(57)【要約】本発明は、ゲノムレベル及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基での、少量のヌクレオチド塩基の変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列等を識別及び定量化するための方法及びデバイスに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内の前記ヌクレオチド配列とは異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素を提供する段階；
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；
前記サンプル、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な前記１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び
（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記段階；
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和して第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中で前記二次伸長生成物を検出及び区別して、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
【請求項２】
サンプルにおいて、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素を提供する段階；
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階；
前記サンプル、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記サンプル中でデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な前記１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和し、ライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）５’部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’部分が、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの１つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするように構成されている、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記５’部分、前記標的特異的部分、前記３’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列の前記５’部分をその相補的３’部分にハイブリダイゼーションする段階；
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階；並びに
前記検出する段階に基づき、前記サンプル中のライゲーション産物配列を区別して、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
【請求項３】
前記混和することによりポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前、またはそれと同時に、前記サンプルを少なくとも第１のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成する段階
を更に含み、
前記第１のメチル化感受性酵素が、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中で核酸分子を切断し、これにより、前記検出する段階が、前記標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の検出を含み、前記核酸分子が元々１つ以上のメチル化残基を含有している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記１つ以上のメチル化残基の上流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記１つ以上のメチル化残基の下流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記混和することによりポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階の前に、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下において、前記制限酵素反応混合物を亜硫酸水素塩処理に供す段階
を更に含み、
前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記１つ以上のメチル化され切断されていない制限酵素切断部位を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記提供された一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された前記伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
メチル化感受性酵素認識配列内に非メチル化残基を含有する核酸分子を切断する１つ以上の第２のメチル化感受性酵素を提供する段階；及び
前記少なくとも１つの第２のメチル化感受性酵素を、前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物と混和して第２の制限酵素反応混合物を形成する段階であって、前記第２のメチル化感受性酵素が、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中に潜在的に存在する核酸分子を切断する、前記段階
を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの３’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む３’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離３’ＯＨ末端を遊離させる段階
を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化標的配列内のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する５’部分
を含むが、前記亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的配列内で、対応するヌクレオチド配列部分とミスマッチする１つ以上のヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’ヌクレアーゼ活性、３’ヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を欠く、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
非メチル化残基を含有する前記亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列の領域にハイブリダイゼーション可能な１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを提供する段階；及び
前記亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含む前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記供す段階の前に前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させる段階であって、前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、亜硫酸水素塩で処理した相補的な標的核酸配列にハイブリダイゼーションし、前記伸長処理の間に一次オリゴヌクレオチドプライマーの伸長を妨害する、前記接触させる段階
を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの３’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む３’部分を有し、
前記方法が、
前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離３’ＯＨ末端を遊離させる段階
を更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記切断可能なヌクレオチドが、１つ以上のＲＮＡ塩基を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする野生型核酸分子内のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する５’部分
を含むが、前記標的核酸分子内の対応するヌクレオチド配列部分に対してミスマッチする１つ以上のヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の配列ミスマッチが、前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端から２つのヌクレオチド塩基、及び／または前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’末端から３つのヌクレオチド塩基に位置する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’ヌクレアーゼ活性、３’ヌクレアーゼ活性、及び鎖置換活性を欠く、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を該サンプルにおいて識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：、
他のリボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させる段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、各プライマーが前記１つ以上の標的リボ核酸分子に相補的である、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
前記接触したサンプル、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写混合物を形成する段階；
前記逆転写混合物中で相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成する段階であって、各ｃＤＮＡ分子が、標的リボ核酸分子に相補的でありかつｄＵを含有するヌクレオチド配列を含む、前記生成する段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）前記ｃＤＮＡの前記標的リボ核酸分子配列相補鎖に隣接するｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ｃＤＮＡ分子を含有する前記逆転写混合物、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びポリメラーゼを混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより１種以上の異なる一次伸長生成物を形成する段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、
（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）５’標的配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的リボ核酸分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記提供する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成する段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２プローブが互いにライゲーションされ、前記リガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記段階；
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別することにより、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列により前記サンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる１つ以上のリボ核酸分子の存在を識別する段階。
【請求項１７】
ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を該サンプルにおいて識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
他のリボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させる段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、各プライマーが前記１つ以上の標的リボ核酸分子に相補的である、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階；
前記接触したサンプル、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写混合物を形成する段階；
前記逆転写混合物中で相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成する段階であって、各ｃＤＮＡ分子が、標的リボ核酸分子に相補的でありかつｄＵを含有するヌクレオチド配列を含む、前記生成する段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）前記ｃＤＮＡの前記標的リボ核酸分子配列相補鎖に隣接するｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ｃＤＮＡ分子を含有する前記逆転写混合物、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びポリメラーゼを混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより１種以上の異なる一次伸長生成物を形成する段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、
（ａ）５’部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’部分が、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの１つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的リボ核酸分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記提供する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成する段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２プローブが互いにライゲーションされ、前記リガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記５’部分、前記標的特異的部分、前記３’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記形成する段階；
前記ライゲーション産物配列の前記５’部分をその相補的３’部分にハイブリダイゼーションする段階；
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階；並びに
前記検出する段階に基づいて、前記サンプル中のライゲーション産物配列を区別して、前記サンプル中で、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列により前記サンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる１つ以上のリボ核酸分子の存在を識別する段階。
【請求項１８】
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させる段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）５’ステムループ部分、ブロック基、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｂ）前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列部分、及び５’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの前記内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、
（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第４のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記接触したサンプル、プライマーセットの前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記サンプル中に存在する場合、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列にハイブリダイゼーションし、前記逆転写酵素が、前記ハイブリダイゼーションした第１のオリゴヌクレオチドプライマーの前記３’末端を伸長して、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する、前記段階；
プライマーセットの前記１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記相補鎖を含む前記伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの前記領域にハイブリダイゼーションし、伸長して前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、前記逆転写反応混合物を、前記プライマーセットの前記第２、第３、及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーと混和し、ポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより複数の一次伸長生成物を形成する段階；
前記複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）５’標的配列特異的部分、一次伸長生成物に相補的な部分、及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記段階；
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別することにより、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を識別する段階。
【請求項１９】
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させる段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）５’ステムループ部分、ブロック基、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｂ）前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列部分、及び５’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの前記内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、
（ｄ）前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第４のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記接触したサンプル、プライマーセットの前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記サンプル中に存在する場合、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列にハイブリダイゼーションし、前記逆転写酵素は前記ハイブリダイゼーションした第１のオリゴヌクレオチドプライマーの前記３’末端を伸長して、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する、前記段階；
プライマーセットの前記１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記相補鎖を含む前記伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの前記領域にハイブリダイゼーションし、伸長して前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、前記逆転写反応混合物を、前記プライマーセットの前記第２、第３、及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより複数の一次伸長生成物を形成する段階；
前記複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）５’部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’部分が、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの１つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記５’部分、前記標的特異的部分、前記３’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列の前記５’部分を、その相補的３’部分にハイブリダイゼーションする段階；
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階；並びに
前記検出する段階に基づいて前記サンプル中で前記ライゲーション産物配列を区別して、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の存在を識別する段階。
【請求項２０】
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
他のｍｉＲＮＡ分子とは配列の１つ以上の塩基の違いが潜在的に異なる１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させる段階；
前記接触したサンプルを、リガーゼと、並びに５’リン酸基、５’ステムループ部分、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと混和してライゲーション反応物を形成する段階；
前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を、その３’末端にて、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’リン酸基にライゲーションして、前記サンプル中に存在する場合、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブに付加した前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸分子を生成する段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列、及び５’プライマー特異的部分を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに
（ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記キメラ核酸分子、前記１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記サンプル中に存在する場合、プライマーセットの前記１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記キメラ核酸分子の前記内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、その３’末端を伸長して前記キメラ核酸分子の相補鎖を生成する、前記段階；
前記逆転写反応混合物をプライマーセットの前記第１及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）５’標的配列特異的部分、一次伸長生成物に相補的な部分、及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記段階；
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記ライゲーション産物配列及び前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解に好適な条件、並びに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別することにより、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を識別する段階。
【請求項２１】
サンプルにおいて、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
他のｍｉＲＮＡ分子とは配列の１つ以上の塩基の違いが潜在的に異なる１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させる段階；
前記接触したサンプルを、リガーゼと、並びに５’リン酸基、５’ステムループ部分、前記ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと混和してライゲーション反応物を形成する段階；
前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を、その３’末端にて、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’リン酸基にライゲーションして、前記サンプル中に存在する場合、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブに付加した前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸分子を生成する段階；
１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、
（ａ）前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の前記５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列、及び５’プライマー特異的部分を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｂ）前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに
（ｃ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記キメラ核酸分子、前記１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写反応混合物を形成する段階であって、前記サンプル中に存在する場合、プライマーセットの前記１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記キメラ核酸分子の前記内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、その３’末端を伸長して前記キメラ核酸分子の相補鎖を生成する、前記段階；
前記逆転写反応混合物をプライマーセットの前記第１及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する段階；
前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の前記相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
前記一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成する段階であって、各オリゴヌクレオチドプローブセットが、
（ａ）５’部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに
（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、前記プローブセットの前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’部分が、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’部分の一部に相補的であり、前記プローブセットの１つのプローブが検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な方法で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される、前記段階；
前記ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供す段階であって、これにより、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、前記ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列が、前記５’部分、前記標的特異的部分、前記３’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む、前記段階；
前記ライゲーション産物配列の前記５’部分を、その相補的３’部分にハイブリダイゼーションする段階；
前記ハイブリダイゼーションの際に生成される、前記検出可能なシグナル生成部位からのシグナルを検出する段階；並びに
前記検出する段階に基づいて前記サンプル中で前記ライゲーション産物配列を区別して、前記サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の存在を識別する段階。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、ｕｎｉｔａｑ検出部分を更に含むことにより、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、前記ｕｎｉｔａｑ検出部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成し、
以下の段階：
１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ｕｎｉｔａｑ検出プローブが相補性ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイゼーションし、かつ前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階；
前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；及び
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に前記供している間に、前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上の相補性ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理間に前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブから切断され、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、請求項１、１６、１８、または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを提供する段階であって、各オリゴヌクレオチド検出プローブが、ライゲーション産物の接合部部分またはその相補鎖にハイブリダイゼーションし、前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階；
前記１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；並びに
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に前記供している間に、前記１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補鎖上で相補性検出部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理の間に前記１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、請求項１、１６、１８、または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ライゲーションの前または後に、固体支持体上で各一次伸長生成物の少なくとも１つの鎖を固定化する段階であって、前記ライゲーション産物配列が前記固定化した一次伸長生成物にハイブリダイゼーションする、前記固定化する段階；並びに
前記ライゲーションの後で、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブ及び非標的特異的ライゲーション産物を前記サンプルから取り除く段階；並びに
前記ハイブリダイゼーションの前に、前記固定化した一次伸長生成物から前記ライゲーション産物配列を変性させる段階
を更に含む、請求項２、１７、１９、または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’部分が、前記３’末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションに不適となるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含み、
以下の段階：
前記プローブが、前記一次伸長生成物の相補性標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする際に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記ライゲーションの前に前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’ＯＨを遊離させる段階
を更に含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、その５’末端に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’末端とオーバーラップする同一のヌクレオチドを有し、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列上の隣接位置における、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによる接合部の形成の際に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブとの前記接合部にてフラップを形成し、
以下の段階：
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップする同一のヌクレオチドを、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断することにより、前記ライゲーションの前に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’末端におけるリン酸基を遊離させる段階
を更に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的部分を有する第３のオリゴヌクレオチドプローブを更に含み、プローブセットの前記第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブが、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接し、これらの間の接合部とハイブリダイゼーションするように構成されており、前記第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブの間でのライゲーションにより、プローブセットの前記第１、第２、及び第３のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成することを可能にする、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
サンプルにおいて、前記サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供する段階；
前記サンプルを、前記サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させる段階；
前記サンプルを１種以上のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成する段階であって、前記１つ以上の前記メチル化感受性酵素が、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含有する前記サンプル中の核酸分子を切断する、前記形成する段階；
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、
（ａ）前記１つ以上のメチル化残基の上流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、
（ｂ）前記１つ以上のメチル化残基の下流にある前記標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー
を含む、前記提供する段階；
前記制限酵素反応混合物を、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する段階；
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、前記一次伸長生成物にハイブリダイゼーション可能な第１及び第２のｎｅｓｔｅｄオリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記提供する段階；
前記一次伸長生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和して二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する段階；
前記二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する段階；並びに
前記サンプル中の前記二次伸長生成物を検出及び区別して、前記サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する段階。
【請求項２９】
１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを提供する段階であって、各オリゴヌクレオチド検出プローブが、前記一次伸長生成物またはその相補鎖内の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、前記検出プローブが、互いに離間した消光剤分子及び検出可能な標識を含む、前記提供する段階；
前記１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物に加える段階；並びに
前記１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを、前記供している間に、前記一次伸長生成物の相補部分にハイブリダイゼーションする段階であって、これにより、前記消光剤分子及び検出可能な標識が、前記二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物の前記１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルの前記伸長処理の間に、前記１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブから切断され、これにより、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を含む、前記ハイブリダイゼーションする段階
を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマーまたは複数のプライマーの３’末端がポリメラーゼ伸長に好適でないように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む３’部分を有し、
以下の段階：
前記一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物の前記１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルの前記ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーの遊離３’ＯＨ端を遊離させる段階
を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの前記一次オリゴヌクレオチドプライマーが、長さが約６〜２０塩基の、同一または実質的に同一な５’ヌクレオチド配列部分を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルが、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞血中循環核酸、無細胞血中循環腫瘍核酸、妊娠した女性の無細胞血中循環胎児核酸、血中循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検、及びエクソソームからなる群から選択される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の標的ヌクレオチド配列は、ゲノムレベル及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基での、１つ以上のヌクレオチド塩基の変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列を含む少量の核酸分子である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
１つ以上のヌクレオチド塩基の、ゲノムレベル及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基での変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列を有する前記少量の核酸分子を、前記少量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、前記１つ以上のヌクレオチド塩基の、ゲノムレベル及び／もしくはメチル化ヌクレオチド塩基での変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、または他の再配列を有しない、前記サンプル中の多量の核酸分子から識別して区別する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上の少量の標的ヌクレオチド配列のコピー数を、前記サンプル中の前記多量の核酸分子のコピー数と比較して定量化する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つ以上の標的ヌクレオチド配列を定量化または計算する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
同一の後の工程を受ける、前記サンプルまたは他のサンプル中の他のヌクレオチド配列と比較して、前記１つ以上の標的ヌクレオチド配列を定量化または計算する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
１つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対的なコピー数を定量化または計算する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記識別する段階に基づいて、病状を診断または予測する段階
を更に含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記識別する段階に基づいて、遺伝子型または病気の素因を区別する段階
を更に含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
マイクロタイタープレートと組み合わせて使用し、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに液体を同時に加えるためのデバイスであって、前記マイクロタイタープレートが、対向した上部表面及び底部表面を有し、前記上部表面が前記ウェルの中に至る開口部を有し、前記底部表面が前記ウェルの閉鎖端を画定し、
前記デバイスが、
第１及び第２の境界により画定される第１層であって、計量チャンバが前記第１層の前記第１及び第２の境界の間に延在して互いに流体連通し、前記第１層は作動可能な位置で、前記マイクロタイタープレートに隣接して適合するように構成され、前記第１層の前記第１の境界は、前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に最も近く、前記計量チャンバのそれぞれは、マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと流体連通しており、前記第１層は、１つ以上の前記計量チャンバと流体連通した充填チャンバを更に含む、前記第１層、並びに
第１及び第２の境界により画定される第２層であって、充填ポートが前記第２層の前記第１及び第２の境界の間に延在し、前記第２層は作動可能な位置で、前記第１層に隣接して適合するように構成され、前記第２層の前記第１の境界は前記第１層の前記第２の境界に最も近く、前記充填ポートは前記充填チャンバと連動している、前記第２層
を含み、前記第１層、前記第２層、及び前記マイクロタイタープレートが、互いに作動可能な位置で配置される場合、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバを通過して、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに入る、前記デバイス。
【請求項４２】
前記第２層が、
前記第２層の前記第１及び第２の境界の間に延在する通気道であって、前記計量チャンバと連動している、前記通気道
を含む、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４３】
第１及び第２の境界により画定される中間層であって、中間層流路が前記中間層の前記第１及び第２の境界の間に延在し、前記中間層は、前記マイクロタイタープレートと前記第１層の間の作動可能な位置で適合するように構成され、前記中間層の前記第１の境界は前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に隣接し、前記中間層の前記第２の境界は前記第１の層の前記第１の境界に隣接し、前記中間層流路の１つは、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと連動している、前記中間層
を更に含み、
前記第１層、前記第２層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過して前記マイクロタイタープレートのウェルに入る、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４４】
前記中間層流路が疎水性壁を含む、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項４５】
前記中間層流路がバーストバルブ（ｂｕｒｓｔ  ｖａｌｖｅ）である、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項４６】
前記第１層が、前記充填チャンバと流体連通しているオーバーフローチャンバを更に含む、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４７】
前記中間層が、前記オーバーフローチャンバを前記充填チャンバと接続するオーバーフロー流路を更に含む、請求項４６に記載のデバイス。
【請求項４８】
前記第２層が、
前記第２層の前記第１及び第２の境界の間に延在するオーバーフロー通気道であって、前記オーバーフローチャンバと連動している、前記オーバーフロー通気道
を有する、請求項４６に記載のデバイス。
【請求項４９】
第１及び第２の境界を有する第３層であって、充填ポートコネクタが前記第３層の前記第１及び第２の境界の間に延在し、前記第３層は、前記第１及び第２層の間で作動可能な位置で適合するように構成され、前記第３層の前記第１の境界は前記第１層の前記第２の境界に隣接し、前記充填ポートコネクタは前記充填ポートと連動している、前記第３層
を更に含み、
前記第１層、前記第２層、前記第３層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で互いに配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填ポートコネクタ、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過し、前記マイクロタイタープレートの前記ウェルに入る、請求項４３に記載のデバイス。
【請求項５０】
毛管現象により前記計量チャンバが満たされることを可能にするよう構成された、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項５１】
機械的な力により前記計量チャンバが満たされることを可能にするよう構成された、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項５２】
前記第１層が、前記計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第２層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの１つと流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記一対の離間した充填ポートの一方が、前記一対の離間した充填チャンバの一方及び前記計量チャンバの半分に液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の充填チャンバのもう一方及び前記計量チャンバの他の半分に液体を提供する、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項５３】
前記第１層が、前記計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第２層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの一方と流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記一対の離間した充填ポートの１つが、前記一対の充填チャンバの一方及び前記計量チャンバの全てに液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の充填チャンバのもう一方及び前記計量チャンバの全てに液体を提供する、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項５４】
前記マイクロタイタープレートの２つ以上の横列及び縦列を液体で満たすように構成される、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項５５】
前記第１層が、
２つ以上の横列に前記計量チャンバを有する第１領域、並びに、
２つ以上の縦列に前記計量チャンバを有する第２領域であって、前記第１及び第２領域が互いに離間している、前記第２領域
を有する、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項５６】
前記層が一体的であり前記デバイスをモノリシック構造とする、請求項４１〜５５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５７】
対向した上部表面及び底部表面を有するマイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルであって、前記上部表面は前記ウェルの中に至る開口部を有し、前記底部表面は前記ウェルの閉鎖端を画定する、前記ウェル
に液体を加える方法であって、以下の段階を含む、前記方法：
第１及び第２の境界を有する第１層であって、計量チャンバが前記第１層の前記第１及び第２の境界の間に延在し、互いに流体連通しており、前記第１層は作動可能な位置で、前記マイクロタイタープレートに隣接して適合するように構成され、前記第１層の前記第１の境界は、前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に最も隣接し、前記計量チャンバの１つは、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと流体連通しており、前記第１層は、１つ以上の前記計量チャンバと流体連通した充填チャンバを更に含む、前記第１層
第１及び第２の境界を有する第２層であって、充填ポートが前記第２層の前記第１及び第２の境界の間に延在し、前記第２層は作動可能な位置で、前記第１層に隣接して適合するように構成され、前記第２層の前記第１の境界は、前記第１層の前記第２の境界に最も近く、前記充填ポートは前記充填チャンバと連動している、前記第２層
を含むデバイスを提供する段階であって、
前記第１層、前記第２層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバを通過して、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに入る、前記段階；
前記デバイスを液体で満たす段階；並びに
前記デバイス内の液体を、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルへ放出する段階。
【請求項５８】
前記デバイスが、
第１及び第２の境界を有する中間層であって、中間層流路が前記中間層の前記第１及び第２の境界の間に延在し、前記中間層は、作動可能な位置で前記マイクロタイタープレートと前記第１層の間に適合するように構成され、前記中間層の前記第１の境界は前記マイクロタイタープレートの前記上部表面に隣接し、前記中間層の前記第２の境界は前記第１の層の前記第１の境界に隣接し、前記中間層流路の１つは、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと連動している、前記中間層
を更に含み、
前記第１層、前記第２層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合に、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過して前記マイクロタイタープレートに入る、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記中間層流路が疎水性壁を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記中間層流路がバーストバルブ（ｂｕｒｓｔ  ｖａｌｖｅ）である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記デバイスが、
第１及び第２の境界を有する第３層であって、充填ポートコネクタが前記第３層の前記第１及び第２の境界の間に延在し、前記第３層は、前記第１及び第２層の間で作動可能な位置で適合するように構成され、前記第３層の前記第１の境界は前記第２層の前記第２の境界に隣接し、前記充填ポートコネクタは前記充填ポートと連動する、前記第３層
を更に含み、
前記第１層、前記第２層、前記第３層、前記中間層、及び前記マイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置され、前記充填ポートを通して前記デバイスに入る液体が、前記充填ポートコネクタ、前記充填チャンバ、前記計量チャンバ、前記中間層流路を通過し、前記マイクロタイタープレートの前記ウェルに入る、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記満たす段階が毛管現象により行われる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記放出する段階が機械的な力により行われる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１層が、前記計量チャンバの反対側に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第２層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの１つと流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記満たす段階の間に、前記一対の離間した充填ポートの一方が、前記一対の離間した充填チャンバの一方及び前記計量チャンバの半分に液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の離間した充填チャンバのもう一方及び前記計量チャンバの他の半分に液体を提供する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１層が、前記計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、前記第２層が、それぞれが前記一対の離間した充填チャンバの一方と流体連通した一対の離間した充填ポートを備え、これにより、前記満たす段階の間に、前記一対の離間した充填ポートの一方が、前記一対の離間した充填チャンバの一方、及び前記計量チャンバの全てに液体を提供しながら、前記一対の離間した充填ポートのもう一方が、前記一対の離間した充填チャンバのもう一方、及び前記計量チャンバの全てに液体を提供する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
前記デバイスが、前記満たす段階の間に、前記マイクロタイタープレートの２つ以上の横列及び縦列を液体で満たすように構成される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１層が、
２つ以上の横列に前記計量チャンバを有する第１領域、並びに、
２つ以上の縦列に前記計量チャンバを有する第２領域であって、前記第１及び第２領域が互いに離間している、前記第２領域
を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
前記層が一体的であり前記デバイスをモノリシック構造とする、請求項５７〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願番号第６２／０６１，３７６号（２０１４年１０月８日出願）、及び米国特許仮出願番号第６２／１０３，８９４号（２０１５年１月１５日出願）の利益を主張し、これら全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、キャリーオーバーを防止するヌクレアーゼ、ライゲーション、及びポリメラーゼ反応の組み合わせを用いた、核酸配列、発現、スプライス変異体、転座、コピー数、及び／またはメチル化変化を識別及び定量化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血液は酸素、栄養素、及び生理学的シグナルを体内の全ての細胞に運搬すると同時に、外の病原体に対する免疫及び防御も提供する。しかし、血液が栄養を拡散するという同じ能力により、病気の伝播もまた可能となり、病気としては肝臓に転移する癌細胞、毛管を破壊するエボラウイルス、筋肉組織を溶かすストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、または、感染症の除去を目的とするＣＤ４陽性細胞内での検出を回避するＨＩＶがある。
【０００４】
病原体及び癌が同様に血液を介して拡散するという普遍的な性質はまた、識別及び早期発見の機会を生み出し、医師がよりよく治療を行い、患者のケアを管理することを可能にする。初期の、逆転写ＰＣＲアッセイによる国家の血液供給保護から、薬剤耐性変異体の配列決定、ウイルス量のＲＴ−ＰＣＲ定量化による、時間の経過における治療効果の測定に至るまで、ＡＩＤＳ治療の進化は、核酸診断の進歩と密に関係していた。現在まで、感染者は治療されていないが、高度な診断ツールが治療、疫学的及び政治的決定を先導し、この世界的な流行病を食い止めている。
【０００５】
癌は、先進国での主な死因であり、発展途上国での２番目に主な死因である。癌は今や、全世界での死亡率の最も大きな原因となってきており、２０１２年には、癌で推定８２０万人が亡くなっている。全世界での癌の事例は７５％増え、次の２０年間で２５００万人近くに達すると予測されている。世界保健機関による最近の報告では、「癌に対する世界的な闘いは、治療だけでは打ち勝つことができない。癌の危機を防止するために、効果的な予防手段が早急に必要とされる」と結論付けている。血液中で初期の癌を検出することは、効果的な予防の最善の手段である。より迅速で良好な治療により、命は救われ癌治療のコスト削減が可能になるだろう。
【０００６】
癌患者の血漿または血清は、異常な生理学的プロセスを受ける癌細胞から放出される核酸を含有する。これらの核酸は、診断における実用性が既に実証されている（Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｂａｒｄｅｌｌｉ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３２：５７９−５８６（２０１４）（非特許文献1）；Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ６：２２４（２０１４）（非特許文献2）；Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０：５４８−５５４（２０１４）（非特許文献3）；Ｔｈｉｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０：４３０−４３５（２０１４）（非特許文献4））。更なる核酸源は血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）内にあるが、局所腫瘍の初期段階及び重要な部分は、１ｍＬあたりＣＴＣをほとんどないし全く放出しない。通常の血漿または血清は、通常の生理学的プロセス（即ちエクソソーム分泌、アポトーシス）を受ける通常の細胞から放出される核酸を含有する。ストレス、炎症、感染、または外傷といった条件下において、核酸が更に放出され得る。
【０００７】
信頼のおける診断及びスクリーニングテストを開発する課題は、病気（例えば初期の癌）を示す腫瘍から出てくるこれらのマーカーと、通常の組織から出てくる（例えば、偽陽性シグナルをもたらす）同一のマーカーを識別することである。アッセイの特異性及び感度により、試験するマーカーの数と、試験のコストのバランスを取る必要性もまた、存在する。癌ゲノムアトラスコンソーシアム（ＴＣＧＡ）による、数千の腫瘍の総合的な分子プロファイリング（ｍＲＮＡ、メチル化、コピー数、ｍｉＲＮＡ、変異）により、結腸腫瘍は、乳がん、前立腺がん、または他の上皮癌とは互いに異なることが明らかとなった（ＴＣＧＡ「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ４８７：３３０−３３７（２０１４）」（非特許文献5））。更に、これらの腫瘍が共通して共有するこれらのいくつかのマーカー（例えばＫＲＡＳ変異）もまた、複数の癌タイプに存在し、起源となる組織を正確に突き止める能力を妨げる。初期の癌を検出するために、核酸アッセイがスクリーニングツールとして第１の役割を果たさなければならず、これには、二次的な診断追跡調査（例えば結腸直腸癌の結腸鏡検査法）を利用できることが必要となる。
【０００８】
非常に少量の初期細胞（すなわち、ＣＴＣ）に由来するか、または癌のシグナルが血液中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）に由来しており正常細胞に由来する過剰の核酸によって希釈される場合、または試料処理中に正常血液細胞から不注意に放出される場合、のいずれかにおいて、変異、プロモーターメチル化、もしくはＤＮＡまたはＲＮＡコピー数を確実に定量化する必要性が、生物学的問題をもたらしている（Ｍａｔｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １５：４４８（２０１４）（非特許文献6））。
【０００９】
同様に、核酸ベースの技術を使用して、血液中で感染症を直接検出する場合に、希少な標的を同定するという類似の問題に遭遇する。手短に言えば、病原体が１以下のコロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬで存在し得る、かつ／または、病原性もしくは薬剤耐性に関与する多くの潜在的な病原体及び配列変異が存在するかのいずれかである。これらの問題は癌で例示されるが、解決策は感染症に平等に適用可能であることが認識されている。
【００１０】
連続した診断ニーズには、連続した診断試験が必要である
癌における現在の分子診断の努力の大多数は、（ｉ）予想及び予言的ゲノム解析、例えばＢｒＣＡ１、ＢｒＣＡ２等の癌疾病素因遺伝子における遺伝的な変異の識別（Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６２：６７６−６８９（１９９８）（非特許文献7））、（ｉｉ）個別化した治療、例えば個別症状に応じた薬を案内するＥＧＦＲ遺伝子における変異（Ｓｅｑｕｉｓｔ  ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ，５９：４２９−４４２（２００８）（非特許文献8）、及び（ｉｉｉ）再発の監視、例えば薬剤治療への耐性が進行する患者において現れるＫＲＡＳ変異の検出（Ｈｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １５：４５３（２０１４）（非特許文献9）；  Ａｍａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：１６２６−１６３４（２００８）（非特許文献10））に集中している。しかし、この方法は、連続した癌分子診断における主要な機会：（ｉ）家族歴を持つ患者の、より頻繁なスクリーニング、（ｉｉ）初期の病気を検出するためのスクリーニング、及び（ｉｉｉ）治療効果の監視を逃している。これら３つの満たされていないニーズに対処するために、ウイルス量に類似した、「癌マーカー量」と称される血液ベースの検出のための新規の測定法が、本明細書で提示される。
【００１１】
ＤＮＡ塩基配列決定法は、病気に関連する全ての核酸の変化を区別する究極的な能力を提供する。しかし、本プロセスには依然として、複数の最前線のサンプル及び鋳型調製が必要であり、必ずしも費用対効果が高いとは限らない。ＤＮＡマイクロアレイ法は、ＳＮＰまたは異なるＲＮＡ発現レベル等の複数の配列変異体についての実質的な情報を提供することができ、配列決定法よりもコストがかからない。しかし、マイクロアレイ法は非常に定量的な結果を得るのにさほど適しておらず、また、数が少ない変異の検出にも適していない。他にはＴａｑＭａｎ（商標）反応があり、これは既知の遺伝子のリアルタイム定量化を行うが、この反応は複数の配列変異体、または数の少ない変異の区別にはさほど適していない。
【００１２】
満たされていない診断ニーズを、適切な診断試験、即ち、高い感度（即ち偽陰性が低い）と高い特異性（すなわち偽陽性が低い）の両方を低コストで達成するという多岐にわたる目標を組み合わせた試験でマッチさせるのが重要である。例えば、腫瘍生検からのＥＧＦＲエクソンの直接配列決定により、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を決定することは、薬剤応答が既に分類されている、既知の１８０種類を超える変異についてのＴａｑＭａｎ（商標）プローブを設計することよりも著しく正確かつ費用対効果が高い（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２３：１４３４−１４４５（２０１３）（非特許文献11））。点変異を検出するための最も感度の高い技術であるＢＥＡＭｉｎｇ（Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：８８１７−８８２２（２００３）（非特許文献12））は、変異を探すための先行知識に依存し、そのため、早期発見ではなく病気の再発の監視に最も適している。同様に、ＣＭＬ患者をグリベック（Ｊａｂｂｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １１２：２１１２−２１１８（２００８）（非特許文献13））で治療する際に、Ｂｃｒ−Ａｂｌ転座の血中レベルを監視するために、簡便な定量的逆転写ＰＣＲアッセイが、血液１ｍＬ中の全ゲノムＤＮＡの配列決定よりもはるかに好ましい（９００万個の細胞×３ＧＢ＝２７００Ｇｂの生データ）。
【００１３】
ＮＳＣＬＣ患者から単離した、それぞれ２．１Ｇｂの無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の配列決定を用いて、１２５ｋｂの標的ＤＮＡにおいて１０，０００倍のカバー率をもたらした（Ｋａｎｄｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０２：３３３−３３９（２０１３）（非特許文献14））。本アプローチは一致した腫瘍に存在する変異を正しく識別したが、ステージ１の腫瘍は５０％しかカバーされなかった。本アプローチは、サンプルの平均が５〜２０個の変異／ＭｂであるＮＳＣＬＣにとって有望であるが、１Ｍｂあたり１ないし２個未満の変異が平均となる乳がん及び卵巣がんの他の癌にとっては費用対効果が高くない。非常に正確に標的化したディープシークエンシングに必要な、現在最前線のライゲーション、増幅、及び／または捕捉工程は、依然としてマルチプレックスＰＣＲ−ＴａｑＭａｎ（商標）またはＰＣＲ−ＬＤＲアッセイよりも一層複雑である。
【００１４】
腫瘍の不均質性、腫瘍クラスター、及び個々のマーカーあたりで３％〜１０％の範囲の生物学的／技術的偽陽性を考慮に入れた、６００個以上の結腸直腸癌サンプルの総合的なデータ分析は、結腸直腸癌の最適の早期発見検査には、試験した２４個のマーカーのうち、少なくとも５ないし６個の陽性マーカーが必要であることを示した（Ｂａｃｏｌｏｄ  ｅｔ  ａｌ，．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：７２３−７２７（２００９）（非特許文献15）；Ｔｓａｆｒｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：２１２９−２１３７（２００６）（非特許文献16），Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４５：１１１３−１１２０（２０１３）（非特許文献17）；Ｎａｖｉｎ  Ｎ．Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １５：４５２（２０１４）（非特許文献18）；Ｈｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １５：４５３（２０１４）（非特許文献9））；Ｅｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １５：ｅ２３４−２４２（２０１４）（非特許文献19））。更に、マーカーの分布は異なる腫瘍クレードでバイアスがかかる。例えば、いくつかの腫瘍は非常にメチル化されている一方で、他はほとんどメチル化されておらず、隣接組織の、年齢に関係するメチル化と区別することができない。したがって、３〜５セットの変異、メチル化、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、コピーの種類、選択的スプライシング、または転座マーカーの組み合わせを使用した多重的なアプローチが、全ての異なる腫瘍クレードの十分なカバー率を得るために必要である。トリソミーの非侵襲的出生前スクリーニングに類似して、ｃｆＤＮＡの無作為断片における配列決定またはライゲーション検出の実施に基づいた（Ｂｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．４２（１）：１５−３３（２０１３）（非特許文献20）；Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：２０４５８−２０４６３（２００８）（非特許文献21）；Ｊｕｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ．３６（４）（２０１４）（非特許文献22））癌検査においてスコアリングされる実際のマーカーは、血漿中のこれらの陽性マーカーの正確な定量化には副次的なものである。
【００１５】
癌診断試験の開発における技術的課題
非常に希少な、または量の少ない変異配列を発見することを目的とする診断試験は、（ｉ）野生型標的の複製におけるポリメラーゼエラー、（ｉｉ）ＤＮＡ塩基配列決定のエラー、（ｉｉｉ）野生型標的でのミスライゲーション、（ｉｉｉ）標的に依存しないＰＣＲ産物、及び、（ｉｖ）以前の陽性サンプルから生じる、ＰＣＲ産物のキャリーオーバー汚染から生じる潜在的な偽陽性シグナルに直面する。癌をスクリーニングする時の、陽性試験結果の重要な臨床的意義は、かかる試験では、事実上偽陽性を排除することが可能なあらゆる手段を用いることを必要とされる。
【００１６】
核酸検出の着想の中心は、通常の細胞からの同一または非常に似たマーカーとは違う、所望の癌特異的マーカーを選択的増幅または精製することである。これらのアプローチとしては、（ｉ）直交増幅（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び検出のための複数のプライマー結合領域、（ｉｉ）ＣＴＣまたはエクソソームの親和性選択、並びに（ｉｉｉ）サンプルの空間的希釈（ｓｐａｔｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）が挙げられる。
【００１７】
感度及び特異性を確保するために４つのプライマー結合領域を用いるＰＣＲ−ＬＤＲの成功が、以前に実証されている。一対の、あるいはタンデム対のＰＣＲプライマー、続いて、検出用の直交入れ子式（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｎｅｓｔｅｄ）ＬＤＲプライマー対を使用して所望の領域を増幅する。ＰＣＲ−ＬＤＲを使用する利点の１つは、複数の断片のバランスの取れたＰＣＲ増幅を実施して、コピー数の少ない標的を濃縮し、次いで、定量的ＬＤＲを使用して癌特異的変異を直接識別することができるという能力である。Ｂｉｏｆｉｒｅ／ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘは、「フィルムアレイ」と呼ばれる同様の技術を開発している。この技術では、初期のマルチプレックスＰＣＲ反応生成物が個々のウェルに分配され、続いてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｙｅ検出でｎｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲを実施する。
【００１８】
抗体またはアプタマー捕捉を用いたＣＴＣの親和性精製が実証されている（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：８６３３−８６４１（２００８）（非特許文献23）；Ｄｈａｒｍａｓｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３０：３２８９−３３００（２００９）（非特許文献24）；Ｓｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ２１：１９３２−１９４２（２００６）（非特許文献25））。エクソソームのペプチドアフィニティーキャプチャーが、文献にて報告されている。血液からこれらの腫瘍特異的フラクションを濃縮することにより、コピー数の定量化、並びにスクリーニング及び検証アッセイの簡素化が可能になる。
【００１９】
最後のアプローチである、サンプルの空間的希釈は、デジタルＰＣＲ、及びＢＥＡＭｉｎｇ法として知られるデジタルＰＣＲの近似法で用いられる（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９６（１６）：９２３６−４１（１９９９）（非特許文献26）；Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：８８１７−８８２２（２００３）（非特許文献12））。デジタルＰＣＲの合理性は、サンプルが、野生型ＤＮＡの１，０００〜１０，０００倍過剰で既知の変異を含有しているごく僅かのターゲット分子を含む場合に、酵素識別力の制限を克服することである。インプットＤＮＡを２０，０００個以上の液滴またはビーズに希釈して、液滴１つあたりに１分子未満の標的を分配することにより、ＤＮＡはＰＣＲにより増幅されて、次いで、プローブハイブリダイゼーションまたはＴａｑＭａｎ（商標）により検出され、本質的に０／１のデジタルスコアが与えられ得る。本アプローチは現在、血漿中で点変異を発見するのに最も感度が高いが、スコアリングされる変異についての先行知識、また各変異について個々のデジタル希釈が必要であるため、サンプル全体が枯渇して、いくつかの変異のみがスコアリングされる。
【００２０】
リアルタイムＰＣＲ及びマイクロ流体器具
多数のＰＣＲ分析／マイクロデバイスが、病原体、並びに疾患に関係する転座及び変異の迅速な検出のために設計されている。それぞれのアッセイ／ハードウェアの組み合わせは特定の強みを有するが、癌の検出のために必要な多次元的かつ多重化されたマーカーの現実的な問題と組み合わせた際に、マイクロ流体を用いるＰＣＲ−ＬＤＲの柔軟性は、ある種の利点をもたらす。
【００２１】
器具、アッセイ設計、及びマイクロ流体構造がシームレスに統合される必要がある。いくつかのＰＣＲ器具では、リアルタイム蛍光またはエンドポイント蛍光を用い、異なる温度でチャンバ、ウェル、または液滴をサイクルにかけることにより、初期の鋳型分子を定量化する。更に他の器具には、リアルタイムＰＣＲ検出のためのアドレス指定可能なマイクロ流体プレートが含まれる。しかし、機器及び消耗品の両方が高コストであるため、これらの機械が臨床用途で幅広く使用されることが制限されてきた。
【００２２】
連続フローＰＣＲと呼ばれる異なる構造では、放射パターンで適切に配置された流路を通って反応混合物が移動し、固定温度の発熱体の上を流れる。この構造により、全体の増幅反応が数分で完了することが可能となり、この構造は、毛管分離及び読出しに理想的である。リガーゼ検出反応に関して、ＬＤＲ−ＦＲＥＴまたは電子検出を利用することにより読出しを達成してもよい。ＬＤＲ−ＦＲＥＴにおいて、一方のプライマーはドナーを有し、他方はアクセプター基を有し、ライゲーションの後、これらがヘアピンを形成する。これにより、単一のライゲーション回数を数え、インプットＤＮＡのコピー数の非常に定量的な読出しを得ることが可能になる。あるいは、各プライマーに金ナノ粒子を付加することにより、ライゲーション産物が２個のナノ粒子を含有し、電子の読出しを用いてこれらを区別してもよい。
【００２３】
様々な程度の自動化を考慮する際に、本明細書で記載される本アプローチは、「モジュラリティ」と「スケーラビリティ」の原理により案内される。まず、本プロセスは、個別の機器で最初に最適化され得るモジュラー工程に分離されなければならない。例えば、デバイスは、血漿ｃｆＤＮＡからのＤＮＡ、及びエクソソームからのＲＮＡを精製するための第１のモジュール、種々の標的の多重化逆転写、及び／または制限複製のための第２のモジュール、並びに、ライゲーション産物を生成及び検出するための第３のモジュールからなってもよい。かかるモジュール構造は、技術開発に追随する、改善されたモジュールへの交換を可能にする。作業のためのモジュラリティアプローチに関して、あるモジュールからの生成物が次のモジュールに、漏出なく、かつクロスオーバー汚染の心配なくシームレスに移動可能であることが重要である。
【００２４】
２番目に、モジュール設計は、低コストで大量の、拡張性のある製造に対応できなければならない。製造コスト、及び、プライマー／試薬／サンプルがデバイス内に配置される方法を、考慮に入れなければならない。
【００２５】
本発明は、当該技術分野におけるこれら、及び他の欠点を克服することに関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｂａｒｄｅｌｌｉ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３２：５７９−５８６（２０１４）
【非特許文献２】Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ６：２２４（２０１４）
【非特許文献３】Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０：５４８−５５４（２０１４）
【非特許文献４】Ｔｈｉｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０：４３０−４３５（２０１４）
【非特許文献５】ＴＣＧＡ「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ４８７：３３０−３３７（２０１４）」
【非特許文献６】Ｍａｔｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １５：４４８（２０１４）
【非特許文献７】Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６２：６７６−６８９（１９９８）
【非特許文献８】Ｓｅｑｕｉｓｔ  ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ，５９：４２９−４４２（２００８）
【非特許文献９】Ｈｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １５：４５３（２０１４）
【非特許文献１０】Ａｍａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：１６２６−１６３４（２００８）
【非特許文献１１】Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２３：１４３４−１４４５（２０１３）
【非特許文献１２】Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：８８１７−８８２２（２００３）
【非特許文献１３】Ｊａｂｂｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １１２：２１１２−２１１８（２００８）
【非特許文献１４】Ｋａｎｄｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０２：３３３−３３９（２０１３）
【非特許文献１５】Ｂａｃｏｌｏｄ  ｅｔ  ａｌ，．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：７２３−７２７（２００９）
【非特許文献１６】Ｔｓａｆｒｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：２１２９−２１３７（２００６）
【非特許文献１７】Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４５：１１１３−１１２０（２０１３）
【非特許文献１８】Ｎａｖｉｎ  Ｎ．Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １５：４５２（２０１４）
【非特許文献１９】Ｅｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １５：ｅ２３４−２４２（２０１４）
【非特許文献２０】Ｂｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．４２（１）：１５−３３（２０１３）
【非特許文献２１】Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：２０４５８−２０４６３（２００８）
【非特許文献２２】Ｊｕｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ．３６（４）（２０１４）
【非特許文献２３】Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：８６３３−８６４１（２００８）
【非特許文献２４】Ｄｈａｒｍａｓｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３０：３２８９−３３００（２００９）
【非特許文献２５】Ｓｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ２１：１９３２−１９４２（２００６）
【非特許文献２６】Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９６（１６）：９２３６−４１（１９９９）
【発明の概要】
【００２７】
本発明の第１の態様は、サンプルにおいて、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が該サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法に関する。本方法は、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を潜在的に含有するサンプルを提供すること、並びに、該サンプルを、サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが提供され、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触したサンプルを、１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖含む一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和し、ライゲーション反応混合物を形成することを含む。各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここで、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイゼーションするように構成される。１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを互いにライゲーションして、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、サンプル中のライゲーション産物配列を検出し区別して、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基がサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する。
【００２８】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、該サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法に関する。本方法は、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供することを含む。本方法は更に、サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素を提供すること、及び、１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含み、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。サンプルを、１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、サンプル中でデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供すことにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成することを含み、各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含む。プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイゼーションするように構成される。ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供すことにより、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は、５’プライマー特異的部分、標的特異的部分、及び３’プライマー特異的部分を含む。本方法は更に、１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット（各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）ライゲーション産物配列の５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）ライゲーション産物配列の３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む）を提供すること、並びに、ライゲーション産物配列、１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和して第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成することを含む。第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する。二次伸長生成物をサンプル中で検出及び区別し、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基がサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する。
【００２９】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、該サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法に関する。本方法は、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供すること；サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素を提供すること；並びに、１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット（各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む）を提供することを含む。本方法は更に、サンプル、１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、サンプル中でデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼを混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成することを含む。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供すことにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する。一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成し、各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）５’部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’部分は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’部分の一部に相補的であり、プローブセットの１つのプローブは、検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補的標的ヌクレオチド配列上にハイブリダイゼーションするように構成される。本方法は更に、ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供すことを含み、これにより、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は５’部分、標的特異的部分、３’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む。ライゲーション産物配列の５’部分がその相補的３’部分にハイブリダイゼーションされ、そのハイブリダイゼーションの際に生成された検出可能なシグナル生成部位からのシグナルが検出される。前述の検出に基づいてライゲーション産物配列がサンプル中で区別され、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基がサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する。
【００３０】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、そのサンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法に関する。本方法は、他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸分子を潜在的に含有するサンプルを提供すること、及び、そのサンプルを、サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。本方法は更に、サンプルを１種以上のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成することを含み、１種以上のメチル化感受性酵素は、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含有するサンプル中の核酸分子を切断する。１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが提供され、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）１つ以上のメチル化残基の上流にある標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）１つ以上のメチル化残基の下流にある標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。制限酵素反応混合物を１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和し、一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。本方法は更に、一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成することを含む。１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供し、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、一次伸長生成物にハイブリダイゼーション可能な第１及び第２のｎｅｓｔｅｄオリゴヌクレオチドプライマーを含む。一次伸長生成物を１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する。サンプル中の二次伸長生成物を検出して区別し、サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する。
【００３１】
本発明の別の態様は、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列により配列がサンプル中の他のリボ核酸分子とは異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を該サンプルにおいて識別するための方法に関する。本方法は、他のリボ核酸分子と異なる配列を潜在的に含有する１つ以上の標的リボ核酸分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、該サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、各プライマーは、１つ以上の標的リボ核酸分子に相補的である。接触したサンプルを１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、及び逆転写酵素と混和して逆転写混合物を形成し、相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子が逆転写混合物中で生成される。各ｃＤＮＡ分子は、標的リボ核酸分子配列に相補的であり、ｄＵを含有するヌクレオチド配列を含む。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含み、各プライマーセットは、（ａ）ｃＤＮＡの標的リボ核酸分子配列の相補鎖に隣接するｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。ｃＤＮＡ分子を含有する逆転写混合物を、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、及びポリメラーゼと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、１種以上の異なる一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供することを含む。各プローブセットは、（ａ）標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）標的配列特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、標的リボ核酸分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される。一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成し、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２プローブを互いにライゲーションし、リガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成する。サンプル中のライゲーション産物配列を検出して区別することにより、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子の存在を識別する。
【００３２】
本発明の別の態様は、サンプル中の他のリボ核酸分子と、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列により配列が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を該サンプルにおいて識別するための方法に関する。本方法は、他のリボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、該サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、各プライマーは１つ以上の標的リボ核酸分子に相補的であり、接触したサンプルを１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素と混和し、逆転写混合物を形成する。逆転写混合物中で相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子が生成され、各ｃＤＮＡ分子は、標的リボ核酸分子に相補的であり、ｄＵを含有するヌクレオチド配列を含む。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含み、各プライマーセットは、（ａ）ｃＤＮＡの標的リボ核酸分子配列相補鎖に隣接するｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。ｃＤＮＡ分子を含有する逆転写混合物を、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びポリメラーゼと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、１種以上の異なる一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供することを含み、各プローブセットは、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）５’標的配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、標的リボ核酸分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される。一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成し、ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供すことにより、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２プローブが互いにライゲーションされてリガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は、５’プライマー特異的部分、標的特異的部分、及び３’プライマー特異的部分を含む。本方法は更に、１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット（各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）ライゲーション産物配列の５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）ライゲーション産物配列の３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む）を提供すること、並びに、ライゲーション産物配列と１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成することを含む。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する。サンプル中の二次伸長生成物を検出して区別することにより、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる１つ以上のリボ核酸分子の存在を識別する。
【００３３】
本発明の別の態様は、サンプル中の他のリボ核酸分子と、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列により配列が異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を該サンプルにおいて識別するための方法に関する。本方法は、他のリボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる１つ以上の標的リボ核酸分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、該サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー（各プライマーは１つ以上の標的リボ核酸分子に相補的である）を提供すること、並びに、接触したサンプル、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素を混和して逆転写混合物を形成することを含む。逆転写混合物中で相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子が生成され、各ｃＤＮＡ分子は、標的リボ核酸分子に相補的であり、ｄＵを含有するヌクレオチド配列を含む。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含み、各プライマーセットは、（ａ）ｃＤＮＡの標的リボ核酸分子配列相補鎖に隣接するｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。ｃＤＮＡ分子を含有する逆転写混合物を、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びポリメラーゼと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、１種以上の異なる一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供することを含み、各プローブセットは、（ａ）５’部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’部分は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’部分の一部に相補的であり、プローブセットの１つのプローブは、検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、標的リボ核酸分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される。一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成し、ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供すことにより、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２プローブが互いにライゲーションされてリガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は５’部分、標的特異的部分、３’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む。ライゲーション産物配列の５’部分はその相補的３’部分にハイブリダイゼーションされ、前記ハイブリダイゼーションの際に生成される検出可能なシグナル生成部位からのシグナルが検出される。前述の検出に基づいて、サンプル中でライゲーション産物配列が検出され、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子とは配列が異なる１つ以上のリボ核酸分子の存在を識別する。
【００３４】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、該サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法に関する。本方法は、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、該サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供し、各プライマーセットは、（ａ）５’ステムループ部分、ブロック基、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）標的ｍｉＲＮＡ分子配列の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列部分、及び５’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーの内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、（ｄ）第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第４のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触したサンプルを、プライマーセットの１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素と混和し、逆転写反応混合物を形成する。第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、サンプル中に存在する場合、標的ｍｉＲＮＡ分子配列にハイブリダイゼーションし、逆転写酵素はハイブリダイゼーションした第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長し、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する。本方法は更に、プライマーセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーを、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの領域にハイブリダイゼーションし、伸長した５’プライマー特異的部分、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び内部プライマー特異的部分の相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、逆転写反応混合物を、プライマーセットの第２、第３、及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーと混和し、ポリメラーゼ反応混合物を形成することを含む。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、複数の一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和し、ライゲーション反応混合物を形成することを含む。各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、（ｂ）標的配列特異的部分、及び一次伸長生成物に相補的な部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される。１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを互いにライゲーションして、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、サンプル中のライゲーション産物配列を検出して区別することにより、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を識別する。
【００３５】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、該サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法に関する。本方法は、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、該サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含み、各プライマーセットは、（ａ）５’ステムループ部分、ブロック基、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）標的ｍｉＲＮＡ分子配列の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列部分、及び５’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーの内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、（ｄ）第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第４のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触したサンプルを、プライマーセットの１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素と混和して逆転写反応混合物を形成し、サンプル中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは標的ｍｉＲＮＡ分子配列にハイブリダイゼーションし、逆転写酵素はハイブリダイゼーションした第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長して、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する。プライマーセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの領域にハイブリダイゼーションし、伸長して５’プライマー特異的部分、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び内部プライマー特異的部分の相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、逆転写反応混合物をプライマーセットの第２、第３、及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、複数の一次伸長生成物を形成する。複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成し、各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）５’標的配列特異的部分、一次伸長生成物に相補的な部分、及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される。ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供すことにより、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は、５’プライマー特異的部分、標的特異的部分、及び３’プライマー特異的部分を含む。本方法は更に、１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット（各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）ライゲーション産物配列の５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）ライゲーション産物配列の３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む）を提供すること、並びに、ライゲーション産物配列と１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成することを含む。第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子の分解、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供すことにより、二次伸長生成物を形成する。サンプル中の二次伸長生成物を検出して区別することにより、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を識別する。
【００３６】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、該サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法に関する。本方法は、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、該サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含み、各プライマーセットは、（ａ）５’ステムループ部分、ブロック基、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）標的ｍｉＲＮＡ分子配列の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列部分、及び５’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーの内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、（ｄ）第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第４のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触したサンプルをプライマーセットの１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素と混和して逆転写反応混合物を形成し、サンプル中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは標的ｍｉＲＮＡ分子配列にハイブリダイゼーションし、逆転写酵素はハイブリダイゼーションした第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長して、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する。プライマーセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの領域にハイブリダイゼーションし、伸長して５’プライマー特異的部分、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び内部プライマー特異的部分の相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、逆転写反応混合物をプライマーセットの第２、第３、及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成する。本方法は更に、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、複数の一次伸長生成物を形成することを含む。複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成し、各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）５’部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’部分は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’部分の一部に相補的であり、プローブセットの１つのプローブは、検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される。ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供すことにより、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は５’部分、標的特異的部分、３’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む。ライゲーション産物配列の５’部分はその相補的３’部分にハイブリダイゼーションされ、そのハイブリダイゼーションの際に生成された検出可能なシグナル生成部位からのシグナルが検出される。その検出に基づいてサンプル中のライゲーション産物配列を区別し、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の存在を識別する。
【００３７】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、該サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法に関する。本方法は、他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基の違いにより配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、該サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。接触したサンプルを、リガーゼと、並びに、５’リン酸基、５’ステムループ部分、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと混和し、ライゲーション反応物を形成する。本方法は更に、標的ｍｉＲＮＡ分子配列をその３’末端にて、第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’リン酸基にライゲーションして、サンプル中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドプローブに付加した標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸分子を生成することを含む。１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供し、各プライマーセットは、（ａ）標的ｍｉＲＮＡ分子配列の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列、及び５’プライマー特異的部分を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプローブの内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。キメラ核酸分子を、１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素と混和して逆転写反応混合物を形成し、プライマーセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、キメラ核酸分子の内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、サンプル中に存在する場合、その３’末端にて伸長してキメラ核酸分子の相補鎖を生成する。本方法は更に、逆転写反応混合物を、プライマーセットの第１及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成すること、並びに、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより一次伸長生成物を形成することを含む。一次伸長生成物は、５’プライマー特異的部分、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び内部プライマー特異的部分の相補鎖を含む。一次伸長生成物を、リガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和し、ライゲーション反応混合物を形成する。各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、（ｂ）標的配列特異的部分、及び一次伸長生成物に相補的な部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される。１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを互いにライゲーションして、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、サンプル中のライゲーション産物配列を検出して区別することにより、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を識別する。
【００３８】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、該サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法に関する。本方法は、他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基の違いにより配列が潜在的に異なる１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を含有する分子を提供すること、及び、該サンプルを、該サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。接触したサンプルを、リガーゼと、並びに５’リン酸基、５’ステムループ部分、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと混和してライゲーション反応物を形成し、その３’末端の標的ｍｉＲＮＡ分子配列を第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’リン酸基にライゲーションして、サンプル中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドプローブに付加した標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸を生成する。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含み、各プライマーセットは、（ａ）標的ｍｉＲＮＡ分子配列の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列、及び５’プライマー特異的部分を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプローブの内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。キメラ核酸分子を、１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素と混和して逆転写反応混合物を形成し、サンプル中に存在する場合、プライマーセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーはキメラ核酸分子の内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、その３’末端にて伸長してキメラ核酸分子の相補鎖を生成する。逆転写反応混合物をプライマーセットの第１及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、５’プライマー特異的部分、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び内部プライマー特異的部分の相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する。一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成し、各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）５’標的配列特異的部分、一次伸長生成物に相補的な部分、及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される。ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供すことにより、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は、５’プライマー特異的部分、標的特異的部分、及び３’プライマー特異的部分を含む。本方法は更に、１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含み、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）ライゲーション産物配列の５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）ライゲーション産物配列の３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。ライゲーション産物配列を、１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和し、第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解するのに好適な条件、並びに、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する。サンプル中の二次伸長生成物を検出して区別することにより、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を識別する。
【００３９】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、該サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法に関する。本方法は、他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基の違いにより配列が潜在的に異なる１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を含有する分子を提供すること、及び、該サンプルを、該サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。接触したサンプルを、リガーゼと、並びに、５’リン酸基、５’ステムループ部分、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと混和し、ライゲーション反応物を形成する。標的ｍｉＲＮＡ分子配列をその３’末端にて、第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’リン酸基にライゲーションして、サンプル中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドプローブに付加した標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸を生成する。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを含み、各プライマーセットは、（ａ）標的ｍｉＲＮＡ分子配列の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列、及び５’プライマー特異的部分を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプローブの内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。キメラ核酸分子を、１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素と混和して逆転写反応混合物を形成し、サンプル中に存在する場合、プライマーセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーはキメラ核酸分子の内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、その３’末端を伸長してキメラ核酸分子の相補鎖を生成する。逆転写反応混合物をプライマーセットの第１及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、５’プライマー特異的部分、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び内部プライマー特異的部分の相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する。一次伸長生成物を、リガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和してライゲーション反応混合物を形成し、各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）５’部分及び３’標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに（ｂ）５’標的ヌクレオチド配列特異的部分及び３’部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’部分は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの３’部分の一部に相補的であり、プローブセットの１つのプローブは、検出可能なシグナル生成部位を含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応する一次伸長生成物の相補部分上でハイブリダイゼーションするように構成される。ライゲーション反応混合物を１回以上のライゲーション反応サイクルに供すことにより、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが互いにライゲーションされ、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、各ライゲーション産物配列は５’部分、標的特異的部分、３’部分、及び検出可能なシグナル生成部位を含む。ライゲーション産物配列の５’部分がその相補的３’部分にハイブリダイゼーションし、そのハイブリダイゼーションの際に生成された検出可能なシグナル生成部位からのシグナルが検出される。その検出に基づいてライゲーション産物配列がサンプル中で区別され、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の存在を識別する。
【００４０】
本発明の別の態様は、マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに同時に液体を加えるためのデバイスに関する。本デバイスは対向した上部表面及び底部表面を有し、上部表面はウェルの中に至る開口部を有し、底部表面はウェルの閉鎖端を画定する。本デバイスは、第１及び第２の境界により画定される第１層を含み、計量チャンバが前記第１層の第１及び第２の境界の間に延在し、互いに流体連通している。第１層は作動可能な位置で、マイクロタイタープレートに隣接して適合するように構成され、第１層の第１の境界はマイクロタイタープレートの上部表面に最も近く、計量チャンバのそれぞれは、マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと流体連通している。第１層は、計量チャンバの１つ以上と流体連通した充填チャンバを更に含む。本デバイスは、第１及び第２の境界により画定される第２層を含み、充填ポートが第２層の第１及び第２の境界の間に延在する。第２層は第１層上で作動可能な位置で適合するように構成され、第２層の第１の境界は第１層の第２の境界に隣接し、充填ポートは充填チャンバと連動している。第１層、第２層、及びマイクロタイタープレートが互いに、作動可能な位置で配置される場合、充填ポートを通してデバイスに入る液体はインプットチャンバ、計量チャンバを通過して、マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに入る。
【００４１】
本発明の別の態様は、対向した上部表面及び底部表面を有するマイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに液体を加える方法に関し、上部表面はウェルの中に至る開口部を有し、底部表面はウェルの閉鎖端を画定する。本方法は、第１及び第２の境界を有する第１層を含み、計量チャンバが第１層の第１及び第２の境界の間に延在し、互いに流体連通しているデバイスを提供することを含む。デバイスの第１層は作動可能な位置で、マイクロタイタープレートと隣接して適合するように構成され、第１層の第１の境界はマイクロタイタープレートの上部表面に最も近く、計量チャンバの一方はマイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと流体連通している。第１層は、前記計量チャンバの１つ以上と流体連通した充填チャンバを更に含む。本デバイスは、第１及び第２の境界を有する第２層を含み、充填ポートが第２層の第１及び第２の境界の間に延在する。第２層は、第１層の作動可能な位置で適合するように構成されており、第２層の第１の境界は第１層の第２の境界に隣接し、充填ポートは充填チャンバと連動している。第１層、第２層、及びマイクロタイタープレートが互いに、作動可能な位置で配置される場合、充填ポートを通してデバイスに入る液体は充填チャンバ、計量チャンバを通過して、前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに入る。本方法は更に、デバイスに液体を満たすこと、及び、デバイス内の液体を前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに再分配することを含む。
【００４２】
本発明は、ヌクレアーゼ、リガーゼ及びポリメラーゼ反応を用いて、標的核酸分子における変異、発現、スプライス変異体、転座、コピー数、及び／またはメチル化変化を検出するための多数のアプローチについて記載する。本発明は、キャリーオーバー防止の問題を解決し、同様に空間的多重化を可能にして、デジタルＰＣＲに類似した相対的定量化を提供する。かかる技術は、癌の非侵襲的早期発見のため、癌の非侵襲的予測のため、及び、血漿または血清サンプルから癌の再発を監視するために利用され得る。 
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】患者の血液サンプルの分析に基づいた、早期発見ｐａｎ  ｃａｎｃｅｒ試験用の条件ロジックツリーを示す。
【図２】血漿ｃｆＤＮＡ、エクソソーム、及びＣＴＣからのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡ分析のためのワークフローを示す。
【図３】あるサンプルの分配による、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの包括的分析を示し、サンプルを最初に希釈をして、マルチプレックスＰＣＲまたは逆転写酵素ＰＣＲ用の２４個のチューブに分配した後、タグ付けしたプローブでＬＤＲを行い、２４×１６列のマイクロタイタープレートに入れた。
【図４】図３のマイクロタイタープレートの２４個の縦列への、１６種類の異なるタグプライマーセットの添加を示す。
【図５】図４のマイクロタイタープレートでの、各ウェルのリアルタイム検出から生成した仮説シグナルパターンを示す。
【図６】血漿ｃｆＤＮＡまたはＣＴＣからのＤＮＡの分析のためのワークフローを示す。
【図７】あるサンプルの分配によるＤＮＡの分析を示し、最初に希釈をして、マルチプレックスＰＣＲまたは逆転写酵素ＰＣＲ用の２４個のチューブに分配した後、タグ付けしたプローブでＬＤＲを行い、２４×１６列のマイクロタイタープレートに入れた。
【図８】図７のマイクロタイタープレートの２４個の縦列への、１６種類の異なるタグプライマーセットの添加を示す。
【図９】図８のマイクロタイタープレートでの、各ウェルのリアルタイム検出から生成した仮説シグナルパターンを示す。
【図１０】血漿エクソソームからのｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの分析のためのワークフローを示し、血漿ｃｆＤＮＡ、エクソソーム、及びＣＴＣからのＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡの分析のためのワークフローを示す。
【図１１】あるサンプルの分配による、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの分析を示し、最初に連続希釈をしてマルチプレックス逆転写酵素ＰＣＲのために２４個のチューブに入れ、続いてタグプローブでＬＤＲを行い、２４×１６列のマイクロタイタープレートに入れた。
【図１２】図１１のマイクロタイタープレートの２４個の縦列への、１６種類の異なるタグプライマーセットの添加を示す。
【図１３】図１２のマイクロタイタープレートでの、各ウェルのリアルタイム検出から生成した仮説シグナルパターンを示す。
【図１４】あるサンプルの分配による、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの包括的分析のためのワークフローを示し、サンプルを最初に、マルチプレックスＰＣＲまたは逆転写酵素ＰＣＲのために２４個のチューブに希釈した後、２４×１６列のマイクロタイタープレートでのストレプトアビジン媒介性捕捉のために、タグ付けしたプローブでＬＤＲを行った。
【図１５】２４個のサンプルの分配による、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの包括的分析を示し、サンプルを最初に、希釈してマルチプレックスＰＣＲまたは逆転写酵素ＰＣＲのために２４個のチューブに分配した後、タグ付けしたプローブでＬＤＲを行い、２４×１６列のマイクロタイタープレートに入れた。
【図１６】図１５のマイクロタイタープレートのウェルでの、ビオチン化ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ単位複製配列のストレプトアビジン媒介性捕捉を示す。
【図１７】図１６のマイクロタイタープレートの２４個の縦列への、１６種類の異なるタグプライマーセットの添加を示す。
【図１８】図１７のマイクロタイタープレートの各ウェルにおける、ＬＤＲ−ＦＲＥＴのリアルタイム検出から生成した仮説シグナルパターンを示す。
【図１９】あるサンプルの分配によるＤＮＡの分析のためのワークフローを示し、最初に、マルチプレックスＰＣＲ用に２４個のチューブに希釈をした後、２４×１６列のマイクロタイタープレートでのストレプトアビジン媒介性捕捉のためにタグ付けしたプローブでＬＤＲを行った。
【図２０】２４個のサンプルの分配によるＤＮＡの分析を示し、サンプルを最初に、希釈してマルチプレックスＰＣＲのために２４個のチューブに分配した後、タグ付けしたプローブでＬＤＲを行い、２４×１６列のマイクロタイタープレートに入れる。
【図２１】図２０のマイクロタイタープレートのウェルでの、ビオチン化ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ単位複製配列のストレプトアビジン媒介性捕捉を示す。
【図２２】図２１のマイクロタイタープレートの２４個の縦列への、１６種類の異なるタグプライマーセットの添加を示す。
【図２３】図２２のマイクロタイタープレートの各ウェルにおける、ＬＤＲ−ＦＲＥＴのリアルタイム検出から生成した仮説シグナルパターンを示す。
【図２４】あるサンプルの分配による、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分析のためのワークフローを示し、サンプルを最初に、マルチプレックスＰＣＲ用に２４個のチューブに希釈をした後、２４×１６列のマイクロタイタープレートでのストレプトアビジン媒介性捕捉のためにタグ付けしたプローブでＬＤＲを行った。
【図２５】あるサンプルの分配による、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの分析を示し、サンプルを最初に連続希釈してマルチプレックス逆転写酵素ＰＣＲのために２４個のチューブに入れ、続いてタグ付けしたプローブでＬＤＲを行い、２４×１６列のマイクロタイタープレートに入れた。
【図２６】図２５のマイクロタイタープレートのウェルでの、ＲＴ−ＰＣＲ単位複製配列のストレプトアビジン媒介性捕捉を示す。
【図２７】図２６のマイクロタイタープレートの２４個の縦列への、１６種類の異なるタグプライマーセットの添加を示す。
【図２８】図２７のマイクロタイタープレートの各ウェルにおける、ＬＤＲ−ＦＲＥＴのリアルタイム検出から生成した仮説シグナルパターンを示す。
【図２９】２４個のウェルに分配した６〜４８個の分子のポアソン分布のシミュレーションを示す。上は、表形式の開始時分子数に対するウェル当たりの分子数である。下は、分子数（ｘ）対ウェル数（ｙ）のヒストグラムである。
【図３０】２４個のウェルに分配した１２〜９６個の分子のポアソン分布のシミュレーションを示す。上は、表形式の開始時分子数に対するウェル当たりの分子数である。下は、分子数（ｘ）対ウェル数（ｙ）のヒストグラムである。
【図３１】４８個のウェルに分配した１２〜９６個の分子のポアソン分布のシミュレーションを示す。上は、表形式の開始時分子数に対するウェル当たりの分子数である。下は、分子数（ｘ）対ウェル数（ｙ）のヒストグラムである。
【図３２】４８個のウェルに分配した２４〜１９２個の分子のポアソン分布のシミュレーションを示す。上は、表形式の開始時分子数に対するウェル当たりの分子数である。下は、分子数（ｘ）対ウェル数（ｙ）のヒストグラムである。
【図３３】８個のウェルに分配した１〜８個の分子のポアソン分布のシミュレーションを示す。上は、表形式の開始時分子数に対するウェル当たりの分子数である。下は、分子数（ｘ）対ウェル数（ｙ）のヒストグラムである。
【図３４】８個のウェルに分配した２〜１６個の分子のポアソン分布のシミュレーションを示す。上は、表形式の開始時分子数に対するウェル当たりの分子数である。下は、分子数（ｘ）対ウェル数（ｙ）のヒストグラムである。
【図３５】８個のウェルに分配した４〜３２個の分子のポアソン分布のシミュレーションを示す。上は、表形式の開始時分子数に対するウェル当たりの分子数である。下は、分子数（ｘ）対ウェル数（ｙ）のヒストグラムである。
【図３６】８個のウェルに分配した８〜６４個の分子のポアソン分布のシミュレーションを示す。上は、表形式の開始時分子数に対するウェル当たりの分子数である。下は、分子数（ｘ）対ウェル数（ｙ）のヒストグラムである。
【図３７】８個のウェルに分配した１６〜１２８個の分子のポアソン分布のシミュレーションを示す。上は、表形式の開始時分子数に対するウェル当たりの分子数である。下は、分子数（ｘ）対ウェル数（ｙ）のヒストグラムである。
【図３８】標的（複数可）及び／または変異を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図３９】標的（複数可）及び／または変異を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４０】標的（複数可）及び／または変異を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４１】標的（複数可）及び／または変異を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４２】標的（複数可）及び／または変異を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４３】標的（複数可）及び／または変異を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４４】標的（複数可）及び／または変異を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４５】標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４６】標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４７】標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４８】標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたヌクレアーゼ−ライゲーション−ＰＣＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図４９】標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたヌクレアーゼ−ライゲーション−ＰＣＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図５０】標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図５１】標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図５２】標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図５３】標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＰＣＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図５４】ｍＲＮＡレベルで転座を識別、または相対的に定量化するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概観を示す。
【図５５】ｍＲＮＡレベルで転座を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図５６】ｍＲＮＡレベルで転座を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図５７】ｍＲＮＡレベルで転座を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図５８】選択的スプライシングを識別、または相対的に定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概観を示す。
【図５９】野生型及び選択的スプライシングを受けた転写物を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図６０】野生型及び選択的スプライシングを受けた転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図６１】野生型及び選択的スプライシングを受けた転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図６２】少量の選択的スプライシングを受けた転写物を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図６３】少量の選択的スプライシングを受けた転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図６４】少量の選択的スプライシングを受けた転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図６５】選択的スプライシングを識別、または相対的に定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概観を示す。
【図６６】野生型及び選択的転写の開始部位を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図６７】野生型及び選択的転写の開始部位を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図６８】野生型及び選択的転写の開始部位を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図６９】少量の選択的転写の開始部位を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図７０】少量の選択的転写の開始部位を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図７１】少量の選択的転写の開始部位を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図７２】エクソン欠失を識別、または相対的に定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概観を示す。
【図７３】野生型及び選択的スプライシングを受けた（エクソン欠失）転写物を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図７４】野生型及び選択的スプライシングを受けた（エクソン欠失）転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図７５】野生型及び選択的スプライシングを受けた（エクソン欠失）転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図７６】少量の選択的スプライシングを受けた（エクソン欠失）転写物を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図７７】少量の選択的スプライシングを受けた（エクソン欠失）転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図７８】少量の選択的スプライシングを受けた（エクソン欠失）転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図７９】イントロンを挿入した選択的スプライシングを識別、または相対的に定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概観を示す。
【図８０】野生型及び選択的スプライシングを受けた（イントロン挿入）転写物を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図８１】野生型及び選択的スプライシングを受けた（イントロン挿入）転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図８２】野生型及び選択的スプライシングを受けた（イントロン挿入）転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図８３】少量の選択的スプライシングを受けた（イントロン挿入）転写物を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図８４】少量の選択的スプライシングを受けた（イントロン挿入）転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図８５】少量の選択的スプライシングを受けた（イントロン挿入）転写物を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図８６】ＤＮＡコピー数を計算するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図８７】ＤＮＡコピー数を計算するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図８８】ＤＮＡコピー数を計算するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図８９】ＲＮＡコピー数を計算するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９０】ＲＮＡコピー数を計算するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９１】ＲＮＡコピー数を計算するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９２】ｍｉＲＮＡを識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９３】ｍｉＲＮＡを識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９４】ｍｉＲＮＡを識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９５】ｍｉＲＮＡを識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９６】ｍｉＲＮＡを識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９７】ｍｉＲＮＡを識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９８】ｍｉＲＮＡを識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ検出を用いたライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図９９】ｍｉＲＮＡを識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ検出を用いたライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１００】ｍｉＲＮＡを識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ検出を用いたライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１０１】市販されている３８４ウェルマイクロタイタープレートの、あるバージョンの寸法を示す。
【図１０２】市販されている３８４ウェルマイクロタイタープレートの、別のバージョンの寸法を示す。
【図１０３】典型的な３８４ウェルマイクロタイタープレートの形状の、上部及び側面図を示す。
【図１０４】典型的な３８４ウェルマイクロタイタープレートの形状の斜視図を示す。
【図１０５】マイクロタイタープレートのいくつかのウェルの上に配置した、サンプル分配デバイスの中間層の上部及び側面図を示す。
【図１０６】マイクロタイタープレートのいくつかのウェルの上に配置した、サンプル分配デバイスの中間層の分解斜視図を示す。
【図１０７】マイクロタイタープレートのいくつかのウェルの上に配置した、サンプル分配デバイスの第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１０８】マイクロタイタープレートのいくつかのウェルの上に配置した、サンプル分配デバイスの第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１０９】マイクロタイタープレートのいくつかのウェルの上に配置した、サンプル分配デバイスの第３、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１１０】マイクロタイタープレートのいくつかのウェルの上に配置した、サンプル分配デバイスの第３、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１１１】マイクロタイタープレートのいくつかのウェルの上に配置した、サンプル分配デバイスの第２、第３、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１１２】マイクロタイタープレートのいくつかのウェルの上に配置した、サンプル分配デバイスの第２、第３、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１１３】マイクロタイタープレートの各列のチャネル及び計量チャンバに圧力を加えて充填するために代わりの充填ポートを用いるサンプル分配デバイスの、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１１４】マイクロタイタープレートの各列のチャネル及び計量チャンバに圧力を加えて充填するために代わりの充填ポートを用いるサンプル分配デバイスの、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１１５】マイクロタイタープレートの各列のチャネル及び計量チャンバに圧力を加えて充填するために代わりの充填ポートを用いるサンプル分配デバイスの、第３、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１１６】マイクロタイタープレートの各列のチャネル及び計量チャンバに圧力を加えて充填するために代わりの充填ポートを用いるサンプル分配デバイスの、第３、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１１７】マイクロタイタープレートの各列のチャネル及び計量チャンバに圧力を加えて充填するために代わりの充填ポートを用いるサンプル分配デバイスの、第２、第３、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１１８】マイクロタイタープレートの各列のチャネル及び計量チャンバに圧力を加えて充填するために代わりの充填ポートを用いるサンプル分配デバイスの、第２、第３、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１１９】マイクロタイタープレートの各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの出口側にある中間層の上部及び側面図を示す。
【図１２０】マイクロタイタープレートの各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの出口側にある中間層の分解斜視図を示す。
【図１２１】マイクロタイタープレートの各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの出口側にある、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１２２】マイクロタイタープレートの各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの出口側にある、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１２３】マイクロタイタープレートの各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの出口側にある、第３、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１２４】マイクロタイタープレートの各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの出口側にある、第３、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１２５】マイクロタイタープレートの各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの出口側にある、第２、第３、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１２６】マイクロタイタープレートの各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの出口側にある、第２、第３、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１２７】マイクロタイタープレートの両側から各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、中間層の上部及び側面図を示す。
【図１２８】マイクロタイタープレートの両側から各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、中間層の分解斜視図を示す。
【図１２９】マイクロタイタープレートの両側から各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１３０】マイクロタイタープレートの両側から各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１３１】マイクロタイタープレートの両側から各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第３、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１３２】マイクロタイタープレートの両側から各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第３、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１３３】マイクロタイタープレートの両側から各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第２、第３、第１及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１３４】マイクロタイタープレートの両側から各列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第２、第３、第１及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１３５】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、中間層の上部及び側面図を示す。
【図１３６】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、中間層の分解斜視図を示す。
【図１３７】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第１層の第１領域、及び中間層の上部及び側面図を示す。
【図１３８】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第１層の第１領域、及び中間層の分解斜視図を示す。
【図１３９】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第１層の第１及び第２領域、並びに中間層の上部及び側面図を示す。
【図１４０】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第１層の第１及び第２領域、並びに中間層の分解斜視図を示す。
【図１４１】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの第３層、（第１及び第２領域を有する）第１層、並びに中間層の上部及び側面図を示す。
【図１４２】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第３層、（第１及び第２領域を有する）第１層、並びに中間層の分解斜視図を示す。
【図１４３】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの第２層、第３層、（第１及び第２領域を有する）第１層、並びに中間層の上部及び側面図を示す。
【図１４４】マイクロタイタープレートの各横列及び各縦列を独立してアドレス指定するサンプル分配デバイスの、第２層、第３層、（第１及び第２領域を有する）第１層、並びに中間層の分解斜視図を示す。
【図１４５】少量の変異を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ読出しを用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１４６】少量の変異を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ読出しを用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１４７】少量の変異を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ読出しを用いたＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１４８】少量の変異を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ読出しを用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１４９】少量の変異を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ読出しを用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５０】少量の変異を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ読出しを用いたＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５１】少量の標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ読出しを用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５２】少量の標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、ＵｎｉＴａｑ読出しを用いたＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５３】少量の標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ読出しを用いたＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５４−１】少量の標的（複数可）及び／または変異を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ読出しを用いたループ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５４−２】少量の標的（複数可）及び／または変異を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ読出しを用いたループ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５５−１】少量の変異を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ読出しを用いたループ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５５−２】少量の変異を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ読出しを用いたループ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５６−１】少量の標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ読出しを用いたループ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５６−２】少量の標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ読出しを用いたループ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５７−１】少量の標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ読出しを用いたループ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５７−２】少量の標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、ＦＲＥＴ読出しを用いたループ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５８】少量の標的メチル化を識別、または相対的に定量化するための、Ｔａｑｍａｎ読出しを用いたＰＣＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。
【図１５９】過剰の野生型ＤＮＡ中におけるＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６０】ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異の単一分子を計算するためのピクセルＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６１】血漿からの過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異の単一分子を計算するためのピクセルＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６２】過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑ変異を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６３】過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑ変異を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６４】過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑ変異の単一分子を計算するためのピクセルＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６５】血漿からの過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑ変異の単一分子を計算するためのピクセルＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６６】過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６７】過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ変異を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６８】血漿からの過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異の単一分子を計算するためのピクセルＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１６９】過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ変異を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１７０】過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ変異を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１７１】過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１７２】血漿中の過剰の野生型ＤＮＡの存在下でＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異の単一分子を計算するためのピクセルＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１７３】ビメンチン遺伝子のメチル化の有無を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１７４】過剰な非メチル化ＤＮＡ（ｈｇＤＮＡ）の存在下でメチル化ＤＮＡの単一分子を計算するためのピクセルＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験で得られた、リアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１７５】Ｔａｑｍａｎプローブバージョン「Ａ」を用いた、ＶＩＭ＿Ｓ３トップ鎖のメチル化を検出するための実験で得られたリアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１７６】Ｔａｑｍａｎプローブバージョン「Ａ」を用いた、ＶＩＭ  Ｓ３ボトム鎖のメチル化を検出する実験で得られたリアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１７７】Ｔａｑｍａｎプローブバージョン「Ｂ」を用いた、ＶＩＭ  Ｓ３トップ鎖のメチル化を検出するための実験で得られたリアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【図１７８】Ｔａｑｍａｎプローブバージョン「Ｂ」を用いた、ＶＩＭ  Ｓ３ボトム鎖のメチル化を検出するための実験で得られたリアルタイムＰＣＲ増幅プロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
「病気マーカーの負荷」を使用した、病気の早期発見のための汎用的設計
最も費用対効果の高い病気の早期発見試験では、最初の多重結合増幅とライゲーションアッセイを組み合わせて「病気の量」を測定してもよい。癌の検出に関して、この試験は、全ての癌（総合腫瘍学）に関して、＞９７％の特異性で＞９５％の感度を達成する。癌腫瘍量のアッセイのフローチャートを図１に示す。突然変異、メチル化、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、選択的スプライシング、及び転座をスコアリングする、最初のマルチプレックスＰＣＲ／ＬＤＲスクリーニングアッセイは、２４〜４８種類のマーカーのうち＞５が陽性であるサンプルを識別する。次に、追加の組織特異的マーカーによる「ピクセル」ＰＣＲ／ＬＤＲを使用して推定上の陽性サンプルをアッセイし、最初の結果を確認して元の組織を識別する。次に医師は、標的化された配列決定を命じ、患者の治療決定を更に手引きしてもよい。
【００４５】
本発明は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション検出反応（ＬＤＲ）、及び、複数の病気マーカー（例えば癌マーカー）の定量的検出の最良の特徴を組み合わせることを求める、汎用的な診断アプローチに関する。一まとまりのアッセイ構造物及びデバイスは、血液からの少量の病気マーカーをＰＣＲ−ＬＤＲ定量化するための３つのモジュールを含む。各モジュールは独立して最適化されてもよく、手動でも、半自動化でも、または完全に自動化されていてもよい。設計により、任意のモジュールを独立して最適化し、向上した性能をアッセイ全体にもたらすようにモジュールを互いに統合することが可能となる。
【００４６】
最初の一まとまりのアッセイ設計は、最初のマルチプレックスＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅、続いて、プライマー特異的部分を含有する独自の配列タグを有するＬＤＲプローブを使用したマルチプレックスＬＤＲに基づく。生成物を分配して、標的用ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、あるいはＵｎｉＴａｑプライマーセットを有するタグプライマーセット及び、リアルタイムＰＣＲを使用して定量化した投入標的核酸と混合する。
【００４７】
第１のモジュールは血液の投入サンプルを受け取り、赤血球（ＲＢＣ）及び白血球（ＷＢＣ）から血漿を分離する。血漿を再び分離し、あらゆる残留細胞を除去する。更に、全てのＷＢＣ及び血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、並びにいくらかのＲＢＣを含有する細胞画分を分離する。エクソソームを血漿から分離するか、親和性捕捉する。モジュールは、（ｉ）ＷＢＣ及びＣＴＣ画分からＲＮＡを、（ｉｉ）エクソソームからｍｉＲＮＡ及びＲＮＡを、及び（ｉｉｉ）血漿から無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を精製する。
【００４８】
第２のモジュールは、標的化遺伝子、プロモーター、ｍｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡ領域の比例マルチプレックスＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅による空間的多重化のための、上記成分の、２４または４８個のチャンバまたはウェルへの分配を可能にする。これらは、（ｉ）ＷＢＣ画分を含有するＣＴＣ中の特異的スプライス変異体または遺伝子融合ｍＲＮＡ、（ｉｉ）エクソソームからの特異的ｍｉＲＮＡ、（ｉｉｉ）エクソソームからの特異的ｍＲＮＡ、（ｉｖ）ｃｆＤＮＡからの特異的癌遺伝子ＤＮＡ領域、及び（ｖ）ｃｆＤＮＡからの特異的（メチル化）プロモーター領域を含む。
【００４９】
第３のモジュールは、上記生成物の、マイクロタイタープレートのウェル、例えば２４×１６または４８×３２の構成のものへの空間的分配を可能にする。このモジュールは、リアルタイムＰＣＲを使用したＬＤＲ産物の検出及び計算により、各病気マーカーの定量的結果をもたらすことを可能にする。
【００５０】
第１及び第２のモジュールは、スクリーニングアッセイモードで複数のサンプルを同時に処理するように構成されてもよく、ここで、配列タグを含有するＬＤＲ産物は、リアルタイムＰＣＲ読出しを用いて相対的な定量的結果をもたらす（図２を参照）。この構成において、２４個の個々のサンプルからの種々の血液画分から単離したＤＮＡ及びＲＮＡをマルチプレックスＰＣＲ−ＬＤＲ及びＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲに供し、次いで、図３に示すように、マイクロタイタープレートの縦列（例えば１６個のウェル）に分配する。標的用ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、あるいはＵｎｉＴａｑプライマーセットを有するタグプライマーセットを、図４に示すように横列にわたって加え、リアルタイムＰＣＲを可能にする（図５）。この図において、サンプル番号２及び１５は＞５の位置で強力なシグナルを有するため、潜在的に陽性と考えられる（以下でより詳細に記載するような更なる確認を待つ）が、４つの弱いシグナルを有するサンプル番号８もまた、更なる処理を受けなければならない。
【００５１】
２つのモジュールはまた、「ピクセル」ＰＣＲ／ＬＤＲを可能にする空間的多重化により、単一のサンプルを処理するように構成されてもよく、ここで、ＬＤＲ生成物は元の標的分子の計算を可能にする。これはデジタルＰＣＲに類似しているが、多重化のレベルが高い（図６を参照）。この構成において、単一のサンプルからのＤＮＡ及びＲＮＡを、図７に示すとおり、マルチプレックスＰＣＲ−ＬＤＲの前に２４個のチャンバに分配する。本実施形態において、いくつかのチャンバは、１つの標的分子を有するか、標的分子を有しない。多重化の後、ＬＤＲ産物を縦列、例えばマイクロタイタープレートの１６個のウェルに分配する（図７）。標的用ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、あるいはＵｎｉＴａｑプライマーセットを有するタグプライマーセットを、横列にわたって加え（図８を参照）、リアルタイムＰＣＲを可能にする（図９を参照）。Ｃｔ値を元の混合物中の単一の分子の整数倍（即ち０、１、２等）として表し、ポアソン分布に基づき、結果を解釈する。図２９及び３０は、それぞれ２４個のウェルでの６〜４８個、及び１２〜９６個の分子のポアソン分布を示し、かつ、図３１及び３２は、それぞれ４８個のウェルでの１２〜９６個、及び２４〜１９２個の分子のポアソン分布を示す。図９・列Ａは、（アドレス番号：最初の標的分子の数）：（１７：０；６：１；１：２）を示し、８個の分子に対応する。図９・列Ｋは（７：０；１０：１；５：２；２：４）を示し、約３０個の分子に対応する。
【００５２】
図１０〜１３にｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡの定量化について示したように、異なる形態の希釈及び分配を用いて、より広範囲にわたり分子を計算してもよい。ここで、例えば、最初のサンプルを８個のチャンバに分配し、１０倍希釈して別の８個のチャンバに分配する（図１１を参照）。サンプルを多重化ＲＴ−ＰＣＲ及びＬＤＲに供し、ＬＤＲ産物をそれぞれ縦列に分配する（図１１）。標的用ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、あるいはＵｎｉＴａｑプライマーセットを有するタグプライマーセットを横列にわたって加え（図１２を参照）、リアルタイムＰＣＲ及び検出を可能にする（図１３を参照）。２４個のチャンバの例に関しては、３等級にわたって定量化が可能であるが、４８個のチャンバでは、６等級にわたる違いをカバーすることが可能である。図３３〜３７は、８個のウェルでの１〜１２８個の分子のポアソン分布を示す。図１３・列Ｇに示す例において、最初の２つの希釈溶液は、最後の８個のウェル（１：０；３：１；３：２；１：４）よりも高いシグナルを与え、これは約１４〜１６×１００×１．２５＝１，７５０〜２，０００個の分子に対応する。対照的に、図１３の列Ｎは、最初の８個のウェルの分布（４：０；３：１；１：２）のみでシグナルを与え、これは約５〜６×１．２５＝６〜８個の分子に対応する。
【００５３】
第２の一群のアッセイ設計は、最初のマルチプレックスＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅、続いて、マイクロタイタープレートのウェル上でのＰＣＲ増幅標的の分配及び捕捉に基づく。１回のＬＤＲサイクルで、固体支持体上で正しい標的のＬＤＲ産物の捕捉が可能になる一方、ライゲーションに失敗したものは洗い流される。ＬＤＲ−ＦＲＥＴ、リアルタイムＰＣＲ、または他のレポーターシステムのいずれかにより、ＬＤＲ産物を定量化する。
【００５４】
第１のモジュールは血液の投入サンプルを受け取り、ＣＴＣが存在する場合これを分離し、血液細胞から血漿を、そして血漿からエクソソームを分離し、次に、（ｉ）存在する場合、ＣＴＣからＤＮＡ及びＲＮＡを、（ｉｉ）エクソソームからｍｉＲＮＡ及びＲＮＡを、及び（ｉｉｉ）血漿からｃｆＤＮＡを分離する。
【００５５】
第２のモジュールは、標的化遺伝子、プロモーター、ｍｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡ領域の比例マルチプレックスＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ増幅による空間的多重化のための、上記成分の、２４または４８個のチャンバまたはウェルへの分配を可能にする。これらは、（ｉ）ＣＴＣからのコピー数計算用の特異的染色体領域、（ｉｉ）ＣＴＣからの特異的スプライス変異体または遺伝子融合ｍＲＮＡ、（ｉｉｉ）エクソソームからの特異的ｍｉＲＮＡ、（ｉｖ）エクソソームからの特異的ｍＲＮＡ、（ｖ）ｃｆＤＮＡからの特異的癌遺伝子ＤＮＡ領域、及び（ｖｉ）ｃｆＤＮＡからの特異的（メチル化）プロモーター領域を含む。
【００５６】
第３のモジュールは、上記生成物の縦列、例えばマイクロタイタープレートの１６個のウェルへの空間的分配、続いて、固体支持体（例えば２４×１６または４８×３２の構成）での増幅標的の捕捉を可能にする。このモジュールは、固体支持体でのＬＤＲ産物の捕捉、続いて、ＬＤＲ産物の検出及び計算により、各マーカーの定量的結果をもたらすことを可能にする。
【００５７】
第１及び第２のモジュールは、スクリーニングアッセイモードで複数のサンプルを同時に処理するように構成されてもよく、ここでＬＤＲ産物は、リアルタイムＰＣＲ読出しに類似する相対的な定量的結果をもたらす（図１４の概略を参照）。この構成において、２４個の個々のサンプルからの種々の血液画分から単離したＤＮＡ及びＲＮＡをマルチプレックスＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲに供し、次いで、縦列（例えばマイクロタイタープレートの１６個のウェル）に分配し、固体支持体上で捕捉する（図１５及び１６を参照）。ＬＤＲプローブを横列にわたって加え、正しい標的でのライゲーションが生成物を捕捉する一方、未反応のプライマーは洗い流される（図１７）。図１８ではＬＤＲ−ＦＲＥＴの結果をそれぞれのウェルで示しているが、このモジュールでは、キャピラリー電気泳動を使用して生成物を選択的に変性及び計算し、定量的結果をもたらしてもよい。この図（図１８）において、サンプル番号２及び１５は＞５の位置で強力なシグナルを有するため、陽性と推定されるが、４つの弱いシグナルを有するサンプル８も、更なる処理を受けなければならない。
【００５８】
２つのモジュールはまた、「ピクセル」ＰＣＲ／ＬＤＲを可能にする空間的多重化により、単一のサンプルを処理するように構成されてもよく、ここでＬＤＲ産物は、デジタルＰＣＲに類似するが、より高いレベルの多重化における、元の標的分子の計算を可能にする（図１９）。この構成において、単一のサンプルからのＤＮＡ及びＲＮＡを、いくつかのチャンバが、１つの標的分子を有するか、あるいは標的分子を有しないように、マルチプレックスＰＣＲの前に２４個のチャンバに分配する（図２０）。単位複製配列を縦列、例えばマイクロタイタープレートの１６個のウェルに分配し、固体支持体上で捕捉する（図２０及び２１）。ＬＤＲプローブの付加、及びＬＤＲ産物の検出は上記のとおりである（図２２及び２３）。ＬＤＲ値を元の混合物中の単一の分子の整数倍（即ち０、１、２等）を表し、ポアソン分布に基づき結果を解釈する。図２９及び３０は、それぞれ２４個のウェルでの６〜４８個、及び１２〜９６個の分子のポアソン分布を示し、かつ、図３１及び３２は、それぞれ４８個のウェルでの１２〜９６個及び２４〜１９２個の分子のポアソン分布を示す。図２３・列Ａは、（アドレス番号：最初の標的分子の数）：（１７：０；６：１；１：２）を示し、８個の分子に対応する。図２３・列Ｋは（７：０；１０：１；５：２；２：４）を示し、約３０個の分子に対応する。
【００５９】
図２４〜２８でｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ定量化について示したように、異なる形態の希釈及び分配を用いて、より広範囲にわたって分子を計算してもよい。ここで、例えば、最初のサンプルを８個のチャンバに分配し、１０倍希釈して別の８個のチャンバに分配する（図２５）。サンプルを多重ＲＴ−ＰＣＲに供し、縦列に分配する。ＲＴ−ＰＣＲ産物を固体支持体上で捕捉し（図２６）、ＬＤＲプライマーセットを横列にわたって加える（図２７を参照）。２４個のチャンバの例に関しては、３等級にわたって定量化が可能であるが、４８個のチャンバでは、６等級にわたる違いをカバーすることが可能である（図３３〜３７のポアソン分布を参照）。図２８・列Ｇに示す例において、最初の２つの希釈溶液は、最後の８個のウェル（１：０；３：１；３：２；１：４）よりも高いシグナルを与え、これは約１４〜１６×１００×１．２５＝１，７５０〜２，０００個の分子に対応する。対照的に、図２８・列Ｎは、最初の８個のウェルの分布（４：０；３：１；１：２）のみにシグナルを与え、これは約５〜６×１．２５＝６〜８個の分子に対応する。
【００６０】
偽陽性及びキャリーオーバーからの保護
所望の疾病特異的な核酸の相違から生成した正しいシグナルと、サンプル中に存在する通常の核酸から生成した間違ったシグナルと、疾病特異的な核酸の相違の不在下で生成した間違ったシグナル（即ち、体細胞突然変異）とを識別する技術的課題が存在する。
【００６１】
これらの課題に対する解決策のいくつかを以下に示すが、これらはいくつかの共通したテーマを分かち合っている。
【００６２】
最初のテーマは多重化である。ＰＣＲは、プライマー濃度が比較的高い（５０ｎＭ〜５００ｎＭ）時に最も良く機能し、多重化を制限する。更に、ＰＣＲプライマー対が追加されればされるほど、正しくない生成物が増幅する、またはプライマー二量体が作製される可能性が指数的に増加する。対照的に、ＬＤＲプローブについては、４ｎＭ〜２０ｎＭのオーダーの低濃度を用い、標的に隣接してハイブリダイゼーションさせることによりプローブ二量体を制限し、ライゲーション現象を可能にする。ユニバーサルプライマー配列「尾部」を含有する、低濃度の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーまたはＬＤＲプローブを用いることにより、より高濃度のユニバーサルプライマーを後で追加し、最初のＰＣＲまたはＬＤＲ産物の比例増幅を達成することが可能になる。間違ったＰＣＲ単位複製配列またはプライマー二量体を避ける、または最小限に抑えるための別の方法は、いくつかの過剰の塩基及びブロック基を含有するＰＣＲプライマーを用いることであり、標的にハイブリダイゼーションした場合にのみ、ブロック塩基はヌクレアーゼによる切断により遊離し、遊離３’ＯＨを形成する（例えば、ブロック基としてリボヌクレオチド塩基、及び切断ヌクレアーゼとしてＲＮａｓｅ  Ｈ２）。
【００６３】
第２のテーマは、投入標的核酸が少量であることによる、シグナルのゆらぎである。多くの場合、標的核酸はわずかの細胞に由来しており、ＣＴＣとして捕捉した、または、アポトーシスを受けた腫瘍細胞がそのＤＮＡを小断片（１４０〜１６０ｂｐ）として放出したもののいずれかである。かかる条件下では、少数の開始分子を（リアルタイム、または液滴ＰＣＲ定量化のために）個々のウェルに分配する場合に、シグナルを完全に見失うことを避けるために、あるいはゆらぎのために不正確なコピー数を報告することを避けるために、いくつかのレベルの比例増幅を実施することが好ましい。これらの最初のユニバーサル増幅が合理的な水準（およそ１２〜２０サイクル）で維持される限り、チューブを開け、（リアルタイム、または液滴ＰＣＲを使用する）後の検出／定量化のために単位複製配列を分配する間のキャリーオーバー汚染のリスクは、最小限に抑えられる。
【００６４】
第３のテーマは、「非鋳型対照」（ＮＴＣ）としても知られる、標的に依存しないシグナルである。これは、正しい標的の不在下で生じるポリメラーゼまたはリガーゼ反応から生じる。このシグナルのいくつかは、賢明なプライマー設計により最小限に抑えられ得る。ライゲーション反応に関して、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を使用して（標的にハイブリダイゼーションした場合にのみ）下流ライゲーションプライマーの５’リン酸基を遊離してもよく、これはライゲーションに適している。低いレベルの変異の存在を識別するための更なる特異性は、（ｉ）３’ＯＨから２番目または３番目の位置にミスマッチを含有する上流ＬＤＲプローブを用いること、（ｉｉ）（任意に）ライゲーションするが、更なる増幅は受けない野生型配列に対するＬＤＲプローブを用いること、並びに、（ｉｉｉ）いくつかの過剰の塩基及びブロック基（相補性標的（例えばＲＮａｓｅ  Ｈ２及びリボヌクレオチド塩基）にハイブリダイゼーションした場合にのみヌクレアーゼによる切断で遊離し、遊離３’ＯＨを形成する）を含有する上流ＬＤＲプローブを用いること、により達成することができる。
【００６５】
第４のテーマは、反応で使用されなかったプライマーによる、抑制された（減少した）増幅または正しくない（間違った）増幅のいずれかである。かかる未使用のプライマーを除去するための１つのアプローチは、固体支持体上で遺伝子または標的または増幅標的ＤＮＡを捕捉し、ライゲーションプローブのハイブリダイゼーションとライゲーションを可能にし、次いで、ハイブリダイゼーションしていないプローブまたは生成物を除去することである。代替の解決策としては、プロセス中に第２のレベルの選択が存在するような、プレ増幅に続く、後のネステッドＬＤＲ及び／またはＰＣＲ工程が挙げられる。
【００６６】
第５のテーマはキャリーオーバー防止である。キャリーオーバーシグナルは、ユニバーサル増幅工程中の標準的なウラシル導入、並びに、プレ増幅処理手順におけるＵＤＧ（及び所望によりＡＰエンドヌクレアーゼ）の使用により除去されてもよい。キャリーオーバー防止の組み込みは、以下でより詳細に記載する本発明の方法の中核をなす。最初のＰＣＲ増幅を、ウラシルの組み込みを用いて実施する。ＬＤＲ反応を、ウラシルを欠くＬＤＲプローブを用いて実施する。したがって、ＬＤＲ産物をリアルタイムＰＣＲ定量化に供す場合、ＵＤＧの添加により最初のＰＣＲ産物は破壊されるが、ＬＤＲ産物は破壊されない。更に、ＬＤＲは直線的なプロセスであり、タグプライマーは、ヒトゲノムに存在しない配列を用いるため、元のＰＣＲに戻るＬＤＲ産物の偶然のキャリーオーバーは、鋳型とは無関係の増幅を引き起こさない。メチル化標的を有するキャリーオーバー防止を提供する更なるスキームとしては、増幅前、または後述のアプローチを用いる場合には亜硫酸水素塩処理の後で制限エンドヌクレアーゼを用いることが挙げられる。
【００６７】
病気マーカーの識別方法
本発明の第１の態様は、サンプルにおいて、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が該サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法に関する。本方法は、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基が他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を潜在的に含有するサンプルを提供すること、並びに、該サンプルを、サンプル中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが提供され、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列に隣接する配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触したサンプルを、１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和してポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和しライゲーション反応混合物を形成することを含む。各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）標的ヌクレオチド配列特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここでプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物に相補的な標的ヌクレオチド配列上で、間に接合部を有して互いに隣接するようにハイブリダイゼーションするように構成される。１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを互いにライゲーションして、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、そしてまたサンプル中のライゲーション産物配列を検出し識別して、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写配列、及び／または１つ以上のメチル化残基がサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の存在を識別する。
【００６８】
図３８〜４４は、本発明の本態様の種々の実施形態を示す。
【００６９】
図３８（工程Ａ〜Ｆ）は、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡから変異を検出するための例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、工程Ａに示すように、ゲノムＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を単離することにより開始する。図３８（工程Ｂ）に示すように、ＤＮＡサンプルを、サンプル中に存在し得るデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な酵素で処理する。好適な酵素としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ  ＵＤＧ、またはヒト一本鎖選択的単機能性ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＳＭＵＧ１）が挙げられるが、これらに限定されない。次に、サンプルを増幅反応（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））に供し、対象の変異を含有する領域を増幅する。遺伝子特異的プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して増幅反応を実施する。一実施形態では、サイクルを制限した増幅（１２〜２０サイクル）を実施し、作製される異なる単位複製配列の相対比率を維持する。別の実施形態では、対象領域は、２０〜４０サイクルを使用して増幅される。図３８・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。
【００７０】
図３８・工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。上流オリゴヌクレオチドプローブは、５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を含有し、下流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の増幅を可能にする３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）を含有する。ライゲーションに続いて、ライゲーション産物の一定量を、１つ以上のタグ特異的プライマーの対（各対は、マッチしたプライマーＡｉ及びＣｉを含む）を含有する個別のウェルに分取し、ＵＤＧまたは類似の酵素で処理を行い、増幅産物または汚染物質を含有するｄＵを取り除き、ＰＣＲ増幅して検出する。図３８・工程Ｅ及びＦに示すように、ライゲーション産物の検出を、従来のＴａｑＭａｎ（商標）検出アッセイを用いて実施することができる（米国特許第６，２７０，９６７号・Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、及び米国特許第７，６０１，８２１号・Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと：これら全体が参考として本明細書に組み込まれる）。ＴａｑＭａｎ（商標）を用いる検出に関して、ライゲーション接合部にまたがるオリゴヌクレオチドプローブを、増幅及び検出用のライゲーション産物のプライマー特異的部分でのハイブリダイゼーションに好適なプライマーと組み合わせて使用する。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、一端に蛍光性レポーター基（Ｆ１）、及び、他端に消光剤分子（Ｑ）を含有し、インタクトなプローブ中で消光剤分子は、レポーター基と互いに十分隣接しており、その蛍光を消光する。増幅の間、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ及び上流プライマーは、ライゲーション産物の相補領域にハイブリダイゼーションする。ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性はハイブリダイゼーションしたプライマーを伸長し、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの蛍光性基を遊離して検出可能なシグナルを生成する（図３８・工程Ｆ）。増幅反応中にｄＵＴＰを用いることによりｄＵを含有する生成物を生成し、この生成物は後で、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧを使用して破壊することができる。
【００７１】
図３９は、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡから変異を検出するための例示的なＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、工程Ａに示すように、ゲノムＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を単離することにより開始する。図３９・工程Ｂに示すように、ＤＮＡサンプルを、ＵＤＧ等のデオキシウラシル（ｄＵ）分解酵素で処理して、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解し、次に、増幅反応（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））に供し、対象の変異を含有する領域を増幅する。遺伝子座特異的プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して増幅反応を実施する。一実施形態では、サイクルを制限した増幅（１２〜２０サイクル）を実施し、作製される異なる単位複製配列の相対比率を維持する。別の実施形態では、対象領域は、２０〜４０サイクルを使用して増幅される。本実施形態において、遺伝子座特異的プライマーは５’プライマー領域（例えばユニバーサルプライマー領域）もまた含有し、この領域は、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする（図３９・工程Ｂ）。
【００７２】
図３９・工程Ｃに示すように、増幅産物は、キャリーオーバー防止を可能にするｄＵを組み込み、付加した５’ビオチン部位を介して固体支持体で捕捉される。図３９・工程Ｄに示すように、変異特異的ライゲーションプローブを使用して対象の変異を検出する。本実施形態において、第１のライゲーションプローブは、３’標的特異的領域、及び、ドナーまたはアクセプター部位を有する５’尾部配列を含有し、かつ、プローブセット内の第２のライゲーションプローブは、５’標的特異的領域、及びアクセプターまたはドナー部位を有する３’尾部配列を、それぞれ含有する。プローブセット内のライゲーションプローブの５’及び３’尾部配列は互いに相補的であり、アクセプター及びドナー基は、互いに極めて接近した場合、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により検出可能なシグナルを生成することができる。ライゲーションに続いて、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブを洗い流し、ライゲーション産物を固定した増幅産物から変性させる。変性の際に（図３９・工程Ｅ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部配列が互いにハイブリダイゼーションし、ドナー及びアクセプター基を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する。
【００７３】
本発明の本態様に従い形成したライゲーション産物は、ＦＲＥＴ検出の代替方法を用いて識別することができる。例えば、図３９・工程Ｆに示すように、上流プローブは、５’末端に蛍光性レポーター基、続いて尾部配列部分、消光基（例えばＺＥＮ）、及び標的特異的部分を含有してもよい。一本鎖形態において、Ｚｅｎ基により蛍光性基が消光される。上流及び下流ライゲーションプローブのライゲーション、並びに得られるライゲーション産物の変性の際に、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部部分がハイブリダイゼーションし、短い二本鎖部分を形成する。この形態において、レポーター基は消光基により消光されず、検出可能なシグナルが生成される。
【００７４】
図３９は、固体支持体上で伸長生成物を捕捉するための、ビオチン化ユニバーサルプライマー−ストレプトアビジンコーティング表面アプローチを示す。かかる捕捉は、ライゲーション工程の前または後に行ってもよい。固体支持体上で生成物を結合する他のアプローチとしては、ＰＣＲ増幅の前に、固体支持体にユニバーサルプライマーの一部または大部分を共有結合することが挙げられる。
【００７５】
ビオチン−ストレプトアビジンを使用したポリメラーゼ伸長生成物の捕捉に加えて、５’末端に捕捉配列、ポリメラーゼ伸長ブロック基、及び３’末端にユニバーサルまたは標的特異的部分を含むように、プライマーを設計することができる。増幅後、生成物の５’捕捉配列部分は一本鎖であり、もしそれが長い、かつ／またはＧＣリッチな配列である場合、非捕捉鎖の変性、または切断（例えばλエキソヌクレアーゼ切断）による除去を可能にする条件下において、相補配列上で捕捉されてもよい。プライマー、捕捉プローブ配列、または両方の中にＰＮＡ、ＬＮＡ、または他のヌクレオチド類似体を用いることにより、捕捉工程を向上してもよい。
【００７６】
別の実施形態において、（アジドへの）銅非含有クリックケミストリー用のジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）；（アジドへの）クリックケミストリー用の５−オクタジイニルｄＵ；アミノ修飾剤Ｃ６  ｄＴ（ペプチド結合用）；または、アルケンもしくはＤＢＣＯへのクリックケミストリー用のアジドを使用して、固体表面にプライマーを共有結合してもよい。
【００７７】
図４０は、変異を検出するための、別の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図４０・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する。本実施形態において、３’末端に切断可能なブロック基を含有する遺伝子座特異的ＰＣＲプライマーを使用して、最初の増幅を実施する。ブロック基は、非標的特異的ポリメラーゼ伸長及び増幅を防止する。図４０・工程Ｂに示すように、好適なブロック基は、プライマーがその相補的配列にハイブリダイゼーションする際にのみＲＮａｓｅ−Ｈ（星印）により切断されるＲＮＡ塩基（ｒ）である（例えば、Ｄｏｂｏｓｙ  ｅｔ．ａｌ．“ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋｅｄ  Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒｓ，”  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（８０）：１０１１（２０１１）を参照：その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。ＲＮＡ塩基の切断により、ポリメラーゼによる伸長に好適な３’ＯＨを遊離させる。
【００７８】
プライマーブロック基の切断に続き、対象の領域を増幅し、ＰＣＲ産物は、キャリーオーバー防止を可能にするｄＵを含有する（図４０・工程Ｃ）。次に、プライマータグ（Ａｉ及びＣｉ’）を含有する標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを塩基特異的な方法で増幅産物にハイブリダイゼーションし、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に、リガーゼ（塗りつぶした円）が２つのオリゴヌクレオチドを共有結合により閉じる（図４０・工程Ｄ）。マッチするプライマーの対（Ａｉ及びＣｉ）、並びに、図３８に記載するようにライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用してライゲーション産物を検出する（図４０・工程Ｅ〜Ｆを参照）。
【００７９】
図４１は、変異を検出するための、別の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図４１・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図４１・工程Ｂ）。遺伝子特異的プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を増幅する。一実施形態では、サイクルを制限した増幅（１２〜２０サイクル）を実施し、作製される異なる単位複製配列の相対比率を維持する。別の実施形態では、対象領域は、２０〜４０サイクルを使用して増幅される。図４１・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。
【００８０】
図４１・工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。本実施形態において、対象の変異を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の検出を容易にする５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を更に含有する一方、野生型（非変異）核酸配列を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、５’プライマー特異的部分を含有しない。変異及び野生型配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは、変異を検出するのに特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後の変異ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする、３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）を含有する。この図の工程Ｄに示すように、上流ライゲーションプローブに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図４１・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、マッチするプライマーの対（Ａｉ及びＣｉ）、並びに、図３８に記載するようにライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図４１・工程Ｅ〜Ｇを参照）、または、当該技術分野において公知の他の好適な手段を使用して、ライゲーション産物を検出することができる。
【００８１】
図４２は、変異を検出するための別の例示的なＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図４２・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図４２・工程Ｂ）。遺伝子座特異的プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を増幅する。本実施形態において、遺伝子座特異的プライマーは、５’プライマー領域（例えば、ユニバーサルプライマー領域）もまた含有する。かかる配列は、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することができる（図４２・工程Ｂ）。図４２・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、変異特異的ライゲーションプローブを使用して対象の変異を検出する。本実施形態において、変異核酸配列を検出可能な（しかし、野生型配列は検出しない）ライゲーション対のライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、図３９で上述したように互いに極めて接近した場合に、ＦＲＥＴにより検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。この図の工程Ｄに示すように、上流ライゲーションプローブに３’切断可能ブロック基（例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図４２・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて（図４２・工程Ｅ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図４２・工程Ｆ）。 
【００８２】
図４３は、変異を検出するための別の例示的なＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図４３・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図４３・工程Ｂ）。遺伝子特異的プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を増幅する。本実施形態において、遺伝子座特異的プライマーは、５’プライマー領域（例えば、ユニバーサルプライマー領域）もまた含有する。これらの領域は、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする（図４３・工程Ｂ）。図４３・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、変異特異的ライゲーションプローブを使用して対象の変異を検出する。本実施形態において、図４３・工程Ｄに示すように、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブを、第１のオリゴヌクレオチドプローブの最も３’側の塩基が、すぐ隣にある、標的核酸分子に相補的な第２のオリゴヌクレオチドプローブの最も５’側の塩基とオーバーラップするように設計する。オーバーラップするヌクレオチドは、「フラップ」と呼ばれる。第２のオリゴヌクレオチドプローブのオーバーラップするフラップヌクレオチドが、標的核酸分子配列に相補的であり、かつ第１のオリゴヌクレオチドプローブの末端３’ヌクレオチドと同一の配列である場合、第２のオリゴヌクレオチドプローブのフラップヌクレオチドのすぐ上流のホスホジエステル結合が、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）または５’ヌクレアーゼ活性（例えばＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ）を有する酵素により識別されて切断される。この特異的ＦＥＮ活性は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの隣接３’ＯＨの傍らに正確に位置する第２のオリゴヌクレオチドプローブ上にライゲーション能のある５’リン酸基末端を作製する。（ａ）互いに隣接するオリゴヌクレオチドプローブによる標的特異的アニーリング、（ｂ）切断したフラップヌクレオチドが鋳型にマッチする場合のみの、５’リン酸基の選択的生成、及び（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプローブの３’塩基に対して、非ワトソン・クリック塩基対を識別するリガーゼの付加、の結果として、非常に高い標的検出特異性及び選択性が達成される。本実施形態に従うと、ライゲーション用のオリゴヌクレオチドプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、図３９で上述したように互いに極めて接近した場合に、ＦＲＥＴにより検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基もまた含有する。ライゲーションに続いて（図４３・工程Ｅ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図４３・工程Ｆ）。
【００８３】
図４４は、変異を検出するための別のＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図４４・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図４４・工程Ｂ）。遺伝子特異的プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を増幅する。本実施形態において、検出を容易にするためのＵｎｉＴａｑプライマー及びタグ配列を含有するように、ライゲーションプローブを設計する。ＵｎｉＴａｑシステムは、米国特許公開第２０１１／０２１２８４６号（Ｓｐｉｅｒ）に完全に記載されており、その全体が参照として本明細書に組み込まれている。ＵｎｉＴａｑシステムは、図４４・工程Ｄに示すように、３つの独自の「タグ」配列の使用を伴い、独自のタグ配列の少なくとも１つ（Ａｉ）は第１のオリゴヌクレオチドプローブに存在し、第２及び第３の独自のタグ部分（Ｂｉ’及びＣｉ’）は、第２のオリゴヌクレオチドプローブ中に存在する。プローブセット内のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションの際に、得られるライゲーション産物はＡｉ配列−標的特異的配列−Ｂｉ’配列−Ｃｉ’配列を含有する。ＵｎｉＴａｑアプローチの本質は、ライゲーションプローブの両方のオリゴヌクレオチドプローブが、陽性シグナルを得るために正しい必要があることであり、これにより、高度に多重化した核酸の検出が可能となる。例えば、そして本明細書に記載するように、このことは、２つの対、即ちタグの２つの互いのハイブリダイゼーションを必要とすることにより達成される。
【００８４】
ライゲーション産物の検出の前に、サンプルをＵＤＧで処理して元の標的単位複製配列を破壊し、本物のライゲーション産物のみが検出されることを可能にする。検出に関して、Ａｉ（第１のプライマー特異的部分）、Ｂｉ’（ＵｎｉＴａｑ検出部分）、及びＣｉ’（第２のプライマー特異的部分）を含有するライゲーション産物を、Ａｉと同じヌクレオチド配列を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、Ｃｉ’に相補的（即ちＣｉ）な第２のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して両方の鎖でプライミングする。第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、一端に検出可能な標識Ｆ１、及び他端に消光剤分子（Ｑ）を有するＵｎｉｔａｑ検出プローブ（Ｂｉ）（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ）もまた含む。任意で消光剤に隣接して配置されるのは、ポリメラーゼブロックユニット、例えばＨＥＧ、ＴＨＦ、Ｓｐ−１８、ＺＥＮ、または、ポリメラーゼ伸長を停止するのに十分な、当該技術分野において公知の任意の他のブロッカーである。図４４・工程Ｆに示すように、ＰＣＲ増幅により二本鎖生成物の形成がもたらされる。本実施例では、生成物のボトム鎖が、一本鎖となったときにヘアピンを形成することができないように、ポリメラーゼブロックユニットが、ポリメラーゼによる第１のユニバーサルプライマーの５’部分（Ｂｉ）のコピーを防止する。かかるヘアピンの形成は、この３’末端のポリメラーゼ伸長がＰＣＲ反応を終結するような、ステムの３’末端の、単位複製配列へのアニーリングをもたらす。
【００８５】
二本鎖ＰＣＲ産物を変性させ、後で温度が低下した場合に、生成物のトップ鎖が、第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’部分（Ｂｉ）と、鎖の反対端の部分Ｂｉ’の間にステムを有するヘアピンを形成する（図４４・工程Ｇ）。この工程の間ではまた、第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、ヘアピン形成した生成物の５’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）にアニーリングする。工程Ｇでの第２のユニバーサルプライマーの伸長の際に、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性が、検出可能な標識Ｄ１、または消光剤分子を単位複製配列の５’末端から切断することにより、標識と消光剤との間の距離を増加させて、標識の検出を可能にする。
【００８６】
図１４５は、低いレベルの変異を検出するための他の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１４５・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図１４５・工程Ｂ）。変異選択的上流プライマー、遺伝子座特異的下流プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を選択的に増幅する。この図に示すように、上流変異特異的プライマーに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及び変異特異的ＲＮＡ塩基（ｍｒ）を含めることにより、別の層の選択性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる（図１４５・工程Ｂ）。ＲＮａｓｅＨは、変異ＤＮＡに完全にマッチする場合にＲＮＡ塩基を優先的に切断するが、野生型ＤＮＡにハイブリダイゼーションした場合、ＲＮＡ塩基を切断する可能性は低い。切断反応が生じると、ポリメラーゼは遊離３’ＯＨを確実に伸長し、標的の変異または野生型塩基をコピーする。したがって、アリル特異的ＰＣＲとは対照的に、ＰＣＲプライマーは、プライマーにより誘導された変異を増殖しない。代わりに、ハイブリダイゼーション、切断、伸長、及び変性のサイクルを繰り返すことにより塩基をコピーすることにより、このＰＣＲは、各サイクルの増幅中に選択的に、野生型標的よりも変異標的を増幅する。野生型配列を有する任意のプライマーはＲＮＡ塩基を欠いてブロックされたままであるため、野生型配列の増幅を更に減らす。所望により、ＰＣＲの前に一定量のサンプルを２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１４５・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。
【００８７】
図１４５・工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。本実施形態において、対象の変異を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の検出を容易にする５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を更に含有する一方、野生型（非変異）核酸配列を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、５’プライマー特異的部分を含有しない。変異及び野生型配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは、変異を検出するのに特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後の変異ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする、３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）を含有する。この図の工程Ｄに示すように、上流ライゲーションプローブに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１４５・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、マッチするプライマーの対（Ａｉ及びＣｉ）、並びに、図３８に記載するようにライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図１４５・工程Ｅ〜Ｇを参照）、または、当該技術分野において公知の他の好適な手段を使用して、ライゲーション産物を検出することができる。
【００８８】
図１４６は、低いレベルの変異を検出するための他の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１４６・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図１４６・工程Ｂ）。変異選択的上流プライマー、遺伝子座特異的下流プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を選択的に増幅する。この図に示すように、上流変異特異的プライマーに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及び変異特異的ＲＮＡ塩基（ｍｒ）を含めることにより、別の層の選択性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる（図１４６・工程Ｂ）。ＲＮａｓｅＨは、変異ＤＮＡに完全にマッチする場合にＲＮＡ塩基を優先的に切断するが、野生型ＤＮＡにハイブリダイゼーションした場合、ＲＮＡ塩基を切断する可能性は低い。切断反応が生じると、ポリメラーゼは遊離３’ＯＨを確実に伸長し、標的の変異または野生型塩基をコピーする。したがって、アリル特異的ＰＣＲとは対照的に、ＰＣＲプライマーは、プライマーにより誘導された変異を増殖しない。代わりに、ハイブリダイゼーション、切断、伸長、及び変性のサイクルを繰り返すことにより塩基をコピーすることにより、このＰＣＲは、各サイクルの増幅中に選択的に、野生型標的よりも変異標的を増幅する。野生型配列を有する任意のプライマーはＲＮＡ塩基を欠いてブロックされたままであるため、野生型配列の増幅を更に減らす。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１４６・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。
【００８９】
図１４６・工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。本実施形態において、対象の変異を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の検出を容易にする５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を更に含有する一方、野生型（非変異）核酸配列を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、５’プライマー特異的部分を含有しない。変異及び野生型配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは、変異を検出するのに特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後の変異ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする３’プライマー特異的部分（Ｂｉ’−Ｃｉ’）を含有する。この図の工程Ｄに示すように、上流ライゲーションプローブに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１４６・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（即ち、Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を使用してライゲーション産物を増幅し、図４４で上述したように検出する（図１４６・工程Ｅ〜Ｈを参照）か、または当該技術分野において公知の他の好適な手段を使用して検出する。
【００９０】
図１４７は、低いレベルの変異を検出するための他の例示的なＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１４７・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図１４７・工程Ｂ）。変異選択的上流プライマー、遺伝子座特異的下流プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を選択的に増幅する。この図の工程Ｂに示すように、上流変異特異的プライマーに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及び変異特異的ＲＮＡ塩基（ｍｒ）を含めることにより、別の層の選択性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる（図１４７・工程Ｂ）。ＲＮａｓｅＨは、変異ＤＮＡに完全にマッチする場合にＲＮＡ塩基を優先的に切断するが、野生型ＤＮＡにハイブリダイゼーションした場合、ＲＮＡ塩基を切断する可能性は低い。切断反応が生じると、ポリメラーゼは遊離３’ＯＨを確実に伸長し、標的の変異または野生型塩基をコピーする。したがって、アリル特異的ＰＣＲとは対照的に、ＰＣＲプライマーは、プライマーにより誘導された変異を増殖しない。代わりに、ハイブリダイゼーション、切断、伸長、及び変性のサイクルを繰り返すことにより塩基をコピーすることにより、このＰＣＲは、各サイクルの増幅中に選択的に、野生型標的よりも変異標的を増幅する。野生型配列を有する任意のプライマーはＲＮＡ塩基を欠いてブロックされたままであるため、野生型配列の増幅を更に減らす。本実施形態において、下流遺伝子座特異的プライマーは、ビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することが可能となる５’プライマー領域（例えばユニバーサルプライマー領域）もまた含有する。（図１４６・工程Ｂ）。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１４７・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、変異特異的ライゲーションプローブを使用して対象の変異を検出する。本実施形態において、変異核酸配列を検出可能な（しかし、野生型配列は検出しない）ライゲーション対のライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、図３９で上述したように互いに極めて接近した場合に、ＦＲＥＴにより検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。この図に示すように、上流ライゲーションプローブに３’切断可能ブロック基（例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１４７・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて（図１４７・工程Ｅ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプタ���部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図１４７・工程Ｆ）。
【００９１】
図１４８は、低いレベルの変異を検出するための他の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１４８・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図１４８・工程Ｂ）。遺伝子座特異的上流プライマー、遺伝子座特異的下流プライマー、野生型配列を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブ、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を選択的に増幅する。本実施形態において、上流プライマーに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の選択性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）が変異の数塩基上流にあるＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる（図１４８・工程Ｂ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的にオーバーラップする野生型配列を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、上流プライマーよりも野生型配列への結合に優先的に競合するが、変異ＤＮＡへの結合にはさほど競合しないため、ＰＣＲの各ラウンドの間、野生型ＤＮＡの増幅を抑制する。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１４８・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。
【００９２】
図１４８・工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。本実施形態において、対象の変異を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の検出を容易にする５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を更に含有する。ここでもまた、野生型配列を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブの存在が、ＰＣＲ増幅工程の間に変異配列を濃縮した後で野生型標的配列が存在する場合でも、野生型標的配列へのライゲーションを抑制する。変異及び野生型配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは、変異を検出するのに特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後の変異ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする、３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）を含有する。この図の工程Ｄに示すように、上流ライゲーションプローブに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１４８・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、マッチするプライマーの対（Ａｉ及びＣｉ）、並びに、図３８で上述したライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図１４８・工程Ｅ〜Ｇを参照）、または、当該技術分野において公知の他の好適な手段を使用して、ライゲーション産物を検出することができる。
【００９３】
図１４９は、低いレベルの変異を検出するための他の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１４９・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図１４９・工程Ｂ）。変異の数塩基上流に、３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含む上流遺伝子座特異的プライマーを設計する。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨを遊離させる（図１４９・工程Ｂ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的にオーバーラップする野生型配列を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、上流プライマーよりも野生型配列への結合に優先的に競合するが、変異ＤＮＡへの結合にはさほど競合しないため、ＰＣＲの各ラウンドの間、野生型ＤＮＡの増幅を抑制する。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１４８・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。
【００９４】
図１４９・工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。本実施形態において、対象の変異を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の検出を容易にする５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を更に含有する。ここでもまた、野生型配列を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブの存在が、ＰＣＲ増幅工程の間に変異配列を濃縮した後で野生型標的配列が存在する場合でも、野生型標的配列へのライゲーションを抑制する。変異体及び野生型配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは、変異を検出するのに特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後の変異ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする、３’プライマー特異的部分（Ｂｉ−Ｃｉ’）を含有する。この図の工程Ｄに示すように、上流ライゲーションプローブに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１４９・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（即ち、Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を使用してライゲーション産物を増幅し、図４４で上述したように検出する（図１４９・工程Ｅ〜Ｈを参照）か、または当該技術分野において公知の他の好適な手段を使用して検出する。
【００９５】
図１５０は、低いレベルの変異を検出するための他の例示的なＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１５０・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図１５０・工程Ｂ）。変異の数塩基上流に３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含む上流遺伝子座特異的プライマーを設計する。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨを遊離させる（図１５０・工程Ｂ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的にオーバーラップする野生型配列を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、上流プライマーよりも野生型配列への結合に優先的に競合するが、変異ＤＮＡへの結合にはさほど競合しないため、ＰＣＲの各ラウンドの間、野生型ＤＮＡの増幅を抑制する。本実施形態において、下流遺伝子座特異的プライマーは、ビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することが可能となる５’プライマー領域（例えばユニバーサルプライマー領域）もまた含有する。（図１５０・工程Ｂ）。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１５０・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、変異特異的ライゲーションプローブを使用して対象の変異を検出する。ここでもまた、野生型配列を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブの存在が、ＰＣＲ増幅工程の間に変異配列を濃縮した後で野生型標的配列が存在する場合でも、野生型標的配列へのライゲーションを抑制する。本実施形態において、変異核酸配列を検出可能な（しかし、野生型配列は検出しない）ライゲーション対のライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、図３９で上述したように互いに極めて接近した場合に、ＦＲＥＴにより検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。この図に示すように、上流ライゲーションプローブに３’切断可能ブロック基（例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１５０・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて（図１５０・工程Ｅ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図１５０・工程Ｆ）。
【００９６】
本発明の本態様の別の実施形態において、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする野生型核酸分子のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する５’部分を含むが、標的核酸分子内の対応するヌクレオチド配列部分とミスマッチする１つ以上のヌクレオチド配列を有する。
【００９７】
本実施形態に従うと、５’ヌクレアーゼ、３’ヌクレアーゼ、及び鎖置換活性を欠くポリメラーゼを提供する。所望により、一次オリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲのハイブリダイゼーション工程中に切断され、前記伸長処理の前にオリゴヌクレオチドプライマーの遊離３’ＯＨ末端を遊離する、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もまた含有してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、反応からの伸長生成物が互いに分離される変性処理、第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーから生じる伸長生成物にハイブリダイゼーションするハイブリダイゼーション処理を含む、１回以上の追加のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供す。第２の一次オリゴヌクレオチドから生じる伸長生成物は、伸長生成物中の３’末端と相補配列との間で分子内ループ−ヘアピンを形成することができ、この伸長生成物は、（ｉ）変異標的配列にハイブリダイゼーションした場合、自身の伸長を阻害する、３’末端もしくはその付近のミスマッチを含むか、または、（ｉｉ）野生型標的配列にハイブリダイゼーションした場合、自身の伸長を高める、３’末端でのマッチを含む。第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから生じる伸長生成物にハイブリダイゼーションする。第１の一次プライマーからの伸長生成物は、伸長生成物内の５’部分と相補配列との間に、分子内ループ−ヘアピンを形成する。ＰＣＲの伸長工程の間、第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、（ｉ）変異標的配列を含む伸長生成物にて選択的に伸長することにより、変異標的ヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む一次伸長生成物を選択的に形成するか、または（ｉｉ）前記標的での、以前の自身のハイブリダイゼーション及び自身の伸長により、野生型標的ヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む一次伸長生成物の形成が阻害される。第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーは標的配列に関係なく伸長生成物を伸長し、ここで変異配列は、第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーの標的またはそのコピーへのハイブリダイゼーションにより生じる異なる一次伸長生成物により選択的に増幅され、ポリメラーゼ連鎖反応の間に、変異配列伸長生成物及びその相補鎖の濃縮をもたらす。
【００９８】
図１５４及び１５５は、本発明の本態様の上記実施形態を表す。図１５４に示すように、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１５４・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図１５４・工程Ｂ）。伸長生成物がループ−ヘアピンを形成可能となるように、プライマーがハイブリダイゼーションする野生型核酸分子のヌクレオチド配列部分と同じヌクレオチド配列を有する５’部分を含む遺伝子座特異的上流プライマーを使用して、対象の領域を選択的に増幅する。即ち、上流プライマーの５’部分は、アンチセンス野生型ＤＮＡ鎖内の配列部分と同じ、または、センス野生型ＤＮＡ鎖内の配列部分に相補的なヌクレオチド配列を含有する。増幅反応は、遺伝子座特異的下流プライマー、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物もまた含有する。この図の工程Ｂに示すように、上流変異特異的プライマーに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の選択性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる（図１５４・工程Ｂ）。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１５４・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。５’ヌクレアーゼ、３’ヌクレアーゼ、及び鎖置換活性を欠くポリメラーゼによりＰＣＲを行う。図１５４・工程Ｄは更に、後のＰＣＲのラウンドの間に、（ｉ）変性した野生型ボトム鎖が、ポリメラーゼにより伸長される、３’末端に完全なマッチを有するループ−ヘアピンを形成し、（ｉｉ）変性した変異ボトム鎖は、通常ポリメラーゼにより伸長されない、３’末端にて少なくとも１つのミスマッチ塩基を有するループ−ヘアピンを形成し、（ｉｉｉ）変性したトップ鎖は５’側に、７２℃でのＰＣＲの伸長工程の間に変性するループ−ヘアピンを形成することを示す。図１５４・工程Ｅは更に、（ｉ）野生型ＤＮＡでのループ−ヘアピンの伸長後、伸長したヘアピン配列は７２℃では変性せず、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを防止することを示す。しかし、変異ＤＮＡ（ｉｉ）のループ−ヘアピン配列は３’ミスマッチ塩基により伸長しないため、７２℃で変性し、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを可能にする。同様に、トップ鎖生成物（ｉｉｉ）は７２℃で変性し、ポリメラーゼが完全長ボトム鎖を生成することを可能にする。野生型（ｉ）及び変異（ｉｉ）鋳型による、上流プライマーのループ−ヘアピン伸長選択性の差は、増幅の各サイクルの間における野生型生成物の選択的除去をもたらすため、変異ＤＮＡの選択的増幅をもたらす。ハイブリダイゼーションした際にループ−ヘアピンを伸長する３’末端での変異体と野生型ＤＮＡの伸長効率の相違は、上流プライマーの５’部分の末端から２番目または３番目の位置において、野生型ＤＮＡに対してミスマッチを含有するように設計するこ���により、更に高められてもよい。ボトムプライマーからの伸長生成物は、野生型配列にセルフハイブリダイゼーションする場合、３’末端から２番目または３番目の位置において１個だけのミスマッチを生成し、これはポリメラーゼを用いて容易に伸長するが、変異配列にセルフハイブリダイゼーションする場合は、３’末端にて２個のミスマッチを生成し、これはポリメラーゼを用いても伸長しない。
【００９９】
図１５４・工程Ｇに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。本実施形態において、対象の変異を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の検出を容易にする５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を更に含有する一方、野生型（非変異）核酸配列を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、５’プライマー特異的部分を含有しない。変異体及び野生型配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは、変異を検出するのに特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後の変異ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）を含有する。この図の工程Ｆに示すように、上流ライゲーションプローブに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１５４・工程Ｈ）。ライゲーションに続いて、マッチするプライマーの対（Ａｉ及びＣｉ）、並びに、図３８に記載するようにライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図１５４・工程Ｈ〜Ｊを参照）、または、当該技術分野において公知の他の好適な手段を使用してライゲーション産物を検出することができる。
【０１００】
図１５５は、変異を検出するための、他の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１５５・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをＵＤＧで処理し、サンプル中に存在し得るｄＵ含有核酸分子を分解する（図１５５・工程Ｂ）。（ｉ）伸長後にループ−ヘアピンの形成を可能にするトップ鎖の野生型配列に相補的な５’配列部分もまた含む遺伝子座特異的上流プライマー、（ｉｉ）遺伝子座特異的下流プライマー、及び（ｉｉｉ）ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、を使用して、対象の領域を選択的に増幅する。この図の工程Ｂに示すように、上流変異特異的プライマーに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の選択性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる（図１５５・工程Ｂ）。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１５５・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。５’ヌクレアーゼ、３’ヌクレアーゼ、及び鎖置換活性を欠くポリメラーゼによりＰＣＲを行う。図１５５・工程Ｄは更に、後のＰＣＲのラウンドの間に、（ｉ）変性した野生型ボトム鎖が、ポリメラーゼにより伸長される、３’末端に完全なマッチを有するループ−ヘアピンを形成し、（ｉｉ）変性した変異ボトム鎖は、通常ポリメラーゼにより伸長されない、３’末端にて少なくとも１つのミスマッチ塩基を有するループ−ヘアピンを形成し、（ｉｉｉ）変性したトップ鎖は５’側に、７２℃でのＰＣＲの伸長工程の間に変性するループ−ヘアピンを形成することを示す。図１５５・工程Ｅは更に、野生型ＤＮＡ（ｉ）でのループ−ヘアピンの伸長後、伸長したヘアピン配列は７２℃では変性せず、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを防止することを示す。しかし、変異ＤＮＡ（ｉｉ）のループ−ヘアピン配列は３’ミスマッチ塩基により伸長しないため、７２℃で変性し、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを可能にする。同様に、トップ鎖生成物（ｉｉｉ）は７２℃で変性し、ポリメラーゼが完全長ボトム鎖を生成することを可能にする。野生型（ｉ）及び変異（ｉｉ）鋳型による、上流プライマーのループ−ヘアピン伸長選択性の差は、増幅の各サイクルの間における野生型生成物の選択的除去をもたらすため、変異ＤＮＡの選択的増幅をもたらす。 
【０１０１】
本実施形態において、下流遺伝子座特異的プライマーは、ビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することが可能となる５’プライマー領域（例えばユニバーサルプライマー領域）もまた含有する。（図１５５・工程Ｂ）。ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、図１５５・工程Ｇに示すように、変異特異的ライゲーションプローブを使用して対象の変異体を検出する。本実施形態において、変異核酸配列を検出可能な（しかし、野生型配列は検出しない）ライゲーション対のライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、図３９で上述したように互いに極めて接近した場合に、ＦＲＥＴにより検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。この図に示すように、上流ライゲーションプローブに３’切断可能ブロック基（例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１５５・工程Ｇ）。ライゲーションに続いて（図１５５・工程Ｈ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図１５５・工程Ｉ）。
【０１０２】
本発明の方法で用いるライゲーション反応は、当該技術分野において周知である。プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブを互いにライゲーションする（所望により、後に続く第１のオリゴヌクレオチドプローブでの３’リボース及びブロック基の切断、または第２のオリゴヌクレオチドプローブで５’フラップを切断する）のに好適なリガーゼとしては、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ、大腸菌リガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、９°Ｎリガーゼ、及びパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）リガーゼ、または当該技術分野において周知の任意の他の熱安定性リガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従うと、本発明のヌクレアーゼ−ライゲーションプロセスは、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  Ｌｉｇａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−８０（１９８８）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，”ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  −−  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２２９−３７（１９８８）；及びＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９８８，６１７  （Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．）を参照）、相補性オリゴヌクレオチドプローブの１セットを用いるライゲーション検出反応（ＬＤＲ）（例えば、ＷＯ９０／１７２３９（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）、または、相補性オリゴヌクレオチドプローブの２つのセットを利用するライゲーション鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷＯ９０／１７２３（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）を用いることにより実施することができる。
【０１０３】
プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体、修飾ペプチドヌクレオチド類似体、修飾リン酸−糖骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及びこれらの組み合わせの形態とすることができる。
【０１０４】
熱ハイブリダイゼーション処理が好ましい、リガーゼ検出反応におけるハイブリダイゼーション工程は、ライゲーション接合部における識別ヌクレオチドに基づき、ヌクレオチド配列を識別する。標的ヌクレオチド配列の違いは、例えば、単一の核酸塩基の違い、核酸の欠失、核酸の挿入、または再配列とすることができる。２つ以上の塩基が関係するかかる配列の違いもまた検出可能である。オリゴヌクレオチドプローブセットは実質的に同一の長さを有し、実質的に類似したハイブリダイゼーション条件にて標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることが好ましい。
【０１０５】
種々のプローブ設計の特徴を用いることにより、リガーゼの識別を更に高めることができる。例えば、意図したミスマッチまたはヌクレオチド類似体（例えばイノシン、ニトロインドール、またはニトロピロール）を、３’接合部末端から２番目または３番目の塩基にて第１のオリゴヌクレオチドプローブに組み込むことで、３’末端で完全にマッチする場合、３’末端のハイブリダイゼーションをわずかに不安定化させるが、３’末端にてミスマッチする場合、３’末端のハイブリダイゼーションを著しく不安定化させることが可能となる。この設計により、変異プローブが野生型標的にハイブリダイゼーションした場合の不適切なミスライゲーションが減少する。あるいは、ＲＮａｓｅにより切断されるＲＮＡ塩基をオリゴヌクレオチドプローブに導入して、鋳型依存性の生成物形成を確実に行うことができる。例えば、Ｄｏｂｏｓｙ  ｅｔ．ａｌ．“ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋｅｄ  Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒｓ，”ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（８０）：１０１１（２０１１）（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）は、３’ブロック末端を有するオリゴヌクレオチドプローブの、３’末端の近くでＲＮＡ塩基を用い、３’末端をＲＮａｓｅ  Ｈ２で切断して、ＰＣＲで伸長可能及びライゲーション可能な３’−ＯＨを生成することについて記載している。５’−ＲＮＡ塩基をライゲーション可能なリガーゼを用いた場合、本アプローチを使用して、ライゲーション能のある３’ＯＨもしくは５’−Ｐのいずれか、または両方を生成することができる。
【０１０６】
他の可能な修飾としては、非塩基部位、例えば内部非塩基フランまたはオキソ−Ｇが挙げられる。これらの異常な「塩基」は特異的酵素により取り除かれ、ライゲーション能のある３’−ＯＨまたは５’Ｐ部位を生成する。エンドヌクレアーゼＩＶ、Ｔｔｈ  ＥｎｄｏＩＶ（ＮＥＢ）は、一本鎖ＤＮＡからではなく、ライゲーションオリゴヌクレオチドが標的核酸にアニーリングした後で、非塩基性残基を取り除く。同様に、オキソ−Ｇと共にＦｐｇを、またはイノシン／ウラシルと共にエンドＶを、またはチミングリコールと共にエンドＶＩＩＩを使用することができる。
【０１０７】
ＷＯ２０１３／１２３２２０（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）に記載されている、連結したヌクレアーゼ−リガーゼ反応を用いることによってもまた、ライゲーションの識別は高めることができる。本実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を有する一方、第２のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション能のない５’末端を有する（即ち、５’リン酸基を有しないオリゴヌクレオチドプローブ）。プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、第１のオリゴヌクレオチドプローブの最も３’側の塩基が、すぐ隣にある、標的核酸分子に相補的な第２のオリゴヌクレオチドプローブの最も５’側の塩基とオーバーラップするように設計される。オーバーラップするヌクレオチドは、「フラップ」と呼ばれる。第２のオリゴヌクレオチドプローブのオーバーラップするフラップヌクレオチドが、標的核酸分子配列に相補的であり、かつ第１のオリゴヌクレオチドプローブ末端３’ヌクレオチドと同じ配列である場合、第２のオリゴヌクレオチドプローブのフラップヌクレオチドのすぐ上流のホスホジエステル結合は、フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）または５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により識別されて切断される。この特異的ＦＥＮ活性は、第１のオリゴヌクレオチドプローブの隣接３’ＯＨの傍らに正確に配置された、第２のオリゴヌクレオチドプローブ上の新規のライゲーション能のある５’リン酸基末端を作製し、２つのプローブのライゲーションの発生を可能にする。本実施形態に従うと、ライゲーションの前に、第２のオリゴヌクレオチドプローブの５’フラップを切断するのに好適なフラップエンドヌクレアーゼまたは５’ヌクレアーゼとしては、５’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、並びにＴａｑ、及びＴ・サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、並びにＴ４ＲＮａｓｅＨ及びＴａｑＥｘｏからのポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
挿入または欠失に関して、第１のオリゴヌクレオチドプローブの接合部から２番目または３番目の位置に、マッチする塩基またはヌクレオチド類似体（例えば−アミノ−ｄＡ、または５−プロピニル−ｄＣ）を組み込むことにより安定性が改善され、そしてまたフレームシフトのような変異を野生型配列から識別することが改善される。挿入に関して、第２のオリゴヌクレオチドプローブの、所望の切断可能なリン酸結合の下流に１つ以上のチオリン酸基修飾ヌクレオチドを用いることにより、プローブが野生型ＤＮＡにハイブリダイゼーションする際に、５’ヌクレアーゼ酵素による不適切な切断が防止されるため、野生型標的での偽陽性ライゲーションが減少する。同様に、欠失に関して、第２のオリゴヌクレオチドプローブの、所望の切断可能なリン酸結合の上流に１つ以上のチオリン酸基修飾ヌクレオチドを用いることにより、プローブが野生型ＤＮＡにハイブリダイゼーションする際に、５’ヌクレアーゼ酵素による不適切な切断が防止されるため、野生型標的での偽陽性ライゲーションが減少する。
【０１０９】
本発明の方法を利用して、サンプル中の他の核酸配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる、１つ以上の標的核酸配列を識別することもできる。本発明の本態様に従うと、本方法は、サンプルを、少なくとも第１のメチル化感受性酵素と接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物の形成前に制限酵素反応混合物を形成することを更に含む。本発明の本態様に従うと、第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、１つ以上のメチル化残基の上流にある標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含み、第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、１つ以上のメチル化残基の下流にある標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む。
【０１１０】
第１のメチル化感受性酵素は、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含有するサンプル中の核酸分子を切断する。本実施形態に従うと、検出方法は、標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子の検出を伴い、ここでこの核酸分子は元々、１つ以上のメチル化残基を含んでいたものである。
【０１１１】
本発明の本態様、及び全ての態様に従うと、「メチル化感受性酵素」は、認識配列がメチル化残基を含有する場合に、核酸分子内の同種の認識配列を切断しない、または切断効率が低下する（即ち、認識配列内でのメチル化残基の存在に対して感受性がある）エンドヌクレアーゼである。「メチル化感受性酵素認識配列」は、メチル化感受性酵素に対する同種の認識配列である。いくつかの実施形態において、メチル化残基は、配列ＣｐＧ内の５−メチル−Ｃ（即ち、５−メチル−ＣｐＧ）である。本発明の方法での使用に適する、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ酵素の非限定的一覧としては、ＡｃｉＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｈａＩ、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応混合物の形成前に、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に転換するのに好適な条件下において、制限酵素反応混合物を亜硫酸水素塩処理に供すことを更に含んでよい。本実施形態において、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、メチル化されており、制限酵素で切断されない部位を１つ以上含有する、亜硫酸水素塩処理した標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、提供する一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、第１のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
本発明の方法は更に、メチル化感受性酵素認識配列内に非メチル化残基を含有する核酸分子を切断する、１つ以上の第２のメチル化感受性酵素を提供することを伴ってもよい。少なくとも１つの第２のメチル化感受性酵素を、亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含むポリメラーゼ連鎖反応混合物と混和して第２の制限酵素反応混合物を形成する。ここで、第２のメチル化感受性酵素は、前記ハイブリダイゼーション処理の間に、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含有するサンプル内に潜在的に存在する核酸分子を切断する。
【０１１４】
本発明の本態様の一実施形態では、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、前記プライマーまたは複数のプライマーの３’末端がポリメラーゼ伸長に不適となるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を有する３’部分、及びブロック基を有する。本実施形態に従うと、本方法は更に、ハイブリダイゼーション処理の間に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマーの切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断することにより、前記伸長処理の前に、一方または両方のオリゴヌクレオチドプライマー上で遊離３’ＯＨ末端を遊離させることを含む。
【０１１５】
本発明の本態様の一実施形態では、本方法は更に、非メチル化残基を含有する亜硫酸水素塩処理した標的の領域にハイブリダイゼーション可能な１つ以上のブロックオリゴヌクレオチドを提供することを含む。亜硫酸水素塩で処理した制限酵素反応混合物を含むポリメラーゼ連鎖反応混合物を、混合物を１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供す前に、１つ以上のブロックオリゴヌクレオチドと接触させる。１つ以上のブロックオリゴヌクレオチドは、前記ハイブリダイゼーション処理の間に相補性標的核酸配列にハイブリダイゼーションし、前記伸長処理の間に一次オリゴヌクレオチドプライマーを妨害する。
【０１１６】
図４５〜５３は、１つ以上のメチル化残基を含有する標的核酸分子を検出するための、本発明の方法の種々の実施形態を示す。
【０１１７】
図４５に示すＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ反応の第１工程は、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡの単離を含む。所望により、メチル化特異的抗体を使用してメチル化ＤＮＡを濃縮することができる。次に、サンプルをメチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）、及び／またはＨｉｎＰ１Ｉ（Ｇ＾ＣＧＣ）、並びにＵＮＧで処理し（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図４５・工程Ａ）。図４５・工程Ｂに示すように、ｄＵＴＰの存在下において、遺伝子座特異的プライマーを使用したＰＣＲを使用して、対象のメチル化領域を増幅する。一実施形態では、サイクルを制限した増幅（１２〜２０サイクル）を実施し、作製される異なる単位複製配列の相対比率を維持する。別の実施形態では、対象領域は、２０〜４０サイクルを使用して増幅される。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能とし（図４５・工程Ｃ）、生成物はメチル基を欠き、更なる保護をもたらす。図４５・工程Ｄに示すように、メチル領域特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブは、タグプライマーＡｉ及びＣｉ’の対、並びにＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用した、後のＰＣＲ増幅に好適なタグプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有する。
【０１１８】
ライゲーション反応に続いて、ライゲーション産物を含有するサンプルの一定量を、検出のため個別のウェルに分取する。ＵＤＧによる処理で元の標的単位複製配列が破壊され（図４５・工程Ｅ）、本物のＬＤＲ産物のみが増幅され検出されることが可能となる。上述した従来のＴａｑＭａｎ（商標）検出アッセイ（図４５・工程Ｅ〜Ｆ）を使用して、本実施形態においてライゲーション産物を検出する。
【０１１９】
図４６は、メチル化を検出するための、別の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本実施形態において、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）及び／またはＨｉｎＰ１Ｉ（Ｇ＾ＣＧＣ）、並びにＵＮＧで処理し（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図４６・工程Ａ）。図４６・工程Ｂに示すように、ｄＵＴＰの存在下において、遺伝子座特異的プライマーを使用したＰＣＲを使用して、対象のメチル化領域を増幅する。一実施形態では、サイクルを制限した増幅（１２〜２０サイクル）を実施し、作製される異なる単位複製配列の相対比率を維持する。別の実施形態では、対象領域は、２０〜４０サイクルを使用して増幅される。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵを含有し、キャリーオーバー防止を可能にする（図４６・工程Ｃ）。
【０１２０】
本実施形態で利用したオリゴヌクレオチドプローブは、ＵｎｉＴａｑプライマー及びタグ配列を含有し、上述したＵｎｉＴａｑ検出を容易にするように設計する。したがって、ライゲーション反応、及びキャリーオーバー防止のためのＵＤＧによる処理に続いて、図４６・工程Ｅ及びＦに示すように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（即ちＦ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を使用してライゲーション産物を増幅し、増幅産物を、図４６・工程Ｇに示し、かつ上述したように検出する。
【０１２１】
図４７は、メチル化を検出するための、別の例示的なＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。本実施形態において、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）及び／またはＨｉｎＰ１Ｉ（Ｇ＾ＣＧＣ）、並びにＵＮＧで処理し（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図４７・工程Ａ）。図４７・工程Ｂに示すように、ｄＵＴＰの存在下において、遺伝子座特異的プライマーを使用したＰＣＲを使用して、対象のメチル化領域を増幅する。本実施形態において、遺伝子座特異的プライマーは５’プライマー領域（例えばユニバーサルプライマー領域）もまた含有し、この領域は、ビオチン標識プライマーを使用して、後のユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする（図４７・工程Ｂ）。図４７・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、変異特異的ライゲーションプローブを使用して対象の変異を検出する。本実施形態に従うと、ライゲーション用のオリゴヌクレオチドプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、図３９で上述したように互いに極めて接近した場合に、ＦＲＥＴにより検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。ライゲーションに続いて（図４７・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図４７・工程Ｅ）。
【０１２２】
図４８は、メチル化を検出するためのヌクレアーゼ−ライゲーション−ＰＣＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本実施形態において、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し、ＨａｅＩＩＩ（ＧＧ＾ＣＣ）、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）及び／またはＨｉｎＰ１Ｉ（Ｇ＾ＣＧＣ）、並びにＵＮＧで処理し（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図４８・工程Ａ）。図４８・工程Ｂに示すように、タグ配列（Ａｉ’）を含有する、ヘアピン形成したオリゴヌクレオチドを、サンプル鋳型鎖内で分解された標的ＤＮＡの、新しく遊離したリン酸基にライゲーションする。図４８・工程Ｃに示すように、ＨｉｎＰ１Ｉ及びＢｓｈ１２３６Ｉにより、サンプルを３７℃で処理する。次に、メチル感受性制限酵素を熱失活させる一方、Ｃｉタグ配列を含有する遺伝子座特異的プライマーを使用した後のＰＣＲ増幅用のＴａｑポリメラーゼを活性化させる。上述のとおり、プライマーは、プライマーが相補性標的配列に結合した場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２（星印）処理により増幅の前に取り除かれる切断可能なブロック基（例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含有することができる。アンブロックしたプライマーをポリメラーゼで伸長し、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性が、ライゲーションしたヘアピンの５’部分を分解して、Ｃｉ及びＡｉ’配列を含有する標的に相補的な生成物を生成する。ライゲーションしなかったヘアピン形成したオリゴヌクレオチドは、それ自身を伸長させる。
【０１２３】
図４８・工程Ｄに示すように、タグプライマーＡｉ及びＣｉと共にｄＵＴＰを含むＰＣＲを用いて、対象のメチル含有領域を増幅する。サイクルを制限した増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にし（図４８・工程Ｅ）、そしてまた生成物はメチル基を欠き、更なる保護をもたらす。遺伝子座特異的プライマー、及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブを用いた上述したＴａｑＭａｎ（商標）検出のために、増幅産物の一定量を個別のウェルに分取する。
【０１２４】
図４９は、メチル化を検出するためのヌクレアーゼ−ライゲーション−ＰＣＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。元々メチル化されていた対象の残基とｄＵを含有するＰＣＲ産物を、工程Ａ〜Ｄに示した通り、及び図４８に関して上述したとおりに生成する。本実施形態において、ＵｎｉＴａｑプライマー及びタグ配列を用いる後の増幅を使用して、対象のメチル化残基を検出する。図４９の工程Ｅに示すように、キャリーオーバー防止のためのｄＵを含有するＰＣＲ産物の一定量を個別のウェルに分取し、尾部にＡｊ、及びＢｊ−Ｃｊを有する遺伝子座特異的プライマー、並びにＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｊ−Ｑ−Ａｊ、及びＣｊ）を使用して増幅する。得られる二本鎖ＤＮＡ産物を図４９・工程Ｆに示す。図４９・工程Ｇに示すように、変性工程の後、温度を下げて、ＢｊとＢｊ’との間でのヘアピン形成を可能にする。Ｔａｑポリメラーゼ（塗りつぶした菱形）の５’→３’ヌクレアーゼ活性はプライマーＣｉを伸長し、蛍光性基を遊離してシグナルを生成する。
【０１２５】
図５０は、メチル化を検出するためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本実施形態において、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）、及びＵＮＧで処理し（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図５０・工程Ａ）。分解したＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理して、非メチル化ｄＣ残基をウラシル（ｄＵ）に転換することにより、二本鎖ＤＮＡを非相補性にする。図５０Ｂに示すように、ＢｓｔＵ１（ＣＧ＾ＣＧ）（塗りつぶした三角形）の存在下にて遺伝子座特異的プライマーをハイブリダイゼーションし、これにより、非メチル化残基を含有するキャリーオーバーＤＮＡを切断する。遺伝子座特異的プライマーは、非標的特異的伸長を防止するために、３’末端に切断可能なブロック基を含有する。相補性標的配列にハイブリダイゼーションすると、ブロック基（Ｃ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基を、ＲＮａｓｅＨ２（星印）で取り除く。ｄＵＴＰの存在下でＰＣＲを使用して、対象のメチル含有領域を増幅する。サイクルを制限した増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持し、所望により、分解したサンプルの一定量を、ＰＣＲの前に１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。本実施形態で示すように、ブロックオリゴヌクレオチド（太い黒棒）を使用して、野生型ＤＮＡの増幅を制限してもよい。
【０１２６】
図５０・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有してメチル基を欠き、キャリーオーバー防止を可能にする。図５０・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的配列（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するメチル領域特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、対象の標的領域にハイブリダイゼーションする。リガーゼ（塗りつぶした円）は、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ、上流及び下流プライマー特異的部分、並びに、対象のメチル化領域に対応する部分を含有するライゲーション産物を形成する。図５０・工程Ｅ〜Ｆに示すように、マッチするプライマーの対（Ａｉ及びＣｉ）、並びに、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用した検出のための個別のウェルに、ライゲーション産物の一定量を分取する。 キャリーオーバー防止、及び、元の標的単位複製配列の除去のために、サンプル混合物をＵＤＧで処理する（図５０・工程Ｅ）ことで、本物のＬＤＲ産物のみが増幅して検出される。
【０１２７】
図５１は、メチル化を検出するための別のＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図示している工程Ａ〜Ｃに従い、かつ、図５０で上述のとおりに、元々メチル化されていた対象の残基とｄＵを含有するＰＣＲ産物を生成する。本実施形態において、メチル領域特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドは、後のＰＣＲ増幅検出用のＵｎｉＴａｑ検出プライマー特異的配列（Ａｉ及びＣｉ’）、並びにタグ配列（Ｂｉ’）を含有する。上述したＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を使用して、ライゲーション産物を増幅して検出する（図５１・工程Ｅ〜Ｇ）。
【０１２８】
図５２は、メチル化を検出するための別のＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。図５０及び５１に示す実施形態と同様に、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）、及びＵＮＧで処理し（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図５２・工程Ａ）。分解したＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理して、非メチル化残基をウラシルに転換することにより、二本鎖ＤＮＡを非相補性にする。図５２Ｂに示すように、３’の切断可能ブロック基を含有する遺伝子座特異的プライマーを、ＢｓｔＵ１（ＣＧ＾ＣＧ）（塗りつぶした三角形）の存在下にてハイブリダイゼーションし、これにより、非メチル化残基を含有するキャリーオーバーＤＮＡを切断する。プライマーが相補性標的配列にハイブリダイゼーションすると、ブロック基を取り除き、ｄＵＴＰの存在下にてＰＣＲを使用して、対象のメチル含有領域を増幅する。本実施形態において、遺伝子座特異的プライマーは（プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１個の塩基を有する）ユニバーサル尾部を含有し、このユニバーサル尾部は、後のユニバーサルプライマー増幅により５’ビオチン基を付加することを可能にする。増幅の間にブロックオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、野生型単位複製配列の形成を制限してもよい。
【０１２９】
５’ビオチン基を介して、増幅産物を固体支持体で捕捉する（図５２・工程Ｃ）。図５２Ｄに示すように、メチル領域特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを使用してライゲーション産物を形成し、ここで下流プローブは、５’アクセプター基、及び、上流ライゲーションプローブの３’配列尾部に相補的な配列尾部を含有する。上流ライゲーションプローブは、ライゲーション産物の形成の際に、生成物の５’及び３’相補領域がハイブリダイゼーションして、アクセプター及びドナー基を互いに極めて接近させ、対象のメチル化残基の検出のためのＦＲＥＴシグナルを生成するように、３’ドナー基もまた含有する（図５２・工程Ｅ）。
【０１３０】
図１５１は、低レベルの標的メチル化を検出するための、別の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１５１・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをメチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）、及びＵＮＧで処理し、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図１５１・工程Ａ）。分解したＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理して、非メチル化残基をウラシルに転換することにより、二本鎖ＤＮＡを非相補性にする。遺伝子座特異的上流プライマー、遺伝子座特異的下流プライマー、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化配列またはその相補鎖を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブ、及びｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を選択的に増幅する。本実施形態において、上流プライマー及び下流プライマーに、３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の選択性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がメチル化部位の数塩基上流にある上流プライマーのＲＮＡ塩基を取り除いて、ポリメラーゼ伸長に適している３’ＯＨ基を遊離させる（図１５１・工程Ｂ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的にオーバーラップする、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化配列（またはその相補鎖）を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、上流プライマー、及び、亜硫酸水素塩により転換されたメチル化配列ＤＮＡよりも、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化配列への結合に優先的に競合するため、ＰＣＲの各ラウンド中における、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化配列ＤＮＡの増幅を抑制する。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１５１・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。
【０１３１】
図１５１・工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。本実施形態において、亜硫酸水素塩により転換された対象のメチル化標的配列を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の検出を容易にする５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を更に含有する。ここでもまた、ＰＣＲ増幅工程の間に亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列が濃縮された後も、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化標的配列が存在した場合でも、それへの上流ライゲーションプローブのハイブリダイゼーションは、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化配列（またはその相補鎖）を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブの存在により抑制される。亜硫酸水素塩により転換された非メチル化、及びメチル化標的配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは、亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列を検出するのに特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）を含有する。上流及び下流オリゴヌクレオチドプローブのライゲーションにより、亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列ライゲーション産物のみの、後の増幅及び検出が可能となる。この図の工程Ｄに示すように、上流ライゲーションプローブに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１５１・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、マッチするプライマーの対（Ａｉ及びＣｉ）、並びに、図３８で上述したライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図１５１・工程Ｅ〜Ｇを参照）、または、当該技術分野において公知の他の好適な手段を使用して、ライゲーション産物を検出することができる。
【０１３２】
図１５２は、低レベルの標的メチル化を検出するための、別の例示的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１５２・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをメチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）、及びＵＮＧで処理し、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図１５２・工程Ａ）。分解したＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理して、非メチル化残基をウラシルに転換することにより、二本鎖ＤＮＡを非相補性にする。３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含むように、上流及び下流遺伝子座特異的プライマーを設計する。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除いて３’ＯＨを遊離し、ＲＮａｓｅＨはポリメラーゼ伸長に好適である（図１５２・工程Ｂ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的にオーバーラップする、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化配列（またはその相補鎖）を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、上流プライマー、及び亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列よりも、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化標的配列への結合に優先的に競合するため、ＰＣＲの各ラウンド中の、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化標的配列の増幅を抑制する。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１５２・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。
【０１３３】
図１５２・工程Ｄに示すように、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。ここでもまた、ＰＣＲ増幅工程の間に亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列が濃縮された後も、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化標的配列が存在した場合でも、それへのライゲーションは、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化配列（またはその相補鎖）を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブの存在により抑制される。本実施形態において、亜硫酸水素塩により転換された対象のメチル化標的配列を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の検出を容易にする５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を更に含有する。亜硫酸水素塩により転換された非メチル化、及びメチル化標的配列の両方に共通の配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは、亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列を検出するのに特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列のみの、後の増幅及び検出を可能にする、３’プライマー特異的部分（Ｂｉ’−Ｃｉ’）を含有する。この図の工程Ｄに示すように、上流ライゲーションプローブに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１５２・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（即ち、Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を使用してライゲーション産物を増幅し、図４４で上述したように検出する（図１５２・工程Ｅ〜Ｈを参照）か、または当該技術分野において公知の他の好適な手段を使用して検出する。
【０１３４】
図１５３は、低レベルの標的メチル化を検出するための、別の例示的なＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し（図１５３・工程Ａ）、単離したＤＮＡサンプルをメチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）、及びＵＮＧで処理し、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図１５３・工程Ａ）。分解したＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理して、非メチル化残基をウラシルに転換することにより、二本鎖ＤＮＡを非相補性にする。３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含むように、上流及び下流遺伝子座特異的プライマーを設計する。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除いてポリメラーゼ伸長に好適である３’ＯＨを遊離させる（図１５３・工程Ｂ）。上流ＰＣＲプライマーと部分的にオーバーラップする、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化配列（またはその相補鎖）を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、上流プライマー、及び亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列よりも、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化標的配列への結合に優先的に競合するため、ＰＣＲの各ラウンド中の、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化標的配列の増幅を抑制する。本実施形態において、下流遺伝子座特異的プライマーは、ビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することが可能となる５’プライマー領域（例えばユニバーサルプライマー領域）もまた含有する。（図１５３・工程Ｂ）。所望により、ＰＣＲの前にサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１５３・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。図１５３・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列特異的ライゲーションプローブを使用して、亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列を検出する。ここでもまた、ＰＣＲ増幅工程の間に亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列が濃縮された後も、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化標的配列が存在した場合でも、それへのライゲーションは、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化配列（またはその相補鎖）を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブの存在により抑制される。本実施形態において、亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列核酸配列を検出可能な（しかし、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化標的配列は検出しない）ライゲーション対のライゲーションプローブは、図３９で上述のように、相補性尾部配列、及びそれぞれ、互いに極めて接近した場合に、ＦＲＥＴにより検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。この図に示すように、上流ライゲーションプローブに３’切断可能ブロック基（例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方���に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１５３・工程Ｄ）。ライゲーションに続いて（図１５３・工程Ｅ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図１５３・工程Ｆ）。
【０１３５】
本発明の本態様の別の実施形態において、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、一次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイゼーションする、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化標的配列内のヌクレオチド配列部分と、同一のヌクレオチド配列を有する５’部分を含むが、亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的配列内で、対応するヌクレオチド配列部分とミスマッチする１つ以上のヌクレオチド配列を有する。
【０１３６】
本実施形態に従うと、ＤＮＡポリメラーゼは、５’ヌクレアーゼ、３’ヌクレアーゼ、及び鎖置換活性を欠くポリメラーゼである。所望により、一次オリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応のハイブリダイゼーション工程中に切断され、伸長に好適なオリゴヌクレオチドプライマー上の遊離３’ＯＨ末端を遊離する、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体もまた含有する。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、反応による伸長生成物が互いに分離される変性処理、及び、第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーから生じる伸長生成物にハイブリダイゼーションするハイブリダイゼーション処理を含む、１回以上の追加のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供す。第２の一次プライマーから生じる伸長生成物は、伸長生成物中の３’末端と相補配列との間で分子内ループ−ヘアピンを形成し、このループ−ヘアピンは、（ｉ）亜硫酸水素塩で処理したメチル化配列に自身がハイブリダイゼーションした場合に、自身の伸長を阻害する、３’末端、またはその付近に１つ以上のミスマッチを含むか、または（ｉｉ）亜硫酸水素塩で処理した非メチル化標的配列に自身がハイブリダイゼーションした場合に、自身の伸長を向上させる、３’末端でのマッチを含む。第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから生じる伸長生成物にハイブリダイゼーションする。第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから生じる伸長生成物は、伸長生成物内の５’部分と相補配列との間に、分子内ループ−ヘアピンを形成する。ＰＣＲの伸長工程の間、第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、（ｉ）亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的配列を含む伸長生成物上で選択的に伸長することにより、亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的ヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む一次伸長生成物を選択的に形成するか、または、（ｉｉ）前記標的での、その前の自身のハイブリダイゼーション及び自身の伸長により、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化標的ヌクレオチド配列もしくはその相補鎖を含む一次伸長生成物の形成が阻害される。第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーは（ｉｉｉ）標的配列とは無関係に伸長生成物上で伸長し、ここで、第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーの、標的またはそのコピーへのハイブリダイゼーションから生じる異なる一次伸長生成物により、亜硫酸水素塩で処理したメチル化配列が選択的に増幅され、それにより、前記一次ポリメラーゼ連鎖反応の間に、亜硫酸水素塩で処理したメチル化配列伸長生成物及びその相補鎖の濃縮がもたらされる。
【０１３７】
図１５６及び１５７は、本発明の本実施形態を表す。図１５６に示すように、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）、及びＵＮＧで処理し（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図１５６・工程Ａ）。分解したＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理して、非メチル化ｄＣ残基をウラシル（ｄＵ）に転換することにより、二本鎖ＤＮＡを非相補性にする。（ｉ）伸長後にループ−ヘアピンの形成を可能にする、亜硫酸水素塩で処理したトップ鎖の非メチル化配列に相補的な５’配列部分もまた含む遺伝子座特異的上流プライマー、（ｉｉ）遺伝子座特異的下流プライマー、及び（ｉｉｉ）ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を選択的に増幅する。この図の工程Ｂに示すように、上流変異特異的プライマーに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の選択性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる（図１５６・工程Ｂ）。所望により、ＰＣＲの前に、分解したサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。図１５６・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。５’ヌクレアーゼ、３’ヌクレアーゼ、及び鎖置換活性を欠くポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施する。図１５６・工程Ｄは更に、後の増幅のラウンドにおいて、（ｉ）変性した、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化ボトム鎖は、ポリメラーゼにより伸長される、３’末端に完全なマッチを有するループ−ヘアピンを形成し、（ｉｉ）変性した、亜硫酸水素塩で処理したメチル化ボトム鎖は、通常はポリメラーゼにより伸長されない、２つ以上のミスマッチを有するループ−ヘアピンを形成し、（ｉｉｉ）変性したトップ鎖は、５’側に７２℃でのＰＣＲの伸長工程の間に変性するループ−ヘアピンを形成することを示す。図１５６・工程Ｅは更に、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化ＤＮＡ（ｉ）でのループ−ヘアピンの伸長の後、伸長したヘアピン配列は７２℃で変性せず、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを防止することを示す。しかし、亜硫酸水素塩で処理したメチル化ＤＮＡ（ｉｉ）のループ−ヘアピン配列は、２つ以上のミスマッチ塩基により伸長しないため、７２℃で変性し、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを可能にする。同様に、トップ鎖生成物（ｉｉｉ）は７２℃で変性し、ポリメラーゼが完全長ボトム鎖を生成することを可能にする。（ｉ）の亜硫酸水素塩で処理した非メチル化、及び（ｉｉ）の亜硫酸水素塩で処理したメチル化鋳型による、上流プライマーのループ−ヘアピン伸長選択性の差は、増幅の各サイクル中の、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化増幅産物の選択的除去をもたらすため、亜硫酸水素塩で処理したメチル化ＤＮＡの選択的増幅をもたらす。
【０１３８】
図１５６・工程Ｇに示すように、亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にハイブリダイゼーションし、リガーゼ（塗りつぶした円）は、相補配列にハイブリダイゼーションした場合に２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合により閉じる。本実施形態において、亜硫酸水素塩で処理した対象のメチル化配列を検出するのに特異的な配列を有する上流オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション産物の後の検出を容易にする５’プライマー特異的部分（Ａｉ）を更に含有する一方、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化核酸配列を検出するのに特異的な配列を有する任意の上流オリゴヌクレオチドプローブは、５’プライマー特異的部分を含有しない。亜硫酸水素塩で処理したメチル化配列を検出するのに特異的な配列を有する下流オリゴヌクレオチドプローブは、亜硫酸水素塩で処理した対象のメチル化配列を検出するのに特異的な配列を有する上流プローブの５’プライマー特異的部分（Ａｉ）と共に、後の変異ライゲーション産物のみの増幅及び検出を可能にする３’プライマー特異的部分（Ｃｉ’）を含有する。この図に示すように、上流ライゲーションプローブに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１５６・工程Ｈ）。ライゲーションに続いて、マッチするプライマーの対（Ａｉ及びＣｉ）、並びに、図３８に記載するようにライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して（図１５６・工程Ｈ〜Ｊを参照）、または、当該技術分野において公知の他の好適な手段を使用してライゲーション産物を検出することができる。
【０１３９】
図１５７は、メチル化を検出するための別のＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。本実施形態において、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）、及びＵＮＧで処理し（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図１５７・工程Ａ）。分解したＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理して、非メチル化ｄＣ残基をウラシル（ｄＵ）に転換することにより、二本鎖ＤＮＡを非相補性にする。（ｉ）伸長後にループ−ヘアピンの形成を可能にする、亜硫酸水素塩で処理したトップ鎖の非メチル化配列に相補的な配列を有する５’部分もまた含む遺伝子座特異的上流プライマー（ｉｉ）遺伝子座特異的下流プライマー、及び（ｉｉｉ）ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物を使用して、対象の領域を選択的に増幅する。この図に示すように、上流プライマーに３’の切断可能ブロック基（Ｂｌｋ  ３’、例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の選択性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）がＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる（図１５７・工程Ｂ）。所望により、ＰＣＲの前に、分解したサンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。 図１５７・工程Ｃに示すように、増幅産物はｄＵを含有し、これは、キャリーオーバー防止のための、ＵＤＧまたは類似の酵素による後の処理を可能にする。５’ヌクレアーゼ、３’ヌクレアーゼ、及び鎖置換活性を欠くポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施する。図１５７・工程Ｄは更に、後の増幅のラウンドにおいて、（ｉ）変性した、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化ボトム鎖は、ポリメラーゼにより伸長される、３’末端に完全なマッチを有するループ−ヘアピンを形成し、（ｉｉ）変性した、亜硫酸水素塩で処理したメチル化ボトム鎖は、通常はポリメラーゼにより伸長されない、２つ以上のミスマッチを有するループ−ヘアピンを形成し、（ｉｉｉ）変性したトップ鎖は、５’側に、７２℃でのＰＣＲの伸長工程の間に変性するループ−ヘアピンを形成することを示す。図１５７・工程Ｅは更に、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化ＤＮＡ（ｉ）でのループ−ヘアピンの伸長の後、伸長したヘアピン配列は７２℃では変性せず、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを防止することを示す。しかし、亜硫酸水素塩で処理したメチル化ＤＮＡ（ｉｉ）のループ−ヘアピン配列は、２つ以上のミスマッチ塩基により伸長しないため、７２℃で変性し、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを可能にする。同様に、トップ鎖生成物（ｉｉｉ）は７２℃で変性し、ポリメラーゼが完全長ボトム鎖を生成することを可能にする。（ｉ）の亜硫酸水素塩で処理した非メチル化、及び（ｉｉ）の亜硫酸水素塩で処理したメチル化鋳型による、上流プライマーのループ−ヘアピン伸長選択性の差は、増幅の各サイクル中の、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化増幅産物の選択的除去をもたらすため、亜硫酸水素塩で処理したメチル化ＤＮＡの選択的増幅をもたらす。
【０１４０】
本実施形態において、下流遺伝子座特異的プライマーは、ビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物への付加を可能にする５’プライマー領域、例えばユニバーサルプライマー領域もまた含有する（図１５７・工程Ｂ）。図１５０・工程Ｇに示されているように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的配列に特異的なライゲーションプローブを使用して、亜硫酸水素塩で処理した対象のメチル化配列を検出する。本実施形態において、亜硫酸水素塩で処理したメチル化核酸配列を検出可能な（しかし、亜硫酸水素塩で処理した非メチル化配列は検出しない）ライゲーション対のライゲーションプローブは、図３９で上述のように、相補性尾部配列、及びそれぞれ、互いに極めて接近した場合に、ＦＲＥＴにより検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。この図の工程Ｇに示すように、上流ライゲーションプローブに３’切断可能ブロック基（例えばＣ３スペーサー）、及びＲＮＡ塩基（ｒ）を含めることにより、別の層の特異性を本方法に導入することができる。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨ（星印）はＲＮＡ塩基を取り除き、ライゲーション能のある３’ＯＨ基を生成する（図１５０・工程Ｇ）。ライゲーションに続いて（図１５７・工程Ｈ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図１５７・工程Ｉ）。
【０１４１】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、サンプル中または他のサンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別するための方法に関する。本方法は、他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の核酸分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、サンプル内に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。本方法は更に、サンプルを１種以上のメチル化感受性酵素と接触させて制限酵素反応混合物を形成することを伴い、ここで、１種以上のメチル化感受性酵素は、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含有するサンプル内の核酸分子を切断する。１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが提供され、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）１つ以上のメチル化残基の上流にある標的ヌクレオチド配列の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）１つ以上のメチル化残基の下流にある標的ヌクレオチド配列の領域と同一のヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む。制限酵素反応混合物を、１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和し、一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。本方法は更に、一次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、標的ヌクレオチド配列またはその相補鎖を含む一次伸長生成物を形成することを含む。１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供し、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、一次伸長生成物にハイブリダイゼーション可能な第１及び第２のネステッドオリゴヌクレオチドプライマーを含む。一次伸長生成物を、１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及びＤＮＡポリメラーゼと混和して二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、二次伸長生成物を形成する。サンプル中の二次伸長生成物を検出して識別し、サンプル中の他の核酸分子内のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基が異なる標的ヌクレオチド配列を含有する１つ以上の核酸分子を識別する。
【０１４２】
本発明の本態様に従うと、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブ、例えばＴａｑＭａｎ（商標）オリゴヌクレオチド検出プローブを更に含んでよい。検出プローブは、一次伸長生成物またはその相補鎖内の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、互いに離間してはいるが、消光剤分子が検出可能な標識を消光するには互いに十分近接している、消光剤分子及び検出可能な標識を有する。二次ポリメラーゼ連鎖反応プロセスのハイブリダイゼーション工程の間、１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブが一次伸長生成物の相補部分にハイブリダイゼーションし、続いて、伸長工程の間に１つ以上のオリゴヌクレオチド検出プローブから消光剤分子及び検出可能な標識が切断される。切断の際に、検出可能な標識が消光剤から分離されるため、検出可能な標識が検出される。
【０１４３】
一実施形態では、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つまたは両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーは、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が切断されるまで、前記プライマーまたは複数のプライマーの３’末端がポリメラーゼ伸長に不適となるように、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロック基を含む３’部分を所望により有してもよい。切断の際に、プライマー伸長が可能になる前に、一方または両方の一次オリゴヌクレオチドプライマーの遊離３’ＯＨ末端が遊離される。
【０１４４】
別の実施形態では、一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一次オリゴヌクレオチドプライマーは、長さが約６〜２０塩基の、同一または実質的に同一な５’ヌクレオチド配列部分を含む。本実施形態に従うと、生成した所望の伸長生成物は、一次プライマーが選択的にハイブリダイゼーションするのに十分な長さを有する。しかし、望ましくないプライマー二量体生成物が形成する場合、その相補的５’末端を介して生成物自身上でヘアピン形成し、これは連続的な増幅に不適である。
【０１４５】
図１５８は、本発明の本態様に従いメチル化を検出するための例示的なＰＣＲ−ＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本実施形態において、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）及び／またはＨｉｎＰ１Ｉ（Ｇ＾ＣＧＣ）、並びにＵＮＧで処理し、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図１５８・工程Ａ）。図１５８・工程Ｂに示すように、ｄＵＴＰの存在下において、遺伝子座特異的プライマーを使用したＰＣＲを使用して、対象のメチル化領域を増幅する。一実施形態では、サイクルを制限した増幅（１２〜２０サイクル）を実施し、作製される異なる単位複製配列の相対比率を維持する。別の実施形態では、対象領域は、２０〜４０サイクルを使用して増幅される。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵを含有し、キャリーオーバー防止を可能にする（図１５８・工程Ｃ）。所望により、ＰＣＲの前に、サンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取する。ネステッド、または半ネステッド遺伝子座特異的プライマー、及び従来の内部ＴａｑＭａｎ（商標）検出アッセイを使用して、メチル含有領域を増幅する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする。
【０１４６】
図５３は、メチル化を検出するための別のＰＣＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本発明の他の実施形態同様に、ゲノムＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを単離し、メチル感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）、及びＵＮＧで処理し（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する（図５３・工程Ａ）。分解したＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理して、非メチル化残基をウラシルに転換することにより、二本鎖ＤＮＡを非相補性にする。図５３・工程Ｂに示すように、３’の切断可能ブロック基を含有する遺伝子座特異的プライマーを、ＢｓｔＵ１（ＣＧ＾ＣＧ）（塗りつぶした三角形）の存在下にてハイブリダイゼーションし、これにより、非メチル化残基を含有するキャリーオーバーＤＮＡを切断する。プライマーが相補性標的配列にハイブリダイゼーションすると、ブロック基が取り除かれる。本実施形態において、ｄＮＴＰの存在下でＰＣＲを使用して、対象のメチル含有領域を増幅する。本実施形態において、増幅の間にブロックオリゴヌクレオチドを使用して、野生型単位複製配列の形成を制限する。図５３・工程Ｃに示すように、ＰＣＲ産物を非メチル化し、キャリーオーバーからの保護をもたらす。
【０１４７】
図５３・工程Ｄ及びＥに示すように、遺伝子座特異的プライマーの一次セットに所望により入れ子構造となるか、または半入れ子構造となる遺伝子座特異的プライマー、及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（黒棒）を用いたＴａｑＭａｎ（商標）検出のために、ＰＣＲ産物の一定量を個別のウェルに分取する。所望により、ブロックオリゴヌクレオチド（太い黒棒）もまたこの反応に組み込み、野生型単位複製配列の形成を制限することができる。本実施形態において、ＴａｑＭａｎ（商標）反応をｄＵＴＰの存在下で実施し、キャリーオーバー防止を可能にする。
【０１４８】
本発明の別の態様は、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子のリボヌクレオチド配列とは異なる標的リボヌクレオチド配列を含有する１つ以上のリボ核酸分子を該サンプル中で識別するための方法に関する。本方法は、他のリボ核酸分子のリボヌクレオチド配列とは異なる標的リボヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つ以上のリボ核酸分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、各プライマーは、標的リボヌクレオチド配列を含有する１つ以上のリボ核酸分子に相補的である。接触したサンプルを１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、及び逆転写酵素と混和して逆転写混合物を形成し、相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子が逆転写混合物中で生成される。各ｃＤＮＡ分子は、標的リボヌクレオチド配列に相補的であり、ｄＵを含有するヌクレオチド配列を含む。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することを伴い、各プライマーセットは、（ａ）ｃＤＮＡの標的リボヌクレオチド配列相補鎖に隣接するｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、及び、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーから形成された伸長生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。ｃＤＮＡ分子を含有する逆転写混合物を、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、及びポリメラーゼと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成し、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、１種以上の異なる一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供することを含む。各プローブセットは、（ａ）標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）標的配列特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここでプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、相補的一次伸長生成物上にて、間に接合部を有して互いに隣接してハイブリダイゼーションするように構成される。一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させてライゲーション反応混合物を形成し、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２プローブを互いにライゲーションし、リガーゼ反応混合物中でライゲーション産物配列を形成する。サンプル中のライゲーション産物配列を検出及び識別することにより、ゲノムレベルでの、選択的スプライシング、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、または他の再配列によりサンプル中の他のリボ核酸分子のリボヌクレオチド配列とは異なる標的リボヌクレオチド配列を含有する１つ以上のリボ核酸分子の存在を識別する。
【０１４９】
図５４〜８５は、本発明の本態様の種々の実施形態を示す。
【０１５０】
図５４は、ｍＲＮＡレベルで転座を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概要を示す。ＤＮＡレベルでの、２つの遺伝子間での転座の図解を図５４・工程Ａに示す。ｍＲＮＡでの、エクソン１−ｂ（ｍＲＮＡ融合物１）、２−ｂ（ｍＲＮＡ融合物２）、及び３−ｂ（ｍＲＮＡ融合３）の間の異なる融合接合部の例を示す（図５４・工程Ｂ）。本方法は、全血細胞、エクソソーム、または血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）からｍＲＮＡを単離し、逆転写酵素、及びエクソンｂに相補的なプライマーを使用してｃＤＮＡを生成することを含む。エクソン１、２及び３に対するフォワードプライマー、及びエクソンｂに対するプライマーを使用して、生成したｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する（図５４・工程Ｂ）。転座切断点に関係なく、エクソン接合部領域を含有する最小の断片を、プライマーによって増幅する。ＰＣＲ増幅の間に形成した種々の生成物を、図５４・工程Ｃに示す。
【０１５１】
エクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを使用してＬＤＲを実施する。プライマー（Ａｉ、Ｃｉ）を使用した後の検出に好適なタグプライマー特異的部分（例えばＡｉ、Ｃｉ’）、及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブを含有するように、ライゲーションプローブを設計することができる（図５４・工程Ｃ〜Ｄ、左パネル）。あるいは、ＵｎｉＴａｑプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びタグ特異的部分（Ｂｉ’）を含有するように、ライゲーションプローブを設計することができる（図５４・工程Ｃ〜Ｄ、右パネル）。エクソン接合部特異的ライゲーション産物の形成に続いて、ライゲーション産物をＰＣＲ増幅し、検出する（図５４・工程Ｄ）。ＬＤＲ産物を増幅するためにタグ特異的プライマー（Ａｉ、Ｃｉ）を使用する場合、各ＴａｑＭａｎ（商標）プローブはライゲーション接合部にまたがり、個別にスコアリングすることができる。ＬＤＲ産物を増幅するためにＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を使用する場合、特異的エクソン接合部に関係なく、同じプライマーセットが所与の転座をスコアリングする。
【０１５２】
図５５は、ｍＲＮＡレベルで転座を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本実施形態において、ｍＲＮＡを単離し（図５５・工程Ａ）、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理する（図５５・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。Ｔａｑポリメラーゼを活性化してサイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図５５・工程Ｂ）。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵＴＰを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図５５・工程Ｃ）。
【０１５３】
図５５・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図５５・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図５５・工程Ｅ）。キャリーオーバー防止のために、サンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図５５・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１５４】
図５６は、ｍＲＮＡレベルで転座を検出するための、別のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本実施形態において、ｍＲＮＡを単離し（図５６・工程Ａ）、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理する（図５６・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。Ｔａｑポリメラーゼを活性化してサイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図５６・工程Ｂ）。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図５６・工程Ｃ）。
【０１５５】
図５６・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅及び検出に好適なＵｎｉＴａｑプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）及びタグ部分（Ｂｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、検出される標的ｍＲＮＡ分子に対応する核酸配列にハイブリダイゼーションする（図５６・工程Ｄ）。オリゴヌクレオチドプローブのライゲーションに続いて、サンプルをＵＤＧで処理して、元の標的単位複製配列を取り除き、上述のＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いた、ライゲーション産物の選択的増幅及び検出（図５６・工程Ｅ〜Ｆ）を可能にすることにより、ｍＲＮＡ転座及びｍＲＮＡ融合の検出を容易にする。図５６・工程Ｅ及びＦに示すように、増幅したライゲーション産物がｄＵＴＰを組み込み、将来的なキャリーオーバー防止を可能にする。
【０１５６】
図５７は、ｍＲＮＡレベルで転座を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応の例を示す。本実施形態において、ｍＲＮＡを単離し（図５７・工程Ａ）、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理する（図５７・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。Ｔａｑポリメラーゼを活性化してサイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図５７・工程Ｂ）。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部、及びユニバーサルプライマー特異的部分を含有し、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図５７・工程Ｃ）。図５７・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図５７・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図５７・工程Ｅ）。 
【０１５７】
図５８は、選択的スプライシングを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概要を示す。図５８・工程Ａは、ＤＮＡレベルで示す、５個のエクソンを有する遺伝子の図解であり、図５８・工程Ｂは、通常（１−２−３ａ−４）、及び選択的スプライシングを受けた（１−２−３ｂ−４）変異ｍＲＮＡの例を示す。本方法は、全血細胞、エクソソーム、またはＣＴＣからｍＲＮＡを単離し、図５８・工程Ｂに示すように、エクソン４に相補的なプライマーと逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを生成することを含む。存在する場合、エクソン４プライマー、及び、エクソン２に対するフォワードプライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、通常及び選択的スプライス変異体の両方の単位複製配列を生成する。図５８・工程Ｃに示すように、タグプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’；左パネル）、またはＵｎｉＴａｑプライマー及びタグ配列（Ａｉ、Ｂｉ’−Ｃｉ’；右パネル）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、ＰＣＲ産物中の対応する標的配列にハイブリダイゼーションし、接合部において完全に相補性である場合、リガーゼが、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じる。上述したタグ特異的プライマー（Ａｉ、Ｃｉ）及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−ＱもしくはＦ２−Ｑ，図５８・工程Ｄ、左パネル）、またはＵｎｉＴａｑプライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｆ２−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ、図５８・工程Ｄ、右パネル）を使用して、ライゲーション産物を増幅して検出する。
【０１５８】
図５９は、野生型ｍＲＮＡ転写物、及び選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡ転写物を定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図５９・工程Ａは、検出される、エクソン３ａを含有する野生型転写物（上部）、及びエクソン３ｂを含有する選択的スプライシングを受けた転写物（下部）を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図５９・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。Ｔａｑポリメラーゼを活性化してサイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図５９・工程Ｂ）。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図５９・工程Ｃ）。図５９・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なタグプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図５９・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、並びに、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ及びＦ２−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図５９・工程Ｅ〜Ｆ）。リアルタイムＰＣＲを使用し、異なる標識を付けたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを検出して、野生型及び選択的スプライス変異体を定量化して識別する。キャリーオーバー防止のために、サンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図５９・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１５９】
図６０は、野生型ｍＲＮＡ転写物、及び選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡ転写物を定量化するための、別のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図６０・工程Ａは、検出されるエクソン３ａを含有する野生型転写物（上部）、及びエクソン３ｂを含有する選択的スプライシングを受けた転写物（下部）を示す。ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを設計することを除いて、本方法の工程Ａ〜Ｄは、図５９で記載したものと実質的に同一である。したがって、本実施形態では、野生型及び選択的スプライス変異体に対応するライゲーション産物を、上述のように、かつ、図６０・工程Ｅ〜Ｇに記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いるリアルタイムＰＣＲを使用して、後で増幅、検出、及び定量化する。
【０１６０】
図６１は、野生型ｍＲＮＡ転写物及び選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡ転写物を定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。図６１・工程Ａは、検出される、エクソン３ａを含有する野生型転写物（上部）、及びエクソン３ｂを含有する選択的スプライシングを受けた転写物（下部）を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図６１・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部、及びユニバーサルプライマー特異的部分を含有し、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図６１・工程Ｃ）。図６１・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図６１・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図６１・工程Ｅ）。
【０１６１】
図６２は、選択的スプライシングを受けた低量の転写物を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図６２・工程Ａは、検出される、エクソン３ａを含有する野生型転写物（上部）、及びエクソン３ｂを含有する選択的スプライシングを受けた少量の転写物（下部）を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図６２・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー（即ち、エクソン４に対する）、及び逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを生成する。Ｔａｑポリメラーゼを活性化してサイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図６２・工程Ｂ）。本実施形態において、選択的スプライス変異体（即ちエクソン３ｂ）に特異的であり、野生型変異体（即ちエクソン３ａ）にはハイブリダイゼーションしないプライマーを利用して、選択的スプライス変異体に対応する増幅産物のみを生成する。ＰＣＲ産物はｄＵＴＰを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図６２・工程Ｃ）。図６２・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図６２・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図６２・工程Ｅ〜Ｆ）。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの蛍光性基の遊離により、リアルタイムＰＣＲの間に選択的スプライス変異体を検出する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図６２・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅される。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１６２】
図６３及び６４は、選択的スプライシングを受けた少量の転写物を検出するための、図６２で記載及び図示したものに類似のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を表す。図６３の実施形態において、ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを設計する。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ図６３・工程Ｅ〜Ｇで記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）によるリアルタイムＰＣＲを使用して、選択的スプライス変異体に対応するライゲーション産物を後で増幅、検出、及び定量化した。図６４の実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図６４・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端が互いにハイブリダイゼーションして、対応するドナー及びアクセプター部位（Ｄ、Ｆ２）を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図６４・工程Ｅ）。 
【０１６３】
図６５は、選択的スプライシングを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概要を示す。図６５・工程Ａは、ＤＮＡレベルでの、３つのエクソン、並びに選択的開始部位及び第１のエクソンを有する遺伝子の図解を示す。図６５・工程Ｂは、通常（１−２−３）及び選択的スプライス変異体（１ａ−２−３）のｍＲＮＡの例を示す。本方法は、全血細胞、エクソソーム、またはＣＴＣからｍＲＮＡを単離し、図６５・工程Ｂに示すように、エクソン２に相補的なプライマーと逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを生成することを含む。エクソン２プライマー、及び、エクソン１またはエクソン１ａのいずれかに相補的なフォワードプライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、両方のスプライス変異体の単位複製配列を生成する。図６５・工程Ｃに示すように、タグプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’；左パネル）、またはＵｎｉＴａｑプライマー及びタグ配列（Ａｉ、Ｂｉ’−Ｃｉ’；右パネル）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、ＰＣＲ産物中の対応する標的配列にハイブリダイゼーションし、接合部において完全に相補性である場合、リガーゼが、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じる。上述したタグ特異的プライマー（Ａｉ、Ｃｉ）及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−ＱもしくはＦ２−Ｑ；図５８・工程Ｄ、左パネル）、またはＵｎｉＴａｑプライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｆ２−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、及びＣｉ、図５８・工程Ｄ、右パネル）を使用して、ライゲーション産物を増幅して検出する。
【０１６４】
図６６は、野生型及び選択的転写開始部位を含有する転写物を定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図６６・工程Ａは、エクソン１を含有する野生型転写物（上部）、及び、開始部位としてエクソン１ａを有する選択的転写物（下部）を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図６６・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。エクソン２特異的プライマー、及びエクソン１またはエクソン１ａのいずれかに相補的なフォワードプライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、両方のスプライス変異体の単位複製配列を生成する。制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０サイクル）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図６６・工程Ｂ）。別の実施形態において、対象領域を、２０〜４０回のＰＣＲサイクルを使用して増幅する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図６６・工程Ｃ）。図６６・工程Ｄに示すように、後のＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ増幅に好適なタグプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図６６・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、並びに、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ及びＦ２−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図６６・工程Ｅ〜Ｆ）。リアルタイムＰＣＲを使用し、異なる標識を付けたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを検出して、野生型及び選択的転写の開始部位の変異体を、定量化して識別する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図６６・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１６５】
図６７は、野生型ｍＲＮＡ転写物、及び選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡ転写物を定量化するための、別のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図６７・工程Ａは、エクソン１を含有する野生型転写物（上部）、及び、開始部位としてエクソン１ａを有する選択的転写物（下部）を示す。ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを設計することを除いて、本方法の工程Ａ〜Ｄは、図６６で記載したものと実質的に同一である。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図６７・工程Ｅ〜Ｆで示したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いるリアルタイムＰＣＲを使用して、野生型及び変異体転写物に対応するライゲーション産物を、後で増幅、検出、及び定量化する。
【０１６６】
図６８は、野生型ｍＲＮＡ転写物及び選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡ転写物を定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。図６８・工程Ａは、エクソン１を含有する野生型転写物（上部）、及び、開始部位としてエクソン１ａを有する選択的転写（下部）を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図６８・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。エクソン２プライマー、及び、エクソン１またはエクソン１ａのいずれかに相補的なフォワードプライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、両方のスプライス変異体の単位複製配列を生成する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部、及びユニバーサルプライマー特異的部分を含有し、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図６８・工程Ｃ）。図６８・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図６８・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図６８・工程Ｅ）。
【０１６７】
図６９は、少量の選択的開始部位転写物を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図６９・工程Ａは、エクソン１を含有する野生型転写物（上部）、及び、開始部位としてエクソン１ａを有する選択的転写（下部）を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図６９・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。Ｔａｑポリメラーゼを活性化してサイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図６９・工程Ｂ）。本実施形態において、野生型変異体（即ちエクソン１）にはハイブリダイゼーションしない、選択的転写物（即ちエクソン１ａ）に特異的なプライマーを使用して、選択的転写に対応する増幅産物のみを生成する。ＰＣＲ産物はｄＵＴＰを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図６９・工程Ｃ）。図６９・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図６９・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図６９・工程Ｅ〜Ｆ）。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの蛍光性基の遊離により、リアルタイムＰＣＲの間に選択的転写物を検出する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図６９・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅される。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１６８】
図７０及び７１は、図６９（工程Ａ〜Ｃ）で記載して示した、少量の選択的開始部位転写物を検出するための類似のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を表し、選択的転写物の増幅に特異的なプライマーのみが利用される。図７０の実施形態において、ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを設計する。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図７０・工程Ｅ〜Ｇに記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、選択的開始部位転写物に対応するライゲーション産物を後で増幅、検出、及び定量化する。図７１の実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図７１・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端が互いにハイブリダイゼーションして、対応するドナー及びアクセプター部位（Ｄ、Ｆ２）を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図７１・工程Ｅ）。
【０１６９】
図７２は、エクソン欠失を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概要を示す。図７２・工程Ａは、ＤＮＡレベルでの、５個のエクソン及び４個のイントロンを有する遺伝子の図解を示す。図７２・工程Ｂは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、並びに、エクソン４が欠失した選択的転写物（下部、即ちエクソン１〜３、及び５）の例を示す。図７２・工程Ｂに示すように、本方法は、全血細胞、エクソソーム、またはＣＴＣからｍＲＮＡを単離し、エクソン５に相補的なプライマーと逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを生成することを含む。エクソン３及びエクソン４に相補的なフォワードプライマーと共に、エクソン５プライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、野生型及び欠失変異体の両方の単位複製配列を生成する。図７２・工程Ｃに示すように、タグプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’；左パネル）、またはＵｎｉＴａｑプライマー及びタグ配列（Ａｉ、Ｂｉ’−Ｃｉ’；右パネル）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、ＰＣＲ産物中の対応する標的配列にハイブリダイゼーションし、接合部において完全に相補性である場合、リガーゼが、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じる。上述したようにタグ特異的プライマー（Ａｉ、Ｃｉ）及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−ＱもしくはＦ２−Ｑ；図７２・工程Ｄ、左パネル）、またはＵｎｉＴａｑプライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｆ２−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、及びＣｉ、図７２・工程Ｄ、右パネル）を使用して、ライゲーション産物を増幅して検出する。
【０１７０】
図７３は、野生型転写物、及びエクソン欠失を有する転写物を定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を表す。図７３・工程Ａは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、並びに、エクソン１〜３及び５を有し、エクソン４が欠損している選択的転写物（下部）を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図７３・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー（例えばエクソン５特異的プライマー）及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。エクソン３及びエクソン４に相補的なフォワードプライマーと共に、エクソン５プライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、野生型及び欠失変異体の両方の単位複製配列を生成する。制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０サイクル）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図７３・工程Ｂ）。別の実施形態において、２０〜４０回のＰＣＲサイクルを使用して対象領域を増幅する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図７３・工程Ｃ）。図７３・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図７３・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、並びに、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ及びＦ２−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図７３・工程Ｅ〜Ｆ）。リアルタイムＰＣＲを使用し、異なる標識を付けたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを検出して、野生型及び欠失変異体を定量化して識別する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図７３・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１７１】
図７４は、野生型転写物、及びエクソン欠失を有する転写物を定量化するための別のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図７４・工程Ａは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、並びに、エクソン１〜３及び５を有し、エクソン４が欠損している選択的転写物（下部）を示す。ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するようにエクソン接合部特異的ライゲーションプローブを設計することを除いて、本方法の工程Ａ〜Ｄは、図７３で記載したものと実質的に同一である。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図７４・工程Ｅ〜Ｇで記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、野生型及び変異体転写物に対応するライゲーション産物を、後で増幅、検出、及び定量化する。
【０１７２】
図７５は、野生型転写物、及びエクソン欠失を有する転写物を定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。図７５・工程Ａは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、並びに、エクソン１〜３及び５を有し、エクソン４が欠損している選択的転写物（下部）を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図７５・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー（例えばエクソン５特異的プライマー）及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。エクソン３及びエクソン４に相補的なフォワードプライマーと共に、エクソン５プライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、野生型及び欠失変異体の両方の単位複製配列を生成する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部、及びユニバーサルプライマー特異的部分を含有し、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図７５・工程Ｃ）。図７５・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図７５・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図７５・工程Ｅ）。 
【０１７３】
図７６は、エクソン欠失を有する少量の転写物を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図７６・工程Ａは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、並びに、エクソン１〜３及び５を有し、エクソン４が欠損している選択的転写物（下部）を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図７６・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー（例えば、エクソン５特異的プライマー）及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。エクソン３に相補的なフォワードプライマー、及びブロックオリゴヌクレオチドと共にエクソン５プライマーを使用して、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する。野生型転写物中のエクソン４にブロッキングオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションすることにより、野生型転写物の増幅を防止する。したがって、欠失転写物に対応する増幅産物のみが生成する。ＰＣＲ産物はｄＵＴＰを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図７６・工程Ｃ）。図７６・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なタグプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ、（図７６・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図７６・工程Ｅ〜Ｆ）。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの蛍光性基の遊離により、リアルタイムＰＣＲの間に欠失転写物を検出する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図７６・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅される。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１７４】
図７７及び７８は、少量の欠失転写物を検出するための、図７６で記載して示したものに類似のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を表す。図７７の実施形態において、ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを設計する。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図７７・工程Ｅ〜Ｇに記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、欠失転写物に対応するライゲーション産物を後で増幅、検出、及び定量化する。図７８の実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図７８・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端が互いにハイブリダイゼーションして、対応するドナー及びアクセプター部位（Ｄ、Ｆ２）を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図７８・工程Ｅ）。
【０１７５】
図７９は、イントロンを挿入した選択的スプライシングを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応の概要を表す。図７９・工程Ａは、ＤＮＡレベルでの、５個のエクソン及び４個のイントロンを有する遺伝子の図解を示す。図７９・工程Ｂは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、及び、イントロンｉ１を挿入し、エクソン１〜５を含有する選択的スプライシングを受けた転写物（下部）の例を示す。図７９・工程Ｂに示すように、本方法は、全血細胞、エクソソーム、またはＣＴＣからｍＲＮＡを単離し、エクソン２に相補的なプライマーと逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを生成することを含む。エクソン１に対するフォワードプライマーと共に、エクソン２特異的プライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、野生型及びイントロン挿入変異体の両方の単位複製配列を生成する。図７９・工程Ｃに示すように、タグプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’；左パネル）、またはＵｎｉＴａｑプライマー及びタグ配列（Ａｉ、Ｂｉ’−Ｃｉ’；右パネル）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、ＰＣＲ産物中の対応する標的配列にハイブリダイゼーションし、接合部において完全に相補性である場合、リガーゼが、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じる。上述したタグ特異的プライマー（Ａｉ、Ｃｉ）及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−ＱもしくはＦ２−Ｑ；図７９・工程Ｄ、左パネル）、またはＵｎｉＴａｑプライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｆ２−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、及びＣｉ、図７９・工程Ｄ、右パネル）を使用して、ライゲーション産物を増幅して検出する。
【０１７６】
図８０は、野生型転写物、及びイントロン挿入を含有する選択的スプライシングを受けた転写物を定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図８０・工程Ｂは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、及び、イントロンｉ１を挿入し、エクソン１〜５を含有する選択的スプライシングを受けた転写物（下部）の例を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図８０・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー（例えばエクソン２特異的プライマー）及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。エクソン１に対するフォワードプライマーと共に、エクソン２特異的プライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、野生型及びイントロン挿入変異体の両方の単位複製配列を生成する。制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０サイクル）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図８０・工程Ｂ）。別の実施形態では、対象領域は、２０〜４０サイクルを使用して増幅される。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図８０・工程Ｃ）。図８０・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なタグプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図８０・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、並びに、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ及びＦ２−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図８０・工程Ｅ〜Ｆ）。リアルタイムＰＣＲを使用し、異なる標識を付けたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを検出して、野生型及び挿入変異体を定量化して識別する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図８０・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１７７】
図８１は、野生型転写物、及びイントロン挿入を含有する選択的スプライシングを受けた転写物を定量化するための、別のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。図８１・工程Ｂは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、及び、イントロンｉ１を挿入し、エクソン１〜５を含有する選択的スプライシングを受けた転写物（下部）の例を示す。ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを設計することを除いて、本方法の工程Ａ〜Ｄは、図８０で記載したものと実質的に同一である。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図８１・工程Ｅ〜Ｇで記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、野生型及び変異体転写物に対応するライゲーション産物を、後で増幅、検出、及び定量化する。
【０１７８】
図８２は、野生型転写物、及びイントロン挿入を含有する選択的スプライシングを受けた転写物を定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。図８２・工程Ｂは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、及び、イントロンｉ１を挿入し、エクソン１〜５を含有する選択的スプライシングを受けた転写物（下部）の例を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図８２・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー（例えばエクソン２特異的プライマー）及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。エクソン１に対するフォワードプライマーと共に、エクソン２特異的プライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、野生型及びイントロン挿入変異体の両方の単位複製配列を生成する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部、及びユニバーサルプライマー特異的部分を含有し、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図８２・工程Ｃ）。図８２・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図８２・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図８２・工程Ｅ）。
【０１７９】
図８３は、イントロン挿入を含有する少量の転写物を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を表す。図８３・工程Ｂは、エクソン１〜５を含有する野生型転写物（上部）、及び、イントロンｉ１を挿入し、エクソン１〜５を含有する選択的スプライシングを受けた転写物（下部）の例を示す。本方法は、ｍＲＮＡを単離して、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図８３・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー（例えば、エクソン２特異的プライマー）及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。イントロン特異的フォワードプライマーと共にエクソン２プライマーを使用して、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する。イントロン特異的プライマーは野生型転写物を増幅しないため、イントロンｉ１挿入を含有する転写物のみが増幅される。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図８３・工程Ｃ）。図８３・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するエクソン接合部特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図８３・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図８３・工程Ｅ〜Ｆ）。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの蛍光性基の遊離により、リアルタイムＰＣＲの間に、イントロン挿入を含有する転写物を検出する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図８３・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅される。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１８０】
図８４及び８５は、少量のイントロン挿入転写物を検出するための、図８３で記載して示したものに類似のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を表す。図８４の実施形態において、ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように、エクソン接合部特異的ライゲーションプローブを設計する。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図８４・工程Ｅ〜Ｇに記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、イントロン挿入転写物に対応するライゲーション産物を後で増幅、検出、及び定量化する。図８５の実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図８５・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端が互いにハイブリダイゼーションして、対応するドナー及びアクセプター部位（Ｄ、Ｆ１）を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図８５・工程Ｅ）。
【０１８１】
本発明の方法は、サンプル中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列の量の定量化または計算に好適である。例えば、本発明の方法を利用して、図８６〜９１に示すように、サンプル中の１つ以上の標的核酸分子の相対的なコピー数を計算することができる。
【０１８２】
図８６は、ＤＮＡコピー数を計算するためのＰＣＲ−ＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、ＣＴＣ、腫瘍特異的エクソソーム、または他の生体サンプルからＤＮＡを単離すること、及び、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図８６・工程Ｂ）。サイクルを制限したＰＣＲ（１２〜２０サイクル）を使用して対象の染色体領域を増幅し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図８６・工程Ｂ）。別の実施形態において、対象の染色体領域を、２０〜４０サイクルを使用して増幅する。正確な計算のために、ＰＣＲ増幅の前に、サンプルを１２、２４、４８、または９６個のウェルに分配する。プライマーは、プライマー二量を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図８６・工程Ｃ）。図８６・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有する遺伝子座特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図８６・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図８６・工程Ｅ〜Ｆ）。異なるウェルまたはチャンバにおけるシグナルのポアソン分布に基づいて、ＤＮＡのコピー数を決定する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図８６・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１８３】
図８７は、ＤＮＡコピー数を計算するための別のＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、本質的には、図８６で示した方法と同一の工程（即ち、工程Ａ〜Ｄ）を含むが、本実施形態では、遺伝子座特異的ライゲーションプローブは、ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように設計される。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図８７・工程Ｅ〜Ｇで記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、ライゲーション産物を後で増幅、検出、及び定量化する。異なるウェルまたはチャンバにおけるシグナルのポアソン分布に基づいてコピー数を決定する。
【０１８４】
図８８も、ＤＮＡコピー数を計算するためのＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応について示す。本方法は、ＣＴＣ、腫瘍特異的エクソソーム、または他の生体サンプルからＤＮＡを単離すること、及び、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図８８・工程Ｂ）。サイクルを制限したＰＣＲ（１２〜２０サイクル）を使用して対象の染色体領域を増幅し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図８８・工程Ｂ）。別の実施形態において、対象の染色体領域を、２０〜４０サイクルを使用して増幅する。正確な計算のために、ＰＣＲ増幅の前に、サンプルを１２、２４、４８、または９６個のウェルに分配する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部、及びユニバーサルプライマー特異的部分を含有し、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図８８・工程Ｃ）。図８８・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、遺伝子座特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図８８・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図８８・工程Ｅ）。異なるウェルまたはチャンバにおけるシグナルのポアソン分布に基づいてコピー数を決定する。
【０１８５】
図８９は、ＲＮＡコピー数を計算するためのＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、全血細胞、エクソソーム、ＣＴＣ、または他の生体サンプルからＲＮＡを単離すること、及び、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図８９・工程Ｂ）。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。Ｔａｑポリメラーゼを活性化してサイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図８９・工程Ｂ）。正確な計算のために、ＰＣＲ増幅の前に、サンプルを１２、２４、４８、または９６個のウェルに分配する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図８９・工程Ｃ）。図８９・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なタグプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有する遺伝子座特異的ライゲーションオリゴヌクレオチドプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図８９・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図８９・工程Ｅ〜Ｆ）。異なるウェルまたはチャンバにおけるシグナルのポアソン分布に基づいたリアルタイムＰＣＲを使用して、ＲＮＡのコピー数を定量化する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図８９・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１８６】
図９０は、ＲＮＡコピー数を計算するための別のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。正確な計算のために、ＰＣＲ増幅の前に、サンプルを１２、２４、４８、または９６個のウェルに分配する。本方法は、本質的には、図８９で示した方法と同一の工程（即ち、工程Ａ〜Ｄ）を含むが、本実施形態では、遺伝子座特異的ライゲーションプローブは、ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように設計される。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図９０・工程Ｅ〜Ｇで記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、ライゲーション産物を後で増幅、検出、及び定量化する。異なるウェルまたはチャンバにおけるシグナルのポアソン分布に基づいてコピー数を決定する。
【０１８７】
図９１は、ＲＮＡコピー数を計算するためのＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、全血細胞、エクソソーム、ＣＴＣ、または他の生体サンプルからＲＮＡを単離すること、及び、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図９１・工程Ｂ）。正確な計算のために、ＰＣＲ増幅の前に、サンプルを１２、２４、４８、または９６個のウェルに分配する。ｄＵＴＰの存在下において、３’転写物特異的プライマー及び逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡを生成する。Ｔａｑポリメラーゼを活性化してサイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施し、異なる単位複製配列の相対比率を維持する（図９１・工程Ｂ）。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部、及びユニバーサルプライマー特異的部分を含有し、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図９１・工程Ｃ）。図９１・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、遺伝子座特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のエクソン接合部特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図９１・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図９１・工程Ｅ）。異なるウェルまたはチャンバにおけるシグナルのポアソン分布に基づいてコピー数を決定する。本発明の別の態様は、サンプルにおいて、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子のマイクロリボヌクレオチド配列とは１つ以上の塩基が異なる標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有する、１つ以上のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別する方法に関する。本方法は、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子のマイクロリボヌクレオチド配列とは１つ以上の塩基が異なる標的マイクロリボヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供し、各プライマーセットは、（ａ）５’ステムループ部分、ブロック基、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、及び、標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有するｍｉＲＮＡ分子の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有するｍｉＲＮＡ分子の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列部分、及び５’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーの内部プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに、（ｄ）第２のオリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第４のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。接触したサンプルを、プライマーセットの１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素と混和し、逆転写反応混合物を形成する。サンプル中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有するｍｉＲＮＡ分子にハイブリダイゼーションし、逆転写酵素はハイブリダイゼーションした第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長し、標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有するｍｉＲＮＡ分子の相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーを生成する。本方法は更に、プライマーセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有するｍｉＲＮＡ分子の相補鎖を含む伸長した第１のオリゴヌクレオチドプライマーの領域にハイブリダイゼーションし、伸長して、５’プライマー特異的部分、ｍｉＲＮＡ分子の標的マイクロリボヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列、及び内部プライマー特異的部分の相補鎖を含む一次伸長生成物を生成するのに効果的な条件下において、逆転写反応混合物を、プライマーセットの第２、第３、及び第４のオリゴヌクレオチドプライマーと混和し、ポリメラーゼ反応混合物を形成することを含む。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより、複数の一次伸長生成物を形成する。本方法は更に、複数の一次伸長生成物をリガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和し、ライゲーション反応混合物を形成することを含む。各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）標的特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、（ｂ）標的特異的部分、及び一次伸長生成物に相補的な部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補性標的特異的部分にて、間に接合部を有して互いに隣接してハイブリダイゼーションするように構成される。１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを互いにライゲーションして、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、サンプル中のライゲーション産物配列を検出して識別することにより、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子のマイクロリボヌクレオチド配列とは１つ以上の塩基が異なる標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有する１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を識別する。
【０１８８】
図９２は、ｍｉＲＮＡを定量化するためのＰＣＲ−ＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、エクソソームまたは他の生体サンプルからＲＮＡを単離すること、及び、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図９２・工程Ｂ）。標的ｍｉＲＮＡの３’末端に相補的な部分を有し、ステムループ、タグ（Ｔｊ）、及びブロック基（塗りつぶした円）を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを、標的ｍｉＲＮＡの３’末端にハイブリダイゼーションする。ｄＵＴＰの存在下において逆転写酵素（塗りつぶした菱形）を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長する（図９２・工程Ｂ）。図９２・工程Ｂに示すように、Ｔａｑポリメラーゼを活性化して、逆転写したｍｉＲＮＡの一部に相補的な配列及び上流プライマー特異的配列部分尾部（Ｔｉ）を含むブリッジプライマー、並びにタグ（Ｔｉ、Ｔｊ）プライマーを使用した、サイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。所望により、ＰＣＲの前に、サンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取することができる。ＰＣＲ産物はｄＵＴＰを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図９２・工程Ｃ）。図９２・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するｍｉＲＮＡ配列特異的ライゲーションプローブを、塩基特異的な方法で、ＰＣＲ産物中の対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図９２・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図９２・工程Ｅ〜Ｆ）。遊離したＴａｑＭａｎ（商標）プローブの標識の検出に基づいたリアルタイムＰＣＲを使用して、サンプル中におけるｍｉＲＮＡの存在を定量化する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図９２・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１８９】
図９３は、ｍｉＲＮＡを定量化するための別のＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、本質的には、図９２で示した方法と同一の工程（即ち、工程Ａ〜Ｄ）を含むが、本実施形態では、ｍｉＲＮＡ特異的ライゲーションプローブは、ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように設計される。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図９３・工程Ｅ〜Ｇで記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、ライゲーション産物を後で増幅、検出、及び定量化する。
【０１９０】
図９４もまた、ｍｉＲＮＡを定量化するためのＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応について示す。本方法は、エクソソームまたは他の生体サンプルからＲＮＡを単離すること、及び、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図９４・工程Ｂ）。標的ｍｉＲＮＡの３’末端に相補的な部分を有し、ステムループ、タグ（Ｔｊ）、及びブロック基（塗りつぶした円）を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを、標的ｍｉＲＮＡの３’末端にハイブリダイゼーションする。ｄＵＴＰの存在下において逆転写酵素（塗りつぶした菱形）を使用して、オリゴヌクレオチドの３’末端を伸長する（図９４・工程Ｂ）。図９４・工程Ｂに示すように、Ｔａｑポリメラーゼを活性化して、逆転写したｍｉＲＮＡの一部に相補的な配列及び上流プライマー特異的配列部分（Ｔｉ）を含むブリッジプライマー、並びにタグ（Ｔｉ、Ｔｊ）プライマーを使用した、サイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０回）を実施する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部、及びユニバーサルプライマー特異的部分を含有し、後のビオチン標識プライマーを使用したユニバーサルＰＣＲ増幅により、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加することを可能にする。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図９４・工程Ｃ）。図９４・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、ｍｉＲＮＡ配列特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のｍｉＲＮＡ配列特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図９４・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図９４・工程Ｅ）。
【０１９１】
本発明の別の態様は、サンプルにおいて、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基の配列が異なる標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有する１つ以上のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子を識別するための方法に関する。本方法は、他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基の違いにより配列が異なる標的マイクロリボヌクレオチド配列を潜在的に含有する１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を含有するサンプルを提供すること、及び、該サンプルを、サンプル中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を分解可能な１種以上の酵素と接触させることを含む。接触したサンプルを、リガーゼと、並びに、５’リン酸基、５’ステムループ部分、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロック基、及び、標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有するｍｉＲＮＡ分子の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプローブと混和してライゲーション反応物を形成する。本方法は更に、サンプル中に存在する場合、３’末端に標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有するｍｉＲＮＡ分子を、第１のオリゴヌクレオチドプローブの５’リン酸基にライゲーションして、第１のオリゴヌクレオチドプローブに付加された標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有するｍｉＲＮＡ分子を含むキメラ核酸分子を生成することを含む。１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供し、各プライマーセットは、（ａ）標的マイクロリボヌクレオチド配列及び５’プライマー特異的部分を含有するｍｉＲＮＡ分子の５’末端の相補鎖に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドプローブの内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分と同一のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。キメラ核酸分子を、１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチド混合物、及び逆転写酵素と混和して逆転写反応混合物を形成し、プライマーセットの１つ以上の第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、キメラ核酸分子の内部プライマー特異的部分にハイブリダイゼーションし、サンプル中に存在する場合、３’末端にて伸長してキメラ核酸分子の相補鎖を生成する。本方法は更に、逆転写反応混合物を、プライマーセットの第１及び第３のオリゴヌクレオチドプライマーと混和してポリメラーゼ反応混合物を形成すること、並びに、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供すことにより一次伸長生成物を形成することを含む。一次伸長生成物は、５’プライマー特異的部分、ｍｉＲＮＡ分子の標的マイクロリボヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列、及び、内部プライマー特異的部分またはその相補鎖を含む。一次伸長生成物を、リガーゼ及び１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと混和し、ライゲーション反応混合物を形成する。各オリゴヌクレオチドプローブセットは、（ａ）標的特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、（ｂ）標的特異的部分、及び一次伸長生成物に相補的な部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的な方法で、一次伸長生成物の相補性標的特異的部分にて、間に接合部を有して互いに隣接してハイブリダイゼーションするように構成される。１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを互いにライゲーションして、ライゲーション反応混合物中でライゲーション産物配列を形成し、サンプル中のライゲーション産物配列を検出して識別することにより、サンプル中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基の配列が異なる標的マイクロリボヌクレオチド配列を含有する１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を識別する。
【０１９２】
図９５は、ｍｉＲＮＡを定量化するためのライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、エクソソームからＲＮＡを単離すること、及び、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図９５・工程Ｂ）。標的ｍｉＲＮＡの３’末端に相補的な部分を有し、ステムループ、タグ（Ｔｊ’）、及びブロック基（塗りつぶした円）を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、プローブの５’末端から標的ｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションする。ライゲーション産物は、ｍｉＲＮＡ、Ｔｊ’タグ、ブロック基、及びｍｉＲＮＡの３’部分に相補的な配列を含む（図９５・工程Ｂ）。Ｔｊ’に対するプライマー、及び逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを生成する。図９５・工程Ｂに示すように、逆転写したｍｉＲＮＡの一部に相補的な配列及び上流プライマー特異的配列部分（Ｔｉ）を含むブリッジプライマー、並びにタグ（Ｔｉ、Ｔｊ）プライマーを使用する、サイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０サイクル）において、ＴａｑポリメラーゼによりｃＤＮＡを増幅する。あるいは、２０〜４０回のＰＣＲサイクルを使用してｃＤＮＡを増幅する。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。所望により、ＰＣＲの前に、サンプルの一定量を１２、２４、４８、または９６個のウェルに分取することができる。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図９５・工程Ｃ）。
【０１９３】
図９５・工程Ｄに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するｍｉＲＮＡ配列特異的ライゲーションプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図９５・工程Ｄ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図９５・工程Ｅ〜Ｆ）。遊離したＴａｑＭａｎ（商標）プローブの標識の検出に基づいたリアルタイムＰＣＲを使用して、サンプル中におけるｍｉＲＮＡの存在を定量化する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図９５・工程Ｅ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１９４】
図９６は、ｍｉＲＮＡを定量化するための別のライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、本質的には、図９５で示した方法と同一の工程（即ち、工程Ａ〜Ｄ）を含むが、本実施形態では、ｍｉＲＮＡ特異的ライゲーションプローブは、ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように設計される。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図９６・工程Ｅ〜Ｇで記載したように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、ライゲーション産物を後で増幅、検出、及び定量化する。
【０１９５】
図９７は、ｍｉＲＮＡを定量化するためのライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ｑＬＤＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、図９５に記載して示したのと実質的に同じ工程、即ち工程Ａ及びＢを含む。しかし、本実施形態では、工程Ｂで生成されるｃＤＮＡを、少なくとも１種のビオチン標識プライマーを使用して増幅し、５’ビオチンを、対象の領域を含有する増幅産物に付加する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図９７・工程Ｃ）。図９７・工程Ｄに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、ｍｉＲＮＡ配列特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のｍｉＲＮＡ配列特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図９７・工程Ｄ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図９７・工程Ｅ）。
【０１９６】
図９８は、ｍｉＲＮＡを定量化するためのライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、エクソソームまたは他の生体サンプルからＲＮＡを単離すること、及び、キャリーオーバー防止のためにＵＤＧで処理することを含む（図９８・工程Ｂ）。標的ｍｉＲＮＡの３’末端に相補的な部分を有し、ステムループ、タグ（Ｔｊ’）、及びブロック基（塗りつぶした円）を含有するオリゴヌクレオチドプローブを、プローブの５’末端から標的ｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションする。ライゲーション産物は、ｍｉＲＮＡ、Ｔｊ’タグ、ブロック基、及びｍｉＲＮＡの３’部分に相補的な配列を含む（図９８・工程Ｂ）。プライマーＴｊ、及び逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを生成する。逆転写したｍｉＲＮＡの一部に相補的な配列及び上流プライマー特異的配列部分（Ｔｉ）を含むブリッジプライマー、並びにタグ（Ｔｉ、Ｔｊ）プライマーを使用する、サイクルを制限したＰＣＲ増幅（１２〜２０サイクル）において、ＴａｑポリメラーゼによりｃＤＮＡを増幅し、ブリッジプライマーは、図９８・工程Ｃに示すように、３’末端に切断可能なブロック基を含有する。あるいは、２０〜４０回のＰＣＲサイクルを使用してｃＤＮＡを増幅する。上述のように、Ｃ３スペーサーは好適なブロック基であり、ＲＮＡ塩基（ｒ）は、プライマーが相補性標的にハイブリダイゼーションする場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ（星印）を使用して切断される。プライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。所望により、ＰＣＲの前に、サンプルの一定量を２４、４８、または９６個のウェルに分取することができる。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図９８・工程Ｄ）。
【０１９７】
図９８・工程Ｅに示すように、後のＰＣＲ増幅に好適なプライマー特異的部分（Ａｉ、Ｃｉ’）を含有するｍｉＲＮＡ配列特異的ライゲーションプローブを、塩基特異的な方法で、対応する標的配列にハイブリダイゼーションする。リガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを互いに共有結合で閉じ（図９８・工程Ｅ）、タグプライマー（Ａｉ、Ｃｉ）、及び、ライゲーション接合部にまたがるＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ｆ１−Ｑ）を使用した検出のために、ライゲーション産物の一定量を個別のウェルに分取する（図９８・工程Ｆ〜Ｇ）。遊離したＴａｑＭａｎ（商標）プローブの標識の検出に基づいたリアルタイムＰＣＲを使用して、サンプル中におけるｍｉＲＮＡの存在を定量化する。キャリーオーバー防止のためにサンプルをＵＤＧで処理し、この処理では、元の標的単位複製配列もまた破壊する（図９８・工程Ｆ）。ｄＵＴＰの存在下においてＰＣＲを使用した場合、本物のＬＤＲ産物のみが増幅する。元のＰＣＲプライマー、及びＬＤＲプローブのどちらもＬＤＲ産物を増幅せず、さらなるキャリーオーバー防止をもたらす。
【０１９８】
図９９は、ｍｉＲＮＡを定量化するための別のライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、本質的には、図９８で示した方法と同一の工程（即ち工程Ａ〜Ｅ）を含むが、本実施形態では、ｍｉＲＮＡ特異的ライゲーションプローブは、ＵｎｉＴａｑプライマー配列（Ａｉ、Ｃｉ’）、及びＵｎｉＴａｑタグ配列（Ｂｉ’）を含有するように設計される。したがって、本実施形態では、上述のように、かつ、図９９・工程Ｆ〜Ｈに記載するように、ＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（Ｆ１−Ｂｉ−Ｑ−Ａｉ、Ｃｉ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して、ライゲーション産物を後で増幅、検出、及び定量化する。
【０１９９】
図１００は、ｍｉＲＮＡを定量化するためのライゲーション−ＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲキャリーオーバー防止反応を示す。本方法は、図９８に記載して示したのと実質的に同じ工程、即ち工程Ａ及びＢを含む。しかし、本実施形態では、工程Ｂで作製するｃＤＮＡを、少なくとも１種のビオチン標識プライマーを使用して増幅し、対象の領域を含有するビオチン化生成物を形成する。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込み、キャリーオーバー防止を可能にする（図１００・工程Ｄ）。図１００・工程Ｅに示すように、ビオチン化ＰＣＲ産物を固体支持体に固定し、ｍｉＲＮＡ配列特異的ライゲーションプローブを使用して対象の領域を検出する。本実施形態において、ライゲーション対のｍｉＲＮＡ配列特異的ライゲーションプローブは、相補性尾部配列、及びそれぞれ、上述のように互いに極めて接近した場合にＦＲＥＴを介して検出可能なシグナルを生成可能なアクセプターまたはドナー基を含有する。したがって、ライゲーションに続いて（図１００・工程Ｅ）、ライゲーション産物の相補性５’及び３’尾部末端は互いにハイブリダイゼーションし、対応するドナー及びアクセプター部位を互いに極めて接近させ、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成する（図１００・工程Ｆ）。
【０２００】
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明の方法は、１つ以上のヌクレオチド塩基の変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、ゲノムレベル及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基での他の再配列を含む少量の核酸分子を検出することが可能である。 
【０２０１】
本明細書で使用する場合、「少量の核酸分子」とは、サンプル中に１％〜０．０１％程の少なさで存在する標的核酸分子を意味する。即ち、１つ以上のヌクレオチド塩基の変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、ゲノムレベル及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基での他の再配列を有する少量の核酸分子を、１つ以上のヌクレオチド塩基の変異、挿入、欠失、転座、スプライス変異体、ｍｉＲＮＡ変異体、選択的転写、選択的開始部位、選択的コード配列、選択的非コード配列、選択的スプライシング、エクソン挿入、エクソン欠失、イントロン挿入、ゲノムレベル及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基での他の再配列を有しない、少量の核酸分子と類似したヌクレオチド配列を有するサンプル（即ち、多量の核酸分子）中の、１００〜１０，０００倍過剰の核酸分子から識別することができる。
【０２０２】
本発明のいくつかの実施形態では、１つ以上の少量の標的ヌクレオチド配列のコピー数を、少量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するサンプル中の、多量の核酸分子のコピー数と比較して定量化する。本発明の他の実施形態において、サンプル中の他のヌクレオチド配列と比較して、１つ以上の標的ヌクレオチド配列を定量化する。本発明の他の実施形態において、１つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対的なコピー数を定量化する。相対的、及び絶対的（即ちコピー数）定量化の方法は、当該技術分野において周知である。
【０２０３】
検出される少量の標的核酸分子は、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞血中循環核酸、無細胞血中循環腫瘍核酸、妊娠した女性の無細胞血中循環胎児核酸、血中循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検、及びエクソソームを含むがこれらに限定されない任意の生体サンプル中に存在することができる。
【０２０４】
本発明の方法は、病状の診断もしくは予測、及び／または遺伝子型もしくは病気の素因の識別に好適である。
【０２０５】
初期の癌検出に関して、本発明の方法は、サンプル中に１％〜０．０１％で存在する場合、既知の遺伝子（例えばＣＲＡＦ、ＫＲＡＳ）中の反復変異体、及び既知の遺伝子（例えばｐ５３）中の一般的でない変異の両方の検出に好適である。本発明の方法は、エクソソームから単離した腫瘍特異的ｍＲＮＡ（例えば、マッチする通常の粘膜から結腸腫瘍組織を識別する多くの発現マーカー）、及び、エクソソームまたはアルゴノートタンパク質から単離した腫瘍特異的ｍｉＲＮＡ（例えば、マッチする通常の粘膜から結腸腫瘍組織を識別する多くのマイクロＲＮＡマーカー）の正確な定量化を達成することもまた可能である。本発明の方法は、血中循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ中の腫瘍特異的コピーの変化の正確な定量化（例えば、マッチする通常の粘膜から結腸腫瘍組織を識別する多くのコピー変化）、及び、血中循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ（例えばＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＡＫＴ、ｐ５３、ＢｒＣＡ１遺伝子）における変異の検出もまた提供する。
【０２０６】
本発明は、（ｉ）エクソソームまたは血中循環腫瘍細胞から単離した腫瘍特異的ｍＲＮＡ、（ｉｉ）エクソソームまたはアルゴノートタンパク質から単離した腫瘍特異的ｍｉＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）転帰を予測可能、または治療をガイド可能な、血中循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ中の腫瘍特異的コピーの変化を正確に定量化することも可能である。本発明は、転帰を予測するか、または治療をガイドする、血中循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ、例えばＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＡＫＴ、ｐ５３、ＢｒＣＡ１または他の遺伝子における変異を検出することも可能である。
【０２０７】
出生前診断に関して、本発明の方法は、コピー数を数えることによる異数性（例えばトリソミー２１）、既知の遺伝子に一般的な変異を含有する遺伝病（例えば鎌形赤血球貧血、嚢胞性線維症）、既知の遺伝子に一般的でない変異を含有する遺伝病（例えば家族性大腸ポリポーシス）、既知の遺伝子における、既知の、または散発性の、コピー数の喪失または増加により生じる遺伝病（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー）を検出し、父子鑑別を行うことが可能である。
【０２０８】
上述のアッセイを臨床的設定において実施する重要な観点は、横列、及び縦列にサンプル、試薬及びアッセイ特異的プローブ／プライマーを満たすのに必要な労力の量を減少させることである。多くの実験室では９６ウェルプレートが標準的であるが、３８４ウェルプレートはより高いスループット、及び各アッセイウェルのコスト低下をもたらす。これらのウェルプレートを採用することによる障害の一部により、これらのプレートに関係する労働が増加し、これはピペッティングロボットにより解決可能であるが、相当の資本的支出を含む。プレート内でのアッセイの特定の構成に応じて、ピペットチップの使用が増加することによってもまた、著しい支出が発生する。上述のアッセイの一実施形態では、２４個のマルチプレックスＰＣＲ−ＬＤＲ反応物をマイクロタイタープレートの２４個の縦列に分配し、続いて、ＬＤＲタグプローブの１６種類の異なるセットを、プレートの横列にわたって分配することを必要とする。このアッセイ設定では、８チップピペッターにより４８回の送達を行い縦列を満たし、次いで、８チップピペッターによる４８回の送達により列を全て満たすことを必要とする。１５３６個のウェルを有するプレートは、アッセイのコストを更に低下させるという利点を有するが、人が操作する手動能力を超えているため、自動化した充填が必要とされる。液体を各「ウェル」に導入する、デッドボリュームが少ないチャネルを使用するマイクロ流体デバイスを使用することにより、ピペット操作の回数を減少させて多くの横列及び縦列を同時に満たすことができる装置が実用化されているが、バルブ及び外部バルブドライバーを更に複雑にする必要がある。異なるアプローチがはっきりと是認されている。
【０２０９】
本発明の別の態様は、マイクロタイタープレートと組み合わせて使用するための、対向した上部表面及び底部表面を有し、上部表面はウェルの中に至る開口部を有し、底部表面はウェルの閉鎖端を画定するマイクロタイタープレートの、横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに同時に液体を加えるデバイスに関する。本デバイスは、第１及び第２の境界により画定される第１層を含み、計量チャンバが前記第１層の第１及び第２の境界の間に延在し、互いに流体連通している。第１層は作動可能な位置で、マイクロタイタープレートに隣接して適合するように構成され、第１層の第１の境界はマイクロタイタープレートの上部表面に最も近く、計量チャンバのそれぞれは、マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと流体連通している。第１層は、計量チャンバの１つ以上と流体連通した充填チャンバを更に含む。本デバイスは、第１及び第２の境界により画定される第２層を含み、充填ポートが第２層の第１及び第２の境界の間に延在する。第２層は、作動可能な位置で第１層に隣接して適合するように構成され、第２層の第１の境界は第１層の第２の境界に最も近く、充填ポートは充填室と連動している。第１層、第２層、及びマイクロタイタープレートが互いに作動可能な位置で配置される場合、充填ポートを通してデバイスに入る液体は、充填チャンバ、計量チャンバを通過して、マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに入る。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、本発明のデバイスは、第１及び第２の境界を有する中間層を更に含み、中間層流路が、前記中間層の第１及び第２の境界の間に延在している。中間層は、作動可能な位置でマイクロタイタープレートと第１層との間に適合するように構成され、中間層の第１の境界はマイクロタイタープレートの上部表面に隣接し、中間層の第２の境界は第１層の第１の境界に隣接している。中間層流路の１つはマイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった個々のウェルと連動しており、第１層、第２層、中間層、及びマイクロタイタープレートが、作動可能な位置で互いに配置される場合、充填ポートを通してデバイスに入る液体は充填チャンバ、計量チャンバ、中間層流路を通過し、マイクロタイタープレートのウェルに入る。
【０２１１】
本発明のデバイスは、第１及び第２の境界を有する第３層を更に含んでよく、充填ポートコネクタが、第３層の第１及び第２の境界の間に延在している。第３層は、作動可能な位置で第１及び第２層の間に適合するように構成され、第３層の第１の境界は第１層の第２の境界に隣接し、充填ポートコネクタは充填ポートと連動している。第１層、第２層、第３層、中間層、及びマイクロタイタープレートが、作動可能な位置で互いに配置される場合、充填ポートを通してデバイスに入る液体は充填ポートコネクタ、充填チャンバ、計量チャンバ、中間層流路を通過し、マイクロタイタープレートのウェルに入る。
【０２１２】
図１０３〜１１２は、本発明のデバイスの１つの例示的実施形態を示す。図１０３は、本発明のデバイスと組み合わせて使用される、典型的な３８４ウェルマイクロタイタープレート１００の上部及び側面図を示す。マイクロタイタープレートはいくつかのウェル１０３により画定され、各ウェルは、サンプル及び／または反応試薬を受けるのに好適な上部開口端１０４、並びに閉口下端１０２を有する。図１０４は、図１０３のマイクロタイタープレートの斜視図を示す。
【０２１３】
図１０５及び１０６は、それぞれ、マイクロタイタープレート１００の上部表面に隣接して配置した、デバイスの中間層１０６の上部及び側面図、並びに分解斜視図を示す。デバイスの中間層１０６は、中間層に延在する中間流路１０８を含有する。中間層１０６の各中間流路１０８は、マイクロタイタープレート１００の横列または縦列の個別のウェル１０３と連動している。一実施形態では、中間層流路は、計量チャンバから、マイクロタイタープレートのウェルへの液体の流れを制御または防止するためのバーストバルブとして機能する。中間層流路１０８の垂直チャネルの直径が、遠心力が加わるまで液体が計量チャンバ１２０（図１０７を参照）から流れることを防止する表面張力を生み出す。いくつかの実施形態において、中間層流路１０８の垂直壁は、遠心力が加わるまで、計量チャンバ１２０からの流体流れの抵抗を増加させる疎水性物質で構成されるか、これによりコーティングされる。好適な疎水性物質としては、≧９０°の水接触角を有する任意の材料、例えば、環状オレフィンコポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリジメチルシロキサン、フッ素化エチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。あるいは、中間層流路の壁を、＜９０°の水接触角を有する親水性材料で構成する一方、疎水性コーティング、例えばテフロン−カーボンブラックで処理し、＞１５０°の水接触角を有する超疎水性表面を作製してもよい。
【０２１４】
計量チャンバ１２０（図１０７を参照）の容積に対する中間層流路１０８の抵抗の比率は、当業者により容易に計算可能である。あるいは、外から加わる力の影響を受けながら液体を放出する受動性バルブの他の実施形態を用いることができる。
【０２１５】
図１０５及び１０６に示すように、中間層１０６は、第１層のオーバーフローチャンバ１１６を第１層の充填チャンバ１１８（図１０７を参照）と接続するオーバーフロー流路１１０もまた含有する。
【０２１６】
図１０１及び１０２に示すように、マイクロタイタープレートの上部の周辺にデバイスの位置を記号で示すことにより、マイクロタイタープレートの上部表面への、デバイスの適切な配置及び配向を達成する。計量チャンバのそれぞれを更に位置合わせすることは、図１０５の側面図に示すように、マイクロタイタープレート１００の各ウェル１０３の開口端１０４と接する中間層１０６にフランジまたはスカート１１２を用いることにより達成可能である。位置決めの他の実施形態は、例えば、マイクロタイタープレートのウェルの上部の小型フランジに基づいて、当業者により想到されることができる。気密シールを提供することを意図したものではないが、図１０５に示す中間層１０６のフランジまたはスカート１１２は、マイクロタイタープレート１００の隣接ウェル間での交差汚染制御のいくらかの対策をもたらす。
【０２１７】
図１０７及び１０８は、それぞれ、デバイスの中間層１０６の第２の境界に隣接して作動可能に配置した、デバイスの第１層１１４の上部及び側面図、並びに分解斜視図を示す。デバイスの第１層１１４は、計量チャンバチャネル１２２を介して互いに、かつ、マイクロタイタープレートの個々のウェル１０３と流体連通した計量チャンバ１２０を含有する。計量チャンバ１２０は、マイクロタイタープレート１００の各ウェル１０３に送達される液体の体積を制御するための固定容積を有する。計量チャンバ１２０は、液体の毛管現象により、または、機械的な力（例えば、液体を充填チャンバ１１８に押すピペッターの力）により、充填チャンバ１１８から液体を受ける。一実施形態では、デバイスの計量チャンバ１２０は全て、同じ計量容積を有する。別の実施形態では、計量チャンバ１２０は、横列及び／または縦列１つあたりで異なる計量容積を有する。充填チャンバ、計量チャンバの壁、及び計量チャンバチャネルは、親水性材料で構成されるか、またはこれでコーティングされてもよい。
【０２１８】
図１０７及び１０８に示すように、各計量チャンバ１２０は、中間層流路１０８を介してマイクロタイタープレートのウェル１０３と流体連通している。上述のように、中間層流路は、適切な力、例えば遠心力が加わるまで、計量チャンバ１２０内の液体がマイクロタイタープレート１００のウェル１０３に流れることを防止するためのバーストバルブとして機能してもよい。
【０２１９】
図１０７及び１０８に示すように、デバイスの第１層１１４は、オーバーフローチャンバ１１６もまた含有する。上記の通り、オーバーフローチャンバ１１６は、中間層１０６のオーバーフロー流路１１０を介して充填チャンバ１１８と流体連通している。
【０２２０】
図１０９及び１１０は、それぞれ、デバイスの第１層１１４の第２の境界に作動可能に隣接して配置された、デバイスの第３層１２４の上部及び側面図、並びに分解斜視図を示す。デバイスの第３層１２４は、第３層１２４を通して延在し第２層１３０の充填ポート１３２（図１１１に示す）を第１層１１４の充填チャンバ１１８と連動させ接続する、充填ポートコネクタ１２８を含有する。第３層１２４は、第３層１２４を通して延在し第１層１１４の計量チャンバ１２０を第２層１３０の通気道１３６（これも図１１１に示す）と連動させ接続する通気道コネクター１２６も含有する。第３層の通気道コネクター１２６の壁は、疎水性物質で構成されるか、またはこれでコーティングされている。デバイスの第３層１２４は、第３層を通して延在し第１層１１４のオーバーフローチャンバ１１６を第２層１３０のオーバーフロー通気道１３４（図１１１に示す）と連動させ接続するオーバーフロー通気道コネクター１２５もまた含有する。
【０２２１】
図１１１及び１１２は、それぞれ、デバイスの第３層１２４の第２の境界に作動可能に隣接して配置された、デバイスの第２層１３０の上部及び側面図、並びに分解斜視図を示す。デバイスの第２層１３０は、第２層１３０を通して延在し第３層１２４の充填ポートコネクタ１２８と連動するか、またはいくつかの実施形態では、第１層１１４の充填チャンバ１１８と直接連動する充填ポート１３２を含有する。デバイスの第２層１３０は、第２層１３０を通して延在し第１層１１４の計量チャンバ１２０と連動する通気道１３６もまた含有する。第２層の通気道１３６は、第３層１２４の通気道コネクター１２６を介して、第１層１１４の計量チャンバ１２０に接続する。図１１１及び１１２で更に示すように、デバイスの第２層１３０は、第２層１３０を通して延在し第１層１１４のオーバーフローチャンバ１１６と連動しているオーバーフロー通気道１３４もまた含有する。オーバーフロー通気道１３４は、第３層１２４のオーバーフロー通気道コネクター１２５を介してオーバーフローチャンバ１１６に接続する。
【０２２２】
個別の層の観点からデバイスが記載されるが、デバイスの層は一体であり、デバイスをモノリシック構造とする。
【０２２３】
本発明の一実施形態では、デバイスの第１層は、計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、第２層は一対の離間した充填ポートを備え、それぞれが一対の離間した充填チャンバの１つと流体連通している。一対の離間した充填ポートの１つは、液体を一対の離間した充填チャンバの１つ及び計量チャンバの半分に提供しながら、一対の離間した充填ポートのもう片方は、一対の充填チャンバのもう一方及び計量チャンバの他の半分に液体を提供する。
【０２２４】
本発明の別の実施形態において、デバイスの第１層は、計量チャンバの反対端に一対の離間した充填チャンバを備え、第２層は一対の離間した充填ポートを備え、それぞれが一対の離間した充填チャンバの１つと流体連通している。一対の離間した充填ポートの１つは、液体を一対の充填チャンバの一方及び計量チャンバの全てに提供しながら、一対の離間した充填ポートのもう一方は、一対の充填チャンバのもう一方及び計量チャンバの全てに液体を提供する。
【０２２５】
本発明のデバイスは、前記マイクロタイタープレートの２つ以上の横列及び縦列を液体で満たすように構成することができる。
【０２２６】
本明細書における図は、３８４ウェルマイクロタイタープレートに適合する異なる設計を示すが、記載した構想は、当業者により１５３６ウェルプレートにも同様に適用可能である。上で詳述した図１０５〜１１２は、デバイス−マイクロタイタープレートスタックの右側から充填ポート１３２を使用することにより、２４個の縦列にわたる全ての列におけるウェル全てを同時に満たすためのデバイスを示す。この構成は、図１１１に示すように、チャネル１２２により接続した個々の計量チャンバ１２０のそれぞれを満たす毛管現象に依存する。
【０２２７】
図１１３〜１１８は、デバイスの第２の構成を示す、一連の上部、側面図、及び分解透視図である。デバイスのこの第２の構成は、液体をチャネル及び計量チャンバに動かすピペッターの機械的な力に依存する。図１１３〜１１８は、図１１７に示すように、液体でウェルを機械的に満たすことを容易にするために、第２層２３０の充填ポート２３２が変更されていることを除いて、図１０７〜１１２に示すものと全て同一のデバイス部品（２００〜２３６として対応した番号を振っている）を示す。標準的な使い捨てチップがポートの中で適合して、正圧を用いて計量チャンバを満たすことを可能にするように、充填ポート２３２の形状は先細りになっている。充填ポートの寸法及び間隔は、手持ち式のマルチチャネルピペット、またはマルチチャネルロボット式ワークステーションの使用に適合している。
【０２２８】
図１１９〜１２６は、図１０５〜１１８に記載したデバイスの異なる部分を示す、一連の上部、側面図、及び分解透視図である。図１１９〜１２６に示したデバイスの部分は、図１０５〜１１８で示した横列及び／または縦列の出口端、即ち、充填ポートに対向しているデバイスの部分を表す。３００〜３３６で表示した、図１１９〜１２６で示すデバイス部品は、図１０５〜１１２に記載し、これらの図を参照して表示した部品（即ち、デバイス部品１００〜１３６）に対応する。
【０２２９】
図１２７〜１３４は、本発明のデバイスの代替構成を示す、一連の上部、側面図、及び分解透視図である。デバイスのこの構成において、マイクロタイタープレートのウェルに試薬を入れるための充填ポート４３２（図１３３を参照）は、デバイス−マイクロタイタープレートスタックの両側に位置している。この構成を使用して、２つの異なる試薬のセットを、各列の全てのウェルに加えることができる。あるいは、流体チャネルの各面は、デバイスの各側面から、２４個の縦列のうち１２個をアドレス指定することにより、プレートを、２つ並んだ１９２個のウェルの領域に分けることができる。この構成は、２つの領域の各横列及び各縦列を独立してアドレス指定する能力を保持する。４００〜４３６で表示した、図１２７〜１３４で示すデバイス部品は、図１０５〜１１２に記載し、これらの図を参照して表示した部品（即ち、デバイス部品１００〜１３６）に対応する。
【０２３０】
図１３５〜１４４は、本発明のデバイスの代替構成を示す、一連の上部、側面図、及び分解透視図である。デバイスのこの構成は、全てのウェルを横列で、及び全てのウェルを縦列で同時に満たすのに好適である。あるいは、流体チャネルの各面は、デバイスの各側面から２４個の縦列のうち１２個に、そして各デバイスの各側面から１６個の横列のうち８個にアドレス指定をして、プレートを９６個のウェルの４つの異なる領域に分割することができる。この構成は、４つの領域の各横列及び各縦列を独立してアドレス指定する能力を保持する。５００〜５３６で表示した、図１３５〜１４４で示すデバイス部品は、図１０５〜１１２に記載し、これらの図を参照して表示した部品（即ち、デバイス部品１００〜１３６）に対応する。
【０２３１】
この構成に従うと、図１３５及び１３６は、それぞれ、マイクロタイタープレート５００の上部表面に隣接して配置した、デバイスの中間層５０６の上部及び側面図、並びに分解斜視図を示す。デバイスの中間層５０６は、中間層に延在する中間流路５０８を含有する。本実施形態において、それぞれ図１３５及び１３６の上部、側面図及び分解斜視図に示すように、マイクロタイタープレートの各ウェルは、少なくとも２個の中間流路５０８と連動する。中間層５０６は、オーバーフロー流路５１０もまた含有する。
【０２３２】
図１３７〜１４０は、デバイスの中間層５０６の第２の境界と作動可能に隣接して配置された、デバイスの第１層５１４（図１３９を参照）の上部、側面図、及び分解斜視図を示す。本実施形態に従うと、本発明のデバイスの第１層５１４は、２つ以上の横列に計量チャンバを有する計量チャンバ５２０を有する第１領域５１３（図１３７及び１３８を参照）、並びに、２つ以上の縦列に計量チャンバ５２０を有する第２領域５１５（図１３９及び１４０を参照）を有し、第１及び第２領域は互いに離間している。第１層５１４の第１領域５１３及び第２領域５１５の計量チャンバ５２０は、計量チャンバチャネル５２２、及び、マイクロタイタープレートの個々のウェル５０３を介して互いに流体連通している。上述のように、計量チャンバ５２０は、マイクロタイタープレート５００の各ウェル５０３に送達される液体の体積を制御するための固定容積を有する。計量チャンバ５２０は、液体の毛管現象により、または、充填チャンバ５１８に液体を押す機械的な力により、充填チャンバ５１８から液体を受ける。計量チャンバ５２０からマイクロタイタープレートのウェルへの液体の流れは、例えば中間層流路５０８の疎水性力により制御される。一実施形態では、デバイスの計量チャンバ５２０は全て、同じ計量容積を有する。別の実施形態では、計量チャンバ５２０は、横列及び／または縦列１つあたりで異なる計量容積を有する。
【０２３３】
デバイスの第１層５１４の第１領域５１３及び第２領域５１５はそれぞれ、図１３７〜１３８、及び図１３９〜１４０に別々に示すように、オーバーフローチャンバ５１６を含有する。上記の通り、オーバーフローチャンバ５１６は、中間層５０６のオーバーフロー流路５１０を介して充填チャンバ５１８と流体連通している。
【０２３４】
図１４１及び１４２は、それぞれ、デバイスの第１層５１４の第２領域５１５の第２の境界に作動可能に隣接して配置されたデバイスの第３層５２４の上部及び側面図、並びに分解斜視図を示す。デバイスの第３層５２４は、第３層５２４を通して延在し第２層５３０の充填ポート５３２（図１４３に示す）を第１層５１４の充填チャンバ５１８と連動させ接続する、充填ポートコネクタ５２８を含有する。第３層５２４は、第３層５２４を通して延在し第１層５１４の計量チャンバ５２０を第２層５３０の通気道５３６（これも図１４３に示す）と連動させ接続する通気道コネクター５２６も含有する。デバイスの第３層５２４は、第３層を通して延在し第１層５１４のオーバーフローチャンバ５１６を第２層５３０のオーバーフロー通気道５３４（図１４３に示す）と連動させ接続するオーバーフロー通気道コネクター５２５もまた含有する。
【０２３５】
図１４３及び１４４は、それぞれ、デバイスの第３層５２４の第２の境界に作動可能に隣接して配置された、デバイスの第２層５３０の上部及び側面図、並びに分解斜視図を示す。本実施形態において、デバイスの第２層５３０は、第２層５３０を通して延在して第３層５２４の充填ポートコネクタ５２８と、または、いくつかの実施形態では、第１層５１４の充填チャンバ５１８と直接連動した、各横列及び各縦列用の充填ポート５３２を含有する。デバイスの第２層５３０は、第２層５３０を通して延在し第１層５１４の計量チャンバ５２０と連動している通気道５３６を更に含有する。第２層の通気道５３６は、第３層５２４の通気道コネクター５２６を介して、第１層５１４の計量チャンバ５２０に接続する。図１４３及び１４４で更に示すように、デバイスの第２層５３０は、各横列及び縦列に、第２層５３０を通して延在し第１層５１４のオーバーフローチャンバ５１６と連動したオーバーフロー通気道５３４もまた含有する。オーバーフロー通気道５３４は、第３層５２４のオーバーフロー通気道コネクター５２５を介してオーバーフローチャンバ５１６に接続する。
【０２３６】
上述の異なる構成のそれぞれは、製造目的のために、デバイスの各層の上部、側面図、及び分解図を示す一連の図面により示されているが、デバイスは当業者により決定されるように、モノリシック構造に作られることも、または個別層から組み立てられることも可能である。
【０２３７】
本発明の別の態様は、対向した上部表面及び底部表面を有するマイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに液体を加える方法に関し、上部表面はウェルの中に至る開口部を有し、底部表面はウェルの閉鎖端を画定する。本方法は、上述した本発明のデバイスを提供すること、及びデバイスを液体で満たすことを含む。液体を、デバイスの前記マイクロタイタープレートの横及び／または縦一列になった２つ以上のウェルに充填する。
【０２３８】
上記の通り、毛管現象または機械的な力によりウェルが満たされることが可能となるように、本発明のデバイスを構成してもよい。
【０２３９】
逐次的、または同時のいずれかにより、マイクロタイタープレートの全ての縦列及び横列を同時的に満たすことを可能にする本発明のデバイスは、生物学的試薬と適合性があり、マイクロタイタープレートのウェル上に配置される好適な材料（例えばポリスチレン、ポリカーボネート等）から製造される。次に、試薬を充填ポート（例えば２４及び／または１６個の充填ポート）に導入し、マイクロタイタープレートウェルのそれぞれの上に配置された計量チャンバ（例えば、プレートの３８４個のウェルに対する３８４個の計量チャンバ）のそれぞれに試薬を自動的に分配する。装填を行ったデバイス−マイクロタイタープレートスタックを、標準的な低速遠心分離のスイングバケットローターに入れ、液体を個々の計量チャンバからそれぞれのウェルに入れるのに十分な力による簡単なスピンに通す。遠心分離を止めた後、デバイス−マイクロタイタープレートスタックを遠心分離器から取り外し、スタックを分離して、デバイスは片付けて、プレートをアッセイプロセスの次工程で使用する。したがって、３８４ウェルプレートについて上述したアッセイ構成を設定する労力は、人力アプローチを用いて８チップピペッターによる送達を合計９６回行うことと比較して、縦列の充填ポートに８チップピペッターによる送達をそれぞれ３回に、横列の充填ポートに８チップピペッターによる送達をそれぞれ２回にまで減少する。更に、デバイスを用いることにより、わずか２４個のピペットチップしか消費しないのに対して、手動アプローチでは３８４個のピペットチップを消費するため相当のコスト削減となり、ハイスループットの臨床用実験室においてはこのコスト削減は重要となる。上述したデバイス及びプロセスは、当業者により１５３６ウェルマイクロタイタープレートに容易に適用されることができ、３８４ウェルプレートで記載したものと類似の利点をもたらす。ピペット操作工程の数を劇的に減らす、本明細書で記載されるデバイスの更なる利点は、ＰＣＲ単位複製配列を含有するエアゾールによる交差汚染の制御である。このことは特に、少ない変異対立遺伝子のコピー数の提示を検出することにおいて重要である。デバイスの充填ポートに液体ｓを導入する間、３８４個または１５３６個のウェルはそれぞれデバイスによりカバーされ、カバーしたウェルの組み合わせ、及び液体移動工程数の減少が、ウェル間でのＰＣＲ単位複製配列の交差汚染の可能性をいくらか低下させる。
【０２４０】
各横列及び縦列は独立してアドレス指定可能であるため、充填ポートをどのように満たすかについての賢明な選択により、同じデバイスにより達成可能な多くのアッセイ構成を考案することができる。したがって、同じ液体を、８チップピペット操作工程をそれぞれ３回行って（チップは変更しない）、２４個全てのカラム全てに入れることができ、また、同じ液体を、８チップピペット操作工程をそれぞれ２回行って（チップは変更しない）、１６個全てのカラムに入れることができる。８チップピペット操作工程をそれぞれ３回行うことにより（チップは３回交換する）、２４個の縦列のそれぞれに２４種類の異なる成分を入れることができ、８チップピペット操作工程をそれぞれ２回行うことにより（チップは２回交換する）、１６個の横列のそれぞれに１６種類の異なる成分を加えることができる。当業者には、多くの他の充填構成が可能である。分配する液体は、任意の生物学的液体、例えば生体サンプル、反応試薬（例えばプライマー、プローブ、酵素、反応生成物等）とすることができる。
【０２４１】
一実施形態では、一連の分配デバイスは固定した計量容積を選択することにより利用可能であり、これにより、臨床的診断実験室、または薬剤開発実験室において見られ得るような、特定の大量の分子生物学的適用が予測される。別の実施形態において、特定の適用向けの特定の計量容積を使用することにより、特注の分配デバイスが作製される。
【０２４２】
好ましい実施形態を本明細書において詳細に記述及び記載したが、関連分野の当業者には、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変更、追加、置換等を行うことができ、したがってこれらは、以下に続く特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内であると考えられることが明らかとなるであろう。
【実施例】
【０２４３】
予測実施例１−  全血漿ｃｆＤＮＡ中の既知の遺伝子における高感度変異マーカー（１％〜０．０１％で存在する場合）、一塩基変異、わずかな挿入及びわずかな欠失変異
アプローチの概要：本アプローチは、３つの酵素：（ｉ）開始時のサンプル中において少量のＤＮＡコピーを正確にコピーするためのＴａｑポリメラーゼ、（ｉｉ）上流ＬＤＲプライマーのブロック基を取り除くＲＮａｓｅ  Ｈ２酵素、及び（ｉｉｉ）上流プライマーの３’側のミスマッチとマッチを識別するリガーゼの忠実性に依存する。後者は、３’末端から２番目または３番目における意図的なミスマッチまたはヌクレオチド類似体を用いることにより、更に濃縮される（３’末端で完全にマッチする場合、３’末端のハイブリダイゼーションをわずかに不安定化させるが、３’末端でミスマッチする場合、３’末端のハイブリダイゼーションを著しく不安定化させる）。最終的に、サイクル時間及び条件の変更といった速度論的アプローチにより、野生型と変異鋳型の識別力を高めることができる。ライゲーション現象が起こると、これらの生成物は後のリアルタイムＰＣＲ増幅工程で増幅されるため、この工程は重要な識別工程である。
【０２４４】
開始時のＰＣＲ工程に関して、部分的に同一のユニバーサル尾部を含有するＰＣＲプライマーを低濃度（１０〜５０ｎＭ）で使用する。同一領域は８〜１１塩基、またはそれ以上で変化してもよい。したがって、任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物はヘアピンを形成し、更なる増幅を阻害する。更に、その尾部は、正しい単位複製配列に対するＰＣＲプライマーのその後の結合を高める。
【０２４５】
あるいは、増幅の忠実性、及び誤った単位複製配列及びプライマー二量体の低減は、低濃度ではあるがＲＮＡ塩基、４種類の追加の塩基、及び３’末端にブロック基を含有するＰＣＲプライマーにより達成される。プライマーが、意図する標的に正しくハイブリダイゼーションする場合のみ、ＲＮａｓｅＨ２がＲＮＡ塩基を切断し、ＤＮＡプライマー上の遊離３’ＯＨを遊離させる。プライマーが誤った標的で偶然活性化されても、次のラウンドで、プライマー３’末端の下流にある塩基は、取り除かれる塩基に対して完全にマッチすることはない。これは、第２の切断及び伸長の可能性を著しく低下させる。簡単に言えば、誤った標的の増幅効率は、有意なバックグラウンドを生み出さない。更に、最初のＰＣＲ増幅に続き、実質的に最初のＰＣＲ産物の中でネスティング（ｎｅｓｔｉｎｇ）するＬＤＲ工程がある。
【０２４６】
ｃｆＤＮＡから開始する場合、平均長は１６０塩基であるため、ＰＣＲプライマーは、各群が約１００ｂｐの断片を増幅するように遺伝子領域（例えばｐ５３）にわたってタイリングされる場合、２つの群にプールされなければならず、これらを互いに、所与の領域にわたって「タイリング」されるように、約５０塩基を移動させる。
【０２４７】
キャリーオーバー汚染から保護するため、ポリメラーゼ活性化の前にＵＮＧを反応に加え、ｄＵＴＰを用いて最初のＰＣＲ増幅を実施する。ＬＤＲプローブは天然塩基を含むため、ＬＤＲ産物はここで、第２のリアルタイムＰＣＲ工程におけるＵＮＧ分解に対して耐性がある。ＬＤＲ産物は、非ライゲーション末端に、標的ＤＮＡでは欠いている配列タグまたはＵｎｉＴａｑ配列を含有するため、ＬＤＲ産物の偶然のキャリーオーバーは大規模な増幅をもたらさないことを記しておく。ＰＣＲとは異なり、最初のＬＤＲ産物は、第２のＬＤＲ反応に対する基質ではない。
【０２４８】
最も困難な事例はＫＲＡＳ変異に関するものであり、ここでは、コドン１２における６つの変化、及びコドン１３における１つの変化は全て、互いに離間している。一般に、最も高い忠実性に関して、変異プローブと野生型配列との間のミスマッチは、少なくとも最後の塩基に関してＧ：Ｔではなく、Ｃ：Ａでなければならない。したがって、即ち１回のＰＣＲ反応あたりでトップ鎖及びボトム鎖プローブの両方、即ち２個のライゲーションセットを実施する必要がある。しかし、目的は変異を発見することであり、互いに異なる変異を区別することでは必ずしもないため、２つ以上の変異が同一のＵｎｉＴａｑ配列、または蛍光標識したＴａｑＭａｎ（商標）プローブに与えられてもよい。
【０２４９】
異なるプローブは、（希少な）変異配列の結合において互いに競合するため、全てのプローブが正しい配列にハイブリダイゼーションすることを可能にすることが重要である。ＫＲＡＳコドン１２の１番目の位置における変異に関して、３つの上流プライマー及び１つの下流プライマーが存在する。野生型標的配列への変異ＬＤＲプローブの誤ったライゲーションは、識別する塩基において野生型配列を有するが適切なタグ配列を欠くブロックされた上流ＬＤＲプローブを使用することによって、更に抑制されてもよい。プローブは、通常の配列に対する変異プローブの誤ったライゲーション／誤ったシグナルを避けるように設計されているが、正しいライゲーションが変異配列の存在下で生じるようにも設計されている。
【０２５０】
各変異の検出用のＰＣＲプライマー及びＬＤＲプローブを使用した上記アプローチの識別レベルを要約する：
１．  任意の標的非依存性プライマー二量体が形成された場合、誤った生成物がヘアピンを形成して更なる増幅を阻害するように、ユニバーサル尾部を有するＰＣＲプライマーを使用する。
２．  最初のＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
３．  標的にハイブリダイゼーションした場合のみ、上流ＬＤＲプローブの非ブロック３’ＯＨを遊離させるために、ＲＮａｓｅＨ２のヌクレアーゼ活性を使用する。
４．  上流ＬＤＲプローブで、熱安定性リガーゼの３’ライゲーション忠実性を使用する。
５．  上流プローブの３’末端から２番目または３番目の塩基において、ミスマッチまたはヌクレオチド類似体を使用する。
６．  リアルタイムＰＣＲ読出し用のＬＤＲ産物を増幅するために、ＵｎｉＴａｑまたはタグプライマーを使用する。
７．  リアルタイムＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
【０２５１】
既知の遺伝子における、変異マーカー（１％〜０．０１％で存在する場合）、反復変異の高感度検出のための詳細プロトコール：
１．１．ａ．  任意の標的非依存性プライマー二量体が形成された場合、誤った生成物がヘアピンを形成して更なる増幅を阻害するように、ＵＮＧ（キャリーオーバーを防止するため、３７℃、１５〜３０分）、ｄＵＴＰ、及び他のｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、並びにユニバーサル尾部を含有する遺伝子特異的プライマーの存在下でゲノムＤＮＡをインキュベーションする。この最初のゲノムＤＮＡ−ＰＣＲ反応混合物は、１２、２４、４８、もしくは９６個の個別のウェルでのマルチプレックスＰＣＲ増幅（空間的多重化）、または単一のウェルでのマルチプレックスＰＣＲ増幅に好適である。血漿由来のゲノムＤＮＡを変性させ、ＵＮＧを不活性化させ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを活性化させ（９４℃、５〜１０分）、回数を制限したサイクルで、変異を含有する断片をマルチプレックスＰＣＲ増幅させる（９４℃・１０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒で１２〜２０サイクル）。ＰＣＲプライマーは、約６４〜６６℃のＴｍ値を有するように設計され、ユニプレックス（ｕｎｉｐｌｅｘ）ＰＣＲの基準の１０〜５０倍未満の濃度（各プライマーが１０ｎＭ〜５０ｎＭ）で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションする。サイクルは、互いに均衡を保ってＰＣＲ産物のバランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約１００，０００〜１，０００，０００倍に増幅する。ＰＣＲ増幅の後、（９９℃で３０分間インキュベーションすることにより）Ｔａｑポリメラーゼを不活性化させる。
【０２５２】
１．１．ｂ．  （好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、ＲＮａｓｅＨ２、最適化したライゲーション条件のための緩衝液補助成分、並びに好適な上流及び下流ＬＤＲプローブ（それぞれ１０ｎＭ〜２０ｎＭ、下流プローブは５’リン酸基を伴って合成されてもよいし、または反応前にバルクでキナーゼにより処理してもよい；上流プローブは、所望の３’末端の後のＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び、標的非依存性ライゲーションを防止するためのブロック基を含む）を加える。上流プローブは、ＵｎｉＡｉ等の５’タグ、続いて３番目または末尾から２番目の塩基にＣ：ＡまたはＧ：Ｔミスマッチを有する標的特異的配列、３’末端での変異塩基、続いて、標的にマッチするＲＮＡ塩基及び４つの更なるＤＮＡ塩基、並びに、ライゲーション（または、ポリメラーゼによる後の伸長）をブロックするＣ３スペーサーを含む。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及びＵｎｉＣｉ’等の３’タグを含む。ＬＤＲを２０サイクル実施する（９４℃・１０秒、６０℃・４〜５分）。これにより、変異ＤＮＡが存在する場合、ＰＣＲ産物でライゲーション現象を生じることが可能となる。
【０２５３】
１．１．ｃ．  チューブ／ウェルを開き、（１０〜１００倍に）希釈して、リアルタイムＰＣＲ反応のためにウェルに一定量を分配する（各ウェルは、キャリーオーバー防止のためにＵＮＧと、適切なＴａｑＭａｎ（商標）マスターミックス、並びに以下のプライマー：ＵｎｉＣｉ及びＵｎｉＡｉ、並びに、ライゲーション接合部にわたる配列をカバーするＴａｑＭａｎ（商標）プローブを含有する）。かかる条件下では、ＬＤＲプローブ上のタグ配列はそれぞれＵｎｉＡｉ及びＵｎｉＣｉであり、生成物は以下：
ＵｎｉＡｉ  −  上流標的−変異−下流標的  −  ＵｎｉＣｉ’
の形態である。
【０２５４】
本アプローチは、第２のリアルタイムＰＣＲ反応において、バックグラウンドのシグナルオフ野生型ＤＮＡの生成を避ける。まず、残っている上流ＬＤＲプローブがハイブリダイゼーションする標的を持たず、それ故３’末端がブロックされたままとなり伸長しないように、ＵＮＧが、最初のＰＣＲ産物のボトム鎖を破壊する。次に、最初のＰＣＲ反応からの任意の残留ＰＣＲプライマーは、（ＵＮＧにより破壊された）最初のＰＣＲ産物、または（結合部位を有しない）ＬＤＲ産物のいずれにも結合することができないため、３’末端がブロックされたままとなり、伸長しない。最後に、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブはここで、野生型配列とは異なる２つの塩基（変異塩基、及び、ライゲーション接合部の３’末端から３番目の位置の塩基）を有するため、６０℃未満の温度でのみハイブリダイゼーションするが、このとき、上流ＰＣＲプライマーがまずハイブリダイゼーションし結果的に伸長するため、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブがハイブリダイゼーションしＴａｑポリメラーゼの５’−３’活性からシグナルを生成することを防止する。
【０２５５】
第２のアッセイ設計は、最初のマルチプレックスＰＣＲ増幅、続いて、ＰＣＲ増幅した標的の、マイクロタイタープレートのウェル上での分配及び捕捉に基づく。１回のＬＤＲサイクルで、固体支持体上での正しい標的のＬＤＲ産物の捕捉が可能になる一方、ライゲーションに失敗したものは洗い流される。ＬＤＲ−ＦＲＥＴ、リアルタイムＰＣＲ、または他のレポーターシステムのいずれかにより、ＬＤＲ産物を定量化する。
【０２５６】
変異検出のためのｃｆＤＮＡの増幅に関しては、ユニバーサル尾部を含有するＰＣＲプライマーを使用する。遺伝子特異的プライマーは低濃度（１０〜５０ｎＭ）で使用し、これは部分的に同一のユニバーサル尾部を含有する。したがって、任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されて存在する場合、生成物は更なる増幅を阻害するヘアピンを形成する。非常に少量の変異を検出する能力を最大化させるために、全ての成分を含有するマスターミックスを生成した後、反応混合物を１２、２４、４８、または９６個の独立したウェルに分配する。（変異を有する）単一分子を所与のウェルだけに分配することが可能であるので、本プロセスは、通常の野生型ＤＮＡと比較して変異を含有する分子を効率的に濃縮し、ノイズに対するシグナルが著しく向上する。１つのアプローチは、２工程増幅を用いることであり、ここで、最初の増幅ではユニバーサル尾部を有する遺伝子特異的プライマーを使用し、第２の増幅では、特異的精製物の鎖にビオチン基を付加するユニバーサルプライマーを使用する。（低濃度のＰＣＲプライマーを用いる）最初の増幅は、約８〜２０サイクルに制限すると依然として定量可能である。次に、増幅生成物を希釈して、元のウェルのそれぞれについて２つの新しいウェルに入れる。それぞれは、対応するウェルの中に、一方または他方がビオチン化された２つのユニバーサルプライマー（より高い濃度である０．５〜１ｐモル）を含有する。ここで、増幅を更に８〜２９サイクル続け、合計約１５〜４０サイクルとする。任意の工程として、使われなかったプライマーから生成物を（電気泳動またはサイズで）分離してもよい。
【０２５７】
あるいは、１つのユニバーサルプライマーのみがビオチン化された複数のユニバーサルプライマーを最初の増幅ウェルに添加することにより、１回の増幅反応で生成物を増幅してもよい。あるいは、ビオチン化遺伝子特異的プライマーを１回の増幅工程で直接使用してもよい。トップ及びボトム鎖の両方に対してＬＤＲプローブを設計する（即ち、変異のＬＤＲ識別を最大化する）のが賢明である場合のみ、所与の単位複製配列のフォワード及びリバース鎖の両方を捕捉する必要がある。このことは、同じ反応で５０％ビオチン化された各プライマーの混合物、または別個の反応で１００％ビオチン化されたプライマーの混合物を使用することにより達成されてもよい。固体支持体上での捕捉の間にビオチン化生成物が分離したままである限り、これらを両方、同一の増幅反応に供してもよい。しかし、ＰＣＲ産物の鎖が捕捉後に再びハイブリダイゼーションする場合、固体支持体上の別のアドレスで捕捉される必要があり得る。この空間的分離は、後のＬＤＲ検出により変異を識別するのに利用可能な一本鎖ＰＣＲ産物が、確実に十分に存在するために必要であり得る。
【０２５８】
ｃｆＤＮＡを用いると、断片長は生物学的に、約１６０ｂｐに制限される。したがって、より大きい領域にわたって共通のホットスポット変異をカバーするために、オーバーラップする断片を生成するようにプライマーセットが設計される。そのために、プライマーは、上述のウェルの数を２倍にして、「Ａ」及び「Ｂ」プールの間に分配される。ＣＴＣのエクソンサイズの断片から単離したＤＮＡを多くの場合使用することができるため、２つの単位複製配列プールを使用する必要性が軽減される。断片によっては、他の断片よりもよりゆっくりと増幅するものがある。この問題は、更に何回かの増幅サイクルを用いた、追加の多重化反応を含めることにより克服され得る。
【０２５９】
図３８は、キャリーオーバーを防止した基本的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した、ゲノムまたはｃｆＤＮＡでの変異検出を示す。生成物は、ライゲーション接合部配列にまたがって設計されるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して検出される。
【０２６０】
図３９は図３８の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体形成を排除しユニバーサルプライマーによる増幅を可能にするユニバーサル尾部を含有し、この一方はビオチンを含有し、ストレプトアビジンでコーティングしたウェルでの生成物の捕捉を可能にする。ライゲーションプローブが標的にハイブリダイゼーションし、ライゲーション接合部に完全な相補性が存在する場合のみ、生成物を形成させる。次に、未反応のライゲーションプローブ、または標的非依存性ライゲーション産物を洗い流す。互いにライゲーションした時だけハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように、ＬＤＲプローブを設計する。
【０２６１】
図４０は図３８の変法を示し、ここでは最初の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端のブロック基を含有する。これらの遺伝子特異的プライマーは、標的にハイブリダイゼーションした場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によって末端からアンブロックされ、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ末端を遊離させる。
【０２６２】
図４１は図３８の変法を示し、ここでは最初の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれ、ＵｎｉＡｉ及びＵｎｉＣｉ’プライマー特異的部分を含有する。更に、上流変異特異的ＬＤＲプローブは、３’末端での変異塩基、続いて、標的にマッチするＲＮＡ塩基及び４つの更なるＤＮＡ塩基、並びに、ライゲーション（または、ポリメラーゼによる後の伸長）をブロックするＣ３スペーサーを含有する。ＲＮａｓｅＨ２の存在下、かつ、正しい標的にハイブリダイゼーションする場合にのみ、上流ブロック基が取り除かれ、ライゲーションに好適な３’ＯＨ末端を遊離させる。この図において、野生型ＤＮＡに相補的な上流ＬＤＲプローブは、ブロック基もまた含有するが、ＲＮＡ塩基または５’タグは含有しない。このプローブは更に、野生型標的から変異を識別するライゲーション特異性を向上させる。
【０２６３】
図４２は図４１の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体形成を排除するユニバーサル尾部を含有し、ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように設計される。
【０２６４】
図４３は図４２の変法を示し、ここでは下流ＬＤＲプローブの５’側は、上流プローブの３’を識別する塩基と同じ塩基を含有し、前記塩基は、ＦｅｎヌクレアーゼまたはＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により取り除かれ、後のライゲーションに好適な５’リン酸基を遊離する。ヌクレアーゼは、下流プローブが変異標的にハイブリダイゼーションする場合にのみ切断しなければならない。上流及び下流変異特異的ＬＤＲプローブの両方が、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有する。この図において、野生型ＤＮＡに相補的な上流ＬＤＲプローブは相補配列を含有せず、切断された下流プローブにライゲーションした場合でも、ＦＲＥＴシグナルを生成しない。
【０２６５】
図４４は図４３の変法を示し、ここでは最初の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。上流及び下流ＬＤＲプローブは、ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’プライマー特異的及び配列タグ部分を含有する。ライゲーションの後、生成物を希釈し、フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを含有するウェルに分配する（式中、Ｆ１は消光剤Ｑにより消光される蛍光染料である）。蛍光標識したプライマーにより形成された生成物鎖は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’配列と対形成をするように、ヘアピン形成する。ＵｎｉＴａｑプライマーＣｉがＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離して、リアルタイムＰＣＲ機器により検出されるシグナルを生成する。
【０２６６】
図１４５は図４１の変法を示し、ここでは変異選択的上流プライマー及び遺伝子座特異的下流プライマーを使用して、ＰＣＲ産物が選択的に増幅される。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨは変異特異的ＲＮＡ塩基を取り除き、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる。ＲＮａｓｅＨは、変異ＤＮＡに完全にマッチする場合にＲＮＡ塩基を優先的に切断するが、野生型ＤＮＡにハイブリダイゼーションした場合、ＲＮＡ塩基を切断する可能性は低い。このことはＰＣＲ増幅の全てのサイクルの間で起こるため、特異的変異標的の増幅を高める。野生型配列を有する任意のプライマーはＲＮＡ塩基を欠いてブロックされたままであるため、野生型配列の増幅を更に減らす。最初のＰＣＲ濃縮工程の後、この手順には、キャリーオーバーを防止したＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールが続く。生成物は、ライゲーション接合部配列にまたがって設計されるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して検出される。
【０２６７】
図１４６は図１４５の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブは、ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’プライマー特異的及び配列タグ部分を含有する。ライゲーションの後、生成物を希釈し、フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを含有するウェルに分配し、ＰＣＲで生成したシグナルを、リアルタイムＰＣＲ機器で検出する。
【０２６８】
図１４７は図１４５の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように設計される。
【０２６９】
図１４８は図４１の変法を示し、ここでは遺伝子座特異的上流及び下流プライマーを使用して、ＰＣＲ産物が選択的に増幅される。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ塩基を取り除いてポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる。上流ＰＣＲプライマーと部分的にオーバーラップする野生型配列を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、上流プライマーと、野生型配列への結合において優先的に競合するが、変異ＤＮＡへの結合はさほど競合しないため、ＰＣＲの各ラウンドの間、野生型ＤＮＡの増幅を抑制する。最初のＰＣＲ濃縮工程の後、この手順には、キャリーオーバーを防止したＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールが続く。生成物は、ライゲーション接合部配列にまたがって設計されるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して検出される。
【０２７０】
図１４９は図１４８の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブは、ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’プライマー特異的及び配列タグ部分を含有する。ライゲーションの後、生成物を希釈し、フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを含有するウェルに分配し、ＰＣＲで生成したシグナルを、リアルタイムＰＣＲ機器で検出する。
【０２７１】
図１５０は図１４８の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように設計される。
【０２７２】
図１５４はもう一つの変法を示し、ここでは伸長後にループ−ヘアピンの形成を可能にする、トップ鎖の野生型配列に相補的な５’部分配列もまた含む遺伝子座特異的上流プライマー、及び遺伝子座特異的下流プライマーを使用して、ＰＣＲ産物が選択的に増幅される。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ塩基を取り除いてポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる。５’ヌクレアーゼ、３’ヌクレアーゼ、及び鎖置換活性を欠くポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施する。（ｉ）野生型ボトム鎖の変性は、３’末端において完全なマッチを有するループ−ヘアピンの形成をもたらし、これは、ポリメラーゼにより伸長され、より長いヘアピン領域を形成する。この領域は７２℃では変性せず、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを防止する。（ｉｉ）変異ボトム鎖の変性は、３’末端においてミスマッチを有するループ−ヘアピンの形成をもたらす。ループ−ヘアピンはポリメラーゼによって伸長されないため７２℃で変性し、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを可能にする。（ｉｉｉ）トップ鎖の変性は５’側にヘアピンをもたらし、ヘアピンはＰＣＲの伸長工程中（７２℃）に変性し、ポリメラーゼが完全長ボトム鎖を生成することを可能にする。（ｉ）野生型及び（ｉｉ）変異鋳型を有する上流プライマーにおけるヘアピン伸長の選択性の差は、変異ＤＮＡの選択的増幅をもたらす。野生型ＤＮＡの増幅に対するこの選択は、ＰＣＲの各サイクルの間に発生するため、変異標的を濃縮する。最初のＰＣＲ濃縮工程の後、この手順には、キャリーオーバーを防止したＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールが続く。生成物は、ライゲーション接合部配列にまたがって設計されるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して検出される。
【０２７３】
図１５５は図１５４の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように設計される。
【０２７４】
４８個のウェルへの空間的多重化を用いる定量的変異計算の一例として、最初のＰＣＲ増幅を受け、約１０，０００個のゲノム当量（これらのうち１２個がＫＲＡＳコドン１２に変異を含有する）の標的サンプル中の全ｃｆＤＮＡを考える。４８個のウェルへの最初の分配では、ウェルあたり約２００個のゲノム当量がもたらされ、１個のウェルは２つの変異コピーを含有し、１０個のウェルは１つの変異コピーを含有し、残りの３７個のウェルは変異コピーを含有しない。約２０ラウンドのＰＣＲ増幅（計算を簡単にするために、９９％の増幅効率、または約９６０，０００倍の完了効率が１，０４６，５７６倍の増幅をもたらすものとする）の後、変異のコピー総数は９６０，０００個であり、野生型のコピー総数は１億９２００万個となる。変異ＤＮＡでのライゲーション効率を１サイクルあたり５０％、回数を２０サイクル、また、野生型ＤＮＡでのライゲーションに関してライゲーション忠実性を１，０００倍と仮定すると、変異ＤＮＡは９６０万個の分子が得られる一方、野生型ＤＮＡは１９０万個の分子が得られる。変異体及び野生型のそれぞれに関して、４８個のウェルへの空間的分配により２００，０００個、及び４０，０００個のＬＤＲ産物の分子が得られる。タグプライマー及びＴａｑＭａｎ（商標）プローブを加えてリアルタイムＰＣＲを行った後、計算を簡単にするため、上記ＬＤＲ産物のＣｔ値をそれぞれ、１０と１２．５に変換する。陽性としてスコアリングされる任意の変異由来のシグナルについは、少なくとも２個または３個のウェルで現れ、また、野生型ＤＮＡのプローブのミスライゲーションから生じる（低レベルの）シグナルと容易に区別される必要がある。野生型ＤＮＡへのかかるミスライゲーションは、ライゲーション産物がシグナルを持たずサイレントとなるように、蛍光性レポーターを欠く野生型上流ＬＤＲプローブを加えることにより更に一層抑制することが可能である。起こり得るポアソン分布（例えば図３１を参照）は、１２個の分子に関して、陰性サンプルが（ウェル：分子）（３８：０；１０：１；１：２）の分布範囲を有することを示す。これらの数は十分に異なっており、ＴａｑＭａｎ（商標）読出しによりシグナルの定量的計算を行うことで、サンプル中の合計１２個の変異ＫＲＡＳ分子に関して、ウェルあたり０、１、または２個の元の分子のスコア（それぞれ１２．５、１０、及び９のＣｔ値で表される）を割り当てることが可能になる。シグナルが０個と１個以上の変異分子の区別のみを行うことができ、最小２４個のウェルで、最初の１２個またはそれ以下の分子計算される場合、変異コピーの最初の数を計算することができる。
【０２７５】
ＬＤＲ−ＦＲＥＴを使用する場合、固相捕捉のために個々の４８個のウェルに分配をした後、ビオチン化生成物の捕捉効率を５０％のみと仮定すれば、各ウェルはそれぞれ、１０，０００個の変異、及び２００万個の野生型ＫＲＡＳ単位複製配列を捕捉する。変異鋳型におけるライゲーション効率を５０％のみと仮定すれば、１つの変異分子がもともと存在していた場合、少なくとも５，０００個のＬＤＲ産物が固体支持体上で捕捉されるはずである。２個の変異分子が元のウェルに存在していた場合、およそ１０，０００個のＬＤＲ産物が捕捉されるはずである。野生型生成物のみを有するウェルに関して、ライゲーション忠実性を１：１，０００（野生型ＤＮＡ上でミスライゲーションした変異上流ＬＤＲプローブ）と仮定すると、１，０００個のＬＤＲ産物のみが捕捉される。陽性としてスコアリングされる任意の変異由来のシグナルについては、少なくとも２個または３個のウェルで現れ、また、野生型ＤＮＡのプローブのミスライゲーションから生じる（低レベルの）シグナルと容易に区別される必要がある。野生型ＤＮＡへのかかるミスライゲーションは、ライゲーション産物がシグナルを持たずサイレントとなるように、蛍光性レポーターを欠く野生型上流ＬＤＲプローブを加えることにより更に一層抑制することが可能である。これらの数は十分に異なっており、ＬＤＲ−ＦＲＥＴ読出しによりシグナルの定量的計算を行うことで、サンプル中の合計１２個の変異ＫＲＡＳ分子に関して、ウェルあたり０、１、または２個の元の分子のスコア（それぞれ、約１，０００、５，０００、及び１０，０００個のＬＤＲ−ＦＲＥＴシグナルとして表される）を割り当てることが可能になる。シグナルが０個と１個以上の変異分子の区別のみを行うことができ、最小２４個のウェルで、最初の１２個またはそれ以下の分子が計算される場合、変異コピーの最初の数を計算することができる。
【０２７６】
ＵｎｉＴａｑを含有するＬＤＲプローブを使用する場合、これらは以下のフォーマットである：上流プローブは、プライマー特異的部分を含有する、ＵｎｉＴａｑＡｉ等の５’配列タグ、続いて、３番目または末尾から２番目の塩基にてＣ：ＡまたはＧ：Ｔのミスマッチを有する標的特異的配列、３’末端での変異塩基、続いて、標的にマッチするＲＮＡ塩基及び４つの更なるＤＮＡ塩基、並びにＣ３スペーサー−ブロック基を含む。下流プライマーは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＣｉ’等の３’配列タグを含み、プライマー特異的部分もまた含有する。
【０２７７】
フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを使用して、ＬＤＲ産物を検出することができる（式中、Ｆ１は消光剤Ｑにより消光される蛍光染料である）。これらの条件下で以下の生成物：
Ｆ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  上流標的−変異−下流標的  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
を形成する。
【０２７８】
この構築物は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’配列と対形成をするようにヘアピン形成する。ＵｎｉＴａｑプライマーＣｉがＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離させる。
【０２７９】
最初のＰＣＲプライマー、または上流ＬＤＲプローブは、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端にブロック基（例えばＣ３スペーサー）もまた含有してもよい。ＲＮａｓｅＨ２を次に、反応に加える。これにより、鋳型非依存性生成物が確実に形成されないようにする。
【０２８０】
好熱性ファージキナーゼ（ロドサーマス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）に感染するバクテリオファージＲＭ３７８に由来）を使用して、ライゲーション反応の間に下流ＬＤＲプローブをリン酸化してもよい。これらの条件下において、好熱性キナーゼは完全な熱安定性ではないため、ＬＤＲでの変性工程は、できるだけ短くする（即ち、９４℃あるいはそれ以下で１秒間）か、または、完全なプライマーリン酸化を達成するために、６５℃で１５分間、適切にプレインキュベーションしなければならない。あるいは、下流ＬＤＲプローブの５’側は、上流プローブの３’を識別する塩基と同じ塩基を含有し、前記塩基は、ＦｅｎヌクレアーゼまたはＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により取り除かれ、後のライゲーションに好適な５’リン酸基を遊離する。
【０２８１】
予測実施例２−  全血漿ＤＮＡ中でのプロモーター高メチル化（１％〜０．０１％で存在する場合）についての、高感度メチル化マーカー（例えば、ｐ１６及び他の癌抑制因子、ＣｐＧ「アイランド」、また、Ｓｅｐｔ９、ビメンチン等）
アプローチｖ１の概観：単離ゲノムＤＮＡ、またはメチルが増加したＤＮＡを、認識要素がＣ及びＧ塩基のみ、または大部分にＣ及びＧ塩基を含むものであるメチル感受性酵素（例えば、Ｂｓｈ１２３６Ｉ＝ＣＧ＾ＣＧ；ＨｉｎＰ１Ｉ＝Ｇ＾ＣＧＣ；ＡｃｉＩ＝Ｃ＾ＣＧＣまたはＧ＾ＣＧＧ；及びＨｐｙ９９Ｉ＝ＣＧＷＣＧ＾）のカクテルで処理する。慎重に選択したＰＣＲプライマーは、約１００〜１３０ｂｐの非切断ＤＮＡ断片を増幅する。断片は、切断がこれらの断片の離散を引き起こすように、少なくとも２〜３個のメチル感受性酵素部位を有しなければならない。これらの部位は、キャリーオーバー防止が２つのレベルで作用するように選択される：（ｉ）これらの部位が、組み込まれたｄＵＴＰを含有するＤＮＡでもなお切断可能であるため、ＵＮＧをキャリーオーバー防止に用いることが可能であり、及び、（ｉｉ）増幅後、生成物が、別の反応にキャリーオーバーするのであれば、速やか再切断されるようにこれらの部位が非メチル化される。最初のＰＣＲ増幅の後で、キャリーオーバーから保護したＬＤＲ及びＵｎｉＴａｑ反応を、上述のとおり実施する。あるいは、ＬＤＲ及びＴａｑＭａｎ（商標）、または直線的ＴａｑＭａｎ（商標）反応を実施して、最初のサンプル中でのメチル化ＤＮＡの相対量を識別し、定量化してもよい。
【０２８２】
少量のメチル化を検出するためのＰＣＲプライマー及びＬＤＲプローブの両方を用いた上記アプローチの識別レベルを要約する：
１．メチル化していない場合に標的を切断する、メチル化感受性制限酵素を使用する。
２．任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するような、ユニバーサル尾部を有するＰＣＲプライマーを使用する。
３．最初のＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧ及びメチル化感受性制限酵素を使用する。
４．上流ＬＤＲプローブで、熱安定性リガーゼの３’ライゲーション忠実性を使用する。
５．リアルタイムＰＣＲ読出しのためのＬＤＲ産物の増幅に、ＵｎｉＴａｑまたはタグプライマーを使用する。
６．リアルタイムＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
【０２８３】
プロモーターメチル化の高感度検出のための詳細プロトコールｖ１：
２．１．ａ．  Ｂｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）及びＨｉｎＰ１Ｉ（Ｇ＾ＣＧＣ）、並びにＵＮＧの存在下にて（３７℃、３０〜６０分）、ゲノムＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、またはメチルが増加したＤＮＡをインキュベーションし、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する。マルチプレックスＰＣＲ増幅を最適化するための緩衝液補助成分、ｄＵＴＰ、及び他のｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、並びに任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するようにユニバーサル尾部を含有する遺伝子特異的プライマーを加える。この最初のゲノムＤＮＡ−ＰＣＲ反応混合物は、１２、２４、４８、もしくは９６個の個別のウェルでのマルチプレックスＰＣＲ増幅（空間的多重化）、または単一のウェルでのマルチプレックスＰＣＲ増幅に好適である。分解したゲノムＤＮＡを変性させ、ＵＮＧ及び制限エンドヌクレアーゼ不活性化させ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを活性化させ（９４℃、５〜１０分）、回数を制限したサイクル（９４℃・１０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒で１６〜２０サイクル）で、断片を含有する変異をマルチプレックスＰＣＲ増幅する。ＰＣＲプライマーは、約６４〜６６℃のＴｍ値を有するように設計され、ユニプレックスＰＣＲの基準の１０〜５０倍未満の濃度（各プライマーが１０ｎＭ〜５０ｎＭ）で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションする。サイクルは、互いにＰＣＲ産物の相対的バランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約１００，０００〜１，０００，０００倍に増幅する。ＰＣＲ増幅の後、（９９℃で３０分間インキュベーションすることにより）Ｔａｑポリメラーゼを不活性化させる。
【０２８４】
２．１．ｂ．  （好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、最適化したライゲーション条件のための緩衝液補助成分、並びに、好適な上流及び下流ＬＤＲプローブ（それぞれ１０ｎＭ〜２０ｎＭ、下流プライマーは５’リン酸基を伴って合成されてもよいし、または反応前にバルクでキナーゼ処理されてもよい）を加える。上流プローブは、ＵｎｉＡｉ等の５’タグ、続いて標的特異的配列を含む。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及びＵｎｉＣｉ’等の３’タグを含む。ＬＤＲを２０サイクル実施する（９４℃・１０秒、６０℃・４〜５分）。これにより、メチル化ＤＮＡが元のサンプルに存在した場合に、ライゲーション現象がＰＣＲ産物で発生することが可能となる。
【０２８５】
２．１．ｃ．  チューブ／ウェルを開き、（１０〜１００倍に）希釈して、リアルタイムＰＣＲ反応のために一定量をウェルに分配する。各ウェルは、キャリーオーバー防止のための、ＵＮＧを含む適切なＴａｑＭａｎ（商標）マスターミックス、並びに、以下のプライマーを含有する：ＵｎｉＣｉ及びＵｎｉＡｉ、並びに、ライゲーション接合部にまたがる配列をカバーするＴａｑＭａｎ（商標）プローブ。かかる条件下では、ＬＤＲプライマー上のタグ配列はそれぞれＵｎｉＡｉ及びＵｎｉＣｉであり、生成物は以下：
ＵｎｉＡｉ  −  上流標的−メチル化領域  −  下流標的−ＵｎｉＣｉ’
の形態である。
【０２８６】
単一のプロモーター領域内の２つまたは３つの断片が、同一の蛍光染料を用いて同時に調査されてもよい。プロモーター１つあたりのメチル化断片の数を、その染料への合計シグナルにより測定してもよい。空間的多重化を使用する場合、３７℃のインキュベーション工程の前（ただし、酵素の添加後）に、サンプルを１２、２４、４８、または９６個の個々のウェルに分配する。このようにして、ＤＮＡの所与の分子のプロモーター領域にまたがるメチル化を、３つの異なる分子における３つの異なる領域のメチル化と区別してもよい。
【０２８７】
野生型と変異シグナルを区別する必要はないため、ＬＤＲ工程を取りやめ、最初のＰＣＲ反応の後に直接、第２のリアルタイムＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎ（商標））反応が続く。第２のＰＣＲに直接進む場合の欠点は、最初のＰＣＲ反応生成物がｄＵＴＰを組み込むのでＵＮＧにより破壊されるため、キャリーオーバーからのＵＮＧによる保護を用いることができないことである。この問題に対応する１つのアプローチは、これらの生成物は非メチル化されているため、最初のＰＣＲで標準的なｄＮＴＰを用い、制限エンドヌクレアーゼのみを頼りにして、最初または後のＰＣＲ反応からの潜在的なキャリーオーバーを破壊する、というものである。
【０２８８】
第２のアッセイ設計は、最初の制限設計、次にマルチプレックスＰＣＲ増幅、続いてマイクロタイタープレートのウェル上でのＰＣＲ増幅した標的の分配と捕捉に基づいている。１回のＬＤＲサイクルで、固体支持体上での正しい標的のＬＤＲ産物の捕捉が可能になる一方、ライゲーションに失敗したものは洗い流される。ＬＤＲ−ＦＲＥＴ（ｑＬＤＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、または他のレポーターシステムのいずれかにより、ＬＤＲ産物を定量化する。
【０２８９】
図４５は、塩基の制限酵素分解、キャリーオーバーを防止したＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した、ゲノムまたはｃｆＤＮＡでのメチル化検出を示す。生成物は、ライゲーション接合部配列にまたがって設計されるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して検出される。
【０２９０】
図４６は図４５の変法を示し、ここでは最初の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。上流及び下流ＬＤＲプローブは、それぞれＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有する。ライゲーションの後、生成物を希釈し、フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを含有するウェルに分配する（式中、Ｆ１は消光剤Ｑにより消光される蛍光染料である）。蛍光標識したプライマーにより形成された生成物鎖は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’配列と対形成をするように、ヘアピン形成する。ＵｎｉＴａｑプライマーＣｉがＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離し、リアルタイムＰＣＲ機器により検出されるシグナルを生成する。
【０２９１】
図４７は図４５の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体形成を排除しユニバーサルプライマーによる増幅を可能にするユニバーサル尾部を含有し、この一方はビオチンを含有し、ストレプトアビジンでコーティングしたウェルでの生成物の捕捉を可能にする。ライゲーションプローブが標的にハイブリダイゼーションし、ライゲーション接合部にて完全な相補性が存在する場合のみ、生成物を形成させる。次に、未反応のライゲーションプローブ、または標的非依存性ライゲーション産物を洗い流す。ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように、ＬＤＲプローブを設計する。
【０２９２】
４８個のウェルへの空間的多重化を用いる定量的メチル化計算の例として、染色体２０のマーカーでのメチル化に関するスコアリングに用いた、腫瘍ＤＮＡの１２個のゲノム当量を含むｃｆＤＮＡのサンプルを考え、これを癌細胞１個あたり、約４個のコピーに増幅する。この増幅により、分解耐性のある４８個のコピーのメチル化ＤＮＡを得る。合計６０個のコピーに関して、非メチル化ＤＮＡは制限酵素により断片化されるが、小数の非メチル化ＤＮＡ（約１２個のコピー）が残存する。また、加齢によるメチル化が起こる場合があり、その非メチル化ＤＮＡが１２個のコピーの範囲となることが可能になる。したがって、腫瘍特異的メチル化を含まないサンプルが、１２〜２４個のコピーの範囲でシグナルを有し得る一方、４つ全ての染色体においてメチル化染色体２０にマーカーを有するサンプルは、合計で６０〜７２個の範囲のコピーを有し得る。起こり得るポアソン分布を確認すると（図３１及び３２を参照）、陰性サンプルは、１２個の分子に関して（ウェル：分子）（３８：０；１０：１；１：２）〜２４個の分子に関して（２９：０；１５：１；４：２；１：３）の分布範囲を有する一方、陽性サンプルは、６０個の分子に関して（１４：０；１７：１；１１：２；４：３；１：４）〜７２個の分子に関して（１１：０；１６：１；１２：２；６：３；２：４；１：５）の分布範囲を有する。２個の分子（例えば、ＬＤＲ−ＴａｑＭａｎ（商標）用、Ｃｔ値は９、または、ＬＤＲ−ＦＲＥＴ検出の１０，０００個のＬＤＲ産物用）、及び３個の分子（例えば、ＬＤＲ−ＴａｑＭａｎ（商標）では、Ｃｔ値は８．５、またはＬＤＲ−ＦＲＥＴでは１５，０００個の分子）から生じるＬＤＲシグナルを識別する正確性は、それぞれのウェル間のＬＤＲシグナルの標準偏差に依存する。しかしながら、ＬＤＲシグナルが十分に変化して、より高レベルのシグナルの区別が困難になった場合でも、０、１、及び２個の最初の分子（ＬＤＲ−ＴａｑＭａｎ（商標）では、それぞれ、Ｃｔ値は１２．５、１０、及び９、または、ＬＤＲ−ＦＲＥＴシグナルは約１，０００、５，０００、及び１０，０００と表される）を区別するシグナルが十分鮮明であるならば、本アプローチは、本物の循環腫瘍ＤＮＡを有するこれらの個体から生じるメチル化シグナルと、通常の血液における加齢性（ただし癌性ではない）メチル化シグナルの区別及び計算において困難はない。Ｃｔまたは蛍光シグナルが、０または１個以上の最初のメチル化分子を区別することのみが可能であり、最小４８個のウェルで腫瘍ＤＮＡの最初の１２個以下のゲノム当量、及び、特定の領域（例えば２０番染色体）についてのメチル化ＤＮＡの、６０個以上のゲノム当量を計算することができる場合、本アプローチは、本物の循環腫瘍ＤＮＡを有するこれらの個体から生じるメチル化シグナルを、通常の血液における加齢性（ただし癌性ではない）メチル化シグナルと区別して計算しなければならない。
【０２９３】
ＵｎｉＴａｑを含有するＬＤＲプローブを使用する場合、これらは以下のフォーマットである：上流プローブは、ＵｎｉＴａｑＡｉ等の５’タグ、続いて標的特異的配列を含む。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及び、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’等の３’タグを含む。
【０２９４】
フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを使用して、ＬＤＲ産物を検出することができる（式中、Ｆ１は消光剤Ｑにより消光される蛍光染料である）。これらの条件下で以下の生成物：
Ｆ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  上流標的−メチル化領域−下流標的  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
を形成する。
【０２９５】
この構築物は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’配列と対形成をするようにヘアピン形成する。ＵｎｉＴａｑプライマーＣｉがＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性はＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離させる。
【０２９６】
上流ＬＤＲプローブ及びＰＣＲプライマーは、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端のブロック基もまた含有してもよい。ＲＮａｓｅＨ２を次に、反応に加える。これにより、鋳型非依存性生成物が確実に形成されないようにする。いくつかの設計においては、メチル感受性制限酵素切断部位は、酵素による切断が、４つの追加の塩基についての結合配列を取り除き、ＲＮａｓｅＨ２によるＲＮＡ塩基の切断が著しく減少するようにＰＣＲプライマーの３’末端の下流にある。
【０２９７】
好熱性ファージキナーゼ（ロドサーマス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）に感染するバクテリオファージＲＭ３７８に由来）を使用して、ライゲーション反応の間に下流ＬＤＲプローブをリン酸化してもよい。これらの条件下において、好熱性キナーゼは完全な熱安定性ではないため、ＬＤＲでの変性工程は、できるだけ短くする（例えば、９４℃あるいはそれ以下で１秒間）か、または、完全なプライマーリン酸化を達成するために、６５℃で１５分間、適切にプレインキュベーションしなければならない。あるいは、下流プローブの５’側は、上流プローブの３’を識別する塩基と同じ塩基を含有してもよく、前記塩基は、ＦｅｎヌクレアーゼまたはＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により取り除かれ、後のライゲーションに好適な５’リン酸基を遊離する。
【０２９８】
アプローチｖ２の概観：上記のように、単離ゲノムＤＮＡ、またはメチルが増加したＤＮＡを、メチル感受性酵素（ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、ＡｃｉＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）のカクテルで、並びに、メチル非感受性酵素（ＨａｅＩＩＩ及びＭｓｐＩ）により処理する。本アイデアは、およそ４０塩基以上のＤＮＡの断片を生成することであり、断片の５’リン酸基はメチル非感受性酵素に由来する。断片は、切断がこれらの断片の離散を引き起こすように、少なくとも２〜３個のメチル感受性酵素部位を有しなければならない。次に、ゲノム断片の一方の鎖を、ヘアピンを含有し、ゲノムＤＮＡには無関係であり、５’リン酸基にてゲノム断片にライゲーションすることが可能である上流領域を有する人工鋳型にハイブリダイゼーションする。ヘアピンの一本鎖部分は、１つ以上のメチル感受性制限酵素部位を含有する標的に相補的な領域もまた含有する。次に、同一のメチル感受性酵素を再度加え、非メチル化標的鎖が最初の制限酵素分解工程を偶然逃れた場合、鎖はこの第２の工程で切断される。鋳型鎖にハイブリダイゼーションした下流のゲノム断片にハイブリダイゼーションする下流オリゴヌクレオチドを加える。遺伝子座特異的プライマーを伸長する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドの鋳型部分を破壊し、上流及び下流タグの両方を含有しかつ増幅に好適な生成物を生成する。ライゲーションしていないヘアピンオリゴヌクレオチドはそれ自体を伸長させ、それ以上増幅しない。上流及び下流オリゴヌクレオチドの両方が、任意のユニバーサル配列、及びＵｎｉＴａｑ特異的配列を有し、チューブを開け、適切なＵｎｉＴａｑまたはＴａｑＭａｎ（商標）アッセイに分ける前に、１２〜２０サイクルの、同時の「プレ増幅」を可能にする。各プロモーター領域に関して、シグナルが現れ（Ｃｔ値は、メチル化配列の相対的な量を示す）、かつ合計のシグナル強度（即ち、このプロモーターに対してメチル化された１、２、または３個の位置）を示すように、３つの調査位置が存在する。本アプローチは、キャリーオーバーからの保護をもたらすためのＵＮＧの使用、及びＰＣＲ増幅工程中に過剰の忠実性をもたらすためのＲＮａｓｅＨ２の使用とも適合性がある。
【０２９９】
少量のメチル化の検出のための上記アプローチの識別レベルを要約する：
１．  二本鎖標的ＤＮＡに独自の５’リン酸基を生成するために、メチル化非感受性制限酵素を使用する。
２．  メチル化されていない場合に二本鎖標的を切断するために、メチル化感受性制限酵素を使用する。
３．  最初のＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧ及びメチル化感受性制限酵素を使用する。
４．  正しいタグを標的鎖にライゲーションするために、熱安定性リガーゼのライゲーション忠実性を使用する。
５．  ライゲーションした標的鎖を増幅するために、遺伝子座特異的プライマー及びポリメラーゼを使用する。
６．  標的にハイブリダイゼーションした場合にのみ、ＰＣＲプライマー上のアンブロックした３’ＯＨを遊離させるために、ＲＮａｓｅＨ２のヌクレアーゼ活性を使用する。
７．  タグと標的鎖がライゲーションされていない場合に、ヘアピンを形成してこれら自身を伸長し増幅しない生成物を形成するために、タグオリゴヌクレオチドの３’末端上の配列を使用する。
８．  リアルタイムＰＣＲ読出しのためにＰＣＲまたはＬＤＲ産物を増幅するために、ＵｎｉＴａｑまたはタグプライマーを使用する。
【０３００】
プロモーターメチル化の高感度検出のための詳細プロトコールｖ２：
２．２．ａ．  制限酵素、人工ヘアピン鋳型（以下を参照）、及び熱安定性リガーゼを含有する混合物を調製する。メチル感受性酵素（例えばＨｉｎＰ１Ｉ、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、ＡｃｉＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、及びＨｐｙＣＨ４ＩＶ）のカクテルを用いて、並びに、メチル非感受性酵素（ＨａｅＩＩＩ及びＭｓｐＩ）により、単離ゲノムＤＮＡ、またはメチルが増加したＤＮＡを切断する。ＨａｅＩＩＩまたはＭｓｐＩ部位からの５’リン酸基、及び、少なくとも３個のメチル感受性部位（これらはメチル化されているため、切断されない）を有する、およそ４０塩基以上の断片を生成する。プロモーター１つあたりで、かかる断片を３個生成するのが好ましい。エンドヌクレアーゼを加熱して失活させ（６５℃で１５分間）、ＤＮＡを変性させる（９４℃で１分間）。人工鋳型は、上流プライマー領域（任意の５’ユニバーサルプライマーＵ１Ｐｍ、続いてＵｎｉＴａｑ  Ａｉ）及びＵｎｉＴａｑ  Ａｉに相補的な領域、並びに、約７２℃のＴｍを有する標的ＤＮＡに相補的な領域、並びに、少なくとも１つのメチル感受性制限酵素切断部位とのオーバーラップを含有する。６０℃でインキュベーションし、断片がメチル化され、正しい鋳型にハイブリダイゼーションした場合、かつその場合に限り、ヘアピンオリゴヌクレオチドが、標的ＤＮＡの５’リン酸基へハイブリダイゼーション及びライゲーションすることを可能にする。この最初のゲノムＤＮＡ−ライゲーション産物は、１２、２４、４８、もしくは９６個の個別のウェルでのマルチプレックスＰＣＲ増幅（空間的多重化）、または単一のウェルでのマルチプレックスＰＣＲ増幅に好適である。
【０３０１】
２．２．ｂ．  以下を加える：メチル感受性制限酵素（３７℃で３０分間インキュベーションする）、並びに、ホットスタートＴａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＵｎｉＴａｑＡｉ、及び下流プライマー（５’ユニバーサルプライマーＵ２、続いてＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ、続いて人工鋳型鎖配列のすぐ下流にある配列を有する標的断片に相補的な標的遺伝子座特異的配列を含有する）。遺伝子座特異的プライマーを伸長する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がライゲーションしたオリゴヌクレオチドの鋳型部分を破壊し、上流及び下流タグの両方を含有しかつ増幅に好適な生成物を生成する。ライゲーションしていないヘアピンオリゴヌクレオチドはそれ自体を伸長し、それ以上増幅しない。理想的には、ＬＤＲ及びＰＣＲ複合プライマー上のユニバーサルプライマー尾部Ｕ１Ｐｍ及びＵ２は、ユニバーサルプライマーＵ１及びＵ２よりもわずかに短い。これにより、（誤った生成物への複合プライマーの結合と比較して）ユニバーサルプライマーＵ１Ｐｍ及びＵ２が所望の生成物に優先的に結合するように、最初のユニバーサル増幅を、低いサイクル温度（例えば５５℃でアニーリング）、続いて高い温度（例えば６５℃でアニーリング）で行うことが可能になる。標的と無関係の増幅を最小限にするための好ましい変法において、下流ＰＣＲプライマーは、ＲＮＡ塩基及びブロック３’末端を含有し、プライマーが標的にハイブリダイゼーションする場合、これは、ＲＮＡ塩基を切断するＲＮａｓｅ−Ｈにより遊離される。これらの状態は、配列：
ユニバーサルプライマーＵ１Ｐｍ−ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  メチル化領域  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’  −  ユニバーサルプライマーＵ２’
の生成物、または、単に配列：
ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  メチル化領域  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
を増幅する。
【０３０２】
２．２．ｃ．  チューブを開き、１０〜１００倍に希釈し、一定量をＴａｑＭａｎ（商標）ウェルに分配する。各ウェルは以下のプライマーを含有する：ユニバーサルプライマーＵ２、及びフォーマットＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ−Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマー（式中、Ｆ１は消光剤Ｑにより消光される蛍光染料である）。これらの条件下で以下の生成物：
Ｆ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  メチル化領域  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’  −  ユニバーサルプライマーＵ２’
を形成する。
【０３０３】
この構築物は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’配列と対形成をするようにヘアピン形成する。ユニバーサルプライマーＵ２がユニバーサルプライマーＵ２’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性はＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離させる。
【０３０４】
配列ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  標的ＤＮＡ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’の生成物に関して、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲプライマー、任意のＲＮａｓｅＨ２切断によるブロック基の除去、及び内部ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用してこれらを検出してもよい。
【０３０５】
存在するＤＮＡの総量に対する対照として、５’リン酸基がメチル非感受性酵素（ＨａｅＩＩＩまたはＭｓｐＩ）により生成され、断片の残りがメチル感受性酵素部位を欠いている、近くの標的断片を選択することができる。標的断片にライゲーションした上流オリゴヌクレオチドは、２つのオリゴヌクレオチド：（ｉ）正しいＵｎｉＴａｑ特異的配列を有する、１００個に１個存在するオリゴヌクレオチド、及び（ｉｉ）３’末端に相補的な約８〜１０個の塩基を有する配列を含む、１００個のうち９９個存在するオリゴヌクレオチドの混合物である。ライゲーション現象、並びにＵＮＧ及びＡＰエンドヌクレアーゼによる鋳型の破壊の後、ＰＣＲ増幅のためにユニバーサルプライマーを加える。ＵｎｉＴａｑ配列を含有するライゲーション産物を増幅すると、元の鋳型１００個のうち１個に等価なシグナルが得られる。ライゲーション産物の大多数は５’末端にユニバーサル配列を欠き、指数関数的に増幅しない。ライゲーションしていない上流プローブは、プローブ自体の後ろにヘアピンを形成してプローブの３’配列を伸長し、別のＰＣＲ単位複製配列の一部となるように、内容物から取り出す。あるいは、または加えて、対照には、目的物のプロモーター部位に存在する少量のメチル化ＤＮＡとの正確な比較を可能にするために、異なる比率、例えば１：１０または１：１，０００の２つのオリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【０３０６】
代替の対照では、２つのオリゴヌクレオチド：（ｉ）正しいＵｎｉＴａｑ特異的配列を有する１００個に１個存在するヘアピンオリゴヌクレオチド、及び、（ｉｉ）ＵｎｉＴａｑ配列を持たない１００個のうち９９個存在するヘアピンオリゴヌクレオチドの混合物を使用する。ライゲーション現象の後、ＰＣＲ増幅のためにユニバーサルプライマーを加える。遺伝子座特異的プライマーを伸長する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドの鋳型部分を破壊し、上流及び下流タグの両方を含有しかつ増幅に好適な生成物を生成する。ライゲーションしていないヘアピンオリゴヌクレオチドはそれ自体を伸長し、それ以上増幅しない。ＵｎｉＴａｑ配列を含有するライゲーション産物を増幅すると、元の鋳型１００個のうち１個に等価なシグナルが得られる。ライゲーション産物の大多数は５’末端にユニバーサル配列を欠き、指数関数的に増幅しない。
【０３０７】
図４８は、キャリーオーバーを防止したＰＣＲ増幅プロトコールによる制限酵素分解、ヘアピンライゲーション、遺伝子座特異的伸長を使用した、ゲノムまたはｃｆＤＮＡでのメチル化検出を示す。メチル化配列にわたって設計したＴａｑＭａｎ（商標）プローブを含むｎｅｓｔｅｄＰＣＲプライマーを使用して生成物を検出する。
【０３０８】
図４９は図４８の変法を示し、ここでは最初の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーはタグＵｎｉＡｉ及びＵｎｉＣｉを含有する。生成物を希釈し、ｎｅｓｔｅｄ増幅のためにウェルに分配する。上流及び下流ｎｅｓｔｅｄＰＣＲプライマーは、５’末端にそれぞれ、ＵｎｉＴａｑ  Ａｊ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｊ−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｊタグを含有する。更に、フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｊ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｊ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｊのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーは、より高濃度で増幅混合物中に存在するため、増幅生成物に組み込まれる優位なプライマーとなる。蛍光標識したプライマーにより形成された生成物鎖は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｊ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｊ’配列と対形成するようにヘアピン形成する。ＵｎｉＴａｑプライマーＣｊがＵｎｉＴａｑ  Ｃｊ’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がＵｎｉＴａｑ  Ｂｊ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離し、リアルタイムＰＣＲ機器により検出されるシグナルを生成する。
【０３０９】
配列ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  標的ＤＮＡ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’の生成物は、ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ａｉ配列の中に入れ子状になったプライマー、並びに標準的なＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用してまた検出してもよい。
【０３１０】
単一のプロモーター領域内の２つまたは３つの断片が、同一の蛍光染料を用いて同時に調査されてもよい。プロモーター１つあたりのメチル化断片の数を、その染料に関する合計シグナルにより測定してもよい。空間的多重化を使用する場合、３７℃のインキュベーション工程の前（ただし、酵素の添加後）に、サンプルを１２、２４、４８、または９６個の個々のウェルに分配する。このようにして、ＤＮＡの所与の分子のプロモーター領域にまたがるメチル化を、３つの異なる分子における３つの異なる領域のメチル化と区別してもよい。
【０３１１】
最初のライゲーション工程が存在するため、後のＬＤＲ工程は必要ではなく、最初のＰＣＲ反応に直接、第２のリアルタイムＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎ（商標））反応が続く。第２のＰＣＲに直接進む場合の欠点は、最初のＰＣＲ反応生成物がｄＵＴＰを組み込むのでＵＮＧにより破壊されるため、キャリーオーバーからのＵＮＧによる保護が用いられないことである。この問題に対応する１つのアプローチは、これらの生成物は非メチル化されているため、最初のＰＣＲで標準的なｄＮＴＰを用い、制限エンドヌクレアーゼのみを頼りにして、最初または後のＰＣＲ反応からの潜在的なキャリーオーバーを破壊する、というものである。
【０３１２】
ＰＣＲプライマーは、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端のブロック基を含有してもよい。ＲＮａｓｅＨ２を次に、反応に加える。これにより、鋳型と無関係な生成物がＵｎｉＴａｑプライマーセットにより形成されないことが確実となる。いくつかの設計においては、メチル感受性制限酵素切断部位は、酵素による切断が、４つの追加の塩基についての結合配列を取り除き、ＲＮａｓｅＨ２によるＲＮＡ塩基の切断が著しく減少するようにＰＣＲプライマーの３’末端の下流にある。
【０３１３】
アプローチｖ３の概要：単離ゲノムＤＮＡ、またはメチルが増加したＤＮＡを、認識要素がＣｐＧジヌクレオチド対（即ち、Ｂｓｈ１２３６Ｉ＝ＣＧ＾ＣＧ；及びＨｐｙ９９Ｉ＝ＣＧＷＣＧ＾）のみを含むメチル感受性酵素で処理する。亜硫酸水素塩で処理し、「ｄＣ」を「ｄＵ」に変換し、鎖を非相補性にする。ＢｓｔＵ１（ＣＧ＾ＣＧ）の存在下で遺伝子座特異的プライマーをハイブリダイゼーションして、キャリーオーバーＤＮＡを切断する。切断されなかったプライマー及び標的を、標的に結合した場合にのみＲＮａｓｅＨ２を用いてアンブロックする。次に、アンブロックしたＰＣＲプライマーで増幅して、切断されていない、亜硫酸水素塩により変換した約１００〜１３０ｂｐのＤＮＡ断片にする。断片は、切断がこれらの断片の離散を引き起こすとなるように少なくとも２個のメチル感受性酵素部位を有しなければならない。これらの部位は、キャリーオーバー防止が２つのレベルで作用するように選択される：（ｉ）これらの部位が、組み込まれたｄＵＴＰを含有するＤＮＡでもなお切断可能であり、ＵＮＧをキャリーオーバー防止に用いることが可能であり、及び、（ｉｉ）増幅後、生成物は、別の反応にキャリーオーバーするのであれば、速やか再切断されるようにこれらの部位が非メチル化される。更に、断片は、ブロックプライマーが最初にメチル化された標的の増幅のために濃縮され、更に、ＬＤＲプローブが最初にメチル化された標的の検出のために選択されるように、更なる内部メチル化ＣｐＧ対を有しなければならない。最初のＰＣＲ増幅の後で、キャリーオーバーから保護したＬＤＲ及びＵｎｉＴａｑ反応を、上述のとおり実施する。あるいは、ＬＤＲ及びＴａｑＭａｎ（商標）、または直線的ＴａｑＭａｎ（商標）反応を実施して、最初のサンプル中でのメチル化ＤＮＡの相対量を識別し、定量化してもよい。
【０３１４】
少量のメチル化の検出のためにＰＣＲ及びＬＤＲプライマーの両方を使用した上記アプローチの識別のレベルを要約する：
１．  メチル化していない場合に標的を切断するために、メチル化感受性制限酵素を使用する。
２．  標的にハイブリダイゼーションした場合にのみ、ＰＣＲプライマー上の非ブロック３’ＯＨを遊離させるために、ＲＮａｓｅＨ２のヌクレアーゼ活性を使用する。
３．  最初のＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧ及びメチル化感受性制限酵素を使用する。
４．  上流ＬＤＲプローブで、熱安定性リガーゼの３’ライゲーション忠実性を使用する。
５．  リアルタイムＰＣＲ読出しのためにＬＤＲ産物を増幅するために、ＵｎｉＴａｑまたはタグプライマーを使用する。
６．  リアルタイムＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
【０３１５】
プロモーターメチル化の高感度検出のための詳細プロトコールｖ３
２．３．ａ．  Ｂｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧ＾ＣＧ）及びＵＮＧの存在下でゲノムＤＮＡ、またはメチルが増加したＤＮＡをインキュベーションし（３７℃、３０〜６０分）、非メチル化ＤＮＡを完全に分解してキャリーオーバーを防止する。亜硫酸水素塩で処理して鎖を非相補性にし、市販されているキット（例えばＺｙｍｏ  ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＱｉａｇｅｎ製のもの）を使用してＤＮＡ鎖を精製する。マルチプレックスＰＣＲ増幅を最適化するための緩衝液補助成分、ｄＵＴＰ、並びに他のｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、ＲＮａｓｅＨ２、ＢｓｔＵ１（ＣＧ＾ＣＧ）、並びに所望の３’末端の後のＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び誤った標的での伸長を防止するためのブロック基を含有する遺伝子特異的プライマーを加える。この最初のゲノムＤＮＡ−ＰＣＲ反応混合物は、１２、２４、４８、もしくは９６個の個別のウェルでのマルチプレックスＰＣＲ増幅（空間的多重化）、または単一のウェルでのマルチプレックスＰＣＲ増幅に好適である。ＢｓｔＵ１は、以前の増幅でのあらゆるキャリーオーバーＤＮＡを切断する。分解したゲノムＤＮＡ及び制限エンドヌクレアーゼを変性させ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを活性化させ（９４℃、５〜１０分）、回数を制限したサイクル（９４℃・１０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒で１６〜２０サイクル）で、断片を含有する変異をマルチプレックスＰＣＲ増幅する。ＰＣＲプライマーは約６０℃のＴｍ値を有するように設計されるが、５個の過剰の塩基を用いるとＴｍ値は６５〜６８℃に近づき、ユニプレックスＰＣＲの基準の１０〜５０倍未満の濃度（各プライマーが１０ｎＭ〜５０ｎＭ）で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションする。更に、ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用して非メチル化ＤＮＡの増幅を制限する。サイクルは、互いにＰＣＲ産物の相対的バランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約１００，０００〜１，０００，０００倍に増幅する。ＰＣＲ増幅の後、（９９℃で３０分間インキュベーションすることにより）Ｔａｑポリメラーゼを不活性化させる。
【０３１６】
２．３．ｂ．  （好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、最適化したライゲーション条件への緩衝液補助成分、並びに好適な上流及び下流ＬＤＲプローブ（それぞれ１０ｎＭ〜２０ｎＭ、下流プローブは５’リン酸基おを伴って合成されてもよく、または反応の前にバルクでキナーゼによりリン酸化されてもよい）を加える。上流プローブは、ＵｎｉＡｉ等の５’タグ、続いて標的特異的配列を含む。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及びＵｎｉＣｉ’等の３’タグを含む。ＬＤＲを２０サイクル実施する（９４℃・１０秒、６０℃・４〜５分）。これにより、メチル化ＤＮＡが元のサンプルに存在した場合に、ライゲーション現象がＰＣＲ産物で発生することが可能となる。
【０３１７】
２．３．ｃ．  チューブ／ウェルを開き、（１０〜１００倍に）希釈して、リアルタイムＰＣＲ反応のために一定量をウェルに分配する。各ウェルは、キャリーオーバー防止のための、ＵＮＧを含む適切なＴａｑＭａｎ（商標）マスターミックス、並びに、以下のプライマーを含有する：ＵｎｉＣｉ及びＵｎｉＡｉ、並びに、ライゲーション接合部にまたがる配列をカバーするＴａｑＭａｎ（商標）プローブ。かかる条件下では、ＬＤＲプローブ上のタグ配列はそれぞれＵｎｉＡｉ及びＵｎｉＣｉであり、生成物は以下：
ＵｎｉＡｉ  −  上流標的−亜硫酸水素塩により変換したメチル化領域−下流標的  −  ＵｎｉＣｉ’
の形態である。
【０３１８】
単一のプロモーター領域内の２つまたは３つの断片が、同一の蛍光染料を用いて同時に調査されてもよい。プロモーター１つあたりのメチル化断片の数を、その染料への合計シグナルにより測定してもよい。空間的多重化を使用する場合、３７℃のインキュベーション工程の前（ただし、酵素の添加後）に、サンプルを１２、２４、４８、または９６個の個々のウェルに分配する。このようにして、ＤＮＡの所与の分子のプロモーター領域にまたがるメチル化を、３つの異なる分子における３つの異なる領域のメチル化と区別してもよい。
【０３１９】
図５０は、制限酵素分解、及び亜硫酸水素塩処理を用いた、ゲノムまたはｃｆＤＮＡでのメチル化検出を示す。最初の亜硫酸水素塩により変換したメチル化領域ＰＣＲプライマーは、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端のブロック基を含有する。ＢｓｔＵ１の存在下でのこれらのプライマーのハイブリダイゼーションは、キャリーオーバーＤＮＡを切断する。これらの遺伝子特異的プライマーは、標的にハイブリダイゼーションした場合にのみ、ＲＮａｓｅＨ２によって末端からアンブロックされ、ポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ末端を遊離させる。ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用して、亜硫酸水素塩により変換した非メチル化ＤＮＡの増幅を制限する。亜硫酸水素塩により変換したメチル化ＤＮＡ標的用のＬＤＲプローブは、更なる特異性を提供する。生成物は、ライゲーション接合部配列にまたがって設計されるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して検出される。
【０３２０】
図５１は図５０の変法を示す。上流及び下流ＬＤＲプローブは、それぞれＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有する。ライゲーションの後、生成物を希釈し、フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを含有するウェルに分配する（式中、Ｆ１は消光剤Ｑにより消光される蛍光染料である）。蛍光標識したプライマーにより形成された生成物鎖は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’配列と対形成をするように、ヘアピン形成する。ＵｎｉＴａｑプライマーＣｉがＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離して、リアルタイムＰＣＲ機器により検出されるシグナルを生成する。
【０３２１】
図５２は図５０の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体形成を排除しユニバーサルプライマーによる増幅を可能にするユニバーサル尾部を含有し、この一方はビオチンを含有し、ストレプトアビジンでコーティングしたウェルでの生成物の捕捉を可能にする。ライゲーション接合部にて完全な相補性が存在する場合、ライゲーションプローブを標的にハイブリダイゼーションし、生成物のみを形成させる。次に、未反応のライゲーションプローブ、または標的非依存性ライゲーション産物を洗い流す。ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように、ＬＤＲプローブを設計する。
【０３２２】
図１５１は図５０の変法を示し、ここでは最初の制限エンドヌクレアーゼ分解及び亜硫酸水素塩変換の後、遺伝子座特異的上流及び下流プライマーを用いてＰＣＲ産物が選択的に増幅される。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ塩基を取り除いてポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる。上流ＰＣＲプライマーと部分的にオーバーラップする、亜硫酸水素塩により変換された非メチル化配列（またはその相補鎖）を含むブロックＬＮＡまたはＰＮＡプローブは、亜硫酸水素塩により転換された非メチル化標的配列への結合で上流プライマーと優先的に競合するが、亜硫酸水素塩により転換されたメチル化標的配列ではそれほど競合しないため、ＰＣＲの各ラウンド中の、亜硫酸水素塩により変換された非メチル化標的配列の増幅を抑制する。最初のＰＣＲ濃縮工程の後、この手順には、キャリーオーバーを防止したＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールが続く。生成物は、ライゲーション接合部配列にまたがって設計されるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して検出される。
【０３２３】
図１５２は図１５１の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブは、ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’プライマー特異的及び配列タグ部分を含有する。ライゲーションの後、生成物を希釈し、フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを含有するウェルに分配し、ＰＣＲで生成したシグナルを、リアルタイムＰＣＲ機器で検出する。
【０３２４】
図１５３は図１５１の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように設計される。
【０３２５】
図１５６は図５０の変法を示し、ここでは伸長後にループ−ヘアピンの形成を可能にする、トップ鎖の亜硫酸水素塩で処理した非メチル化配列に相補的な５’部分配列、及び遺伝子座特異的下流プライマーもまた含む遺伝子座特異的上流プライマーを使用して、ＰＣＲ産物が選択的に増幅される。標的特異的ハイブリダイゼーションの際に、ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ塩基を取り除いてポリメラーゼ伸長に好適な３’ＯＨ基を遊離させる。５’ヌクレアーゼ、３’ヌクレアーゼ、及び鎖置換活性を欠くポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施する。（ｉ）亜硫酸水素塩で処理した非メチル化ボトム鎖の変性は、３’末端で完全にマッチするループ−ヘアピンをもたらし、これは、ポリメラーゼにより伸長され、より長いヘアピン領域を形成する。この領域は７２℃では変性せず、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを防止する。（ｉｉ）亜硫酸水素塩で処理したメチル化ボトム鎖の変性は、２つ以上のミスマッチを有するループ−ヘアピンをもたらす。ループ−ヘアピンはポリメラーゼによって伸長されないため７２℃で変性し、上流プライマーが完全長トップ鎖を生成することを可能にする。（ｉｉｉ）トップ鎖の変性は５’側にヘアピンをもたらし、ヘアピンはＰＣＲの伸長工程中（７２℃）に変性し、ポリメラーゼが完全長ボトム鎖を生成することを可能にする。（ｉ）亜硫酸水素塩で処理した非メチル化鋳型、及び（ｉｉ）亜硫酸水素塩で処理したメチル化鋳型を有する上流プライマーにおけるヘアピン伸長の選択性の違いは、変異ＤＮＡの選択増幅をもたらす。亜硫酸水素塩で処理した非メチル化標的の増幅に対するこの選択は、ＰＣＲの各サイクルで発生するため、亜硫酸水素塩で処理したメチル化標的を濃縮する。最初のＰＣＲ濃縮工程の後、この手順には、キャリーオーバーを防止したＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールが続く。生成物は、ライゲーション接合部配列にまたがって設計されるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して検出される。
【０３２６】
図は図１４８の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように設計される。
【０３２７】
上流ＬＤＲプローブ及びＰＣＲプライマーは、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端のブロック基もまた含有してもよい。ＲＮａｓｅＨ２を次に、反応に加える。これにより、鋳型非依存性生成物が確実に形成されないようにする。いくつかの設計においては、メチル感受性制限酵素切断部位は、酵素による切断によりブロック基を取り除くようにＰＣＲプライマーの３’末端の下流にある。
【０３２８】
好熱性ファージキナーゼ（ロドサーマス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）に感染するバクテリオファージＲＭ３７８に由来）を使用して、ライゲーション反応の間に下流ＬＤＲプローブをリン酸化してもよい。これらの条件下において、好熱性キナーゼは完全な熱安定性ではないため、ＬＤＲでの変性工程は、できるだけ短くする（例えば、９４℃あるいはそれ以下で１秒間）か、または、完全なプライマーリン酸化を達成するために、６５℃で１５分間、適切にプレインキュベーションしなければならない。あるいは、下流プライマーの５’側は、上流プライマーの３’を識別する塩基と同じ塩基を含有してもよく、前記塩基は、ＦｅｎヌクレアーゼまたはＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により取り除かれ、後のライゲーションに好適な５’リン酸基を遊離する。
【０３２９】
図５３は図５０の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、次いで、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ及びブロックオリゴヌクレオチドを使用して第２のｎｅｓｔｅｄＰＣＲに通し、亜硫酸水素塩により変換した非メチル化ＤＮＡの増幅を制限する。
【０３３０】
図１５１、１５８は図４５の変法を示し、ここでは一次ＰＣＲ産物が、ｎｅｓｔｅｄ遺伝子座特異的プライマー及び内部ＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して直接検出される。ＰＣＲ産物はｄＵを組み込んで非メチル化されており、キャリーオーバー防止を可能にする。
【０３３１】
予測実施例３−  全ての血漿ｍＲＮＡ、エクソソーム、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）またはＣＴＣを含有する全血細胞から単離されたｍＲＮＡにおける遺伝子転座またはスプライス部位変化の非常に高感度な検出
アプローチの概要：本アプローチは、（ｉ）最初のサンプル中において異常なＲＮＡ転写産物の少量のコピーを正確にコピーするための逆転写酵素、（ｉｉ）ｃＤＮＡを比例的に増幅するためのＴａｑポリメラーゼ、及び（ｉｉｉ）互いに隣接してハイブリダイゼーションしたプライマーを識別する熱安定性リガーゼ、の３つの酵素の忠実性に依存する。ライゲーション現象が起こると、これらの生成物は後のリアルタイムＰＣＲ増幅工程で増幅されるため、この工程が鍵となる区別工程である。
【０３３２】
ＬＤＲを使用する利点の１つは、正確な切断点に関係ない転座現象を識別することができることである。更に、転座または選択的スプライシングが新しいエクソン−エクソン接合部を生成する場合、ＬＤＲは、接合部における厳密な塩基に至るまで、これらの接合部を正確に区別するのに理想的に適している。
【０３３３】
腫瘍内には、異常にスプライシングを受けた転写物について少なくとも２つの供給源が存在する。腫瘍は、全てが低メチル化されることで、遺伝子発現の全体的な調節異常を受ける場合がある。低メチル化の結果の１つは、プロモーター領域内の転写開始部位の調節の悪化であり、転写物の５’末端に代わりの配列が存在することが可能になる。次いで、かかる選択的スプライシングを受けたリーダー配列は、ＬＤＲベースのアッセイを使用することにより、正確に識別及び定量化することができる。異常なスプライシングを受けた転写物の第２の供給源は、スプライシング機構の調節異常に起因する。いくつかのかかる転写物は、腫瘍増殖を促進する、あるいは作動させるタンパク質に翻訳される。ここでもまた、これらの選択的スプライシングを受けた転写物は次いで、同一のＬＤＲ反応において、相対レベルで異常及び野生型転写物の両方を提供することを含むＬＤＲベースのアッセイを使用して、正確に識別及び定量化することができる。
【０３３４】
キャリーオーバー汚染から保護するため、ポリメラーゼ活性化の前にＵＮＧを反応に加え、ｄＵＴＰを用いて最初のＰＣＲ増幅を実施する。ＬＤＲプローブは天然塩基を含むため、ＬＤＲ産物はここで、第２のリアルタイムＰＣＲ工程におけるＵＮＧ分解に対して耐性がある。ＬＤＲ産物は非ライゲーション末端に、標的ＤＮＡを欠くタグまたはＵｎｉＴａｑ配列を含有するため、ＬＤＲ産物の偶然のキャリーオーバーは大規模な増幅をもたらさないことを注意しなければならない。ＰＣＲとは異なり、最初のＬＤＲ産物は、第２のＬＤＲ反応に対する基質ではない。
【０３３５】
ｍＲＮＡでの転座またはスプライス部位変化の非常に高感度な検出のための上記アプローチの識別レベルを要約する：
１．  任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するように、ユニバーサル尾部を有するＰＣＲプライマーを使用する。
２．  最初のＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
３．  上流ＬＤＲプローブで、熱安定性リガーゼの３’ライゲーション忠実性を使用する。
４．  リアルタイムＰＣＲ読出しのためにＬＤＲ産物を増幅するために、ＵｎｉＴａｑまたはタグプライマーを使用する。
５．  リアルタイムＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
【０３３６】
ｍＲＮＡにおける遺伝子転座またはスプライス部位変化の非常に高感度な検出のための詳細プロトコール
３．１．ａ．  単離ｍＲＮＡ（あるいは全ての単離核酸）を、ＵＮＧ（３７℃、１５〜３０分、キャリーオーバーを防止するために）、ｄＵＴＰ、及び他のｄＮＴＰ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、並びに転写物特異的プライマーの存在下において、インキュベーションする。（ＭＭＬＶ逆転写酵素は、全ての投入ＲＮＡから、５０〜６０℃にてｃＤＮＡを合成するものを設計してもよい（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）。あるいは、逆転写活性を向上させるためのＴｔｈまたはＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼが設計されてきた（Ｍｎ補助因子の追加が必要となる場合がある）。最後に、好熱性ＰｙｒｏＰｈａｇｅ  ３１７３  ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換及び逆転写活性を共に有しており、これもまた用いてもよい。この最初のｃＤＮＡ−ＰＣＲ反応混合物は、１２、２４、４８、もしくは９６個の個別のウェル（空間的多重化）、または単一のウェルでの多重逆転写転写物ＰＣＲ増幅に好適である。同種のＲＮＡ転写物上でのリバースプライマーの伸長によりｃＤＮＡを生成した後、ＵＮＧ及びＭＭＬＶ逆転写酵素を不活性化させ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを活性化させ（９４℃、５〜１０分）、回数を制限したサイクル（９４℃・１０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒で１６〜２０サイクル）で、転写物含有断片をマルチプレックスＰＣＲ増幅する。ＰＣＲプライマーは、約６４〜６６℃のＴｍ値を有するように設計され、ユニプレックスＰＣＲの基準の１０〜５０倍未満の濃度（各プライマーが１０ｎＭ〜５０ｎＭ）で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションように設計される。サイクルは、互いにＰＣＲ産物の相対的バランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約１００，０００〜１，０００，０００倍に増幅する。ＰＣＲ増幅の後、（９９℃で３０分間インキュベーションすることにより）Ｔａｑポリメラーゼを不活性化させる。
【０３３７】
３．１．ｂ．  （好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、最適化したライゲーション条件への緩衝液補助成分、並びに好適な上流及び下流ＬＤＲプローブ（それぞれ１０ｎＭ〜２０ｎＭ、下流プローブは５’リン酸基を伴って合成されるか、または反応前にバルクでキナーゼによりリン酸化されてもよい；上流プローブは、ＵｎｉＡｉ等の５’タグ、続いて転写物特異的配列を含む）を加える。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及びＵｎｉＣｉ’等の３’タグを含む。ＬＤＲを２０サイクル実施する（９４℃・１０秒、６０℃・４〜５分）。これにより、所望のエクソン−エクソン接合部が存在する場合、ｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物上でライゲーション現象を生じることが可能となる。正確な接合部が未知である転座を検出するために、３種類のＬＤＲプローブを使用する。中間のプローブ（１つまたは複数）は、（種々の）スプライシングした転写物の既知の上流及び下流領域に相補的な配列を含有する。上流及び下流プローブは、所望のライゲーション産物の、後でのＵｎｉＴａｑまたはＴａｑＭａｎ（商標）増幅及び検出を可能にする、上述のタグを含有する。
【０３３８】
３．１．ｃ．  チューブ／ウェルを開き、（１０〜１００倍に）希釈して、リアルタイムＰＣＲ反応のために一定量をウェルに分配する。各ウェルは、キャリーオーバー防止のための、ＵＮＧを含む適切なＴａｑＭａｎ（商標）マスターミックス、並びに、以下のプライマーを含有する：ＵｎｉＣｉ及びＵｎｉＡｉ、並びに、ライゲーション接合部にまたがる配列をカバーするＴａｑＭａｎ（商標）プローブ。かかる条件下では、ＬＤＲプローブ上のタグ配列はそれぞれＵｎｉＡｉ及びＵｎｉＣｉであり、生成物は以下：
ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  上流エクソン−下流エクソン接合部  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
の形態である。
【０３３９】
未知の接合部を有する転写物を検出するための３種類のＬＤＲプローブを使用して、以下の生成物：
ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  上流エクソン−ブリッジ配列−下流エクソン  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
を形成する。
【０３４０】
図５４は、キャリーオーバーを防止したＰＣＲ−ＬＤＲ反応を使用して、ｍＲＮＡレベルで転座を検出するためのアプローチの概観を示す。２つの遺伝子間での転座の図解を示す。クロスオーバーにより、上流遺伝子のエクソン１、２、または３が、下流遺伝子のエクソンｂと融合することができる。起こりうる全てのエクソン接合部（１−ｂ、２−ｂ、及び３−ｂ）を検出するためにＬＤＲプローブを設計する。
【０３４１】
図５５は、キャリーオーバーを防止した基本的なＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した融合遺伝子上での転座検出（概観は図５４）のクローズアップを示す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。生成物は、ライゲーション接合部配列にまたがって設計されるＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して検出される。
【０３４２】
図５６は図５５の変法を示し、上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれ、ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーを使用して生成物を検出する。
【０３４３】
図５７は図５５の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように設計される。
【０３４４】
図５８は、キャリーオーバーを防止したＰＣＲ−ＬＤＲ反応を使用して、選択的スプライシングを検出するためのアプローチの概観を示す。通常（１−２−３ａ−４）及び選択的スプライス変異体（１−２−３ｂ−４）ｍＲＮＡの例の図解を示す。通常及び／または選択的スプライス変異体の両方（３ａ−４、及び３ｂ−４）を検出するように、ＬＤＲプローブを設計する。
【０３４５】
図５９は、キャリーオーバーを防止した基本的なＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した選択的スプライス変異体検出（概観は図５８）のクローズアップを示す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。通常の転写物３ａ−４（Ｆ１）、及び選択的スプライス変異体３ｂ−４（Ｆ２）に関して、ライゲーション接合部配列にまたがって設計した、異なる標識を付けたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０３４６】
図６０は図５９の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれ、ＵｎｉＴａｑ  ＡｉまたはＵｎｉＴａｑ  Ａｊ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＦ２−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ａｊを使用して生成物を検出してシグナルＦ１及びＦ２を検出し、これらのシグナルそれぞれ通常の転写物３ａ−４、及び選択的スプライス変異体３ｂ−４を表す。
【０３４７】
図６１は図５９の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時に互いにハイブリダイゼーションだけを行う短い相補配列を含有するように設計され、検出に好適なＦＲＥＴシグナルＦ１及びＦ２を生成し、これらのシグナルはそれぞれ、通常の転写物３ａ−４、及び選択的スプライス変異体３ｂ−４を表す。
【０３４８】
図６２は、キャリーオーバーを防止した基本的なＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した少量の選択的スプライス変異体検出（概観は図５８）のクローズアップを示す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有し、３ｂ−４接合部を含有する少数の転写物のみを増幅するように設計されている。少量の選択的スプライス変異体３ｂ−４のライゲーション接合部配列にまたがって設計されたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０３４９】
図６３は図６２の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれＵｎｉＴａｑ  Ａｉ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −ＵｎｉＴａｑ  Ａｉを使用して生成物を検出してシグナルＦ１を検出し、このシグナルは少量の選択的スプライス変異体３ｂ−４を表す。
【０３５０】
図６４は図６２の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時に互いにハイブリダイゼーションだけを行う短い相補配列を含有するように設計され、検出に好適なＦＲＥＴシグナルＦ１を生成し、このシグナルは、少量の選択的スプライス変異体３ｂ−４を表す。
【０３５１】
図６５は、キャリーオーバーを防止したＰＣＲ−ＬＤＲ反応を使用して、第１のエクソンの選択的開始部位を有する選択的スプライシングを検出するアプローチの概観を示す。通常（１−２−３）及び選択的スプライス変異体（１ａ−２−３）ｍＲＮＡの例の図解を示す。通常及び／または選択的スプライス変異体の両方（１−２、及び１ａ−２）を検出するように、ＬＤＲプローブを設計する。
【０３５２】
図６６は、キャリーオーバーを防止した基本的なＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した選択的スプライス変異体検出（概観は図６５）のクローズアップを示す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。通常の転写物１−２（Ｆ１）、及び選択的開始部位変異体１ａ−２（Ｆ２）に関して、ライゲーション接合部配列にまたがって設計した、異なる標識を付けたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０３５３】
図６７は図６６の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれ、ＵｎｉＴａｑ  ＡｉまたはＵｎｉＴａｑ  Ａｊ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＦ２−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ａｊを使用して生成物を検出してシグナルＦ１及びＦ２を検出し、これらのシグナルはそれぞれ、通常の転写物１−２、及び選択的開始部位変異体１ａ−２を表す。
【０３５４】
図６８は図６６の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時に互いにハイブリダイゼーションだけを行う短い相補配列を含有するように設計され、検出に好適なＦＲＥＴシグナルＦ１及びＦ２を生成し、これらのシグナルはそれぞれ、通常の転写物１−２、及び選択的開始部位変異体１ａ−２を表す。
【０３５５】
図６９は、キャリーオーバーを防止した基本的なＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した少量の選択的スプライス変異体検出（概観は図５８）のクローズアップを示す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有し、１ａ−２接合部を含有する少数の転写物のみを増幅するように設計される。少量の選択的開始部位変異体１ａ−２のライゲーション接合部配列にまたがって設計したＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０３５６】
図７０は図６９の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれＵｎｉＴａｑ  Ａｉ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −ＵｎｉＴａｑ  Ａｉを使用して生成物を検出してシグナルＦ１を検出し、このシグナルは、少量の選択的開始部位変異体１ａ−２を表す。
【０３５７】
図７１は図６９の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時に互いにハイブリダイゼーションだけを行う短い相補配列を含有するように設計され、検出に好適なＦＲＥＴシグナルＦ１を生成し、このシグナルは、少量の選択的開始部位変異体１ａ−２を表す。
【０３５８】
図７２は、キャリーオーバーを防止したＰＣＲ−ＬＤＲ反応を使用して、エクソンを欠失した選択的スプライシングを検出するアプローチの概観を示す。通常（ｅ１−ｅ２−ｅ３−ｅ４−ｅ５）及び選択的スプライス変異体（ｅ１−ｅ２−ｅ３−ｅ５）ｍＲＮＡの例の図解を示す。通常及び／または選択的スプライスエクソン欠失変異体（ｅ４−ｅ５、及びｅ３−ｅ５）の両方を検出するように、ＬＤＲプローブを設計する。
【０３５９】
図７３は、キャリーオーバーを防止した基本的なＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した選択的スプライス変異体（エクソン欠失）検出（概観は図５８）のクローズアップを表す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。通常の転写物ｅ４−ｅ５（Ｆ１）、及び選択的スプライスエクソン欠失変異体ｅ３−ｅ５（Ｆ２）に関して、ライゲーション接合部配列にまたがって設計した、異なる標識を付けたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０３６０】
図７４は図７３の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれ、ＵｎｉＴａｑ  ＡｉまたはＵｎｉＴａｑ  Ａｊ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＦ２−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ａｊを使用して生成物を検出してシグナルＦ１及びＦ２を検出し、これらのシグナルはそれぞれ、通常の転写物ｅ４−ｅ５、及び選択的スプライスエクソン欠失変異体ｅ３−ｅ５を表す。
【０３６１】
図７５は図７３の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時に互いにハイブリダイゼーションだけを行う短い相補配列を含有するように設計され、検出に好適なＦＲＥＴシグナルＦ１及びＦ２を生成し、これらのシグナルはそれぞれ、通常の転写物ｅ４−ｅ５、及び選択的スプライスエクソン欠失変異体ｅ３−ｅ５を表す。
【０３６２】
図７６は、キャリーオーバーを防止した基本的なＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した少量の選択的スプライス変異体（エクソン欠失）検出（概観は図５８）のクローズアップを示す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有し、ｅ４配列を有するブロックオリゴヌクレオチドを使用することにより、ｅ３−ｅ４接合部を含有する少数の転写物のみを増幅し、野生型転写物の増幅を抑制する。少量の選択的スプライスエクソン欠失変異体ｅ３−ｅ５のライゲーション接合部配列にまたがって設計したＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０３６３】
図７７は図７６の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれ、ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −ＵｎｉＴａｑ  Ａｉを使用して生成物を検出してシグナルＦ１を検出し、このシグナルは、少量の選択的スプライスエクソン欠失変異体ｅ３−ｅ５を表す。
【０３６４】
図７８は図７６の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時に互いにハイブリダイゼーションだけを行う短い相補配列を含有するように設計され、検出に好適なＦＲＥＴシグナルＦ１を生成し、このシグナルは、少量の選択的スプライスエクソン欠失変異体ｅ３−ｅ５を表す。
【０３６５】
図７９は、キャリーオーバーを防止したＰＣＲ−ＬＤＲ反応を使用して、イントロンを挿入した選択的スプライシングを検出するアプローチの概観を表す。通常（ｅ１−ｅ２−ｅ３−ｅ４−ｅ５）及び選択的スプライス変異体（ｅ１−ｉ１−ｅ２−ｅ３−ｅ４−ｅ５）ｍＲＮＡの例の図解を示す。通常、及び／またはイントロンを挿入した選択的スプライス変異体（ｅ１−ｅ２、及びｉ１−ｅ２）の両方を検出するように、ＬＤＲプローブを設計する。
【０３６６】
図８０は、キャリーオーバーを防止した基本的なＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−リアルタイムＰＣＲ検出プロトコールを使用した選択的スプライス変異体検出（概観は図７９）のクローズアップを示す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。通常の転写物ｅ１−ｅ２（Ｆ１）、及びイントロンを挿入した選択的スプライス変異体ｉ１−ｅ２（Ｆ２）に関して、ライゲーション接合部配列にまたがって設計した、異なる標識を付けたＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０３６７】
図８１は図８０の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれ、ＵｎｉＴａｑ  ＡｉまたはＵｎｉＴａｑ  Ａｊ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＦ２−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −  ＵｎｉＴａｑ  Ａｊを使用して生成物を検出してシグナルＦ１及びＦ２を検出し、これらのシグナルはそれぞれ、通常の転写物ｅ１−ｅ２、及びイントロンを挿入した選択的スプライス変異体ｉ１−ｅ２に表す。
【０３６８】
図８２は図８０の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時に互いにハイブリダイゼーションだけを行う短い相補配列を含有するように設計され、検出に好適なＦＲＥＴシグナルＦ１及びＦ２を生成し、これらのシグナルはそれぞれ、通常の転写物ｅ１−ｅ２、及びイントロンを挿入した選択的スプライス変異体ｉ１−ｅ２に表す。
【０３６９】
図８３は、キャリーオーバーを防止した基本的なＲＴ−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した少量の選択的スプライス変異体（イントロン挿入）検出（概観は図７９）のクローズアップを表す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有し、ｉ１−ｅ２接合部を含有する少数の転写物のみを増幅するように設計される。このことは、（ｉ）膵臓ＤＮａｓｅ１により核酸を分解し、ｍＲＮＡをインタクトなまま残して全てのゲノムＤＮＡを分解すること、または、（ｉｉ）例えば、ブロックプライマーの存在下でｅ３からｉ２まで逆転写するのと同様に、イントロンｉ２にまたがるプライマーセットを使用することにより達成されてもよい。イントロンｉ１−ｅ２が挿入された少量の選択的スプライス変異体のライゲーション接合部配列にまたがって設計したＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０３７０】
図８４は図８３の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれＵｎｉＴａｑ  Ａｉ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −ＵｎｉＴａｑ  Ａｉを使用して生成物を検出してシグナルＦ１を検出し、このシグナルは、少量のイントロンを挿入した選択的スプライス変異体ｉ１−ｅ２を表す。
【０３７１】
図８５は図８３の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時に互いにハイブリダイゼーションだけを行う短い相補配列を含有するように設計され、検出に好適なＦＲＥＴシグナルＦ１を生成し、このシグナルは、少量のイントロンを挿入した選択的スプライス変異体ｉ１−ｅ２を表す。
【０３７２】
ＵｎｉＴａｑを含有するＬＤＲプローブを使用する場合、これらは以下のフォーマットである：上流プローブはＵｎｉＴａｑＡｉ等の５’タグ、続いて標的特異的配列を含む。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及び、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’等の３’タグを含む。
【０３７３】
フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを使用して、ＬＤＲ産物を検出することができる（式中、Ｆ１は消光剤Ｑにより消光される蛍光染料である）。これらの条件下で以下の生成物：
Ｆ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  上流エクソン−下流エクソン接合部  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’  −ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
を形成する。
【０３７４】
この構築物は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’配列と対形成をするようにヘアピン形成する。ＵｎｉＴａｑプライマーＣｉがＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性はＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離させる。
【０３７５】
未知の接合部を有する転写物を検出するための３種類のＬＤＲプローブを使用して、以下の生成物：
Ｆ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  上流エクソン−ブリッジ配列−下流エクソン−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
を形成する。
【０３７６】
最初のＰＣＲプライマーまたは上流ＬＤＲプローブの１つは、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端のブロック基もまた含有してもよい。ＰＣＲのための逆転写工程の後、及び／またはＬＤＲ反応の間に、ＲＮａｓｅＨ２を反応に加える。これにより、鋳型非依存性生成物が確実に形成されないようにする。
【０３７７】
好熱性ファージキナーゼ（ロドサーマス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）に感染するバクテリオファージＲＭ３７８に由来）を使用して、ライゲーション反応の間に下流ＬＤＲプローブをリン酸化してもよい。これらの条件下において、好熱性キナーゼは完全な熱安定性ではないため、ＬＤＲでの変性工程は、できるだけ短くする（例えば、９４℃あるいはそれ以下で１秒間）か、または、完全なプライマーリン酸化を達成するために、６５℃で１５分間、適切にプレインキュベーションしなければならない。あるいは、下流プライマーの５’側は、上流プライマーの３’を識別する塩基と同じ塩基を含有してもよく、前記塩基は、ＦｅｎヌクレアーゼまたはＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により取り除かれ、後のライゲーションに好適な５’リン酸基を遊離する。
【０３７８】
予測実施例４−  血中循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡ中の腫瘍特異的コピーの変化の正確な定量化
アプローチの概要：精製サンプル中にはほんのわずかのＣＴＣしか存在しないため、空間的多重化を使用して、サンプル中の各染色体コピーの数を正確に数えることが重要である。本アプローチは、（ｉ）最初のサンプル中においてＤＮＡ領域の少量のコピーを正確にコピーするためのＴａｑポリメラーゼ、及び（ｉｉ）互いに隣接してハイブリダイゼーションするプライマーを識別するリガーゼ、の２つの酵素の忠実性に依存する。ライゲーション現象が起こると、これらの生成物は後のリアルタイムＰＣＲ増幅工程で増幅されるため、この工程が鍵となる区別工程である。
【０３７９】
キャリーオーバー汚染から保護するため、ポリメラーゼ活性化の前にＵＮＧを反応に加え、ｄＵＴＰを用いて最初のＰＣＲ増幅を実施する。ＬＤＲプローブは天然塩基を含むため、ＬＤＲ産物はここで、第２のリアルタイムＰＣＲ工程におけるＵＮＧ分解に対して耐性がある。ＬＤＲ産物は非ライゲーション末端に、標的ＤＮＡを欠くタグまたはＵｎｉＴａｑ配列を含有するため、ＬＤＲ産物の偶然のキャリーオーバーは大規模な増幅をもたらさないことを注意しなければならない。ＰＣＲとは異なり、最初のＬＤＲ産物は、第２のＬＤＲ反応に対する基質ではない。
【０３８０】
特異的領域のコピー数検出の区別のためにＰＣＲ及びＬＤＲプライマーの両方を使用した上記アプローチの識別のレベルを要約する：
１．  任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するように、ユニバーサル尾部を有するＰＣＲプライマーを使用する。
２．  最初のＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
３．  上流ＬＤＲプローブで、熱安定性リガーゼの３’ライゲーション忠実性を使用する。
４．  リアルタイムＰＣＲ読出しのためにＬＤＲ産物を増幅するために、ＵｎｉＴａｑまたはタグプライマーを使用する。
５．  リアルタイムＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
【０３８１】
血中循環腫瘍細胞から単離したＤＮＡまたはＲＮＡにおける腫瘍特異的コピー変化の非常に正確な定量化のための詳細プロトコール
４．１．ａ．  任意の標的非依存性プライマー二量体が形成されると、誤った生成物が更なる増幅を阻害するヘアピンを形成するように、ＵＮＧ（キャリーオーバーを防止するため、３７℃、１５〜３０分）、ｄＵＴＰ、及び他のｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、並びにユニバーサル尾部を含有する遺伝子特異的プライマーの存在下でゲノムＤＮＡをインキュベーションする。この最初のゲノムＤＮＡ−ＰＣＲ反応混合物は、マルチプレックスＰＣＲ増幅のために１２，２４、４８、または９６個の個別のウェル（空間的多重化）に分配される。血漿からゲノムＤＮＡを変性させ、ＵＮＧを不活性化させ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを活性化させ（９４℃、５〜１０分）、回数を制限したサイクル（９４℃・１０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒で１２〜２０サイクル）で、染色体領域をマルチプレックスＰＣＲ増幅する。ＰＣＲプライマーは、約６４〜６６℃のＴｍ値を有し、ユニプレックスＰＣＲの基準の１０〜５０倍未満の濃度（各プライマーが１０ｎＭ〜５０ｎＭ）で使用した場合でも、頑健にハイブリダイゼーションするように設計する。サイクルは、互いに均衡を保ってＰＣＲ産物のバランスを保持するために制限されるが、依然として少量の配列を約１００，０００〜１，０００，０００倍に増幅する。ＰＣＲ増幅の後、（９９℃で３０分間インキュベーションすることにより）Ｔａｑポリメラーゼを不活性化させる。
【０３８２】
４．１．ｂ．  （好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、最適化したライゲーション条件への緩衝液補助成分、並びに好適な上流及び下流ＬＤＲプローブ（それぞれ１０ｎＭ〜２０ｎＭ、下流プローブは５’リン酸基を伴って合成されてもよいし、または反応前にバルクでキナーゼにより処理してもよい；上流プローブは、ＵｎｉＡｉ等の５’タグ、続いて標的特異的配列を含む）を加える。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及びＵｎｉＣｉ’等の３’タグを含む。ＬＤＲを２０サイクル実施する（９４℃・１０秒、６０℃・４〜５分）。これにより、染色体ＤＮＡが存在する場合、ＰＣＲ産物上でライゲーション現象を生じることが可能となる。
【０３８３】
４．１．ｃ．  チューブ／ウェルを開き、（１０〜１００倍に）希釈して、リアルタイムＰＣＲ反応のために一定量をウェルに分配する。各ウェルは、キャリーオーバー防止のための、ＵＮＧを含む適切なＴａｑＭａｎ（商標）マスターミックス、並びに、以下のプライマーを含有する：ＵｎｉＣｉ及びＵｎｉＡｉ、並びに、ライゲーション接合部にまたがる配列をカバーするＴａｑＭａｎ（商標）プローブ。かかる条件下では、ＬＤＲプライマー上のタグ配列はそれぞれＵｎｉＡｉ及びＵｎｉＣｉであり、生成物は以下：
ＵｎｉＡｉ  −  染色体標的領域  −ＵｎｉＣｉ’
の形態である。
【０３８４】
図８６は、キャリーオーバーを防止した基本的なＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した、空間的多重化（図６〜９を参照）によるＤＮＡコピー数の計算を示す。最初の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。各染色体領域、及び計算した全コピー数について、ライゲーション接合部配列にまたがって設計したＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０３８５】
図８７は図８６の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれＵｎｉＴａｑ  Ａｉ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −ＵｎｉＴａｑ  Ａｉを使用して生成物を検出し、各染色体領域及び計算した全コピー数についてのシグナルを検出する。
【０３８６】
図８８は図８６の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される（図１９〜２３を参照）。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、各染色体領域、及び計算した全コピー数の検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように設計される。
【０３８７】
図８９は、キャリーオーバーを防止した基本的な逆転写ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用した、空間的多重化（図１０〜１３を参照）によるｍＲＮＡ転写物の数の計算を示す。最初の遺伝子特異的逆転写及びＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を防止するための同一の８〜１１塩基尾部を含有する。各ｍＲＮＡ転写物について、ライゲーション接合部配列にまたがって設計したＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出し、正確な計算を可能にする。
【０３８８】
図９０は図８９の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれ、ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −ＵｎｉＴａｑ  Ａｉを使用して生成物を検出して、各ｍＲＮＡ転写物についてのシグナルを検出し、正確な計算を可能にする。
【０３８９】
図９１は図８９の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される（図２４〜２８を参照）。ＬＤＲプローブは、正確な計算を可能にするために、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行い、各ｍＲＮＡ転写物の検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する短い相補配列を含有するように設計される。
【０３９０】
４８個のウェルにまたがる空間的多重化の一例として、染色体腕８ｐのヘテロ接合性の喪失（８ｐにおけるＬＯＨ；より悪い転帰が予測される）、または１７ｐ１２におけるＨｅｒ２遺伝子の増幅（ハーセプチン治療に対する反応性が予測される）等の予後または治療効果を有する種々のコピー領域のために調製したプローブと共に、１２個のＣＴＣから単離したＤＮＡを考える。著しい増幅が起こることが知られている重要な点における追加の対と共に、ゲノム全域でのコピー数を測定する複数のＬＤＲプローブセットを使用してもよい。この例に関して、ゲノムの二倍体領域は２４個のコピー（即ち２×１２個の細胞）からシグナルを生み出し、８ｐでのＬＯＨ減少は１２個のコピーを生み出し、かつ、例えばＨｅｒ２遺伝子が８倍に増幅されると、９６個のコピー（即ち８×１２）からシグナルを生み出す。起こり得るポアソン分布（図３１及び３２）は、ＬＯＨ領域は、１２個の分子に関して約（ウェル：分子）（３８：０；１０：１；１：２）の分布を有し、二倍体領域は、２４個の分子に関して約（２９：０；１５：１；４：２；１：３）の分布を有する一方で、増幅領域は、９６個の分子に関して約（６：０；１３：１；１３：２；９：３；４：４；２：５；１：６）の分布を有することを示す。領域が穏やかな増幅のみを受ける、例えば細胞あたり２個のコピーから３個のコピーに増幅を受けるとしても、トリソミー領域は、３６個の分子に関して約（２３：０；１７：１；６：２；２：３）の分布を有するため、二倍体領域と区別可能であることに注意しなければならない。前述のとおり、ＬＤＲ−ＴａｑＭａｎ（商標）ＬＤＲシグナルが十分に変化して、より高レベルのシグナルを識別するのが困難になった場合でも、０、１、及び２個の最初の分子（それぞれ１２．５、１０、及び９のＬＤＲ−ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｔ値、または約１，０００、５，０００、及び１０，０００個のＬＤＲシグナルとして表される）を識別するのにシグナルが十分鮮明であるならば、本アプローチは、ＬＯＨを受けた領域、二倍体である領域、及び増幅を受けた領域の識別及び計算において困難はない。ＣＴまたは蛍光シグナルは、０個、及び１個以上の最初の染色体分子のみを区別するのに十分なほど変化可能であり、最小４８個のウェルにおける二倍体染色体の２４個のコピーがある場合、本アプローチは、ＬＯＨを受けた領域、二倍体である領域、及び増幅を受けた領域を区別して計算しなければならない。
【０３９１】
腫瘍ＤＮＡの量が多い、またはｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを有する、開始標的が多量に存在する、といったｃｆＤＮＡサンプルに関して、ＬＤＲシグナルは比例的に強力となる。最初のシグナルを弱めるための異なる方法を使用することにより、最初の分子のより大きなダイナミックレンジを達成してもよい。例えば、エクソソームから単離したｍＲＮＡについての逆転写工程の後、サンプルを４８個のウェルに等しく分ける代わりに、サンプルを１０個の一定量に分配し、最初の８個をウェルに分配し、残った一定量の１つを１０個の一定量に希釈し、これらの８個をウェルに分配する。これは、６等級の希釈規模（即ち、８×６＝４８）を可能にする。ポアソン分布の調査は、最後の希釈において１個のウェルが０個の分子を表すのであれば、ＬＤＲ読出しが、２０倍のダイナミックレンジ、または４〜５のＣｔ範囲を提供する必要がある場合のみであっても、所与の８個のウェルのセットは、１〜１２８個の分子から２等級のダイナミックレンジにわたり、開始分子の半定量的推定をもたらすことができることを示す（８個のウェルの１〜１２８個の分子からのポアソン分布を示す図３３〜３７を参照）。希釈はたった１０倍であるため、いくつかのｍＲＮＡ分子が１０個の分子オーダーである一方、他は１×１０６個の分子オーダーである場合でも、少なくとも２セットの８個のウェルを使用して、サンプル中の複数の異なる転写物における元の分子の数を測定してもよい。
【０３９２】
同じアプローチを、ＲＮＡコピーの定量化のために使用してもよいが、逆転写酵素が第１の工程で加えられ、そしてまた空間的分配された最初の反応混合物は、上で概略を述べたように希釈及び分配されている。
【０３９３】
ＵｎｉＴａｑを含有するＬＤＲプローブを使用する場合、これらは以下のフォーマットである：上流プローブは、ＵｎｉＴａｑＡｉ等の５’タグ、続いて、３番目または末尾から２番目の塩基にてＣ：ＡまたはＧ：Ｔのミスマッチを有する標的特異的配列、３’末端での変異塩基、続いて、標的にマッチするＲＮＡ塩基及び４つの更なるＤＮＡ塩基、並びにＣ３スペーサー−ブロック基を含む。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及び、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＣｉ’等の３’タグを含む。 
【０３９４】
フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを使用して、ＬＤＲ産物を検出することができる（式中、Ｆ１は消光剤Ｑにより消光される蛍光染料である）。これらの条件下で以下の生成物：
Ｆ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  染色体標的部位  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’  −ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
を形成する。
【０３９５】
この構築物は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’配列と対形成をするようにヘアピン形成する。ＵｎｉＴａｑプライマーＣｉがＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性はＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離させる。
【０３９６】
最初のＰＣＲプライマー（ＲＮＡを有する）の１つ、または最初のＰＣＲプライマー（ＤＮＡを有する）の両方、または上流ＬＤＲプローブもまた、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端のブロック基を含有してもよい。ＤＮＡコピーを定量化する場合、ＲＮａｓｅＨ２をＰＣＲ反応、及び／またはＬＤＲ反応で加える。ＲＮＡを定量化する場合、ＲＮａｓｅＨ２を、ＰＣＲ及び／またはＬＤＲ反応による逆転写工程の後で反応に加える。これにより、鋳型非依存性生成物が確実に形成されないようにする。
【０３９７】
好熱性ファージキナーゼ（ロドサーマス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）に感染するバクテリオファージＲＭ３７８に由来）を使用して、ライゲーション反応の間に下流ＬＤＲプローブをリン酸化してもよい。これらの条件下において、好熱性キナーゼは完全な熱安定性ではないため、ＬＤＲでの変性工程は、できるだけ短くないといけない（例えば、９４℃あるいはそれ以下で１秒間）か、または、完全なプライマーリン酸化を達成するために、６５℃で１５分間、適切にプレインキュベーションしなければならない。あるいは、下流プライマーの５’側は、上流プライマーの３’を識別する塩基と同じ塩基を含有してもよく、前記塩基は、ＦｅｎヌクレアーゼまたはＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により取り除かれ、後のライゲーションに好適な５’リン酸基を遊離する。
【０３９８】
予測実施例５−  単離したエクソソーム、または血中循環腫瘍細胞からのｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、またはｍＲＮＡ変化の正確な定量化
アプローチの概要：本アプローチは、（ｉ）最初のサンプル中においてｍｉＲＮＡの少量のコピーを正確にコピーするための逆転写酵素及びＴａｑポリメラーゼ、並びに（ｉｉ）互いに隣接してハイブリダイゼーションしたプローブを識別するためのリガーゼ、の２つの酵素の忠実性に依存する。ライゲーション現象が起こると、これらの生成物は後のリアルタイムＰＣＲ増幅工程で増幅されるため、この工程が鍵となる区別工程である。
【０３９９】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、腫瘍の存在、分類及び予後の潜在的な組織特異的マーカーとして認識されてきた。ｍｉＲＮＡは、Ａｇｏ２タンパク質との複合体、またはエクソソームによるカプセル化のいずれかとして、血清及び血漿中に存在する。
【０４００】
キャリーオーバー汚染から保護するため、ＭＭＬＶによる逆転写の前にＵＮＧを反応に加え、ｄＵＴＰを用いて最初のＰＣＲ増幅を実施する。ＬＤＲプローブは天然塩基を含むため、ＬＤＲ産物はここで、第２のリアルタイムＰＣＲ工程におけるＵＮＧ分解に対して耐性がある。ＬＤＲ産物は非ライゲーション末端に、標的ｍｉＲＮＡでは欠いているタグまたはＵｎｉＴａｑ配列を含有するため、ＬＤＲ産物の偶然のキャリーオーバーは大規模な増幅をもたらさないことに注意しなければならない。ＰＣＲとは異なり、最初のＬＤＲ産物は、第２のＬＤＲ反応に対する基質ではない。
【０４０１】
ユニバーサルリバースプライマー領域、及び６〜８塩基のｍｉＲＮＡ特異的領域を含有するｍｉＲＮＡ特異的ヘアピンループをｍｉＲＮＡの３’末端にハイブリダイゼーションし、ｄＵＴＰの存在下でＭＭＬＶにより伸長する。正しい条件下において、ＭＭＬＶは、鋳型とは無関係の伸長反応において、ｍｉＲＮＡ鋳型の５’末端の後に２〜３個のＣヌクレオチドを加える。
【０４０２】
最初のｃＤＮＡを生成した後、２〜３個の追加のＣヌクレオチド及びｍｉＲＮＡの１２〜１４個の特異的塩基にハイブリダイズする特異的塩基からのユニバーサルリバースプライマー及びユニバーサル尾部を有するフォワードプライマーを加える。Ｔａｑポリメラーゼを使用して、１６〜２０サイクルのユニバーサル増幅を実施する。ユニバーサルリバースプライマーはｃＤＮＡ生成の間、ヘアピン領域の大部分を取り除くように位置する。
【０４０３】
ｍｉＲＮＡの非常に高感度な検出のための上記アプローチの識別レベルを要約する：
１．  最初の逆転写及びＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
２．  上流ＬＤＲプローブ上で熱安定性リガーゼの３’ライゲーション忠実性を使用する。
３．  リアルタイムＰＣＲ読出しのためにＬＤＲ産物を増幅するために、ＵｎｉＴａｑまたはタグプライマーを使用する。
４．  リアルタイムＰＣＲ反応のキャリーオーバー汚染を防止するために、ＵＮＧを使用する。
【０４０４】
ｍｉＲＮＡの高感度検出のための詳細プロトコール：
５．１．ａ．  ＵＮＧ（３７℃、１５〜３０分、キャリーオーバーを防止するために）、ｄＵＴＰ、及び他のｄＮＴＰ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、並びに転写物特異的プライマーの存在下にて単離ｍｉＲＮＡ（あるいは全ての単離核酸）をインキュベーションする。この最初のｃＤＮＡ−ＰＣＲ反応混合物は、１２、２４、４８、もしくは９６個の個別のウェル（空間的多重化）、または単一のウェルでの多重逆転写物ＰＣＲ増幅に好適である。同種のｍｉＲＮＡ上でのヘアピンリバースプライマーの伸長によりｃＤＮＡを生成した後、ＵＮＧ及びＭＭＬＶ逆転写酵素を不活性化させ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを活性化させ（９４℃、５〜１０分）、回数を制限したサイクル（９４℃・１０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒で１６〜２０サイクル）で、ブリッジ及びタグプライマーＴｉ、及びＴｊを使用して、転写物含有断片をマルチプレックスＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ増幅の後、（９９℃で３０分間インキュベーションすることにより）Ｔａｑポリメラーゼを不活性化させる。
【０４０５】
５．１．ｂ．  （好ましくは株ＡＫ１６Ｄからの）熱安定性リガーゼ、最適化したライゲーション条件への緩衝液補助成分、並びに好適な上流及び下流ＬＤＲプローブ（それぞれ１０ｎＭ〜２０ｎＭ、下流プローブは５’リン酸基を伴って合成されてもよいし、または反応前にバルクでキナーゼにより処理してもよい；上流プローブは、ＵｎｉＡｉ等の５’タグ、続いて標的特異的配列を含む）を加える。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及びＵｎｉＣｉ’等の３’タグを含む。ＬＤＲを２０サイクル実施する（９４℃・１０秒、６０℃・４〜５分）。これにより、染色体ＤＮＡが存在する場合、ＰＣＲ産物上でライゲーション現象を生じることが可能となる。
【０４０６】
５．１．ｃ．  チューブ／ウェルを開き、（１０〜１００倍に）希釈して、リアルタイムＰＣＲ反応のために一定量をウェルに分配する。各ウェルは、キャリーオーバー防止のための、ＵＮＧを含む適切なＴａｑＭａｎ（商標）マスターミックス、並びに、以下のプライマーを含有する：ＵｎｉＣｉ及びＵｎｉＡｉ、並びに、ライゲーション接合部にまたがる配列をカバーするＴａｑＭａｎ（商標）プローブ。かかる条件下では、ＬＤＲプローブ上のタグ配列はそれぞれＵｎｉＡｉ及びＵｎｉＣｉであり、生成物は以下：
ＵｎｉＡｉ −  上流ｍｉＲＮＡ  −  下流ｍｉＲＮＡ接合部  −ＵｎｉＣｉ’
の形態である。
【０４０７】
上記主題の一変法において、ヘアピンオリゴヌクレオチドを塩基特異的な方法でｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションし、タグ−プライマー結合部位（Ｔｊ）を含有する人工ループ配列を付加する。これにより、伸長によりｍｉＲＮＡ配列全体をコピーすること、並びに、ｍｉＲＮＡ標的特異的ブリッジプライマー（（Ｔｉ）及びｍｉＲＮＡ特異的配列を含む）、並びに２つのタグプライマー（Ｔｉ、Ｔｊ）を使用してＰＣＲ反応を開始することが可能となる。ＰＣＲ産物はここで、上述した後のＬＤＲ工程に好適である。
【０４０８】
図９２は、ループプライマーの逆転写、続いてキャリーオーバーを防止したタグ及びブリッジプライマーＰＣＲプロトコールを使用した、ｍｉＲＮＡ検出を示す。キャリーオーバーを防止して、後のＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出プロトコールを使用する。最初のｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を予防するためのタグプライマーの一部としての、同一の８〜１１塩基尾部を含有する。検出した各ｍｉＲＮＡについて、ライゲーション接合部配列にまたがるように設計したＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０４０９】
図９３は図９２の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれＵｎｉＴａｑ  Ａｉ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、各ｍｉＲＮＡについてのシグナルを検出するための蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −ＵｎｉＴａｑ  Ａｉを使用して、生成物を検出する。
【０４１０】
図９４は図９２の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行う短い相補配列を含有するように設計され、各ｍｉＲＮＡの検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する。
【０４１１】
図９５は、ループプライマーのｍｉＲＮＡへの直接のライゲーション、続いて、キャリーオーバーを防止したループに相補的なタグプライマーを使用する逆転写を使用した、ｍｉＲＮＡ検出を示す。本手順では、キャリーオーバーを防止したＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出のためのタグ及びブリッジプライマーを使用する。最初のｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマーは、プライマー二量体を予防するためのタグプライマーの一部としての、同一の８〜１１塩基尾部を含有する。検出した各ｍｉＲＮＡについて、ライゲーション接合部配列にまたがり設計したＴａｑＭａｎ（商標）プローブを使用して生成物を検出する。
【０４１２】
図９６は図９５の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプライマーはそれぞれＵｎｉＴａｑ  Ａｉ及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、各ｍｉＲＮＡについてのシグナルを検出するための蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −ＵｎｉＴａｑ  Ａｉを使用して、生成物を検出する。
【０４１３】
図９７は図９５の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時だけ互いにハイブリダイゼーションを行う短い相補配列を含有するように設計され、各ｍｉＲＮＡの検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する。
【０４１４】
図９８は図９５の変法を示し、ここではブリッジＰＣＲプライマーは、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端のブロック基を含有する。逆転写工程の後にＲＮａｓｅＨ２を反応に加え、ＰＣＲプライマーをアンブロックする。これにより、鋳型非依存性生成物が確実に形成されないようにする。
【０４１５】
図９９は図９８の変法を示し、ここでは上流及び下流ＬＤＲプローブはそれぞれＵｎｉＴａｑ  Ａｉ、及びＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’タグを含有し、各ｍｉＲＮＡについてのシグナルを検出するための蛍光標識したＵｎｉＴａｑプライマーＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ  −ＵｎｉＴａｑ  Ａｉを使用して、生成物を検出する。
【０４１６】
図１００は図９８の変法を示し、ここではＰＣＲ産物が分配され（空間的多重化）、固体支持体上で捕捉される。ＬＤＲプローブは、ライゲーションした時にだけ互いにハイブリダイゼーションを行う短い相補配列を含有するように設計され、各ｍｉＲＮＡの検出に好適なＦＲＥＴシグナルを生成する。
【０４１７】
ＵｎｉＴａｑを含有するＬＤＲプローブを使用する場合、これらは以下のフォーマットである：上流プローブはＵｎｉＴａｑＡｉ等の５’タグ、続いて標的特異的配列を含む。下流プローブは、５’リン酸化末端、続いて標的特異的配列、及び、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’−ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’等の３’タグを含む。
【０４１８】
フォーマットＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ及びＦ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  ＡｉのＵｎｉＴａｑ特異的プライマーを使用して、ＬＤＲ産物を検出することができる（式中、Ｆ１は消光剤Ｑにより消光される蛍光染料である）。これらの条件下で以下の生成物：
Ｆ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  上流ｍｉＲＮＡ  −  下流ｍｉＲＮＡ接合部  ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
を形成する。
【０４１９】
この構築物は、ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列がＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’配列と対形成をするようにヘアピン形成する。ＵｎｉＴａｑプライマーＣｉがＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’配列に結合する場合、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性はＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ配列を分解し、Ｆ１蛍光染料を遊離させる。
【０４２０】
未知の接合部を有する転写物を検出するための３種類のＬＤＲプローブを使用して、以下の生成物：
Ｆ１−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ  −  Ｑ−ＵｎｉＴａｑ  Ａｉ  −  上流エクソン−ブリッジ配列−下流エクソン−ＵｎｉＴａｑ  Ｂｉ’  −  ＵｎｉＴａｑ  Ｃｉ’
を形成する。
【０４２１】
最初のＰＣＲプライマーまたは上流ＬＤＲプローブの１つは、ＲＮＡ塩基、４つの追加の塩基、及び３’末端のブロック基もまた含有してもよい。ＰＣＲのための逆転写工程の後、及び／またはＬＤＲ反応の間に、ＲＮａｓｅＨ２を反応に加える。これにより、鋳型非依存性生成物が確実に形成されないようにする。
【０４２２】
好熱性ファージキナーゼ（ロドサーマス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）を感染させるバクテリオファージＲＭ３７８に由来）を使用して、ライゲーション反応の間に下流ＬＤＲプローブをリン酸化してもよい。これらの条件下において、好熱性キナーゼは完全な熱安定性ではないため、ＬＤＲでの変性工程は、できるだけ短くないといけない（例えば、９４℃あるいはそれ以下で１秒間）か、または、完全なプライマーリン酸化を達成するために、６５℃で１５分間、適切にプレインキュベーションしなければならない。あるいは、下流プローブの５’側は、上流プローブの３’を識別する塩基と同じ塩基を含有してもよく、前記塩基は、ＦｅｎヌクレアーゼまたはＴａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により取り除かれ、後のライゲーションに好適な５’リン酸基を遊離する。
【０４２３】
実証用実施例−ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲによる、癌に関係する変異及びメチル化の検出
実証用実施例１〜４についての一般的な方法
使用した細胞株は、Ｖ６００Ｅ（１７９９Ｔ＞Ａ）ＢＲＡＦヘテロ接合変異を有するＨＴ−２９結腸腺癌細胞株；Ｒ２４８Ｑ（７４３Ｇ＞Ａ）ＴＰ５３及びＧ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ）ＫＲＡＳヘテロ接合変異を有するＨＥＣ−１（Ａ）子宮内膜腺癌細胞株；Ｇ１２Ｓ（３４Ｇ＞Ａ）ＫＲＡＳヘテロ接合変異を有するＬＳ１２３結腸腺癌細胞株；Ｇ１２Ｃ（３４Ｇ＞Ｔ）ＫＲＡＳホモ接合変異を有するＳＷ１４６３結腸腺癌細胞株；Ｇ１２Ｖ（３５Ｇ＞Ｔ）ＫＲＡＳホモ接合変異を有するＳＷ４８０結腸腺癌細胞株；並びにＧ１２Ａ（３５Ｇ＞Ｃ）ＫＲＡＳヘテロ接合変異を有するＳＷ１１１６結腸腺癌細胞株であった。全ての細胞株を、１０％ウシ胎児血清を補充し、４．５ｇ／Ｌグルコースを含有するマッコイ５Ａ内の６０ｃｍ２培養皿に播種し、５％  ＣＯ２を含有する加湿雰囲気に維持した。細胞が８０〜９０％コンフルエンスに達したら、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し（ｘ３）、遠心分離（５００ｘｇ）により収集した。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＤＮＡを単離した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）により、ＤＮＡの濃度を測定した。ヒトの血液（軟膜）から単離した高分子量（＞５０ｋｂ）のゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ）を含有するヒトゲノムＤＮＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を、Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。ヒトゲノムＤＮＡの正確な濃度をＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにより測定すると、３９ｎｇ／μＬであった。
【０４２４】
年齢が２１〜６１歳の、癌に罹っていないドナーからのヒト血漿（抗凝固薬としてＫ２  ＥＤＴＡを含む）を、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ（Ｎａｓｓａｕ，ＮＹ）から購入した。個々の血漿サンプル（５ｍＬ）から、メーカーの取扱説明書に従ってＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔを使用し、ＤＮＡを単離し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）により定量化した。
【０４２５】
実証用実施例１−Ｖ６００Ｅ（１７９９Ｔ＞Ａ）ＢＲＡＦ変異の検出
使用した全てのプライマーを表１に示す。Ｅｘｉｑｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から購入したプライマーｉＣＤｘ−３１５−ＢＲＡＦ＿ＦＬＷを除いて、全てのプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。
【０４２６】
（表１）ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異のＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出用プライマー
2017533697.tif 000003
／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４２７】
希釈実験。ＰＣＲ工程は、１．５８μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２μＬのマグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．８μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−３２８−Ｂｒａｆ＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−２８４−Ｂｒ６００−ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１．２５μＬのｉＣＤｘ−２８４−Ｂｒ６００−ＰＲ  ＬＮＡブロックプライマー（２μＭ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、０．２μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）と混合した０．２２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．０２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を０．２μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより混合物を調製）、並びに３μＬの対応する鋳型を添加することによって調製した１０μＬの反応物中で実施した。鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水、１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（したがって、３μＬ中に３５ｎｇまたは１００００ゲノム当量（ＧＥ））（野生型）、及び、以下の通りに混合したＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡとＨＴ−２９  ｗｃＤＮＡ：１）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中に０．０４７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９、したがって、３μＬ中に０．１４ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ４０ＧＥのＨＴ−２９（２０ＧＥのみが変異）、及び１００００ＧＥのＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ（即ち、５００個の野生型（ｗｔ）中に１個の変異（ｍｔ）に対応）；２）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中に、０．０２３ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９、したがって、３μＬ中に０．０７ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（２０ＧＥのＨＴ−２９（１０ＧＥのみが変異）及び１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（即ち、１０００個のｗｔ中に１個の１ｍｔ）に対応）；３）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中に０．０１１７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９、したがって、３μＬ中に０．００３５ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（１０ＧＥのＨＴ−２９（５ＧＥのみが変異）及び１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（即ち、２０００個のｗｔ中に１個のｍｔ）に対応）；４）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中に０．００６ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９、したがって、３μＬ中に０．００１７５ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（５ＧＥのＨＴ−２９（２または３ＧＥのみが変異）及び１００００個のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥ（即ち、５０００個のｗｔ中に１個のｍｔ）に対応）であった。注：１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物中に０．０４７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９（１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中に４０ＧＥの変異）を調製した後、上述の変異体−Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物（０．５体積）とＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（０．５体積）を１１．７ｎｇ／μＬで混合する連続希釈によって変異体とＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡの混合物の残りを調製することで、変異ＧＥは２分の１に希釈される一方、Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ  ＧＥは希釈されないままである（１００００ＧＥ）。Ｐｒｏｆｌｅｘ  ＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を４０サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。
【０４２８】
５．８２μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、１μＬの１０Ｘ  ＡＫ１６Ｄリガーゼ反応緩衝液［１Ｘ緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．５）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０ｍＭのＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）及び２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を含有する］、０．２５μＬのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、０．２５μＬのＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−３０８−Ｂｒ６００＿（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿Ｒｍ上流プライマー（５００ｎＭ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−２７６−Ｂｒ６００−Ｌ＿Ｄｎ＿Ｐ下流プライマー（５００ｎＭ）、０．０２８μＬの精製したＡＫ１６Ｄリガーゼ（８．８μＭ）、並びに２μＬのＰＣＲ反応物を加えて調製した１０μＬの反応物でＬＤＲ工程を実施した。Ｐｒｏｆｌｅｘ  ＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：（９４℃で１０秒、及び６０℃で４分）を２０サイクル、続いて最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＬＤＲ反応を実施した。
【０４２９】
１．５μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、５μＬの２Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（高速増幅ｔａｑ，ＵＤＧ及びｄＵＴＰ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ製）、１μＬのｉＣＤｘ−２７７＿Ａ４フォワードプライマー（２．５μＭ）、１μＬのｉＣＤｘ−２７９＿Ｃ４リバースプライマー（２．５μＭ）、０．５μＬのｉＣＤｘ−２８１−Ｂｒ６００＿（３）＿Ｐｒｏｂｅ  Ｔａｑｍａｎプローブ（５μＭ）、及び１μＬのＬＤＲ反応物を加えて調製した１０μＬの反応物でｑＰＣＲ工程を実施した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）で密封したＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ−９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ０．１ｍＬプレート、並びに以下の設定：高速ブロック、実験様式として検量線、内部標準としてＲＯＸ、定量化法としてＣｔ（自動閾値、ただし必要に応じて０．０４に調節）、レポーターとしてＴＡＭＲＡ、及び消光剤としてＮＦＱ−ＭＧＢを使用して、また、以下のプログラム：５０℃で２分、及び（９５℃で１秒、及び６０℃で２０秒）を４０サイクル：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＶｉｉＡ７リアルタイムサーモサイクラーの中でｑＰＣＲ反応を実施した。図１５９及び表２に結果を示す。
【０４３０】
（表２）ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを検出するための希釈実験の結果
2017533697.tif 000004
Ｍｔ＝変異ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ。ＷＴ＝野生型ＢＲＡＦ。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。太字のＣｔ値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。 
【０４３１】
ＲｏｃｈｅのｈｇＤＮＡを使用したピクセル実験。ＰＣＲ工程は、５６．５４μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２６μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１０．４μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．６μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−３２８−Ｂｒａｆ＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−２８４−Ｂｒ６００−ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１６．２５μＬのｉＣＤｘ−２８４−Ｂｒ６００−ＰＲ  ＬＮＡブロックプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、２．６μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した２．８６μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．３μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を３μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに３μＬの対応する鋳型を加えることによって調製した１３０μＬの混合物中で実施した。鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水、２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（したがって、３μＬ中に８．７５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡまたは２５００ゲノム当量（ＧＥ））（野生型）、及び、以下の通りにＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡと混合したＨＴ−２９  ｗｃＤＮＡ：１）２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．０２３ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９、したがって、３μＬ中に０．０７ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９及び８．７５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（２０ＧＥのＨＴ−２９（１０ＧＥのみが変異）及び２５００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡに対応）；２）２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の、０．０１１７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９、したがって、３μＬ中に０．００３５ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９及び８．７５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（１０ＧＥのＨＴ−２９（５ＧＥのみが変異）及び２５００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡに対応）であった。注：２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物中の０．０２３ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９（０．５体積）（２５００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡにおいて、２０ＧＥが変異体、１０ＧＥが変異）に加えて、０．５体積のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（２．９２５ｎｇ／μＬ）を混合する連続希釈により、２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．０１１７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９を調製することで、変異体が１０ＧＥ（５ＧＥが変異）に希釈される一方、Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥは希釈されないままである（２５００ＧＥ）。
【０４３２】
それぞれの１３０μＬのＰＣＲ混合物を１２個のチューブ（それぞれ１０μＬ）に分け、次に、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を４０サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。後のＬＤＲ及びｑＰＣＲ工程は、希釈実験セクションで上述のとおりに実施した。図１６０及び表３に結果を示す。
【０４３３】
（表３）Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡに希釈したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを検出するためのピクセル実験の結果
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Ｍｔ＝変異ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ。ｗｔ＝野生型ＢＲＡＦ。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。縦列１〜１２はそれぞれ、チューブ１〜１２で得たＣｔに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線に対応する。
【０４３４】
ヒト血漿ＤＮＡ（血漿＃８）を使用したピクセル実験。ＰＣＲ工程は、４６．５４μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２６μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１０．４μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．６μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−３２８−Ｂｒａｆ＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−２８４−Ｂｒ６００−ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１６．２５μＬのｉＣＤｘ−２８４−Ｂｒ６００−ＰＲ  ＬＮＡブロックプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、２．６μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した２．８６μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．３μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を３μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに１３μＬの対応する鋳型を加えることによって調製した１３０μＬの混合物中で実施した。鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水、血漿ＤＮＡ（６．９μＬのヌクレアーゼフリー水及び６．１μＬの血漿ＤＮＡ（０．７１４ｎｇ／μＬ）として調製、したがって、ＰＣＲ反応物中の４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０のゲノム当量（ＧＥ））（野生型）、及び、以下の通りに混合した血漿ＤＮＡとＨＴ−２９  ｗｃＤＮＡ：１）４．９μＬのヌクレアーゼフリー水、加えて６．１μＬの血漿ＤＮＡ（０．７１４ｎｇ／μＬ）、加えて０．０３５ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９（２μＬ）、したがって、４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０ゲノム当量（ＧＥ）に加えて０．０７ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９（ＰＣＲ反応物中の２０ＧＥのＨＴ−２９（１０ＧＥのみが変異）に対応）；２）５．９μＬのヌクレアーゼフリー水、加えて６．１μＬの血漿ＤＮＡ（０．７１４ｎｇ／μＬ）、加えて０．０３５ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９（１μＬ）、したがって、４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０ゲノム当量（ＧＥ）に加えて０．０３５ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＴ−２９（ＰＣＲ反応物中の１０ＧＥのＨＴ−２９（５ＧＥのみが変異）に対応）であった。注：４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０ゲノム当量（ＧＥ）、及び０．０７ｎｇのｗｃＤＮＡ（２０ＧＥの変異体、１０個が変異）の以前の混合物（０．５体積）を、４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡ混合物（０．５体積）と混合する連続希釈により、４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０ゲノム当量（ＧＥ）、及び０．０３５ｎｇのｗｃＤＮＡ（１０ＧＥの変異体、５個が変異）の混合物を調製する。
【０４３５】
それぞれの１３０μＬのＰＣＲ混合物を１２個のチューブ（それぞれ１０μＬ）に分け、次に、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を４５サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。後のＬＤＲ及びｑＰＣＲ工程は、希釈実験セクションで上述のとおりに実施した。図１６１及び表４に結果を示す。
【０４３６】
（表４）ヒト血漿ＤＮＡに希釈したＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを検出するためのピクセル実験の結果
2017533697.tif 000006
Ｍｔ＝変異ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ。ｗｔ＝野生型ＢＲＡＦ。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。縦列１〜１２はそれぞれ、チューブ１〜１２で得たＣｔに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線に対応する。
【０４３７】
実証用実施例２−Ｒ２４８Ｑ（７４３Ｇ＞Ａ）ＴＰ５３変異の検出
使用した全てのプライマーを表５に示す。ＰＮＡＢｉｏ  Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）から購入したＰＮＡプライマーを除いて、全てのプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（（ＩＤＴ），Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。
【０４３８】
（表５）ＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑ変異のＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出用プライマー
2017533697.tif 000007
ＰＮＡ＝ペプチド核酸、／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４３９】
希釈実験。ＰＣＲ工程は、１．５８μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．８μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−３２６−ｐ５３−２４８＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−２４８−ｐ５３−２４８＿ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１．２５μＬのＰＮＡ−ｐ５３−２４８−１０  ＰＮＡ（ブロックプライマー）（または直近の実験でのＰＮＡ−ｐ５３−２４８−１１Ｌ）（２μＭ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、０．２μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した０．２２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．０２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬで保存）を０．２μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬで保存）に加えることにより調製）、並びに３μＬの対応する鋳型を添加することによって１０μＬの反応で実施した。鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水、１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（したがって、３μＬ中に３５ｎｇまたは１００００ゲノム当量（ＧＥ））（野生型）、並びに、以下の通りに混合したＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡとＨＥＣ−１（Ａ）ｗｃＤＮＡ：１）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中に０．０４７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）、したがって、３μＬ中に０．１４ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（４０ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）（２０ＧＥのみが変異）及び１００００ＧＥのＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ（即ち、５００ｗｔ中に１ｍｔ）に対応）；２）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中に、０．０２３ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）、したがって、３μＬ中に０．０７ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（２０ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）（１０ＧＥのみが変異）及び１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（即ち、１０００ｗｔ中に１ｍｔ）に対応）；３）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の、０．０１１７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）、したがって、３μＬ中に０．００３５ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（１０ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）（５ＧＥのみが変異）及び１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（即ち、２０００ｗｔ中に１ｍｔ）に対応）；４）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の、０．００６ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）、したがって、３μＬ中に０．００１７��ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（５ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）（２または３ＧＥのみが変異）及び１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（即ち、５０００ｗｔ中に１ｍｔ）であった。注：１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物中の０．０４７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）（１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡの中に４０ＧＥの変異）を調製した後、以前の変異体−Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物（０．５体積）とＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（０．５体積）を１１．７ｎｇ／μＬで混合する連続希釈により変異体とＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡの混合物の残りを調製することで、変異ＧＥは２分の１に希釈される一方、Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ  ＧＥは希釈されないままである（１００００ＧＥ）。ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を３５サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。
【０４４０】
５．８２μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、１μＬの１０Ｘ  ＡＫ１６Ｄリガーゼ反応緩衝液［１Ｘ緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．５）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０ｍＭのＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）及び２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を含有する］、０．２５μＬのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、０．２５μＬのＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−３０５−Ｐ５３−２４８（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿Ｒｍ上流プライマー（５００ｎＭ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−２０２−Ｐ５３−２４８−Ｌ＿Ｄｎ＿Ｐ下流プライマー（５００ｎＭ）、０．０２８μＬの精製したＡＫ１６Ｄリガーゼ（８．８μＭ）、並びに２μＬのＰＣＲ反応物を加えて調製した１０μＬの反応物でＬＤＲ工程を実施した。ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：（９４℃で１０秒、及び６０℃で４分）を２０サイクル、続いて最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＬＤＲ反応を実施した。
【０４４１】
１．５μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、５μＬの２Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（高速増幅ｔａｑ，ＵＤＧ及びｄＵＴＰ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ製）、１μＬのｉＣＤｘ−８２＿ＧＴＴ−ＧＣＧＣ＿Ａ２フォワードプライマー（２．５μＭ）、１μＬのｉＣＤｘ−２４４−Ｃ２リバースプライマー（２．５μＭ）、０．５μＬのｉＣＤｘ−２２８−ｐ５３−２４８＿Ｐｒｏｂｅ＿ｓ  Ｔａｑｍａｎプローブ（５μＭ）、及び１μＬのＬＤＲ反応物を加えて調製した１０μＬの反応物でｑＰＣＲ工程を実施した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）で密封したＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ−９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ０．１ｍＬプレート、並びに以下の設定：高速ブロック、実験様式として検量線、内部標準としてＲＯＸ、定量化法としてＣｔ（自動閾値、ただし必要に応じて０．０４に調節）、レポーターとしてＦＡＭ、及び消光剤としてＮＦＱ−ＭＧＢを使用して、また、以下のプログラム：５０℃で２分、及び（９５℃で１秒、及び６０℃で２０秒）を４０サイクル：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＶｉｉＡ７リアルタイムサーモサイクラーの中でｑＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ工程でＰＮＡ−ｐ５３−２４８−１０ブロックプライマーを使用した実験の結果を図１６２及び表６に示し、ＰＣＲ工程でＰＮＡ−ｐ５３−２４８−１１Ｌブロックプライマーを使用した実験の結果を図１６３及び表７に示す。
【０４４２】
（表６）ＰＣＲ工程でＰＮＡ−ｐ５３−２４８−１０をブロックプライマーとして使用し、ＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑを検出する希釈実験の結果
2017533697.tif 000008
Ｍｔ＝変異ＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑ。ＷＴ＝野生型ＴＰ５３。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。太字のＣｔ値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
【０４４３】
（表７）ＰＣＲ工程でＰＮＡ−ｐ５３−２４８−１１Ｌをブロックプライマーとして使用し、ＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑを検出する希釈実験の結果
2017533697.tif 000009
Ｍｔ＝変異ＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑ。ＷＴ＝野生型ＴＰ５３。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。太字のＣｔ値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
【０４４４】
ＲｏｃｈｅのｈｇＤＮＡを使用したピクセル実験。ＰＣＲ工程は、５６．５４μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、 ２６μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、 １０．４μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、 ２．６μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、 ３．２５μＬのｉＣＤｘ−３２６−ｐ５３−２４８＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−２４８−ｐ５３−２４８＿ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、 １６．２５μＬのＰＮＡ−ｐ５３−２４８−１０  ＰＮＡブロックプライマー（２μＭ）、 ３．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、 ２．６μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、 及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した２．８６μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．３μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を３μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに３μＬの対応する鋳型を加えることによって調製した１３０μＬの混合物中で実施した。 鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水、２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（したがって、３μＬ中に８．７５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡまたは２５００ゲノム当量（ＧＥ））（野生型）、並びに、以下の通りに混合したＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡとＨＥＣ−１（Ａ）ｗｃＤＮＡ：１）２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の、０．０２３ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）、したがって、３μＬ中に０．０７ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）及び８．７５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（２０ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）の（１０ＧＥのみが変異）及び２５００個のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥに対応）；２）２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の、０．０１１７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）、したがって、３μＬ中に０．００３５ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）及び８．７５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（１０個のＨＥＣ−１（Ａ）のＧＥ（５ＧＥのみが変異）及び２５００個のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥに対応）であった。注：２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物中の０．０２３ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）（０．５体積）（２５００個のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥにおいて、２０ＧＥが変異体、１０ＧＥが変異）に加えて、０．５体積のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（２．９２５ｎｇ／μＬ）を混合する連続希釈により、２．９２５ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．０１１７ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）を調製することで、変異体が１０ＧＥ（５ＧＥが変異）に希釈される一方、Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥは希釈されないままである（２５００ＧＥ）。
【０４４５】
それぞれの１３０μＬのＰＣＲ混合物を１２個のチューブ（それぞれ１０μＬ）に分け、次に、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を３５サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。後のＬＤＲ及びｑＰＣＲ工程は、希釈実験セクションで上述のとおりに実施した。図１６４及び表８に結果を示す。
【０４４６】
（表８）Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡに希釈したＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑを検出するためのピクセル実験の結果
2017533697.tif 000010
Ｍｔ＝変異ＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑ。ＷＴ＝野生型ＴＰ５３。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。縦列１〜１２はそれぞれ、チューブ１〜１２で得たＣｔに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線に対応する。
【０４４７】
ヒト血漿ＤＮＡ（血漿＃１０）を使用したピクセル実験。ＰＣＲ工程は、４６．５４μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２６μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１０．４μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．６μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−３２６−ｐ５３−２４８＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−２４８−ｐ５３−２４８＿ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１６．２５μＬのＰＮＡ−ｐ５３−２４８−１１Ｌ  ＰＮＡブロックプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、２．６μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した２．８６μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．３μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を３μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに１３μＬの対応する鋳型を加えることによって調製した１３０μＬの混合物中で実施した。鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水；血漿ＤＮＡ（７．６μＬのヌクレアーゼフリー水及び５．４μＬの血漿ＤＮＡ（０．８１１ｎｇ／μＬ）として調製、したがって、ＰＣＲ反応物中の４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０ゲノム当量（ＧＥ））（野生型）；並びに以下の通りに混合した血漿ＤＮＡとＨＥＣ−１（Ａ）  ｗｃＤＮＡ：１）５．６μＬのヌクレアーゼフリー水、加えて５．４μＬの血漿ＤＮＡ（０．８１１ｎｇ／μＬ）、加えて０．０３５ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）（２μＬ）、したがって、４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０ゲノム当量（ＧＥ）に加えて０．０７ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）（ＰＣＲ反応物中の２０ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）（１０ＧＥのみが変異）に対応）；２）６．６μＬのヌクレアーゼフリー水、加えて５．４μＬの血漿ＤＮＡ（０．８１１ｎｇ／μＬ）、加えて０．０３５ｎｇ／μＬのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）（１μＬ）、したがって、４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０ゲノム当量（ＧＥ）に加えて０．０３５ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＨＥＣ−１（Ａ）（ＰＣＲ反応物中の１０ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）（５ＧＥのみが変異）に対応）であった。注：４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０ゲノム当量（ＧＥ）、及び０．０７ｎｇのｗｃＤＮＡ（２０ＧＥの変異体、１０個が変異）の以前の混合物（０．５体積）を、４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡ混合物（０．５体積）と混合する連続希釈により、４．３７５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１２５０ゲノム当量（ＧＥ）、及び０．０３５ｎｇのｗｃＤＮＡ（１０ＧＥの変異体、５個が変異）の混合物を調製する。
【０４４８】
それぞれの１３０μＬのＰＣＲ混合物を１２個のチューブ（それぞれ１０μＬ）に分け、次に、Ｐｒｏｆｌｅｘ  ＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、及び以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を３５サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。後のＬＤＲ及びｑＰＣＲ工程は、希釈実験セクションで上述のとおりに実施した。図１６５及び表９に結果を示す。
【０４４９】
（表９）ヒト血漿ＤＮＡに希釈したＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑを検出するためのピクセル実験の結果
2017533697.tif 000011
Ｍｔ＝変異ＴＰ５３  Ｒ２４８Ｑ。ＷＴ＝野生型ＴＰ５３。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。縦列１〜１２はそれぞれ、チューブ１〜１２で得たＣｔに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線に対応する。
【０４５０】
実証用実施例３−ＫＲＡＳコドン１２の第１の位置での変異の検出：Ｇ１２Ｃ（３４Ｇ＞Ｔ）及びＧ１２Ｓ（３４Ｇ＞Ａ）
使用した全てのプライマーを表１０に示す。ＰＮＡＢｉｏ  Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）から購入したＰＮＡプライマーを除いて、全てのプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（（ＩＤＴ），Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。
【０４５１】
（表１０）ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ及びＧ１２Ｓ変異のＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出用プライマー
2017533697.tif 000012
ＰＮＡ＝ペプチド核酸、／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４５２】
希釈実験。ＰＣＲ工程は、１．５８μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２μＬのマグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．８μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−３２７−Ｋｒ＿１２＿２＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−３０３−Ｋｒ−１２＿１＆２＿ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１．２５μＬのＰＮＡ−Ｋｒａｓ  １２＿２−１１Ｌ（またはＰＮＡ−Ｋｒａｓ  １２＿２−１１Ｒ）ＰＮＡブロックプライマー（２μＭ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、０．２μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した０．２２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．０２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を０．２μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに３μＬの対応する鋳型を添加することによって１０μＬの反応物で実施した。鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水、１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（したがって、３μＬ中に３５ｎｇまたは１００００ゲノム当量（ＧＥ））（野生型）、並びに、以下の通りに混合したＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡとＳＷ１４６３（Ｇ１２Ｃ、３４Ｇ＞Ｔ、ホモ接合）またはＬＳ１２３（Ｇ１２Ｓ、３４Ｇ＞Ａ、ヘテロ接合）ｗｃＤＮＡ：１）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．０４７ｎｇ／μＬのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡ、したがって、３μＬ中に０．１４ｎｇのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡ及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（４０ＧＥのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡの（ＳＷ１４６３では４０ＧＥが変異し、ＬＳ１２３では２０ＧＥが変異）、及び、１００００ＧＥのＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ（即ち、ＳＷ１４６３では２５０ｗｔに１ｍｔ、及びＬＳ１２３では５００ｗｔに１ｍｔ）に対応する）；２）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．０２３ｎｇ／μＬのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡ、したがって、３μＬ中に０．０７ｎｇのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡ及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（２０個のＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡのＧＥ（ＳＷ１４６３では２０ＧＥが変異し、ＬＳ１２３では１０ＧＥが変異）、及び１００００個のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥ（即ち、ＳＷ１４６３では５００ｗｔに１ｍｔ、及びＬＳ１２３では１０００ｗｔに１ｍｔ）に対応する）；３）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．０１１７ｎｇ／μＬのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡ、したがって、３μＬ中に０．００３５ｎｇのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡ及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（１０個のＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡのＧＥ（ＳＷ１４６３では１０ＧＥが変異し、ＬＳ１２３では５ＧＥが変異）、及び１００００個のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥ（即ち、ＳＷ１４６３では１０００ｗｔに１ｍｔ、及びＬＳ１２３では２０００ｗｔに１ｍｔ）に対応する）；４）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．００６ｎｇ／μＬのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡ、したがって、３μＬ中に０．００１７５ｎｇのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡ及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（５個のＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡのＧＥ（ＳＷ１４６３では５ＧＥが変異し、ＬＳ１２３では２または３ＧＥが変異）及び１００００個のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥ（即ち、ＳＷ１４６３では２０００ｗｔに１ｍｔ、及びＬＳ１２３では５０００ｗｔに１ｍｔ）に対応する）であった。注：１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物中に０．０４７ｎｇ／μＬのＳＷ１４６３またはＬＳ１２３  ｗｃＤＮＡ（１００００個のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのＧＥ中に４０ＧＥの変異）を調製した後、以前の変異体−Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物（０．５体積）とＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（０．５体積）を１１．７ｎｇ／μＬで混合する連続希釈により変異体とＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡの混合物の残りを調製することで、変異ＧＥは２分の１に希釈される一方、Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ  ＧＥは希釈されないままである（１００００ＧＥ）。ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、及び以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を５０サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。
【０４５３】
５．８２μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、１μＬの１０Ｘ  ＡＫ１６Ｄリガーゼ反応緩衝液［１Ｘ緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０ｍＭのＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）及び２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を含有する］、０．２５μＬのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、０．２５μＬのＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−３９３−Ｋｒ−１２＿１（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿Ｒｍ上流プライマー（５００ｎＭ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−２２２−Ｋｒ−１２＿１−Ｌ＿Ｄｎ＿Ｐ下流プライマー（５００ｎＭ）、０．０２８μＬの精製したＡＫ１６Ｄリガーゼ（８．８μＭ）、並びに２μＬのＰＣＲ反応物を加えて調製した１０μＬの反応物でＬＤＲ工程を実施した。ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：（９４℃で１０秒、及び６０℃で４分）を２０サイクル、続いて最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＬＤＲ反応を実施した。
【０４５４】
１．５μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、５μＬの２Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（高速増幅ｔａｑ，ＵＤＧ及びｄＵＴＰ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ製）、１μＬのｉＣＤｘ−２４５＿Ａ３フォワードプライマー（２．５μＭ）、１μＬのｉＣＤｘ−２４６−Ｃ３リバースプライマー（２．５μＭ）、０．５μＬのｉＣＤｘ−２５９−Ｔ−Ｋｒ−１２＿１＿Ｐｒｏｂｅ  Ｔａｑｍａｎプローブ（５μＭ）、並びに１μＬのＬＤＲ反応物を加えて調製した１０μＬの反応物でｑＰＣＲ工程を実施した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）で密封したＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ−９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ０．１ｍＬプレート、並びに以下の設定：高速ブロック、実験様式として検量線、内部標準としてＲＯＸ、定量化法としてＣｔ（自動閾値、ただし必要に応じて０．０４に調節）、レポーターとしてＨＥＸ、並びに消光剤としてＮＦＱ−ＭＧＢを使用して、また、以下のプログラム：５０℃で２分、及び（９５℃で１秒、及び６０℃で２０秒）を４０サイクル：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＶｉｉＡ７リアルタイムサーモサイクラーの中でｑＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ工程でＰＮＡ−Ｋｒａｓ  １２＿２−１１Ｌ  ＰＮＡブロックプライマーを使用した実験の結果を図１６６及び表１１に示す。ＰＣＲ工程でＰＮＡ−Ｋｒａｓ  １２＿２−１１Ｒ  ＰＮＡブロックプライマーを使用した実験の結果を図１６７及び表１２に示す。
【０４５５】
（表１１）ＰＣＲ工程でＰＮＡ−Ｋｒａｓ  １２＿２−１１Ｌ  ＰＮＡブロックプライマーを使用してＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ  （３４Ｇ＞Ｔ）変異を検出する希釈実験の結果
2017533697.tif 000013
Ｍｔ＝変異ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ。ＷＴ＝野生型ＫＲＡＳ。Ｈｏｍ＝ホモ接合。ＵＤ＝未測定。太字のＣｔ値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。 
【０４５６】
（表１２）ＰＣＲ工程でＰＮＡ−Ｋｒａｓ  １２＿２−１１Ｒ  ＰＮＡブロックプライマーを使用してＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ  （３４Ｇ＞Ａ）変異を検出する希釈実験の結果
2017533697.tif 000014
Ｍｔ＝変異ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ。ＷＴ＝野生型ＫＲＡＳ。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。太字のＣｔ値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。 
【０４５７】
ヒト血漿ＤＮＡ（血漿＃９）を使用したピクセル実験。ＰＣＲ工程は、４６．５４μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２６μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１０．４μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．６μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−３２７−Ｋｒ＿１２＿２＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−３０３−Ｋｒ−１２＿１＆２＿ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１６．２５μＬのＰＮＡ−Ｋｒａｓ  １２＿２−１１Ｌ  ＰＮＡブロックプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、２．６μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した２．８６μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．３μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を３μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに１３μＬの対応する鋳型を加えることによって調製した１３０μＬの混合物中で実施した。鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水；血漿ＤＮＡ（８．３μＬのヌクレアーゼフリー水及び４．７μＬの血漿ＤＮＡ（０．７４３ｎｇ／μＬ）として調製、したがって、ＰＣＲ反応物中の３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００ゲノム当量（ＧＥ））（野生型）；並びに以下の通りに混合した血漿ＤＮＡとＳＷ１４６３  ｗｃＤＮＡ：１）６．３μＬのヌクレアーゼフリー水、加えて４．７μＬの血漿ＤＮＡ（０．７４３ｎｇ／μＬ）、加えて２μＬのｗｃＤＮＡ  ＳＷ１４６３（０．０１７５ｎｇ／μＬ）、したがって、３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００ゲノム当量（ＧＥ）に加えて０．０３５ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＳＷ１４６３（ＰＣＲ反応物中の１０ＧＥのＳＷ１４６３（１０ＧＥ全てが変異）に対応）；２）７．３μＬのヌクレアーゼフリー水、加えて４．７μＬの血漿ＤＮＡ（０．７４３ｎｇ／μＬ）、加えて１μＬのｗｃＤＮＡ  ＳＷ１４６３（０．０１７５ｎｇ／μＬ）、したがって、３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００ゲノム当量（ＧＥ）に加えて０．０１７５ｎｇのｗｃＤＮＡ  ＳＷ１４６３（ＰＣＲ反応物中の５個のＳＷ１４６３のＧＥ（５ＧＥ全てが変異）に対応）であった。注：３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００ゲノム当量（ＧＥ）、及び０．０３５ｎｇのｗｃＤＮＡ（１０ＧＥの変異体、１０個が変異）の以前の混合物（０．５体積）を、３．５ｎｇの血漿ＤＮＡ混合物（０．５体積）と混合する連続希釈により、３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００ゲノム当量（ＧＥ）、及び０．０１７５ｎｇのｗｃＤＮＡ（５ＧＥの変異体、５個が変異）の混合物を調製する。
【０４５８】
それぞれの１３０μＬのＰＣＲ混合物を１２個のチューブ（それぞれ１０μＬ）に分け、次に、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を５０サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。後のＬＤＲ及びｑＰＣＲ工程は、希釈実験セクションで上述のとおりに実施した。図１６８及び表１３に結果を示す。
【０４５９】
（表１３）ヒト血漿ＤＮＡに希釈したＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃを検出するピクセル実験の結果
2017533697.tif 000015
Ｍｔ＝変異ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ。ＷＴ＝野生型ＫＲＡＳ。Ｈｏｍ＝ホモ接合。ＵＤ＝未測定。縦列１〜１２はそれぞれ、チューブ１〜１２で得たＣｔに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線に対応する。
【０４６０】
実証用実施例４−  ＫＲＡＳコドン１２の第２の位置での変異の検出：Ｇ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ）、Ｇ１２Ａ（３５Ｇ＞Ｃ）及びＧ１２Ｖ（３５Ｇ＞Ｔ）
使用した全てのプライマーを表１４に示す。ＰＮＡＢｉｏ  Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）から購入したＰＮＡプライマーを除いて、全てのプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（（ＩＤＴ），Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。
【０４６１】
（表１４）ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ及びＧ１２Ｖ変異のＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ検出用プライマー
2017533697.tif 000016
ＰＮＡ＝ペプチド核酸、／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４６２】
希釈実験。ＰＣＲ工程は、１．５８μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．８μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−３２７−Ｋｒ＿１２＿２＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−３０３−Ｋｒ−１２＿１＆２＿ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１．２５μＬのＰＮＡ−Ｋｒａｓ  １２＿２−１１Ｌ  ＰＮＡブロックプライマー（２μＭ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、０．２μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した０．２２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．０２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を０．２μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに３μＬの対応する鋳型を添加することによって１０μＬの反応物中で実施した。鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水、１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（したがって、３μＬ中に３５ｎｇまたは１００００ゲノム当量（ＧＥ））（野生型）、以下の通りにＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡと混合したＨＥＣ−１（Ａ）（Ｇ１２Ｄ、３５Ｇ＞Ａ、ヘテロ接合）またはＳＷ１１１６（Ｇ１２Ａ、３５Ｇ＞Ｃ、ヘテロ接合）またはＳＷ４８０（Ｇ１２Ｖ、３５Ｇ＞Ｔ、ホモ接合）ｗｃＤＮＡ：１）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．０４７ｎｇ／μＬのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ、したがって、３μＬ中に０．１４ｎｇのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０、及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（４０ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０（ＨＥＣ−１（Ａ）またはＳＷ１１１６では２０ＧＥが変異、ＳＷ４８０では４０ＧＥが変異）、及び、１００００個のＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡのＧＥ（即ち、ＨＥＣ−１（Ａ）またはＳＷ１１１６では５００ｗｔに１ｍｔ、及びＳＷ４８０では２５０ｗｔに１ｍｔ）に対応する）；２）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．０２３ｎｇ／μＬのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０のｗｃＤＮＡ、したがって、３μＬ中に０．０７ｎｇのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ、及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（２０ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０（ＨＥＣ−１（Ａ）またはＳＷ１１１６では１０ＧＥが変異、ＳＷ４８０では２０ＧＥが変異）、及び、１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（即ち、ＨＥＣ−１（Ａ）またはＳＷ１１１６では１０００ｗｔに１ｍｔ、及びＳＷ４８０では５００ｗｔに１ｍｔ）に対応する）；３）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．０１１７ｎｇ／μＬのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ、したがって、３μＬ中に０．００３５ｎｇのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ、及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（１０ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０（ＨＥＣ−１（Ａ）またはＳＷ１１１６では５ＧＥが変異、ＳＷ４８０では１０ＧＥが変異）、及び１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（即ち、ＨＥＣ−１（Ａ）またはＳＷ１１１６では２０００ｗｔに１ｍｔ、及びＳＷ４８０では１０００ｗｔに１ｍｔ）に対応する；４）１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中の０．００６ｎｇ／μＬのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ、したがって、３μＬ中に０．００１７５ｎｇのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ、及び３５ｎｇのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（５ＧＥのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０（ＨＥＣ−１（Ａ）またはＳＷ１１１６では２または３ＧＥが変異、ＳＷ４８０では５ＧＥが変異）、及び、１００００ＧＥのＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ（即ち、ＨＥＣ−１（Ａ）またはＳＷ１１１６では５０００ｗｔに１ｍｔ、及びＳＷ４８０では２０００ｗｔに１ｍｔ）に対応する）であった。注：１１．７ｎｇ／μＬのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物（１００００ＧＥのＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ中に４０ＧＥの変異）中に０．０４７ｎｇ／μＬのＨＥＣ−１（Ａ）、ＳＷ１１１６またはＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡを調製した後、以前の変異体−Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ混合物（０．５体積）とＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ（０．５体積）を１１．７ｎｇ／μＬで混合する連続希釈により変異体とＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡの混合物の残りを調製することで、変異ＧＥは２分の１に希釈される一方、Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡ  ＧＥは希釈されないままである（１００００ＧＥ）。Ｐｒｏｆｌｅｘ  ＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、及び以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を５０サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。
【０４６３】
５．８２μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、１μＬの１０Ｘ  ＡＫ１６Ｄリガーゼ反応緩衝液［１Ｘ緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０ｍＭのＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）及び２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を含有する］、０．２５μＬのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、 ０．２５μＬのＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、 ０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−３０７−Ｋｒ−１２＿２（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿ＲｍまたはｉＣＤｘ−３９４−Ｋｒ−１２＿２（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿Ｒｍ上流プライマー（５００ｎＭ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−２６９−Ｋｒ−１２＿２−Ｌ＿Ｄｎ＿Ｐ下流プライマー（５００ｎＭ）、０．０２８μＬの精製したＡＫ１６Ｄリガーゼ（８．８μＭ）、並びに２μＬのＰＣＲ反応物を加えて調製した１０μＬの反応物でＬＤＲ工程を実施した。 ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：（９４℃で１０秒、及び６０℃で４分）を２０サイクル、続いて最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＬＤＲ反応を実施した。
【０４６４】
１．５μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、５μＬの２Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（高速増幅ｔａｑ，ＵＤＧ及びｄＵＴＰ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ製）、１μＬのｉＣＤｘ−２４５＿Ａ３フォワードプライマー（２．５μＭ）、１μＬのｉＣＤｘ−２４６−Ｃ３リバースプライマー（２．５μＭ）、０．５μＬのｉＣＤｘ−２７０−Ｋｒ−１２＿２（３）＿ＰｒｏｂｅＴａｑｍａｎプローブ（５μＭ）、及び１μＬのＬＤＲ反応物を加えて調製した１０μＬの反応物でｑＰＣＲ工程を実施した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）で密封したＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ−９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ０．１ｍＬプレート、並びに以下の設定：高速ブロック、実験様式として検量線、内部標準としてＲＯＸ、定量化法としてＣｔ（自動閾値、ただし必要に応じて０．０４に調節）、レポーターとしてＨＥＸ、並びに消光剤としてＮＦＱ−ＭＧＢを使用して、また、以下のプログラム：５０℃で２分、及び（９５℃で１秒、及び６０℃で２０秒）を４０サイクル：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＶｉｉＡ７リアルタイムサーモサイクラーの中でｑＰＣＲ反応を実施した。ｉＣＤｘ−３０７−Ｋｒ−１２＿２（３）−Ｌ  ｕｐ  Ｒｍ上流ＬＤＲプライマーを使用してＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ）変異を検出する実験の結果を、図１６９及び表１５に示す。ｉＣＤｘ−３０７−Ｋｒ−１２＿２（３）−Ｌ  ｕｐ  Ｒｍ上流ＬＤＲプライマーを使用してＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ  （Ｇ＞Ｃ）を検出する実験の結果を、図１７０及び表１６に示す。ｉＣＤｘ−３０７−Ｋｒ−１２＿２（３）−Ｌ  ｕｐ  Ｒｍ上流ＬＤＲプライマーを使用してＫＲＡＳＧ１２Ｖ（３５Ｇ＞Ｔ）変異を検出する実験の結果を、図１７１及び表１７に示す。
【０４６５】
（表１５）ｉＣＤｘ−３０７−Ｋｒ−１２＿２（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿Ｒｍ上流ＬＤＲプライマーを使用してＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ（３５Ｇ＞Ａ）を検出する希釈実験の結果
2017533697.tif 000017
Ｍｔ＝変異ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ。ＷＴ＝野生型ＫＲＡＳ。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。太字のＣｔ値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
【０４６６】
（表１６）ｉＣＤｘ−３０７−Ｋｒ−１２＿２（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿Ｒｍ上流ＬＤＲプライマーを使用してＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ（３５Ｇ＞Ｃ）を検出する希釈実験の結果
2017533697.tif 000018
Ｍｔ＝変異ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ａ。ＷＴ＝野生型ＫＲＡＳ。Ｈｅｔ＝ヘテロ接合体。ＵＤ＝未測定。太字のＣｔ値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
【０４６７】
（表１７）ｉＣＤｘ−３０７−Ｋｒ−１２＿２（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿Ｒｍ上流ＬＤＲプライマーを使用してＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ（３５Ｇ＞Ｔ）を検出する希釈実験の結果
2017533697.tif 000019
Ｍｔ＝変異ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ。ＷＴ＝野生型ＫＲＡＳ。Ｈｏｍ＝ホモ接合。ＵＤ＝未測定。太字のＣｔ値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線から得た値に対応する。
【０４６８】
ヒト血漿ＤＮＡ（血漿＃９）を使用したピクセル実験。ＰＣＲ工程は、４６．５４μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２６μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１０．４μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．６μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−３２７−Ｋｒ＿１２＿２＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２フォワードプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−３０３−Ｋｒ−１２＿１＆２＿ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１６．２５μＬのＰＮＡ−Ｋｒａｓ  １２＿２−１１Ｌ  ＰＮＡブロックプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、２．６μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した２．８６μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．３μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を３μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに１３μＬの対応する鋳型を加えることによって調製した１３０μＬの混合物中で実施した。鋳型は、ＮＴＣ（非鋳型対照）用のヌクレアーゼフリー水；血漿ＤＮＡ（８．３μＬのヌクレアーゼフリー水及び４．７μＬの血漿ＤＮＡ（０．７４３ｎｇ／μＬ）として調製、したがって、ＰＣＲ反応物中の３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００ゲノム当量（ＧＥ））（野生型）；並びに以下の通りに血漿ＤＮＡと混合したＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ：１）６．３μＬのヌクレアーゼフリー水、加えて４．７μＬの血漿ＤＮＡ（０．７４３ｎｇ／μＬ）、加えて２μＬのＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ（０．０１７５ｎｇ／μＬ）、したがって、３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００ゲノム当量（ＧＥ）に加えて０．０３５ｎｇのＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ（ＰＣＲ反応物中の１０ＧＥのＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ（１０ＧＥ全てが変異）に対応）；２）７．３μＬのヌクレアーゼフリー水、加えて４．７μＬの血漿ＤＮＡ（０．７４３ｎｇ／μＬ）、加えて１μＬのＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ（０．０１７５ｎｇ／μＬ）、したがって、３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００のゲノム当量（ＧＥ）に加えて０．０１７５ｎｇのＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ（ＰＣＲ反応物中の５ＧＥのＳＷ４８０（５ＧＥ全てが変異）に対応）であった。注：３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００ゲノム当量（ＧＥ）及び０．０３５ｎｇのＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ（１０ＧＥの変異、１０個が変異）の以前の混合物（０．５体積）を３．５ｎｇの血漿ＤＮＡ混合物（０．５体積）と混合する連続希釈により、３．５ｎｇの血漿ＤＮＡまたは１０００個のゲノム当量（ＧＥ）、及び０．０１７５ｎｇのＳＷ４８０  ｗｃＤＮＡ（５ＧＥの変異、５個が変異）の混合物を調製する。
【０４６９】
それぞれの１３０μＬのＰＣＲ混合物を１２個のチューブ（それぞれ１０μＬ）に分け、次に、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：３７℃で３０分、９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で３０秒）を５０サイクル、９９．５℃で１０分、並びに最終的に４℃で保持：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）の透明接着フィルムで密封した、ＢｉｏＥｘｃｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  ９６ウェルＰＣＲ  ０．２ｍＬプレート（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）の中でＰＣＲ反応を実施した。後のＬＤＲ及びｑＰＣＲ工程は、ｉＣＤｘ−３９４−Ｋｒ−１２＿２（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿ＲｍをＬＤＲ工程用の上流プライマーとして使用して、希釈実験セクションで上述のとおりに実施した。図１７２及び表１８に結果を示す。
【０４７０】
（表１８）ヒト血漿ＤＮＡに希釈したＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖを検出するピクセル実験の結果
2017533697.tif 000020
Ｍｔ＝変異ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ。ＷＴ＝野生型ＫＲＡＳ。Ｈｏｍ＝ホモ接合。ＵＤ＝未測定。縦列１〜１２はそれぞれ、チューブ１〜１２で得たＣｔに対応し、太字の値は「正しい曲線」から得たＣｔに対応し、通常のフォントタイプの値は「平らな曲線」から得られた値、即ち、後期の増幅サイクル（通常は３６のＣｔ値の後）で現れる非ベースライン曲線に対応する。
【０４７１】
実証用実施例５−細胞株ゲノムＤＮＡでのメチル化の検出
通常の方法。使用した細胞株は、ＬＳ−１７４Ｔ、ＨＣＴ−１５、ＨＴ−２９、ＷｉＤｉ、ＳＷ１１１６、結腸腺癌細胞株であった。全ての細胞株を、１０％ウシ胎児血清を添加した、４．５ｇ／Ｌグルコースを含有するマッコイ５Ａ培地の入った６０ｃｍ２培養皿に播種し、５％  ＣＯ２を含有する加湿雰囲気に維持した。細胞がコンフルエンスの８０〜９０％に達した後に、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し（ｘ３）、遠心分離（５００ｘｇ）により収集した。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＤＮＡを単離した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）によりＤＮＡ濃度を測定した。
【０４７２】
ヒト血液（軟膜）から単離した、高分子量（＞５０ｋｂ）のゲノムＤＮＡを含有するヒトゲノムＤＮＡ（０．２ｍｇ／ｍＬ）（ＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡ）をＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキットにより、このＤＮＡの濃度を３９ｎｇ／μＬと測定した。
【０４７３】
酵素Ｂｓｈ１２３６Ｉによる、ゲノムＤＮＡの制限酵素分解。上で記載した細胞株からのゲノムＤＮＡ（５００ｎｇ）を、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ（２５℃でｐＨ７．９））を含有する反応混合物（２０μＬ）中で１０単位の制限酵素Ｂｓｈ１２３６Ｉにより分解した。分解反応を３７℃で１時間行い、８０℃で２０分間加熱して後の酵素不活性化を行った。
【０４７４】
分解したゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩変換。Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）製のＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキットを使用して亜硫酸水素塩変換を行った。１３０μＬのＬｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ試薬を、Ｂｓｈ１２３６Ｉで分解したゲノムＤＮＡ（２０μＬ）に加えた。変換反応物を９８℃で８分間、続いて５４℃で１時間インキュベーションしてから４℃まで冷却した。６００μＬのＭ−Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液をＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎ（商標）カラムに加え、続いてカラムを収集チューブの中に配置した。分解したＤＮＡ及びＬｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ試薬を含有する１５０μＬの反応混合物を、６００μＬのＭ−Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液を含有するＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎ  ＩＣカラム内に入れた。カラムのキャップを密閉し、カラムを数回反転させて溶液を混合した。最高速度（≧１０，０００ｘｇ）でカラムを３０秒間遠心分離し、通過画分を廃棄した。１００μＬのＭ−ｗａｓｈｉｎｇ緩衝液をカラムに加え、最高速度で３０秒間カラムを遠心分離し、通過画分を廃棄した。２００μＬのＬ−Ｄｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｉｏｎ緩衝液をカラムに加え、カラムを室温で１５〜２０分静置させた。インキュベーション後、カラムを最高速度で３０秒間遠心分離した。２００μＬのＭ−Ｗａｓｈ緩衝液をカラムに加え、カラムを最高速度で３０秒間遠心分離し、通過画分を廃棄した。この洗浄工程をもう一度繰り返した。最終的に、カラムを１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブの中に入れ、１０μＬのＭ−Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝液をカラムマトリックスに加え、最高速度で３０秒間遠心分離し、亜硫酸水素塩により変換されたＤＮＡを溶出した。
【０４７５】
ＰＣＲ及びＬＤＲプライマー。使用した全てのプライマーを表１９に示す。Ｅｘｉｑｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から購入したＬＮＡ１及びＬＮＡ２、並びにＰＮＡ  Ｂｉｏ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）から購入したＰＮＡを除いて、全てのプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（（ＩＤＴ），Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。
【０４７６】
（表１９）ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲメチル化用プライマー
2017533697.tif 000021
／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４７７】
ＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ実験。ＰＣＲ工程は、２μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．８μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−２０３１−Ｖｉｍ−Ｓ３−ＦＰフォワードプライマー（２μＭ）、０．２５μＬのｉＣＤｘ−２０３２Ａ−Ｖｉｍ−Ｓ３−ＲＰリバースプライマー（２μＭ）、１．２５μＬのＶＩＭ−Ｓ３−ＬＮＡまたはＶＩＭ−Ｓ３−ＰＮＡ２ブロックプライマー（２μＭ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）と混合した０．２２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．０２μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を０．２μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに、３５ｎｇのゲノムＤＮＡを含有する、４．７８μＬの対応する鋳型を添加することによって調製した１０μＬの反応物で実施した。鋳型は、ＬＳ−１７４Ｔ、ＨＣＴ−１５、ＨＴ−２９、ＷｉＤｒ、ＳＷ１１１６細胞株ゲノムＤＮＡ、及びＲｏｃｈｅヒトゲノムＤＮＡであった。ＰｒｏＦｌｅｘ  ＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）の中でＰＣＲ反応を実施し、以下のプログラム：９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒）を４０サイクル、９９．５℃で１０分、及び最終的に４℃で保持：で実施した。
【０４７８】
５．８２μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、１μＬの１０Ｘ  ＡＫ１６Ｄリガーゼ反応緩衝液［１Ｘ緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．５）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０ｍＭのＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、１０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）及び２０μｇ/ｍＬのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を含有する］、０．２５μＬのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、０．２５μＬのＮＡＤ＋（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）（４０ｍＭ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−２０３３Ａ−Ｖｉｍ−Ｓ３−Ｕｐプライマー（５００ｎＭ）、０．２μＬのｉＣＤｘ−２０３４Ａ−Ｖｉｍ−Ｓ３−Ｄｎプライマー（５００ｎＭ）、０．０２８μＬの精製したＡＫ１６Ｄリガーゼ（８．８μＭ）、並びに２μＬのＰＣＲ反応物を加えて調製した１０μＬの反応物でＬＤＲ工程を実施した。ＰｒｏＦｌｅｘ  ＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）、並びに以下のプログラム：（９４℃で１０秒、及び６０℃で４分）を２０サイクル、続いて最終的に４℃で保持、の中でＬＤＲ反応を実施した。
【０４７９】
１．５μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、５μＬの２Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（高速増幅ｔａｑ，ＵＤＧ及びｄＵＴＰ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ製）、１μＬのｉＣＤｘ−２０３６−Ｖｉｍ−Ｓ３−ＲＴ−ＦＰフォワードプライマー（２．５μＭ）、１μＬのｉＣＤｘ−２０３７−Ｖｉｍ−Ｓ３−ＲＴ−ＲＰリバースプライマー（２．５μＭ）、０．５μＬのｉＣＤｘ−２０３５Ａ−Ｖｉｍ−Ｓ３−ＲＴ−ＰｂＴａｑｍａｎプローブ（５μＭ）、及び１μＬのＬＤＲ反応生成物を加えることにより調製した１０μＬの反応混合物の中でｑＰＣＲ工程を実施した。ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ接着フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）で密封したＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ−９６−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ０．１ｍＬプレート、並びに以下の設定：高速ブロック、実験様式として検量線、内部標準としてＲＯＸ、定量化法としてＣｔ（自動閾値、ただし必要に応じて０．０５に調節）、レポーターとしてＴＡＭＲＡ、及び消光剤としてＮＦＱ−ＭＧＢを使用して、また、以下のプログラム：５０℃で２分、及び（９５℃で１秒、及び６０℃で２０秒）を４０サイクル：を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）製のＶｉｉＡ７リアルタイムサーモサイクラーの中でｑＰＣＲ反応を実施した。図１７３及び表２０に結果を示す。
【０４８０】
（表２０）細胞株ゲノムＤＮＡ内でのメチル化を検出する実験の結果
2017533697.tif 000022
【０４８１】
ピクセル実験。５９．１４μＬのヌクレアーゼフリー水（ＩＤＴ）、２６μＬの、マグネシウム非含有Ｇｏｔａｑ  Ｆｌｅｘｉ緩衝液５Ｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１０．４μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．６μＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＵＴＰ、それぞれ１０ｍＭ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−２０３１−ＶＩＭ−Ｓ３−ＦＰフォワードプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのｉＣＤｘ−２０３２−ＶＩＭ−Ｓ３−ＰＲリバースプライマー（２μＭ）、１６．２５μＬのｉＣＤｘ−ＶＩＭ−Ｓ３−ＬＮＡ２ブロックプライマー（２μＭ）、３．２５μＬのＲＮａｓｅＨ２（ＩＤＴ）（２０ｍＵ／μＬ）（ＩＤＴからのＲＮａｓｅＨ２希釈緩衝液に希釈）、２．６μＬのＡｎｔａｒｃｔｉｃ熱不安定性ＵＤＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（１Ｕ／μＬ）、及び、白金Ｔａｑ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合した２．８６μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（混合物は、０．３μＬのＫｌｅｎｔａｑ１ポリメラーゼ（５０Ｕ／μＬ）を３μＬの白金Ｔａｑ抗体（５Ｕ／μＬ）に加えることにより調製）、並びに３μＬの対応する鋳型を加えることによって調製した１３０μＬの混合物中でＰＣＲ工程を設定した。３μＬの鋳型は、（１）９ｎｇ（２５００ＧＥ）のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡと混合した０．０７０ｎｇ（２０ＧＥ）のＨＴ−２９  ＤＮＡ、（２）９ｎｇ（２５００ＧＥ）のＲｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡと混合した０．０３５ｎｇ（１０ＧＥ）のＨＴ−２９細胞株ＤＮＡ、（３）９ｎｇ（２５００ＧＥ）のＲｏｃｈｅ  ＤＮＡ、（４）非鋳型対照（ＮＴＣ）用のヌクレアーゼ非含有水を含有する。
【０４８２】
それぞれの１３０μＬのＰＣＲ混合物を１２個のチューブ（それぞれ１０μＬ）に分け、次に、Ｐｒｏｆｌｅｘ  ＰＣＲシステムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａ）の中で、以下のプログラム：９５℃で２分、（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒）を４０サイクル、９９．５℃で１０分、及び最終的に４℃で保持、によりＰＣＲ反応を実施した。後のＬＤＲ及びｑＰＣＲ工程を上述の通りに実施した。結果を図１７４及び表２５に示す。
【０４８３】
ＶＩＭ−Ｓ３トップ及びボトム鎖でのメチル化検出のためのＰＣＲ−ＬＤＲ−ｑＰＣＲ手順を、ＬＤＲ及びＴａｑｍａｎプローブ（即ちバージョンＢ）プローブの修飾版を使用して上述の通りに繰り返した。メチル化検出の結果の比較を、図１７５〜１７８の増幅プロットに示す。図１７５は、ＶＩＭ−Ｓ３トップ鎖プライマー設計及びＴａｑｍａｎプローブバージョン「Ａ」（表２１）を使用した、細胞株及び野生型（Ｒｏｃｈｅ）ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲプロットを提供する。結果は、ＷｉＤｒ及びＨＴ−２９細胞株ＤＮＡのそれぞれに関して、約１０及び１１．５のＣｔ値を示し、ＶＩＭプロモーター領域内のＳ３部位におけるメチル化を示す。細胞株ＳＷ１１１６、Ｒｏｃｈｅ  ＤＮＡ、最初のＰＣＲ工程、続いてのＬＤＲ工程、及び最後のＴａｑｍａｎ工程用の非鋳型対照（ＮＴＣ）は全てベースライン（即ち平坦）である。ボトム鎖用に設計したバージョン「Ａ」プローブ（図１７６及び表２２）を使用して同じ実験を繰り返した。予想通り、ＷｉＤｒ及びＨＴ−２９細胞株ＤＮＡのそれぞれに関して、結果は約１１及び９のＣｔ値を示し、ＶＩＭプロモーター領域内のＳ３部位におけるメチル化を示す。しかし、以前の実験から、ＶＩＭプロモーター領域内のＳ３部位にてメチル化が存在しないことが分かっていたが、ＳＷ１１１６、Ｒｏｃｈｅ  ＤＮＡ、最初のＰＣＲ工程用の非鋳型対照（ＮＴＣ）、及び後のＬＤＲ工程用のＮＴＣの結果は全て、約２８．５〜３１のＣｔ値となっている。この矛盾は、Ｔａｑｍａｎプローブを、ＬＤＲ産物の上流ＬＤＲプローブ部分に約９塩基、及び、ＬＤＲ産物の下流ＬＤＲプローブ部分にプローブの残りの塩基分、オーバーラップするように設計することにより解決された。更に、５’側上にある２つの非相補性塩基をＴａｑｍａｎプローブに加えることで、任意の偶然の交差ポリメラーゼ伸長部が、後のラウンドで上流ＬＤＲプローブ上に確実に伸長できないようにした。図１７７は、ＷＩＭ−Ｓ３トップ鎖プライマー設計及びＴａｑｍａｎプローブバージョン「Ｂ」（表２３）を使用した、細胞株及び野生型（Ｒｏｃｈｅ）ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲプロットを提供する。結果は、ＷｉＤｒ及びＨＴ−２９細胞株ＤＮＡのそれぞれに関して、約１２及び１３．５のＣｔ値を示し、ＶＩＭプロモーター領域内のＳ３部位におけるメチル化を示す。細胞株ＳＷ１１１６、Ｒｏｃｈｅ  ＤＮＡ、最初のＰＣＲ工程、続いてのＬＤＲ工程、及び最後のＴａｑｍａｎ工程用の非鋳型対照（ＮＴＣ）は全てベースライン（即ち平坦）である。ボトム鎖用に設計したバージョン「Ｂ」プローブ（図１７８及び表２４）を使用して同じ実験を繰り返した。予想通り、ＷｉＤｒ及びＨＴ−２９細胞株ＤＮＡのそれぞれに関して、結果は約１１．５及び９．５のＣｔ値を示し、ＶＩＭプロモーター領域内のＳ３部位におけるメチル化を示す。ここで、細胞株ＳＷ１１１６、Ｒｏｃｈｅ  ＤＮＡ、最初のＰＣＲ工程、続いてのＬＤＲ工程、及び最後のＴａｑｍａｎ工程用の非鋳型対照（ＮＴＣ）の結果は全てベースライン（即ち平坦）であり、新しいプローブ設計バージョン「Ｂ」は、ＶＩＭ部位３領域内でのメチル化を行うことなく、ＮＴＣまたはサンプルからの誤ったシグナルの問題を解���したことを示す。
【０４８４】
（表２１）Ｔａｑｍａｎプローブバージョン「Ａ」を使用したＶＩＭ＿Ｓ３＿トップ鎖用メチル化プライマー
2017533697.tif 000023
／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４８５】
（表２２）Ｔａｑｍａｎプローブバージョン「Ａ」を使用した、ＶＩＭ＿Ｓ３＿ボトム鎖用メチル化プライマー
2017533697.tif 000024
／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４８６】
（表２３）Ｔａｑｍａｎプローブバージョン「Ｂ」を使用したＶＩＭ＿Ｓ３＿トップ鎖用メチル化プライマー
2017533697.tif 000025
／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４８７】
（表２４）Ｔａｑｍａｎプローブバージョン「Ｂ」を使用したＶＩＭ＿Ｓ３＿ボトム鎖用メチル化プライマー
2017533697.tif 000026
／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４８８】
（表２５）Ｒｏｃｈｅ  ｈｇＤＮＡのバックグラウンドにおけるＨＴ−２９  ＤＮＡのメチル化を検出するピクセル実験の結果
2017533697.tif 000027
【０４８９】
実証用実施例６−メチル化及び変異検出プライマー設計
まず、ビメンチン（ＶＩＭ）及びＴＭＥＭ９０Ｂ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列のコンピューター解析を行い、予想される高度にメチル化されたＣＧ部位を識別することにより、メチル化アッセイ設計を行った。複数のメチル化部位のコンピューター解析及び識別の後、各遺伝子内の３つないし４つの部位をアッセイ開発のために選択した。アッセイ開発を補助するために、コンピューターによる亜硫酸水素塩変換を、それぞれの遺伝子の亜硫酸水素塩により変換されたゲノムＤＮＡ上で実施する。この変換をトップ及びボトム鎖の両方で実施し、想定される亜硫酸水素塩により変換された配列のオリゴヌクレオチドを設計する。コンピューターによる変換を、トップ鎖上では直接５’Ｃ塩基の直後に続かないＧ塩基をＡ塩基に変換し（ＣＧでない全てのＧについて、Ｇ−Ａ変換）、ボトム鎖については、直接３’Ｇ塩基に隣接するＣ塩基をＴ塩基に変換する（ＣＧでない全てのＣ塩基について、Ｃ−Ｔ変換）ことにより実施する。亜硫酸水素塩による変換の後で非常に高いＧＣ含有量を有する配列を避けることを含む、設計基準を補助する配列における多数の追加の特徴の識別として、ライゲーションアッセイの設計基準は、メチル化Ｃまたは隣接Ｇ（相補鎖のＣはメチル化されている）のいずれかである識別する塩基を同定することから始まる。アッセイ開発用のメチル化部位が選択されると、トップ及びボトム鎖の両方における同じ部位がアッセイされる。４工程のアプローチを利用し、本アッセイ用のオリゴヌクレオチドを設計した。第１の工程は、上流及び下流リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）オリゴヌクレオチドを設計することである。次に、遺伝子特異的フォワード及びリバースオリゴヌクレオチドを設計して、全長が１００〜１４０塩基の遺伝子特異的単位複製配列内のＬＤＲ部位及びＬＤＲオリゴヌクレオチドをカバーする。３番目に、ライゲーション部位をカバーし、ライゲーションしたＬＤＲ産物に特異的に結合する、蛍光染色標識プローブ（ＦＡＭ及びＨＥＸ（商標））を設計する。そして、最終工程は対応するＷＴ固定核酸（ＬＮＡ（商標））プローブを設計し、亜硫酸水素塩により変換した非メチル化プロモーター領域の増幅をブロックすることである。
2017533697.tif 000028
亜硫酸水素塩変換前、及び亜硫酸水素塩変換後のトップＶＩＭ部位３（Ｓ３）ゲノム配列（赤色の太字ヌクレオチドは、メチル化のＳ３部位を表す）。
【０４９０】
ＬＤＲ上流（Ｕｐ）オリゴヌクレオチドプローブは、６４〜６６℃のＴｍで、対象の識別する塩基の３’末端に、メチル化ＣＧのＣまたはＧのいずれかを有するように設計する。プライマー配列を選択し、必要なＴｍ範囲となると、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉａ）ＲＮａｓｅＨ２（商標）切断法に基づく非特異的伸長をブロックする技術を利用して、識別する塩基の３’側に隣接して相補性ＲＮＡ塩基を、続いて、第２及び第３の位置に、２つのマッチするＤＮＡ塩基を、そして第４及び第５（または第３及び第５）の位置に、２つのミスマッチＤＮＡ塩基（Ｇ−ＴまたはＡ−Ｃミスマッチのいずれかが好ましい）を加え、続いて３’Ｃ３スペーサーを加える。５つ全ての塩基尾部、及びスペーサーを使用して、上流ＬＤＲプローブの非特異的伸長をブロックする。上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブに関して、追加のミスマッチ（Ｇ−ＴまたはＡ−Ｃミスマッチのいずれかが好ましい）もまた、識別する塩基の５’側上の隣接する第２または第３の位置で利用してもよい。追加の修飾としては、ライゲーション産物のλエキソヌクレアーゼ分解をブロックするための任意の５’Ｃ３スペーサーが挙げられる。上流オリゴヌクレオチドの選択及び修飾の後、後のリアルタイムＰＣＲ実験用のフォワードオリゴヌクレオチドに対応するタグ配列を、配列の５’側に加える。タグ配列を、以前に設計したｑＰＣＲオリゴヌクレオチドフォワード及びリバースプライマーの対のリストから選択する。
上流ＬＤＲプローブ配列： 
2017533697.tif 000029
５’タグ配列＋上流ＬＤＲプローブ配列：
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５’タグ配列＋５’スペーサー、並びに第４及び第５の切断位置におけるミスマッチを有する上流ＬＤＲプローブ配列：
2017533697.tif 000031
５’タグ配列＋５’スペーサー、並びに第３及び第５の切断位置におけるミスマッチを有する上流ＬＤＲプローブ配列
2017533697.tif 000032
ＶＩＭ  Ｓ３の、亜硫酸水素塩により変換されたゲノムＤＮＡ上流ＬＤＲ位置は太字とし、小文字「ａ」は第３の位置のミスマッチ部位であり、ＲＮＡ切断部位には下線を引いた。
【０４９１】
下流（Ｄｎ）ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは、識別する塩基の３’側の直後の塩基にて設計した。オリゴヌクレオチドプローブは、７０〜７２℃のＴｍで設計した。上流プローブと同様に、選択したタグ配列を配列の３’末端に加える。設計に加えた更なる修飾には、５’側に最も近い第４の位置におけるミスマッチの追加、及び、リアルタイムタグ配列の直前でのオリゴヌクレオチドの３’末端への、更なるミスマッチ塩基の包含を含む。
下流ＬＤＲプローブ配列：
2017533697.tif 000033
下流ＬＤＲプローブ＋３’相補性タグプライマー配列：
2017533697.tif 000034
第４の位置におけるミスマッチ、及びｑＰＣＲ配列からの亜硫酸水素塩により変換されたゲノム配列と離間した更なる塩基を有する下流オリゴヌクレオチド：
2017533697.tif 000035
ＶＩＭ  Ｓ３の、亜硫酸水素塩により変換されたゲノムＤＮＡ下流（Ｄｎ）ＬＤＲの位置は太字とし、メチル化のＣＧ部位には下線を引いた。
【０４９２】
遺伝子特異的フォワード（ＦＰ）及びリバース（ＲＰ）オリゴヌクレオチドプライマーを、単位複製配列の合計長が約１００〜１４０塩基の上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブと著しくオーバーラップするＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブのすぐ上流に設計した。フォワード及びリバース遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、６２〜６４℃のＴｍで設計した。リバースプライマーを、Ｄｎ  ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブのオーバーラップなしで更に下流に設計し、存在する場合、メチル化部位の更なる区別のために、更なるＣＧＣＧ制限酵素切断部位を組み込んだ。１つ以上のＢｓｈ１２３６Ｉ（ＣＧＣＧ）制限酵素切断部位が標的ＤＮＡ中に存在し、亜硫酸水素塩変換の前に非メチル化ＤＮＡの任意の切断を可能にするのが好ましい。所望により、リバースプライマーは、他のリバースプライマーとのプライマー−二量体形成を防止するために、５’末端に付加した非特異的な１０個の塩基尾部を有する。フォワード及びリバースプライマーは共にまた、プライマーの３’末端におけるＲＮＡ切断法を利用するが、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブとは異なり、プライマーはブロック基に隣接する３’末端に１つのミスマッチを有するのみである。
フォワードプライマー：
2017533697.tif 000036
リバースプライマー：
2017533697.tif 000037
リバースプライマー＋１０個の塩基尾部：
2017533697.tif 000038
プライマーのＲＮＡ切断部分に１個の塩基ミスマッチ（小文字かつ太字）を含有するフォワード及びリバースプライマー：
2017533697.tif 000039
ＶＩＭ  Ｓ３の、亜硫酸水素塩により変換されたゲノムＤＮＡ遺伝子特異的フォワード（ＦＰ）及びリバース（ＲＰ）プライマーは太字にし、メチル化のＣＧ部位は拡大し、ＲＮＡ切断部位領域には下線を引いた。
【０４９３】
上記分析により識別した３ないし４つの部位について、トップ及びボトム鎖の両方でのアッセイ開発のために２つの部位を選択した。２つの部位を区別するために、部位特異的５’ＦＡＭまたは５’ＨＥＸ（商標）標識プローブを含むライゲーション産物をカバーするように鎖特異的リアルタイムプローブを設計した。リアルタイムプローブを設計して、識別する塩基の５’側の上流ＬＤＲプローブに組み込んだ第３の位置のミスマッチを組み込み、更なるプローブを設計し、下流プローブの識別する塩基の３’側における５’ミスマッチ、及び所望の第４の位置のミスマッチをカバーした。プローブのＴｍは６８〜７０℃に設計する。最初に、ライゲーション部位の５’及び３’側を等しくカバーするようにプローブを設計するが、カバー率の偏りがライゲーション部位の（５’）側の１／３、続いて下流側（３’）が２／３である更なるプローブを設計し、大部分のプローブについて、最も多い場合でライゲーション部位の７塩基上流、及び１５塩基下流にあった。Ｇ塩基に結合した場合の低いＦＡＭ染料蛍光による問題を回避するために、全てのプローブは、最初の５’塩基にＧ塩基を避けるように設計することで、染料は配列修正を必要とすることなく、必要に応じて交換可能となる。更なる修飾は、蛍光染料の直後でのミスマッチの付加を含む。プローブはＩＤＴから合成し、５’側から９塩基にＺＥＮ（商標）（ＩＤＴ）消光剤、及び３’末端ではＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ  （ＩＤＴ）を利用する。
第３の位置でのミスマッチ（太字）とマッチするリアルタイムプローブ：
2017533697.tif 000040
第３の位置のミスマッチ（太字）、及び２つの更なる塩基とマッチするリアルタイムプローブ：
2017533697.tif 000041
ＶＩＭ  Ｓ３の、亜硫酸水素塩により変換された、リアルタイムプローブゲノムのＤＮＡ部位、小文字「ａ」は、第３の位置のミスマッチ上流の部位、及び、下線を引いたＡは、第４の位置のミスマッチ下流の部位。
【０４９４】
固定した核酸（ＬＮＡ（商標））ブロックプライマーを設計し、亜硫酸水素塩により変換された非メチル化標的に結合する完全にマッチするＬＮＡプローブを有し、かつ、５〜１０個のロック（ＬＮＡ）塩基を利用して増幅を防止することにより、亜硫酸水素塩により変換された非メチル化標的の増幅を低下させた。ＬＮＡブロックプローブは、Ｅｘｉｑｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａ）により７２〜７５℃のＴｍで合成する。
【０４９５】
（表２６）メチル化検出オリゴヌクレオチドの一覧
2017533697.tif 000042
／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０４９６】
ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、及びＧ１２Ｖ）、ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ、１７９９Ｔ＞Ａ）、及びＴｐ５３（Ｒ２４８Ｑ、７４３Ｇ＞Ａ）を含む既知のホットスポット変異を有する、多数の異なる癌遺伝子及び癌抑制因子で変異検出を実施した。対象の変異に位置する塩基を識別することを除いて、定量的リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）アプローチを使用するメチル化アッセイ同様にアッセイを実施する。
【０４９７】
６４〜６６℃のＴｍで、（対象の塩基を識別する）変異の５’上流及び末端にてＬＤＲ上流（Ｕｐ）オリゴヌクレオチドプローブを設計する。この塩基からプライマーを、必要なＴｍの範囲内で選択すると、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉａ）ＲＮａｓｅＨ２（商標）切断法をベースにした、非特異的な伸長をブロックする技術を利用し、識別する塩基のすぐ３’側に相補性ＲＮＡ塩基を、続いて、第２及び第３の位置にて２つのマッチしたＤＮＡ塩基を、そして、第４及び第５の位置にて２つのミスマッチＤＮＡ塩基（Ｇ−Ａ、Ｃ−Ｔ）を加え、続いて３’Ｃ３スペーサーを加える。５つ全ての塩基尾部、及びスペーサーを使用して、上流ＬＤＲプローブの非特異的伸長をブロックする。上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブに関して、追加のミスマッチ（Ｇ−ＴまたはＡ−Ｃミスマッチのいずれかが好ましい）を、識別する塩基の５’側の隣接する位置、第２、または好ましくは第３の位置でもまた利用する。上流オリゴヌクレオチドの選択及び修飾の後、後のリアルタイムＰＣＲ実験用のフォワードプライマーに対応するタグ配列を、上流ＬＤＲプローブ配列の５’側に加える。タグ配列を、以前に設計したｑＰＣＲオリゴヌクレオチドフォワード及びリバースプライマーの対のリストから選択する。
ｉＣＤｘ−３０８−Ｂｒ６００＿（３）−Ｌ＿Ｕｐ＿Ｒｍ：
2017533697.tif 000043
上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドの例（５’から：大文字かつ太字のタグ、小文字斜体字の短いリンカー配列、変異（太字）の前の位置３におけるミスマッチを有する、大文字の上流ＬＤＲプローブ配列、並びに、太字かつ小文字の、５つの塩基尾部の最後の位置におけるミスマッチ）。
【０４９８】
追加の上流ＬＤＲプローブを、以下の修飾を加えて上述の通りに設計した：「Ａ」バージョンのＬＤＲプローブについて、識別する塩基の３’側のすぐ隣にＲＮＡ塩基、続いて、第２、第３、及び第４の位置に３つのマッチしたＤＮＡ塩基、そして第５の位置に１つのミスマッチＤＮＡ塩基（Ｇ−Ａ、Ｃ−Ｔ）、続いて３’Ｃ３スペーサーの付加；「Ｂ」バージョンのＬＤＲプローブについて、識別する塩基の３’側のすぐ隣にＲＮＡ塩基、続いて第２及び第３の位置にて２つのマッチしたＤＮＡ塩基、そして、第４及び第５の位置にて２つのミスマッチＤＮＡ塩基（Ｇ−Ａ、Ｃ−Ｔ）、続いて３’Ｃ３スペーサーの付加；「Ｄ」バージョンのＬＤＲプローブについて、識別する塩基の３’側のすぐ隣にＲＮＡ塩基、続いて第２及び第４の位置にて２つのマッチしたＤＮＡ塩基、そして、第３及び第５の位置にて２つのミスマッチＤＮＡ塩基（Ｇ−Ａ、Ｃ−Ｔ）、続いて３’Ｃ３スペーサーの付加。更に、「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｄ」バージョンの上流ＬＤＲプローブは、ライゲーション接合部（ＲＮａｓｅＨによる切断後の３’末端）から第３の位置にてミスマッチＤＮＡ塩基（Ｇ−Ａ、Ｃ−Ｔ）を有し、「Ｄ」バージョンの下流ＬＤＲプローブは、ライゲーション接合部（即ち５’末端）から第４の位置にてミスマッチＤＮＡ塩基（Ｇ−Ａ、Ｃ−Ｔ）を有した。
【０４９９】
下流（Ｄｎ）ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは、識別する塩基の３’側の直後の塩基にて設計した。６８℃のＴｍでオリゴヌクレオチドを設計した。後のリアルタイムＰＣＲ実験用のリバースプライマーの逆相補鎖に対応するタグ配列を、ＬＤＲ特異的配列の３’側に加える。上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブ同様に、これらの配列もまた、最適のｑＰＣＲプライマー対の所定の一覧から選択する。
ｉＣＤｘ−２７６−Ｂｒ６００＿Ｌ＿Ｄｎ＿Ｐ：
2017533697.tif 000044
下流ＬＤＲオリゴヌクレオチドの例（５’から：大文字の上流ＬＤＲプローブ配列、小文字斜体字の短いリンカー配列、続いて大文字かつ太字のリアルタイムＰＣＲ用タグ）。
【０５００】
ＰＣＲ工程用の遺伝子特異的フォワード（ＦＰ）及びリバース（ＲＰ）プライマーを、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれすぐ上流または下流に設計した。ＦＰと上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブとの間には著しいオーバーラップが存在し、ＲＰと下流ＬＤＲプローブとの間にはオーバーラップは存在しない。フォワード及びリバース遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、６４〜６６℃のＴｍで、かつ７４〜９４塩基の合計の単位複製配列長さで設計した。更に、リバースプライマーは、下流プライマーのプライマー−二量体形成を防止するために５’末端に付加した、非特異的な１０個の塩基尾部を有する。所望により、フォワード及びリバースプライマーは共に、プライマーの３’末端にて５塩基ＲＮａｓｅＨ２（商標）切断法を利用するが、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブとは異なり、３’末端ではゼロまたは１個のミスマッチを有する（この３’末端が識別される変異塩基である場合、この末端は野生型配列とマッチし、変異配列とミスマッチする）。
ｉＣＤｘ−３２８−Ｂｒａｆ＿ＰＦ＿ＷＴ＿ｂｌｋ２（５塩基ＲＮａｓｅＨ２（商標）切断法による、３’末端がミスマッチした遺伝子特異的ＦＰ）：
2017533697.tif 000045
ｉＣＤｘ−２８４−Ｂｒ６００−ＰＲ（１０塩基の尾部（太字）、１個の余分なリンカー塩基（斜体字）、及び遺伝子特異的配列（大文字）を有する遺伝子特異的ＲＰ）：
2017533697.tif 000046
遺伝子特異的フォワード及びリバースＰＣＲプライマーの例。
【０５０１】
リアルタイムＰＣＲ工程用に、５’末端をＦＡＭ、ＨＥＸ（商標）またはＴＡＭＲＡで標識した鎖特異的リアルタイムプローブを設計し、上流及び下流ＬＤＲプライマー間の接合部にまたがるライゲーション産物をカバーした。対応する上流オリゴヌクレオチドに組み込まれた識別する塩基の５’側に位置する、隣接する位置、第２、または第３の位置におけるミスマッチのいずれかを組み込み、異なるプローブを設計した。６８℃のＴｍでプローブを設計した。Ｇ塩基に結合した場合の低いＦＡＭ染料蛍光による問題を回避するために、全てのプローブを、第１の５’開始塩基でＧ塩基を用いることなく設計したことで、染料は配列修正を必要とすることなく、必要に応じて交換可能となる。更なる修飾は、蛍光プローブの直後にミスマッチの付加を含む。プローブはＩＤＴから合成し、多くでは５’側ではＺＥＮ（商標）消光剤の９個の塩基、及び３’末端ではＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱまたはＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ（ＩＤＴ）を利用する。
ｉＣＤｘ−２７７＿Ａ４：
2017533697.tif 000047
ｉＣＤｘ−２７９＿Ｃ４：
2017533697.tif 000048
ｉＣＤｘ−２８１−Ｂｒ６００＿（３）＿Ｐｒｏｂｅ：
2017533697.tif 000049
リアルタイムＰＣＲ実験で使用したオリゴヌクレオチドの例。
【０５０２】
野生型標的の増幅、並びに増幅した野生型標的での上流及び下流ＬＤＲプローブのライゲーションの増幅を減らすように、固定した核酸（ＬＮＡ（商標））ブロックプライマーを設計した。これを達成するために、３〜６個の固定塩基を利用した、野生型に完全にマッチするＬＮＡプローブを、７１〜７６℃のＴｍでＥｘｉｑｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａ）により合成した。ＬＮＡは、野生型ＤＮＡでのプローブ伸長により生じる偽陽性の結果を防止するために、５’リン酸基基、および３つのプライムＣ３スペーサーもまた含有する。
ｉＣＤｘ−３１５−ＢＲＡＦ＿ＦＬＷ：
2017533697.tif 000050
野生型シグナルをブロックするために使用したＬＮＡオリゴヌクレオチドの例（ＬＮＡ塩基は、＋の記号が前にある塩基である）。
【０５０３】
あるいは、野生型標的の増幅、並びに増幅した野生型標的での上流及び下流ＬＤＲプローブのライゲーションを減らすように、ペプチド核酸（ＰＮＡ（商標））ブロックプライマーを設計した。この設計を行うために、識別する塩基の両側に４〜８個の塩基を含み、７０〜７６℃のＴｍを有するように、野生型に完全にマッチするＰＮＡオリゴヌクレオチドを設計した。ＰＮＡオリゴヌクレオチドはＰＮＡ  Ｂｉｏ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）により合成した。
ＰＮＡ−ｐ５３−２４８−１１Ｌ：
2017533697.tif 000051
野生型シグナルをブロックするために使用したＰＮＡオリゴヌクレオチドの例（識別する塩基は太字であり、野生型標的にマッチする）。
【０５０４】
（表２７）変異検出プライマーの一覧
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2017533697.tif 000053
／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【０５０５】
（表２８）メチル化検出オリゴヌクレオチド
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／５ＳｐＣ３／  −  ５’  Ｃ３スペーサー、／３ＳｐＣ３／  −  ３’  Ｃ３スペーサー、／５Ｐｈｏｓ／  −  ５’リン酸基、／５６−ＦＡＭ／  −  ５’ＦＡＭ蛍光染料、／５ＨＥＸ／  −  ＨＥＸ（商標）蛍光染料、／ＺＥＮ／  −  ＺＥＮ（商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、／３ＩＡＢｋＦＱ／  −  ３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、緑からピンクのスペクトル範囲、「＋」  −  固定された核酸塩基、「ｒＡ」  −  リボヌクレオチド塩基リボアデノシン；「ｒＴ」  −  リボヌクレオチド塩基リボチミジン；「ｒＧ」  −  リボヌクレオチド塩基リボグアノシン；「ｒＣ」  −  リボヌクレオチド塩基リボシトシン
【図１】
2017533697.tif 000060
【図２】
2017533697.tif 000061
【図３】
2017533697.tif 000062
【図４】
2017533697.tif 000063
【図５】
2017533697.tif 000064
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2017533697.tif 000068
【図１０】
2017533697.tif 000069
【図１１】
2017533697.tif 000070
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2017533697.tif 000073
【図１５】
2017533697.tif 000074
【図１６】
2017533697.tif 000075
【図１７】
2017533697.tif 000076
【図１８】
2017533697.tif 000077
【図１９】
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【図２０】
2017533697.tif 000079
【図２１】
2017533697.tif 000080
【図２２】
2017533697.tif 000081
【図２３】
2017533697.tif 000082
【図２４】
2017533697.tif 000083
【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
2017533697.tif 000092
【図３４】
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【図３５】
2017533697.tif 000094
【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2017533697.tif 000099
【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
2017533697.tif 000109
【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
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【図１３６】
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【図１３７】
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【図１３８】
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【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【図１４２】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５】
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【図１４６】
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【図１４７】
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【図１４８】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１】
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【図１５２】
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【図１５３】
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【図１５４−１】
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【図１５４−２】
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【図１５５−１】
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【図１５５−２】
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【図１５６−１】
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【図１５６−２】
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【図１５７−１】
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【図１５７−２】
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【図１５８】
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【図１５９】
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【図１６０】
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【図１６１】
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【図１６２】
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【図１６３】
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【図１６４】
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【図１６５】
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【図１６６】
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【図１６７】
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【図１６８】
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【図１６９】
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【図１７０】
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【図１７１】
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【図１７２】
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【図１７３】
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【図１７４】
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【図１７５】
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【図１７６】
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【図１７７】
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【図１７８】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年6月15日(2017.6.15)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017533697000001.app
【国際調査報告】
2017533697.tif 000242
2017533697.tif 000243
2017533697.tif 000244