(57)【要約】【課題】本発明は、バイオ検体を含む生体試料を採取及び保持するための電気化学的に活性の装置を提供する。【解決手段】装置は、少なくとも二電極部材と、二電極部材及び生体試料とに化学的に接触するアルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体とを備える。また、本発明は、本発明の装置を備えたポイントオブケア用バイオセンサ、及び生体試料中のバイオ検体の測定方法を提供する。本発明の装置、ポイントオブケア用バイオセンサ及び方法では、少量の生体試料の酸化還元電流値を測定することにより、尿中アルブミン、フィト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコアルブミン（ＧＡ）及びメトヘムアルブミン（ＭＨＡ）の濃度を正確に測定できる。【選択図】図４ａ
2017530371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）基板に配置された少なくとも一対の導電路と、
（ｉｉ）前記導電路に接続された少なくとも１つの二電極部材と、
（ｉｉｉ）アルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体と、を備え、前記受容体は前記少なくとも１つの二電極部材及びバイオ検体を含む生体試料と化学的に接触することを特徴とする、
生体試料を採取及び保持するための電気化学的に活性の装置。
【請求項２】
前記基板がポリマ又は紙である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
１つの三電極部材が前記基板に配置される、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
複数の二電極部材が前記基板に配置される、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
複数の三電極部材が前記基板に配置される、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記電極部材はパターン電極である、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
薄膜が前記電極部材に配置される、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記薄膜を、ボロン酸、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）、アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）と、その誘導体からなる群から選択されるボロネート親和剤で、好ましくはアミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）で処理する、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記受容体は、少なくとも有機物、無機物、金属ポルフィリン物質であり、好ましくはヘミン、ヘマチン、アルカリヘマチン、塩化銅（ＣｕＣｌ２）、銅塩（Ｃｕ（II））、メチレンブルー、メチレンブルーとヘミン、ヘマチン、アルカリヘミン又はアルカリヘマチンとの組合せ、及び、メチレンブルーと銅塩（Ｃｕ（II））との組み合わせからなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記アルブミンは、尿中アルブミン、フィト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコアルブミン（ＧＡ）又はメトヘムアルブミン（ＭＨＡ）である、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記装置は、ハウジングの内部に配置され、前記ハウジングはカートリッジ又はカセットである、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
電気化学的に活性の装置を保持するホルダであって、
（ｉ）ハウジングの内部に配置された装置を検出し信号を調整する手段と、
（ｉｉ）前記ハウジングの一端に配置されたＵＳＢコネクタと、前記ハウジングの他端に配置された導電ポートと、
（ｉｉｉ）生体試料を採取及び保持するために前記導電ポートを介して前記ハウジングに接続するように配置された電気化学的に活性の装置と、を備え、
前記装置は、少なくとも一対の導電路と、少なくとも１つの二電極部材と、アルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体とが基板に配置され、前記受容体は前記少なくとも１つの二電極部材及びバイオ検体を含む前記生体試料と化学的に接触することを特徴とするホルダ。
【請求項１３】
生体試料中のバイオ検体濃度を測定するためのポイントオブケア用バイオセンサであって、
（ｉ）表示部材と導電ポートとを有するハウジングと、
（ｉｉ）生体試料を採取及び保持するために前記導電ポートを介して前記ハウジングに接続するように配置された電気化学的に活性の装置であって、少なくとも一対の導電路と、少なくとも１つの二電極部材と、アルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体とが基板に配置され、前記受容体は前記少なくとも１つの二電極部材及びバイオ検体を含む前記生体試料と化学的に接触する装置と、
（ｉｉｉ）前記ハウジングの内部に配置され、前記装置に印加される酸化還元電位から酸化還元電流を測定し、アルブミン濃度に直線的にマッチングさせることによりアルブミンバイオ検体濃度を読み取り表示するように構成されたデジタル制御部と、を備えることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項１４】
データベース部材は、前記デジタル制御部に接続され、相互作用する酸化還元電流と併せて生体試料中のアルブミンバイオ検体濃度の基準値を記憶する、請求項１３に記載のポイントオブケア用バイオセンサ。
【請求項１５】
（ａ）アルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体に化学的に接触し、少なくとも１つのバイオ検体を含む少量の生体試料を載置した少なくとも１つの二電極部材に酸化還元電位を印加する工程と、
（ｂ）前記少なくとも１つの二電極部材の対応する酸化還元電位に直線的にマッチングさせることにより生体試料中の少なくともアルブミンバイオ検体の濃度を測定する工程と、
を有する生体試料中のバイオ検体濃度を測定する方法。
【請求項１６】
前記生体試料は、フィトの血液及び尿である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少量は、１〜３００マイクロリットル（μＬ）の範囲である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
薄膜が前記少なくとも１つの二電極部材に配置される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記薄膜を、ボロン酸、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）、アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）及びその誘導体からなる群から選択されるボロネート親和剤で、好ましくはアミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）で処理する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記受容体は、少なくとも有機物、無機物、金属ポルフィリン物質であり、好ましくはヘミン、ヘマチン、アルカリヘミン、アルカリヘマチン、塩化銅（ＣｕＣｌ２）、銅塩（Ｃｕ（II））、メチレンブルー、メチレンブルーとヘミンとの組合せ、及び、メチレンブルーと銅塩（Ｃｕ（II））との組み合わせからなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルブミンは、尿中アルブミン、フィト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコアルブミン（ＧＡ）又はメトヘムアルブミン（ＭＨＡ）である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、生体試料中のバイオ検体を定量測定するためのバイオセンサ及び方法に関する。本発明は、特に、少量の生体試料中のアルブミン及びその複合体を正確に検出し定量測定するための電気化学的に活性のバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶性球状タンパク質であるアルブミンは、ヒト血液中に最も多く存在するタンパク質である。６６，４３８ダルトンの分子量を有するヒト血清アルブミンは、肝臓で生合成されるものであり、５８５個のアミノ酸を含んでいる。血清中の総タンパク質の６０％を占め、血液浸透圧の８０％を担っている。アルブミンは、甲状腺ホルモン、脂肪酸、非抱合型ビリルビン、ヘミン、薬物分子及び金属イオンを運搬する。そのため、人体内の分子のタクシーと呼ばれている。成人の血清中の一般的なアルブミン濃度は、３５〜５０ｇ／Ｌである。
【０００３】
血漿中のアルブミン値が正常であることは、健康状態が良好であることを示すものとして認識されている。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、壊死、ネフローゼ、肝炎、栄養失調、関節炎、免疫異常、癌、糖尿病及び一部の重症感染症などのいくつかの慢性疾患において、それ自体がバイオマーカー又は準じるものである。血液中のアルブミンが不足する低アルブミン血症は、肝疾患、ネフローゼ症候群、腸内の過剰なアルブミン喪失及び血管透過性の増加が原因となる場合がある。一方、高アルブミン血症は、人体において重度の脱水症状の兆候である。
【０００４】
尿中アルブミンは、潜在的な糖尿病性腎症のバイオマーカーである。糖尿病は慢性代謝性疾患であり、心臓、脳、腎臓、眼、神経系といった生命に不可欠な身体部位のほとんど全てに影響を及ぼす。世界的にも、糖尿病性腎症は腎不全の主要な原因である。糖尿病性腎症は、腎臓糸球体の毛細血管障害によって引き起こされる進行性腎疾患である。アルブミンは血液成分であり、アルブミンの分子サイズと糸球体における負の電荷を理由としてり、健康な腎臓では尿中排泄されない。尿中のアルブミンの存在は、糖尿病性腎症の早期発見では定着したバイオマーカーである。健常者では、尿中アルブミンは３０ｍｇ／Ｌ未満でなければならない。尿中アルブミンが３０〜３００ｍｇ／Ｌの間であれば、この状態を微量アルブミン尿と呼ぶ。米国糖尿病協会によれば、２型糖尿病患者は診断時から、１型糖尿病患者は診断５年後から糖尿病性腎症の年１回の微量アルブミン尿症の定期検診が義務付けられている。
【０００５】
アルブミンは肝臓で生成されるため、血清アルブミンは、肝機能検査において重要なバイオマーカーである。急性肝炎や肝硬変を患うほとんどの患者は、アルブミン値はほぼ３０ｇ／Ｌであり、中毒性肝炎や肝腫瘍を患っている場合は２５ｇ／Ｌまで低下する。
【０００６】
アルブミンは健康や疾病において重要な役割を果たしている。広範囲の生理的状態を対象に、血清アルブミンには計り知れないほど多くの用途がある。
【０００７】
タンパク質糖化は、糖尿病合併症の進行において、また、タンパク質糖化から生じるその他の重篤な合併症の原因の理解において、現在広く知られたマーカーである。糖化ヘモグロビンは、長期に渡る糖尿病管理では確立された基準であり、９０〜１２０日間の平均血糖値が得られる。アルブミンは、補欠分子族や添加物を含まないタンパク質である。血液が循環する際、アルブミンは非酵素的糖化によってグルコースを蓄積する。グリコ（糖化）アルブミンは、血糖コントロールマーカーとして用いることができる。アルブミンの半減期はＲＢＣの寿命より著しく短いため、グリコアルブミンは、中間の血糖指標として用いることができる。５年以上になる糖尿病患者では、グリコアルブミンの月次評価が糖尿病合併症予防に効果的である。ＨｂＡ１ｃの臨床測定値が不正確でありうる貧血患者や異常ヘモグロビン症患者にとって、グリコアルブミン検査は有用である。
【０００８】
メトヘムアルブミンは、急性出血性膵炎の診断に重要である。高メトヘムアルブミン値と出血性膵炎には関連があり、この疾患の診断の良い指標となることを示す研究がある。
【０００９】
アルブミンの電気化学的検出は、金属タンパク質の検出よりも幾分か困難である。ヘモグロビンやミオグロビンなどの金属タンパク質は、ヘム補欠分子族の形態で鉄Ｆｅ（II）を酸化還元中心として含むため、タンパク質分子は比較的容易に電極表面に到達する。一方、アルブミンはその構造中にヘム補欠分子族を含まないため、理論上、タンパク質分子と電極表面との間の電子伝達の可能性はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
バイオ検体を検出するための電気化学センサは、生体試料中のアルブミンタンパク質を定量的に検出して測定するなど、多くの特殊なセンサ用途で使用されている。一般的な電気化学センサは、薄膜蒸着工程を施した後にフォトリソグラフィマスク及び／又はエッチング技術を使ってパターン化された１本以上の薄い導体を非導電性薄膜層と共に含むが、これらの技術の代わりに、スクリーン印刷を用いるのが電気化学バイオセンサを低コストとするのには良い選択である。しかし、既知の装置及び方法は、免疫学的技術又は複雑な電極改良に基づくものであり、低コストのポイントオブケア用バイオセンサには適していない。
【００１１】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ｖｏｌ.１７（２００７）８３５−８４２には、Ｃｈａｏ−Ｊｕｎｅ  Ｈｕａｎｇらにより、尿中アルブミン濃度を測定するための尿中アルブミンの電気化学的検出において、硫黄−金結合形成により金電極の表面にアルブミンが吸着されることが開示されている。
【００１２】
Ｊ.  Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ａｃｔａ（１９２１）では、Ｒｉｃｈａｒｄらの「ポリピロールをベースとしたヒト血清アルブミンセンサの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｓｅｎｓｏｒ）」において、導電性ポリマコーティングへの抗体の直接混入に適した電気合成方法が開示されている。
【００１３】
欧州特許公開第２０４００７４号には、ハロゲン化キサンテン系色素を含有するタンパク質分析試薬を用いて尿中アルブミンを分析する比色法が開示されている。
【００１４】
米国特許第５１８２２１４号には、血清アルブミン検出のための蛍光をベースとした方法が開示されている。この方法は、血清アルブミンの存在下で増強されるアニオン性シアニン色素の蛍光に基づいている。
【００１５】
米国特許出願公開第２００６／０２２３１９２号には、サンプル中の総アルブミン値に対する血液サンプル中のグリコアルブミン量を測定するための免疫クロマトグラフィ測定装置が開示されている。
【００１６】
欧州特許公開第０７６９６９７号には、アルブミン染色色素及びグリコアルブミン染色色素を含有する試薬層を用いてグリコアルブミンを測定する比色乾燥試験装置が開示されている。
【００１７】
欧州特許公開第１８１００３６号には、尿サンプル中のアルブミン量を半定量的に測定するための試験紙が開示されている。試験紙のテストパッド領域には、クマシーブリリアントブルーが含まれており、その部分に尿サンプルを染み込ませると、タンパク質が存在していれば色が変化するようになっている。
【００１８】
米国特許出願公開第２００５／２２３３９２１５号には、モノクローナル抗体とハイブリドーマに基づいてグリコアルブミンを検出する方法が開示されている。
【００１９】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１／１０，１５０６−１５１０（１９７５）には、Ｓｃｏｔ  Ｎ  Ａｎｄｒｅｓにより、ジエチルアミノエチル−セファデックスのイオン交換クロマトグラフィを用いたメトヘムアルブミンの検出が開示されている。
【００２０】
米国特許出願第２０１４／０１７０７６６号には、アプタマー受容体に基づく光度測定法を用い、唾液サンプル中の総アルブミンに対するグリコアルブミンを測定するためのポイントオブケア用装置が開示されている。
【００２１】
これらの開示された方法は、主に抗アルブミン抗体結合、電極表面におけるアルブミンの吸着による酸化還元電流の変化、及びマイクロ流体力学に基づいている。
【００２２】
また、様々なポイントオブケア用装置、例えば、Ｈｅｍｏｃｌｕｅ社のＡｌｂｕｍｉｎ２０１、Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ社のＡＣＲ、Ｓｉｅｍｅｎｓ社のＤＣＡ  Ｖａｎｔａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒなどもアルブミン検出に利用できる。
【００２３】
これらの既知の装置及び方法はすべて、免疫学的技術に基づくものか、あるいは、複雑な電極の改良を伴うものである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の主な目的は、生体試料を採取及び保持し、引き続き、少量の生体試料中のアルブミンとその複合体、特に、尿中アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコアルブミン（ＧＡ）及びメトヘムアルブミン（ＭＨＡ）を定量検出する電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置を提供することにある。
【００２５】
本発明の目的の１つは、電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置を収容するように構成された装置ホルダを提供することにある。
【００２６】
本発明の別の目的は、電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置を収容するように構成され、電位の印加時に電気化学的に活性の装置を流れる酸化還元電流を測定することにより、少量の生体試料中の尿中アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコアルブミン（ＧＡ）及びメトヘムアルブミン（ＭＨＡ）を検出及び定量測定するためのポイントオブケア用バイオセンサを提供することにある。
【００２７】
また、本発明の目的の１つは、電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置を流れる酸化還元電流を正確に測定することにより、尿中アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコアルブミン（ＧＡ）及びメトヘムアルブミン（ＭＨＡ）を検出及び定量測定する方法を提供することにある。
【００２８】
また、本発明の目的は、金属補欠分子族を持たない電気的に絶縁された既知の生体分子であるＧＡを定量測定する方法を提供することにある。
【００２９】
本発明は、少なくとも１つの二電極部材と、二電極部材と化学的に接触するアルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体とを備えた、生体試料を採取及び保持するための電気化学的に活性の装置を提供する。また、本発明は、本発明の装置を有するポイントオブケア用バイオセンサと、生体試料中のバイオ検体を測定する方法を提供する。本発明の装置、ポイントオブケア用バイオセンサ及び方法では、尿及び血液サンプル中の酸化還元電流値を判定することによりアルブミンバイオ検体濃度の正確な測定を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明の一態様における電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の二電極構造を示す概略分解図である。
【図２】図２は、本発明の別の態様における電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の三電極構造の概略分解図である。
【図３ａ】図３ａは、本発明の更に別の態様における電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の２対の三電極構造の概略分解図である。
【図３ｂ】図３ｂは、本発明の更に別の態様における電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置のトレイを備えた２対の三電極構造の概略分解図である。
【図４ａ】図４ａは、尿中アルブミン及びヒト血清アルブミン用の三電極構造を有する電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の概略上面図である。
【図４ｂ】図４ｂは、受容体が薄膜の表面に配置された電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図４ｃ】図４ｃは、受容体が電極の表面に配置された電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図４ｄ】図４ｄは、電極が受容体としての役割を果たす電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図５ａ】図５ａは、メトヘムアルブミン用の三電極構造を有する電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の概略上面図である。
【図５ｂ】図５ｂは、受容体が薄膜の表面に配置された電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図５ｃ】図５ｃは、受容体が電極の表面に配置された電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図６ａ】図６ａは、グリコアルブミンを定量測定するための２組の三電極構造を有する電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の概略上面図である。
【図６ｂ】図６ｂは、総ヒト血清アルブミン検出のために受容体が薄膜の表面に配置された電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図６ｃ】図６ｃは、総ヒト血清アルブミン検出のために受容体が電極の表面に配置された電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図６ｄ】図６ｄは、総ヒト血清アルブミン検出のために電極が受容体としての役割を果たす電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図６ｅ】図６ｅは、受容体が薄膜の表面に配置され、生体試料からグリコアルブミン成分を濾過するためにボロン酸誘導体からなる別の化学物質層が第２の薄膜の表面に配置された電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図６ｆ】図６ｆは、受容体が薄膜の表面に配置され、ボロン酸誘導体の別の化学物質層も受容体と同じ薄膜表面に配置された電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置の断面図である。
【図７】図７は、本発明の装置を保持する装置ホルダの斜視図である。
【図８ａ】図８ａは、本発明の装置を保持するポイントオブケア用バイオセンサの斜視図である。
【図８ｂ】図８ｂは、ポイントオブケア用バイオセンサの大まかな内部電子構造の概略図である。
【図９】図９は、生体試料である尿中のヘミンの還元ピークを示すプロットである。
【図１０】図１０は、本発明の装置及びポイントオブケア用バイオセンサを用いてバイオ検体濃度を定量測定するための工程段階を示す高水準フローチャートである。
【図１１】図１１は、合成尿溶液中のＣｕＣｌ２の酸化還元挙動を示すプロットである。
【図１２】図１２は、メチレンブルー（ＭＢ）のサイクリックボルタモグラムを示すプロットである。
【図１３】図１３は、メトヘモグロビン血症におけるメチレンブルーの酸化還元挙動の模式図である。
【図１４】図１４は、ヘミンを添加した場合と添加しなかった場合のメチレンブルー（ＭＢ）のサイクリックボルタモグラムのプロットを示す。
【図１５】図１５は、ＭＢ及びロイコメチレンブルー（ＬＭＢ）のＵＶ−ＶＩＳスペクトルを示すプロットである。
【図１６】図１６は、ヘミン濃度が異なるロイコメチレンブルーのＵＶ−ＶＩＳスペクトルを示す。
【図１７】図１７は、メチレンブルーとヘミンにより変形したメチレンブルーのＵＶ−ＶＩＳスペクトルを示す。
【図１８】図１８は、ヘミンのＵＶ−ＶＩＳスペクトルを示す。
【図１９】図１９は、ＭＢ−ヘミンをベースとした検出の反応機構の概略図である。
【図２０ａ】図２０ａは、ＣｕＣｌ２を添加する前のＭＢのサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２０ｂ】図２０ｂは、還元電流に対するＣｕＣｌ２濃度のプロットを示す。
【図２１】図２１は、本発明の装置及びポイントオブケア用バイオセンサを用いてグリコアルブミン濃度を定量測定するための工程段階を示す高水準フローチャートである。
【図２２ａ】図２２ａは、様々な尿中アルブミン濃度における遊離ヘミンのサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２２ｂ】図２２ｂは、還元電流に対する尿中アルブミン濃度のプロットを示す。
【図２３ａ】図２３ａは、様々な尿中アルブミン濃度におけるＣｕＣｌ２中の遊離Ｃｕ（II）のサイクリックボルタモグラムである。
【図２３ｂ】図２３ｂは、還元電流及び酸化電流に対する尿中アルブミン濃度のプロットを示す。
【図２４ａ】図２４ａは、様々な尿中アルブミン濃度における遊離ヘミンとＭＢのサイクリックボルタモグラムである。
【図２４ｂ】図２４ｂは、還元電流に対する尿中アルブミン濃度のプロットを示す。
【図２５ａ】図２５ａは、様々な尿中アルブミン濃度におけるＣｕＣｌ２中の遊離Ｃｕ（II）とＭＢのサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２５ｂ】図２５ｂは、還元電流に対する尿中アルブミン濃度のプロットを示す。
【図２６ａ】図２６ａは、様々なヒト血漿中アルブミン濃度におけるＣｕＣｌ２中の遊離Ｃｕ（II）のサイクリックボルタモグラムである。
【図２６ｂ】図２６ｂは、還元電流及び酸化電流に対する尿中アルブミン濃度のプロットを示す。
【図２７ａ】図２７ａは、様々なメトヘムアルブミン濃度におけるＭＢのサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２７ｂ】図２７ｂは、還元電流に対するメトヘムアルブミン濃度を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
このように、本発明は、少量の尿及び血液の生体試料中のアルブミンとその複合体、例えば、尿中アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコアルブミン（ＧＡ）及びメトヘムアルブミン（ＭＨＡ）などのバイオ検体を正確に検出し定量測定のための電気化学的に活性かつアルブミン結合性のバイオセンサを提供する。
【００３２】
本発明の一態様では、生体試料を採取及び保持するための電気化学的に活性の装置は、基板に配置された少なくとも一対の導電路を備え、導電路が少なくとも１つの二電極部材に接続される。受容体は、電極部材及びバイオ検体を含む生体試料と化学的に接触している。本発明の装置は、カートリッジ又はカセットの形態のハウジングを効果的に備える。
【００３３】
本発明の別の態様では、本発明の電気化学的に活性の装置を保持するホルダはハウジングを備え、ハウジングの内部には少なくとも１つの装置検出・信号調整装置が配置される。コネクタ、好ましくはＵＳＢコネクタがハウジングの一端に設けられ、導電ポートがハウジングの他端に配置される。電気化学的に活性の装置は、生体試料を採取及び保持するために導電ポートを介してハウジングに接続するように配置される。装置は、少なくとも一対の導電路と、少なくとも１つの二電極部材と、アルブミン結合性で電気化学的に活性の受容体が基板に配置されている。受容体は、二電極部材及び測定対象のバイオ検体を含む生体試料と化学的に接触するように配置される。
【００３４】
本発明の更に別の態様では、生体試料中のバイオ検体濃度を測定するためのポイントオブケア用バイオセンサは、表示部材と導電ポートとを有するハウジングを備える。電気化学的に活性の装置は、生体試料を採取及び保持するために導電ポートを介してハウジングに接続される。装置は、少なくとも一対の導電路と、少なくとも１つの二電極部材と、アルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体が基板に配置されている。受容体は、二電極部材及びバイオ検体を含む生体試料と化学的に接触する。デジタル制御部は、ハウジングの内部に配置され、装置に印加される酸化還元電位から酸化還元電流を測定し、アルブミン濃度に直線的にマッチングする対応する酸化還元電流を測定することにより、アルブミンバイオ検体濃度を読み取り表示するように構成される。
【００３５】
本発明の一態様では、また、生体試料中のアルブミンバイオ検体及びその複合体の濃度を測定する方法を提供する。この方法では、アルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体に化学的に接触し、バイオ検体を含む少量の生体試料を載置した少なくとも１つの二電極部材に、酸化還元電位を印加する。この方法では、二電極部材の対応する酸化還元電流と直線的にマッチングさせることにより、生体試料中のアルブミンバイオ検体濃度を測定する。
【００３６】
以下、添付の図面を参照して、本発明の好適な実施形態について説明する。最初に、生体試料を採取及び保持し、引き続き生体試料中に存在する目的のアルブミン検体とその複合体を測定するための、本発明の電気化学的に活性の装置の好適な実施形態を、図１を参照して説明する。
【００３７】
図１に示す装置１００は、基板１０１を備えており、その上に装置の他の構成要素が組み立てられる又は配置されるベースとなっている。本実施形態において、基板１０１は、長尺の長方形構造として例示されている。しかし、基板１０１は、装置１００を保持するバイオセンサの形状及び構成に応じて、正方形、円形などの他の形状をとることができることが理解される。基板１０１は、パターン電極の組み込みに適した任意の適切な剛性材料又は可撓性材料で形成することができる。基板１０１の好適な材料としては、例えば、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、エポキシ繊維複合材料、ポリアミド複合材料及び紙などの材料を使用することができる。また、基板１０１の好適な剛性材料としては、セラミック、ガラス又は同様の他の材料とすることができる。いずれの場合でも、基板１０１に適した材料の選択は、基板１０１が所望の強度及び可撓性を有するだけでなく、電気絶縁体としても機能することができるように行われる。本発明の用途を考慮すると、生体試料が基板１０１と物理的に接触したときに浸出しないように、基板１０１に親水性を持たせると効果的である。基板１０１の表面の質は、一般的には滑らかである。しかし、基板１０１の表面は、粗面であってもよく、及び／又は、凹みや穴があってもよい。また、基板１０１の端部は、バイオ検体の測定に使用されるバイオセンサへ容易に挿抜できるように、テーパ形状又は湾曲形状など適切な形状とされる。
【００３８】
一対の導電路１０２ａ及び１０２ｂが、基板１０１に配置される。導電路１０２ａ及び１０２ｂは、スクリーン印刷、リソグラフィ、熱蒸着、スパッタリング、レーザパターニングなどのパターン形成法を用いて形成されるが、スクリーン印刷が好ましい。図１の例示的態様は、一対の導電路１０２ａ及び１０２ｂを形成して実施される。しかし、必要な導電路数は適切に増加・変更することができる。導電路１０２ａ及び１０２ｂの経路は、図１では直線状の路線として例示されている。多角形などの他の適切な構成の導電路を使用することもできる。導電路１０２ａ及び１０２ｂの物質は、銅、アルミニウム、金、銀、プラチナ、炭素などの導電性物質、その他の適切な導電性物質、又は、これらの物質の合金とすることができる。また、導電路１０２ａ及び１０２ｂの物質は、金、プラチナ、水銀、炭素、ガラス状炭素及びグラファイトなどのように電気化学的に活性とすることもできる。導電路１０２ａ及び１０２ｂは、以下に説明する本発明のバイオセンサと電気的に接続するために使用される。
【００３９】
図１に示すように、一対の電極１０３ａ及び１０３ｂが、導電路１０２ａ及び１０２ｂにそれぞれ電気的に接続される。図１に示すように、電極１０３ａ及び１０３ｂは、導電路１０２ａ及び１０２ｂに重ねられ、導電路１０２ａ及び１０２ｂに層を形成するように導電路１０２ａ及び１０２ｂの終端に配置される。電極１０３ａ及び１０３ｂの材料は、金、プラチナ、水銀、炭素、ガラス状炭素及びグラファイトなどの電気化学的に活性な金属又は合金から選択される。図１に示す電極配置では、電極１０３ａは作用電極、電極１０３ｂは対電極となる。
【００４０】
薄膜１０４は、図１に示すように一対の電極１０３ａ、１０３ｂに配置され、以下に説明する受容体を一体化するベース部材となる。薄膜１０４の物質は、ポリマ、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、綿布、ろ紙などとすることができる。薄膜１０４は、ボロン酸、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）、アミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）及びその誘導体からなる群から選択されるボロネート親和剤で、好ましくはアミノフェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）で処理される。薄膜は、グリコアルブミンを検出するためにボロネート親和剤で処理される。
【００４１】
本発明の装置１００は、ヒト生体試料中の尿中アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコアルブミン（ＧＡ）及びメトヘムアルブミン（ＭＨＡ）などのアルブミンバイオ検体を個別に又は共に検出及び定量測定するために使用される。よって、本発明では、アルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体１０５が電極と化学的に接触している。この好適な実施形態では、受容体１０５は、電気化学的に活性の物質の層として示されている。尿生物試料中の尿中アルブミン及び血液生体試料中の血清アルブミン（ＳＡ）を検出するために受容体１０５として使用される電気化学的に活性の物質は、少なくとも有機物、無機物、金属ポルフィリン物質であり、好ましくはヘミン、ヘマチン、アルカリヘミン又はアルカリヘマチン、塩化銅（ＣｕＣｌ２）、銅塩（Ｃｕ（II））、メチレンブルー、メチレンブルーとヘミン、ヘマチン、アルカリヘミン又はアルカリヘマチンとの組合せ、メチレンブルーと銅塩（Ｃｕ（II））との組み合わせ、及び、その変異体である。
【００４２】
受容体１０５と電極１０３ａ、１０３ｂとの化学的接触は、以下のように開始することが好ましい。受容体１０５の溶液を調製した後、電極に吐出し乾燥することで、電極１０３ａ及び１０３ｂ上に固体化学物質層を形成し、この官能化電極をバイオ検体の定量測定に使用する。
【００４３】
あるいは、受容体溶液を、目的のバイオ検体を含む選択された生体試料と予め混合しておき、薄膜１０４を必要に応じて備えた電極１０３ａ及び１０３ｂに少量の予混合溶液を吐出する。
【００４４】
本発明の別の態様では、受容体溶液を別途調製し、電極に直接又は電極に配置された薄膜上に吐出する。その後、アルブミンバイオ検体を含む目的の生体試料を電極に塗布する。
【００４５】
図１に示すように、パッシベーション層１０６が導電路を覆うように配置される。パッシベーション層１０６は、装置の導電素子を保護し、電極領域を正確に画定するために使用される。
【００４６】
本発明の更に別の態様では、図２に示すように、生体試料を採取及び保持するために、本発明の装置１００は、受容体（図１に示す）と併せて使用される３つの電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃを一組とした構成を有するものとして示されており、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃはそれぞれ導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続される。電極の数が多くなるほど、より高精度で生体試料中の単一のバイオ検体の検出を容易に行うことができる。この実施形態では、電極１０３ｃは基準電極として機能する。基準電極１０３ｃに好適な物質は、銀（Ａｇ）、塩化銀（ＡｇＣｌ）、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）又は飽和カロメルであり、電極の電位は経時変化しない。
【００４７】
図３ａに示す本発明の更に別の態様では、本発明の装置１００は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ、１０２ｄ、１０２ｅ、１０２ｆ上に配置され、所定の生体試料中の複数のバイオ検体濃度を測定するために使用されるように構成された二対の三電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃ、１０３ｄ、１０３ｅ、１０３ｆを有するものとして示されている。この態様では、目的の生体試料が血液及び尿である場合、電極にシールドされたウェルプレート又はトレイが配置され、図３ｂに示すように検知領域を２つに区分し、生体試料の個別検知が容易に行うことができるように構成される。したがって、電極の各対と併せて設けられた２つの別々の受容体がこれらの試料を受け取り、これらの２つの異なる生体試料中のアルブミン濃度の測定が別々に行われる。また、必要と思われる場合には、図３ｂに示すような物理的な仕切り壁を設けて電極を分離してもよい。
【００４８】
図４ａには、少なくとも有機物、無機物、金属ポルフィリン物質であり、好ましくはヘミン、アルカリヘミン、アルカリヘマチン、塩化銅（ＣｕＣｌ２）、銅塩（Ｃｕ（II））、メチレンブルー、メチレンブルーとヘミン、ヘマチン、アルカリヘミン又はアルカリヘマチンとの組合せ、及び、メチレンブルーと銅塩（Ｃｕ（II））との組み合わせから選択された受容体を採用することにより、微量アルブミン尿及びＨＳＡを測定する装置１００の三電極構造が例示される。
【００４９】
図４ｂは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとからなる。薄膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５は、薄膜１０４の表面に配置される。
【００５０】
図４ｃは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとからなる。受容体１０５は、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。
【００５１】
図４ｄは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとからなり、これらの電極には受容体１０５が塗布されている。
【００５２】
図４ａ、ｂ、ｃ及びｄに示すこれらの実施形態は、尿及び血液サンプル中のアルブミンバイオ検体を測定するために用いられる。
【００５３】
図５ａには、受容体としてとしてメチレンブルー（ＭＢ）を用いて生体試料中のメトヘムアルブミン（アルブミン−ヘム複合体）を測定する装置１００の三電極構造が例示される。
【００５４】
図５ｂは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとからなる。薄膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５は、薄膜１０４の表面に配置される。
【００５５】
図５ｃは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとからなる。受容体１０５は、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。
【００５６】
図５ａ、ｂ及びｃに示すこれらの実施形態は、生体試料中のメトヘムアルブミン複合体を測定するために用いられる。
【００５７】
図６ａに、２組の三電極構造を有し、生体試料中の総アルブミン及びグリコアルブミンの測定に用いられる電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置１００の上面図を示す。
【００５８】
図６ｂは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとからなる。薄膜１０４が、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。受容体層１０５は、薄膜１０４の表面に配置される。
【００５９】
図６ｃは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとからなる。受容体１０５は、電極１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃの表面に配置される。
【００６０】
図６ｄは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面左半分に導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃが配置される。基板１０１の左半分の三電極構造は、導電路１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃに接続された作用電極１０３ａと、対電極１０３ｂと、基準電極１０３ｃとからなり、これらの電極には受容体１０５が塗布されている。
【００６１】
図６ｅは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ｄ、１０２ｅ、１０２ｆが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ｄ、１０２ｅ、１０２ｆに接続された作用電極１０３ｄと、対電極１０３ｅと、基準電極１０３ｆとからなる。薄膜１０４が、電極１０３ｄ、１０３ｅ、１０３ｆの表面に配置される。受容体層１０５は、薄膜１０４の表面に配置される。第２の薄膜１０７が受容体層１０５の表面に配置される。ボロン酸誘導体からなる化学物質層１０８が、生体試料からグリコアルブミン成分を濾過するために第２の薄膜１０７の表面に配置される。
【００６２】
図６ｆは前図に対応する断面図であり、基板１０１の表面右半分に導電路１０２ｄ、１０２ｅ、１０２ｆが配置される。基板１０１の右半分の三電極構造は、導電路１０２ｄ、１０２ｅ、１０２ｆに接続された作用電極１０３ｄと、対電極１０３ｅと、基準電極１０３ｆとからなる。受容体１０５及びボロン酸誘導体が、電極１０３ｄ、１０３ｅ、１０３ｆの表面に配置される。
図６ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆに示すこれらの実施形態は、血液サンプル中の総アルブミン及びグリコアルブミン成分を除くアルブミンを測定するために用いられる。
【００６３】
本発明の更に別の態様における、生体試料中のバイオ検体の検出用の装置ホルダ２００が、図７に示される。装置ホルダ２００は、装置検出・調整装置を有するハウジング２０１を備え、ハウジング２０１は、プロセッサ及び表示部材に接続するように構成される。ハウジング２０１には、装置挿入口２０３が設けられている。装置挿入口２０３に挿入される装置１００は、ハウジング２０１に接続された基板上に少なくとも１つの二電極部材とアルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体を有し、受容体が生体試料２０４を受けるように構成されている。図７に示すように、ＵＳＢプラグ２０２がハウジング２０１に接続される。装置ホルダ２００は、検査用の生体試料を採取及び保持するために使用される。また、装置ホルダ２００には、装置検出機能、信号調整機能、及び、装置１００に収容されたバイオ検体の種類を識別するためのデータ取得機能が設けられている。装置ホルダ２００のユーザは、ホルダ２００をプロセッサに挿入し、測定用の生体試料を採取することができる。
【００６４】
本発明の装置ホルダ２００は、処理・表示装置に挿入された後に電源が投入される。そして、装置１００を装置ホルダ２００内に装着する。装置ホルダ２００のハウジング２０１内にある装置検出装置は、指定の装置を検出したことを示すように構成されている。装置ホルダ２００が装置１００を検出すると、装置１００に生体試料が載せられ、基準電極に対して所望の酸化還元電位が、デジタル／アナログ変換器（ＤＡＣ）を介して装置の作用電極に印加される。対電極及び作用電極を通過する酸化還元電流は、コンバータ（電圧電流変換器）を用いて測定される。
【００６５】
図８ａに、生体試料中のバイオ検体を検知するためのポイントオブケア用バイオセンサ３００を示す。ポイントオブケア用バイオセンサ３００はハウジング３０１を備え、これにマイクロＵＳＢ３０２用及びマイクロＳＤカード３０３用のポートが設けられている。マイクロＵＳＢ３０２はバイオセンサ３００の充電に用いられ、マイクロＳＤカードは記憶装置として用いられる。また、表示部材３０４がハウジング３０１に備えられており、タッチセンサ式の装置を含む、ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＯＬＥＤ、ＯＭＬＥＤ、ＴＦＴ又はそのディスプレイとすることができる。ハウジング３０１には、装置挿入口３０５が設けられている。装置挿入口３０５には、装置と電気的に係合する金属接点が設けられている。つまり、挿入口３０５は、装置１００の電極部材を介して装置１００が収容されるように設けられている。ポイントオブケア用バイオセンサ３００は、ユーザが容易に簡単な方法でポイントオブケア用バイオセンサ３００と装置１００を使用できるように設けられている。最初に装置１００がポイントオブケア用バイオセンサ３００に挿入され、その後、生体試料の採取に際し伴う侵襲的手段が最小限ですむ１〜３００μＬの範囲の少量の生体試料が装置１００に載せられる。また、ユーザは、湿度、温度変化及び保存条件などの環境要因に制限されることなく、室温で自由にバイオセンサ３００を使用することができる。バイオセンサ３００を使用することにより、ユーザは、大幅に短時間で、目的のバイオ検体の濃度レベルを測定することができる。これは、バイオ検体が受容体に瞬間的に結合するためである。バイオセンサ３００では濃度レベルを測定するためにバイオ検体固有の結合特性を利用しているため、表示部材３０４上にバイオ検体濃度が瞬時且つ正確に表示され、ユーザに提供される。本発明のバイオセンサ３００を使用することにより、ユーザは、検査前の生体試料の活性調製を必要とすることなくバイオセンサを使用することができる。
【００６６】
次に、図８ｂを参照すると、バイオセンサ３００の電子機器の内部構造が示されている。ハウジング３０１内には、データベース部材３０６が設けられており、生体試料中に存在するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコアルブミン（ＧＡ）、メトヘムアルブミン（ＭＨＡ）及び尿中アルブミンのバイオ検体濃度と酸化還元電流の標準値が保存されている。また、データベース３０６は、過去及び現在のバイオ検体濃度に関するデータを含む。バイオセンサ３００の様々な機能を実行するために必要な実行ファイルが、バイオセンサ３００の記憶媒体に保存されている。ハウジング３０１内にデータベース部材３０６に接続して設けられたデジタル制御部３０７は、アルブミンバイオ検体を含む生物試料を載置したアルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体を有する少なくとも１つの二電極部材に酸化還元電位を印加し、対応する酸化還元電流を測定するように構成されている。デジタル制御部３０７は、濃度レベルに直線的にマッチングさせることによりアルブミンバイオ検体の酸化還元電流を測定し、アルブミンバイオ検体濃度の測定値を表示するように設けられる。
【００６７】
バイオセンサ３００への電力供給は、バイオセンサ３００に接続された電源装置３０８により制御される。電源装置３０８は、充電回路を備えたオンライン及びオフラインの両方の方式の充電式電池を含む。信号調整・装置検出装置３０９は、マイクロコントローラ３０７に接続され、バイオセンサ３００内に装置１００があることを検出し、電極に酸化還元電位を印加し、選択された生体試料からの酸化還元電流を測定する。湿度センサ３１０及び温度センサ３１１が、ハウジング３０１内に配置される。マイクロコントローラ３０７によるバイオ検体の濃度レベルの測定が完了すると、その濃度レベルが、バイオ検体の濃度レベルの過去のデータと共にディスプレイ部材３０４に表示される。
【００６８】
また、本発明は、生体試料中のアルブミンバイオ検体を正確に検出及び定量測定する方法を提供する。血液や尿などの目的の生体試料を、以下に示す標準プロトコルに従った最小限の侵襲的手段により、非常に少量、即ち、マイクロリットル（μＬ）の範囲の量で、ヒト被験者から採取する。本発明の方法において、バイオ検体の測定に使用することができる生体試料の好適な量は、１〜３００マイクロリットル（μＬ）の範囲が好ましい。生体試料の必要量は、装置の受容体の表面積の大きさによって決まる。少量の試料の採取は、侵襲性が最小限の試料採取技術で行うことができることから、被験者の負担を大幅に減少させることができる。生体試料の量を少量とすることにより、ユーザは、瀉血による採取製品の必要性を回避することができる。
【００６９】
本発明の方法では、バイオ検体の判定と正確な測定は、電気化学の原理を実施することにより行われる。よって、電位の印加時に電気化学的に活性の装置を流れる酸化還元電流の測定による場合、測定用に選択されると効果的なバイオ検体は、球状タンパク質−ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び尿中アルブミン−である。また、本発明の方法では、グリコアルブミン（ＧＡ）やメトヘムアルブミン（ＭＨＡ）などのアルブミン複合体の量を測定する。本発明においては、特に、金属補欠分子族を持たない電気的に絶縁された既知の生体分子であるＧＡの定量測定が行われる。
【００７０】
本発明において、受容体物質は、金属ポルフィリン配位子、金属イオン、有機分子及びこれらの物質の組み合わせからなる群から選択される。
【００７１】
本発明の方法では、受容体物質が、以下に記載される好適な化学物質の溶液として効果的に調製される。例えば、ヘミンが好適な受容体として選択される場合、好ましくはアルカリ性水溶液（ＮａＯＨ／ＫＯＨ）又はジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）、又は当該物質が可溶な他の溶媒にヘミンを溶解させる。
【００７２】
ベースとなる化学物質がＣｕ（II）である受容体物質、好ましくはＣｕＣｌ２及びＣＵ２ＳＯ４の場合、その化学物質を、蒸留水、アルコール、水酸化アンモニウム又は当該物質が可溶な他の溶媒に溶解させることが好ましい。
【００７３】
受容体としてメチレンブルー（ＭＢ）を用いる場合、当該化学物質を、蒸留水又は当該化学物質が可溶な他の溶媒に溶解させることが好ましい。
【００７４】
このようにして調製された受容体溶液は、生体試料の塗布前に、本発明の装置における電極部材又は薄膜を有する電極部材に塗布される。
【００７５】
また、受容体溶液を生体試料と予め混合し、混合溶液を装置における電極部材又は薄膜を有する電極部材に塗布することもできる。
【００７６】
次に、例示的態様における尿中アルブミンの検出及び測定方法を説明する。尿サンプル中のアルブミンの存在を検査するために、少量の生体試料（尿）を、本発明の装置の受容体と化学的に接触させる。受容体は、金属ポルフィリン物質のヘミンである。ヒトアルブミンは、脂肪酸、金属イオン、ヘミンやビリルビン、また、ワルファリン、アセチルサリチル酸といった医薬品などの様々な物質に結合することが知られている。ヘミンはアルブミンへの結合定数が高い。ヘミンの結合定数は１．１×１０８Ｍ−１であり、図９に示すようにヘミンは電気化学的に活性である。ヘミンは、第二鉄（Ｆｅ（III））の状態の鉄を含むが、これが、サイクリックボルタンメトリーにおいて式Ｆｅ（III）＋ｅ−→Ｆｅ（II）に示すように第一鉄（Ｆｅ（II））に還元され、図９に示すような還元ピークが得られる。ヘミンに対するアルブミンの結合とヘミンが示す還元電流ピークを考慮し、アルブミン濃度検出には、リガンド受容体としてヘミンが選択される。図９に示す遊離ヘミンの還元ピーク電流を用いて、尿サンプル中でヘミンがアルブミンと結合した場合の対応する還元ピーク電流の変化と照らし合わせる。
【００７７】
目的の生体試料中のアルブミン濃度の測定に先立ち、様々な尿や合成尿試料中の基準アルブミン濃度（ｍｇ／Ｌ）に関するデータを収集し、データベース部材に保存する。これにより、データベース部材には基準尿中アルブミン濃度（ｍｇ／Ｌ）の値と対応するヘミン酸素還元電流値（μＡ）とが保存される。指定の濃度の好適な酸素還元電流値は、試験を繰り返し、選択されたアルブミン濃度に対する酸素還元電流値が同一となった結果として得られたものである。
【００７８】
次に、図１０ａ及び図１０ｂを参照し、バイオ検体測定の工程段階を説明する。本発明のバイオセンサを選び、電源を投入する。そして、バイオセンサに装置を装着する。バイオセンサは、指定の装置を検出したことを示すように構成されている。バイオセンサが装置を検出すると、生体試料が装置に載せられ、デジタル／アナログ変換器（ＤＡＣ）により基準電極に対して所望の酸化還元電位が装置の作用電極に印加される。酸化還元電位は、化学物質の電子を受け取りやすさと、それによる還元の尺度である。化学物質は、それぞれ固有の酸化還元電位を有する。電位が正であるほど、電子に対する物質の親和性が大きくなり、還元される傾向にある。よって、人工尿溶液中のヘミンの酸化還元電位は、約−０．５Ｖとなることもある。対電極と作用電極を通過する酸化還元電流は、電圧／電流変換器を用いて測定される。
【００７９】
測定された酸化還元電流は、記憶された酸化還元電流値と照合され、一致すると、これに対応する尿中アルブミン濃度がバイオセンサに取り込まれ、表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。尿サンプル中のアルブミン濃度レベルを抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。
【００８０】
本発明の別の態様においては、ヒト血漿が、アルブミン含有量を判断するための生体試料として使用される。この生体試料に対し、上述したステップに沿って上述した受容体を使用してアルブミン含有量を判断する。
【００８１】
例示的態様においては、ＣｕＣｌ２が、血漿アルブミンに結合する受容体として採用される。Ｃｕ（II）はアルブミンへの結合定数が最も高い。Ｃｕ（II）の結合定数は１．６×１０１６Ｍ−１であり、図１１に示すように、Ｃｕ（II）は電気化学的に活性である。ＣｕＣｌ２は、酸化数＋２の銅を含み、Ｃｕ（０）に還元され、図１１に示すような酸化ピークに伴う還元ピークが得られる。Ｃｕとアルブミンの結合の観点からみると、生体試料中のアルブミン濃度の変化に直線的に比例する還元ピーク及び酸化ピークの減少が観察される。Ｃｕ（II）に対するアルブミンの結合とＣｕ（II）が示す還元ピーク及び酸化ピークを考慮し、アルブミン濃度の検出には、受容体としてＣｕ（II）が選択される。
【００８２】
メチレンブルー（ＭＢ）は、周知の電気化学的酸化還元色素である。図１２に示すように、ＭＢは、サイクリックボルタモグラムにおいて可逆的な酸化還元ピークを示す。一般に、ＭＢは、生物学におけるＤＮＡ染色や、メトヘモグロビン血症の解毒剤として使用される。メトヘモグロビン血症治療において、ＭＢは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）酵素の存在下で（電子を受け取ることにより）ロイコメチレンブルー（ＬＭＢ）に還元される。その後、ＬＭＢは、メトヘモグロビン分子中の第二鉄（Ｆｅ＋３）に電子を供与し、これをヘモグロビン分子中の第一鉄（Ｆｅ＋２）に変える。ＮＡＤＰＨ酵素の存在下でのＭＢからＬＭＢへの還元が、図１３に示すこのプロセスの鍵である。本発明では、サイクリックボルタンメトリー法を用いて、電気化学的経路によりＭＢをＬＭＢに還元する。Ｆｅ＋３含有元素又は第二鉄の元素が還元形態のＭＢ（ＬＭＢ）に添加されると、ＭＢはその電子を第二鉄（Ｆｅ＋３）に供与し、これを第一鉄（Ｆｅ＋２）に還元する。この反応では、以下の化学反応式に示されるように、Ｆｅ＋３の形の鉄がＦｅ＋２の形の鉄に還元される一方で、ＬＭＢは更に酸化され、ＭＢの形態となる。
ＭＢ＋２ｅ−＋Ｈ＋→ＬＭＢ
ＬＭＢ＋２Ｆｅ＋＋＋→ＭＢ＋２Ｆｅ＋＋
【００８３】
図１４に示すように、ＭＢの還元電流ピークは、ＬＭＢからＦｅ＋３への電子供与による接触電流のため、ヘミンを添加した後に増加する。この反応は、紫外・可視（ＵＶ−ＶＩＳ）分光法を用いて分析される。図１５に示すように、ＭＢは約６６０ｎｍに吸収ピークを示すが、ＬＭＢは無色の液体であり、ＵＶ−ＶＩＳスペクトルに吸収ピークを示さない。ここで、ＬＭＢ溶液は、アスコルビン酸を用いたＭＢの化学的還元により調製される。ヘミンをＬＭＢ溶液に加えると、ＬＭＢは電子をヘミンに供与することにより酸化してＭＢとなり、図１６に示すようにＭＢピークが現れる。純粋なＭＢのＵＶ−ＶＩＳスペクトルをヘミンによりＭＢに変換されたものと比較すると、図１７に示すように６００ｎｍ以下で吸収の増加が見られる。この吸収の増加は、ＭＢ試料中の図１８に示すようなヘミンが存在することに起因する。
【００８４】
上述したヘミンのＭＢに対する活性の原理に基づき、本発明の方法では、ヘミン−ＭＢの組み合わせをベースとした受容体をアルブミン検出に採用している。
【００８５】
ヘミン−ＭＢをベースとするアルブミン検出では、低ヘミン濃度でも高還元ピーク電流が測定されるが、これはＬＭＢが電子供与することによるヘミンの還元に起因するものであり、一部のヘミン分子は、図１９に示すような直接検出の場合と同様に電極表面で直接還元される。その結果、少量のＭＢが電流増幅器として作用する。
【００８６】
ヘミンをベースとした尿中アルブミンの直接検出では、ヘミンが電極表面で還元され、これによる還元電流が得られる。一方、ＭＢ−ヘミンをベースとした検出の場合、ＬＭＢ分子からヘミン分子への電子の供与によってもヘミンは還元され、ＭＢ−ヘミンをベースとした検出では、より低いヘミン濃度でも同様のピーク電流が得られる。このように、ＭＢ−ヘミンの組み合わせを用いることで、同等の還元電流値を得ながら、ヘミンの使用量を大幅に低減できる。
【００８７】
測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応する尿中アルブミン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。尿サンプル中のアルブミン濃度レベルを抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。
【００８８】
本発明の別の態様では、ＭＢ−ＣｕＣｌ２の組み合わせの受容体が使用される。この種の受容体が使用されると、ＭＢ−ヘミン反応の場合で前述したように、接触電流に起因して、図２０に示すように、Ｃｕ（II）を添加した後のＭＢのサイクリックボルタモグラムにおける還元ピーク電流が増加する。銅−アルブミン複合体は、スーパーオキシドジスムターゼ活性を有することが知られており、還元形態のＭＢから電子を消去することができる。尿中アルブミン検出用の受容体がＣｕＣＩ２−ＭＢの組み合わせの場合、アルブミンをＣｕ（II）−ＭＢ溶液に添加すると、銅−アルブミン複合体が還元形態のＭＢ（ＬＭＢ）から電子を消去することでメチレンブルーの酸化を促進し、電極表面でＭＢ濃度が増加するという事実により、還元ピーク電流が増加する。
【００８９】
測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応する尿中アルブミン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。尿サンプル中のアルブミン濃度レベルを抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。
【００９０】
本発明の別の態様においては、ヒト血漿が、アルブミン含有量を判断するための生体試料として使用される。この生体試料に対し、上述したステップに沿って上述した受容体を使用してアルブミン含有量を判断する。
【００９１】
本発明の方法の別の態様においては、ＣｕＣｌ２が、血漿アルブミンに結合する受容体として採用される。Ｃｕ（II）はアルブミンへの結合定数が最も高い。Ｃｕ（II）の結合定数は１．６×１０１６Ｍ−１であり、図１１に示すように、Ｃｕ（II）は電気化学的に活性である。ＣｕＣｌ２は、酸化数＋２の銅を含み、Ｃｕ（０）に還元され、図１１に示すような酸化ピークに伴う還元ピークが得られる。Ｃｕとアルブミンの結合の観点からみると、生体試料中のアルブミン濃度の変化に直線的に比例する還元ピーク及び酸化ピークの減少が観察される。Ｃｕ（II）に対するアルブミンの結合とＣｕ（II）が示す還元ピーク及び酸化ピークを考慮し、アルブミン濃度の検出には、受容体としてＣｕ（II）が選択される。
【００９２】
ここでは、ＣｕＣｌ２を受容体として用いた血液サンプル中のアルブミンバイオ検体の測定について説明してきたが、他の適切な受容体、例えば、ヘミン、ＭＢ−ヘミン、ＭＢ−ＣｕＣｌ２もまたアルブミン濃度を判定するために使用することができる。
【００９３】
本発明の更なる態様では、本発明のバイオセンサを用いてグリコアルブミン濃度を測定する。このように使用されるバイオセンサは、図６ａに示す電極構成を効果的に備えている。２組の電極のそれぞれをＣｕＣｌ２で処理し、そのうちの１組の電極にボロン酸又はその誘導体で処理した薄膜が設けられる。
【００９４】
ボロン酸及びボロン酸誘導体は、グルコースなどの炭水化物や、糖化ヘモグロビン、グリコアルブミンなどの糖化タンパク質に対し親和性を持つ。本発明では、ボロン酸アフィニティー法の原理（又はボロネート親和性の原理）を利用して、全アルブミン成分からグリコアルブミン成分を分離する。
【００９５】
図２１の工程段階に示されるように、両組の電極に少量の血液又は血漿を塗布する。両組の電極に酸化還元電位印加し、対応する酸化還元電流をこれらの電極から測定する。両電極において測定された酸化還元電流の差を計算することにより、グリコアルブミン濃度が得られる。
【００９６】
本発明の別の態様におけるヒト血漿中のメトヘムアルブミン濃度を判断するステップを説明する。メトヘムアルブミンは、ヘミンとアルブミンの複合体であり、鉄が（Ｆｅ＋３）の形態で存在する。メトヘムアルブミン複合体は、本文献に記載の方法でＨＳＡとウシのヘミンを用いて調製される。使用される受容体はＭＢである。
【００９７】
測定された酸化還元電流が、記憶された酸化還元電流値との照合で一致すると、これに対応した尿中アルブミン濃度がバイオセンサに取り込まれ表示される。あるいは、線形フィット方程式を使って、酸化還元電流値からバイオ検体濃度を計算することもできる。尿サンプル中のアルブミン濃度レベルを抽出した後、バイオセンサはその値を表示する。
【００９８】
次に、本発明の主題を以下の実施例を使って説明する。これらの実施例は説明目的のものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００９９】
ヘミンを受容体として用いた場合の尿中アルブミン濃度とその対応する還元電流の測定
１４．１ｇのＮａＣｌ、２．８ｇのＫＣｌ、１７．３ｇの尿素、１９ｍｌのアンモニア水（２５％）、０．６０ｇのＣａＣｌ２及び０．４３ｇのＭｇＳＯ４を０．０２モル／ＬのＨＣｌに溶解して合成尿を調製する。ＨＣｌ及びアンモニア水を使って、合成尿の最終ｐＨを６.０４に調節する。蒸留水中に水酸化ナトリウムが０．１〜１Ｎの溶液２０ｍｌに、１〜６ｍｇのヘミンを溶解させる。溶液を蒸留水でさらに希釈する。ヘミン溶液の最終容積は４０ｍｌであり、ｐＨは１１．５である。容積２０μＬのヘミン溶液を受容体として用いて、尿中アルブミンを検出する。３ｍｇのヒトアルブミンを１０ｍｌの合成尿溶液に溶解し、微量アルブミン溶液を調製する。この原液を適切に希釈することにより、様々な濃度の微量アルブミン溶液を調製する。濃度の異なる微量アルブミン溶液を一定量の受容体（例えば２０μＬ）と予混合し、試験用に最終容量３００μＬとする。
【０１００】
所望量の生体試料（尿）を取り、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２２ａに示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．１Ｖ／秒、０Ｖから−１．４Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用した値から得られる。
【０１０１】
尿サンプルに含まれるアルブミンがヘミンに結合し、図２２ａ及び図２２ｂに示すように還元ピーク電流が尿中アルブミン濃度に対し直線的に減少する。尿サンプル中のアルブミン濃度が増加すると、アルブミンはますますヘミンと結合し、これにより電極上の遊離ヘミン濃度が減少し、その結果、遊離ヘミンの還元ピーク電流が減少する。
【０１０２】
尿中アルブミン濃度値（ｍｇ／Ｌ）をその対応する還元電流値（μＡ）と共に記録し、表１に示すような表にまとめる。表１は、以下に示す線形フィット方程式から作成することができる。
ｙ＝−１．９６ｘ＋２０９
上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。
【表１】
2017530371.tif 000003
【実施例２】
【０１０３】
ヘミン受容体を使った尿中アルブミンの測定
試料容積３００μＬの合成尿を１〜５μｇのヘミン受容体を有する電極に載せ、電位窓を０Ｖ〜−１．４Ｖに指定してＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、還元ピーク電流値を得る。還元ピーク電流の値は２００μＡである。この電流値を表１に当てはめると、対応する尿中アルブミン濃度５ｍｇ／Ｌが得られる。
【実施例３】
【０１０４】
銅を受容体として用いた場合の尿中アルブミン濃度値及びその対応する還元電流値の測定
１４．１ｇのＮａＣｌ、２．８ｇのＫＣｌ、１７．３ｇの尿素、１９ｍｌのアンモニア水（２５％）、０．６０ｇのＣａＣｌ２及び０．４３ｇのＭｇＳＯ４を０．０２モル／ＬのＨＣｌに溶解して合成尿を調製する。ＨＣｌ及びアンモニア水を使って、合成尿の最終ｐＨを６.０４に調節する。５〜２５ｍｇのＣｕＣｌ２を５０ｍｌの人工尿溶液に溶解する。容積２０μＬのこの溶液を受容体として用いて、尿中アルブミンを検出する。２ｍｇのヒトアルブミンを１０ｍｌの合成尿溶液に溶解し、微量アルブミン溶液を調製する。この微量アルブミン溶液を２０μＬの微量の受容体と既知濃度で予混合し、最終容量２２０μＬとする。
【０１０５】
所望量の生体試料（尿）を取り、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２３ａに示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．１５Ｖ／秒、０．６Ｖから−０．４Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用することで得られる。
【０１０６】
尿サンプルに含まれるアルブミンがＣｕ（II）に結合し、図２３ａ及び図２３ｂに示すように酸化還元ピーク電流が尿中アルブミン濃度に対し直線的に減少する。尿サンプル中のアルブミン濃度が増加すると、アルブミンはますますＣｕ（II）と結合し、これにより電極上の遊離Ｃｕ（II）濃度が減少し、その結果、遊離Ｃｕ（II）の還元ピーク電流が減少する。
【０１０７】
尿中アルブミン濃度値（ｍｇ／Ｌ）をその対応する還元電流値（μＡ）と共に記録し、表２に示すような表にまとめる。表２は、以下に示す線形フィット方程式から作成することができる。
ｙ＝−０．０１０３ｘ＋４．３６３
上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。
【表２】
2017530371.tif 000004
【実施例４】
【０１０８】
銅をベースとした合成尿中の尿中アルブミンの直接検出
試料容積２２０μＬの合成尿を２〜６μｇのＣｕＣｌ２受容体を有する電極に載せ、電位窓を０．６Ｖ〜−０．４Ｖに指定してＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、酸化還元ピーク電流値を得る。還元ピーク電流の値は４．１７μＡである。この電流値を表２に当てはめると、対応する尿中アルブミン濃度１８．２ｍｇ／Ｌが得られる。
【実施例５】
【０１０９】
ＭＢ−ヘミンを受容体として用いた場合の尿中アルブミン濃度値及びその対応する還元電流値の測定
１４．１ｇのＮａＣｌ、２．８ｇのＫＣｌ、１７．３ｇの尿素、１９ｍｌのアンモニア水（２５％）、０．６０ｇのＣａＣｌ２及び０．４３ｇのＭｇＳＯ４を０．０２モル／ＬのＨＣｌに溶解して合成尿を調製する。ＨＣｌ及びアンモニア水を使って、合成尿の最終ｐＨを６.０４に調節する。ＭＢを脱イオン水に溶解させる。１０〜４５ｍｇのＭＢを１０ｍｌの脱イオン水に溶解させる。１〜１０ｍｇのヘミンを４０ｍｌの合成尿に溶解させる。容積９μＬ（ヘミン５μＬ＋ＭＢ４μＬ）のこの溶液を受容体として用いて、尿中アルブミンを検出する。３ｍｇのヒトアルブミンを１０ｍｌの合成尿溶液に溶解し、微量アルブミン溶液を調製する。この微量アルブミン溶液を９μＬの微量の受容体と既知濃度で予混合し、最終容量３００μＬとする。
【０１１０】
上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。
【０１１１】
所望量の生体試料（尿）を取り、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２４ａに示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．１Ｖ／秒、０Ｖから−１Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用することにより得られる。
【０１１２】
前述したように、ＬＭＢがヘミンに電子供与するために起る接触電流により、ヘミンをベースとした尿中アルブミンの直接検出と比較し、より低いヘミン濃度でもより高いピーク電流が得られる。尿サンプルに含まれるアルブミンがヘミンに結合し、図２４ａ及び図２４ｂに示すように酸化還元ピーク電流が尿中アルブミン濃度に対し直線的に減少する。尿サンプル中のアルブミン濃度が増加すると、アルブミンはますますヘミンと結合し、これにより電極上の遊離ヘミン濃度が減少し、その結果、遊離ヘミンの酸化還元ピーク電流が減少する。
【０１１３】
尿中アルブミン濃度値（ｍｇ／Ｌ）をその対応する還元電流値（μＡ）と共に記録し、表３に示すような表にまとめる。表３は、以下に示す線形フィット方程式から作成することができる。
ｙ＝−１．２８８ｘ＋１８９
【０１１４】
上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。
【表３】
2017530371.tif 000005
【実施例６】
【０１１５】
ＭＢ−ヘミンをベースとした合成尿中の尿中アルブミンの直接検出
試料容積３００μＬの合成尿を、ＭＢが５〜１５μｇとヘミンが０．１〜１μｇであるＭＢ−ヘミン受容体を有する電極に載せ、電位窓を０．６Ｖ〜−０．４Ｖに指定してＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、酸化還元ピーク電流値を得る。還元ピーク電流の値は１８７．９μＡである。この電流値を表３に当てはめると、対応する尿中アルブミン濃度５ｍｇ／Ｌが得られる。
【実施例７】
【０１１６】
ＭＢ−ＣｕＣｌ２を受容体として用いた場合の尿中アルブミン濃度値及びその対応する還元電流値の測定
１４．１ｇのＮａＣｌ、２．８ｇのＫＣｌ、１７．３ｇの尿素、１９ｍｌのアンモニア水（２５％）、０．６０ｇのＣａＣｌ２及び０．４３ｇのＭｇＳＯ４を０．０２モル／ＬのＨＣｌに溶解して合成尿を調製する。ＨＣｌ及びアンモニア水を使って、合成尿の最終ｐＨを６.０４に調節する。１〜１０ｍｇのＭＢを１０ｍｌの合成尿に、５〜３５ｍｇのＣｕＣｌ２を３０ｍｌの合成尿に溶解させ（例えば、ＣｕＣｌ２４０μＬ＋ＭＢ３０μＬ）、尿中アルブミンを検出する。２ｍｇのヒトアルブミンを１０ｍｌの合成尿溶液に溶解し、微量アルブミン溶液を調製する。この微量アルブミン溶液を７０μＬの少量の受容体と既知濃度で予混合し、最終容量２２０μＬとする。
【０１１７】
所望量の生体試料（尿）を取り、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２５ａに示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．１Ｖ／秒、０Ｖから−０．５Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用することにより得られる。
【０１１８】
尿サンプルに含まれるアルブミンがＣｕ（II）に結合し、アルブミン−銅複合体を形成する。この複合体がメチレンブルーの還元ピーク電流を増加させ、図２５ａ及び図２５ｂに示すように還元ピーク電流が尿中アルブミン濃度に対し直線的に増加する。尿サンプル中のアルブミン濃度が増加すると、アルブミンはますますＣｕ（II）と結合してアルブミン−銅複合体を形成し、これにより電極上で更に多くのメチレンブルーが酸化され、メチレンブルーの還元ピーク電流が増加する。
【０１１９】
尿中アルブミン濃度値（ｍｇ／Ｌ）をその対応する還元電流値（μＡ）と共に記録し、表４に示すような表にまとめる。表４は、以下に示す線形フィット方程式から作成することができる。
ｙ＝０．１０９８ｘ＋０．６９０３
【０１２０】
上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。
【表４】
2017530371.tif 000006
【実施例８】
【０１２１】
ＭＢ−ＣｕＣｌ２をベースとした合成尿中の尿中アルブミンの直接検出
試料容積２２０μＬの合成尿を、ＭＢが１０〜５０μｇとＣｕＣｌ２が５〜５５μｇであるＭＢ−ＣｕＣｌ２受容体を有する電極に載せ、電位窓を０Ｖ〜−０．５Ｖに指定してＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、酸化還元ピーク電流値を得る。還元ピーク電流の値は３０．８μＡである。この電流値を表４に当てはめると、対応する尿中アルブミン濃度９．０９ｍｇ／Ｌが得られる。
【実施例９】
【０１２２】
ＣｕＣｌ２を受容体として用いた場合の血漿サンプル中のヒト血清アルブミン濃度値及びその対応する還元電流値の測定
アルブミン濃度が３４．０２ｇ  ／Ｌのヒト血漿を原液として採取する。血漿を希釈して、アルブミン濃度を５ｇ／ｌから３２．０９ｇ／ｌにする。ＣｕＣｌ２受容体のストック溶液を７０〜１５０ｇ／Ｌ濃度で塩水を使って調製し、２０μＬの少量を希釈血漿溶液と予混合し、総量３００μＬを電極表面に載せて、還元ピーク電流値を測定する。
【０１２３】
所望量のヒト血漿を取り、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２６ａに示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．３Ｖ／秒、１Ｖから−０．６Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用することにより得られる。
【０１２４】
ヒト血漿サンプルに含まれるアルブミンがＣｕ（II）に結合し、図２６ａ及び図２６ｂに示すように酸化還元ピーク電流が尿中アルブミン濃度に対し直線的に減少する。血漿サンプル中のアルブミン濃度が増加すると、アルブミンはますますＣｕ（II）と結合し、これにより電極上の遊離Ｃｕ（II）濃度が減少し、その結果、遊離Ｃｕ（II）の還元ピーク電流が減少する。
【０１２５】
ヒト血漿中のアルブミン濃度値（ｇ／Ｌ）をその対応する還元電流値（μＡ）と共に記録し、表５に示すような表にまとめる。表５は、以下に示す線形フィット方程式から作成することができる。
ｙ＝−１９．２８ｘ＋７１６．８
【０１２６】
上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。
【表５】
2017530371.tif 000007
【実施例１０】
【０１２７】
ＣｕＣｌ２をベースとしたヒト血漿中のアルブミンの直接検出
試料容積３００μＬの合成尿を、ＣｕＣｌ２が１〜１０μｇであるＣｕＣｌ２受容体を有する電極に載せ、電位窓を１Ｖ〜−０．６Ｖに指定したＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使ったサイクリックボルタモグラムから、酸化還元ピーク電流値を得る。還元ピーク電流の値は６７６．８μＡである。この電流値を表５に当てはめると、対応する尿中アルブミン濃度５ｇ／Ｌが得られる。
【実施例１１】
【０１２８】
メチレンブルーを受容体として用いた場合の生体試料中のメトヘムアルブミン値及び対応する還元電流値の測定
ヘミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）をアルカリ溶液に公知の方法で溶解してメトヘムアルブミンを調製する。この溶液を５ｍｌの２％ヒトアルブミンと混合し、１ＮのＨＣｌでｐＨを７．４に調節する。  １〜７ｍｇのＭＢをｐＨ７で１０ｍｌのＰＢＳに溶解する。濃度の異なるメトヘムアルブミン溶液をＭＢ溶液に添加し、還元ピーク電流値を得る。還元ピーク電流値は、走査速度０．１Ｖ／秒、−０．２Ｖから−０．５Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用したものである。メトヘムアルブミン量をその対応する還元電流値（μＡ）と共に記録し、表６に示すような表にまとめる。表６は、以下に示す線形フィット方程式から作成することができる。
ｙ＝１．００６ｘ＋４１．１９
【０１２９】
上記の式において、「ｙ」は酸化還元電流値を表し、「ｘ」は検体濃度を表す。
【表６】
2017530371.tif 000008
【０１３０】
所望量（μＬ）のＭＢ受容体をバイオセンサ装置の電極表面に載せ、乾燥させる。
【０１３１】
所望量の生体試料（標準溶液中のメトヘムアルブミン複合体）を取り、バイオセンサ装置の電極に載せる。図２７ａ及び図２７ｂに示されるように、これに対応するサイクリックボルタモグラムが、走査速度０．１Ｖ／秒、−０．２Ｖから−０．５Ｖまでの様々な電位窓でＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用することにより得られる。
【０１３２】
還元形態のＭＢ（ＬＭＢ）がメトヘムアルブミン複合体に電子供与するため、図２７ａ及び図２７ｂに示すように還元ピーク電流がメトヘムアルブミン複合体に対し直線的に増加する。
【０１３３】
本発明では、生体試料中のバイオ検体、すなわち、尿中アルブミン、ＨＳＡ、メトヘムアルブミン及びＧＡを定量測定するために、非酵素的な非抗体ベースの受容体が電極と併用される。
【０１３４】
本発明は、ヒトアルブミンに電気化学的に活性の物質を添加し、ヒトアルブミンに関連するバイオ検体を電気化学的に検出する方法を採用している。
【０１３５】
本発明のバイオ検体の定量測定は、少量の試料を用いて行う最小侵襲技術である。
【０１３６】
また、以下の特許請求の範囲は、本明細書に記載された本発明の一般的及び特定の特徴の全てと、言語上その中間にあると考えられるであろう本発明の特許請求の範囲の記述の全てを対象とすることを意図していることも理解される。
【符号の説明】
【０１３７】
１００  電気化学的に活性かつアルブミン結合性の装置
１０１  基板
１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃ、１０２ｄ、１０２ｅ、１０２ｆ  導電路
１０３ａ、１０３ｂ、１０３ｃ、１０３ｄ、１０３ｅ、１０３ｆ  電極
１０４  薄膜
１０５  アルブミン結合性かつ電気化学的に活性の受容体
１０６  パッシベーション層
１０７  第２の薄膜
１０８  化学物質層
２００  装置ホルダ
２０１  ハウジング
２０２  ＵＳＢプラグ
２０３  装置挿入口
２０４  生体試料
３００  ポイントオブケア用バイオセンサ
３０１  ハウジング
３０２  マイクロＵＳＢ
３０３  マイクロＳＤカード
３０４  表示部材
３０５  装置挿入口
３０６  データベース部材
３０７  デジタル制御部（マイクロコントローラ）
３０８  電源装置
３０９  信号調整・装置検出装置
３１０  湿度センサ
３１１  温度センサ
【図１】
2017530371.tif 000009
【図２】
2017530371.tif 000010
【図３ａ】
2017530371.tif 000011
【図３ｂ】
2017530371.tif 000012
【図４ａ】
2017530371.tif 000013
【図４ｂ】
2017530371.tif 000014
【図４ｃ】
2017530371.tif 000015
【図４ｄ】
2017530371.tif 000016
【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【国際調査報告】
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