(57)【要約】本発明は、人体内に長期持続性ホメオスタシス状態を維持することができる、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属に属する細菌の選択された菌株に関する。さらに、本発明は、人体内に長期持続性ホメオスタシス状態の治療における使用；または腎不全、好ましくは急性もしくは慢性の腎不全の治療における使用；または好ましくは細菌由来の尿毒症毒素、たとえば、インドールおよび/またはクレゾールを減少させることにおける使用のための組成物、たとえば、食品組成物、補助食品、医療機器用組成物または医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系を調節し、老化過程を遅延させ、長期持続性ホメオスタシス状態を維持することにおける使用のための、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌株であって、以下の特性を有することを特徴とする菌株：
(i)1に設定されたベースライン値に対して2.5〜4.5倍の値に、IL-4などの抗炎症性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(ii)1に設定されたベースライン値に対して0.85〜1.05倍の値に、IL-12p70などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iii)1に設定されたベースライン値に対して7〜19.5倍の値に、IFN-γなどの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iv)1に設定されたベースライン値に対して0.90〜1.40倍の値に、IL-17などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(v)2.90〜4.50のTh1/Th2比の値を与える、炎症誘発性/抗炎症性サイトカインの比率を調節する全体的な能力。
【請求項２】
請求項1に記載の使用のための菌株であって、以下の特性を有することを特徴とする菌株：
(i)1に設定されたベースライン値に対して3〜4倍の値に、IL-4などの抗炎症性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(ii)1に設定されたベースライン値に対して0.90〜1倍の値に、IL-12p70などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iii)1に設定されたベースライン値に対して8〜18倍の値に、IFN-γなどの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iv)1に設定されたベースライン値に対して0.95〜1.30倍の値に、IL-17などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(v)3〜4のTh1/Th2比の値を与える、炎症誘発性/抗炎症性サイトカインの比率を調節する全体的な能力。
【請求項３】
請求項1または2に記載の使用のための菌株であって、該菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガム種に属し、好ましくは、該菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673、またはその混合物を含むか、あるいはそれらからなる群から選択される、菌株。
【請求項４】
免疫系を調節し、老化過程を遅延させ、長期持続性ホメオスタシス状態を維持することにおける使用のための、a)請求項1または請求項2または請求項3に記載の条件(i)〜(v)の全てを満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌の少なくとも1つの菌株を含むか、あるいはそれらからなる、口腔組成物。
【請求項５】
該組成物が、長期持続性ホメオスタシス状態の維持のための、腎不全、好ましくは急性もしくは慢性の腎不全の治療における使用のための組成物である、請求項4に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
該組成物が、長期持続性ホメオスタシス状態の維持のための、尿毒症毒素を減少させることにおける使用のための組成物である、請求項4または請求項5に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
該尿毒症毒素が、細菌由来であり、好ましくは、インドールおよび／またはクレゾールから選択される、請求項4または5または6に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
請求項4〜7のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物は、以下を含むか、あるいは、以下からなる：
(a)施態様1または請求項2または請求項3に記載の(i)〜(v)の全ての条件を満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌株の少なくとも1種；および
(b)細菌ストレプトコッカス・サーモフィルス ST10 DSM25246の株によってインサイチュで生成された細菌由来のエキソポリサッカライド(EPS)および植物由来のポリサッカライドからなる特異的な粘膜接着性ゲル化複合体；好ましくは、タラガム。
【請求項９】
請求項4〜8のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、それぞれ身体により資化性の高い形態、好ましくは、ティンダル化形態(tyndallized form)で、セレンおよび亜鉛を提供する、ラクトバチルス・ブフネリ Lb 26 (DSM 16341)および／またはビフィドバクテリウム・ラクティス Bb1 (DSM 17850)をさらに含む、組成物。
【請求項１０】
請求項4〜9のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、葉酸を合成することができる菌株ビフィドバクテリウム・ラクティス BA05 (DSM 18352)をさらに含む、組成物。
【請求項１１】
請求項4〜10のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、イヌリン、フルクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖およびトランスガラクトオリゴ糖(GOSおよびTOS)、グルコオリゴ糖(GOSα)、キシロオリゴ糖、(XOS)、キトサンオリゴ糖(COS)、大豆オリゴ糖(SOS)、イソマルトオリゴ糖(IMOS)、難消化性デンプン、ペクチン、オオバコ種子、アラビノガラクタン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キシラン、ラクトスクロース、ラクツロース、ラクチトールおよび他の多くの種類のガム、好ましくはタラガム、アカシア、イナゴ、オートムギ、竹繊維、柑橘類果実繊維、および一般に、可溶性部分および不溶性部分を互いに異なる比率で含む繊維などのビフィズス菌増殖促進活性を有するいくつかのプレバイオティクス繊維および炭水化物をさらに含む、組成物。
【請求項１２】
請求項4〜11のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、1x106〜1x1011 UFC/g、好ましくは1x108〜1x1010 UFC/gからなる濃度を有する細菌負荷を有する、組成物。
【請求項１３】
請求項4〜12のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、請求項1または請求項2または請求項3に記載の条件(i)〜(v)の全てを満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌の菌株を、組成物の総重量に対して0.1〜65重量％、好ましくは0.5〜15重量％、さらにより好ましくは1〜10重量％の量で含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人体内に長期持続性ホメオスタシス状態を維持することができる、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属に属する細菌の選択された菌株に関する。さらに、本発明は、人体内に長期持続性ホメオスタシス状態の治療における使用；または腎不全、好ましくは急性もしくは慢性の腎不全の治療における使用；または好ましくは細菌由来の尿毒症毒素、たとえば、インドールおよび/またはクレゾールを減少させることにおける使用のための組成物、たとえば、食品組成物、補助食品、医療機器用組成物または医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホメオスタシスは、さまざまな外的要因および内的要因によって継続的に妨げられるいくつかの内部パラメータの値を、所定のレベル付近で維持するという生物の姿勢である。外部環境の変化にかかわらず、内部環境を変化させないか、またはほとんど変化させないために、人体を構成するサブシステムの順序付けられたセットのために制御システムのネットワークが指定されており、その同時作用がエネルギーおよび代謝産物の流れを調節する。
【０００３】
生物の自己調節は、現代生物学の主要な概念である。身体の全てのシステムは、ホメオスタシスの維持に寄与するが、主要なコントロールセンターは最も適切な種類の応答(内分泌、免疫など)を確立する中枢神経系である。身体のシステムの中で、非常に重要なシステムは、内分泌系とともに、外部環境の変化によって表される外部刺激に対する身体の防御において重要な役割を果たす免疫系によって代表される。
【０００４】
老化は、免疫系の再構築および免疫応答の機能性の低下を特徴とする過程であり、呼吸器感染に対する脆弱性の増大および死亡リスクの増大に関連する過程であることが知られている。
【０００５】
これらの年齢に関連する変化が、主に、抗原および酸化ストレスなどのストレス要因に対する寿命を通しての継続的な曝露によって主に引き起こされる免疫老化現象の原因であるべきである。
【０００６】
これは、炎症性サイトカインの増加が重要な役割を果たす、免疫系の全体的な「劣化」をもたらす：これらは、実際には、身体の老化を導く慢性炎症の現象を意味する炎症過程に寄与する。
【０００７】
さらに、老化過程は、酸化還元ホメオスタシスにおける変化および酸化的ストレスの漸進的増加を特徴とする。これは、細胞シグナル伝達、炎症応答および組織損傷の形質導入に関与し、代謝的およびエネルギー的変化を引き起こし、増殖、プログラムされた細胞死(アポトーシス)およびホメオスタシスなどのいくつかの細胞機能を改変する。
【０００８】
活性酸素種(ROS)はまた、全てが強力な炎症性および免疫学的成分を共有する、アテローム性動脈硬化症、II型糖尿病、神経変性、骨粗しょう症などのいくつかの加齢性疾患の病因に関与する。さらに、酸化ストレスおよびROSは、アポトーシスの活性誘導因子であり、老化過程におけるその変化は記憶細胞の拡大メガクロンの蓄積、Tリンパ球レパートリーの縮小および自己免疫現象の増加などの免疫老化の最も重要な局面の一部を説明し得る。
【０００９】
したがって、酸化ストレスおよび炎症ストレスに適切に反応する身体の能力に関連する細胞および分子メカニズムは、ヒトの長寿を促進し、主な加齢性疾患の発症を回避/遅延させるのに重要な役割を果たすと思われる。さらに、老化過程において、血漿亜鉛レベルの一般的な低下が観察され、免疫系に重大な結果がもたらされる。したがって、高齢者において亜鉛欠乏を避けることが重要であり、高齢者集団が腸の吸収不良の問題を抱えていることが多いことを考慮して、適切な用量でそれを摂取すること、主としてその最良のバイオアベイラビリティを可能にする形態で摂取することが、依然として必要である。したがって、免疫システムの劣化に対抗し、老化過程を遅延させ、長期持続性ホメオスタシス状態を維持することを可能にする上記の問題に対する解決策を得る必要性が依然として存在する。
【００１０】
良好な腎機能もまた、長期持続性ホメオスタシス状態の維持に寄与する。多くの要因が共同で腎機能を損なうことに関与し、それらの中には、腎臓がそれらを排泄できないことによる、尿中の窒素化合物、特に尿素の血液蓄積が含まれる。この蓄積は、腎不全(急性または慢性)の最終段階を表す尿毒症をもたらす。
【００１１】
腎臓がもはやそれらの機能を発揮できなくなると、腎不全の段階が起こり、腎不全の程度に応じて、急性または慢性になり得る。大部分の腎疾患では、腎機能が次第に悪化する。体内に保持された廃棄物(尿毒症毒素、たとえば、大腸菌などの微生物由来のバクテリア尿毒症毒素であるインドールやクレゾールなど)は、ほとんど全身の臓器に毒性作用を及ぼす。尿毒症状態の主な主観的発現は、悪心、衰弱、眠気、食欲不振および正常な日常活動の実施における困難さである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、良好な腎機能および良好なホメオスタシス状態を維持するために、尿毒症毒素に干渉してそれらを減少させうることが根本である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本出願人は、長期持続性ホメオスタシス状態を維持するためには、所定の値の範囲内で特異的かつ十分に確立されたサイトカインの維持に寄与する制御された中程度の内因性の生成または分泌が起こるように、免疫系を刺激することが重要であることを見出した。
【００１４】
強力で拡張された研究開発活動に続いて、本出願人は、免疫炎症および炎症現象に対して効果的である、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属に属する細菌の特定の菌株を選択することにより上記の必要性を満たした。
【００１５】
本出願人は、ラクトバチルスおよびビフィドバクテリウム属に属する細菌の中から、特定のヒト細胞株において測定可能なサイトカインの所与のセットについて、特定の範囲内の値を有する特定の菌株が、抗炎症活性および炎症誘発活性の両方を有するサイトカイン(IFN-γ)の生成を調節することにより、免疫系の劣化を抑制し、老化過程を遅延させ、長期持続性ホメオスタシスを維持することができることを初めて見出した。
【００１６】
本発明の目的はラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌株であって、以下の特性を有することを特徴とする菌株である：
(i)1に設定されたベースライン値に対して2.5〜4.5倍の値に；好ましくは、1に設定されたベースライン値に対して3〜4倍の値に、IL-4などの抗炎症性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(ii)1に設定されたベースライン値に対して0.85〜1.05倍の値に；好ましくは、1に設定されたベースライン値に対して0.90〜1倍の値に、IL-12p70などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iii)1に設定されたベースライン値に対して7〜19.5倍の値に；好ましくは、1に設定されたベースライン値に対して8〜18倍の値に、IFN-γなどの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iv)1に設定されたベースライン値に対して0.90〜1.40倍の値に；好ましくは、1に設定されたベースライン値に対して0.95〜1.30倍の値に、IL-17などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(v)2.90〜4.50、好ましくは3〜4のTh1/Th2比の値を与える、炎症誘発性/抗炎症性サイトカインの比率を調節する全体的な能力。
【００１７】
本発明のさらに好ましい実施態様を、以下に記載し、以下の詳細な説明において説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
本出願人は、熱心な研究活動を行い、その間に、本発明の目的である以下の細菌株を検出、選択、単離、および特徴付けした。
【００１９】
本出願人は、上記の条件(i)〜(v)の全てを満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌株を、少なくとも2週間、好ましくは4〜8週間の期間、生物に投与すると、所定の値の範囲内での特異的かつ十分に確立されたサイトカインの維持に寄与する、制御された中程度の内在性の生成または分泌が起こるように免疫系を刺激することができることを見い出した。
【００２０】
有利なことには、上記の条件(i)〜(v)の全てを満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌の少なくとも1つの菌株を含む本発明の組成物は、免疫系を調節し、老化過程を遅延させ、長期持続性ホメオスタシス状態を維持するため効果的に適用され、身体に健康上の利益を提供する。
【００２１】
一実施態様では、百歳超え(ultra-centenarian)の被験者からのヒト糞便物質から、上記の条件(i)〜(v)の全て満たすビフィドバクテリウム属に属する細菌株を単離し、選択した。これらの細菌株はビフィドバクテリウム・ロンガム種に属する。
【００２２】
ビフィドバクテリウム・ロンガム種に属する細菌株が、以下の細菌を含むか、あるいは細菌からなる群から選択されるのが好都合である：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673、またはそれらの混合物。
【００２３】
前記細菌株は、ドイツのDSMZ-Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbHに、ブダペスト条約に従って、Italy、28100 Novara(NO)Via Mattei3の会社、Probiotical SpA によって、2012年2月16日に寄託された。
【００２４】
上述の細菌株は、以下に記載され、特許請求の範囲に記載されるように、医薬組成物、医療機器または補助食品または食品組成物(以下、「本発明の組成物」と略記する)を製造するために有効に使用される。
【００２５】
第1の実施態様は、口腔医療機器のための組成物であり、該組成物は、以下を含むか、あるいは、以下からなる：
免疫システムの調節、老化過程の遅延、長期持続性ホメオスタシス状態の維持に用いて、身体に健康効果を提供し、腸機能の強化を促進するための、
(a)上記(i)〜(v)の全ての条件を満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌株の少なくとも1種。組成物の成分(a)が、以下の細菌を含むか、あるいは細菌からなるのが有利である：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672およびビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673。
【００２６】
別の実施態様は、口腔医療機器のための組成物であり、該組成物は、以下を含むか、あるいは、以下からなる：
免疫システムの調節、老化過程の遅延、長期持続性ホメオスタシス状態の維持に用いて、身体に健康上の利益を提供し、腸機能の強化を促進するための、
(a)上記(i)〜(v)の全ての条件を満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌株の少なくとも1種；および
(b)細菌ストレプトコッカス・サーモフィルス ST10 DSM25246の株によってインサイチュで生成された細菌由来のエキソポリサッカライド(EPS)および植物由来のポリサッカライドからなる特異的な粘膜接着性ゲル化複合体；好ましくは、タラガム。組成物の成分(a)が、以下の細菌を含むか、あるいは細菌からなるのが有利である：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672およびビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673。
【００２７】
口腔医療機器用組成物は、免疫系を調節し、老化過程を遅延させ、長期持続性ホメオスタシス状態を維持し、したがって身体に健康上の利益をもたらし、良好な腸機能を促進することができる。
【００２８】
該成分(a)は、以下の細菌を含むか、あるいは細菌からなる群から選ばれるビフィドバクテリウム・ロンガム種に属する最菌株の1つ以上でありうる：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673、またはそれらの混合物(成分(a))。
【００２９】
組成物は、EPS、エキソポリサッカライドおよびタラガムからなる特定の粘膜接着性ゲル化複合体(成分(b))を含有し、そのチキソトロピー特性のために摂取後数分以内にヒドロゲルを形成することができ、それによって、炎症誘発活性を有し、したがって身体の酸化ストレスを増強し、巨視的レベルおよび細胞レベルの両方で老化過程を促進しうる代謝産物に対する機械的バリア効果を生み出す。
【００３０】
好ましい実施態様では、百歳以上の被験者から単離され、加齢に関連する腸内微生物および代謝産物に対するバリア効果を強化することができ、腸内微生物の定性的および定量的組成に直接作用する、上記(i)〜(v)の条件を満たす5種類の微生物：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 (DSM 25669)、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 (DSM 25670)、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 (DSM 25671)、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 (DSM 25672)およびビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 (DSM 25673)を含むか、あるいは該微生物からなる混合物(成分(a))を含む。
【００３１】
さらに、インサイチュで、エキソポリサッカライド(EPS)を逆に合成して周辺環境の粘性を高めることができる微生物であるストレプトコッカス・サーモフィルス ST10(タラガムとの組み合わせ)も存在する。上述の細菌であるST10の摂取は、ゲル化活性を有する分子の源となるヒトの腸を提供し、それによってタラガムとの相乗作用が発揮され、それによって炎症誘発活性を有し、身体の酸化ストレスを増強し、巨大分子レベルと細胞レベルの両方において老化過程を促進する代謝産物に対する機械的バリア効果が強化される。
【００３２】
もう1つの実施態様では、組成物は、さらに、細菌(a)および粘膜接着性ゲル化複合体(b)に加えて、セレンと亜鉛を体内で資化性の高い形態で提供し、酸化ストレスに対する防御機構を強化する、菌株ラクトバチルス・ブフネリ Lb 26 (DSM 16341)および／またはビフィドバクテリウム・ラクティス Bb1 (DSM 17850) (それぞれ、ProbioSel(登録商標)およびProbioZinc(登録商標))を含む。該細菌株は、Italy 10100 Torino, Via Alfieri 18の会社、Bioman S.r.l、によって、ドイツのDSMZ研究所に寄託された。組成物の成分(a)が、以下の細菌を含むか、あるいは細菌からなるのが有利である：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672およびビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673。
【００３３】
もう1つの実施態様では、組成物は、さらに、細菌(a)、粘膜接着性ゲル化複合体(b)および菌株ラクトバチルス・ブフネリ Lb 26 (DSM 16341)および／またはビフィドバクテリウム・ラクティス Bb1 (DSM 17850)に加えて、葉酸を合成し、老化中のこの代謝産物の進行性欠損を解消することができる、菌株ビフィドバクテリウム・ラクティス BA05 (DSM 18352)を含む。組成物の成分(a)が、以下の細菌を含むか、あるいは細菌からなるのが有利である：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672およびビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673。
【００３４】
それらの全体的な作用機序に照らして、本発明の目的である組成物は、上記(i)〜(v)で規定した所定の範囲の値内でのIL-4、IL-12、IFN-γなどの特異的かつ十分に確立されたサイトカインおよびその部分集団ならびに炎症誘発性/抗炎症性サイトカインのTh1/Th2比の維持に由来する第1の効果を、高い酸化ストレスおよび老化に多かれ少なかれ強く関連する腸内微生物および代謝産物に対する効果的な機械的バリア効果の確立および維持に由来する第2の効果と相乗的に組み合わせる。
【００３５】
粘膜接着性ゲル化複合体中に存在するタラガムは、常在微生物叢によるその腸内輸送中に徐々に分解され、その結果、機械的妨害であるゲル化能が徐々に低下する。植物ガム作用の漸進的減少は、主に回腸および結腸にその効果を発揮する細菌株ST10による腸管腔内でのエキソポリサッカライド(EPS)放出の漸進的な増加によって効果的に解消される。
【００３６】
インサイチュで生成されるタラガムとエキソポリサッカライド(EPS)の相乗的な組み合わせは、このようにして胃腸管全体のゲル化分子の存在を保証し、生成物に特有の機械的バリア作用を最大にし、最適化する。したがって、植物ガムの作用が最大である第1の領域と、エキソポリサッカライド(EPS)が最大である第2の領域とで、臓器の内腔における親水性ゲルの存在、生成および維持が、初めて、実際に完了したとみなされうる。
【００３７】
上記に関して、老化は、免疫系の再構築および免疫応答の機能性の低下を特徴とする過程であることが知られている。これらの年齢に関連する変化は、免疫老化現象、抗原およびストレス要因、たとえば、酸化ストレスなど対して寿命を通して継続的に暴露されることによって主として引き起こされる事象に起因すべきである。
【００３８】
これは、免疫系の全体的な「劣化」をもたらし、炎症誘発性サイトカインの増加が重要な役割を果たす：実際、それらは、身体の老化を導く慢性炎症現象を意味する炎症過程に寄与する。
【００３９】
さらに、老化過程は、酸化還元ホメオスタシスの変化および酸化ストレスの漸進的増加によって特徴付けられる。したがって、身体が酸化ストレスおよび炎症ストレスの両方に適切に反応する能力に関連する細胞および分子機構は、ヒトの寿命を促進し、主要な加齢性機能不全の発症を回避または遅延させる重要な役割を果たすと思われる。
【００４０】
もう1つの重要な態様は、老化中に定性的および定量的に変化する腸内微生物叢の特徴である。実際、消化管内の細菌集団は、免疫学的および粘膜バリア改変のためにその組成に変化を受ける可能性がある。高齢被験者におけるこのような微生物叢の変動は、いくつかの細菌種の過剰繁殖が、その増殖のために細菌種によって必要とされる要素であるカルシウム、鉄および葉酸塩の不足をもたらしうると考える場合に、主に価値がある。
【００４１】
上記から、主に、炎症誘発性および酸化促進性活性を有する代謝産物に対する粘膜の正常なバリア効果の機能の漸進的かつ、ほとんどの場合、不可逆的な喪失に関連して、腸内微生物叢の適正かつ適切な平衡を経時的に考慮に入れることの重要性が推測されうる。
【００４２】
100歳の被験者から単離され、腸内微生物叢の定性的および定量的組成に直接作用することにより、タラガムとエキソポリサッカライド(EPS)からなる粘膜接着性複合体によって仲介される老化に関連する腸内微生物叢および代謝産物に対するバリア効果を強化することができる、5種の微生物の混合物：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 (DSM 25669)、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 (DSM 25670)、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 (DSM 25671)、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 (DSM 25672)およびビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 (DSM 25673)-成分(a)。老化中、腸レベルにおける亜鉛を資化する能力の全体的な低下が観察され、したがって、胸腺および免疫系にとって決定的な結果をもたらす欠損状態が導かれる。
【００４３】
亜鉛は、免疫応答のあらゆる局面に影響を与える多価作用を発揮するので、実際には、免疫系の正常な機能にとって不可欠な要素である。人体中の亜鉛は約2グラムが組織全体に分布しているが、主に線条筋肉(60％)、骨(30％)および皮膚(4〜6％)に集中している。肝臓の亜鉛のみが、時限的欠損の場合に部分的に動員されうるが、亜鉛の特定のリザーバーが存在しないので、定期的な食事摂取が必要となる。食物とともに導入された亜鉛の約10〜40％が近位の小腸レベルで吸収される。吸収される量は、その化学形態、その血中濃度、輸送に競合する微小要素の腸内腔における同時存在、キレート剤および粘膜細胞によって合成されるメタロチオネインの濃度に依存して変化する。
【００４４】
しかし、高齢者集団がしばしば腸の吸収不良の問題に苦しんでいることを考慮すると、上記に基づいて、高齢では亜鉛欠乏を回避することが重要であり、したがって適切な用量でそれを摂取すること、主としてその最良のバイオアベイラビリティを可能にする形態で摂取することが必要である。
【００４５】
高齢者集団で欠乏が頻繁に発生し、抗酸化活性のために亜鉛自体と相乗的に作用するセレンの食事補給はまた、封鎖される細胞内区画からの亜鉛の放出を可能にするための基本的なものである。セレンは、実際に、酸化ストレスに対抗するために重要な抗酸化活性を有する酵素であるグルタチオンペルオキシダーゼの構成成分である。
【００４６】
１つの実施態様では、ラクトバチルス・ブフネリ Lb26 (DSM 16341)およびビフィドバクテリウム・ラクティス Bb1 (DSM 17850) (それぞれ、ProbioSel(登録商標)およびProbioZinc(登録商標))の菌株は、ティンダル化形態(tyndallized form)で、本発明の目的である組成物中にある；この形態において、該菌株は、老化過程によって誘導された欠損を補うのに有用な、身体により資化性の高い形態でセレンおよび亜鉛を提供することができ、40〜50歳を超える人々にとって特に重要な、酸化ストレスに対する防御機構を付随的に強化する。そのような体内細菌は、腸粘膜に到達すると、腸細胞、亜鉛およびセレンの有機体を放出し、このような、ティンダル化された細菌は、超粘膜に到達すると、腸細胞の近くで、有機形態の亜鉛およびセレンを放出し、それらは、このようにして腸粘膜を介して直接吸収され、全身循環に入り、生物にその効果を及ぼす。
【００４７】
細菌ビフィドバクテリウム・ラクティスBb1(DSM 17850)の菌株は、液体培地中で増殖する間に細胞内に亜鉛を蓄積することができる。微生物細胞内に蓄積された食餌性亜鉛は、Transwellシステムにおける腸上皮を模倣するCaco-2細胞についてのインビトロでの研究によって示されるように、グルコン酸亜鉛より16倍以上、および硫酸亜鉛より31.5倍以上大きい資化性を有する。
【００４８】
ラクトバチルス・ブフネリ Lb26 (DSM 16341)は、細胞内にセレンを蓄積することができる。該セレンは、亜セレン酸ナトリウムより5.9倍、セレンメチオニンより9.4倍、およびセレンシステインより65倍大きい資化性を有する。
【００４９】
2つの微量元素、亜鉛およびセレンの高資化性は、非常に低用量であっても、非常に有効な方法で欠損を解消することを可能にする。
【００５０】
全身レベルで直接入手できる亜鉛を得る可能性は、この微量元素の欠損を解消して、腸吸収の困難な高齢被験者における摂取に関連する全ての問題を回避する。
【００５１】
さらに、セレンとの組み合わせは、高齢期における細胞内レベルでの亜鉛のメタロチオネインによる典型的な金属イオン封鎖に関する上述の問題を克服し、実際、セレンは、細胞からの放出を促進する。
【００５２】
本発明の組成物に微生物ビフィドバクテリウム・ラクティス BA05 (DSM 18352)がさらに存在する場合、上記の機械的バリア効果が強化され、さらに、インサイチュで葉酸(ビタミンB9)が天然で合成され、このように老化期間におけるこの抗酸化代謝産物の漸進的な欠損が解消されうる。特に、葉酸塩は、フリーラジカルの強力な産生およびそれに続く酸化ストレスを誘導しうるイオウアミノ酸から誘導された分子であるホモシステインに対するバリア効果を発揮することが知られている。
【００５３】
その全体的な作用機序に照らして、本発明の組成物は、炎症に有効であり、主として、高酸化ストレスおよび老化に多かれ少なかれ強く関連する代謝産物に対する効果的な機械的バリア効果の確立および維持を介して作用し、高齢者向けの健康上の進歩を確保するために50歳以上の成人において重要な活動をする特定の微量栄養素および葉酸の欠乏を解消する。
【００５４】
このことによって、本発明の組成物は、主として機械的タイプのバリア効果を、炎症に対して確立し、維持し、その結果、より良い健康状態で老化に立ち向かうのを補佐することができると言える。
【００５５】
本発明の文脈において、ビフィドバクテリウム・ロンガム種に属する細菌などの、条件(i)〜(v)を満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌の菌株は、生細胞および/または死細胞の形態で、および/またはその代謝産物として、および/またはその細胞誘導体として、および/またはその細胞成分もしくは酵素成分として、該本発明組成物中に存在しうる。
【００５６】
本発明組成物は、長期持続性ホメオスタシス状態を維持し、被験者の寿命の延長を補佐するため；老化の生物学的過程、たとえば、身体および/または皮膚の老化を遅延および/または解消および/または低減するため；記憶または視覚記憶および/または集中する能力を失わせる老化過程を弱めるため；非特異的阻害メカニズム(代謝産物の産生)および/または特異的阻害メカニズム(バクテリオシン産生)を介するバクテロイデスの産生を阻害するため；大腸炎、潰瘍性大腸炎、IBD(炎症性腸疾患)およびクローン病の発症に導く現象を阻害することができる酪酸塩を生成することができる酪酸クロストリジウムの産生を刺激するため；腸内細菌科に属する腸内細菌の産生を阻害および/または減少させるため、特に微生物叢に通常存在する腸内細菌の負荷を減少させるため；ビフィドバクテリウム・ロンガム種が優勢であることを可能にするために、腸内微生物フローラ平衡を改変するため；抗酸化活性、サイトカインの産生による免疫調節活性に積極的に影響を及ぼすために、制限されることなく、全てのカテゴリーの人々に投与することができる。
【００５７】
本発明の目的である前記条件(i)〜(v)を全て満たすビフィドバクテリウム・ロンガム属に属する細菌の菌株は、プロテアソーム(UPS＝ユビキチン-プロテアソーム系)により有意に介入することができるので、ヒトの寿命の延長に寄与するのを補佐することができる。プロテアソームの作用は、老化に導く生物学的現象を解消し、ヒトの身体的および/または精神的状態を維持することを可能にする。
【００５８】
有利なことに、本発明組成物は、少なくとも条件(i)〜(v)を満たす細菌の菌株と組合せて、N-アセチルシステイン(NAC)それ自体を含むか、またはN-アセチルシステイン(NAC)またはその誘導体に基づく物質を含むことができる。
【００５９】
したがって、本発明においては、大腸菌の腸壁への接着能力を中和するための機械的バリア効果を有する遊離型およびマイクロカプセル化胃保護型としてのN-アセチルシステイン(10〜1000mg/die)の使用が企図される。さらに、N-アセチルシステインは、グルタチオン産生を刺激し、したがって、抗酸化活性を有する。本発明組成物は、プロテアソームの活性を維持することができる。このような理由から、それらは、寿命を延長することを補佐するために、人々に効果的に投与されうる。
【００６０】
条件(i)〜(v)の全てを満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌の菌株は、組成物の総重量に対して0.1〜65重量％、好ましくは0.5〜15重量％、さらにより好ましくは1〜10重量％の量で存在する。しかしながら、組成物の総重量に対する割合は、製造される組成物の製品カテゴリーに依存する。たとえば、カプセル中の該細菌の量は、40％より多いのが好ましい。
【００６１】
本発明組成物は、1x106〜1x1011 UFC/g、好ましくは1x108〜1x1010 UFC/gからなる濃度を有する細菌負荷を含む。
【００６２】
組成物は、1x106〜1x1011 UFC/g、好ましくは1x108〜1x1010 UFC/gからなる濃度の細菌を含みうる。用量は、0.2〜10g、たとえば、0.25g、1g、3g、5gまたは7gからなりうる。
【００６３】
本発明で使用される細菌は、固体形態、特に粉末、脱水、噴霧または凍結乾燥粉末として存在することができる。
【００６４】
食物組成物または補助食品または医療機器または医薬組成物は、さらに、イヌリン、フルクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖およびトランスガラクトオリゴ糖(GOSおよびTOS)、グルコオリゴ糖(GOSα)、キシロオリゴ糖、(XOS)、キトサンオリゴ糖(COS)、大豆オリゴ糖(SOS)、イソマルトオリゴ糖(IMOS)、難消化性デンプン、ペクチン、オオバコ種子、アラビノガラクタン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キシラン、ラクトスクロース、ラクツロース、ラクチトールおよび他の多くの種類のガム、好ましくはタラガム、アカシア、イナゴ、オートムギ、竹繊維、柑橘類果実繊維、および一般に、可溶性部分および不溶性部分を互いに異なる比率で含む繊維などのビフィズス菌増殖促進活性を有するいくつかのプレバイオティクス繊維および炭水化物を含むことができる。
【００６５】
有利には、該繊維が、FOS、イヌリンおよび柑橘類果実繊維から選択され、好ましくは1：3〜3：1の重量比であるのが有利である。
【００６６】
ビフィズス菌増殖促進活性を有するプレバイオティック繊維および/または炭水化物の量は、もしあれば、組成物の総量に対して、0.5〜75 重量%、好ましくは1〜40重量%、およびさらに好ましくは2〜20重量%からなる。この場合、組成物または補助食品は共生活性を有する。
【００６７】
本発明組成物は、さらに、一種以上の生理的に許容しうる添加剤または賦形剤を含み、ならびに、さらに、組成物の総量に対して、活性成分の種類およびその任意の推奨１日用量に応じて、いずれの場合でも、通常、0.001重量％〜10重量％、好ましくは0.5重量％〜5重量％の重量で、ビタミン、ミネラル、生物活性ペプチド、抗酸化活性,低コレステロール血症活性,低血糖活性,抗炎症活性を有する物質、甘味料などの他の成分および／または活性成分も含む。
【００６８】
本発明の組成物は、既知の装置および装置および適切な製造方法を使用することができる、当業者に知られており、アクセス可能な技術によって調製される。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
表Aは、出願人が本発明との関連において試験した菌株に関する。
表A
【表１】
2017536828.tif 000002
【００７０】
【表２】
2017536828.tif 000003
【００７１】
【表３】
2017536828.tif 000004
【００７２】
【表４】
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【００７３】
【表５】
2017536828.tif 000006
【００７４】
【表６】
2017536828.tif 000007
【００７５】
【表７】
2017536828.tif 000008
【００７６】
【表８】
2017536828.tif 000009
【００７７】
【表９】
2017536828.tif 000010
【００７８】
【表１０】
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【００７９】
【表１１】
2017536828.tif 000012
【００８０】
【表１２】
2017536828.tif 000013
【００８１】
【表１３】
2017536828.tif 000014
【００８２】
【表１４】
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【００８３】
本出願人は、単一細胞亜集団を特徴付ける分子を分析し、E.L.I.S.Aによるサイトカインアッセイを決定するために、表Aの菌株を試験した。使用する方法を以下に開示する。
【００８４】
単一細胞亜集団を特徴とする分子の分析
免疫表現型の特徴付けのために、フ0.1 x 106 PBMC/1% BSA-PBS 100μlのサンプルを、ルオレセインイソチオシアナート(FITC)、フィコエリトリン(PE)またはペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)と複合したモノクローナル抗体(mAb)の異なる組み合わせとともに、暗室にて30分間インキュベートする。適切なアイソタイプコントロールも測定中にインキュベートする。以下の表Bにおいて、使用される抗体の組合せが詳述される。
【００８５】
表B
【表１５】
2017536828.tif 000016
【００８６】
インキュベーションの際に、サンプルを1.5mLの1% BSA-PBSで洗浄して過剰の抗体の痕跡を除去する(遠心分離1600 rpm、5分間)。インキュベーションの際に、サンプルを1.5mLの1％BSA-PBSで洗浄して過剰の抗体の痕跡を除去する(遠心分離1600 rpm、5分間)。1% PFA-PBS200μlを加えて細胞を固定し、4℃で保存する。調製後24時間以内に、サンプルを、サイトフルオロメーターFACScaliburによって分析し、分析から夾雑細胞破片を除外するように細胞を選択する。
【００８７】
E.L.I.S.A.によるサイトカインアッセイ
本方法は、酵素結合免疫吸着検査法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays: E.L.I.S.A.)によって細胞培養上清、血清、血漿および尿中に存在するヒトインターロイキンの濃度を決定することを可能にする。サイトカインアッセイに関して、本方法では、eBioscience Company製のKIT Human ELISA Ready-SET-Go(登録商標)が使用される。
【００８８】
方法の原理
酵素結合免疫吸着検査法(E.L.I.S.A.)は、所与のサンプル中の特定の抗原(Ag)の存在を検証することを目的とする免疫酵素試験である。特に、本方法が関連するE.L.I.S.A.法は、直接型またはサンドイッチ型である。目的のサイトカインを特異的に検出することができるモノクローナル抗体(捕捉抗体)を、マイクロプレートのウェルをコーティングするために使用する。サンプルを、存在する対象となる全てのサイトカインが固定された抗体に結合することができるように、異なるマイクロウェルに分配する。したがって、対象となるサイトカインを検出および結合することができるビオチン結合抗体(検出抗体)およびビオチンに結合し、酵素自体を複合体に固定することができるストレプトアビジンに結合した酵素ペルオキシダーゼ(HRP)を順次追加した。最後に、酵素の存在下で酸化される無色の発色基質を添加し、したがって、固定化されたサイトカインの量に比例する強度で青色を発色させる。硫酸を添加することによって反応を停止させ、青色から黄色へ色を変化させる。
【００８９】
操作
この方法を実施するために使用される全ての試料および試薬は、使用前に室温にしなければならないことを留意すべきである。記載されたすべてのステップは、室温で実行されるべきである。
【００９０】
E.L.I.S.A.アッセイに特化した96平底ウェルプレート(キットに含まれるCorming Costar 9018 ELISA)により、試験される各サンプル用のウェルと標準較正曲線の調製用の適切な数のウェル(合計16ウェル)を準備する。
曲線(合計16ウェル)。
【００９１】
コーティング溶液1X(キットに含まれるストック溶液10X、滅菌蒸留水で1:10に希釈する)で、一次抗体(捕捉抗体；最終濃度10μg/ml)の原液を250倍に希釈する。
【００９２】
この溶液100μlを全ウェルに分注し、プレートを粘着性ストリップで覆い、4℃(冷蔵庫)にて一夜(O.N.)インキュベートする。
【００９３】
各ウェルを、200μlの洗浄液(PBS中の0.05% Tween20)で5回洗浄する。真空ポンプを用いて、すべてのウェルにおいて最後の洗浄液を吸引し、溶液の残渣を除去するためにプレートを吸収紙上で裏返す。
【００９４】
アッセイ緩衝液1X(キットに含まれるストック溶液5X、滅菌蒸留水で1：5に希釈する)200μlをすべてのウェルに加え、室温(RT)で1時間インキュベートする。
【００９５】
各ウェルを、200μlの洗浄液で5回洗浄する。真空ポンプを用いて、すべてのウェルにおいて最後の洗浄液を吸引し、溶液の残渣を除去するためにプレートを吸収紙上で裏返す。
【００９６】
標準較正曲線のために必要なヒト組換えサイトカインを含む溶液を、以下の表にしたがって調製し、遠心分離をした後、すべてのチューブを開封する：
【００９７】
表C
【表１６】
2017536828.tif 000017
【００９８】
下記スキームより、100μlのアッセイ緩衝液1XをウェルC2〜C8に分配する。
ウェルC1に200μlの“原液”(上記表に従って調製)を分配し、スキームに特定されるように、1：2の連続希釈を続ける。希釈は、ウェルまたはエッペンドルフチューブ内で直接行うことができる。
【００９９】
曲線は二反復で作成されるべきである。
【０１００】
プレートのスキームにしたがって、所定のウェルに、試験される各サンプル100μl(S、二反復で)を加える。プレートを粘着性ストリップで覆い、4℃(冷蔵庫)にて一夜(O.N.)インキュベートする。
【０１０１】
製造者の説明書に記載されているように、アッセイ緩衝液1X中の原液を250倍に希釈することにより、二次ビオチン化抗体(検出抗体)を含有する溶液を調製する。
【０１０２】
各ウェルを200μlの洗浄液で5回洗浄する。真空ポンプを用いて、すべてのウェルにおいて最後の洗浄液を吸引し、溶液の残渣を除去するためにプレートを吸収紙上で裏返す。
【０１０３】
すべてのウェルに、二次抗体を含む溶液100μlを分配し、プレートを粘着性ストリップで覆い、室温にて１時間インキュベートする。
【０１０４】
製造者の説明書に記載されているように、アッセイ緩衝液1X中の原液を250倍に希釈することにより、酵素アビジン-HRPを含む溶液を調製する。
【０１０５】
各ウェルを、200μlの洗浄液で5回洗浄する。真空ポンプを用いて、すべてのウェルにおいて最後の洗浄液を吸引し、溶液の残渣を除去するためにプレートを吸収紙上で裏返す。
【０１０６】
すべてのウェルに、酵素を含む溶液100μlを分配し、プレートを粘着性ストリップで覆い、室温にて30分間インキュベートする。
【０１０７】
各ウェルを、200μlの洗浄液で７回洗浄する。真空ポンプを用いて、すべてのウェルにおいて最後の洗浄液を吸引し、溶液の残渣を除去するためにプレートを吸収紙上で裏返す。
【０１０８】
すべてのウェルに100μlの基質(1X TMB溶液)を加え、暗室で室温にて10分間インキュベートする(アルミニウムホイル紙でプレートを覆う)。
【０１０９】
すべてのウェルに50μlの2N硫酸を加えて、反応を停止させる(色が、青色から黄色に変わる)。
【０１１０】
展開から30分以内に450nm波長にて96ウェルプレート用分光光度計でプレートを読み取る。
【０１１１】
結果の計算/表現
計算機のExcelシートまたは使用したリーダーに付属のソフトウェアを使用することにより、分光光度計で読み取ったすべての吸光度値を挿入する。二反復物それぞれ(標準およびサンプル)の吸光度値の平均を計算する。
【０１１２】
標準曲線についてのみ、異なる希釈度の組換えサイトカインの既知濃度の吸光度値と一致させる。
【０１１３】
標準曲線値を使用して、x軸上に平均吸光度値、およびy軸上にサイトカインの既知濃度を示すグラフをプロットする。
【０１１４】
標準較正曲線をプロットし、グラフのポイント(R＝1が、完全なものである)に適合させる。5パラメータ曲線(5パラメータロジスティック5-PL曲線フィット)の構築が推奨される。
【０１１５】
プロットされた曲線とR値の式をグラフに挿入する。
【０１１６】
次いで、プロットされた標準曲線の式を外挿することにより、各サンプルのサイトカイン濃度を決定する(以下の例を参照)。
【０１１７】
例：IL-4サイトカインアッセイに続いて得られる、標準較正曲線の構築のための吸光度値 対 濃度の表
表D
【表１７】
2017536828.tif 000018
【０１１８】
各サンプルについて、曲線式のX値を、読み取られるODに置き換えることによって、存在するIL-4の未知の濃度を外挿により得ることができる。
【０１１９】
結果の解釈
手順が正確に実行される場合、各試験サンプル中の試験されたサイトカインの量は、標準較正曲線値の範囲内に含まれるべきである。標準較正曲線の外側のサイトカイン濃度は不正確であるとみなされるべきである。特に、大きな値の場合は、アッセイ緩衝液を使用することによって、試験サンプルをさらに希釈することが推奨される。
【０１２０】
表Eに示す結果
5種の菌株：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672およびビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673の組成物に関し、結果は以下の通りである：IL-12p70＝1.02±0.02；IL-4＝3.19±0.41；IFN-g＝16.17±4.84；IL-17A＝1.11±0.04。ベースライン値に対するTh1/Th2比の変動は、3.10±1.06である。
【０１２１】
ビフィドバクテリウム・ロンガム種に属する菌株によるインドールの生物変換試験
この研究は、B. longum種に属する細菌の5つの菌株：ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672およびビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673に基づく混合物(簡単に言えば、「5菌株株混合物」)の能力および性能を調べた。生物変換試験は、細胞増殖条件下で行なわれた。
【０１２２】
材料および方法
DMSO(ジメチルスルホキシド)中のインドールの1M原液を調製した。上記のビフィドバクテリウムの5つの菌株の凍結乾燥混合物を、MRS寒天(BD Difco、Sparks、USA)中でL-システインHClを添加することにより活性化し、嫌気条件下(N2 85%、CO2 10%、H2 5%)、室温にて48時間インキュベートした。
【０１２３】
インドール変換を評価するために、1mMインドールを含有する10mlのMRS(10％v/v)にビフィドバクテリウムの活性化培養物を接種し、嫌気条件下(N2 85%、CO2 10%、H2 5%)で37℃の温度にて48時間インキュベートした。
【０１２４】
48時間後、アリコートを採取し、遠心分離(13000×g、4℃にて5分間)し、得られた上清を濾過した(酢酸セルロースのフィルター、0.22μm)。次いで、10μlの濾過上清を、可変波長検出器およびカラムZORBAX Eclipse XDB-C18(迅速分解能、1.8μm粒径、4.6×50mm、Agilent)を備えたHPLC(Agilent 1100、Agilent Technologies Inc.、Santa Clara、CA、USA)によって分析した。移動相は、40mM酢酸アンモニウム水溶液(溶媒A)およびアセトニトリル(溶媒B)からなった。流速は、0.8ml/分に設定された。HPLC分析のために、以下の勾配を適用した：0〜10分、溶媒Bの10％〜50％の直線的；1〜11分、90％までの直線的；11〜16分、イソクラティック90％；16〜17分、直線的10％；17〜20分、イソクラティック10％。分析物であるインドールは、275nmの波長で同定され、外部標準を用いて定量された。
【０１２５】
結果
尿毒症毒素インドールを変換する能力、したがって、培養ブロス中のその濃度を低下させる能力について、上記のビフィドバクテリウム・ロンガムの5つの菌株の混合物を分析した。
【０１２６】
実験を、培養ブロス中の活性細菌増殖条件下で行った。ビフィドバクテリウム・ロンガムの混合物の不在下では、培養液中のインドール濃度は変化しない。ビフィドバクテリウム・ロンガムの活性化混合物の存在下では、嫌気条件下(N2 85%、CO2 10%、H2 5%)、37℃の温度で行ったインキュベーションの48時間後に、インドール濃度(1mM)が24%±2%減少した。培養ブロス中の尿毒症毒素インドールの存在は、ビフィドバクテリウム・ロンガムの混合物の細菌増殖を制限しなかった(P＞0.05)。
【０１２７】
本発明の実施態様(実施態様n)を以下に示す：
実施態様1．免疫系を調節し、老化過程を遅延させ、長期持続性ホメオスタシス状態を維持することにおける使用のための、ラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌株であって、以下の特性を有することを特徴とする菌株：
(i)1に設定されたベースライン値に対して2.5〜4.5倍の値に、IL-4などの抗炎症性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(ii)1に設定されたベースライン値に対して0.85〜1.05倍の値に、IL-12p70などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iii)1に設定されたベースライン値に対して7〜19.5倍の値に、IFN-γなどの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iv)1に設定されたベースライン値に対して0.90〜1.40倍の値に、IL-17などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(v)2.90〜4.50のTh1/Th2比の値を与える、炎症誘発性/抗炎症性サイトカインの比率を調節する全体的な能力。
実施態様2．実施態様1に記載の使用のための菌株であって、以下の特性を有することを特徴とする菌株：
(i)1に設定されたベースライン値に対して3〜4倍の値に、IL-4などの抗炎症性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(ii)1に設定されたベースライン値に対して0.90〜1倍の値に、IL-12p70などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iii)1に設定されたベースライン値に対して8〜18倍の値に、IFN-γなどの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(iv)1に設定されたベースライン値に対して0.95〜1.30倍の値に、IL-17などの炎症誘発性サイトカインの生成を調節することによって免疫系を調節する能力；および
(v)3〜4のTh1/Th2比の値を与える、炎症誘発性/抗炎症性サイトカインの比率を調節する全体的な能力。
実施態様3．実施態様1または実施態様2に記載の使用のための菌株であって、該菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガム種に属し、好ましくは、該菌株が、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 07 DSM 25669、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 08 DSM 25670、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 09 DSM 25671、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 10 DSM 25672、ビフィドバクテリウム・ロンガム DLBL 11 DSM 25673、またはその混合物を含むか、あるいはそれらからなる群から選択される、菌株。
実施態様4．免疫系を調節し、老化過程を遅延させ、長期持続性ホメオスタシス状態を維持することにおける使用のための、a)実施態様1または実施態様2または実施態様3に記載の条件(i)〜(v)の全てを満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌の少なくとも1つの菌株を含むか、あるいはそれらからなる、口腔組成物。
実施態様5．該組成物が、長期持続性ホメオスタシス状態の維持のための、腎不全、好ましくは急性もしくは慢性の腎不全の治療における使用のための組成物である、実施態様4に記載の使用のための組成物。
実施態様6．該組成物が、長期持続性ホメオスタシス状態の維持のための、尿毒症毒素を減少させることにおける使用のための組成物である、実施態様4または実施態様5に記載の使用のための組成物。
実施態様7．該尿毒症毒素が、細菌由来であり、好ましくは、インドールおよび／またはクレゾールから選択される、実施態様4または実施態様5または実施態様6に記載の使用のための組成物。
実施態様8．実施態様4〜実施態様7のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物は、以下を含むか、あるいは、以下からなる：
(a)施態様1または実施態様2または実施態様3に記載の(i)〜(v)の全ての条件を満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌株の少なくとも1種；および
(b)細菌ストレプトコッカス・サーモフィルス ST10 DSM25246の株によってインサイチュで生成された細菌由来のエキソポリサッカライド(EPS)および植物由来のポリサッカライドからなる特異的な粘膜接着性ゲル化複合体；好ましくは、タラガム。
実施態様9．実施態様4〜実施態様8のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、それぞれ身体により資化性の高い形態、好ましくは、ティンダル化形態(tyndallized form)で、セレンおよび亜鉛を提供する、ラクトバチルス・ブフネリ Lb 26 (DSM 16341)および／またはビフィドバクテリウム・ラクティス Bb1 (DSM 17850)をさらに含む、組成物。
実施態様10．実施態様4〜実施態様9のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、葉酸を合成することができる菌株ビフィドバクテリウム・ラクティス BA05 (DSM 18352)をさらに含む、組成物。
実施態様11．実施態様4〜実施態様10のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、イヌリン、フルクトオリゴ糖(FOS)、ガラクトオリゴ糖およびトランスガラクトオリゴ糖(GOSおよびTOS)、グルコオリゴ糖(GOSα)、キシロオリゴ糖、(XOS)、キトサンオリゴ糖(COS)、大豆オリゴ糖(SOS)、イソマルトオリゴ糖(IMOS)、難消化性デンプン、ペクチン、オオバコ種子、アラビノガラクタン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キシラン、ラクトスクロース、ラクツロース、ラクチトールおよび他の多くの種類のガム、好ましくはタラガム、アカシア、イナゴ、オートムギ、竹繊維、柑橘類果実繊維、および一般に、可溶性部分および不溶性部分を互いに異なる比率で含む繊維などのビフィズス菌増殖促進活性を有するいくつかのプレバイオティクス繊維および炭水化物をさらに含む、組成物。
実施態様12．実施態様4〜実施態様11のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、1x106〜1x1011 UFC/g、好ましくは1x108〜1x1010 UFC/gからなる濃度を有する細菌負荷を有する、組成物。
実施態様13．実施態様4〜実施態様12のいずれか１つに記載の使用のための組成物であって、該組成物が、実施態様1または実施態様2または実施態様3に記載の条件(i)〜(v)の全てを満たすラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属に属する細菌の菌株を、組成物の総重量に対して0.1〜65重量％、好ましくは0.5〜15重量％、さらにより好ましくは1〜10重量％の量で含む、組成物。
【０１２８】
【表１８】
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【表１９】
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【国際調査報告】
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