(57)【要約】  本発明は、ここに、いかなる追加の選択マーカー遺伝子及び/又はいかなる追加の自殺遺伝子も必要としない、外因性免疫受容体を提供する。本発明は、ここに、そのままで濃縮され得る操作されたT細胞の産生を可能とし、すなわち、該操作されたT細胞は、例えば、抗体のようないかなる外部の作用物質との結合又は相互作用も必要とせず、内因性アルファベータT細胞受容体を発現するT細胞を除去することによって選択可能である。内因性T細胞受容体から区別され得、今や外因性免疫受容体を特異的に標的とする選択的抗体によって除去され得る、すなわち、枯渇され得る、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物から、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞を濃縮するための方法であって
a)外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程;
b)T細胞混合物を、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体と接触させて、抗体-操作されていないT細胞複合体の形成を可能とする工程;
c)T細胞混合物から、抗体-操作されていないT細胞複合体を分離し、それによって、操作されたT細胞が濃縮された調製物を得る工程
を含む方法。
【請求項２】
工程a)が;
i.T細胞を準備する工程;
ii.外因性免疫受容体をコードする核酸(単数)又は核酸(複数)を準備する工程;
iii.核酸(単数)又は核酸(複数)をT細胞中に導入して、それによって、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程、
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
外因性免疫受容体をコードすることに加えて、核酸(単数)又は核酸(複数)が、別個に発現される選択マーカーをコードしない、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
外因性免疫受容体が、操作されたアルファベータT細胞受容体又は操作されたガンマデルタT細胞受容体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
操作されていない及び操作されたT細胞がヒトのものであり、抗体が、BW242/412であり、外来性免疫受容体が、ヒトガンマデルタT細胞受容体、操作されたヒトガンマデルタT細胞受容体、又は操作されたヒトアルファベータT細胞受容体であり、ヒトアルファベータT細胞受容体の操作が、T細胞受容体ベータ鎖のドメイン3の改変を含み、好ましくは、改変がドメイン3のマウス化を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
外因性免疫受容体が、ガンマデルタT細胞受容体、好ましくは、ヒトガンマデルタT細胞受容体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項1から6に記載の方法のいずれか１つによって得ることができる操作されたT細胞が濃縮された調製物。
【請求項８】
医学的処置における使用のための、好ましくは、癌の処置における使用のための、請求項7に記載の操作されたT細胞が濃縮された調製物。
【請求項９】
請求項1から4のいずれか一項に規定の外因性免疫受容体、又は請求項5に規定の操作された外因性免疫受容体に特異的に結合する抗体であって、請求項1から5に記載の方法のいずれか１つによって得ることができる、前記外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞が濃縮された調製物で処置された場合に有害事象を患う対象の処置における使用のための抗体。
【請求項１０】
対象がヒトであり、抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項9に記載の使用のための抗体。
【請求項１１】
抗体が、操作されたT細胞の細胞死を誘導する、請求項9又は10に記載の使用のための抗体。
【請求項１２】
外因性免疫受容体に特異的に結合する抗体であって、外因性免疫受容体を有する操作されたリンパ球で処置されている場合に有害事象を患う対象の処置における使用のための抗体。
【請求項１３】
リンパ球が、操作されたNK細胞又は操作されたT細胞である、請求項12に記載の使用のための抗体。
【請求項１４】
操作されたリンパ球がヒトリンパ球であり、好ましくは、抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項12又は13に記載の使用のための抗体。
【請求項１５】
抗体が、操作された外因性免疫受容体を有する操作されたリンパ球の細胞死を誘導する、請求項12から14のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野におけるものである。特に、遺伝子療法の分野におけるものである。本発明は、免疫学及び癌の処置のための細胞療法に関する。本発明は、更に、操作されたT細胞の濃縮のための方法及び医学的処置における操作されたT細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
操作された抗腫瘍特異性又は抗病原体特異性を有するT細胞の養子移入は、開発中である。そのような戦略において、アルファベータT細胞受容体又はガンマデルタT細胞受容体又は特別な抗腫瘍特異性若しくは特別な抗病原体特異性を有するキメラ抗原受容体のような外因性免疫受容体が、患者からの自家T細胞に又は例えば、患者への同種幹細胞移植の場合には、対応する同種T細胞に移入される。例えば、血液幹細胞移植を受けている白血病患者は、処置の間に、リンパ球も枯渇する。したがって、そのような患者は、例えば、特定の抗白血病性T細胞受容体を発現するように操作されたドナーT細胞の注入からの利益も受け得る。癌患者におけるTCR操作された細胞の養子移入の価値が臨床試験で確立されているにもかかわらず、そのような戦略の臨床的利益は、一般に、患者の一部において観察されるのみである。観察されたTCR操作されたT細胞の限られた有効性の1つの説明は、新たに導入されたTCRと内因性TCRとの間のCD3成分をめぐる競合により引き起こされる、治療的TCRの最適以下の表面発現である(Provasiら、Nat Med. 2012年5月:18(5):807〜15頁)。更に、同種の設定、例えば、同種幹細胞移植におけるそのような戦略の適用は、深刻な安全性の問題により妨げられ、それは、内因性アルファベータT細胞受容体を発現する操作されていないT細胞が、例えば、同種幹細胞移植設定における移植片対宿主病のような望まない副作用を誘発し得るからである。したがって、操作されたT細胞を選択する戦略が開発され、それらの戦略では、操作されたT細胞の正の選択に焦点があてられている。今日存在する戦略は、例えば、ネオマイシン遺伝子のような代替遺伝子マーカー、或いは形質導入された又はトランスフェクトされた細胞の正の選択を可能とする、例えば、蛍光タンパク質又はなんらかの他の追加の遺伝子を含むことを目的とする。しかしながら、そのような戦略は、所望の特異性を持つ外因性免疫受容体の養子移入に加えて、免疫原性であり得る通常大きな外来遺伝子を含めることが必要になるという、更なる安全性の問題を有する。
【０００３】
更に、当技術分野においては、遺伝子操作された細胞が患者に注入されるという事実により、有害事象の場合には、これらの細胞を選択的に患者から除去することが有益であり得るということも認識されてきた。したがって、操作されたT細胞は、外因性免疫受容体に加えて、操作されたT細胞を選択的に除去することを可能とする更なる遺伝子も含むことが多い。そのような遺伝子は、例えば、患者への作用剤の投与に際して、自殺遺伝子を有する細胞を選択的に殺滅する、HSV-TKのような自殺遺伝子を含む(Bondanzaら、Blood 107、1828〜1836頁(2006)に概説されている)。
【０００４】
したがって、当技術分野では、T細胞を操作するため及びヒトの処置におけるような対象における使用のための戦略は、対象における使用のための操作された細胞の選択を可能とし及び/又は操作されたT細胞によって処置されている対象からの前記操作されたT細胞の枯渇を可能とする追加の遺伝子を操作されたT細胞に含ませることに焦点をあててきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ヨーロッパ特許第0403156B1号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Provasiら、Nat Med. 2012年5月:18(5):807〜15頁
【非特許文献２】Bondanzaら、Blood 107、1828〜1836頁(2006)
【非特許文献３】Sommermeyer及びUckert、2010年、Journal of Immunology
【非特許文献４】Sambrookら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989年
【非特許文献５】Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1987年及び定期的更新
【非特許文献６】Methods in Enzymologyシリーズ、Academic Press、San Diego
【非特許文献７】COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年
【非特許文献８】BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith, D. W編、Academic Press、New York、1993年
【非特許文献９】COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I、Griffin, A. M.及びGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994年
【非特許文献１０】SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY、von Heinje, G.、Academic Press、1987年
【非特許文献１１】SEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M.及びDevereux, J.,編、M Stockton Press、New York、1991年
【非特許文献１２】Carillo, H.及びLipton, D.、SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073頁
【非特許文献１３】GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop編、Academic Press, San Diego、1994年
【非特許文献１４】Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387頁
【非特許文献１５】Atschul, S. F.ら、J. Molec. Biol. (1990) 215:403頁
【非特許文献１６】Claudio Tripodoら、Gamm delta T cell lymphomas Nature Reviews Clinical Oncology 6、707〜717頁(2009年12月)
【非特許文献１７】Shiら、Mol Cancer. 2014年9月21日;13:219頁
【非特許文献１８】Warrenら、Tissue antigens 59, 293〜303頁、(2002)
【非特許文献１９】Szymczakら、Nature biotechnology 22、589〜594頁、(2004)
【非特許文献２０】Engelsら、Hum Gene Ther 14、1155〜1168頁、(2003)
【非特許文献２１】Stanislawskiら、Nat Immunol 2、962〜970頁、(2001)
【非特許文献２２】Kuballら、Immunity 22、117〜129頁、(2005)
【非特許文献２３】Riddell及びGreenberg、Journal of immunological methods 128、189〜201頁、(1990)
【非特許文献２４】Vossら、Methods in molecular medicine 109、229〜256頁、(2005)
【非特許文献２５】Stanislawskiら、Nat Immunol、2001年、2(10): 962〜70頁
【非特許文献２６】Kuballら、Immunity、2005年、22(1): 117〜29頁
【非特許文献２７】Sommermeyerら、J Immunol、2010年、184(11):6223〜31頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ここに、いかなる追加の遺伝子の添加も必要とせずに、操作されたT細胞の濃縮を可能とする更なる方法を提供する。また、方法は、操作されたT細胞のいかなる妨害も必要とせずに操作されたT細胞を選択することも可能とする。操作されたT細胞は、そのままの形に留まり得る。
【０００８】
本発明者らは、正の選択方法を使用して、例えば、選択マーカーを使用して、操作されたT細胞を選択することによって、所望の特異性を有する外因性免疫受容体及び別個の選択マーカーを発現することに加えて、機能的レベルの内因性アルファベータT細胞受容体を発現する操作されたT細胞の亜集団がなお存在し得ることに気づいた。そのような亜集団は、任意の正の選択戦略において選択され、操作された細胞生成物の治療的有効性及び安全性を制限し得る。従来技術においては、そのような亜集団を除去することを可能とする方法は提供されていない。
【０００９】
更に、例えば、外因性免疫受容体に結合する抗体を使用して、操作されたT細胞を選択するための正の選択方法は、相当な数の形質導入された細胞にアポトーシスを誘発し得る。加えて、選択マーカーを含む正の選択方法は、望まない免疫応答を誘発し得る遺伝子の添加を必要とし、それは、そのような選択マーカーが典型的に、非宿主(例えば、非ヒト)であり、したがって、外来性であると認識され、結果として形質導入された細胞の宿主による除去を生じ得るからである。
【００１０】
したがって、本発明者らは、操作されたT細胞を選択することに加えて、上記の望まない亜集団を除去することもでき、外因性免疫受容体以外はいかなる追加の遺伝子も操作されたT細胞に含まれる必要がなく、操作されたT細胞をそのままとする、新規戦略を開発することを立案する。
【００１１】
任意の従来技術の方法とは対照的に、操作されたT細胞を濃縮するための本発明の方法は、負の選択工程の使用を含む。外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物から、操作されていないアルファベータT細胞が分離され得る。そのような方法は、外因性免疫受容体の最適以下の発現を有するT細胞及びなお相当量の発現される内因性アルファベータT細胞受容体を有するT細胞混合物中に含まれる任意の操作されたT細胞の分離も含む。そのような方法は、例えば、操作されたT細胞に結合する抗体を使用する正の選択方法によって発生し得るアポトーシスの望ましくない誘発を回避して、T細胞混合物中に含まれる操作されたT細胞がそのままであることを可能とする。
【００１２】
前記方法は、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する選択的抗体の使用を含む。したがって、内因性アルファベータT細胞受容体をその細胞表面に含む、T細胞混合物中の任意のT細胞が、混合物から分離され、それによって、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞が濃縮された調製物が得られる。そのような選択的抗体は、内因性アルファベータT細胞受容体と外因性免疫受容体の間の配列の相違を利用する。T細胞の起源が同じである操作されたアルファベータT細胞受容体でさえ、外因性免疫受容体として使用され得る。必要なのは、内因性アルファT細胞受容体への抗体の結合部位に対応する外因性アルファベータT細胞受容体のアミノ酸配列が、抗体がもはやそこへ結合できないように、改変されることだけである。例えば、T細胞受容体の機能を維持又は最適化し、特異性を維持し及び/又は2つの鎖の好ましい対形成を導入するために、更なる改変が含まれてもよい。
【００１３】
選択的抗体が、MACS、FACS及びイムノアフィニティークロマトグラフィーのような分離技術において使用され得る。本発明により得られた操作されたT細胞が濃縮された調製物は、特に、医学的処置において有用である。そのような医学的処置は、癌の処置であり得る。例えば、白血病の処置においては、同種幹細胞移植を受けている患者は、濃縮された操作されたT細胞、すなわち、本発明の任意の方法により得ることができる同種の操作されたT細胞であって、例えば、患者の白血病細胞に対する特異性を有する外因性免疫受容体を提供された操作されたT細胞の調製物の注入からも利益を受けることができる。このように、白血病の消失は、処置において更に促進され得る一方、内因性アルファベータT細胞受容体を発現するT細胞の存在による望まない副作用を誘発するリスクが、実質的に低減又は完全に回避され得る。
【００１４】
同様に、本発明の異なる態様では、操作されたリンパ球、すなわち、操作されたT細胞又は操作されたNK細胞に、外因性免疫受容体が対応する内因性アルファベータT細胞受容体と異なるように、外因性免疫受容体、例えば、CAR又は操作されたアルファベータT細胞受容体又は(操作された)ガンマデルタT細胞受容体が提供されるか、或いは、外因性免疫受容体に特異的な抗体が操作されたT細胞を特異的に除去するように、内因性ガンマデルタT細胞受容体が提供されてもよい。本発明のこれらの態様は、濃縮方法については図1に、枯渇方法については図2に示される。よって、従来技術の任意の方法とは対照的に、操作されたT細胞の枯渇を可能とするためには、外因性免疫受容体をコードする遺伝子以外は、操作されたT細胞中のいかなる更なる遺伝子も含むことを必要としない。
【００１５】
したがって、従来技術において使用される、例えば、選択マーカーを使用する選択方法のいずれか又は従来技術において使用される、例えば、自殺遺伝子を使用する選択的な殺滅方法のいずれかとは対照的に、本発明は、ここに、いかなる追加の選択マーカー遺伝子及び/又はいかなる追加の自殺遺伝子も必要としない、外因性免疫受容体を提供する。本発明は、ここに、そのままで濃縮され得る操作されたT細胞の産生を可能とし、すなわち、該操作されたT細胞は、例えば、抗体のようないかなる外部の作用物質との結合又は相互作用も必要としない。加えて、内因性T細胞受容体から区別し得る外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞は、外因性免疫受容体を特異的に標的化することによって、選択的抗体によって除去すること、すなわち、枯渇させることができる。濃縮プロセスにおいて使用されたのと同じ改変が、枯渇プロセスにおいて使用され得る。この濃縮方法においては、第1の抗体は、内因性アルファベータT細胞受容体に選択的に結合する一方、操作されたアルファベータT細胞受容体の改変された配列とは結合しない。逆に、ここで、第2の抗体は、操作されたアルファベータT細胞受容体の前記改変された配列には結合するが、内因性アルファベータT細胞受容体には結合しない。こうして、最小限に改変されたアルファベータT細胞受容体が、濃縮及びインビボでの枯渇を両方とも可能とする外因性免疫受容体として、2つの異なる選択的抗体と組み合わせて提供され得る。必要なのは、外因性免疫受容体及び内因性アルファベータT細胞受容体に特異的な選択的抗体、及び/又は外因性免疫受容体に特異的な抗体だけである。
【００１６】
よって、本発明は、ここに、選択的抗体と組み合わせられ、操作されたT細胞の濃縮及び/又は枯渇のためにいかなる追加の外因性遺伝子も必要としない、外因性免疫受容体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】操作されたT細胞を濃縮することの根底をなす原理を示す図である。A)内因性アルファベータT細胞受容体に結合する抗体が提供される(矢印で示される)。このシナリオでは、抗体が定常領域に結合する。B)、C)、E)及びF)提供された抗体がそこへ結合しない、外因性免疫受容体が提供される(×印で消された矢印で示される)。B)は、可変領域(V)が内因性起源であり、定常領域が別の種のものである、アルファベータT細胞受容体を示す。定常領域の配列は、抗体がそこへ結合しないように異なる。C)は、定常ベータ鎖の一部が、別の種の対応する部分で置換されている、内因性起源のアルファベータT細胞受容体を示す。E)はガンマデルタT細胞受容体を示し、F)は、キメラ抗原受容体を示す。D)は、提供された抗体がそこへ結合できるため、外因性免疫受容体としては適さない、内因性起源の操作されたアルファベータ鎖を示す。
【図２】操作されたT細胞の(インビボでの)枯渇の根底をなす原理を示す図である。B)に示される外因性アルファベータT細胞受容体に選択的に結合し(矢印で示される)、A)に示される内因性アルファベータT細胞受容体には結合しない(×印で消された矢印で示される)抗体が提供される。そのような抗体は、内因性アルファベータT細胞受容体に実質的に対応するC)に示される外因性アルファベータT細胞受容体にも結合することができ、抗体の結合部位は、ベータ鎖の小さな領域のみを置換することによってベータ鎖に導入されている。抗体を結合させない、D)に示されるような外因性アルファベータT細胞受容体の改変は、枯渇戦略における使用には適さない。同様に、F)に示される外因性ガンマデルタT細胞受容体に選択的に結合し、E)に示される内因性アルファベータT細胞受容体には結合しない抗体が提供される。抗体は、外因性免疫受容体を含む操作されたT細胞を選択的に標的とするが、A)及びF)に示される内因性T細胞受容体を有する内因性T細胞は標的としない。
【図３】実施例の項で使用される外因性免疫受容体及びT細胞受容体成分を示す図である。内因性起源の外因性アルファベータT細胞受容体が、A)に提供される。この外因性アルファベータT細胞受容体は、その後、そのセグメントを、別の種からのセグメントと交換することによって改変された。定常領域全体が、B)に示すように置換された。或いは、ベータ鎖の定常領域の一部がC)に示すように置換された。置換戦略は、内因性アルファベータT細胞受容体を標的とする抗体が結合する配列を同定するために、各鎖の定常領域の異なる部分、異なるドメイン(D1、D2、D3、D4)を置換するために利用された。改変された各鎖は、C)に示されるような未改変の鎖と対形成させられる。別の戦略では、使用された外因性免疫受容体は、選択されたガンマデルタT細胞受容体であった。
【図４Ａ】T細胞混合物からのαβTCR陽性T細胞のGMPグレードの枯渇による、γδTCRが操作されたT細胞の濃縮を示す図である。pMP71のフローサイトメトリー表示:γδTCR T細胞分離(αβTCRが枯渇された)の前及び直後のγ-T2A-δ形質導入されたαβT細胞。T細胞の増殖中、濃縮されたT細胞は、γδTCR発現についてフォローアップされた。T細胞は、pan-γδTCR及びpan-αβTCR抗体で染色され、各四分円中の細胞のパーセンテージが示された。
【図４Ｂ】濃縮された、外因性ガンマデルタT細胞受容体を有する操作されたT細胞調製物の改善された抗腫瘍機能を示す図である。γδTCR形質導入されたT細胞(バルク、9%γδTCR+)及びαβTCR枯渇(41%γδTCR+)T細胞が、示されたE:T比で51CrをローディングされたDaudi細胞とともに4〜5時間インキュベートされた。pB:αMDM2/βp53形質導入された細胞が、対照T細胞として使用された。特異的溶解のパーセンテージが、3回の平均+/-SDとして示される。統計学的有意性は、2要因の分散分析により計算された;**p<0.01;***p<0.001。
【図４Ｃ】濃縮された、外因性ガンマデルタT細胞受容体を有する操作されたT細胞調製物の改善された抗腫瘍機能を示す図である。γδTCR形質導入されたバルク(6%γδTCR+)及びαβTCR枯渇(51%γδTCR+)T細胞が、示された異なる腫瘍標的細胞とともにインキュベートされ、IFNγ分泌が、IFNγELISPOTにより測定された。pMP71:ΔNGFR形質導入されたT細胞が、対照T細胞として使用された。T細胞15000個当たりのIFNγのスポットが、3回の平均+SDとして示される。T細胞は、いかなる有意なレベルのIFNγも産生しなかった。統計学的有意性は、2要因の分散分析により計算された;*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。
【図５】濃縮された、外因性ガンマデルタT細胞受容体を有する操作されたT細胞調製物の消失したアロ反応性及び保存された抗腫瘍反応性を示す図である。健康なドナー由来のPBMCが、レトロウイルスによりpMP71:ΔNGFR又はpMP71:γ-T2A-δで形質導入され、γδTCR形質導入されたT細胞が、濃縮され(αβTCR枯渇及び65%γδTCR+)又はされずに(バルク及び9%γδTCR+)、記載したとおりに増殖された。T細胞は、20日間超の間刺激されず、最後の6日間はIL-2飢餓状態に置かれ、静止T細胞とみなされた。A)静止T細胞は、OPM2腫瘍細胞及びミスマッチEBV-LCLのパネルとともに24時間、共培養された。抗腫瘍活性及びアロ反応性が、IFNγ  ELISPOTにより測定された。T細胞15000個当たりのIFNγのスポットが、3回の平均+SDとして示される。
【図６】αβTCR定常ドメイン内のマウスアミノ酸配列へのαβTCR-mAb BW242抗体の抑制された結合を示す図である。A)pan-αβTCR mAb BW242を使用するMACSによる負の選択後に、完全なマウスナンセンス(αMDM2/βp53)αβTCRs (αMU/βMU)で形質導入されたPBMCの効率的な濃縮。左図は、αβTCR+ T細胞の存在により図示された、形質導入された及び形質導入されていない細胞を含むT細胞混合物を表す。右図は、マウスαβTCRの発現について陽性の細胞が濃縮された集団を表す。内因性αβTCRを発現する形質導入されていない細胞は、集団から枯渇させられている。B)JurMa細胞が、マウス定常ドメイン(αhuMU/βhuMU)を含む、完全なマウスナンセンス(αMDM2/βp53)αβTCRs (αMU/βMU)、完全なヒトNY-ESO-1  αβTCRs (αhu/βhu)又はNY-ESO-1キメラαβTCRで形質導入された。Vβ4染色及びβマウス染色は、発現レベルを表し、パーセンテージで示される。αβTCR-PEによる染色は、臨床グレードのpan-αβTCR-mAb BW242の結合を表し、平均蛍光強度(MFI)により示される。すべてのFACSプロットに関して:データは、7回の個別の実験の代表である。
【図７】ヒト及びマウスアルファ及びベータ鎖の整列化並びにドメイン交換を示す図である。A)ヒト及びマウスTCRα及びTCRβ定常領域のアミノ酸配列の整列化。ボックスは、ヒト及びマウス間のすべてのアミノ酸の相違を網羅するドメインを示し;TCRCαは3つの異なるドメインを有するが、TCRCβは4つのドメインを有する。アスタリスクは、ヒト及びマウス配列内の同一のアミノ酸を意味する。B)pMP71ベクター中にクローニングされた3つの異なるTCRα及び4つの異なるTCRβ遺伝子の図式的概観であり、濃いグレーのボックスは、薄いグレーのボックスで示されるヒトアミノ酸配列に隣接するマウス化ドメインを表す。TCRCβは、1〜5と番号付けされたアミノ酸、EDLKNで始まり、176〜180と番号付けされたアミノ酸KDSRGまでである。整列されたマウスTCRCβのドメイン3は、突然変異Q88H、Y101H、N106E、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S、A114P、I120N、V121Iを有するヒトドメイン3に相当する。配列番号5及び6のアミノ酸217〜250も参照されたい。V:可変ドメイン及びC:定常ドメイン。V:可変ドメイン及びC:定常ドメイン。図A及び図Bの出典は、Sommermeyer及びUckert、2010年、Journal of Immunologyである。
【図８】ヒトTCRβ鎖のドメイン3は、αβTCR-mAb BW242結合エピトープの一部であることを示す図である。JurMa細胞が、完全なヒトNY-ESO-1  αβTCR(αhu/βhu)、キメラNY-ESO-1  αβTCR(αhuMU/βhuMU)又は部分的なマウス化TCRβ鎖と対応するヒトTCRα鎖の様々な組み合わせ又は部分的なマウス化TCRα鎖とヒトTCRβ鎖の組み合わせでそれぞれ形質導入された。TCRの発現は、Vβ4染色により測定され、すべてのTCRの組み合わせは、フローサイトメトリーによって決定したαβTCR-mAb BW242によるそれらの認識について試験された。数字は、Vβ4陽性細胞画分のパーセンテージ及び全細胞集団の平均蛍光強度(MFI)を示す。
【図９】部分的にマウス化されたヒトアルファベータTCRで形質導入された、操作されたT細胞の効率的な濃縮を示す図である。ヒトαβTCR(αhu/βhu)、キメラαβTCR(αhuMU/βhuMU)、β鎖にマウス化ドメイン3を含むαβTCR(αhu/βM3)又はαM2及びβM3ドメインを組み合わせたマウス化を含むαβTCR(αM2/βM3)を発現するJurMa細胞が、αβTCR被覆ビーズを使用するMACSによる負の選択による濃縮について試験された(右パネル)。すべての変異型TCR鎖はNY-ESO-1/HLA-A2特異的であるため、ソーティング前にそれらは、完全なヒトWT1特異的αβTCRを発現するJurMa細胞と1:1の割合で混合され、不均一な細胞集団を模倣した(左パネル及び中央パネル)。枯渇後、陰性の細胞画分が収集され、フローサイトメトリーで測定された。Vβ4陽性画分は、NY-ESO-1特異的TCRを表し、Vβ21画分は、WT1特異的TCRの代表である。数字は、Vβ4又はVβ21染色に陽性の細胞のパーセンテージを示す。
【図１０】ヒト及びマウスTRA、TRB、TRG及びTRD C-DOMAINのTR C-DOMAINからのC-DMAIN配列の例の整列化を示す図である。配列及び対応する配列番号は、Table 1(表1)に列挙されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
以下の説明及び実施例においては、いくつかの用語が使用される。明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、そのような用語に与えられる範囲を含む、以下の定義が提供される。本明細書において別段の定義のない限り、使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本発明の方法において使用される慣用技術を実行する方法は、当業者に明らかである。分子生物学、生化学、計算機化学、細胞培養、組換えDNA、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、シーケンシング及び関連分野における慣用技術の実践は、当業者に周知であり、例えば、以下の参考文献:Sambrookら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989年; Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1987年及び定期的更新;並びにMethods in Enzymologyシリーズ、Academic Press、San Diego中で議論されている。
【００２０】
この文書及びその特許請求の範囲においては、動詞「含む」及びその活用形がその非限定的観念で使用されて、この用語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されない項目が除外されないことを意味する。これは、動詞「から本質的になる」並びに「からなる」を包含する。
【００２１】
本明細書中で使用される単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、明らかに文脈がそうでないと命じない限り、複数の指示物を含む。例えば、上記で使用される「1つの(a)」DNA分子を単離するための方法は、複数の分子(例えば、何十個、何百個、何千個、何万個、何十万個、何百万個、又はそれを超える分子)を単離することを含む。
【００２２】
整列させること及び整列化:用語「整列させること」及び「整列化」によって、短い又は長い一続きの同一又は類似のヌクレオチドの存在に基づく、2つ以上のヌクレオチド配列の比較が意味される。当技術分野においては、ヌクレオチド配列の整列化のための数種の方法が知られ、以下において更に説明される。用語「整列させること」及び「整列化」によって、短い又は長い一続きの同一又は類似のアミノ酸の存在に基づく、2つ以上のアミノ酸配列の比較も意味される。以下に更に説明されるアミノ酸配列の整列化のために数種の方法が当技術分野で知られている。
【００２３】
「遺伝子の発現」は、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたDNA領域が、生物学的に活性な、すなわち、生物学的に活性なタンパク質若しくはペプチド(若しくは活性ペプチド断片)に翻訳され得る、又はそれ自体が活性な(例えば、転写後遺伝子サイレンシング若しくはRNAi)RNAに転写されるプロセスを指す。ある一定の実施形態での活性タンパク質は、構成的活性型であるタンパク質を指す。コード配列は、センス方向にあり、所望の生物学的に活性なタンパク質若しくはペプチド、又は活性ペプチド断片をコードすることが好ましい。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「作動可能に連結される」は、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター、というよりは転写調節配列は、コード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているDNA配列が、典型的に近接し、2つ以上のタンパク質コード領域を結合することが必要である場合には、近接し、読み枠内にあることを意味する。
【００２５】
用語「遺伝子構築物」は、細胞中でRNA分子(例えば、mRNA)に転写される、好適な調節領域(例えば、プロモーター)に作動可能に連結された領域(転写領域)を含むDNA配列を意味する。よって、遺伝子構築物は、プロモーター、例えば、翻訳開始に関与する配列を含む5'リーダー配列、(タンパク質)コード領域、スプライスドナー及びアクセプター部位、イントロン及びエクソン配列並びに例えば、(3'非翻訳配列又は3'UTRとして知られる)転写終結配列部位を含む3‘非翻訳配列のような数個の作動可能に連結された配列を含み得る。
【００２６】
「同一性」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最高位の一致が得られるように、配列が整列化される。「同一性」自体は、当技術分野で認められた意味を有し、公表された技術を使用して計算され得る。例えば: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年;BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith, D. W編、Academic Press、New York、1993年;COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I、Griffin, A. M.及びGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994年; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY、von Heinje, G.、Academic Press、1987年;並びにSEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M.及びDevereux, J.,編、M Stockton Press、New York、1991年)を参照されたい。2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の同一性を測定するためのいくつかの方法が存在するが、用語「同一性」は当業者に周知である(Carillo, H.及びLipton, D.、SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073頁)。2つの配列間の同一性又は類似性を決定するために一般的に採用される方法は、GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop編、Academic Press, San Diego、1994年並びにCarillo, H.及びLipton, D.、SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073頁に開示されたものを含むが、それに限定されない。同一性及び類似性を決定するための方法は、コンピュータープログラムに成文化されている。2つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、GCSプログラムパッケージ(Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387頁)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, S. F.ら、J. Molec. Biol. (1990) 215:403頁)を含むが、それに限定されない。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、1つ又は複数の遺伝子の転写を制御するように機能し、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置し、DNA依存性RNAポリメラーゼの結合部位、転写開始部位並びに転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位を含むが、それに限定されない任意の他のDNA配列、並びにプロモーターからの転写の量を直接的又は間接的に制御するために作用することが当業者に知られた任意の他のヌクレオチド配列の存在によって構造的に同定される核酸配列を指す。任意選択により、本明細書中で用語「プロモーター」は、5'UTR領域(5'非翻訳領域)も含む(例えば、本明細書中でプロモーターは、この領域が転写及び/又は翻訳を調節することにおける役割を有し得るため、遺伝子の翻訳開始コドンの上流(5')の1つ又は複数の部分を含み得る)。
【００２８】
用語「アミノ酸配列」又は「タンパク質」又は「ペプチド」は、特定の作用様式、サイズ、三次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。よって、その「断片」又は「部分」も、「アミノ酸配列」又は「タンパク質」又は「ペプチド」と呼ばれる。
【００２９】
本明細書中で「操作された細胞」は、例えば、外因性核酸配列の導入又は内因性遺伝子配列の特定の変更によって、操作された細胞を指す。導入される外因性核酸配列は、改変され得る、任意の種の野生型配列を含み得る。操作された細胞は、内因性遺伝子における1つ又は複数の突然変異、挿入及び/又は欠失、並びに/或いはゲノムにおける外因性核酸(例えば、遺伝子構築物)の挿入のような、遺伝子改変を含み得る。操作された細胞は、単離された又は培養中の細胞を指し得る。操作された細胞は、「形質導入された細胞」であってよく、細胞は、例えば、操作されたウイルスに感染している。例えば、実施例に記載されたようなレトロウイルスベクター使用され得るが、レンチウイルスのような他の好適なウイルスベクターも考慮され得る。DNAベクターのトランスフェクション又はエレクトロポーレーションのような、非ウイルス的方法も使用され得る。使用され得るDNAベクターは、トランスポゾンベクターである。よって、操作された細胞は、「安定にトランスフェクトされた細胞」又は「一過性にトランスフェクトされた細胞」であることもできる。トランスフェクションは、遺伝子が発現されるように、細胞にDNA(又はRNA)を移入するための非ウイルス的方法を指す。トランスフェクション方法は、核酸のリン酸カルシウムトランスフェクション、PEGトランスフェクション及びリポソーム若しくはリポプレックストランスフェクションのように、当技術分野で広く知られている。そのようなトランスフェクションは一過性であり得るが、それらのゲノム中に遺伝子構築物が組み込まれた細胞が選択される、安定なトランスフェクションでもあり得る。
【００３０】
用語「選択可能なマーカー」は、当技術分野の当業者によく知られた用語であり、発現されたときに、選択可能なマーカーを含有する細胞(単数)又は細胞(複数)を選択するために使用可能な任意の遺伝的実体を記載するために本明細書中で使用される。選択可能なマーカーの遺伝子産物は、例えば、抗生物質耐性又は別の選択可能な形質若しくは栄養要求性を与える。当技術分野で周知なもののような選択可能なマーカーは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、eGFP、ルシフェラーゼ、GUS等を含む。
【００３１】
「αβT細胞」又は「アルファベータT細胞」は、多様な細胞の表面上に発現されるMHC分子(主要組織適合性複合体)に結合したペプチドを認識する、αβTCRを発現するTリンパ球としての機能に関して定義され得る。MHCは、細胞のタンパク質に由来するペプチドを提示する。例えば、細胞がウイルスに感染した場合、MHCは、ウイルスペプチドを提示し、αβTCRとMHC複合体との間の相互作用が、感染した細胞を排除するための免疫応答を開始する、特定のタイプのT細胞を活性化する。したがって、αβT細胞は、MHC分子に結合したペプチドを認識することができる細胞として、機能的に定義され得る。αβT細胞は、以下に記載されるようなαβT細胞受容体に特異的な抗体(例えば、ヒトαβTCRに特異的なBW242抗体)を使用して同定され得る。αβT細胞は、例えば、T細胞の大部分がαβTCRを有するため、CD3抗原を介して末梢血から選択され得る。そのような選択は、γδT細胞も含む。そのような選択された細胞から、αT細胞受容体鎖及びβT細胞受容体鎖に対応する核酸(又はアミノ酸)配列が決定され得る。したがって、αβT細胞は、αT細胞受容体鎖及び/又はβT細胞受容体鎖に対応する核酸(又はアミノ酸)配列を含む細胞としても定義され得る。
【００３２】
「γδT細胞」又は「ガンマデルタT細胞」は、その活性化の引き金を引く抗原分子がほとんど知られていないT細胞の小さなサブセットを表す。ガンマデルタT細胞は、それらがTCR遺伝子を再編成して、結合多様性をもたらし、メモリー表現型を発生させるという点で、適応免疫の成分と見なされ得る。しかしながら、多様なサブセットが、限定されたTCRがパターン認識受容体として使用される先天性免疫の一部であるとも見なされ得る。例えば、Vγ9/Vδ2 T細胞は、ホスホ抗原(phosphoantigen)と総称される一組の非ペプチドリン酸化イソプレノイド前駆体によって特異的かつ迅速に活性化される。γδT細胞は、γδT細胞受容体に特異的な抗体を使用して同定され得る。FACSに適した抗体が、広く利用可能である。抗体製造者により提供されるような、陰性及び/又は陽性細胞の選択を可能とする条件が選択される。好適であり得る抗体の例は、BD Pharmingen社(BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA)から入手可能なγδTCR-APC (クローンB1, #555718)であるか又はBeckman Coulter社から入手可能なpan-γδTCR-PE (クローンIMMU510, # IM1418U)である。また、そのような選択された細胞から、γT細胞受容体鎖及び/又はδT細胞受容体鎖に対応する核酸(又はアミノ酸配列)配列も決定され得る。したがって、γδT細胞は、γT細胞受容体鎖及び/又はδ2T細胞受容体鎖に対応する核酸(又はアミノ酸)配列を含む細胞としても定義され得る。
【００３３】
T細胞又はTリンパ球は、リンパ球と名付けられる白血球の群に属し、細胞媒介性免疫における役割を演じる。T細胞は、骨髄中の造血幹細胞に起源を有し、(T細胞が由来する)胸腺中で成熟し、末梢リンパ組織においてそれらの完全な機能を獲得する。T細胞の発生の間、初期のβ又はδTCR遺伝子再編成の結果として、(CD4及びCD8共受容体の両方について陰性の)CD4-CD8-T細胞は、αβ(アルファベータ)又はγδ(ガンマデルタ)運命のいずれかに傾倒する。早期のβ鎖再編成を受ける細胞は、完全なβ鎖及びプレTCRα鎖からなるプレTCR構造を細胞表面上に発現する。そのような細胞は、CD4+CD8+状態にスイッチし、TCRα鎖遺伝子座を再編成し、表面上にαβTCRを発現する。β遺伝子再編成の前にγ遺伝子再編成を首尾よく完了するCD4-CD8-T細胞は、γδTCRを発現し、CD4-CD8-のままである。(Claudio Tripodoら、Gamm delta T cell lymphomas Nature Reviews Clinical Oncology 6、707〜717頁(2009年12月)。T細胞受容体は、CD3タンパク質と会合して、T細胞受容体複合体を形成する。T細胞は、すなわち、αβTCR又はγδTCRを発現して、T細胞受容体複合体を細胞表面上に発現する。γδT細胞は、T細胞の全集団の約1〜5%を構成する。T細胞受容体鎖の細胞外領域は、可変領域を含む。T細胞受容体鎖の可変領域には、3つの相補性決定領域(CDR1、CDR2、CDR3)が位置する。これらの領域は、一般に、最も変化しやすく、TCRの間の多様性に寄与する。CDR領域は、T細胞の発生の間に構成され、所謂、可変(V)、多様な(D)及び結合(J)遺伝子セグメントが無作為に組み合わされて多様なTCRを生成する。T細胞受容体鎖の定常領域、すなわち、アルファ、ベータ、ガンマ又はデルタ鎖のいずれかは、実質的に変化しない。同様に、T細胞受容体鎖のフレームワーク領域、すなわち、アルファ、ベータ、ガンマ又はデルタ鎖のいずれかも、実質的に変化しない。
【００３４】
ナチュラルキラー細胞(NK細胞)は、大型顆粒リンパ球(LGL)と定義され、共通のリンパ球前駆細胞産生性B及びTリンパ球から分化した第3の種類の細胞を構成する。NK細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、舌及び胸腺において分化、成熟し、次いで、循環中へ入ることが知られている。NK細胞は、T細胞抗原受容体(TCR)又はPan Tマーカー、CD3又は表面イムノグロブリン(Ig)B細胞受容体を発現しないが、通常は、表面マーカーCD16(FcγRIII)及びCD56をヒトにおいて、NK1.1又はNK1.2をC57BL/6マウスにおいて発現する。ヒトNK細胞の80%までがCD8も発現する。
【００３５】
本明細書中で使用され、当技術分野で知られた用語「抗体」は、相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを指す。この用語は、抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、重鎖のみの抗体、ラマ抗体、単一ドメイン抗体及びナノボディ(例えば、VHH)を含むが、それに限定されない。用語「抗体」は、Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb等のイムノグロブリン断片、及び抗原結合機能を保持するCDRを含む他の抗体断片又は他の構築物も含み得る。典型的に、そのような断片は、抗原結合ドメインを含む。抗体又はその断片は、知られた抗体アイソタイプ及びそのコンフォメーションのいずれか、例えば、IgA1若しくはIgA2のようなIgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4のようなIgG又はIgMクラスを含み得る。
【００３６】
発明の詳細な説明
操作されたT細胞の濃縮
第1の態様では、本発明は、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物から、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞を濃縮するための方法であって
a)外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程;
b)T細胞混合物を、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体と接触させて、抗体-操作されていないT細胞複合体の形成を可能とする工程;
c)T細胞混合物から、抗体-操作されていないT細胞複合体を分離し、それによって、操作されたT細胞が濃縮された調製物を得る工程
を含む方法に関する。
【００３７】
本発明による外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞は、外因性免疫受容体を発現するように操作されたT細胞である。外因性免疫受容体は、抗原認識及びT細胞の作用に関して、内因性T細胞受容体と同じ機能を有する。操作されていないT細胞は、内因性T細胞受容体を発現する細胞である。内因性T細胞受容体は、γδT細胞受容体タイプ又はαβT細胞受容体タイプのいずれかである。
【００３８】
本発明による外因性免疫受容体は、内因性T細胞受容体でないと定義される。例えば、外因性免疫受容体は、癌の処置において有用な、特別な選択されたγδT細胞受容体であり得る。前記配列は、内因性γδT細胞受容体に類似する可能性がある。違いは、外因性免疫受容体が特定の標的のために意図的に選択されたことである。外因性免疫受容体は、例えば、導入遺伝子構築物から発現され、内因性遺伝子座から発現されたものではない。本発明による外因性免疫受容体は、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞を提供するために操作されたT細胞の起源に対して、起源が異なる、すなわち、別の種由来であってよい。外因性免疫受容体は、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞を提供するために操作されたT細胞の起源に対して、同じ起源、すなわち、同じ種由来であってよい。外因性免疫受容体は、操作されたγδT細胞受容体又は操作されたαβT細胞受容体であってもよい。
【００３９】
操作されたT細胞受容体は、そのアミノ酸配列が、内因性T細胞受容体の対応するアミノ酸配列に比較して、すなわち、少なくともそのCDRを考慮せずに、異なるアミノ酸配列を有するように改変されたT細胞受容体である。したがって、操作されたT細胞受容体中に存在する改変は、元の抗原特異性を妨害すべきでない。これは、実施例の項において、元のT細胞受容体がそれに対して特異的であるペプチド抗原を負荷された蛍光標識MHC多量体による、操作された及び操作されていないT細胞受容体の間の同等の染色レベルによって実証される。そのような操作は、例えば、一方又は両方のT細胞受容体鎖の定常領域のアミノ酸配列の改変を含む。
【００４０】
外因性免疫受容体は、キメラ抗原受容体(CAR)であってもよい。(最近、Shiら、Mol Cancer. 2014年9月21日;13:219頁において概説されるように)キメラ抗原受容体(CAR)は、抗原特異的な抗体の特異性とT細胞の活性化機能を組み合わせた組換え受容体である。CARは、免疫細胞の細胞表面における抗体の発現並びに細胞中へのシグナリングを可能とする、抗体及び膜貫通ドメインの融合分子であり得る。
【００４１】
本発明の一態様では、外因性免疫受容体が、操作されたγδT細胞受容体、操作されたαβT細胞受容体、γδT細胞受容体又はキメラ抗原受容体(CAR)からなる群から選択される。本発明の一態様では、外因性免疫受容体が、操作されたγδT細胞受容体、操作されたαβT細胞受容体又はγδT細胞受容体からなる群から選択される。別の態様では、外因性免疫受容体が、操作されたT細胞受容体又は操作されたαβ又はγδT細胞受容体からなる群から選択される。
【００４２】
方法の第1の工程では、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性αβT細胞受容体を発現するT細胞を含むT細胞混合物が提供される。T細胞のそのような混合物は、以下に更に記載されるように調製され得る。T細胞のこの混合物は、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体と接触させられて、抗体-操作されていないT細胞受容体複合体の形成を可能とする。内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する前記抗体は、外因性免疫受容体には特異的に結合しない。したがって、前記抗体は、内因性アルファベータT細胞受容体に選択的である。
【００４３】
アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体は、例えば、T細胞受容体のアルファ鎖、T細胞受容体のベータ鎖、又はT細胞受容体のアルファ及びベータ鎖の両方に結合する。ヒト起源のアルファ及びベータ鎖の細胞外ドメインの例が、配列番号1〜2にそれぞれ列挙される。述べたように、アルファベータT細胞受容体は、アルファ及びベータ鎖のCDRにより構成される最も変化しやすい領域を含む、可変ドメインを有する。述べたとおり、操作されていないT細胞受容体の内因性アルファベータT細胞受容体は、特異性に関して不均一であり、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体は、アルファベータT細胞受容体の不均一な集団と結合する。したがって、抗体は、アルファベータT細胞受容体の不均一な集団中に見いだされるアルファベータT細胞受容体の領域に特異的に結合する。好ましくは、抗体は、アルファベータT細胞受容体の定常領域に特異的に結合する。好ましくは、抗体は、ヒトアルファ鎖の定常領域及び/又はヒトベータ鎖の定常領域に特異的に結合する。好ましくは、抗体は、配列番号1に列挙され、図7Aに示されたヒトアルファ鎖の定常領域及び/又は配列番号2に列挙され、図7Aに示されたヒトベータ鎖の定常領域に結合する。
【００４４】
アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体の結合は、例えば、FACS分析によって検出され得る。例えば、操作されていないT細胞が、対照抗体又はアルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体のいずれかと接触させられる。本発明によるアルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体は、フローサイトメトリーにより決定して、対照抗体に比較して平均蛍光強度(MFI)の増加をもたらす抗体として定義され得る。MFIは、選ばれた蛍光チャネル(FITC、PE、PerCP等)における蛍光強度の平均である。陰性対照抗体として、イムノグロブリン(又は非常に異なるイムノグロブリン)に結合しない抗体が使用され得る。したがって、当業者は、抗体のアルファベータT細胞受容体への特異的結合を決定するための適切な条件をうまく選択することができる。抗体の結合は、特異性及び親和性によって表され得る。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが抗体により結合されるかを決定する。親和性は、抗体と抗原の間の結合の強さの尺度である(Ka)。
【００４５】
よって、当業者は、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体をうまく選択することができる。例えば、ヒト内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体は、Miltenyi社(Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich-Ebert-StraBe 68, 51429 Bergisch Gladbach, Germany)から市販されている。この抗体は、細胞クローンBW242/412由来のマウスアイソタイプIgG2bである。FITC標識BW242/412抗体は、注文番号130-098-688でMiltenyi社から入手可能である。BW242/412細胞クローン及びBW242/412により発現される抗体は、参照することにより本明細書に組み込まれるヨーロッパ特許第0403156B1号に詳細に記載されている。特に、そのような抗体は、ヨーロッパ特許第0403156B1号中でクローンBMA031について列挙されたBMA031重鎖及び軽鎖配列によりコードされた抗体である。他の好適な抗体は、Beckman Coulter社、Marseille Cedex, Franceから入手可能な抗αβTCR抗体、例えば、pan-αβTCR-PE (#A39499)又はpan-αβTCR-PC5 (#A39500)である。マウスアルファベータ鎖に関して更に好適なのは、BD Pharmingen社(BD, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA)から入手可能なマウスTCRβ-PE (クローンH57-597)であり得る。
【００４６】
抗体-操作されていないT細胞複合体の形成後、次に、抗体-操作されていないT細胞複合体がT細胞混合物から分離されて、それによって操作されたT細胞が濃縮された調製物を得る。この方法で、内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞がT細胞混合物から除去される。特異抗体を使用する好適な分離工程は、当技術分野で周知である。例えば、磁気活性化細胞選別(MACS)、蛍光活性化細胞選別(FACS)又はイムノアフィニティークロマトグラフィーが、使用され得る方法である。アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体が、MACSのための磁性ビーズにカップリングされるか又はFACSのために蛍光標識されるか又は好適なクロマトグラフィー樹脂にカップリングされ得る。MACS又はイムノアフィニティークロマトグラフィーにより、樹脂に結合しない細胞が得られ、それによって、操作されたT細胞が濃縮された調製物を得る。FACSにおいては、標識されない細胞が得られ、それによって操作されたT細胞が濃縮された調製物を得る。アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体のみを使用する代わりに、前記抗体に対して特異的な2次抗体が使用され得る。例えば、前記抗体がマウス抗体である場合、樹脂又は磁性ビーズにカップリングされたヤギ抗マウス抗体が使用され得る。抗体-操作されていないT細胞複合体は、ヤギ抗マウス抗体を介して樹脂又は磁性ビーズに結合する。或いは、アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体は、実施例に記載のようなビオチン標識を担持することができ、樹脂又は磁性ビーズにカップリングされた抗ビオチン抗体が使用され得る。したがって、T細胞混合物から、抗体-操作されていないT細胞複合体を分離し、それによって、操作されたT細胞が濃縮された調製物を得るのに好適であり得る多くの分離方法が利用可能であり、当業者に周知である。
【００４７】
述べたとおり、T細胞混合物は、外因性免疫受容体の最適以下の発現を有し、なお、相当量の内因性アルファベータT細胞受容体を発現させることができる、操作されたT細胞も含み得る。したがって、提供されるT細胞混合物は、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞、内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞及び外因性免疫受容体と内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されたT細胞を含み得る。よって、分離工程においては、内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞及び外因性免疫受容体と内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されたT細胞も、混合物から分離され得る。したがって、分離工程は、内因性アルファベータT細胞受容体を混合物から分離することのみに限定されない。よって、方法の工程a)においては、T細胞混合物が提供され、この混合物は、外因性免疫受容体及び内因性アルファベータT細胞受容体を有するそのような操作されたT細胞も含み得る。工程b)においては、抗体-操作されたT細胞複合体が、内因性アルファベータT細胞受容体を介して形成され得、操作されていないT細胞に加えて、工程c)におけるこれらの細胞の分離を可能とする。例えば、図4A左グラフに示されるように、T細胞混合物は、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞(γδTCR、右下四分図)、内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞(αβTCR、左上四分図)並びに外因性免疫受容体及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されたT細胞(γδTCR及びαβTCRの両方、右上四分図)を含む。枯渇に際しては、γδTCR及びαβTCRを両方についてマークされた大部分の細胞を含むαβTCR陽性細胞が除去される。そのような細胞は、典型的に、現在利用可能な任意の標準的な位置選択方法において残留した。
【００４８】
述べたとおり、本発明の方法においては、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物が提供される。本発明の一実施形態では、前記混合物を提供することは、以下の:
i.T細胞を準備する工程;
ii.外因性免疫受容体をコードする核酸(単数)又は核酸(複数)を準備する工程;
iii.核酸(単数)又は核酸(複数)をT細胞中へ導入して、それによって、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程
を含む。
【００４９】
T細胞を準備する工程は、例えば、BW242のようなアルファベータT細胞受容体抗体等を使用するMACS選択を使用して細胞を選択することを介して、アルファベータT細胞を準備する工程を含み得る。T細胞を準備する工程は、ガンマ及びデルタT細胞及びアルファベータT細胞を含むT細胞を含むPBMCを準備する工程も含み得る。T細胞を準備する工程は、アルファベータT細胞及びガンマデルタT細胞を含む細胞混合物、例えば、CD3抗体によるMACS選択を介したTリンパ球を準備することも含み得る。T細胞は、例えば、ヒト対象のような対象からの初代細胞であり得る。細胞集団又は実質的なその一部が、アルファベータT細胞受容体を発現する細胞を含む、すなわち、αβT細胞受容体に関して、例えばFACSソーティングにおいて陽性である限り、初代細胞又は任意の他の細胞株である、任意の細胞タイプが十分である。
【００５０】
外因性免疫受容体は、例えば、ガンマである第1の鎖及びデルタ鎖である第2の鎖を含むガンマデルタT細胞受容体であり得る。これらは、単一の核酸又は2つの離れた核酸に提供され得る。第1の鎖をコードしている第1の核酸及び第2の鎖をコードしている第2の核酸、又は第1及び第2の鎖を両方ともコードしている単一の核酸であり得る。前記核酸(単数)又は核酸(複数)は、DNA又はRNAであり得る。細胞中に導入され、それがコードする外因性免疫受容体のアミノ酸配列が細胞の表面上に発現されるように発現される限り。
【００５１】
好ましくは、一実施形態では、外因性免疫受容体をコードする核酸は、実施例の項に記載されたような外因性免疫受容体をコードし、ここで、異なる鎖、すなわち、アルファ及びベータ鎖又はガンマ及びデルタ鎖が、両鎖のコード配列の間に、実施例に記載されたようなF2A又はT2Aペプチドリンカー配列を含む単一の翻訳されたタンパク質生成物として発現され、別個の鎖が形成されるように、翻訳されたタンパク質の自己切断を結果としてもたらす。
【００５２】
外因性免疫受容体をコードする核酸(単数)又は核酸(複数)は、T細胞の細胞質に、例えば、トランスフェクションによって導入された場合に、外因性免疫受容体に直接翻訳され得るmRNAであり得る。好ましくは、例えば、T細胞受容体鎖をコードする核酸(単数)(又は核酸(複数))が、遺伝子構築物中に含まれる。遺伝子構築物(単数)(又は構築物(複数))は、外因性免疫受容体が操作されたT細胞の表面上に発現されるように、外因性免疫受容体をコードするmRNAの発現を可能とする。遺伝子構築物は、DNAベクター又はウイルスベクター中に含まれ得る。核酸(単数)又は核酸(複数)の導入は、どんなタイプの核酸(単数)又は核酸(複数)が使用されるかに依存して、トランスフェクション又は形質導入方法によることができる。どんなタイプの遺伝子構築物(単数)又は構築物(複数)が使用されるかに依存して、遺伝子構築物は、DNA又はRNAからなることができると理解される。例えば、遺伝子構築物がレトロウイルス又はレンチウイルスベクター中に組み込まれる場合、遺伝子構築物は、RNAベクターゲノム(すなわち、遺伝子構築物をコードする配列)中に含まれる。レトロウイルス及びレンチウイルスベクターは、細胞中に入った場合に、その後、宿主ゲノムに組み込まれるDNAに逆転写されるRNAゲノムを有すると、当技術分野で周知である。よって、逆転写は、RNAから二本鎖DNAに変換される遺伝情報、すなわち、遺伝子構築物を結果として生じ、それによってそこからの発現を可能とする。組み込みは、それが、遺伝子構築物を含むウイルスベクターゲノムを維持する一方、形質導入された細胞の増殖を可能とするため、有利である。遺伝子構築物は、DNAベクター、例えば、プラスミドDNA中にも含まれ得る。好適なDNAベクターは、トランスポゾンであり得る。好適なトランスポゾン系(例えば、クラスI又はクラスIIトランスポゾン)は、当技術分野で周知である。述べたとおり、外因性免疫受容体が2つの鎖、例えば、ガンマ及びデルタT細胞受容体鎖を含む場合、2つの別個の遺伝子構築物が、例えば、単一又は2つの別個のレトロウイルス又はDNAベクターに提供され得る。或いは、単一の遺伝子構築物は、実施例の項に記載されたような2つの鎖をコードする単一のmRNAも発現し得る。そのようなmRNAは、2つの鎖
を別々に、例えば、IRESによって、又は本明細書に記載の自己切断型ペプチド配列を使用することによって、コードし得る。
【００５３】
使用される核酸(単数)又は核酸(複数)は、コードされる外因性免疫受容体の発現を提供する。これは、例えば、強力なプロモーター等を使用することによる外因性免疫受容体の高レベルの発現等によって達成される。高い発現レベルを使用することは、実施例の項において例示するように、内因性T細胞受容体の発現の抑制を結果としてもたらす。内因性T細胞受容体の発現は、例えば、shRNAの発現によるRNAi、ジンクフィンガー、CRISPR又はTALENSのような代わりの及び追加の方法によっても抑制され得る。
【００５４】
いずれの場合においても、核酸(単数)又は核酸(複数)をT細胞中へ導入することは、効率的であり得るが、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を提供し得る。内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞は、核酸(単数)又は核酸(複数)がその中に導入されていないT細胞を表す。また、述べたとおり、操作されたT細胞は、導入が内因性アルファベータT細胞受容体の(十分な)抑制をもたらさなかったT細胞混合物中にも存在する、操作されたT細胞の亜集団も含み得る。内因性アルファベータT細胞受容体が(十分に)抑制されないT細胞のそのような亜集団も、T細胞混合物から効率的に除去され得、それは、抗アルファベータT細胞受容体抗体がそこへ結合し得るからである。操作されたT細胞のそのような亜集団は、例えば、FACS分析において、外因性免疫受容体及び内因性アルファベータT細胞受容体について陽性に染色され得る。
【００５５】
外因性免疫受容体を含む操作されたT細胞は、選択可能なマーカーも含み得る。選択可能なマーカーは、外因性免疫受容体に加えて、それが提供される細胞が選択されることを可能とする、任意の核酸配列及び/又はアミノ酸配列であると定義され得る。例えば、選択可能なマーカーは、ネオマイシン又はピューロマイシン耐性遺伝子であり得る。遺伝子構築物及び/又はベクターがそこへ導入されている細胞の選択が、ネオマイシ又はピューロマイシンの存在下でインキュベートすることによって実行され得る。他の選択可能なマーカーは、例えば、緑色、赤色及び黄色蛍光タンパク質のいずれか1つであり得る。次いで、選択は、例えば、FACSを使用することによって実行され得る。上記のとおり、内因性アルファベータT細胞受容体の不十分な抑制の結果である、操作されていないT細胞は、遺伝子構築物、ひいては選択可能なマーカーも含む可能性がある。そのような細胞は望ましくなく、これらを除去することも、操作されたT細胞の濃縮をもたらす。したがって、濃縮方法は、例えば、追加の選択マーカーを含ませること及び/又は外因性免疫受容体に対する抗体によって細胞を選択することによる、正の選択方法によって選択された従来技術の操作されたT細胞にも有益である。
【００５６】
しかしながら、本発明の方法は、いかなる選択可能なマーカーも使用せずに操作されていない細胞を除去することを可能とするため、選択可能なマーカーを含む必要はない。本発明によれば、選択可能なマーカーは外因性免疫受容体ではないと理解される。よって、本発明の一態様では、操作されたT細胞は、選択可能なマーカーを別個に発現しない。したがって、本発明による前記核酸(単数)又は核酸(複数)は、外因性免疫受容体をコードすることに加えて、別個に発現される選択マーカーをコードする必要はない。したがって、一実施形態では、前記核酸(単数)又は核酸(複数)、或いは外因性免疫受容体をコードするDNAベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、トランスポゾン等は、選択可能なマーカーを含まない。選択可能なマーカーは、操作されたT細胞中で機能的であると理解される。
【００５７】
本発明の別の態様では、操作されていないT細胞及び操作されたT細胞を含むT細胞混合物は、ヒト細胞である。したがって、これは、外因性免疫受容体をコードする核酸(単数)又は核酸(複数)がヒトT細胞中に導入されて、そのようなT細胞混合物を提供することを意味する。これは、該方法において使用される抗体が、ヒトアルファベータT細胞受容体に特異的に結合することを意味する。本発明の更なる態様では、ヒトアルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体は、BW242/412抗体である。述べたとおり、前記抗体は、Miltenyi社(Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich-Ebert-StraBe 68, 51429 Bergisch Gladbach, Germany)から市販されており、参照することにより本明細書に組み込まれる、ヨーロッパ特許第0403156B1号に詳細に記載されている。
【００５８】
上記から明らかなとおり、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体は、外因性免疫受容体には特異的に結合しない。したがって、これらの選択基準は、上記方法のために選択され得る任意の抗体にあてはまる。したがって、外因性免疫受容体は、導入遺伝子として提供されるにもかかわらず、使用されるT細胞にとって内因性であるアルファベータT細胞受容体に対応することはできない。これは、そうでなければ、本発明の工程b)及びc)において、操作されていないT細胞だけでなく、操作されたT細胞も除去されるからである。よって、外因性免疫受容体としてアルファベータT細胞受容体を使用することが望ましい場合には、抗体がもはや外因性免疫受容体に特異的に結合しないように、その配列を改変することが必要である。したがって、本発明の一態様では、外因性免疫受容体は、操作されたアルファベータT細胞受容体である。
【００５９】
本発明の一態様では、外因性免疫受容体は、ガンマデルタT細胞受容体又は操作されたガンマデルタT細胞受容体又は操作されたアルファベータT細胞受容体である。本発明の一態様では、外因性免疫受容体は、ガンマデルタT細胞受容体又は操作されたガンマデルタT細胞受容体又は操作されたアルファベータT細胞受容体であって、該外因性免疫受容体は、T細胞混合物と起源が同一である。別の態様では、外因性免疫受容体は、ヒトガンマデルタT細胞受容体又は操作されたヒトガンマデルタT細胞受容体又は操作されたヒトアルファベータT細胞受容体である。アルファベータT細胞受容体とは対照的に、ガンマデルタT細胞受容体は、アルファベータT細胞受容体と異なる配列を有する。したがって、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体は、通常は、内因性ガンマデルタT細胞受容体には特異的に結合しない。したがって、外因性免疫受容体として使用されるガンマデルタT細胞受容体を改変する必要はない。それにもかかわらず、ガンマデルタT細胞受容体を改変することは、例えば、以下に更に説明されるように、操作されたT細胞をインビボで使用し、内因性ガンマデルタT細胞から区別しようとする場合には、他の理由のために考慮され得る。
【００６０】
一実施形態では、外因性免疫受容体は、配列番号3及び配列番号4に列挙されたガンマ及びデルタ鎖配列を含む、ガンマデルタT細胞受容体である。これらの配列は、G115及びδ5に相当する。この外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞は、例えば、BW242抗体を使用することによって濃縮され得る。
【００６１】
本発明の別の態様では、操作されたアルファベータT細胞受容体又は操作されたガンマデルタT細胞受容体は、改変された定常領域を含む。定常領域を改変することは、可変領域に影響を及ぼし、ひいては抗原特異性及び/又は親和性に影響を与える任意のリスクが回避される可能性があるために、有利であり得る。
【００６２】
一実施形態では、本発明による方法において、ヒトアルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体は、BW242/412抗体であり、外因性免疫受容体は、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体である。好ましくは、操作は、ヒトアルファベータT細胞受容体の定常領域の改変を含む。より好ましくは、定常領域の改変は、T細胞受容体ベータ鎖のドメイン3の改変を含み、好ましくは、改変はドメイン3のマウス化を含む。実施例の項において例示するとおり、BW242/412抗体の結合部位は、T細胞受容体ベータ鎖のドメイン3に位置することが特定された。したがって、この領域のみを改変することは、BW242/412抗体がヒト内因性アルファベータT細胞受容体に対して選択的であるが、外因性免疫受容体、すなわち、前記改変されたヒトアルファベータT細胞受容体鎖に実質的に結合しないことを可能とする。好ましくは、図7A(対応するマウス配列と整列化されたヒト配列のアミノ酸88〜121を参照されたい)に示されるように、アルファベータT細胞受容体鎖は、対応するマウスドメイン3のマウスアミノ酸配列を、ヒトベータT細胞受容体のヒトドメイン3の代わりに含む。
【００６３】
したがって、対応するヒトアルファベータT細胞受容体の特定の改変と組み合わせたBW242抗体(又はBMA031抗体)について実施例の項において示されるとおり、内因性アルファベータT細胞受容体に結合する抗体の結合部位の位置を特定することによって、対応するヒトアルファベータT細胞受容体の改変が最小化することができる。例えば、BW242/412抗体の結合部位は今やドメイン3に位置することが特定され、更にドメイン3のアミノ酸を選択的に改変することは、BW242/412抗体と相互作用するドメイン3のアミノ酸を同定する。こうして、わずかなアミノ酸のみにおいて異なる、最小限に改変された、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体が提供され得る。同様に、BW242以外の抗体が内因性アルファベータT細胞受容体及び対応する操作されたアルファベータT細胞受容体の間で選択的である場合には、同じアプローチがたどられる。
【００６４】
濃縮された、操作されたT細胞及びそれらの使用
別の実施形態では、上記の本発明による方法は、前記方法のいずれか1つにより得ることができる操作されたT細胞が濃縮された調製物を提供する。そのような調製物は、上記方法に供されない調製物と比較して、高いパーセンテージの操作されたT細胞を含む。前記方法のいずれかにより得ることができる濃縮された操作されたT細胞のそのような調製物は、内在性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていない及び良好に操作されていないT細胞が、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体を使用してそこから分離された、濃縮された操作されたT細胞の調製物としても定義され得る。そのような調製物は、濃縮された操作されたT細胞が内因性アルファベータT細胞受容体を実質的に含まない、濃縮された操作されたT細胞の調製物としても定義され得る。そのような調製物は、濃縮された操作されたT細胞が内因性アルファベータT細胞受容体を実質的に含まず、選択可能なマーカーも含まない、濃縮された操作されたT細胞の調製物としても定義され得る。そのような調製物は、濃縮された操作されたT細胞が、内因性アルファベータT細胞受容体を実質的に含まず、選択可能なマーカーも含まず、外因性免疫受容体と結合する抗体によって選択されていない、濃縮された操作されたT細胞の調製物としても定義され得る。
【００６５】
濃縮された操作されたT細胞の前記調製物は、実施例において示される正の選択方法を使用して濃縮された、従来技術の調製物と比較して、亢進された癌細胞の殺滅を示す。実施例の項においても示されるとおり、特別な癌に対する特異性を提供する外因性免疫受容体がT細胞に与えられた場合、対象に前記操作されたT細胞が濃縮された前記調製物が提供されたときに、そのような細胞が選択的に殺滅される。したがって、本発明による操作されたT細胞が濃縮されたそのような調製物は、医学的処置において特に有用である。考慮され得る医学的処置は、例えば、癌の処置である。操作されたT細胞はもはや、選択マーカーの発現を必要としないため、選択マーカーの発現に関連する任意の有害事象が回避され得る。更に、濃縮された操作されたT細胞は、すべてでなくとも、内因性アルファベータT細胞受容体を発現するT細胞のほとんどが除去され、したがって、望まない標的化を引き起こす内因性アルファベータT細胞受容体の任意のリスクが回避され得る。濃縮された操作されたT細胞は、投与される濃縮された操作されたT細胞生成物の質に対しても有害である可能性のある従来技術の選択及び濃縮方法において使用されるような、外因性免疫受容体への抗体の結合に伴ういかなる細胞死にもさいなまれない。
【００６６】
インビボでの(濃縮された)操作されたT細胞の枯渇
別の実施態様では、上で定義された外因性免疫受容体に特異的に結合する抗体が、上記方法のいずれか1つによって得ることができる前記外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞が濃縮された調製物で処置されたときに有害事象を患う対象の処置における使用のために提供される。上で説明されたとおり、本発明の方法のいずれか1つによって得ることができる濃縮された操作されたT細胞は、医学的処置において有用である。それにもかかわらず、そのような処置は、ある場合には、投与された、濃縮された操作されたT細胞による有害な副作用をもたらし得る。副作用は、制御されない増殖又は活性化、或いは抗原の例えば、対象の健康な細胞に対する予期しない抗原の活性化であり得る。したがって、そのようなシナリオでは、対象に投与された操作されたT細胞を選択的に除去(枯渇させる)ことが望ましい。これは、操作されたT細胞、すなわち、外因性免疫受容体を含むT細胞を特異的に標的化する抗体を投与することによって達成され得る。前記抗体は、内因性アルファベータT細胞又は内因性ガンマデルタT細胞のような内因性T細胞を標的としない。この方法で、外因性免疫受容体に加えて、例えば、自殺遺伝子又は操作されたT細胞を選択的に殺滅することを可能とする他の遺伝子をコードする更なる遺伝子構築物を操作されたT細胞に含めることはもはや必要でない。
【００６７】
前記抗体は内因性T細胞を標的としないため、内因性T細胞受容体に対応する起源を有する操作されたアルファベータT細胞受容体又は操作されたガンマデルタT細胞受容体が使用される場合、前記外因性免疫受容体は、抗体が外因性免疫受容体のみを標的とするように改変、すなわち、操作されなければならない。例えば、ヒトドメイン3領域がマウスドメイン3領域で置換された外因性免疫受容体が使用される場合、例えば、H57-597由来、HB-218(ATCC)由来の前記抗体は、マウスドメイン3領域を標的とする。このように、ヒト対象においては、抗体は操作された外因性免疫受容体を選択的に標的とし、内因性T細胞受容体を標的としない。したがって、例えば、マウスアルファベータT細胞受容体又はマウスガンマデルタT細胞受容体に結合する抗体の結合部位の位置を特定することは、それが、対応するヒトT細胞受容体に移入され得る各T細胞受容体の特定領域(又は特定の抗体さえ)を提供するため、有用である。最適には、言及された抗体(濃縮のために使用される)BW242/412及び(枯渇のために使用される)H57-597により例示されたとおり、濃縮のために使用される改変された領域は、マウスドメイン3領域由来の領域のような、枯渇のために使用される配列と、配列において同一である。この領域は、T細胞受容体中のその突出した位置並びに免疫原性である可能性によって、特に興味深い。同様に、キメラ抗原受容体が使用される場合、それは、(例えば、宿主抗体由来及び/又は宿主CD3由来の)宿主タンパク質と同一であり得る成分から構築される可能性があり、抗体は、対応する宿主タンパク質を標的としないが、キメラ抗原受容体のみを標的とするように選択される。アルファベータTCRについて記載したのと同じアプローチにおいて、そのような宿主配列も、投与された抗体が前記宿主タンパク質を標的としないように改変、すなわち、操作され得る。したがって、キメラ抗原受容体が使用される場合、それは、使用される抗体が操作されたCARと対応する宿主タンパク質配列を識別できるように宿主配列の一部が改変され得るという意味で、操作されたキメラ抗原受容体であり得る。したがって、例えば、マウス及びヒト配列を整列化することにより及び実施例に記載されたような抗体の結合に関して、マウス及びヒト免疫受容体を比較
することにより、ヒト免疫受容体がマウス化され得、すなわち、ヒト免疫受容体の一部がマウス受容体の対応する部分に交換され得る。対応する部分は、例えば、図10に示されるようなヒト及びマウス配列を整列化することによって容易に得られ得る。よって、マウス化は、免疫受容体の配列の一部を、マウス起源の対応する部分で置換することを含み、そのような部分は、例えば、10〜50アミノ酸の長さであるが、一部(単数)(又は一部(複数))は、2つの配列間で対応する及び異なる領域の一部である、1つ又は複数のアミノ酸も含み得る。
【００６８】
好ましくは、対象の処置は、ヒトの処置を含み、好ましくは、抗体はヒト抗体であるか又は例えば、H57-597抗体のような非ヒト抗体由来の可変ドメインを、ヒト化によりヒト抗体骨格中へと含めるように操作する。非ヒト配列は望まない反応を呼び起こし、例えば、マウス抗体の場合には、望ましくないヒト抗マウス反応が誘発されるため、ヒト抗体が使用されることが好ましい。用語、ヒト抗体は、ヒト化抗体も含むと理解される。
【００６９】
述べたとおり、外因性免疫受容体及びひいては操作されたT細胞を標的とする抗体を投与することは、操作されたT細胞の選択的な殺滅を誘導し得る。そのような選択的殺滅は、抗体の外因性免疫受容体への結合後に死を誘導し得る。そのような選択的な殺滅は、直接的又は間接的に誘導され得る。抗体骨格のヒト由来の配列が、ヒトの処置においては好ましく、それは、選択的な殺滅が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)又は直接的なアポトーシスを含み得るからである。そのような選択的な殺滅の例が、実施例の項に記載される。
【００７０】
操作されたT細胞を標的とする抗体の使用に関する上記の医学的用途に関して、そのような医学的用途は、上記の本発明の方法により得ることができる操作されたT細胞が濃縮された調製物に限定されない。そのような医学的用途は、使用される前記抗体が外因性免疫受容体に特異的に結合し、宿主の免疫受容体又はCARに含まれる宿主タンパク質配列には特異的に結合しないという条件で、任意の操作されたT細胞にも適用され得る。そのような操作されたT細胞は、例えば、選択マーカーを使用する従来技術の方法を用いることによっても、濃縮され得る。更に、改変されたT細胞を選択するための方法が必要でないため、前記用途は、外因性免疫受容体を有する操作されたNK細胞にも適用可能である。
【００７１】
したがって、別の実施形態では、外因性免疫受容体に特異的に結合する抗体が、外因性免疫受容体を有する操作されたリンパ球で処置されていた場合に有害事象を患う対象の処置における使用のために提供される。好ましくは、前記外因性免疫受容体は、操作された免疫受容体である。
【００７２】
好ましくは、前記対象はヒトである。好ましくは、前記操作されたリンパ球は、操作されたヒトリンパ球である。好ましくは、前記操作されたリンパ球は、操作されたNK細胞又は操作されたT細胞である。最も好ましくは、前記抗体は、好ましくは、上記の外因性免疫受容体を有する操作されたリンパ球の細胞死を誘導する、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
【００７３】
実施形態
1.外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物から、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞を濃縮するための方法であって:
a)外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程;
b)T細胞混合物を、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体と接触させて、抗体-操作されていないT細胞複合体の形成を可能とする工程;
c)T細胞混合物から、抗体-操作されていないT細胞複合体を分離し、それによって、操作されたT細胞が濃縮された調製物を得る工程
を含む方法。
【００７４】
2.工程a)が;
i.T細胞を準備する工程;
ii.外因性免疫受容体をコードする核酸(単数)又は核酸(複数)を準備する工程;
iii.核酸(単数)又は核酸(複数)をT細胞中に導入して、それによって、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程、
を含む、実施形態1による方法。
【００７５】
3.外因性免疫受容体をコードすることに加えて、核酸(単数)又は核酸(複数)が、別個に発現される選択マーカーをコードしない、実施形態2による方法。
【００７６】
4.操作されていない及び操作されたT細胞がヒトのものである、実施形態1〜3のいずれか1つによる方法。
【００７７】
5.抗体がBW242/412である、実施形態4による方法。
【００７８】
6.外因性免疫受容体が、操作されたアルファベータT細胞受容体、又は操作されたガンマデルタT細胞受容体である、実施形態1〜5のいずれか1つによる方法。
【００７９】
7.操作されたアルファベータT細胞受容体又は操作されたガンマデルタT細胞受容体が、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体又は操作されたヒトガンマデルタT細胞受容体である、実施形態6による方法。
【００８０】
8.操作されたアルファベータT細胞受容体又は操作されたガンマデルタT細胞受容体が、改変された定常領域を含む、実施形態6又は実施形態7による方法。
【００８１】
9.外因性免疫受容体が、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体であり、操作が、T細胞受容体ベータ鎖のドメイン3の改変を含み、好ましくは、改変がドメイン3のマウス化を含む、実施形態5による方法。
【００８２】
10.外因性免疫受容体が、ガンマデルタT細胞受容体、好ましくは、ヒトガンマデルタT細胞受容体である、実施形態1〜5のいずれか1つによる方法。
【００８３】
11.実施形態1〜9の方法のいずれか1つにより得ることができる、操作されたT細胞が濃縮された調製物。
【００８４】
12.医学的処置における使用のための、実施形態11による操作されたT細胞が濃縮された調製物。
【００８５】
13.癌の処置における使用のための、実施形態12による操作されたT細胞が濃縮された調製物。
【００８６】
14.実施形態1〜9のいずれか1つに定義された外因性免疫受容体に特異的に結合する抗体であって、実施形態1〜9の方法のいずれか1つにより得ることができる、前記外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞が濃縮された調製物によって処置される場合に有害事象を患う対象の処置における使用のための抗体。
【００８７】
15.対象がヒトである、実施形態14による抗体。
【００８８】
16.抗体が、ヒト抗体又はヒト化抗体である、実施形態15による抗体。
【００８９】
17.抗体が、操作されたT細胞の細胞死を誘導する、実施形態14〜16のいずれか1つによる抗体。
【００９０】
18. 外因性免疫受容体に特異的に結合する抗体であって、外因性免疫受容体を有する操作されたリンパ球によって処置されている場合に有害事象を患う対象の処置における使用のための抗体。
【００９１】
19.対象がヒトである、実施形態18による抗体。
【００９２】
20.操作されたリンパ球が操作されたヒトリンパ球である、実施形態18又は実施形態19による抗体。
【００９３】
21.操作されたリンパ球が、操作されたNK細胞又は操作されたT細胞である、実施形態18〜20のいずれか1つによる抗体。
【００９４】
22.抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、実施形態18〜21のいずれか1つによる抗体。
【００９５】
23.抗体が、外因性免疫受容体を有する操作されたリンパ球の細胞死を誘導する、実施形態18〜22のいずれか1つによる抗体。
【実施例】
【００９６】
(実施例1)
外因性免疫受容体、すなわち、ガンマデルタT細胞受容体を有する操作されたヒトT細胞の濃縮
【００９７】
細胞及び細胞株
Daudi、K562、MDA-MB231、BV173、OPM2及びPhoenix-Ampho細胞を、American Type Culture Collectionから得た。ご厚意により、OPM2-ルシフェラーゼ(OPM2-Luc)及びRPMI8226/S-luc (RPMI-Luc)をAnton Martensから、SCC9をNiels Bovenschenから(両者とも、University Medical Center Utrecht, The Netherlands)並びにDaudiルシフェラーゼ(Daudi-Luc)をGenmab (Utrecht, The Netherlands)から提供された。EBV-形質転換されたリンパ芽球様細胞株(EBV-LCL)(Warrenら、Tissue antigens 59, 293〜303頁、(2002)は、Tuna Mutis (University Medical Center, The Netherlands)から贈与された。PBMCは、the Sanquin Blood Bank (Amsterdam, The Netherlands)から又はthe Institute for Transfusion Medicine and Immunohematology, Frankfurt, Germanyから得たバフィーコートから単離した。AML患者からのPBMCサンプルは、Matthias Theobald (Mainz, Germany)から及びthe University Medical Center Utrecht Biobankから贈与され、GCP及びヘルシンキ宣言に従って収集した。
【００９８】
γ9δ2TCRレトロウイルスベクターのデザイン
腫瘍反応性の高いγ9δ2TCR鎖遺伝子、ガンマクローンG115及びデルタクローン5を、コンビナトリアルTCR鎖交換により得て、コドン最適化し(Geneart Life Technologies社、Regensburg, Germany)、γ鎖-IRES-ネオマイシン又はδ鎖-IRES-ピューロマイシンのいずれかを含有する単一のTCR鎖ベクターとしてのレトロウイルスベクターpBullet中にクローニングした。G115及びデルタクローン5は、配列番号3及び4に列挙した配列を含む。更に、2つの異なる2Aペプチドリンカー配列、F2A及びT2A並びにTCR鎖の順番(γ9-F2A-δ2;δ2-F2A-γ9;γ9-T2A-δ2;γ9-T2A-δ2) (Fig 1A)を交換することによって、両TCR鎖を含有する4つの異なるトランス遺伝子カセットをデザインした(Szymczakら、Nature biotechnology 22、589〜594頁、(2004))。これらのTCRカセットを、最適化したレトロウイルスベクターpMP71 (Engelsら、Hum Gene Ther 14、1155〜1168頁、(2003))中にクローニングして、両TCR鎖を同時に発現させた。MDM2/HLA-A2 TCR由来のアルファ鎖(Stanislawskiら、Nat Immunol 2、962〜970頁、(2001))及びp53/HLA-A2 TCR由来のベータ鎖(Kuballら、Immunity 22、117〜129頁、(2005))からなるナンセンスマウスTCRを、対照TCRとして、pBullet及びpMP71レトロウイルスベクター系の両方において使用した。pMP71における切断型神経成長因子受容体も、レトロウイルス形質導入実験(pM71:DNGFR)において対照として使用した。標準的な方法を使用する形質導入によって、ドナーT細胞にレトロウイルスベクターを導入した。標準的なアッセイを使用して、F2A及びT2Aが両方とも外因性γ9δ2T細胞受容体の発現をもたらし、特異的溶解を誘導し、並びに例えば、Daudi又はOPM2癌細胞株においてIFN-γ産生を誘導したことがわかった。形質導入されたドナーT細胞のFACS分析におけるγ9δ2TCRの平均蛍光強度を測定することによって決定して、ペプチドリンカーT2Aが高い発現レベルをもたらすことがわかった。更に、γ9-T2A-δ2は、最高のIFN-γ産生をもたらした。γ9-T2A-δ2ベクターを更なる実験において使用した。
【００９９】
操作されたT細胞の濃縮
pMP71: γ-T2A-δでαβT細胞に形質導入し、ビオチン標識抗αβTCR抗体(クローンBW242/412、Miltenyi Biotec社、Germany)とともにインキュベートし、その後、磁性ビーズにカップリングした抗ビオチン抗体(anti-biotin MicroBeads, Miltenyi Biotec社)とともにインキュベートした。次に、細胞懸濁液をLDカラムに添加し、αβTCR陽性のT細胞を、製造者のプロトコール(Miltenyi Biotec社)に従って、MACS細胞分離によって枯渇させた。
【０１００】
濃縮された、外因性γ9δ2TCRを有する操作されたT細胞の消失したアロ反応性及び保存された抗腫瘍活性
濃縮後、先に記載のT細胞増殖プロトコール(Riddell及びGreenberg、Journal of immunological methods 128、189〜201頁、(1990))を利用して、γδTCR T細胞を増殖させた。この手順は、結果として、シングルαβTCR陽性T細胞のほぼ完全な枯渇(51%から0.4%まで)及びγδTCRシングル陽性T細胞の劇的な増加(20%から77%まで)をもたらした(図4A)。重要なのは、残ったαβTCR/γδTCRダブル陽性T細胞が、内因性αβTCRの比較的低い表面発現を特徴としたことであった。この表現型は、T細胞が高度に活性化され、増殖性である場合、刺激の5日後まで安定であった。しかしながら、T細胞がより静止状態にある場合、この表現型は、9日目にαβTCR/γδTCRダブル陽性T細胞の主要集団(68%)及びγδTCRシングル陽性T細胞の減少したパーセンテージ(25%)に変化した(図4A)。
【０１０１】
濃縮された操作されたT細胞の機能性を、選択及び増殖の10日後に試験し、αβTCR枯渇なしに操作された細胞及び対照と比較した。αβTCR T細胞の枯渇は、Daudi細胞の特異的溶解(p<0.01)(図4B)並びに3つの異なる腫瘍細胞株に応答したIFN-γ産生(p<0.001)(図4C)を有意に増加させた。10日目に、操作されたT細胞を、急性骨髄性白血病(AML)患者からの初代白血病細胞のパネルに対しても試験した。イソペンテニルピロリン酸へのメバロン酸経路の下流を遮断するためのパミドロネートによる白血病細胞の処置は、16個のAMLサンプルのうち9個に反応したT細胞によるIFNγ分泌をもたらした。8個の試験したサンプルのうちの5個において、濃縮されたγδTCR-操作されたT細胞は、健康なドナーから単離した操作されていないポリクローナルg9d2T細胞に比較して有意に亢進したレベルのIFNγを産生した。
【０１０２】
内因性αβTCR鎖が実質的に再び発現する、インビボの移入後の静止期のT細胞の刺激を行うために、20日間超の間刺激されず、6日間、IL-2欠乏状態に置かれた操作されたT細胞を使用した。モック(DNGFR形質導入)、γδTCR-操作された及びγδTCR-操作されαβTCR枯渇T細胞を、IFNγ  ELISPOTアッセイにおいて、13のミスマッチEBV-LCL細胞株のパネル又は健康なドナー由来のPBMCに対して試験した。モックT細胞は、13個のうちの9個のEBV-LCL細胞株に反応して、IFNγを産生した。γδTCR操作されたバルクT細胞のアロ反応性は、大きく減少し(9個のEBV-LCL株のうちの8個について有意な減少)、より重要なことには、γδTCR-操作されたαβTCR枯渇T細胞集団においては、更に完全に消失した(図5A)。γδTCR-操作されたT細胞の減少したアロ反応性は、20個の異なる健康なドナー由来のPBMCのパネルに対して異なるT細胞集団を試験した場合に、より明らかであった。γδTCRで形質導入したT細胞集団においては、アロ反応性は検出しなかったが、モックT細胞は、10個のPBMCドナーの組み合わせのうちの9個に反応してIFNγを産生した。
【０１０３】
最適化した操作されたT細胞生成物による改善したインビボでの腫瘍制御
濃縮されたγδTCR-操作されたT細胞生成物の臨床的効力を評価し、pB:γδTCR T細胞と呼ばれる、pBulletレトロウイルス形質導入方法及び抗生物質選択系(Vossら、Methods in molecular medicine 109、229〜256頁、(2005))により生成したγδTCR-操作されたT細胞と比較した。末梢血αβT細胞の形質導入、抗生物質(pBullet)又は濃縮による、アルファベータTCRビーズ(pMP71)による選択及び続くT細胞増殖後に、両調製物を評価した。γδTCR陽性T細胞のパーセンテージは、濃縮されたγδTCR T細胞生成物については高かったが、細胞あたりのγδTCR複合体数も、MFIにより測定して、pB:γδTCR T細胞に比較して、2倍超に増加した。更に、3つの試験した腫瘍細胞株の溶解は、pB:γδTCR T細胞に比較して、pMP71:γ-T2A-δベクターカセットで形質導入した濃縮されたγδTCR-操作されたT細胞調製物によって亢進した。これらの調製物の抗腫瘍活性を試験するために、γδTCR-操作されたT細胞の養子移入のためのヒト化マウス腫瘍モデルにおいてインビボで試験した。
【０１０４】
照射したRag2-/-γc-/-ダブルノックアウトマウスに、ルシフェラーゼ陽性Daudi腫瘍細胞をγδTCR又はモックTCR操作されたT細胞とともに注射し、バイオルミネッセンスイメージングによって腫瘍成長を評価した。両γδTCR-操作されたT細胞生成物は、モックTCR T細胞に比較して有意に腫瘍成長を阻害したが、濃縮されたγδTCR T細胞は更に、pB:γδTCR T細胞に比較して腫瘍の増殖を遅らせ、有意に生存を増加させた。同様の結果を、照射したRag2-/-γc-/-ダブルノックアウトマウスに注射したルシフェラーゼOPM2細胞を使用する第2の腫瘍モデルにおいて得た。濃縮されたγδTCR操作されたT細胞調製物を用いて、7頭のマウス中、4頭において腫瘍成長を完全に防止した。最初の腫瘍及びT細胞の注射の120日後に、腫瘍フリーのマウスに、先に照射をせずに腫瘍細胞の第2の注射を再チャレンジし、非照射未処置マウスを腫瘍成長に関して対照として使用した。再チャレンジしたマウスは、腫瘍フリーのままであったが、未処置マウスにおいては腫瘍が成長し、γδTCR T細胞による処置が長期の腫瘍防御をインビボで提供したことを示している。
【０１０５】
結論
結果は、操作されたT細胞、すなわち、ガンマデルタT細胞受容体(ガンマクローンG115及びデルタクローン5)を提供されたT細胞を、アルファベータT細胞受容体に結合する抗体(BW242)を使用して濃縮することが、形質導入されていない細胞の除去を結果としてもたらすことを示す。更に、発現された外因性免疫受容体が、内因性アルファベータT細胞受容体の下方制御をもたらす。そのような濃縮された操作されたT細胞調製物は、抗腫瘍効果の改善及びアロ反応性の低減又は消失を提供する。更に、そのような濃縮された、操作されたT細胞調製物は、高度に改善されたインビボでの腫瘍制御を提供する。
【０１０６】
(実施例2)
外因性免疫受容体、すなわち、操作されたアルファベータT細胞受容体を有する操作されたヒトT細胞の濃縮
【０１０７】
外因性免疫受容体、すなわち、マウスアルファベータT細胞受容体を有する操作されたヒトT細胞の濃縮
腫瘍特異的γδTCRの導入は、操作されたT細胞における内因性αβTCRの発現を下方制御することを示した(上記実施例1を参照されたい)。その結果として、操作されたT細胞は、操作されていないαβT細胞に比較して、その表面上の内因性αβTCRのはるかに低い密度を示す。これは、使用した外因性免疫受容体のタイプに限定されない効果である。マウスアルファベータT細胞受容体を、ヒトT細胞を操作するための外因性免疫受容体として使用した。ヒトアルファベータT細胞を、モノクローナル抗体αβTCR-mAbクローンBW242を使用するMACSによって除去した。したがって、MACSによる単離の後、マウスαβTCRを発現するように再指示されたヒトαβT細胞は、その表面上の内因性αβTCRの減少したレベルを示す(図6A、MACSの前及び後を比較する)。したがって、ヒトアルファベータT細胞受容体に特異的な抗体を使用することによって、マウスアルファベータT細胞受容体を有する操作されたT細胞を濃縮することができる。
【０１０８】
BW242抗体は、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体には結合しない。したがって、BW242抗体は、マウスアルファベータT細胞受容体及びヒトアルファベータT細胞受容体の間で選択的である。したがって、ヒトアルファベータTCR定常ドメインのマウス化を、αβTCRモノクローナル抗体の結合について分析した。マウス化を最小化することは、操作された抗原特異性を有する「そのままの」T細胞の濃縮を可能とする。マウス化が最小限である場合、かなりの量のアルファベータT細胞受容体を発現するT細胞を選択的に除去することを可能とする一方、外因性アルファベータT細胞受容体は、内因性T細胞受容体と実質的に同一である。
【０１０９】
完全なヒトαβTCR及びマウス化変異体への、臨床グレードの(mAb BW242又はBW242とも呼ばれる)αβTCRモノクローナル抗体BW242の結合をフローサイトメトリーによって比較した。TCRβ-/- JurMa細胞を、操作されたマウスナンセンスαβTCR(MDM2-特異的TCRから得たα鎖(Stanislawskiら、Nat Immunol、2001年、2(10): 962〜70頁)及びp53特異的TCRから得たβ鎖(Kuballら、Immunity、2005年、22(1): 117〜29頁))を含有する臨床的に承認されたレトロウイルスベクターpMP71、又はNY-ESO-1/HLA-A2特異的な完全なヒトαβTCR、又はヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインからなるNY-ESO-1/HLA-A2特異的なキメラαβTCR(それぞれ、αMU/βMU、αhu/βhu及びαhuMU/βhuMUと呼ばれる)で、レトロウイルスにより形質導入した。トランスジェニックなTCRの発現を、NY-ESO-1 TCRβ鎖の可変領域に対する抗Vβ4抗体、又はMDM2/p53マウスTCRのTCRβ鎖に対する抗βマウス抗体のいずれかによる染色によって確認した。ヒトTCRα及びβ定常ドメインをマウス等価物によって置換することは、mAb BW242の結合を、完全なマウスTCRへの結合と同様のレベルまで抑制した(図6B下のパネル、パネル6及び8を比較する)。これらのデータは、ヒトαβTCRの定常領域のマウス化が、mAb BW242の結合を抑制するために十分であることを示す。
【０１１０】
ヒト及びマウスαβTCRの定常領域間のすべてのアミノ酸の相違を網羅する突然変異ブロック(mutational block)を有するハイブリッド-TCRα及びβ鎖が利用可能である(図7A及び図7Bを参照されたい) (Sommermeyerら、J Immunol、2010年、184(11):6223〜31頁)。発明者らは、それぞれが、完全なヒトアミノ酸配列に隣接する1つの非相同マウスドメインを含有する、4つのNY-ESO-1 TCRβ鎖及び3つのNY-ESO-1 TCRα鎖構築物を得た。これらを、模式的に図3に示す。7つの異なるTCR構築物を、他の完全なヒトTCR鎖とともにJurMa細胞に導入し、発現させ、mAb BW242による認識について試験した(図8)。構築物の導入効率を、抗Vβ4抗体によって測定し、平行して導入を行った。抗αβTCR  クローンBW242による認識については、両鎖の全マウス定常ドメインを含むαβTCRを発現する細胞(パネルαhuMu/βhuMu)及びαhuMu/βM3を発現する細胞のみが、mAb BW242の結合の低減を示した。これは、mAb BW242の抗体結合が、マウスドメイン3(βM3)を含む構築物を発現する細胞において有意に害されたことを意味する。したがって、ベータ鎖ドメイン3鎖が、それをマウスベータ鎖のベータ鎖ドメイン3と置換するようなことによって又は両アルファ及びベータ鎖の全定常領域を置換するようなことによって改変されている、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体は、例えば、BW242を使用するMACS分離方法等においては選択されない。
【０１１１】
操作されたアルファベータT細胞受容体は、特異性を維持する
ヒトNY-ESO-1  αβTCR、キメラNY-ESO-1  αβTCR又はヒトTCRα鎖を含むマウス化βM3を発現するJurMa細胞を、NY-ESO-1特異的ペンタマーで染色し、ペンタマー結合について陽性の細胞画分の平均蛍光強度(MFI)をフローサイトメトリーによって測定した。NY-ESO-1  完全なヒトαβTCR、完全なマウス定常領域を有するキメラNY-ESO-1  αβTCR及びヒトTCRα鎖を有するマウス化βM3は、すべて、NY-ESO-1特異的ペンタマーと結合することが示された。
【０１１２】
BW242抗体は、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体を有する操作されたT細胞を濃縮することを可能とする
BW242 MACS分離技術が、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体を有する操作されたT細胞を濃縮するために使用できるか否かを決定した。混合細胞集団を使用した。いかなるアルファベータT細胞受容体も発現しないT細胞、野生型アルファベータT細胞受容体を発現するT細胞及び所望の特異性を有するアルファベータT細胞受容体を発現する細胞であって、この受容体が任意選択で改変されてBW242との結合を抑制する細胞を含むT細胞集団。したがって、トランスジェニックTCR、NY-ESO-1/HLA-A2-特異的αβTCRを発現するT細胞を、1:1の割合で、WT1-特異的ヒトαβTCR-トランスジェニック細胞と混合した。その後、これらの細胞混合物の精製を、αβTCR1 mAbでコーティングした免疫磁性ビーズを使用することによって評価し、未結合の細胞画分をフローサイトメトリーによって分析した(図9)。ヒト-マウスキメラαβTCR、すなわち、αhuMU/βhuMU-TCR、αhu/βM3-TCR又はαM2/βM3-TCRで改変した細胞を、混合集団から効率的に濃縮した(Vβ4染色を含むパネルを参照されたい、13%から42%までのパーセンテージ増加)一方、完全なヒトNY-ESO-1又はWT1-特異的αβTCRのいずれかを発現する細胞は、素通り画分中で検出しなかった(Vβ21染色を含むパネルを参照されたい、45%から約1%までのパーセンテージ減少)。注目すべきは、TCR陰性の細胞もmAb BW242によってそのままであるため、形質導入されない細胞は結果として生じた集団中に残留する。これは、少なくともTCRβ中のドメイン3のマウス化が、腫瘍反応性のαβTCRの濃縮には十分であることを示す。
【０１１３】
マウス化ヒトαβTCRを有する操作されたT細胞の選択的溶解
ヒトαβTCR及びマウス化ヒトキメラαβTCRを発現するJurMa細胞を提供した(αhu/βM3)。TCRβ鎖を特異的に標的とする抗体、H57-597 (Biolegend社、San Diegeo、CA 92121から、例えば、カタログ番号109201で購入)を提供した。H57-597は、アルメニアンハムスターIgG1アイソタイプである。溶解のパーセンテージを、標準的なクロム放出アッセイを使用して評価した。マウス化ヒトαβTCRを有するJurMa細胞は、4倍の溶解増加を示した。これは、H57-597が、完全なヒトαβTCRよりもマウス化ヒトαβTCRを有するJurMa細胞を選択的に殺滅することを示す。
【０１１４】
配列表
配列番号1〜4は、TCRのアミノ酸配列を列挙する。可変領域には下線を付していない。可変領域中のイタリック配列は、CDR3領域に対応する。鎖の定常領域を、下線を付して列挙する。
【０１１５】
配列番号1:ヒトTCRα鎖(クローンRA14)
【化１】
2017536123.tif 000002
配列番号2:ヒトTCRβ鎖(クローンRA14):
【化２】
2017536123.tif 000003
配列番号3  ヒトTCRγ鎖(クローンG115):
【化３】
2017536123.tif 000004
配列番号4  ヒトTCRδ鎖(クローンG115):
【化４】
2017536123.tif 000005
【０１１６】
以下に列挙するのは、参照することにより本明細書に組み込まれる、番号AAT27465、AAK49780、AAT27464、X02883、M64239、M12887、M12888、X02384(AH002088)、M26057、M22148、M23381、M14996、M15002、M17323、M13340、M12834、M12837、AF021335のもとにNCBIからのGenbankデータベースから利用可能な配列(の一部)である。
【０１１７】
【表１Ａ】
2017536123.tif 000006
【０１１８】
【表１Ｂ】
2017536123.tif 000007
【０１１９】
【表１Ｃ】
2017536123.tif 000008
【図１Ａ】
2017536123.tif 000009
【図１Ｂ】
2017536123.tif 000010
【図１Ｃ】
2017536123.tif 000011
【図１Ｄ】
2017536123.tif 000012
【図１Ｅ】
2017536123.tif 000013
【図１Ｆ】
2017536123.tif 000014
【図２Ａ】
2017536123.tif 000015
【図２Ｂ】
2017536123.tif 000016
【図２Ｃ】
2017536123.tif 000017
【図２Ｄ】
2017536123.tif 000018
【図２Ｅ】
2017536123.tif 000019
【図２Ｆ】
2017536123.tif 000020
【図３Ａ】
2017536123.tif 000021
【図３Ｂ】
2017536123.tif 000022
【図３Ｃ】
2017536123.tif 000023
【図３Ｄ】
2017536123.tif 000024
【図３Ｅ】
2017536123.tif 000025
【図４Ａ】
2017536123.tif 000026
【図４Ｂ】
2017536123.tif 000027
【図４Ｃ】
2017536123.tif 000028
【図５】
2017536123.tif 000029
【図６】
2017536123.tif 000030
【図７】
2017536123.tif 000031
【図８】
2017536123.tif 000032
【図９】
2017536123.tif 000033
【図１０】
2017536123.tif 000034
【配列表】
2017536123000001.app
【国際調査報告】
2017536123.tif 000035
2017536123.tif 000036
2017536123.tif 000037
2017536123.tif 000038