(57)【要約】  本発明は、細胞における変異型ＨＴＴｍＲＮＡの転写またはＣＡＧの伸長したＨＴＴタンパク質の発現を阻害するための組成物およびその使用の方法であって、区別的な多型をターゲティングする有効量のオリゴマーに細胞を接触させることを含み、前記区別的な多型は、ｒｓ７２２３９２０６、ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、ｒｓ２５３０５９５、ｒｓ１１３４０７８４７から選択される、方法に関する。特異的なオリゴマー配列もまた提供する。
2017529082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全長１０〜２６ヌクレオチドの間の連続的なヌクレオチド配列を含む、長さが１０〜３０核酸塩基の間のオリゴマーであって、前記連続的なヌクレオチド配列は、以下からなる群：
５’−ＴＧＡＣＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＣ  −３’  （配列番号５２２）；
５’−ＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＴＴＡＡＧ−３’（配列番号５２３）；
５’−  ＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号５２４）；
５’−ＧＣＴＴＴＧＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣ−３’（配列番号５２５）；および
５’−ＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧ−３’（配列番号５２６）；
より選択される配列にハイブリダイズするようにターゲティングされ、上式で、太字のヌクレオチド（複数可）を標的とし、０〜３個の間のミスマッチを許容し、細胞または組織で、変異型ハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡまたは変異型ＨＴＴタンパク質を低減する、オリゴマー。
【請求項２】
配列番号６〜１０から選択される、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
配列番号１１〜５１７から選択される、請求項１または２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
５’−ＧＡＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣ−３’（配列番号３６）；
５’−ＡＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡ−３’（配列番号６６）；
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＡ−３’（配列番号９２）；
５’−ＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＣＡ−３’（配列番号１６３）；
５’−ＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号２６８）；
５’−ＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡ−３’（配列番号３７３）；ａｎｄ
５’−ＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＣＣ−３’（配列番号４７８）
からなる群から選択される配列を有する、請求項１、２または３に記載のオリゴマー。
【請求項５】
前記連続的なヌクレオチド配列は、ヌクレオチド類似体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項６】
前記オリゴマーは、修飾ヌクレオシド間連結を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項７】
前記修飾ヌクレオシド間連結は、ペプチド−核酸連結、モルホリノ連結、Ｎ３’からＰ５’のホスホロアミデート連結、メチルホスホネート連結、またはホスホロチオエート連結である、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項８】
１つまたは複数の 修飾 糖 部分を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項９】
前記修飾糖部分は、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドである、請求項８に記載のオリゴマー。
【請求項１０】
ギャップマーである、請求項の１〜９のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１１】
２’ＭＯＥギャップマー修飾を有する、請求項９に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
修飾核酸塩基を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１３】
前記修飾核酸塩基は、５−メチルピリミジンまたは５−プロピニルピリミジンである、請求項１２に記載のオリゴマー。
【請求項１４】
前記１つまたは複数のヌクレオチド類似体は、ロックド核酸（ＬＮＡ）ユニットを含む、請求項８に記載のオリゴマー。
【請求項１５】
前記ＬＮＡユニットは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーからなる、請求項１３または１４に記載のオリゴマー。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のオリゴマーおよび医薬的に許容可能な希釈剤、担体、塩、またはアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項１７】
細胞または組織で、変異型ハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡまたは変異型ＨＴＴタンパク質を低減する方法であって、区別的な多型をターゲティングする有効量のオリゴマーに前記細胞または組織を接触させることを含み、前記区別的な多型は、ｒｓ７２２３９２０６、ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、ｒｓ２５３０５９５、ｒｓ１１３４０７８４７から選択される、方法。
【請求項１８】
細胞または組織で、変異型ハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡまたは変異型ＨＴＴタンパク質を低減する方法であって、有効量の請求項１〜１５の何れか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１６に記載の医薬組成物に、前記細胞または組織を接触させることを含む、方法。
【請求項１９】
前記細胞は、哺乳動物の組織内にある、請求項  １７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物でハンチントン病（ＨＤ）を治療する方法であって、区別的な多型をターゲティングする有効量のオリゴマーを哺乳動物に投与することを含み、前記区別的な多型は、ｒｓ７２２３９２０６、ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、ｒｓ２５３０５９５、ｒｓ１１３４０７８４７から選択される、方法。
【請求項２１】
哺乳動物でハンチントン病（ＨＤ）を治療する方法であって、有効量の請求項１〜１５の何れか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１６に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含み、前記哺乳動物は、現在ＨＤに罹っているかまたは罹るリスクがある、方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１９、２０、または２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＤの治療のための医薬品の調製の際の請求項１〜１５のいずれか１項に記載のオリゴマーの使用。
【請求項２４】
ＨＤの治療のためのオリゴマーの使用であって、前記オリゴマーは、区別的な多型を標的とし、前記区別的な多型は、ｒｓ７２２３９２０６、ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、ｒｓ２５３０５９５、ｒｓ１１３４０７８４７から選択される使用。
【請求項２５】
ＨＤの治療のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のオリゴマーの使用。
【請求項２６】
ＨＤの治療のための請求項１６の医薬組成物  の使用。
【請求項２７】
ＨＤの治療の際の治療のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項２８】
ａ．請求項１〜１５のいずれか１項に記載のオリゴマー、および
ｂ．ＨＤの治療のための使用説明書
を含む、商業用パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ：ＨＤ）の治療のための方法および組成物に関する。この治療は、大多数のＨＤ患者に適する対立遺伝子特異的なＨＴＴサイレンシングによるものであり、これらの集団の変異型ＨＴＴをハプロタイプ特異的にターゲティングすることを介する。本発明は、核酸サイレンシング剤を使用して、変異型転写物の強力かつ選択的なサイレンシングをさらに提供する。
関連出願の相互参照
【０００２】
本願は、いずれも「ハンチントン病ハプロタイプのための対立遺伝子特異的な療法」と題された２０１４年９月１８日出願の米国仮特許出願第６２／０５２，２８２号および２０１５年７月１０日出願の第６２／１９１，１４４号の利益を請求するものである。
【背景技術】
【０００３】
ハンチントン病［ＨＤ、（ＭＩＭ１４３１００）］は、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）のエクソン１内の伸長したＣＡＧリピートによって引き起こされる、単一遺伝子性の動作障害であり、１コピーのＨＴＴ遺伝子内にある３５回を超える縦列のＣＡＧトリプレットによって分子的に定義される（非特許文献１〜３）。伸長したＣＡＧトリプレットは、ＨＴＴタンパク質中のグルタミン残基の繰り返しを同様にコードし、複数の下流の病原性効果および選択的な神経病理性に導く（非特許文献４）。ＨＤの遺伝子的な原因とその結果である機能獲得による毒性によって、治療戦略としてＨＴＴを抑制することが可能になる（非特許文献５）。複数の前臨床研究で、トランスジェニック変異型ＨＴＴを誘導によりまたは外因的にサイレンシングすることによって、ＨＤ表現型が反転することが示されている（非特許文献６〜９）。しかし、野生型ＨＴＴと変異型ＨＴＴの双方をサイレンシングする試薬は、長期にわたる有害な結果をヒトにもたらすことがある。マウスのホモログであるＨｄｈを構成的に失うことは、胚性致死性であり、出生後にＨｄｈが抑圧されることによって、神経変性の表現型がもたらされるが、これらのことは、発生期および成体期におけるＨＴＴの決定的な役割を示唆している（非特許文献１０〜１３）。野生型ＨＴＴもまた、変異型ＨＴＴの毒性効果に対して、用量依存的な様式で防御的であることが示されている。変異型ＨＴＴの優先的なサイレンシング、および正常な野生型ＨＴＴの発現の保存によって、機能獲得による効果が最小となり、ＨＴＴ抑制の総計よりも大きな治療上の利益を生み出すことがある。
【０００４】
変異型ＨＴＴを正常の相当物に対して選択的に抑制するために使用することのできる、２つのクラスの遺伝子標的がある。すなわち、伸長したＣＡＧリピート、および病原性の変異に連関する多型である（非特許文献１４）。どちらのクラスの標的の有用性も、所与の患者集団のＨＴＴ遺伝子座における遺伝子的多様性によって情報が得られる（非特許文献１５）。ＣＡＧリピートは、本来的に多型性を有し、伸長したＣＡＧと正常なＣＡＧとの薬理学的な区別を達成する能力は、この２つのリピート間のサイズ差が低下するのに伴って減少する（非特許文献１６、１７）。これに対して、多型をターゲティングするか、またはＳＮＰをターゲティングする変異型ＨＴＴのサイレンシングは、特異的な標的対立遺伝子を有した変異型転写物を分解するように作用することによって、正常なＨＴＴ転写物の発現にはごく僅かな効果を及ぼしつつ、変異型ＨＴＴの強力な低減を達成している（非特許文献１８、１９）。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の綿密な構造−活性研究では、適切な前臨床スクリーニングがあれば、ＳＮＰをターゲティングする試薬を用いて、正常なＨＴＴの抑制が回避される場合があることが示唆されている（非特許文献１９、２０）。
【０００５】
ＳＮＰをターゲティングする試薬の開発における決定的な課題は、ＨＤ患者集団に最大の治療上の利益を得るための対立遺伝子標的の選択である。薬の開発に関わる時間とコストから、対立遺伝子特異的なＨＴＴサイレンシングを患者の最大の割合でもたらすための標的を、明確に最優先にすることが求められている。様々な標的ＳＮＰのヘテロ接合性が、特定の場所の患者コホートでは評価されているものの、対立遺伝子特異的な試薬の開発を導くために多様な患者群にわたって利用することが可能な、相の特定された推定は殆ど存在しない。例えば、ＨＴＴのエクソン５８に存在するΔ２６４２コドンの欠失は、ｓｉＲＮＡによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択的なＨＴＴサイレンシングのためにターゲティングされているが［２１］、ＨＤ染色体間でのこの多型の頻度は、アメリカ人コホートでの５９％［２２］からイタリアでの１８．６％［２３］まで様々である。全ての潜在的な標的について相の特定されたヘテロ接合性とハプロタイプとの関係を調べた研究はないことから、ＨＴＴ多型が世界中の患者の最大多数のための治療をもたらしうるかは依然として不明である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、部分的に、ＨＤハプロタイプに関連する多型を特定することに基づいており、このハプロタイプは、ＣＡＧの伸長した変異型ハンチンチン遺伝子を優先的にサイレンシングするために、ターゲティングされることがある。本発明は、ＨＤの治療のための方法および組成物を提供する。
【０００７】
本明細書に提供されるのは、ヨーロッパ系統の最大数のＨＤ患者で対立遺伝子特異的なＨＴＴサイレンシングを行うのに用いる標的の効率的かつ有用なパネルであり、これらの集団で変異型ＨＴＴを合理的かつハプロタイプ特異的にターゲティングすることを可能にするためのものである。部分的には、本発明は、核酸サイレンシング剤を使用して、変異型転写物の強力かつ選択的なサイレンシングをさらに提供する。
【０００８】
第１の態様では、細胞で変異型ＨＴＴの発現を低減する方法があり、その方法は、特異的なＨＤハプロタイプをターゲティングする有効量の核酸サイレンシング剤に細胞を接触させることを含む。
【０００９】
本発明のさらに別の態様では、特異的なハプロタイプをターゲティングする核酸サイレンシング剤を選択する方法が提供され、この方法は、対象から核酸試料を取得することと、核酸試料中の１つまたは複数の対立遺伝子特異的な多型を特定することと、特異的なＨＤハプロタイプを優先的にターゲティングする配列を含む核酸サイレンシング剤を選択することとを含む。
【００１０】
本発明のさらに別の態様では、対象で変異型ＨＴＴの発現を低減する方法が提供され、この方法は、対象から核酸試料を取得することと、核酸試料中の１つまたは１つを超える対立遺伝子特異的な多型を特定することと、特異的なＨＤハプロタイプを優先的にターゲティングする配列を含む１つまたは１つを超える核酸サイレンシング剤を選択することと、１つまたは１つを超える有効量の核酸サイレンシング剤を対象に投与することとを含む。
【００１１】
さらに別の態様では、全長１０〜２６ヌクレオチドの間の連続的なヌクレオチド配列を含む、長さが１０〜３０核酸塩基の間のオリゴマーが提供され、この中の連続的なヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される配列にハイブリダイズするようにターゲティングされる。
５’−ＴＧＡＣＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＣ−３’（配列番号５２２）；
５’−ＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＴＴＡＡＧ−３’（配列番号５２３）；
５’−ＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号５２４）；
５’−ＧＣＴＴＴＧＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣ−３’（配列番号５２５）；および
５’−ＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧ−３’（配列番号５２６）；
上式で、オリゴマーは、太字のヌクレオチド（複数可）を標的とし、０〜３個の間のミスマッチを許容し、細胞または組織で、変異型ハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡまたは変異型ＨＴＴタンパク質を低減する。
【００１２】
さらに別の態様では、長さが１０〜３０核酸塩基の間のオリゴマーが提供され、以下からなる群より選択される配列にハイブリダイズする。
５’−ＴＧＡＣＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＣ−３’（配列番号５２２）；
５’−ＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＴＴＡＡＧ−３’（配列番号５２３）；
５’−ＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号５２４）；
５’−ＧＣＴＴＴＧＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣ−３’（配列番号５２５）；および
５’−ＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧ−３’（配列番号５２６）；
上式で、オリゴマーは、太字のヌクレオチド（複数可）を標的とし、細胞または組織で、変異型ハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡまたは変異型ＨＴＴタンパク質を低減する。
【００１３】
さらに別の態様では、長さが１０〜３０核酸塩基の間のオリゴマーが提供され、以下からなる群より選択される配列にハイブリダイズする。
５’−ＴＧＡＣＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＣ−３’（配列番号５２２）；
５’−ＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＴＴＡＡＧ−３’（配列番号５２３）；
５’−ＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号５２４）；
５’−ＧＣＴＴＴＧＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣ−３’（配列番号５２５）；および
５’−ＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧ−３’（配列番号５２６）；
上式で、オリゴマーは、太字のヌクレオチド（複数可）をターゲティングする。
【００１４】
さらに別の態様では、長さが１０〜３０核酸塩基の間のオリゴマーが提供され、以下からなる群より選択される配列にハイブリダイズする。
５’−ＴＧＡＣＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＣ−３’（配列番号５２２）；
５’−ＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＴＴＡＡＧ−３’（配列番号５２３）；
５’−ＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡ−３’（配列番号５２４）；
５’−ＧＣＴＴＴＧＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣ−３’（配列番号５２５）；および
５’−ＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧ−３’（配列番号５２６）；
上式で、オリゴマーは、細胞または組織で、変異型ハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡまたは変異型ＨＴＴタンパク質を低減する。
【００１５】
さらに別の態様では、本明細書に記載のオリゴマー、および医薬的に許容可能な希釈剤、担体、塩、またはアジュバントを含む、医薬組成物が提供される。
【００１６】
さらに別の態様では、細胞または組織で、変異型ハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡまたは変異型ＨＴＴタンパク質を低減する方法が提供され、この方法は、区別的な多型をターゲティングする有効量のオリゴマーに細胞または組織を接触させることを含み、区別的な多型は、ｒｓ７２２３９２０６、ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、ｒｓ２５３０５９５、ｒｓ１１３４０７８４７から選択される。
【００１７】
さらに別の態様では、細胞または組織で、変異型ハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡまたは変異型ＨＴＴタンパク質を低減する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載のオリゴマーまたは本明細書に記載の医薬組成物に、細胞または組織を接触させることを含む。
【００１８】
さらに別の態様では、哺乳動物のハンチントン病（ＨＤ）を治療する方法を提供し、この方法は、区別的な多型をターゲティングする有効量のオリゴマーを、哺乳動物に投与することを含み、区別的な多型は、ｒｓ７２２３９２０６、ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、ｒｓ２５３０５９５、ｒｓ１１３４０７８４７から選択される。
【００１９】
さらに別の態様では、哺乳動物のハンチントン病（ＨＤ）を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の有効量のオリゴマーまたは本明細書に記載の医薬組成物を、哺乳動物に投与することを含み、哺乳動物は、現在ＨＤに罹患しているか、または罹患する危険性がある。
【００２０】
さらに別の態様では、ＨＤの治療のために医薬品を調整する際の本明細書に記載のオリゴマーの使用を提供する。
【００２１】
さらに別の態様では、ＨＤの治療のためのオリゴマーの使用を提供し、この場合、オリゴマーは、区別的な多型を標的とし、区別的な多型は、ｒｓ７２２３９２０６、ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、ｒｓ２５３０５９５、ｒｓ１１３４０７８４７から選択される。
【００２２】
さらに別の態様では、ＨＤの治療のための本明細書に記載のオリゴマーの使用が提供される。
【００２３】
さらに別の態様では、ＨＤの治療のための本明細書に記載の医薬組成物の使用が提供される。
【００２４】
さらに別の態様では、ＨＤの治療における使用のための本明細書に記載のオリゴマーが提供される。
【００２５】
さらに別の態様では、本明細書に記載のオリゴマー、およびＨＤの治療のための取扱説明書を含む、商業用パッケージを提供する。
【００２６】
さらに別の態様では、以下からなる群より選択される配列を有するオリゴマーが提供される。
５’−Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｇ＊ｔ＊ｇ＊ｔ＊ｃ＊ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ−３’；
５’−Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ａ＊Ｔ＊ａ＊ｃ＊ｇ＊ｔ＊ｇ＊ｔ＊ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ−３’；
５’−Ｔ＊Ａ＊Ａ＊Ｔ＊ａ＊ｃ＊ｇ＊ｔ＊ｇ＊ｔ＊ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ−３’；
５’−Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｇ＊ｔ＊ｇ＊ｔ＊ｃ＊ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ−３’；
５’−Ｔ＊Ａ＊Ｔ＊Ａ＊ｔ＊ｔ＊ｔ＊ｔ＊ｃ＊ａ＊ａ＊ａ＊ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ−３’；
５’−Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊ｃ＊ａ＊ｔ＊ｃ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｇ＊ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ−３’
５’−Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊ｃ＊ｃ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊ｃ＊ａ＊ｇ＊ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ−３’；および
５’−Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊ｃ＊ｃ＊ｔ＊ｃ＊ｃ＊ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ−３’．
上式で、大文字の字体は、ＬＮＡモノマーを表し、小文字の字体は、ＤＮＡモノマーを表し、「＊」は、モノマー間のホスホロチオエート連結基を表す。
【００２７】
さらに別の態様では、以下からなる群より選択される配列を有するオリゴマーが提供される。
５’−ＧＡＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣ−３’（配列番号３６）；
５’−ＡＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡ−３’（配列番号６６）；
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＡ−３’（配列番号９２）；
５’−ＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＣＡ−３’（配列番号１６３）；
５’−ＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号２６８）；
５’−ＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡ−３’（配列番号３７３）；および
５’−ＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＣＣ−３’（配列番号４７８）；
上式で、オリゴマーは、細胞または組織で、変異型ハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡまたは変異型ＨＴＴタンパク質を低減する。
【００２８】
ハプロタイプは、Ａ１、Ａ２、またはＡ３ａハプロタイプとしてよい。対立遺伝子特異的な多型は、ｒｓ７２２３９２０６、ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、ｒｓ２５３０５９５、またはｒｓ１１３４０７８４７からなる群より選択されてもよい。
【００２９】
オリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしてもよい。オリゴマーは、配列番号６〜５１７またはそれらの断片を含む群から選択されてもよい。オリゴマーは、１０から３０ヌクレオチド、１０から１４ヌクレオチド、１２から２５ヌクレオチド、１５から２５ヌクレオチド、または１８から２４ヌクレオチドの長さとしてもよい。対象または患者は、本明細書に記載されるようなヨーロッパ人または白色人種のマーカーを有する。
【００３０】
オリゴマーは、配列番号：６〜１０から選択されてもよい。オリゴマーは、配列番号：１１〜５１７から選択されてもよい。オリゴマーは、以下からなる群より選択される配列を有する。
５’−ＧＡＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＣ−３’（配列番号３６）；
５’−ＡＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡ−３’（配列番号６６）；
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＡ−３’（配列番号９２）；
５’−ＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＣＡ−３’（配列番号１６３）；
５’−ＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号２６８）；
５’−ＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＧＧＡ−３’（配列番号３７３）；および
５’−ＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＣＣ−３’（配列番号４７８）．
【００３１】
オリゴマーは、ヌクレオチド類似体を含んでいてもよい。オリゴマーは、修飾されたヌクレオシド間連結を含んでいてもよい。修飾されたヌクレオシド間連結は、ペプチド−核酸連結、モルホリノ連結、Ｎ３’からＰ５’のホスホロアミデート連結、メチルホスホネート連結、またはホスホロチオエート連結としてもよい。オリゴマーは、１つまたは複数の修飾糖部分を有していてもよい。修飾糖部分は、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドとしてもよい。オリゴマーは、ギャップマーとしてもよい。オリゴマーは、２’ＭＯＥギャップマー修飾を有していてもよい。オリゴマーは、修飾核酸塩基を有していてもよい。修飾核酸塩基は、５−メチルピリミジンまたは５−プロピニルピリミジンとしてもよい。１つまたは複数のヌクレオチド類似体は、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＬＮＡ）を含んでいてもよい。ＬＮＡユニットは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを含む。細胞は、哺乳動物の組織内にあるとしてもよい。哺乳動物は、ヒトとしてもよい。
【００３２】
ＡＳＯは、修飾されたヌクレオシド間連結をさらに含んでいてもよい。修飾されたヌクレオシド間連結は、ペプチド−核酸連結、モルホリノ連結、Ｎ３’からＰ５’のホスホロアミデート連結、メチルホスホネート連結、またはホスホロチオエート連結としてもよい。ＡＳＯは、修飾糖部分をさらに含んでいてもよい。修飾糖部分は、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドとしてもよい。ＡＳＯは、２’ＭＯＥギャップマー修飾をさらに有していてもよい。ＡＳＯは、２’ＭＯＥギャップマー修飾をさらに有していてもよい。ＡＳＯは、修飾核酸塩基をさらに含んでいてもよい。修飾核酸塩基は、５−メチルピリミジンまたは５−プロピニルピリミジンとしてもよい。
【００３３】
この本発明の概要は、本発明の全ての特徴を必ずしも記載するものではない。本発明の具体的な実施形態に関する以下の記載を検討した際に、本発明の他の態様、特徴、および利点は、当業者に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】（ａ）最も一般的なＨＤハプロタイプであるＡ１を、ＨＴＴ中にわたって高いペアワイズ連鎖不均衡にある転写された３つの多型によって、一意的に定義した図である。４ｂｐのインデルのｒｓ７２２３９２０６は、ＣＡＧ伸長に関連がある新規の多型を表す。（ａ）の右パネルは、ヨーロッパ系白色人種の相の特定された７００個のハプロタイプから計算される際の、Ａ１ハプロタイプを規定する多型のペアワイズＬＤプロット（ｒ２）を示す。（ｂ）２番目に一般的なＨＤハプロタイプであるＡ２を、５つの遺伝子内ＳＮＰによって定義した図である。これらの多型のうちの３つ（ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、およびｒｓ２５３０５９５）は、新規のＨＤ関連多型を表す。（ｂ）の右パネルは、ヨーロッパ系白色人種の相の特定された７００個のハプロタイプから計算される際の、Ａ２ハプロタイプを規定する多型のペアワイズＬＤプロット（ｒ２）を示す。（ｃ）ＨＤに関連するＡ３ａという３番目に一般的なＨＤハプロタイプを、新規のＳＮＰであるｒｓ１１３４０７８４７で特異的に印付けした図である。
【図２】（ａ）ΔＡＣＴＴ−相補的なＡＳＯを用いた患者由来リンパ芽球の能動トランスフェクションによって、変異型ＨＴＴタンパク質が選択的に低減されることを示す図である。５−７−５（配列番号６６）および５−９−５（配列番号３６）のＬＮＡギャップマーを用いてギャップマーを用いてトランスフェクトされた患者のリンパ芽球は、非処理対照に比べて変異型ＨＴＴタンパク質の用量依存的な低減を示す。非筋肉型のミオシンをロードの対照として使用した。（ｂ）培地中７８、３１２、および１２５０ｎＭのＡＳＯで幼若Ａ１リンパ芽球を１２０時間処理した後の、相対的なｍＨＴＴおよびｗｔＨＴＴのレベルの定量を示す図である（ｎ＝４，＊ｐ＜０．０５）。
【図３】（ａ）変異型  ＨＴＴ  Ａ１  ｍＲＮＡをΔＡＣＴＴ（ｒｓ７２２３９２０６）配列で選択的にターゲティングする、アンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーのデザインを示す図である。（ｂ）ΔＡＣＴＴに相補的なＡＳＯを用いた患者由来リンパ芽球（４４／１８ＣＡＧ）のトランスフェクションによって、変異型ＨＴＴ  ｍＲＮＡが選択的に低減されることを示す図である。５−９−５（配列番号３６）、５−７−５（配列番号６６）、および４−７−４ＬＮＡ（配列番号９２）のギャップマーを用いてトランスフェクトされた患者のリンパ芽球は、非処理対照に比べて変異型ＨＴＴ  ｍＲＮＡの用量依存的な低減を示し、４−７−４の最高用量では、変異型ＨＴＴ  ｍＲＮＡが２１．５％に低下する。野生型ＨＴＴ  ｍＲＮＡのレベルは、供試したどの用量５−７−５（配列番号６６）または４−７−４ＬＮＡ（配列番号９２）のギャップマーでも、非処理のレベルを下回って低下しなかった。ｃ：変異型ＨＴＴタンパク質が、非処理対照に比べて用量依存的に低減することを示す図であり、供試した全ての５−７−５および４−７−４ＬＮＡギャップマーの用量で、ｗｔＨＴＴが保たれた。＊＊および＊＊＊は、ボンフェローニの事後検討を用いたＡＮＯＶＡによるｐ＝０．０１およびｐ＝０．００１を表す。
【図４】（ａ）ｒｓ７２２３９２０６主要対立遺伝子に相補的なＷＴ５−９−５ＬＮＡギャップマーを用いて、ＹＡＣ１２８マウスをＩＣＶ注射して４週間後に、変異型ＨＴＴタンパク質が、非処理対照に比べてｉｎ  ｖｉｖｏで強力に低減されるという結果を得たことを示す図である。（ｂ）標示された用量のＷＴ５−９−５ＬＮＡギャップマーを用いた治療の後の、相対的なヒトＨＴＴおよびマウスＨｔｔのレベルの定量を示す図である。
【図５】ｒｓ７２２３９２０６に相補的なＡＳＯを用いた患者由来リンパ芽球の能動的トランスフェクションによって、変異型ＨＴＴタンパク質が選択的に低減されることを示す図である。配列＋Ａ＊＋Ｔ＊＋Ａ＊＋Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊＋Ｃ＊＋Ａ＊＋Ａ＊＋Ａ（＊＝ホスホロチオエート連結、＋＝ＬＮＡ）（配列番号６６）を有する４−９−４ＬＮＡ／ホスホロチオエート骨格ギャップマーを用いて処理した、ＨＤ患者由来のリンパ芽球（Ａ１／Ｃハプロタイプ、ＣＡＧ長５９／１８）は、非処理対照に比べて変異型ＨＴＴタンパク質の用量依存的な低減を示す。細胞は、１２０時間の間、０．５、１、２、もしくは５μＭのＡＳＯで処理するか、または非処理のままとして、ウェスタンブロット解析のために回収した。変異型と野生型のハンチンチンを７％の低ビスゲル上で分離し、バンド強度をデンシトメトリーで定量した。非筋肉型ミオシンをロード／正規化の対照として使用した。相対ハンチンチンレベルを、下記のグラフに提示する。Ｎ＝４、エラーバーは、標準誤差を表す。
【図６】ｒｓ２５３０５９５に相補的なＡＳＯを用いた患者由来リンパ芽球の能動的トランスフェクションによって、変異型ＨＴＴタンパク質が低減されることを示す図である。配列＋Ｔ＊＋Ｃ＊＋Ｃ＊＋Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊＋Ｇ＊＋Ｇ＊＋Ｇ＊＋Ａ（＊＝ホスホロチオエート連結、＋＝ＬＮＡ）（配列番号３７３）を有する４−９−４ＬＮＡ／ホスホロチオエート骨格ギャップマーを用いて処理された、ＨＤ患者由来のリンパ芽球（Ａ２／Ｃハプロタイプ、ＣＡＧ長４４／１８）は、非処理対照に比べて変異型ＨＴＴタンパク質の用量依存的な低減を示す。細胞は、１２０時間の間、０．５、１、２、もしくは５μＭのＡＳＯで処理するか、または非処理のままとして、ウェスタンブロット解析のために回収した。変異型と野生型のハンチンチンを７％の低ビスゲル上で分離し、バンド強度をデンシトメトリーで定量した。非筋肉型ミオシンをロード／正規化の対照として使用した。相対ハンチンチンレベルを、下記のグラフに提示する。Ｎ＝３、エラーバーは、標準誤差を表す。
【図７】ｒｓ３６３１０７に相補的なＡＳＯを用いた患者由来リンパ芽球の能動的トランスフェクションによって、変異型ＨＴＴタンパク質が低減されることを示す図である。配列＋Ｔ＊＋Ａ＊＋Ｔ＊＋Ａ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊＋Ａ＊＋Ｔ＊＋Ｃ＊＋Ａ（＊＝ホスホロチオエート連結、＋＝ＬＮＡ）（配列番号１６３）を有する４−９−４ＬＮＡ／ホスホロチオエート骨格ギャップマーを用いて処理された、ＨＤ患者由来のリンパ芽球（Ａ２／Ｃハプロタイプ、ＣＡＧ長４４／１８）は、非処理対照に比べて変異型ＨＴＴタンパク質の用量依存的な低減を示す。細胞は、１２０時間の間、０．５、１、２、もしくは５μＭのＡＳＯで処理するか、または非処理のままとして、ウェスタンブロット解析のために回収した。変異型と野生型のハンチンチンを７％の低ビスゲル上で分離し、バンド強度をデンシトメトリーで定量した。非筋肉型ミオシンをロード／正規化の対照として使用した。相対ハンチンチンレベルを、下記のグラフに提示する。Ｎ＝３、エラーバーは、標準誤差を表す。
【図８】ｒｓ３６２３１３に相補的なＡＳＯを用いた患者由来リンパ芽球の能動的トランスフェクションによって、変異型ＨＴＴタンパク質が低減されることを示す図である。配列＋Ａ＊＋Ａ＊＋Ｇ＊＋Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊＋Ｇ＊＋Ａ＊＋Ａ＊＋Ｇ（＊＝ホスホロチオエート連結、＋＝ＬＮＡ）（配列番号２６８）を有する４−９−４ＬＮＡ／ホスホロチオエート骨格ギャップマーを用いて処理された、ＨＤ患者由来のリンパ芽球（Ａ２／Ｃハプロタイプ、ＣＡＧ長４４／１８）は、非処理対照に比べて変異型ＨＴＴタンパク質の用量依存的な低減を示す。細胞は、１２０時間の間、０．５、１、２、もしくは５μＭのＡＳＯで処理するか、または非処理のままとして、ウェスタンブロット解析のために回収した。変異型と野生型のハンチンチンを７％の低ビスゲル上で分離し、バンド強度をデンシトメトリーで定量した。非筋肉型ミオシンをロード／正規化の対照として使用した。相対ハンチンチンレベルを、下記のグラフに提示する。Ｎ＝４、エラーバーは、標準誤差を表す。
【図９】ｒｓ１１３４０７８４７に相補的なＡＳＯを用いた患者由来リンパ芽球の能動的トランスフェクションによって、変異型ＨＴＴタンパク質が低減されることを示す図である。配列＋Ｃ＊＋Ｔ＊＋Ｃ＊＋Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊＋Ｇ＊＋Ｇ＊＋Ｃ＊＋Ｃ（＊＝ホスホロチオエート連結、＋＝ＬＮＡ）（配列番号４７８）を有する４−９−４ＬＮＡ／ホスホロチオエート骨格ギャップマーを用いて処理された、ＨＤ患者由来のリンパ芽球（Ａ３ａ／Ｃハプロタイプ、ＣＡＧ長さ６７／１５）は、非処理対照に比べて変異型ＨＴＴタンパク質の用量依存的な低減を示す。細胞は、１２０時間の間、０．５、１、２、もしくは５μＭのＡＳＯで処理するか、または非処理のままとして、ウェスタンブロット解析のために回収した。変異型と野生型のハンチンチンを７％の低ビスゲル上で分離し、バンド強度をデンシトメトリーで定量した。非筋肉型ミオシンをロード／正規化の対照として使用した。相対ハンチンチンレベルを、下記のグラフに提示する。Ｎ＝４、エラーバーは、標準誤差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、部分的には、ＨＤの治療のための方法および組成物を提供する。さらに具体的には、特異的なＨＤハプロタイプを規定する多型が提供される。そして、そのような多型は、ＨＤの治療、予防、または寛解での使用のための、対立遺伝子特異的なサイレンシング化合物を開発するために、最適な標的を構成する。
【００３６】
以下に続く記載では、多数の用語が広範囲にわたって使用され、以下の定義は、本発明の様々な態様の理解を容易にするために提供される。本明細書中の例の使用は、用語の例を含めて、説明のみを目的とし、本明細書の本発明の実施形態の範囲および意味を限定することを意図するものではない。
【００３７】
本明細書に直接的に定義されないいかなる用語も、本願の技術分野内で理解されるようなものに一般的に伴う意味を有することが理解されよう。多少の用語は、下記に議論されているか、または本明細書の別の箇所にあり、実施形態の組成物、デバイス、方法など、ならびにそれらをどのように作製または使用するかを記載する際に、実務者に追加の指南を提供する。同じ事物を１通り以上で言う場合があることを認識されたい。その結果として、代替の言語および同義語が、本明細書に議論される任意の１つまたは複数の用語のために使用されることがある。用語が本明細書に詳述または議論されているか否かには重要性がおかれない。いくつかの同義語または置き換え可能な方法、材料などが提供される。明示的に述べられない限り、１つもしくは少数の同義語または等価語の詳述は、他の同義語または等価語の使用を除外するものではない。本明細書中の例の使用は、用語の例を含めて、説明のみを目的とし、本明細書に記載の実施形態の範囲および意味を限定することを意図するものではない。
【００３８】
ハンチントン病（ＨＤ）を「治療する」ための方法が提供される。ここで、治療するとは、ＣＡＧ伸長を持つハンチントン遺伝子（ＨＴＴ）の転写物を選択的にサイレンシングすること、および野生型ＨＴＴを保つと共にＨＤに伴う症状を寛解させることを含むことが意図される。本明細書に使用されるような用語「治療する」もまた、化合物の早期の投与や後期の投与を含めて、ＨＤのどの段階の投与をも含むことが意図される。用語「寛解させる」とは、ＨＤを、それに罹患した対象にとって（例えば、動作を改善するかまたは死を遅延させることによって）さらに耐えられるようにする見通しを含むことが意図されることを、当業者は認識されたい。したがって、本明細書に使用されるような「治療」とは、ＨＤの予防、ＨＤに伴う症状の寛解、ＨＤ患者における動作または他の症状の改善、ＨＤ患者の期待される余命の延長、またはそれらの組合せとして参照されることがある。
【００３９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、典型的には１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ化合物であり、それらは、相補的なＲＮＡ化合物、例えば標的ｍＲＮＡ分子や前駆体ｍＲＮＡ分子などに結合して、転写物のＲＮＡｓｅＨ依存的分解の誘導を含めた下流の事象を触媒する（ＢｅｎｎｅｔｔおよびＳｗａｙｚｅ、２０１０年）。この過程は、ＲＮＡ干渉の過程を媒介するために追加の酵素を必要としないかまたは含まない点で、通常は受動的である。所望の遺伝子の発現を阻害するためにアンチセンス化合物を特異的にターゲティングすることは、概して、アンチセンス化合物を所望の遺伝子転写物に相同かつ相補的な配列を持つように設計することを含んでいることがある。完全な相同性は、ＲＮＡ干渉効果に必ずしも必要でないことがある。本発明の一実施形態では、アンチセンス化合物は、ＣＡＧ伸長リピートを持つＨＴＴ前駆体ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写物に優先的に結合するのに充分に相補的な相同性を有した、いかなるＤＮＡまたはＲＮＡ化合物を含んでいてもよく、そのようなＨＴＴ前駆体ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写物は、ＣＡＧ伸長リピートを持つハンチンチン転写物の分解を引き起こし、その結果、ポリグルタミン伸長リピートを持つハンチンチンタンパク質の産生の減少をもたらす。
【００４０】
アンチセンス化合物は、特にｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために、オリゴヌクレオチドの安定性を増強するように修飾してもよい。アンチセンス化合物を設計および最適化するための方法の非常に数多くの例が、定期刊行文献、すなわち（ＰａｎおよびＣｌａｗｓｏｎ、２００６年；Ｐａｔｚｅｌ、２００７年；ＰｅｅｋおよびＢｅｈｌｋｅ、２００７年）に見出される。本願の発明者らは、ＣＡＧ伸長を持つハンチントン遺伝子の発現を変調させるアンチセンス化合物の非限定的な例を提供している。
【００４１】
本明細書に記載されるような、または本明細書に記載されるような使用のための、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列は、インプラント、生体移植片、人工器官、ステントなどの医療用のデバイスまたは器具によって投与されてもよい。また、そのような化合物または組成物を含有および放出することが意図されたインプラントが考案されてもよい。一例としては、一定期間にわたって化合物を放出するよう適応されたポリマー材で作製されたインプラントがあろう。
【００４２】
本明細書に使用されるような「オリゴマー」とは、任意の核酸サイレンシング剤（例えば、本明細書に記載されるような全ての修飾形態のｓｉＲＮａ、ｍｉＲＮＡ、ＡＳＯ）および核酸サイレンシング剤を含む組成物を含むことが意図される。オリゴマーは、標的配列にハイブリダイズすることによって作用してもよい。
【００４３】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド結合修飾によって、非架橋の酸素の１つを硫黄に置き換えることによりリン酸連結が変わる。ホスホロチオエート連結の導入によって、オリゴヌクレオチドの化学特性が変わる。具体的には、ホスホロチオエート連結を加えることによって、ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの分解が減少し、それによってｉｎ  ｓｉｔｕでの半減期が増加する。したがって、この修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに特に有用であり、細胞または生体マトリックス内に導入した際に、標的核酸と相互作用して、具体的な転写物の発現をサイレンシングすることができる。ホスホロチオエート連結を含有するオリゴヌクレオチドは、翻訳の直接的な遮断を介するか、または標的転写物の酵素分解を（例えば、ＲＮａｓｅＨを介して）可能にするかのどちらかで、この妙技を達成する。
【００４４】
ホスホロチオエート連結は、半減期の向上をもたらすものの、これらの連結をオリゴヌクレオチド内に導入することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしてのそれらの機能に制限が導入されることもある。各ホスホロチオエート連結は、各結合にキラル中心を作り出し、その結果、合成中に生成したオリゴヌクレオチドの多様なアイソマーを生じることがあり、アイソマーは、異なる特徴および機能特性を有することがある。しかし、アイソマーの効果の多くは、周到な修飾の位置決めを通して、またはホスホロチオエート結合と接合された追加の修飾を使用することによって、軽減される場合がある。
【００４５】
オリゴヌクレオチド部分の１つまたは複数のホスホジエステル連結は、その連結の２つの架橋酸素原子のうち１つまたは両方を類似体、例えば−ＮＨ、−ＣＨ２、または−Ｓなどに置き換えることによって修飾されていてもよい。当技術分野で公知の他の酸素類似体もまた使用してもよい。
【００４６】
本明細書に使用されるような「修飾オリゴヌクレオチド」とは、置換または修飾されたオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。天然に生じた主要な塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、およびチミン、または他の天然の塩基、例えばイノシン、デオキシイノシン、およびヒポキサンチンなどに加えて、夥しい数の他の修飾がある。例えば、等配電子のプリン２’デオキシ−フラノシド類似体類、２’−デオキシネブラリン、もしくは２’デオキシキサントシン、または他のプリンおよびピリミジン類似体類、例えば５−メチルピリミジンもしくは５−プロピニルピリミジンなどもまた利用して、安定性および標的ハイブリダイゼーションを向上させてもよい。
【００４７】
オリゴヌクレオチド部分を議論する際に、本明細書に使用されるような「修飾糖」は、リボース、グルコース、スクロース、もしくはガラクトースとなるように修飾または置き換えされた糖である。または任意の他の糖．あるいは、オリゴヌクレオチドは、その２’位で置換または修飾された、すなわち２’アルキルまたは２’−Ｏ−アルキルの１つまたは複数のその糖を有していてもよい。２’−Ｏ−アルキル糖の一例は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。さらに、オリゴヌクレオチドは、置換または修飾されてα−アノマー糖を形成する、１つまたは複数のその糖を有していてもよい。
【００４８】
本明細書に使用されるような「第２世代」オリゴヌクレオチドとは、細胞のヌクレアーゼによる分解に抵抗性であり、かつその標的前駆体のｍＲＮＡか、または第１世代ＡＳＯ以上の親和性を有するｍＲＮＡに、特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドとして定義されよう。第２世代ＡＳＯの一例は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−ＲＮＡ（２’ＭＯＥギャップマー修飾）である。２’−ＭＯＥまたは２’ＯＭｅギャップマーを用いて、５’末端および３’末端は、分解に対する保護のために、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドを有していてもよいが、５’末端と３’末端との間のギャップは、ＲＮａｓｅＨの基質である、非修飾ホスホジエステルまたはホスホロチオエートの連結としてもよい。夥しい数の他の化学修飾が、ＡＳＯを改良するために開発されている。例えば、モルホリノ、Ｎ３’からＰ５’までのホスホロアミデート、およびメチルホスホネートの化学修飾が、当技術分野で公知である（Ｎ．ＤｉａｓおよびＣ．Ａ．Ｓｔｅｉｎ、２００２年）。さらに、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）も使用されてもよい。
【００４９】
本明細書に使用されるような「ＬＮＡ」は、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）として参照される。この核酸は、リボース環が２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子との間のメチレン架橋によって繋がれているために、ワトソン−クリック結合をとるための所望の立体配置でリボース環が「ロックされる（ｌｏｃｋｉｎｇ）」、ＲＮＡ類似体である。ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド内に組み込まれた際に、ＬＮＡは、相補的なヌクレオチド鎖を用いてさらに迅速にペアを作り、結果として得られる二重鎖の安定性を増加させる。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的なＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖にハイブリダイズする際に、さらに良好な熱安定性を有する。さらに、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドよりも短く作製されてもよい。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、低分子標的または高い類似性のある標的を検出するために、特に有用である。
【００５０】
「ギャップマー」または「ギャップオリゴマー」は、本明細書に使用される際に、３’および５’の「翼」を側面に配した中心部分（「ギャップ」）を有するキメラオリゴマーとして参照され、そのオリゴマーでは、ギャップは、各翼と比較して異なる修飾を有する。そのような修飾は、核酸塩基、モノマー連結、および糖修飾、ならびに修飾の不在（非修飾ＲＮＡやＤＮＡなど）を含んでいてもよい。したがって、ギャップマーは、ＤＮＡギャップによって区切られたＲＮＡ翼のように単純にしてもよい。場合によっては、翼のヌクレオチド連結は、ギャップのヌクレオチド連結とは異なっていてもよい。ある特定の実施形態では、各翼は、高親和性の修飾を有したヌクレオチドを含み、ギャップは、その修飾を含まないヌクレオチドを含む。あるいは、ギャップ内のヌクレオチド、および翼内のヌクレオチドは、高親和性修飾を有していてもよいが、ギャップ内の高親和性修飾は、各翼内の高親和性修飾とは異なる。翼内の修飾は、ＲＮａｓｅＨを含めた内在性ヌクレアーゼによる切断に対する抵抗性を付与することがあり、一方で、ギャップ内の修飾は、ＲＮａｓｅＨのための基質であることがある。翼内の修飾は、ＲＮａｓｅＨを含めた内在性ヌクレアーゼによる切断に対する抵抗性を付与することがあり、一方で、ギャップ内の修飾は、ＲＮａｓｅＨのための基質であることがある。翼内の修飾は、互いに同じであっても異なっていてもよい。ギャップ内のヌクレオチドは、非修飾としてもよく、翼内のヌクレオチドは、修飾されていてもよい。ギャップマーは、翼−ギャップ−翼の比を有し、その比は、数値的に表されてもよい（翼＃−ギャップ＃−翼＃）。ギャップマーは、対称としてもよい（例えば、９−１３−９、９−１２−９、９−１１−９、９−１０−９、９−９−９、９−８−９、９−７−９、９−６−９、９−５−９、９−４−９、９−３−９、９−２−９、９−１−９、８−１５−８、８−１４−８、８−１３−８、８−１２−８、８−１１−８、８−１０−８、８−９−８、８−８−８、８−７−８、８−６−８、８−５−８、８−４−８、８−３−８、８−２−８、８−１−８、７−１５−７、７−１４−７、７−１３−７、７−１２−７、７−１１−７、７−１０−７、７−９−７、７−８−７、７−７−７、７−６−７、７−５−７、７−４−７、７−３−７、７−２−７、７−１−７、６−１５−６、６−１４−６、６−１３−６、６−１２−６、６−１１−６、６−１０−６、６−９−６、６−８−６、６−７−６、６−６−６、６−５−６、６−４−６、６−３−６、６−２−６、６−１−６、５−１５−５、５−１４−５、５−１３−５、５−１２−５、５−１１−５、５−１０−５、５−９−５、５−８−５、５−７−５、５−６−５、５−５−５、５−４−５、５−３−５、５−２−５、５−１−５、４−１７−４、４−１６−４、４−１５−４、４−１４−４、４−１３−４、４−１２−４、４−１１−４、４−１０−４、４−９−４、４−８−４、４−７−４、４−６−４、４−５−４、４−４−４、４−３−４、３−２４−３、３−２３−３、３−２２−３、３−２１−３、３−２０−３、３−１９−３、３−１８−３、３−１７−３、３−１６−３、３−１５−３、３−１４−３、３−１３−３、３−１２−３、３−１１−３、３−１０−３、３−９−３、３−８−３、３−７−３、３−６−３、３−５−３、３−４−３、２−２６−２、２−２５−２、２−２４−２、２−２２−２、２−２１−２、２−２０−２、２−１９−２、２−１８−２、２−１７−２、２−１６−２、２−１５−２、２−１４−２、２−１３−２、２−１２−２、２−１１−２、２−１０−２、２−９−２、２−８−２、２−７−２、２−６−２、２−５−２、１−２６−１、１−２５−１、１−２４−１、１−２２−１、１−２１−１、１−２０−１、１−１９−１、１−１８−１、１−１７−１、１−１６−１、１−１５−１、１−１４−１、１−１３−１、１−１２−１、１−１１−１、１−１０−１、１−９−１、１−８−１、または１−７−１）。ギャップマーは、非対照としてもよい（例えば、８−１３−９、８−１２−９、８−１１−９、８−１０−９、８−９−９、８−８−９、８−７−９、８−６−９、８−５−９、８−４−９、８−３−９、８−２−９、８−１−９、７−１５−８、７−１４−８、７−１３−８、７−１２−８、７−１１−８、７−１０−８、７−９−８、７−８−８、７−７−８、７−６−８、７−５−８、７−４−８、７−３−８、７−２−８、７−１−８、６−１５−７、６−１４−７、６−１３−７、６−１２−７、６−１１−７、６−１０−７、６−９−７、６−８−７、６−７−７、６−６−７、６−５−７、６−４−７、６−３−７、６−２−７、６−１−７、５−１５−６、５−１４−６、５−１３−６、５−１２−６、５−１１−６、５−１０−６、５−９−６、５−８−６、５−７−６、５−６−６、５−５−６、５−４−６、５−３−６、５−２−６、５−１−６、４−１５−５、４−１４−５、４−１３−５、４−１２−５、４−１１−５、４−１０−５、４−９−５、４−８−５、４−７−５、４−６−５、４−５−５、４−４−５、４−３−５、４−２−５、４−１−５、３−１７−４、３−１６−４、３−１５−４、３−１４−４、３−１３−４、３−１２−４、３−１１−４、３−１０−４、３−９−４、３−８−４、３−７−４、３−６−４、３−５−４、３−４−４、３−３−４、２−２４−３、２−２３−３、２−２２−３、２−２１−３、２−２０−３、２−１９−３、２−１８−３、２−１７−３、２−１６−３、２−１５−３、２−１４−３、２−１３−３、２−１２−３、２−１１−３、２−１０−３、２−９−３、２−８−３、２−７−３、２−６−３、２−５−３、２−４−３、１−２６−２、１−２５−２、１−２４−２、１−２２−２、１−２１−２、１−２０−２、１−１９−２、１−１８−２、１−１７−２、１−１６−２、１−１５−２、１−１４−２、１−１３−２、１−１２−２、１−１１−２、１−１０−２、１−９−２、１−８−２、１−７−２、３−２６−１、３−２５−１、３−２４−１、３−２２−１、３−２１−１、３−２０−１、３−１９−１、３−１８−１、３−１７−１、３−１６−１、３−１５−１、３−１４−１、４−１３−１、４−１２−１、４−１１−１、４−１０−１、３−９−１、３−８−１または４−７−１）。
【００５１】
デオキシギャップ領域を有したキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１０を超えるヌクレオチドであり、「ギャップで広げられたアンチセンスオリゴヌクレオチド」として参照されることがある。翼領域は、長さが１個から８個の高親和性の修飾ヌクレオチドとしてもよい。ギャップで広げられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有することのできる長さが１２個から３０個のヌクレオチドとしてもよい。例えば、様々な翼−ギャップ−翼の比は、以下から選択されてもよい：２−１５−１、１−１５−２、１−１４−３、３−１４−１、１−１３−４、４−１３−１、２−１３−３、３−１３−２、１−１２−５、５−１２−１、２−１２−４、４−１２−２、３−１２−３、１−１１−６、６−１１−１、２−１１−５、５−１１−２、３−１１−４、４−１１−３、２−１６−１、１−１６−２、１−１５−３、３−１５−１、２−１５−２、１−１４−４、４−１４−１、２−１４−３、３−１４−２、１−１３−５、５−１３−１、２−１３−４、４−１３−２、３−１３−３、１−１２−６、６−１２−１、２−１２−５、５−１２−２、３−１２−４、４−１２−３、１−１１−７、７−１１−１、２−１１−６、６−１１−２、３−１１−５、５−１１−３、４−１１−４、１−１８−１、１−１７−２、２−１７−１、１−１６−３、１−１６−３、２−１６−２、１−１５−４、４−１５−１、２−１５−３、３−１５−２、１−１４−５、５−１４−１、２−１４−４、４−１４−２、３−１４−３、１−１３−６、６−１３−１、２−１３−５、５−１３−２、３−１３−４、４−１３−３、１−１２−７、７−１２−１、２−１２−６、６−１２−２、３−１２−５、５−１２−３、４−１２−４、１−１１−８、８−１１−１、２−１１−７、７−１１−２、３−１１−６、６−１１−３、４−１１−５、５−１１−４、１−１８−１、１−１７−２、２−１７−１、１−１６−３、３−１６−１、２−１６−２、１−１５−４、４−１５−１、２−１５−３、３−１５−２、１−１４−５、２−１４−４、４−１４−２、３−１４−３、１−１３−６、６−１３−１、２−１３−５、５−１３−２、３−１３−４、４−１３−３、１−１２−７、７−１２−１、２−１２−６、６−１２−２、３−１２−５、５−１２−３、４−１２−４、１−１１−８、８−１１−１、２−１１−７、７−１１−２、３−１１−６、６−１１−３、４−１１−５、５−１１−４、１−１９−１、１−１８−２、２−１８−１、１−１７−３、３−１７−１、２−１７−２、１−１６−４、４−１６−１、２−１６−３、３−１６−２、１−１５−５、２−１５−４、４−１５−２、３−１５−３、１−１４−６、６−１４−１、２−１４−５、５−１４−２、３−１４−４、４−１４−３、１−１３−７、７−１３−１、２−１３−６、６−１３−２、３−１３−５、５−１３−３、４−１３−４、１−１２−８、８−１２−１、２−１２−７、７−１２−２、３−１２−６、６−１２−３、４−１２−５、５−１２−４、２−１１−８、８−１１−２、３−１１−７、７−１１−３、４−１１−６、６−１１−４、５−１１−５、１−２０−１、１−１９−２、２−１９−１、１−１８−３、３−１８−１、２−１８−２、１−１７−４、４−１７−１、２−１７−３、３−１７−２、１−１６−５、２−１６−４、４−１６−２、３−１６−３、１−１５−６、６−１５−１、２−１５−５、５−１５−２、３−１５−４、４−１５−３、１−１４−７、７−１４−１、２−１４−６、６−１４−２、３−１４−５、５−１４−３、４−１４−４、１−１３−８、８−１３−１、２−１３−７、７−１３−２、３−１３−６、６−１３−３、４−１３−５、５−１３−４、２−１２−８、８−１２−２、３−１２−７、７−１２−３、４−１２−６、６−１２−４、５−１２−５、３−１１−８、８−１１−３、４−１１−７、７−１１−４、５−１１−６、６−１１−５、１−２１−１、１−２０−２、２−２０−１、１−２０−３、３−１９−１、２−１９−２、１−１８−４、４−１８−１、２−１８−３、３−１８−２、１−１７−５、２−１７−４、４−１７−２、３−１７−３、１−１６−６、６−１６−１、２−１６−５、５−１６−２、３−１６−４、４−１６−３、１−１５−７、７−１５−１、２−１５−６、６−１５−２、３−１５−５、５−１５−３、４−１５−４、１−１４−８、８−１４−１、２−１４−７、７−１４−２、３−１４−６、６−１４−３、４−１４−５、５−１４−４、２−１３−８、８−１３−２、３−１３−７、７−１３−３、４−１３−６、６−１３−４、５−１３−５、１−１２−１０、１０−１２−１、２−１２−９、９−１２−２、３−１２−８、８−１２−３、４−１２−７、７−１２−４、５−１２−６、６−１２−５、４−１１−８、８−１１−４、５−１１−７、７−１１−５、６−１１−６、１−２２−１、１−２１−２、２−２１−１、１−２１−３、３−２０−１、２−２０−２、１−１９−４、４−１９−１、２−１９−３、３−１９−２、１−１８−５、２−１８−４、４−１８−２、３−１８−３、１−１７−６、６−１７−１、２−１７−５、５−１７−２、３−１７−４、４−１７−３、１−１６−７、７−１６−１、２−１６−６、６−１６−２、３−１６−５、５−１６−３、４−１６−４、１−１５−８、８−１５−１、２−１５−７、７−１５−２、３−１５−６、６−１５−３、４−１５−５、５−１５−４、２−１４−８、８−１４−２、３−１４−７、７−１４−３、４−１４−６、６−１４−４、５−１４−５、３−１３−８、８−１３−３、４−１３−７、７−１３−４、５−１３−６、６−１３−５、４−１２−８、８−１２−４、５−１２−７、７−１２−５、６−１２−６、５−１１−８、８−１１−５、６−１１−７、または７−１１−６。ギャップにより広げられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２−１６−２、３−１４−３、または４−１２−４の翼−ギャップ−翼の比を有していてもよい。
【００５２】
本明細書に使用される際に、ヌクレオチドに関する用語「高親和性の修飾」は、その修飾が、修飾ヌクレオチドを含むアンチセンス化合物の標的核酸への親和性を増加させるように、少なくとも１つの修飾核酸塩基、ヌクレオシド間の連結、または糖部分を有する、ヌクレオチドとして参照される。高親和性の修飾としては、以下に限定されないが、二環核酸（ＢＮＡ）、ＬＮＡ、および２’−ＭＯＥが挙げられる。さらに、望ましい力価および毒性の特性は、ヌクレオチド修飾、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオシド間連結、１つもしくは複数の修飾糖部分の含有、および／またはギャップマー翼−ギャップ−翼の比を選択することによって得られることがある（例えば、米国特許出願公開第２０１００１９７７６２号を参照）。
【００５３】
化合物は、本明細書に記載される際には、単離の状態としてもよいし、またはトレーサー化合物、リポソーム、炭水化物担体、ポリマー担体、または当業者に明らかな他の薬剤もしくは賦形剤に、連結されているかもしくは組合せられていてもよい。代替の実施形態では、そのような化合物は、追加の医薬品をさらに含んでいてもよく、その場合、そのような化合物は、薬理学的有効量で存在していることがある。
【００５４】
本明細書に使用されるような用語「医薬品」は、患者または試験対象に投与され、その患者または試験対象で効果を産み出すことのできる組成物として参照されることがある。効果は、化学的、生物学的、物理学的であってもよく、患者または試験対象は、ヒト、または非ヒト動物、例えば齧歯類（例えば、トランスジェニックマウス、マウス、もしくはラット）、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ハムスター、モルモット、ウサギ、またはブタなどとしてもよい。医薬品は、有効な化学実体のみ、または医薬的に許容可能な賦形剤との組合せから構成されていてもよい。
【００５５】
用語「医薬的に許容可能な賦形剤」は、任意のおよび全ての溶媒；分散媒；被覆剤；抗細菌剤、抗微生物剤、または抗真菌剤；等張剤、および吸収遅延剤；ならびに物理的に適合可能な他のものを含めることがある。賦形剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、局所、又は経口の投与に適することがある。賦形剤は、滅菌済みの注射可能な溶液または分散体を即時調製するための滅菌済みの水性溶液または分散体を含めることがある。医薬品を調製するためのそのような媒体の使用は、当技術分野で公知である。
【００５６】
本明細書に記載のいくつかの実施形態による組成物または化合物は、種々の公知の経路のいずれで投与されてもよい。化合物の投与に適することがある方法の例としては、経口、静脈内、くも膜下腔内、吸入、筋肉内、皮下、局所の、腹腔内、直腸内または膣内の座剤、舌下などが挙げられる。本明細書に記載の化合物は、滅菌済みの水性溶液として投与されてもよいし、脂溶性賦形剤で、または適切となるような別の溶液、懸濁液、パッチ、錠剤、もしくはペーストの形式で、投与されてもよい。本明細書に記載の化合物を含む組成物は、吸入による投与用に製剤化されてもよい。例として、化合物を、賦形剤と組み合わせて、エアロゾルで分散させてもよい。吸入製剤の例は、当業者に公知となる。他の薬剤を、本明細書に記載の化合物との組み合わせに含めて、取り込みもしくは代謝の、または徐放製剤などで宿主内での分布の遅延の、一助としてもよい。徐放製剤の例は、当業者に公知となり、マイクロカプセル化、炭水化物もしくはポリマーマトリックス内の塞栓などを含むことがある。製剤を作製するための当技術分野で公知の他の方法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、（第１９版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９５、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシルベニア州に見られる。
【００５７】
本明細書に記載のいくつかの実施形態の組成物または化合物の投薬量は、投与経路（口腔、静脈内、くも膜下腔内、吸入など）、および組成物または化合物を投与する形態（溶液、徐放など）に応じて変化してもよい。適切な投薬量を決定することは、当業者の能力の範疇にある。本明細書に使用される際に、化合物の「有効量」、「治療有効量」、または「薬理学的有効量」は、ある濃度のアンチセンスオリゴマーの量として参照され、その濃度は、化合物の使用期間にわたってデリバリされる治療レベルの化合物を、結果として生じるための濃度である。これは、デリバリの方式、投薬の期間、化合物を受けた対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事に依存することがある。有効量を決定する方法は、当技術分野で公知である。本明細書に記載の化合物を、所望の組織または細胞のタイプにターゲティングすることが望ましい場合があることが理解される。そのため、本明細書に記載の化合物は、ターゲティング部分に係合されていてもよい。本化合物は、細胞取り込み部分に係合されていてもよい。ターゲティング部分は、細胞取り込み部分として機能してもよい。
【００５８】
概して、本明細書に記載されるようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実質的な毒性を引き起こすことなく使用してもよい。本明細書に記載されるような化合物の毒性は、標準的な手法を使用して、例えば、細胞培養物または実験動物で試験し、治療指標、すなわちＬＤ５０（５０％の集団に致死性である用量）とＬＤ１００（１００％の集団に致死性である用量）との比を決定することによって、決定することができる。しかし、状況によっては、例えば重症の疾患状態などでは、実質的に過剰な組成物を投与することが適切である場合がある。本明細書に記載されるようないくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、濃度によっては毒性である場合がある。力価試験を使用して毒性濃度および非毒性濃度を決定してもよい。毒性は、細胞系統にわたって、具体的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性を検討することによって、評価されてもよい。動物試験を使用して、化合物が他の組織に効果を及ぼすか否かの標示を提供してもよい。
【００５９】
「核酸サイレンシング剤」または「薬剤」は、配列特異的な様式で作用し、所与の核酸配列（例えば「遺伝子」）の産物（「遺伝子産物」）のレベルの減少をもたらす組成物として参照される。この減少は、細胞もしくは対象のＤＮＡからの転写に続く、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのプロセッシングのうちいずれか（例えばスプライシング、５’キャッピング、５’もしくは３’のプロセッシング、またはプロセッシングされたｍＲＮＡの細胞質への輸送）を伴う干渉によって、または、成熟ｍＲＮＡの翻訳を伴う干渉によって、または、プレｍＲＮＡもしくは成熟ｍＲＮＡの特異的かつ直接的な破壊によって、もたらされることがある。アンチセンス（ＡＳＯ）およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ−低分子干渉ＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡによってもたらされる）は、そのような方法の２つの例である。そして、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は別物である。
【００６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、特異的なＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、この特異的な配列にハイブリダイズする際に、ＲＮＡのプロセッシングもしくは翻訳に干渉するか、または特異的なＲＮＡの分解を酵素的な経路（例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈ−依存的分解）によって誘発する。ＡＳＯを含むヌクレオシドは、ヌクレオシド間連結によって接続されたプリンもしくはピリミジンヌクレオシド、またはプリンおよびピリミジンヌクレオシドの組合せとしてもよい。ＡＳＯは、概して、例えば、Ｃｒｏｏｋｅ、２００４年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ、第５５巻、６１〜９５頁；およびＣｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、第４巻、４６５〜４８７頁に記載されている。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉経路を介したｍＲＮＡの特異的な破壊を可能にすることによって、遺伝子産物のレベルの減少をもたらすことがある、短い（２０〜３０ヌクレオチド）二重鎖ＲＮＡ（または修飾ＲＮＡ）分子である。特異的なｍＲＮＡは、ＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって細胞質中で分解される。ｍｉＲＮＡは、遺伝子産物のレベルの減少をもたらすことがある、短い（２０〜３０ヌクレオチド）単鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの一部、すなわちコード領域または非翻訳領域（例えば５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ）のどちらかに相補的である。ｍｉＲＮＡは、アニーリングして二重鎖複合体を形成し、ｓｉＲＮＡのものと同様の過程で分解を誘発することがある。翻訳もまた、ｍｉＲＮＡによって破綻をきたすことがある。ＤＮＡ  ＡＳＯは、一般に、単にＡＳＯとして参照され、ＲＮＡｓｅ  Ｈ媒介性切断を介してｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの特異的な破壊を誘発することにより遺伝子産物のレベルの減少をもたらすことがある、短い（１２〜５０ヌクレオチド）１本鎖ＤＮＡ（または修飾ＤＮＡ）分子である。ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡｓｅ  Ｈ切断を誘導することによって、特異的なｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡを、核内および／または細胞質内で分解することができる。ＤＮＡ  ＡＳＯは、一般に単にＡＳＯとして参照され、ＲＮＡｓｅ  Ｈ媒介性切断を介してｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの特異的な破壊を誘発することにより遺伝子産物のレベルの減少をもたらすことがある、短い（１２〜５０ヌクレオチド）１本鎖ＤＮＡ（または修飾ＤＮＡ）分子である。ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡｓｅ  Ｈ切断を誘発することによって、特異的なｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡを、核内および／または細胞質内で分解することができる。
【００６１】
用語「ヌクレオシド」は、窒素性塩基へ糖環の炭素−１を通じて結合しているリボースまたはデオキシリボース糖の分子として参照される。窒素性塩基の例としては、アデニン、グアニン、６−チオグアニン、ヒポキサンチン、キサンチンなどのプリン、およびシトシン、チミン、およびウラシルなどのピリミジンが挙げられる。プリンヌクレオシドの例としては、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、イノシン（Ｉ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−グアニン、２−クロロデオキシアデノシン、７−ハロ−７−デアザ−アデノシン、７−ハロ−７−デアザ−グアニン、７−プロピン−７−デアザアデノシン、７−プロピン−７−デアザ−グアニン、２−アミノ−アデノシン、７−デアザイノシン、７−チア−７，９−ジデアザイノシン、フォルマイシンＢ、８−アザイノシン、９−デアザイノシン、アロプリノールリボシド、８−ブロモ−イノシン、８−クロロイノシン、７−デアザ−２−デオキシ−キサントシン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−デオキシアデノシン、７−デアザ−８−アザ−デオキシグアノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−デオキシアデノシン、７−デアザ−デオキシグアノシン、８−アミノ−アデノシン、８−アミノ−デオキシアデノシン、８−アミノ−グアノシン、８−アミノ−デオキシグアノシン，３−デアザ−デオキシアデノシン、３−デアザ−アデノシン、６−チオ−デオキシグアノシンなど、および参照により本明細書に組み入れられるＦｒｅｉｅｒら、１９９７（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２２５巻、４４２９〜４４４３頁）に記載の他のプリンヌクレオシドが挙げられる。ピリミジンヌクレオシドの例としては、デオキシウリジン（ｄＵ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、チミジン（Ｔ）、デオキシチミジン（ｄＴ）、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモウラシル、２’−Ｏ−メチル−ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−ヨードウラシル、５−メトキシ−エトキシ−メチル−ウラシル、５−プロピニルデオキシウリジン、シュードイソシチジン、５−アザシチジン、５−（１−プロピニル）シチジン、２’−デオキシシュードウリジン、４−チオ−デオキシチミジン、４−チオ−デオキシウリジンなど、およびＦｒｅｉｅｒら、１９９７（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２２５巻、４４２９〜４４４３頁）に開示の他の置換ピリミジンが挙げられる。また、プリンまたはピリミジンヌクレオシドとしては、標準的な方法を使用したオリゴヌクレオチド合成に使用されるホスホラミダイト誘導体が挙げられる。
【００６２】
「ヌクレオシド」はまた、置換リボース糖類（二環またはその他）を有したヌクレオシドを含む。非二環性修飾糖の調製を教示するいくつかの代表的な特許および刊行物としては、以下に限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、第５，７００，９２０号、および第６，６００，０３２号、ならびにＷＯ２００５／１２１３７１が挙げられる。二環性修飾糖の調製を教示するいくつかの代表的な特許および刊行物としては、以下に限定されないが、「ロックド核酸」が、例えばＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ０１／２５２４８、ＷＯ０１４８１９０、ＷＯ０２／２８８７５、ＷＯ０３／００６４７５、ＷＯ０３／０９５４７、ＷＯ２００４／０８３４３０、米国特許第６，２６８，４９０号、米国特許第６，７９４４９９号、米国特許第７，０３４，１３３号などに記載される。置換されるリボース糖類の他の例は、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ、１９９７（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４４２９〜４４４３）ａｎｄＨｅｒｄｅｗｉｊｎｅｔａｌ．、２０００．（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ１０：２９７〜３１０）に記載され、どちらも参照により本明細書に組み込まれている。
【００６３】
「ヌクレオチド」は、糖の環の炭素−５を介して結合したヌクレオシド間連結基、通常はモノ−、ジ−、またはトリ−リン酸である基を有するヌクレオシドとして参照され、酵素的な重合化に適することがある。他の例では、ヌクレオチドは、核酸ポリマーの非酵素的な重合化または合成に適した、ホスホアミダイトであることがある。
【００６４】
ヌクレオシド間の連結基は、オリゴヌクレオチド骨格の一部として、２つのヌクレオシドを係合することができる基として参照される。ヌクレオシド間の連結基の例は、Ｐｒａｓｅｕｔｈら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４８９巻、１８１〜２０６頁）およびＳｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７年（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ、７巻、１８７〜１９５頁）によって記載されており、どちらも本明細書に参照により組み入れられる。例えば、ホスホジエステル（ＰＯ４−）、ホスホロチオエート（ＰＯ３Ｓ−）、ホスホロアミデート（Ｎ３’−Ｐ５’）（ＰＯ３ＮＨ）、およびメチルホスホネート（ＰＯ３ＣＨ３）、ペプチド連結（「ＰＮＡ」）などである。例えば、米国特許第５９６９１１８号を参照されたい。そのような修飾連結基、修飾リボース、または窒素性塩基をオリゴヌクレオチド内に含めることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチドの加水分解の速度が減少することがある。
【００６５】
「対立遺伝子」は、異なる形態の所与の遺伝子座、マーカーまたは多型の対または一式のうちの１つである。２倍体の生物または細胞では、対立遺伝子対のメンバーが、相同染色体対上の対応の位置（遺伝子座）を占める。これらの対立遺伝子が、一致する場合、生物は、その対立遺伝子について「ホモ接合性」であるという。そして、それらが異なっている場合、生物または細胞は、その対立遺伝子について「ヘテロ接合性」であるという。
【００６６】
「ハプロタイプ」は、概ね共に遺伝する染色体上の密接に連鎖した対立遺伝子の一式である。例えば、染色体上の核酸配列の第１の部位にある多型対立遺伝子は、同じ染色体上の第２の部位で、別の多型対立遺伝子と頻度の点で関連があることが見出されることがあり、頻度以外は、無作為な関連であることが予想される（例えば「連鎖平衡」）。これらの２つの多型対立遺伝子は、連鎖不均衡（ＬＤ）にあるものとして記載されることがある。ハプロタイプは、２、３、４、またはそれを超える対立遺伝子を含んでいてもよい。所与の染色体のセグメントに沿うハプロタイプの対立遺伝子の一式は、組換え事象がない限り、概して共に子孫に伝達される。
【００６７】
「ハプログループ」は、共通の祖先を共有するか、または同じ対立遺伝子または対立遺伝子の一式を全てが共有する、同様のハプロタイプのグループである。
【００６８】
「正常」および「野生型」のＨＴＴのヒト核酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ参照配列ＮＭ＿００２１１１．７（ｍＲＮＡ）およびＮＣ＿０００００４．１２、およびＮＴ＿００６０５１．１９（ゲノム）がある。ヒトの野生型ＨＴＴタンパク質は、例えばＧｅｎＰｅｐｔ参照配列ＮＰ＿００２１０２．４がある。そのような配列の他の例は、これらまたは同様のデータベースから、または、ＨＴＴの核酸またはタンパク質を含む試料の配列決定によって取得されるとき、入手可能となろう。ＨＤに罹患している対象は、配列の変異型ＨＴＴ対立遺伝子について、通常はヘテロ接合性である。
【００６９】
区別的な多型とは、核酸配列の「野生型」および変異型の対立遺伝子間の区別を可能にする、ヌクレオチド配列におけるバリエーションである。区別的な多型は、配列中の１つまたは数個ヌクレオチドの挿入もしくは欠失、または配列中の１つまたは数個のヌクレオチドの変化を含めることがある。
【００７０】
「単ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」とは、同じ種の個体のゲノム間の単個のヌクレオチドのバリエーションである。場合によっては、ＳＮＰは、単ヌクレオチドの欠失または挿入であることがある。概して、ＳＮＰは、ゲノムで比較的頻繁に起こり、それゆえ遺伝的多様性に寄与する。ヒトゲノムにおけるＳＮＰの密度は、１０００塩基対当たり１個と見積もられている。その上、ＳＮＰは、ゲノム中にわたって比較的一様に間隔を空けて位置するものと考えられている。さらに、ＳＮＰは、他の多型よりも変異の観点で安定であるものと考えられており、その使用を、マーカーと未知のバリアントとの間の連鎖不均衡を使用して疾患原因変異のマッピングを行う関連研究に役立つものとしている。ＳＮＰは、２、３、または４つの対立遺伝子を有していてもよく、または（異なるヌクレオチドに対応する３つまたは４つの異なる形態のＳＮＰを有することができる場合があるにもかかわらず）、それゆえ遺伝子型判定（長さの測定よりもむしろ単純なプラス／マイナスアッセイによって）および自動化が容易となっている。ＳＮＰの場所は、概して高度に保存された配列の側面に位置する。個体は、各ＳＮＰの場所の対立遺伝子についてホモ接合性であってもヘテロ接合性であってもよい。ヘテロ接合性のＳＮＰ対立遺伝子は、区別的な多型の一例である。
【００７１】
当業者は、核酸分子が二重鎖であり、それゆえ一方の鎖の特定のＳＮＰ部位を参照することが、その相補鎖の対応する部位を参照することでもあることを認識されたい。そのため、参照によって、どちらかの鎖が、特定のＳＮＰ部位もしくは位置、ＳＮＰ、対立遺伝子、またはヌクレオチド配列、例えば本明細書に記載のものなどを参照することが可能にする。
【００７２】
表１に示した配列（配列番号：１〜５）は、ＨＴＴ遺伝子のＡ１、Ａ２、およびＡ３ａのＨＤハプロタイプを規定する、選択された多型を含むかまたはその側面に位置する正鎖のゲノムＤＮＡ配列を示し、５’から３’の方位で図説されている。
【００７３】
表１：Ａ１、Ａ２、およびＡ３ａのＨＤハプロタイプを規定する選択した多型の標的ＤＮＡ配列。多型の部位を括弧で定めた（少数型対立遺伝子／多数型対立遺伝子）。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
表２に示した配列は、Ａ１、Ａ２、またはＡ３のＨＤハプロタイプを規定する区別的な多型に特異的にハイブリダイズする、１つまたは複数の核酸サイレンシング剤を設計するために、当業者に有用である可能性がある。
【００７６】
表２：Ａ１、Ａ２、またはＡ３のＨＤハプロタイプを規定する選択された多型についての逆相補配列。多型の部位を括弧で定めた。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
核酸サイレンシング剤の例を表Ｓ３〜７に示す。ＡＳＯは、本発明のいくつかの実施形態による核酸サイレンシング剤の例である。概して、ＡＳＯは、約２０ヌクレオチドとしてよいが、約１２から約２５ヌクレオチドの範囲、またはその間の任意の長さとしてもよい。例えば、ＡＳＯが多型で選択的に核酸分子を区別するという条件で、ＡＳＯを１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さとしてもよい。
【００７９】
表３：Ａ１のＨＤハプロタイプを規定するｒｓ７２２３９２０６多型をターゲティングする例示的なＡＳＯ配列。特異的な対立遺伝子の場所を大文字フォントで標示している。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
表４：Ａ２のＨＤハプロタイプを規定するｒｓ３６３１０７多型をターゲティングする例示的なＡＳＯ配列。特異的な対立遺伝子の場所を大文字フォントで標示している。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
表５：Ａ２のＨＤハプロタイプを規定するｒｓ３６２３１３多型をターゲティングする例示的なＡＳＯ配列。特異的な対立遺伝子の場所を大文字フォントで標示している。
【００８４】
【表５】
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【００８５】
表６：Ａ２のＨＤハプロタイプを規定するｒｓ２５３０５９５多型をターゲティングする例示的なＡＳＯ配列。特異的な対立遺伝子の場所を大文字フォントで標示している。
【００８６】
【表６】
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【００８７】
表７：Ａ３ａのＨＤハプロタイプを規定するｒｓ１１３４０７８４７多型をターゲティングする例示的なＡＳＯ配列。特異的な対立遺伝子の場所を大文字フォントで標示している。
【００８８】
【表７】
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【００８９】
本発明は、１つまたは１つ以上の配列番号６〜５１７またはその一部もしくは断片配列を有する１つまたは複数の核酸サイレンシング剤を提供する。
【００９０】
さらに別の態様では、本発明は、ＨＤの治療、予防、または寛解のための、１つまたは１つ以上の配列番号６〜５１７またはその一部もしくは断片配列を有する１つまたは複数のＡＳＯの使用を提供する。
【００９１】
表８：Ａ１、Ａ２、およびＡ３のＨＤハプロタイプを規定する選択された多型のための標的ＤＮＡ配列。標的多型バリアントを示す。
[0092]
【表８】
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【００９２】
材料および方法
本明細書に記載の実施例について、以下の方法を採用した。
【００９３】
カナダ人対象での遺伝子型判定 およびハプロタイプの帰属 
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ遺伝子型判定アレイおよびＢｅａｄＸｐｒｅｓｓプラットフォームを使用して、＞１０００人のカナダ人白人のＨＤ患者および親族で、９１ＳＮＰについて遺伝子型を判定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して遺伝子型をコールし、ＰＨＡＳＥｖ２．１．を使用して９１ＳＮＰのハプロタイプを再構築した。ハプロタイプを手動でアノテーションし、次いでＣＡＧリピート長に相を特定し、家族相関によって配列同一性を確定した。我々の元のパネルの２８／９１のＳＮＰが、非白人民族群に稀であるか優先的に起こり、残りの６３のＳＮＰが、ヨーロッパ人集団（１０００ゲノム）で＞１％の頻度である。これら６３の共通ＳＮＰのうち５１がＨＴＴ遺伝子配列内に起こり、拡張された６３のＳＮＰハプロタイプ内の遺伝子内ハプロタイプのアノテーションに使用された。
【００９４】
１０００ゲノムでのＨＴＴハプロタイプの解析
１０００ゲノムプロジェクトコンソーシアム（１０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（第Ｉ相）から、Ｄａｔａ  Ｓｌｉｃｅｒツールを使用して、ＨＴＴ遺伝子領域（ＧＲＣｈ３７３０３４０８８〜３２８８００７、ＨＴＴ遺伝子の＋／−５０ｋｂ、ＳＨＡＰＥＩＴハプロタイプ）を包含するバリアントコールファイル（Ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌ  ｆｉｌｅｓ：ＶＣＦ）をダウンロードし、Ｒの統計コンピューティング環境で解析した。１０８３人の個人から、第４染色体内の２１６６の相の特定されたハプロタイプが利用可能であった。以前に規定されたタグＳＮＰであるｒｓ３６２３０７［２４］を使用して、遺伝子内Ａ１ハプロタイプを担持する染色体を特定した。ｒｓ３６２３０７［Ｔ］を含有する７６の染色体のうち少なくとも９０％に存在する（すなわち７６の染色体のうち少なくとも７０の上に存在するＳＮＰ）と共に、全２１６６の染色体のうち１００未満に存在するＳＮＰを、さらに進んだ解析を行うためのＡ１の候補マーカーとして特定した。カナダ白人の６３ＳＮＰのハプロタイプを手動によりアノテーションすることで規定されたＡ２マーカーである、ｒｓ２７９８２３５およびｒｓ３６３０８０を使用して、Ａ２の染色体を同様に特定した。連鎖したＡ１バリアントに用いたものと同様の戦略に従い、連鎖したＡ２バリアントを発見した。我々の６３ＳＮＰのパネルにおいて、特異的なＡハプロタイプを規定するいずれかのＳＮＰを有する全ての染色体を排除することによって、Ａハプログループ染色体のうちＡ３染色体を特定した。Ａ１、Ａ２、およびＡ３サブタイプマーカーを、完全な１０００ゲノムのデータセットにおいて、各ハプロタイプのサブタイプの上に存在するが、他の染色体上には存在しない、任意のＳＮＰとして規定した。全てのＡ１、Ａ２、およびＡ３バリアントを特定したのに続いて、１０００ゲノムの第Ｉ相のデータセット内に≧５％のＥＵＲの頻度で存在する、遺伝子内ＨＴＴ  ＳＮＰの相の特定された遺伝子型を、７３８のヨーロッパ人の染色体から抽出し、我々が直接的に遺伝子型判定を行った６３ＳＮＰのハプロタイプのデータと比較して、手動でアノテーションした。
【００９５】
ヨーロッパ対象の遺伝子型判定およびハプロタイプの帰属
２００人のスウェーデン人、１００人のフランス人、および２９１人のイタリア人のＨＤ家族メンバーを、イタリア・ポッツィッリのＩＲＣＣＳ  Ｎｅｕｒｏｍｅｄと共同で、ＵＢＣ  ＨＤ  ＢｉｏＢａｎｋから特定した。全てのフランス人およびスウェーデン人の試料を、１９９０年代のＨＤ遺伝子マッピング研究に用いたそれぞれの起源の国域で収集した。これらの試料のうち、１２０人のスウェーデン人、７６人のフランス人、２２人のフィンランド人、および２０９人のイタリア人の家族メンバーを、ハプロタイプおよびＣＡＧリピート長の相の特定が可能であるものとして特定した。カナダ白人コホートで遺伝子型判定された、ハプロタイプを規定する６３のＳＮＰ全てについて、遺伝子型判定を行った。遺伝子型判定は、選択されたヨーロッパ人の試料で、６つの新規のＡ１およびＡ１サブタイプのＳＮＰ、５つの新規のＡ２およびＡ２サブタイプのＳＮＰ、および新規のＡ３ｓサブタイプのＳＮＰを追加して用いて行った。上記６３のＳＮＰのパネルには存在しないが、先の４ｐ１６．３遺伝子座での遺伝子型判定で推測されたハプロタイプ［２２］の再構築に必要な、１５のＳＮＰで、ヨーロッパ人の試料をさらに遺伝子型判定に供した。ヨーロッパ人試料のハプロタイプを、ＰＨＡＳＥｖ２．１を用いて再構築し、カナダ白人コホートについて手動でアノテーションした。
【００９６】
ＨＴＴ  Ａ１バリアントの直接的な遺伝子型判定 
Ａ１マーカーであるｒｓ１４９１０９７６７およびｒｓ７２２３９２０６は、二対立遺伝子のインデルであり、６３ＳＮＰのハプロタイプのデータを用いて、ＵＢＣ  ＨＤ  ＢｉｏＢａｎｋ由来の相の特定が可能な試料の断片解析によって、遺伝子型判定に付された。ｒｓ１４９１０９７６７およびｒｓ７２２３９２０６の遺伝子型では、家族相関によって、ＳＮＰのハプロタイプおよびＣＡＧリピート長に相を特定した。合計で、４５４の重複性のないかつ相の特定されたＨＤ染色体と、６５２の重複性のない対照染色体とを、直接的に遺伝子型判定し、ＣＡＧリピート長に相を特定した。色素標識されたｄｅｌ２６４２Ｆ（配列番号５１８として特定される６ＦＡＭ−ＧＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＣＣＣ）およびｄｅｌ２６４２Ｒ（配列番号５１９として特定されるＣＣＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＴＴＧ）を使用して、ｒｓ１４９１０９７６７を含有するＰＣＲ産物を増幅した。ｒｓ７２２３９２０６を含有する産物を、ｄｅｌＡＣＴＴ３Ｆ（配列番号５２０として特定されるＧＡＧＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＴ）と、色素標識されたｄｅｌＡＣＴＴ３Ｒ（配列番号５２１として特定されるＥＸ−ＡＴＧＴＧＧＣＣＡＴＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＡ）とを用いて増幅した。プライマーは、遺伝子型判定を容易にするために縮重したものであり、ＰＣＲ産物は、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを備えたＡＢＩ  ３７３０ｘｌ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによって分析した。
【００９７】
Ａ１をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
変異型ΔＡＣＴＴ（ｒｓ７２２３９２０６）、ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、ｒｓ２５３０５９５、ｒｓ１１３４０７８４７の少数型対立遺伝子、および対応の多数型対立遺伝子参照配列をターゲティングするロックド核酸（ＬＮＡ）ギャップマーＡＳＯを、学内で設計し、Ｅｘｉｑｏｎが個別支払いベースで合成した。オリゴを１×ＴＥに再懸濁し、トランスフェクション実験間では−２０℃で保存した。
【００９８】
Ａ１をターゲティングするＡＳＯを用いたＨＤ患者細胞の受動的トランスフェクション
以前にＡ１／Ｃ１ハプロタイプとしてハプロタイプ判定されたヒトＨＤリンパ芽球（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＮＩＧＭＳヒト遺伝子細胞リポジトリＩＤ＃ＧＭ０３６２０、ＣＡＧ長５９／１８）を、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地（１５％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン中５００，０００細胞個）中で、７８ｎＭ、３１２ｎＭ、または１２５０ｎＭに用量を変化させたＡＳＯ配列と共に培養し、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地（１５％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン中５００，０００細胞個）中で、７８ｎＭ、３１２ｎＭ、または１２５０ｎＭに用量を変化させたＡＳＯ配列と共に培養した。細胞を、１２０時間インキュベートし、以前に記載されたように［２５］、回収してウェスタンブロット解析に供した。抗非筋肉型ミオシンＩＩＡ（Ａｂｃａｍａｂ２４７６２）の免疫ブロッティングを、ロードの対照として使用した。
【００９９】
Ａ１、Ａ２、またはＡ３ａをターゲティングするＡＳＯを用いたＨＤ患者細胞の能動的トランスフェクション
以前にＡ１／Ｃ１ハプロタイプ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＮＩＧＭＳヒト遺伝子細胞リポジトリＩＤ＃ＧＭ０３６２０、ＣＡＧ長５９／１８）、Ａ２／Ｃハプロタイプ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＮＩＧＭＳヒト遺伝子細胞リポジトリＩＤ＃ＧＭ０２１５０、ＣＡＧ長さｓ４４／１８）、またはＡ３ａ／Ｃハプロタイプ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＮＩＧＭＳヒト遺伝子細胞リポジトリＩＤ＃ＧＭ０４７２４、ＣＡＧ長さｓ６７／１５）のいずれかとしてハプロタイプ判定されたヒトＨＤリンパ芽球を、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地（１５％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）中で培養した。Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｃ（ＶＣＡ−１００４）を使用した電気穿孔によって、１００μＬのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液中の各ＡＳＯ用量について、１〜５×１０６細胞個をトランスフェクトした。細胞を７２時間または１２０時間インキュベートし、以前に記載されたように［２５］、回収してウェスタンブロット解析に供した。抗非筋肉型ミオシンＩＩＡ（Ａｂｃａｍ  ａｂ２４７６２）の免疫ブロッティングを、ロードの対照として使用した。
【０１００】
対立遺伝子特異的なＨＴＴ  ｍＲＮＡの定量
図３について、トランスフェクト細胞を再び２４時間培養し、各培養物の半量をペレットにして、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および対立遺伝子特異的なｑＰＣＲに供した。残りの細胞培養物を７２時間増殖させて、タンパク質解析に供した。他の全ての図については、トランスフェクト細胞を１２０時間目で回収して、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および対立遺伝子特異的なｑＰＣＲに供した。Ａ１およびＣ１のＨＴＴ  ｍＲＮＡ転写物を、各実験の各用量につき４連で定量し、定量では、ｒｓ３６２３３１（ＡＢＩ、Ｃ＿＿＿２２３１９４５＿１０）に対し設計したＴａｑＭａｎプローブを使用し、ＧＡＰＤＨに正規化した（ＡＢＩ、４３３３７６４Ｆ）。全ての実験を３回実施し、各実験での各データ点について２回のトランスフェクションの反復実験を行った（各データ点についてｎ＝４〜６）。
【０１０１】
対立遺伝子特異的なＨＴＴタンパク質定量
以前にＡ１／Ｃハプロタイプ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＮＩＧＭＳヒト遺伝子細胞リポジトリＩＤ＃ＧＭ０３６２０、ＣＡＧ長５９／１８）、Ａ２／Ｃハプロタイプ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＮＩＧＭＳヒト遺伝子細胞リポジトリＩＤ＃ＧＭ０２１５０、ＣＡＧ長さｓ４４／１８）、Ａ３ａ／Ｃハプロタイプ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＮＩＧＭＳヒト遺伝子細胞リポジトリＩＤ＃ＧＭ０４７２４、ＣＡＧ長さｓ６７／１５）のいずれかとしてハプロタイプ判定されたヒトＨＤリンパ芽球を、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地（１５％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）中で培養した。Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｃ（ＶＣＡ−１００４）を使用した電気穿孔によって、１００μＬのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液中の各ＡＳＯ用量について、１×１０６細胞個をトランスフェクトした。トランスフェクトしたリンパ芽球培養物を、７２時間（図３）または１２０時間（図５〜９）で回収し、ペレットにして、定量的ウェスタンブロット解析に供した。細胞を、２５０ｇ、４℃で５分間の遠心分離によってペレットとし、−８０℃で保存した。以前記載されたように（Ｃａｒｒｏｌｌら、２０１１）、タンパク質を、ＳＤＰ＋緩衝液を用いた溶解によって抽出し、３０〜６０μｇの総タンパク質を１０％低ＢＩＳアクリルアミドゲル上で分離して、０．４５μｍニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをＰＢＳ中５％ミルクを用いてブロッキングし、次いで、ＨＴＴを検出するため、抗ＨＴＴ抗体２１６６（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてブロットした。抗非筋肉型ミオシンＩＩＡ（Ａｂｃａｍａｂ２４７６２）のの免疫ブロッティングを、ロードの対照として使用した。二次抗体であるＩＲ  ｄｙｅ  ８００ＣＷヤギ抗マウス（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、６１０−１３１−００７）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０ヤギ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ２１０７６）を使用して検出し、ＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙを使用してメンブレンをスキャンした。赤外線画像システムＬｉｃｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅを使用して、個別のバンドの強度を定量した（各データ点について＝３〜６）。図面データは、＋／−ＳＥＭの平均として示されている。ボンフェローニの事後検定を用いた２要因ＡＮＯＶＡを、各用量の一式に実施し、ｐ値は、＊＊および＊＊＊を用いて、それぞれｐ＝０．０１およびｐ＝０．００１について表記した。ＨＴＴの代表的な画像を選んだ。
【０１０２】
ＡＳＯを用いたＩｎ  Ｖｉｖｏ  ＡＳＯ治療
ＹＡＣ１２８  ＨＤモデルマウス［２６］を、清潔な施設内で、１２時間の明期：１２時間の暗期の周期下で維持し、食餌と水に自由にアクセスさせた。実験は、ブリティッシュコロンビア大学動物管理委員会の認可により実施した。ＡＳＯを、滅菌済みＰＢＳ中１０μＬの体積となるように標示の用量に希釈し、［１９］にあるように脳室内注射によってデリバリした。４週間後、脳を採集し、１ｍｍの冠状縫合方向の齧歯類脳マトリックス（ＡＳＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中で切片とした。最前方の２ｍｍの切片は、その大部分が嗅球を含有しており、廃棄した。次に最前方の２ｍｍの切片は、大部分が皮質および線条を含有しており、以前［１９］に記載されたように半球に分割して溶解した。４０μｇの総タンパク質を、上記の対立遺伝子特異的なＨＴＴタンパク質の定量に使用した。
【０１０３】
以下の実施例は、説明の目的のために示され、そのように限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：ＨＴＴ中にわたるＳＮＰは、遺伝子じゅうに広がるハプロタイプを表し、Ａ１、Ａ２、およびＡ３ａハプロタイプは、遺伝子じゅうに広がる最も共通するＨＤハプロタイプを表す
互いに異なる対立遺伝子特異的なＨＴＴ標的の頻度およびヘテロ接合性を決定するために、我々は、ＨＴＴ遺伝子領域中にわたる数多くの共通の多型について、ハプロタイプの確立を目指した。様々な部分的なハプロタイプが、ＨＴＴ中にわたって構築されているが、これらのハプロタイプ間の配列の同一性および組換えは、〜１７０ｋｂの遺伝子配列にわたるマーカー密度の低さゆえに、依然として不明である。我々は、以前、ＨＴＴ遺伝子領域中にわたる９１のＳＮＰについて遺伝子型判定したところ［１８］、そのうち６３が、ヨーロッパ人集団に１％を超える頻度存在した［２７］。これら６３の共通のＳＮＰのうち、５１が、ＨＴＴの５’ＵＴＲの開始部と３’ＵＴＲの終結部との間（ｃｈｒ４：３０７６４０８〜３２４５６８７、ＧＲＣｈ３７）に位置する（示さず）。合計で、本研究について、ＵＢＣ  ＨＤ  Ｂｉｏｂａｎｋ由来の５２７人のカナダ人ＨＤ患者および３０５人の対照の親族を遺伝子型判定し、６３の全てのＳＮＰで相を特定した。我々は、家族性分離のパターンを使用して、ヨーロッパ人家系カナダ人の個人に由来する、ＣＡＧの伸長した非血縁の２９３の染色体（ＣＡＧ＞３５）および８２９の対照染色体（ＣＡＧ≦３５）について、遺伝子じゅうに広がるハプロタイプを６３の全てのＳＮＰで再構築した。密集した６３ＳＮＰのハプロタイプがアノテーションされたことで、以前にＨＴＴ遺伝子領域中にわたる２２のｔＳＮＰを使用して得られた主要なハプログループ［２４、２８］の帰属が再現されたことから、共通のハプロタイプ間の組換えはＨＴＴ遺伝子の遺伝子外で主に起こることが裏付けられた。例えば、Ａ３ハプロタイプは、Ｃ１ハプロタイプとの歴代の遺伝子外５’交差にしばしば関連しているが、その一方で、ＨＴＴ遺伝子配列内で組換えが起こるＣ１に共通するハプロタイプは観察されない。我々のカナダ人コホートで、９／２８３（３．２％）のみのＨＤ染色体および２５／８２９（３．０％）の対照染色体が、遺伝子じゅうに広がるＨＴＴハプロタイプの遺伝子内組換えを表し、このことは、ＨＴＴ内の組換えは稀であることを裏付ける。カナダ人ＨＤ患者および対照由来の相の特定された１６６４のハプロタイプにおける、６３全てのＳＮＰの遺伝子型間のペアワイズ連鎖不均衡（ＬＤ）解析によって、高いＬＤ（Ｄ’＞０．９）を有するｒｓ７６２８５５からｒｓ３６２３０３（ｃｈｒ４：３０７４７９５〜３２４２３０７）までの〜１７０ｋｂ領域が明らかになり、このことは、転写されているＨＴＴ配列全体にわたる極めて低い組換えのハプロタイプブロックを示している（示さず）。
【０１０５】
これに対して、相関係数（ｒ２）によるストリンジェントなペアワイズＬＤによって、ＨＴＴハプロタイプブロック内の断続的なＳＮＰ不均衡のパターンが明らかになり、このことは、遺伝子座に広がったハプロタイプの多様性を反映する。驚くべきことに、ＨＴＴタグ特異的な遺伝子内ハプロタイプ内で、高いペアワイズ相関にあるＳＮＰである。例えば、ｒｓ２７９８２３５およびｒｓ３６３０８０は、Ａ２ハプロタイプの特有のマーカーを表し、完全に近いペアワイズ相関（ｒ２＝０．９８）に見出されるが、一方、どちらのＳＮＰも、６３ＳＮＰのパネル中の他の全てのバリアントと低いペアワイズ相関を示す。どちらのＳＮＰも、ＨＴＴ遺伝子全体に広がっているＡ２ハプロタイプの高度に特異的な連鎖マーカーである。ＨＴＴを横断して観察される高いＬＤのパターン、および特有のＳＮＰのセットによってタグ付けされている同一のハプロタイプの存在は、ＨＴＴ内のＳＮＰが、ＨＴＴ配列全体を包含する特異的なハプロタイプまたはハプロタイプ群が、歴代の組換えによって絶え間ないものとなっていることを示す。カナダ人対象の中では、ＨＤ染色体の９５．８％（２７１／２８３）および対照染色体の９５．９％（７９５／８２９）が、５１の共通の遺伝子内ＳＮＰ、およびエクソン１のＣＣＧリピート長における、２０の特異的な非組換えハプロタイプに合致する（表９）。
【０１０６】
表９：カナダ白人コホート由来の２０の共通の遺伝子内ハプロタイプ（５１のＳＮＰ）
【０１０７】
【表９】
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【０１０８】
次に、我々は、ＨＤ染色体上で起こっている、遺伝子じゅうに広がる最も高頻度のハプロタイプを決定した。２８３の非血縁性のカナダ人ＨＤ染色体の中で、４８．１％（１３６／２８３）が、ｒｓ３６２３０７で印付けられたＡ１ハプロタイプ上に見出され、３２．２％（９１／２８３）が、密に関連するＡ２ａまたはＡ２ｂ上に見出され、１２．０％（３４／２８３）が、Ａ３上に見出されている。合計で、カナダ人ＨＤ染色体の９２．２％（２６１／２８３）が、ＨＴＴに広がるＡ１、Ａ２、またはＡ３のハプロタイプ上に見出された。対照染色体の中では、８．０％のみがＡ１であり、１６．４％がＡ２ａまたはＡ２ｂであり、１３．１％がＡ３であった。ハプロタイプＡ４およびＡ５は、それぞれ対照染色体の６．３％の上に存在したが、カナダ人ＨＤ染色体上には全く観察されなかった。特に、Ａ１およびＡ２ａは、最も頻度の高いＨＤハプロタイプを代表するにもかかわらず、Ａハプログループ内で最も遺伝的に離れたハプロタイプを代表する。ハプログループＢは、ＨＴＴ対照の５．３％にある別個の遺伝的な系列であり、カナダ人コホートの３／２８３（１．１％）のみのＨＤ染色体に存在する。ハプログループＣは、ハプロタイプの複合体の集まりであり、非血縁の対照染色体の約半数から構成されるが（４２．６％）、ＨＤ染色体の３．２％にのみ見出される。アノテーションされた全ての遺伝子内ハプロタイプの中で最も共通なものは、Ｃ１であり、カナダ人コホートの非血縁の対照染色体の２９．８％に存在する。
【０１０９】
実施例２：ＨＤ関連ハプロタイプ上の規定された全ての遺伝子内対立遺伝子の特定
変異型ＨＴＴは、対照に比べて、遺伝子じゅうに広がるＡ１およびＡ２ハプロタイプに濃縮されている。このことは、これらのハプロタイプ上に専ら見出される対立遺伝子が、変異型ＨＴＴの対立遺伝子特異的なサイレンシングのための魅力的な標的を表す可能性があることを示唆する。最も高頻度のＨＤ関連ハプロタイプ（Ａ１およびＡ２）上で一意的に見出される全ての多型を決定するために、我々は、これらのハプロタイプ特異的なＳＮＰを担持する１０００ゲノムプロジェクトの全ゲノム配列解析データ内の全ての染色体を特定した。１０００ゲノム第Ｉ相データセットのＨＴＴ（ｃｈｒ４：３０７６４０８−３２４５６８７、ＧＲＣｈ３７）にわたって、合計で２２９７遺伝子内の多型がアノテーションされた。
【０１１０】
我々の５１ＳＮＰのパネルでは、Ａ１ハプロタイプは、一意的にｒｓ３６２３０７、すなわちＨＴＴのエクソン６７および３’ＵＴＲに存在する［Ｔ／Ｃ］ＳＮＰによって規定される。１０００ゲノム染色体全てのうち、３．５％（７６／２１６６）がこのＳＮＰを有する。ｒｓ３６２３０７［Ｔ］を担持する７６の染色体のうち、７５が、Δ２６４２（ｒｓ１４９１０９７６７）として知られるグルタミン酸の欠失を有し、７４が、新規の４ｂｐのイントロンの欠失（ｒｓ７２２３９２０６）を有する。２１６６染色体の全てのうち、ｒｓ３６２３０７［Ｔ］を担持する７６の染色体を含めて、７７の上にΔ２６４２が存在し、ｒｓ７２２３９２０６は、８３の上に存在する。したがって、Δ２６４２を有する染色体の９７．４％（７５／７７）およびｒｓ７２２３９２０６を有する染色体の８９．２％（７４／８３）はまた、ｒｓ３６２３０７［Ｔ］を有する。そのため、両多型は、ｒｓ３６２３０７の高感度の代理マーカーを表す（図１ａ）。ｒｓ３６２３０７と強い関連がある他のＳＮＰはなかった。例えば、Ａ１染色体の少なくとも９０％の上に存在する、次に最も共通なＳＮＰもまた、６３３／２１６６の染色体上に非特異的に見出された。ｒｓ３６２３０７よりも頻度の低いＳＮＰのうち、ある遺伝子内ＳＮＰ（ｒｓ１８７０５９１３２）は、３２／７６のＡ１染色体のサブセット上に特異的に起こる。したがって、バリアントｒｓ３６２３０７、ｒｓ１４９１０９７６７（Δ２６４２）、およびｒｓ７２２３９２０６（ΔＡＣＴＴ）は、Ａ１ハプロタイプ高度に特異的であり、互いに高いペアワイズ相関（ｒ２＞０．９）を有するが、１０００ゲノムデータセット中の他のＳＮＰには相関がない。Ａ１を規定する３つ全ての多型は、ヨーロッパ人またはヨーロッパ民族背景との混血である個人にも専ら見出され（表１０）、このことは、東アジア人または南アフリカ系統の黒人である個人にはｒｓ１４９１０９７６７（Δ２６４２）対立遺伝子が存在しないという報告［２８、２９］に一致する。
【０１１１】
表１０：１０００ゲノム第Ｉ相配列データから得られたＵＢＣＨＤＢｉｏｂａｎｋ（ＣＭＭＴ  ＨＤ染色体およびＣＭＭＴ正常染色体と表示）由来および正常染色体由来のＨＤ染色体および対照染色体におけるＡ１対立遺伝子のカウント（ｎ）および相対頻度（％）
[0113]
【表１０】
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【０１１２】
Ａ２ハプロタイプは、密に関連するサブタイプＡ２ａおよびＡ２ｂからなり、上に記載された我々の５１ＳＮＰのパネル中のｒｓ２７９８２３５およびｒｓ３６３０８０によって一意的にタグ付けされる。１０００ゲノム第Ｉ相中の１００の染色体が、ｒｓ３６３０８０を有し、そのうち９８がｒｓ２７９８２３５をも有する。後者のＳＮＰは、ｒｓ３６３０８０によってタグ付けされた染色体上に専ら見出され、他の染色体上には見出されない。これらの２つのマーカー間の高いペアワイズ相関は、我々のカナダ人ＨＴＴ染色体を直接的に遺伝子型判定する際に、同様に観察される（ｒ２＝０．９８）。１０００ゲノムでは、３つの追加的な遺伝子内ＳＮＰ−ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、およびｒｓ２５３０５９５−が、ｒｓ３６３０８０を担持する１００、９９、および９９の染色体上にそれぞれ見出され、同様にこれらの染色体上にのみ存在する。５つの多型全てが、５つのバリアントのいずれかを担持する染色体の９８％の上に存在し、それゆえＡ２ハプロタイプの特異的なマーカーを表す（図１ｂ）。
【０１１３】
ＨＤは、一般にＡ３にも起こる。我々の５１ＳＮＰのパネルでは、Ａ３ハプロタイプは、他のＡハプロタイプに特異的なＳＮＰが不在の際に、Ａハプログループの遺伝子内マーカーによって規定される。ヨーロッパ人系統の７３８の対照染色体から、１１９のＡ３ハプロタイプが特定された（１６．１％）。Ａ３染色体全てを一意的に包含する、特定されたＳＮＰは見出されなかった。しかし、Ａ３染色体の４５．４％（５４／１１９）上に、Ａ３ａと称する特異的なサブタイプのＳＮＰ−ｒｓ１１３４０７８４７−が観察された（図１ｃ）。７３８のヨーロッパ人の個人では、ｒｓ１１３４０７８４７は、Ａ３ハプロタイプのサブセットにのみ見出される。共通してＨＤに関連があるにもかかわらず、他の非ＨＤ関連Ａハプロタイプと共有される場合を除いて、Ａ１およびＡ３の両方に特異的なＳＮＰは見出されなかった。
【０１１４】
実施例３：ＨＴＴ  Ａ１ハプロタイプに特異的な多型の妥当性確認
１０００ゲノムの網羅性の低い全ゲノム配列解析データから得た、Ａ１を規定する３つ全ての多型について、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの関連の妥当性を確認するため、Δ２６４２およびｒｓ７２２３９２０６を直接的に遺伝子型判定し、以前にｒｓ３６２３０７であるものと遺伝子型判定されたＨＴＴ染色体中のＣＡＧリピートに相を特定した。これらは、元の６３−ＳＮＰのパネルを用いて遺伝子型判定された全てのカナダ人ＨＤ染色体、ならびに様々な民族グループからの以前ハプロタイプ判定された他の試料からなっていた。合計で、相を特定されかつ重複性のない４５４のＨＤ染色体、および重複性のない６５２の対照染色体を、ｒｓ１４９１０９７６７（Δ２６４２）およびｒｓ７２２３９２０６で首尾良く遺伝子型判定し、ＣＡＧリピートに相を特定した。直接的な遺伝子型判定のデータのペアワイズＬＤでは、３つ全ての多型がＨＤに存在し、対照染色体が完全に近いＬＤ（ｒ２＞０．９９、表１１）にあること、および３つ全ての少数型対立遺伝子が対照に対してＨＤ染色体上に高度に濃縮されていることが示されている。
【０１１５】
表１１：白人ＨＤ染色体およびＵＢＣ  ＨＤ  ＢｉｏＢａｎｋ由来の正常染色体における、ａ１ハプロタイプを規定する対立遺伝子ｒｓ３６２３０７、ｒｓ１４９１０９７６７、ｒｓ７２２３９２０６の直接的な遺伝子型判定
【０１１６】
【表１１】
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【０１１７】
Δ２６４２コドン欠失のマーカー研究は、Ａ１ハプロタイプの頻度が、白人ＨＤ患者集団間（すなわち、フィンランド人、アメリカ人、スウェーデン人、カナダ人、フランス人、クロアチア人、インド人、イタリア人、中国人、および日本人）でかなり異なることを示唆する。したがって、遺伝子中に広がる特異的なＨＤハプロタイプに関する我々の定義に続いて鍵となる疑問は、ヨーロッパ人系統の各種患者集団間でのこれらのハプロタイプの分布を決定することであった。先の６３ＳＮＰのパネル、ならびに１０００ゲノムプロジェクト由来のＡ１、Ａ２、およびＡ３を規定する新規のＳＮＰを含むように、改訂ＳＮＰパネルを設計した。この改訂パネルを使用して、我々は、それぞれの起源の国域を由来とする１２０人のスウェーデン人、７６人のフランス人、および２０９人のイタリア人のＨＤ家族メンバーを、遺伝子型判定した。カナダ人白人コホートと同じ様式で、ハプロタイプを再構築し、ＣＡＧリピートサイズに相を特定した。カナダ人白人コホートに見出された共通の６３ＳＮＰのハプロタイプ全てが、我々の改訂パネルを使用したヨーロッパ人ＨＤコホートの遺伝子型判定によって再現された。３つ全てのＡ１バリアントおよび５つ全てのＡ２バリアントが、改訂パネルを用いたヨーロッパ人コホートの直接的な遺伝子型判定の際に高く予想されたペアワイズ相関に合致した（図１）。全ヨーロッパ人患者のうち、Ａ３上のＣＡＧ伸長は、Ａ３ａを特定する特有のＳＮＰであるｒｓ１１３４０７８４７を伴う相に専ら見出されが、このＳＮＰを欠いたＡ３ｂの上には見出されず、このことは、Ａ３ａが疾患関連ハプロタイプであることを示唆する。同様に、カナダ人ＨＤのＡ３染色体におけるｒｓ１１３４０７８４７の直接的な遺伝子型判定では、ＣＡＧ伸長が、Ａ３上に存在する際に、専らＡ３ａ上にも起こること（３４のＡ３のカナダ人ＨＤ染色体のうち３１）が明らかになった。したがって、共通のＨＤ関連ハプロタイプであるＡ１、Ａ２、およびＡ３ａは、民族的に別個のヨーロッパ人ＨＤ患者コホート中で一律の規定マーカーのセットを共有しており、このことは、異なるヨーロッパ人集団にわたってこれらの疾患関連ハプロタイプが先祖代々深い関係にあったことを意味する。
【０１１８】
遺伝子内ＨＴＴハプロタイプの配列同一性が、白人ＨＤ患者集団にわたって不変である一方で、我々の直接的な遺伝子型判定によって、異なるヨーロッパ人集団では、ＣＡＧの伸長した染色体と対照染色体との両方の間で、特異的なＨＤ関連ハプロタイプの頻度に著しい差異があることが明らかになった。非血縁のスウェーデン人のＨＤ染色体の間では、５１％（２６／５１）がＡ１上に見出され、我々が以前遺伝子型解析したカナダ人ＨＤコホート（ｐ＝０．７６１６、フィッシャーの正確確率）と同様である。スウェーデン人のＨＤの中でのＡ２の頻度は、カナダでのものよりも比較的低く（３２％に対し１８％、ｐ＝０．０４５５）、Ａ３ａは頻度がより高い（カナダ人での１１％に対し２８％、ｐ＝０．００３３）。フランス人のＨＤ染色体もまた、最も高頻度にＡ１（４８％に対し４５％、ｐ＝０．７６５４）であり、カナダ人のＨＤと同様の頻度でＡ２が存在し、Ａ３ａはより共通する（Ａ２、ｐ＝０．１９５７；Ａ３ａ、ｐ＝０．０２５６）。これに対して、イタリア人のＨＤ染色体は、大部分がＡ２上に見出され（カナダ人に対し５８％、ｐ＜０．０００１）、カナダ人コホートに対してはるかに少ない割合のＨＤがＡ１上にあり（１９％、ｐ＜０．０００１）、同様の割合のＡ３ａがある（７％、ｐ＝０．２６４７）。我々の元の６３ＳＮＰのパネルを用いてハプロタイプ判定された少数のセットのフィンランド人のＨＤ家族では、全ての非血縁の疾患染色体が、Ａ１（６／１０、６０％）またはＡ２（４／１０、４０％）である。我々のカナダ人コホートとヨーロッパ人コホートとの間で特異的なハプロタイプの頻度に差異があるにもかかわらず、北ヨーロッパ期限の４つ全ての集団で、＞９０％のＨＤ染色体が、Ａ１、Ａ２、およびＡ３ａハプロタイプ上に見出され、イタリア人のＨＤ染色体の８４％が見出される。
【０１１９】
ＣＡＧの伸長した染色体よりも劇的ではないものの、対照染色体上のＨＴＴハプロタイプもヨーロッパ人集団間で異なる。ハプログループは、カナダ人に対してイタリア人対照ではより高い頻度に向かう傾向がある（ｐ＝０．０５９７）が、同様の頻度でスウェーデン人（ｐ＝０．６８３８）およびフランス人（ｐ＝０．８０７３）の対照染色体の間に見出される。Ａ１は、４つ全ての対照コホートで、統計学的に同様の頻度で起こるのに対し、Ａ２は、イタリア人対照ではカナダ人（１６％に対し２４％、ｐ＝０．０１８５）またはスウェーデン人対照（１３％、ｐ＝０．０２０３）よりも高い頻度で起こり、このことは、イタリア人ＨＤ染色体の中で頻度が上がっていることを反映する。
【０１２０】
実施例４：Ａ１、Ａ２、およびＡ３ハプロタイプは、ＨＤ患者集団における対立遺伝子特異的なＨＴＴサイレンシングのための最適な標的パネルを表す
特異的なハプロタイプを規定する多型のペアワイズ相関が高いことは、選択的ＨＴＴサイレンシングの戦略として、Ａ１およびＡ２ハプロタイプをターゲティングすることを可能にする。３つ全てのＡ１マーカーが、完全に近いＬＤに存在し、いずれの単独のＡ１多型をターゲティングすることも、このハプロタイプについてヘテロ接合性であるＨＤ患者とほぼ同数で、対立遺伝子特異的なＨＴＴサイレンシングを行うことを可能にすることになる。ＨＤ患者のＡ１のヘテロ接合性は、ＣＡＧ伸長に相を特定される場合、ｉｓｈｉｇｈｅｓｔｉｎスウェーデン（４７％）、カナダ（４４％）、およびフランス（４３％）で最も高いが、イタリアでははるかに低く（１５％）、このことは、北ヨーロッパ系統の患者で、より大きな有用性があることを示唆する（表１２）。
【０１２１】
表１２：伸長ＣＡＧに相を特定された標的ハプロタイプを有する、各コホート由来ＨＤ患者におけるハプロタイプのヘテロ接合性
【０１２２】
【表１２】
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【０１２３】
Ａ２上にＨＤを有する（ｒｓ３６３０８０に相を特定される）患者のうち推定で９８％に、５つ全てのＡ２標的が存在することになる。Ａ２についてヘテロ接合性であり、そのＡ２がＣＡＧ伸長に相を特定される患者のパーセントは、スウェーデンでは１８％に、イタリアでは４３％に及び、このことは、南ヨーロッパ人集団で、より大きな有用性があることを示唆する。ｒｓ１１３４０７８４７の三次ターゲティングは、Ａ３ａにＣＡＧ伸長を担持する患者の治療を可能にし、その範囲は、スウェーデンで最大２７％の患者からイタリアでの５％のみまでに及ぶ。合計で、Ａ１、Ａ２、およびＡ３ａを表す３つの特異的な多型をターゲティングすることによって、カナダ人、スウェーデン人、フランス人、およびイタリア人の患者集団由来全体のＨＤ患者の〜８０％の選択的サイレンシング治療を可能にすることがある。したがって、これらのＨＤ関連ハプロタイプのＳＮＰを特定することは、対立遺伝子特異的なＨＴＴサイレンシング戦略によって、約８０％の患者の治療を達成することができる標的のパネルを表す。
【０１２４】
実施例５：ＡＳＯはヒト細胞でＨＴＴ  Ａ１を選択的にサイレンシングする
本研究の遺伝子型判定された全てのＨＤ患者のうち、Ａ１は、伸長ＣＡＧリピートをｃｉｓに有する最も頻度の高いヘテロ接合性ハプロタイプである。したがって、Ａ１規定マーカーであるｒｓ３６２３０７、ｒｓ１４９１０９７６７（Δ２６４２）、およびｒｓ７２２３９２０６は、対立遺伝子バリアントがＣＡＧリピート伸長に相を特定される際に、ＨＤ患者で最大のヘテロ接合性を有する対立遺伝子特異的な標的を表す。ｒｓ３６２３０７とｒｓ１４９１０９７６７（Δ２６４２）のどちらも、成熟ｍＲＮＡに見出され、ＣＡＧリピート伸長と関連することが知られており、ｓｉＲＮＡ媒介性の選択的なＨＴＴサイレンシングの標的として調査されてきた［２１、３０］。これらのバリアントとは異なり、ｒｓ７２２３９２０６は、イントロン性であり、以前にＣＡＧ伸長との関連の報告がなかった。我々は、変異型配列を指向するＡＳＯを使用して、選択的なＨＴＴサイレンシングの標的としてのｒｓ７２２３９２０６の潜在性を評価することを目指した。
【０１２５】
以前はＨＤとの関連がなかった新規のＡ１標的の提供に加えて、我々は、４ｂｐのｒｓ７２２３９２０６インデル配列のターゲティングが、単ヌクレオチド多型による区別よりも大きな選択性を提供する可能性があるという仮説を立て、選択的な変異型ＨＴＴサイレンシングの標的としてのｒｓ７２２３９２０６の潜在性を評価することを目指した。ｒｓ３６２３０７およびΔ２６４２とは異なり、ｒｓ７２２３９２０６は、イントロン（ＨＴＴのイントロン２２）中に位置し、それゆえスプライシングされていないｍＲＮＡ前駆体に相補的な試薬によってのみ、ターゲティングすることが可能である。ＡＳＯは、相補的なｍＲＮＡ前駆体ならびにｍＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｈ媒介性分解を誘発することができ［３１］ることから、我々は、ギャップマーのデザインをロックド核酸（ＬＮＡ）翼およびホスホロチオエート連結と組み合わせた、ｒｓ７２２３９２０６欠失配列に相補的なＡＳＯ配列を設計した（図３ａ）。
【０１２６】
ＡＳＯを、初代培養のニューロンによって受動的に取り込ませた［１８］。ｒｓ７２２３９２０６を担持するトランスジェニックＨＴＴニューロンが存在せず、我々は、Ａ１ハプロタイプ（ＧＭ０３６２０、ＣＡＧ５９／１８）を担持するヒトＨＤリンパ芽球での受動的取り込みにより、ＬＮＡギャップマーの潜在的なサイレンシング能を試験することを目指した。注目すべきことに、Ａ１  ＨＴＴは、ｒｓ７２２３９２０６をターゲティングするＬＮＡギャップマーと共に培地中で成長したヒトリンパ芽球で選択的にサイレンシングされ、このことは、リンパ芽球が、培地中のＡＳＯも受動的に取り込むことを示唆する。（図２は、５−９−５ＬＮＡギャップマー（配列番号３６）を用いて処理したＡ１／Ｃ１リンパ芽球を示し、図５は、４−９−４ＬＮＡギャップマー（配列番号：６６）を用いて処理したＡ１／Ｃ１リンパ芽球を示す。これらの予備実験に基づいて、我々は、有効用量を最大にするための能動的トランスフェクションを使用して、典型的なＣＡＧ長さのＨＤ患者リンパ芽球におけるＡ１  ＨＴＴのｍＲＮＡおよびタンパク質の用量依存的なノックダウンを検討することを目指した。
【０１２７】
５−９−５ＬＮＡギャップマー（配列番号３６）を用いたヒトＡ１／Ｃ１リンパ芽球のトランスフェクションは、結果として強力なＨＴＴ  ｍＲＮＡのサイレンシングをもたらしたが、Ａ１転写物とＣ１転写物との間の区別は最低限のみであった（未処理細胞に対し、最高用量で１１％のＡ１と２９％のＣ１のＨＴＴ  ｍＲＮＡが残っていた）（図３）。ＤＮＡギャップを５−７−５の立体配置（配列番号６６）にまで２ヌクレオチド減少させたことで、選択性が向上し、最高用量で、ＨＴＴ  Ｃ１対照が未処理のｍＲＮＡレベルの９２％であったのに対し、ＨＴＴ  Ａ１転写物は２９％にまで減少した。Ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇこの分子を４−７−４ＬＮＡギャップマーのデザイン（配列番号９２）に短縮することで、さらにＨＴＴ  Ａ１転写物への選択性が向上し、最高のトランスフェクション用量で、ＨＴＴＣ１のｍＲＮＡを残す一方、Ａ１  ＨＴＴのｍＲＮＡを未処理レベルの２８．５％にまで減少させた（図３ｂ）。ＣＡＧ４４／１８バンドの対立遺伝子による分離を使用したウェスタンブロット解析では、３つ全てのＬＮＡギャップマーのデザインについてタンパク質レベルで同様に減少し、５−７−５および４−７−４ギャップマーによって、正常ＨＴＴは残る一方で変異型ＨＴＴの用量依存的な減少を誘発することが明らかになった（図３ｃ）。相補的なＡＳＯを用いたＡ１特異的なｒｓ７２２３９２０６欠失配列をターゲティングすることによって、Ａ１ハプロタイプを担持するＨＤ患者の遺伝的な代理物である細胞で、変異型ＨＴＴのｍＲＮＡおよびタンパク質を強力かつ選択的にサイレンシングすることができる。
【０１２８】
実施例６：ｒｓ７２２３９２０６欠失部位のターゲティングは、Ｉｎ  Ｖｉｖｏで有効であり忍容性である
伸長ＣＡＧをｃｉｓに有したｒｓ７２２３９２０６の欠失を担持するトランスジェニックマウスが存在せず、Ａ１  ＨＴＴ  ｍＲＮＡおよびタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシングを直接的に評価することができなかった。しかし、Ａ１で欠失している４塩基を含む参照配列に対して設計された野生型類似体の５−９−５ＬＮＡギャップマー（配列番号３６）もまた、トランスジェニックの完全長の変異型ＨＴＴ担持するＹＡＣ１２８マウスの脳で、ヒトＨＴＴの強力な減少を惹起した（図４）。したがって、ｒｓ７２２３９２０６欠失部位は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＳＯ媒介性のＨＴＴ  ｍＲＮＡサイレンシングに近付くことが可能である。
【０１２９】
実施例７：ＡＳＯは、ヒト細胞でＨＴＴ  Ａ２をサイレンシングする
我々は、これらの変異型配列を指向するＡＳＯを使用して、ＨＴＴサイレンシング標的としてのｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３、およびｒｓ２５３０５９５の潜在性を評価することを目指した。特に、配列＋Ｔ＊＋Ａ＊＋Ｔ＊＋Ａ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊＋Ａ＊＋Ｔ＊＋Ｃ＊＋Ａ（＊＝ホスホロチオエート連結、＋＝ＬＮＡ）（配列番号：１６３）のロックド核酸（ＬＮＡ）／ホスホロチオエート骨格ギャップマーを用いて、ｒｓ３６３１０７を標的とし；配列＋Ａ＊＋Ａ＊＋Ｇ＊＋Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊＋Ｇ＊＋Ａ＊＋Ａ＊＋Ｇ（＊＝ホスホロチオエート連結、＋＝ＬＮＡ）（配列番号：２６８）のロックド核酸（ＬＮＡ）／ホスホロチオエート骨格ギャップマーを用いて、ｒｓ３６２３１３を標的とし；配列＋Ｔ＊＋Ｃ＊＋Ｃ＊＋Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊＋Ｇ＊＋Ｇ＊＋Ｇ＊＋Ａ（＊＝ホスホロチオエート連結、＋＝ＬＮＡ）（配列番号：３７３）のロックド核酸（ＬＮＡ）／ホスホロチオエート骨格ギャップマーを用いて、ｒｓ２５３０５９５を標的とした。Ａ２／Ｃハプロタイプ（ＧＭ０２１５０、ＣＡＧ長４４／１８）を担持するヒトＨＤリンパ芽球を、０．５、１、２および５μＭでＬＮＡギャップマー配列を用いて１２０時間処理し、ウェスタンブロット解析のために回収した。図６、７および８に示されるように、ＣＡＧ４４／１８のバンドの対立遺伝子による分離を使用したウェスタンブロット解析によって、３つ全てのＬＮＡギャップマー配列について、変異型ＨＴＴがタンパク質レベルで減少することが明らかになった。要約すると、相補的なＡＳＯを用いてＡ２特異的な多型（ｒｓ３６３１０７、ｒｓ３６２３１３ａｎｄｒｓ２５３０５９５）をターゲティングすることによって、Ａ２ハプロタイプを担持するＨＤ患者の遺伝的な代理物である細胞で、変異型ＨＴＴタンパク質をサイレンシングすることができる。
【０１３０】
実施例８：ＡＳＯは、ヒト細胞でＳｉｌｅｎｃｅＨＴＴ  Ａ３ａをサイレンシングする
我々は、変異型配列を指向するＡＳＯを使用して、選択的ＨＴＴサイレンシング標的としてのｒｓ１１３４０７８４７の潜在性を評価することを目指した。Ａ３ａ／Ｃハプロタイプ（ＧＭ０４７２４、ＣＡＧ長６７／１５）を担持するヒトＨＤリンパ芽球を、０．５、１、２および５μＭで配列＋Ｃ＊＋Ｔ＊＋Ｃ＊＋Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊＋Ｇ＊＋Ｇ＊＋Ｃ＊＋Ｃ（＊＝ホスホロチオエート連結、＋＝ＬＮＡ）（配列番号４７８）の４−９−４ロックド核酸（ＬＮＡ）／ホスホロチオエート骨格ギャップマーを用いて１２０時間処理し、ウェスタンブロット解析のために回収した。図９に示すように、対立遺伝子によるＣＡＧ６７／１５のバンドの分離を使用したウェスタンブロット解析によって、変異型ＨＴＴがタンパク質レベルで用量依存的に減少することが明らかになった。相補的なＡＳＯを用いてＡ３ａ特異的なｒｓ１１３４０７８４７をターゲティングすることによって、Ａ３ａハプロタイプを担持するＨＤ患者の遺伝的な代理物である細胞で、変異型ＨＴＴタンパク質のレベルを減少させることができる。
【０１３１】
考察
対立遺伝子特異的なＨＴＴサイレンシングを治療適用へ転換するには、転写されているどのＳＮＰがＨＤ患者集団の最も有用な標的であるかを明確にする必要がある。特異的な多型の標的の頻度が、臨床コホート間で異なることが知られる一方で、治療可能な患者の総数を最大にする二次および三次の標的については、不充分に記載されてきた。我々の研究は、多様な患者集団でＨＴＴ転写物中にわたる包括的なヘテロ接合性を初めて推定し、選択的なアンチセンス療法の開発のために最も優先度の高い特異的な対立遺伝子標的を特定することを提供する。我々は、ヨーロッパ人家系中の変異型ＨＴＴ−Ａ１、Ａ２、およびＡ３ａ−を選択的に抑制するのに適切な、遺伝子じゅうに広がる最も共通なハプロタイプを充分に記載し、これらのハプロタイプに特異的な全ての共通多型を特定している。４つの異なる患者集団では、これらの遺伝子じゅうに広がるハプロタイプは、最大割合のＨＤ患者の治療を実現する可能性がある、対立遺伝子特異的な標的のパネルを表す。我々は、我々は、Ａ１、Ａ２、およびＡ３ａのハプロタイプをターゲティングするわずか３つの遺伝子サイレンシング試薬が、ヨーロッパ人出身の全患者の８０％のための対立遺伝子特異的なＨＴＴサイレンシング療法をもたらす可能性があることを示している。Ａ１は、３つの規定された多型のうち１つを使用して、Ａ２は、５つの規定された多型のうち１つを使用して、サイレンシングされる可能性がある。対立遺伝子標的を開発のために１つのみ選ぶことができる場合、ｒｓ２２９８９６９によるＡハプログループのサイレンシングは、最大割合の患者で治療を提供する可能性がある。しかし、２つの標的を追加的に考えると、Ａ１標的およびＡ２標的の組み合わせは、本研究で検討した４つ全ての主要な集団の大多数の患者の治療を可能にする。３つの標的を考えると、遺伝子内多型に組換えがないことは、Ａ１、Ａ２、およびＡ３ａハプロタイプの多型を規定するよりも多くの割合の場合で、選択的なサイレンシングを可能にする。したがって、Ａ１およびＡ２ハプロタイプは、三次の優先的な候補であるｒｓ１１３４０７８４７を用いた場合、対立遺伝子特異的なＨＴＴサイレンシング試薬の前臨床評価のための優先的な標的のセットを表す。
【０１３２】
ＣＡＧリピートの伸長は、異なる白人集団の多様なハプロタイプ上で起こることが示されている［２２、２４］。ここで我々は、ヨーロッパ系統の４つの異なる集団にわたって一致している３つの遺伝子内ＨＴＴハプロタイプが、これらのグループにわたってＨＤ染色体のおよそ９０％を占めることを実証している。このことは、リピートＣＡＧ伸長の減少が起こるハプロタイプが、ヨーロッパ人出身の全ての個人で先祖代々のものであり、おそらくは他の血縁集団と共有されている可能性があることを示唆する。Ａ１ハプロタイプの専用マーカーとしてここで特定されたΔ２６４２コドン欠失（ｒｓ１４９１０９７６７）が、インド出自のＨＤ患者および対照に観察されているのに対し［３２］、Ａ１は、ＨＤの罹患率が劇的に低い南アフリカ系黒人および東アジア人のＨＤ染色体と対照染色体との両方で全く存在しない［２８、２９］。このことは、Ａ１ハプロタイプとＨＤとの関連が、ヨーロッパ人出身の南アジア、ヨーロッパ、およびアメリカ集団に跨がるインド−ヨーロッパ人系統の全ての集団で起こる可能性があることを示唆する。Ａ１、Ａ２、およびＡ３ａハプロタイプ上のＨＤの頻度については、これらの標的の世界的な治療上の影響を評価するために、東アジア、中央アジア、南アジア、およびアフリカ由来の患者集団内の詳細なハプロタイプ解析を必要とする。ヨーロッパ人出身の全ての患者集団の中で、Ａ１、Ａ２、およびＡ３ａ上の伸長ＣＡＧが高度に行き渡っていること、およびこれらのハプロタイプが他の出身の血縁集団に存在することは、これらのハプロタイプが、世界中の最大割合の患者で対立遺伝子特異的なサイレンシングを可能にする可能性があることを示唆する。
【０１３３】
要約すると、我々は、ＨＴＴが、ヨーロッパ人出身の集団内の遺伝子じゅうに広がるハプロタイプブロックによって規定されること、および特異的なＳＮＰのセットが、ＨＤ患者と対照との両方において、遺伝子じゅうに広がるハプロタイプを規定することを示している。我々の知る限り、これは、全ゲノム配列解析データを使用した、ＨＴＴ遺伝子を包含する密集したハプロタイプの最初のアノテーションである。我々は、ヨーロッパ人系統の４つの別個の集団内のＨＤ染色体の＞９０％を含む、３つの最も共通なＨＤハプロタイプに特異的な全ての多型を特定して妥当性を確認した。これらのハプロタイプを規定する多型は、対立遺伝子特異的なサイレンシング化合物を開発するのに最適な標的を構成する。本研究によって明らかにされた、ターゲティングすることが可能なＨＴＴハプロタイプは、その目的に向けた、および最大数のＨＤ患者の安全な遺伝子サイレンシング治療に向けた、臨床上のステップを表す。
【０１３４】
本発明の様々な実施形態が本明細書に開示されているとはいえ、当業者の共通の一般的な知識に従って、多数の適応および改変が、本発明の範囲内で為されてもよい。そのような改変には、実質的に同じ方法で同じ結果を実現するために、本発明の任意の態様に代えて公知の等価物を置換することを含む。数的範囲は、範囲を規定する数を含む。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書ではオープンエンドの用語として使用され、実質的には句「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と等価であるが、それに限定されず、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、対応の意味を有する。本明細書に使用される際に、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別段に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。そのため、例えば、「ａ  ｔｈｉｎｇ」を参照することは、１つを超えるそのようなｔｈｉｎｇを含む。本明細書で参照文献を引用することは、そのような参照文献が本発明の実施形態の先行技術であることを自認するものではない。本発明は、実質的に本明細書で上述したような、および実施例および図面を参照して、全ての実施形態および変形を含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１３５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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