(57)【要約】  本発明は、鳥ウイルスを含む液体安定な家禽用ワクチンに注目を引く。本発明はまた、該ワクチンの製造、これらのワクチンを動物被験体にワクチン接種する方法にも注目を引く。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生家禽ウイルス、５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、および、アルギニン、グルタミン酸およびグリシンから成る群より選択される、０．１５ないし０．７５Ｍのアミノ酸を含む液体安定ワクチンであって；ここで液体安定ワクチンは、６．０ないし８．０のｐＨを有し；ここで生家禽ウイルスは、弱毒化ウイルス、組換え家禽ウイルスベクターおよび弱毒化家禽ウイルスの組換えウイルスベクターから成る群より選択され；そしてここで、組換え家禽ウイルスベクターまたは弱毒化家禽ウイルスの組換えウイルスベクターは、異種抗原をさらにコードし得る、前記の液体安定ワクチン。
【請求項２】
糖アルコールがソルビトールである、請求項１の液体安定ワクチン。
【請求項３】
アミノ酸がアルギニンである、請求項２の液体安定ワクチン。
【請求項４】
生家禽ウイルスが、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリギウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、トリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）およびそのいずれかの組み合せから成る群より選択される、請求項３の液体安定ワクチン。
【請求項５】
非‐糖アルコールである糖添加物をさらに含み、ここで液体安定ワクチンにおける糖アルコールおよび非‐糖アルコールの合計量が１５〜４０％（ｗ／ｖ）である、請求項１の液体安定ワクチン。
【請求項６】
非‐糖アルコールがショ糖およびトレハロースから成る群より選択される、請求項５の液体安定ワクチン。
【請求項７】
緩衝剤をさらに含む、請求項１の液体安定ワクチン。
【請求項８】
緩衝剤が２．５ないし５０ｍＭのリン酸カリウムを含む、請求項７の液体安定ワクチン。
【請求項９】
アミノ酸がアルギニンである、請求項１の液体安定ワクチン。
【請求項１０】
弱毒化生ウイルスがＩＢＶである、請求項４の液体安定ワクチン。
【請求項１１】
ＩＢＶが、デラウェア株、マサチューセッツ株、アーカンソー株、コネチカット株、ジョージア株およびそのいずれかの組み合せから成る群より選択される、請求項１０の液体安定ワクチン。
【請求項１２】
弱毒化生ＩＢＤＶをさらに含む、請求項１１の液体安定ワクチン。
【請求項１３】
弱毒化生ＮＤＶをさらに含む、請求項１２の液体安定ワクチン。
【請求項１４】
弱毒化生ＭＤＶまたは異種抗原をコードする弱毒化組換えＭＤＶベクターをさらに含む、請求項１３の液体安定ワクチン。
【請求項１５】
生ＨＶＴまたは異種抗原をコードする組換えＨＶＴベクターをさらに含む、請求項１４の液体安定ワクチン。
【請求項１６】
弱毒化生ａＭＰＶをさらに含む、請求項１５の液体安定ワクチン。
【請求項１７】
死滅家禽ウイルスをさらに含む、請求項４の液体安定ワクチン。
【請求項１８】
細菌をさらに含む、請求項４の液体安定ワクチン。
【請求項１９】
細菌が弱毒化生パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、弱毒化生サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、弱毒化生アビバクテリウム・パラガリナラム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、弱毒化生マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、生ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのいずれかの組み合せから成る群より選択される、請求項１８の液体安定ワクチン。
【請求項２０】
細菌が死滅パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、死滅サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、死滅アビバクテリウム・パラガリナラム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、死滅マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の不活化トキソイドおよびそのいずれかの組み合せから成る群より選択される、請求項１８の液体安定ワクチン。
【請求項２１】
請求項１７の液体安定ワクチンを鳥に投与することを含む、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリギウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、トリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）または七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）に対し鳥にワクチン接種する方法。
【請求項２２】
前記の投与が皮下注射によって実施される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
請求項１の液体安定ワクチンを鳥に投与することを含む、家禽ウイルスに対し鳥にワクチン接種する方法。
【請求項２４】
前記の投与が噴霧または給餌によって実施される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
治療的有効量の弱毒化生家禽ウイルスを５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、および０．１５ないり０．７５Ｍのアルギニンと組み合わせることを含み；ここで液体安定ワクチンが６．０ないし８．０のｐＨを有する、液体安定ワクチンを作成する方法。
【請求項２６】
アミノ酸がアルギニンである、請求項１または２の液体安定ワクチン。
【請求項２７】
糖アルコールの量が１０〜３０％（ｗ／ｖ）である、請求項１、２または２６の液体安定ワクチン。
【請求項２８】
弱毒化生家禽ウイルスが伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリギウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）および七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）から成る群より選択される、請求項１、２、２６または２７の液体安定ワクチン。
【請求項２９】
非‐糖アルコールである糖添加物をさらに含み、ここで液体安定ワクチンにおける糖アルコールおよび非‐糖アルコールの合計量が１５〜４０％（ｗ／ｖ）である、請求項１、２、２６、２７または２８の液体安定ワクチン。
【請求項３０】
液体安定ワクチンにおける糖アルコールおおび非‐糖アルコールの合計量が２５〜４０％（ｗ／ｖ）である、請求項２９の液体安定ワクチン。
【請求項３１】
非‐糖アルコールがショ糖およびトレハロースから成る群より選択される、請求項２９または３０の液体安定ワクチン。
【請求項３２】
緩衝剤をさらに含む、請求項１、２、２６〜３０または３１の液体安定ワクチン。
【請求項３３】
緩衝剤が２．５ないし５０ｍＭのリン酸カリウムを含む、請求項３２の液体安定ワクチン。
【請求項３４】
アミノ酸がグルタミン酸である、請求項１、２、２７〜３２または３３の液体安定ワクチン。
【請求項３５】
弱毒化生ウイルスがＩＢＶである、請求項１、２、２６〜３３または３４の液体安定ワクチン。
【請求項３６】
ＩＢＶがデラウェア株、マサチューセッツ株、アーカンソー株、コネチカット株およびジョージア株から成る種類より選択される、請求項３５の液体安定ワクチン。
【請求項３７】
弱毒化生ＩＢＤＶをさらに含む、請求項１、２、２６〜３５または３６の液体安定ワクチン。
【請求項３８】
弱毒化生ＮＤＶをさらに含む、請求項１、２、２６〜３６または３７の液体安定ワクチン。
【請求項３９】
弱毒化生ＭＤＶまたは異種抗原をコードする弱毒化組換えＭＤＶベクターをさらに含む、請求項１、２、２６〜３７または３８の液体安定ワクチン。
【請求項４０】
生ＨＶＴ、または異種抗原をコードする組換えＨＶＴベクターをさらに含む、請求項１、２、２６〜３８または３９の液体安定ワクチン。
【請求項４１】
弱毒化生ａＭＰＶをさらに含む、請求項１、２、２６〜３９または４０の液体安定ワクチン。
【請求項４２】
死滅家禽ウイルスをさらに含む、請求項１、２、２６〜４０または４１の液体安定ワクチン。
【請求項４３】
細菌をさらに含む、請求項１、２、２６〜４１または４２の液体安定ワクチン。
【請求項４４】
細菌が弱毒化生パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、弱毒化生サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、弱毒化生アビバクテリウム・パラガリナラム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、弱毒化生マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、弱毒化生ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのいずれかの組み合せから成る群より選択される、請求項４３の液体安定ワクチン。
【請求項４５】
細菌が死滅パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、死滅サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、死滅アビバクテリウム・パラガリナラム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、死滅マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来の不活化トキソイドおよびそのいずれかの組み合せから成る群より選択される、請求項４４の液体安定ワクチン。
【請求項４６】
寄生生物をさらに含む、請求項１、２、２６〜４４または４５の液体安定ワクチン。
【請求項４７】
寄生生物がエイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）である、請求項４６の液体安定ワクチン。
【請求項４８】
請求項１〜２０、２６〜４６または４７の液体安定ワクチンを家禽に投与することを含む、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリギウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、トリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）および七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）またはそのいずれかの組み合せをワクチン接種する方法。
【請求項４９】
前記の投与が噴霧、卵内、点眼、口腔または鼻腔経路で実施される、請求項４８の方法。
【請求項５０】
治療的有効量の弱毒化生家禽ウイルスを５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖添加物と組み合わせることを含む、請求項１〜２０、２６〜４６または４７の液体安定ワクチンを作成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生鳥ウイルスを含む、液体安定な家禽用ワクチンに関する。本発明はまた、該ワクチンの製造および動物被験体にワクチン接種する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
家禽に感染可能なかなり多数のウイルスが存在する。該ウイルスには、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性喉頭気管炎（ＩＬＴＶ），マレック病ウイルス（ＭＤＶ），ＭＤＶ３としても知られる七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）およびトリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）が含まれる。また、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、マイコプラズマ属菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｓｐ．）、アビバクテリウム・パラガリナラム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒａｒｕｍ）、エリシパラス属菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ  ｓｓｐ．）、カンピロバクター属菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｓｐ．）およびウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を含む、家禽に感染することのできる多数の細菌も存在する。エイメリア等の寄生生物もまた、家禽に感染し得る。
【０００３】
家禽における細菌、寄生生物またはウイルス感染に起因する疾患を予防する最良の方法は、家禽にこれらの微生物に対するワクチンを接種することであると現在広く認められている。さらに、必要とされるワクチン注射の回数を制限する、多価の弱毒化生ウイルスまたは細菌ワクチンを安全に投与することができる。従って多様な病原菌から防御する、多数の市販の多価の生ウイルスワクチンが存在する。しかしながら、従来、弱毒化生鳥ウイルスは、溶液において保存されるとき不安定であった。従ってほとんどの弱毒化生鳥ウイルスワクチンは、その長期保存の前に凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｌｉｚｅｄ，ｉ．ｅ．，ｆｒｅｅｚｅ‐ｄｒｉｅｄ）または凍結される。弱毒化生鳥ウイルスは通常、防御剤と共に水中における懸濁液として混合され、凍結され、次に凍結乾燥プロセスの間に、昇華および二次乾燥によって乾燥される。凍結の低温度および昇華による乾燥は、関与する低い比表面積も加わって、長い乾燥期間を必要とし、その結果、製造時間と費用を著しく増加させる。
【０００４】
さらに大規模な市販の乾燥工程には；全体の製品負荷の全域にわたる棚温度、乾燥機にわたる可変な凍結速度、周縁効果および放射エネルギー効果を調整できないことに起因する、固有のムラが存在する。乾燥温度が保護タンパク質基質のガラス転移温度より著しく低くなければならないので、乾燥時間を短縮するために乾燥温度を高めるということは、しばしば選択肢とはならない。さらにムラのある長期にわたる乾燥時間および／または高い乾燥温度は、しばしば弱毒化生ウイルスに対しその生物活性の顕著な損失と共に、構造的損傷をもたらす。
【０００５】
前述の理由によって、有効性における固有の損失の責任をもつために、弱毒化生ウイルスを含む凍結乾燥した家禽用ワクチンは、増強された力価の状態で保存される。しかしながらこのような増強された力価は著しい有害事象をもたらし得るので、実際には凍結乾燥プロセスは見込まれるよりもより少ない活性損失をもたらさなければならない。従って、有害事象をもたらす量より間違いなく低いというだけでなく、凍結乾燥およびその後の保存によるウイルス力価損失の観点から十分な有効性も維持するウイルス力価を含むようにワクチンを処方するために、高度の注意が要求される。
【０００６】
さらに、これらのバイアルの蓋用の比較的に小さな標準栓のサイズに起因する、凍結乾燥バイアルのサイズおよび／または該バイアルの内部に含まれる投与数の制限が存在する。従って大容量の液体は、比較的に小さな口を通って昇華することが困難となる。それ故にそのウイルス力価を安全かつ有効なレベルで確実に保持し得る、新規な弱毒化生鳥ウイルスワクチンに対するニーズが存在する。
【０００７】
さらに、ほとんどの家禽用ワクチンに利用可能な最小のバイアルサイズは、１０００回分の投与量である。凍結乾燥ワクチンのバイアルは、凍結乾燥ケーキの再水和後にその全体が使用されねばならない。このことが、大用量サイズを購入しなければならないその数が増えている小規模の家禽農家が、ほんのわずかの鳥にワクチン接種することを困難にしている。それ故に、ただ一個のバイアルが数日、数週間または数カ月にわたり使用し得て、従って費用を減少させ小規模な群れのワクチン接種を奨励する、家禽用ワクチンに対するニーズが存在する。
【０００８】
最終的に、鳥用ワクチンは、バイアル当たり２５、０００回分もの投与数で包装され得て、その後ユーザーによって混合され、飲料水に入れられまたは群れに噴霧される。このことは、金属性のシールリングおよび栓を除去し、大きなバケツの水にバイアルを沈めて凍結乾燥ワクチンを流し出し、それから大きなブラシまたはへらによって溶液を混合することをユーザーに要求する。これは、ユーザーにとってもワクチンが計画される家禽種にとっても衛生的ではない。実際に凍結乾燥バイアルを扱うことは、ワクチンの受容者、例えば鶏が居住する商業環境において特に厄介である。
【０００９】
本明細書のいずれの参考文献の引用も、該参考文献が本出願に対する先行技術として利用し得ることを承認するものと解釈されてはならない。
【発明の概要】
【００１０】
現行ワクチンの欠陥を克服するために、本発明は、新規で液体安定な、生の家禽ウイルスワクチン、ならびにその対応する免疫原性組成物を提供する。本発明の液体安定な、生の家禽ウイルスワクチンは、例えば、６、７、９カ月またはそれ以上（例えば、約１ないし３年まで）の長期間にわたり依然として有効であり得る。本発明はまた、該ワクチンを鳥（ａｖｉａｎ）に投与する方法も提供する。本発明は、本発明のワクチンを投与することにより、動物、例えば鳥における疾患を予防する方法をさらに提供する。
【００１１】
従って本発明は、多価ワクチンを含み、生ウイルスを含む液体安定ワクチンを提供する。一定の実施形態において生ウイルスは、弱毒化ウイルスである。他の実施形態において生ウイルスは、組換えウイルスである。特定の実施形態において生ウイルスは、弱毒化および組換えウイルスの双方である。本発明の組換えウイルスはまた、異種タンパク質もコードし得る。このタイプの特定の実施形態において異種タンパク質は、ウイルスまたは細菌抗原である。
【００１２】
特定の実施形態において、ワクチンは、糖アルコールである糖添加物および／またはアミノ酸を含む。一定の実施形態においてワクチンは、５ないし４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。特定の実施形態においてワクチンは、１０ないし３０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。特定の実施形態においてワクチンは、１５ないし２５％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。関連する実施形態においてワクチンは、１０ないし２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。他の実施形態においてワクチンは、２０ないし２５％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。さらなる他の実施形態においてワクチンは、２５ないし４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。より特定の実施形態においてワクチンは、１２ないし１８％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。より一層特定の実施形態においてワクチンは、約１５％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。関連する実施形態においてワクチンは、約２３％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。一定の実施形態において本発明の液体安定なウイルスワクチンは、液体安定ワクチン中の糖アルコールの合計量が５〜４０％（ｗ／ｖ）である状態で、二以上の糖アルコールを含む。他のこのような実施形態において、本発明の液体安定なウイルスワクチンは、液体安定ワクチン中の糖アルコールの合計量が２５〜４０％（ｗ／ｖ）である状態で、二以上の糖アルコールを含む。
【００１３】
本発明の液体安定なウイルスワクチンの特定の実施形態において、糖アルコールはソルビトールである。このタイプの別の実施形態において、糖添加物はマンニトールである。関連する実施形態において液体安定ワクチンは、非‐糖アルコールである糖添加物をさらに含み、ここで液体安定ワクチン中の糖アルコールおよび非‐糖アルコールの合計量は１５〜４０％（ｗ／ｖ）である。他の実施形態において液体安定ワクチンは、非‐糖アルコールである糖添加物をさらに含み、ここで液体安定ワクチン中の糖アルコールおよび非‐糖アルコールの合計量は２５〜４０％（ｗ／ｖ）である。特定の実施形態において非‐糖アルコール、糖添加物はトレハロースである。さらなる他の実施形態において非‐糖アルコール、糖添加物はデキストロースである。さらなる他の実施形態において非‐糖アルコール、糖添加物はショ糖である。このタイプの特定の実施形態において糖添加物は、ショ糖（非‐糖アルコール）およびソルビトール（糖アルコール）の組み合せである。このタイプのより特定の実施形態において糖添加物は、１０〜２５％のソルビトールおよび５〜２０％のショ糖の組み合わせである。このタイプの他の実施形態において糖添加物は、１５〜３０％のソルビトールおよび１０〜２５％のショ糖の組み合せである。このタイプのさらなるより特定の実施形態において糖添加物は、１５％のソルビトールおよび１０％のショ糖である。特定の実施形態において非‐糖アルコール、糖添加物は事実上、二以上の非‐糖アルコール、糖添加物の組み合わせである。
【００１４】
本発明の液体安定ワクチンは、ｐＨにおいてｐＨ６．０からｐＨ８．０まで変動し得る。一定の実施形態においてｐＨ範囲は、ｐＨ６．５からｐＨ７．８である。特定の実施形態においてｐＨ範囲は、ｐＨ６．８からｐＨ７．５である。他の特定の実施形態においてｐＨ範囲は、ｐＨ６．６からｐＨ７．４である。より特定の実施形態においてｐＨ範囲は、ｐＨ７．０からｐＨ７．４である。より一層特定の実施形態においてｐＨは、７．２である。
【００１５】
本発明の液体安定ワクチンは、緩衝剤を含み得る。このタイプの特定の実施形態において緩衝剤は、２．５ないし５０ｍＭのリン酸塩、例えばリン酸ナトリウム（ＮａＰＨＯＳ）またはリン酸カリウム（ＫＰＨＯＳ）を含む。関連する実施形態において緩衝剤は、５ないし２５ｍＭのリン酸塩を含む。特定の実施形態において緩衝剤は、１０ないし２０ｍＭのリン酸塩を含む。
【００１６】
さらなる他の実施形態において緩衝剤（すなわち緩衝液）は、０．１５ないし０．７５Ｍのアルギニンをさらに含み得る。特定の実施形態において緩衝剤は、２．５ないし５０ｍＭのリン酸塩および０．１５ないし０．７５Ｍのアルギニンを含む。より特定の実施形態において緩衝剤は、５ないし２５ｍＭのリン酸塩および０．１５ないし０．７５Ｍのアルギニンを含む。より一層特定の実施形態において緩衝剤は、１０ないし２０ｍＭのリン酸塩および０．３ないし０．５５Ｍのアルギニンを含む。他の実施形態において緩衝剤は、２．５ないし５０ｍＭのリン酸塩を含む。特定の実施形態において緩衝剤は、５ないし２５ｍＭのトリスを含む。特定の実施形態において緩衝剤は、１０ないし２０ｍＭのトリスを含む。関連する実施形態においてトリス緩衝剤はヒスチジンを含む。
【００１７】
本発明の液体安定ワクチンはアミノ酸を含み得る。上で詳述した通り一定の実施形態においてアミノ酸はアルギニンである。他の実施形態においてアミノ酸はメチオニンである。さらなる他の実施形態においてアミノ酸はグリシンである。さらなる他の実施形態においてアミノ酸はグルタミン酸である。関連する実施形態において液体安定ワクチンはアルギニンおよびメチオニンの双方を含む。他の実施形態において液体安定ワクチンはアルギニンおよびグリシンの双方を含む。さらなる他の実施形態において液体安定ワクチンはグリシンおよびメチオニンの双方を含む。関連する実施形態において液体安定ワクチンはグルタミン酸およびメチオニンの双方を含む。他の実施形態において液体安定ワクチンはグルタミン酸およびグリシンの双方を含む。さらなる他の実施形態において液体安定ワクチンはグルタミン酸およびアルギニンの双方を含む。
【００１８】
関連する実施形態において液体安定ワクチンは、アルギニン、グルタミン酸およびメチオニンを含む。他の実施形態において液体安定ワクチンは、アルギニン、グルタミン酸およびグリシンを含む。さらなる他の実施形態において液体安定ワクチンは、アルギニン、グルタミン酸およびメチオニンを含む。さらなる他の実施形態において液体安定ワクチンは、アルギニン、グリシンおよびメチオニンを含む。さらなる他の実施形態において液体安定ワクチンは、アルギニン、グリシンおよびメチオニンを含む。特定の実施形態において液体安定ワクチンは、アルギニン、グリシン、メチオニンおよびグルタミン酸を含む。
【００１９】
特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるアルギニン、またはグルタミン酸、またはグリシンの終濃度は、０．１５ないし０．７５Ｍである。関連する実施形態において液体安定ワクチンにおけるアルギニン、またはグルタミン酸、またはグリシンの終濃度は、０．２５ないし０．７５Ｍである。より特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるアルギニン、またはグルタミン酸、またはグリシンの終濃度は、０．２ないし０．６Ｍである。より特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるアルギニン、またはグルタミン酸、またはグリシンの終濃度は、０．２ないし０．５Ｍである。さらなる他の実施形態において液体安定ワクチンにおけるアルギニン、またはグルタミン酸、またはグリシンの終濃度は、０．２５ないし０．４５Ｍである。より一層特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるアルギニン、またはグルタミン酸、またはグリシンの終濃度は、約０．４５Ｍである。他の特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるアルギニン、またはグルタミン酸、またはグリシンの終濃度は、約０．３Ｍである。
【００２０】
特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるグルタミン酸および／またはグリシンと共に併せたアルギニンの終濃度は、０．１５ないし０．７５Ｍである。関連する実施形態において液体安定ワクチンにおけるグルタミン酸および／またはグリシンと共に併せたアルギニンの終濃度は、０．２５ないし０．７５Ｍである。他の実施形態において液体安定ワクチンにおけるグルタミン酸および／またはグリシンと共に併せたアルギニンの終濃度は、０．２ないし０．６Ｍである。より特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるグルタミン酸および／またはグリシンと共に併せたアルギニンの終濃度は、０．３ないし０．５Ｍである。さらなる実施形態において液体安定ワクチンにおけるアルギニンおよびグルタミン酸、またはグリシンの終濃度は、０．２５ないし０．４５Ｍである。より一層特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるグルタミン酸および／またはグリシンと共に併せたアルギニンの終濃度は、約０．４５Ｍである。他の特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるグルタミン酸および／またはグリシンと共に併せたアルギニンの終濃度は、約０．３Ｍである。
【００２１】
特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるメチオニンの終濃度は、０．０２５ないし０．３Ｍである。関連する実施形態において液体安定ワクチンにおけるメチオニンの終濃度は、０．０４ないし０．１５Ｍである。より特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるメチオニンの終濃度は、０．０６ないし０．０９Ｍである。より一層特定の実施形態において液体安定ワクチンにおけるメチオニンの終濃度は、約０．０７Ｍである。
【００２２】
本発明の液体安定ワクチンはまた、安定化剤タンパク質も含み得る。安定化剤タンパク質は、無傷のタンパク質および／またはタンパク質加水分解物であり得る。特定の実施形態において安定化タンパク質は、ゼラチンである。より特定の実施形態において本発明の液体安定ワクチンによって含まれる安定化剤タンパク質は、０．４ないし１．６％のゼラチンである。別の実施形態において安定化剤タンパク質は、全カゼイン加水分解物である。このタイプの特定の実施形態において本発明の液体安定ワクチンによって含まれる安定化剤タンパク質は、０．５〜２．０％の全カゼイン加水分解物である。一定の実施形態において全カゼイン加水分解物は、全カゼインのタンパク分解加水分解物である。さらなる他の実施形態において本発明の液体安定ワクチンによって含まれる安定化剤タンパク質は、ラクトグロブリンまたはラクトアルブミン加水分解物である。
【００２３】
さらに本発明の液体安定ワクチンはまた、キレート剤もさらに含み得る。該キレート剤には、限定されるものではないが：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１、２‐ビス（ｏ‐アミノフェノキシ）エタン‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’‐四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）および２、３‐ジメルカプト‐１‐プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）が含まれ得る。本発明の液体安定ワクチンにおける該キレート剤の濃度は、約５０μＭから１０ｍＭまで変動し得る。
【００２４】
特定の実施形態においてキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。このタイプの一定の実施形態において液体安定ワクチンは、０．０５０ないし１ｍＭのＥＤＴＡを含む。特定の実施形態において液体安定ワクチンは、０．２５ないし０．７５ｍＭのＥＤＴＡを含む。より特定の実施形態において液体安定ワクチンは、約０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む。
【００２５】
一定の実施形態において本発明の液体安定ワクチンは、成分として一または複数のフリーラジカル・スカベンジャー（遊離基捕捉剤）および／または抗酸化剤をさらに含み得る。このタイプの特定の実施形態において本発明のワクチンは、アスコルビン酸を含む。このタイプの特定の実施形態において液体安定ワクチンは、約０．５ｍＭのアスコルビン酸を含む。関連する実施形態においてワクチンは、アルファ‐トコフェロールを含む。このタイプの特定の実施形態において液体安定ワクチンは、約０．５ｍＭのアルファ‐トコフェロールを含む。さらにもう一つの実施形態においてワクチンは、グルタチオンを含む。このタイプの特定の実施形態において液体安定ワクチンは、約３ｍＭのグルタチオンを含む。さらなるもう一つの実施形態においてワクチンは、アルファ‐トコフェロールおよびアスコルビン酸の双方を含む。さらにもう一つの実施形態においてワクチンは、アルファ‐トコフェロールおよびグルタチオンの双方を含む。さらなるもうひとつの実施形態においてワクチンは、グルタチオンおよびアスコルビン酸の双方を含む。さらにもう一つの実施形態においてワクチンは、アスコルビン酸、アルファ‐トコフェロールおよびグルタチオンを含む。
【００２６】
関連する実施形態において本発明の液体安定ワクチンは、密閉容器に保持される。このタイプの特定の実施形態において本発明の液体安定ワクチンは、不活性ガス、例えば、液体の上にアルゴン、窒素またはヘリウム等を有する密閉容器に保持される（例えば、密閉容器は不活性ガスにより埋め戻されている）。
【００２７】
本発明の液体安定ワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。このタイプの特定の実施形態においてアジュバントは、リン酸アルミニウムである。他のこのような実施形態においてアジュバントは、水酸化アルミニウムである。さらなる他の実施形態においてアジュバントは、溶液において高分子量ゲルとなるように架橋を形成し得る低分子量共重合体である。さらに他の実施形態においてアジュバントは、水中のアクリル酸ナトリウムゲル粒子で構成されている。さらなる他の実施形態においてアジュバントは、二以上の該アジュバントの組み合せである。
【００２８】
特定の実施形態において本発明の液体安定ワクチンは、洗浄剤および／または界面活性剤をさらに含み得る。このタイプの一定の実施形態において界面活性剤は、ポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレンブロック共重合体である。このタイプの特定の実施形態において液体安定ワクチンは、約０．０１％のポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレンブロック共重合体を含む。このタイプの特定の実施形態においてポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレンブロック共重合体は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ‐６８である。
【００２９】
本発明の液体安定ワクチンは、弱毒化生家禽ウイルスを含み得る。一定の実施形態において弱毒化生家禽ウイルスは、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）である。他の実施形態において弱毒化生家禽ウイルスは、伝染性ファブリギウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）である。さらなる実施形態において弱毒化生家禽ウイルスは、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。さらなる他の実施形態において弱毒化生家禽ウイルスは、伝染性喉頭気管炎（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｌａｒｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）（ＩＬＴＶ）である。さらに他の実施形態において弱毒化生家禽ウイルスは、トリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）である。さらなる他の実施形態において弱毒化生家禽ウイルスは、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）である。さらに他の実施形態において生家禽ウイルスは、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）である。［ＨＶＴは、鶏において病原性でない。］
生家禽ウイルスはまた、組換えベクターでもあり得る。このことは、特にＨＶＴおよび他の二つのＭＤＶ、すなわちＭＤＶ１およびＭＤＶ２に当てはまる。ニューカッスル病ウイルス（例えば、ＮＤＶ『融合』タンパク質あるいはＮＤＶ  Ｆタンパク質と言及される）または伝染性喉頭気管炎ウイルス（例えば、ＩＬＴＶ  ｇＩおよびｇＤタンパク質）由来の抗原をコードする組換えＨＶＴベクターは、既に市販されている。ごく最近、ＮＤＶ（ＮＤＶ  Ｆタンパク質）およびＩＬＴＶ（ＩＬＴＶ  ｇＩおよびｇＤタンパク質）由来の抗原をコードする、ユニークな組換えＨＶＴベクターが記載されている［その内容を本明細書で参照することにより援用する、Ｕ．Ｓ．８，９３２，６０４を参照されたい］。本発明の液体安定ワクチンは、単独でまたは本明細書記載のいずれかの組み合せで、これらの組換え家禽ウイルスのいずれをも含み得る。
【００３０】
従って、本発明の液体安定ワクチンは、死滅ウイルスおよび／または死滅細菌（例えば、バクテリン）および／またはバクテリンのサブフラクションをさらに含み得る。それ故に、一または複数の生ウイルスワクチンを含む本発明の液体安定ワクチンのいずれも、死滅ウイルスおよび／または死滅細菌および／またはバクテリンのサブフラクション、または弱毒化または非弱毒化の生のエイメリア等の寄生生物さえもさらに含み得る。
【００３１】
一定の実施形態において液体安定ワクチンは、弱毒化生ＩＢＶ、弱毒化生ＩＢＤＶ、生ＨＶＴおよび弱毒化生ＭＤＶを含む。他の実施形態において液体安定ワクチンは、弱毒化生トリメタニューモウイルス、弱毒化生ＩＢＤＶ、弱毒化生ＮＤＶおよび生ＨＶＴを含む。さらなる他の実施形態において液体安定ワクチンは、弱毒化生ＩＢＶ、弱毒化生ＩＢＤＶ、弱毒化生ＮＤＶ、弱毒化生ＭＤＶおよび弱毒化生ａＭＰＶを含む。さらに他の実施形態において液体安定ワクチンは、弱毒化生ＩＢＶ、弱毒化生ＩＢＤＶ、弱毒化生ＮＤＶ、弱毒化生ＭＤＶ、生ａＭＰＶおよび弱毒化生鶏痘ウイルスを含む。これらの実施形態のいずれにおいても生家禽ウイルスは、異種抗原をコードする組換えウイルスベクターであり得る。さらに本発明の液体安定ワクチンのいずれもまた、投与前に一または複数の弱毒化または死滅細菌抗原、例えばパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、アビバクテリウム・パラガリナラム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびマイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）等と組み合わせることもできる。本発明の液体安定ワクチン中に含まれ得る抗原および抗原の組合せを含む家禽用ワクチン（一価および多価の双方）の例は、以下の表１Ａ〜１Ｃを参照されたい。
【００３２】
本発明は、本発明のワクチンを動物に投与することを含む、鳥ウイルス感染に起因する臨床疾患からの鳥の防御を補助する方法をさらに提供する。従って本発明は、本発明のいずれかの液体安定ワクチンを鶏（ｆｏｗｌ）に投与することを含む方法を提供する。一定の実施形態において投与は、粘膜に実施される（点眼または飲料水による）。他の実施形態において投与は、非経口的に実施される。さらなる他の実施形態において投与は、皮内に実施される。さらに他の実施形態において投与は、経皮的に実施される。より特定の実施形態において本発明のワクチンは、噴霧によって動物に投与される。さらなる他の実施形態において投与は、卵内経路によって実施される。他の特定の実施形態において本発明のワクチンは、筋肉内で鳥（ａｖｉａｎ）に投与される。本発明はまた、初発ワクチンおよび／または追加ワクチンの使用も含む。
【００３３】
特定の実施形態において該方法は、生ウイルス、例えば弱毒化生ウイルスを含む本発明の液体安定ワクチンを、鶏（ｆｏｗｌ）に投与することを含む。従って特定の実施形態において、弱毒化生ＩＢＶ、弱毒化生ＩＢＤＶ、生ＨＶＴ、弱毒化生ＭＤＶ、弱毒化生トリメタニューモウイルスおよび／または弱毒化生ＮＤＶより選択される一または複数の生家禽ウイルスを含み得る本発明の液体安定ワクチンを投与する方法が提供される。これらの実施形態のいずれにおいても、ワクチン中の生家禽ウイルスは、異種抗原をコードする組換えウイルスベクターであり得る。さらに本発明の液体安定ワクチンのいずれかの投与前に、投与と共にまたは投与後に、一または複数の弱毒化または死滅細菌抗原、例えばパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ・エンテリディディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、アビバクテリウム・パラガリナラム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびマイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）等もまた投与され得る。
【００３４】
本発明の任意の及びすべての液体安定ワクチンを作成する方法がまた提供される。一定の実施形態において該方法は、液体安定ワクチンを形成するために、治療的有効量の弱毒化生ウイルスと例えば５〜４０％の糖添加物（例えば、糖アルコールまたは糖アルコールと非‐糖アルコールの組み合せ）、アミノ酸およびｐＨ６．０ないしｐＨ８．０の緩衝液を組み合わせることを含む。該アミノ酸は、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、メチオニンまたはアルギニン、グリシン、グルタミン酸および／またはメチオニンの組み合せであり得る。特定の実施形態においてアルギニンおよび／またはグリシンおよび／またはグルタミン酸は、液体安定ワクチン中で０．１５ないし０．７５Ｍの終濃度を有する。特定の実施形態においてワクチンは、液体安定ワクチン中で０．０２５ないし０．３Ｍの終濃度でメチオニンをさらに含む。特定の実施形態において弱毒化生ウイルスの治療的有効量は、弱毒化生鳥ウイルスの治療的有効量である。このタイプの特定の実施形態において弱毒化生家禽ウイルスの治療的有効量には、弱毒化生ＩＢＶ、弱毒化生ＩＢＤＶ、弱毒化生ニューカッスル病ウイルス、弱毒化生マレック病ウイルスおよび弱毒化生トリメタニューモウイルスの治療的有効量が含まれる。このタイプのより特定の実施形態において弱毒化生家禽ウイルスの治療的有効量には、弱毒化生ＩＢＶ、弱毒化生ＩＢＤＶ、弱毒化生ニューカッスル病ウイルス、弱毒化生マレック病ウイルス、弱毒化生トリメタニューモウイルスおよび弱毒化生鶏痘ウイルスの治療的有効量が含まれる。
【００３５】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるであろう。
【００３６】
［発明の詳細な説明］
本発明の液体安定な家禽ウイルスワクチンは、生ウイルス、例えば弱毒化生ウイルスを含むために、ワクチンの製剤化の間に弱毒化ウイルスの力価を、著しい有害事象をもたらし得るレベルより低いレベルに間違いなく維持するために、従来、特別な注意が必要であったであろう。実際にほとんどの弱毒化生家禽ウイルスワクチンは凍結乾燥され、しかも凍結乾燥は、凍結乾燥プロセス自体、ならびに長期保存の経過時間により弱毒化生ウイルスワクチンの有効性の実質的な低下をもたらす。
【００３７】
本発明は、弱毒化生ウイルス抗原の初期力価を確実に安全であるレベルを超えて高める必要なしに、保存中でさえ依然として有効な、液体安定な家禽用ワクチンを提供することによってこの課題を克服した。さらなる利点として、本発明は、安全でかつ有効な該ワクチンを作成するために必要な弱毒化生家禽ウイルスの量を著しく減少させることによってもたらされる、ワクチンの製造コストを低下させる方法を提供する。さらに本発明の弱毒化生家禽ウイルスワクチンは、その凍結乾燥カウンターパートよりも使用するのに便利である。従って本発明は、冷蔵温度で液体として保存され得て、５ないし７か月、６ないし９か月、９ないし１２か月、１２ないし１８か月および／または１８ないし２４か月および／またはそれ以上長期にわたり依然として安定な、安全でかつ有効な弱毒化生家禽ウイルスワクチンを提供する。その凍結乾燥カウンターパートと違って、本発明の液体安定ワクチンは、常に水和されているので再水和されてすぐに使用しなくてもよい。家禽用ワクチンはしばしば、最小の体裁として１０００回投与数のバイアルで供給されるので、小規模な農場を持つ人々は、購入した凍結乾燥ワクチンのほんの一部しか使用しないことになる。液体安定な家禽用ワクチンについては、小規模な農家は、ワクチンが適正に扱われ汚染されないとすれば、同じワクチンバイアルを数週間または数か月にわたり使用し続けられ得る。これは、小規模農家向けのまったく新規な独占市場を切り開く。
【００３８】
さらに驚いたことには、本発明の液体安定な生家禽ウイルスワクチンは、いかなるタイプの家禽ウイルスをも含み得る。従って本発明の液体安定な生ウイルスワクチンは、エンベロープ型および非エンベロープ型の家禽ウイルスを含み得る。さらに本発明の液体安定な生ウイルスワクチンは、一本鎖ＲＮＡゲノム、一本鎖ＤＮＡゲノムまたは二本鎖ＤＮＡゲノムを有する弱毒化生家禽ウイルスを含み得る。
【００３９】
説明における便宜のための単数形の用語の使用は、決してそのように限定することを意図しない。従って例えば、ある「糖添加物」（ａ  “ｓｕｇａｒ  ａｄｄｉｔｉｖｅ”））という言及には、別段の定めがない限り、一または複数の該糖添加物への言及が含まれる。複数形の用語の使用はまた、別段の定めがない限り、限定することを意図していない。同様に酸またはその対応する塩基として言及される化合物は、本明細書でどちらか一方として示される場合、別段の定めがない限り該化合物のどちらの形態をも意味することを意図している。従って用語、グルタミン酸の使用は、グルタミン酸塩を含むことを意図しており、逆もまた同様である。
【００４０】
本明細書で用いる場合、用語「家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）」には、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジが含まれる。
【００４１】
本明細書で用いる場合、用語「鳥（ａｖｉａｎ）」および「鶏（ｆｏｗｌ）」は、双方の用語が上で定義したような家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）を含むことを意図し、ほとんど同じ意味で使用される。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「ワクチン」とは、動物（一定の実施形態においてヒトを含む）に適用するために適した、動物への投与に際して野生型の微生物による感染に起因する臨床疾患からの防御を最小限で促進するのに十分なほど強力な、すなわち臨床疾患の予防を促進するためにおよび／または臨床疾患を予防、改善または治癒するために十分なほど強力な免疫応答を誘導する組成物である。明確に別段の指示がない限り用語ワクチンの使用は、多価ワクチンを含む。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「多価ワクチン」とは、二以上の異なる抗原を含むワクチンである。このタイプの特定の実施形態において多価ワクチンは、二以上の異なる病原菌に対し受容者の免疫系を刺激する。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「液体安定な」ワクチンとは、７℃以下に保存された場合（例えば、標準的な冷蔵庫、および／または０℃〜７℃）に少なくとも６か月の間依然として有効性を保つ液体（液体多価ワクチンを含む）として維持されるワクチンである。特定の実施形態において液体安定ワクチンは、７℃以下に保存された場合に少なくとも９か月間依然として有効である。より特定の実施形態において液体安定ワクチンは、７℃以下に保存された場合に少なくとも１年間依然として有効である。より一層特定の実施形態において液体安定ワクチンは、７℃以下に保存された場合に少なくとも１．５年間依然として有効である。さらなるより特定の実施形態において液体安定ワクチンは、７℃以下に保存された場合に少なくとも２．０ないし３年間依然として有効である。
【００４５】
本明細書で用いる場合、用語「防御する」、「防御している」、「に対し防御を提供する」、「に対し防御を提供している」および「防御における促進」は、いずれかの感染症状からの完全な防御を必要としない。例えば「防御における促進」とは、攻撃感染後に潜在する感染の症候が少なくとも減少するように、および／または症候を引き起こしている潜在する一または複数の細胞的、生理学的または生化学的要因または作用が減少および／または除去されるように、防御が十分であることを意味し得る。これに関連して用いられる「減少させる」とは、感染の生理学的状態だけでなく、感染の分子的状態を含む感染状態に関連して意味することを理解されたい。
【００４６】
用語「予防的有効量」とは、家禽に投与された場合に、所定の病原菌に起因する感染／侵襲の可能性および／または範囲を著しく減少させる組成物の量を意味する。
【００４７】
「発症予防（Ｍｅｔａｐｈｙｌａｘｉｓ）」とは、例えば、感染／侵襲のリスクが高い一または複数の動物における、予想される疾患の発生を除去しまたは最小限化するための、動物の群全体に対するタイムリーな集団薬物治療である。
【００４８】
用語「化学的予防」とは、ウイルス、細菌および／または寄生生物の感染／侵襲を予防または減少させる；および／またはその感染／侵襲に関連する疾患および／または症候を予防または減少させることを目的とする薬剤／治療、例えば一または複数の予防的組成物の投与を意味する。
【００４９】
用語「予防的組成物」とは、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用される、家禽における所定の病原菌に起因する感染／侵襲の可能性および／または範囲を著しく減少させる、いずれかの薬剤を意味する。このような一実施形態において、家禽は、混入、気象の変化、栄養の変化、および／または、薬剤または薬剤の組み合せによって標的とされる、通常家禽と関連するウイルス、細菌または寄生生物病原体の存在に伴う症候および／または疾患を惹起し得る他のストレス要因を受けて、家禽の呼吸器系疾患を発症するリスクが高い。
【００５０】
本明細書で用いる場合、用語「治療的有効量」とは、単独投与で提供される場合および／または意図して一または複数のその後の追加免疫投与を伴う初発投与として投与される場合に、それから防御するために抗原が投与される病原菌に対し防御を提供するために、および／または同病原菌からの防御を促進するために十分である所定の抗原、例えば弱毒化生家禽ウイルスの量である。
【００５１】
本明細書で用いる場合「有効な」ワクチンは、所定抗原の治療的有効量を含む。「有効な」ワクチンは、ワクチンが投与されるところのその抗原の管轄のための法的規制に準拠するように、例えば合衆国におけるワクチン投与は、合衆国農務省（ＵＳＤＡ）によって規制されているように、所定の抗原に対する十分な力価を保持する。
【００５２】
本明細書で用いる場合、用語「薬剤的に許容可能」とは、修飾される名詞が医薬品における使用に適していることを意味するために形容詞的に用いられる。例えば、該用語が医薬ワクチン中の賦形剤を記載するために用いられる場合、該用語は、賦形剤が組成物の他の成分と親和性があり、目的の受容者に対し不都合なほどには有害でないと見なす。
【００５３】
用語「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、化合物がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。薬剤的に許容可能な担体は、滅菌液体、例えば水および／または石油、動物、植物または合成油を含む油等、例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等であり得る。水または水溶液、食塩溶液および糖水溶液、例えばデキストロースおよび／またはグリセリン水溶液が担体として、特に注射可能な溶液用に使用され得る。さらに担体は、例えば鳥に噴霧される家禽用ワクチンの粘度を増すために、親水コロイドおよび／またはポリマー溶液であり得、および／または同溶液を含み得る。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「アジュバント」は、免疫学的事象のカスケードを助力しまたは増幅することのできる物質であり、最終的により良好な免疫学的応答、すなわち抗原に対する統合された全身性の応答をもたらす。アジュバントは、一般的に免疫応答を引き起こすために必要とされないが、この応答を助力または増幅する。
【００５５】
本明細書で用いる場合、「全身投与」とは、身体の循環器系（心血管系およびリンパ系を含む）への投与であり、それ故に消化管（例えば、経口、噴霧による）および呼吸器系（例えば、点眼投与による）等の特定部位としてよりも全体として身体に作用する。全身投与は、例えば、筋肉組織中へ（筋肉内）、真皮中へ（皮内、経皮または真皮の上）、皮膚の下へ（皮下）、粘膜の下へ（粘膜下）、静脈の中へ（静脈内）等に投与することによって実施され得る。
【００５６】
「非経口投与」には、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および注入が含まれる。
【００５７】
本明細書で用いる場合、「卵内で（ｉｎ  ｏｖｏ）」とは、鳥がまだその内部で生育している卵内への投与である。このタイプの投与は、卵内にいる間に鳥によって経口的に吸収されるワクチンをもたらし得るし、または偶然に筋肉内に注射され得るし、または卵黄嚢を通して吸収され得る。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「糖添加物」とは、５ないし１２炭糖（例えば、ショ糖、マルトース、トレハロース、デキストロース、ラクトース、ブドウ糖、果糖、ガラクトース）または糖アルコール／ポリオール（例えば、ソルビトール、マンニトール、アラビトール、イノシトール、マルチトール、グリセリン）である。逆に特に明記しない限り糖添加物のパーセント（％）は、ワクチンにおける（ｗ／ｖ）、すなわちワクチンの容量（ｖ）に対する糖添加物の重量（ｗ）として示される。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「非‐還元糖」とは、塩基性水溶液においてアルデヒド基を含むいかなる化合物をも生じない糖添加物である。本発明の非‐還元糖の例には、ショ糖およびトレハロースが含まれる。
【００６０】
本明細書で用いる場合、用語「非‐糖アルコール」および「非‐アルコール性糖」は、同じ意味で用いられる。「非‐糖アルコール」（または「非‐アルコール性糖」）である糖添加物は、本明細書で用いる場合、糖アルコールでないいずれかの糖添加物、例えば非‐還元糖であり得る。
【００６１】
本明細書で用いる場合、特に反対に明記しない限り、ワクチン中の個体添加物、例えば糖添加物またはゼラチンのパーセント（％）は、１ｇの個体／１００ｍｌのワクチン容量（ｗ／ｖ）である１％溶液に基づく。
【００６２】
本明細書で用いる場合、特に反対に明記しない限り、ワクチン中の液体添加物、例えばエタノールのパーセント（％）は、１ｍｌの液体添加物／１００ｍｌのワクチン容量（ｖ／ｖ）である１％溶液に基づく。
【００６３】
本明細書で用いる場合、用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」と同じ意味で用いられ、別段の定めがない限り、値が示された値の二十五パーセント以内、すなわち「約」２ｍＭのＥＤＴＡの濃度は、１．５ｍＭないし２．５ｍＭのＥＤＴＡであり得ることを意味する。
【００６４】
本明細書で用いる場合、反対に特に明記しない限り、示されたｐＨ値は、２５℃で定量／測定されたｐＨ値である。
【００６５】
本発明の液体安定ワクチンは、理想的にはｐＨにおいてｐＨ６．０からｐＨ８．０まで変動するので、本発明の液体安定ワクチンは緩衝剤を含み得る。本発明の液体安定ワクチン中で使用する緩衝剤には、限定するものではないが：リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、トリス、トリス‐ヒスチジン、ビス‐トリス、ビス‐トリスプロパン、ピロリン酸ナトリウムまたはカリウム、イミダゾール、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、トリシン、グリシルグリシンおよびＨＥＰＥＳが含まれる。緩衝液は、いずれかの適した対イオンの使用により所望のｐＨをもたらし得る。
【００６６】
本発明の液体安定ワクチンにおいて使用し得る全カゼインの加水分解物は、例えば酸加水分解物または酵素加水分解物を含む、いくつかの手順によって獲得し得る。当該加水分解物は、元々カゼインに含まれるすべてのアミノ酸を有する、混合形態のアミノ酸およびペプチドを含む。本発明の液体安定ワクチンにおいて使用し得る一つの全カゼイン膵液加水分解物は、ＭＰ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓによってＣＡＳＥＩＮ  ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ（登録商標）として販売されている。同等の製品が、ＮＺ‐ＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＮＺ‐ＡＭＩＮＥ（登録商標）Ａ、ＮＺ‐ＡＭＩＮＥ（登録商標）ＡＳおよびＮＺ‐ＡＭＩＮＥ（登録商標）Ｂおよびトリプトンとの名称の下でＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって販売されている。
【００６７】
本発明のワクチンに含まれる得る親水コロイドの例には：ゼラチン、デンプンポリマー、およびガム類、例えばキサンタンガム、カラギーナンおよびアラビアガム（アカシアガム）が含まれる。
【００６８】
多価ワクチン：本発明は、液体安定な多価ワクチンを提供する。本発明の液体安定な家禽用多価ワクチンは、以下の弱毒化生家禽ウイルス：ＩＢＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶ、ＭＤＶ、ＩＬＴＶ、ａＭＰＶおよび／または一または複数の異種抗原をコードする組換えＨＶＴの一または複数を含む、二以上の抗原を含み得る。上述の通り、本発明の液体安定な家禽用多価ワクチンはまた、一または複数の死滅家禽ウイルスと共に、以下の弱毒化生ウイルス：ＩＢＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶ、ＩＬＴＶ、ＭＤＶ、ａＭＰＶ、および／または一または複数の異種抗原をコードする組換えＨＶＴをも含み得る。
【００６９】
さらに本発明の液体安定ワクチンは、投与の前に、抗原、例えばパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、アビバクテリウム・パラガリナラム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびマイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）および／またはエイメリア等の非弱毒化または弱毒化寄生生物等を含む、一または複数の弱毒化生または死滅細菌ワクチンと順次組み合わされ得る。本発明の液体安定ワクチン中で使用され得る一価および多価のワクチンの例は、以下の表１Ａから１Ｃを参照されたい。
【表１】
2017505807.tif 000002
【表２】
2017505807.tif 000003
【表３】
2017505807.tif 000004
【００７０】
アジュバント：本発明のワクチンは、しばしばワクチンが含む抗原に依存して、アジュバントを含み得るかまたはアジュバントを含み得ない。特定の実施形態において、アジュバントはアルミニウム塩を含む。生ウイルスワクチンと併せてのアルミニウム塩の使用が記載されている。特定の実施形態において、アルミニウム塩は、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウムおよび水酸化アルミニウムからなる群より選択される。一つのリン酸アルミニウムアジュバントは、ＲＥＨＹＤＲＯＰＨＯＳ（登録商標）（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐａｒｓｉｐｐａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）である。水酸化アルミニウムアジュバントの例には：ＲＥＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）ＨＰＡまたはＲＥＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）ＬＶ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が含まれる。他の周知のアジュバントには、炭化水素油、ポリマー、サポニンおよび／または水中のアクリル酸ナトリウムのゲル粒子から成るアジュバント、例えばＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＰＥＴ  ＧＥＬ  Ａ（登録商標）（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ  Ｆｒａｎｃｅ）が含まれる。低分子量共重合体アジュバントは、溶液中で架橋を形成して高分子量ゲル、例えばＰＯＬＹＧＥＮ（登録商標）（ＭＶＰ  Ｌａｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｍａｈａ）になることが可能である。添加される場合、アジュバントの量は、通常、ワクチン中で約１％ないし２０％（ｖ／ｖ）の間である。特定の実施形態において、アジュバント量は約２％ないし１０％（ｖ／ｖ）の間である。より特定の実施形態において、アジュバント量は約３％ないし６％（ｖ／ｖ）の間である。
【００７１】
ワクチン投与：本発明の液体安定なウイルスワクチンは、限定されるものではないが、皮下または筋肉内投与等の非経口投与によるのを含む任意の従来法により、例えば全身投与により投与され得る。本発明の液体で安定なウイルスワクチンはまた、粘膜投与によって、例えば噴霧、経口、卵内および／または点眼投与等によっても投与され得る。あるいはワクチンは、皮膚パッチ、緩効性インプラント、切皮または局所投与によって投与され得る。本発明の液体安定なウイルスワクチンはまた、受容者である家禽の飲料水および／または食餌によっても投与されうることが意図される。
【００７２】
本発明のワクチン（多価ワクチンを含む）はまた、併用療法、すなわちワクチンそのものに加えて一または複数の追加の活性薬剤、治療等を施すことを含む療法の一部として投与され得る。その場合、「治療的有効」量を構成するワクチン量は、もしワクチンが単独で投与されるならば「治療的有効」量を構成するであろうワクチン量と同じくらいであり得る。他の療法には当該分野で既知の療法、例えば鎮痛剤、熱降下薬、去痰薬、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤および／または輸液等が含まれ得る。
【００７３】
本発明の方法の一定の実施形態において、粘膜投与に適した本発明のウイルスワクチンは、以下：弱毒化生ＩＢＶ、弱毒化生ＩＢＤＶ、弱毒化生ＭＤＶ、弱毒化生ＩＬＴＶ、弱毒化生ａＭＰＶ、組換えＨＶＴ生ウイルスおよび弱毒化生ＮＤＶの一または複数を含む。より特定の実施形態において、粘膜投与に適した本発明のウイルスワクチンは、弱毒化生ＩＢＶ、および以下：弱毒化生ＩＢＤＶ、弱毒化生ＭＤＶ、弱毒化生ＩＬＴＶ、弱毒化生ａＭＰＶ、組換えＨＶＴ生ウイルスおよび弱毒化生ＮＤＶの一または複数をさらに含む。
【００７４】
免疫原性レベルは、当該技術分野において既知のワクチン用量漸増法および攻撃感染研究法によって実験的に定量され得る。当該技術は、典型的に多数の動物被験体を異なる用量のワクチンにより接種すること、それから最小防御用量を定量するために動物被験体をビルレントなウイルスで攻撃感染することを含む。
【００７５】
望ましい投与計画に影響を与える因子には、例えば、種または品種（例えば、鳥）、年齢、体重、食餌、活動性、肺サイズおよび被験体の状態；投与経路；使用される具体的なワクチンの有効性、安全性および免疫持続性プロファイル；送達システムが使用されるか否か；およびワクチンが薬剤および／またはワクチン併用の一部として投与されるか否かが含まれる。従って用いられる用量は、具体的な動物に対して変動し得て、それ故に上に示した典型的な用量から逸脱し得る。用量の調節を決定することは、一般的に従来法を使用するワクチン開発の当業者の技術の範囲内である。
【００７６】
同様に、当該用量が典型的に投与され得る容量は、０．０１ｍＬ（点眼適用）と２．０ｍＬの間である。投与量の典型的な範囲は、０．０３と１．０ｍＬの間であり、筋肉内投与については約０．１ないし０．５ｍＬである。
【００７７】
鳥被験体が食肉用、卵生産用またはペットとして飼育されているか否かは、所定のワクチンが鳥被験体に投与される回数に関する決定において含まれ得る。従ってワクチンは、ワクチン受容者に単回、あるいは数日、数週間、数か月または数年間にわたり２回以上投与され得ることが意図される。いくつかの実施形態において、ワクチンは少なくとも二回投与される。一定の当該実施形態において、例えばワクチンは二回投与され、二回目の投与（例えば、追加免疫）は初回投与の少なくとも２週間後に投与される。特定の実施形態においてワクチンは二回投与され、二回目の投与は初回投与の遅くとも８週間後に投与される。他の実施形態において二回目の投与は、初回投与の１週間から２年後に、初回投与の１．５週間から８週間後に、または初回投与の２から４週間後に投与される。他の実施形態において二回目の投与は、初回投与の約３週間後に投与される。
【００７８】
上記の実施形態において初回およびその後の投与は、量および／または形態等において変動し得る。しかしながら、しばしば投与は量および形態において同じである。単回の用量のみが投与される場合、その用量中のワクチン量は、一般的に単独でワクチンの治療的有効量を含む。しかしながら二用量以上が投与される場合、これらの用量を併せたワクチン量が治療的有効量を構成し得る。さらに上で論じた通り、ワクチンが最初に投与され、それから２から１２週間後に追加免疫が投与され得る。しかしながらその後のワクチンの投与は、追加免疫が投与されるか否かにかかわらず、一年に一度（１‐年）または二年に一度（２‐年）実施され得る。
【００７９】
本発明のワクチンはまた、抗生物質等の抗菌薬も含み得る。当該抗生物質の例には：１０〜１０００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、０．５〜５．０μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ、１０〜１００μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、１０〜１００単位／ｍＬのナイスタチン（マイコスタチン）、１０〜１００単位／ｍＬのペニシリン、１０〜１００μｇのストレプトマイシン、１０〜１００μｇのポリミキシンＢおよび１０〜１００μｇのネオマイシンが含まれ得る。
【００８０】
本発明は、本発明の代表例として示される、以下の非限定的な実施例を参照することによってより良く理解され得る。以下の実施例は、本発明の実施形態をより完全に説明するために示される。しかしながら実施例は、決して本発明の広い範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【００８１】
実施例
液体家禽ウイルス液体ワクチンの安定性
材料および方法
バルク抗原調製：凍結したＩＢＶウイルスバルク抗原を生産から獲得し、ワクチンを混合する時点まで−６０℃に保存した。ＩＢＶバルク抗原は、約９．１  ｌｏｇ（ＥＩＤ５０）の力価を有する。
【００８２】
材料：細胞培養液またはより高い等級のショ糖およびソルビトールを、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入する。９８％超の純度を有する分子生物学等級のＬ‐アルギニン一塩酸塩を、Ｓｉｇｍａから購入する。ＮＺアミン（ブルーム２５０）溶液を、利用可能な最良の市販試薬から調製する。以下の溶液：８０％（ｗ／ｖ）のショ糖、７０％（ｗ／ｖ）のソルビトール、１．２ＭのＬ‐アルギニン一塩酸塩、１．０Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、トリプトースリン酸ブロス（ＴＰＢ）溶液および２５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンの溶液を調製し、オートクレーブまたは０．２ｕｍ濾過によって滅菌した。
【００８３】
安定化剤溶液およびワクチン混合液のｐＨ調整：最終ワクチン混合液のｐＨは、液体中のウイルスの安定性に決定的であり得る。ｐＨは、非常に高感度のｐＨプローブおよび測定器を使用して測定する。測定器は、小数部の有効数字３のｐＨを示す。測定器を有する分離した温度プローブがあり、双方とも溶液中に存在し、安定でなければならない。このｐＨメーターは、３点が最小限である５点検量線が可能である。ウイルス抗原を添加するに先立って、ワクチン混合液の調製の間に安定化剤溶液のｐＨを目標ｐＨに調整し、安定化剤溶液とウイルス抗原を混合した後に再度ｐＨを測定する。
【００８４】
安定化剤溶液の調製：一旦初期のｐＨ調整がなされたならば、０．２μＭのフィルターを使用してすべての製剤を濾過滅菌した（ＰＥＳは、改善された濾過容量だけに起因して、望ましいフィルター基質である）。一般に濾過は減圧を使用して実施する。減圧濾過の副次的な利益は、製剤のさらなる脱気である。製剤を濾過滅菌した後に、おそらく経時的により低反応性の製剤を獲得しうるＯ２の枯渇を増大するために、製剤をアルゴンガスでスパージする。一旦スパージが完了すると、保存の前にアルゴンのオーバーレイ（重層）が載置され、密封される。製剤の調製後に、ｐＨを確認し／所望の温度（例えば、４℃、５℃または２５℃）においてｐＨ７．２に調整するが、すなわち本明細書で実施した多くの実験に対する所望の温度は４℃であった。製剤化および前記の手順が正しく実施されるならば、ｐＨは目標とするｐＨに近くなるであろう。一晩のインキュベーションにより、ｐＨはそれ以前のｐＨ調整および追加的な脱気に伴う化学反応の完成のためにわずかに移動し得る。
【００８５】
ウイルスバルク抗原の解凍：凍結抗原を室温で（１５〜３０℃）または冷蔵温度で（２〜８℃）ゆっくりと解凍する。解凍した抗原は、使用前に２〜８℃で８時間以上保持すべきでない。
【００８６】
ワクチン混合液の調製：２００ｍＬのワクチン混合液を作成するために、最初に表３に記載の表示容量の各ストック溶液を滅菌容器に加え、撹拌子を使用して安定化剤および賦形剤を混合した。安定化剤溶液およびすべての賦形剤を激しく混合した後、表示容量のウイルス抗原を容器に加えて激しく混合した。この混合ステップの間、気泡や泡沫の発生を回避した。ウイルスをごく短時間枠（数分）内で添加する場合は、その結果ウイルスをなんら問題なく添加し得る。ウイルスがすぐには添加されない場合は、残存するＯ２を置換するためにアルゴンのオーバーレイを導入する。一旦ウイルスを添加したならば、混合前に新鮮なアルゴンのオーバーレイを導入する。アルゴンガスを低流量でボトルに添加する。ワクチン混合液が完成した後、ワクチン混合液を少量の分割量で分注するまで２〜８℃に保つ。
【００８７】
ワクチンの充填：ワクチン混合液を、バイアル当たり１．８ｍＬでガラスアンプルバイアルに分注した。その後各バイアルを、アルゴンガスにより埋戻しオーバーレイ（重層）する。アンプルバイアルを火炎シールし、ラベルを貼り、それから箱の中に移し、表示温度でインキュベーターに保存した。
【００８８】
高温およびリアルタイム条件における安定性試験：アンプルバイアル中の液体ＩＢＶワクチンを、それぞれ相当するインキュベーター中に１５℃および４℃で保存した。表示の時点において、各製剤から２以上のバイアルを回収し、各抗原の力価を卵に基づく滴定法によって測定し、平均卵感染量（ＥＩＤ５０）として示した。
【００８９】
分析法
胚感染量アッセイを、クリーンセル環境下で実施する。操作および希釈を、無菌条件下のクラスＩＩの生物学的安全キャビネット内で実施する。あらゆる操作の前に卵を表面殺菌し、すべてのボトル、ピペット、ピペットチップおよび希釈用試験管を使用の前に滅菌しなければならない。全ての培地および関連成分を滅菌しなければならない。
【００９０】
ＩＢＶ  ＤＥ‐０７２効力検定：所定の伝染性気管支炎ウイルス原液の効力を検定するための望ましい方法は、特定の病原体フリーの孵化鶏卵における感染力をアッセイすることである。ウルイス原液の幾何平均力価（ＧＭＴ）を、尿膜腔において、２９μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むトリプトースリン酸ブロス（ＴＰＢ）中で希釈した０．１ｍｌのウイルス液体により９ないし１１日齢の胚に接種することによって定量する。試験当たり４ないし６倍の間の希釈液（１０倍を超えない）を使用し、希釈液当たり最小限５個の胚を接種しなければならない。卵を関係湿度６０〜７０％、３８〜３９℃で７日間インキュベートし、明かりに透かして毎日検査する。最初の２４時間の間に起こる死は無視し得るが、接種後の２および７日の間の死亡率はウイルス特異的と考えられる。各希釈液中の少なくとも４個の生存能力のある胚が、有効な検査の２４時間を超えて生存しなければならない。インキュベーション７日後に、胚を典型的なＩＢＶ感染のエビデンス、例えば成長阻害、湾曲、産毛のばち状化または腎臓の中腎中の尿酸塩沈着等について検査する。比較するために、最小限６個の卵にＴＰＢ希釈液を接種し負の対照として用い、既知の力価を有するＩＢＶ  ＤＥ‐０７２の調製標準品をアッセイして正の対照として使用する。満足のいく滴定は、５０ないし１００パーセント陽性である少なくとも一つの希釈液および５０ないし０パーセント陽性である少なくとも一つの希釈液を有さなければならない。平均胚感染量（ＥＩＤ５０）を、リード・ミュンヒ（Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ）法かまたはスピアマン・ケルバー（Ｓｐｅａｒｍａｎ‐Ｋａｅｒｂｅｒ）法を使用して計算し得る。より良好な精度のためには、試験する原液試料当たり少なくとも３回の反復滴定を実施し、平均ＧＭＴを定量することが薦められる。
【００９１】
結果および結論
いくつかの可能性のある液体安定なＩＢＶ製剤を表２に示す。これらの製剤を、種々の安定化剤および賦形剤の液体中のＩＢＶの安定性に対する貢献を評価するために使用した。Ｓｔａｂｌ＃１７は、低い安定性に起因して＜−５０℃に凍結して販売されている市販製品用の製剤である。Ｓｔａｂｌ＃１７は、安定化剤として３．３％（ｗ／ｖ）のＮＺアミンおよび３．３％（ｗ／ｖ）のショ糖を含む。製剤Ｐ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３は、安定化剤として糖添加物（ソルビトールおよびショ糖）およびＬ‐アルギニンを含む三個の製剤である。表２は、各製剤用の最終ワクチン混合液における各安定化剤または賦形剤の終濃度を示す。すべての製剤は、緩衝剤として１０ｍＭのＫＰＯ４を使用して約７．２のｐＨ値をもたらし、４個すべての製剤は、保存料として１．０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含む。製剤に対する目標とするｐＨは７．２であり、ＩＢＶ抗原と混合後の実際のｐＨは約ｐＨ６．８ないし７．２である。製剤Ｐ‐０１は、安定化剤として１５％（ｗ／ｖ）のソルビトールおよび０．３ＭのＬ‐アルギニンを含む。製剤Ｐ−０２は、安定化剤として１５％（ｗ／ｖ）のソルビトールおよび０．４５ＭのＬ‐アルギニンを含む。製剤Ｐ−０３は、安定化剤として１５％（ｗ／ｖ）のソルビトール、１０％（ｗ／ｖ）のショ糖および０．３ＭのＬ‐アルギニンを含む。ＴＰＢを最終の目標とする容量を調整するための充填溶液として使用する。
【００９２】
実験用ワクチンの２００ｍＬのバッチを、安定化剤、賦形剤および保存料を一緒に組み合わせることによって、クリーンフード内で原溶液から滅菌ボトルの中に調製した。Ｓｔａｂｌ＃１７については、６７ｍＬの３Ｘの安定化剤＃１７［１０％のショ糖（ｗ／ｖ）および１０％のＮＺアミン（ｗ／ｖ）］を、６５．２ｍＬのＴＰＢ溶液および０．８ｍＬの１００〜２５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン溶液と激しく混合した。製剤Ｐ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３については、各安定化剤（ショ糖、ソルビトール、Ｌ‐アルギニン）、賦形剤（ＫＰＯ４、ＴＰＢ）を、表３に示した表示容量で保存料（ゲンタマイシン）と共に調剤した。安定化剤、賦形剤および保存料を激しく混合した後に；融解した６７ｍＬのＩＢＶ抗原を各製剤に添加し激しく混合した。各ワクチン混合液を、それから１．８ｍＬ／バイアルでガラスアンプルバイアルに等分した。ワクチンバイアルを、アルゴンにより逆充填し、火炎シールしそれから１５℃かまたは４℃における安定性試験にかけた。
【００９３】
１５℃および４℃でのインキュベーション後の指示時点において、各製剤由来の最低限二個のバイアルをインキュベーターから回収し、ＩＢＶ力価をＥＩＤ５０に基づく効力検定を使用して定量した。表４および５は、それぞれ１５℃で１７週目までおよび４℃で１２か月目まで保存後の各製剤におけるＩＢＶ試料の平均力価を示す。表４に示す通り、ＩＢＶウイルス力価は製剤Ｓｔａｂｌ＃１７において１５℃での保存中に０日から４．５週目までで２．８  ｌｏｇ低下する。非常に対照的に、他の三つの製剤（Ｐ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３）におけるＩＢＶは、１５℃に保存された場合に０日目に比較してすべて安定である。０時点に比較しての１５℃での１、２および４．５週間目におけるすべて三個の製剤の力価の変化は、効力検定変動（０．５  ｌｏｇ）以内である。表４のデータは、ＩＢＶが現行製品製剤、例えばＳｔａｂｌ＃１７において安定ではないが、製剤Ｐ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３において１５℃で４．５週間目まで安定であることを裏付ける。
【００９４】
さらに、４℃におけるリアルタイムの安定性データもまた収集した［表５］。１５℃での安定性データに見られるように、４℃におけるＳｔａｂ＃１７中のＩＢＶは、最初の時点（３か月）で著しい力価の損失を示し、第二の時点（すなわち６か月）で本質的に不活性であったのに反して、すべての三個の製剤、すなわちＰ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３は、著しく改善された安定性をもたらした。４℃での安定性データは、Ｐ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３が現行製剤Ｓｔａｂｌ＃１７よりも改善されたＩＢＶの安定性をもたらすこと、および製剤Ｐ‐０３が保存４℃で０日と比較して７か月まで本質的に力価の変化がないことを示し、三つの間で最良の候補であることを示す。
【００９５】
表４における１５℃での安定性データに基づいて、各製剤におけるＩＢＶの安定性を一次多項式回帰を使用して分析する。回帰分析から得た方程式を使用して、１５℃における１．０  ｌｏｇの力価低下に要する時間を計算し、表６の最終行に記載する。ＩＢＶの１．０  ｌｏｇの力価低下に要する時間は、製剤Ｓｔａｂｌ＃１７、Ｐ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３において、それぞれ１．６、１６．６、２２．７および４９．８週間である。この分析は、製剤Ｐ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３における安定化剤が異なる貢献をなすことを示す。製剤Ｐ‐０１およびＰ‐０２の比較は、Ｌ‐アルギニンの濃度を０．３Ｍから０．４５Ｍまで上昇することがＩＢＶの安定性を著しくは改善しないことを示す。製剤Ｐ‐０１とＰ‐０３の比較は、追加の１０％のショ糖がＩＢＶの安定性を著しく改善したことを示す。Ｐ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３製剤のＳｔａｂｌ＃１７を上回る著しい安定化効果は、ソルビトール、ショ糖およびＬ‐アルギニンの組み合せが液体製剤におけるＩＢＶの安定性について有益であり得ることを示す。表５の４℃におけるＩＢＶのリアルタイム安定性は、１５℃での安定性データから生み出された推定相対安定性と一致しており、すべての三つの新規製剤、すなわちＰ‐０１、Ｐ‐０２およびＰ‐０３がＳｔａｂｌ＃１７よりも著しく良好な成績を上げることをさらに裏付ける。さらにＰ‐０３製剤は、標準的な冷蔵温度において最良の安定性を提供する。
【表４】
2017505807.tif 000005
【００９６】
注：
・各製剤について記載された濃度は、ワクチン混合液における終濃度である。
【００９７】
・ＫＰＯ４は、ｐＨ７．２となる容量比で一塩基性および二塩基性リン酸カリウムを含むリン酸カリウム溶液である。
【００９８】
・ＮＺアミン、ソルビトールおよびショ糖について、濃度単位は容量分の重量（ｗ／ｖ）である；アルギニンおよびＫＰＯ４について、濃度単位はそれぞれモル濃度およびミリモル濃度である。
【００９９】
・すべての製剤はまた、最終ワクチン混合液において１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンも含む。
【表５】
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【０１００】
注：
・製剤Ｓｔａｂｌ＃１７を調製するために、６７ｍＬの安定化剤＃１７（１０％のＮＺアミンおよび１０％のショ糖を含む）を、６５．２ｍＬのＴＰＢ、０．８ｍＬのゲンタマイシン（２５０ｍｇ／ｍＬ）および６７ｍＬのＩＢＶバルクウイルスと混合する。
【０１０１】
・すべてのワクチン混合物について、ウイルスを製剤に添加する前に、安定化剤（ソルビトール、ショ糖、Ｌ‐Ａｒｇ）、賦形剤（ＴＰＢ、ＫＰＯ４）および保存料（ゲンタマイシン）を最初に混合した。
【表６】
2017505807.tif 000007
【０１０２】
注：
・各時点におけるワクチンの力価は、各製剤由来の試料の最小限２バイアルの平均である。
【０１０３】
・ＩＢＶウイルス陽性の対照を常に各ウイルス滴定に含め、各時点におけるウイルス効力検定を検証するために使用する。
【０１０４】
・本ＥＩＤ５０に基づくウイルス効力検定の変動は、０．５  ｌｏｇ以下である。
【表７】
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【０１０５】
注：
・各時点におけるワクチンの力価は、各製剤由来の試料の最低限２バイアルの平均である（ただし*がＳｔａｂｌ＃１７の個別の測定のために一つのバイアルのみが使用されたことを示す場合を除く）。
【０１０６】
・ＩＢＶウイルス陽性の対照を常に各ウイルス滴定において含め、各時点におけるウイルス効力検定を検証するために使用する。
【表８】
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【０１０７】
注：
・表４の安定性データを、種々の製剤におけるＩＢＶの安定性を予測するために使用した。
【０１０８】
・表４のデータから予測するために、ＩＢＶ力価をｙ軸の値とし、保存時間（週間）をｘ軸の値として、非線形一次多項式回帰を使用する。
【０１０９】
・ＩＢＶの安定性勾配は、一週間当たりの力価の変化［Ｌｏｇ１０（ＥＩＤ５０）］であり、Ｙ切片は回帰方程式に基づく０時間での力価である。
【０１１０】
・回帰方程式（ＩＢＶ力価対保存時間）に基づいて、各製剤について１．０  ｌｏｇの力価低下に要する０時間からの推定時間を計算し、表の最終行に記載する。
【０１１１】
本発明は、本明細書に記載する具体的な実施形態によって範囲を限定されない。実際に、本明細書に記載する実施形態に加えて本発明の種々の変更は、上述の記載から当業者にとって明らかであろう。当該変更は、付属の請求項の範囲に入るように意図されている。
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月17日(2016.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生家禽ウイルス、５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、および、アルギニン、グルタミン酸およびグリシンから成る群より選択される、０．１５ないし０．７５Ｍのアミノ酸を含む液体安定ワクチンであって；ここで液体安定ワクチンは、６．０ないし８．０のｐＨを有し；ここで生家禽ウイルスは、弱毒化ウイルス、組換え家禽ウイルスベクターおよび弱毒化家禽ウイルスの組換えウイルスベクターから成る群より選択され；そしてここで、組換え家禽ウイルスベクターまたは弱毒化家禽ウイルスの組換えウイルスベクターは、異種抗原をさらにコードし得る、前記の液体安定ワクチン。
【請求項２】
糖アルコールがソルビトールである、請求項１の液体安定ワクチン。
【請求項３】
アミノ酸がアルギニンである、請求項１または２の液体安定ワクチン。
【請求項４】
糖アルコールの量が、１０〜３０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチン。
【請求項５】
弱毒化生家禽ウイルスが、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性ファブリギウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、および七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）より成る群から選択される、請求項１〜４のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチン。
【請求項６】
非‐糖アルコールである糖添加物をさらに含み、ここで液体安定ワクチンにおける糖アルコールおよび非‐糖アルコールの合計量が１５〜４０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチン。
【請求項７】
糖アルコールおよび非‐糖アルコールの合計量が２５〜４０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜６のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチン。
【請求項８】
非‐糖アルコールがショ糖およびトレハロースから成る群より選択される、請求項６または７の液体安定ワクチン。
【請求項９】
緩衝剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチン。
【請求項１０】
弱毒化生ウイルスがＩＢＶである、請求項１〜９のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチン。
【請求項１１】
弱毒化生ＭＤＶまたは異種抗原をコードする弱毒化組換えＭＤＶベクターをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチン。
【請求項１２】
死滅家禽ウイルスをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチン。
【請求項１３】
細菌をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチン。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチンを鳥に投与することを含む、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）に対し鳥の防御を補助する方法。
【請求項１５】
治療的有効量の弱毒化生家禽ウイルスを、
５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、及び
アルギニン、グルタミン酸およびグリシンから成る群より選択される、０．１５ないし０．７５Ｍのアミノ酸、と組み合わせることを含む、請求項１〜１２のいずれかの請求項に記載の液体安定ワクチンを作成する方法であって、ここで、液体安定ワクチンは、６．０ないし８．０のｐＨを有する、方法。
【国際調査報告】
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