(57)【要約】エキソソームなどの細胞外微小小胞体、とりわけ、腫瘍由来エキソソームおよびウイルス由来エキソソームにより例示される疾患関連細胞外微小小胞体およびホスファチジルセリン（ＰＳ）陽性細胞外微小小胞体を単離するための驚くべき新規な方法および組成物を開示する。本発明の方法は、迅速で、効率的で、費用対効果が高く、重要なことに、大きな体積の生体液での使用に適し、抗原的に完全な細胞外微小小胞体およびエキソソームをもたらす。上記方法および組成物は、溶液から大量の細胞外微小小胞体、とりわけ腫瘍由来エキソソームを、それらの形態学的もしくは機能的な特性または抗原性を損なうことなく、単離するための酢酸緩衝液の驚くべき使用に基づいている。
2017509332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患関連細胞外微小小胞体を生体液から単離する方法であって、該疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、該方法は、該生体液の試料を、該生体液から疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、該沈殿物から疾患関連細胞外微小小胞体を収集し、それにより該疾患関連細胞外微小小胞体を単離するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記疾患関連細胞外微小小胞体の表面上の前記ホスファチジルセリンが非脂質膜成分と結合して存在し、該非脂質膜成分が膜タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酢酸緩衝液が前記疾患関連細胞外微小小胞体上の前記ホスファチジルセリンの表面電荷を中和し、それにより、前記生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体液が疾患関連細胞外微小小胞体および正常細胞外微小小胞体を含む細胞外微小小胞体の混合集団を含有し、前記方法が、該正常細胞外微小小胞体とは対照的に、該混合集団から該疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記疾患関連細胞外微小小胞体が、それらの形態学的もしくは機能的な特性または細胞表面抗原を実質的に損なうことなく、単離される、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記細胞外微小小胞体がエキソソームである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記疾患関連細胞外微小小胞体が細胞内寄生生物に感染した細胞に由来する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患関連細胞外微小小胞体がウイルス感染細胞に由来する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ウイルス感染細胞から感染性ウイルスを実質的に含まない疾患関連細胞外微小小胞体を単離する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患関連細胞外微小小胞体が腫瘍由来細胞外微小小胞体である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍由来細胞外微小小胞体が、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、前立腺がん、乳がんまたは卵巣がんに由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍由来細胞外微小小胞体が腫瘍由来エキソソームである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患関連細胞外微小小胞体がヒト細胞外微小小胞体である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記酢酸緩衝液が約４．２５と約５．２５の間のｐＨを有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記酢酸緩衝液が約４．５と約５．０の間のｐＨを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酢酸緩衝液が約４．７５のｐＨを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酢酸緩衝液が約０．０５Ｍと約０．２５Ｍの間の前記試料中最終濃度を有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記酢酸緩衝液が約０．０５Ｍと約０．１Ｍの間の前記試料中最終濃度を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料に１／１０容の１．０Ｍ酢酸緩衝液を加える、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記酢酸緩衝液が約４．２５と約５．２５の間のｐＨおよび約０．０５Ｍと約０．２５Ｍの間の前記試料中最終濃度を有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記酢酸緩衝液が約４．５と約５．０の間のｐＨおよび約０．０５Ｍと約０．１Ｍの間の前記試料中最終濃度を有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記酢酸緩衝液が約４．７５のｐＨおよび約０．１Ｍの前記試料中最終濃度を有する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記酢酸緩衝液が酢酸ナトリウムを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記酢酸緩衝液が酢酸カリウムを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記酢酸緩衝液が体積排除ポリマーを本質的に含まない、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記酢酸緩衝液がポリエチレングリコールを本質的に含まない、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記酢酸緩衝液が、約４．７５のｐＨおよび約０．１Ｍの前記試料中最終濃度を有する酢酸ナトリウムである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記生体液がマウス、ウシまたはヒトの生体液である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記生体液が細胞培養上清、全血、血清、血漿、腹水、脳脊髄液、骨髄吸引液、気管支肺胞洗浄液、尿、精液、膣液、粘液、唾液、痰、または生体組織試料からの清澄にした溶解物である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記生体液が細胞培養上清、血清、血漿または腹水である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記生体液が、低速遠心分離に既にかけた澄明にした細胞培養上清である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記生体液が、非腫瘍細胞外微小小胞体を含有する血清の存在下で培養した腫瘍細胞から得られた細胞培養上清である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記生体液が、非ヒト血清の存在下で培養したヒト腫瘍細胞から得られた細胞培養上清である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体液が、ウシ血清またはウシ胎児血清の存在下で培養したマウス腫瘍細胞またはヒト腫瘍細胞から得られた細胞培養上清である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体液を、前記酢酸緩衝液と接触させる前に低速遠心分離にかけて、細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を除去するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記酢酸緩衝液との接触後の前記疾患関連細胞外微小小胞体を含有する前記沈殿物を低速遠心分離により収集する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患関連細胞外微小小胞体を含有する収集された前記沈殿物を、ほぼ中性ｐＨの、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液に再懸濁して、疾患関連細胞外微小小胞体の単離集団を提供するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
疾患関連細胞外微小小胞体の前記単離集団を遠心分離して混入成分を除去し、それにより、疾患関連細胞外微小小胞体の本質的に純粋な組成物を提供するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）腫瘍由来エキソソームおよび非腫瘍エキソソームを含むエキソソームの混合集団を含有する生体液を得るステップと、
（ｂ）該生体液を、該生体液から非腫瘍エキソソームではなく腫瘍由来エキソソームを選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｃ）該腫瘍由来エキソソームを選択的に含有する、ステップ（ｂ）からの沈殿物を収集するステップと、
（ｄ）該沈殿物を、ほぼ中性ｐＨの、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液に再懸濁し、それにより、非腫瘍エキソソームを本質的に含まない腫瘍由来エキソソームの精製集団を提供するステップと
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）腫瘍由来エキソソームおよび非腫瘍エキソソームを含むエキソソームの混合集団を含有する生体液を得るステップと、
（ｂ）該生体液について第１の低速遠心分離を実施して、細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を本質的に含まない、清澄にした液を提供するステップと、
（ｃ）該清澄にした液を、選択的に沈殿した腫瘍由来エキソソームを含むが、沈殿した非腫瘍エキソソームを実質的に含まない混濁懸濁液を提供するのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液とともに、有効な時間、インキュベートするステップと、
（ｄ）該混濁懸濁液を低速遠心分離にかけて、該腫瘍由来エキソソームを選択的に含む沈殿物、および上清を提供するステップと、
（ｅ）該腫瘍由来エキソソームを含む該沈殿物を収集するステップと、
（ｆ）該沈殿物を、ほぼ中性ｐＨの、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液に再懸濁し、それにより、腫瘍由来エキソソームを含み、非腫瘍エキソソームを本質的に含まない精製エキソソーム集団を提供するステップと、任意選択で、
（ｇ）該精製エキソソーム集団をさらなる遠心分離にかけて、非エキソソーム成分を含むペレットを提供し、該ペレットを除去し、それにより、非腫瘍エキソソームおよび非エキソソーム成分の両方を実質的に含まない腫瘍由来エキソソームの本質的に純粋な組成物を提供するステップと
を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患関連細胞外微小小胞体における少なくとも第１のバイオマーカーを同定するかまたは定量するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記バイオマーカーがＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質バイオマーカーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
正常細胞外微小小胞体を含有する血清の存在下で培養した罹患細胞の上清から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体を得る方法であって、該上清を、該上清から疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、該沈殿物を収集し、それにより、該血清中の正常細胞外微小小胞体の実質的な混入なしで、該上清から疾患関連細胞外微小小胞体を得るステップとを含む方法。
【請求項４４】
前記罹患細胞が、ウシ血清またはウシ胎児血清の存在下で培養したマウス腫瘍細胞またはヒト腫瘍細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
疾患関連細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清を調製する方法であって、該疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、該方法は、
（ａ）疾患関連細胞外微小小胞体を含有する疑いがある血清を得るステップと、
（ｂ）該血清を、該血清から疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された沈殿物を該血清から除去し、それにより、疾患関連細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清を提供するステップであって、該沈殿物は、該疾患関連細胞外微小小胞体を含有するステップと
を含む方法。
【請求項４６】
前記疾患関連細胞外微小小胞体がウイルス感染細胞に由来する、請求項４３または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患関連細胞外微小小胞体が腫瘍由来エキソソームである、請求項４３または４５に記載の方法。
【請求項４８】
感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を実質的に含まない血液、血清または血漿を調製する方法であって、
（ａ）感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を含有する疑いがある血液、血清または血漿を得るステップと、
（ｂ）該血液、血清または血漿を、該感染性ウイルスを不活性化するかまたは沈殿させ、該血液、血清または血漿から該細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された沈殿物を該血液、血清または血漿から除去し、それにより、感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を実質的に含まない血液、血清または血漿を提供するステップであって、該沈殿物は、該不活性化したかまたは該沈殿したウイルスおよび沈殿した細胞外微小小胞体を含有するステップと
を含む方法。
【請求項４９】
輸血の前に実施される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
清澄にした生体液中の疾患関連細胞外微小小胞体を検出する方法であって、該疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、該方法は、該清澄にした生体液を、該清澄にした生体液から疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、結果として生じた生体液中の濁りの存在を決定するステップであって、該結果として生じた生体液中の濁りの存在が疾患関連細胞外微小小胞体の検出を示すステップとを含む方法。
【請求項５１】
前記結果として生じた生体液中の濁りの存在が視覚的に検出される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患関連細胞外微小小胞体が腫瘍由来エキソソームである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
検出可能な濁りを有する前記結果として生じた生体液から前記腫瘍由来エキソソームを単離するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
低速遠心分離を使用して沈殿物を収集することによって、前記腫瘍由来エキソソームが検出可能な濁りを有する前記結果として生じた生体液から単離される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
疾患関連細胞外微小小胞体であって負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体の存在によって特徴付けられる第１の疾患を有する患者を診断する方法であって、該方法は、該患者からの生体液中の該疾患関連細胞外微小小胞体の存在を検出し、それにより、該患者を該第１の疾患を有すると診断するステップを含み、該疾患関連細胞外微小小胞体を、
（ａ）該生体液を、該生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）結果として生じた生体液中の該沈殿物の存在を決定するステップであって、該結果として生じた生体液中の該沈殿物の存在が該疾患関連外微小小胞体の検出を示すステップと
を含む方法により検出する方法。
【請求項５６】
前記生体液が清澄にした生体液であり、前記結果として生じた生体液中の前記沈殿物の存在が該結果として生じた生体液中の濁りの存在によって決定される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患関連細胞外微小小胞体の量を定量する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
疾患関連細胞外微小小胞体であって負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体の量によって特徴付けられる第１の疾患を有する患者の疾患負荷をモニターする方法であって、該方法は、該患者からの生体液中の該疾患関連細胞外微小小胞体の量を測定するステップを含み、該疾患関連細胞外微小小胞体の量を、
（ａ）該生体液を、該生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）該沈殿物中の該疾患関連細胞外微小小胞体の量を測定するステップと
を含む方法により測定する、方法。
【請求項５９】
前記第１の疾患の実体が、該第１の疾患のバイオマーカーまたは臨床徴候について試験することによって確認される、請求項５５または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１の疾患がウイルス感染症である、請求項５５または５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の疾患ががんであり、前記疾患関連細胞外微小小胞体が腫瘍由来エキソソームである、請求項５５または５８に記載の方法。
【請求項６２】
複数の時点での前記患者から得られた一連の生体液試料中の腫瘍由来エキソソームの量を測定し、腫瘍由来エキソソームの量の増加が腫瘍負荷の増加を示し、該腫瘍由来エキソソームの量の減少が腫瘍負荷の減少を示す、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
生体液から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させることによる診断に使用するのに有効なｐＨおよび濃度を有する酢酸緩衝液。
【請求項６４】
生体液から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させることによる治療に使用するのに有効なｐＨおよび濃度を有する酢酸緩衝液。
【請求項６５】
生体液から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体を単離するためのキットであって、生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液ならびに使用のための指示を含むキット。
【請求項６６】
疾患関連細胞外微小小胞体における１つまたは複数のバイオマーカーを同定するかまたは定量するのに使用する少なくとも第１の試薬をさらに含む、請求項６５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の引用
本願は、同時係属中の第１の米国仮出願第６１／９４５，７１８号（２０１４年２月２７日出願）および同時係属中の第２の米国仮出願第６１／９７０，５２９号（２０１４年３月２６日出願）に対する優先権を主張する。明細書、特許請求の範囲および図面を含めたこれらの出願の開示全体は、権利放棄をすることなく、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
２．発明の分野
本発明は、生物工学の分野に関し、とりわけ、エキソソームなどの細胞外微小小胞体に関する。本発明は、大量の生体液での使用に特に適し、抗原的に完全である細胞外微小小胞体およびエキソソームをもたらす、腫瘍およびウイルス由来エキソソーム、とりわけ腫瘍由来エキソソームなどの疾患関連およびホスファチジルセリン（ＰＳ）陽性細胞外微小小胞体を単離するための驚くべき新規な方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
３．関連技術の説明
細胞外微小小胞体は、細胞により放出または分泌された一群の膜結合成分であり、エキソソーム、エクトソーム、ミクロ粒子または微小小胞体およびアポトーシス小体またはブレブなどを含む（Ｇｙｏｅｒｇｙら、２０１１年；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＆  Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ、２０１２年）。この細胞外微小小胞体の群内では、エキソソームが近年特に注目を集めている。
【０００４】
エキソソームは、４０〜５０ナノメートルから１００ナノメートルの大きさの膜由来の小胞として一般的に記載され、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞により能動的に分泌されることが公知である。それらは、エンドソーム膜の内方出芽および切断により後期エンドソームから発生し、内腔小胞を含有する多小胞体（ＭＶＢ）を形成している。これらのエキソソームは、ＭＶＢと原形質膜との融合により細胞外空間に放出される。それらが細胞の原形質膜に由来し、エンドソーム膜の陥入により形成されるので、分泌されたエキソソームは、細胞質ゾル由来の水性腔（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｐａｃｅ）を封入している原形質膜およびエンドソームタンパク質を有する。
【０００５】
エキソソームなどの細胞外微小小胞体は、例えば、異なる細胞型間に情報を転送する分子メッセンジャーとして作用することにより、幅広い一連の重要な生理学的機能を発揮する。例えば、エキソソームは、その供給源によって、アポトーシス（Ａｎｄｒｅｏｌａら、２００２年；Ｈｕｂｅｒら、２００５年；Ｋｉｍら、２００５年）、転移（Ｐａｒｏｌｉｎｉら、２００９年）、血管新生（Ｋｉｍら、２００５年；Ｉｅｒｏら、２００８年）、腫瘍進行（Ｋｅｌｌｅｒら、２００９年；Ｔｈｅｒｙら、２００２年）、血栓症（Ａｈａｒｏｎ  ＆  Ｂｒｅｎｎｅｒ、２００９年；Ａｌ  Ｎｅｄａｗｉら、２００５年）およびＴ細胞を免疫活性化に向かわせることによる免疫（Ａｎｄｒｅら、２００４年；Ｃｈａｐｕｔら、２００５年）または免疫抑制（Ｓｚａｊｎｉｋら、２０１０年；Ｖａｌｅｎｔｉら、２００７年；Ｗｉｅｃｋｏｗｓｋｉら、２００９年）に影響を及ぼし得るシグナル伝達経路に関与するタンパク質、脂質ならびにＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含む可溶性因子を送出する（Ｔｈｅｒｙら、２００９年）。
【０００６】
悪性滲出液およびがん患者の末梢血ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した細胞株および腫瘍細胞の上清などの種々の供給源からの細胞外微小小胞体およびエキソソーム集団の単離および精製のためのいくつかの技術が記載された。これらの方法としては、超遠心分離ステップを含む、分画遠心分離法（Ｔｈｅｒｙら、２００６年）；アフィニティークロマトグラフィー（Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ、２００８年）；とりわけ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの総エキソソーム単離試薬（米国特許第８，９０１，２８４号）およびＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（ＵＳ２０１３／０３３７４４０Ａ１）を含む、異なる分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する、ポリマー媒介沈殿法（Ｔａｙｌｏｒら、２０１１年）；ならびに直列に接続された異なる孔径の２つのフィルターを一般的に使用するＥｘｏＭｉｒ（商標）（ＵＳ２０１３／００５２６４７Ａ１）などの、規定の孔径の膜上への捕捉（Ｇｒａｎｔら、２０１１年）が挙げられる。
【０００７】
しかし、利用できる技術は、２つの重要な事項における欠点によって制限される。第一に、一般的に細胞外微小小胞体およびエキソソーム調製物に適用するときに、それらは、時間がかかり、扱いにくく、かつ／または費用がかかり、処理することができる材料の量によって制限される。特に、細胞外微小小胞体およびエキソソームを単離するために現在利用できる技術はすべて、試験または使用のための十分な濃度を得るために体積の著しい減少を必要とする。エキソソームの単離を始める前に超遠心分離を使用して生物学的媒体を濃縮する一般的なアプローチは、非常に時間のかかるものであり、特殊な実験装置を必要とする。
【０００８】
第二に、現在の技術は、腫瘍由来細胞外微小小胞体およびエキソソームに適用するときに特に制約がある。例えば、患者の血液をポンプによりレクチンアフィニティーカラムを通して送り出し、次いで患者に戻すという、がん患者の循環からのエキソソームの体外除去が提案された（米国特許第８，２８８，１７２号）。ＨＥＲ２／ｎｅｕなどの腫瘍特異的タンパク質に対する抗体で被覆した常磁性ビーズを使用して腫瘍由来エキソソームを精製することができることも報告された（Ｋｏｇａら、２００５年）。Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ（商標）キットなどの、特異的エキソソームを捕捉するための磁気ビーズを使用したキットも利用できる。上記の一般的な欠点に加えて、そのような方法およびキットは、非常に限定的であり、抗体結合に活用すべき特定のエキソソーム表面マーカーの予備知識、ならびにビオチニル化捕捉抗体の調製および使用などの、プロトコールにおける多くの詳細な技術的ステップの両方を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８，９０１，２８４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／０３３７４４０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１３／００５２６４７号明細書
【特許文献４】米国特許第８，２８８，１７２号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Gyoergyら,  "Membrane  vesicles,  current  state-of-the-art:  emerging  role  of  extracellular  vesicles",  Cell.  Mol.  Life  Sci.,  68:2667-2688,  2011年
【非特許文献２】Simpson  and  Mathivanan,  "Extracellular  Microvesicles:  The  Need  for  Internationally  Recognised  Nomenclature  and  Stringent  Purification  Criteria",  J.  Proteomics  Bioinform.,  5:2  http://dx.doi.org/10.4172/jpb.10000e10,  2012年
【非特許文献３】Andreolaら,  "Induction  of  lymphocyte  apoptosis  by  tumor  cell  secretion  of  FasL-bearing  microvesicles",  J.  Exp.  Med.,  195:1303-1316,  2002年
【非特許文献４】Huberら,  "Human  colorectal  cancer  cells  induce  T-cell  death  through  release  of  proapoptotic  microvesicles:  role  in  immune  escape",  Gastroenterology,  128:1796-1804,  2005年
【非特許文献５】Kimら,  "Fas  ligand-positive  membranous  vesicles  isolated  from  sera  of  patients  with  oral  cancer  induce  apoptosis  of  activated  T  lymphocytes",  Clin.  Cancer  Res.,  11:1010-1020,  2005年
【非特許文献６】Paroliniら,  "Microenvironmental  pH  is  a  key  factor  for  exosome  traffic  in  tumor  cells"'  J.  Biol.  Chem.,  284:34211-34222,  2009年
【非特許文献７】Ieroら,  "Tumour-released  exosomes  and  their  implications  in  cancer  immunity",  Cell  Death.  Differ.,  15:80-88,  2008年
【非特許文献８】Kellerら,  "Systemic  presence  and  tumor-growth  promoting  effect  of  ovarian  carcinoma  released  exosomes",  Cancer  Lett.,  278:73-81,  2009年
【非特許文献９】Theryら,  "Exosomes:  composition,  biogenesis  and  function",  Nat.  Rev.  Immunol.,  2:569-579,  2002年
【非特許文献１０】Aharon  and  Brenner,  "Microparticles,  thrombosis  and  cancer",  Best  Practice  &  Research  Clinical  Haematology,  22:61-69,  2009年
【非特許文献１１】Al  Nedawiら,  "Mast  cell-derived  exosomes  activate  endothelial  cells  to  secrete  plasminogen  activator  inhibitor  type  1",  Arterioscler.  Thromb.  Vasc.  Biol.,  25:1744-1749,  2005年
【非特許文献１２】Andreら,  "Exosomes  as  potent  cell-free  peptide-based  vaccine.  I.  Dendritic  cell-derived  exosomes  transfer  functional  MHC  class  I/peptide  complexes  to  dendritic  cells",  J.  Immunol.,  172:2126-2136,  2004年
【非特許文献１３】Chaputら,  "The  potential  of  exosomes  in  immunotherapy",  Expert.  Opin.  Biol.  Ther.,  5:737-747,  2005年
【非特許文献１４】Szajnikら,  "Tumor-derived  microvesicles  induce,  expand  and  up-regulate  biological  activities  of  human  regulatory  T  cells  (Treg)",  PLoS  One,  5:e11469,  2010年
【非特許文献１５】Valentiら,  "Tumor-released  microvesicles  as  vehicles  of  immunosuppression",  Cancer  Res.,  67:2912-2915,  2007年
【非特許文献１６】Wieckowskiら,  "Tumor-derived  microvesicles  promote  regulatory  T  cell  expansion  and  induce  apoptosis  in  tumor-reactive  activated  CD8+  T  lymphocytes",  J.  Immunol.,  183:3720-3730,  2009年
【非特許文献１７】Theryら,  "Membrane  vesicles  as  conveyors  of  immune  responses",  Nat.  Rev.  Immunol.,  9:581-593,  2009年
【非特許文献１８】Theryら,  "Isolation  and  characterization  of  exosomes  from  cell  culture  supernatants  and  biological  fluids",  Curr.  Protoc.  Cell  Biol.,  Chapter  3:Unit,  2006年
【非特許文献１９】Taylor  and  Gercel-Taylor,  "MicroRNA  signatures  of  tumor-derived  exosomes  as  diagnostic  biomarkers  of  ovarian  cancer",  Gynecol.  Oncol.,  110:13-21,  2008年
【非特許文献２０】Taylorら,  "Exosome  isolation  for  proteomic  analyses  and  RNA  profiling",  Methods  Mol.  Biol.,  728:235-246,  2011年
【非特許文献２１】Grantら,  "A  filtration-based  protocol  to  isolate  human  Plasma  Membrane-derived  Vesicles  and  exosomes  from  blood  plasma",  J.  Immunol.  Methods,  371(1-2):143-51,  2011年
【非特許文献２２】Kogaら,  "Purification,  characterization  and  biological  significance  of  tumor-derived  exosomes",  Anticancer  Res.,  25:3703-3708,  2005年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、エキソソーム、とりわけ疾患関連および腫瘍由来エキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離する新規かつ改善された方法が当技術分野において依然として必要とされている。形態学的および抗原的に完全な細胞外微小小胞体およびエキソソームを単離する簡単かつ費用対効果の高い新規方法の特定は、重要な進歩である。本当に必要とされているのは、特殊な実験装置を用いず、初期超遠心分離ステップの必要なしに、大きな体積の生物学的材料を扱う能力を備えた方法、とりわけ、疾患関連および腫瘍由来エキソソームを優先的に単離するために使用することができる方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、エキソソーム、とりわけ、腫瘍由来エキソソームを含む、疾患関連およびホスファチジルセリン（ＰＳ）陽性エキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離するための新規な方法および組成物を提供することによって従来技術の上記および他の必要に対処するものであり、方法は、迅速で、効率的で、費用対効果が高く、大きな体積の生体液での使用に適する。これらの方法は、溶液からエキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離するための酢酸緩衝液の驚くべき使用に基づいている。本発明は、時間がかかり、扱いにくく、体積により制約がある現在の超遠心分離法により調製されるものと区別がつかない、大量の細胞外微小小胞体およびエキソソーム、とりわけ抗原的に完全であり、腫瘍由来エキソソームなどの疾患関連およびＰＳ陽性エキソソームを単離する能力を提供するものである。
【００１３】
本発明は、一般的に膜タンパク質などの非脂質膜成分と結合した、負に荷電したリン脂質であるホスファチジルセリン（ＰＳ）を表面上に発現する、疾患関連、ウイルス由来および腫瘍由来エキソソームを精製または単離するのに特に適している。酢酸緩衝液は、驚くべきことに、得られる細胞外微小小胞体およびエキソソームの形態学的または機能特性を損なうことなく、とりわけそれらの最初の抗原性プロファイルを維持し、それらが「抗原的に完全」であるようにしながら、細胞外微小小胞体およびエキソソームの表面電荷を中和し、ひいてはそれらを溶液から除去する。そのような疾患関連エキソソームは、宿主細胞にＰＳを外在化させる、ウイルスまたは細胞内寄生生物もしくは病原体に感染した細胞由来のものを含み、一般的に有意な量のＰＳを表面上に含有する腫瘍由来エキソソームであることが好ましい。
【００１４】
本発明の広範囲に適用可能な実施形態は、疾患関連細胞外微小小胞体を生体液から単離する方法であって、疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、そのような方法は、生体液の試料を、生体液から疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、沈殿物から疾患関連細胞外微小小胞体を収集し、それにより疾患関連細胞外微小小胞体を単離するステップとを含む。
【００１５】
そのような方法は、ウイルス感染細胞から細胞外微小小胞体を単離するための方法であって、ウイルス由来細胞外微小小胞体を含有する生体液を、生体液からウイルス由来細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、沈殿物からウイルス由来細胞外微小小胞体を収集し、それによりウイルス由来細胞外微小小胞体を単離するステップとを含む方法を含む。ウイルス法（viral  method）は、好ましくは、感染性ウイルスを実質的に含まない細胞外ウイルス由来微小小胞体を単離する。
【００１６】
本発明の方法は、生体液から腫瘍由来細胞外微小小胞体を単離するための方法であって、生体液の試料を、生体液から腫瘍由来細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、沈殿物から腫瘍由来細胞外微小小胞体を収集し、それにより腫瘍由来細胞外微小小胞体を単離するステップとを含む方法をさらに含む。
【００１７】
疾患関連細胞外微小小胞体の他の例は、細胞内寄生生物または病原体に感染した細胞に由来するものである。
【００１８】
上記の方法において、疾患関連、ウイルス由来および腫瘍由来細胞外微小小胞体は、好ましくは疾患関連、ウイルス由来および腫瘍由来エキソソームである。好ましくは、疾患関連、ウイルス由来ならびに腫瘍由来細胞外微小小胞体およびエキソソームは、それらの形態学的もしくは機能的な特性または細胞表面抗原を実質的に損なわずに単離される。ヒト腫瘍エキソソームなどの、ヒト細胞外微小小胞体は、本発明により単離することができる。
【００１９】
本発明を疾患関連エキソソームなどの、すべての疾患関連細胞外微小小胞体に適用することにより、ホスファチジルセリンは、細胞外微小小胞体の表面上に好ましくは存在し、より好ましくは非脂質膜成分と結合しており、非脂質膜成分は、膜タンパク質を含む。この点に関しては、酢酸緩衝液は、疾患関連細胞外微小小胞体上のホスファチジルセリンの表面電荷を中和し、それにより、生体液から疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させると考えられる。
【００２０】
したがって、本発明は、とりわけ疾患関連細胞外微小小胞体および正常細胞外微小小胞体を含む細胞外微小小胞体の混合集団を含有する生体液での使用のための方法を提供するものであり、本方法は、混合集団から、正常細胞外微小小胞体とは対照的に、疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させる。これの実施形態は、腫瘍由来エキソソームおよび正常エキソソームを含むエキソソームの混合集団を含有する生体液での使用のための方法であり、本方法は、混合集団から、正常エキソソームとは対照的に、腫瘍由来エキソソームを選択的に沈殿させる。
【００２１】
そのような方法は、
（ａ）腫瘍由来エキソソームおよび非腫瘍エキソソームを含むエキソソームの混合集団を含有する生体液を得るステップと、
（ｂ）該生体液を、該生体液から非腫瘍エキソソームではなく腫瘍由来エキソソームを選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｃ）腫瘍由来エキソソームを選択的に含有する、ステップ（ｂ）からの沈殿物を収集するステップと、
（ｄ）沈殿物を、ほぼ中性ｐＨの、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液に再懸濁し、それにより、非腫瘍エキソソームを本質的に含まない腫瘍由来エキソソームの精製集団を提供するステップと
を含み得る。
【００２２】
より詳細には、これらの実施形態は、
（ａ）腫瘍由来エキソソームおよび非腫瘍エキソソームを含むエキソソームの混合集団を含有する生体液を得るステップと、
（ｂ）該生体液について第１の低速遠心分離を実施して、細胞、細胞デブリおよび大きな膜小胞を本質的に含まない清澄にした液を提供するステップと、
（ｃ）該清澄にした液を、選択的に沈殿した腫瘍由来エキソソームを含むが、沈殿した非腫瘍エキソソームを実質的に含まない混濁懸濁液を提供するのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液とともに、有効な時間、インキュベートするステップと、
（ｄ）該混濁懸濁液を低速遠心分離にかけて、腫瘍由来エキソソームを選択的に含む沈殿物、および上清を提供するステップと、
（ｅ）該腫瘍由来エキソソームを含む該沈殿物を収集するステップと、
（ｆ）該沈殿物を、ほぼ中性ｐＨの、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液に再懸濁し、それにより、腫瘍由来エキソソームを含み、非腫瘍エキソソームを本質的に含まない精製エキソソーム集団を提供するステップと、任意選択で、
（ｇ）該精製エキソソーム集団をさらなる遠心分離にかけて、非エキソソーム成分を含むペレットを提供し、該ペレットを除去し、それにより、非腫瘍エキソソームおよび非エキソソーム成分の両方を実質的に含まない腫瘍由来エキソソームの本質的に純粋な組成物を提供するステップと
を含み得る。
【００２３】
本発明は、細胞外微小小胞体の混合集団を含有する生体液から疾患関連細胞外微小小胞体を効果的に分離するので、本発明は、正常細胞外微小小胞体を含有する血清の存在下で培養した罹患細胞または腫瘍細胞の上清から疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を得る方法をさらに提供し、好ましくは該疾患関連または腫瘍由来細胞外微小小胞体は、それらの表面上に負に荷電したホスファチジルセリンを有する。これらの方法は、上記上清を、該上清から疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、該沈殿物を収集し、それにより、上記血清中の正常細胞外微小小胞体の実質的な混入なしで、該上清から疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を得るステップとを含む。特定の例は、マウス腫瘍細胞またはヒト腫瘍細胞をウシ血清またはウシ胎児血清の存在下で培養する場合である。
【００２４】
別の分離する実施形態は、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清（「枯渇血清」）を調製する方法であって、
（ａ）疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を含有する疑いがある血清を得るステップと、
（ｂ）該血清を、該血清から疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された、該疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を含有する沈殿物を該血清から除去し、それにより、疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清を提供するステップと
を含む方法である。
【００２５】
これらの方法は、ウイルス感染細胞に適用でき、感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を実質的に含まない血液、血清または血漿を調製する方法（輸血の前に実施することができるような）であって、
（ａ）感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を含有する疑いがある血液、血清または血漿を得るステップと、
（ｂ）該血液、血清または血漿を、感染性ウイルスを不活性化するかまたは沈殿させ、該血液、血清または血漿から細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された、該不活性化したかまたは沈殿したウイルスおよび該沈殿した細胞外微小小胞体を含有する沈殿物を該血液、血清または血漿から除去し、それにより、感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を実質的に含まない血液、血清または血漿を提供するステップと
を含む方法を含む。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明は、清澄にした生体液中の、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する、疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を検出する方法を提供する。これらの方法は、上記清澄にした生体液を、該清澄にした生体液から疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、結果として生じた生体液中の視覚的に検出することができる濁りの存在を決定するステップであって、結果として生じた生体液中の濁りの存在が疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体の検出を示すステップとを含む。
【００２７】
他の実施形態では、本発明は、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体の存在によって特徴付けられる、がんなどの少なくとも第１の疾患を有する動物または患者を診断する方法を提供する。これらの方法は、上記患者からの生体液中の上記疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体の存在を検出し、それにより、該患者をがんなどの上記第１の疾患を有すると診断するステップを含む。好ましくは、該疾患関連または腫瘍由来細胞外微小小胞体は、
（ａ）該生体液を、該生体液から該疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）結果として生じた生体液中の沈殿物の存在を決定するステップであって、該結果として生じた生体液中の沈殿物の存在が該疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体の検出を示すステップと
を含む方法であって、
（ｃ）任意選択で、第１のそのような疾患を同定または第２のそのような疾患と鑑別すべきである場合、例えば、がんを同定またはウイルス感染症と鑑別すべきである場合、がんのさらなるおよび／または独立したバイオマーカーまたは臨床徴候などの、該第１の疾患のさらなるおよび／または独立したバイオマーカーまたは臨床徴候について試験することにより該第１の疾患の存在が確認される、方法により検出される。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、がん患者の腫瘍負荷をモニターするためなどの、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体の量によって特徴付けられる第１の疾患を有する患者の疾患負荷をモニターする方法である。これらの方法は、上記患者からの生体液中の上記疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体の量を測定するステップを含み、該疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体の量は、
（ａ）該生体液を、該生体液から該疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）該沈殿物中の該疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体の量を測定するステップと
を含む方法により測定する。
【００２９】
例えば、がん患者の腫瘍負荷をモニターする方法は、
（ａ）複数の時点に該患者から一連の生体液試料を得るステップと、
（ｂ）
（ｉ）該一連の生体液試料を、該一連の生体液試料から腫瘍由来細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｉｉ）該沈殿物中の腫瘍由来細胞外微小小胞体の量を測定するステップであって、腫瘍由来細胞外微小小胞体の量の増加が腫瘍負荷の増加を示し、該腫瘍由来細胞外微小小胞体の量の減少が腫瘍負荷の減少を示すステップ、
とを含む方法により該一連の生体液試料中の腫瘍由来細胞外微小小胞体の量を測定するステップと
を含む。
【００３０】
さらなる実施形態では、本発明は、生体液から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を沈殿させることによる診断に使用するのに有効なｐＨおよび濃度を有する酢酸緩衝液および酢酸緩衝液の組成物を提供する。本発明はまた、生体液から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を沈殿させることによる治療に使用するのに有効なｐＨおよび濃度を有する酢酸緩衝液および酢酸緩衝液の組成物を提供する。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、生体液から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する、疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を単離するためのキットである。そのようなキットは、生体液から上記疾患関連、好ましくは腫瘍由来細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液を含み、好ましくは使用のための指示をさらに含む。そのようなキットは、疾患関連細胞外微小小胞体、好ましくはエキソソームにおける１つもしくは複数のバイオマーカーを同定もしくは定量するのに使用する、かつ／または特定の疾患を同定するためのもしくは疾患を鑑別するための１つもしくは複数のさらなるおよび／もしくは独立したバイオマーカーを同定もしくは定量するのに使用する、少なくとも第１の試薬もさらに含み得る。
【００３２】
本発明のすべての方法、組成物およびキットにおいて、酢酸緩衝液は、生体液から上記疾患関連、好ましくは腫瘍由来の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度である。これらは、約４．２５と約５．２５の間のｐＨを有する、より好ましくは、約４．５と約５．０の間のｐＨを有する、最も好ましくは、約４．７５のｐＨを有する酢酸緩衝液、および約０．０５Ｍと約０．２５Ｍの間の、より好ましくは、約０．０５Ｍと約０．１Ｍの間の生体液の試料中の最終濃度を有する酢酸緩衝液を含む。
【００３３】
酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムの両方、ならびにそれらの混合物を含む酢酸緩衝液が有効である。ある特定の実施形態では、上記酢酸緩衝液は、ポリエチレングリコールなどの、体積排除ポリマー（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ）を本質的に含まない。例としての好ましい実施形態は、約４．７５のｐＨおよび約０．１Ｍの試料中最終濃度を有する酢酸ナトリウム緩衝液である。
【００３４】
以下の図面は、本明細書の一部を構成するものであり、本発明のある特定の態様をさらに示すために含める。本発明は、本明細書に示す特定の実施形態の詳細な記載と一緒にこれらの図面の１つまたは複数を参照することによってより十分に理解することができる。米国特許または出願ファイルは、彩色を施して作成された少なくとも１つの図面を含む。彩色図面（複数可）を付したこの米国特許または特許出願公開の写しは、請求および所要の手数料の納付により特許商標庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】腫瘍エキソソーム単離の塩およびｐＨ依存性。図１Ａおよび図１Ｂ、あらかじめ澄明にしたＫ１７３５上清の４．５ｍＬのアリコートを１／１０容（０．５ｍＬ）の１０倍濃縮緩衝溶液と、表示したように混合した（黒丸、０．５Ｍ；白丸、０．３６７Ｍ；黒四角、０．２３３Ｍ；白四角、０．１Ｍ；＋、０．０５Ｍ）。懸濁液を氷上で６０分間インキュベートし、５，０００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、ペレットを可溶化し、それらの最初の体積に戻し、タンパク質をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイにより評価した。
【図１Ｂ】腫瘍エキソソーム単離の塩およびｐＨ依存性。図１Ａおよび図１Ｂ、あらかじめ澄明にしたＫ１７３５上清の４．５ｍＬのアリコートを１／１０容（０．５ｍＬ）の１０倍濃縮緩衝溶液と、表示したように混合した（黒丸、０．５Ｍ；白丸、０．３６７Ｍ；黒四角、０．２３３Ｍ；白四角、０．１Ｍ；＋、０．０５Ｍ）。懸濁液を氷上で６０分間インキュベートし、５，０００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、ペレットを可溶化し、それらの最初の体積に戻し、タンパク質をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイにより評価した。
【図１Ｃ】腫瘍エキソソーム単離の塩およびｐＨ依存性。図１Ｃ、Ｋ１７３５上清（右）またはＣＥＬＬｉｎｅフラスコの上部チャンバーから採取した対照培地（左）を１／１０容の１．０Ｍ酢酸塩ｐＨ４．７５と混合し、５分間の氷上インキュベーションの後に写真撮影した。
【図２Ａ】腫瘍エキソソーム単離の温度依存性。図２Ａ、０．１ｍＬの１Ｍ酢酸Ｎａを０．９ｍＬのあらかじめ澄明にしたＫ１７３５上清と急速に混合し、同時に濁度をモニターしながら、表示した温度（黒四角、０℃；白丸、２０℃；黒丸、３７℃）でインキュベートした。矢印は、０℃および３７℃でインキュベートした試料をそれぞれ３７℃および０℃に移行させた時を示す。
【図２Ｂ】腫瘍エキソソーム単離の温度依存性。図２Ｂ、酢酸塩／エキソソーム混合物を図２Ａと同様に調製した。ＯＤの測定のためにアリコートを２倍に希釈し、残りの懸濁液を５，０００ｇで１０分間遠心分離した。沈殿したタンパク質をブラッドフォードアッセイにより定量した。
【図３Ａ】細胞上清および使用済み培地からの腫瘍エキソソームの分別単離（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）。ＣＥＬＬｉｎｅフラスコ下部（黒丸、細胞）および上部（白丸、培地）チャンバーからのアリコートをあらかじめ澄明にし、１／１０容の表示したｐＨの１．０Ｍ酢酸塩と混合した。１時間の氷上インキュベーションの後、濁度（図３Ａ）を６００ｎｍで評価し、再可溶化して遠心分離した（５，０００ｇ；１０分）ペレット中のタンパク質（図３Ｂ）を評価した。
【図３Ｂ】細胞上清および使用済み培地からの腫瘍エキソソームの分別単離（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）。ＣＥＬＬｉｎｅフラスコ下部（黒丸、細胞）および上部（白丸、培地）チャンバーからのアリコートをあらかじめ澄明にし、１／１０容の表示したｐＨの１．０Ｍ酢酸塩と混合した。１時間の氷上インキュベーションの後、濁度（図３Ａ）を６００ｎｍで評価し、再可溶化して遠心分離した（５，０００ｇ；１０分）ペレット中のタンパク質（図３Ｂ）を評価した。
【図４Ａ】酢酸塩は腫瘍エキソソームを沈殿させる。図４Ａ、沈殿は、酢酸塩に起因するものであって、ｐＨに起因するのではない。澄明にした組織培養上清を１／１０容の、表示した緩衝液（グリシンＨＣｌ、クエン酸塩、酢酸塩および対照）の１．０Ｍ溶液と４℃で１時間混合した。次いで懸濁液を５，０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を収集し、１００，０００ｇで１時間遠心分離し、ペレット中のタンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイにより決定した。
【図４Ｂ】酢酸塩は腫瘍エキソソームを沈殿させる。図４Ｂ、沈殿は、酢酸塩に起因するものであって、対イオンに起因するのではない。４Ｔ１乳癌細胞からの組織培養上清（下部、チューブ２および４）または培地（上部、チューブ１および３）を１／１０容の約ｐＨ４．７５の１０倍酢酸ナトリウム（チューブ１および２）または１０倍酢酸カリウム（チューブ３および４）と別個に混合し、３０分間放置した。
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂ。酢酸塩対１００，０００ｇ超遠心分離により単離された腫瘍エキソソームの収率の比較。５０ｍＬのあらかじめ澄明にした細胞上清を１００，０００ｇで１時間または酢酸塩とともに６０分間インキュベートした後５，０００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットをＨＢＳに再懸濁した。ａｌｉｘ抗体で染色したエキソソームのフロー解析（図５Ａ；アイソタイプ対照、黒（左）線；１００，０００ｇ、赤（中央）線；酢酸塩、青（右）線）およびアネキシン５で染色したエキソソームのフロー解析（図５Ｂ；Ｃａ２＋無、黒（最も左）線；１００，０００ｇ、赤線；酢酸塩、青線）を示す（赤線の曲線が青線の曲線の左右に広がっている）。
【図５Ｂ】図５Ａおよび図５Ｂ。酢酸塩対１００，０００ｇ超遠心分離により単離された腫瘍エキソソームの収率の比較。５０ｍＬのあらかじめ澄明にした細胞上清を１００，０００ｇで１時間または酢酸塩とともに６０分間インキュベートした後５，０００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットをＨＢＳに再懸濁した。ａｌｉｘ抗体で染色したエキソソームのフロー解析（図５Ａ；アイソタイプ対照、黒（左）線；１００，０００ｇ、赤（中央）線；酢酸塩、青（右）線）およびアネキシン５で染色したエキソソームのフロー解析（図５Ｂ；Ｃａ２＋無、黒（最も左）線；１００，０００ｇ、赤線；酢酸塩、青線）を示す（赤線の曲線が青線の曲線の左右に広がっている）。
【図６】図６は、腫瘍エキソソームの特徴付けを示す写真である。１００，０００ｇ超遠心分離によりまたは酢酸塩を用いて精製した逆染色黒色腫由来エキソソームを透過型電子顕微鏡法により視覚化した。
【図７Ａ】正常エキソソームおよび腫瘍エキソソームにおけるＰＳの膜分布。図７Ａ、同じ患者から得られた正常中皮細胞および卵巣癌細胞に由来するエキソソームをＦＩＴＣ−アネキシンＶラテックスビーズに結合させ、ＦＡＣＳ解析にかけた。赤線（左）、正常中皮細胞由来エキソソーム；青線（右）、卵巣癌由来エキソソーム。
【図７Ｂ】正常エキソソームおよび腫瘍エキソソームにおけるＰＳの膜分布。図７Ｂ、４Ｔ１乳癌細胞に由来するエキソソームは、陰性対照としてのＢＳＡ（赤線、左）と比較して、ＰＳ陽性（青線、右）である。
【図７Ｃ】正常エキソソームおよび腫瘍エキソソームにおけるＰＳの膜分布。図７Ｃ、Ｂ１６黒色腫に由来するエキソソームは、陰性対照としてのＢＳＡ（赤線、左）と比較して、ＰＳ陽性（青線、右）である。
【図８】酢酸緩衝液が純粋リン脂質リポソームを沈殿させない。ホスファチジルセリン（ＰＣ）またはＰＣ／ＰＳ混合物（２対１の比）から作製した蛍光標識リポソームの調製物を５，０００ｇで５分間遠心分離して、任意の大きい沈殿性リポソームを除去した。上清を除去し、各調製物の０．４ｍＬを２つのチューブに等分して入れた。０．５ｍＬのＰＢＳを各チューブに加えた後、それぞれ０．１ｍＬのＰＢＳまたは酢酸緩衝液（１．０Ｍ；ｐＨ５．７）を加えた。チューブを混合し、氷上で１時間インキュベートし、ボルテックスし、０．１ｍＬのアリコートを取り出して、総蛍光を決定した。次いで、各チューブを５，０００ｇで５分間遠心分離し、上清から０．１ｍＬのアリコートを取り出して、残留（非沈殿）蛍光を決定した。
【図９Ａ】エキソソームの混合物からのＰＳ陽性エキソソームの選択的単離。図９Ａ、出発材料の特徴付け。左パネル、陽性および陰性対照：アルデヒドで活性化したラテックスビーズに共有結合させたアネキシン５（黒（右）線）およびＢＳＡでブロッキングしたラテックスビーズ（赤（左）線）。右パネル、アルデヒドで活性化したラテックスビーズに結合させ、１ｍＭ  Ｃａ２＋の存在下でＦＩＴＣ−アネキシン５で標識したエキソソーム：４Ｔ１乳癌細胞からのＰＳ陽性エキソソーム（黒（右）線）および対応する細胞からのＰＳ陰性エキソソーム（赤（左）線）。
【図９Ｂ】エキソソームの混合物からのＰＳ陽性エキソソームの選択的単離。図９Ｂ、エキソソーム集団および混合物のＦＡＣＳ解析。赤色蛍光（Ｎ−Ｒｈｏ−ＰＥ）標識ＰＳ陰性エキソソームおよび緑色蛍光（Ｎ−ＮＢＤ−ＰＥ）標識ＰＳ陽性エキソソームをアルデヒドで活性化したラテックスビーズに結合させ、ＦＡＣＳにより解析した。上部横列、酢酸塩による沈殿にかけていないエキソソーム（対照）；下部横列、可溶化した、酢酸塩で沈殿させたエキソソーム（酢酸塩）。左縦列、ＰＳ陰性エキソソーム集団（Ｒｈｏ  ＰＳ−ｖｅ）；中央縦列、ＰＳ陽性エキソソーム集団（ＮＢＤ  ＰＳ＋ｖｅ）；右縦列、ＰＳ陽性およびＰＳ陰性エキソソームの等量の混合物（Ｒｈｏ  ＰＳ−ｖｅ  ＮＢＤ  ＰＳ＋ｖｅ）。
【図１０Ａ−Ｃ】図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃ。ウイルス感染細胞およびウイルス培養物からのエキソソームなどの細胞外微小小胞体の単離。ベロ細胞の別個の集団を偽感染させ（陰性対照；図１０Ａ）またはＳＶ４０ウイルス（図１０Ｂ）もしくはＨＳＶ−１ウイルス（図１０Ｃ）に感染させた。偽、ＳＶ４０またはＨＳＶ−１感染体を採取し、１／１０容の１．０Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７５と混合することによって酢酸塩による沈殿にかけた。酢酸塩による沈殿後の遠心管を示す。偽感染体（図１０Ａ）と対照的に、ＳＶ４０感染体（図１０Ｂ）およびＨＳＶ−１感染体（図１０Ｃ）からの明らかに目に見えるペレットが存在する。
【図１１Ａ】ウイルス感染細胞から単離した細胞外微小小胞体およびエキソソームのＦＡＣＳ解析。ベロ細胞の別個の集団を偽感染させ（ベロ、陰性対照）またはＳＶ４０（ＳＶ４０）もしくはＨＳＶ−１ウイルスに感染させ、採取し、酢酸塩による沈殿にかけ、ペレットを再懸濁した。ＨＳＶ−１感染体からの再懸濁ペレットをＦｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配分離にかけ、２つの画分（ＨＳＶ  Ｆ５およびＨＳＶ  Ｆ１５）を得た。偽（ベロ）、ＳＶ４０ならびにＨＳＶ  Ｆ５およびＨＳＶ  Ｆ１５材料からの試料をラテックスビーズに結合させ、ＦＡＣＳにより解析してＳＶ４０またはＨＳＶ−１に対して特異的なウイルス抗原（図１１Ａ）；エキソソームのマーカーであるＣＤ６３（図１１Ｂ）；アネキシンＶにより検出されるＰＳを検出した。結果は、偽感染体（ベロ）と比較して示す。
【図１１Ｂ】ウイルス感染細胞から単離した細胞外微小小胞体およびエキソソームのＦＡＣＳ解析。ベロ細胞の別個の集団を偽感染させ（ベロ、陰性対照）またはＳＶ４０（ＳＶ４０）もしくはＨＳＶ−１ウイルスに感染させ、採取し、酢酸塩による沈殿にかけ、ペレットを再懸濁した。ＨＳＶ−１感染体からの再懸濁ペレットをＦｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配分離にかけ、２つの画分（ＨＳＶ  Ｆ５およびＨＳＶ  Ｆ１５）を得た。偽（ベロ）、ＳＶ４０ならびにＨＳＶ  Ｆ５およびＨＳＶ  Ｆ１５材料からの試料をラテックスビーズに結合させ、ＦＡＣＳにより解析してＳＶ４０またはＨＳＶ−１に対して特異的なウイルス抗原（図１１Ａ）；エキソソームのマーカーであるＣＤ６３（図１１Ｂ）；アネキシンＶにより検出されるＰＳを検出した。結果は、偽感染体（ベロ）と比較して示す。
【図１１Ｃ】ウイルス感染細胞から単離した細胞外微小小胞体およびエキソソームのＦＡＣＳ解析。ベロ細胞の別個の集団を偽感染させ（ベロ、陰性対照）またはＳＶ４０（ＳＶ４０）もしくはＨＳＶ−１ウイルスに感染させ、採取し、酢酸塩による沈殿にかけ、ペレットを再懸濁した。ＨＳＶ−１感染体からの再懸濁ペレットをＦｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配分離にかけ、２つの画分（ＨＳＶ  Ｆ５およびＨＳＶ  Ｆ１５）を得た。偽（ベロ）、ＳＶ４０ならびにＨＳＶ  Ｆ５およびＨＳＶ  Ｆ１５材料からの試料をラテックスビーズに結合させ、ＦＡＣＳにより解析してＳＶ４０またはＨＳＶ−１に対して特異的なウイルス抗原（図１１Ａ）；エキソソームのマーカーであるＣＤ６３（図１１Ｂ）；アネキシンＶにより検出されるＰＳを検出した。結果は、偽感染体（ベロ）と比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の実施形態の詳細な説明
エキソソームなどの細胞外微小小胞体に関連する研究および刊行物の件数の指数関数的な増加が過去１０年間に認められた。これらの研究は、それらの単離のための方法からがん診断におけるある特定の細胞外微小小胞体、とりわけエキソソームの実用性および免疫応答を媒介するそれらの能力にまで及んでいる。細胞外微小小胞体の放出は、原核生物および真核生物の両方において起こり、広範囲の生理学的および病理学的過程において重要である。
【００３７】
Ａ．  細胞外微小小胞体
細胞外微小小胞体は、エキソソーム、エキソソーム様小胞、エクトソーム（原形質膜からの直接的な小胞の出芽に起因する）、ミクロ粒子、微小小胞体、排出微小小胞体（ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）（ＳＭＶ）、ナノ粒子およびさらには（大きい）アポトーシスブレブもしくは小体（細胞死に起因する）または膜粒子を含む、一群としての細胞由来および細胞分泌微小小胞体である。その理由は、そのような用語は、当分野で同義で使用されているからである（Ｇｙｏｅｒｇｙら、２０１１年；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＆  Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ、２０１２年）。
【００３８】
「細胞外微小小胞体」は、本明細書で使用する場合、細胞外微小小胞体が得られた試料源に基づく用語を含む、過去に命名に使用された用語法によって言及される細胞外微小小胞体を含む。特に腫瘍由来エキソソームに適用するとき、テキソソーム（ｔｅｘ）およびオンコソームという用語が使用され、プロスタソームと称する前立腺がん細胞由来エキソソームなどの、特定の種類のがん細胞を反映する用語に加えて、本明細書に含める。さらに、樹状細胞から単離されたエキソソームは、デキソソーム（ｄｅｘ）と称し、エピディディモソーム、アルゴソーム、プロミニノソーム（ｐｒｏｍｉｎｉｎｏｓｏｍｅ）、プロスタソームおよびアーケオソーム（ａｒｃｈｅｏｓｏｍｅ）などの他の命名法も使用された（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＆  Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ、２０１２年）。
【００３９】
上記の実体のそれぞれ、ならびにその混合物および不純調製物は、「細胞外微小小胞体」という用語の範囲内に含まれる。実際に、細胞および組織の細胞外環境は、同時に存在する異なる種類の細胞外微小小胞体を含むので、細胞外微小小胞体の混合物は、本発明の重要な部分である。それにもかかわらず、特定の種類の細胞外微小小胞体を他の種類の細胞外微小小胞体と異なるものとして同定するための様々な技術およびマーカーが存在するので、本発明は、したがって特定の種類の細胞外微小小胞体の実質的に純粋な調製物を包含する。
【００４０】
古い用語法が本明細書に含まれているが、それでもなお全体的な合意により改善された、ますます標準化されつつある命名法を使用して「細胞外微小小胞体」を定義することが好ましい。細胞外微小小胞体の命名は、膜小胞が細胞外微小環境内に放出される次の３つの公知の機構を考慮することが好ましい：「エキソソーム」をもたらす、多小胞体の細胞外融合；「エクトソーム」をもたらす、原形質膜からの直接的な小胞の出芽；および「アポトーシスブレブ」をもたらす、細胞死。
【００４１】
最近、細胞外微小小胞体は、それら自体ともに「ＭＶ」および「エキソソーム」と称する、微小小胞体またはミクロ粒子という２つの主要な種類を有すると記載された。微小小胞体、ミクロ粒子またはＭＶは、活性化誘導微小小胞体もしくはミクロ粒子またはアポトーシス誘導微小小胞体もしくはミクロ粒子としばしば記載されている。第３の種類の細胞外微小小胞体は、アポトーシスブレブ、アポトーシス小体および関連する実体である。
【００４２】
細胞外微小小胞体の生物発生により、以下でより詳細に記載するように、「エキソソーム」は、微小小胞体／ＭＶおよびアポトーシス小体と本質的に区別される。Gyoergyら、２０１１年の表１も参照のこと。
【００４３】
「ミクロ粒子」という用語は、細胞外微小小胞体の分野で使用する場合、本明細書にも包含されるが、用語法としてさほど好ましくない。その理由は、「粒子」は、小胞性構造よりむしろ、固体の粒子状構造を示唆するからである。したがって、「微小小胞体」という名称が膜限定構造を示す際に好ましい。それにもかかわらず、内皮細胞由来ミクロ粒子および血小板由来ミクロ粒子は、細胞外微小小胞体という用語の範囲内に集合的に入るすべての微小小胞体、小胞性構造および膜小胞と同様に、本明細書に含まれる、「内皮ミクロ粒子（ＥＭＰ）」および「血小板ミクロ粒子（ＰＭＰ）」と記載された。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「微小小胞体」および「ＭＶ」という用語は、一般的に、直径が約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、または血漿中約１００ｎｍ〜約４００ｎｍであるリン脂質二重層により囲まれたより大きい細胞外膜小胞または構造を意味する。微小小胞体／ＭＶは、原形質膜の出芽またはブレビングによる制御放出により形成される。
【００４５】
細胞外微小小胞体の群内では、重要な成分は、好ましくは直径が約４０〜５０ｎｍと約１００ｎｍの間にあり、膜小胞、すなわち、多小胞体（ＭＶＢ）の細胞外融合、または「エキソサイトーシス」に起因する、エンドサイトーシス起源のリン脂質二重層により囲まれた小胞であると記載されている、「エキソソーム」自体である（Ｇｙｏｅｒｇｙら、２０１１年；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＆  Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ、２０１２年）。「小胞形成」および「トロゴサイトーシス」もさほど一般的でないが、含められる用語である。
【００４６】
記載したように、細胞外微小小胞体の生物発生により、「エキソソーム」は、ＭＶおよびアポトーシス小体と本質的に区別される。エキソソームは、構成的にかつ誘導により、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞により能動的に分泌され、特に、エンドソーム膜から腔（lumen）への内方出芽（「陥入」）および芽の切断により、後期エンドソームから発生し、内腔小胞を含有するＭＶＢを形成する。エキソソームは、ＭＶＢと原形質膜との融合により細胞外空間に放出される（例えば、Ｓｉｍｏｎｓ  ＆  Ｒａｐｏｓｏ、２００９年の図２；およびＳｃｈｏｒｅｙ  ＆  Ｂｈａｔｎａｇａｒ、２００８年の図１を参照）。エキソソームが細胞の原形質膜に由来し、エンドソーム膜の陥入により形成されるので、分泌されたエキソソームは、細胞質ゾル由来の水性腔を封入している原形質膜およびエンドソームまたはエンドソームタンパク質を有する。
【００４７】
エキソソームは、親細胞の特性を反映している広範囲の細胞質ゾルおよび膜成分を組み込んでいる。例えば、エキソソームの腔は、新生物の検出および特定の腫瘍型の同定について解読することができる疾患のデータシグネチャーを表すＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む、細胞の細胞質ゾルから取り込まれた様々な成分を含有する（Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ、２００８年；Ｔａｙｌｏｒら、２０１１年；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｓら、２００９年；Ｓｋｏｇら、２００８年）。エキソソーム膜は、クラスＩおよびＩＩ  ＭＨＣ（Ｉｅｒoら、２００８年）、Ｔｈ１媒介免疫応答を上方制御する熱ショックタンパク質７０、Ｈｓｐ７０（Ｃｈｏら、２００９年）、および腫瘍由来エキソソームの場合には、親細胞の原形質膜からの腫瘍抗原を含む多くの細胞表面成分を含有する。これらの知見から、腫瘍エキソソームをがんの処置のための免疫療法剤として使用することができることが示唆される。実際、最近の臨床試験で、腫瘍エキソソームによる「免疫処置」は、最小限の副作用を有し、耐容性が良好であり、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き起こすことが示された（Ｅｓｃｕｄｉｅｒら、２００５年；Ｄａｉら、２００８年）。
【００４８】
エキソソーム表面膜は、それらの親細胞の原形質膜を反映しているので、罹患細胞または異常細胞からのエキソソームは、正常細胞からのエキソソームとは対照的に、それらの表面上にホスファチジルセリン（ＰＳ）を有することによって特徴付けられる。したがって、本発明は、露出したＰＳを表面上に有する疾患関連エキソソーム、好ましくはそれらの表面上に露出したＰＳが、非脂質膜成分と、結合してかつ／もしくは近接して、または活動性に結合してかつ／もしくは密に近接して、好ましくは膜タンパク質と、結合してかつ／もしくは近接して、または活動性に結合してかつ／もしくは密に近接して存在する疾患関連エキソソームを単離するのに有利に使用することができる。以下で詳細に記載するように、そのような疾患関連エキソソームは、宿主細胞にＰＳを外在化させる、ウイルスまたは細胞内寄生生物に感染した細胞からのものを含み、有意な量のＰＳを表面上に一般的に含有する、好ましくは腫瘍由来エキソソームである。
【００４９】
エキソソームと共通の起源を有する、「エキソソーム様小胞」は、一般的にそれらをエキソソームと区別するサイズおよび沈降特性を有すると、また特に、脂質ラフト微小ドメインを欠くと記載されている。
【００５０】
「エクトソーム」は、本明細書で使用する場合、一般的に好中球由来のまたは単球由来の微小小胞体である。
【００５１】
「膜粒子」（ＭＰ）は、本明細書で使用する場合、一般的に直径が約５０〜８０ｎｍであり、原形質膜に由来する。「細胞外膜構造」も例えば、壊死性死による線状または折りたたまれた膜断片、ならびに分泌リソソームおよびナノチューブを含む、他の細胞源からの膜構造を含む。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「アポトーシスブレブまたはアポトーシス小体」は、一般的に直径が１〜５μｍであり、アポトーシスを受ける細胞、すなわち、罹患した、不要なおよび／または異常な細胞のブレブとして放出される。それらは、ＰＳの外在化によって特徴付けられ、断片化ＤＮＡを含有し得る。
【００５３】
Ｂ．  精製技術および酢酸塩による沈殿の利点
広範な研究にもかかわらず、細胞外微小小胞体に対する急速に出現しつつある研究の分野は、依然として技術的に困難であることは、文献で広く受け入れられている。例えば、Gyoergyら、２０１１年は、細胞外微小小胞体の調製および測定に関連する主要な課題および問題および落とし穴について、そのような物質の単離に関連する困難を含めて、レビューしている。
【００５４】
エキソソームなどの細胞外微小小胞体の精製のための最初に記載され、最も広く使用される方法は、細胞および細胞デブリを除去する段階的遠心分離ステップと、それに続く、細胞外微小小胞体およびエキソソームをペレット化するための１００，０００ｇでの超遠心分離ステップを含む（Ｔｈｅｒｙら、２００６年）。他の技術は、規定の孔径の膜を介する濾過（Ｇｒａｎｔら、２０１１年）、ＰＥＧ（例えば、米国特許第８，９０１，２８４号およびＵＳ２０１３／０３３７４４０Ａ１）を含む、ポリマーベースの沈殿（Ｔａｙｌｏｒら、２０１１年）、およびＥＬＩＳＡプレート（Ｌｏｇｏｚｚｉら、２００９年）または抗体被覆ビーズ（Ｃｌａｙｔｏｎら、２００１年）上の捕捉を含む。ＨＥＲ２／ｎｅｕなどの腫瘍特異的タンパク質（Ｋｏｇａら、２００５年）、または他のエキソソーム表面マーカー（例えば、Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ（商標）キット）に対する抗体で被覆した磁気ビーズを使用して腫瘍由来エキソソームを精製するための高度に特殊な方法およびキットが利用可能である。
【００５５】
それらの方法のほとんどが原理的には大きな体積の材料に適応することができるが、それらは、骨の折れるものであり、非常に時間がかかり、特殊な実験装置を必要とするため、実際には制約がある。大多数の研究で大きな体積の組織培養上清からのエキソソームの単離が必要であるので、研究のために十分な濃度を得るために必要な体積の著しい減少は、すべての現在の技術における制約である。
【００５６】
したがって、本発明者らは、培養上清および生体液から、エキソソーム、とりわけ疾患関連および腫瘍由来エキソソームなどの細胞外微小小胞体の精製または単離のための新規な方法の調査に努めた。本発明者らは、酢酸緩衝液の驚くべき使用に基づく新規かつ有利な技術を開発した（実施例Ｉおよび実施例ＩＩ）。以前の方法と対照的に、本発明は、超遠心分離により得られるものと区別がつかないエキソソームが得られる迅速かつ効率のよい単離手順を提供する。重要なことに、新規な方法は、非常に大きな体積の材料に容易に適応し、エキソソームなどの細胞外微小小胞体の精製は、特殊な装置を用いずに、最低限の費用で達成することができる。
【００５７】
細胞外微小小胞体は、原核生物および真核生物の両方に、またすべての進化にわたって存在する（Ｇｙｏｅｒｇｙら、２０１１年）ので、本発明は、原核生物、真核生物、細菌、真菌、酵母、無脊椎動物、脊椎動物、爬虫類、魚、昆虫、植物またはげっ歯類および霊長類などの哺乳動物を含む動物からの任意の生体液での使用が可能である。例えば、生体液は、ニワトリ血清、マウス血清、ラット血清、ウサギ血清、ヤギ血清、ラム血清、ヒツジ血清、ウマ血清、ブタ血清、ウシ血清（ウシ胎児血清）およびヒト血清であり得る。生体液の好ましい例は、マウス、ウシまたはヒトのエキソソームなどの細胞外微小小胞体を調製するためにそれぞれ使用されるマウス、ウシまたはヒト生体液である。
【００５８】
適切な生体液（または生物流体（biofluid））の例は、細胞培養上清、全血、血清、血漿、腹水、脳および脳脊髄液、骨髄吸引液、気管支肺胞洗浄液、尿、精液、膣液、粘液、唾液、痰、および生体組織試料からの、清澄にした溶解物である。乳汁、涙液、汗、関節液または滑液、羊水、濾胞液、および糞便または糞便液（ｆａｅｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）も使用することができる。生体液は、新鮮なものであっても、または事前に凍結し、その後解凍したものであってもよい。
【００５９】
本発明での使用に好ましい生体液は、細胞培養上清、血清、血漿および腹水である。細胞培養上清およびならし培地のために、感作細胞を含む、細胞または細胞の集団は、細胞によるエキソソームなどの細胞外微小小胞体の放出および／または分泌を可能にする条件下で培養する。
【００６０】
ある特定の実施形態では、生体液は、既に低速遠心分離にかけたことを意味する、澄明にした細胞培養上清などの「澄明にした」生体液である。しかし、他の実施形態では、生体液を酢酸緩衝液と接触させる前に低速遠心分離にかけて、本発明の一部としての細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を除去することができる。
【００６１】
生体液は、以下でより詳細に記載するように、罹患細胞または組織から得ることができる。がんについては、固形腫瘍および癌を含む、任意の悪性腫瘍を使用することができ、例としての腫瘍は、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、子宮頚部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、甲状腺癌、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽腫などを含むが、それらに限定されない。そのような例から、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、前立腺がん、乳がんおよび卵巣がんからの試料が一般的に使用される。
【００６２】
生体液試料を酢酸緩衝液と接触させて、エキソソームなどの細胞外微小小胞体を含有する沈殿物を形成させた後、好ましくは低速遠心分離により、該沈殿物を収集する。所望の場合、エキソソームなどの細胞外微小小胞体の単離集団をさらに遠心分離して、任意の混入成分を除去し、それにより、エキソソームなどの細胞外微小小胞体の本質的に純粋な組成物を提供することができる。
【００６３】
単離された、エキソソームなどの細胞外微小小胞体は、好ましくは洗浄して残留培地を除去し、ほぼ中性ｐＨ、生理的ｐＨ（約ｐＨ７．３５〜７．４５などの）および／または約ｐＨ７．５もしくは７．６ほどなどの任意の標準的な実験室ｐＨの酢酸塩不含有緩衝液への再懸濁によりさらに好ましくは「再可溶化」する。
【００６４】
本発明の方法は、培養上清などの生体液からかなりの量のエキソソームなどの細胞外微小小胞体を有利に回収することができ、例えば、培養上清からエキソソームなどの細胞外微小小胞体の本質的にすべてを回収することまでを含めて、培養上清からエキソソームなどの細胞外微小小胞体の少なくとも約半分を回収することができる。
【００６５】
この簡単で、費用対効果の高い方法は、無制限の量の培養上清からのエキソソームなどの細胞外微小小胞体の収率を有意に増加させる。この技術によって単離されたエキソソームなどの細胞外微小小胞体は、直接的な超遠心分離によって回収されたものと区別することができないこと（実施例ＩＩＩ）、および実質的に抗原的に完全であること（例えば、実施例ＩＩＩおよび実施例ＸＩＩＩ）も示されている。種にわたる、エキソソーム、とりわけ腫瘍由来エキソソームなどの細胞外微小小胞体の共通の特徴を考慮すると、本発明は、寄託腫瘍細胞株（例えば、実施例ＩＶ）から、ならびにマウスおよび他のげっ歯類、ウシならびにヒト源に由来する細胞および体液（例えば、実施例Ｖで示すような）からなど、広範囲の供給源からの細胞および体液からエキソソームを単離するために使用することができる。
【００６６】
必要であると考えるわけではないが、実施例Ｉおよび実施例ＩＶのプロトコール、とりわけ実施例ＩＶにおけるＡＴＣＣ（登録商標）寄託腫瘍細胞株で使用されるプロトコールは、定量的参照例として含む、本発明と比較するための参照例として使用することができる。
【００６７】
エキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離するための酢酸緩衝液の本使用は、細胞外微小小胞体およびエキソソームの表面上、とりわけ腫瘍由来エキソソームなどの疾患関連エキソソーム（Ｋｅｌｌｅｒら、２００９年；Ｔａｙｌｏｒら、２０１１年；Ｇｒａｎｔら、２０１１年）上に存在する、負に荷電したリン脂質であるホスファチジルセリン（ＰＳ）に作用する「電荷中和」によって機能すると考えられる。本リポソーム試験（実施例ＶＩＩＩ）によって示されるように、脂質小胞単独は、それらの表面上にＰＳを有する場合でさえ、酢酸塩の同じ使用で沈殿しない。したがって、ＰＳは、必要であるが、小胞の単離のために十分でないこと、および本発明は、疾患関連の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体が、非脂質膜成分、とりわけ膜タンパク質と結合したＰＳを表面上に有するため、それらを単離するのに有効であることが考えられる。
【００６８】
細胞外微小小胞体、例えば、エキソソームの膜表面は、それらが由来する細胞の原形質膜を反映している。ＰＳが健常または正常細胞の内側に保持されているので、正常細胞に由来する細胞外微小小胞体は、ＰＳ陰性である。例えば、Ｃｏｎｎｏｒら（２０１０年）は、循環血小板由来細胞外微小小胞体の大部分がアネキシンＶと結合せず、したがって、ＰＳ陰性であることを報告した。対照的に、疾患および／または細胞活性化の様々な状態において、ＰＳは、細胞の外側に露出した状態になり、そのため罹患した、感染した、過度に活性化したまたは他の点で異常な細胞に由来するエキソソームなどの細胞外微小小胞体は、以下でより詳細に記載するようにＰＳ陽性である。
【００６９】
本発明を成功裏に実施するために、酢酸塩ベースのエキソソーム沈殿および単離に関与する詳細な機構を理解することは必要でない。それでもなお、以下の知見および洞察を提供する。エキソソームなどの細胞外微小小胞体は、溶液をＨＣｌまたはクエン酸で酸性化した場合に沈殿しなかったことから、機構は、等電点における沈殿に起因するようではない。興味深いことに、過去４０年間にわたる文献の調査で、本発明者らは、赤血球アポタンパク質の再結合により形成された小胞の沈殿（Ｚｗａａｌ  ＆  ｖａｎ  Ｄｅｅｎｅｎ、１９７０年）が負に荷電したホスファチジン酸またはＰＳの存在に依存したことに注目した。したがって、本発明者らは、エキソソームなどの細胞外微小小胞体の沈殿および単離に関与する原理的な機構は、凝集および付随する沈殿の増加をもたらす疎水性相互作用を促進する小胞およびエキソソーム水和層の、酢酸塩によって媒介される除去であると考えている。好ましいｐＨ範囲（４．２５〜５．２５、好ましくは４．５〜５．０、４．７５が最適である）の何れかの側における沈殿の減少は、水和層を増強する正または負表面電荷の増加に起因する可能性があり、それにより同じ程度の沈殿をもたらすために塩を減少させることを必要とする。
【００７０】
とりわけ酢酸緩衝液の驚くべき使用に加えて、エキソソームなどの細胞外微小小胞体、とりわけ形態学的に完全な細胞外微小小胞体およびエキソソームを効果的に単離するための約４と約６の間のｐＨ範囲の任意の緩衝液の使用は、エキソソームを完全に溶解するためのこのｐＨ範囲の緩衝液（米国特許第８，５３０，２２８号における溶解溶液１および２）の使用に関する文献における情報に反している。それにもかかわらず、本発明は、他の技術により調製されたエキソソームと区別できない、形態学的に完全な、エキソソームなどの細胞外微小小胞体の調製を提供する。
【００７１】
ａｌｉｘ抗体およびｈｓｐ７０抗体を用いたフローサイトメトリー、ＥＭ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによる酸性化した細胞外微小小胞体およびエキソソーム集団と超遠心分離した細胞外微小小胞体およびエキソソーム集団との比較により、両集団が互いに区別できなかったことが示された。Ｋ１７３５黒色腫細胞からの酢酸塩で沈殿させたエキソソーム集団におけるα２−マクログロブリン（約１６０ｋＤａにおけるバンド）の増加があったが、これは、本発明の限界ではない。第一に、異質なタンパク質の沈殿は、供給源細胞の種類に依存する可能性が最も高く、α２−マクログロブリンは、一部の黒色腫細胞および肉腫細胞により産生されることが公知である（Morgan、１９８４年；Bizikら、１９８６年）。実際、α２−マクログロブリンは、Ｂ１６黒色腫細胞またはＴＲＡＭＰ前立腺癌細胞に由来する細胞外微小小胞体およびエキソソームでは検出されなかった（実施例ＩＶ）。第二に、一部の異質なタンパク質の沈殿は、核酸ベースのエキソソーム診断アッセイに支障をきたさないが、それらの異質なタンパク質は、とにかく容易に除去することができ、これは、免疫療法での使用の前に行うことが好ましい。この場合、大きな体積の培養上清が酢酸塩により、操作可能な体積に減少すると、再可溶化した沈殿物の１００，０００ｇ遠心分離により、任意の混入タンパク質を容易に除去することができる。
【００７２】
予備的試験でも、酢酸緩衝液は、ヒト全血からエキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離するために使用することができることが示された（実施例ＶＩ）。既知量の精製腫瘍由来エキソソームをドープした（ｄｏｐｅｄ）全血を使用した場合、酢酸塩による沈殿により、凝固血清試料およびＥＧＴＡ−血漿からそれぞれ添加したエキソソームの約４０％および約１００％が回収された。回収されたタンパク質の量に差があり、これは、血漿試料中のフィブリノゲンの沈殿に起因すると考えられる。任意のそのようなフィブリノゲンは、例えば、５６℃で３分間のプレインキュベーションにより容易に除去することができる（Millarら、１９７１年；Marxら、２００８年）。実際、このステップにより、酢酸塩による沈殿試料中の異質なタンパク質のレベルが、エキソソームの本質的な損失を伴うことなく、血清試料で得られたものと同等のレベルまで低下した。上で考察したように、エキソソーム調製物中の一部の異質なタンパク質の存在は、トランスクリプトーム解析に対して何ら問題をもたらさないはずである。免疫原としてまたは他の治療に使用するために、体積が酢酸塩により、操作可能な体積に一旦減少すると、非エキソソームタンパク質は、超遠心分離によって容易に除去することができる。
【００７３】
本発明の重要な態様は、正常な細胞および体液からの細胞外微小小胞体およびエキソソームと対照的に、疾患関連の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体、とりわけウイルス由来ならびに腫瘍由来細胞外微小小胞体およびエキソソームを沈殿させることに関する特異性である（実施例ＶＩＩおよび実施例ＩＸ）。これは、実際的な実験室試験ならびに診断検査およびキットの両方について意義を有する。
【００７４】
本発明の特異性は、他の成分を「実質的に含まない」エキソソームなどの細胞外微小小胞体の特定の集団を調製する多くの実施形態をもたらす。例えば、例えば、正常細胞からの非疾患関連細胞外微小小胞体またはエキソソームを実質的に含まない疾患関連の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体；例えば、正常細胞からの非腫瘍由来細胞外微小小胞体またはエキソソームを実質的に含まない腫瘍由来の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体；例えば、正常細胞からの非ウイルス由来細胞外微小小胞体またはエキソソームを実質的に含まないウイルス由来の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体；疾患関連、腫瘍由来および／またはウイルス由来の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清などの体液；感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来するエキソソームなどの細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清などの体液；感染性ウイルスを実質的に含まない、ウイルス由来の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体；非疾患関連、非腫瘍由来および／または非ウイルス由来細胞外微小小胞体またはエキソソームを、ならびに非エキソソーム成分または混入物を実質的に含まない疾患関連、腫瘍由来および／またはウイルス由来の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体。
【００７５】
すべてのそのような状況では、他の列挙した成分（複数可）を「実質的に含まない」および「本質的に含まない」組成物は、そのような他の列挙した成分（複数可）の例えば、標準的な定量アッセイ、または好ましくは機能アッセイで測定したとき、他の列挙した成分（複数可）が、検出可能な影響がないことまでを含むそれ以下の、組成物に対する実質的な影響を本質的に有さないような、他の列挙した成分（複数可）を十分に含まない組成物を指すために使用される。すなわち、他の列挙した成分（複数可）は、組成物の活性成分の例えば、標準的な定量アッセイ、または好ましくは機能アッセイで測定したとき、組成物の機能に実質的に、もしくは測定できるほどに支障をきたさず、またはさもなければ、有害な反応、それにおける特性もしくは欠陥をもたらさない。
【００７６】
同様な意味は、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液、細胞を本質的に含まないおよびポリエチレングリコールなどの体積排除ポリマーを本質的に含まないという用語における「実質的に含まない」および「本質的に含まない」に与えられる。
【００７７】
例えば、実験室でのほとんどの細胞用の標準増殖培地は、ウシ血清またはウシ胎児血清などの動物血清を含むので、培地中の血清は、当該動物源からのエキソソームなどの、大量の細胞外微小小胞体を一般的に含有する。それらの培地由来細胞外微小小胞体およびエキソソームは、培養細胞により分泌された細胞外微小小胞体およびエキソソームを解析することを目的とする試験に支障をきたし得る。この問題に対処するための選択肢は、培地／血清からエキソソームを枯渇させる追加のステップを含めること、またはエキソソーム枯渇ウシ胎児血清（例えば、Ｅｘｏ−ＦＢＳ（商標））などの、エキソソーム枯渇増殖補充剤を購入し、使用することである。
【００７８】
しかし、本発明は、正常細胞に由来する細胞外微小小胞体およびエキソソーム（いわゆる「正常」細胞外微小小胞体および「正常」エキソソーム）から分離して腫瘍由来の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離する能力を提供するので、培養腫瘍細胞から腫瘍由来エキソソームなどの腫瘍由来細胞外微小小胞体を直接単離するために本発明を使用する場合、そのような骨のおれ、かつ／または費用のかかる手順はもはや必要ではない。
【００７９】
さらに、本発明により提供する、正常細胞外微小小胞体およびエキソソームから腫瘍由来エキソソームなどの腫瘍由来細胞外微小小胞体を分離する能力は、腫瘍由来細胞外微小小胞体およびエキソソームの存在についてヒト患者からの体液を検査するためのものを含む、診断検査およびキットに対する重要性を有する。この点に関しては、腫瘍由来エキソソームなどの腫瘍由来細胞外微小小胞体を沈殿させる簡単な検査は、診察で通常得られる血液試料について実施される一連の検査に追加することができる。そのような検査における最初の陽性は、とりわけＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質バイオマーカーなどの、バイオマーカーについて検査するための沈殿した、腫瘍由来エキソソームなどの腫瘍由来細胞外微小小胞体のさらなる解析、ならびに患者のさらなる臨床評価により追跡されることとなる。
【００８０】
単離された、腫瘍由来エキソソームなどの細胞外微小小胞体をさらに解析するために、例えば、Gyoergyら、２０１１年に記載されているように、広範囲のバイオマーカーが公知であり、それらのいずれか１つまたは複数を本発明の一部として評価することができる。例として、エキソソームのバイオマーカーは、Ａｌｉｘおよびｈｓｐ７０、ＣＤ６３およびカベオリン−１（Logozziら、２００９年）、ＣＤ８１およびＣＤ８２を含む。解析するバイオマーカーは、腫瘍マーカーまたはウイルスマーカーなどの非エキソソーム性であり得る。バイオマーカーは、電気泳動分離、免疫単離、クロマトグラフィーまたはそれらの組合せなどの、いずれかの手段により単離し、ＭＡＬＤＩ  ＭＳおよびウエスタンブロット、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または競合結合アッセイなどのイムノアッセイを含む、イムノアッセイ、質量分析またはそれらの組合せなどの、いずれかの手段により定量することができる。
【００８１】
単離された、腫瘍由来エキソソームなどの細胞外微小小胞体のさらなる解析に関しては、科学研究ならびに／または臨床診断および予後診断目的のためかどうかを問わず、単離されたエキソソームなどの細胞外微小小胞体が、それらの元の表面マーカーおよび「抗体結合型」の抗原を実質的に保持するように、実質的に「抗原的に完全」であることは、本発明の特別の利点である。さらに、エキソソームなどの、実質的に抗原的に完全な細胞外微小小胞体は、細胞外微小小胞体またはエキソソーム上に保持された、保存抗原またはマーカー、とりわけ腫瘍抗原もしくは腫瘍マーカーまたはウイルス抗原もしくはウイルスマーカーを認識する、ヒト化抗体またはヒト抗体などの、新規な治療用抗体を得るための実験動物の免疫処置を含む、抗体を産生するための免疫処置に使用することができる。
【００８２】
しかし、単離細胞外微小小胞体およびエキソソームの内部に関しては、単離方法の比較的に低いｐＨは、小胞の内部も酸性化する可能性がある。したがって、例えば、ＲＴ−ＰＣＲによる核酸バイオマーカーの解析について、少なくとも解析の前に、より好ましくは、単離後および／または任意の保存もしくは凍結の前の適時に、細胞外微小小胞体およびエキソソームを中性ｐＨ、生理的ｐＨ（約ｐＨ７．３５〜７．４５などの）または任意の標準実験室ｐＨ（例えば、約ｐＨ７．５または７．６）に戻すことが好ましい。単離された、エキソソームなどの細胞外微小小胞体を約７．０〜約７．６のｐＨの酢酸塩不含有緩衝液に再懸濁することは、とにかく好ましいが、核酸解析のためにより重要であると考えられる。
【００８３】
Ｃ．  酢酸緩衝液
実施例Ｉならびに図１Ａおよび図１Ｂに示すように、本発明により提供する、エキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離する「塩析」または沈殿法は、酢酸緩衝液の全範囲にわたって有効である。とりわけ、「酢酸緩衝液」は、それらの性質上、約ｐＨ３．７５と約ｐＨ５．７５の間のｐＨ範囲を有するような、または約ｐＨ３．７と約ｐＨ５．６の間のｐＨ範囲を有するような、約ｐＨ３．７と約ｐＨ５．８の間のｐＨ範囲を有することに注意すること。
【００８４】
例えば、特に酢酸ナトリウムに関しては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）の緩衝液リファレンスセンター（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの周知の情報源は、酢酸ナトリウム−酢酸緩衝溶液が約ｐＨ３．７と約ｐＨ５．６の間の有用なｐＨ範囲を有することを示している（Ｄａｗｓｏｎ、１９８６年も参照）。以下の緩衝液表には、酢酸ナトリウム三水和物、ＣＨ３ＣＯＯＮａ・３Ｈ２Ｏ、分子量１３６．０９を記載しており、ここで、０．２Ｍ溶液は２７．２２ｇ／ｌを含有し、ｘ  ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＯＡｃおよびｙ  ｍｌの０．２Ｍ−ＨＯＡｃが混合されている。
【００８５】
【表４】
2017509332.tif 000003
【００８６】
本発明は、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム（例えば、実施例ＩＩおよび図４Ｂを参照）および酢酸アンモニウム、ならびにそれらの混合物などの、一価または二価カチオンを有する一連の酢酸緩衝液での使用に適しており、酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムが好ましく、酢酸ナトリウムが特に好ましい。酢酸カリウムおよび酢酸アンモニウムなどのそれらの他の酢酸緩衝液も約ｐＨ３．７５と約ｐＨ５．７５の間のｐＨ範囲を有するような、または約ｐＨ３．７と約ｐＨ５．６の間のｐＨ範囲を有するような、約ｐＨ３．７と約ｐＨ５．８の間の一般的ｐＨ範囲にある。
【００８７】
実施例Ｉならびに図１Ａおよび図１Ｂに示すように、塩およびｐＨ条件の全範囲は、腫瘍由来エキソソームなどの細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効であり、意味のあるレベルのタンパク質がすべての試験条件から回収される。例えば、図１Ａにおけるデータポイントに曲線を当てはめることにより、ｐＨ３．７５〜ｐＨ５．７５、および０．０５Ｍ〜０．５Ｍの酢酸緩衝液が有効であることを確認することができる。実際のデータポイントは、０．０５Ｍ〜０．５Ｍの濃度の全範囲にわたり、有効な沈殿がｐＨ４．１４、ｐＨ４．３９、ｐＨ４．６４、ｐＨ４．８９、ｐＨ５．１４およびｐＨ５．６４で起こったことを示している（図１Ａ）。有効な沈殿は、試験した各濃度、すなわち、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２３３Ｍ、０．３６７Ｍおよび０．５Ｍにおいても起こった（図１Ａ）。データポイントに曲線を当てはめることにより、各濃度についての最適なｐＨを次のように決定することができる：０．０５ＭでｐＨ４．６５；０．１ＭでｐＨ４．７５；０．２３３ＭでｐＨ４．８０、０．３６７ＭでｐＨ４．７７；および０．５ＭでｐＨ４．７８（図１Ｂ）。
【００８８】
しかし、ｐＨおよび濃度の全範囲にわたる緩衝液が有効であるにもかかわらず、ある特定の好ましい範囲を選択することができる。図１Ａに示すように、本発明は、約ｐＨ４．１４と約ｐＨ５．２５の間、または約４．２５と約５．２５の間のｐＨを有し、好ましくは約４．５と約５．０の間のｐＨを有し、０．０５Ｍ、０．１Ｍおよび０．２３３Ｍなどの、約０．０５Ｍと約０．２５Ｍの間の濃度の酢酸緩衝液を使用した場合に有効であり、約０．０５Ｍと約０．１Ｍの間の濃度が好ましい。例えば、ｐＨ４．７５までの０．１Ｍ酢酸塩による組織培養上清の滴定で、実質的にすべてのエキソソームの即時の沈殿が生じることが本明細書で示されている。
【００８９】
したがって、本発明は、約４．１４、４．２５、４．３、４．３９、４．３５、４．４、４．４５、４．５、４．５５、４．６、４．６４、４．６５、４．７、４．７５、４．８、４．８５、４．８９、４．９、４．９５、５．０、５．０５、５．１、５．１４、５．１５、５．２、５．２５、５．６４または約５．７５のｐＨを有する；より好ましくは、約４．５、４．５５、４．６、４．６５、４．７、４．７５、４．８、４．８５、４．９、４．９５または５．０のｐＨを有する；最も好ましくは、約４．６５、４．７、４．７５、４．８または４．８５のｐＨを有する酢酸緩衝液の使用を含む。
【００９０】
したがって、本発明は、約０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、０．１０Ｍ、０．１１Ｍ、０．１２Ｍ、０．１３Ｍ、０．１４Ｍ、０．１５Ｍ、０．１６Ｍ、０．１７Ｍ、０．１８Ｍ、０．１９Ｍ、０．２０Ｍ、０．２１Ｍ、０．２２Ｍ、０．２３Ｍ、０．２３３Ｍ、０．２４Ｍ、０．２５Ｍ、０．２６Ｍ、０．２７Ｍ、０．２８Ｍ、０．２９Ｍ、０．３０Ｍ、０．３１Ｍ、０．３２Ｍ、０．３３Ｍ、０．３４Ｍ、０．３５Ｍ、０．３６Ｍ、０．３６７Ｍ、０．３７Ｍ、０．３８Ｍ、０．３９Ｍ、０．４０Ｍ、０．４１Ｍ、０．４２Ｍ、０．４３Ｍ、０．４４Ｍ、０．４５Ｍ、０．４６Ｍ、０．４７Ｍ、０．４８Ｍ、０．４９Ｍ、０．５０Ｍ、０．５１Ｍ、０．５２Ｍ、０．５３Ｍ、０．５４Ｍまたは０．５５Ｍの濃度の；より好ましくは約０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、０．１０Ｍ、０．１１Ｍ、０．１２Ｍ、０．１３Ｍ、０．１４Ｍ、０．１５Ｍ、０．１６Ｍ、０．１７Ｍ、０．１８Ｍ、０．１９Ｍ、０．２０Ｍ、０．２１Ｍ、０．２２Ｍ、０．２３Ｍ、０．２３３Ｍ、０．２４Ｍまたは０．２５Ｍの濃度の；さらにより好ましくは約０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍまたは０．１０Ｍの濃度の酢酸緩衝液の使用を含む。
【００９１】
図１Ａにおけるものと同じデータの空間充填（または３Ｄ）モデルから、約ｐＨ４．１４と約ｐＨ５．２５の間、約ｐＨ４．１４と約ｐＨ５．０の間、約ｐＨ４．３９と約ｐＨ５．４の間、約ｐＨ４．３９と約ｐＨ５．２５の間および約ｐＨ４．３９と約ｐＨ５．１４の間のｐＨ範囲、ならびに約０．０５Ｍと０．２５Ｍの間、約０．０５Ｍと０．２３３Ｍの間および約０．０５Ｍと０．１５Ｍの間の濃度が好ましく、約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．４の間、約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．２５の間および約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．０の間のｐＨ範囲、ならびに約０．０５Ｍと０．２３３Ｍの間、約０．０５Ｍと０．１５Ｍの間および約０．０５Ｍと０．１Ｍの間の濃度が特に好ましい。
【００９２】
したがって、さらにより好ましい範囲は、約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．２５の間、または約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．０の間、および約０．０５Ｍと０．１５Ｍの間、または約０．０５Ｍと０．１Ｍの間の濃度である。
【００９３】
任意のｐＨ範囲または数は、任意の濃度範囲または数と組み合わせることができる。例えば、好ましい実施形態の範囲内で、酢酸緩衝液は、約４．２５と約５．２５の間のｐＨおよび約０．０５Ｍと約０．２５Ｍの間の試料中最終濃度を有し得る。より好ましくは、酢酸緩衝液は、約４．５と約５．０の間のｐＨおよび約０．０５Ｍと約０．１Ｍの間の試料中最終濃度を有する。現在最も好ましい実施形態は、約０．１Ｍの濃度および約４．７５のｐＨの酢酸ナトリウム緩衝液の使用である。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「濃度」の考察全体を通して、一般的に、１／１０容の１０倍濃縮酢酸緩衝液を生体液の試料に加えるなどの、有効濃度は、生体液の試料中の「最終濃度」として記載される。例えば、１／１０容の１．０Ｍ酢酸緩衝液を加えて、０．１Ｍの試料中最終濃度を得る。
【００９５】
ある特定の実施形態では、本発明に使用する酢酸緩衝液は、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの体積排除ポリマー；デキストラン硫酸およびデキストラン酢酸などのデキストラン；ならびにポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニルまたはポリ硫酸ビニルなどの親水性ポリマーを本質的に含まない。
【００９６】
Ｄ．  疾患におけるホスファチジルセリンの露出
腫瘍からのエキソソームなどの細胞外微小小胞体の単離は、本発明の重要な態様である。それらの組成物は発生源の細胞のそれを反映するので、腫瘍由来細胞外微小小胞体およびエキソソームに加えて、本発明を使用して単離することができるＰＳ陽性細胞外微小小胞体およびエキソソームの他の供給源は、広範囲の病原体に感染した細胞からのものである。
【００９７】
例えば、寄生性原虫であるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ（Ｚａｎｄｂｅｒｇｅｎら、２００６年；Ｗａｎｄｅｒｌｅｙら、２００９年；Ｗａｎｄｅｒｌｅｙら、２０１３年）、マラリアを引き起こすＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｅｄａ  ＆  Ｓｈｅｒｍａｎ、２００２年；Ｐａｔｔａｎａｐａｎｙａｓａｔら、２０１０年；米国特許第７，２６２，１６７号）および寄生性原虫であるＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ（ＤａＭａｔｔａら、２００７年）などの細胞内寄生生物は、すべてＰＳの露出をもたらす。同様に、寄生性扁形動物であるＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａもＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ（Ｓｅａｂｒａら、２００４年）と同様にＰＳを露出させる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌｅｉｊら、２００２年）。
【００９８】
ＰＳの露出は、それぞれペストおよびツラレミアを引き起こす、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓなどの、細胞内細菌性病原体による感染後の外細胞表面上でも示された（Ｌｏｎｓｄａｌｅら、２０１１年）。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓも感染宿主細胞からの外表面ＰＳを有する膜由来小胞の放出を促進する（Ｃｚｕｃｚｍａｎら、２０１４年）。同様に、髄膜炎を引き起こす病原体であるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに感染した内皮細胞は、細胞表面へのＰＳの転移を示した（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ−Ｕｎｋｍｅｉｒら、２００７年）。マクロファージにおいて細胞内で複製する、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染は、結核病変における好中球でＰＳの外在化を伴う（Ｆｒａｎｃｉｓら、２０１４年）。同様に、通性細胞内寄生生物であるＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａは、ヒト単球におけるＰＳの外在化を誘導する（Ｈａｅｇｅｌｅら、１９９８年）。
【００９９】
したがって、上で詳述した通性細胞内寄生生物に共通するＰＳの外在化は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＢｒｕｃｅｌｌａなどの、他のそのような病原体で起こる可能性がある。これは、ＰＳの外在化が病原に重要なものであり、感染した上皮細胞、内皮細胞、顆粒球細胞および単球細胞で示された、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．などの偏性細胞内寄生生物による感染でも実証された（Ｇｏｔｈ  ＆  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ、２００１年）。
【０１００】
実際、宿主細胞におけるＰＳの外在化は、今や一連の細菌および病原体による感染に反応する一般的に認識されている現象である（Ｗａｎｄｌｅｒら、２０１０年）。これは、胃上皮細胞に侵入し（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＆  Ｋｒｏｇｆｅｌｔ、２００３年）、それらの細胞との直接接触により、宿主原形質膜の外部リーフレット（ｏｕｔｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）へのＰＳの外在化を誘導する（Ｍｕｒａｔａ−Ｋａｍｉｙａら、２０１０年）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉをさらに含む。
【０１０１】
宿主細胞にＰＳを外在化させる著名な病原体は、ウイルスである（例えば、米国特許第７，７９０，１５９号；米国特許第７，９０６，１１５号；Ｓｏａｒｅｓら、２００８年；ＭｅｒｃｅｒおよびＨｅｌｅｎｉｕｓ、２００８年；Ｍｏｏｄｙら、２０１０年；Ｍｏｒｉｚｏｎｏら、２０１１年；Ｍｅｅｒｔｅｎｓら、２０１２年；Ｂｅｓｔ、２０１３年；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａら、２０１３年；Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙら、２０１３年；Ｍｏｌｌｅｒ−Ｔａｎｋ  ＆  Ｍａｕｒｙ、２０１４年）。実際、エンベロープウイルスの侵入および感染のエンハンサーとしてのＰＳおよびＰＳ受容体の役割は、現在十分に実証されている（例えば、Ｍｏｌｌｅｒ−Ｔａｎｋ  ＆  Ｍａｕｒｙ、２０１４年における表１；また本明細書における実施例Ｘを参照）。エキソソームなどの細胞外微小小胞体およびウイルス感染の間の関連も近年ますます明らかになり（Ｍｅｃｋｅｓ  ＆  Ｒａａｂ−Ｔｒａｕｂ、２０１１年；Ｓｉｍｓら、２０１４年）、広範囲のウイルスに再び適用されている（例えば、Ｗａｌｋｅｒら、２００９年；Ｍｅｃｋｅｓら、２０１０年；Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｕｓｅｒｏｓら、２０１０年；Ｍｅｃｋｅｓ  ＆  Ｒａａｂ−Ｔｒａｕｂ、２０１１年）。
【０１０２】
さらに、ＰＳ、ウイルスおよびＰＳ陽性ウイルス由来細胞外微小小胞体の間の関連は、エンベロープウイルスに限定されず、非エンベロープウイルスに拡大される（Ｃｌａｙｓｏｎら、１９８９年；Ｃｈｅｎら、２０１５年）。特に、「ＰＳ脂質小胞」を示し、ＰＳ小胞がエンテロウイルスの効率的な一括感染を可能にすることを示すデータを添付している、Ｃｈｅｎら、２０１５年によるＣｅｌｌ論文の表紙ページの図を参照のこと。
【０１０３】
本発明を使用してウイルス感染細胞およびウイルス培養物からエキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離することに成功を収めている（実施例ＸＩおよび実施例ＸＩＩＩ；図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃ）が、これらは、感染性ウイルスを本質的に含まないことが示されている（実施例ＸＩＩ）。総合すると、それらのデータから、エンベロープウイルス（例えば、ＨＳＶ−１）および非エンベロープウイルス（例えば、ＳＶ４０）に感染した細胞から本質的に非感染性で、ＰＳ陽性の細胞外微小小胞体が単離されることがわかる。
【０１０４】
これに拘束されるものでないが、以下のコメントは、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの両方からの細胞外微小小胞体を沈殿させる際の本発明の使用の理論的根拠の説明となるものである。すべてのウイルスは、新たな宿主細胞の成功裏での感染を保証するために宿主細胞からの成熟ビリオンの持続的脱出（timed  exit）を調整する。エンベロープウイルスは宿主細胞原形質膜を利用して、次の宿主細胞に対して子孫ビリオンの効率のよい侵入を媒介するウイルスタンパク質を埋め込む。ＰＳは、ウイルスの放出前のウイルス感染細胞の外部に見いだされ、エンベロープウイルスは、宿主細胞を出るときにＰＳをウイルスエンベロープに組み込む（例えば、実施例Ｘ）。
【０１０５】
それらの成熟ビリオンにエンベロープを組み込んでいないウイルスは、他の機構によって宿主細胞を出る。細胞から新たなビリオンを放出するために非エンベロープウイルスが使用するいくつかの戦略は、感染細胞（Ｔ細胞またはマクロファージ）に対する宿主の免疫応答によって直接的に引き起こされ得る、または宿主細胞タンパク質合成もしくは細胞構造に対する直接的なウイルスの活性に起因する、細胞の溶解を含む。細胞の溶解を誘導するために細胞の構造を変化させるウイルスの例は、アデノウイルスである。アデノウイルスは、フィラメントネットワークおよびタンパク質合成を破綻させることによって細胞の構造的完全性を変化させるいくつかのタンパク質を感染の間の後期に発現する（Ｆｌｉｎｔ、２０００年）。一部の非エンベロープウイルスは、如何なる細胞変性効果も伴わない非破壊的機構によってそれらの子孫ウイルスを放出することができる。ポリオウイルスは、細胞溶解を速やかに誘導する（約８時間）が、新たな宿主細胞に感染することができるＰＳ脂質小胞において細胞から放出されもする。ＰＳ−小胞中のポリオウイルス粒子は、ＰＳ−小胞から離れたウイルス粒子よりも効率的にＨｅＬａ細胞および初代マクロファージに感染し、またアネキシンＶにより該小胞をブロックすることにより感染細胞からの該小胞が用量依存的様式で阻害され、このことから、該ＰＳ脂質がポリオウイルス感染の補因子であることが示唆される。ポリオウイルスに加えて、コクサッキーウイルスＢ３粒子およびライノウイルス粒子もＰＳ脂質小胞中に放出され（Ｃｈｅｎら、２０１５年）、このことから、エンテロウイルスにより共通の機構が利用されて、細胞の溶解を伴うことなく成熟粒子を選択的に放出することが示される。
【０１０６】
本明細書で使用したＳＶ４０に関しては、ＳＶ４０も上記の種類のＰＳ脂質小胞において細胞から放出される可能性がある。これは発表されていないが、ＳＶ４０粒子は、細胞変性効果の誘導の前に細胞から放出されることを認めることができることが報告された（Ｃｌａｙｓｏｎら、９８９年）。また、ＳＶ４０ビリオンは、感染後４８時間目に細胞質平滑小胞中に認められ、ＳＶ４０粒子の放出は、脂質膜を通してのカチオン輸送をブロックすることによって細胞内タンパク質輸送をブロックするナトリウムイオノフォアであるモネンシンによって阻害された。
【０１０７】
本発明の他の実施形態では、エキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離するための酢酸緩衝液の使用が非脂質膜成分、とりわけ膜タンパク質と結合している表面ＰＳに影響を及ぼすと考えられ、エキソソームとウイルスが同じサイズ範囲にある（例えば、Ｇｙｏｅｒｇｙら、２０１１年を参照）ことから、本発明は、酢酸緩衝液を使用してウイルスを単離するための方法および組成物を含む。約４．７５のｐＨを含む、約５．２５と約４．２５の間のｐＨを有する緩衝液の使用は、比較的に低いｐＨのためウイルスを不活性化する可能性があるので、該方法は、現在のところ感染性ウイルスを単離するためには提案されない。むしろ、該方法は、例えば、特徴付け、抗原タイピングおよび関連する解析における使用に適する、非感染性ウイルスを単離するのにより適している。おそらく、該方法は、とりわけ有効ｐＨ範囲の上限近くで使用する場合、さらにとりわけ高収率が必要でないかまたは望まれない場合には、感染性ウイルスを単離するためになお使用することができる。さもなければ、上記したように、本発明の方法および組成物は、ウイルスからエキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離するのにより十分に適しており、それが、感染性ウイルスを実質的に含まない、エキソソームなどのウイルス細胞外微小小胞体を単離するのに適していることが本発明の利点である。
【０１０８】
宿主細胞がＰＳを露出し、かつ／またはＰＳ陽性細胞外微小小胞体およびエキソソームが実証された、いくつかの他の疾患および障害が公知である。例えば、鎌状赤血球症およびクリーゼにおいて、健常者では約１％にすぎないのに対して、赤血球の３０〜４０％が成熟前老化およびＰＳ陽性（「鎌状赤血球」）である。ＰＳ陽性鎌状赤血球は、循環中に残存し、内皮に付着し、それらの露出ＰＳは、凝血塊伝播の原因である凝固カスケードの開始のためのプラットフォームの機能を果たす（Ｋｅｎｎｅｄｙら、２０１５年）。
【０１０９】
ＰＳ陽性細胞外微小小胞体は、アテローム動脈硬化性プラークからも放出される（Ｍａｌｌａｔら、１９９９年）。１型および２型糖尿病患者の両方が、アネキシンＶ陽性であることによって示される（Ｓａｂａｔｉｅｒら、２００２年）ように、ＰＳ陽性細胞外微小小胞体を有する。アルツハイマー病では、脳エキソソームは、ＰＳおよび該疾患の病原性因子である、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ）を含有する（Ｙｕｙａｍａら、２０１２年）。ＰＳ陽性細胞外微小小胞体は、敗血症にも関与し、この場合、それらは、敗血症誘発性微小血管機能不全および免疫抑制のマーカーおよびメディエーターである（Ｓｏｕｚａら、２０１５年）。したがって、本発明は、すべてのそのような疾患および障害からのＰＳ陽性細胞外微小小胞体の単離に適用することができる。
【０１１０】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含める。以下の実施例で開示する技術が、本発明の実施において十分に機能することが発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成するとみなすことができることは、当業者によって十分に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行っても、同様または類似の結果をなお得ることができることを十分に理解すべきである。
【実施例】
【０１１１】
（実施例Ｉ）
酢酸緩衝液を使用した腫瘍由来エキソソームの単離
【０１１２】
本実施例では、酢酸緩衝液を使用してエキソソーム、とりわけ腫瘍由来エキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離するための有利な方法を示す。
【０１１３】
Ａ．  材料および方法
以下の材料および方法は、実施例Ｉ、実施例ＩＩおよび実施例ＩＩＩで報告する結果に関連する。
【０１１４】
１．  組織培養
Ｋ１７３５Ｐマウス黒色腫（腫瘍）細胞（Ｉ．Ｊ．  Ｆｉｄｌｅｒ、Ｍ．Ｄ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸにより提供された。ただし、いずれにせよ広く入手可能）を、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、非必須アミノ酸およびウシ胎児血清（１０％）を補充した最少必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。細胞（１５ｍＬ培地中約２５ｘ１０６個）を上部チャンバーに２５０ｍＬの培地を含有しているＣＥＬＬｉｎｅ  ＡＤ１０００フラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ）の下部チャンバーに播種した（Mitchellら、２００８年）。ならし培地（約１５ｍＬ）を下部チャンバーから週１回採取した。コンパートメントを１５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、ならし培地と合わせた。次いで、新鮮な培地を下部チャンバーに加えた。上部チャンバーは、約１００ｍＬの使用済み培地を新鮮な培地で置き換えることにより週１回補充した。週１回の採取物を酢酸緩衝液沈殿プロトコールに供し、一般的に７５〜１２５μｇの精製エキソソーム／ｍＬのならし培地を得た（以下の結果を参照）。
【０１１５】
２．  腫瘍由来エキソソームの単離
超遠心分離  −  ５００ｇで３０分間と続く１２，０００ｇでさらなる３０分間の逐次的遠心分離により、細胞ならし培地から細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を除去した。エキソソームは、１００，０００ｇで１時間の超遠心分離の後に澄明にした上清から収集した。ペレットを約２ｍＬのＨＥＰＥＳ−食塩水（ＨＢＳ；ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＥＧＴＡ  ２ｍＭ、ｐＨ７．６）に再懸濁した。エキソソームの量は、ＢＣＡタンパク質アッセイにより推定した。
【０１１６】
酢酸緩衝液沈殿プロトコール（標準）  −  逐次的遠心分離により、細胞ならし培地から細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を除去した。細胞ならし培地を５００ｇで３０分間（または２５０ｇで１０分間）遠心分離し、上清を収集し、次いで１２，０００ｇ〜１３，０００ｇでさらに３０分間遠心分離した。これらのステップにより、澄明にしたまたは清澄にした上清が提供される。水中１．０Ｍ酢酸ナトリウムの溶液を調製し、氷酢酸でｐＨ４．７５まで滴定し、１／１０容のこの酢酸Ｎａ緩衝液を澄明にした上清と混合し、氷上に３０〜６０分間放置した。一般的に、混合物を次に３７℃にさらに５分間移行させた（これは任意選択であるが）。得られた混濁懸濁液を２，０００ｇ〜５，０００ｇ、一般的に５，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、得られたペレットを０．１Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液で１回洗浄した。再懸濁したペレットを再び約２，０００ｇで１０分間遠心分離し、最終ペレットを、酢酸塩不含有緩衝液の例としての、ヘペス緩衝食塩水（ＨＢＳ）またはＴＲＩＳ緩衝食塩水（ＴＢＳ）で「可溶化」した。任意選択で、任意の残存不溶性物質を約２，０００ｇで１０分間の遠心分離により除去することができ、かつ／または追加のラウンドの沈殿によりさらなる精製が達成された。精製エキソソームを４℃で保存した。
【０１１７】
３．  フローサイトメトリー
０．５ｍＬのＰＢＳ中の腫瘍エキソソーム（１０μｇタンパク質）を５μＬの４μＭアルデヒドで活性化した（ａｌｄｅｈｙｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅ）ラテックスビーズ（４重量／体積％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と４℃で終夜混合した。次いで、０．５ｍＬの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１時間加えた後、０．１ｍＬの１００ｍＭグリシンをさらに１時間加えることによってビーズをブロッキングした。次いでビーズを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。抗体は、ウサギ抗ａｌｉｘ（ｓｃ−９９０１０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびアイソタイプ対照としてのウサギ抗チューブリン（ｓｃ−５５４６；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と続くＣＹ３標識ロバ抗ウサギＩｇを含んでいた。一次抗体をビーズとともに氷上で１時間インキュベートし、２回洗浄した後、標識二次抗体（ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）とともにさらに１時間インキュベートした。ビーズを再び洗浄し、解析した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−アネキシン５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者によって記載された通りに使用した。試料は、Ｃａ２＋（１ｍＭ）の存在下および非存在下でアネキシン５とともにインキュベートしたＢＳＡでブロッキングしたビーズおよびエキソソーム−ビーズを含んでいた。
【０１１８】
４．  電子顕微鏡法
Theryら、２００６年により記載された手順にわずかに修正を加えた手順を使用して、透過型電子顕微鏡法による検査のために、単離されたエキソソームを調製した。手短かに述べると、２５μｌのエキソソーム懸濁液をパラフィン上に置き、炭素被覆グリッドを裏向きに懸濁液上に１分間懸垂した。次いで、グリッドを水でそれぞれ１分間、３回逐次的に洗い流すことにより洗浄した。次いで、グリッドを、２％酢酸ウラニルの２５μｌ液滴上に１分間のせることにより染色し、再度上記のように水で洗浄した。過剰の水は、濾紙で吸い取ることにより除去した。次いで、グリッドを数分間風乾した。試料をＪＥＯＬ  １２００ＥＸ電子顕微鏡で検査した。
【０１１９】
５．  ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
エキソソームは、等体積の５％β−メルカプトエタノール含有Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で９５℃で５分間可溶化した。アリコート（２０μｇタンパク質）を二連「Ｒｅａｄｙ  Ｃａｓｔ」１０％アクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）による電気泳動にかけた。１つのゲルをクーマシーブルーで染色し、二連をＰＶＤＦ膜に４℃で終夜転写した。膜を１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＲＩＳ緩衝食塩水（ＴＢＳ）中５％無脂肪乳でブロッキングした。示した一次抗体（抗ａｌｉｘ、抗ｈｓｐ７０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を１時間加えた後、ＴＢＳで３回洗浄した。抗体結合は、適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体で評価し、高感度ケミルミネッセンス（chemoluminescence）により視覚化した。
【０１２０】
Ｂ．  ｐＨおよび濃度範囲
腫瘍細胞培養は、高効率ＣＥＬＬｌｉｎｅ  ＡＤ組織培養システム（Mitchellら、２００８年）で確立した。上清を下部の細胞含有チャンバーから回収し、５００ｇおよび１２，０００ｇでの遠心分離によりそれぞれ完全な細胞および細胞デブリを除去した。次いで、澄明な上清の小（４．５ｍＬ）アリコートを、酢酸で表示ｐＨまで滴定した１／１０容の漸増１０倍酢酸塩濃度のものと混合した。
【０１２１】
図１Ａおよび図１Ｂは、酢酸緩衝液のこの範囲にわたる腫瘍由来エキソソームの有効な単離を示している。全範囲の塩およびｐＨ条件が腫瘍エキソソームを沈殿させるのに有効であり、意味のあるレベルのタンパク質がすべての試験条件で回収されたことを確認することができる。本試験が広範囲の比較データを容易に提供するように設計されたものであって、収率を最適化しようとして設計されたものではないことも注意すべできある。有効な条件の範囲では、沈殿は、本質的に瞬間的であり、明らかに目に見えるものであった（例えば、ｐＨ４．７５と０．１Ｍ酢酸塩を使用した場合の図１Ｃに示す通り）。
【０１２２】
データポイントに曲線を当てはめることにより、図１ＡからｐＨ３．７５〜ｐＨ５．７５および０．０５Ｍ〜０．５Ｍを含む、塩およびｐＨ条件の全範囲にわたる酢酸緩衝液が腫瘍エキソソームを沈殿させるのに有効であることがわかる。実際のデータポイントは、０．０５Ｍ〜０．５Ｍの濃度の全範囲にわたって、有効な沈殿がｐＨ４．１４、ｐＨ４．３９、ｐＨ４．６４、ｐＨ４．８９、ｐＨ５．１４およびｐＨ５．６４（図１Ａ）で起こったことを示している。有効な沈殿は、試験した各濃度、すなわち０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２３３Ｍ、０．３６７Ｍおよび０．５Ｍ（図１Ａ）でも起こった。データポイントに曲線を当てはめることにより、各濃度について最適なｐＨを次のように決定することができる：０．０５ＭでｐＨ４．６５；０．１ＭでｐＨ４．７５；０．２３３ＭでｐＨ４．８０；０．３６７ＭでｐＨ４．７７；および０．５ＭでｐＨ４．７８（図１Ｂ）。
【０１２３】
しかし、ｐＨおよび濃度の全範囲にわたる酢酸緩衝液が有効であるにもかかわらず、この「塩析」または沈殿法は、ｐＨと塩濃度の両方による影響を受けた。図１Ａは、約ｐＨ４．１４と約ｐＨ５．２５の間または約ｐＨ４．２５と約ｐＨ５．２５の間、さらにとりわけ約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．０の間の範囲、および約０．０５Ｍと０．２５Ｍの間、さらにとりわけ約０．０５Ｍと０．１Ｍの間の濃度の酢酸塩が最も有効であることを示している。これらの同じデータの空間充填（または３Ｄ）モデルを使用して、約ｐＨ４．１４と約ｐＨ５．２５の間、約ｐＨ４．１４と約ｐＨ５．０の間、約ｐＨ４．３９と約ｐＨ５．４の間、約ｐＨ４．３９と約ｐＨ５．２５の間および約ｐＨ４．３９と約ｐＨ５．１４の間の範囲、ならびに約０．０５Ｍと０．２５Ｍの間、約０．０５Ｍと０．２３３Ｍの間および約０．０５Ｍと０．１５Ｍの間の濃度、さらにとりわけ、約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．４の間、約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．２５の間および約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．０の間、ならびに約０．０５Ｍと０．２３３Ｍの間、約０．０５Ｍと０．１５Ｍの間および約０．０５Ｍと０．１Ｍの間の濃度が最も有効である。
【０１２４】
図１Ａおよび同じデータの空間充填モデルから、好ましい範囲は、約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．２５の間、または約ｐＨ４．５と約ｐＨ５．０の間、および約０．０５Ｍと０．１５Ｍの間、または約０．０５Ｍと０．１Ｍの間の濃度である。これらの有効範囲内では、０．１Ｍ酢酸塩を用いたこれらの試験における最大沈殿は、約ｐＨ４．７５で起こった。したがって、これを、以下のものを含む、さらなる試験の好都合な標準条件として選択し、後の実施例で報告した。
【０１２５】
Ｃ．  収量
約２５ｘ１０６個のＫ１７３５Ｐ細胞から開始して、ならし培地の最初の採取の前の２週間上記の条件下で培養し、上記のように（およびｐＨ４．７５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムを使用して）酢酸塩による沈殿を実施し、１ｍＬのならし培地当たり約７５〜１２５μｇの収量の精製エキソソームを得る。これらの細胞を培養で維持し、上記のように使用済み培地を新鮮な培地で補充し、いわゆる「十分に飽和した」細胞ならし培地（その時は未知数の細胞からであるが）の一定の供給源を用意し、それから酢酸緩衝液沈殿プロトコールを使用して約７５〜１２５μｇ／ｍＬ、一般的に約１００〜１２５μｇ／ｍＬの精製エキソソームを週１回得ることができる。
【０１２６】
記載したように、図１Ａおよび図１Ｂにおけるデータは、条件の比較を示すために小試料から得られたものであって、一般的な収量を示すことを目的とするものではない。より低い濃縮度の小試料とは対照的に、十分に飽和した培地を使用した場合に収率（％）が増加することが認められた。
【０１２７】
（実施例ＩＩ）
腫瘍エキソソームの単離のさらなる特徴付け
【０１２８】
この実施例では、疾患関連の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体の単離方法論をさらに特徴付けし、腫瘍エキソソームに関する技術における酢酸緩衝液の重要性を強調する。
【０１２９】
Ａ．  温度非依存性
本試験では、腫瘍エキソソームの沈殿が本質的に温度非依存性であることを示す。しかし、温度の効果を解析したところ、濁りの発生が温度依存性であることが示された。
【０１３０】
酢酸塩の添加により、濁度の即時の温度依存的増加が起こり、これがその後横ばいの状態になり始めた。継続的インキュベーションで、０℃と２０℃の間では速度のわずか約２倍の増加を示した。しかし、温度を２０℃から３７℃に上昇させたときに速度の有意な差は認められなかった（図２Ａ）。興味深いことに、反応が０℃で一旦プラトーになると、温度を３７℃に上昇させることにより、３７℃で全期間インキュベートした試料の濁度に近いレベルに濁度が即時に増加した（図２Ａ）。逆に、３７℃でインキュベートした試料の温度を低下させても効果はなかった（図２Ａ）。
【０１３１】
濁度に関係なく、ペレット化沈殿物において回収されたタンパク質の量は、本質的に同じであった（図２Ｂ）ことから、腫瘍エキソソームの沈殿が温度非依存性であり、より高い温度でより大きい凝集体が形成されることが示された。
【０１３２】
Ｂ．  ｐＨ依存性
腫瘍由来エキソソームの沈殿のｐＨ依存性をさらに評価するために、同じＩｎｔｅｇｒａフラスコからの使用済み培地および澄明にした細胞上清を０．１Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液中で１時間インキュベートした。濁度を６００ｎｍで評価し、沈殿したタンパク質（エキソソーム）をブラッドフォードアッセイにより評価した。
【０１３３】
図３Ａおよび図３Ｂに示すように、上清についてはｐＨ依存性濁度（図３Ａ）および沈殿タンパク質（図３Ｂ）が得られたのに対して、対照培地については本質的に濁りまたは沈殿物は認められなかった。有効ｐＨ範囲内では、本試験における上清からの最大の濁度および沈殿タンパク質は、約ｐＨ４．７５で再び得られた。
【０１３４】
Ｃ．  沈殿は酢酸塩に依存し、ｐＨに依存しない
腫瘍由来エキソソームを沈殿させるうえで、ｐＨ自体よりも酢酸塩が重要であることをこれらの酸性化試験で示す。グリシンＨＣｌまたはクエン酸塩により酸性化した上清で沈殿が発生しなかったことから、沈殿は、酢酸塩の存在に依存するのであって、単に酸性化に依存するのではないことがわかった（図４Ａ）。
【０１３５】
Ｄ．  沈殿は酢酸塩に依存し、対イオンに依存しない
腫瘍エキソソームの沈殿は、酢酸塩の存在に依存するが、標準的酢酸ナトリウムは、酢酸カリウムまたは酢酸アンモニウムなどの、他の酢酸緩衝液で置き換えることができる。対イオンが無関係であることは、酢酸カリウムによる沈殿が酢酸ナトリウムによる沈殿と同等であることが示されているこれらの対照試験によって示されている。
【０１３６】
４Ｔ１乳癌細胞をＣＥＬＬｌｉｎｅ  ＡＤ組織培養システムで培養した。上清を下部の細胞含有チャンバーから回収し、透析膜により下部セルチャンバーから分離されている、上部チャンバーから培地を得た。下部チャンバーからの上清および上部チャンバーからの培地の等体積の試料を１／１０容の約ｐＨ４．７５の１０倍酢酸ナトリウムまたは１０倍酢酸カリウムと別個に混合し、３０分間放置した。
【０１３７】
図４Ｂは酢酸カリウムの使用が酢酸ナトリウムの使用と区別できないことを示している。これらの２種の酢酸緩衝液を使用した場合、下部チャンバーからの上清からのエキソソームの沈殿は、明らかに目に見え、同等であった。予想通り、エキソソームが下部セルチャンバーに保持されており、大きすぎて透析膜を通過することができないので、いずれの酢酸緩衝液を用いても上部チャンバーからの培地からの沈殿は認められなかった。明らかに目に見える混濁懸濁液を遠心分離したところ、酢酸カリウムと酢酸ナトリウムとで肉眼で区別できないエキソソームのペレットが得られた。
【０１３８】
（実施例ＩＩＩ）
形態学的に検証された腫瘍エキソソームの同等の収量
【０１３９】
本実施例では、酢酸緩衝液を使用して単離した疾患関連の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体の収量は、該酢酸塩法がより容易で、より迅速であるにしても、一般的な超遠心分離法によるものと同等であることを示す。腫瘍エキソソームにより例示される、酢酸塩精製エキソソームは、伝統的な超遠心分離により調製されたものと形態学的に区別できず、抗原的に完全であることも示されている。
【０１４０】
Ａ．  同等の収量
酢酸塩による単離および従来の１００，０００ｇ超遠心分離で得られた腫瘍エキソソームの相対収量を両集団におけるａｌｉｘおよびＰＳを評価することによって定量した。Ｃｙ３標識ａｌｉｘ抗体によるａｌｉｘ（図５Ａ）およびＦＩＴＣ標識アネキシン５によるＰＳ（図５Ｂ）のフローサイトメトリー解析により、両方法で同様なエキソソームの量が得られることが示唆された。
【０１４１】
酢酸塩による単離および従来の１００，０００ｇ超遠心分離で得られたタンパク質の収量を直接比較するに際して、Ｋ１７３５上清の同じアリコートを両方法によって単離した。さらに、１００，０００ｇ超遠心分離および酢酸塩プロトコールによる上清をそれぞれ酢酸塩ｐＨ４．７５および超遠心分離（溶液をｐＨ７．５にした後）によるさらなるラウンドの単離にかけた。
【０１４２】
酢酸塩プロトコールによるタンパク質の収量は、超遠心分離法より約２倍高かった（１６７．０μｇ／ｍｌ対８８．１μｇ／ｍｌ）。中和された酢酸塩上清の超遠心分離後にさらなるタンパク質は回収することができず、事実上すべてのエキソソームが酢酸塩により沈殿したことが示唆された。他方で、１００，０００ｇ超遠心分離上清の酢酸塩処理によってさらに５３３μｇのタンパク質（３９．５μｇ／ｍｌ）が回収され、酢酸塩が非エキソソームタンパク質を非特異的に沈殿させた可能性があることが示唆された。酢酸塩による沈殿および１００，０００ｇ沈殿により回収されたエキソソームのＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、酢酸塩レーンの上部におけるさらなるバンドを除いて、同様のタンパク質パターンが示された。質量分析では、酢酸塩試料におけるこの上部バンド（約１６０ｋＤａ）が、一部の黒色腫細胞により分泌されることが公知のタンパク質であるα２−マクログロブリン（Morganら、１９８４年）であることが示された。
【０１４３】
Ｂ１６黒色腫またはＴＲＡＭＰ前立腺癌細胞からのエキソソームを精製するために酢酸塩による沈殿を使用した別個の試験では、α２−マクログロブリンは、得られたエキソソームに検出されなかった（実施例ＩＶ）。
【０１４４】
エキソソームの沈殿と関係のない酸依存性共沈の結果である可能性がある、Ｋ１７３５細胞からの酢酸塩による沈殿エキソソーム（acetate-precipitated  exosome）におけるより高い濃度のα２−マクログロブリンに関しては、これは、１００，０００ｇで１回、中和した酢酸塩による沈殿エキソソームを洗浄することによって容易に除去することができる。実際、洗浄済みエキソソームのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、α２−マクログロブリンの大部分が除去されたことが明らかにされた。
【０１４５】
Ｂ．  形態学的に区別できないエキソソーム
酢酸塩および伝統的な超遠心分離により精製された腫瘍エキソソームを、電子顕微鏡法により、また特徴的なエキソソーム関連マーカーについてウエスタンブロッティングにより解析した。酢酸塩により回収されたエキソソームが超遠心分離により収集されたエキソソームと形態学的に区別できないと判定された。両集団は、同じサイズの小胞を含有し、内腔空間を取り囲む典型的な二重層膜を有していた（図６）。
【０１４６】
ウエスタンブロット解析により、両調製物は、エキソソームマーカーであるａｌｉｘおよびｈｓｐ７０を含有していたことが確認された。したがって、ウエスタンブロットにおける抗体への結合は、単離されたエキソソームが抗原的に完全であることを示すものである。
【０１４７】
（実施例ＩＶ）
寄託腫瘍細胞株からのエキソソームの単離
【０１４８】
この実施例では、酢酸塩による沈殿を使用して、さらなる腫瘍細胞株からの疾患関連細胞外微小胞、とりわけ腫瘍エキソソームを精製した。これらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））に対して寄託されており、したがって、比較試験のための標準として容易に入手できる腫瘍細胞株を含む。
【０１４９】
４Ｔ１乳癌細胞は、ＡＴＣＣからＣＲＬ−２５３９（商標）として入手できる。Ｂ１６黒色腫細胞は、ＡＴＣＣからＢ１６−Ｆ０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６３２２（商標））、Ｂ１６−Ｆ１（ＣＲＬ−６３２３（商標））およびＢ１６−Ｆ１０（ＣＲＬ−６４７５（商標））として入手できる。トランスジェニックマウス前立腺癌細胞である、ＴＲＡＭＰ細胞は、ＡＴＣＣからＣＲＬ−２７３０（商標）、ＣＲＬ−２７３１（商標）およびＣＲＬ−２７３２（商標）として入手できる。Ｃ４細胞は、ＬＮＣａＰ細胞株からのアンドロゲン感受性ヒト前立腺腺癌細胞（Wuら、１９９４年）であり、広く入手できる。
【０１５０】
それぞれＡＴＣＣから得られた、４Ｔ１細胞、Ｂ１６細胞およびＴＲＡＭＰ細胞、ならびにＣ４細胞をＬ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、非必須アミノ酸およびウシ胎児血清（１０％）を補充した最少必須培地（ＭＥＭ）中で別個に培養した。１５ｍＬの培地中約２５ｘ１０６個の各細胞型（４Ｔ１、Ｂ１６、ＴＲＡＭＰおよびＣ４）を、上部チャンバーに２５０ｍＬの培地を含有しているＣＥＬＬｉｎｅ  ＡＤ１０００フラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ）の下部チャンバーに播種した（０日目）（Mitchellら、２００８年）。播種の２週間後に開始して、ならし培地（約１５ｍＬ）を下部チャンバーから採取し、採取は、その後は週１回継続した。毎回、コンパートメントを１５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、ならし培地と合わせた。次いで、新鮮な培地を下部チャンバーに加えた。上部チャンバーは、１００ｍＬの使用済み培地を新鮮な培地で置き換えることにより週１回補充した。
【０１５１】
採取したならし培地（ＰＢＳ洗浄液と合わせた場合、合計約３０ｍＬ）から逐次的遠心分離によって細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を除去した。すなわち、細胞ならし培地を最初に５００ｇで３０分間（または２５０ｇで１０分間）遠心分離し、上清を収集し、次いで、当上清を１２，０００ｇ〜１３，０００ｇでさらに３０分間遠心分離した。これらのステップにより、澄明にしたまたは清澄にした上清が提供される。
【０１５２】
約２５ｘ１０６個の４Ｔ１細胞、Ｂ１６細胞、ＴＲＡＭＰ細胞、Ｃ４（またはＫ１７３５Ｐ）細胞を上記の条件下で培養し、約２週間の培養の後、および／またはその後は週１回の間隔で合計約３０ｍＬのならし培地（ＰＢＳ洗浄液と合わせた場合）を採取し、氷上で１／１０容の酢酸ナトリウム緩衝液（１．０Ｍ；ｐＨ４．７５）と約３０〜６０分間混合することによって澄明にした上清を沈殿させ、２，０００ｇ〜５，０００ｇで１０分間１回または２回遠心分離することにより、本発明は、約７５〜１２５μｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有する実質的に精製されたエキソソーム集団を提供する。
【０１５３】
このプロトコールは、Ｋ１７３５Ｐ腫瘍細胞、４Ｔ１腫瘍細胞、Ｂ１６腫瘍細胞、ＴＲＡＭＰ腫瘍細胞およびＣ４腫瘍細胞に対して使用して成功を収めた。そのような細胞から精製された腫瘍エキソソームをＦＡＣＳによっても解析したところ、実施例ＶＩＩおよび実施例ＩＸで詳細に記載するように、ホスファチジルセリンについて陽性であることが示された。
【０１５４】
少なくとも４Ｔ１細胞、Ｂ１６細胞およびＴＲＡＭＰ細胞がＡＴＣＣに対して寄託されているので、したがって、これらの細胞を、記載したプロトコールを使用する比較試験のための標準として使用することができる。Ｂ１６細胞およびＴＲＡＭＰ細胞からの腫瘍エキソソームを精製するために酢酸塩による沈殿を使用した際に、α２−マクログロブリンは、得られたエキソソームに検出されなかった（Ｋ１７３５細胞と対照的に）。Ｂ１６細胞およびＴＲＡＭＰ細胞がＡＴＣＣに対して寄託され、酢酸塩による沈殿法の使用が異質の入タンパク質または混入タンパク質を本質的に含まない精製エキソソームをもたらすので、Ｂ１６およびＴＲＡＭＰ細胞は、本発明の酢酸塩による沈殿法を使用する比較試験のための参照例または標準としてとりわけ有用であると考えられる。
【０１５５】
（実施例Ｖ）
ヒト腫瘍エキソソームの単離
【０１５６】
この実施例は、酢酸緩衝液の使用が、ヒトの疾患関連の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体、とりわけヒト患者からの腫瘍由来エキソソームを単離するのに有効であることを確認するためのデータを提供する。
【０１５７】
Ａ．  組織培養からのヒト腫瘍エキソソーム
エキソソームは、ヒト腫瘍細胞から得られた組織培養上清から単離した。腹水から単離したヒト卵巣癌細胞をＣＥＬＬｉｎｅ  ＡＤ１０００フラスコの下部セルチャンバー内で培養した。下部の細胞含有コンパートメントからのならし培地を週１回採取した。それぞれ５００ｇおよび１２，０００ｇでの逐次的遠心分離によってエキソソーム含有培地から細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を除去した。１／１０容の酢酸Ｎａ緩衝液（１．０Ｍ；ｐＨ４．７５）を澄明にした上清と混合し、氷上に３０〜６０分間放置し、次いで３７℃にさらに５分間移行させた。混濁懸濁液を５，０００ｇで１０分間遠心分離し、得られたペレットを０．１Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液で１回洗浄した。懸濁液を再び遠心分離し、ペレットをｐＨ７．５の２ｍＭ  ＥＧＴＡを含有するヘペス緩衝食塩水で「可溶化」した。精製エキソソームは、４℃で保存した。
【０１５８】
Ｂ．  患者からのヒト腫瘍エキソソーム
エキソソームは、卵巣癌を有するヒト患者から得られた腹水からも単離した。腹水（約５００ｍＬまで）を５００ｇおよび１２，０００ｇで遠心分離して、細胞および細胞デブリを除去した。１／１０容の酢酸Ｎａ緩衝液（１．０Ｍ；ｐＨ４．７５）を氷冷した澄明化腹水に３０分間〜１時間加えた。沈殿エキソソームを遠心分離（５，０００ｇで１５分間）により収集した。ドナーによって、収量は、３０〜５０μｇ／ｍＬ体液の範囲にあった。
【０１５９】
（実施例ＶＩ）
血液試料からの腫瘍エキソソーム単離
【０１６０】
本実施例では、酢酸緩衝液の使用は、腫瘍エキソソームを単離することにより例示される、ヒト全血からの疾患関連の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体の単離にも適用することができることを示す。
【０１６１】
ＥＤＴＡ中に採取した２．５ｍＬのヒト全血を０．５ｍＬの１．０ｍｇ／ｍＬ精製腫瘍エキソソーム（合計０．５ｍｇ）と混合した。次いで、血液を遠心分離し、血漿を収集した。血漿の半分を氷上に保持し、他の半分を５６℃で３分間加熱して、フィブリノゲンを沈殿させた。両試料を５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集した。１／１０容の酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ４．７５で１．０Ｍ）を加えた。試料を０℃で６０分間インキュベートした後、試料を５００ｇで１５分間遠心分離し、ペレット中のエキソソームをｐＨ７．５の２ｍＭ  ＥＧＴＡを含有するヘペス緩衝食塩水で可溶化し、タンパク質を定量した。
【０１６２】
５００μｇの腫瘍エキソソームをドープした全血からのエキソソームの回収の本試験では、全血漿からの総タンパク質の回収量は、３４０μｇであり、これは、腫瘍エキソソームおよび酢酸塩による沈殿フィブリノゲンを含む。加熱した、フィブリノゲンを含まない血漿からの総タンパク質の回収量は、２０１μｇであり、これは、補正された総腫瘍エキソソーム回収量を表す。これは、腫瘍エキソソームの約４０％が回収されている（５００μｇのドープされたエキソソームから２０１μｇ）ことを示す。
【０１６３】
別の試験では、精製エキソソームを細胞不含有血漿に直接添加して上記のプロトコールを繰り返したが、２６０μｇの精製腫瘍エキソソームを添加した。全血漿からのタンパク質の回収量は、４０５μｇであり、これは、腫瘍エキソソームおよび酢酸塩による沈殿フィブリノゲンを含む。加熱した、フィブリノゲンを含まない血漿からのタンパク質の回収では、本質的に１００％の腫瘍エキソソームの回収率が示された（実際の値は、２８８μｇのタンパク質であり、これは、この最初の試験の実験誤差の範囲内にあり、かつ／またはさらなる血漿タンパク質の沈殿を示し得る）。
【０１６４】
これらの試験から、回収されたタンパク質の差が血漿試料中のフィブリノゲンの沈殿に主として起因することがわかる。実際、プレインキュベーションステップ（５６℃で３分間；Millarら、１９７１年；Marxら、２００８年）によるフィブリノゲンの除去により、酢酸塩による沈殿試料中の異質なタンパク質のレベルが、エキソソームの損失を本質的に伴わない、血清試料について得られたものと同等のレベルにまで減少した。α２−マクログロブリンに関して実施例ＩＩＩで考察したように、腫瘍エキソソーム調製物中の任意の異質なタンパク質は、体積が酢酸塩により、操作可能な体積に減少したならば、超遠心分離によって容易に除去することができる。
【０１６５】
（実施例ＶＩＩ）
腫瘍由来エキソソームの選択的単離
【０１６６】
この実施例では、正常細胞からのエキソソームと対照的に、腫瘍由来エキソソームによって例示されるように、疾患関連の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体を沈殿させる酢酸緩衝液の特異性を示す。これは、実験技術における、ならびに診断検査およびキットに重要な新たな用途を提供する。
【０１６７】
ヒト患者から得られた卵巣癌（腫瘍）細胞および同じ患者からの正常中皮細胞を組織培養で維持した。この最初の試験では、エキソソームは、１００，０００ｇで１時間の１ステップの超遠心分離によって各組織培養上清から回収した。超遠心分離ペレットは、遠心沈殿エキソソームおよび残留組織培養培地を含有していた。
【０１６８】
超遠心分離ペレットを食塩水に再懸濁し、ブラッドフォードアッセイによりタンパク質を定量した。特異的ホスファチジルセリン（ＰＳ）マーカーである、ＦＩＴＣ標識アネキシン５を用いたＦＡＣＳ解析によりエキソソーム表面上のＰＳの存在を評価するために、再懸濁材料のそれぞれからのアリコートを残しておいた。再懸濁材料のそれぞれからの別個のアリコートを酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．７５）で０℃で１時間処理した。酢酸塩による沈殿ペレットを食塩水に再懸濁して、最初の体積とし、ブラッドフォードアッセイによりタンパク質を再び定量した。結果を表１に示す。
【０１６９】
【表１】
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【０１７０】
表１に示すように、酢酸緩衝液は、卵巣癌細胞からの腫瘍由来エキソソームを特異的に沈殿させ、正常細胞からのエキソソームは、事実上回収されない。１回の超遠心分離ステップのみをこの最初の試験で使用したため、エキソソーム懸濁液は残留組織培地を含有していたことも注意すべきである。酢酸塩による沈殿プロトコールは、腫瘍エキソソーム特異的であるので、卵巣癌細胞について引用した回収率（％）は、過小評価である。
【０１７１】
残しておいたアリコートを使用して、正常中皮細胞および卵巣癌細胞からの上清の超遠心分離によって得られたエキソソームをＦＩＴＣ−アネキシンＶラテックスビーズに結合させ、ＦＡＣＳ解析にかけて、エキソソーム表面上のＰＳの存在を評価した。予想通り、腫瘍由来エキソソームは、それらの表面上にＰＳを有していた。これは、図７Ａにおいて左方にシフトしている赤線（正常中皮細胞由来エキソソーム）と比較して、青線（卵巣癌由来エキソソーム）が右方にシフトしていることによって示されている。
【０１７２】
関連試験では、酢酸塩による沈殿を使用して４Ｔ１乳癌細胞およびＢ１６黒色腫細胞から精製されたエキソソームもＦＡＣＳ解析にかけて、表面ＰＳを検出した。それぞれ図７Ｂおよび図７Ｃに示すように、４Ｔ１細胞およびＢ１６細胞の両方からの精製エキソソームが実際にＰＳ陽性である。
【０１７３】
したがって、本試験は、腫瘍由来エキソソームがそれらに由来するＰＳ陽性腫瘍細胞を反映していることから、酢酸緩衝液が、該腫瘍由来エキソソームの表面上に存在する、負に荷電したＰＳに関与する電荷の中和によって作用するという本発明者らの理論を確認するものである。正常細胞では、ＰＳは、原形質膜の内部リーフレットに保持されており、そのため、ＰＳは正常細胞に由来するエキソソームの表面に大部分存在しない。
【０１７４】
（実施例ＶＩＩＩ）
ＰＳ陽性エキソソームの選択的単離
【０１７５】
本実施例では、疾患関連および腫瘍由来細胞外微小小胞体およびエキソソームなどの、ＰＳ陽性細胞外微小小胞体およびエキソソームを沈殿させることに関する酢酸緩衝液の特異性が、エキソソームには適用されるが、ＰＳ陽性リポソームには適用されないことを示す。
【０１７６】
第１の試験では、腫瘍由来エキソソームについて使用して成功を収めた、酢酸塩による単離法を純粋なホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンから生成させたＰＳ陽性リポソームに適用した。上記の実施例に示したように、酢酸緩衝液は、表面上にＰＳを有する腫瘍由来エキソソームを沈殿させるのに有効である。対照的に、表面上にＰＳを有するリポソームの同等の試料に同じ方法論を適用した場合、肉眼的に検出できる沈殿は生じなかった。
【０１７７】
第２の試験では、ＰＳ陰性およびＰＳ陽性リポソーム集団を蛍光脂質で標識し、沈殿したリポソームの量を定量することを可能にした。本試験では、酢酸緩衝液が、意味のある量のリン脂質リポソームを、これらがＰＳ陽性であった場合でさえ、沈殿させないことが確認された。
【０１７８】
この第２の試験では、蛍光リポソームの次の２つの集団を調製した。１つは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）からのものであり、もう１つは、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンの混合物（ＰＣ／ＰＳ）からのものであった。ＰＣリポソームは、１ｍｇのホスファチジルコリンを０．１μｇの蛍光成分であるＮ−ローダミン−ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−ｒｈｏ−ＰＥ）とＣＨＣｌ３中で混合することによって調製した。溶媒を蒸発させ、乾燥脂質を１．０ｍＬのＰＢＳ中で２０℃で３０分間再水和した。水和脂質混合物をボルテックスし、次いで超音波処理して、小単層小胞を得た。ＰＣ／ＰＳリポソームは、ＣＨＣｌ３中０．６６ｍｇのＰＣおよび０．３３ｍｇのジオレオイルホスファチジルセリン（３２ｍｏｌ％）を０．１μｇのＮ−ｒｈｏ−ＰＥと混合した出発材料を除いて、同じ技術により調製した。
【０１７９】
別個のＰＣおよびＰＣ／ＰＳリポソーム調製物を５，０００ｇで５分間遠心分離して、任意の大きい沈殿性リポソームを除去した。上清を取り出し、各調製物からの０．４ｍＬを２つのチューブに分割して加えた。０．５ｍＬのＰＢＳを各チューブに加えた後、０．１ｍＬのＰＢＳまたは酢酸緩衝液（１．０Ｍ；ｐＨ５．７）をそれぞれ加えた。チューブを混合し、氷上で１時間インキュベートし、ボルテックスし、０．１ｍＬのアリコートを取り出して、総蛍光を決定した。次いで、各チューブを５，０００ｇで５分間遠心分離し、上清からの０．１ｍＬのアリコートを取り出して、残留（非沈殿）蛍光を決定した。
【０１８０】
結果を図８に示す。図８により、酢酸緩衝液は、かなりの量のＰＳを含有する場合でさえも、リン脂質リポソームを沈殿させないことが示されている。
【０１８１】
総合すると、本実施例のデータから、酢酸緩衝液がリン脂質小胞を沈殿させるためにＰＳが必要であるが、十分ではないことが示され、ＰＳ陽性微小小胞体およびエキソソーム、とりわけ疾患関連および腫瘍由来微小小胞体およびエキソソームを単離することに関する特異性は、酢酸緩衝液と、ＰＳが非脂質膜成分、とりわけ膜タンパク質と結合して表面上に発現する特有の微小小胞体／エキソソームの構造（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）との相互作用に起因することが示唆される。これは、微小小胞体およびエキソソームが、細胞由来および／または細胞分泌微小小胞体であって、合成脂質小胞ではないという理解を裏付けるものである。
【０１８２】
（実施例ＩＸ）
混合物からのＰＳ陽性腫瘍エキソソームの分離
【０１８３】
この実施例では、細胞外微小小胞体およびエキソソームの混合物を含有する試料から、腫瘍由来エキソソームよって例示される、ＰＳ陽性の、エキソソームなどの細胞外微小小胞体を選択的に単離する、酢酸塩による沈殿法の能力を強調する。腫瘍由来エキソソームを沈殿させる酢酸緩衝液の特異性が、エキソソーム膜外部リーフレット上のＰＳの発現に依存することも示す。
【０１８４】
ＰＳ陽性エキソソームは、ＰＳ発現４Ｔ１乳癌細胞から、ＰＳ陰性エキソソームは、対応する細胞から得た。エキソソームは、遠心分離により精製し、ＦＩＴＣ−アネキシンを用いたＦＡＣＳ解析によりＰＳ陽性またはＰＳ陰性であることを確認した（図９Ａ）。
【０１８５】
図９Ａの左パネルはアルデヒドで活性化したラテックスビーズに共有結合させたアネキシン５（陽性対照）およびＢＳＡでブロッキングしたラテックスビーズ（陰性対照）の形態の陽性および陰性対照を示している。図９Ａの右パネルに示すように、異なるエキソソーム集団をラテックスビーズに結合させ、ＦＩＴＣ−アネキシン５で標識した場合、４Ｔ１乳癌細胞からのＰＳ陽性エキソソームは、アネキシン５ビーズの陽性対照を反映するのに対して、ＰＳ陰性エキソソームは、ＢＳＡ対照のプロファイルを反映し、それらが実際にＰＳ陰性であることを示す。
【０１８６】
さらなる超遠心分離の後、ＰＳ陰性エキソソーム集団をＮ−ローダミン−ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−Ｒｈｏ−ＰＥ、赤色蛍光）で標識し、ＰＳ陽性エキソソーム集団をＮ−ＮＢＤ−ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−ＮＢＤ  ＰＥ、緑色蛍光）で標識した。両集団を遠心分離して、組み込まれていない残留プローブを除去し、試料をＦＡＣＳ解析のために残しておいた。
【０１８７】
次いで、各エキソソーム集団を別個に、ならびにＰＳ陰性およびＰＳ陽性エキソソームの両方の混合集団を１／１０容の１Ｍ酢酸塩（ｐＨ４．７５）とともに氷上で１時間インキュベートした。懸濁液を２，０００ｇで５分間遠心分離し、リン酸緩衝食塩水で再可溶化し、ＦＡＣＳ解析のためにアルデヒドラテックスビーズに結合させた（図９Ｂ）。
【０１８８】
図９Ｂは酢酸塩処理前の個別集団および混合集団の強い蛍光強度を示している（上部横列）。すなわち、ＰＳ陰性エキソソームは、強い赤色蛍光を示し（上部左パネルの左上隅）、ＰＳ陽性エキソソームは、強い緑色蛍光を示し（上部中央パネルの右下隅）、エキソソームの混合集団は、ダブルポジティブであり、赤色および緑色蛍光の両方のシフトを有する（上部右パネルの右上隅）。しかし、酢酸塩による沈殿の後には、ＰＳ陽性エキソソーム集団のみが回収された（図９Ｂ、下部横列）。赤色のＰＳ陰性集団は、沈殿後に存在しなかった、すなわち、酢酸塩で沈殿しなかった（下部左パネルにおける赤色蛍光はなし）のに対して、緑色のＰＳ集団は、酢酸塩による沈殿物から回収された（下部中央パネルにおける強い緑色蛍光）ことがわかる。非常に重要なことに、ＰＳ陽性エキソソームのみが混合調製物から回収された（下部右パネルにおける強い緑色蛍光、対応する上部右パネルで認められた赤色蛍光はなし）。
【０１８９】
したがって、これらのデータは、腫瘍エキソソームの酢酸塩媒介沈殿がエキソソーム表面におけるＰＳの発現に依存することを明確に示している。
【０１９０】
（実施例Ｘ）
ウイルスにおけるホスファチジルセリンの発現および重要性
【０１９１】
上記の実施例で、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の存在は、正常細胞とは対照的に、腫瘍由来細胞外微小小胞体およびエキソソームを選択的に単離するための酢酸緩衝液の使用における重要な識別因子であることが示されている。本実施例では、正常細胞の表面には存在しないＰＳがウイルス感染細胞およびウイルス上に露出した状態になり、ウイルス感染において重要な役割を有することを実証する本発明者らおよび同僚によるデータをまとめる。
【０１９２】
ビリオンおよびウイルス感染細胞の表面上のＰＳの存在を実証するのに使用した方法は、フローサイトメトリー／ＦＡＣＳ解析、ＥＬＩＳＡ、ビーズによる枯渇、免疫金標識、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲおよびＱ  ＲＴ−ＰＣＲを含む）および免疫蛍光顕微鏡法であった（表２Ａおよび表２Ｂ）。これらの方法は、以下で記載するように実施した。
【０１９３】
ＰＳに結合するまたはＰＳを標的とする抗体（以下で「ＰＳを標的とする抗体」と呼ぶ）を使用する際に、次の２つのカテゴリーの抗体が利用できる：ＰＳに直接結合するもの（例えば、Ranら、２００２年の９Ｄ２抗体）およびＰＳに間接的に、すなわち、β２−糖タンパク質Ｉなどの血清タンパク質を介して結合するもの（例えば、Huangら、２００５年の３Ｇ４抗体）、この場合、抗体、血清タンパク質およびＰＳが一緒に強固に結合した複合体を形成する。以下の試験では、すべての結合するステップは、間接結合抗体を含む、両方の種類のＰＳを標的とする抗体の有効な結合を保証するために血清（または血清タンパク質も使用することができる）の存在下で実施した。
【０１９４】
Ａ．  フローサイトメトリー／ＦＡＣＳ解析
許容細胞にウイルスを感染させ、感染後所定の時点に細胞をＰＳを標的とする抗体（一次抗体）とともに、続いて一次抗体（抗マウスまたは抗ヒト）を検出するための二次抗体とともにインキュベートした。この場合、二次抗体をＦＩＴＣまたはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄなどの蛍光体とコンジュゲートさせた。次いで細胞をホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーターにより解析して、感染細胞への一次抗体の結合に起因する蛍光事象を検出した。ウイルスに感染しなかった細胞を陰性対照として使用して、ウイルス感染に関連しないバックグラウンドＰＳ外在化を決定した。
【０１９５】
Ｂ．  ＥＬＩＳＡ（エボラ以外）
ＰＳを標的とする抗体（一次抗体）をポリスチレンマイクロタイタープレート上に被覆した。次いで、プレートを洗浄し、ウシ血清アルブミンまたは非熱不活性化ヒト血清のいずれかでブロッキングして、プレート上の非特異的結合部位をブロックし、次いで十分に洗浄した。ウイルスの希釈物をプレートに加え、室温で３時間結合させた。次いで、プレートを洗浄し、ビオチンコンジュゲートウイルスタンパク質特異抗体を加え、洗浄した後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを加えることによって抗体被覆プレートに付着したウイルスを検出した。ウイルスタンパク質のレベルに対応するペルオキシダーゼ活性の定量は、分光光度計を利用して比色法により実施し、対照標準と比較した。
【０１９６】
Ｃ．  ＥＬＩＳＡ（エボラ）
生エボラザイールウイルス（ＭＥ７１８株；ＥＢＯＶ）をポリスチレンマイクロプレート上に被覆した。ＰＳを標的とする抗体（ヒトＩｇＧ）の希釈物をＥＢＯＶ被覆プレートに加え、３７℃で１〜２時間結合させた。次いで、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧを加えることによって結合した、ＰＳを標的とする抗体を検出した。結合した、ＰＳを標的とする抗体のレベルに対応するペルオキシダーゼ活性の定量は、分光光度計を利用して比色法により実施し、アイソタイプ適合対照抗体と比較した。
【０１９７】
Ｄ．  ビーズによる枯渇
抗マウス抗体または抗ヒト抗体を被覆した磁気ビーズを洗浄し、次いで、それぞれマウスまたはヒトのＰＳを標的とする抗体とともにインキュベートした。次いで、被覆磁気ビーズを精製ウイルスとともにインキュベートした。磁気ビーズを除去し、許容細胞における標準プラークアッセイ手順によって溶液中の残存プラーク形成単位を決定した。
【０１９８】
Ｅ．  免疫金標識
感染細胞の上清からのビリオンをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって沈殿させ、スクロースクッションによる超遠心分離により単離した。ＰＳを標的とする抗体による固定化ウイルスへの結合は、粒子を、６ｎｍ金粒子にコンジュゲートした、ＰＳを標的とする抗体および１０ｎｍ金粒子にコンジュゲートしたウイルス特異抗体とともにインキュベートすることによって決定した。透過型電子顕微鏡法のために試料を処理して、両サイズの金粒子に対して陽性のウイルス粒子を視覚化した。
【０１９９】
Ｆ．  ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｑ  ＲＴ−ＰＣＲ
ＰＳを標的とする抗体をポリスチレンマイクロタイタープレート上に被覆した。次いで、プレートを洗浄し、ウシ血清アルブミンおよび非熱不活性化ヒト血清を加えて、プレート上の非特異的結合部位をブロックし、次いで十分に洗浄した。ウイルスの希釈物を加え、室温で３時間結合させた。次いで、プレートを洗浄し、抗体被覆プレートに付着したウイルスからのウイルス核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を単離し、精製した。ウイルスゲノムの定量は、ウイルス特異的配列プライマーを使用してＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲ、Ｑ  ＲＴ−ＰＣＲにより実施した。
【０２００】
Ｇ．  免疫蛍光顕微鏡法
カバーガラスに付着している細胞にウイルスを感染させ、生細胞をＰＳを標的とする抗体または対照抗体とともにインキュベートした後、緩衝液で洗浄することにより非結合抗体を除去することによって、感染細胞へのＰＳを標的とする抗体または対照抗体の結合を行った。ＰＳを標的とする抗体または対照抗体の局在化は、ビオチンコンジュゲート二次抗体とのインキュベーションの後のＦＩＴＣコンジュゲートストレプトアビジンとのインキュベーションにより決定した。次いで、細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過性にし、Ａｌｅｘａ−５９４（赤色）をコンジュゲートしたウイルス特異抗体によりウイルスを検出した。カバーガラスを核染色液（ＤＡＰＩ）でマウントし、スライドを、各蛍光シグナルについて共焦点顕微鏡法により調べた。
【０２０１】
上記の方法を使用して、表２Ａおよび表２Ｂに示すように、広範囲のウイルス科のウイルスおよびウイルス感染細胞の表面上にＰＳが存在することを実証した。さらに、ウイルスおよびウイルス感染細胞上のそのようなＰＳの露出が単に偶発的なものでなく、ウイルス感染における重要な役割を有することを実証するために、本発明者らおよび同僚によるデータを表２Ｃおよび表２Ｄに示す。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方での様々なウイルス科による感染を阻害するためのＰＳを標的とする抗体の使用によって示される。
【０２０２】
【表２Ａ】
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【表２Ｂ】
2017509332.tif 000006
【表２Ｃ】
2017509332.tif 000007
【表２Ｄ】
2017509332.tif 000008
【０２０３】
（実施例ＸＩ）
酢酸緩衝液を使用したウイルス微小小胞体の単離
【０２０４】
本実施例では、酢酸緩衝液を使用してエキソソームなどの細胞外微小小胞体を単離するための方法が、ウイルス感染細胞およびウイルス培養物からのエキソソームなどの細胞外微小小胞体を沈殿させるのにも有効であることを示す。
【０２０５】
約２．５ｘ１０８個のベロ細胞をウイルス感染培地（ＤＭＥＭ、抗生物質および抗真菌剤を含む２％ウシ胎児血清）中で培養し、３つの集団に均等に分割した（集団ごとに合計１０００ｍｌ培地、集団ごとに約２５個のＴ２２５フラスコ中に分散させた）。２日で約２倍加後に、第１の細胞集団を陰性対照として偽感染させ、第２の細胞集団をサル空胞形成ウイルス４０（ＳＶ４０）Ｐａ−５７株、ＬＮ  Ｌ１４１２Ａに０．１感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、第３の細胞集団を単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）Ｆ株、ＬＮ  Ｈ１４１１Ｂに０．０５ＭＯＩで感染させた。ＳＶ４０は、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科の非エンベロープウイルスであり、ＨＳＶ−１は、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科のエンベロープウイルスである。
【０２０６】
偽感染体、ＳＶ４０感染体およびＨＳＶ−１感染体をそれぞれ感染後４、７および３日目に採取した。細胞および細胞デブリを低速遠心分離（１，０００ｇで３０分間）により最初に除去し、大きい粒子を１２，０００ｇで３０分間のさらなる遠心分離によりそれらの上清から除去した。感染体のそれぞれからの上清のアリコートを感染性ウイルスを定量するために残しておいた。
【０２０７】
偽感染体、ＳＶ４０感染体およびＨＳＶ−１感染体からの澄明にした上清のそれぞれを１／１０容の酢酸ナトリウム（１．０Ｍ；ｐＨ４．７５）と別個に混合し、氷上で６０分間放置し、次いで１２，０００ｇで３０分間遠心分離した。上記偽、ＳＶ４０およびＨＳＶ−１上清をそれぞれ別個に保持し、１Ｍ  ＮａＯＨで中和した。偽感染体、ＳＶ４０感染体およびＨＳＶ−１感染体からの酢酸塩による沈殿ペレットを約２ｍｌの最終体積の再懸濁緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ）に、酸性が完全に中和されるように注意を払いながら（必要な場合、さらなる懸濁および遠心分離ステップによることを含む）、別個に再懸濁した。これらの酢酸塩による沈殿による上清および再懸濁ペレットのアリコートを感染性ウイルスを定量するために残しておいた。
【０２０８】
偽感染体、ＳＶ４０感染体およびＨＳＶ−１感染体に適用した酢酸塩による沈殿からの視覚的結果をそれぞれ図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃに示す。わかるように、偽感染体（図１０Ａ）からは肉眼で見えるペレットはほとんど存在しないが、酢酸塩による沈殿プロトコールは、ＳＶ４０感染体（図１０Ｂ）およびＨＳＶ−１感染体（図１０Ｃ）の両方からのかなり大きい、肉眼で見えるペレットをもたらした。
【０２０９】
（実施例ＸＩＩ）
単離したウイルス微小小胞体はウイルスをほとんど含まない
【０２１０】
この実施例では、ウイルス感染細胞およびウイルス培養物から酢酸塩による沈殿によって得られたエキソソームなどの細胞外微小小胞体が感染性ウイルスを本質的に含まないことを示す。
【０２１１】
上記の実施例の試験では、酢酸塩による沈殿の前の感染性ＳＶ４０およびＨＳＶ−１ウイルスの量、ならびに酢酸塩による沈殿の後の上清およびペレット中に残存している感染性ウイルスの量は、感染能を試験するＴＣＩＤ５０アッセイを使用して定量した。ＴＣＩＤ５０は、感染性ウイルス力価の尺度である。このエンドポイント希釈アッセイは、接種した組織培養細胞（この場合、ベロ細胞）の５０％に細胞変性効果をもたらすのに必要なウイルスの量を定量するものである。ＴＣＩＤ５０とプラーク形成単位（ＰＦＵ）との理論的関係は、１ＴＣＩＤ５０が０．６９ＰＦＵに等しいことである。結果を表３に示す。
【０２１２】
【表３】
2017509332.tif 000009
【０２１３】
表３に示すように、１０００ｍｌのＳＶ４０含有培地は、合計５．８ｘ１０１１ＩＵのウイルスを有していたことがわかる。酢酸塩による沈殿にかけた後、上清とペレットを合わせたものにおけるウイルスの量が２．１５ｘ１０９であったことから、５．７７８５ｘ１０１１ＩＵのＳＶ４０ウイルスがその手順中に除去され、かつ／または不活性化したことが示された。したがって、感染性ＳＶ４０ウイルスの９９．６３％が酢酸塩による沈殿中に除去され、かつ／または不活性化した。酢酸塩による沈殿の後に残存している０．３７％の感染性ＳＶ４０ウイルスのうち、９２．５％が上清に存在し、そのため、最初の出発材料のうち、０．０２８％の感染性ＳＶ４０ウイルスのみがペレットに存在していた。
【０２１４】
同様に、ＨＳＶ−１について表３に示すように、１０００ｍｌのＨＳＶ−１含有培地は、合計５．８ｘ１０１０ＩＵのウイルスを有していた。酢酸塩による沈殿にかけた後、上清とペレットを合わせたものにおけるウイルスの量が１．０６３ｘ１０９であったことから、５．６９４ｘ１０１０ＩＵのＨＳＶ−１ウイルスがその手順中に除去され、かつ／または不活性化したことが示された。この場合、感染性ＨＳＶ−１ウイルスの９８．１７％が酢酸塩による沈殿中に除去され、かつ／または不活性化した。酢酸塩による沈殿の後に残存している１．８３％の感染性ＨＳＶ−１ウイルスのうち、９３．７％が上清に存在し、そのため、最初の出発材料のうち、０．１１％の感染性ＨＳＶ−１ウイルスのみがペレットに存在する。
【０２１５】
目的が酢酸塩による沈殿法によりウイルス由来エキソソームおよび／または微小小胞体を調製することであり、したがって、図１０Ｂおよび図１０Ｃで観察される大きいペレットの両方が感染性ウイルスを本質的に含まないことが有利である。
【０２１６】
（実施例ＸＩＩＩ）
単離したウイルス微小小胞体のさらなる特徴付け
【０２１７】
本実施例では、酢酸塩による沈殿を使用して単離したウイルス由来細胞外微小小胞体およびエキソソームの予備的特徴付けの結果を報告する。
【０２１８】
Ａ．  勾配精製
異なる用語法を使用しているが、ＳｚｉｌａｇｙｉおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ（１９９１年）は、今やウイルス由来エキソソームまたは微小小胞体と称する非感染性ＨＳＶ−１膜封入粒子の存在を報告した。ＨＳＶ−１の５〜１５％Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配精製を使用して、彼らは、２つのバンド：鋭い下側のバンドおよびより広がった上側のバンド、の粒子を観察した（ＳｚｉｌａｇｙｉおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ、１９９１年における図１を参照）。下側のバンド（重い粒子またはＨ粒子と呼ぶ）は、ほぼもっぱらＨＳＶ−１ビリオンを含有すると報告されたが、上側のバンドは、０．１〜０．５％の感染性Ｈ粒子による交差汚染があるが、主として非感染性膜封入粒子（軽い粒子またはＬ粒子と呼ぶ）を含有すると言われた（ＳｚｉｌａｇｙｉおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ、１９９１年における表１を参照）。Ｌ粒子は、外観がビリオンに類似しているが、ウイルスヌクレオキャプシドを欠き、感染性ではないと報告された。今やウイルス由来微小小胞体またはエキソソームと称するのは、これらの「Ｌ粒子」である。
【０２１９】
ＳｚｉｌａｇｙｉおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ（１９９１年）技術に一般的に従って、ＨＳＶ−１感染体の酢酸塩による沈殿からの再懸濁ペレットの試料を５〜１５％Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配に適用した。再懸濁ペレット材料を、改変培地中に懸濁した５〜１５％Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）４００の３５ｍｌプレフォーム勾配上に重層し、２６，０００ｇで４℃で２時間遠心分離した。５％Ｆｉｃｏｌｌフラクション（Ｆ５）の上部の１つのバンドの存在が１５％フラクション（Ｆ１５）の上部の１つのバンドとともに認められ、両方が肉眼で見えた。本試験におけるＦ１５バンドがより広がっていたことを除いて、これらは、ＳｚｉｌａｇｙｉおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ（１９９１年）によって報告された軽いバンド（Ｆ５）および重いバンド（Ｆ１５）に類似している。
【０２２０】
２つのバンドにおける物質は、注射器の針でチューブの側面を刺すことによって別個に取り出した。上記と同じＴＣＩＤ５０アッセイを使用して感染性ウイルスを定量するためにアリコートを採取した。Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配上に加えた感染性ウイルスのうち、約０．２％のみが軽いＦ５フラクションから回収された。
【０２２１】
Ｂ．  ＦＡＣＳ解析
偽感染体およびＳＶ４０感染体の酢酸塩による沈殿からの再懸濁ペレット、ならびにＨＳＶ−１酢酸塩による沈殿のＦｉｃｏｌｌ（登録商標）分離からの２つのフラクション（Ｆ５およびＦ１５）の試料を次にＦＡＣＳ解析にかけた。異なるフラクション（それぞれ１５μｇタンパク質）をラテックスビーズに結合させ、以下の検出剤を使用してＦＡＣＳにより解析した。
【０２２２】
ＳＶ４０ウイルス抗原については、主要キャプシドタンパク質であるＳＶ４０  ＶＰ１に対するウサギポリクローナル抗体を使用し、ＨＳＶ−１ウイルス抗原については、ビリオン（Ｈ）およびいわゆるＬ粒子の両方に存在することが公知である表面糖タンパク質であるＨＳＶ  ｇＢに対するマウスモノクローナル抗体を使用した。蛍光プローブであるアロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートした抗ウサギおよび抗マウス抗体をそれぞれＳＶ４０抗体およびＨＳＶ−１抗体を検出するために使用した。フィコエリスリン（ＰＥ）にコンジュゲートした抗ＣＤ６３抗体を微小小胞体またはエキソソームを検出するために使用した。その理由は、ＣＤ６３がエキソソームに存在する膜結合タンパク質であるからである。ＦＩＴＣにコンジュゲートしたアネキシンＶをＰＳを検出するために使用した。陰性対照には、ＢＳＡラテックスビーズおよびＰＥまたはＡＰＣにコンジュゲートしたアイソタイプ対照抗体を含めた。
【０２２３】
偽感染体（標識ベロ）、ＳＶ４０感染体ならびにＨＳＶ−１感染体からのＦ５およびＦ１５フラクションからの酢酸塩ペレットのＦＡＣＳ解析による比較結果を図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃに示す。図１１Ａから、酢酸塩による沈殿試料がそれぞれのウイルス抗原（ＨＳＶ  ｇＢおよびＳＶ４０  ＶＰ１）について陽性のままであることがわかる。偽感染体から決定したバックグラウンドと比較して、ＳＶ４０およびＨＳＶ−１酢酸塩による沈殿物のそれぞれが、エキソソームマーカーＣＤ６３（図１１Ｂ）およびアネキシンＶ結合（図１１Ｃ）について示されたＰＳについても陽性である。重いバンド（Ｆ１５）および軽いバンド（Ｆ５）にさらに分画したＨＳＶ−１再懸濁酢酸塩ペレットについては、ＣＤ６３およびＰＳの両方は、Ｆ５フラクションにおいて同定され、これは、文献（ＳｚｉｌａｇｙｉおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ、１９９１年）に報告されているＬ粒子と一致している。
【０２２４】
総合すると、したがって、これらのデータは、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの両方に感染した細胞からの本質的に非感染性のＰＳ陽性細胞外微小小胞体およびエキソソームの単離と一致している。
【０２２５】
本明細書で開示し、請求する組成物および方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験なしに作製し、実施することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載したが、その変形形態は、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、組成物および方法ならびに本明細書で記載した方法のステップまたは一連のステップに適用することができることは、当業者には明らかである。より具体的には、化学的および生理学的の両方に関連するある特定の作用物質は、同じまたは類似の結果が得られる限りでは、本明細書に記載した作用物質の代わりに用いることができることは、明らかである。当業者に明らかなすべてのそのような類似の代用および修正は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあるとみなされる。
【０２２６】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載するものを補足する例としての手順または他の詳細を提供している限り、参照により本明細書に特に組み込む。
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【図１Ａ】
2017509332.tif 000010
【図１Ｂ】
2017509332.tif 000011
【図２Ａ】
2017509332.tif 000012
【図２Ｂ】
2017509332.tif 000013
【図３Ａ】
2017509332.tif 000014
【図３Ｂ】
2017509332.tif 000015
【図４Ａ】
2017509332.tif 000016
【図５Ａ】
2017509332.tif 000017
【図５Ｂ】
2017509332.tif 000018
【図７Ａ】
2017509332.tif 000019
【図７Ｂ】
2017509332.tif 000020
【図７Ｃ】
2017509332.tif 000021
【図８】
2017509332.tif 000022
【図９Ａ】
2017509332.tif 000023
【図１１Ａ】
2017509332.tif 000024
【図１１Ｂ】
2017509332.tif 000025
【図１１Ｃ】
2017509332.tif 000026
【図１Ｃ】
2017509332.tif 000027
【図４Ｂ】
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【図６】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
2017509332.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月21日(2016.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患関連細胞外微小小胞体を生体液から単離する方法であって、該疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、該方法は、該生体液の試料を、該生体液から疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、該沈殿物から疾患関連細胞外微小小胞体を収集し、それにより該疾患関連細胞外微小小胞体を単離するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記酢酸緩衝液が前記疾患関連細胞外微小小胞体上の前記ホスファチジルセリンの表面電荷を中和し、それにより、前記生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体液が疾患関連細胞外微小小胞体および正常細胞外微小小胞体を含む細胞外微小小胞体の混合集団を含有し、前記方法が、該正常細胞外微小小胞体とは対照的に、該混合集団から該疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患関連細胞外微小小胞体が、それらの形態学的もしくは機能的な特性または細胞表面抗原を実質的に損なうことなく、単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患関連細胞外微小小胞体が
（ａ）エキソソームであるか、
（ｂ）ウイルス感染細胞に由来するか、
（ｃ）腫瘍由来細胞外微小小胞体であるか、
（ｄ）腫瘍由来エキソソームであるか、または
（ｅ）ヒト細胞外微小小胞体である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記酢酸緩衝液が
（ａ）約４．２５と約５．２５の間のｐＨを有するか、
（ｂ）約４．７５のｐＨを有するか、
（ｃ）約０．０５Ｍと約０．２５Ｍの間の前記試料中最終濃度を有するか、
（ｄ）前記試料に１／１０容の１．０Ｍ酢酸緩衝液として加えられるか、
（ｅ）約４．２５と約５．２５の間のｐＨおよび約０．０５Ｍと約０．２５Ｍの間の前記試料中最終濃度を有するか、
（ｆ）約４．７５のｐＨおよび約０．１Ｍの前記試料中最終濃度を有するか、
（ｇ）酢酸ナトリウムもしくは酢酸カリウムを含むか、
（ｈ）体積排除ポリマーを本質的に含まないか、または
（ｉ）ポリエチレングリコールを本質的に含まない、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生体液が
（ａ）マウス、ウシまたはヒトの生体液であるか、
（ｂ）細胞培養上清、全血、血清、血漿、腹水、脳脊髄液、骨髄吸引液、気管支肺胞洗浄液、尿、精液、膣液、粘液、唾液、痰、または生体組織試料からの清澄にした溶解物であるか、
（ｃ）低速遠心分離に既にかけた澄明にした細胞培養上清であるか、
（ｄ）非腫瘍細胞外微小小胞体を含有する血清の存在下で培養した腫瘍細胞から得られた細胞培養上清であるか、
（ｅ）非ヒト血清の存在下で培養したヒト腫瘍細胞から得られた細胞培養上清であるか、あるいは
（ｆ）ウシ血清またはウシ胎児血清の存在下で培養したマウス腫瘍細胞またはヒト腫瘍細胞から得られた細胞培養上清である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）前記生体液を、前記酢酸緩衝液と接触させる前に低速遠心分離にかけて、細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を除去するステップ、
（ｂ）前記酢酸緩衝液との接触後の前記疾患関連細胞外微小小胞体を含有する前記沈殿物を低速遠心分離により収集するステップ、
（ｃ）前記疾患関連細胞外微小小胞体を含有する収集された前記沈殿物を、ほぼ中性ｐＨの、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液に再懸濁して、疾患関連細胞外微小小胞体の単離集団を提供するステップ、または
（ｄ）疾患関連細胞外微小小胞体の前記単離集団を遠心分離して混入成分を除去し、それにより、疾患関連細胞外微小小胞体の本質的に純粋な組成物を提供するステップ
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患関連細胞外微小小胞体における少なくとも第１のバイオマーカーを同定するかまたは定量するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
疾患関連細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清を調製する方法であって、該疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、該方法は、
（ａ）疾患関連細胞外微小小胞体を含有する疑いがある血清を、該血清から疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で形成された沈殿物を該血清から除去し、それにより、疾患関連細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清を提供するステップであって、該沈殿物は、該疾患関連細胞外微小小胞体を含有するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を実質的に含まない血液、血清または血漿を調製する方法であって、
（ａ）感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を含有する疑いがある血液、血清または血漿を、該感染性ウイルスを不活性化するかまたは沈殿させ、該血液、血清または血漿から該細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で形成された沈殿物を該血液、血清または血漿から除去し、それにより、感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を実質的に含まない血液、血清または血漿を提供するステップであって、該沈殿物は、該不活性化したかまたは該沈殿したウイルスおよび沈殿した細胞外微小小胞体を含有するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
清澄にした生体液中の疾患関連細胞外微小小胞体を検出する方法であって、該疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、該方法は、該清澄にした生体液を、該清澄にした生体液から疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、結果として生じた生体液中の濁りの存在を決定するステップであって、該結果として生じた生体液中の濁りの存在が疾患関連細胞外微小小胞体の検出を示すステップとを含む方法。
【請求項１３】
患者からの生体液中の疾患関連細胞外微小小胞体の存在を、疾患関連細胞外微小小胞体であって負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体の存在によって特徴付けられる第１の疾患を有する患者の指標とする方法であって、該方法は、該患者からの生体液中の該疾患関連細胞外微小小胞体の存在を検出し、それにより、該患者が該第１の疾患を有することが示されるステップを含み、該疾患関連細胞外微小小胞体を、
（ａ）該生体液を、該生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）結果として生じた生体液中の該沈殿物の存在を決定するステップであって、該結果として生じた生体液中の該沈殿物の存在が該疾患関連外微小小胞体の検出を示すステップと
を含む方法により検出する方法。
【請求項１４】
疾患関連細胞外微小小胞体であって負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体の量によって特徴付けられる第１の疾患を有する患者の疾患負荷をモニターすることを補助する方法であって、該方法は、該患者からの生体液中の該疾患関連細胞外微小小胞体の量を測定するステップを含み、該疾患関連細胞外微小小胞体の量を、
（ａ）該生体液を、該生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）該沈殿物中の該疾患関連細胞外微小小胞体の量を測定するステップと
を含む方法により測定する、方法。
【請求項１５】
（ａ）前記第１の疾患の実体が、該第１の疾患のバイオマーカーまたは臨床徴候について試験することによって確認されるか、
（ｂ）前記第１の疾患がウイルス感染症であるか、または
（ｃ）前記第１の疾患ががんであり、前記疾患関連細胞外微小小胞体が腫瘍由来エキソソームである、
請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
複数の時点での前記患者由来の一連の生体液試料中の腫瘍由来エキソソームの量を測定し、腫瘍由来エキソソームの量の増加が腫瘍負荷の増加を示し、該腫瘍由来エキソソームの量の減少が腫瘍負荷の減少を示す、請求項１５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
酢酸ナトリウムおよび酢酸カリウムの両方、ならびにそれらの混合物を含む酢酸緩衝液が有効である。ある特定の実施形態では、上記酢酸緩衝液は、ポリエチレングリコールなどの、体積排除ポリマー（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ）を本質的に含まない。例としての好ましい実施形態は、約４．７５のｐＨおよび約０．１Ｍの試料中最終濃度を有する酢酸ナトリウム緩衝液である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
疾患関連細胞外微小小胞体を生体液から単離する方法であって、該疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、該方法は、該生体液の試料を、該生体液から疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、該沈殿物から疾患関連細胞外微小小胞体を収集し、それにより該疾患関連細胞外微小小胞体を単離するステップとを含む方法。
（項目２）
前記疾患関連細胞外微小小胞体の表面上の前記ホスファチジルセリンが非脂質膜成分と結合して存在し、該非脂質膜成分が膜タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記酢酸緩衝液が前記疾患関連細胞外微小小胞体上の前記ホスファチジルセリンの表面電荷を中和し、それにより、前記生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させる、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記生体液が疾患関連細胞外微小小胞体および正常細胞外微小小胞体を含む細胞外微小小胞体の混合集団を含有し、前記方法が、該正常細胞外微小小胞体とは対照的に、該混合集団から該疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させる、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記疾患関連細胞外微小小胞体が、それらの形態学的もしくは機能的な特性または細胞表面抗原を実質的に損なうことなく、単離される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記細胞外微小小胞体がエキソソームである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記疾患関連細胞外微小小胞体が細胞内寄生生物に感染した細胞に由来する、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記疾患関連細胞外微小小胞体がウイルス感染細胞に由来する、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
ウイルス感染細胞から感染性ウイルスを実質的に含まない疾患関連細胞外微小小胞体を単離する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記疾患関連細胞外微小小胞体が腫瘍由来細胞外微小小胞体である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記腫瘍由来細胞外微小小胞体が、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、前立腺がん、乳がんまたは卵巣がんに由来する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記腫瘍由来細胞外微小小胞体が腫瘍由来エキソソームである、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１３）
前記疾患関連細胞外微小小胞体がヒト細胞外微小小胞体である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記酢酸緩衝液が約４．２５と約５．２５の間のｐＨを有する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記酢酸緩衝液が約４．５と約５．０の間のｐＨを有する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記酢酸緩衝液が約４．７５のｐＨを有する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記酢酸緩衝液が約０．０５Ｍと約０．２５Ｍの間の前記試料中最終濃度を有する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記酢酸緩衝液が約０．０５Ｍと約０．１Ｍの間の前記試料中最終濃度を有する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記試料に１／１０容の１．０Ｍ酢酸緩衝液を加える、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記酢酸緩衝液が約４．２５と約５．２５の間のｐＨおよび約０．０５Ｍと約０．２５Ｍの間の前記試料中最終濃度を有する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記酢酸緩衝液が約４．５と約５．０の間のｐＨおよび約０．０５Ｍと約０．１Ｍの間の前記試料中最終濃度を有する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記酢酸緩衝液が約４．７５のｐＨおよび約０．１Ｍの前記試料中最終濃度を有する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記酢酸緩衝液が酢酸ナトリウムを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記酢酸緩衝液が酢酸カリウムを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記酢酸緩衝液が体積排除ポリマーを本質的に含まない、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記酢酸緩衝液がポリエチレングリコールを本質的に含まない、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記酢酸緩衝液が、約４．７５のｐＨおよび約０．１Ｍの前記試料中最終濃度を有する酢酸ナトリウムである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
前記生体液がマウス、ウシまたはヒトの生体液である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
前記生体液が細胞培養上清、全血、血清、血漿、腹水、脳脊髄液、骨髄吸引液、気管支肺胞洗浄液、尿、精液、膣液、粘液、唾液、痰、または生体組織試料からの清澄にした溶解物である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目３０）
前記生体液が細胞培養上清、血清、血漿または腹水である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記生体液が、低速遠心分離に既にかけた澄明にした細胞培養上清である、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記生体液が、非腫瘍細胞外微小小胞体を含有する血清の存在下で培養した腫瘍細胞から得られた細胞培養上清である、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記生体液が、非ヒト血清の存在下で培養したヒト腫瘍細胞から得られた細胞培養上清である、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記生体液が、ウシ血清またはウシ胎児血清の存在下で培養したマウス腫瘍細胞またはヒト腫瘍細胞から得られた細胞培養上清である、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記生体液を、前記酢酸緩衝液と接触させる前に低速遠心分離にかけて、細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を除去するステップをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記酢酸緩衝液との接触後の前記疾患関連細胞外微小小胞体を含有する前記沈殿物を低速遠心分離により収集する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記疾患関連細胞外微小小胞体を含有する収集された前記沈殿物を、ほぼ中性ｐＨの、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液に再懸濁して、疾患関連細胞外微小小胞体の単離集団を提供するステップをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
疾患関連細胞外微小小胞体の前記単離集団を遠心分離して混入成分を除去し、それにより、疾患関連細胞外微小小胞体の本質的に純粋な組成物を提供するステップをさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
（ａ）腫瘍由来エキソソームおよび非腫瘍エキソソームを含むエキソソームの混合集団を含有する生体液を得るステップと、
（ｂ）該生体液を、該生体液から非腫瘍エキソソームではなく腫瘍由来エキソソームを選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｃ）該腫瘍由来エキソソームを選択的に含有する、ステップ（ｂ）からの沈殿物を収集するステップと、
（ｄ）該沈殿物を、ほぼ中性ｐＨの、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液に再懸濁し、それにより、非腫瘍エキソソームを本質的に含まない腫瘍由来エキソソームの精製集団を提供するステップと
を含む、項目１２に記載の方法。
（項目４０）
（ａ）腫瘍由来エキソソームおよび非腫瘍エキソソームを含むエキソソームの混合集団を含有する生体液を得るステップと、
（ｂ）該生体液について第１の低速遠心分離を実施して、細胞、細胞デブリおよび大きい膜小胞を本質的に含まない、清澄にした液を提供するステップと、
（ｃ）該清澄にした液を、選択的に沈殿した腫瘍由来エキソソームを含むが、沈殿した非腫瘍エキソソームを実質的に含まない混濁懸濁液を提供するのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液とともに、有効な時間、インキュベートするステップと、
（ｄ）該混濁懸濁液を低速遠心分離にかけて、該腫瘍由来エキソソームを選択的に含む沈殿物、および上清を提供するステップと、
（ｅ）該腫瘍由来エキソソームを含む該沈殿物を収集するステップと、
（ｆ）該沈殿物を、ほぼ中性ｐＨの、実質的に酢酸塩を含まない緩衝液に再懸濁し、それにより、腫瘍由来エキソソームを含み、非腫瘍エキソソームを本質的に含まない精製エキソソーム集団を提供するステップと、任意選択で、
（ｇ）該精製エキソソーム集団をさらなる遠心分離にかけて、非エキソソーム成分を含むペレットを提供し、該ペレットを除去し、それにより、非腫瘍エキソソームおよび非エキソソーム成分の両方を実質的に含まない腫瘍由来エキソソームの本質的に純粋な組成物を提供するステップと
を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記疾患関連細胞外微小小胞体における少なくとも第１のバイオマーカーを同定するかまたは定量するステップをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
前記バイオマーカーがＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質バイオマーカーである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
正常細胞外微小小胞体を含有する血清の存在下で培養した罹患細胞の上清から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体を得る方法であって、該上清を、該上清から疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、該沈殿物を収集し、それにより、該血清中の正常細胞外微小小胞体の実質的な混入なしで、該上清から疾患関連細胞外微小小胞体を得るステップとを含む方法。
（項目４４）
前記罹患細胞が、ウシ血清またはウシ胎児血清の存在下で培養したマウス腫瘍細胞またはヒト腫瘍細胞である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
疾患関連細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清を調製する方法であって、該疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、該方法は、
（ａ）疾患関連細胞外微小小胞体を含有する疑いがある血清を得るステップと、
（ｂ）該血清を、該血清から疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された沈殿物を該血清から除去し、それにより、疾患関連細胞外微小小胞体を実質的に含まない血清を提供するステップであって、該沈殿物は、該疾患関連細胞外微小小胞体を含有するステップと
を含む方法。
（項目４６）
前記疾患関連細胞外微小小胞体がウイルス感染細胞に由来する、項目４３または４５に記載の方法。
（項目４７）
前記疾患関連細胞外微小小胞体が腫瘍由来エキソソームである、項目４３または４５に記載の方法。
（項目４８）
感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を実質的に含まない血液、血清または血漿を調製する方法であって、
（ａ）感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を含有する疑いがある血液、血清または血漿を得るステップと、
（ｂ）該血液、血清または血漿を、該感染性ウイルスを不活性化するかまたは沈殿させ、該血液、血清または血漿から該細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された沈殿物を該血液、血清または血漿から除去し、それにより、感染性ウイルス、およびウイルス感染細胞に由来する細胞外微小小胞体を実質的に含まない血液、血清または血漿を提供するステップであって、該沈殿物は、該不活性化したかまたは該沈殿したウイルスおよび沈殿した細胞外微小小胞体を含有するステップと
を含む方法。
（項目４９）
輸血の前に実施される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
清澄にした生体液中の疾患関連細胞外微小小胞体を検出する方法であって、該疾患関連細胞外微小小胞体は、負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有し、該方法は、該清澄にした生体液を、該清澄にした生体液から疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、結果として生じた生体液中の濁りの存在を決定するステップであって、該結果として生じた生体液中の濁りの存在が疾患関連細胞外微小小胞体の検出を示すステップとを含む方法。
（項目５１）
前記結果として生じた生体液中の濁りの存在が視覚的に検出される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記疾患関連細胞外微小小胞体が腫瘍由来エキソソームである、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
検出可能な濁りを有する前記結果として生じた生体液から前記腫瘍由来エキソソームを単離するステップをさらに含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
低速遠心分離を使用して沈殿物を収集することによって、前記腫瘍由来エキソソームが検出可能な濁りを有する前記結果として生じた生体液から単離される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
疾患関連細胞外微小小胞体であって負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体の存在によって特徴付けられる第１の疾患を有する患者を診断する方法であって、該方法は、該患者からの生体液中の該疾患関連細胞外微小小胞体の存在を検出し、それにより、該患者を該第１の疾患を有すると診断するステップを含み、該疾患関連細胞外微小小胞体を、
（ａ）該生体液を、該生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）結果として生じた生体液中の該沈殿物の存在を決定するステップであって、該結果として生じた生体液中の該沈殿物の存在が該疾患関連外微小小胞体の検出を示すステップと
を含む方法により検出する方法。
（項目５６）
前記生体液が清澄にした生体液であり、前記結果として生じた生体液中の前記沈殿物の存在が該結果として生じた生体液中の濁りの存在によって決定される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記疾患関連細胞外微小小胞体の量を定量する、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
疾患関連細胞外微小小胞体であって負に荷電したホスファチジルセリンをその表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体の量によって特徴付けられる第１の疾患を有する患者の疾患負荷をモニターする方法であって、該方法は、該患者からの生体液中の該疾患関連細胞外微小小胞体の量を測定するステップを含み、該疾患関連細胞外微小小胞体の量を、
（ａ）該生体液を、該生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を選択的に沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液と接触させるステップと、
（ｂ）該沈殿物中の該疾患関連細胞外微小小胞体の量を測定するステップと
を含む方法により測定する、方法。
（項目５９）
前記第１の疾患の実体が、該第１の疾患のバイオマーカーまたは臨床徴候について試験することによって確認される、項目５５または５８に記載の方法。
（項目６０）
前記第１の疾患がウイルス感染症である、項目５５または５８に記載の方法。
（項目６１）
前記第１の疾患ががんであり、前記疾患関連細胞外微小小胞体が腫瘍由来エキソソームである、項目５５または５８に記載の方法。
（項目６２）
複数の時点での前記患者から得られた一連の生体液試料中の腫瘍由来エキソソームの量を測定し、腫瘍由来エキソソームの量の増加が腫瘍負荷の増加を示し、該腫瘍由来エキソソームの量の減少が腫瘍負荷の減少を示す、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
生体液から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させることによる診断に使用するのに有効なｐＨおよび濃度を有する酢酸緩衝液。
（項目６４）
生体液から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させることによる治療に使用するのに有効なｐＨおよび濃度を有する酢酸緩衝液。
（項目６５）
生体液から、負に荷電したホスファチジルセリンを表面上に有する疾患関連細胞外微小小胞体を単離するためのキットであって、生体液から該疾患関連細胞外微小小胞体を沈殿させるのに有効なｐＨおよび濃度の酢酸緩衝液ならびに使用のための指示を含むキット。
（項目６６）
疾患関連細胞外微小小胞体における１つまたは複数のバイオマーカーを同定するかまたは定量するのに使用する少なくとも第１の試薬をさらに含む、項目６５に記載のキット。
【国際調査報告】
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