(57)【要約】ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含有する核酸が提供される。ある特定の実施形態において、本核酸はドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰはコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含み、かつこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。対象の核酸を含む、発現ベクター、遺伝子改変宿主細胞、及びキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含む核酸であって、前記Ｄ２ＳＰが、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、前記Ｄ２ＳＰがコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含み、かつ前記Ｄ２ＳＰが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前記核酸。
【請求項２】
前記コザック配列が、前記Ｄ２ＳＰの３’末端に存在する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記Ｄ２ＳＰがＢａｍＨＩ制限部位を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
前記ＢａｍＨＩ制限部位が、前記コザック配列の５’に位置する、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記Ｄ２ＳＰが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
前記Ｄ２ＳＰが、検出可能なシグナルを提供する遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
前記検出可能なシグナルを提供する遺伝子産物が蛍光タンパク質である、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、カルシウムインジケーター、及び電圧インジケーターからなる群から選択される、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
前記Ｄ２ＳＰが、光反応性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記光反応性ポリペプチドが脱分極光反応性ポリペプチドであり、前記脱分極光反応性ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜３７のいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
前記光反応性ポリペプチドが過分極光反応性ポリペプチドであり、前記過分極光反応性ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８〜５６のいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項１２】
前記Ｄ２ＳＰが、リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１３】
前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＦＬＰリコンビナーゼからなる群から選択される、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸または請求項１４に記載の組換え発現ベクターを含む、遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１６】
神経細胞である、請求項１５に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１７】
前駆細胞である、請求項１５に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１８】
前記前駆細胞が幹細胞である、請求項１７に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１９】
標的ニューロンの活性を調節する方法であって、前記方法が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸を前記標的ニューロンに導入することを含み、前記Ｄ２ＳＰが、光によって活性化されたときに前記標的ニューロンの過分極または脱分極を誘発する光反応性ポリペプチドに作動可能に連結されている、前記方法。
【請求項２０】
標的細胞を蛍光標識する方法であって、前記方法が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸を前記標的細胞に導入することを含み、前記Ｄ２ＳＰが、発現したときに前記標的細胞を蛍光標識する蛍光タンパク質に作動可能に連結されている、前記方法。
【請求項２１】
前記標的細胞が神経細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的細胞が前駆細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記前駆細胞が幹細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含む核酸を含む組換え発現ベクターであって、前記Ｄ２ＳＰが、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、前記Ｄ２ＳＰがコザック配列を含み、かつ前記Ｄ２ＳＰが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前記組換え発現ベクターと、
前記組換え発現ベクターを標的細胞に導入するための使用説明書と
を含む、キット。
【請求項２５】
前記キットが、ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含む核酸を含む対照発現ベクターをさらに含み、前記Ｄ２ＳＰが、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、前記Ｄ２ＳＰがコザック配列を含み、かつ前記Ｄ２ＳＰが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１４年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／０８７，６０３号の利益を主張するものであり、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
序論
ドーパミンは、脳内の細胞と体全体の細胞との間のシグナル伝達に関与するカテコールアミン神経伝達物質である。ドーパミンは、その受容体であるＧタンパク質共役７回膜貫通型受容体に結合することによって、標的細胞に対するその細胞効果及び生化学的作用を発揮する。ドーパミン２型（Ｄ２）受容体は、同定された数種のドーパミン受容体のうちの１つである。ニューロンを含み、Ｄ２受容体を発現する細胞は、薬物依存症、肥満症、及びギャンブル依存症を含む多くの精神障害に関与する。
【発明の概要】
【０００３】
概要
ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含む核酸が提供される。ある特定の実施形態において、この核酸は、ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含み、かつこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、コザック配列は、Ｄ２ＳＰの３’末端に存在する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、ＢａｍＨＩ制限部位を含む。ある特定の実施形態において、ＢａｍＨＩ制限部位は、コザック配列の５’に位置する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００４】
上記または下記に示すいずれかの実施形態において、Ｄ２ＳＰは、検出可能なシグナルを提供する遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、検出可能なシグナルを提供する遺伝子産物は、蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、カルシウムインジケーター、及び電圧インジケーターからなる群から選択される。
【０００５】
上記または下記に示すいずれかの実施形態において、Ｄ２ＳＰは、光反応性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、光反応性ポリペプチドは、脱分極光反応性ポリペプチドであり、この脱分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜２３のいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは、過分極光反応性ポリペプチドであり、この過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４〜５４のいずれか１つと少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００６】
上記または下記に示すいずれかの実施形態において、Ｄ２ＳＰは、リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、このリコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＦＬＰリコンビナーゼからなる群から選択される。
【０００７】
上記実施形態のいずれかの核酸を含む組換え発現ベクターも本明細書に提供される。
【０００８】
上記核酸実施形態のいずれかの核酸、または上記発現ベクター実施形態のいずれかの組換え発現ベクターを含む遺伝子改変宿主細胞も本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、神経細胞である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、前駆細胞である。ある特定の実施形態において、前駆細胞は、幹細胞である。
【０００９】
標的ニューロンの活性を調節する方法も本明細書に提供され、本方法は、上記核酸実施形態のいずれかの核酸を標的ニューロンに導入することを含み、ここでＤ２ＳＰは、光によって活性化されたときに標的ニューロンの過分極または脱分極を誘発する光反応性ポリペプチドに作動可能に連結されている。
【００１０】
標的細胞を蛍光標識する方法も本明細書に提供され、本方法は、上記実施形態のいずれかの核酸を標的細胞に導入することを含み、ここではＤ２ＳＰが、発現したときに標的細胞を蛍光標識する蛍光タンパク質に作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、標的細胞は、神経細胞である。ある特定の実施形態において、標的細胞は、前駆細胞である。ある特定の実施形態において、前駆細胞は、幹細胞である。
【００１１】
キットも本明細書に提供され、本キットは、ａ）ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含む核酸を含む組換え発現ベクターであって、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターと、ｂ）組換え発現ベクターを標的細胞に導入するための使用説明書とを含む。
【００１２】
上記または下記に記載されたキット実施形態のいずれかにおいて、キットは、ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含む核酸を含む対照発現ベクターをさらに含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本開示の一実施形態による、２型ドーパミン受容体（Ｄ２Ｒ）に対する従来のプロモーター及びＤ２特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）の概略図を示す。
【図２】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰの整列されたヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び従来のＤ２受容体プロモーターの整列されたヌクレオチド配列（Ｄ２Ｒ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。
【図３】標準プロトコール（左）及び改変プロトコール（右）を用いる、Ｄ２受容体特異的抗体による組織薄片の染色を示す。
【図４】本開示の一実施形態による、改変染色プロトコールを用いてＤ２受容体と染色された、Ｄ２ＳＰ下でｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰを発現するラット海馬一次ニューロン及び抗体を示す。
【図５】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰ下及び従来のＤ２受容体プロモーター（Ｄ２Ｒ）下でのｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰの発現ならびにＤ２受容体に対する抗体染色を示す。
【図６】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクターの概略的マップを示す。
【図７】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクターの概略的マップを示す。
【図８】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクターの概略的マップを示す。
【図９】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクターの概略的マップを示す。
【図１０】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクターの概略的マップを示す。
【図１１】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクターの概略的マップを示す。
【図１２】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクターの概略的マップを示す。
【図１３】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクターの概略的マップを示す。
【図１４】本開示の一実施形態による、Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクターの概略的マップを示す。
【図１５】ラットＤ２受容体のエクソン１のヌクレオチド配列を示す。
【図１６】本開示の一実施形態による、脱分極光反応性ポリペプチド及びそれらの誘導体のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜２３）を示す。
【図１７】本開示の一実施形態による、過分極光反応性ポリペプチド及びそれらの誘導体のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４〜５４）を示す。
【図１８】本開示の一実施形態による、宿主細胞または標的細胞における光反応性ポリペプチドの発現を向上させるために用いることができるペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５〜６６）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、それぞれの複数形を、各々これら用語が利用される文脈に応じて含むことができる。これらは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、もしくはこれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、また既知または未知の任意の機能を果たしてもよい。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードもしくは非コード領域、連鎖解析から画定される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ（Ａ、Ｂ及びＺ構造）、ＰＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＴＮＡ（トレオーセ核酸）、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。しばしば近づき難いＲＮＡとも称されるＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’及び４’炭素を連結するエクストラ架橋で修飾されている。この架橋は、３’−エンド型構造配座中のリボースを「ロック」し、これは、頻繁に、ＤＮＡまたはＲＮＡのＡ型で見出され、熱安定性を著しく改善することができる。
【００１５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書で互換的に使用される。このポリマーは、直線状であってもよく、これは修飾アミノ酸を含んでもよく、また非アミノ酸によって割り込まれてもよい。この用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などの任意の他の操作も包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン及びＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体及びペプチド模倣物を含む、天然及び／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかを指す。
【００１６】
本明細書で使用される場合、２つの核酸配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、配列比較アルゴリズムによってまたは目視検査によって測定されるとき、指定された比較ウインドウにわたって最大一致について整列されるときに、同一である２つの配列中の残基の特定の百分率に言及するものである。配列同一性の百分率が、タンパク質を参照して使用される場合、同一ではない残基位置が、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なり、ここではアミノ酸残基が、同様な化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有するアミノ酸残基で置き換えられており、したがって、分子の機能的特性を変更しないことが認識される。保存的置換において配列が異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するために上方修正されてもよい。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この調整を行うための任意の好適な手段が用いられてもよい。これは、完全ミスマッチよりはむしろ部分的ミスマッチとして保存的置換をスコア付けすることを伴ってもよい。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換は、０〜１のスコアが与えられる。保存的置換のスコア付け、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）によって実行されて、算出される。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「配列同一性の百分率」とは、２つの最適に整列された配列を比較ウインドウにわたって比較することによって決定される値を意味し、２つの配列の最適なアライメントのために、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較すると付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む。百分率は、両配列中で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の個数を決定し、マッチした位置の個数を得て、マッチした位置の個数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、この結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得る。
【００１８】
比較のための配列のアライメントの任意の好適な方法が使用されてもよい。したがって、任意の２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。このような数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１（１９８８）のアルゴリズム；その全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズム；その全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，ＪＭＢ，４８：４４３（１９７０）のホモロジーアライメントアルゴリズム；その全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ−ｆｏｒ−ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−ｍｅｔｈｏｄ）；その全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４（１９９０）のアルゴリズム；その全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ｋａｒｈｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３（１９９３）などの改変されたものである。
【００１９】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータ実装は、配列同一性を決定するために、配列の比較のために利用することができる。このような実装としては、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプログラムを用いるアライメントは、デフォルトパラメータを用いて実行することができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、それらの全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７３：２３７（１９８８)、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：１０８８１（１９８８）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡＢＩＯＳ，８：１５５（１９９２）；及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４：３０７（１９９４）に十分に説明されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、上記のＭｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムに基づいている。それら全体が参照として本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２１５：４０３（１９９０）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムは、上記のＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムに基づいている。
【００２０】
ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して公開されている。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがそれによってｍＲＮＡ中に転写されるプロセス及び／または転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも称される）が、それによって、引き続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質中に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコード化ポリペプチドは、文脈に応じて、総じて「遺伝子産物」と称される。
【００２２】
「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要な制御及びコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。ポリペプチドは、全長コード配列によって、またはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。遺伝子は、割り込まれていないコード配列を構成してもよく、またはこれは、適切なスプライス部位によって結合された１つ以上のイントロンを含んでもよい。さらには、遺伝子は、コード配列または非翻訳領域のいずれかにおいて１つ以上の改変を含んでもよく、これは、発現産物の生物学的活性または化学的構造、発現の速度、または発現制御の方法に影響を及ぼし得る。このような改変としては、１つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、及び置換が挙げられるが、これらに限定されない。この点については、このような改質遺伝子は、「ネイティブ」遺伝子の「変異体」と称されてもよい。
【００２３】
「遺伝子改変」という用語は、異種核酸（すなわち、細胞と外因性である核酸）の細胞への導入後に、細胞中で誘導された永続的または一時的な遺伝子変化を指す。遺伝子変化（「改変」）は、異種核酸の宿主細胞のゲノム中へ組み込みによって、または異種核酸の染色体外因子としての一時的もしくは安定した管理によって達成することができる。細胞が真核細胞である場合、永続的遺伝子変化は、核酸の細胞のゲノムへの導入によって達成することができる。遺伝子改変の好適な方法としては、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、原形質融合、電気穿孔法、パーティクルガン技法、リン酸カルシウム析出、直接マイクロインジェクション等が挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、遺伝子の発現（転写）に向けるＤＮＡの配列を指す。プロモーターは、原核または真核遺伝子の転写に向けてもよい。プロモーターは、誘導剤に応答して転写を開始する「誘導性」であってもよく、または対照的に、プロモーターは、これに従って誘導剤が転写の速度を調節しない「構成的」であってもよい。プロモーターは、組織特異的または組織に好ましい方法で調節することができ、それにより、特定の１つの組織型または複数の組織型において作動可能に連結されたコード領域を転写することのみで、これは活性である。
【００２５】
「作動可能に連結された」という用語は、制御配列とコード配列との間の機能的連携を指す。このように記述される成分は、したがって、それらがそれらの意図された方法で機能することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターの調節制御下に配置することは、コード配列の発現がプロモーターによって制御されるようにコード配列を位置付けることを意味する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の終端または末端に関する「終端」または「末端」は、ヌクレオチド配列の５’または３’末端、もしくはアミノ酸配列のアミノまたはカルボキシル末端を指す。したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の終端にある配列は、ヌクレオチド配列の最も５’側にあるかまたは最も３’側にあるヌクレオチドを含む、もしくはポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシル末端を含む配列である。
【００２７】
光反応性であるポリペプチドまたはタンパク質に関する「光活性化」、「光反応性」は、互換的に使用され、光反応性イオンチャネルまたはオプシン、及び本明細書に記載されるイオンポンプを含む。このような光反応性タンパク質は、細胞の形質膜上でこのタンパク質が活性化タンパク質のイオン透過性と形質膜にわたって存在する電気化学的勾配とに応じて発現する細胞に対する、脱分極または過分極効果を有することができる。
【００２８】
本発明を更に説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、当然のことながら変化し得ることを理解するべきである。本明細書に使用される専門用語は、本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろうことから、特定の実施形態を説明する目的のものにすぎず、また限定することを意図するものではないことも理解するべきである。
【００２９】
値の一定の範囲が提供される場合、文脈上他の明確な指示がない限り、下限から１０番目の単位のところまでの各介在値、この範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載される値もしくは介在する値が、本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、このより小さな範囲内に含まれてもよく、記載された範囲内の具体的に除外された限界に従って、本発明の範囲内に包含される。記載された範囲が、これら限界の一方または双方を含む場合、これらの包含される限界のいずれかまたは双方を除外する範囲も、本明細書に含まれる。
【００３０】
他に別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様もしくは等価である任意の方法または材料が、本発明の実行または試験で使用することも可能であるが、好ましい方法及び材料がここで記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、その刊行物が引用するものと関連付けて方法及び／または材料を開示かつ説明するために、参照として本明細書に組み込まれる。
【００３１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他の明確な指示がない限り、複数の指示物を含むことに留意するべきである。したがって、例えば、「遺伝子改変宿主細胞（ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」に対する言及は、複数のこのような遺伝子改変宿主細胞を含み、「神経細胞（ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）」に対する言及は、１つ以上の神経細胞及び当業者に既知のそれらの等価物への言及を含むことなどである。特許請求の範囲は、いかなる任意の要素も除外するように立案され得ることもさらに留意される。このように、この記述は、例えば「ただ単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「単に（ｏｎｌｙ）」等のこのような排他的な用語の使用のための、または「消極的な」限定の使用のための先行詞（ａｎｔｅｃｅｄｅｎｔ  ｂａｓｉｓ）としての役目を果たすように意図される。
【００３２】
明確にするために別の実施形態の文脈で記載される、本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、本発明の様々な特徴で、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載されるものは、別個にまたは任意の好適な部分的組合せで提供されてもよい。本発明に係る実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって包含され、またありとあらゆる組み合わせがあたかも個別かつ明示的に本明細書に開示されるように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素の全ての部分的組合せも、本発明によって具体的に包含され、またありとあらゆる部分的組み合わせがあたかも個別かつ明示的に本明細書に開示されるように本明細書に開示される。
【００３３】
本明細書で論議される刊行物は、ただ単にそれらの開示が本出願の出願日よりも前であるために提供されている。本明細書に記載されるいかなる内容も、本発明が、先行発明のためにこのような刊行物に先行する権利があることを認めるものとしては解釈されるべきではない。さらに、提示される刊行物の日付は、実際の刊行日付とは異なる場合があり、これらは個々に確認する必要がある。
【００３４】
詳細な説明
ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含む核酸及び関心対象の標的細胞中でポリペプチドを発現させるためにこの核酸を使用する方法が提供される。本開示の態様は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列（図２）と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、対象の核酸は、Ｄ２ＳＰを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
ある特定の実施形態において、対象の核酸は、Ｄ２ＳＰを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列を含み、このＤ２ＳＰは、コザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
ある特定の実施形態において、対象の核酸は、Ｄ２ＳＰを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列を含み、このＤ２ＳＰは、コザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、このＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。場合によっては、遺伝子産物は、ポリペプチドである。場合によっては、遺伝子産物は、ポリヌクレオチドである。場合によっては、遺伝子産物は、蛍光タンパク質；遺伝的にコードされたインジケーター；光反応性ポリペプチド；リコンビナーゼ；またはこれらの組み合わせなどの検出可能なシグナルを提供するポリペプチドである。
【００３８】
ある特定の実施形態において、対象の核酸は、Ｄ２ＳＰを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列を含み、このＤ２ＳＰは、コザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、このＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜５４のポリペプチドから選択される光反応性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【００３９】
ある特定の実施形態において、対象の核酸は、Ｄ２ＳＰを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列を含み、このＤ２ＳＰは、コザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、このＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、カルシウムインジケーター、及び電圧インジケーターから選択される蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【００４０】
Ｄ２ＳＰを含む核酸を含む組換え発現ベクターも本明細書に提供され、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
ある特定の実施形態において、組換え発現ベクターは、Ｄ２ＳＰを含む核酸を含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列を含み、このＤ２ＳＰは、コザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、このＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。場合によっては、遺伝子産物は、蛍光タンパク質；遺伝的にコードされたインジケーター；光反応性ポリペプチド；リコンビナーゼ；またはこれらの組み合わせなどの検出可能なシグナルを提供するポリペプチドである。
【００４２】
Ｄ２ＳＰを含む核酸を含む遺伝子改変宿主細胞も本明細書に提供され、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、この核酸は、遺伝子改変宿主細胞において組換え発現ベクター中に含まれる。
【００４３】
ある特定の実施形態において、本開示の遺伝子改変宿主細胞は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を含む組換え発現ベクターを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列を含み、このＤ２ＳＰは、コザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、このＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。場合によっては、遺伝子産物は、蛍光タンパク質；遺伝的にコードされたインジケーター；光反応性ポリペプチド；リコンビナーゼ；またはこれらの組み合わせなどの検出可能なシグナルを提供するポリペプチドである。
【００４４】
標的ニューロンの活性を調節する方法も本明細書に提供され、本方法は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を標的ニューロンに導入することを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列及びコザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、このＤ２ＳＰは、光によって活性化されたときに標的ニューロンの過分極または脱分極を誘導する光反応性ポリペプチドに作動可能に連結されている。
【００４５】
標的ニューロンの活性を調節する方法も本明細書に提供され、本方法は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を標的ニューロンに導入することを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列及びコザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、このＤ２ＳＰは、光によって活性化されたときに標的ニューロンの脱分極を誘導する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４〜２３のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む光反応性ポリペプチドに作動可能に連結されている。
【００４６】
標的ニューロンの活性を調節する方法も本明細書に提供され、本方法は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を標的ニューロンに導入することを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列及びコザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、このＤ２ＳＰは、光によって活性化されたときに標的ニューロンの過分極を誘導する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４〜５４のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む光反応性ポリペプチドに作動可能に連結されている。
【００４７】
標的細胞を蛍光標識する方法も本明細書に提供され、本方法は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を標的細胞に導入することを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列及びコザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、このＤ２ＳＰは、発現したときに標的細胞を蛍光標識する蛍光タンパク質に作動可能に連結されている。
【００４８】
ある特定の実施形態において、標的細胞を蛍光標識する本開示の方法は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を標的ニューロンに導入することを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列及びコザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、このＤ２ＳＰは、発現したときに標的ニューロンを蛍光標識する蛍光タンパク質に作動可能に連結されている。
【００４９】
ある特定の実施形態において、標的細胞を蛍光標識する本開示の方法は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を標的前駆細胞に導入することを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列及びコザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、このＤ２ＳＰは、発現したときに標的前駆細胞を蛍光標識する蛍光タンパク質に作動可能に連結されている。
【００５０】
ある特定の実施形態において、標的細胞を蛍光標識する本開示の方法は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を標的幹細胞に導入することを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端においてコザック配列及びコザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、このＤ２ＳＰは、発現したときに標的幹細胞を蛍光標識する蛍光タンパク質に作動可能に連結されている。
【００５１】
本開示のさらなる態様はここでより詳細に以下に説明されるであろう。
【００５２】
核酸
ドーパミン受容体２型特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）
上で概説したように、本開示の態様は、Ｄ２ＳＰ、すなわち、２型ドーパミン（Ｄ２）受容体を発現する細胞中のプロモーターに動作可能に連結された遺伝子の発現を指示するプロモーター配列を含む核酸を含む。ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、ゲノム中のＤ２受容体の第１のエクソンのゲノム配列５’に由来する。
【００５３】
ある特定の実施形態において、Ｄ２受容体は、ラット、マウス、サル、非ヒト霊長類またはヒトゲノムが挙げられるが、これらに限定されない哺乳動物ゲノムに由来する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、Ｄ２ＳＰは、Ｄ２受容体の第１のエクソンの５’に存在するゲノム配列に由来する。したがって、いくつかの実施形態において、Ｄ２ＳＰは、３．０キロベース（ｋｂ）以下、例えばＤ２受容体の第１のエクソンの開始点の１．６ｋｂ以下の５’を含む、２．０ｋｂ以下などの２．５ｋｂ以下を開始するゲノム配列に由来する。他の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、０．５キロベース（ｋｂ）以上、例えばＤ２受容体の第１のエクソンの開始点の１．５ｋｂ以上の５’を含む、１．２ｋｂ以上などの１．０ｋｂ以上を開始するゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、Ｄ２受容体の第１のエクソンの開始点または転写開始点の３．０〜０．５ｋｂ、例えば２．５ｋｂ〜１．０ｋｂ、または２．０ｋｂ〜１．２ｋｂ５’の範囲で開始するゲノム配列に由来する。
【００５５】
遺伝子の転写開始点、または第１のエクソンの開始点は、本明細書で互換的に使用され、遺伝子をコードする遺伝子座から転写された成熟ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’末端として定義されてもよい。したがって、ある特定の実施形態において、Ｄ２受容体の第１のエクソンの開始点は、Ｄ２受容体ゲノム遺伝子座から転写されたｍＲＮＡの５’末端によって定義される。ある特定の実施形態において、Ｄ２受容体の第１のエクソンの開始点は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１２５４７（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））；ＮＭ＿０１００７７（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））；またはＮＭ＿０００７９５（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））によって表される配列によって定義される。
【００５６】
ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＲの長さは、５００塩基対（ｂｐ）〜２５００ｂｐ、例えば、７５０ｂｐ〜２２５０ｂｐ、１０００ｂｐ〜２０００ｂｐ、例えば１２５０ｂｐ〜１７５０ｂｐである。場合によっては、Ｄ２ＳＲの長さは、５００ｂｐ以上、例えば、７５０ｂｐ以上、１０００ｂｐ以上、１２５０ｂｐ以上、１３５０ｂｐ以上、１４５０ｂｐ以上、１５００ｂｐ以上、１５１０ｂｐ以上、１５２０ｂｐ以上、または１５３０ｂｐ以上である。場合によっては、Ｄ２ＳＲの長さは、２０００ｂｐ以下、例えば、１７５０ｂｐ以下、１７００ｂｐ以下、１６５０ｂｐ以下、１６００ｂｐ以下、１５９０ｂｐ以下、１５８０ｂｐ以下、１５７０ｂｐ以下、１５６０ｂｐ以下、または１５５０ｂｐ以下である。別の実施形態において、Ｄ２ＳＲの長さは、約１５４０ｂｐである。
【００５７】
本開示の態様は、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まないＤ２ＳＰを含む核酸を含む（図１）。Ｄ２受容体遺伝子は、任意の哺乳動物Ｄ２受容体遺伝子であってもよく、これらとしてはラットＤ２受容体遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ  ２４３１８）、マウスＤ２受容体遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ  １３４８９）またはヒトＤ２受容体遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ  １８１３）が挙げられるが、これらに限定されない。他の哺乳動物Ｄ２受容体遺伝子としては、サル及び非ヒト霊長類Ｄ２受容体遺伝子が含まれる。Ｄ２受容体遺伝子の第１のエクソンを決定するための任意の好適な方法が用いられてもよい。ある特定の実施形態において、ラットＤ２受容体遺伝子のエクソン１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（図１５）に示される配列と８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％同一である配列によって定義される。したがって、ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（図１５）に示される配列と８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％同一である配列を含まない。ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（図１５）に示される配列のヌクレオチド１〜３１３、例えば、ヌクレオチド１〜３００、ヌクレオチド１〜２５０、ヌクレオチド１〜２００、ヌクレオチド１〜１５０、ヌクレオチド１〜１００、ヌクレオチド１〜９０、ヌクレオチド１〜８０、ヌクレオチド１〜７０、ヌクレオチド１〜６０、ヌクレオチド１〜５０、ヌクレオチド１〜４０、例えばヌクレオチド１〜３０と９０％以上、例えば９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含まない。ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（図１５）に示される配列のヌクレオチド１〜２７０と９０％以上、例えば、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含まない。
【００５８】
本開示のさらなる態様は、コザック配列を含むＤ２ＳＰを含む核酸を含む。「コザック配列」という用語は、翻訳の開始のために、ｍＲＮＡのリボソームの小サブユニットへの初期結合を容易にするための配列を指す。例示のコザック配列はＧＣＣＲＣＣであり、式中、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である。ある特定の実施形態において、コザック配列はＧＣＣＡＣＣである。ある特定の実施形態において、コザック配列が機能するための能力に大きく影響を及ぼすことなく、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のヌクレオチドは、例示のコザック配列において置換されてもよい（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ，４４（２）：２８３−９２，１９８６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｏｃｔ  ２６；１５（２０）：８１２５−４８，１９８７；Ｋｏｚａｋ，Ｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（３０）：１９８６７−１９８７０，１９９１）。
【００５９】
ある特定の実施形態において、コザック配列は、Ｄ２ＳＰの３’末端、または端部に位置する。したがって、Ｄ２ＳＰが、ポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物の発現を指示するある特定の実施形態において、ポリペプチドに対するコード配列は、Ｄ２ＳＰの終端の３’のすぐ近くで開始する。第２の配列のすぐ隣に存在する第１の配列に関して本明細書で使用される「すぐ近く」は、第１と第２の配列との間に介在する配列がないこと（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸がないこと）を示す。したがって、ある特定の実施形態において、コザック配列は、そのすぐ後の３’にコード配列の開始コドン（すなわち、ヌクレオチド配列ＡＴＧ）が続く。
【００６０】
ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、制限ヌクレアーゼに対する認識部位を含む。ある特定の実施形態において、この制限ヌクレアーゼはＢａｍＨＩである。ＢａｍＨＩの認識部位は、ＧＧＡＴＣＣである。したがって、ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、ＧＧＡＴＣＣの配列によって定義されるＢａｍＨＩ認識部位を含む。ある特定の実施形態において、ＢａｍＨＩ認識部位は、コザック配列の５’に位置する。ある特定の実施形態において、ＢａｍＨＩ部位は、コザック配列の５’のすぐ近くに位置する。いくつかの実施形態において、ＢａｍＨＩ制限部位は、Ｄ２ＳＰが由来するＤ２受容体ゲノム遺伝子座のゲノム配列の３’に位置する。したがって、ある特定の実施形態において、ＢａｍＨＩ制限部位は、Ｄ２ＳＰが由来するＤ２受容体ゲノム遺伝子座のゲノム配列の３’かつコザック配列の５’に位置する。
【００６１】
ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（図２）に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。したがって、本開示の一態様は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様において、対象の核酸は、Ｄ２ＳＰを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック配列及びＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、この核酸はＤ２ＳＰを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、Ｄ２ＳＰの３’末端にコザック配列を、及びコザック配列の５’に位置するＢａｍＨＩ制限部位を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。遺伝子産物は、Ｄ２受容体を発現する標的細胞において特異的に発現する、用途を見出す任意の好適な遺伝子産物であることができる。ある場合には、遺伝子産物は、ポリペプチドである。ある場合には、遺伝子産物は、ポリヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、遺伝子産物は、光反応性ポリペプチドである。ある特定の実施形態において、光反応性ポリペプチドは、標的細胞の細胞膜上で発現して適切な波長及び強度の光への露光によって活性化されたときに標的細胞を脱分極または活性化するポリペプチドである。ある特定の実施形態において、光反応性ポリペプチドは、標的細胞の細胞膜上で発現して適切な波長及び強度の光への露光によって活性化されたときに標的細胞を過分極または阻害するポリペプチドである。対象のＤ２ＳＰに作動可能に連結され得る例示の光反応性ポリペプチドは、以下にさらに記載されている。
【００６３】
ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された遺伝子産物は、検出可能なシグナルを提供する。検出可能なシグナルは、蛍光、化学発光、酵素活性等であることができる。ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰが作動可能に連結され、検出可能なシグナルを提供する遺伝子産物は、蛍光タンパク質であり、これらとしては、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Ｄ２ＳＰが作動可能に連結され、検出可能なシグナルを提供する遺伝子産物は、遺伝的にコードされたインジケーターであり、例えば、限定されるものではないが、カルシウムインジケーターまたは電圧インジケーターである。カルシウムインジケーターは、１つ以上のカルシウムイオンに結合するように操作された蛍光ポリペプチドであり、蛍光特性、例えばカルシウムイオンの結合が、ポリペプチドの強度、励起及び／または発光波長等を変更する。任意の好適なカルシウムインジケーターが、標的細胞中で検出可能なシグナルを提供するために用いられてもよい。場合によっては、カルシウムインジケーターは、カメレオン及びその誘導体などの供給電圧比例型（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）カルシウムインジケーターである。関心対象の他のカルシウムインジケーターとしては、ＧＣａＭＰ１、ＧＣａＭＰ２、ＧＣａＭＰ３、及びこれらの誘導体、ならびに参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６２９，２５６号、及びＴｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｐｒｏｇ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，１９６：７９に列記されたものが挙げられるが、これらに限定されない。電圧インジケーターは、膜電位における変化に応答するように操作されている蛍光ポリペプチドであり、膜電位における変化は、ポリペプチドの強度、励起及び／または発光波長等を変更する。任意の好適な電圧インジケーターが、標的細胞中で検出可能なシグナルを提供するために用いられてもよい。関心対象の電圧インジケーターとしては、ＱｕａｓＡｒ１、ＱｕａｓＡｒ２、ＶＳＦＰ、及びこれらの誘導体、ならびに参考として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３０２２４７５６号、Ｈｏｃｈｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４  １１：８２５，Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００８  ３６：５３；及びＭｕｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２０１１  ９６：１３に列記されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
ある特定の実施形態において、Ｄ２ＳＰは、リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。Ｄ２ＳＰに作動可能に連結され得る任意の好適なリコンビナーゼを使用することができる。好適なリコンビナーゼとしては、Ｃｒｅ及びＦｌｐリコンビナーゼ、及びこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。リコンビナーゼ及び標的核酸との部位特異的組換えを誘導することにおけるその使用は、例えば、参照として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３００１９３２５号及び同第２００６０００３４４３号、米国特許第８，５１８３９２号ならびにＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２００９  ４：ｅ８０５４に記載されている。
【００６５】
光反応性ポリペプチド
上で概説したように、本開示の態様は、光反応性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＤ２ＳＰを含む。光活性化イオンチャネルポリペプチドは、このポリペプチドが活性化波長の光で照射されるとき、１つ以上のイオンに標的細胞の形質膜を通過させるように適合される。光活性化タンパク質は、光のプロトンごとに少数のイオンの形質膜の通過を容易にするイオンポンプタンパク質として、またはチャネルが開かれるとき、イオンの流れが形質膜を通って自由に流れることを可能にするイオンチャネルタンパク質として特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは、活性波長の光によって活性化されたときに標的細胞を脱分極する。いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは、活性波長の光によって活性化されたときに標的細胞を過分極する。
【００６６】
いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは青色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは緑色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは黄色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは橙色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは赤色光によって活性化される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、細胞中で発現する光反応性ポリペプチドは、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）輸送シグナル、膜トラフィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）シグナル、及び／またはＮ末端ゴルジ輸送シグナルからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合することができる。哺乳動物細胞の形質膜への光反応性タンパク質の輸送を向上させる１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光反応性ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に融合することができる。ある場合には、哺乳動物細胞の形質膜への光反応性タンパク質の輸送を向上させる１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光反応性ポリペプチドの内部に融合される。任意に、光反応性ポリペプチド及び１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離されてもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは、タンパク質の細胞形質膜への輸送を向上させるトラフィッキングシグナル（ｔｓ）の付加によって改変されてもよい。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000002
を含むことができる。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000003
などのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００６９】
トラフィッキング配列は、約１０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、例えば約１０個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、または約４０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸の長さを有することができる。
【００７０】
光反応性ポリペプチドに好適であるＥＲ輸送配列としては、
2017536130.tif 000004
等が含まれる。ＥＲ輸送配列は、約５個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、例えば約５個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、または約２０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸の長さを有することができる。
【００７１】
使用するために好適であるシグナル配列は、１）ｈＣｈＲ２のシグナルペプチド
2017536130.tif 000005
２）ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットシグナルペプチド
2017536130.tif 000006
３）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
2017536130.tif 000007
及び４）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列
2017536130.tif 000008
のうちの１つなどのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００７２】
シグナル配列は、約１０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸、例えば約１０個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸〜約３０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸、または約４０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸の長さを有することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、タンパク質中のシグナルペプチド配列は、欠失され得るか、または異なるタンパク質からのシグナルペプチド配列で置き換えられ得る。
【００７４】
例示の光反応性ポリペプチドは、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３に記載され、これは、参考として本明細書に組み込まれる。本開示における用途を見出す代表的な光反応性ポリペプチドは、以下にさらに記載される。
【００７５】
脱分極性光反応性ポリペプチド
ＣｈＲ
いくつかの実施形態において、脱分極性光反応性ポリペプチドは、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に由来し、このポリペプチドは、細胞が光によって照射されるとき、カチオンを、細胞膜を横切って輸送することができる。別の実施形態において、光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。コナミドリムシに由来する光反応性カチオンチャネルタンパク質を活性化するために使用される光は、約４６０〜約４９５ｎｍの波長を有するか、または約４８０ｎｍの波長を有する。さらに、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスが、光反応性タンパク質を活性化するために使用することができる。いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスによるコナミドリムシに由来する光反応性カチオンチャネルタンパク質の活性化は、光反応性カチオンチャネルを発現するニューロンの脱分極を引き起こすことが可能である。光反応性カチオンチャネルタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／または光反応性カチオンチャネルタンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、光反応性カチオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有する光反応性プロトンポンプタンパク質は、細胞膜を横切ってカチオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換及びＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、及びＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光反応性カチオンチャネルは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換及びＥ１２３Ａ置換を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、標的細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）を含むことができる。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000009
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000010
等である。
【００７９】
ある特定の実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有することができる。
【００８０】
他の実施形態において、光反応性ポリペプチドは、タンパク質のレチナール結合ポケット内の重要な位置における特異的アミノ酸置換を有し得る階段関数オプシン（ｓｔｅｐ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｐｓｉｎ）（ＳＦＯ）タンパク質または安定化階段関数オプシン（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｔｅｐ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｐｓｉｎ）（ＳＳＦＯ）タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基Ｃ１２８において突然変異を有することができる。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４中にＣ１２８Ａ突然変異を有する。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４中にＣ１２８Ｓ突然変異を有する。別の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４中にＣ１２８Ｔ突然変異を有する。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸残基Ｄ１５６において突然変異を有することができる。他の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の両方のアミノ酸残基Ｃ１２８及びＤ１５６において突然変異を有することができる。一実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４中にＣ１２８Ｓ及びＤ１５６Ａ突然変異を有する。別の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができ、アミノ酸１２８においてアラニン、セリン、またはスレオニンを含み、アミノ酸１５６においてアラニンを含む。別の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４中にＣ１２８Ｔ突然変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６中のＣ１２８Ｔ及びＤ１５６Ａを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質は、細胞が青色光で照射されるとき、細胞中の脱分極電流を仲介する能力を有し得る。他の実施形態において、この光は、約４４５ｎｍの波長を有し得る。さらに、いくつかの実施形態において、この光はＳＦＯ及びＳＳＦＯ光電流の長期安定性のために、光の単一パルスとして、または光の間隔をあけたパルスとして送出することができる。いくつかの実施形態において、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質の光の単一パルスもしくは間隔をあけたパルスによる活性化は、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を発現するニューロンの脱分極を引き起こすことができる。いくつかの実施形態において、開示された段階関数オプシン及び安定化段階関数オプシンタンパク質のそれぞれは、光に反応して神経細胞の膜を脱分極することで使用するための特異性及び特性を有することができる。
【００８３】
ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質に関連するさらなる開示は、国際特許出願公報番号ＷＯ２０１０／０５６９７０で見出すことができ、この開示は、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【００８４】
ある場合には、ＣｈＲ２ベースのＳＦＯまたはＳＳＦＯは、膜トラフィッキングシグナル及び／またはＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000011
を含む。使用に好適であるトラフィックイング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列（例えば、
2017536130.tif 000012
）などのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば、
2017536130.tif 000013
等である。
【００８５】
ある特定の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８６】
ボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）光反応性ポリペプチド
いくつかの実施形態において、好適な光反応性ポリペプチドは、ボルボックス・カルテリに由来するカチオンチャネル（ＶＣｈＲ１）であり、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、例えば約５２５ｎｍ〜約５５０ｎｍ、例えば５４５ｎｍの波長の光による照射によって活性化される。いくつかの実施形態において、光反応性イオンチャネルタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。光反応性イオンチャネルタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／または光反応性イオンチャネルタンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、光反応性イオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有する光反応性イオンチャネルタンパク質は、光に反応して神経細胞の形質膜を横切ってイオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【００８７】
ある場合には、ＶＣｈＲ１光反応性カチオンチャネルタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、哺乳動物細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上など）のアミノ酸配列モチーフとを含む。いくつかの実施形態において、光反応性プロトンイオンチャネルは、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光反応性イオンチャネルタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、光反応性イオンチャネルタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、光反応性イオンチャネルタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000014
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列（例えば、
2017536130.tif 000015
）のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000016
等である。
【００８９】
ある特定の実施形態において、ＶＣｈＲ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９０】
ＶＣｈＲ１に基づく段階関数オプシン及び安定化段階関数オプシン
他の実施形態において、光反応性ポリペプチドは、ＶＣｈＲ１に基づくＳＦＯまたはＳＳＦＯである。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸残基Ｃ１２３において突然変異を有することができる。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８中にＣ１２３Ａ突然変異を有する。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８中にＣ１２３Ｓ突然変異を有する。別の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８中にＣ１２３Ｔ突然変異を有する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸残基Ｄ１５１において突然変異を有することができる。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の両方のアミノ酸残基Ｃ１２３及びＤ１５１において突然変異を有することができる。一実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８中にＣ１２３Ｓ及びＤ１５１Ａ突然変異を有する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質は、細胞が青色光で照射されるとき、細胞中の電流の脱分極を仲介する能力を有し得る。いくつかの実施形態において、この光は、約５６０ｎｍの波長を有する。さらに、いくつかの実施形態において、この光はＳＦＯ及びＳＳＦＯ光電流の長期安定性のために、光の単一パルスとして、または光の間隔をあけたパルスとして送出される。いくつかの実施形態において、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質の光の単一パルスもしくは間隔をあけたパルスによる活性化は、ＳＦＯまたはＳＳＦＯを発現するニューロンの脱分極を引き起こすことができる。いくつかの実施形態において、開示された段階関数オプシン及び安定化段階関数オプシンタンパク質のそれぞれは、光に反応して神経細胞の膜を脱分極することで使用するための特異性及び特性を有することができる。
【００９３】
ある場合には、ＶＣｈＲ１ベースのＳＦＯまたはＳＳＦＯは、膜トラフィッキングシグナル及び／またはＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。使用に好適であるトラフィックイング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000017
などのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば、
2017536130.tif 000018
等である。
【００９４】
Ｃ１Ｖ１キメラカチオンチャネル
他の実施形態において、光反応性カチオンチャネルタンパク質は、ボルボックス・カルテリのＶＣｈＲ１タンパク質とコナミドリムシからのＣｈＲ１タンパク質とに由来するＣ１Ｖ１キメラタンパク質であり、このタンパク質は、ＣｈＲ１の第１及び第２の膜貫通ヘリックスによって置き換えられた少なくとも第１及び第２の膜貫通ヘリックスを有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、光と反応性であり、細胞が光によって照射されるとき、細胞中の電流の分極を仲介することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、キメラ光反応性タンパク質の第２と第３の膜貫通ヘリックスとの間に位置する細胞内ループドメイン内に置換をさらに含み、細胞内ループドメインの少なくとも一部が、ＣｈＲ１の対応する部分によって置き換えられている。別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの一部は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ａ１４５に延びるＣｈＲ１からの対応する部分で置き換えられ得る。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、キメラ光反応性タンパク質の第３の膜貫通ヘリックス内に置換をさらに含み、第３の膜貫通ヘリックスの少なくとも一部が、ＣｈＲ１の対応する配列によって置き換えられている。さらに別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの一部は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ｗ１６３に延びるＣｈＲ１からの対応する部分で置き換えられ得る。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、緑色光によって照射されるとき、細胞中の電流の脱分極を仲介する。いくつかの実施形態において、この光は、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、この光は、約５４２ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、細胞が紫色光によって照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できない。いくつかの実施形態において、このキメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光によって照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できない。さらに、いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを、Ｃ１Ｖ１タンパク質を活性化するために使用することができる。
【００９６】
ある場合には、Ｃ１Ｖ１ポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル及び／またはＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000019
を含む。使用に好適であるトラフィックイング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000020
などのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば、
2017536130.tif 000021
等である。
【００９７】
ある特定の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００９８】
Ｃ１Ｖ１変異体
いくつかの実施形態において、好適な光反応性ポリペプチドは、置換されたまたは変異したアミノ酸配列を含み、変異体ポリペプチドは、前駆体Ｃ１Ｖ１ポリペプチドの特徴的な光活性化可能な性質を保持するが、いくつかの特定の態様においては変更された特性も有し得る。例えば、本明細書に記載される変異体光反応性Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、動物細胞内でまたは動物細胞形質膜上の両方での増加した発現のレベル；異なる波長の光、特に赤色光に露光されたときの変更された反応性；及び／またはこれによってキメラＣ１Ｖ１ポリペプチドが、低脱感作、高速の不活性化、他の光反応性カチオンチャネルとの最小交差活性化のための低紫色光活性化、ならびに／もしくは動物細胞中の強い発現を有する形質の組み合わせを呈することができる。
【００９９】
したがって、好適な光反応性タンパク質は、キメラポリペプチドのＶＣｈＲ１部分のレチナール結合ポケット全体にわたる重要な位置において特異的なアミノ酸置換を有することができるＣ１Ｖ１キメラ光反応性タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸残基Ｅ１２２においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸残基Ｅ１６２においてアミノ酸置換を含む。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸残基Ｅ１６２及びＥ１２２の両方においてアミノ酸置換を含む。
【０１００】
いくつかの態様において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は、細胞が光によって照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できる。いくつかの実施形態において、この光は、緑色光である。他の実施形態において、この光は、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、この光は、約５４６ｎｍの波長を有する。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は、細胞が赤色光で照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できる。いくつかの実施形態において、この赤色光は、約６３０ｎｍの波長を有する。Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は、細胞が紫色光によって照射されるときは、細胞中の電流を脱分極することを仲介できない。いくつかの実施形態において、このキメラタンパク質は、約４０５ｎｍの波長を有する光で照射されるときは、細胞中の電流を脱分極することを仲介できない。さらに、いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質を活性化するために使用することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質の１００Ｈｚの周波数を有する光パルスによる活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極化を引き起こし得る。
【０１０１】
他の態様において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞が光によって照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できる。いくつかの実施形態において、この光は、緑色光とすることができる。他の実施形態において、この光は、約５３５ｎｍ〜約５４０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、この光は、約５４２ｎｍの波長を有することができる。他の実施形態において、この光は、約５３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できない。いくつかの実施形態において、このキメラタンパク質は、約４０５ｎｍの波長を有する光で照射されるときは、細胞中の電流を脱分極することを仲介できない。さらに、いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を活性化するために使用することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質の１００Ｈｚの周波数を有する光パルスによる活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘導シナプス枯渇を引き起こし得る。
【０１０２】
さらに他の態様において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞が光によって照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できる。いくつかの実施形態において、この光は、緑色光とすることができる。他の実施形態において、この光は、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、この光は、約５４６ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できない。いくつかの実施形態において、このキメラタンパク質は、約４０５ｎｍの波長を有する光で照射されるときは、細胞中の電流を脱分極することを仲介できない。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、Ｅ１２２／Ｅ１６２における突然に変異を欠如するＣ１Ｖ１キメラタンパク質に比べると、または他の光反応性カチオンチャネルタンパク質に比べると、紫色光に露光されたときにより少ない活性化を呈し得る。さらに、いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を活性化するために使用することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質の１００Ｈｚの周波数を有する光パルスによる活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘導シナプス枯渇を引き起こし得る。
【０１０３】
ある場合には、Ｃ１Ｖ１変異体ポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル及び／またはＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000022
を含む。使用に好適であるトラフィックイング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000023
などのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば、
2017536130.tif 000024
等である。
【０１０４】
Ｃ１Ｃ２キメラカチオンチャネル
他の実施形態において、光反応性カチオンチャネルタンパク質は、コナミドリムシからのＣｈＲ１及びＣｈＲ２タンパク質に由来するＣ１Ｃ２キメラタンパク質であり、このタンパク質は、光に反応性であり、細胞が光によって照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できる。別の実施形態において、この光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。この光反応性カチオンチャネルタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／または光反応性カチオンチャネルタンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、光反応性カチオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有する光反応性プロトンポンプタンパク質は、細胞膜を横切ってカチオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、標的細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上など）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000025
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000026
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000027
等である。
【０１０７】
ある特定の実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
ＲｅａＣｈＲ
いくつかの態様において、脱分極性光反応性ポリペプチドは、コナミドリムシに由来する脱分極性光反応性ポリペプチドの赤色シフト（ｒｅｄ  ｓｈｉｆｔｅｄ）変異体であり、このような光反応性ポリペプチドは、本明細書において「ＲｅａＣｈＲポリペプチド」または「ＲｅａＣｈＲタンパク質」もしくは「ＲｅａＣｈＲ」と称される。別の実施形態において、この光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＲｅａＣｈＲポリペプチドを活性化するために使用される光は、約５９０ｎｍ〜約６３０ｎｍの波長を有することができるか、または約６１０ｎｍの波長を有することができる。ＲｅａＣｈＲタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／または光反応性カチオンチャネルタンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＲｅａＣｈＲは、細胞膜を横切ってカチオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、標的細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上など）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000028
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000029
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000030
等である。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
ＳｄＣｈＲ
いくつかの態様において、脱分極性光反応性ポリペプチドは、シェルフェリア・デュビア（Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ  ｄｕｂｉａ）に由来するＳｄＣｈＲポリペプチドであり、ＳｄＣｈＲポリペプチドは、細胞が光によって照射されるとき、細胞膜を横切ってカチオンを輸送することができる。ある場合には、ＳｄＣｈＲポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＳｄＣｈＲポリペプチドを活性化するために使用される光は、約４４０ｎｍ〜約４９０ｎｍの波長を有することができるか、または約４６０ｎｍの波長を有することができる。ＳｄＣｈＲタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＳｄＣｈＲタンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。場合によっては、ＳｄＣｈＲタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＳｄＣｈＲタンパク質は、細胞膜を横切ってカチオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、標的細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上など）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000031
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000032
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000033
等である。
【０１１５】
ある特定の実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
ＣｎＣｈＲ１
いくつかの態様において、脱分極性光反応性ポリペプチドは、例えば、クラミドモナス・ノクチガマ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｎｏｃｔｉｇａｍａ）に由来するＣｎＣｈＲ１ポリペプチドとすることができ、ＣｎＣｈＲ１ポリペプチドは、細胞が光によって照射されるとき、細胞膜を横切ってカチオンを輸送することができる。ある場合には、ＣｎＣｈＲ１ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示される配列に少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＣｎＣｈＲ１ポリペプチドを活性化するために使用される光は、約５６０ｎｍ〜約６３０ｎｍの波長を有することができるか、または約６００ｎｍの波長を有することができる。ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＣｎＣｈＲ１タンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。ある場合には、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＣｎＣｈＲ１タンパク質は、細胞膜を横切ってカチオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、標的細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上など）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000034
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000035
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000036
等である。
【０１１９】
ある特定の実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
Ｃｓクリムソン（ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎ）
いくつかの態様において、脱分極性光反応性カチオンチャネルタンパク質は、クロロモナス・スブジビザ（Ｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ｓｕｂｄｉｖｉｓａ）のＣｓＣｈＲタンパク質及びクラミドモナス・ノクチガマからのＣｎＣｈＲ１タンパク質に由来するＣｓクリムソンキメラタンパク質であり、このタンパク質のＮ末端は、ＣｓＣｈＲの残基１〜７３のアミノ酸配列それに続くＣｎＣｈＲ１のアミノ酸配列の残基７９〜３５０を含み、脱分極性光反応性カチオンチャネルタンパク質は、光と反応性であり、細胞が光によって照射されるとき、細胞中の電流を脱分極することを仲介できる。別の実施形態において、Ｃｓクリムソンポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。Ｃｓクリムソンタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＣｓクリムソンタンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、Ｃｓクリムソンタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＣｓクリムソンタンパク質は、細胞膜を横切ってカチオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、Ｃｓクリムソンタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、標的細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上など）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｓクリムソンタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｓクリムソンタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｓクリムソンタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃｓクリムソンタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000037
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000038
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000039
等である。
【０１２３】
ある特定の実施形態において、Ｃｓクリムソンタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
ＳｈＣｈＲ１
いくつかの態様において、脱分極性光反応性ポリペプチドは、例えば、スチゲオクロニウム・ヘルベチクム（Ｓｔｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｍ）に由来するＳｈＣｈＲ１ポリペプチドとすることができ、ＳｈＣｈＲ１ポリペプチドは、細胞が光によって照射されるとき、細胞膜を横切ってカチオンを輸送することができる。ある場合には、ＳｈＣｈＲ１ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。Ｓｔｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｍに由来するＳｈＣｈＲ１タンパク質を活性化するために使用される光は、約４８０ｎｍ〜約５１０ｎｍの波長を有することができるか、または約５００ｎｍの波長を有することができる。ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＳｈＣｈＲ１タンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＳｈＣｈＲ１タンパク質は、細胞膜を横切ってカチオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、標的細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上など）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000040
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000041
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000042
等である。
【０１２７】
ある特定の実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
他の好適な脱分極性光反応性ポリペプチドは、例えば、Ｋｌａｐｏｅｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４  １１：３３８に記載されている。
【０１２９】
過分極性光反応性ポリペプチド
Ａｒｃｈ
いくつかの実施形態において、好適な光反応性ポリペプチドは、アーケロドプシン（Ａｒｃｈａｅｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）（Ａｒｃｈ）プロトンポンプ（例えば、ハロルブルム・ソドメンス（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｓｏｄｏｍｅｎｓｅ）に由来するプロトンポンプ）であり、これは、細胞が光によって照射されるとき、細胞の形質膜を横切って１つ以上のプロトンを輸送することができる。この光は、約５３０〜約５９５ｎｍの波長を有することができるか、または約５６０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。Ａｒｃｈタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＡｒｃｈタンパク質の標的細胞の形質膜を横切ってイオンを輸送するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、Ａｒｃｈタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＡｒｃｈタンパク質は、光に反応して標的細胞の形質膜を横切ってイオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルから選択される、標的細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上など）のアミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000043
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000044
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000045
等である。
【０１３２】
ある特定の実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３３】
ＡｒｃｈＴ
いくつかの実施形態において、好適な光活性化タンパク質は、アーケロドプシン（ＡｒｃｈＴ）プロトンポンプ（例えば、ハロルブルム属（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ）ＴＰ００９に由来するプロトンポンプ）であり、これは、細胞が光によって照射されるとき、細胞の形質膜を横切って１つ以上のプロトンを輸送することができる。この光は、約５３０〜約５９５ｎｍの波長を有することができるか、または約５６０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、ＡｒｃｈＴタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６（ＡｒｃｈＴ）に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ＡｒｃｈＴタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＡｒｃｈＴタンパク質の標的細胞の形質膜を横切ってイオンを輸送するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、ＡｒｃｈＴタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＡｒｃｈＴタンパク質は、光に反応して標的細胞の形質膜を横切ってイオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１３４】
ある場合には、ＡｒｃｈＴポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル及び／またはＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000046
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000047
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000048
等である。
【０１３５】
ある特定の実施形態において、ＡｒｃｈＴタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
ＧｔＲ３
いくつかの実施形態において、光反応性ポリペプチドは、青色光に反応性であり、グィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ）に由来するプロトンポンプタンパク質であり、このプロトンポンプタンパク質は、細胞が青色光によって照射されるとき、細胞中の電流を過分極することを仲介でき、このようなタンパク質は、本明細書では、「ＧｔＲ３タンパク質」または「ＧｔＲ３ポリペプチド」と称される。この光は、約４５０〜約４９５ｎｍの波長を有することができるか、または約４９０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８（ＧｔＲ３）に示される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＧｔＲ３タンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＧｔＲ３タンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、ＧｔＲ３タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＧｔＲ３タンパク質は、光に反応して神経細胞の形質膜を過分極するための能力を適切に保持する。
【０１３７】
ある場合には、ＧｔＲ３タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、哺乳動物細胞の形質膜への輸送を向上させる、少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のアミノ酸配列モチーフとを含む。いくつかの実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、この光反応性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000049
を含む。いくつかの実施形態において、最初の１９個のアミノ酸は、
2017536130.tif 000050
で置き換えられている。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。ＧｔＲ３タンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000051
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000052
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000053
等である。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
Ｏｘｙ
いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、細胞が光によって照射されるとき、１つ以上のプロトンを細胞の形質膜を横切って輸送することができるオキシルリス・マリーナ（Ｏｘｙｒｒｈｉｓ  ｍａｒｉｎａ）（Ｏｘｙ）タンパク質である。この光は、約５００〜約５６０ｎｍの波長を有することができるか、または約５３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。Ｏｘｙタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＯｘｙタンパク質の標的細胞の形質膜を横切ってイオンを輸送するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、Ｏｘｙタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＯｘｙタンパク質は、光に反応して標的細胞の形質膜を横切ってイオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、標的細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つの（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。Ｏｘｙタンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、Ｏｘｙポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル及び／またはＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000054
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000055
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000056
等である。
【０１４３】
ある特定の実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
Ｍａｃ
いくつかの実施形態において、光反応性プロトンポンプタンパク質（本明細書では「Ｍａｃタンパク質」と称される）は、光に反応性であり、レプトスフェリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）に由来し、このＭａｃタンパク質は、細胞が５２０ｎｍ〜５６０ｎｍの照射されるとき、細胞の膜を横切ってプロトンを能動輸送することができる。この光は、約５２０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、Ｍａｃタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３（Ｍａｃ；Ｍａｃ  ３．０）に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。Ｍａｃタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＭａｃタンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、Ｍａｃタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＭａｃタンパク質は、光に反応して神経細胞の形質膜を横切ってプロトンを能動輸送するための能力を適切に保持する。
【０１４５】
他の態様において、Ｍａｃタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される、哺乳動物細胞の形質膜への輸送を向上させる、少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のアミノ酸配列モチーフとを含む。いくつかの実施形態において、Ｍａｃタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｍａｃタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｍａｃタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｍａｃタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。Ｍａｃタンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１４６】
ある場合には、Ｍａｃポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル及び／またはＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000057
を含む。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000058
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000059
等である。
【０１４７】
光活性化プロトンポンプタンパク質に関するさらなる開示は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３で見出すことができ、この開示は、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
ＮｐＨＲ
ある場合には、好適な光反応性塩化物ポンプタンパク質は、ナトロモナス・ファラオニス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ）に由来し、このようなタンパク質は、本明細書において「ＮｐＨＲタンパク質」または「ＮｐＨＲポリペプチド」と称される。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、濃黄色の光ならびに赤色光と反応性であることができ、ＮｐＨＲが濃黄色または赤色光によって照射されるとき、ニューロン中の電流を過分極することを仲介できる。ＮｐＨＲタンパク質を活性化することができる光の波長は、約５８０〜６３０ｎｍとすることができる。いくつかの実施形態において、この光は、約５８９ｎｍの波長であることができるか、またはこの光は、約６３０ｎｍ超（例えば、約７４０ｎｍ未満）の波長を有することができる。別の実施形態において、この光は、６３０ｎｍ周辺の波長を有することができる。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、光の連続パルスに露光されたとき、神経膜を少なくとも約９０分間にわたって過分極することができる。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも約７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。さらに、ＮｐＨＲタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＮｐＨＲタンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含む。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＮｐＨＲタンパク質は、光に反応して神経細胞の形質膜を過分極するための能力を適切に保持する。
【０１４９】
ある場合には、ＮｐＨＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも約７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）輸送シグナルとを含む。このＥＲ輸送シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合することができるか、またはコアアミノ酸配列のＮ末端に融合することができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、リンカーによってコアアミノ酸配列に連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）を含み、式中Ｘは、任意のアミノ酸とすることができる。別の実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、式中Ｘは、任意のアミノ酸とすることができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）を含む。
【０１５０】
使用するために好適である小胞体（ＥＲ）輸送配列としては、例えば
2017536130.tif 000060
等が挙げられる。ＥＲ輸送配列は、約５個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸、例えば、約５個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸〜約１５個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、または約２０個のアミノ酸〜約２５個のアミノ酸の長さを有することができる。
【０１５１】
他の態様において、ＮｐＨＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、（例えば、形質膜への輸送を向上させることができる）トラフィッキングシグナルとを含む。このトラフィッキングシグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合することができるか、またはコアアミノ酸配列のＮ末端に融合することができる。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、リンカーによってコアアミノ酸配列に連結されており、このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。ＮｐＨＲタンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来することができる。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000061
を含む。
【０１５２】
いくつかの態様において、ＮｐＨＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される選択される、哺乳動物細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つの（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。ＮｐＨＲタンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000062
を含む。別の実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
さらに、他の態様において、ＮｐＨＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のＮ末端シグナルペプチドは、欠失または置換されている。いくつかの実施形態において、他のシグナルペプチド（他のオプシンからのシグナルペプチドなど）を使用することができる。この光反応性タンパク質は、本明細書に記載されるＥＲ輸送シグナル及び／または膜トラフィッキングシグナルをさらに含むことができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、光反応性タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むＮｐＨＲタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、小胞体（ＥＲ）輸送シグナル及び／または膜トラフィッキングシグナルをさらに含む。例えば、ＮｐＨＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列は、リンカーを通してＥＲ輸送シグナルに連結されている。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）を含み、式中Ｘは、任意のアミノ酸とすることができる。別の実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、式中Ｘは、任意のアミノ酸とすることができる。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）を含む。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列と、ＥＲ輸送シグナルと、膜トラフィッキングシグナルとを含む。他の実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルを含む。他の実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、膜トラフィッキングシグナル、及びＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、膜トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において、膜トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000063
を含む。いくつかの実施形態において、膜トラフィッキングシグナルは、リンカーによってＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列に連結されている。いくつかの実施形態において、膜トラフィッキングシグナルは、リンカーを通してＥＲ輸送シグナルに連結されている。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかとすることができる。このリンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、光反応性タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチドをさらに含む。
【０１５５】
光反応性塩化物ポンプタンパク質に関するさらなる開示は、米国特許出願公開第２００９／００９３４０３号及び同第２０１０／０１４５４１８号ならびに国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３で見出すことができ、これらのそれぞれの開示は、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
ドナリエラ・サリーナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  Ｓａｌｉｎａ）光反応性ポリペプチド
いくつかの実施形態において、好適な光反応性イオンチャネルタンパク質は、例えば、ドナリエラ・サリーナに由来するＤｓＣｈＲタンパク質であり、このイオンチャネルタンパク質は、細胞が光によって照射されるとき、細胞中の電流を過分極することを仲介できる。この光は、約４７０ｎｍ〜約５１０ｎｍの波長を有することができるか、または約４９０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。さらに、ＤｓＣｈＲタンパク質は、光感応性を増加もしくは減少させるために、光の特定の波長に対する感応性を増加もしくは減少させるために、及び／またはＤｓＣｈＲタンパク質の細胞の形質膜の分極状態を調節するための能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入をさらに含むことができる。さらに、ＤｓＣｈＲタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換及び／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含むことができる。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含有するＤｓＣｈＲタンパク質は、光に反応して神経細胞の形質膜を横切ってイオンを輸送するための能力を適切に保持する。
【０１５７】
ある場合には、ＤｓＣｈＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ輸送シグナル、及び膜トラフィッキングシグナルからなる群から選択される選択される、哺乳動物細胞の形質膜への輸送を向上させる少なくとも１つの（１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチド、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル、及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のＥＲ輸送シグナル及びＣ末端のトラフィッキングシグナルは、リンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のアミノ酸の長さのうちのいずれかを含むことができる。ＤｓＣｈＲタンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸送シグナルは、トラフィッキングシグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ＥＲ輸送シグナルよりも一層Ｃ末端側に位置する。
【０１５８】
ある場合には、ＤｓＣｈＲポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル及び／またはＥＲ輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、トラフィッキングシグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、トラフィッキングシグナルは、アミノ酸配列
2017536130.tif 000064
を含むことができる。使用するために好適であるトラフィッキング配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のトラフィッキング配列
2017536130.tif 000065
のようなアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。ある場合には、ＥＲ輸送シグナルは、例えば
2017536130.tif 000066
等である。
【０１５９】
ある特定の実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
Ｃ１Ｃ２に基づくアニオンチャネルポリペプチド
いくつかの実施形態において、光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、Ｃ１Ｃ２タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質のアミノ酸配列は、以下の突然変異：Ｔ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、Ｖ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ｔ２８５Ｎ、Ｖ２８１Ｋ及び／またはＮ２９７Ｑのうちの１つ以上をアミノ酸配列に導入することによって修飾される。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、上記に列挙したアミノ酸置換のうちの９個全てを有するＣ１Ｃ２のアミノ酸配列を含み、これにより、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に記載されるものとなる。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＣ１Ｃ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）に対して、Ｔ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、Ｖ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ｔ２８５Ｎ、Ｖ２８１Ｋ及び／またはＮ２９７Ｑから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＣ１Ｃ２のアミノ酸配列に対して、Ｔ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、及びＴ２８５Ｎ置換を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＣ１Ｃ２のアミノ酸配列に対して、Ｖ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ｖ２８１Ｋ、及びＮ２９７Ｑ置換を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に記載される通りである。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000067
を含むことができる。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含むことができる。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000068
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含むことができる。したがって、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）に基づいており、このアミノ酸配列は、Ｃ１Ｃ２の最初の５０個のＮ末端アミノ酸が、タンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１
2017536130.tif 000069
で置き換えることによって修飾されている。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、「ｉｂＣ１Ｃ２」と称され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000070
を含むことができる。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含むことができる。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000071
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含むことができる。したがって、ｉｂＣ１Ｃ２タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）に基づいており、１６７位のシステインアミノ酸残基が、スレオニン残基で置き換えられている。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチド、例えばＳｗｉＣｈＲＣＴは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、かつＴ１６７を含む。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７を含み、かつＴ１６７を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提供されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、この光反応性ポリペプチドは、光電流の長期安定性を示す。いくつかの実施形態において、最初の５０個のアミノ酸は、
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で置き換えられている。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000073
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000074
の両方を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列に基づいており、１６７位のシステインアミノ酸残基が、アラニン残基で置き換えられている。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチド、例えばＳｗｉＣｈＲＣＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、かつＡ１６７を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７を含み、かつＡ１６７を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、最初の５０個のアミノ酸は、
2017536130.tif 000075
で置き換えられている。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000076
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000077
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列に基づいており、１６７位のシステインアミノ酸残基が、セリン残基で置き換えられている。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチド、例えばＳｗｉＣｈＲＣＳは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、かつＳ１６７を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７を含み、かつＳ１６７を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、最初の５０個のアミノ酸は、
2017536130.tif 000078
で置き換えられている。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000079
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000080
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１６７】
ある特定の実施形態において、ＳｗｉＣｈＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチド、ＳｗｉＣｈＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、Ｎ１９５、またはＡ１９５を含み、またＡ１６７を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７を含み、Ａ１６７を含み、またＮ１９５、またはＡ１９５を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、最初の５０個のアミノ酸は、ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）で置き換えられている。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000081
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000082
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、上述した修飾のうちの１つ以上を有するタンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列に基づいており、元の１９５位のアスパラギン酸アミノ酸残基が、アラニン残基で置き換えられている。このタンパク質の最初の５０個のＮ末端アミノ酸が、タンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１によって置き換えられているある特定の実施形態において、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸（これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に記載されるＣ１Ｃ２アミノ酸配列の元の１９５位に相当する）は、アラニン残基によって置き換えられている。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、上述した修飾のうちの１つ以上を有するタンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列に基づいており、元の１９５位のアスパラギン酸アミノ酸残基が、アスパラギン残基で置き換えられている。このタンパク質の最初の５０個のＮ末端アミノ酸が、タンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１によって置き換えられているある特定の実施形態において、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸（これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に記載されるＣ１Ｃ２アミノ酸配列の元の１９５位に相当する）は、アスパラギン残基によって置き換えられている。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＡ１２８、Ｔ１２８またはＳ１２８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８を含み、またＡ１２８、Ｔ１２８またはＳ１２８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000083
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000084
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１７２】
ＣｈＲ２に基づくアニオンチャネルタンパク質
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、タンパク質ＣｈＲ２のアミノ酸配列に基づく。ＣｈＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されている。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列は、以下の突然変異：Ａ５９Ｓ、Ｅ９０Ｓ、Ｅ１０１Ｓ、Ｅ１２３Ｓ、Ｑ１１７Ｋ、Ｈ１３４Ｒ、Ｖ２４２Ｋ、Ｔ２４６Ｎ、及び／またはＮ２５８Ｑのうちの１つ以上をアミノ酸配列に導入することによって修飾されている。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、上で列記したアミノ酸置換の全ての９個を有するタンパク質ＣｈＲ２のアミノ酸配列を含み、これにより、このポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５（ｉＣｈＲ２）に提供されている。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドｉＣｈＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＣｈＲ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に対して、Ａ５９Ｓ、Ｅ９０Ｓ、Ｅ１０１Ｓ、Ｅ１２３Ｓ、Ｑ１１７Ｋ、Ｈ１３４Ｒ、Ｖ２４２Ｋ、Ｔ２４６Ｎ、及び／またはＮ２５８Ｑから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸置換を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチド（「ｉＣｈＲ２」）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｋ２４２、Ｎ２４６及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に記載される通りである。いくつかの実施形態において、ｉＣｈＲ２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｋ２４２、Ｎ２４６及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個を含み、またＮ１５６またはＡ１５６のいずれかを含み、またＴ１２８、Ａ１２８、またはＳ１２８のいずれかを含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に記載される通りである。いくつかの実施形態において、ｉＣｈＲ２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｋ２４２、Ｎ２４６、及びＱ２５８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、ｉＣｈＲ２ポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000085
を含むことができる。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、ｉＣｈＲ２ポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含むことができる。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、ｉＣｈＲ２ポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000086
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含むことができる。したがって、ある特定の実施形態において、ｉＣｈＲ２タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１７５】
Ｃ１Ｖ１に基づくアニオンチャネルポリペプチド
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列に基づく。Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載されている。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質のアミノ酸配列は、以下の突然変異：Ｔ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、Ｖ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ａ２８５Ｎ、Ｐ２８１Ｋ及び／またはＮ２９７Ｑのうちの１つ以上をアミノ酸配列に導入することによって修飾される。いくつかの実施形態において、過分極光反応性ポリペプチドは、上記に列挙したアミノ酸置換のうちの９個全てを有するタンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列を含み、これにより、このポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に提供されるものとなる。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチド、ｉＣ１Ｖ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＣ１Ｖ２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）に対して、Ｔ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、Ｖ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ａ２８５Ｎ、Ｐ２８１Ｋ及び／またはＮ２９７Ｑから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸置換を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチド、ｉＣ１Ｖ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチド（「ｉＣ１Ｖ１」と称される）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＮ１９５を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000087
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000088
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。したがって、ある特定の実施形態において、ｉＣ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）に基づいており、このアミノ酸配列は、Ｃ１Ｖ１の最初の５０個のＮ末端アミノ酸が、タンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１
2017536130.tif 000089
で置き換えることによって修飾されている。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性アニオンチャネルポリペプチド、ｉｂＣ１Ｖ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチド（「ｉｂＣ１Ｖ１」と称される）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＮ１５６を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000090
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000091
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含むことができる。したがって、ｉｂＣ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）に基づいており、１６７位のシステインアミノ酸残基が、スレオニン残基で置き換えられている。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＴ１６７を含む。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７を含み、またＴ１６７、Ｓ１６７またはＡ１６７を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、及びＱ２９７を含み、Ｔ１６７、Ｓ１６７またはＡ１６７を含み、またＡ１９５またはＮ１９５を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に記載される通りである。いくつかの実施形態において、最初の５０個のアミノ酸は、ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）で置き換えられている。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000092
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極光反応性ポリペプチド、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000093
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、上述された修飾の１つ以上を含むタンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列に基づいており、元の１９５位のアスパラギン酸アミノ酸残基が、アラニン残基で置き換えられている。このタンパク質の最初の５０個のＮ末端アミノ酸がタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１によって置き換えられているある特定の実施形態において、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸（これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載されるＣ１Ｖ１アミノ酸配列の元の１９５位に相当する）は、アラニン残基によって置き換えられている。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、上述された修飾の１つ以上を含むタンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列に基づいており、元の１９５位のアスパラギン酸アミノ酸残基が、アスパラギン残基で置き換えられている。このタンパク質の最初の５０個のＮ末端アミノ酸がタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１によって置き換えられているある特定の実施形態において、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸（これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載されるＣ１Ｖ１アミノ酸配列の元の１９５位に相当する）は、アスパラギン残基によって置き換えられている。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチド、ｉｂＣ１Ｖ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＴ１２８、Ａ１２８、またはＳ１２８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８を含み、またＴ１２８、Ａ１２８、またはＳ１２８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000094
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000095
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＴ１２８、Ａ１２８、またはＳ１２８を含み、またＡ１５６またはＮ１５６を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載される通りである。いくつかの実施形態において、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８を含み、またＴ１２８、Ａ１２８、またはＳ１２８を含み、またＡ１５６またはＮ１５６を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000096
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極光反応性ポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000097
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１８４】
ＲｅａＣｈＲに基づくアニオンチャネルポリペプチド
いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、タンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列に基づく。ＲｅａＣｈＲタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に記載されている。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質のアミノ酸配列は、以下の突然変異：Ｔ９９Ｓ、Ｅ１３０Ｓ、Ｅ１４１Ｓ、Ｅ１６３Ｓ、Ｖ１５７Ｋ、Ｈ１７４Ｒ、Ａ２８６Ｎ、Ｐ２８２Ｋ及び／またはＮ２９８Ｑのうちの１つ以上をアミノ酸配列に導入することによって修飾される。いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、上記に列挙したアミノ酸置換のうちの９個全てを有するタンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列を含み、これにより、このポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に提供されるものとなる。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、対象の光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）に対して、Ｔ９９Ｓ、Ｅ１３０Ｓ、Ｅ１４１Ｓ、Ｅ１６３Ｓ、Ｖ１５７Ｋ、Ｈ１７４Ｒ、Ａ２８６Ｎ、Ｐ２８２Ｋ及び／またはＮ２９８Ｑから選択される１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸置換を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、対象の光反応性アニオンチャネルポリペプチド、ｉＲｅａＣｈＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、及びＱ２９８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、対象の光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、及びＱ２９８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000098
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000099
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。したがって、ある特定の実施形態において、ｉＲｅａＣｈＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、対象の光反応性アニオンチャネルポリペプチド、ｉＲｅａＣｈＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、及びＱ２９８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＮ１９６を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、対象の光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、及びＱ２９８を含み、またＮ１９６を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000100
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000101
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、タンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）に基づいており、このアミノ酸配列は、ＲｅａＣｈＲの最初の５１個のＮ末端アミノ酸が、タンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１
2017536130.tif 000102
で置き換えることによって修飾されている。いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性アニオンチャネルポリペプチド、ｉｂＲｅａＣｈＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載される通りである。いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載される通りである。いくつかの実施形態において、対象の光反応性アニオンチャネル、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000103
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000104
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。したがって、ｉｂＲｅａＣｈＲタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、タンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）に基づいており、このアミノ酸配列は、ＲｅａＣｈＲの最初の５１個のＮ末端アミノ酸が、タンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１
2017536130.tif 000105
で置き換えることによって修飾されている。いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性アニオンチャネルポリペプチド、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＮ１５６を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載される通りである。いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８を含み、またＮ１５６を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000106
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000107
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、タンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）に基づいており、１６８位のシステインアミノ酸残基が、スレオニン残基で置き換えられている。いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、及びＱ２９８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＴ１６８、Ｓ１６８またはＡ１６８を含む。いくつかの実施形態において、対象の光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、及びＱ２９８を含み、またＴ１６８、Ｓ１６８またはＡ１６８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、最初の５１個のアミノ酸は、
2017536130.tif 000108
で置き換えられている。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000109
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000110
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチド、ｉＲｅａＣｈＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、及びＱ２９８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、Ａ１９６またはＮ１９６を含み、またＴ１６８、Ｓ１６８、またはＡ１６８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性アニオンチャネルポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、及びＱ２９８を含み、Ａ１９６またはＮ１９６を含み、またＴ１６８、Ｓ１６８、またはＡ１６８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に記載される通りである。いくつかの実施形態において、最初の５１個のアミノ酸は、
2017536130.tif 000111
で置き換えられている。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000112
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000113
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、上述した修飾の１つ以上を含むタンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列に基づいており、元の１９６位のアスパラギン酸アミノ酸残基が、アラニン残基で置き換えられている。このタンパク質の最初の５１個のＮ末端アミノ酸がタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１によって置き換えられているある特定の実施形態において、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸（これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に記載されるＲｅａＣｈＲアミノ酸配列の元の１９６位に相当する）は、アラニン残基によって置き換えられている。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、上述した修飾の１つ以上を含むタンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列に基づいており、元の１９６位のアスパラギン酸アミノ酸残基が、アスパラギン残基で置き換えられている。このタンパク質の最初の５１個のＮ末端アミノ酸がタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１によって置き換えられているある特定の実施形態において、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸（これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に記載されるＲｅａＣｈＲアミノ酸配列の元の１９６位に相当する）は、アスパラギン残基によって置き換えられている。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチド、ｉｂＲｅａＣｈＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＴ１２８、Ｓ１２８、またはＡ１２８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載される通りである。いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８を含み、またＴ１２８を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000114
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000115
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチド、ｉｂＲｅａＣｈＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個を含み、またＴ１２８、Ｓ１２８、またはＡ１２８を含み、またＡ１５６またはＮ１５６を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載される通りである。いくつかの実施形態において、対象の過分極光反応性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載されるアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またＳ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、及びＱ２５８を含み、またＴ１２８、Ｓ１２８、またはＡ１２８を含み、またＡ１５６またはＮ１５６を含み、このアミノ酸番号付けは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に記載される通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000116
を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、ＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、対象のアニオンチャネルポリペプチドは、膜トラフィッキングシグナル
2017536130.tif 000117
及びＥＲ輸送シグナル（例えば、ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））の両方を含む。
【０１９６】
発現ベクター
上で述べたように、本開示の態様は、Ｄ２ＳＰを含む核酸を含んでいる組換え発現ベクターを含む。好適な発現ベクターとしては、ベクターのポリヌクレオチドから転写されるとき、対象の遺伝子産物の発現をもたらすことになる、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが含まれる。ある場合には、遺伝子産物はポリペプチドである。ある場合には、発現ベクター中でコードされる遺伝子産物は、標的細胞の形質膜上で発現する光反応性ポリペプチドである。他の例では、発現ベクター中でコードされる遺伝子産物は、標的細胞の細胞質ゾル中で発現する蛍光タンパク質である。使用され得るベクターとしては、限定されるものではないが、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくベクターが挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、モロニ―マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、バキュロウイルス及びエボラウイルスが含まれるがこれらに限定されない他のウイルスのエンベロープタンパク質でシュードタイプ化されてもよい。このようなベクターは、当該技術分野における標準方法を用いて調製することができる。
【０１９７】
関心対象の他のベクターとして、プラスミドベクターが含まれる。本明細書で使用されるプラスミドという用語は、核酸、例えば、プラスミドベクター、コスミド、ファージミドまたはバクテリオファージに由来するＤＮＡを指し、その中に特定の遺伝子をコードする核酸の１つ以上の断片が挿入またはクローンされ得る。これは、通常、宿主細胞において染色体ＤＮＡから独立して複製することができるＤＮＡの環状二本鎖からなる染色体外遺伝物質から構成された構築物を含む。
【０１９８】
ある特定の実施形態において、組換え発現ベクターは、関心対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を組換え発現ベクター中にサブクローニングすることを容易にする複数のクローニングサイトを含み、これによって、関心対象の遺伝子才物をコードするヌクレオチド配列をＤ２ＳＰに作動可能に連結する。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えＡＡＶベクターであることができる。ＡＡＶベクターは、安定かつ部位特異的方法で、これらが感染する細胞のゲノム中に一体化することができる比較的小型のＤＮＡウイルスである。これらはまた、細胞の増殖、形態または分化にいかなる作用も誘発することなく、広範囲の細胞に感染することが可能であり、これらは人体病理学に関与するとは見なされていない。ＡＡＶのゲノムはクローンされ、配列決定され、また特性評価されている。これは、およそ４７００個の塩基を包含し、各末端に、ウイルスのための複製起点として機能するおよそ１４５個の塩基の末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を含む。ゲノムの残部は、キャプシド形成機能を実行する２つの必須領域：ウイルスの複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含むゲノムの左側部分、ならびにウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含むゲノムの右側部分に分割される。
【０２００】
ＡＡＶベクターは、当該技術分野における標準方法を用いて調製することができる。任意の血清型のアデノ随伴ウイルスが好適である（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，ｐｐ．１６５−１７４  ｏｆ“Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ”Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．（１９８８）；Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１，１９７４；Ｐ．Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ“Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ”Ｉｎ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＪＲ  Ｋｅｒｒ，ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ５−１４，Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）；及びＤＥ  Ｂｏｗｌｅｓ，ＪＥ  Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ＲＪ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ“Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ”（ＪＲ  Ｋｅｒｒ，ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ１５−２３，Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）を参照されたい。これらのそれぞれは、それらの全体が参考として本明細書に組み込まれる）。ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、同第６，９８９，２６４、及び同第６，９９５，００６号、ならびに“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｔｉｔｅｒ  Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”と題されたＷＯ／１９９９／０１１７６４で見出すことができ、これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書に組み込まれる。バキュロウイルス系でＡＡＶベクターを調整する方法が、例えばＷＯ２００８／０２４９９８に記載されている。ＡＡＶベクターは、自己相補性または一本鎖とすることができる。ハイブリッドベクターの調製物が、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１に記載され、この開示は、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。ＡＡＶに由来するベクターの遺伝子をインビトロならびにインビボで導入するための使用が記載されている（例えば、国際特許出願公開第９１／１８０８８号及びＷＯ  ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号、同第６，５９６，５３５号、及び同第５，１３９，９４１号；ならびに欧州特許第０４８８５２８号を参照されたい。これらの全ては、それらの全体が参考として本明細書に組み込まれる）。これらの刊行物は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子が欠失され、関心対象の遺伝子によって置き換えられた様々なＡＡＶ由来の構築物、及びこれらの構築物の関心対象の遺伝子をインビトロで（培養細胞中に）またはインビボで（生物に直接）導入するための使用を記載している。本開示による複製欠損の組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）領域に隣接する関心対象の核酸配列を含むプラスミドと、ＡＡＶのキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）を担持するプラスミドとを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）で感染されている細胞株にコトランスフェクトすることによって調製することができる。生成されるＡＡＶ組換え体は、次いで標準技法によって精製される。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、本開示の方法で使用するためのベクターは、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６が挙げられるが、これらに限定されないＡＡＶウイルス粒子）中にキャプシド化される。したがって、本開示は、本明細書に記載されるベクターのいずれかを含む組換えウイルス粒子（これが組換えポリヌクレオチドを含有するために組換え体である）を含む。このような粒子を生成する方法は当該技術分野において既知であり、米国特許第６，５９６，５３５号に記載されており、この開示は、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。ある場合には、ＡＡＶ６が用いられる。ある場合には、ＡＡＶ１が用いられる。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、対象のＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体発現神経集団を標的化するために、様々な光反応性ポリペプチド（ＬＲＰ）、蛍光タンパク質（ＸＦＰ）、及び遺伝的にコードされたインジケータ（ＧＥＩ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。例えば、以下のアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）及びそれらの構成成分：限定されるものではないが、ＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＬＲＰ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＧＥＩ、ＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＦＬＥＸ−ＬＲＰ−ＸＦＰ、ＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＦＬＥＸ−ＧＥＩが使用されてもよい。ポリヌクレオチドと関連付けて使用することができる他のＡＡＶベクターとしては、Ｃｒｅ及びＦｌｐなどのリコンビナーゼの制御下でのタンパク質の発現を可能にするＬｏｘ配列に挟まれた逆向き挿入（ｄｏｕｂｌｅ  ｆｌｏｘｅｄ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ）リーディングフレーム（ＤＩＯ）を伴うもの：ＡＡＶ−２ＳＰ−ＤＩＯ（Ｃｒｅ）−ＬＲＰ−ＸＦＰ（Ｃｒｅ依存的発現）、ＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＤＩＯ（Ｆｌｐ）−ＬＲＰ−ＸＦＰ（Ｆｌｐ依存的発現）、ＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＤＩＯ（Ｃｒｅ）−ＤＩＯ（Ｆｌｐ）−ＬＲＰ−ＸＦＰ（Ｃｒｅ及びＦｌｐ依存的発現）が挙げられる。
【０２０３】
遺伝子改変宿主細胞
本開示は、対象の核酸で遺伝的に改変されている単離された遺伝子改変宿主細胞（例えば、インビトロの細胞）を提供する。いくつかの実施形態において、対象の単離された遺伝子改変宿主細胞は、本開示のＤ２ＳＰに作動可能に連結されたヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子産物を生成することができる。
【０２０４】
好適な宿主細胞は、哺乳動物細胞などの真核宿主細胞を含む。関心対象の哺乳動物細胞は、ヒト細胞、ラット細胞及びマウス細胞などの齧歯類細胞を含む。対象核酸の宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、電気穿孔法、ウイルス感染、または他の既知の方法によって行うことができる。
【０２０５】
好適な哺乳動物細胞は、初代細胞または幹細胞などの前駆細胞を含む。ある場合には、哺乳動物細胞は、ニューロン、例えば、非不死化（一次）ニューロンである。いくつかの実施形態において、細胞は、神経細胞または神経様細胞である。この細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、またはラット起源のもの、もしくはヒト以外の哺乳動物、非ヒト霊長類、ラット、またはマウスから誘導されたものとすることができる。好適な細胞株としては、ヒト神経膠腫細胞株、例えばＳＶＧｐ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８６２１）、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１８）、ＳＷ  １０８８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２）、ＳＷ  １７８３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３）、ＬＬＮ−１８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６１０）、LNＺＴＡ３ＷＴ４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１５４３）、ＬＮＺＴＡ３ＷＴ１１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１５４４）、Ｕ−１３８ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１６）、Ｕ−８７  ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）、Ｈ４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４８）、及びＬＮ−２２９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６１１）；ヒト髄芽腫由来細胞株、例えば、Ｄ３４２  Ｍｅｄ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８７）、Ｄａｏｙ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８６）、Ｄ２８３  Ｍｅｄ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８５）；ヒト腫瘍由来神経様細胞、例えば、ＰＦＳＫ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６０）、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ（ＡＴＣＣＣＲＬ−２１４９）、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１３７）、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１４２）、ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２７）等；マウス神経細胞株、例えば、ＢＣ３Ｈ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４３）、ＥＯＣ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４６７）、Ｃ８−Ｄ３０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３４）、Ｃ８−Ｓ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３５）、Ｎｅｕｒｏ−２ａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３１）、ＮＢ４１Ａ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１４７）、ＳＷ１０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７６６）、ＮＧ１０８−１５（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２３１７）；ラット神経細胞株、例えば、ＰＣ−１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）、ＣＴＸ  ＴＮＡ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２００６）、Ｃ６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０７）、Ｆ９８  （ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３９７）、ＲＧ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４３３）、Ｂ３５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７５４）、Ｒ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７６４）、ＳＣＰ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７００）、ＯＡ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６５３８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
場合によっては、宿主細胞は、前駆細胞または幹細胞である。本明細書で使用される「幹細胞」とは、誘導される際に、多系列の細胞に分化する能力（多分化能性または多能性）及び細胞分裂後にその多分化能性または多能性を維持するための能力（自己複製するための能力）の両方を有する細胞を指す。幹細胞は、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、真皮幹細胞、生殖幹細胞、及び胚性幹細胞（ＥＳ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、ならびにこれらの細胞から誘導された幹細胞等を包含する。幹細胞は、胚、出生後、未成体及び成体組織から得ることができる。「前駆細胞」とは、幹細胞に由来する未分化細胞を指し、それ自体は幹細胞ではない。一部の前駆細胞は、複数の細胞型に分化することができる子孫を生み出すことができる。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ヒトＥＳ細胞である。ある特定の実施形態において、ヒトＥＳ細胞は、ニューロンに分化することができる。ＥＳ細胞の増殖及び分化を誘導するための任意の好適な方法を用いることができ、それらのいくつかは、例えば、米国特許第８，４６０，９３１号及び同第７，８９２，８３５号；米国出願公開第２０１３０２５２３３５号及び同第２０１０００７５４１６号；ＰＣＴ出願公報番号ＷＯ２００１／０８８１００；ならびにＫａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２０００  ２８：３１に記載されており、これらは、参考として本明細書に組み込まれる。他の実施形態において、宿主細胞は、ｉＰＳ細胞であり、これは、例えば、ＰＣＴ出願公報番号ＷＯ２００７／０６９６６６にさらに詳細に記載されており、これは、参考として本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
方法
上で概説したように、本開示の態様は、標的細胞に、遺伝子産物に作動可能に連結されたＤ２ＳＰを含む核酸を導入する方法を含み、この遺伝子産物は、発現したときに、関心対象の機能、例えば、光誘発脱分極／過分極及び／または蛍光標識を実行する。核酸を標的細胞に導入することは、遺伝子改変宿主細胞について上述された任意の簡便な方法によって行うことができる。標的細胞は、インビトロ培養中にあるものでもよく、インビボに位置するもの、例えば、脳内の神経細胞などのインビボの組織中の細胞であってもよい。
【０２０９】
ある特定の実施形態において、標的細胞は、神経前駆細胞などの前駆細胞である。場合によっては、標的細胞は、幹細胞である。核酸を前駆細胞または幹細胞中に導入するための任意の簡便な方法を、遺伝子改変された宿主細胞に関して上述された遺伝子産物に作動可能に連結されたＤ２ＳＰを含む核酸を導入するために使用することができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、標的ニューロンは、例えば感覚ニューロン、運動ニューロン、または介在ニューロンである。本開示の標的ニューロンは、中枢神経系のニューロン及び／または末梢神経系の細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態において、標的組織は、複数の神経線維、神経、神経細胞節、神経筋接合部、筋肉、皮膚、または内分泌組織が含まれるが、これらに限定されない神経によって神経支配された組織、もしくは脳または脊髄の一部もしくは一部分（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎ）などの解剖学的領域を含んでもよい。いくつかの実施形態において、標的組織は、神経細胞（ｎｅｒｖｅ  ｃｅｌｌ）の特定の軸索などの個々の細胞の一部であってもよい。
【０２１１】
例示の標的細胞、脳領域及び組織としては、大脳基底核、側坐核、皮質、手綱、腹側被蓋野、黒質、嗅結節、中隔、扁桃体、海馬、小脳、視床、化学受容基引金帯、脳下垂体、視床下部、交感神経節、副腎、末梢求心性神経、腸神経、胃腸粘膜、心臓、肺組織、血管組織、腎皮質ならびに腎臓の髄質内層、及び神経膠芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１２】
Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、任意の簡便な手段によって、ニューロンに導入することができる。例えば、Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、神経束または神経に導入する（注入する）ことができ、これにより、核酸はニューロンに入り込み、ここでＤ２ＳＰに作動可能に連結された遺伝子産物がニューロン中で生成される。Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ニューロンに近接して導入する（注入する）ことができる。定位的注入を用いることができ、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７３：３４２４３４２９，１９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７：３４２８−３４３２，２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９−２２３，１９９３；及びＡｌｉｓｋｙ  ＆  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：２３１５−２３２９，２０００を参照されたく、これらのそれぞれの内容はそれらの全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
対象のポリペプチドが標的ニューロンまたは組織に送達されると、ポリヌクレオチドは標的細胞に入り込み、発現する。いくつかの実施形態において、対象の核酸からの発現は、Ｄ２ＳＰが活性である標的細胞中のみで起こる。このように、対象のポリペプチドが標的細胞以外の細胞に送達される場合には、このポリペプチドは、Ｄ２ＳＰがこれらの細胞中では不活性であるために、非標的細胞中では発現しないであろう。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、これに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、高い特異度で駆動する。プロモーターの特異度は、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子産物を発現し、Ｄ２受容体に特異的な抗体（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ａｂ１５５８；図３）によって陽性染色される細胞の数を、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子産物を発現する細胞の総数で割ったものとして表すことができる。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、９１％以上、例えば９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９５．５％以上、９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．２％以上、９８．３％以上、９８．４％以上、または９８．５％以上の特異度で駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、９９％以下、例えば、９９．５％以下、９９．３％以下、９９．１％以下、９９．０％以下、９８．９％以下、９８．８％以下、９８．７％以下、９８．６％以下、９８．５％以下、９８．４％以下、９８．３％以下、または９８．２％の特異度で駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、９１〜９９％の範囲の、例えば、９２〜９９％、例えば、９３〜９９％、９４〜９８．５％、または９５〜９８．５％の特異度で駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、約９８．２％の特異度で駆動する。
【０２１４】
場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、従来のＤ２受容体プロモーター、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（図２）に示される配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の配列を有する核酸などの、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含むＤ２受容体プロモーターによって駆動される遺伝子産物の発現の特異度パーセンテージよりも、５％以上まで、例えば６％以上、７％以上、８％以上、例えば９％以上などまで高い特異度パーセンテージで駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、従来のＤ２受容体プロモーター、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（図２）に示される配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の配列を有する核酸などの、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含むＤ２受容体プロモーターによって駆動される遺伝子産物の発現の特異度パーセンテージよりも、９％以下まで、例えば９．５％以下、９．０％以下、８．５％以下、例えば８％以下などまで高い特異度パーセンテージで駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、従来のＤ２受容体プロモーター、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（図２）に示される配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の配列を有する核酸などの、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含むＤ２受容体プロモーターによって駆動される遺伝子産物の発現の特異度パーセンテージよりも、５〜９％の範囲で、例えば６〜９．５％、６．５〜９．０％、７〜８．５％、例えば７．５〜８．０％の範囲などの高い特異度パーセンテージで駆動する。
【０２１５】
場合によっては、Ｄ２ＳＰは、これに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、高い浸透度度で駆動する。プロモーターの浸透度は、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子産物を発現し、Ｄ２受容体に特異的な抗体（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ａｂ１５５８；図３）によって陽性染色される細胞の数を、Ｄ２受容体に特異的な抗体（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ａｂ１５５８；図３）によって陽性染色される細胞の総数で割ったものとして表すことができる。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、７０％以上、例えば７２％以上、７４％以上、７６％％以上、７８％以上、７９％以上、８０以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８６．５％以上、８６．８％以上、または８７％以上の浸透度で駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、９９％以下、例えば、９５％以下、９４％以下、９３％以下、９２％以下、９１％以下、９０％以下、８９．５％以下、８９％以下、８９．５％以下、８９％以下、８８．５％以下、８８％以下、８７．５％以下、または８７％以下の浸透度で駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、７０〜９５％の範囲の、例えば、７５〜９５％、例えば、７８〜９３％、７９〜９１％、８０〜９０％、８１〜８９％、または８２〜８７％の特異度で駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、約８６．８％の浸透度で駆動する。
【０２１６】
場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、従来のＤ２受容体プロモーター、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の配列を有する核酸などの、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含むＤ２受容体プロモーターによって駆動される遺伝子産物の発現の浸透度パーセンテージよりも、５％以上まで、例えば８％以上、１０％以上、１２％以上、１４％以上、１６％以上、１７％以上、例えば１８％以上などまで高い浸透度パーセンテージで駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、従来のＤ２受容体プロモーター、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の配列を有する核酸などの、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含むＤ２受容体プロモーターによって駆動される遺伝子産物の発現の浸透度パーセンテージよりも、３５％以下まで、例えば３０％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、例えば１８％以下などまで高い浸透度パーセンテージで駆動する。場合によっては、Ｄ２ＳＰは、それに作動可能に連結された遺伝子産物の発現を、従来のＤ２受容体プロモーター、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一の配列を有する核酸などの、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含むＤ２受容体プロモーターによって駆動される遺伝子産物の発現の浸透度パーセンテージよりも、５〜３５％の範囲まで、例えば８〜３０％、１０〜２５％、１２〜２０％、１４〜１９％、例えば１６〜１８％の範囲などで高い浸透度パーセンテージで駆動する。
【０２１７】
ある特定の例において、標的細胞中に導入された核酸中のＤ２ＳＰに作動可能に連結された遺伝子産物は、上記及び本明細書の他の箇所で記載された光反応性ポリペプチドである。遺伝子産物が、Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された光反応性ポリペプチドであるとき、標的ニューロンなどの標的細胞中で発現する光反応性ポリペプチドは、このポリペプチドが光によって活性化される場合、標的細胞の過分極または脱分極を誘発させることによって、標的細胞の活性を調節することができる。場合によっては、光反応性ポリペプチドの活性化によって調節される活性は、標的ニューロンにおける活動電位発火のパターンまたは振幅、静止電位、膜電位のおける閾下変化、遺伝子の活性依存的転写及び／または翻訳などである。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは、細胞（例えば、哺乳動物細胞）の膜上で発現したとき、ならびに活性化波長の光に露光されたときに、膜を過分極する。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは、光電流の長期安定性を示す。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは、細胞膜における発現の向上及び培養ニューロン中のより大きな光電流を示す。いくつかの実施形態において、対象の光活性化ポリペプチドは、減速したチャネル動態／減速したチャネル閉鎖を示す。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは、より低い光強度における簡便な光刺激の後に、アニオンを伝導し、長時間にわたって（例えば、約０．５時間から、最長約０．７５時間、最長約１時間、最長約１．２５時間、最長約１．５時間、最長約１．７５時間、最長約２時間、最長約２．２５時間、最長約２．５時間、最長約２．７５時間、最長約３時間以上）ニューロン中の活動電位の形成を阻害する。
【０２１９】
場合によっては、標的細胞中に導入された核酸中のＤ２ＳＰに作動可能に連結された遺伝子産物は、上記及び本明細書の他の箇所で記載された蛍光タンパク質ポリペプチドである。遺伝子産物が、Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された蛍光タンパク質であるとき、標的ニューロンなどの標的細胞中で発現する蛍光タンパク質は、このタンパク質が上述したように、適切な波長の光によって刺激される場合、光を放射することによって標的細胞を蛍光標識することができる。ある特定の実施形態において、蛍光タンパク質は、カルシウムインジケーターまたは電圧インジケーターなどの遺伝的にコードされたインジケーターである。遺伝子産物が、Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された遺伝的にコードされたインジケーターであるとき、標的ニューロンなどの標的細胞中で発現する遺伝的にコードされたインジケーターは、その蛍光特性、例えば、強度、励起及び／または発光波長などを変更する。
【０２２０】
任意の簡便な手段が、Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された遺伝子産物を発現する標的細胞またはニューロンに送るために用いられてもよく、これによって、標的細胞を調節または蛍光標識する。培養物中または生体外組織片中の標的細胞は、蛍光顕微鏡を用いて光に曝されてもよく、懸濁液中の標的細胞は、蛍光活性化細胞分析分離（ＦＡＣＳ）装置または蛍光計などを用いて光に曝されてもよい。
【０２２１】
ある場合には、光は、インビボでは、標的細胞またはニューロンに経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）にまたは皮膚を通して（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）送達される。ある場合には、移植可能な光源が使用され、光は体内の部位に送達される。ある場合には、光りは体内の処置部位に送達される。ある場合には、光りは頭蓋内に送達される。
【０２２２】
ある場合には、ニューロン内で発現する光反応性ポリペプチドを活性化するために使用される光は、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２〜約０．１ｍＷ／ｍｍ２、約０．１ｍＷ／ｍｍ２〜約０．２ｍＷ／ｍｍ２、約０．２ｍＷ／ｍｍ２〜約０．３ｍＷ／ｍｍ２、約０．３ｍＷ／ｍｍ２〜約０．４ｍＷ／ｍｍ２、約０．４ｍＷ／ｍｍ２〜約０．５ｍＷ／ｍｍ２、約０．５ｍＷ／ｍｍ２〜約０．６ｍＷ／ｍｍ２、約０．６ｍＷ／ｍｍ２〜約０．７ｍＷ／ｍｍ２、約０．７ｍＷ／ｍｍ２〜約０．８ｍＷ／ｍｍ２、約０．８ｍＷ／ｍｍ２〜約０．９ｍＷ／ｍｍ２、または約０．９ｍＷ／ｍｍ２〜約１．０ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。ある場合には、ニューロン内で発現する光反応性ポリペプチドを活性化するために使用される光は、約１．０ｍＷ／ｍｍ２〜約１．１ｍＷ／ｍｍ２、約１．１ｍＷ／ｍｍ２〜約１．２ｍＷ／ｍｍ２、約１．２ｍＷ／ｍｍ２〜約１．３ｍＷ／ｍｍ２、約１．３ｍＷ／ｍｍ２〜約１．４ｍＷ／ｍｍ２、約１．４ｍＷ／ｍｍ２〜約１．５ｍＷ／ｍｍ２、約１．５ｍＷ／ｍｍ２〜約１．６ｍＷ／ｍｍ２、約１．６ｍＷ／ｍｍ２〜約１．７ｍＷ／ｍｍ２、約１．７ｍＷ／ｍｍ２〜約１．８ｍＷ／ｍｍ２、約１．８ｍＷ／ｍｍ２〜約１．９ｍＷ／ｍｍ２、約１．９ｍＷ／ｍｍ２〜約２．０ｍＷ／ｍｍ２、約２．０ｍＷ／ｍｍ２〜約２．５ｍＷ／ｍｍ２、約２．５ｍＷ／ｍｍ２〜約３ｍＷ／ｍｍ２、約３ｍＷ／ｍｍ２〜約３．５ｍＷ／ｍｍ２、約３．５ｍＷ／ｍｍ２〜約４ｍＷ／ｍｍ２、約４ｍＷ／ｍｍ２〜約４．５ｍＷ／ｍｍ２、約４．５ｍＷ／ｍｍ２〜約５ｍＷ／ｍｍ２、約５ｍＷ／ｍｍ２〜約５．５ｍＷ／ｍｍ２、約５．５ｍＷ／ｍｍ２〜約６ｍＷ／ｍｍ２、約６ｍＷ／ｍｍ２〜約７ｍＷ／ｍｍ２、または約７ｍＷ／ｍｍ２〜約１０ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。ある場合には、ニューロン内で発現する光反応性ポリペプチドを活性化するために使用される光は、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２〜約０．１ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。ある場合には、ニューロン内で発現する光反応性ポリペプチドを活性化するために使用される光は、約０．２５ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。ある場合には、光反応性ポリペプチドを活性化するために使用される光は、約１ｍＷ／ｍｍ２の強度を有する。
【０２２３】
有用性
対象の核酸、遺伝子改変宿主細胞及び方法は、インビトロ／エクスビボの遺伝子解析、プロテオーム解析、トランスクリプトーム解析、電気生理学的解析、及び薬理学的解析のために、健康なまたは疾患のあるヒト及び動物対象集団に由来するＤ２Ｒ発現生細胞を、トランスフェクト、同定、標的化、及び単離すること、ならびに健康なまたは疾患のある対象由来の幹細胞／前駆細胞集団からのＤ２Ｒ発現細胞のトランスフェクション、同定、及び単離を含む、多種多様な用途における利用法を見出す。
【０２２４】
Ｄ２ＳＰを含む核酸は、何十というドーパミン関連障害と関係がある細胞集団の分析及び特性評価のためのみならず、Ｄ２Ｒ発現細胞の治療用移植の目的のためにも、蛍光活性化細胞分析分離（ＦＡＣＳ）などの細胞選別技術を通してのＤ２Ｒ発現細胞の濃縮における利用法を見出すことができる。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、ドーパミン受容性ニューロンに分化するための細胞の誘導に関与する因子は、Ｄ２Ｒ発現培養細胞及びＤ２Ｒ発現ヒト由来幹細胞ならびに非ヒト由来幹細胞を研究するためにＤ２ＳＰを用いて同定され得る。ある特定の実施形態において、薬物依存症、肥満症、ギャンブル依存症などのための移植細胞は、移植用に関連する細胞集団を同定するためにＤ２ＳＰを用いて、未分化細胞から得ることができる。他の場合には、治療用の新規薬剤は、蛍光タンパク質のＤ２ＳＰに駆動された発現に基づいて同定された細胞を用いて、ドーパミン受容性ニューロンの分化及び誘導因子に基づいて開発することが可能である。対象の核酸及びそれを用いる方法は、単離及び薬理学的直接刺激もしくは抗体をベースとした介入治療との併用の双方で、患者集団におけるウイルス仲介光遺伝子学構築物の標的化、ＲＮＡもしくはＤＮＡを用いた療法、及び他の遺伝子療法アプローチを可能にする。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、対象の核酸及び方法は、統合失調症、ギャンブル依存症、薬物依存症、トゥレット症候群、多系統萎縮症、核上性麻痺、パーキンソン病、痴呆、自閉症、ＡＤＨＤ、うつ病、遅発性ジスキネジア、神経膠芽腫、強迫的／衝動的性行動、強迫的衝動買い、肥満症、機能性消化不良、胃内容うっ滞、嘔吐、糖尿病性胃アトニー、過敏性腸症候群、クッシング病、高血圧症、及び腎臓炎症／損傷、ならびに女性乳房症、乳汁漏出症、無月経及びインポテンスなどの変質に関連する高プロラクチン血症が挙げられるがこれらに限定されない中枢ならびに末梢障害の両方の研究及び治療のために、遺伝子産物の発現を標的とするために用いることができる。Ｄ２Ｒ発現細胞はまた、より詳細な特性評価及び薬剤／治療スクリーニングを行うことができるこれらの疾患の動物モデルを提供すると特徴付けることができる。
【０２２７】
キット
本開示のさらなる態様は、対象の核酸、すなわち、ドーパミン２型受容体特異的プロモーター（Ｄ２ＳＰ）を含んでいる核酸を含む、上述した組換え発現ベクターを含むキットを含み、このＤ２ＳＰは、Ｄ２受容体遺伝子のエクソン１を含まず、このＤ２ＳＰは、コザック配列を含み、またこのＤ２ＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、対象のキットの組換え発現ベクターは、ユーザーが関心対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を組換え発現ベクター中にサブクローニングすることを容易にする複数のクローニングサイト、またはその等価物を含み、これによって、関心対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列をＤ２ＳＰに作動可能に連結する。
【０２２８】
ある特定の実施形態において、対象のキットの組換え発現ベクターは、Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された、光反応性ポリペプチド、遺伝的にコードされたインジケーター及び／または蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２２９】
キットはまた、陽性対照発現ベクター及び／または陰性対照発現ベクターなどの対照発現ベクターも含むことができる。いくつかの実施形態において、陽性対照発現ベクターは、Ｄ２ＳＰに作動可能に連結された、上述された光反応性ポリペプチドまたは蛍光タンパク質などの、既知の遺伝子産物をコードする核酸を含む。場合によっては、陽性対照発現ベクターは、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、または赤色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質をコードする核酸を含有する。
【０２３０】
対象のキットの構成要素は、別個の容器内に入れることができるか、または単一の容器内に組み合わせて入れることができる。
【０２３１】
上述した構成要素に加えて、対象のキットは、キットの構成要素を使用して、対象の方法を実行するための説明書をさらに含むことができる。対象の方法を実行するための説明書は、一般的に、適切な記録媒体に記録されている。例えば、説明書は、例えば紙またはプラスチックなどの基材上に印刷されてもよい。このように、説明書は、添付文書として、キットの容器またはその構成要素（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに関連する）のラベルなどで、存在してもよい。他の実施形態において、説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク、フラッシュドライブなどとして電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明書はキット内に存在しないが、例えば、インターネットを介して、リモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書を視聴することができ及び／または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書を視聴することと同様に、説明書を取得するための手段は好適な基材上に記録される。
【実施例】
【０２３２】
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように行い使用するかの完全な開示及び説明を提供するように提示されており、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものでもなく、以下の実験が実行される全てまたは唯一のものであることを表明することを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確保するための努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。特に断りのない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧周辺である。標準省略形；例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース、ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内（筋肉内に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（腹腔内に）；ｓ．ｃ．、皮下（皮下に）などを用いることができる。
【０２３３】
実施例１：２型ドーパミン受容体を発現する細胞を抗体染色するためのプロトコール
以下のプロトコールを用いて、固定組織部分内の細胞を２型ドーパミン（Ｄ２）受容体特異的抗体で染色した。
【０２３４】
Ａ．標準染色プロトコール：
１）４０μｍの切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で１０分間、３回濯ぐ。
２）ＰＢＳ＋３％正常ロバ血清＋０．３％トリトン−Ｘ（ＰＢＳ＋＋）中で３０分間ブロッキングする。
３）ＰＢＳ＋＋中、一次抗体（ウサギ抗Ｄ２Ｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ａｂ１５５８）１：５００で、ロータリーシェーカー上で４℃にて終夜インキュベートする。
４）薄片をＰＢＳ中で１５分間、４回洗浄する。
５）ＰＢＳ＋＋中、二次抗体（Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ  ６４７、ヤギ抗ウサギ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ−２１２４５）１：５００中で、室温にて３時間インキュベートする。
６）ＰＢＳ中で１５分間洗浄する。
７）ＰＢＳ中、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）１：５００００中で１５分間洗浄する。
８）ＰＢＳ中で１５分間洗浄する。
【０２３５】
上記プロトコールは、図３Ａに見られるパターンを生成した。
【０２３６】
Ｂ．改変染色プロトコール
１）４０μｍの切片をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１０分間、３回濯ぐ。
２）ＰＢＳ＋３％正常ロバ血清＋０．３％トリトン−Ｘ（ＰＢＳ＋＋）中で３０分間ブロッキングする。
３）ＰＢＳ＋＋中、一次抗体（ウサギ抗Ｄ２Ｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ａｂ１５５８）１：２００で、ロータリーシェーカー上で室温にて２４時間インキュベートする。
４）薄片をＰＢＳ中で１５分間、４回洗浄する。
５）ＰＢＳ＋＋中、二次抗体（Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ  ６４７、ヤギ抗ウサギ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ−２１２４５）１：５００中で、室温にて８時間インキュベートする。
６）ＰＢＳ中で１５分間、４回洗浄する。
７）ＰＢＳ＋＋中、三次抗体（Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ  ６４７、ロバ抗ヤギ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ−２１４４７）１：５００中で、室温にて８時間インキュベートする。
８）ＰＢＳ中で１５分間洗浄する。
９）ＰＢＳ中ＤＡＰＩ  １：５００００中で１５分間洗浄する。
１０）ＰＢＳ中で１５分間洗浄する。
【０２３７】
上記プロトコールは、図３Ｂに見られるパターンを生成した。
【０２３８】
実施例２：Ｄ２ＳＰはラット海馬一次ニューロンにおいて発現を駆動する
ラット海馬一次ニューロンにＤ２ＳＰ−ｅＮｐＨＲ  ３．０−ＥＹＦＰをトランスフェクトし、実施例１に記載された改変染色プロトコールを用いてＤ２Ｒに対して染色した（図４）。緑色はＥＹＦＰからのものであり、Ｄ２ＳＰ−ｅＮｐＨＲ  ３．０−ＥＹＦＰを発現する細胞を示し、青色は、全てのドーパミン受容体２細胞を示す。
【０２３９】
実施例３：Ｄ２ＳＰ及びＤ２ＲのもとでのｅＮｐＨＲ  ３．０−ＥＹＦＰの発現の比較
図５を参照すると、中間パネルは、ＥＹＦＰを示し、Ｄ２ＳＰ−ｅＮｐＨＲ  ３．０−ＥＹＦＰを発現する細胞（上部）またはＤ２Ｐ−ｅＮｐＨＲ  ３．０−ＥＹＦＰを発現する細胞（下部）を示しており、左パネルは、全てのドーパミン受容体２細胞を示す。各プロモーター構築物についての右パネルは、前の２つのパネルの合成を示す。
【０２４０】
２つのプロモーターの特異度及び浸透度もまた比較し、表１に示す。
【０２４１】
【表１】
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【０２４２】
実施例４：Ｄ２ＳＰを含有する組換え発現ベクター
１つ以上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＤ２ＳＰを含有する以下の組換え発現ベクターを構築した：
ｐＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰ（図６）；
ｐＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ｅｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰ（図７）；
ｐＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ｅＮｐＨＲ  ３．０−ＥＹＦＰ（図８）；
ｐＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＳｗｉＣｈＲｃａ−ＴＳ−ＥＹＦＰ（図９）；
ｐＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＥＹＦＰ（図１０）；
ｐＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＧＣａＭＰ  ６ｆ（図１１）；
ｐＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ＧＣａＭＰ  ６ｍ（図１２）；
ｐＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ（図１３）；及び
ｐＡＡＶ−Ｄ２ＳＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＩＲＥＳ−Ｆｌｐｏ（図１４）。
【０２４３】
本発明が、その特定の実施形態を参照して説明されてきたが、当業者であれば、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更がなされてもよく、また等価物に置き換えられてもよいことを理解されるべきである。加えて、多くの改変が、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程を本発明の目的、趣旨及び範囲に適合するようになされてもよい。全てのこのような修正は、添付された請求項の範囲内に入るものと意図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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