(57)【要約】  膀胱癌を処置する方法が提供される。膀胱癌を処置する方法は、シクロピロクス、又はシクロピロクスオラミン、又は本願で提供される式のいずれか１つの構造を有するシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ、又はそれらの誘導体、又はそれらの立体異性体、又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有する医薬組成物を提供し；そして前記医薬組成物を、膀胱癌を罹患する対象に投与することを含み得る。シクロピロクス、又はシクロピロクスオラミン、又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、治療有効量で投与され得る。
2017533952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱癌の処置方法であって：
シクロピロクス、又はシクロピロクスオラミン、又は式１：
【化１】
2017533952.tif 000029
［式中、
Ｒ1〜Ｒ12は、各々独立して、１又は２以上の水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、置換若しくは無置換体、又はそれらの組み合わせを含み；
Ｒ13〜Ｒ14は、各々独立して、１又は２以上の陽イオン、ナトリウムイオン、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、置換若しくは無置換体、又はそれらの組み合わせを含み；
ｎは０〜２０であり、置換又は無置換であり；そして
ｍは０、１又は２である］
の構造を有するシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ、又はそれらの立体異性体、又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有する医薬組成物を提供し；そして
前記医薬組成物を、膀胱癌を罹患する対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記化合物が、式２：
【化２】
2017533952.tif 000030
の構造によって表されるか、又はその立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、式３：
【化３】
2017533952.tif 000031
の構造によって表されるか、又はその立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、式４：
【化４】
2017533952.tif 000032
の構造によって表されるか、又はその立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、式５：
【化５】
2017533952.tif 000033
の構造によって表されるか、又はその立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、式６：
【化６】
2017533952.tif 000034
の構造によって表されるか、又はその立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、式７：
【化７】
2017533952.tif 000035
の構造によって表されるか、又はその立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、式８：
【化８】
2017533952.tif 000036
の構造によって表されるか、又はその立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、式９：
【化９】
2017533952.tif 000037
の構造によって表されるか、又はその立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、式１０、１１、１２又は１３：
【化１０】
2017533952.tif 000038
の構造によって表されるか、又はその立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記医薬組成物がシクロピロクスを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記医薬組成物がシクロピロクスオラミンを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、治療有効量の前記化合物と医薬上許容し得る担体とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記医薬組成物が治療有効量で投与されて、治療有効量の６−シクロヘキシル−１−ヒドロキシ−４−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オンを提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療有効量は、ＮＯＴＣＨ経路を阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療有効量は、ＴＧＦ−ベータ経路を阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療有効量は、ＳＴＡＴ３経路を阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療有効量は、膀胱癌細胞の成長を阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療有効量は、ＤＮＡ修復を阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療有効量は、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療有効量は、膀胱癌幹細胞の成長を阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療有効量は、膀胱癌細胞の成長をＳ期で阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療有効量は、膀胱癌スフェロイドの形成を阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療有効量は、膀胱癌細胞の増殖を阻害するために十分である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、式１０、１１、１２又は１３：
【化１１】
2017533952.tif 000039
の構造によって表されるか、又はそれらの立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記膀胱癌がＮＭＩＢＣ（筋層非浸潤性膀胱癌）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記膀胱癌がＭＩＢＣ（筋層浸潤性膀胱癌）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
上部尿路における膀胱癌の処置方法であって：
シクロピロクス、シクロピロクスオラミン、又は式１：
【化１２】
2017533952.tif 000040
［式中、
Ｒ1〜Ｒ12は、各々独立して、１又は２以上の水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、置換若しくは無置換体、又はそれらの組み合わせを含み；
Ｒ13〜Ｒ14は、各々独立して、１又は２以上の陽イオン、ナトリウムイオン、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、置換若しくは無置換体、又はそれらの組み合わせを含み；
ｎは０〜２０であり、置換又は無置換であり；そして
ｍは０、１又は２である］
の構造によって表されるシクロピロクスプロドラッグ、又はそれらの立体異性体、又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有する医薬組成物を提供し；そして
前記医薬組成物を、上部尿路における膀胱癌を罹患する対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項２９】
膀胱癌の処置のための医薬を製造するための化合物の使用であって、前記化合物は、シクロピロクス、シクロピロクスオラミン、又は式１：
【化１３】
2017533952.tif 000041
［式中、
Ｒ1〜Ｒ12は、各々独立して、１又は２以上の水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、置換若しくは無置換体、又はそれらの組み合わせを含み；
Ｒ13〜Ｒ14は、各々独立して、１又は２以上の陽イオン、ナトリウムイオン、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、置換若しくは無置換体、又はそれらの組み合わせを含み；
ｎは０〜２０であり、置換又は無置換であり；そして
ｍは０、１又は２である］
の構造を有するシクロピロクスプロドラッグ、又はそれらの立体異性体、又はそれらの薬学的に許容し得る塩を含む、使用。
【請求項３０】
前記膀胱癌がＮＭＩＢＣ（筋層非浸潤性膀胱癌）である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記膀胱癌がＭＩＢＣ（筋層浸潤性膀胱癌）である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
膀胱癌の処置のための組成物であって、
膀胱癌の処置のための治療有効量のシクロピロクス、シクロピロクスオラミン、又は式１：
【化１４】
2017533952.tif 000042
［式中、
Ｒ1〜Ｒ12は、各々独立して、１又は２以上の水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、置換若しくは無置換体、又はそれらの組み合わせを含み；
Ｒ13〜Ｒ14は、各々独立して、１又は２以上の陽イオン、ナトリウムイオン、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、置換若しくは無置換体、又はそれらの組み合わせを含み；
ｎは０〜２０であり、置換又は無置換であり；そして
ｍは０、１又は２である］
の構造によって表されるシクロピロクスプロドラッグ、又はそれらの立体異性体、又はそれらの薬学的に許容し得る塩を含む、組成物。
【請求項３３】
前記膀胱癌がＮＭＩＢＣ（筋層非浸潤性膀胱癌）である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記膀胱癌がＭＩＢＣ（筋層浸潤性膀胱癌）である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
ｎが１〜４であり、ｍが１である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
ｎが１であり、ｍが１である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記シクロピロクスプロドラッグが、式１０、１１、１２又は１３：
【化１５】
2017533952.tif 000043
の構造によって表されるか、又はそれらの立体異性体であるか、又はそれらの薬学的に許容し得る塩である、請求項３２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本特許出願は、２０１５年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／１３４，７４７号に基づく優先権を主張する。本特許出願はまた、２０１４年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／０７８，０６９号に基づく優先権を主張する。上記の仮出願は、その全体において本明細書において具体的な参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
シクロピロクスとしても知られている、６−シクロヘキシル−１−ヒドロキシ−４−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オン分子は、市販の外用抗真菌剤である。シクロピロクスは表在性真菌症及び癜風の治療に使用されている。市販の外用製剤はシクロピロクスのオラミン塩を含有する。ヒトへの経口投与の後、シクロピロクスオラミンは完全に吸収され、続いて迅速且つ完全な薬物排泄が起こる。ヒトにおけるシクロピロクスオラミンの経口生物学的利用能は報告されていない。しかし、動物においては、経口によるシクロピロクスオラミンの絶対的生物学的利用能は低い。シクロピロクスのオラミン塩の反復的な経口投与は、動物及びヒトの両方において、胃腸毒性と関連付けられている。最後に、シクロピロクスのオラミン塩は注射用製剤としての製剤形態に必要な水溶性を有していない。したがって、注射による薬剤投与のために、水溶性が向上するようにシクロピロクスを構成することは有益であろう。
【０００３】
膀胱癌は米国において５番目に多い癌診断である。患者は再発及び進行の危険性が高いため、膀胱癌は患者生存期間あたりの計算で治療に最もコストがかかる癌である。その発生率及び罹患率にもかかわらず、膀胱癌の研究は資金が非常に不足しており、その結果、膀胱癌治療の改善はほとんど進展していない。膀胱癌は、歴史的には「表在性膀胱癌」と称される筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ）、及び筋層浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）の、一連の２つの疾患である。ＮＭＩＢＣは、内視鏡的切除、並びに膀胱内注入（膀胱内投与）によって投与される局所的なワクチン及び薬剤処置で治療可能である。ＭＩＢＣは、通常は根治的膀胱切除及び／又は全身化学療法の形式で、より積極的な介入を必要とする。非浸潤性乳頭状癌（Ｔａ）、固有層の腫瘍浸潤（Ｔ１）、及び上皮内癌（Ｔｉｓ）という、３種のＮＭＩＢＣ病変が存在する。Ｔａ腫瘍及びＴ１腫瘍は低悪性度腫瘍及び高悪性度腫瘍に分類される。高悪性度のＴａ腫瘍及びＴ１腫瘍、並びにＴｉｓ腫瘍は、ＭＩＢＣに進行する中度から高度のリスクを伴って、より高い再発率を有する。ＮＭＩＢＣの５０％は内視鏡的切除及び膀胱内療法の後、１２ヵ月以内に再発する。ＮＭＩＢＣの５年再発率又は新規発生率は、外科、免疫療法及び化学療法による治療介入を受けても、腫瘍型及び腫瘍悪性度に依存して、３１〜７８％の範囲である。したがって、ＮＭＩＢＣ治療を改善して、再発及びＭＩＢＣへの進行を防止することは有益であろう。
【発明の概要】
【０００４】
一実施形態において、膀胱癌を治療する方法が提供される。膀胱癌を治療する方法は、シクロピロクス、又はシクロピロクスオラミン、又は本明細書において提供される式のうちの１つの構造を有するシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ、又はそれらの誘導体、又はそれらの立体異性体、又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有する医薬組成物を提供し；そして、膀胱癌を罹患する対象へ前記医薬組成物を投与すること、を含み得る。シクロピロクス又はシクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは治療有効量で投与され得る。一態様において、治療有効量は、ＮＯＴＣＨシグナル経路、γ−セクレターゼ複合体、並びにＮｏｔｃｈ下流標的タンパク質であるサイクリンＤ１及びｃ−Ｍｙｃの阻害に十分な量である。一態様において、治療有効量はＴＧＦβシグナル経路の阻害に十分な量である。一態様において、治療有効量はＳＴＡＴ３シグナル経路の阻害に十分な量である。一態様において、治療有効量は膀胱癌細胞の成長 (growth)の阻害に十分な量である。一態様において、治療有効量はＤＮＡ修復の阻害に十分な量である。一態様において、治療有効量はリボヌクレオチド還元酵素の阻害に十分な量である。一態様において、治療有効量は膀胱癌幹細胞の成長の阻害に十分な量である。一態様において、治療有効量はＳ期における膀胱癌細胞の成長の阻害に十分な量である。一態様において、治療有効量は膀胱癌スフェロイド形成の阻害に十分な量である。一態様において、治療有効量は膀胱癌細胞の増殖 (proliferation)の阻害に十分な量である。
【０００５】
一実施形態において、シクロピロクスを全身送達することによる、上部尿路における膀胱癌疾患を治療する方法が提供される。前記方法は、シクロピロクス、シクロピロクスオラミン、又は本明細書において提供されるいずれかの式の構造で表されるシクロピロクスプロドラッグ、又はそれらの誘導体、又はそれらの立体異性体、又はそれらの薬学的に許容し得る塩を有する医薬組成物を提供し；そして、上部尿路に膀胱癌疾患を有する対象へ前記医薬組成物を投与することを含み得る。
【０００６】
上記及び下記の情報ならびに本開示の他の特徴は、付随する図面と組み合わせた以下の説明及び添付の請求の範囲から、より完全に明らかとなるであろう。これらの図面は、単に本開示に従う幾つかの実施形態を表わすものであり、したがってその範囲を限定するものとは見なされないと理解される。本開示は、付随する図面の使用を通してさらに具体的に且つ詳細に説明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、６−シクロヘキシル−１−ヒドロキシ−４−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オンを調製する方法の模式的説明を示す。それは、本明細書においてシクロピロクス（Cyclopirox）とも呼ばれる（スキーム１）。
【図２】図２は、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（クロロメチル）ホスフェートを調製する方法の模式的説明を示す（スキーム２）。
【図３】図３は、６−シクロヘキシル−１−ヒドロキシ−４−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オンのプロドラッグを調製する方法の模式的説明を示す（スキーム３）。
【図３Ａ】図３Ａは、スキーム３Ａとして同定される副反応プロセスの模式的説明を示す。それは図３のスキーム３の副次的プロセスであり得る。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａのスキーム３Ａの反応生成物を示す質量分析のクロマトグラフを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルジハイドロゲンホスフェートの遊離酸形態の存在を示す質量分析のクロマトグラフを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの２量体型形態を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、図３Ｄのシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの２量体型形態の質量分析のクロマトグラフを示す。
【図４】図４は、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルホスフェートの２ナトリウム塩を得るために、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルジハイドロゲンホスフェートを塩にする模式的説明を示す（スキーム４）；しかし、最終的には合成は当該化合物の薬学的に許容し得る任意の他の塩とし得る。
【図４Ａ】図４Ａは、図４の（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルホスフェートの２ナトリウム塩の存在を示す質量分析クロマトグラフを示す。
【図５】図５は、ジベンジル（クロロメチル）ホスフェートを製造する方法の模式的説明を示す（スキーム５）。
【図６】図６は、ジベンジル（（（６−シクロヘキシル−４−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェートを製造する方法の模式的説明を示す（スキーム６）。
【図７】図７は、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルホスフェートの２ナトリウム塩を製造する方法の模式的説明を示す（スキーム７）。
【図８】図８は、ＰＯＭ試薬であるジベンジル（クロロメチル）ホスフェートを製造する方法の模式的説明を示す（スキーム８）。
【図９】図９は、シクロピロクス（ＣＰＸ）が小さな濃度範囲に亘ってＮＭＩＢＣ（Ｔ２４）膀胱癌細胞増殖を阻害することを示すグラフを含む。
【図１０】図１０は、ＣＰＸが膀胱癌スフェロイド形成を阻害することを示す画像を含む。
【図１１】図１１は、シクロピロクス（ＣＰＸ）がより大きな濃度範囲に亘ってＮＭＩＢＣ（Ｔ２４）及びＭＩＢＣ（２５３ＪＢＶ）膀胱癌細胞増殖を阻害することを示すグラフを含む。
【図１２Ａ】図１２Ａは、処置群  時点あたりの６匹のマウスへの１０ｍｇ／ｋｇ静脈内（ＩＶ）シクロピロクスオラミン（ＣＰＸ−Ｏ）、１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ、３０ｍｇ／ｋｇ  経口（ＰＯ）ＣＰＸ−Ｏ及び３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＯ  ＣＰＸ−ＰＯＭの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、処置群あたり、時点あたりの３匹のマウスへの１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ及び５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ  ＣＰＸ−ＰＯＭの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、処置群あたり６匹のラットへの１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−Ｏの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の片対数プロファイルを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、処置群あたり６匹のラットへの２０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ、３０ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＱ）ＣＰＸ−ＰＯＭ、及び３０ｍｇ／ｋｇ  ＣＰＸ−Ｏの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示す。
【図１４】図１４は、４匹の雄ビーグル犬への３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−Ｏの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示す。
【図１５】図１５は、４匹の雄ビーグル犬への３ｍｇ／ｋｇ  静脈内（ＩＶ）  ＣＰＸ−ＰＯＭ、９ｍｇ／ｋｇ  皮下（ＳＱ）  ＣＰＸ−ＰＯＭ、及び９ｍｇ／ｋｇ  経口（ＰＯ）  ＣＰＸ−Ｏの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示す。
【図１６】図１６は、ＣＰＸからの、Ｔ２４膀胱癌細胞のアポトーシスを示すウエスタンブロットを含む。
【図１７】図１７は、ＣＰＸからの、Ｔ２４膀胱癌細胞のアポトーシスを示すウエスタンブロットを含む。
【図１８】図１８は、インキュベーション時間と比較した、ＣＰＸ−ＰＯＭからの、ＣＰＸ形成を示すグラフを含む。
【図１９】図１９は、対照と比較した、ＣＰＸの存在下におけるＴ２４細胞の細胞成長の差異を示す画像を含む。
【図２０】図２０は、対照と比較した、ＣＰＸの存在下における２５３ＪＢＶ細胞の細胞成長の差異を示す画像を含む。
【図２１】図２１は、ＣＰＸが２５３ＪＢＶ細胞株及びＴ２４細胞株の両方においてスフェロイド形成を阻害することを示すグラフを含む。
【図２２】図２２は、ＣＰＸがＴ２４膀胱癌細胞株において細胞死を誘導することを示す画像を含む。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ＣＰＸがＴ２４膀胱癌細胞においてＮｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、及びＨｅｄｇｅｈｏｇ細胞内シグナル経路を阻害することを示すグラフを含む。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ＣＰＸがＴ２４膀胱癌細胞においてＮｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、及びＨｅｄｇｅｈｏｇ細胞内シグナル経路を阻害することを示すグラフを含む。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、ＣＰＸがＴ２４膀胱癌細胞においてＮｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、及びＨｅｄｇｅｈｏｇ細胞内シグナル経路を阻害することを示すグラフを含む。
【図２４】図２４は、ＷＴ  Ｔ２４細胞及びＮＣＩＤ過剰発現Ｔ２４細胞における細胞増殖、並びにＮｏｔｃｈ１及びアクチンのレベルに対するＣＰＸの影響を示すグラフ及び画像を含む。
【図２５Ａ】図２５Ａは、膀胱癌細胞に対するＣＰＸの影響を示すグラフを含む。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、膀胱癌細胞に対するＣＰＸの影響を示すグラフを含む。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、膀胱癌細胞に対するＣＰＸの影響を示すグラフを含む。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、膀胱癌細胞に対するＣＰＸの影響を示すグラフを含む。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ＣＰＸ−ＰＯＭによる処置あたりの膀胱重量を示すグラフを含む。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ＣＰＸ−ＰＯＭ投与による処置あたりの腫瘍の病期を示すグラフを含む。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ＣＰＸ−ＰＯＭがインビボにおいてＮｏｔｃｈ１シグナル伝達及びγ−セクレターゼ複合体タンパク質を阻害することを示す画像を含む。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ＣＰＸ−ＰＯＭがＢＢＮ誘導膀胱腫瘍モデルにおいてＮｏｔｃｈ下流標的タンパク質であるサイクリンＤ１及びｃ−Ｍｙｃを阻害することを示す画像を含む。
【図２８】図２８は、ＣＰＸ−ＰＯＭがインビトロ及びインビボの両方において増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を形成する添付の図面への参照がなされる。図面において、文脈が他を指示しない限り、類似の記号は典型的には類似の成分を同定する。詳細な説明、図面及び請求の範囲において記載される説明的な実施形態は、限定することを意味しない。本明細書において提示される主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行ってもよい。本明細書において一般的に記載され、図面において説明される本開示の態様を、多種多様な異なる構造において配置し、置換し、組み合わせ、分離し、及び設計することができ、これらの全てが本明細書において明示的に企図されることが、容易に理解されるであろう。
【０００９】
概して、本発明は、シクロピロクスとしても知られている６−シクロヘキシル−１−ヒドロキシ−４−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オン、及びそのプロドラッグに関する。本明細書に記載のシクロピロクス及びシクロピロクスプロドラッグは、本明細書のデータによって裏付けられるように、膀胱癌の治療で使用することができる。シクロピロクスプロドラッグは、水溶性及び注射による薬剤投与性の向上による、活性部分であるシクロピロクスの標的作用部位への送達のために、ホスホリルオキシメチル（ＰＯＭ）部分を含み得る。本発明のシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグはまた、ＰＯＭプロドラッグ部分を含むシクロピロクスの誘導体を含むこともあり、この誘導体プロドラッグは、概してシクロピロクス−ＰＯＭという表現で参照されるか、又は、具体的にシクロピロクス−ＰＯＭ誘導体と称され得る。本発明のシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、本明細書に記載されるもの等の、伝統的な化学手法で調製することができる。シクロピロクスは膀胱癌治療においてはシクロピロクスオラミンとして使用され得る。
【００１０】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、シクロピロクスの水溶性を向上させることで、シクロピロクス−ＰＯＭの注入による、有意濃度のシクロピロクスを尿路全体に選択的に送達する機会を得ることが示されている。生物学的に活性なシクロピロクスを尿路全体に送達することにより、薬剤が尿管、集尿系、及び腎臓を含む上部尿路に送達されることから、注入によるシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの投与は、膀胱内注入を介した局所送達の制限を克服する。したがって、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、シクロピロクス、又はシクロピロクスオラミンのようなシクロピロクス塩等のシクロピロクスの他の形態の製剤及び／又は送達経路に伴う制限を克服する。シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの溶解性の向上は、注入により有効量のシクロピロクスを投与するための、医薬組成物の改善を可能にし得る。医薬組成物は、静脈内、皮下、及び筋肉内等の注射可能な投与経路に適するように製剤化され得る。
【００１１】
生物学的に活性な元の親薬剤であるシクロピロクスを生成するために、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、ＰＯＭ部分がホスファターゼ酵素により切断されるように構成される。シクロピロクス−ＰＯＭの生物学的に活性なシクロピロクスへの代謝的変換は迅速且つ完全である。したがって、シクロピロクス−ＰＯＭは、生体対象に投与された後、対象の身体内で酵素的に処理されて生理活性シクロピロクスになり得る。対象は通常ヒトであるが、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、種々様々な動物、例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、又は同種のもの、に適していると判明され得る。
【００１２】
シクロピロクスは伝統的に局所性抗真菌剤として使用されてきたが、本発明のシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグに使用可能な異なる製剤は、シクロピロクス処置に適していると示されている、又はシクロピロクス処置に適するよう生じ得る、他の疾患に治療有効量のシクロピロクスを与え得る。したがって、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、以下の治療で使用され得る：真菌の阻害、治療及び／又は予防；癌（例えば、膀胱癌等）の治療、予防、及び／又は制御；皮膚炎の阻害、治療及び／又は予防；表在性真菌症の阻害、治療及び／又は予防；炎症の阻害、治療及び／又は予防（例えば、抗炎症、又はＮＳＡＩＤとして）；足白癬、股部白癬、及び体部白癬、紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）、毛瘡白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、有毛表皮糸状菌（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）、及びイヌ小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）、カンジダ症（モニリア症）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、癜風、又は癜風菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ）のうちの一つ又は複数の阻害、治療及び／又は予防、並びにＨＩＶを含むウィルス感染の阻害、治療及び／又は予防。現在、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクスプロドラッグ等のシクロピロクスが、膀胱癌の治療で使用できることが分かっている。すなわち、前記作用剤は、プロドラッグ部分無しで、又は、プロドラッグとしてプロドラッグ部分有りで、使用可能である。シクロピロクスのそのような使用は、本明細書に記載のように施行され得る。また、シクロピロクスは、膀胱内注入を介して膀胱癌に直接送達される局所送達系に含まれ得る。ＣＰＸが、ＨＩＶ−１によるウィルス感染を選択的に除去し、シクロピロクス、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ、又はシクロピロクスオラミンとして送達可能であることも分かっている。
【００１３】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、シクロピロクスへの全身及び尿路暴露の増加が達成されるように、プロドラッグの溶解性を向上させる。すなわち、より多くのシクロピロクスが、対象の全体にわたって、及び対象の個々の細胞内で、利用可能であり得る。利用可能なシクロピロクスの量の増加は、生理活性及び治療可能性を向上させ、細胞プロセスを調節する能力も向上させる。したがって、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、細胞におけるＤＮＡ修復、細胞分裂、又は核内輸送を乱すために使用され得る。さらに、シクロピロクス−ＰＯＭを使用することで、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害して、幹細胞性に影響を与えること、並びに、膀胱癌の浸潤及び転移を促進すること、が可能である。前記細胞はインビボ、エキソビボ、又はインビトロであってよい。したがって、シクロピロクス−ＰＯＭは、細胞におけるＤＮＡ修復、細胞分裂、又は核内輸送を乱すことにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することにより、及び、本明細書に記載の他のあらゆる生物学的経路を阻害することにより、広範囲の癌系統に対して使用され得る。
【００１４】
シクロピロクスプロドラッグが記載されてきたが、かかるプロドラッグは、利用可能なヒドロキシル及び／又はアミノ基を用いて形成される通常のエステル、例えば塩基の存在下で活性化された酸のアシル化によって形成されるエステルに限定されてきた。記載されてきたエステルは、フェニルエステル、脂肪族（Ｃ8−Ｃ24）エステル、アシルオキシメチルエステル、カルバメート、及びアミノ酸エステルを有するプロドラッグを含み得る（ＷＯ２０１０／０４８７１２を参照：それはその全体において本明細書において具体的な参照により組み込まれる）。
【００１５】
さらに、２級及び３級アミン含有薬物を含む化合物について、可溶性が増大したプロドラッグが創製されてきた。かかるプロドラッグの例は、Ｎ−ホスホリルオキシメチル (N-phosphoryloxymethyl)（ＰＯＭ）プロドラッグを含む。ここで、ＰＯＭ部分のメチル基が２級及び３級アミンにカップリングされている（ＵＳ５，９８５，８５６を参照：それはその全体において本明細書において具体的な参照により組み込まれる）。
【００１６】
代替的な化学技術により、現在では、本発明のシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを形成するためにＰＯＭプロドラッグ体をシクロピロクスへカップリングできることが見出されている。化学合成プロトコルにより、以下に示されるシクロピロクスを、２級及び３級アミンを介してよりも、そのヒドロキシル基を介して複合体化させることができる。シクロピロクスは環窒素を含むが、かかる窒素がＰＯＭへ連結することは、当該窒素に連結したヒドロキシル基又は酸素がシクロピロクスの生物学的活性のために重要である可能性があるために、望ましくないことが見出されている。したがって、本発明は、ＰＯＭ部分を、シクロピロクスの環窒素に連結したヒドロキシル基へ複合体化させるための化学技術を提供する。
【化１】
2017533952.tif 000003
【００１７】
一実施形態において、本発明は、シクロピロクスプロドラッグ又はその誘導体を含む。当該プロドラッグは、式１の構造又はその誘導体、又はそれらの立体異性体、並びにそれらの薬学的に許容し得る塩を含み得る。
【化２】
2017533952.tif 000004
【００１８】
当該式中、Ｒ1〜Ｒ14は、各々独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、それらの誘導体、置換若しくは無置換体、又はそれらの組み合わせ、ならびに他の周知の化学置換基を含み得る。Ｒ13及び／又はＲ14は、化合物が塩を形成するように、ナトリウムイオンなどの陽イオンであり得る。また、Ｒ13及び／又はＲ14は、独立して、プロドラッグと塩形成するために陽イオンを含み得、あるいは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分枝状脂肪族、環状脂肪族、置換脂肪族、無置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、ヘテロ芳香族、アミン、１級アミン、２級アミン、３級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又はそれらの組み合わせの１又は２以上を含み得る。所望の場合、ｎが約０〜２０、より好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜４であり得るように、メチルリンカーを、置換又は無置換のより大きな脂肪族基に拡大し得る。リンカーはまた、ｍが０、１又は２であり得るように、１又は２個の酸素原子を有してもよい。本明細書に示される全ての式に関して、ｎは１〜４であり得、且つｍは１であり、あるいはｎ及びｍがいずれも１であり得る。
【００１９】
一実施形態において、Ｒ13及び／又はＲ14は、独立して、種々の陽イオンのいずれか１つであってもよい。一例において、Ｒ13及び／又はＲ14は、独立して、＋１の正の電荷を有するイオンを含み得る。Ｒ13及び／又はＲ14は、アルカリ金属であり得る。また、Ｒ13及び／又はＲ14は、独立して、ナトリウムイオンなどの第１族のイオンであり得る。したがって、酸素とＲ13及び／又はＲ14との間の結合は、共有結合又はイオン結合であり得る。
【００２０】
一実施形態において、Ｒ13及び／又はＲ14は、独立して、保護基であり得る。保護基の例は、ｔｅｒｔ−ブチル及びベンジルを含み得る。しかし、他の有機ベースの保護基が使用され得る。これらの保護基は、投与のためにプロドラッグ上に残されても良いし、投与の前に除去されても良い。
【００２１】
一実施形態において、Ｒ1は、メチル又は他のアルキルなどの短い脂肪族である。
【００２２】
一実施形態において、Ｒ2〜Ｒ12は、全て水素である。
【００２３】
一実施形態において、Ｒ13及び／又はＲ14は、各々独立して水素である。
【００２４】
一実施形態において、Ｒ13及び／又はＲ14は、各々独立して、ベンジル又はｔｅｒｔ−ブチルである。
【００２５】
一実施形態において、Ｒ13及び／又はＲ14は、シクロピロクス−ＰＯＭを含み得、且つ他方は水素である。それは以下の式１０において示される。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、式２の構造を有する化合物、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ｎ、ｍ、Ｒ1、ならびにＲ13及び／又はＲ14は、式１について上で記載されたものと同一であり得る。
【化３】
2017533952.tif 000005
【００２７】
一実施形態において、化合物は、式３の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ｎ、ｍ、Ｒ1、ならびにＲ13及び／又はＲ14は、式１について上で記載されたものと同一であり得る。
【化４】
2017533952.tif 000006
【００２８】
一実施形態において、化合物は、式４の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ｎ及びｍは、式１について上で記載されたものと同一であり得る。
【化５】
2017533952.tif 000007
【００２９】
一実施形態において、化合物は、式５の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ｎ及びｍは、式１について上で記載されたものと同一であり得る。
【化６】
2017533952.tif 000008
【００３０】
一実施形態において、化合物は、式６の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ｎ及びｍは、式１について上で記載されたものと同一であり得る。
【化７】
2017533952.tif 000009
【００３１】
一実施形態において、化合物は、式７の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ｎ及びｍは、式１について上で記載されたものと同一であり得る。
【化８】
2017533952.tif 000010
【００３２】
一実施形態において、化合物は、式８の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ｎ及びｍは、式１について上で記載されたものと同一であり得る。
【化９】
2017533952.tif 000011
【００３３】
一実施形態において、化合物は、式９の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ｎ及びｍは、式１について上で記載されたものと同一であり得る。
【化１０】
2017533952.tif 000012
【００３４】
一実施形態において、化合物は、式１０の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。
【化１１】
2017533952.tif 000013
【００３５】
一実施形態において、化合物は、式１１の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ここで、化合物は、塩、例えば薬学的に許容し得るあらゆる塩、を形成するように陽イオンとイオン結合可能な、負電荷を有する２個の酸素原子を有する。
【化１２】
2017533952.tif 000014
【００３６】
一実施形態において、化合物は、式１２の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ここで、化合物は、塩、例えば薬学的に許容し得るあらゆる塩、を形成するように陽イオンと結合した、２個の酸素原子を有する。
【化１３】
2017533952.tif 000015
【００３７】
一実施形態において、化合物は、式１３の構造、又はその誘導体、又はそれらの立体異性体を含み得る。ここで、化合物は、水素を失った後に、塩、例えば薬学的に許容し得るあらゆる塩、を形成するように陽イオンとイオン結合可能な、２個の酸素原子を有する。
【化１４】
2017533952.tif 000016
【００３８】
前記化合物のいずれも、可能ならば薬学的に許容し得る塩として調製され得る。薬学的に許容し得る通常のあらゆる塩イオンが使用され得る。そのような塩の例としては、アルカリ及びアルカリ土類金属塩、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、及びその水和物；より好ましくは、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、及びその水和物；さらにより好ましくは、マグネシウム、カルシウム及びその水和物、を挙げることができる。前記塩は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、シュウ酸等の種々の有機酸の対応する塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の種々の無機酸の対応する塩も包含し得る。他のいかなる塩も好適であり得る。
【００３９】
さらに、本明細書に記載され、前記化学式で表される化合物のいずれも、以下から成る群から選択される置換基から独立して選択されるＲ基（Ｒ1〜Ｒ14）のいずれかを有し得る：水素、Ｃ1〜Ｃ24アルキル、Ｃ2〜Ｃ24アルケニル、Ｃ2〜Ｃ24アルキニル、Ｃ5〜Ｃ20アリール、Ｃ6〜Ｃ24アルカリル、Ｃ6〜Ｃ24アラルキル、ハロ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ1〜Ｃ24アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ24アルケニルオキシ、Ｃ2〜Ｃ24アルキニルオキシ、Ｃ5〜Ｃ20アリールオキシ、アシル（例えばＣ2〜Ｃ24アルキルカルボニル（−ＣＯ−アルキル）及びＣ6〜Ｃ20アリールカルボニル（−ＣＯ−アリール））、アシルオキシ（−Ｏ−アシル）、Ｃ2〜Ｃ24アルコキシカルボニル（−（ＣＯ）−Ｏ−アルキル）、Ｃ6〜Ｃ20アリールオキシカルボニル（−（ＣＯ）−Ｏ−アリール）、ハロカルボニル（−ＣＯ）−Ｘ、式中Ｘはハロ）、Ｃ2〜Ｃ24アルキルカルボナト（−Ｏ−（ＣＯ）−Ｏ−アルキル）、Ｃ6〜Ｃ20アリールカルボナト（−Ｏ−（ＣＯ）−Ｏ−アリール）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（−ＣＯＯ-）、カルバモイル（−（ＣＯ）−ＮＨ2）、一（Ｃ1〜Ｃ24アルキル）置換カルバモイル（−（ＣＯ）−ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ24アルキル））、二（Ｃ1〜Ｃ24アルキル）置換カルバモイル（−（ＣＯ）−Ｎ（Ｃ1〜Ｃ24アルキル）2）、一置換アリールカルバモイル（−（ＣＯ）−ＮＨ−アリール）、チオカルバモイル（−（ＣＳ）−ＮＨ2）、カルバミド（−ＮＨ−（ＣＯ）−ＮＨ2）、シアノ（−Ｃ≡Ｎ）、イソシアノ（−Ｎ+≡Ｃ-）、シアナト（−Ｏ−Ｃ≡Ｎ）、イソシアナト（−Ｏ−Ｎ+≡Ｃ-）、イソチオシアナト（−Ｓ−Ｃ≡Ｎ）、アジド（−Ｎ＝Ｎ+＝Ｎ-）、ホルミル（−（ＣＯ）−Ｈ）、チオホルミル（−（ＣＳ）−Ｈ）、アミノ（−ＮＨ2）、一及び二（Ｃ1〜Ｃ24アルキル）置換アミノ、一及び二（Ｃ5〜Ｃ20アリール）置換アミノ、Ｃ2〜Ｃ24アルキルアミド（−ＮＨ−（ＣＯ）−アルキル）、Ｃ6〜Ｃ20アリールアミド（−ＮＨ−（ＣＯ）−アリール）、イミノ（−ＣＲ＝ＮＨ、式中Ｒは水素、Ｃ1〜Ｃ24アルキル、Ｃ5〜Ｃ20アリール、Ｃ6〜Ｃ24アルカリル、Ｃ6〜Ｃ24アラルキル等）、アルキルイミノ（−ＣＲ＝Ｎ（アルキル）、式中Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル、アラルキル等）、アリールイミノ（−ＣＲ＝Ｎ（アリール）、式中Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル等）、ニトロ（−ＮＯ2）、ニトロソ（−ＮＯ）、スルホ（−ＳＯ2−ＯＨ）、スルホナト（−Ｓ2−Ｏ-）、Ｃ1〜Ｃ24アルキルスルファニル（−Ｓ−アルキル；「アルキルチオ」とも称される）、アリールスルファニル（−Ｓ−アリール；「アリールチオ」とも称される）、Ｃ1〜Ｃ24アルキルスルフィニル（−（ＳＯ）−アルキル）、Ｃ5〜Ｃ20アリールスルフィニル（−（ＳＯ）−アリール）、Ｃ1〜Ｃ24アルキルスルホニル（−ＳＯ2−アルキル）、Ｃ5〜Ｃ20アリールスルホニル（−ＳＯ2−アリール）、ホスホノ（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2）、ホスホナト（−Ｐ（Ｏ）（Ｏ-）2）、ホスフィナト（−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−））、ホスホ（−ＰＯ2）、ホスフィノ（−ＰＨ2）、これらの誘導体、及びこれらの組合せ。
【００４０】
医薬組成物
一実施形態において、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは医薬組成物中に含まれ得る。医薬組成物は、静脈内、皮下、及び筋肉内等の注射可能な投与経路に適するように製剤化され得る。投与は、腎臓内、又は膀胱内、又は尿道内、又はそのあらゆる血管の上流への投与であり得る。
【００４１】
一実施形態において、シクロピロクス又はシクロピロクスオラミンは医薬組成物中に含まれ得る。医薬組成物は、静脈内、皮下、及び筋肉内等の注射可能な投与経路に適するように製剤化され得る。一例では、シクロピロクス又はシクロピロクスオラミン又はＣＰＸ−ＰＯＭは、膀胱癌又はその近接にデポ剤として投与され得る高分子担体等の局所送達系に含まれ得る。高分子担体は、局所部位に送達可能であるナノ粒子、微小粒子、ヒドロゲル、又は他のものであり、シクロピロクス又はシクロピロクスオラミン又はＣＰＸ−ＰＯＭが膀胱内注入を介して膀胱癌細胞に局所的に送達されることを可能にし得る。送達系は、生分解性送達系であるか、又はそれからの作用剤の拡散を可能にし得る。
【００４２】
一実施形態において、医薬組成物は、本明細書において記載されるようなシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを含み得る。例えば、医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体を含み得る。シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは高度に水溶性であるため、薬学的に許容し得る担体は、水を含み得る。しかし担体は、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを投与するために、それが投与されるヒト又はその細胞などの対象の水性環境に到達するように、十分であり得る。
【００４３】
一実施形態において、医薬組成物は、約０．７７％超の、より好ましくは約１％超の、又は最も好ましくは約２％超の量で存在する、シクロピロクス、又はシクロピロクスオラミン、又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを含み得る。
【００４４】
一実施形態において、医薬組成物は水を担体として含み得る。
【００４５】
一実施形態において、シクロピロクス、又はそのオラミン、又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、シクロピロクス、又はそのオラミンの既知の送達法に従って送達され得る。しかし、膀胱癌細胞への直接的な局所投与が有利であり得る。同様に、注射による投与経路、例えば静脈内、皮下及び筋肉内投与が好適であり得る。
【００４６】
本明細書において記載される組成物は、対象に投与することができる薬学的に許容し得る組成物の調製のための既知の方法により調製され得る。その結果、有効量の活性物質が薬学的に許容し得るビヒクルとの混合物において組み合わされる。好適なビヒクルは、例えばRemington's Pharmaceutical Sciencesにおいて記載される。これに基づいて、当該組成物は、必ずしもではないが、１又は２以上の薬学的に許容し得るビヒクル又は希釈剤と組み合わされた、そして好適なｐＨ及び生理液との等張性を有する緩衝化溶液中に含まれた、当該物質の溶液を含む。
【００４７】
一実施形態において、シクロピロクス、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの有効量は、対象の体重１ｋｇあたり約０．０１〜約２００ｍｇの範囲内である。一態様において、シクロピロクス、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの有効量は、体重１ｋｇあたり約０．５〜約５０ｍｇの範囲内である。シクロピロクス、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇのシクロピロクス、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを含む注射用投与形態へと調製することができる。一態様において、組成物は、対象の体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜約２００ｍｇのシクロピロクス、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを含み得、液体の投与形態、又は注射可能な投与量へと製剤化することができる。しかし、他の量が使用され得る。例えば、当該薬物は、広範囲の用量で投与され得、例えば、０．５ｍｇ／ｍ2〜３００ｍｇ／ｍ2、１ｍｇ／ｍ2〜２００ｍｇ／ｍ2、５ｍｇ／ｍ2〜１５０ｍｇ／ｍ2、１０ｍｇ／ｍ2〜７５ｍｇ／ｍ2又は任意の好適な量で投与され得る。
【００４８】
一実施形態において、本発明は、白血病性障害 (leukemic disorder)の処置のために設計された医薬組成物を含み得る。かかる組成物は、経口で、又は静脈内注射、皮下注射若しくは筋肉内注射によって投与され得る、有効量のシクロピロクス、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを含み得る。
【００４９】
医薬組成物は、限定することなく、凍結乾燥粉末、又は水性若しくは非水性の無菌の注射可能溶液若しくは懸濁液を含み、それはさらに、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び、組成物を意図されるレシピエントの組織又は血液と実質的に適合性にする溶質を含んでもよい。かかる組成物中に含まれ得る他の成分は、例えば水、界面活性剤（例えばTween（登録商標））、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油を含む。即時型注射溶液及び懸濁液は、無菌の粉末、顆粒、錠剤、又は濃縮溶液若しくは懸濁液から調製されてもよい。組成物は、例えば、限定するものではないが、患者への投与の前に無菌の水又は食塩水を用いて再構成される凍結乾燥粉末として供給されてもよい。
【００５０】
好適な薬学的に許容し得る担体は、本質的に化学的に不活性であり非毒性の組成物であって、医薬組成物の生物学的活性の有効性に干渉しないものを含む。好適な薬学的担体の例は、限定されないが、水、食塩水溶液、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、ジオレシル−ホスホチジル−エタノールアミン（DOPE）及びリポソームを含む。かかる組成物は、患者への直接投与のための形態を提供するために、化合物の治療有効量を、担体の好適な量と共に含むべきである。
【００５１】
本明細書において記載される、シクロピロクス、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ組成物は、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、眼窩内投与、眼内投与、脳室内投与、関節内投与、脊髄内投与、大槽内投与、腹腔内投与、鼻内投与、エアロゾル投与、経皮投与又は経口投与により、投与することができる。一般的な担体又は賦形剤を、かかる投与の経路のために設計された医薬組成物を調製するために使用し得る。
【００５２】
別の態様は、本明細書において記載される組成物と、それと組み合わせて、本明細書において記載されるもののようなシクロピロクスが有効である障害の処置のためのその使用のための説明書とを含む、市販用パッケージを提供する。例えば、パッケージは、かかる処置を必要とする対象において急性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病などの白血病性障害を処置するために好適な量を含み得る。別の実施形態において、市販用パッケージは、慢性骨髄性白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫の処置のための投与及び／又は治療計画についての説明書を含み得る。別の実施形態は、本明細書において記載される組成物と、それと組み合わせて、白血病細胞などの白血病性障害細胞において、細胞死を引き起こす、及び／又は生存活性若しくは生存レベルを阻害するための説明書とを含む、市販用パッケージを提供する。これはまた、シクロピロクス、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを用いる、膀胱癌の処置と共に提供され得る。
【００５３】
一実施形態において、組成物は、オラミンを含まない。実際、プロドラッグはオラミンを含まなくてもよい。したがって、当該組成物は、シクロピロクスオラミン又はその誘導体を含まなくてもよい。一実施形態において、組成物は、プロドラッグ部位を欠くシクロピロクスを含まなくてもよい。
【００５４】
一実施形態において、シクロピロクス、シクロピロクスオラミン又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、治療としての使用のための治療有効量で存在し得る。例えば、治療有効量は、以下の１又は２以上のために十分であり得る：真菌の処置における使用のため；癌（膀胱癌又は他の癌）の処置における使用のため；皮膚炎の処置における使用のため；ＤＮＡ修復、細胞分裂又は細胞における核内輸送の妨害のため；表在性真菌症の処置における使用のため；抗炎症剤としての使用のため；足白癬、股部白癬及び体部白癬、紅色白癬菌、毛瘡白癬菌、有毛表皮糸状菌及びイヌ小胞子菌、カンジダ症（モニリア症）、カンジダ・アルビカンス、癜風（粃糠疹）又は癜風菌の１又は２以上の処置における使用のため；急性骨髄性白血病又は急性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫、又は他の処置における使用のため；並びに、ＨＩＶを含むウィルス感染の阻害、処置及び／又は予防のため。同様に、当該処置は、任意の好適な癌、例えば膀胱癌の処置に使用され得る。
【００５５】
合成
一般的に、シクロピロクスが得られた後に、当該シクロピロクスは、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを製造するために本明細書に記載される反応プロトコルを通して反応され得る。同様に、シクロピロクス誘導体が得られた後に、当該シクロピロクス誘導体は、本明細書に記載される合成プロトコルに従って反応され得る。ここで、シクロピロクス誘導体試薬は、対応するシクロピロクス−ＰＯＭ誘導体プロドラッグをもたらす。一部の場合において、シクロピロクス又はその誘導体は、オラミン塩などの塩として得ることができる。したがって反応スキームは、ＰＯＭプロドラッグ部分と複合体化する前にシクロピロクスを脱塩することを含み得る。
【００５６】
化学反応及び対応する反応物の図面及び関連する以下の説明において、化学物質を記載するために略語を用い、これらの略語は、以下のとおり定義される：ＥＤＡＣは、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩であり；ＤＩＡＤは、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートであり；ＢＢＤＩは、１−ｔｅｒｔ−ブトキシ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１，２−ジヒドロイソキノリンであり；ＤＩＣＤは、ジイソプロピルカルボジイミドであり；ＤＢＰは、ジベンジルホスフェートである。
【００５７】
一実施形態において、本発明は、６−シクロヘキシル−１−ヒドロキシ−４−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オンを調製するための方法を提供し、当該方法は、図１において示すような反応スキーム１を含み得る。スキーム１の反応は、シクロピロクスを、そのオラミン塩から調製する。簡単に述べると、シクロピロクスを得るために、シクロピロクスオラミン（５ｇ、１８．６ｍｍｏｌ）を、２ＮのＨＣｌ中に溶解し、ＥｔＯＡｃで抽出し、ヘキサンで沈殿させることができる（約８４％の収率）。
【００５８】
一実施形態において、本発明は、６−シクロヘキシル−１−ヒドロキシ−４−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オンのプロドラッグの調製における使用のための試薬を調製する方法を提供し、当該方法は、図２において示すような反応スキーム２を含み得る。反応スキーム２は、ＰＯＭプロドラッグ部分の試薬の調製のための試薬を提供し、これは、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（クロロメチル）ホスフェートである。簡単に述べると、ジ−ｔｅｒｔホスフェートを形成させるために、カリウムジ−ｔｅｒｔホスフェート（５ｇ、２０ｍｍｏｌ）を、最少量の冷水中に溶解し、沈殿を形成させるために６ＮのＨＣｌを一滴ずつ添加し、次いで、沈殿物を冷水で洗浄し、これを次いで、濾過して真空中で乾燥させる。ジ−ｔｅｒｔ−ホスフェート（４ｇ、１９ｍｍｏｌ）を、次いで、約１００ｍＬのアセトン中で、ｐＨが約７に達するまでテトラメチルアンモニウムヒドロキシドを一滴ずつ添加しながら溶解し、次いで、溶媒を除去して真空中で乾燥させ、テトラ−メチルアンモニウムジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフェートを生成する。テトラ−メチルアンモニウムジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフェート（５．１１ｇ、１８ｍｍｏｌ）を、次いで、約１５０ＭＬのＤＭＥ中でヨードクロロメタン（ＣＨ2ＣｌＩ）（２５ｇ、１４２ｍｍｏｌ、７．８８当量）と反応させ、約２時間還流し、その後、濾過して沈殿物を除去し、溶媒を除去し、次いで、ＥＡ／Ｈ中に溶解し、次いで、シリカ床を通して濾過し、溶媒を除去し、生成物を乾燥して、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（クロロメチル）ホスフェートを得る。生成物を確認するために、ＴＬＣを示す。
【００５９】
一実施形態において、本発明は、６−シクロヘキシル−１−ヒドロキシ−４−メチルピリジン−２（１Ｈ）−オンのプロドラッグ（すなわち、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルホスフェートの２ナトリウム塩）を調製するための方法を提供し、当該方法は、図３において示されるような反応スキーム３を含み得る。反応スキーム３は、シクロピロクスを、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（クロロメチル）ホスフェートと反応させて、２ナトリウム塩を含むシクロピロクス−ＰＯＭを形成する。簡単に述べると、シクロピロクス（０．２５７ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチル（クロロメチル）ホスフェート（０．４５０ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を、５ｍＬ中に溶解し、６０％のＮａＨ（０．６２ｇ、１５４ｍｍｏｌ）と、０℃で３０分間、次いで室温で２時間反応させ、その後、水でクエンチし、次いで、溶媒を除去し、分離カラムを通してＥＡ／Ｈ（１：１）で処理し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェートを得、これをＴＬＣで確認した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェートを、次いで、１０ｍＬのＴＨＦ／ＣＨ2Ｃｌ2（３：１）中で溶解し、室温で２時間インキュベートし、その後、溶媒を除去し、RPHPLCを介して精製し、水／ＡＣＮ中の等モルのＮａ2ＣＯ3を添加し、凍結乾燥して、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルジハイドロゲンホスフェート（１４ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）及び（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルホスフェートの２ナトリウム塩（１５．８９ｍｇ）を得た。これを、本明細書において、一次（primary）シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグと呼ぶ。
【００６０】
図３Ａは、スキーム３Ａとして同定される副反応プロセスを示し、これは、スキーム３の副次的プロセスであり得る。スキーム３Ａは、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェートが、ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ハイドロゲンホスフェートへと変換することを示し、これは、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルジハイドロゲンホスフェートへと変換する。図３Ｂは、これらの化学物質の実体の存在を示す質量分析クロマトグラフを示す。
【００６１】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの遊離酸形態（すなわち、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルジハイドロゲンホスフェート）をまた、図３Ｃにおいて示すように、RPHPLCにより精製した。精製した生成物は、図３Ｃにおいて示される質量分析クロマトグラフを有することが示された。
【００６２】
さらに、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの別の２量体型形態を、図３Ｄにおいて示すように作製した。シクロピロクス−ＰＯＭの２量体プロドラッグを、図３Ｅにおいて示すように、質量分析クロマトグラフにより確認した。
【００６３】
図４は、スキーム４を説明し、これは、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルホスフェートの２ナトリウム塩（これは、図４Ａにおいて示すとおり質量分析クロマトグラフにより確認される）を得るために、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルジハイドロゲンホスフェートを、ナトリウムイオンで塩にするプロセスである。
【００６４】
一実施形態において、本発明は、図５の反応スキーム５において示されるように、ＰＯＭ試薬であるジベンジル（クロロメチル）ホスフェートを調製する方法を含み得る。簡単に述べると、ジベンジル（クロロメチル）ホスフェートを得る（これは、ＴＬＣを介して確認される）ために、ＣＨ2ＣｌＩ（５ｍＬ；６８．６ｍｍｏｌ）を、約２５ｍＬのトルエン中で、銀ジベンジルホスフェート（２ｇ、５２ｍｍｏｌ）と反応させ、約１時間還流し、その後、溶媒を除去して、分離カラムを通して１／１ＥＡ／Ｈにより処理する。
【００６５】
一実施形態において、本発明は、図６のスキーム６により示されるように、プロドラッグであるジベンジル（（（６−シクロヘキシル−４−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェートを調製する方法を提供する。簡単に述べると、ジベンジル（（（６−シクロヘキシル−４−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェートを得るために（これは、示されるとおり、ＴＬＣにより確認される）、シクロピロクス（０．４３１ｇ、２．０８ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのＤＭＦ中で、ジベンジル（クロロメチル）ホスフェート（０．９２０ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）及び６０％のＮａＨ（０．０９６ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）と共に溶解し、０℃で３０分、次いで室温で１時間インキュベートし、その後水でクエンチする。次いで溶媒を除去して、分離カラムを通してＥＡ／Ｈ（１：１）で処理する。
【００６６】
一実施形態において、図７のスキーム７に示すとおり、ジベンジル（（（６−シクロヘキシル−４−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェートを、（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルホスフェートの２ナトリウム塩へと変換する。簡単に述べると、ジベンジル（（（６−シクロヘキシル−４−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェートを、２５ｍＬのＴＨＦ中で、１００ｍｇのＰｄ／Ｃの存在下において、水素（Ｈ2）下において室温で３時間かけて溶解し、その後溶媒を除去して、生成物をＡＣＮ中で溶解する。次いでＮａ2ＣＯ3水溶液を添加して、凍結乾燥する。生成物は微量の（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルジハイドロゲンホスフェート（約０．２７３ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）であり、主な生成物は（（６−シクロヘキシル−４−メチルピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチルホスフェート２ナトリウム塩（０．３１０ｇ）と決定し、これを、示すとおりＴＬＣを介して確認した。
【００６７】
一実施形態において、図８の反応スキーム８において示すとおり、ＰＯＭ試薬であるジベンジル（クロロメチル）ホスフェートを調製する別の方法である。簡単に述べると、ジベンジルホスフェート（１０．６ｇ；３８．０８ｍｍｏｌ）及びクロロメチルスルホクロリデート（chloridate）（７．５２ｇ、４５６．６ｍｍｏｌ／１２０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2）を、３２０ｍＬの水及び２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中で、ＮａＨＣＯ3（１２．８０ｇ、１５２．３２ｍｍｏｌ）及びｎ−Ｂｕ4ＮＨＳＯ4（１２．９４ｇ、３８．０８ｍｍｏｌ）と共に、０℃から室温まで一晩かけて溶解し、次いで、分離カラムを通して１／２のＥＡ／Ｈ、ＥＡで処理する。この反応は、約４８％のジベンジル（クロロメチル）ホスフェート（６ｇ）を生じ、これは、示すとおりＴＬＣで確認される。
【００６８】
一実施形態において、本発明は、プロドラッグであるジベンジル（（（６−シクロヘキシル−４−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェートを調製する別の方法を提供し、これは、図６のスキーム６により示される。簡単に述べると、６７％のジベンジル（（（６−シクロヘキシル−４−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）オキシ）メチル）ホスフェート（１．６１６ｇ）を得るために、シクロピロクス（１ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬのＤＭＦ中で、ジベンジル（クロロメチル）ホスフェート（２ｇ、６．１２ｍｍｏｌ）及び６０％のＮａＨ（０．３７５ｇ）と共に溶解し、０℃で３０分、次いで室温で１時間インキュベートし、その後水でクエンチする。次いで溶媒を除去し、生成物をＥｔＯＡｃ中で溶解し、水で洗浄し、溶媒を除去し、分離カラムを通してＥＡ／Ｈ（１：２）で、及びRPHPLCで処理する。
【実施例】
【００６９】
現在、本発明の化合物が、膀胱癌の治療に有用であることが分かっている。膀胱癌はＮＭＩＢＣ（筋層非浸潤性膀胱癌）及びＭＩＢＣ（筋層浸潤性膀胱癌）、並びに他の膀胱癌を包含し得る。図９〜２８を参照されたい。化合物（式１０）は抗膀胱癌活性を有することが示されている。全身注射（例えば、静脈内、筋肉内、皮下等）によりプロドラッグを与えることで、活性な、臨床的に意義のある濃度（例えば、有意濃度）のシクロピロクス活性薬剤の、尿路全体への選択的送達がもたらされる。これにより筋層非浸潤性膀胱癌又は表在性膀胱癌が治療され得る。
【００７０】
プロドラッグは、膀胱癌内の幹細胞を効果的に抑制し、Ｎｏｔｃｈ−１シグナル経路を特異的に標的とする活性シクロピロクス化合物に変換する。前記化合物の存在下において、シグナル伝達が有意に抑制されること、及び、前記化合物がこの機構を通じて膀胱癌に影響を与えていること、が示されている。Ｎｏｔｃｈの抑制は、膀胱癌及びＮｏｔｃｈシグナル伝達が活性な他の癌（例えば結腸がん、骨肉腫）を阻害する、前記化合物の顕著な活性である。
【００７１】
ＮＭＩＢＣは、尿路（例えば、尿と接触する内壁）の外膜（尿路上皮）の癌から始まり、外膜上の癌細胞は膀胱の筋肉内への内向きの浸潤を開始し、その後、前記がんは身体中に拡散する。しかし、シクロピロクスの活性及びプロドラッグとしての送達は、前記薬剤がこの特定の癌の浸潤性に関連する経路を阻害することを可能にする。
【００７２】
一実施形態において、プロドラッグは、白血病、リンパ腫、結腸直腸癌、肝細胞腫、横紋筋肉腫、及び乳癌細胞系統、並びに他の癌、例えば、限定はされないが、膵癌、腎（ｒｅｎｅｌ）細胞癌、造血器腫瘍、子宮頸癌、骨髄腫、及び可能性のある他の癌、を治療するシクロピロクスの抗癌活性を与えるために投与され得る。
【００７３】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、シクロピロクスの活性に基づいて、オートファジーの誘導、ｍＴＯＲの阻害、サイクリンＡ、Ｂ１、Ｄ１及びＥ並びにＣＤＫ２及びＣＤＫ４、並びに他の活性の下方制御のためにも使用され得る。
【００７４】
プロドラッグで膀胱癌を治療する方法は、膀胱癌の治療のためにシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（例えば、プロドラッグ）を全身投与することを含み得るが、これは、本明細書に記載されるもの等の驚くべき且つ予想外の結果を提供する。
【００７５】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの全身投与は、臨床的に有意な濃度の活性なシクロピロクス（遊離酸）抗癌剤の尿路全体への選択的送達をもたらすことが分かっている。
【００７６】
筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＭＩＢＣ、以前は表在性膀胱癌と称された）の現在の治療法は膀胱内注入を介したものである。膀胱内注入以外のいずれかの経路によって投与される、ＮＭＩＢＣに対する薬物療法は現在のところ存在しない。抗癌剤の膀胱内注入は、患者が膀胱内に液体を保持可能な期間（例えば、２時間）、膀胱癌を抗癌剤に暴露するのみである。第二に、膀胱内注入は、解剖学的に膀胱の上部に位置する尿路全体、すなわち尿管、集尿系、及び腎臓、に薬剤を送達しない。ＮＭＩＢＣ患者の１０％以下が上部尿路疾患を有する。それと異なり、本発明は、活性薬剤を尿路全体に与える全身送達（例えば、注射）を含む。しかし、治療薬は膀胱内注入（ｂｌａｄｄｅｒ  ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）によって送達されてもよい。
【００７７】
膀胱癌は２つの疾患、ＮＭＩＢＣ及び筋層浸潤性膀胱癌（ＭＩＢＣ）、として現れる。新たに診断された膀胱癌患者のおよそ３／４はＮＭＩＢＣを呈する。ＮＭＩＢＣは、膀胱筋内に浸潤する際、ＭＩＢＣになる。ＭＩＢＣはしばしば転移し、化学療法薬剤の全身投与を必要とする。驚くべきことに、そして予想外に、シクロピロクスがＮＭＩＢＣ及びＭＩＢＣ膀胱癌において抗癌活性を有しており、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの全身送達がこれらの膀胱癌細胞にシクロピロクスを与えることが、現在示されている。シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ送達由来のシクロピロクスは、特徴がはっきりしたＮＭＩＢＣ及びＭＩＢＣ細胞株における、細胞増殖、コロニー形成、及びスフェロイド形成を阻害する。シクロピロクスの殺真菌活性は鉄をキレート化し、鉄依存性の細胞内プロセスを妨げる能力を介したものであるが、シクロピロクスのインビトロ抗癌活性は市販の鉄キレート剤に非依存である。シクロピロクスがＮｏｔｃｈ−１シグナル経路を阻害することが初めて示されたが、このＮｏｔｃｈ−１シグナル経路は、浸潤性膀胱癌において過剰発現されていると最近特定された経路であり、いくつかの癌にわたって癌幹細胞において過剰発現される経路である。したがって、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、膀胱癌の全ての形態の治療で、及びＮｏｔｃｈシグナル経路が活性である多くの様々な癌の癌幹細胞において、使用することができる。
【００７８】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは尿路全体に臨床的有意濃度のシクロピロクスを選択的に送達する。
【００７９】
以下を実証する、マウス、ラット及びイヌにおける一連の薬物動態研究を行った。シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは全身投与後に迅速且つ完全に血漿から消失する。シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの全身投与後のシクロピロクスの生物学的利用能は優れており、マウス、ラット及びイヌにおいて７７〜１３７％の範囲である。シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの全身投与後、この用量（ｄｏｓｅ）は、シクロピロクス及びシクロピロクスのグルクロニド代謝産物（ＣＰＸ−Ｇ）の腎クリアランスにより身体から排泄される。薬剤排泄はシクロピロクスオラミン（ＣＰＸ−Ｏ）について報告されたものと一致する。最大耐用量を十分に下回るシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの用量において、ＮＭＩＢＣ細胞株及びＭＩＢＣ細胞株において決定されたインビトロＩＣ５０値を超える、シクロピロクスの尿中濃度が認められる。
【００８０】
マウス、ラット及びイヌにおいて薬物動態研究が行われ、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグが迅速且つ完全に代謝されてシクロピロクスが形成されることが示された。シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの迅速な代謝がインビボで起こると、シクロピロクスが形成される。マウス、ラット、及びイヌにおいて、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグは、ＩＶ投与後に血漿中にも尿中にも検出されない。マウス、ラット及びイヌにおいて、血漿中シクロピロクス濃度はＩＶボーラス投与直後（５分以内）に最大となり、その後下降する。ＰＯＭ部分が血液中を循環するホスファターゼによって代謝されることは、十分に理解されることである。シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの完全な代謝により、シクロピロクスが形成される。シクロピロクスオラミンのＩＶボーラス投与との比較において、マウスへのシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグのＩＶ投与後、シクロピロクスは完全な生物学的利用能を有する。
【００８１】
マウスにおけるクロピロクス（Ｃｌｏｐｉｒｏｘ）−ＰＯＭプロドラッグ薬物動態
【００８２】
試験２０８−０２：マウスにおけるシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの経口投与後及び静脈内投与後のシクロピロクスの生物学的利用能
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの薬物動態学的な原理証明を、マウスにおいて、処置群あたり、時点当たり６匹のマウスへの、それぞれ３０ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口的及び静脈内に与えられたシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ及びシクロピロクスオラミンの投与後に、決定した。この試験の目的は、さらなる癌原理証明試験の支持として、ＣＰＸ−ＰＯＭ代謝の速度及び程度を特徴付け、経口投与されたシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの実行可能性を評価することであった。
【００８３】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの経口投与及びＩＶ投与後、プロドラッグは血漿中に検出されなかった。さらに、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグのＩＶ投与後のシクロピロクスのＡＵＣは、シクロピロクスオラミンのＩＶ投与との比較で１３７％であった。これは、おそらくは血漿中ホスファターゼによるプロドラッグのシクロピロクスへの代謝が、迅速なだけでなく完全であることを示している。シクロピロクスオラミン（２１％）及びシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（１２％）の投与後のシクロピロクスの経口生物学的利用能は低く、これは、この投与経路に関連した初回通過効果が著しいことを示している。
【００８４】
図１２Ａは、１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  シクロピロクスオラミン（ＣＰＸ−Ｏ）、１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）、３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＯ  ＣＰＸ−Ｏ及び３０ｍｇ／ｋｇ  ＰＯ  ＣＰＸ−ＰＯＭの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示している。表１Ａは得られた薬物動態データの要約である。
【表１】
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【００８５】
試験１１１７７：マウスにおけるＩＰ投与後のシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの絶対生物学的利用能
【００８６】
マウスにおいて、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）の１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ投与後及び５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ投与後に、シクロピロクス（ＣＰＸ）の血漿中及び尿中薬物動態を特徴付けした。この試験の目的は、ＩＰ投与後のシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの絶対的生物学的利用能を特徴付けして、膀胱癌の有効モデルにおける前臨床原理証明試験でのＩＰ投与を支持することであった。さらに、ＣＰＸ−ＰＯＭのＩＰ投与後のＣＰＸへの尿路暴露を説明するために、ＣＰＸ及びシクロピロクスグルクロニド（ＣＰＸ−Ｇ）の尿中排泄を特徴付けした。それぞれ３０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスから成る２つの処置群をＣＰＸ−ＰＯＭで処置した。投与に先立ち、及び投与後６時間に亘って、それぞれ選択された血漿採取時点において、３匹の動物を屠殺した。生物分析用に血液（血漿）を心穿刺により採取した。血漿を各時点においてプールした。さらに、それぞれ６匹のマウスから成る２つの群に、１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ及び５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ  ＣＰＸ−ＰＯＭを投与して、尿中薬物動態を特徴付けした。マウスを代謝ケージ内に入れ、投与後２４時間に亘って尿を採取した（０〜８時間及び８〜２４時間の尿採取間隔）。血漿と同様に、６匹の動物から採取した尿試料を生物分析用にプールした。
【００８７】
ＣＰＸ−ＰＯＭの１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ及び５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ単回投与量は耐容性良好であった。ＩＰ  ＣＰＸ−ＰＯＭの絶対的生物学的利用能は６５％であった。先の薬物動態学的な原理証明試験と一致して、ＣＰＸ−ＰＯＭはいずれの処置後も血漿中２５ｎｇ／ｍＬのＢＱＬにおいて検出不可であった。図１２Ｂに示されるように、ＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ及びＩＰ投与後に、ＣＰＸへの広範囲全身暴露が達成される。ＣＰＸ−ＰＯＭの１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶボーラス投与の後、インビトロＩＣ５０値を数倍超える、８，０９８ｎｇ／ｍＬ（３９μＭ）のピーク血漿中ＣＰＸ濃度値が認められた。５０ｍｇ／ｋｇ  ＣＰＸ−ＰＯＭのＩＰ投与後、投与の０．２５時間後に、４，１２７ｎｇ／ｍＬ（１０．０μＭ）のＣｍａｘ値が認められた。筋層非浸潤性膀胱癌細胞株及び筋層浸潤性膀胱癌細胞株における２μＭ（４１４ｎｇ／ｍＬ）のインビトロＩＣ５０値を前提として、５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ  ＣＰＸ−ＰＯＭはＩＣ５０より５倍高いＣＰＸのＣｍａｘ値を達成する。
【００８８】
得られた血漿中薬物動態データを表２Ａに要約する。先の２０８−０２試験と一致して、ＩＰ投与のＣＰＸの見掛けの消失速度は迅速であり、平均血漿中終末相半減期は１時間未満（０．８８時間）である。この試験でのＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与の後、ＣＰＸの全身クリアランスは、マウスにおいて７，６０５ｍＬ／hr／ｋｇであった。ＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与後のＣＰＸの分布容積はマウスにおいて中程度であり、先のマウス試験よりもまた大きい、およそ９．０Ｌ／ｋｇであった。図１２Ｂは、処置群あたり、時点あたりの３匹のマウスへの１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ及び５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ  ＣＰＸ−ＰＯＭの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示す。
【表２】
2017533952.tif 000018
【００８９】
１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ及び５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ  ＣＰＸ−ＰＯＭの後にマウスにおいて得られた尿中ＣＰＸ薬物動態パラメータを以下の表３Ａにまとめる。ＣＰＸ−ＰＯＭの単回ＩＶ及びＩＰ投与後、用量の１％未満がＣＰＸとして排泄される。しかし、尿中ＣＰＸ濃度は２μＭのインビトロＩＣ５０値を数倍超えていた。ＩＶ投与経路とは対照的に、ＩＰ投与後の投与後２４時間の全体に亘って顕著な尿中ＣＰＸ濃度が認められた。ＣＰＸ−ＰＯＭ用量の２３％〜２６％がシクロピロクスの不活性なグルクロニド代謝産物として排泄された。
【表３】
2017533952.tif 000019
【００９０】
試験１１２０６：マウスにおける単回及び反復ＩＰ投与後のシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの尿中薬物動態
【００９１】
それぞれ６匹のマウスからなる３つの別々の群への５０、１００、及び２００ｍｇ／ｋｇシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）の単回（１日目）及び反復（１０日目）投与（１日１回を１０日間連続）施行後のマウスにおいて、尿中シクロピロクス（ＣＰＸ）薬物動態を特徴付けした。以下の表３Ｂに要約される。この試験は、一連の一日一回のＩＰ投与後のＣＰＸ−ＰＯＭプロドラッグの投与後の尿におけるシクロピロクス暴露を実証することによって、膀胱癌の有効モデルにおけるインビボ前臨床原理証明試験を裏付けるために行われた。５０、１００、及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＰＸ−ＰＯＭの単回及び反復ＩＰ投与後、用量の１％未満が２４時間に亘ってＣＰＸとして排泄された。しかし、シクロピロクスとしての用量回収率（ｄｏｓｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）が低いパーセントであるにもかかわらず、尿中ＣＰＸ濃度は全用量範囲に亘って２μＭのインビトロＩＣ５０値を数倍超過した。この試験で採取されたいかなる尿試料にもＣＰＸ−ＰＯＭは検出されず、このことは、プロドラッグの完全な代謝を示唆している。全用量範囲に亘って、投与された用量のかなりの部分が不活性なシクロピロクスグルクロニド代謝産物として排泄された。これらのデータに基づき、１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇのシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの亜慢性ＩＰ投与計画を、後の膀胱癌の有効モデルにおける原理証明試験用に選択した。
【表４】
2017533952.tif 000020
【００９２】
ラットにおけるシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ薬物動態
【００９３】
試験１０９５４：ラットにおけるシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの静脈内投与後のシクロピロクスの生物学的利用能
ラットにおいて、１０ｍｇ／ｋｇのシクロピロクスオラミン（ＣＰＸ−Ｏ）及びシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）のＩＶ投与後に、シクロピロクス（ＣＰＸ）の血漿中及び尿中薬物動態を特徴付けした。この種（ｓｐｅｃｉｅ）におけるＩＶシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの後のシクロピロクスの生物学的利用能の特徴付けにおいて、静脈内シクロピロクスオラミンを基準として用いた。ＣＰＸ−Ｏ及びＣＰＸ−ＰＯＭの投与後のマウスにおいて認められたＣＰＸの低い経口生物学的利用能を鑑みて、この試験ではこの投与経路を検討しなかった。
【００９４】
ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−Ｏの投与後の得られた平均血漿シクロピロクス濃度−時間プロファイルを、図１３Ａに示す。血漿中シクロピロクス濃度は両方の処置のＩＶ投与後に速やかに下降し、見掛けの排出半減期は１時間未満であった。得られた血漿中シクロピロクス薬物動態パラメータを表４Ａにまとめる。
【００９５】
ＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与の後、ＣＰＸの全身アベイラビリティはシクロピロクスオラミンの静脈内投与との比較で７７％であった。ＩＶボーラス投与の数分以内に採取された少数の血液試料においてプロドラッグの血漿中濃度が認められたが、採取された大部分の試料でＣＰＸ−ＰＯＭは検出されなかった。ＣＰＸ−ＰＯＭは採取されたいかなる尿試料中にも検出されなかった。１０ｍｇ／ｋｇ  ＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与後にＣＰＸへの広範囲の全身暴露が達成され、ＩＶボーラス投与直後の平均初期血漿中シクロピロクス濃度値は９，３１０ｎｇ／ｍＬである。筋層非浸潤性膀胱癌細胞株及び筋層浸潤性膀胱癌細胞株における２μＭ（４１４ｎｇ／ｍＬ）のインビトロＩＣ５０値を前提として、１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭはＩＣ５０よりおよそ２０倍高いＣｍａｘ値を達成する（Ｃｍａｘ＝４５μＭ）。図１３Ａは、処置群あたり６匹のラットへの１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−Ｏの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の片対数プロファイルを示す。
【表５】
2017533952.tif 000021
【００９６】
１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−Ｏ及びＣＰＸ−ＰＯＭの後のラットにおいて得られた尿中ＣＰＸ薬物動態パラメータを以下の表５Ａにまとめる。ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−Ｏの単回ＩＶ投与後、用量の１％未満がＣＰＸとして排泄される。しかし、尿中ＣＰＸ濃度は２  μＭのインビトロＩＣ５０値を超過した。
【表６】
2017533952.tif 000022
【００９７】
試験１１４２８：ラットにおけるシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの皮下投与後及び経口シクロピロクスオラミンの後のシクロピロクスの生物学的利用能
ラットにおいて、２０ｍｇ／ｋｇのシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）のＩＶ投与後、３０ｍｇ／ｋｇのＣＰＸ−ＰＯＭの皮下（ＳＱ）投与後、及び３０ｍｇ／ｋｇのシクロピロクスオラミン（ＣＰＸ−Ｏ）の経口投与後に、シクロピロクス（ＣＰＸ）の血漿中及び尿中薬物動態を特徴付けした。この種におけるＳＱシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの後のシクロピロクスの生物学的利用能の特徴付けにおいて、静脈内ＣＰＸ−ＰＯＭを基準として用いた。注射用ＣＰＸ−ＰＯＭと、オラミン局所的抗真菌性生成物の裏付けとして行われた登録研究を通じてＨｏｅｃｈｓｔ  ＡＧにより作成された前臨床安全性データとの間の薬物動態学的な「橋渡し (bridge)」を確立するために、オラミン塩の投与後のＣＰＸの経口生物学的利用能を決定した。
【００９８】
ＩＶ及びＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭ及び経口投与されたシクロピロクスオラミンの投与後の得られた平均血漿シクロピロクス濃度−時間プロファイルを、図１３Ｂに示す。１０９５４試験と一致して、血漿中シクロピロクス濃度はＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与後に速やかに下降し、見掛けの排出半減期は１時間未満であった。ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭから得られた血漿中シクロピロクス濃度−時間プロファイルはＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭと大きく異なっていた。シクロピロ（ｃｉｃｌｏｐｉｒｏ）のオラミン塩の経口投与後の血漿中シクロピロクス濃度は、比較上かなり低かった。得られた血漿中シクロピロクス薬物動態パラメータを表６Ａにまとめる。
【００９９】
ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭは、８０％において、ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭと比較して優れた生物学的利用能を示した。ＩＶ及びＳＱ投与されたＣＰＸ−ＰＯＭは、２μＭのインビトロＩＣ５０値を数倍超過した血漿中シクロピロクス濃度をもたらした。オラミン塩の経口投与後のシクロピロクスの血漿中シクロピロクス濃度はかなり低かった。経口投与されたこの塩形態の絶対的生物学的利用能は、ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭとの比較において４．６％であった。ＣＰＸ−ＰＯＭはこの試験で採取されたいかなる血液試料にも尿試料にも検出されなかった。図１３Ｂは、処置群あたり６匹のラットへの２０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ、３０ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＱ）ＣＰＸ−ＰＯＭ、及び３０ｍｇ／ｋｇ  ＣＰＸ−Ｏの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示す。
【表７】
2017533952.tif 000023
２０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ、３０ｍｇ／ｋｇ  ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭ、及び３０ｍｇ／ｋｇ  経口ＣＰＸ−Ｏの後のラットにおいて得られた尿中ＣＰＸ薬物動態パラメータを以下の表７Ａにまとめる。ＩＶ及びＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭ投与は、経口投与されたＣＰＸ−Ｏと比較して、より高い尿中シクロピロクス濃度をもたらした。ＩＶ及びＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭ投与はこれらの動物において耐容性良好であり、インビトロＩＣ５０値を数倍超過した尿中シクロピロクス濃度をもたらした。ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭはシクロピロクスの顕著な全身及び尿路暴露をもたらした。
【表８】
2017533952.tif 000024
【０１００】
イヌにおけるシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ薬物動態
試験１０９５３：イヌにおけるシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの静脈内投与後のシクロピロクスの生物学的利用能
ラットにおいて、１０ｍｇ／ｋｇのシクロピロクスオラミン（ＣＰＸ−Ｏ）及びシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）のＩＶ投与後に、シクロピロクス（ＣＰＸ）の血漿中及び尿中薬物動態を特徴付けした。この種におけるＩＶシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの後のシクロピロクスの生物学的利用能の特徴付けにおいて、静脈内シクロピロクスオラミンを基準として用いた。ＣＰＸ−Ｏ及びＣＰＸ−ＰＯＭの投与後のマウスにおいて認められたＣＰＸの低い経口生物学的利用能を鑑みて、この試験ではこの投与経路を検討しなかった。
【０１０１】
図１４は、４匹の雄ビーグル犬への３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−Ｏの投与後の、平均血漿中ＣＰＸ濃度−時間プロファイルを示す。
【０１０２】
ＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与の後、ＣＰＸの全身アベイラビリティは８５％であった。血漿中ＣＰＸ−ＰＯＭ濃度がＩＶボーラス投与後の数分以内に採取されたほんの少数の血液試料において検出されたが、プロドラッグはアッセイされた大部分の血漿試料中に検出されなかった。ＣＰＸ−ＰＯＭはいかなる尿試料中にも検出されなかった。ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭの後の活性薬剤シクロピロクスの絶対的生物学的利用能は良好であり、ＩＶ  ＣＰＸ−Ｏを基準として８５％の値を有していた。プロドラッグの３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ投与は、１４μＭに相当する、２，９０７ｎｇ／ｍＬの平均初期血漿中シクロピロクス濃度を達成した。筋層非浸潤性膀胱癌細胞株及び筋層浸潤性膀胱癌細胞株における２μＭ（４１４ｎｇ／ｍＬ）のインビトロＩＣ５０値を所与として、実測平均Cmax値はＩＣ５０よりもおよそ７倍高い。図１４は、４匹の雄ビーグル犬への３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−Ｏの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示す。
【表９】
2017533952.tif 000025
【０１０３】
３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−Ｏ及びＣＰＸ−ＰＯＭの後のイヌにおいて得られた尿中ＣＰＸ薬物動態パラメータを以下の表９Ａにまとめる。ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−Ｏの単回ＩＶ投与後、用量の１％未満がＣＰＸとして排泄される。しかし、尿中ＣＰＸ濃度は、ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−Ｏの両方の３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ投与において、２μＭのインビトロＩＣ５０値を超過した。不活性なシクロピロクスグルクロニド代謝産物が、尿に排出される主要物質種の代表であった。
【表１０】
2017533952.tif 000026
【０１０４】
試験１１４２９：イヌにおけるシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの皮下投与後及び経口シクロピロクスオラミンの後のシクロピロクスの生物学的利用能
イヌにおいて、３ｍｇ／ｋｇのシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）のＩＶ投与後、９ｍｇ／ｋｇのＣＰＸ−ＰＯＭの皮下（ＳＱ）投与後、及び９ｍｇ／ｋｇのシクロピロクスオラミン（ＣＰＸ−Ｏ）の経口投与後に、シクロピロクス（ＣＰＸ）の血漿中及び尿中薬物動態を特徴付けした。この種におけるＳＱシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの後のシクロピロクスの生物学的利用能の特徴付けにおいて、静脈内ＣＰＸ−ＰＯＭを基準として用いた。注射用ＣＰＸ−ＰＯＭと、オラミン局所的抗真菌性生成物の裏付けとして行われた登録研究を通じてＨｏｅｃｈｓｔ  ＡＧにより作成された前臨床安全性データとの間の薬物動態学的な「橋渡し」を確立するために、オラミン塩の投与後のＣＰＸの経口生物学的利用能を決定した。
【０１０５】
イヌへのＩＶ及びＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭ及び経口投与されたシクロピロクスオラミンの投与後に得られた平均血漿シクロピロクス濃度−時間プロファイルを、図１５に示す。１０９５３試験と一致して、血漿中シクロピロクス濃度はＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与後に速やかに下降し、見掛けの排出半減期は１時間未満であった。ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭから得られた血漿中シクロピロクス濃度−時間プロファイルはＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭと大きく異なっていた。シクロピロ（ｃｉｃｌｏｐｉｒｏ）のオラミン塩の経口投与後の血漿中シクロピロクス濃度は、比較上かなり低かった。得られた血漿中シクロピロクス薬物動態パラメータを表１０Ａにまとめる。
【０１０６】
ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭは、１０６％において、ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭと比較して優れた生物学的利用能を示した。ＩＶ及びＳＱ投与されたＣＰＸ−ＰＯＭは、２μＭのインビトロＩＣ５０値を数倍超過した血漿中シクロピロクス濃度をもたらした。オラミン塩の経口投与後のシクロピロクスの血漿中シクロピロクス濃度はかなり低かった。経口投与されたこの塩形態の絶対的生物学的利用能は、ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭとの比較において１７．４％であった。ＣＰＸ−ＰＯＭはこの試験で採取されたいかなる血液試料にも尿試料にも検出されなかった。図１５は、４匹の雄ビーグル犬への３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ、９ｍｇ／ｋｇ  ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭ、及び９ｍｇ／ｋｇ  経口ＣＰＸ−Ｏの投与後の、平均血漿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間の直線的プロファイルを示す。
【表１１】
2017533952.tif 000027
【０１０７】
３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ  ＣＰＸ−ＰＯＭ、９ｍｇ／ｋｇ  ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭ、及び９ｍｇ／ｋｇ  経口ＣＰＸ−Ｏの後のイヌにおいて得られた尿中ＣＰＸ薬物動態パラメータを以下の表１１Ａにまとめる。ＩＶ及びＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭ投与は、経口投与されたＣＰＸ−Ｏと比較して、比較的より高い尿中シクロピロクス濃度をもたらした（用量調節）。ＩＶ及びＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭ投与はこれらの動物において耐容性良好であり、インビトロＩＣ５０値を数倍超過した尿中シクロピロクス濃度をもたらした。ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭはシクロピロクスの顕著な全身及び尿路暴露をもたらした。
【表１２】
2017533952.tif 000028
【０１０８】
膀胱癌患者の尿におけるシクロピロクスグルクロニドのインビトロ安定性
シクロピロクスグルクロニド（ＣＰＸ−Ｇ）は、ＣＰＸ−ＰＯＭ及びシクロポリクス（cicloporix）のオラミン塩の投与後のマウス、ラット、イヌ及びヒトにおいて観察される主な尿中代謝産物である。ＣＰＸ−Ｇは抗膀胱癌剤としての活性は無い。ＣＰＸ−Ｇはβ−グルクロニダーゼにより代謝されて活性シクロピロクスを形成し、実際には、活性抗膀胱癌剤を再活性化する。ヒト排泄データ［Ｋｅｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．  ３１  （８Ａ）：１３３７−１３５３］、及び、膀胱癌患者が尿中に増加したグルクロニダーゼ活性を有するという証拠［Ｐａｉｇｅｎ，  Ｋ．，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｊ．，  Ｐａｉｇｅｎ  Ｂ．  （１９８４）    Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４４：３６２０−３６２３］に基づき、健常人から採取された対照尿と比較して、膀胱癌患者から得られた尿（１５０μＭの濃度）中のシクロピロクスグルクロニドの安定性を特徴付けるためのインビトロ代謝試験を行った。
【０１０９】
６人のＮＭＩＢＣ患者から得られたプールされた患者尿中でのＣＰＸ−Ｇの６時間のインキュベーションに亘って、膀胱癌患者尿中での１５０μＭ  ＣＰＸ−Ｇの加水分解によって、７．９μＭシクロピロクスの形成（５％の形成率）が生じた。シクロピロクス形成の程度は、健常人から得られた検体を用いた尿中インキュベーションと比較して、膀胱癌患者尿においておよそ１１．６倍高かった。シクロピロクスグルクロニドのβ−グルクロニダーゼ介在性加水分解の割合は、対照尿と比較して、プールされた膀胱癌患者尿において５．６〜１１．５倍の範囲でより高かった。尿中β−グルクロニダーゼ活性は、それぞれＮＭＩＢＣ患者及び健常人から得られた尿において、６９．５Ｕ／ｍＬ及び１．３９Ｕ／ｍＬであった（膀胱癌患者尿中での１１８倍より高い酵素活性）。膀胱癌患者尿中でのＣＰＸ−Ｇの選択的加水分解は、活性抗癌剤シクロピロクスの再活性化をもたらす。
【０１１０】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグのＩＶ投与後のシクロピロクスのヒト尿中濃度の予測
ヒトに経口投与されたシクロピロクスオラミン（ＣＰＸ−Ｏ）は、迅速且つ完全に尿に排泄され、用量の８７％が６時間以内に排泄され、用量のおよそ９５％が薬剤投与の１２時間以内に排泄される［Ｋｅｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．  ３１  （８Ａ）：１３３７−１３５３］。尿において回収される用量の９５％のうち、８３％はシクロピロクス（４％）及びシクロピロクスグルクロニド（７９％）と同定された。ＣＰＸグルクロニドはインビトロにおいて活性を有さない。
【０１１１】
尿中シクロピロクス（ＣＰＸ）濃度−時間データを以下の前提に基づいてシミュレートした：３２ｍｇ／ｍ2  シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）の静脈内投与は耐容性良好である（なお、８０ｍｇ／ｍ2の経口ＣＰＸ−Ｏは一日一回投与された場合に耐容性良好であった）；１０ｍｇ  Ｃ14  ＣＰＸ−Ｏの単回経口投与量の投与後の尿に排泄されたＣＰＸのパーセントと同様に、３２ｍｇ／ｍ2  ＣＰＸ−ＰＯＭの静脈内投与の４％がシクロピロクスとして排泄される；膀胱癌患者の尿においてＣＰＸ−Ｇの５％がＣＰＸに加水分解される；及び、新たに診断された膀胱癌患者に典型的な尿生産速度は１ｍＬ／hr／ｋｇである。図１８は、患者（ｐａｔｅｎｔ）尿及び対照尿におけるプロドラッグからのシクロピロクスの形成を示している。また図１９〜２０も参照されたい。
【０１１２】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグの全身投与はＣＰＸを尿路全体に選択的に送達する
これらの前提に基づいて、シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）のＩＶ及びＳＱ投与が、筋層非浸潤性膀胱癌細胞株においてインビトロＩＣ５０値を数倍超過する尿中ＣＰＸ濃度をもたらすることが予測される。
【０１１３】
ＣＰＸ−ＰＯＭの注射用投与経路は、胃腸毒性及び乏しい経口生物学的利用能を回避するために、経口投与よりも好ましい。一日４回投与の経口シクロピロクスオラミン（ＣＰＸ−Ｏ）によって用量制限胃腸毒性が引き起こされることが分かっている（Ｍｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８９（４）：３６３−３６８，  ２０１４。
【０１１４】
ＮＭＩＢＣ及びＭＩＢＣの治療においての有効な新規治療薬としてのシクロピロクスの役割を理解するために、インビトロ試験を行った。十分に特徴付けされたヒトＮＭＩＢＣ細胞株及びＭＩＢＣ細胞株として、それぞれ２５３ＪＢＶ及びＴ２４を研究した。細胞培地はＣＰＸ−ＰＯＭをシクロピロクス（ＣＰＸ）に代謝するために必要な酵素（ホスファターゼ）を欠いているため、ＣＰＸ−Ｏを細胞培地に添加して膀胱癌細胞株をＣＰＸに暴露することにより、作用機序研究を行った。
【０１１５】
Ｔ２４（ＭＩＢＣ）細胞及び２５３−ＪＢＶ（ＮＭＩＢＣ）細胞における膀胱癌細胞増殖に対するＣＰＸの影響を決定するために、ウェルあたり５，０００個の細胞を９６ウェルプレート上に播種し、一晩増殖させた。次に細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地中の漸増用量のＣＰＸで処理した。処理期間後の細胞増殖の分析は、ヘキソサミニダーゼアッセイによって評価された。簡潔に説明すると、培地を除去し、クエン酸緩衝液（ｐＨ５）（７．５ｍＭ）中のヘキソサミニダーゼ基質溶液、ｐ−ニトロフェノール−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（シグマ・アルドリッチ社）を７５μＬ／ウェルで添加した。プレートを１００％湿度中３７℃で３０分間インキュベートした。５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１１２．５μＬの５０ｍＭグリシン（ｐＨ１０．４）で反応を止めた。吸光度を４０５ｎｍで測定した。実験はｎ＝６で行い、その後少なくとも３回繰り返した。データを対照のパーセントとして解析し、ここで、対照ウェルは等量のＤＭＳＯ単独で処理した。ＩＣ50算出において、薬剤濃度及びヘキソサミニダーゼ活性間のプロットを作成し、そのデータを直線的又は指数関数的に当てはめた。最良当てはめをさらなるデータ処理に使用した。処理の４８時間後に５０％の細胞死をもたらす化合物濃度を決定することにより、ＩＣ50を得た。
【０１１６】
シクロピロクスはＮＭＩＢＣ及びＭＩＢＣにおいて抗癌活性を示す：
シクロピロクス（ＣＰＸ）は膀胱癌細胞増殖を阻害することが分かった。図９、１０、及び１１は、ＣＰＸが膀胱癌細胞株の増殖を阻害することを示している。細胞は、表示用量の化合物と一緒に７２時間までインキュベートされた。ＣＰＸ処理は、Ｔ２４細胞及び２５３ＪＢＶ細胞の両方において、細胞増殖の有意な用量及び時間依存的減少をもたらした。図９及び図１１に示される、この実験から得られた結果は、ＣＰＸが用量及び時間依存的に両細胞株の増殖を有意に抑制したことを示している。この効果は２４時間以内に観察され、その後４８時間に亘って残り続けた。化合物のＩＣ５０値は、２５３ＪＢＶ細胞及びＴ２４細胞それぞれについて、４８時間において２μＭ及び４μＭであると決定された。
【０１１７】
シクロピロクスは２次元及び３次元モデル系において膀胱癌の成長を阻害する：
次に、細胞増殖性アッセイを用いて膀胱癌細胞に対するシクロピロクス（ＣＰＸ）の長期的効果を決定した。このアッセイでは、６ウェルプレートに５００個の生細胞を播種し、一晩増殖させた。次に、細胞を種々の濃度（１及び５μＭ）のＣＰＸの存在下又は非存在下で４８時間インキュベートした。次に、ＣＰＸを含有する培地を除去し、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、完全培地中でさらに１０日間インキュベートした。各処理は３連で行った。得られたコロニーをＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリン中で室温で１０分間固定し、次いでＰＢＳで洗浄した後、クリスタルバイオレットで染色した。コロニーを未処理細胞と比較した。
【０１１８】
図１９〜２０に示されるように、ＣＰＸは対照と比較してコロニーの数及びサイズを抑制したが、このことは、前記化合物との細胞の短期間のインキュベーションが、細胞の生存率に対して長期間の阻害効果を有していたことを示唆している。図１９〜２０はＣＰＸが膀胱癌細胞の成長を阻害することを示している。Ｔ２４及び２５３−ＪＢＶ膀胱癌細胞を播種し、ＩＣ５０濃度のＣＰＸ（表示用量）で４８時間処理した。新鮮な培地に交換し、１０日間増殖させた。コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、未処理細胞と比較した。
【０１１９】
シクロピロクスは膀胱癌スフェロイドを抑制する：
最近の研究において腫瘍内の不均一性が示され、ごく一部の幹細胞が自己複製能を伴って腫瘍内に生じ、分化した子孫を生み出す能力を有することが示された。３Ｄアッセイと称されることもあるスフェロイドアッセイは、インビトロで上皮幹細胞を増殖させる方法として開発されたものであり、現在では、幹細胞活性の標準的な代替レポーターとなっている。前記アッセイ（この場合、ブラドスフェアアッセイ（bladdosphere assay）と称される）は、他の細胞がアノイキスによって死ぬ一方、膀胱癌内に存在するユニークな未分化細胞は浮遊培養において生存するという仮定に基づいている。したがって、ブラドスフェアアッセイにおいてシクロピロクス（ＣＰＸ）の作用を特徴付けた。ここでは、癌細胞が超低結合性プレート内に播種され、得られたスフェロイドが、幹細胞からの成長を表すと考えられる。
【０１２０】
スフェロイドの形成において、細胞を、２０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（インビトロジェン社）、５００ｍＬ当たり１０ｍＬの５０Ｘ  Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社）、ＥＧＦ  ２０ｎｇ／ｍＬ（インビトロジェン社）及び抗生物質及び抗真菌剤溶液を添加したＲＰＭＩ１６４０（メディアテック社（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ））中で培養した。細胞を６ウェル低接着プレート内に低密度（５０００細胞／ｍＬ）で播種した。細胞を漸増濃度のＣＰＸ（細胞増殖アッセイから算出されたＩＣ50（２５３ＪＢＶは２μＭ、Ｔ２４は４μＭ）の０．５倍、１倍、及び２倍）で処理した。７日後、スフェロイドを撮影した（I世代）。二次スフェロイド成長（ＩＩ世代）、続く三次スフェロイド発生（ＩＩＩ世代）のために、対照スフェロイド及びＣＰＸ（１×ＩＣ５０）で処理したスフェロイドを収集、トリプシン処理、及び再播種した。
【０１２１】
図２１はＣＰＸが膀胱癌スフェロイドを抑制することを示している。細胞を超低接着プレート内に播種し、ＣＰＸで処理し、表示用量の化合物と共にインキュベートした。ＣＰＸ処理は、Ｔ２４及び２５３−ＪＢＶ膀胱癌細胞の両方によって形成されるスフェロイド（Ｉ世代）のサイズ及び数の有意な減少をもたらした。ＣＰＸ処理は二次及び三次スフェロイドの成長も有意に減少させた。図２１に示される、この実験から得られた結果は、細胞がＣＰＸで処理された場合に、Ｔ２４及び２５３ＪＢＶ膀胱癌細胞スフェロイドのスフェロイドサイズ及び数に、有意な減少があったことを示している。二次及び三次スフェロイドの発生はＣＰＸ処理によって有意に阻害された。これらのデータは、前記化合物が膀胱癌内の癌幹細胞に影響を与えることを示唆している。図１０も参照されたい。
【０１２２】
シクロピロクスは細胞周期のＳ期で細胞を停止させる：
Ｔ２４細胞における細胞周期進行に対するシクロピロクス（ＣＰＸ）の影響を決定するために、フローサイトメトリーに基づく細胞周期分析試験を行った（データ未記載）。試験により、ＣＰＸがＳ期細胞周期停止を誘導することが示された（データ未記載）。１×ＩＣ５０及び２×ＩＣ５０の濃度において、ＣＰＸは細胞をＧ０／Ｇ１期に停止させる。細胞をＣＰＸで処理し、フローサイトメーターに基づく分析を行った。ＣＰＸ処理はＳ期及びＧ０／Ｇ１期で停止される細胞の割合を有意に増加させた。
【０１２３】
ＣＰＸによってアポトーシスが誘導されることが確定された。次に、前記化合物がアポトーシス経路を介して細胞死を誘導し得るかどうかを決定した。このために、Ｔ２４膀胱癌細胞をＣＰＸ（４μＭ）で処理し、細胞をＦＩＴＣ結合型アネキシンＶで標識して、アポトーシス細胞を検出した。結果を図２２に示すが、これは、ＣＰＸ処理がＣＰＸ誘導性細胞死を意味する高レベルのＦＩＴＣ＋細胞を有していたことを示している。図２２は、ＣＰＸが膀胱癌細胞株において細胞死を誘導することを示している。細胞は、表示用量の化合物と一緒に４８時間までインキュベートされた。ＣＰＸ処理は、アネキシンＶ-ＦＩＴＣ標識細胞の増加から明らかであるように、Ｔ２４細胞における細胞死の有意な増加をもたらした。
【０１２４】
シクロピロクスは癌幹細胞シグナル経路に影響を与える：
シクロピロクス（ＣＰＸ）によって影響を受ける経路を特定するための予備的研究としてＲＴ−ＰＣＲアレイ解析を行った。ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲ  Ａｒｒａｙｓ（ＳＡバイオサイエンス社（SA Biosciences）、米国メリーランド州フレデリック）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いて、発現解析を行った。Ｈｕｍａｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｉｎｄｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＣＲ）  ａｒｒａｙ（カタログ番号ＰＡＨＳ−０１４ＺＡ）を使用した。簡潔に説明すると、ＴＲＩＺＯＬ試薬を用いてＴ２４細胞から単離した全ＲＮＡを、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー（全てインビトロジェン社製、カリフォルニア州カールズバッド）の存在下において、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素で逆転写した。相補ＤＮＡ（２μｇ）を１，２７５μＬのＲＴ２  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＡ−０１０；ＳＡバイオサイエンス社）と混合して、２，５５０μＬの総体積にした。各ウェルに２５μＬのこの混合物（mix）を加えた。ＳＡバイオサイエンス社が推奨する検出プロトコルにしたがってバイオラド社製ＣＦＸ装置上でｑＰＣＲを行った。ｍＲＮＡ発現における変化は対照に対する倍率変化として表した。
【０１２５】
図２３Ａ〜２３ＣはＣＰＸがＣＳＣシグナル経路を阻害することを示している。ＣＰＸ処理はＮｏｔｃｈ及びその下流シグナル伝達タンパク質のｍＲＮＡ発現を有意に減少させた。さらに、ＣＰＸはＴ２４細胞におけるＷｎｔシグナル経路及びＨｅｄｇｅｈｏｇシグナル経路に関与する遺伝子の発現を阻害した。図２３Ａ〜２３Ｃに示すように、ＣＰＸ処理はＮｏｔｃｈ、Ｗｎｔ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ等のＣＳＣシグナル経路に関与する遺伝子の発現（ｍＲＮＡレベル）を有意に減少させた。
【０１２６】
シクロピロクスはＮｏｔｃｈシグナル経路に影響を与える：
シクロピロクス（ＣＰＸ）によって影響を受ける経路を特定するためのＲＴ−ＰＣＲアレイ解析を行った。予備的研究によって、ＣＰＸ処理がＮｏｔｃｈシグナル経路に影響を与えることが特定された。リガンドが隣接細胞上のｎｏｔｃｈ膜貫通受容体と相互作用した際に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は惹起される。これにより、γ−セクレターゼ介在性タンパク質分解によるＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の放出が開始され、これが次に、細胞の核内に移行し、その転写補助因子ＣＢＦ１／ＲＢＰＪと相互作用し、標的遺伝子をトランス活性化して、増殖及び転移の増加をもたらす。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は癌幹細胞の自己複製において決定的な役割を果たすことが示されており、以前の研究によって、ｎｏｔｃｈ経路阻害が幹細胞に基づく治療のための優れた機構になり得ると示唆された。
【０１２７】
以前の研究によって、高レベルのＮｏｔｃｈ１活性が膀胱癌の腫瘍進行と関連していること、及び、Ｎｏｔｃｈ１が膀胱癌治療のための有望な治療標的であり得ることが示された。ウエスタンブロット研究を行って、Ｎｏｔｃｈシグナル経路に関与するタンパク質の発現に対するＣＰＸの影響を検出した。細胞可溶化物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎポリフッ化ビニリデン膜（ミリポア社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）上にブロッティングした。抗体をセル・シグナリング・テクノロジー社（Cell Signaling Technology）（米国マサチューセッツ州ベバリー）、アブカム社（Abcam Inc.）（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）及びサンタクルーズバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology Inc.）（米国カリフォルニア州サンタクルーズ）から購入し、特異的タンパク質を増強化学発光システム（ＧＥヘルスケア社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって検出した。膀胱癌細胞株におけるＣＰＸ処理は、プレセニリン１、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２等のγ−セクレターゼ複合体タンパク質の発現を有意に阻害し、それにより、切断活性化型Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ１）の減少をもたらした。ＣＰＸはＮｏｔｃｈ受容体のリガンドであるＪａｇｇｅｄ１も減少させた。さらに、Ｈｅｓ１及びサイクリン−Ｄ１を含む前記経路の下流標的のレベルもＣＰＸ処理後に有意に阻害された。これらのデータは、ＣＰＸがＮｏｔｃｈ細胞内シグナル伝達経路のタンパク質を有意に阻害し、それによりＣＳＣ成長を阻害することを示唆している。図１６〜１７を参照されたい。
【０１２８】
図１６〜１７は、ＣＰＸがＮｏｔｃｈ１シグナル伝達及びγ−セクレターゼ複合体タンパク質を阻害することを示している。ＣＰＸ処理はＮｏｔｃｈ１活性化及びそのリガンドＪａｇｇｅｄ１を有意に減少させた。また、ＣＰＸ処理は、下流標的タンパク質であるＨｅｓ−１及びサイクリンＤ１を減少させた。さらに、ＣＰＸは、Ｔ２４細胞における、γ−セクレターゼ複合体タンパク質であるプレセニリン１、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２の発現を阻害した。右側にＮｏｔｃｈシグナル経路が示される。
【０１２９】
シクロピロクスはγ−セクレターゼ複合体の不活性化を介して細胞の成長を阻害する：
ＮＩＣＤの異所性発現が細胞増殖のシクロピロクス（ＣＰＸ）介在性阻害を逆行させるかどうかを決定した。この研究のために、Ｔ２４細胞にＮｏｔｃｈ−１細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードするプラスミドＥＦ．ｈＩＣＮ１．ＣＭＶ．ＧＦＰ又は空ベクターＥＦ．ｖ−ＣＭＶ．ＧＦＰ（アドジェン社（Addgene Inc.））を形質移入し、その後ＣＰＸ（４μＭ）で処理した。ヘキソサミニダーゼ（hexoaminidase）アッセイを用いて細胞増殖を検出した。ウエスタンブロット解析によって、Ｔ２４細胞株におけるＮＩＣＤの異所性発現後のＮｏｔｃｈ−１の発現増加が示された。ＮＩＣＤの異所性発現は細胞増殖のＣＰＸ介在性阻害を逆行させた。これらのデータは、ＣＰＸがγ−セクレターゼ複合体を阻害することによりＮｏｔｃｈシグナル伝達に影響を与えることを示唆している。
【０１３０】
Ｎｏｔｃｈ−１発現は腫瘍進行に関連しており、浸潤性膀胱移行細胞癌の発癌及び進行に関与している（J Clin Oncol 30, 2012 (suppl 5; abstr 299)）。Ｎｏｔｃｈ−１は膀胱癌の治療のための治療標的であると示されている（Oncogene (2008) 27, 5132-5137）。Ｎｏｔｃｈ−１シグナル伝達はまた、ＮＭＩＢＣからＭＩＢＣへの進行の有望な診断マーカーであり得る（J Clin Oncol 30, 2012 (suppl 5; abstr 299)）。我々の研究室で作成されたデータは、ＣＰＸが、Ｎｏｔｃｈ−１シグナル経路を抑制することにより、インビトロにおいて膀胱癌の成長を阻害することを示唆している。
【０１３１】
図２４は、ＣＰＸがγ−セクレターゼ複合体タンパク質の不活性化を通じて細胞の成長を阻害することを示している。ＮＩＣＤを発現する細胞をＣＰＸで処理した後、増殖を測定した。ＮＩＣＤの異所性発現は細胞増殖のＣＰＸ介在性阻害を低減した。
【０１３２】
シクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグ（ＣＰＸ−ＰＯＭ）又はシクロピロクスグルクロニド（ＣＰＸ−Ｇ）はインビトロにおいて非常に低い抗癌活性を示す：
【０１３３】
増殖アッセイを行って、インビトロにおいて、ＣＰＸ、ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−グルクロニドの影響を決定し、ＣＰＸとＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−グルクロニドとで比較した。Ｔ２４（ＭＩＢＣ）細胞及び２５３−ＪＢＶ（ＮＭＩＢＣ）細胞における膀胱癌細胞増殖に対するＣＰＸ、ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−グルクロニドの影響を決定するために、ウェルあたり５，０００個の細胞を９６ウェルプレート上に播種し、一晩増殖させた。次に細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地中の漸増用量のＣＰＸ、ＣＰＸ−ＰＯＭ及びＣＰＸ−グルクロニドで処理した。処理期間後の細胞増殖の分析は、ヘキソサミニダーゼアッセイによって評価された。簡潔に説明すると、培地を除去し、クエン酸緩衝液（ｐＨ５）（７．５ｍＭ）中のヘキソサミニダーゼ基質溶液、ｐ−ニトロフェノール−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（シグマ・アルドリッチ社）を７５μＬ／ウェルで添加した。プレートを１００％湿度中３７℃で３０分間インキュベートした。５ ｍＭのＥＤＴＡを含有する１１２．５μＬの５０ｍＭグリシン（ｐＨ１０．４）で反応を止めた。吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【０１３４】
実験はｎ＝６で行い、その後少なくとも３回繰り返した。データを対照のパーセントとして解析し、ここで、対照ウェルは等量のＤＭＳＯ単独で処理した。ＩＣ50算出において、薬剤濃度及びヘキソサミニダーゼ活性間のプロットを作成し、そのデータを直線的又は指数関数的に当てはめた。処理の４８時間 後に５０％の細胞死をもたらす化合物濃度を決定することにより、ＩＣ50を得た。
【０１３５】
この実験から得られた結果は、ＣＰＸが両方の細胞株（Ｔ２４及び２５３ＪＢＶ）の増殖を用量及び時間依存的に有意に抑制することを示している（Ｔ２４細胞及び２５３ＪＢＶ細胞それぞれにおいて、ＩＣ50＝＞４μＭ及び３μＭ）。ＣＰＸ−ＰＯＭは増殖に対して非常に小さな影響を示す（Ｔ２４細胞及び２５３ＪＢＶ細胞それぞれにおいてＩＣ50＝＞４５μＭ及び４８μＭ）が、ＣＰＸ−グルクロニドは両方の細胞において処置の７２時間までいかなる有意な影響も全く示さなかった。この要約の時点で、ＣＰＸ−ＰＯＭがインビトロでＣＰＸを形成するかどうかを評価するための、細胞培養液中でのＣＰＸ−ＰＯＭの化学安定性を評価する実験が進行中である。
【０１３６】
ヒト尿における予想ＣＰＸ濃度は十分な抗癌活性を示す：
【０１３７】
ヒト尿における予想ＣＰＸ濃度が抗癌活性をもたらすのに十分であるかどうかを決定した。膀胱内の環境を模倣するために正常な尿（ＫＵＭＣの生物検体貯蔵所から入手）の存在下で細胞をＣＰＸ処理した。一方、パーセンテージ用量曲線（percentage dose curve）を行って、細胞に対して無毒である、さらなる試験に使用可能な尿の割合を決定した（図２５Ａ）。図２５Ａは細胞に対する正常尿の影響を示している。２５３ＪＢＶ細胞を表示割合の正常尿と一緒に７２時間までインキュベートした。２０％未満の尿中濃度は細胞に対して無毒であることが分かっている。
【０１３８】
２５３ＪＢＶ細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で種々の割合の尿と一緒に１２時間までインキュベートした。１２時間後、培地を１００％完全ＲＰＭＩ培地と交換した。細胞を７２時間まで増殖させた。ヘキソサミニダーゼアッセイを行って、異なる時点（２４時間、４８時間及び７２時間）における尿の影響を決定した。所与の期間（１２時間）細胞に対して有毒でないことが分かったため、２０％の正常尿がさらなる試験に使用可能であると判定される。
【０１３９】
ヒト尿中の予想ＣＰＸ濃度が抗癌活性をもたらすのに十分であるかどうかを決定するために、ＮＭＩＢＣ細胞を正常な尿（完全ＲＰＭＩ培地中２０％の正常尿）中でＣＰＸと一緒にインキュベートした。細胞は５０μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、次に２５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、次に１２．５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、次に６．２５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、次に３．１２５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、その後最後に、１．５６２５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露される。ＣＰＸの影響を、異なるＣＰＸ濃度の、１２時間以上経過後（２４時間、４８時間、及び７２時間）の、ヘキソサミニダーゼアッセイによって決定した。正常尿中のＣＰＸの影響が完全培地中のＣＰＸの影響と比較される。
【０１４０】
この実験から得られた結果は、図２５Ｂに示されるように、ヒト尿中の予想尿中濃度のＣＰＸが細胞の増殖を阻害するのに十分であることを示している。ＣＰＸが１２時間経過後もその抗増殖作用を示しており、作用が７２時間まで継続していることが分かる。
【０１４１】
次に、７２時間まで（３日間処理）毎日処理した後の、Ｔ２４細胞及び２５３ＪＢＶ細胞に対する正常尿中のＣＰＸの影響を決定した。この実験の裏にある意図は、患者の膀胱は予測濃度のＣＰＸに毎日暴露されることになるため、膀胱癌細胞に対するヒト尿中の予測濃度のＣＰＸの影響を理解することである。３セットのプレート、ＣＰＸ（５０〜１．５６２５μＭ）の１日間処理、２日間処理及び３日間処理のそれぞれに１プレート、を使用した。Ｔ２４細胞及び２５３ＪＢＶ細胞を、正常尿（完全ＲＰＭＩ培地中２０％の正常尿）中でＣＰＸと一緒にインキュベートした。１日間処理では、細胞は５０μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、次に２５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、次に１２．５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、次に６．２５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、次に３．１２５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露され、その後最後に、１．５６２５μＭ  ＣＰＸに２時間暴露される。ＣＰＸの影響を、異なるＣＰＸ濃度の、１２時間以上経過後（２４時間、４８時間、及び７２時間）の、ヘキソサミニダーゼアッセイによって決定した。２日間処理では、細胞は５０μＭ〜１．５６２５μＭに２日間暴露され、４８時間及び７２時間の時点においてヘキソサミニダーゼアッセイにより影響が決定された。３日間処理では、細胞は５０μＭ〜１．５６２５μＭに３日間暴露され、７２時間の時点においてヘキソサミニダーゼアッセイにより影響が決定された。
【０１４２】
図２５Ｃは、ヒト尿中での予想ＣＰＸ濃度によるＴ２４細胞の毎日処理が有意な抗癌活性を示すことを示している。Ｔ２４細胞を、正常尿（完全ＲＰＭＩ培地中２０％の正常尿）中でＣＰＸと一緒にインキュベートした。１日処理では、細胞は異なるＣＰＸ濃度（５０μＭ〜１．５６２５μＭ）に１２時間暴露される。ＣＰＸの影響を、異なるＣＰＸ濃度の、１２時間以上経過後（２４時間、４８時間、及び７２時間）の、ヘキソサミニダーゼアッセイによって決定した。２日間処理では、細胞は５０μＭ〜１．５６２５μＭに２日間暴露され、４８時間及び７２時間の時点においてヘキソサミニダーゼアッセイにより影響が決定された。３日間処理では、細胞は５０μＭ〜１．５６２５μＭに３日間暴露され、７２時間の時点においてヘキソサミニダーゼアッセイにより影響が決定された。ＣＰＸと一緒にインキュベートされたＴ２４細胞は、時間依存的な増殖減少を示し、３日間処理された細胞は最大の増殖阻害（２０％）を示した。
【０１４３】
図２５Ｄは、ヒト尿中での予想ＣＰＸ濃度による２５３ＪＢＶ細胞の毎日処理が有意な抗癌活性を示すことを示している。２５３ＪＢＶ細胞を、正常尿（完全ＲＰＭＩ培地中２０％の正常尿）中でＣＰＸと一緒にインキュベートした。１日処理では、細胞は異なるＣＰＸ濃度（５０μＭ〜１．５６２５μＭ）に１２時間暴露される。ＣＰＸの影響を、異なるＣＰＸ濃度の、１２時間以上経過後（２４時間、４８時間、及び７２時間）の、ヘキソサミニダーゼアッセイによって決定した。２日間処理では、細胞は５０μＭ〜１．５６２５μＭに２日間暴露され、４８時間及び７２時間の時点においてヘキソサミニダーゼアッセイにより影響が決定された。３日間処理では、細胞は５０μＭ〜１．５６２５μＭに３日間暴露され、７２時間の時点においてヘキソサミニダーゼアッセイにより影響が決定された。ＣＰＸと一緒にインキュベートされた２５３ＪＢＶ細胞は、時間依存的な増殖減少を示し、３日間処理された細胞は最大の増殖阻害（３５％）を示した。
【０１４４】
この実験から得られた結果は、図２５Ｃ〜２５Ｄに示されるように、ヒト尿中の予想尿中濃度のＣＰＸが時間依存的な細胞増殖減少を示すことを示している。Ｔ２４及び２５３ＪＢＶ等の両方の細胞株において、３日間のＣＰＸ処理はそれぞれ２０％及び３５％の最大増殖阻害を示す。
【０１４５】
図２６Ａ〜２６Ｂは共に、ＣＰＸ−ＰＯＭがＢＢＮ誘導性膀胱腫瘍の膀胱重量を減少させることを示すグラフを含む。１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇの一日一回のＩＰ  ＣＰＸ−ＰＯＭ投与の４週間後、膀胱重量（腫瘍容積の目安）は対照と比較してＣＰＸ−ＰＯＭ処置動物において有意により低かった（ｐ＝０．０１３）。２つのＣＰＸ−ＰＯＭ処置群の間に膀胱重量の有意差は無かった。ＢＢＮ単独を与えられた動物は、対照健常膀胱と比較した場合に、腫瘍の誘導及び成長のために、膀胱重量の増加を示した。ＣＰＸ−ＰＯＭ処置は１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇの両方の処置用量において膀胱重量を有意に減少させた。
【０１４６】
ＣＰＸ−ＰＯＭ処置と腫瘍の病期の間には強い相関関係がある。対照（ＢＢＮ単独）動物から得られた膀胱組織は主に高悪性度（Ｔ３）腫瘍を含んでいたが、一方、ＣＰＸ−ＰＯＭ処置動物はより病期が低い腫瘍への明らかな移行を示した。ＢＢＮ単独群動物のヘマトキシリン−エオシン染色をした膀胱組織切片は非常に高頻度のＴ３病期腫瘍を示す。ＣＰＸ−ＰＯＭ処置膀胱から得られた組織切片は、Ｔ３病期頻度の有意な減少を示したが、これは、ＣＰＸ−ＰＯＭが腫瘍をその早期に停止させることを示している。
【０１４７】
以前の研究によって、高レベルのＮｏｔｃｈ１活性が膀胱癌の腫瘍進行と関連していること、及び、Ｎｏｔｃｈ１が膀胱癌治療のための有望な治療標的であり得ることが示された。ＣＰＸ−ＰＯＭ処置膀胱組織から得られた組織切片は、プレセニリン１等のγ−セクレターゼ複合体タンパク質の発現を有意に阻害し、それにより、切断活性化型Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ１）の減少をもたらした。さらに、Ｈｅｙ１を含む前記経路の下流標的のレベルもＣＰＸ−ＰＯＭ処理後に有意に阻害された。これらのデータは、ＣＰＸ−ＰＯＭがＮｏｔｃｈ細胞内シグナル伝達経路のタンパク質を有意に阻害し、それによりインビボで癌幹細胞（ＣＳＣ）の成長を阻害することを示唆している。
【０１４８】
図２７Ａは、ＣＰＸ−ＰＯＭがインビボにおいてＮｏｔｃｈ１シグナル伝達及びγ−セクレターゼ複合体タンパク質を阻害することを示す画像を含む。ＣＰＸ−ＰＯＭ処置はＮｏｔｃｈ１活性化及びγ−セクレターゼ複合体タンパク質であるプレセニリン１を有意に減少させ、Ｈｅｙ−１等の下流標的タンパク質を減少させる。Ｎｏｔｃｈシグナル経路の阻害が両方のＣＰＸ−ＰＯＭ処置群において認められた。
【０１４９】
図２７Ｂは、ＣＰＸ−ＰＯＭがＢＢＮ誘導膀胱腫瘍モデルにおいてＮｏｔｃｈ下流標的タンパク質であるサイクリンＤ１及びｃ−Ｍｙｃを阻害することを示す画像を含む。ＣＰＸ−ＰＯＭは、サイクリンＤ１及びｃ−Ｍｙｃ等のＮｏｔｃｈ下流標的タンパク質を有意に減少させたが、これは細胞の成長において重要な役割を果たす。したがって、ＣＰＸ−ＰＯＭ処置は、ＢＢＮ誘導性膀胱腫瘍モデルにおいて、Ｎｏｔｃｈ下流標的タンパク質であるサイクリンＤ１及びｃ−Ｍｙｃの阻害ももたらす。これらの下流標的タンパク質は細胞周期を通じた細胞の進行において大きな役割を果たす。結論として、有効な膀胱癌マウスモデルにおいてインビボ前臨床原理証明が確立された。十分な濃度のシクロピロクスが、注射用ＣＰＸ−ＰＯＭ投与の後、定常状態で十分な期間（すなわち、２４時間に亘って）、標的作用部位（すなわち、尿路）において、達成されることが示された。第二に、シクロピロクスが、作用部位において、提唱された標的（例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル経路）と結合（engage）すること証明された。第三に、作用部位におけるシクロピロクス−標的間の関与が、提唱された作用機序（腫瘍サイズ減少、腫瘍病期移行）と一致する薬理的活性をもたらすことが証明された。
【０１５０】
ＣＰＸ−ＰＯＭはインビトロ及びインビボの両方において増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を阻害する。筋層非浸潤性膀胱癌細胞株における、及びＣＰＸ−ＰＯＭ処置膀胱腫瘍組織における、ＰＣＮＡ含量を調べた。ウエスタンブロット研究により、ＣＰＸ−ＰＯＭ処置Ｔ２４細胞におけるＰＣＮＡレベルの時間依存的な減少が示されている。ＣＰＸ−ＰＯＭはインビボにおいてＰＣＮＡのレベルを減少させた。また、研究によって、ｎｏｔｃｈ細胞内経路とＰＣＮＡとの間の正相関が示されている。我々の研究室で作成されたデータは、ＣＰＸ−ＰＯＭが、Ｎｏｔｃｈ−１シグナル経路、Ｎｏｔｃｈ下流標的タンパク質及び増殖性細胞核抗原を抑制することにより、インビボにおいて膀胱癌の成長を阻害することを示唆している。
【０１５１】
図２８は、ＣＰＸ−ＰＯＭがインビトロ及びインビボの両方において増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を阻害することを示す。画像は、ＤＮＡ複製で重要な役割を果たす、ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡと一緒に保持することにおけるＰＣＮＡの役割を説明している。ウエスタンブロット研究は、ＣＰＸ処置Ｔ２４細胞におけるＰＣＮＡレベルの時間依存的な減少を示している。ＣＰＸ−ＰＯＭはインビボにおいてもＰＣＮＡのレベルを減少させた。
【０１５２】
さらに、仮出願からのデータ（本明細書に援用される）は、ＣＰＸがＴ２４細胞株におけるＮｏｔｃｈ経路、Ｗｎｔ経路及びＨｅｄｇｅｈｏｇ経路を抑制すること；ＣＰＸがＴ２４細胞株におけるＮＯＴＣＨ経路関連遺伝子を抑制すること；ＣＰＸがＴ２４細胞株におけるＷｎｔシグナル経路関連遺伝子を抑制すること；並びに、ＣＰＸがＴ２４細胞株におけるＨｅｄｇｅｈｏｇ経路関連遺伝子を抑制すること、を示している。
【０１５３】
本明細書において提供されたデータは、以下の情報形成を提供する。ＰＯＭ部分が血液中を循環するホスファターゼによって代謝されることは、十分に理解されることである。ＣＰＸ−ＰＯＭの完全な代謝が生じて、シクロピロクスが形成される。シクロピロクスオラミンのＩＶボーラス投与との比較において、マウスへのＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与後、シクロピロクスは完全な生物学的利用能を有する。シクロピロクスオラミンのＩＶボーラス投与との比較において、ラットへのＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与後、シクロピロクスの生物学的利用能は７７％である。シクロピロクスオラミンのＩＶボーラス投与との比較において、イヌへのＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与後、シクロピロクスの生物学的利用能は８５％である。ＣＰＸ−ＰＯＭは、プロドラッグのＩＶ、ＳＱ及び経口投与の後、薬物動態研究に参加したマウス、ラット及びイヌの血漿中及び尿中でほとんど検出されなかった。耐容性良好な用量での注射可能な投与経路によるＣＰＸ−ＰＯＭ投与は、報告されたインビトロＩＣ５０値を超過する血漿中及び尿中のシクロピロクス濃度をもたらす。シクロピロクスは、ラット及びイヌにおける皮下投与経路によるＣＰＸ−ＰＯＭの投与後に、生物学的に利用可能である。ＣＰＸ−ＰＯＭの耐容性良好なＩＶ投与の後の血漿中シクロピロクス濃度は、報告されたインビトロＩＣ５０値を超過する。ＣＰＸ−ＰＯＭの耐容性良好なＩＶ及びＳＱ投与の後の血漿中シクロピロクス濃度は、報告されたインビトロＩＣ５０値を超過する。ＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ、ＳＱ及び経口投与の後の尿中シクロピロクス濃度は、マウス、ラット、及びイヌにおける筋層非浸潤性膀胱癌及び筋層浸潤性膀胱癌のインビトロＩＣ５０値を超過する。マウスへの５０、１００及び２００ｍｇ／ｋｇのＩＰ  ＣＰＸ−ＰＯＭ投与は、インビトロＩＣ５０値を数倍超過するシクロピロクスの尿中濃度をもたらす。ＩＶ  １０ｍｇ／ｋｇ及びＩＰ  ５０ｍｇ／ｋｇのＣＰＸ−ＰＯＭ投与は、インビトロＩＣ５０値を数倍超過するシクロピロクスの単回投与尿中濃度をもたらす。ラットへのＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与及びＳＱ投与の後、シクロピロクスの尿中濃度は、耐容性良好な用量の２〜４μＭの範囲のインビトロＩＣ５０値を超過する。イヌへのＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与及びＳＱ投与の後、シクロピロクスの尿中濃度は、耐容性良好な用量の２〜４μＭの範囲のインビトロＩＣ５０値を超過する。
【０１５４】
ヒト尿中の予想ＣＰＸ濃度は、抗癌活性（例えば、膀胱癌又は本明細書に記載の他の癌に対する活性）をもたらすのに十分な濃度である。ヒト尿中の予測濃度のＣＰＸでの毎日処置手順は、細胞の最大阻害を示す。さらに、本発明の化合物は上部尿路疾患の治療に有用である。
【０１５５】
本明細書において提供されるデータは、シクロピロクス、シクロピロクスオラミン、又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグが本明細書に記載の治療に使用可能であることを明確に示している。特に、膀胱癌処置のいずれも、シクロピロクス、シクロピロクスオラミン、又はシクロピロクス−ＰＯＭプロドラッグを用いて実行可能である。
【０１５６】
要約すると、ＣＰＸ−ＰＯＭは、投与後に活性薬剤シクロピロクスに迅速且つ完全にインビボ変換される。マウス試験２０８−０２は、シクロピロクス暴露の程度が、ＩＶでＣＰＸ−ＰＯＭを投与するかシクロピロクスのオラミン塩を投与するかにかかわらず、本質的に同じ（１３７％）であることを示した。ラット試験１０９５４は、シクロピロクス暴露の程度が、ＩＶでＣＰＸ−ＰＯＭを投与するかシクロピロクスのオラミン塩を投与するかにかかわらず、本質的に同じ（７７％）であることを示した。イヌ試験１０９５３は、シクロピロクス暴露の程度が、ＩＶでＣＰＸ−ＰＯＭを投与するかシクロピロクスのオラミン塩を投与するかにかかわらず、本質的に同じ（８５％）であることを示した。また、全ての試験にわたって記載されたように、ＣＰＸ−ＰＯＭは、実際にいかなる試験においても、血漿中でも尿中でも検出できない。これらの試験は、ＣＰＸ−ＰＯＭのＩＶ投与経路が実行可能な経路であることを示している。
【０１５７】
ＣＰＸ−ＰＯＭの皮下投与経路は生物学的に利用可能である。ラット試験１１４２８は、ＣＰＸ−ＰＯＭのＳＱ投与後のシクロピロクスの絶対的生物学的利用能が８０％であり、ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭの後のシクロピロクスの尿中濃度がインビトロＩＣ５０値を超過していたことを示した。イヌ試験１１４２９は、ＣＰＸ−ＰＯＭのＳＱ投与後のシクロピロクスの絶対的生物学的利用能が１０６％であり、ＳＱ  ＣＰＸ−ＰＯＭの後のシクロピロクスの尿中濃度がインビトロＩＣ５０値を超過していたことを示した。これらの試験は、マウス試験２０８−０２と共に、シクロピロクスオラミンの経口生物学的利用能がかなり低いことも示した。この投与経路は、イヌの尿中濃度がより低いこととも関連しており、これにより、皮下投与経路が、特にＣＰＸ−ＰＯＭを反復的に投与することが必要な場合（Ｉ型糖尿病患者によるインスリン投与のような）において、有益であることが証明された。
【０１５８】
膀胱癌の有効なマウスモデルにおいて示されたように、ＣＰＸ−ＰＯＭを用いることで、膀胱癌を治療することが可能であることが、データにより証明された。腹腔内（ＩＰ）投与経路（マウス膀胱癌試験で使用される）が生物学的に利用可能であることが、マウス試験１１１７７により証明された。マウス膀胱癌試験用に選択された投与計画を用いた作用部位（すなわち、尿路）におけるシクロピロクス暴露（例えば、尿中濃度）がインビトロＩＣ５０値を数倍超過したことが、マウス試験１１２０６により証明された。
【０１５９】
ＣＰＸ−ＰＯＭの注射投与（injectable administration）後に、活性薬剤（シクロピロクス）の十分な濃度が作用部位（すなわち、血液、尿）において達成されることが、試験により証明された。一日量１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＰＸ−ＰＯＭが膀胱重量（腫瘍のサイズ及び体積の指標）の有意な減少、並びにより病期が低い腫瘍への移行をもたらしたことが、マウスＢＢＮ試験により証明された。また、ＣＰＸ−ＰＯＭ処置動物から得られた膀胱組織において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が阻害されたこと、及び下流Ｎｏｔｃｈ標的タンパク質が減少したことが、試験により証明された。ＣＰＸ−ＰＯＭ処置動物における膀胱癌組織の分析によって、シクロピロクスが作用部位（膀胱組織）において標的（例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル経路）と結合（engage）することが証明された。膀胱癌組織で見られた作用は、インビトロのＮＭＩＢＣ及びＭＩＢＣヒト細胞株において作成されたデータと一致する。また、ＣＰＸ−ＰＯＭの毎日注射投与が、シクロピロクスが抗癌剤であり、ＣＰＸ−ＰＯＭの注射投与が十分な活性薬剤を作用部位に送達して抗癌反応を生み出すという仮説と一致する薬理的作用（例えば、腫瘍のサイズ及び体積の減少、より低い腫瘍病期）を生み出したことが、試験により証明された。
【０１６０】
用語「アルキル」又は「脂肪族」とは、本明細書において用いられる場合、分枝状又は非分枝状の飽和炭化水素基を指す。必須ではないが、通常は１〜約２４個の炭素原子を含み、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシルなどであり、ならびにシクロペンチル、シクロヘキシルなどのシクロアルキル基を含む。一般的には、これも必須ではないが、アルキル基は、本明細書において、１〜約１８個の炭素原子又は１〜約１２個の炭素原子を含む。用語「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子のアルキル基を意図する。「Ｃ1−Ｃ6アルキル」又は「低級アルキル」として同定される置換基は、１〜３個の炭素原子を含み、かかる置換基は、１又は２個の炭素原子（すなわちメチル及びエチル）を含む。「置換アルキル」は、１又は２以上の置換基によるアルキル置換を指し、用語「ヘテロ原子含有アルキル」及び「ヘテロアルキル」は、以下により詳細に記載するように、少なくとも１つの炭素原子が、ヘテロ原子により置き換えられているアルキルを指す。他に示されない場合は、用語「アルキル」及び「低級アルキル」は、それぞれ、直鎖状、分枝状、環状の、無置換の、置換された、及び／又はヘテロ原子を含有する、アルキル又は低級アルキルを含む。
【０１６１】
本明細書において用いられる用語「アルケニル」は、少なくとも１個の二重結合を含む、直鎖状、分枝状又は環状の、２個〜約２４個の炭素原子の炭化水素基、例えばエテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなどを指す。一般的に、これも必須ではないが、アルケニル基は、本明細書において、２〜約１８個の炭素原子又は２〜１２個の炭素原子を含む。用語「低級アルケニル」とは、２〜６個の炭素原子のアルケニル基を意図し、特定の用語「シクロアルケニル」とは、５〜８個の炭素原子を有する環状アルケニル基を意図する。用語「置換アルケニル」とは、１又は２以上の置換基で置換されたアルケニルを指し、用語「ヘテロ原子含有アルケニル」及び「ヘテロアルケニル」は、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているアルケニルを指す。他に示されない場合、用語「アルケニル」及び「低級アルケニル」は、それぞれ、直鎖状、分枝状、環状の、無置換の、置換された、及び／又はヘテロ原子を含有する、アルケニル及び低級アルケニルを含む。
【０１６２】
本明細書において用いられる用語「アルキニル」は、直鎖状又は分枝状の２〜２４個の炭素原子の炭化水素基であって、少なくとも１個の三重結合を含むもの、例えばエチニル、ｎ−プロピニルなどを指す。一般的に、これも必須ではないが、アルキニル基は、本明細書において、２〜約１８個の炭素原子又は２〜１２個の炭素原子を含む。用語「低級アルキニル」は、２〜６個の炭素原子のアルキニル基を意図する。用語「置換アルキニル」とは、１又は２以上の置換基で置換されたアルキニルを指し、用語「ヘテロ原子含有アルキニル」及び「ヘテロアルキニル」とは、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているアルキニルを指す。他に示されない場合、用語「アルキニル」及び「低級アルキニル」は、それぞれ、直鎖状、分枝状、無置換の、置換された、及び／又はヘテロ原子を含有する、アルキニル及び低級アルキニルを含む。
【０１６３】
本明細書において用いられる用語「アルコキシ」は、単一の、末端のエーテル連結を通して結合したアルキル基を意図する。すなわち、「アルコキシ」基は、−Ｏ−アルキルとして表わすことができ、ここで、アルキルは上で定義したとおりである。「低級アルコキシ」基は、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ基を意図し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブチルオキシなどを含む。「Ｃ1−Ｃ6アルコキシ」又は「低級アルコキシ」として同定される置換基は、本明細書において、１〜３個の炭素原子を含み、かかる置換基は、１又は２個の炭素原子を含む（すなわちメトキシ及びエトキシ）。
【０１６４】
本明細書において用いられる用語「アリール」は、他に特定されない場合、単一の芳香族環、又は共に融合しているか、直接的に連結されているか、又は間接的に連結されている（異なる芳香族環がメチレン又はエチレン部分などの一般的な基に結合している）複数の芳香族環を含む芳香族置換基を指す。アリール基の例として、５〜２０個の炭素原子を含むアリール基、及び５〜１４個の炭素原子を含むアリール基が挙げられる。例示的なアリール基は、１つの芳香族環又は２つの融合した又は連結された芳香族環を含むもの、例えば、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン、ベンゾフェノンなどを含む。「置換アリール」とは、１又は２以上の置換基で置換されたアリール部分を指し、用語「ヘテロ原子含有アリール」及び「ヘテロアリール」とは、以下にさらに詳細に記載するとおり、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているアリール置換基を指す。他に示されない場合、用語「アリール」は、無置換の、置換された、及び／又はヘテロ原子を含有する、芳香族置換基を含む。
【０１６５】
本明細書において用いられる用語「アリールオキシ」は、単一の、末端のエーテル連結を通して結合したアリール基を指し、ここで、「アリール」は、上で定義されるとおりである。「アリールオキシ」基は、−Ｏ−アリールとして表わすことができ、ここでアリールは、上で定義されるとおりである。アリールオキシ基の例は、５〜２０個の炭素原子を含み、アリールオキシ基は、５〜１４個の炭素原子を含む。アリールオキシ基の例として、限定することなく、フェノキシ、ｏ−ハロ−フェノキシ、ｍ−ハロ−フェノキシ、ｐ−ハロ−フェノキシ、ｏ−メトキシ−フェノキシ、ｍ−メトキシ−フェノキシ、ｐ−メトキシ−フェノキシ、２，４−ジメトキシ−フェノキシ、３，４，５−トリメトキシ−フェノキシなどが挙げられる。
【０１６６】
用語「アルカリル (alkaryl)」とは、アルキル置換基を有するアリール基を指し、用語「アラルキル (aralkyl)」とは、アリール置換基を有するアルキル基を指し、ここで、「アリール」及び「アルキル」は、上で定義したとおりである。アラルキル基の例は、６〜２４個の炭素原子を含み、アラルキル基は６〜１６個の炭素原子を含む。アラルキル基の例は、限定することなく、ベンジル、２−フェニル−エチル、３−フェニル−プロピル、４−フェニル−ブチル、５−フェニル−ペンチル、４−フェニルシクロヘキシル、４−ベンジルシクロヘキシル、４−フェニルシクロヘキシルメチル、４−ベンジルシクロヘキシルメチルなどを含む。アルカリル基として、例えば、ｐ−メチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、ｐ−シクロヘキシルフェニル、２，７−ジメチルナフチル、７−シクロオクチルナフチル、３−エチル−シクロペンタ−１，４−ジエンなどが挙げられる。
【０１６７】
用語「環状」とは、脂環式又は芳香族の置換基を指し、これは、置換されていても、置換されていなくても、及び／又はヘテロ原子を含有していてもよく、単環式、二環式又は多環式であってもよい。
【０１６８】
用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、クロロ、ブロモ、フルオロ又はヨード置換基を指す、慣用的な意味において用いられる。
【０１６９】
「ヘテロ原子含有アルキル基」（「ヘテロアルキル」基とも称される）又は「ヘテロ原子含有アリール基」（「ヘテロアリール」基とも称される）などにおける用語「ヘテロ原子含有」とは、１又は２以上の炭素原子が炭素以外の原子、例えば、窒素、酸素、硫黄、リン又はケイ素により、通常は窒素、酸素又は硫黄により置き換えられている、分子、連結又は置換基を指す。同様に、用語「ヘテロアルキル」とは、ヘテロ原子を含有するアルキル置換基を指し、用語「ヘテロ環式」とは、ヘテロ原子を含有する環状の置換基を指し、用語「ヘテロアリール」及び「ヘテロ芳香族」は、それぞれ、ヘテロ原子を含有する「アリール」及び「芳香族」置換基などを指す。ヘテロアルキル基の例は、アルコキシアリール、アルキルスルファニル置換アルキル、Ｎ−アルキル化アミノアルキルなどを含む。ヘテロアリール置換基の例は、ピロリル、ピロリジニル、ピリジニル、キノリニル、インドリル、ピリミジニル、イミダゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリルなどを含み、ヘテロ原子含有脂環式基の例は、ピロリジノ、モルホリノ、ピペラジノ、ピペリジノなどである。
【０１７０】
用語「ヒドロカルビル (hydrocarbyl)」とは、１〜約３０個の炭素原子、又は１個〜約２４個の炭素原子、又は１個〜約１８個の炭素原子、又は約１〜１２個の炭素原子を含む、一価のヒドロカルビルラジカルを指し、直鎖状、分枝状、環状の、飽和、及び不飽和の種、例えばアルキル基、アルケニル基、アリール基などを含む。「置換ヒドロカルビル」とは、１又は２以上の置換基で置換されたヒドロカルビルを指し、用語「ヘテロ原子含有ヒドロカルビル」とは、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているヒドロカルビルを指す。他に示されない限り、用語「ヒドロカルビル」は、置換されている及び／又はヘテロ原子を含有するヒドロカルビル部分を含むものとして解釈されるべきである。
【０１７１】
「置換アルキル」、「置換アリール」などにおけるような「置換 (substituted)」により、前述の定義の一部において言及されるように、アルキル、アリール又は他の部分において、炭素（又は他の）原子に結合した少なくとも１個の水素原子が、１又は２以上の非水素置換基により置き換えられていることが意味される。
【０１７２】
さらに、前述の官能基は、特定の基が許容する場合、さらに、１若しくは２以上のさらなる官能基により、又は、上で特に列挙されたものなどの１若しくは２以上のヒドロカルビル部分により、さらに置換されていてもよい。同様に、上述のヒドロカルビル部分は、１若しくは２以上の官能基、又は、特に列挙されたものなどのさらなるヒドロカルビル部分により、さらに置換されていてもよい。
【０１７３】
用語「置換」が、可能な置換された基のリストの前に現れる場合、それは、当該用語が、その基の全員に適用されることを意図する。例えば、句「置換アルキル、アルケニル及びアリール」は、「置換アルキル、置換アルケニル及び置換アリール」として解釈されるべきである。同様に、用語「ヘテロ原子含有」が、可能なヘテロ原子含有基のリストの前に現れる場合、それは、当該用語が、その基の全員に適用されることを意図する。例えば、句「ヘテロ原子含有アルキル、アルケニル及びアリール」は、「ヘテロ原子含有アルキル、ヘテロ原子含有アルケニル及びヘテロ原子含有アリール」として解釈されるべきである。
【０１７４】
当業者は、本明細書において開示されるこのプロセス及び方法ならびに他のプロセス及び方法、当該プロセス及び方法において実行される機能は、異なる順序において実行してもよいことを理解する。さらに、概説された工程及び操作は、単に例として提供されたものであって、当該工程及び操作の一部は、開示された実施形態の本質を損なうことなく、随意的であっても、より少ない工程及び操作中に組み合わされても、又はさらなる工程及び操作へと拡大されてもよい。
【０１７５】
本開示は、本願において記載される特定の実施形態（これは、多様な態様の説明として意図される）により限定されるべきではない。その精神及び範囲から解離することなく、多くの修飾及び改変を行うことができ、このことは、当業者には明らかであろう。本明細書において列記されるものに加えて、開示の範囲内の機能的に等価な方法及び装置は、前述の記載から当業者には明らかであろう。かかる修飾及び改変は、添付の請求の範囲の範囲内に該当することを意図される。本開示は、添付の請求の範囲が権利を付与される均等物の完全な範囲と共に、かかる請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。本開示は、特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生物学的システムに限定されるものではないことが理解されるべきであり、これらは、無論、変化してもよい。また、本明細書において用いられる用語は、単に特定の実施形態を記載することを目的とするものであって、限定することを意図しない。
【０１７６】
本明細書における実質的に全ての複数形及び／又は単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈又は用途に適切であるように、複数形から単数形へ、及び／又は単数形から複数形へ、翻訳することができる。明確化のために、多様な単数形／複数形の置換が、本明細書において明示的に記載され得る。
【０１７７】
一般的に、本明細書において、及び特に添付の請求の範囲（例えば添付の請求項の主部）において用いられる用語は、一般的に「開放的（open）な」用語として意図されることが、当業者により理解されるであろう（例えば、用語「含んでいる（including）」は、「〜を含んでいるがそれに限定されない」ものとして解釈されるべきであり、用語「有する（having）」は、「少なくとも〜を有する」ものとして解釈されるべきであり、用語「含む（include）」は、「〜を含むがそれに限定されない」として解釈されるべきであるなど）。前置きされる請求項の記述の特定のメンバーが意図される場合、かかる意図は、請求項において明示的に記述され、かかる記述の不在下において、かかる意図は存在しないことが、当業者によりさらに理解されるであろう。例えば、理解の助けとして、以下の添付の請求の範囲は、請求項の記述に前置きして、前置句「少なくとも１の」及び「１又は２以上の」の使用を含んでもよい。しかし、かかる句の使用は、同じ請求項が前置句「１又は２以上の」又は「少なくとも１の」及び「a」又は「an」などの不定冠詞を含む場合であっても（例えば、「a」及び／又は「an」が「少なくとも１の」又は「１又は２以上の」を意味すると解釈されるべきである）、不定冠詞「a」又は「an」による請求項の記述の前置きが、かかる前置的な請求項の記述を含む任意の特定の請求項を、１つのみのかかる記述を含む実施形態に限定するものと暗示するものと解釈されるべきではない。これは、請求項の記述を前置きするために用いられる不定冠詞の使用についても真である。さらに、前置きされた請求項の記述の特定の数が明示的に記述される場合であっても、かかる記述は、少なくともその記述された数であることを意味すると解釈されるべきであることを、当業者は理解するであろう（例えば、最低限の「２つの記述」の記述は、他の修飾語句がない場合、少なくとも２つの記述、又は２又は３以上の記述を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ及びＣなどの少なくとも１」に類似する類句が用いられる場合において、一般的に、かかる構文は、当業者が当該構文を理解する意味を意図する（例えば、「Ａ、Ｂ及びＣなどの少なくとも１を有するシステム」は、限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、及び／又はＡ、Ｂ及びＣを一緒に有するシステムを含む）。「Ａ、Ｂ又はＣなどの少なくとも１」に類似する類句が用いられる場合において、一般的に、かかる構文は、当業者が当該構文を理解するような意味を意図する（例えば、「Ａ、Ｂ又はＣなどの少なくとも１を有するシステム」は、限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、及び／又はＡ、Ｂ及びＣを一緒に有するシステムを含む）。さらに、明細書、請求の範囲又は図面のいずれにおいても、２又は３以上の代替的用語を表わす実質的に全ての離接語及び／又は句は、用語のうちの１つ、用語のうちのいずれか、又は両方の用語を含む可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者により理解されるであろう。例えば、句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むものと理解されるであろう。
【０１７８】
さらに、開示の特徴又は態様がマーカッシュ群により記載される場合、当業者は、当該開示はまた、それにより、当該マーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループにより記載されることを、当業者は理解するであろう。
【０１７９】
当業者により理解されるであろうことだが、任意の及び全ての目的のために、明細書を提供することなどにより、本明細書において開示される範囲はまた、任意の及び全ての可能な部分範囲及びその部分範囲の組み合わせを包含する。任意の列記される範囲は、同じ範囲が少なくとも半等分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分割されることを、十分に記載し、可能にするものとして、容易に理解される。非限定的な例として、本明細書において議論される各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１などへと容易に分割することができる。これもまた当業者により理解されるであろうことだが、「〜まで」、「少なくとも」などの全ての言語は、記述される数を含み、その後に上記のとおり部分範囲へと分割することができる範囲を指す。最後に、当業者により理解されるであろうことだが、範囲は、かかる個々の数を含む。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群とは、１、２又は３個の細胞を有する群を指す。同様に、例えば、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４又は５個の細胞を有する群を指す。
【０１８０】
以上から、本開示の多様な実施形態は、本明細書において説明を目的として記載されており、多様な修飾が、本開示の範囲及び精神から解離することなく行い得ることが、理解されるであろう。したがって、本明細書において開示される多様な実施形態は、限定することを意図されず、真の範囲及び精神は、以下の請求の範囲により示されている。本明細書において記述されるか本明細書において組み込まれる参考文献における全ての参考文献は、その全体において、本明細書において具体的な参照により組み込まれる。
【０１８１】
本特許出願は、２０１３年１０月２１日に出願された米国特許出願第１４／０５９，２８７号を参照により組み込む。当該出願は、２０１１年１２月２日に出願された米国特許出願第１３／３１０，０８７号の分割出願であり、それは２０１０年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６１／４１９，２１８号の利益を主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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