(57)【要約】大きなインタクトな組織試料の高速、高分解能の撮像を行うための方法及び装置が提供される。方法の態様は、光学的に均一な試料操作構成要素にサンプルを設置すること、試料内の複数の位置で、光シート及び検出焦点面をアライメントする較正手順を実施すること、ならびに、各位置から画像を収集するために、試料上で撮像手順を実施することを含む。収集された画像は、試料の三次元画像を形成するために、再構築される。方法の工程を実行するための装置が、さらに提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡装置であって、
光源を備える照明光路、
カメラを備える検出光路、
容積を有する試料チャンバを備える光学的に均一な試料操作構成要素、
制御部、
処理部、ならびに
前記処理部により実行される時、前記制御部に
前記試料チャンバ内に設置された試料に対する複数のアライメントパラメータを取得するための較正手順を実行させ、及び
前記試料の三次元画像を生成するために、前記アライメントパラメータを利用する撮像手順を実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体を備える、前記顕微鏡装置。
【請求項２】
前記光学的に均一な試料操作構成要素が、ｘｙｚ−θ試料搭載ステージを備える、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記ｘｙｚ−θ試料搭載ステージが、各次元で少なくとも４５ｍｍの移動範囲を有する、請求項１又は２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記試料チャンバが、溶液で充たされる、請求項１から３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記光学的に均一な試料操作構成要素が、前記試料チャンバの前記容積よりも小さい容積を有する内側チャンバを備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記内側チャンバが、キュベットである、請求項１から５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記キュベットが、溶液で充たされる、請求項１から６のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記キュベットが、溶融石英を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項９】
前記較正手順が、前記ｚ方向における試料に対する開始地点及び終了地点を特定することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記較正手順が、Ｚ−ステップ値を特定することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１１】
前記較正手順が、複数のタイルに試料をデジタル的に分割することを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１２】
前記較正手順が、各位置に対するアライメントパラメータを取得するために、試料内の複数の位置で光シート及び検出焦点面をアライメントすることを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記較正手順が、２つの隣接する位置からの線形補間により、前記試料内の複数の位置に対するアライメントパラメータを取得することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１４】
前記光シート及び前記検出焦点面をアライメントすることが、画像品質測定値を最大化することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１５】
前記画像品質測定値が、光学焦点品質測定値である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１６】
前記光学焦点品質測定値が、フーリエ空間における高周波及び低周波シグナルの比を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１７】
前記較正手順が、自動化される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１８】
前記撮像手順が、
アライメントパラメータを用いて前記試料の照射面と前記顕微鏡の検出焦点面をアライメントすること、
前記光源で前記照射面の直線部分を照明すること、及び
前記カメラで、前記照射面の前記照明された直線部分に沿って、複数の発された光シグナルを取り込むことを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項１９】
前記照射面と、前記顕微鏡の前記検出焦点面をアライメントすることが、前記照射面の前記直線部分を照明することと同期される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２０】
前記撮像手順が、
前記照射面の複数の異なる直線部分を照射するために、前記光源を向けること、及び
前記カメラで、前記試料の二次元画像を形成するために、前記照射面の前記異なる直線部分のそれぞれに沿って、複数の発された光シグナルを取り込むことをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２１】
前記撮像手順が、
前記試料内の異なる照射面から複数の二次元画像を収集すること、及び
前記試料の三次元画像を形成するために、前記二次元画像を組み立てることをさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２２】
前記撮像手順が、自動化される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２３】
前記カメラが、ＣＣＤカメラまたはｓＣＭＯＳカメラである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２４】
前記検出光路が、検出対物レンズを備える、請求項１から２３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２５】
前記検出対物レンズが、試料の屈折率に合致する屈折率を有する、請求項１から２４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２６】
前記照明光路が、動的光シートを発生させるように構成された開口数が小さい対物レンズを備える、請求項１から２５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２７】
前記装置が、２つの照明光路を備える、請求項１から２６のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２８】
前記装置が、２つの検出光路を備える、請求項１から２７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項２９】
前記２つの照明光路が、前記光学的に均一な試料操作構成要素の両側から前記試料を照明するように構成される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項３０】
前記検出光路のうちの１つ以上が、前記照明光路のうちの１つ以上と直交配置される、請求項１から２９のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項３１】
顕微鏡装置を用いて試料を撮像する方法であって、前記方法が、
光学的に均一な試料操作構成要素内の試料チャンバ内に前記試料を設置すること、
各位置に対するアライメントパラメータを取得するために、前記試料内の複数の位置で、１つ以上の光シート及び顕微鏡装置の１つ以上の検出焦点面をアライメントする較正手順を実施すること、
前記試料内の前記複数の位置のそれぞれから画像を収集する撮像手順を実施することであって、前記撮像手順が、
各位置に前記アライメントパラメータを適用すること、及び
光シートで前記位置を同時に照明すること及び前記位置の画像を取り込むことを含む撮像手順を実施すること、ならびに
各位置からの前記画像を用いて、前記試料の三次元画像を構成することを含む。
【請求項３２】
前記撮像手順が、２つ以上の独立した光シートを用いて、前記試料の２つ以上の異なる面を同時に照明することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記撮像手順が、単一の光シートの高速スイッチングを用いて、前記試料の２つの異なる面を同時に照明することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が、
複数のヒドロゲルサブユニットに前記試料を固定すること、
ヒドロゲル包埋試料を形成するために、前記ヒドロゲルサブユニットを重合すること、及び
前記ヒドロゲル包埋試料をクリアリングすることにより顕微鏡分析のために調製されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が、生物学的組織を含む、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記生物学的組織が、脳組織を含む、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料が、完全な器官を含む、請求項３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記器官が、脳、目、心臓、肝臓、膵臓、筋肉、骨、腎臓、または卵巣である、請求項３１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料が、完全な器官または発生中の胚を含む、請求項３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料の屈折率に合致する屈折率を有する溶液で前記試料チャンバを充たすことをさらに含む、請求項３１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記較正手順が、前記ｚ方向における前記試料に対する開始地点及び終了地点を特定することを含む、請求項３１から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記較正手順が、ｚ−ステップ値を特定することを含む、請求項３１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記較正手順が、複数のタイルに前記試料をデジタル的に分割することを含む、請求項３１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記較正手順が、各位置に対するアライメントパラメータを取得するために、前記試料内の複数の位置で光シート及び検出焦点面をアライメントすることを含む、請求項３１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記較正手順が、２つの隣接する位置からの線形補間により、前記試料内の複数の位置に対するアライメントパラメータを取得することを含む、請求項３１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記光シート及び前記検出焦点面をアライメントすることが、画像品質測定値を最大化することを含む、請求項３１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記画像品質測定値が、光学焦点品質測定値である、請求項３１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記光学焦点品質測定値が、フーリエ空間における高周波及び低周波シグナルの比を含む、請求項３１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記較正手順が、自動化される、請求項３１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記撮像手順が、
アライメントパラメータを用いて、前記試料の照射面とカメラの検出焦点面をアライメントすること、
前記光源で前記照射面の直線部分を照明すること、及び
前記照射面の前記照明された直線部分に沿って、複数の発された光シグナルを取り込むことを含む、請求項３１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記照射面と前記カメラの前記検出焦点面をアライメントすることが、前記照射面の前記直線部分を照明することと同期する、請求項３１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記撮像手順が、
照射面の複数の異なる直線部分を照射するために、前記光源を向けること、及び
前記試料の二次元画像を形成するために、前記照射面の前記異なる直線部分のそれぞれに沿って、複数の発された光シグナルを取り込むことをさらに含む、請求項３１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記撮像手順が、
前記試料内の異なる照射面から複数の二次元画像を収集すること、及び
前記試料の三次元画像を形成するために、前記二次元画像を組み立てることをさらに含む、請求項３１から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記撮像手順が、自動化される、請求項３１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／００５，７０３号の出願日の優先権を主張し、この出願の開示は、全体として本明細書に参考として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
緒言
大きなインタクトな組織試料の撮像の主な課題は、実用的に可能な期間で、撮像プロセスを行うことである。共焦点顕微鏡は、撮像速度が遅いという欠点があり、試料が完全に撮像される前に、光退色に起因する試料のシグナルを発する能力をさらに損傷する可能性がある。試料の光退色効果を最小限に抑えながら、大きな組織試料を撮像するために必要とされる時間を低減させるために用いることができる、高速、高分解能の撮像法及び装置に対するニーズが、当該技術分野にある。本発明は、これらのニーズ及び他のニーズを提起する。
【発明の概要】
【０００３】
大きなインタクトな組織試料の高速、高分解能の撮像を行うための方法及び装置が提供される。方法の態様は、光学的に均一な試料操作構成要素にサンプルを設置すること、試料内の複数の位置で、光シート及び検出焦点面をアライメントする較正手順を実施すること、ならびに、各位置から画像を収集するために、試料上で撮像手順を実施することを含む。収集された画像は、試料の完全な三次元画像を形成するように再構築される。方法の工程を実行するための装置が、さらに提供される。
【０００４】
本発明は、添付図面とともに読む場合に、次の詳述される記載から最も理解されることがある。次の図が、図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ】ＣＬＡＲＩＴＹ最適化光シート顕微鏡（ＣＯＬＭ）の光学レイアウトを示す。
【図１Ｂ】パネルａ−ｄ：大きなインタクトな試料のための光学的に均一な試料搭載フレームワークを示す。
【図１Ｃ】ＣＯＬＭにおける同期される照明検出及び自動アライメントパラメータ較正のための概略図を示す。全てのスケールバー：１００μｍ。
【図１Ｄ】同上。
【図２】パネルａ−ｄ：ＣＯＬＭを用いてインタクトな透明化Ｔｈｙ１−ｅＹＦＰマウス脳から取得されたインタクトなマウス脳容積の内部の詳細のレンダリングされた画像を示す。
【図３】パネルａ−ｉ：大きな脳容積の種々の拡大図を提供する。パネルｄ〜ｉは、ＣＯＬＭを用いてインタクトな透明化Ｔｈｙ１−ｅＹＦＰマウス脳から取得された、５０マイクロメートル厚の容積の高分解能画像を示す。全てのスケールバー：１００μｍ。
【図４Ａ−Ｃ】ＣＯＬＭを用いて撮像されたインタクトな透明化マウス脳のパルブアルブミン免疫染色の画像を示す。図４Ｂの画像は、ＣＯＬＭを用いて収集され、一方、図４Ａ及び図４Ｃの画像は、共焦点顕微鏡検査を用いて収集された。全ての画像は、最大Ｚ投影物を表し、全てのスケールバーは、１００μｍである。
【図５】共焦点、２光子、及び光シート顕微鏡の概略的な比較を示す。
【図６】制御電子回路のフレームワーク及びＣＯＬＭの部品の概略的な一覧を示す。
【図７】方法の一実施形態のブロックフロー図を示す。
【図８Ａ】パネルａは、２つの照明光路及び２つの検出光路を有する多断面ＣＯＬＭの概略図を示す。
【図８Ｂ】パネルｂ及びｃは、深部撮像及び増大した撮像速度を達成するために、パネルａに示されたシステムを用いて実行できる種々の撮像法の概略図を示す。
【図８Ｃ】同上。
【図９】１つの照明光路から４つの独立した光シートを発生させて、このように、２つの照明光路及び２つの同時撮像経路を含む実施形態において合計で８つの独立した光シートを生成させるために用いることができる多断面ＣＯＬＭシステムの概略図を示す。
【図１０】パネルａは、図８パネルａで詳述された多断面ＣＯＬＭシステム物理的実施の写真を示す。パネルｂ、ｃ、及びｄは、２つの検出系を用いて取得された成体マウスの全中枢神経系（脳及び脊髄）の一例のデータセットを示す。パネルｂは、１つのカメラからの３Ｄ画像の最大投影であり、パネルｃは、他のカメラからのものであり、パネルｄは、２つの画像をマージした後のものである。
【図１１】電動フリップミラー（ＦＭ）を用いることによる、４つの検出ビーム光路を有する拡張多断面ＣＯＬＭシステムの概略図である。ＦＭを用いて、試料は、直交ビューから撮像でき、次に、これらは等方性分解能３Ｄ容積データを生成するために融合される（ＬＳ：レーザ光源、Ｓｈ：シャッター、ＩＦＷ：照明フィルタホイール、ＢＥ：ビームエキスパンダ、２ＤＳｃ：２Ｄガルボスキャナ；ＳＬ：ｆ−θ走査レンズ、ＴＬ：チューブレンズ、ＦＭ：電動フリップミラー、Ｏｂｊ：照明対物レンズ、ＥＦＷ：発光フィルタホイール及びＣｍ：ｓＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラ。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
大きなインタクトな組織試料の高速、高分解能の撮像を行うための方法及び装置が提供される。方法の態様は、光学的に均一な試料操作構成要素にサンプルを設置すること、試料内の複数の位置で、光シート及び検出焦点面をアライメントする較正手順を実施すること、ならびに、各位置から画像を収集するために、試料上で撮像手順を実施することを含む。収集された画像は、試料の三次元画像を形成するために、再構築される。方法の工程を実行するための装置が、さらに提供される。
【０００７】
本発明をより詳細に記載する前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものであるから、当然変形してもよいことが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであり、限定することを意図しないことが、さらに理解されるべきである。というのは、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
【０００８】
値の範囲が提供される場合、その範囲及び他の任意の記載された値またはその記載された範囲の介在値の上限及び下限の間の、文脈が明らかに別途示さない限り、下限の単位１０分の１までの、各介在値は、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、記載された範囲において任意の具体的に除外された境界を条件に、本発明の範囲にさらに包含される。記載された範囲が、境界の１つまたは両方を含む場合、これらの含まれる境界の一方またはその両方を除外する範囲は、本発明にさらに含まれる。
【０００９】
特定の範囲は、数値が用語「約」に先行される状態で、本明細書に提示される。用語「約」は、それが先行する正確な数字、及びこの用語が先行する数字に近いまたは近似的である数字への字義通りのサポートを提供するために本明細書で用いられる。数字が具体的に記載された数字に近いか、または近似的であるかを判定する際に、近いまたは近似する記載されない数字は、用語が提示される文脈中で、具体的に記載された数字と実質的に同等のものを提供する数字であってもよい。
【００１０】
別途定義されない限り、全ての本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者に通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で記載されるものと類似したまたは同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施または試験にさらに用いることができるが、ここで、代表的な実例となる方法及び材料が記載される。
【００１１】
本明細書に引用された全ての出版物及び特許は、各個別の出版物または特許が、参照により組み込まれることが具体的に及び個別に示されるように、本明細書に参照により組み込まれ、出版物が引用される関連の方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の出版物の引用は、出願日に先立つその開示のためのものであり、本発明が、先行発明により、このような出版物より以前に発生する権利を与えられないことの容認として解釈されるべきでない。さらに、提供される出版物の日付は、独立して承認される必要があり得る実際の発行日と異なってもよい。
【００１２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別途示さない限り、複数の指示物を含むことを留意すべきである。特許請求の範囲が、任意の要素を除外するように策定してもよいことを、さらに留意すべきである。そのようなものであるから、この記載は、特許請求の範囲の要素の記載に関連して「単に」、「のみ」、及び同類のもののような限定した用語を用いるための、または「否定的な」限定を用いるための先行詞として用いられるように意図される。
【００１３】
本開示を読めば、当業者に明らかであるので、本明細書で記載及び説明される個別の実施形態のそれぞれが、本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に分離または結合し得る別々の構成要素及び特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順番で、または論理的に可能な任意の他の順番で実行できる。
【００１４】
本発明の実施形態の種々の態様をより詳細にさらに記載することにおいて、種々の実施形態のシステム及び装置の態様は、まずより詳細に検討され、続いて、本発明の特定の実施形態による方法及びキットの議論が検討される。
【００１５】
システム
本発明の態様は、大きなインタクトな組織試料を撮像するために構成された、それらのシステム及び装置を含む。一部の実施形態では、対象システムは、光源を備える照明光路、カメラを備える検出光路、試料チャンバを備える光学的に均一な試料操作構成要素、制御部、処理部、及び処理部により実行される場合に、制御部に試料チャンバ内の試料に対する複数のアライメントパラメータを取得するために較正手順を実行させ、試料の三次元画像を生成するためにアライメントパラメータ利用する撮像手順を実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体を備える顕微鏡装置を含む。ここで、これらの構成要素のそれぞれは、より詳細にさらに記載される。
【００１６】
上で要約したように、本発明の態様は、照明光路を備えるシステムを含む。照明光路構成要素は、当該技術分野において周知であり、本明細書において極めて詳細には記載されない。一部の実施形態では、照明光路構成要素は、以下にさらに記載されるように、コリメータ、シャッター、照明フィルタホイール、ビームエキスパンダ、二次元スキャナ、走査レンズ、チューブレンズ、１つ以上のミラー、及び光源を備えてもよい。これらの構成要素またはそれらの組み合わせもしくはアレンジのいずれかは、対象システム及び装置に、好適な仕方で利用されてもよい。
【００１７】
一部の実施形態では、照明光路は、静的光シートを発生させるように構成されたシリンドリカルレンズを備える。一部の実施形態では、照明光路は、ガウシアンまたはベッセルビームで、動的光シートを生成するように構成されたガルバノメータスキャナ／ｆ−θレンズを備える。一部の実施形態では、システムは、２つの照明光路を含んでもよく、照明光路は、試料の両側または対向する側から試料を照明するように構成される。
【００１８】
一部の実施形態では、システムは、単一の照明光路から、複数の光シート、例えば１つ、２つ、３つ、４つ以上の光シートを発生させるように構成してもよい。特定の実施形態では、光シートは、試料の所望の部分を照明するように独立して操作できる。一部の実施形態では、２つ以上の光シートは、第１の光シートが試料の第１の部分を照射し、第２の光シートが試料の第２の部分を照射するように連係して試料の一部分を照明するために用いることができ、試料の第１の部分は、試料の第２の部分とは異なる。一部の実施形態では、複数の光シートは、試料の一部分を照明するように用いることができ、例えば多くとも３つ以上、例えば４つ以上、例えば５つ以上、例えば６つ以上、例えば７つ以上、例えば８つ以上の光シートは連係して、試料の一部分を照明するために用いることができる。一部の実施形態では、各光シートは独立して、試料の所与の部分を照明するように操作できる。一部の実施形態では、複数の光シートは連係して、本明細書にさらに記載された方法に従って、試料の撮像を達成するように操作できる。
【００１９】
一部の実施形態では、システムは、２つの照明光路を含んでもよい。特定の実施形態では、２つの照明光路は、両側から試料を照明し、それにより試料の半分が１つの側から撮像され、試料の残りの半分が別の側から撮像されるように用いてもよい。
【００２０】
本発明の実施形態による照明光路は、３９０〜７００ｎｍの範囲の波長を有する可視スペクトル、または７００〜１５００の部分的な範囲の赤外スペクトルの光を発生するように構成された種々の光源をさらに備えてもよい。一部の実施形態では、光源はレーザを含んでもよい。一部の実施形態では、光源（例えばレーザ光源）は、例えば４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４ｎｍ、５６１ｎｍ、５９４ｎｍ、または６４７ｎｍの波長を有する光を発するように構成される。種々の好適な光源のいずれかは、対象システムで用いてもよい。
【００２１】
上で要約したように、本発明の態様は、検出光路を含むシステムを含む。検出光路構成要素は、当該技術分野において周知であり、本明細書において極めて詳細には記載されない。一部の実施形態では、検出光路構成要素は、カメラ、チューブレンズ、発光フィルタホイール、及び検出対物レンズを含む。これらの構成要素またはそれらの組み合わせもしくはアレンジのいずれかは、対象システム及び装置に、好適な仕方で利用されてもよい。
【００２２】
一部の実施形態では、カメラは、極めて低ノイズ、高速フレームレート、広いダイナミックレンジ、高量子効率（ＱＥ）、高分解能、及び広い実視野を提供する、ＣＣＤカメラまたは科学用ＣＭＯＳカメラ（ｓＣＭＯＳ）である。このようなカメラは、科学技術販売会社から市販されている。
【００２３】
一部の実施形態では、検出対物レンズは、撮像を受ける試料の屈折率（ＲＩ）に合致するＲＩを有するように構成される。例えば、一部の実施形態では、検出対物レンズは、２５倍、１０倍、または４倍の検出対物レンズであってもよく、このＲＩは、撮像分析を受ける浸液及び／または組織試料のものに合致する。
【００２４】
一部の実施形態では、検出対物レンズは、開口数の小さい検出対物レンズであってもよい。対物レンズの開口数は、発された光シグナル（例えば、蛍光シグナル）が、どれだけ対物レンズにより収集できるか、及び回折限界分解能がどの程度達成できるかを記載する。開口数がより大きいことは、アッベの回折限界のλ／２ＮＡで定義される関係式に従って、分解能が波長依存的に向上することを意味する。一部の実施形態では、検出対物レンズの開口数は、０．１〜１．４、例えば０．６〜１．０の範囲である。
【００２５】
一部の実施形態では、検出対物レンズは、作動距離（ＷＤ）を有しており、これは、焦点面（または撮像面）及び対物レンズの物理的な端の間の距離である。従って、検出対物レンズのＷＤにより、試料及び対物レンズの間の物理的接触がなく、試料にいかに深く撮像を行うことができるかが決定される。一部の実施形態では、検出対物レンズのＷＤは、０．１〜１００ｍｍ、例えば６〜８ｍｍの範囲である。
【００２６】
一部の実施形態では、システムは、２つの検出光路を含んでもよい。特定の実施形態では、２つの検出光路は、両側から試料を同時に撮像し、それにより試料の半分が１つの側から撮像され、試料の残りの半分が別の側から撮像されるように用いてもよい。本実施形態により、両方の対物レンズの組み合わせの全体的な作動距離が、第２の検出光路に第２の対物レンズを追加することにより、２倍増大したので、撮像できる試料サイズが２倍増大した。
【００２７】
上で要約したように、本発明の態様は、光学的に均一な環境で試料を含有するための光学的に均一な試料操作構成要素を含む。「光学的に均一な」は、光学的に均一な環境を通過する光線が、通過する材料のＲＩにおける任意の変化により実質的でない影響を受けることになるように、環境における種々の材料の屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｃｅｓ）（ＲＩ）が、合致または類似することを意味する。
【００２８】
一部の実施形態では、光学的に均一な試料操作構成要素は、上部が開いた箱の形状の試料チャンバを規定する底部または底面及び外壁を含む。一部の実施形態では、１つ以上の照明光路のレンズは、照明光路から発された光が、透明窓を通して試料チャンバの内部に直接入射するように、外壁の上にまたはそれの一部分に配置される。一部の実施形態では、透明窓は、光学的に均一な環境のＲＩに合致する材料で作製される。一部の実施形態では、透明窓は、例えば、石英カバーガラスで作製される。一部の実施形態では、検出光路の検出対物レンズは、外壁の上にまたはそれの一部分に配置される。一部の実施形態では、検出対物レンズは、照明光路と直交する関係で配置される（例えば、照明光路に対し９０°の角度で配置される）。
【００２９】
一部の実施形態では、光学的に均一な試料操作構成要素は、ｘ、ｙ、及びｚ方向ならびに角度または回転方向を含む複数方向のいずれかに試料を移動させるように構成されるｘｙｚ−θ試料搭載部を含む。一部の実施形態では、ｘｙｚ−θステージ搭載部は、移動範囲が大きく、ｘ、ｙ、及びｚ方向のそれぞれに、少なくとも４５ｍｍ移動させるように構成される。一部の実施形態では、ｘｙｚ−θステージ搭載部は、角度またはθ方向に最大３６０°試料を回転させるように構成される。このようなｘｙｚ−θ試料搭載部は科学技術販売会社から市販されている。
【００３０】
一部の実施形態では、システムの光学系は、試料に対して移動するように構成されるが、一部の実施形態では、試料操作構成要素はシステムの光学系に対して移動するように構成される。光学系または試料操作構成要素のいずれかの移動は、例えば、段階的にまたは連続的とすることができる。一部の実施形態では、光学系及び試料操作構成要素は、同期して移動できるが、特定の実施形態では、光学系及び試料操作構成要素は、非同期で移動できる。
【００３１】
一部の実施形態では、光学的に均一な試料操作構成要素の試料チャンバは、溶液で充たされる。一部の実施形態では、溶液は、試料または検出光路の検出対物レンズのＲＩに合致するＲＩを有する。例えば、一部の実施形態では、試料チャンバを充たすために用いられる溶液は、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒまたはＭｏｕｎｔＣｌｅａｒ（両方がＣｅｌＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｌａｂｓから市販されている）である。一部の実施形態では、チャンバを充たすために用いられる溶液は、１．４２から１．４６までの範囲、例えば１．４５の屈折率を有する液体である。一部の実施形態では、試料チャンバを充たすために用いられる溶液は、８７％のグリセロールである。所望の屈折率の範囲を有する溶液は、Ｃａｒｇｉｌｌｅ  Ｌａｂｓなどの販売会社から市販されている。
【００３２】
一部の実施形態では、光学的に均一な試料操作構成要素の試料チャンバは、より小さな内側チャンバを含み、内側チャンバの容積は、より大きな外側の試料チャンバの容積より小さい。例えば、一部の実施形態では、内側チャンバは、分析のために試料を収容するように構成されるキュベットである。特定の実施形態では、溶融石英で作製されたキュベットは、内側チャンバとして用いられる。一部の実施形態では、内側チャンバは、前記のように溶液で充たされ、溶液のＲＩは、試料または検出光路の検出対物レンズのＲＩに合致する。例えば、一部の実施形態では、内側チャンバを充たすために用いられる溶液は、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒまたはＭｏｕｎｔＣｌｅａｒ（両方がＣｅｌＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｌａｂｓから市販されている）である。一部の実施形態では、内側チャンバを充たすために用いられる溶液は、ＲＩが１．４５４であり、Ｃａｒｇｉｌｌｅ  Ｌａｂｓなどの販売会社から市販されている。一部の実施形態では、内側チャンバを充たすために用いられる溶液は、８７％のグリセロールである。特定の実施形態では、最初の溶液は内側チャンバを充たすために用いてもよく、別の溶液は、より大きな外側のチャンバを充たすために用いてもよい。例えば、一部の実施形態では、内側チャンバは、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒで充たされるが、外側のチャンバは、ＲＩが１．４５４の溶液または８７％のグリセロールで充たされる。
【００３３】
上で要約したように、本発明の態様は、対象システムの１つ以上の構成要素を制御するまたは作動させるように、構成されるまたは適合する制御部、処理部、及びコンピュータ可読媒体を含む。一部の実施形態では、システムは、本明細書に記載されるようにシステムの１つ以上の構成要素と通信し、システムの態様を制御する、及び／または対象システムの１つ以上の動作もしくは機能を実行するように構成される制御部を含む。一部の実施形態では、システムは、メモリ媒体及び／または記憶媒体を含み得る処理部及びコンピュータ可読媒体を含む。コンピュータ可読メモリ上でコンピュータ可読命令として具体化されるアプリケーション及び／またはオペレーティングシステムは、本明細書に記載される機能性の一部または全てを提供する処理部により実行できる。
【００３４】
一部の実施形態では、システムは、ユーザーから入力を受け、本明細書に記載されるような方法のうちの１つ以上を実行するように適合するまたは構成されるユーザーインターフェース、例えば、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を含む。一部の実施形態では、ＧＵＩは、ユーザーにデータまたは情報を表示するように構成される。
【００３５】
ここで、図１Ａを参照すると、顕微鏡装置の実施形態が示される。示された顕微鏡装置は、第１の及び第２の照明光路を含み、各照明光路は、コリメータ、シャッター、照明フィルタホイール、ビームエキスパンダ、２Ｄガルバノメータスキャナ、走査レンズ（またはｆ−θレンズ）、チューブレンズ、ミラー、及び照明対物レンズを備える。示された顕微鏡装置は、光学的に均一な試料操作構成要素内に配置される、ｓＣＭＯＳカメラ、チューブレンズ、発光フィルタホイール、及び検出対物レンズを備える検出光路をさらに備える。
【００３６】
ここで、図１Ｂを参照すると、光学的に均一な試料操作構成要素の種々の構成要素が示される。パネルａは、内部試料チャンバとして用いられ得る石英キュベットを示す。パネルｂは、試料チャンバの底面の、ｘｙｚ−θ試料搭載ステージを示す。検出光路の検出対物レンズ及び２つの照明光路のレンズが、さらに示される。パネルｃは、内部試料チャンバを形成する、試料チャンバ内に置かれたキュベットを示す。パネルｄは、ＲＩが１．４５４の液体で充たされる試料チャンバを示す。
【００３７】
ここで、図６を参照すると、制御電子回路のフレームワーク及びＣＯＬＭの部品の概略的な一覧が示される。示されるように、制御コンピュータまたは処理部は、例えば、検出光路のｓＣＭＯＳカメラ、照明光路のレーザ制御部、及び種々の追加の構成要素を含む、システムの種々の構成要素と通信する。
【００３８】
ここで、図を８参照すると、多断面ＣＯＬＭシステムの実施形態が示される。示されるように、システムは、２つの照明光路及び２つの検出光路を含む。照明光路は、両側から試料を照明するように構成され、検出光路は、両側から試料を撮像するように構成される。複数の面の同時撮像が、行単位のリードアウト方向に、２つの検出アームを作動させて、互いにわずかに位置を変える（約１００マイクロメートルは、図８パネルｃに示されるように十分である）ことにより達成される。
【００３９】
ここで、図９を参照すると、多断面ＣＯＬＭシステムの照明光路の実施形態が示される。示されるように、照明光路は、複数の独立した光シートを発生させるように構成される種々の構成要素を含む。具体的には、示された実施形態は、４つの独立した光シートを発生するように構成される。当該技術分野の当業者が、本明細書にさらに記載される対象方法に用いられる、異なる数の独立した光シートを発生させるために、種々の構成要素をさらに選択できるであろうという点に留意すべきである。
【００４０】
ここで、図１１を参照すると、２つの検出経路は、対応する一対の検出アームにより撮像を可能にする２つの異なる構成に照明ビームを向け直すための電動フリップミラーの使用を採用することにより、４つの検出経路に拡張できる。
【００４１】
方法
本発明の態様は、大きなインタクトな組織試料を撮像するために用い得る方法を含む。一部の実施形態では、対象方法は、光学的に均一な試料操作構成要素の試料チャンバ内に試料を設置すること、各位置に対するアライメントパラメータを取得するために、試料内の複数の位置で光シート及び顕微鏡装置の検出焦点面をアライメントする較正手順を実施すること、試料内の複数の位置のそれぞれから画像を収集する撮像手順を実施すること、及び、各位置の画像を用いて、試料の三次元画像を構築することを含む。ここで、方法の態様は、以下でより詳細にさらに記載される。
【００４２】
前記のように、方法の態様が、光学的に均一な試料操作構成要素に試料を設置することを含む。一部の実施形態では、試料は、試料搭載ステージ、例えば、任意の方向に、試料を移動させるように構成されるｘｙｚ−θ試料搭載ステージに設置される。一部の実施形態では、方法は、光学的に均一な試料操作構成要素の試料チャンバに試料を設置すること、及び試料に合致する屈折率（ＲＩ）を有する溶液で試料チャンバを充たすことを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される撮像分析を実施する前に、試料は、顕微鏡分析のために調製してもよい。一部の実施形態では、試料は、複数のヒドロゲルサブユニットで試料を固定すること、ヒドロゲル包埋試料を形成するために、ヒドロゲルサブユニットを重合すること、及び、ヒドロゲル包埋試料をクリアリングすることにより調製される。調製法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１０６６号でさらに記載され、この開示は、全体として本明細書に参考として組み込まれる。
【００４３】
方法の態様は、光のシートで照明される試料の照射面と顕微鏡装置の検出焦点面をアライメントするために用いられる較正手順を実行することを含む。一部の実施形態では、較正手順は、ｚ方向における試料に対する開始地点及び終了地点を特定することを含む。特定の実施形態では、較正手順は、Ｚ−方向で複数の面に試料を分割するために用いられるＺ−ステップ値を特定することを含み、各面は、試料の二次元セグメントまたは部分を表す。一部の実施形態では、Ｚ−ステップ値は、０．１μｍ〜１ｍｍの範囲、例えば１〜５μｍである。
【００４４】
一部の実施形態では、較正手順は、複数のタイルに試料をデジタル的に分割することを含む。「タイル」は、試料の別々の部分の画像を意味する。顕微鏡対物レンズの実視野が試料自体よりも小さい場合、タイリング配置の複数のスタック画像を収集し、次に、完全な画像を生成するために、タイルをつなぎ合わせる必要があることがある。一部の実施形態では、方法は、タイルの数を決定することになる領域の２つの対向する角の座標を決定すること、及びタイル画像のスタックを収集するために用いられることになる所望のＺ−ステップ値を設定することを含む。一部の実施形態では、領域は、１０〜５０％、例えば１５〜２０％の範囲で互いに重なったタイルとして選択される。
【００４５】
較正手順の態様は、試料内の複数の位置のそれぞれに対するアライメントパラメータを取得することを含む。各位置でのアライメントパラメータを取得するために、一次元において光線を移動させることにより発生した光シートは、試料の面を照明するために用いられる。シート光により照明される試料の面は、本明細書においては、「試料照射面」または「照射面」と称する。顕微鏡の検出焦点面及び試料照射面の間のアライメントは、試料照射面及び検出焦点面の間の最適なアライメントに対応する特定の付近の最大画像品質測定値を見つけることにより行われる。一部の実施形態では、画像品質測定値は、フーリエ空間における高周波及び低周波シグナルの比を含む光学焦点品質測定値である。
【００４６】
較正手順の結果は、試料内の異なる位置に相当する複数のアライメントパラメータである。試料内の所与の位置でアライメントパラメータを適用することにより、顕微鏡装置の検出焦点面及び光シートの最適なアライメントが、同じ位置で達成される。一部の実施形態では、１ｍｍのＺ−ステップ値は、較正手順を実行するために用いられ、試料内の２つの隣接する位置の間の線形補間は、２つの隣接する位置の間の位置でのアライメントパラメータを決定するために用いられる。この手段では、較正手順は、１ｍｍのＺ−ステップ値を用いて実施することができ、次に、結果は、任意の位置でのアライメントパラメータを決定するために試料全体に適用できる。一部の実施形態では、較正手順は自動化される。一部の実施形態では、処理部は、制御部に較正手順を実行させ、試料に対する複数のアライメントパラメータを取得する命令を実行する。
【００４７】
前記のように、方法の態様は、試料の照射面と、顕微鏡装置の検出焦点面をアライメントするために、顕微鏡装置のアライメントパラメータを利用する撮像手順を実施することを含む。一部の実施形態では、撮像手順は、試料の照射面と、顕微鏡装置の検出焦点面をアライメントすること、光源からの光線で、照射面の直線部分を照明すること、及び、カメラで照射面の照明された直線部分から、複数の発された光シグナルを取り込むことを含む。特定の実施形態では、顕微鏡装置の検出焦点面及び試料の照射面のアライメントは、照射面の照明が、検出焦点面が照射面とアライメントされるのと同時に実行されるように、同期される。この手段では、動的に撮像される試料の部分のみが照明され、それにより、過度の照明から生じ得る試料におけるシグナルの光退色が低減する。
【００４８】
一部の実施形態では、撮像手順は、照射面全体を掃引して、それにより、照射面の複数の直線部分を照明するために光源からの光線を向けることを含む。一部の実施形態では、光線が照射面全体を掃引する場合、照射面の異なる直線部分のそれぞれからの複数の発された光シグナルは、カメラで取り込まれ、照射面と一致する試料の二次元画像がもたらされる。一部の実施形態では、試料の照射面が照明される期間は、１ミリ秒（ｍｓ）〜１秒、例えば５〜１００ｍｓの範囲である。
【００４９】
一部の実施形態では、方法は、試料の異なる部分を照明するために、複数の独立した光シートを向けることを含む。例えば、一部の実施形態では、２つ以上の光シートは、試料の両側から、試料を照明するために用いられる。一部の実施形態では、複数の光シート、例えば２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、７つ以上の、または８つ以上の光シートは、試料を照明するために用いられる。一部の実施形態では、単一の光シートは、ある地点から他の地点へ、光シートを素早く移動または「スイッチング」することにより、試料の２つ以上の異なる部分を照明するために用いられる。
【００５０】
一部の実施形態では、撮像手順は、光シートが新しい照射面を照明することになるように、ｚ方向に試料を移動すること、及び、新しい照射面と一致する試料の別の二次元画像を生成するために撮像手順を繰り返すことをさらに含む。一部の実施形態では、試料は静止したままであるが、光シート及び検出対物レンズは新しい照射面を撮像するために移動する。一部の実施形態では、撮像手順は、光学系（例えば、照明光路の対物レンズ）、及び試料を照明するために用いられる光シートを同期して移動させることを含む。一部の実施形態では、撮像手順は、試料の種々の面が照明される時、検出光路のカメラが、それらを連続的に撮像できるように、決められた速度で、試料操作構成要素と共に試料を連続的に移動させることを含む。前記方法論のいずれかは、任意の所与の光シートに関して、実施できる。そのようなものであるから、ＣＯＬＭシステムで複数の光シートを利用することは、特定の試料に対する撮像手順の全体的な速度を増大させる、ならびに対象システム及び方法を用いて撮像できる試料サイズを増大させるために用いることができる。
【００５１】
一部の実施形態では、照明手順の結果は、試料の複数の二次元画像であり、それぞれが、試料の異なる照射面に対応する。一部の実施形態では、撮像手順は自動化される。一部の実施形態では、処理部は、制御部に撮像手順を実行させる、及び試料の複数の二次元画像を取得する命令を実行し、それぞれが、試料の異なる照射面に対応する。
【００５２】
一部の実施形態では、撮像手順は、試料の三次元画像を形成するために、複数の二次元画像のデータ処理することをさらに含む。一部の実施形態では、試料の２つ以上の異なる二次元画像は、試料の面の単一の二次元画像を、結合または「つなぎ」合わせてもよい。例えば、前記のように、２つ以上の異なる独立した光シートを用いて、試料が撮像をされる場合、各光シートから得られる画像は、試料の所与の面に対応する単一の二次元画像を形成するために結合してもよい。
【００５３】
三次元再構築ソフトウエアは、市販されており、タイル画像をつなぎ合わせるために用いる、及び／または複数の二次元画像を三次元画像に再構築できる。市販のソフトウエアプログラムとしては、Ｉｍａｒｉｓ、Ｂｉｔｐｌａｎｅ、及びＡｍｉｒａからのもの、ならびにＦｉｊｉ、ＸｕｖＴｏｏｌｓ、Ｖａａ３Ｄ  ｐｌｕｇｉｎ、及びＴｅｒａＳｔｉｔｃｈｅｒのステッチングプラグインなどのオープンソースソフトウエアが挙げられる。一部の実施形態では、神経組織を含む試料における神経形態の手動または半自動のトレースは、Ｉｍａｒｉｓ及びＡｍｉｒａなどの市販のソフトウエア、またはＮｅｕｒｏｍａｎｔｉｃなどのオープンソースツールの特定モジュールを用いて実施できる。
【００５４】
ここで、図７を参照すると、方法の一実施形態のブロックフロー図が示される。示された実施形態では、方法は、光学的に均一な試料操作構成要素内に試料を設置すること、複数のアライメントパラメータを取得するために、試料に較正手順を実施すること、アライメントパラメータを用いて、試料に撮像手順を実施すること、及び、撮像手順中に取り込まれた画像を用いて、試料全体の三次元画像を構築することを含む。
【００５５】
ここで、図８パネルｂを参照すると、大きなインタクトな試料の高品質の深部画像を得るための方法の実施形態が示される。示されるように、２つのアライメントされた光のシートで照明された２つの独立した面（２つの異なる面を照明する１つの側からの１つビーム、または両側からの２つのビームのいずれかであって、各面側からの１つビームが同一面を照明し、残りのビームが残りの面を照明する状態で）は、反対の検出アームで同時にまたは逐次的に撮像される。試料の二次元画像は、各光シートから生成される。パネルｂは、２つの対向する検出アームで撮像される同一面の画像を示す。検出アームは、正確に（例えば、サブミクロンの精度で）アライメントできる。パネルｂは、わずかにミスアライメントされたアームでの画像を示し、ＸまたはＹ方向の小さな補正による画像は、重ね合わせることができる。本方法を用いて、より大きな試料が撮像できる。両方の対物レンズの組み合わせの全体的な作動距離は、第２の検出光路に第２の対物レンズを加えることにより、２倍に増大する。
【００５６】
ここで、図８パネルｃを参照すると、撮像速度を増大させる種々の方法が、示される。示されるように、２つの独立した面を撮像するための光シートの高速スイッチングは、全体的な撮像速度を増大させるために用いてもよい。同様に、同時の多断面撮像は、撮像プロセスの全体的な速度を増大させるためにさらに用いることができる。複数の光シートが、試料の中を連続的に移動される、または試料が、画像を連続的に取得しながら、複数の光シートの中を連続的に移動されるノンストップ試料撮像は、撮像プロセスの全体的な速度を増大させるために、さらに用いることができる。加えて、段階的な光学的Ｚ−走査は、試料の異なる光学面を逐次的に撮像するために、複数の光シートと用いることができる。一方方向及び双方向の同期される照明及び検出は、撮像プロセスの全体的な速度を増大させるために、さらに用いることができる。双方向の同期される照明及び検出では、２つ以上の独立した光シートが、図８パネルｃで示されるように、試料の異なる部分を照明及び撮像するために用いられる。異なる方向に移動する複数の光シートを用いることにより、撮像プロセスの全体的な速度が増大する。
【００５７】
ここで、図１１を参照すると、軸方向（Ｚ分解能）を増大させる方法が示される。４つの独立した直交配置されたシグナル検出アームで試料を撮像することにより、３Ｄ画像が、４つの直交ビューから取得される。これらの４つのビューを融合することにより、軸方向の分解能（Ｚ分解能）の向上が達成される。図１１は、試料がまず２つの検出アームのセットで撮像され、次に、検出アームの直交配置された部分で撮像される２つの自動的に切り替え可能な構成を示す。このスイッチングは、励起光を反射させるか、または妨害されずに通過させる高速で精密なフリップミラーを用いることにより実施される。
【００５８】
用途
対象方法及びシステムを用いて、通常の当業者が任意の生物学的組織を撮像することが可能となる。方法及びシステムは、任意の植物または動物、例えば、脊椎動物もしくは無脊椎動物、例えば昆虫、ワーム、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミ、齧歯動物、非ヒト霊長類またはヒトからの標本を撮像するために用いてもよい。標本は、任意の組織型、例えば、造血、神経（中枢または末梢）、グリア、間葉系、皮膚、粘膜、間質、筋肉（骨格筋、心筋、または平滑筋）、脾臓、細網内皮、上皮、内皮、肝臓、腎臓、膵臓、胃腸、肺、線維芽細胞、及び他の細胞型であってもよい。場合によっては、標本は、生体、例えば、ワーム、昆虫、ゼブラフィッシュ、または発生中の胚である。他の場合、標本は、完全な器官、例えば齧歯動物の全脳である。他の場合、標本は、器官の部分、すなわち生検、例えば移植組織の生検である。標本は、新たに分離または保存、例えば急速凍結してもよい。標本は、「通常の」病状を有してもよく、または異常な徴候もしくは疾患に付随する病状を示してもよい。このような標本の例としては、腫瘍または腫瘍関連組織、疾患の組織、及び同類のものから得られるものが挙げられる。そのようなものであるから、対象方法及びシステムは、組織標本の病理学的分析において使用を見出す。
【００５９】
対象方法及びシステムは、顕微鏡分析ために生物学的標本を調製するための手法と組み合わせた使用を見出す。一部の実施形態では、方法は、複数のヒドロゲルサブユニットで試料を固定することより、対象の撮像分析のために試料を調製すること、ヒドロゲル包埋試料を形成するために、ヒドロゲルサブユニットを重合すること、及び、ヒドロゲル包埋試料をクリアリングすることを含む。顕微鏡分析のための標本の調製に関するさらなる詳細は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１０６６号に見出すことができ、この開示は、全体として本明細書に参考として組み込まれる。本明細書で用いられる場合、用語「ＣＬＡＲＩＴＹ」は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１０６６に開示されるような分析のための生物学的標本を調製する方法を指す。
【００６０】
対象方法及びシステムは、多くの使用を見出す。例えば、対象方法は、中枢神経系の接続性の研究に適用してもよい。本明細書で用いられる「接続性」は一般に、ニューロン間の接続を意味し、単一細胞レベルでの接続、例えばシナプス、軸索末端、樹状突起など、及び主要な軸索路としての、ニューロン群及びＣＮＳの領域の間の接続、例えば、脳梁（ＣＣ）、前交連（ＡＣ）、海馬交連（ＨＣ）、錐体交叉、錐体路、外包、内包（ＩＣ）、大脳脚（ＣＰ）などを含む。全脳及び／もしくは脊髄の標本またはそれらの領域（例えば、大脳（すなわち大脳皮質）、小脳（すなわち小脳皮質）、前脳の腹側領域（例えば線条体、尾状核、被殻、淡蒼球、側坐核、中隔核、視床下核）；視床及び視床下部の領域及び核；深部小脳の領域及び核（例えば、歯状核、球形核、栓状核、室頂核）、ならびに脳幹（例えば黒質、赤核、脳橋、オリーブ核、脳神経核）；ならびに脊椎の領域（例えば、前角、側角、後角））は、死後に調製してもよく、その中のニューロンの接続性は、例えば、脳（例えば、死後のヒトの脳）の完全な接続性を提供するために、対象方法及びシステムを用いて顕微鏡で分析される、例えば、取得される、保存される、レンダリングされる、用いられる、及び作動される。このような研究は、脳が健康及び疾患の時にいかに発達及び機能するかの理解、ならびに認知及びパーソナリティの基礎の理解に大いに貢献することになる。
【００６１】
別の例として、対象方法及びシステムは、疾患を診断または監視するために用いてもよい。本明細書で用いられる「診断」は一般に、疾患または障害に対する対象の感受性の予測、対象が疾患または障害の影響を目下受けているか否かの判断、疾患または障害の影響を受ける対象の予後（例えば、癌の状態、癌のステージ、患者が癌で死亡することになる可能性の確認）、疾患または障害の治療に対する患者の応答性の予測（例えば、同種造血幹細胞移植、化学療法、放射線療法、抗体療法、低分子化合物の治療に対し、例えば、肯定的応答、否定的応答、全く応答なし）、及びセラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）の使用（例えば、治療法の効果または有効性に関する情報を提供するために対象の状態を監視すること）を含む。例えば、生検は、癌の種類、癌の進行している程度、癌が治療的介入に応答することになるか否か、などを判定するために、癌組織から調製し、対象方法及びシステムを用いて顕微鏡で分析してもよい。別の例として、生検は、組織の状態、疾患の進行している程度、治療が成功することになる可能性などを判定するために、疾患に罹患した組織、例えば腎臓、膵臓、胃などから調製し、対象方法及びシステムを用いて撮像してもよい。用語「治療」、「治療すること」及び同類のものは、一般に所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で用いられる。効果は、疾患またはその徴候を完全にまたは部分的に予防するという点で、予防的であってもよく、ならびに／または、疾患及び／もしくは疾患に起因する副作用に対する部分的もしくは完全な治療という点で治療的であってもよい。本明細書で用いられる「治療」は、哺乳動物の疾患の任意の治療をカバーし、（ａ）疾患にかかりやすい性質があり得るが、疾患があると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち疾患の進行を抑えること、または、（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の症候を緩解させることを含む。治療薬は、疾患または負傷の発生の前、その間、またはその後に投与してもよい。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または減少させる、進行中の疾患の治療は、特に重要である。このような治療は、影響を受けた組織において機能が完全に消失する前に実施されることが望ましい。対象治療法は、望ましくは、疾患の症候段階の間に、及び場合によっては疾患の症候段階の後に投与されることが望ましいであろう。用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は、本明細書で同じ意味で用いられ、診断、治療、または治療法が望まれる任意の哺乳動物の対象、特にヒトを指す。
【００６２】
同様に、対象方法及びシステムは、いかに良好に対象が移植された器官／組織、例えば心臓、腎臓、肝臓、または他の器官を受け入れているかを判定するために、組織移植片を監視するために用いてもよい。このような例において、移植された器官の生検は、例えば組織の完全性、組織の血管新生、免疫細胞の浸潤などを調べるために、対象方法及びシステムを用いて顕微鏡で分析してもよい。
【００６３】
対象方法及びシステムにより、組織または疾患への効果に関し候補治療薬をスクリーニングするための有用なシステムがさらに提供される。例えば、対象、例えばマウス、ラット、イヌ、霊長類、ヒトなどは、候補薬と接触してもよく、器官またはその生検は、調製してもよく、調製された標本は、１つ以上の細胞または組織パラメータを調べるために、対象方法及びシステムを用いて顕微鏡で分析してもよい。パラメータは、細胞または組織の定量化可能な構成要素、特に、望ましくは高スループットシステムにおいて、正確に測定できる構成要素である。パラメータは、細胞表面決定基、受容体、タンパク質またはそれらの構造的なもしくは翻訳後の修飾、脂質、炭水化物、有機または無機分子、核酸、例えばｍＲＮＡ、ＤＮＡなど、あるいはこのような細胞構成要素またはその組み合わせから誘導される部分を含む、任意の細胞の構成要素または細胞産生物とすることができる。ほとんどのパラメータは、定量的なリードアウトを提供することになるが、場合によっては、半定量的または定性的な結果が許容可能となる。リードアウトは、単一の決められた値を含んでもよく、または平均、中央値、もしくは分散などを含んでもよい。特徴的なパラメータのリードアウト値の範囲は、多数の同一のアッセイからの各パラメータに対して得られることになる。変動が予想され、試験パラメータのセットのそれぞれに対する値の範囲は、単一の値を提供するために用いられる一般的な統計的方法と標準的な統計的方法を用いて得られることになる。従って、例えば、１つのこのような方法は、細胞生存性、組織血管新生、免疫細胞浸潤の存在、疾患の進行を変化させることにおける有効性などを検出することを含んでもよい。一部の実施形態では、スクリーンは、対照または参照試料、例えば、候補薬と接触していない対象から同様に調製した標本からのものと、分析されたパラメータを比較することを含む。スクリーニングのための目的の候補薬は、有機金属分子、無機分子、遺伝子配列などを含み得る多数の化学的部類、主に有機分子を包含する既知及び未知の化合物を含む。スクリーニングのための目的の候補薬は、核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子、もしくはｍｉＲＮＡをコードする核酸、またはポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。本発明の重要な態様は、毒性試験及び同類のものを含む、候補薬を評価することである。
【００６４】
対象方法及びシステムは、細胞より小さい分解能で、全組織において遺伝的にコードされるマーカー、例えば、染色体異常（逆位、重複、転座など）、遺伝的ヘテロ接合性の喪失、疾患または良好な健康状態になりやすい傾向を示す遺伝子の対立遺伝子の存在、治療法への応答性の可能性、家系、及び同類のものの分布を可視化するためにさらに用いてもよい。このような検出は、例えば、個別化医療において、及び起源の研究において、例えば、前記のように、疾患を診断及び監視することに用いてもよい。
【実施例】
【００６５】
上記の開示から理解できるように、本開示は、多種多様な用途を有する。従って、次の実施例は、本発明を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載され、発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することが意図されるものでなく、以下の実験が、実施された全てのまたは唯一の実験であることを表すことが意図されるものでもない。当業者は、実質的に同様の結果を得るために、変更または修正できる種々の重要でないパラメータを速やかに認識するであろう。従って、次の実施例は、本発明を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載され、発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することが意図されるものでなく、以下の実験が、実施された全てのまたは唯一の実験であることを表すことが意図されるものでもない。用いられる数字（例えば、量、大きさなど）に関して精度を確保するための努力がなされているが、一部の実験誤差及び偏差は、考慮されるべきである。
【００６６】
実施例の概要
前記のように、光シート顕微鏡では、試料は薄い光のシートで、側面から照明され、発された光シグナル（例えば、蛍光シグナル）は、焦点を合わせた、直交配置された対物レンズで検出される。光学セクショニングは、選択面への照明を制限することにより達成され、高速ＣＣＤまたはｓＣＭＯＳカメラを用いると、同時に全体画像を取り込むことが可能になり、撮像速度が増大する。さらに、光シート顕微鏡は、目的の面に照明を制限することにより、光退色（図５）を最小限に抑える。光シート顕微鏡のこれらの特性は、例えばＣＬＡＲＩＴＹプロセスにより作製された大きな透明化試料の撮像に非常に適している。ＣＬＡＲＩＴＹ最適化光シート顕微鏡（ＣＯＬＭ）（図１Ａ〜Ｄ）により、透明化試料の全深部、例えばマウス脳（＞５ｍｍ）が、ＣＬＡＲＩＴＹ最適化対物レンズ（図２、３、４Ｂ）を用いて高分解能で撮像可能になり、大きな透明化容積を高速収集することにより、光退色の大幅な低減がもたらされる（図２、３）。２つの検出アームにより、より深部での向上した撮像品質が可能になる。というのは、試料の一部が、その近くの検出アームから撮像されるからである（図１０パネルｂ、ｃ、及びｄ）。
【００６７】
材料及び方法
試薬及び試料
ヒドロゲルモノマー（ＨＭ）溶液
４０ｍＬの４０％のアクリルアミド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１６１−０１４０、４％の最終濃度）、１０ｍＬの２％のビスアクリルアミド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１６１−０１４２、０．０５％の最終濃度）、４０ｍＬの１０×ＰＢＳ、１００ｍＬの１６％のＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１０−Ｓ、４％の最終濃度）、２１０ｍＬの蒸留水、及び１ｇのＶＡ−０４４熱反応開始剤（Ｗａｋｏ、カタログ番号ＶＡ−０４４、０．２５％ｗ／ｖの最終濃度）を混合することにより、４００ｍＬのＨＭ溶液を調製した。全ての試薬は、氷上に保った。４０ｍＬのＨＭ溶液を、５０ｍＬのファルコンチューブに等分し、必要になるまで−２０℃で保存した。ＨＭ溶液中のアクリルアミド及びビスアクリルアミドの濃度は、クリアリングプロセスの速度を上げために、比例して低減できる。４．０％／０．０５％までの範囲のアクリルアミド／ビスアクリルアミドの０．５％／０．０１２５％の濃度をうまく用いたが、下限のアクリルアミド／ビスアクリルアミドの濃度は、クリアリング速度が数倍に増大した場合に、開始するために用いてもよい。
【００６８】
ＳＤＳ／ボレートクリアリング緩衝液（ＳＢＣ）
２０％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ３３７またはＡｍｒｅｓｃｏカタログ番号０８３７、Ｈ２Ｏ中）及び１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨは８．５に調整された）のストックを調製した。最終のクリアリング緩衝液を、２０％のＳＤＳ及び１Ｍのホウ酸緩衝液を蒸留水で５倍に希釈することにより新たに調製した。
【００６９】
他の試薬
用いられた他の試薬は、次のとおりであった。ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（ＣｅｌＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｌａｂｓ）、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  ｌｉｑｕｉｄｓ（ＲＩ１．４５４、カタログ番号１８０６Ｙ、Ｃａｒｇｉｌｌｅ  Ｌａｂｓ）、Ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｏｒｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ７９０１）、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｐｅｌｌｅｔｓ（ＥＭＤ、カタログ番号ＳＸ０５９０−３）。
【００７０】
撮像試料
撮像試料を、成体Ｔｈｙ１−ｅＹＦＰまたはＷＴマウスから調製した。全ての動物実験を、スタンフォード大学の施設内審査委員会の承認を受けて実行した。
【００７１】
分子の標識化
組織試料は、試料において分子の及び構造的な細部を標識化するために、蛍光体の内因性のトランスジェニック発現を有してもよいが、さらに、免疫組織化学は、目的の構造及び分子を標識化するために用いることができる。
【００７２】
組織を、３７℃で少なくとも１日、ＰＢＳＴ（または脳全体の洗浄にはホウ酸緩衝液／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で完全に洗浄した。試料を、組織ブロックの場合３７℃で２日間、または完全なインタクトな脳の場合多くとも１週間、一次抗体／ＰＢＳＴ溶液（１：５０希釈から開始）でインキュベーションした。約１Ｍのボレート／０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液（ｐＨ８．５）は、抗体インキュベーションが背景染色を低減させるために、ＰＢＳＴの代わりにさらに用いることができる。抗体を、拡大する抗体量を定期的に補充しながら、１ｍＬの溶液中で１ｍｍ厚のブロックと、または５ｍＬの溶液中で完全なマウス脳とインキュベーションした。例えば、５０μＬの抗ＴＨ抗体（１０〜２０μｌ）を追加でき、続いて、２０μＬ以上を２日ごとに約１週間追加できる。効果的な免疫染色が、組織に深く浸透するために、及び容積全体に総数の多い抗体結合部位を封じるために、高い抗体濃度（１：２０〜１：１００）を必要とした。良好な免疫染色の第２の主要な要因は、クリアリング時の脂質の完全な除去であった。
【００７３】
一次抗体を、組織ブロックの場合１日、全脳の場合２〜３日間、３７℃、ＰＢＳＴ緩衝液で洗浄した（４〜６時間ごとに緩衝液を新しくする）。試料を、組織ブロックの場合２日間、または全脳の場合多くとも１週間、３７℃、ＰＢＳＴ中で所望の二次抗体（１：５０〜１：１００）とインキュベーションした。ＤＡＰＩなどの核の標識色素を、この工程でさらに追加できることに注意を要する。組織ブロックの場合１日、全脳の場合２〜３日、３７℃、ＰＢＳＴで二次抗体を洗浄した。撮像のために調製するには、屈折率の均質化のために、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒに組織を移した。一晩６０℃、クリアリング緩衝液中で組織をインキュベーションすることにより、撮像した後に、前の標識を溶出させる（除去する）ことにより複数ラウンドの標識化を実施し、続いて、別のラウンドの標識化を実施した。
【００７４】
機器のセットアップ
ＣＬＡＲＩＴＹ最適化光シート顕微鏡
光シート顕微鏡は、検出対物レンズ、チューブレンズ、及び、カメラを含む１つ以上の標準的広視野検出光学的アーム、ならびに、開口数の小さい対物レンズ、チューブレンズ、及び、ガウシアンまたはベッセルビームで、静的光シートを発生させるシリンドリカルレンズまたは動的光シートを発生させるためのガルバノメータスキャナ／ｆ−θレンズから構成される１つ以上の直交配置された独立した照明アームから構成される。
【００７５】
ＣＬＡＲＩＴＹ対物レンズ（２５×及び１０×、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、高速ｓＣＭＯＳカメラ、ｆ−θレンズと連動する二軸ガルボスキャナ、ガウシアンビームを用いて動的光シートを発生させる開口数の小さい対物レンズ、最適化試料チャンバ（続くセクションで詳述される）、ならびに大きな試料の撮像を可能にするために、次元のそれぞれにおいて４５ｍｍの範囲の長い移動を提供するｘｙｚ−θ試料搭載ステージを用いて、光シート顕微鏡と透明化試料の適合性を最大化するために、ＣＬＡＲＩＴＹ最適化光シート顕微鏡（ＣＯＬＭ）を開発した（図１Ａ〜Ｄ）。
【００７６】
ＣＯＬＭは、特により深部での撮像品質を向上させるために、同期照明−検出を用い（図１Ｃ）、次世代ｓＣＭＯＳカメラで利用可能な（標準的な双方向でない）一方方向リードアウトモードを利用した。（動的光シートを発生させた）走査ビームを、発されたシグナルの一方方向の単一ラインリードアウトと同期させて、試料内の深部散乱に起因する焦点面外シグナルを拒絶した仮想共焦点スリット配置が得られた。ＣＯＬＭの（線形適応を用いた）自動アライメントパラメータ較正により、試料空間全体にわたるミスアライメント人為現象が補正された（図１Ｄ）。ＣＯＬＭ用の制御電子回路の設計及び部品は、図６にまとめる。ＦＰＧＡ論理回路を用いて、顕微鏡の種々の部品を制御し、同期させた。
【００７７】
ＣＯＬＭ用の試料搭載機器
ＣＯＬＭの構成要素は、１つ以上の検出経路に沿った光学的不均一性を最小限に抑える、ＣＬＡＲＩＴＹ最適化試料搭載方策であった（図１Ｂ）。透明化完全なマウス脳（または、脊髄などの任意の大きさのインタクトな透明化組織）を、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒで充たした、溶融石英ガラスで作製されたキュベット（分光光度測定のために用いられる標準的なキュベット）に搭載した。溶融石英の屈折率（約１．４５８）は、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒのものとほぼ同一であった。ボトムアダプタ（図１Ｂ）を用いて、試料チャンバ（図１Ｂ）の内側のｘｙｚ−θステージに試料キュベットを搭載した。次に、比較的経済的な価格のカスタム屈折率マッチング液（ＲＩ１．４５４、カタログ番号１８０６Ｙ、Ｃａｒｇｉｌｌｅ  Ｌａｂｓ）で、はるかに大きなチャンバを充たして、光学的に均一な試料操作系をもたらした。ＲＩ液は、試料チャンバを充たすのに十分な半リットルあたり、数百ドルがかかり（ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒよりも１桁以上安い）、何度も再利用できた。あるいは、８７％のグリセロールでチャンバをさらに充たすことができた。
【００７８】
データ解析用の計算ワークステーション
画像データが非常に大きいので、大量のＲＡＭ、マルチコアＣＰＵ、及び優れたグラフィックスカードを有する計算ワークステーションを用いることが重要であった。次の構成を有するワークステーションで、ここに示されたデータを扱った。Ｉｎｔｅｌ  サーバボードＳ２６００ＣＯ、２つのＩｎｔｅｌ  Ｘｅｏｎ  Ｅ５−２６８７Ｗ  ８Ｃ  ＣＰＵ、約１３０ＧＢのＤＩＭＭ  ＲＡＭ、約８ＴＢのハードディスク（Ｓｅａｇａｔｅ  Ｓａｖｖｉｏ  １０Ｋ）、ＮＶｉｄｉａ  Ｋ５０００グラフィックスカード、及び高分解能モニタ（ＮＥＣ  ＭｕｌｔｉＳｙｎｃ  ＰＡ３０１Ｗ  ３０インチ  ２５６０×１６００）。
【００７９】
撮像及び分析
ＣＬＡＲＩＴＹ最適化光シート顕微鏡
適切な大きさの石英キュベットに、試料（例えば、インタクトなマウス脳）を搭載したので、試料は、撮像しながら静止したままであった（図１Ｂ）。多くの異なるサイズの石英キュベットが、販売会社（例えば、Ｓｔａｒｎａ  Ｃｅｌｌｓ）から入手でき、アクリルアミドゲル（または、同様の透明材料）の小片は、撮像側と反対側に、構造パディングを提供するために用いてもよいことに注意を要する。成体マウス脳の場合、パディングを有する１０×５ｍｍまたは１０×１０ｍｍベースのキュベットが、年齢に応じて用いてもよい。
【００８０】
キュベットを、試料全体をカバーするのにちょうど十分なＦｏｃｕｓＣｌｅａｒで充たした。アダプタを用いて、ｘｙｚ−θステージにキュベットを搭載した（図１Ｂ）。気泡またはダスト粒子は、撮像を妨げるので、それらを防止した。
【００８１】
ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒなどの屈折率マッチング溶液で充たした石英キュベットに、インタクトな成体マウス脳などの透明化試料を搭載した。石英ガラスの屈折率（約１．４５８）は、ＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（約１．４５４）のものと同一であった。ボトムアダプタを用いて、試料チャンバ内のｘｙｚ−θステージにキュベットを取付け、次に屈折率マッチング液（ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ  ｌｉｑｕｉｄ）（約１．４５４）で充たした。これにより、最小の屈折率遷移境界を有する光学的に均一な試料操作系がもたらされた。
【００８２】
次のとおり、タイリングパラメータを設定した。一部の試料は、用いられた対物レンズの実視野より大きかった。従って試料全体をカバーするための画像スタックのタイリングが必要とされた。タイルの数を特定するためには、２０％以上のタイルが重なった状態で、目的の領域の２つの対向する角の座標を定めた。試料からの有用なシグナルを含有する最初及び最後の画像フレームを見つけることにより、スタックの開始ｚ位置及び終了ｚ位置を特定し、次に所望のＺ−ステップ値を設定した。
【００８３】
（特に大きな試料の撮像中に）ぼやけた画像をもたらす可能性がある、光シート及び検出焦点面の間の任意のミスアライメントを調整した。光シート及び焦点面のアライメントパラメータを、上で定義されたように試料空間全体にわたって最適化した。全てのタイルに対して、組織のミリメートルごとに、これらのパラメータを最適化し、次にこれらのミリメートルステップの間に、ｚステップの値を線形補間することにより、これを達成した。最適なパラメータを、画像品質尺度に対応する特定された近傍で最大値を見つけることにより同定した。このプロセスを自動化するために、光学焦点品質測定値を、フーリエ空間における高周波及び低周波シグナルの比として実施した。
【００８４】
撮像実験を開始し、データを次のとおり収集した。２つの光シートを両側から発生させ、焦点を合わせた検出対物レンズ、チューブレンズ、及びｓＣＭＯＳカメラで、発された蛍光を撮像した。（電動式の）照明及び発光フィルタホイールを用いて、それぞれ輪郭のはっきりした励起光及び発光シグナルバンドを発生させた。
【００８５】
ＣＯＬＭ及び従来の光シート顕微鏡で同一面から取得された、示された画像（図１Ｃ）により説明されるように、ｓＣＭＯＳカメラチップの一方方向リードアウトと、走査ビームを同期させて、撮像品質を実質的に向上させた仮想スリット効果をもたらすことにより、同期される照明及び検出を達成した。従来の光シート顕微鏡で取得された画像と比較して、ＣＯＬＭで取得された画像における視野のシグナル強度特性を改善した（図１Ｃ、右のグラフ）。
【００８６】
大きな透明化試料の屈折率の不均一性を調整するために、照明のミスアライメントを、前記のような撮像実験を開始する前に、線形適応較正手順で検出対物レンズの焦点面で補正した。
【００８７】
３Ｄ再構築及び分析
市販のソフトウエア（例えば、Ｂｉｔｐｌａｎｅ製ＩｍａｒｉｓもしくはＡｍｉｒａ）または無料の／オープンソースのプロジェクト（例えば、Ｖａａ３Ｄ、ｗｗｗ．ｖａａ３ｄ．ｏｒｇ）で、三次元の再構築を実施した。タイルのステッチングを、ＴｅｒａＳｔｉｔｃｈｅｒで実施した。神経形態の手動または半自動のトレースは、Ｉｍａｒｉｓ及びＡｍｉｒａなどの市販のソフトウエアまたはＮｅｕｒｏｍａｎｔｉｃなどのオープンソースツールの特定モジュールを用いて実施できる。
【００８８】
実施例１：ＣＯＬＭを用いた完全なマウス脳の超高速撮像  Ｔｈｙ１−ｅＹＦＰマウス脳に、０．５％のアクリルアミドモノマー溶液を灌流させ、これを、穏やかに振とうしながら３７℃で受動的に透明化した。２０ミリ秒のカメラの露光時間を用い、１．４５４の屈折率液を液浸媒体として用いた。１０×、開口数０．６の対物レンズを用いて、約４時間で全データセットを取得した。遮蔽背面側画像を連続的に除去することにより、インタクトなマウス脳容積の内部の詳細を可視化した（図２、パネルｂ、ｃ、及びｄ）。図１０パネルｂ、ｃ、及びｄは、２つの独立した検出アームＣＯＬＭ実施を用いて全中枢神経系（脳及び付随する脊髄）を撮像する例を示す。
【００８９】
実施例２：ＣＯＬＭを用いた透明化脳の高速高分解能撮像  Ｔｈｙ１−ｅＹＦＰマウス脳に、０．５％のアクリルアミドモノマー溶液を灌流させた。２５×の倍率を有するＣＯＬＭを用いて、インタクトな透明化脳から、３．１５ｍｍ×３．１５ｍｍ×５．３ｍｍの容積を取得した。約１．５時間で完全な画像データセットを取得した。最適なコントラストのために、パネル間でズームイン画像のＬＵＴを線形調整した。図３のパネルｃの矩形で規定された領域の拡大ビューを得た（図３パネルａ、ｂ）。５０マイクロメートル以上の厚さの容積にわたる最大強度投影を得た（図３パネルｄ〜ｉ、ボックス及び矢印の進行により示される）。２０ミリ秒のカメラの露光時間を用い、１．４５４の屈折率液を液浸媒体として用いた。
【００９０】
実施例３：透明化組織から分子的情報を引き出す
完全なマウス脳に、４％のアクリルアミドモノマー溶液を灌流させて、受動的に透明化し、全てのパルブアルブミン（ＰＶ）陽性ニューロンを標識するために免疫染色した。２５×の対物レンズを有するＣＯＬＭを用いて、インタクトな脳を撮像した。試料内の異なる深部で標識された細胞を観察した（図４Ｂ）。
【００９１】
ＣＬＡＲＩＴＹ最適化対物レンズを用いて、共焦点顕微鏡で透明化マウス脳組織ブロックを撮像した（図４Ａ及びＣ）。マウス脳に、４％のアクリルアミドモノマー溶液を灌流させ、抗ＰＶ抗体で免疫染色した。ＣＬＡＲＩＴＹ最適化水浸対物レンズ（１０×、開口数０．６、３ｍｍ）を用いて、１ｍｍ厚の組織ブロックの高品質画像を取得し、画像を処理して、ＰＶ陽性ニューロンの最大強度投影画像を生成した（図４Ａ）。
【００９２】
透明化マウス脳からの同一の組織ブロックにおいて、複数ラウンドの免疫染色及びＣＬＡＲＩＴＹ最適化水浸対物レンズ（１０×、開口数０．６、３ｍｍ）での共焦点撮像を実施することがさらに可能であった。１％のアクリルアミドモノマー溶液を用いて、マウス脳に灌流した。ＰＶのための第１ラウンドの免疫染色（図４Ｃ、左パネル）の後に、６０℃、クリアリング緩衝液中でインキュベーションすることにより、一晩（約１２時間）標識を溶出させた（図４Ｃ、真ん中のパネル）。続いて、抗ＰＶ抗体で、組織ブロックを免疫染色した（図４Ｃ、右のパネル）。第１ラウンドに存在するＤＡＰＩを、同様にうまく溶出させた。示された全ての画像は、最大Ｚ投影を表す。
【００９３】
実施例４：共焦点、２光子、及び光シート顕微鏡の比較  共焦点顕微鏡（図５、左列）は、光電子増倍管（ＰＭＴ）の前にピンホールを用いることにより、光学セクショニングを達成する。２光子顕微鏡（図５、真ん中の列）は、（より長い波長の）２光子の同時吸収のみにより、試料における光強度の最も高い点、すなわち焦点面で生じる可能性が高い事象である蛍光シグナル発光がもたらされるという事実を利用する。光シート蛍光顕微鏡（図５、右の列）は、目的の面に照明を選択的に制限することにより、選択的に光学セクショニングを達成する。共焦点及び２光子は、点走査であり、従って本質的に遅いが、光シート顕微鏡は、選択的に照明された焦点面を撮像するために高速ｓＣＭＯＳ／ＣＣＤカメラを用いて、２〜３桁より高速な撮像速度及び最小限の光退色がもたらされる。
【００９４】
光シートとの透明化試料の適合性を評価すると、最小限の光退色を伴う２桁を超えるより速い撮像速度が達成された。例えば、１０×の倍率の対物レンズを用いて約４時間、及び２５×の対物レンズを用いて約１．５日でマウス脳の全体を撮像した。これらは、共焦点顕微鏡によるそれぞれ数日間及び数ヶ月間とは対照的である。ＣＬＡＲＩＴＹ最適化光シート顕微鏡（ＣＯＬＭ）は、トランスジェニックまたは組織化学的アプローチで標識された特に大きな組織試料から情報を引き出すことに適している。本明細書で記載された、並列化された及び効率的な組織の形質転換プロトコルにより可能になる高速ＣＬＡＲＩＴＹ処理自身と組み合わされた新しい顕微鏡法を用いてＣＬＡＲＩＴＹで生成されたデータの取得速度が向上し、品質が高くなると、大きく及び完全に組み立てられた組織から構造的及び分子的情報を引き出すための汎用性のある及び効率的なプラットフォームがともに形成される。
【００９５】
前述の発明が、理解を明確にするための説明及び例示により、いくらか詳細に記載されているが、特定の変更及び改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それになされてもよいことは、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかである。
【００９６】
従って、前述は、本発明の原理を単に説明する。本明細書で明示的に記載または示されていないが、本発明の原理を具体化し、その趣旨及び範囲に含まれる種々のアレンジを、当業者が考え出すことが可能となると理解されよう。また、本明細書で記載された、全ての実施例及び条件付きの語法は、本発明の原理及び発明者らにより当該技術を促進させることに寄与される概念を理解する上で読み手を助けることが主として意図され、このような具体的に記載された実施例及び条件に限定されないものとして解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、及び実施形態、ならびにそれらの具体例を記載する、本明細書の全ての記載は、それらの構造的等価物及び機能的等価物の両方を包含することが意図される。さらに、構造にかかわらず、同一の機能を実施するような等価物は、現在知られている等価物及び今後開発される等価物、すなわち開発される任意の要素の両方を含むことが意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され、及び記載される代表的実施形態に限られることが意図されるものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲により具体化される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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