(57)【要約】本発明は、ヘンドラまたはニパウイルスに結合し、これを中和し、かつ／または阻害する抗体または抗体断片に関する。本発明は、ヘンドラまたはニパウイルスのＦ糖タンパク質に選択的に結合する抗体または抗体断片、並びにかかる抗体及び／または断片を含む医薬組成物を提供する。本発明は更に、本発明の抗体及び断片をコードするポリヌクレオチド、並びにこのポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞を提供する。更に、本発明は、本発明の抗体、断片、ポリヌクレオチド及び／または組成物を用いる予防、治療及び診断方法について開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体が、配列番号：３５、３７及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号：４３、４５及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、前記抗体またはその断片。
【請求項２】
前記抗体または抗体断片はＦｄ断片を含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項３】
前記抗体断片はＦａｂ断片である、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項４】
前記抗体断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項５】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項６】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項７】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項８】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、及び配列番号：３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項９】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１０】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチドを含む重鎖を含む、請求項９に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３３の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１２】
前記または抗体断片抗体は、配列番号：４１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１３】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：４１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチドを含む軽鎖を含む、請求項１２に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１４】
前記抗体または抗体断片は配列番号：４１の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１５】
前記ｓｃＦｖが更にコネクターペプチドを含む、請求項４に記載の抗体断片。
【請求項１６】
前記コネクターペプチドは配列番号：５２を含む、請求項１５に記載の抗体断片。
【請求項１７】
前記ｓｃＦｖが配列番号：５１を含む、請求項４に記載の抗体断片。
【請求項１８】
ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合するヒト化抗体または抗体断片であって、前記抗体または抗体断片が、配列番号：３３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、前記ヒト化抗体または抗体断片。
【請求項１９】
前記重鎖可変領域は、配列番号：３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２０】
前記重鎖可変領域は、配列番号：３３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２１】
前記重鎖可変領域は、配列番号：３３のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２２】
前記抗体はＩｇＧ１である、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２３】
前記抗体または抗体断片がヘンドラまたはニパウイルス感染症を阻害する、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２４】
前記抗体または抗体断片は、ウイルス宿主の膜融合を妨げることによりヘンドラまたはニパウイルス感染症を阻害する、請求項２３に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２５】
前記抗体または抗体断片は、Ｆ糖タンパク質のリフォールディングをブロックすることによりウイルス宿主の膜融合を妨げる、請求項２４に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２６】
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）の保管物ＰＴＡ−１２０５７５として保管されているＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞内に含有されるプラスミドにコードされた抗体と同一の配列の重鎖及び軽鎖可変領域を含む、抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、ウイルス宿主の膜融合中にＦ糖タンパク質のフォールディングをブロックすることによりヘンドラまたはニパウイルス感染症を阻害する、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドはベクター内に含まれる、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
製薬上許容できる担体と、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片とを含む医薬組成物。
【請求項３１】
患者に、治療上有効な量の請求項３０に記載の医薬品を投与することを含む、ヘンドラウイルス病またはニパウイルス病の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、免疫学の分野に関し、特に、ヘンドラ及びニパウイルスに結合し、かつ／またはヘンドラ及びニパウイルス活性を阻害する抗体及び抗体断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニパウイルス（ＮｉＶ）及びヘンドラウイルス（ＨｅＶ）は、ヘニパウイルス属を含むパラミクソウイルスに密接に関係している（Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  １９９９  ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ    Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｗ．ｅｄ．４８：３３５−３３７；Ｃｈｅｗ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８１：１７６０−１７６３；Ｃｈｕａ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．２０００  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４８：８０２−８０５；Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｔ．２００１  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ３：２７７−２７８；Ｇｏｈ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４２：１２２９−１２３５；Ｌｅｅ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４６：４２８−４３２；Ｌｉｍ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２０００  Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ  ２１：４５５−４６１；Ｍｕｒｒａｙ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：９４−９７）。パラミクソウイルスは、エンベロープウイルスを含有するネガティブセンスＲＮＡであり、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、センダイウイルス、ニューカッスル病ウイルス、牛疫ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びシミアンウイルス５を含む、種々の重要なヒト及び動物病原体を包含する（Ｌａｍｂ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ，２００７，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｋｎｉｐｐｅ  ＆  Ｈｏｗｌｅｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐｐ．１４４９−１４９６を参照）。
【０００３】
他のパラミクソウイルスと同様に、ＨｅＶ及びＮｉＶは、ウイルス粒子のエンベロープ内に、膜に固定された２つの主要な糖タンパク質を有する。一方の糖タンパク質は、宿主細胞受容体認識及び結合のために必要であり、ヘマグルチニンノイラミニダーゼタンパク質（ＨＮ）、ヘマグルチニンタンパク質（Ｈ）、またはへニパウイルスの場合、糖タンパク質（Ｇ）のいずれかとして示され、糖タンパク質は血球凝集活性もノイラミニダーゼ活性も示さない。他方の主要な糖タンパク質は融合（Ｆ）糖タンパク質であり、これは、２つの７反復（ＨＲ）領域、及び疎水性融合ペプチド（Ｆｐ）を含有する三量体クラスＩの膜融合性エンベロープ糖タンパク質である。へニパウイルスＦ糖タンパク質は、最も多くの場合、Ｆをエンドサイトーシスし、保存されたシスチン残基を介するジスルフィド結合により結合している、成熟膜融合Ｆ１（大きなカルボキシ末端断片）＋Ｆ２（小さなアミノ末端断片）サブユニットにリサイクルする間に、エンドソーム区画内で生じる宿主細胞カテプシンＬによる翻訳後切断を受ける前駆体Ｆ０ として合成される。Ｐａｇｅｒ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４６：２５１−７；Ｐａｇｅｒ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：１２７１４−２０；Ｍｅｕｌｅｎｄｙｋｅ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７９：１２６４３−９；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８０：２９８９９−９０３を参照のこと。Ｆの成熟形態において、ＦｐはＦ１のＮ末端に位置し、続いて、第１のＨＲ（ＨＲＡ）及び第２のＨＲ（ＨＲＢ）が、膜貫通ドメイン直前のＦ１のＣ末端に位置する（Ｌａｍｂ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ，２００７，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｋｎｉｐｐｅ  ＆  Ｈｏｗｌｅｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐｐ．１４４９−１４９６を参照）。
【０００４】
Ｇ糖タンパク質を介しての、宿主受容体エフリン（ＥＦＮ）Ｂ２またはＢ３への結合に続き、ＨｅＶ及びＮｉＶは、ｐＨ依存性膜融合プロセスにより、細胞に感染する。本プロセスは依然として、不十分にしか理解されておらず、Ｆの活性化及びトリガリングをもたらす受容体結合に際し、Ｇの構造変化を伴うと考えられている（Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３４４：３０−７；Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｖｉｒｕｓｅｓ，４：２８０−３０８）。トリガリングに際し、Ｆは著しい構造再構成を受けて、融合ペプチドの標的膜内への挿入を促進し、ウイルス及び細胞膜の融合中またはその直後に、２つのＨＲ領域を合わせて、６つのヘリックスバンドル構造またはヘアピン三量体を形成する。Ｆ由来の膜融合プロセスは、準安定形態からの不可逆的フォールディング、続いてより低いエネルギー状態への個々の構造変化を伴うと考えられている。トリガリングの際の、このＦのリフォールディングにおける幾つかの分子の詳細は、レスピロウイルス属Ｆの融合後構造及び融合前構造の両方における構造ソリューションで明らかにされた（Ｙｉｎ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０２（２６）：９２８８−９３；Ｙｉｎ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：３８−４４）。
【０００５】
現在、ＨｅＶまたはＮｉＶに対して臨床的に認可されたワクチンまたは治療薬は存在しないにも関わらず、ヘニパウイルスＧ糖タンパク質に特異的な中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｍ１０２．４は、感染後最大７２時間までに投与された場合、ＨｅＶに対して、アフリカミドリザルを致死病から守ったことを示した（Ｂｏｓｓａｒｔ，Ｋ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，３：１０５ｒａ１０３）。抗体または抗体断片、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びその断片は、タンパク質構造の明確化及び種々の領域と関係する機能の理解、並びに、抗Ｇ  ｍ１０２．４の場合のように、予防及び／または治療薬として使用するための可能性がある試薬の提供において有用であることができる。現在まで、抗へニパウイルスＦ  ｍＡｂは殆ど報告されておらず、また、組み換えタンパク質から作製されたものはない（Ａｇｕｉｌａｒ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８１：４５２０−３２；Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，Ｖ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８０：１９７２−８）。これらの報告は、単離した抗体の特定の性質に関して限定的な情報しか提供していない。中和抗Ｆ抗体及び抗体断片を開発することで、ｍ１０２．４と組み合わせた際に、おそらくより効果的に、別の潜在的なへニパウイルス感染症治療薬として機能する可能性がある。抗Ｆ抗体及び抗体断片はまた、へニパウイルス中でＦが仲立ちする融合の構造的及び機能的性質決定を容易にするための貴重な手段を提供する可能性がある。
【０００６】
したがって、ＮｉＶ及びＨｅＶに対する中和または阻害抗体及び抗体断片を開発することは、予防及び受動免疫療法に対して重要な示唆を有する可能性がある。更に、抗体及び抗体断片のエピトープの性質決定、並びにＮｉＶ及びＨｅＶ感染症の中和及び阻害メカニズムは、候補となるワクチン及び薬剤の開発に有益な情報を提供する可能性がある。最終的に、かかる抗体及び抗体断片はまた、診断のために、及び研究用試薬としても使用されることができる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ヘンドラ及び／またはニパウイルスに結合し、これらを中和し、かつ／または阻害する抗体または抗体断片に関する。特に、本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質を選択的に結合する抗体またはその断片を提供し、前記抗体は、配列番号：３５、３７及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号：４３、４５及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。本発明はまた、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合するヒト化抗体または抗体断片も提供し、前記抗体または抗体断片は、配列番号：３３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ｍ５Ｂ３及びｓｃＦｖ構築物のアミノ酸配列の画である。（Ａ）ｍ５Ｂ３のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列。ＣＤＲ領域はラベリング及び下線を引き、フレームワーク領域（ＦＲ）もまたマーキングした。ｍ５Ｂ３、ヒト化５Ｂ３（ｈ５Ｂ３）及びヒト化５Ｂ３．１（ｈ５Ｂ３．１）のＶＨ及びＶＬはフレキシブルなリンカー（例えばコネクターペプチド−（Ｇ４Ｓ）３−）により分離されており、プロモーター促進ｐｃＤＮＡベクター内に、構築物のＮ末端にてハイグロマイシン選択マーカーである免疫グロブリン軽鎖（ｌｃ）リーダー配列（Ｉｇｋリード）と、並びにＣ末端にてＳペプチドタグ（Ｓｔａｇ）、及びヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）と共に挿入されている。
【図２】マウス５Ｂ３（ｍ５Ｂ３）、ヒト化５Ｂ３（ｈ５Ｂ３）、及びヒト化５Ｂ３．１（ｈ５Ｂ３．１）の、Ｆとの結合。（Ａ）ｍ５Ｂ３、ｈ５Ｂ３、及びｈ５Ｂ３．１  ｓｃＦｖの、可溶性（ｓＦ）及び完全長（ＦＬ）Ｆとの結合。図１Ｂに示すｍ５Ｂ３、ｈ５Ｂ３、及びｈ５Ｂ３．１のｓｃＦｖ構築物を２９３Ｔ細胞内にトランスフェクションし、感染の４８時間後に上清を収集した。ヒトｓｃＦｖライブラリーからのヒトｓｃＦｖを対照（ｃｔｒｌ）として使用した。等量の上清をｓＦタンパク質、またはＦＬＦを発現する細胞可溶化物と共に添加し、示したように、Ｎｉ２＋ビーズまたはＳタンパク質アガロースと共に沈殿させた（ＩＰ）。（Ｂ）ｈ５Ｂ３、ｈ５Ｂ３．１  ＩｇＧのＦＬＦとの結合。同一のＦｃ及びＣＬ断片を有するヒト抗ＨｅＶ  Ｇ  ｍＡｂであるｍ１０２．４を、対照ｍＡｂとして使用した。精製したｍＡｂ（各２μｇ）をＦＬＦを発現する細胞可溶化物に添加し、続いてプロテインＧセファロースと共に沈殿させた。全ての場合において、沈殿生成物をＳＤＳ  ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロットにより分析し、ブロットを適切な抗体でプローブして（ＩＢ）、示したようなバンドを検出した。ＩＰ：免疫沈殿物；ＩＢ：免疫ブロット；Ｈ：重鎖；Ｌ：軽鎖。
【図３】ｍ５Ｂ３及びｈ５Ｂ３のフレームワーク領域（ＦＲ）の、ヒトｓｃＦｖライブラリーのフレームワーク領域とのアラインメント、並びにｈ５Ｂ３．１のＶＨ配列。（Ａ）ＦＲの、ｍ５Ｂ３のＶＨ及びＶＬをヒトｓｃＦｖライブラリーのそれとアラインメントし、保存したヒト残基を、アラインメント上で垂直の矢印により示したように識別した。これらの保存残基を次いで、ｍ５Ｂ３相同位置に置き換え、アラインメントの第１の列で示すように、ｈ５Ｂ３のＦＲを作製した。（Ｂ）ｈ５Ｂ３．１のアミノ酸配列。ＣＤＲ領域をラベリングし、下線を引いている。ＣＤＲ内で強調した残基は、ｈ５Ｂ３に変異してｈ５Ｂ３．１を産生したアミノ酸を示している。
【図４】ｐｃＤＮＡ内でｈ５Ｂ３．１  ＩｇＧ１を作製するために使用したベクターの図、及び精製したｍ５Ｂ３、ｈ５Ｂ３、並びにｈ５Ｂ３．１  ＩｇＧのクマシー染色。（Ａ）矢印により示したように、ｐＤＲ１２の軽鎖及び重鎖ＯＲＦに隣接するＸｈｏ  Ｉ部位を有するＰＣＲプライマーを使用して、ｐＤＲ１２  ｈ５Ｂ３．１プラスミドＤＮＡを増幅し、次に、ＰＣＲ産物を消化して、示すようにプロモーターで促進したｐｃＤＮＡ３．Ｉ  Ｈｙｇｒｏ（＋）内のＸｈｏ  Ｉ部位内に挿入した。（Ｂ）示すように、各４μｇの精製ｍＡｂをＳＤＳ  ＰＡＧＥ、続いてクマシーブルー染色により分析した。垂直の矢印はｍＡｂの重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を示す。Ｍｗ：分子量マーカー。
【図５】５Ｂ３鎖結合の測定。示すように、異なるＳペプチドでタグ付けしたｈ５Ｂ３及びヒトｓｃＦｖ  ＶＨ  ＶＬキメラを発現する細胞の上清を、細胞可溶化物を発現するタグなしＦに添加し、Ｓタンパク質アガロースにより沈殿させた。沈殿生成物をＳＤＳ  ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロットにより分析し、ブロットを抗Ｓペプチド抗体でプローブしてｓｃＦｖを検出するか、または抗Ｆ抗体でプローブしてＦを検出した（ＩＢ）。
【図６】ＮｉＶ及びＣｅｄＰＶ  Ｆキメラの、異なる抗ＮｉＶ  Ｆ  ｍＡｂとの結合、並びにキメラの融合活性。（Ａ）異なるＳペプチドでタグ付けしたＮｉＶ及びＣｅｄＰＶ  Ｆキメラを発現する細胞溶解物を、示したように、異なる抗ＮｉＶ  Ｆ  ｍＡｂまたはＳタンパク質アガロースにより沈殿させた。沈殿生成物をＳＤＳ  ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロットにより分析し、ブロットを抗ＳペプチドＡｂでプローブした。６４ｋＤａマーカーの真下の最も上のバンドはＦ０であり、５１ｋＤａマーカーの真下の低いバンドはＦ１である。キメラの概略図をブロットの左側に示し、ここでは、赤色及び青色はＣｅｄＰＶ及びＮｉＶ  Ｆ領域を示す。１Ｅ１１、１２Ｂ２、及び５Ｂ３は、Ｆ糖タンパク質に対するマウスｍＡｂである。（Ｂ）標的集団として許容状態のＨｅＬａ−ＡＴＣＣ細胞を使用して、レセプター陰性ＨｅＬａ−ＵＳＵ細胞内でＮｉＶ  Ｇと共発現させることにより、異なるＮｉＶ及びＣｅｄＰＶ  Ｆキメラを、β−ガラクトシダーゼレポーター細胞融合アッセイにおいて細胞融合を容易にする能力に関して試験した。アッセイは３通りに実施し、融合結果を計算し、３−ガラクトシダーゼ活性の平均速度（１分あたり５７０ｎｍでの光学密度の変化×１０００）として表現した。Ｎｉ：ＮｉＶ；Ｃｅ：ＣｅｄＰＶ；Ｈｄ：Ｆの球状頭部；ＨＲＢ：Ｆの７反復Ｂ。
【図７】突然変異誘発による５Ｂ３エピトープのマッピング。（Ａ）マウス５Ｂ３欠失Ｆ変異体の沈殿及びウェスタンブロット分析。Ｓペプチドでタグ付けしたＮｉＶ  Ｆ変異体のパネルを作製し、２９３Ｔ細胞内で発現させた。Ｆ発現する細胞可溶化物を均等に分割し、５Ｂ３、１２Ｂ２、及びＳタンパク質アガロースにより別々に沈殿させた。次いで、ｍＡｂ−Ｆ複合体をプロテインＧセファロースと共に添加した。沈殿生成物をＳＤＳ  ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロットにより分析し、ブロットを抗ＳペプチドＡｂでプローブした。最上部のバンドはＦ０であり、下のバンドはＦ１である。（Ｂ）β−ガラクトシダーゼレポーター細胞融合アッセイにおける、５Ｂ３欠失ＮｉＶ  Ｆ変異体の融合活性。（Ａ）に示すＮｉＶ  Ｆの変異体の細胞融合を容易にする能力を、標的集団として許容状態のＨｅＬａ−ＡＴＣＣ細胞を使用して、レセプター陰性ＨｅＬａ−ＵＳＵ細胞内でＮｉＶ  Ｇと共発現させることにより試験した。示すデータは、ウェスタンブロットバンドのデンシトメトリーにより測定した、全発現で正規化した３つの別の実験から計算した各変異体に対する、ＷＴ融合レベルの平均百分率である。棒は複数の実験からの範囲を表す。ＷＴ：野生型Ｆ。（Ｃ）表面表示として示す、ＮｉＶ  Ｆ３量体構造に対してマッピングした５Ｂ３エピトープの位置。灰色の異なる陰影は、３量体Ｆのサブユニットをマーキングしている。色の付いた残基は、本研究で変異したものをマーキングしている。オレンジ色の残基は、試験をしたが５Ｂ３結合に影響を有しなかった。ピンク色の残基は、５Ｂ３及びＩ２Ｂ２の両方を欠失している。マゼンダ色は、５Ｂ３を欠失しているが１２Ｂ２結合には影響を有しなかった残基をマーキングしている。エピトープが有色であるサブユニットの融合ペプチドは青色である。（Ｄ）本研究で試験した全ての残基をラベリングしている、（Ｃ）の拡大画像。
【図８】５Ｂ３阻害のメカニズム。（Ａ）ｓＦはトリプシンにより切断されて成熟Ｆ１＋Ｆ２を作製し、プロテアーゼ阻害剤を添加して反応を停止した。ビオチン化ＦＣペプチド（２μｇ）を、示したように異なる量のｍＡｂと共に添加した。次に、サンプルを１５分間５０℃まで加熱して、Ｆをトリガリングした。次に、ＦＣ２−ｓＦ複合体をアビジンアガロースで沈殿させた。（Ｂ）ｍ５Ｂ３及びｈ５Ｂ３．１を用いて（Ａ）に記載したようにアッセイを行い、５μｇのｍＡｂ反応（左側から４番目のレーン）での非結合物質を収集し、プロテインＧセファロースで沈殿させた（左側から５番目のレーン）。（Ｃ）２μｇのｍＡｂにより、及び熱処理に関して示したように、増加した温度で、（Ａ）に記載したようにアッセイを実施した。全ての反応における非結合物質を収集し、プロテインＧセファロースで沈殿させた。上記の全ての場合において、沈殿生成物をＳＤＳ  ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロットで分析し、ブロットを抗Ｆウサギ抗体によりプローブしてＦを検出した。
【表１】
2017505124.tif 000002
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
別段定めがない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同様の意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  Ｐ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｄ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１，ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｋｎｉｐｅ  Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ  Ｐ．Ｍ．ｅｄｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ２００１を参照のこと。
【００１０】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、特定の抗原に特異的に結合する能力を有し得る免疫グロブリン分子を意味する。抗体はアイソタイプまたはクラスとして知られている異なる種類を有してよく、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭとして知られている５つの基本的な抗体のアイソタイプが挙げられるが、これらに限定されない。抗体断片は、免疫グロブリン分子の一部、または免疫グロブリン分子の一部の組み合わせを含んでよい。抗体断片は抗原結合能を保持し得る。抗体断片は、抗原結合活性断片を含んでよく、例えば、既知の活性断片Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｃ、及びＦｄ、並びに融合ペプチド（ｓｃＦｖ等）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体及び抗体断片は、免疫学科学の当業者によく知られている。抗体及び抗体断片は一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ研究及びプロセスの両方に用いられる。
【００１１】
本明細書で使用する場合、用語「重鎖」及び「軽鎖」とは、既知の免疫グロブリンサブユニットを意味し、かつ、抗体の一部及びサブユニットの断片としての意味も持つ。これらの完全な形態において、重鎖は通常、軽鎖よりも長いポリペプチドである。重鎖は、抗原を結合するのに重要な重鎖可変領域（ＶＨ）を１つ含んでよく、軽鎖は、抗原を結合するのに重要な軽鎖可変領域（ＶＬ）を１つ含んでよい。
【００１２】
Ｆａｂ断片（抗原に結合する断片）は、抗原に結合する抗体の領域である。Ｆａｂは、各重鎖及び軽鎖の、１つの定常領域、及び１つの可変領域を含んでよい。これらの領域は、モノマーのアミノ終末端にてパラトープ（抗原結合部位）を形成する。２つの可変領域は、これらの特異的抗原上のエピトープと結合する。Ｆ（ａｂ’）２とは、Ｆａｂの２量体を含む抗体断片を意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２は、組み換え技術により、または抗体もしくは抗体の断片の切断により、作製してよい。従来技術で公知なように、抗体分子の一部（パラトープ）のみが、抗原のエピトープへの抗体の結合に関与する。ｐＦｃ’及びＦｃ領域（断片結晶化領域）は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。
【００１３】
本明細書で使用する場合、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）は、コネクターまたはリンカーペプチドと連結した、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合ペプチドである。幾つかの実施形態では、コネクターペプチドは約２〜約５０個のアミノ酸の範囲である。幾つかの実施形態では、コネクターペプチドは約１０〜約２５個のアミノ酸の範囲である。ｓｃＦｖは、元の免疫グロブリン分子の抗原結合能を保持し得る。本明細書において、ｓｃＦｖは抗体断片と考えられる。
【００１４】
本明細書で使用する場合、Ｆｄ断片はＦａｂ断片の重鎖部分を含んでよい。Ｆｄ断片は酵素切断または組み換え技術により作製されてよい。幾つかの実施形態では、Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要決定基であり（単一のＦｄ断片が、抗体特異性を変更することなく、１０個以下の異なる軽鎖を伴ってよい）、Ｆｄ断片は単独で、エピトープ結合能を保持する。
【００１５】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の抗原結合部内のペプチド領域である。ＣＤＲは抗原のエピトープと直接相互作用してもよく、かつ、ＣＤＲは抗体特異性の主要な決定基である。フレームワーク領域（ＦＲ）は、パラトープの三次構造を維持する、抗体の抗原結合部内のペプチド領域である。幾つかの実施形態では、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によりそれぞれ分離された、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）がある。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、かつより詳細には重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性の大きな原因であり得る。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「ヘンドラウイルス病」及び「ニパウイルス病」とは、ヘンドラまたはニパウイルスの感染により直接、または間接的に引き起こされる病気を意味する。ヘンドラウイルス（ＨｅＶ）及びニパウイルス（ＮｉＶ）において、広範の種における親和性、並びに、動物及びヒトの両方で致死的疾患を引き起こす能力が、他の全ての既知のパラミクソウイルスよりも特徴的である（Ｅａｔｏｎ  Ｂ．Ｔ．２００１  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ３：２７７−２７８）。これらのウイルスは増幅されて大型動物での病気を引き起こす可能性があり、また、ヒトに伝染する可能性もあり、ヒトにおいては、感染は重度の呼吸器疾患及び／または熱性脳炎（ｆｅｂｒｉｌｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）として現れる。
【００１７】
ポリペプチドに関して本明細書で使用する場合、用語「実質的に純粋な」とは、ポリペプチドが、自然またはｉｎ  ｖｉｖｏ系内で、それらの使用目的に対して実際的かつ適切な程度見出され得る他の物質を実質的に含まないことを意味する。特に、このポリペプチドは十分に純粋であり、その宿主細胞内にある、例えば抗体の作製、シークエンシングまたは医薬品の製造に有用となるような、他の生物学的成分を実質的に含まない。本明細書にて開示したポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を考慮して、当該技術分野において既知の技術により、実質的に純粋なポリペプチドを製造してよい。本発明の実質的に純粋なポリペプチドは、医薬品中で製薬上許容できる担体と共に混合され得るため、ポリペプチドは、調製物の重量に対して特定の割合のみを占めてよい。それにも関わらず、生物系で関係し得る物質から実質的に分離されているという点で、ポリペプチドは実質的に純粋である。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」とは、参照ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較した、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の程度である。参照アミノ酸配列（例えば配列番号：１）に対して、少なくとも例えば約９５％「配列同一性」のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列の１００個のアミノ酸当たり、約５個以下の変異を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列に同一であることを意味すると理解される。即ち、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の約５％以下を欠失もしくは他のアミノ酸と置換してもよく、または、参照配列内の総アミノ酸の約５％以下の数のアミノ酸を参照配列に挿入してよい。参照配列の変異は、参照アミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端位置、またはこれらの末端位置の間の任意の場所にて、参照配列内のアミノ酸の間で個別に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続した基の中に点在して生じてよい。
【００１９】
一般に配列は、最大の順序のマッチングが得られるようにアラインメントされる。「配列同一性」それ自体は、当技術分野で認識されている意味を有し、既知の技術を用いて計算することができる。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するための方法は複数あるものの、用語「同一性」は、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ（１９８８）Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３）。２つの配列間の配列同一性及び類似性を測定するためのコンピュータープログラムの方法の例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３）、及びＦＡＳＴＤＢが挙げられるが、これらに限定されない。配列同一性及び類似性を測定する方法の例は、Ｍｉｃｈａｅｌｓ（２０１１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓで論じられている。
【００２０】
本発明の一実施形態では、２つ以上のポリペプチド間の配列同一性を測定するために使用するアルゴリズムはＢＬＡＳＴＰである。本発明の別の実施形態において、２つ以上のポリペプチド間の配列同一性を測定するために使用するアルゴリズムは、Ｂｒｕｔｌａｇ（１９９０）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６，２３７−２４５のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢである。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントにおいて、クエリー及び参照配列はアミノ配列である。配列アラインメントの結果はパーセント配列同一性で表す。一実施形態では、パーセント配列同一性を計算するために、アミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントで使用され得るパラメーターとしては、マトリックス＝ＰＡＭ、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００、または、いずれか短いほうの、対象のアミノ配列の長さが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
内部付加または欠失のためではなく、Ｎ末端またはＣ末端付加または欠失のために参照配列がクエリー配列よりも短いかまたは長い場合、パーセント配列同一性を計算する際にＦＡＳＴＤＢプログラムは参照配列のＮ末端及びＣ末端切断または付加を考慮しないため、手動修正を行うことができる。参照配列に対して、ＮまたはＣ末端で切断されるクエリー配列に関しては、パーセント配列同一性は、マッチング／アラインメントされない参照配列に対して、Ｎ及びＣ末端のクエリー配列の残基数を、クエリー配列の全塩基の百分率として計算することにより修正される。ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果はマッチング／アラインメントを決定する。次いで、明記したパラメーターを使用した上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算したパーセント配列同一性からアラインメントの割合を減じ、最終のパーセント配列同一性スコアに到達する。この修正スコアは、アラインメントが互いにどのように「対応する」か、及びパーセント配列同一性を測定する目的のために使用することができる。クエリー配列のＮまたはＣ末端を超えて延びる参照配列の残基を、パーセント配列同一性スコアを手動で調節するために考慮してよい。即ち、比較配列のＮまたはＣ末端とマッチング／アラインメントしない残基を、パーセント配列同一性スコアまたはアラインメントナンバリングを手動調節する際にカウントしてよい。
【００２２】
例えば、９０個のアミノ酸残基のクエリー配列を１００個の残基の参照配列とアラインメントして、パーセント同一性を測定する。欠失はクエリー配列のＮ末端で生じるため、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端における最初の１０個の残基のマッチング／アラインメントを示さない。対にならない１０個の残基は参照配列の１０％を示し（マッチングしないＮ及びＣ末端における残基数／参照配列中の残基の総数）、そのため、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されるパーセント配列同一性スコアから１０％を減じる。残りの９０個の残基が完全にマッチ（１００％アラインメント）すれば、最終のパーセント配列同一性は９０％（１００％アラインメント−１０％のマッチしないオーバハング）となるであろう。別の例において、欠失が内部欠失であることを除いて、９０個の残基クエリー配列を１００個の参照配列と比較する。この場合、クエリーとマッチング／アラインメントしない対象配列のＮまたはＣ末端において残基が存在しないため、ＦＡＳＴＤＢにより計算されるパーセント配列同一性は手動で調節されない。更に別の例において、１１０個のアミノ酸クエリー配列を１００個の残基参照配列とアラインメントし、パーセント配列同一性を測定する。クエリーでの付加はクエリー配列のＮ末端で生じるため、ＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端において最初の１０個の残基のマッチング／アラインメントを示し得ない。クエリー配列の残りの１００個のアミノ酸残基が、参照配列の全長に対して９５％の配列同一性を有する場合、クエリーのＮ末端付加は無視され、参照配列に対するクエリーのパーセント同一性は９５％となるであろう。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「保存的置換」とは、生物学的に類似した別の残基によるアミノ酸残基置換を意味する。本目的のための保存的置換は、以下の表に記載するとおりに規定されてよい。アミノ酸は、物理的性質、並びにタンパク質の二次構造及び三次構造に対する寄与にしたがって分類することができる。当該技術分野において、保存的置換は、あるアミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換することとして認識されている。代表的な保存的置換を以下の表Ｉに示す。
【表２】
2017505124.tif 000003
【００２４】
あるいは、保存的アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ｐｐ．７１−７７に記載されているように、以下の表ＩＩに示すように分類することができる。
【表３】
2017505124.tif 000004
【００２５】
かつ更に他の代替として、代表的な保存的置換を以下の表ＩＩＩで説明する。
【表４】
2017505124.tif 000005
【００２６】
ポリペプチド及びポリヌクレオチドに関して本発明で使用する場合、用語「単離した」とは、（ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された；（ｉｉ）クローニングによる組み換えによって作製された；（ｉｉｉ）切断及びゲル分離等により精製された；または（ｉｖ）例えば化学合成により合成された、ことを意味する。単離ポリヌクレオチドは、当該技術分野において周知の組み換えＤＮＡ技術により速やかに操作可能なものである。したがって、５’及び３’制限酵素切断部位が既知の、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されているベクターに含有されるヌクレオチド配列が単離されたと考えられるが、自然宿主の天然状態に存在するポリヌクレオチド配列は該当しない。単離したポリペプチド及びポリヌクレオチドは実質的に精製されてよいが、その必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内で単離されたポリヌクレオチドは、それが存在する細胞内に、微量の割合のみで物質を含み得るという点で純粋ではない。しかし、当業者に既知の標準的な技術により速やかに操作可能であるため、この用語が本明細書で使用されるように、かかるポリヌクレオチドは単離される。
【００２７】
本明細書で使用する場合、コード配列及び調節配列は、調節配列の影響または制御下で、コード配列の発現または転写を行うように共有結合している場合、「作用可能に結合している」と言われる。コード配列を機能性タンパク質に翻訳するのが望ましい場合、５’調節配列中のプロモーターの誘発がコード配列の転写をもたらす場合に、かつ、２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を引き起こさない、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指示する能力に干渉しない、または（３）対応するＲＮＡ転写産物をタンパク質に翻訳する能力に干渉しない場合に、２つのＤＮＡ配列は作用可能に結合していると言われる。したがって、プロモーター領域が、そのＤＮＡ配列の転写を行い、得られる転写が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されることが可能であるなら、プロモーター領域はコード配列に作用可能に結合しているであろう。
【００２８】
遺伝子発現に必要な調節配列の厳密な性質は種または細胞型により異なり得るが、通常は必要に応じて、転写及び翻訳の開始にそれぞれ関与する、５’非転写及び５’非翻訳配列（例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等）を含まなければならない。特に、かかる５’非転写調節配列は、作用可能に結合した遺伝子の転写制御を行うためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。調節配列もまた、所望によりエンハンサー配列または上流アクティベーター配列を含み得る。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、異なる遺伝子環境間での輸送、または宿主細胞内での発現のための制限及びライゲーションにより所望の配列が挿入され得る、多数のポリヌクレオチドのいずれかであってよい。ベクターは通常ＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターもまた利用可能である。ベクターとしてはプラスミド及びファージミドが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞内で複製可能であり、かつ１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限酵素切断部位により更に性質決定されるものであり、この切断部位において、ベクターは測定可能なように切断され、この間に所望のＤＮＡ配列が、新規の組み換えベクターが宿主細胞内で複製する能力を維持したままとなるようにライゲーションされてよい。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主バクテリア内でプラスミドがコピー数増加するだけ多くの回数、または宿主が有糸分裂により再生する前に、宿主１つ当たりで１回だけ生じてよい。ファージの場合、複製は溶解フェーズ中に能動的に、または溶原フェーズ中に受動的に生じ得る。発現ベクターは、その中で所望のＤＮＡ配列が、調節配列と作用可能に結合し、ＲＮＡ転写産物として発現し得るように制限及びライゲーションにより挿入され得るものである。ベクターは更に、ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた細胞の識別及び選択での使用に好適な１つ以上のマーカー配列を含有してよい。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物に対して、耐性または感受性のいずれかを増加または低下させるタンパク質をコードする遺伝子、活性を当該技術分野において公知の標準的なアッセイにより検出可能な酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、及び形質転換もしくはトランスフェクト細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に明らかに影響を与える遺伝子が挙げられる。幾つかの実施形態では、ベクターは、作用可能に結合するＤＮＡ断片中に存在する構造的遺伝子産物を自律複製及び発現することができる。
【００３０】
新規の抗ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｆ糖タンパク質抗体または抗体断片
本発明は、部分的には、ヘンドラ及びニパウイルスに選択的に結合し、かつこれらを阻害する新規の抗体または抗体断片の開発、単離及び性質決定に由来する。以下でより完全に記載されるように、これらの抗体または抗体断片は、Ｆ糖タンパク質に結合し、ヘンドラ及びニパウイルスの感染を低下またはブロックすることが示されている。ＨｅＶ及びＮｉＶ糖タンパク質Ｆ上で中和エピトープと結合する、抗ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｆａｂ断片のパラトープは、表Ａに記載した免疫グロブリン重鎖及び軽鎖領域、並びに配列番号：１〜配列番号：４８のアミノ酸（ａａ）配列により規定される。更なる抗体、抗体断片及び関連する配列は、配列番号：４９〜８０で開示されている。
【００３１】
幾つかの実施形態では、本発明は、ヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質に選択的に結合する、単離形態及び医薬品中の完全長抗体またはその抗体断片を提供する。同様に、後述のように、本発明は、単離ポリヌクレオチド、ベクター、ポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞、並びに、完全長ヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質抗体及び／または抗体断片をコードする単離ポリペプチドを含む組成物及び医薬品を提供する。最終的に、本発明は、以下により完全に説明するように、ヘンドラウイルス病またはニパウイルス病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ診断、予防及び治療における、これらの抗体及びポリヌクレオチドを用いる方法を提供する。
【００３２】
ヘンドラ及びニパモノクローナル抗体ｍ５Ｂ３（マウス５Ｂ３）、ｈ５Ｂ３（ヒト化５Ｂ３）、及びｈ５Ｂ３．１（ヒト化５Ｂ３．１）の抗原結合Ｆａｂ部分、並びに関係するＶＨ、ＶＬ、ＦＲ及びＣＤＲ領域の完全なアミノ酸配列を表Ａに示して本明細書で開示する。配列番号：１、１７及び３３は、ヘンドラ及びニパモノクローナル抗体のＦｄ断片のアミノ酸配列を開示する。重鎖ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４領域のアミノ酸配列は、（ＦＲ１、配列番号：２、１８及び３４）；（ＣＤＲ１、配列番号：３、１９及び３５）；（ＦＲ２、配列番号：４、２０及び３６）；（ＣＤＲ２、配列番号：５、２１及び３７）；（ＦＲ３、配列番号：６、２２及び３８）；（ＣＤＲ３、配列番号：７、２３及び３９）；並びに（ＦＲ４、配列番号：８、２４及び４０として開示されている。配列番号：９、２５及び４１は、ヘンドラ及びニパ抗体の軽鎖可変断片のアミノ酸配列を開示する。軽鎖ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４領域のアミノ酸配列は、（ＦＲ１、配列番号：１０、２６及び４２）；（ＣＤＲ１、配列番号：１１、２７及び４３）；（ＦＲ２、配列番号：１２、２８及び４４）；（ＣＤＲ２、配列番号：１３、２９及び４５）；（ＦＲ３、配列番号：１４、３０及び４６）；（ＣＤＲ３、配列番号：１５、３１及び４７）；（ＦＲ４、配列番号：１６、３２及び４８）として開示される。
【００３３】
現在、当該技術分野においては、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域を同種または異種特異的抗体の類似の領域で置換できることが確立されている。この技術は、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲ及び／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して機能的抗体を産生する、「ヒト化」抗体の開発及び使用において、最も明確に現れている。したがって、例えば、ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ９２／０４３８１号は、マウスＦＲ領域の少なくとも一部がヒトＦＲ領域により置換されている、ヒト化マウスＲＳＶ抗体の作製及び使用について教示している。
【００３４】
したがって、当業者には明らかとなるであろうとおり、本発明はまた、ヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ及びｓｃＦｖ断片；ヘンドラ及びニパ抗体のＦｃ及び／またはＦＲ１及び／またはＦＲ２及び／またはＦＲ３及び／またはＦＲ４及び／またはＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列により置換されているキメラ抗体；ヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質抗体のＦＲ１及び／またはＦＲ２及び／またはＦＲ３及び／またはＦＲ４及び／またはＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列により置換されているキメラＦ（ａｂ’）２断片；ＦＲ及び／またはＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列により置換されているキメラＦａｂ断片；ＦＲ１及び／またはＦＲ２及び／またはＦＲ３及び／またはＦＲ４及び／またはＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列により置換されているキメラＦｄ断片抗体；並びに、ＦＲ１及び／またはＦＲ２及び／またはＦＲ３及び／またはＦＲ４及び／またはＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列により置換されているｓｃＦｖも提供する。したがって、当業者は、Ｆ糖タンパク質エピトープに対する抗体の特異性を破壊することなく、開示した重鎖及び軽鎖Ｖ領域のＣＤＲアミノ酸配列の全て、またはその一部を含有する、ＣＤＲグラフトまたはキメラ抗体またはその抗体断片の構築物（Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：１５３４−１５３６；及びＴｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１）によりヘンドラ及びニパ抗体を変更することができる。かかるＦＲまたはＣＤＲグラフトまたはキメラ抗体または抗体断片は、動物（例えばウマ）及びヒトにおけるヘンドラまたはニパウイルス感染症の予防及び治療に有効であり得る。
【００３５】
幾つかの実施形態では、ヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質抗体のＦＲ領域の幾つかまたは全てが、他の相同なヒトＦＲ領域により置換されている抗体及び／または抗体断片が作製され得る。また、Ｆｃ部分を置換して、ヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質抗体のＣＤＲの幾つかまたは全てを有するＩｇＡまたはＩｇＭ、及びＩｇＧ抗体を作製してよい。ヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質抗体重鎖ＣＤＲ、そしてより少量の、ヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質抗体の他のＣＤＲを含むことが特に大事である。かかるヒト化抗体及び／または抗体断片は、これらが抗体そのものに対して免疫応答を引き起こさないという点で、特に有用性を有する。
【００３６】
本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質を選択的に結合する抗体またはその抗体断片について開示しており、前記抗体は、配列番号：３、５、７、１９、２１、２３、３５、３７及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号：１１、１３、１５、２７、２９、３１、４３、４５及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。特に、本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質を選択的に結合する抗体またはその抗体断片について開示しており、前記抗体は、配列番号：３５、３７及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号：４３、４５及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。
【００３７】
本発明は、配列番号：３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１を含み得る抗体もしくは抗体断片、配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２を含み得る抗体もしくは抗体断片、及び／または配列番号：３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み得る抗体もしくは抗体断片、について開示している。更に、本発明は、配列番号：４３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１を含み得る抗体もしくは抗体断片、配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を含み得る抗体もしくは抗体断片、及び／または配列番号：４７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み得る抗体もしくは抗体断片、について開示している。
【００３８】
本発明は、配列番号：１、１７または３３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む抗体または抗体断片について開示している。本発明は、配列番号：１、１７または３３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体または抗体断片について開示している。幾つかの実施形態では、抗体断片はｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｄである。
【００３９】
本発明は、配列番号：１９、２５または４１に対して少なくとも９０％または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体または抗体断片について開示している。本発明は、配列番号：９、２５または４１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体または抗体断片について開示している。幾つかの実施形態では、抗体断片はｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２である。
【００４０】
本発明は、配列番号：１、１７または３３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号：９、２５または４１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体または抗体断片について開示している。
【００４１】
本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合する抗体または抗体断片について開示しており、前記抗体または抗体断片は、配列番号：２、１８または３４を含むＦＲ１領域、配列番号：４、２０または３６を含むＦＲ２領域、配列番号：６、２２または３８を含むＦＲ３領域及び配列番号：８、２４または４０を含むＦＲ４領域からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。更に、本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合する抗体または抗体断片について開示しており、前記抗体または抗体断片は、配列番号：１０、２６または４２を含むＦＲ１領域、配列番号：１２、２８または４４を含むＦＲ２領域、配列番号：１４、３０または４６を含むＦＲ３領域、及び配列番号：１６、３２または４８を含むＦＲ４領域からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４２】
幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号：１、１７、３３、９、２５及び４１からなる群から選択される配列を有するＶＨ及びＶＬを含むｓｃＦｖ抗体断片について開示している。ＶＨ及びＶＬは、２〜５０個のアミノ酸の長さを有するコネクターペプチドによって結合されてよい。幾つかの実施形態では、ｓｃＦｖ断片は配列番号：３３のＶＨと配列番号：４１のＶＬを含んでよく、コネクターペプチドは１０〜２５個のアミノ酸を含んでよい。幾つかの実施形態では、コネクターペプチドは配列番号：５２を含んでよい。
【００４３】
幾つかの実施形態では、本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合する抗体または抗体断片に関し、前記抗体または抗体断片は、配列番号：３４を含むＦＲ１領域、配列番号：３６を含むＦＲ２領域、配列番号：３８を含むＦＲ３領域、及び配列番号：４０を含むＦＲ４領域からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号：４２を含むＦＲ１領域、配列番号：４４を含むＦＲ２領域、配列番号：４６を含むＦＲ３領域、及び配列番号：４８を含むＦＲ４領域からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００４４】
本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合するヒト化抗体または抗体断片について開示しており、前記抗体または抗体断片は、配列番号：１７または３３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号：１７または３３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合するヒト化抗体または抗体断片について開示しており、前記抗体または抗体断片は、配列番号：２５または４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態では、抗体または抗体断片は、配列番号：２５または４１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４５】
幾つかの実施形態では、本発明は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）保管物ＰＴＡ−１２０５７５として保管したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞内に含有されるプラスミド上にコードされた抗体の重鎖及び／または軽鎖可変領域に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖及び／または軽鎖可変領域を含む抗体について開示している。幾つかの実施形態では、本発明は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）保管物ＰＴＡ−１２０５７５として保管したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞内に含有されるプラスミド上にコードされた抗体の重鎖及び軽鎖可変領域に対して同一の配列を有する重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体について開示している。
【００４６】
本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質エピトープに選択的に結合するヒト化抗体または抗体断片について開示しており、前記抗体または抗体断片はヘンドラまたはニパウイルス感染症を阻害する。本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質エピトープに選択的に結合するヒト化抗体または抗体断片について開示しており、前記抗体または抗体断片はウイルス宿主の膜融合を妨げる。本発明は、ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質エピトープに選択的に結合するヒト化抗体または抗体断片について開示しており、前記抗体または抗体断片はＦ糖タンパク質のフォールディングをブロックする。幾つかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス宿主の膜融合を妨げることにより、ヘンドラまたはニパウイルス感染症を阻害する。幾つかの実施形態では、抗体または抗体断片は、Ｆ糖タンパク質のフォールディングをブロックすることにより、ウイルス宿主の膜融合を妨げる。
【００４７】
本発明に従い、非ヒト配列を含むキメラ抗体または抗体断片を作製することもまた可能である。したがって、例えばマウス、ヒツジ、ウマ、ウシまたは他の哺乳類のＦｃまたはＦＲ配列を使用して、ヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質抗体のＦｃまたはＦＲ領域の幾つか、または全てを置き換えることができる。ＣＤＲの幾つかも同様に置き換えられてよい。かかるキメラ抗体または抗体断片は、ヒトヘンドラ及びニパＦ糖タンパク質抗体のＣＤＲと混ぜ合わせた非ヒト免疫グロブリン配列を有する。短期間で、または免疫抑制された個体において、とりわけ、これらの抗体または抗体断片を使用してよい。ヘンドラ及びニパウイルスはまた動物にも感染し、かかる抗体を短期間、または免疫抑制された対象に使用することができる。
【００４８】
播種または予防での使用のために、幾つかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を含む完全長抗体分子である。かかる完全長抗体は、より小さい抗体断片（例えばＦａｂ）よりも長い半減期を有してよく、静脈内、腹腔内、筋肉内、膣内、皮下または経皮投与に一層好適である。
【００４９】
幾つかの実施形態では、キメラＦａｂ断片を含むがこれに限定されないＦａｂ断片及び他の抗体断片を使用してよい。ＦａｂはＦ（ａｂ’）２、及び本治療法での全免疫グロブリン分子に優る幾つかの利点をもたらす。まず、Ｆａｂはコグネイト抗原に対するただ１つの結合部位を有するため、免疫複合体の形成が起きない一方で、かかる複合体は、二価のＦ（ａｂ’）２及び全免疫グロブリン分子が標的抗原と遭遇した際に産生されることができる。免疫複合体が組織に付着することで拒絶炎症反応が生じる可能性があるため、このことはある程度重要である。第２に、Ｆａｂ断片はＦｃ領域を欠いているため、これらは通常、Ｆｃにより活性化（例えば補体カスケードの活性化）される拒絶炎症反応を引き起こすことができない。第３に、小さなＦａｂ分子の組織透過は、より大きな全抗体の組織透過よりも一層良好となりやすい。第４に、Ｆａｂ断片は大腸菌等の細菌内で容易かつ安価に作製できるが、全免疫グロブリン抗体分子は、有用量の産生のためには哺乳類細胞が必要である。後者には、免疫グロブリン配列を哺乳類細胞内にトランスフェクションし、結果的に形質転換を伴うことを必要とする。次いで、これらの配列の増幅は正確な選択手順により達成されなければならず、安定した形質転換細胞が同定及び維持されなければならない。全免疫グロブリン分子は培養液内で、安定して形質転換した高発現哺乳類細胞により作製されなければならないが、これには血清含有培地に付随する課題が伴う。対照的に、Ｆａｂを大腸菌内で作製することでこれらの課題が取り除かれ、大型の発酵槽の中でこれらの抗体断片を作製することが可能となり、この抗体断片は細胞培養由来の生成物よりも安価である。
【００５０】
Ｆａｂ断片に加えて、ヘンドラ及びニパ抗体により規定されるエピトープに対して結合特異性を有する、より小さな抗体断片及びエピトープ結合ペプチドもまた、ウイルスの結合または阻害に使用することができる。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）の方法に従い、一本鎖抗体を構築することができる。一本鎖抗体断片（例えばｓｃＦｖ）は、フレキシブルなリンカー部位により結合している軽鎖及び重鎖の可変領域を含む。更に小さいのは、単一ドメイン抗体またはＦｄとして知られている抗体断片であり、これは単離したＶＨ単一ドメインを含む。単一ドメイン抗体が由来する完全長抗体の結合特異性の少なくとも幾つかを有する単一ドメイン抗体を得るための技術は、当技術分野において既知である。
【００５１】
過度な実験をすることなく、変異した、またはキメラ抗体または抗体断片が、ヘンドラ及びニパ抗体と同じ特異性を有するかどうかを測定することは、前者が後者を、Ｆ糖タンパク質への結合からブロックするかどうかを確認することにより、可能である。ヘンドラまたはニパ抗体の結合の低下により示されるように、試験されている抗体またはその断片が既知のヘンドラまたはニパ抗体と競合するのであれば、２つの抗体及び／または抗体断片は同一の、または狭い間隔で配置されたエピトープに結合する可能性が高い。抗体が、既知のヘンドラ及びニパ抗体または抗体断片への特異性を有するかどうかを測定する更に別の方法は、既知のヘンドラまたはニパ抗体を、通常反応するＦ糖タンパク質と共に予めインキュベートした後、試験されている抗体または抗体断片を添加し、試験されている抗体または抗体断片が、Ｆ糖タンパク質を結合する能力を阻害されたかどうかを測定することである。試験した抗体または抗体断片が阻害された場合、おそらく、この抗体または抗体断片は、本発明の既知のヘンドラ及びニパ抗体または抗体断片と同一、または機能的に等価なエピトープ及び特異性を有する可能性が高い。ヘンドラ及びニパ抗体または抗体断片のスクリーニングはまた、ヘンドラまたはニパウイルスを利用し、ｍＡｂがウイルスを中和するかどうかを測定することによっても実施することができる。
【００５２】
本発明の抗体または抗体断片を使用することにより、ここにおいて、他の抗体または抗体断片をスクリーニングするために使用可能な抗イディオタイプ抗体または抗体断片を作製し、抗体または抗体断片が本発明の抗体と同一の結合特異性を有するかどうかを測定することが可能である。更に、かかる抗イディオタイプ抗体または抗体断片を能動免疫化に使用することができる（Ｈｅｒｌｙｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１００−１０２）。かかる抗イディオタイプ抗体または抗体断片は、既知のハイブリドーマ技術を使用して作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）。抗イディオタイプ抗体または抗体断片は、対象の細胞株により産生される抗体上に存在する固有の決定基を認識する抗体または抗体断片である。これらの決定基は抗体の超可変領域に位置する。所与のエピトープに結合し、そのために抗体の特異性の原因となるのはこの領域である。抗イディオタイプ抗体は、対象の抗体または抗体断片により動物を免疫化することで調製することができる。免疫を有する動物は免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識してこれに応答し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体を産生する。本発明の抗体または抗体断片に特異的な免疫を有する動物の抗イディオタイプ抗体または抗体断片を使用することにより、免疫化に用いたハイブリドーマの抗体または抗体断片と同一のイディオタイプを有する他のクローンを同定することが可能である。２つの細胞株の抗体または抗体断片間でのイディオタイプ同一性は、２つの抗体及び／または抗体断片が、同一のエピトープ決定基を認識することに関しては同じであることを示す。したがって、抗イディオタイプ抗体または抗体断片を使用することにより、同一のエピトープ特異性を有する抗体または抗体断片を発現する他のハイブリドーマを同定することが可能である。
【００５３】
抗イディオタイプ技術を使用して、エピトープに類似する抗体または抗体断片を作製することもまた可能である。例えば、第１の抗体に対して作製した抗イディオタイプ抗体または抗体断片は、超可変領域内に結合領域を有し、この結合領域は、第１の抗体により結合したエピトープのイメージである。したがって、抗イディオタイプ抗体結合領域は抗原として効果的に機能するため、抗イディオタイプ抗体を免疫付与に使用することができる。
【００５４】
幾つかの実施形態では、本発明は、重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域、並びにこれらの保存的置換を含むＦ糖タンパク質抗体及び／または抗体断片に関する。抗体または抗体断片の特異的配列については、上述した通りである。一態様において、置換は事実上保存的置換であるが、本発明は非保存的置換も包含する。
【００５５】
本発明のペプチドまたはポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の変異を有するポリペプチドを含むことを意図していると理解されるべきである。例として、変異は事実上共有結合であり、例えばポリマー、脂質、他の有機及び無機部位との化学結合を含む。かかる誘導体を調製してポリペプチドの循環半減期を増大させることができるか、または誘導体を設計して所望の細胞、組織もしくは臓器に対するポリペプチドの標的能力を改善することができる。同様に、本発明は更に、共有結合修飾をしたＦＧＦＢＰ３またはその変異体を包含し、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール等の、１つ以上の水溶性ポリマーの結合を含む。
【００５６】
抗ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｆ糖タンパク質抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチド
本明細書の、Ｆ糖タンパク質に対する、ヘンドラ及びニパ抗体または抗体断片の重鎖Ｆｄ及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の開示を考えれば、当業者はここで、本抗体をコードするか、または上述の種々の抗体断片もしくはキメラ抗体をコードするポリヌクレオチドを作製することが可能となる。かかるポリヌクレオチドは他のポリヌクレオチドと作用可能に結合して、本発明の抗体のクローニングまたは発現用の組み換えベクターを形成すると考えられている。本発明には、原核細胞または真核細胞の形質転換、トランスフェクションまたは遺伝子治療用に関係ない、コード配列またはその一部を含有する組み換えベクターが含まれる。かかるベクターは、当業者に既知の従来の分子生物学技術を使用して調製することができ、フレームワーク及びＣＤＲまたはこれらの一部を含み、並びに、搬出または分泌のためのシグナル配列を有する好適なプロモーター（Ｗｈｉｔｔｌｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．１９８７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １：４９９−５０５  ａｎｄ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０２４−１０２７）またはこれを有しない好適なプロモーター（Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：７８８９−７８９３  ａｎｄ  Ｄｕａｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：５０７５−５０７９）を含む、ヘンドラ及びニパ抗体の免疫グロブリンＶ領域に対するＤＮＡコード配列を含むであろう。かかるベクターは、原核細胞（Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；  Ｗａｒｄ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６；  Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１−５９７；及びＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２）、もしくは真核細胞（Ｗｈｉｔｔｌｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．１９８７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １：４９９−５０５  ａｎｄ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１０２４−１０２７）の中に形質転換またはトランスフェクションすることができるか、または当業者に既知の従来技術によって、遺伝子治療に使用することができる（Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：７８８９−７８９３  ａｎｄ  Ｄｕａｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：５０７５−５０７９）。
【００５７】
本発明の発現ベクターとしては、本発明の抗体の１つをコードするヌクレオチド配列に作用可能に結合した調節配列が挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「調節配列」とは、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写に必要であるかもしくは転写を補助し、かつ／または得られた転写物を翻訳して所望のポリペプチドを得るのに必要であるかもしくはこれを補助するヌクレオチド配列を意味する。調節配列としては、５’配列（オペレーター、プロモーター及びリボソーム結合配列等）、並びに３’配列（ポリアデニル化シグナル等）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のベクターは、５’リーダーまたはシグナル配列、融合生成物をコードしてタンパク質精製を補助する５’または３’配列、及び形質転換細胞の識別または選択を補助する種々のマーカーを任意に含んでもよい。適切なベクターの選択及び設計は、当業者の能力及び自由裁量内である。その後の抗体の精製は、当該技術分野において公知の種々の標準的な方法のいずれかにより達成されてよい。
【００５８】
幾つかの実施形態では、抗体または抗体断片をスクリーニングためのベクター は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向にかけて、（１）原核細胞分泌シグナル領域、（２）本発明のポリペプチド、及び任意に（３）融合タンパク質領域、を含有する融合ポリペプチドをコードし、発現することが可能なヌクレオチド配列を含有する組み換えＤＮＡ分子であってよい。ベクターは、融合ポリペプチドを発現するＤＮＡ調節配列、例えば原核細胞調節配列を含んでいても含んでいなくてもよい。かかるベクターは当業者により構築可能であり、Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５１３１７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８）；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，Ｒ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ  １１１−１１８）；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３）により説明されている。
【００５９】
融合ポリペプチドは、本発明の抗体または抗体断片の精製に有用であってよい。融合ドメインは例えば、Ｎｉ＋カラム上での精製を可能にするポリ−Ｈｉｓ尾部、または市販されているベクターｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のマルトース結合タンパク質を含んでよい。幾つかの実施形態では、融合ドメインは繊維状ファージ膜アンカーである。このドメインはモノクローナル抗体のファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするのに特に有用であるが、抗体の大量生産では実用性が低くなり得る。幾つかの実施形態では、繊維状ファージ膜アンカーは、繊維状ファージ粒子のマトリックスと会合可能なｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩコートタンパク質のドメインであるため、融合ポリペプチドをファージ表面に組み込んで、固相が特異的抗原またはエピトープに結合することを可能にし、またこれにより、ファージミドベクターによりコードされた特異的抗体または断片の濃縮及び選択が可能になる。
【００６０】
分泌シグナルは通常、タンパク質を宿主細胞の膜（例えばグラム陰性細菌のペリプラズム膜）に標的化する、タンパク質のリーダーペプチドドメインである。幾つかの実施形態では、大腸菌に対する分泌シグナルは、ｐｅｌＢ分泌シグナルである。ｐｅｌＢタンパク質のリーダー配列は以前に、融合タンパク質に対する分泌シグナルとして使用されている（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｓａｓｔｒｙ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：５７２８−５７３２；及びＭｕｌｌｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：８０９５−８０９９）。本発明にて有用な、大腸菌からの他の分泌シグナルポリペプチドドメインに対するアミノ酸残基配列は、Ｎｅｉｄｈａｒｄ，Ｆ．Ｃ．（ｅｄ．），１９８７  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃに見出すことができる。
【００６１】
大腸菌内での高レベルでの遺伝子発現を得るために、大量のｍＲＮＡを作製するための強力なプロモーターだけでなく、ｍＲＮＡが確実に効率的に翻訳されるためのリボソーム結合部位もまた使用することが必要な場合がある。大腸菌において、 リボソーム結合部位は、開始コドン（ＡＵＧ）、及び開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置する、３〜９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｎｅ  Ｊ．ａｎｄ  Ｄａｌｇａｒｎｏ  Ｌ．１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：３４−３８）。シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列と呼ばれるこの配列は、大腸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端に相補的である。リボソームがｍＲＮＡ、及びｍＲＮＡの３’末端の配列に結合することは、複数の要因：１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端のＳＤ配列との相補性の程度；ＳＤ配列とＡＵＧとの間にあるスペーシング；及び、リボソーム結合に影響を及ぼす、ＡＵＧに続くヌクレオチド配列の影響を受ける。３’調節配列は、フレーム内で少なくとも１つの終結（終止）コドンを規定し、異種融合ポリペプチドに作用可能に結合している。
【００６２】
原核細胞発現宿主に関し、幾つかの実施形態では、使用したベクターは、複製またはレプリコンのための原核細胞の起点、即ち、原核生物宿主細胞内、例えばそれで形質転換した細菌宿主細胞内で、自律複製を指示し、染色体外での組み換えＤＮＡ分子の維持を指示する能力を有するＤＮＡ配列を含む。かかる複製起点は当該技術分野において周知である。幾つかの実施形態では、複製起点は、宿主生物内で効率的なものである。幾つかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。幾つかの実施形態では、大腸菌内でのベクターの使用に関し、複製の起点は、ｐＢＲ３２２及び種々の他の一般的なプラスミドに見出されるＣｏｌＥＩである。幾つかの実施形態では、起点はｐＡＣＹＣ及びその誘導体に見出されるｐ１５Ａ複製起点である。ＣｏｌＥＩ及びｐ１５Ａレプリコンは分子生物学で幅広く利用されており、種々のプラスミドで利用可能であり、かつＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓにより説明されている。
【００６３】
加えて、原核細胞レプリコンを含むこれらの実施形態は、発現により選択有利性、例えばそれで形質転換した細菌宿主に対する薬剤耐性が付与される遺伝子もまた含んでよい。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与するものである。ベクターは通常、翻訳可能なＤＮＡ配列の挿入のために便利な制限酵素切断部位もまた含有している。代表的なベクターは、プラスミドｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９、並びに由来ベクター、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の供給元から市販されているものである。
【００６４】
本発明の抗体または抗体断片が重鎖配列及び軽鎖配列の両方を含む場合、これらの配列は別々のベクターでコードされてもよいし、またはより便利には、単一のベクターにより発現されてもよい。重鎖及び軽鎖は、翻訳後または分泌後に、天然抗体分子のヘテロ二量体構造を形成してよい。かかるヘテロ二量体抗体は、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合により安定化されてもされなくてもよい。
【００６５】
本発明の完全長抗体、もしくは本発明のｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂまたはＦｖ断片等のヘテロ二量体抗体もしくは抗体断片を発現するためのベクターは、翻訳可能な第１及び第２のＤＮＡ配列を受けて発現するのに適した組み換えＤＮＡ分子である。即ち、ヘテロ二量体抗体を発現するためのＤＮＡ発現ベクターは、２つの翻訳可能なＤＮＡ配列を、ベクター内に存在する２つの別々のカセット内に独立してクローニング（挿入）し、ヘテロ二量体抗体の第１及び第２のポリペプチドを発現するための２つの別々のシストロンを形成するシステムを提供する。２つのシストロンを発現するためのＤＮＡ発現ベクターは、ジシストロン性発現ベクターと呼ばれる。
【００６６】
幾つかの実施形態では、ベクターは、インサートＤＮＡへの直接のライゲーションに適したヌクレオチドの配列を介して作用可能に結合した、上流及び下流ＤＮＡ調節配列を含む第１のカセットを含む。上流の翻訳可能配列は、上述のとおり分泌シグナルをコードしてよい。カセットは、インサートの翻訳可能ＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）が、直接のライゲーションに適したヌクレオチド配列を介してカセット内に直接挿入される際に作製される、第１の抗体ポリペプチドを発現するためのＤＮＡ調節配列を含む。
【００６７】
ジシストロン性発現ベクターはまた、第２の抗体ポリペプチドを発現するための第２のカセットも含有する。第２のカセットは、上述の通り、分泌シグナルをコードし得る第２の翻訳可能ＤＮＡ配列を含み、この配列は、カセットのリーディングフレーム内で少なくとも１つの終止コドンを通常規定するベクターの下流ＤＮＡ配列に対する直接的ライゲーションに適したヌクレオチド配列を介して、カセットの３’末端に作用可能に結合している。第２の翻訳可能ＤＮＡ配列は、その５’末端において、５’成分を形成するＤＮＡ調節配列に作用可能に結合している。第２のカセットは、翻訳可能ＤＮＡ配列（インサートＤＮＡ）の挿入に際し、インサートＤＮＡによりコードされたポリペプチドを用いて、分泌シグナルを含む第２の融合ポリペプチドを発現することが可能である。
【００６８】
本発明の抗体または抗体断片は更に、真核細胞、例えばＣＨＯ細胞、ヒトまたはマウスハイブリドーマ、不死化Ｂ−リンパ芽細胞等により作製することができる。この場合、ベクターは、抗体ポリペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作用可能に結合した真核細胞調節配列内で構築される。適切な真核細胞ベクターの設計及び選択は、当業者の能力及び自由裁量内である。その後の抗体の精製は、当該技術分野において公知の種々の標準的な方法のいずれかにより達成されてよい。
【００６９】
本発明の抗体または抗体断片は更に、植物で作製されてもよい。１９８９年に、Ｈｉａｔｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：７６−７８は初めて、機能的抗体がトランスジェニック植物で作製可能であることを示した。この時以来、抗体（または「植物抗体（ｐｌａｎｔｉｂｏｄｙ）」）作製のための植物の開発に、多量の労力が投入されてきた（概説にはＧｉｄｄｉｎｇｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：１１５１−１１５５；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｅｍａｎｓ，Ｎ．２０００  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  ９：２７９−２９９を参照のこと）。組み換え抗体は種子、塊茎または果物を標的にすることができ、かかる植物組織に抗体を投与することで、発展途上国及び世界中での免疫付与プログラムが有利なものとなる。
【００７０】
別の実施形態において、本発明は、本発明のベクターにより形質転換またはトランスフェクションした、すなわち本発明のベクターを含む、原核細胞及び真核細胞両方の宿主細胞を提供する。
【００７１】
診断用及び医薬品用抗ＨｅＶ及びＮｉＶ  Ｆ糖タンパク質抗体の調製
本発明はまた、本発明の抗体もしくは抗体断片、または本発明の抗体もしくは抗体断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む診断用または医薬組成物の調製方法に関し、この医薬組成物は、ヘンドラウイルス病またはニパウイルス病の免疫予防または免疫療法に使用される。医薬品は製薬上許容できる担体を含む。本明細書で使用する場合、かかる単体は、有効成分の生物活性の有効性に干渉しない無害物質を意味する。用語「生理学上許容できる」とは、生物学的システム、例えば細胞、細胞培養液、組織または生体と適合性のある無害物質を意味する。担体の特徴は投与経路に応じて異なるであろう。生理学上及び製薬上許容できる担体としては、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、及び当該技術分野において周知の他の物質が挙げられる。
【００７２】
本発明の抗ヘンドラ及び抗ニパＦ糖タンパク質抗体または抗体断片は、診断用途及び／または医薬品用途で使用するための種々の方法により標識されてよい。当業者に既知の、多くの異なる標識及び標識方法が存在する。本発明で使用可能な標識の種類の例としては、酵素、放射性同位体、蛍光性化合物、コロイド金属、化学発光化合物、及び生物発光化合物が挙げられる。当業者は、本発明の抗体もしくは抗体断片に結合する他の好適な標識を知っているか、または通常の実験を用いてかかる標識を確認することができるであろう。更に、これらの標識の、本発明の抗体または抗体断片への結合は、当業者に一般的な標準的な技術を用いて行うことが可能である。
【００７３】
より大きな感度をもたらし得る別の標識技術は、抗体を低分子量ハプテンに結合させることからなる。これらのハプテンは次いで、第２の反応により特異的に変化することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応可能なジニトロフェノール、ピリドキサールもしくはフルオレセインを用いることが一般的である。
【００７４】
本発明のアッセイで用いるための物質は、キットの調製に理想的に適している。かかるキットは、区画に分けられて、密接領域（ｃｌｏｓｅ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）内で１つ以上の容器手段、例えばバイアル瓶、チューブ等を受容するキャリア手段を含んでよく、各容器手段は、本方法で使用される別々の要素の１つを含む。例えば、容器手段の１つは、検出可能に標識されるかまたは標識可能な、本発明の抗体及び／または抗体断片を含んでよい。キットはまた、緩衝液を含有する容器、及び／または、酵素標識もしくは蛍光標識等のレポーター分子に結合した、アビジンもしくはストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質といったレポーター手段を含む容器を有してもよい。
【００７５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出及び診断
本発明の抗体または抗体断片は、例えば液相で使用可能であるか、または固相担体に結合可能な免疫学的検定といったｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用に適している。更に、これらの免疫学的検定における抗体または抗体断片は、種々の方法により検出可能に標識することができる。本発明の抗体または抗体断片を利用可能な免疫学的検定の種類の例は、直接または間接フォーマットのいずれかにおいて競合的及び非競合的な免疫学的検定である。かかる免疫学的検定の例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイがある。本発明の抗体または抗体断片を使用した抗原の検出は、生理学的サンプルでの免疫組織化学アッセイを含む、フォワード、リバースまたは同時モードのいずれかで実行される免疫学的検定を利用して行うことができる。当業者は過度な実験をすることなく、他の免疫学的検定フォーマットを知っているか、または速やかに理解することができるであろう。
【００７６】
本発明の抗体または抗体断片は多くの異なる担体に結合可能であり、ヘンドラまたはニパウイルスの存在を検出するために使用することができる。既知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース並びにマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために可溶性であるか不溶性であるかのいずれかとすることができる。当業者は結合抗体に対する他の好適な担体を知っているか、または通常の実験を用いてかかる標識を確認することができるであろう。
【００７７】
本発明の目的のために、ヘンドラまたはニパウイルスは、生物学的流体及び組織内に存在する場合、本発明の抗体または抗体断片により検出することができる。検出可能量のヘンドラまたはニパウイルスを含有する任意のサンプルを使用することができる。サンプルは、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清等の液体；組織、排泄物等の固体または半固体；あるいは、組織学診断で一般に用いられるもの等の固体組織とすることができる。
【００７８】
ヘンドラまたはニパウイルスのｉｎ  ｖｉｖｏ検出
本発明の抗体または抗体断片を抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ検出に用いる場合、検出可能に標識された抗体または抗体断片を、診断上効果的な用量で与える。用語「診断上効果的な」とは、検出可能に標識された抗体を十分な量で投与することで、抗体が特異的であるヘンドラまたはニパウイルス抗原を有する部位の検出が可能になることを意味する。
【００７９】
投与される、検出可能に標識された抗体または抗体断片の濃度は、ヘンドラまたはニパウイルスの結合がバックグランドと比較して検出可能であるほど十分でなければならない。更に、検出可能に標識された抗体または抗体断片は、最良の標的：バックグランドシグナル比を与えるために、循環系より速やかに取り除かれることが望ましい。
【００８０】
一般に、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断のための、検出可能に標識された抗体または抗体断片の用量は、年齢、性別、及び個体の病気の程度等の因子に応じて変化するであろう。抗体または抗体断片の用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇで変化することができる。かかる用量は、例えば、アッセイされる組織に複数回の注入が行われるかどうか、及び、当業者に既知の他の因子に応じて変化し得る。
【００８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの診断イメージングに関し、利用可能な検出機器の種類は、適切な放射性同位体を選択するための主要因子である。選択される放射性同位体は、所与の機器の種類で検出可能な種類の崩壊を有していなければならない。ｉｎ  ｖｉｖｏ診断のために放射性同位体を選択する際の、更に別の重要な因子は、放射性同位体の半減期が、標的による最大吸収時にも検出可能である程度に十分長いが、宿主に関しては、有害な放射線が許容可能である程度に十分に短いことである。理想的には、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに使用する放射性同位体は、粒子放射を行わないが、１４０〜２５０ｋｅＶの範囲で多数の光子を産生し、この光子は従来のガンマカメラにより速やかに検出することができる。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ診断に関して、放射性同位体は、中間官能基を使用することにより直接または間接的に、抗体または抗体断片に結合することができる。多くの場合、金属イオンとして存在する放射性同位体を結合するために使用される中間官能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）及びエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、並びに他の類似の分子等の二官能性キレート剤である。本発明の抗体に結合可能な金属イオンの典型例は、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ及び２０１Ｔｌである。
【００８３】
本発明の抗体または抗体断片はまた、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるようなｉｎ  ｖｉｖｏ診断用の常磁性同位体により標識することもできる。一般に、診断イメージングを可視化する任意の従来の方法を利用することができる。通常は、ガンマ線及び陽電子放出放射性同位体を、ＭＲＩのカメライメージング及び常磁性同位体に使用する。かかる技術において特に有用である元素としては、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ及び５６Ｆｅが挙げられる。
【００８４】
本発明の抗体または抗体断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで使用して、ヘンドラウイルス病またはニパウイルス病治療の過程を監視することができる。したがって、例えばヘンドラもしくはニパウイルスに感染した細胞の数の増減、または体内もしくは種々の体液に存在するヘンドラもしくはニパウイルスの濃度の変化を測定することにより、ヘンドラウイルス病またはニパウイルス病を緩和するための特定の治療レジメンが効果的であるかどうかを判定することが可能となるであろう。
【００８５】
ヘンドラウイルス病及びニパウイルス病の予防及び治療
抗体または抗体断片はまた、ヒト及び他の動物の両方における、ヘンドラウイルス病及びニパウイルス病の予防にも、及び治療としても使用することができる。本発明の抗体に関して本明細書で使用する場合、用語「予防」及び「治療」とは、予防的用途及び治療用投与の両方、並びに、実質的に純粋なポリペプチド生成物による受動免疫化、及び生成物またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列の転写による遺伝子治療の両方を意味する。したがって、抗体または抗体断片は、ヘンドラウイルス病及びニパウイルス病の可能性及び／または重症度を低減するために、高リスクの対象に投与することが可能であるか、または活性のヘンドラもしくはニパウイルス感染症を既に発症している対象に投与することができる。本発明では、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片もまた、ヘンドラまたはニパウイルスに結合するかまたはこれらを中和するため、感染症を治療するために使用することができる。
【００８６】
本明細書で使用する場合、本発明の抗体または抗体断片の「予防的有効量」とは、投与後１ヶ月〜２ヶ月、またはそれ以上といった妥当な期間、ヘンドラまたはニパウイルス感染症から個体を保護するのに望ましい効果を生み出すのに十分多くの用量である。しかし、予防的有効量とは、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全等の副作用を引き起こすほど多くの用量ではない。通常、予防的有効量は対象の年齢、状態及び性別、並びに対象における病気の程度に応じて異なる場合があり、当業者により決定することができる。予防的有効量の用量は、任意の合併症の際には、個々の医師または獣医により調整されることができる。予防的有効量は、１回以上の投与（初回投与及び追加投与）において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇで変化してよい。
【００８７】
本明細書で使用する場合、本発明の抗体または抗体断片の「治療上有効な量」とは、ヘンドラウイルス病もしくはニパウイルス病の症状が緩和されるか、または感染の可能性が低下する所望の効果を生み出すのに十分な多さの用量である。しかし、治療上有効な量とは、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全等の副作用を引き起こすほど多くの用量ではない。通常、治療上有効な量は対象の年齢、状態及び性別、並びに対象における病気の程度に応じて異なる場合があり、当業者により決定することができる。治療上有効な量の用量は、任意の合併症の際には、個々の医師または獣医により調整されることができる。治療上有効な量は、１日または数日間における、毎日の１回以上の用量投与において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇで変化してよい。幾つかの実施形態では、ウイルス複製の「リバウンド」の発生を避けるために、抗体の投与は２〜５日、またはそれ以上連続した日の間行われる。
【００８８】
本発明の抗体または抗体断片は、注射により、または時間の経過と共に徐々に注入することにより投与することが可能である。本発明の抗体または抗体断片の投与は例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、膣内、皮下または経皮投与であってよい。抗体を含有する注射液または注入液デリバリーシステムを調製するための技術は、当業者には周知である。通常、かかるシステムは、抗体の生物学的性質、例えばパラトープ結合能を著しく損なわない構成成分を利用しなければならない（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照）。当業者は速やかに、過度の実験を行うことなく、抗体注射液または注入液を作製するための種々のパラメーター及び条件を決定することができる。
【００８９】
非経口的投与のための調製物としては、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、及び注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）がある。水性キャリアとしては、水、アルコール溶液／水溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられ、生理食塩水及び緩衝培養液を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル油または不揮発性油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流体及び栄養補充液、電解質補液（例えばリンゲルデキストロースに基づくもの）等が挙げられる。防腐剤及び他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤等もまた存在してよい。
【００９０】
ｍ５Ｂ３  ｓｃＦｖ、ｈ５Ｂ３及びｈ５Ｂ３．１の産生
幾つかの可溶性形態のＮｉＶまたはＨｅＶ  Ｆ（ｓＦ）を改変し、組み換えｓＦ構築物を作製した。異なる形態のＮｉＶ及びＨｅＶ  ｓＦを発現する安定した２９３Ｔ細胞の培養上清を収集し、親和性クロマトグラフィー精製の前にＳプロテインアガロースビーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）により分類した。Ｓアガロースで精製した物質をＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００分取グレードゲル濾過カラムにアプライし、純粋な三量体を単離した。Ｂａｌｂ／ｃＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、表１に示す、異なる精製済可溶ウイルス性抗原を用いて、３０日間隔で４回播種した。示した際に、ｓＦを切断した酵素Ｓタグを免疫付与に使用した。各マウスを免疫付与の前に出血させ、血清（プレブリード）を陰性対照として得た。一度の免疫付与において、各動物に、Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｓｉｇｍａ）で混合したｓＦ（１２μｇ）を与えた。２５ｇａの針を用いて、それぞれ２つの部位に０．０５ｍＬの腹腔内及び皮下注射により投与して、０．１ｍＬの用量で各免疫付与を行った。アジュバント及び抗原配合物は、メーカーの取扱説明書に基づいて作製した。マウスは３回目の免疫付与の後７〜１０日で出血させ、血清サンプルを回収した。最終の出血を収集するためにマウスを犠牲にする４日前に、アジュバントなしで別の免疫付与を実施した。ｓＦ糖タンパク質構築物は全て、免疫化マウス間で強力な抗体応答を誘発する。各マウスのＥＬＩＳＡ終点におけるタイターは全ての場合において１：３２０，０００より大きく、ヒーラー細胞で発現する内在性完全長Ｆを沈殿することができた。ほとんどの場合、免疫化マウスから回収した血清はＮｉＶ及びＨｅＶウイルス感染を阻害する。
【００９１】
ｓＦの一形態は、膜貫通（ＴＭ）及び細胞質尾部（ＣＴ）ドメインを欠失させ、３量体コイルドコイル（ＧＣＮｔ）ドメインを付加することにより作製した。ＧＣＮｔを付加した構築物（ｓＦＧＣＮｔ）は、マウス内で交差反応性へニパウイルスを中和する抗体を誘発した。加えて、ｓＦＧＣＮｔ構築物は、プロテアーゼ切断に続いて熱処理することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発することができる。一連のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、異なるｓＦ、例えばＧＣＮｔを付加していないＮｉＶ  ｓＦｄＦｐ及びＮｉＶ  ｓＦＧＣＮｔにより免疫化したマウスから誘導した。
【００９２】
免疫化マウスのリンパ球を、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、市販されているＳｐ２／０細胞株（マウス骨髄腫細胞）と融合させ、標準的な方法により、ハイブリドーマ細胞を選択した。マウス骨髄腫細胞と融合させたリンパ球を、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンサプリメント（ＨＡＴ，ｌｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）を含む培地中の培養液に通すことで選択した。ウイルス性抗原と反応性である抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を、各細胞から回収した上清を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により同定した。ｓＦを結合するｍＡｂを分泌するコロニーを単離し、少なくとも２回限界希釈に曝してクロナリティーを確保した。ヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びに組み換えマウスのインターロイキン６（１００Ｕ／ｍＬ）（ｒｌ  Ｌ−６，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充したＳＦＭ４ＭＡｂ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）内で高密度で増殖させたハイブリドーマ細胞から、精製ｍＡｂを調製した。使用済み培養液の上清内の抗体を、プロテインＧセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓ）ビーズ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。各調製物の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて測定した。
【００９３】
融合プレートからの培養液上清のＥＬＩＳＡスクリーニングに基づき、ｓＦと反応する抗体を分泌する、６０個を超えるハイブリドーマクローンを同定した。２４個のクローンを、限界希釈による更なる精製のために選択し、ｍＡｂ単離に対して安定なハイブリドーマ株を生成し、これらのｍＡｂのうち１９個を性質決定のために使用した。１８個のｍＡｂはＮｉＶ及びＨｅＶ  Ｆに対して交差反応性であり、１個はｍＡｂライブラリー間でＮｉＶ特異的であり、１３個は完全長Ｆ及びｓＦＧＣＮｔ（融合前のＦ構築物）を沈殿することが可能であり、残りの１つはｓＦｄＦｐ（融合後Ｆ）のみを沈殿させる。１３個の融合前特異的ｍＡｂのうち、１２個は、Ｆ０及びＦ１を沈殿し、１個のｍＡｂはＦ０のみを沈殿した。この観察結果は、切断されたＦ、及び切断されていないＦにより、異なる構造が得られ得ることを示唆している。融合後Ｆのみを沈殿したｍＡｂのうちの６個をウェスタンブロットで試験すると、直線状エピトープを認識することが判明した。１０個のｍＡｂを、ＮｉＶ及びＨｅＶ偽型ウイルス侵入阻害に関して試験すると、侵入を阻害することを示し、更に２つは高濃度で阻害することを示した。ｍＡｂ（マウス５Ｂ３またはｍ５Ｂ３）の１つを、生きたＮｉＶ及びＨｅＶの感染に関して試験すると、ＨｅＶに関しては１２．５μｇ／ｍＬの濃度で、ＮｉＶに関しては１．５μｇ／ｍＬの濃度で中和することを示した。
【００９４】
ｍ５Ｂ３は、Ｆ特異的ｍＡｂの１つであった。更に、ｍ５Ｂ３は構造依存性エピトープを認識することが測定され、それぞれ１．５μｇ／ｍＬ、及び１２．５μｇ／ｍＬの濃度で、感染性２００ＴＣＩＤ５０  ＮｉＶ及びＨｅＶを完全に中和することもできた。免疫沈降法、続いてウェスタンブロット分析を用いることにより、ｍ５Ｂ３は、ＮｉＶ及びＨｅＶ  ｓＦＧＣＮｔ、並びに、融合前の構造状態において明らかに存在するｓＦ及び内在性Ｆの両方の、完全長野生型ＮｉＶ及びＨｅＶ  Ｆ糖タンパク質形態にのみ結合することが測定された。
【００９５】
５Ｂ３マウスハイブリドーマクローンのｃＤＮＡを合成し、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）配列の可変領域を、複数セットのユニバーサルプライマーを使用して増幅させてクローニングし、シークエンシングした（図１Ａ）。図１Ａのペプチド及び断片配列は、表Ａに記載するように、配列番号：１〜１６により示す。マウス５Ｂ３（ｍ５Ｂ３）のｓｃＦｖ（配列番号：４９）を次に、コネクターペプチド（Ｇ４Ｓ）３（配列番号：５２）により結合したＶＨ（配列番号：１）とＶＬ（配列番号：９）、 続いて、プロモーターで改変した市販の哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）（７）内のＳペプチド及びＨｉｓタグを用いて構築した（図１Ｂ）。ｍ５Ｂ３の可溶性ｓｃＦｖを２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）懸濁細胞内で発現させ、Ｓアガロース親和性カラム、その後サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。図２Ａは、一時的に発現したｍ５Ｂ３  ｓｃＦｖが可溶性（ｓＦ）及び完全長（ＦＬ）Ｆに結合可能であることを示す。
【００９６】
ｍ５Ｂ３の保存ＦＲ配列に基づき、ヒトｓｃＦｖライブラリーを構築した。本ライブラリーからのクローンを、大腸菌内での発現量の高さに基づいて選択した。選択したヒトｓｃＦｖクローンのＦＲ配列を、ｍ５Ｂ３  ｓｃＦｖの配列とアラインメントした。保存したヒト残基を同定し、ｍ５Ｂ３  ＦＲ相同位置にて変異させて、図３Ａに示すようにヒト化５Ｂ３（ｈ５Ｂ３）を作製した。図３Ａ（上のパネル）、配列番号：５３−ｈ５Ｂ３の組み合わせたＶＨ  ＦＲ領域；配列番号：５４−ｍ５Ｂ３の組み合わせたＶＨ  ＦＲ領域；配列番号：５５〜６６−図３Ａに示す組み合わせたＶＨ  ＦＲ領域を含有するヒトｓｃＦｖライブラリークローン。図３Ａ（下のパネル）、配列番号：６７−ｈ５Ｂ３の組み合わせたＶＬ  ＦＲ領域；配列番号：６８−ｍ５Ｂ３の組み合わせたＶＬ  ＦＲ領域；配列番号：６９〜８０−図３Ａに示す組み合わせたＶＬ  ＦＲ領域を含有するヒトｓｃＦｖライブラリークローン。
【００９７】
ｍ５Ｂ３  ｓｃＦｖと同じ方法で、ｈ５Ｂ３  ｓｃＦｖを合成、クローニング、発現及び精製した。ｈ５Ｂ３のペプチド及び断片配列は、表Ａに示すように配列番号：１７〜３２により示している。ｈ５Ｂ３  ｓｃＦｖは配列番号：５０のペプチド配列を有し、この配列では、ｈ５Ｂ３のＶＨ（配列番号：１７）とＶＬ（配列番号：２５）がコネクターペプチド（配列番号：５２）により結合されている。その後、別の種類のｈ５Ｂ３を作製し、ｈ５Ｂ３．１と名付けた。ｈ５Ｂ３．１では、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１及び２それぞれの１つの残基、並びにＣＤＲ３上の２つの残基が、上述のヒトｓｃＦｖライブラリーからの配列に基づき変異され、ヒト残基に変換されている（図３Ｂ）。次に、ｈ５Ｂ３．１を発現させ、ｈ５Ｂ３  ｓｃＦｖとして精製した。ｈ５Ｂ３．１のペプチド及び断片配列は、表Ａに示すように配列番号：３３〜４８により示す。ｈ５Ｂ３．１  ｓｃＦｖは配列番号：５１のペプチド配列を有し、この配列では、ｈ５Ｂ３．１のＶＨ（配列番号：３３）とＶＬ（配列番号：４１）がコネクターペプチド（配列番号：５２）により接続されている。
【００９８】
図２Ａに示すように、ｈ５Ｂ３とｈ５Ｂ３．１の両方がＦＬ  Ｆを結合することができた。
【００９９】
ｈ５Ｂ３及びｈ５Ｂ３．１  ＩｇＧ１の作製
ｈ５Ｂ３とｈ５Ｂ３．１の両方のＶＨ及びＶＬをベクターｐＤＲ１２内にクローニングし、完全ＩｇＧ１を作製した。次いで、ｈ５Ｂ３−ＩｇＧ１とｈ５Ｂ３．１−ＩｇＧ１は共に、ＦＬ  Ｆに結合することを示した（図２Ｂ）。ｈ５Ｂ３．１  ＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、図４Ａに示すように、プロモーターにより増大させた発現ベクター内にクローニングし、構築物を使用して安定した２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）懸濁細胞株を作製した。この株は振盪フラスコ内の血清非含有培地内で、高収率（約８ｍｇ／振盪フラスコ）のｈ５Ｂ３．１  ＩｇＧ１を生成した（図４Ｂ）。
【０１００】
ｈ５Ｂ３．１抗体をコードするプラスミドを含有するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞株２９３細胞を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）保管物ＰＴＡ−１２０５７５として保管した。
【０１０１】
次に、ｍ５Ｂ３−ＩｇＧ１、ｈ５Ｂ３−ＩｇＧ１及びｈ５Ｂ３．１−ＩｇＧ１の親和性を、表１に示すように測定した。これは、ｓＦに対するｍ５Ｂ３、ｈ５Ｂ３及びｈ５Ｂ３．１の結合反応速度を示している。
【表５】
2017505124.tif 000006
【０１０２】
表１は、可溶性Ｆに対するｍ５Ｂ３、ｈ５Ｂ３及びｈ５Ｂ３．１の結合反応速度分析を示す。Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００を使用してＡ＆Ｇ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）によりＢｉａｃｏｒｅ分析を実施した。認可グレード（Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ  ｇｒａｄｅ）のＣＭ５チップをキャプチャー抗体でコーティングした（マウスｍＡｂに対するヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃと、ヒト化ｍＡｂに対するヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ）。次いで、試験ｍＡｂをチップ上で捕捉し、５つの異なるｓＦ濃度（０〜飽和）にて結合反応速度を分析した。各ｓＦ濃度における結合反応速度パラメーターを測定し、χ２分析を行い、データの正確性を評価した。
【０１０３】
更に、ｈ５Ｂ３−ＩｇＧ１及びｈ５Ｂ３．１−ＩｇＧ１は共に、ｍ５Ｂ３と比較して同等のタイターにて、生きたＮｉＶ及びＨｅＶを阻害したことを示した（表２）。
【表６】
2017505124.tif 000007
【０１０４】
表２は、ｍ５Ｂ３、ｈ５Ｂ３及びｈ５Ｂ３．１によるウイルスの中和を示す。精製ｍＡｂを、１００μｇ／ｍＬから開始して二倍に希釈することにより繰り返し連続希釈し、ＮｉＶまたはＨｅＶと共に、３７℃にて３０分間別々にインキュベーションした。次に、ウイルス−ｍＡｂ混合物を使用して、９６ウェル組織培養プレート１ウェル当たり２×１０４個のベロ細胞を感染させた。感染３日後に、ウイルスによる細胞変性効果（ｃｐｅ）が観察された。タイターは、２つのウェルにおいてウイルスによるｃｐｅが依然として完全に阻害された（存在しなかった）最大希釈とされた。アッセイを別々に行い、ｍ５Ｂ３とｈ５Ｂ３；及びｍ５Ｂ３とｈ５Ｂ３．１とで比較した。
【０１０５】
５Ｂ３結合の性質決定と、５Ｂ３エピトープのマッピング
５Ｂ３の重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）が共にＦへの結合に関与しているかどうかを測定するため、ｈ５Ｂ３のＶＨ及びＶＬのキメラ、並びにヒトＳｃＦｖライブラリー（図３Ａ）からのクローンの１つを図１Ｂのように構築した。図５に示すように、キメラはいずれも、ＦＬ  Ｆに結合することができなかった。これは、５Ｂ３のＨ及びＬの両方がＦへの結合に関与していることを示す。
【０１０６】
次に、Ｆにおける５Ｂ３エピトープの位置を測定するため、ＮｉＶ  Ｆのキメラ、及び５Ｂ３が反応しないセダーウイルス（Ｃｅｄａｒ  ｖｉｒｕｓ、新たに発見されたへニパウイルス（Ｍａｒｓｈ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０１２，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ，８：ｅ１００２８３６））のＦタンパク質（ＣｅｄＰＶ）を作製した。ＮｉＶ  Ｆの球状頭部ドメイン及びＨＲＢヘリックスステム、ＣｅｄＰＶ  ＦのＴＭ及びＣＴを有する構築物のみが、５Ｂ３に結合することができた（図６）。これは、エピトープが球状頭部ドメインに位置することを示している。頭部及びＨＲＢキメラもまた、細胞間融合アッセイにおいて機能的であることが示された。
【０１０７】
ＮｉＶ  Ｆの変異体であるＬ５３Ｄは、５Ｂ３に結合できないことが示された。ｓＦの溶解した結晶構造に基づき、Ｌ５３を取り囲む残基を、Ｃ末端Ｓペプチドタグを有するＷＴ  Ｆ構築物から、親水性及び／もしくは疎水性残基に関してはアラニンに、かつ／または疎水性残基に関してはセリンに変異させた（表３）。
【表７】
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【０１０８】
表３は、５Ｂ３及び１２Ｂ２（別の構造依存性中和ｍＡｂ）との、Ｆ変異体の反応性の一覧を示す。図７Ｃに示す、Ｌ５３を取り囲む残基を、親水性残基に関してはアラニンに、及び／または疎水性残基に関してはセリンに変異させた。次に、単一及び二重Ｆ変異体を、５Ｂ３との結合に関しては、Ｆ発現細胞可溶化物を５Ｂ３により別に沈殿させることにより、及び１２Ｂ２との結合に関しては、プロテインＧセファロース及びＳタンパク質アガロースにより、試験した。沈殿生成物をＳＤＳ  ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロットにより分析した。Ｆのバンドを、ＨＲＰがコンジュゲートした抗Ｓペプチド抗体を使用して検出した。＋＋：強力な結合；＋：それほど結合せず；＋／−弱い結合；−−：結合なし。
【０１０９】
次いで、Ｆ変異体を、Ｆ発現細胞可溶化物を５Ｂ３、及び別の構造依存性中和ｍＡｂ（１２Ｂ２）により沈殿させて、これらの５Ｂ３との結合を試験し、Ｆ変異体が構造的にインタクトであるかどうかを測定した。等量のＦ発現細胞可溶化物をＳタンパク質アガロースにより沈殿させ、全ての発現を監視した。結果一覧を表３に示し、選択した変異体のウェスタンブロットを図７Ａに示す。この実験により、複数の単一Ｆ変異体（Ｌ５３Ｄ／Ｓ、Ｋ５５Ａ／Ｅ、Ｔ２５０Ａ）並びに２つの二重変異体（ＹＡ２４８−２４９ＡＤ及びＥ１２５１−２８４ＡＳ）は、５Ｂ３への結合が不完全であるが、１２Ｂ２結合には影響を有しないことが確認され、このことは、５Ｂ３エピトープの位置が球状頭部側にあることを示している（図７）。変異体Ｙ２４８Ａのみは５Ｂ３結合に影響を及ぼさなかったが、ほぼ欠陥を有していた（５Ｂ３により沈殿させた際に僅かなバンドの）変異体Ａ２４９Ｄと組み合わせた場合、二重変異体は５Ｂ３結合を行うことが完全にできず、これは、両方の残基が結合部位において重要であることを示している。同様に、変異体Ｅ２５１Ａ及びＩ２８４Ｓは、組み合わせた場合のみに欠陥を有する。変異体Ｆ２８２Ａは５Ｂ３結合の僅かな低下を示したが、Ｐ２８３Ａと組み合わせた場合、完全に欠陥を有した。この二重変異体はまた、１２Ｂ２結合を行うことができない。複数の他の５Ｂ３欠陥変異体（Ｄ５６Ａ、Ｌ２４６Ｄ及びＬＧ２４６−２４７ＤＡ）もまた、１２Ｂ２結合を行うことができなかった（図７Ａ、表３）。したがって、５Ｂ３欠陥性のみであるものと組み合わせたこれらの変異体を融合アッセイで試験し、細胞融合の促進能を試験した。上述の通り、変異体Ｌ５３Ｄは融合の促進にさほど効率的ではなく、組み合わせた変異体Ｌ２４６Ｄ及びＧ２４７Ａもまた、野生型（ＷＴ）と比較して５０％未満の融合活性を示した。これは、機能の低下を示している。変異体ＦＰ２８２−２８３ＡＡのみが融合を完全に失っており、これは、この二重変異体は構造的に、かつ機能的にインタクトでないことを示している。変異体Ｄ５６Ａ及びＬ２４６Ｄは、おそらく、１２Ｂ２結合に関して間接的な影響を有し、これは融合促進においてＦ機能に影響を及ぼさない。１２Ｂ２との結合を維持しながら、ＷＴと比較して４０％未満の活性を有するＥ１２５１−２８４ＡＳを除き、試験した他の変異体は全て、８０％を超える融合活性を保持している（図７Ｂ）。残基Ｅ２５１及びＩ２８４は恐らく、融合の促進の際にＦタンパク質機能に関与し、また恐らく、これらの残基での変異は、変異体Ｌ５３Ｄに見られるように、構造的にではなく機能的にタンパク質に影響を与える。
【０１１０】
これらを合わせると、５Ｂ３エピトープは、残基Ｌ５３、Ｋ５５、Ｙ２４８、Ａ２４９、Ｔ２５０、Ｅ２５１、１２８４、Ｆ２８２、並びに場合により残基Ｄ５６及びＬ２４６に関係する領域内の球状頭部側に位置する（図７Ｃ及びＤ）。
【０１１１】
５Ｂ３阻害のメカニズム
Ｆ融合における５Ｂ３阻害のメカニズムもまた調査した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓＦ誘発アッセイを事前に開発し（Ｃｈａｎ，Ｙ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８６：１１４５７−７１）、このアッセイでは、ｓＦはトリプシン消化により成熟Ｆ１＋Ｆ２形態となることができ、続いて熱処理により、ｓＦの融合後構造へのリフォールディングを誘発するであろう。ＦのＨＲＢ配列を有するビオチン化ペプチドを、トリプシン消化したＦ１＋Ｆ２に添加することができ、これは熱処理中に、トリガリングＦの中間形態に結合することができ、この中間形態はその後、アビジンアガロースにより沈殿させることができる。５Ｂ３をＦＣ２ペプチドと共に加えた場合、ｍＡｂは、用量に依存して、トリガリングｓＦへの結合に関してＦＣ２と競合することができる（図８Ａ）。本アッセイにて非結合の物質を次いでプロテインＧにより沈殿させた。図８Ｂは、ｍ５Ｂ３とｈ５Ｂ３．１の両方が依然としてｓＦに結合したことを示す。５Ｂ３は融合前Ｆにのみ結合するため、このことは、５Ｂ３がトリガリング中に存在した場合、ｍＡｂは安定化し、ｓＦを融合前形態で保持したことを示す。このことを更に調査するために、次いで、５Ｂ３の存在下でトリガリングを行うために、より多くのエネルギーを与えて、トリガリングを種々の増加温度にて行った。図８Ｃに示すように、温度の増加により、中間形態のＦＣ２沈殿物を回収することができた。このことは、トリガリングを行うためにより高いエネルギーの障壁を作ることにより、５Ｂ３の結合によりＦが安定化することを示している。
【０１１２】
ここでの結果は、５Ｂ３がＦの球状頭部側に結合しＦの安定化に重要な領域となりうる新規のエピトープを表していることを示した。５Ｂ３結合に重要であることをここで示した残基の１つであるＬ５３もまた、ウイルス表面でＦの六量体の三量体の形成にとって重要な残基であることを示しており、効率的な融合のために必要である。ここでは、単一三量体Ｆのトリガリングが、六量体における連鎖効果を生み出す。５Ｂ３のＦへの結合はまた、この鎖トリガリング効果と干渉し、ウイルス融合を不十分なものにし得る。
【０１１３】
Ｆ糖タンパク質に対する抗体及び抗体断片の利用可能性
５Ｂ３を速やかに利用することは、ヘニパウイルス調査のための手段である。例えば、現在、ｍＡｂはいずれも、融合前Ｆ及び融合後Ｆを検出して分化させることはできない。５Ｂ３は構造依存性エピトープを認識するため、融合前Ｆ及び融合後Ｆを区別するのに使用することができる。これらのアッセイは、Ｇ受容体結合に引き続いてＦで生じる構造変化等の操作の後の糖タンパク質の機能的及び構造的特徴の調査において有用である。へニパウイルスに対する更なる診断及び検出材料の必要性が、元の病気の発生地から大変離れた場所で発生する定期的な流行病により生じている。へニパウイルスはこれらのウイルスの広範な種への親和性を示すこと、及びウイルスの人獣伝染源は多くの場合、家畜からヒトへの感染を伴うことを考慮すると、診断及び検出技術は強靱であり、かつ多くの種のサンプルで用いるのに適していなければならない。へニパウイルスを初期に検出することにより、十分な通知を行い、罹患率及び死亡率を低下させることができる制御手段を設けることが可能である。ヘニパウイルスとの感染により生じる病気の初期診断は、臨床疾患及び疫学的特徴に依存する。診断は後に、参照試験所にてウイルスの識別を行うことで正式に認められる。５Ｂ３は安価で素早い診断／検出手段の開発に用いられ、この手段は、十分な特異性及び感受性を有し、ヘニパウイルスの存在に早期の警告を与えるであろう。
【０１１４】
ｈ５Ｂ３及びｈ５Ｂ３．１の最も有望な使用法の１つは、ヘニパウイルス感染症の治療のための、追加の治療薬の開発の際である。これらのヒト化ｍＡｂは大規模に発現、精製することができ、レシピエントでのイディオタイプ応答による合併症のリスク無しで抗ウイルス薬として使用することができる。生きたウイルスＳＮＴからのデータでは、５Ｂ３は、ＮｉＶ及びＨｅＶ  Ｆが仲立ちする融合の強力阻害剤であることが示されている。治療薬としてのｈ５Ｂ３及び／またはｈ５Ｂ３．１を抗Ｇヒトｍ１０２．４  ｍＡｂと組み合わせたカクテル療法の開発をすることで、２つの糖タンパク質の独立したエピトープを同時に標的化することにより、治療に対するウイルス耐性の形成を最小限に抑えるのに役立つであろう。
【０１１５】
へニパウイルスは、これまでに認識されている、最も病原性がありかつ致死性の高い、幾らかの新しいウイルス病である。これらのウイルスの研究及び制御に関して著しい進歩がなされてきたが、更なる研究が行われている。研究、及び臨床用途における広範な応用性を有するヘニパウイルスＦ糖タンパク質を標的にして、ヒト化抗ウイルスｍＡｂが開発されてきた。見たように、５Ｂ３は構造依存性融合前特異的エピトープを標的にする。５Ｂ３の結合領域をマッピングすることで、Ｆの安定化に重要な新規のエピトープが明らかとなった。ヒト化ｈ５Ｂ３．１は、ｍ５Ｂ３と比較して、Ｆとの結合活性全て、及びウイルス中和タイターを維持した。本明細書で開発したｈ５Ｂ３．１  ＩｇＧ１の最適な発現系は、ヒト化ｍＡｂの容易かつ迅速、そして高収率の作製をもたらした。Ｆとの結合親和性を向上させ、動物モデルにおける病気を防ぐ能力を試験するために、ｈ５Ｂ３．１の更なる開発、例えばＣＤＲ領域における突然変異誘発が必要であり現在進行中であるが、潜在的な利点及び商業上の利用は明確である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月23日(2016.9.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体が、配列番号：３５、３７及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域；並びに、配列番号：４３、４５及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、前記抗体またはその断片。
【請求項２】
前記抗体または抗体断片はＦｄ断片を含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項３】
前記抗体断片はＦａｂ断片である、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項４】
前記抗体断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項５】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項６】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項７】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項８】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、配列番号：３７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ、及び配列番号：３９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項９】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む重鎖を含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１０】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチドを含む重鎖を含む、請求項９に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：３３の重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１２】
前記または抗体断片抗体は、配列番号：４１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１３】
前記抗体または抗体断片は、配列番号：４１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチドを含む軽鎖を含む、請求項１２に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１４】
前記抗体または抗体断片は配列番号：４１の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１５】
前記ｓｃＦｖが更にコネクターペプチドを含む、請求項４に記載の抗体断片。
【請求項１６】
前記コネクターペプチドは配列番号：５２を含む、請求項１５に記載の抗体断片。
【請求項１７】
前記ｓｃＦｖが配列番号：５１を含む、請求項４に記載の抗体断片。
【請求項１８】
ヘンドラウイルスまたはニパウイルスＦ糖タンパク質に選択的に結合するヒト化抗体または抗体断片であって、前記抗体または抗体断片が、配列番号：３３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、前記ヒト化抗体または抗体断片。
【請求項１９】
前記重鎖可変領域は、配列番号：３３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２０】
前記重鎖可変領域は、配列番号：３３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２１】
前記重鎖可変領域は、配列番号：３３のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２２】
前記抗体はＩｇＧ１である、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２３】
前記抗体または抗体断片がヘンドラまたはニパウイルス感染症を阻害する、請求項１８に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２４】
前記抗体または抗体断片は、ウイルス宿主の膜融合を妨げることによりヘンドラまたはニパウイルス感染症を阻害する、請求項２３に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２５】
前記抗体または抗体断片は、Ｆ糖タンパク質のリフォールディングをブロックすることによりウイルス宿主の膜融合を妨げる、請求項２４に記載のヒト化抗体または抗体断片。
【請求項２６】
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）の保管物ＰＴＡ−１２０５７５として保管されているＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞内に含有されるプラスミドにコードされた抗体と同一の配列の重鎖及び軽鎖可変領域を含む、抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、ウイルス宿主の膜融合中にＦ糖タンパク質のフォールディングをブロックすることによりヘンドラまたはニパウイルス感染症を阻害する、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドはベクター内に含まれる、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
製薬上許容できる担体と、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片とを含む医薬組成物。
【請求項３１】
ヘンドラウイルス病またはニパウイルス病の治療のための請求項３０に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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