(57)【要約】  本開示は、新生児のＦｃ受容体ＦｃＲｎへの結合親和性を有する操作されたポリペプチドの二量体に関し、第一の単量体単位、第二の単量体単位およびアミノ酸リンカーを含む、ＦｃＲｎ結合二量体を提供し、ここで前記第一および第二の単量体単位は各々ＦｃＲｎ結合モチーフを含む。前記ＦｃＲｎ結合二量体は、前記第一の単量体単位または第二の単量体単位単独に比べ、より高い能力で、ＦｃＲｎに結合する。本開示はまた、薬物動態学的および薬力学的特性を改変するための薬剤として、ならびに治療薬としての前記ＦｃＲｎ結合二量体の使用にも関する。
2017533885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の単量体単位、第二の単量体単位およびアミノ酸リンカーを含む、ＦｃＲｎ結合二量体であって、ここで前記第一および第二の単量体単位が各々、ＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）を含み、このモチーフが、アミノ酸配列：
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＲＷＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＲＸ21ＡＦＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29
（配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ17は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ21は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ25は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；ならびに
Ｘ29は、ＤおよびＲから選択される）
からなり、
且つここで前記ＦｃＲｎ結合二量体が、前記第一の単量体単位または前記第二の単量体単位単独と比べ、より高い結合能でＦｃＲｎへ結合する、前記ＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項２】
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つのＢＭが、
ｉ）  ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6ＨＥＩＲＷＬＰＮＬＴＸ17Ｘ18ＱＲＸ21ＡＦＩＸ25ＫＬＸ28Ｄ
（配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ17は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ21は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ25は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される）；ならびに
ｉｉ）  ｉ）に定義された配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項３】
前記第一および第二の単量体単位が、同一のＢＭ配列を含む、請求項１又は２に記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項４】
前記第一および第二の単量体単位が、異なるＢＭ配列を含む、請求項１又は２に記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項５】
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜３５３からなる群、例えば配列番号１７〜３５２からなる群、例えば配列番号１７〜１４０からなる群、例えば配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群、例えば配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＦｃＲｎ結合モチーフＢＭを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項６】
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号１、配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる群、例えば配列番号４４から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＦｃＲｎ結合モチーフＢＭを含む、請求項５記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項７】
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、
ｘｉ）  ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ｘｖ）  ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ｘｖｉｉ）  ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
（配列中、［ＢＭ］は、請求項１〜２のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）、ならびに
ｘｉ）、ｘｖ）またはｘｖｉｉ）により定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項８】
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号３５４〜３５７および配列番号３６０〜３６７からなる群、例えば配列番号３５７および配列番号３６０〜３６７からなる群から選択される配列ｘｉ）を含む、請求項７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項９】
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、
ｘｘｉ）  ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
（配列中、［ＢＭ］は、請求項１〜２のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）、ならびに
ｘｘｉｉ）  ｘｘｉ）により定義された配列と少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項１０】
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜３５３からなる群、例えば配列番号１７〜３５２からなる群、例えば配列番号１７〜１４０からなる群、例えば配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群、例えば配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号４１、配列番号４４および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、請求項９記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項１１】
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号１、配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる群、例えば配列番号４４から選択される配列ｘｘｉ）を含む、請求項１０記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項１２】
前記第一および第二の単量体単位が、それぞれ、配列番号３６５および配列番号３６５；配列番号３６６および配列番号３６６；または、配列番号３６７および配列番号３６７を含む、請求項８記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項１３】
前記リンカーが、
（ＧnＳm）pおよび（ＳnＧm）p
（式中、独立して、
ｎ＝１−７、
ｍ＝０〜７、
ｎ＋ｍ≦８、および
ｐ＝１〜７である）
から選択される一般式を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項１４】
対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも６倍、例えば少なくとも７倍、例えば少なくとも８倍、例えば少なくとも９倍、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも２５倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍より高い能力で、ＦｃＲｎへ結合することが可能である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＦｃＲｎ結合二量体。
【請求項１５】
融合タンパク質またはコンジュゲート体であって：
−先行する請求項のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体からなる第一の部分：および
−望ましい生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分：
を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
【請求項１６】
ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を阻害する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
【請求項１７】
ＦｃＲｎ結合二量体のＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を遮断する能力が、対応する第一または第二の単量体単位単独の遮断能力と比べ、少なくとも２倍高い、例えば少なくとも３倍高い、例えば少なくとも４倍高い、例えば少なくとも５倍高い、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも１５倍、例えば少なくとも２０倍、例えば少なくとも２５倍高いように、ＦｃＲｎに結合する、請求項１６記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体、および少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤または担体を含有する、組成物。
【請求項１９】
医薬品として使用するための、請求項１〜１７のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体、または請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
前記医薬品が、自己免疫状態、同種免疫状態、てんかんおよび発作からなる群から選択される状態の治療または予防用である、請求項１９記載の使用のためのＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本開示は、新生児のＦｃ受容体（以下ＦｃＲｎと称す）への結合親和性を有する操作されたポリペプチドの二量体に関する。本開示は、生体分子、例えば医薬品の薬物動態学的および薬力学的特性を改変するための薬剤として、および治療薬としてのかかる二量体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、膜貫通ＭＨＣクラスＩ様重鎖（ＦｃＲｎα鎖）およびβ２−ミクログロブリン軽鎖からなるヘテロ二量体のタンパク質であり、β２−ミクログロブリン軽鎖は、ＭＨＣクラスＩ分子の一部も形成する（ＳｉｍｉｓｔｅｒおよびＭｏｓｔｏｖ、（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：１８４−７；Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３７９−８３）。
【０００３】
ＦｃＲｎは、エンドソームに主に位置しており、ｐＨ≦６．５で血清アルブミンおよび免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に結合し、ｐＨ≧７．０でそれらを遊離することができる（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ、（２００７）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、７：７１５−２５において検証）。
【０００４】
ＦｃＲｎは、哺乳類においていくつかの独特なタスクを行う（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ、前掲）。ＦｃＲｎは、飲食されたＩｇＧおよび血清アルブミンの再利用に関与しており、従って、リソソームにおけるそれらの分解を防ぎ、それらに血液中での他の血清タンパク質より長い半減期およびより高い利用可能性を与える。ＩｇＧ、血清アルブミンおよび他の血清タンパク質が、血液と接触している細胞によって受動的に飲作用された場合、ｐＨは、形成されたエンドソームにおいて次第に低くなり、これによってＦｃＲｎへのＩｇＧおよび血清アルブミンの結合が可能になる。次いで、受容体は、その結合したリガンドとともに、再利用エンドソームを介して輸送されて細胞膜に戻る。細胞膜に戻った後、ｐＨは、７を超えるまで増加し、この時点で、結合したリガンドは遊離される。
【０００５】
ＦｃＲｎは、胎盤、上気道上皮、血液脳関門および近位小腸のような障壁を通過してＩｇＧを輸送するその能力も認められている。
【０００６】
哺乳類において、ＦｃＲｎの特性は、胎盤を介して母親から胎児へＩｇＧを経細胞輸送するために、および母乳から近位小腸における乳児の血流にＩｇＧを経細胞輸送するために使用される。
【０００７】
ＦｃＲｎの発現パターンは、種間で異なる。しかしながら、ＦｃＲｎは、大部分の種において、血液脳関門、上気道上皮、腎臓および血管内皮における細胞によって、および抗原提示細胞によって、ならびに造血起源の他の細胞によって、広く発現される（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ、（２００７）、前掲）。
【０００８】
ＦｃＲｎ（Ｌｉｕら、（２００７）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７９：２９９９−３０１１、Ｍｅｚｏら、（２００８）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０５：２３３７−４２）およびβ２−ミクログロブリン（ＧｅｔｍａｎおよびＢａｌｔｈａｓａｒ、（２００５）、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、９４：７１８−２９）への親和性を有する抗体およびペプチドは、内在性ＩｇＧとＦｃＲｎの間の結合を阻害するという見解が展開されてきた。別の手法は、ＦｃＲｎへのより高い親和性を得るために、ＩｇＧのＦｃ領域を変異導入することであった（Ｐｅｔｋｏｖａら、（２００６）、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８：１７５９−６９、Ｖａｃｃａｒｏら、（２００５）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３：１２８３−８）。
【０００９】
Ｆｃドメインへのまたはアルブミンへの融合は、タンパク質のインビボ半減期を増加させるために広く使用されている戦略である。しかしながら、大きいサイズのかかる融合タンパク質は、組織透過性に悪影響を及ぼし、融合パートナーへの特異性を減少させる（Ｖａｌｌｅｓら、（２０１１）、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ、３２：１７８−１８４）。他方では、変異は、非ヒト霊長類に投与される抗体のＦｃ断片において半減期を延長するために行われてきた（Ｈｉｎｔｏｎら、（２００４）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：６２１３−６）。しかしながら、この手法は、使用において治療的抗体のみに限定され、問題のタンパク質がＦｃ断片に融合されていない限り、他の治療的タンパク質に外挿することはできず、この融合もまた大きいサイズの分子を生じる。ペグ化およびＩｇＧのＦｃドメインまたはアルブミンへのタンパク質の遺伝子融合のような、いくつかの化学的および組換え方法が考案されて、タンパク質半減期を改善した（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、（２００９）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２１：１１８６−１１９０において検証）。タンパク質のペグ化はそれらの効力を減少させ、それらの免疫反応性の一因となることが報告された。
【００１０】
Ｆｃ融合タンパク質は、ＦｃＲｎによって媒介される経口および肺送達にも使用されてきた（Ｌｏｗら、（２００５）、Ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｊｕｌ；２０（７）：１８０５−１３）が、しかしながら、融合分子のサイズにより、組織透過性および減少した特異性に関する同様の問題が残る。
【００１１】
故に、ＦｃＲｎへの高親和性を有する分子の継続した提供のための当分野における大きな必要性がある。特に、融合パートナーとして存在する場合、それらが融合している分子の特性に悪影響を及ぼさず、免疫反応性の一因とならない、小さい結合分子が必要とされている。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
本発明の開示は、二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、対応する単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチドと比べ、有意に改善されたＦｃＲｎ結合特性を示すという予想外の認識を基にしている。本発明者らは、前記二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチドの結合特性の改善は、２個のＦｃＲｎ結合ポリペプチドの単なる融合により予想されるよりもより大きいことを認めた。
【００１３】
従って、新規ＦｃＲｎ結合体を提供することは、本開示の目的である。
【００１４】
生体分子の薬物動態学的および／または薬力学的特性の改変における使用のためのかかる薬剤、例えば医薬品を提供することもまた、本開示の目的である。
【００１５】
それ自体で単独での治療薬としてのまたは組合せ治療としての使用のためのかかる薬剤を提供することも、本開示の目的である。
【００１６】
現在の療法の上記のおよび他の欠点を緩和すると同時に、ＦｃＲｎの効率的な標的化を可能にする分子を提供することは、本開示の目的である。
【００１７】
本開示から当業者に明白であるこれらおよび他の目的は、添付の特許請求の範囲で特許請求し、本明細書で一般に開示した本発明の種々の態様によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、本開示の第一の態様において、第一の単量体単位、第二の単量体単位およびアミノ酸リンカーを含む、二量体型の新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチド、すなわち「ＦｃＲｎ結合二量体」であって、前記第一および第二の単量体単位が、各々ＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）を含み、そのモチーフが、アミノ酸配列
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＲＷＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＲＸ21ＡＦＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29
（配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ，Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ，ＷおよびＹから選択され；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳＴ、Ｖ，ＷおよびＹから選択され；
Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ17は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ21は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ25は、Ａ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；ならびに
Ｘ29は、ＤおよびＲから選択される）
からなり、
且つここで前記ＦｃＲｎ結合二量体は、前記第一の単量体単位または前記第二の単量体単位単独と比べ、より高い結合能でＦｃＲｎへ結合する、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合ポリペプチドが提供される。
【００１９】
配列に関連する、ＦｃＲｎ結合モチーフのクラスの上記の定義は、いくつかの異なる選択実験においてＦｃＲｎとのそれらの相互作用に関して選択された、親骨格 (parent scaffold)のいくつかのランダムポリペプチド単量体の変異体(variant)の統計的分析に基づく。同定されたＦｃＲｎ結合モチーフ、または「ＢＭ」は、親骨格の標的結合領域に相当し、その領域は、３ヘリックス束タンパク質ドメイン（ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｂｕｎｄｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ）内に２つのαヘリックスを構成する。親骨格において、２つのＢＭヘリックスの多様なアミノ酸残基は、抗体の定常Ｆｃ部との相互作用のための結合表面を構成する。本開示において、結合表面残基のランダムな変動およびその後の変異体の選択は、Ｆｃ相互作用能力を、ＦｃＲｎとの相互作用のための能力と置き換えた。
【００２０】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つのＦｃＲｎ結合モチーフは、アミノ酸配列
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＲＷＬＰＮＬＴＸ17Ｘ18ＱＲＸ21ＡＦＩＸ25ＫＬＸ28Ｄ
（配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ17は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ21は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ25は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；ならびに
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択される）からなる。
【００２１】
本開示の第一の態様の一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つの前記結合モチーフは、アミノ酸配列
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6Ｘ7ＥＩＲＷＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＲＸ21ＡＦＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29
（配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ17は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ21は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ25は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；ならびに
Ｘ29は、ＤおよびＲから選択される）からなる。
【００２２】
第一の態様の別の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つの前記結合モチーフは、かかるアミノ酸配列からなり、配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ17は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ｄであり；
Ｘ21は、Ｖであり；
Ｘ25は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；ならびに
Ｘ29は、ＤおよびＲから選択される。
【００２３】
第一の態様の別の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおける前記ＢＭは、
ｉ）  ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6ＨＥＩＲＷＬＰＮＬＴＸ17Ｘ18ＱＲＸ21ＡＦＩＸ25ＫＬＸ28Ｄ
（配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ17は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ21は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ25は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される）；ならびに
ｉｉ）  前記配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００２４】
前記態様の更に別の実施形態において、前記配列ｉ）におけるＢＭは、
ＥＸ2Ｘ3Ｘ4ＡＸ6ＨＥＩＲＷＬＰＮＬＴＸ17Ｘ18ＱＲＸ21ＡＦＩＸ25ＫＬＸ28Ｄ
（配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＷから選択され；
Ｘ3は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ17は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ21は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ25は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、ＲおよびＶから選択され；ならびに
Ｘ28は、Ａ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される）
から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００２５】
当業者は理解することになるように、本開示の二量体のＦｃＲｎ結合能を含めた、任意のポリペプチドの機能は、ポリペプチドの三次構造次第である。従って、その機能に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列に軽微な変更を行うことが可能である。従って、本開示は、ＦｃＲｎ結合二量体の変異体、例えば前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが改変されているが、ＦｃＲｎ結合特徴は保持されている変異体を、包含している。
【００２６】
従って、上記のように、ＦｃＲｎ結合二量体も、本開示によって包含され、ここで前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは、ｉ）において定義されたポリペプチドへの９６％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、かかる変更は、本明細書で開示したＢＭの配列の全ての位置において行うことができる。他の実施形態において、かかる変更は、骨格アミノ酸残基 (scaffold amino acid residues)としても表示される、非可変位置においてのみ行うことができる。かかる場合において、変更は、可変位置、すなわち配列ｉ）における「Ｘ」で表示された位置において許容されない。例えば、アミノ酸残基のある官能グループ（例えば疎水性、親水性、極性など）に属しているアミノ酸残基を、同じ官能基からの別のアミノ酸残基と交換することが可能である。
【００２８】
本明細書全体を通して使用される、「％の同一性 (% identity)」という用語は、例えば以下のように計算することができる。問い合わせ配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３−４６８０）を使用して、標的配列に整列させる。比較を、整列した配列の最も短いものに相当するウインドウ上で行う。いくつかの場合において、整列した配列の最も短いものは、標的配列であり得る。他の場合において、問い合わせ配列は、整列した配列の最も短いものを構成し得る。各位置でのアミノ酸残基を比較し、標的配列において同一の一致を有する問い合わせ配列における位置の百分率を、％の同一性として報告する。
【００２９】
本明細書で使用される「Ｘn」および「Ｘm」は、先に定義されたＢＭの配列における位置ｎおよびｍでのアミノ酸を示すように使用され、ここでｎおよびｍは、前記配列のＮ末端から数えた、前記配列内のアミノ酸の位置を示す整数である。例えば、Ｘ3およびＸ7は、前記ＢＭのＮ末端から、各々、３番目および７番目の位置にあるアミノ酸を示す。
【００３０】
第一の態様の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、ＦｃＲｎ結合モチーフを含む、ＦｃＲｎ結合二量体が提供され、ここでＸnは、表１に従い可能性のある残基の群から独立して選択される。当業者は、Ｘnは、可能性のある残基の列挙された基のいずれか一つから選択され得ること、ならびにこの選択は、Ｘmにおけるアミノ酸の選択には左右されない（ここで、ｎ≠ｍ）ことを、理解するであろう。従って、表１において位置Ｘnで列挙された可能性のある残基は、表１のいずれか他の様々な位置の本明細書で開示された可能性のある残基のいずれかと組合せることができる。
【００３１】
当業者は、表１は、下記のように判読されるべきであることを理解するであろう：第一の態様の一実施形態において、前記第一の単量体単位および前記第二の単量体単位が各々、ＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）を含み、且つ前記第一の単量体単位および前記第二の単量体単位の少なくとも一つのＢＭにおけるアミノ酸残基「Ｘn」が、「可能性のある残基」から選択される、ＦｃＲｎ結合二量体が提供される。当業者は、第一の単量体単位のＢＭにおけるアミノ酸残基「Ｘn」は、第二の単量体単位のＢＭにおけるアミノ酸残基「Ｘn」から独立して選択されることを理解するであろう。従って、表１は、本開示の第一の単量体単位および第二の単量体単位のいくつかの特徴的および個別の変異体を明らかにしている。例えば、一実施形態において、少なくとも一つの第一または第二の単量体単位を含み、ここでＢＭのＸ2は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択される、ＦｃＲｎ結合二量体が提供され、ならびに別の実施形態において、少なくとも一つの第一または第二の単量体単位を含み、ここでＢＭのＸ2は、Ａ、Ｉ、ＬおよびＱから選択される、ＦｃＲｎ結合二量体が提供される。不確かさを避けるために、前記第一および第二の単量体単位は、他の実施形態において自在に組合せることができる。例えば、一つのかかる実施形態において、Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴから選択されると同時に、Ｘ7は、ＡおよびＨから選択され、ならびにＸ25は、Ｈ、Ｌ、Ｒ、ＶおよびＷから選択される。
【００３２】
【表１−１】
2017533885.tif 000003
【表１−２】
2017533885.tif 000004
【表１−３】
2017533885.tif 000005
【００３３】
一実施形態において、Ｘ6Ｘ7が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてＡＨおよびＧＨから選択されるＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。一実施形態において、Ｘ6Ｘ7はＡＨである。一実施形態において、Ｘ6Ｘ7はＧＨである。一実施形態において、Ｘ17Ｘ18は、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてＦＤおよびＹＤから選択される。一実施形態において、Ｘ17Ｘ18はＦＤである。
【００３４】
ＦｃＲｎ結合二量体のサブクラスを定義するより具体的な実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つのＢＭの配列は、６つの条件Ｉ−ＶＩ：
Ｉ．  Ｘ6は、Ａ、Ｇ、ＫおよびＳから選択され、例えば特にＡである；
ＩＩ．  Ｘ7は、Ｈである；
ＩＩＩ．  Ｘ17は、ＦおよびＹから選択され、例えば特にＦである；
ＩＶ．  Ｘ18は、Ｄである；
Ｖ．  Ｘ21は、ＶおよびＷから選択され、例えば特にＶである；
ＶＩ．  Ｘ25は、ＨおよびＲから選択され、例えば特にＨである：
の少なくとも３つを満たしている。
【００３５】
第一の態様のＦｃＲｎ結合二量体の一部の例において、前記配列は、６つの条件Ｉ〜ＶＩの少なくとも４つを満たしている。より具体的には、配列は、６つの条件Ｉ〜ＶＩの少なくとも５つを、例えば６つの条件Ｉ〜ＶＩの全てを満たすことができる。
【００３６】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位のＢＭ配列は、同じである。別の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位のＢＭ配列は、異なる。
【００３７】
下記実施例の項目において詳細に説明したように、ＦｃＲｎ結合ポリペプチド単量体単位の選択は、いくつかの個別のＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）配列の同定に繋がる。これらの配列は、本明細書に開示したような、第一および第二の単量体単位として有用な個別の変異体を構成する。個別のＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）の配列は、図１に示されており、且つ配列番号１〜３５３からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に相当している。故に、第一の態様のＦｃＲｎ結合二量体の一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは、配列番号１〜３５３からなる群から選択される、例えば配列番号１７〜３５２からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む。一実施形態において、前記ＢＭ配列は、配列番号１〜１５、配列番号１７〜１４０および配列番号３５３からなる群、例えば配列番号１７〜１４０からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記配列は、配列番号１〜２および配列番号１７〜１４０からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記配列は、配列番号１〜２、配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群、例えば配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記配列は、配列番号１〜８、配列番号１３、配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３５３からなる群、例えば配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。別の実施形態において、前記配列は、配列番号１、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。別の実施形態において、前記配列は、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。更に別の実施形態において、前記配列は、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。更に別の実施形態において、前記配列は、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。更に別の実施形態において、前記配列は、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。更に別の実施形態において、前記配列は、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記配列は、配列番号１、配列番号２３および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２３および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記配列は、配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる群、例えば配列番号２０および配列番号４１からなる群；配列番号２０および配列番号４４からなる群；または、配列番号４１および配列番号４４からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記配列は、配列番号１、配列番号２３および配列番号４４からなる群、例えば配列番号２３および配列番号４４からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記配列は、配列番号１または配列番号２３または配列番号４４における位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記配列は、配列番号２０または配列番号４１または配列番号４４における位置８から位置３６までの配列に対応する。
【００３８】
本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合二量体の一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、先に定義した群の一つから選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む。一実施形態において、前記群は、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる。一実施形態において、前記群は、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４および配列番号７５からなる。一実施形態において、前記群は、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる。別の実施形態において、前記群は、配列番号１、配列番号２３および配列番号４４からなる。更に別の実施形態において、前記群は、配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる。一つの特定の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、配列番号１の位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む。一実施形態において、前記ＢＭは、配列番号２０の位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭは、配列番号２３の位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭは、配列番号４１の位置８から位置３６までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭは、配列番号４４の位置８から位置３６までの配列に対応する。
【００３９】
本開示のいくつかの実施形態において、上記で定義されたＢＭは、３ヘリックス束タンパク質ドメイン「の一部を形成する (forms part of)」。これは、ＢＭが本来の (original)ドメインにおける同様の構造モチーフと置き換わるように、ＢＭの配列が、本来の３ヘリックス束ドメインの配列中に「挿入された (inserted)」またはこの配列上に「移植された(grafted)」ことを意味すると理解される。例えば、理論によって束縛されることを望むことなく、ＢＭは、３ヘリックス束の３つのヘリックスの２つを構成すると考えられ、従って、任意の３ヘリックス束内のそのような２ヘリックスモチーフと置き換わることができる。当業者は理解することになるように、２つのＢＭヘリックスによる３ヘリックス束ドメインの２つのヘリックスの置換は、ポリペプチドの基本構造に影響を及ぼさないように行わなければならない。つまり、本発明のこの実施形態によるポリペプチドのＣα主鎖の全体的な折り畳みは、例えば同じ順序で二次構造の同じエレメントを有するなど、それが一部を形成する３ヘリックス束タンパク質ドメインの折り畳みと実質的に同じである。従って、本態様のこの実施形態によるポリペプチドが本来のドメインと同じ折り畳みを有する場合、本開示によるＢＭは、３ヘリックス束ドメインの「一部を形成し」、これは、基本構造の特性が共有されていることを暗示しており、それらの特性は、例えば同様のＣＤスペクトルを生じる。当業者は、関連する他のパラメーターを知っている。
【００４０】
従って、特定の実施形態において、前記第一および第二の単量体の少なくとも一つにおけるＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する。例えば、ＢＭは、前記３ヘリックス束タンパク質ドメイン内に、相互接続ループを有する２つのαヘリックスを本質的に構成し得る。特定の実施形態において、前記３ヘリックス束タンパク質ドメインは、細菌の受容体タンパク質のドメインから選択される。かかるドメインの非限定的な例は、ドメインＢのような、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡおよびその誘導体の５つの異なる３ヘリックスドメインである。いくつかの実施形態において、３ヘリックス束タンパク質ドメインは、ブドウ球菌のプロテインＡのドメインＢに由来するプロテインＺの変異体である。
【００４１】
本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合モチーフが３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体の前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは、結合モジュール（ＢＭｏｄ）を含むことができ、このモジュールは、
ｉｉｉ）  Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＸaＸbＬＬＸcＥＡＫＫＬＸdＸeＸfＱ；
（配列中、
［ＢＭ］は、Ｘ29がＤであるという条件で、本明細書に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり；
Ｘaは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘbは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘdは、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘeは、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘfは、ＡおよびＳから選択される）、ならびに
ｉｖ）  ｉｉｉ）により定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４２】
本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合モチーフが３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体の前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは、結合モジュール（ＢＭｏｄ）を含むことができ、このモジュールは、
ｖ）  Ｋ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＸaＸbＬＬＸcＥＡＫＫＬＸdＸeＸfＱ：
（配列中、
［ＢＭ］は、Ｘ29がＲであるという条件で、本明細書に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり；
Ｘaは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘbは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘdは、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘeは、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘfは、ＡおよびＳから選択される）、ならびに
ｖｉ）  ｖ）により定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４３】
上記のように、三次構造およびその機能に大きな影響を及ぼさない、上記のアミノ酸配列と比較して軽微な変更を含むポリペプチドも、本開示の範囲内である。従って、いくつかの実施形態において、配列ｉｖ）または配列ｖｉ）は、それぞれ、ｉｉｉ）およびｖ）によって定義された配列と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の同一性を有する。
【００４４】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、ＸaはＡである、配列ｉｉｉ）またはｖ）を含むＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。別の実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸaは、Ａである。別の実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸaは、Ｓである。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸaは、Ａである。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸaは、Ｓである。
【００４５】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、ＸbはＮである、配列ｉｉｉ）またはｖ）を含むＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸbは、Ｅである。
【００４６】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、ＸcはＡである、配列ｉｉｉ）またはｖ）を含むＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸcは、Ｓである。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸcは、Ｃである。
【００４７】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、ＸdはＥである、配列ｉｉｉ）またはｖ）を含むＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸdは、Ｎである。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸdは、Ｓである。
【００４８】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、ＸeはＤである、配列ｉｉｉ）またはｖ）を含むＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸeは、Ｓである。
【００４９】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、ＸdＸeが、ＥＥ、ＥＳ、ＳＤ、ＳＥおよびＳＳから選択される、配列ｉｉｉ）またはｖ）を含むＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸdＸeは、ＥＳである。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸdＸeは、ＳＥである。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸdＸeは、ＳＤである。
【００５０】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、ＸfはＡである、配列ｉｉｉ）またはｖ）を含むＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）におけるＸfは、Ｓである。
【００５１】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり、およびＸfはＡである、配列ｉｉｉ）またはｖ）を含むＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。
【００５２】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＡであり、およびＸfはＡである。
【００５３】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＣであり、およびＸfはＡである。
【００５４】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＳであり、およびＸfはＳである。
【００５５】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＣであり、およびＸfはＳである。
【００５６】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり；ＸdＸeはＮＤであり、およびＸfはＡである。
【００５７】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＡであり；ＸdＸeはＮＤであり、およびＸfはＡである。
【００５８】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＣであり；ＸdＸeはＮＤであり、およびＸfはＡである。
【００５９】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＳであり；ＸdＸeはＮＤであり、およびＸfはＳである。
【００６０】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＣであり；ＸdＸeはＮＤであり、およびＸfはＳである。
【００６１】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり；ＸdＸeはＳＥであり、およびＸfはＡである。
【００６２】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＡであり；ＸdＸeはＳＥであり、およびＸfはＡである。
【００６３】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＣであり；ＸdＸeはＳＥであり、およびＸfはＡである。
【００６４】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＳであり；ＸdＸeはＳＥであり、およびＸfはＳである。
【００６５】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＣであり；ＸdＸeはＳＥであり、およびＸfはＳである。
【００６６】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり；ＸdＸeはＥＳであり、およびＸfはＡである。
【００６７】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＡであり；ＸdＸeはＥＳであり、およびＸfはＡである。
【００６８】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＣであり；ＸdＸeはＥＳであり、およびＸfはＡである。
【００６９】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＳであり；ＸdＸeはＥＳであり、およびＸfはＳである。
【００７０】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＣであり；ＸdＸeはＥＳであり、およびＸfはＳである。
【００７１】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＡであり；ＸdＸeはＳＤであり、およびＸfはＡである。
【００７２】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＡであり；ＸdＸeはＳＤであり、およびＸfはＡである。
【００７３】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＡであり；ＸbはＮであり；ＸcはＣであり；ＸdＸeはＳＤであり、およびＸfはＡである。
【００７４】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＳであり；ＸdＸeはＳＤであり、およびＸfはＳである。
【００７５】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）またはｖ）における、ＸaはＳであり；ＸbはＥであり；ＸcはＣであり；ＸdＸeはＳＤであり、およびＸfはＳである。
【００７６】
第一の態様に従うＦｃＲｎ結合二量体の一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは、配列番号１〜３５３、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する配列ｉｉｉ）のＢＭｏｄを含む。故に、第一の態様に従うＦｃＲｎ結合二量体の一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは、配列番号１〜３５３、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号１７〜３５２および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１〜１５、配列番号１７〜１４０、配列番号３５３、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号１７〜１４０および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１〜２、配列番号１７〜１４０、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１〜２、配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５、配列番号１２７〜１４０、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５、配列番号１２７〜１４０および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１〜８、配列番号１３、配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７、配列番号３５３、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。別の実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３、配列番号７５〜７７、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。別の実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。別の実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。更に別の実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号７７、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。別の実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。更に別の実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号７５および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。更に別の実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。別の実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。更に別の実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２３、配列番号７５、配列番号３５８、配列番号３６１および配列番号３６４からなる群、例えば配列番号２３、配列番号７５、配列番号３６１および配列番号３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２３および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２３および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。
【００７７】
一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号２０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号３６０、配列番号３６２および配列番号３６３からなる群、例えば配列番号２０、配列番号４１、配列番号３６０および配列番号３６２からなる群；配列番号２０、配列番号４４、配列番号３６０および配列番号３６３からなる群；または、配列番号４１、配列番号４４、配列番号３６２および配列番号３６３からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。
【００７８】
一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号３５８、配列番号３６１および配列番号３６３からなる群、例えば配列番号２３、配列番号４４、配列番号３６１および配列番号３６３からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１、配列番号２３および配列番号４４からなる群、例えば配列番号２３および配列番号４４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号１または配列番号２３または配列番号４４における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号２０または配列番号４１または配列番号４４における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号３６０または配列番号３６２または配列番号３６３における位置７から位置５５までの配列に対応する。
【００７９】
本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合二量体の一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、先に定義された群のひとつから選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む。一実施形態において、前記群は、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる。一実施形態において、前記群は、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号７５および配列番号３６０〜３６４からなる。一実施形態において、前記群は、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４および配列番号７５からなる。別の実施形態において、前記群は、配列番号３６０〜３６４からなる。一実施形態において、前記群は、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる。別の実施形態において、前記群は、配列番号１、配列番号２３および配列番号４４からなる。一実施形態において、前記群は、配列番号２０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号３６０、配列番号３６２および配列番号３６３からなる。別の実施形態において、前記群は、配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる。別の実施形態において、前記群は、配列番号３６０、配列番号３６２および配列番号３６３からなる。一つの特定の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、配列番号１または配列番号３５８における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号２０または配列番号３６０における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号２３または配列番号３６１における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号４１または配列番号３６２における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号４４または配列番号３６３における位置７から位置５５までの配列に対応する。一実施形態において、前記ＢＭｏｄは、配列番号７５または配列番号３６４における位置７から位置５５までの配列に対応する。
【００８０】
同じく、更なる実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｖｉｉ）  ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＸcＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ：
（配列中、［ＢＭ］は、先に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ならびにＸcは、Ａ、ＳおよびＣから選択される）；ならびに
ｖｉｉｉ）  ｖｉｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、先に定義したようなＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。
【００８１】
別の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｉｘ）  ＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＸcＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ：
（配列中、［ＢＭ］は、先に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ならびにＸcは、Ａ、ＳおよびＣから選択される）；ならびに
ｘ）  ｉｘ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、先に定義したようなＦｃＲｎ結合二量体が提供される。
【００８２】
一実施形態において、ｉｘ）に定義された配列におけるＸcは、Ｓである。
【００８３】
代わりに、第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｘｉ）  ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＸcＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ：
（配列中、［ＢＭ］は、先に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ならびにＸcは、ＡおよびＣから選択される）；ならびに
ｘｉｉ）  ｘｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、先に定義したようなＦｃＲｎ結合二量体が提供される。
【００８４】
上記のように、三次構造およびその機能に大きな影響を及ぼさない、上記のアミノ酸配列と比較して軽微な変更を含むポリペプチドも、本開示の範囲内である。従って、いくつかの実施形態において、上記で定義されたＦｃＲｎ結合二量体は、ｖｉｉ）、ｉｘ）またはｘｉ）によって定義された配列と、少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％同一である配列ｖｉｉｉ）、ｘ）またはｘｉｉ）を含むことができる。
【００８５】
ＦｃＲｎ結合二量体のいくつかの実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは、
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＥＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＥＳＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＥＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＥＳＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；および
ＡＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
（配列中、［ＢＭ］は、上記で定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００８６】
一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体の前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは：
ｘｉｉｉ）  ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、先に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｉｖ）  ｘｉｉｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００８７】
一実施形態において、配列ｘｉｉｉ）は、配列番号３５４〜３５７からなる群から選択され、例えば特に配列番号３５４および３５７からなる群から選択される。
【００８８】
一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、配列番号３５４〜３５７からなる群から選択される、例えば特に配列番号３５４および３５７からなる群から選択される配列ｘｉｉｉ）を含む。一実施形態において、前記配列ｘｉｉｉ）は、前記第一および第二の単量体単位の両方において配列番号３５４である。一実施形態において、前記配列ｘｉｉｉ）は、前記第一および第二の単量体単位の両方において配列番号３５７である。
【００８９】
一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体の前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは：
ｘｖ）  ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、先に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｖｉ）  ｘｖ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００９０】
一実施形態において、配列ｘｖ）は、配列番号３６５〜３６７からなる群から選択される。一実施形態において、配列ｘｖ）は、配列番号３６５、配列番号３６６または配列番号３６７である。
【００９１】
一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体の前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは：
ｘｖｉｉ）  ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、先に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｖｉｉｉ）  ｘｖｉｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００９２】
一実施形態において、配列ｘｖｉｉ）は、配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される。一実施形態において、配列ｘｖｉｉ）は、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３または配列番号３６４である。
【００９３】
一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体の前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは：
ｘｉｘ）  ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＲＱＰＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、先に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｘ）  ｘｉｘ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００９４】
一実施形態において、配列ｘｉｘ）は、配列番号３５９である。
【００９５】
一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体の前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは：
ｘｘｉ）  ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、先に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｘｉｉ）  ｘｘｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００９６】
また、三次構造およびその機能に大きな影響を及ぼさない、上記のアミノ酸配列と比較して軽微な変更を含むポリペプチドも、本開示の範囲内である。従って、いくつかの実施形態において、上記で定義されたＦｃＲｎ結合二量体は、ｘｉｉｉ）、ｘｖ）、ｘｖｉｉ）、ｘｉｘ）またはｘｘｉ）によって定義された配列と、それぞれ、少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％同一である配列ｘｉｖ）、ｘｖｉ）、ｘｖｉｉｉ）、ｘｘ）またはｘｘｉｉ）を含むことができる。
【００９７】
第一の態様に従うＦｃＲｎ結合二量体の一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つは、配列番号１〜３５３からなる群、例えば配列番号１７〜３５２からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１〜１５、配列番号１７〜１４０および配列番号３５３からなる群、例えば配列番号１７〜１４０からなる群から選択される配列である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１〜２および配列番号１７〜１４０からなる群から選択される配列である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１〜２、配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群、例えば配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群から選択される配列である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１〜８、配列番号１３、配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３５３からなる群、例えば配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列である。別の実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列である。別の実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列である。更に別の実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群から選択される配列である。更に別の実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群から選択される配列である。更に別の実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４および配列番号７５からなる群から選択される配列である。更に別の実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群から選択される配列である。一実施形態において、前記配列ｘｉｉｉ）は、配列番号１、配列番号２３および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２３および配列番号７５からなる群から選択される配列である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる群、例えば配列番号２０および配列番号４１からなる群；配列番号２０および配列番号４４からなる群；または、配列番号４１および配列番号４４からなる群から選択される配列である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１、配列番号２３および配列番号４４からなる群、例えば配列番号２３および配列番号４４からなる群から選択される配列である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号１であるか、または配列番号２０であるか、または配列番号２３であるか、または配列番号４１であるか、または配列番号４４である。
【００９８】
本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合二量体の一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、先に定義された群の一つから選択される配列ｘｘｉ）またはｘｉｉｉ）を含む。一実施形態において、前記群は、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号３５４および配列番号３５７からなり、例えば配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号３５４および配列番号３５７からなる群、例えば配列番号１、配列番号２３および配列番号４４からなる群、または配列番号２３、配列番号４４、配列番号３５４および配列番号３５７からなる群である。
【００９９】
本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合二量体の一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、先に定義された群の一つから選択される配列ｘｉｉｉ）、ｘｖ）、ｘｖｉｉ）、ｘｉｘ）またはｘｘｉ）を含む。
【０１００】
一実施形態において、前記群は、配列番号１、配列番号２０；配列番号２３、配列番号４１；配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号３５４、配列番号３５７および配列番号３６０〜３６７からなり、例えば配列番号２０；配列番号２３、配列番号４１；配列番号４４、配列番号７５、配列番号３５７および配列番号３６０〜３６７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号３５７、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６５、配列番号３６６および配列番号３６７からなる群、例えば配列番号３５７、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６５、配列番号３６６および配列番号３６７からなる群である。一つの特定の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、配列番号１、配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２３、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２３および配列番号４４からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む。一つの特定の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、配列番号１に対応する配列ｘｘｉ）を含む。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号２０である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号２３である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号４１である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号４４である。一実施形態において、前記配列ｘｘｉ）は、配列番号７５である。
【０１０１】
別の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、配列番号３５４に対応する配列ｘｉｉｉ）を含む。
【０１０２】
一つの特定の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、配列番号３６０に対応する配列ｘｉｘ）を含む。一実施形態において、前記配列ｘｉｘ）は、配列番号３６１である。一実施形態において、前記配列ｘｉｘ）は、配列番号３６２である。一実施形態において、前記配列ｘｉｘ）は、配列番号３６３である。一実施形態において、前記配列ｘｉｘ）は、配列番号３６４である。別の特定の実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の両方は、配列番号３６５に対応する配列ｘｖ）を含む。一実施形態において、前記配列ｘｖ）は、配列番号３６６である。一実施形態において、前記配列ｘｖ）は、配列番号３６７である。
【０１０３】
ＦｃＲｎ結合二量体の具体的実施形態において、第一および第二の単量体単位は、それぞれ、配列番号１および配列番号１；配列番号１および配列番号２３；配列番号１および配列番号４４；配列番号１および配列番号６５；配列番号１および配列番号７５；配列番号１および配列番号３５４；配列番号１および配列番号３５７；配列番号２３および配列番号２３；配列番号２３および配列番号４４；配列番号２３および配列番号６５；配列番号２３および配列番号７５；配列番号２３および配列番号３５４；配列番号２３および配列番号３５７；配列番号４４および配列番号４４；配列番号４４および配列番号６５；配列番号４４および配列番号７５；配列番号４４および配列番号３５４；配列番号４４および配列番号３５７；配列番号６５および配列番号６５；配列番号６５および配列番号７５；配列番号６５および配列番号３５４；配列番号６５および配列番号３５７；配列番号７５および配列番号３５４；配列番号７５および配列番号３５７；配列番号３５４および配列番号３５４；配列番号３５４および配列番号３５７；または、配列番号３５７および配列番号３５７を含む。一実施形態において、第一および第二の単量体単位は、それぞれ、配列番号１および配列番号１；配列番号１および配列番号２３；配列番号１および配列番号４４；配列番号１および配列番号３５４；配列番号１および配列番号３５７；配列番号２３および配列番号２３；配列番号２３および配列番号４４；配列番号２３および配列番号３５４；配列番号２３異および配列番号３５７；配列番号４４および配列番号４４；配列番号４４および配列番号３５４；配列番号４４および配列番号３５７；配列番号３５４および配列番号３５４；配列番号３５４および配列番号３５７；または、配列番号３５７および配列番号３５７を含む。別の実施形態において、第一および第二の単量体単位は、それぞれ、配列番号１および配列番号１；配列番号２３および配列番号２３；配列番号４４および配列番号４４；配列番号３５４および配列番号３５４；または、配列番号３５７および配列番号３５７を含む。更に別の実施形態において、第一および第二の単量体単位は、それぞれ、配列番号４４および配列番号４４；または、配列番号３５７および配列番号３５７を含む。
【０１０４】
ＦｃＲｎ結合二量体の具体的実施形態において、第一および第二の単量体単位は、それぞれ、配列番号１および配列番号１；配列番号１および配列番号２０；配列番号１および配列番号２３；配列番号１および配列番号４１；配列番号１および配列番号４４；配列番号１および配列番号６５；配列番号１および配列番号７５；配列番号１および配列番号３５４；配列番号１および配列番号３５７；配列番号１および配列番号３６５；配列番号１および配列番号３６６；配列番号１および配列番号３６７；配列番号２０および配列番号２０；配列番号２０および配列番号２３；配列番号２０および配列番号４１；配列番号２０および配列番号４４；配列番号２０および配列番号３５７；配列番号２０および配列番号３６５；配列番号２０および配列番号３６６；配列番号２０および配列番号３６７；配列番号２３および配列番号２３；配列番号２３および配列番号４１；配列番号２３および配列番号４４；配列番号２３および配列番号６５；配列番号２３および配列番号７５；配列番号２３および配列番号３５４；配列番号２３および配列番号３５７；配列番号２３および配列番号３６５；配列番号２３および配列番号３６６；配列番号２３および配列番号３６７；配列番号４１および配列番号４１；配列番号４１および配列番号４４；配列番号４１および配列番号３５７；配列番号４１および配列番号３６５；配列番号４１および配列番号３６６；配列番号４１および配列番号３６７；配列番号４４および配列番号４４；配列番号４４および配列番号６５；配列番号４４および配列番号７５；配列番号４４および配列番号３５４；配列番号４４および配列番号３５７；配列番号４４および配列番号３６５；配列番号４４および配列番号３６６；配列番号４４および配列番号３６７；配列番号６５および配列番号６５；配列番号６５および配列番号７５；配列番号６５および配列番号３５４；配列番号６５および配列番号３５７；配列番号７５および配列番号３５４；配列番号７５および配列番号３５７；配列番号３５４および配列番号３５４；配列番号３５４および配列番号３５７；配列番号３５７および配列番号３５７；配列番号３５７および配列番号３６５；配列番号３５７および配列番号３６６；配列番号３５７および配列番号３６７；配列番号３６５および配列番号３６５；配列番号３６５および配列番号３６６；配列番号３６５および配列番号３６７；配列番号３６６および配列番号３６６；配列番号３６６および配列番号３６７；または、配列番号３６７および配列番号３６７を含む。一実施形態において、第一および第二の単量体単位は、それぞれ、配列番号１および配列番号１；配列番号１および配列番号２０；配列番号１および配列番号２３；配列番号１および配列番号４１；配列番号１および配列番号４４；配列番号１および配列番号３５４；配列番号１および配列番号３５７；配列番号１および配列番号３６５；配列番号１および配列番号３６６；配列番号１および配列番号３６７；配列番号２０および配列番号２０；配列番号２０および配列番号２３；配列番号２０および配列番号４１；配列番号２０および配列番号４４；配列番号２０および配列番号３５７；配列番号２０および配列番号３６５；配列番号２０および配列番号３６６；配列番号２０および配列番号３６７；配列番号２３および配列番号２３；配列番号２３および配列番号４１；配列番号２３および配列番号４４；配列番号２３および配列番号３５４；配列番号２３および配列番号３５７；配列番号２３および配列番号３６５；配列番号２３および配列番号３６６；配列番号２３および配列番号３６７；配列番号４１および配列番号４１；配列番号４１および配列番号４４；配列番号４１および配列番号３５７；配列番号４１および配列番号３６５；配列番号４１および配列番号３６６；配列番号４１および配列番号３６７；配列番号４４および配列番号４４；配列番号４４および配列番号３５４；配列番号４４および配列番号３５７；配列番号４４および配列番号３６５；配列番号４４および配列番号３６６；配列番号４４および配列番号３６７；配列番号３５４および配列番号３５４；配列番号３５４および配列番号３５７；配列番号３５７および配列番号３５７；配列番号３５７および配列番号３６５；配列番号３５７および配列番号３６６；配列番号３５７および配列番号３６７；配列番号３６５および配列番号３６５；配列番号３６５および配列番号３６６；配列番号３６５および配列番号３６７；配列番号３６６および配列番号３６６；配列番号３６６および配列番号３６７；または、配列番号３６７および配列番号３６７を含む。別の実施形態において、第一および第二の単量体単位は、それぞれ、配列番号１および配列番号１；配列番号２０および配列番号２０；配列番号２３および配列番号２３；配列番号４１および配列番号４１；配列番号４４および配列番号４４；配列番号３５４および配列番号３５４；配列番号３５７および配列番号３５７；配列番号３６５および配列番号３６５；配列番号３６６および配列番号３６６；または、配列番号３６７および配列番号３６７を含む。更に別の実施形態において、第一および第二の単量体単位は、それぞれ、配列番号２０および配列番号２０；配列番号４１および配列番号４１；配列番号４４および配列番号４４；配列番号３５７および配列番号３５７；配列番号３６５および配列番号３６５；配列番号３６６および配列番号３６６；または、配列番号３６７および配列番号３６７を含む。
【０１０５】
更に別の実施形態において、第一および第二の単量体単位は、それぞれ、配列番号３６５および配列番号３６５；配列番号３６６および配列番号３６６；または、配列番号３６７および配列番号３６７を含む。
【０１０６】
明確さのために、本開示を通じて使用される第一および第二の単量体単位の名称は、これらの間を識別することを明確にするために成され、且つＦｃＲｎ結合二量体のポリペプチド鎖中の単量体単位の実際の順番に言及することを意図するものではない。従って、例えば、前記第一の単量体単位は、前記第二の単量体単位に関して、ポリペプチド鎖中のＮ末端側またはＣ末端側に出現してよい。
【０１０７】
当業者の理解に従い、融合タンパク質の構築は、融合されるべき官能基部分の間のリンカーの使用に関与することが多い。当業者は、可動性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカーおよび切断可能なアミノ酸リンカーなどの、異なる特性を伴う、異なる種類のリンカーを知っている。リンカーは、例えば、融合タンパク質の安定性を増大するかまたは折り畳みを改善するため、融合タンパク質の発現を増大し、生物活性を向上し、標的化を可能にし且つ薬物動態を変更するために使用される。
【０１０８】
従って第一の態様の一実施形態において、前記リンカーが、可動性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカーおよび切断可能なアミノ酸リンカーからなる群から選択される、本明細書に定義されたようなＦｃＲｎ結合二量体が提供される。本明細書に定義されたＦｃＲｎ結合二量体の一実施形態において、前記リンカーは、第一の単量体単位と第二の単量体単位の間に配置される。当業者は、第一の単量体単位と第二の単量体単位の間に配置されたリンカーの存在は、追加のリンカーの存在を排除するものではないことを理解するであろう。
【０１０９】
可動性リンカーは、結合されたドメインが、ある程度の運動または相互作用を必要とする場合に、当該技術分野において使用されることが多く、ＦｃＲｎ結合二量体のいくつかの実施形態において特に有用であることができる。かかるリンカーは一般に、小型の非極性（例えばＧ）または極性（例えばＳまたはＴ）アミノ酸で構成される。一部の可動性リンカーは主に、ＧおよびＳ残基の部分配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）、例えば、（ＧＧＧＧＳ）pおよび（ＳＳＳＳＧ）pからなる。コピー数「ｐ」の調節は、官能基部分間の適切な分離を実現するため、または必要な部分間相互作用を維持するために、リンカーを最適化することができる。ＧおよびＳリンカーとは別に、可動性を維持するためにＴ、Ａ、ＫおよびＥなどの追加のアミノ酸残基を含む、更には溶解度を向上するために極性アミノ酸残基を含む、ＧおよびＳリンカーのような、他の可動性リンカーが、当該技術分野において公知である。
【０１１０】
追加の非限定的リンカーの例は、ＧＧＧＧＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＳ、（ＧＳ）3、（ＧＳ）4、（ＧＳ）8、ＧＧＳＧＧＨＭＧＳＧＧ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＧＳＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧ、ＡＡＧＡＡＴＡＡ、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＳＳＧ、ＧＳＧＧＧＴＧＧＧＳＧ、ＧＳＧＧＧＴＧＧＧＳＧ、ＧＴ、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＧＳＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳおよびＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧを含む。当業者は、他の好適なリンカーを知っている。
【０１１１】
一実施形態において、前記リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）および／またはトレオニン（Ｔ）残基を含む、可動性リンカーである。一実施形態において、前記リンカーは、（ＧnＳm）pおよび（ＳnＧm）pから選択される一般式を有し、式中、独立して、ｎ＝１〜７、ｍ＝０〜７、ｎ＋ｍ≦８、およびｐ＝１〜７である。一実施形態において、ｎ＝１〜５である。一実施形態において、ｍ＝０〜５である。一実施形態において、ｐ＝１〜５である。より具体的実施形態において、ｎ＝４、ｍ＝１およびｐ＝１〜４である。一実施形態において、前記リンカーは、Ｓ4Ｇ、（Ｓ4Ｇ）3および（Ｓ4Ｇ）4からなる群から選択される。一実施形態において、前記リンカーは、ＧＳ、Ｇ4Ｓおよび（Ｇ4Ｓ）3からなる群から選択される。一つの特定の実施形態において、前記リンカーはＧ4Ｓであり、別の実施形態において、前記リンカーは（Ｇ4Ｓ）3である。
【０１１２】
本明細書において使用される、「ＦｃＲｎ結合」および「ＦｃＲｎへの結合親和性」という用語は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術またはＥＬＩＳＡの使用によって試験することができるポリペプチドの特性を意味する。
【０１１３】
例えば以下の実施例において記載したように、ＦｃＲｎ結合親和性を、ＦｃＲｎ、またはその正しく折り畳まれた断片を機器のセンサーチップ上に固定化し、試験するポリペプチドを含有するサンプルを、チップ上を通過させる実験において試験することができる。代わりに、試験するポリペプチドを、機器のセンサーチップ上に固定化し、ＦｃＲｎ、またはその正しく折り畳まれた断片を含有するサンプルを、チップ上を通過させる。次いで、当業者は、かかる実験によって得られた結果を解釈して、ＦｃＲｎへのポリペプチドの結合親和性の定性的測定値を少なくとも樹立することができる。定量的測定値が望ましい場合、例えば相互作用に関するＫD値を決定するために、表面プラズモン共鳴法も使用することができる。結合値は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ  ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）機器において定義することができる。ＦｃＲｎを、機器のセンサーチップ上に適切に固定化し、その親和性を決定するポリペプチドのサンプルを、連続希釈によって調製し、ランダムな順序で注入する。次いで、ＫD値を、例えばＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデル、または機器製造業者によって提供される、他の適したソフトウェアを使用して、結果から計算することができる。
【０１１４】
代わりに、下記実施例において記載したように、ポリペプチドのサンプルを、抗体をコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で捕捉し、ビオチン化ＦｃＲｎを加え、その後ストレプトアビジンをコンジュゲートしたＨＲＰを加える実験において、ＦｃＲｎ結合親和性を試験することができる。ＴＭＢ基質を加え、Ｖｉｃｔｏｒ3（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のような、マルチウェルプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでの吸光度を測定する。次いで、当業者は、かかる実験によって得られた結果を解釈して、ＦｃＲｎへのポリペプチドの結合親和性の定性的測定値を少なくとも樹立することができる。定量的測定値が望ましい場合、例えば相互作用に関するＫD値（最大半量有効濃度）を決定するために、ＥＬＩＳＡも使用することができる。ビオチン化ＦｃＲｎの希釈系列に対するポリペプチドの反応を、上記のＥＬＩＳＡを使用して測定する。次いで、当業者は、かかる実験によって得られた結果を解釈することができ、ＫD値を、例えばＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５および非線形回帰を使用して、結果から計算することができる。
【０１１５】
代わりに、ＦｃＲｎへの親和性はまた、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を遮断するＦｃＲｎ結合ポリペプチドの能力に注目することにより、間接的に試験することもできる。従って、当業者は、ＦｃＲｎ結合二量体は、ＦｃＲｎのＩｇＧと同じ領域または少なくとも部分的に重複している領域で、ＦｃＲｎと相互作用するという条件で、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの前記結合を遮断する能力は、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのＦｃＲｎへの結合能と相関することを理解するであろう。従って、ポリペプチドのＦｃＲｎへの結合能が高くなれば、ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を遮断する能力が高まる。
【０１１６】
当業者はまた、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの相互作用は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）分析により評価することができ、ここで得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）値は、同じ実験で試験した他のポリペプチドと比較した、試験したポリペプチドの結合強度の間接的測定値であることも理解するであろう。従って、より高いＭＦＩ値は、より高い相対親和性に相関し、且つより低いＭＦＩ値は、より低い相対親和性に相関する。
【０１１７】
本明細書においてＦｃＲｎに関する結合親和性またはＦｃＲｎの結合の文脈で使用される「より高い結合能」という用語は、親和性の直接または間接評価のための前述の１種以上のアッセイの文脈であると理解されるべきである。
【０１１８】
本明細書に定義するように、ＦｃＲｎ結合二量体は、前記第一または第二の単量体単位単独と比べ、より高い結合能で、ＦｃＲｎへ結合する。一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体は、対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも６倍、例えば少なくとも７倍、例えば少なくとも８倍、例えば少なくとも９倍、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも２５倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍高い能力で、ＦｃＲｎへ結合することができる。この関係は、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で、またはｐＨ６．０でのみ、またはｐＨ７．４でのみ真であり得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、以下に更に説明されるように、ＦｃＲｎ結合二量体は、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を阻害する。かかる実施形態において、ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を遮断するＦｃＲｎ結合二量体の能力は、対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも２倍高い、例えば少なくとも３倍高い、例えば少なくとも４倍高い、例えば少なくとも５倍高い、例えば少なくとも１０倍高い、例えば少なくとも１５倍高い、例えば少なくとも２０倍高い、例えば少なくとも２５倍高いように、前記ＦｃＲｎ結合二量体は、ＦｃＲｎへ結合することができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ＦｃＲｎとＦｃＲｎ結合二量体の間の相互作用のＭＦＩ値が、ＦｃＲｎと対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独との間の相互作用のＭＦＩ値と比べ、少なくとも２倍高い、例えば少なくとも３倍高い、例えば少なくとも４倍高い、例えば少なくとも５倍高い、例えば少なくとも１０倍高いように、前記ＦｃＲｎ結合二量体は、ＦｃＲｎへ結合することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ＦｃＲｎとＦｃＲｎ結合二量体の間の相互作用のＫD値が、ＦｃＲｎと対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独との間の相互作用のＫD値と比べ、少なくとも２倍低い、例えば少なくとも３倍低い、例えば少なくとも４倍低い、例えば少なくとも５倍低い、例えば少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも２５倍低い、例えば少なくとも５０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１０００倍低いように、前記ＦｃＲｎ結合二量体は、ＦｃＲｎへ結合することができる。
【０１２２】
一実施形態において、相互作用のＫD値が、最大１×１０-7Ｍ、例えば最大１×１０-8Ｍ、例えば最大１×１０-9Ｍ、例えば最大１×１０-10Ｍ、例えば最大１×１０-11Ｍ、例えば最大１×１０-12Ｍであるように、ｐＨ６．０で、ＦｃＲｎへ結合することができる、ＦｃＲｎ結合二量体が提供される。この実施形態のＦｃＲｎ結合二量体は、例えばエンドソーム内などの、ｐＨ６．０のような酸性ｐＨ条件でＦｃＲｎに結合するかまたは結合したままである。かかるポリペプチドが、次第に酸性になる細胞内環境に入る場合、それは、そのＦｃＲｎとの相互作用を通して細胞膜に再利用され、従って分解を避ける。
【０１２３】
一実施形態において、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合二量体とＦｃＲｎの間の相互作用のＫD値は、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫD値のよりも高い。従って、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０において、より高い親和性で、ＦｃＲｎへ結合するであろう。一実施形態において、ｐＨ７．４での前記相互作用のＫD値は、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫD値よりも、少なくとも２倍高い、例えば少なくとも５倍高い、例えば少なくとも１０倍高い、例えば少なくとも２５倍高い、例えば少なくとも５０倍高い、例えば少なくとも１００倍高い、例えば少なくとも１０００倍高い。
【０１２４】
前述のように、ＦＡＣＳ分析を使用し、ＦｃＲｎ結合二量体とＦｃＲｎの間の相互作用を分析することができる。故に、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合二量体とＦｃＲｎの間の相互作用は、評価することができ、且つｐＨ６．０およびｐＨ７．４でのＭＦＩ値は、以下の実験の項目において明らかにされるように比較することができる。得られたＭＦＩ値は、同じ実験設定内で比較されるという条件で、得られたより高い相対ＭＦＩ値は、より高い親和性に対応し、且つより低い相対ＭＦＩ値は、より低い親和性に対応している。従って一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体は、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０で、少なくとも１０％高い、例えば少なくとも２０％高い、例えば少なくとも３５％高い、例えば少なくとも５０％高い、例えば少なくとも１００％高いなど、より高い親和性でＦｃＲｎへ結合する。
【０１２５】
一実施形態において、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合二量体とＦｃＲｎの間の相互作用のＫD値は、少なくとも１×１０-10Ｍ、例えば少なくとも１×１０-9Ｍ、例えば少なくとも１×１０-8Ｍ、例えば少なくとも１×１０-7Ｍ、例えば少なくとも１×１０-6Ｍ、例えば少なくとも１×１０-5Ｍである。いくつかの実施形態において、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合二量体とＦｃＲｎの間の相互作用に関する唯一の基準は、より酸性の条件の間にＦｃＲｎに結合した任意のＦｃＲｎ結合二量体が、ｐＨ値が増加した場合にＦｃＲｎからより速く遊離するということである。
【０１２６】
代わりの実施形態において、ｐＨ７．４での前記相互作用のＫDが、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫDと等しいかまたはより低いＦｃＲｎ結合二量体が、提供される。この実施形態のＦｃＲｎ結合二量体は、酸性ｐＨ条件で、例えばエンドソームにおいて、および例えば細胞膜上でなど、中性またはわずかに塩基性のｐＨ条件で、ＦｃＲｎに結合するかまたは結合したままである（すなわち遊離を避けるために十分遅い、ｐＨ６．０でのオフ速度を有する）。より具体的実施形態において、ｐＨ７．４での前記相互作用のＫD値は、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫD値よりも、少なくとも２倍低い、例えば少なくとも５倍低い、例えば少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも５０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い。
【０１２７】
別の実施形態において、相互作用のＫD値が、最大１×１０-7Ｍ、例えば最大１×１０-8Ｍ、例えば最大１×１０-9Ｍ、例えば最大１×１０-10Ｍ、例えば最大１×１０-11Ｍ、例えば最大１×１０-12Ｍであるように、ｐＨ７．４でＦｃＲｎに結合することが可能であるＦｃＲｎ結合二量体が提供される。この実施形態のＦｃＲｎ結合二量体は、ｐＨ７．４の、例えば細胞膜上でなど、例えば中性またはわずかに塩基性のｐＨ条件で、ＦｃＲｎに結合するかまたは延長された時間結合したままである。「結合したままである (remain bound)」という用語は、所与の条件で遅いオフ速度を有する相互作用を意味すると理解されるべきである。
【０１２８】
一般に、当業者は、相互作用のＫD値が、オフ速度（ｋoff）とオン速度（ｋon）の比として定義されることを知っている。従って、高いＫD値は、高いｋoff、低いｋonまたはその両方に起因し得、逆に、低いＫD値は、低いｋoff、高いｋonまたはその両方のいずれかに起因し得る。
【０１２９】
当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく、特定の適用にポリペプチドを合わせるために、本明細書で開示した任意の態様によるＦｃＲｎ結合二量体に様々な改変および／または付加を行うことができることを理解することになる。
【０１３０】
例えば、一実施形態において、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つがＣ末端および／またはＮ末端で少なくとも１個の追加のアミノ酸を含む、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合二量体が提供される。かかるポリペプチドは、少なくとも一つの前記第一および第二の単量体単位のポリペプチド鎖におけるまさに最初および／またはまさに最後の位置で、１個またはそれ以上の追加のアミノ酸残基を有するポリペプチドとして理解されるべきである。従って、ＦｃＲｎ結合二量体の前記単量体単位の前記少なくとも一つは、任意の適した数の追加のアミノ酸残基、例えば少なくとも１個の追加のアミノ酸残基を含むことができる。各追加のアミノ酸残基は、例えば、ポリペプチドのインビボまたはインビトロでの作製、精製、安定化、カップリング、または検出を改善するために、個々にまたは集団的に付加することができる。かかる追加のアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的のために付加された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。この一例は、システイン残基の付加である。かかる追加のアミノ酸残基は、タグに特異的な抗体との相互作用またはヘキサヒスチジンタグの場合における固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のためのＨｉｓ6タグまたは「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグまたは「ＦＬＡＧ」タグのような、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」も提供することができる。
【０１３１】
上記のように、別のアミノ酸を、（既知の有機化学的方法を使用して）化学的コンジュゲーションによって、または融合タンパク質としてのＦｃＲｎ結合二量体の発現のような、任意の他の手段によってＦｃＲｎ結合二量体または前記第一および第二の単量体単位の一方または両方のいずれかに結合することができるか、または直接的にもしくはリンカー、例えば前述のアミノ酸リンカーを介してのいずれかの、任意の他の様式で連結することができる。
【０１３２】
上記のように、別のアミノ酸は、例えば、１つまたはそれ以上のポリペプチドドメインを含むことができる。別のポリペプチドドメインは、例えば別の結合機能、もしくは酵素機能、もしくは毒性機能もしくは蛍光シグナル伝達機能、またはそれらの組合せのような、別の機能を有するＦｃＲｎ結合二量体を提供することができる。
【０１３３】
従って、本開示の第二の態様において、第一の態様のＦｃＲｎ結合二量体からなる第一の部分、および望ましい生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体 (cojugate) が提供される。別の実施形態において、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体は、第二の部分の生物活性と同じかまたは異なっていてもよい望ましい生物活性を含む部分を更に含むことができる。
【０１３４】
前記融合タンパク質またはコンジュゲート体の一実施形態において、分子の全体のサイズは、哺乳類の対象への投与時の効率的な腎クリアランスのための閾値未満である。
【０１３５】
前記融合タンパク質またはコンジュゲート体の別の実施形態において、分子の全体のサイズは、哺乳類の対象への投与時の効率的な腎クリアランスのための閾値を超える。
【０１３６】
前記融合タンパク質またはコンジュゲート体の一実施形態において、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体のインビボ半減期は、それ自体で望ましい生物活性を有するポリペプチドのインビボ半減期よりも長い。
【０１３７】
望ましい生物活性の非限定的な例は、治療活性、結合活性、および酵素活性を含む。
【０１３８】
一実施形態において、前記望ましい生物活性は、選択された標的への結合活性である。
【０１３９】
かかる結合活性の一例は、融合タンパク質またはコンジュゲート体のインビボ半減期を増加させる結合活性である。この融合タンパク質またはコンジュゲート体は、少なくとも１つの別の部分を含むことができる。特定の一実施形態において、前記標的は、アルブミンであり、それへの結合は、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体のインビボ半減期を増加させる。一実施形態において、前記アルブミン結合活性は、連鎖球菌のプロテインＧまたはその誘導体のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）によって提供される。例えば、少なくとも１つの別の部分を含む前記融合タンパク質またはコンジュゲート体は、［ＦｃＲｎ結合二量体］−［アルブミン結合部分］−［選択された標的への親和性を有する部分］を含むことができる。更に、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体は、本明細書記載のＦｃＲｎ結合二量体を作製する２つのＦｃＲｎ結合単量体単位の間に配置されたアルブミン結合部分または他の標的結合部分を含むことができることは理解され、従って非限定的例として、［ＦｃＲｎ結合単量体部分］−［アルブミン結合部分］−［ＦｃＲｎ結合単量体部分］−［選択された標的への親和性を有する部分］に従うか、または［ＦｃＲｎ結合単量体部分］−［選択された標的への親和性を有する部分］−［ＦｃＲｎ結合単量体部分］−［アルブミン結合部分］に従い配置される。融合タンパク質またはコンジュゲート体における部分は、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端まで任意の順序で配列することができることが理解されるべきである。一実施形態において、前記インビボ半減期は、それ自身の融合タンパク質またはコンジュゲート体のインビボ半減期と比べ、少なくとも１０倍、例えば少なくとも２５倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも７５倍、例えば少なくとも１００倍増大される。
【０１４０】
一実施形態において、標的と本明細書に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体の複合体が、ｐＨ６．０のような酸性ｐＨで形成される（または維持される）場合、標的は、リソソーム分解による排除から救済される。従って、標的半減期は、延長される。半減期延長は、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体と相互作用している場合、標的の排除速度が、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体の非存在下での標的分子の排除速度よりも遅いことを暗示している。更に、この実施形態において、融合タンパク質またはコンジュゲート体による標的の結合が、標的の機能に実質的に干渉しないことが望ましい。
【０１４１】
他方では、標的と本明細書に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体の複合体が、酸性ｐＨで維持されないまたは形成されない場合、標的は、細胞内リソソームに向けられ、そこで分解される。
【０１４２】
一実施形態において、対象からの選択された、望ましくない標的の排除の速度が増加される、融合タンパク質またはコンジュゲート体が提供される。望ましくない標的の増加した排除は、それ自体での、すなわち融合タンパク質またはコンジュゲート体との前もっての相互作用を有さない標的分子の「通常の」排除速度と比較した、多細胞生物の体からの標的の増加した排除速度を暗示している。
【０１４３】
別の実施形態において、選択された望ましくない標的の結合は、標的の機能を失活させ、それによって、これが望ましい状況においてその生物活性を遮断する。かかる生物活性は、例えば受容体の活性化もしくは遮断、または酵素のもしくはさもなければ毒性のもしくは望ましくない活性とすることができる。かかる望ましくない標的は、内在性ホルモン、酵素、サイトカイン、ケモカインまたはいくつかの他の生物活性を有する標的とすることができる。失活のための標的結合を使用することによって、標的が分解のために送達され、低いｐＨ値で遊離されるまで生物活性が遮断され、標的結合融合タンパク質が、循環へ再利用される。標的結合融合タンパク質のこの再利用（そのＦｃＲｎ結合部分を介した）により、選択された望ましくない標的の１つを超える分子の除去をそれが「触媒する」ことが可能になる。
【０１４４】
望ましくない標的は、例えば医学的状態の後で血漿中で上昇したレベルを示し、治療効果がこれらのタンパク質の排除によって達成される、外来性タンパク質および化合物、または天然に発現されたタンパク質とすることができる。望まれない標的は、血漿中で必ずしも均等に分布するわけではなく、いくつかの領域、例えば腫瘍の周囲または炎症の部位で濃縮され得る。
【０１４５】
標的の非限定的な例は、アレルゲン、アミロイド、抗体、自己抗原、血液凝固因子、ホルモン、腫瘍細胞、薬物分子、サイトカイン、ケモカイン、プロテアーゼ、過敏性メディエーター、炎症促進性因子、細菌毒素およびヘビ毒のような毒素；汚染物質、金属および抗酸化物質からなる群から選択される標的である。
【０１４６】
いくつかの癌疾患におけるようないくつかの状態下で、内在性分子、例えばＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦおよび他の増殖刺激ホルモンを除去することが望ましい。かかる分子も、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体における結合機能によって標的とされる。
【０１４７】
いくつかの免疫疾患におけるような他の状態下で、選択されたインターロイキンまたはＴＮＦのような内在性分子を一過性に除去することが望まれ得る。かかる分子も、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体における結合機能によって標的とされる。
【０１４８】
一実施形態において、望ましい生物活性を有する第二の部分は、治療活性のあるポリペプチドである。治療活性のあるポリペプチドの非限定的な例は、酵素、例えばアルガシダーゼαおよびβ、グルコセレブロシダーゼ、ラロニダーゼ、アリールスルファターゼ、アグルコシダーゼ（ａｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）−α、アスパラギナーゼ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘａ因子；ホルモンおよび増殖因子、例えば成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子−β２、エリスロポエチン、インスリン、インスリン様増殖因子１、ミオスタチン、骨由来増殖因子およびグルカゴン様ペプチド１；ケモカイン、例えばＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２７、ＸＣＬ１およびＣＸＣ３ＣＬ１；ならびに、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージＣＳＦ、および顆粒球／マクロファージＣＳＦからなる群から選択される分子のような、生体分子である。
【０１４９】
当業者は理解するように、第一の態様によるＦｃＲｎ結合二量体は、融合タンパク質においてまたは任意の他の部分へのコンジュゲートパートナーとして有用であり得る。従って、治療活性のあるポリペプチドの上記のリストは、いかなる方法においても限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１５０】
融合ポリペプチドまたはコンジュゲート体を作るための他の可能性も企図される。従って、本発明の第一の態様によるＦｃＲｎ結合二量体は、標的結合に加えてまたはこの代わりに他の機能を示す第二のまたは別の部分に共有結合していてもよい。一例は、１つまたはそれ以上のＦｃＲｎ結合二量体とレポーターまたはエフェクター部分として役立つ酵素的に活性なポリペプチド間の融合である。
【０１５１】
本開示によるＦｃＲｎ結合二量体を組み込んでいる融合タンパク質またはコンジュゲート体の上記の記載に関して、第一の、第二のおよび別の部分という命名は、一方での本開示によるＦｃＲｎ結合二量体と、他方での他の機能を示す部分とを区別するための明瞭さが理由で行われていることに注目すべきである。これらの命名は、融合タンパク質またはコンジュゲート体のポリペプチド鎖における種々のドメインの実際の順序を表すことは意図されていない。従って、例えば、前記第一の部分は、制限なく、融合タンパク質またはコンジュゲート体のＮ末端で、中央において、またはＣ末端で現れ得る。更に、本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合二量体は、ＦｃＲｎ結合二量体の２つのＦｃＲｎ結合単量体単位の間に配置された第二の部分を含むことができる。
【０１５２】
半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、特異的定量可能な生物学的または生化学的機能を阻害する物質の有効性の測定値である。この定量的測定値は、どれだけ多くの特定の物質が、５０％だけ特異的生物学的機能を阻害するのに必要であるかを示し、当該技術分野において一般に使用される。一つの特定の実施形態において、この遮断の半数阻害濃度（ＩＣ５０）が、最大１×１０-8Ｍ、例えば最大６×１０-9Ｍ、例えば最大４×１０-9Ｍ、例えば最大１×１０-9Ｍ、例えば最大１×１０-10Ｍ、例えば最大１×１０-11Ｍであるように、ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を遮断することが可能である、本明細書に定義されるＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体が提供される。一実施形態において、この遮断の半数阻害濃度（ＩＣ５０）が、対応する第一および第二の単量体単位単独による遮断のＩＣ５０と比べ、少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１０００倍低いように、ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を遮断することが可能である、本明細書に定義されるＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体が提供される。
【０１５３】
この阻害は、ＩｇＧと同じ、または少なくとも部分的に重複しているＦｃＲｎの領域へのＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体の結合に起因し得る。代わりに、ＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体は、ＩｇＧとは異なるＦｃＲｎの領域に結合するが、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を立体的に妨げることができる。従って、循環系からのＩｇＧの排除またはクリアランスの速度は、ＩｇＧの増加したリソソーム分解に起因して増加するが、これはなぜならＩｇＧのＦｃＲｎ媒介再利用が、本開示のＦｃＲｎ結合二量体によるＦｃＲｎ結合部位の占有に起因して全体的または部分的に利用できないからである。換言すれば、本開示によるＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体の投与は、循環ＩｇＧ抗体の異化を増加させるように作用することになる。
【０１５４】
一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体とＦｃＲｎの間の相互作用のＫD値は、ＩｇＧとＦｃＲｎの間の相互作用のＫDよりも低い。この関連性は、ｐＨ６．０とｐＨ７．４の両方で、またはｐＨ６．０のみで当てはまり得る。
【０１５５】
上記の態様は、第一の態様によるＦｃＲｎ結合二量体、または第二の態様による融合タンパク質またはコンジュゲート体に含まれるＦｃＲｎ結合二量体が、蛍光色素および金属、発色団色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および放射性粒子からなる群から選択される標識のような、標識を更に含むポリペプチドを更に包含する。かかる標識は、例えばポリペプチドの検出に使用することができる。
【０１５６】
他の実施形態において、標識化ＦｃＲｎ結合二量体は、望ましい生物活性を有する第二の部分も含むかつ／または上記の結合機能を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体における部分として存在する。標識は、いくつかの場合において、ＦｃＲｎ結合二量体へのみ（例えば、前記第一および第二の単量体単位の一つ、二つまたは両方へ）、ならびにいくつかの場合において、ＦｃＲｎ結合二量体とコンジュゲート体または融合タンパク質の第二の部分の両方に結合していてもよい。更に、標識が、第二の部分のみに結合しており、ＦｃＲｎ結合部分には結合していなくてもよいこともあり得る。故に、更に別の実施形態において、前記標識が第二の部分のみに結合している、第二の部分を含むＦｃＲｎ結合二量体が提供される。
【０１５７】
標識化ポリペプチドを参照する場合、これは、ＦｃＲｎ結合二量体ならびに第二のおよび場合により別の部分を含む融合タンパク質およびコンジュゲート体を含めた、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合二量体の全ての態様への参照として理解されるべきである。従って、標識化ポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合二量体および例えば、キレート化されているかまたはＦｃＲｎ結合二量体に共有結合していてもよい治療的放射性核種のみを含有するか、またはＦｃＲｎ結合二量体、治療的放射性核種および例えば治療的効能を生じる、望ましい生物活性を有する小型分子のような、第二の部分を含有することができる。
【０１５８】
ＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体が放射標識されている実施形態において、かかる放射標識されたポリペプチドは、放射性核種を含むことができる。放射性核種の大部分は、金属性を有し、イオン形で使用され、タンパク質およびペプチドにおいて提示される元素と安定な共有結合を形成する能力が典型的にない。この理由により、放射性金属でのタンパク質およびペプチドの標識化は、キレートと称される、金属イオンとの非共有結合性化合物を形成する、キレート剤、すなわち多座配位子を使用して行う。ＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体の実施形態において、放射性核種の組込みは、それを通して放射性核種がポリペプチドに配位し、キレート化するまたは錯体化することができる、キレート化環境の提供を通して可能になる。
【０１５９】
キレート剤の一例は、キレート剤のポリアミノポリカルボン酸型である。かかるポリアミノポリカルボン酸型キレート剤の２つのクラスを、区別することができる：大環状キレート剤および非環式キレート剤。
【０１６０】
一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体は、システイン残基のチオール基またはリジン残基のイプシロンアミン基を介してＦｃＲｎ結合二量体に結合したポリアミノポリカルボン酸型キレート剤によって提供されたキレート化環境を含む。代わりに、ポリアミノポリカルボン酸型キレート剤は、本明細書に開示された融合タンパク質またはコンジュゲート体の任意の部分を、前記融合タンパク質またはコンジュゲート体の第二のもしくは別の部分などに結合することができる。
【０１６１】
インジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、ラジオアクチニドおよびラジオランタニドの放射性同位体のための最も一般に使用される大環状キレート剤は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）の種々の誘導体である。一実施形態において、ＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体のキレート化環境は、ＤＯＴＡまたはその誘導体によって提供される。より明確には、一実施形態において、本開示によって包含されるキレート化ポリペプチドは、ＤＯＴＡ誘導体１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミド（マレイミドモノアミド−ＤＯＴＡ）を前記ポリペプチドと反応させることによって得られる。
【０１６２】
更に、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸（ＮＯＴＡ）およびその誘導体も、キレート剤として使用することができる。故に、一実施形態において、ポリアミノポリカルボン酸型キレート剤が、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸またはその誘導体である、ＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体が提供される。
【０１６３】
最も一般に使用される非環式ポリアミノポリカルボン酸型キレート剤は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸）の種々の誘導体である。故に、ジエチレントリアミンペンタ酢酸またはその誘導体によって提供されるキレート化環境を有するポリペプチドも、本開示によって包含される。
【０１６４】
更なる実施形態において、ポリヌクレオチドの発現を通して組換えでまたは合成的に作製されたＦｃＲｎ結合二量体は、例えばその流体力学半径を増加させるために、１つまたはそれ以上の合成ポリマーにコンジュゲートされている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、この目的のために一般に使用されるが、他のポリマーも、当技術分野において使用されてきた。かかる「ペグ化」を使用して、本明細書で記載したＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体のサイズを、効果的な腎排泄のための閾値を超えるサイズに増加させることができる。
【０１６５】
一実施形態において、合成ポリマーは、１つまたはそれ以上の化学的に合成されたＦｃＲｎ結合二量体にコンジュゲートしている。他の官能性も、同じ合成ポリマーにコンジュゲートしていてもよい。ＦｃＲｎ結合二量体および他の構成要素が化学的に合成されている場合、構成要素のいずれも、これが望ましくない場合、生物系において作られていなくてもよいことになる。
【０１６６】
好ましい実施形態において、１つまたはそれ以上の合成的にまたは生物学的に製造されたＦｃＲｎ結合二量体は、効率的な腎クリアランスと関連しているサイズを超えるサイズを達成するために、合成ポリマーにコンジュゲートしており、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を遮断するために使用される。ＦｃＲｎ結合二量体の単量体単位における独自のシステインを、部位特異的コンジュゲーション、例えばこの目的のために導入されたＣ末端に位置するシステインに使用することができる。分岐合成ポリマーにより、２つを超えるＦｃＲｎ結合部分を、同じポリマーにコンジュゲートして、アビディティー、従って遮断効力を増強することができる。
【０１６７】
本開示の第三の態様において、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合二量体または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチド；ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および発現ベクターを含む宿主細胞を発現させることを含む、上記のＦｃＲｎ結合二量体または融合タンパク質を作製する方法も、本開示によって包含される。
【０１６８】
前記宿主細胞をその発現ベクターからの前記ポリペプチドの発現に許容的な条件下で培養すること、およびポリペプチドを単離することを含む、ＦｃＲｎ結合二量体または融合タンパク質を作製する方法も、包含される。
【０１６９】
本開示のＦｃＲｎ結合二量体または融合タンパク質は、代わりに、保護された反応性側鎖を有するアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を使用する、非生物学的ペプチド合成によって作製することができ、この非生物学的ペプチド合成は、
−保護された反応性側鎖を有するＦｃＲｎ結合二量体または融合タンパク質を形成するためのアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体の段階的なカップリング、
−ＦｃＲｎ結合二量体または融合タンパク質の反応性側鎖からの保護基の除去、および
−水溶液中でのＦｃＲｎ結合二量体または融合タンパク質の折り畳み：を含む。
【０１７０】
本開示の第四の態様において、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体を含む組成物が提供される。その一実施形態において、前記組成物は、少なくとも１つの追加の活性薬剤、例えば少なくとも２つの追加の活性薬剤、例えば少なくとも３つの追加の活性薬剤などを更に含む。かかる組合せにおいて有用であると判明し得る追加の活性薬剤の非限定的な例は、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗菌剤および酵素である。
【０１７１】
この態様の一実施形態において、前記組成物は、経口投与、鼻腔内投与、肺投与、膣投与、直腸投与、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射および皮内注射からなる群から選択される経路による投与に適応される。
【０１７２】
本明細書では、「全身投与」という用語は、全身が影響されるように、目的の物質が循環系中に入る、投与の経路を表す。当業者は、全身投与が、腸内投与（胃腸管を通しての薬物の吸収）または非経口投与（一般的に注射、輸注または移植）を介して起こり得ることを認識している。
【０１７３】
一実施形態において、前記組成物は、全身的または局所的投与に適応される。いくつかの実施形態において、前記化合物の全身投与を使用することができる。別の実施形態において、前記組成物は、局所経路による投与に適応される。例えば、局所投与は、軟膏、泥膏、泡剤またはクリーム剤での外用であってもよい。別の実施形態において、前記組成物は、内皮または上皮層を通過しての投与に適用される。ここで、組成物を、前記層を通過して経細胞輸送することができる。
【０１７４】
一実施形態において、本明細書に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体を含む組成物の取込みの速度は、それ自体で第二のまたは別の部分に相当するポリペプチドの取込みの速度よりも高い。一実施形態において、取込みの速度は、それ自体で第二のまたは別の部分の取込みの速度よりも、少なくとも２倍高い、例えば少なくとも５倍高い、例えば少なくとも１０倍高い、例えば少なくとも２５倍高い。
【０１７５】
上記の開示から、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体または組成物は、例えば、治療薬として、および／または融合パートナーのインビボ半減期を延長するための手段として、および／または望ましくない標的の排除の速度を増加させるための手段として有用であり得ることが理解されるべきである。
【０１７６】
故に、本開示の第五の態様において、医薬としての使用のための本明細書で開示したＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物が提供される。
【０１７７】
本開示の関連する第六の態様において、治療活性または予防活性のある量の本明細書で開示したＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物を投与する工程を含む、それを必要としている対象の治療または予防の方法が提供される。
【０１７８】
これら最後の二つの態様のいずれか一つの一実施形態において、医薬または方法は、それを必要とする対象におけるＩｇＧレベルの低下が意図される。
【０１７９】
これら最後の二つの態様のいずれか一つの一実施形態において、医薬または方法は、ＦｃＲｎ結合二量体が少なくとも部分的にＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を遮断する能力が開拓される治療または予防、例えばＩｇＧ抗体の増加した異化が望まれる治療または予防を目的とする。
【０１８０】
ＩｇＧ遮断能が使用される別の実施形態において、本明細書記載のＦｃＲｎ結合二量体の投与は、抗−薬剤特性を示す抗体を遮断することにより、薬剤の有効性の向上作用を有する。特に、抗体によりクリアランスされる薬剤またはそのために中和抗体が誘導される薬剤の作用は、問題の薬剤の投与前のＦｃＲｎ結合二量体の投与により、この方法で改善され得る。
【０１８１】
ＩｇＧ遮断能が使用される別の実施形態において、本明細書記載のＦｃＲｎ結合二量体の投与は、抗体を除去するかまたは対象の血流中のそれらの循環時間を減少することにより抗体の有害作用を減少する作用を有する。例えば、放射標識されたまたは毒素−コンジュゲートされた抗体は、本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合二量体の引き続き投与により除去されることができる。代わりに、毒性有害作用が治療的抗体薬剤に対する反応として生じる場合において、かかる有害作用は、かかる抗体を除去するかまたはそれらの循環時間を制限するためのＦｃＲｎ結合二量体の引き続き投与により、改善または中和されることができる。
【０１８２】
一実施形態において、かかる治療または予防が指示され得る状態は、自己免疫状態である。指示される状態の非限定的な例として、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛、アミロイド症、ＡＮＣＡ−関連血管炎、強直性脊椎炎、抗−ＧＢＭ／抗−ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性辺縁系脳炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんま疹、軸索肛門側（ａｎａｌ）神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、拡張性心筋症、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性血管中心性線維症、好酸球性筋膜炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、実験的アレルギー脳脊髄炎、エバンス症候群、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ；ウェゲナー）、グレーヴス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性低補体血性尿細管間質性腎炎、特発性膜性腎症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４−関連疾患、ＩｇＧ４−関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク、炎症性大動脈瘤、炎症性偽腫瘍、封入体筋炎、インスリン−依存型糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎病、クトナー腫瘍、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ライム病、慢性縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミクリッツ症候群、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、モルバン症候群、ムッカ・ハーベルマン疾患、粘膜類天疱瘡、多巣性線維性硬化症、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、発作性睡眠、視神経脊髄炎（デビック）、神経ミオトニー（アイザックス症候群）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、オルモンド疾患（後腹膜線維症）、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌感染症と関連する小児自己免疫性神経精神疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、パラプロテイン血症性ニューロパシー、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、辺縁部炎（周辺部ブドウ膜炎）、妊娠性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、大動脈周囲炎、動脈周囲炎、末梢神経障害、静脈周囲の脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、多発性関節炎、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性異栄養症、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症（オルモンド疾患）、リウマチ熱、関節リウマチ、リーデル甲状腺炎、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子精巣の自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚病、白斑、ワルデンストレームマクログロブリン血症および温式特発性溶血性貧血が挙げられる。
【０１８３】
第五および第六の態様の別の実施形態において、かかる治療または予防が指示され得る状態は、同種免疫状態である。指示された状態の非限定的例として、抗−ＨＬＡ抗体に起因した移植ドナーの不適合；胎児および新生児同種免疫性血小板減少症、ＦＮＡＩＴ（または新生児同種免疫性血小板減少症、ＮＡＩＴＰまたはＮＡＩＴまたはＮＡＴ、または胎児母体同種免疫性血小板減少症、ＦＭＡＩＴＰまたはＦＭＡＩＴ）が挙げられる。
【０１８４】
第五および第六の態様の別の実施形態において、かかる治療または予防が指示され得る状態は、自己免疫性多内分泌性症候群の１型（ＡＰＥＣＥＤまたはウィタカー症候群）および２型（シュミット症候群）；全身性脱毛症；筋無力症クリーゼ；甲状腺クリーゼ；甲状腺関連眼疾患；甲状腺眼症状；自己免疫型糖尿病；自己抗体関連脳炎および／または脳障害；落葉状天疱瘡；表皮水疱症；疱疹状皮膚炎；シデナム舞踏病；急性運動軸索型ニューロパシー（ＡＭＡＮ）；ミラー・フィッシャー症候群；多発性運動ニューロパシー（ＭＭＮ）；眼球クローヌス；炎症性ミオパシー；アイザック症候群（自己免疫性神経ミオトニー）、腫瘍随伴症候群および辺縁系脳炎からなる群から選択される。
【０１８５】
第五および第六の態様の別の実施形態において、かかる治療または予防が指示され得る状態は、てんかんおよび発作から選択される。
【０１８６】
別の実施形態において、循環からの望ましくない標的の遮断または除去における使用のための、本明細書に記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物が提供される。一実施形態において、前記望ましくない標的は、アレルゲン、アミロイド、抗体、自己抗原、血液凝固因子、ホルモン、腫瘍細胞、薬物分子、サイトカイン、ケモカイン、過敏性メディエーター、炎症促進性因子、細菌毒素およびヘビ毒のような毒素、汚染物質、金属および抗酸化物質を含む群から選択される。
【０１８７】
本発明を様々な例示的な態様および実施形態を参照して記載したが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、均等物をそのエレメントの代わりに用いることができることは、当業者によって理解されることになる。更に、多くの改変を、その本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または分子を本発明の教示に適応するために行うことができる。従って、本発明は企図されたいかなる特定の実施形態にも限定されず、本発明は添付の特許請求の範囲の範囲内にある全ての実施形態を含むことになることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１Ａ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｂ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｃ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｄ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｅ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｆ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｇ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｈ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｉ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｊ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｋ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｌ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｍ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｎ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図１Ｏ】図１は、単量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号１〜３６７）および二量体型のＦｃＲｎ結合ポリペプチド（配列番号３６８〜３７６）の例のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）、Ｔａｑポリメラーゼ結合Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号３７８）、ヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）、マウスαＦｃＲｎ（配列番号３８４）、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）、マウスβ２−ミクログロブリン（配列番号３８１）、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のヒトαＦｃＲｎ（配列番号３８２）およびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰにおける場合のマウスαＦｃＲｎ（配列番号３８３）のアミノ酸配列の一覧である。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１〜３６７の配列中の残基８から残基３６まで伸びている。４９のアミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びたこれらのＺ変異体の各々内で、完全な３ヘリックス束を構成すると推定された。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｅは、実施例３において記載した、Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体およびＩｇＧに関する、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの結合ならびにｐＨ６．０および７．４での解離を示す。ｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ６．０での解離（実線）およびｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ７．４での解離（破線）を表すＢｉａｃｏｒｅ機器から得られたセンサーグラムのオーバーレイを、（Ａ）Ｚ０７９１８（配列番号１）、（Ｂ）Ｚ０７９６０（配列番号４）、（Ｃ）Ｚ１０１０９（配列番号３）、（Ｄ）Ｚ１０１９３（配列番号２）および（Ｅ）ＩｇＧについて表した。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｅは、実施例３において記載した、Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体およびＩｇＧに関する、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの結合ならびにｐＨ６．０および７．４での解離を示す。ｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ６．０での解離（実線）およびｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ７．４での解離（破線）を表すＢｉａｃｏｒｅ機器から得られたセンサーグラムのオーバーレイを、（Ａ）Ｚ０７９１８（配列番号１）、（Ｂ）Ｚ０７９６０（配列番号４）、（Ｃ）Ｚ１０１０９（配列番号３）、（Ｄ）Ｚ１０１９３（配列番号２）および（Ｅ）ＩｇＧについて表した。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｅは、実施例３において記載した、Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体およびＩｇＧに関する、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの結合ならびにｐＨ６．０および７．４での解離を示す。ｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ６．０での解離（実線）およびｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ７．４での解離（破線）を表すＢｉａｃｏｒｅ機器から得られたセンサーグラムのオーバーレイを、（Ａ）Ｚ０７９１８（配列番号１）、（Ｂ）Ｚ０７９６０（配列番号４）、（Ｃ）Ｚ１０１０９（配列番号３）、（Ｄ）Ｚ１０１９３（配列番号２）および（Ｅ）ＩｇＧについて表した。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｅは、実施例３において記載した、Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体およびＩｇＧに関する、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの結合ならびにｐＨ６．０および７．４での解離を示す。ｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ６．０での解離（実線）およびｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ７．４での解離（破線）を表すＢｉａｃｏｒｅ機器から得られたセンサーグラムのオーバーレイを、（Ａ）Ｚ０７９１８（配列番号１）、（Ｂ）Ｚ０７９６０（配列番号４）、（Ｃ）Ｚ１０１０９（配列番号３）、（Ｄ）Ｚ１０１９３（配列番号２）および（Ｅ）ＩｇＧについて表した。
【図２Ｅ】図２Ａ〜２Ｅは、実施例３において記載した、Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体およびＩｇＧに関する、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの結合ならびにｐＨ６．０および７．４での解離を示す。ｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ６．０での解離（実線）およびｐＨ６．０での注入、それに続くｐＨ７．４での解離（破線）を表すＢｉａｃｏｒｅ機器から得られたセンサーグラムのオーバーレイを、（Ａ）Ｚ０７９１８（配列番号１）、（Ｂ）Ｚ０７９６０（配列番号４）、（Ｃ）Ｚ１０１０９（配列番号３）、（Ｄ）Ｚ１０１９３（配列番号２）および（Ｅ）ＩｇＧについて表した。
【図３】図３は、実施例４において記載した、ヒト（上部のパネル）およびマウス（下部のパネル）ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ  ＨｅＬａ細胞へのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の結合のフローサイトメトリー分析からのドットプロットである。ＨｅＬａ細胞によるＦｃＲｎ−ｅＧＦＰの不均一な発現のために、細胞をＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ発現レベルに従ってゲートで制御した。ゲートＨにおける細胞は、ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ陰性であると考えられ、ゲートＩにおける細胞は、陽性であると考えられる。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化Ｚ変異体とのインキュベーションは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７とｅＧＦＰの両方に関して陽性の集団を生じたが、緩衝液（緩衝液対照）とのインキュベーションは、生じなかった。図は、３種の変異体Ｚ０７９６０（配列番号４）、Ｚ０７９３０（配列番号６）およびＺ０７９１８（配列番号１）がヒトＦｃＲｎおよびマウスＦｃＲｎに結合することを示している。ｙ軸は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７強度を示し、ｘ軸は、ｅＧＦＰ活性を示す。
【図４】図４は、実施例４において記載した、細胞結合アッセイにおいて測定された、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化Ｚ０７９６０（配列番号４）、Ｚ０７９３０（配列番号６）およびＺ０７９１８（配列番号１）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す図である。ダイヤグラム（Ａ）は、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰで形質導入されたＨｅＬａ細胞からのＭＦＩを示し、ダイヤグラム（Ｂ）は、マウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰで形質導入されたＨｅＬａ細胞からのＭＦＩを示す。
【図５】図５は、実施例５において記載した、ヒト（上部のパネル）およびマウス（下部のパネル）ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ  ＨｅＬａ細胞に結合するヒトまたはマウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７のフローサイトメトリー分析からのドットプロットである。ＨｅＬａ細胞によるＦｃＲｎ−ｅＧＦＰの不均一な発現のために、細胞表面上のＦｃＲｎ−ｅＧＦＰの存在量に従って細胞にゲートで制御した。ゲートＭにおける細胞は、ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ陰性であると考えられ、ゲートＮにおける細胞は、陽性であると考えられる。ＦｃＲｎ形質導入ＨｅＬａ細胞への１００ｎＭヒトまたはマウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７の結合を、左パネル（０ｎＭ）に示す。図は、ＩｇＧ結合が、Ｈｉｓ6−タグ付けＺ０７９１８（配列番号１）によって用量依存的（１、１０、１００および１０００ｎＭ）に遮断されたことを示している。ｙ軸は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７強度を示し、ｘ軸は、ｅＧＦＰ活性を示す。
【図６】図６は、実施例５において記載した、（Ａ）ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞および（Ｂ）マウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞上での、種々の濃度のＨｉｓ6−タグ付けＺ０７９１８（配列番号１）の存在下でのＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７のＦｃＲｎ結合から生じた平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す図である。図は、Ｚ変異体によるＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合の用量依存性遮断を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃは、実施例６において記載した、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用した、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの３種のＺ変異体の結合の動態を示す図である。アルブミン結合ポリペプチドＰＰ０１３（配列番号３７７）および対照Ｚ変異体分子Ｚ０３６３８（配列番号３７８；ＦｃＲｎに特異的ではない）と融合した、それぞれ、（Ａ）Ｚ１１９４８（配列番号３５４）、（Ｂ）Ｚ１１９４６（配列番号３５５）、および（Ｃ）Ｚ１１９４７（配列番号３５６）の濃度系列に関するセンサーグラムを示す。６４０ｎＭ（破線）、１６０ｎＭ（点線）および４０ｎＭ（灰色の実線）からの曲線を、ラングミュア１：１結合モデルを使用して、動態解析に供した。動態パラメーターおよび親和性を、近似曲線（黒の実線）から計算し、表６に示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃは、実施例６において記載した、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用した、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの３種のＺ変異体の結合の動態を示す図である。アルブミン結合ポリペプチドＰＰ０１３（配列番号３７７）および対照Ｚ変異体分子Ｚ０３６３８（配列番号３７８；ＦｃＲｎに特異的ではない）と融合した、それぞれ、（Ａ）Ｚ１１９４８（配列番号３５４）、（Ｂ）Ｚ１１９４６（配列番号３５５）、および（Ｃ）Ｚ１１９４７（配列番号３５６）の濃度系列に関するセンサーグラムを示す。６４０ｎＭ（破線）、１６０ｎＭ（点線）および４０ｎＭ（灰色の実線）からの曲線を、ラングミュア１：１結合モデルを使用して、動態解析に供した。動態パラメーターおよび親和性を、近似曲線（黒の実線）から計算し、表６に示す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、実施例６において記載した、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用した、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎへの３種のＺ変異体の結合の動態を示す図である。アルブミン結合ポリペプチドＰＰ０１３（配列番号３７７）および対照Ｚ変異体分子Ｚ０３６３８（配列番号３７８；ＦｃＲｎに特異的ではない）と融合した、それぞれ、（Ａ）Ｚ１１９４８（配列番号３５４）、（Ｂ）Ｚ１１９４６（配列番号３５５）、および（Ｃ）Ｚ１１９４７（配列番号３５６）の濃度系列に関するセンサーグラムを示す。６４０ｎＭ（破線）、１６０ｎＭ（点線）および４０ｎＭ（灰色の実線）からの曲線を、ラングミュア１：１結合モデルを使用して、動態解析に供した。動態パラメーターおよび親和性を、近似曲線（黒の実線）から計算し、表６に示す。
【図８】図８は、実施例６において記載したように得られたアルブミン結合ポリペプチドＰＰ０１３に融合した、３種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体に関する薬物動態学的プロファイルを示す図である。Ｚ変異体Ｚ１１９４７（配列番号３５６、白抜き四角形）、Ｚ１１９４６（配列番号３５５、白抜き三角形）およびＺ１１９４８（配列番号３５４、白抜きひし形）は、陰性対照ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８（白抜き円）と比較して、全て延長された半減期を示した。
【図９】図９は、実施例１０において記載したようにアッセイした、それぞれ、Ｈｉｓ6−Ｚ０７９１８（配列番号１；黒の円）、ＩＶＩｇ（灰色の四角形）およびＳＣＩｇ（灰色の三角形）による、ヒトＦｃＲｎへのヒトＩｇＧ結合の遮断を示す図である。
【図１０】図１０は、マウスにおけるＦｃＲｎ特異的Ｚ変異体でのＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用の遮断が、ＩｇＧの減少したレベルを生じることを示す。実施例１１において更に記載したように、マウスを、ビヒクル（＋）、ＡＢＤ融合Ｚ変異体Ｚ０７９１８−ＰＰ０１３（白抜き四角形）およびＺ１１９４８（配列番号３５４；黒塗り円）の５回の毎日の注射で処置した。内在性ＩｇＧの濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。２４、７２、１２０および１６８時間での、個々のマウスにおけるＩｇＧの濃度は、０時間でのレベルと関連しており、従って結果を０時間でのＩｇＧの百分率として提示する。
【図１１】図１１は、実施例１３に記載したように測定した、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質転換ＨｅＬａ細胞へ結合するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化二量体および単量体ポリペプチドの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す。（Ａ）ｐＨ６（黒色）およびｐＨ７．４（白色）でＦｃＲｎへ結合する、二量体Ｚ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１１９４８（配列番号３６９）およびＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）−Ｚ１１９４８（配列番号３６８）、および対応する単量体Ｚ変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）。（Ｂ）ｐＨ６（黒色）およびｐＨ７．４（白色）でＦｃＲｎへ結合する、単量体プライマリーＺ変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）および単量体成熟型Ｚ変異体Ｚ１３５８３（配列番号２３）、Ｚ１３６２１（配列番号４４）、Ｚ１３６５４（配列番号６５）およびＺ１３６７４（配列番号７５）。
【図１２】図１２は、実施例１４に記載したようにアッセイした、二量体および単量体ポリペプチドによるヒトＦｃＲｎへのヒトＩｇＧ結合の遮断を示す。（Ａ）二量体Ｚ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１１９４８（配列番号３６９）およびＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）−Ｚ１１９４８（配列番号３６８）；対応する単量体Ｚ変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）、ＳＣＩｇおよびＩＶＩｇ。（Ｂ）単量体プライマリーＺ変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）および単量体成熟型Ｚ変異体Ｚ１３５８３（配列番号２３）およびＺ１３６２１（配列番号４４）。
【図１３】図１３は、実施例１７に記載したようにＥＬＩＳＡにより分析したｈＦｃＲｎへのポリペプチドのｐＨ依存性の結合を示す。（Ａ）ｐＨ６での指定されたポリペプチドの結合。（Ｂ）ｐＨ７．４での指定されたポリペプチドの結合。両方のｐＨ値で、単量体Ｚ変異体（Ｚ１３６２１）よりも、二量体ポリペプチド（ＺＡＺ＃＃＃＃）について、より効果的な結合が認められた。
【図１４】図１４は、実施例２０に記載したように、二量体ポリペプチドで処理したＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるｈＩｇＧレベルの低下を示す。（Ａ）ｈＩｇＧレベルの低下は、２つのＺ部分（ＺＡＺ３７１５；配列番号３７１）の間に配置されたアルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号３７７）と、ポリペプチド（ＺＺＡ３７１６；配列番号３７２）のＣ−末端に配置されたＰＰ０１３で同等に有効であった。（Ｂ）ｈＩｇＧレベルの同等の低下が、ポリペプチドＺＡＺ３８６９（配列番号３７４）、ＺＡＺ３８７０（配列番号３７５）およびＺＡＺ３８７１（配列番号３７６）により得られた。
【図１５】図１５は、実施例２１に記載したように、二量体ポリペプチドＺＡＺ３７１５（配列番号３７１）およびＺＡＺ３８２４（配列番号３７３）で処理したＮＭＲＩマウスにおけるｈＩｇＧレベルの用量依存的低下を示す。
【図１６】図１６は、図１５に示したものと同じＩｇＧ異化試験において測定した、それぞれ、ＺＡＺ３７１５（配列番号３７１）およびＺＡＺ３８２４（配列番号３７３）の血清濃度を示す。
【図１７】図１７は、安定性試験の前（０）および２週間後（２ｗ）の、本来のおよび変異したＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。レーン１：Ｚ１１９４８（０）、レーン２：Ｚ１１９４８（２ｗ）、レーン３：Ｍｗ、レーン４：Ｚ１７３４７（０）、レーン５：Ｚ１７３４７（２ｗ）、レーン６：Ｚ１７３４８（０）、レーン７：Ｚ１７３４８（２ｗ）。分子量マーカー（Ｍｗ）は、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐプレ染色タンパク質標準（２１６、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、３．５ｋＤａ）である。図中に認められる対角線バンドは、同じ容器中で染色した第二ゲルの痕跡から生じるアーチファクトである。
【図１８】図１８は、実施例２５に記載したような、ｐＨ６．０でのヒトおよびカニクイザルＦｃＲｎへの結合を示す。ｈＦｃＲｎ（黒色）およびｃＦｃＲｎ（灰色）の上の９０ｎＭ  Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体の注射からの反応を表す、Ｂｉａｃｏｒｅ機器から得られたセンサーグラムのオーバーレイは、（Ａ）Ｚ１３５７８（実線）およびＺ１８６３２（破線）、（Ｂ）Ｚ１３６１６（実線）およびＺ１８６３３（破線）、ならびに（Ｃ）Ｚ１３６２１（実線）およびＺ１８６３４（破線）について示している。
【実施例】
【０１８９】
実施例
概要
以下の実施例は、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）を標的とする新規なＺ変異体分子の開発を開示する。Ｚ変異体を、ファージディスプレイテクノロジーを使用して得た。本明細書に記載したＦｃＲｎ結合ポリペプチドをコードする遺伝子を配列決定し、相当するアミノ酸配列を、図１において列挙し、識別名配列番号１〜３５３によって表示した。本明細書に開示されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの推定されたＦｃＲｎ結合モチーフ（ＢＭ）は、配列番号１−３５３の配列において、残基８から残基３６まで伸びている。更に、ＦｃＲｎ結合特性および二量体型での前記ポリペプチドのＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を遮断する能力を、調べた。
【０１９０】
実施例１
ヒトαＦｃＲｎおよびヒトβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の作製
この実施例において、ヒトβ２−ミクログロブリン（配列番号３８０）との複合体であるヒトαＦｃＲｎ（配列番号３７９）（ＦｃＲｎと表示する複合体）および非複合型であるヒトβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍと表示する）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、可溶性タンパク質として作製した。この実施例において作製されたヒトＦｃＲｎおよびＢ２Ｍを、実施例２および３において、ファージ選択、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅアッセイに使用した。
【０１９１】
材料および方法
同時発現に使用されるヒトαＦｃＲｎおよびヒトβ２−ミクログロブリンに関する遺伝子を含有するプラスミドの構築：ヒトαＦｃＲｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＣ００８７３４．２）およびヒトβ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＣ０３２５８９．１）をコードする遺伝子を、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た。ＰＣＲ重複伸長を使用し、ヒトαＦｃＲｎ（αＦｃＲｎECD）（配列番号３７９）のアミノ酸２４〜２９０をコードする遺伝子断片を、ａｔｔＢ１−部位／コザック配列、それに続くＩｇカッパ鎖リーダー配列、ｈＦｃＲｎECD、ＧＳリンカーおよびｆｌａｇタグをコードする遺伝子、それに続くａｔｔＢ２部位からなる構築物に増幅した。ヒトＢ２Ｍ（配列番号３８０）のアミノ酸２１〜１１９をコードする遺伝子断片を含有する、Ｈｉｓ6タグがｆｌａｇタグに置き換わっていること以外は同様の構築物を作製した。構築物を、製造業者の推奨に従って、Ｇａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７８９０２０、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ酵素ミックス）を使用した組換えによって、プラスミドｐＤＯＮＯＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２５３６−０１７）中に挿入した。正確な配列の検証後、ヒトαＦｃＲｎECD構築物を、プロモーター含有プラスミドｐＥＮＴＲ−ＣＭＶ（Ｔａｉら（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（９）：ｅ４６２６９）とともに、マルチサイトGａｔｅｗａｙクローニングを使用して、２Ｋ７bsd（Ｓｕｔｅｒら（２００６）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：６１５〜６２３）中に挿入し、ベクター２Ｋ７bsd−ＣＭＶ−ｈＦｃＲｎECDを生じた。ヒトＢ２Ｍ遺伝子構築物を、同様に２Ｋ７neo（Ｓｕｔｅｒら、前掲）中に挿入し、ベクター２Ｋ７neo−ＣＭＶ−ｈＢ２Ｍを得た。
【０１９２】
細胞培養、組換えレンチウイルスベクターの調製およびＳＫＯＶ−３細胞株への遺伝子挿入：  ＨＥＫ２９３ＴおよびＳＫＯＶ−３細胞株を、ＡＴＣＣから得た。細胞を、５％ＣＯ2の存在下で、加湿インキュベーターにおいて３７℃で増殖させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株のための完全培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％抗生物質抗真菌溶液（ＡＡ）および１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）を補充した、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）であった。ＳＫＯＶ−３細胞株のための完全培地は、１０％ＦＢＳおよび１％ＡＡを補充した、ＭｃＣｏｙ’５Ａ培地であった。
【０１９３】
プラスミド２Ｋ７bsd−ＣＭＶ−ｈＦｃＲｎECDおよび２Ｋ７neo−ＣＭＶ−ｈＢ２Ｍを、ＶＳＶ−Ｇエンベロープおよびｇａｇ／ｐｏｌパッケージングプラスミドとともに、塩化カルシウムトランスフェクションを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に別々にコトランスフェクトした（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５（９）：８７１〜５；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（２００６）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ８４：５８〜６７）。それぞれ、ヒトαＦｃＲｎECD遺伝子およびヒトＢ２Ｍ導入遺伝子を有する、形成されたレンチウイルス粒子を含有するＨＥＫ２９３培養物上清を、遠心分離およびろ過によって細胞片から取り除いた。レンチウイルス粒子の２つの型を使用して、ＳＫＯＶ−３細胞を順次形質導入した。ヒトαＦｃＲｎECDとＢ２Ｍ遺伝子の両方を含有する成功的な二重の組込み体を、細胞を２週間継代している間に、培地へのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＧ４１８硫酸塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加によって選択した。生じた安定して形質導入されたＳＫＯＶ−３細胞株を、ＳＫＯＶ−３  ｈＦｃＲｎECD／ｈＢ２Ｍと表示した。
【０１９４】
組換えヒトＦｃＲｎの発現：  ヒトＦｃＲｎを生じるヒトαＦｃＲｎECDおよびＢ２Ｍを同時発現するＳＫＯＶ−３細胞を増殖させ、１．５×１０7細胞を、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の５６０ｍｌ完全増殖培地に播種した。５日後、細胞が定着し、増加した際に、培地を、ＦＢＳを有さない完全増殖培地に交換した。５日後、培養を終結し、上清を採取し、４５μｍフィルターを通過させ、−８０℃で凍結した。
【０１９５】
ヒトＩｇＧクロマトグラフィーを使用した組換えヒトＦｃＲｎの精製：  タンパク質精製を、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において行った。１０ｍｇ／ｍｌの濃度の０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．３中のヒトＩｇＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍｌを、製造業者の指示に従って、１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させた。ＳＫＯＶ−３細胞由来の組換えヒトＦｃＲｎを含有する上清を解凍し、ｐＨをＨＣｌで５．８に調整した。その後、上清を、１００ｍｌのバッチで、２０ｍＭビストリスｐＨ５．８で前もって平衡したカラム上へ装加した。カラムを、２０ｍＭビストリスｐＨ５．８  ２０ｍｌで洗浄し、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．１を使用して、１ｍｌの画分で溶出した。ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、１０ｍＭリン酸塩、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）への緩衝液交換を、透析を使用して行った。
【０１９６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット：  タンパク質精製からの溶出画分の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）およびＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（登録商標）銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での染色によって、分析した。ウエスタンブロットを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ（商標）−Ｃ  Ｅｘｔｒａニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。膜を、ＴＢＳ＋Ｔ（５０ｍＭトリズマ塩基、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０、ｐＨ８）中５％脱脂粉乳（Ｓｅｍｐｅｒ）で１時間ブロッキングし、次いでＴＢＳ＋Ｔ中の０．１５μｇ／ｍｌの濃度でのウサギ抗ＦＣＧＲＴポリクローナル抗体（Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および０．２３μｇ／ｍｌの濃度でのウサギ抗Ｂ２Ｍポリクローナル抗体（Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の混合物で探索した。その後、膜をＴＢＳ＋Ｔにおいて１：１０，０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）にコンジュゲートしている安定化ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加後、膜の画像をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で取得した。Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍを、ＧＢＸ現像液およびＧＢＸ定着液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、加工した。
【０１９７】
ヒトＢ２Ｍの非複合型の作製：ヒトＢ２Ｍを大腸菌において作製した。発現および精製を、本質的にＳａｎｄａｌｏｖａら（２００５）Ａｃｔａ  Ｃｈｒｙｓｔ  Ｆ６１：１０  ９０〜１０９３およびＭｉｃｈａｅｌｓｓｏｎら（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６  ６：７３２７〜７３３４において報告されているように行った。尿素中のヒトＢ２Ｍのアミノ酸２１〜１１９からなる精製タンパク質を、以下のようにアルギニン再折り畳みに供した；Ｂ２Ｍ  ０．５ｍｇを、２ｍｌ再折り畳み緩衝液（２０ｍｌ  １Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１６．８７ｇ  Ｌ−アルギニン（ＨＣｌで緩衝された）、０．８ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、６１ｍｇ  ＧＳＳＧ、３０７ｍｇ  ＧＳＨおよび２００ｍｌ、ｐＨ８．０の最終体積までミリＱ水、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１  ８７３  ５８０  ００１）を補充した）に急速に加えた。再折り畳み手順を、４℃で４時間の間行った。再び折り畳まれたＢ２Ｍタンパク質を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＢＳに緩衝液交換した。
【０１９８】
結果
同時発現に使用されるヒトαＦｃＲｎおよびヒトβ２−ミクログロブリンに関する遺伝子を含有するプラスミドの構築：  ヒトＦｃＲｎのα鎖の細胞外ドメイン（αＦｃＲｎECD）およびヒトＢ２Ｍをコードする遺伝子を、それぞれ、レンチウイルストランスファープラスミド２Ｋ７bsdおよび２Ｋ７neo中に挿入した。両方の場合において、挿入された遺伝子は、ＣＭＶプロモーターの制御下にあった。生じたタンパク質が、小胞体を通しての培地への排出のためのタンパク質を標的とするためのＮ末端におけるＩｇカッパ鎖リーダー配列（シグナル配列が分泌時に切断された）を有するように、遺伝子が伸長された。更に、αＦｃＲｎECDは、潜在的な検出のためのＦＬＡＧ−タグが後に続くＣ末端スペーサー配列を有した。ヒトＢ２Ｍは、潜在的な検出のためのＨｉｓ6タグが後に続くＣ末端スペーサー配列を有した。スペーサー配列は、タグの利便性を増強するために加えた。レンチウイルストランスファープラスミドは、両方の構築物が挿入された細胞の選択を可能にするための２つの異なる抗生物質耐性遺伝子も含有した。
【０１９９】
組換えヒトＦｃＲｎの発現および精製：  αＦｃＲｎECDおよびＢ２Ｍをコードする遺伝子を、レンチウイルスによってＳＫＯＶ−３のゲノム中に挿入し、生じたＦｃＲｎタンパク質を、培地中に分泌させた。保持されたｐＨ依存ＩｇＧ結合を有するＦｃＲｎのみを捕捉するために、固定化ＩｇＧを使用するアフィニティクロマトグラフィーを使用し、受容体がｐＨ５．８で捕捉され、ｐＨ８．１で溶出された。捕捉されたタンパク質を、３つの画分において溶出した。
【０２００】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット：  作製されたＦｃＲｎタンパク質の２つのペプチド鎖（αＦｃＲｎECDおよびＢ２Ｍ）の存在を調査するために、および溶出された物質の純度を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を溶出画分に行った。ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色で染色されたゲルに関して、２つのバンドが、それぞれ、１２および３６ｋＤａの分子量で検出された。これは、Ｂ２Ｍに関する１２ｋＤａおよびαＦｃＲｎECDに関する３１ｋＤａの非グリコシル化ペプチド鎖の理論上の分子量にほぼ相当する。タンパク質のαＦｃＲｎECD部は、１つのグリコシル化部位を含有し、従って、その分子質量が３１ｋＤａよりも高いことが予想された。ゲルに銀染色もして、感受性を増加させ、できる限り不純物を検出した。約６６ｋＤａのバンドが、第一の溶出画分において検出され、これは、細胞接着から生じるＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に相当した。画分２および３において回収されたタンパク質の総量は、１．４ｍｇ／ｌ培地に相当した。プールされた物質へのウエスタンブロット分析を行い、これは、本質的に２つの主要なバンドのみを示し、更に分解産物に相当する１２ｋＤａ未満の非常に弱いバンドを示した。
【０２０１】
実施例２
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の選択およびＥＬＩＳＡ結合
この実施例において、ヒトＦｃＲｎを、Ｚ変異体のファージライブラリーを使用した、ファージディスプレイ選択における標的として使用した。選択されたクローンを、ＤＮＡ配列決定し、大腸菌ペリプラズム画分において作製し、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）においてＦｃＲｎに対してアッセイした。
【０２０２】
材料および方法
標的タンパク質ＦｃＲｎおよびＢ２Ｍのビオチン化：  実施例１において記載したように作製した、ヒトＦｃＲｎおよびヒトＢ２Ｍを、製造業者の推奨に従って、それぞれ、３１×（ＦｃＲｎ）および１０×（Ｂ２Ｍ）モル過剰でＮｏ−Ｗｅｉｇｈ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１３２７）を使用して、ビオチン化した。反応を、室温（ＲＴ）で３０分間行った。それに続くＰＢＳへの緩衝液交換を、製造業者の指示に従って、Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＦｃＲｎ；Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号６６３８０、１０，０００ＭＷＣＯおよびＢ２Ｍ；Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号６６３３３、３，５００ＭＷＣＯ）を使用して、行った。
【０２０３】
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：  本質的にＧｒｏｎｗａｌｌら（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１２８：１６２〜１８３において報告されているように、バクテリオファージ上に提示され、ファージミドｐＡＹ０２５９２において構築された、プロテインＺのランダム変異体のライブラリーを使用して、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を選択した。このライブラリーにおいて、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ、連鎖球菌株Ｇ１４８由来のプロテインＧのＧＡ３）を、Ｚ変異体への融合パートナーとして使用した。ライブラリーは、Ｚｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩと表示され、１．５×１０10ライブラリーメンバー（Ｚ変異体）のサイズを有した。ファージミドライブラリーＺｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩを含有するグリセリンストックからの大腸菌ＲＲＩΔＭ１５細胞（Ｒｕｔｈｅｒら、（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：５７６５〜５７７２）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した、定義されたプロリンを含まない培地２０ｌ［リン酸水素二カリウム７ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物１ｇ／ｌ、ウラシル０．０２ｇ／ｌ、ＹＮＢ（Ｄｉｆｃｏ（商標）酵母窒素塩基ｗ／ｏアミノ酸、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）６．７ｇ／ｌ、グルコース一水和物５．５ｇ／ｌ、Ｌ−アラニン０．３ｇ／ｌ、Ｌアルギニン一塩酸塩０．２４ｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１１ｇ／ｌ、Ｌ−システイン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．３ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン０．１ｇ／ｌ、グリシン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−ヒスチジン０．０５ｇ／ｌ、Ｌ−イソロイシン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−ロイシン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−リジン一塩酸塩０．２５ｇ／ｌ、Ｌ−メチオニン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−セリン０．３ｇ／ｌ、Ｌ−トレオニン０．２ｇ／ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１ｇ／ｌ、Ｌ−チロシン０．０５ｇ／ｌ、Ｌ−バリン０．１ｇ／ｌ］に播種した。培養物を、発酵槽（Ｂｅｌａｃｈ  Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ、ＢＲ２０）において３７℃で増殖させた。細胞が６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学濃度０．７５に達したとき、培養物約２．６ｌを、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｎ０３１５Ｓ）の１０×モル過剰を使用して、感染させた。細胞を、３０分間インキュベートし、そこで発酵槽を、発現の誘発のための１００μＭイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍｌカルベニシリンを補充したＴＳＢ−ＹＥ（トリプシン処理ダイズブロス−酵母抽出物；３０ｇ／ｌ  ＴＳＢ、５ｇ／ｌ酵母抽出物）で２０ｌまで満たし、３０℃で２２時間増殖させた。培養物における細胞を、１５，９００ｇでの遠心分離によってペレット化した。ファージ粒子を、上清からＰＥＧ／ＮａＣｌ（ポリエチレングリコール／塩化ナトリウム）において２回沈澱させ、ろ過し、上記のＧｒｏｎｗａｌｌらにおいて報告されているようにＰＢＳおよびグリセリンに溶解した。ファージストックを、使用前に−８０℃で保管した。
【０２０４】
ビオチン化ヒトＦｃＲｎに対する選択を、２個の異なるトラックに分けた４つのサイクルで行った。ファージストック調製および選択手順を、本質的にＷＯ２００９／０７７１７５において別のビオチン化標的に対する選択に関して報告されているように行った。選択サイクル間のファージの増幅を、大腸菌ＲＲＩΔＭ１５をファージに感染させ、次いで以下のように溶液中で培養を行うことによって行った。溶出したファージおよび細菌と比較してＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージの１０×過剰を、回転なしで３７℃で３０分間、その後ゆっくり回転させながら３０分間、対数期細菌に同時に感染させておいた。感染に先立って、細菌を、上記の定義されたプロリンを含まない培地において対数期まで増殖させた。感染させた細菌を、４，３００ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した２００ｍｌ  ＴＳＢ＋ＹＥ培地に再懸濁し、ファージ作製のために３０℃で終夜培養した。
【０２０５】
選択緩衝液は、塩化水素でｐＨ５．５に調整し、０．１％ゼラチンおよび０．１％ツイーン２０を補充した、１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウムからなった。選択において、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ａｌｂｕｃｕｌｔ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を、１．５μＭの最終濃度まで選択緩衝液に加えた。バックグラウンド結合体の量を減少させるために、事前選択を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（ＳＡ−ビーズ、Ｄｙｎａｌ、カタログ番号１１２．０６）との、ＲＴで１時間のファージストックのインキュベーションによって行った。第二の事前選択を、イムノチューブ（Ｎｕｎｃ、カタログ番号４４４４７４）において固定化されたヒトＢ２Ｍに対してＲＴで３０分間行った。炭酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号０６８Ｋ８２１４）におけるヒトＢ２Ｍ  ５μｇ／ｍｌを、チューブにおいて７℃で＞１時間、固定化した。水道水で２回洗浄した後、チューブを、使用前に、ＰＢＳ＋０．５％カゼイン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ８６５４）でＲＴで３０分間ブロッキングした。選択において使用する全てのチューブおよびビーズを、ＰＢＳ＋０．１％ゼラチンで前もってブロッキングした。選択を、溶液においてＲＴで行い、その後、２．９μｇビオチン化ＦｃＲｎ毎に１ｍｇビーズを使用して、ＳＡ−ビーズ上で標的−ファージ複合体の捕捉を行った。選択のサイクル１において、１００ｎＭビオチン化ＦｃＲｎを使用し、各２分の２回の洗浄を、選択緩衝液を使用して行った。増加したストリンジェンシーを、低下した標的濃度および回数が増加した洗浄を使用して、それに続くサイクルに適用した：５０ｎＭ／５洗浄、２５ｎＭ／８洗浄および１０ｎＭ／１２洗浄を、それぞれ、サイクル２、３および４に適用した。洗浄後、結合したファージを、２つの異なる手順；１）５００μｌ  ０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２、その後の５０μｌ  １Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および４５０μｌ  ＰＢＳでの即時の中和、または；２）１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０  ５００μｌならびに５００μｌ  ＰＢＳでの中和を使用して、２個の選択トラックから溶出した。
【０２０６】
配列決定：  ＰＣＲ断片を、標準的なＰＣＲプログラムおよびプライマーＡＦＦＩ−２１（５’−ｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇ（配列番号３８５））およびＡＦＦＩ−２２（５’−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号３８６））を使用して、単一コロニーから増幅した。増幅された断片の配列決定を、製造業者のプロトコールに従って使用した、ビオチン化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５’−ビオチン−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ（配列番号３８７））およびＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。配列決定反応物を、Ｍａｇｎａｔｒｉｘ  ８０００（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して、磁性ストレプトアビジンをコーティングしたビーズ（剥離ストレプトアビジンビーズ、Ｎｏｒｄｉａｇ、カタログ番号２０１２−０１）への結合によって精製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分析した。
【０２０７】
ＥＬＩＳＡのためのＺ変異体の作製：  配列決定されたＺ変異体を、選択からの単一のコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した１０ｍｌ  ＴＳＢ−ＹＥ培地中に接種し、３７℃で２４時間インキュベートすることによって作製した。細胞を遠心分離によってペレット化し、２ｍｌ  ＰＢＳＴ（０．０５％ツイーン２０を補充したＰＢＳ）に再懸濁し、−８０℃で凍結し、水浴で解凍して、細胞のペリプラズム画分を遊離した。凍結解凍手順を７回繰返し、次いで細胞を遠心分離によってペレット化した。ペリプラズム抽出物の上清は、ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＹＶＰＧ（Ｇｒｏｎｗａｌｌら、前掲）として発現される、ＡＢＤへの融合物としてのＺ変異体を含有した。Ｚ＃＃＃＃＃は、個々の、５８アミノ酸残基Ｚ変異体を表す。
【０２０８】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ  ＫD分析：  ＦｃＲｎへのＺ変異体の結合を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて分析した。ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）において希釈した抗ＡＢＤヤギ抗体２μｇ／ｍｌ（内部で作製した）で４℃で終夜コーティングした。抗体溶液を捨て、ウェルをＰＢＳＣ  １００μｌ（０．５％カゼインを補充したＰＢＳ）で、ＲＴで１．５時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄し、１：４で希釈した５０μｌペリプラズム溶液をウェルに加え、ゆっくりとした振とう下でＲＴで１．５時間インキュベートした。溶液を捨て、ウェルを０．０５％ＰＣＴ緩衝液、ｐＨ６．０（０．０５％ツイーン２０を補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）または０．０５％ＰＣＴ緩衝液、ｐＨ７．４（０．０５％ツイーン２０を補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で、４回洗浄した。標的タンパク質、ビオチン化ヒトＦｃＲｎを、それぞれ、ＰＣＣ緩衝液、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４（０．５％カゼインを補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４）において希釈した、２μｇ／ｍｌ（４５ｎＭ）から０．３ｎｇ／ｍｌ（６．９ｐＭ）の１：３希釈濃度系列でウェルに加えた。プレートをＲＴで１．５時間インキュベートし、その後上記のように洗浄した。ストレプトアビジンをコンジュゲートしたＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｎ１００）を、それぞれ、ＰＣＣ緩衝液、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４において１：３００００に希釈し、ウェルに加え、その後４５分間インキュベートした。上記の洗浄後、５０μｌ  ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４０２１）をウェルに加え、プレートを製造業者の推奨に従って処置した。吸光度を、マルチウェルプレートリーダー、Ｖｉｃｔｏｒ3（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して４５０ｎｍで測定した。無関係のタンパク質に結合しているＺ変異体を陰性対照として使用し、ブランクを、ペリプラズム工程を省略することによって作り出した。予備実験においてＦｃＲｎに結合したＺ変異体（Ｚ０７９１８、配列番号１）を、陽性対照として使用した。相互作用の親和性（ＫD）を決定するために、測定値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）および非線形回帰を使用して分析した。
【０２０９】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ特異性分析：  別のＥＬＩＳＡ実験において、Ｚ変異体の特異性を、それらを２μｇ／ｍｌビオチン化ヒトタンパク質Ｂ２Ｍ、ＰＳＭＡ（内部で作製した）およびＩｇＧ（ポリクローナル、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に対して、ならびにそれぞれ、ＰＣＣ緩衝液ｐＨ６．０またはｐＨ７．４に対してアッセイすることによって試験した。アッセイを、上記のように、それぞれ、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４で行った。ビオチン化タンパク質または緩衝液を、標的タンパク質工程においてＦｃＲｎの代わりにウェルに加えた。
【０２１０】
結果
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：  個々のクローンを、ビオチン化ヒトＦｃＲｎに対するファージディスプレイ選択の４つのサイクル後に得た。
【０２１１】
配列決定：  配列決定を、選択ラウンド４からランダムに採取したクローンに行った。各Ｚ変異体に、独自の同定番号＃＃＃＃＃を与え、個々の変異体をＺ＃＃＃＃＃と称した。５８アミノ酸残基長のＺ変異体のアミノ酸配列を、配列番号１〜１６および配列番号３５３として図１において列挙した。
【０２１２】
これらのＺ変異体の推定されるＦｃＲｎ結合モチーフは、図１の配列番号１−１６および配列番号３５３の残基８から残基３６まで伸びている。これらのＺ変異体のそれぞれ内で完全な３ヘリックス束を構成することが予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びている。
【０２１３】
Ｚ変異体でのＥＬＩＳＡアッセイ：  １６種のクローンを、大腸菌においてＡＢＤ融合タンパク質として作製した。ペリプラズム画分を、ヒトＦｃＲｎの希釈系列に対するＥＬＩＳＡにおいて使用した。クローンは：Ｚ０７９０９（配列番号１３）、Ｚ０７９１８（配列番号１）、Ｚ０７９３０（配列番号６）、Ｚ０７９６０（配列番号４）、Ｚ１０１０９（配列番号３）、Ｚ１０１１１（配列番号８）、Ｚ１０１２７（配列番号１２）、Ｚ１０１２９（配列番号９）、Ｚ１０１４０（配列番号５）、Ｚ１０１４１（配列番号１０）、Ｚ１０１４５（配列番号１５）、Ｚ１０１５２（配列番号１４）、Ｚ１０１５６（配列番号１１）、Ｚ１０１６１（配列番号１６）、Ｚ１０１８３（配列番号７）およびＺ１０１９３（配列番号２）であった。ＫD値を、ｐＨ６．０で全ての変異体に関して、およびｐＨ７．４で３種の変異体に関して決定した（表２）。１３種の変異体に関して、データを、ｐＨ７．４でのＫD分析に関して得なかった。ヒトＢ２Ｍ、ＩｇＧまたはＰＳＭＡに対してアッセイした場合、１６種の変異体のいずれも、非特異的結合を示さなかった。
【０２１４】
【表２】
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【０２１５】
実施例３
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の作製および特徴付け
この実施例において、１７種のＺ変異体を大腸菌において作製し、精製し、ＢｉａｃｏｒｅにおいてヒトＦｃＲｎに対してアッセイした。前記変異体のサブセットを、マウスＦｃＲｎに対してもアッセイした。円二色性（ＣＤ）分光法を、それらの二次構造の調査のために、Ｚ変異体のサブセットに関して行った。
【０２１６】
材料および方法
Ｚ変異体のサブクローニング：  １７種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体（配列番号１〜１６および配列番号３５３）のＤＮＡを、ライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２から増幅した。Ｎ末端Ｈｉｓ6タグを有する単量体Ｚ変異体分子の構築のためのサブクローニング戦略を、（本質的に別の標的に結合するＺ変異体に関してＷＯ２００９／０７７１７５において詳細に報告されているように）標準的な分子生物学的技法を使用して、適用した。Ｚ遺伝子断片を、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤを生じる発現ベクターｐＡＹ０１４４８中にサブクローニングした。
【０２１７】
更に、ＦｃＲｎ結合変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）であるが、アミノ酸ＶＤの代わりにＡＥで始まり、Ｚ１１９４８（配列番号３５４）と表示したものを、Ｚ変異体間の２つの異なるリンカーおよびそれに続くＣ末端Ｈｉｓ6タグを有するホモ二量体構築物としてクローニングした。これを、ＤＮＡ増幅、適した制限酵素での制限およびＤＮＡのライゲーションを含めた従来の分子生物学的方法を使用して行った。２つのリンカーを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。Ｚ遺伝子断片を、それぞれ、コードされた配列［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＧＴ−（Ｇ4Ｓ）−ＰＲ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＬＥＨＨＨＨＨＨおよび［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＧＴ−（Ｇ4Ｓ）3−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＬＥＨＨＨＨＨＨを生じる発現ベクター（ｐＥＴ−２６  ｏｒｉｇｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ）中にサブクローニングした。
【０２１８】
培養および精製：  大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、各それぞれのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の遺伝子断片を含有するプラスミドで形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地８００または１０００ｍｌにおいて３７℃で培養した。ＯＤ600＝２で、ＩＰＴＧを加えて、０．１７または０．２ｍＭの最終濃度で発現を誘発し、培養物を更に５時間３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離によって採取した。
【０２１９】
各細胞ペレット約２〜５ｇを、１５Ｕ／ｍｌの濃度までＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１．０１６５４．０００１）を、および０．５ｍｇ／ｍｌの濃度までＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ−７６５１）を補充した１０〜２５ｍｌ結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）に再懸濁した。３つの凍結解凍サイクルまたは超音波処理による細胞破壊後、細胞片を遠心分離によって除去し、各上清を１ｍｌ  Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ  ＩＭＡＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１１−００３３−９９）上に適用した。混入物を、洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０または６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄することによって除去し、その後ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を、溶出緩衝液１（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）または溶出緩衝液２（０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．５）で溶出した。精製Ｚ変異体を、製造業者のプロトコールに従って、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＢＳに緩衝液交換した。タンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計を使用して、およびそれぞれのタンパク質の消衰係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の純度を、クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。各精製ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の同一性を、ＬＣ／ＭＳ分析を使用して確認した。
【０２２０】
ＣＤ分析：  精製されたＨｉｓ6−タグ付けＺ変異体を、ＰＢＳにおいて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。各希釈されたＺ変異体に関して、２５０〜１９５ｎｍまたは２５０〜１９０ｎｍでのＣＤスペクトルを、２０℃で得た。更に、可変温度測定（ＶＴＭ）を行って、融解温度（Ｔｍ）を決定した。ＶＴＭにおいて、吸光度を、温度を５℃／分の温度勾配で２０℃から９０℃まで上げながら、２２１ｎｍで測定した。新しいＣＤスペクトルを、Ｚ変異体の再折り畳み能力を研究するために、加熱手順後に２０℃で得た。ＣＤ測定を、１ｍｍの光路長を有する細胞を使用して、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ  Ｓｃａ  ｎｄｉｎａｖｉａ  ＡＢ）上で行った。
【０２２１】
Ｂｉａｃｏｒｅ結合および動態解析：  ヒトＦｃＲｎとのＦｃＲｎ結合Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体の相互作用を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において分析した。ヒトＦｃＲｎを、ＣＭ５チップ表面のカルボキシル化デキストラン層上のフローセル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において固定化した。固定化を、製造業者のプロトコールに従ってアミンカップリング化学作用を使用して、およびランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。チップ上の１つのフローセル表面を、分析物注入時にブランクとしての使用のために活性化し、非活性化した。以下に提示する２つの結合実験において、０．００５％ツイーン２０（０．００５％ＰＣＴ）を補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液ｐＨ６．０を、ランニング緩衝液として使用した。全ての実験において、５０μｌ／分の流量を使用した。
【０２２２】
一実験において、ｐＨ６．０での解離を、ｐＨ７．４での解離と比較した。Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体およびヒトモノクローナルＩｇＧ１を、それぞれ、２５０ｎＭまたは２．５ｎＭの最終濃度まで、ランニング緩衝液において希釈し、同時注入手順を使用して、１分間ＦｃＲｎチップ上に注入した。相互作用の解離フェーズを代表する、同時注入手順の第二の注入は、ランニング緩衝液（ｐＨ６．０）または０．００５％ＰＣＴ  ｐＨ７．４を含有した。Ｚ変異体を、ランニング緩衝液における５分間の表面平衡化の前に、Ｚ０７９１８およびＺ１０１９３を除いて１分間解離させておき、Ｚ０７９１８およびＺ１０１９３は４分間解離させておいた。ＩｇＧを、平衡化の前に４分間解離させておいた。緩衝液注入を、同様の方法で行った；緩衝液ｐＨ６．０の同時注入その後ｐＨ６．０、または緩衝液ｐＨ６．０の同時注入その後ｐＨ７．４。結果を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において分析した。ブランク表面の曲線を、リガンド表面の曲線から減算した。更に、緩衝液注入の曲線を、Ｚ変異体曲線からおよびＩｇＧ曲線から減算して、緩衝液効果に関して調整した。
【０２２３】
別の実験において、近似の速度定数（ｋonおよびｋoff）および親和性（ＫD）を、Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体のサブセットに関して決定した。Ｚ変異体の３つの濃度を１分間注入し、その後ランニング緩衝液において１分間解離させた。表面を、次のサイクルの開始前に７．５分間、ランニング緩衝液で平衡化した。注入した濃度は、６７５ｎＭ、２２５ｎＭおよび７５ｎＭ（Ｚ１０１４０、Ｚ１０１５６およびＺ１０１８３）または２２５ｎＭ、７５ｎＭおよび２５ｎＭ（Ｚ０７９１８およびＺ１０１９３）のいずれかであった。速度定数を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のラングミュア１：１モデルを使用して、センサーグラムから計算した。
【０２２４】
別個の実験において、それぞれ、ｈＦｃＲｎ（配列番号３７９）およびｍＦｃＲｎ（配列番号３８４）へのＺ変異体の相互作用の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で測定した。ｈＦｃＲｎおよびｍＦｃＲｎを、ｍＦｃＲｎの作製のためにヒトＳＫＯＶ−３細胞の代わりにマウス３Ｔ３細胞を使用して、本質的に実施例１において記載したように作製し、ｐＨ４．６５での酢酸緩衝液においてＣＭ５チップ上の別個のフローセル上で固定化した。固定化レベルは、両方の受容体に関して、約１０００ＲＵであった。参照フローセルを、活性化および非活性化によって作り出した。０．００５％ＰＣＴ  ｐＨ６．０または７．４をランニング緩衝液としておよび分析物の希釈のために使用した。全ての分析を、２５℃で行った。Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）、Ｚ０７９６０（配列番号４）およびＺ１０１９３（配列番号２）に関する親和性定数を、１０２４ｎＭから０．５ｎＭ（ｐＨ６．０）または１０２４０ｎＭから５ｎＭ（ｐＨ７．４）の希釈系列を注入することによって決定した。親和性を、１部位結合飽和モデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して、誘導した。
【０２２５】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイ：  Ｚ変異体がＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を阻害する潜在力を、ＥｎＳｐｉｒｅマルチプレートリーダー２３００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でのＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて分析した。ヒトＩｇＧ（Ｒｏａｃｔｅｍｒａ）を、製造業者の推奨に従って、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６７７２００２）上で固定化した。２５０ｎＭから３８ｐＭの最終濃度への、Ｈｉｓ−タグ付けＺ変異体の段階的な連続希釈１：３を、３８４ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号Ｇ６００５３５０）において行い、ＨＣｌを使用してｐＨ６．０に調整したＡｌｐｈａＬＩＳＡ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＬ０００Ｆ）において、１０ｎＭビオチン化ヒトＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号ｏｒｂ８４３８８；本質的に実施例２において記載したようにビオチン化した）と共に４５分間インキュベートした。ＩｇＧをコーティングしたアクセプタービーズを、１０μＭの最終濃度まで加え、４５分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンをコーティングしたドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６７７２００２）を、４０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、３０分間インキュベートした。全てのインキュベーションを、暗所においてＲＴで行った。プレートを、ＥｎＳｐｉｒｅ機器において分析し、ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して計算した。
【０２２６】
結果
培養および精製：  Ｎ末端Ｈｉｓ6タグとともに構築された、１７種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体（配列番号１〜１６および配列番号３５３）を、大腸菌において作製した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって分光光度的に決定した、約２〜５ｇ細菌ペレットからのＩＭＡＣ−精製タンパク質の量は、種々のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体に関して約１０ｍｇから２０ｍｇの範囲にわたった。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらがＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を主に含有したことを示した。各ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の正確な同一性および分子量を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。
【０２２７】
ＣＤ分析：  ６種のＺ変異体に関して決定したＣＤスペクトルは、それぞれが２０℃でαヘリックス構造を有したことを示した。この結果を、可変温度測定においても検証し、ここで融解温度（Ｔｍ）が決定された（表３）。９０℃への加熱前および後に測定したスペクトルをオーバーレイした場合、可逆的な折り畳みが６種のＺ変異体に関して見られた。
【０２２８】
【表３】
2017533885.tif 000007
【０２２９】
Ｂｉａｃｏｒｅ結合および動態解析：  ヒトＦｃＲｎへの１７種のＨｉｓ6−タグ付けＺ変異体の結合および種々のｐＨでの解離を、ＦｃＲｎを含有するチップ表面上に、ｐＨ６．０でのＺ変異体のそれぞれおよび緩衝液ｐＨ６．０またはｐＨ７．４を順次注入することによって、Ｂｉａｃｏｒｅ機器において試験した。表面のリガンド固定化レベルは、１６６８ＲＵヒトＦｃＲｎであった。１７種のＺ変異体は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎへの結合を示し、全ての変異体に関して、より速いオフ速度が、ｐＨ６．０と比較してｐＨ７．４で見られた。ＩｇＧに関する結果は同様であり、ｐＨ７．４でのより速いオフ速度を示した。変異体Ｚ０７９１８およびＺ１０１９３は、最も遅い解離曲線を示した。変異体およびＩｇＧのサブセットに関するセンサーグラムを、図２Ａ〜Ｅに示す。
【０２３０】
【表４】
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【０２３１】
ｐＨ６．０でＦｃＲｎと相互作用する５種のＺ変異体の速度定数を決定した（表４参照）。表面の固定化レベルは、２０１５ＲＵヒトＦｃＲｎであった。各Ｚ変異体に関して、速度定数を、３つの注入した濃度の曲線セットを使用して計算した。
【０２３２】
親和性（ＫD）定数も、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４でヒトおよびマウスＦｃＲｎと相互作用するＨｉｓ6−タグ付けＺ変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）、Ｚ０７９６０（配列番号４）およびＺ１０１９３（配列番号２）に関して決定した（表５）。３つ全ての変異体に関して、ＫD値は、ｐＨ７．４と比較してｐＨ６．０で低かった。
【０２３３】
【表５】
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【０２３４】
【表６】
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【０２３５】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイ：  １７種のＨｉｓ6−タグ付け単量体Ｚ変異体（配列番号１〜１６および配列番号３５３）ならびに２種の二量体の変異体、Ｚ１１９４８−Ｇ4Ｓ−Ｚ１１９４８およびＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１１９４８が、ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を阻害する能力を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイにおいて試験した。Ｚ変異体の連続希釈物を、ビオチン化ヒトＦｃＲｎと共にインキュベートし、各それぞれの変異体の遮断能力を、ＩｇＧをコーティングしたアクセプタービーズの添加およびその後のストレプトアビジンをコーティングしたドナービーズの添加後に測定した。阻害は、陽性Ｚ変異体に関するＡｌｐｈａＬＩＳＡカウントの減少として測定される。このアッセイにおいてＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を遮断することが示された、１０種の単量体変異体および２種の二量体変異体に関して計算されたＩＣ５０値を、表６に示す。
【０２３６】
実施例４
ヒトまたはマウスＦｃＲｎ／ｅＧＦＰトランスフェクトＨｅＬａ細胞へのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の結合
この実施例において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の結合能を調査した。ヒトおよびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ導入遺伝子を発現するＨｅＬａ細胞の作製およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化Ｚ変異体でのフローサイトメトリー分析に関するこれらの細胞の使用を、記載する。
【０２３７】
材料および方法
ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびＢ２Ｍウイルスベクターのクローニング：  マウスＦｃＲｎ（ｍＦｃＲｎ、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＣ００３７８６．１、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびマウスＢ２Ｍ（ｍＢ２Ｍ、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＣ０８５１６４．１、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をコードする遺伝子を、実施例１において記載したヒトＦｃＲｎおよびヒトＢ２Ｍに関する遺伝子と同様の方法で増幅した。ヒトおよびマウスＦｃＲｎならびにＢ２Ｍ遺伝子を、以下のように増幅した：ｈＦｃＲｎに関して、アミノ酸１〜３６５（配列番号３８２）をコードする配列を増幅し；ｈＢ２Ｍに関して、アミノ酸２１〜１１９（配列番号３８０）をコードする配列を増幅し；ｍＦｃＲｎに関して、アミノ酸１〜３６９（配列番号３８３）をコードする配列を増幅し；ｍＢ２Ｍに関して、アミノ酸２１〜１１９（配列番号３８１）をコードする配列を増幅した。ベクターｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（２００３）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ７３：８７６〜８５）およびＦｃＲｎ  ＰＣＲ単位複製配列（ヒトおよびマウス）を、制限酵素ＢａｍＨＩ（ヒト）またはＢｃｌＩ（マウス）およびＭｌｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、それぞれ、カタログ番号Ｒ０１３６Ｍ、Ｒ０１６０Ｌお  よびＲ０１９８Ｌ）を使用して切り、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｍ）を使用してライゲートした。ライゲーション混合物を、大腸菌ＲＲＩΔＭ１５中に化学的に形質転換し、アンピシリンプレート上で広げた。コロニーを採取し、適したプライマー対でスクリーニングした。細胞質側末端で本来のシグナルペプチド、ヒトまたはマウスＦｃＲｎおよびｅＧＦＰをコードする構築物を、配列決定によって検証し、それぞれ、ｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｍＦｃＲｎ−ｅＧＦＰと表示した。
【０２３８】
ヒトおよびマウスＢ２Ｍ  ＰＣＲ単位複製配列を、製造業者の推奨に従って、Ｇａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１７８９０２０、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ酵素ミックス）を使用して、組換えによってプラスミドｐＤＯＮＯＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２５３６−０１７）中に挿入した。正確な配列の検証後、ヒトまたはマウスＢ２Ｍを、プラスミドｐＥＮＴＲ−ＣＭＶ（Ｔａｉら、前掲）を含有するプロモーターとともにマルチサイトＧａｔｅｗａｙクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７９１０２０、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ酵素ミックス）を使用して、ｐ２ｋ７＿ｇｔｃ（Ｓｕｔｅｒら、前掲）中に挿入し、それぞれ、ベクター２ｋ７neo−ＣＭＶ−ｈＢ２Ｍおよび２ｋ７neo−ＣＭＶ−ｍＢ２Ｍを生じた。
【０２３９】
ＨｅＬａ細胞のレンチウイルス形質導入：  ベクター対２ｋ７neo−ＣＭＶ−ｈＢ２ＭおよびｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰまたは２ｋ７neo−ＣＭＶ−ｍＢ２ＭおよびｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｍＦｃＲｎ−ｅＧＦＰを、塩化カルシウムトランスフェクション（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、前掲；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（２００６）、前掲）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に、ＶＳＶ−Ｇエンベロープおよびｇａｇ／ｐｏｌパッケージングプラスミドとともに同時トランスフェクトした。それぞれＦｃＲｎおよびＢ２Ｍ導入遺伝子とともに形成されたレンチウイルス粒子を含有するＨＥＫ２９３Ｔ培養物上清を使用し、低い継代数で順次ＨｅＬａ子宮頚癌腺腫細胞（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）に形質導入した。生じた２つの安定に形質導入されたＨｅＬａ細胞株を、以下でｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ（ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびｈＢ２Ｍに関する遺伝子で形質導入された）およびｍＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ（マウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびｍＢ２Ｍに関する遺伝子で形質導入された）と表示する。
【０２４０】
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化：  ３種のＨｉｓ6−タグ付けＺ変異体Ｚ０７９１８、Ｚ０７９３０およびＺ０７９６０を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２０１０６）で標識化した。標識化前に、緩衝液を、１０，０００ｇで回転させたＶｉｖａｓｐｉｎ５００遠心ろ過機ユニット（１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号５１２−２８３８）を使用して、０．２Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ８．３に交換した。標識化を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００において行い、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステル色素１μｌ（１．３×モル過剰に相当するＤＭＳＯ中４０μｇ／μｌ）を２００μｇ／２５μｌ  Ｚ変異体に加えた。混合物を、小刻みに揺れる回転ミキサーにおいて暗所においてＲＴで４０分間インキュベートした。その後、反応混合物を３．５時間氷上に置き、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００において１５×１００μｌ  ＰＢＳで洗浄することによって、遊離の色素を除去した。
【０２４１】
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を有するヒトおよびマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰトランスフェクトＨｅＬａ細胞の免疫蛍光染色：  ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびｍＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ  ＨｅＬａ細胞を、トリプシン処置によって採取し、計数する前にｐＨ６．０でＰＢＳにおいて２回洗浄した。ｖ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号２７７１４３）のウェル当たり１００，０００細胞をピペットで取り、その後プレート中の細胞を、１，７００ｒｐｍで４℃で４分間ペレット化した。上清を除去し、細胞をＲＴで１０分間、ｐＨ６．０でのＰＢＳにおける２％ホルムアルデヒド５０μｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ８７７５）で固定した。その後細胞を２×１００μｌ  ＰＢＳ  ｐＨ６．０で洗浄し、カゼイン（ＰＢＳＣ）で飽和させ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体；Ｚ０７９６０、Ｚ０７９３０およびＺ０７９１８の６２０ｎＭを含む、０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ４５１８．０１００）を含有するＰＢＳＣに再懸濁した。緩衝液単独でインキュベートした形質導入ＨｅＬａ細胞を、対照として使用した。細胞を暗所において振盪機上で８℃で１時間インキュベートし、２×１００μｌ  ＰＢＳＣで洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ６．０、１８０μｌ（フラクションＶ、Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号１．１２０１８．０１００）に再懸濁した。１０，０００細胞／ウェルを、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）において分析し、データを、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。
【０２４２】
結果
フローサイトメトリー分析を利用して、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体がヒトまたはマウスＦｃＲｎ／ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞上のヒトおよび／またはマウスＦｃＲｎに結合するかどうかを決定した。実験を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化Ｚ０７９６０、Ｚ０７９３０およびＺ０７９１８（それぞれ、配列番号４、６および１）を用いてｐＨ６．０で行った。ドットプロット分析（ｙ軸：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ｘ軸：ｅＧＦＰ）は、形質導入細胞集団が、ＨｅＬａ細胞によるＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ融合タンパク質の不均一な発現を示す（図３）、ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ陰性および陽性集団（図３、それぞれ、ゲートＨおよびＩ）に分けられることを示した。従って、ゲートＩにおけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、ゲートＨにおけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７のバックグラウンドＭＦＩ値によって減算した。計算されたＭＦＩ値を、図４において提示する。結果は、Ｚ０７９６０、Ｚ０７９３０およびＺ０７９１８がヒト（図４Ａ）またはマウス（図４Ｂ）ＦｃＲｎ−ｅＧＦＰを提示するＨｅＬａ細胞に結合する能力があることを示している。
【０２４３】
実施例５
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ０７９１８によるＦｃＲｎへのＩｇＧ結合の遮断
この実施例において、ＦｃＲｎへの結合に関するＩｇＧとのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の潜在的な競合を、細胞に基づくアッセイにおいて調査した。かかる結合は、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用の遮断を生じることになる。
【０２４４】
材料および方法
ＩｇＧ−ＦｃＲｎ免疫蛍光染色のブロッキング：  ヒトまたはマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、実施例４において記載したように調製した。固定された細胞を、１００ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７をコンジュゲートしたヒトまたはマウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、それぞれ、カタログ番号００９−６００−００３および０１５−６００−００３）および０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を含有するＰＢＳ−カゼイン、ｐＨ６．０中に希釈した１０００、１００、１０、１または０（緩衝液対照）ｎＭのＨｉｓ6−タグ付けＺ０７９１８の混合物５０μｌに再懸濁した。細胞を、暗所において振盪機上で３７℃で１時間インキュベートし、２×１００μｌ  ＰＢＳ−カゼインｐＨ６．０で洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ６．０、１８０μｌに再懸濁した。１０，０００細胞／ウェル（マウス１００ｎＭ  ｍＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に関していくらか少ない細胞を除いて）からのデータを、Ｇａｌｌｉｏｓ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して得、データを、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。
【０２４５】
結果
実験を行って、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）がＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を遮断するかどうかを決定した。ヒトまたはマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、ヒトまたはマウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７をコンジュゲートしたＩｇＧと共にインキュベートした。結合を、種々の濃度での非標識Ｚ０７９１８で遮断した。形質導入ＨｅＬａ細胞（実施例４において記載した）によるＦｃＲｎの不均一な発現により、各サンプルのゲートＮにおけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７に関するＭＦＩ値を、ゲートＭにおける相当するＭＦＩ値によって減算した（図５）。ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７結合の百分率を、種々のＭＦＩ値をブランク対照に関するＭＦＩで除算することによって計算した。結果は、Ｚ０７９１８が用量依存的にｈＦｃＲｎへのｈＩｇＧ結合を効果的に遮断したことを示した（図６Ａ）。更に、Ｚ０７９１８は、ｍＦｃＲｎへのｍＩｇＧ結合も遮断した（図６Ｂ）が、ｈＩｇＧ結合と比較して、効率性は低かった。
【０２４６】
実施例６
３種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の薬物動態学的研究
この実施例において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体が非特異的Ｚ変異体の血清半減期を延長する能力を、マウスにおいて行った薬物動態学的研究によって調査した。
【０２４７】
材料および方法
Ｚ変異体のサブクローニング：  Ｚ変異体（Ｚ０７９１８、Ｚ０７９６０およびＺ１０１９３）のサブセットを、第二のサブクローニングにかけた。実施例３においてサブクローニングされたＨｉｓ6−タグを付けた変異体からのＤＮＡを、鋳型として使用した。最初に、適したプライマー対を使用したＰＣＲ増幅を行って、アミノ酸ＶＤの代わりにＡＥで始まるＺ変異体をコードする遺伝子を作った。変異導入したＺ変異体を、図１において列挙し、それぞれ、変異導入したＺ０７９１８、Ｚ０７９６０およびＺ１０１９３に相当する、Ｚ１１９４８（配列番号３５４）、Ｚ１１９４６（配列番号３５５）およびＺ１１９４７（配列番号３５６）と表示した。新しいＺ変異体をコードする遺伝子を制限切断し、スペーサー配列を有するアルブミン結合変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）およびＺ０３６３８（配列番号３７８）をコードする遺伝子を有するベクター中にライゲートし、［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＧＡＰ（Ｇ4Ｓ）4ＴＳ−［ＰＰ０１３］−ＧＴ（Ｇ4Ｓ）4ＰＲ−［Ｚ０３６３８］（「Ｚ＃＃＃＃＃−ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８」または「ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８と融合したＺ変異体」とも表示した）をコードする遺伝子融合物を生じた。陰性対照分子［Ｚ０３６３８］−ＧＡＰ（Ｇ4Ｓ）4ＴＳ−［ＰＰ０１３］を、Ｚ０３６３８を（Ｇ4Ｓ）4リンカーおよびＰＰ０１３に関する配列を含有するベクター中にライゲートすることによって同様の方法でサブクローニングした。大腸菌中へのベクター形質転換に関するそれに続く工程を、実施例３におけるように行った。
【０２４８】
培養および精製：  ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８と融合したＺ変異体を、実施例３において記載したように大腸菌において作製した。各細胞ペレット約３ｇを、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を補充した３０ｍｌ  ＴＳＴ−緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０、ｐＨ８．０）に再懸濁した。超音波処理による細胞破壊および遠心分離による清澄化後に、各上清を、抗ＡＢＤリガンド（ＷＯ２０１４／０６４２３７参照）を固定化した５ｍｌアガロースを有する重力流カラム上に適用した。ＴＳＴ−緩衝液および５ｍＭ  ＮＨ4Ａｃ緩衝液、ｐＨ５．５での洗浄後、Ｚ変異体を、０．１Ｍ  ＨＡｃで溶出した。アセトニトリル（ＡＣＮ）を、１０％の最終濃度まで抗ＡＢＤアガロースアフィニティークロマトグラフィー精製工程からの溶出画分に加え、サンプルを、ＲＰＣ溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１０％ＡＣＮ、９０％水）で前もって平衡化した３ｍｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  １５ＲＰＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装加した。ＲＰＣ溶媒Ａでのカラム洗浄後、結合したタンパク質を、６０ｍｌ中に直線勾配０〜５０％ＲＰＣ溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ、８０％ＡＣＮ、２０％水）で溶出した。純粋なＺ変異体を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって同定し、プールした。ＲＰＣ精製後、プールの緩衝液を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＰＢＳに交換した。最後に、Ｚ変異体を、１ｍｌ  ＥｎｄｏＴｒａｐ  ｒｅｄカラム（Ｈｙｇｌｏｓ、カタログ番号３２１０６３）上で精製して、低いエンドトキシン含有量を保証した。
【０２４９】
各精製Ｚ変異体のタンパク質濃度、純度および同一性を、実施例３において記載したように分析した。
【０２５０】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析：  ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８に融合した、発現され、精製されたＺ変異体を、本質的に実施例３において動態解析に関して記載したように、ｐＨ６．０でヒトＦｃＲｎに対してアッセイした。Ｚ変異体および陰性対照Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３を、１分間の間に４０ｎＭ、１６０ｎＭおよび６４０ｎＭで注入し、その後２．５分間解離させ、１分間平衡化した。速度定数および親和性を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、Ｚ変異体に関して決定した。
【０２５１】
薬物動態学的研究：  ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８に融合したＺ１１９４７、Ｚ１１９４６およびＺ１１９４８を、９２ｎｍｏｌ／体重ｋｇの用量で雄性ＮＭＲＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、独国）に静脈内（ｉ．ｖ．）に投与した。３匹のマウスの群からの血清を、０．０８、６、１８、７８、１２０、１６８および２４０時間で得た。それぞれのＺ変異体の濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２５２】
ＥＬＩＳＡ：  ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）において４μｇ／ｍｌに希釈したＺ特異的ヤギ抗体（内部で作製した）５０μｌ／ウェルで４℃で終夜コーティングした。抗体溶液を捨て、ウェルをＰＢＳＣ  １００μｌでＲＴで１．５時間ブロッキングした。血清を、希釈プレートにおいて２倍希釈系列で１：１００から１：５１，２００まで、１％マウス血清（マトリックス）を含有するＰＢＳＣにおいて希釈した。マトリックスにおいて希釈したそれぞれのＺ変異体および４つの質対照（非常に低い、低い、中間および高い対照）に関する標準的な滴定を、各プレート上に含んだ。希釈物５０μｌをウェル毎に移し、ＥＬＩＳＡプレートをＲＴで１．５時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。結合したＺ変異体を、ＰＢＳＣにおいて４μｇ／ｍｌに希釈したウサギ抗ＰＰ０１３  Ｉｇ（内部で作製した）５０μｌ／ウェルで検出した。その後、プレートをＲＴで１．５時間インキュベートし、その後上記のように洗浄した。ＰＢＳＣにおいて１：２０，０００に希釈した、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得たＨＲＰをコンジュゲートしたロバ抗ウサギＨＲＰ（カタログ番号７１１−０３５−１５２）を加え、プレートを１時間インキュベートした。上記のように洗浄した後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質５０μｌをウェルに加え、プレートを、製造業者の推奨に従って、展開した。１５分間の展開の後、吸光度を、マルチウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3）を使用して、４５０ｎｍで測定した。吸光度値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して分析して、濃度（三次スプラインカーブフィット）および曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。次いで、濃度を、時間に対するそれらの自然対数としてプロットした。生じた曲線は、２コンパートメントモデルに従い、終末相半減期を、最後３つの時点に基づく勾配によって分けたｌｎ２として計算した。
【０２５３】
結果
培養および精製：  Ｚ＃＃＃＃＃−ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８として構築された、３種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ１１９４７、Ｚ１１９４６およびＺ１１９４８（配列番号３５６、３５５および３５４）、および陰性対照Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３を、大腸菌において作製した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって分光光度的に決定した、約３ｇの細菌のペレットからの精製タンパク質の量は、種々のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体に関して約１０から２５ｍｇの範囲にわたった。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、それらが、それぞれのＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を主に含有したことを示した。各ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の正確な分子量を、ＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。
【０２５４】
【表７】
2017533885.tif 000011
【０２５５】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析：  ＦｃＲｎへの結合を、３種のＰＰ０１３−Ｚ０３６３８融合Ｚ変異体に関して分析した。表面の固定化レベルは、ヒトＦｃＲｎの５４８ＲＵであった。生じた大まかな速度定数およびｐＨ６．０での標的結合に関する親和性を、表７に示す。近似曲線を、図７Ａ〜Ｃに示す。陰性対照Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３は、ＦｃＲｎに対して陰性であった。
【０２５６】
薬物動態学的研究：  ＰＰ０１３−Ｚ０３６３８に融合したＺ変異体の上記の構築物の薬物動態学的プロファイルを、マウス薬物動態学的研究における陰性対照Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３と比較した。例えばＰＣＴ出願ＷＯ２００９／０１６０４３において報告されているように、以前の研究において、ＡＢＤ融合タンパク質は、血清アルブミンへのＡＢＤ結合によって引き起こされる、血清における長い半減期を有することが示されている。以前の結果と一致して、ＡＢＤ−融合Ｚ変異体分子（Ｚ０３６３８−ＰＰ０１３）の終末相半減期は、約４３時間であったが、これはマウスアルブミンの半減期（３５時間）に匹敵する。ＡＢＤに加えてＦｃＲｎ結合Ｚ変異体分子を含有する構築物の終末相半減期は、２から３倍長かった（図８）。計算された終末相半減期は、９９時間（Ｚ１１９４７）、６９時間（Ｚ１１９４６）および５８時間（Ｚ１１９４８）であり、これは、Ｚ変異体のＦｃＲｎ結合が延長された半減期の一因となったことを示している。
【０２５７】
実施例７
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の成熟ライブラリーの設計および構築
この実施例において、成熟したライブラリーを構築した。ライブラリーを、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の選択のために使用した。成熟したライブラリーからの選択は、増加した親和性を有する結合体を生じることが通常予想される（Ｏｒｌｏｖａら、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６６（８）：４３３９〜４８）。この研究において、ランダム化された一本鎖リンカーを、合成における望ましい位置における定義されたコドンの組込みを可能にするスプリットプール合成を使用して、産出した。
【０２５８】
材料および方法
ライブラリー設計：  ライブラリーは、表１において、および実施例２〜６において更に記載したヒトＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の１６種の配列に基づいた。新しいライブラリーにおいて、Ｚ分子骨格における１３個の可変位置は、配列番号１〜１６において定義されたＺ変異体の結合モチーフに主に基づいた戦略に従って、いくつかのアミノ酸残基に向かって偏っていた。ＤＮＡリンカーを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、米国）から注文した、制限部位ＸｈｏＩおよびＳａｃＩが隣接したアミノ酸配列：５’−ＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＴＴＡ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＮＮＮ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  Ａ  −３’（配列番号３８８；ランダム化されたコドンを、ＮＮＮとして例示する）の１４７ｂｐの部分的にランダム化されたヘリックス１および２を含有するスプリットプール合成を使用して産出した。Ｚ分子骨格における８つの可変のアミノ酸位置（９、１０、１１、１３、１４、２４、３２および３５）および５つの定常アミノ酸位置（１７、１８、２５、２７および２８）を含む新しいライブラリーにおけるアミノ酸残基の理論上の分布を、表８に示す。生じた理論上のライブラリーサイズは、５．３×１０8変異体である。
【０２５９】
【表８】
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【０２６０】
ライブラリー構築：  ライブラリーを、１２サイクルのＰＣＲ中にＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１１８１６）を使用して増幅し、プールされた産物を、供給業者の推奨に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号２８１０６）で精製した。ランダム化されたライブラリー断片の精製プールを、制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｃＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１４６Ｌ、およびカタログ番号Ｒ３１５６Ｍ）で消化し、ＰＣＲ精製キットを使用して、濃縮した。その後、産物を、調製用２．５％アガロース（Ｎｕｉｓｉｅｖｅ  ＧＴＣアガロース、Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲル電気泳動に供し、供給業者の推奨に従ってＱＩＡＧＥＮゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号２８７０６）を使用して精製した。
【０２６１】
ファージミドベクターｐＡＹ０２５９２を（本質的に上記のＧｒｏｎｗａｌｌらにおいて報告されたｐＡｆｆｉ１のように）、同じ酵素で制限し、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を使用して精製した。制限された断片および制限されたベクターを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、カタログ番号ＥＬ００１１）により、ＲＴで２時間、５：１のモル比でライゲートし、その後４℃で終夜インキュベートした。ライゲートしたＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって回収し、その後１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５に溶解した。従って、それぞれがアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）に融合している、ベクターｐＡＹ０２５９２がコードしたＺ変異体において生じたライブラリーは、連鎖球菌のプロテインＧに由来した。
【０２６２】
ライゲーション反応物（約１６０ｎｇ  ＤＮＡ／形質転換）を、エレクトロコンピテント大腸菌ＥＲ２７３８細胞（５０μｌ、Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、米国）中に電気穿孔した。電気穿孔後すぐに、回復培地約１ｍｌ（ＥＲ２７３８細胞を補充した）を加えた。形質転換細胞を、３７℃で６０分間インキュベートした。サンプルを、滴定のためおよび形質転換体の数の決定のために採取した。その後、細胞をプールし、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した、ＴＳＢ−ＹＥ培地１ｌにおいて、３７℃で終夜培養した。細胞を、４，０００ｇで７分間ペレット化し、ＰＢＳ／グリセリン溶液（約４０％グリセリン）に再懸濁した。細胞をアリコートし、−８０℃で保管した。Ｚ変異体のライブラリーからのクローンを、内容を検証するためおよびライブラリー設計に対して構築されたライブラリーの成果を評価するために配列決定した。配列決定を、実施例１において記載したように行い、アミノ酸分布を検証した。
【０２６３】
ファージストックの調製：  ファージミドライブラリーを含有するファージストックを、２０ｌ発酵槽（Ｂｅｌａｃｈ  Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ）において調製した。ファージミドライブラリーを含有するグリセリンストックからの細胞を、１ｇ／ｌグルコース、１００ｍｇ／ｌアンピシリンおよび１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを補充したＴＳＢ−ＹＥ  １０ｌ（トリプシン処理ダイズブロス−酵母抽出物；３０ｇ／ｌ  ＴＳＢ、５ｇ／ｌ酵母抽出物）に接種した。細胞が６００ｎｍでの０．６の光学濃度（ＯＤ６００）に達したとき、培養物約１．５ｌを、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージの５×モル過剰を使用して感染させた。細胞を、３０分間インキュベートし、それからすぐ発酵槽を、複合発酵培地［２．５ｇ／ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4；５．０ｇ／ｌ酵母抽出物；３０ｇ／ｌトリプトン、２ｇ／ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4；３ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、１．２５ｇ／ｌ；Ｎａ3Ｃ6Ｈ5Ｏ7・２Ｈ2Ｏ；Ｂｒｅｏｘ  ＦＭＴ３０消泡剤０．１ｍｌ／ｌ］で１０ｌまで満たした。以下の構成要素を加えた：１０ｍｌカルベニシリン２５ｍｇ／ｍｌ；５ｍｌカナマイシン５０ｍｇ／ｍｌ；１ｍｌ  １Ｍイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）；３００ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ4  １７．５ｍｌ／ｌ、および微量元素溶液５ｍｌ［１．２Ｍ  ＨＣｌに溶解した、３５ｇ／ｌ  ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ；１０．５６ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；２．６４ｇ／ｌ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；１３．２ｇ／ｌ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；１３．８４ｇ／ｌ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ］。グルコース制限流加培養を開始し、６００ｇ／ｌグルコース溶液を反応器に供給した（開始時に３．５ｇ／時間、２０時間後および培養の終わりまで３７．５ｇ／時間）。ｐＨを、２５％ＮＨ4ＯＨの自動添加を通してｐＨ７で調節し、空気を補充し（５ｌ／分）、撹拌機を５００ｒｐｍに設定した。２４時間の流加培養後、ＯＤ６００は、３３．２であった。培養物における細胞を、１５，９００ｇでの遠心分離によってペレット化した。ファージ粒子を、実施例２におけるように、ＰＥＧ／ＮａＣｌにおいて２回上清から沈澱させ、ろ過し、ＰＢＳおよびグリセリンに溶解した。ファージストックを、選択における使用まで−８０℃で保管した。
【０２６４】
結果
ライブラリー構築：  新しいライブラリーを、検証された結合特性を有する１６種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体（実施例２〜６）のセットに基づいて設計した。設計されたライブラリーの理論上のサイズは、５．３×１０8Ｚ変異体であった。大腸菌ＥＲ２７３８細胞への形質転換後の滴定によって決定された、ライブラリーの実際のサイズは、４．５×１０9形質転換体であった。
【０２６５】
ライブラリー品質を、９６形質転換体の配列決定によっておよびそれらの実際の配列を理論上の設計と比較することによって試験した。設計されたライブラリーと比較した、実際のライブラリーの内容は、申し分のないものであることが示された。従って、ＦｃＲｎへの潜在的な結合体の成熟したライブラリーは、成功的に構築された。
【０２６６】
実施例８
成熟ライブラリーからのＺ変異体の選択およびスクリーニング
材料および方法
成熟したＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：  標的タンパク質ヒトＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号ｏｒｂ８４３８８）およびマウスＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号ｏｒｂ９９０７６）を、１０×モル過剰でビオチンを使用して、本質的に実施例２において記載したように、ビオチン化した。実施例７において記載したＺ変異体分子の新しいライブラリーを使用して、ファージディスプレイ選択を、本質的に実施例２においてのように、しかし以下の例外を伴って、ヒトＦｃＲｎまたはマウスＦｃＲｎに対する４つのサイクルで行った。選択緩衝液は、それぞれ、０．１％ＰＣＴＧ緩衝液、ｐＨ５．５（０．１％ツイーン２０および０．１％ゼラチンを補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ５．５）または０．１％ＰＣＴＧ緩衝液、ｐＨ７．４、（０．１％ツイーン２０および０．１％ゼラチンを補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）であった。選択に先立って、ＨＳＡを、１．５μＭの最終濃度まで選択緩衝液に加えた。選択において使用する全てのチューブおよびビーズを、２つの異なる選択緩衝液のどちらかで前もってブロッキングした。ＳＡ−ビーズとの４５分間のファージストックのインキュベーションによる事前選択工程を、サイクル１において行った。ファージ−標的複合体の捕捉のために、１．１μｇビオチン化ヒトＦｃＲｎまたは１．６μｇビオチン化マウスＦｃＲｎ当たり１ｍｇビーズを使用した。洗浄を、表９において概要を述べたように、それぞれ、２５ｎＭ  ＩｇＧ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））または１０ｎＭ  ＩｇＧを補充した０．１％ＰＣＴを使用したトラック２−１−２−１および２−１−２−２を除いて、０．１％ＰＣＴ緩衝液ｐＨ５．５またはｐＨ７．４で行った。
【０２６７】
サイクル１における５個のトラック（１〜５）を、第二から第四のサイクルで分け、全体でサイクル２における７個のトラック（１−１から５−１）、サイクル３における１１個のトラック（１−１−１から５−１−１）およびサイクル４における１４個のトラック（１−１−１−１から５−１−１−１）を生じた。結合したファージ粒子を、実施例２において記載したように溶出した。
【０２６８】
低下した標的濃度および増加した数の洗浄を使用した、それに続くサイクルにおける増加したストリンジェンシーを記載した、選択戦略の概要を、表９に示す。
【０２６９】
ファージ粒子の増幅：  選択サイクル１と２の間のファージ粒子の増幅を、以下の例外を伴って、本質的に実施例２において記載したように行った。大腸菌ＥＲ２７３８をファージ増幅に使用し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを、５×過剰で使用した。選択サイクル２と４の間のファージ粒子の増幅を、以下のように、溶液において細菌の感染を行うことによって行った。ファージ粒子での対数期大腸菌ＥＲ２７３８の感染後、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＴＳＢを加え、その後回転させながら３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細菌を、５×過剰でＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させた。感染した細菌を、遠心分離によってペレット化し、１００μＭ  ＩＰＴＧ、２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地に再懸濁し、３０℃で終夜増殖させた。終夜培養物を、遠心機においてペレット化し、上清におけるファージ粒子を、ＰＥＧ／ＮａＣｌ緩衝液で２回沈澱させた。最後に、次の選択サイクルに入る前に、ファージ粒子を選択緩衝液に再懸濁した。
【０２７０】
最終選択サイクルにおいて、ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて使用する単一のコロニーを形成するために、０．２ｇ／ｌアンピシリンを補充したＴＢＡＢプレート（３０ｇ／ｌトリプトース血液寒天ベース、Ｏｘｏｉｄ、カタログ番号ＣＭＯ２３３Ｂ）上に広げる前に、対数期細菌を溶出液に感染させ、希釈した。
【０２７１】
【表９】
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【０２７２】
潜在的な結合体の配列決定：  種々の選択トラックからの個々のクローンを、配列決定のために採取した。ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて走らせた全てのクローンを配列決定した。遺伝子断片の増幅および遺伝子断片の配列分析を、本質的に実施例２において記載したように行った。
【０２７３】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：  Ｚ変異体（実施例２において記載したＺ変異体ＡＢＤ融合タンパク質として発現される）を含有する単一のコロニーを、ＦｃＲｎ成熟したライブラリーの選択されたクローンからランダムに採取し、本質的に実施例２において記載したように、１ｍｌ培養物において増殖させた。ペリプラズム上清の調製を、８つの凍結解凍サイクルで実施例２におけるように行い、ペリプラズム画分を、ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて無希釈で使用した。ＥＬＩＳＡスクリーニングを、各ウェルにおいて２ｎＭの濃度でビオチン化ヒトＦｃＲｎを使用して、本質的に実施例２において記載したようにｐＨ６．０とｐＨ７．４の両方で行った。プライマリーＦｃＲｎ結合体Ｚ１０１９３（配列番号２；上記の実験においてアッセイした）のペリプラズム画分を、陽性対照として使用した。ＡＢＤ部分のみを含有するペリプラズムを、陰性対照として使用した。
【０２７４】
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ  ＫD分析：  ＦｃＲｎ結合体の選択を、上記のようにｐＨ６．０とｐＨ７．４の両方でＥＬＩＳＡを使用して、ビオチン化ヒトＦｃＲｎの希釈系列に対する応答の分析に供した。ビオチン化ヒトＦｃＲｎを、３０ｎＭの濃度で加え、１４ｐＭまで段階的に１：３希釈した。バックグラウンド対照として、全てのＺ変異体も、標的タンパク質を加えずにアッセイした。プライマリーＦｃＲｎ結合体Ｚ０７９１８（配列番号１）を含有するペリプラズムサンプルを含み、陽性対照として分析した。ＡＢＤ部分のみを含有するペリプラズムを、陰性対照として使用した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５および非線形回帰を使用して分析し、ＫD値（最大半量有効濃度）を計算した。
【０２７５】
結果
成熟したＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：  選択を、それぞれ４つのサイクルを含む全体で１４個の平行したトラックにおいて行った。種々の選択トラックは、標的濃度、標的型（ヒトＦｃＲｎまたはマウスＦｃＲｎ）、選択時間、および洗浄条件が異なった。
【０２７６】
潜在的な結合体の配列決定：  ランダムに採取したクローンを、配列決定した。各個々のＺ変異体に、実施例２において記載したように、同定番号、Ｚ＃＃＃＃＃を与えた。全体で、４４５種の新しい独自のＺ変異体分子を同定した。
【０２７７】
５８アミノ酸残基長のＺ変異体のアミノ酸配列を、図１において配列番号１７〜３５２として配列表に一覧表にした。これらのＺ変異体の推定されるＦｃＲｎ結合モチーフは、配列番号１７〜３５２の配列の残基８から残基３６まで伸びる。これらのＺ変異体のそれぞれ内で完全な３ヘリックス束を構築することが予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチド（ＢＭｏｄ）のアミノ酸配列は、残基７から残基５５まで伸びる。
【０２７８】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：  ４つの選択サイクル後に得たクローンを、９６ウェルプレートにおいて作製し、ＥＬＩＳＡを使用して、ＦｃＲｎ結合活性をスクリーニングした。全てのランダムに採取したクローンを分析した。ｐＨ６．０で、４４５種の独自のＺ変異体のうちの３３３種が、２ｎＭの濃度でヒトＦｃＲｎに対して０．３ＡＵ以上の応答（少なくとも３×陰性対照に相当する）を示すことが見出された。ｐＨ７．４で、４４５種の独自のＺ変異体のうちの２７８種が、２ｎＭの濃度でヒトＦｃＲｎに対して０．３ＡＵ以上の応答（少なくとも３×陰性対照に相当する）を示すことが見出された。ヒトＦｃＲｎに対して陽性シグナルを有するクローンが、１−１−１−１を除く全てのトラック（マウス標的でのものを含めた）において見出された。陰性対照は、それぞれ、０．０７０〜０．０９６ＡＵ（ｐＨ６．０）および０．０６０〜０．１１２ＡＵ（ｐＨ７．４）の吸光度を有した。ブランク対照の平均応答は、０．０７０ＡＵ（ｐＨ６．０）および０．０６２（ｐＨ７．４）であった。
【０２７９】
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ  ＫD分析：  Ｚ変異体のサブセットを、上記のＥＬＩＳＡ実験における結果（ｐＨ６．０および／またはｐＨ７．４での最も高いＥＬＩＳＡ値）に基づいて選択し、ＥＬＩＳＡフォーマットにおける標的滴定に供した。ペリプラズムサンプルを、ビオチン化ヒトＦｃＲｎの連続希釈でインキュベートした。プライマリー結合体Ｚ０７９１８（配列番号１）を有するペリプラズムサンプルも、陽性対照としてアッセイした。取得した値を分析し、それらのそれぞれのＫD値を計算した（表１０）。
【０２８０】
【表１０−１】
2017533885.tif 000014
【表１０−２】
2017533885.tif 000015
【０２８１】
実施例９
成熟ライブラリーからのＺ変異体の作製および特徴付け
この実施例において、１２種のＺ変異体を、大腸菌において作製し、精製し、安定性に関して、ＦｃＲｎへの結合に関しておよびＦｃＲｎへのＩｇＧ結合の阻害に関してアッセイした。
【０２８２】
材料および方法
発現ベクター中へのＺ変異体のサブクローニング：  １２種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体（Ｚ１３５７７（配列番号１９）、Ｚ１３５７８（配列番号２０）、Ｚ１３５８３（配列番号２３）、Ｚ１３５９２（配列番号２８）、Ｚ１３６１６（配列番号４１）、Ｚ１３６２１（配列番号４４）、Ｚ１３６５４（配列番号６５）、Ｚ１３６６３（配列番号７０）、Ｚ１３６６９（配列番号７３）、Ｚ１３６７４（配列番号７５）、Ｚ１３６７５（配列番号７６）およびＺ１３６７６（配列番号７７））のＤＮＡを、ライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２から増幅した。サブクローニングを、実施例３において記載したように行った。Ｚ遺伝子断片を、発現ベクターｐＡＹ０１４４８中にサブクローニングし、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤを生じた。
【０２８３】
Ｚ変異体の作製：  Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体の培養および精製を、本質的に実施例３において記載したように行った。より高い純度を得るために、１２の成熟された変異体およびプライマリーＺ変異体Ｚ０７９１８の第二のバッチのＩＭＡＣ精製後に、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）工程を、加えた。指示される場合は、このバッチからのサンプルを使用した。
【０２８４】
ＣＤ分析：  Ｚ変異体（ＲＰＣ精製バッチ）の融解温度（Ｔｍ）を決定し、二次構造を評価するために、ＣＤ分析を、実施例３において記載したように行った。
【０２８５】
Ｂｉａｃｏｒｅ結合および動態解析：  ヒトＦｃＲｎとのＦｃＲｎ結合Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体の相互作用を、本質的に実施例３において記載したようにＢｉａｃｏｒｅ２０００機器において分析した。Ｂｉｏｒｂｙｔから購入したヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）またはカニクイザルＦｃＲｎ（ｃＦｃＲｎ）（それぞれのカタログ番号ｏｒｂ８４３８８およびｏｒｂ９９０７５）を、標的タンパク質として使用した。第一の実験セットにおいて、Ｚ変異体１００ｎＭを、固定されたｈＦｃＲｎの上に３０μｌ／分で、ｐＨ６．０で２分間注入し、引き続き同時注入手順を使用し、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４の緩衝液中で解離した。解離相は、４分間であり、分析物注入間の平衡化時間は、３０分であった。第二の実験セットにおいて、近似の速度定数（ｋonおよびｋoff）および親和性（ＫD）を、固定されたｈＦｃＲｎ上に、濃度５４０ｎＭ、１８０ｎＭ、６０ｎＭ、２０ｎＭおよび６．７ｎＭで注入した、Ｚ変異体のサブセットに関して決定した。前述のように、分析物を、３０μｌ／分で２分間注入し、解離フェーズは４分であり、分析物注入間の平衡化時間は、３０分であった。
【０２８６】
第三の実験セットにおいて、ｈＦｃＲｎおよびｃＦｃＲｎへ結合する１２の成熟したＺ変異体およびプライマリーＺ変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）（ＲＰＣ精製バッチ）の動態解析を、ｐＨ６で行った。Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体の濃度系列（２７０、９０、３０および１０ｎＭ）を、ＣＭ５チップ表面の異なるフローセルに固定された、ｈＦｃＲｎおよびｃＦｃＲｎ上に３０μｌ／分で４分間注入した。０．００５％ＰＣＴ  ｐＨ６．０を、ランニング緩衝液としておよびＨｉｓ6−タグ付けＺ変異体の希釈のため使用した。ランニング緩衝液中の解離を、２０分間させ、その後３×３０秒パルスの０．００５％ＰＣＴ  ｐＨ７．４注入により表面再生し、１０分間平衡とし、その後次サイクルを開始した。
【０２８７】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイ：  Ｚ変異体がＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を阻害する潜在力を、実施例３において記載したＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおいて分析した。
【０２８８】
結果
Ｚ変異体の作製：  Ｎ末端Ｈｉｓ6タグとともに構築された１２種のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を、大腸菌において作製した。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらが、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を主に含有したことを示した。各ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の正確な同一性および分子量を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。
【０２８９】
ＣＤ分析：  融解温度の決定は、表１１に示した。可逆性の折り畳みが、９０℃で加熱の前後に測定したオーバーレイスペクトルで、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の全てについて認められた。
【０２９０】
Ｂｉａｃｏｒｅ結合および動態解析：  第一の実験セットにおいて、ヒトＦｃＲｎへの１２種のＺ変異体の結合および異なるｐＨでの解離を、ＦｃＲｎを含有するチップ表面上にｐＨ６．０でのＺ変異体のそれぞれおよび緩衝液ｐＨ６．０またはｐＨ７．４を順次注入することによって、Ｂｉａｃｏｒｅ機器において試験した。表面のリガンド固定化レベルは、８９０ＲＵヒトＦｃＲｎであった。１２種のＺ変異体は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎへの結合を示し、全ての変異体に関して、より速いオフ速度が、ｐＨ６．０と比較して、ｐＨ７．４で見られた。
【０２９１】
ｐＨ６．０でＦｃＲｎと相互作用するＺ変異体Ｚ１３５７７（配列番号１９）およびＺ１３６２１（配列番号４４）の速度定数を、第二の実験セットにおいて決定した（表１２参照）。速度定数を、それぞれ、Ｚ１３５７７およびＺ１３６２１の２つまたは４つの注入した濃度の曲線セットを使用して、計算した。
【０２９２】
【表１１】
2017533885.tif 000016
【０２９３】
【表１２】
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【０２９４】
第三の実験のセットにおいて、ｐＨ６．０でヒトまたはカニクイザルＦｃＲｎと相互作用する１３のＨｉｓ6−タグ付けＺ変異体の速度定数を、決定した（表１３）。チップ表面上のＦｃＲｎ固定レベルは、各々、１１９６ＲＵ（ヒト）および７８８ＲＵ（カニクイザル）であった。各Ｚ変異体に関して、速度定数は、４つの注入濃度の曲線のセットを使用して、計算した。
【０２９５】
【表１３】
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【０２９６】
【表１４】
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【０２９７】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断分析：  １２種の成熟したＨｉｓ6−タグを付けた単量体Ｚ変異体がＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を阻害する能力を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイにおいて試験した。Ｚ変異体の連続希釈物を、ビオチン化ヒトＦｃＲｎと共にインキュベートし、各それぞれの変異体の遮断能力を、ＩｇＧをコーティングしたアクセプタービーズおよびその後ストレプトアビジンをコーティングしたドナービーズの添加後に測定した。阻害は、陽性Ｚ変異体に関するＡｌｐｈａＬＩＳＡカウントの減少として測定される。１２種の全ての試験したＺ変異体は、ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を遮断することが示され、計算されたＩＣ５０値を、表１４に示した。
【０２９８】
実施例１０
ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合の遮断能力の比較
この実施例において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｈｉｓ6−Ｚ０７９１８（配列番号１）のＩｇＧ遮断能力を、いくつかの自己免疫障害の治療において現在使用されている静脈免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）および皮下免疫グロブリン（ＳＣＩｇ）と比較した。
【０２９９】
材料および方法
ＩｇＧ−ＦｃＲｎ免疫蛍光染色のブロッキング：  ヒトまたはマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、実施例４において記載したように調製した。固定された細胞を、それぞれ、５０ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７をコンジュゲートしたヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号００９−６００−００３）およびＨｉｓ6−タグ付けＺ０７９１８、ＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）またはＳＣＩｇ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）の混合物５０μｌに再懸濁し、２．５％ＦＢＳウルトラロー (ultra low)ＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ、ｐＨ６．０において１０００、１００、１０、１、０．１または０（緩衝液対照）ｎＭの濃度で希釈した。細胞を、暗所において３７℃で１時間インキュベートし、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧ  ｐＨ６．０を含有する、２×１００μｌ  ＭｃＩｌｖａｎｅｓ、ｐＨ６．０で洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ、ｐＨ６．０  １８０μｌに再懸濁した。１０，０００ＧＦＰ／ＦｃＲｎ陽性細胞からのデータを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して得、データを、Ｆｌｏｗｉｎｇソフトウェア２．５．０（Ｔｕｒｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して分析した。
【０３００】
結果
実験を行って、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｈｉｓ6−Ｚ０７９１８（配列番号１）が、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を遮断するかどうかを決定し、ＩＶＩｇおよびＳＣＩｇと遮断効果を比較した。ヒトまたはマウスＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、ヒトＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７をコンジュゲートしたＩｇＧと共にインキュベートした。結合を、種々の濃度での非標識Ｈｉｓ6−Ｚ０７９１８、ＩＶＩｇまたはＳＣＩｇで遮断した。結果は、Ｈｉｓ6−Ｚ０７９１８が、ＩＶＩｇまたはＳＣＩｇと同程度までｈＦｃＲｎへのｈＩｇＧ結合を効果的に遮断したことを示した（図９）。
【０３０１】
実施例１１
マウスにおけるＦｃＲｎ結合Ｚ変異体による増加したＩｇＧ異化
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ０７９１８がＦｃＲｎへのＩｇＧ結合をインビトロで遮断する能力が、実施例１０において示された。この実施例においては、同じＺ変異体の遮断能力を、インビボで評価した。インビボでのＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用の遮断は、増加したＩｇＧ異化および随伴するＩｇＧの減少したレベルにつながることになる（Ｍｅｚｏ、２００８、前掲）。
【０３０２】
材料および方法
動物試験：  ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ１１９４８（配列番号３５４）およびＺ０７９１８−ＰＰ０１３（Ｚ０７９１８（配列番号１）（ＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）と融合した、Ｚ１１９４８と同一であるが、アミノ酸ＡＥの代わりにＶＤで始まるＮ末端を有する）またはビヒクル（ＰＢＳ緩衝液）を、１６．３μｍｏｌ／ｋｇの用量で雄性ＮＭＲＩ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に投与した。マウスを、０、２４、４８、７２および９６時間で与えた５回の静脈内注射で処置した。血清サンプルを、０、７２、１２０および１６８時間（試験の終結）で採取し、−２０℃で保管した。血清におけるマウスＩｇＧの濃度を、ＥＬＩＳＡによって定量化した。
【０３０３】
マウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ：  マウス血清サンプル中のマウスＩｇＧの濃度を、マウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（Ｍａｂｔｅｃｈ  ３８２５−１ＡＤ−６）を、製造業者によって報告されているように行うことにより、分析した。ｍＩｇＧの濃度を、非線形回帰式を使用して、提供された標準曲線およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５から計算した。２４、７２、１２０および１６８時間での個々のマウスにおけるＩｇＧの濃度は、０時間でのレベルと関連があり、従って、結果を、ＩｇＧ（０時間）の百分率として提示した。
【０３０４】
結果
結果は、ＦｃＲｎ特異的Ｚ変異体で処置したマウスにおけるマウスＩｇＧ濃度の減少を示した。Ｚ１１９４８とＡＢＤ−融合変異体Ｚ０７９１８−ＰＰ０１３の両方が、マウスにおける内在性ＩｇＧの濃度をインビボで低下させた。最も顕著な効果は、ＡＢＤ−融合変異体で１２０時間後に得られた。従って、結果は、ＦｃＲｎ特異的Ｚ変異体が、ＩｇＧの再利用を遮断し、マウスにおける増加したＩｇＧ異化およびそれに続くＩｇＧの低いレベルを生じたことを示している。
【０３０５】
実施例１２
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のインビトロ経細胞輸送
この実施例において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を、上皮または内皮細胞を通して輸送されるまたはＦｃＲｎによって再利用されるそれらの能力に関してインビトロで試験した。経細胞輸送力を有するＺ変異体を含有する薬物は、例えば経口または肺投与後に、薬物取り込みを促進することになる。
【０３０６】
材料および方法
ＦｃＲｎの内在性または組換え発現を有するかまたは有さない細胞、例えばＴ８４、ＭＤＣＫ、ＨｅＬａ、ＣａＣｏ２、ＣａＬｕ−１および／またはＣａＬｕ−３細胞を、トランスウェルにおける膜上のそれぞれの増殖培地において増殖させて、単層を形成した。単層の完全性は、電気抵抗を測定することまたは細胞単層上で透過することができないもしくは活発に輸送されることができないプローブを加えることによって評価することができる。細胞の規定された単層を、適したｐＨおよび温度でのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ９２６９）または増殖培地のような緩衝液におけるＦｃＲｎ結合Ｚ変異体、ＨＳＡまたはＩｇＧのようなリガンドで、頂端または側底側からパルスし、反対側上で適したｐＨおよび温度でのＨＢＳＳまたは増殖培地のような緩衝液で追跡した。
【０３０７】
このアッセイの変異体において、リガンドを、投与と同じ側上で適したｐＨおよび温度で、ＨＢＳＳまたは増殖培地のような緩衝液で追跡して、再利用されたリガンドも測定することができる。これを、トランスウェルにおいてまたは細胞培養皿において行うことができる。細胞を、トランスウェルまたは細胞培養皿中に播種し、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体、ＨＳＡまたはＩｇＧのようなリガンドでパルスした。飲食されたリガンドは、ＦｃＲｎに結合し、それらが装加されたのと同じまたは反対側の細胞表面に戻ることになる。パルス後、遊離のリガンドを、冷たい緩衝液で細胞を洗浄することによって除去した。リガンドを追跡するために、温かい緩衝液または培地を細胞に加え、１０分から数時間の範囲にわたる期間後、緩衝液または培地を除去し、リガンドの存在に関してアッセイした。
【０３０８】
このアッセイの変異体において、ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体、ＨＳＡまたはＩｇＧのようなリガンドを使用して、他のＦｃＲｎ結合Ｚ変異体、ＨＳＡまたはＩｇＧのようなリガンドによるＦｃＲｎへの結合を、それらを細胞に同時または順次投与することによって、遮断することができた。
【０３０９】
リガンドの量は、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ−ＭＳ、蛍光色素または放射標識のような方法によって、定量化することができた。
【０３１０】
上記の実験の結果は、ＦｃＲｎ特異的Ｚ変異体が、インビトロで経細胞輸送され得、かつ／または再利用され得ることを示すことが予想された。
【０３１１】
実施例１３
ホモ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのヒトＦｃＲｎ／ｅＧＦＰトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞への結合
この実施例において、ホモ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの結合能を調べ、単量体のプライマリーおよび成熟したＺ変異体の結合能と比較した。ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ導入遺伝子を発現しているＨｅＬａ細胞の作製は、実施例４に記載のように行い、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化されたＺ変異体によるフローサイトメトリー分析のためのこれらの細胞の使用を説明する。
【０３１２】
材料および方法
ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化：  ２つのホモ二量体Ｈｉｓ6−タグを付けたポリペプチドＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１１９４８（配列番号３６９）およびＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）−Ｚ１１９４８（配列番号３６８）、プライマリー単量体Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体Ｚ０７９１８（配列番号１）および成熟した単量体Ｈｉｓ6−タグ付けＺ−変異体Ｚ１３５８３（配列番号２３）、Ｚ１３６２１（配列番号４４）、Ｚ１３６５４（配列番号６５）およびＺ１３６７４（配列番号７５）を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２０１０６）により標識化した。標識化前に、サンプル懸濁液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中）のｐＨを、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３  １０μｌをサンプル懸濁液９０μｌへ添加することにより、８．３に調整した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステル色素（４×モル過剰に相当するＤＭＳＯ中の１０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを、各サンプル懸濁液の１００μｌへ添加した。この混合物を、小刻みに揺れる回転ミキサーにおいて、暗所、ＲＴで１時間インキュベートした。反応混合物を、透析カセット（３５００ＭＷＣＯ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６６３３３）へ直ちに移し、遊離色素を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中での透析により、除去した。
【０３１３】
ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰトランスフェクトＨｅＬａ細胞のＦｃＲｎ結合ポリペプチドによる免疫蛍光染色：  ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ  ＨｅＬａ細胞を、トリプシン処理によって採取し、ＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０で２回洗浄し、その後計数した。１００，０００細胞を、ｖ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号２７７１４３）のウェル毎にピペットで取り、引き続きプレート中の細胞を、１，７００ｒｐｍで、４℃で４分間ペレット化した。上清を除去し、細胞を、ＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液中の２％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ８７７５）５０μｌで、ＲＴで１０分間固定した。その後細胞を、６４０ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化Ｈｉｓ6−タグを付けたポリペプチド；Ｚ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１１９４８およびＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）−Ｚ１１９４８およびＺ０７９１８を含有する、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０の１００μｌで２回洗浄し、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧおよび０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ４５１８．０１００）を含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０中に再懸濁した。形質導入ＨｅＬａ細胞を、緩衝液単独とインキュベートし、これを対照として使用した。これらの細胞を、振盪機上で、暗所において、８℃で１時間インキュベートした。次に細胞を、２つの異なる洗浄条件に供した：２．５  ％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有する２×１５０μｌ  ＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０、または２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有する２×１５０μｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４、および２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中での２０分間のインキュベーション工程。洗浄後、全てのサンプルを、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ、ｐＨ６．０の１８０μｌ中に再懸濁した。１０，０００ＧＦＰ／ＦｃＲｎ陽性細胞からのデータを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して得、データを、Ｆｌｏｗｉｎｇソフトウェア２．５．０（Ｔｕｒｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して分析した。
【０３１４】
結果
フローサイトメトリー分析を利用し、ＦｃＲｎ結合二量体が、ヒトＦｃＲｎ／ｅＧＦＰ形質導入されたＨｅＬａ細胞上のヒトＦｃＲｎに結合するかどうかを決定し、且つ単量体ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体へのそれらの結合能を比較した。この分析はまた、ＦｃＲｎタンパク質からのｐＨ依存性の脱離が、二量体フォーマットにより影響されるかどうかを決定するために行った。実験は、ｐＨ６．０で行い、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識した二量体Ｚ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１１９４８およびＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）−Ｚ１１９４８、ならびに単量体Ｚ０７９１８、Ｚ１３５８３、Ｚ１３６２１、Ｚ１３６５４およびＺ１３６７４で、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４で洗浄した。Ｚ１１９４８とＺ０７９１８は、最初の２個のアミノ酸残基（ＡＥ対ＶＤ）以外は、配列は同じである。計算したＭＦＩ値を、図１１に示す。結果は、二量体フォーマットは、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの結合能を、対応する単量体と比べ増大すること（図１１Ａ）、および成熟Ｚ変異体（Ｚ１３５８３、Ｚ１３６２１、Ｚ１３６５４およびＺ１３６７４）は、プライマリーＺ変異体Ｚ０７９１８よりも高い結合能を有すること（図１１Ｂ）を示している。データは、ＦｃＲｎからのｐＨ依存性の脱離は、二量体フォーマットの使用により減少することを示し、このことは、ＦｃＲｎ結合二量体は、対応する単量体変異体と比べ、改善されたｐＨ依存性結合プロファイルを有することを示唆している。
【０３１５】
実施例１４
ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合の遮断能の比較
この実施例において、ＦｃＲｎ結合二量体Ｚ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１１９４８およびＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）−Ｚ１１９４８のＩｇＧ遮断能を、単量体ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体、ならびにいくつかの自己免疫疾患の治療において現在使用されている静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）および皮下免疫グロブリン（ＳＣＩｇ）のそれと比較した。
【０３１６】
材料および方法
ＩｇＧ−ＦｃＲｎ免疫蛍光測定染色のブロッキング：  ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、実施例４に記載のように調製した。固定された細胞を、５０ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７−コンジュゲートされたヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号００９−６００−００３）およびＨｉｓ6−タグ付けＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１１９４８（配列番号３６９）、Ｚ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）−Ｚ１１９４８（配列番号３６８）、Ｚ０７９１８（配列番号１）、Ｚ１３５８３（配列番号２３）、Ｚ１３６２１（配列番号４４）；ＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）またはＳＣＩｇ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）の５０μｌ混合物中にそれぞれ再懸濁し、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を含有する、ＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０中に、濃度１０００、１００、１０、１、０．１または０（緩衝液対照）ｎＭで希釈した。細胞を、暗所において、３７℃で１時間インキュベートし、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有する２×１００μｌのＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０により洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０の１８０μｌ中に再懸濁した。１０，０００ＧＦＰ／ＦｃＲｎ陽性細胞からのデータを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して得、データを、Ｆｌｏｗｉｎｇソフトウェア２．５．０（Ｔｕｒｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して分析した。
【０３１７】
結果
実験は、ＦｃＲｎ結合二量体Ｚ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１１９４８およびＺ１１９４８−（Ｇ4Ｓ）−Ｚ１１９４８は、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を遮断するかどうかを決定し、且つ単量体ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体Ｚ０７９１８、Ｚ１３５８３およびＺ１３６２１、ならびにＩＶＩｇおよびＳＣＩｇのそれと遮断効果を比較するために行った。ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、ヒトＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートされたＩｇＧとインキュベートした。この結合は、種々の濃度の標識化されないＺ変異体、ＩＶＩｇまたはＳＣＩｇにより遮断された。結果は、ＦｃＲｎ結合二量体は、ｈＦｃＲｎへのｈＩｇＧ結合に関して、単量体Ｚ変異体Ｚ０７９１８、ＩＶＩｇおよびＳＣＩｇと比べ、改善された遮断効果を有することを示している（図１２Ａ）。更に、成熟した単量体Ｚ変異体Ｚ１３５８３およびＺ１３６２１の遮断能は、プライマリー単量体Ｚ変異体Ｚ０７９１８の遮断能と比べ、改善された（図１２Ｂ）。遮断アッセイの計算したＩＣ５０値を、表１５にまとめている。
【０３１８】
【表１５】
2017533885.tif 000020
【０３１９】
実施例１５
二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの作製
材料および方法
Ｚ変異体Ｚ１７３０３（配列番号３５７）、Ｚ１８６３２（配列番号３６５）、Ｚ１８６３３（配列番号３６６）およびＺ１８６３４（配列番号３６７）を、アルブミン結合変異体ＰＰ０１３（配列番号３７７）と融合し、一般的フォーマット［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＡＳＧＳ−ＰＰ０１３−ＧＴ−（Ｇ4Ｓ）−［Ｚ＃＃＃＃＃］の二量体として構築した。得られたポリペプチドを、各々、ＺＡＺ３８２４（配列番号３７３）、ＺＡＺ３８６９（配列番号３７４）、ＺＡＺ３８７０（配列番号３７５）およびＺＡＺ３８７１（配列番号３７６）と表示した。ＰＰ０１３と融合したＺ変異体Ｚ１７３０３の二量体ポリペプチドはまた、異なるリンカーまたはＰＰ０１３のＣ−末端融合によっても構築し、ポリペプチドＺ１７３０３−ＧＡＰ（Ｇ4Ｓ）3ＴＳ−ＰＰ０１３−ＧＴ（Ｇ4Ｓ）3ＰＲ−Ｚ１７３０３およびＺ１７３０３−ＧＡＰ（Ｇ4Ｓ）3ＴＳ−Ｚ１７３０３−ＧＴ（Ｇ4Ｓ）3ＰＲ−ＰＰ０１３を生じ、各々、ＺＡＺ３７１５（配列番号３７１）およびＺＺＡ３７１６（配列番号３７２）と表示した。更に、Ｚ１７３０３は、ＰＰ０１３を有さないが、Ｎ−末端Ｈｉｓ6−タグを伴う二量体として構築し、ポリペプチドＧＳＳ−Ｈｉｓ6−ＬＱ−Ｚ１７３０３−ＧＴ（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ１７３０３を生じ、ＺＺ３５５６（配列番号３７０）と表示した。
【０３２０】
培養は、実施例３に記載のように行った。ＰＰ０１３を含むポリペプチドの精製は、抗−ＡＢＤアフィニティクロマトグラフィーおよび実施例６に記載のＲＰＣにより実行したのに対し、Ｈｉｓ6−タグ付けＺＺ３５５６の精製は、実施例３に記載のようにＩＭＡＣにより行った。
【０３２１】
結果
Ｈｉｓ6−タグまたはＡＢＤ部分のいずれかを伴い構築した７種のＦｃＲｎ結合二量体ポリペプチドを、大腸菌において作製した。アフィニティ精製したタンパク質の量を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、分光学的に決定し、１ｇの細菌ペレットにつき２ｍｇから１８ｍｇの範囲にわたった。各最終タンパク質調製品のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらはＦｃＲｎ結合ポリペプチドを主に含んだことを示した。各ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの正確な同一性および分子量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により確認した。
【０３２２】
実施例１６
ヒトＦｃＲｎ／ｅＧＦＰトランスフェクトＨｅＬａ細胞へのホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの結合
この実施例において、成熟したＺ変異体を含むホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの結合能を調べた。実施例４に記載のように作製した、ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ導入遺伝子を発現しているＨｅＬａ細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識したＺ変異体によるフローサイトメトリー分析に使用した。
【０３２３】
材料および方法
ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識化：  ホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドを、実施例１３に記載のように、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２０１０６）により標識化した。
【０３２４】
ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰトランスフェクトＨｅＬａ細胞のＦｃＲｎ結合ポリペプチドによる免疫蛍光染色：  ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ  ＨｅＬａ細胞を、トリプシン処理により採取し、ＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０で２回洗浄し、その後計数した。１００，０００細胞を、ｖ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号２７７１４３）のウェル毎にピペットで取り、引き続きプレート中の細胞を、１，７００ｒｐｍで、４℃で４分間ペレット化した。上清を除去し、細胞を、ＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液中の２％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ８７７５）５０μｌで、ＲＴで１０分間固定した。その後細胞を、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０の１００μｌで２回洗浄し、６４０ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識したＨｉｓ6−タグを付けたホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドおよび対応する単量体Ｚ変異体を含有する、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧおよび０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号Ａ４５１８．０１００）を含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０中に再懸濁した。
【０３２５】
ホモおよび／またはヘテロ二量体のフォーマットの例は、Ｚ＃＃＃＃＃−（Ｇ4Ｓ）3−Ｚ＃＃＃＃＃およびＺ＃＃＃＃＃−（Ｇ4Ｓ）−Ｚ＃＃＃＃＃であり、ここでＺ＃＃＃＃は、例えば、Ｚ１３５８３（配列番号２３）、Ｚ１３６２１（配列番号４４）、Ｚ１３６５４（配列番号６５）またはＺ１３６７４（配列番号７５）か、もしくはＮ−末端ＡＥ以外は、Ｚ１３６２１（配列番号４４）と同一である、例えばＺ１７３０３（配列番号３５７）においてアミノ酸残基ＶＤの代わりにＡＥから始まる同じＺ変異体から選択される。クローニングは任意に、実施例３に記載のようにＣ−末端Ｈｉｓ6タグによるか、または配列番号３６２のようにＮ−末端Ｈｉｓ6タグにより行ってよい。
【０３２６】
形質導入ＨｅＬａ細胞を、緩衝液単独とインキュベートし、これを対照として使用した。これらの細胞を、振盪機上で、暗所において、８℃で１時間インキュベートした。次に細胞を、２つの異なる洗浄条件に供した：２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有する２×１５０μｌ  ＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０、または２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有する２×１５０μｌ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４、および２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中での２０分間のインキュベーション工程。洗浄後、全てのサンプルを、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ、ｐＨ６．０の１８０μｌ中に再懸濁した。１０，０００ＧＦＰ／ＦｃＲｎ陽性細胞からのデータを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して得、データを、Ｆｌｏｗｉｎｇソフトウェア２．５．０（Ｔｕｒｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して分析した。
【０３２７】
結果
フローサイトメトリー分析を使用し、成熟Ｚ変異体を含むホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、ヒトＦｃＲｎ／ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞上のヒトＦｃＲｎへ結合することができるかどうかを決定し、且つプライマリーＺ変異体を含む単量体ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体または二量体変異体の結合能を比較した。この分析はまた、ＦｃＲｎタンパク質からのｐＨ依存性の脱離は、二量体フォーマットにより影響されるかどうかを決定するために行った。実験は、ｐＨ６．０で行い、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識したＦｃＲｎ結合Ｚ変異体により、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４で洗浄した。この実験の結果は、ホモおよび／またはヘテロ二量体フォーマット、ならびにＦｃＲｎへの改善された親和性を伴う成熟Ｚ変異体の封入は、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの結合能を増加すること、およびＦｃＲｎからのｐＨ依存性の脱離は、前記ポリペプチドで減少されることを示すと予想される。
【０３２８】
実施例１７
二量体ポリペプチドのヒトＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合
この実施例において、種々のｐＨ値での二量体ポリペプチドのＦｃＲｎへ結合する能力を、ＥＬＩＳＡにより調べ、単量体Ｚ変異体の結合能と比較した。
【０３２９】
材料および方法
二量体ポリペプチドＺＡＺ３８２４（配列番号３７３）、ＺＡＺ３８６９（配列番号３７４）、ＺＡＺ３８７０（配列番号３７５）およびＺＡＺ３８７１（配列番号３７６）、ならびに単量体Ｚ変異体Ｚ１３６２１（配列番号４４）の、種々のｐＨ値でヒトＦｃＲｎへ結合する能力を、ＥＬＩＳＡにより試験し、ここで全ての結合および洗浄工程は、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４のいずれかで行った。ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中に希釈したｈＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号ｏｒｂ８４３８８）４μｇ／ｍｌにより、４℃で終夜コーティングした。プレートを、水道水により２回洗浄し、ウェルをＰＢＳＣ（１％カゼインを補充したＰＢＳ、ｐＨ７．４）１００μｌによりＲＴで１．５時間ブロックした。このブロック液を捨て、ｐＨ６．０処理に供したウェルを、ＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０により１回洗浄した。様々なＦｃＲｎ結合ポリペプチドを、濃度１００ｎＭで添加し、ＰＣＣ（１％カゼインを補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）またはＰＢＳＣのいずれか中に、０．１ｐＭまで１：１０段階希釈した。希釈液５０μｌを、ウェル毎に移し、ＥＬＩＳＡプレートを、ＲＴで１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＣＴ（０．０５％ツイーン２０を補充したＭｃＩｌｖａｉｎｅｓリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）またはＰＢＳＴ（０．０５％ツイーン２０を補充したＰＢＳ、ｐＨ７．４）のいずれかにより、４回洗浄した。結合したポリペプチドを、ＰＣＣまたはＰＢＳＣのいずれか中に２μｇ／ｍｌに希釈したＺ特異性マウス抗体（内部で作製した）の５０μｌ／ウェルで検出した。続けてプレートを、ＲＴで１．５時間インキュベートし、引き続き前述のように洗浄した。ＤＡＫＯ（Ｐ０４４７）から入手したＨＲＰ−コンジュゲートされたヤギ抗−マウスＩｇを、ＰＣＣまたはＰＢＳＣのいずれかの中に１：５０００に希釈し、添加し、これらのプレートを、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄（前述）の後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質５０μｌを、各ウェルに添加し、プレートを、製造業者の推奨に従い展開した。３０分間の展開後、マルチウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3）を使用し、吸光度を４５０ｎｍで測定し、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用し計算した。
【０３３０】
結果
解析を行い、種々のｐＨでの単量体対二量体のフォーマットの結合の潜在力を比較したが、導入された骨格変異（Ｙ５Ｆ、Ｎ５２ＳおよびＤ５３Ｅ：更に実施例２４および２５参照）が、ＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合へ影響を及ぼすかどうかも決定した。実験は、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４で、ＥＬＩＳＡフォーマットで行った。結果は、二量体フォーマットは、ｐＨとは無関係に、ＦｃＲｎ結合において、単量体フォーマットよりも優れていた（ｐＨ６．０およびｐＨ７．４で各々、最大１０×および８５×）ことを示した。ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で最も強力な結合は、二量体ポリペプチドＺＡＺ３８２４において認められ、これはまたｐＨ６．０およびｐＨ７．４で類似の結合能（ＥＣ５０値）を示した。ＥＬＩＳＡ滴定曲線は、図１３に示し、計算されたＥＣ５０値は、表１６にまとめている。
【０３３１】
【表１６】
2017533885.tif 000021
【０３３２】
実施例１８
ＦｃＲｎへのＩｇＧ結合の遮断能の比較
この実施例において、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を阻害するポリペプチドの能力を、２種の異なるインビトロ法を用いて分析した：ＡｌｐｈａＬＩＳＡおよび細胞を基本としたアッセイ。
【０３３３】
材料および方法
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイ：  二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドＺＺ３５５６（配列番号３７０）、ＺＡＺ３７１５（配列番号３７１）およびＺＺＡ３７１６（配列番号３７２）、ならびに単量体Ｚ１３６２１（配列番号４４）のＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を遮断する能力を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。ヒトＩｇＧ（Ｒｏａｃｔｅｍｒａ）を、製造業者の推奨に従い、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６７７２００２）上に固定した。ヒトＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号ｏｒｂ８４３８８）を、本質的に実施例２に記載されたように、ビオチン化した。ポリペプチドは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＬ０００Ｆ）ｐＨ６．０（ＨＣｌを用いて調整）中に、１：３で連続希釈し、３８４ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号Ｇ６００５３５０）中に最終濃度２５０ｎＭから１３ｐＭとし、１０ｎＭビオチン化ｈＦｃＲｎと一緒に４５分間インキュベートした。ＩｇＧ−コーティングされたアクセプタービーズを、最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、４５分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンコーティングされたドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６７６０００２）を、最終濃度４０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３０分間インキュベートした。全てのインキュベーションは、暗所においてＲＴで行った。プレートを、ＥｎＳｐｉｒｅマルチプレートリーダー２３００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において分析し、ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いて計算した。
【０３３４】
ＨｅＬａ細胞ＩｇＧ−ＦｃＲｎ遮断アッセイ：  ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、実施例４に記載したように調製した。ポリペプチドＺＺ３５５６（配列番号３７０）、ＺＡＺ３７１５（配列番号３７１）、ＺＺＡ３７１６（配列番号３７２）、ＺＡＺ３８２４（配列番号３７３）、ＺＡＺ３８６９（配列番号３７４）、ＺＡＺ３８７０（配列番号３７５）、ＺＡＺ３８７１（配列番号３７６）、Ｚ１３６２１（配列番号４４）、Ｚ１８６３２（配列番号３６５）、Ｚ１８６３３（配列番号３６６）およびＺ１８６３４（配列番号３６７）、ならびにＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）またはＳＣＩｇ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）を、各々、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％サポニン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）および５０ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７−コンジュゲートされたヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号００９−６００−００３）を含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０中に、濃度１０００、１００、１０、１、０．１または０（緩衝液対照）ｎＭに希釈した。固定した細胞を、この混合物１００μｌ中に再懸濁し、暗所において３７℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０中に再懸濁した。１０，０００ＧＦＰ／ＦｃＲｎ陽性細胞からのデータを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して得、データを、Ｆｌｏｗｉｎｇソフトウェア２．５．０（Ｔｕｒｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して分析し、ＩＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いて計算した。
【０３３５】
結果
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ：  １種の単量体ポリペプチドおよび３種の二量体ポリペプチドのＦｃＲｎへのＩｇＧ結合を阻害する能力を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイにおいて試験した。結果は、二量体ポリペプチドは、単量体フォーマットと比べ、より良いＩｇＧ遮断能を有することを示している。２種のＡＢＤ融合した二量体ポリペプチドＺＡＺ３７１５およびＺＺＡ３７１６は、ＡＢＤ部分を含まないＺＺ３５５６のＩＣ５０値に非常に類似したＩＣ５０値を有した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ遮断アッセイの計算したＩＣ５０値は、表１７にまとめている。
【０３３６】
ＨｅＬａ細胞ＩｇＧ遮断アッセイ：  ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＨｅＬａ細胞を、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を遮断するポリペプチドの能力を評価するために、ヒトＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−コンジュゲートされたＩｇＧおよび選択されたポリペプチドと共にインキュベートした。いくつかの自己免疫疾患の治療において現在使用される静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）および皮下免疫グロブリン（ＳｃＩｇ）も、この試験に含んだ。実験は、ｐＨ６．０で行った。結果は、二量体フォーマットは、単量体フォーマットと比べ、改善されたＩｇＧ遮断能を有することを示した。ＺＡＺ３７１５（長いリンカー）を、ＺＡＺ３８２４（短いリンカー）と比べ、これら２種の構築物は、類似したＩＣ５０値を示した。ＺＡＺ３７１５とＺＺＡ３７１６、すなわち、異なる位置にＡＢＤを伴う二量体構築物について得られたＩＣ５０値の間にも、差異はなかった。全ての試験したポリペプチドは、ＩＶＩｇおよびＳＣＩｇと比べ、優れたＩｇＧ遮断効果を有した。細胞遮断アッセイの計算したＩＣ５０値は、表１８に示す。
【０３３７】
【表１７】
2017533885.tif 000022
【０３３８】
【表１８】
2017533885.tif 000023
【０３３９】
実施例１９
ＩｇＧ再利用の遮断能の比較
この実施例において、ＩｇＧ再利用に対するホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの効果を、ＦｃＲｎ形質導入されたＭＤＣＫ．２細胞において調べる。
【０３４０】
材料および方法
ＭＤＣＫ．２細胞におけるレンチウイルス形質導入：ベクター対２ｋ７neo−ＣＭＶ−ｈＢ２ＭおよびｐＨＲ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰを、塩化カルシウムトランスフェクションを使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ、ＶＳＶ−Ｇエンベロープおよびｇａｇ／ｐｏｌパッケージングプラスミドと一緒に同時トランスフェクトした（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、前掲；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、（２００６）、前掲）。それぞれＦｃＲｎおよびＢ２Ｍ導入遺伝子と共に形成されたレンチウイルス粒子を含むＨＥＫ２９３Ｔ培養上清を使用し、低い継代数で順次ＭＤＣＫ．２細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２９３６）に形質導入した。生じた安定して形質導入されたＭＤＣＫ．２細胞株を、ｈＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ（ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰおよびｈＢ２Ｍの遺伝子で形質導入された）と表示する。
【０３４１】
ＩｇＧ再利用の遮断能：  ヒトＦｃＲｎ−ｅＧＦＰ形質導入ＭＤＣＫ．２細胞を、９６ウェルプレートに２５０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ2で終夜インキュベートした。細胞を、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０中の濃度範囲２００から０．０１ｎＭまでのホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドと一緒にインキュベートし、その後５００ｎｇ／ｍｌ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７−コンジュゲートされたヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号００９−６００−００３）を添加し、更に１時間インキュベートした。細胞を、２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有するＭｃＩｌｖａｎｅｓ緩衝液、ｐＨ６．０により洗浄し、次に２．５％ＦＢＳウルトラローＩｇＧを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４において、３７℃、５％ＣＯ2で、２時間インキュベートした。上清を次に、ＥｎＳｐｉｒｅマルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７−コンジュゲートされたヒトＩｇＧの存在について分析した。阻害曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用し、非線形回帰により分析し、ＩＣ５０値を決定した。
【０３４２】
結果
実験からの結果は、二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの作用による、ＩｇＧ再利用の用量依存型の減少を示すと予想される。
【０３４３】
実施例２０
ＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドによる増大したＩｇＧ異化
この実施例において、ホモ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのＩｇＧ異化に対する効果を、２つの異なる状況でヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおいて調べた。
【０３４４】
材料および方法
動物試験：  第一の試験において、ホモ二量体ＦｃＲｎ−結合ポリペプチドＺＡＺ３７１５（配列番号３７１）またはＺＺＡ３７１６（配列番号３７２）、またはビヒクル（ＰＢＳ緩衝液）を、雄性Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ  Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号１４５６５）へ、用量６ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．注射により０時間で投与した。ポリペプチド投与の２４時間前に、５００ｍｇ／ｋｇ  ｈＩｇＧ（Ｋｉｏｖｉｇ、Ｂａｘｔｅｒ）を、ｉ．ｖ．注射により投与した。血清サンプルを、−１６８、０、２４、７２、１２０および１４４時間（試験の終了時）に収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０３４５】
第二の試験において、ホモ二量体ＦｃＲｎ−結合ポリペプチドＺＡＺ３８６９（配列番号３７４）、ＺＡＺ３８７０（配列番号３７５）またはＺＡＺ３８７１（配列番号３７６）、またはビヒクル（ＰＢＳ緩衝液）を、雄性Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ  Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号１４５６５）へ、用量６ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．注射により０時間で投与した。ポリペプチド投与の２４時間前に、５００ｍｇ／ｋｇ  ｈＩｇＧ（Ｋｉｏｖｉｇ、Ｂａｘｔｅｒ）を、ｉ．ｖ．注射により投与した。血清サンプルを、−１６８、０、２４、７２、１２０および１４４時間（試験の終了時）に収集し、−２０℃で貯蔵した。
【０３４６】
ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ：  ２つの試験から収集したマウス血清サンプル中のヒトＩｇＧの濃度を、製造業者の説明により、ヒトＩｇＧ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＬ２０５Ｃ）により分析した。ｈＩｇＧの濃度を、非線形回帰式を用い標準曲線およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５から計算した。
【０３４７】
結果
実験の結果は、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの作用による、経時的なヒトＩｇＧ濃度の減少を示す。ポリペプチドＺＡＺ３７１５およびＺＺＡ３７１６を受け取る２群の間で、ＩｇＧレベルの減少に差は、ほとんどまたは全くない（図１４Ａ）。これらの結果は、中央またはＣ−末端位置のＡＢＤを伴うＦｃＲｎ結合ポリペプチドは、ＩｇＧ異化の増加に同等に有効であることを指摘している。ポリペプチドＺＡＺ３８６９、ＺＡＺ３８７０およびＺＡＺ３８７１は、各々、ｈＩｇＧレベルを、同程度減少した（図１４Ｂ）。第二の実験の結果は、第一の実験で得られた結果と同じ範囲であった。
【０３４８】
従って、これら２つの実験の結果は、ＦｃＲｎ−特異的ポリペプチドは、ＩｇＧの再利用を遮断し、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける増加したＩｇＧ異化、およびそれに続くＩｇＧの低下したレベルを生じることを指摘している。
【０３４９】
実施例２１
ＮＭＲＩマウスにおける二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドによる増大したＩｇＧ異化
この実施例において、ホモ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのＩｇＧ異化に対する効果を、ＮＭＲＩマウスにおいて調べた。
【０３５０】
材料および方法
動物試験：  ホモ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドＺＡＺ３７１５（配列番号３７１）またはＺＺＡ３８２４（配列番号３７３）、またはビヒクル（ＰＢＳ緩衝液）を、雌性ＮＭＲＩマウスへ、用量０．６または１．７μｍｏｌ／ｋｇのｉ．ｖ．注射により、０時間に投与した。血清サンプルを、０、２４、４８および７２時間（試験の終了）に採取し、−２０℃で貯蔵した。
【０３５１】
マウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ：  マウス血清サンプル中のマウスＩｇＧの濃度を、マウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（Ｍａｂｔｅｃｈ、カタログ番号３８２５−１ＡＤ−６）により分析し、製造業者の記載のように行った。ｍＩｇＧの濃度は、非線形回帰式を使用し標準曲線およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５から、計算した。２４、４８および７２時間での個々のマウスにおけるＩｇＧの濃度は、０時間でのレベルに関連し、従って結果をＩｇＧ（０時）の割合として表した。
【０３５２】
ＰＫ  ＥＬＩＳＡ：  マウス血清サンプル中のＦｃＲｎ結合ポリペプチドの濃度は、ＥＬＩＳＡにより決定した。このアッセイにおいて、ハーフエリア９６ウェルプレートを、マウス抗Ｚポリクローナル抗体（内部で作製した）により、ＰＢＳ中濃度４μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）でコーティングし、終夜４℃でインキュベートした。次に、プレートを水道水で２回すすぎ、ブロック緩衝液により１時間ブロックした。内部で作製したＺ変異体標準を、３倍連続希釈（０．００３〜３００ｎｇ／ｍｌ）で滴定し、希釈した血清サンプルを、コーティングされたＥＬＩＳＡプレート（５０μｌ／ウェル）に添加し、ＲＴで１．５時間インキュベートした。プレートを、自動ＥＬＩＳＡ洗浄機において４回洗浄し、ヤギ抗−ＡＢＤポリクローナル抗体（内部で作製した）４μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）を添加した。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、濃度２０ｎｇ／ｍｌの抗−ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号７１１−０３５−１５２）の５０μｌを、各ウェルに添加した。更に１時間インキュベートし、引き続き洗浄し、プレートを、１ウェルにつき５０μｌ  ＴＭＢで展開し、この反応を、２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4の５０μｌで停止した。４５０ｎｍでの吸光度を、９６ウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3）において測定した。
【０３５３】
結果
ＩｇＧ異化：  結果は、ＦｃＲｎ−特異性ポリペプチドＺＡＺ３７１５およびＺＡＺ３８２４で各々処理したマウス中のマウスＩｇＧ濃度の減少を示した（図１５）。ポリペプチドＺＡＺ３８２４で得られた結果は、内在性ＩｇＧレベルの減少は、用量依存性であり、且つ最も顕著な効果は７２時間で観察されたことを示した。注目すべきは、単量体が繰り返し且つ二量体よりもはるかに高い用量で投与されたとしても、二量体の使用により得られたＩｇＧレベルの減少は、実施例１１における単量体Ｚ０７９１８により得られた減少よりも大きかったことである（図１５および１０の７２時間を比較）。従って、これらの結果は、本明細書に開示されたＦｃＲｎ−特異性ポリペプチドは、ＩｇＧの再利用を遮断することができ、マウスにおいて増大したＩｇＧ異化およびその後のより低いレベルのＩｇＧを生じることを指摘している。
【０３５４】
薬物動態分析：  ＺＡＺ３７１５およびＺＡＺ３８２４の薬物動態プロファイルを、図１６に示している。ＺＡＺ３８２４の半減期は、約６２時間であり、これは実施例６に示した薬物動態試験で得られた半減期と一致し、ポリペプチドの薬物動態特性は、アルブミン結合から生じる延長された半減期に加え、ＦｃＲｎへの結合により更に改善されことを明らかにした。
【０３５５】
実施例２２
カニクイザルにおけるＦｃＲｎ結合二量体により増加したＩｇＧ異化
この実施例において、ホモまたはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドのＩｇＧ異化に対する効果を、カニクイザルにおいて調べた。
【０３５６】
材料および方法
動物試験：  ＰＰ０１３（配列番号３７７）に組換えにより融合されたホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドを、調製した。かかるＦｃＲｎ結合二量体の例は、本明細書に開示した配列番号３７１〜３７６を含む。
【０３５７】
アルブミン結合ドメインを含むＦｃＲｎ結合二量体を、カニクイザルへ、用量２、０．４および０．１μｍｏｌ／ｋｇで投与した。二量体ポリペプチドは、０時間に静脈内に注射した。第一回投与前１時間に、および最大２１日目まで毎日、その後最大５０日目まで週１回、サルを採血した。血清を調製し、−２０℃で貯蔵した。カニクイザルＩｇＧの濃度を、ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０３５８】
アルブミン結合ドメインを伴わないホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドを、カニクイザルへ、用量２、０．４および０．１μｍｏｌ／ｋｇで投与した。二量体ポリペプチドは、２週間は週３回投与した。第一回投与前１時間に、および最大２１日目まで毎日、その後最大５０日目まで週１回、サルを採血した。血清を調製し、−２０℃で貯蔵した。カニクイザルＩｇＧの濃度を、ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０３５９】
カニクイザルＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ：  血清サンプル中のカニクイザルＩｇＧの濃度を、ヒト／カニクイザルＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｍａｂｔｅｃｈ  ３８５０−１ＡＤ−６、これはヒトとカニクイザルＩｇＧの両方と交差反応する）により、製造業者の説明のように決定した。
【０３６０】
結果
実験からの結果は、ＦｃＲｎ結合二量体の作用により、カニクイザルＩｇＧの濃度の用量依存型の減少を示し、アルブミン結合ドメインも含むかかる二量体についてより顕著な効果を示すと予想される。
【０３６１】
実施例２３
二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの薬物動態試験
この実施例において、ホモおよび／またはヘテロ二量体ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの血清半減期を、マウスにおいて実行した薬物動態試験において調べた。
【０３６２】
材料および方法
薬物動態試験：  単独のまたはＰＰ０１３（配列番号３７７）へ組換えにより融合された、ホモおよび／またはヘテロ二量体としてのＦｃＲｎ結合ポリペプチドを、雄性ＮＭＲＩマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、独国）へ、用量９２ｎｍｏｌ／で、静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。３匹のマウスの群からの血清を、０．０８、６、１８、７８、１２０、１６８および２４０時間に得た。各々のポリペプチドの濃度を、ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０３６３】
ＥＬＩＳＡ：  ハーフエリア９６ウェルプレートを、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中４μｇ／ｍｌに希釈した一般にＺ変異体に特異的なヤギ抗体（内部で作製した）の５０μｌ／ウェルにより、終夜４℃でコーティングした。抗体溶液を捨て、ウェルを、ＰＢＳＣの１００μｌにより、ＲＴで１．５時間ブロックした。血清を、１％マウス血清（マトリクス）を含有するＰＢＳＣ中に、希釈プレート中の２倍連続希釈で１：１００から１：５１，２００まで、希釈した。マトリクスに希釈した各Ｚ変異体ポリペプチドおよび４つの品質対照（非常に低い、低い、中間および高い対照）に関する標準滴定を、各プレートに含んだ。希釈物５０μｌを、ウェル毎に移し、ＥＬＩＳＡプレートを、ＲＴで１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴにより４回洗浄した。結合したＺ変異体ポリペプチドを、ＰＢＳＣ中に４μｇ／ｍｌに希釈したウサギ抗−ＰＰ０１３  Ｉｇ（内部で作製した）５０μｌ／ウェルまたはマウス抗−Ｚ  ｍＡｂ（内部で作製した）５０μｌ／ウェルにより検出した。次にプレートを、ＲＴで１．５時間インキュベートし、引き続き前述のように洗浄した。ＰＢＳＣ中に１：２０，０００希釈した、ＨＲＰコンジュゲートされたロバ抗−ウサギＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号７１１−０３５−１５２）を添加し、プレートを１時間インキュベートした。前述のような洗浄後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質の５０μｌを、ウェルへ添加し、プレートを、製造業者の推奨に従い展開させた。１５分間展開の後、吸光度を、４５０ｎｍで、マルチウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3）を使用し測定した。吸光度値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いて分析し、濃度（三次スプラインカーブフィット）および曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。次に濃度を、それらの時間に対する自然対数としてプロットした。得られた曲線は、２コンパートメントモデルに従うと予想され、終末半減期は、最後の３時点を基にした勾配により除算したｌｎ２として計算した。
【０３６４】
結果
本明細書に記載した実験からの結果は、ＡＢＤを持たないポリペプチドに関して約６０分間、およびＡＢＤを含むポリペプチドに関して約９０時間の終末半減期を持つ、２コンパートメント排泄相を示すと予想される。
【０３６５】
実施例２４
骨格修飾された（scaffold-modified）ＦｃＲｎ結合ポリペプチドの生成、安定性試験および結合評価
下記の実施例は、高温で改善された安定性を示す、骨格修飾されたＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を明らかにしている。アミノ酸置換Ｎ５２ＳおよびＤ５３Ｅを有するＺ変異体Ｚ１７３４７（配列番号３５８）、ならびにアミノ酸置換Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７Ｑ、Ｓ３９Ｅ、Ｎ５２ＳおよびＤ５３Ｅを有するＺ１７３４８（配列番号３５９）を、安定性およびＦｃＲｎへの結合能に関して、それらの親分子Ｚ１１９４８（配列番号３５４）と比較した。
【０３６６】
材料および方法
骨格修飾されたポリペプチドの生成：  Ｚ１７３４７（配列番号３５８）、Ｚ１７３４８（配列番号３５９）およびＺ１１９４８（配列番号３５４）を、Ｎ−末端６×ヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ6）とクローニングし、フォーマットＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］の構築物をコードしたポリペプチドを得た。変異は、望ましいアミノ酸置換をコードしている重複するオリゴヌクレオチドプライマー対を使用し、確立された分子生物学技術の適用により、修飾されたＺ変異体のプラスミドに導入した。正確なプラスミド配列は、ＤＮＡ配列決定により検証した。
【０３６７】
大腸菌（Ｔ７Ｅ２株）細胞（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ）を、本来のおよび骨格修飾されたＺ変異体をコードしている遺伝子断片を含むプラスミドにより形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地において、３７℃で培養し、引き続きタンパク質発現を、ＩＰＴＧの添加により誘導した。ペレット化した細胞を、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４ホモジナイザー（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて破壊し、細胞片を遠心分離により除去した。Ｈｉｓ6−タグを付けたタンパク質としてＺ変異体を含む各上清を、Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ（商標）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造業者の指示に従い使用し、固定された金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。精製されたＺ変異体を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、リン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ；１．４７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）と緩衝液交換した。各ポリペプチドの正確な同一性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＭＳにより検証した。
【０３６８】
円二色性スペクトル分析：  円二色性（ＣＤ）分析を、実施例３に説明されたように実行し、融解温度（Ｔｍ）を決定し、アミノ酸置換の結果としての本発明のポリペプチドの二次構造の潜在的変化を評価した。
【０３６９】
比較安定性試験：  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中に配合したＨｉｓ6−タグ付けＺ変異体を、１ｍｇ／ｍｌに希釈し、２００μｌアリコートを、３７℃で２週間インキュベートした。安定性試験の前後に、収集したサンプルを、１０％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、各ウェルに５μｇタンパク質を充填するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。安定性は、高温でインキュベーション後の新たな変異体の出現により評価し、変異した変異体を、本来のポリペプチドと比較した。
【０３７０】
骨格修飾されたポリペプチドの結合評価：  Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体を、骨格中の変更の導入後、ならびに安定性試験に供された後、すなわち３７℃で２週間のインキュベーション後に、保存されたＦｃＲｎへの結合能に関して、更に評価した。比較のための速度定数（ｋonおよびｋoff）ならびに親和性（ＫD）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００機器を用いて決定した。標的タンパク質ヒトＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号ｏｒｂ  ８４３８８）を、ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカルボキシル化デキストラン層表面上に固定した。固定は、製造業者のプロトコールに従いアミンカップリング化学を用い、ならびにランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰを用いて、行った。チップ上の１個のフローセル表面は、被検体注入時にブランクとして使用するために、活性化および非活性化した。表面上のｈＦｃＲｎの固定レベルは、約７５０ＲＵであった。Ｚ変異体を、ランニング緩衝液中に最終濃度３．３３、１０および３０ｎＭまで希釈し、３分間注入し、その後ランニング緩衝液中で１５分間解離した。ＨＢＳ−ＥＰの３パルスによる再生、その後のランニング緩衝液中の１０分間の平衡化を、各被検体注入後に適用した。速度定数を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１：１ラングミュアモデルを使用し、センサーグラムから計算した。シグナルの何らかの偏りを補正するために、ブランク表面の曲線を、リガンド表面曲線から減算し、緩衝液サイクルからのデータを、試験サンプルサイクルのデータから減算した。
【０３７１】
結果
円二色性スペクトル分析：  ＣＤシグナル、対、温度プロットにおいて転移の中間点から決定した各代表的Ｚ変異体のＴｍを、表１９に示している。変異導入されたＺ変異体は、９０℃の加熱後に、保存されたαヘリックス構造および可逆的再折り畳みを示した。
【０３７２】
【表１９】
2017533885.tif 000024
【０３７３】
比較安定性試験：  骨格が修飾されたＺ変異体Ｚ１７３４７およびＺ１７３４８は、本来のポリペプチドＺ１１９４８と比べ、改善された安定性を示した。Ｚ１１９４８の主要バンドのすぐ上にゲル上で可視できる第二のバンドは、Ｚ１７３４７およびＺ１７３４８のサンプルにおいては認めることができず（図１７）、すなわち、この骨格変異は、本来の骨格においてサンプルについて認められた代替種の形成を妨害する。
【０３７４】
骨格修飾されたポリペプチドの結合評価：  ＦｃＲｎ−結合Ｚ変異体に関する比較速度定数を、表２０に示す。親和性は、Ｚ１７３４７（配列番号３５８）におけるような、位置５２−５３のＮＤのＳＥへのアミノ酸置換により、ならびにＺ１７３４８（配列番号３５９）におけるような、Ｄ３６Ｒ、Ｄ３７ＱおよびＳ３９Ｅと組合せた位置５２−５３のＮＤのＳＥへの置換により、わずかに作用され、ならびに１０-9 Ｍの範囲にＫDを持つ機能性結合体が得られた。評価された変異体はまた、３７℃で２週間のインキュベーション後にも、結合能を保存していた。
【０３７５】
【表２０】
2017533885.tif 000025
【０３７６】
実施例２５
追加の骨格修飾されたＦｃＲｎ結合ポリペプチドの生成および評価
この実施例において、骨格アミノ酸置換Ｎ５２ＳおよびＤ５３Ｅを伴う追加の変異体、ならびにアミノ酸置換Ｙ５Ｆも伴ういくつかの変異体を、それらの安定性およびＦｃＲｎへの結合について、それらの各親ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体と比較し、分析した。結果は、構造、安定性およびＦｃＲｎ結合能は、変異導入された変異体において維持されることを示している。
【０３７７】
材料および方法
骨格修飾されたポリペプチドの生成：  アミノ酸置換Ｎ５２ＳおよびＤ５３Ｅを、確立された分子生物学技術を使用し、Ｈｉｓ6−タグ付けＺ１３５７８（配列番号２０）、Ｚ１３５８３（配列番号２３）、Ｚ１３６１６（配列番号４１）、Ｚ１３６２１（配列番号４４）およびＺ１３６７４（配列番号７５）のプラスミドに導入し、各Ｚ変異体Ｚ１８６１４（配列番号３６０）、Ｚ１８６１５（配列番号３６１）、Ｚ１８６１６（配列番号３６２）、Ｚ１８６１７（配列番号３６３）およびＺ１８６１８（配列番号３６４）を生じた。チロシン残基である位置５での追加の修飾は、フェニルアラニンへ置換し、ならびにアミノ酸残基ＶＤの代わりにＡＥで始まるようなＮ末端修飾は、各々、Ｚ１３５７８、Ｚ１３６１６およびＺ１３６２１と同じ結合モチーフ（ＢＭ）を有する、Ｚ変異体Ｚ１８６３２（配列番号３６５）、Ｚ１８６３３（配列番号３６６）およびＺ１８６３４（配列番号３６７）を生じた。培養および精製を、本質的に実施例３および実施例９に記載されたように行った。５種のＺ変異体Ｚ１８６１４−Ｚ１８６１８は、ＩＭＡＣのみにより精製したのに対し、３種のＺ変異体Ｚ１８６３２−Ｚ１８６３４は、更にＲＰＣにより精製した。
【０３７８】
ＣＤ分析：  ＣＤ分析を、実施例３に記載のように実行し、融解温度（Ｔｍ）を決定し、変異導入されたＺ変異体の、それらの各親Ｚ変異体と比較した、二次構造の潜在的変化を評価した。
【０３７９】
Ｂｉａｃｏｒｅ結合分析：  Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用する、ｐＨ６．０での結合分析を、本質的に実施例３に記載されたように行った。Ｈｉｓ6−タグ付けＺ変異体Ｚ１８６３２、Ｚ１８６３３およびＺ１８６３４ならびにそれらの各々の対応する親Ｚ変異体Ｚ１３５７８、Ｚ１３６１６およびＺ１３６２１の濃度系列（２７０、９０、３０、１０および３．３ｎＭ）を、ＣＭ５チップ表面の異なるフローセルに固定された、ｈＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号ｏｒｂ８４３８８）およびｃＦｃＲｎ（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号ｏｒｂ９９０７５）上に、４分間、３０μｌ／分で注入した。０．００５％ＰＣＴ  ｐＨ６．０を、ランニング緩衝液として、およびＨｉｓ6−タグ付けＺ変異体の希釈のために、使用した。ランニング緩衝液中で、２０分間解離させ、その後０．００５％ＰＣＴ  ｐＨ７．４の３×３０秒パルスの注入、１５分間の平衡化により、表面を再生し、その後次のサイクルを開始した。
【０３８０】
結果
培養および精製：  ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体を、Ｎ末端Ｈｉｓ6−タグにより構築し、大腸菌において生成した。各最終タンパク質調製品のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これがＺ変異体に主に含まれたことを示した。各ＦｃＲｎ結合Ｚ変異体の正確な同一性および分子量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析により確認した。
【０３８１】
ＣＤ分析：  変異導入されたＦｃＲｎ結合Ｚ変異体のＴｍは、それぞれの親Ｚ変異体のＴｍと同一であるか、またはほぼ同一であった（表２１）。更に、９０℃での加熱の前後に得られた重複スペクトルにより、可逆的折り畳みが、７種全てのＺ変異体について認められた。
【０３８２】
Ｂｉａｃｏｒｅ結合分析：  ＦｃＲｎのｐＨ６．０での相互作用に関する結合プロファイルを、３種の変異導入されたＺ変異体とそれらの各々の親Ｚ変異体の対で比較した；Ｚ１８６３２／Ｚ１３５７８（配列番号３６５／２０）、Ｚ１８６３３／Ｚ１３６１６（配列番号３６６／４１）およびＺ１８６３４／Ｚ１３６２１（配列番号３６７／４４）。ｈＦｃＲｎおよびｃＦｃＲｎ表面上のＺ変異体の９０ｎＭ注入からのセンサーグラムのオーバーレイは、変異導入されたＺ変異体は、それらのヒトおよびカニクイザルＦｃＲｎに結合する能力を維持していることを示している（図１８Ａ〜Ｃ）。チップ表面のＦｃＲｎ固定レベルは、ヒトＦｃＲｎについて１５７７  ＲＵおよびカニクイザル  ＦｃＲｎについて１０９８  ＲＵであった。
【０３８３】
【表２１】
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【０３８４】
実施形態を項目にした一覧
［項目１］
第一の単量体単位、第二の単量体単位およびアミノ酸リンカーを含む、ＦｃＲｎ結合二量体であって、ここで前記第一および第二の単量体単位が各々、ＦｃＲｎ  結合モチーフ（ＢＭ）を含み、このモチーフが、アミノ酸配列：
ＥＸ2  Ｘ3  Ｘ4  ＡＸ6  Ｘ7  ＥＩＲ  ＷＬＰＮＬＸ16Ｘ17  Ｘ18  ＱＲ  Ｘ21  ＡＦＩＸ25  Ｘ26ＬＸ28  Ｘ29
（配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ17は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ21は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ25は、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；ならびに
Ｘ29は、ＤおよびＲから選択される）
からなり、
且つここで前記ＦｃＲｎ結合二量体が、前記第一の単量体単位または前記第二の単量体単位単独と比べ、より高い結合能でＦｃＲｎへ結合する、前記ＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２］
互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ16は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ17は、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ｄであり；
Ｘ21は、Ｖであり；
Ｘ25は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ26は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから選択され；ならびに
Ｘ29は、ＤおよびＲから選択される、項目１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つのＢＭが、
ｉ）  ＥＸ2  Ｘ3  Ｘ4  ＡＸ6  ＨＥＩＲ  ＷＬＰＮＬＴＸ17  Ｘ18  ＱＲ  Ｘ21  ＡＦＩＸ25  ＫＬＸ28  Ｄ
（配列中、互いに独立して、
Ｘ2は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ3は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ4は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ6は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＳおよびＶから選択され；
Ｘ17は、Ｆ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ18は、Ａ、Ｄ、ＥおよびＮから選択され；
Ｘ21は、Ａ、Ｓ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ25は、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ28は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択される）；ならびに
ｉｉ）  ｉ）に定義された配列と少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列からなる、項目１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４］
Ｘ6Ｘ7が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてＡＨおよびＧＨから選択される、項目１〜３のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５］
Ｘ6Ｘ7が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてＡＨである、項目４記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６］
Ｘ6Ｘ7が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてＧＨである、項目４記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７］
Ｘ17Ｘ18が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてＦＤおよびＹＤから選択される、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８］
Ｘ17Ｘ18が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてＦＤである、項目７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つのＢＭの配列が、６つの条件Ｉ〜ＶＩ：
Ｉ．  Ｘ6は、Ａ、Ｇ、ＫおよびＳから選択され、例えば特にＡである；
ＩＩ．  Ｘ7は、Ｈである；
ＩＩＩ．  Ｘ17は、ＦおよびＹから選択され、例えば特にＦである；
ＩＶ．  Ｘ18は、Ｄである；
Ｖ．  Ｘ21は、ＶおよびＷから選択され、例えば特にＶである；
ＶＩ．  Ｘ25は、ＨおよびＲから選択され、例えば特にＨである：
の少なくとも３つを満たしている、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１０］
配列が、６つの条件Ｉ〜ＶＩの少なくとも４つを満たしている、項目９記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１１］
配列が、６つの条件Ｉ〜ＶＩの少なくとも５つを満たしている、項目１０記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１２］
配列が、６つの条件Ｉ〜ＶＩの全てを満たしている、項目１１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１３］
前記第一および第二の単量体単位が、同じＢＭ配列を含む、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１４］
前記第一および第二の単量体単位が、異なるＢＭ配列を含む、項目１〜１２のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１５］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜３５３からなる群、例えば配列番号１７〜３５２からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＦｃＲｎ結合モチーフＢＭを含む、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１６］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜１５、配列番号１７〜１４０および配列番号３５３からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目１５記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１７］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜２および配列番号１７〜１４０からなる群、例えば配列番号１７〜１４０からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目１６記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１８］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜２、配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群、例えば配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５−１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目１７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１９］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜８、配列番号１３、配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３５３からなる群、例えば配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目１６記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２０］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目１８または１９記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２１］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目２０記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２２］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目２１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２３］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２３および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２３および配列番号７５からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目２２記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２４］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる群、例えば配列番号２０および配列番号４１からなる群；配列番号２０および配列番号４４からなる群；または、配列番号４１および配列番号４４からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目２２記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２５］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２３および配列番号４４からなる群、例えば配列番号２３および配列番号４４からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目２２記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２６］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号４４の配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目２４または２５記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２７］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、独立して、項目１５〜２６のいずれか一項に定義された選択された配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２８］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、独立して、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる群から選択される配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目２７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目２９］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号４４の配列における位置８から位置３６までの配列に対応するＢＭを含む、項目２８記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３０］
前記第一および第二の単量体の少なくとも一つにおける前記ＦｃＲｎ結合モチーフＢＭが、３ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３１］
前記ＢＭが、前記３ヘリックス束タンパク質ドメイン内に、内部結合ループにより２ヘリックス部分を本質的に形成する、項目３０記載のＦｃＲｎ結合二量体方法。
［項目３２］
前記３ヘリックス束タンパク質ドメインが、細菌受容体ドメインから選択される、項目３１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３３］
前記３ヘリックス束タンパク質ドメインが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡまたはそれらの誘導体のドメインから選択される、項目３２記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３４］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、結合モジュール（ＢＭｏｄ）を含み、前記モジュールが
ｉｉｉ）  Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ  ＸaＸbＬＬＸc  ＥＡＫＫＬ  ＸdＸeＸfＱ；
（配列中、
［ＢＭ］は、Ｘ29がＤであるという条件で、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり
Ｘaは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘbは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘdは、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘeは、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘfは、ＡおよびＳから選択される）、ならびに
ｉｖ）  ｉｉｉ）により定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列からなる、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３５］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、結合モジュール（ＢＭｏｄ）を含み、前記モジュールが
ｖ）  Ｋ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＸaＸbＬＬＸcＥＡＫＫＬＸdＸeＸfＱ：
（配列中、
［ＢＭ］は、Ｘ29がＲであるという条件で、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり；
Ｘaは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘbは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘdは、Ｅ、ＮおよびＳから選択され；
Ｘeは、Ｄ、ＥおよびＳから選択され；
Ｘfは、ＡおよびＳから選択される）、ならびに
ｖｉ）  ｖ）により定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列：
から選択されるアミノ酸配列からなる、項目１〜３３のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３６］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜３５３、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号１７〜３５２および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目３４記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３７］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜１５、配列番号１７〜１４０、配列番号３５３、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目３６記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３８］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜２、配列番号１７〜１４０、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号１７〜１４０および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目３７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目３９］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜２、配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５、配列番号１２７〜１４０、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５、配列番号１２７〜１４０および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目３８記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４０］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜８、配列番号１３、配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７、配列番号３５３、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目３６記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４１］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３、配列番号７５〜７７、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目３９または４０記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４２］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号７７、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号７７および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目４１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４３］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号３５８および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号７５および配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目４２記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４４］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２３、配列番号７５、配列番号３５８、配列番号３６１および配列番号３６４からなる群、例えば配列番号２３、配列番号７５、配列番号３６１および配列番号３６４からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目４３記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４５］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号２０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号３６０、配列番号３６２および配列番号３６３からなる群、例えば配列番号２０、配列番号４１、配列番号３６０  および配列番号３６２からなる群；配列番号２０、配列番号４４、配列番号３６０および配列番号３６３からなる群；または、配列番号４１、配列番号４４、配列番号３６２および配列番号３６３からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目４３記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４６］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２３  ，配列番号４４、配列番号３５８、配列番号３６１および配列番号３６３からなる群、例えば配列番号２３，配列番号４４、配列番号３６１および配列番号３６３からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目４３記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４７］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号４４における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目４６記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４８］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、項目３６〜４７のいずれか一項に定義された群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目１〜１３および１５〜４７のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目４９］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号７５および配列番号３６０〜３６４からなる群、例えば配列番号２０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号３６０、配列番号３６２および配列番号３６３からなる群から選択される配列における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目４８記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５０］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号４４における位置７から位置５５までの配列に対応するＢＭｏｄを含む、項目４９記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５１］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｖｉｉ）  ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＸcＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ：
（配列中、［ＢＭ］は、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ならびにＸcは、Ａ、ＳおよびＣから選択される）；ならびに
ｖｉｉｉ）  ｖｉｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５２］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｉｘ）  ＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＸcＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ：
（配列中、［ＢＭ］は、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ならびにＸcは、Ａ、ＳおよびＣから選択される）；ならびに
ｘ）  ｉｘ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、項目１〜５０のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５３］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｘｉ）  ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＸcＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰ：
（配列中、［ＢＭ］は、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフであり、ならびにＸcは、ＡおよびＣから選択される）；ならびに
ｘｉｉ）  ｘｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、項目１〜５０のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５４］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＥＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＥＳＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ；
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ＶＤＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＥＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＥＳＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＳＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；および
ＡＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
（配列中、［ＢＭ］は、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）
から選択される配列を含む、項目３３記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５５］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｘｉｉｉ）  ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｉｖ）  ｘｉｉｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５６］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号３５４〜３５７からなる群から選択される、例えば配列番号３５４および３５７から選択される配列ｘｉｉｉ）を含む、項目５５記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５７］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号３５７である配列ｘｉｉｉ）を含む、項目５６記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５８］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｘｖ）  ＡＥＡＫＦＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｖｉ）  ｘｖ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、項目１〜５４のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目５９］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号３６５〜３６７からなる群から選択される配列ｘｖ）を含む、項目５８記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６０］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｘｖｉｉ）    ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｖｉｉｉ）  ｘｖｉｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、項目１〜５４のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６１］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号３６０〜３６４からなる群から選択される配列ｘｖｉｉ）を含む、項目６０記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６２］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｘｉｘ）  ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＲＱＰＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｘ）  ｘｉｘ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６３］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号３５９である配列ｘｉｘ）を含む、項目６２記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６４］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが：
ｘｘｉ）  ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ：
（配列中、［ＢＭ］は、項目１〜２９のいずれか一項に定義されたＦｃＲｎ結合モチーフである）；ならびに
ｘｘｉｉ）  ｘｘｉ）に定義された配列と少なくとも９４％の同一性を持つアミノ酸配列：
からなる群から選択される配列を含む、項目１〜５４のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６５］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜３５３からなる群、例えば配列番号１７〜３５２からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目６４記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６６］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜１５、配列番号１７〜１４０および配列番号３５３からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含むか、または配列番号１〜２および配列番号１７〜１４０からなる群、例えば配列番号１７〜１４０からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目６５記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６７］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜２、配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群、例えば配列番号１７〜９２、配列番号９４〜１０３、配列番号１０５〜１２５および配列番号１２７〜１４０からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目６６記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６８］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１〜８、配列番号１３、配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７５〜７７および配列番号３５３からなる群、例えば配列番号１９〜２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目６７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目６９］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号２８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７３および配列番号７５〜７７からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目６６または６８記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７０］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５および配列番号７７からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目６９記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７１］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４および配列番号７５からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目７０記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７２］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２３および配列番号７５からなる群、例えば配列番号２３および配列番号７５からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目７１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７３］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号２０、配列番号４１および配列番号４４からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目７１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７４］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号１、配列番号２３および配列番号４４からなる群、例えば配列番号２３および配列番号４４からなる群から選択される配列ｘｘｉ）を含む、項目７１記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７５］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号４４である配列ｘｘｉ）を含む、項目７３または７４記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７６］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、項目５５、５６および６２〜７５のいずれか一項に定義された群から選択される配列に対応する、項目１〜１３および１５〜７５のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７７］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号１、配列番号２０、配列番号２３、配列番号４１、配列番号４４、配列番号６５、配列番号７５、配列番号３５４、配列番号３５７および配列番号３６０〜３６７からなる群、例えば配列番号２０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号３６０、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６５、配列番号３６６および配列番号３６７からなる群から選択される配列に対応している、項目７６記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７８］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号１または配列番号３５７に対応している、項目７７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目７９］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号２０、配列番号３６０または配列番号３６５に対応している、項目７７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８０］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号４１、配列番号３６２または配列番号３６６に対応している、項目７７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８１］
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号４４、配列番号３６３または配列番号３６７に対応している、項目７７記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８２］
前記リンカーが、可動性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカーおよび切断可能なアミノ酸リンカーからなる群から選択される、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８３］
前記リンカーが、前記第一の単量体単位と前記第二の単量体単位の間に配置される、項目８２記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８４］
前記リンカーが、グリシン、セリンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含む可動性リンカーである、項目８２または８３記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８５］
前記リンカーが、
（ＧnＳm）p  および  （ＳnＧm）p
（式中、独立して、
ｎ＝１−７、
ｍ＝０〜７、
ｎ＋ｍ≦８、および
ｐ＝１〜７である）
から選択される一般式を有する、請求項８４記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８６］
ｎ＝１〜５である、請求項８５記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８７］
ｍ＝０〜５である、請求項８５〜８６のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８８］
ｐ＝１〜５である、請求項８５〜８７のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目８９］
ｎ＝４、ｍ＝１およびｐ＝１〜４である、請求項８６〜８８のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９０］
前記リンカーが、（Ｇ4Ｓ）3である、請求項８９記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９１］
前記リンカーが、Ｇ4Ｓである、項目８９記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９２］
対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも６倍、例えば少なくとも７倍、例えば少なくとも８倍、例えば少なくとも９倍、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも２５倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍より高い能力で、ＦｃＲｎへ結合することが可能である、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９３］
対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍より高い能力で、ｐＨ６．０で、ＦｃＲｎへ結合することが可能である、項目９２記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９４］
対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも６倍、例えば少なくとも７倍、例えば少なくとも８倍、例えば少なくとも９倍、例えば少なくとも１０倍より高い能力で、ｐＨ７．４で、ＦｃＲｎへ結合することが可能である、項目９２記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９５］
相互作用のＫD値が、最大１×１０-7Ｍ、例えば最大１×１０-8Ｍ、例えば最大１×１０-9Ｍ、例えば最大１×１０-10Ｍ、例えば最大１×１０-11Ｍ、例えば最大１×１０-12Ｍであるように、ｐＨ６．０で、ＦｃＲｎへ結合することが可能である、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９６］
ＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの間のｐＨ７．４での相互作用のＫD値が、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫD値よりも高く、例えばｐＨ６．０での前記相互作用のＫD値よりも少なくとも２倍高く、例えば少なくとも５倍高く、例えば少なくとも１０倍高く、例えば少なくとも５０倍高く、例えば少なくとも１００倍高い、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９７］
ＦｃＲｎ結合ポリペプチドとＦｃＲｎの間のｐＨ７．４での相互作用のＫD値が、少なくとも１×１０-10Ｍ、例えば少なくとも１×１０-9Ｍ、例えば少なくとも１×１０-8Ｍ、例えば少なくとも１×１０-7Ｍ、例えば少なくとも１×１０-6Ｍ、例えば少なくとも１×１０-5Ｍである、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９８］
前記ｐＨ７．４での相互作用のＫD値が、ｐＨ６．０での前記相互作用のＫD値と等しいかまたはより低い、項目１〜９４のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目９９］
前記ｐＨ７．４での相互作用のＫD値が、最大１×１０-7Ｍ、例えば最大１×１０-8Ｍ、例えば最大１×１０-9Ｍ、例えば最大１×１０-10Ｍ、例えば最大１×１０-11Ｍ、例えば最大１×１０-12Ｍである、項目１〜９４のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１００］
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、Ｃ−末端および／またはＮ−末端に、少なくとも１個の追加のアミノ酸を含む、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１０１］
前記少なくとも1個の追加のアミノ酸伸長が、ポリペプチドの生成、精製、インビボまたはインビトロにおける安定化、カップリングおよび検出を改善または簡略化する、項目１００記載のＦｃＲｎ結合二量体。
［項目１０２］
融合タンパク質またはコンジュゲート体であって：
−先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体からなる第一の部分：および
−望ましい生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分：
を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１０３］
前記融合タンパク質またはコンジュゲート体のインビボ半減期が、それ自身望ましい生物活性を有するポリペプチドのインビボ半減期よりも長い、項目１０２記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１０４］
前記望ましい生物活性が、治療的活性である、項目１０２〜１０３のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１０５］
前記望ましい生物活性が、選択された標的への結合活性である、項目１００〜１０２のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１０６］
前記選択された標的が、アルブミンである、項目１０５記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１０７］
前記アルブミン結合活性が、連鎖球菌のプロテインＧのアルブミン結合ドメイン、またはそれらの誘導体により提供される、項目１０６記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１０８］
前記アルブミン結合活性が、融合タンパク質またはコンジュゲート体のインビボ半減期を増加する、項目１０６〜１０７のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１０９］
前記望ましい生物活性が、酵素活性である、項目１０３〜１０４のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１０］
望ましい生物活性を有する第二の部分が、治療活性ポリペプチドである、項目１０３〜１０５のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１１］
望ましい生物活性を有する第二部分が、酵素、ホルモン、増殖因子、ケモカインおよびサイトカインからなる群から選択される、項目１０３〜１０５および１０９〜１１０のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１２］
ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を阻害する、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１３］
ＦｃＲｎ結合二量体のＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を遮断する能力が、対応する第一または第二の単量体単位単独の遮断能力と比べ、少なくとも２倍高い、例えば少なくとも３倍高い、例えば少なくとも４倍高い、例えば少なくとも５倍高い、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも１５倍、例えば少なくとも２０倍、例えば少なくとも２５倍高いように、ＦｃＲｎに結合する、項目１１２記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１４］
前記ＦｃＲｎ結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体とＦｃＲｎの間の相互作用のＫD値が、ＩｇＧとＦｃＲｎの間の相互作用のＫD値よりも低い、項目１１２または１１３記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１５］
標識を更に含む、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１６］
前記標識が、蛍光色素および金属、色素体、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および放射性粒子からなる群から選択される、項目１１５記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１７］
ＦｃＲｎ結合ポリペプチドへ、システイン残基のチオール基またはリジン残基のアミン基を介してコンジュゲートされたポリアミノポリカルボン酸型キレート剤により提供されるキレート環境を含む、先行する項目のいずれかに記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１８］
ポリアミノポリカルボン酸型キレート剤が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸またはその誘導体である、項目１１７記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１１９］
１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸誘導体が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドである、項目１１８記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１２０］
ポリアミノポリカルボン酸型キレート剤が、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−トリ酢酸またはその誘導体である、項目１１７記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１２１］
ポリアミノポリカルボン酸型キレート剤が、ジエチレントリアミン五酢酸またはその誘導体である、項目１１７記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
［項目１２２］
項目１〜１１４のいずれか一項記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
［項目１２３］
項目１２２記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［項目１２４］
項目１２３記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
［項目１２５］
ポリペプチドの生成方法であって：
−前記発現ベクターから前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、項目１２４記載の宿主細胞を培養する工程、および
−前記ポリペプチドを単離する工程、
を含む、項目１〜１１４のいずれか一項記載のポリペプチドの生成方法。
［項目１２６］
項目１〜１２１のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体、および少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤または担体を含有する、組成物。
［項目１２７］
少なくとも一種の追加の活性剤を更に含有する、項目１２６記載の組成物。
［項目１２８］
経口投与、鼻腔内投与、肺内投与、膣投与、直腸投与、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射および皮内注射からなる群から選択される経路による投与に適合される、項目１２６〜１２７のいずれか一項記載の組成物。
［項目１２９］
医薬品として使用するための、項目１〜１２１のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体、または項目１２６〜１２８のいずれか一項記載の組成物。
［項目１３０］
前記医薬品が、自己免疫状態の治療または予防用である、項目１２９記載の使用のためのＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
［項目１３１］
前記医薬品が、同種免疫状態の治療または予防用である、項目１２９記載の使用のためのＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
［項目１３２］
前記医薬品が、てんかんおよび発作からなる群から選択される状態の治療または予防用である、項目１２９記載の使用のためのＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
［項目１３３］
項目１〜１２１のいずれか一項記載のＦｃＲｎ結合二量体、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体、または項目１２６〜１２８のいずれか一項記載の組成物の治療的または予防的活性量を対象へ投与することを含む、それを必要とする対象の治療または予防の方法。
［項目１３４］
自己免疫状態の治療または予防のための、項目１３３記載の方法。
［項目１３５］
同種免疫状態の治療または予防のための、項目１３３記載の方法。
［項目１３６］
てんかんおよび発作からなる群から選択される状態の治療または予防のための、項目１３３記載の方法。
【図１Ａ】
2017533885.tif 000027
【図１Ｂ】
2017533885.tif 000028
【図１Ｃ】
2017533885.tif 000029
【図１Ｄ】
2017533885.tif 000030
【図１Ｅ】
2017533885.tif 000031
【図１Ｆ】
2017533885.tif 000032
【図１Ｇ】
2017533885.tif 000033
【図１Ｈ】
2017533885.tif 000034
【図１Ｉ】
2017533885.tif 000035
【図１Ｊ】
2017533885.tif 000036
【図１Ｋ】
2017533885.tif 000037
【図１Ｌ】
2017533885.tif 000038
【図１Ｍ】
2017533885.tif 000039
【図１Ｎ】
2017533885.tif 000040
【図１Ｏ】
2017533885.tif 000041
【図２Ａ】
2017533885.tif 000042
【図２Ｂ】
2017533885.tif 000043
【図２Ｃ】
2017533885.tif 000044
【図２Ｄ】
2017533885.tif 000045
【図２Ｅ】
2017533885.tif 000046
【図３】
2017533885.tif 000047
【図４】
2017533885.tif 000048
【図５】
2017533885.tif 000049
【図６】
2017533885.tif 000050
【図７Ａ】
2017533885.tif 000051
【図７Ｂ】
2017533885.tif 000052
【図７Ｃ】
2017533885.tif 000053
【図８】
2017533885.tif 000054
【図９】
2017533885.tif 000055
【図１０】
2017533885.tif 000056
【図１１Ａ】
2017533885.tif 000057
【図１１Ｂ】
2017533885.tif 000058
【図１２】
2017533885.tif 000059
【図１３】
2017533885.tif 000060
【図１４】
2017533885.tif 000061
【図１５】
2017533885.tif 000062
【図１６】
2017533885.tif 000063
【図１７】
2017533885.tif 000064
【図１８】
2017533885.tif 000065
【配列表】
2017533885000001.app
【国際調査報告】
2017533885.tif 000066
2017533885.tif 000067
2017533885.tif 000068