(57)【要約】  本発明は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む防腐用及び抗生組成物を提供する。本発明は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含むにきびの予防または治療用組成物を提供する。本発明の緑膿菌培養液抽出物を含む組成物は、多様な菌に対して幅広い抗菌スペクトル及び高い抗酸化効果を示し、このような組成物は、化粧品のような化粧料組成物に適用が可能であり、それ以外にも、食品、医薬品、農薬及び生活用品などの多様な分野で抗菌、殺菌、防腐の目的として有用に利用可能である。本発明は、緑膿菌培養液抽出物の抗菌効果を引き起こす特定の有効成分を究明し、その構造を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む防腐用組成物。
【請求項２】
緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む抗生（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）組成物。
【請求項３】
緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含むにきびの予防または治療用組成物。
【請求項４】
緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項５】
前記緑膿菌培養液抽出物は、緑膿菌培養液に塩酸溶液を添加して沈澱させた後、前記沈殿物にエチルエーテルを添加して収得したことを特徴とする請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記緑膿菌培養液抽出物は、ラムノリピドを含むことを特徴とする請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ラムノリピドは、次の化学式１で表されるジラムノリピドまたは化学式２で表されるモノラムノリピドであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【化１】
2017519824.tif 000023
【化２】
2017519824.tif 000024
【請求項８】
前記組成物は、組成物総１００重量部に対して０．００５〜１．０重量部の緑膿菌培養液抽出物を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、スタフィロコッカス属、バチルス属、シュードモナス属、カンジダ属、プロピオニバクテリウム属、ストレプトコッカス属、プロテウス属、コリネバクテリウム属、エンテロコッカス属、クレブシエラ属、及び大腸菌で構成された群から選択される１つ以上の微生物に対して抗菌活性を示すことを特徴とする請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、化粧料組成物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、食品組成物であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、皮膚外用剤組成物であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
前記皮膚外用剤組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーのうちから選択される何れか１つの剤型に剤形化されたことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
緑膿菌培養液抽出物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に適用する段階を含む防腐方法。
【請求項１５】
緑膿菌培養液抽出物を対象に適用する段階を含む抗生方法。
【請求項１６】
緑膿菌培養液抽出物を対象に適用する段階を含むにきびの予防または治療方法。
【請求項１７】
緑膿菌培養液抽出物を対象に適用する段階を含む抗酸化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年６月２０日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−００７５５０７号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参考として組み込まれる。
本発明は、抗菌及び防腐活性を有する緑膿菌培養液抽出物を含む組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
パラベンは、主に化粧品、食品、薬品などに微生物の成長を抑制し、保存期間の増加に用いられる殺菌性防腐剤であって、一般的に毒性を有さないと知られて、１９２０年代中盤に薬品に初めて使われた以来、長期間使われてきた。パラベンの使用が広範囲であり、多様な製品で使用が長期化されている一方、パラベンのエストロゲン性についての研究が報告されながら、ヒトに対するパラベン類の安全性の問題が提起されている。
【０００３】
実験動物を対象とした多様な分析結果に基づいて、パラベンの急性、亜急性及び慢性毒性についての研究がなされて、メチルパラベンの皮膚炎症反応、メチルとプロピルパラベンの遅延性、接触性、過敏性誘発など感作反応が報告され、パラベンの発癌性に関しては、パラベンがエストロゲン性を有するので、化粧品使用を通じるパラベンと乳房癌との関連性が提示された。パラベンの抗アンドロゲン性も、雄の生殖系の機能を妨害すると知られ、また、下水に放出されたパラベンが生態系を含めた環境に及ぼす内分泌障害の影響に対しても論議されている。その潜在的な有害性にも拘らず、継続的に多様な分野でパラベンが使われている理由は、天然成分の防腐力が、既存の化学合成防腐剤ほど優れないためであると分析されている。しかし、前述したパラベン類の危険性が報告されながら、消費者は、パラベン類防腐剤の使用に対する拒否感を表現しており、代替天然保存剤の要求が高まりつつある。
【０００４】
生物界面活性剤（Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）は、微生物、動物、植物のような生物素材から得られる界面活性剤であって、低毒性であり、生態系による分解が容易であるために、注目を浴びている。生物界面活性剤が化学合成界面活性剤に対して有する長所は、第１に、無毒性であり、生分解が容易であり、したがって、それを使った場合、二次汚染源にならないという点、第２に、既存の方法としては合成しにくい複雑な化学構造によって、特殊な目的として使われるという点、第３に、表面張力の低下能力、温度、ｐＨに対する安定性など界面活性剤の物理・化学的性能面で既存の化学合成界面活性剤とほぼ対等な結果を示すという点がある。
【０００５】
実際、生物界面活性剤は、医薬品、食品、化粧品、洗剤、原油の２次回収、パルプと製紙産業、陸上と海上との油類汚染浄化、処理槽の乳脂肪分解など化学合成界面活性剤が使われるほとんどの多様な産業分野で使われており、また、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）から生産されたラムノリピド−生物界面活性剤は、細胞表面の形態を変化させて病源菌に対する阻害効果を発揮するので、生物医学の新たな分野として接木される可能性があるという研究も発表された。したがって、このような長所を有する生物界面活性剤についての研究が、全世界的に活発に進められて多種の生物界面活性剤が報告されている。
【０００６】
本発明に先立って、シュードモナス属培養液からラムノリピドを含んだ混合物状態の生物界面活性剤を抽出して、多様な病源菌に対する阻害効果を測定し、その結果、特定の病源菌（にきび誘発菌：Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対して既存の抗生剤と比較した時、卓越した阻害効果を有することを確認した。また、多様な病源菌に対して低い濃度で殺菌効果を有することを確認し、このような結果に基づいて、既存に化粧品防腐剤として使われているが、人体に対する危険性が報告されているメチルパラベンを対処することができる環境親和的でありながらも、生体親和的な保存剤の開発と、同時に抗生剤の耐性を有するにきび誘発菌を阻害してにきびを緩和させることができる原料の開発と、を研究し、下記の実験の結果は、本発明を実施するための具体的な内容及び根拠になりうる。
【０００７】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、微生物の生長を効果的に抑制して、化粧品または食品の保存期間を増加させることができる天然物質由来の防腐用組成物を開発するために努力した。その結果、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液抽出物が、各種の細菌に抗菌効果を示すことを究明し、本発明の緑膿菌培養液抽出物が、合成パラベン類の化粧品防腐剤を代替して、化粧品防腐剤及び食品防腐剤として使われうるということを確認することによって、本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む防腐用組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む抗生組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含むにきびの予防または治療用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、緑膿菌培養液抽出物の抗菌効果を引き起こせる有効成分を明らかにすることである。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、及び特許請求の範囲によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様によれば、本発明は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む防腐用組成物を提供する。
本発明の他の態様によれば、本発明は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む抗生組成物を提供する。
本発明の他の態様によれば、本発明は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含むにきびの予防または治療用組成物を提供する。
本発明の他の態様によれば、本発明は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物を提供する。
【００１２】
本発明者らは、微生物の生長を効果的に抑制して、化粧品または食品の保存期間を増加させることができる天然物質由来の防腐用組成物を開発するために努力した。その結果、緑膿菌培養液抽出物が、皮膚常在菌及びにきび誘発菌を含む各種の細菌に抗菌効果を示すことを究明し、本発明の緑膿菌培養液抽出物が、合成パラベン類の化粧品防腐剤を代替して、化粧品防腐剤及び食品防腐剤として使われうるということを確認した。
【００１３】
本発明の組成物は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む。
本明細書で、用語“緑膿菌培養液抽出物”は、緑膿菌を培養した培養液から抽出して得たものを意味する。
【００１４】
本発明によれば、本発明の緑膿菌培養液抽出物は、生物界面活性剤であるラムノリピド（ｒｈａｍｎｏｌｉｐｉｄ）を含む。
【００１５】
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物に含まれるラムノリピドは、次の化学式１で表されるジラムノリピドまたは化学式２で表されるモノラムノリピドである。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
【化２】
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【００１８】
本発明によれば、緑膿菌培養液抽出物は、多様な構造のラムノリピドが存在するが、そのうち、前記化学式１または化学式２のラムノリピドが、緑膿菌培養液抽出物から抽出された他のラムノリピドと比較して著しく高い抗菌活性を有する。
【００１９】
本発明の一具現例によれば、本発明の緑膿菌培養液抽出物は、緑膿菌を培地に接種して培養した後、培養液を遠心分離して上澄み液を収得し、上澄み液に塩酸溶液を添加して沈澱させた後、再び遠心分離して沈殿物のみを収得し、その沈殿物にエチルエーテルを添加した後、エチルエーテル層のみ分離して濃縮することで収得する。
【００２０】
本発明の抽出物は、前述した溶媒を用いて得たものだけではなく、これに精製過程をさらに適用して得たものも含む。例えば、前記抽出物を一定の分子量カットオフ値を有する限外濾過膜を通過させて得た分画、多様なクロマトグラフィー（サイズ、電荷、疎水性または親和性による分離のために製作されたもの）による分離など、追加的に実施された多様な精製方法を通じて得られた分画も、本発明の抽出物に含まれるものである。
【００２１】
本発明の抽出物は、減圧蒸留及び凍結乾燥または噴霧乾燥のような追加的な過程によって粉末状態で製造可能である。
【００２２】
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物で、前記緑膿菌培養液抽出物の含量は、全体組成物を１００重量部を基準にして０．００５〜１．０重量部である。
本発明の他の具現例によれば、本発明の組成物で、前記緑膿菌培養液抽出物の含量は、全体組成物を１００重量部を基準にして０．０１〜０．５重量部である。
本発明の特定の具現例によれば、本発明の組成物で、前記緑膿菌培養液抽出物の含量は、全体組成物を１００重量部を基準にして０．０２〜０．１重量部である。
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、抗細菌活性及び／または抗真菌活性を有する。本発明の組成物は、多様な微生物、特に、細菌、真菌及び酵母に対して幅広い抗生活性を示す。
【００２３】
本発明の他の具現例によれば、本発明の組成物は、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で構成された群から選択される１つ以上の細菌に対して抗生活性を示す。
【００２４】
本発明の他の具現例によれば、本発明の組成物は、０．５％以上の濃度で抗酸化効果を有する代表成分であるアスコルビン酸（ＡＡ）のようなレベルの高い抗酸化効果を有する。
前記のように、幅広い抗生スペクトル及び抗酸化効果を有する本発明の防腐／抗生組成物は、化粧品だけではなく、食品、生活用品、農薬、医薬などで抗菌、殺菌、消毒、防腐などの目的を果たすために広範囲に使われる。
【００２５】
本発明によれば、本発明の防腐用組成物は、化粧料組成物として製造可能である。本発明の組成物が、化粧料組成物として製造される場合、緑膿菌培養液抽出物は、細菌によって化粧料組成物の変質を予防するので、化粧品防腐剤を代替して使われる。本発明の組成物が、化粧料組成物として製造される場合、本発明の組成物は、前記有効成分である緑膿菌培養液抽出物、その塩、またはそれらの溶媒化物または水化物だけではなく、化粧料組成物に通用される成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤、そして、担体を含みうる。
【００２６】
本発明によれば、本発明の防腐用組成物は、食品組成物として製造可能である。本発明の組成物が、食品組成物として製造される場合、緑膿菌培養液抽出物は、細菌によっての食品の変質を予防するので、食品防腐剤を代替して使われる。
【００２７】
本発明の組成物が、食品組成物として製造される場合、有効成分として緑膿菌培養液抽出物だけではなく、食品製造時に通常添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤、及び香味剤を含む。前述した炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、葡萄糖、果糖など；ジサッカライト、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンのような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として、天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど］）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使うことができる。例えば、本発明の食品組成物が、ドリンク剤として製造される場合には、本発明の緑膿菌培養液抽出物の以外に、クエン酸、液状果糖、砂糖、葡萄糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、トチュウ抽出液、ナツメ抽出液、甘草抽出液などをさらに含ませることができる。
【００２８】
本明細書で、用語“抗生組成物（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）”は、ウイルス、菌類（ｆｕｎｇｉ）、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）及び細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）を含む微生物を殺すか、成長を抑制させる抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）を含有した組成物を意味する。したがって、前記抗生物質は、抗生活性、すなわち、抗細菌活性（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、抗真菌活性（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）または抗ウイルス活性（ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する。
【００２９】
本発明の組成物は、前記細菌によって誘発された皮膚感染またはにきびの予防及び治療に有意な効果を示す。下記の一実施例で立証したように、本発明の組成物は、にきび誘発菌としてよく知られたプロピオニバクテリウムアクネス及びグラム陽性菌であるスタフィロコッカスアウレウス、バチルスセレウス、グラム陰性菌であるシュードモナスエルギノーサ、カンジダアルビカンスのような多様な細菌の成長を有意に抑制する。
【００３０】
本発明のにきびの予防または治療用組成物は、前述した本発明の有効成分である緑膿菌培養液抽出物の化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）及び化粧品学的に許容される担体を含んで製造することができる。
本明細書で、用語“化粧品学的有効量”は、前述した本発明の組成物の微生物に対する抗生効能を果たすのに十分な量を意味する。
【００３１】
本発明の皮膚外用剤組成物は、当業者に通常製造される如何なる剤型にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーなどに剤形化されうるが、これらに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤型に製造可能である。
本発明の剤型が、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられうる。
【００３２】
本発明の剤型が、パウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが用いられ、特に、スプレーである場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含みうる。
【００３３】
本発明の剤型が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００３４】
本発明の剤型が、懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガントなどが用いられうる。
【００３５】
本発明の剤型が、界面−活性剤含有クルリンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウリン、サルコシン酸、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられうる。
【００３６】
本発明の皮膚外用剤組成物に含まれる成分は、前記有効成分及び担体成分の以外に、皮膚外用剤組成物に通用される成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤を含みうる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む防腐用及び抗生組成物を提供する。
（ｉｉ）本発明は、緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含むにきびの予防または治療用組成物を提供する。
（ｉｉｉ）本発明の緑膿菌培養液抽出物を含む組成物は、多様な菌に対して幅広い抗菌スペクトル及び高い抗酸化効果を示し、このような組成物は、化粧品のような化粧料組成物に適用が可能であり、それ以外にも、食品、医薬品、農薬及び生活用品などの多様な分野で抗菌、殺菌、防腐の目的として有用に利用可能である。
（ｉｖ）本発明の緑膿菌培養液抽出物の高い抗菌効果を引き起こす有効成分は、多様なラムノリピドのうちでも、特定の構造（Ｒｈａ  Ｃ１０  Ｃ１０、Ｒｈａ  Ｒｈａ  Ｃ１０  Ｃ１０）のラムノリピドであることを究明し、これを通じてラムノリピドの産業的適用に対する効率性を高めた。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ペーパーディスク拡散法（ｐａｐｅｒ  ｄｉｓｋ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ）を行って緑膿菌培養液抽出物（Ｒ１）の抗菌効果を確認した結果である。
【図２】緑膿菌培養液抽出物を含むトナー剤型の製品に対する防腐力試験（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｔｅｓｔ）結果であって、ｃｆｕを示すグラフである。
【図３】緑膿菌培養液抽出物を含むトナー剤型の製品に対する防腐力試験時に、プレート塗抹後の形状を示す写真である。
【図４】緑膿菌培養液抽出物の含有濃度によるにきび関連トラブルの改善率を測定した結果である（赤色棒は、バーム剤型、紫色棒は、クリーム剤型を意味する）。
【図５】図５Ａ〜Ｉは、緑膿菌培養液抽出物を含む本発明の組成物を被験者の皮膚に塗布した後、にきび関連トラブルの改善を写真撮影を通じて確認した結果である。
【図６】ラムノース及びラムノリピドの構造を示す図面である。
【図７】１Ｄ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを通じてラムノリピドを分析した結果である。
【図８】ラムノース陽性子の分析結果である。
【図９】２Ｄ−ＮＭＲ分析結果である。
【図１０】２Ｄ  ＮＭＲ  ＲＯＥＳＹ実験結果である。
【図１１】１Ｄ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトラ予備分析を通じるサンプル内のラムノースの相対的な密度を測定した結果である。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、緑膿菌培養液抽出物Ｒ１の抗酸化効果試験結果である。
【図１３】Ｒ１とＲ１から分離された分画のＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性を試験した結果である。
【図１４】Ｒ１とＲ１から分離された分画のＬＣ分析結果である。
【図１５】図１５Ａ〜Ｄは、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを活用した有効成分ピーク１、ピーク２の構造分析結果である。
【図１６】Ｒ１のＬＣ分析結果である。
【図１７】ラムノリピド（Ｒ９０、Ｒ９５）のＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００４０】
材料及び方法
１．生物界面活性剤の生産
実験に先立って、菌株（ＣＪＭ０１）が選発された。同定結果、緑膿菌であると明かになり、菌株をＭ９培地（ＣａＣｌ２  ０．０１５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４  ０．０６２５ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ）に接種して３７℃で７２時間培養した。培養後、培養液を遠心分離して細胞が完全に除去された培養液を得た。細胞が除去された培養液をＨＣＬを用いてｐＨ２に低めた後、一日間４℃で沈澱させた。沈澱後、再び遠心分離して上澄み液を除去し、沈殿物のみを得た。その沈殿物をエチルエーテルを用いて抽出した後、エチルエーテル層のみ分離して回転蒸発濃縮器で濃縮してエチルエーテルをいずれも蒸発させて得られた抽出物（ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｃｒｕｄｅ）をＲ１と名付けた。
【００４１】
２．抽出した生物界面活性剤の抗菌力テスト（ｐａｐｅｒ  ｄｉｓｋ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ）
微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出された混合物状態の生物界面活性剤をＲ１と名付け、グラム陽性病原性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、グラム陰性病原性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に対してペーパーディスク拡散法を施行した。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｏｇｉｎｏｓａとＥ．ｃｏｌｉとをそれぞれＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ）に接種して３７℃好気性条件で１８時間液体培養した。培養後、それぞれの菌培養液２００μｌをＬＢアガープレートに塗抹した。微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出されたＲ１は、メタノールに２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、対照区として使われたメチルパラベン（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｐａｒａｂｅｎ）、フェノキシエタノール（Ｐｈｅｎｏｘｙ  Ｅｔｈａｎｏｌ）、ナチュロティックス（Ｎａｔｕｒｏｔｉｃｓ）は、メタノールに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。溶解されたＲ１、メチルパラベン、フェノキシエタノール、ナチュロティックス溶液を、それぞれペーパーディスク（直径：６ｍｍ）上に２０μｌずつ付けた後、ペーパーディスクを十分に乾燥させた。その後、ペーパーディスクをＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｏｇｉｎｏｓａとＥ．ｃｏｌｉとが塗抹されたアガープレート上に載せた。それぞれのアガープレートは、３７℃好気性条件で１８時間培養された。１８時間後、ペーパーディスク周辺に生成されたクリアゾーンを観察した。
【００４２】
３．抽出した生物界面活性剤の防腐力試験（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｔｅｓｔ）
メチルパラベンと比較してＲ１の保存剤としての可能性を確認するために、トナー剤型とローション剤型とでグラム陽性病原性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、グラム陰性病原性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）、真菌類（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する殺菌力を測定する防腐力試験を施行した。防腐力試験は、米国化粧品協会、すなわち、ＣＴＦＡ（Ｔｈｅ  ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ、Ｔｏｉｌｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の法を基準に施行され、その基準は、特定の物質がトナーとローション剤型とで７日以内に接種された菌数の９９．９％を死滅させれば、保存剤としての可能性を有するということである。実験に先立って、トナーとローション剤型とが製作され、その組成は、表１及び表２のようである。
【００４３】
【表１】
2017519824.tif 000005
【００４４】
【表２】
2017519824.tif 000006
【００４５】
４．トナー剤型でのグラム陽性病原性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）に対する実験
製作されたトナー剤型にメタノールに溶解させたＲ１を添加して、Ｒ１の最終濃度が０％、０．０１％、０．０５％、０．１％になるようにし、それぞれの容器にＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ培養液を接種した。また、トナー剤型にメタノールに溶解させたメチルパラベンを添加して、メチルパラベンの最終濃度が０％、０．１％、０．５％、１％になるようにし、それぞれの容器にＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ培養液を接種した。接種菌数は、１０６〜１０７ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／ｍｌになるようにした。菌が接種されたトナーを常温で保管しながら、菌接種直後、１日、３日、５日、７日後に、各トナーを希釈してＬＢアガープレートに２００μｌ塗抹して細胞数を計算した後、初期接種菌数と比較して死滅の有無を把握した。対照区としてトナー剤型にメタノールのみを添加して菌培養液を接種した後、繰り返し実験した。
【００４６】
５．トナー剤型でのグラム陰性病原性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）、真菌類（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する実験
製作されたトナー剤型にメタノールに溶解させたＲ１とメチルパラベンとをそれぞれ添加して、最終濃度が０％、０．１％、０．５％、１％になるようにし、それぞれの容器にＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ培養液を接種した。接種菌数は、１０６〜１０７ｃｆｕ／ｍｌになるようにした。菌が接種されたトナーを常温で保管しながら、菌接種直後、１日、３日、５日、７日後に、各トナーを希釈してＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが接種されたトナーは、ＬＢアガープレートに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓが接種されたトナーは、ＹＰＤアガープレートに２００μｌ塗抹して細胞数を計算した後、初期接種菌数と比較して死滅の有無を把握した。対照区としてトナー剤型にメタノールのみを添加して菌培養液を接種した後、繰り返し実験した。
＊ＹＰＤアガー（ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、デキストロース５ｇ／Ｌ、アガー１５ｇ／Ｌ）
【００４７】
６．ローション剤型でのグラム陽性病原性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、グラム陰性病原性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）、真菌類（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する実験
製作されたローション剤型にメタノールに溶解させたＲ１とメチルパラベンとをそれぞれ添加して、最終濃度が０％、０．５％になるようにし、それぞれの容器にＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ培養液を接種した。接種菌数は、１０６〜１０７ｃｆｕ／ｍｌになるようにした。菌が接種されたローションを常温で保管しながら、菌接種直後、１日、３日、５日、７日後に、各ローションを希釈してＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが接種されたローションは、ＬＢアガープレートに、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓが接種されたローションは、ＹＰＤアガープレートに２００μｌ塗抹して細胞数を計算した後、初期接種菌数と比較して死滅の有無を把握した。対照区としてローション剤型にメタノールのみを添加して菌培養液を接種した後、繰り返し実験した。
【００４８】
７．抽出した生物界面活性剤を含有する製品のにきび関連トラブルの改善効果
７−１．製品の種類、製品の分量及び剤型
微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出された生物界面活性剤Ｒ１を含有する天然化粧品を製造して、にきび関連トラブル症状（化膿性、粟、にきび傷跡、できものなど）を有している被験者に適用（５ｇ／１人／２週）して改善効果を観察した。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
【表４】
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【００５１】
【表５】
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【００５２】
【表６】
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【００５３】
【表７】
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【００５４】
【表８】
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【００５５】
【表９】
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【００５６】
【表１０】
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【００５７】
７−２．被験者
本研究は、単一機関で、対照群、実験群の観察研究臨床試験でにきび関連トラブルを有した被験者に製品を塗った時、にきび関連トラブルの症状改善など有効性及び安全性を評価しようとした。
【００５８】
一次結果変数（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｎｄ  ｐｏｉｎｔ）は、製品使用後、２週後のにきび関連トラブルの症状改善率であり、試験前と試験後とのにきび関連トラブルの症状改善率が差があるか否かを評した。過去行われた臨床試験に基づいて脱落率約１０％を考慮して、総被験者数を３０人にし、個人的な事情によって臨床試験同意書に署名していない３人は臨床試験に参加することができず、臨床試験に参加した被験者は、総２７人であり、中途脱落率は０％であって、最終評価可能な被験者数は２７人であった。
【００５９】
７−３．試験方法
２週間に５ｇの試験製品を使い、一日２回以上（朝、夕方、常時）２週間試験者が指定した皮膚病変部位にクリームまたはバーム形態の製品を塗布する。
【００６０】
韓国の仁荷大学校と仁川大学校との学生を対象にしてにきび関連トラブル化粧品効能評価臨床試験参加者を募集し、自発的に支援した志願者のうち、選定基準に適し、除外基準に該当しない志願者を対象にして臨床研究を進行した。あらゆる被験者は、スクリーニングを通じて被験者を選別し、総２７人の被験者が試験参加に同意し、男は１６人、女は１１人であり、被験者の年齢は、満２０歳から満２８歳の間に分布した。脱落及び中途放棄被験者は０人であって、評価を完了した最終被験者は２７人であった。
【００６１】
にきび関連トラブルの改善効果に対する評価のために、毎訪問時ごとに肉眼評価及びイメージ撮影を実施し、毎日自身の変化程度（変化を感じる程度及び異常反応有無）を直接チェックする被験者の主観的意見が入れられたアンケート調査を実施した。肉眼的評価で臨床試験開始０日になる時点で製品を塗布する前、試験者が定めた病変部位に存在する進行状態のにきび個数を開始点として定め、この部位で試験経過２週後、目で改善された程度を数値化し、臨床研究に参加した研究対象者の病変部位を試験前と臨床試験測定訪問の時ごとにイメージを撮影した。また、被験者主観的意見のアンケート調査を実施した。
【００６２】
７−４．効果評価基準、評価方法及び解析方法
選定基準に適した被験者及び提供した製品を２週間使った被験者を有効性評価対象者として選定し、０週、１週、２週目に進行中であるにきび個数の把握及びイメージ撮影などにきび関連トラブルの改善に対する肉眼的評価を施行し、被験者の主観的意見が入れられたアンケート調査を施行した。試験の結果、整理及び分析は、統計的推定によって分析された。
【００６３】
８．ＮＭＲ分析
微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出された生物界面活性剤Ｒ１のようなＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して培養及び抽出方式を変更して得られたＲ２、Ｒ３、そして、ラムノリピド（生物界面活性剤の一種）を９０％含有しているＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨから購入したＲ９０をＮＭＲ分析した。
【００６４】
ラムノリピドの構造は、１つまたは２つのラムノース（糖）部分（図６の左側）と２つの脂肪族鎖（ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｃｈａｉｎｓ）を含む脂質部分とで構成される（図６の右側）。ラムノリピド構造の多様性は、１つまたは２つのラムノースリングの数と脂質部分の２つの脂肪族鎖の構造（長さ及び飽和度）に起因する。４つの他の生物界面活性剤抽出物（サンプル０、１、２、３）と商業的に（Ｓｉｇｍａ）販売されているラムノリピド（サンプル９０）は、クロロホルム−メタノール（２：１）混合物に溶解された後、ＮＭＲ分析された。
【００６５】
９．緑膿菌培養液抽出物の抗酸化効果
緑膿菌培養液抽出物の防腐剤としての適用のために、抗酸化効果に対する実験を進行した。
ＤＰＰＨラジカルは、紫色を帯びているが、これが抗酸化剤と反応すれば、黄色を帯びる。抗酸化能に優れた試料と反応するほど、ＤＰＰＨラジカルの色の変化は鮮明になる。Ｒ１とアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ、ＡＡ）、メチルパラベン（ＭＴＰ）をそれぞれ異なる濃度でメタノールに溶解させた。このように得られた試料（１００μｌ）をそれぞれ０．００６％の濃度でメタノールに溶解させたＤＰＰＨラジカル溶液１００μｌに混合して、総２００μｌを作った後、光が遮断された空間で３０分間反応させた。反応が完了した後、各混合液に対して５１７ｎｍで吸光度の値を測定して、各試料の抗酸化能を測定した。
【００６６】
１０．緑膿菌培養液抽出物の抗菌効果を引き起こす有効成分の探索
緑膿菌培養液抽出物は、単一成分ではない多様な成分が混合された状態である。緑膿菌培養液抽出物に含まれた多様な成分のうち、抗菌効果を引き起こす有効成分が何なのかを探索し、その構造を明らかにする実験を進行した。
【００６７】
微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出された混合物状態のＲ１の分離
微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出された混合物状態のＲ１１ｍｇをメタノールに溶解させた後、ｓｅｐ−Ｐａｋ  ｖａｃ１ｃｃ  ｔｃ１８カートリッジカラムに注入した。その後、カラムは、溶媒Ａで洗浄され、展開溶媒である溶媒Ｂが注入された。溶媒Ｂの濃度をそれぞれ異ならせてカラムに注入した後、カラムを通過した分画をそれぞれ収集して、分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）１、分画２、分画３、分画４、分画５、分画６と名付けた。溶媒Ｂの濃度は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％にそれぞれ異ならせてカラムに注入され、溶媒Ａと溶媒Ｂとの組成は、表１１のようである。
【００６８】
【表１１】
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【００６９】
Ｒ１から分離された分画の抗菌活性分析
得られた各分画は、乾燥させた後、メタノールに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。メタノールに溶解された各分画の２０μｌをＳ．ａｕｒｅｕｓ培養液が塗抹されたアガープレート上に落とした後、１８時間３７℃で培養し、１８時間後、アガープレート上に生成されたクリアゾーンを観察した。
【００７０】
Ｒ１から分離された分画のＬＣ／ＭＳを通じる構造分析
分離された分画の構造分析のために行われたＬＣ−ＭＳは、ネガティブモードのイオン極性で１．８μｍ  ２．１＊１００ｍｍのＳＢ−Ａｑ  ＲＲＨＤ（分析カラム）と２．１＊５ｍｍ  １．８μｍのＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８（ガードカラム）とを使って進められた。分離された分画をメタノールに溶解させてサンプルを準備した。サンプルの２０μｌを前記のカラムが装着されたＨＰＬＣに注入し、質量分析計まで連結して分析した。ＨＰＬＣには、溶媒Ａと溶媒Ｂとの混合液が展開溶媒として使われ、初期の溶媒Ａと溶媒Ｂとの混合比率は５０％であり、その後の順序は、次の通りである。１００％溶媒Ｂ（１９分）、１００％溶媒Ｂ（２０．５分）、５０％溶媒Ｂ（２１分）、５０％溶媒Ｂ（２５分）、ＨＰＬＣ流速：０．１５ｍｌ／分。
スキャニング質量範囲は、７５〜１０００ｍ／ｚに準備された。抗菌効果を引き起こす特定の成分に対しては、ＭＳ／ＭＳを進行した。
【００７１】
実験の結果
１．抽出した生物界面活性剤の抗菌力試験
微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出された混合物状態の生物界面活性剤をＲ１と名付け、グラム陽性病原性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、グラム陰性病原性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に対して抗菌力テストを施行した。ペーパーディスク拡散法の結果、Ｒ１は、既存の化粧品保存剤として使われているメチルパラベン、フェノキシエタノール、ナチュロティックスよりも５倍少ない濃度で格段に大きなクリアゾーンを生成した（図１）。
【００７２】
２．抽出した生物界面活性剤の防腐力試験
防腐力試験の結果、トナー剤型で、Ｒ１は、接種したあらゆる菌に対して７日内に接種菌数の９９．９％を死滅させ、特に、Ｒ１は、メチルパラベンよりも１０倍少ない濃度である０．０１％でグラム陽性病原性菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓに対して１日ぶりに接種菌数の９９．９％を死滅させた。グラム陰性病原性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）と真菌類（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に対しては、メチルパラベンと同じ濃度である０．５％で５日ぶりに接種菌数の９９．９％を死滅させた（図２〜図３）。また、ローション剤型で接種したあらゆる菌に対して、Ｒ１は、メチルパラベンと同じ濃度である０．５％で７日内に接種された菌数の９９．９％を死滅させた（表１２）。このような結果は、Ｒ１の保存剤としての可能性を有するということを示す。
【００７３】
【表１２】
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【００７４】
３．抽出した生物界面活性剤を含有する製品のにきび関連トラブルの改善効果
微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出された生物界面活性剤Ｒ１を含有する天然化粧品を製造して、にきび関連トラブル症状を有している被験者に適用した結果、Ｒ１を含有していない製品よりもＲ１を含有した製品を使った被験者からにきび関連トラブルの改善率が格段に増加し、あらゆる被験者から皮膚異常反応（かゆみ、ひりつき、赤い班点、腫れ上がり、腫れもの、痛みなど）は観察されていない。
【００７５】
【表１３】
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【００７６】
臨床試験開始０日になる時点で製品を塗布する前、試験者が定めた病変部位に存在する進行状態のにきび個数を開始点として定め、この部位で試験経過２週後、目で改善された程度を数値化ものであって、微生物培養液抽出物を含有していない製品と比較した時、微生物培養液抽出物を含有した製品を使った被験者からさらに高い改善率が確認された。特に、微生物培養液抽出物０．０２％を含有したクリーム形態の製品を使った被験者から最も高い改善率が確認され、次いで、微生物培養液抽出物０．１％を含有したクリーム形態の製品を使った被験者から高い改善率が確認された（図４）。これに基づいて、本発明者が製造した微生物培養液抽出物を含有した天然化粧品は、にきび改善に役に立つと判断することができる。被験者のイメージ撮影結果は、図５Ａ〜図５Ｉのようである。
【００７７】
【表１４】
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【００７８】
５：症状がなくなった、４：全般的に症状が明らかに良くなった、３：全般的に症状が少し良くなった、２：試験前と症状の変化がなし、１：試験前よりも症状が悪くなった
【００７９】
【表１５】
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１：よく分からない、２：不満足、３：普通、４：満足、５：非常に満足
【００８０】
臨床試験２週後、被験者のにきび関連トラブルの改善効果に対する全体的な満足度は高く評価された。アンケート評価と肉眼評価とで最も顕著な変化を示した部分は、化膿性にきびと一時的に発生するできもののような皮膚トラブルであった。一方、粟にきびとにきび傷跡の改善に対しては、相対的に変化が少なかった。また、バーム剤型よりは、クリーム剤型の製品を使った被験者の改善効果と満足度とがさらに高いと確認された。
【００８１】
２週間の臨床試験結果、肉眼評価及びアンケート評価、イメージ撮影を通じて、本発明者が製作した微生物培養液抽出物を含有した天然化粧品は、にきび関連トラブルの改善に役に立つ製品であるということが分かった。
【００８２】
４．ＮＭＲ分析
一般的観測
あらゆるサンプルは、４種の主要成分（２つの類型のジラムノリピドと２つの類型のモノラムノリピド）で構成された類似しているラムノリピドセットを含んでいた。各サンプル内でジラムノリピドのＡ分画の含有率は、いずれも異なった（サンプル９０の場合、３５％まで含有しており、サンプル２と３は、６５％以上を含有する）（表１７）。また、サンプル０、１、２、３は、抗菌活性に影響を与えると予想される芳香族成分を含有していた。
【００８３】
１Ｄ−ＮＭＲ分析
サンプル１に対する１Ｄ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルでラムノリピドに該当する部分は、図７から見られる。信号強度（ｉｎｔｅｇｒａｌｓ）は、スペクトルの下から見られる。あらゆる信号強度は、０．８２ｐｐｍでのメチルピークによって標準化され、そのピークは、６つの陽性子（ｐｒｏｔｏｎ）に該当する（２メチルグループ）。したがって、単一陽性子ピークは、ほぼ１００ユニット程度の信号強度を有すると見られる。例えば、１．４〜１．５ｐｐｍと２．４〜２．６ｐｐｍとで表われる２つのグループのピークは、〜４００程度の信号強度を示し、それぞれＣ２Ｈ２／Ｃ５Ｈ２及びＣ７Ｈ２／Ｃ１０Ｈ２グループで表われる４つの陽性子信号と一致する。モノ及びジラムノリピドの質量比は、脂質とラムノースグループから得た信号の強度を比較することで測定されうる。
【００８４】
もし、サンプルがモノラムノリピドのみを含むならば、ラムノースからきた１つの陽性子のみが脂質部分にある１つの陽性子と一致する。また、サンプルが、ただジラムノリピドのみを含むならば、“２−ｔｏ−１”と一致される。図８から証明されたように、Ｈ１とＨ４脂質陽性子（暗いオレンジ色ボックス）は、同じタイプの信号を示すが、その強度の和は、ほぼ１００程度であり、それは、混合物内にある各ラムノリピド分子が正確にこのタイプの陽性子を１つ有するということを意味する。
【００８５】
結果的に、Ｈ１’／１”、Ｈ２’／２”、Ｈ３’／３”、Ｈ５’／５”ラムノース陽性子（図８の青色ボックス）から得た信号強度の和は、モノラムノリピド混合物で予想したことよりもさらに高い。モノラムノリピド混合物内にある分子当たり１つのＨ１’陽性子は、１００値を有する信号が出なければならない。３つのＨ２’、Ｈ３’、Ｈ５’の陽性子は、３００値を有する信号が出なければならない。ところで、サンプル１でのこのような信号強度は、ほぼ１５０〜４８０程度に測定された。このような信号強度数値からサンプル１にジラムノリピドがほぼ６０％程度存在すると推定することができる。類似している分析でサンプル０、２、３、そして、９０を１Ｄ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトラを通じて行った。
【００８６】
２Ｄ−ＮＭＲ分析
サンプル内のジラムノリピドの存在は、２Ｄ  １Ｈ−１３Ｃ−ＨＳＱＣ実験によって確認された。β−Ｌ−Ｒｈａｐ（１’’→２’）−β−Ｌ−Ｒｈａｐ結合の形成は、酸素を通じて連結されているジラムノースのＣ２’とＣ１’原子の強いＮＭＲ信号移動を起こした（図６の構造）。ＨＳＱＣスペクトルのＣ１’／１”Ｈ及びＣ２’／２”Ｈ区域は、図９から見られる。１０２ｐｐｍで表われるクロスピーク（１３Ｃスケール、赤色ボックス）は、ジラムノリピドでのＨ１”／Ｃ１”の相関係数と一致する。一方、９５〜９６ｐｐｍで表われるクロスピークは、モノラムノリピドのＨ１’／Ｃ１’の相関係数と一致する（図６の構造）。〜７９ｐｐｍで表われる２つのクロスピーク（図９の青色ボックス）は、ジラムノリピド部分の２つのＣ２’原子と一致する。
【００８７】
スピンシステム割り当て
サンプル内の他のラムノリピドの相対的な密度と数とを測定するために、２Ｄ  ＮＭＲスペクトラ（ＨＳＱＣ、ＴＯＣＳＹ、ＣＯＳＹ−ＤＱＦ）を用いてスピンシステムを分離し、これらは、ラムノリピド分子のラムノース環構造、脂肪酸しっぽ構造と一致した。また、ラムノース部分（システム１〜６）の６つの知られていないシステムと脂肪酸しっぽの８つのシステム（システム７〜１４）とを証明することができた。そのシステムは、ラムノース部分のタイプであらかじめ割り当てられ（ジラムノースの最初の（‘）または二番目の（“）単一リング構造）ヒドロキシル脂肪酸の位置（直接に、または間接にラムノースと連結される、図６）は、知られた化学的移動（パート３、２Ｄ−ＮＭＲ分析、図９の例示）に基づいている。システム１と２は、ジラムノースの二番目のラムノースリング構造に割り当てられ、システム３と４は、ジラムノースの最初のラムノース環構造に割り当てられた。システム５と６は、モノラムノリピド内のラムノース環構造と一致する。それらの最小成分９と１０だけではなく、システム７と８は、脂質内の二番目の脂肪酸に割り当てられた（ラムノース部分に直接に連結されない）。結果的に、システム１１〜１４は、最初の脂肪酸鎖に割り当てられ、直接にラムノース部分に連結された。
【００８８】
スピンシステム連結
ラムノリピド分子の構造的な部分のためのスピンシステムの割り当て後に、それらをラムノリピド内に連結させる幾つかの可能な方法を行った。ラムノース環構造に存在する陽性子と脂肪酸の陽性子との表面を通じる双極子−双極子相互作用を感知するために、２Ｄ  ＮＭＲ  ＲＯＥＳＹ実験を用いた。予想したように、ラムノースシステム３〜６のＨ１陽性子と脂肪酸システム１１〜１４のＨ１陽性子とのクロスピークが感知された（図１０）。この実験は、ラムノース最初の環構造あるいは単一構造に割り当てられたスピンシステムを脂肪酸に割り当てられたスピンシステムと連結することを可能にする。
【００８９】
ジラムノース内の二番目の環構造と脂肪酸陽性子に割り当てられたシステム１と２のＨ１陽性子の間で如何なるクロスピークも観察されていない。遂に、スピンシステムは、４つのラムノリピド分子Ｉ〜ＩＶと整理された（表１６）。
【００９０】
【表１６】
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【００９１】
ＮＭＲサンプル内のＩ〜ＩＶ分子の相対的な密度
１Ｄ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトラの予備分析は、サンプル内のラムノースの相対的な密度を明確に示す（図１１）。脂肪酸システムでも、同じ結果が観察された。Ｉ〜ＩＶ分子の相対的な密度を信号強度を用いて推定したが、信号強度は、Ｈ１／Ｈ１”とＨ２／Ｈ２”ラムノース陽性子、Ｈ１とＨ４脂肪酸陽性子に割り当てられたよく分離された信号を得るために、１Ｄ  １ＨＮＭＲスペクトラで測定された。分析の要約は、表１６に提示された。
【００９２】
微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出された生物界面活性剤Ｒ１のようなＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対して培養及び抽出方式を変更して得られたＲ２、Ｒ３、そして、ラムノリピドを９０％含有しているＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨから購入したＲ９０をＮＭＲ分析した結果、各抽出物と購入したＲ９０は、いずれもラムノリピドを含有していると明かになった。これで、微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出されたＲ１は、ラムノリピド系の生物界面活性剤を含有しているということを証明することができる（図１１）（表１６）。また、ＮＭＲ分析を通じて、５つのサンプルは、ラムノリピドを含有しており、その含有率は、異なることが分かった。そして、ラムノリピドは、多分他の生物学的研究に関連されうる。
【００９３】
【表１７】
2017519824.tif 000021
【００９４】
５．緑膿菌培養液抽出物の抗酸化効果
緑膿菌培養液抽出物Ｒ１の抗酸化効果を調査するために、ＤＰＰＨ消去活性試験を進行した結果、Ｒ１は、０．５％以上の濃度で抗酸化効果を有する代表成分であるアスコルビン酸（ＡＡ）のようなレベルの抗酸化効果を示した。一方、メチルパラベン（ＭＴＰ）は、Ｒ１と比較した時、同じ濃度で著しく低い抗酸化効果を示した。このような結果に基づいて、抗酸化効果を有する緑膿菌培養液抽出物Ｒ１は、防腐剤としての適用が可能であると考えられる（図１２）。
【００９５】
６．緑膿菌培養液抽出物の抗菌効果を引き起こす有効成分の探索
微生物（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養液から抽出された混合物状態のＲ１を分離して、分画１、分画２、分画３、分画４、分画５、分画６を得た。得られた各試料に対してＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性を試験した結果、分画１、分画２、分画３は、Ｒ１と相応する抗菌活性を示し、分画４、分画５は、Ｒ１よりも比較的弱い抗菌活性を示し、分画６は、抗菌活性を示していない（図１３）。あらゆる試料に対してＬＣ分析を進行し、その結果、抗菌活性を示した分画１、分画２、分画３で高く存在しながら、分画４、分画５では、徐々に減少した共通した２つのピークを発見し、ピーク１、ピーク２と名付けた（図１４）。抗菌活性試験と連結させて見る時、ピーク１、ピーク２の存否が抗菌活性を決定つけると判断され、ピーク１、ピーク２のＭＳ及びＭＳ／ＭＳ試験進行結果、ピーク１は、６５０の分子量、Ｒｈａ−Ｒｈａ−Ｃ１０−Ｃ１０の構造を有するジラムノリピド（Ｄｉ−ｒｈａｍｎｏｌｉｐｉｄ）で分析され、ピーク２は、５０４の分子量、Ｒｈａ−Ｃ１０−Ｃ１０の構造を有するモノラムノリピド（Ｍｏｎｏ−ｒｈａｍｎｏｌｉｐｉｄ）で分析された（図１５Ａ〜図１５Ｄ）。Ｒ１には、多様な構造を有するラムノリピドが存在し（図１６、表１８）、その中でも、Ｒｈａ−Ｒｈａ−Ｃ１０−Ｃ１０、Ｒｈａ−Ｃ１０−Ｃ１０の構造を有するラムノリピドが、抗菌活性を有する有効性分であることを確認した。また、シグマアルドリッチコリアから購入したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養液から抽出したラムノリピド（Ｒ９０、Ｒ９５）のＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性は、Ｒ１と比較した時、著しく低かった（図１７）。
【００９６】
【表１８】
2017519824.tif 000022
【００９７】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
2017519824.tif 000025
【図２】
2017519824.tif 000026
【図３】
2017519824.tif 000027
【図４】
2017519824.tif 000028
【図５Ａ】
2017519824.tif 000029
【図５Ｂ】
2017519824.tif 000030
【図５Ｃ】
2017519824.tif 000031
【図５Ｄ】
2017519824.tif 000032
【図５Ｅ】
2017519824.tif 000033
【図５Ｆ】
2017519824.tif 000034
【図５Ｇ】
2017519824.tif 000035
【図５Ｈ】
2017519824.tif 000036
【図５Ｉ】
2017519824.tif 000037
【図６】
2017519824.tif 000038
【図７】
2017519824.tif 000039
【図８】
2017519824.tif 000040
【図９】
2017519824.tif 000041
【図１０】
2017519824.tif 000042
【図１１】
2017519824.tif 000043
【図１２Ａ】
2017519824.tif 000044
【図１２Ｂ】
2017519824.tif 000045
【図１３】
2017519824.tif 000046
【図１４】
2017519824.tif 000047
【図１５Ａ】
2017519824.tif 000048
【図１５Ｂ】
2017519824.tif 000049
【図１５Ｃ】
2017519824.tif 000050
【図１５Ｄ】
2017519824.tif 000051
【図１６】
2017519824.tif 000052
【図１７】
2017519824.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月20日(2016.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む防腐用組成物。
【請求項２】
緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む抗生（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）組成物。
【請求項３】
緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含むにきびの予防または治療用組成物。
【請求項４】
緑膿菌培養液抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項５】
前記緑膿菌培養液抽出物は、緑膿菌培養液に塩酸溶液を添加して沈澱させた後、前記沈殿物にエチルエーテルを添加して収得したことを特徴とする請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記緑膿菌培養液抽出物は、ラムノリピドを含むことを特徴とする請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ラムノリピドは、次の化学式１で表されるジラムノリピドまたは化学式２で表されるモノラムノリピドであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【化１】
2017519824.tif 000054
【化２】
2017519824.tif 000055
【請求項８】
前記組成物は、組成物総１００重量部に対して０．００５〜１．０重量部の緑膿菌培養液抽出物を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、スタフィロコッカス属、バチルス属、シュードモナス属、カンジダ属、プロピオニバクテリウム属、ストレプトコッカス属、プロテウス属、コリネバクテリウム属、エンテロコッカス属、クレブシエラ属、及び大腸菌で構成された群から選択される１つ以上の微生物に対して抗菌活性を示すことを特徴とする請求項１ないし請求項４のうち何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、化粧料組成物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、食品組成物であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、皮膚外用剤組成物であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
前記皮膚外用剤組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーのうちから選択される何れか１つの剤型に剤形化されたことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【国際調査報告】
2017519824.tif 000056
2017519824.tif 000057
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