(57)【要約】  無エクスポゾーム条件下でドナーから採取された周産期細胞に由来するiPSCまたはiPSC由来細胞において刺激応答試験を行う方法が提供される。ある実施形態では複数のドナーが関与する。他の実施形態ではiPSCは分化される。新生児に由来する細胞から誘導された人工多能性幹細胞（iPSC）の使用は、加齢および環境的曝露の影響を大部分除去することを可能にし、刺激と試験対象の間の直接的相互作用に的を絞った分析を可能にする。複数のドナーに由来する細胞から誘導されたiPSCの使用は、試験対象間で異なる加齢と環境の影響の大部分を排除することにより、他の試験材料を使用した場合と比べて、所与の刺激に対する応答の決定における遺伝学的差異の役割をより正確に測定することを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激に対する試験試料の応答を決定するための方法であって、前記方法は、
a）前記試験試料に前記刺激を適用する工程であって、前記試験試料は、1つ以上の人工多能性幹細胞またはそれから分化された1つ以上の細胞を含み、前記人工多能性幹細胞は1以上のドナーから単離された周産期細胞に由来するものであり、前記周産期細胞は無エクスポゾーム条件下で1以上のドナーから単離されたものである工程と、
b）前記刺激に対する前記試験試料の応答を検出する工程と
を含み、非刺激対照と比較した場合の応答の検出は、前記刺激が前記試験試料において影響を有することを示す、前記方法。
【請求項２】
前記ドナーがヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記刺激が化学物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記化学物質が医薬化合物である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記刺激が生物学的物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記分化された細胞は1つ以上の組織を形成している、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
ドナーの数が10以上である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記応答が定量化される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
刺激に対する複数の試験試料の応答における、遺伝学的差異の影響を決定する方法であって、前記方法は、
a）前記試験試料に前記刺激を適用する工程であって、各々の試験試料が1つ以上の人工多能性幹細胞またはそれから分化された1つ以上の細胞を含み、前記人工多能性幹細胞は1以上のドナーから単離された周産期細胞に由来するものであり、前記周産期細胞は無エクスポゾーム条件下で1以上のドナーから単離されたものである工程と、
b）前記刺激に対する前記試験試料の応答を検出する工程と
を含み、他の試験試料と比較した場合の応答の検出は、前記刺激が、前記試験試料において、試料の遺伝学的差異による影響を有することを示す、前記方法。
【請求項１０】
前記周産期細胞は、無エクスポゾーム条件下で1以上のドナーから単離されたものである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナーがヒトである、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
前記刺激が化学物質である、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学物質が医薬化合物である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記刺激が生物学的物質である、請求項9に記載の方法。
【請求項１５】
前記分化された細胞は1つ以上の組織を形成している、請求項9に記載の方法。
【請求項１６】
ドナーの数が10以上である、請求項9に記載の方法。
【請求項１７】
前記応答が定量化される、請求項9に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、細胞の挙動に対する環境的因子の影響が最小限化されている人工多能性幹細胞を使用して刺激応答試験を行う方法、あるいは、これらから分化された細胞を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬の投与、ならびに化学物質、細菌およびウイルスへの曝露のような、様々な刺激に対する細胞と組織の生物学的応答の根底にある要因に、科学コミュニティは長年関心を寄せてきた。科学者らは、以下の因子が応答において鍵となる役割を果たすことを認識してきた：刺激の性質；試験対象の遺伝学的プロファイル；試験対象の年齢；ならびに、その対象がその生存期間を通して耐えてきた食事、疾患、化学物質、および環境面の負荷（insults）のような身体的曝露の固有の履歴。しかしながら、科学者らは、これら多様な因子の貢献を分析することに苦慮してきた。なぜならば、試験対象から入手可能なあらゆる細胞または組織、および関連する試験方法論は、不可避的に、4つ全ての因子の個体特異的な組合せを示したからである。
【０００３】
医薬および環境毒性学のような特定の分野の科学者らは、多数の試験対象における所与の刺激に対する生物学的応答の相違の根底にある要因を決定することに特に関心を寄せてきた。科学者らは、遺伝学的多様性が生物学的応答の相違において果たす役割を発見することに特に注目してきた。しかしながら、その役割を識別することは難しい。成功するためには、科学者らは、4つの問題を同時に克服しなければならない。
【０００４】
問題1：科学者らは、大きな標本基礎を必要とする。なぜならば、遺伝学的プロファイルの多様性は非常に広範であり、特定の刺激に対する応答において正確にどの遺伝子の群が関与しているかについての事前の手引きは通常存在しないからである。
【０００５】
問題2：科学者らは、刺激応答実験（インビボまたはインビトロ）において負荷を与えたときの応答が、生物体個体としての試験対象の応答を少なくとも1つの適切な態様において予測するものである、（細胞、組織、器官、または動物個体もしくは人間の形態の）試験プラットフォームを必要とする。
【０００６】
問題3：科学者らは、変動が実験手順における変動ではなく遺伝学的差異によるものとなるように、適切な対照を用いて刺激応答実験を行う必要がある。
【０００７】
問題4：科学者らは、外来性因子の「ノイズ」を効果的に克服しなければならない。すなわち、一対象由来の細胞または組織の生物学的応答は、その対象の特異的な遺伝学的プロファイルに依存するだけでなく、その対象の年齢、および様々な外的な力（例えば食事、疾患、化学物質、および環境的汚染）への曝露についてのその対象に固有の履歴にも依存するという事実に科学者らは対処しなければならない。
【０００８】
試験プラットフォーム（すなわち、細胞、組織、器官、または動物個体もしくは人間）および試験対象そのものの性質が、科学者らがこれらの問題の各々を克服できる度合いにおいて重要な役割を果たす。
【０００９】
今日まで、生物学的応答の根底にある要因を研究するための科学コミュニティの主要なツールは、疫学データに基づく大規模遺伝子相関研究であった。このアプローチは問題1と2（大きな標本基礎、および試験対象の応答を予測する応答を有する試験プラットフォームであること）に十分に対処できるが、問題3と4（実験手順における変動が最小限であること、および外来性因子の「ノイズ」の除去）については不十分である。例えば候補薬剤やプラシーボを指導されたように服用しなかったり、その薬剤に対する生物学的応答を正確に報告しなかったりするような、試験対象の個体特異的行動は広範囲に及ぶこと、そして実験の整合性を妨げることはよく知られている。さらに、全ての試験対象は、他の対象のものとは大抵異なる特定の年齢を有しており、また、外的な力への曝露の固有の履歴を有している。結果として、遺伝学的特徴により果たされる役割についての統計学的発見は多くの場合おぼろげであり、小さな影響を示すにとどまる。
【００１０】
これに対して、ある科学者らは、生きたヒトまたは屍体から採られた初代細胞または組織を使用して、細胞ベースまたは組織ベースのモデルに基づいて刺激応答実験を行うことを選んだ。これらの試料は取得するのが難しくかつ高価であり、従って問題1の犠牲となる―遺伝学的研究の統計学的要件を満たすための十分に大きなドナー群から試料を集めることが不可能なのである。さらに、これらのモデルは問題4（すなわち、年齢および曝露履歴による干渉）を克服することができない。
【００１１】
問題1を克服するための代替的試みにおいて、ある科学者らは、腫瘍性の細胞または人工操作された細胞を試みてきた。これらの試料は問題2（すなわち、試験に使用される細胞の応答が、それらが体現すべき生物体の応答を表すものではないこと）、および問題4（すなわち、加齢（age）および曝露履歴による干渉）の犠牲となるリスクを有する。
【００１２】
最近になって、科学者らは、刺激応答研究において、人工多能性幹細胞（iPSC）、あるいはiPSCから誘導された機能的細胞を使用し始めた。そのような細胞は、問題1（大きな標本基礎の必要性）、問題2（体現的な試験プラットフォームの必要性）、および問題3（実験手順対照の必要性）を克服する。第一に、それらは多数の対象から得ることができる。第二に、細胞が非組込み型の方法を介して多能性状態に完全にリプログラミングされている限り、遺伝学的プロファイルを壊すことなく応答を臨床的結果と関連付けることができる。そして第三に、刺激応答実験はコントロールすることができる。
【００１３】
しかしながら、問題4はまだ克服されていない。成体体細胞からリプログラミングされたiPSCを使用して今日までに行われた刺激応答実験は、リプログラミングされた体細胞のドナーの年齢、および、そのドナーの固有の曝露履歴を埋め込んでいる。今日までそのような実験における全てのドナーは成体であったため、年齢および曝露履歴における変動性が大きい。
【００１４】
試験対象の年齢が身体の生物学的プロセスに影響することはよく確立されている（Finch 1990, Vijg 2000, Ono et al 2002, Trifunovia and Larssen 2008）。科学コミュニティは、（1）加齢が細胞または組織のレベルで有する全ての影響は理解しておらず、（2）理解されている影響を人工的にいかに逆転または除去できるかも理解していないため、これは問題となる。従って、加齢の影響を最小限化するための試みは、細胞に既に存在している加齢の影響を除去する努力を通じては達成することができない。
【００１５】
同様に、疾患、汚染物質、医薬、またはレクリエーショナルドラッグのような多岐にわたる環境的曝露、さらには食事までもが、後続の刺激に対する反応における永続的な変化につながり得ることも、科学文献においてよく確立されている。しかし、年齢の場合と同じように、科学者らはこれらの影響の全容も性質も理解しておらず、細胞または組織からこれらの影響をいかに除去できるかも理解していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、ドナーの試料由来のiPSCを取得し利用するための方法であって、加齢または異なる環境的曝露の影響を埋め込んでおらず、従ってこれらの因子における差異が刺激応答挙動に異なる影響を与える可能性を排除する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本開示では、無エクスポゾーム（null-exposome）条件下でドナーから採取された周産期（perinatal）細胞から誘導されたiPSCあるいはそのiPSCに由来する細胞において刺激応答試験を行う方法が提供される。いくつかの実施形態では、複数のドナーが関与する。さらに、いくつかの実施形態では、iPSCは、心筋細胞または神経細胞のような機能的細胞型へと分化される。
【００１８】
本方法に従って、試験のために適切な無エクスポゾーム条件が同定され、採取すべき周産期細胞の種類が特定され、最適なドナー選択条件が決定され、細胞採取手順が確立され、試験により要求される無エクスポゾーム条件を満たし得る潜在的ドナーが同定される。
【００１９】
実際にその同定された細胞が同定されたドナーから記載された方法において採取され、iPSCに転換され、任意で多様な機能的細胞型のいずれかへと分化され、任意で組織へと形成され、刺激が適用され、結果としての生物学的応答が測定され分析された場合に、科学的に有用な測定がもたらされる。任意で、実務者は、プロセスのあらゆる適切な時点においてその細胞（またはその子孫もしくはあらゆる誘導細胞）を凍結保存し後で解凍し得る。
【００２０】
刺激の性質；試験対象の遺伝学的プロファイル；試験対象の年齢；ならびに、その対象がその生存期間を通して耐えてきた食事、疾患、化学物質、および環境面の負荷のような身体的曝露の固有の履歴という、4つの因子が相互作用して、特定の試験対象あるいは試料からの個々の細胞または組織の、特定の刺激に対する生物学的応答を決定する。無エクスポゾーム条件下でドナーから採取された周産期細胞から誘導された人工多能性幹細胞（iPSC）の使用は、実務者が加齢および環境的曝露の影響を大部分除去することを可能にし、刺激と試験試料との間の直接的相互作用の、より的を絞った分析を可能にする。さらに、複数のドナーからの周産期細胞に由来する細胞から誘導されたそのようなiPSCの使用は、試験対象間の年齢および環境の異なる影響のほとんどの部分を排除することにより、他の試験材料の使用と比べて、所与の刺激に対する異なる応答の決定における遺伝学的差異の役割のより正確な測定を、実務者が得ることを可能にし得る。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
人工多能性細胞（iPSC）あるいはそれから誘導された細胞が利用される、刺激応答試験を行うための方法が、本開示において提供される。この方法において使用されるiPSCは、事前に選ばれたドナーから無エクスポゾーム条件下で得られた周産期細胞から作製されたものである。いくつかの実施形態では、複数のドナーが関与する。さらに、いくつかの実施形態では、iPSCは機能的な細胞型に分化される。
【００２２】
試験を行う前に、以下の3つの独立した行為が決定される：（a）試験にとって適切な無エクスポゾーム条件が特定されなければならない；（b）取得するべき周産期細胞の種類、そしてドナー選択条件および細胞採取手順が決定されなければならない；（c）試験により要求される無エクスポゾーム条件を満たす潜在的なドナー（または複数のドナー）が同定される。
【００２３】
特定種類の周産期細胞が、同定されたドナーから無エクスポゾーム条件下で採取され、iPSCに変換され、（そのときの試験にとって適切であれば）多様な機能的細胞型の1つまたは複数に分化され、（やはり、適切であれば）組織へと組み合わされ、刺激が適用され、そして得られる生物学的応答が測定され分析された場合に、本開示で提供される方法の使用から科学的に有用な情報がもたらされる。任意で、プロセスのあらゆる適切な時点においてその細胞（またはその子孫もしくはあらゆる誘導細胞）を凍結保存し後で解凍される。
【００２４】
［定義］
【００２５】
本開示において使用される場合、「周産期間（perinatal period）」という用語は、出生の時の周辺の生命段階を意味し、具体的には、出生の直前および直後の時間、例えば妊娠第二期（second trimester）の始めから出生後6ヵ月以内までを意味する。
【００２６】
本開示において使用される場合、「周産期細胞」という用語は、周産期間中のドナー（ヒトまたはその他の哺乳類）に由来するものとして遺伝学的に同定され得るあらゆる細胞を意味する。周産期細胞は以下のものを含むがこれらの限定されない：臍帯血細胞、またはあらゆる種類の臍帯組織（それに由来するあらゆる細胞を含む）；末梢血細胞；羊水幹細胞（羊水に直接見出されるものであっても、胎盤もしくはそれ以外の場所から採られるものであってもよい）；新生児尿に見出される細胞；皮膚（皮膚線維芽細胞を含む）または毛から得られる細胞；および、ドナーの頬または消化経路の拭き取り検体を介して得られる細胞。
【００２７】
本開示において使用される場合、「エクスポゾーム」という用語は、行動、食事、疾患、細菌、ウイルス、医薬品、化学物質、および環境からの曝露を含むがこれらに限定されない、ヒトまたはその他の哺乳類の生存期間全体に渡る生物学的応答の環境的影響、ならびに、その後の生物学的応答に永続的に影響する、これら外的刺激に対するあらゆる過去の内的応答の累積的程度を意味する。従って、この定義は、外的負荷の直接的影響だけでなく、そのような負荷の間接的効果、例えばエピジェネティックな変化、瘢痕、DNA変異、あるいはより大きな染色体性損傷をも含む。
【００２８】
本開示において使用される場合、「無エクスポゾーム条件」という用語は、細胞の実験的応答に対する、細胞自体の加齢関連作用またはエクスポゾームへの細胞の曝露に起因する影響を（その実験のために定められた許容可能な耐容範囲内に）制限、低減、または排除するために研究者が何らかの種類の対策を講じた細胞から、細胞、細胞の組、または組織の全体もしくは一部が構成された条件を意味し、そのような行為は、選択基準の利用、妊娠または出産の際に行動を制限するように母親を誘導すること、ならびに、採取および処理の際に供給源細胞を曝露から遮蔽する行為を含み得るが、これらに限定されない。複数の試験対象が関与する状況においては、無エクスポゾーム条件は、エクスポゾームへのいくらかの曝露を経験した細胞を含むが、ただし、（1）その曝露が、調査中の実験または試験における応答に対しておそらくごく小さな影響しか有さないと判断されること；（2）試験対象間の曝露の差異を最小限化するためのステップが採られていること；および（3）曝露に関してドナー間に残された差異が、その実験または試験のために定められた許容可能な耐容範囲内に収まると明確に判断されること、を条件とする。
【００２９】
本開示において使用される場合、「刺激（複数可）」という用語は、単独、複数、または組合せで適用され、調べられている細胞または組織の挙動または構造において反応を引き起こし得る、外因性のあらゆる物理的もしくは物質的な力を意味する。刺激の例としては、医薬化合物および産業的化学物質を含む化学物質；細菌、ウイルス、カビ、マイコプラズマ、アレルゲンその他の病原体のような、生物学的物質；光；熱；音；気圧；電気的衝撃；身体的外傷；放射線；および、外因的に誘導された細胞自体の物理的活性によりもたらされるものも含むあらゆる形態の身体的ストレスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
［方法開発］
【００３１】
出願人らは、一以上の試験対象における刺激に対する生物学的応答の要因を精査するという課題において、（1）遺伝学的影響を加齢および曝露の影響から分離する唯一の方法は、同一の年齢であり、全てのドナー間で非常に類似した穏和な環境に最小限にかぎり曝露されたことが明確に知られている試験対象から構築されたプラットフォームにおいて刺激応答試験を行うことであるということ、および（2）実際的な観点からこれらの条件を満たす唯一の潜在的試験対象は、胎児または新生児であるドナーの細胞であるということを推論した。
【００３２】
出願人らはさらに、（i）胎児または新生児のほとんどの細胞型（例えば胚性幹細胞、羊水細胞、初代細胞）は、刺激応答試験のための適性において制約を含むこと、（ii）周産期細胞から誘導されるiPSCは、刺激応答試験に非常に適している可能性があること、（iii）しかしながら、周産期細胞由来iPSCを使用するという実務者の決定は、それ自体では、加齢および環境的曝露の影響を、細胞から、そしてひいては刺激応答試験から、除去するために必要な無エクスポゾーム条件をもたらさず、追加的な決定およびコントロールが必要とされること、ならびに、（iv）刺激応答試験において無エクスポゾーム条件を達成するために3セットの相互依存的な行為が必要であることを推論した。
【００３３】
これらの推論（i）から（iv）までのそれぞれを以下において詳細に論ずる。
【００３４】
（i）胎児または新生児のほとんどの細胞型（例えば胚性幹細胞、妊娠第一期羊水細胞、初代細胞）は、刺激応答試験のための適性において制約を含む。出願人らは、いくつかの細胞型の適性を再検討した。すなわち、胚性幹細胞；周産期間前の期間からの初代細胞の直接的使用；周産期間前の羊水に由来する細胞の直接的使用；および、（下記で項目（ii）の下で論ずるような、周産期細胞から誘導されたiPSCの使用とは別に）初代周産期細胞の直接的使用である。
【００３５】
インビトロで培養される胚性幹細胞（ESC）およびそれから誘導される細胞は、刺激応答試験のための基礎としては限られた有用性を有し得る。それらは、「理論的ゼロ年齢」である唯一の細胞であるということから利益を得る。しかしながら、ESCは単一ドナーの実験のためには有用であり得るが、複数ドナーの実験には適していない。なぜならば、関わってくる倫理的問題に鑑みると、異なる応答における遺伝学の影響についての統計学的に有意な分析を可能にするために十分に多い数のドナー胚から実務者がESCの集団を開発できる可能性は非常に低いからである。
【００３６】
周産期間前の期間からの初代細胞の直接的使用は、胎児へのある程度の侵襲性がなければ得ることができず、倫理面、安全面、および実践面での問題が妨げとなる。
【００３７】
周産期間前に採取される羊水からの細胞の直接的使用（すなわち、本発明で記述されるようなiPSCへのトランスフェクション後の機能的細胞型への分化を介するものではなく、それら細胞そのものの使用、またはそのような細胞から直接分化した細胞の使用）は、複数の問題点を有する。第一に、そのような細胞は、より若いという点において周産期細胞に対するいくらかの優位性を有し得るが、そのような細胞は、例えば成熟心筋細胞などのいくつかの重要な機能的細胞型に分化することができないことが示されてきたことを実務者は見出す。さらに、少なくとも以下の3つの理由により、試験対象間の相互比較性が問題となる：（1）正確に同じ年齢の細胞を得ることが極めて難しい（例えば平均45日齢である妊娠第一期細胞のような、極めて若い細胞を扱う場合には、加齢のいかなる偏差（例えば5日）であっても著しい変動に相当することに注意）；たとえ、多数の母親に（受胎時を基準にして）正確に「同じ」時間に羊水穿刺術を行うことに同意してもらうことが調整できたとしても、受胎の正確な日付が知られていることはほとんどないため、実務者はそれぞれの母親についてその時間を特定することはできないであろうから、年齢一致はせいぜい概算であろう。（2）2つの胎児が正確に同じ速度で発達することはなく、特に妊娠第一期のあいだはそうである；従って、受胎後のいずれの特定の日付においても、異なる胎児は異なる発達点にある。同じ曝露が胎児の発達の異なる時点において異なる影響を有することが示されているから、これは曝露の見込まれた影響における明白な（しかし分析不能な）差異を創出する。（3）羊水中には多くの種類の「幹細胞」が存在することが知られており、受胎後の一の時点におけるいずれか特定の羊水細胞型の特徴における、胎児間の多様性に関する研究は、ほとんど存在していない。従って、可能な限り若い細胞の使用を追及することは、試験対象間で同等の無エクスポゾーム条件を達成するうえでの著しい「ノイズ」の導入という代償を伴う。
【００３８】
初代周産期細胞、およびその他の周産期細胞または出生付近細胞（near-natal cells）は、年齢・曝露ニュートラルな刺激応答試験のためには概して良好でない候補である。健常な乳児の初代培養組織は、関わってくる倫理的な問題、ならびに、一対象からの組織の供給は供給量および時間の両方において限定されており従って実験間比較を難しくするという事実のために、有用性が限られている。死産乳児または中絶胎児からの組織はこれらの同じ制約を受け、また、必然的に、発達になんらかの異常があるかまたは望ましくないもしくは致死的な環境的曝露を受けたものである。
【００３９】
（ii）上記全ての細胞型および供給源と対比して、周産期細胞から発生させたiPSCは、刺激応答試験に非常に適している。
【００４０】
出産の時に直ちに採取される周産期細胞は、複数の試験対象に渡り機能的に同等であるゼロ年齢条件を達成するための最善の実際的選択肢を提供する。満期（full-term）出産で（しかし過熟期（post-mature term）ではなく）産まれた新生児は本質的に年齢同等でありかつ発生学的に同等であるという前提を、科学は長年認めてきた。この前提の知的根拠は、出生のためにその特定の胎児が発生学的に準備完了状態となる時点において母体と胎児とが典型的に協調して出産プロセスを開始するということである。胎児に応じてその時間は（受胎時を基準にして）より早く来たり遅く来たりし得るが、出生のときには各新生児の発生学的年齢は同等とみなされる。幼児期発達および医学の分野全体で、参照すべき中心的年齢パラメータとして暦年齢（すなわち誕生からの時間）に頼っているのは、そのためである。従って、加齢の影響を最小限にするためには、実務者は、集団中の全ての試験対象について、実際上可能な限り誕生の瞬間に近いものとして周産期細胞を取得し得る。
【００４１】
刺激応答試験において使用するための、新生児から非侵襲的に採取できる材料（すなわち周産期細胞）から創出されるiPSCの使用は、上述した4つの問題の全てを克服し得る。第一に、採取は非侵襲的であり得、もたらされるiPSCは無限に複製し得る（従って複数の実験における使用のために利用可能である）ので、必要な供給源材料を良好な費用効果で多数のドナーから取得し利用することができる。第二に、iPSC（およびその誘導細胞）の応答は、臨床的結果と関連する予測をもたらすことが示されている。第三に、インビボではなくインビトロで実験が行われるため、厳密な実験コントロールを適用することができる。第四に、妊娠のあいだ母親の環境的曝露および個人的消費行動が類似していた新生児のみからドナー細胞を出生時に得ることにより、実務者は、試験対象間の年齢的差異を無くすとともに、曝露的差異を、成体ドナー間で経験されるものと比べてごく僅かにまで低減させることができる。
【００４２】
年齢・曝露ニュートラルな刺激応答試験のために周産期細胞由来のiPSCを使用することに関する可能性は、これまで検討されてこなかった。いくつかの研究グループが、周産期の様々な組織および細胞型からiPSCを首尾よく誘導することができることを実証してきた（例えば、Cai et al. 2010、Connell et al. 2013、Haase et al. 2009、Jiang et al. 2014参照）。しかしながら、これらいずれの実務者も、この目的のために周産期細胞由来iPSC（あるいはそれから誘導される下流の細胞）を使用することは記述していない。事実、文献は、この文脈でのこれらの細胞の使用可能性を理解するために必要な、これらの細胞のユニークな特徴（すなわち、加齢の欠如および胎内での最小限環境的曝露の類似性の可能性）の認識を示してすらいない。
【００４３】
（iii）しかしながら、周産期細胞由来iPSCを使用するという実務者の決定は、それ自体では、加齢および環境的曝露の影響を、細胞から、そしてひいては刺激応答試験から、排除するために必要な無エクスポゾーム条件をもたらさず、追加的な決定およびコントロールが必要となる。従って、本方法は、刺激応答試験を行う目的に関する周産期細胞由来iPSCの適切な特徴の単なる認識を超えて発展するものである。むしろ、科学者らは、いくつかの追加的な選択肢および条件を明示的に選び適用しなければならない。具体的には、無エクスポゾーム条件を達成するためには、科学者が、（1）妊娠のあいだの母親と胎児の両方の潜在的曝露の幅を狭くすることに基づく、ドナーの選択と、（2）細胞採取プロセスの（出生の瞬間を基準にした）正確なタイミングと、の両方に関してコントロールを行使することが求められる。
【００４４】
妊娠のあいだの母親と胎児の両方の潜在的曝露の幅を狭くすることに関して、あらゆる周産期細胞の使用は母親に対して、ひいては母親の子宮に対して、エクスポゾームからの影響の可能性を導入し、従ってドナー間差異の可能性を導入することに留意することが重要である。幸いなことに、生殖生物学は母体よりも胎児の健康を優先し従って通常は母体がその環境における変動を吸収し、胎児に必要な栄養分と環境とを（母体の身体が可能とする限りにおいて）受け渡すという点において、基礎的な女性生理学がそのような差異からの有意な保護を提供する。いずれにしても、母親自身の環境における変動、および母親自身の行動選択が胎児に強いる環境を制限することに基づく、厳密な包含／除外基準を適用することにより、実務者による選択が、胎内環境における差異をさらに低減させることができる。そのような基準としては、（1）例えば過度な喫煙、飲酒、もしくはレクリエーショナルドラッグの使用のような、胎児に有害な作用を生じることが知られる活動に母親が従事した場合、（2）妊娠中にある種の処方薬を母親が服薬した場合、（3）子宮に影響し得る外傷を母親が経験した場合、（4）新生児が未熟もしくは過熟のいずれかで出生した場合、（5）母親が放射線もしくは高レベルの汚染（風媒性、地下水、もしくは基礎環境ベースの汚染）に晒された場合、または（6）母親が毒素に晒された場合に、試験対象者を除外することが挙げられるが、これらに限定されない。さらに実務者は、例えばドナー新生児の集団を特定の地域かつ短い期間の内に生まれたものだけに限定することのように、さらなる制限を設けてより高い一貫性を確実にすることができ、このことは、妊娠中に母親らによって経験される外的汚染環境を均一化する作用をする。実務者は、除外基準または母親との行動約束を通して、妊娠期間中の母親の食事をいくらかコントロールすることさえも可能である。
【００４５】
細胞採取プロセスの（誕生の瞬間を基準にした）正確なタイミングに関し、新生児が化学物質および疾患へのある種の曝露によって永続的な影響を受け得ることは広く記述されている。現代の出産慣行はしばしばそのような曝露を出産の数分以内に導入する。例えば、米国の多くの病院において誕生する新生児は分娩室そのものにおいてB型肝炎のワクチンを注射される。その後まもなくさらなる免疫処置が行われる。従って、無エクスポゾーム条件を達成するためには、実務者は、特定の周産期細胞がそのような曝露によって影響される時点の前に全てのドナーからその特定された周産期細胞を取得するか、または、採取の前に起こるその特定の曝露は（対象となる刺激応答試験の目的のためには）刺激に対する生物学的応答に影響しないと明確に結論付けできなければならない。そして、いずれの場合にも、実務者は、全てのドナーの曝露経験がその試験に関して特定された許容範囲内にあることを確実にするために状況をコントロールしなければならない。
【００４６】
（iv）刺激応答試験において無エクスポゾーム条件を達成するために、3セットの相互依存的な行為が必要とされる。それらは、（a）その試験に適切な無エクスポゾーム条件を特定すること；（b）それに応じて、取得するべき周産期細胞の種類、ドナー選択条件、および細胞採取手順を特定すること；ならびに、（c）その試験に求められる無エクスポゾーム条件を満たし得る潜在的ドナー（複数可）を同定することである。
【００４７】
上述したように、事前に同定された細胞がその事前に決められたドナーから記載された方法において実際に採取され、iPSCに転換され、（そのときの実験にとって適切であれば）多様な機能的細胞型のいずれかに分化され、（やはり、適切であれば）組織へと組み合わされ、刺激が適用され、そして得られる生物学的応答が測定され分析された場合に、科学的に有用な測定がもたらされる。任意で、実務者は、プロセスのあらゆる適切な時点において、その細胞またはその子孫もしくはあらゆる誘導細胞を、当業者に知られる方法を用いて凍結保存し後で解凍し得る。
【００４８】
［刺激・応答の方法］
【００４９】
従って、事前に定義された無エクスポゾーム条件下で一または複数のドナーから単離された一または複数の周産期細胞に由来する一または複数の試験試料に刺激を適用しその刺激に対する試験試料の応答を検出することにより、刺激に対する試験試料の応答を決定する方法が提供される。ドナー間の示差的応答は、試料採取の前にドナーが受けた加齢または環境的条件ではなく、ドナーの遺伝学における差異に帰される。
【００５０】
本方法に従えば、試験試料は、一以上の人工多能性幹細胞もしくはそれから分化された一以上の細胞、またはその分化された幹細胞から形成された組織である。人工多能性幹細胞を産生する方法、幹細胞を分化させる方法、および分化した幹細胞から組織を形成する方法は、当業者に知られている。そのような公知の方法が本明細書において使用される。やはり本方法に従えば、対照と比較して、正または負のいずれであるかに関わらず、検出される応答は、その刺激が試験試料に対して影響を有することを示す。対照と比較して検出可能な応答の欠如は、その刺激が試験試料に対して影響を有さないかまたは取るに足らない影響しか有さないことを示す。刺激に対する試験試料の応答を検出するための方法は当業者に知られている。そのような公知の方法が本明細書において使用される。
【００５１】
遺伝学的差異による、刺激の影響におけるドナー間の差異は、2以上のドナーから試験試料を採取して本明細書に記述される方法を実行することにより決定され得る。
【００５２】
［試験に適切な無エクスポゾーム条件の同定］
【００５３】
実務者は、実験に適切な細胞および条件の種類の規範的な記述から開始する。それからこの記述を、下記で詳細に述べるように、妊娠および出産の環境についての要件へと転換する。
【００５４】
この記述は、以下のものからなる：（a）ドナー新生児の出生時における遺伝学的プロファイルおよび健康状態に関する要件；（b）母親の健康履歴、特に妊娠中についてのものに関する要件；（c）ドナー新生児の長期的健康、ひいてはドナー新生児の細胞のエピジェネティックプロファイルに影響し得る、環境的因子への母親の曝露（妊娠の前および／または最中のもの）に関する要件；（d）有害な物質または環境への、ドナーの赤ん坊（子宮内）の曝露に関する要件；ならびに（e）出生後のドナー新生児の曝露に関する要件（実験適性細胞が出生後に採取される場合）。
【００５５】
いかなる細胞も（周産期細胞であっても）環境的曝露を完全に排してはいない。しかし、幸いなことに、特定のドナー由来の特定の細胞の特定のサブセットにより経験される曝露が、特定の設計の刺激応答実験の結果に有意に影響しないことが過去の研究から知られている場合（あるいは、より理想から離れるが、有意に影響しないと考えられている場合）、その細胞のサブセットは、実用上、無エクスポゾーム条件細胞であるとみなされ得る。同様に、複数のドナーから採られた周産期細胞の特定のサブセットが、結果に影響し得る種類の曝露に関して実質的に同一のものを経験していた場合には、それらの細胞は、その特定の実験に限っては無エクスポゾーム条件細胞とみなされ得る（ただし、複数ドナーに渡る比較結果は、全てのドナーに共通な特定セットの環境的条件のみに関するものとして報告されるべきである）。
【００５６】
この構成は、科学者が供給源細胞についての規格を開発する際の手引きを提供する。適用されるべき刺激および測定されるべき応答の具体的性質に基づいて、科学者らは、実験結果に影響すると知られる（あるいは影響すると考えられている）曝露の種類（および付随する度合い）の包括的リストを決定し、それに応じて供給源細胞についての規格を設計しなければならない。例えば、もし刺激が医薬化合物で、測定されるべき応答がiPSC（またはその誘導細胞）による特定タンパク質の産生における変化であれば、規格は、子宮内のその供給源細胞によるそのタンパク質の産生を直接的に増加または減少させる曝露（例えばある種の医薬、レクリエーショナルドラッグ等）の禁止をおそらく含むであろう。
【００５７】
［周産期細胞型、ドナー選択条件、および細胞採取手順の特定］
【００５８】
求められる無エクスポゾーム条件の特定は、取得されるべき周産期細胞型の選択、適格なドナーの同定、および細胞採取手順を導く。
【００５９】
単一ドナーの文脈においてさえも様々な種類の周産期細胞は異なる曝露を経験し得るので、iPSCの供給源とする周産期細胞型は事前に定められる。例えば、出産時に採取される羊水（通常は、予定された帝王切開の際に取得される）からの細胞は、帝王切開から起こる出血の結果として通常は母体の血液に曝露されているが、第三期羊水穿刺を通して得られる羊水に由来する細胞はそのような曝露を受けていない。別の例として、出生後に皮膚線維芽細胞から採られた細胞は、出産過程で母体の腟感染（例えば性行為感染症、またはB群溶レン菌感染）に曝露されている潜在的可能性があるが、臍帯血からの細胞はそのような曝露を受けている可能性はより低い。
【００６０】
適格なドナーの特定は、以下の2セットの不適切ドナーを除外することに役立つ：すなわち、根底にある健康状態のために、その細胞から誘導されたiPSCが不正確なモデルとなるドナー、および、禁じられた曝露を経験したドナーである。第1のカテゴリーの例としては、既知の遺伝学的な欠陥もしくは損傷を有するドナー；その家族が、目的の実験に影響を及ぼす遺伝学的病因の疾患の経歴を有するドナー；あるいは、著しく未熟に出生したドナーが挙げられ得るが、これらに限定されない。第2のカテゴリーの例としては、その母親が、妊娠中に、例えばレクリエーショナルドラッグ、ある種の処方薬、もしくは過度のアルコールのような、禁じられた物質を摂取したドナー；その母親が、妊娠中に、例えば過度の喫煙のような禁じられた行為を行ったドナー；あるいは、その母親が、放射線もしくは高レベルの毒性汚染に曝露されたドナーが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６１】
細胞採取の条件および手順も、指定された無エクスポゾーム条件を満たす能力に影響を有し得、従って特定されなければならない。明らかな例としては、採取、輸送、および処理の無菌性を確保することが挙げられるが、それほど明らかではない考慮点も存在する。例えば、組織採取の正確な時間が重要となり得る。米国疾病管理予防センター（CDC：The Centers for Disease Control and Prevention）は、出生時にB型肝炎ワクチンの投与を推奨しており、多くの病院では、新生児の誕生から数分以内に分娩室そのものにおいてこのワクチンが投与され、これは多くの場合ビタミンKの注射を伴う。CDCは、2ヶ月以内にさらに5つのワクチンを接種することを推奨している：すなわち、RV、PTaP、Hib、PCV、およびIPVである。これらの各々が、特定の刺激に対する新生児の応答を変えることを意図しており、従って、免疫化後の細胞採取は無エクスポゾーム条件の潜在的違反となる。
【００６２】
［無エクスポゾーム条件を満たすドナーの同定］
【００６３】
出産に関連する組織を取得する技術に習熟した者は、関わる通常の手順（機関審査委員会（IRB：internal review board）と協働すること、候補ドナーを集めスクリーニングすること等を含む）に既に精通しているであろうが、無エクスポゾーム条件の要件は、他の生組織取得の試みに関連するものを超えた追加的な工程および考慮点を不可避的にもたらす。
【００６４】
例えば、求められる無エクスポゾーム条件の厳密さに応じて、検証の問題が生じ得る。出産関連組織採取の試みの多くは、質問票または面談を通じて得られる母親提供の医学的情報のみに頼っている。しかしながら、そのようなレポートはしばしば不正確さを含むことが知られており、子供がドナーに選ばれたら母親が報酬を受けるという場合には、不適格曝露の申告を控える動機づけが母親に働く。
【００６５】
従って、所与の実験のための無エクスポゾーム条件が厳密である場合、あるいは通常の行動からの自制を要する場合には、実務者は、検証を行うか否か、そしていかにして行うか（例えば、妊娠中に研究室報告への定期的なアクセスを得たり、あるいは、薬物乱用の指標のためにサンプルの採取後スクリーニングを行ったりすることによる）を考慮しなければならない。
【００６６】
下記の実施例は、本明細書に記述される方法の特定の側面をさらに説明することを意図するものであり、特許請求の範囲を限定することは意図していない。
【実施例】
【００６７】
［実施例1：医薬毒性試験のプラットフォームの開発］
【００６８】
人々の間の遺伝学的差異は、医薬に対する毒性反応における多様性を引き起こすことが知られている。しかしながら、年齢および環境における差異もまた、そのような反応における多様性を引き起こすことが知られている。この実施例では、科学者は、医薬化合物に対する毒性反応における差異を試験できるようにするために、両方の性別および様々な人種の多数のヒトが関わるプラットフォームを開発することを望んでおり、その差異は、厳密に試験対象の遺伝学差異によるものであり、試験対象の年齢および環境的曝露における差異の影響に干渉されないものとする。従ってこの科学者は、無エクスポゾーム条件下で、一群のヒトドナーから細胞株のセットを開発することを望んでいる。
【００６９】
彼女が成功するためには、無エクスポゾーム条件のための基準は必然的に非常に高くしなければならない。というのも、毒性反応に影響し得る曝露の包括的リストは存在せず、特に、毒性反応は、問題となる化合物（刺激）に応じても変化するところ、実務者はそのプラットフォームをオープンエンドのものにすることを望んでおり、すなわち、毒性作用の狭いサブセットのみを測定したり、医薬化合物の狭いサブセットのみに適用可能なプラットフォームを開発することは科学者は望まないからである。
【００７０】
科学者は、以下のようにして無エクスポゾーム条件を特定することにより開始する。
（1）ドナーの遺伝学的プロファイルおよび健康状態：ドナーの母親と父親のいずれの家族にも、主要な遺伝的疾患の経歴があってはならない。ドナーは満期で出生し、出生体重が10〜90パーセンタイルになければならない。ドナーのAPGARスコアは、1分および5分の測定点の両方において7以上でなければならない。先天異常の目に見える証拠があってはならない。ドナーは、子宮内または出産過程において、HIV、その他の性行為感染症、肝炎、またはB群溶レン菌感染を含む感染に曝露されていないものでなければならない。
（2）母親の健康履歴：母親は、いずれの時点においても、その子孫における先天異常の可能性を永続的に高めることが知られる疾患または状態を有してはならない。特定された疾患リストのいずれかに現在罹患していてはならない。極度の栄養失調を経験したものであってはならない。
（3）母親の曝露：妊娠の前および最中において、母親は、高レベルの放射線、または医学的処置を要する毒性物質に曝露されていてはならない。妊娠の最中において、EPAにより「厳戒」状態と分類された空気汚染または水汚染に曝露されていてはならない。妊娠の最中において、医学的処置を要する腹部外傷を受けていてはならない。
（4）子宮内での胎児の曝露：妊娠の最中において母親が高レベルのアルコールを摂取し、多量の煙草を喫煙し、レクリエーショナルドラッグを服用し、または禁止リスト上のある種の処方薬を服用していてはならない。
（5）出生後の新生児の曝露：細胞の供給源組織は、ワクチンあるいはビタミンの投与に先立って、誕生時に直ちに新生児から採取されなければならない。
【００７１】
次に、科学者は、上記要件を利用して、選別の条件およびプロセスに関する選択とともに、使用されるべき周産期細胞の種類に関する選択を行う。
【００７２】
科学者は、供給源材料として血管内皮前駆細胞（EPC：Endothelial Progenitor Cell）を臍帯血から採取することを選ぶ。この供給源が好ましいのは、細胞が誕生の瞬間（あるいは、より正確には、臍帯が切断される瞬間）に起源を有し、かつ、臍帯の物理的障壁が、出産プロセス途中および分娩室内における病原体への曝露から細胞を保護するからである。科学者は、新鮮な臍帯血の購入も検討するが、利用可能な販売者は彼女の研究が要求する患者除外基準のレベルをサポートする態勢にはないので、その選択肢は排除される。従って、科学者は必要な試料を得るために1つまたは複数の病院と仕事をしなければならない。
【００７３】
科学者は、包含／除外基準および採取プロトコールに関して病院およびそのIRBの同意を得ることができるが、家族歴および妊娠中の個人的行動についての母親の主張の独立的検証に関わる問題がある。科学者は、結局、これらの事項の独立的検証を求めることに関しては軟化を強いられる。代わりに、科学者は、母体中のアルコールおよび薬剤の不在を検証するための臍帯血血漿の物理的検査を行うことを選ぶ。
【００７４】
最終的に、残りのプロセスが確立された業界プロトコールに基づいて進行する。EPCは刊行されたプロトコール（Geti 2012）に従って臍帯血から単離され、それからそのEPCは市販のキット（ステムジェント、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を用いてiPSCへとトランスフェクトされる。
【００７５】
［実施例2：二つ両方の毒物に曝露された人において二つの毒物の作用を見分ける］
【００７６】
ナイジェリアにおいて毒性化学物質流出が起こり、地元部族の住民が法定限度をはるかに超えるレベルの、ある毒素に晒された。多数の死者および神経系損傷がもたらされた。流出を起こした当事者は過失を認めたが、それら住民は近隣の化学工場からの毒性汚染に長年晒されてきているので、報告された損傷のいくらかは全く流出に因るものではないし、流出による損傷はそれ以前の長期的汚染曝露によって増悪されたと主張している。（この主張は、アスベスト曝露の有害な影響は被害者が喫煙歴を有する場合には増悪するという科学的知見と対応している。）
【００７７】
実務者は、どの損傷が2つの刺激（すなわち、最近起こった毒性流出と、以前からの長期的汚染曝露）の各々による可能性が高いものであるか、そして、以前からの長期的汚染曝露が毒性流出により引き起こされた損傷の程度を増悪させた可能性が高いか否かを（少なくとも方向付けとして）解明する研究を行うことを依頼される。
【００７８】
実務者が好む研究設計は、（1）化学的ストレスなし；（2）長期的汚染のみからのストレス；（3）最近流出した毒性化学物質のみからのストレス；および（4）長期的汚染および最近流出した毒性化学物質の両方からのストレスの下で、神経細胞の健康状態および機能性を比較分析することを想定するものである。結果に対する遺伝学の影響を最小限にするために、彼は、上記4つの試験のそれぞれにおいて同じ試験対象からの神経細胞を利用し、各々の試験対象は損傷を受けた住民らと同じ部族の構成員とすることを選ぶ。さらに、化学工場からの歴史的な汚染あるいはさらに別の歴史的曝露への試験対象の事前曝露が実験結果を混乱させるという批判者の主張を避けるために、神経細胞は無エクスポゾーム条件ドナーから（iPSCトランスフェクションおよびそれらiPSCの神経分化を介して）誘導されるべきことを決定する。
【００７９】
しかしながら、実務者は、ドナー細胞を集める能力の制約に直面する。彼は、損傷を受けた住民と同じ部族である住民を有し、かつ過去に著しい汚染に晒されていない地区を同定することに成功する。しかし、様々な種類の周産期細胞を採取することは厳しい制約を受ける。なぜならば、（1）その地域では妊娠末期羊水穿刺は実施されておらず、かつ、計画的帝王切開出産は稀であり、従って、細胞源として羊水は除外され、（2）皮膚生検および採血は新生児にとって侵襲性が高すぎると判断されるからである。
【００８０】
従って、実務者は、臍帯血から採られる周産期細胞を使用することを選ぶ。
【００８１】
遺伝学的要件を考慮して、実務者は、（1）それぞれの性別から5人のドナーが必要であること、および（2）ドナーのどちらの親もその特定された部族でなければならないことを特定する。
【００８２】
それに加えて、実務者は、以下のことを含む、ドナー適格性についての包含／排除健康基準のセットを特定する：（1）地区および病院は、良性の空気質および水質を有することが知られる地域のものに限定され、母親は、妊娠中の大部分の時間をその地区で過ごしたこと；（2）ドナーは満期新生児でなければならず、この場合それは少なくとも5ポンドの出生体重を有することによって決定される；および（3）ある種の遺伝的疾患の家族歴を有する潜在的ドナーは除外される。
【００８３】
実務者はさらに、母親の行動に基づく除外基準のセットを特定するが、その行動は、実験が測定するように設計されているものと同様の神経学的効果を生じ得る、ある種の毒性を有する物質を導入し得た行動であり、具体的には、（1）過剰なアルコール消費がなかったこと；および（2）レクリエーショナルドラッグまたはある種の処方薬の使用がなかったことである。
【００８４】
なお、その地域住民によく見られる行動および健康状態のために、実務者は、無エクスポゾーム条件を創出する他の試みにおいてしばしば採用されるその他の除外基準は利用しない。というのも、そのような行動のインパクトが、彼が求めている特定の比較に影響を及ぼす可能性は低く、むしろそのようなドナーを排除すると、求められる期間内に十分なドナーを得ることが妨げられる可能性が高いと判断するからである。ここで使用されなかった除外基準としては、たばこ喫煙の禁止、および、出産時に新生児に伝染され得る性行為感染症の存在が挙げられる。
【００８５】
いったん臍帯血の試料が採取されると、それらは直ちに実務者の研究室に輸送され、そこで実務者はその血液を処理し、必要な細胞を培養し、それらをiPSCへとトランスフェクトする。神経細胞への分化は、よく知られたプロトコールに従う。各ドナーからもたらされた神経細胞は適宜分注され、実務者が実施したい刺激応答研究の以下の4セットのために必要な試験対象を実務者に提供する：（1）化学的ストレスなし（対照）；（2）長期的汚染のみからのストレス；（3）最近流出した毒性化学物質のみからのストレス；および（4）長期的汚染および最近流出した毒性化学物質の両方からのストレス。
【００８６】
［実施例3：検討対象化合物（COI：Compound of Interest）への応答の程度が、COIと他の化合物との間の超相加性の程度に影響するか否かを決定するために、薬剤・薬剤薬力学的相互作用を分析する］
【００８７】
研究科学者は、特定の検討対象化合物（COI）が特定の他の化合物（ここでは「共反応物」と呼ぶ）と同じ期間中に人間に投与された場合の超相加的な心毒性薬力学的効果についての可能性を調査することを課される。超相加性は、2つの化合物を合わせた影響が、その2つの化合物が別個に作用することの影響の合計よりも大きくなるという相乗的効果として定義される。この研究のスポンサーには、調査される特定化合物の超相加性は全ての人間において同じではないと信じる理由がある。具体的には、このスポンサーは、COIの予測される治療的濃度（単独で摂取される）に対して75パーセンタイル超の心毒性反応を示す人々は、75パーセンタイルよりも低い反応を有する人々と比べて、特定の他の化合物と共にCOIを摂取した場合により大きな程度の超相加性を経験し得ると信じている。
【００８８】
研究の範囲は広い。例えば、スポンサーは、超相加性の程度の（75パーセンタイル超群と75パーセンタイル未満群との間での）上昇は、（どちらかの）化合物の用量を一定に保ちながら他方を増加させた場合に変化するか否か、そしてどのように変化するか、という問題に興味を持っている。
【００８９】
この研究者は、インビボの実験の使用は、非倫理的であるか（ヒトの場合）またはヒトの遺伝学的多様性の影響を調べることが不可能である（動物の場合）として、すぐに
考慮から除外する。従ってこの研究者は、心筋細胞のインビトロ実験を通じた研究を行うことを決める。初代心筋細胞は本願の始めの方で検討した理由により非実際的である。従って、研究者は、個体群の代表的サンプル由来のiPSC細胞株から誘導された心筋細胞を使うことを選ぶ。
【００９０】
さらに、様々な環境的因子（例えば喫煙、ある種の産業汚染物質、および化学療法による過去の治療歴など）が患者の心毒性反応に影響を有し得ることを心配する理由が研究者にはある。しかしながら、これらの問題は以前に調査されたことがなく、また、これらの問題を調査することはこの特定の任務の範囲内ではない。従って、交絡因子の可能性を回避するために、研究者は、無エクスポゾーム細胞を使用することを決める。
【００９１】
研究者は、ドナーの標本サイズを40に決める。得られる事例・対照標本サイズ（それぞれ10と30）は、75パーセンタイル超コホートと75パーセンタイル未満コホートとの間に超相加的挙動における差異が存在するか否かについての知見をサポートするために十分である。さらに、実際的な観点からは、この数は、著しい遺伝学的多様性の可能性を提供しつつ、実施しなければならない物理的実験の数を十分に低く抑え、研究者が研究により求められる物理的作業およびデータ記録作業を管理することが可能になる。
【００９２】
それから研究者は、新生児細胞型、および彼が求める無エクスポゾーム条件の程度を守るドナー選択の基準を選定する。
【００９３】
研究者は、臍帯血から内皮前駆細胞を採取することを選ぶが、その理由は、これらの細胞が、（1）満期の子供に付随し、（2）ワクチン投与等より前に、出生の瞬間において得ることができ、（3）注射器で臍帯から直接採取することができ、従って風媒性の汚染物への曝露を避けることができ、（4）細胞のDNAに干渉しない非組込み型のリプログラミング方法を介してiPSCにリプログラミングされる能力が示されてきたからである。
【００９４】
それから研究者は、ドナー選択の基準を決定する。彼は上述した基準を選ぶ。
【００９５】
ドナーからの臍帯血採取は、当業者によく知られるプロセスを用いて達成される。臍帯血からEPCが単離され、上記で参照されたプロトコールに従ってiPSCにリプログラミングされる。
【００９６】
選定された40ドナーから細胞株が確立されたら、研究者は、米国特許第8,951,798号に記述されたプロトコールを用いて、それらの各々由来の十分なiPSC細胞を心筋細胞に分化させる。
【００９７】
得られた心筋細胞はその後、多電極アレイを用いて心拍における変化（頻度、安定性、および振幅）を測定するとともにGE Cell Healthアッセイを用いて構造的特徴（生存率、ミトコンドリア健常性）を測定する、心毒性アッセイに使用される。これらについてのプロトコールは本分野において広く記述されている。各アッセイにおいて、細胞は、特定用量のCOI、特定用量の一共反応物、またはその両方の負荷に晒される。
試験は以下のように構成される。
【００９８】
（1）試験される各化合物の用量濃度のマトリックスを含め、物理的実験の全セットが特定される。
【００９９】
（2）全てのドナーからの心筋細胞が一度に調製され、必要な実験の全範囲をサポートするために十分なロットに分注される。
【０１００】
（3）全ての実験は物理的に平行に行われ、各実験のデータ捕捉は、ドナーのアイデンティティ、COI用量濃度、共反応物用量濃度、複製実験識別子、および全てのエンドポイントを含む。
【０１０１】
（4）最初に分析されるデータのセットは、予測される治療的COI濃度におけるCOI単独による負荷のもとで全てのドナーが試験される実験からのものである。各エンドポイントについて、ドナー間で結果が比較され、どのドナーの反応が75パーセンタイルを上回りどのドナーの反応が下回るかの（隠蔽されている）アイデンティティが決定される。この仕事が、残りのデータ分析全体を通じて使用される（各エンドポイントについての）2つの別個のコホートを確立させる。
【０１０２】
（5）残された物理的実験からのデータは、調べられている各エンドポイントについて、以下の順序で分析される：（i）1つだけの化合物（COI、単一共反応物）が関わる実験についてのデータが分析されて、各用量における各ドナーの各エンドポイントについての「単独的」応答が明らかにされる。それからこのデータがアイソボログラム上にプロットされて、等効果（すなわち、非超相加性）最前線が示される。（b）様々なCOIおよび共反応物の混合物からのデータが分析されて、（特定の用量濃度における）2つの化合物の協働的影響が決定され、それから上記アイソボログラムと比較されて、相加未満的効果あるいは超相加的効果のいずれかが存在するか否かが決定される。（iii）75パーセンタイル超コホートおよび75パーセンタイル未満コホートについて工程（i）および（ii）の結果を（分布に）集計し、それらの分布を比較して、統計学的に有意な相違が存在するか否かを決定する。
【０１０３】
この仕事の結果として研究者は、（当該標本からの）個体がCOIと共にある特定の共反応物を摂取した場合に、そのCOIが予測的な治療的用量において単独で摂取された場合の75パーセンタイルにて確立されたカットオフを上回る反応をその個体が有するならば、心毒性への相乗的（超相加的）影響のより高い可能性が確かに存在することを決定する。
【０１０４】
この情報は、より大きな標本サイズおよびより広範な共反応物を用いてより詳細な調査を行うことへとスポンサーを導く。これらさらなる調査の結果として、スポンサーは、患者がCOI自体に対して低レベルの心毒性反応しか有さないことを決定する検査が実施されない限りそのCOIをある種の共反応物と共に含んで開発された薬の使用を禁止することについてFDAと同意することを要する。
【０１０５】
参考文献
Arnheim, N. and Cortopassi, G., 1992 “Deleterious mitochondrial DNA mutations accumulate in aging human tissues”Mutation Research, 275; 157-167
【０１０６】
Arnhold, S. et al, 2011 “Amniotic Fluid Stem Cells: Growth Dynamics and Differentiation Potential after a CD-117-Based Selection Procedure” Stem Cells International, pp. 1-11
【０１０７】
Brown, M. E. et al, 2010 “Derivation of induced Pluripotent Stem Cells from human Peripheral Blood T Lymphocytes” PLoS ONE, 5; 1-9
【０１０８】
Cai, J. et al, 2010 “Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Umbilical Cord Matrix and Amniotic Membrane Mesenchymal Cells” The Journal of Biological Chemistry
【０１０９】
Carraro, G. et al, 2008 “Human Amniotic Fluid Stem Cells Can Integrate and Differentiate into Epithelial Lung Lineages” Stem Cells, 26; 2902-2911
【０１１０】
Connell, J. P. et al, 2013 “Amniotic Fluid-Derived Stem Cells for Cardiovascular Tissue Engineering Applications” Tissue Engineering: Part B, 19; 368-379
【０１１１】
De Coppi, P. et al, 2007 “Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy” Nature Biotechnology, 25; 100-106
【０１１２】
Fakunle, E. S., 2012 “iPSCs for personalized medicine: what will it take for Africa?” Trends in Molecular Medicine, 18; 695-699
【０１１３】
Finch, C. E., 1990 “Longevity, Senescence and the Genome” University Chicago Press, pp. 428-463
【０１１４】
Geti, I. et al, 2012 “A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells”.
【０１１５】
Giorgetti, A. et al, 2009 “Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Cord Blood Using OCT4 and SOX2” Cell Stem Cell, 5; 353-357
【０１１６】
Haase, A. et al, 2009 “Generation of Induced Pluripotent Stem  Cells from Human Cord Blood” Cell Stem Cell, 5; 434-441
【０１１７】
Jiang, G. et al, 2014 “Induced Pluripotent Stem Cells from Human Placental Chorion for Perinatal Tissue Engineering Applications” Tissue Engineering, 20; 731-739
【０１１８】
Liang, P. et al, 2013 “Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity” Circulation, 127; 1677-1691
【０１１９】
Loh, Y., et al, 2009 “Generation of induced pluripotent stem cells from human blood” Blood, 113; 5476-5479
【０１２０】
Mandal, P. K. and Rossi, D. J., 2013 “Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA” Nature Protocol, 8; 568-582
【０１２１】
Miller, G. W. “The Exposome, a Primer”Academic Press 2014. Chapter 1: The Exposome: Purpose, Definition, and Scope
【０１２２】
Moretti, A. et al, 2010 “Patient-Specific Induced Pluripotent Stem-Cell Models for Long-QT Syndrome” The New England Journal of Medicine, 363; 1397-1409
【０１２３】
Okita, K. et al, 2013 “An Efficient Nonviral Method to Generate Integration-Free Human-Induced Pluripotent Stem Cells from Cord Blood and Peripheral Blood Cells” Stem Cells, 31; 458-466
【０１２４】
Ono, T. et al, 2002 “Mutation Theory of aging, assess in transgenic mice and knockout mice” Mechanisms of Ageing and Development, 123; 1543-1552
【０１２５】
Park, I. et al, 2008 “Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells” Cell, 134; 877-886
【０１２６】
Quing, L. I. et al, 2013 “Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free conditions” Journal of Reproduction and Development, 59; 72-77
【０１２７】
Steigman, S. A. et al, 2008 “Preclinical regulatory validation of a 3-stage amniotic mesenchymal stem cell manufacturing protocol”Journal of Pediatric Surgery, 42; 1164-1169
【０１２８】
Trifunovic, A. and Larsson, N.G., 2008 “Mitochondrial dysfunction as a cause of ageing” Journal of Internal Medicine, 263; 167-178 
【０１２９】
Vijg, J., 2000 “Somatic mutations and aging; a re-evaluation.” Mutation Res., 447; 117-135
【０１３０】
Wang, J. et al, 2013 “Generation of Induced Pluripotent Stem Cells with High Efficiency from Human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cells” Genomics Proteomics Bioinformatics, 11; 304-311
【０１３１】
Warren, L. et al, 2010 “Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA” Cell Stem Cell, 7; 618-630
【０１３２】
Wild, C., 2005 “Complementing the genome with an “exposome”: the outstanding challenge of environmental exposure measurement in molecular epidemiology.” American Association for Cancer Research, pp. 1847-1849
【０１３３】
You, Q. et al, 2008 “Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid” International Journal of Gynecology and Obstetrics, 103; 149-152
【０１３４】
Zhou, T. et al, 2012 “Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples” Nature Protocol, 7; 2081-2088
【０１３５】
添付の特許請求の範囲の方法は、本明細書に記述された具体的な方法によって範囲を限定されるものではなく、それらの具体的な方法は、特許請求の範囲のいくつかの側面の説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる方法が、本開示の範囲内に入る。本明細書に示され記述されているものに加え、方法の様々な改変が、添付の特許請求の範囲に入ることが意図される。さらに、ある代表的な方法およびこれら方法のある側面のみが具体的に記述されているが、他の方法およびそれら方法の様々な特徴の組合せは、たとえ具体的に記載されていなかったとしても、添付の特許請求の範囲に入ることが意図される。すなわち、工程、要素、成分、または構成の組合せが本明細書において明示的に言及されているが、しかしながら、他の全ての工程、要素、成分、または構成の組合せも、明示的には言及されていなくても包含される。本明細書で引用する全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的についてその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【国際調査報告】
2017530716.tif 000002