(57)【要約】  本発明は、ヘパロサン(HEP)ポリマーにコンジュゲートされたFVIII、それを製造するための方法及びかかるコンジュゲートの使用に関する。得られたコンジュゲートは、出血障害、たとえば血友病の治療又は予防において使用できる。
2017507135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第VIII因子ポリペプチド、結合部分、及びヘパロサンポリマーを含むコンジュゲートであって、前記第VIII因子ポリペプチドと前記ヘパロサンポリマーとの間の前記結合部分が、以下
[ヘパロサンポリマー]-[X]-[第VIII因子]
のとおりXを含み、
式中、Xは、以下の式1
【化１】
2017507135.tif 000046
の部分に接続されたシアル酸誘導体を含む、コンジュゲート。
【請求項２】
前記シアル酸誘導体が、以下の式2
【化２】
2017507135.tif 000047
のシアル酸誘導体であり、
式中、R1は、-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPrから選択され、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は独立に、-H、-NH2、-SH、-N3、-OH、-Fから選択される、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記シアル酸誘導体が、以下の式3
【化３】
2017507135.tif 000048
のグリシルシアル酸であり、
前記式1の部分が、式3の末端-NH基に接続される、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
[ヘパロサンポリマー]-[X]-
が、以下の式4
【化４】
2017507135.tif 000049
(式中、nは、5〜450の整数である)に示す構造断片を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
FVIIIが、BドメイントランケートFVIII分子であり、トランケートされたBドメインの配列が、配列番号2、配列番号3、及び配列番号4からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記ヘパロサンポリマーの分子量が5〜150kDaである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記ヘパロサンポリマーの分子量が35〜45kDaである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記ヘパロサンポリマーの分子量が40kDa±10%である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記ヘパロサンポリマーが、前記BドメインのO結合グリカンを介してFVIIIにコンジュゲートされ、FVIII活性化が、前記ヘパロサンポリマーの除去をもたらす、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ヘパロサンポリマーが、配列番号1のSer750残基に相当するセリンアミノ酸残基に結合されたO結合グリカンを介してFVIIIに結合されており、FVIIIとヘパロサンとの間の結合が、以下の構造
【化５】
2017507135.tif 000050
を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項１２】
aPTTベースアッセイにおけるアッセイ間変動を減少させるための、請求項1〜10のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１３】
医薬としての使用のための、請求項1〜10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
血友病の治療における使用のための、請求項1〜10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
ヘパロサンポリマーをFVIIIポリペプチドとコンジュゲートする方法であって、
(i)反応性アミンを含むヘパロサンポリマー[HEP-NH]を、活性化4-ホルミル安息香酸と反応させ、以下の式6
【化６】
2017507135.tif 000051
の化合物を得る工程であって、前記反応性アミンが、前記ヘパロサンポリマーに直接結合されていてもよく、又は、前記反応性アミンを前記ヘパロサンポリマーと接続する結合部分を介して結合されていてもよい、工程、
(ii)還元条件下で前記式6の化合物をCMP-活性化シアル酸誘導体と反応させる工程、
(iii)工程(ii)において得られる化合物を前記第VIII因子ポリペプチド上のグリカンにコンジュゲートする工程
を含む、方法。
【請求項１６】
請求項15に記載の方法を使用して得られるコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固第VIII因子とヘパロサンポリマーとのコンジュゲート及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在のところ、血友病Aに罹患している患者を治療するために、FVIIIのIV投与によるタンパク質補充療法が使用される。現在の推奨治療法は、従来のオンデマンド治療から予防へと移りつつある。内因性FVIIIの循環半減期は12〜14時間であり、したがって、患者が事実上無症状の生活を得るためには、予防的治療が週に複数回実施されなければならない。多くの患者、特に子供にとって、IV投与は、顕著な不便さ及び/又は苦痛を、特にカテーテルとの関連での感染症の危険性とともに伴う。したがって、当技術分野において、FVIII IV投与の頻度を減少させるため、有意に延長された循環半減期を有するFVIII化合物が必要とされる。
【０００３】
循環半減期を延長するためのポリマー性の側鎖(たとえばPEG)とのFVIIIのコンジュゲーションが、当技術分野において公知である。たとえば親水性ポリマーの形態の半減期延長部分とペプチド又はポリペプチドとのコンジュゲーションは、酵素法の使用により実行できる。これらの方法は選択的である可能性があることから、タンパク質配列における特異的ペプチドコンセンサスモチーフの存在、又は翻訳後部分、たとえばグリカンの存在を必要とする。血液凝固因子上のN-及びO-グリカンを修飾するための選択的酵素法が記述されてきた。たとえば、化学修飾シアル酸基質(Malmstrom、J. Anal Bioanal Chem. 2012; 403:1167〜1177頁)が記述されており、これらは、シアリルトランスフェラーゼST3GalIIIを使用してN-グリカン上の第VIIa因子(Stennicke, HR.ら  Thromb Haemost. 2008年11月; 100(5):920〜8頁)、及びST3GalIを使用して第VIII因子上のO-グリカン(Stennicke, HR.ら、Blood. 2013年3月14日;121(11):2108〜16頁)を糖PEG化するために使用できる。
【０００４】
選択的酵素法に共通の特徴は、修飾シアル酸基質、グリシルシアル酸シチジン一リン酸(glycyl sialic acid cytidine monophosphate)(GSC)、及び半減期延長部分でのGSCの化学的アシル化の使用である。
【０００５】
たとえば、ニトロフェニル-又はN-ヒドロキシ-スクシンイミドエステルとして活性化されたPEGポリマーを、GSCのグリシルアミノ基上にアシル化し、糖タンパク質のN-及びO-グリカンに酵素的に転移できるPEG置換シアル酸基質を創出できる(WO2006127896、WO2007022512、US2006040856を参照のこと)。同様の仕方で、N-ヒドロキシ-スクシンイミド活性化エステル化学を使用して、脂肪酸をGSCのグリシルアミノ基上にアシル化できる(WO2011101277)。
【０００６】
半減期延長部分、たとえば炭水化物ポリマー(たとえばヘパロサン)をFVIII等の糖タンパク質と結合するための通常の方法は、オキシム、ヒドラゾン又はヒドラジド結合形成を含む。WO2006094810は、ヒドロキシエチルデンプンポリマーを糖タンパク質、たとえばエリスロポエチンに結合するための方法を記載し、これは、活性化エステル化学を使用することに付随する問題を回避する。これらの方法において、ヒドロキシエチルデンプン及びエリスロポエチンは、炭水化物部分の上の過ヨウ素酸イオンで個別に酸化され、反応性カルボニル基が、ビス-ヒドロキシルアミン結合剤を使用して結合される。この方法は、オキシム結合を介してエリスロポエチンに結合されたヒドロキシエチルデンプンを創出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2006127896
【特許文献２】WO2007022512
【特許文献３】US2006040856
【特許文献４】WO2011101277
【特許文献５】WO2006094810
【特許文献６】WO11101267
【特許文献７】WO07056191
【特許文献８】US20100036001
【特許文献９】WO03031464
【特許文献１０】WO2005014035
【特許文献１１】WO08025856
【特許文献１２】国際出願WO92/16640、1992年10月1日公開
【特許文献１３】US8088604
【特許文献１４】US2010036001
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Malmstrom、J. Anal Bioanal Chem. 2012; 403:1167〜1177頁
【非特許文献２】Stennicke, HR.ら  Thromb Haemost. 2008年11月; 100(5):920〜8頁
【非特許文献３】Stennicke, HR.ら、Blood. 2013年3月14日;121(11):2108〜16頁
【非特許文献４】Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482頁
【非特許文献５】Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版  2013 309頁
【非特許文献６】Eur. J. Biochem 168、594〜602頁(1987)
【非特許文献７】JC. Gildersleeve、Bioconjug Chem. 2008年7月; 19(7): 1485〜1490頁
【非特許文献８】Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、Easton、PA (1990)
【非特許文献９】Nadanoら(1986) J. Biol. Chem. 261: 11550〜11557頁
【非特許文献１０】Kanamoriら、J. Biol. Chem. 265: 21811〜21819頁(1990)
【非特許文献１１】Thimら、Haemophilia (2010)、16、349〜359頁
【非特許文献１２】Bitter T、Muir HM. Anal Biochem 1962年10月;4:330〜4頁
【非特許文献１３】DeAngelis及びWhite、2002 J Biol Chem
【非特許文献１４】Sismey-Ragatzら、2007 J Biol Chem
【非特許文献１５】Nano Letters (2007) 7(8)、2207〜2210頁
【非特許文献１６】Fujiwara, K.ら(1988) J Immunol Meth 112、77〜83頁
【非特許文献１７】Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482頁
【非特許文献１８】Christiansen MLSら  Haemophilia 2010; 16: 878〜887頁
【非特許文献１９】Poulsen, F及びJensen KB、J Biomol Screen 2007;12(2):240〜7頁
【非特許文献２０】Nichols TCら  ILAR J 2009; 50(2): 144〜67頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
類似したオキシムベース結合方法が、炭水化物ポリマーをGSCに結合するために考えられる(たとえばWO11101267を参照のこと)が、かかるオキシム結合は、シン及びアンチ異性体型の両方で存在することが知られているので、ポリマーとタンパク質との間の結合は、シン及びアンチ異性体の両方の組合せを含有すると考えられる。かかる異性体混合物は、長期反復投与のために使用されるFVIII等のタンパク質様薬剤において、通常は望ましくない。なぜなら、リンカー不均質性により、抗体生成の危険性が生じうるからである。
【００１０】
上述の方法は、更なる欠点を有する可能性がある。糖タンパク質の活性化に必要な酸化過程において、炭水化物残基の一部が化学的に切断されることから、炭水化物は最終コンジュゲートにおいてインタクトな形態で存在しないと考えられる。更に酸化過程は、生成物の不均質性をもたらす。なぜなら、酸化剤、すなわちほとんどの場合過ヨウ素酸イオンは、いずれのグリカン残基を酸化するかに関して非特異的だからである。最終薬物コンジュゲートにおける生成物の不均質性及び非インタクトなグリカン残基の存在の両方が、免疫原性の危険性をもたらしうる。
【００１１】
炭水化物ポリマーをFVIII等の糖タンパク質に結合することに代わる選択肢には、マレイミド化学の使用が含まれる(WO2006094810)。たとえば、炭水化物ポリマーは、標的タンパク質上のスルフヒドリル基と選択的に反応できるマレイミド基を伴って製造できる。このとき、この結合は環式スクシンイミド基を含有すると考えられる。
【００１２】
しかしながら、本発明者らは、以前に公開された方法が、高度に官能化された半減期延長部分、たとえば炭水化物ポリマーを、GSCと結合するのに適さないことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書に記載されるのは、新規ヘパロサン-第VIII因子(HEP-FVIII)コンジュゲート、コンジュゲートを製造するための方法、コンジュゲートを含む医薬組成物及びコンジュゲートの使用である。新規FVIII-ヘパロサンポリマー(HEP)分子/コンジュゲートの記載されている調製及び特性は、様々なリンカー部分を考慮する。これらのコンジュゲートは、たとえば、コンジュゲーションプロセスの相対的単純性に関して、いくつかの利点を提供する。有利なことに、記載されているコンジュゲート及び方法は、側鎖及び/又はリンカーの物理的及び/又は化学的安定性を改善した。他の利点は、均質な生成物に関する。他の利点は、アッセイ、たとえば活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)アッセイにおける有利なアッセイ可能性に関し、本発明のコンジュゲートで相対的に信頼性が高く再現性のある結果が得られる。他の利点は、記載の方法により調製されるコンジュゲートを含む液状/水性溶液の粘度に関する。
【００１４】
本明細書に記載の様々な実施形態は、コンジュゲートされたFVIII化合物をコンジュゲーション方法とともに提供し、安定的で異性体を含まないコンジュゲートが得られるようにFVIIIは結合される。本明細書に記載の方法により得られるか、又は得ることが可能なFVIIIコンジュゲートもまた、それらの使用とともに提供される。
【００１５】
本明細書に記載のコンジュゲートは、第VIII因子(FVIII)のインビボ半減期を延長させる、ヘパロサン(HEP)の形態の生分解性半減期延長部分により保護される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のHEP-FVIIIポリペプチドコンジュゲートは、非コンジュゲートFVIIIポリペプチドと比較して増加した循環半減期、又は非コンジュゲートFVIIIポリペプチドと比較して増加した機能的半減期を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、記載のHEP-FVIIIコンジュゲートは、非コンジュゲートFVIIIポリペプチドと比較して増加した平均滞在時間、又は非コンジュゲートFVIIIポリペプチドと比較して増加した機能的平均滞在時間を有する。
【００１７】
更にいくつかの実施形態において、コンジュゲートは、aPTTアッセイにおいて、類似のPEG化FVIIIバリアントと比較して、改善した性能を示す。
【００１８】
一実施形態において、ポリマーは、およそ5からおよそ150kDaの間、たとえばおよそ35及び45kDaの平均サイズを有していてもよい。
【００１９】
また、本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートは、改善した特性(たとえば安定性)を有するリンカーを使用して製造できる。一実施形態において、HEP-FVIIIコンジュゲートが提供され、HEP部分は、安定的で異性体を持たないコンジュゲートが得られるようにFVIIIに連結される。一実施形態において、HEPポリマーは、シアル酸誘導体、たとえばグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)に結合された4-メチルベンゾイル部分を含む化学リンカーを使用してFVIIIに連結される。
【００２０】
本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートは、凝固障害の治療、特に血友病Aの予防的治療において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ベンズアルデヒド基でのグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の官能化の図である。GSCを4-ホルミル安息香酸でアシル化し、続いて還元的アミノ化反応によりヘパロサン(HEP-)アミンと反応させる。
【図２】ベンズアルデヒド基でのヘパロサン(HEP)ポリマーの官能化及びそれに続く還元的アミノ化反応におけるグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)との反応の図である。
【図３】チオ基でのグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の官能化及びそれに続くマレイミド官能化ヘパロサン(HEP)ポリマーとの反応の図である。
【図４】ヘパロサン(HEP)-グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の図である。
【図５】第VIII因子(配列番号1)のアミノ酸残基Ser750に結合された本明細書に記載のFVIII-HEPリンカーの図である。
【図６】シアリルトランスフェラーゼの存在下でのアシアロFVIII糖タンパク質とHEP-GSCとの反応の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
配列の簡単な説明
配列番号1:野生型ヒト第VIII因子のアミノ酸配列。
配列番号2:FVIII軽鎖(FVIII-LC)及びFVIII重鎖(FVIII-HC)と結合する21個のアミノ酸残基の配列(L)。
配列番号3:FVIII軽鎖(FVIII-LC)及びFVIII重鎖(FVIII-HC)と結合する20個のアミノ酸残基の配列(L)。
配列番号4:FVIII軽鎖(FVIII-LC)及びFVIII重鎖(FVIII-HC)と結合する20個のアミノ酸残基の配列(L)。
【００２３】
本明細書に記載されるのは、新規ヘパロサン-第VIII因子ポリペプチド(HEP-FVIII)コンジュゲート及びそれらの調製である。これらのコンジュゲートは、当技術分野において公知の他のコンジュゲートより優れた生物学的特性を提供する。
【００２４】
FVIIIのインビボでの循環半減期を増加させることは、血友病患者におけるFVIII投与の頻度を減少させるために望ましい。半減期延長部分とFVIIIとの間の化学結合の質が、複数の理由から重要である。製造の観点から、結合のタイプは、コンジュゲートにおける異性体形成に影響する可能性があることから、生成物の品質や規制を考慮する観点から重要である。保存の観点から、結合の質は、コンジュゲートの安定性に影響しうるのであり、したがって、保存有効期間の観点から重要である。薬物動態学的観点から、FVIIIコンジュゲートが、所望の機能性、たとえば長期の半減期を保持するためにインビボで安定的であることもまた重要である。
【００２５】
したがって、当技術分野において、半減期延長部分をFVIIIとコンジュゲートする方法が必要とされており、安定的で異性体を含まないFVIIIコンジュゲートが得られる。FVIIIのグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)ベースコンジュゲーションにおける使用のための安定的で異性体を含まないリンカーが本明細書に記載される。
【００２６】
本明細書において使用されるGSC出発物質は、化学的に合成できる(Dufner, G. Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482頁)か、又はそれは、WO07056191に記載の化学酵素的経路により得られうる。
【００２７】
GSC構造を下に示す。
【００２８】
【化１】
2017507135.tif 000003
【００２９】
本明細書のFVIIIコンジュゲートは、以下の構造:
【００３０】
【化２】
2017507135.tif 000004
【００３１】
を含むリンカー部分を含み、これは、本明細書において以降、サブリンカー又はサブ連結/サブリンカーとも呼ばれ、HEP-アミンとGSCとを以下の方法のうちの1つで接続する。
【００３２】
【化３】
2017507135.tif 000005
【００３３】
したがって、強調されている4-メチルベンゾイルサブリンカーは、半減期延長部分をFVIIIと結合する完全な結合構造の一部を構成する。強調されている4-メチルベンゾイルサブリンカーは、代替物、たとえばスクシンイミドベースリンカー(スルフヒドリル基とのマレイミド反応から調製される)と比較して安定的な構造である。なぜなら、後者のタイプの環式結合は、コンジュゲートが長期間水性溶液中に保存されるときに加水分解による開環を受ける傾向を有する(Bioconjugation Techniques、G.T. Hermanson、Academic Press、第3版  2013 309頁)。この場合の開環スクシンイミド結合(たとえばHEPとFVIII上のシアル酸との間のもの)がインタクトなままでありうるとしても、開環反応は、最終FVIIIコンジュゲート組成物に、位置異性体及び立体異性体の形態の不均質性を付加することとなる。
【００３４】
したがって、本明細書に記載の方法により調製されるFVIIIコンジュゲートに伴う利点の一つは、均質な生成物が得られることであり、リンカー構造及び安定性による異性体形成の傾向が顕著に減少することである。別の利点は、FVIIIコンジュゲートを、単純なプロセス、好ましくは一段階プロセスで製造できることである。本明細書に記載の、半減期延長部分とGSCとの間の4-メチルベンゾイルサブ結合は、立体-又は位置-異性体を形成可能ではない。異性体形成が望ましくないのは、不均質な生成物の形成と、そのことによるヒトにおける望まれない免疫応答の危険性の増加ゆえである。異性体形成が望ましくないのは、異性体の存在が不均質な生成物をもたらし、ヒトにおける望まれない免疫応答の危険性を増加させうるからである。
【００３５】
ヘパロサン
ヘパロサン(HEP)は、(-GlcUA-1,4-GlcNAc-1,4-)リピートを含む天然糖(多糖)ポリマーである。それは、グリコサミノグリカン多糖ファミリーに属し、生理的pHで負に荷電したポリマーである。HEPは特定の細菌の莢膜に見出すことができるが、それはまた高等脊椎動物にも見出され、天然ポリマーであるヘパリン及びヘパラン硫酸の前駆体として役立つ。ヘパロサンは、リソソーム酵素、たとえばN-アセチル-a-D-グルコサミニダーゼ(NAGLU)及びβ-グルクロニダーゼ(GUSB)により分解できる。
【００３６】
HEPポリマーは、パスツレラ・ムルトシダ(Pasturella multocida)に由来するヘパランシンテターゼI(PmHS1)を使用した同期的酵素重合反応(synchronised enzymatic polymerisation reaction)により調製できる(US20100036001)。この酵素は、大腸菌(E.coli)においてマルトース結合タンパク質(MBP)融合コンストラクトとして発現させうる。精製MBP-PmHS1酵素は、糖ヌクレオチドの等モル混合物(たとえば、GlcNAc-UDP及びGlcUA-UDP)に添加されたとき、同期的な、化学量論的に制御された反応において、単分散ポリマーを生成可能である。三糖開始剤(たとえば、GlcUA-GlcNAc-GlcUA)を、反応を開始するために使用され、ポリマー長は、プライマー:糖ヌクレオチド比により決定される。重合反応は、典型的には、約90%の糖ヌクレオチドが消費されるまで実施される。ポリマーは、陰イオン交換クロマトグラフィーにより反応混合物から単離され、続いて安定的な粉末へと凍結乾燥される。官能性HEPポリマーの調製方法はUS20100036001に記載されている。たとえば、US20100036001は、アルデヒド、アミン及びマレイミド官能化HEP試薬を挙げている。一定の範囲の他の官能修飾されたHEP誘導体が、類似の化学を使用して利用可能である。ここで使用されるHEPポリマーがまず、US20100036001に記載の方法に従って、還元末端における一級アミンのハンドルにより製造される。
【００３７】
アミン官能化HEPポリマーは、US20100036001に従い調製し、4-ホルミル安息香酸NHSエステルとの反応によりヘパロサンベンズアルデヒドポリマーへと変換できる。ヘパロサンベンズアルデヒドポリマーは、後工程において、還元的アミノ化反応によりGSCのグリシルアミノ基とカップリングされる。得られたHEP-GSC生成物を、続いて、たとえばシアリルトランスフェラーゼを使用してFVIIIと酵素的にコンジュゲートできる。HEP上のアミンのハンドル(反応性アミン基)を、下のスキームにより、N-ヒドロキシスクシンイミジル4-ホルミル安息香酸を使用して、ベンズアルデヒドハンドル(反応性アルデヒド基)へと変換できる。
【００３８】
【化４】
2017507135.tif 000006
【００３９】
上のスキームにおけるHEPアミン(1)の4-ホルミルベンズアミド化合物(2)への変換は、4-ホルミル安息香酸のアシル活性型との反応により実施できる。アシル活性化基としてN-ヒドロキシスクシンイミジルを選択できるが、数多くの他のアシル活性化基が当業者に知られている。非限定的な例には、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール-、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール-、ペンタフルオロフェニル-エステルが、ペプチド化学から知られているものとして含まれる。ベンズアルデヒド修飾HEP試薬は、乾燥形態で冷凍(-80℃)保存されたとき、長期間安定に保つことができる。
【００４０】
本発明における使用のためヘパロサンポリマーは、典型的には、式(-GlcUA-ベータ1,4-GlcNAc-アルファ1,4-)nのポリマーである。ヘパロサンポリマーのサイズは、この式におけるリピートの数「n」により定義できる。前記「n」回リピートの数は、たとえば、2から約5,000であってもよい。「n」回リピートの数は、たとえば、50から2,000単位、100から1,000単位又は200から700単位であってもよい。「n」回リピートの数は、200から250単位、500から550単位又は350から400単位であってもよい。好ましくは、「n」は、約100から約125、たとえば90〜120、95〜115、又は94〜116の範囲である。これらの範囲の下限のいずれかが、ヘパロサンポリマーにおける単位の数の好適な範囲を形成するため、これらの範囲の任意の上限と組み合わされてもよい。
【００４１】
ヘパロサンポリマーのサイズは、その分子量により定義できる。分子量は、ヘパロサンポリマー分子の集団の平均分子量、たとえば質量平均分子量であってもよい。ヘパロサンポリマーは、たとえば、500Daから1,000kDaの分子量を有していてもよい。ポリマーの分子量は、500Daから650kDa、5kDaから750kDa、10kDaから500kDa、15kDaから550kDa、25kDaから250kDa又は50kDaから175kDaであってもよい。
【００４２】
分子量は、第VIII因子ポリペプチドの活性とコンジュゲートの半減期との間の好適なバランスを達成するため、これらの範囲内の特定のレベルで選択できる。たとえばポリマーの分子量は、5〜15kDa、15〜25kDa、25〜35kDa、35〜45kDa、45〜55kDa、55〜65kDa、65〜75kDa、75〜85kDa、85〜95kDa、95〜105kDa、105〜115kDa、115〜125kDa、125〜135kDa、135〜145kDa、145〜155kDa、155〜165kDa又は165〜175kDaから選択される範囲であってもよい。より具体的な分子量の範囲を選択できる。たとえば、分子量は、500Daから20kDa、たとえば1kDaから15kDa、たとえば5kDaから15kDa、たとえば8kDaから17kDa、たとえば10kDaから14kDa、たとえば約12kDaであってもよい。分子量は、20kDaから35kDa、たとえば22kDaから32kDa、たとえば25kDaから30kDa、たとえば約27kDaであってもよい。分子量は、35から65kDa、たとえば40kDaから60kDa、たとえば47kDaから57kDa、たとえば50kDaから55kDa、たとえば約52kDaであってもよい。分子量は、50から75kDa、たとえば60から70kDa、たとえば63から67kDa、たとえば約65kDaであってもよい。分子量は、75から125kDa、たとえば90から120kDa、たとえば95から115kDa、たとえば100から112kDa、たとえば106から110kDa、たとえば約108kDaであってもよい。分子量は、125から175kDa、たとえば140から165kDa、たとえば150から165kDa、たとえば155から160kDa、たとえば約157kDa、たとえば20から157kDaであってもよい。分子量は、5から100kDa、たとえば10から60kDa、たとえば20から50kDaであってもよい。
【００４３】
これらの分子量の範囲の下限のいずれかをこれらの範囲のいずれかの上限と組み合わることにより、本発明によるヘパロサンポリマーの分子量の好適な範囲を形成することができる。
【００４４】
HEPポリマーのサイズに関して本明細書に記載の分子量値は、実際には挙げられた正確なサイズでなくてもよい。HEPポリマー製造中の個々のバッチ間の変動ゆえに、ある程度のHEPポリマーサイズの変動が予想されるはずである。したがって、バッチごとの変動を包含するため、標的HEPポリマーサイズ近辺で約+/-10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%の変動が予想されるべきことが理解されるべきである。たとえば、40kDaのHEPポリマーサイズは、40kDa+/-10%を示し、40kDaはたとえば実際には、個々のポリマーサイズが約36〜44kDaの範囲であることを意味するのであり、両端が40kDaの±10%である36から44kDaの範囲に収まる。
【００４５】
本明細書におけるFVIIIポリペプチドコンジュゲートに関連して、HEPは、インビボ循環半減期を延長する非常に柔軟な方法を提示する。なぜなら、HEPポリマーサイズの広範な範囲が、顕著に改善した半減期をもたらすと考えられるからである。
【００４６】
ヘパロサンポリマーは、狭いサイズ分布(たとえば単分散)又は広いサイズ分布(たとえば多分散)を有していてもよい。多分散性のレベルは、式Mw/Mnに基づいて数値的に表現されてもよく、式中、Mw=質量平均分子量であり、Mn=数平均分子量である。理想的な単分散ポリマーのこの式を使用した多分散性値は、1である。好ましくは、本発明における使用のためのヘパロサンポリマーは、単分散である。したがって、ポリマーは、約1の多分散性を有していてもよく、多分散性は、1.25未満、好ましくは1.20未満、好ましくは1.15未満、好ましくは1.10未満、好ましくは1.09未満、好ましくは1.08未満、好ましくは1.07未満、好ましくは1.06未満、より好ましくは1.05未満であってもよい。ヘパロサンの分子量サイズ分布は、アガロースゲル上を泳動できる単分散サイズ標準(HA Lo-Ladder(商標)、Hyalose LLC社)との比較により測定できる。
【００４７】
或いは、ヘパロサンポリマーのサイズ分布は、高性能サイズ排除クロマトグラフィー-多角度レーザー光散乱(SEC-MALLS)により決定できる。かかる方法を、ヘパロサンポリマーの分子量及び多分散性を評価するために使用できる。ポリマーサイズは、酵素製造法において調節できる。UDP糖に対するヘパロサンアクセプター鎖のモル比を制御することにより、所望の最終的なヘパロサンポリマーサイズを選択することが可能である。
【００４８】
FVIII-HEPコンジュゲートを調製するための方法
炭水化物ポリマー、たとえばHEPを、マレイミド基を介してチオ修飾GSC分子と結合し、シアリルトランスフェラーゼにより試薬を糖タンパク質、たとえばFVIII上のインタクトなグリコシル基へと移し、そのことにより環式スクシンイミド基を含有する結合を創出することが可能であることが、本発明者らにより示される。しかしながら、すでに論じたとおり、スクシンイミドベース結合は、保存中に(望ましくない)加水分解性開環を受けうる。
【００４９】
上述のことから、1)糖タンパク質のグリカン残基がインタクトな形態で貯蔵され、2)インタクトなグリコシル残基と半減期延長部分との間のリンカー部分に不均質性が存在しないように、半減期延長部分をFVIIIに結合することが好ましい。
【００５０】
したがって、当技術分野において、2つの化合物を、たとえば半減期延長部分(たとえばHEP)とFVIIIとをコンジュゲートする方法が必要とされており、化合物は、安定的で異性体を含まないコンジュゲートが得られるように結合される。
【００５１】
一実施形態において、安定的で異性体を含まないリンカーが、HEPとFVIIIとのシアル酸ベースコンジュゲーションにおける使用のために提供され、HEPポリマーを、誘導体化のために適切な位置でシアル酸に結合できる。適切な部位は、当業者に知られているか、又はWO03031464(ここにその全体が参照により組み込まれる)から推論でき、たとえば、PEGポリマーは、シアル酸シチジン一リン酸に複数の方法で結合される。
【００５２】
一実施形態において、2つの化合物のグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)ベースコンジュゲーション、たとえばFVIIIにコンジュゲートされる半減期延長部分、たとえばFVIIIにコンジュゲートされるHEPにおける使用のための、安定的で異性体を含まないリンカーが提供される。
【００５３】
本発明において使用されるGSC出発物質は、化学的に合成してもよいし(Dufner, G. Eur. J. Org Chem 2000、1467〜1482頁)、又はより好ましくは、WO07056191に記載の化学酵素的経路により得てもよい。GSC構造及びシアル酸部分の炭素原子ナンバリングを下に示す(化学式1)。
【００５４】
【化５】
2017507135.tif 000007
【００５５】
いくつかの実施形態において、シアル酸ピラノース環の位置C4及びC5が、側鎖の位置C7、C8及びC9とともに、誘導体化の点として役立ちうる。誘導体化は、好ましくは、シアル酸の存在するヘテロ原子、たとえばヒドロキシル又はグリシルアミノ(NH2-CH2-C(O)NH-)部分のアミン基を伴うが、シアル酸上の適切な結合点を与える官能基変換もまた可能性の1つである。
【００５６】
一実施形態において、シアル酸N-アセチルノイラミン酸の9-ヒドロキシ基を、当技術分野において公知の方法によりアミノ基に変換できる[Eur. J. Biochem 168、594〜602頁(1987)]。下に示す得られた9-デオキシ-アミノN-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸(化学式5)は、GSCの代替物として役立ちうる活性化シアル酸誘導体である。
【００５７】
【化６】
2017507135.tif 000008
【００５８】
別の実施形態において、非アミン含有シアル酸、たとえばKDNとしても公知の2-ケト-3-デオキシノノン酸もまた、同じスキームに従い、9-アミノ誘導体化シアル酸に変換できる(化学式6)。
【００５９】
【化７】
2017507135.tif 000009
【００６０】
類似のスキームを、シアル酸ファミリーに属するより短いC8-糖アナログのために使用できる。したがって、より短いバージョンのシアル酸、たとえばKDOとしても公知の2-ケト-3-デオキシオクトネートを、8-デオキシ-8-アミノ-2-ケト-3-デオキシオクトネートシチジン一リン酸に変換でき、GSCの代替物として使用できる。
【００６１】
また別の一実施形態として、ノイラミン酸シチジン一リン酸(化学式7)を、本発明において使用できる。この物質は、たとえば、Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482頁に記載のものとして調製できる。
【００６２】
【化８】
2017507135.tif 000010
【００６３】
一実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、以下の構造を含むリンカーを含む。
【００６４】
【化９】
2017507135.tif 000011
【００６５】
-  これは、本明細書において以下で、サブリンカー又はサブ結合とも呼ばれ、HEP-アミンとGSCとを以下の方法のうちの1つで接続する。
【００６６】
【化１０】
2017507135.tif 000012
【００６７】
したがって、強調されている4-メチルベンゾイルサブリンカーは、半減期延長部分を標的タンパク質と結合する完全な結合構造の一部を構成する。サブリンカーは、代替物、たとえばスクシンイミドベースリンカーと比較して安定的な構造である。なぜなら、すでに論じたとおり、後者のタイプの環式結合は、保存中に加水分解性開環を受ける傾向を有するからである。本明細書に記載のコンジュゲートに伴う利点の一つは、均質な組成物が得られること、すなわち、リンカー構造及び安定性による異性体形成の傾向が顕著に減少することである。別の利点は、記載の方法により調製されるコンジュゲートを、単純なプロセス、好ましくは一段階プロセスで製造できることである。
【００６８】
本発明において使用されるHEPとGSCとの間の4-メチルベンゾイルサブ結合は、立体-又は位置-異性体を形成可能ではない。官能性HEPポリマーの調製方法はUS20100036001に記載されており、これはたとえば、アルデヒド、アミン及びマレイミド官能化HEP試薬を開示している。一定の範囲の他の官能修飾されたHEP誘導体が、類似の化学を使用して利用可能である。ここで使用されるHEPポリマーがまず、US20100036001に記載の方法に従って、還元末端における一級アミンのハンドルにより製造される。
【００６９】
ベンズアルデヒド官能基で修飾されたHEP試薬は、乾燥形態で冷凍(-80℃)保存されたとき、長期間安定に保つことができる。
【００７０】
或いは、ベンズアルデヒド部分を、GSC化合物に結合し、そのことにより、アミン官能化半減期延長部分とのコンジュゲーションに好適なGSC-ベンズアルデヒド化合物を得ることができる。この合成経路を図1に示す。
【００７１】
たとえば、GSCを、pH中性条件下で4-ホルミル安息香酸N-スクシンイミジルと反応させ、反応性アルデヒド基を含有するGSC化合物を提供することができる(たとえばWO11101267参照のこと)。次に、アルデヒド誘導体化GSC化合物(GSC-ベンズアルデヒド)を、HEP-アミン及び還元剤と反応させ、HEP-GSC試薬を形成することができる。
【００７２】
上述の反応は、HEP-アミンをまず4-ホルミル安息香酸N-スクシンイミジルと反応させ、アルデヒド誘導体化HEPポリマーを形成し、これを続いて還元剤の存在下でGSCと直接反応させるというように、逆にすることができる。実際には、これはGSC-CHOの冗長なクロマトグラフィーの取扱いを排除する。この合成経路を図2に示す。
【００７３】
したがって、本発明の一実施形態において、HEP-ベンズアルデヒドは、還元的アミノ化によりGSCとカップリングされる。
【００７４】
還元的アミノ化は、以下のとおり進行する二段階反応である。最初に、アルデヒド成分とアミン成分(本実施形態においてはGSCのグリシルアミノ基)との間にイミン(シッフ塩基としても公知である)を形成する。次に、第2の工程でイミンをアミンへと還元する。還元剤は、形成されたイミンをアミン誘導体に選択的に還元するように選択される。
【００７５】
数多くの好適な還元試薬を当業者は利用可能である。非限定的な例には、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)、ピリジンボラン錯体(BH3:Py)、ジメチルスルフィドボラン錯体(Me2S:BH3)及びピコリンボラン錯体が含まれる。
【００７６】
炭水化物の還元末端(たとえばHEPポリマーの還元末端)への還元的アミノ化は可能であるとはいえ、それは一般に緩徐で非効率的な反応として記述されてきた[JC. Gildersleeve、Bioconjug Chem. 2008年7月; 19(7): 1485〜1490頁]。副反応、たとえば初期に形成されたイミンがケトアミンへと転位するアマドリ反応もまた可能であり、前に論じたとおり本文脈では望ましくない不均質性をもたらすと考えられる。
【００７７】
芳香族アルデヒド、たとえばベンズアルデヒド誘導体は、かかる転位反応を形成可能ではない。なぜなら、イミンはエノール化できず、炭水化物由来のイミンで典型的に見出される必要な隣接ヒドロキシ基も欠くからである。したがって、芳香族アルデヒド、たとえばベンズアルデヒド誘導体は、異性体を持たないHEP-GSC試薬を生成するための還元的アミノ化反応において特に有用である。
【００７８】
還元的アミノ化化学を早期に完了させるために、過量のGSC及び還元試薬が任意選択で使用される。反応が完了するとき、過剰な(反応しなかった)GSC試薬及び他の小分子成分、たとえば過剰な還元試薬は、続いて、たとえば透析、タンジェント流濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーにより除去される。
【００７９】
シアリルトランスフェラーゼの天然基質であるSia-CMP及びGSC誘導体の両方が、多官能性で、荷電し高度に親水性の化合物であり、これらは、標準的なクロマトグラフィー方法を使用して修飾及び単離することが困難でありうる。加えてそれらは、とりわけpHが6.0未満である場合、溶液中で長期間安定的ではない。かかる低pHでは、基質転移に必要なCMP活性化基が、酸触媒リン酸ジエステル加水分解により失われる。したがって、Sia-CMP誘導体の選択的修飾及び単離は、CMP-加水分解を回避するために、慎重なpH制御を、迅速で効率的な単離方法とともに必要とする。
【００８０】
大きな半減期延長部分が、還元的アミノ化化学を使用してGSCにコンジュゲートされうる。アリールアルデヒド、たとえばベンズアルデヒド修飾HEPポリマーが、このタイプの修飾にとって最適であると見出された。なぜならそれらは、還元的アミノ化条件下でGSCと効率的に反応できるからである。
【００８１】
GSCは酸媒体において加水分解を受けうるので、HEP-ベンズアルデヒドのカップリング中にほぼ中性又は若干塩基性の環境を維持することが重要である。HEPポリマー及びGSCはどちらも高度に水溶性であることから、水性緩衝系は、pHをほぼ中性のレベルに維持することが好ましい。数多くの有機及び無機両方の緩衝液を使用できる。しかしながら、緩衝液成分は、好ましくは、還元的アミノ化条件下で反応性であるべきではない。このことは、たとえば、一級及びより低い程度で二級アミノ基を含有する有機緩衝系を排除する。当業者は、どの緩衝液が好適で、どれが好適でないかを知ると考えられる。好適な緩衝液のいくつかの例を、下のTable 1(表1)に示す。
【００８２】
【表１】
2017507135.tif 000013
【００８３】
この方法を適用することにより、半減期延長部分(HEP等)で修飾されたGSC試薬は、異性体を含まない安定的な結合を有し、効率的に調製され、CMP活性化基の加水分解の可能性を最小化する単純なプロセスにおいて単離されうる。
【００８４】
前記化合物のいずれかを互いに反応させることにより4-メチルベンゾイルサブリンカー部分を含むHEP-GSCコンジュゲートを創出できる。
【００８５】
GSCはまた、チオブチロラクトンと反応させ、そのことによりチオール修飾GSC分子(GSC-SH)を創出してもよい。かかる試薬を、マレイミド官能化HEPポリマーと反応させ、HEP-GSC試薬を形成してもよい。この合成経路を図3に示す。得られた生成物は、スクシンイミドを含む結合構造(化学式8)を有する。
【００８６】
【化１１】
2017507135.tif 000014
【００８７】
しかしながら、スクシンイミドベース(サブ)結合は、とりわけ修飾GSC試薬が長期間水性溶液中に保存されるときに加水分解による開環を受けうるのであり、結合がインタクトなままでありうる一方で、開環反応は、位置異性体及び立体異性体の形態の望ましくない不均質性を付加すると考えられる。
【００８８】
糖コンジュゲーション(glycoconjugation)の方法
HEP-GSCコンジュゲートとFVIIIとのコンジュゲーションは、FVIII上に存在するグリカンを介して実施できる。この形態のコンジュゲーションはまた、糖コンジュゲーションと呼ばれる。
【００８９】
システインアルキル化、リジンアシル化に基づくコンジュゲーション方法及びタンパク質骨格におけるアミノ酸を伴う類似のコンジュゲーションとは対照的に、グリカンを介したコンジュゲーションは、タンパク質/ペプチド断片のポリマー等のより大きな構造を、生物活性による妨害を少なくして生物活性タンパク質に結合する有望な方法である。これはなぜなら、グリカンが高度に親水性であり、一般に、タンパク質表面とは逆方向に溶液中へと向く傾向にあり、タンパク質活性に重要な結合表面を自由にするからである。
【００９０】
グリカンは、天然であってもよく、又はそれは、たとえば当技術分野において周知の方法を使用したN結合グリカンの挿入を介して挿入されてもよい。
【００９１】
HEPポリマーの糖コンジュゲーションのための方法には、ガラクトースオキシダーゼベースコンジュゲーション(WO2005014035)及び過ヨウ素酸ベースコンジュゲーション(WO08025856)が含まれる。シアリルトランスフェラーゼに基づく方法は、長年にわたり、血液凝固因子上のN-グリカン又はO-グリカンを修飾するための穏やかで高度に選択的な方法とされてきた。
【００９２】
システインアルキル化、リジンアシル化に基づくコンジュゲーション方法及びタンパク質骨格におけるアミノ酸を伴う類似の化学的コンジュゲーションとは対照的に、グリカンを介したコンジュゲーションは、タンパク質/ペプチド断片のポリマー等のより大きな構造を、生物活性による阻害を比較的少なくして生物活性タンパク質に結合する有望な方法である。これはなぜなら、グリカンが高度に親水性であり、一般に、タンパク質表面とは逆方向に溶液中へと向く傾向にあり、タンパク質活性に重要な結合部位を自由にするからである。グリカンは、天然であってもよく、又はそれは、たとえば当技術分野において周知の遺伝子操作方法を使用したN結合グリカンの挿入を介して挿入されてもよい。
【００９３】
GSCは、シアリルトランスフェラーゼの使用によりFVIII等の糖タンパク質に転移させることができるシアル酸誘導体である。それは、置換基、たとえばグリシルアミノ基上のPEG又はHEPで選択的に修飾されうるのであり、それでもシアリルトランスフェラーゼを使用して糖タンパク質に酵素的に転移させることができる。GSCは、大規模な酵素過程により効率的に調製できる(WO07056191)。
【００９４】
糖タンパク質上の末端シアル酸は、シアリダーゼ処理により除去され、アシアロ糖タンパク質を提供しうる。アシアロ糖タンパク質及び半減期延長部分で修飾されたGSCはともに、シアリルトランスフェラーゼのための基質として作用しうる。反応の生成物は、グリカン上のインタクトなグリコシル結合基を介して結合された半減期延長部分を有する糖タンパク質コンジュゲートである。
【００９５】
シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、自然に活性化されたシアル酸(Sia)-CMP(シチジン一リン酸)化合物からシアル酸を、たとえばタンパク質上のガラクトシル部分へと転移させるグリコシルトランスフェラーゼの一種である。多くのシアリルトランスフェラーゼ(ST3Gal-III、ST3Gal-I、ST6GalNAc-I)が、C5アセトアミド基上において修飾されたSia-CMP誘導体の転移を可能にする(WO03031464)。本発明で使用できる関連シアリルトランスフェラーゼの非限定的なリストが、WO2006094810に開示される。
【００９６】
FVIII上の末端シアル酸は、シアリダーゼ処理により除去され、アシアロFVIII糖タンパク質を提供しうる。アシアロFVIII及び半減期延長部分で修飾されたGSCは、シアリルトランスフェラーゼのための基質として作用しうる。反応の生成物は、インタクトなグリコシル連結基、この場合にはインタクトなシアル酸リンカー基を介して半減期延長部分が結合したFVIIIコンジュゲートである。アシアロFVIII糖タンパク質をシアリルトランスフェラーゼの存在下でHEP-GSCと反応させる反応スキームを、図6に示す。
【００９７】
実施例において、シアリルトランスフェラーゼST3Gal-Iが、コンジュゲートを生成するために使用され、HEPがFVIII上のO-グリカンに結合される。シアリルトランスフェラーゼST3Gal-IIIが選択された場合、N-グリカンに結合されたHEPを有するコンジュゲートが作製されたものと考えられる。
【００９８】
HEP-FVIIIコンジュゲートの特性
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートは、様々な有利な特性を有する。たとえば、コンジュゲートは、好適なFVIII対照分子と比較した以下の(非限定的)利点のうちの1つ又は複数を示しうる。
-  改善されたインビボ循環半減期
-  改善されたインビボでの平均滞在時間
-  改善されたインビボでの生分解性
-  FVIIIノックアウトマウスにおける尾静脈離断(TVT)モデルにおける改善された出血時間及び失血
-  様々なaPTTベースアッセイにおける改善されたアッセイ間変動
【００９９】
コンジュゲートは、本明細書に記載のFVIIIの任意の生物学的活性における改善を示してもよく、これは、本明細書に記載の任意のアッセイ又は方法、たとえばFVIIIの活性に関して下に記載の方法を使用して(たとえば実施例に記載されるように)測定されてもよい。
【０１００】
本発明のコンジュゲートが好適な対照FVIII分子と比較されるときに、利点が見出されうる。対照分子は、たとえば、非コンジュゲートFVIIIポリペプチドであっても、コンジュゲートFVIIIポリペプチドであってもよい。コンジュゲート対照は、水溶性ポリマーにコンジュゲートされたFVIIIポリペプチドであっても、タンパク質に化学的に結合されたFVIIIポリペプチドであってもよい。コンジュゲートFVIII対照は、目的のコンジュゲートにおけるHEP分子と同等のサイズの化学的部分(タンパク質又は水溶性ポリマーである)にコンジュゲートされたFVIIIポリペプチドであってもよい。水溶性ポリマーは、たとえば、PEG、分枝状PEG、又はヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、たとえばヒドロキシエチルデンプン(HES)でありうる。
【０１０１】
対照FVIII分子におけるFVIIIポリペプチドは、好ましくは、目的のコンジュゲートに存在するのと同じFVIIIポリペプチドである。たとえば、対照FVIII分子は、目的のコンジュゲートにおけるFVIIIポリペプチドと同じアミノ酸配列を有していてもよい。対照FVIIIは、目的のコンジュゲートにおけるFVIIIポリペプチドと同じグリコシル化パターンを有していてもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、好適な対照と比較して、循環半減期、又は平均滞在時間に改善がある。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートは、野生型FVIII分子と比較して改変された循環半減期、好ましくは増加した循環半減期を有する。循環半減期は、好ましくは、少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、好ましくは少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、好ましくは少なくとも35%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも45%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、好ましくは少なくとも100%、より好ましくは少なくとも125%、より好ましくは少なくとも150%、より好ましくは少なくとも175%、より好ましくは少なくとも200%、最も好ましくは少なくとも250%又は300%増加する。より一層好ましくは、かかる分子は、少なくとも400%、500%、600%、又は700%まで増加した循環半減期を有する。
【０１０４】
比較される活性がFVIIIの生物学的活性、たとえば、凝固活性又は発色アッセイにおける活性である場合、対照は、本発明のHEPコンジュゲートと同等のサイズの水溶性ポリマーにコンジュゲートされた好適なFIXポリペプチドでありうる。
【０１０５】
コンジュゲートは、HEPの付加により修飾されていないFVIIIに見出される生物学的活性のレベルを保持していなくてもよい。好ましくは、コンジュゲートは、可能な限り非コンジュゲートFVIIIの生物学的活性を保持する。たとえば、コンジュゲートは、非コンジュゲートFVIII対照の生物学的活性の少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%を保持していてもよい。上で論じたとおり、対照は、コンジュゲートにおけるFVIIIポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するが、HEPを欠くFVIII分子であってもよい。しかしながら、コンジュゲートは、好適な対照と比較して、生物学的活性の改善を示してもよい。ここでの生物学的活性は、本明細書に記載のFVIIIの任意の生物学的活性、たとえば凝固活性又は発色アッセイにおける活性であってもよい。
【０１０６】
本明細書に記載の好適な対照と比較して改善した生物学的活性は、生物学的活性における任意の測定可能又は統計的に有意な増加であってもよい。生物学的活性は、本明細書に記載のFVIIIの任意の生物学的活性、たとえば凝固活性、発色アッセイにおける活性、出血時間及び失血の減少であってもよい。増加は、たとえば、好適な対照における同じ活性と比較して、関係する生物学的活性における少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%以上の増加であってもよい。
【０１０７】
本明細書に記載のコンジュゲートの利点は、HEPポリマーが酵素的に生分解可能な点である。したがって、コンジュゲートは、好ましくは、インビボで酵素的に生分解可能である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、FVIIIに結合されたHEPポリマーを含むコンジュゲートは、異なるaPTTベース凝固アッセイを使用する際に、有意なアッセイ間変動を減少させるか、又は引き起こさない。
【０１０９】
組成物
記載されるのはまた、本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートを含む組成物である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体とともに配合される1つ又は複数のコンジュゲートを含む。
【０１１０】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性である、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。好ましい薬学的に許容される担体には、水性担体又は希釈剤が含まれる。
【０１１１】
医薬組成物は、予防的及び/又は治療的処置のための非経口投与が主に意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口、すなわち、静脈内、皮下、若しくは筋肉内投与されるか、又はそれは、持続又は拍動性注入により投与されてもよい。非経口投与のための組成物は、記載されるHEP-FVIII FVIIIコンジュゲートを、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体と組み合わせて、好ましくはその中に溶解させて含む。組成物は、生理条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、たとえばpH調整剤及び緩衝剤、等張性調整剤等、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含有していてもよい。
【０１１２】
これらの配合物中のHEP-FVIIIコンジュゲートの濃度は、広範に、すなわち、約0.5質量%未満、通常は約1質量%又は少なくとも約1質量%から、15又は20質量%まで変化する場合があり、選択された特定の投与方法に従って、主に流体体積、粘度等により選択されると考えられる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知か又は彼らにとって明らかであり、たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、Easton、PA (1990)により詳細に記載されている。
【０１１３】
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の秩序立った構造として製剤できる。
【０１１４】
組成物は、投与の簡便さ及び用量の均一性のため、用量単位形態で配合されてもよい。本明細書において使用される用量単位形態は、治療される対象のための単回用量に合わせて物理的に区分された単位を指し、各単位は、所望の治療効果をもたらすよう算出された所定の量のコンジュゲートを含有する。請求項に記載され開示された本発明の用量単位形態の詳細は、(a)HEPコンジュゲートの固有特性及び達成されるべき特定の治療効果、並びに(b)対象における選択された病態の治療のためのかかる治療化合物を配合する技術分野に固有の制限により定められ、それらに直接左右される。
【０１１５】
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載のコンジュゲートに加えて、追加の活性成分を含んでいてもよい。たとえば、医薬組成物は、追加の治療剤又は予防剤を含んでいてもよい。たとえば、医薬組成物が、出血障害の治療における使用のために意図されている場合、それは、出血障害の症状を減少させることが意図された1つ又は複数の試剤を追加で含んでいてもよい。たとえば、組成物は、1つ又は複数の追加の凝固因子を含んでいてもよい。組成物は、患者の病態を改善することが意図された1つ又は複数の他の成分を含んでいてもよい。組成物を、特定の方法における使用又は特定の経路による投与のために配合できる。
【０１１６】
コンジュゲートの使用
本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートは、それを必要とする個体に、FVIIIポリペプチドをその個体に送達するために投与されてもよい。個体は、FVIIIポリペプチドを必要とする任意の個体であってよい。
【０１１７】
本明細書に記載されるHEP-FVIIIコンジュゲートは、たとえば、凝固因子欠損(たとえば血友病A)又は凝固因子阻害因子により引き起こされうる出血障害を制御するために使用でき、又はそれらは、正常に機能する血液凝固カスケードを有する対象(凝固因子欠損又は任意の凝固因子に対する阻害因子がない)において生じる過度の出血を制御するために使用できる。
【０１１８】
記載されるHEP-FVIIIコンジュゲートを含有する組成物を、予防的及び/又は治療的処置のために投与できる。治療的応用において、組成物は、疾患、たとえば上述の任意の出血障害にすでに罹患している対象に、疾患及びその合併症を治癒、緩和又は部分的抑止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。当業者には理解されると考えられるとおり、この目的のために有効な量は、疾患又は傷害の重症度並びに対象の体重及び一般的状態に依存すると考えられる。しかしながら、一般に有効送達量は、70kgの対象にとって1日当たり約0.05mgから約500mgまでの範囲のHEP-FVIIIコンジュゲートであると考えられ、1日当たり約1.0mgから約100mgの用量のコンジュゲートが送達され、より一般的には使用される。
【０１１９】
PEG化は長年、長時間作用性の薬物を生成するための好ましい半減期延長技術のうちの1つであり続けており、現在では複数のPEG-タンパク質コンジュゲートが市場に出ている。PEGポリマーは、それが結合されるタンパク質薬の活性を低下させる傾向を有している。これは、典型的には、溶液中でそれぞれの薬物結合パートナーに対するより低い薬物受容体親和性又はより低い結合親和性をもたらす。ほとんどの場合、タンパク質薬に結合された活性の低下は、PEGサイズ又はPEG基の数のいずれかと相関し、大きなPEG基の結合は、典型的には、小さなPEG基の結合よりもかなり高い活性消失をもたらす。
【０１２０】
PEGサイズ及びPEG数の活性調節効果に加えて、PEGは、止血において使用される標準アッセイに強力に干渉することが近年示された。たとえば、一段階凝固アッセイにおいて測定される糖PEG化FVIIIの比活性は、使用されるaPTT試薬に応じて変化する(Stennicke、Blood 2013;121(11):2108〜16頁)。
【０１２１】
aPTT一段階FVIII凝固アッセイの使用は、治療開始中の用量投与方式の個体最適化及びFVIII予防のルーチンモニタリングのために使用される標準的手順である。一般に、aPTTアッセイは中央検査室で行われ、aPTT試薬の添加及び再石灰化により、患者から得られた血液の凝固が開始され、その後、凝固分析装置上で線維素凝塊形成の時間が測定される。このアッセイには、多くの市販のフォーマットが存在する。
【０１２２】
PEGのアッセイ干渉特性は、前臨床開発において顕著な影響を有する場合があり、多成分一段階凝固アッセイにおける患者の血液凝固因子の正確な測定が必要な臨床的応用において特にそうである。
【０１２３】
一実施形態において、本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートは、類似のPEG化FVIIIコンジュゲートと比較して、aPTTアッセイにおいて改善した性能を示す。一実施形態において、本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートは、類似のpeg化FVIIIコンジュゲート(PEG-FVIII)をアッセイしたときのアッセイ間変動と比較して、aPTTベースアッセイにおけるアッセイ間変動を減少させる。
【０１２４】
定義
特に定義しない限り、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、概して技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１２５】
本明細書において使用される「対象」という用語は、任意のヒト患者、又は非ヒト脊椎動物を含む。
【０１２６】
本明細書において使用される「治療」という用語は、それを必要とする任意のヒト又は他の脊椎動物対象の医学療法を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が前記ヒト又は他の脊椎動物における疾患の治療に有益であることを示すと考えられる暫定的又は最終的診断を下す医療従事者、又は獣医医療従事者により、理学的検査を受けていることが期待される。前記治療のタイミング及び目的は、対象の健康に従い、個体によって変化してもよい。したがって、前記治療は、予防的、緩和的、対症的及び/又は治癒的であってもよい。
【０１２７】
投与方法:化合物(コンジュゲート)及び本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートを含む医薬組成物は、非経口的に、たとえば静脈内又は血管外(たとえば皮内、筋肉内、皮下等)に投与できる。化合物及び本明細書に記載のHEP-FVIIIコンジュゲートを含む医薬組成物は、予防的に且つ/又は治療的に且つ/又はオンデマンドで投与できる。
【０１２８】
併用治療/共投与:2種以上の活性化合物の併用投与を、数多くの異なる方式で達成できる。一実施形態において、2つの活性化合物を、単一の組成物において一緒に投与できる。別の一実施形態において、2つの活性化合物を、別々の組成物において併用療法の一部として投与できる。
【０１２９】
「凝固障害」という用語は、正常な凝固カスケードの任意の凝固促進性成分の任意の定性的又は定量的欠損、又は線維素溶解の任意の上方制御により引き起こされうる出血傾向の増加を指す。かかる凝固障害は、先天性及び/又は後天性及び/又は医原性でありうるのであり、当業者により同定される。
【０１３０】
先天性凝固低下障害(congenital hypocoagulopathies)の非限定的な例には、血友病Aが含まれる。血友病Aの臨床的重症度は、血中のFVIIIの機能単位の濃度により決定され、軽症、中等症、又は重症に分類される。重症血友病は、正常レベルの<1%に相当する<0.01U/mlの凝固因子レベルにより定義され、一方で、中等症及び軽症患者はそれぞれ、1〜5%及び>5%のレベルを有する。「阻害因子」(すなわち、第VIII因子に対する同種抗体)を伴う血友病Aは、部分的に先天性であり、部分的に後天性である凝固障害の非限定的な一例である。
【０１３１】
本明細書においてペプチド薬を患者に投与する文脈で使用される「半減期」という用語は、患者における薬物の血漿中濃度が2分の1に減少するのに必要な時間として定義される。
【０１３２】
「半減期延長部分」(又は「側鎖」)という用語は、数多くの治療用タンパク質/ペプチドのインビボ循環半減期を、これらのタンパク質/ペプチドにコンジュゲートされたときに増加させることができる、1つ又は複数の化学基を指すものと、本明細書において理解される。半減期延長部分の例には、生体適合性脂肪酸及びそれらの誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、たとえばヒドロキシエチルデンプン(HES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ヘパロサン並びにそれらの任意の組合せが含まれる。
【０１３３】
「シアル酸」という用語は、9-炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、N-アセチルノイラミン酸(2-ケト-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノース-1-オン酸)(多くの場合、Neu5Ac、NeuAc、NeuNAc、又はNANAと短縮される)である。ファミリーの第2のメンバーは、N-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5Gc又はNeuGc)であり、NeuNAcのN-アセチル基がヒドロキシル化されている。第3のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソニン酸(KDN)である[Nadanoら(1986) J. Biol. Chem. 261: 11550〜11557頁; Kanamoriら、J. Biol. Chem. 265: 21811〜21819頁(1990)]。また含まれるのが、9-置換シアル酸、たとえば9-O-C1〜C6アシル-Neu5Ac、たとえば9-O-ラクチルNeu5Ac又は9-O-アセチル-Neu5Acである。シアル化手順におけるシアル酸化合物の合成及び使用は、国際出願WO92/16640、1992年10月1日公開に開示されている。
【０１３４】
「シアル酸誘導体」という用語は、1つ又は複数の化学的部分で修飾された上に定義したシアル酸を指す。修飾基は、たとえばアルキル基、たとえばメチル基、アジド-及びフルオロ基、又は他の化学的部分を結合するためのハンドルとして機能することができる官能基、たとえばアミノ又はチオール基であってもよい。例には、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Ac及び9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acが含まれる。この用語はまた、1つ若しくは複数の官能基、たとえばカルボキシル基又は1つ若しくは複数のヒドロキシル基を欠くシアル酸を包含する。カルボキシル基がカルボキサミド基又はエステル基と置き換えられる誘導体もまた、この用語により包含される。この用語はまた、1つ又は複数のヒドロキシル基がカルボニル基に酸化されたシアル酸を指す。更にこの用語は、たとえば過ヨウ素酸イオンでの酸化処理後に、C9炭素原子又はC9〜C8炭素鎖の両方を欠くシアル酸を指す。
【０１３５】
グリシルシアル酸は、NeuNAcのN-アセチル基が、アミノアセチル基としても公知のグリシル基と置き換えられた、上の定義によるシアル酸誘導体である。グリシルシアル酸は、以下の構造で表されてもよい(シアル酸部分の炭素原子ナンバリングを上の化学式1に示す)。
【０１３６】
【化１２】
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【０１３７】
「CMP-活性化」シアル酸又はシアル酸誘導体という用語は、シアル酸部分及びシチジン一リン酸(CMP)を含有する糖ヌクレオチドを指す。
【０１３８】
本記述において、「グリシルシアル酸シチジン一リン酸」という用語は、GSCを記述するために使用され、同じCMP活性化グリシルシアル酸の代替名と同義語である。代替名には、CMP-5'-グリシルシアル酸、シチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルノイラミン酸、シチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルシアル酸が含まれる。
【０１３９】
「インタクトなグリコシル連結基」という用語は、グリコシル部分に由来する連結基を指し、そこでは、ポリペプチドとHEP部分との間に挿入され、それらと共有結合された糖モノマーは、コンジュゲート形成中に、たとえばメタ過ヨウ素酸ナトリウムにより分解、たとえば酸化しない。「インタクトなグリコシル連結基」は、グリコシル単位の付加又は親糖構造からの1つ又は複数のグリコシル単位の除去により、天然オリゴ糖に由来しうる。
【０１４０】
「アシアロ糖タンパク質」という用語は、ガラクトース又はN-アセチルガラクトサミンの基底「層」から少なくとも1つのガラクトース又はN-アセチルガラクトサミン残基を露出させる(「露出ガラクトース残基」)、たとえばシアリダーゼでの処理又は化学的処理により、1つ又は複数の末端シアル酸残基が除去された糖タンパク質を含むことが意図される。
【０１４１】
「グリカン」という用語は、単一のアミノ酸残基に共有結合されたオリゴ糖構造全体を指す。グリカンは、通常はN結合又はO結合であり、たとえばグリカンは、アスパラギン残基(N結合グリコシル化)又はセリン若しくはトレオニン残基(O結合グリコシル化)に結合される。N結合オリゴ糖鎖は、多分岐、たとえば二、三、又は四分岐でありうるのであり、最も多くの場合、Man3-GlcNAc-GlcNAc-のコア構造を含有する。N-グリカン及びO-グリカンの両方が、タンパク質を生成する細胞によりタンパク質に結合される。細胞性N-グリコシル化機構は、新生タンパク質がリボソームから小胞体に移行するときに、アミノ酸鎖におけるコンセンサスモチーフ(N-X-S/Tモチーフ)を認識し、N-グリコシル化する(Kielyら、1976; Glabeら、1980)。いくつかの糖タンパク質は、ヒトにおいてインサイチューで生成されるとき、末端又は「キャッピング」シアル酸残基を有する、すなわち、各分岐の末端糖がa2->3又はa2->6結合を介してガラクトースに結合されたN-アセチルノイラミン酸であるグリカン構造を有する。他の糖タンパク質は、他の糖残基で末端をキャッピングされたグリカンを有する。しかしながら、他の状況において生成されたとき、糖タンパク質は、それらの分岐のうちの1つ又は複数に異なる末端構造を有する、たとえばガラクトースの代わりにN-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)残基を含有するか、又は末端N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基を含有するオリゴ糖鎖を含有しうる。
【０１４２】
構造式における点線は、開いた原子価結合(すなわち、構造を他の化学的部分と接続する結合)を意味する。
【０１４３】
第VIII因子
本明細書におけるFVIIIコンジュゲート/化合物/分子/ポリペプチドは、wt/内因性FVIIIと機能的に類似、又は同等の方式で凝固カスケードにおいて機能可能であり、活性化させられた血小板上のFIXaとの相互作用を介してFXaの形成を誘導し、血栓の形成を補助する。本明細書において使用される「第VIII因子ポリペプチド」又は「FVIIIポリペプチド」という用語は、限定することなしに、野生型ヒトFVIII及びFVIIIを、野生型ヒトFVIIIに対して実質的に同じ又は改善した生物学的活性を示すポリペプチドとともに包含する。これらのポリペプチドには、特に指示のない限り、化学修飾されたFVIII又はFVIIIa、及び、ポリペプチドの生物活性を改変する特定のアミノ酸配列変更が導入されたFVIII又はFVIIIaアナログが含まれるが、これに限定されない。FVIII活性は、当技術分野において周知の技術を使用して、インビトロで評価できる。凝固アッセイ、FX活性化アッセイ(発色アッセイと呼ばれることが多い)、トロンビン生成アッセイ及び全血トロンボエラストグラフィーアッセイが、かかるインビトロ技術の例である。本明細書に記載のヘパロサンにコンジュゲートできるFVIII分子は、これらのアッセイのうちの1つ又は複数で測定したときに、天然ヒトFVIIIのFVIII活性の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、100%又は100%超までのFVIII活性を有する。
【０１４４】
内因性完全長FVIIIは、単鎖前駆体分子として合成される。分泌前に、前駆体は、重鎖及び軽鎖へと切断される。組換えBドメイン欠失又はトランケートFVIIIを、2つの異なる方略により製造できる。Bドメインを有しない(又はBドメインがトランケートされた)重鎖及び軽鎖が、2つの異なるポリペプチド鎖として個別に合成される(2鎖方略)か、又は、Bドメイン欠失若しくはトランケートFVIIIが、完全長FVIII前駆体と同様にプロテアーゼにより重鎖及び軽鎖へと切断される単一前駆体ポリペプチド鎖として合成される(単鎖方略)かのいずれかである。
【０１４５】
単鎖方略により製造されたBドメイン欠失(又はトランケート)FVIII前駆体ポリペプチドにおいて、重鎖及び軽鎖部分は、多くの場合、リンカーにより分離される。凝固カスケードにおいて機能可能であるためには、このFVIIIリンカーは、Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドを重鎖及び軽鎖へと分離するプロテアーゼのための認識部位を含んでいなければならない。Bドメイン欠失/トランケートFVIIIに免疫原性エピトープを導入する危険性を最小化するため、リンカーの配列は、好ましくは、FVIIIBドメインに由来する。完全長FVIIIのBドメインにおいては、アミノ酸1644〜1648が、この認識部位を構成する。Bドメイン欠失FVIIIの活性化の際にリンカーの除去をもたらすトロンビン切断部位は、重鎖に位置する。したがって、Bドメインリンカーのサイズ及びアミノ酸配列が、トロンビン活性化による残りのFVIII分子からのその除去に影響する可能性は低い。Bドメインの欠失/トランケートは、FVIIIの製造にとって利点である。その一方で、Bドメインの一部は、生産性を減じることなくリンカーに含まれうる。Bドメインが生産性に与えるネガティブな影響は、Bドメインのいかなる特定のサイズ又は配列にも帰されなかった。
【０１４６】
本明細書において使用される「FVIII」という用語は、FVIII活性を有する任意のFVIII分子、たとえばwt FVIII、Bドメイン欠失/トランケートFVIII分子、wt FVIIIと比較して実質的に同じ又は改善された生物学的活性を示すFVIIIの変異体、及び親ペプチドのうちの1つ又は複数のアミノ酸が、たとえばタンパク質:タンパク質融合、アルキル化、PEG化、HES化、PAS化、PSA化、アシル化、エステル形成又はアミド形成により化学的に修飾されているFVIII関連ポリペプチドを指すことが意図されている。
【０１４７】
野生型ヒト凝固第VIII因子の配列を下に挙げる[配列番号1:wtヒトFVIII(Ser750残基を太字及び下線で示す)]。
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
【０１４８】
FVIIIは、血漿由来であっても、よく知られている製造及び精製方法を使用して組換えにより製造されてもよい。グリコシル化及び他の翻訳後修飾の度合い及び位置は、選択された宿主細胞及びその成長条件に応じて変化してもよい。
【０１４９】
組換えタンパク質を製造するための宿主細胞は、好ましくは、フォールディング及び翻訳後修飾、たとえばO及びNグリコシル化及び硫酸化(sulfatation)中に分子が適切に処理されることを保証するため、哺乳動物由来のものである。好適な宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、ベビーハムスター腎臓(BHK)、及びHEK293細胞株が含まれるが、これに限定されない。
【０１５０】
FVIIIにおけるBドメインは、配列番号1のアミノ酸残基741〜1648に及ぶ。Bドメインは、複数の異なる部位で切断され、循環血漿FVIII分子に大きな不均質性をもたらす。重度にグリコシル化されたBドメインの正確な機能は知られていない。知られているのは、Bドメインが凝固カスケードにおけるFVIII活性のためには不要なことである。したがって、組換えFVIIIは、多くの場合、Bドメイン欠失/トランケート変異体の形態で製造される。
【０１５１】
一実施形態において、HEPにコンジュゲートされたFVIIIは、BドメイントランケートFVIII分子である。一実施形態において、HEPにコンジュゲートされたFVIIIは、Cys残基を介してコンジュゲートされる。一実施形態において、HEPにコンジュゲートされたFVIIIは、FVIIIグリカンを介してコンジュゲートされる。この一実施形態において、グリカンはN-グリカンである。代替的一実施形態において、グリカンはO-グリカンである。一実施形態において、FVIIIは、配列番号1のSer750に相当するセリンアミノ酸残基上に存在するO-グリカンを介してHEPにコンジュゲートされる。
【０１５２】
本明細書におけるFVIII分子は、たとえば、配列番号2:SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR(O-グリカンは下線のSに結合される)の配列を有する21個のアミノ酸残基のL(リンカー)配列を含むFVIII分子をコードする発現ベクターにより製造できる。
【０１５３】
本明細書におけるFVIII分子における代わりに好ましいBドメインリンカー配列は、配列番号2に記載のアミノ酸残基のうちの1つ又は複数を欠いていてもよい。たとえば、配列番号2のC末端のRが欠失し、20個のアミノ酸のリンカー配列、SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQ(配列番号3)をもたらしてもよい。或いは、配列番号2のN末端のSが欠失し、以下のアミノ酸リンカー配列、FSQNSRHPSQNPPVLKRHQR(配列番号4)をもたらしてもよい。
【０１５４】
一実施形態において、HEPにコンジュゲートされたFVIIIは、BドメイントランケートFVIII分子であり、配列番号1のアミノ酸残基1〜740(FVIII重鎖)及び配列番号1のアミノ酸残基1649〜2332が、アミノ酸リンカー配列、Lにより結合されており、
HC(1〜740)-L-LC(1649〜2332)
式中、Lは、欠失/トランケートにより、配列番号1のアミノ酸残基741〜1648(FVIIIBドメイン)に由来する。
【０１５５】
一実施形態において、リンカー配列、Lは、配列番号2の配列を有する。別の一実施形態において、リンカー配列、Lは、配列番号3の配列を有する。また別の一実施形態において、リンカー配列、Lは、配列番号4の配列を有する。
【０１５６】
一実施形態において、HEPにコンジュゲートされたFVIII分子は、ツロクトコグアルファ(turocotoc alfa)(N8)[たとえば、Thimら、Haemophilia (2010)、16、349〜359頁に記載]である。
【０１５７】
本明細書において好ましいFVIIIコンジュゲートは、Ser 750 O-グリカンを介してヘパロサンポリマーにコンジュゲートされた、配列番号1のSer 750残基(太字及び下線で示す)に結合されたO-グリカンを含むBドメイン欠失/トランケート変異体である。(配列番号2、3、及び4の残基におけるSerも同様に、太字及び下線で示す。)。
【０１５８】
異なる実施形態において、HEPにコンジュゲートされたFVIIIは、BドメイントランケートFVIII分子であり、配列番号1のアミノ酸残基1〜740(FVIII重鎖)及び配列番号1のアミノ酸残基1649〜2332が、アミノ酸リンカー配列、Lにより以下のとおり結合されており、
HC(1〜740)-L-LC(1649〜2332)
式中、Lは、欠失/トランケートにより、配列番号1のアミノ酸残基741〜1648(FVIIIBドメイン)に由来し、HEPは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4のSer 750に結合されるグリカンを介してFVIII分子にコンジュゲートされる。
【０１５９】
上のものの好ましい実施形態において、HEPは、ヘパロサンポリマーの分子量が35〜45kDaである。
【０１６０】
更なる実施形態
1.ヘパロサンポリマー(HEP)、及び結合部分を含むFVIIIコンジュゲートであって、FVIIIとHEPとの間の結合部分が、以下
[ヘパロサンポリマー]-[X]-[FVIII]
のとおりXを含み、
式中、Xは、下の式1
【０１６１】
【化１３】
2017507135.tif 000016
【０１６２】
に記載の構造に接続されたシアル酸グリコシル基を含む、コンジュゲート。
【０１６３】
2.シアル酸グリコシル基が、下の式3
【０１６４】
【化１４】
2017507135.tif 000017
【０１６５】
に記載のグリシルシアル酸である、本発明によるコンジュゲート。
【０１６６】
3.{[ヘパロサンポリマー]-[X]}が、下の式4
【０１６７】
【化１５】
2017507135.tif 000018
【０１６８】
に示す構造を含み、
式中、nは、5から450の整数である、本発明によるコンジュゲート。
【０１６９】
4.FVIII分子が、BドメイントランケートFVIII分子であり、Bドメインの配列が、配列番号2、配列番号3、及び配列番号4からなる群から選択される、本発明によるコンジュゲート。
【０１７０】
5.ヘパロサンポリマーのサイズが35〜45kDaである、本発明によるコンジュゲート。この実施形態におけるヘパロサンポリマーの平均サイズは、約40kDaである。
【０１７１】
6.ヘパロサンポリマーが、BドメインのO結合グリカンを介してFVIIIにコンジュゲートされ、FVIII活性化が、前記ヘパロサンポリマーの除去をもたらす、本発明によるコンジュゲート。
【０１７２】
7.前記ヘパロサンポリマーが、配列番号1のSer750残基に相当するセリン残基に結合されたO結合グリカンを介してFVIIIに結合されており、FVIIIとヘパロサンとの間の結合が、以下の構造
【０１７３】
【化１６】
2017507135.tif 000019
【０１７４】
を含む、本発明によるコンジュゲート。
【０１７５】
8.本発明によるコンジュゲートを含む医薬組成物。医薬組成物は更に、1つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を任意選択で含む。配合物は、凍結乾燥されるか、又は液状水性溶液の形態であるかのいずれかでありうる。
【０１７６】
9.インビトロaPTTベースアッセイにおけるアッセイ間変動を減少させるための、本発明によるコンジュゲートの使用。
【０１７７】
10.薬剤としての使用のための、本発明によるコンジュゲート。
【０１７８】
11.血友病の治療における使用のための、本発明によるコンジュゲート。
【０１７９】
12.一実施形態において、目的の化合物とのコンジュゲーションに好適な、ベンズアルデヒド部分で官能化されたGSC化合物が提供される。
【０１８０】
13.一実施形態において、ベンズアルデヒド部分がGSC化合物に結合されており、そのことにより、アミン基で官能化された半減期延長部分とのコンジュゲーションに好適なGSC-ベンズアルデヒド化合物がもたらされる(図1を参照のこと)。
【０１８１】
14.一実施形態において、4-ホルミル安息香酸は、HEPを含む半減期延長部分と化学的にカップリングされ、続いて、還元的アミノ化によりGSCとカップリングされる。
【０１８２】
15.かかる一実施形態において、4-ホルミル安息香酸は、HEPとカップリングされる(図2を参照のこと)。
【０１８３】
16.好ましい一実施形態において、本発明は、GSCベースコンジュゲーションを提供し、4-メチルベンゾイル部分が、結合構造の一部である(図4を参照のこと)。
【０１８４】
17.一実施形態において、反応性アミンを含む第1の化合物は、ベンズアルデヒド部分で官能化されたGSC化合物にコンジュゲートされ、前記アミンを、ベンズアルデヒドと反応させ、4-メチルベンゾイルサブ結合部分を含む、第1の化合物とGSCとの間の(サブ)リンカーをもたらす。
【０１８５】
18.別の一実施形態において、反応性ベンズアルデヒドを含む第1の化合物は、GSC化合物のグリシルアミン部分にコンジュゲートされ、前記ベンズアルデヒドをアミンと反応させ、4-メチルベンゾイルサブ結合部分を含む、第1の化合物とGSCとの間の(サブ)リンカーをもたらす。
【０１８６】
19.一実施形態において、上述の第1の化合物とGSCとの間のコンジュゲートは、目的の第3の化合物に更にコンジュゲートされてコンジュゲートをもたらし、第1の化合物は、4-メチルベンゾイルサブ結合部分及びシアル酸誘導体を介して、目的の第3の化合物に結合される。
【０１８７】
20.本発明の一実施形態において、HEPポリマーは、4-メチルベンゾイル-GSCベースコンジュゲーションを使用して、タンパク質にコンジュゲートされる。
【０１８８】
21.一実施形態において、アミノ基を含む半減期延長部分を、4-ホルミル安息香酸と反応させ、続いて還元的アミノ化によりGSCのグリシルアミノ基とカップリングする。
【０１８９】
22.一実施形態において、WO07056191に従い調製されたGSCを、還元条件下でベンズアルデヒド部分を含む半減期延長部分と反応させる。
【０１９０】
23.一実施形態において、GSCとのカップリングに好適な様々なHEP-ベンズアルデヒド化合物が提供される。
【０１９１】
24.一実施形態において、半減期延長部分とGSCとの間のサブリンカーは、立体異性体又は位置異性体を形成可能でない。
【０１９２】
25.一実施形態において、半減期延長部分とGSCとの間のサブリンカーは、立体異性体又は位置異性体を形成可能でなく、したがって、ヒトにおいて免疫応答を生成する可能性が低い。
【０１９３】
26.一実施形態において、HEP-GSCは、N-グリカン及び/又はO-グリカンHEP FVIIIコンジュゲートを調製するために使用される。
【０１９４】
27.一実施形態において、本発明において使用されるCMP活性化シアル酸誘導体は、以下の構造により表される。
【０１９５】
【化１７】
2017507135.tif 000020
【０１９６】
式中、R1は、-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPrから選択され、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は独立に、-H、-NH2、-SH、-N3、-OH、-Fから選択できる。
【０１９７】
好ましい一実施形態において、R1は、-COOHであり、R2は、-Hであり、R3=R5=R6=R7=-OHであり、R4は、グリシルアミド基[-NHC(O)CH2NH2]である。
【０１９８】
好ましい一実施形態において、CMP活性化シアル酸は、以下の構造
【０１９９】
【化１８】
2017507135.tif 000021
【０２００】
を有するGSCである。
【０２０１】
28.一実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、FVIIIポリペプチド、結合部分、及びヘパロサンポリマーを含み、第VIII因子ポリペプチドとヘパロサンポリマーとの間の結合部分は、以下
[ヘパロサンポリマー]-[X]-[第VIII因子ポリペプチド]
のとおりXを含み、
式中、Xは、下の式1
【０２０２】
【化１９】
2017507135.tif 000022
【０２０３】
に記載の部分に接続されたシアル酸誘導体を含む。
【０２０４】
29.一実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、下の式3
【０２０５】
【化２０】
2017507135.tif 000023
【０２０６】
に記載のシアル酸誘導体グリシルシアル酸を含み、
式中、式1の部分は、式3の末端-NHハンドルに接続される。
【０２０７】
30.一実施形態において、本発明によるコンジュゲート、
[ヘパロサンポリマー]-[X]-
が、下の式4
【０２０８】
【化２１】
2017507135.tif 000024
【０２０９】
に示す構造断片を含み、
式中、nは、5から450の整数である。
【０２１０】
31.一実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、約5から100kDaの範囲の分子量を有するヘパロサンポリマーを含む。
【０２１１】
32.一実施形態において、本発明は、本発明によるコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
【０２１２】
33.一実施形態において、本発明は、aPTTベース凝固アッセイ[インビトロ又はエクスインビボ(ex in vivo)凝固アッセイ]におけるアッセイ間変動を減少させるための、第VIII因子ポリペプチドにコンジュゲートされるヘパロサンポリマーの使用に関する。
【０２１３】
34.一実施形態において、本発明は、薬剤としての本発明によるコンジュゲートの使用に関する。
【０２１４】
35.一実施形態において、本発明は、凝固障害、たとえば血友病Aの治療における使用のための、本発明によるコンジュゲートの使用に関する。
【０２１５】
36.一実施形態において、本発明は、ヘパロサン部分を第VIII因子ポリペプチドとコンジュゲートする方法であって、
(a)反応性アミンを有するヘパロサン部分を、活性化4-ホルミル安息香酸と反応させ、下の式6
【０２１６】
【化２２】
2017507135.tif 000025
【０２１７】
の化合物を得る工程、
(b)式6の化合物を還元条件下でGSC部分と反応させ、下の式7
【０２１８】
【化２３】
2017507135.tif 000026
【０２１９】
に記載の化合物を得る工程、
(C)式7に記載の化合物を第VIII因子ポリペプチドにコンジュゲートする工程
を含む、方法に関する。
【０２２０】
本発明は更に、この方法により得られる又は得ることが可能な化合物に関する。
【実施例】
【０２２１】
実施例において使用される略語:
CMP:シチジン一リン酸
GlcUA:グルクロン酸
GlcNAc:N-アセチルグルコサミン
GSC:グリシルシアル酸シチジン一リン酸
GSC-SH:[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸
HEP:ヘパロサン
HEP-GSC:GSC官能化ヘパロサンポリマー
HEP-FVIII FVIIIにコンジュゲートされたヘパロサンポリマー
HEP-[C]-FVIIIシステイン残基を介してFVIIIにコンジュゲートされたヘパロサンポリマー
HEP-[N]-FVIII N-グリカンを介してFVIIIにコンジュゲートされたヘパロサンポリマー
HEP-[O]-FVIII O-グリカンを介してFVIIIにコンジュゲートされたヘパロサンポリマー
N8-HEP:BドメインのO-グリカンを介してBドメイントランケートFVIIIにコンジュゲートされたヘパロサンポリマー
40k-HEP-[O]-N8 BドメインのO-グリカンを介してBドメイントランケートFVIIIにコンジュゲートされた、40kDaの分子量を有するヘパロサンポリマー
N8 BドメイントランケートFVIII(ツロクトコグアルファ)
Hepes:2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸
His:ヒスチジン
PmHS1:パスツレラ・ムルトシダヘパロサンシンターゼI
TCEP:トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
UDP:ウリジン二リン酸
【０２２２】
タンパク質定量方法
本発明のコンジュゲートを、純度についてHPLCにより解析した。HPLCはまた、FVIII標準分子に基づいて単離コンジュゲートの量を定量するためにも使用した。FeF Chemicals A/S社製のDaisoカラム(300Å、5mm、2.1×250mm)を使用した。カラムを40℃で操作した。10μgの試料を注入し、カラムを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水(A)-アセトニトリル(B)溶媒系で溶出した。勾配プログラムは以下のとおりだった:0分(28% B)、30分(67% B)、30.5分(28% B)、40分(28% B)。コンジュゲートタイプ(O-グリカン又はシステインコンジュゲーション)に応じて、FVIIIコンジュゲートの非修飾重鎖又は非修飾軽鎖を、FVIII重鎖/軽鎖標準物質と比較した定量のために使用した。N-グリカン修飾については、重鎖及び修飾重鎖について組み合わせた曲線下面積を、FVIII重鎖標準物質と比較した定量のために使用した。
【０２２３】
SDS-PAGE解析
すべてInvitrogen社から入手したプレキャストNupage7%トリス-アセテートゲル、NuPageトリス-アセテートSDSランニングバッファー及びNuPage LDSサンプルバッファーを使用して、SDS PAGE解析を実施した。解析前に試料を変性させた(70℃で10分間)。HiMark HMW(Invitrogen社)を標準として使用した。電力装置を備えるXCell Surelock Complete(Invitrogen社)において、80分間、150V、120mAで電気泳動した。Invitrogen社製SimplyBlue SafeStainを使用してゲルを染色した。
【０２２４】
カルバゾールアッセイ
ヘパロサンポリマーを、Bitter T、Muir HM. Anal Biochem 1962年10月;4:330〜4頁による方法に従い、カルバゾールアッセイにより定量した。
【０２２５】
例示的FVIIIa活性アッセイ:発色アッセイ
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を、Coatest SP試薬(Chromogenix社)を使用した発色FVIIIアッセイにおいて、以下のとおり評価する。rFVIII試料及びFVIII標準物質(たとえばNIBSCからの7th international FVIII standardに対して較正された精製野生型rFVIII)を、Coatestアッセイバッファー(50mMトリス、150mM NaCl、1% BSA、pH7.3、保存剤を伴う)中に希釈する。50μlの試料、標準物質及びバッファー陰性対照を、96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc社)に二連で添加する。Coatest SPキットからの第IXa因子/第X因子試薬、リン脂質試薬及びCaCl2を、5:1:3(体積:体積:体積)で混合し、75μlのこれをウェルに添加する。室温での15分のインキュベーション後に、50μlの第Xa因子基質S-2765/トロンビン阻害剤I-2581ミックスを添加し、試薬を10分間室温でインキュベートし、その後、25μlの1Mクエン酸、pH3を添加する。Spectramaxマイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices社)上で、620nmでの吸光度を参照波長として使用して、415nmでの吸光度を測定する。陰性対照の値をすべての試料から減算し、吸光度値の直線回帰により作成された較正曲線をFVIII濃度に対してプロットする。試料の活性をHPLCにより決定されるタンパク質濃度で除算することにより、比活性を算出する。試料の濃度は、軽鎖に対応するクロマトグラムのピーク下面積を積分し、濃度がアミノ酸解析により決定される野生型未修飾rFVIIIの平行分析における同じピークの面積と比較することにより決定される。
【０２２６】
例示的FVIIIa活性アッセイ:一段階凝固アッセイ
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を、一段階FVIII凝固アッセイにおいて、以下のとおり評価する:rFVIII試料及びFVIII標準物質(たとえばNIBSCからの7th international FVIII standardに対して較正された精製野生型rFVIII)を、HBS/BSAバッファー(20mM hepes、150mM NaCl、pH7.4、1% BSAを伴う)中でおよそ10U/mlまで希釈し、その後、VWFを含有するFVIII欠損血漿(Dade Behring社)中で10倍希釈する。続いて、試料をHBS/BSAバッファー中で希釈する。APTT凝固時間を、ACL300R又はACL5000機器(Instrumentation Laboratory社)を使用して、単一因子プログラムを使用して測定する。VWFを伴うFVIII欠損血漿(Dade Behring社)をアッセイ血漿として、SynthASil[HemosIL(商標)、Instrumentation Laboratory社]をaPTT試薬として使用する。凝固機器内で、希釈された試料又は標準物質を、FVIII欠損血漿及びaPTT試薬と37℃で混合する。塩化カルシウムを添加し、濁度を測定することにより、凝固形成までの時間を決定する。試料中のFVIII:Cを、FVIII標準物質の希釈物の凝固形成時間の標準曲線に基づいて算出する。
【０２２７】
(実施例1-HEP-マレイミド及びHEP-アルデヒドポリマーの調製)
定義されたサイズのマレイミド及びアルデヒド官能化HEPポリマーを、2つの糖ヌクレオチドであるUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAを使用して、酵素的(PmHS1)重合反応により調製した。プライミング三糖である(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2を、反応を開始するために使用し、糖ヌクレオチドビルディングブロックが枯渇するまで重合させた。次に、末端アミン(プライマーに由来)を、好適な反応基、この場合には、遊離システイン及びチオGSC誘導体とのコンジュゲーションのために設計されたマレイミド官能基、又は、GSCとの還元的アミノ化化学のために設計されたベンズアルデヒド官能基のいずれかで官能化した。HEPポリマーのサイズは、糖ヌクレオチド:プライマー化学量論における変動により、前もって決定できる。この技術は、US2010/0036001に詳細に記載されている。三糖プライマーを以下のとおり合成する。
【０２２８】
工程1:(2-Fmoc-アミノ)エチル2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルクロン酸メチルエステルの合成
【０２２９】
【化２４】
2017507135.tif 000027
【０２３０】
粉末分子篩(1.18g、4Å)を、磁気撹拌器を備える50ml丸底フラスコ中で110℃で一晩加熱し、アルゴンで洗い流し、室温に冷却させた。900mg(2.19mmol)のアセト-ブロモ-β-D-グルクロン酸メチルエステル及び748.5mg(2.64mmol、1.2当量)の2-(Fmoc-アミノ)エタノールをアルゴン下で添加し、続いて28mlのジクロロメタンを添加した。懸濁液を15分間、室温で撹拌し、次に、氷/NaClスラリー上で30分間冷却した。冷却プロセス中に白色の沈殿物が形成された。676.3mg(2.63mmol、1.2当量)のトリフルオロメタンスルホン酸銀(AgOTf)を3部で、約5分間にわたって添加した。20分後、氷浴を除去した。前述の白色の沈殿物が溶解し始める一方で、同時に灰色の沈殿物が形成され始めた。反応物を一晩、室温で撹拌し、次に、190μLのトリエチルアミン(2.63mmol、1.2当量)の添加により失活させた。薄いCelite 521パッド(厚さ約0.1〜0.2cm)で濾過し、続いて濾過ケーキを20mlのジクロロメタンで洗浄した後、組み合わされた濾物をジクロロメタンで150mlに希釈した。有機相を、5%NaHCO3(1×50mL)及び水(1×50mL)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。濾物を、ロータリーエバポレーター(≦40℃水浴)上で真空中で濃縮して乾燥させ、次に2mLのジクロロメタン中に再溶解させた。溶液を、VersaPakシリカゲルフラッシュカラム(23×110mm、23g)上に注入し、生成物をヘキサン中の50%酢酸エチルで溶出した。生成物含有画分を、TLC(酢酸エチル:ヘキサン、1:1)により同定し、ロータリーエバポレーター(≦40℃水浴)上で真空中で濃縮して乾燥させた。約10mLのジエチルエーテルでの得られた残留物の粉砕により、白色の結晶泡沫として標題物質がもたらされた。収量:293mg(0.49mmol、22.4%)。
【０２３１】
工程2:(2-Fmoc-アミノ)エチルβ-D-グルクロン酸ナトリウム塩の合成
【０２３２】
【化２５】
2017507135.tif 000028
【０２３３】
490mg(0.817mmol、1当量)の工程1で得られた(2-Fmoc-アミノ)エチル2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルクロン酸メチルエステルを、47.5mLのメタノール中に溶解させ、2.5mL(2.45mmol、3当量)の1M NaOH溶液を撹拌しながら緩徐に添加した。1-ブタノール:酢酸:水=1:1:1を溶出液として使用して、TLCにより反応をモニタリングした。TLCがメチルエステルの完全な消費を示した後、反応混合物のpHを、1N HClの添加によりpH8〜9まで低下させた。次に、204mg(2.45mmol、3当量)の固体NaHCO3を添加し、続いて241.7mg(0.899mmol、1.1当量)のFmoc-クロリドを添加した。TLC解析が反応の完了を示したとき、反応混合物を約150mLの水で希釈し、酢酸エチル(2×30mL)で2回抽出し、次に40℃水浴上で、真空中で約20mLまで濃縮し、一切の残留有機溶媒を除去した。溶液を、約5%(v:v)の含有量までの酢酸の添加により酸性化させ、5グラムStrata C-18E SPEチューブ(メタノール中で事前に湿らせ、製造者の指示に従い5%酢酸中で平衡化)を通過させた。樹脂を5%酢酸で洗浄し、生成物を10%トリス.HClを伴う90%メタノールの混合物、pH7.2(v:v)で溶出した。真空中(≦40℃水浴)で濃縮し乾燥した後、残留物を再溶解させ、pHを水酸化ナトリウムでpH7.2に調整した。この溶液を、下の(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸の合成において、更なる精製なしに、原液として直接使用した。
【０２３４】
工程3:(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸ナトリウム塩の合成
【０２３５】
【化２６】
2017507135.tif 000029
【０２３６】
工程2で得られた100.8mLの水中の380mgの(2-Fmoc-アミノ)エチルβ-D-グルクロン酸の溶液(0.83mmole、1当量)に、5.6mLの1M トリスHCl、pH7.2、5.6mLの100mM MnCl2、及び1.8gのUDP-GlcNAc(2.79mmole、3.4当量)を添加した。5.1mLのMBP-PmHS1酵素(15.47mg/mL、78.9mg)を約1分間にわたって緩徐に添加した後、TLC解析(1-ブタノール:酢酸:水=2:1:1)が出発物質のほぼ完全な変換を示すまで、反応物を室温で緩徐に撹拌した。2.8mL酢酸の添加により溶液を酸性化させ、消費されたMBP-PmHS1を沈殿させ、50mLの遠心ボトル内に移した。次に、溶液をJM-12ローター(約16,000×g)内で30分間、10,000rpmで、室温で遠心した。上清をデカントし、160mLのメタノールを添加した。4×25mLのペレットを、水:メタノール:酢酸=45:50:5(v:v:v)の溶液で抽出した。組み合わされた上清及び抽出物は、2gStrata-SAXチューブ[水:メタノール:酢酸=45:50:5(v:v:v)中で平衡化]を通過させ、一切のUDP及びUDP-GlcNAcを除去した(完全除去には、28グラムの樹脂を要した)。これらの条件下では、標的分子は保持されずに樹脂を通過する一方で、より高く荷電したUDP及びUDP-GlcNAcは保持された。組み合わされた溶出液を、真空中(水バッチ、≦40℃)で濃縮し、水中に再溶解させ、水酸化ナトリウムを使用してpHをpH7.2に調整した。この溶液を更なる精製なしに次の工程において直接使用した。
【０２３７】
工程4:(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸ジナトリウム塩の合成
【０２３８】
【化２７】
2017507135.tif 000030
【０２３９】
9mM (2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸、30mM UDP-GlcUA、50mM Tris.HCl、及び5mM MnCl2を含有する水性溶液(38ml)を、スピナーフラスコ内に入れた。約1分間にわたって、9.5mLのMBP-PmHS1を緩徐に撹拌しながら滴下添加した。反応混合物を一晩撹拌し、その後、TLC解析[溶出液:n-BuOH:AcOH:H2O=4:1:1(v:v:v)]は、出発物質の完全な変換を示した。反応混合物を1μmのグラスファイバーシリンジフィルターで濾過し、5グラムのC18-E SPEチューブ(製造者の指示に従い水で平衡化)を通過させた。樹脂を水で洗浄し、続いて標的分子を90%水性MeOH、1mMトリスHCl、pH7.2の混合物で溶出した。溶出液を真空中(水浴≦40℃)で濃縮し、次に25mLの10mMトリスHCl、pH7.2中に再溶解させ、0.2μmのSFCAシリンジフィルターで濾過した。標的分子を含有する濾物を、陰イオン交換クロマトグラフィーにより更に精製した。2.6×13cmのQ Sepharose HPカラムを備え、Unicorn 5.11ソフトウェアで操作されるAkta Explorer 100を使用した。溶出のために2つの緩衝系(バッファーA:10mMトリスHCl、pH7.2及びバッファーB:10mMトリスHCl、pH7.2、1M NaCl)を使用した。0〜20%B勾配を175分間にわたって、10ml/分の流速で使用して標的分子を溶出した。10ml画分を回収した。生成物を含有する画分を組み合わせ、ロータリーエバポレーター上で真空中(水浴<40℃)で濃縮して乾燥させ、次の工程で更なる精製なしに使用した。
【０２４０】
工程5:(2-アミノエチル)4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸ジナトリウム塩の合成
【０２４１】
【化２８】
2017507135.tif 000031
【０２４２】
工程4に記載したようにして得られた(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸ジナトリウム塩を、4mLの水中に溶解させ、氷浴上で冷却した。4mLちょうどの体積のモルホリンを、撹拌しながら添加し、氷浴を除去した。UV 254nm検出を使用したTLC解析[n-BuOH:AcOH:H2O=3:1:1(v:v:v)]が出発物質の完全な消費を示すまで、室温で撹拌を継続した。1.5時間以内に反応は完了した。反応混合物を約50mLの水で希釈し、50mLのEtOAcで3回抽出した。標的分子を含有する水性相を、ロータリーエバポレーター上で真空中(水浴<40℃)で濃縮し、水と3回同時蒸発させた。残留物を10mLの水中に再溶解させ、水中で事前に平衡化された1グラムのSDB-L SPEカラムを通過させた。標的は、カラムに保持されず通過した。10mLの水でカラムを洗浄し、標的と組み合わされた画分を真空中で濃縮して乾燥させた(水浴、≦40℃)。得られた残留物を、1.5mLの1M NaOAc、pH7.5中に溶解させ、0.2μmのスピンフィルターで濾過し、溶出液として水を用いて、Sephadex G-10カラム(2×75cm、235mL)を通したサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。MALDI-TOF MS(マトリックス:5mg/mL ATT、50%アセトニトリル/0.05%トリフルオロ酢酸):636.83[M+Na+]により標題物質の構造を確認した。凍結乾燥後、標題物質を水中に溶解させ、水酸化ナトリウムの添加により得られた溶液のpHをpH7.0〜7.5に調整し、カルバゾールアッセイにより三糖含有量を決定した(Bitter T、Muir HM. Anal Biochem 1962年10月;4:330〜4頁)。得られた原液を分注し、必要になるまで-80℃で密閉容器中に保存した。
【０２４３】
(2-Fmoc-アミノ)エチルβ-D-グルクロン酸から開始される(2-アミノエチル)4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸の単離収量の全体は、210mg(0.34mmole、41%)だった。
【０２４４】
ヘパロサンポリマーを、三糖プライマーから以下のとおり合成する。
【０２４５】
アミン末端を有するヘパロサン多糖の生成
【０２４６】
【化２９】
2017507135.tif 000032
【０２４７】
遊離アミン基(HEP-NH2)を有するヘパロサンポリマー誘導体を得るため、パスツレラ・ムルトシダヘパロサンシンターゼ1(PmHS1;DeAngelis及びWhite、2002 J Biol Chem)を、インビトロで平行してポリマー鎖を化学酵素的に合成するために使用した(Sismey-Ragatzら、2007 J Biol Chem及びUS8088604)。E. coliマルトース結合タンパク質とPmHS1との融合が、工程5で得られる(2-アミノエチル)4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸(HEP3-NH2)を、US2010036001に記載のとおり、UDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA前駆体並びにMnCl2触媒を使用して、より長いポリマー鎖へと伸長させるための触媒として使用された。
【０２４８】
HEP-マレイミド及びHEP-ベンズアルデヒドポリマーの合成:
HEP-ベンズアルデヒドは、水性中性溶液中でアミン官能化HEPポリマーを過量のN-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸と反応させる工程[Nano Letters (2007) 7(8)、2207〜2210頁]により調製できる。ベンズアルデヒド官能化ポリマーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はHPLCにより単離できる。
【０２４９】
HEP-マレイミドは、アミン官能化HEPポリマーを余剰のN-マレイミドブチリル-オキシスクシンイミドエステル(GMBS;Fujiwara, K.ら(1988) J Immunol Meth 112、77〜83頁)と反応させる工程により調製できる。
【０２５０】
より具体的には、還元的アミノ化等を介して、標的薬物化合物上のアクセス可能なアミノ官能基とカップリングするためのヘパロサンポリマー誘導体を得るため、ヘパロサン-NH2を、N-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸とカップリングし、ベンズアルデヒド修飾ヘパロサンポリマーを形成した。一例において、基本的に、ジメチルスルホキシド中に溶解されたN-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸(Chem-Impex, Inc社)(205mL中11.94mg)を、380mLの1Mリン酸ナトリウム、pH7.0、2180mlの水、及び1040mLのジメチルスルホキシド中に溶解された、62.7gの43.8kDaヘパロサンポリマー-NH2の撹拌された溶液に緩徐に添加した。反応混合物を一晩室温で撹拌し、続いて室温でアルコール沈殿を行った。生成物を有するペレットを、3Lの500mM酢酸ナトリウム、pH6.8中に溶解させ、更に精製し、次にクロスフロー濾過により濃縮した。或いは、ベンズアルデヒド又はマレイミド官能化ポリマーは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はHPLCにより単離できる。
【０２５１】
末端一級アミン(HEP-NH2)で官能化された任意のHEPポリマーを、本実施例において使用できる。2つの選択肢を下に示す。
【０２５２】
【化３０】
2017507135.tif 000033
【０２５３】
更に、多糖の非還元末端における末端糖残基は、N-アセチルグルコサミン又はグルクロン酸のいずれかでありうる(上ではグルクロン酸が描かれている)。典型的には、重合反応において等モル量のUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAが使用された場合には、両者の混合物が期待される。nは、5〜450、たとえば50から400、100から200、又は150から190でありうる。
【０２５４】
{実施例2:[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸(GSC-SH)の合成}
【０２５５】
【化３１】
2017507135.tif 000034
【０２５６】
グリシルシアル酸シチジン一リン酸(200mg、0.318mmol)を水(2ml)中に溶解させ、チオブチロラクトン(325mg、3.18mmol)を添加した。二相溶液を、穏やかに21時間、室温で混合した。次に、反応混合物を水(10ml)で希釈し、逆相HPLCカラム(C18、50mm×200mm)に適用した。カラムを50ml/分の流速で、水(A)、アセトニトリル(B)及び250mM炭酸水素アンモニウム(C)の以下の勾配系で溶出した。すなわち、0分(A:90%、B:0%、C:10%)、12分(A:90%、B:0%、C:10%)、48分(A:70%、B:20%、C:10%)。画分(20mlのサイズ)を回収し、LC-MSで解析した。純画分をプールし、ナトリウム形態のDowex 50W×2(100〜200メッシュ)樹脂のショートパッドを緩徐に通過させ、その後乾燥粉末へと凍結乾燥した。次に、260nmの吸光度及び参照物質としてグリシルシアル酸シチジン一リン酸を使用して、凍結乾燥粉末中の標題物質の含有量をHPLCにより決定した。HPLC解析のため、Waters X-Bridgeフェニルカラム(5μm 4.6mm×250mm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)を使用した。収量:61.6mg(26%)。LCMS:732.18(MH+)、427.14(MH+-CMP)。-80℃で保存したとき、化合物は長期間(>12ヶ月)安定だった。
【０２５７】
[実施例3-38.8kDaのHEP-GSC試薬(スクシンイミドサブリンカー)の調製]
HEP試薬を、GSC-SH([(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸)をHEP-マレイミドと1:1モル比で以下のとおりカップリングすることにより調製した。すなわち、50mM Hepes、100mM NaCl、pH7.0(50μl)中に溶解されたGSC-SH(0.50mg)に対して、50mM Hepes、100mM NaCl、pH7.0(1350μl)中に溶解された26.38mgの38.8kDaのHEP-マレイミドが添加された。透明溶液を2時間、25℃で静置した。過剰なGSC-SHを、10kDaのカットオフでSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を使用して、透析により除去した。透析バッファーは、50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH=7.0だった。反応混合物を2回、2.5時間透析した。回収した物質をそのまま、GSC-SHとHEP-マレイミドとの間の定量的反応を仮定して使用した。この手順により製造されたHEP-GSC試薬は、スクシンイミド結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合されたHEPポリマーを含有すると考えられる。
【０２５８】
【化３２】
2017507135.tif 000035
【０２５９】
[実施例4-20kDaのHEP-GSC試薬(スクシンイミドサブリンカー)の調製]
この化合物を、20kDaのHEP-マレイミド及び[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸を使用して、上の38.8kDaのHEP-GSCについて記載したのと同様の方式で調製できる。
【０２６０】
[実施例5-73kDaのHEP-GSC試薬(スクシンイミドサブリンカー)の調製]
この化合物を、73kDaのHEP-マレイミド及び[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸を使用して、上の38.8kDaのHEP-GSCについて記載したのと同様の方式で調製した。
【０２６１】
[実施例6-21kDa、40kDa及び73kDaのHEP-GSC試薬(4-メチルベンゾイルサブリンカー)の作製についての一般的説明]
HEP-ベンズアルデヒドを、凍結乾燥Hepes安定化粉末として(任意選択で)得た。WO07056191に従い調製されたGSCを、中性バッファー中に溶解させ、凍結乾燥HEP-ベンズアルデヒドに直接添加した。HEP-ベンズアルデヒドと比較して5〜25当量(eq)のGSCを使用した。すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで、液状溶液を穏やかに混合した。次に、還元剤(NaBH3CN或いはボラン錯体)を、2時間にわたって、50mM溶液が得られるまで少しずつ添加した。次に、溶液を透析チャンバー(10.000 MWCO)に移し、500〜1000倍の体積の25mM Hepes、pH7.2に対して2回、それぞれ2時間及び16時間透析した。次に、Waters X-bridgeフェニル(5μm)4.6mm×250mm(0.1%リン酸-水-アセトニトリル系)を使用して、GSC残留物について内部チャンバーを解析した。GSC除去の際に、チャンバーの内容物を、Hepes安定化HEP-GSCを含有する粉末へと凍結乾燥した。
【０２６２】
[実施例7-41.5kDaのHEP-GSC試薬(4-メチルベンゾイルサブリンカー)の調製]
5.0mlの50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2バッファー、pH7.0中のグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)(20mg、32μmol)を、乾燥した41.5kDaのHEP-ベンズアルデヒド(99.7mg、2.5μmol、カルバゾール定量アッセイ)に直接添加した。混合物を、すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで穏やかに回転させた。以後の2時間の間、MilliQ水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの1M溶液を部単位(5×50μl)で添加し、48mMの最終濃度に達した。次に、過剰なGSCを透析により以下のとおり除去した。すなわち、総反応体積(5250μl)を、透析カセット(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette、カットオフ10kDa性能:3〜12mlを有するThermo Scientific社製品#66810)に移した。溶液を、2000mlの25mM Hepesバッファー(pH7.2)に対して2時間透析し、もう一度17時間、2000mlの25mM Hepesバッファー(pH7.2)に対して透析した。内部チャンバーからの過剰なGSCの完全な除去を、GSCを参照として使用して、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)でのHPLCにより検証した。内部チャンバー物質を回収し、凍結乾燥し、83%(カルバゾール定量アッセイ)の41.5kDaのHEP-GSCを白色の粉末として得た。
【０２６３】
この手順に従い調製されたHEP-GSC試薬は、メチルベンゾイル結合を介してGSCに結合されたHEPポリマーを含有した。
【０２６４】
【化３３】
2017507135.tif 000036
【０２６５】
(実施例8-21kDaのHEP-GSC試薬の調製)
この化合物を、21kDaのHEP-アルデヒド及びグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)を使用して、上の41.5kDaのHEP-GSCについて記載したのと同様の方式で調製した。収量は、凍結乾燥後で78%だった。
【０２６６】
(実施例9-73kDaのHEP-GSC試薬の調製)
この化合物を、73kDaのHEP-アルデヒドグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)を使用して、上の41.5kDaのHEP-GSCについて記載したのと同様の方式で調製した。収量は、凍結乾燥後で70%だった。
【０２６７】
(実施例10-FVIII-K1804Cの還元)
哺乳動物細胞内で製造されたFVIII-K1804Cを、低分子チオールにより混合ジスルフィドとしてブロッキングされたそのC1804システインとともに単離した。HEPコンジュゲーションを促進するため、タンパク質は、C1804チオール基をカップリングに利用可能とするために、最初にデブロッキングされなければならない。デブロッキングは、以下のとおりホスフィンベース還元を使用して、化学的還元により実施される。FVIII-K1804C(15.6mg)を、トリス(3-スルホフェニル)ホスフィン(42mg)と、4.5時間、5℃で、15.5mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、1M NaCl、pH7.3(イミダゾールバッファー)中でインキュベートした。反応混合物を3つの部に分け、それぞれを15mlのイミダゾールバッファーで希釈し、その後限外濾過チューブ(Millipore Amicon Ultra社、カットオフ10kD)に移した。試料体積を遠心により減少させたが、タンパク質沈殿を回避するため、5ml未満とならないようにした。新たなバッファーを添加し、遠心希釈工程を更に2回反復した。組み合わせた試料を、ローディングバッファー(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3)で45mlまで希釈し、ローディングバッファー中で平衡化された1ml MonoQ 5/50 GLイオン交換カラム(Amersham Biosciences社、GE Healthcare社)に適用した。非結合タンパク質を除去するための2カラム容積のローディングバッファーAでの洗浄後、FVIII K1804Cを、バッファーB(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween80、1M NaCl、1Mグリセロール、pH7.3)で、一段階溶出した。FVIII K1804Cを含有する画分をプールし、溶出バッファー(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween 80、1M NaCl、1Mグリセロール、pH7.3)中で平衡化されたHiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradカラム(CV 124ml)に適用した。次に、FVIII K1804Cを同じ溶出バッファー中に溶出した。限外濾過(Millipore Amicon Ultra社、カットオフ10kD)を使用することにより画分を濃縮した。9.0mgの脱保護されたFVIII K1804Cを、7mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween80、1M NaCl、1Mグリセロール、pH7.3(1.29mg/ml)中で単離し、RP-HPLCにより決定した。
【０２６８】
{実施例11-52k-HEP-[C]-FVIII K1804Cの調製}
上述のとおり還元したFVIII-K1804C(6.3mg)を、52k-HEP-マレイミド(5.7mg)と、4.9mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、1M NaCl、pH7.3中で、20時間、室温で反応させた。反応混合物を、ローディングバッファー(50mM Hepes、10mM CaCl2、0.02% Tween80、100mM NaCl、pH7.0)で45mlまで希釈し、ローディングバッファー中で平衡化された1ml MonoQ 5/50 GLイオン交換カラム(Amersham Biosciences社、GE Healthcare社)に適用した。10カラム容積の50mM Hepes、10mM CaCl2、100mM NaCl、pH7.0を使用して、非結合タンパク質を洗い流した。52k-HEP-[C]-FVIII K1804Cを、20カラム容積の80%A(50mM Hepes、10mM CaCl2、100mM NaCl、pH7.0)及び20%B(50mM Hepes、10mM CaCl2、1M NaCl、pH7.0)バッファー混合物で溶出した。52k-HEP-[C]-FVIII K1804C及び非コンジュゲートFVIII K1804Cの混合物を、10カラム容積の50%A(50mM Hepes、10mM CaCl2、100mM NaCl、pH7.0)及び50%B(50mM Hepes、10mM CaCl2、1M NaCl、pH7.0)バッファー混合物での、続く工程の溶出により得ることができた。精製画分をHPLCにより同定し、その後、プールして、10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中で平衡化されたHiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradカラム(CV 124ml)に適用した。カラムを同じバッファー中で溶出し、生成物を含有する画分をプールして、限外濾過(Millipore Amicon Ultra社、カットオフ10kD)を使用することにより濃縮し、7mlの10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中の2.2mgの52k-HEP-[C]-FVIII K1804Cを得た。
【０２６９】
{実施例12-27k-HEP-[C]-FVIII K1804Cの調製}
このコンジュゲートを、FVIII-K1804C(4.30mg)及び27k-HEP-マレイミド(5.41mg)を使用して、上述のとおり調製した。2.46mg(56%)の27k-HEP-[C]-FVIII K1804Cを、7mlの10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中で単離した。
【０２７０】
{実施例13-73k-HEP-[C] FVIII K1804Cの調製}
このコンジュゲートを、FVIII-K1804C(4.0mg)及び73k-HEP-マレイミド(5.8mg)を使用して、上述のとおり調製した。1.48mg(37%)の73k-HEP-[C]-FVIII K1804Cを、7mlの10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中で単離した。
【０２７１】
{実施例14-108k-HEP-[C] FVIII K1804Cの調製}
上述のとおり還元したFVIII-K1804C(5.8 mg)を、108k-HEP-マレイミド(27.0mg)と、5.7mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、1M NaCl、pH7.3中で、16時間、室温で反応させた。反応混合物を、20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3で50mlまで希釈し、バッファーA(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3)中で平衡化された1ml MonoQ 5/50 GLイオン交換カラム(Amersham Biosciences社、GE Healthcare社)に適用した。10カラム容積のバッファーAを使用して、非結合タンパク質を洗い流した。次にカラムを、0〜35%勾配の10カラム容積のバッファーB(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3)で溶出し、その後、追加の10カラム容積の35%Bバッファーで溶出した。純粋画分をHPLCにより同定し、プールして、10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中で平衡化されたHiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradカラム(CV 124ml)に適用した。カラムを同じバッファー中で溶出し、生成物を含有する画分を回収して、限外濾過(Millipore Amicon Ultra社、カットオフ10kD)により濃縮し、7mlの10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中の1.40mg(24%)の108k-HEP-[C]-FVIII K1804Cを得た。
【０２７２】
{実施例15-157kDaのHEP-[C]-FVIII K1804Cの調製}
このコンジュゲートを、108kDaのHEP-[C]-FVIII K1804Cについて記載のとおり、FVIII-K1804C(2.86mg)及び157k-HEP-マレイミド(20mg)を使用して、上述のとおり調製した。0.55mg(19%)の157k-HEP-[C]-FVIII K1804Cを、7mlの10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中で単離した。
【０２７３】
(実施例16-アシアロFVIIIの調製)
6mlの20mlイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、600mM NaCl、7.3中のFVIII(28.2mg)を、シアリダーゼ[アルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)、50μg、242U/mg]に添加し、1時間、25℃でインキュベートした。次に、3分の1の反応混合物を、バッファーA(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween80、25mM NaCl、1Mグリセロール、pH7.3)中で平衡化された1ml MonoQ 5/50 GLイオン交換カラム(Amersham Biosciences社、GE Healthcare社)にロードした。2カラム容積のバッファーAを使用して、非結合タンパク質を洗い流した。次にカラムを、0〜20%勾配の5カラム容積のバッファーB(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、0.02% Tween80、1M NaCl、1Mグリセロール、pH7.3)で溶出し、その後、10カラム容積の20%Bバッファーでシアリダーゼを溶出した。次に、10カラム容積の100%バッファーBでアシアロFVIIIを溶出した。クロマトグラフィー分離を、各回3分の1の反応混合物で更に2回反復した。純粋タンパク質を含有する画分を組み合わせ、6mlの20mlイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、1M NaCl、7.3中の24.5mgのアシアロFVIIIを得た。
【０２７４】
{実施例17-38.8kDaのHEP-[O]-FVIIIの調製}
2.45mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、1M NaCl、7.3中のアシアロFVIII(10mg)を、1mlの50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中の実施例3から得られた38.8k-HEP-GSC(8.46mg)及びST3GalI(600μlの50mMトリス、100mM NaCl、pH8.0中1.44mg、21.6U/mg)に添加した。反応混合物を32℃で17時間インキュベートした。N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、1M NaCl、7.3中の134μlの156mM溶液)を、ST3GalIII(1.40mlの20mM HEPES、120mM NaCl、50%グリセロール、pH7.0中の1mg、1.1U/mg)とともに添加し、インキュベーションを更に1時間継続した。次に、全反応混合物を、バッファーA(50mM hepes、10mM CaCl2、0.02% Tween80、100mM NaCl、pH7.0)中で平衡化された1ml MonoS 5/50 GLイオン交換カラム(Amersham Biosciences社、GE Healthcare社)にロードした。非結合タンパク質を12カラム容積のバッファーAで溶出し、HEP修飾FVIIIを、20%バッファーB(50mM hepes、10mM CaCl2、0.02% Tween80、1M NaCl、pH7.0)で溶出した。HEP修飾FVIIIを含有する画分をHPLCにより同定し、プールして、10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中で平衡化されたHiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradカラム(CV 124ml)に適用した。カラムを同じバッファー中で溶出し、生成物を含有する画分を回収して、HPLCにより定量された、12mlの10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中の2.48mg(25%)の38.8k-HEP-[O]-FVIIIを得た。
【０２７５】
{実施例18-73kDaのHEP-[O]-FVIIIの調製}
この化合物を、38.8kDaのHEP-[O]-FVIIIについてとほぼ同様の方式で調製した。2.45mlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、1M NaCl、7.3中のアシアロFVIII(10mg)を、1mlの50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中の実施例5から得られた73kDa-HEP-GSC(15.35mg)及びST3GalI(600μlの50mMトリス、100mM NaCl、pH8.0中1.44mg、21.6U/mg)に添加した。反応混合物を32℃で20時間インキュベートした。N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸(20mMイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、1M NaCl、7.3中の134μlの156mM溶液)を、ST3GalIII(1.40mlの20mM HEPES、120mM NaCl、50%グリセロール、pH7.0中の1mg、1.1U/mg)とともに添加し、インキュベーションを更に30分間継続した。反応混合物を、バッファーA(50mM hepes、10mM CaCl2、0.02% Tween80、100mM NaCl、pH7.0)中で平衡化された1ml MonoS 5/50 GLイオン交換カラム(Amersham Biosciences社、GE Healthcare社)にロードした。非結合タンパク質を12CVのバッファーAで溶出した。次にカラムを、10CVの20%バッファーB(50mM hepes、10mM CaCl2、0.02% Tween80、1M NaCl、pH7.0)で段階溶出し、純粋な73kDaのHEP-[O]-FVIIIを得た。画分を組み合わせ、10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中で平衡化されたHiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradカラム(CV 124ml)に適用した。カラムを同じバッファー中で溶出し、生成物を含有する画分を回収して、HPLCにより定量された、6.7 mlの10mMヒスチジン、2mM CaCl2、25mM NaCl、0.01% Tween 80、8.8mMスクロース、pH7.0中の1.23 mg(12%)の73k-HEP-[O]-FVIIIを得た。
【０２７６】
{実施例19-73kDa-HEP-[N]-FVIIIの調製}
この物質は、分析規模でのみ調製した。5μlの20mMイミダゾール、10mM CaCl2、1Mグリセロール、0.02% Tween80、1M NaCl、7.3中のアシアロFVIII(20μg)を、4つの異なる実験において、50mM HEPES、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0中の73kDa-HEP-GSC[2当量(17μg、9.4μl)、4当量(34μg、19μl)、8当量(66μg、38μl)、及び20当量(165μg、94μl)]の溶液にそれぞれ添加した。次に、すべての試料に、4μgのST3GalIII(5.7μlの20mM Hepes、120mM NaCl、50%グリセロール、pH7.0、1.1U/mg)を添加した。次に、4つすべての反応について50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.0を使用して最終体積を18.3μlに調整した。反応混合物を28時間、32℃でインキュベートし、その後、モノ及びポリコンジュゲートされた73kDa-HEP-[N]-FVIIIを続くSDS-PAGE解析によりはっきりと観察した(図4)。
【０２７７】
{実施例20-41.5kDa-HEP-[O]-FVIIIの調製}
FVIIIを5.9mg/mLまで濃縮し、20mmol/kgヒスチジン+500mmol/kg NaCl+10mmol/kg CaCl2+2.1mol/kgグリセロール、pH6.1で、Amicon Ultra遠心式フィルター、Ultracel-30K(Millipore社)内でバッファー交換した。GSC-HEPを同じバッファー中に溶解させ、Slide-A-Lyzer透析カセット、10.000MWCO(Thermo Scientific社)での透析を使用してバッファー交換し、15.6mg/mLの最終濃度を得た。
【０２７８】
18.2mgのFVIIIを、16μgのシアリダーゼ、アルスロバクター・ウレアファシエンス、0.6mgのST3GalI、ブタ、及び7.6mgの41.5kDaのGSC-HEPと混合した。成分を穏やかに混合し、室温で16時間インキュベートした。
【０２７９】
溶液を20mmol/kgヒスチジン+10mmol/kg CaCl2+2mol/kgグリセロール+0.05%(w/w)Poloxamer 188、pH6.1で1:9に希釈し、Source 30Q(GE Healthcare Bio-Sciences社)、10cmのベッド高で20mLの樹脂が充填されたカラムにロードした。カラムは、20mmol/kgヒスチジン+10mmol/kg CaCl2+50mmol/kg NaCl+2mol/kgグリセロール+0.05%(w/w)Poloxamer 188、pH6.1で前もって平衡化され、HEP-N8を平衡化バッファーから20mmol/kgヒスチジン+10mmol/kg CaCl2+500mmol/kg NaCl+2mol/kgグリセロール+0.05%(w/w)Poloxamer 188、pH6.1へと50CVにわたって勾配溶出した。41.5kDaのHEP-[O]-N8を有する画分をプールし、Amicon Ultra遠心式フィルター、Ultracel-30K(Millipore社)を使用して1.2mg/mLまで濃縮した。
【０２８０】
41.5kDaのHEP-[O]-N8、4.8mgを、81μgのST3GalIII、ラット、及びCMP-NANと混合した。溶液を穏やかに混合し、室温で16時間インキュベートした。
【０２８１】
溶液を、適用前に20mmol/kgヒスチジン+10mmol/kg CaCl2+450mmol/kg NaCl+1mol/kgグリセロール+0.05%(w/w)Poloxamer 188、pH6.1で平衡化されたTSK Phenyl-5PW、20μm(Tosoh Bioscience社)、5cmのベッド高で1mLの樹脂が充填されたカラムに適用した。41.5kDa-HEP-[O]-N8は、樹脂に結合せず、フロースルーで回収された。ST3Gal3は、樹脂に結合し、41.5kDa-HEP-[O]-N8から分離される。
【０２８２】
41.5kDaのHEP-[O]-N8を有する溶液を、Superdex 200pg(GE Healthcare Bio-Sciences社)、60cmのベッド高で120mLの樹脂が充填されたカラムに適用した。カラムは、実施中にもバッファーとして使用される37.5mmol/kgヒスチジン+1.5mmol/kgメチオニン+6.6mmol/kg CaCl2+600mmol/kg NaCl+34mmol/kgスクロース+0.05%(w/w)Poloxamer 188、pH6.1で平衡化された。41.5kDaのHEP-[O]-N8を含有する画分をプールし、Amicon Ultra遠心式フィルター、Ultracel-30K(Millipore社)で0.4mg/mLまで濃縮した。
【０２８３】
(実施例21:4-メチルベンゾイル結合を有するノイラミン酸シチジン一リン酸ベースの41.5kDaのHEPコンジュゲートの合成)
【０２８４】
【化３４】
2017507135.tif 000037
【０２８５】
ノイラミン酸シチジン一リン酸は、Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482頁に記載のとおり製造される。実施例7に記載のとおりHEP-アルデヒドとの反応が実施され、GSCをノイラミン酸シチジン一リン酸と置き換えた。50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2バッファー、pH7.0バッファー中に溶解したノイラミン酸シチジン一リン酸(32μmol)を、乾燥した41.5kDaのHEP-ベンズアルデヒド(2.5μmol)に直接添加した。混合物を、すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで穏やかに回転させる。以後の2時間の間、MilliQ水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの1M溶液を部単位で添加し、48mMの最終濃度に達する。次に、過剰なノイラミン酸シチジン一リン酸を、実施例7に記載のとおり、透析により除去する。内部チャンバーからのノイラミン酸シチジン一リン酸の完全な除去を、ノイラミン酸シチジン一リン酸を参照として使用して、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)でのHPLCにより検証する。次に、内部チャンバー物質を、回収して凍結乾燥した。この手順により製造された試薬は、4-メチルベンゾイル結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合されたHEPポリマーを含有する。
【０２８６】
(実施例22:4-メチルベンゾイル結合を有する9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸ベースHEPコンジュゲートの合成)
【０２８７】
【化３５】
2017507135.tif 000038
【０２８８】
9-デオキシ-アミノN-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸は、Eur. J. Biochem 168、594〜602頁(1987)に記載のとおり製造される。実施例7に記載のとおりHEP-アルデヒドとの反応が実施され、GSCを9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸と置き換える。50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2バッファー、pH7.0バッファー中に溶解した9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸(32μmol)を、乾燥した41.5kDaのHEP-ベンズアルデヒド(2.5μmol)に直接添加した。混合物を、すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで穏やかに回転させる。以後の2時間の間、MilliQ水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの1M溶液を部単位で添加し、48mMの最終濃度に達する。次に、過剰な9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸を、実施例7に記載のとおり、透析により除去する。内部チャンバーからの9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸の完全な除去を、9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸を参照として使用して、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)でのHPLCにより検証する。内部チャンバー物質を、回収して凍結乾燥した。この手順により製造された試薬は、4-メチルベンゾイル結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合されたHEPポリマーを含有し、アシアロFVIII糖タンパク質との糖コンジュゲーションに好適である。
【０２８９】
(実施例23:4-メチルベンゾイル結合を有する2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸ベースHEPコンジュゲートの合成)
【０２９０】
【化３６】
2017507135.tif 000039
【０２９１】
実施例19及び20に示されているのと同様の仕方で、HEP-シアル酸シチジン一リン酸試薬を、シアル酸KDNから開始して製造できる。最初の9位のアミノ誘導体化は、Eur. J. Org. Chem. 2000、1467〜1482頁に記載のとおり実施される。実施例7に記載のとおりHEP-アルデヒドとの反応が実施され、GSCを9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸と置き換える。50mM Hepes、100mM NaCl、10mM CaCl2バッファー、pH7.0バッファー中に溶解した9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸(32μmol)を、乾燥した41.5kDaのHEP-ベンズアルデヒド(2.5μmol)に直接添加した。混合物を、すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで穏やかに回転させる。以後の2時間の間、MilliQ水中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの1M溶液を部単位で添加し、48mMの最終濃度に達する。次に、過剰な9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸を、実施例7に記載のとおり、透析により除去する。内部チャンバーからの9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸の完全な除去を、9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシノノン酸シチジン一リン酸を参照として使用して、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び水アセトニトリル系(0.1%リン酸を含有する0〜85%のアセトニトリルの30分間にわたる直線勾配)でのHPLCにより検証する。内部チャンバー物質を、回収して凍結乾燥した。この手順により製造された試薬は、4-メチルベンゾイル結合を介してシアル酸シチジン一リン酸に結合されたHEPポリマーを含有し、アシアロ-FVIII糖タンパク質との糖コンジュゲーションに好適である。
【０２９２】
(実施例24:ヘパロサンコンジュゲートFVIIIのFVIII活性)
ヘパロサンコンジュゲートFVIIIである40K-HEP-[O]-N8のFVIII活性(FVIII:C)を、HBS/BSA(20mM hepes、150mM NaCl、pH7.4、1%ウシ血清アルブミンを補充)、その後正常レベルのVWFを有する10倍希釈FVIII欠損血漿(Siemens社)中でおよそ10IU/mLまで前希釈した後に、2段階発色アッセイ[Coamatic(登録商標)第VIII因子キット、Chromogenix社]を使用して評価した。キャリブレーター(WHO 8th IS)を再構成し、血漿中で9.4倍に希釈した。試料及びキャリブレーターをキットからの希釈液中で20mU/mlまで希釈し、続いて5-4-3-2-1-0.5及び0.25mIU/mLまで希釈した。試料、キャリブレーター及び陰性対照(希釈液)を、FX/FIXa/(プロ)トロンビン/リン脂質/カルシウム試薬と200秒間、37℃でインキュベートし、その後、停止試薬及びFXa基質を添加した。405nmでの吸光度を、Spectramaxプレートリーダー(Molecular Device社)上で5分間、継続的に測定した。キャリブレーターのΔa405/分対FVIII:Cの線形プロットを、試料のFVIII:Cを算出するために、SoftMax Pro 5.4.1ソフトウェアにより使用した。
【０２９３】
試料の活性を、記述されている逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)により決定されるタンパク質濃度で除算することにより、比活性を算出した(Thim Lら  Haemophilia 2010; 16: 349〜359頁)。FVIIIの濃度を、ピークの面積を既知量の非コンジュゲートFVIIIのそれと比較することにより決定した。タンパク質含有量のみが濃度決定に含まれ、ヘパロサンは含まれない。40K-HEP-[O]-N8の比活性は、11850±850IU/mLと算出された(n=3の平均及び標準偏差)。
【０２９４】
{実施例25:血友病A血漿に添加された40K-HEP-[O]-N8のFVIII:C}
投与後試料を、発色アッセイにおいて決定される活性に基づいて、40k-HEP-[O]-N8を重症血友病A血漿(George King BioMed Inc社)に0.2、0.6、及び0.9IU/mLまで添加することによりシミュレートした。FVIII:Cを、ACL TOP 500機器(Instrumentation laboratories社)上で、7つの異なるaPTT試薬を伴って測定した[下のTable 2(表2)を参照のこと]。ヒト血漿(Siemens社)をキャリブレーターとして使用した。測定されたFVIII:Cは、一般に、公称値の+/-25%の内だった[Table 1(表1)]。低濃度(0.2IU/mL)では、FVIII:Cを過大評価する傾向があった一方で、測定されたFVIII:Cは、0.6及び0.9IU/mLの40K-HEP-[O]-N8を含有する試料についての公称値に近似していた。とりわけ、異なるaPTT試薬でFVIII:Cにおける大きな差は観察されなかった。
【０２９５】
【表２】
2017507135.tif 000040
【０２９６】
(実施例26.酵素動力学により解析されるFVIII補因子活性、トロンビンによる活性化速度及びFVIIIa崩壊及び不活性化)
活性化40k-HEP-[O]-N8のトロンビンによる活性化速度及び補因子活性を、FX活性化のKm及びKcatを決定するためのFXの滴定において、活性化FVIII及びFIXaの最終濃度をそれぞれ5nM(公称)及び0.02nMに修正した以外は、記述されたとおり(Christiansen MLSら  Haemophilia 2010; 16: 878〜887頁)、リン脂質及びカルシウムを含有する精製系において第X因子(FX)の第IXa因子(FIXa)触媒活性化を研究することにより特徴づけた。加えて、活性化40k-HEP-[O]-N8の自然崩壊を、活性化プロテインC(APC)による不活性化とともに決定した。非コンジュゲートFVIII(N8/ツロクトコグアルファ)を比較として含めた。下のTable 3(表3)に示すデータは、トロンビンによるFVIII活性の動力学的パラメータ、FIXa触媒FX活性化におけるFVIIIa補因子機能及びAPC媒介性不活性化は、自然FVIIIa崩壊と並んで、40k-HEP-[O]-N8及びツロクトコグアルファについて統計学的差がないことを実証する。これは、40k-HEP-[O]-N8が完全なFVIII活性を維持していたことを示す。
【０２９７】
【表３】
2017507135.tif 000041
【０２９８】
(実施例27.トロンビン生成アッセイにおける止血効果)
ヒト血友病A血漿における40k-HEP-[O]-N8の止血効果を、正常ヒト血小板を補充した血友病A患者からの血漿を用いたトロンビン生成アッセイにおいて評価した。血小板は、正常ドナーからのクエン酸安定化末梢血から調製されたヒト多血小板血漿(PRP)から単離した。酢酸クエン酸デキストロース(acetate citrate dextrose:ACD、85mMクエン酸三ナトリウム、71mMクエン酸及び111mMグルコース)を5容積の血液に添加することにより、血液を酸性化させ、20分間、220×gで遠心した。PRPを新しい試験管に移し、その後、15分間、500×gで遠心した。ペレットを、5μg/mLプロスタグランジンE1(Sigma社)を添加した10mlのHepes-Tyrodesバッファー(15mM HEPES、138mM NaCl、2.7mM KCl、1mM MgCl2、5mM CaCl2、5.5mMデキストロース及び1mg/mL BSA、pH6.5)中に穏やかに再懸濁させた。500×gでの15分間の遠心後、ペレットを0.5mlのHepes-Tyrodesバッファー中に穏やかに再懸濁させ、血小板密度をMedonic細胞カウンター(Boule社)上で決定した。血小板を、重症血友病A血漿(George King Bio-Medical Inc.社)に150×109/L(最終密度100×109/L)まで添加した。各試料について、80μlのこの模倣血友病A PRPを、HBS/BSA(20mM Hepes、150mM NaCl、2% BSA、pH7.4)中の10μlのFVIII(発色アッセイ活性に基づいて最終濃度1、0.3、及び0.1IU/mL)及び10μlのPRP試薬(Thrombinoscope社)と混合し、Fluoroskan Ascentプレートリーダー(Thermo Electron Corporation社)内で10分間、37℃で予熱した。蛍光基質及びカルシウムを含有するFluCa試薬(Thrombinoscope社、20μl)を添加し、390nmでの励起後に460nmでの発光を、120分間継続的に測定した。蛍光シグナルを、α2-マクログロブリン結合トロンビン活性について補正し、キャリブレーター(Thrombinoscope社)及びThrombinoscopeバージョン5.0.0ソフトウェア(Synapse BV社)の使用によりトロンビン濃度に変換した。遅延時間、ピークトロンビンまでの時間、ピークトロンビン、トロンビン生成の最高速度(「Velindex」)及び、曲線下面積(ETP、内因性トロンビン産生能)に相当する総トロンビン活性のパラメータを、ソフトウェアにより算出した。トロンビン生成の最高速度を、GraphPad Prismバージョン6.03ソフトウェアを使用して、トロンビン活性の最も急な増加を伴うトロンビン生成曲線の部分の直線回帰により追加で決定した。代表例からのパラメータを、下のTable 4(表4)に示す。FVIIIの非存在下では、少量のトロンビンしか形成されなかった(結果として、ETPを算出することはできなかった)。40k-HEP-[O]-N8又はFVIII出発物質(ツロクトコグアルファ、N8)の添加は両方とも、用量依存的方式でトロンビン生成を改善し、遅延時間及びピークトロンビンまでの時間の短縮、並びにピークトロンビンレベル、ETP及びトロンビン生成の最高速度(Velindex及び傾き)の増加として見られる。40k-HEP-[O]-N8及びツロクトコグアルファの効果は同程度であり、40k-HEP-[O]-N8がヒト血友病A血漿において完全に活性であることを示す。
【０２９９】
【表４】
2017507135.tif 000042
【０３００】
{実施例28:F8-KOマウスへのi.v.投与後の40k-HEP-[O]-N8の薬物動態}
薬物動態学的研究を実施し、第8因子ノックアウト(F8-KO)マウスにおける40K-HEP-[O]-N8の単一用量薬物動態及び用量比例性を評価した。およそ22gの平均体重を有する48匹のF8-KOマウス(B6.129S4-F8tm1Kaz/J、エクソン16を破壊、Taconic M&B社にて育成)に、単一用量280、140、70又は35U/kg(5ml/kg)の40k-HEP-[O]-N8を尾静脈に静脈内投与した。血液を、n=4のスパースサンプリングスケジュールで各時点において3つの試料を各マウスから投与後0.08から65時間の時間範囲で、眼窩神経叢から採取した。血液を0.13Mクエン酸ナトリウム中で安定化させ(9:1)、FVIII Coatest SPバッファー(50mMトリス-HCl、1% BSA、シプロフロキサシン10mg/L、pH7.3)で1:4で希釈し、室温、4000gで5分間遠心した。FVIII発色活性及びFVIII抗原ベース蛍光酸素チャネリング免疫アッセイ(LOCI:Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay)による解析前に、血漿を-80℃に保った。
【０３０１】
FVIII発色活性アッセイは、Coatest(登録商標)SP FVIII、Chromogenix社(#82 4086 63)を使用して解析した。較正は、0〜5.0mU/mlの範囲のキャリブレーターを製造するためにFVIII coatest SPバッファー中で希釈されたN8 SRM(Novo Nordisk社製のFVIII内部参照物質、バッチ307.7008.09.2)を使用してなされた。血漿試料は、1:80、1:240、1:720及び1:2160で希釈され、管理血漿N(ORKE 41,Siemens Health care diagnostics product GmbH社)の異なる希釈液が品質管理として含まれた。
【０３０２】
FVIII抗原ベースLOCIアッセイは、Poulsen, F及びJensen KB、J Biomol screen 2007; 12(2):240〜7頁により記述されているヒトインスリンLOCiとして実質的に構築された。使用された2つの抗体は、インハウスで製造されたNovo Nordiskモノクローナル抗rFVIII4F11及び4F45だった。
【０３０３】
Phoenix WinNonlin(バージョン6.3、Pharsight社)を使用した非コンパートメント解析(NCA)により結果を解析した。40K-HEP-[O]-N8のiv投与後のFVIII発色活性対時間プロファイル又はFVIII抗原濃度対時間プロファイルは、研究された時間間隔では単相対数線形関係(single phase log-linear relationship)に従うようであり、初期分布のマイナーな貢献を反映していた。FVIII発色活性に基づいて、40K-HEP-[O]-N8の平均推定半減期は14.0時間であり、平均クリアランス及び分布容積はそれぞれ、3.9ml/h/kg及び78ml/kgと推定された[Table 5(表5)]。用量が増加したとき、比例した血漿中濃度の増加が観察された。推定クリアランスはおよそ2倍減少し、40K-HEP-[O]-N8の半減期は、ツロクトコグアルファについて以前に公開されたもの(N8、Cl=8.1ml/h/kg、t1/2=6.8h、MRT 9.7h、Stennickeら、Blood、14、2013、Vol 121:11)よりもおよそ2倍大きかった。
【０３０４】
【表５】
2017507135.tif 000043
【０３０５】
{実施例29:ラットへのi.v.投与後の40k-HEP-[O]-N8の薬物動態}
4匹の雄ウィスターラット(Taconic社、およそ250g)における薬物動態学的研究を実施した。ラットに、単一用量250U/kgの40k-HEP-[O]-N8を尾静脈に静脈内投与し、別の尾静脈から、投与前、投与0.08、1、4、7、24、30、48時間後に血液を採取した(フルプロファイル、n=4)。血液を0.13Mクエン酸ナトリウム中で安定化させ(9:1)、FVIII Coatest SPバッファー(50mMトリス-HCl、1% BSA、シプロフロキサシン10mg/L、pH7.3)で、1:4で希釈し、室温、4000gで5分間遠心した。FVIII発色活性及びFVIII抗原ベース蛍光酸素チャネリング免疫アッセイ(LOCI)による解析前に、血漿を-80℃に保った(アッセイの説明については実施例28を参照のこと)。FVIII発色活性アッセイにおいて、0.42±0.17U/mlの平均±SDでベースライン値(投与前試料)を得た。すべてのFVIII発色活性データを、Phoenix WinNonlin(バージョン6.3、Pharsight社)を使用した非コンパートメント解析(NCA)による解析の前にベースライン減算した。ウィスターラットへのi.v.投与後に、FVIII発色活性に基づいて、40k-HEP-[O]-N8の平均クリアランス及び分布容積はそれぞれ、3.1ml/h/kg及び51ml/kgと推定された。FVIII発色活性に基づいて、40k-HEP-[O]-N8の平均半減期は、12時間と推定された。これは、およそ2倍の半減期の延長に相当する。なぜなら、ラットへのi.v.投与後の組換えFVIIIのクリアランス及び半減期はそれぞれ、9.4ml/h/kg及び5.8時間と以前に報告されていたからである(Stennickeら、Blood、14、2013、Vol 121:11)。
【０３０６】
{実施例30:カニクイザルへのi.v.投与後の40k-HEP-[O]-N8の薬物動態}
3匹の雄カニクイザル[マカカ・ファスキクラリス(Macaca fascicularis)、Bioculture (Mauritius) Ltd社、Mauritius、およそ3kg]における薬物動態学的研究を実施した。サルに40K-HEP-[O]-N8 250U/kgを伏在静脈を介してi.v.投与し、投与前、投与0.25、2、6、12、24及び48時間後に0.9mlの血液を大腿静脈/動脈から取り、0.1mlの0.13Mクエン酸三ナトリウム抗凝固剤に添加した。試料を穏やかに手で、次に自動ミキサー上で継続的に少なくとも1分間混合した。試料を10分以内に5分間、2000g、室温で遠心し、FVIII抗原ベースFVIII蛍光酸素チャネリング免疫アッセイ(LOCI)及びFVIII発色活性の解析前に、血漿を-80℃で保存した(アッセイの説明については実施例28を参照のこと)。すべてのデータを、Phoenix WinNonlin(バージョン6.3、Pharsight社)を使用した非コンパートメント解析(NCA)によるPK解析の前にベースライン減算した。
【０３０７】
カニクイザルへのi.v.投与後に、FVIII発色活性に基づいて、40k-HEP-[O]-N8の平均クリアランス及び分布容積はそれぞれ、1.13ml/h/kg及び32ml/kgと推定された。FVIII発色活性に基づいて、40k-HEP-[O]-N8の平均半減期は、20時間と推定された。これは、およそ2倍の40k-HEP-[O]-N8の半減期の延長に相当する。なぜなら、カニクイザルへのi.v.投与後のツロクトコグアルファのクリアランス及び半減期はそれぞれ、8.3ml/h/kg及び5.4時間と以前に報告されていたからである(Stennickeら、Blood、14、2013、Vol 121:11)。
【０３０８】
【表６】
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【０３０９】
{実施例31:F8-KOマウスの尾静脈離断(TVT)モデルにおける40k-HEP-[O]-N8の用量反応}
40k-HEP-[O]-N8の用量反応効果研究を、イソフルラン麻酔F8-KOマウス(B6.129S4-F8tm1Kaz/J、エクソン16を破壊、Taconic M&B社で育成)のTVT出血モデルにおいて実施した。各12匹の4群のマウスに、0(ビヒクル)、0.25、1、及び4U/kg(5ml/kg)の用量で、右側尾静脈にTVT5分前に40k-HEP-[O]-N8を投与した。傷害後、尾を37℃の生理食塩水中に置いた。血液を60分間回収し、失血をヘモグロビンの解析により定量した。逆用量反応式(inverse dose response equation)をデータにフィッティングすることにより、失血のED50値を推定した。
【０３１０】
失血は、40k-HEP-[O]-N8について0(ビヒクル)、0.25、1、及び4U/kgで処置された群において、5482±663、6117±573、2754±611、及び1782±423nmolヘモグロビンだった。最高用量レベル(4U/kg)での失血は、ビヒクル群と差があった。ED50及び95% CIは、40k-HEP-[O]-N8について1.4U/kg[0.3〜7U/kg]と推定された。
【０３１１】
{実施例32:F8-KOマウスのTVTモデルにおける40k-HEP-[O]-N8の効果持続期間}
効果持続期間の研究を、イソフルラン麻酔F8-KOマウス(B6.129S4-F8tm1Kaz/J、エクソン16を破壊、Taconic M&B社で育成)の尾静脈離断(TVT)出血モデルにおいて40k-HEP-[O]-N8の投与後に実施した。
【０３１２】
右側尾静脈に、10U/kg(5ml/kg)の用量で、TVT24、48又は72時間前に、40k-HEP-[O]-N8を注射した(n=12)。ビヒクル群は全部で12匹のマウス、各時点で4匹のマウスを含んでいた。全部で60分間血液を回収する一方で、尾を37℃の予熱された生理食塩水中に浸漬した。失血を、回収された血液中のヘモグロビン濃度により決定した。
【０３１３】
24、48、及び72時間での失血は、40k-HEP-[O]-N8について526±145、1919±558、及び4686±648nmolヘモグロビンだった(平均±SEM)。ビヒクル群における平均失血は、7269±258nmolヘモグロビンだった。
【０３１４】
40k-HEP-[O]-N8は、すべての研究された時点において止血活性を有しており、循環からの予測された消失に従って効果は減少した。
【０３１５】
{実施例33:血友病Aイヌにおける40k-HEP-[O]-N8及びN8-GPの薬物動態及びエクスビボ薬力学}
薬物動態及びエクスビボ薬力学の研究を、4匹の血友病Aイヌにおいて評価した[Blood Research Laboratory (FOBRL)、University of North Carolina、Chapel Hillのコロニー]。イヌに、10分間にわたって125U/kgの40k-HEP-[O]-N8をiv注入した。全血試料を、注入前に且つ6日間にわたって異なる時点で抜き取った。
【０３１６】
全血試料の一部を遠心し、実施例28に記載のFVIII発色活性を使用した、後のFVIII濃度の測定のために、血漿をアリコートに分けた。薬物動態学的パラメータを、Phoenix WinNonlin(バージョン6.3、Pharsight社)を使用した非コンパートメント解析(NCA)を使用して推定した。非安定化全血試料の別の一部を、全血凝固時間(WBCT)及びトロンボエラストグラフィー(TEG、データを含まず)を測定することにより、試料採取直後に解析した。
【０３１７】
WBCTを、以前に記述されたとおり28℃での2試験管法により実施した(Nichols TCら  ILAR J 2009; 50(2): 144〜67頁)。簡潔に述べると、1mLシリンジで1mlの全血を回収し、2つのシリコン試験管(Vacutainer(商標); Becton-Dickinson社、Franklin Lakes、NJ、米国)に均等に分配した。1分間の初期インキュベーション後、第1の試験管を30秒ごとに傾けた。凝固の形成後、第2の試験管を30秒ごとに傾け、観察した。終点は、第2の試験管の凝固時間だった。エクスビボ効果プロファイルを、ランダム係数直線回帰モデルにより解析した。
【０３１８】
【表７】
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【０３１９】
注入前のWBCTは、40k-HEP-[O]-N8について32.0±2.1分と測定された。注入直後(t=5分)に、WBCTは標準化され、40k-HEP-[O]-N8について10.8±1.0分だった。その後、WBCTは時間経過とともに血友病表現型へと徐々に増加し、推定の傾きは40k-HEP-[O]-N8について0.079分*h-1だった。
【０３２０】
本明細書では本発明のいくつかの特徴を例示し説明したが、当業者であれば多くの修正、置換、変更、及び等価物に想到すると予想される。したがって、添付の特許請求の範囲は、すべてのかかる修正及び変更を、本発明の真の趣旨内に収まるものとして包含することが意図されることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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