(57)【要約】  本発明は、コハク酸脱水素酵素の細胞透過性可逆性阻害剤である、コハク酸の蓄積を阻害することによる、虚血性再灌流傷害などの再灌流傷害の治療又は予防における使用のための、コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩に関する。
2017519020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コハク酸脱水素酵素の細胞透過性及び可逆性阻害剤である、コハク酸の蓄積を阻害することによる再灌流傷害の治療又は予防における使用のための、コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2017519020.tif 000008
（式中、
ｎは、０又は１であり；
Ｒ１は、Ｃ１−１２アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ及びＯＨから選択され；
Ｒ３は、ＣＯ２Ｒ４及びＣ（Ｏ）−ＣＯ２Ｒ４から選択され；
Ｒ４は、Ｃ１−１２アルキルから選択される）
を有する、請求項１に記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
Ｒ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｒ４、Ｒ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＣＯ２Ｒ４、及びＲ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ２Ｒ４から選択される、請求項２に記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項４】
Ｒ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｒ４（式中、Ｒ１及びＲ４は独立に、メチル、エチル、プロピル、及びブチルから選択される）から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項５】
ジメチルマロン酸である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項６】
再灌流傷害が虚血性再灌流傷害である、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項７】
再灌流傷害が、腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化、動脈疾患、火傷、がん、心停止、脳血管疾患、脳卒中に続発する脳浮腫、慢性閉塞性肺疾患、うっ血性心臓病、経皮経管冠動脈形成後の狭窄、冠疾患、糖尿病、高血圧、挫滅又は外科手術から生じる機械的外傷、偏頭痛、心筋梗塞、末梢血管疾患、肺血管疾患、心臓外科手術後の再灌流、脳卒中後の再灌流、網膜の血管疾患、脳卒中、及び外科的な組織の再灌流傷害から選択される障害の結果である、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項８】
コハク酸の蓄積を阻害することによる待機的外科手術での再灌流傷害の治療又は予防における使用のための、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項９】
保存する臓器での再灌流傷害の治療又は予防における使用のための、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項１０】
臓器移植での再灌流傷害の治療又は予防における使用のための、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項１１】
コハク酸脱水素酵素阻害剤が、血流の閉塞を取り除くために使用した、或いはそれを意図した治療と組み合わせて投与される、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項１２】
血流の閉塞を取り除くために使用した、或いはそれを意図した治療が、血液希釈剤、溶解剤、MitoSNO及びステントから選択される、請求項１１に記載の細胞透過性及び可逆性コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項１３】
コハク酸脱水素酵素の細胞透過性及び可逆性阻害剤である、コハク酸の蓄積を阻害することによる再灌流傷害を治療する又は予防する薬品の製造のための、コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩の使用。
【請求項１４】
対象において再灌流傷害を治療する又は予防する方法であって、コハク酸脱水素酵素の細胞透過性及び可逆性阻害剤である、有効量のコハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩を前記対象に投与するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コハク酸脱水素酵素の細胞透過性及び可逆性阻害剤である、コハク酸の蓄積を阻害することによる、再灌流傷害の治療又は予防における使用のためのコハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸は、嫌気性条件で産生されることが公知である。例えば、潜水する動物、腫瘍の中心の低酸素領域、及び特定の寄生生物が、低酸素の状態でコハク酸の増加を示すことが観察され得る。しかし、これらの研究は、典型的には、細胞を死滅させる、又は研究下のシステムから細胞をブロック若しくは取り除こうとする試みに関連する。さらに、これらのシステムは、低酸素下の哺乳動物細胞が経験する状態にいつも相当するとは限らない。例えば、バクテリアにおいて、コハク酸代謝に含まれる２つの酵素活性は、［哺乳動物細胞における同じ単一の酵素、コハク酸脱水素酵素（ＳＤＨ）にではなく］２つの別々の酵素にある。
【０００３】
コハク酸は、特定のインビトロでのシステムにおいて研究されてきた。特定のインビトロでのシステムにおいて観察されてきたコハク酸を介する活性酸素種（ＲＯＳ，reactive oxygen species）生成が可能である。しかし、このような観察は、インビボでの可能な条件の純粋な反映というよりはむしろ、インビトロでの珍しい存在として主にみなされてきた。
【０００４】
コハク酸は酸素検知適用について研究されてきた。先行技術における抗炎症効果を達成するために、コハク酸をブロックする試みがなされてきた。
【０００５】
インビボでのコハク酸蓄積を、再灌流時のコハク酸の酸化に起因するミトコンドリア複合体ＩによるＲＯＳ産生と関連付ける、先行技術における公知の実験的な関連はない。
【０００６】
Hu et al, Journal of Huazhong University of Science and Technology, Medical Sciences, vol. 25, 2005, pages 439-441及びHirata et al, Transplantation, vol. 71, 2001, pages 352-359はともに、３−ニトロプロピオン酸を用いる化学的プレコンディショニングがラットの虚血再灌流傷害を減らしたことを示している。化合物３−ニトロプロピオン酸はミトコンドリア複合体IIの阻害剤である。Wojtovich et al, Basic Research in Cardiology, vol. 104, 2009, pages 121-129は、複合体II阻害剤であるアトペニンＡ５（atpennin A5）が、mKATPチャネル依存性機構を介して、シミュレートした虚血再灌流傷害から心臓を保護すると報告している。しかし、３−ニトロプロピオン酸及びアトペニンＡ５などの阻害剤は、不可逆性であるという不都合がある。結果として、そのような不可逆性阻害剤と結合するいずれの複合体IIも、その正常な機能を永久に実行できない。
【０００７】
Drose et al, Molecular Pharmacology, vol. 79, 2011, pages 814-822は、２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＦＡ，thenoyltrifluoroacetone）、３−ニトロプロピオン酸、アトペニンＡ５、及びマロン酸を含むいくつかの心臓保護的な複合体II阻害剤を研究した。試験した阻害剤のうち、マロン酸は、アトペニンＡ５（atepennin A5）に必要なナノモル濃度レベルと比較して、最大半量の阻害を達成するためにミリモル濃度レベルの最も高濃度を必要とした。さらに、マロン酸は、細胞透過性でないという不都合がある。他の阻害剤であるＴＴＦＡ、３−ニトロプロピオン酸、及びアトペニンＡ５は、不可逆性であるという不都合がある。
【０００８】
ジメチルマロン酸は、公知の化合物である。マロン酸及びその誘導体は、ポリマー形成の供給原料として使用される工業的化合物である。ジメチルマロン酸など、ＳＤＨの阻害剤のプロドラッグとしてのマロン酸誘導体の使用のための先行技術における公知の教示はない。プロドラッグであるジメチルマロン酸は、ＳＤＨの阻害剤であるマロン酸へとインビボで加水分解される。
【０００９】
本発明は先行技術に関係する問題点を克服するために探求する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hu et al, Journal of Huazhong University of Science and Technology, Medical Sciences, vol. 25, 2005, pages 439-441
【非特許文献２】Hirata et al, Transplantation, vol. 71, 2001, pages 352-359
【非特許文献３】Wojtovich et al, Basic Research in Cardiology, vol. 104, 2009, pages 121-129
【非特許文献４】Drose et al, Molecular Pharmacology, vol. 79, 2011, pages 814-822
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、広範なメタボロミック調査を実施し、虚血時に蓄積される代謝物を同定した。注意深く制御された研究の一部として、このメタボロミック分析を広範囲の組織型で並行して行った。多くの代謝物は、異なる組織の虚血状態で変わることが観察された。しかし、この発見にも関わらず、本発明者らは、それらの分析に固執し、組織研究のフルスペクトルにわたって同様に影響されるそれらの代謝物のみ選択した。このようにして、本発明者らは、虚血の効果に共通である可能性がより高い代謝物を巧妙に選択することができた。
【００１２】
さらに、本発明者らは、分析物における再灌流の効果の分析を続けた。これにより、本発明者らは、虚血時の蓄積において、組織型の範囲にわたって同様に作用する、わずか３つの代謝物（ヒポキサンチン、キサンチン、及びコハク酸）を選択した。最も驚くことに、本発明者らは、これら３つのうち、コハク酸のみが再灌流後の活性酸素種の生成にまことしやかに役割を果たし得るであろうことを観察した。虚血時に蓄積する、並びに急速に代謝される及び再灌流後の活性酸素種の産生に含まれるコハク酸を選び抜くこれらのドラマチックな洞察に、本発明は基づく。
【００１３】
コハク酸が、再灌流時にそんなに早く消滅するということは、本発明者らにとって驚きであった。コハク酸が、正常酸素圧状態下で代謝機能の回復後の活性酸素種の供給源であるという発見も驚きであった。複数の臓器が同じ代謝シグネチャーを共有することは、さらに驚きであり、コハク酸代謝が、虚血状態への哺乳動物細胞の応答において広く適用可能な事象であることを実証した。
【００１４】
したがって、一態様において、本発明は、コハク酸脱水素酵素の細胞透過性及び可逆性阻害剤である、コハク酸の蓄積を阻害することによる再灌流傷害の治療又は予防における使用のためのコハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、対象において再灌流傷害を治療する又は予防する方法であって、コハク酸脱水素酵素の細胞透過性及び可逆性阻害剤である、有効量のコハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、コハク酸脱水素酵素の細胞透過性及び可逆性阻害剤である、再灌流傷害の治療又は予防における使用のためのコハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、コハク酸脱水素酵素の細胞透過性及び可逆性阻害剤である、コハク酸の蓄積を阻害することによる再灌流傷害の治療又は予防における使用のためのコハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１８】
定義
Ｃ１−１２アルキルは、一般に１〜１２個の炭素原子を有する直鎖状及び分岐状の飽和炭化水素基を指す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンタ−１−イル、ペンタ−２−イル、ペンタ−３−イル、３−メチルブタ−１−イル、３−メチルブタ−２−イル、２−メチルブタ−２−イル、２，２，２−トリメチルエタ−１−イル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン、ｎ−ドデカンなどが挙げられる。
【００１９】
「薬剤」、「原薬」、「有効活性成分」などは、治療を必要とする対象を治療するために使用され得る化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物及び以下に具体的に命名した化合物）を指す。
【００２０】
「賦形剤」は、薬剤の生物学的利用能に影響を及ぼし得るが、薬理学的に不活性であり得る任意の物質を指す。
【００２１】
「薬学的に許容される」物質は、過度の毒性、刺激性、アレルギー応答などなく、対象の組織と接触する使用に適し、妥当なリスク対効果比に見合い、それらの意図された使用に有効な、堅実な医学的判断の範囲内である物質を指す。
【００２２】
「医薬組成物」は、１又は２以上の原薬及び１又は２以上の賦形剤の組合せを指す。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト又は非ヒト動物を指す。非ヒト動物の例としては、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ及びシカなどの家畜動物、並びにネコ、イヌ、ネズミ、及びウマなどのコンパニオンアニマルが挙げられる。
【００２４】
薬剤の「治療上有効な量」は、対象の治療に有効であり、所望の治療上の、寛解性の、阻害性の、又は予防する効果を生み出す、薬剤又は組成物の量を指す。治療上有効な量は、特に対象の体重及び年齢、並びに投与の経路に依存し得る。
【００２５】
「治療すること（treating）」は、そのような用語が適用される障害、疾患、又は状態を回復すること、緩和すること、そのような用語が適用される障害、疾患、又は状態の進行を阻害すること、又はそのような用語が適用される障害、疾患、又は状態を予防すること、あるいはそのような障害、疾患又は状態の１又は２以上の症状を回復すること、緩和すること、そのような障害、疾患又は状態の１又は２以上の症状の進行を阻害すること、又はそのような障害、疾患又は状態の１又は２以上の症状を予防することを指す。
【００２６】
「治療（treatment）」は、直前に定義したように「治療すること（treating）」の作用を指す。
【００２７】
「予防する」は、所与の疾患又は障害を得るリスクの低減、すなわち臨床症状を発生しないようにすることを指す。それゆえ、「予防する」は、それを必要とする対象の予防的治療を指す。予防的治療は、障害の症状がない若しくは最小限であるが、障害にかかりやすい傾向又は障害を発生するリスクがある対象に、適切な投与量の治療剤を投与し、それにより障害の発症を実質的に防ぐことにより達成され得る。
【００２８】
用語「プロドラッグ」は、対象への投与後、インビボ、好ましくは血中での加水分解などの構造変化に供され、ＳＤＨｉ又はその塩を産生する化合物を意味する。例えば、カルボン酸、アミノ基、ヒドロキシル基などを有する薬学的化合物からプロドラッグを産生する様々な手段が公知であり、当業者は適切な手段を選択できる。ＳＤＨｉ又はその塩のプロドラッグの型は特に限定されない。例えば、ＳＤＨｉが１又は２以上のカルボン酸を有する場合、例は１又は２以上のカルボン酸がエステルに変換されるプロドラッグを含む。好ましい例は、メチルエステル又はジメチルエステルなどのエステル化合物を含む。
【００２９】
「コハク酸脱水素酵素阻害剤」又は「ＳＤＨｉ」は、コハク酸脱水素酵素の作用を阻害する化合物を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「含む（comprising）」は「少なくとも〜の一部からなる」を意味する。用語「含む（comprising）」を含む本明細書の各記載を説明する場合、それ以外の特徴又は該用語で始まるものも存在し得る。「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの関連用語は同様に説明される。
【００３１】
コハク酸脱水素酵素阻害剤（ＳＤＨｉ’ｓ）又はそのプロドラッグ
ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、コハク酸の蓄積を阻害することによる再灌流傷害の治療又は予防において有用である。したがって、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩の投与は、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩を投与しない再灌流において観察されるコハク酸の量と比較して、組織における再灌流において観察されるコハク酸の量を減らすことにより、虚血心筋層などの対象の組織における再灌流傷害を治療又は予防する。
【００３２】
ＳＤＨｉはＳＤＨの可逆性阻害剤である。ＳＤＨｉの可逆性は、競合的結合により阻害剤を経時的にミトコンドリア複合体から離すことができ、その効果が一過性であるため重要である。結果として、複合体はその正常な機能の実施に戻り得る。
【００３３】
コハク酸部位を介して作用するＳＤＨｉに関して、ＳＤＨｉの可逆性は、（１）ＳＤＨｉで治療した心臓、（２）治療していない心臓、及び（３）ＳＤＨｉ＋ジメチルコハク酸で治療した心臓の梗塞サイズを測定及び比較することにより決定され得る。ＳＤＨｉで治療した心臓における梗塞サイズが、治療していない心臓の梗塞サイズと比較して減少する場合、心臓保護が示される。ＳＤＨｉの可逆性は、ＳＤＨｉで治療した心臓によって示される心臓保護が、ジメチルコハク酸を戻すことにより抑制される場合、実証される。この手順は、トリフェニルテトラゾリウムクロリド染色を用い、心臓の梗塞サイズを決定する実施例において述べる（図４ｂ＆ｃも参照）。
【００３４】
ＳＤＨｉの有効性は、虚血時のコハク酸蓄積を予防するＳＤＨｉの能力を決定することにより評価され得る。虚血時のコハク酸蓄積を予防するＳＤＨｉの能力は、実施例のメタボロミック分析において詳述されるように、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により組織におけるコハク酸レベルを測定することによって決定され得る。ＳＤＨｉの可逆性は、ＳＤＨｉでの治療後のコハク酸レベルを、ＳＤＨｉ＋ジメチルコハク酸での治療後のコハク酸レベルと比較することによって示され得る。
【００３５】
ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、膜透過性である。この膜透過性により、化合物は細胞に入り、蓄積することができる。
【００３６】
膜透過性は、酸素消費率（ＯＣＲ，oxygen consumption rate）の測定、ジメチルコハク酸によるこの駆動、次いでＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩（例えば、ジメチルマロン酸）の添加によるこの阻害によって、細胞実験において分析することができ、有効性及び取り込みの時間尺度及びＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩の加水分解を評価できる。さらに、図５ａに示したように、化合物の細胞透過性は、処置していない細胞における化合物のレベルを処置した細胞の化合物のレベルと比較することにより決定され得る。典型的には、化合物のレベルは、実施例のメタボロミック分析において詳述されるようにＬＣ／ＭＳを用いて決定され得る。
【００３７】
より好適には、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、ＳＤＨｉのプロドラッグ又は薬学的に許容されるその塩である。
【００３８】
最も好適には、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、プロドラッグである。
【００３９】
好適には、ＳＤＨｉはＳＤＨに結合する。
【００４０】
好適には、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、一般式（Ｉ）：
【００４１】
【化１】
2017519020.tif 000003
【００４２】
（式中、
ｎは、０又は１であり；
Ｒ１は、Ｃ１−１２アルキルから選択され；
Ｒ２は、Ｈ及びＯＨから選択され；
Ｒ３は、ＣＯ２Ｒ４及びＣ（Ｏ）−ＣＯ２Ｒ４から選択され；
Ｒ４は、Ｃ１−１２アルキルから選択される）
を有する。
【００４３】
好適には、コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、Ｒ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｒ４、Ｒ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＣＯ２Ｒ４、及びＲ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ２Ｒ４から選択される。
【００４４】
より好適には、コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、Ｒ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｒ４（式中、Ｒ１及びＲ４は独立に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、及びｔ−ブチルから選択される）から選択される。
【００４５】
最も好適には、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、マロン酸化合物である。
【００４６】
好適には、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、細胞透過性マロン酸を含んでよい。
【００４７】
好適には、本発明のマロン酸ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、エチルエステルマロン酸である。
【００４８】
最も好適には、コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、ジメチルマロン酸である。
【００４９】
ジメチルマロン酸は、きわめて毒性が低いため有利である。例えば、ジメチルマロン酸のＬＤ５０は、経口投与する場合、キログラムあたりおよそ５グラムである。
【００５０】
好適には、ＳＤＨｉのＳＤＨへの結合は、コハク酸結合部位においてである。好適には、これはコハク酸との競合的結合である。
【００５１】
好適には、コハク酸結合部位においてＳＤＨと結合するＳＤＨｉ、又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、Ｒ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｒ４、Ｒ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＣＯ２Ｒ４、及びＲ１Ｏ２Ｃ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＯ２Ｒ４から選択される。
【００５２】
好適には、ＳＤＨｉはユビキノン結合部位においてＳＤＨに結合する。好適には、この結合はキノンとの競合的結合である。
【００５３】
最も好適には、ＳＤＨは本発明において有用であり、正常酸素圧状態下でコハク酸の再酸化を阻害する。
【００５４】
好適には、本発明のＳＤＨｉは「複合体II」阻害剤である。
【００５５】
本発明のＳＤＨｉは、可逆性阻害剤である。
【００５６】
好適には、本発明のＳＤＨｉは可逆性ＳＤＨｉである。
【００５７】
Ｒ１
好適には、Ｒ１は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルから選択される。
【００５８】
より好適には、Ｒ１は、メチル及びエチルから選択される。
【００５９】
Ｒ２
好適には、Ｒ２はＨである。
【００６０】
Ｒ３
好適には、Ｒ３はＣＯ２Ｒ４である。
【００６１】
Ｒ４
好適には、Ｒ４は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、及びヘキシルから選択される。
【００６２】
より好適には、Ｒ４は、メチル及びエチルから選択される。
【００６３】
投与及びタイミング
好適には、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、経口的に、局所的に、皮下に、非経口的に、筋肉内に、動脈内に、及び／又は静脈内に投与される。
【００６４】
より好適には、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、静脈内に投与される。
【００６５】
ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、冠動脈への直接注射により投与され得る。
【００６６】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、虚血の前に投与される。そのような状況において、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、虚血のリスクのある対象に投与される。
【００６７】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、虚血後に投与される。
【００６８】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、再灌流の前に投与される。
【００６９】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、再灌流の開始後できるだけ早く投与される。
【００７０】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、再灌流開始の５分以内に投与される。好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、再灌流開始の４分以内、再灌流開始の３分以内、再灌流開始の２分以内、又は再灌流開始の１分以内に投与される。
【００７１】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、外科手術前に投与される。
【００７２】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、外科手術中に投与される。
【００７３】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、虚血前に保存することが意図される臓器に投与される。
【００７４】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、虚血後できるだけ早く、保存する臓器に投与される。
【００７５】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、再灌流後できるだけ早く、保存する臓器に投与される。
【００７６】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、再灌流の５分以内に、保存する臓器に投与される。好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、再灌流開始の４分以内、再灌流開始の３分以内、再灌流開始の２分以内、又は再灌流開始の１分以内に投与される。
【００７７】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、臓器移植における適用を見出す。
【００７８】
保護的な治療が提供されることは、本発明の利点である。現在、認可された保護的な化合物は市場にない。
【００７９】
好適には、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、哺乳動物においてすぐに代謝される。
【００８０】
哺乳動物細胞内で代謝されることは、マロン酸ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩の利点である。細胞透過性マロン酸誘導体は、マロン酸を一度細胞内へ放出するために好適に代謝される。マロン酸自体は、細胞内の自然の代謝経路により有利に代謝される。より特異的には、マロン酸は、哺乳動物細胞に自然に存在する脂肪分解経路の一部に代謝される。このことは、ＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩がマロン酸化合物である場合、本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩の代謝物の副作用又は副産物がないという利点を提供する。
【００８１】
好適には、コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、１〜３０分間、０．１〜５０ｍｇ／対象のｋｇ／分の用量で投与され得る。より好適には、コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、１〜３０分間、０．５〜２０ｍｇ／対象のｋｇ／分の用量で投与され得る。より好適には、コハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、１〜３０分間、１〜１０ｍｇ／対象のｋｇ／分の用量で投与され得る。
【００８２】
発明の詳細な説明
分析した候補代謝物から、本発明者らは、異なる組織で異なって変わるものを除外した。例えば、虚血状態後、いくつかの代謝物はある組織で上昇したが、別の組織では減少した。いくつかの代謝物は、異なるレベルで影響を受けた。他の代謝物は、影響を受けるようには全く見えなかった。さらなる代謝物は、研究した全ての組織型において、影響を受けるようには見えなかった。本発明者らは、系統的にデータを調べ、これらの多様な基準を持つそれぞれの代謝物を除き、研究したある範囲の異なる組織の虚血にわたって共通の性質を示す代謝物のみを選択した。
【００８３】
本発明が基づく重要な発見は、再灌流後、コハク酸を正常レベルに急速に戻すことである。これは、例えば、コハク酸レベルが、再灌流のわずか５分以内に正常に急速に減少することがみられる図１Ｅに例示する。この応答の速さは注目すべきである。これは、コハク酸が、虚血状態時に生み出された電子のリザーバーを形成しているという、本発明者らによって蓄積された証拠に寄与する。さらに、タイミングは、再灌流により組織に与えた損傷のタイムコースと正確にオーバーラップするため驚きである。それは、その間にほとんどの損傷が引き起こされ、再灌流後のコハク酸代謝のタイムコースにも正確に従う、本発明者らによって観察された、この同じ５分ウィンドウである。
【００８４】
適用
好適には、本発明は、コハク酸の蓄積を阻害することによる再灌流傷害の治療又は予防における使用のためのコハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩に関する。
【００８５】
好適には、本発明は、コハク酸の輸送を阻害することによる再灌流傷害の治療又は予防における使用のためのコハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩に関する。
【００８６】
好適には、本発明は、コハク酸の酸化を阻害することによる再灌流傷害の治療又は予防における使用のためのコハク酸脱水素酵素阻害剤又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩に関する。
【００８７】
本発明は、外科手術における適用を見出す。
【００８８】
本発明は、臓器保存における適用を見出す。
【００８９】
本発明は、ＲＯＳ産生の低減又は阻害における適用を見出す。
【００９０】
本発明は、コハク酸蓄積の阻害又は予防における適用を見出す。
【００９１】
本発明は、再灌流後のＲＯＳの放出の緩徐化における適用を見出す。
【００９２】
本発明は、待機的外科手術の全ての形態における適用を見出す。本発明のこれらの適用において、治療は予防的、すなわち、再灌流後のＲＯＳの産生に対して予防的であってよい。
【００９３】
再灌流傷害
好適には、再灌流傷害は虚血再灌流傷害である。
【００９４】
好適には、再灌流傷害は、腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化、動脈疾患、火傷、がん、心停止、脳血管疾患、脳卒中に続発する脳浮腫、脳損傷、慢性閉塞性肺疾患、うっ血性心臓病、経皮経管冠動脈形成後の狭窄、冠疾患、糖尿病、高血圧、出産中／後の低酸素症、挫滅又は外科手術から生じる機械的外傷、偏頭痛、心筋梗塞、（非致死性の）溺水、末梢血管疾患、肺血管疾患、再生医療、心臓外科手術後の再灌流、脳卒中後の再灌流、網膜の血管疾患、脳卒中、及び外科的な組織の再灌流傷害から選択される障害の結果である。
【００９５】
好適には、外科的な組織の再灌流傷害は、肝臓、腎臓、又は腸の外科手術の結果であり得る。
【００９６】
外科的な組織の再灌流傷害は、臓器が、肝臓外科手術（肝臓への血液の供給が一時的に止められ、切開／部分切除を可能にする場合）及び腎臓外科手術（例えば、腫瘍の部分切除）を含む虚血の期間にさらされる、待機的外科手術の結果であり得る。
【００９７】
脳損傷の一般的な原因は、外科手術中の全身性低血圧であり、脳の一時的な低灌流をもたらす。
【００９８】
より好適には、再灌流傷害は、腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化、動脈疾患、心停止、脳血管疾患、脳卒中に続発する脳浮腫、うっ血性心臓病、経皮経管冠動脈形成後の狭窄、冠疾患、挫滅又は外科手術から生じる機械的外傷、心筋梗塞、末梢血管疾患、肺血管疾患、心臓外科手術後の再灌流、脳卒中後の再灌流、網膜の血管疾患、脳卒中、及び外科的な組織の再灌流傷害から選択される障害の結果である。
【００９９】
好適には、外科手術は、血管外科手術、心臓バイパス外科手術、又は移植外科手術である。
【０１００】
より好適には、再灌流傷害は、脳卒中後の再灌流、脳卒中、及び心筋梗塞から選択される障害の結果である。
【０１０１】
好適には、再灌流傷害は、保存する臓器における再灌流傷害である。好適には、保存される臓器は、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、膵臓、及び皮膚から選択され得る。
【０１０２】
臓器は、移植のため、又は再生医療における使用のための細胞及び組織の供給源（例えば、幹細胞の単離）として保存され得る。
【０１０３】
より好適には、再灌流傷害は、再生医療における再灌流傷害である。再生医療の未来は、適当な酸素欠乏状態下での（冷凍）保存幹細胞並びに幹細胞由来細胞及び組織の原理に基づき、続く酸素化したレシピエントへの養子移植及び／又は移植を伴う。
【０１０４】
組合せ
本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、血流の閉塞を取り除くために使用した、或いはそれを意図した治療と組み合わせて投与され得る。
【０１０５】
本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、１又は２以上のステント、MitoSNO、血液希釈剤、溶解剤、血液保存液、臓器保存液、又は血流の閉塞を取り除くために使用した、或いはそれを意図した任意の他の治療と組み合わせて投与され得る。
【０１０６】
好適には、血液又は臓器保存液は、晶質液及び非晶質液を含んでよく、これらに限定されないが、生理食塩水、ヒトアルブミン液、ハルトマン液、及びゲロフシンを含む。
【０１０７】
MitoSNOはＷＯ２００８０３９０８５に記載のように調製され得る。
【０１０８】
好適には、血液希釈剤は、Coumadin（商標）（ワルファリン）、Pradaxa（商標）（ダビガトラン）、Xarelto（商標）（リバーロキサバン）、及びEliquis（商標）（アピキサバン）、フォンダパリヌクス、未分画ヘパリン、これらに限定されないが、エノキサパリン及びデルタパリン（deltaparin）を含む低分子ヘパリン、これらに限定されないが、ストレプトキナーゼ（SK，Streptokinase）、ウロキナーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、スタフィロキナーゼ、及びテネクテプラーゼを含む血栓溶解剤から選択されてよい。
【０１０９】
本発明のＳＤＨｉ又はプロドラッグ及び／又は薬学的に許容されるその塩は、ＳＤＨｉ及び薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を含む医薬組成物として投与され得る。
【０１１０】
好適な賦形剤、担体、及び希釈剤は標準的な薬学文書において見つけられる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Handbook for Pharmaceutical Additives, 3rd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2007 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA)及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition (ed. D. B. Troy) 2006 (Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, USA)を参照。
【０１１１】
本発明の組成物における使用のための賦形剤は、これらに限定されないが、微結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム及びグリシンを含み、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ、又はタピオカデンプン）、アルギン酸、及び特定の複雑ケイ酸塩などの様々な崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン、及びアカシアのような造粒結合剤と一緒に用いてよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルクなどの潤滑剤は、打錠工程に非常に有用であることが多い。同様の型の固体組成物は、ゼラチンカプセルの充填剤としても用いられ得る。この結合の好ましい材料は、ラクトース又は乳糖並びに高分子ポリエチレングリコールも含む。水性懸濁液及び／又はエリキシル剤は、経口投与が望ましい場合、有効成分は様々な甘味料又は香味料、着色剤又は色素と、並びに、所望される場合、乳化剤及び／又は懸濁剤も、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン及びそれらのあり得る様々な組合せなどの希釈剤と共に、組み合わせられ得る。
【０１１２】
医薬担体は、固体希釈剤又は充填剤、滅菌水性培地及び様々な非毒性有機溶媒などを含む。
【０１１３】
薬学的に許容される担体は、ゴム、デンプン、糖、セルロース系材料、及びその混合物を含む。化合物は、例えば、ペレット剤の皮下埋め込みによって対象に投与され得る。製剤は、液体製剤の静脈内、動脈内、又は筋肉内注射によって、液体又は固体製剤の経口投与によって、又は局所適用によっても投与され得る。投与は、肛門坐剤又は尿道坐剤の使用によっても達成され得る。
【０１１４】
さらに、本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は当業者に周知であり、これらに限定されないが、０．０１〜０．１Ｍ及び好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液、又は０．９％の生理食塩水を含む。さらに、そのような薬学的に許容される担体は、水溶液又は非水溶液、懸濁液、及び乳状液であってよい。非水溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用の有機エステルである。水性担体は、生理食塩水及び緩衝化培地を含む、水、アルコール／水溶液、乳状液又は懸濁液を含む。
【０１１５】
薬学的に許容される非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液及び不揮発性油を含む。静脈内媒体は、ブドウ糖リンゲル液に基づくものなどの、流体及び栄養補充液、電解質補充液などを含む。例えば抗菌剤、抗酸化剤、照合剤（collating agents）、不活性ガスなど、防腐剤及び他の添加剤も存在し得る。
【０１１６】
本発明に従って投与可能な制御放出組成物又は徐放性組成物の薬学的に許容される担体は、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、オイル）中製剤を含む。ポリマー（例えば、ポロキサマー又はポロキサミン）で被覆された微粒子組成物及び組織特異的受容体、リガンド若しくは抗原に対する抗体に結合した化合物、又は組織特異的受容体のリガンドに結合した化合物もまた、本発明に包含される。
【０１１７】
薬学的に許容される担体は、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、又はポリプロリンなどの水溶性ポリマーの共有結合によって修飾された化合物を含み、相当する未修飾の化合物よりも、静脈内注射後、血液中で実質的に長い半減期を示すことが公知である（Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, N.Y., (1981), pp 367-383; 及び［６５］）。そのような修飾により、水溶液中での化合物の可溶性を増加し、凝集を除去し、化合物の物理的及び化学的安定性を増強し、化合物の免疫原性及び反応性を大幅に減少することもできる。結果として、所望のインビボでの生物活性は、未修飾の化合物を用いるよりも低い頻度又は低用量で、そのようなポリマー化合物付加物（abducts）の投与により達成することができる。
【０１１８】
さらに、特定の及び好ましい態様は、添付の独立請求項及び従属請求項において述べられる。従属請求項の特徴は、必要に応じて独立請求項の特徴と組み合わせることができ、請求項にはっきりと述べたもの以外の組合せである。
【０１１９】
異性体、塩、及び溶媒和物
特定の化合物は、１又は２以上の特定の幾何学異性体、光学異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、エピマー、アトロプ、立体異性体、互変異性体、配座異性体、又はアノマーの形態で存在することができ、シス−及びトランス−形；Ｅ−及びＺ−形；ｃ−、ｔ−、及びｒ−形；エンド及びエキソ形；Ｒ−、Ｓ−、及びメソ−形；Ｄ−及びＬ−形；ｄ−及びｌ−形；（＋）及び（−）形；ケト−、エノール−、及びエノラート−形；シン−及びアンチ−形；シンクリナル−及びアンチクリナル−形；アルファ−及びベータ−形；アキシアル及びエクアトリアル形；舟形、いす形、ねじれ形、エンベロープ形、及び半いす形；並びにこれらの組合せを含むが、これらに限定されず、以降、まとめて「異性体」（又は「異性体形態」）と呼ぶ。
【０１２０】
互変異性体形態について下記で述べることを除いて、本明細書で使用する場合、用語「異性体」から特に除外されるものは、構造的（又は構成的）異性体（すなわち、単に空間における原子の位置が異なっているのではなく、原子間の結合が異なる異性体）であることに留意されたい。例えば、メトキシ基、−ＯＣＨ３への言及は、その構造異性体であるヒドロキシメチル基、−ＣＨ２ＯＨへの言及と解釈されない。
【０１２１】
構造のクラスへの言及は、そのクラスに分類される構造異性体形態を含むことができる（例えば、Ｃ１−６７アルキルはｎ−プロピル及びイソ−プロピルを含み；ブチルはｎ−、ｉｓｏ−、ｓｅｃ−、及びｔｅｒｔ−ブチルを含み；メトキシフェニルはオルト−、メタ−、及びパラ−メトキシフェニルを含む）。
【０１２２】
上記の除外は、例えば、下記の互変異性体のペア：ケト／エノール、イミン／エナミン、アミド／イミノアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エンチオール、Ｎ−ニトロソ／ヒドロキシアゾ（hyroxyazo）、及びニトロ／ａｃｉ−ニトロのように、例えば、ケト−、エノール−、及びエノラート形態などの互変異性体形態には適用しない。
【０１２３】
用語「異性体」には、１又は２以上の同位体置換を有する化合物が特に含まれることに留意されたい。例えば、Ｈは１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、及び３Ｈ（Ｔ）を含む、いかなる同位体の形態であってもよい；Ｃは１２Ｃ、１３Ｃ、及び１４Ｃを含む、いかなる同位体の形態であってもよい；Ｏは１６Ｏ及び１８Ｏを含む、いかなる同位体の形態であってもよい。
【０１２４】
特別の定めのない限り、特定の化合物への言及は、その（全体的に又は部分的に）ラセミ体及びその他の混合物を含む、そのような全ての異性体形態を含む。
【０１２５】
そのような異性体形態の調製（例えば、不斉合成）及び分離（例えば、分別結晶及びクロマトグラフ手段）の方法は、当技術分野において公知であり、又は本明細書において教示される方法、若しくは公知の方法を、公知の様式で適合させることによって容易に得られる。
【０１２６】
特別の定めのない限り、特定の化合物への言及は、例えば下記で述べるように、そのイオン形態、互変異性体形態、塩形態、溶媒和物形態、保護形態、及びそれらの組合せも含む。
【０１２７】
それらの組合せの例としては、ＳＤＨｉへ言及する場合、互変異性体の塩を含む。例えば、化合物リンゴ酸ジエチルへの言及は、下記に示すようにエノラート形態のナトリウム塩を含む。
【０１２８】
【化２】
2017519020.tif 000004
【０１２９】
上記で特別に名付けた化合物を含むＳＤＨｉは、薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、及び水和物を形成することができる。これらの塩は、非毒性酸付加塩（二酸を含む）及び塩基性塩を含む。
【０１３０】
化合物が陽イオンである場合、又は陽イオンとなり得る官能基を有している場合（例えば、−ＮＨ２は−ＮＨ３＋となり得る）、好適な陰イオンと酸付加塩を形成することができる。好適な無機陰イオンの例としては、これらに限定されないが、以下の無機酸：塩酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、硫酸、亜硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、リン酸、及び亜リン酸に由来するものが挙げられる。好適な有機陰イオンの例としては、これらに限定されないが、以下の有機酸：２−アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルフォン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸（glucheptonic）、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び吉草酸に由来するものが挙げられる。好適なポリマー性有機陰イオンの例としては、これらに限定されないが、以下のポリマー酸：タンニン酸、カルボキシメチルセルロースに由来するものが挙げられる。そのような塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、シクラミン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチルスルホン酸塩、ナフチル酸塩、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ピログルタミン酸塩、糖酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩、及びキシナホ酸塩に由来するものが挙げられる。
【０１３１】
例えば、化合物が陰イオンである場合、又は陰イオンになり得る官能基を有している場合（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ−になり得る）、好適な陽イオンと塩基性塩を形成することができる。好適な無機陽イオンの例としては、これらに限定されないが、アルカリ又はアルカリ土類金属陽イオン、アンモニウム及び置換されたアンモニウム陽イオン、並びにアミンなどの金属陽イオンが挙げられる。好適な金属陽イオンの例としては、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、亜鉛（Ｚｎ２＋）及びアルミニウム（Ａｌ３＋）が挙げられる。好適な有機陽イオンの例としては、これらに限定されないが、アンモニウムイオン（すなわちＮＨ４＋）及び置換されたアンモニウムイオン（例えばＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が挙げられる。いくつかの好適な置換されたアンモニウムイオンの例は、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミン、並びに、リシン及びアルギニンなどのアミノ酸に由来するものである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。好適なアミンの例としては、アルギニン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、塩化プロカイン、コリン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、グリシン、リシン、Ｎ−メチルグルカミン、オラミン、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール、及びプロカインが挙げられる。有用な酸付加塩及び塩基性塩の議論は、S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci. (1977) 66: 1-19を参照されたい。また、Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (2011)も参照されたい。
【０１３２】
薬学的に許容される塩は、様々な方法を用いて調製され得る。例えば、ＳＤＨｉを適切な酸又は塩基と反応させ、所望の塩を得ることができる。ＳＤＨｉの化合物の前駆体を酸又は塩基と反応させ、酸又は塩基不安定保護基を取り除く、若しくは前駆体のラクトン又はラクタム基を開くこともできる。さらに、ＳＤＨｉの化合物の塩を、適切な酸又は塩基による治療を介して、若しくはイオン交換樹脂との接触を介して別の塩に変換することができる。反応後、溶液から沈殿する場合は濾過により、又は塩を回収する蒸発により、塩を単離することができる。塩のイオン化の程度は、完全なイオン化からほとんど非イオン化まで多様であり得る。
【０１３３】
活性化合物の対応する溶媒和物を調製し、精製し、及び／又は取り扱うことが都合の良い又は望ましい場合がある。用語「溶媒和物」は、化合物及び１又は２以上の薬学的に許容される溶媒分子（例えば、ＥｔＯＨ）を含む分子複合体を記載する。用語「水和物」は、溶媒が水である溶媒和物である。薬学的に許容される溶媒和物は、溶媒が同位体的に置換され得るものを含む（例えば、Ｄ２Ｏ、アセトン−ｄ６、ＤＭＳＯ−ｄ６）。
【０１３４】
現在、有機化合物の溶媒和物及び水和物に関して許容されている分類システムは、単離部位、チャネル、及び金属イオン配位溶媒和物及び水和物の間を区別するものである。例えば、K. R. Morris (H. G. Brittain ed.) Polymorphism in Pharmaceutical Solids (1995)を参照されたい。単離部位溶媒和物及び水和物は、有機化合物の妨害分子によって溶媒（例えば、水）分子が互いの直接接触から単離されているものである。チャネル溶媒和物では、溶媒分子は格子チャネルに存在し、ここで他の溶媒分子と隣接している。金属イオン配位溶媒和物では、溶媒分子は金属イオンに結合している。
【０１３５】
溶媒又は水が強く結合している場合、複合体は湿度と無関係に明確な化学量論を有するであろう。しかし、チャネル溶媒和物及び吸湿性化合物のように、溶媒又は水が弱く結合している場合、水又は溶媒含量は、湿度及び乾燥条件に依存するであろう。そのような場合、非化学量論が典型的に観察されるであろう。
【０１３６】
さらに、特定の及び好ましい態様は、添付の独立請求項及び従属請求項において述べられる。従属請求項の特徴は、必要に応じて独立請求項の特徴と組み合わせることができ、請求項にはっきりと述べたもの以外の組合せである。
【０１３７】
広範なＳＤＨｉの化合物は、市販されている。そのような市販の化合物の誘導体は、当技術分野において公知のように、官能基の相互変換の実行、又は置換及び一般的な反応の実行により調製され得る。一般的な技術及び反応は、酸化、還元などを含み、分離技術（抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、研和、結晶化など）並びに分析手順が、有機化学の当業者に公知である。そのような反応及び技術の詳細は、Richard Larock, Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 2nd Ed (2010), and the multi-volume series edited by Michael B. Smith and others, Compendium of Organic Synthetic Methods (1974 et seq.)を含む、いくつかの論文において見つけることができる。出発材料及び試薬は、市販の原料から得ることができ、文献の方法を用いて調製することができる。さらに、いくつかの例では、反応中間体は、単離又は精製しない続くステップにおいて使用され得る（例えば、インサイチュ）。
【０１３８】
ある化合物は、他の反応部位での望ましくない化学反応を防ぐ保護基を使用して調製され得る。保護基はまた、化合物の可溶性の増強又は他の物理的性質の改変にも使用され得る。保護基戦略の議論に関して、保護基の導入及び除去のための材料及び方法の記載、並びにアミン、カルボン酸、アルコール、ケトン、アルデヒドなどを含む一般的な官能基の有用な保護基の編集は、T. W. Greene and P. G. Wuts, Protecting Groups in Organic Chemistry, 4th Edition, (2006) and P. Kocienski, Protective Groups, 3rd Edition (2005)を参照されたい。
【０１３９】
一般に、ある反応は過剰な１又は２以上の反応物質を用いることから利益を得ることができるが、化学的変換は反応物質の実質的に化学量論的な量を用いて実行できる。さらに、多くの好適な反応が約室温（ＲＴ，room temperature）及び大気圧で実行され得るが、反応速度論、収率などに依存し、いくつかの反応は、高圧下、又は高温（例えば、還流状態）若しくは低温（例えば、−７８℃〜０℃）を用いて行われ得る。化学量論的な範囲、温度範囲、ｐＨ範囲などに対する本開示におけるいかなる参照も、単語「範囲」を明確に用いるかどうかに関わらず、示した終点も含む。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
本発明の実施形態を添付の図面を参照してここでさらに記載する。
【図１】比較メタボロミクスは、再灌流ＲＯＳ産生を駆動する潜在的なミトコンドリアの代謝物としてコハク酸を同定する。
【図１ａ】虚血状態下、インビボで蓄積する代謝物の同定のための比較メタボロミクス戦略の概要を示す図である。
【図１ｂ】インビボでの全ての虚血組織にわたって著しく蓄積した代謝物のＨＩＶＥプロット比較分析を示す図である。全ての組織にわたって共通に蓄積した代謝物をハイライトした。
【図１ｃ】虚血時のマウス組織における代謝物の蓄積の出現率を示す図である。
【図１ｄ】５つの虚血組織状態にわたる虚血後の、ミトコンドリアのクエン酸回路（ＣＡＣ，citric acid cycle）代謝物レベルのプロファイルを示す図である。ｎ＝群につき、組織あたり３〜４匹のマウス。
【図１ｅ】心筋虚血及びエクスビボでの心臓における５分間の再灌流時のＣＡＣ代謝物レベルのタイムコースを示す図である。ｎ＝群につき、４つのマウス心臓。
【図１ｆ】リスクがあるインビボでの心筋ＩＲ時、並びに虚血後及び５分間再灌流後の末梢心臓組織のＣＡＣ代謝物レベルを示す図である。ｎ＝群につき、３〜５匹のマウス。
【図１ｇ】虚血後及び５分間再灌流後すぐのインビボでの脳ＩＲ時のＣＡＣ代謝レベルを示す図である。ｎ＝群につき、３匹のラット。
【図１ｈ】虚血後及び５分間再灌流後すぐのインビボでの腎臓ＩＲ時のＣＡＣ代謝レベルを示す図である。ｎ＝群につき、３匹のマウス。
【図１ｉ】ＩＲ時の成体の初代心筋細胞におけるジヒドロエチジウム（ＤＨＥ，dihydroethidium）酸化によって評価したＲＯＳ産生におけるコハク酸の効果を示す図である。ｎ＝群につき、３回の独立した心筋細胞調製。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、少なくとも３回の反復の平均±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図２】逆ＳＤＨ活性は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル及びプリンヌクレオチドサイクルによって産生されるフマル酸の還元によって虚血性コハク酸蓄積を駆動する。
【図２ａ】コハク酸による虚血性フラックスへの潜在的なインプットを示す図である。
【図２ｂ】１３Ｃ−グルコースの代謝標識戦略を示す図である。
【図２ｃ】正常酸素圧及び虚血心筋層におけるコハク酸の１３Ｃ同位体標識プロファイルを示す図である。ｎ＝群につき、４つの心臓。
【図２ｄ】γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ，γ-aminobutyric acid）におけるビガバトリンでのＧＡＢＡシャントの阻害効果及び虚血心筋層におけるコハク酸レベルを示す図である。ｎ＝群につき、３つの心臓。
【図２ｅ】逆ＳＤＨ操作によって駆動される虚血性コハク酸蓄積の潜在的な駆動体の、インシリコでの代謝性モデリングの要約；虚血性コハク酸蓄積におけるリンゴ酸及びアデニロコハク酸連結経路の寄与を決定する１３Ｃ−アスパラギン酸の代謝標識戦略を示す図である。
【図２ｆ】コハク酸蓄積におけるジメチルマロン酸によるＳＤＨ阻害の効果及びインビボでの虚血心筋層におけるＣＡＣ代謝物存在量を示す図である。ｎ＝群につき、３匹のマウス。
【図２ｇ】正常酸素圧及び虚血心筋層における、示したＣＡＣ代謝物への１３Ｃ−アスパラギン酸の相対的な虚血性フラックスを示す図である。ｎ＝群につき、４つの心臓。
【図２ｈ】アスパラギン酸アミノ基転移酵素のアミノオキシ酢酸（ＡＯＡ，aminooxyacetate）媒介性阻害、又はＡＩＣＡＲでのアデニロコハク酸リアーゼの阻害によるＰＮＣのブロッキングを介して、ＮＡＤＨ依存性アスパラギン酸のＣＡＣへの参加をブロッキングしたインビボでの虚血心筋層におけるＣＡＣ代謝物存在量への効果を示す図である。ｎ＝群につき、３匹のマウス。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、少なくとも３回の反復の平均±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図３】成人の初代心筋細胞における再灌流時に、虚血性コハク酸レベルは、ＲＯＳ産生、ミトコンドリアの膜の分極、及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ減少状態を制御する。
【図３ａ】後期の虚血及び初期の再灌流時にＤＨＥ酸化として測定したＲＯＳ産生における虚血性コハク酸レベルの操作の効果を示す図である。ｎ＝群につき、３回の独立した心筋細胞調製。
【図３ｂ】MitoSNOによる選択的阻害を介して、ミトコンドリア複合体ＩであるＲＥＴの再灌流時のコハク酸駆動のＲＯＳ産生への寄与の測定を示す図である。ｎ＝群につき、３回の独立した心筋細胞調製。
【図３ｃ】後期の虚血及び初期の再灌流時にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化への、虚血性コハク酸レベルの操作の効果を示す図である。ｎ＝群につき、３回の独立した心筋細胞調製。
【図３ｄ】非クエンチモードでのＴＭＲＭ蛍光を用いて、後期の虚血（左のパネル）及び初期の再灌流（右のパネル）後のミトコンドリアの膜電位への、虚血性コハク酸レベルの操作の効果を示す図である（高蛍光＝低膜電位）。
【図３ｅ】再灌流時のＴＭＲＭクエンチング速度により決定した、４０分虚血後の内膜の再分極の初速度における虚血性コハク酸レベルの操作の効果を示す図である。ｎ＝群につき、３回の独立した心筋細胞調製。
【図３ｆ】好気性Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞におけるジメチルコハク酸及びオリゴマイシンのミトコンドリアのＲＯＳへの効果を示す図である。正常酸素圧インキュベーション下の筋芽細胞内のミトコンドリアは、オリゴマイシン及びジメチルコハク酸により過分極され、MitoSOX酸化の速度を評価し、ミトコンドリアのＲＯＳ産生を測定した。ｎ＝試験につき、１０〜１２個の筋芽細胞の４回の独立した実験。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。データは、少なくとも３回の反復の平均±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図４】ＮＡＤＨ及びＡＭＰセンシング経路は虚血性コハク酸蓄積を駆動し、ミトコンドリアのＲＯＳ産生を介して、インビボでの再灌流の病理を制御する。
【図４ａ】虚血時のコハク酸蓄積及び再灌流時の逆電子伝達（ＲＥＴ，reverse electron transport）によるスーパーオキシド形成のモデルを示す図である。
【図４ｂ】心筋梗塞±ジメチルマロン酸のｉ．ｖ．注射による虚血性コハク酸蓄積の阻害、又はジメチルマロン酸及びジメチルコハク酸のｉ．ｖ．注射による虚血性コハク酸の再導入後の、マウス心臓の横断面の代表的な画像である。梗塞した組織は白、リスクのある残りの領域は赤、及びリスクのない組織は濃青色である。
【図４ｃ】図４ｂに記載したように実行した、心筋梗塞サイズの定量を示す図である。各白丸は、一匹のマウスからのデータを表し、黒丸は特定の状態の全てのマウスの平均値を表す。ｎ＝群につき、６匹のマウス。
【図４ｄ】インビボでの脳ＩＲ傷害に対するジメチルマロン酸による保護を示す図である。ジメチルマロン酸による治療あり又はなしのインビボでのｔＭＣＡＯが起こった後のラットの脳の横断面の代表的な画像である。脳をヘマトキシリン及びエオシンで処理し、梗塞した組織を描写した。脳の梗塞体積の定量
【図４ｅ】吻側尾側の梗塞分布を示す図である。
【図４ｆ】インビボでのｔＭＣＡＯによる脳のＩＲ傷害後の±ジメチルマロン酸を示す図である。ｎ＝群につき、３〜６匹のラット。
【図４ｇ】ｔＭＣＡＯ後±ジメチルマロン酸のラットの神経学的スコアを示す図である。ｎ＝群につき、３〜６匹のマウス。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、データが中央値±Ｃ．Ｉ．である図４ｇを除き、平均±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図５】細胞及びインビボでのジメチルマロン酸及びジメチルコハク酸処置は、マロン酸及びコハク酸の細胞内の蓄積をもたらす。（ａ）インビボでのジメチルマロン酸の静脈内注入によりもたらされる、虚血心筋層におけるマロン酸の蓄積を示す図である。（ｂ）Ｃ２Ｃ１２細胞を、無添加、グルコース、５ｍＭジメチルコハク酸、５ｍＭジメチルマロン酸、又は５ｍＭジメチルマロン酸及び５ｍＭジメチルコハク酸とインキュベートした。ＡＴＰ合成による細胞の酸素消費率を示す図である。（ｃ）Seahorse XF96 analyserを用いて決定した、細胞の最大酸素消費率を示す図である。ｎ＝３〜４、＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図６】コハク酸による虚血性フラックスのための３つの潜在的な代謝インプットの要約を示す図である。虚血下でのコハク酸産生に寄与し得る代謝経路を理解するため、心臓代謝のiAS253モデルの最新版を用いて、フラックスバランス分析を使用して虚血をシミュレートした。モデルは、コハク酸を産生する３つの可能な機構を示した：ＣＡＣによって産生され、解糖系及びグルタミノリシス由来のアルファケトグルタル酸から（灰色のボックス）、ＧＡＢＡシャントから産生されたコハク酸セミアルデヒドから（青色のボックス）、ＳＤＨの逆転を介したリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル及びプリンヌクレオチドサイクルによって産生されるフマル酸から（赤色のボックス）。
【図７】虚血及び正常酸素圧心筋層における、１３ＣグルコースによるＣＡＣ及び近位の代謝物の代謝標識を示す図である。正常酸素圧及び虚血心筋層呼吸時のＣＡＣ及び近位の代謝物の比例の同位体標識プロファイルを示す図である。マウスの心臓を１１ｍＭ  １３Ｃグルコースで１０分間灌流し、続いて３０分間の無フロー虚血又は３０分間の正常酸素圧呼吸のいずれか、続いて急速凍結し、ＬＣ−ＭＳ代謝物分析した。ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】虚血及び正常酸素圧心筋層における、１３ＣグルタミンによるＣＡＣ及び近位の代謝物の代謝標識を示す図である。正常酸素圧及び虚血心筋層呼吸時のＣＡＣ及び近位の代謝物へのグルタミンからの同位体フラックスを示す図である。マウスの心臓を４ｍＭ  １３Ｃグルタミン（＋５標識）で１０分間灌流し、続いて３０分間の無フロー虚血又は３０分間の正常酸素圧呼吸のいずれか、続いて急速凍結し、代謝物分析した。
【図８ａ】それぞれの代謝物の同位体プロファイルを全プールの割合として表した図である。
【図８ｂ】さらに、心臓における＋５グルタミンプールの割合に対して決定した、αＫＧへのフラックスを示す図である。ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５。
【図９】虚血心筋層におけるＧＡＢＡシャント及びＣＡＣ代謝物へのビガバトリンによるＧＡＢＡアミノ基転移酵素阻害の効果を示す図である。灌流したマウスの心臓を３０分間、無フロー虚血±虚血１０分前のビガバトリンの連続的な注入（Ｖｉｇ；１００、３００及び７００μＭ）に供した。心臓組織を急速凍結し、（ａ）ＧＡＢＡ及び（ｂ）コハク酸存在量をＬＣ−ＭＳによる正常酸素圧レベルに対して定量した。ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５。
【図１０】コハク酸蓄積を駆動する組織虚血により活性化され得る経路を同定する完全な代謝モデルを示す図である。虚血下のコハク酸産生に寄与し得る代謝経路を同定するために、中心的な心臓代謝のiAS253ミトコンドリアモデルの拡大版と合わせてフラックスバランス分析を用いてこれらの状態をシミュレートした。コハク酸蓄積に寄与する主な経路（太い赤線）は、ＳＤＨの逆活性へのフマル酸の供給を介した。フマル酸は、プリンヌクレオチドサイクル（ＰＮＣ，purine nucleotide cycle）及びリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ＭＡＳ，malate-aspartate shuttle）によって産生され、グルコース及びアスパラギン酸を消費し、乳酸及びアラニンの著しい産生ももたらす。コハク酸の少ない供給源（細い赤線）は、解糖系及びグルタミノリシスを含むが、このルートはＮＡＤＨの過剰産生により抑圧されるため、相対的に少なかった。さらに、少量のフマル酸はピルビン酸カルボキシラーゼ活性により生成される。ＧＡＢＡシャントは寄与しない（黒い点線）。
【図１１】コハク酸への１３Ｃ虚血代謝物フラックスの同位体プールに対する比較を示す図である。マウスの心臓を１３Ｃ−グルコース（＋６標識）、１３Ｃ−グルタミン（＋５標識）、又は１３Ｃ−アスパラギン酸（＋１標識）で１０分間灌流し、続いて３０分間の無フロー虚血又は３０分間の正常酸素圧呼吸、及び急速凍結、並びに代謝物分析した。各炭素源からの代謝物フラックスの相対振幅を比較するため、未標識のコハク酸プールと比較した、コハク酸への虚血性１３Ｃの取り込みは、正常酸素圧と比較して決定され、１３Ｃ注入前駆体の全標識プールに対して表した。データは直線（左）上に、対数（右）スケールでプロットした。
【図１２】虚血及びその後の再灌流時の、コハク酸及びＯＸＰＨＯＳ代謝経路における予想される変化を示す図である。虚血、再灌流及び正常酸素圧時のコハク酸代謝における可能な変化を決定するために、フラックスバランス分析を伴うiAS253モデルの拡大版を用いて、これらの状態の心臓代謝をシミュレートした。シミュレーションにより、以下の通り予想された。
【図１２ａ】虚血下、複合体Ｉによって産生されたユビキノールを用いることによって複合体IIは逆に作用し、フマル酸をコハク酸に還元し、それにより酸素の代わりに最終電子受容体として作用する。フマル酸はプリンヌクレオチドサイクル（ＰＮＣ）及びクエン酸回路（ＣＡＣ）の逆転により産生される。他の呼吸鎖を介するフラックスは減少し、ＡＭＰは不十分なＡＴＰ産生によりＡＤＰから産生された。
【図１２ｂ】酸素が回復した複合体IIにより、過剰なコハク酸を代謝した。再灌流の最初の数分において典型的であるように、ＡＭＰからＡＤＰへの再生の遅延は、ＡＴＰ合成酵素を介するフラックスを制限した。これは次に、膜が過分極になるため、複合体IIにより生成された全てのユビキノールを消費する複合体IIIを妨げる。ユビキノール及びプロトンの過剰なフラックスにより複合体Ｉは逆に作用し、ＲＯＳを生成する。
【図１２ｃ】一度、コハク酸のフラックスが正常レベルまで減少すると、後期再灌流から正常酸素圧への移行のように、呼吸鎖及びクエン酸回路を介したフラックスは正常に戻った。
【図１３】インサイチュでのＩＲ時の初代心筋細胞における心筋細胞のＲＯＳレベルの追跡を示す図である。初代ラット心筋細胞を４０分間虚血に供し、ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）酸化の供給電圧に比例した測定による実験を通して、ＲＯＳレベルでの再酸素負荷を追跡した。虚血性緩衝液は、無添加、４ｍＭジメチルマロン酸、又は４ｍＭジメチルコハク酸のいずれかを含有した。各状態の代表的な結果を示す。ハイライトしたウィンドウは、図３ａに詳細に記載した実験の期間を示す。
【図１４】インサイチュでのＩＲ時の初代心筋細胞におけるＮＡＤＨ還元状態の追跡を示す図である。初代ラット心筋細胞を４０分間虚血に供し、再酸素負荷及びＮＡＤＨ還元状態をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ自発蛍光の測定による実験を通して追跡した。虚血緩衝液は、無添加、４ｍＭジメチルマロン酸、又は４ｍＭジメチルコハク酸のいずれかを含有した。各状態の代表的な結果を示す。ハイライトしたウィンドウは、図３ｃにおいて詳細に記載した実験の期間を示す。
【図１５】インサイチュでのＩＲ時の初代心筋細胞におけるミトコンドリアの膜電位の追跡を示す図である。初代ラット心筋細胞を４０分間虚血に供し、再酸素負荷及びミトコンドリアの膜電位をテトラメチルローダミン（ＴＭＲＭ）蛍光の測定による実験を通して追跡した。虚血緩衝液は、無添加、又は４ｍＭジメチルマロン酸のいずれかを含有した。少なくとも３回の反復実験の結果の平均を示す。
【図１５ａ】全体の実験を通して、ＴＭＲＭシグナルを示す図である。
【図１５ｂ】虚血から再酸素負荷への移行時のＴＭＲＭシグナルを示す図である。ｎ＝群につき、別に単離した初代ラット心筋細胞から３〜４回の実験。
【発明を実施するための形態】
【０１４１】
ミトコンドリアのＲＯＳ産生は、虚血再灌流（ＩＲ，ischaemia-reperfusion）傷害の重要な初期の駆動体であるが、再灌流時に機能障害性の呼吸鎖の酸素との相互作用の非特異的な結果であると考えられてきた（Murphy, E. & Steenbergen, C. Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury. Physiol. Rev. 88, 581-609, (2007)、Yellon, D. M. & Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. N. Engl. J. Med. 357, 1121-1135, (2007)、Burwell, L. S., Nadtochiy, S. M. & Brookes, P. S. Cardioprotection by metabolic shut-down and gradual wake-up. J. Mol. Cell. Cardiol. 46, 804-810, (2009)、Eltzschig, H. K. & Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat. Med. 17, 1391-1401, (2011)）。本発明者らは、ＩＲ時のミトコンドリアのＲＯＳは、特異的な代謝工程によって生成されるという別の仮説を調べた。これを行うため、本発明者らは、ＩＲ時の組織において保存された代謝シグネチャーを同定する比較メタボロミクス手法を開発し、それはミトコンドリアのＲＯＳの供給源を示すであろう（図１ａ）。インビボでの虚血に供したマウスの脳、腎臓、肝臓及び心臓の液体クロマトグラフィー−質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）に基づくメタボロミック分析（図１ａ）により、いくつかの代謝物における変化を明らかにした。しかし、３つのみが全ての組織にわたって上昇した（図１ｂ及び表１）。
【０１４２】
再灌流ＲＯＳ産生を刺激するのに十分な期間虚血にさらされた様々なマウスの組織を、メタボロミック分析及び比較に供した。
【０１４３】
【表１】
2017519020.tif 000005
2017519020.tif 000006
【０１４４】
２つの代謝物は、虚血性プリンヌクレオチド破壊の特徴がはっきりした副生成物、キサンチン及びヒポキサンチンであり（Harmsen, E., de Jong, J. W. & Serruys, P. W. Hypoxanthine production by ischemic heart demonstrated by high pressure liquid chromatography of blood purine nucleosides and oxypurines. Clin. Chim. Acta 115, 73-84 (1981)）、我々の手法の正当性を確証している。キサンチン及びヒポキサンチンは、細胞基質のキサンチン酸化還元酵素によって代謝され、ミトコンドリアの代謝には寄与しない（Pacher, P., Nivorozhkin, A. & Szabo, C. Therapeutic effects of xanthine oxidase inhibitors: renaissance half a century after the discovery of allopurinol. Pharmacol. Revs. 58, 87-114, (2006)）。第３の代謝物、ミトコンドリアのクエン酸回路（ＣＡＣ）中間物であるコハク酸は、試験した組織にわたって３倍から１９倍に増加し（図１ｄ）、ある範囲の代謝的に異なる組織で普遍的に起こる、たった１つの虚血のミトコンドリアの代謝特徴であった。したがって、本発明者らは、ＩＲ時のミトコンドリアのＲＯＳ産生におけるコハク酸の潜在的役割に注目した。
【０１４５】
ミトコンドリアのＲＯＳ産生は再灌流の初期に起こるため（Murphy, E. & Steenbergen, C. Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury. Physiol. Rev. 88, 581-609, (2007)、Yellon, D. M. & Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. N. Engl. J. Med. 357, 1121-1135, (2007)、Burwell, L. S., Nadtochiy, S. M. & Brookes, P. S. Cardioprotection by metabolic shut-down and gradual wake-up. J. Mol. Cell. Cardiol. 46, 804-810, (2009)、Eltzschig, H. K. & Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat. Med. 17, 1391-1401, (2011)、Chouchani, E. T. et al. Cardioprotection by S-nitrosation of a cysteine switch on mitochondrial complex I. Nat. Med. 19, 753-759, (2013)、Zweier, J. L., Flaherty, J. T. & Weisfeldt, M. L. Direct measurement of free radical generation following reperfusion of ischemic myocardium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1404-1407 (1987)）、ＲＯＳをあおる代謝物は素早く酸化されるべきであるということになる。際立ったことに、虚血時に蓄積されたコハク酸は、心臓におけるエクスビボでの５分間再灌流によって正常酸素圧レベルに回復され（図１ｅ）、これは心臓、脳及び腎臓においてもインビボで観察された（図１ｆ〜ｈ）。さらに、これらのコハク酸変化は、インビボでのＩＲ傷害が起こった組織の領域に局在し、他のＣＡＣ代謝物の蓄積がない状態で起こる（図１ｄ、ｆ）。ＲＯＳ産生の駆動におけるコハク酸の役割をさらに評価するため、本発明者らはコハク酸の細胞透過性誘導体、ジメチルコハク酸（図５）を虚血性初代心筋細胞（Chouchani, E. T. et al. Cardioprotection by S-nitrosation of a cysteine switch on mitochondrial complex I. Nat. Med. 19, 753-759, (2013)）に投与し、これが再灌流時のミトコンドリアのＲＯＳ産生を著しく増加することを見出した（図１ｉ）。これらのデータは虚血時にコハク酸が蓄積し、次いで再灌流時のＲＯＳ産生をあおることを示唆した。
【０１４６】
虚血時のコハク酸蓄積の原因である機構を決定するため、及びＩＲ傷害におけるその役割を探索するため、多くの実験的及び理論的な供給源が入手可能であることから、本発明者らは心臓に注目した。哺乳動物組織において、コハク酸はピルビン酸若しくはグルタミン酸、又はγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）シャントから、α−ケトグルタル酸−依存性ＣＡＣフラックスを介して生成され得る（図２ａ及び６）（Tannahill, G. M. et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1beta through HIF-1alpha. Nature 496, 238-242, (2013)、Smith, A. C. & Robinson, A. J. A metabolic model of the mitochondrion and its use in modelling diseases of the tricarboxylic acid cycle. BMC Syst. Biol. 5, 102, (2011)）。α−ケトグルタル酸を介するコハク酸への虚血性ＣＡＣフラックスは、それぞれピルビン酸及びグルタミン酸からＣＡＣに入る１３Ｃ−標識グルコース又はグルタミンの注入に続く、その同位体置換体分配を測定することによって調べた。Ｕ−１３Ｃ−グルコースでの、灌流時のコハク酸の１３Ｃ−同位体置換体分配は、虚血心臓において著しく減少し、ピルビン酸及びコハク酸へのα−ケトグルタル酸連結ＣＡＣフラックスが虚血時に減少したことを示している（図２ｂ、ｃ、及び７）。グルタミンは、正常酸素圧又は虚血におけるＣＡＣ代謝物の主要な炭素供給源ではない（図８ａ）。さらに、観察されたα−ケトグルタル酸への最少の１３Ｃ−グルタミンの取り込みが、虚血において減少し（図８ｂ）、ビガバトリン（Tannahill, G. M. et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1beta through HIF-1alpha. Nature 496, 238-242, (2013)）でのＧＡＢＡシャントの阻害は虚血性コハク酸蓄積を低減しなかった（図２ｄ及び９）。したがって、虚血時のコハク酸の増加は、心臓代謝の従来の手術によって引き起こされない。
【０１４７】
虚血時にコハク酸蓄積をもたらし得る他の機構を探索するため、本発明者らは、嫌気性代謝時にＳＤＨが逆に作用しフマル酸をコハク酸に還元するかどうか調べた（Pisarenko, O. I. et al. On the mechanism of enhanced ATP formation in hypoxic myocardium caused by glutamic acid. Basic Res. Cardiol. 80, 126-134 (1985)、Taegtmeyer, H. Metabolic responses to cardiac hypoxia. Increased production of succinate by rabbit papillary muscles. Circ. Res. 43, 808-815 (1978)、Hochachka, P. W. & Storey, K. B. Metabolic consequences of diving in animals and man. Science 187, 613-621 (1975)）。ＳＤＨの逆転は虚血組織において実証されていないが、インシリコでのフラックス分析により、虚血時のＳＤＨ逆転によるコハク酸産生を最適解として決定した（図２ｅ及び１０）。この手法はまた、ＳＤＨへのフマル酸の供給は２つの収束する経路：高ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比が、フマル酸に変換されるリンゴ酸形成を駆動するリンゴ酸／アスパラギン酸シャトル（ＭＡＳ）（Hochachka, P. W. & Storey, K. B. Metabolic consequences of diving in animals and man. Science 187, 613-621 (1975)、Easlon, E., Tsang, F., Skinner, C., Wang, C. & Lin, S. J. The malate-aspartate NADH shuttle components are novel metabolic longevity regulators required for calorie restriction-mediated life span extension in yeast. Genes Dev. 22, 931-944, (2008)、Barron, J. T., Gu, L. & Parrillo, J. E. Malate-aspartate shuttle, cytoplasmic NADH redox potential, and energetics in vascular smooth muscle. J. Mol. Cell. Cardiol. 30, 1571-1579, (1998)）；フマル酸産生を駆動するプリンヌクレオチドサイクル（ＰＮＣ）のＡＭＰ依存性活性化（Van den Berghe, G., Vincent, M. F. & Jaeken, J. Inborn errors of the purine nucleotide cycle: adenylosuccinase deficiency. J. Inherit. Metab. Dis. 20, 193-202 (1997)、Sridharan, V. et al. O2-sensing signal cascade: clamping of O2 respiration, reduced ATP utilization, and inducible fumarate respiration. Amer. J. Physiol. 295, C29-37, (2008)）に由来し得ることを示唆した（図２ｅ及び１０）。この予測を実験的に試験するために、本発明者らはマウスにジメチルマロン酸、ＳＤＨの競合的阻害剤であるマロン酸の膜透過性前駆体を注入した（図５）（Dervartanian, D. V. & Veeger, C. Studies on succinate dehydrogenase. I. spectral properties of the purified enzyme and formation of enzyme-competitive inhibitor complexes. Biochim. Biophys. Acta 92, 233-247 (1964)、Gutman, M. Modulation of mitochondrial succinate dehydrogenase activity, mechanism and function. Mol. Cell. Biochem. 20, 41-60 (1978)）。驚くことに、ジメチルマロン酸注入により虚血心筋層におけるコハク酸蓄積が著しく減少した（図２ｆ）。この結果は、その従来の方向でのＳＤＨ操作の阻害として、虚血心臓においてＳＤＨが逆に操作し、さらにコハク酸を増加することを示している（図２ａ及び１０）。したがって、ＳＤＨの逆転によるフマル酸還元から、虚血時にコハク酸が蓄積した。
【０１４８】
アスパラギン酸が、ＰＮＣ及びＭＡＳ経路の両方において、フマル酸の共通の炭素供給源であるため（図２ｅ）、本発明者らは１３Ｃ−標識アスパラギン酸を使用し、これらの経路の虚血時のコハク酸産生への寄与を評価した（図６及び１０）。１３Ｃ−アスパラギン酸の注入により、正常酸素圧と比較して虚血心筋層の１３Ｃ−コハク酸含量が著しく増加した（図２ｇ）。実際、１３Ｃ−アスパラギン酸は、虚血時にコハク酸へと著しく取り込まれる唯一の１３Ｃ−炭素供給源であった（図１１）。虚血性コハク酸蓄積へのＭＡＳ及びＰＮＣの相対的寄与を特徴づけるため、本発明者らは、ＭＡＳにおけるアスパラギン酸アミノ基転移酵素を阻害するアミノオキシ酢酸（ＡＯＡ）（Bunger, R., Glanert, S., Sommer, O. & Gerlach, E. Inhibition by (aminooxy)acetate of the malate-aspartate cycle in the isolated working guinea pig heart. Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 361, 907-914 (1980)）（図２ｅ）、及びＰＮＣにおけるアデニロコハク酸リアーゼを阻害する５−アミノ−１−β−Ｄ−リボフラノシル−イミダゾール−４−カルボキサミド（ＡＩＣＡＲ）（Sridharan, V. et al. O2-sensing signal cascade: clamping of O2 respiration, reduced ATP utilization, and inducible fumarate respiration. Amer. J. Physiol. 295, C29-37, (2008)、Swain, J. L., Hines, J. J., Sabina, R. L., Harbury, O. L. & Holmes, E. W. Disruption of the purine nucleotide cycle by inhibition of adenylosuccinate lyase produces skeletal muscle dysfunction. J. Clin. Invest. 74, 1422-1427, (1984)）（図２ｅ）を使用した。両阻害剤は虚血性コハク酸レベルを減少した（図２ｈ）。したがって、これらの結果は、虚血時にＭＡＳ及びＰＮＣの両経路がフマル酸産生を増加し、次いでＳＤＨ逆転によりコハク酸に変換されることを示した。
【０１４９】
コハク酸駆動性のミトコンドリアのＲＯＳ産生の根底にある潜在的な機構を調べるため、本発明者らは、再灌流時に虚血性心臓代謝をどのように変えるかをモデル化した（図１２）。この分析によって、ＳＤＨが蓄積したコハク酸を酸化し、それにより、ミトコンドリア複合体Ｉを介して逆電子伝達（ＲＥＴ）を駆動するであろうということを示唆した（Hirst, J., King, M. S. & Pryde, K. R. The production of reactive oxygen species by complex I. Biochem. Soc. Trans. 36, 976-980 (2008)、Kussmaul, L. & Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 7607-7612 (2006)、Pryde, K. R. & Hirst, J. Superoxide is produced by the reduced flavin in mitochondrial complex I: a single, unified mechanism that applies during both forward and reverse electron transfer. J. Biol. Chem. 286, 18056-18065, (2011)、Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem. J. 417, 1-13, (2009)）。興味深いことに、コハク酸はインビトロでのＲＥＴによる複合体Ｉからの広範なスーパーオキシド形成を駆動し、それをＩＲ時のミトコンドリアのＲＯＳの強制的な潜在的供給源にする（Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem. J. 417, 1-13, (2009)）。しかし、ＩＲ傷害における複合体Ｉ  ＲＥＴの役割は調べられてこなかった。虚血時に蓄積したコハク酸が、再灌流時に複合体Ｉ  ＲＥＴを駆動できるか試験するため、本発明者らは、ＩＲ傷害の心筋細胞モデルにおいて、蛍光プローブであるジヒドロエチジン（ＤＨＥ）及びテトラメチルローダミン（ＴＭＲＭ）の電位感受性蛍光からミトコンドリアの膜電位によってミトコンドリアのＲＯＳを追跡した（Davidson, S. M., Yellon, D. & Duchen, M. R. Assessing mitochondrial potential, calcium, and redox state in isolated mammalian cells using confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 372, 421-430, (2007)）。ＤＨＥの酸化率は、虚血時に安定なままであったが、再灌流時に急速に上昇し、スーパーオキシド産生の増加と一致している（図３ａ及び１３）（Davidson, S. M., Yellon, D. & Duchen, M. R. Assessing mitochondrial potential, calcium, and redox state in isolated mammalian cells using confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 372, 421-430, (2007)）。ジメチルマロン酸によるＳＤＨ媒介虚血性コハク酸蓄積の阻害は、再灌流時のＤＨＥ酸化を低減し（図３ａ）、一方でジメチルコハク酸により虚血時にさらにコハク酸を増加することは、再灌流ＤＨＥ酸化を増幅し、コハク酸レベルが再灌流ＲＯＳの程度を制御することを示している（図３ｂ）。重要なことに、MitoSNOによる複合体Ｉ  ＲＥＴの選択的ブロッキングは（Chouchani, E. T. et al. Cardioprotection by S-nitrosation of a cysteine switch on mitochondrial complex I. Nat. Med. 19, 753-759, (2013)）、再灌流時のジメチルコハク酸駆動ＤＨＥ酸化を廃止し（図３ｂ）、虚血性コハク酸レベルが複合体Ｉ  ＲＥＴを介してスーパーオキシドの産生を駆動したことを示している。コハク酸依存性ＲＥＴは、ジメチルコハク酸によりコハク酸レベルを増加することによって再灌流時のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化が抑制された観察によって、さらに支持された（図３ｃ及び１４）。ミトコンドリアの膜電位の追跡により、虚血性コハク酸蓄積の阻害が再灌流時のミトコンドリアの分極率を減らすことが明らかになり（図３ｄ、ｅ及び１５）、コハク酸依存性の増強した複合体Ｉ  ＲＥＴと一致した。最後に、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞においてジメチルコハク酸によりコハク酸を増加することは、オリゴマイシンによるミトコンドリアの過分極はＩＲとは無関係にMitoSOX酸化を増加するが（図３ｆ）、高レベルのコハク酸を大きなプロトン推進力と組み合わせることが、ＲＥＴにより複合体ＩのＲＯＳ産生を駆動するのに十分であることを示唆している。
【０１５０】
本発明者らの発見は以下のモデルによって説明され得る（図４ａ）：虚血時に、ＭＡＳ及びＰＮＣの活性化を介してフマル酸産生が増加し、次いでＳＤＨ逆転によりコハク酸に還元される。再灌流時、蓄積したコハク酸は急速に酸化され、それにより大きなプロトン推進力を維持し、複合体ＩにおけるＲＥＴを駆動し、ＩＲ傷害を開始するミトコンドリアのＲＯＳを産生する（Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem. J. 417, 1-13, (2009)）。このモデルは、虚血時に、再灌流時のＲＯＳを誘導する初回刺激の必要性、複合体Ｉ（Chouchani, E. T. et al. Cardioprotection by S-nitrosation of a cysteine switch on mitochondrial complex I. Nat. Med. 19, 753-759, (2013)）及びII（Wojtovich, A. P., Smith, C. O., Haynes, C. M., Nehrke, K. W. & Brookes, P. S. Physiological consequences of complex II inhibition for aging, disease, and the mKATP channel. Biochim. Biophys. Acta 1827, 598-611, (2013)）の阻害並びに軽度の非共役（Brennan, J. P. et al. Mitochondrial uncoupling, with low concentration FCCP, induces ROS-dependent cardioprotection independent of KATP channel activation. Cardiovas. Res. 72, 313-321, (2006)）によるＩＲ傷害に対する保護など、多くの今までは関係のないＩＲ傷害の態様を統一する構成を提供する。
【０１５１】
興味深いことに、本発明者らのモデルは、予期しないが試験可能な予測も生み出す。虚血時にコハク酸を増加する及び再灌流においてそれを酸化する経路の操作は、ＩＲ傷害の程度を決定する。ＳＤＨの可逆性阻害は、虚血時のコハク酸蓄積（図２ｂ）及び再灌流時のその酸化の両方をブロックするので、インビボでのＩＲ傷害に対して保護する。ジメチルマロン酸、ＳＤＨ阻害剤であるマロン酸の前駆体の静脈内（ｉ．ｖ．）注入は、心臓のＩＲ傷害のインビボモデルでは保護的であった（図４ｂ、ｃ）。重要なことに、この心臓保護は、ジメチルコハク酸を添加し戻すことによって抑制され（図４ｂ、ｃ）、保護が単なるコハク酸蓄積の軽減によりもたらされることを示している。最後に、ラット脳の一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ，transient middle cerebral artery occlusion）時のジメチルマロン酸のｉ．ｖ．注入、脳卒中時の脳のＩＲ傷害のインビボモデルは、保護的であり、核濃縮した核の形態及び神経網の空胞形成を減らし（図４ｄ）、ＩＲ傷害によって引き起こされる梗塞性の脳組織の体積を減らし（図４ｅ、ｆ）、脳卒中に関係する神経機能の低下を防ぐ（図４ｇ及び表２）。
【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
これらの発見は、コハク酸駆動性ＩＲ傷害の本発明者らのモデルを評価し、コハク酸蓄積が心臓及び脳におけるＩＲ傷害の根底にあることを実証し、コハク酸蓄積及びＩＲ傷害を治療するための酸化を減少する治療手法を評価する。
【０１５４】
本発明者らは、フマル酸産生及びＳＤＨの逆転を介して、コハク酸の蓄積が、インビボでの虚血の普遍的な代謝シグネチャーであることを実証した。次に、コハク酸はある範囲の組織におけるＩＲ傷害の根底にある再灌流時のミトコンドリアのＲＯＳ産生の初代駆動体である。虚血性コハク酸蓄積は、炎症性の及び低酸素のシグナル伝達におけるその役割を介してさらに適切であり得る（Tannahill, G. M. et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1beta through HIF-1alpha. Nature 496, 238-242, (2013)）。したがって、コハク酸は、ミトコンドリアのＲＯＳによるＩＲ傷害の急性の原因、並びに次いで分泌時にも炎症及び血管新生の誘引の両方となり得る（Hamel, D. et al. G-Protein-coupled receptor 91 and succinate are key contributors in neonatal postcerebral hypoxia-ischemia recovery. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34, 285-293, (2014)）。ＩＲ傷害の根底にある代謝応答を説明する他にも、本発明者らは虚血時のコハク酸蓄積を予防することは、インビボでのＩＲ傷害に対して保護的であることを実証し、したがって、心臓発作及び脳卒中などの病理においてＩＲ傷害の新規の治療標的を提供する。
【０１５５】
方法の要約
以下の温虚血及び／又はＩＲ傷害のマウスモデルを使用した：エクスビボでの灌流したマウス心臓の全虚血；インビボでのマウス左冠動脈下行枝（ＬＡＤ）結紮；インビボでのラット脳の一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）；腎門の片側閉塞によるインビボでのマウス腎臓の虚血；インビボでの頸椎脱臼後の肝臓の全虚血。虚血心筋層における代謝経路のモデリングは、先に記載したように実施した（Smith, A. C. & Robinson, A. J. A metabolic model of the mitochondrion and its use in modelling diseases of the tricarboxylic acid cycle. BMC Syst. Biol. 5, 102, (2011)）。使用したＩＲ傷害の細胞モデルは、成体の単離した初代ラット心筋細胞及びマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞株である。心筋細胞内の蛍光をレーザー走査型共焦点顕微鏡によって評価した。ＤＨＥ蛍光を使用して、ＲＯＳ産生を測定し、ミトコンドリア膜電位に関しては非クエンチモードでＴＭＲＭ蛍光を使用し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ自発蛍光を使用してＮＡＤ（Ｐ）Ｈプールの還元電位を評価した（Chouchani, E. T. et al. Cardioprotection by S-nitrosation of a cysteine switch on mitochondrial complex I. Nat. Med. 19, 753-759, (2013)）。エクスビボでの灌流したマウス心臓における代謝経路を評価するため、１３Ｃ−標識グルコース、グルタミン、又はアスパラギン酸を単離した心臓に注入し、次いでＣＡＣ代謝物の１３Ｃ同位体置換体をＬＣ−ＭＳによって定量した。虚血代謝物蓄積における代謝阻害剤の効果及び１３Ｃ−標識の分布を、代謝阻害剤のｉ．ｖ．注入に続く組織代謝物のＬＣ−ＭＳ分析によって評価した。心臓のＣｏＱプールの酸化還元状態をＬＣによって評価した。代謝阻害剤によるインビボでのＩＲ傷害の改良は、阻害剤のｉ．ｖ．投与に続くトリフェニルテトラゾリウム塩化物染色による心臓の梗塞サイズの測定、脳において組織学による神経機能及び梗塞サイズの決定よって評価した。
【実施例】
【０１５６】
方法
インビボでのマウス心筋実験。使用したマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊだった。
インビボでのマウス心筋実験。インビボでの心臓ＩＲモデルについは、開胸、インサイチュでの心臓モデルを使用した（Schmidt, K. et al. Cardioprotective effects of mineralocorticoid receptor antagonists at reperfusion. Eur. Heart J. 31, 1655-1662, (2010)、Methner, C. et al. Protection through postconditioning or a mitochondria-targeted S-nitrosothiol is unaffected by cardiomyocyte-selective ablation of protein kinase G. Basic Res. Cardiol. 108, 337, (2013)）。雄のマウス（８〜１０週齢；Charles River Laboratories, UK）をペントバルビタールナトリウム（７０ｍｇ／ｋｇ  腹腔内（ｉ．ｐ．））で麻酔し、気管内挿管及び３ｃｍＨ２Ｏ呼気終末陽圧呼吸で人工呼吸した。麻酔の妥当性は、角膜及び引込め反射を用いてモニターした。呼吸数を、１２５〜１５０μＬの間の一回呼吸量で１分あたり１１０呼吸に維持した。開胸を実施し、心膜をはぐことにより心臓を露出した。左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）の卓越した枝を、７〜０のProlene縫合によって囲み、次いで小さなプラスチックチューブに通した。心臓表面に対して管を締めることにより虚血を誘導した。インビボでのＩＲ時の代謝物を評価するため、マウスを３つの群に分けた：３０分間虚血、３０分間虚血＋５分間再灌流、及び３０分間偽手術、偽手術では縫合は配置するがＬＡＤはふさがない。各プロトコルの終わりに、組織をリスクのある状態及び心臓の末梢領域から取り除き、白対赤組織を比較することによって視覚的に選択し、液体窒素中で急速凍結した。偽手術した組織を、仮定したリスクゾーンから取り除いた。
【０１５７】
梗塞サイズは３０分間の虚血、続いて１２０分間の再灌流後に２％トリフェニルテトラゾリウム塩化物染色を用いて評価し、リスクゾーンの百分率として表した（Nadtochiy, S. M., Redman, E., Rahman, I. & Brookes, P. S. Lysine deacetylation in ischaemic preconditioning: the role of SIRT1. Cardiovasc. Res. 89, 643-649, (2011)）。滅菌生理食塩水中の代謝阻害剤（全てSigma社製）を以下の用量で虚血１０分前及び虚血中を通して尾静脈を介してｉ．ｖ．注入した：ジメチルマロン酸塩（４ｍｇ／ｋｇ／分）、ＡＯＡ（５０μｇ／ｋｇ／分；Fluorochem社）及びＡＩＣＡＲ１０ｍｇ／ｋｇ／分）。ジメチルコハク酸（８ｍｇ／ｋｇ／分）は、ジメチルマロン酸と組み合わせて注入した。対照のマウスには滅菌生理食塩水を注入した。投与した総容量は２００μＬ／マウスを超えないようにした。
【０１５８】
代謝分析のためのエクスビボでのランゲンドルフ心臓実験。マウスは、ヘパリン添加し（２００Ｕ  ｉ．ｐ．）、ペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔した。次いで、胸を開き、心臓を素早く切除し、冷Krebs-Henseleit（ＫＨ）緩衝液（０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１１ｍＭグルコース、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、及び２ｍＭ  ＣａＣｌ２）、ｐＨ７．４で停止した。次いで、大動脈を２２Ｇの鈍針でカニューレ処置し、灌流装置に移した。心臓を、３７℃のＫＨ緩衝液（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）、８０ｍｍＨｇの定圧で灌流した。２０分平衡化後の心臓を４つの群に分けた：６０分間正常酸素圧灌流、３０分間全虚血、３０分間全虚血＋５分間再灌流、及び３０分間全虚血＋３０分間再灌流。代謝阻害剤は、冠動脈血流量の１％で大動脈カニューレ上のサイドポートを通して、虚血前に１０分間注入した。実験の終わりには心臓は液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【０１５９】
エクスビボでのランゲンドルフ心臓実験における１３Ｃ代謝物標識。マウスは、ペントバルビタールナトリウム（約１４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。心臓を素早く切除し、カニューレ処置し、等容性のランゲンドルフモード、８０ｍｍＨｇ灌流圧、３７℃、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２（ｐＨ７．４）で連続的にガスを供給したＫＨ緩衝液で灌流した（Ashrafian, H. et al. Fumarate is cardioprotective via activation of the Nrf2 antioxidant pathway. Cell Metab. 15, 361-371, (2012)）。左心室（ＬＶ，left ventricle）に挿入した流体充填のバルーンを用いて、圧力変換機及びPowerLab（商標）システム（ADInstruments社, UK）につないで心臓機能を評価した。バルーン体積を、最初のＬＶ拡張期圧４〜９ｍｍＨｇに合わせ（Ashrafian, H. et al. Fumarate is cardioprotective via activation of the Nrf2 antioxidant pathway. Cell Metab. 15, 361-371, (2012)）、全心臓を５５０ｂｐｍにペース調整した。最大左心室圧（ＬＶＤＰ，left ventricular developed pressure）を収縮期圧（ＳＰ，systolic pressure）と拡張期圧（ＤＰ，diastolic pressure）の間の差から計算した。関数引数（ＳＰ、拡張末気圧、心拍数、ＬＶＤＰ、冠動脈血流量、灌流圧）を、LabChart（商標）ソフトウェアv.7（ADInstruments社、UK）を連続的に用いて記録した。
【０１６０】
標準的なＫＨ緩衝液で２０分間平衡化後、心臓を以下の群に分けた：１１ｍＭ  Ｕ−１３Ｃグルコースを含有するＫＨ緩衝液で灌流、続いて３０分間正常酸素圧呼吸（ｎ＝４／群）；１１ｍＭ  Ｕ−１３Ｃグルコースを含有するＫＨ緩衝液で１０分間灌流、次いで３０分間全正常温虚血に供した（ｎ＝４／群）；１ｍＭ  ５−１３Ｃ  Ｌグルタミンを含有するＫＨ緩衝液の１０分間灌流、続いて未標識のＫＨ緩衝液で標準的な正常酸素圧灌流３０分（ｎ＝４）；１ｍＭ  １３Ｃ５Ｌグルタミンで１０分間灌流、続いて３０分間全虚血（ｎ＝４）；１ｍＭ  １−１３Ｃ  Ｌアスパラギン酸の１０分間灌流、続いて未標識のＫＨ緩衝液で３０分間正常酸素圧灌流；１ｍＭ  １−１３Ｃ  Ｌアスパラギン酸で１０分間灌流、続いて３０分間全虚血。終わりに、心臓を液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【０１６１】
インビボでのラット脳虚血及び再灌流。Glasgow大学が維持するコロニーからの雄の脳卒中易発症高血圧自然発症（ＳＨＲＳＰ，spontaneously hypertensive stroke prone）ラット（２７０〜３１０ｇ）を、酸素中５％イソフルランで麻酔し、外科手術中を通して挿管及び人工呼吸した（約２．５％イソフルラン／酸素）。体温は３７±０．５℃に維持した。動物は一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ、４５分）前に、前脳卒中穿頭孔手術を行った（Ord, E.N.J., Shirley, R., van Kralingen, J.C., Graves, A., McClure, J.D., Wilkinson, M., McCabe, C., Macrae, I.M. & Work, L.M. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J. Neurosci. Methods 211, 305-308, (2012)）。手短に言えば、シリコーン被覆モノフィラメント（Doccol Corporation社, USA）を総頸動脈を通して進め、ＭＣＡの原因をブロックした（Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T. & Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn. J. Stroke 8, 1-8 (1986)）。動物は虚血時、麻酔下で維持した。フィラメントの除去後すぐに、又は再灌流の５分後に、頸椎脱臼後脳を取り除き、同側の周辺組織から梗塞組織を分離し、代謝分析のために液体窒素中で急速凍結した。相当する領域を対側から取り出した。別の群にジメチルマロン酸（６ｍｇ／ｋｇ／分）ｔＭＣＡＯの１０分前及びｔＭＣＡＯ時にｉ．ｖ．注入により）又は担体を注入し、３日間回復させ、その期間にわたり、改変したように（Ord, E. N. J. et al., Combined antiapoptotic and antioxidant approach to acute neuroprotection for stroke in hypertensive rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 33, 1215-1224, (2013)）神経機能を記録した（Hunter, A. J., et al., Functional assessments in mice and rats after focal stroke. Neuropharmacology. 39, 806-816, (2000)）。これらのラットは、次いで経心臓の灌流固定法によって屠殺し、梗塞領域をヘマトキシリン及びエオシン染色後、７つの冠側位にわたって評価した（Osborne, K. A. et al. Quantitative assessment of early brain damage in a rat model of focal cerebral ischaemia. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 50, 402-410 (1987)）。
【０１６２】
インビボでのマウス腎臓虚血及び再灌流。イソフルオラン全身麻酔下で、マウスの開腹術及び両側の腎門の露出を行った。血管クリップ（８ｍｍ、InterFocus Fine Science Tools社、Cambridge、UK）を１つの腎門上に置き、片側の腎臓虚血を誘導した。４５分間虚血の終わりに、クリップを取り除き、腎臓の再灌流は、紅潮した色の戻り及び腎静脈からの流れの可視化により明らかであった。腎臓を虚血の終わり又は５分間再灌流後に取り出し、代謝分析のために液体窒素中で急速凍結した。
【０１６３】
インビボでのマウス肝臓温虚血。マウスを頸椎脱臼により殺し、確実に血流を中断した。肝臓組織は、サーモスタット温熱パッドを使用して３７℃で４５分間、体腔内インサイチュで維持し、続いて取り除き、続く代謝分析のために液体窒素中で急速凍結した。
【０１６４】
代謝分析。等量の湿重量マウス組織を、製造業者の指示に従って、Precellysis 24バイアル中で、１０ｍｇの組織あたり２５０μＬの抽出溶液（ＥＳ，extraction solution；３０％アセトニトリル、５０％メタノール、及び２０％水）に溶解した。懸濁液をすぐに遠心分離（１６，０００ｇ、１５分、０℃）し、上澄み液をＬＣ−ＭＳ分析に使用した。ＬＣ分離のため、カラムＡはHiChrom, Reading社, UKのガードカラム（２０ｍｍ×２．１ｍｍ  ３．５μｍ）を備えたSequant Zic-Hilic（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、内径３．５μｍ）であった。移動相。Ａ：水中０．１％フマル酸（ｖ／ｖ）。Ｂ：アセトニトリル中０．１％フマル酸（ｖ／ｖ）。流速３００μＬ／分。勾配：０〜３分  ８０％Ｂ、２５分  ２０％Ｂ、２６分  ８０％Ｂ、３６分  ８０％Ｂ。カラムＢはHiChrom, Reading社, UKのガードカラム（２０ｍｍ×２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．３．５μｍ）を備えたsequant Zic-pHilic（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、ｉ．ｄ．３．５μｍ）であった。移動相。Ｃ：水中２０ｍＭ炭酸アンモニウム＋０．１％水酸化アンモニウム。Ｄ：アセトニトリル。流速１００μＬ／分。勾配：０分  ８０％Ｄ、２８分  ２０％Ｄ、２９分  ８０％Ｄ、４５分  ８０％Ｄ。質量分析装置（Thermo QExactive Orbitrap）をフルＭＳ及び極性切り替えモードで操作した。機械のドリフトを避けるために試料はランダム化した。標的手法及び非標的手法両方を用いてスペクトルを分析した。標的手法は、化合物の内部ライブラリーを参照することによって、スペクトルをXCalibur Qual Browser及びXCalibur Quan Browserソフトウェア（Thermo Scientific社）を用いて分析した。非標的手法は、スペクトルをSieve（商標）2.0ソフトウェア（Thermo Scientific社）で処理し、スペクトルピークを抽出した。スペクトルのアレイは、Ｒパッケージmumaの関数explore data及びunivariateを用いて統計的に分析した（Gaude, E. et al. muma, An R Package for metabolomics univariate and multivariate statistical analysis. Current Metabol. 1, 180-189 (2013)）。
【０１６５】
成体ラットの初代心筋細胞のインサイチュでの虚血及び再灌流。雄のSprague-Dawleyラット（３００〜３７０ｇ）を、ペントバルビトンナトリウム２００ｍｇ／ｋｇ及びヘパリン３３０Ｕ／ｋｇのＩＰ注射により終末麻酔した。心臓を切除し、３７℃で、１３ｍＬ／分で酸素化したＫＨ緩衝液を用いて、ランゲンドルフ灌流システムで逆行性灌流した。細胞は、標準的な方法を用いてコラゲナーゼ消化によって単離した（Davidson, S. M. & Duchen, M. R. Effects of NO on mitochondrial function in cardiomyocytes: Pathophysiological relevance. Cardiovasc. Res. 71, 10-21, (2006)）。簡単に言えば、心臓をＫＨ緩衝液で５分間、次いで１００μＭ  ＥＧＴＡを含有するＣａ２＋を含まないＫＨ緩衝液で５分間、続いて１００μＭ  ＣａＣｌ２及び０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼII（Worthington社）を含有するＫＨ緩衝液で８分灌流した。カニューレから心臓を取り除き、心室を素早く切り、２０ｍＬの同じコラゲナーゼ緩衝液に１５分間漬けた。消化した組織を１００μｍの細胞フィルターに通し、細胞を重力によって回収した。上澄み液を取り除き、細胞を初め０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＫＨ緩衝液で、次いで１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＫＨ緩衝液で洗浄した。典型的な収率は９０％生存、桿状細胞で、２×１０６個の細胞／心臓であった。細胞をMedium 199（５ｍＭクレアチン、２ｍＭカルニチン、５ｍＭタウリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシンを補充）に再懸濁し、ラミニン（Sigma社）で被覆したカバーガラス上に置いた。３７℃／５％ＣＯ２で１時間インキュベーション後、接着していない細胞を洗い落とし、新しいMedium 199を少なくとも４時間、３７℃／５％ＣＯ２で各ウェルに添加した。
【０１６６】
プレーティング後３６時間以内に、細胞を画像化した。画像はFluar 20x/0.75NA UV対物レンズを備えたZeiss（商標）LSM 510 META共焦点顕微鏡、又はOrca（商標）ER cooled CCD camera（Hamamatsu社）を装備した顕微鏡、モノクロメーター（Cairn Research社）及びFluar 20x/0.75NA対物レンズを備えたemission filter wheel（Prior社）を用いた。注文製の画像チャンバーの基部を形成するカバーガラスに接着した細胞を、正常酸素圧のレコーディング緩衝液（１５６ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース；ｐＨ７．４）を用いて、顕微鏡の３７℃に加熱したステージ上に置いた。緩衝液を、虚血をシミュレートするガス供給前の低酸素圧レコーディング緩衝液（上記の通りであるが、グルコースを欠き、１０ｍＭ  酪酸ナトリウム、１４．８ｍＭ  ＫＣｌを含有する；ｐＨ６．４）で置き換え、透明でガス不透過な蓋で加熱したステージをカバーし、低酸素に維持するようにアルゴンが吹き込まれる小さなチャンバーを形成して、虚血をシミュレートした。シミュレートした虚血の間、ｐＯ２を＜２．０ｍｍＨｇになるように常に測定した。再灌流をシミュレートするために、チャンバーから蓋を取り除き、緩衝液を正常酸素圧レコーディング緩衝液で置き換えた。
【０１６７】
ミトコンドリア膜電位を非クエンチモードでテトラメチルローダミン、メチルエステル（ＴＭＲＭ，Life Technologies社）を用いて測定した。このモードで、ミトコンドリアの脱分極は、ミトコンドリアから細胞質への高濃度のクエンチしたＴＭＲＭの再分配を引き起こし、低濃度は非クエンチング及び蛍光の増加をもたらす（Davidson, S. M., Yellon, D. & Duchen, M. R. Assessing mitochondrial potential, calcium, and redox state in isolated mammalian cells using confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 372, 421-430, (2007)）。３μＭ  ＴＭＲＭを含有する正常酸素圧のレコーディング緩衝液を用いて、室温で３０分間、細胞をロードした。画像化の前に、ローディング緩衝液を除き、正常酸素圧のレコーディング緩衝液で置き換えた。ＴＭＲＭ蛍光を、５４３ｎｍで励起し、発光はＬＰ５６０フィルターを用いて回収した。
【０１６８】
ＲＯＳ産生をＤＨＥの酸化により推定した。この細胞を５μＭジヒドロエチジウム（ＤＨＥ，Invitrogen社）とロードするため、ＤＨＥは正常酸素圧及び虚血状態を通して存在したままであった。ＤＨＥは３５１ｎｍで励起し、発光したシグナルはＢＰ４３５〜４８５ＩＲフィルターで得た。酸化したＤＨＥは５４３ｎｍで励起し、発光はＬＰ５６０フィルターで回収した。ＮＡＤＨの自発蛍光は３５１ｎｍで励起し、発光したシグナルはＢＰ４３５〜４８５ＩＲフィルターを用いて回収した。全ての測定した細胞パラメーターは、Fiji画像処理ソフトウェアで分析した。
【０１６９】
筋芽細胞におけるコハク酸依存性ミトコンドリアスーパーオキシド産生の評価。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を３５ｍｍガラスボトム培養ディッシュ（MatTek社）に播種し、低グルコース（１ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭで２４時間インキュベートした。画像化の２時間前に、ＤＭＥＭを取り除き、Tris baseでｐＨ７．４に調整し、２−デオキシグルコース（２５μＭ）、及びピルビン酸ナトリウム（１０ｍｇ／Ｌ又は適用があれば４μＭオリゴマイシン）を補ったイメージング緩衝液（１３２ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；４．２ｍＭ  ＫＣｌ；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １ｍＭ  ＣａＣｌ２）と置き換えた。筋芽細胞は、画像化の前に１５分間、２μＭ  MitoSOXで前もってインキュベートした。MitoSOX蛍光は、Nikon Eclipse Ti共焦点顕微鏡を用いて、３０分間温度制御ステージ上で３７℃でモニターした。MitoSOXは５１０ｎｍで励起し、発光したシグナルは、示した添加後ＬＰ５６０フィルターで回収した。
【０１７０】
虚血及び再灌流時の代謝フラックスのインシリコでの分析。心筋のミトコンドリア代謝モデルiAS253の拡張版を使用してシミュレーションを実施した（Smith, A. C. & Robinson, A. J. A metabolic model of the mitochondrion and its use in modelling diseases of the tricarboxylic acid cycle. BMC Syst. Biol. 5, 102, (2011)）。ミトコンドリアのプロテオミクスデータベースであるMitoMinerの最新版を使用して（Smith, A. C., Blackshaw, J. A. & Robinson, A. J. MitoMiner: a data warehouse for mitochondrial proteomics data. Nucleic Acids Res. 40, (2012)）、モデルをさらなるミトコンドリアの反応を含むように拡張した。MitoMinerを使用して、これらのデータをBRENDA（Chang, A., Scheer, M., Grote, A., Schomburg, I. & Schomburg, D. BRENDA, AMENDA and FRENDA the enzyme information system: new content and tools in 2009. Nucleic Acids Res. 37, D588-592, (2009)）、HumanCyc（Romero, P. et al. Computational prediction of human metabolic pathways from the complete human genome. Genome Biol. 6, R2, (2005)）、及び関連文献からの情報と相互参照することによる包含のための新しいミトコンドリアの反応を同定し、新しい反応がヒトにおいて存在し、心臓組織において発現し、ミトコンドリアマトリックスに局在することを確かめた。さらに、アミノ酸分解及び転換反応並びにプリンヌクレオチドサイクルなどのエネルギー産生に寄与することができる細胞質反応が含まれる。モデルにおける代謝物のプロトン化状態を、計算化学ソフトウェアのMarvin suite（ChemAxon Ltd社, Budapest, Hungary）を使用して計算した。次いで、反応は、ミトコンドリアマトリックス（Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhaes, P. J., Filippin, L. & Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J. Biol. Chem. 279, 11521-11529, (2004)）ではｐＨ８．０５、細胞質ではｐＨ７．３０で見出される主な小種のプロトン化状態によって荷電平衡化した。さらに、不可逆性、熱力学、並びにBRENDA及びHumanCycなど公共の情報源からの情報の通則に基づく方向性の制約が課され、容量の制約は文献（Smith, A. C. & Robinson, A. J. A metabolic model of the mitochondrion and its use in modelling diseases of the tricarboxylic acid cycle. BMC Syst. Biol. 5, 102, (2011)）から取る。最終モデルは、２２７のミトコンドリアマトリックス反応、７６の細胞質反応、２つの区画間の９１の輸送ステップ、及びシステムへのインプット及びアウトプットを表す８４の境界条件を含有する。拡張モデルは、手動で精選され、高精度のミトコンドリアのモデルであり、iAS253のように、行き止まりの代謝物は存在せず、全ての反応がフラックスを有することができる。
【０１７１】
虚血を表すために、酸素の最大取り込みを正常状態下で、そのレベルの５％に低減した（０．９９対１９．８μｍｏｌ／分／乾燥重量グラム）。再灌流を表すために、酸素レベルをその正常レベルに回復し、コハク酸、乳酸、ピルビン酸、及びＮＡＤＨの入手可能性は、これらの代謝物の虚血性蓄積を反映するように様々なレベルに増加した。ＡＴＰ合成酵素のフラックス能は最大５０％まで減少し、事実上電子伝達系の他のプロトンポンプ複合体の効率を制約することによって、ＡＴＰ合成酵素が機能する、またミトコンドリア膜の過分極をモデルするのに必要なＡＭＰからのＡＤＰ生成の遅延を表した。
【０１７２】
ミトコンドリアネットワークの代謝は、他で詳細に記載された技術であるフラックスバランス分析を用いてシミュレートした（Orth, J. D., Thiele, I. & Palsson, B. O. What is flux balance analysis? Nat. Biotechnol. 28, 245-248, (2010)）。反応フラックスを最適化するために使用する目的の機能は、最大ＡＴＰ産生である。全てのＦＢＡシミュレーションは、COBRA Toolbox（Becker, S. A. et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nat. Prot. 2, 727-738, (2007)）、線形計画解析GLPK（http://www.gnu.org/software/glpk）を備えた、MATLAB（商標）R2012b（Math Works, Inc社, Natick, MA）を使用して実行した。
【０１７３】
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【０１７４】
上記明細書に記載した全ての文献は、本明細書において参照により組み込まれる。本発明の例示的な実施形態は、本明細書において添付の図面を参照して詳細に開示されるが、本発明は精密な実施形態に限定されず、様々な変更及び改変が、添付の請求項及びその等価物によって定義される本発明の範囲を逸脱しない限り当業者によって達成できることを理解されたい。
【図１ａ−ｃ】
2017519020.tif 000009
【図１ｄｅ】
2017519020.tif 000010
【図１ｆ−ｉ】
2017519020.tif 000011
【図２ａ−ｄ】
2017519020.tif 000012
【図２ｅ】
2017519020.tif 000013
【図２ｆ−ｈ】
2017519020.tif 000014
【図３ａ−ｃ】
2017519020.tif 000015
【図３ｄ−ｆ】
2017519020.tif 000016
【図４ａ−ｃ】
2017519020.tif 000017
【図４ｄ−ｇ】
2017519020.tif 000018
【図５】
2017519020.tif 000019
【図６】
2017519020.tif 000020
【図７−１】
2017519020.tif 000021
【図７−２】
2017519020.tif 000022
【図８−１】
2017519020.tif 000023
【図８−２】
2017519020.tif 000024
【図９】
2017519020.tif 000025
【図１０】
2017519020.tif 000026
【図１１】
2017519020.tif 000027
【図１２ａ】
2017519020.tif 000028
【図１２ｂ】
2017519020.tif 000029
【図１２ｃ】
2017519020.tif 000030
【図１３】
2017519020.tif 000031
【図１４】
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【図１５】
2017519020.tif 000033
【国際調査報告】
2017519020.tif 000034
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