(57)【要約】本明細書において、（１）アルミニウム塩に吸着させた免疫原を、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム（Ｌ（ＭＰＬＡ））と混合する方法および（２）得られた免疫原性組成物が提供される。得られた免疫原性組成物は、Ｌ（ＭＰＬＡ）と混合された封入されていない免疫原を含む組成物またはアルミニウム塩に吸着させた免疫原単独と比較して、強化された免疫賦活能を有する。
2017509713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性組成物を調製する方法であって、
アルミニウム塩に吸着させた免疫原を、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム（Ｌ（ＭＰＬＡ））と混合して、液相中に前記免疫原性組成物を得る工程を含み、前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原は、アルミニウム塩によって吸収された免疫原を含む、方法。
【請求項２】
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原およびＬ（ＭＰＬＡ）を、混合時に、約４℃〜約３７℃の範囲の温度で、約３０分間〜約２４時間インキュベートする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｌ（ＭＰＬＡ）を凍結乾燥する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｌ（ＭＰＬＡ）が、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン脂質を含み、前記免疫原性組成物中のアルミニウムと前記ＭＰＬＡとの間の乾燥重量比が、約１：１１０〜約８５：３の範囲である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原中の前記アルミニウムと前記免疫原との間の乾燥重量比が、約１：３０〜約８５：１の範囲である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記アルミニウム塩が、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムまたはそれらの任意の組合せである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原が、ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、パンデミックインフルエンザ、日本脳炎、髄膜炎菌（meningococcus）、肺炎球菌（pneumococcus）、狂犬病、破傷風トキソイド、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、ライム病、炭疽、腸チフスまたはそれらの組合せのための、アルミニウム塩に吸着させたワクチンである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原が、アルミニウム塩に吸着させたＨＩＶ−１タンパク質ｇｐ１２０を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アルミニウム塩が、水酸化アルミニウムである、請求項１から６および８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫原性組成物が、前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原単独と比較して、強化された免疫賦活能を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫原性組成物が、Ｌ（ＭＰＬＡ）と混合された封入されていない免疫原と比較して、強化された免疫賦活能を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記請求項のいずれか一項に記載の方法によって調製される免疫原性組成物。
【請求項１３】
生理学的に許容される媒体をさらに含む、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原が、水酸化アルミニウムに吸着させたＨＩＶ−１タンパク質ｇｐ１２０であり、前記免疫原性組成物の単回用量が、
約１０μｇ〜約６００μｇのｇｐ１２０タンパク質、
約２０μｇ〜約８５０μｇのアルミニウム、および
約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン脂質を含む約３０μｇ〜約２．２ｍｇのＬ（ＭＰＬＡ）
をさらに含む、請求項１２または請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
アルミニウム塩に吸着させた免疫原の免疫賦活能を強化する方法であって、
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原に、Ｌ（ＭＰＬＡ）を混合して、液相中に免疫原性組成物を得る工程を含み、前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原は、アルミニウム塩によって吸収された免疫原を含む、方法。
【請求項１６】
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原およびＬ（ＭＰＬＡ）を、混合時に、約４℃〜約３７℃の範囲の温度で、約３０分間〜約２４時間インキュベートする工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｌ（ＭＰＬＡ）を凍結乾燥する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｌ（ＭＰＬＡ）が、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン脂質を含み、前記免疫原性組成物中のアルミニウムと前記ＭＰＬＡとの間の乾燥重量比が、約１：１１０〜約８５：３の範囲である、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原中の前記アルミニウムと前記免疫原との間の乾燥重量比が、約１：３０〜約８５：１の範囲である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記アルミニウム塩が、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムまたはそれらの任意の組合せである、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原が、ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、パンデミックインフルエンザ、日本脳炎、髄膜炎菌（meningococcus）、肺炎球菌（pneumococcus）、狂犬病、破傷風トキソイド、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、ライム病、炭疽、腸チフスまたはそれらの組合せのための、アルミニウム塩に吸着させたワクチンである、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルミニウム塩に吸着させた免疫原が、アルミニウム塩に吸着させたＨＩＶ−１タンパク質ｇｐ１２０を含む、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルミニウム塩が、水酸化アルミニウムである、請求項１５から２０および２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
アルミニウム塩に吸着させた免疫原の免疫賦活能を強化するためのＬ（ＭＰＬＡ）組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年３月２５日に出願された米国仮出願第６１／９６９，９０５号の利益を主張する。
【０００２】
米国政府の権利
本発明は、政府の援助で行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
分野
アルミニウム塩に吸着させた免疫原（aluminum salt-adsorbed immunogen）を、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）を含むリポソームと混合することによって、アルミニウム塩に吸着させた免疫原の免疫賦活能（immunostimulation potency）を強化する方法および得られるその組成物が、本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００４】
背景
現代の多くのワクチンが最適な有益効果をもたらすには、注射後に全身の安全性および最小限の副反応を維持しながら免疫応答を強化するワクチンアジュバントの使用を必要とする。臨床的に承認されたアジュバントの最も一般的な形はアルミニウム塩であり、これはほとんど９０年前に初めて試験された。アルミニウム塩は現在のところ、多くのワクチン、例えば、子宮頚がん（ＨＰＶ）、肝炎、ポリオ、破傷風、ジフテリアおよび季節性インフルエンザに対するワクチンに使用されている。例えば、Baylor et al., 2002, Vaccine 20: S18-S23を参照のこと；インターネット上のhypertext transfer protocol://www.path.org/publications/files/TS_vaccine_stability_table.pdfにおけるKristensen, 2012 Summary of Stability data for licensed vaccinesも参照のこと。それらの正確な作用機序は、これから完全に理解されることになろうが、これらのアジュバントは、何十年もの間、認可されたヒトワクチンに幅広く使用されてきた。それらは安全性についてのより長い記録を有し、ヒトに莫大な回数の投与が行われてきた。同文献。
【０００５】
それにもかかわらず、アルミニウム塩のアジュバント効果はさまざまであり、例えば、それらは有効なものからほとんど有効でないものまでまたは全く無効なものさえあるなどの範囲に及ぶ。例えば、Aprile et al., 1966, Can. J. Public Health 57: 343-60を参照のこと。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
よって、当技術分野において、より強力なワクチン製剤を開発することが依然として必要とされている。これに関して、新規なアジュバントが同定され、特性決定される必要があり得る。あるいは、そのような目標は、以前から存在するアルミニウム塩に吸着させたワクチンの免疫賦活能を強化することによって達成され得る。本明細書において、アルミニウム塩に吸着させた免疫原の免疫賦活能を強化する方法であって、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム（Ｌ（ＭＰＬＡ））組成物を、アルミニウム塩に吸着させた免疫原と混合して、強化された免疫賦活能を有する組成物を得ることによる方法が提供される。そのような方法によって生成される組成物も記載される。例えば、本明細書において、強化された免疫応答、例えば、免疫対象における抗体産生の増加を示す、Ｌ（ＭＰＬＡ）と混合された、水酸化アルミニウムゲルに吸着させたｇｐ１２０タンパク質を含むＨＩＶワクチン組成物が提供される。
【０００７】
よって、免疫原性組成物を調製する方法であって、アルミニウム塩に吸着させた免疫原を、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム（Ｌ（ＭＰＬＡ））と混合して、液相中に免疫原性組成物を得る工程を含み、アルミニウム塩に吸着させた免疫原は、アルミニウム塩によって吸収された免疫原を含む、方法が提供される。方法は、アルミニウム塩に吸着させた免疫原およびＬ（ＭＰＬＡ）を、混合時（混合に際して（upon mixing））に、約４℃〜約３７℃の範囲の温度で、約３０分間〜約２４時間または好ましくは約１時間〜約１２時間インキュベートする工程をさらに含み得る。
【０００８】
方法は、アルミニウム塩に吸着させた免疫原単独と比較して、強化された免疫賦活能を有する免疫原性組成物をもたらし得る。加えてまたはその代わりに、方法は、免疫原性組成物が、Ｌ（ＭＰＬＡ）と混合された封入されていない免疫原と比較して、強化された免疫賦活能を有することに帰着し得る。
【０００９】
一態様では、Ｌ（ＭＰＬＡ）を凍結乾燥し得る。Ｌ（ＭＰＬＡ）は、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン脂質を含み得、免疫原性組成物中のアルミニウムとＭＰＬＡとの間の乾燥重量比は、約１：１１０〜約８５：３の範囲であり得る。アルミニウム塩に吸着させた免疫原中のアルミニウムと免疫原との間の乾燥重量比は、約１：３０〜約８５：１の範囲であり得る。
【００１０】
別の態様では、アルミニウム塩は、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムまたはそれらの任意の組合せであり得る。アルミニウム塩に吸着させた免疫原は、ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、パンデミックインフルエンザ、日本脳炎、髄膜炎菌（meningococcus）、肺炎球菌（pneumococcus）、狂犬病、破傷風トキソイド、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、ライム病、炭疽、腸チフスまたはそれらの組合せのための、アルミニウム塩に吸着させたワクチンであり得る。
【００１１】
さらなる態様では、アルミニウム塩に吸着させた免疫原は、アルミニウム塩に吸着させたＨＩＶ−１タンパク質ｇｐ１２０を含み得る。好ましくは、アルミニウム塩に吸着させたＨＩＶ−１タンパク質ｇｐ１２０におけるアルミニウム塩は、水酸化アルミニウムである。
【００１２】
アルミニウム塩に吸着させた免疫原を、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム（Ｌ（ＭＰＬＡ））と混合することによって調製される免疫原性組成物も提供される。免疫原性組成物は、生理学的に許容される媒体をさらに含み得る。免疫原性組成物は、水酸化アルミニウムに吸着させたＨＩＶ−１タンパク質ｇｐ１２０を、アルミニウム塩に吸着させた免疫原として含み得、免疫原性組成物の単回用量（single dose）は、（１）約１０μｇ〜約６００μｇのｇｐ１２０タンパク質、（２）約２０μｇ〜約８５０μｇのアルミニウム、および（３）約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン脂質を含む約３０μｇ〜約２．２ｍｇのＬ（ＭＰＬＡ）をさらに含み得る。
【００１３】
アルミニウム塩に吸着させた免疫原の免疫賦活能を強化する方法であって、アルミニウム塩に吸着させた免疫原に、Ｌ（ＭＰＬＡ）を混合して、液相中に免疫原性組成物を得る工程を含み、アルミニウム塩に吸着させた免疫原は、アルミニウム塩によって吸収された免疫原を含む、方法も提供される。方法は、アルミニウム塩に吸着させた免疫原およびＬ（ＭＰＬＡ）を、混合時に、約４℃〜約３７℃の範囲の温度で、約３０分間〜約２４時間または好ましくは約１時間〜約１２時間インキュベートする工程をさらに含み得る。
【００１４】
一態様では、Ｌ（ＭＰＬＡ）を凍結乾燥し得る。Ｌ（ＭＰＬＡ）は、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン脂質を含み得、免疫原性組成物中のアルミニウムとＭＰＬＡとの間の乾燥重量比は、約１：１１０〜約８５：３の範囲であり得る。アルミニウム塩に吸着させた免疫原中のアルミニウムと免疫原との間の乾燥重量比は、約１：３０〜約８５：１の範囲であり得る。
【００１５】
別の態様では、アルミニウム塩は、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムまたはそれらの任意の組合せであり得る。アルミニウム塩に吸着させた免疫原は、ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、パンデミックインフルエンザ、日本脳炎、髄膜炎菌（meningococcus）、肺炎球菌（pneumococcus）、狂犬病、破傷風トキソイド、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、ライム病、炭疽、腸チフスまたはそれらの組合せのための、アルミニウム塩に吸着させたワクチンであり得る。
【００１６】
さらなる態様では、アルミニウム塩に吸着させた免疫原は、アルミニウム塩に吸着させたＨＩＶ−１タンパク質ｇｐ１２０を含み得る。好ましくは、アルミニウム塩に吸着させたＨＩＶ−１タンパク質ｇｐ１２０におけるアルミニウム塩は、水酸化アルミニウムである。
【００１７】
アルミニウム塩に吸着させた免疫原の免疫賦活能を強化するためのＬ（ＭＰＬＡ）組成物の使用も提供される。
【００１８】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、種々の実施形態の限定されない説明を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例１に記載されているように、ＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）（ＨＩＶ−１ｇｐ１２０を含む実験的ＨＩＶワクチン）をＬ（ＭＰＬＡ）と混合することによって生成された、得られた複合物を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
１．定義
「免疫原」は、体液性および／または細胞性免疫応答を誘導することができる物質（agent）である。本明細書に記載されているような免疫原は、抗原または不活化病原体であり得る。本明細書に記載されているような免疫原性組成物は、例えば、ワクチン製剤であり得る。
【００２１】
アジュバントのために使用される「アルミニウム塩」は、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ａｌｕｍ）またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ワクチンの分野において、すべてのアルミニウム塩アジュバントは、正確な化学組成にかかわらず、一般に略式に「ａｌｕｍ」と称される。
【００２２】
本明細書において使用される「リポソーム」は、閉じ込められた水性容積を含有する閉じた二重膜を指す。リポソームはまた、単一膜二重層を有する単層小胞であり得るまたは多重膜二重層を有し、それぞれが水性層によって隣と分離されている多層小胞であり得る。得られた膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）の尾部が二重層の中央方向に配向され、親水性（極性）の頭部が水性相方向に配向しているものである。リポソームは、それらが通常使用される場合、スメクチック中間層からなり、リン脂質または非リン脂質のスメクチック中間層からなり得る。スメクチック中間層は、Small, HANDBOOK OF LIPID RESEARCH, Vol. 4, Plenum, NY, 1986, pp. 49-50によって、最も正確に記載されている。Ｓｍａｌｌによると、「与えられた分子が加熱されると、融解して直ちに等方性液体になる代わりに、むしろそれは中間層または液晶と呼ばれる中間状態を通過し得る。この状態は、いくつかの方向には秩序が残っているが、他の方向では秩序が失われていることを特徴とする・・・。一般に、液晶の分子は、幅広いというよりも幾分長く、分子の縦方向に沿ったある場所に、極性または芳香族部分を有する。分子の形および極性−極性または芳香族の相互作用によって、分子は、部分的に秩序を保った配置に整列することができる・・・。これらの構造は、一端に極性基を有する分子において特徴的に生じる。分子の長軸方向に長距離秩序を有する液晶は、スメクチック液晶、層状液晶またはラメラ液晶と呼ばれる・・・。スメクチック状態では、分子は単層または二重層の状態であり、層面に対して垂直または傾いており、凝固したまたは融解した脂肪族鎖を有し得る。」
【００２３】
リピッドＡは、一組の複雑な、大いにアシル化およびアミド化されたジグルコサミン二リン酸エステル分子であり、グラム陰性細菌由来のすべてのリポ多糖類（ＬＰＳ；エンドトキシンとしても知られている）に共通している脂質部分である。ＬＰＳは、すべてのグラム陰性細菌の外表面のほぼ全体を覆っており、リピッドＡは、ＬＰＳを細菌の脂質の外表面に繋ぎ留めている。野生型のスムース型細菌におけるＬＰＳのＯ−多糖部分は、ラフ型変異体に発現される比較的保存されたコアオリゴ糖に結合されており、これは次に、細菌の生存に必要とされ、ＬＰＳにおいてのみ見出される独特の化学構造である高度に保存された２−ケト−３−デオキシオクタン酸糖を介して、リピッドＡに結合されている。例えば、Alving et al., 2012, Expert Rev. Vaccines 11: 733-44を参照のこと。「モノホスホリルリピッドＡ」は、リピッドＡの類似物であり、頭部極性基上のグルコサミン−１−リン酸基が取り除かれている。ＭＰＬＡの類似物も多数存在する。
【００２４】
本明細書において使用される「生理学的に許容される媒体」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与（例えば、経口、経皮または非経口投与）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用、すなわち、細胞培養に適した媒体を指す。例示的な生理学的に許容される媒体は、米国特許第４，１８６，１８３号明細書および同第４，３０２，４５９号明細書に開示されているような、リポソームの生理学的に許容される成分であることができる。
【００２５】
本明細書において使用される「約」は、言及されている値の±１５％を指す。
【００２６】
他に特に定義されない限り、本明細書において使用される科学技術用語はすべて、当業者によって共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他に特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「抗体」への言及は、複数のそのような抗体を含み、「投与量（dosage）」への言及は、１回または複数の投与量および当業者に知られているその等価物などへの言及を含む。
【００２７】
本明細書において使用される「好ましい」および「好ましくは」は、欧州のみにおける請求項の解釈のためのものと解釈されるべきである。この用語は、それらが米国の請求項の解釈のために現れる文およびパラグラフの解釈から、除外または削除されるべきである。
【００２８】
２．アルミニウム塩に吸着させたワクチン
アジュバントのために使用されるアルミニウム塩は、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ａｌｕｍ）またはそれらの任意の組合せを含むことができる。アルミニウム塩に吸着させたワクチンの例示的なリストを以下に示す：
ＤＴａＰ（ジフテリア、破傷風および百日咳ワクチンを表す）
ＤＴＰ（ジフテリア、破傷風および百日咳ワクチンを表す）
Ｈｉｂコンジュゲート（Ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、Ｈｉｂ）
Ｐｎｅｕｍｏコンジュゲート（肺炎球菌ワクチン）
ＤＴＰ−Ｈｉｂ（ジフテリアおよびｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）用の組合せワクチン）
ＨｅｐＢ−Ｈｉｂ（Ｂ型肝炎／Ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）用の組合せワクチン）
ＨｅｐＢ（ＨｅｐＢはＢ型肝炎を表す）
沈降ＤＴ（DT adsorbed）（沈降ジフテリアおよび破傷風トキソイド）
沈降Ｔ（T, adsorbed）（破傷風を表す）
沈降Ｔｄ（Td, adsorbed）（Ｔｄは破傷風およびジフテリアを表す）
ＨｅｐＡ（Ａ型肝炎を表す）
ライム
炭疽
狂犬病
Baylor et al., 2002, Vaccine 20: S18-S23を参照のこと。より拡張されたリストは、インターネット上のhypertext transfer protocol://www.path.org/publications/files/TS_vaccine_stability_table.pdfにおけるKristensen, 2012 Summary of Stability data for licensed vaccinesに提供されている。
【００２９】
現在のところ、少なくとも１４６種の認可されたワクチンが、単一または複数の病原体に対して存在し、現在のところ、アルミニウム塩を用いてアジュバント化されている。例示的なワクチンは、限定されないが、ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、パンデミックインフルエンザ、日本脳炎、髄膜炎菌（meningococcus）、肺炎球菌（pneumococcus）、狂犬病、破傷風トキソイド、ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、ライム病、炭疽、腸チフスおよびそれらの組合せのためのものを含む。好ましくは、アルミニウム塩に吸着させたワクチンは、水性懸濁液として提供される。
【００３０】
ワクチン中のアルミニウム塩アジュバントの実際の量は、複数の因子、例えば、免疫されるべき対象（動物対ヒト、成人対小児）および投与経路によって変化し得る。免疫原の投与量は、当業者によって決定され得る。米国で認可されているワクチンでは、アルミニウムの量は、約０．１２５〜０．８５ｍｇ／用量の範囲である。Baylor et al., 2002, Vaccine 20: S18-S23を参照のこと。ヒトのワクチン接種に関して、アルミニウムの量の好ましい範囲は、ワクチン１回用量当たり約２０μｇ〜約８５０μｇの範囲であり得る。免疫原の量、最も一般的にはタンパク質抗原の量は、ワクチン１回用量当たり約１μｇ〜約１ｍｇ、または好ましくはワクチン１回用量当たり約１０μｇ〜約６００μｇの範囲であり得る。
【００３１】
典型的には、アルミニウム塩に吸着させたワクチンによる免疫応答は、特定のポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在によって検出することができる。抗体を検出する方法は、当業者によって知られており、これには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ、ウェスタンブロットアッセイおよび競合アッセイのようなアッセイが含まれる。
【００３２】
３．モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム（Ｌ（ＭＰＬＡ））
リポソームは、閉じ込められた水性容積を含有する閉じた二重膜である。リポソームはまた、単一膜二重層を有する単層小胞であり得るまたは多重膜二重層を有し、それぞれが水性層によって隣と分離されている多層小胞であり得る。得られた膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）の尾部が二重層の中央方向に配向され、親水性（極性）の頭部が水性相方向に配向しているものである。リポソームを囲むための適した親水性ポリマーは、限定されることなく、米国特許第６，３１６，０２４号明細書、同第６，１２６，９６６号明細書、同第６，０５６，９７３号明細書および同第６，０４３，０９４号明細書に記載されているような、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列を含む。リポソームは、親水性ポリマーを用いずに作製することができる。それ故に、リポソーム製剤は、親水性ポリマーを含有しても、含有しなくてもよい。
【００３３】
リポソームは、当技術分野において知られている任意の脂質または脂質の組合せから構成され得る。例えば、小胞を形成する脂質は、米国特許第６，０５６，９７３号明細書および同第５，８７４，１０４号明細書に開示されているような、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールおよびスフィンゴミエリンなどの、リン脂質を含む、天然に存在するまたは合成の脂質であり得る。
【００３４】
小胞を形成する脂質はまた、米国特許第６，０５６，９７３号明細書にも開示されているような、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１［（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、３［Ｎ−−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣＣｈｏｌ）またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）などの、糖脂質、セレブロシドまたは陽イオン性脂質であり得る。コレステロールはまた、米国特許第５，９１６，５８８号明細書および同第５，８７４，１０４号明細書に開示されているように、リポソーム小胞に安定性を付与する適切な範囲に存在し得る。追加的なリポソームの技術は、米国特許第６，７５９，０５７号明細書、同第６，４０６，７１３号明細書、同第６，３５２，７１６号明細書、同第６，３１６，０２４号明細書、同第６，２９４，１９１号明細書、同第６，１２６，９６６号明細書、同第６，０５６，９７３号明細書、同第６，０４３，０９４号明細書、同第５，９６５，１５６号明細書、同第５，９１６，５８８号明細書、同第５，８７４，１０４号明細書、同第５，２１５，６８０号明細書および同第４，６８４，４７９号明細書に記載されている。これらは、リポソームおよび脂質コーティングされた超微粒気泡ならびにそれらの製造方法を記載していた。したがって、当業者は、本開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、本実施形態の目的のためのリポソームを生成することができた。本実施形態に関して、リポソームは、好ましくは５０〜１５０ｍＭのリン脂質を含有する。
【００３５】
以上の例示的なリポソームはいずれも、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）を含むまたは他のリポソームおよびリピッドＡ（ＭＰＬＡ）と組み合わせることができる。ＭＰＬＡは単独で、ヒトおよび動物に対して毒性であり得る。しかし、リポソーム中に存在する場合、毒性は検出されない。例えば、Alving et al., 2012, Expert Rev. Vaccines 11: 733-744を参照のこと。本明細書に記載されているような、ＭＰＬＡを含むリポソームの調製のための例示的な手順は、少なくともAlving et al., 2012, Expert Rev. Vaccines 11: 733-744に教示されている。ＭＰＬＡは、強力なアジュバントとしての役割を果たし、リポソームおよびリポソームと関連するペプチド、タンパク質またはハプテンの免疫原性を高める役割を果たす。本実施形態に関して、ＭＰＬＡの量は、好ましくは、ワクチン１回用量当たり約３０μｇ〜約２．２ｍｇの範囲であり得る。
【実施例】
【００３６】
以下の実施例は、本開示のある特定の代表的な実施形態および態様を実証し、さらに説明するために提供されるものであり、本明細書または特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００３７】
原料および方法
免疫
ＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）（ＶａｘＧｅｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌ．、Ｕ．Ｓ．）は、Adis International Ltd., 2003, Drugs R. D. 4: 249-53に記載されているようなＨＩＶ表面糖タンパク質ｇｐ１２０を含む、実験的ＨＩＶワクチンである。Ｌ（ＭＰＬＡ）の調製は、Wassef et al., 1994, ImmunoMethods 4: 217-22に記載されているように行った。
【００３８】
ＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅは、水酸化アルミニウム（ＧＳＩＤ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌ．、Ｕ．Ｓ．）に吸着させたｃｌａｄｅ  ＢおよびＥ  ＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質の混合物を含む。異なる量のＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅを、Ｌ（ＭＰＬＡ）の凍結乾燥されたバイアルに加え、混合物を４℃で１時間または４℃で一晩放置した。各バイアルを旋回して、目視検査によって観察されるように、凍結乾燥された原料の塊が全く見られないことを確実にした。下表１に示されているように、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（マウス６匹／群）の９群に、試験品（５０μｌ／マウス）を、針およびシリンジによって筋肉内注射した。
【００３９】
【表１】
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表１に表されているｇｐ１２０タンパク質およびアルミニウム塩の量は、乾燥重量を指す。アルミニウム塩に吸着させたｇｐ１２０が水性懸濁液として提供された場合には、得られた混合物は液相中に存在し、凍結乾燥されたＬ（ＭＰＬＡ）は自発的に水和されている。
【００４０】
マウスを、０、３、６週目に筋肉内経路によって免疫し、０、２、４、６、８および１０週目に採血した。示されている時点での、Ａ２４４ｇｐ１２０およびＭＮｇｐ１２０タンパク質（ＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅ中に存在するタンパク質）に対するＩｇＧ結合抗体について、個々の血清サンプルをＥＬＩＳＡによって試験した。
【００４１】
ワクチン接種後の抗体応答のＥＬＩＳＡによる検出
Karasavvas et al., 2012, AIDS Res. Hum. Retroviruses 28: 1444-57に記載されているように、９６ウェルＵ底ＥＬＩＳＡプレートに、Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｓｉｃｏ、Ｃａｌ．、Ｕ．Ｓ．）によって提供された、精製されたＡ２４４またはＭＮタンパク質を１ウェルにつき１００μｌ加え、４℃で一晩コーティングした。タンパク質を除去し、各ウェルを２５０μｌのブロッキング緩衝液（０．５％カゼインおよび０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４）で、４℃にて一晩ブロックした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で、プレートを２回洗浄し、１００μｌの血清（１：２００希釈）をウェルに三連で加え、次いで、ブロッキング緩衝液中、連続的に２倍希釈した。プレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。プレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液中１：１０００に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲートヒツジ抗−マウスＩｇＧ（ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌ．、Ｕ．Ｓ．）１００μｌを、各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄し、１００μｌのＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．、Ｕ．Ｓ．）を、各ウェルに加えた。次いで、プレートを暗所で室温にて１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートリーダー上で、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【００４２】
実施例１    水酸化アルミニウムに吸着させたＨＩＶ−１  ｇｐ１２０（ＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅ）にＬ（ＭＰＬＡ）を加えると抗体力価が増加した
アジュバントの分野は、多くのアジュバント候補を発展させており、これらのうちで最も有効なものが、２種以上のアジュバントまたは担体分子を含むアジュバント製剤として投与されている。Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＩＤＳ）  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｔｕｄｙ  ０１５（ＡＶＥＧ０１５）において、７種のアジュバント（水酸化アルミニウムを含み、「ａｌｕｍ」として識別される）を、安全性についておよびＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ｇｐ１２０に対する免疫応答をヒトに誘導する能力について比較した。McElrath, 1995, Semin. Cancer Biol. 6: 375-85。封入されたｇｐ１２０およびモノホスホリルリピッドＡを含有する、ａｌｕｍに吸着させたリポソームは、ａｌｕｍに吸着させたｇｐ１２０に比べて優れており、ｇｐ１２０に対する免疫応答を誘導するための他のアジュバントのそれぞれと同様のまたはより良好な成果を有することならびにこれらの同ａｌｕｍに吸着させたリポソームは、低いレベルの局所毒性および全身毒性を示し、ａｌｕｍに吸着させたｇｐ１２０単独の低いレベルと同等であることが、ＡＶＥＧ０１５試験中、ＭｃＥｌｒａｔｈによって観察された。
【００４３】
ＭｃＥｌｒａｔｈの結果を考慮して、ＭＰＬＡ含有リポソーム、すなわち、ｇｐ１２０がリポソーム内に封入されていない（図１）、ＭｃＥｌｒａｔｈに記載されているものとは異なるリポソームと、ａｌｕｍに吸着させたｇｐ１２０を直接混合する効果を評価するために、以下の実験を実施した。これに関して、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫を、原料および方法に記載されているように、表１に説明されているように行った。血液サンプルを、各マウスについて、０、２、４、６、８および１０週目に採取した。以上の原料および方法に記載されているように、ＥＬＩＳＡを行って、血清中の抗体の力価を決定した。各群についての各時点での相加平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）を算出し、データを下表２にまとめた。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
表２の結果によると、Ｌ（ＭＰＬＡ）をＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅに加えると、Ａ２４４およびＭＮに特異的なＩｇＧ抗体が劇的に増加した。複数倍の増加は、免疫後の週および免疫中に使用される抗原の量によって、２．７倍増加から１２倍増加の間で変化する。Ｌ（ＭＰＬＡ）を含有するＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅ１μｇでのマウスの免疫は、Ｌ（ＭＰＬＡ）を欠いているＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅ１０μｇでマウスを免疫した後に誘導された抗体応答と同等である抗体応答を誘導した。したがって、Ｌ（ＭＰＬＡ）も存在した場合、より少ない用量の抗原（抗原の用量節約）が、同様の応答を誘導した。すべての場合において、Ｌ（ＭＰＬＡ）を含有するＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅでのマウスの免疫は、ＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅ単独と比較すると、Ａ２４４およびＭＮタンパク質の両方に対して、より高い抗体力価を示した。加えて、ＡＩＤＳＶＡＸ（登録商標）Ｂ／Ｅを、凍結乾燥されたＬ（ＭＰＬＡ）に加える際に、１時間で行うか一晩かけて行うかについては、抗体力価は類似しているように思われるため、差はないように思われた。
【００４６】
Baylor et al., 2002およびKristensen, 2012に教示されているもののいずれか１つなどの、アルミニウム塩に吸着させたワクチンを、本明細書に記載されているＬ（ＭＰＬＡ）と混合する方法は、例示されているワクチン組成物のみならず、各ワクチン組成物の免疫賦活能を強化すると考えられる。本明細書に記載されている方法は、リポソームＭＰＬＡを、以前から作製されているアルミニウム塩に吸着させたタンパク質ワクチンのためのアジュバントとして、大いに利用し易くすることができ得る。
【００４７】
本発見、すなわち、アルミニウム塩に吸着させたワクチンをＬ（ＭＰＬＡ）と混合することによる、強化された免疫賦活能は、驚くべきものである。アルミニウム塩アジュバントの存在が、リポソームを破壊し、リポソーム膜の構造変化を引き起こし、結局は免疫応答を減少させることになり得ることは知られていた。米国特許第５，８２０，８８０号明細書を参照のこと。加えて、アルミニウム塩によるリポソームの破壊の理由は、不明なままである。よって、当業者はおそらく、アルミニウム塩に吸着させたワクチンのいずれかをＬ（ＭＰＬＡ）と混合するのを止めるように勧められたであろう。
【図１】
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【国際調査報告】
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