(57)【要約】本発明は、エレクトロポレーションを受けたT細胞の集団を拡大するための方法を含む。本方法は、T細胞を含む細胞の集団に対して、ある分子に対する抗原結合ドメインと共刺激分子の細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階を含み、培養したT細胞は少なくとも10倍に拡大する。本発明は、拡大したT細胞の集団、それらの細胞を含む組成物、および処置の方法をさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
T細胞を含む細胞の集団に対して、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階であって、キメラ膜タンパク質が、ある分子に対する抗体またはその断片を含む抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含み、該mRNAが該集団内の細胞のうちの少なくとも1つに導入されて該細胞の表面に発現される、該段階；ならびに
エレクトロポレーションを受けた細胞の集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する、該段階
を含む、T細胞の集団を拡大するための方法。
【請求項２】
エレクトロポレーションを受ける細胞の集団が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
エレクトロポレーションを受ける細胞の集団が末梢血単核細胞を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
エレクトロポレーションを受ける細胞の集団が精製されたT細胞を含む、請求項2記載の方法。
【請求項５】
前記mRNAがインビトロ転写されたRNAまたは合成RNAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖可変断片、およびそれらの抗原結合性断片からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記抗原結合ドメインが、抗CD3、抗TCR、抗CD28、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
キメラ膜タンパク質をコードするmRNAが膜貫通ドメインをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
キメラ膜タンパク質をコードするmRNAがヒンジドメインをさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞の集団内の少なくとも1つの細胞がCD3を発現する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
キメラ膜タンパク質を発現する少なくとも1つの細胞が、CD3を発現する別の細胞と相互作用する、請求項2記載の方法。
【請求項１２】
T細胞が約20倍〜約50倍の範囲で拡大する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
ある作用物質をコードするmRNAを、拡大したT細胞の集団中にエレクトロポレーションする段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記作用物質のmRNAをキメラ膜タンパク質mRNAと共にコエレクトロポレーションする、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
拡大したT細胞の集団を、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BBL IL2、IL21、IL-15、IL-7、PD1-CD28およびPD1からなる群より選択される少なくとも1つの分子またはサイトカインによって刺激する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
培養したT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
T細胞を含む細胞の集団に対して、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階であって、キメラ膜タンパク質が、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含み、該mRNAが該集団内の細胞のうちの少なくとも1つに導入されて該細胞の表面に発現される、該段階；ならびに
エレクトロポレーションを受けた細胞の集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する、該段階
を含む、エレクトロポレーションを受けたT細胞の集団を拡大するための方法。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか一項記載の方法によって作製された、拡大したT細胞集団。
【請求項１９】
CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む、キメラ膜タンパク質
をコードするエレクトロポレーションされたmRNAを含む、T細胞。
【請求項２０】
ある分子に対する抗体またはその断片を含む抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む、キメラ膜タンパク質
をコードするエレクトロポレーションされたmRNAを含む、エレクトロポレーションを受けたT細胞の集団。
【請求項２１】
対象にとって有害である免疫反応を予防または処置するために、T細胞を含む拡大した細胞の集団をその必要のある対象に投与する段階であって、T細胞を含む細胞の集団に対して、
CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む、キメラ膜タンパク質
をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行うことを含む方法に従って該拡大した細胞の集団が拡大されており、該集団内の細胞のうちの少なくとも1つがキメラ膜タンパク質を発現する、該段階；ならびに
該細胞集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する段階
を含む、養子細胞移入療法のための方法。
【請求項２２】
T細胞を含む拡大した細胞の集団をその必要のある対象に投与する段階であって、T細胞を含む細胞の集団に対して、
CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む、キメラ膜タンパク質
をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行うことを含む方法に従って該拡大した細胞の集団が拡大されており、該集団内の細胞のうちの少なくとも1つがキメラ膜タンパク質を発現する、該段階；ならびに
該集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する段階
を含む、対象における免疫亢進と関連する疾患または状態を処置する方法。
【請求項２３】
対象に対して、請求項1記載の方法において作製された改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法。
【請求項２４】
免疫応答が自己免疫疾患である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群（AIDS）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病（AIED）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎（celiac sprue-dermatitis hepetiformis）；慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、これは全身性硬化症（SS）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
免疫応答が、がんである、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、および甲状腺がんからなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、請求項19記載のT細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願には、米国特許法第119（e）条（35 U.S.C. § 119（e））の下で、2014年10月31日に提出された米国仮特許出願第62／073,268号への優先権が与えられており、その出願はその全体が本明細書に参照により組み入れられる。
【０００２】
連邦政府の資金援助を受けて行われた研究または開発に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institute of Health）によって授与されたCA120409号の下に、政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
遺伝的に操作されたT細胞の養子細胞移入は、がんの処置のための魅力的な代替的選択肢であることが証明されている。しかし、T細胞は一般に、処置用に十分な数を操作できるようになるまで拡大させなければならない。臨床状況でT細胞を刺激および拡大するためには、抗CD3／CD28ビーズによる刺激、抗CD28抗体を伴うかまたは伴わない抗CD3による刺激、および抗原提示細胞を用いる細胞ベースの人工的刺激を含む、複数の方法を用いることができる。これらの種々の方法によって作製されたT細胞は、異なる表現型およびインビトロ／インビボ機能を呈する。
【０００４】
このため、当技術分野には、T細胞ベースの養子免疫療法のためにインビボでそのエフェクター機能を最大限に発揮しうると考えられるT細胞を作製することを目的とした、T細胞の集団を得るための改良された方法に対する需要が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書において記載されるように、本発明は、T細胞を刺激および拡大するための組成物および方法に関する。
【０００６】
本発明の1つの局面は、T細胞を含む細胞の集団に対してキメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階であって、キメラ膜タンパク質が、ある分子に対する抗体またはその断片を含む抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含み、該mRNAが該集団内の細胞のうちの少なくとも1つに導入されて該細胞の表面に発現される該段階、ならびにエレクトロポレーションを受けた細胞の集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する該段階を含む、T細胞の集団を拡大するための方法を含む。
【０００７】
もう1つの局面において、本発明は、T細胞を含む細胞の集団に対してキメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階であって、キメラ膜タンパク質が、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含み、該mRNAが該集団内の細胞のうちの少なくとも1つに導入されて該細胞の表面に発現される該段階、ならびにエレクトロポレーションを受けた細胞の集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する該段階を含む、エレクトロポレーションを受けたT細胞の集団を拡大するための方法を含む。
【０００８】
さらにもう1つの局面において、本発明は、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするエレクトロポレーションされたmRNAを含むT細胞を含む。
【０００９】
もう1つの局面において、本発明は、ある分子に対する抗体またはその断片を含む抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインとCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするエレクトロポレーションされたmRNAを含む、エレクトロポレーションを受けたT細胞の集団を含む。
【００１０】
本発明のもう1つの局面は、対象にとって有害である免疫反応を予防または処置するために、T細胞を含む拡大した細胞の集団をその必要のある対象に投与する段階であって、T細胞を含む細胞の集団に対して、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行うことを含む方法に従って該拡大した細胞の集団が拡大されており、該集団内の細胞のうちの少なくとも1つがキメラ膜タンパク質を発現する該段階；ならびに該細胞集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する段階、を含む、養子細胞移入療法のための方法を含む。
【００１１】
本発明のなおもう1つの局面は、T細胞を含む拡大した細胞の集団をその必要のある対象に投与する段階であって、T細胞を含む細胞の集団に対して、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行うことを含む方法に従って該拡大した細胞の集団が拡大されており、該集団内の細胞のうちの少なくとも1つがキメラ膜タンパク質を発現する該段階；ならびに該集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する段階を含む、対象における免疫亢進と関連する疾患または状態を処置する方法を含む。
【００１２】
もう1つの局面において、本発明は、本明細書に記載の方法によって作製された、拡大したT細胞集団を含む。
【００１３】
さらにもう1つの局面において、対象における状態を処置する方法は、対象に対して、本明細書に記載の方法において作製された改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を投与する段階を含む。
【００１４】
なおもう1つの局面において、本発明は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本明細書に記載のT細胞の使用を含む。
【００１５】
本明細書において描写される本発明の上記の諸局面および任意の他の局面のさまざまな態様において、エレクトロポレーションを受ける細胞の集団は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より選択される。もう1つの態様において、エレクトロポレーションを受ける細胞の集団は、末梢血単核細胞を含む。さらにもう1つの態様において、エレクトロポレーションを受ける細胞の集団は、精製されたT細胞を含む。
【００１６】
1つの態様において、mRNAは、インビトロ転写されたRNAまたは合成RNAを含む。もう1つの態様において、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAは、膜貫通ドメインをさらに含む。さらにもう1つの態様において、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAは、ヒンジドメインをさらに含む。
【００１７】
もう1つの態様において、抗体は、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖可変断片、およびそれらの抗原結合性断片からなる群より選択される。さらにもう1つの態様において、抗原結合ドメインは、抗CD3、抗TCR、抗CD28、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１８】
さらにもう1つの態様において、細胞の集団内の少なくとも1つの細胞は、CD3を発現する。もう1つの態様において、キメラ膜タンパク質を発現する少なくとも1つの細胞は、CD3を発現する別の細胞と相互作用する。
【００１９】
さらにもう1つの態様において、T細胞は約20倍〜約50倍の範囲で拡大する。
【００２０】
1つの態様において、本明細書に記載の方法は、ある作用物質をコードするmRNAを、拡大したT細胞の集団中にエレクトロポレーションする段階をさらに含む。もう1つの態様においては、作用物質のmRNAとキメラ膜タンパク質mRNAとのコエレクトロポレーションが行われる。さらにもう1つの態様において、本明細書に記載の方法は、拡大したT細胞の集団を、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BBL IL2、IL21、IL-15、IL-7、PD1-CD28およびPD1からなる群より選択される少なくとも1つの分子またはサイトカインによって刺激する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本明細書に記載の方法は、培養したT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。
【００２１】
もう1つの態様において、免疫応答は自己免疫疾患である。さらにもう1つの態様において、自己免疫疾患は、後天性免疫不全症候群（AIDS）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病（AIED）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎（celiac sprue-dermatitis hepetiformis）；慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、これは全身性硬化症（SS）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００２２】
もう1つの態様において、免疫応答はがんである。さらにもう1つの態様において、がんは、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、および甲状腺がんからなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことにより、さらに良く理解されるであろう。本発明を実例で説明するために、現時点で好ましい態様を図面として示している。しかし、本発明は、図面中に示された態様の厳密な配置および手段には限定されないことが理解されるべきである。
【図１】図1は、抗CD3-H5L1-28BBおよび抗CD3-OKT3-28BBの一群のベクター地図である。いずれの構築物においても、抗CD3 scFvをCD8ヒンジ領域と融合させ、その後にCD28膜貫通領域、CD28細胞内領域および4-1BB細胞内領域と融合させた。
【図２】図2は、OKT-28BB RNAのエレクトロポレーションによって刺激されたT細胞の拡大を示しているグラフである。
【図３】図3は、拡大したT細胞の表現型分析を示している一群のグラフである。OKT-28BBまたはH5L1-28BB RNAのエレクトロポレーションを受けたT細胞によって拡大したT細胞の表現型を、OKT3刺激（OKT3）またはCD28／CD3ビーズ（ビーズ）刺激によって拡大したT細胞の表現型と、刺激から10日後に比較した。
【図４】図4は、拡大したT細胞の機能を強く示す一群のグラフである。T細胞を、表記の通りの種々の方法を用いて10日間拡大させた。OKT3：OKT3抗体をPBMCに直接添加（OKT3）；OKT-28BB：OKT3-28BBによるエレクトロポレーションを受けたPBMC；H5L1-28BB：H5L1-28BBによるエレクトロポレーションを受けたPBMC；またはビーズ：CD3／CD28ビーズをPBMCに直接添加。すべての群に対して、CD19陽性腫瘍Nalm6で刺激することによってT細胞機能を検査するために、CD19キメラ抗原受容体（CAR）RNを用いてエレクトロポレーションを行った。CD19 CAR RNAエレクトロポレーションを受けたT細胞のCD19 CAR発現を、RNAエレクトロポレーションから18時間後に測定した。
【図５Ａ】CD19 CAR RNAを用いてエレクトロポレーションを受けた拡大したT細胞の機能をさらに描写している。拡大した細胞を、Nalm6により、種々のT細胞：Nalm6細胞比で刺激した（図5A）。
【図５Ｂ】CD19 CAR RNAを用いてエレクトロポレーションを受けた拡大したT細胞の機能をさらに描写している。CD107a陽性T細胞のパーセンテージをプロットした（図5B）。
【図６】図6は、拡大したT細胞の表現型分析を示している一群のグラフである。OKT-28BBによって10日間拡大させたT細胞、または他のRNAのエレクトロポレーションを受けたT細胞と組み合わせたものの表現型を、OKT3（OKT3）刺激によって拡大させたT細胞の表現型と比較した。
【図７】図7は、OKT-28BBと他の分子をコードするRNAとのコエレクトロポレーションによって拡大させ、CD19 CAR RNAを用いてエレクトロポレーションを行い、CD19陽性細胞株によって18時間刺激したT細胞のインターフェロン-γ（IFN-γ）産生のレベルを示している棒グラフである。IFN-γのレベルはELISAによって測定した。
【図８】図8は、OKT-28BBと他の分子をコードするRNA（図10に列記）とのコエレクトロポレーションによって拡大させ、CD19 CAR RNAを用いてエレクトロポレーションを行い、CD19陽性細胞株によって18時間刺激したT細胞のIL-2産生のレベルを示している棒グラフである。IL-2のレベルはELISAによって測定した。
【図９】図9は、OKT-28BBと他の分子をコードするRNAとのコエレクトロポレーションによって拡大させ、CD19 CAR RNAを用いてエレクトロポレーションを行い、CD19陽性腫瘍Nalm6；PDL1を発現させたNalm6；またはHVEMを発現させたNalm6によって刺激したT細胞に関する、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）アッセイによって検査したT細胞溶解活性を図示している一群のグラフである。
【図１０】図10は、RNAのコエレクトロポレーションを詳述している表である。OKT-28BB-1：OKT-28BB RNAのみによるPBMCのエレクトロポレーションによって拡大させたT細胞。OKT-28BB-2〜OKT-28BB-6：OKT-28BBと図示した他の分子をコードするRNAとの種々の組み合わせによるPBMCのコエレクトロポレーションによって拡大させたT細胞。
【図１１】図11は、第0日に1E6 Nalm6-ESO-CBGを静脈内注入したNSGマウスを示している一群の画像である。第7日の時点で、NY-ESO-T TCR（1G4 TCR）RNAのエレクトロポレーションを受けたOKT3-28BB RNA T細胞（RNA-T）またはCD3／CD28ビーズT細胞（ビーズ）を1×106個、静脈内に注射した。腫瘍量は生物発光イメージングによってモニターした。結果からは、TCRが移入されたRNA-T細胞の方が、ビーズで刺激されたT細胞よりも優れた腫瘍抑制を示すことが示された。
【図１２】図12は、RNA-T細胞の効率的なレンチウイルス形質導入を示している一群のグラフである。第1日または第2日のRNA T細胞を採取して、24ウェルプレートに、細胞濃度1.5×106個／mlで、0.5ml、1mlまたは2ml／ウェルとして分注した。0.1mlの濃縮4D5.BBZレンチウイルスベクター（力価5×106／ml）を各ウェルに添加した。対照として、4D5.BBZレンチウイルスベクターを、CD3／CD28ビーズで刺激した第1日または第2日のT細胞に対して表記の感染多重度（MOI）で添加した。刺激後の第9日に、拡大したT細胞を、形質導入されたCAR発現の検出のためのフローサイトメトリー染色に供した。
【図１３】図13は、レンチウイルス形質導入を受けたRNA T細胞のT細胞拡大を示しているグラフである。この結果は、レンチウイルス形質導入RNA T細胞または非形質導入RNA T細胞の両方が、CD3／CD28ビーズで刺激したT細胞と同程度に効率的に拡大したことを指し示している。
【図１４】図14は、レンチウイルス形質導入を受けたRNA-T細胞におけるCD107aアップレギュレーションを示している一群のグラフである。レンチウイルス形質導入を受けたRNA T細胞、またはビーズで刺激したT細胞を、Her2陽性細胞株であるSK-OV3、MCF7およびMDA231、またはHer2陰性腫瘍株であるMDA468によって4時間刺激して、CD107a発現をフローサイトメトリーにより検出した。
【図１５】図15は、レンチウイルス形質導入RNA-T細胞のサイトカイン産生を示している一群のグラフである。レンチウイルス形質導入を受けたRNA T細胞、またはビーズで刺激されたT細胞を、Her2陽性細胞株であるSK-OV3、MCF7およびMDA231、またはHer2陰性腫瘍株であるMDA468によって刺激し、サイトカイン産生をELISAにより一晩のインキュベーション後に検出した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
定義
別に定める場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等な任意の方法および材料を本発明の試験のために実地に用いることができるが、本明細書では好ましい材料および方法について説明する。本発明の説明および特許請求を行う上では、以下の専門用語を用いる。
【００２５】
また、本明細書中で用いる専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定的であることは意図しないことも理解される必要がある。
【００２６】
「1つの（a）」および「1つの（an）」という冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは複数（すなわち、少なくとも1つ）を指して用いられる。一例として、「1つの要素」は、1つの要素または複数の要素を意味する。
【００２７】
量、時間的長さなどの測定可能な値に言及する場合に本明細書で用いる「約」は、特定された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、なおより好ましくは±0.1％のばらつきを範囲に含むものとするが、これはそのようなばらつきが、開示された方法を実施する上で妥当なためである。
【００２８】
「抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子のことを指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンであってもよく、インタクトな免疫グロブリンの免疫応答部分であってもよい。抗体は典型的には、免疫グロブリン分子のテトラマーである。テトラマーは天然に存在してもよく、または一本鎖抗体もしくは抗体断片から再構築されてもよい。抗体にはダイマーも含まれ、それらは天然に存在してもよく、または一本鎖抗体もしくは抗体断片から構築されてもよい。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab')2、さらには一本鎖抗体（scFv）、ヒト化抗体およびヒト抗体を含む、種々の形態で存在しうる（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。
【００２９】
「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体のある領域のことを指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域のことも指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖状抗体、scFv抗体、標的に対する十分な親和性を示すVLドメインまたはVHドメインのいずれかで構成される単一ドメイン抗体、例えばラクダ科動物（camelid）抗体（Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38）など、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が非限定的に含まれる。抗体断片はまた、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはそのヒト抗体もしくはヒト化抗体の断片も含む。
【００３０】
「抗体重鎖」とは、本明細書で用いる場合、その天然型高次構造にあるすべての抗体分子に存在する2種類のポリペプチドのうち、長い方のことを指す。
【００３１】
「抗体軽鎖」とは、本明書で用いる場合、その天然型高次構造にあるすべての抗体分子に存在する2種類のポリペプチドのうち、短い方のことを指す。α軽鎖およびβ軽鎖とは、2種の主要な抗体軽鎖アイソタイプのことを指す。
【００３２】
「合成抗体」とは、本明細書で用いる場合、組換えDNA技術を用いて作製される抗体、例えば、本明細書に記載されたようなバクテリオファージによって発現される抗体などを意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって作製される抗体であって、そのDNA分子が抗体タンパク質またはその抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、そのDNA配列またはアミノ酸配列が、利用可能であって当技術分野において周知であるDNA配列またはアミノ酸配列の合成技術を用いて得られるような抗体も意味するとみなされるべきである。
【００３３】
「抗原」または「Ag」という用語は、本明細書で用いる場合、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方が含まれうる。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役を果たしうることを理解するであろう。その上、抗原が組換えDNAまたはゲノムDNAに由来してもよい。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それ故に、本明細書中でその用語が用いられる通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。その上、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことも理解するであろう。本発明が複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を非限定的に含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するさまざまな組み合わせで並べられていることは直ちに明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことも理解するであろう。抗原を合成して作製することもでき、または生物試料から得ることもできることは直ちに明らかである。そのような生物試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液が非限定的に含まれうる。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「自己」という用語は、後にその個体に再び導入される、同じ個体に由来する任意の材料を指すものとする。
【００３５】
「同種」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片のことを指す。
【００３６】
「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片のことを指す。
【００３７】
「がん」という用語は、本明細書で用いる場合、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖を特徴とする疾患と定義される。がん細胞は局所的に広がることもあれば、または血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がることもある。さまざまながんの例には、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、甲状腺がんなどが非限定的に含まれる。
【００３８】
「キメラ抗原受容体」または「CAR」という用語は、本明細書で用いる場合、免疫エフェクター細胞上に発現されて抗原と特異的に結合するように操作された人工的T細胞受容体のことを指す。CARは、養子細胞移入を伴う治療法として用いることができる。T細胞を患者から取り出して、それらが特定形態の抗原に対して特異的な受容体を発現するように改変する。いくつかの態様において、CARは、例えば、腫瘍関連抗原に対する特異性を有して発現されている。また、CARが、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、および腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含んでもよい。いくつかの局面において、CARは、一本鎖可変断片（scFv）由来のモノクローナル抗体が、CD3-ζ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと融合された融合体を含む。CARの設計の特異性が、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）に由来してもよい。いくつかの態様において、CARは、腫瘍関連抗原に特異的なCARを発現するT細胞の特異性を再度方向付けることによって、がんを標的にすることができる。
【００３９】
「キメラ膜タンパク質」という用語は、1つまたは複数のシグナル伝達分子および／または受容体分子に由来するかまたはそれを活性化することができる細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有する、操作された膜タンパク質のことを指す。例えば、本明細書に記載のキメラ膜タンパク質は、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響することもそれを有意に変化させることもないアミノ酸改変を指すことを意図している。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。改変は、当技術分野において公知の標準的な手法、例えば部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介性突然変異誘発などによって、本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられるもののことである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において明確に定められている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。このため、本発明の抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基によって置き換えることができ、改変された抗体を、本明細書に記載の機能アッセイを用いて、抗原と結合する能力に関して試験することができる。
【００４１】
「共刺激リガンド」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、T細胞上のコグネイト共刺激分子と特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子のTCR／CD3複合体への結合によって与えられる一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などを非限定的に含むT細胞応答を媒介するシグナルも与えることのできる、抗原提示細胞（例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など）上の分子が含まれる。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞内接着分子（ICAM）、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3／TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドが非限定的に含まれる。共刺激リガンドはまた、とりわけ、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3などの、ただしこれらに限定されない、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、およびCD83と特異的に結合するリガンドも範囲に含む。
【００４２】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、増殖などの、ただしこれに限定されない、T細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上のコグネイト結合パートナーのことを指す。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体が非限定的に含まれる。
【００４３】
「〜に由来する」という用語は、由来する物質が供給源と関連付けられるように、特定の供給源から生成される、合成される、または生じることを指す。由来する物質はその特定の供給源と同一である必要はない。1つの態様において、ある抗原はあるタンパク質に由来する。もう1つの態様において、ある一本鎖可変断片はあるモノクローナル抗体に由来する。
【００４４】
「エレクトロポレーションを行う」、「エレクトロポレーション」、「エレクトロポレーションを受けた」という用語は、細胞原形質膜に対してその透過性を高めるために電場が印加される過程のことを指す。特定の持続時間および形状のパルスが細胞の細胞膜に印加されて、核酸が細胞に導入される。
【００４５】
「有効量」または「治療的有効量」は、本明細書において互換的に用いられ、特定の生物学的結果を達成するために有効な、本明細書に記載するような化合物、製剤、材料または組成物の量のことを指す。そのような結果には、当技術分野における好適な任意の手段によって判定される、ウイルス感染の阻害が非限定的に含まれうる。
【００４６】
「コードする」とは、所定のヌクレオチド配列（すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA）または所定のアミノ酸配列のいずれか、およびそれに起因する生物学的特性を有する、生物過程において他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして働く、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性のことを指す。すなわち、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、そのタンパク質をコードする。mRNA配列と同一であって通常は配列表として提示されるヌクレオチド配列を有するコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード鎖の両方を、タンパク質、またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードすると称することができる。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「内因性」とは、生物体、細胞、組織もしくは系の内部に由来するか、またはそれらの内部で産生される、任意の材料のことを指す。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「外因性」という用語は、生物体、細胞、組織もしくは系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される、任意の材料のことを指す。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「拡大する」および「拡大」という用語は、T細胞などの細胞の増殖または増加のことを指す。
【００５０】
「発現」という用語は、本明細書で用いる場合、そのプロモーターによって作動する特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。
【００５１】
「発現ベクター」とは、発現させようとするヌクレオチド配列と機能的に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターのことを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されうる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み入れたコスミド、プラスミド（例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）といった、当技術分野において公知であるすべてのものが含まれる。
【００５２】
「相同な」とは、本明細書で用いる場合、2つのポリマー分子の間、例えば、2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子などの2つの核酸分子の間、または2つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列同一性のことを指す。2つの分子の両方においてあるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットで占められているならば；例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおいてある位置がアデニンによって占められているならば、それらはその位置で相同である。2つの配列間の相同性は、一致するかまたは相同な位置の数の直接的な関数である；例えば、2つの配列における位置の半分（例えば、長さが10サブユニットであるポリマーにおける5つの位置）が相同であるならば、2つの配列は50％相同である；位置の90％（例えば、10のうち9）が一致するかまたは相同であるならば、2つの配列は90％相同である。
【００５３】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、キメラ性の免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合性部分配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（CDR）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のCDR由来の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。その上、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたCDR配列またはフレームワーク配列のいずれにも認められない残基も含みうる。これらの改変は、抗体の性能をさらに精緻化し、最適化するために加えられる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含むと考えられ、ここでCDR領域のすべてまたは実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FRのすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は最適には、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含むと考えられる。これ以上の詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986；Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988；Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
【００５４】
「完全ヒト」とは、分子全体がヒト由来であるか、またはヒト型の抗体と同一なアミノ酸配列からなる、抗体などの免疫グロブリンのことを指す。
【００５５】
「免疫学的有効量」、「抗免疫応答有効量」、「免疫応答阻害有効量」または「治療量」という語句は、対象に投与されることになる本発明の組成物の量のことを指し、この量は、対象（患者）の年齢、体重、免疫応答、疾患／状態の種類、および健康状態の個々の違いを考慮して、その対象において所望の結果が得られるように、任意で科学者と相談した上で、医師によって決定される。
【００５６】
本明細書で用いる場合、「説明材料（instructional material）」には、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために用いうる、刊行物、記録、略図または他の任意の表現媒体が含まれる。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含む容器に添付してもよく、または核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含む容器と一緒に出荷してもよい。または、説明材料および化合物がレシピエントによって一体として用いられることを意図して、説明材料を容器と別に出荷してもよい。
【００５７】
「単離された」とは、天然の状態から変更されるかまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然の状態で共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することもでき、または例えば宿主細胞などの非ネイティブ性環境で存在することもできる。
【００５８】
「改変された」という用語は、本明細書で用いる場合、本発明の分子または細胞の状態または構造が変化していることを意味する。分子は、化学的、構造的および機能的を含む、多くの方法で改変することができる。細胞は核酸の導入によって改変することができる。
【００５９】
「モジュレートすること」という用語は、本明細書で用いる場合、処置もしくは化合物の非存在下でのその対象における反応のレベルと比較して、および／または他の点では同一であるが処置を受けていない対象における反応のレベルと比較して、対象における反応のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、対象、好ましくはヒトにおいて、ネイティブ性のシグナルまたは反応を擾乱させるか、および／またはそれに影響を及ぼして、それにより、有益な治療反応を媒介することを範囲に含む。
【００６０】
本発明に関連して、一般的に存在する核酸塩基に関しては以下の略号を用いる。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
【００６１】
別に指定する場合を除き、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互に縮重型であって、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチドが含まれる。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型においてイントロンを含みうる限り、イントロンも含まれうる。
【００６２】
「機能的に連結した」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の、後者の発現を結果的にもたらす機能的連結のことを指す。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列との機能的関係の下で配置されている場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターはコード配列と機能的に連結している。一般に、機能的に連結したDNA配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、同一のリーディングフレーム内にある。
【００６３】
免疫原性組成物の「非経口的」投与には、例えば、例えば、皮下（s.c）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）または胸骨内の注射法または注入法が含まれる。
【００６４】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で用いる場合、ヌクレオチドの連鎖と定義される。その上、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で用いる核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらはモノマー性「ヌクレオチド」に加水分解されうるという一般知識を有する。モノマー性ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解されうる。本明細書で用いるポリヌクレオチドには、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCR（商標）などを用いて組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列をクローニングすること、および合成手段を非限定的に含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られる、すべての核酸配列が非限定的に含まれる。
【００６５】
本明細書で用いる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物のことを指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で用いる場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当技術分野において一般にタンパク質と称される長鎖の両方のことを指し、それらには多くの種類がある。「ポリペプチド」には、いくつか例を挙げると、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００６６】
「プロモーター」という用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。
【００６７】
本明細書で用いる場合、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列と機能的に連結した遺伝子産物の発現のために必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、また別の場合には、この配列が、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の制御エレメントをも含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現させるものであってもよい。
【００６８】
「構成性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。
【００６９】
「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的にはそのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。
【００７０】
「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的には細胞がそのプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。
【００７１】
「シグナル伝達経路」とは、細胞の1つの部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係のことを指す。「細胞表面受容体」という語句は、シグナルを受け取って、細胞の原形質膜をまたいでシグナルを伝達することができる分子および分子の複合体のことを指す。「細胞表面受容体」の一例はヒトCD3またはCD28である。
【００７２】
「一本鎖抗体」とは、免疫グロブリンの重鎖断片および軽鎖断片が互いに連結されて人工的に作製したある長さのアミノ酸が介在するFv領域となる組換えDNA手法によって形成される抗体のことを指す。一本鎖抗体を作製するためのさまざまな方法が公知であり、それには米国特許第4,694,778号；Bird (1988) Science 242:423-442；Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Ward et al. (1989) Nature 334:54454；Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041に記載されたものが含まれる。
【００７３】
「特異的に結合する」という用語は、本明細書で用いる場合、試料中に存在するコグネイト結合パートナー（例えば、T細胞上に存在する刺激分子および／または共刺激分子）タンパク質を認識してそれと結合する抗体またはリガンドが、試料中の他の分子を実質的に認識せず、それと結合することもないことを意味する。
【００７４】
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、TCR／CD3複合体）がそのコグネイトリガンドと結合して、それにより、TCR／CD3複合体を介するシグナル伝達などの、ただしこれには限定されないシグナル伝達イベントを媒介することによって誘導される、一次応答のことを意味する。刺激は、TGF-βのダウンレギュレーション、および／または細胞骨格構造の再構築などのような、ある種の分子の発現の改変を媒介することができる。
【００７５】
「刺激分子」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、抗原提示細胞上および／または腫瘍細胞上に存在するコグネイト刺激リガンドに特異的に結合する、T細胞上の分子のことを意味する。
【００７６】
「刺激リガンド」は、本明細書で用いる場合、抗原提示細胞（例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など）上または腫瘍細胞上に存在する場合に、T細胞上のコグネイト結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称する）と特異的に結合して、それにより、活性化、免疫応答の開始、増殖などを非限定的に含む、T細胞による一次応答を媒介することができるリガンドのことを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体、およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を範囲に含む。
【００７７】
「対象」という用語は、免疫応答を惹起させることができる、生きている生物（例えば、哺乳動物）を含むことを意図している。「対象」または「患者」は、その中で用いる場合、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であってよい。非ヒト哺乳動物には、例えば、家畜および愛玩動物、例えばヒツジ、ウシ科動物、ブタ、イヌ科動物、ネコ科動物およびネズミ科の哺乳動物などが含まれる。好ましくは、対象はヒトである。
【００７８】
本明細書で用いる場合、「実質的に精製された」細胞とは、他の細胞型を本質的に含まない細胞のことである。また、実質的に精製された細胞は、その天然の状態に本来付随する他の細胞型から分離された細胞のことも指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団とは、均一な細胞集団のことを指す。また別の場合には、この用語は、単に、天然の状態において本来付随する細胞から分離された細胞のことを指す。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロでは培養されない。
【００７９】
「標的部位」または「標的配列」とは、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合しうる核酸の領域を明確に定めるゲノム核酸配列のことを指す。
【００８０】
本明細書で用いる場合、「T細胞受容体」または「TCR」という用語は、抗原の提示に応答したT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体のことを指す。TCRは主要組織適合複合体分子と結合した抗原を認識する原因となる。TCRは、アルファ（α）およびベータ（β）鎖のヘテロダイマーで構成されるが、一部の細胞では、TCRはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる。TCRはα／β形態およびγ／δ形態で存在することもあり、これらは構造的に類似しているが、解剖学的な部位および機能は異なる。各鎖は2つの細胞外ドメイン、1つの可変ドメインおよび1つの定常ドメインからなる。いくつかの態様において、TCRは、例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、およびγδT細胞を含む、TCRを含む任意の細胞上で改変することができる。
【００８１】
「治療的」という用語は、本明細書で用いる場合、処置および／または予防を意味する。治療効果は、疾病状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
【００８２】
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、本明細書で用いる場合、外因性核酸が宿主細胞内に移入または導入される過程のことを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外因性核酸によってトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入されたもののことである。この細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
【００８３】
「転写制御下」または「機能的に連結した」という語句は、本明細書で用いる場合、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために正しい位置および向きにあることを意味する。
【００８４】
「ベクター」とは、単離された核酸を含み、かつその単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いうる組成物のことである。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを非限定的に含む数多くのベクターが、当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製性プラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物も含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが非限定的に含まれる。
【００８５】
範囲：本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を、範囲形式で提示することができる。範囲形式による記載は、単に便宜上かつ簡潔さのためであって、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定とみなされるべきではないことが理解される必要がある。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内におけるすべての可能な部分的範囲とともに、個々の数値も具体的に開示されていると考慮されるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分的範囲とともに、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6も、具体的に開示されていると考慮されるべきである。これは範囲の幅広さとは関係なく適用される。
【００８６】
説明
本発明は、エレクトロポレーションを受けたT細胞の集団を拡大するための方法を含む。本方法は、T細胞を含む、末梢血単核細胞などの細胞の集団に対して、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階であって、該mRNAが前記集団内の細胞のうちの少なくとも1つに導入されて該細胞の表面に発現される該段階を含む。1つの態様において、キメラ膜タンパク質は、例えばTCR／CD3等のある分子と結合する抗原結合ドメインと、共刺激分子の細胞内ドメインなどの分子と結合する抗原結合ドメインとを含む。もう1つの態様においては、エレクトロポレーションを受けた集団を培養し、その中に含まれるT細胞を少なくとも10倍に拡大する。したがって、本発明は、養子細胞移入などの治療応用のための、細胞の集団からのT細胞の拡大、および細胞の調製を可能にする。
【００８７】
方法
1つの局面において、本発明は、T細胞を含む末梢血単核細胞などの細胞の集団に対して、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階を含む、T細胞の集団を拡大する方法を含む。キメラ膜タンパク質は、例えばTCR／CD3等のある分子と結合する抗体またはその断片を含む抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む。前記mRNAは前記集団内の細胞のうちの少なくとも1つに導入されて該細胞の表面に発現され、エレクトロポレーションを受けた細胞の集団を培養して、その中に含まれるT細胞を少なくとも10倍に拡大する。
【００８８】
もう1つの局面において、本発明は、T細胞を含む細胞の集団に対して、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階を含む、エレクトロポレーションを受けたT細胞の集団を拡大するための方法を含む。キメラ膜タンパク質は、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む。前記mRNAは前記集団内の細胞のうちの少なくとも1つに導入されて該細胞の表面に発現される。エレクトロポレーションを受けた細胞の集団を培養し、その中に含まれるT細胞を少なくとも10倍に拡大する。
【００８９】
1つの態様において、細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より選択される。
【００９０】
もう1つの態様において、本明細書に記載の方法は、拡大したT細胞の集団に対して、ある作用物質をコードするmRNAのエレクトロポレーションを行う段階、例えば作用物質をコードする核酸とキメラ膜タンパク質をコードする核酸とのコエレクトロポレーションを行う段階をさらに含む。
【００９１】
さらにもう1つの態様において、本明細書に記載の方法は、拡大したT細胞の集団を、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BBL、IL21、IL15、IL-7、PD1-CD28およびPD1からなる群より選択される少なくとも1つの分子またはサイトカインによって刺激する段階をさらに含む。
【００９２】
なおもう1つの態様において、本明細書に記載の方法は、培養したT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。
【００９３】
核酸の導入
核酸を細胞に導入する方法には、物理的、生物学的および化学的方法が含まれる。宿主細胞にRNAなどのポリヌクレオチドを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。RNAは、エレクトロポレーション（Amaxa Nucleofector-II（Amaxa Biosystems, Cologne, Germany））、（ECM 830（BTX）（Harvard Instruments, Boston, Mass.）またはGene Pulser II（BioRad, Denver, Colo.）、Multiporator（Eppendort, Hamburg Germany）を含む、市販の方法を用いて、標的細胞に導入することができる。また、RNAを、リポフェクションを用いるカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクションを用いて、ポリマーカプセル封入を用いて、ペプチド媒介性トランスフェクションを用いて、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック（biolistic）粒子送達システムを非限定的に含む市販の方法（例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照）を用いて、細胞に導入することもできる。
【００９４】
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクターおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第5,350,674号および第5,585,362号を参照されたい。
【００９５】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなど、ならびに、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達媒体として用いるための例示的なコロイド系の1つは、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【００９６】
使用に適した脂質は、販売元から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC」）はSigma, St. Louis, MOから入手することができ；ジアセチルホスファート（「DCP」）はK & K Laboratories（Plainview, NY）から入手することができ；コレステロール（「Chol」）はCalbiochem-Behringから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.（Birmingham, AL）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中にある脂質の貯蔵溶液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、それを唯一の溶媒として用いることが好ましい。「リポソーム」とは、閉じた脂質二重層または凝集物の生成によって形成される、種々の単層および多重層の脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜による小胞構造および内部の水性媒質を有するものとして特徴づけることができる。多重層リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらはリン脂質を過剰量の水性溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は自己再配列を起こし、その後に閉鎖構造の形成が起こり、水および溶解溶質を脂質二重層の間に封じ込める（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5:505-10）。しかし、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も想定している。例えば、脂質がミセル構造をとってもよく、または単に脂質分子の不均一な凝集物として存在してもよい。また、リポフェクタミン-核酸複合体も想定している。
【００９７】
宿主細胞における核酸の存在を確かめる目的で、宿主細胞に外因性核酸を導入するため、または他の様式で細胞を本発明の阻害因子に曝露させるために用いられる方法にかかわらず、種々のアッセイを用いることができる。そのようなアッセイには、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、RT-PCRおよびPCRなど；「生化学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ELISAおよびウエスタンブロット）または本発明の範囲内にある作用物質を同定するための本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの有無を検出すること、などが含まれる。
【００９８】
RNA
1つの態様においては、RNAが標的細胞に導入される。もう1つの態様において、RNAは、インビトロ転写されたRNAまたは合成RNAを含むmRNAである。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により生成されるテンプレートを用いるインビトロ転写によって生成される。任意の供給源からの関心対象のDNAを、PCRによって、適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを用いるインビトロmRNA合成のためのテンプレートに直接変換することができる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、またはDNAの他の任意の適切な供給源でありうる。インビトロ転写のための所望のテンプレートは、キメラ膜タンパク質である。一例を挙げると、テンプレートは、抗体、抗体の断片または抗体の一部分をコードする。もう1つの例を挙げると、テンプレートは、抗CD3などの抗体の一本鎖可変ドメインを含む細胞外ドメインと、共刺激分子の細胞内ドメインとを含む。1つの態様において、RNAキメラ膜タンパク質のテンプレートは、キメラ膜タンパク質は、ある分子に対する抗体またはその断片を含む抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む。
【００９９】
PCRは、トランスフェクションに用いられるmRNAのインビトロ転写のためのテンプレートを作製するために用いられる。PCRを行うための方法は、当技術分野において周知である。PCRに用いるためのプライマーは、PCRのためのテンプレートとして用いようとするDNAの領域に対して実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的な」とは、本明細書で用いる場合、プライマー配列中の塩基の大半もしくはすべてが相補的であるか、または1つもしくは複数の塩基が非相補的もしくはミスマッチ性である、ヌクレオチドの配列のことを指す。実質的に相補的な配列は、PCRのために用いられるアニーリング条件下で、意図したDNA標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、DNAテンプレートの任意の部分に対して実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーを、5'および3' UTRを含めて、細胞において通常転写される遺伝子の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。また、プライマーを、関心対象の特定のドメインをコードする遺伝子の一部分を増幅するように設計することもできる。1つの態様において、プライマーは、5'および3'UTRの全体または部分を含めて、ヒトcDNAのコード領域を増幅するように設計される。PCRのために有用なプライマーは、当技術分野において周知である合成法によって作製される。「順方向プライマー」とは、増幅させようとするDNA配列の上流にある、DNAテンプレート上のヌクレオチドに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「上流」とは、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするDNA配列の5'側にある場所（location 5）を指して用いられる。「逆方向プライマー」とは、増幅させようとするDNA配列の下流にある、二本鎖DNAテンプレートに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「下流」とは、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするDNA配列の3'側にある場所のことを指す。
【０１００】
RNAの安定性および／または翻訳効率を高める能力を有する化学構造を用いることもできる。RNAは5'および3' UTRを有することが好ましい。1つの態様において、5' UTRは長さが0〜3000ヌクレオチドである。コード領域に付加される5'および3' UTR配列の長さは、UTRの異なる領域とアニールするPCR用のプライマーを設計することを非限定的に含む、異なる方法によって変化させることができる。このアプローチを用いて、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な5'および3' UTRの長さを改変することができる。
【０１０１】
5'および3' UTRは、関心対象の遺伝子の天然の内因性5'および3' UTRであってよい。または、UTR配列を順方向および逆方向プライマーに組み入れることによって、またはテンプレートの他の任意の改変によって、関心対象の遺伝子にとって内因性でないUTR配列を付加することもできる。関心対象の遺伝子にとって内因性でないUTR配列の使用は、RNAの安定性および／または翻訳効率を改変するために有用な可能性がある。例えば、3' UTR配列中のAUリッチエレメントはmRNAの安定性を低下させうることが知られている。このため、当技術分野において周知であるUTRの特性に基づき、転写されたRNAの安定性が高まるように3' UTRを選択または設計することができる。
【０１０２】
1つの態様において、5' UTRは内因性遺伝子のKozak配列を含みうる。または、関心対象の遺伝子にとって内因性でない5' UTRを上記のようにPCRによって付加する場合には、5' UTR配列を付加することによってコンセンサスKozak配列を設計し直すこともできる。Kozak配列はある種のRNA転写物の翻訳の効率を高めることができるが、すべてのRNAで効率的な翻訳が可能になるのに必要なわけではないように思われる。多くのmRNAに対するKozak配列の必要性は、当技術分野において公知である。他の態様においては、5' UTRを、そのRNAゲノムが細胞内で安定しているRNAウイルスから導き出すことができる。他の態様においては、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、さまざまなヌクレオチド類似体を3'または5' UTRに用いることができる。
【０１０３】
遺伝子クローニングと必要とせずにDNAテンプレートからのRNAの合成を可能にするためには、転写のプロモーターが、転写させようとする配列の上流でDNAテンプレートと結びつく必要がある。RNAポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの5'末端に付加すると、RNAポリメラーゼプロモーターが、転写させようとするオープンリーディングフレームの上流でPCR産物に組み入れられるようになる。1つの好ましい態様において、本明細書の他所に記載したように、プロモーターはT7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが非限定的に含まれる。T7、T3およびSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。
【０１０４】
1つの態様において、mRNAは5'末端のキャップおよび3'ポリ（A）尾部の両方を有し、それらがリボソーム結合、翻訳の開始および細胞におけるmRNA安定性を決定づける。環状DNAテンプレート、例えばプラスミドDNA上では、RNAポリメラーゼは真核細胞における発現には適さない長いコンカテマー産物を生成させる。3' UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写では、転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物トランスフェクションには有効でない、正常サイズのmRNAがもたらされる。
【０１０５】
線状DNAテンプレート上で、ファージT7 RNAポリメラーゼは、転写物の3'末端をテンプレートの最終塩基を越えて伸長させることができる（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。
【０１０６】
DNAテンプレートへのポリA／T連鎖の従来の組み込み方法は分子クローニングである。しかし、プラスミドDNAに組み込まれたポリA／T配列はプラスミド不安定性を引き起こす恐れがあり、このことが、細菌細胞から得られたプラスミドDNAテンプレートに欠失および他の異常がしばしば高度に混入する理由となっている。このためにクローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、往々にして信頼性も損なわれる。これがクローニングを伴わずにポリA／T 3'連鎖を有するDNAテンプレートの構築を可能にする方法が非常に望まれる理由である。
【０１０７】
転写DNAテンプレートのポリA／Tセグメントは、ポリT尾部、例えば100T尾部など（サイズは50〜5000 Tでありうる）を含む逆方向プライマーを用いることによってPCR中に、またはDNA連結もしくはインビトロ組換えを非限定的に含む他の任意の方法によってPCRの後に生成させることができる。ポリ（A）尾部はまた、RNAに安定性を与え、それらの分解も低下させる。一般に、ポリ（A）尾部の長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関関係にある。1つの態様において、ポリ（A）尾部は100〜5000個のアデノシンである。
【０１０８】
RNAのポリ（A）尾部は、インビトロ転写後に、ポリ（A）ポリメラーゼ、例えば大腸菌ポリAポリメラーゼ（E-PAP）などを用いることによって、さらに伸長させることができる。1つの態様においては、ポリ（A）尾部の長さを100ヌクレオチドから300〜400ヌクレオチドに増やすことにより、RNAの翻訳効率が約2倍に高くなる。さらに、異なる化学基を3'末端に結びつけることもmRNA安定性を高める可能性がある。そのような付属物（attachment）は、改変／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含みうる。例えば、ポリ（A）ポリメラーゼを用いて、ATP類似体をポリ（A）尾部に組み入れることができる。ATP類似体は、RNAの安定性をさらに高めることができる。
【０１０９】
5'キャップもまた、RNA分子に安定性を与える。1つの好ましい態様において、本明細書に開示された方法によって生成されたRNAは5'キャップを含む。5'キャップは、当技術分野において公知であって本明細書に記載された手法を用いて付与される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。
【０１１０】
本明細書で開示された方法によって生成されたRNAはまた、配列内リボソーム進入部位（IRES）配列も含みうる。IRES配列は、mRNAに対するキャップ非依存的なリボソーム結合を開始させて翻訳開始を助長する、任意のウイルス配列、染色体配列または人工的に設計された配列であってよい。細胞の透過性および生存能力を高める因子、例えば糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化物質および界面活性剤などを含みうる、細胞エレクトロポレーションのために適した任意の溶質を含めることができる。
【０１１１】
いくつかの態様においては、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAの、細胞へのエレクトロポレーションが行われる。1つの態様において、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAは、インビトロ転写されたmRNAである。
【０１１２】
開示される方法は、遺伝的に改変されたT細胞が標的がん細胞を死滅させる能力の評価を含め、基礎研究および治療法において、がん、幹細胞、急性および慢性感染症、ならびに自己免疫疾患の分野で、T細胞活性のモジュレーションのために適用することができる。
【０１１３】
本方法はまた、例えばプロモーターまたは投入RNAの量を変化させることによって、発現のレベルを広範囲にわたって制御する能力も提供し、そのため発現レベルを個別に調節することが可能になる。その上、PCRに基づくmRNA生成の手法は、種々の構造およびそれらのドメインの組み合わせを有するキメラ受容体mRNAの設計を非常に容易にする。例えば、同じ細胞における複数のキメラ受容体上の種々の細胞内エフェクター／共刺激ドメインを変えることにより、多抗原標的に対する細胞傷害性の最高レベル、およびそれと同時に正常細胞に対する最も低い細胞傷害性を評価する、受容体の組み合わせの構造の判定が可能になる。
【０１１４】
本発明のRNAトランスフェクション法の1つの利点は、RNAトランスフェクションが本質的に一過性であり、かつベクターを用いないことである。RNA導入遺伝子をリンパ球に送達し、短時間のインビトロ細胞活性化の後に、その中で、いかなる別のウイルス配列も必要としない最小発現カセットとして発現させることができる。これらの条件下では、宿主細胞ゲノム中への導入遺伝子の組み込みが起こる可能性は低い。RNAのトランスフェクションの効率の高さ、およびそれがリンパ球集団全体を均質に改変させる能力があることから、細胞のクローニングは必要でない。
【０１１５】
インビトロで転写されたRNA（IVT-RNA）を用いるT細胞の遺伝的改変では、両者ともにさまざまな動物モデルで継続的に検討されてきた2種類の戦略を利用する。これらは細胞に対して、インビトロで転写されたRNAを、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによってトランスフェクトさせる。好ましくは、移入されたIVT-RNAの長期間にわたる発現を達成するために、さまざまな改変を用いてIVT-RNAを安定化することが望ましい。
【０１１６】
インビトロ転写のためのテンプレートとして標準化された様式で利用され、安定化されたRNA転写物が産生されるように遺伝的に改変されている、いくつかのIVTベクターが文献で公知である。現在、当技術分野で用いられるプロトコールは、以下の構造を有するプラスミドベクターに基づく：RNA転写を可能にする5' RNAポリメラーゼプロモーターと、それに続いて、3'および／または5'側に非翻訳領域（UTR）が隣接している関心対象の遺伝子、ならびに50〜70ヌクレオチドを含む3'ポリアデニルカセット。インビトロ転写の前に、環状プラスミドはII型制限酵素（認識配列は切断部位に対応する）によってポリアデニルカセットの下流で線状化される。したがって、ポリアデニルカセットは転写物における後のポリ（A）配列に対応する。この手順の結果として、いくつかのヌクレオチドは、線状化の後に酵素切断部位の一部として残存し、伸長するか、または3'末端でポリ（A）配列を覆い隠す。この非生理的な突出部が、そのような構築物から細胞内で産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすか否かは不明である。
【０１１７】
RNAには、より従来的なプラスミドまたはウイルスによるアプローチを上回るいくつかの利点がある。RNA供給源からの遺伝子発現は転写を必要とせず、トランスフェクション後にタンパク質産物が迅速に産生される。さらに、RNAは核ではなく細胞質に到達しさえすればよく、そのため、典型的なトランスフェクション法によって、極めて高率でのトランスフェクションがもたらされる。加えて、プラスミドに基づくアプローチは、関心対象の遺伝子の発現を作動させるプロモーターが、試験中の細胞において活性があることを必要とする。
【０１１８】
もう1つの局面において、RNA構築物はエレクトロポレーションによって細胞内に送達することができる。例えば、US 2004／0014645号、US 2005／0052630A1号、US 2005／0070841A1号、US 2004／0059285A1号、US 2004／0092907A1号に教示されているような、哺乳動物細胞への核酸構築物のエレクトロポレーションの処方物および方法を参照されたい。任意の既知の細胞型のエレクトロポレーションのために必要な電場強度を含むさまざまなパラメーターは、関連研究文献ならびに当技術分野における数多くの特許および出願において一般に公知である。例えば、米国特許第6,678,556号、米国特許第7,171,264号および米国特許第7,173,116号を参照されたい。エレクトロポレーションの治療的適用のための装置は市販されており、これには例えば、MedPulser（商標）DNA Electroporation Therapy System（Inovio／Genetronics, San Diego, Calif）があり、米国特許第6,567,694号；米国特許第6,516,223号、米国特許第5,993,434号、米国特許第6,181,964号、米国特許第6,241,701号および米国特許第6,233,482号などの特許に記載されている；また、エレクトロポレーションを、例えばUS20070128708A1号に記載されたように、インビトロでの細胞のトランスフェクションのために用いることもできる。また、エレクトロポレーションを、インビトロで細胞に核酸を送達するために利用することもできる。このように、当業者に公知の多くの利用可能なデバイスおよびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用した、発現構築物を含む核酸の細胞へのエレクトロポレーション媒介性投与は、関心対象のRNAを標的細胞に送達するための素晴らしい新たな手段となる。
【０１１９】
T細胞の供給源
拡大の前に、T細胞の供給源を対象から入手する。対象の非限定的な例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。好ましくは、対象はヒトである。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、および腫瘍を含む、数多くの供給源から入手することができる。ある態様においては、当技術分野において利用可能な任意のさまざまなT細胞株を用いることができる。ある態様において、T細胞は、フィコール分離などの、当業者に公知の任意のさまざまな手法を用いて対象から収集された血液ユニットから得られる。1つの好ましい態様において、個体の流血由来の細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス製剤は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む。アフェレーシスによって収集された細胞を、血漿画分を除去するために洗浄した上で、その後の処理段階のために細胞を適切な緩衝液もしくは培地、例えばリン酸緩衝食塩水（PBS）など、またはその後の処理段階のための、カルシウムを含まないか、もしくはマグネシウムを含まないか、もしくはすべてではないものの多くの二価カチオンを含まない洗浄液の中に入れることができる。洗浄の後に、細胞を、例えば、Ca非含有、Mg2非含有PBSといった、種々の生体適合性緩衝液中に再懸濁させることができる。または、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去して、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。
【０１２０】
もう1つの態様においては、赤血球を溶解させて、例えば、PERCOLL（商標）勾配での遠心分離によって単球を除去することによって、T細胞を末梢血から単離する。または、T細胞を臍帯血から単離することもできる。いずれの場合にも、陽性選択または陰性選択の手法によって、T細胞の特定の部分集団をさらに単離することができる。
【０１２１】
そのようにして単離された臍帯血単核細胞から、CD34、CD8、CD14、CD19およびCD56を非限定的に含む、特定の抗原を発現する細胞を除去することができる。これらの細胞の除去は、単離された抗体、抗体を含む生体試料、例えば腹水など、物理的支持体と結合した抗体、および細胞と結合させた抗体を用いて実現することができる。
【０１２２】
陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞への独自の表面マーカーに対する抗体の組み合わせによって実行することができる。好ましい方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体カクテルを使用する、負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、陰性選択によってCD4+細胞を濃縮するためのモノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。
【０１２３】
陽性または陰性選択によって望ましい細胞集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。ある態様においては、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容積の著しい減少（すなわち、細胞の濃度の増加）が望ましいことがある。例えば、1つの態様においては、1 ml当たり細胞20億個の濃度を用いる。1つの態様において、1 ml当たり細胞10億個の濃度を用いる。さらなる態様においては、1 ml当たり細胞10000万個よりも高い濃度を用いる。さらなる態様においては、1 ml当たり細胞1000万個、1500万個、2000万個、2500万個、3000万個、3500万個、4000万個、4500万個または5000万個の細胞濃度を用いる。さらにもう1つの態様においては、1 ml当たり細胞7500万個、8000万個、8500万個、9000万個、9500万個、または10000万個からの細胞濃度を用いる。さらなる態様においては、1 ml当たり細胞12500万個または15000万個の濃度を用いることができる。高濃度を用いることにより、増加した細胞収量、細胞活性化および細胞拡大を生じることができる。
【０１２４】
また、T細胞を、単球除去段階を伴わずに、洗浄段階の後に凍結することもできる。理論に拘束されることは望まないが、凍結段階およびそれに続く解凍段階は、細胞集団における顆粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な作製物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄段階の後に、これらの細胞を凍結液中に懸濁させてもよい。多くの凍結液およびパラメーターが当技術分野において公知であり、かつこの状況において有用であるが、1つの方法は、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または他の適した細胞凍結培地の使用を伴う。続いてこれらの細胞は、1分間に1℃の速度で-80℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンク内で気相中に貯蔵される。その他の制御された凍結法に加え、即時-20℃または液体窒素中の制御されない凍結を用いてもよい。
【０１２５】
1つの態様において、細胞の集団は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株を含みうる。もう1つの態様において、エレクトロポレーションを受ける細胞の集団は、末梢血単核細胞を含む。さらにもう1つの態様において、エレクトロポレーションを受ける細胞の集団は、精製されたT細胞を含む。
【０１２６】
キメラ膜タンパク質
本発明のキメラ膜タンパク質は、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント、例えば抗体などを含む。1つの態様において、キメラ膜タンパク質の細胞外ドメインは、TCR、CD3、CD28などを非限定的に含む、T細胞上の分子を標的とする。
【０１２７】
細胞外ドメイン
本発明は、T細胞上のある分子に対して方向付けられた抗体またはその断片を含む抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。その分子には、TCR、CD3、CD28、またはそれらの組み合わせなど、ただしそれらには限定されない、T細胞を共刺激する任意の分子が含まれうる。1つの態様において、細胞外ドメインは、抗CD3抗体のCD3結合ドメイン、抗TCR抗体、抗CD28抗体、またはそれらの組み合わせを含む抗原結合ドメインを含みうる。
【０１２８】
もう1つの態様において、細胞外ドメインは、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖可変断片の抗原結合ドメイン、およびそれらの断片を非限定的に含む、抗原と結合する抗体の任意の断片を含みうる。場合によっては、細胞外ドメインは、キメラ膜タンパク質が最終的に用いられることになるものと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトに用いる目的には、キメラ膜タンパク質の細胞外ドメインがヒト抗体またはその断片を含むことが有益であると考えられる。したがって、1つの態様において、細胞外ドメイン部分は、ヒト抗体またはその断片を含む。
【０１２９】
1つの態様において、抗体は、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖可変断片、およびそれらの抗原結合性断片である。
【０１３０】
細胞内ドメイン
細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域を含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインのことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。
【０１３１】
キメラ膜タンパク質の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞のエフェクター機能のうち少なくとも1つの活性化の原因である。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化した機能のことを指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であろう。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達して、細胞が特化した機能を遂行するように導く、タンパク質の部分のことを指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体を使用しうるが、多くの場合には、その鎖全体を用いることは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が用いられる範囲内において、そのような短縮部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに用いることができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、それ故に、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むものとする。
【０１３２】
キメラ膜タンパク質に用いるための細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例には、CD28、4-1BB、T細胞受容体（TCR）、共刺激分子の細胞内ドメインの任意の部分、同じ機能的能力を有する、これらの配列の誘導体または変異体、任意の合成配列、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１３３】
キメラ膜タンパク質の他のドメイン
キメラ膜タンパク質の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはキメラ膜タンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインを組み入れてもよい。本明細書で用いる場合、「スペーサードメイン」という用語は、一般に、ポリペプチド鎖中の膜貫通ドメインを、細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかと連結させる働きをする、あらゆるオリゴペプチドまたはポリペプチドのことを意味する。スペーサードメインは、最大で300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸で構成されうる。
【０１３４】
いくつかの態様において、キメラ膜タンパク質は膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、キメラ膜タンパク質ヒンジドメインをさらに含む。1つの態様において、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAは、膜貫通ドメインおよびヒンジドメイン、例えばCD28膜貫通ドメインおよびCD8-αヒンジドメインをさらに含む。
【０１３５】
ヒト抗体
ヒトにおける抗体のインビボ使用のためには、ヒト抗体を用いることが好ましいと考えられる。ヒト対象の治療的処置のためには、完全ヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法を、これらの手法の改良法と併せて含む、当技術分野において公知の種々の方法によって作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；ならびにPCT公開第WO 98／46645号、WO 98／50433号、WO 98／24893号、WO 98／16654号、WO 96／34096号、WO 96／33735号およびWO 91／10741号も参照されたい；これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。また、ヒト抗体が、重鎖および軽鎖がヒトDNAの1つまたは複数の供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされている抗体であってもよい。
【０１３６】
また、ヒト抗体を、機能的内因性免疫グロブリンを発現する能力はないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することはできるトランスジェニックマウスを用いて産生させることもできる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為に、または相同組換えによって、マウス胚性幹細胞に導入することができる。または、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することもできる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々または同時に、非機能性にすることができる。例えば、キメラマウスおよび生殖系列突然変異型マウスにおける抗体重鎖連結領域（JH）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。この改変された胚性幹細胞を増やし、胚盤胞に微量注入してキメラマウスを生じさせる。続いて、キメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスに対して、通常の様式で、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部分による免疫処置を行う。免疫処置を行ったトランスジェニックマウスから、最適な標的に対して方向付けられた抗体を、従来のハイブリドーマ技術を用いて入手することができる。トランスジェニックマウスによって保有されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子はB細胞分化の際に再編成され、その後にクラススイッチおよび体細胞突然変異を起こす。したがって、そのような手法を用いて、IgG1（γ1）およびIgG3を非限定的に含む、治療的に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を産生させることが可能である。ヒト抗体を産生させるためのこの技術の概略については、Lonberg and Huszar（Int. Rev. Immunol, 13:65-93 (1995)）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生させるためのこの技術の詳細な考察、ならびにそのような抗体を産生させるためのプロトコールについては、例えば、PCT公開第WO 98／24893号、WO 96／34096号およびWO 96／33735号；ならびに米国特許第5,413,923号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,569,825号；第5,661,016号；第5,545,806号；第5,814,318号；および第5,939,598号も参照されたく、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。加えて、Abgenix, Inc.（Freemont, Calif.）およびGenpharm（San Jose, Calif.）などの会社と、選択した抗原に対して方向付けられたヒト抗体を、上記のものに類似した技術を用いて得るための契約を結ぶこともできる。抗原負荷刺激によってヒト抗体の産生がもたらされると考えられる、生殖系列突然変異型マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入に関する具体的な考察については、例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993)；およびDuchosal et al., Nature, 355:258 (1992)を参照されたい。
【０１３７】
また、ヒト抗体を、ファージディスプレイライブラリーから導き出すこともできる（Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)；Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996)）。ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)）は、免疫処置を受けていないドナーの免疫グロブリン可変（V）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を産生させるために用いることができる。この手法によれば、抗体Vドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージ、例えばM13またはfdの主要コートタンパク質またはマイナーコートタンパク質の遺伝子中にインフレームでクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示させる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択により、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択ももたらされる。このため、ファージはB細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは種々のフォーマットで行うことができる；それらの概説については、Johnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照されたい。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに用いることができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫処置を受けたマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離している。免疫処置を受けていないヒトドナーからV遺伝子のレパートリーを構築して、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、本質的にはMarks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993)に記載された手法に従って単離することができる。米国特許第5,565,332号および第5,573,905号も参照されたく、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３８】
また、ヒト抗体をインビトロ活性化B細胞によって作製することもできる（米国特許第5,567,610号および第5,229,275号を参照。これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。また、ヒト抗体を、限定はされないが、Roder et al.（Methods Enzymol, 121:140-167 (1986)）によって記載されたものなどのハイブリドーマ手法を用いてインビトロで作製することもできる。
【０１３９】
ヒト化抗体
または、いくつかの態様においては、非ヒト抗体をヒト化し、この場合には、抗体の特定の配列または領域を、ヒトにおいて天然に産生される抗体との類似性を高めるために改変する。1つの態様において、抗原結合ドメインはヒト化される。
【０１４０】
「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保っている。しかし、あるヒト化方法を用いると、ヒトCD19抗原に対する抗体の結合の親和性および／または特異性を、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wu et al., J. Mol. Biol, 294:151 (1999)によって記載されたような「定方向進化」の方法を用いて高めることができる。
【０１４１】
ヒト化抗体は、非ヒト性である供給源からその中に導入された、1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、典型的には「インポート」可変ドメインから採られる。したがって、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子由来の1つまたは複数のCDR、およびヒト由来のフレームワーク領域を含む。抗体のヒト化は当技術分野において周知であり、本質的にはWinterらの方法（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）に従って、ヒト抗体の対応する配列を齧歯動物のCDRまたはCDR配列へと置換すること、すなわち、CDRグラフティング（EP 239,400号；PCT公開公報第WO 91／09967号；および米国特許第4,816,567号；第6,331,415号；第5,225,539号；第5,530,101号；第5,585,089号；第6,548,640号。これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）によって行うことができる。そのようなヒト化キメラ抗体では、実質的にインタクトではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際上は、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基およびおそらくはいくつかのFR残基が、齧歯動物抗体における類似部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。また、抗体のヒト化を、ベニヤリングもしくはリサーフェイシング（EP 592,106号；EP 519,596号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)；およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)）またはチェーンシャッフリング（米国特許第5,565,332号）によって達成することもでき、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４２】
ヒト化抗体を作製する上で用いられる、軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させることを目的とする。いわゆる「ベストフィット」法に従って、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。続いて、齧歯動物のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（FR）として受け入れる（Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993)；Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。もう1つの方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる（(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１４３】
抗体は、標的抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性を保ったままでヒト化することができる。本発明の1つの局面によれば、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列およびさまざまな概念上のヒト化産物の分析の過程によって、ヒト化抗体が調製される。免疫グロブリンの三次元モデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列に関して可能性のある三次元立体構造を図示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大といった所望の抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント配列およびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関与している。
【０１４４】
T細胞の拡大
1つの態様において、本発明は、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするエレクトロポレーションされたmRNAを含む、T細胞を含む。本発明はまた、ある分子に対する抗体またはその断片を含む抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインとCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするエレクトロポレーションされたmRNAを含む、エレクトロポレーションを受けた、または拡大したT細胞の集団も含む。もう1つの態様において、mRNAは集団の細胞の少なくとも1つに導入されて細胞の表面に発現される。
【０１４５】
1つの態様において、エレクトロポレーションを行って拡大させようとするT細胞の供給源は、末梢血単核細胞である。
【０１４６】
一般に、T細胞は、CD3／TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結び付けられた表面との接触によって拡大する。本発明は、エレクトロポレーションを受けた集団を培養する段階を含む、エレクトロポレーションを受けたT細胞の集団を拡大する方法を含み、この方法において、集団内に含まれるエレクトロポレーションを受けたT細胞は、少なくとも10倍に拡大する。1つの態様において、細胞の集団内の少なくとも1つの細胞はCD3を発現する。特定の理論には拘束されないが、CD3を発現する細胞は、エレクトロポレーションを受けた細胞の表面上に発現されているキメラ膜タンパク質と接触して結合すると考えられる。キメラ膜タンパク質を発現する少なくとも1つの細胞は、CD3を発現する別の細胞とも相互作用すると考えられる。これにより、エレクトロポレーションを受けたT細胞の拡大が刺激されると考えられる。
【０１４７】
本明細書において開示されるデータによって実証されているように、エレクトロポレーションを受けたT細胞を、本明細書において開示される方法によって拡大することにより、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍またはそれを上回って、またはそれを上回って、ならびにそれらの間のいずれかおよびすべての全体的および部分的な整数倍に増やすことができる。1つの態様において、T細胞は約20倍〜約50倍の範囲に拡大する。
【０１４８】
培養後に、T細胞を培養装置内にて細胞培地中で、ある期間にわたって、または細胞が最適な継代のために集密もしくは高い細胞密度に達するまでインキュベートし、その後に別の培養装置への継代を行う。培養装置は、インビトロで細胞を培養するために一般的に用いられる任意の培養装置であってよい。期間は、インビトロでの細胞の培養に適する任意の時間であってよい。T細胞培地の入れ替えは、T細胞の培養中にどの時点に行ってもよい。好ましくは、T細胞培地を約2〜3日毎に入れ替える。続いてT細胞を培養装置から採取し、その上でT細胞を直ちに用いるか、または後に用いるための貯蔵のために凍結保存することができる。1つの態様において、本方法は、培養したT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。
【０１４９】
米国特許第5,199,942号（これは参照により本明細書に組み入れられる）に記載された方法を用いて、細胞をさらに拡大することもできる。米国特許第5,199,942号に記載されたような拡大を別の選択肢としてもよく、または本明細書に記載の他の拡大方法に加えてもよい。手短に述べると、T細胞のエクスビボ培養および拡大は、米国特許第5,199,942号に記載されたものなどの細胞増殖因子の、または例えばRapid Expansion Protocol（REP）に関してDudley et al., J. Immunol., 26(4):332-342, 2003に記載されたもののような、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドなどの他の因子の添加を含む。
【０１５０】
1つの局面において、T細胞を拡大する方法は、T細胞を単離して、引き続いてエレクトロポレーションを行い、その後に培養を行う段階をさらに含みうる。
【０１５１】
本明細書において記載されるような培養段階（本明細書において記載されるような作用物質との接触）は、極めて短くてもよく、例えば、24時間未満、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23時間未満などであってよい。本明細書において記載されるような培養段階（本明細書において記載されるような作用物質との接触）は、より長くてもよく、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日、またはそれを上回る日数であってもよい。
【０１５２】
培養下にある細胞を記述するために、さまざまな用語を用いる。細胞培養物とは、一般に、生体から採取して、制御された条件下で増殖させた細胞のことを指す。初代細胞培養物とは、生物体から直接採取した、初回継代培養の前の細胞、組織または器官の培養物のことである。細胞は、それらが細胞の増殖および／または分裂を助長する条件下で増殖培地中に置かれた場合に、培養下で拡大して、その結果、より大きな細胞集団となる。細胞が培養下で拡大する場合、細胞増殖の速度は典型的には、細胞の数が2倍になるのに要する時間、別名では倍加時間としても知られる時間によって測定される。
【０１５３】
継代培養の各回は継代と称される。細胞を継代培養する場合、それらは継代されたと称される。細胞または細胞株の特定の集団は、時に、それが継代された回数によって称されるか、または特徴付けられることがある。例えば、10回継代された培養細胞集団はP10培養物と称することができる。初代培養物、すなわち、組織からの細胞の単離後の最初の培養物はP0と名付けられる。初回の継代培養後に、細胞は二次培養物（P1または継代1）と記載される。2回目の継代培養後、細胞は三次培養物（P2または継代2）となり、以後も同様である。継代の期間中には集団の倍加が数多く起こりうることが当業者には理解されよう。したがって、培養物の集団の倍加回数は継代数よりも大きい。継代間の期間中の細胞の拡大（すなわち、集団倍加の回数）は多くの要因に依存し、これには播種密度、基質、培地、および継代間の時間が非限定的に含まれる。
【０１５４】
1つの態様においては、細胞を数時間（約3時間）〜約14日間、またはその間の任意の整数値単位の時間にわたって培養することができる。T細胞の培養に適する条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβおよびTNF-α、または当業者に公知である細胞増殖のための他の添加物を含む、増殖および生存のために必要な因子を含みうる適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640または、X-vivo 15（Lonza））が含まれる。細胞の増殖のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えばN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールなどが非限定的に含まれる。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加された、血清非含有であるか、またはT細胞の増殖および拡大のために十分な、適量の血清（または血漿）もしくは規定されたホルモンのセットおよび／もしくは一定量のサイトカインが加えられた、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれうる。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は実験培養物のみに含められ、対象に注入しようとする細胞の培養物には含められない。標的細胞は、増殖を支えるために必要な条件下、例えば適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％ CO2）の下で維持される。
【０１５５】
T細胞を培養するために用いられる培地は、T細胞を共刺激しうる作用物質を含んでもよい。例えば、CD3を刺激しうる作用物質はCD3に対する抗体であり、CD28を刺激しうる作用物質はCD28に対する抗体である。これこそが、本明細書において開示されるデータによって実証されているように、本明細書において開示される方法によって単離された細胞が、およそ10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、またはそれを上回って拡大することができる理由である。1つの態様において、T細胞は、エレクトロポレーションを受けた集団を培養することによって、約20倍〜約50倍の範囲で、またはそれを上回って拡大する。
【０１５６】
もう1つの態様において、T細胞を拡大する方法は、拡大したT細胞をさらなる用途のために単離する段階をさらに含みうる。さらにもう1つの態様において、拡大する方法は、拡大したT細胞に引き続いてエレクトロポレーションを行い、その後に培養する段階をさらに含みうる。この引き続いてのエレクトロポレーションは、ある作用物質をコードするmRNAの、拡大したT細胞の集団中へのエレクトロポレーションを行う段階を含んでよく、ここでその作用物質はT細胞をさらに刺激する。作用物質は、さらなる拡大、エフェクター機能、または別のT細胞機能を刺激することなどによって、T細胞を刺激することができる。1つの態様においては、作用物質のmRNAとキメラ膜タンパク質mRNAとのコエレクトロポレーションが行われる。もう1つの態様において、作用物質のmRNAのエレクトロポレーションは、エレクトロポレーションを受けた集団を培養した後に行われる。
【０１５７】
もう1つの態様において、本方法は、拡大したT細胞の集団を、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BBLおよびPD1からなる群より選択される少なくとも1つの共刺激分子によって刺激する段階をさらに含む。
【０１５８】
治療法
本明細書に記載のT細胞を、治療法のための組成物中に含めることができる。組成物は薬学的組成物を含むことができ、かつ、薬学的に許容される担体をさらに含む。T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を投与することができる。
【０１５９】
1つの局面において、本発明は、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、対象に対して、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするmRNAを含むT細胞の有効量を投与する段階を含み、集団内の細胞のうちの少なくとも1つがキメラ膜タンパク質を発現する方法を含む。T細胞は、誘導される溶解が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）である場合など、標的細胞または組織の溶解を誘導するために投与することができる。
【０１６０】
1つの態様において、本発明は、養子細胞移入療法のための方法を含む。本方法は、T細胞を含む拡大した細胞の集団をその必要のある対象に対して、対象にとって有害である状態を予防または治療するために投与する段階を含む。この態様において、拡大した細胞の集団は、T細胞を含む細胞の集団に対して、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階であって、集団内の細胞のうちの少なくとも1つがキメラ膜タンパク質を発現する該段階；ならびに該細胞集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する該段階を含む方法に従って拡大する。
【０１６１】
もう1つの態様においては、T細胞を含む拡大した細胞の集団をその必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫亢進と関連する疾患または状態を治療する方法が提供される。拡大した細胞の集団は、T細胞を含む細胞の集団に対して、CD3に対して方向付けられた一本鎖可変断片（scFv）とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードするmRNAを用いてエレクトロポレーションを行う段階であって、集団内の細胞の少なくとも1つがキメラ膜タンパク質を発現する該段階；ならびに該細胞集団を培養する段階であって、その中に含まれるT細胞が少なくとも10倍に拡大する該段階を含む方法に従って拡大されている。
【０１６２】
本明細書において記載されたように作製された、拡大したT細胞は、均一であり、かつT細胞機能を保有する。さらに、拡大したT細胞を、哺乳動物、好ましくはヒトに対して、糖尿病、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、GVHDなどの自己免疫疾患、同種免疫寛容誘導強化、移植拒絶反応などに共通するものなどの免疫反応を抑制するために投与することができる。加えて、本発明の細胞を、免疫応答、特に細胞媒介性免疫応答の減弱化または他の様式での阻害が、疾患を治療または軽減するために望まれる、任意の状態の治療のために用いることもできる。
【０１６３】
また、本明細書において記載されたように作製された、拡大したT細胞を、自己免疫疾患を治療するために用いることもできる。自己免疫疾患の例には、後天性免疫不全症候群（AIDS、これは自己免疫性要素を伴うウイルス性疾患である）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病（AIED）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ATP）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎；慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（CIPD）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（進行性全身性硬化症（PSS）、これは全身性硬化症（SS）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ならびにヴェーゲナー肉芽腫症が非限定的に含まれる。
【０１６４】
また、本明細書において記載されたように作製された、拡大したT細胞を、炎症性障害を治療するために用いることもできる。炎症性障害の例には、慢性および急性の炎症性障害が非限定的に含まれる。炎症性障害の例には、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、骨関節炎、敗血症、脳卒中、組織および臓器の移植、血管炎、糖尿病性網膜症および人工呼吸器誘発肺損傷が非限定的に含まれる。
【０１６５】
もう1つの態様において、本明細書に記載のT細胞を、その必要のある対象における免疫応答の治療のための医薬の製造のために用いることもできる。
【０１６６】
本発明の細胞は、がんを治療するために、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒトに対して投与することができる。加えて、本発明の細胞を、疾患を治療または軽減することが望ましい場合に、がんと関連する任意の状態、特に腫瘍細胞に対する細胞媒介性免疫応答の治療のために用いることもできる。がんの例には、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、甲状腺がんなどが非限定的に含まれる。
【０１６７】
本発明の細胞は、適切な前臨床的および臨床的な実験および治験で決定される投与量および経路ならびに回数で投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内にある投与量で複数回投与することができる。本発明の細胞の投与を、当業者による判断で、所望の疾患または状態を治療するために有用な他の方法と組み合わせてもよい。
【０１６８】
投与される本発明の細胞は、治療法を受ける対象にとって、自己性、同種性または異種性であってよい。
【０１６９】
本発明の細胞の投与は、当業者に公知である任意の好都合な様式で実施することができる。本発明の細胞は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、植え込みまたは移植によって対象に投与することができる。本明細書に記載の組成物は、患者に対して、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（i.v.）注射または腹腔内に投与することができる。また別の場合には、本発明の細胞は、対象における炎症の部位、対象における局所的疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍などに直接的に注射される。
【０１７０】
また、本明細書に記載の細胞を、いくつかのマトリックスを用いて投与することもできる。本発明では、そのようなマトリックスを、典型的にはT細胞のモジュレーションを通じて免疫系を支援し、維持し、またはモジュレートするための人工リンパ系器官として作用させる新しい状況で利用する。したがって、本発明は、組織工学において有用性が実証されているそのようなマトリックス組成物および製剤を利用することができる。したがって、本発明の組成物、装置、および方法に用いうるマトリックスの種類は事実上制限がなく、生体マトリックスおよび合成マトリックスの両方が含まれてよい。1つの具体例では、米国特許第5,980,889号；第5,913,998号；第5,902,745号；第5,843,069号；第5,787,900号；または第5,626,561号によって記載された組成物および装置が利用され、そのためこれらの特許はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。マトリックスは、哺乳動物宿主に投与した場合に生体適合性であることに一般的に関連する特徴を含む。マトリックスは、天然材料および／または合成材料で形成してよい。マトリックスは、インプラントのように永続的構造または除去可能な構造を動物の体内に残すことが望ましい場合には非生分解性であってもよく；または生分解性であってもよい。マトリックスは、スポンジ、インプラント、管、テルファパッド（telfa pad）、繊維、中空糸、凍結乾燥成分、ゲル、粉末、多孔性組成物、またはナノ粒子の形態をとりうる。加えて、マトリックスを、播種された細胞または産生されたサイトカインもしくは他の活性物質の持続放出が可能になるように設計することもできる。ある態様において、本発明のマトリックスは可撓性および伸縮性であり、無機塩、水性液、および酸素を含む溶存気体状物質などの物質を透過させる半固体スカフォールドとして記載することもできる。
【０１７１】
マトリックスは、本明細書において生体適合性物質の一例として用いられる。しかし、本発明はマトリックスには限定されないため、マトリックスという用語が出てきた場合、これらの用語はいずれも、細胞の保持または細胞の移動を可能にし、生体適合性であり、かつその物質自体が半透過性膜であるようにその物質中を直接高分子が移動するかまたは特定の半透過性物質とともに用いて高分子が移動することを可能にする、装置または他の物質を含むと解釈されるべきである。
【０１７２】
薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載されたような拡大したT細胞集団を、1つまたは複数の薬学的または生理的に許容される担体、希釈剤または添加剤と組み合わせて含みうる。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；ブドウ糖、マンノース、ショ糖またはデキストラン、マンニトールなどの糖質；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；酸化防止剤；EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤を含有してもよい。本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤されることが好ましい。
【０１７３】
本発明の薬学的組成物は、治療（または予防）される疾患に適した方法で投与することができる。投与量および投与回数は、患者の状態、並びに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適量は臨床試験により決定され得る。
【０１７４】
一般に、本明細書に記載のT細胞を含む薬学的組成物は、細胞104〜109個／kg体重、好ましくは細胞105〜106個／kg体重であって、これらの範囲内のすべての整数値を含む投与量で投与することができると言うことができる。また、T細胞組成物をこれらの用量で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般的に公知である輸注手法を用いることによって投与することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照されたい）。個々の患者に関する最適な投与量および治療レジメンは、疾患の徴候に関して患者をモニタリングして、それに応じて治療を調節することによって、医療の当業者によって容易に決定されうる。
【０１７５】
ある態様においては、活性化されたT細胞を対象に投与し、続いてその後に血液を再び採取して（またはアフェレーシスを行って）、それ由来のT細胞を本発明に従って活性化した上で、これらの活性化および拡大されたT細胞を患者に再び輸注することが望ましいと考えられる。この過程を数週間毎に複数回行うことができる。ある態様において、T細胞は10ml〜400mlの採取血から活性化させることができる。ある態様において、T細胞は20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90mlまたは100mlの採取血から再活性化される。理論に拘束されるわけではないが、この複数回の採血／複数回の再輸注プロトコールを用いることは、T細胞のある特定の集団を選別するために役立つ可能性がある。
【０１７６】
本発明のある態様において、本明細書に記載の方法、またはT細胞が治療レベルまで拡大される当技術分野において公知の他の方法を用いて活性化および拡大が行われた細胞は、MS患者に対する抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン-2、シタラビン（ARA-Cとしても知られる）もしくはナタリズマブ治療、乾癬患者に対するエファリズマブ治療、またはPML患者に対する他の治療などの薬剤による治療を非限定的に含む、任意のさまざまな妥当な治療様式とともに患者に投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびFK506など、抗体、またはCAMPATHなどの他の免疫除去薬、抗CD3抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および照射と組み合わせて用いてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存型ホスファターゼのカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子が誘導したシグナル伝達に重要であるp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）かのいずれかである（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991；Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）。1つのさらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法薬、外部ビーム照射（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いるT細胞除去療法と組み合わせて（例えば、その前、同時またはその後に）、患者に投与される。もう1つの態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えばリツキサンなどによるB細胞除去療法の後に投与される。例えば、1つの態様において、対象は、高用量の化学療法薬に続いて末梢血幹細胞移植を行う標準治療を受けることができる。ある態様においては、移植後に、対象は本発明の拡大された免疫細胞の輸注を受ける。1つの追加的な態様において、拡大された細胞は、手術の前または後に投与される。
【０１７７】
患者に投与される上記の治療の投与量は、治療される状態および治療のレシピエントの厳密な性質と応じて異なると考えられる。ヒトへの投与に関する投与量の増減は、当技術分野において許容される実践に従って行うことができる。例えば、CAMPATHの用量は、一般に成人患者について1〜約100mgの範囲であり、通常は1〜30日の期間にわたって毎日投与される。好ましい一日量は1〜10mg/日であるが、場合によっては、最大40mg／日までのより多くの用量を用いることもできる（米国特許第6,120,766号に記載）。
【０１７８】
本発明において有用であると考えられる方法および組成物は、実施例に示された特定の製剤に限定されないことが理解される必要がある。以下の実施例は、当業者に対して、本発明の細胞、拡大および培養の方法、ならびに治療法の作製および使用の行い方の徹底した開示および説明を行う目的で述べられ、本発明者らが自分たちの発明とみなしていることの範囲を限定することを意図するものではない。
【０１７９】
本発明の実施には、別段の表示がある場合を除き、当技術分野の技能の範囲内にある分子生物学（組換え手法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の手法が用いられる。そのような手法は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", fourth edition (Sambrook, 2012)；"Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)；"Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010)；"Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997)；"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)；"Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002)；"Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011)；"Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002)などの文献中に十分に説明されている。これらの手法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製に適用可能であり、そのため、本発明の策定および実施において考慮されている。特定の態様のために特に有用な手法について、以下の項において考察する。
【実施例】
【０１８０】
実験的実施例
本発明を、以下の実験的実施例を参照することによってさらに詳細に説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供されるものであり、別に指定のある場合を除き、限定的であることは意図していない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるとは全くみなされるべきではなく、そうではなくて、本明細書において提供される教示の結果として明らかになる任意かつすべての変更も範囲に含むとみなされるべきである。
【０１８１】
それ以上の説明がなくても、当業者は、前記の説明および以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製して利用し、請求される方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、このため、本発明の好ましい態様を具体的に指摘したものであり、本開示のそれ以外の部分を限定するものとは全くみなされるべきでない。
【０１８２】
本明細書において開示される実験の実施に用いられる材料および方法について以下に説明する。
【０１８３】
インビトロ転写（IVT）mRNAベクターの構築：
遺伝子はすべて、公開されている配列情報を用いて、合成するか、かつ／またはPCRによって増幅して組み立てた。公開されているシークエンシング情報を用いて、PCR産物をpGEM.64Aベースのベクター中にpGEM-GFP.64AのGFPを置き換えることによってサブクローニングして、pGEM.64AベースのIVTベクターを作製した。
【０１８４】
RNAのインビトロ転写（IVT）：
mMESSAGE mMACHINE（登録商標）T7 Ultra（Ambion, Inc）などのインビトロ転写キットを用いて、IVT RNAを作製した。IVT RNA産物を、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Inc., Valencia, CA）などのRNA精製プロトコールを用いて精製した。精製されたRNAを、RNase非含有水中に約1〜2mg／mlで溶出させた。
【０１８５】
T細胞のRNAエレクトロポレーション：
PBMCまたは拡大したT細胞をエレクトロポレーションに供し、OPTI-MEM（Invitrogen）で3回洗浄し、OPTI-MEM中に最終濃度1〜3×108個／mlで再懸濁させた。その後に、0.1mlの細胞を10ugのIVT RNA（または指定の通り）と混合して、BTX EM830（Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA）などのエレクトロポレーターを用いて、2mmキュベット内でエレクトロポレーションを行った。
【０１８６】
T細胞の刺激および拡大：
PBMCに対して、抗CD3 scFv-28BBをコードするRNAを用いてエレクトロポレーションを行い、300u／mlのIL-2を加えたR10培地中で培養した。エレクトロポレーション後の第3日以後は、IL-2を含む新たな培地を培養物に1日置きに添加した。T細胞の表現型および機能を刺激後の第9日に検査した。CD3／CD28ビーズで刺激したT細胞、またはPBMCにOKT3抗体を添加することによって拡大したT細胞を、対照として用いた。
【０１８７】
エレクトロポレーションを受けたT細胞上のCAR検出：
細胞を洗浄し、FACs緩衝液（PBS＋0.1％アジ化ナトリウムおよび0.4％ BSA）中に再懸濁させた。ビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスF(ab)2抗体（マウスscFvに対して）または抗ヒト抗F(ab)2（ヒトscFvに対して）（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）を細胞に添加し、4℃で25分間インキュベートして、続いて2回洗浄した。続いて細胞をフィコエリトリン標識ストレプトアビジン（BD Pharmingen, San Diego, CA）で染色した。
【０１８８】
ELISAアッセイおよびLuminexアッセイ：
CD19を発現する種々の腫瘍細胞株である標的細胞を洗浄し、R10培地中に106個／mLで懸濁させた。各標的細胞型につき細胞10万個ずつを96ウェル丸底プレート（Corning）の2つずつのウェルに添加した。エフェクターT細胞培養物である、CD19 CAR RNAのエレクトロポレーションを受けたT細胞集団を洗浄し、R10中に106個／mLで懸濁させた。96ウェルプレートの指定のウェル内で、10万個のエフェクターT細胞を標的細胞と合わせた。さらに、T細胞のみを含むウェルも用意した。プレートを37℃で18〜20時間インキュベートした。インキュベーション後に、上清を採取して、標準的な方法（Pierce, Rockford, IL）を用いるELISAアッセイに供した。
【０１８９】
CD107a染色：
細胞を、96ウェルプレート内の160μlの完全RPMI培地中にE：T比1：1（エフェクター105個：標的105個）でプレーティングした。20μlのフィコエリトリン標識抗CD107a抗体（BD Pharmingen, San Diego, CA）を添加し、細胞を37℃で1時間インキュベートして、その後にGolgi Stopを添加し、さらに2.5時間インキュベートした。2.5時間後に10μlのFITC-抗CD8およびAPC-抗CD3を添加し、細胞を37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後に、試料をFACS緩衝液で1回洗浄した。フローサイトメトリー取得をBD FacsCalibur（BD Biosciences）を用いて行い、FlowJo（Treestar Inc, Ashland, OR）によって分析を行った。
【０１９０】
ルシフェラーゼベースのCTLアッセイ：
Nalm6-CBG（またはPDL1またはHVEMのいずれかを形質導入したNalm6-CBG）を作製して、以下の通りに、改変型のルシフェラーゼベースの細胞傷害性Tリンパ球（CTL）アッセイに用いた。Nalm6-CBG細胞を洗浄し、R10培地中に1×105個／mlで再懸濁させて、100ulのCBG標識細胞をT細胞とともに種々の比（例えば、30：1、15：1など）で37℃で一晩インキュベートした。この混合物の100ulを96ウェルの白いルミノメータープレートに移し、100ulの基質を添加して、発光を直ちに測定した。
2017533707.tif 000002
2017533707.tif 000003
2017533707.tif 000004
2017533707.tif 000005
【０１９１】
本明細書に開示された実験の結果について以下に説明する。
【０１９２】
抗CD3 OKT3抗体によって刺激されたT細胞と同程度に効率的であった、CD3 scFv-28BB RNAを用いたエレクトロポレーションを受けたT細胞の拡大：
CD3に対して方向付けられた抗体（OKT3またはH5L1）由来の一本鎖可変断片（scFv）ドメインを合成し、かつ／またはPCRによって増幅して、CD8膜貫通ドメイン、CD28および4-1BB細胞内シグナル伝達ドメインと連結させて、pGEM.64A RNAベースのベクター中にサブクローニングした（図1）。RNAを改変pGEM.64A構築物（OKT3-28BB RNAまたはH5L1 RNA）から合成し、末梢血単核細胞（PBMC）に対してエレクトロポレーションを行った。2例の正常PBMCドナーから入手したPBMC集団においてT細胞の拡大を評価した。OKT3-28BB RNAエレクトロポレーション後に拡大したPBMCを、抗CD3 OKT3抗体とともにインキュベートしたPBMCと比較した。この結果により、OKT3-28BB RNAエレクトロポレーション後に拡大したT細胞は、OKT3抗体刺激後のT細胞の拡大と同程度に効率的であることが実証された（図2）。
【０１９３】
CD3 scFv-28BB RNAのエレクトロポレーションを受けたPBMCから拡大したT細胞は、OKT3抗体で刺激されたT細胞と類似の表現型を呈し、かつ、より優れたエフェクター機能を示した：
OKT3によるPBMCの刺激、抗CD3／抗CD28でコーティングしたビーズによる精製されたT細胞の刺激（ビーズ）、またはOKT-28BB RNAもしくはH5L1-28BB RNAのいずれかによってPBMCにエレクトロポレーションを行うことを含む、異なる方法によって拡大したT細胞の表現型を評価した。その結果により、OKT-28BBまたはH5L1-28BBをコードするRNAによるPBMCのエレクトロポレーションによって得られたT細胞の表現型は、OKT3抗体によって刺激したPMBC由来のT細胞のものと類似しており、これにはエフェクターメモリーT細胞（CD45RO+／CD62L-）が多数含まれており、一方、抗CD3／抗CD28ビーズで刺激したT細胞は、均一にセントラルメモリー表現型（CD45RO+／Cd62L+）である表現型を呈した（図3）。
【０１９４】
T細胞をさらに、CD19 CARをコードするRNAによるエレクトロポレーション後の機能に関しても評価した。エレクトロポレーションが行われたCD19 CAR RNAの発現は、T細胞集団のそれぞれで同程度であった（図4）。OKT3抗体で刺激したPBMCから得られた、CD19 CAR RNAのエレクトロポレーションを受けたT細胞集団、OKT-28BB RNAのエレクトロポレーションを受けたPBMC、H5L1-28BB RNAのエレクトロポレーションを受けたPBMC、および抗CD3／抗CD28ビーズで刺激したPBMCを、T細胞をCD19陽性腫瘍細胞株Nalm6とコインキュベートした後のCD107aアップレギュレーションに関して評価した（図5Aおよび5B）。その結果により、OKT-28BB RNAのエレクトロポレーションを受けたT細胞におけるCD107a発現は、OKT3抗体または抗CD3／抗CD28ビーズによって刺激したT細胞よりも高度であることが実証された。OKT-28BB RNAのエレクトロポレーションを受けたPBMCから得られたT細胞は、抗腫瘍活性による評価で、OKT3抗体およびCD3／CD28ビーズのいずれで刺激されたT細胞よりも機能が強固であった。
【０１９５】
共刺激分子、スイッチ受容体およびサイトカインをコードするRNAのコエレクトロポレーションを通じての、拡大したT細胞のさらなる最適化：
RNAエレクトロポレーションによって追加の分子を加えることによって、RNAのエレクトロポレーションを受けたPBMCの拡大を通じて得られたT細胞をさらに強化できるか否かを検討するために、図10に列記した通りに、OKT-28BB RNAを、共刺激分子、スイッチ受容体またはサイトカインをさまざまな組み合わせでコードするRNAと混合した。RNAのエレクトロポレーションを受けたPBMCから得られたT細胞の表現型および機能を、OKT3抗体で刺激したPBMCから得られたT細胞と比較した。表現型分析を図6に示す。OKT-28BB RNAエレクトロポレーションにより得られたT細胞（OKT-28bb-1）は、OKT3抗体刺激により得られたT細胞との比較で、セントラルメモリーT細胞の表現型を呈した。OKT-28BB RNAエレクトロポレーションにより得られたT細胞でのおよそ54.54％に対して、OKT3抗体刺激により得られたT細胞の約25.08％がCCR7／CD62L二重陽性細胞であった。
【０１９６】
さらに、他のRNAである、プログラム細胞死1（programmed cell death 1：PD1）、CD83、CD86、4-1BBL、PD1-CD28またはIL-21をコードするRNAと、OKT-28BB RNAとのエレクトロポレーションを行ったところ、T細胞拡大が増加した。OKT-28bb-2およびOKT-28bb-6では、T細胞拡大は約64.85％（OKT-28bb-5）から約69.21％（OKT-28bb-3）にさらに増加した。PD1は、OKT-28BB RNAのみのエレクトロポレーションを受けたPBMCから得られたT細胞において有意にアップレギュレートされたが、PD1／CD27二重陽性細胞は、OKT-28BB RNAのエレクトロポレーションを受けたPBMCから得られたT細胞で約32.37％検出されたのに対して、OKT3抗体で刺激したPBMCから得られたT細胞において検出されたPD1／CD27二重陽性細胞は6.24％であった。T細胞拡大段階における他のRNAのコエレクトロポレーションでも、拡大したT細胞集団の一部であるOKT-28bb-6（9.30％）およびOKT-28bb-2（14.08％）ではPD1発現が減少した。
【０１９７】
CD19 CAR RNAを用いたエレクトロポレーションを受け、かつCD19を発現する種々の腫瘍細胞株とともにインキュベートした拡大したT細胞（CD19 CAR T細胞）において、サイトカイン産生として、インターフェロン-γ（図7）およびIL-2（図8）について評価した。他のRNAとのコエレクトロポレーションの結果、種々のCD19腫瘍細胞株とのインキュベーション後のCD19 CAR RNA T細胞から、さまざまなレベルでのIFN-γ分泌が生じた。OKT-28BB RNAを用いたエレクトロポレーションを受けたPBMCから得られたCD19 CAR RNA T細胞からは、OKT3抗体で刺激したPBMCから得られたCD19 CAR RNA T細胞よりも高レベルのIL-2が分泌された。
【０１９８】
CD19 CAR RNA T細胞の溶解能力も測定した。CD19 CAR RNA T細胞を、CD19陽性細胞株である、Nalm6、およびPLL1またはHVEMを形質導入したNalm6とともにインキュベートした。溶解活性は、いくつかのCD19 CAR RNA T細胞、特にOKT-288bb-2およびOKT-28bb-4で低下した（図9）。対照的に、CD19 CAR RNAのエレクトロポレーションを受けたOKT-28bb-1およびOKT-28bb-3 T細胞における溶解活性は、PBMCのOKT3抗体刺激によって得られたCD19 CAR RNA T細胞と同程度に良好であった。OKT-28BB RNAエレクトロポレーションによって拡大されたCD19 CAR RNA T細胞からはより多くのセントラルメモリーT細胞が生じたものの、それらが腫瘍細胞を死滅させる能力は、主にエフェクターメモリー細胞である、OKT3抗体で刺激されたT細胞と同程度に効率的であった（図10）。
【０１９９】
概念実証として、NSGマウスに対して、1E6 Nalm6-ESO-CBGを第0日に注射した（静脈内）。第7日の時点で、NY-ESO-T TCR（1G4 TCR）RNAのエレクトロポレーションを受けたOKT3-28BB RNA T細胞（RNA-T）またはCD3／CD28ビーズT細胞（ビーズ）を1×106個、注射した（静脈内）。腫瘍量を生物発光イメージングによってモニターした。図11は、TCRが移入されたRNA-T細胞において、ビーズで刺激されたT細胞よりも優れた腫瘍抑制が観察されたことを示している。
【０２００】
RNA-T細胞へのレンチウイルス形質導入の効率を検討するために、第1日または第2日のRNA T細胞を採取して、1.5×106個／mlの細胞密度で、24ウェルプレートに、0.5ml、1mlまたは2ml／ウェルとして分注した。0.1mlの濃縮4D5.BBZレンチウイルスベクター（力価5×106／ml）を各ウェルに添加した。対照として、4D5.BBZレンチウイルスベクターを、CD3／CD28ビーズで刺激した第1日または第2日のT細胞に指定通りの感染多重度（MOI）で添加した。刺激後の第9日に、拡大したT細胞を、形質導入されたCAR発現の検出のためのフローサイトメトリー染色に供した（図12）。
【０２０１】
図13に示す結果は、レンチウイルス形質導入を受けたRNA T細胞および非形質導入RNA T細胞がいずれも、CD3／CD28ビーズで刺激したT細胞と同程度に効率的に拡大したことを指し示している。
【０２０２】
レンチウイルス形質導入を受けたRNA T細胞、またはビーズで刺激したT細胞を、続いて、Her2陽性細胞株であるSK-OV3、MCF7およびMDA231、またはHer2陰性腫瘍株であるMDA468によって4時間刺激して、CD107a発現をフローサイトメトリーによって検出した。図14を参照されたい。
【０２０３】
レンチウイルス形質導入を受けたRNA-T細胞におけるサイトカイン産生を、ビーズで刺激したT細胞と比較した。レンチウイルス形質導入を受けたRNA T細胞、またはビーズで刺激したT細胞を、Her2陽性細胞株であるSK-OV3、MCF7およびMDA231、またはHer2陰性腫瘍株であるMDA468によって4時間刺激した。一晩のインキュベーション後にサイトカインレベルをELISAによって分析したところ、レンチウイルス形質導入を受けたRNA T細胞は、ビーズで刺激したT細胞よりも多くのIL-2およびIFN-γを産生した（図15）。
【０２０４】
本明細書に引用された特許、特許出願および刊行物のそれぞれおよびすべての開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。具体的な態様を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物も当業者によって考案されうることは明らかである。添付された特許請求の範囲は、そのようなすべての態様および等価な変形物を含むことを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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