コラーゲンがほとんどまたは全く観察されず、少量のI型コラーゲンが観察されたことから、この群での新しい細胞外マトリックスの産生が他の群と比べて有意に遅れていることが示唆された。未処置創傷、AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチ処置創傷では、III型コラーゲン染色をほとんど伴わないで、強いI型コラーゲン染色が観察されたことから、不均衡なI型コラーゲン産生、および潜在的に線維性組織の発生が示唆された。逆に、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷では、前の3つの線維性群よりも少ないI型コラーゲン染色が観察され、健常な皮膚でよりも多いが、健常な皮膚と同様のレベルのIII型コラーゲン染色が観察された。これは、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末の処置が、他の処置よりも健常な皮膚に似た皮膚再生を達成することを示唆している。
【０１７１】
要約すると、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷は、健常な皮膚で観察されるような類似の強度のIII型コラーゲンを示し、I型染色がわずかに高い。未処置創傷、AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチ処置創傷は、ほとんどIII型なしに、強いI型染色を示した。GRAFTJACKET(登録商標)は、かさぶた領域においてほとんどIII型を示した。
【０１７２】
好中球免疫組織化学的染色:
抗体およびHRP-ストレプトアビジン染色を用いて、好中球の免疫組織化学的視覚化を行った。6つの処置群および健常皮膚対照から得られた染色組織切片(図22)により、組織採取時に起こる免疫応答のレベルに対する洞察を与えるさまざまな相対レベルの褐色染色が示された。GRAFTJACKET(登録商標)処置創傷は、かさぶた-組織界面の下に高密度の、褐色に染色された好中球を示した。AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチ群は、主に創傷の表面および/または適用された処置パッチとの界面に、強い褐色染色の局在化領域を示した。さらに、好中球が真皮全体に観察された。羊膜ヒドロゲル、羊膜粉末、および未処置群は、健常な皮膚においても観察されたのと同様な低レベルの好中球の存在を示した。低レベルの非特異的なバックグラウンド染色があったが、それは、これらの群全体で一貫していた。これらの結果は、(1) 処置の欠如(未処置群)により、早期に好中球免疫応答が起こり、8週間目に観察不能とされうること; (2) 羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末は応答を惹起せず、またはそれらは、より容易に再構築されるので、免疫反応が短縮されるのに対し、AMNIOGRAFT(登録商標)、GRAFTJACKET(登録商標)および静電紡糸パッチは、その組成のため、またはそれらが通常のECMに容易に再構築されにくいので、長時間の応答を惹起することを示唆している。
【０１７３】
要約すると、羊膜ヒドロゲル処置創傷、羊膜粉末処置創傷および未処置創傷は、健常な皮膚において観察されるのと同様な低レベルの好中球の存在を示す。AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチは、創傷の表面に顕著に、強い染色の局在した領域を示した。GRAFTJACKET(登録商標)は、下部のかさぶた領域において高濃度の強く染色された好中球を示した。
【０１７４】
創傷バイオマーカー分析:
創傷バイオマーカーは、ヒト患者での創面切除の必要性または創傷治癒の予測でのその成功によって選択された。炎症性非治癒創傷のバイオマーカー(IL1α、IL1βおよびIP-10)、単球関連炎症マーカー(MCP-1、MIP-1βおよびIL-8)ならびに治癒創傷の抗炎症マーカー(IL2、IL-4およびIL-5)を定量的PCRによって分析し、正常皮膚と比べて表した。GRAFTJACKET(登録商標)処置創傷は、炎症性非治癒創傷のバイオマーカーの一貫して高い発現を示したが、静電紡糸パッチ処置創傷および未処置創傷は、炎症バイオマーカーIL1αおよびIL1βの、それぞれの、発現を示し、炎症の存在および潜在的に治癒遅延の結果を示唆していた(図23)。AMNIOGRAFT(登録商標)、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷は全て、健常な皮膚よりも高いが他の処置群よりも有意に少ないバイオマーカーの発現を示した。GRAFTJACKET(登録商標)処置創傷は、この場合も先と同様に、これらの組織での浸潤性炎症細胞の所見と一致して、単球関連炎症マーカーのバイオマーカーの一貫して高い発現を示した(図24)。未処置創傷はMIP1βおよびIL8の発現の増加を有していたが、これはごくわずかな傾向にすぎなかった。静電紡糸パッチ、AMNIOGRAFT(登録商標)、羊膜粉末および羊膜ヒドロゲルで処置した創傷は、単球関連炎症バイオマーカーの発現が低かった。治癒創傷の抗炎症マーカーの発現は一般的に低く、バラツキがあったが、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷は、IL4およびIL5について他の処置群よりも高い傾向があった(図25)。IL2については群間でバラツキは少なかったが、AMNIOGRAFT(登録商標)、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した群におけるこのバイオマーカーの発現は、他の処置群と比べてわずかに増加していた。
【０１７５】
要約すると、動物間でバラツキが観察されたが、これらのマーカーについて観察された明確な傾向があった。GRAFTJACKET(登録商標)で処置した創傷は、画像分析と一致して非治癒創傷の全てのマーカーの発現増加を有していた。静電紡糸パッチで処置した創傷は、IL1αの発現の増加を有していたが、IL1βまたはIP10の発現の増加は有しておらず、未処置創傷はIL1βの増加を有していたが、IL1αまたはIP10の増加を有していなかった。全体として、AMNIOGRAFT(登録商標)で処置した創傷、羊膜粉末で処置した創傷および羊膜ヒドロゲルで処置した創傷は、非治癒創傷の全てのマーカーの発現が低かった。
【０１７６】
要約
処置実施の容易さ:
外科手術からの所見により、パッチタイプの処置の適用は、製品の剛性および柔軟性に影響され、サイズおよび形状のわずかな差異でさえ、より硬くより厚いGRAFTJACKET(登録商標)が創傷領域にうまく適合しないことが明らかになった。非常に薄くて柔軟性のあるAMNIOGRAFT(登録商標)は、2人の外科医であっても、取り扱いが難しく、創傷に貼り付けるのが難しかった。より厚く、より硬い製品は取り扱いおよび適用がより容易であったが、この特性は創傷治癒にとって有害で、創傷閉鎖および上皮化を阻害すると考えられた。羊膜粉末は、事前に測定した重量の粉末を創傷領域に単に散布し、続いて滅菌生理食塩水1 mLでぬらすことにより、投与するのが最も簡単な製品であった。創傷に適用する前に粉末を生理食塩水の容量中に最初に懸濁させることによって羊膜粉末を適用することも試験し、これによって処置結果が損なわれることはなく、手法がさらに単純化されることが分かった。この方法論はまた、所望なら創傷領域当たりの用量を増加させるという選択肢を提供する。羊膜ヒドロゲルは、製品のゲル化に創傷領域内で約10〜15秒かかり、投与するのが非常に簡単であった。この製品はUV光の使用を必要としたが、製品開発により、現時点で、この要件はなくなっている。UV光の除外により、羊膜ヒドロゲルは最も簡単な適用を有すると考えられる。
【０１７７】
創傷治癒の質:
創傷閉鎖、収縮、および上皮化の分析から、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末は創傷閉鎖および上皮化において優れており、収縮を防ぐ上で、中でも最良の遂行体(performer)であることが実証された。創傷治癒の機構を適切に含めるために、創傷治癒の全体的分析が行われることが重要である。羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末は、創傷の再上皮化の顕著な加速によって全創傷閉鎖の速度および程度を加速した。これは、これらの製品を用いて再生された創傷がより速く治癒するだけでなく、瘢痕および収縮の少ない、成熟した健常な表皮被覆で治癒することも示唆している。これらの研究は、顕著な内因性の創傷治癒能力を有する健常皮膚モデルにおいて行われたが、上皮成長能を遅延または阻害した創傷においてこれらの効果は強められる可能性が高い。興味深いことに、AMNIOGRAFT(登録商標)は、他の2つの羊膜製品に続いて次善性能の製品であった。これは、これらの処置の再生可能性が当初の羊膜の出発材料に関連していること、ならびにヒドロゲルおよび粉末を製造するためにとられた処理段階がこの特性を低下させるのではなく、むしろ治療因子の利用可能性/放出を促進することを示唆している。これは、創傷内のヒドロゲルおよび粉末の放出プロファイルに関連する可能性があり、これは羊膜の自然分解プロファイルと比べて創傷治癒にさらに有益でありうる。画像分析の成果測定の全てにわたって、静電紡糸パッチは未処置創傷とほぼ同一の性能を発揮し、この製品は、創傷閉鎖、収縮または上皮化に及ぼす有益な影響も有害な影響もないことを示唆していた。上記のように、厚くて堅いGRAFTJACKET(登録商標)パッチは、全ての成果測定において十分な性能を発揮せず、創傷閉鎖、収縮および上皮化を阻害するようであった。これは、製品の分解速度と自然の創傷閉鎖速度との間の不一致によるものである可能性が高い。これは、臨床的に意義のある時間軸で切れ目なく、再生創を支持し、再生創に一体化する創傷治癒製品の重要性を強調している。ゲルのような、創傷環境に適合するように改変されうる製品は、種々の創傷および処置困難な創傷の閉鎖を大きく加速すると考えられる。
【０１７８】
皮膚の質:
真皮の所見により、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷は、組織化された大きなコラーゲン線維からなる、健常な皮膚に類似した真皮を有することが示された。これにより、真皮が、健常な皮膚と同様の機能的および機械的特性を有するこれらの群において成熟していたことが示唆された。組織の組織学的分析により、創傷治癒中の表皮被覆の増加の所見が確認された。初期の時点での組織切片の分析は行われなかったが、真皮突起を伴う厚く成熟した表皮の存在は、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末処置群における上皮化の加速の所見を支持するものである。他の処置では表皮被覆をもたらしたが、これはより薄く見え、これらの真皮突起を欠いていた。これは、これらの組織における表皮があまり成熟しておらず、おそらく治癒期の後期に発達していることを示唆している。創傷ECMの質は、治癒創傷の長期的成功にとって重要性の鍵を握る。ECM組成は、治癒創傷の特性に大きな影響を及ぼす。通常の健常ECMは、通常の細胞的および機械的特性を促進し、異常ECM組成は、瘢痕、収縮および機能喪失を引き起こす。このため、これらの製品に対するECMの組成および組織の組織像に関する広範な特性決定が行われた。組織学的染色により初期の所見が確認され、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷が、成熟皮膚と一致する局在および染色強度で、ずっと未熟なコラーゲンおよびムチン/GAGと絡み合った厚い成熟コラーゲン線維からなる真皮ECM組成を有していることが示された。IHCコラーゲン染色では、他の群と比べて羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した群におけるI型コラーゲンの少ないことが観察された。これは、典型的には組織化されていない瘢痕様の線維性コラーゲンがより少ないことを示唆しうる。再生組織中の組織化されていないI型コラーゲンの沈着を遅くすることで、形成は遅くなるが、より組織化された成熟コラーゲン線維が得られ、その組織は本質的に線維性が乏しいようである。さらに、他の群と比べて、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末処置群におけるムチン/GAGの鉄コロイド染色がわずかに増加したことが観察された。これは、組織化されていない線維性コラーゲンの形成を妨げることにより、成熟したコラーゲン線維が形成できるだけでなく、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ならびに健常なマトリックスおよび組織にとって重要である他のGAG/プロテオグリカンのような他のECM成分も形成できることをさらに示唆しうる。その一方で、未処置創傷、AMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチ処置創傷は、組織化されていない未成熟コラーゲンおよび、びまん性(diffuse)ムチン/GAGからなる真皮ECM組成を示した。これは、III型コラーゲン染色をほとんど伴わない、強いI型コラーゲン染色の所見により裏付けられ、これらの組織が線維性組織の発生に進展し、収縮および瘢痕に至りうることを示唆していた。
【０１７９】
免疫応答:
以前の研究は免疫不全動物において行われたので、ヒト組織由来材料がこれらの免疫適格性動物において免疫応答を誘導するかどうかを評価することが重要であった。興味深いことにAMNIOGRAFT(登録商標)および静電紡糸パッチで処置した創傷における炎症細胞浸潤の増加が観察された。これは、AMNIOGRAFT(登録商標)におけるインタクトなヒト細胞の存在によるものでありうるが、静電紡糸パッチの組成が不明であるため、これらの群における炎症の原因は不明である。予想通り、未処置創傷は、健常な皮膚に類似した低レベルの炎症細胞浸潤しかなかった。GRAFTJACKET(登録商標)処置創傷は、かさぶた領域内と下層組織中の両方で、主要な炎症応答を示した。これらの応答がヒト患者における同種異系適用においても観察されたか否かは不明である。しかしながら、それは、これらの製品での刺激性抗原の存在を示唆している。重要なことに、組織採取時の羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末における炎症細胞浸潤の増加は観察されず、これらの製品が他の処置と同じ程度には異種環境における有害な免疫反応を刺激しないことが示唆された。これにより、最小限のリスクでの同種環境における本製品の適用が支持される。炎症バイオマーカーは、さまざまな創傷治癒処置戦略の成功または失敗を予測する上で、ある程度の成功を収めている。ヒトの創傷において創傷治癒結果を予測する能力に基づき9種のバイオマーカーのパネルを選択した。遅延型治癒GRAFTJACKET(登録商標)は、非治癒創傷の炎症バイオマーカーの高い発現、および治癒創傷のバイオマーカーの低い発現を示し、3つの部類のバイオマーカー全体にわたる強い傾向が観察された。羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末で処置した創傷を分析した際には反対の結果が観察され、非治癒創傷の炎症バイオマーカーの低い発現、および治癒創傷のバイオマーカーの発現の増加が示された。これは、このモデルにおける創傷治癒を予測するためのこれらのバイオマーカーの使用を支持する。しかしながら、モデルにおけるバイオマーカーの使用にはいくつかの制限があった。第一に、この健常な創傷治癒動物モデルでは、有効性のレベルはさまざまであるが、ほとんどの他の処置が完全な創傷閉鎖を最終的にもたらす。真の非治癒創傷と比べて、観察された傾向が画像および組織学的分析と一致するにもかかわらず、これらの処置選択肢の間の発現レベルの差異はもっと小さくなる可能性が高かった。第二に、組織がこの研究の最終時点で、潜在的にピーク炎症の時間後に回収された。これは、これらの実験でいくつかのマーカーについて観察された全体的な低レベル発現を説明しうる。
【０１８０】
結論として、羊膜ヒドロゲルおよび羊膜粉末は、ブタモデルにおいて全層創傷に投与するのが最も簡単な製品であった。これらの製品の適用は、主に新たな上皮化によってかつ免疫拒絶反応なしで推進された最も速い創傷閉鎖速度を生じた。これらの所見は、これらの処置がこれらの全層創傷の迅速な治癒を促進し、健常な皮膚と同様の組成を有する成熟した表皮および真皮の形成をもたらすことを実証した、組織学的分析およびバイオマーカー分析によって支持された。
【０１８１】
インビボ研究2
PEGDMalで架橋された新規ヒドロゲルを用いたインビボ研究
この研究の目的は、ポリエチレン(グリコール)ジアクリレート(PEGDA)架橋剤をマレイミド官能化ポリエチレングリコール(PEGDMal)で置き換えることにより、基本的なヒドロゲル特性が変化するかどうかを評価することであった。このインビボ研究により、いずれかの製品で架橋されたヒドロゲル間に有意差がないことが実証された。
【０１８２】
PEGDMalは、ヒドロゲルのマレイミド基とチオール基との間に安定な結合を形成できる反応性PEG誘導体である。マレイミド-チオール反応は、従来のアクリレート-チオール反応と比較して架橋を促進し、ヒドロゲル成分の混合時にほぼ瞬間的な架橋をもたらし、それにより、UV光がヒアルロニック(hyaluronic)ヒドロゲルを架橋する必要性を排除する。
【０１８３】
新規のヒドロゲル製剤は、PEGDMal架橋剤と羊膜粉末/溶液および生理食塩水とを一方のシリンジピストンで、ならびにHAおよびゼラチンを他方のシリンジピストンで混ぜ合わせることにより、羊膜粉末または可溶化羊膜と組み合わせることもできる。さらに、個々の成分は、架橋することなく二重チャンバのシリンジ内に無期限に凍結保存することができる。融解後、チオール化されたHAおよびゼラチン溶液内でチオール-チオールジスルフィド結合が形成し始める前に、作業時間は約8時間までであることが示されている。
【０１８４】
動物および創傷:
3頭の特定病原体未感染(SPF)のヨークシャーブタを購入し、必要な2週間順応させた。研究の開始時に、ブタはおよそ40〜50 kgの重さがあった。この研究は、Wake Forest大学の学内動物飼育使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により審査および承認された(A13-015-Amnion製品 ブタでの創傷治癒用)。全ての訓練、創傷作製および包帯法は、上記のように行った。手短に言えば、胸部および腰部に沿う背中中央の全層皮膚4×4 cmを切除することにより、皮膚創傷8領域を作製した。創傷縁に沿って皮筋層に切り込みを入れ、覆っている皮膚を切除した。
【０１８５】
創傷処置:
創傷領域を、創傷表面に直接適用した羊膜粉末88 mg、修飾ヒアルロナンヒドロゲル担体のみ、ヒドロゲル下に積層した羊膜粉末またはヒドロゲルと予め混合した羊膜粉末8 mLのいずれかで処置した。追加の群は処置を受けなかった。羊膜/ヒドロゲル製剤の各々で処置した創傷の画像を図30および図31に示す。5つの実験的選択肢を8つの皮膚欠損にわたって配し、創傷位置の差異を制御した。実験ラウンドは28日間継続し、その間に創傷を毎週2回、(1) 創傷サイズ、再上皮化および閉鎖の文章化、ならびに(2) 洗浄、および再び包帯することのために検査した。
【０１８６】
ヒドロゲルの調製
このインビボ研究において用いられたヒドロゲルの調製は、架橋剤としてPEGDMalを用いることを除き、本明細書中のインビボ研究1に記述されたのと同じ手法に従った。HA:ゼラチン:架橋剤(PEGDMal)の終濃度はインビボ研究1におけるHA:ゼラチン:架橋剤(PEGDA)と同じ終濃度であるが、上記の開始濃度および容量は、沈着のため二重シリンジw/混合シリンジチップに配されうる2等量の試薬の作製を可能とするように改変される(図27)。14日間にわたる累積タンパク質放出およびゲル膨潤を測定した(図28および図29)。どちらの製品で架橋したヒドロゲル間にも有意差は観察されなかった。
【０１８７】
群:
1. 未処置対照
2. ヒドロゲル
3. 羊膜粉末
4. 羊膜粉末+ヒドロゲル(ヒドロゲル下の積層粉末)
5. ヒドロゲル中の羊膜粉末(適用前に混合された)
【０１８８】
（表３）創傷配分
2017530153.tif 000004
【０１８９】
研究分析:
処置後28日の時点で、研究を終了し、創傷領域を採取した。創傷を2つに分けた: 組織学および免疫組織化学のために1つ、ならびに機械的試験のために1つ。機械的試験の後、この組織を再び分割し、創傷治癒バイオマーカーのPCR分析およびタンパク質アッセイ法の潜在的使用のために保存した。
【０１９０】
画像分析:
収縮は、ソフトウェアImageJを用いて、刺青された正方形内の領域を測定することにより各時点で測定され、当初の刺青のサイズと比べて表示された。創傷収縮率は、創傷が最初の正方形の創傷から形状を変化させた程度を記述する。再上皮化による創傷治癒は、通常、わずかに対称的に収縮しながら初期の正方形の形状を維持する。収縮性の高い創傷は、通常、創傷の縁から収縮し、星形の創傷を生じる。創傷閉鎖および上皮化は、ImageJを用いることで測定し、開放創、成熟および未熟上皮の領域を決定した。この領域は、治癒創の色および質感によって同定することができる。一般に開放創は暗赤色で光沢があり、未熟上皮は薄い赤色で不透明/艶なしであり(薄い表皮被覆のため)、成熟上皮は白色/ピンク色かつ不透明/艶なしであった。これらの構成要素を、当初の創傷サイズに対する個々の測定値として測定、表示し、経時的な創傷治癒への全構成要素の寄与を実証するために組み合わせた(図38)。
【０１９１】
組織学およびIHC:
(1) H&E染色
(2) コラーゲン、ムチン/GAG、エラスチンおよび成熟線維のペンタクロム染色
(3) 成熟および未成熟コラーゲンのシリウスレッド染色
【０１９２】
機械的試験:
再生された皮膚創傷の機械的特性を分析するために、安楽死の時点で切除された各創傷の半分をInstron機械試験機を用いた圧縮試験によって直ちに評価した。サンプルは、創傷の中心までの創傷の外縁から構成され、圧縮装置は、図44に描かれるように、この経路に沿って配向された。各サンプルは5 mm/分の速度で圧縮され、その間にInstron機に付随するBluehill Softwareパッケージを用いて荷重、応力、およびひずみが測定され、記録された。
【０１９３】
GraphPad Prismにデータをインポートすることにより、各サンプルについて応力ひずみ曲線を作成し、全ての下流分析を実施した。一般に、軟組織は完全には弾性ではないため、非線形応力ひずみ曲線を生じる。したがって、代表的な応力ひずみ曲線は、図45に描かれるものに類似している。そのような曲線は、図45にも描かれた以下のデータをもたらす。
・圧縮強度。これは、材料が破損したときの最終強度に対応する。これは赤色の矢印で示される。
・曲線の最初のほぼ直線部分。これは材料の弾性分域を記述する。この分域において、材料は伸張するが、加えられた力が取り除かれた場合に反発する能力を有する。この直線部分の傾きは、圧縮Eのヤング率を与える。これは緑色の線で示される。
・青色の矢印で示される、弾性分域の終端または曲線の最初の直線部分が降伏点である。この点を上回ると、材料に損傷が生じ、塑性的に振る舞い、元の状態には戻らない。
【０１９４】
結果
一般的な観察結果:
全ての外科的手技は、合併症を発症せずに行われた。均一なサイズと深さで創傷が作製された。正方形の皮膚切片の除去後、皮膚のいくらかのたるみが観察された。創傷の上方で管を穏やかにたたくことにより羊膜粉末を均等に分布させ、引き続き滅菌生理食塩水1 mLを適用して粉末を湿らせた。あるいは、粉末は最初に生理食塩水と混合することによって適用することができた。これまでの研究では、測定されたパラメータに対する各送達方法には差異がないことが示されている。新たなヒドロゲル製剤は、手術前の朝に滅菌条件下で調製され、氷上で手術室に輸送された。ヒドロゲル処置の各々は、投与するのが非常に容易であり、片手だけで済み、創傷内でほぼ瞬間的にゲルの形成をもたらした。材料のしたたり、または喪失は起こらなかった。ヒドロゲル成分中での羊膜粉末の事前混合および二重チャンバシリンジによる送達は、実施するのが容易であった。粉末は、送達された濃度で100%可溶性ではなかったが、ヒドロゲル処理で混合された粉末は、製品の損失なしに容易に送達された。
【０１９５】
画像分析:
デジタル写真を各時点(0日目、4日目、7日目、11日目、14日目、18日目、21日目、24日目および28日目)で撮影し、8つの創傷の各々についてまとめた(図32、図33および図34)。注記: 創傷処置配分は、上記の表3に記述されている。処置選択肢は、比較を容易にするために各動物について同じ順序で維持される。各ブタに対する下の3つの処置は、そのブタに対する3つの処置選択肢を繰り返したものである。
【０１９６】
創傷閉鎖:
創傷閉鎖は、創傷治癒の成功と相関する。創傷閉鎖率が高いほど、治癒転帰はより良好になる。創傷閉鎖を各時点について測定し、当初の創傷領域と比べて存在する創傷の割合として表した(図35)。平均創傷サイズは17.5 cm2であり、処置またはブタの間に有意差はなかった。創傷処置後の即時の時点では、創傷の伸張/垂れ下がりによる、羊膜粉末で処置した創傷以外の全創傷についての創傷領域の初期増加があった。これは、羊膜粉末の適用が創傷領域を直ちに安定化するのに役立つことを示唆している。未処置創傷およびヒドロゲル処置創傷は、初期の時点で創傷サイズの最大の拡大を示した。羊膜粉末処置群は、造粒のより初期かつより顕著な開始を示した。これは主に4日目と11日目の間に起き、羊膜粉末を含有するすべての処置製剤で起きた。全ての群が、7日目と14日目の間に創傷領域の急速な減少を示し、この期間中に全ての群が同様に機能を果たした。しかし、14日目と28日目の間に、3つの羊膜粉末処置群は、創傷閉鎖の加速を示し、24日目までにほぼ100%の閉鎖をもたらした。この時点で、未処置創傷およびヒドロゲル処置創傷は依然として、約15〜20%の創傷領域を示した。この差異は、14日目後の各時点で観察された。本明細書における2つのインビボ研究の間の結果を比較するために、各研究(未処理および羊膜粉末)からの複製群をプロットし、比較した(図48)。この比較は、創傷の拡張および収縮のタイミングに若干の差異が見られたとはいえ、創傷閉鎖の傾向および速度は、粉末が適用された場合の改善と同様にかなり似通っていたことを示す。
【０１９７】
創傷収縮:
創傷収縮は、創傷治癒の有効性と相関する。収縮率が高いほど、治癒転帰はそれだけ悪くなった。創傷収縮を、刺青内の領域を測定することにより各時点について測定し、当初の刺青領域に対する領域の割合として表した(図36)。創傷閉鎖データの場合と同様に、最初の7日間にわたる創傷/刺青領域の初期増加が観察された。これにより、約20%の負の初期収縮率が得られた。未処置創傷およびヒドロゲル処置創傷は、最大の収縮を示し、7日目と14日目の間に急速な収縮が起こり、当初の刺青領域の約50%に達した。最終の時点で、これらの製品は60%の収縮を示した。羊膜粉末、粉末+ゲルおよびゲル中の粉末は最小限に収縮し、粉末および粉末+ゲルが最高の性能を発揮した。これらの製品は、遅延した収縮増加および7日目と18日目との間のより短いかつあまり急速でない収縮期間を示し、約30%の収縮に達した。最終の時点で、これらの製品は35%の収縮を示した。
【０１９８】
創傷収縮比:
この現象を測定するために、全ての時点にわたっていくつかの創傷測定を行った(図37)。2つの左側創傷角の間の中心点に対する創傷左縁の距離を測定し、これらの角の間の全距離の比として表した。この比率は、創傷の形状変化の量を近似的に説明する。正方形の非収縮創傷は0に近い比率を有し、高度に収縮した「星形」状の創傷は0.2に近い比率を有した。収縮データを確認すると、未処置創傷およびヒドロゲル処置創傷の比率は、28日間で約0.15に増加した。羊膜粉末で処置した群は全て、それほどではないにせよ増加し、研究の間にわたって0.1未満の比率を維持した。
【０１９９】
創傷上皮化:
創傷上皮化は、創傷治癒の成功と相関する。上皮化率が高いほど、創傷治癒が良好である。上皮化は、創傷領域とは異なった、艶のないように見える上皮コーティングの存在により全ての時点で測定した(図38)。上皮化は、各時点での上皮により覆われた、当初の創傷領域の割合として記述される。それゆえ、残存している創傷、収縮および上皮化の割合は、約100%のはずである。全ての組織は初めに、刺青線の内側に切開創が作製されていたため、ある程度の上皮化があった。この最初の領域は、刺青内部の領域の約18〜20%であり、全ての処置およびブタに対して一貫していた。未処置創傷、およびヒドロゲル処置創傷は、最小限の創傷上皮化を示し、非常に遅い上皮化開始(14〜18日目の時点まで0%の増加)および研究終了時に低い総上皮化(およそ25〜30%)を示した。羊膜粉末および粉末+ゲルで処置した創傷は、全創傷上皮化に最良の性能であり、迅速な初期上皮化を示し、14日目までに約45%および研究終了までにほぼ70%に達した。ヒドロゲル中の羊膜は、他の2つの羊膜粉末処置群と比べてわずかに少ない上皮化を示したが、それでも未処置群およびヒドロゲル群よりも有意に良好であった。また、創傷上皮化の領域を、収縮した刺青境界の領域で割ることにより、収縮した創傷領域と比べて創傷上皮化を分析した(図39)。これは、収縮の境界内の創傷組成の情報を提供し、上皮化の影響を受けた創傷閉鎖を示す。
【０２００】
創傷領域、収縮、および上皮化の複合分析:
重要な情報は創傷治癒機構の個々の成分を分析することから得られるが、治癒の質を正確に表示するものが得られるのは、治癒中の創傷の全体像を見ることによるのみである。これを達成するために、総創傷領域を創傷領域の割合、収縮割合および上皮化割合に分類して各時点で表す(図40)。これら3つの測定された構成要素が経時的な治癒創傷を完全に描写することにより、各処置に対する収縮および上皮化の競合機構が観察されうる。各処置のランク付けは、小さい創傷領域、最小の収縮、および大部分の上皮化のように最良の治癒の基準で行った。最悪の治癒の基準は、大きな創傷領域、最大の収縮、および最小の上皮化であった。全3つの羊膜粉末処置群は、これらの基準を用いて最良の性能の製品であり、上皮化の増加および最小限の収縮によって推進された、創傷の最も迅速かつ完全な閉鎖を有していた。これらの群において、収縮は創傷閉鎖の約30%を占めたが、70%は研究の終了までに上皮化によって推進された。未処置群およびヒドロゲル処置群は、最悪の性能であり、研究の終了までに60〜70%の収縮、20〜30%の上皮化および10%の開放創の残存を示した。これらのデータから、収縮は創傷領域の減少をもたらしうるだけでなく、外観の欠損、瘢痕化および機能喪失を招きもするため、創傷治癒のタイプおよび質の重要性が強調される。この理由で、再上皮化による創傷閉鎖が最も望ましい。というのは、これは最適な美容的および機能的転帰を伴って、皮膚バリアの迅速な回復をもたらすからである。
【０２０１】
組織学的分析
ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片を用いて、創傷の各々の一般的な構造および組成を評価かつ比較した。ブタ7〜9からの代表的画像を図41に示す。健常ブタ皮膚を、この分析の対照として用いた。ブタ7〜9からの創傷の分析により、羊膜粉末、羊膜+ゲルおよびゲル中の羊膜で処置した創傷由来の表皮は、表皮被覆率、厚さおよび表皮突起の存在に関して健常皮膚と同様に見えることが明らかにされた。未処置創傷およびヒドロゲル処置創傷の表皮は、必ずしも存在するとは限らないが、存在した場合、それは薄くて未成熟で、真皮との境界を欠き、表皮突起を欠くように見えた。健常な皮膚の真皮は、色が薄いピンク色の、組織化された大きな線維からなり、組織化されていない、薄い、紫色の線維が最小限しかなかった。羊膜粉末、羊膜+ゲルおよびゲル中の羊膜で処置した創傷は、健常皮膚と同様に見え、組織化された大きな真皮線維を含む類似の組成物が、より小さな線維と絡み合っている。未処置創傷およびヒドロゲル処置創傷は、小さな暗色線維および異常肥大細胞の高密度ネットワークを示した。全体として、全ての羊膜粉末処置群は、表皮および真皮の両方に関して健常皮膚と最も類似しているように見えた。
【０２０２】
ペンタクロム染色:
創傷の細胞外マトリックス(ECM)組成の概要を説明するために、ペンタクロム染色を行った。ペンタクロムは、複数のECM成分を同時に同定できる染色剤である。ペンタクロム染色はコラーゲンを黄色で、成熟線維を赤色で、ムチンおよびグリコサミノグリカン(GAG)を青色/緑色で、ならびに核および弾性線維を黒色で示す。図42は、5つの処置群および健常な皮膚の代表的画像を示す。健常な皮膚は、太い成熟コラーゲン線維(赤色)ならびにコラーゲンおよびムチン/GAGに対する陽性の黄色および緑色の染色からなる真皮を有していた。真皮上層にもいくつかの黒色エラスチン染色が観察された。羊膜粉末、羊膜+ゲルおよびゲル中の羊膜で処置した創傷は、コラーゲン、ムチンおよびGAGの黄色/緑色のバックグラウンド上に中間量の厚い成熟コラーゲン線維(赤色)を有する健常な皮膚と類似して見えた。また、全ての羊膜粉末処置群においてさまざまな程度にエラスチン線維が観察された。未処置創傷は主に、いくらかのGAG/ムチン染色(青色)を有する未成熟コラーゲン線維(黄色)であった。ごくわずかな成熟コラーゲン染色しか観察されなかった。ヒドロゲルで処置した創傷は、成熟コラーゲンに対するいくらかの染色を示したが、しかしこれは明白ではなく、線維は依然として小さく、組織化されていないように見えた。未処置創傷およびヒドロゲル処置創傷の両方が細胞肥大を示した。
【０２０３】
未成熟および成熟コラーゲンのシリウスレッド染色:
シリウスレッド染色では、偏光下で見た場合、未成熟コラーゲンと成熟コラーゲンとが区別される。未成熟な組織化されていないコラーゲンが緑色に染まり、成熟な組織化されたコラーゲンが黄色/オレンジ色に染まる。図43は、5つの処置群および健常な皮膚の代表的画像を示す。健常な皮膚は、緑色とオレンジ色の両方の強い染色を示し、より小さなコラーゲン線維が混在した、より大きな成熟コラーゲン線維の組織化ネットワークを示す。全ての羊膜粉末処置群は、健常な皮膚と同様に見え、真皮全体にオレンジ色および緑色の同様の分布を示す。未処置群およびヒドロゲル処置群は、成熟した(赤色)コラーゲンがごく少量しか見られず、最低限のコラーゲン染色を示した。
【０２０４】
圧縮強度
圧縮強度は、粉末、粉末+ヒドロゲル、およびヒドロゲル中の粉末の群(それぞれ32.69、31.93、および32.01 MPa; 図46A)と比較して未処置群およびヒドロゲル群(それぞれ40.72および42.35 MPa)において一般的に高いと測定された。これらの差異に有意差はなかったが、羊膜粉末を含めると圧縮強度が減少されたという点で一貫した傾向を示す。実際、未処置およびヒドロゲルの実験値を組み合わせ、粉末を含む全群を組み合わせたなら、羊膜粉末を含めると圧縮応力が有意に減少される(それぞれ41.54対32.21 MPa; p＜0.05) (図46B)。
【０２０５】
ヤング率
ヤング率は未処置群(9.78 MPa)において最も低かった。他の群−ヒドロゲル、粉末、粉末+ヒドロゲル、およびヒドロゲル中の粉末は、それぞれ11.10、12.84、10.07、および11.62 MPaの、より高いヤング率を有していた。観察された差異のいずれも統計学的に有意ではなかった(図47A)。
【０２０６】
降伏点
降伏応力に関していずれの群間にも有意差は見られなかった(図47B)。
【０２０７】
要約
処置実施の容易さ:
修飾されたヒドロゲル系の適用では、必要最小限の調製および無菌適用に片手だけを必要とした。このヒドロゲル系は、すぐに使える二重チャンバシリンジ中で凍結保存することができる。適用の場合、この製品は単に融解され、適用される。
【０２０８】
創傷治癒の質:
創傷閉鎖、収縮、および上皮化の分析から、羊膜粉末を含有する群は全て、創傷閉鎖および上皮化において優れており、収縮を防ぐ上で最良の遂行体であることが実証された。未処置創傷およびヒドロゲル処置創傷は、収縮の増加、上皮化の減少およびより遅い創傷閉鎖時間を示し、ヒドロゲルは未処置よりもわずかに良好に機能を果たした。羊膜粉末を含んだ処置は、創傷の再上皮化の顕著な加速によって全創傷閉鎖の速度および程度を加速した。他の2つの羊膜群と比べてヒドロゲル中の粉末群の上皮化速度の間に最小限の差異が認められた。羊膜粉末および羊膜+ヒドロゲル処置では、創傷への粉体の全用量の適用を必要としたが、羊膜粉末をヒドロゲルで希釈すると、創傷床への生物活性因子の放出がわずかに遅れ、また潜在的に、創傷治癒中の重要な時点での羊膜粉末の効果を希釈してしまう可能性があった。
【０２０９】
皮膚の質:
組織学的所見により、全ての羊膜粉末群が、類似の表皮被覆率、厚さおよび表皮突起の存在からなる、健常皮膚に類似した創傷組成、ならびにより小さな線維と絡み合っている組織化された大きな真皮線維を含む真皮組成を有することが示された。創傷ECMの質は、治癒創傷の長期的成功にとって重要性の鍵を握る。ECM組成は、治癒創傷の特性に大きな影響を及ぼす。組織学的染色により初期の所見が確認され、羊膜粉末で処置した群の全てが、ずっと未熟なコラーゲンと絡み合った厚い成熟コラーゲン線維からなる真皮ECM組成を有していること、成熟皮膚と一致する局在および染色強度でエラスチン線維の染色が示された。真皮コラーゲン組成に関して、シリウスレッド染色により、羊膜粉末で処置した群の全てが、真皮内に未成熟コラーゲン線維と成熟コラーゲン線維の類似の比率および組成を有することが示された。未処置創傷およびヒドロゲル処置創傷では、未成熟な表皮または表皮なし、ならびに高密度、未成熟かつ組織化されていないコラーゲン線維および細胞過形成の真皮組成が示された。
【０２１０】
圧縮試験
圧縮試験の差異は、大部分、統計的に有意ではなかった。しかしながら、全体的な傾向、粉末なし対粉末の圧縮強度データ、および切除した組織サンプルの組織学的検査を組み合わせたものに基づき、データから、処置の中に羊膜粉末を含めることで、圧縮強度が低下することが示唆される。圧縮強度は、組織圧縮生体力学の非弾性成分を表し、圧縮強度の増加は、再生された皮膚が変形して弾性的に反発する能力の減少を意味する。それゆえ、このデータは、治癒過程のこの時点で、粉末処置群は剛性がより低く、弾力性がより高いことを示唆している。さらに、羊膜粉末を有するまたは有しないヒドロゲルの全ての組み合わせが、未処置群よりも高いヤング率をもたらす。これは、これらの処置が実際に再生皮膚の弾力性を増加させることを示唆しうる。しかしながら、損傷後28日の時点で測定を行ったこれらの組織は、再生過程が早すぎて十分であるとはできない可能性が高い。研究がもっと長時間行われると、機械的特性の差異によって統計的有意性が生じうる可能性がある。
【０２１１】
結論として、羊膜粉末、羊膜粉末+ヒドロゲル(積層)およびヒドロゲル中の羊膜粉末(混合)は、全層損傷に等しく投与しやすく、かつ、主に新たな上皮化によって推進された最も速い創傷閉鎖速度をもたらしたが、健常な皮膚と同様の組成を有する成熟した表皮および真皮の形成をもたらす。これらの所見は、本明細書において記述される他のインビボ研究と一致しており、臨床上の創傷治癒適用に向けてこの製品を送達するための複数の選択肢を提供する。
【０２１２】
値および範囲が本明細書において提供されている場合は常に、これらの値および範囲によって包含される全ての値および範囲が、本発明の範囲内に包含されるよう意図されることが理解されるべきである。さらに、これらの範囲内に入る全ての値、ならびに値の範囲の上限または下限も本出願によって企図される。
【０２１３】
当業者は、単なるルーチンの実験を用いて、本明細書において記述される具体的な手法、態様、特許請求の範囲、および実施例に対する多数の同等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような同等物は、本発明の範囲内であると見なされ、本明細書に添付される特許請求の範囲により網羅される。例えば、溶媒、触媒、圧力、大気条件、例えば、窒素雰囲気および還元/酸化剤のような、反応時間、反応規模/体積、および実験試薬を含むがこれらに限定されない反応条件を、当技術分野において認識される代替物によって、および単なるルーチンの実験を用いて改変することは、本出願の範囲内であることが理解されるべきである。
【０２１４】
本明細書において引用されたありとあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。具体的態様を参照して本発明を開示してきたが、当業者によって本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形が考案されうることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および等価な変形の全てを含むと解釈されるよう意図される。
【図１】
2017530153.tif 000005
【図２Ａ】
2017530153.tif 000006
【図２Ｂ】
2017530153.tif 000007
【図２Ｃ】
2017530153.tif 000008
【図２Ｄ】
2017530153.tif 000009
【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【国際調査報告】
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