(57)【要約】  本発明は、多重分析方法の結果を確実にするために用いることができる対照に関する。したがって、本発明は、１つまたはいくつかの対照を含む固体支持体、および試料中に潜在的に存在するいくつかの分析物を検出するための多重分析方法でのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの対照スポットおよび分析物に対する少なくとも２つの検出スポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む、少なくとも１つの試料の多重分析に適切な固体支持体であって、前記対照スポットは、試料の沈着を対照するためのスポット、分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットおよびレポーターの沈着を対照するためのスポットからなる群から選択されることを特徴とする固体支持体。
【請求項２】
前記対照スポットまたは複数の前記対照スポットの１つが、試料の沈着を対照するためのスポットまたは分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットであることを特徴とする、請求項１に記載の固体支持体。
【請求項３】
前記コンパートメントが、レポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのスポットを含むことを特徴とする、請求項２に記載の固体支持体。
【請求項４】
前記コンパートメントが、試料の沈着を対照するための少なくとも１つのスポットおよび分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも１つのスポットを含むことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項５】
試料の沈着を対照するための前記スポットが、対照化合物の少なくとも１つの捕捉リガンドを含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項６】
分析物の検出リガンドの沈着を対照するための前記スポットが、添加剤の少なくとも１つの捕捉リガンドを含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項７】
レポーターの沈着を対照するための前記スポットが、間接マーカーまたは間接マーカーに結合した担体分子を含むことを特徴とする、請求項１または３から６のいずれか一項に記載の固体支持体。
【請求項８】
少なくとも１つの対照ビーズおよび分析物に対する少なくとも２つの検出ビーズを含む、試料の多重分析に適切なビーズのセットであって、前記対照ビーズは、試料の沈着を対照するためのビーズ、分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズおよびレポーターの沈着を対照するためのビーズからなる群から選択されることを特徴とするビーズのセット。
【請求項９】
試料の沈着を対照するための少なくとも１つのビーズ、分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも１つのビーズおよび任意選択でレポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのビーズを含む、請求項８に記載のビーズのセット。
【請求項１０】
少なくとも１つの試料中の少なくともｎ個の分析物を検出するための多重分析方法であって、ｎは２以上の整数であり、前記方法は、
ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのコンパートメントを含む少なくとも１つの固体支持体、または請求項８または９に記載のビーズの少なくとも１つのセットを用意するステップ、
ｂ）前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に、検出するｐ個の分析物のｌ個の検出リガンド、および適用可能であれば少なくとも１つの添加剤を置くステップであって、ｌは好ましくはｐ以上である、ステップ、
ｃ）分析する試料を前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くステップ、
ｄ）前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に、
検出するｍ個の分析物のｌ’個の検出リガンド、および適用可能であれば、前記添加剤（複数可）の少なくとも１つの検出リガンドを置くステップであって、ｌ’は好ましくはｍ以上である、ステップ、
ｅ）前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に、
対照化合物の少なくとも１つの検出リガンドおよび検出するｙ個の分析物のｌ’’個の検出リガンドを置くステップであって、ｌ’’は好ましくはｙ以上である、ステップ
のうち、少なくともステップａ）、ｃ）およびｅ）または少なくともステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）を含み、
ｌ、ｌ’、ｌ’’、ｍ、ｐおよびｙは０以上の整数であり、ｍ＋ｐ＋ｙの合計は１以上である、多重分析方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのレポーターを前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くことからなる後続のステップｆ）を含む、請求項１０に記載の多重分析方法。
【請求項１２】
ステップｆ）の前記レポーターまたは前記レポーターの少なくとも１つが間接マーカー、例えば酵素に結合していること、および前記方法が、ステップｆ）の前記レポーターに結合した前記間接マーカーの少なくとも１つの第２のレポーターを、前記コンパートメントの前記スポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くことからなる後続のステップｇ）を含み、前記第２のレポーターが、例えば、好ましくはルミノール、イソルミノールまたはそれらの誘導体の１つの中から選択される基質であることを特徴とする、請求項１１に記載の多重分析方法。
【請求項１３】
試料の多重分析を確実にするための、試料の沈着の少なくとも１つの対照、および／または分析物の検出リガンドの沈着の少なくとも１つの対照、および／またはレポーターの沈着の少なくとも１つの対照の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つまたはいくつかのステップを含む多重分析法の結果を確実にするために用いることができる対照に関する。
【背景技術】
【０００２】
多重分析法は、同じ試料の中のいくつかの分析物の潜在的存在の同時検出を可能にする。多重分析は、同時にいくつかの分析物の分析を可能にすることによる時間的節約、試薬および消耗品のより少ない消費、ならびに分析物を検出するために必要なより少ない量の試料などの、いくつかの利点を有する。
【０００３】
１つまたはいくつかの分析物の存在の検出を追求する分析法の終了後に得られる結果を検証するために、１つまたはいくつかの対照を用いることが一般的である。分析装置によって提供される結果の信頼性は、特にそれが医学的診断および／または献血の資格証明を目的とする分析を伴う場合は、実際主要な問題である。
【０００４】
伝統的に用いられる１つの陽性対照は、既知量で用いられ、その潜在的な存在が所与の試料で追求される分析物に対応する、既知化合物の検出を検証することからなる。しかし、このタイプの対照は、分析方法の全体的実行だけを検証することを可能にし、その方法の各ステップを検証することを可能にしない。
【０００５】
さらに、他のタイプの対照を用いることができる。例えば、国際公開第２００４／０４６６８５号パンフレットの文献では、免疫組織化学試験で用いられる試薬の品質を検証するために対照を用いる。その目的のために、異なる対照化合物の一連の溶液を含む、対照のスライドが用いられる。前記対照化合物の特異的抗体または前記対照化合物のレポーターもしくは基質がイムノマーキング法（immuno-marking method）の間に用いられるならば、対照化合物での対照スライドの陽性着色だけが観察されなければならない。試薬の品質を検証するためのこの方法は、対照スライドにおける多数の対照化合物の使用を必要とする。
【０００６】
実際、多重分析法の場合、ステップの全部、特に、試料の沈着（deposition）、試薬の沈着、異なる水およびインキュベーションサイクルを制御することを可能にする単純な手段は現在ない。しかし、高いレベルの安全およびトレーサビリティを達成することは、輸血および医学的診断の分野で重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、多重分析方法の実行の間に得られた結果の信頼性を保証することを可能にし、特にその方法の各ステップを検証することを可能にする解決方法を提供する、実際的な必要性がある。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、多重分析方法の各ステップが正しく起こったことを検証することによって（その方法の全体的実行を検証することだけによってではなく）、得られた結果の信頼性を保証することを可能にする対照手段の、本発明者らによる発見に基づく。したがって、本発明者らは、試料自体の沈着、より一般的にはその方法の異なるステップを検証することを可能にする対照を初めて提供する。
【０００９】
したがって、本発明による２つまたは３つの対照だけを組み合わせることによって、試料の沈着ステップ、試料で検出される分析物の特異的検出リガンドの沈着ステップ（複数可）、異なる洗浄およびインキュベーションステップ、ならびに適用可能であれば、検出マーカーのレポーターの沈着ステップおよび／または前記レポーターに結合したマーカーの基質の沈着ステップを検証することが可能である。
【００１０】
本発明による多重分析方法では、全体の多重方法の各ステップを検証するのに２つまたは３つの対照だけが必要である。
【００１１】
結果の検証の他に、本発明による対照の使用は、多重分析方法の実行の間に存在する潜在的な誤りを特定すること、および、例えば分析方法の実行を改善するために対応するステップ（複数可）を改変することを可能にする。
【００１２】
本発明は、実行するのが容易であり、限られた数の対照だけを必要とし、分析方法に追加のステップを加えることなく、追加の機器の使用を必要としない（例えば、分光計の使用を必要としない）利点を有する。実際、分析方法のステップは単一の位置（例えば、試料が置かれるウェルを有するチューブ）で行われ、例えばスポットまたはビーズの形の対照は、分析物を検出するために用いられるスポットまたはビーズと同時に処理される。
【００１３】
本発明による第１のタイプの対照は、試料の沈着の検証を可能にする、試料の沈着の対照である。下で概説されるある特定の実施形態では、試料の沈着の対照は、１つまたはいくつかの分析物検出リガンドの沈着の検証も可能にする。
【００１４】
「試料または添加剤の沈着」または「試料または添加剤の添加」は、固体支持体に固定された目的の化合物の存在下に、試料または少なくとも１つの添加剤を置くことを指す。
【００１５】
「少なくとも１つ」は、本出願の意味の範囲内で１つまたはいくつかを指し、いくつかは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１６超を特に意味する。
【００１６】
「検出リガンド、レポーターまたは基質の沈着」または「検出リガンド、レポーターまたは基質の添加」は、固体支持体に固定された目的の化合物および目的の前記化合物に固定された任意の化合物の存在下に、検出リガンド、レポーターまたは基質を置くことを指す。
【００１７】
第２のタイプの対照は、試料で検出される分析物の１つまたは複数の特異的検出リガンド（例えば検出リガンドの混合物）の沈着を検証することを可能にする、分析物の検出リガンドの沈着の対照である。この対照は、インキュベーションおよび洗浄ステップを検証することも可能にする。
【００１８】
第３のタイプの対照は、発色ステップ（複数可）が正しく起こったことを検証することを可能にするレポーターの沈着の対照である。レポーターの沈着の対照は、検出リガンドの間接マーキングの場合に有益である。
【００１９】
最後に、本発明による対照は、マイクロアレイで、例えばマイクロプレートタイプの固体支持体において、または液体チップにおいて、例えばビーズ型の固体支持体において多重分析方法を実行するのに特に適切である。
【００２０】
試料
分析する試料は、好ましくは生体試料である。
【００２１】
生体試料は、体液、例えば血液、血液派生物（血漿または血清など）、尿、脳脊髄液、唾液の試料、または組織試料、例えば生検によって得られた組織、細胞もしくは細胞のセット、植物抽出物、またはそれらの組合せであってもよい。
【００２２】
血液派生物は、血液試料から得られる任意の産物、特に体液を指す。
【００２３】
分析する試料は、培地および／または培養上清であってもよい。
【００２４】
分析する前に、試料は１つまたはいくつかの前の処理ステップ、例えば希釈、遠心分離、加熱および／または化学的処理、細胞溶解（例えば、１つまたはいくつかのカオトロピック剤、１つまたはいくつかの還元剤および／または加熱による）、抽出、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、マーキングされていない検出リガンドまたはそれらの組合せの添加を受けることができる。マーキングされていない検出リガンドの添加は、それ自体当業者に公知の試験である中和試験を実行するために特に有益である。
【００２５】
試料は、同じ性質または異なる性質であってもよい少なくとも２つの試料の混合物であってもよい。
【００２６】
異なる性質の試料の混合物の例は、血液と血清の混合物、血液と血漿の混合物、血清と血漿の混合物または血液、血清および血漿の混合物である。
【００２７】
本発明による１つの好ましい試料は、血液および／または血液派生物の試料または試料の混合物である。
【００２８】
分析物
試料で検出される分析物は、試料で検出および／または数量化しようとする天然または合成の任意のタイプの化合物であってもよい。
【００２９】
分析物は、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、炭水化物、脂質、細胞、オルガネラ、ウイルスまたは核酸であってもよい。
【００３０】
細胞は、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物、後生動物細胞、酵母細胞、真菌細胞または原生動物であってもよい。
【００３１】
核酸は、一本鎖または二本鎖の形態の、ホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオチドのポリマー、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはそれらの類似体、例えばホスホロチオエートまたはチオエステルを指す。
【００３２】
分析物または分析物の少なくとも１つまたは分析物（複数）は、例えば、抗原、抗体、抗体断片、ハプテン、ホルモン、ホルモン受容体、酵素または核酸からなる群から選択される。
【００３３】
好ましい一実施形態では、分析物（複数可）は核酸ではない。
【００３４】
分析物（複数可）は、例えば、抗原、抗体、抗体断片、ハプテン、ホルモン、ホルモン受容体および酵素からなる群から選択される。
【００３５】
本明細書では、「抗原」は、抗体または免疫系の細胞によって認識され、それが適切な条件下で宿主の免疫系に提示される場合に免疫応答を引き起こすことが可能である、天然、組換えまたは合成の分子を指す。これは、線状または立体配置的であってもよい少なくとも１つのエピトープを含む、またはそれからなる分子、特にポリペプチドであってもよい。用語「線状エピトープ」は、前記抗原に対する抗体分子に結合することが可能な、３〜１５、より一般的には５〜１５アミノ酸、好ましくは少なくとも６、８、１０または１２アミノ酸を含む、または一般的にそれからなるポリペプチド、特にペプチドを指す。用語「立体配置的エピトープ」は、抗体によって認識され、空間のいくつかのアミノ酸の並置によって決定される三次元構造を指し、それは、この抗体が向けられるタンパク質（またはポリペプチド）のペプチド配列が連続でなくてもよいが、それは、ポリペプチド鎖の折畳みのために空間でお互いに近接し、したがって、抗体が認識することができるパターンを形成することができる。
【００３６】
抗原は、例えば、タンパク質（特に天然または組換えタンパク質）、ペプチド（例えば、合成ペプチド）、糖タンパク質、炭水化物または脂質であり、前記ペプチドは、担体分子、例えばＢＳＡ（ウシの血清アルブミン）と関連することも関連しないこともできる。
【００３７】
本出願では、「担体分子」は、タンパク質または炭水化物の担体分子を特に指す。担体分子はポリペプチド（特にタンパク質またはペプチド）であってもよく、それは天然であってもなくても（例えば、組換えタンパク質または合成ペプチド）、官能基化ポリマーであってもなくても（例えば、デキストラン、多糖またはポリリシン）または混合コポリマーであってもなくても（特に異なるアミノ酸のコポリマー、例えばリシン−チロシンコポリマー）よい。担体分子は、抗体（特にモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）、例えば免疫グロブリンであってもよい。
【００３８】
担体分子の一例は、ＢＳＡである。
【００３９】
具体的な一実施形態では、担体分子は、抗体ではない。
【００４０】
本明細書では、「ハプテン」は、免疫系が認識することが可能であるが、それが担体分子に結合している場合だけ免疫原性である、低分子量分子を指す。
【００４１】
分析物または分析物の少なくとも１つは、好ましくは、対象で病的であっても病的でなくてもよい状態を診断すること、または病的であっても病的でなくてもよい状態の発症リスクを診断することを可能にする化合物である。非病的状態の例は、妊娠である。
【００４２】
対象は、ヒト、ヒト以外の動物または植物であってもよい。ヒト以外の動物は、好ましくは哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、サル、ウサギ、マウスまたはラットである。
【００４３】
用語「ヒト」は広義で用いられ、特に任意の年齢の男女、例えば小児、児童、青年、成人または高齢者を指す。
【００４４】
分析物または分析物の少なくとも１つが抗原である場合は、それは、好ましくは、感染、例えばウイルス、細菌、真菌または寄生虫によって引き起こされる感染の診断を可能にする抗原である。
【００４５】
分析物または分析物の少なくとも１つが抗体である場合は、それは、好ましくは、感染、例えばウイルス、細菌、真菌または寄生虫によって引き起こされる感染の診断を可能にする抗体である。
【００４６】
一般的に、これは、
−  ウイルス、例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）、ＨＴＬＶ（ヒトＴリンパ親和性ウイルス）、特にＨＴＬＶ−ＩまたはＨＴＬＶ−ＩＩ、
−  寄生虫、例えばヒトまたはヒト以外の動物でトキソプラズマ症（特にトキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii））、マラリア（特にプラスモディウム属の寄生虫、例えば熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）またはプラスモディウム・ノウレシ（Plasmodium knowlesi））またはシャガス病（特にクルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi））を引き起こすことができる寄生虫、または
−  細菌、例えばヒトまたはヒト以外の動物で梅毒（梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum））またはライム病（特にボレリア属からの細菌）を引き起こすことができる細菌
の１つまたはいくつかの抗原および／または１つまたはいくつかの抗体を含むことができる。
【００４７】
本明細書では、「寄生虫」は、体に関して寄生虫として作用して寄生虫症を引き起こす、後生動物または原生動物を指す。したがって、本発明の意味の範囲内で、寄生虫はウイルスでも、細菌でも真菌でもない。
【００４８】
分析物または分析物の少なくとも１つは、疾患のマーカー、例えば心血管疾患のマーカーまたは糖尿病マーカー、肝炎などの疾患の発生のマーカー、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫によって引き起こされる感染症の発生のマーカー、療法、例えば抗ウイルス療法、抗生物質療法またはがん療法への抵抗性のマーカーであってもよい。
【００４９】
多重分析方法の間、試料で本出願に記載のいくつかの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１５を超える数の）分析物を同時に検出することができる。これは、対象の同じ試料で、１つまたはいくつかの感染症もしくは疾患、感染症もしくは疾患の発生、状態（病的または非病的）、状態（病的または非病的）を発症するリスク、または療法への抵抗性のマーカーを診断することを可能にすることができる。
【００５０】
多重分析方法の間に検出される分析物は、同じ性質のもの（例えば、抗体だけまたは抗原だけ）または異なる性質のもの（例えば、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの抗体）であってもよい。
【００５１】
好ましくは、検出される分析物（複数可）は、検出マーカーでマーキングされていない。
【００５２】
好ましい一実施形態では、検出される分析物（複数可）は、抗体および／または抗原の中から選択される。
【００５３】
対照化合物
本明細書では、「対照化合物」は、分析する試料中に、好ましくは同じ性質の試料の全てで検出可能な濃度で天然に存在する化合物を指す。
【００５４】
分析する試料中に天然に存在する化合物は、試料中に最初から存在する化合物または試料中に最初から存在する化合物の誘導体であってもよい。
【００５５】
試料中に最初から存在する化合物の誘導体は、分析方法の前の試料の１つまたはいくつかの処理ステップの終わりに得ることができる。これらのステップは、特に上で規定されるもの、例えば、熱および／もしくは化学的処理、細胞溶解、抽出、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、マーキングされていない検出リガンドの添加またはそれらの組合せである。
【００５６】
試料中に最初から存在する化合物の誘導体は、例えば、熱および／もしくは化学的処理、細胞溶解、マーキングされていない検出リガンドの添加またはそれらの組合せによって改変されたＰＣＲ生成物および／または化合物である。
【００５７】
好ましくは、分析する試料中に天然に存在する化合物は、試料中に最初から存在する化合物である。この場合、分析方法の前に試料の１つまたはいくつかの処理ステップが実行されるならば、その化合物はしたがって試料のいかなる前処理ステップの前にも存在する。
【００５８】
分析する試料中に天然に存在する化合物は、分析時に試料中に存在する化合物を含まないが、それは、試料の１つまたはいくつかの前処理ステップの間に添加されたか、または試料に添加された化合物に由来する。
【００５９】
試料が少なくとも２つの試料の混合物である場合、対照化合物は、前記試料の少なくとも１つ、好ましくは混合物の各試料に天然に存在する化合物である。
【００６０】
「同じ性質の試料」は、適用可能であれば同じ処理ステップ（複数可）を経た、異なる対象でまたは同じ対象で異なる時間間隔で実質的に同じ方法で抜き取られた同起源の試料を指す。
【００６１】
「検出可能な濃度」は、試験、特に対照化合物が固体支持体に固定された捕捉抗体に結合し、マーキングされた検出抗体によって検出されるサンドイッチタイプの免疫学的試験の間に、対照化合物の存在の検出を可能にする濃度である。
【００６２】
好ましくは、対照化合物の濃度は、同じ性質の試料でほとんど異ならない。
【００６３】
本明細書では、「対照化合物の濃度は同じ性質の試料でほとんど異ならない」という表現は、試料間で６０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは２０％未満しか異ならない濃度を意味し、濃度はμｇ／ｍＬで与えられる。
【００６４】
有利な一実施形態では、対照化合物は、それらの分析物が存在する場合、検出される分析物（複数可）の濃度と同じ桁の濃度で試料中に存在する。好ましくは、対照化合物は、検出される分析物の各々の濃度と同じ桁の濃度で試料中に存在する。
【００６５】
対照化合物の濃度は、測定される分析物の各々の濃度と同じ桁である。
【００６６】
好ましくは、対照化合物の濃度は、それが試料中に存在する場合、分析する前記分析物のそれより５０倍を超えてより低いかより高く、好ましくは少なくとも４０倍、より好ましくは少なくとも３０倍である。
【００６７】
例えば、１ｎｇ／ｍＬの分析する分析物の濃度に対して、対照化合物の濃度は、１００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以下である。
【００６８】
好ましくは、その分析物を含有する分析試料中の分析物の濃度と対照化合物のそれとの間の偏りが、５０倍以下、好ましくは４０倍以下、より好ましくは３０倍以下である場合、対照化合物の濃度は分析物の濃度と同じ桁である。
【００６９】
ヒトまたは動物起源の試料の場合、対照化合物は、その分析について問題のヒトまたは動物の集団の中で保持される構造を好ましくは有する。好ましい一実施形態では、対照化合物は、考慮される集団の中で多型を有しない。
【００７０】
対照化合物は、好ましくは疾患のマーカーではない。
【００７１】
少なくとも１つの分析物が抗体によって検出される場合、対照化合物は好ましくは抗体によって検出可能な化合物である。
【００７２】
対照化合物は、抗体によって検出可能であるように、試料のいかなる可能な前処理ステップ（複数可）によっても好ましくは変更されない。
【００７３】
対照化合物は、分子、または同一であっても異なってもよい少なくとも２つの分子の複合体であってもよい。
【００７４】
一例として、分析する試料が血液または血漿試料、特にヒト血液またはヒト血漿である場合、対照化合物は、トランスフェリンとの複合型のトランスフェリンの可溶性受容体、ホルモン、例えばステロイド、凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子または第ＸＩＩＩ因子から選択される凝固因子であってもよい。
【００７５】
具体的な一実施形態では、対照化合物は、第ＸＩＩＩ因子ではない。
【００７６】
特定の一実施形態では、対照化合物はＧ型の免疫グロブリン（ＩｇＧ）、特にヒトＩｇＧではなく、および／またはＭ型の免疫グロブリン（ＩｇＭ）、特にヒトＩｇＭではなく、またはより一般的に免疫グロブリン、特にヒト免疫グロブリンではない。
【００７７】
トランスフェリンとの複合型のトランスフェリンの可溶性受容体は、トランスフェリンの可溶性受容体の２つの分子および２つのトランスフェリン分子を含む複合体である。
【００７８】
例えば、トランスフェリンとの複合型のトランスフェリンの可溶性受容体は、対象の状態と関係なく、ヒト対象から来る分析試料中に０．８μｇ／ｍＬ〜４μｇ／ｍＬを含む濃度で一般に存在する。
【００７９】
対照化合物の濃度が、例えば試料の性質および／または試料がとられた対象の状態に基づいて異なり得る場合は、少なくとも２つの異なる対照化合物を用いることが有利かもしれない。
【００８０】
添加剤
添加剤は、試料中に存在しない、すなわち試料中に最初から存在しないか、または試料中に最初から存在する化合物に由来しない化合物または化合物のセットである。
【００８１】
添加剤は特に抗原またはハプテンであってもよく、前記抗原または前記ハプテンは担体分子に結合することができるか、結合していない。
【００８２】
一例として、ヒトまたは動物の生体試料の場合、分析する試料中に存在しない化合物または化合物の１つは、例えば、ジゴキシゲニン、植物ホルモン、アルカロイド、植物ステロイド、核酸および殺有害生物剤からなる群から選択される。
【００８３】
好ましい一実施形態では、添加剤は核酸ではない。
【００８４】
ジゴキシゲニンは、ある特定の植物から抽出されたステロイドである。
【００８５】
殺有害生物剤は、例えば、有機リン化合物または有機塩素化合物などの殺虫剤、およびトリアジンまたはフェニル尿素などの除草剤、またはそれらの組合せである。
【００８６】
本発明による１つの好ましい添加剤は、担体分子と結合したジゴキシゲニン、担体分子と結合したオーキシン、担体分子と結合したトリアジンであり、前記担体分子は例えばＢＳＡである。
【００８７】
本発明による１つの好ましい添加剤は、ＢＳＡに結合したジゴキシゲニンである。
【００８８】
さらに、添加剤は多重分析方法の実行の間に分析物の検出に干渉しない。特に、添加剤は、検出される分析物、用いる捕捉リガンド（複数可）、用いる検出リガンド（複数可）、対照化合物（複数可）、適用可能であればレポーター（複数可）、適用可能であれば基質（複数可）、およびシグナルの検出に干渉しない。
【００８９】
特定の一実施形態では、添加剤は、ビオチンもしくはビオチンの類似体、および／またはアビジンもしくはアビジンの類似体（特にストレプトアビジンまたはニュートラアビジン）を含まないかまたはそれからならず、前記ビオチン、アビジンまたはそれらの類似体の１つは担体分子に接がれるかまたは接がれない。
【００９０】
捕捉リガンド
捕捉リガンドは、固体支持体に、特にビーズのスポットまたは表面に固定された化合物である。
【００９１】
捕捉リガンドは、好ましくは固体支持体に、特にビーズのスポットまたは表面に固定される抗体または抗原である。
【００９２】
捕捉リガンドは、試料で検出される分析物、対照化合物または添加剤に特異的であってもよい。
【００９３】
捕捉リガンドは、抗体、抗原、ペプチド、炭水化物、脂質または核酸であってもよい。
【００９４】
好ましい一実施形態では、捕捉リガンドは、核酸ではない。
【００９５】
好ましい一実施形態では、捕捉リガンドは、抗体、抗原、ペプチド、炭水化物および脂質からなる群から選択される。
【００９６】
捕捉リガンドは、好ましくは抗体または抗原である。
【００９７】
捕捉リガンドが抗体である場合は、それは、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む。
【００９８】
検出リガンド
検出リガンドは、それが特異的である化合物の存在を明らかにすることを目的とする。
【００９９】
検出リガンドは、抗体、抗原、ペプチド、炭水化物、脂質または核酸であってもよい。
【０１００】
好ましい一実施形態では、検出リガンドは核酸ではない。
【０１０１】
好ましい一実施形態では、検出リガンドは、抗体、抗原、ペプチド、炭水化物および脂質からなる群から選択される。
【０１０２】
検出リガンドは、好ましくは抗体または抗原である。
【０１０３】
検出リガンドが抗体である場合は、それは、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む。
【０１０４】
検出リガンドは、好ましくは、マーキングされた検出リガンド、すなわち検出マーカー（それは、例えばビオチンまたはペルオキシダーゼであってもよい）が共有結合または非共有結合によって結合した検出リガンドである。
【０１０５】
検出リガンドがマーキングされていない場合は、前記検出リガンドのマーキングされた特異的抗体を用いることによってその検出を得ることができる。
【０１０６】
検出リガンドは、試料で検出される分析物、対照化合物または添加剤に特異的であってもよい。
【０１０７】
検出リガンドは、検出マーカーのいかなる存在も除いて、用いられる捕捉リガンドもしくは用いられる捕捉リガンドの１つと同一であってもよく、および／または、捕捉リガンドもしくは捕捉リガンドの１つが結合するのと同じゾーンでそれが特異的である化合物に結合してもよい。この場合には、前記捕捉リガンドおよび前記検出リガンドが抗体であるならば、それは「相同的サンドイッチ」を含む。
【０１０８】
立体障害による、それらが特異的である化合物に関する捕捉リガンドと検出リガンドの競合を回避するように、捕捉リガンドおよび検出リガンドまたは検出リガンドの１つは、それらが特異的である化合物の別々のゾーンに特異的であってもよい。この場合には、前記検出リガンドおよび前記捕捉リガンドが抗体であるならば、それは「非相同サンドイッチ」を含む。
【０１０９】
好ましい一実施形態では、同じ化合物に特異的である検出リガンドおよび捕捉リガンドは、前記化合物の同じ位置に結合しない。より好ましくは、前記検出リガンドは、前記捕捉リガンドとの結合ゾーンから遠い前記化合物のゾーンに結合する。
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、検出リガンドは、検出マーカーのいかなる存在も除いて、捕捉リガンドと同一であり、および／または、特に、それが特異的である化合物が少なくとも２つの同一の結合ゾーンを有する複合体の形である場合、前記捕捉リガンドが結合するのと同じゾーンでそれが特異的である化合物に結合する。
【０１１１】
検出マーカー
検出マーカーは、直接マーカーまたは間接マーカーであってもよい。
【０１１２】
直接マーカーは、そのシグナルを直接的に、すなわちレポーターの事前の添加を必要とすることなく検出することができるマーカーである。
【０１１３】
直接マーカーは、例えば、放射性同位体、蛍光色素、およびランタニドなどの周期表の重元素、発光性の化合物、ルテニウムなどの遷移金属、発色性の、および有色、蛍光性または発光性のナノ粒子からなる群から選択される。
【０１１４】
本出願では、「発光性の化合物」は、電子発光、熱発光または（好ましくは）化学発光化合物を特に指す。
【０１１５】
直接マーカーとして用いることができる一例の発光性化合物（より具体的には、熱発光性の化合物）は、ジオキセタン化合物、特に１，２−ジオキセタン化合物、またはジオキセタン化合物の誘導体、例えば１，２−ジオキセタンの誘導体の分子を含む（例えば、注入された）シリカナノ粒子からなる。
【０１１６】
間接マーカーは、そのシグナルの検出がレポーターの事前の添加、および適用可能であれば、前記レポーターに結合したマーカーの基質の添加を必要とするマーカーである。
【０１１７】
レポーターは、間接マーカーの基質または間接マーカーに特異的に結合する分子であり、前記分子それ自体は直接もしくは間接マーカーであるかまたは直接もしくは間接マーカーにそれ自体結合する。
【０１１８】
間接マーカーは、例えば、酵素（特に、基質から発光性の化合物を生成する酵素）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ハプテン、抗原または抗体であってもよい。
【０１１９】
酵素のレポーターは、例えば、前記酵素の基質である。
【０１２０】
発光性化合物のレポーターは、例えば、酵素または触媒である。
【０１２１】
ビオチンのレポーターは、例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンであり、好ましくは直接マーカーまたは間接マーカー、例えば酵素または触媒に結合している。
【０１２２】
一例の酵素は、ペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。
【０１２３】
本発明による１つの好ましいビオチンレポーターは、ペルオキシダーゼ、好ましくはホースラディッシュペルオキシダーゼに結合しているストレプトアビジンである。
【０１２４】
本発明の特定の一実施形態では、用いる検出マーカーまたは検出マーカーの１つは、ルミノール（３−アミノフタルヒドラジド、別称５−アミノ−２，３−ジヒドロ−フタラジン−１，４−ジオン、分子式Ｃ８Ｈ７Ｎ３Ｏ２）、イソルミノール（別称４−アミノフタルヒドラジド）、アクリジン、セレンテラジン、ジオキセタンまたは過酸化シュウ酸化合物、またはそれらの誘導体の１つ、特に刊行物Dodeigne C. et al (2000), Talanta 51, 415-439, "Chemiluminescence as diagnostic tool. A review"に記載の化合物であるか、またはそれを基質として有する。
【０１２５】
本発明の好ましい一実施形態により、用いる検出マーカーまたは検出マーカーの１つは、ルミノール、イソルミノールまたはそれらの誘導体の１つを基質として有する。
【０１２６】
ルミノールまたはイソルミノールの誘導体は、好ましくは、全ての可能な改変（複数可）（例えば、化学的および／または酵素的）を通してルミノールまたはイソルミノールからそれぞれ得られる分子である。ルミノールまたはイソルミノールの誘導体は、例えば、ペルオキシダーゼ酵素の基質であり、前記ペルオキシダーゼ酵素とルミノールまたはイソルミノールの前記誘導体との反応は、化学発光化合物の生成を可能にする。
【０１２７】
イソルミノールの誘導体は、例えば、刊行物Dodeigne C. et al (2000), Talanta 51, 415-439, "Chemiluminescence as diagnostic tool. A review"に記載の通り、アミノエチルイソルミノール（またはＡＥＩ）、アミノエチルエチルイソルミノール（またはＡＥＥＩ）、アミノブチルイソルミノール（またはＡＢＩ）、アミノブチルエチルイソルミノール（またはＡＢＥＩ）、アミノペンチルエチルイソルミノール（またはＡＰＥＩ）、アミノヘキシルイソルミノール（またはＡＨＩ）、アミノヘキシルエチルイソルミノール（またはＡＨＥＩ）、アミノオクチルメチルイソルミノール（またはＡＯＭＩ）またはアミノオクチルエチルイソルミノール（またはＡＯＥＩ）であってもよい。
【０１２８】
発色
発色ステップ（複数可）は、検出マーカー（複数可）によって生成されるシグナルの検出に対応する。
【０１２９】
検出されたシグナルが蛍光発光シグナルである場合は、「生成されたシグナル」は特に「放出されたシグナル」である。
【０１３０】
発色ステップ（複数可）は、用いられるマーカーのタイプに依存する。
【０１３１】
蛍光体タイプの直接マーカーによって生成または放出されるシグナルは、蛍光によって直接的に読み取ることができる。
【０１３２】
酵素タイプ、発光性化合物タイプまたはビオチンタイプの間接マーカーは、レポーターの添加を必要とする。
【０１３３】
上で示されるように、ビオチンタイプの間接マーカーは、レポーター、好ましくはマーカーに結合しているレポーターの添加を必要とする。
【０１３４】
レポーターが間接マーカー、例えば酵素に結合している場合は、後のステップでその間接マーカーの基質、例えばその酵素の基質を添加することが必要である。
【０１３５】
一例として、レポーターがペルオキシダーゼに結合している場合は、後のステップでルミノールなどのその酵素の基質を添加することが必要である。
【０１３６】
好ましい一実施形態では、シグナルは化学発光によって検出され、前記シグナルは、ペルオキシダーゼ酵素とその基質、例えばルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体との反応によって生成される化学発光化合物によって生成される。ペルオキシダーゼ酵素とその基質とのこの反応は、酸化剤、および適用可能であれば、電子伝達体の存在も一般に必要とする。
【０１３７】
一般に、化学発光反応は、少なくとも２つの溶液を含むキットを用いて行われる。
【０１３８】
第１の溶液は、ペルオキシダーゼの基質、例えばルミノール、イソルミノールおよび／またはルミノールもしくはイソルミノールの誘導体、ならびに電子伝達体を含む。第２の溶液は、酸化剤を含む。一例として、以下のキットを用いることができる：「Ｉｍｍｕｎ−ｓｔａｒ  ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃ」（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、「ＥＬＩＳＴＡＲ  ＥＴＡ  Ｃ  Ｕｌｔｒａ  ＥＬＩＳＡ」（Ｃｙａｎａｇｅｎ、Ｉｔａｌｙ）、「Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ」（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、「Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  ＨＲＰ」（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）。
【０１３９】
確実な多重分析に適切な固体支持体
本発明による分析方法を実行するために用いられる支持体（複数可）は、固体支持体である。
【０１４０】
固体支持体は、分析方法を実行するのに適切な任意の材料から作製することができる。
【０１４１】
固体支持体は、例えば、ポリマーまたはポリマーの混合物のベースを有する支持体である。本発明による適切な固体支持体は、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリブタジエンまたはそれらの組合せから作製される支持体である。
【０１４２】
本発明による別のタイプの適切な固体支持体は、例えば、無機の支持体、例えばガラスおよび／または金属支持体である。
【０１４３】
支持体は、プレート、マイクロプレート、スライド、ビーズまたは膜の形であってもよい。
【０１４４】
適切な固体支持体の別の例は、膜、例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦ（フッ化ポリビニリデン）、ナイロンまたはそれらの組合せから作製される膜である。
【０１４５】
１つの好ましい固体支持体は、ポリスチレンまたはポリプロピレンから作製される。
【０１４６】
用いる技術によって、多重分析方法は、単一の固体支持体、例えば少なくとも２つのスポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体を用いて、または、固体支持体のセットにおいて、例えばビーズのセットにおいて実行することができる。
【０１４７】
本発明による対照は、単一の固体支持体において、または固体支持体のセットにおいて使用するために転位可能である。第１の場合には、対照および分析物の検出手段はスポットの形であり、第２の場合には、対照および分析物の検出手段はビーズの形である。
【０１４８】
ビーズ（「粒子」、「マイクロビーズ」または「微粒子」と呼ぶこともできる）は、溶液もしくは懸濁液の状態であってもよく、または別の固体支持体、例えばプレート、マイクロプレート、スライドもしくは膜に固定されてもよく、特に固体支持体（例えばマイクロプレート）の１つまたはいくつかのウェルの底に固定されてもよい。
【０１４９】
使用する固体支持体（複数可）によって、試料の沈着の対照は、試料の沈着を対照するスポットまたは試料の沈着を対照するビーズと呼ばれ、分析物の１つまたはいくつかの検出リガンド（複数可）の沈着の対照は、分析物の検出リガンドの沈着を対照するスポットまたは分析物の検出リガンドの沈着を対照するビーズと呼ばれ、レポーターの沈着の対照は、レポーターの沈着を対照するスポットまたはレポーターの沈着を対照するビーズと呼ばれる。
【０１５０】
好ましい一実施形態では、固体支持体（複数可）は、サンドイッチタイプの免疫学的試験の形の多重分析を実行するのに適切である。
【０１５１】
本発明による固体支持体は、試料のマトリックスから独立して分析物を検出することができる利点も有する。例えば、血液に存在する分析物の検出は、血液試料または血液派生物、例えば血漿もしくは血清、または血液および／または血液派生物試料の混合物から、本発明による固体支持体を用いて実行することができる。
【０１５２】
スポット上での確実な多重分析に適切な固体支持体
本発明は、少なくとも１つの対照スポットおよび分析物に対する少なくとも２つの検出スポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む、少なくとも１つの試料の多重分析に適切な固体支持体であって、前記対照スポットは、試料の沈着を対照するためのスポット、分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットおよびレポーターの沈着を対照するためのスポットからなる群から選択されることを特徴とする固体支持体に特に関する。
【０１５３】
固体支持体は、少なくとも１つのコンパートメント（分析ゾーンとも呼ばれる）、好ましくは少なくとも２つのコンパートメントを含む。
【０１５４】
本発明の１つの特定の実施形態により、固体支持体は単一のコンパートメントを含む。前記単一のコンパートメントは、１つまたはいくつかの壁を含むコンパートメントであってもよい。あるいは、前記単一のコンパートメントは壁を有さなくてもよく、その場合、固体支持体自体と同等であってもよい。コンパートメントの底は、その場合、固体支持体の上面からなることができる。１つまたはいくつかの壁を含むまたは含まなくてもよい単一のコンパートメントを含むそのような固体支持体の一例は、スライドまたは膜である。
【０１５５】
固体支持体（例えばスライドまたは膜）が単一のコンパートメントを含む本発明の１つの特定の実施形態では、一般的に、分析試料１つにつき少なくとも１つの（例えば１つまたは２つの）固体支持体が用いられる。
【０１５６】
固体支持体が少なくとも２つのコンパートメントを含む場合は、それらがお互いと連絡しないように、すなわち分析のために用いられる様々な組成物または溶液が分析の間に１つのコンパートメントから別のものに循環することができないように、それらはお互いから隔離される。したがって、１つのコンパートメントに添加される溶液は、他のコンパートメントに入らない。例えば、コンパートメント（複数可）は、底および１つまたはいくつかの壁を含む、またはそれで構成され、前記壁（複数可）は、コンパートメント（複数可）がお互いと連絡しないようにお互いからコンパートメント（複数可）を隔離する。
【０１５７】
分析試料１つにつき、固体支持体の１つのコンパートメントが用いられる。
【０１５８】
１つの例のコンパートメントは、ウェルである。
【０１５９】
固体支持体は、例えば、マイクロプレートである。
【０１６０】
マイクロプレートは、一般的に９６ウェルまたは３８４ウェルのマイクロプレートである。
【０１６１】
試料を分析するために用いられる固体支持体のコンパートメントは、少なくとも３つのスポット、例えば３つのスポット、４つのスポットまたは５つのスポット、または少なくとも６つのスポット、好ましくは６つのスポット、７つのスポット、８つのスポット、より好ましくは少なくとも９つのスポット、例えば９つのスポット、１０個のスポット、１１個のスポット、１２個のスポット、１３個のスポット、１４個のスポット、１５個のスポット、１６個のスポットまたは１６を超える数のスポットを含む。
【０１６２】
本明細書では、「スポット」は、非共有結合による物理化学的相互作用（特に、弱い結合タイプの、例えば、イオン性、ファンデルワールス、水素および／または疎水性の）を通して、および／または共有結合によってコンパートメントの表面に結合した、少なくとも１つの目的化合物を含む固体支持体のコンパートメントのゾーンを指す。
【０１６３】
スポットは、目的の化合物（複数可）の他に、少なくとも１つのポリマー、特に親水基を含む少なくとも１つのポリマー、例えば少なくとも１つのヒドロゲルを含むことができる。
【０１６４】
「少なくとも」は、本出願の意味の範囲内で、１つまたはいくつかを指し、いくつかは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６または１６超を特に意味する。
【０１６５】
スポットは、一般に球状または卵形で小さい、例えば０．００７８ｍｍ２〜５．３０９ｍｍ２、好ましくは０．１９６ｍｍ２〜３．１４２ｍｍ２、より好ましくは０．５０３ｍｍ２〜２．０１１ｍｍ２の、明確なゾーンに相当する。
【０１６６】
スポットは、円板状、円筒状または概ね円板状もしくは円筒状の形状、例えば固体支持体がマイクロプレートまたはスライドである場合は特に卵形を有することができる。
【０１６７】
あるいは、スポットは、例えば固体支持体が膜である場合は、四角または長方形（これは特にストリップであってもよい）を、または任意の他の形状を有することができる。
【０１６８】
スポットは、当業者に周知の技術、例えば米国特許第７，４７０，５４７Ｂ２号明細書、米国特許第６，５７６，２９５Ｂ２号明細書、米国特許第５，９１６，５２４Ａ号明細書および米国特許第５，７４３，９６０Ａ号明細書で開示されるものを用いて得られる。
【０１６９】
例えば、スポットは、コンパートメントの表面の特定位置に、目的の前記化合物（複数可）の所定量を含有する溶液の少なくとも１滴を沈着して得られる。
【０１７０】
スポットが少なくとも１つのポリマー（例えば少なくとも１つのヒドロゲル）を含む場合、前記スポットは、前記ポリマーが前に沈着されているコンパートメントの表面の特定位置に、目的の前記化合物（複数可）の所定量を含有する溶液の少なくとも１滴を沈着して得ることができる。
【０１７１】
スポットは、コンパートメントの表面の特定位置での目的の前記化合物（複数可）のｉｎ  ｓｉｔｕ合成によって得ることもできる。目的の前記化合物（複数可）は、この場合、プローブの資格がある。これは、核酸またはペプチドを含むことができる（例えば米国特許第５，１４３，８５４号明細書の文献を参照する）。
【０１７２】
コンパートメントの表面は、「固相」とも呼ばれる。
【０１７３】
目的の化合物は、一般に、捕捉リガンド、間接マーカーに結合した担体分子または間接マーカーである。捕捉リガンド、間接マーカーに結合した担体分子および間接マーカーは、特に上で規定した通りである。
【０１７４】
有利な一実施形態では、固体支持体の各コンパートメントは、同数のスポットを含む。さらに、固体支持体の各コンパートメントは、同数のスポットおよび同じスポット組成を含む。
【０１７５】
別の有利な実施形態では、支持体は、スポットのない、または異なる数のスポットおよび／もしくはスポット組成を有する１つまたはいくつかのコンパートメントを含むことができる。支持体の一部または全体は、例えば、少なくとも２つの別々の群（またはタイプ）のスポットまたはコンパートメントを含むことができ、別々の群の各々は異なる数のスポットおよび／またはスポット組成を有する。
【０１７６】
コンパートメントは、少なくとも１つの対照スポット（例えば、試料の沈着を対照するための少なくとも１つのスポット）、好ましくは少なくとも２つの対照スポット、および分析物に対する少なくとも２つの検出スポットを含む。
【０１７７】
コンパートメントは、検出する分析物１つにつき少なくとも１つのスポットを一般に含み、各分析物は、例えば、検出する感染症もしくは疾患、感染症もしくは疾患の発生、対象の状態（病的または非病的）、状態（病的または非病的）を発症するリスク、または治療への抵抗性のマーカーに対応することができる。コンパートメントのいくつかのスポットは、同じ分析物を分析することを目的とすることもできる。
【０１７８】
試料の沈着を対照するための、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットは、好ましくは捕捉リガンドを含む。捕捉リガンドは、特に上で規定される通りである。
【０１７９】
同じスポットがいくつかの異なる捕捉リガンド（例えば、いくつかの抗体および／または抗原）を含むことができ、それらは検出される同じ病状、感染症または疾患に一般的に特異的（特に、同じウイルス、同じ細菌、同じ真菌または同じ寄生虫に特異的）であるか、または対象の感染症もしくは疾患の同じ発生、同じ状態（病的または非病的）、状態（病的または非病的）を発症する同じリスク、または療法への抵抗性の同じマーカーに特異的である。
【０１８０】
本発明は特に、少なくとも１つの対照スポットおよび分析物に対する少なくとも２つの検出スポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む、少なくとも１つの試料の多重分析に適切な固体支持体であって、前記対照スポットは、試料の沈着を対照するためのスポット、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットであることを特徴とする固体支持体に関する。前記コンパートメントは、レポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのスポットをさらに含むことができる。
【０１８１】
好ましい一実施形態では、試料の沈着を対照するための、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットは、１つまたは少なくとも１つの捕捉リガンドを含み、前記捕捉リガンド（複数可）は核酸ではない。
【０１８２】
より一般的には、試料の沈着を対照するための、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットは、好ましくは核酸を含まない。
【０１８３】
好ましい一実施形態では、試料の沈着を対照するための、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットは、抗体、抗原、ペプチド、炭水化物および脂質からなる群から選択される１つまたは少なくとも１つの捕捉リガンドを含む。
【０１８４】
本発明は特に、少なくとも２つの対照スポットおよび分析物に対する少なくとも２つの検出スポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む、少なくとも１つの試料の多重分析に適切な固体支持体において、前記対照スポットは、試料の沈着を対照するためのスポット、分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットおよびレポーターの沈着を対照するためのスポットからなる群から選択されることを特徴とする固体支持体に関する。
【０１８５】
本発明による固体支持体は、確実な多重分析を可能にする。
【０１８６】
有利な一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの対照スポットおよび分析物に対する少なくとも２つの検出スポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む、少なくとも１つの試料の多重分析に適切な固体支持体において、前記対照スポットは、試料の沈着を対照するためのスポットおよび分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのスポットの中から選択されることを特徴とする固体支持体に関する。
【０１８７】
固体支持体のコンパートメント（複数可）は、例えば、試料の沈着を対照するための少なくとも２つのスポットまたは分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも２つのスポットを含むことができる。
【０１８８】
好ましい一実施形態では、固体支持体のコンパートメント（複数可）は、試料の沈着を対照するための少なくとも１つのスポットおよび分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも１つのスポットを含む。
【０１８９】
上で説明されるように、少なくとも１つの検出リガンドの間接マーキングの場合には、コンパートメント（複数可）がレポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのスポットを含むことが有益である。
【０１９０】
本発明は、少なくとも１つの試料の多重分析に適切な固体支持体であって、試料の沈着を対照するための少なくとも１つのスポット、分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも１つのスポット、レポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのスポットおよび分析物を検出するための少なくとも２つのスポットを含む少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体にも関する。
【０１９１】
したがって、固体支持体のコンパートメント（複数可）は、少なくとも２つの異なる間接マーカーが関与する分析のために、レポーターの沈着を対照するための少なくとも２つのスポット、例えばレポーターの沈着を対照するための２つまたは３つのスポットを含むことができる。この場合には、レポーターの沈着を対照するための各スポットは、マーカーに特異的である。
【０１９２】
確実な多重分析に適切なビーズのセット
固体支持体がビーズである場合は、試料のための多重分析方法はビーズのセットで行われる。
【０１９３】
したがって、本発明は、少なくとも１つの対照ビーズおよび分析物に対する少なくとも２つの検出ビーズを含む、試料の多重分析に適切なビーズのセットであって、対照ビーズは、試料の沈着を対照するためのビーズ、分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズおよびレポーターの沈着を対照するためのビーズからなる群から選択されることを特徴とするビーズのセットにも関する。
【０１９４】
本出願の意味の範囲内で、「少なくとも１つのビーズＸ」は、少なくとも１つのタイプ（または群）のビーズＸを意味し、「ビーズＸ」は、「対照ビーズ」、「試料の沈着を対照するためのビーズ」、「分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズ」または「レポーターの沈着を対照するためのビーズ」を意味することができる。
【０１９５】
本発明の意味の範囲内の「ビーズのタイプ」（または「ビーズの群」）は、いくつかのビーズ（例えば、１０、５０、１００、２００、３００または５００個のビーズ）を含む、またはそれからなり、それらはお互いと同一であるか、または少なくともいくつかのビーズは目的の同じ化合物（複数可）が固定される表面にある。
【０１９６】
同様に、「少なくとも２つのビーズＸ」は、少なくとも２つのビーズＸもしくは２つの異なるタイプ（または群）のビーズＸを意味し、「ビーズＸ」は、「対照ビーズ」、「分析物を検出するためのビーズ」、「試料の沈着を対照するためのビーズ」、「分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズ」または「レポーターの沈着を対照するためのビーズ」を意味することができる。
【０１９７】
各ビーズは、「固相」とも呼ばれる、ビーズの表面に結合している目的の少なくとも１つの化合物でも覆われる。
【０１９８】
試料を分析するために用いられるビーズのセットは、少なくとも３つのビーズ（またはビーズのタイプ）、例えば３、４または５つのビーズ（またはビーズのタイプ）、または少なくとも６つのビーズ（またはビーズのタイプ）、好ましくは６、７、８つのビーズ（またはビーズのタイプ）、より好ましくは少なくとも９つのビーズ（またはビーズのタイプ）、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のビーズまたは１６個のビーズ（またはビーズのタイプ）、または１６を超える数のビーズ（またはビーズのタイプ）を含む。
【０１９９】
本出願では、「ビーズ」、「粒子」、「マイクロビーズ」または「微粒子」は、サイズが直径０．３μｍ〜１００μｍ、好ましくは０．５μｍ〜４０μｍであってもよい、好ましくは球状または概ね球状の任意の粒子を意味する。そのような粒子は、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＭｅｒｃｋおよびＤｙｎａｌ社によって製造される。本発明との関連で用いることができるビーズは、立方体もしくは厚板の形、または概ね立方体もしくは厚板の形の粒子であってもよく、その側の長さは、例えば、０．３μｍ〜１００μｍ、好ましくは０．５μｍ〜４０μｍであろう。
【０２００】
本発明によるビーズは、好ましくは、生体試料の構成成分と比較して不活性である１つまたはいくつかのポリマーで構成され、それは、分析する試料中で固体かつ不溶性である。用いることができる不活性ポリマーの例は、ポリエステル、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリアミド、多糖、ポリウレタンまたはセルロースである。
【０２０１】
目的の１つまたはいくつかの化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、脂質、炭水化物または核酸）の固定または結合を可能にするために、１つまたはいくつかの官能基を前記不活性ポリマー（複数可）に組み込むことができる。当業者に公知であるこれらの官能基は、アミン（＝ＮＨ２）官能基またはアンモニウム官能基（−ＮＨ３＋または−ＮＨＲ、Ｒは脂肪族鎖、好ましくは
−  炭素原子数１からｚの、直鎖状または分枝状の（置換されたまたは無置換の）アルキル鎖、ｚは好ましくは１から２０の整数である、
−  炭素原子数２からｚの、直鎖状または分枝状のアルケニル鎖、ｚは好ましくは１から２０の整数である、または
−  アリール基）、
アルコール官能基（−ＯＨ）、カルボキシル官能基（−ＣＯＯＨ）、イソシアネート官能基（−ＮＣＯ）、チオール官能基（ＳＨ）またはエポキシ官能基からなる群から選択することができる。−ＣＯＯＨカルボキシル官能基をポリオレフィンに導入するために最も一般的に用いられる単量体は、アクリル酸またはメタクリル酸である。
【０２０２】
ビーズは、当業者に周知の任意の適切な方法を用いて、目的の１つまたはいくつかの化合物で実際覆われる。ビーズ表面への目的の化合物（複数可）の固定は、静電引力、親和性相互作用、疎水性相互作用および／または共有結合によって行うことができる。
【０２０３】
好ましい一実施形態では、目的の化合物（複数可）は、共有結合によってビーズ表面に固定される。
【０２０４】
ビーズの表面に１つまたはいくつかの化合物を固定する方法は、当業者に周知である（例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ（登録商標）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ＫｉｔＵｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ、Joseph Dasso et al. (Journal of Immunological Methods 263 (2002) 23- 33)による論文または国際公開第１９９７／０１４０２８号パンフレットの文献を参照）。
【０２０５】
例えば、その表面にカルボキシル化学官能基を含むビーズの場合、これらの化学官能基は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドとの反応によって形成される活性化エステルに変換することができる。目的の化合物、例えば抗体、タンパク質またはペプチドは、次に目的の前記化合物に存在する遊離アミン基によって、各ビーズの活性化エステル基に接ぐことができる。活性化エステル型への変換およびビーズへの目的の化合物の結合は、当業者に周知の手順を用いて行われる（例えば、米国特許第７，１４１，３６２号明細書を参照）。
【０２０６】
方法の異なるステップの間、特に洗浄ステップの終わりでのビーズの回収を可能にするために、ビーズのセットのビーズまたはビーズの一部は、好ましくは磁気ビーズ、例えばＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（登録商標）技術を用いたビーズである。
【０２０７】
各ビーズは、ビーズのセットの他のビーズからそれを区別することができるように、コードで、例えば蛍光コードまたはバーコードでマーキングされる。
【０２０８】
コード、例えば蛍光またはバーコードによるビーズのマーキングは、例えば、欧州特許第１，８０２，７１０号明細書および欧州特許第１，０４９，８０７号明細書の文献に記載の、当業者に周知である任意の適切な方法を用いて行うことができる。
【０２０９】
少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体に関しては、目的の化合物は、一般に、捕捉リガンド、間接マーカーに結合した担体分子または間接マーカーである。捕捉リガンド、間接マーカーに結合した担体分子および間接マーカーは、特に上で規定した通りである。
【０２１０】
本発明によるビーズのセットは、所望の１対照につき１つのビーズ（またはビーズのタイプ）および検出する１分析物につき少なくとも１つのビーズ（またはビーズの少なくとも１つのタイプ）を含む。いくつかのビーズ（またはビーズのタイプ）を、同じ分析物の検出を目的とさせることもできる。
【０２１１】
試料の沈着を対照するための、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズは、好ましくは捕捉リガンドを含む。捕捉リガンドは、特に上で規定される通りである。
【０２１２】
同じビーズ（または所与のタイプのビーズの各ビーズ）をいくつかの異なる捕捉リガンド（例えば、いくつかの抗体および／または抗原）で覆うことができ、それらは一般的に検出する同じ感染症に特異的であり、特に同じウイルス、同じ細菌または同じ寄生虫に特異的である。
【０２１３】
したがって、ビーズのセットは、少なくとも１つの対照ビーズ（例えば、試料の沈着を対照するための少なくとも１つのビーズ）、好ましくは少なくとも２つの対照ビーズ、および分析物に対する少なくとも２つの検出ビーズを含む。
【０２１４】
分析する１試料につき、ビーズの少なくとも１つのセットが用いられる。
【０２１５】
本発明は特に、少なくとも１つの対照ビーズおよび分析物に対する少なくとも２つの検出ビーズを含む、少なくとも１つの試料の多重分析に適切なビーズのセットにおいて、前記対照ビーズは、試料の沈着を対照するためのビーズ、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズであることを特徴とするビーズのセットに関する。前記ビーズのセットは、レポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのビーズをさらに含むことができる。
【０２１６】
好ましい一実施形態では、試料の沈着を対照するための、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズは、１つまたは少なくとも１つの捕捉リガンドを含み、前記捕捉リガンド（複数可）は核酸ではない。
【０２１７】
より一般的には、試料の沈着を対照するための、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズは、好ましくは核酸を含まない。
【０２１８】
好ましい一実施形態では、試料の沈着を対照するための、または分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズは、抗体、抗原、ペプチド、炭水化物および脂質からなる群から選択される１つまたは少なくとも１つの捕捉リガンドを含む。
【０２１９】
本発明は、少なくとも２つの対照ビーズおよび分析物に対する少なくとも２つの検出ビーズを含む、試料の多重分析に適切なビーズのセットにおいて、前記対照ビーズは、試料の沈着を対照するためのビーズ、分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズおよびレポーターの沈着を対照するためのビーズからなる群から選択されることを特徴とするビーズのセットに特に関する。
【０２２０】
有利な一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの対照ビーズおよび分析物に対する少なくとも２つの検出ビーズを含む、試料の多重分析に適切なビーズのセットにおいて、前記対照ビーズは、試料の沈着を対照するためのビーズおよび分析物の検出リガンドの沈着を対照するためのビーズの中から選択されることを特徴とするビーズのセットに関する。
【０２２１】
ビーズのセットは、例えば、試料の沈着を対照するための少なくとも２つのビーズまたは分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも２つのビーズを含むことができる。
【０２２２】
好ましい一実施形態では、ビーズのセットは、試料の沈着を対照するための少なくとも１つのビーズおよび分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも１つのビーズを含む。
【０２２３】
上で説明されるように、分析物に対する少なくとも１つの検出リガンドの間接マーキングの場合には、レポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのビーズを用いることが有利である。
【０２２４】
本発明は、試料の多重分析に適切なビーズのセットであって、試料の沈着を対照するための少なくとも１つのビーズ、分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも１つのビーズ、レポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのビーズおよび分析物を検出するための少なくとも２つのビーズ含むビーズのセットにも関する。
【０２２５】
したがって、ビーズのセットは、少なくとも２つの異なる間接マーカーが関与する分析のために、レポーターの沈着を対照するための少なくとも２つのビーズ、例えばレポーターの沈着を対照するための２つまたは３つのビーズを含むことができる。この場合には、レポーターの沈着を対照するための各ビーズは、好ましくはマーカーに特異的である。
【０２２６】
本発明によるビーズのセットは、確実な多重分析を可能にする。
【０２２７】
試料の沈着の対照
試料の沈着の対照は、試料が固体支持体のコンパートメントのスポットの存在下に、またはビーズのセットと置かれたことを検証することを可能にする。
【０２２８】
試料の沈着の対照は、分析する試料中に天然に存在する対照化合物に特異的である、少なくとも１つの捕捉リガンド、特に抗体または抗原を含む。対照化合物は、特に上で規定される通りである。
【０２２９】
したがって、試料の沈着の対照で検出されるシグナルは、試料の沈着ステップを検証することを可能にする。
【０２３０】
試料の沈着は、分析する試料を、少なくとも１つの対照スポットおよび少なくとも２つの分析物検出スポットを含む、本発明による固体支持体のコンパートメントに添加すること、または本発明によるビーズの少なくとも１つのセットの存在下に試料を置くことからなる。
【０２３１】
次に、対照化合物は、試料沈着対照で捕捉リガンドに固定される。このように固定される対照化合物は、対照化合物の特異的検出リガンドによって検出することができる。
【０２３２】
好ましくは、対照化合物に関する捕捉リガンドと検出リガンドの立体障害による競合を回避するために、対照化合物の検出リガンドは、用いられる捕捉リガンドが特異的に結合する対照化合物のゾーンから離れている、対照化合物のゾーンに特異的である。
【０２３３】
対照化合物が少なくとも２つの分子の複合体である場合は、検出リガンドまたは検出リガンドの１つは２つの分子の１つに特異的であってもよく、捕捉リガンドまたは捕捉リガンドの１つは複合体の他の分子に特異的であってもよい。
【０２３４】
あるいは、対照化合物が少なくとも２つの分子の複合体である場合は、検出リガンドまたは検出リガンドの１つおよび捕捉リガンドまたは捕捉リガンドの１つは同じ分子に、および、複合体がこれらの同一の分子の少なくとも２つを含む場合は分子の同じゾーンにさえ特異的であってもよく、それによって、複合体における検出抗体および捕捉抗体の同時固定を可能にする。
【０２３５】
例えば、対照化合物がトランスフェリンとの複合型のトランスフェリンの可溶性受容体である場合は、沈着対照は、トランスフェリンまたはトランスフェリンの可溶性受容体のいずれかの特異的抗体を捕捉リガンドとして含むことができる。好ましくは、血液試料で見出すことができる遊離のトランスフェリンに対する干渉を回避するために、捕捉リガンド（複数可）またはその１つは、トランスフェリンの可溶性受容体の特異的抗体である。
【０２３６】
好ましい一実施形態では、沈着対照の捕捉リガンド（複数可）またはその１つは、トランスフェリンの可溶性受容体に特異的であり、対照化合物の検出リガンド（複数可）またはその１つは、トランスフェリンに特異的であるかまたはトランスフェリンの可溶性受容体に特異的である。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、前記分析物検出リガンド（複数可）が分析する試料と同時に添加されない場合、しかし、例えば後のステップで対照化合物の検出リガンド（複数可）の添加と同時の場合を除き、試料の沈着の対照は、１つまたはいくつかの分析物検出リガンド（複数可）が固体支持体のコンパートメントのスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれたことを検証することも可能にする。「対照化合物の検出リガンド（複数可）の添加と同時に」は、前記分析物検出リガンド（複数可）が、前記分析物検出リガンド（複数可）および対照化合物の検出リガンド（複数可）を含む溶液の形で添加されることを一般に意味する。
【０２３８】
あるいは、前記分析物検出リガンド（複数可）および対照化合物の前記検出リガンド（複数可）が同じステップで、しかし別々の溶液の形で添加されてもよい。
【０２３９】
実際、分析する試料が対照化合物の検出リガンドに干渉するかもしれない化合物を含む場合は、試料の沈着ステップの後、特に試料の沈着ステップとその後の少なくとも１回の洗浄ステップの後のステップで、対照化合物に検出リガンドを添加することが必要かもしれない。この場合には、分析物の検出リガンド（複数可）の全部または一部は、対照化合物の検出リガンドと同時に添加することができる。そこで、沈着の対照は、これらの検出リガンドが、固体支持体のコンパートメントのスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれたことを検証することも可能にする。
【０２４０】
例えば、血液試料は、トランスフェリンとの複合型のトランスフェリンの可溶性受容体と、遊離の、すなわち受容体に結合していないトランスフェリンの両方を含む。したがって、検出リガンド（複数可）またはその１つがトランスフェリンの特異的抗体であって、それが試料と同時に添加される場合は、それは遊離のトランスフェリンに一部結合する危険を冒し、対照化合物の検出がゆがめられるだろう。この場合には、対照化合物の前記検出リガンドは、後続のステップで、すなわち、試料の沈着ステップとその後の少なくとも１回の洗浄ステップの後に与えられる。
【０２４１】
特定の一実施形態では、試料の沈着の対照（複数可）は、第ＸＩＩＩ因子の特異的抗体を含まない（すなわち、四量体形の特異的抗体も、第ＸＩＩＩ因子のサブユニットの特異的抗体も含まない）。好ましくは、試料の沈着の対照（複数可）は、第ＸＩＩＩ因子の特異的補足リガンドを含まない（すなわち、四量体形の特異的補足リガンドも、第ＸＩＩＩ因子のサブユニットの特異的補足リガンドも含まない）。
【０２４２】
特定の一実施形態では、試料の沈着の対照（複数可）は、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはより一般的には免疫グロブリン（特に、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭまたはヒト免疫グロブリン）の特異的捕捉リガンド（特に、特異的抗体）を含まない。
【０２４３】
試料の沈着の少なくとも２つの対照を用いることは非常に有利かもしれず、これらの対照は異なる対照化合物および／または異なる感受性を有する同じ対照化合物を検出し、例えば対照化合物の濃度が、例えば試料の性質および／または試料がとられた対象の状態に基づいて異なり得る場合は、少なくとも２つの異なる対照化合物を用いることが有利かもしれない。
【０２４４】
分析物の検出リガンドの沈着の対照
分析物の検出リガンドの沈着の対照は、添加剤の検出リガンドと同時に沈着した１つまたはいくつかの分析物検出リガンド（複数可）および／または添加剤と同時に沈着した１つまたはいくつかの分析物検出リガンド（複数可）が、固体支持体のコンパートメントのスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれたことを検証することを可能にする。
【０２４５】
「添加剤の検出リガンドと同時に沈着した」は、前記分析物検出リガンド（複数可）が、前記分析物検出リガンド（複数可）および添加剤の検出リガンド（複数可）を含む溶液の形で添加されることを一般に意味する。あるいは、前記分析物検出リガンド（複数可）および／または添加剤の検出リガンド（複数可）が同じステップで、しかし別々の溶液の形で添加されてもよい。
【０２４６】
「添加剤と同時に沈着した」は、前記分析物検出リガンド（複数可）が、前記分析物検出リガンド（複数可）および添加剤を含む溶液の形で添加されることを一般に意味する。あるいは、前記分析物検出リガンド（複数可）および／または１つまたはいくつかの添加剤が同じステップで、しかし別々の溶液の形で添加されてもよい。
【０２４７】
分析物の検出リガンドの沈着の対照は、インキュベーションおよび洗浄ステップを検証することも可能にする。実際、固体支持体のコンパートメントのスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれた添加剤の濃度は既知であり、検出されるシグナルの変動は、方法のステップ、特にインキュベーションおよび洗浄ステップでの方法の欠陥を特定することを可能にする。これは、欠陥のあるインキュベーションおよび／または洗浄ステップ、すなわち不履行のまたは不十分なステップからもたらされる「偽陽性」を回避することを特に可能にすることができる。
【０２４８】
「偽陽性」は、試料中に検出される１つまたはいくつかの分析物の存在を反映する陽性結果であるが、前記分析物（複数可）は試料中に存在せず、したがって検出されるはずではなかった。
【０２４９】
分析物の検出リガンドの沈着の対照は、分析する試料中に存在せず、多重分析方法の実行の間に用いられる添加剤の少なくとも１つの特異的捕捉リガンドを含む。添加剤は、特に上で規定される通りである。
【０２５０】
したがって、分析物の検出リガンドの沈着の対照で検出されるシグナルは、添加剤の検出リガンドと同時に沈着する分析物検出リガンド（複数可）の沈着ステップを検証することを可能にする。
【０２５１】
スポットおよび／またはビーズのセットの存在下に置かれる添加剤は、分析物の検出リガンドの沈着の対照で捕捉リガンドに固定される。このように固定される添加剤は、前記添加剤の特異的検出リガンドによって検出することができる。
【０２５２】
例えば、添加剤がジゴキシゲニンを含む場合は、方法対照の捕捉リガンドはジゴキシゲニンの特異的抗体であってもよい。好ましくは、添加剤の検出リガンドも、ジゴキシゲニンの特異的抗体である。
【０２５３】
例えば分析物の検出リガンドがいくつかの異なるステップで、特に少なくとも３つの異なるステップの間に添加される場合は、検出分析物の沈着のいくつかの異なる対照、したがって同数の異なる添加剤を用いることが有利かもしれない。
【０２５４】
本発明の特定の一実施形態によると、
−  本発明による分析方法の実行の間に試料の沈着対照の捕捉リガンドに固定される対照化合物は、前記対照化合物の特異的検出リガンドによって検出され（サンドイッチタイプの免疫学的フォーマット）、
−  分析方法の実行の間に分析物の検出リガンドの沈着対照の捕捉リガンドに固定される添加剤は、前記添加剤の特異的検出リガンドによって検出される（サンドイッチタイプの免疫学的フォーマット）。
【０２５５】
これらのサンドイッチタイプの免疫学的フォーマットは、他の免疫学的フォーマット、特に間接フォーマットと比較して、高レベルの特異性および／または感受性を達成することを可能にする。
【０２５６】
レポーターの沈着の対照
レポーターの沈着の対照は、検出マーカーレポーターが固体支持体のコンパートメントのスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれたことを検証することを可能にする。
【０２５７】
レポーターの沈着の対照は、分析物の少なくとも１つの検出リガンドの間接マーキングの場合にだけ有益である。
【０２５８】
レポーターの沈着の対照は、間接マーカーまたは間接マーカーに結合した担体分子を含む。
【０２５９】
レポーターの沈着の対照の間接マーカーは、分析物の少なくとも１つの検出リガンドの間接マーカーと同一である。
【０２６０】
少なくとも２つの分析物検出リガンドを検出するために少なくとも２つの異なる間接マーカーが用いられる場合は、各マーカーのためにレポーターの沈着の対照を用いることが好ましい。
【０２６１】
本発明による有利な一実施形態では、検出リガンド（複数可）をマーキングするために単一のおよび同じ間接マーカーが用いられ、したがって、レポーターの沈着の単一の対照を用いることができる。
【０２６２】
したがって、レポーターの沈着の対照で検出されるシグナルは、対応する検出マーカーのレポーターの沈着ステップを検証することを可能にする。
【０２６３】
したがって、レポーターはレポーターの沈着の対照で検出マーカーに固定され、レポーターの沈着の陽性対照の場合には、必要ならば前記レポーターのマーカーの基質を添加した後にシグナルが得られる。
【０２６４】
例えば、間接マーカーがビオチンである場合は、レポーターの沈着の対照はビオチンまたはビオチンに結合した担体分子を含む。
【０２６５】
確実な多重分析方法
したがって、本発明は、少なくとも１つの試料中の少なくともｎ個の分析物を検出するための多重分析方法であって、ｎは２以上の整数であり、前記方法は、
ａ）上で規定される少なくとも１つのコンパートメントを含む少なくとも１つの固体支持体、または上で規定されるビーズの少なくとも１つのセットを用意するステップ、
ｂ）前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に、検出するｐ個の分析物のｌ個の検出リガンド、および適用可能であれば少なくとも１つの添加剤を置くステップであって、ｌは好ましくはｐ以上である、ステップ、
ｃ）分析する試料を前記コンパートメントのスポット（複数可）または前記ビーズのセットの存在下に置くステップ、
ｄ）前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に：
検出するｍ個の分析物のｌ’個の検出リガンド、および適用可能であれば、前記添加剤（複数可）の少なくとも１つの検出リガンドを置くステップであって、ｌ’は好ましくはｍ以上である、ステップ、
ｅ）前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に：
対照化合物の少なくとも１つの検出リガンドおよび検出するｙ個の分析物のｌ’’個の検出リガンドを置くステップであって、ｌ’’は好ましくはｙ以上である、ステップ、
ｆ）任意選択で少なくとも１つのレポーターを前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くステップ、
ｇ）任意選択で、特にステップｆの前記レポーターまたは前記レポーターの１つがマーカー、特に間接マーカー（例えば、酵素）に結合する場合に、ステップｆ）のレポーターに結合した前記マーカーの少なくとも１つの第２のレポーター（例えば、基質、例えばルミノール、イソルミノールまたはそれらの誘導体の１つ）を前記コンパートメントのスポットまたは前記ビーズのセットの存在下に置くステップ
のうち、少なくともステップａ）、ｃ）およびｅ）、少なくともステップａ）、ｃ）およびｆ）、または少なくともステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）を含み、
ｌ、ｌ’、ｌ’’、ｍ、ｐおよびｙは０以上の整数であり、ｍ＋ｐ＋ｙの合計は１以上である、多重分析方法に関する。
【０２６６】
少なくともｎ個の分析物を検出するための方法は、検出する少なくとも２つの分析物が同一である場合は、ｎ未満である異なる数の分析物を検出することからなることができる。例えば、固体支持体のコンパートメントの少なくとも２つのスポットまたはビーズのセットの少なくとも２つのビーズ（またはビーズのタイプ）は、同じ分析物を検出することを目的とする。
【０２６７】
数「ｎ」は、固体支持体のコンパートメントの分析物の検出スポットの数またはビーズのセットの分析物を検出するためのビーズ（またはビーズのタイプ）の数に一般に等しい。
【０２６８】
好ましくは、ｍ＋ｐ＋ｙの合計は、１からｎである。
【０２６９】
検出するいくつかの分析物が同一である場合は、同一の分析物の少なくとも２つまたは全てのために同じ検出リガンドを用いることが可能である。そこで、ｍ＋ｐ＋ｙの合計は１以上であってもよく、厳密にｎ未満である。
【０２７０】
別の実施形態では、例えば固体支持体のコンパートメントに分析物のｎ個の検出スポットまたはビーズのセットの分析物を検出するためにｎ個のビーズ（またはビーズのタイプ）がある場合は、ｍ＋ｐ＋ｙの合計はｎに等しい。
【０２７１】
下で概説されるように、ステップａ）からｅ）は同時におよび／または連続して行うことができ（例えば、これらのステップの一部は同時に、他は連続して行うことができる）、それらのうちの少なくとも２つについてはａ）からｅ）の順序または別の順序で、ステップａ）は常に実行される最初のステップであり；方法が、ステップｆ）および任意選択でステップｇ）を［含む］場合、これらのステップは常にステップａ）からｅ）の後に実行される。
【０２７２】
方法が少なくともステップａ）、ｃ）およびｅ）を含む場合、固体支持体は少なくとも１つのコンパートメントを含み、前記コンパートメントは、試料の沈着を対照するための少なくとも１つのスポットを含み、またはビーズのセットは、試料の沈着を対照するための少なくとも１つのビーズを含む。
【０２７３】
方法が少なくともステップａ）、ｃ）およびｆ）を含む場合、固体支持体は少なくとも１つのコンパートメントを含み、前記コンパートメントは、レポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのスポットを含み、または、ビーズのセットは、レポーターの沈着を対照するための少なくとも１つのビーズを含む。
【０２７４】
ステップｂ）がスポットまたはビーズのセットを少なくとも１つの添加剤の存在下に置くことを含む場合、ステップｄ）は、スポットまたはビーズのセットを前記添加剤（複数可）の少なくとも１つの検出リガンドの存在下に置くことを好ましくは含む。
【０２７５】
方法が少なくともステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）を含み、ステップｂ）で少なくとも１つの添加剤がスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれ、ステップｄ）で前記添加剤（複数可）の少なくとも１つの検出リガンドがスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれる場合は、固体支持体は少なくとも１つのコンパートメントを含み、前記コンパートメントは、分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも１つのスポットを含み、または、ビーズのセットは、分析物の検出リガンドの沈着を対照するための少なくとも１つのビーズを含む。
【０２７６】
方法がステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）を含むがステップｅ）を含まない場合は、ステップｂ）で少なくとも１つの添加剤がスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれ、ステップｄ）で前記添加剤（複数可）の少なくとも１つの検出リガンドがスポットまたはビーズのセットの存在下に置かれる。
【０２７７】
「化合物Ｘをコンパートメントのスポットの存在下に置く」という表現は、化合物Ｘが前記スポットを含むコンパートメントに添加されることを意味し、前記コンパートメントは試料を分析することを目的とする。
【０２７８】
「化合物Ｘをビーズのセットの存在下に置く」という表現は、化合物Ｘが、前記ビーズのセットを含有する任意の適切な容器中の試料を分析することを目的とするビーズの少なくとも１つのセットの存在下に置かれることを意味する。適切な容器の一例は、マイクロチューブ、マイクロプレートまたは反応シャーレである。
【０２７９】
ステップｂ）からｆ）の少なくとも２つが同時に実行される場合、化合物（複数可）Ｘは、試料を分析することを目的とする、コンパートメントのスポット（複数可）またはビーズ（複数可）またはビーズのセット（複数可）の存在下に別々に、すなわち別々の組成物の形で置くことができる。あるいは、これらの化合物Ｘまたはこれらの化合物Ｘ（複数可）の一部は、試料を分析することを目的とする、コンパートメントのスポット（複数可）またはビーズ（複数可）またはビーズのセット（複数可）の存在下に、１つまたはいくつかの混合物の形で置くことができる。
【０２８０】
各コンパートメントのスポットまたはビーズの各セットの存在下に、異なる化合物がある特定の時間、例えば１秒から２時間、好ましくは１分から１時間、より好ましくは５分から５０分、さらにより好ましくは１０分から４０分の間置かれる。
【０２８１】
当業者は、各インキュベーションステップのための適切な温度を決定する方法を知っている。インキュベーションの温度は、例えば４℃、１９℃から２４℃、３７℃または４０℃の温度であってもよい。
【０２８２】
ステップｂ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）およびｇ）の間に用いられる異なる構成成分は、当業者に周知である。例えば、それらは抗原−抗体、マーカー−レポーター複合体の形成を可能にする。
【０２８３】
ステップａ）は、少なくとも１つのコンパートメントを含む上に規定される固体支持体または上に規定されるビーズの少なくとも１つのセットを提供することからなる。
【０２８４】
ステップａ）は、多重分析方法が前記固体支持体または前記ビーズのセットを用いて、すなわち、前記固体支持体または前記ビーズのセットを用いて実行されることを特に意味する。
【０２８５】
したがって、本発明による多重分析方法は、例えばマイクロプレートタイプのコンパートメント（複数可）を有する固体支持体を用いること、またはビーズのセットのいずれかにより実行される。
【０２８６】
分析するＸ個の試料のために、ステップａ）は、
−  少なくともＸ個のコンパートメントを含む固体支持体または固体支持体の全てで少なくともＸ個のコンパートメントを有するようないくつかの固体支持体（例えば、固体支持体が１つのコンパートメントだけを含み、それが、特定の一実施形態では固体支持体自体に擬すことができて少なくともＸ個の固体支持体を提供する場合）、または
−  ビーズの少なくともＸ個のセット
を提供することからなる。
【０２８７】
例えば、本発明による多重分析方法は、少なくとも１つの試料、少なくとも２つの試料、少なくとも５つの試料、少なくとも１０個の試料、好ましくは少なくとも２０個の試料、例えば少なくとも４０個の試料、少なくとも６０個の試料または少なくとも８０個の試料でｎ個の分析物を検出することを可能にする。
【０２８８】
数ｎは、２以上の整数、例えば２、３、４、５、好ましくは６以上、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１８超である。
【０２８９】
ステップが同時に行われない場合は、それらの後に１つまたはいくつかの洗浄ステップが一般に続く。
【０２９０】
洗浄ステップは、スポットまたはビーズに、または前記スポットもしくはビーズに結合した様々な化合物に結合していない化合物を排除することを可能にする。
【０２９１】
一般的に、洗浄ステップは、各コンパートメントで、またはビーズの各セットの存在下で洗浄溶液を分配（例えば、４００μｌの量）、吸引するために、少なくとも１サイクル、好ましくは少なくとも２サイクル、より好ましくは３〜６サイクルからなる。一般的に、洗浄溶液は、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を注入したトリスＮａＣｌの０．０１Ｍ緩衝液、ｐＨ７．４であってもよい。
【０２９２】
少なくとも２つのコンパートメントを含む少なくとも１つの固体支持体でこの方法が実行される場合は、固体支持体（複数可）のコンパートメントは、特にスポットの数および組成に関して好ましくは同一である。
【０２９３】
あるいは、この方法は、少なくとも２つの別々の群（またはタイプ）のコンパートメントを含む少なくとも１つの固体支持体で実行することができ、別々の群の各々は異なる数のスポットおよび／またはスポット組成を有する。
【０２９４】
この方法が少なくとも２セットのビーズで実行される場合は、ビーズのセットは、特にビーズの数および組成に関して同一であってもよい。
【０２９５】
あるいは、この方法は、少なくとも２つの別々の群（またはタイプ）のビーズのセット、特に異なる数および／または組成のビーズを有する別々の群のビーズのセットの各々で実行することができる。
【０２９６】
ステップｂ）、ｄ）、ｅ）およびｆ）は、試料を分析することを目的とする各コンパートメントで、または試料を分析することを目的とするビーズのセットを含有する各容器で実行される。
【０２９７】
ステップｃ）に関して、１コンパートメントにつき、またはビーズのセットを含有する１つの容器につき、１つの試料が添加される。
【０２９８】
試料（複数可）、分析物、添加剤（複数可）、対照化合物（複数可）、分析物の検出リガンド、添加剤（複数可）の検出リガンド（複数可）、対照化合物（複数可）の検出リガンドおよびレポーター（複数可）は、特に対応する段落で上で規定される通りである。
【０２９９】
本発明による方法で用いられる添加剤は、分析物の検出リガンドの沈着対照の捕捉リガンド（複数可）によって認識される添加剤である。
【０３００】
試料中に存在する対照化合物は、試料の沈着対照の捕捉リガンド（複数可）によって認識される対照化合物である。
【０３０１】
分析物の各検出リガンドは、分析物の検出スポットまたは分析物の検出ビーズに存在する少なくとも１つの捕捉リガンドによって認識される分析物に特異的である。
【０３０２】
ステップｂ）がステップｃ）、ｄ）またはｅ）の１つと同時に実行されない場合は、ｌが０に等しい場合だけ、ステップｂ）の後、かつ前記ステップｃ）、ｄ）およびｅ）の前に１つまたはいくつかの洗浄ステップを実行することができる。
【０３０３】
ステップｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）が存在する場合は、それらは任意の所望の順序で連続して、またはこれらのステップの１つ、２つもしくは３つを同時に実行することができる。しかし、ステップｂ）およびステップｄ）が少なくとも１つの添加剤および前記添加剤の少なくとも１つの検出リガンドをそれぞれ実行する場合は、前記ステップｄ）はなお前記ステップｂ）と同時にかまたはその後に行われる。同様に、ステップｅ）が存在する場合は、ステップｅ）とｃ）の間に洗浄ステップがない限り、それは常にステップｃ）と同時にかまたはその後、またはステップｃ）の前に行われる。さらに、ステップｃ）が、ｌが１以上であるステップｂ）の後、および／またはｌ’が１以上であるステップｄ）の後、および／またはステップｅ）の後に行われる場合、このまたはこれらのステップとステップｃ）の間に洗浄ステップは行われない。
【０３０４】
例として、ステップｂ）からｅ）が存在する場合は、それらは同時におよび／または以下の順序で連続して行うことができる：ｂ）からｅ）、ｂ）ｃ）ｅ）ｄ）、ｃ）ｂ）ｄ）ｅ）、ｃ）ｂ）ｅ）ｄ）またはｃ）ｅ）ｂ）ｄ）。
【０３０５】
ステップｃ）、ｄ）および／またはｅ）は、ステップｂ）と同時に行うことができる。
【０３０６】
本発明による有利な一実施形態では、ステップｂ）およびｃ）は同時に行われる。
【０３０７】
本発明による別の有利な実施形態では、ステップｃ）およびｄ）は同時に行われる。
実際、試料を分析物の検出リガンドの存在下に同時に置くことは有利である可能性があり、それは、分析物が分析物の捕捉抗体に既に結合している場合より、それらが特異的である分析物と溶液中でより良好に相互作用する。
【０３０８】
本発明によるさらに別の有利な実施形態では、ステップｂ）、ｃ）およびｄ）は同時に行われる。
【０３０９】
いくつかの添加剤が用いられる場合、この方法は１つまたはいくつかのステップｂ）（および１つまたはいくつかのステップｄ））を含むことができ、ステップｂ）の各々はステップｃ）の前、その後または同時に独立して行うことができる。少なくとも２つのステップｂ）が例えばあってもよく、１つはステップｃ）の前または同時に行われ、他はステップｃ）の後または同時に行われる。
【０３１０】
所与のステップの化合物は、そのステップの化合物の全ておよび任意選択で同時に行われる１つまたはいくつかのステップの化合物を含む混合物、すなわち溶液の形で提供されてもよい。
【０３１１】
２つまたは２つを超えるステップが同時に行われる場合は、これらの異なるステップの化合物は１つまたはいくつかの混合物、すなわち１つまたはいくつかの溶液の形、好ましくは単一の混合物（すなわち、単一の溶液）の形で与えられてもよい。
【０３１２】
例えば、ステップｂ）、ｃ）およびｄ）が同時に行われる場合は、添加剤（複数可）（それらが存在する場合）、検出されるｐ個の分析物の各々のｌ個の検出リガンド、前記添加剤（複数可）の検出リガンド（複数可）（それらが存在する場合）、検出されるｍ個の分析物の各々のｌ’’個の検出リガンドは、単一の混合物の形で与えられてもよい。
【０３１３】
有利な一実施形態では、ｌ’はｎに等しく、すなわち、ｎ個の分析物の少なくともｎ個の検出リガンドがステップｄ）で添加される。
【０３１４】
ある特定の実施形態では、ステップｅ）は、ステップｃ）の後に行われる。これは、化合物のための検出リガンドまたはその１つの存在が、試料が同時に干渉を引き起こす危険を冒すかどうか対照する場合を特に含む。
【０３１５】
例えば、対照化合物の検出リガンドがトランスフェリンの特異的抗体であり、試料が遊離のトランスフェリンを含む場合、ステップｅ）はステップｃ）の後に実行される。
【０３１６】
ステップｅ）がステップｃ）の後に実行される場合、好ましくはコンパートメントの少なくとも１つの洗浄ステップがステップｃ）の後およびステップｅ）の前に行われる。
【０３１７】
本発明による方法がステップｆ）を含む場合、このステップは常にステップａ）からｅ）の後に行われ、各コンパートメントのスポットまたはビーズの各セットの少なくとも１つの洗浄ステップが一般にそれに先行する。
【０３１８】
レポーターの少なくとも２つの沈着対照が用いられる場合は、この方法はいくつかのステップｆ）、すなわち、１つのレポーターにつき好ましくは１つのステップｆ）を含むこともできる。
【０３１９】
本発明による方法がステップｇ）を含む場合、このステップは常にステップｆ）の後に行われ、各コンパートメントのスポットまたはビーズの各セットの少なくとも１つの洗浄ステップが一般にそれに先行する。
【０３２０】
ステップｆ）のレポーターまたはその少なくとも１つは、好ましくは、分析物の少なくとも１つの検出リガンドに結合した間接検出マーカーのレポーターおよびレポーターの沈着の少なくとも１つの対照に存在する検出マーカーのそれの両方である。
【０３２１】
本発明による多重分析方法の実行のために用いられる対照は、分析物の検出の異なるステップを模倣することが有利かもしれない。例えば、分析物の捕捉リガンドおよび分析物の検出リガンドが抗体である場合は、添加剤の検出リガンドおよび好ましくは対照化合物の検出リガンドも抗体である。同様に、添加剤の検出リガンドおよび好ましくは対照化合物の検出リガンドは、分析物の検出リガンドのそれと同じマーカーでマーキングされる。
【０３２２】
本発明による方法は、対照（複数可）（特に対照スポット（複数可）または対照ビーズ（複数可））および分析物（複数可）の検出マーカーに対応するシグナルを検出するためのステップｈ）を一般に含む。
【０３２３】
陽性シグナルが方法の終わりに検出されるならば、対照は陽性である。
【０３２４】
陽性シグナルが方法の終わりに検出されないならば、対照は陰性である。
【０３２５】
方法の実行の間に用いられる各対照の陽性シグナルの検出は、方法全体の検証を可能にする。
【０３２６】
１つまたはいくつかの対照でのシグナルの不在は、１つまたはいくつかのステップが正しく起こらなかったことを意味する。この場合には、得られる結果を用いてはならない。
【０３２７】
試料の沈着の後、および少なくとも１つの洗浄ステップの後に対照化合物の検出リガンドが沈着する場合は、試料の沈着の陰性対照は、試料が沈着しなかったこと、および／または対照化合物の前記検出リガンドが沈着しなかったことを意味する。
【０３２８】
試料の沈着の対照、分析物の検出リガンドの沈着の対照、および適用可能であればレポーターの沈着の対照は相補的であり、方法のステップの各々の適正な性能を確保することを可能にし、分析方法で遭遇するいかなる欠陥の起源でも理解することを可能にする。
【０３２９】
本発明による方法は、
−  分析物の検出リガンドの沈着の少なくとも２つの対照が用いられる場合は少なくとも２つのステップｂ）および少なくとも２つのステップｄ）、
−  試料の沈着の少なくとも２つの対照が用いられる場合は少なくとも２つのステップｆ）、および／または
−  レポーターの沈着の少なくとも２つの対照が用いられる場合は少なくとも２つのステップｆ）
を含むこともできる。
【０３３０】
試料の多重分析方法を確実にする１つまたはいくつかの対照の使用。
本発明は、試料の多重分析を確実にするための、試料の沈着の少なくとも１つの対照、および／または分析物の検出リガンドの沈着の少なくとも１つの対照の使用にも関する。
【０３３１】
前記使用は、レポーターの沈着の少なくとも１つの対照の使用をさらに含むことができる。
【０３３２】
本発明は、試料の多重分析を確実にするための、試料の沈着の対照、分析物の検出リガンドの沈着の対照およびレポーターの沈着の対照からなる群から選択される少なくとも１つの対照の使用に特に関する。
【０３３３】
本明細書では、「試料の多重分析を確実にする」は、特に「偽陰性」の存在を回避することによって、多重分析の結果の信頼性を保証することを意味する。
【０３３４】
「偽陰性」は、試料中に検出される１つまたはいくつかの分析物の不在を反映する陰性結果であるが、前記分析物（複数可）は試料中に存在していて、検出されるはずであった。
【０３３５】
本発明は、試料の多重分析を確実にするための、試料の沈着の対照、分析物の検出リガンドの沈着の対照およびレポーターの沈着の対照からなる群から選択される少なくとも２つの対照の使用にも関する。
【０３３６】
本発明は、試料の多重分析を確実にするための、試料の沈着の少なくとも１つの対照、分析物の検出リガンドの沈着の少なくとも１つの対照およびレポーターの沈着の少なくとも１つの対照の使用に特に関する。
【０３３７】
前記使用は、好ましくは、上で規定される少なくとも１つのコンパートメントを含む固体支持体または上で規定されるビーズの少なくとも１つのセットで実行される。
【０３３８】
試料の沈着の対照、分析物の検出リガンドの沈着の対照、レポーターの沈着の対照および試料は、特に上で規定される通りである。
【０３３９】
本発明は、本発明による少なくとも１つの固体支持体および／または本発明によるビーズの少なくとも１つのセット、および適用可能であれば、本発明による多重分析方法を実行するために使用される少なくとも１つの組成物もしくは溶液、および／またはユーザー使用説明書を含む、またはそれからなることを特徴とするキットにも関する。
【０３４０】
本発明の他の特徴および利点は、例として非限定的に提供される以下の実施例を通じてより明らかになる。これらの実施例および図は、その範囲を限定することなく本発明を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０３４１】
【図１】確実な多重分析のためのマイクロプレートタイプの固体支持体の例を示す図である。Ａは、１８個のウェルを含むマイクロプレートのブロック図を示す。Ｂは、マイクロプレートのウェルの底を概略的に示す。マイクロプレートの各ウェルは９つのスポットを含み、その中の６つのスポットは各々１つまたはいくつかの分析物を検出することを目的とし、感染症の診断を可能にし（それぞれＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５およびＡ６）、３つは対照スポット：ＳＤＣ（試料沈着対照）、ＰＶＣ（分析物検出リガンド沈着対照）およびＲＶＣ（レポーター沈着対照）である。Ｃは、固相（ＰＳ）に結合した検出抗体を含む３つの対照スポットを概略的に示す。Ａｃ  ＣＣ：対照化合物の検出抗体。Ａｃ  Ａｄｄ：添加剤の検出抗体。ＭＳ＋Ｂ：ビオチンでマーキングした担体分子。
【図２】非相同フォーマットでの試料の沈着の陽性対照（ＳＤＣ）の図である。試料の沈着の対照は、固相（ＰＳ）に固定された対照化合物の捕捉抗体を含む。ここで、捕捉抗体はトランスフェリンの可溶性受容体（ｓＴｆＲ）に特異的である。対照化合物、ここでは複合体２：２つの可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）：トランスフェリン（Ｔｆ）は、試料の沈着の対照で捕捉抗体に、およびトランスフェリンに特異的である検出抗体（Ａｃ２）に固定される。検出抗体（Ａｃ２）は、ビオチン（Ｂ）でマーキングされる。発色は、ペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジン（Ｓ−ＰＯＤ）を添加し、次にこの酵素の基質（示さず）を添加することによって実行される。捕捉抗体および検出抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であってもよい。全ての場合に、それは非相同サンドイッチを含む。
【図３】相同フォーマットでの試料の沈着の陽性対照（ＳＤＣ）の図である。試料の沈着の対照は、固相（ＰＳ）に固定された対照化合物の捕捉抗体を含む。ここで、捕捉抗体はトランスフェリンの可溶性受容体（ｓＴｆＲ）に特異的である。対照化合物、ここでは複合体２：２つの可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）：トランスフェリン（Ｔｆ）は、試料の沈着の対照で捕捉抗体に、および同じく可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）に特異的である検出抗体（Ａｃ２）に固定される。検出抗体（Ａｃ２）は、ビオチン（Ｂ）でマーキングされる。発色は、ペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジン（Ｓ−ＰＯＤ）を添加し、次にこの酵素の基質（示さず）を添加することによって実行される。捕捉抗体および検出抗体は、例えばモノクローナル抗体である。それは、相同的サンドイッチを含む。
【図４】分析物の検出リガンドの沈着の陽性対照（ＰＶＣ）の図である。方法対照は、固相（ＰＳ）に固定された添加剤の捕捉抗体を含む。ここで、捕捉抗体はジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）に特異的である。添加剤はジゴキシゲニンおよびＢＳＡを含み、ジゴキシゲニンはＢＳＡと複合している。添加剤は、ジゴキシゲニンを通して分析物の検出リガンドの沈着の対照で捕捉抗体に、および検出抗体（Ａｃ２）に結合している。検出抗体（Ａｃ２）は、ビオチン（Ｂ）でマーキングされる。発色は、ペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジン（Ｓ−ＰＯＤ）を添加し、次にこの酵素の基質（示さず）を添加することによって実行される。捕捉抗体および検出抗体は両方ともモノクローナル抗体または両方ともポリクローナル抗体であってもよく、その場合には、それは相同的サンドイッチを含む。捕捉抗体はモノクローナル抗体で検出抗体はポリクローナル抗体であってもよく、またはその逆であってもよく、その場合は、それは非相同サンドイッチを含む。
【図５】レポーターの沈着の陽性対照（ＲＶＣ）の図である。レポーターの沈着の対照は、固相（ＰＨ）に固定されたビオチン（Ｂ）に結合した担体分子（ＭＳ）を含む。発色は、ペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジン（Ｓ−ＰＯＤ）を添加し、次にこの酵素の基質（示さず）を添加することによって実行される。
【図６】マイクロプレートのウェルの底に置かれ、分析する５つの分析物のスポット（Ａ１からＡ５）および３つの対照スポットＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣを含む「スポッティング」格子を示す図である。
【図７】９４個の試料の集団の単純なフォーマットでのＳＤＣ対照ビーズのシグナルの分布を示す図である。Ｙ軸は試料数を示し、Ｘ軸は相対蛍光強度（ＲＦＩ）の区間を示す。
【図８】３８個の試料の集団の単純なフォーマットでのＰＶＣ対照ビーズのシグナルの分布を示す図である。Ｙ軸は試料数を示し、Ｘ軸は相対蛍光強度（ＲＦＩ）の区間を示す。
【実施例】
【０３４２】
［実施例１］
「液体チップ」方法
原理
この実施例に記載される２つの対照は、
−  ＳＤＣ（「試料沈着対照」または「試料の沈着の対照」）：試料さらにステップ２（コンジュゲート２の沈着、すなわちステップ２で沈着した検出リガンド）およびステップ３）（Ｓ−ＰＥレポーターの沈着：フィコエリトリンに結合したストレプトアビジン）の沈着、ならびに
−  ＰＶＣ（「プロセス検証対照」または「分析物の検出リガンドの沈着の対照」）：ステップ１（コンジュゲート１の沈着、すなわちステップ１で沈着した検出リガンド）、さらにステップ２（コンジュゲート２の沈着、この実施例で例示されていないので点線で示す）およびステップ３）（Ｓ−ＰＥレポーターの沈着）の沈着
について検証することを可能にする（表１を参照）。
【０３４３】
【表１】
2017509897.tif 000002
【０３４４】
材料
（ｉ）分析システム
ＢｉｏＰｌｅｘ  ２００（登録商標）アナライザー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ−ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を、製造業者の使用説明書に従って用いる。この免疫分析機はフローサイトメーターおよびＬｕｍｉｎｅｘ  １００（商標）検出器（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を有し、超常磁性粒子の不均一なセットを用いる。直径８μｍのサイズを有する粒子の各均一な群、ポリスチレン化合物およびメタクリル酸（ＣＯＯＨ官能基）は、異なる百分率の蛍光色素（ＣＬ１およびＣＬ２）で製造されており、粒子の各群に割り当てられてＬｕｍｉｎｅｘ  １００（商標）検出器（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）のレーザーによって検出可能である、特異な識別コードを生成する。免疫学的反応の後、１セットのビーズは液体シースの中心のフローセルを１個ずつ通り、同時に励起され、２つの別々のレーザーで読み取られる。測定は、各ビーズの通過と同時に実行される。
【０３４５】
６３８ｎｍの赤色光線のレーザーは各粒子の表面を覆う識別蛍光色素（ＣＬ１およびＣＬ２）を励起し、複合シグナルは粒子によって検出される分析物を識別するために解釈される。したがって、このレーザーは、粒子のカテゴリーを識別することによって、進行中の試験を識別する役目をする。
【０３４６】
５３２ｎｍ緑色光線のレーザーはＳ−ＰＥ（フィコエリトリンと結合しているストレプトアビジン）レポーターを励起し、放出される蛍光は粒子に固定されるレポーターの量に比例する。したがって、このレーザーは、前記粒子に固定化される分析物の反応性を測定する役目をする。
【０３４７】
このシステムのソフトウェアは、検出リガンドの存在に関係するシグナルを相対蛍光強度（ＲＦＩ）値に変換する。結果を陽性または陰性と定性的に評価するために、比を計算することができる。
【０３４８】
（ｉｉ）固相（ビーズ）
６つの別々の群のＬｕｍｉｎｅｘ（商標）超常磁性粒子（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を含むビーズのセットを用いる。ビーズのこのセットは、試料の沈着を対照するための一群のビーズ（ＳＤＣビーズ）、分析物の検出リガンドの沈着を対照するための一群のビーズ（ＰＶＣビーズ）および分析物を検出するための４群のビーズ（分析する分析物：Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４）を含む。
【０３４９】
各群の粒子は、特定の試験の特異的捕捉リガンドでコーティングされる。各捕捉リガンドは、ヘテロ二官能基試薬を用いて結合される。
【０３５０】
ＳＤＣビーズは、粒子１ｍｇにつき１μｇで固定化されたトランスフェリンの可溶性抗受容体マウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）で覆われる。
【０３５１】
ＰＶＣビーズは、粒子１ｍｇにつき５μｇで固定化された抗ジゴキシゲニンヒツジポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）で覆われる。
【０３５２】
分析物Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４の検出ビーズは、検出する分析物の１つまたはいくつかの特異的捕捉リガンドで覆われる。
【０３５３】
（ｉｉｉ）検出リガンド
対照化合物（ＳＤＣ対照）の検出リガンド、ｐＡｂ−抗Ｔｆ−ｂｉｏｔは、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いてビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）に結合されている抗トランスフェリンヒツジポリクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｂａｒｎｅｓ  ｌａ  Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）である。
【０３５４】
（ＰＶＣ対照の）添加剤の検出リガンド、ｐＡｂ−抗ＤＩＧ−ｂｉｏｔは、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いてビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）に結合されている抗ジゴキシゲニンヒツジポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ｆｒａｎｃｅ）である。
【０３５５】
（ｉｖ）添加剤
ＢＳＡ−ＤＩＧ添加剤は、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いて担体分子、この実施例ではウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に接がれたジゴキシゲニン（Ｓｉｇｍａ、Ｆｒａｎｃｅ）である。
【０３５６】
（ｖ）レポーター
Ｓ−ＰＥレポーターは、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いてフィコエリトリン（Ｃｙａｎｏｔｅｃｈ、Ｈａｗａｉｉ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）に結合されているストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。
【０３５７】
（ｖｉ）希釈剤
ｖｉ．１．超常磁性粒子の希釈剤
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２０ｍＭ、１０％のウシ血清アルブミン、５００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、０．１０％のオクチル−ｎ−グルコシド、０．０９５％のＮａＮ３を含有するトリス緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．５。
ｖｉ．２．コンジュゲート１の希釈剤
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２０ｍＭ、Ｃｈａｐｓ  ０．１％、グリセロール１０％、０．０９５％のＮａＮ３を含有するトリス緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．５。
ｖｉ．３．コンジュゲート２の希釈剤
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ５．６ｍＭ、１％のウシ血清アルブミン、２％のＴｒｉｔｏｎ、１０％のヒツジ血清、５００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、０．５％のＰｒｏｃｌｉｎ  ３００（商標）（Ｓｕｐｅｌｃｏ社の商標）、１５％の牛乳（１００％スキム）、グリセロール１０％、０．０９５％のＮａＮ３を含有するクエン酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ６．７。
ｖｉ．４．Ｓ−ＰＥレポーターの希釈剤
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ社の商標）、０．５％のＰｒｏｃｌｉｎ  ３００（商標）（Ｓｕｐｅｌｃｏ社の商標）、ＰＥＧ  ６０００  ２．７５％、ウシ血清アルブミン１％、正常なヒツジ血清１％、０．０９５％のＮａＮ３を含有するリン酸緩衝液、ｐＨ７．４。
ｖｉ．５．洗浄溶液
ＮａＣｌ  ２１８ｍＭ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ社の商標）、０．００２％のＰｒｏｃｌｉｎ  ３００（商標）（Ｓｕｐｅｌｃｏ社の商標）を含有するトリス１０ｍＭ緩衝液、ｐＨ７．４。
【０３５８】
（ｖｉｉ）反応シャーレ
免疫反応は、１ウェルにつき３５５μＬの最大容量を有するポリプロピレンから作製された９６ウェルマイクロプレートのウェルで起こる。
【０３５９】
（ｖｉｉｉ）試料
用いた陰性試料（血清または血漿）は、Ｌｉｌｌｅのフランス血液機関から来る。
【０３６０】
方法
多重フォーマット試験プロトコールは４つの異なる分析物を分析することを含み、分析物Ａ１およびＡ２のアッセイは１つの免疫時間で実行され、分析物Ａ３およびＡ４のアッセイは２つの免疫時間で実行される。
【０３６１】
試験のフォーマットは図２および４に示し、そこにおいて、Ｓ−ＰＯＤの代わりにＳ−ＰＥが用いられる。
【０３６２】
ステップ１：
１．マイクロプレートの各ウェルに、
＋１００μＬの試料
＋以下を含有するコンジュゲート１の２５μｌの希釈剤：
±ＢＳＡ−ＤＩＧ
±分析物Ａ１およびＡ２の検出リガンド
＋２５μＬの免疫反応性超常磁性粒子（粒子の混合物、ビーズのタイプにつき１．２μｇ：ＳＤＣ、ＰＶＣ±分析する分析物のビーズ）
が連続して分配される。
２．撹拌しながら混合物を３７℃で４０分間インキュベートする。
３．以下の洗浄ステップを実行する：磁化による固相と液相の分離および少なくとも３００μｌの洗浄液による３回の連続洗浄。最後の洗浄で、粒子は懸濁状態に戻される。
【０３６３】
ステップ２：
４．各反応ウェルに、
±ｐＡｂ−抗Ｔｆ−ｂｉｏｔ対照化合物の検出リガンド
±ｐＡｂ−抗ＤＩＧ−ｂｉｏｔ添加剤の検出リガンド
±分析物Ａ３およびＡ４の検出リガンド
を含有するコンジュゲート２の９０μｌの希釈剤が分配される。
５．撹拌しながら混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。
６．洗浄ステップ（同上のポイント３）を実行する。
【０３６４】
ステップ３：
７．各反応ウェルに９０μＬのＳ−ＰＥレポーターが分配される。
８．撹拌しながら混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。
９．洗浄ステップ（同上のポイント３）を実行する。
１０．１２０μＬの洗浄液を添加している間に各反応ウェルで粒子を懸濁状態に戻し、次にマイクロプレートを撹拌する。
１１．各ウェルの粒子の懸濁液を、フローサイトメーターによって吸引する。
１２．各ウェルの粒子の懸濁液を、２つのレーザー光線を用いて読み取る。
１３．読み取りの結果をフローサイトメーターによって直接的に処理し、相対蛍光強度（ＲＦＩ）単位で記録する。
１４．結果を解釈するために、各試料について閾値（「カットオフ」）に対する比を計算する。
【０３６５】
比の計算
試料のＳＤＣ比を以下の通りに計算する：
【０３６６】
【数１】
2017509897.tif 000003
【０３６７】
同様に、試料のＰＶＣ比を以下の通りに計算する：
【０３６８】
【数２】
2017509897.tif 000004
【０３６９】
１を上回る比（ＳＤＣまたはＰＶＣ）を有する試料は、「有効」と宣言され；比が１を下回るものは「無効」と宣言される。
【０３７０】
ＳＤＣおよびＰＶＣ閾値は、下の結果に記載される統計的研究によって確立された。
【０３７１】
結果
（ｉ）単純フォーマットのＳＤＣシステム
このシステムでは、分析物Ａ１からＡ４の検出ビーズおよびそれらの検出リガンドは用いられない。
【０３７２】
９４個の試料の研究が、ＳＤＣシステムの閾値の決定を可能にする（図７を参照）。ＳＤＣシステムの閾値は、母集団のシグナルの平均値から試料母集団のシグナルの標準偏差の３倍を引き算することによって計算される。
【０３７３】
【表２】
2017509897.tif 000005
【０３７４】
ＳＤＣシステムの応答は、公称方法の場合に測定される（試料の沈着量＝１００μＬ、コンジュゲート２の量＝９０μＬ、Ｓ−ＰＥの量＝９０μＬ）（表３のケース番号１）。表３のケース２、３、４は、ランクを下げた方法である：ケース２＝試料の沈着なし、ケース３＝コンジュゲート２の沈着なし、ケース４＝Ｓ−ＰＥの沈着なし。
【０３７５】
この場合には、「コンジュゲート２」を含む混合物は、ｐＡｂ−抗Ｔｆ−ｂｉｏｔ対照化合物の検出リガンドを含有するコンジュゲート２の希釈剤の９０μＬを含む。
【０３７６】
【表３】
2017509897.tif 000006
【０３７７】
ケース２、３、４は１未満のＳＤＣ比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。
【０３７８】
（ｉｉ）多重フォーマットでの性能に及ぼすＳＤＣシステムの影響
多重フォーマット（ＭＰＸ）のＳＤＣシステムでは、分析物Ａ１からＡ４の検出ビーズおよび対応する検出リガンドが用いられる。
【０３７９】
ＳＤＣのないＭＰＸフォーマット対ＳＤＣのあるＭＰＸの間で得られたＲＦＩシグナルを比較すると（表４を参照）、ＳＤＣフォーマットの添加は４つの分析物を含むマルチプレックスの性能に影響しない（すなわち、ＳＤＣのないＭＰＸフォーマット対ＳＤＣのあるＭＰＸの間のＲＦＩシグナルの％偏差は±２０％の区間に含まれ、それは統計学的に許容されると考えられる）。
【０３８０】
【表４】
2017509897.tif 000007
【０３８１】
（ｉｉｉ）単純フォーマットのＰＶＣ
前と同様に、このフォーマットでは、分析物Ａ１からＡ４の検出ビーズおよび対応する検出リガンドは用いられない。
【０３８２】
３８個の試料の研究が、ＰＶＣシステムの閾値の決定を可能にする（図８を参照）。
【０３８３】
ＰＶＣシステムの閾値は、母集団のシグナルの平均値から試料母集団のシグナルの標準偏差の３倍を引き算することによって計算される（表５を参照）。
【０３８４】
【表５】
2017509897.tif 000008
【０３８５】
ＰＶＣシステムの応答は、公称方法の場合に測定される（試料の沈着量＝１００μＬ、コンジュゲート１の量＝９０μＬ、Ｓ−ＰＥの量＝９０μＬ）（表６のケース番号１）。表６のケース２、３は、ランクを下げた方法である：ケース２＝コンジュゲート１の沈着なし、ケース３＝Ｓ−ＰＥの沈着なし。
【０３８６】
【表６】
2017509897.tif 000009
【０３８７】
ケース２および３は１未満のＰＶＣ比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。
【０３８８】
（ｉｖ）ＰＶＣシステムの性能に及ぼす単純対多重モードの影響
多重フォーマットのＰＶＣシステムでは、分析物Ａ１からＡ４の検出ビーズおよび対応する検出リガンドが用いられる。
【０３８９】
ＰＶＣシステムの性能は、単純モードおよび多重モードで類似している（表７を参照）。
【０３９０】
【表７】
2017509897.tif 000010
【０３９１】
さらに、ＳＤＣまたはＰＶＣのないＭＰＸフォーマット対ＳＤＣおよびＰＶＣのあるＭＰＸフォーマットの間で得られたＲＦＩシグナルを比較すると、ＳＤＣおよびＰＶＣ試験の追加は分析する４つの分析物を含む多重方式の性能に影響しないようである（すなわち、ＳＤＣまたはＰＶＣのないＭＰＸフォーマット対ＳＤＣおよびＰＶＣのあるＭＰＸフォーマットの間のＲＦＩシグナルの％偏差は±２０％の区間に含まれ、それは統計学的に許容されると考えられる）。
【０３９２】
［実施例２］
スポッティング方法
材料および方法
この実施例に記載される３つの対照は、
−  ＳＤＣ（「試料沈着対照」または「試料の沈着の対照」）：試料、さらにステップ２（コンジュゲート２の沈着）、ステップ３（Ｓ−ＰＯＤレポーターの沈着）およびステップ４（ルミノール基質の沈着）の沈着、
−  ＰＶＣ（「プロセス検証対照」または「分析物の検出リガンドの沈着の対照」）：ステップ１（添加剤の沈着およびコンジュゲート１の沈着）、ステップ３（Ｓ−ＰＯＤレポーターの沈着）およびステップ４（ルミノール基質の沈着）の沈着、ならびに
−  ＲＶＣ（「暴露検証対照」または「レポーターの沈着の対照」）：ステップ３（Ｓ−ＰＯＤレポーターの沈着）およびステップ４（ルミノール基質の沈着）の両方を対照することによる暴露ステップ
について検証することを可能にする（表８を参照）。
【０３９３】
【表８】
2017509897.tif 000011
【０３９４】
材料
（ｉ）分析システム
このシステムのために用いられる技術は、バイオチップ多重技術の革新的なナノスポッティング（下の定義を参照）であり、発色は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの酵素によってマーキングされ、ルミノールタイプの基質によって発色されるレポーターのおかげで、化学発光による。
【０３９５】
用語「バイオチップ」は、より速いリズムを得るために同時に多くの試験を実施することを可能にする、固体支持体に配置される小型化された試験部位（または「マイクロアレイ」）の集合である。
【０３９６】
マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の各ウェルの中で、分析する分析物（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、ＳＤＣ、ＲＶＣおよびＰＶＣ）に特異的であるタンパク質または抗体を含有するタンパク質溶液の５０ｎＬの液滴を沈着させるために、スポッターロボットが用いられる（図６を参照）。これらのマイクロプレートの各ウェルの底は、当業者にそれら自身公知であるタンパク質およびペプチド吸着能力を有する。このように得られるスポットは、当業者にそれ自体公知である飽和溶液で飽和する。
【０３９７】
これらのバイオチップの中で、１つまたは２つの免疫学的時間で伝統的な免疫反応を実施することが次に可能である。
【０３９８】
免疫反応の後、発色基質の添加は光放射を引き起こす。実際、酵素触媒作用によるルミノールの酸化は、スポットによって固定されるストレプトアビジン−ペルオキシダーゼレポーターの量に比例する光放射をもたらす。シグナルの獲得は、科学カメラで実行される。生じた画像は、各スポットに対応するウェルの底の各地理的ゾーンによって生成される発光の強度を判定するために、次に分析される（アドレス情報）。
【０３９９】
システムのソフトウェアは、スポットによって測定されるシグナルを相対発光単位（ＲＬＵ）の値に変換する。下に概説されるように、結果を陽性または陰性と定性的に評価するために、比を計算することができる。
【０４００】
（ｉｉ）固相（スポット）
異なる対照スポットは
−  ５０μｇ／ｍＬで固定化されたトランスフェリンの可溶性抗受容体マウスモノクローナル抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を含むＳＤＣスポット、
−  ２５μｇ／ｍＬで固定化された可溶性抗ジゴキシゲニンマウスモノクローナル抗体（Ｃｏｖａｌａｂ、Ｆｒａｎｃｅ）を含むＰＶＣスポット、および
−  当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いてビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）に結合され、１μｇ／ｍＬで固定化された、抗ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）マウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｗａｙ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を含むＲＶＣスポット
である。
【０４０１】
（ｉｉｉ）検出リガンド
対照化合物（ＳＤＣ対照に対して）の検出リガンド、ｐＡｂ−抗Ｔｆ−ｂｉｏｔは、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いてビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）に結合されている抗トランスフェリンヒツジポリクローナル抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｂａｒｎｅｓ  ｌａ  Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）である。
【０４０２】
添加剤（ＰＶＣ対照に対して）の検出リガンド、ｍＡｂ−抗ＤＩＧ−ｂｉｏｔは、ビオチンに結合した抗ジゴキシゲニンマウスモノクローナル抗体である（Ｃｏｖａｌａｂ、Ｆｒａｎｃｅ）。
【０４０３】
（ｉｖ）添加剤
ＢＳＡ−ＤＩＧ添加剤は、担体分子、この実施例ではウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に接がれたジゴキシゲニン（Ｓｉｇｍａ、Ｆｒａｎｃｅ）である。結合は、当業者にそれ自体公知であるヘテロ二官能基試薬を用いて実行される。
【０４０４】
（ｖ）レポーター
Ｓ−ＰＯＤレポーターは、P. Nakane and A. Kawaoi (J Histochem Cytochem (1974) Vol. 22, No. 12. pp. 1084-1091)に記載される方法によってペルオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合された、当業者にそれ自体公知であるストレプトアビジン（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。
【０４０５】
（ｖｉ）希釈剤
ａ）添加剤の希釈剤
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２０ｍＭ、５００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、１５％の牛乳（１００％スキム）、１０％のヒツジ血清、０．０９５％のＮａＮ３を含有するトリス緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．５。
ｂ）コンジュゲート１の希釈剤
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２０ｍＭ、Ｃｈａｐｓ  ０．１％、グリセロール１０％、０．０９５％のＮａＮ３を含有するトリス緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．５。
ｃ）コンジュゲート２の希釈剤
ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ５．６ｍＭ、２％のＴｒｉｔｏｎ、１０％のヒツジ血清、５００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ、０．５％のＰｒｏｃｌｉｎ  ３００（商標）（Ｓｕｐｅｌｃｏ社の商標）、１５％の牛乳（１００％スキム）、グリセロール１０％、０．０９５％のＮａＮ３を含有するクエン酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ６．７。
ｄ）Ｓ−ＰＯＤレポーターの希釈剤
ＮａＣｌ  ２０５３ｍＭ、０．５％のＴｗｅｅｎ  ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ社の商標）、０．５％のＰｒｏｃｌｉｎ  ３００（商標）（Ｓｕｐｅｌｃｏ社の商標）、７％の牛乳（１００％スキム）、グリセロール２０％を含有するクエン酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ６．７。
ｅ）洗浄液
ＮａＣｌ  ２１８ｍＭ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ社の商標）、０．００２％のＰｒｏｃｌｉｎ  ３００（商標）（Ｓｕｐｅｌｃｏ社の商標）を含有するトリス１０ｍＭ緩衝液、ｐＨ７．４。
ｆ）発色基質
ＥＬＩＳＴＡＲ  ＥＴＡ  Ｃ  Ｕｌｔｒａ  ＥＬＩＳＡ用発色基質（Ｃｙａｎａｇｅｎ、Ｉｔａｌｙ）は、２つの溶液：ＸＬＳＥ０２４Ｌルミノールエンハンサー溶液（Ａ）およびＸＬＳＥ０２４Ｐペルオキシド溶液（Ｂ）で構成される。
【０４０６】
（ｖｉｉ）反応シャーレ
免疫反応は、１ウェルにつき３９２μＬの最大容量を有するポリスチレンから作製された９６ウェルマイクロプレートで起こる。
【０４０７】
（ｖｉｉｉ）試料
用いた陰性試料（血清または血漿）は、Ｌｉｌｌｅのフランス血液機関から来る。
【０４０８】
方法
試験プロトコールは、以下のステップを含む。
ステップ１：
１．マイクロプレートの各ウェル（スポットを含む）に、
＋ＢＳＡ−ＤＩＧ添加剤を含有する添加剤の２０μｌの希釈剤、
＋以下を含有するコンジュゲート１の２０μｌの希釈剤：
＋ｍＡｂ−抗ＤＩＧ−ｂｉｏｔ添加剤の検出リガンド、および
＋分析する分析物１、２および３の検出リガンド
＋４０μｌの試料
が連続して分配される。
２．撹拌しながら混合物を３７℃で４０分間インキュベートする。
３．少なくとも４００μｌの洗浄液による３回の連続洗浄を実行する。
【０４０９】
ステップ２：
４．各反応ウェルに、
＋ｐＡｂ−抗Ｔｆ−ｂｉｏｔ対照化合物の検出リガンド、
＋分析する分析物４および５の検出リガンド
を含有するコンジュゲート２の５０μｌの希釈剤が分配される。
５．撹拌しながら混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。
６．洗浄ステップ（同上のポイント３）を実行する。
【０４１０】
ステップ３：
７．各反応ウェルに５０μＬのＳ−ＰＯＤレポーターが分配される。
８．撹拌しながら混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。
【０４１１】
ステップ４：
９．各反応ウェルに２５μＬの発色溶液「Ｂ」を分配する。
１０．各反応ウェルに２５μＬの発色溶液「Ａ」を分配する。
１０．撹拌しながら混合物を３７℃で１分間インキュベートする。
１１．発光シグナルの獲得を、１８０秒間実行する。
１２．読み取りの結果を画像分析システムによって直接的に処理し、相対光単位（ＲＬＵ）で記録する。
１３．結果を解釈するために、各試料について閾値（または「カットオフ」）に対する比を計算する。
【０４１２】
比の計算
２つの分析モードを下に例示する：
分析モード１：単一の閾値
試料のＳＤＣ比を以下の通りに計算する：
【０４１３】
【数３】
2017509897.tif 000012
【０４１４】
同様に、試料のＰＶＣ比を計算する：
【０４１５】
【数４】
2017509897.tif 000013
【０４１６】
同様に、試料のＲＶＣ比を計算する：
【０４１７】
【数５】
2017509897.tif 000014
【０４１８】
１を上回る比（ＳＤＣまたはＰＶＣまたはＲＶＣ）を有する試料は「有効」と宣言され；比が１を下回るものは「無効」と宣言される。ＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣ閾値は、下の結果のチャプターに記載される統計的研究によって確立された。
【０４１９】
分析モード２：２つの閾値
試料の２つのＳＤＣ比を以下の通りに計算する：
【０４２０】
【数６】
2017509897.tif 000015
【０４２１】
同様に、試料のＰＶＣ比を計算する：
【０４２２】
【数７】
2017509897.tif 000016
【０４２３】
同様に、試料のＲＶＣ比を計算する：
【０４２４】
【数８】
2017509897.tif 000017
【０４２５】
１を上回る比（閾値−）（ＳＤＣまたはＰＶＣまたはＲＶＣ）を有する試料は「有効」と宣言され；比が１を下回るものは「無効」と宣言される。
【０４２６】
１を下回る比（閾値＋）（ＳＤＣまたはＰＶＣまたはＲＶＣ）を有する試料は「有効」と宣言され；比が１を上回るものは「無効」と宣言される。
【０４２７】
ＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣ閾値は、下の結果のチャプターに記載される統計的研究によって確立された。
【０４２８】
結果
この実施例に記載される多重方式は、分析する５つの分析物、３つの分析物はその検出リガンドがステップ１で添加され（Ａ１、Ａ２およびＡ３）、２つの分析物はその検出リガンドがステップ２で添加され（Ａ４およびＡ５）、ならびに３つのＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣ対照を含む。
【０４２９】
表９は、ＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣ対照の独立したまたは累積の無効の後に遭遇する可能性のあるシナリオをグループ分けする。
【０４３０】
ＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣ対照の応答は、２２個の試料についての公称方法の場合に測定される（添加剤の量＝２０μＬ、コンジュゲート１の量＝２０μＬ、沈着試料の量＝４０μＬ、コンジュゲート２の量＝５０μＬ、Ｓ−ＰＯＤの量＝５０μＬ、ルミノールの量＝２５μＬの溶液Ｂ＋２５μＬの溶液Ａ）。
【０４３１】
これらの２２個の試料の研究は、ＳＰＣ、ＰＶＣ、ＲＶＣの応答を、平均スポット、標準偏差、最小値および最大値に関して特徴付けることを可能にする（表１０ａおよび１０ｂを参照）。ＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣ対照の閾値も、計算される。
【０４３２】
【表９】
2017509897.tif 000018
【０４３３】
分析モード１：単一の閾値
【０４３４】
【表１０】
2017509897.tif 000019
【０４３５】
分析モード２：２つの閾値
【０４３６】
【表１１】
2017509897.tif 000020
【０４３７】
ＳＤＣ、ＰＶＣ、ＲＶＣ対照の応答および計算された閾値（表１０ａおよび１０ｂを参照）を組み合わせることによって、各試料のＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣ比が計算される（表１１ａおよび１１ｂを参照）。
【０４３８】
分析モード１：単一の閾値
【０４３９】
【表１２】
2017509897.tif 000021
【０４４０】
分析モード２：２つの閾値
【０４４１】
【表１３】
2017509897.tif 000022
【０４４２】
ＳＤＣ、ＰＶＣ、ＲＶＣ対照の（閾値＋）および（閾値−）比からの解釈の状態は、全２２個の試料で「有効」である。ＳＤＣ、ＰＶＣ、ＲＶＣ対照からの解釈の状態は、全２２個の試料で「有効」である。
【０４４３】
ランクを下げたモードで実行した方法のケーススタディを、表１２および１３ａおよび１３ｂに例示する。６つのケースを示す：
−  ケース１＝試料の沈着がない。
−  ケース２＝添加剤の沈着がない。
−  ケース３＝コンジュゲート１の沈着がない。
−  ケース４＝コンジュゲート２の沈着がない。
−  ケース５＝Ｓ−ＰＯＤの沈着がない。
−  ケース６＝ルミノールの沈着がない。
【０４４４】
分析モード１：単一の閾値
ケース１および４は１未満のＳＤＣ比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。
ケース２および３は１未満のＰＶＣ比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。
ケース５および６は１未満のＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣ比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。ＲＶＣシグナルは、発色ステップ（Ｓ−ＰＯＤ沈着およびルミノール沈着）を特異的に無効にすることを可能にする。しかし、１未満のＲＶＣ比による手法の無効化は、ＳＤＣおよびＰＶＣ対照の系統的なシグナルの不在を暗示する（表９の灰色ゾーンを参照）。この場合、試料およびコンジュゲート２の沈着（ＳＤＣによって対照される沈着）かまたは添加剤およびコンジュゲート１の沈着（ＰＶＣによって対照される沈着）が正しく起こったか判定することができない。
【０４４５】
分析モード２：２つの閾値
ケース１および４は１未満のＳＶＣ（閾値−）比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。ケース１に加えて、ＰＶＣ（閾値＋）比は１を超え、それはＰＶＣ対照に及ぼす試料の不在の間接的な影響を反映する。
ケース２および３は１未満のＰＶＣ（閾値−）比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。
ケース５および６は１未満のＳＤＣ、ＰＶＣおよびＲＶＣ（閾値−）比をもたらし、それはこれらのランクを下げた方法からの測定を無効にすることを可能にする。ＲＶＣシグナルは、発色ステップ（Ｓ−ＰＯＤ沈着およびルミノール沈着）を特異的に無効にすることを可能にする。しかし、１未満のＲＶＣ（閾値−）比による手法の無効化は、ＳＤＣおよびＰＶＣ対照の系統的なシグナルの不在を暗示する（表９の灰色ゾーンを参照）。この場合、試料およびコンジュゲート２の沈着（ＳＤＣによって対照される沈着）かまたは添加剤およびコンジュゲート１の沈着（ＰＶＣによって対照される沈着）が正しく起こったか判定することができない。
【０４４６】
【表１４】
2017509897.tif 000023
【０４４７】
分析モード１：単一の閾値
【０４４８】
【表１５】
2017509897.tif 000024
【０４４９】
分析モード２：２つの閾値
【０４５０】
【表１６】
2017509897.tif 000025
【０４５１】
さらに、ＳＤＣまたはＰＶＣのないＭＰＸフォーマット対ＳＤＣおよびＰＶＣのあるＭＰＸフォーマットの間で得られたＲＬＵシグナルを比較すると、ＳＤＣおよびＰＶＣ試験の追加は分析する４つの分析物を含む多重方式の性能に影響しないようである（すなわち、ＳＤＣまたはＰＶＣのないＭＰＸフォーマット対ＳＤＣおよびＰＶＣのあるＭＰＸフォーマットの間のＲＬＵシグナルの％偏差は±２０％の区間に含まれ、それは統計学的に許容可能であると考えられる）。
【図１】
2017509897.tif 000026
【図２】
2017509897.tif 000027
【図３】
2017509897.tif 000028
【図４】
2017509897.tif 000029
【図５】
2017509897.tif 000030
【図６】
2017509897.tif 000031
【図７】
2017509897.tif 000032
【図８】
2017509897.tif 000033
【国際調査報告】
2017509897.tif 000034
2017509897.tif 000035
2017509897.tif 000036
2017509897.tif 000037