(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸は、単一の細胞内の単一のＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、本件方法は量子ドットの使用に関する。一実施形態は、ＲＮＡ（又は他のヌクレオチド）標的に結合できる２つ以上（いくつかの実施形態では少なくとも５つ）の核酸プローブを用いることを含む方法に関する。いくつかの実施形態において、本件方法は、１つ以上のＲＮＡ標的を検出するのに用いられ得る。いくつかの実施形態において、本件方法は、インビボでのＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析をさらに含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの標的核酸を検出する方法であって、
前記少なくとも１つの標的核酸を、複数の異なる核酸プローブに接触することを備え、
前記複数の異なる核酸プローブは、該複数の異なる核酸プローブが前記少なくとも１つの標的核酸に結合する条件下で長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素に結合されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの検出可能な要素は、長波長の発光をする粒子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子は、量子ドットであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸は、ＲＮＡを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記標的核酸は、単一の細胞内の単一のＲＮＡ分子を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の異なる核酸プローブは、５以上の異なるプローブを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の異なる核酸プローブのそれぞれは、約１０〜約１００ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の異なる核酸プローブのそれぞれは、約２０〜約８０ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の異なるプローブのそれぞれは、約３０ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
複数の前記標的核酸が検出されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素と結合された核酸プローブ。
【請求項１２】
少なくとも１つの検出可能な前記要素は、長波長の発光をする粒子を含むことを特徴とする請求項１１に記載の核酸プローブ。
【請求項１３】
前記粒子は、量子ドットであることを特徴とする請求項１２に記載の核酸プローブ。
【請求項１４】
少なくとも１つの検出可能な前記要素は、前記核酸プローブに共有結合で結合されることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の核酸プローブ。
【請求項１５】
約１０〜約１００ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の核酸プローブ。
【請求項１６】
約２０〜約８０ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の核酸プローブ。
【請求項１７】
約３０ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の核酸プローブ。
【請求項１８】
少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズできる複数の異なる核酸プローブを含むキットであって、
前記複数の異なる核酸プローブは、長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素に結合されていることを特徴とするキット。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの検出可能な要素は、長波長の発光をする粒子を含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記粒子は、量子ドットであることを特徴とする請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの検出可能な要素は、前記複数の異なる核酸プローブのそれぞれに共有結合されていることを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
複数の標的核酸を検出するための方法であって、
前記複数の標的核酸を複数の核酸プローブのセットと接触させることを備え、
前記核酸プローブのセットのそれぞれは、長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素に結合された複数の異なる核酸プローブを含み、
前記核酸プローブのセットのそれぞれは、異なる前記標的核酸にハイブリダイズし、
前記核酸プローブのセットのそれぞれは、長波長の発光をする検出可能な要素に結合され、
前記長波長は、前記核酸プローブの他のセットに結合された検出可能な要素の長波長の発光と区別可能であり、
前記接触は、前記複数の核酸プローブのセットが前記複数の標的核酸に結合する条件下で行われることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１４年９月２２日に出願され、発明の名称が「単分子ＲＮＡ検出」である米国仮出願番号第６２／０５３５９５号による優先権の利益を主張する。上記出願の開示の全体は、本明細書の全体に参照として明確に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府資金による研究開発の記載）
本発明は、国立衛生研究所により付与された認可番号ＮＩＨＤＰ２−ＯＤ００７４１７に基づく政府支援で行われた。政府は、本発明における所定の権利を有する。
【０００３】
（配列表、表、又はコンピュータプログラム表の参照）
本願は、電子フォーマットにおける配列表と共に出願されている。該配列表は、２６ｋｂの大きさであり、２０１５年９月１１日に作成され、UCSD090-001WO_Sequence_Listing.TXTのファイル名で提供されている。該配列表の電子フォーマットにおける情報は、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【０００４】
（技術分野）
本発明は、少なくとも１つの標的核酸を検出するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００５】
標的核酸を検出するための従来の方法は、多大の数のプローブの使用を必要とし、又は高額である。従って、それに用いられる改良された方法及び組成物が有益である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態は、以下の番号付けされたパラグラフにおいて示される。
【０００７】
１．少なくとも１つの標的核酸を検出する方法であって、該少なくとも１つの標的核酸を複数の異なる核酸プローブに接触することを備え、前記複数の異なる核酸プローブは、該複数の異なる核酸プローブが前記少なくとも１つの標的核酸に結合する条件下における長波長の発光によって検出可能な少なくとも１つの要素に結合されている。
【０００８】
２．上記パラグラフ１の方法において、前記少なくとも１つの検出可能な要素は、長波長の発光をする粒子を含む。
【０００９】
３．上記パラグラフ２の方法において、前記粒子は、量子ドットである。
【００１０】
４．上記パラグラフ１〜３のいずれかの方法において、前記標的核酸はＲＮＡを含む。
【００１１】
５．上記パラグラフ１〜４のいずれかの方法において、前記標的核酸は、単一の細胞内の単一のＲＮＡ分子を含む。
【００１２】
６．上記パラグラフ１〜５のいずれかの方法において、前記複数の異なるプローブは、５以上の異なるプローブを含む。
【００１３】
７．上記パラグラフ１〜６のいずれかの方法において、前記複数の異なるプローブのそれぞれは、約１０〜約１００ヌクレオチド長である。
【００１４】
８．上記パラグラフ１〜７のいずれかの方法において、前記複数の異なるプローブのそれぞれは、約２０〜約８０ヌクレオチド長である。
【００１５】
９．上記パラグラフ１〜８のいずれかの方法において、前記複数の異なるプローブのそれぞれは、約３０ヌクレオチド長である。
【００１６】
１０．上記パラグラフ１〜９のいずれかの方法において、前記複数の標的核酸は検出される。
【００１７】
１１．長波長の発光によって検出可能な少なくとも１つの要素と結合された核酸プローブ。
【００１８】
１２．上記パラグラフ１１の核酸プローブにおいて、少なくとも１つの検出可能な前記要素は、長波長の発光をする粒子を含む。
【００１９】
１３．上記パラグラフ１２の核酸プローブにおいて、前記粒子は量子ドットである。
【００２０】
１４．上記パラグラフ１１〜１３のいずれかの核酸プローブにおいて、少なくとも１つの検出可能な前記要素は、前記核酸プローブに共有結合で結合される。
【００２１】
１５．上記パラグラフ１１〜１４のいずれかの核酸プローブにおいて、前記核酸プローブは、約１０〜約１００ヌクレオチド長である。
【００２２】
１６．上記パラグラフ１１〜１５のいずれかの核酸プローブにおいて、前記核酸プローブは、約２０〜約８０ヌクレオチド長である。
【００２３】
１７．上記パラグラフ１１〜１６のいずれかの核酸プローブにおいて、前記核酸プローブは、約３０ヌクレオチド長である。
【００２４】
１８．少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズできる複数の異なる核酸プローブを含むキットであって、前記複数の異なる核酸プローブは、長波長の発光をすることで検出可能な少なくとも１つの要素に結合されている。
【００２５】
１９．上記パラグラフ１８のキットにおいて、前記少なくとも１つの検出可能な要素は、長波長で発光する粒子を含む。
【００２６】
２０．上記パラグラフ１９のキットにおいて、前記粒子は、量子ドットである。
【００２７】
２１．上記パラグラフ１８〜２０のいずれかのキットにおいて、前記少なくとも１つの検出可能な要素は、前記複数の異なる核酸プローブのそれぞれに共有結合されている。
【００２８】
２２．複数の標的核酸を検出するための方法が提供され、前記方法は、前記標的核酸を複数の核酸プローブのセットと接触させることを備え、前記核酸プローブのセットのそれぞれは、長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素に結合された複数の異なる核酸プローブを含み、核酸プローブのセットのそれぞれは、異なる標的核酸にハイブリダイズし、また、核酸プローブのセットのそれぞれは、長波長で発光する検出可能な要素に結合され、該長波長は、核酸プローブの他のセットに結合された検出可能な要素の長波長の発光と区別可能であり、前記接触は、前記複数の核酸プローブのセットが前記複数の標的核酸に結合する条件下で行われる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンでコートされた量子ドットとの結合を示す図である。図１に示すように、淡い色の配列は、量子ドットで結合されたオリゴヌクレオチドプローブに相補的である。
【図２】スポット識別とリボ核酸の単分子のカウントのステップを示す。（Ａ）は６０倍の油浸対物レンズで得られた原画像（７１のｚスタックの２９番目のスライス）である。スケールバーは約１μｍを示す。（Ｂ）はLaplacian of Gaussianフィルタ後の画像が適用される。（Ｃ）はデコンボリューションされた画像であり、１６ビットフォーマットに変換された画像である。（Ｄ）強度閾値規格による信号のデジタル識別を示す。
【図３】検出及びカウントされたスポットのデジタル３Ｄ再構成を示す。カウントされたスポットの視覚化について（Ａ）は側面視を示し、（Ｂ）は上面視を示す。
【図４Ａ】QD-smRNA-FISHを用いたＲＮＡ分子の定量を示し、（ａ）は量子ドットで標識されたプローブを有する単分子ＲＮＡ−ＦＩＳＨを示す。図に示すように、淡い色の配列は、プローブに相補的である。
【図４Ｂ】QD-smRNA-FISHを用いたＲＮＡ分子の定量を示し、（ｂ）は幹細胞中のＡｃｔｂＲＮＡ分子の定量を示す。図に示すように、複製１は１３、１４、１５、１９、２２、２３、２７、３０〜３３及び３７の位置である。
【図４Ｃ−Ｄ】QD-smRNA-FISHを用いたＲＮＡ分子の定量を示し、（ｃ）はＡｃｔｂ遺伝子に関するsmRNA-FISH又はQD-smRNA-FISHのためのプローブの位置を示す。（ｄ）は有機（Ａｌｅｘａ５５５）及び無機（ＱＤ５６５）ダイで標識されたプローブから検出された信号（矢印）の共局在を示す。
【図５Ａ】５Ｍａｌａｔ１及びＳｌｃ２ａ３遺伝子からのＲＮＡの共局在の実験的証拠を示し、（ａ）はＭａｌａｔ１及びＳｌｃ２ａ３ＲＮＡの共局在の仮説を試験するための二重標識を示す。
【図５Ｂ−Ｄ】５Ｍａｌａｔ１及びＳｌｃ２ａ３遺伝子からのＲＮＡの共局在の実験的証拠を示し、（ｂ）はＭａｌａｔ１ＲＮＡ分子の定量を示す。（ｃ）はＳｌｃ２ａ３ＲＮＡ分子の定量を示す。（ｄ）はＭａｌａｔ１及びＳｌｃ２ａ３ＲＮＡの共局在するＲＮＡ分子の定量を示す。図に示すように、グラフの下側にＭａｌａｔ１を示し、数字で示す領域はオーバーラップを示し、グラフの上側にＳｌｃ２ａ３を示す。
【図５Ｅ】５Ｍａｌａｔ１及びＳｌｃ２ａ３遺伝子からのＲＮＡの共局在の実験的証拠を示し、（ｅ）は異なるダイ及びフィルタで得られた代表的な画像であり、４つのスポット（矢印）の共局在を示す。
【図６】プローブ標識のための最適な混合物を試験するための量子ドット及びオリゴヌクレオチドの用量設定について示す。ｑＤｏｔ６２５＋  Ａｃｔｂオリゴを赤のラベルで標識し、Ａｃｔｂオリゴを緑のラベルで標識した。ｑＤｏｔ６２５＋  Ａｃｔｂオリゴ及びＡｃｔｂオリゴの移動は、ゲル上に示される。
【図７】進行性の蛍光の閾値でのスポットのカウントを示す。挿入されたグラフは、３つの連続的なカウントの第１のプラトー周辺のカウントである。１７０００〜２７０００の任意蛍光単位を含む領域が挿入されたグラフに示され（左図、図７Ａ）、３００００〜４００００の任意蛍光単位を含む領域が挿入されたグラフに示される（右図、図７Ｂ）。
【図８Ａ−Ｂ】Ａｌｅｘａ５５５及びｑＤｏｔ ５６５の励起及び発光の差を示し、（ａ）、（ｂ）は、ｑＤｏｔ及びＡｌｅｘａ ５５５の励起波長が異なることを示す（ｂの刺激レーン）。
【図８Ｃ】Ａｌｅｘａ５５５及びｑＤｏｔ ５６５の励起及び発光の差を示し、（ｃ）は対応する変換発光フィルタで得られたＡｌｅｘａ５５５及びｑＤｏｔ ５６５のRNA-FISHシグナルを示す。
【図９Ａ−Ｂ】ｑＤｏｔ５２５シグナル及びｑＤｏｔ ６０５シグナルの差を示す。ｑＤｏｔ ５２５及びｑＤｏｔ ６０５の発光波長（実線）は分離され、左のピークがｑＤｏｔ ５２５であり、右のピークがｑＤｏｔ６０５である。（ａ）は重なっていない範囲の発光フィルタの組合せを示す（（ｂ）の発光レーン）（FluorescenceSpectraViewer, Life Technologiesを用いて描画した）。
【図９Ｃ】ｑＤｏｔ５２５シグナル及びｑＤｏｔ ６０５シグナルの差を示す。ｑＤｏｔ ５２５及びｑＤｏｔ ６０５の発光波長（実線）は分離され、左のピークがｑＤｏｔ ５２５であり、右のピークがｑＤｏｔ６０５である。（ｃ）は対応する変換発光フィルタで得られたｑＤｏｔ ５２５及びｑＤｏｔ６０５のRNA-FISHシグナルを示す。
【図１０Ａ−Ｂ】二色smRNA-FISHを用いた共局在ＲＮＡを示し、（Ａ）は、（１つのＲＮＡ分子にそれぞれ対応する）検出された全てのスポットのボクセル分布を示す。中央のドットは平均サイズである。エラーバーはサンプルの標準偏差である。（Ｂ）は、同定されたスポットの平均体積及び半径を示す。
【図１０Ｃ−Ｄ】二色smRNA-FISHを用いた共局在ＲＮＡを示し、（Ｃ）は局在スポットの基準を示す。（Ｄ）は、２つの細胞をカバーする視野で同定された全てのスポットを示すグラフである。矢印は、異なる波長で蛍光を発光する色素を用いて表された共局在スポットを示す。１ピクセルは約１０７ｎｍである。矢印は、Ｍａｌａｔ１とＳｃｌ２ａ３との間の共局在を示す。
【図１１】種々のサイズのＣｄＴｅ量子ドットの蛍光スペクトルを示す。異なるサイズの量子ドットは、量子閉じ込めに従って異なる色の光を発する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（定義）
以下の記載において、多くの用語が広く用いられる。以下の定義は、現存する選択肢の理解を促進する。
【００３１】
本明細書で用いられる「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は１つよりも多いことを意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる「約」の用語は、値が、値を測定するために採用された方法における誤差の固有の差異、又は試験間に存在する差異を含むことを示す。
【００３３】
本明細書で用いられる「核酸プローブ」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）等のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成された断片、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼの作用及びエキソヌクレアーゼの作用のいずれかにより生成された断片を意味し、それは標的核酸（すなわち、ＤＮＡ標的又はＲＮＡ標的）の存在を検出するために用いられ得る。核酸プローブは、天然起源のヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡ等）、天然起源のヌクレオチドのアナログ（例えば天然起源ヌクレオチドのエナンチオマー型）又はその両方の組合せであるモノマーにより構成され得る。長波長で発光する量子ドット又は同等の粒子でラベルされる核酸プローブ又はハイブリダイゼーションプローブは、種々の微生物の核酸配列に存在する相補的な部分又は配列を同定するのに用いられ得る。核酸プローブは、可変長のＤＮＡ又はＲＮＡの断片を含み得る。プローブのサイズは、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００若しくは約１０００塩基長、又は上記値のいずれか２つの間の長さの範囲であってもよい。標的核酸配列は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００若しくは約１０００塩基長、又は上記値のいずれか２つの間の長さの範囲のサイズを含む。それは、プローブの配列に相補的な核酸配列（ＤＮＡ標的又はＲＮＡ標的鎖）の存在を検出するために、ＤＮＡ又はＲＮＡサンプルに用いられ得る。それにより、プローブは、プローブと標的との間の相補性によりプローブと標的との塩基対を形成できる塩基配列を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）にハイブリダイズする。プローブは、まず（例えば加熱処理又は水酸化ナトリウムに曝露する等のアルカリ処理によって）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変性され、その後に標的ｓｓＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法が提供され、その方法は、前記少なくとも１つの標的核酸を、前記複数の異なる核酸プローブが前記少なくとも１つの標的核酸に結合する条件下で長波長発光をする少なくとも１つの検出可能な要素と結合する複数の異なる核酸プローブに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、プローブは標的核酸鎖内の標的配列に結合する。
【００３４】
本明細書において、「標的」又は「標的核酸」は、核酸プローブに相補的な核酸配列を意味する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、単一の細胞内の単一のＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、細胞内に存在する、又は１つの細胞若しくは複数の細胞から得られる核酸サンプル内に存在する。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、単一の標的核酸鎖における標的配列に相補的である。いくつかの実施形態において、標的核酸鎖はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸鎖は、少なくとも１つの標的配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸プローブは、標的核酸鎖における少なくとも１つの標的配列に相補的である。
【００３５】
「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味し、遺伝子のコード、デコード、制御及び発現における種々の生物学的役割に関与する高分子である。ＲＮＡは、生物的反応を触媒する、遺伝子発現を制御する、又は細胞シグナルを検知して応答することにより、細胞内で積極的役割を果たす。メッセンジャーＲＮＡは、リボソームにタンパク質配列の情報を輸送し、それはリボソームを通じて翻訳される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法を提供し、その方法は、前記少なくとも１つの標的核酸を、複数の異なる核酸プローブが前記少なくとも１つの標的核酸に結合する条件下で長波長発光をする少なくとも１つの検出可能な要素に結合する複数の異なる核酸プローブに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、単一の細胞内の単一のＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、さらにインビボにおけるＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単分子解析を含む。
【００３６】
「相補的」の用語は、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全て又は一部に相補的であることを意味する。例えば、ヌクレオチド配列5’-“CATTAG”-3’は、参照配列“CATTAG”に対応し、参照配列3’-“GTAATC”-5’に相補的である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法が提供され、その方法は、前記少なくとも１つの標的核酸を、複数の異なる核酸プローブが少なくとも１つの標的核酸に結合する条件下で長波長発光する少なくとも１つの検出可能な要素に結合する複数の異なる核酸プローブに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、異なる核酸プローブは、少なくとも１つの標的核酸に相補的である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
【００３７】
本明細書で記載される「粒子」は、ナノ結晶等の微小物を意味し、例えばそれは、長波長で発光することにより高エネルギー状態から低エネルギー状態に粒子崩壊され得る。本明細書に記載された所定の実施形態において、粒子は、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ若しくは約８５０ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間の波長での長波長発光をする。
【００３８】
「量子ドット」は、無機ナノ結晶半導体を意味する。量子ドットのサイズは、高度に調整可能な色スペクトルを可能にする発光された光の波長を反映する。量子ドットのサイズは調整可能であり、サイズの増大は、発光の波長範囲を増大し得る。従って、量子ドットは、粒子の高い比表面積の結果、特有な電子特性を示す。最も明確な結果はそれらの蛍光であり、それらのサイズにより決定される明確な色が生成される。量子ドットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約９、約１０又は約１１ｎｍのサイズの範囲にあってもよい。本明細書に記載された所定の実施形態において、量子ドットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０若しくは約１１ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズを含む。図１１に示すように、例示的な量子ドットは、非常に狭い波長範囲内で発光し得るが、異なる波長で発光する異なるサイズの量子ドットを含む異なる核酸プローブと多重化又は組合せ可能な広いスペクトルに亘って励起される。図１１に示すように、例示的な量子ドットは、４５０〜８５０ｎｍで発光し得る。量子ドットのサイズが大きくなるほど、その蛍光スペクトルはより赤くなる（より低いエネルギー）。反対に、小さいドットはより青い光で発光する（より高いエネルギー）。限定されることは無いが、下記表１は、発光ピーク及び発光色と例示的なサイズとの関連性を示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
量子ドットの発光は、例えば４５０〜８５０ｎｍの波長の長波長で見られる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ若しくは約８５０ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間の波長での長波長発光をする。本明細書に記載された所定の実施形態において、量子ドットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０若しくは約１１ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズを含む。
【００４１】
量子ドットは、種々の二元化合物により形成され得る。量子ドットは、以下に限定されないが、例えば硫化鉛、セレン化鉛、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウム及びリン化インジウム等で構成され得る。本明細書に記載される所定の実施形態において、量子ドットは、硫化鉛、セレン化鉛、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウム又はリン化インジウムを含む。
【００４２】
標的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出するために、プローブは、長波長の発光をする量子ドット又は同等の粒子によってタグ化（又はラベル化）され得る。プローブに対して中程度から高度の相補性を有するＤＮＡ配列又はＲＮＡ転写物は、当業者に周知の画像化技術によりハイブリダイズされたプローブを可視化することにより検出される。中程度から高度の類似性を有する配列の検出は、ハイブリダイゼーション条件がどの程度の厳しさ（厳密性）かに依存し、例えば、高い厳密性は、高いハイブリダイゼーション温度やハイブリダイゼーションバッファ中の低い塩濃度等が適用され、これは高い類似性をもつ核酸配列同士のハイブリダイゼーションにのみ許容される。一方、低い厳密性は、低い温度や高い塩濃度が適用され、より低い類似性をもつ配列同士のハイブリダイゼーションの際に許容される。
【００４３】
その方法に依存して、プローブは、アミド亜リン酸法を用いて合成され得る、又はＰＣＲ増幅若しくはクローニング（両方とも昔からある方法）により生成され且つラベル化され得る。例えば、プローブは、プローブのインビボでの安定性の増強のためにインビボで用いられ、ＲＮＡは好適に用いられず、代わりに、特にモルフォリノ誘導体等のＲＮＡアナログが用いられ得る。ＤＮＡベース又はＲＮＡベースプローブ分子は、例えば遺伝子ライブラリのスクリーニング、ブロッティング法によるヌクレオチド配列の検出、並びに核酸及び組織マイクロアレイ等の他の遺伝子技術に用いられ得る。いくつかの実施形態において、プローブは、アミド亜リン酸法を用いて合成され得る、又はＰＣＲ増幅若しくはクローニングにより生成され且つラベル化され得る。いくつかの実施形態において、プローブは、例えばモルフォリノ誘導体等のＲＮＡアナログを含む。
【００４４】
本明細書で定義される「発光スペクトル」は、高いエネルギー状態から低いエネルギー状態への変換を起こす原子又は分子により発射された電磁放射の周波数のスペクトルを意味する。
【００４５】
（実施形態）
本開示は、少なくとも１つの標的核酸を検出するための方法である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸は、単一の細胞内の単一のＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、その方法は、量子ドットの使用に関連する。いくつかの実施形態において、その方法は、約３分の１にまでコストを低減する。
【００４６】
一実施形態は、ＲＮＡ（又は他のヌクレオチド）標的に結合可能な２つ以上（いくつかの実施形態においては少なくとも５つ）の核酸プローブの使用を含む方法に関する。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、約１０〜約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００若しくは約１１０ヌクレオチド長、又は上記値のいずれか２つの間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、約２０〜約８０ヌクレオチド長である。本明細書に記載される所定の実施形態において、核酸プローブは、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０若しくは約８０ヌクレオチド長、又は上記値のいずれか２つの間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、核酸プローブのそれぞれは、少なくとも１つの量子ドット（又は長波長の発光により特徴付けられる同等の粒子）を含む。いくつかの実施形態において、量子ドットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０若しくは約１１ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの量子ドット又は長波長の発光により特徴付けられる同等の粒子は、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ若しくは約８５０ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間の波長での長波長発光をする。
【００４７】
いくつかの実施形態において、上記方法は、１つ以上のＲＮＡ標的を検出するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、さらに、インビボでのＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析を含む。
【００４８】
現在の方法は、約２０ｎｔを含み、蛍光色素に結合された約４０の核酸プローブの使用に依拠する。現在の色素は制限された発光スペクトルを有するため、このような多数のプローブが必要となる。これにより、約１５００ＵＳドル／ＲＮＡ標的のコストが生じる。量子ドット（ＱＤ）の使用は、それら固有の「点滅」のため、以前にはこの問題を解決するとは考えられていなかった。従って、使用中に、サンプルを観察する際にＱＤが発光しない約１０％の機会がある。しかしながら、いくつかの実施形態において、上記問題は、同一の標的に複数のＱＤラベル化プローブ（好ましくは約５つ）を用いることにより回避される。これは、所定のＲＮＡ標的に結合された５つのＱＤによるものであり、全てのＱＤが同時に発光しない機会は約１０５である。これは、プローブの数を約４０から約５に低減する。また、プローブ−標的特異性及び信号雑音比を増大し得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、上記方法は、複数のＲＮＡ標的の評価を同時に可能とする。これは、現在における複数のＲＮＡ標的の同時評価が困難であり、高価な顕微鏡の使用が必要であることからも有利である。いくつかの実施形態において、その方法は、細胞イメージング研究室で一般に用いられる比較的に高価でない顕微鏡の使用を許容する。いくつかの実施形態において、その方法は、１つ以上のＲＮＡ標的の検出に用いられ得る。いくつかの実施形態において、その方法は、インビボでのＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析をさらに含む。
【００５０】
本件方法のいくつかの態様は、単一細胞内の単一ＲＮＡの検出を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、マイクロアレイ技術と共に用いられ得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、その方法は、単一細胞内の単一ＲＮＡを検出し、いずれかの遺伝子のＲＮＡ転写物をデジタル的に定量する。いくつかの実施形態において、その方法は、１つ以上のＲＮＡ標的を検出するのに用いられ得る。いくつかの実施形態において、その方法は、インビボでのＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析をさらに含む。いくつかの実施形態において、その細胞は、真核細胞又は原核細胞である。いくつかの実施形態において、その細胞は真核細胞であり、その細胞はヒト細胞、ガン細胞、マクロファージ、リンパ球、腫瘍細胞、前ガン細胞又は小グリア細胞である。一つの細胞内におけるＲＮＡ又はＤＮＡの存在による遺伝子発現の追跡に用いられ得るその分析に依存して、その細胞型は、疾病や疾病の進行を分析するために、又はその細胞内における多数の標的核酸の存在若しくは欠損により特定の疾病を予測するために、検出に用いられ得る。いくつかの実施形態において、その方法は、顕微鏡による可視化及び定量化のために、量子ドットでラベルされた一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションを使用する。以前には量子ドットは、周知の点滅問題のため、単一分子研究を可能にするものと考えられていなかった。いくつかの実施形態において、この問題は低減され又は克服され得る。いくつかの実施形態において、その方法は、単一分子ＲＮＡ−ＦＩＳＨのための有機色素及び数倍ものオリゴヌクレオチドを用いる技術と比較して、コストを３分の１に低減し、検出をより明確且つ容易にし、さらにより信頼性の高い信号が得られる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０若しくは約１１ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズを含む。いくつかの実施形態において、量子ドットは、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ若しくは約８５０ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間の波長での長波長発光をする。
【００５２】
所定の遺伝子の科学的発見の大半は、その転写を研究することにより得られる。この生物学的減少（遺伝子転写）から得られた情報は、コード配列の構造からタンパク質レベルでの潜在的相互作用までの遺伝子機能に関連する重要なパラメータを推測するのに用いられる。遺伝子発現の情報の大半は、細胞集団（例えば細胞培養液又は組織サンプル）から収集されてきたが、広い領域又は研究では個々の細胞に注意が向いている。結果として、構成や組織における単一の細胞の重要性は、研究者及び資金源から注目を得ている。いくつかの実施形態において、その方法は、所望の遺伝子の転写レベルを得ることをさらに含む。いくつかの実施形態において、所望の遺伝子の転写レベルを得ることは、疾病や疾病の進行を分析するために、又はその細胞内における多数の標的核酸の存在若しくは欠損により特定の疾病を予測するために用いられ得る。
【００５３】
非常に重要ではあるが、単一細胞の遺伝子発現を研究することは、技術的課題を伴う。現在、１つの技術のみが、技術的偏りが導入されること無く、単一細胞の遺伝子発現の情報を得ることを可能とする(Raj, A., Peskin, C.S., Tranchina, D., Vargas, D.Y., and Tyagi, S.(2006). Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4, e309)。この技術は、蛍光in situハイブリダイゼーションであり、近年の技術的改善は、研究者らに、顕微鏡を用いて所望の遺伝子のリボ核酸の単一分子を画像化することを可能とした(Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S.A., van Oudenaarden, A., andTyagi, S. (2008). Imaging individual mRNA molecules using multiple singlylabeled probes. Nat. Methods 5, 877-879; Batish, M., Raj, A., and Tyagi, S.(2011). Single molecule imaging of RNA in situ. Methods Mol. Biol. 714, 3-13.Raj, A., and Tyagi, S. (2010). Detection of individual endogenous RNAtranscripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472,365-386; Shaffer, S.M., Wu, M.-T., Levesque, M.J., and Raj, A. (2013). TurboFISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One 8, e75120)。この利点は遺伝子発現の研究に大きなステップを与えたが、いくつかの実施形態における本件方法及び組成物は、上記現在の方法と比較してより低いコストでリボ核酸の単一分子の標的検出について、より大きく改善する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、量子ドットと結合した複数の異なる核酸プローブを用いた蛍光in situハイブリダイゼーションにより核酸の単一分子を検出する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、量子ドットと結合した５つの異なる核酸プローブが用いられる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、核酸プローブに共有結合され得る。いくつかの実施形態において、量子ドットと結合した核酸プローブは、単一分子を検出するのに用いられ得る。量子ドットと結合するオリゴヌクレオチドは、新規の技術と共に（培養細胞又は組織中の）ＲＮＡの数をカウントするのに用いられ得る。いくつかの実施形態において、その方法は、標的分子（ＲＮＡ等）に１つ以上（所定の数）の量子ドットをもたらす。例えば、いくつかの実施形態において、複数の量子ドットは、他の信号のそれぞれを補完して、標的分子の近くにもたらされ、従って「点滅」の際の信号消失を「相殺」する。点滅によって生じる量子ドットの信号の消失は、分子の検出及び定量のためにそれらを適用するための障壁となっていた。
【００５５】
量子ドットは、当業者に周知の種々の技術により、核酸プローブにコンジュゲートされ得る。以下に限定されないが、量子ドットは、ＥＤＣ及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）(Choi et al. In situ visualization of gene expression usingpolymer-coated quantum-dot-DNA conjugates. Small 2009; 5:2085e91; incorporatedby reference in its entirety)、アミド架橋の形成を介して量子ドット表面に結合するためのＤＮＡのアミン修飾体、並びにストレプトアビジンにコーティングされた量子ドットに結合するためのオリゴヌクレオチドのビオチン化物(Kim et al., Conjugation of DNA to Streptavidin-coated Quantum Dots forthe Real-time Imaging of Gene Transfer into Live Cells, NSTI-Nanotech 2004,www.nsti.org, ISBN 0-9728422-9-2 Vol. 3, 2004;これらの内容は参照として本願明細書に組み込まれる。)の存在下で核酸プローブにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、量子ドットは、ＥＤＣ及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）の存在下で核酸にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、アミド架橋の形成を介して量子ドット表面に結合するための核酸のアミン修飾体によって、核酸にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、ストレプトアビジンにコーティングされた量子ドットに結合するための核酸のビオチン化によって、核酸にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、標的核酸配列に相補的であり、プローブは、ＱＤに共有結合されたリンカー核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、リンカーＤＮＡは、アニーリングの際の量子ドットの動きを自由にできて、さらに、ＱＤのサイズがアニーリングを妨げる場合にはアニーリングサイトから量子ドットを離すことを可能とする。アニーリング条件を改善する方法がさらに実行可能であり、当業者に周知である。例えば、標的結合サイトに相補的でない短いリンカーは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９若しくは約１０の核酸、又は上記値のいずれか２つの間の数の核酸を含む。上記核酸プローブのいくつかの実施形態において、そのプローブは核酸リンカーをさらに含み、その核酸リンカーは標的結合サイトに相補的ではなく、その核酸リンカーは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９若しくは約１０の核酸、又は上記値のいずれか２つの間の数の核酸を含み、ＱＤはその核酸リンカーに共有結合される。
【００５６】
（予め設定された）少数の異なる核酸プローブの使用により、核酸の少なくとも１つの特定の配列にハイブリダイズすることを設計され、それは、量子ドットに結合され、標的核酸の単一分子の検出を可能とする。いくつかの実施形態において、予め設定された数（例えば５つ以上）の量子ドットの累積的蛍光は、ラベルに用いられ、分子標的の検出及び定量に用いられる。
【００５７】
以前の量子ドットでラベル化されたプローブを用いる蛍光in situハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチド毎に１つの量子ドット分子のみで画像化することに依拠していた(Yang, H., Wanner, I.B., Roper, S.D., and Chaudhari, N. (1999). Anoptimized method for in situ hybridization with signal amplification thatallows the detection of rare mRNAs. J. Histochem. Cytochem. 47, 431-446; Chan,P., Yuen, T., Ruf, F., Gonzalez-maeso, J., & Sealfon, S. C. (2005). Methodfor multiplex cellular detection of mRNAs using quantum dot fluorescent in situhybridization. Nucleic acids research, 33(18), 1-8. doi:10.1093/nar/gni162; Choi,Y., Kim, H. P., Hong, S. M., Ryu, J. Y., Han, S. J., & Song, R. (2009). Insitu Visualization of Gene Expression Using Polymer-Coated Quantum-Dot - DNAConjugates. Small, 5(18), 2085-2091. doi:10.1002/smll.200900116; Akita, H.,Umetsu, Y., Kurihara, D., & Harashima, H. (2011). Dual imaging of mRNA andprotein production: An investigationof the mechanism of heterogeneity in cationic lipid-mediated transgeneexpression. International Journal of Pharmaceutics, 415, 218-220.doi:10.1016/j.ijpharm.2011.05.051; Ioannou, A., Eleftheriou, I., Lubatti, A.,Charalambous, A., & Skourides, P. A. (2012). High-resolution whole-mount insitu hybridization using Quantum Dot nanocrystals. Journal of biomedicine &biotechnology, 2012, 627602. doi:10.1155/2012/627602)。この方法は、量子ドットが断続的に蛍光を発光する固有の特性を有するため、光の励起により発光状態のオン／オフを示すので、標的の単一のリボ核酸を画像化するのに有効ではなく(Wu, S., Zhao, X., Zhang, Z., and Xie, H. (2006). Quantum-Dot-LabeledDNA Probes for Fluorescence In Situ Hybridization ( FISH ) in the MicroorganismEscherichia coli. 1062-1067; Smith, A.M., Duan, H., Mohs, A.M., and Nie, S.(2008). Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging.Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1226-1240). This phenomenon, so called blinking, hasbeen observed at different intervals at the order of deciseconds (Wu, S., Zhao,X., Zhang, Z., and Xie, H. (2006). Quantum-Dot-Labeled DNA Probes forFluorescence In Situ Hybridization ( FISH ) in the Microorganism Escherichiacoli. 1062-1067; Friedrich, M., Nozadze, R., Gan, Q., Zelman-femiak, M.,Ermolayev, V., Wagner, T.U., and Harms, G.S. (2009). Biochemical andBiophysical Research Communications Detection of single quantum dots in modelorganisms with sheet illumination microscopy. Biochem. Biophys. Res. Commun.390, 722-727)、１つのプローブとハイブリダイズされた単一分子のリボ核酸の安定した画像化のために１つの量子ドットの使用は非実際的である。結果として、単一の分子は、光励起に従って画像化される又はされず、リボ核酸分子の正確なカウンティングが妥協される。
【００５８】
現在のリボ核酸の単一分子の画像化及び検出は、有機色素でラベル化された約４０のプローブ（２０ヌクレオチド長）の使用に依拠する。いくつかの実施形態において、量子ドットによりラベル化された予め設定された少数（例えば５以上）のプローブは、単一のリボ核酸分子の画像化を達成するのに用いられる。いくつかの実施形態において、プローブは、約３０ヌクレオチド長であってもよいが、本明細書で記載される使用に適合されるいずれの長さも用いられ得る。いくつかの実施形態において、プローブは、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０若しくは約１００ヌクレオチド長、又は上記値のいずれか２つの間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、上記方法は、現在用いられる方法（有機色素に基づく方法等）と比較して、単一分子の検出のコストを数分の１に低減する。２つの会社から得られたオリゴヌクレオチド合成のコスト見積りは、いくつかの実施形態において、リボ核酸の標的毎にオリゴヌクレオチド合成のコストを約５分の１に低減可能である（値について下記表２を参照）。
【００５９】
【表２】
2017529103.tif 000004
2017529103.tif 000005
【００６０】
いくつかの実施形態において、上記方法は、有機色素に基づく方法よりも小さいＲＮＡを検出することが可能である。これは、有機色素に基づく方法が、ＲＮＡに対して、４０個のオリゴの同時のハイブリダイゼーションに十分な長さを必要とするためであり、一方、本明細書に記載された所定の実施形態は、単に２つ又はそれ以上のプローブのハイブリダイゼーションが必要なだけであるため、より短いＲＮＡの検出が可能である。いくつかの実施形態において、上記方法は、小さいＲＮＡを検出可能であり、その小さいＲＮＡのサイズは、約１０ｎｔ、約２０ｎｔ、約３０ｎｔ、約４０ｎｔ、約５０ｎｔ、約６０ｎｔ、約７０ｎｔ、約８０ｎｔ、約９０ｎｔ、約１００ｎｔ、約１１０ｎｔ、約１２０ｎｔ、約１３０ｎｔ、約１４０ｎｔ、約１５０ｎｔ、約１６０ｎｔ、約１７０ｎｔ、約１８０ｎｔ、約１９０ｎｔ若しくは約２００ｎｔ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズである。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本件方法は、他の方法と比較してより低いコストで単一分子のリボ核酸の画像化及び検出を達成するために、少数のプローブと共に光安定性の無機蛍光色素（量子ドット）を使用する。
【００６２】
量子ドットを用いた蛍光in situハイブリダイゼーションによりリボ核酸の標的検出法の現在の最先端(Yang, H.,Wanner, I.B., Roper, S.D., and Chaudhari, N. (1999). An optimized method for insitu hybridization with signal amplification that allows the detection of raremRNAs. J. Histochem. Cytochem. 47, 431-446; Chan, P., Yuen, T., Ruf, F.,Gonzalez-maeso, J., & Sealfon, S. C. (2005). Method for multiplex cellulardetection of mRNAs using quantum dot fluorescent in situ hybridization. Nucleicacids research, 33(18), 1-8. doi:10.1093/nar/gni162; Choi, Y., Kim, H. P.,Hong, S. M., Ryu, J. Y., Han, S. J., & Song, R. (2009). In situVisualization of Gene Expression Using Polymer-Coated Quantum-Dot - DNAConjugates. Small, 5(18), 2085-2091. doi:10.1002/smll.200900116; Akita, H.,Umetsu, Y., Kurihara, D., & Harashima, H. (2011). Dual imaging of mRNA andprotein production: An investigationof the mechanism of heterogeneity in cationic lipid-mediated transgeneexpression. International Journal of Pharmaceutics, 415, 218-220.doi:10.1016/j.ijpharm.2011.05.051; Ioannou, A., Eleftheriou, I., Lubatti, A.,Charalambous, A., & Skourides, P. A. (2012). High-resolution whole-mount insitu hybridization using Quantum Dot nanocrystals. Journal of biomedicine &biotechnology, 2012, 627602. doi:10.1155/2012/627602)は、単一分子又は単一細胞の分析における検出を達成できない、又は達成に近づくことさえできない。これらの方法は、全体として多くの細胞及び多くのＲＮＡの全体の信号の粗い定量を目的としていた。これらの方法は、大きい技術的変動を受けるため、正確な定量を保証するものとみなされない。
【００６３】
単一分子のリボ核酸の標的検出における現在の最先端は、有機色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５又は他の購入可能な代替品）に結合された複数の短いオリゴヌクレオチド（４０〜４８個のオリゴ、２０ヌクレオチド長）の使用に基づく(Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A.,& Tyagi, S. (2008). Imaging individual mRNA molecules using multiple singlylabeled probes. Nature methods, 5(10), 877-9. doi:10.1038/nmeth.1253; Batish,M., Raj, A., & Tyagi, S. (2011). Single molecule imaging of RNA in situ.Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 714, 3-13.doi:10.1007/978-1-61779-005-8_1; Raj, A., & Tyagi, S. (2010). Detection ofindividual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeledprobes. Methods in enzymology, 472, 365-86. doi:10.1016/S0076-6879(10)72004-8;Shaffer, S. M., Wu, M.-T., Levesque, M. J., & Raj, A. (2013). Turbo FISH: AMethod for Rapid Single Molecule RNA FISH. PloS one, 8(9), e75120.doi:10.1371/journal.pone.0075120)。
【００６４】
本件発明のいくつかの実施形態は、量子ドットに結合された予め設定された数（例えば５以上）の異なる核酸プローブを用いる。いくつかの実施形態において、各プローブは、標的リボ核酸に相補的な３０ヌクレオチドの配列を用いて設計及び合成される。いくつかの実施形態において、特注のプローブが、各ヌクレオチドの５’末端に結合されたビオチンと共に合成された。それでもなお、ビオチンリンカーがプローブのいずれかの位置に配置され得ることが好ましいであろう。例えば、いくつかの実施形態において、ビオチンリンカーは、プローブの５’末端及び／又は３’末端に付けられ得る。いくつかの実施形態において、プローブは核酸リンカーを含み、そのリンカーは標的結合サイトに相補的ではなく、その核酸リンカーは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９若しくは約１０の核酸、又は上記値のいずれか２つの間の数の核酸を含み、その核酸リンカーは量子ドットに共有結合される。いくつかの実施形態において、量子ドットは、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ若しくは約８５０ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間の波長での長波長発光をする。いくつかの実施形態において、量子ドットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０若しくは約１１ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズを含む。
【００６５】
本明細書に記載された所定の実施形態において、ストレプトアビジンでコーティングされた量子ドットは、会社から購入された。量子ドットは、オリゴヌクレオチドの混合物を含むμチューブに加えられた。試験は、０．５μＭのオリゴヌクレオチド毎に１μＭの量子ドットの比率で行われた。そうではあるが、量子ドットとプローブとが混合された組成物のそれぞれは、適切な比率で試験されることが好ましい。コンジュゲーションは、室温（２４℃）で３０分間行われた。量子ドット及びオリゴヌクレオチドの溶液は、ハイブリダイゼーションに適するバッファーで混合され、その溶液は接着細胞を含むカバーガラスに接触するように滴下された。蛍光in situハイブリダイゼーションのための固定及び透過化方法の２つの異なるプロトコールは、コンジュゲート化プローブを用いて試験された。ハイブリダイゼーションは、ａ）細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、triton 1xで透過化する、又はｂ）細胞をメタノールで固定及び透過化する、のいずれかを用いて成功した。
【００６６】
本明細書に記載のように、本件方法のいくつかの実施形態を使用すると、アクチンβ遺伝子の単一分子リボ核酸が、量子ドットと結合した５つのオリゴヌクレオチドを用いた蛍光in situハイブリダイゼーションにより、マウスのインビトロ培養幹細胞で有効に検出された。
【００６７】
単一分子ＲＮＡ−ＦＩＳＨは、多くの研究室で用いられて益々有名となっている技術である。この技術の主要な欠点は、その多大なコストであり、そのコストは一遺伝子当たり約１５００ＵＳドルである。そのようなコストで数ダース又は数百の遺伝子を研究することは研究室にとって困難である。いくつかの実施形態において、本件方法は、一遺伝子当たり５００ＵＳドル未満にコストを低減し、単一分子ＲＮＡ−ＦＩＳＨ市場の急速な拡大に用いられ得る。
【００６８】
単一細胞のＲＮＡ定量は、急速に市場が拡大している。まず、単一細胞分析に政府支出が向いていることは明らかである。ＮＩＨ単独で２０１２年〜２０１７年に単一細胞分析で９千万ＵＳドル以上の初期投資が計画された(www.nih.gov/news/health/oct2012/nibib-15.htm)。ＮＩＨの所長室は、単一細胞プロジェクトのための共同資金を設け(www.commonfund.nih.gov/singlecell/)、それは、より大きい投資を伴う。産業部門から、単一細胞分析がガン、幹細胞及び神経分析になる。結局、細胞不均一性は、これらの分析の中心課題である。これらの急速な注目から、単一分子ＲＮＡ検出のためのプローブに対して高い需要が生じるであろう。
【００６９】
所定の遺伝子の科学的発見の大半は、その発現を研究することにより得られる。遺伝子転写から得られる情報は、コード配列の構造からタンパク質レベルでの潜在的相互作用までの遺伝子機能に関する重要なパラメータを推測するのに用いられる。遺伝子発現の相互作用の大半は、細胞集団（例えば細胞培養液又は組織サンプル）から収集されてきたが、広い領域又は研究では個々の細胞に注意が向いている。近年における正常組織及び疾病組織における細胞不均一性の認識は、単一細胞における正確なＲＮＡ検出及び定量の重要性にさらに興味が集中する。
【００７０】
遺伝子転写物の正確な定量は、技術的課題を伴う。用いられる方法の大半は、リアルタイムｑＰＣＲ(Valleron W, Laprevotte E, Gautier EF, Quelen C, Demur C, et al. (2012)Specific small nucleolar RNA expression profiles in acute leukemia. Leukemia26: 2052-2060)、遺伝子発現マイクロアレイ(Schena M, Shalon D, Davis RW,Brown PO (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with acomplementary DNA microarray. Science 270: 467-470)、及びＲＮＡシークエンシング(Chu Y, Corey DR (2012) RNA sequencing: platform selection,experimental design, and data interpretation. Nucleic Acid Ther 22: 271-274)を含む遺伝子の転写物のコピー数（カウント）を近似するように設計される。技術的偏りは、近似の生化学的又は生物物理学的ステップの際に、必然的に導入される。さらに、単一細胞レベルでのＲＮＡ定量は、更なる課題を含む。単一細胞分析のためのほとんどの方法は、測定の前にＲＮＡの増幅を必要とし、それは、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ（図３を参照(Nanostring (2014) nCounter Single Cell Gene Expression))、ＳＭＡＲＴ−ｓｅｑ(Ramskold D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, et al. (2012) Full-lengthmRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.Nat Biotechnol 30: 777-782)、及びＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１−ＢｉｏＭａｒｋ(MoignardV, Macaulay IC, Swiers G, Buettner F, Schutte J, et al. (2013) Characterizationof transcriptional networks in blood stem and progenitor cells usinghigh-throughput single-cell gene expression analysis. Nat Cell Biol 15:363-372)を含む。ＲＮＡ増幅ステップは、これらの測定方法における技術的偏りに加える。我々の知る限り、単一細胞におけるＲＮＡコピー数を確実にカウントできるのはただ１つの技術のみである(Raj A, Peskin CS, Tranchina D, Vargas DY, Tyagi S (2006) StochasticmRNA synthesis in mammalian cells. PLoS biology 4: e309)。単一分子ＲＮＡの蛍光in situハイブリダイゼーション（ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨ）技術は、遺伝子のいずれのＲＮＡ分子も可視化し、ＲＮＡ分子を直接的にカウントできる(Batish M, Raj A, Tyagi S (2011) Single molecule imaging of RNA in situ.Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 714: 3-13: Raj A, van den Bogaard P,Rifkin SA, van Oudenaarden A, Tyagi S (2008) Imaging individual mRNA moleculesusing multiple singly labeled probes. Nature methods 5: 877-879; Shaffer SM, WuM-T, Levesque MJ, Raj A (2013) Turbo FISH: A Method for Rapid Single MoleculeRNA FISH. PloS one 8: e75120)。このキーとなる機能は、このデジタル技術（ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨ）を、他の近似技術と区別する。さらに、ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、単一細胞におけるＲＮＡ分子を定量するための増幅を必要とせず、単一細胞分析における技術的偏りの主要な原因を排除する。
【００７１】
標準ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨの主要な制限は、多数のオリゴヌクレオチドプローブを必要とすることである。その技術は、いずれのＲＮＡ分子に対して４０程度の有機蛍光分子（色素）を付けるために、遺伝子毎に約４０のオリゴヌクレオチドプローブを必要とし、ＲＮＡ分子は信号を蓄積し、明らかにバックグラウンドが上昇する。従来の器具（蛍光顕微鏡）に基づいて、この技術は、雑音から信号を分離することが困難であるため、より少ないプローブで行うことができない。そのプローブの数は、超解像度の画像化のための器具が入手可能である場合に低減可能である(Lubeck E, Cai L (2012) Single-cell systems biology by super-resolutionimaging and combinatorial labeling. Nat Methods 9: 743-748)。しかしながら、そのような器具は約５０００００ＵＳドルのコストがかかり、研究室の大半が入手できない。以後、我々は、本文において、入手可能な器具として通常の蛍光顕微鏡のことのみを論じる。本明細書で記載された所定の実施形態において、蛍光顕微鏡は、標的核酸の検出に用いられる。本明細書に記載された所定の実施形態において、本件方法は、インビボでのＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析をさらに含む。
【００７２】
多数のプローブを必要とすることは、複数の欠点を有する。まず、標準ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、比較的に小さいＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子における特定の標的となる小さい領域を試験することができない。４０程度のプローブは、標的に同時に付着可能とするために非重複でなければならず、それは、最低でも１０００塩基長の標的配列を必要とする。しかしながら、５０％以上のヒトｍＲＮＡ分子は、１０００塩基よりも短い（図４を参照、Takahashi H, Lassmann T, Murata M, Carninci P (2012) 5’ end-centeredexpression profiling using cap-analysis gene expression and next-generationsequencing. Nat Protoc 7: 542-561)。さらに、約７５％のヒトｌｎｃＲＮＡは、１０００塩基よりも短く、ｓｎｏＲＮＡｓ及びｔＲＮＡは通常７０〜９５塩基であり、ｓｎＲＮＡは約１５０塩基である。総合すれば、ヒトのトランスクリプトームは、主に７０〜１０００塩基長のＲＮＡ分子からなり、それは、標準ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨにより試験できない。ＲＮＡ分子が１０００塩基よりも長いとしても、全体の転写物がハイブリダイゼーションに利用可能であることは考えられない。ＲＮＡ分子の種々の部分は、タンパク質により(Ray D, Kazan H, Cook KB, Weirauch MT, Najafabadi HS, et al. (2013) Acompendium of RNA-binding motifs for decoding gene regulation. Nature 499:172-177)、又は堅く束ねられること(Tripathi V, Ellis JD, Shen Z, SongDY, Pan Q, et al. (2010) The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulatesalternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Mol Cell39: 925-938)により結合され得て、プローブハイブリダイゼーションに利用可能な部分を大幅に低減する。さらに、ＲＮＡ分子のタンパク質結合部分は、多くの場合に知られていないため、プローブの断片のハイブリダイズの失敗が、偽陰性として生じる。同じ理由で、その技術は、特に、ＲＮＡ分子の特定の領域（１０００塩基未満）を研究することができない。結果として、標準ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用又はＲＮＡスプライシングを研究するのに用いることができない。本明細書におけるいくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸を検出するための方法が提供され、その方法は、少なくとも１つの標的核酸を複数の異なる核酸プローブに接触させることを含み、その複数の異なる核酸プローブは、該複数の異なる核酸プローブが前記少なくとも１つの標的核酸に結合する条件下で長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素に結合されている。いくつかの実施形態において、一つの標的核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、７０〜１０００塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００若しくは１０００塩基、又は上記値のいずれか２つの間の数の塩基を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、インビボでのＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析をさらに含む。
【００７３】
第２に、４０個のオリゴヌクレオチド（それぞれ２５塩基）を合成するためのコストは、（一遺伝子毎に）約３７０ＵＳドルである。そのコストは、複数の遺伝子を試験するためには急速に増大するであろう。
【００７４】
第３に、複数の遺伝子を平行して試験することは困難である。これは２つの理由による。異なる蛍光色素が、それぞれの遺伝子に必要とされる。しかしながら、異なる有機色素は、大幅に異なる光安定性を示し(Lichtman JW, Conchello JA (2005) Fluorescence microscopy. Nat Methods2: 910-919; Panchuk-Voloshina N, Haugland RP, Bishop-Stewart J, Bhalgat MK,Millard PJ, et al. (1999) Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes thatyield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem 47:1179-1188)、一定レベルで信号を得ることが困難である。有機色素の発光は、通常、ロングテール分布となり、他の色素からの信号のコンタミネーション（漏れ）を排除することが困難である。複数の遺伝子を平行して試験することが必要である場合の、その２つの問題を解決することは非常に困難である。２色ＲＮＡ−ＦＩＳＨが試みられているが、我々は複数の遺伝子の転写コピー数を平行して正確にカウントすることが成功したという報告を知らない。さらに、漏れ及び光安定性の度合いの差の問題がある。
【００７５】
いくつかの実施形態では、単一分子の検出及びカウントのために、量子ドットでラベル化された一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションを用いてＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨを示す。本明細書のいくつかの実施形態において、ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨのための方法が提供され、その方法は、単一分子の検出及びカウントのために、量子ドットでラベル化された一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的とのハイブリダイズすることを含む。量子ドットは、有機色素と比較してより優れた光安定性及びより強い蛍光発光性を有する(Resch-Genger U, Grabolle M, Cavaliere-Jaricot S, Nitschke R, Nann T(2008) Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels. Nature methods5: 763-775)。我々が知る限り、これは、量子ドットが単一分子をカウントするのに用いられる初めてのことである。また、量子ドットが個々のＲＮＡ分子を可視化するために用いられる初めてのことである。量子ドットはタンパク質分子の画像化に用いられていたが(Zrazhevskiy P, Gao X (2013) Quantum dot imaging platform forsingle-cell molecular profiling. Nat Commun 4: 1619; Smith AM, Nie S (2012)Compact quantum dots for single-molecule imaging. J Vis Exp.)、量子ドットが単一分子のカウントに適用可能でないことは、一般に認められていた。これは、信号が途切れる、周知の「点滅」の問題によるものである(Medintz IL, Uyeda HT, Goldman ER, Mattoussi H (2005) Quantum dotbioconjugates for imaging, labelling and sensing. Nat Mater 4: 435-446; Roch N,Florens S, Bouchiat V, Wernsdorfer W, Balestro F (2008) Quantum phasetransition in a single-molecule quantum dot. Nature 453: 633-637)。画像化の際に量子ドットが単一分子のラベルに用いられていたとしても、量子ドットの無作為のサブセットは見えず、単一分子の無作為のサブセットは検出できないであろう。
【００７６】
本明細書に記載された所定の実施形態において、ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨが提供され、その方法は、単一分子の検出及びカウントのために、量子ドットでラベル化された一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとＲＮＡ標的とのハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、量子ドットは、単一分子のカウントのために用いられる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、見えないＲＮＡ分子を可視化するために適用される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの量子ドット又は長波長発光により特徴付けられる同等の粒子は、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ若しくは約８５０ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間の波長での長波長発光をする。いくつかの実施形態において、量子ドットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０若しくは約１１ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズを含む。いくつかの実施形態において、その方法は、インビボにおけるＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析をさらに含む。
【００７７】
この問題を解決するためのアイデアを生み出した。このアイデアは、各標的分子に複数の量子ドットを付けることにより、それらの信号が、単一の量子ドットのいずれかの中断した信号を補完というものである。従って、標的分子の累積的な信号は、途切れないであろう。いずれのときの画像獲得でも、いずれの分子も失われないであろう。本明細書における一実施形態の実験的検証において、５つのプローブを用いたＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、４３個のプローブを用いた標準ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨと同じようにＲＮＡ分子を同定した。必要なプローブの数の低減は、８０〜１０００塩基のＲＮＡを試験することができ、それは、標準ＲＮＡ−ＦＩＳＨでは試験できない。従って、上記ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨの方法論を用いることで、予想外の効果が得られた。また、インビボでのＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析を可能とする。さらに、ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、平行して複数の遺伝子を分析するための単純な方法を提供する。最後に重要なことは、オリゴの合成にコストがかかるため、この方法は数分の１に試薬コストを低減する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸を検出するための方法が提供され、その方法は、少なくとも１つの標的核酸を複数の異なる核酸プローブに接触させることを含み、その複数の異なる核酸プローブは、該複数の異なる核酸プローブが前記少なくとも１つの標的核酸に結合する条件下で長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素に結合されている。いくつかの実施形態において、その方法は、インビボでのＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析をさらに含む。
【００７９】
ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の機能は不明なところが多いが、複数のレベルの分子特性間の相互作用は、その存在が大きな興味をもたらす。このＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の追求の増大は、研究者にｍＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を特徴付けるための重要な手段を開発させ(Chi SW, Zang JB, Mele A, Darnell RB (2009) Argonaute HITS-CLIP decodesmicroRNA-mRNA interaction maps. Nature 460: 479-486; Helwak A, Kudla G,Dudnakova T, Tollervey D (2013) Mapping the human miRNA interactome by CLASHreveals frequent noncanonical binding. Cell 153: 654-665). Despite limitedevidence (Batista PJ, Chang HY (2013) Long noncoding RNAs: cellular addresscodes in development and disease. Cell 152: 1298-1307)、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が遺伝子発現の転写後調節のためにタンパク質コードＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と相互作用する仮説が立てられた(Amaral PP, Dinger ME, Mercer TR, Mattick JS (2008) The eukaryoticgenome as an RNA machine. Science 319: 1787-1789)。そのためにも、計算モデルが、ｌｎｃＲＮＡ−ｍＲＮＡ対の仮説駆動型予測のための手段を提供していたが(Kato Y, Sato K, Hamada M, Watanabe Y, Asai K, et al. (2010) RactIP:fast and accurate prediction of RNA-RNA interaction using integer programming.Bioinformatics 26: i460-466; Wenzel A, Akbasli E, Gorodkin J (2012) RIsearch:fast RNA-RNA interaction search using a simplified nearest-neighbor energymodel. Bioinformatics 28: 2738-2746)、未だＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を検証するための実験的アプローチは発明されていない。相互作用をするＲＮＡ同士は、細胞内において物理的に互いに近接するという原理を用いて、本明細書で記載された実施形態は、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を画像化及び可視化するためのＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨを適用することにより、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の計算予測と実験的証明との間の溝を埋めるために用いられ得ることを提示する。
【００８０】
（結果）
ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨ技術の開発
特定の所望するＲＮＡを標的にする複数のＱＤラベル化プローブを設計した（図４ａ）。標的ｍＲＮＡの配列を配列番号５９に提示する（Genbank受入番号gi 145966868も参照、本開示は参照として本明細書に組み込まれる）。本明細書におけるＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨ試験の全てにおいて、一遺伝子毎に５つのオリゴヌクレオチドを用いた。各オリゴヌクレオチドは、２５〜３０塩基で設計し、５’末端に付けられた一つのビオチンを含むように合成した（ＩＤＴ、表２）。ＱＤは、ストレプトアビジン(Invitrogen)でコーティングされているので、ラベル化は、１μＭのＱＤ毎に０．５μＭのオリゴヌクレオチドの比率で、室温で３０分間の条件で行った（図６）。ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨのためのハイブリダイゼーション及び画像化のプロトコールは、標準ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨのハイブリダイゼーションプロトコール(Shaffer SM, Wu M-T, Levesque MJ, Raj A (2013) Turbo FISH: A Method forRapid Single Molecule RNA FISH. PloS one 8: e75120) (Methods, SupplementaryText)から、試薬及びパラメータの多くの変化を試験することにより最適化した。プローブのハイブリダイゼーション及び画像化の後、生画像を、ＬｏＧ（Laplacian of Gaussian）フィルタを最初に適用することによって、ImageJ(SchneiderCA, Rasband WS, Eliceiri KW (2012) NIH Image to ImageJ: 25 years of imageanalysis. Nature methods 9: 671-675)で加工し (Sage D, Neumann FR, Hediger F, Gasser SM,Unser M (2005) Automatic tracking of individual fluorescence particles:application to the study of chromosome dynamics. IEEE transactions on imageprocessing : a publication of the IEEE Signal Processing Society 14: 1372-1383)、その後、３Ｄ表示された信号スポットをカウントした(Bolte S, Cordelieres FP (2006) A guided tour into subcellularcolocalization analysis in light microscopy. Journal of microscopy 224:213-232)（方法欄）。最終のカウントが用いられた閾値に無反応であることが観察される（図７）。
【００８１】
【表３】
2017529103.tif 000006
【００８２】
ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨ信号の連続性
ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨの発光の断続性を試験した。ＡｃｔｂｍＲＮＡのための５つのハイブリダイゼーションプローブを設計し（図３）、ＱＤと結合させた。プローブハイブリダイゼーションの後、同一の試験サンプルの５０個の画像を、２つの画像収集の間において１秒間隔で得た。分析の単純化のために、各画像は、１つの焦点面(スタック)でのみ得た。マルチスタック画像は、スタックのいずれかの獲得の際に信号を発するようにＲＮＡ分子のより大きな機会を与えるため、より厳密な試験となる。５０個の画像のいずれかにおいて、スポットが存在し、累積的な信号が途切れないという我々の理論が確認された。
【００８３】
ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨと標準ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨとの比較
ＲＮＡ分子を定量するためのＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨの能力を試験した。マルチスタック画像を、上記と同様のハイブリダイズされたサンプルで得た。画像処理の後、画像化された細胞（Ｎ＝８２）毎に１１±９（平均値±標準偏差）ＡｃｔｂｍＲＮＡ分子を同定した（図４ｂ）。この実施形態であるＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨを用いたＲＮＡ分子のブロービングの正確さを評価するために、同一のＲＮＡを標的にする色素及びプローブの異なるセットを用いてスポットの共局在を比較するための４３個のプローブを設計し、Ａｌｅｘａ５５５でラベル化した（表４、図４ｃ）。５つのプローブを用いたＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、Ａｌｅｘａ５５５でラベル化された４３個のプローブが同定したスポットとほとんど同じように同定できた（図５ｄ）。観察された共局在は、複数の色素が異なる波長で励起されるため、フィルタ間で色素のクロスイメージングが生じない（方法欄、表５、図８）。従って、５つのプローブを用いて行われたＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、有機色素でラベル化された４３個のプローブを用いたｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨと同等の正確さを達成した。従って、ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、有機色素でラベル化された４３個のプローブを用いたｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨを用いた場合と比較して、より有効であるといった驚くべき効果を引き起こすといえる。
【００８４】
【表４】
2017529103.tif 000007
2017529103.tif 000008
2017529103.tif 000009
【００８５】
【表５】
2017529103.tif 000010
【００８６】
ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨを用いたＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の試験
マウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞内でＭａｌａｔ１ｌｎｃＲＮＡとＳｌｃ２ａ３ ｍＲＮＡとが互いに相互作用するといった仮説が立てられた。従って、細胞質内で２つの遺伝子の転写物の共局在について試験するために、両方のＲＮＡを標的にする二重プロービングＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨ試験を行った（図５ａ）。２７のＥ１４ｍＥＳ細胞を分析し、それぞれ７．６及び４．５分子のＭａｌａｔ１及びＳｌｃ２ａ３ＲＮＡ（図５ｂ、図５ｃ）を定量した。約１．７のＭａｌａｔ１／Ｓｌｃ２ａ３の転写物間の分子の比率は、ｑＰＣＲ測定で観察した場合（Ｍａｌａｔ１／Ｓｌｃ２ａ３が約５．１）よりもわずかに低かった。この少しの不一致は、核内におけるＭａｌａｔ１転写物のｑＰＣＲの定量による可能性があり(Hutchinson JN, Ensminger AW, Clemson CM, Lynch CR, Lawrence JB, et al.(2007) A screen for nuclear transcripts identifies two linked noncoding RNAsassociated with SC35 splicing domains. BMC genomics 8: 39)、一方、我々のＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは細胞質内の転写物を標的とする。興味深いことに、ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、マウスＥＳ細胞の細胞質内における豊富なＭａｌａｔ１が変動しやすいことを示す。Ｍａｌａｔ１の転写物カウントは１〜２４の範囲である一方、Ｓｌｃ２ａ３の範囲は２〜７であった（図５ｂ、図５ｃ）。
【００８７】
次に、同一の細胞内におけるＭａｌａｔ１とＳｌｃ２ａ３とのハイブリダイゼーション、共局在を示す信号があるか否かを問題とした。２つのＲＮＡ分子の共局在を、異なる色素によりラベル化された２つの別のスポットの質量中心が、ｘ、ｙ、ｚの各座標において２ピクセル（２１４ｎｍ）よりも近いか否かで決定した（図９）(Ghavi-Helm Y, Klein FA, Pakozdi T, Ciglar L, Noordermeer D, et al.(2014) Enhancer loops appear stable during development and are associated withpaused polymerase. Nature 512: 96-100.)。Ｍａｌａｔ１又はＳｌｃ２ａ３を発現する２７の細胞のうち１０の細胞が、両方の遺伝子の重複するＲＮＡ分子を含んでいた。全体として、１６対の共局在ＲＮＡ分子を検出し（図５ｄ）、１つの細胞で１〜３の範囲で起こっていた（図５ｅ）。両方の遺伝子のＲＮＡ分子は細胞質中で無作為の分布を示し、従って、異なる色素でラベル化された２つのスポットの発生は無作為事象でないことが推測された（ｐ値＝４×１０−４０、超幾何試験）。従って、四次構造における異なる遺伝子からのＲＮＡ分子の相互作用についての実験的証明が得られた。
【００８８】
（検討）
この新規技術の本質的なアイデアは、量子ドットのセットにおける無作為の信号の断続性の補完を開発することである。オン状態又はオフ状態で維持する量子ドットの時間間隔は、ミリ秒から秒の範囲である(Durisic N, Wiseman PW, Grutter P, Heyes CD (2009) A common mechanismunderlies the dark fraction formation and fluorescence blinking of quantumdots. ACS Nano 3: 1167-1175; Yao J, Larson DR, Vishwasrao HD, Zipfel WR, WebbWW (2005) Blinking and nonradiant dark fraction of water-soluble quantum dotsin aqueous solution. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 14284-14289)。通常、量子ドットは、オン状態で半分以上の時間を費やす(33. Durisic N, Wiseman PW, Grutter P, Heyes CD (2009) A commonmechanism underlies the dark fraction formation and fluorescence blinking ofquantum dots. ACS Nano 3: 1167-1175; Yao J, Larson DR, Vishwasrao HD, ZipfelWR, Webb WW (2005) Blinking and nonradiant dark fraction of water-solublequantum dots in aqueous solution. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 14284-14289;Frantsuzov PA, Volkan-Kacso S, Janko B (2013) Universality of the fluorescenceintermittency in nanoscale systems: experiment and theory. Nano Lett 13:402-408)。異なる量子ドットの断続的な発光が独立していると仮定すると、所定の時点で、５つの量子ドットに付着されたＲＮＡ分子が蛍光信号を発しない確率は、約０．０３（１／２５）。通常の画像獲得は、異なる時点で１５以上の焦点面（スタック）をスキャンするため、ＲＮＡ分子が３つの連続的なスタックで検出されない確率は１０−４〜１０−６のオーダーであり、単一の細胞内でＲＮＡ分子をカウントする場合において極めて少ない。必要であれば、ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨサンプルは、複数回画像化されてもよく、これにより、量子ドットがオフ状態で集まる確率を完全に排除する。経験的に、５０の連続的に得られた画像のいずれかの単一のスタックでさえ、オフ状態で集まることは見られなかった(systemsbio.ucsd.edu/qdsmrnafish/, この開示は本願明細書に参照として組み込まれる)。さらに、ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、連続的な信号を用いたｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨと同一の標的を同定した（図４ｃ）。まとめると、一般的な考えとは逆に、量子ドットが単一分子をカウントするのに用いられ得ることを、理論的に導き出し、実験的に確認した。
【００８９】
ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨの主要な利点は、より少ないオリゴヌクレオチドプローブに依存していることである。一遺伝子毎に約３７０ＵＳドルから４６ＵＳドルへのコスト削減の効果がある。より重要なことは、１０００以下の塩基を有するＲＮＡ分子を標的にすることができることである。そのようなＲＮＡ分子はＲＮＡの大半を含み、従来のｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨにより試験されるものとしては短すぎる。同じ理由で、ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨは、ＲＮＡ分子の特定の領域を標的にすることについて特有の利点を有する。これは、ＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析を可能とする。
【００９０】
ＱＤ−ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨの他の利点は、複数の遺伝子のＲＮＡ生成物を平行して試験することの適用性である。これは、２つの理由で困難な課題となっていた。まず、「色素及び蛍光タンパク質はここ数十年の間、蛍光イメージングの中心であったが、それらの蛍光は、個々の分子を観察することを必要とする高い光子束の基では不安定であり、信号の完全な消失前に数秒間のみ観察できるように発する」(Smith AM, Nie S (2012) Compact quantum dots for single-moleculeimaging. J Vis Exp.)。異なる遺伝子を標的とするのに必要な他の色素は、第１色素（遺伝子）をスキャンする際に光が退色し得る。ナノ結晶は、有機色素よりも光安定性が高く(Resch-Genger U, Grabolle M, Cavaliere-Jaricot S, Nitschke R, Nann T(2008) Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels. Nature methods5: 763-775; Lee LY, Ong SL, Hu JY, Ng WJ, Feng Y, et al. (2004) Use ofsemiconductor quantum dots for photostable immunofluorescence labeling ofCryptosporidium parvum. Appl Environ Microbiol 70: 5732-5736)、同一の試験サンプルのスキャンを繰り返すことを可能とする。第２に、有機色素は、特に３つ以上の異なる色素が共に用いられる際に、互いにコンタミネーションし得る。これに対して、量子ドットは、特定の蛍光スペクトルのプロファイルを有し、それらの全ては、蛍光強度の狭いガウス分布を有する(Resch-Genger U, Grabolle M, Cavaliere-Jaricot S, Nitschke R, Nann T(2008) Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels. Nature methods5: 763-775)。この機能は、一つの試験において、複数の量子ドットの多重化の基礎を形成する。さらに、発光のスペクトル位置は、粒子サイズに従って調整可能である(Resch-Genger U, Grabolle M, Cavaliere-Jaricot S, Nitschke R, Nann T(2008) Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels. Nature methods5: 763-775)。一つの特定の波長のために用いられる粒子のサイズは非常に類似するので、発光曲線の幅も狭くなる。商業的ＱＤにおいて、強度の大半は、標的波長の周囲１００ｎｍの範囲内で発光される。最適なフィルタの選択と組み合わされた特定のＱＤの蛍光の狭い発光は、同一細胞内で異なる色素を用いて複数の標的をプローブする試験において、ＱＤの使用を奨励する。試験は、２つの異なる波長を標的とするＱＤの間の信号の明確な区別により、細胞の二重プロービングを示した(Jaiswal JK, Mattoussi H, Mauro JM, Simon SM (2003) Long-term multiplecolor imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Naturebiotechnology 21: 47-51; Wu X, Liu H, Liu J, Haley KN, Treadway JA, et al.(2003) Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellulartargets with semiconductor quantum dots. Nature biotechnology 21: 41-46)。さらなる多重化は、３つの波長(Han M, Gao X, Su JZ, Nie S (2001) Quantum-dot-tagged microbeads formultiplexed optical coding of biomolecules. Nature biotechnology 19: 631-635)又は４つの波長(Goldman ER, Clapp AR, Anderson GP, Uyeda HT, Mauro JM, et al. (2004)Multiplexed toxin analysis using four colors of quantum dot fluororeagents.Anal Chem 76: 684-688)を標的とするＱＤを用いて可能とする。
【００９１】
（方法）
オリゴヌクレオチドを５’末端にビオチンを付着させて合成した（表２、表３、ＩＤＴ）。オリゴヌクレオチドと、ストレプトアビジンに結合された色素とを、１μＭの色素に対して０．５μＭのオリゴヌクレオチドの比率で、室温で３０分間インキュベートすることによりラベル化を行った（図６）。ＥＳ細胞を、ポリ−ｄ−リジン（５μＭ、Sigma）及びラミニン（０．０１ｍｇ／μｌ、Sigma）で予めコーティングされたガラス底のマイクロチャンバ（１．５、Lab Teck）に播種した。２時間のインキュベートの後に、細胞をヌクレアーゼが入っていないＰＢＳで洗浄し、−２０℃のメタノールで透過化した。ＦＩＳＨ試験を、確立されたｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨプロトコールの修正版を用いて行った(Shaffer SM, Wu M-T, Levesque MJ, Raj A (2013) Turbo FISH: A Method forRapid Single Molecule RNA FISH. PloS one 8: e75120)。ハイブリダイゼーションを、約１５μＭのオリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションバッファを用いて、４０℃で３０分間行った。過剰なプローブ及び色素を、３７℃で３０分間の洗浄（ＳＳＣ２×、ホルムアルデヒド１０％）を２度行って除去した。その後、細胞をＳＳＣ ２×バッファー（ｐＨ７．５）で画像化した。
【００９２】
広視野蛍光イメージングを、用いた色素に適するキューブ（表４、Chroma）、及び６０倍の油浸対物レンズ（NA=1.4、Olympus）を備えたOlympus IX83倒立顕微鏡で行った。画像を、ｚ軸において０．２μｍの間隔でORCA-R2CCDカメラ(Hamamatsu)を用いて得た。
【００９３】
イメージングの後に、生画像スタックをＩｍａｇｅＪで加工した(Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, et al.(2012) Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Naturemethods 9: 676-682)。まず、ＬｏＧ（Laplacian of Gaussian）フィルタを適用し(Sage D, Neumann FR, Hediger F, Gasser SM, Unser M (2005) Automatictracking of individual fluorescence particles: application to the study ofchromosome dynamics. IEEE transactions on image processing: a publication ofthe IEEE Signal Processing Society 14: 1372-1383)、ｚスタック全体を検討した。その画像の黒と白との値を反転させ、その後、１６ビット値をグレーの深度に変換した。次に、３Ｄレンダリングされた単一のスポットを、５００蛍光任意単位の増大する閾値間隔でカウントした(Bolte S, Cordelieres FP (2006) A guided tour into subcellular colocalizationanalysis in light microscopy. Journal of microscopy 224: 213-232)（図７）。さらに、それらの体積（ボクセル）を８〜１２５ピクセル３の範囲にあるとして、スポットがＲＮＡ分子を表しているとみなした。各画像スタックにおけるスポットの数を、３つの連続的な同等のカウントの閾値間隔で得た（図７）。このプラトーを超える選択された蛍光強度が、一単位のオーダーで同定されたスポットの数を低減し、実際のスポットを同定しない機会を潜在的に増大することを観察した。この基準は、画像のバックグラウンドに関わらず、信頼できるスポットの定量を可能とする。
【００９４】
カウントに加えて、データを、スポットのｘ−ｙ−ｚそれぞれの質量中心において収集した。異なる色素でラベル化された２つの異なるスポットにおける質量中心が、ｘ、ｙ及びｚ座標のそれぞれにおいて２ピクセル（２１４ｎｍ）よりも近い場合に、２つのＲＮＡ分子の共局在が推測される（図１０）。
【００９５】
ハイブリダイゼーション及び画像化のプロトコールを最適化に導くための以下の原理を用いた。
【００９６】
オリゴヌクレオチドの長さ及び数
ｓｍＲＮＡ−ＦＩＳＨの以前のプロトコールでは、所望の遺伝子を標的とする２０塩基長の１２個以上のオリゴヌクレオチドを用いていた。本件では、２５〜３０塩基長の５個のオリゴヌクレオチドを用いた。１つのｍＲＮＡ分子に対応するスポットの信号検出は、ＲＮＡ分子をプロービングするオリゴヌクレオチドに結合された各色素の累積的な蛍光強度による。ＱＤは、有機色素に比較して蛍光強度が大きいため(Resch-Genger et al., 2008)、プローブの数はかなり低減される。２５〜３０塩基長の５つのオリゴヌクレオチドを用いることは、蛍光スポットをバックグラウンドと見分けることを可能とし、それは通常、散在された単一のＱＤを含む。以前の研究では、３０塩基長の５つのオリゴヌクレオチドが、比較的に多くのＲＮＡ分子を定量する際に、感度と特異性との間の適切なバランスを達成することを示した(Relogio et al., 2002)。
【００９７】
ＱＤとオリゴヌクレオチドとの適切な比率の検討
量子ドットとオリゴヌクレオチドとの適切な比率を見つけるための試験について、ＱＤでラベル化されたオリゴヌクレオチドを最大にするために行った。また、それは、オリゴヌクレオチドとＱＤとが接触していない数を低減する。非ラベル化オリゴヌクレオチドは、プローブサイトにおいて競合し、ＲＮＡ分子に結合しても蛍光を発光しない。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていないＱＤは、洗い流されず、バックグラウンドの増大に寄与し得る。
【００９８】
１０〜５０μＭのプローブ濃度
現在のturbo fishプロトコールでは、３０秒から１０分の範囲で、４００μＭの濃度でプローブをハイブリダイズする。この現在のプロトコールでは、各ヌクレオチドが１０〜５０μＭの濃度で行われる。用いられるプローブは、１０分の１よりも少ない濃度であり、試験毎における我々のコストを最適化する。これを補うために、ハイブリダイゼーションの時間が延長され得る。
【００９９】
ハイブリダイゼーション時間
ハイブリダイゼーションバッファ中のプローブが少ないため、ハイブリダイゼーション時間を３０秒から３０分に延長した。さらに、ＱＤは有機色素よりも大きく(Resch-Genger et al., 2008)、細胞を透過するのに構造的により長い時間を必要とし得る。
【０１００】
洗浄時間
ＱＤは、有機色素よりも大きく、細胞組織を出るのに長い時間がかかり得るため、プローブを３０分間洗浄した。
【０１０１】
上述から、本開示の種々の実施形態は、説明のために本明細書に記載されたものであり、種々の変更が、本開示の範囲及び精神から逸脱しない範囲でなされ得ると考えられるであろう。従って、本明細書に開示された種々の実施形態は、以下の特許請求の範囲により示された実際の範囲及び精神に限定されると意図されない。
【０１０２】
（追加の実施形態）
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的核酸を検出する方法が提供され、その方法は、前記少なくとも１つの標的核酸を、複数の異なる核酸プローブに接触することを備え、前記複数の異なる核酸プローブは、該複数の異なる核酸プローブが前記少なくとも１つの標的核酸に結合する条件下で長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素に結合されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの検出可能な要素は、長波長の発光をする粒子を含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つの標的核酸のための少なくとも１つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、異なり且つ区別可能な長波長で発光する検出要素に結合されたプローブのセットのそれぞれを含む複数のプローブのセットは、複数の標的核酸を検出するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、１つの核酸鎖におけるプローブに相補的な固有の配列に向かう。いくつかの実施形態において、異なるプローブは、１つの標的核酸鎖における異なる固有の標的核酸配列を標的とする。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つ又は２つの標的核酸のための少なくとも２つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つ、２つ又は３つの標的核酸のための少なくとも３つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つ、２つ、３つ又は４つの標的核酸のための少なくとも４つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの標的核酸のための少なくとも５つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの標的核酸のための少なくとも６つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つの標的核酸のための少なくとも７つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つの標的核酸のための少なくとも８つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つの標的核酸のための少なくとも９つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０個の標的核酸のための少なくとも１０個のプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なる核酸プローブは、５つ以上の異なるプローブを含む。いくつかの実施形態において、前記複数の異なるプローブのそれぞれは、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０若しくは約１００ヌクレオチド長、又は上記値のいずれか２つの間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、量子ドットは、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ若しくは約８５０ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間の波長での長波長発光をする。本明細書に記載された所定の実施形態において、量子ドットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０若しくは約１１ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの検出可能な要素は、長波長発光をする粒子を含む。いくつかの実施形態において、前記粒子は量子ドットである。いくつかの実施形態において、前記標的核酸はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、前記標的核酸は、単一細胞内の単一のＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、前記複数の異なるプローブは、５つ以上の異なるプローブを含む。いくつかの実施形態において、前記複数の異なるプローブは、約１０〜約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実子啓太において、前記複数の異なるプローブは、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０若しくは約１００ヌクレオチド長、又は上記値のいずれか２つの間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、前記複数の異なるプローブは、約２０〜約８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、前記複数の異なるプローブは、約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、複数の標的核酸が検出される。いくつかの実施形態において、核酸プローブはさらに核酸リンカーを含み、前記リンカーは標的結合サイトに相補的ではなく、前記核酸リンカーは、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９若しくは約１０個の核酸、又は上記値のいずれか２つの間の核酸を含み、前記核酸リンカーは量子ドットに共有結合される。いくつかの実施形態において、プローブと標的核酸との接触は、約０．５分、約１分、約５分、約１０分、約２０分、約３０分若しくは約４０分、又は上記値のいずれか２つの間の時間で行われる。いくつかの実施形態において、その方法は、少なくとも１つの標的核酸をハイブリダイゼーション又は接触させて後に、プローブを３０分間洗い流すことをさらに含む。いくつかの実施形態において、プローブは、約１０、約２０、約３０、約４０若しくは約５０μＭ、又は上記値のいずれか２つの間の濃度である。いくつかの実施形態において、その方法はインビボでのＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用の単一分子解析をさらに含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、核酸プローブが提供される。核酸プローブは、長波長発光をする少なくとも１つの検出可能な要素と結合され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの検出可能な要素は、長波長発光をする粒子を含む。いくつかの実施形態において、前記粒子は量子ドットである。いくつかの実施形態において、粒子は、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ若しくは約８５０ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間の波長での長波長発光をする。いくつかの実施形態において、粒子又は量子ドットは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０若しくは約１１ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの検出可能な要素は、核酸プローブに共有結合される。いくつかの実施形態において、量子ドットは、ＥＤＣ及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）の存在下で核酸プローブにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、アミド架橋の形成を介して量子ドット表面に結合するための核酸のアミン修飾体によって、核酸にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、ストレプトアビジンにコーティングされた量子ドットに結合するための核酸のビオチン化によって、プローブにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、標的核酸配列に相補的であり、プローブは、ＱＤに共有結合されたリンカー核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、リンカーＤＮＡは、アニーリングの際の量子ドットの動きを自由にできて、さらに、ＱＤのサイズがアニーリングを妨げる場合にはアニーリングサイトから量子ドットを離すことを可能とする。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、約１０〜約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０若しくは約１００ヌクレオチド長、又は上記値のいずれか２つの間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、約２０〜約８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、前記核酸プローブは約３０ヌクレオチド長である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、キットが提供される。キットは、少なくとも１つの標的核酸に少なくとも１つのハイブリダイズされ得る複数の異なる核酸プローブを備え、前記複数の異なる核酸プローブは、複数の異なる核酸プローブのそれぞれは、長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素に結合されている。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの検出可能な要素は、長波長発光をする粒子を含む。いくつかの実施形態において、粒子は、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ若しくは約８５０ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間の波長での長波長発光をする。いくつかの実施形態において、粒子は、
【０１０５】
約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０若しくは約１１ｎｍ、又は上記値のいずれか２つの間のサイズを含む。いくつかの実施形態において、粒子は量子ドットである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの検出可能な要素は、複数の異なる核酸プローブのそれぞれに共有結合される。いくつかの実施形態において、量子ドットは、ＥＤＣ及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）の存在下で核酸プローブにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、アミド架橋の形成を介して量子ドット表面に結合するための核酸のアミン修飾体によって、核酸にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、量子ドットは、ストレプトアビジンにコーティングされた量子ドットに結合するための核酸のビオチン化によって、プローブにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、標的核酸配列に相補的であり、プローブは、ＱＤに共有結合されたリンカー核酸をさらに含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、複数の標的核酸を検出する方法が提供され、その方法は、前記複数の標的核酸を複数の核酸プローブのセットと接触させることを備え、前記核酸プローブのセットのそれぞれは、長波長の発光をする検出可能な少なくとも１つの要素に結合された複数の異なる核酸プローブを含み、前記核酸プローブのセットのそれぞれは、異なる前記標的核酸にハイブリダイズし、前記核酸プローブのセットのそれぞれは、長波長の発光をする検出可能な要素に結合され、前記長波長は、前記核酸プローブの他のセットに結合された検出可能な要素の長波長の発光と区別可能であり、前記接触は、前記複数の核酸プローブのセットが前記複数の標的核酸に結合する条件下で行われる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの検出可能な要素は、長波長の発光をする粒子を含む。いくつかの実施形態において、前記粒子は量子ドットである。いくつかの実施形態において、標的核酸はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、標的核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、単一細胞内の単一ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、標的核酸は、単一細胞内における単一ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、複数の異なるプローブは５以上の異なるプローブを含む。いくつかの実施形態において、複数の異なるプローブは、約１０〜約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、複数の異なるプローブは、約２０〜約８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、複数の異なるプローブのそれぞれは、約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、複数の標的核酸が検出される。
【０１０７】
本明細書において、以下に挙げられた参考文献のそれぞれの開示は、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
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【図１】
2017529103.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５Ａ】
2017529103.tif 000017
【図５Ｂ−Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
2017529103.tif 000021
【図８Ａ−Ｂ】
2017529103.tif 000022
【図８Ｃ】
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【図９Ａ−Ｂ】
2017529103.tif 000024
【図９Ｃ】
2017529103.tif 000025
【図１０Ａ−Ｂ】
2017529103.tif 000026
【図１０Ｃ−Ｄ】
2017529103.tif 000027
【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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