(57)【要約】  本発明は、粗生体試料において抽出したＲＮＡで実施できる等温核酸増幅反応を使用する、ＲＮＡウイルス感染を迅速に同定する方法を提供する。
2017536813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写とカップリングされた等温増幅反応において特定の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中の標的ポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中の標的ポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ；
を含む、方法。
【請求項２】
試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子の存在又は量を示し、アンプリコンを検出できないことがＲＮＡウイルスの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチド分子が、エボラウイルス、ＨＩＶ、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス、又はアレナウイルスのポリヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中のエボラポリヌクレオチドをプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するエボラポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中に存在するエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
【請求項５】
試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）生体試料を、試料中に存在するポリヌクレオチド分子を抽出することができる薬剤及びポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、抽出した及び安定化したエボラＲＮＡをプライマーと接触させ、それによりエボラｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｃ）エボラｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、エボラｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、エボラアンプリコンの存在が試料中のエボラポリヌクレオチド分子を検出し、アンプリコンを検出できないことが試料中のエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチド分子が、試料を、試料中に存在するＲＮＡ分子を抽出することができる薬剤及びＲＮＡ分子を分解に対して安定化することができる薬剤の１つ又は複数と接触させるステップによって得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
アッセイの開始の７分後、１０分後、及び／又は１５分後に標的ポリヌクレオチドを欠く対照のアッセイにおいて検出可能なシグナルが存在しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）で使用したプライマーが、ステップ（ｂ）で使用したプライマーと同じ配列又は異なる配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）〜（ｃ）が単一の反応で実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
逆転写酵素及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが同じ又は異なる酵素である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）のｃＤＮＡが第一の反応器で生成され、次いでステップ（ｂ）が実施される第二の反応器に移される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
試料が体液である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
体液が、唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
体腔が腹膜腔又は囲心腔である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
検出の限界が１反応当たり１０又は２０コピーである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
約５、７、１０、１５、２０、２５又は３０分間で実施される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）〜（ｄ）が生体試料において実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
エボラＲＮＡが生体試料から精製も単離もされていない、請求項３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ポイントオブケア又は診断において携帯電池式装置で実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
別々の逆転写酵素プライマーは必要ではないが、フォワードプライマー及び／又はリバースプライマーが使用される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
試料が生体試料又は環境試料である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
生体試料が、対象、コウモリ、ブッシュミート、又は家畜から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
生体試料が、頬、鼻、目、直腸、及び膣からなる群から選択される粘膜のスワブ、又は皮膚である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
生体試料が、対象、剖検、又は培養培地から得られる組織試料である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
剖検が、ヒト、霊長動物、コウモリ、又は他の哺乳動物のものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
環境試料が、エボラウイルス感染を有するか、又は発症する傾向を有する、対象の生体液により汚染され得る材料である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
環境試料が、ベッド、シートクッション、ラグ、空調フィルター、又は他の材料である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ポリメラーゼが、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｋａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｃａ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇａｎ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｂｏ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ７０ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｓｐＴ３ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ５２ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び／又はそれらの断片の５’−エキソ−誘導体である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ニッキング酵素が、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、又はＮ．ＢｓｔＳＥＩの１つ又は複数である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
逆転写酵素が、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ、ＡＭＶ  ＲＴ、ＲＳＶ  ＲＴ、及び／又はそれらの変異体／誘導体である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
検出可能なプローブが分子ビーコンを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＥＢＯＶの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含む、請求項３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＢＯＶの増幅が、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを有するプローブを使用して検出される、請求項３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
プローブが、
5‘-CALRed610nm- gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
３’クエンチャーがＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＨＩＶの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含む、請求項３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ＨＩＶの増幅が、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcgを有するプローブを使用して検出される、請求項３〜３１、及び３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
デングウイルスの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含む、請求項３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
デングウイルスの増幅が、以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcgを有するプローブを使用して検出される、請求項３〜３１、及び３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含む、請求項３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
Ｂ型インフルエンザウイルスの増幅が、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggcを有するプローブを使用して検出される、請求項３〜３１、及び４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＢＶＤＶ１の検出のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含む、請求項３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ＢＶＤＶ１の増幅が、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcgを有するプローブを使用して検出される、請求項３〜３１、及び４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
蛍光色素がＣＡＬＲｅｄ６１０ｍｍであり、クエンチャーがＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
蛍光色素がＦＡＭ又はＦＩＴＣであり、クエンチャーがＢＨＱ１又はＤＡＢｓｙｌである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
フォワードプライマー又はリバースプライマーが、３’末端に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アルキル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）の１つ又は複数である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＲＮＡウイルス配列に特異的に結合するプライマー、ＲＮＡウイルスアンプリコンに特異的に結合する検出可能なプローブ、逆転写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを含む、ＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を検出するためのキット。
【請求項５１】
プライマーが、以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含む、ＥＢＯＶの検出のための、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
プローブが、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５３】
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
プローブが、
5’-CALRed610nm- gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
３’クエンチャーがＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含む、ＨＩＶの検出のための、請求項５０に記載のキット。
【請求項５７】
プローブが、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcgを含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５８】
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含む、デングウイルスの検出のための、請求項５０に記載のキット。
【請求項５９】
プローブが以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcgを含む、デングウイルスの検出のための、請求項５０に記載のキット。
【請求項６０】
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のための、請求項５０に記載のキット。
【請求項６１】
プローブが、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggcを含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のための、請求項５０に記載のキット。
【請求項６２】
プライマーが、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含む、ＢＶＤＶ１の検出のための、請求項５０に記載のキット。
【請求項６３】
プローブが、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcgを含む、ＢＶＤＶ１の検出のための、請求項５０に記載のキット。
【請求項６４】
プローブが、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する、請求項５０、５７、５９、６１、及び６３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６５】
蛍光色素がＣＡＬＲｅｄ６１０ｍｍであり、クエンチャーがＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌである、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
蛍光色素がＦＡＭ又はＦＩＴＣであり、クエンチャーがＢＨＱ１又はＤＡＢｓｙｌである、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU];
以下のプローブ：
gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにエボラポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてエボラポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
【請求項６８】
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcg；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにＨＩＶポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてＨＩＶポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
【請求項６９】
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcg；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにデングウイルスポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてデングウイルスポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
【請求項７０】
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT;
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにＢ型インフルエンザウイルスポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてＢ型インフルエンザウイルスポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
【請求項７１】
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数、
以下のプローブ：
gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、並びにＢＶＤＶ１ポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含む、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてＢＶＤＶ１ポリヌクレオチド分子を増幅するためのキット。
【請求項７２】
ウイルスのポリヌクレオチド抽出のための凍結乾燥溶解試薬又はＲＮＡ安定化試薬を含み得るか又は含み得ないキャピラリーチューブをさらに含む、請求項５０〜７１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７３】
逆転写酵素及び／又は増幅反応を実施するのに好適な緩衝液を含む１つ又は複数の器をさらに含む、請求項５０〜７２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７４】
逆転写酵素、ニッキング酵素、及び凍結乾燥形態の鎖置換ポリメラーゼを含む器をさらに含む、請求項５０〜７３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７５】
ＲＮＡウイルスを有するヒト又は動物の対象を診断する方法であって、
（ａ）対象の試料を、試料中に存在するＲＮＡウイルスを抽出することができる薬剤及び抽出したポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、ポリヌクレオチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりポリヌクレオチド分子のｃＤＮＡコピーを生成するステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワードプライマー及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を有し、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、ＲＮＡウイルスのアンプリコンの存在が対象のＲＮＡウイルス感染を診断し、アンプリコンを検出できないことが対象のＲＮＡウイルス感染の非存在を診断する、ステップ
を含む、方法。
【請求項７６】
ＲＮＡウイルスが、エボラウイルス、ＨＩＶ、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ラッサウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、又は一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ウイルスを抽出することができる薬剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、及び／又は塩酸グアニジンの１つ又は組合せである、請求項７５又は７６に記載の方法。
【請求項７８】
医療従事者の毎日のスクリーニングに使用される、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
試料がプールされ、ヒト又は動物の集団においてスクリーニングが実施される、請求項７７〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／０６６，２７７号及び２０１５年１月１５日に出願された米国仮特許出願６２／１０４，００８号の優先権並びに利益を主張する。これらの出願のそれぞれの全内容はここで本明細書に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
エボラウイルスは出血熱を引き起こし、死亡率が感染したヒトの５０％〜９０％に達する。エボラウイルス（ＥＢＯＶ）は、４つの種、ザイールＥＢＯＶ、スーダンＥＢＯＶ、コートジボアールＥＢＯＶ、レストンＥＢＯＶを含む。エボラウイルスによるヒトへの感染は典型的には、エボラウイルスに感染した動物又は患者の汚染血液、組織、及び／又は排泄物との接触によって生じる。患者は、典型的にはエボラ感染の４〜１０日後に症状を示す。この長い潜伏期間は、保有者が疾病の任意の兆候を表す前に、ウイルスが新しい地域へと運ばれる機会を与える。エボラの症状は、発熱、悪寒、吐き気、及び筋肉痛を含む。そのような症状は、様々な疾病で現れるため、初期ではエボラ感染が誤診され、それにより疾患の蔓延が助長され得る重大なリスクがある。後期では、エボラ−感染対象は、典型的には嘔吐、下痢、咳、血管症状、頭痛、錯乱、昏睡、粘膜出血、血性下痢、及び最終的には多臓器不全を発症して死亡する。エボラ患者の体液は感染性が高く、エボラ患者の死体も同様である。
【０００３】
西アフリカにおける２０１４年後半のエボラ感染が、１週間当たり１０，０００人に上ると予想されるように、エボラ感染の公衆衛生上の懸念が高まっている。医療従事者は、エボラ患者の体液に曝露されるため、感染した患者からエボラがうつるリスクがある。接触の程度及び頻度が増加すると、感染のリスクが高まる。１９７６年のスーダンエボラ大流行では、エボラ患者を看護する医療従事者の８１％がウイルスに感染した。医療スタッフ及び医療従事者の不必要な感染を避けるために、適切な感染対策を設け、伝染のリスクを最小限にするようなエボラの早期の検出が重要である。
【０００４】
西アフリカでも国際的にもエボラの蔓延を止めるために、感染した対象はすぐに隔離され、適切な保護具がこれらの対象をケアする医療従事者に使用され得るような迅速な診断が必須である。高力価の感染性フィロウイルスが、疾病の初期に血液及び組織に存在する。現在、エボラは、ウイルス単離、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、抗原捕捉酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫染色による抗原検出、及び真性ウイルス抗原を使用するＩｇＧ−及びＩｇＭ−ＥＬＩＳＡによって同定される。残念ながら、これらの試験は、精製及び単離されたＲＮＡにしか実施することができず、エボラが風土病である多くの地域では不足している実験道具及び熟練の技術者の利用を必要とするため、時間がかかる。
【０００５】
したがって、エボラウイルスに感染した患者を迅速に同定する改善された方法が緊急に必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、粗生体試料において抽出したＲＮＡで実施できる等温核酸増幅反応を使用する、エボラ感染を迅速に同定する方法を提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、逆転写とカップリングされた等温増幅反応において特定の標的ポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ）を検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、試料中の標的ポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワード及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在する標的ポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中の標的ポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ；
を含む、方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、試料中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、生体試料中のＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワード及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子の存在又は量を示し、アンプリコンを検出できないことがＲＮＡウイルスの非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
【０００９】
関連する態様では、本発明は、試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、生体試料中のエボラポリヌクレオチド分子をプライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させるステップであって、フォワード及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｃ）アンプリコンへの検出可能なオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出するステップであって、シグナルの検出が試料中に存在するエボラポリヌクレオチドの存在又は量を示し、シグナルを検出できないことが試料中に存在するエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
【００１０】
上記の態様の様々な実施形態又は本明細書に記述する本発明の任意の他の態様では、エボラポリヌクレオチドは、生体試料を試料中に存在するＲＮＡ分子を抽出することができる薬剤及びＲＮＡ分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップにより得られる。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）生体試料を、試料中に存在するポリヌクレオチド分子を抽出することができる薬剤及びポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、抽出した及び安定化したエボラＲＮＡをプライマーと接触させ、それによりエボラｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｃ）エボラｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプライマーはそれぞれ、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持ち、エボラｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、エボラアンプリコンの存在が試料中のエボラポリヌクレオチドを検出し、アンプリコンを検出できないことが試料中のエボラポリヌクレオチドの非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、ＲＮＡウイルス配列に特異的に結合するプライマー、ウイルス（例えば、エボラ）アンプリコンに特異的に結合する検出可能なプローブ、逆転写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを含むＲＮＡウイルスポリヌクレオチド分子を検出するキットを提供する。一実施形態では、プライマーは、以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含有し、プローブは、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを含有する。
【００１３】
別の実施形態では、プローブは、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又はその逆を有する。一実施形態では、プローブは、
5’-CALRed610nm- gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3’
である。一実施形態では、３’クエンチャーはＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、
以下のプライマー：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]；
以下のプローブ：
gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc；
逆転写酵素、ニッキング酵素、鎖置換ポリメラーゼ、及びエボラポリヌクレオチド分子を検出するための上記プライマー、プローブ、及び酵素の使用のための指示書を含有する、逆転写酵素ニッキング増幅反応においてエボラポリヌクレオチド分子を増幅するためのキットを提供する。
【００１５】
一実施形態では、キットは、ウイルスのポリヌクレオチド抽出のための凍結乾燥溶解又はＲＮＡ安定化試薬を含有しても含有しなくてもよいキャピラリーチューブをさらに含有する。別の実施形態では、キットは、逆転写酵素及び／又は増幅反応を実施するのに好適な緩衝液を含有する１つ又は複数の器をさらに含有する。別の実施形態では、キットは、逆転写酵素、ニッキング酵素、及び鎖置換ポリメラーゼを凍結乾燥形態で含有する器をさらに含有する。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、ＲＮＡウイルスを有するヒト又は動物対象を診断する方法であって、
（ａ）対象の試料を、試料中に存在するＲＮＡウイルスを抽出することができる薬剤及び抽出したポリヌクレオチド分子を分解に対して安定化することができる薬剤と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、ポリヌクレオチド分子を逆転写酵素プライマーと接触させ、それによりポリヌクレオチド分子のｃＤＮＡコピーを生成するステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプライマーは、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、ＲＮＡウイルスのアンプリコンの存在が対象のＲＮＡウイルス感染を診断し、アンプリコンを検出できないことが対象のＲＮＡウイルス感染の非存在を診断する、ステップ
を含む、を提供する。
【００１７】
本明細書に記述の任意の態様の様々な実施形態では、アッセイの開始の７分後、１０分後、及び／又は１５分後に標的ポリヌクレオチドを欠く対照のアッセイにおいて検出可能なシグナルが存在しない。本明細書に記述の任意の態様の他の実施形態では、ステップ（ａ）で使用したプライマーは、ステップ（ｂ）で使用したプライマーと同じ配列又は異なる配列を有する。上記の任意の他の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｃ）は単一の反応で実施される。上記の態様のさらに他の実施形態では、逆転写酵素及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは同じ又は異なる酵素である。さらに他の実施形態では、ステップ（ａ）のｃＤＮＡは第一の反応器で生成され、次いでステップ（ｂ）が実施される第二の反応器に移される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子はエボラポリヌクレオチドである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、試料は体液（例えば唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿）である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、体腔は腹膜腔又は囲心腔である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、検出の限界は１反応当たり１０又は２０コピーである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、本方法は、約５、７、１０、１５、２０、２５又は３０分間実施される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ステップａ〜ｄは生体試料において実施される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、エボラ又は他のウイルスＲＮＡは生体試料（例えば、粗製）から精製も単離もされない。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、本方法は、ポイントオブケア又は診断において携帯電池式装置で実施される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、別々の逆転写酵素プライマーは必要ではないが、フォワード及び／又はリバースプライマーが使用される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、試料は生体試料又は環境試料である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、生体試料は、対象、コウモリ、ブッシュミート、又は家畜から得られる。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、生体試料は、頬、鼻、目、直腸、及び膣のいずれか１つ又は複数である粘膜のスワブ又は皮膚である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、生体試料は、対象、剖検、又は培養培地から得られる組織試料である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、剖検はヒト、霊長動物、コウモリ、又は他の哺乳動物のものである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、環境試料は、エボラウイルス感染を有する、又は発症する傾向を有する対象の生体液により汚染され得る材料である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、環境試料は、ベッド、シートクッション、ラグ、空調フィルター、又は他の材料である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ポリメラーゼは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｓｔＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｋａＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｃａＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧａｎＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｂｏＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ７０ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＧｓｐＴ３ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｐ５２ＤＮＡポリメラーゼＩ、及び／又はそれらの断片の５’−エキソ−誘導体である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ニッキング酵素は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、又はＮ．ＢｓｔＳＥＩの１つ又は複数である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ、ＡＭＶ  ＲＴ、ＲＳＶ  ＲＴ、及び／又はそれらの変異体／誘導体である。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、検出可能なプローブは分子ビーコンを含有する。本明細書に記述の任意の態様の様々な実施形態では、増幅プライマー（例えば、フォワード及び／又はリバースプライマー）は、３’末端領域又は認識領域に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、増幅プライマーは、３’末端に、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アルキル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、２’−ＬＮＡ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）を含む、１つ又は複数の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。
【００１８】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、エボラウイルスの検出のためのフォワード及びリバースプライマーはそれぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGCTTCCA[MeOC]AGTTATC[MeOU][MeOA][MeOC][MeOC][MeOG]
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGAAATGC[MeOA]ACGA[MeOC][MeOA][MeOC][MeOC][MeOU]
を含有する。
【００１９】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagcを有するプローブを使用して検出される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、プローブは、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又はその逆を有する。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、プローブは、
5‘-CALRed610nm- gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc BHQ2- 3’又は
5’-FAM又はFITC - gctacACGACTTTYGCTGAAGgtagc-BHQ1-3”
である。
【００２０】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、３’クエンチャーはＤＡＢｓｙｌによって置き換えられる。
【００２１】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ＨＩＶウイルスの検出のためのフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCGGAGGmCmTmAmGmAmAmG、
GACTCGATATCGAGTCTGACTAGmCAGAGGmCmTmAmGmAmAmG；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTATTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC、
GACTCGATATCGAGTCTACTGACmGCTCmTmCmGmCmAmC
の１つ又は複数を含有する。
【００２２】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：cgcaagGGAGAGAGATGGGTGcttgcgを有するプローブを使用して検出される。
【００２３】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、デングウイルスの検出のためのフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCAAAAACmAGCATATTmGmAmCmGmC；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmCmTmGmG、
GACTCGATATCGAGTCAGACAGCmAGGATCmTmGmTmGmG
の１つ又は複数を含有する。
【００２４】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：cgcatcTGGTCTTTCCCAGCgatgcgを有するプローブを使用して検出される。
【００２５】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出のためのフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmAATGGTCTCmAmGmCmTmA、
GACTCGATATCGAGTCAAATGCAmGATGGTTTCmAmGmCmTmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCCTTmTCCCATTCCATmTmCmAmTmT、
GACTCGATATCGAGTCCTCCTTTmCCCCATTCCATmTmCmAmTmT
の１つ又は複数を含有する。
【００２６】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：gccaaGCTATGAACACAGCAAActtggcを有するプローブを使用して検出される。
【００２７】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ＢＶＤＶ１ウイルスの検出のためのフォワード及びリバースプライマーは、それぞれ以下の配列：
フォワードプライマー：
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGTATTGCTmAmCmTmGmAmAmA、
GACTCGATATCGAGTCGGCCCACmTGCACTGCTmAmCmTmAmAmAmA；及び
リバースプライマー：
GACTCGATATCGAGTCTGTGATCmAACTCCmAmTmGmTmGmCmC
の１つ又は複数を含有する。
【００２８】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、増幅は、以下の配列：cgctacATCTCTGCTGTACATGgtagcgを有するプローブを使用して検出される。
【００２９】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、プローブは、５’末端に蛍光色素及び３’末端にクエンチャー、又は３’末端に蛍光色素及び５’末端にクエンチャーを有する。特定の実施形態では、蛍光色素はＣＡＬＲｅｄ６１０ｍｍであり、クエンチャーはＢＨＱ２又はＤＡＢｓｙｌである。特定の実施形態では、蛍光色素はＦＡＭ又はＦＩＴＣであり、クエンチャーはＢＨＱ１又はＤＡＢｓｙｌである。
【００３０】
本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、エボラウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デングウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ｂ型インフルエンザ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（例えば、ＢＶＤＶ遺伝子型Ｉ）、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、又は一本鎖ＲＮＡウイルスである。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、ウイルスを抽出することができる薬剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、及び／又は塩酸グアニジンの１つ又は組合せである。様々な実施形態では、チオシアン酸グアニジン又はウイルスを抽出することができる他の薬剤は、約０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、７．５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２５０、５００ｍＭ又はそれ以上の濃度で使用される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、本方法は、医療従事者の毎日のスクリーニングに使用される。本明細書に記述の任意の態様のさらに他の実施形態では、試料がプールされ、ヒト又は動物集団においてスクリーニングが実施される。
定義
「エボラウイルス（ＥＢＯＶ）」は、エボラウイルスと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するフィロウイルス科ウイルスを意味する。エボラウイルスの例としては、限定はされないが、ヒトで疾患を引き起こすエボラ−ザイールウイルス、エボラ−スーダンウイルス、エボラ−コートジボアールウイルス、及びエボラ−ブンディブギョウイルス、又は非ヒト霊長動物に影響を及ぼすエボラ−レストンウイルスが挙げられる。
【００３１】
例示的なエボラザイールゲノムの配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＫＣ２４２８００．１で提供され、以下に再現される。
【００３２】
【化１−１】
2017536813.tif 000003
【００３３】
【化１−２】
2017536813.tif 000004
【００３４】
【化１−３】
2017536813.tif 000005
【００３５】
【化１−４】
2017536813.tif 000006
【００３６】
【化１−５】
2017536813.tif 000007
【００３７】
【化１−６】
2017536813.tif 000008
【００３８】
【化１−７】
2017536813.tif 000009
【００３９】
【化１−８】
2017536813.tif 000010
【００４０】
本発明は、この配列と少なくとも約８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチドをさらに提供する。他のエボラザイールゲノムは当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＢａｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４；３７１：１４１８〜２５に記載される。
【００４１】
「リボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ成分Ｈ１（ＲＰＰＨ１）」は、ｔＲＮＡ前駆体分子を切断し、それらのｔＲＮＡ配列の成熟５’プライム末端を形成するＲＮａｓｅＰリボ核タンパク質のＲＮＡ成分、エンドヌクレアーゼを意味する。例示的な核酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＲ＿００２３１２で提供される。
【００４２】
【化２】
2017536813.tif 000011
【００４３】
「アンプリコン」は、目的のポリヌクレオチドの増幅の間に生成されるポリヌクレオチドを意味する。一例では、アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応の間に生成される。
【００４４】
「増幅率モディファイヤー」は、ポリメラーゼの伸長率に影響を及ぼすことができる薬剤を意味する。
【００４５】
「塩基置換」は、相補的なヌクレオチド鎖間のハイブリダイゼーションの重大な破壊を引き起こさないヌクレオ塩基ポリマーの置換を意味する。
【００４６】
本開示では、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」及び「有する（having）」等は、米国特許法のそれらに帰する意味を有することができ、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味することができ；「から本質的になる（consisting essentially of）」又は「本質的になる（consists essentially）」は同様に米国特許法に帰する意味を有し、用語はオープンエンド型であり、列挙したよりも多くの存在により、列挙したその基本的な又は新規の特徴が変更されない限り、列挙したよりも多くの存在を可能にするが、先行技術の実施形態を除外する。
【００４７】
「相補的」又は「相補性」は、伝統的なワトソン・クリック型又はフーグスティーン型塩基対のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成することができる核酸を意味する。相補的な塩基対はＧ−Ｃ及びＡ−Ｔ塩基対だけでなく、イノシンなどユニバーサル塩基を含む塩基対も含む。パーセント相補性は、第二の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック型塩基対）を形成することができる、核酸分子中の連続した残基のパーセンテージを示す（例えば、第一のオリゴヌクレオチドにおいて合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドが１０ヌクレオチドを有する第二の核酸配列と塩基対を形成すると、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的であること表す）。少なくとも特定のパーセンテージのパーセント相補性を決定するため、第二の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック型塩基対）を形成することができる核酸分子の連続する残基のパーセンテージを算出し、四捨五入した（例えば、２３ヌクレオチドを有する第二の核酸配列と塩基対を形成する第一のオリゴヌクレオチドの全部で２３ヌクレオチドのうち、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７ヌクレオチドは、それぞれ５２％、５７％、６１％、６５％、７０％、及び７４％を表し、それぞれ少なくとも５０％、５０％、６０％、６０％、７０％、及び７０％の相補性を有する）。本明細書で使用する場合、「実質的に相補的」は、生物学的条件下でハイブリダイズすることができるような鎖間の相補性を指す。実質的に相補的な配列は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％もの相補性を有する。さらに、それらのヌクレオチド配列を調べることにより、２本の鎖が生物学的条件下でハイブリダイズすることができるか調べる技術は当技術分野で周知である。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「二重鎖」は、２つの一本鎖核酸の相互作用によって形成される二重らせん構造を指す。二重鎖は、典型的には、互いに逆平行の２つの一本鎖核酸の間で塩基の対の水素結合、すなわち「塩基対形成」によって形成される。二重鎖の塩基対形成は、通常ワトソン・クリック型塩基対形成によって起こり、例えばグアニン（Ｇ）はＤＮＡ及びＲＮＡでシトシン（Ｃ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）はＤＮＡでチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）はＲＮＡでウラシル（Ｕ）と塩基対を形成する。塩基対を形成することができる条件は、生理学的及び生物学的に適当な条件を含む（例えば、細胞内ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）。さらに、二重鎖は、隣接するヌクレオチド間の相互作用をスタッキングすることにより安定化される。本明細書で使用されるように、二重鎖は、塩基対形成により又はスタッキング相互作用により確立又は維持することができる。二重鎖は、実質的に相補的又は完全に相補的であり得る２つの相補的核酸鎖によって形成される。いくつかの塩基に渡って塩基対を形成する一本鎖核酸は「ハイブリダイズ」と呼ぶ。
【００４９】
「検出する」は、検出される分析物の存在、不在、又は量を同定することを指す。一実施形態では、分析物はエボラポリヌクレオチド又は他のＲＮＡウイルスポリヌクレオチドである。
【００５０】
「検出可能な部分」は、目的の分子に結合した場合、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段によってその分子を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識は、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるように）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンを含む。
【００５１】
「断片」は、核酸分子の部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照の核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を含有する。断片は、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチドを含有し得る。一実施形態では、断片は、エボラポリヌクレオチド又は他のＲＮＡウイルスポリヌクレオチドの少なくとも約５０、７５、８０、８５、８９、９０、又は１００ヌクレオチドを含む。
【００５２】
「自由エネルギー（ΔＧ）」は、式：ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳによって記載される一定温度及び圧力で系とその環境の間の正味のエネルギー交換を意味する。自由エネルギーは、熱力学的に安定な（すなわち、低いΔＧを有する構造は、高いΔＧを有するものよりも安定である）ネガティブΔＧ（例えば、ｋｃａｌ／ｍｏｌｅで表される）を有する構造の形成により、構造がどの程度熱力学的に安定かを表す。一定の圧力及び温度で系が平衡に達する場合、熱力学ポテンシャルは最小限である。
【００５３】
「ハイブリダイズ」は、ストリンジェンシーの様々な条件下で相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）、又はその部分間の二本鎖分子を形成することを意味する。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照）。ハイブリダイゼーションは水素結合によって生じ、相補的なヌクレオ塩基間のワトソン・クリック型、フーグスティーン型、又は逆フーグスティーン水素結合であってよい。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成によって対をなす相補的なヌクレオ塩基である。
【００５４】
「単離したポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子が由来する生物体の天然のゲノムにおいて、遺伝子に隣接する遺伝子がない核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を意味する。したがって、用語は、例えば、ベクター；自律複製プラスミド又はウイルス；又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる又は他の配列に非依存的な別々の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるｃＤＮＡ又はゲノム若しくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。さらに、用語は、ＤＮＡ分子並びにさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡから転写されるＲＮＡ分子を含む。
【００５５】
用語「単離した」、「精製した」、又は「生物学的に純粋な」は、材料が、その天然の状態で見出されるような通常それに付随する成分を様々な程度で含まないことを指す。「単離する」は、供給源又は周囲からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を示す。「精製した」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさない、又は他の有害な結果を引き起こさないように、他の材料をそれほど含まない。すなわち、本発明の核酸又はペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって製造される場合は細胞物質、ウイルス性物質、若しくは培養培地、又は化学的に合成される場合は化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まなければ、精製されている。純度及び均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製した」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルでほぼ１つのバンドを生じることを意味することができる。例えばリン酸化又はグリコシル化などの修飾にさらされるタンパク質については、様々な修飾が様々な単離したタンパク質を生じ、それらのタンパク質は別々に精製することができる。
【００５６】
「融解温度（Ｔｍ）」は、分子集団の５０％がある状態であり、その集団の５０％が別の状態である平衡な系の温度を意味する。本発明の核酸に関して、Ｔｍは集団の５０％が一本鎖であり、５０％が二本鎖（例えば、分子内又は分子間）である温度である。
【００５７】
「反応のモニタリング」は、反応の進行を検出することを意味する。一実施形態では、反応の進行のモニタリングは、ポリメラーゼ伸長の検出及び／又は増幅反応の完了の検出を含む。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「薬剤を得る」のように「得る」は、薬剤の合成、購入、又はその他の獲得を含む。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチド、及び一本鎖又は二本鎖形態のそのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された主鎖残基又は連結を含有し、合成、天然、及び非天然であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似の形で代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｆヌクレオチド）が挙げられる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペントース環、又はリン酸基に対して１つ又は複数の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを除く。修飾は、メチル基転移酵素などヌクレオチドを修飾する酵素による修飾によって生じる天然のものを含む。修飾ヌクレオチドはまた、合成又は非天然のヌクレオチドも含む。ヌクレオチドの合成又は非天然の修飾は、２’修飾、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル（ＲＮＡ）、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）を有するもの又は塩基類似体を含むものを含む。
【００６１】
「ヌクレオチド付加物」は、標準的なヌクレオチド塩基に共有結合によって結合される又はそうでなければ固定される部分を意味する。
【００６２】
「ニッキング剤」は、二本鎖核酸分子の特定の構造を認識してそれに結合し、その認識される特定の構造に結合すると一本鎖上の隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を切断し、それにより、ニック部位に先行する末端ヌクレオチドに遊離３’−ヒドロキシル基を作ることができる化学実体を意味する。好ましい実施形態では、３’末端はエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによって伸長することができる。例示的なニッキング剤は、ニッキング酵素、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、及び遷移金属キレート剤を含む。
【００６３】
「パリンドローム」は、１つの鎖で５’から３’、又は相補鎖で５’から３’へと読んだ場合、互いに同一又は実質的に同一である核酸配列を意味する。完全なパリンドロームは、１つのサブ配列が５’から３’方向へ読まれる場合、それが３’から５’方向へと読まれる他のサブ配列と同一であるような２つの隣接するサブ配列を有する配列を指す。
【００６４】
「ポリメラーゼ休止分子」は、ポリヌクレオチド鋳型上のポリメラーゼの進行を防ぐ又は著しく減少するポリヌクレオチド鋳型／プライマーと関連する部分を意味する。好ましくは、その部分はポリヌクレオチドに組み込まれる。好ましい一実施形態では、その部分はポリメラーゼの鋳型上の進行を防ぐ。
【００６５】
「ポリメラーゼ伸長」は、鋳型ポリヌクレオチド上のポリメラーゼの結合パートナーと次に来るモノマーをマッチさせるポリメラーゼの前方向の進行を意味する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「プライマーダイマー」は、２つのモノマーオリゴヌクレオチドプライマーのダイマーを意味する。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーでは、モノマープライマーの５’テール領域がダイマー化する。
【００６７】
「半定量的」は、内部標準に基づく相対量の見積もりを提供することを意味する。
【００６８】
「特異的産物」は、プライマーオリゴヌクレオチドが相補的な標的配列にハイブリダイズした後、標的配列がポリメラーゼを介して伸長することによって生じるポリヌクレオチド産物を意味する。
【００６９】
「実質的に等温条件」は、単一の温度であるか、又は大きく変わらない温度の狭い範囲内にあることを意味する。一実施形態では、反応は、約１〜５℃のみ変わる（例えば、１、２、３、４、又は５℃変わる）温度で実施される実質的に等温条件下で実施される。別の実施形態では、反応は、利用する機器の操作パラメーター内の単一温度で実施される。
【００７０】
「量閾値方法」は、比較標準を量で超えるかまたは超えないかに基づく量の見積もりを提供することを意味する。
【００７１】
「参照」は、標準又は対照条件を意味する。当業者には明らかなように、適切な参照は要素の効果を決定するために要素が変更される。
【００７２】
「逆転写酵素」は、デオキシリボヌクレオチド並びに限定はされないが、緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）、ナトリウム及び／又はカリウムイオン、並びにマグネシウムイオンを含む許容的な反応媒体の存在下で、プライマーが作用した（primed）一本鎖ＲＮＡ鋳型鎖を相補的なＤＮＡ鎖へと複製する酵素を意味する。当業者には明らかなように、許容的な反応媒体の濃度及びｐＨ範囲は、特定の逆転写酵素に関して変わり得る。当業者に周知の好適な「逆転写酵素」の例は、限定はされないが、ＭｍＬＶ逆転写酵素及びその市販の誘導体「ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、「ＭａｘｉＳｃｒｉｐｔ」（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ＲＳＶ逆転写酵素及びその市販の誘導体「ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ」（Ｑｉａｇｅｎ）、ＡＭＶ逆転写酵素及びその市販の誘導体「Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ」（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。
【００７３】
「対象」は、限定はされないが、ヒト又はウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコなどの非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物を意味する。
【００７４】
「標的核酸分子」は、分析されるポリヌクレオチドを意味する。そのようなポリヌクレオチドは、標的配列のセンス又はアンチセンス鎖であり得る。用語「標的核酸分子」は、元々の標的配列のアンプリコンも指す。
【００７５】
本明細書に提供される範囲は、範囲内の全ての値の簡略表記法であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群の任意の数、数の組合せ、又は部分範囲を含むと理解される。
【００７６】
具体的に述べない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、用語「又は」は、包括的であると理解される。具体的に述べない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、単数又は複数であると理解される。
【００７７】
具体的に述べない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、用語「約」は、当技術分野の一般公差の範囲内、例えば平均の２標準偏差内であると理解される。約は、述べた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解され得る。文脈から明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、用語約によって修飾される。
【００７８】
本明細書の変数の任意の定義における化学基の列挙の記載は、その変数が任意の単一の基又は列挙した基の組合せである定義を含む。本明細書の変数の実施形態又は態様の記載は、実施形態が任意の単一の実施形態又は任意の他の実施形態との組合せ又はそれらの一部であることを含む。
【００７９】
本明細書で提供される任意の組成物又は方法は、本明細書で提供される１つ又は複数の任意の他の組成物及び方法と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】エボラウイルス（ＥＢＯＶ）の候補アッセイの設計を例示する模式図である。
【図２】試験した様々なプローブ及びプライマー、並びにアッセイ開発において使用したエボラｇＢｌｏｃｋ配列を示す図である。ｇＢｌｏｃｋは、インビトロで合成一本鎖オリゴヌクレオチドと完全にアセンブルされる１００ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲のサイズのＤＮＡの合成二本鎖断片であり、ゲノムＤＮＡの配列確認済みの合成ブロックを表す。具体的に述べない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、「ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）」は、天然の標的配列又は標的ゲノムが入手できない及び／又は有用でない場合には合成標的核酸として使用される。任意の標的配列のゲノムＤＮＡの配列を確認したブロックは、ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．からカスタム注文サービスで入手でき（１７１０  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐａｒｋ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ  ５２２４１、ＵＳＡ）、用語「ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）」はその会社の登録商標である。
【図３Ａ−３Ｘ】アッセイ１及びアッセイ２で得た増幅結果を示す図である。
【図４】ワンステップアッセイにおける全ヒトＲＮＡバックグラウンドでのエボラウイルスの検出を示す図である。
【図５】ワンステップアッセイにおける全ヒトＲＮＡバックグラウンドでの合成エボラウイルスＲＮＡの検出を示す図である。
【図６Ａ−６Ｃ】例えば、ハンドヘルド装置を含む増幅及び検出機器における使用のための試料の処理を例示するフローチャートを示す図である。図６Ａは、安定化／溶解試薬（例えば、グアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ））がキャピラリーチューブ内で凍結乾燥されることを示す。図６Ｂは、凍結乾燥ＧＩＴＣ及び緩衝液を含浸させた紙（例えば、Ｗｈａｔｍａｎｔｍ（商標）  ＦＴＡｔｍ（商標）  Ｅｌｕｔｅカード）の使用を例示する。図６Ｃは、多重の（例えば、８ウェルストリップ）又は単一のチューブでの凍結乾燥アッセイ手順を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】試料調製方法を示す図である。図７Ａは、スワブ試料からの試料調製を示す。図７Ｂは、血液試料からの試料調製を示す。
【図８】逆転写酵素及びポリメラーゼが単一の反応に含まれる、ワンステップ反応工程で得られた結果を示すグラフである。
【図９】逆転写酵素反応が室温又は５６℃で実施され、ｃＤＮＡを、増幅反応が５６℃で実施される２番目のチューブに移すツーステップ反応工程で得られた結果を示すグラフである。
【図１０】１×１０ｅ４コピーの、５６℃でのＲＴ、５６℃でのＤＮＡｂｌｅを示すグラフである。
【図１１Ａ−１１Ｂ】全細胞ＲＮＡを含有する試料の標的ＲＮＡの検出を示すグラフである。図１１Ａは、２−ステップ反応でＲＰＰＨ１（ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ成分）の検出を示すグラフである。図１１Ｂは、１−ステップ反応でＲＰＰＨ１の検出を示すグラフである。
【図１２】１−ステップ反応で粗血液調製物におけるザイールエボラの検出を示すグラフである。
【図１３】スーダンエボラボニファス株ではなく、ザイールエボラメインガ株を特異的に検出するザイールエボラアッセイを示すグラフである。
【図１４】ザイールエボラウイルスメインガ株の様々な希釈の検出のための機器比較を示すグラフである。
【図１５Ａ−１５Ｄ】エボラウイルスアッセイの検出の限界を示すグラフである。図１５Ａは、１００コピーのエボラウイルス標的ＲＮＡを含有する試料における検出を示すグラフである。図１５Ｂは、５０コピーのエボラウイルス標的ＲＮＡを含有する試料における検出を示すグラフである。図１５Ｃは、２５コピーのエボラウイルス標的ＲＮＡを含有する試料における検出を示すグラフである。図１５Ｄは、１２コピーのエボラウイルス標的ＲＮＡを含有する試料における検出を示すグラフである。
【図１６Ａ−１６Ｂ】ワンステップアッセイでのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の検出を示す図である。図１６Ａは、アッセイプライマー及びプローブの設計に使用される配列を示すアンプリコンマップである。フォワード及びリバースプライマーの集団の配列変異を示す。外側プライマー配列は、ＨＩＶサブタイプＣ（使用した精製ＲＮＡ試料に関して）に特異的である。図１６Ｂは、ワンステップアッセイでのＨＩＶのリアルタイム標的特異的な増幅を示す。Ｃｐ値は、各コピー数に関して５つの技術的な複製物に渡って示す（１０μＬ反応物）。ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１  ｖ２．０試験で定量した場合、精製ＨＩＶ  ＲＮＡ（サブタイプＣ）（ＳｅｒａＣａｒｅ）のコピーを示す。
【図１７Ａ−１７Ｂ】ワンステップアッセイでのデングウイルス４型（ＤＥＮＶ−４）の検出を示す図である。図１７Ａは、アッセイプライマー及びプローブの設計に使用される配列を示すアンプリコンマップである。リバースプライマーの集団の配列変異を示す。図１７Ｂは、ワンステップアッセイでのＤＥＮＶ−４のリアルタイム標的特異的増幅を示す。Ｃｐ値は４つの技術的な複製物に渡って示す（１０μＬ反応物）。細胞培養から単離した全ＲＮＡ（２０ｐｇ）は、ウイルスと宿主細胞ＲＮＡの両方を含み、ウイルスＲＮＡの全コピー数は未知である。
【図１８Ａ−１８Ｂ】ワンステップアッセイでのＢ型インフルエンザの検出を示す。図１８Ａは、アッセイプライマー及びプローブの設計に使用される配列を示すアンプリコンマップである。フォワード及びリバースプライマー並びに外側プライマーの集団の配列変異を示す。図１８Ｂは、ワンステップアッセイのＢ型インフルエンザのリアルタイム標的特異的増幅を示す。Ｃｐ値は４つの技術的な複製物に渡って示す（１０μＬ反応物）。細胞培養から単離した全ＲＮＡ（２０ｐｇ）は、ウイルスと宿主細胞ＲＮＡの両方を含み、ウイルスＲＮＡの全コピー数は未知である。試料１及び２は、異なるウイルス単離体である。
【図１９Ａ−１９Ｂ】ワンステップアッセイでのウシウイルス性下痢ウイルス遺伝子型１（ＢＶＤＶ１）の検出を示す。図１９Ａは、アッセイプライマー及びプローブの設計に使用される配列を示すアンプリコンマップである。フォワードプライマーの集団の配列変異を示す。図１９Ｂは、ワンステップアッセイでのウシウイルス性下痢ウイルス遺伝子型１（ＢＶＤＶ１）のリアルタイム標的特異的増幅を示す。技術的な複製物（１０μＬ反応物）を示す。細胞培養から単離した全ＲＮＡ（２０ｐｇ）は、ウイルスと宿主細胞ＲＮＡの両方を含み、ウイルスＲＮＡの全コピー数は未知である。細胞培養粗溶解物を希釈せずに及び１：１００希釈で使用した。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
本発明は、粗生体試料において抽出したＲＮＡで実施できる等温核酸増幅反応を使用する、ＲＮＡウイルス感染（例えば、エボラウイルス）を迅速に同定する方法を提供する。
【００８２】
エボラは、診断及び区別が臨床的に難しい。エボラが疑われる症例では、迅速及び確かな検査診断が必要である。本発明は、そのようなアッセイを提供する。本発明は、エボラウイルスポリヌクレオチドのワンステップ又はツーステップリアルタイム逆転写−等温増幅アッセイで、エボラウイルスのポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）が検出できる発見に少なくとも部分的に基づく。
エボラウイルス
エボラウイルスは、ネガティブセンスＲＮＡゲノムを有する糸状ウイルスである。ウイルス粒子は、ウイルスエンベロープ、マトリックス、及びヌクレオキャプシド成分を含有し、およそ直径８０ｎｍ及び長さ８００〜１０００ｎｍの、円柱状／管状である。エボラは、バイオセイフティーレベル４に分類される。エボラウイルス出血熱の潜伏期間は、通常５〜１８日であるが、罹患したウイルス株及び感染した個体の状態によって２〜２１日に延長する場合がある。エボラウイルスは、素早く作用する。エボラの初期症状は、マラリア、インフルエンザ、又は様々な細菌感染の症状に似ている。したがって、エボラが診断される前に数日又は数週間経過する場合がある。続発症状は、下痢、赤目、吐血、鼻、口、又は直腸からの出血、及び脳での出血さえも含む。ウイルスが感染した個体の約５０〜９０％が全身性多臓器不全及び死へと進行する。
患者の診断及びモニタリング
生体試料におけるエボラウイルスポリヌクレオチドを検出するステップ及びこの検出をエボラ感染の存在と関連付けるステップにより、エボラを有する又は有さない患者の状態を診断することができる。一実施形態では、エボラウイルスを有する患者の疾患状態は、患者の生体試料においてエボラウイルスを検出する本発明の方法及び組成物を使用して検出することができる。例示的な生体試料は、体液（例えば、唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿）、組織抽出物、培養培地（例えば、病原性細胞など細胞が成長する液体）又は例えば対象の生体液に汚染されている可能性がある材料から得られる環境試料を含む。
【００８３】
一実施形態では、本発明は、逆転写酵素及びニッキング増幅反応において標的ポリヌクレオチドを増幅する方法であって、
（ａ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、標的ＲＮＡ分子（例えば、エボラウイルスゲノム）を逆転写酵素（ＲＴ）プライマーと接触させ、それによりｃＤＮＡを生成するステップ；及び
（ｂ）ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプライマーは、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持ち、ｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；
を含む、方法を提供する。
【００８４】
特定の一実施形態では、本発明は、生体試料中のエボラウイルスを検出する方法であって、
（ａ）試料を、試料中に存在するエボラＲＮＡを抽出することができる薬剤（例えば、ＳＤＳ、ラウリル硫酸ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン）及びエボラＲＮＡを分解に対して安定化することができる薬剤（例えば、ＳＤＳ、ＲＮＡａｓｅ阻害剤、ＲＮＡｓｅに対する抗体、競合ＲＮＡｓｅ阻害剤、又はインサイチュでＲＮＡを可逆的に化学的修飾することができる薬剤（例えば、無水酢酸））と接触させるステップ；
（ｂ）ｃＤＮＡ合成に許容的な条件下で、逆転写酵素及びｄＮＴＰの存在下、エボラＲＮＡをＲＴプライマーと接触させ、それによりエボラＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成するステップ；
（ｃ）エボラｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの等温増幅に許容的な条件下で、ニッキング酵素、ｄＮＴＰ、及び鎖置換ポリメラーゼの存在下、フォワード及びリバースプライマーと接触させ、それによりアンプリコンを生成するステップであって、フォワード及びリバースプライマーは、それらのそれぞれの５’末端領域内に少なくとも１つのニッキング酵素認識配列を持ち、エボラｃＤＮＡにそれらのそれぞれの３’末端領域で特異的に結合する、ステップ；及び、
（ｄ）アンプリコンを検出するステップであって、エボラウイルスアンプリコンの存在が試料中のエボラウイルス感染を検出し、アンプリコンを検出できないことがエボラウイルス感染の非存在を示す、ステップ
を含む、方法を提供する。
【００８５】
一実施形態では、本明細書に記載の本発明の方法は、５、７、１０、１５、２０、２５又は３０分間以内に結果を提供する。有利には、本発明の方法は、粗生体試料（例えば、唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿）から抽出されたが、精製も単離もされていないＲＮＡに適用できる。試験は現地（例えば、病院、診療所、医師のオフィス、外来治療施設、自宅、コミュニティーセンター、空港、船（例えば、クルーズ船、又はヒト若しくは動物を輸送するために使用される他の船）、電車若しくは駅、又は国へ入る地点（例えば、入国））で実施されるためである。有利には、一実施形態では、試験は携帯電池式装置（例えば、増幅器）で実施される。
【００８６】
一実施形態では、カオトロピック塩（例えば、ＧＩＴＣ、ＧＨＣＬ）又は界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ及びトリトン）を使用して、ＲＮＡは生体試料から抽出される。所望であれば、ＲＮＡｓｅ阻害剤が、抽出ステップの前、間、又は後に添加される。
【００８７】
別の実施形態では、逆転写酵素及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは全く同一のものである。
【００８８】
別の実施形態では、別のプライマーは必要ではなく、ＲＴプライマーはフォワード及び／又はリバースプライマーと同じである。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡ検出のためのＤｕａｌ  ＦＲＥＴ分子ビーコン（例えば、Ｓａｎｔａｇｅｌｏ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４；３２（６）：ｅ５７によって記載されるように）、ｄＮＴＰからのピロリン酸の濁度放出、及びマグネシウム又はカルシウムによる沈殿を使用する、ＥＢＯＶ又は他のウイルスアンプリコンの検出を提供する。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、エボラウイルスアンプリコンが対の結合パートナー（例えば、ビオチン及びストレプトアビジン）の１つのメンバーを含む横流れ型装置を使用し、横流れ型装置が対の他のメンバーを含み、アンプリコンの検出の手段（例えば、比色分析）を提供する、エボラウイルスアンプリコンの検出を提供する。
【００９１】
本発明の方法において使用する逆転写酵素は、限定はされないが、モロニー（Maloney）マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴ）及び野生型ＭＭＬＶ−ＲＴに対して変異を含むその誘導体又は変異体；トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ  ＲＴ）及びそれに対して熱安定性を付与する変異を含むその誘導体又は変異体、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ（例えば、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ、Ｑｉａｇｅｎ）及びその誘導体又は変異体、並びにパイロ逆転写酵素（例えば、ＰｙｒｏＳｃｒｉｐｔ、Ｌｕｃｉｇｅｎ）及びその誘導体又は変異体、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０９４，５３９号に記載のＲＴ、又は市販のＲＴ  ＰＣＲ及びトランスクリプトーム解析（例えば、Ｌｕｃｉｇｅｎ）用のハイフィデリティ熱安定性逆転写酵素を含む。
【００９２】
一実施形態では、５６℃でプライマー及びＲＮＡ又はアンプリコンは安定な複合体を形成する。一実施形態では、プライマー配列の５０％より多くが標的核酸分子と相補的でなければならない。一実施形態では、ＲＴプライマーは長さが約１８塩基である。一実施形態では、逆転写酵素（ＲＴ）プライマーは、ランダムプライマー（例えば、各配列位置において、４つの塩基のいずれか１つが可能であり、これらのプライマーのいずれかが標的とハイブリダイズする）である。一実施形態では、ＲＴプライマーは、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、又はノナマーである。
【００９３】
一実施形態では、ＲＴは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）由来、ＭＭＬＶ  ＲＴ（すなわち、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ／ＬｉｆｅＴｅｃｈ、Ｍａｘｉｍａ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）及び／又はその変異体／誘導体、ＡＭＶ  ＲＴ（すなわち、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ／ＬｉｆｅＴｅｃｈ）及び／又はその変異体／誘導体、ＲＳＶ  ＲＴ（すなわち、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ／Ｑｉａｇｅｎ）及び／又はその変異体／誘導体である。
【００９４】
本発明の方法は、高度な感受性を提供する。一実施形態では、ＥＢＯＶは、血液中１ｍｌ当たり１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又は１×１０９コピーのＥＢＯＶ  ＲＮＡが検出される。別の実施形態では、本発明は、１反応当たり約１〜１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）コピーの間のＲＮＡの検出を提供する。
【００９５】
ＥＢＯＶ（又は他のウイルス）は、ＥＢＯＶ感染を有する又は有する疑いのある対象から試料（例えば生体試料）を得ることによって、又はエボラウイルス又はＥＢＯＶ含有生体液に汚染されている又は汚染されている疑いのある家、病室、輸送手段からの環境試料を得ることによって検出される。一実施形態では、生体試料は、血液試料、粘液試料、排泄物を得ることによって、又は患部組織を拭き取ることによって得られる。スワブは鼻、喉、目、又は他の粘膜から採取することができる。剖検では、試料は死者の血液又は組織から集めることができる。
【００９６】
有利には、本発明の診断方法は、事実上いずれの設定での使用にも好適である。ＥＢＯＶは、リベリア、ナイジェリア、ギニア、及びシエラレオネを含む西アフリカのほとんどで風土病である。西アフリカの多くの地域で、基礎医学設備及び診断施設が利用できない。本発明は、電気が利用できない地域での生体試料の試験によく適している電池式ハンドヘルド装置で使用することができる。さらに、本方法は、十分に簡単であり、診断技術の使用の訓練が制限される医療従事者によって容易に実施することができる。
【００９７】
本発明は、粗生体試料において抽出したＲＮＡで実施できる等温核酸増幅反応を使用する、ＥＢＯＶ又は他のウイルス感染を迅速に同定する方法を提供する。
【００９８】
疾患過程の初期には、対象の生体試料、例えば血液試料には低レベルのウイルスのみが存在する。所望であれば、例えば、ＰＥＧ及びＮａＣｌの添加により試料からウイルス粒子を沈殿し、次いでナノポアフィルターを使用して試料からウイルス粒子を濾過し、それによりウイルスポリヌクレオチドの早期の検出を提供することによって、試料中に存在するウイルス粒子は当技術分野で公知の方法を使用して増やされる。
【００９９】
エボラウイルス（又は他のウイルス）に曝露された可能性のある対象の疾患状態又は治療は、本発明の方法及び組成物を使用してモニターすることができる。一実施形態では、体液、例えば唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿に存在するエボラウイルスポリヌクレオチド（又は他のウイルスのポリヌクレオチド）の検出をモニターする。そのようなモニタリングは、例えば、対象がエボラ（又は他のウイルス）を有すると診断する、又は対象における特定の薬物の効果を決定する、又は疾患の進行を評価するのに有用であり得る。
核酸増幅方法
核酸増幅技術は、ＥＢＯＶ又は他のＲＮＡウイルスなどの病原菌の複雑な生物学的工程を理解し、それを検出、同定、及び定量する手段を提供する。本発明は、逆転写酵素を使用してＲＮＡゲノムからＥＢＯＶ  ＤＮＡ分子を合成し、次いで等温ニッキング増幅反応においてＤＮＡを増幅することにより生体試料のＥＢＯＶネガティブセンスＲＮＡゲノムの検出を提供する。
【０１００】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡ融解及びＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡの酵素的な複製反応の加熱及び冷却の繰り返しのサイクルからなるＤＮＡを増幅するために使用する、一般的な熱サイクル依存性核酸増幅技術である。リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、生体試料の所与の核酸配列のコピー数を定量するために使用する技術である。現在、ｑＰＣＲはリアルタイムの反応全体の反応産物の検出を利用し、増幅プロファイルを各反応の開始時に公知の量の核酸を含有する対照の増幅と比較する（又は未知の試験した核酸に対する公知の核酸の相対比）。対照の結果を使用して標準曲線を構築し、典型的には標準的な反応増幅曲線の対数部分に基づく。標準的な対照の量と比較したそれらの増幅曲線に基づいて、これらの値を使用して未知の量を補間する。
【０１０１】
ＰＣＲに加えて、限定されないが、ニッキング増幅反応、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、Ｑ−βレプリカーゼシステム、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含む熱サイクル非依存性増幅システム又は等温核酸増幅技術が存在する。
【０１０２】
等温ニッキング増幅反応はＰＣＲ熱サイクルと類似点を有する。ＰＣＲのように、ニッキング増幅反応は、プライマーと呼ばれる標的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を用いる。さらに、標的配列のニッキング増幅反応は、標準のＰＣＲでもそうであるように標的配列の対数増加をもたらす。標準のＰＣＲとは違い、ニッキング増幅反応は等温で進行する。標準のＰＣＲでは、温度を上げてＤＮＡの２つの鎖を分離する。ニッキング増幅反応では、標的核酸配列は試験試料に存在する特異的なニッキング部位にニックを入れる。ポリメラーゼはニック部位に浸潤し、既存の相補的なＤＮＡ鎖の置換とともにニックを入れた標的ヌクレオチド配列（添加した外来性ＤＮＡ）の相補的な鎖の合成を開始する。鎖置換複製工程は、温度上昇を必要としない。この時点で、プライマー分子は、添加した外来性ＤＮＡから置換した相補的な配列とアニールする。ここで、ポリメラーゼは鋳型の３’末端から伸長し、事前に置換した鎖と相補的な鎖を作る。第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、次いで、新しく合成された相補的な鎖とアニールし、伸長してニッキング酵素認識配列を含むＤＮＡの二重鎖を作製する。この鎖は、次いで、ポリメラーゼによる続く鎖置換伸長によりニックを入れやすく、本来の標的ＤＮＡのいずれかの部位にニック部位を有するＤＮＡの二重鎖の産生をもたらす。これが合成されると、分子は、新しい鋳型分子で置換された鎖の複製により指数関数的に増幅され続ける。さらに、増幅はまた、ニック部位を導入した鋳型でのニック翻訳合成の繰り返し作用により、各生成物分子から直線的に進行する。結果は、標的シグナル増幅の非常に速い増加であり、ＰＣＲ熱サイクルよりもずっと早く、増幅は１０分未満で生じる。
ニッキング増幅アッセイ
本発明は、等温ニッキング増幅アッセイで増幅したＥＢＯＶ標的核酸分子の検出を提供する。
【０１０３】
本明細書に記載の方法に有用なポリメラーゼは、ヌクレオチドの取り込みを触媒し、鎖置換活性を伴い、標的核酸分子に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の３’ヒドロキシル末端及び／又は二本鎖ＤＮＡ分子のニック部位の３’ヒドロキシル末端を伸長することができる。そのようなポリメラーゼはまた、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損又は実質的に減少し、好熱性のものを含み得る。６つの３’−末端ヌクレオチドを含むプライマー領域の２’−修飾ヌクレオチドを有するプライマーを含む方法に有用なＤＮＡポリメラーゼは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスとしても分類されるバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）から、並びに５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損又は実質的に減少し、鎖置換活性を有するゲオバチルス属を含む密接に関連した細菌株、単離体、及び種から単離されたＤＮＡポリメラーゼＩの誘導体及び変異体を含む。例示的なポリメラーゼは、限定はされないが、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びＧｋａ  ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片を含む。
【０１０４】
本明細書に記載の方法に有用なニッキング剤は、二本鎖核酸分子の特定の構造を認識及び結合し、その認識した特定の構造への結合時にボトム鎖上に隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合の切断よりも実質的に高い率で、トップ鎖上に隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を切断し、それにより５’−３’−エキソヌクレアーゼ欠損鎖置換ポリメラーゼによって伸長することができるニック部位に先行する末端ヌクレオチド上に遊離の３’−ヒドロキシル基を作ることができる化学実体である。本明細書に開示の方法の好ましい実施形態では、「ニッキング剤」のトップ鎖のリン酸ジエステル結合切断率は１００％に達し、ボトム鎖のリン酸ジエステル結合切断率は０％である。本明細書に記載の方法に有用なニッキング剤は、等モル比様式で、酵素、すなわち複数の基質分子を代謝回転する自己再生触媒、又は単一の基質分子だけを代謝回転する非再生触媒のいずれかであり得る。
【０１０５】
ニッキング酵素は二本鎖ＤＮＡに結合し、二本鎖の１つの鎖を切断する。本発明の方法では、ニッキング酵素はトップ鎖（ニッキング剤認識部位の５’−３’配列を含む鎖）を切断する。本明細書に開示の本発明の特定の実施形態では、ニッキング酵素はトップ鎖のみ及び認識部位の３’下流を切断する。例示的な実施形態では、反応は、生成物の配列がニッキング部位を含有しないように結合部位の下流を切断又はニックを入れるニッキング酵素の使用を含む。結合部位の下流を切断する酵素の使用によりニッキング酵素を置換することなくポリメラーゼがより容易に伸長する。理想的には、ニッキング酵素は、ポリメラーゼと同じ反応条件下で機能的である。例示的なニッキング酵素は、限定はされないが、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、Ｎ．ＢｓｔＳＥＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０Ｉ（Ｆｅｒｍａｎｔａｓ）、Ｎｂ．ＢｓｍＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．ＢｔｓＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＡｌｗＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．Ｂｐｕ１０Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ）、及びＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ（ＮＥＢ）を含む。ニッキング酵素認識部位の配列は表１に提供する。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
ニッキング酵素は、制限エンドヌクレアーゼの切断活性を改変して作られた、操作したニッキング酵素も含む（ＮＥＢ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  Ｊｕｌｙ  ２００６、ｖｏｌ  １．２）。制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡのそれらの認識配列と結合する場合、各鎖を加水分解する各酵素内の２つの触媒部位が並行して進行する２つの非依存的な加水分解反応を誘導する。変更した制限酵素は操作することができ、二重鎖の１つの鎖のみを加水分解し、切断ではなく、「ニックを入れた」（３’−ヒドロキシル、５’−リン酸）ＤＮＡ分子を産生する。ニッキング酵素は、修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びニッカーゼ活性を有するＺｎフィンガーヌクレアーゼも含み得る。
【０１０８】
ニッキング増幅反応は、典型的には、例えばジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのヌクレオチドを含む。反応は、限定はされないが、放射線標識（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓ）酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ）、蛍光標識（例えば、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ビオチン、アビジン、ジオキシゲニン、抗原、ハプテン、又は蛍光色素を含む検出可能な部分を含むｄＮＴＰの存在下でも実施され得る。反応は、ニッキング酵素及びポリメラーゼの活性を提供する特定の塩及び緩衝液をさらに含む。
【０１０９】
有利には、ニッキング増幅反応は、増幅反応の経過の間、反応の温度が大体一定である実質的に等温条件下で実施される。温度は、高温と低温の間でサイクルされる必要がないため、ニッキング増幅反応は、従来のＰＣＲを実施するのが難しい条件下で実施することができる。典型的には、反応は約３５℃と９０℃の間（例えば、約３５、３７、４２、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５℃）で実施される。有利には、温度をより精密に維持することは必須ではない。温度のある程度の変動は許容される。
【０１１０】
増幅反応のプライマーセットは、ΔΔＧ’ｓ≦−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２５、−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ又はそれ以上を有するものが選択される。増幅反応の性能特性は、１つ又は複数のオリゴヌクレオチド（例えば、１つ又は複数のプライマー及び／若しくはプローブ）の濃度並びに／又はそれらの比を増加させることによって変更することができる。高濃度のプライマーもプライマーダイマー形成を好む。様々な実施形態では、プライマーの濃度は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎＭ又はそれ以上である。融解温度（Ｔｍ）及び反応率モディファイヤーは、（限定はされないが）エチレングリコール及びグリセロールなど、オリゴヌクレオチドの融解温度を下げるためにも使用され得る。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ反応率モディファイヤー（ｄＮＴＰ及びマグネシウム濃度など）は、反応率を変更し、より定量精度を上げるために使用され得る。特定の実施形態では、フォワード及びリバースプライマーの５’テール配列は同じ核酸配列を有する。
【０１１１】
本発明は、例えば本明細書に記載の増幅戦略の利用を含む、リアルタイムでのニッキング増幅反応をモニタリングする方法を提供する。一実施形態では、定量的核酸増幅は、公知の量の対照の増幅とともに標的核酸増幅を利用する。標的核酸の量は、対照（外因性又は内因性対照）の供給源に基づいて絶対定量又は相対定量（半定量的）として算出することができる。
【０１１２】
未知のヌクレオチド配列の定量は、反応の別々のセット若しくは同じ反応のいずれかにおいて未知の対数閾値増幅と一連の公知の標的配列の比較によって、又は閾値を産み出し、陽性結果（未知が閾値を超える場合）又は陰性結果（未知が閾値を超えない場合）のいずれかを示す、体内の内在性又は外在性の同時増幅産物として達成することができる。
【０１１３】
本発明は、候補フォワードプライマー及び／又は候補リバースプライマーの多くの組合せを実験的にスクリーニングすることなく、ニッキング剤依存性等温鎖置換増幅アッセイを設計する方法も提供する。標的配列内の３５〜７０ｂｐの長い領域は、Ｔｍ≧アッセイ温度（例えば、〜５５℃）での中心部分に１２〜２０ｂｐ配列を有することが同定される。上記の基準に従って、中心領域の１５〜２０ｂｐ長のすぐ下流及び上流の隣接する配列１２〜２０ｂｐ長が同定される。選択した二本鎖の隣接する配列の下流及び上流のＴｍは、互いに±３℃未満外れる。フォワード及びリバースプライマーの標的特異的対は、安定なダイマー形成プライマーの５’テール領域を、隣接する配列の１２〜２０塩基上流の５’末端、及び隣接する配列の１２〜２０塩基下流の相補的な鎖の５’末端に結合することにより作られる。フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブを組み合わせる場合、プローブに相補的な鎖の合成を誘導するプライマーは、モル比約１．１：１〜１０：１で他のプライマーを超過する。アッセイにおいてプライマーの合わせた濃度は、１０００ｎＭ以下である。アッセイ設計方法は、≦７０ｂｐのアンプリコンの事前に検証されたＰＣＲアッセイをニッキング剤依存性等温鎖置換増幅アッセイに変えるために使用することもできる。
プライマー設計
プライマー設計の従来の方法は、プライマー融解温度、プライマーアニーリング温度、ＧＣ（グアニン及びシトシン）含量、プライマー長、及びプライマーの標的核酸以外全てとの相互作用を最小限にすることに注目されてきた（例えば、www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.htmlを参照）。これらの方法に反して、安定なプライマー／ダイマーを形成し、形成の自由エネルギー（ΔＧ）で表されるプライマーは、核酸増幅反応において予想通りに機能することが見出されてきた。自由エネルギー（ΔＧ）及び融解温度（Ｔｍ）は、主成分のエンタルピー（ΔＨ）及びエントロピー（ΔＳ）を共有するが、ΔＧ及びＴｍ値は別々に由来し、相関する関係がなく、所与のΔＧと所与のＴｍ値を関係させる唯一の方法は、それらが由来するΔＨ及びΔＳの値をはっきりと知ることである（Ｍａｎｔｈｅｙ、「ｍＦｏｌｄ，Ｄｅｌｔａ  Ｇ，ａｎｄ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ」（著作権）２００５及び２０１１  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。図１〜１１は、最適なプライマーの設計に関する。
【０１１４】
分子間のプライマー構造の形成の自由エネルギー（ΔＧ）は、当技術分野で公知の式を使用して算出され得る。様々な分子内及び分子間プライマー構造の形成の決定、及びそれらのΔＧの算出にいくつかのプログラムが利用可能であり、例えば、ｍ倍及びＵＮＡ倍の予測アルゴリズムを含む（例えば、Ｍａｒｋｈａｍ及びＺｕｋｅｒ．ＵＮＡＦｏｌｄ：Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｖｏｌｕｍｅ２、Ｃｈａｐｔｅｒ１、ｐｐ３〜３１、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、２００８；Ｚｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｉｎ  ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１〜４３，ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９９；Ｍ．  Ｚｕｋｅｒ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｂｙ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２６７〜２９４、１９９４；Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ＲＮＡ．Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３、２８１〜３０６、１９９０；Ｚｕｋｅｒ．Ｏｎ  Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ａｌｌ  Ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  Ｆｏｌｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４、４８〜５２、１９８９を参照）。ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ３．１は、ｍ倍のプライマー設計を実施するものである（www.idtdna.com/analyzer/ Applications/OligoAnalyzer/）。例えば、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ３．１を参照すると、ΔＧの算出は以下のパラメーター：標的型：ＤＮＡ；オリゴ濃度０．２５μＭ；Ｎａ＋濃度：６０ｍＭ；Ｍｇ＋＋濃度：１５ｍＭ；及びｄＮＴＰ濃度；０．３ｍＭを使用して実施され得る。
３’認識領域
本発明は、プライマー−標的形成が安定であり（ΔＧ≦約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又はそれ以上）、核酸増幅反応の実施を増強する能力を有する、３’認識配列を有するプライマーを提供する。３’認識領域は核酸分子、例えば核酸分子の相補的な配列に特異的に結合する。特定の実施形態では、３’認識領域は、核酸配列の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０塩基又はそれ以上に相補的な配列を有する。特定の実施形態では、３’認識領域は、１つ又は複数のイノシン塩基を含む。特定の実施形態では、３’認識領域は２／１２以下のイノシンを含む。様々な実施形態では、プライマー−標的融解温度は、アッセイの反応又は伸長温度より８℃又は６℃低い温度以上である（Ｔｍ≧アッセイ温度−８℃）。特定の実施形態では、３’認識配列は１２〜２０、１２〜１７、又は１２〜１４塩基含む。特定の実施形態では、プライマー−標的形成は、自己ダイマー形成よりもより安定である（例えば、ΔΔＧ≦約−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又はそれ以上）。好ましくは、３’認識配列は、プライマー−標的アニーリングに干渉する能力を有する、自己相補的な配列、短い逆方向反復（例えば、＞４塩基／反復）、又はそうでなければ分子内相互作用を促進する配列を含有しない。
【０１１５】
一実施形態では、プライマーは、アニーリングに寄与しないプライマーの端に４つの配列特異的な塩基を有し、Ｔｍが５６℃になるように設計する。一実施形態では、プライマーは１６、１７、１８、１９、２０、又は２１塩基長である。
【０１１６】
特に、３’認識配列を有する本発明のプライマーは、ニッキング増幅アッセイに有用である。さらに、ＥＢＯＶ又は他のウイルス標的特異的３’認識領域は１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを含む（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アルキル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、２’−ヒドロキシル（ＲＮＡ）、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−ブリッジ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−ブリッジ、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート））。理論に縛られることなく、１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドの認識領域への組込みは、プライマー／鋳型の分子間及び／若しくは分子内相互作用を減少させる又は除き（例えば、プライマー−ダイマー形成）、それにより等温増幅の背景シグナルを減少させる又は除くと仮定される。２’修飾ヌクレオチドは、好ましくは標的配列と塩基対を形成する塩基を有する。特定の実施形態では、ＥＢＯＶ又は他のウイルス標的特異的認識領域の２つ又はそれ以上の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の２’修飾ヌクレオチド）は近接している（例えば、修飾ヌクレオチドのブロック）。いくつかの実施形態では、２’修飾ヌクレオチドのブロックは標的特異的認識領域の３’末端に位置する。他の実施形態では、２’修飾ヌクレオチドのブロックは、ＥＢＯＶ又は他のウイルス標的特異的認識領域の５’末端に位置する。２’修飾ヌクレオチドのブロックが標的特異的認識領域の５’末端に位置する場合、２’修飾ヌクレオチドは、１つ又は複数の非修飾ヌクレオチド（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の２’非修飾ヌクレオチド）によるニック部位から分けられ得る。出願人らは、１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド又は２’修飾ヌクレオチドのブロックの位置により増幅の速度論が変更することを見出した。１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド又は２’修飾ヌクレオチドのブロックが、認識領域の５’末端若しくはその近く、又はニック部位の近位に位置する場合、リアルタイム増幅反応は検出時間の減少を示した。さらに、シグナル曲線は縮小され、曲線の傾斜が変わる。
【０１１７】
関連する実施形態では、１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマーの比を使用し、検出時間及び／又は反応の「調整」のための反応の効率を変更し、反応速度論の予測可能な調節をもたらすことができる。認識配列の３’末端に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマーと認識配列の５’末端に１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマーの比が増加すると、シグナル曲線を縮小し、曲線の傾斜が変わる。検出時間並びに反応の効率の両方を操作する手段を提供する反応を「調整」できることは有利である。内部対照を使用する相対定量は、２つの重要な条件が合うことが必要である。まず、非競合反応条件を作り出す反応の検出時間を改変できることは有利である。したがって、後半の時点で検出可能な対照の反応に影響を及ぼすことにより（目的の標的に対して）、目的の標的が少ない初期存在量である場合でさえ、対照の反応は目的の特異的標的を打ち負かさない。第二に、真の相対存在量の算出を確実にするため、対照及び特異的標的反応は効率が釣り合う必要がある。「調整」条件を使用して各反応の効率を調節することによって、反応を釣り合わせることができ、十分な相対定量算出を可能にする。反応の調整は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）において、標的核酸増幅と参照核酸増幅（例えば、内部標準）の効率を釣り合わせるために使用できる。さらに、標的核酸及び内部標準の増幅曲線は変更することができ、それらの増幅産物の検出時間が分けられ、一方標的核酸増幅及び内部標準増幅に同じ効率を提供する。反応におけるオリゴヌクレオチド構造の特定の組合せ及び比の使用によって、調整した反応の実施を可能にする条件を作り出すことが可能である。
５’テールダイマー化領域
本発明は、ＥＢＯＶ又は他のウイルス核酸増幅反応性能を増強する自己ダイマー化可能な５’テール領域を有するプライマーを提供する。理論に縛られることなく、核酸増幅反応において、プライマーはプライマー−ダイマーとして標的核酸にアニールする。例えば、ニッキング増幅プライマーは、標的認識配列へのプライマーの結合特異性と関連しない５’末端に存在するニッキング剤認識部位を有する。非特異的なプライマー相互作用による非特異的なバックグラウンド産物は、そうでなければ特異的な産物の増幅に利用される隔絶反応成分の可能性がある。様々な実施形態では、ホモダイマー形成は安定である（例えば、ΔＧ≦約−３０、−３５、−４０、−４５、−５０、−５５、−６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又はそれ以上）。様々な実施形態では、ホモダイマーは伸長反応温度よりも高い融解温度を有する。特定の実施形態では、５’テール領域はパリンドロームである配列を有する。さらなる実施形態では、５’テール領域は少なくとも長さが１２塩基（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４塩基）である。さらなる実施形態では、５’テール領域は８０〜９０％のＧＣ含量を有する。特定の実施形態では、ホモダイマー形成は、他のより不安定なプライマーダイマー形態形成の形成よりも安定である（例えば、ΔΔＧ≦約−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２５、−３０、−３５、−４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ又はそれ以上）。
【０１１８】
特に、５’テール配列を有する本発明のプライマーは、ニッキング増幅反応に有用である。ニッキング増幅反応に使用するため、１つ又は複数のニッキング剤認識部位及び５’テール領域を含む５’テール領域は、対称的に反転した配列を有する。特定の実施形態では、５’テール領域は偶数個のヌクレオチドを含有する（例えば、２２、２４ヌクレオチド）。ニック部位は５’テール領域の３’末端のヌクレオチドと３’認識領域の５’末端のヌクレオチドの間に位置するように設計される。理論に縛られることなく、ニッキング酵素は３’認識領域が一本鎖である場合、ニック部位で切断しない。しかし、３’認識領域が二本鎖である場合、ニック部位での切断が起こる（例えば、核酸増幅反応の経過の間に二本鎖標的核酸分子へとプライマーが組み込まれる場合）。
【０１１９】
様々な実施形態では、５’テール配列は、ニッキング酵素認識配列に動作可能に連結したパリンドローム配列（又は、自己相補的な配列）に動作可能に連結した、５’から３’への反転したニッキング酵素認識配列を含む。特定の実施形態では、スペーサー領域は偶数個のヌクレオチドである（例えば、２、４、６個など）。２、４、及び６個のヌクレオチドスペーサーを有するＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素認識配列（５’−GAGTC−３’）に基づく例示的な５’テールは、以下の式：
【０１２０】
【化３】
2017536813.tif 000013
【０１２１】
（式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、又はグアニン（Ｇ）ヌクレオ塩基を有する）であり、Ｎ１はＮ１’と相補的であり、Ｎ２はＮ２’と相補的であり、Ｎ３はＮ３’と相補的であるなど）による核酸配列を含む。
【０１２２】
例示的な５’テール領域は、以下の鋳型５’−NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN−３’に基づいて生成することができるＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有する長さ２４ヌクレオチドを配列する。この鋳型に基づいて、以下の特性：ΔＧ＝−４８Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ〜−６２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；ΔΔＧ＜−４０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；及びＧＣ含量６８％〜８４％を有する５３７,８２４個の５’テール配列がある。これらのうち、１０５０個の選択された配列が提供され、全体の配列空間（２４８，８３２）の０．２％を表す。例示的な５’テール領域は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有する長さ２２ヌクレオチドを配列し、以下の鋳型５’−NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN−３’に基づく。この鋳型に基づいて、以下の特性：ΔＧ＝−４７Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ〜−５５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；ΔΔＧ＜−４０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ；及びＧＣ含量７２％〜８２％を有する２４８，８３２個の５’テール配列がある。これらのうち、２００個の選択された配列が提供され、全体の配列空間（２４８，８３２）の０．０８％を表す。
標的核酸分子
本発明の方法及び組成物は、試験試料中のＥＢＯＶ又は他のウイルス核酸分子の増幅及び／又は同定に有用である。標的配列は、ＥＢＯＶ核酸分子を含むウイルス核酸分子を含む事実上任意の試料から増幅される。特に、本発明の方法及び組成物は、ＲＮＡウイルスの増幅及び／又は同定に有用である。ＥＢＯＶに加えて、本発明の方法及び組成物を使用して検出できる例示的なＲＮＡウイルスは、限定はされないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デングウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ｂ型インフルエンザ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（例えば、ＢＶＤＶ遺伝子型Ｉ）、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎、ラッサウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス、及び一本鎖ＲＮＡウイルスを含む。
【０１２３】
例示的な試験試料は、体液（例えば、唾液、汗、涙、体腔に蓄積した液、尿、精液、膣分泌物、脳脊髄液、リンパ液、排泄物、痰、分解液、嘔吐物、汗、母乳、血液、血清、及び血漿）、組織抽出物、培養培地（例えば、病原性細胞など細胞が成長する液体）、環境試料、農産物、又は他の食料品、及びそれらの抽出物、並びにＤＮＡ同定タグを含む。所望であれば、試料は、生体試料から核酸分子を単離するために典型的に使用される任意の標準の方法を使用するニッキング増幅反応に包含される前に精製される。
【０１２４】
一実施形態では、プライマーは病原体の標的核酸を増幅し、試料中のＥＢＯＶ又は他のウイルスの存在を検出する。環境への適用のため、試験試料は、ＥＢＯＶに感染した対象、環境スワブ、又は任意の他の試料に曝露されてきた水、建築材料（例えば、乾式壁、天井タイル、壁材、織物、壁紙、及び床材）の液体抽出物を含み得る。
【０１２５】
本発明の方法は、血液中１ｍｌ当たり１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、又は１×１０９コピーのＥＢＯＶ  ＲＮＡの検出を提供する。
適用
本発明のプライマーを使用する標的核酸増幅は、ウイルス（例えば、ＥＢＯＶ）核酸分子の迅速な検出に有用な特徴を有する。本発明の組成物及び方法はヒトの診断に有用であり、迅速な診断回答が望まれる（例えば、２０、１５、１０、９、８、７、６、５分又はそれ以下で検出可能な増幅）。特定の実施形態では、本発明は、臨床背景若しくは野外でのヒト又は獣医診断におけるＥＢＯＶニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。他の実施形態では、本発明は、熱サイクル装置が入手できない又は極めて高価な野外作業での診断における、ニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、迅速な定量的回答が望まれる臨床背景でのニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。
検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ
本発明は、少なくとも１つのポリメラーゼ休止分子を含む増幅できない検出可能なポリヌクレオチドプローブを使用するニッキング増幅反応における、標的核酸分子又はそれらのアンプリコンの検出を提供する（例えば、オリゴヌクレオチドを標的核酸分子に結合できるようにするが、標的として検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを利用するポリメラーゼ伸長を支持することができないようにするヌクレオチド修飾又は他の部分）。理論に縛られることを望まないが、ポリメラーゼを進行させない１つ又は複数の部分の存在は、オリゴヌクレオチドに加えて又は複製ポリメラーゼの失速によって、非核酸主鎖におけるポリメラーゼの休止を引き起こす（すなわち、Ｃ３−スペーサー、損傷したＤＮＡ塩基、他のスペーサー部分、Ｏ−２−Ｍｅ塩基）。したがって、これらの構築物は、ニッキング増幅反応の経過の間にプローブの異常な増幅を防ぐ又は減少する。これは、それらを従来の検出プローブから区別し、ニッキング増幅反応の最後に添加し、それらの増幅を防ぐ。
【０１２６】
従来の検出プローブは、リアルタイムでのニッキング増幅反応を検出するためには非実用的であることが分かっている。従来の検出プローブがニッキング増幅反応に組み込まれる場合、これらの従来の検出プローブは標的と同時に増幅される。これらの検出分子の増幅は、反応の開始時の検出プローブの開始分子の数により正当な標的アンプリコンの検出をマスクする。
【０１２７】
本発明は、少なくとも１つのポリメラーゼ休止分子を含む増幅できない検出可能なポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリメラーゼ休止分子は、限定はされないが、複製のＤＮＡポリメラーゼによる伸長を遮断し、それにより検出分子の増幅を防ぐが、標的分子若しくは増幅した標的分子のコピーへの正確なハイブリダイゼーション又はヌクレオチドスペーシングを可能にするヌクレオチド修飾又は他の部分を含む。一実施形態では、本発明の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、検出分子の異常な増幅を防ぐ又は減少する３個の炭素スペーサー（３Ｃ−スペーサー）を含む。
【０１２８】
一実施形態では、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、相補的なヌクレオチドへの増強した結合親和性を有する１つ又は複数の修飾ヌクレオチド塩基を含む。修飾塩基の例は、限定はされないが、２’フルオロアミダイト、及び２’ＯＭｅ  ＲＮＡアミダイト（ポリメラーゼ休止分子としても機能する）を含む。本発明の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、異なる蛍光色素で合成することができ、事実上任意の標的配列とハイブリダイズするように設計され得る。それらの顕著な特異性のため、本発明の増幅できない検出可能なポリヌクレオチドプローブは試料中の単一の標的核酸分子を検出するために使用され、又はそれぞれが異なる標的核酸分子に結合する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて使用される。したがって、本発明の増幅できない検出可能なポリヌクレオチドプローブは、同じ反応で１つ又は複数の標的核酸分子を検出するために使用し、これらの標的を同時に検出するようにし得る。本発明は、本明細書に記載の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブと併せてそのような蛍光の使用を包含する。
ハードウェア及び／又はソフトウェアの実行
本明細書に記載の方法は、多目的の又は特別にプログラムしたハードウェア若しくはソフトウェアで実行することができる。例えば、本方法は、コンピューター可読媒体によって実行することができる。したがって、本発明は、本発明の任意の実施形態によるアルゴリズム及び／又は方法を実施するように構成されたソフトウェア及び／又はコンピュータープログラム製品も提供する。本発明において提供するアルゴリズム及び／又は方法を実施できるソフトウェアを構成する方法は、当業者に周知である。コンピューター可読媒体は、非一時的及び／又は有形であり得る。例えば、コンピューター可読媒体は揮発性メモリー（例えば、ランダムアクセスメモリなど）又は非揮発性メモリー（例えば、読み出し専用メモリー、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、光ディスク、紙テープ（paper table）、パンチカードなど）であり得る。コンピューター実行可能な命令は、好適なコンピューター言語又はいくつかの言語の組合せで記述され得る。基本的な計算生物学の方法は、例えば、Ｓｅｔｕｂａｌ及びＭｅｉｄａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９７）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ、Ｓｅａｒｌｅｓ、Ｋａｓｉｆ、（Ｅｄ．）、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９８）；Ｒａｓｈｉｄｉ及びＢｕｅｈｌｅｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２０００）並びにＯｕｅｌｅｔｔｅ及びＢｚｅｖａｎｉｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、２ｎｄ  ｅｄ．、２００１）に記載されている。
【０１２９】
本発明は、プローブ設計、データの管理、分析、及び機器操作など、様々な目的のために様々なコンピュータープログラム製品及びソフトウェアも使用する。（米国特許第５，５９３，８３９号、５，７９５，７１６号、５，７３３，７２９号、５，９７４，１６４号、６，０６６，４５４号、６，０９０，５５５号、６，１８５，５６１号、６，１８８，７８３号、６，２２３，１２７号、６，２２９，９１１号及び６，３０８，１７０号を参照）さらに、本発明は、ＵＳ  Ｓｅｒ  Ｎｏｓ  １０／１９７，６２１、１０／０６３，５５９（ＵＳ  Ｐｕｂ  Ｎｏ  ２００２０１８３９３６）、１０／０６５，８５６、１０／０６５，８６８、１０／３２８，８１８、１０／３２８，８７２、１０／４２３，４０３、及び６０／４８２，３８９に示すように、インターネットなどネットワーク上で遺伝情報を提供するための方法を含む好ましい実施形態を有し得る。
キット
本発明はＥＢＯＶ又は他のＲＮＡウイルス核酸分子の増幅のためのキットも提供する。そのようなキットは、対象から得た生体試料のＥＢＯＶ又は他のＲＮＡ核酸の検出又は定量に有用である。本発明のキットは、本明細書に記載のように、例えば、１つ又は複数の逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、フォワード及びリバースプライマー、及び１つ又は複数のニッキング酵素、並びに検出可能なプローブを含み得る。ＥＢＯＶ又は他のＲＮＡが増幅される場合、１つ又は２つのニッキング酵素がキットに含まれ得る。複数の病原体配列が増幅される場合、それらの標的配列のために設計された鋳型が同じニッキング酵素のためのニッキング酵素部位を含み、次いで１つ又は２つのニッキング酵素が含まれ得る。鋳型が異なるニッキング酵素によって認識される場合、例えば３つ又はそれ以上など、より多くのニッキング酵素がキットに含まれ得る。
【０１３０】
一態様では、本発明は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、一次プライマー、二次プライマー、プライマー内のニッキング酵素結合部位に特異性を有するニッキング酵素、及びデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む核酸増幅のためのキットを提供する（例えば、増幅に十分な成分を含有する緩衝溶液中）。様々な実施形態では、一次プライマー及び二次プライマーは、それぞれ、標的配列に相補的又は実質的に相補的な３’末端特異的認識領域配列を有し、末端特異的認識領域は１つ又は複数の２’修飾ヌクレオチド；それ自身でダイマー化できる（例えば、自己相補的）３’末端特異的認識領域配列の上流のニッキング酵素結合部位を含有する５’末端テール領域を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数のプライマーは、プライマー−ダイマー形状である（例えば、約Ｔｍに加熱し、ゆっくりと冷却することにより産生される）。
【０１３１】
本発明のキットは、任意の数の別々の容器、パケット、チューブ（例えば、＜０．２ｍｌ、０．２ｍｌ、０．６ｍｌ、１．５ｍｌ、５．０ｍｌ、＞５．０ｍｌ）、バイアル、マイクロタイタープレート（例えば、＜９６ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル、＞１５３６ウェル）、ＡｒｒａｙＴａｐｅなど１つ又は複数の成分、又はそのような容器内で様々な組合せで合わせることができる成分も含み得る。様々な実施形態では、キットは、参照配列を結合及び増幅することができるプライマー対をさらに含む。特定の実施形態では、キットは、プライマーダイマー形状中に１つ又は複数のプライマーを含む（例えば、約Ｔｍに加熱し、ゆっくりと冷却することにより産生される）。さらに他の実施形態では、キットはプライマーを含有する無菌容器を含み；そのような容器は箱、アンプル、ビン、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、プラスチックの包み、又は当技術分野で公知の他の好適な容器形態を含み得る。そのような容器はプラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は核酸の保持に好適な他の材料から作製され得る。
【０１３２】
キットの成分は、例えば、１つ又は複数の容器に存在してもよく、例えば成分の全てが１つの容器内にあってもよく、例えば酵素がプライマーとは別々の容器にあってもよい。成分は、例えば乾燥（例えば、粉末）又は安定な緩衝液中（例えば。化学的に安定、熱安定）であってもよい。乾燥成分は、例えば、凍結乾燥、真空及び遠心分離による乾燥、及び／又は周囲環境下での乾燥によって調製され得る。様々な実施形態では、ポリメラーゼ及びニッキング酵素は単一の容器内で凍結乾燥形態であり、プライマーは異なる容器内で、凍結乾燥、フリーズドライ、又は緩衝液中のいずれかである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、及びプライマーは単一の容器内で凍結乾燥形態である。他の実施形態では、ポリメラーゼ及びニッキング酵素は異なる容器に分けられてもよい。
【０１３３】
キットは、例えば、反応に使用されるｄＮＴＰ、又は修飾ヌクレオチド、反応に使用されるキュベット若しくは他の容器、又は再水和する凍結乾燥成分のための水若しくは緩衝液のバイアルをさらに含み得る。使用する緩衝液は、例えば、ポリメラーゼとニッキング酵素活性の両方に適切であり得る。
【０１３４】
本発明のキットは、本明細書に記載の１つ又は複数の方法を実施するための使用説明書及び／又は本明細書に記載の１つ若しくは複数の組成物又は試薬の指示書も含み得る。使用説明書及び／又は指示書は印刷形態であってもよく、キットの中に含まれてもよい。キットは、そのような使用説明書又は指示書を提供するインターネットに記載された指示書も含み得る。
【０１３５】
本発明の実践は、特に指示しない限り、当業者の範囲内で周知の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ、１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ、１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｌｏｓ、１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”、（Ｍｕｌｌｉｓ、１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ、１９９１）など、文献で完全に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用可能であり、そのように、本発明の作製及び実践において考えられ得る。特定の実施形態に特に有用な技術は、以下の節で記載する。
【０１３６】
以下の例は、当業者にアッセイ、スクリーニング、及び本発明の治療方法の作製及び使用方法の完全な開示及び記載を提供するように記載され、本発明者らが彼らの発明と認識する範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【０１３７】
実施例１．ＥＢＯＶのワンステップ及びツーステップリアルタイム逆転写−等温増幅アッセイ
ワンステップ反応は、単一の反応プロトコールで逆転写と増幅が起こる逆転写（ＲＴ）反応を指す。ツーステップ反応は、第一に逆転写が起こり、続いて第二の増幅反応に移る逆転写反応を指す。
【０１３８】
アッセイ１及びアッセイ２は、ＥＢＯＶポリヌクレオチドを検出するそれらの能力を試験した（図１）。これらのアッセイのためのプライマーは図２に示す。
【０１３９】
図３Ａ〜３Ｘは、アッセイ１及びアッセイ２で得られた増幅結果を示す。アッセイは、ヒトｃＤＮＡのバックグラウンドにおけるＥＢＯＶ  ｇＢｌｏｃｋのコピーを検出するために使用した。反応条件を特定した。
【０１４０】
図４は、ワンステップアッセイでの全ヒトＲＮＡのバックグラウンドでのＥＢＯＶの検出を示す。
【０１４１】
図５は、ワンステップアッセイでの全ヒトＲＮＡのバックグラウンドでの合成ＥＢＯＶ  ＲＮＡの検出を示す。
【０１４２】
図６Ａ〜６Ｃは、増幅及び検出機器に使用するための試料の処理を例示するフローチャートを提供する。
【０１４３】
図７Ａ及び７Ｂは、それぞれスワブ及び血液から試料を調製する方法を示す。
【０１４４】
一実施例では、エボラウイルスは以下のプライマー及びプローブ配列：
【０１４５】
【表２】
2017536813.tif 000014
【０１４６】
を使用して検出した。
【０１４７】
上記の配列では、GAGTCはニッキング酵素認識部位である。ピリミジンは、ザイールを含むエボラ株の縮重検出を提供する。
合成ＤＮＡ標的：
【０１４８】
【化４】
2017536813.tif 000015
【０１４９】
合成ＲＮＡ標的：
【０１５０】
【化５】
2017536813.tif 000016
【０１５１】
１ステップ及び２ステップ反応の両方とも、最終濃度１６６．７ｎＭのフォワードプライマー及び最終濃度８３３．３ｎＭのリバースプライマーと、２００ｎＭの濃度のプローブ及び０．１×ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（最終濃度）を含有した。１及び２ステップ反応両方に加えて、Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、ＮＨ４＋、Ｎａ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ  ＢＳＴポリメラーゼ；及び０．３Ｕ／ｕｌ  Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×抽出緩衝液２を含有した。これらの成分に加えて；１ステップ反応は１０Ｕ／ｕｌのＭａｘｉｍａ逆転写酵素；１．０Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳＵＢＥＲａｓｅ  ＩＮ）を含有した。合成ＲＮＡは分解を防ぐために１．０Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤も同様に加えた。使用した全ての水は購入した核酸フリーのものであった。
【０１５２】
反応物は氷上で混合し、Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ４８０を実行するまで冷たく維持した。Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ４８０は、ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９０ｎｍ／Ｅｍ６１０ｎｍ）及びＳＹＢＲｇｒｅｅｎシグナル（Ａｂｓ４９５ｎｍ／Ｅｍ５２０ｎｍ）を検出する２色検出下で実行した。１ステップ反応は５６℃で２０分間実施した。結果は図８に示す。
【０１５３】
２ステップ反応は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（https://www.neb.com/protocols/2012/10/03/first-strand-cdna-synthesis-kit-using-protoscript-ii-reverse-transcriptase-m0368）に概説されている設定条件に従って、５６℃で５分間（ヒートブロック中）又は室温で５分間の逆転写酵素ステップで実施した（図９）。これらのＲＴ温度は両方、１反応当たり１×１０５コピーの標的のシグナルを産生した。逆転写酵素ステップは、ＬＣ４８０上５６℃で１５分間の増幅ステップへと続いた。このアッセイの結果は図１０に示す。１反応当たり示したコピー数は、製造業者の算出を使用して決定した。
実施例２．複合のＲＮＡ混合物における標的ＲＮＡの検出
１ステップ及び２ステップ反応が、ＲＮＡ分子の複合混合物において標的ＲＮＡを検出できるかどうか決定するため、アッセイは、全ヒトＲＮＡのＲＰＰＨ１（ＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ成分）の検出のために設計した。一実施例では、ＲＰＰＨ１は、以下のプライマー及びプローブ配列：
【０１５４】
【表３】
2017536813.tif 000017
【０１５５】
を使用して検出した。
【０１５６】
２ステップ反応では、ヒトＲＮＡ（１０ｎｇ）は、ランダムヘキサマープライマーによってｃＤＮＡに変換し、ＲＰＰＨ１は、標的特異的配列の増幅によって検出した（図１１Ａ）。１ステップ反応では、特異的な逆転写プライマーを使用する標的特異的配列の増幅によってヒトＲＮＡ（２０ｎｇ）を検出した（図１１Ｂ）。
実施例３．生体試料におけるエボラウイルスの検出。
【０１５７】
別の実施例では、合成エボラウイルスＲＮＡ標的は、１ステップアッセイを使用する粗血液調製物と混合した場合に検出された。粗血液調製物は、全血液（２０μｌ）と硫酸ドデシルナトリウム（０．５％  ＳＤＳ；２０μｌ）を混合し、室温で混合物をインキュベートする（３分間）ことによって調製した。インキュベーション後、ウシ血清アルブミン（２％  ＢＳＡ；２０μｌ）を添加し、得られた混合物を室温でインキュベートした（１分間）。粗血液調製物（１μｌ）は、合成エボラウイルスＲＮＡ標的（１０００コピー）をスパイクした。反応は、ＲｏｃｈｅＬＣ４８０で５６℃で３回実行した。結果は図１２に示す。
【０１５８】
さらなる実験では、１ステップアッセイは、ザイールエボラウイルスラメインガ株とスーダンエボラボニファス株ＲＮＡ分子を区別できた。Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞に、ザイールエボラウイルスラメインガ株又はスーダンエボラボニファス株ウイルスを感染させ、ウイルスＲＮＡを精製した。反応のセットは、精製ＲＮＡザイールエボラウイルスメインガ株（６８３コピー）又はスーダンエボラウイルスボニファス株ウイルス（６５０コピー）を使用して実行した。各セットに関して、４回の反応（１０μｌ）をＲｏｃｈｅＬＣ４８０で実行した。アッセイによりザイールエボラウルメインガ株ＲＮＡを検出したが（図１３；Ａで表す曲線のセット）、スーダンエボラウイルスボニファス株ＲＮＡは検出しなかった（図１３；Ｂで表す曲線のセット）。したがって、ザイールエボラアッセイは、ザイールエボラウイルスメインガ株の検出に特異的であった。
【０１５９】
機器の比較は、非標的対照（ＮＴＣ）試料を含む、約１０１〜１０７コピーの標的ＲＮＡからザイールエボラウイルスメインガ株ＲＮＡの様々な希釈を使用して実行した。試験した機器は、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩ、Ａｘｘｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、及びＤｏｕｇｌａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｐｌｉｆｉｒｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを含む。いくつかの機器では変動が観察されたが、全ての機器が広範に渡ってＥＢＯＶ  ＲＮＡのコピーを検出できた（図１４）。
【０１６０】
１ステップＥＢＯＶアッセイの検出の下限を決定するため、１００、５０、２５、及び１２コピーのザイールエボラウイルスメインガ株ＲＮＡを含有する段階希釈した試料を試験した。１ステップ反応（１０μｌ）は、各希釈に関して少なくとも１０個の技術的複製物を使用して、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０で実行した。２０個（２０）の技術的複製物を、１００及び５０コピーの反応に実行した。４０個（４０）の技術的複製物を、２５コピーの反応に実行した。１反応当たり、１００及び５０コピーの検出に関して、１００％（２０／２０）の検出率が観察された（図１５Ａ及び１５Ｂ）。１反応当たり２５コピーの検出に関して、９５％（３８／４０）の検出率が観察された（図１５Ｃ）。したがって、これらの結果は、１ステップアッセイとして実施した場合でさえも、ＥＢＯＶアッセイの感受性及び特異性を示す。
実施例４：生体試料におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の検出。
【０１６１】
一実施例では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ギャップタンパク質配列を標的とする１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。精製ＨＩＶ  ＲＮＡ（サブタイプＣ）が得られ（ＳｅｒａＣａｒｅ）、ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＩＶ−１  ｖ２．０試験によって定量したように、ＨＩＶ  ＲＮＡの公知の量を、１ステップＨＩＶ  ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで試験した。以下のプライマー及びプローブ配列：
【０１６２】
【表４】
2017536813.tif 000018
【０１６３】
を使用した。
【０１６４】
図１６Ａは使用した配列の位置を示すアンプリコンのマップである。外側プライマーの配列はＨＩＶサブタイプＣに特異的であった（使用した精製ＲＮＡ試料に関して）。１ステップＨＩＶＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、フォワード及びリバースプライマーの２つのセットで設計し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識部位である。
【０１６５】
１ステップ反応は、約１：１０のフォワード対リバースプライマーのプライマー比で、最終濃度９ｎＭのフォワードプライマー（Ｈｇａｇ．Ｆ２ａ＋Ｈｇａｇ．Ｆ２ｂの１：１混合）及び最終濃度９１ｎＭのリバースプライマー（Ｈｇａｇ．Ｒ１ａ＋Ｈｇａｇ．Ｒ１ｂの１：１混合）を含有した。最終濃度２００ｎＭのプローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；グアニジニウムチオシアネート（ＧＩＴＣ）；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ  ＢＳＴポリメラーゼ；及び０．３Ｕ／ｕｌ  Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩衝液を含有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ＸＬ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
【０１６６】
反応は、ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９０ｎｍ／Ｅｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、ＨＩＶ  ＲＮＡの１２５、２５０、５００、及び１０００コピーを使用して５６℃で２０分間実施した。全てのコピー数でのＨＩＶ  ＲＮＡの特異的な検出は、１ステップＨＩＶ  ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１６Ｂ）。
実施例５：生体試料におけるデングウイルス４型（ＤＥＮＶ−４）の検出
一実施例では、デングウイルス４型（ＤＥＮＶ−４）は、３’ＵＴＲ配列を標的とする１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。ウイルスと宿主細胞ＲＮＡの両方を含む細胞培養物から全ＲＮＡを単離し、１ステップＤＥＮＶ−４  ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイに使用した。したがって、全コピー数は未知であった。以下のプライマー及びプローブ配列：
【０１６７】
【表５】
2017536813.tif 000019
【０１６８】
を使用した。
【０１６９】
図１７Ａは、使用した配列の位置を示すアンプリコンのマップである。１ステップＤＥＮＶ−４  ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、リバースプライマーの２つのセットで設計し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識部位である。
【０１７０】
１ステップ反応は、約５：１のフォワード対リバースプライマーのプライマー比で、最終濃度８３ｎＭのフォワードプライマー及び最終濃度１７ｎＭのリバースプライマー（Ｄｅｎ４．Ｒ１ａ＋Ｄｅｎ４．Ｒ１ｂの１：１混合）を含有した。最終濃度２００ｎＭのプローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ  ＢＳＴポリメラーゼ；及び０．３Ｕ／ｕｌ  Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩衝液を含有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ＸＬ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
【０１７１】
反応は、ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９０ｎｍ／Ｅｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、２０ｐｇの全ＲＮＡを使用して５６℃で２０分間実施した。デング４ＲＮＡの特異的な検出は、１ステップＤＥＮＶ−４  ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１７Ｂ）。
実施例６：生体試料におけるＢ型インフルエンザの検出
一実施例において、Ｂ型インフルエンザは、インフルエンザセグメント７配列を標的とする１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。ウイルスと宿主細胞ＲＮＡの両方を含む細胞培養物から全ＲＮＡを単離し、１ステップＢ型インフルエンザＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイに使用した。したがって、全コピー数は未知であった。以下のプライマー及びプローブ配列：
【０１７２】
【表６】
2017536813.tif 000020
【０１７３】
を使用した。
【０１７４】
図１８Ａは使用した配列の位置を示すアンプリコンのマップである。１ステップＢ型インフルエンザＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、フォワード及びリバースプライマー並びに２つの外側プライマーの３つのセットで設計し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識部位である。
【０１７５】
１ステップ反応は、約１：１０のフォワード対リバースプライマーのプライマー比で、最終濃度９ｎＭのフォワードプライマー（ＦｌｕＢ．Ｆ２ａ＋ＦｌｕＢ．Ｆ２ｂ＋ＦｌｕＢ．Ｆ２ｃの１：１：１混合）及び最終濃度９１ｎＭのリバースプライマー（ＦｌｕＢ．Ｒ３ａ＋ＦｌｕＢ．Ｒ３ｂ＋ＦｌｕＢ．Ｒ３ｃの１：１：１混合）を含有した。最終濃度２００ｎＭのプローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ  ＢＳＴポリメラーゼ；及び０．３Ｕ／ｕｌ  Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩衝液を含有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ＸＬ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
【０１７６】
反応は、ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９０ｎｍ／Ｅｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、異なる単離体からの全ＲＮＡを使用して５６℃で２０分間実施した。全ての単離体におけるＢ型インフルエンザの特異的な検出は、１ステップＢ型インフルエンザＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１８Ｂ）。
実施例７：生体試料におけるウシウイルス性下痢ウイルス遺伝子型１（ＢＶＤＶ１）の検出。
【０１７７】
一実施例において、ウシウイルス性下痢ウイルス遺伝子型１（ＢＶＤＶ１）は、インフルエンザセグメント７配列を標的とする１ステップＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで検出された。ウイルスと宿主細胞ＲＮＡの両方を含む細胞培養物から全ＲＮＡを単離し、１ステップＢＶＤＶ１ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイに使用した。したがって、全コピー数は未知であった。以下のプライマー及びプローブ配列：
【０１７８】
【表７】
2017536813.tif 000021
【０１７９】
を使用した。
【０１８０】
図１９Ａは使用した配列の位置を示すアンプリコンのマップである。１ステップＢＶＤＶ１ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイは、フォワードプライマーの２つのセットで設計し、集団の配列変異を説明する。上記の配列において、GAGTCはニッキング酵素認識部位である。
【０１８１】
１ステップ反応は、約１：１０のフォワード対リバースプライマーのプライマー比で、最終濃度９ｎＭのフォワードプライマー（ＢＶＤＶ１．Ｆ１ａ＋ＢＶＤＶ１．Ｆ１ｂの１：１混合）及び最終濃度９１ｎＭのリバースプライマーを含有した。最終濃度２００ｎＭのプローブ及び１００ｎＭの外側プライマーを使用した。さらに、１ステップ反応は、Ｔｒｉｓ、Ｋ＋、及びＭｇ２＋；ｄＮＴＰ；０．４Ｕ／ｕｌ  ＢＳＴポリメラーゼ；及び０．３Ｕ／ｕｌ  Ｎｔ．ＢＳＴｎｂｉニッキング酵素を含む、最終濃度１×ラン緩衝液を含有した。これらの成分に加えて、１ステップ反応は、０．２Ｕ／ｕｌのＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ＸＬ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．５Ｕ／ｕｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｉｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有した。使用した全ての水は核酸フリーであった。
【０１８２】
反応は、ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０ビーコンシグナル（Ａｂｓ５９０ｎｍ／Ｅｍ６１０ｎｍ）のリアルタイム検出を使用して実行した。１ステップ反応は、ＢＶＤＶ１ウイルス培養物（混合したウシ宿主細胞ＲＮＡ及びウイルス）及び細胞培養粗溶解物（未希釈及び１：１００希釈）からの精製ＲＮＡ（２０ｐｇ／技術的複製物）を使用して５６℃で２０分間実施した。全ての試料におけるＢＶＤＶ１ウイルスの特異的な検出は、１ステップＢＶＤＶ１ＲＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイで実証した（図１９Ｂ）。
実施例８：エボラ株の分子ビーコン認識
例示的なビーコンＢＬＡＳＴアライメント出力及び株リスト
【０１８３】
【表８】
2017536813.tif 000022
【０１８４】
ビーコン単独株リスト：
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｔｃ／ＣＯＤ／１９７６／Ｙａｍｂｕｋｕ−Ｅｃｒａｎ、全ゲノム
２９．４  ８９．２  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ６５５２４６．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅｃｋｅｄｏｕ−Ｃ０５、全ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＪ６６０３４８．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅｃｋｅｄｏｕ−Ｃ０７、全ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＪ６６０３４７．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｋｉｓｓｉｄｏｕｇｏｕ−Ｃ１５、全ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＪ６６０３４６．２
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＮＭ０４２．３、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１１８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＮＭ０４２．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１１７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＮＭ０４２．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１１６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５７、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１１５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５６．３、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１１４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５６．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１１３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１１２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５０、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１１１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８４８、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１１０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８４６、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１０９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８４１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１０７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８４０、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１０６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８３８、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１０５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８３４、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１０４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８３１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１０３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２９、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１０２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２７、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１０１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２６、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３１００．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２５.２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０９９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２５．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０９８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２３、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０９７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０９６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０９５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８１９、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０９３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８１８、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０９２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８１７、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０９１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８１６、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０９０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８１４、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８１０．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８１０．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８０９、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８０８、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８０７、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８０５．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８０５．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８００、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７９９、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０８０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７９８、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０７９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７９５、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０７７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８９．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０７６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８８、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０７５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８７、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０７４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８６、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０７３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０７２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７７１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０７１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７７０．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０７０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７７０．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０６９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６９．３、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０６７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６９．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０６６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６９．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０６５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６５．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０６４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６４、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０６３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５８、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０６１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５０．３、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５０．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５０．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７３５．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７３５．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７３４．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７２９、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７２４、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７１３．４、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７１３．３、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７１３．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０５０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７０７、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２４．４、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２４．３、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２４．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２４．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２０、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１９、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１５、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１３、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０４０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０３９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０３８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１０、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０３７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１０６、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０３６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１０４、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ２３３０３５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８７．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５６３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８６．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３１５６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８３．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５６１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８２．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８０．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７９．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７７．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７７．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７６．２、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７６．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７０．１、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ０９８、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ０９６、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ０９５、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５５０．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ０９５Ｂ、部分ゲノム
２９．４  １０４  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＭ０３４５４９．１
変異ザイールエボラウイルス、全ゲノム
２９．４  ８９．２  １００％  ０．０１７  ９４％  ＫＦ８２７４２７．１。
【０１８５】
エボラ株間のアンプリコン類似性分析
例示的なＢＬＡＳＴアライメント出力及び株リスト
【０１８６】
【表９】
2017536813.tif 000023
【０１８７】
株リスト：
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｔｃ／ＣＯＤ／１９７６／Ｙａｍｂｕｋｕ−Ｅｃｒａｎ、全ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ６５５２４６．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅｃｋｅｄｏｕ−Ｃ０５、全ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＪ６６０３４８．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｇｕｅｃｋｅｄｏｕ−Ｃ０７、全ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＪ６６０３４７．２
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｋｉｓｓｉｄｏｕｇｏｕ−Ｃ１５、全ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＪ６６０３４６．２
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＮＭ０４２．３、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３１１８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＮＭ０４２．２、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３１１７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＮＭ０４２．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３１１６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５７、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３１１５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５６．３、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３１１４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５６．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３１１３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３１１２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８５０、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８４８、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８４６、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８４１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８４０、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８３４、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８３１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２９、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２５．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２３、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８２２、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８１０．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８０９、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８０８、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３８００、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７９８、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７９５、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８９．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８８、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８７、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８６、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７８２、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７７１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７７０．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６９．３、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６９．２、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０６６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６９．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６５．２、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０６４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７６４、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５８、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５２、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０６１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５０．３、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５０．２、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７５０．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７３５．２、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０５７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７３５．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７３４．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７２９、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７２４、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７１３．４、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７１３．３、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７１３．２、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０５０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３７０７、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２４．３、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０４７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２４．２、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２４．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１２０、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１９、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１５、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０４１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１３、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ２３３０４０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１２、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１１０、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１０６、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ１０４、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８７．１、部分ゲノム
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ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８６．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５６２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８３．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５６１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８２．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５６０．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６８０．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５９．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７９．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５８．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７７．２、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５７．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７７．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５６．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７６．２、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５５．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７６．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５４．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−Ｇ３６７０．１、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５３．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ０９８、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５２．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ０９６、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５１．１
ザイールエボラウイルス単離体エボラウイルスＨ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ０９５、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５５０．１
ザイールエボラウイルス単離体Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＳＬＥ／２０１４／ＭａｎｏＲｉｖｅｒ−ＥＭ０９５Ｂ、部分ゲノム
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％  ＫＭ０３４５４９．１
変異体ザイールエボラウイルス、全配列
１０２  １０２  １００％  １ｅ−２３  １００％。
【０１８８】
他の実施形態
先の記述により、変異及び修飾が本明細書に記載の本発明になされ、様々な利用及び条件に採用し得ることが明らかである。そのような実施形態は以下の特許請求の範囲内でもある。
【０１８９】
本明細書の変数の任意の定義における要素の列挙の引用は、その変数が任意の単一の要素又は列挙した要素の組合せ（又は部分的組合せ）である定義を含む。本明細書の実施形態の引用は、実施形態が任意の単一の実施形態又は任意の他の実施形態若しくはその部分との組合せであることを含む。
【０１９０】
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる２０１２年４月９日に出願した米国仮特許出願第６１／６２１，９７５号の利益を主張する、２０１３年４月９日に出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３５７５０号に関し得る。
【０１９１】
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる２０１０年８月１３日に出願した米国仮特許出願第６１／３７３，６９５号の利益を主張する、２０１１年８月９日に出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４７０４９に関し得る。
【０１９２】
本明細書に述べた全ての特許及び刊行物は、それぞれの特許及び刊行物が特異的に及び個々に参照に組み込まれると示されるのと同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
2017536813.tif 000026
【図３Ｃ−Ｄ】
2017536813.tif 000027
【図３Ｅ−Ｆ】
2017536813.tif 000028
【図３Ｇ−Ｈ】
2017536813.tif 000029
【図３Ｉ−Ｊ】
2017536813.tif 000030
【図３Ｋ−Ｌ】
2017536813.tif 000031
【図３Ｍ−Ｎ】
2017536813.tif 000032
【図３Ｏ−Ｐ】
2017536813.tif 000033
【図３Ｑ−Ｒ】
2017536813.tif 000034
【図３Ｓ−Ｔ】
2017536813.tif 000035
【図３Ｕ−Ｖ】
2017536813.tif 000036
【図３Ｗ−Ｘ】
2017536813.tif 000037
【図４】
2017536813.tif 000038
【図５】
2017536813.tif 000039
【図６Ａ】
2017536813.tif 000040
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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