(57)【要約】  本発明は、ヒト染色体の座位１４ｑ３２に位置するマイクロＲＮＡ遺伝子クラスターからのマイクロＲＮＡが、血管の発達およびリモデリングにおいて重要な役割を果たすという知見に基づく。１４ｑ３２マイクロＲＮＡのいずれかのモジュレーターを、血管リモデリングプロセスを調節するための手段として、および／または血管障害または疾患の処置および／または防止において、利用することができる。
2017505771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管リモデリングプロセスの調節に使用するため、および／または血管障害の処置または防止に使用するための、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡの、モジュレーター。
【請求項２】
血管障害が、ヒトまたは動物の身体の任意の血管および／または血管系に影響を与える障害、疾患、症候群および／または状態である、請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のモジュレーター。
【請求項３】
モジュレーターが、１４ｑ３２マイクロＲＮＡ発現のモジュレーターである、請求項１または２に記載の使用のための請求項１または２に記載のモジュレーター。
【請求項４】
モジュレーターが、１４ｑ３２マイクロＲＮＡ発現を増加させるかまたは阻害する／減少させることができる、分子または化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項５】
モジュレーターが、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡの阻害剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜４のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項６】
モジュレーターが、末梢動脈疾患の処置および／または防止、および／または末梢動脈の血管リモデリングプロセスの調節において用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜５のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項７】
モジュレーターが、心血管／冠動脈および／または脳血管の血管リモデリングプロセスの調節において用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項８】
モジュレーターが、心血管／冠動脈および／または脳動脈疾患の処置および／または防止において用いられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜７のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項９】
モジュレーターが、再狭窄および／またはアテローム性動脈硬化の処置および／または防止において用いられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜８のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項１０】
モジュレーターが、心筋梗塞後に起きる血管リモデリングプロセスの調節における使用、および動脈瘤形成の処置および／または防止のためである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜９のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項１１】
モジュレーターが、外科手術または介入の後に起き得る再狭窄の処置および／または防止において用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項１２】
モジュレーターが、高コレステロール血症の処置において用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜１１のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項１３】
プラーク安定性の調節における使用、および／または再狭窄の処置または防止のための、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡの、モジュレーター。
【請求項１４】
モジュレーターが、以下からなる群：
１）マイクロＲＮＡ−２３９２
２）マイクロＲＮＡ−７７０
３）マイクロＲＮＡ−４９３
４）マイクロＲＮＡ−３３７
５）マイクロＲＮＡ−６６５
６）マイクロＲＮＡ−４３１
７）マイクロＲＮＡ−４３３
８）マイクロＲＮＡ−１２７
９）マイクロＲＮＡ−４３２
１０）マイクロＲＮＡ−１３６
１１）マイクロＲＮＡ−３７０
１２）マイクロＲＮＡ−３７９
１３）マイクロＲＮＡ−４１１
１４）マイクロＲＮＡ−２９９
１５）マイクロＲＮＡ−３８０
１６）マイクロＲＮＡ−１１９７
１７）マイクロＲＮＡ−３２３ａ
１８）マイクロＲＮＡ−７５８
１９）マイクロＲＮＡ−３２９−１
２０）マイクロＲＮＡ−３２９−２
２１）マイクロＲＮＡ−４９４
２２）マイクロＲＮＡ−１１９３
２３）マイクロＲＮＡ−５４３
２４）マイクロＲＮＡ−４９５
２５）マイクロＲＮＡ−３７６ｃ
２６）マイクロＲＮＡ−３７６ａ−２
２７）マイクロＲＮＡ−６５４
２８）マイクロＲＮＡ−３７６ｂ
２９）マイクロＲＮＡ−３７６ａ−ｌ
３０）マイクロＲＮＡ−３００
３１）マイクロＲＮＡ−１１８５−１
３２）マイクロＲＮＡ−１１８５−２
３３）マイクロＲＮＡ−３８１
３４）マイクロＲＮＡ−４８７ｂ
３５）マイクロＲＮＡ−５３９
３６）マイクロＲＮＡ−８８９
３７）マイクロＲＮＡ−５４４ａ
３８）マイクロＲＮＡ−６５５
３９）マイクロＲＮＡ−４８７ａ
４０）マイクロＲＮＡ−３８２
４１）マイクロＲＮＡ−１３４
４２）マイクロＲＮＡ−６６８
４３）マイクロＲＮＡ−４８５
４４）マイクロＲＮＡ−３２３ｂ
４５）マイクロＲＮＡ−１５４
４６）マイクロＲＮＡ−４９６
４７）マイクロＲＮＡ−３７７
４８）マイクロＲＮＡ−５４１
４９）マイクロＲＮＡ−４０９
５０）マイクロＲＮＡ−４１２
５１）マイクロＲＮＡ−３６９
５２）マイクロＲＮＡ−４１０
５３）マイクロＲＮＡ−６５６
５４）マイクロＲＮＡ−１２４７
から選択される１種または２種以上のマイクロＲＮＡのモジュレーターである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜１３のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項１５】
モジュレーターが、１種または２種以上のｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４８７ｂおよび／またはｍｉＲ−４９５のモジュレーターである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項１６】
モジュレーターが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡベースのアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための請求項１〜１５のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項１７】
血管リモデリングプロセスを調節する、および／または血管障害を処置または防止するための方法であって、これを必要とする対象に対して、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーターを投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
血管障害が、ヒトまたは動物の身体の任意の血管および／または血管系に影響を与える障害、疾患、症候群および／または状態である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
モジュレーターが、以下からなる群：
１）マイクロＲＮＡ−２３９２
２）マイクロＲＮＡ−７７０
３）マイクロＲＮＡ−４９３
４）マイクロＲＮＡ−３３７
５）マイクロＲＮＡ−６６５
６）マイクロＲＮＡ−４３１
７）マイクロＲＮＡ−４３３
８）マイクロＲＮＡ−１２７
９）マイクロＲＮＡ−４３２
１０）マイクロＲＮＡ−１３６
１１）マイクロＲＮＡ−３７０
１２）マイクロＲＮＡ−３７９
１３）マイクロＲＮＡ−４１１
１４）マイクロＲＮＡ−２９９
１５）マイクロＲＮＡ−３８０
１６）マイクロＲＮＡ−１１９７
１７）マイクロＲＮＡ−３２３ａ
１８）マイクロＲＮＡ−７５８
１９）マイクロＲＮＡ−３２９−１
２０）マイクロＲＮＡ−３２９−２
２１）マイクロＲＮＡ−４９４
２２）マイクロＲＮＡ−１１９３
２３）マイクロＲＮＡ−５４３
２４）マイクロＲＮＡ−４９５
２５）マイクロＲＮＡ−３７６ｃ
２６）マイクロＲＮＡ−３７６ａ−２
２７）マイクロＲＮＡ−６５４
２８）マイクロＲＮＡ−３７６ｂ
２９）マイクロＲＮＡ−３７６ａ−ｌ
３０）マイクロＲＮＡ−３００
３１）マイクロＲＮＡ−１１８５−１
３２）マイクロＲＮＡ−１１８５−２
３３）マイクロＲＮＡ−３８１
３４）マイクロＲＮＡ−４８７ｂ
３５）マイクロＲＮＡ−５３９
３６）マイクロＲＮＡ−８８９
３７）マイクロＲＮＡ−５４４ａ
３８）マイクロＲＮＡ−６５５
３９）マイクロＲＮＡ−４８７ａ
４０）マイクロＲＮＡ−３８２
４１）マイクロＲＮＡ−１３４
４２）マイクロＲＮＡ−６６８
４３）マイクロＲＮＡ−４８５
４４）マイクロＲＮＡ−３２３ｂ
４５）マイクロＲＮＡ−１５４
４６）マイクロＲＮＡ−４９６
４７）マイクロＲＮＡ−３７７
４８）マイクロＲＮＡ−５４１
４９）マイクロＲＮＡ−４０９
５０）マイクロＲＮＡ−４１２
５１）マイクロＲＮＡ−３６９
５２）マイクロＲＮＡ−４１０
５３）マイクロＲＮＡ−６５６
５４）マイクロＲＮＡ−１２４７
から選択される１種または２種以上のマイクロＲＮＡのモジュレーターである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
モジュレーターが、１種または２種以上のｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４８７ｂおよび／またはｍｉＲ−４９５のモジュレーターである、請求項１７、１８または１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
モジュレーターが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡベースのアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１７、１８、１９または２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血管障害の処置に使用するため、および／または血管リモデリングのプロセスを調節するための、マイクロＲＮＡ阻害化合物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
心血管疾患は、ヨーロッパおよび北米における主要な死亡原因である。バルーン血管形成術またはバイパス手術などの血管内介入は、重度の閉塞性動脈疾患を有する患者を救命することができる。しかし、最高で５０％の患者においては、動脈の生理学的位置に依存して、介入により誘発される再狭窄は、動脈の１年以内の完全な再閉塞をもたらす。
血管新生、血管形成および動脈形成は、虚血後の身体の自然な修復機構である。治療的血管新生は、下流の組織への血流を回復する。しかし、血管新生を刺激することを目指した臨床試験は、これまで成功していない。
治療的血管新生に伴う重要な問題は、血管形成および動脈形成などの正の血管リモデリングを刺激する因子は、多くの場合、アテローム性動脈硬化および再狭窄などの負の血管リモデリングも刺激することである。これは「ヤーヌス現象（Janus phenomenon）」として知られており、閉塞性動脈疾患を有する患者において、特に（血管内）介入後に血管新生を刺激する場合に、明白な問題を引き起こす。
【０００３】
アテローム性動脈硬化は、免疫調節およびコレステロール恒常性を含む様々なプロセスが関与する、複雑な多因子疾患である。大および中サイズの動脈における内皮層の損傷は、接着分子およびケモカイン産生の局所的上方制御をもたらし、これらは共に、血管壁への単球の流入を促進するｉ。スカベンジャー受容体を介する酸化脂質のその後の取り込みは、初期脂肪線条の形成をもたらす。継続的な炎症は複数の免疫細胞を病変部に引きよせ、最終的には進行性アテローム硬化性プラークとなるｉｉ、ｉｉｉ。進行性アテローム硬化性プラークは、コラーゲンと平滑筋をほとんど含有しない薄い線維性被膜で覆われた大きな脂質コアを有するプラークとして、定義されるｉｖ、ｖ。進行性プラークの破裂は、心筋梗塞や脳卒中などの重篤な急性心血管イベントを引き起こし得る。現在の脂質低下療法にもかかわらず、心血管疾患は依然として、西洋社会における主要な死亡原因である。アテローム性動脈硬化の多因子的性質を考えると、治療戦略の改善は、単一の要因に着目するのではなく、プロセスを全体として標的化することにより達成することができるであろう。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、約２０ヌクレオチド長の短い非コードＲＮＡのクラスであり、転写後レベルで、標的遺伝子発現を下方制御することができるｖｉ。単一のｍｉＲは、平均２００個の推定標的遺伝子を有するｖｉｉ。複数の遺伝子の発現を微調整するそれらの能力は、それらを、複雑な疾患のための優れた薬物標的とする。
【０００４】
アテローム性動脈硬化におけるｍｉＲの阻害は、いくつかの研究において以前に検討されている。Raynerらは、ｍｉＲ−３３の阻害が、血漿ＨＤＬを増加させつつ、血漿ＶＬＤＬの低下をもたらすことを示したｖｉｉｉ。コレステロール恒常性の調節に加えて、ｍｉＲはまた、アテローム性動脈硬化に影響を与える他の細胞メカニズムに関与している。例えば、ｍｉＲ−１２６は、トリグリセリドリッチリポタンパク質に応答した転写後ＶＣＡＭの発現を調節するｉｘ。また、ｍｉＲ−９２ａの阻害は、アテローム形成抑制特性を有するクルッペル様因子であるｘｉ内皮ＫＬＦ−２およびＫＬＦ−４の発現を上方制御することが実証されているｘ。さらに、平滑筋細胞の増殖および遊走は、ｍｉＲ−１９５によって抑制することができる；したがって、新生内膜形成は、ｍｉＲ−１９５遺伝子治療によって低減することができるｘｉｉ。ｍｉＲ−１５５は転写因子ＢｃＬ６を抑制することが示され、これによりマクロファージにおけるＮＦ−κＢ活性化およびＣＣＬ２の発現を増加させるｘｉｉｉ。したがって、この研究分野における結果は非常に有望であるように見える。しかし、これらの研究の多くは、ｍｉＲの単一の細胞型またはプロセスに対する効果に焦点を当てていることは明らかであり、このためｍｉＲの広範囲な効果を発揮する能力については、不当に扱われている。Yael Nossent et al, 2013 Annals of Surgery Vol. 258(5) 743-753には、１４ｑ３２マイクロＲＮＡ−４８７ｂが、大動脈の高血圧誘発性のリモデリングにおいて、抗アポトーシスインスリン受容体基質１を標的とすることが記載されている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ヒト染色体の座位１４ｑ３２に位置するマイクロＲＮＡ遺伝子クラスターからのマイクロＲＮＡ（以下では「１４ｑ３２マイクロＲＮＡ」と称する）が、血管の発達およびリモデリングにおいて重要な役割を果たすという知見に基づく。したがって、本発明は、血管リモデリングのプロセスを調節するための手段として、および／または血管障害または疾患の処置および／または防止に、利用することができる。
したがって第１の側面において、本発明は、血管リモデリングプロセスを調節するため、および／または血管障害の処置または防止に使用するための、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーターを提供する。
第２の側面において、本発明は、血管リモデリングプロセスを調節するため、および／または血管障害を処置または防止するための方法であって、これを必要とする対象に対して、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーターを投与することを含む、前記方法を提供する。モジュレーターは、治療的に有効な量で投与することができる。必要とする対象は、ヒトまたは動物の対象であってよい。
【０００６】
なお、本明細書を通して用語「含む」および／または「含むこと」は、本発明の態様が注目の特徴を「含む」ことを示すために使用され、したがって他の特徴も含み得ることに留意すべきである。しかしながら、本発明の文脈において、用語「含む」および「含むこと」は、発明が関連する特徴「から本質的になる」か、または関連する特徴「からなる」態様を、包含する。
用語「血管」は、ヒトまたは動物の体内の、任意の形態の血管を包含してよい。具体的には、用語「血管」は、動脈、毛細血管および／または静脈などの血管に適用することができる。したがって、用語「血管リモデリング」は、動脈、毛細血管および／または静脈内および／またはそれらが定義する管腔の機能、大きさ、形状および／または構造の任意の変化に適用することができる。したがって、「血管リモデリングプロセス」は、血管の機能、大きさ、形状および／または構造の変化に関連するか、またはこれを導く、任意のプロセスとして定義することができる。同様に、用語「血管障害」は、ヒトまたは動物の体内の血管の１または２以上の種類に影響を与える、任意の疾患、状態、または症候群に適用することができる。
【０００７】
血管リモデリングは、正のリモデリングの形態をとり得る；すなわち、リモデリングは、例えば血管新生、血管形成および／または動脈形成などの血管機能の回復を目的としたプロセスを含む。血管リモデリングはまた、負のリモデリングの形態をとり得る；すなわち、さらなる血管損傷および／または血管構造および／または支持体の有害な調節を導くリモデリングである。負のリモデリングは、例えば、アテローム性動脈硬化および／または再狭窄を含み得る。したがって用語「血管リモデリング」は、リモデリングの正と負両方の形態を包含する。
用語「血管系」は、ヒトまたは動物の身体の特定の組織型、器官または領域内の血管（動脈、毛細血管および／または静脈）を包含し得る。したがって、用語「血管障害」および「血管リモデリングプロセス」は、血管系、例えば心血管（冠動脈）系、ならびに四肢（たとえばヒトまたは動物の身体の構造、例えば脚または腕）、および肺、脳、腎臓および／または肝臓の器官、組織および／または領域の血管系内の任意の血管に影響を与える疾患およびプロセスを包含することができる。
【０００８】
したがって本発明は、ヒトまたは動物の身体の血管および／または血管系のいずれかに影響を与える障害、疾患、症候群および／または状態の処置および／または防止に、用途を見出すことができる。さらに本発明は、これらの血管および／または系のいずれかにおける血管リモデリングのプロセスを調節するための手段として、利用することができる。
理論に束縛されるものではないが、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡの調節は、血管リモデリングに関連する遺伝子の調節を導く。血管新生、血管形成、および動脈形成などの正のリモデリングプロセスは、血管損傷に対する身体の自然な反応の一部を形成する。しかし、負のリモデリングプロセスが、正のリモデリングプロセスと同時に（またはこれに続いて）起きることが知られている（ヤーヌス現象：以下を参照）。本発明者らは、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡの阻害が、アテローム性動脈硬化および再狭窄に対する有効な処置を提供するだけでなく、これがさらに、例えば血管新生、血管形成、および動脈形成などの正のリモデリングプロセスを刺激することを発見した。
【０００９】
「血管リモデリングプロセス」に適用される「調節する」との用語は、血管リモデリングプロセスの速度または出現／発生率の任意の増加または減少を包含し得る。したがって、本発明で開示された１４ｑ３２モジュレーターは、１または２以上の血管リモデリングプロセスを阻害（防止または抑制）および／または刺激（助長または増加）する手段として利用することができる。本発明の１４ｑ３２モジュレーターおよび方法は、血管新生、血管形成、および／または動脈形成などのリモデリングプロセスを、増加または刺激するために使用することができる。本発明の１４ｑ３２モジュレーターが影響を及ぼす調節の程度は、血管疾患に関連する病状を示さない、および／または本明細書に記載の１種または２種以上の１４ｑ３２阻害剤と接触していない、細胞または組織で生じるであろう血管リモデリングの「正常」または「対照」レベルと比較して、評価することができる。
【００１０】
１４ｑ３２マイクロＲＮＡ発現の適切なモジュレーターの具体例は、他の箇所に記載されているが、しかし読者は、１４ｑ３２マイクロＲＮＡ発現のモジュレーターは、関連するマイクロＲＮＡの発現を増加および／または阻害（減少）することができる、任意の分子または化合物であることに留意すべきである。典型的には、本発明のモジュレーターは、マイクロＲＮＡ阻害剤；具体的には、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡの阻害剤である。マイクロＲＮＡ阻害剤は、本明細書に記載の１４ｑ３２マイクロＲＮＡを含む１種または２種以上のマイクロＲＮＡの発現、機能および／または活性を阻害または低下させる化合物または分子を含んでもよい。当業者は、調節の程度は、マイクロＲＮＡ発現の「正常」または「対照」レベルと比較して評価できることを理解するであろう。例えば、調節の程度は、血管疾患に関連する病状を示さない、および／または１４ｑ３２マイクロＲＮＡモジュレーターに供されていないかこれと接触していない試験系（例えば細胞ベースの系）における、同等のマイクロＲＮＡ（複数可）の発現と比較して評価することができる。
本発明は、末梢動脈疾患の処置および／または防止に、および／または末梢動脈における血管リモデリングプロセスの調節に、適用することができる。
【００１１】
本発明は、心血管／冠動脈および／または脳血管における血管リモデリングプロセスの調節に使用するための、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡの方法および／またはモジュレーターを提供することができる。さらに本発明は、心血管／冠動脈および／または脳動脈疾患の処置および／または防止に、用途を見出すことができる。
用語「心血管」または「冠動脈」疾患は、（重度）閉塞性動脈疾患、心筋梗塞（および／またはそれに起因する血管損傷）、虚血性脳卒中、ならびに虚血イベントの結果として起こる組織または血管損傷を包含することができる。
さらに、本発明は、疾患、手術または処置の後に起こり得る、障害、疾患、症候群または状態の処置および／または防止（prevention）（予防（prophylaxis））にも適用することができる。心血管疾患の文脈において、本発明のマイクロＲＮＡモジュレーター化合物および方法は、再狭窄および／またはアテローム性動脈硬化などの状態の処置および／または防止に使用することができる。
【００１２】
本発明はまた、例えば、心筋梗塞（心臓リモデリングと呼ばれる）、動脈瘤形成（腹部または胸郭大動脈瘤を含むがこれに限定されない）の後に発生し得る血管リモデリングプロセスの調節にも適用することができる。本発明は、かかる状態（またはそれに関連する合併症）の処置および／または防止に応用され得る。
これに加えて、または代替的に、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーターは、例えば、バイパス手術（冠動脈および末梢バイパス手術を含む）、透析手順（透析シャントリモデリング）および／またはステントの移植またはバルーン血管形成術などを含む、外科的処置または介入などの後に起き得る再狭窄を、処置または防止するために使用することができる。
さらに、本発明の使用および方法は、血管疾患および／または血管リモデリングプロセスと関連する、またはこれの原因となる、障害、疾患、状態および／または症候群の処置および／または防止に適用することができる。例えば、本発明者らは、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡの調節を介して、血中コレステロールレベルを調節することが可能であることを指摘している。当業者は、上昇した血中コレステロールレベルは多くの場合、アテローム性動脈硬化に関連しているため、本発明が、アテローム性動脈硬化および他のコレステロール関連疾患、状態、または症候群の処置に適用され得ることを理解するであろう。本発明は、高コレステロール血症をコントロールするための手段として利用することができる。
【００１３】
本発明のマイクロＲＮＡモジュレーター化合物および方法は、例えば、血管新生、血管形成および／または動脈形成を調節する、例えば増加、増進、促進または増強するために、使用してもよい。
本発明者らは、本発明の方法および使用が、血管疾患に対する従来技術の治療に多くの場合に連関する副作用である、ヤーヌス現象に関連する問題を克服し得ることに気付いた。ヤーヌス現象は、正の血管リモデリング（すなわち、血管形成および動脈形成）を刺激する因子が、負のリモデリング（すなわち、アテローム性動脈硬化および再狭窄）も刺激すると述べている。上述したように本発明者らは、以下を発見した；すなわち、１４ｑ３２マイクロＲＮＡの調節を介して血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化など）を抑制することが可能であり、しかも負の血管リモデリングプロセスも刺激する可能性のある他の治療法とは異なって、本発明の化合物、使用および方法は、血管新生、血管形成および／または動脈形成を（同時に）調節する、例えば増加、刺激、増強または促進することができる。
【００１４】
具体的には、血管疾患のための先行技術の処置は、血管新生、血管形成および／または動脈形成を刺激することができるが、それらは多くの場合再狭窄および／またはアテローム性動脈硬化ももたらし得る。しかし、本発明者らは、１４ｑ３２マイクロＲＮＡの阻害による血管障害または疾患（本明細書中に記載される）の処置が、アテローム硬化性プラーク形成および病変サイズの減少、ならびに血管新生、血管形成および／または動脈形成などの正のリモデリングプロセスの増加をもたらすことを、観察した。
上記を考慮し、本発明は、アテローム性動脈硬化の処置または防止に使用するための、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーター（例えば阻害剤）を提供する。実際本発明者らはまた、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡの調節が、アテローム硬化性プラークの形成および病変サイズの一般的な減少をもたらすのみでなく、アテローム硬化性プラーク内の壊死性コアの形成を低減することを発見した。壊死性コアのサイズは、プラーク安定性およびプラーク破裂と相関するため、本発明のマイクロＲＮＡモジュレーターは、アテローム硬化性プラークを安定化するために使用することができる。
【００１５】
本発明はさらに、高コレステロール血症の処置または防止における使用のための、または血中コレステロールレベルを調節するための、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーターを提供する。
本発明は、プラーク安定性の調節における使用のための、または再狭窄を処置または防止するための、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーターを提供する。
本発明はさらに、動脈形成および／または血管形成の調節に使用するための、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーターに関する。ここでアテローム性動脈硬化および／または再狭窄の同時の阻害もさらに観察され得ることが理解されるべきである。
誤解を避けるために、本発明はさらに、アテローム性動脈硬化、再狭窄および／または高コレステロール血症を処置または防止する方法、または血管形成、動脈形成、および／または血中コレステロールレベルを調節する方法にも拡張され、該方法は、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーターの治療的有効量を、それらを必要とする対象に対して投与することを含む。ここで再び、次のことが理解されるべきである；すなわち、本発明の１つの利点は、血管形成および／または動脈形成（すなわち正の血管リモデリング）の調節に適用される本発明の薬剤（１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーターを含む）が、顕著に減少したレベルの、例えばアテローム性動脈硬化および／または再狭窄を含む負のリモデリングまたは疾患をもたらすと思われることである。
【００１６】
なお、本発明は一般に１４ｑ３２マイクロＲＮＡの「モジュレーター」について言及するが、１４ｑ３２マイクロＲＮＡの阻害剤であるモジュレーターは特に有用であり得ることが理解されるべきである。
当業者は、用語「マイクロＲＮＡ」（または「ｍｉＲＮＡ」）に精通しているであろう。マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の調節に影響を与える、約２２ヌクレオチドの長さの小さな非コードＲＮＡ分子である。これらは、遺伝子配列またはイントロン／エキソン配列のいずれかから産生され；多くは、遺伝子間配列によってコードされる。
ヒト染色体座位１４ｑ３２は、マイクロＲＮＡのアレイまたはクラスターをコードし、これらのマイクロＲＮＡの各々は、本発明の範囲内に包含されるとみなされるべきである。血管リモデリングにおけるそれらの役割のために、１４ｑ３２マイクロＲＮＡは、総称して「血管作用性マイクロＲＮＡ」と称されてもよい。
【００１７】
一例として、本発明は、以下からなる群から選択される１種または２種以上のマイクロＲＮＡの調節、例えば阻害、に関し得る：
１）マイクロＲＮＡ−２３９２
２）マイクロＲＮＡ−７７０
３）マイクロＲＮＡ−４９３
４）マイクロＲＮＡ−３３７
５）マイクロＲＮＡ−６６５
６）マイクロＲＮＡ−４３１
７）マイクロＲＮＡ−４３３
８）マイクロＲＮＡ−１２７
９）マイクロＲＮＡ−４３２
１０）マイクロＲＮＡ−１３６
１１）マイクロＲＮＡ−３７０
１２）マイクロＲＮＡ−３７９
１３）マイクロＲＮＡ−４１１
１４）マイクロＲＮＡ−２９９
１５）マイクロＲＮＡ−３８０
１６）マイクロＲＮＡ−１１９７
１７）マイクロＲＮＡ−３２３ａ
１８）マイクロＲＮＡ−７５８
１９）マイクロＲＮＡ−３２９−１
２０）マイクロＲＮＡ−３２９−２
２１）マイクロＲＮＡ−４９４
２２）マイクロＲＮＡ−１１９３
２３）マイクロＲＮＡ−５４３
２４）マイクロＲＮＡ−４９５
２５）マイクロＲＮＡ−３７６ｃ
２６）マイクロＲＮＡ−３７６ａ−２
２７）マイクロＲＮＡ−６５４
２８）マイクロＲＮＡ−３７６ｂ
２９）マイクロＲＮＡ−３７６ａ−ｌ
３０）マイクロＲＮＡ−３００
３１）マイクロＲＮＡ−１１８５−１
３２）マイクロＲＮＡ−１１８５−２
３３）マイクロＲＮＡ−３８１
【００１８】
３４）マイクロＲＮＡ−４８７ｂ
３５）マイクロＲＮＡ−５３９
３６）マイクロＲＮＡ−８８９
３７）マイクロＲＮＡ−５４４ａ
３８）マイクロＲＮＡ−６５５
３９）マイクロＲＮＡ−４８７ａ
４０）マイクロＲＮＡ−３８２
４１）マイクロＲＮＡ−１３４
４２）マイクロＲＮＡ−６６８
４３）マイクロＲＮＡ−４８５
４４）マイクロＲＮＡ−３２３ｂ
４５）マイクロＲＮＡ−１５４
４６）マイクロＲＮＡ−４９６
４７）マイクロＲＮＡ−３７７
４８）マイクロＲＮＡ−５４１
４９）マイクロＲＮＡ−４０９
５０）マイクロＲＮＡ−４１２
５１）マイクロＲＮＡ−３６９
５２）マイクロＲＮＡ−４１０
５３）マイクロＲＮＡ−６５６
５４）マイクロＲＮＡ−１２４７
【００１９】
誤解を避けるために、上記の５４のマイクロＲＮＡの各々は、１４ｑ３２マイクロＲＮＡである−すなわち、これらはヒト染色体の１４ｑ３２座位内に位置する配列によってコードされる。さらに、上記１〜５４のマイクロＲＮＡの各々は、「血管作用性マイクロＲＮＡ」と称してもよい。
したがって本発明は、血管リモデリングプロセスを調節するため、および／または血管障害の処置または防止における使用のための、上記１〜５４としてリストされた１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーター、例えば阻害剤を提供する。
さらに、本発明は、血管リモデリングプロセスを調節する、および／または血管障害を処置または防止する方法であって、該方法が、上記１〜５４としてリストされた１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡのモジュレーター、例えば阻害剤を、それを必要とする対象に対して投与することを含む、前記方法を提供する。モジュレーターは、治療的に有効な量で投与することができる。それを必要とする対象は、ヒトまたは動物の対象であってよい。
【００２０】
本発明は、血管障害／疾患の処置における、および／または血管リモデリングのプロセスの調節における使用のための、１種または２種以上のｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４８７ｂおよび／またはｍｉＲ−４９５のモジュレーター（例えば阻害剤）を提供する。より具体的には、これらマイクロＲＮＡのモジュレーター例えば阻害剤は、アテローム性動脈硬化を阻害する（特にｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９４および／またはｍｉＲ−４９５のモジュレーター）、血中コレステロールレベルを低下させる（特にｍｉＲ−４９４および／またはｍｉＲ−４９５のモジュレーター）、プラークの安定性を高める（特にｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９４および／またはｍｉＲ−４９５のモジュレーター）、および血管形成および／または動脈形成を誘発する（特にｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４８７ｂおよび／またはｍｉＲ−４９５のモジュレーター）方法における使用のためであってよい。
ｍｉＲ−４８７ｂのモジュレーターは、高血圧が誘発する大動脈のリモデリングを調節するために使用することはできない。
【００２１】
ヒト１４番染色体の１４ｑ３２に位置するクラスターに等価なマイクロＲＮＡクラスターは、マウスの１２番、およびラットの６番染色体上に位置していることが理解されるべきである。したがって、本発明がヒトゲノムの血管作用性マイクロＲＮＡを利用する方法および使用に関する限りにおいて、本発明は、他の哺乳類の染色体座位からの等価なマイクロＲＮＡの方法および使用に及ぶことが理解されるべきである。
動脈形成現象を調査している間に、本発明者らは、特定のマイクロＲＮＡの発現パターンが異なることに気付いた。例えば、いくつかのマイクロＲＮＡは、動脈形成の発生後に、発現の急速な減少を示すことに気付いた−これらは、「高速応答者」と名付けられた。別のものは、動脈形成の発生後に、発現の適度な初期増加と、続いて約３〜７日後に強い減少を示した。約７日後、これらのマイクロＲＮＡの発現レベルは再び上昇した。これらのマイクロＲＮＡは、「低速応答者」と名付けられた。別のものは、動脈形成の全期間を通して、発現のわずかな減少のみを示した−これらは「非応答者」である。以下の表１は、高速、低速および非応答マイクロＲＮＡを同定する。
【００２２】
【表１】
2017505771.tif 000003
【００２３】
上記に基づいて、および特定の疾患を処置するかまたは動脈形成などの血管リモデリングプロセスを調節する際に、当業者は、１４ｑ３２マイクロＲＮＡの調節に段階的なアプローチを採用する場合もあろう。例として、および動脈形成を増加または促進することを目的とする使用および方法を参照して、まず１種または２種以上の高速応答型マイクロＲＮＡ（表１に識別されているような）の発現を、次に１種または２種以上の低速応答型マイクロＲＮＡの発現を調節することを選ぶ可能性がある。必要に応じて、１種または２種以上の非応答型マイクロＲＮＡもまた継続して阻害する可能性がある。
本発明での使用に適したモジュレーターとしては、本明細書に記載の特定の１４ｑ３２マイクロＲＮＡを含む、１４ｑ３２マイクロＲＮＡの阻害剤が挙げられる。
本発明での使用に適した阻害剤は、例えば、有機／無機小分子、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはＰＮＡを含む合成もしくはペプチドベースの核酸を含む）、炭水化物、脂質、抗体（その抗原結合断片を含む）などを含んでよい。
特に、用語「阻害剤」は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡベースのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに適用され、これらは、特定の標的マイクロＲＮＡに結合するかまたはこれと相補的な分子／配列を含む。オリゴヌクレオチドベースの阻害剤は、「遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド」（ＧＳＯ）と称してもよい。したがって、本発明は、ＧＳＯ型阻害剤化合物を利用することができる。
【００２４】
例えば、用語「阻害剤」は、WO2012/135152（この開示はその全体が本明細書に組み込まれる）およびBhagat et al, (J. Med. Chem., 2011, 54, 3027-3036)に記載された、合成オリゴヌクレオチドベースの化合物を包含することができる。
本発明における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡ配列（またはマウスおよびラットのゲノムを含む他のゲノムにおける等価なマイクロＲＮＡ配列）の全体または一部に相補的である（核酸、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、または下記のような合成／修飾塩基）配列を含むことができる。例えば、本発明における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的マイクロＲＮＡのシード配列に相補的な配列を含むことができる。標的マイクロＲＮＡ（複数可）の配列に相補的な配列を含むことにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、標的マイクロＲＮＡと二本鎖を形成することができ、かかる二重鎖の形成は、マイクロＲＮＡがその意図される（ｍＲＮＡ）標的に結合することを防止する。
本発明のオリゴヌクレオチドおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンタゴｍｉｒ、および／またｂｌｏｃｋｍｉｒ型阻害剤、ならびに阻害性ＲＮＡ分子を含んでもよい。
【００２５】
当業者は、「アンタゴｍｉｒ」が、標的マイクロＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な配列を有する一本鎖の化学修飾リボヌクレオチド、例えば、本発明の標的血管作用性マイクロＲＮＡ配列であることを理解するであろう。
本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１種または２種以上の修飾オリゴヌクレオチドおよび／または１つ以上の化学修飾を含むことができる。例えば、本発明における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロＲＮＡ阻害剤は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の化学的修飾を含むことができ、例えば、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−エチルおよび２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’−チオ修飾などの糖修飾、ならびにホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボキシ結合などの骨格修飾（例えば、米国特許第6,693,187号および第7,067,641号、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）である。本発明のオリゴヌクレオチドは、分子の安定性および／またはそのin vivo送達の向上を目的とした修飾を、含むかまたはさらに含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチド／アンチセンスオリゴヌクレオチドは、コレステロール部分を含むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、５’末端および３’末端に２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボヌクレオチドと、それらの間に少なくとも１０のデオキシリボヌクレオチドを含む、２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー」を含むことができる。「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ  Ｉ依存性分解のメカニズムの引き金となることができる。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１種または２種以上のロックされた核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。ＬＮＡは、リボース部分が２’酸素と４’炭素を接続する余分な架橋で修飾されている、「ロックされた形態」の修飾リボヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合されて、本発明における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを形成することができる。
本発明の阻害分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、少なくとも約５〜約５０のヌクレオチド、例えば、少なくとも約１０〜約４０のヌクレオチド、または少なくとも約１５〜約３０のヌクレオチドを含むことができる。適切なアンチセンス阻害剤分子は、少なくとも約２０〜約２５のヌクレオチド、例えば約２２のヌクレオチドを含むことができる。当業者は、マイクロＲＮＡ阻害剤としての用途を見出すアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が、標的マイクロＲＮＡ配列に存在するヌクレオチドの数に対応する多数のヌクレオチドを含むことができることを理解するであろう。
【００２７】
本発明の阻害剤は阻害性ＲＮＡ分子を含んでよく、この阻害性ＲＮＡ分子は、標的マイクロＲＮＡ配列に相補的な配列を含む。適当な阻害性ＲＮＡ阻害剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびリボ核酸酵素（リボザイム）であってよい。
１４ｑ３２マイクロＲＮＡ阻害剤を利用することに加えて、当業者は、本発明が、該１４ｑ３２（血管作用性）マイクロＲＮＡの標的である遺伝子の発現、機能および／または活性のいくつかの側面を調節する化合物または分子も利用し得るか、またはさらに利用することを理解するであろう。マイクロＲＮＡの役割は遺伝子発現を制御することであるため、マイクロＲＮＡ発現の調節は次に、遺伝子発現の調節につながることが理解されるべきである。このように、１種または２種以上の１４ｑ３２遺伝子標的の発現、機能および／または活性を増加させる化合物を含むモジュレーターは、血管リモデリングプロセスの調節、および／または血管障害、疾患、状態および／または症候群の処置および／または防止を達成するために使用することができる。
【００２８】
適切なモジュレーターは、１４ｑ３２マイクロＲＮＡが標的とする遺伝子の発現、機能および／または活性を増強する分子を含んでもよい。この種類のモジュレーターは、特定の遺伝子に関連するプロモーターの活性に影響を及ぼす（増加させる）ことができる。遺伝子発現を増強するモジュレーターは、問題の遺伝子のタンパク質産物（またはその機能的断片）またはそれをコードする核酸配列を、含むことができる。モジュレーターとして使用するための核酸配列は、発現ベクターの形態で提供することができる。
本発明における使用のためのモジュレーターは、１４ｑ３２マイクロＲＮＡが標的とする遺伝子の発現、機能および／または活性を阻害または抑制する分子を含んでもよい。この種類のモジュレーターは、特定の遺伝子に関連するプロモーターの活性を阻害する（低減する）ことができる。阻害性モジュレーターはさらに、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、または特定の遺伝子の発現を抑制、切除または阻害するように設計された合成的に調製されたマイクロＲＮＡ分子を含むことができる。この種類の阻害剤（核酸ベース）分子を設計するための技術および「apps」は、当該技術分野の当業者に知られており、更なる情報は、Rebecca Schwab et al (2006: Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidops is Plant Cell 18: 1121-1133およびStephan Ossowski et al (2008: Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs The Plant Journal 53 (4), 674-690から得ることができる。
【００２９】
本発明における使用のためのモジュレーターは、その発現を１４ｑ３２マイクロＲＮＡによって（少なくとも部分的に）制御することができる遺伝子のタンパク質産物（またはそのエピトープ）に対する親和性または特異性を示す、抗体の形態をとることができる。抗体は、ポリクローナルおよび／またはモノクローナルであってよく、抗体を作製するために使用する技術は、当該技術分野で知られており、これは、動物の免疫化プロトコルの使用（ポリクローナル抗体の生成のため）またはハイブリドーマの生成（モノクローナル抗体の生成のため）を、含むことができる。ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体の調製および使用に関するさらなる情報は、Using Antibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane (CSHLP: 1999)およびAntibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane (CSHLP: 1988)から得ることができ、これらは両方とも、本明細書に参照により組み込まれる。
したがって、さらなる側面において、本発明は、血管のリモデリングプロセスを調節するため、および／または血管障害の処置または防止に使用するための、１種または２種以上の１４ｑ３２マイクロＲＮＡにより標的化されるか、または少なくとも部分的に調節される、１種または２種以上の遺伝子のモジュレーターを提供する。
本発明のモジュレーターは、１種または２種以上の賦形剤、担体および／または希釈剤を含む組成物として、提供することができる。組成物は、医薬組成物の形態をとることができ、したがって、無菌であるか、および／または薬学的に許容し得る賦形剤、担体および／または希釈剤を含んでもよい。
本発明を、ここに以下の図を参照して詳細に説明する。図は、以下を示す：
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒト１４ｑ３２座位およびマウス１２Ｆ１座位の概略図。色は、マウスｍｉＲが、健康なＣ５７Ｂ１／６マウスにおける大腿動脈の単結紮により誘発される後肢虚血後に、高速応答、低速応答または非応答であったかどうかを示す。
【図２】有効な動脈形成の間の１４ｑ３２  ｍｉＲ発現。左大腿動脈の単結紮の前、ならびに１、３、および７日後のマウス（１時点あたり４匹のマウス）の左内転筋から単離された全ＲＮＡのマイクロアレイ解析。ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−４９４の発現レベルは、大腿動脈結紮前のそれらの個々の発現レベルのパーセンテージとして表す。
【００３１】
【図３】初代ヒト動脈線維芽細胞および後肢虚血を施したマウスの内転筋組織におけるｍｉＲ阻害。（Ａ）アンタゴｍｉＲ（５ｎｇ／μｌ）による、初代ＨＵＡＦにおける個々の１４ｑ３２  ｍｉＲの阻害。（Ｂ）ＧＳＯ（５ｎｇ／μｌ）による、初代ＨＵＡＦにおける個々の１４ｑ３２  ｍｉＲの阻害。（Ｃ）アンタゴｍｉＲ−４９４（５ｎｇ／μｌ）での処置後の、初代ＨＵＡＦにおける個々の１４ｑ３２  ｍｉＲの発現レベル（上の図）、およびＧＳＯ（５ｎｇ／μｌ）での処置後の、初代ＨＵＡＦにおける個々の１４ｑ３２  ｍｉＲの発現レベル（下の図）。少なくとも３つの独立した実験からの、ｍｉＲ−１９１と比較した平均発現レベルを、±ＳＥＭで示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｄ）ＧＳＯ−３２９、ＧＳＯ−４８７ｂ、ＧＳＯ−４９４およびＧＳＯ  ４９５での処置後４、８および１８日目における、左大腿動脈の二重結紮を施したＣ５７Ｂ１／６マウスの内転筋組織における１４ｑ３２  ｍｉＲの発現を、ＧＳＯ対照と比較して示す。１群当たり、３匹のマウスの内転筋組織を用いた。ｌｅｔ−７Ｃに相対的な平均発現レベル±ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５。
【００３２】
【図４】in vivoでの１４ｑ３２  ｍｉＲ阻害後の血流の回復。（Ａ）ＰＢＳまたはＧＳＯ（１ｍｇ／マウス）のいずれかで処置したマウス（１群当たり１１匹）における、経時的なＬＤＰＩ測定の定量化。データは、虚血足の非虚血足に対する比率として算出する。データは、平均±ＳＥＭとして提示する。（Ｂ）ＧＳＯ対照またはＧＳＯ−３２９のいずれかで処置したマウスの左肢でのＨＬＩの誘発の直後および７日後における、代表的なＬＤＰＩの画像。
【図５】１４ｑ３２  ｍｉＲ阻害後のin vivo動脈形成。ＧＳＯで処置したマウスの右（処置なし）および左（大腿動脈を結紮）内転筋組織の代表的なα−ＳＭＡ染色の画像を、ＧＳＯ対照で処置したマウスにおける増加と比較した、α−ＳＭＡ＋細動脈の直径の増加の定量化。１群当たり、１１匹のマウスの左右の内転筋を含めた。各筋肉から８つの切片を使用し、各切片から代表的な１枚の写真を用いた。スケールバーは１００μｍを表す。データは、平均±ＳＥＭとして示す。
【００３３】
【図６】１４ｑ３２  ｍｉＲ阻害後のin vivo血管形成。ＧＳＯで処置したマウスの右（正常酸素）および左（虚血性）ヒラメ筋におけるＣＤ３１染色の代表的な画像、およびＧＳＯ対照で処置したマウスでの増加と比較した、右および左ヒラメ筋の間のＣＤ３１＋面積の増加の定量化。１群当たり、３匹のマウスからの左右のヒラメ筋を含めた。各筋肉について６切片を使用し、各切片から代表的な１枚の写真を用いた。スケールバーは１００μｍを表す。データは、平均±ＳＥＭとして示す。
【図７】推定標的遺伝子のin vivoでの調節。ｍｉＲ−３２９についての推定標的遺伝子の発現レベルを、ＨＬＩの後３日目（Ａ）および７日目（Ｂ）の、ＧＳＯ−３２９で処置したマウスの内転筋組織におけるＨＰＲＴ１と比較したもの。ｍｉＲ−４９４についての推定標的遺伝子の発現レベルを、ＨＬＩの後３日目（Ｃ）および７日目（Ｄ）の、ＧＳＯ−４９４で処置したマウスの内転筋組織におけるＨＰＲＴ１と比較したもの。１群当たり、３匹のマウスからの内転筋組織を使用した。データは、平均±ＳＥＭとして示す。＊Ｐ＜０．０５。
【００３４】
【図８】１４ｑ３２  ｍｉＲ阻害のin vitro効果。（Ａ）ＧＳＯ処置（１５ｎｇ／μｌ）後のＨＵＡＥＣの増殖を、３Ｈチミジン取り込みにより、ＧＳＯ対照と比較して測定したもの。（Ｂ）ＧＳＯ処置（１０ｎｇ／μｌ）後のＨＵＡＥＣの増殖を、３Ｈチミジン取り込みにより、ＧＳＯ対照と比較して測定したもの。データは平均±ＳＥＭとして示し、少なくとも３回の独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図９】１４ｑ３２／１２ＦＬ  ｍｉＲの発現。ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５の発現レベルを、健康な成体Ｃ５７Ｂ１／６マウスの大動脈、心臓、脾臓、腎臓、骨格筋と脳でのＬｅｔ−７ｃ、および肝臓でのＬｅｔ−７ｃおよびｍｉＲ−１２２と比較して示したもの。９匹のマウスからの組織／臓器が含まれており、３匹の動物ごとにプールした。データは、平均±ＳＥＭとして示す。
【図１０】ｍｉＲ−４９５の推定標的遺伝子のin vivoでの調節。ｍｉＲ−４９５についての推定標的遺伝子の発現レベルを、ＨＬＩの後３日目（Ａ）および７日目（Ｂ）の、ＧＳＯ−４９５で処置したマウスの内転筋組織でのＨＰＲＴ１と比較したもの。１群当たり、３匹のマウスからの内転筋組織を使用した。データは、平均±ＳＥＭとして示す。
【００３５】
【図１１】１４ｑ３２  ｍｉＲ阻害のin vitro効果。ＧＳＯ処置（１０ｎｇ／μｌ）後のＨＵＡＳＭＣの増殖を、３Ｈチミジン取り込みにより、ＧＳＯ対照と比較して測定したもの。データは平均±ＳＥＭとして示し、少なくとも３回の独立した実験を表す。
【図１２】ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−３２９の阻害は、アテローム硬化性病変の形成を減少させる。ＧＳＯによるｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５の阻害は、ＡｐｏＥ-/-マウスの頚動脈におけるアテローム硬化性プラーク形成の減少をもたらす。ＧＳＯ−３２９は、病変サイズの減少傾向を示す。ＰＢＳとＧＳＯ対照の間で有意差は見出されなかった。顕微鏡写真は、各処置群の代表的な画像を示す（１０×）。
【００３６】
【図１３】ＧＳＯ−４９４、ＧＳＯ−４９５による処置は、大幅に増加したアテローム硬化性病変の安定表現型につながる。ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−４３２９の阻害の、プラーク形態および病変の安定性に対する効果。Ａ．病変におけるコラーゲン含有量は、ＧＳＯ  ４９４および４９５で処置した群で増加した（＊Ｐ＜０．０５）。Ｂ．壊死性コアサイズは、デブリの豊富な細胞面積として定義され、総プラーク面積のパーセンテージとして測定した。興味深いことに、ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５の阻害は、壊死性コアサイズの減少をもたらし（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１）、これは、増加したコラーゲン含有量と共に、増加した安定表現型を示唆するものである。Ｃ．マクロファージをＭＡＣ−３抗体により可視化し、内膜中の染色面積のパーセンテージとして表した。ＧＳＯ−４９５で処置したマウスのみが、病変マクロファージの減少を示した（＊Ｐ＜０．０５）。Ｄ．アテローム硬化性プラークの平滑筋細胞中含有量に、差は見られなかった。顕微鏡写真は、すべての処置群における壊死性コアサイズの代表的な画像を示す（１０×）。
【図１４】ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５の阻害後のコレステロールレベルの減少。コレステロールレベルは、ＧＳＯ−４９４およびＧＳＯ−４９５で処置した後に、６週間の西洋型食餌の後のサクリファイス時（Ａ）に減少した。ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ分析は、ＶＬＤＬ／ＬＤＬレベルの明らかな低下を示した（Ｂ）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３７】
【図１５】ＧＳＯ処置後の血中リンパ球と好中球の変化。ｍｉＲ−３２９およびｍｉＲ−４９５の阻害は、２８日目に、血液中のリンパ球の絶対量の減少を導く（Ａ）。さらに、ｍｉＲ−３２９の阻害はまた、好中球の減少をもたらした（Ｂ）。＊Ｐ＜０．０５。
【図１６】ＧＳＯ処置後のＴＩＭＰ／ＭＭＰ比の増加。ＧＳＯによる処置後、ｍｉＲ−３２９およびｍｉＲ−４９４の標的遺伝子であるＴＩＭＰ３の発現レベルは、ＢＭ由来マクロファージ中で顕著に増加した。ｍｉＲ−４９５の標的遺伝子であるＴＩＭＰ２は、ＧＳＯ−４９５での処置後にＢＭ由来マスト細胞において増加した。ＭＭＰレベルは、ＧＳＯ処置後にも変化せず、正のＴＩＭＰ／ＭＭＰ比をもたらした。＊Ｐ＜０．０５。
【図１７】マウス内皮細胞、平滑筋細胞、骨髄（ＢＭ）由来マスト細胞およびＢＭ由来マクロファージにおける、ｍｉＲ−４９４のＧＳＯ誘発性阻害後の、標的遺伝子発現のin vitro調節。
【００３８】
【図１８】マウス内皮細胞、線維芽細胞、骨髄（ＢＭ）由来マスト細胞およびＢＭ由来マクロファージにおける、ｍｉＲ−４９５のＧＳＯ誘発性阻害後の、標的遺伝子発現のin vitro調節。
【図１９】マウス内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞および骨髄（ＢＭ）由来マクロファージにおける、ｍｉＲ−３２９のＧＳＯ誘発性阻害後の、標的遺伝子発現のin vitro調節。
【図２０】１ｍｇのＧＳＯ、ＧＳＯ対照またはＰＢＳの注射後３日目のマウスの頸動脈における、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−４９４の発現。
【図２１】in vitroでのコラーゲン合成を、３Ｈ−プロリンの取り込みにより、ＧＳＯ対照と比較して、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５またはｍｉＲ−３２９のＧＳＯ誘発性阻害の後にマウス平滑筋細胞において測定した。結果は、総タンパク質合成と比較した毎分の崩壊（ＤＰＭ）として表す。
【実施例】
【００３９】
例１
材料および方法
逆標的予測
動脈形成および血管形成に関与するｍｉＲを識別するために、in silicoの逆標的予測（ＲＴＰ）を実施した。選択は、文献および我々のグループ内の以前の研究から、動脈形成と血管形成において重要な役割を果たすことが知られている１２７の遺伝子についてなされた（表Ｓ１）。識別されたｍｉＲのマスタースイッチの特徴を確認するために、我々は、血管リモデリングのすべての側面をカバーする標的遺伝子を選択した；内皮活性化、平滑筋細胞増殖、細胞外マトリックス再配列、ケモカインおよびサイトカインおよびそれらの受容体、増殖因子およびそれらの受容体、ナチュラルキラー複合体、動脈形成促進および血管形成促進転写因子、およびシグナル伝達分子（表Ｓ１）。次に我々は、それぞれの個々の遺伝子についてwww.target.scan.orgを使用し、これらの１２７の遺伝子を標的とすることが予測されるすべてのｍｉＲのリストを生成した。制限の適用なしの各リストをスプレッドシートにコピーし、各ｍｉＲについて、それらがファイルに現れた回数を単純にカウントした。
【００４０】
【表２−１】
2017505771.tif 000004
【００４１】
【表２−２】
2017505771.tif 000005
【００４２】
【表２−３】
2017505771.tif 000006
【００４３】
【表２−４】
2017505771.tif 000007
【００４４】
我々の調査結果の妥当性を確認するために、マイクロアレイ解析を使用して、左大腿動脈の単結紮を施されたＣ５７Ｂ１／６マウスの内転筋群における活性な動脈形成の部位において、上方制御されたことが判明した追加の７０の遺伝子を選択した（表Ｓ２）。我々は、これらの７０の遺伝子についてＲＴＰを繰り返し、２つの逆標的予測で識別されたｍｉＲの間における類似点を探索した（１４ｑ３２  ｍｉＲについて、表Ｓ３）。
【表３−１】
2017505771.tif 000008
【００４５】
【表３−２】
2017505771.tif 000009
【００４６】
【表３−３】
2017505771.tif 000010
【００４７】
【表４】
2017505771.tif 000011
【００４８】
両方のＲＴＰは、臨床的関連性を保証するために、ヒト標的遺伝子のｍｉＲ結合部位を探索して実施した。ヒトおよびマウスの標的部位間の保存をチェックして、後肢虚血の我々のマウスモデルの妥当性を確認した（１４ｑ３２  ｍｉＲについて、表Ｓ４）。
【表５−１】
2017505771.tif 000012
【００４９】
【表５−２】
2017505771.tif 000013
【００５０】
マイクロアレイ
健康な成体の雄Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、以下の記載のように大腿動脈の単結紮を行った。４匹のマウスを、以下の各時点でサクリファイスした：結紮前；結紮の２４時間後；結紮の７２時間後；結紮の１週間後。内転筋を採取し、ドライアイス上でスナップ凍結した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ線維組織ミニキット（Qiagen）を用いて単離した。RNA濃度、純度および完全性を、ナノドロップ（NanoDrop（登録商標）Technologies）およびBioanalyzer（Agilent 2100）測定によって調べた。
全ゲノム発現のプロファイリングのために、増幅されビオチン化されたＲＮＡを、Illumina TotalPrep RNA増幅キットを使用して生成した。配列解析には、４５，２００より多くの転写産物を含むMouseWG-6 v2.0 Expression BeadChip（Illumina）を使用した。発現レベルはＬｏｇ２変換し、クォンタイル（quantile）正規化の後、ベースラインおよびＨＬＩ誘発後の両方でバックグラウンド強度を示した転写物は、分析から除外した。
【００５１】
ｍｉＲ発現プロファイリングは、ＬＮＡベースのアレイ上の２色共通の基準ハイブリダイゼーション（miRCURY LNA（商標）miR Array既製スポットプローブセット、Exiqon, Denmark）として実施し、CodeLink（商標）HD活性化スライド上（DHD1-0023, SurModics, Eden Prairie, MN）に製造業者のプロトコルに従ってインハウスでスポットした。試料は、miRCURY LNA miR Array Power標識キット（208032-A, Exiqon）を使用してＨＹ５で標識し、１６時間ハイブリダイズした。スライドを洗浄し(208021, Exiqon)、Agilent（G2565CA）マイクロアレイスキャナーでスキャンし、Genepix 6.0ソフトウェアで解析した。正規化およびバックグラウンド補正を、「統計的言語Ｒ」で「vsn」パッケージ（Bioconductor）を用いて行い、四重のスポットを平均した。差次的発現変動（differential expression）は、「limma」パッケージ（Bioconductor）を使用し、eBayes線形モデルを当てはめて、個々の処置を未処置の対照と対比することにより分析した。Ｌｏｇ２の倍率変化はlimmaパッケージのtoptable関数を使用して算出した。
様々なマウス組織における、ｍＲＮＡ、ｒｔ／ｑＰＣＲを介したｍｉＲ発現、および１４ｑ３２  ｍｉＲ発現を、図９に示す。
【００５２】
マイクロＲＮＡ阻害剤
アンタゴｍｉＲは、成熟標的ｍｉＲ配列に対して完全な逆相補性で設計されており、VBC Biotech（Vienna, Austria）から購入した。アンタゴmiRは、５’末端および３’末端ホスホロチオエート結合を有する一本鎖Ｏ−メチル修飾ＲＮＡ鎖、および３’末端のコレステロール尾部からなる。
遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド（ＧＳＯ）は、成熟標的ｍｉＲ配列に対して完全な逆相補性で設計されており、Idera Pharmaceuticals （Cambridge, MA, USA）で合成された２１。陰性対照としてスクランブル配列を使用し、これは、任意の既知のマウスｍｉＲを標的としないように設計された。ＧＳＯは、その５’末端でホスホロチオエートリンカーにより互いに連結された、２つの一本鎖Ｏ−メチル修飾ＤＮＡ鎖から成る。一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端の遮蔽は、Ｔｏｌｌ様受容体を介して自然免疫系の活性化を防止する；ＤＮＡ二重鎖は、標的ｍｉＲに対する特異性を増加させる。
【００５３】
使用するすべてのアンタゴｍｉＲおよびＧＳＯの配列を、表Ｓ５に示す。
【表６】
2017505771.tif 000014
「X」：ホスホロチオエートリンカー
「-NNN-」：２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド
「S」：ホスホロチオエート結合
「Chol」：ヒドロキシプロリノール結合を介して結合されたコレステロール基
【００５４】
後肢虚血モデル
８〜１２週齢の健康な成体雄Ｃ５７Ｂ１／６マウス（Charles River and Harlan）を、４〜５匹の群で、水道水および通常の飼料に自由にアクセスできるようにして収容した。すべての実験は、Leiden University Medical Center (Leiden, The Netherlands)の動物福祉に関する委員会によって承認された。
ｍｉＲ阻害実験のために、マウスに対し、ＰＢＳ中１ｍｇ（〜４０ｍｇ／ｋｇ）のＧＳＯまたはＰＢＳのみのボーラス注射を、大腿動脈結紮の１日前に行った。
【００５５】
マウスの麻酔は、ミダゾラム（８ｍｇ／ｋｇ、Roche Diagnostics）、メデトミジン（０．４ｍｇ／ｋｇ、Orion）およびフェンタニル（０．０８ｍｇ／ｋｇ、Janssen Pharmaceuticals）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって実施した。片側後肢虚血は、浅腹壁動脈近傍の左大腿動脈のみの電気凝固（単一結紮：有効動脈形成のモデル）、または膝窩動脈と伏在動脈の分岐に近傍の遠位大腿動脈の電気凝固と組み合わせて２２（二重結紮：重度の末梢動脈疾患のモデル）、実施した。手術後、麻酔を、フルマゼニル（０．７ｍｇ／ｋｇ、Fresenius Kabi）、アチパメゾール（３．３ｍｇ／ｋｇ、Orion）およびブプレノルフィン（０．２ｍｇ／ｋｇ、MSD Animal Health）で拮抗させた。
足への血流の回復は、記載のようにレーザードップラー灌流イメージング（Laser Doppler Perfusion Imaging）（LDPI）を用いて経時的に測定した。
鎮痛薬フェンタニル（０．０８ｍｇ／ｋｇ）を最後のＬＤＰＩ測定後に皮下投与し、マウスをサクリファイスした。内転筋、腓腹筋およびヒラメ筋を採取し、ドライアイス上でスナップ冷凍するか、または４％ＰＦＡに固定した。
組織を用いて、ｍｉＲのｒｔ／ｑＰＣＲ分析および標的遺伝子発現のため、または免疫組織化学のために、全ＲＮＡを単離した。
【００５６】
初代ヒト動脈細胞における増殖アッセイ
初代ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）、平滑筋細胞（ＨＵＡＳＭＣ）および線維芽細胞（ＨＵＡＦ）の単離および培養について、以下に説明する。
細胞を４８ウェルプレートに、ウェル当り２５００個（ＨＵＡＦ）または５０００個（ＨＵＡＳＭＣおよびＨＵＡＥＣ）の細胞で播種した。翌日、細胞を培養培地中でＧＳＯ（ＨＵＡＦＳとＨＵＡＳＭＣについては１０ｎｇ／μｌ、ＨＵＡＥＣについては１５ｎｇ／μｌ）と共にインキュベートした。２４時間後、培地を、ＨＵＡＦＳとＨＵＡＳＭＣについては０．５％ＦＣＳ、またはＨＵＡＥＣについては１０％ＮＢＣＳと、ＧＳＯとを共に含む培地と交換した。再度２４時間後に、細胞を、ＨＵＡＦＳとＨＵＡＳＭＣについては２４時間、またはＨＵＡＥＣについては４０時間刺激し、続いて細胞増殖を３Ｈチミジン（PerkinElmer, Zaventum, Belgium）を０．５μＣｉ／ｍｌの最終濃度で添加することによって決定した。５時間後、細胞を、氷冷ＰＢＳで洗浄し、１００％メタノールで固定し、５％のトリ塩素酸を透過させ、０．３ＮのＮａＣｌで溶解した。１分当たりの崩壊（ＤＰＭ）は、Ultima Gold（商標）シンチレーションカクテル（Canberra-Packard, Frankfurt, Germany）中、試料あたり５分間カウントした。
【００５７】
ｒｔ／ｑＰＣＲ
ｍｉＲ  ＲＴ／ｑＰＣＲ．全ＲＮＡを、標準のＴＲＩｚｏｌ−クロロホルム抽出プロトコルを用いて単離した。ＲＮＡ濃度、純度および完全性は、ナノドロップ（Nanodrop（登録商標）Technologies）によって調べた。ｍｉＲの定量は、製造業者のプロトコルに従って、TaqMan（登録商標）miRアッセイ（Applied Biosystems）を使用して実施した。ｑＰＣＲは、7900HT Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）上で実行し、増幅効率は、標準曲線によって確認した。データの正規化は、安定的に発現する内因性対照（マウス試料についてｍｍｕ−ｌｅｔ−７ｃとｍｍｕ−ｍｉＲ−１２２、およびヒト細胞培養物についてｈｓａ−ｍｉＲ−１９１）を用いて実施した。
ｍＲＮＡ  ＲＴ／ｑＰＣＲ．相対的な定量ｍＲＮＡ  ＰＣＲは、タックマン遺伝子発現アッセイを用いて逆転写されたｃＤＮＡで実施した。ｑＰＣＲは、7900HT Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）上で実行し、増幅効率は、標準曲線によって確認した。データの正規化は、安定的に発現する内因性対照（ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１）を用いて実施した。
【００５８】
レーザードップラー灌流イメージング
足への血流の回復は、Laser Doppler Perfusion Imaging（LDPI）（Moore Instruments）を用いて経時的に測定した。マウスを、ミダゾラム（８ｍｇ／ｋｇ）およびメデトミジン（０．４ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射により麻酔した。マウスを二重ガラスポットに入れ、各測定の前に、３７℃の水で５分間灌流した。ＬＤＰＩ後、麻酔をフルマゼニル（０．７ｍｇ／ｋｇ）とアチパメゾール（３．３ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射により拮抗した。処置した足のＬＤＰＩ測定は、内部対照として未処置の足の測定値に対して正規化した。
【００５９】
免疫組織化学
α−ＳＭＡ．内転筋の厚さ５μｍのパラフィン包埋断面を再水和化し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。平滑筋細胞を、抗α平滑筋アクチン（抗α−ＳＭＡ）（DAKO, Glostrup, Denmark）で染色した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。α−ＳＭＡ陽性の細動脈を、画像分析を用いて解析した（Image J 1.43, NHI, USA）。
ＣＤ３１．ヒラメ筋の厚さ６μｍの新鮮凍結断面において、内皮細胞を氷冷アセトン中に固定し、抗ＣＤ３１（BD Pharmingen）で染色した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。ＣＤ３１陽性面積の定量化は、ランダムに撮影した切片上で（群当たり３匹の動物、マウス当たりの筋肉あたり、６つの代表画像）、画像解析（Qwin, Leica, Wetzlar, Germany）を用いて実施した。
【００６０】
ヒト臍帯動脈内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞（ＨＵＡＥＣ、ＨＵＡＳＭＣおよびＨＵＡＦ）の単離
臍帯は、満期妊娠から収集し、滅菌ＰＢＳ中に４℃で保存し、その後７日以内に細胞単離のために使用した。ＨＵＡＥＣ単離のために、カニューレを臍動脈の１つに挿入し、滅菌ＰＢＳでフラッシュした。動脈に、０．０７５％のコラゲナーゼＩＩ型（Worthington, Lakewood, NJ, USA）を注入し、３７℃で２０分間インキュベートした。コラゲナーゼ溶液を回収し、動脈をＰＢＳでフラッシュして、すべての剥離した内皮細胞を収集した。細胞懸濁液を４００ｇで５分間遠心分離し、ペレットをＨＵＡＥＣ培養培地（M199（PAA, Pasching, Austria）、１０％熱不活性化ヒト血清（PAA）、１０％熱不活性化新生ウシ血清（PAA）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（MP Biomedicals, Solon, OH, USA）、１５０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子（Dr. Koolwijk, VU Medical Center, Amsterdam, the Netherlandsからの提供）、および０．１％ヘパリン（LEO Pharma, Ballerup Danmark））に再懸濁した。ＨＵＡＥＣは、１％ゼラチンで被覆したプレート中で培養した。
【００６１】
第２動脈を取り出し、残りの結合組織を除去した。内皮細胞は、動脈をブラントな針を介してゆっくり転がすことにより除去した。外膜と中膜を、手術用鉗子を用いて分離した。ＨＵＡＳＭＣ／ＨＵＡＦ培地（DMEM GlutaMAX（商標）（Invitrogen, GIBCO, Auckland, New Zealand）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（PAA）、１０％熱不活性化ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％非必須アミノ酸（PAA））中で一晩インキュベートした後、両方の膜を、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼタイプＩI溶液（Worthington）中で別々に、３７℃でインキュベートした。細胞懸濁液を７０μｍセルストレーナーで濾過し、４００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁させ、培養培地中にプレートした。外膜から単離した細胞は、９０分後に培養培地で洗浄して、ゆっくり接着する非線維芽細胞を除去した。
【００６２】
初代細胞培養
細胞を、加湿した５％ＣＯ２環境において３７℃で培養した。培養培地は、２〜３日毎に交換した。細胞は、トリプシンＥＤＴＡ（Sigma, Steinheim, Germany）を使用して、９０〜１００％（ＨＵＡＥＣおよびＨＵＡＳＭＣ）または７０〜８０％（ＨＵＡＦ）のコンフルエンシーで継代させた。ＨＵＡＳＭＣおよびＨＵＡＦは６継代まで、およびＨＵＡＥＣは３継代まで使用した。４継代までの単離されたＨＵＡＳＭＣおよびＨＵＡＦ、および２継代までの単離されたＨＵＡＥＣのストック溶液を、−１８０℃で、２０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ（Sigma）を含有するDMEM GlutaMAX（商標）中に保存した。
【００６３】
結果
逆標的予測
我々は、２つの逆標的予測分析を行った。最初のＲＴＰでは、文献および我々自身の研究の両方から血管新生に関与することが知られている、１２７の遺伝子を含めた（表Ｓ１）。予想通り、虚血後の血管新生に影響を与えることが以前に報告されたいくつかのｍｉＲについて、推定結合部位の富化を観察し、これは以下を含む：ｍｉＲ−１７／９２ａ１０（それぞれ、２９および２１の推定標的遺伝子）、ｍｉＲ−１０６ｂ／９３／２５８，９（それぞれ、２９、２９および２１の推定標的遺伝子）、ｍｉＲ−１５ａファミリー１１、１２、１７（２６の推定標的遺伝子）、ｍｉＲ−５０３１４（１１の推定標的遺伝子）、およびｍｉＲ−１００７（２つの推定標的遺伝子）；ただし例えば、ｍｉＲ−１２６６は含まれない。しかし、より驚くことは、１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターからの２７のｍｉＲについての推定結合部位の富化であり、これは以下を含む：ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５（それぞれ、２０、３１および４４の推定標的遺伝子）（表Ｓ３）。
【００６４】
第２のＲＴＰでは、有効な血管新生のモデルである、大腿動脈の単結紮により誘発される後肢虚血後のマウス組織における血管リモデリングの初期段階に上方制御されることを我々が見出した、７０の追加の遺伝子を含めた（表Ｓ２）。我々は再度、ｍｉＲ−１７／９２（それぞれ、８および４の推定標的遺伝子）、ｍｉＲ−１０６／９３／２５（それぞれ、８、８および４の推定標的遺伝子）、ｍｉＲ−１５ａファミリー（３の推定標的遺伝子）、ｍｉＲ−５０３（５の推定標的遺伝子）、およびｍｉＲ−１００（１の推定標的遺伝子）についての結合部位の富化を観察した。さらに、最初に識別された２７の１４ｑ３２  ｍｉＲのうち、２６の結合部位の富化が回収され、これは、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５（それぞれ、１０、８および７の推定標的遺伝子）を含む（表Ｓ３）。
我々は、両方のＲＴＰでヒト標的遺伝子配列を使用し、ヒトとマウスの標的部位の間の保存を確認した。１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターは哺乳動物の間で高度保存され、我々は、全てではないが多くの推定標的部位も、同様に保存されていることを見出した（表Ｓ４）。
【００６５】
マイクロアレイ
我々は、ｍＲＮＡマイクロアレイ解析に使用したのと同じマウスの組織試料の、ｍｉＲ発現プロファイルのマイクロアレイ解析を行った。後肢虚血（大腿動脈の単一結紮）後の２４時間および７２時間の時点で、１４ｑ３２  ｍｉＲ−４９４は、最も顕著に調節されたマイクロＲＮＡであった。ｍｉＲ−４９４は２４時間および７２時間後に急速に下方制御された；発現は、７日後に正常化された（図２）。他の１４ｑ３２  ｍｉＲを見ると、半分以上のクラスターメンバーが、有効な血管新生の間に下方制御されたことを観察した。１０個の１４ｑ３２  ｍｉＲは、虚血の２４時間後に既に下方制御されていた（初期応答者）；２４個の１４ｑ３２  ｍｉＲは、虚血７２時間後に初めて下方制御された（後期応答者）；１６個の１４ｑ３２  ｍｉＲは、全く制御されなかった（非応答者）。９個の１４ｑ３２  ｍｉＲは、マイクロアレイ上に存在しなかった（表Ｓ６）。
【表７】
2017505771.tif 000015
【００６６】
さらなる研究のために、我々は各応答者群から１種ずつの１４ｑ３２  ｍｉＲを調査することを選択し、これらのすべては複数の血管新生遺伝子を標的とすることが予測されたものであった。ｍｉＲ−４９４（初期応答者）、ｍｉＲ−３２９（後期応答者）およびｍｉＲ−４９５（非応答者）を選択した。ｍｉＲ−４８７ｂは、２番目に顕著に下方制御された１４ｑ３２  ｍｉＲ（初期応答者）であった。これはどちらのＲＴＰにおいても識別されなかったが、我々は以前に、ｍｉＲ−４８７ｂが大動脈の外向きリモデリングに重要な役割を果たしていることを報告し２４、したがってｍｉＲ−４８７ｂもさらなる研究に含めた。
【００６７】
遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド
より一般的に使用されるアンタゴｍｉＲに対するＧＳＯの有効性および特異性を、初代ヒト動脈外膜線維芽細胞の培養物を用いて比較した。アンタゴｍｉＲとＧＳＯの両方は、ＨＵＡＦにおけるその標的ｍｉＲの発現を阻害するのに、同様に強力であることが証明された（図３Ａ＆Ｂ）。しかし、他のｍｉＲの発現を測定すると、ＧＳＯはその標的ｍｉＲの発現のみを阻害するが、アンタゴｍｉＲは、他のｍｉＲの発現にも影響を与えたことがわかった（図３Ｃ）。したがってＧＳＯは、主要な動脈線維芽細胞においてアンタゴｍｉＲと同等の有効性と、しかしより高い特異性を示した。
【００６８】
in vivoでのｍｉＲ阻害
ｒｔ／ｑＰＣＲを使用して、ＧＳＯ処置マウスの内転筋における標的１４ｑ３２  ｍｉＲの下方制御を確認した。全４種のＧＳＯは、ＧＳＯ対照と比較して、注射後４日目および８日目に対応する、手術後３日目および７日目において、それらの標的ｍｉＲの顕著なノックダウンを達成した（７日目におけるＧＳＯ−４９４のｐ値は、０．０６であった）。手術後１７日目、ＧＳＯの注射後１８日目に、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５の発現は正常化されたが、ｍｉＲ−４８７ｂは、まだ下方制御されていた（図３Ｄ）。
【００６９】
in vivoでの血流の回復
マウスに、尾静脈を介してＰＢＳ中の１ｍｇのＧＳＯ、またはＰＢＳ単独のボーラス注射を行った。翌日マウスに、重度の末梢動脈疾患のモデルである左大腿動脈の二重結紮を行った。足への血流の回復は、後肢虚血後の１７日までＬＤＰＩで追った。全群のマウスは健康に見え、顕著な体重減少は観察されなかった。全４つの処置群、ＧＳＯ−３２９、ＧＳＯ−４８７ｂ、ＧＳＯ−４９４およびＧＳＯ−４９５は、ＰＢＳおよびＧＳＯ対照群の両方に比べて、大幅に改善された血流の回復を示した（図４Ａ）。ＰＢＳおよびＧＳＯ対照群の間で有意差はなかった。ＧＳＯ−３２９またはＧＳＯ−４９５のいずれかを受けたマウスは、ＧＳＯ対照と比較し、虚血誘発後３日目という早い時期に、灌流の増加を示した。灌流の増加は、両群で時間経過と共に持続し、ＧＳＯ−３２９で処置したマウスは、驚異的にも虚血の誘発後７日以内に足の灌流の完全な回復を示し、これと比較してＧＳＯ対照処置マウスでは約６０％の回復率であった（図４Ｂ）。ＧＳＯ−４９５またはＧＳＯ−４９４で処置したマウスは、１０日後にほぼ完全に灌流を回復し、それに続くのはＧＳＯ−４８７ｂで処置したマウスの２週間後であった。ＧＳＯ対照およびＰＢＳ群は、１７日目にサクリファイスされる前に、完全な回復を示さなかった。
【００７０】
in vivo動脈形成
細動脈の数および直径を、左大腿動脈の二重結紮の７日後にサクリファイスしたＧＳＯ処置マウスの内転筋のα−ＳＭＡ陽性の血管を分析することにより決定した。側副動脈は既存細動脈から形成される。したがって、左右の足の間で側副動脈の数が、群内でも、また群間でも類似していたことに驚きはなかった。しかし、ＧＳＯ対照と比較して、ＧＳＯ−３２９（２．６倍、ｐ＝０．０９）およびＧＳＯ−４８７ｂ（３倍、ｐ＝０．０２）で処置したマウスの左右の内転筋の細動脈の直径の間で、増加が観察された。細動脈の直径はまた、ＧＳＯ−４９４（１．９倍、ｐ＝０．３）およびＧＳＯ−４９５（２．３倍、ｐ＝０．３）で処置したマウスにおいても増加したように見え、ＧＳＯ誘発性の動脈形成の増加を示唆した（図５）。
【００７１】
in vivo血管形成
左大腿動脈の二重結紮の７日後にサクリファイスした、ＧＳＯ処置マウスの左（虚血性）と右（正常酸素）ヒラメ筋をＣＤ３１について染色し、毛細管形成を可視化した。ＧＳＯ対照と比較して、毛細血管形成の増加がＧＳＯ−３２９（９．５倍、ｐ＝０．００３）およびＧＳＯ−４９４（８．１倍、ｐ＝０．０６）で処置したマウスの左ヒラメ筋で観察された。毛細管形成はまた、ＧＳＯ−４８７ｂ（４．２倍、ｐ＝０．１）およびＧＳＯ−４９５（５．９倍、ｐ＝０．２）で処置したマウスの左ヒラメ筋でも、増加したように見えた（図６）。
【００７２】
in vivo標的遺伝子調節
１４ｑ３２マイクロＲＮＡを、広範囲の動脈形成促進よび血管形成促進標的遺伝子を標的とするそれらの可能性に関して選択した。すべての推定標的に対する調節を確認することは可能ではないであろうため、ヒトとマウスの間で保存された標的部位の数に基づき、潜在的な１４ｑ３２  ｍｉＲ標的の３’ＵＴＲにおいて、選択を行った（表Ｓ５）。ｍｉＲ−３２９について、ＴＬＲ４、ＭＥＦ２Ａ、ＩＴＧＢ３、ＥＦＮＢ２、ＶＥＧＦＡおよびＦＧＦＲ２を選択した；ｍｉＲ−４９４について、ＡＲＦ６  ＴＬＲ４、ＶＥＧＦＡ、ＥＦＮＢ２およびＦＧＦＲ２を選択した；ｍｉＲ−４９５について、ＴＧＦＢ２、ＩＴＧＡＶ、ＳＴＡＴ３およびＴＧＦＢＲを選択した。我々が以前に示したように、ｍｉＲ−４８７ｂは、わずか１４の保存された推定標的遺伝子を有する。我々は、ｍｉＲ−４８７ｂが、動脈壁内の血管作用性インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１）を直接対象とし、内側平滑筋細胞および外膜線維芽細胞の両方の生存の上昇につながることを確認した２４。
【００７３】
ｒｔ／ｑＰＣＲを使用して、これらの遺伝子が、関連するＧＳＯで処置したマウスの左内転筋において上方制御されたかどうかを決定した。ＧＳＯ−３２９で処置したマウスの内転筋において、ｍｉＲ−３２９についていくつかの標的遺伝子の上方制御を観察し、これにはＨＬＩの３日後のＴＬＲ４、ＩＴＧＢ３、ＶＥＧＦＡおよびＦＧＦＲ２を含むが、ＨＬＩの７日後にはそうではなかった（図７Ａ−Ｂ）。ＧＳＯ−４９４で処置したマウスでは、ＨＬＩの３日目後に標的遺伝子ＴＬＲ４とＶＥＧＦＡの、および７日後にＴＬＲ４、ＡＲＦ６およびＦＧＦＲ２の、上方制御を観察した（図７Ｃ−Ｄ）。ｍｉＲ−３２９は後期応答者であるため、ｍｉＲ−３２９阻害の最大の利益は、ＨＬＩ後の早期に観察されることが予想され、これは初期応答者であるｍｉＲ−４９４がＨＬＩ後に急速に下方制御され、したがって、追加的な阻害の利益が、後期の時点で観察されることが予想されるのとは対照的である。
ｍｉＲ−４９５は効率的に下方制御され、血管新生および血流の回復に対するＧＳＯ−４９５の刺激効果も同時に観察されたが、我々は、ＧＳＯ−４９５で処置したマウスにおける推定標的遺伝子の上方制御を、ｒｔ／ｑＰＣＲによって確認することはできなかった（図１０）。
【００７４】
１４ｑ３２  ｍｉＲ阻害のin vitro効果
血管形成は主に、内皮細胞のみの活性化および増殖に依存するのに対して、動脈形成は、動脈内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞の活性化および増殖を必要とする。したがって我々は、ＧＳＯ処置の、これらの３つの細胞型に対する効果を検討した。我々が以前にＧＳＯ−４８７ｂ２４について示したように２４、いずれのＧＳＯも、平滑筋細胞の増殖に影響を与えなかった（図１１）。しかし、動脈内皮細胞において、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−４８７ｂおよびｍｉＲ−４９５の阻害はすべて、それぞれ約２０％、５０％および３５％の細胞増殖の増加をもたらした。ｍｉＲ−４９４の阻害は、内皮細胞増殖には影響しなかった（図８Ａ）。対照的に、線維芽細胞において、ｍｉＲ−４９４阻害後に細胞増殖の２０％の増加を観察し（図８Ｂ）、一方他のＧＳＯについては、効果は観察されなかった。
【００７５】
考察
本研究において、我々は、個々の１４ｑ３２  ｍｉＲの阻害が血流の回復を改善し、内転筋の動脈形成および虚血性腓腹筋の血管形成の両方を刺激することを示す。我々は、それらのマスタースイッチの特徴を利用し、逆標的予測によって血管新生を調節するｍｉＲを識別した。血管形成と動脈形成の両方に関連するおよそ２００の遺伝子のセット全体において、すべてがヒト１４番染色体上のｍｉＲ遺伝子クラスターに属する２７個のｍｉＲの結合部位について、富化があった。１４ｑ３２  ｍｉＲは、マウスでの有効な血管新生の間、下方制御される。我々は遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチドを使用して、in vivoで４種の１４ｑ３２  ｍｉＲの発現を阻害し、マウスでの左大腿動脈の二重結紮後の、足への血流の回復を追跡した。
【００７６】
以前の研究では、個々のｍｉＲ阻害の、虚血後の血管新生への有益な効果を実証しているが、特にｍｉＲ−３２９についてここで観察された効果の大きさは、前例がないものである。２００９年にBonauerら１０は、血管形成におけるｍｉＲ−１７／９２ａクラスターの役割について報告した。彼らは、ｍｉＲ−９２ａの阻害が、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて、虚血後の血流の回復を改善したことを示した。著者らは、血流回復の実際のパーセンテージを報告していないが、著者らのＬＤＰＩ画像は明らかに、大腿動脈と静脈の二重結紮後１４日目にマウスが回復していないことを示している。２０１１年にGrundmannら１４は、ｍｉＲ−１００の阻害はまた、虚血後に血流回復の改善につながることを示した。著者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける大腿動脈の二重結紮後７日目に、１０〜１５％の灌流の絶対的増加を記述した。最後に、２０１２年にYinら１１は逆のアプローチを取り、ｍｉＲ−１５ａの過剰発現が虚血後の血流の回復を減衰させ、大腿動脈の切除後７日目に１０％、１４日目に２５％の、灌流の絶対的な減少が、対照動物と比較してもたらされることを実証した。
【００７７】
大規模なＲＴＰを使用して、血管新生を調節するｍｉＲ、またはこれについての任意の生理学的プロセスを識別することは、新規のアプローチである。血管新生に対して、ＲＴＰは、堅牢かつ効果的な方法であることを証明した。我々は、以前に血管新生と関連することが報告されたほとんどのｍｉＲを回収し、新たな血管新生ｍｉＲの大規模なセット、１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターを識別した。１４ｑ３２  ｍｉＲの阻害が虚血後の血流の回復を実際に増加させ、in vivoで動脈形成および血管形成の両方を増強するという事実は、この新規な方法の有効性を支持する。
しかし興味深いことには、我々は、血管新生を阻害することが以前に報告されたｍｉＲを回収しただけでなく、血管新生を増強することが以前に報告されたｍｉＲも回収し、これにはｍｉＲ−１０６ｂ／９３／２５８，２５およびｍｉＲ−４２４２３を含むが、ここでｍｉＲ−４２４は、抗血管形成効果を有することが報告されているものである２６。我々の標的遺伝子のリストは、主に動脈形成促進遺伝子および血管形成促進遺伝子から構成され；これらの遺伝子を標的とすることが予測されたｍｉＲはしたがって、血管新生を阻害する可能性がある。おそらく、血管新生促進経路および抗血管新生経路の調節は、以前に考えられていたよりも緊密に絡み合っている。この知見はまた、ＲＴＰを使用して、抗動脈形成遺伝子を標的とする、動脈形成促進ｍｉＲを識別できることを示す。血管新生は、ｍｉＲ模倣物を使用することによって潜在的に改善することができ、これらのｍｉＲの過剰発現およびそれらの抗動脈形成標的の下方制御が導かれる。しかし、例えばｍｉＲ模倣物の使用によるｍｉＲ過剰発現は、阻害よりも多くのオフターゲット効果につながる可能性があり、また、標的としたｍｉＲを内因的に発現しない臓器または組織におけるｍｉＲの過剰発現、したがって遺伝子阻害活性が生じ得る。
【００７８】
いくつかのｍｉＲ標的遺伝子予測アルゴリズムがオンラインで利用可能であるが、我々は、我々のＲＴＰをwww .targetscan.org.に限定することを選択した。ｍｉＲ結合部位における多型に関する以前の研究において、我々は、TargetScanによって行われた予測が、約６０％の精度を有することを見出した２７；ＲＴＰに含まれる多数の遺伝子と組み合わせて、TargetScanの予測のみで、重要な血管新生ｍｉＲを識別するのに十分な堅牢性を証明した。マイクロアレイ解析は、有効な血管新生の間において、ほとんどの１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターメンバーの下方制御を示し、これはさらに、両方のＲＴＰの知見を確認する。
１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターは、ヒトとマウスの間で高度に保存されている。in vivoサイレンシングのために選択された４種の１４ｑ３２  ｍｉＲのうち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９の配列のみは、そのマウスのバリアントＭＭＵ−ｍｉＲ−３２９からわずかに変化していた（表Ｓ１）。しかし、多くの推定結合部位は、ヒトとマウスの間で保存されていた。驚くべきことに、ＲＴＰ１においてほとんどの推定の動脈形成促進および血管形成促進標的を有したｍｉＲ−４９５は、選択された４種のｍｉＲの内で、最も少ない保存標的部位を有していた。種にわたる保存は多くの場合にゲノム配列の生物学的意義を反映するため、この低い保存の程度はおそらく、免疫組織化学によって測定されるように、新生血管新生に対するｍｉＲ−４９５阻害のより緩やかな効果を説明する。これはまた、ｍｉＲ−４９５が、マウスにおける有効な血管リモデリングおよび血管新生の間に調節されなかった理由、証拠に基づくＲＴＰ２においてより少ない推定標的を有していた理由、および、ＧＳＯ−４９５処置後の推定標的遺伝子の上方制御を確認できなかった理由を、説明することができる。
【００７９】
ｍｉＲ−４８７ｂは、ヒトとマウスの両方で１４個のみの保存された推定標的遺伝子を有するために、例外的なｍｉＲである。我々は以前に、大動脈の外向き（outward）リモデリングにおけるｍｉＲ−４８７ｂの役割を、in vivoでラットにおいて、およびin vitroでヒト初代動脈細胞において、生存促進因子インスリン受容体基質１（ＩＲＳｌ）を標的とすることにより、確認した２４。単一の保存された血管新生標的遺伝子のみを有するため、ＩＲＳｌは、血流の回復と血管新生に対するｍｉＲ−４８７ｂ阻害の、ｍｉＲ−３２９およびｍｉＲ−４９４阻害と比べてわずかにより緩やかな効果を説明する。ヒト肺癌におけるｍｉＲ−４８７ｂの役割に関する最近の研究は、ＳＵＺ１２、ＢＭＩｌ、ＷＮＴ５ＡおよびＫＲＡを、ｍｉＲ−４８７ｂについての直接の標的として確認した２８。しかし、ＷＮＴ５Ａ  ３’ＵＴＲ内の２つの部位の１つを除いて、これらの遺伝子におけるｍｉＲ−４８７ｂのための結合部位はマウスで保存されておらず、したがって我々のマウスモデルにおける血管新生に対する効果には、貢献することができない。
【００８０】
我々は、マスタースイッチとして機能し、動脈形成のすべての側面に関与する多くの異なる標的遺伝子の発現レベルに、おそらく適度な効果のみを有するｍｉＲを識別することを目指した。特にｍｉＲ−３２９およびｍｉＲ−４９４は、in vivoで選択された標的遺伝子の大部分を調節することが判明した。血管リモデリングの様々な側面に関与するこれらの標的遺伝子は、ｍｉＲ−３２９またはｍｉＲ−４９４阻害後にin vivoで上方制御された。これに対応して、血流の回復、動脈形成および血管形成に対する効果は、堅牢であった。ｍｉＲ−３２９の阻害は、足の灌流の前例のない急速な回復をもたらした。ｍｉＲ−３２９は我々のマイクロアレイ解析で後期応答者であったため、血管新生の初期段階でのｍｉＲ−３２９の阻害はおそらく、全体としてのプロセスを大幅に強化する。この仮説は、せん断応力によって誘発される内皮活性化の後に動脈形成が開始されるため、内皮細胞増殖がＧＳＯ−３２９での処置の後に強化されたとの観察によって支持される。ｍｉＲ−３２９と同様に、ｍｉＲ−４９５の阻害もまた、虚血後血管新生の非常に早い段階で足の灌流の増加につながった。ｍｉＲ−４９５阻害後の内皮細胞の増殖のここに示された増加に加えて、以前の研究はまた、細胞の生存および遊走の両方におけるｍｉＲ−４９５の役割を示している２９〜３１。ｍｉＲ−４８７ｂの阻害もまた、内皮細胞増殖を増加させる。
【００８１】
我々のマイクロアレイ解析により、ｍｉＲ−４９４の発現は、迅速な下方制御の後、虚血後１週間以内に正常化し始めることが示された。本研究で用いた４種のＧＳＯのうち、ＧＳＯ−４９４は血流の回復に関して最も遅いスターターであるが、しかし特に大腿動脈結紮後の７日と１０日の間、ＧＳＯ−４９４処置は、対照と比較して、足の灌流を改善する。ｍｉＲ−４９４は以前に、他の細胞種類の中でも心筋細胞の増殖および生存の両方に影響を与えることが報告された３２、３３。我々は、ｍｉＲ−４９４が、動脈内皮細胞の増殖に影響を与えないが、動脈外膜線維芽細胞の増殖を強化することを観察し、これは、我々がin vivoで観察した、遅いスタートと、その後の、特に血管新生（すなわち線維芽細胞の動員および細胞外マトリックスの回復）の後期段階の流れにおける強い増加と整合する。したがって潜在的には、ＧＳＯ−３２９とＧＳＯ−４９４の併用投与は、虚血後の血流の回復と血管新生をさらに高めるであろう。
結論として、ここで我々は、個々の１４ｑ３２  ｍｉＲの阻害がin vivoでの虚血後の血流回復の増加につながることを実証した。我々は、１４ｑ３２  ｍｉＲが、血管リモデリングおよび血管新生におけるマスタースイッチとして機能すると考える。１４ｑ３２  ｍｉＲの個々の、または組み合わせの阻害は、将来的に治療的血管新生における成長因子の代替を提供することができるであろう。
【００８２】
例２
材料および方法
逆標的予測
文献ｘｉｖ，ｘｖ，ｘｖｉ，ｘｖｉｉ，ｘｖｉｉｉおよび我々のグループ内の既存の知識に基づき、ケモカイン、サイトカイン、接着分子、スカベンジャー受容体、脂質関連標的、補体因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）および増殖因子を含む、アテローム性動脈硬化に関与する１６３の遺伝子のリストを編集した。全遺伝子を２つの群に分けた：アテローム性動脈硬化を低減すると予想されるもの（４３遺伝子）、および悪化させると予想されるもの（１２０遺伝子）。オンラインアルゴリズムTargetscan（www .targetscan.org）を使用して、我々が選択した遺伝子を標的とすることが予想されるすべてのｍｉＲについてのリストを生成した。これらのリストを次にスプレッドシートに移し、リスト回数（個々のｍｉＲが総スプレッドシートにリストされた回数）を、各ｍｉＲについて手動でカウントした。ｍｉＲを、その出現率に応じてランク付けし、これは、３’ＵＴＲ結合部位で最も高出現のｍｉＲが、ほとんどのアテローム性動脈硬化関連遺伝子を調節すると予測されることを意味する（表１ａ）。ＲＴＰを、ヒト標的遺伝子における結合部位を分析することにより実施して、臨床的関連性を保証した。その後、ヒトおよびマウスの標的部位間の保存をチェックし、我々のマウスモデルの、アテローム性動脈硬化のための使用の妥当性を確認した。
【００８３】
【表８】
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【００８４】
マウス
すべての動物の作業は、オランダ政府のガイドラインおよび欧州議会のDirective 2010/63/EUに準拠して実施した。地元の動物飼育施設（Gorlaeus Laboratories, Leiden, the Netherlands）から入手した雄のａｐｏＥ−／−マウスには、０．２５％コレステロールおよび１５％のカカオバターを含有する西洋型食餌（SSDS, Sussex, UK）を６週間与えた。外科的介入前に、マウスは、年齢、コレステロール、および体重を適合させた。コレステロール測定の詳細については後述する。白血球（WBC）数および細胞分化は、Sysmex細胞分化装置（Goffin Meyvis, Etten-Leur, The Netherlands）で決定した。
【００８５】
外科的介入
西洋型食餌の開始の２週間後、頸動脈プラークの形成を、前述のように、血管周囲のカラーの配置により誘発したｘｉｘ。簡単に述べると、半収縮カラーを、マウスの左右の頸動脈の周囲に配置した。カラーの近位部位での低せん断応力および流れの妨害は、内皮接着分子の発現増加とアテローム硬化性病変形成をもたらす。カラー配置の４週間後、マウスを麻酔し、in situで灌流し、その後頸動脈病変を分析した。
【００８６】
ＧＳＯによる処置
手術後４日目に、マウスに、１ｍｇの遺伝子サイレンシングオリゴヌクレオチド（ＧＳＯ、Idera Pharmaceuticals, Cambridge, MA, USAからの提供）またはＰＢＳ対照のいずれかの静脈注射を施した。マウスのサブセット（群あたりｎ＝６）を、in vivoでのｍｉＲの下方制御を確立するために、４日後にサクリファイスした。アテローム性動脈硬化に対する効果について、残りのマウスに、マウスあたり０．５ｍｇのＧＳＯの第２の注射を、１８日目に施した（群あたりｎ＝１５）。ＧＳＯは、成熟した標的ｍｉＲ配列に対して完全な逆相補性で設計され、Idera Pharmaceuticalsにより合成された。陰性対照として、任意の既知のマウスｍｉＲを標的としないように設計されたスクランブル配列を使用した。ＧＳＯは、ＴＬＲ活性化を避けるために、ホスホロチオエートリンカーによりその５’末端で一緒に連結された２つの一本鎖Ｏ−メチル修飾ＤＮＡ鎖で構成される。使用される全てのＧＳＯの配列を、表Ｓ１ａに示す。
【表９】
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【００８７】
コレステロール測定と解析
血液を尾部出血によりマウスから採取した。血漿中のコレステロール濃度は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル中の０．０２５Ｕ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼ（Sigma）および０．０６５Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼおよび１５μg／ｍｌのコレステロールエステラーゼ（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）、ならびに７．５％メタノールとのインキュベーションにより決定した。Precipath（標準化血清；Boehringer Mannheim, Germany）を、内部標準として使用した。吸光度は４９０ｎｍで測定した。
脂質プロファイリングのために、血漿をプールし（試料当たりｎ＝３匹のマウス）、６回希釈し、その後血漿リポタンパク質の分画を、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣを使用して実施した。トリグリセリドレベルおよび総コレステロールレベルは、各画分中および元のプールされた試料中で、コレステロールＣＨＯＤ−ＰＡＰ試薬（Roche/Hitachi）とのインキュベーションにより測定した。吸光度を４９２ｎｍで測定した。
【００８８】
組織学および形態学
パラフィン切片（厚さ５μｍ）を、規定通りにＨＰＳ（ヘマトキシリン−フロキシン−サフラン）染色し、これを使用してプラークのサイズを決定した。ピクロシリウス赤染色を使用して、コラーゲンを視覚化し、壊死性コアの大きさを測定した。プラーク組成物はさらに、平滑筋細胞（α平滑筋アクチン、Sigma）およびマクロファージ（MAC3, BD-Pharmingen）についての染色により調査した。マスト細胞の量およびそれらの活性化状態は、酵素染色キット（Naphtol-CAE, Sigma）を用いて可視化した。
形態計測分析（Leica Qwin画像解析ソフトウェア）を、ＨＰＳ染色アテローム硬化性病変の最大狭窄部位で実施した。（免疫）組織化学染色は、コンピュータ支援解析（Leica, Qwin）によって定量化し、総病変面積に対する正の染色面積の割合として表した。マスト細胞は手動でカウントした。全ての顆粒が細胞内に維持されている場合に、マスト細胞は休止中と考えられ、一方顆粒がマスト細胞の周囲の組織に堆積された場合に、マスト細胞は活性化されたと評価された。壊死性コアは、細胞性デブリに富んだプラーク領域の、総プラーク面積に対するパーセンテージとして定義した。
【００８９】
細胞培養
Ｃ５７Ｂ１／６マウスから単離したＢＭ（骨髄）細胞を、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍｍｏｌ／Ｌの１−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地、およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）のソースとしての３０％Ｌ９２９細胞馴化培地中で、７日間培養し、BM由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を生成したｘｘ。初代マスト細胞の生成のため、ＢＭ細胞を、１０％ＩＬ−３上清（ＷＥＨＩ細胞を過剰発現し分泌するマウスインターロイキン３（ｍＩＬ３）の上清）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ＭＥＭ非必須アミノ酸、１０％ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌの１−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地で、４週間培養したｘｘｉ。マスト細胞の純度および成熟は、サイトスピンを０．５％水性トルイジンブルーで染色することにより、顕微鏡で測定した。初代培養マウス平滑筋細胞（ｖＳＭＣ）ならびに線維芽細胞（３Ｔ３）および内皮細胞（Ｈ５Ｖ）の細胞株を、１０％ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌの１−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充した、完全ＤＭＥＭ培地で培養した。
【００９０】
マスト細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞および内皮細胞を、１０６細胞／ｍＬの密度で、トリプリケートでプレートした。ＧＳＯを５ｎｇ／ｍＬの濃度で一晩添加し、その後細胞をＲＮＡ単離のために溶解した。
ＢＭＤＭについては、ＧＳＯは、ＢＭからの単離の直後に、５ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した。３日後、培地を、５ｎｇ／ｍＬ濃度のＧＳＯの同様の添加で新鮮にした。４日後、培地を除去し、細胞をＲＮＡ単離のために溶解した。
【００９１】
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲ
カラー配置の７日後からの３つの頸動脈セグメントをプールし、Pellet Pestle Cordless Motor（Kimble Chase Life Science, USA）を用いて粉砕することにより均質化した。全ＲＮＡを、標準のＴＲＩｚｏｌ−クロロホルム抽出プロトコルを用いて単離した。ＲＮＡ濃度、純度および完全性は、ナノドロップ（Nanodrop（登録商標）Technologies）によって調べた。ｍｉＲの定量は、製造業者のプロトコルに従い、TaqMan（登録商標）ｍｉＲアッセイ（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて実施した。ｑＰＣＲは、7900HT Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）で実施した。データの正規化は、安定的に発現された内因性対照（ｍｍｕ−ｌｅｔ−７ｃ）を用いて行った。
in vitro実験のために、全ＲＮＡを、グアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）法ｘｘｉｉを用いて細胞から抽出した。ＲＮＡは、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（RevertAid, MBI Fermentas, Leon-Roth）により逆転写し、ABI PRISM 7700 Taqman装置（Applied Biosystems）によるマウス遺伝子（表Ｓ２ａ）の定量分析のために使用した。マウスＨＰＲＴおよびＲＰＬ２７は、標準的なハウスキーピング遺伝子として使用した。
【００９２】
【表１０】
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【００９３】
コラーゲン合成アッセイ
ｖＳＭＣによるコラーゲン産生を測定するために、細胞を、ウェル当たり０．２×１０６細胞の密度で播種した。細胞の付着後、対照培地または、ＧＳＯ対照、ＧＳＯ−４９４、ＧＳＯ−４９５またはＧＳＯ−３２９（５ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地を添加した。続いて、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸の存在下で、１μＣｉ［３Ｈ］プロリン（Perkin Elmer）を加え、３７℃で一晩インキュベートした。細胞をウェルから剥離し、２０ｍＭのトリス×ＨＣｌ／０．３６ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ＝７．６）に入れ、２分間超音波処理した。コラーゲンを、１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼとともに３７℃で２時間インキュベートすることによって分解し、その後試料を、１３．２ｇで１５分、遠心分離した。タンパク質を、氷上で３０分間、５０％トリクロロ酢酸を用いて沈殿させ、その後上清中の［３Ｈ］プロリン含有量を、コラーゲン産生の指標として、液体シンチレーションアナライザー（Packard 1500 Tricarb, USA）で定量した。タンパク質含有量は、標準的なBCAタンパク質アッセイを用いて測定した。
【００９４】
統計分析
データは、平均±ＳＥＭとして表す。両側スチューデントｔ検定を、in vivo研究における個々の群を比較するために使用した。ノンパラメトリックデータは、マンホイットニーＵ検定を用いて分析した。Ｐ＜０．０５のレベルを有意とみなした。
【００９５】
結果
ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−３２９は、複数のアテローム性動脈硬化関連遺伝子を調節することが予測される
文献および以前の研究から知られている我々が編集した１５０のアテローム性動脈硬化関連遺伝子のリストに基づき、逆標的予測を行った。予想されたように、我々は、ｍｉＲ−１４３／１４５ｘｘｉｉｉ、ｍｉＲ−２３／２４ｘｘｉｖおよびｍｉＲ−３３１１を含む、アテローム性動脈硬化において以前に記載されている複数のｍｉＲを識別した。より確立されていないｍｉＲ、例えばｍｉＲ−５９０−３ｐも同様に識別された。ｍｉＲ−５９０−３ｐはほとんどの遺伝子を標的とすると予測され、これは、ｍｉＲ−５９０−３ｐが、最小限に酸化されたＬＤＬが誘発するｖＳＭＣ表現型形質転換において調節されているという最近の知見と、一致しているｘｘｖ。
興味深いことに、我々は、１４番染色体（１４ｑ３２（マウスの染色体１２ｆｌ））の長腕上のインプリント領域に位置する、単一のｍｉＲ遺伝子クラスターからの複数のｍｉＲについての結合部位の富化を見出した（表１ａ）。我々は、以下を含む、この遺伝子クラスターの１１のｍｉＲを識別した：ｍｉＲ−３２９（２３のアテローム生成促進性標的および１１の抗アテローム生成標的）、ｍｉＲ−４９４（３０のアテローム生成促進性標的および８の抗アテローム生成標的）およびｍｉＲ−４９５（３５のアテローム生成促進性標的および１０の抗アテローム生成標的）、これらは、さらなる調査のために選択された。１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターは、哺乳動物の間で、より具体的にはマウスとヒトの間で高度に保存され、また我々は、全てではないがほとんどの推定上の標的部位も保存されていることを見出した。
【００９６】
標的遺伝子発現はＧＳＯによるｍｉＲの阻害後にin vitroで上方制御される
ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、およびｍｉＲ−３２９の阻害後の標的遺伝子発現の上方制御を確認するために、培養細胞をＧＳＯで処置した。アテローム性動脈硬化における種々の細胞種類の関与を反映させるために、平滑筋細胞、内皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞およびマスト細胞を、これらのアッセイに使用した。サイトカイン、補体成分、脂質関連標的およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）を含む複数の標的遺伝子を調査し、ｍｉＲが発揮することができる幅広い効果を調べた。
【００９７】
ｍｉＲ−４９４の阻害は、内皮細胞および平滑筋細胞の両方において、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の有意な上方制御をもたらした。また、そのリガンドＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）は、マクロファージおよびマスト細胞において有意に増加した。ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２は以前に、アテローム性動脈硬化において保護的な役割を果たしていることが示されているｘｘｖｉ、ｘｘｖｉｉ。ｍｉＲ−４９４の阻害はまた、ＡＣＶＲ１（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）およびＡＤＩＰＯＲ２（脂肪酸酸化に関与する）の上方制御を導いた（図１７）。ｍｉＲ−４９５の阻害は、線維芽細胞におけるＣＤＫＮ１Ｂ発現の有意な増加をもたらした。ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７Ｋｉｐ１）は、アテローム硬化性プラーク中で発現され、ｖＳＭＣ増殖を阻害する能力を有するｘｘｖｉｉｉ。補体調節タンパク質ＣＤ５９の発現もまたマクロファージにおいて増加し、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の表現も同様であった（図１８）。ｍｉＲ−３２９の阻害後の標的遺伝子発現は、ＡＤＩＰＯＲ２、ＣＤ５９、ＩＬ１０ＲＡおよびＣＸＣＬ１２の上方制御を明らかにした（図１９）。
【００９８】
ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−３２９の阻害はアテローム硬化性病変形成を低減する
アテローム硬化性病変を、ａｐｏＥ−／−マウスの両方の頸動脈の周囲に血管周囲のカラーを配置することによって誘発した。手術の４日後、マウスに、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、またはｍｉＲ−３２９に対するＧＳＯを与えた；対照群には、ＰＢＳまたはＧＳＯ対照のいずれかを与えた。ｍｉＲ−４９４（４６％）、ｍｉＲ−４９５（２３％）およびｍｉＲ−３２９（３５％）の発現の下方制御は、ＧＳＯの注射後３日目に頸動脈において検出された（図２０）。
ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−３２９阻害の、アテローム性動脈硬化の発症に対する効果を評価するために、マウスをカラー配置の４週間後にサクリファイスし、プラークを、サイズおよび組成について分析した。ＨＰＳ染色した切片により、ＧＳＯ−４９４で処置した群において、アテローム硬化性プラークのサイズの６５％の減少が明らかになった（ＧＳＯ対照：４７±１１×１０３μｍ２；ＧＳＯ−４９４：１６±３×１０３μｍ２；ＧＳＯ対照に対してｐ＜０．０５）。ＧＳＯ−４９５による処置は、病変サイズの５２％の減少につながった（ＧＳＯ−４９５：２２±５×１０３μｍ２；ＧＳＯ対照に対してｐ＜０．０５、図１２）。ＧＳＯ−３２９で処置したマウスも、プラークサイズの減少（４２％）を示したが、有意性には達しなかった（ＧＳＯ−３２９：２７±６×１０３μｍ２；ＧＳＯ対照に対してｐ＜０．１３）。我々は、ＰＢＳと対照ＧＳＯ処置の間で、病変サイズの違いを観察せず（ＧＳＯ対照：４７±１１×１０３μｍ２；ＰＢＳ：３８±１１×１０３；ｐ＝０．４７；図１２）、ＧＳＯ対照が非特異的効果を発揮しなかったことを例証した。
【００９９】
ＧＳＯ−４９４およびＧＳＯ−４９５の処置は、アテローム硬化性病変の強化された安定表現型をもたらす
興味深いことに、アテローム硬化性プラークは、ＧＳＯでの処置後にサイズが縮小されるだけではなかった；プラークはまた、プラーク安定性の増加を示した。いわゆる「安定な病変」は、小さな壊死性コアおよび、コラーゲンと平滑筋細胞が豊富な厚い線維性被膜によって特徴付けられる。実際に、壊死性コアのサイズは、ＧＳＯ−４９４で処置したマウスにおいて８０％（対照ＧＳＯ：３３±６％；ＧＳＯ−４９４：６±３％；Ｐ＜０．００１；図１３）、ＧＳＯ−４９５で処理したマウスでは６０％（対照ＧＳＯ：３３±６％；ＧＳＯ−４９５：１３±５％；Ｐ＜０．０５）と、有意に減少した。さらに、コラーゲン含有量は、ｍｉＲ−４９４の阻害後（対照ＧＳＯ：６．６±１．６％；ＧＳＯ−４９４：１２．７±２．１％；Ｐ＜０．０５）およびｍｉＲ−４９５の阻害後（対照ＧＳＯ：６．６±１．６％；ＧＳＯ−４９５：１５．８±３．１％；Ｐ＜０．０２）に、有意な増加を示した。まとめると、壊死性コアサイズの減少と、同時のコラーゲン含有量の増加は、強化されたプラーク安定性を示す。
【０１００】
プラーク形態計測を、抗α平滑筋アクチン抗体を用いて平滑筋細胞を可視化することにより、さらに検討した。陽性染色された病変面積のパーセンテージは、処置群の間で類似していた（対照ＧＳＯ：４．６±１．０％；ＧＳＯ−４９４：６．４±１．８％；ＧＳＯ−４９５：４．７±１．６％；ＧＳＯ−３２９：６．０±１．３％）。マクロファージ含有量は、ＧＳＯ−４９５で処置した群のみで減少した（対照ＧＳＯ：２０．０±２．２％：ＧＳＯ−４９５：１４．１±１．３％；Ｐ＜０．０５）。マスト細胞数（対照ＧＳＯ：２．９±０．６マスト細胞／ｍｍ２；ＧＳＯ−４９４：２．２±０．５マスト細胞／ｍｍ２；ＧＳＯ−４９５：２．０±０．４マスト細胞／ｍｍ２；ＧＳＯ−３２９：２．５±０．６マスト細胞／ｍｍ２）またはそれらの活性化状態（データは示さず）のいずれにおいても、差は見出されなかった。
【０１０１】
ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５の阻害後のコレステロールレベルの低下
総コレステロールレベルは、ＧＳＯ−４９４での処置後（対照ＧＳＯ：３０．４±１．１ｍＭ、ＧＳＯ−４９４：２６．４±０．７ｍＭ；Ｐ＜０．０１；図１４Ａ）およびＧＳＯ−４９５での処置後（ＧＳＯ−４９５：２６．４±１．６；対照ＧＳＯに対してＰ＝０．０５６、図１４Ａ）に、減少を示した。ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣによる脂質プロファイリングは、ＧＳＯ−４９４およびＧＳＯ−４９５で処置した後に、ＶＬＤＬ画分の減少を明らかにした（図１４Ｂ）。
【０１０２】
ｍｉＲ−３２９およびｍｉＲ−４９５の阻害は、ＧＳＯ処置後の血中リンパ球および好中球の数を変化させる
Sysmex細胞分化分析によるＷＢＣの分析は、ＧＳＯ−４９５で処置後のサクリファイス時における、リンパ球の絶対量の減少を示した。ＧＳＯ−３２９で処置したマウスはまた、リンパ球の数の減少だけでなく、血液中の好中球の絶対量の減少を有した。（図１５）
【０１０３】
ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５の阻害はコラーゲン恒常性の変化をもたらす
プラークに存在するコラーゲン量の増加の裏にあるメカニズムを解明するために、我々は、コラーゲン合成とコラーゲン分解の両方を研究した。初めに、in vitroのセットアップにおけるコラーゲン合成を見た。平滑筋細胞におけるｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−３２９の阻害は、コラーゲン合成速度の増加をもたらさなかった（図２１）。
次に、コラーゲン分解を調べた。我々は、培養細胞をＧＳＯで処置した後の、ＴＩＭＰ発現を測定した；これは、ＴＩＭＰがＭＭＰによるコラーゲンの分解を阻害するためである。ＴＩＭＰ３は、ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−３２９の予測標的であり、ＴＩＭＰ２は、ｍｉＲ−４９５の標的遺伝子である。実際、ＴＩＭＰ３の発現は、ＧＳＯ−３２９で処置後の内皮細胞で増加した。また、ＴＩＭＰ３の発現レベルは、ｍｉＲ−４９４の阻害後のマスト細胞およびマクロファージにおいて増加した。ｍｉＲ−４９５の阻害は、マスト細胞におけるＴＩＭＰ２発現の上方制御をもたらした。我々は次に、コラーゲンを分解することができるためにプラーク安定性に重要であることが知られている、ＭＭＰ２、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２を含むＭＭＰの発現を測定した。ＭＭＰ８のみは、ｍｉＲ−４９５の予測標的であり、実際に我々は、ｍｉＲ−４９５の阻害後にＭＭＰ８発現の増加を観察した。他のＭＭＰの発現レベルは変化せず、ＴＩＭＰ／ＭＭＰ比の純増加をもたらした（図１６）。したがって、プラーク中のコラーゲン含有量の増加は、コラーゲン合成の増加によるのではなく、その分解の減少が原因である可能性が高い。
【０１０４】
考察
本研究は、すべて１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターのメンバーであるｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−３２９の、アテローム性動脈硬化の発症における役割を報告する、最初のものである。我々は、ユニークな戦略を使用し、我々自身の以前の実験と文献からの知識をin silicoアプローチで組み合わせることにより、これらのｍｉＲを識別した。この逆標的予測のために、我々は、アテローム性動脈硬化を悪化させるかまたは改善することが予想される、ｍｉＲの２つのリストを編集した。予想されるように、このアプローチによって識別されたｍｉＲの多くは、血管炎症に影響を与えることが文献に記載されている。アテローム性動脈硬化において重要であることが知られているｍｉＲの回収に加えて、我々は、この疾患ではまだ調べられていないｍｉＲを、特に１４ｑ３２クラスターからのものを、識別することができた。１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターは、哺乳動物において高度に保存され、マウスにおいて５９の、およびヒトにおいて５４のｍｉＲ遺伝子から構成されているｘｘｉｘ。以前に、１４ｑ３２  ｍｉＲの多くが、ヒトの疾患に関与していることが示されているｘｘｘ。アテローム性動脈硬化におけるそれらの役割を確立するために、我々は、アテローム性動脈硬化のin vivoモデルにおいてｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−３２９を阻害した。我々は、アテローム硬化性プラーク形成における減少と同時に、プラーク安定性の増加を観察した。
【０１０５】
ｍｉＲ−４９４は、我々のＲＴＰにおいて、抗炎症標的遺伝子よりも多くの炎症促進性標的遺伝子を標的化すると予測されたが、ｍｉＲ−４９４の阻害のin vivo効果は、アテローム性動脈硬化に対するプラスの効果を明らかにした。我々は、ｍｉＲ−４９４の阻害、およびこれについてのｍｉＲ−３２９およびｍｉＲ−４９５の阻害は、アテローム硬化促進性および抗アテローム硬化性の両方の遺伝子の、上方制御につながる。多くの研究は、アテローム性動脈硬化を低減するために、アテローム生成促進性遺伝子を標的としているが、我々のデータは、抗アテローム生成遺伝子の上方制御も、この複雑な疾患を処置する際に、同様に、またはより以上に有望であることを示唆する。
【０１０６】
スタチンによるコレステロールレベルの低下は、依然としてアテローム性動脈硬化の最も一般的に使用される処置法である。スタチン処置後のＬＤＬレベルの低下は２０〜６０％の範囲であり、これは、約３０％の心血管イベントの減少をもたらすｘｘｘｉ。ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５の阻害は、主にＶＬＤＬ画分の減少によって、コレステロールレベルをわずか１３％低下させた。この減少が寄与することはほぼ確実であるが、しかし我々は、プラークサイズの主な減少が、血漿コレステロールのこの比較的控えめな減少のみによるものである可能性は低いと考えている。さらに、血漿リポタンパク質で観察された変化は、我々の研究に見られるプラーク安定性の顕著な増加を完全には説明しておらず、我々はしたがって、ｍｉＲＮＡ阻害の、マトリックス恒常性への影響をさらに解明することを目的とした。ｍｉＲ−４９４およびｍｉＲ−４９５の阻害は、壊死性コアサイズの減少およびコラーゲン含有量の増加によって示されるように、アテローム硬化性プラークの安定性の向上に有効であることが判明した。平滑筋細胞の含有量に差は検出されなかったので、我々は特にコラーゲンの増加量に注目し、これが、増加したコラーゲン恒常性によって引き起こされ得るとの仮説を立てた。平滑筋細胞をin vitroで、ＧＳＯで処置した後に、コラーゲン合成速度の変化は検出されなかった。しかし、ＴＩＭＰ／ＭＭＰ比が著しく増加し、コラーゲン分解の低下を示唆した。in vivoにおいて、コラーゲン分解の低下は線維性被膜の厚さの増加をもたらし、それによって、プラークの破裂と付随する心血管イベントのリスクを低減するであろう。
【０１０７】
まとめると、我々の結果は、ｍｉＲが、その標的遺伝子を完全に阻害するというよりも、複数の遺伝子の発現を微調整できることを示す。ｍｉＲは、多数の個々の遺伝子を調節することができるため、遺伝子発現の微妙な変化は、加えると大きな正味の効果となり得る。本研究において、１４ｑ３２  ｍｉＲの阻害は多くのアテローム性動脈硬化関連遺伝子に影響を与え、アテローム硬化性病変の発症および進行の著しい低減をもたらす。
１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターの関与は、アテローム性動脈硬化において以前には示されていない；しかし、我々のグループは最近、これらのｍｉＲの、治療的血管新生における役割を記述した３８。末梢動脈疾患および心筋梗塞後などの虚血に罹患している患者に対して、組織への血流を増加させることは重要である。動脈形成および血管形成の刺激には常に炎症反応が伴い、これは多くの場合、虚血の根本的な原因であるアテローム性動脈硬化の悪化につながる。このいわゆるヤーヌス現象はｘｘｘｉｉ、研究のこの分野における、特に診療所における、主な欠点である。興味深いことに、我々のグループは、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−３２９の阻害が、後肢虚血後の血流の大幅な増加につながることを示したｘｘｘｉｉｉ。１４ｑ３２遺伝子クラスターを阻害することはしたがって、アテローム性動脈硬化を同時に低減しつつ、血管形成および動脈形成の誘発にユニークであることができる。
【０１０８】
結論として、我々は、複数の遺伝子および細胞プロセスを調節するｍｉＲの特定の特性を利用することによる、アテローム性動脈硬化における１４ｑ３２  ｍｉＲ遺伝子クラスターの役割を発見した。１４ｑ３２  ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５およびｍｉＲ−３２９の阻害は、病変サイズの減少、プラーク安定性の増加およびコレステロールレベルの低下につながった。このことは、１４ｑ３２  ｍｉＲを、心血管疾患を患う患者のための新しい有望な治療標的とする。
【０１０９】
参考文献
【表１１−１】
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【０１１０】
【表１１−２】
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【０１１１】
【表１１−３】
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【０１１２】
【表１１−４】
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【０１１３】
【表１２−１】
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【０１１４】
【表１２−２】
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【０１１５】
【表１２−３】
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【０１１６】
【表１２−４】
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【０１１７】
【表１２−５】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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