(57)【要約】  本発明は、対象の炎症性疾患の状態を決定する方法であって、前記対象のサンプル中の（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに対して特異性のある自己抗体の有無またはレベルを検出することを含む方法、に関する。
2017507337.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の炎症性疾患の状態を決定する方法であって、前記対象のサンプル中の（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに対して特異性のある自己抗体の有無またはレベルを検出することを含む方法。
【請求項２】
サンプルにおいて検出される（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに対して特異性のある自己抗体のレベルを一つまたは複数の基準値と比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象のサンプル中の（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに対して特異性のある自己抗体の存在が、対象が炎症性疾患であると結論づける上で十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
炎症性疾病の進行をモニターする、または対象に行った治療の有効性をモニターする方法であって、前記対象由来のサンプル中の、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体のレベルを検出すること、および、そのレベルを正常値および／または基準値と比較することを含む、方法。
【請求項５】
基準値が、対象における、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の、初期レベルである、または、対象における、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の、以前に試験した際のレベルである、またはその両方である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象により提供されるサンプル中の、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の、存在またはレベルを検出するための少なくとも一つの薬剤を含む、対象の炎症性疾患の状態の決定に使用するためのキット。
【請求項７】
さらに、シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの存在またはレベルを検出するための抗体、および／またはシトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在またはレベルを検出するためのシトルリン化テネイシンＣの抗原性フラグメントまたはペプチドをさらに含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
対象から取得したサンプル中の、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の、存在またはレベルの決定の、対象の炎症性疾患の状態を評価する手段としての使用。
【請求項９】
（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の、炎症性疾患のバイオマーカーとしての使用。
【請求項１０】
炎症性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫症状、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム動脈硬化症、シェーグレン病、糖尿病、エリテマトーデス（全身性エリテマトーデスを含む）、喘息、線維性疾患（肝硬変症を含む）、肺線維症、紫外線損傷、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、筋炎および循環器病を含む群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法、キット、または使用。
【請求項１１】
炎症性疾患が関節リウマチである、請求項１０に記載の方法、キット、または使用。
【請求項１２】
（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在が炎症性の症状の徴候である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法、キット、または使用。
【請求項１３】
（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在が関節リウマチの徴候である、請求項１２に記載の方法、キット、または使用。
【請求項１４】
サンプルが、前記対象由来の血液、血清、血漿、滑液および／または関節組織である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法、キット、または使用。
【請求項１５】
実施例および図面を参照して実質的に本明細書に記載される、炎症性疾患の状態を決定する方法。
【請求項１６】
実施例および図面を参照して実質的に本明細書に記載される、キット。
【請求項１７】
実施例および図面を参照して実質的に本明細書に記載される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性炎症におけるシトルリン化テネイシンＣおよびその活性に関する。特に、本発明は、シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣに特異性のある自己抗体の、関節リウマチのような炎症性疾患のバイオマーカーとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、病原体、組織損傷、または刺激物のような有害な刺激に対する、組織の複雑な生物学的応答である。炎症は、傷害性の刺激を取り除き、組織の治癒プロセスを開始させるための、組織による保護的な試みである。炎症に関連する異常には、種々のヒトの疾病の根底をなす、広範囲に渡る、互いに無関係な疾患のグループ（炎症性疾患）が含まれる。炎症性の側面を有する疾病の例には、（限定されないが）喘息、自己免疫病、糸球体腎炎、アレルギー（過敏症）、炎症性腸疾患、再灌流傷害、関節リウマチおよび移植片拒絶が含まれる。
【０００３】
特に、慢性炎症は、上述の多くの疾病に関連する、衰弱性の重篤な症状であり、自己免疫病で見られるように、持続性の炎症および／または免疫応答の変化を特徴とする。
【０００４】
関節リウマチ（ＲＡ）は、決して唯一の例ではないが、慢性炎症性疾患の典型例である。ＲＡは、炎症促進性サイトカインおよび細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ）の持続的な合成によって媒介される、滑膜炎および関節の軟骨や骨の破壊を特徴とする。ＴＮＦαやＩＬ−６のような炎症性サイトカインの合成を抑制する生物学的な化合物は、短期的にＲＡを治療するのに成功している。しかしながら、生物学的な化合物は反復治療を必要とし、よって高価な治療アプローチとなり、長期寛解には至らない。さらに、サイトカイン機能の完全な全身性の抑制は、感染リスクの増加のような特有の問題がないわけではない。治療の進歩にもかかわらず、長期に渡って効果的な、慢性炎症性治療の経済的方法に対する満たされていないニーズが、依然として存在する（Smolen (2006)およびWilliams (2007)）。
【０００５】
疾病の慢性化を裏打ちするメカニズムは依然として不明であり、炎症性かつ破壊性のメディエーターの長期に渡る発現を引き起こす因子は、今のところ知られていない。
【０００６】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が、ＲＡにおいて炎症性メディエーターの産生を引き起こす重要な役割を果たしており、ＴＬＲの機能の遮断が大いに臨床的に有効である可能性がある（Brentano (2005)およびO'Neill (2002）に概説されている）。
【０００７】
テネイシンＣは、組織損傷および創傷の修復に関連する、細胞外マトリクス糖タンパク質である。テネイシンＣは、胚発生の期間の活発な組織再構成の間に特異的に発現され、原腸陥入および体節形成の期間に最初に観察される。発生の後期では、発現は、乳腺および肺の分枝形態形成の部位、発生途中の骨格や循環器、上皮間葉転換の部位の結合組織に制限される。発現は、これらのプロセスが終了し、胚発生が完了する前に、負に制御される（Jones (2000)）。
【０００８】
テネイシンＣは、健康な成人の組織では通常は発現されていないが、成人では急性炎症の際に特異的かつ一過性に正に制御され、また慢性炎症においては持続的に発現される（Chiquet-Ehrismann (2003)に概説されている）。免疫組織化学の研究により、正常なヒトの関節においてテネイシンＣはほとんど発現されていないが、ＲＡの滑膜、炎症や線維症の領域、特に滑膜表層下、浸潤性のパンヌス、および血管周辺において、テネイシンＣの発現レベルは非常に大きいことが明らかになっている（Cutolo (1992）、MacCachren (1992)およびSalter (1993)）。ＲＡ患者の滑液において（Chevalier (1994)およびHasegawa (2007)）、およびＲＡの軟骨においてもまた（Salter (1993)およびChevalier (1994)）、テネイシンＣのレベルの顕著な増加がみられる。
【０００９】
テネイシンＣは、１，５００，０００ダルトンの、大きな六量体のタンパク質である。各鎖は、アセンブリドメイン（ＴＡ）、ＥＧＦ様リピート（ＥＧＦ−Ｌ）、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（fibronectin type III like repeats）（ＴＮＩＩＩ）およびフィブリノーゲン様グローブ（ＦＢＧ）を含む、複数のドメインを含んでいる（Orend(2005)に概説されている）。テネイシンＣおよびそのドメインの配列は、図１３に示した。
【００１０】
本発明者は、テネイシンＣが、関節炎で見られる破壊性の関節炎症にとって必要であり、また慢性炎症性疾患を特徴付ける炎症性応答の持続に関係する、内在性のＴＬＲ４リガンドであることを、既に明らかにしている。特に、テネイシンＣはＴＬＲ４の内在性の活性化因子であることが明らかにされており、当該分子が破壊性の関節炎症にとって必要であることが証明されている（WO 2010/103289）。
【００１１】
テネイシンＣの厳密な発現制御パターンにより、テネイシンＣは慢性炎症を診断するための魅力的な標的となっている。テネイシンＣは健康な成人にはほとんど存在しないが、組織損傷に特異的に発現が誘導される。急性炎症の際、テネイシンＣは一時的に発現される：誘導はしばしば炎症に先立って起こり、ｍＲＮＡおよびタンパク質は共に、炎症が消散した時には組織に存在しない（Chiquet-Ehrismann (2003)に概説されている）。
【００１２】
テネイシンＣの持続的な発現は、慢性炎症と関連することが、現在明らかになっている。テネイシンＣのレベルの増加は、ＲＡに加えて、多発性硬化症（Gutowski (1999)）およびシェーグレン病（Amin (2001)）を含む他の自己免疫病において、また非治癒性創傷および糖尿病性かつ静脈性の潰瘍において（Loots (1998)）、観察される。テネイシンＣの新規合成は、口腔粘膜の疾病における炎症強度とよく相関し、またテネイシンＣの血漿レベルは、薬物療法または手術の前後の炎症性腸疾患の活性に対する信頼性のある指標である（Chiquet-Ehrismann (2003)に概説されている）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者は、驚くべきことに、テネイシンＣがインビトロでシトルリン化され得ること、およびシトルリン化テネイシンＣが慢性炎症性疾患の患者に優先的に発見されることを、今回明らかにした。
【００１４】
シトルリン化は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって媒介される、アルギニン残基のシトルリンへの変換に起因する。当該翻訳後修飾は、皮膚および中枢神経系において生理学的に生じ、炎症部位において病理学的に生じる。当該変化は、タンパク質のコンフォメーション、イオン相互作用、タンパク質切断に対する感受性に、大きく影響を与える。シトルリン化によってまた、特異的な抗体を産生させる新規のエピトープが作り出される。シトルリン化タンパク質に対する抗体（ＡＣＰＡ）は、特異的にシトルリン化タンパク質抗原を認識する。さらに、シトルリン化によって作り出されたエピトープはまた、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｔ細胞受容体、および自然免疫系の特異的リガンドへのタンパク質の結合を決定しうる（６７）。
【００１５】
ＡＣＰＡはＲＡ患者において見出されており、このことが当該疾病を診断する一つの方法である。さらに最近になって、ＡＣＰＡが当該疾病を活発に促進することもまた、明らかになってきている。しかしながら、ＡＣＰＡが認識するタンパク質は十分に特徴付けられていない。これまでのところ、ＲＡ滑液中で同定され、エピトープマッピングされ、複数の研究室で抗体の特異性が再現性よく確認されているシトルリン化抗原（６７）は、フィブリノーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ビメンチンおよびα−エノラーゼに限られる。
【００１６】
本発明者は既に、シトルリン化α−エノラーゼを、ＲＡの自己抗原として同定し、診断および病因の両方において、シトルリン化α−エノラーゼの重要性を証明した（６８−７４）。他のグループの最近のデータにより、ＡＣＰＡとその抗原もまた、病因に積極的に寄与していることが示唆されている。例えばシトルリン化フィブリノーゲン含有免疫複合体は、実験マウスの関節炎を強め（７５、７６）、ヒト単核球のＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）およびＦｃγ受容体の活性化により、サイトカイン合成を相乗的に促進する（７７、７８）。
【００１７】
ＲＡ患者において、フィブリノーゲンがシトルリン化されるていること、またシトルリン化された形態のフィブリノーゲンに対する抗体が存在することが、長い間知られている。Sokolove (2011) （１６）によって、フィブリノーゲンは、シトルリン化されると、天然のフィブリノーゲンよりも優れたＴＬＲ４の活性化因子であること、およびシトルリン化フィブリノーゲンは、相乗的なＴＬＲ−Ｆｃγ受容体シグナル伝達を介して炎症を活性化させる抗体と複合体を形成することが明らかにされている。このように、フィブリノーゲンタンパク質の修飾は、ＲＡの炎症を悪化させる。
【００１８】
本発明者は既に、炎症促進性糖タンパク質テネイシンＣを、自然免疫応答および適応免疫応答の内在性活性化因子として同定し、テネイシンＣの発現がインビボでの慢性関節炎に必要であることを示した（７９、８０）。さらに、高レベルのテネイシンＣが、ＲＡの滑膜（８１）および血清（８２）に見られた。WO2013/088140では、炎症性疾患のバイオマーカーとしてのテネイシンＣの利用、特に、びらん性ＲＡのバイオマーカーとしてのテネイシンＣの利用について述べている。
【００１９】
しかしながら、テネイシンＣがシトルリン化され得ること、当該シトルリン化がテネイシンＣの炎症促進性活性を調節し得ること、シトルリン化テネイシンＣが自己抗原であり得ることは、いずれも、これまで考慮していなかった。
【００２０】
本発明者は、全長テネイシンＣ、およびＦＢＧドメインを含む個々のドメイン（ＦＢＧドメインに限らない）が、インビトロでシトルリン化によって翻訳後修飾され得ることを、今回明らかにした。本発明者は、シトルリン化ＦＢＧが、初期のヒトマクロファージによるサイトカイン合成を、天然のＦＢＧよりも良好に刺激することを示す。本発明者は、ＲＡ患者のみがシトルリン化テネイシンＣを認識する抗体を持っており、健常対照は持っていないこと、また、ＲＡ患者および健常対照由来の血清が、天然の、すなわち非シトルリン化のテネイシンＣと反応しないことを明らかにした。本発明者はまた、ＲＡ患者において、ＦＢＧドメインと併せて、他のテネイシンＣのドメインがシトルリン化されることもまた、示す。
【００２１】
これは、テネイシンＣがシトルリン化されることについての最初の発見であり、テネイシンＣの当該修飾がＲＡと関連していることについての最初の証明である。本発明者はシトルリン化が、テネイシンＣがＲＡにおいて炎症を引き起こす、少なくとも三つの主要な新規のメカニズムを提供して、テネイシンＣの炎症性の能力を高めるよう作用することもまた、示している。シトルリン化抗原、すなわちテネイシンＣの炎症促進性効果は、重要な発見である。なぜなら、本発見は、ＡＣＰＡ含有テネイシンＣ免疫複合体の、抗体成分（例えば、Ｆｃγ受容体シグナル伝達による）および抗原成分（例えば、ＴＬＲシグナル伝達による）の両方が炎症促進性であることを示しているからである。従って、シトルリン化テネイシンＣ単独、シトルリン化テネイシンＣの自己抗体単独、またはシトルリン化テネイシンＣ−抗体複合体が、疾病において炎症を引き起こすことができる。
【００２２】
さらにより驚くべき事に、本発明者は、ＦＢＧ−Ｃにおいて、シトルリン化され、ＡＣＰＡの標的であるアミノ酸が、フィブリノーゲンの領域のホモログでないことを見出した。各タンパク質中の同じ配列が修飾されると予測されるため、このことは驚くべきことである。
【００２３】
従って、ＦＢＧドメインを含むテネイシンＣのドメインがＲＡにおいてシトルリン化されていること、またシトルリン化テネイシンＣに対する抗体がＲＡ患者において優先的に発見されることが、今回初めて明らかとなった。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の第一の局面に従えば、対象の炎症性疾患の状態を決定する方法であって、前記対象由来のサンプル中において、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／または一つまたは複数のシトルリン化テネイシンＣのフラグメントに特異性のある自己抗体の有無またはレベルを検出することを含む方法、が提供される。
【００２５】
炎症性疾患は、不適切な炎症と関連するいずれの症状を伴ってもよい。当該疾患は、限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫症状、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム動脈硬化症、シェーグレン病、糖尿病、エリテマトーデス（全身性エリテマトーデスを含む）、喘息、線維性疾患（肝硬変症を含む）、肺線維症、紫外線損傷、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、筋炎および循環器病を含む。
【００２６】
他を排除するわけではないが、特に、本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）に関連する慢性炎症に、関係している。
【００２７】
「炎症性疾患の状態」という表現は、炎症性疾患の識別可能ないずれの徴候も含み、限定されないが、炎症性疾患の有無、炎症性疾患の発症リスク、炎症性疾患のステージ、炎症性疾患の進行、炎症性疾患への治療に対する対象における有効性または応答、を含む。
【００２８】
好ましい実施形態において、言及される炎症性疾患は関節リウマチであり、本発明の方法によって、限定されないが、関節リウマチの有無、関節リウマチの発症リスク、関節リウマチのステージ、関節リウマチの進行、関節炎の寛解、関節リウマチの最も可能性の高い治療、および関節リウマチの治療に対する対象における有効性または応答、の測定を可能にする。
【００２９】
例えば、本発明の方法は、以下の目的のうちの任意の一つまたは複数のために、使用してもよい：対象の関節リウマチを診断すること；対象が関節リウマチを発症する確立を評価すること；関節リウマチである対象の予後について助言すること；疾病の進行をモニターすること；治療の選択肢について助言すること、および対象の関節リウマチの治療に対する有効性または応答をモニターすること。
【００３０】
好ましくは、本方法は、対象によって提供されたサンプル中の、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の有無またはそのレベルの解析から、対象の関節リウマチを診断することを可能にする。本方法は、他の関節リウマチの症状がなくても、関節リウマチの診断を対象に行うことを可能にしうる。
【００３１】
サンプル中のシトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントの存在、および所望によりそのレベルは、任意の最適なアッセイによって測定されてよく、任意の最適なアッセイには、免疫測定法、分光法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、スロットまたはドットブロットアッセイ、等電点電気泳動法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗体マイクロアレイ免疫組織染色、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定、アビジン−ビオチンまたはストレプトアビジン−ビオチンシステムを用いた免疫測定法などを含む群のいずれかの方法、またはこれらの組み合わせの利用が含まれてもよい。これらの方法は当業者には十分知られている。
【００３２】
サンプル中のシトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントの存在、および所望によりそのレベルは、天然のテネイシンＣに結合しない、シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異的な抗体を用い、その後例えばＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロットによって免疫測定することにより、決定してもよい。血清または組織／細胞のいずれかにおいて、免疫測定は好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡである。すなわち、シトルリン化テネイシンＣ（ｃｉｔＴＮＣ）抗体を捕捉抗体として使用し、その後血清／組織可溶化液を最適な希釈液として添加し、その後別のｃｉｔＴＮＣ二次抗体を検出のために使用する。いずれの標準的なＥＬＩＳＡプロトコールにもあるように、二次抗体は、検出または間接的検出のために標識することができる。二つの異なる好適なｃｉｔＴＮＣ抗体が見つけられない場合は、プレート上の血清／組織可溶化液およびここに直接添加した抗体から構成される、ＥＬＩＳＡの直接法を使用する。あるいは、非シトルリン化−ＴＮＣ抗体を捕捉のために使用してもよく、シトルリン化−ＴＮＣ抗体を検出のために使用してもよい。あるいは逆も同様である。
【００３３】
ある実施形態において、天然のＴＮＣとシトルリン化ＴＮＣの比が測定されてもよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチに対して予測的または診断的である、シトルリン化ＴＮＣと天然のＴＮＣの比は、少なくとも１：２であってよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣと天然のＴＮＣの比は、少なくとも１：１であってよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣと天然のＴＮＣの比は、少なくとも２：１であってよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣと天然のＴＮＣの比は、少なくとも５：１であってよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣと天然のＴＮＣの比は、少なくとも１０：１であってよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣと天然のＴＮＣの比は、少なくとも１００：１であってよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣのレベルは、血清または血漿中２０ｎｇ／ｍｌを超えるレベルであってよい。ある実施形態において、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣのレベルは、血清または血漿中２５ｎｇ／ｍｌを超えるレベルであってよい。あるいは、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣのレベルは、血清または血漿中３１ｎｇ／ｍｌを超えるレベルであってよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣのレベルは、血清または血漿中３３ｎｇ／ｍｌを超えるレベルであってよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣのレベルは、血清または血漿中のｃＴＮＣにおいて、正常なサンプルのｃＴＮＣのレベルと比較して、５０％を超えて増加したレベルであってよい。関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチの予測的または診断的な、シトルリン化ＴＮＣのレベルは、血清または血漿中のｃＴＮＣにおいて、正常なサンプルのＴＮＣのレベルと比較して、５０％を超えて増加したレベルであってよい。例えば、正常なサンプルは非ＲＡ患者または非びらん性ＲＡ患者由来のサンプルから測定された値であってよい。あるいは、正常なサンプルは、ＲＡまたはびらん性ＲＡを患う前の同じ患者のサンプルから測定された値であってよい。
【００３４】
ある実施形態において、シトルリン化ＴＮＣに対する自己抗体の存在を測定することは、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチに対して予測的または診断的であり得る。あるいは、シトルリン化ＴＮＣに対する自己抗体の存在が少なくとも５０％増加することは、関節リウマチ、特にびらん性関節リウマチに対して予測的または診断的であり得る。
【００３５】
あるいは、テネイシンＣおよび／またはテネイシンＣのフラグメントは免疫沈降されてもよく、その後、テネイシンＣがシトルリン化されているかどうかを測定するために、ウエスタンブロッティングまたはマススペクトロメトリーが用いられてもよい。
【００３６】
シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣのフラグメントに対して特異性を有する自己抗体を含むサンプルは、実施例に記載したように、ＲＡ血清によるウエスタンブロッティングを用いて測定されてもよい。
【００３７】
あるいは、テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣのフラグメントにおいてシトルリン化された残基は、より明確にされてもよく、従ってペプチドアッセイが作成されてもよい（上記のようなウエスタンブロット、および／またはＥＬＩＳＡ法のいずれか）。シトルリン化されたペプチドのみが作成され、コントロールとして、非シトルリン化ペプチドが作成される。プレートはペプチドでコーティングされ、ＲＡ血清がアプライされ、抗体を検出するために使用される（詳細な方法は、Lundberg (2008)参照）。アッセイに用いられるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、残基５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２を含む群のいずれか；またはその組み合わせ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択されるシトルリン化残基を含む、任意のテネイシンＣペプチドを含んでもよい。アッセイに用いられるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、残基５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０を含む群のいずれか；またはその組み合わせから選択されるシトルリン化残基を含む、任意のテネイシンＣペプチドを含んでもよい。ある実施形態において、当該ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ５５ｌ、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、および／またはＣＩＴ２２０を含んでもよい。ある実施形態において、当該ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ５０を含んでもよい。ある実施形態において、当該ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ５１を含んでもよい。ある実施形態において、当該ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ５５を含んでもよい。あるいは、当該ペプチドは為シトルリン化残基ＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含んでもよい。あるいは、当該ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含んでもよい。あるいは、当該ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ２２２を含んでもよい。上記ペプチドの組み合わせもまた、プールとして使用してもよい。同配列に対応する非シトルリン化ペプチドをアッセイコントロールとして、使用してもよい。
【００３８】
シトルリン化テネイシンＣペプチド、またはそのフラグメントは、ペプチドアッセイに使用するために、例えば抗体認識を助ける目的で、ループ状または環状の構造をとってもよい。
【００３９】
ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、ＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ７２、ＣＩＴ１２０、ＣＩＴ１６９、ＣＩＴ１７３、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２０およびＣＩＴ２２２から選択される一つまたは複数のシトルリン化残基；またはその組み合わせを有する、配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。あるいは、ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ７２、ＣＩＴ１２０、ＣＩＴ１６９、ＣＩＴ１７３、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、およびＣＩＴ２２０から選択される一つまたは複数のシトルリン化残基；またはその組み合わせを有する、配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ５０を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ５１を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ５５を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ７２を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ１２０を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ１６９を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ１７３を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン残基ＣＩＴ２０９を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ２１４を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ２１９を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ２２０を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに使用する、シトルリン化テネイシンＣペプチドまたはそのフラグメントは、シトルリン化残基ＣＩＴ２２２を有する配列番号７０の一部の配列を含んでもよい。互いに異なるシトルリン化残基を有する、配列番号７０の二つ以上の異なるフラグメントを使用してもよい。配列番号７０のフラグメントまたは配列はまた、その変異体を含んでもよい。例えば、ある変異体は、配列番号７０由来の配列に加えて、付加的なアミノ酸残基または修飾を有してもよい。
【００４０】
シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約５〜約２５の連続したアミノ酸残基を含んでもよい。シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約１０〜約２５の連続したアミノ酸残基を含んでもよい。シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約１５〜約２５の連続したアミノ酸残基を含んでもよい。シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約１８〜約２２の連続したアミノ酸残基を含んでもよい。シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約８〜約２０の連続したアミノ酸残基を含んでもよい。
【００４１】
例えば、ペプチドアッセイに用いられるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３および配列番号６４；またはその変異体を含む群のいずれかおよび／またはその組み合わせから選択されるペプチド配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに用いられるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号５５またはその変異体のペプチド配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに用いられるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号５７またはその変異体のペプチド配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに用いられるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号５９またはその変異体のペプチド配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに用いられるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号６１またはその変異体のペプチド配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに用いられるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号６３またはその変異体のペプチド配列を含んでもよい。ペプチドアッセイに用いられるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号６４またはその変異体のペプチド配列を含んでもよい。
【００４２】
前記対象由来のサンプル中の、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在は、対象が炎症性疾患を有すると結論付けるのに十分であろう。
【００４３】
本発明の方法は、サンプルにおける（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の測定レベルを、一つまたは複数の基準値と比較するステップをさらに含んでもよい。
【００４４】
好ましくは、シトルリン化テネイシンＣまたはそのフラグメント、および／またはシトルリン化テネイシンＣまたはそのフラグメントに特異性のある自己抗体の測定レベルと比較される基準値は、関節リウマチのような検出可能な炎症性疾患、または関節リウマチのような炎症性疾患の臨床症状を、いずれも有さず、かつ、シトルリン化テネイシンＣまたはそのフラグメント、および／またはシトルリン化テネイシンＣまたはそのフラグメントに特異性のある自己抗体がいわゆる「正常値」である、一人または複数の対象において観察される、シトルリン化テネイシンＣまたはそのフラグメント、および／またはシトルリン化テネイシンＣまたはそのフラグメントに特異性のある自己抗体のレベルである。
【００４５】
さらなる実施形態において、シトルリン化テネイシンまたはそのフラグメントの、天然のテネイシンＣに対する比が、考慮および比較されてもよい。
【００４６】
あるいは、シトルリン化テネイシンＣまたはそのフラグメントおよび／またはシトルリン化テネイシンＣに特異性のある自己抗体またはそのフラグメントの測定レベルと比較される基準値は、特定の対象について以前に取得した値であってもよい。本方法が疾病の進行をモニターするため、または特定の治療に対する対象の応答をモニターするために用いられるのであれば、この種の基準値が使われてもよい。
【００４７】
（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の、存在またはレベルは、患者を分類するために使用されてもよい。このような分類が、適当な治療を決定するために使用されてもよい。例えば、シトルリン化テネイシンＣまたはそのフラグメントにおいて、特異的なシトルリン化残基を検出することによって、患者を分類してもよい。患者は、ＣＩＴ５５陽性（すなわち、配列番号７０の残基５５がシトルリン化されている）であってもよい。さらに、または、あるいは、患者はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４陽性であってもよい。患者は、ＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０陽性であってもよい。いくつかの実施形態において、患者はＣＩＴ５５、ＣＩＴ７２、ＣＩＴ１２０、ＣＩＴ１６９、ＣＩＴ１７３、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、およびＣＩＴ２２０陽性であってもよく；これらのシトルリン化残基の組み合わせに陽性であってもよい。他の実施形態において、患者はＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ７２、ＣＩＴ１２０、ＣＩＴ１６９、ＣＩＴ１７３、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２０およびＣＩＴ２２２陽性であってもよく；これらのシトルリン化残基の組み合わせに陽性であってもよい。それゆれ、ある実施形態において、患者の特異的残基のシトルリン化を測定する。患者の一つまたは複数の特異的残基５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および／または２２２（配列番号７０に従って番号付けした残基）のシトルリン化を測定してもよい。あるいは、患者の一つまたは複数の特異的残基５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９および／または２２０（配列番号７０に従って番号付けした残基）のシトルリン化を測定してもよい。
【００４８】
あるいは、または、さらに、自己抗体を検出する実施形態において、自己抗体のエピトープは、特異的なシトルリン化残基、例えば、一つまたは複数のＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ７２、ＣＩＴ１２０、ＣＩＴ１６９、ＣＩＴ１７３、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２０およびＣＩＴ２２２；または一つまたは複数のＣＩＴ５５、ＣＩＴ７２、ＣＩＴ１２０、ＣＩＴ１６９、ＣＩＴ１７３、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、およびＣＩＴ２２０を有することに基づいて、区別される。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ５０を有することに基づいて、区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ５１を有することに基づいて、区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ５５を有することに基づいて、区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ７２を有する事に基づいて、区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ１２０を有することに基づいて区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ１６９を有することに基づいて、区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ１７３を有することに基づいて、区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ２０９を有することに基づいて、区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン残基ＣＩＴ２１４を有することに基づいて、区別されてもい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ２１９を有することに基づいて、区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ２２０を有することに基づいて、区別されてもよい。自己抗体のエピトープは、特異的シトルリン化残基ＣＩＴ２２２を有することに基づいて、区別されてもよい。
【００４９】
様々なシトルリン化または関連エピトープの存在は、ｃｉｔＦＢＧをいかに標的とするかを明確にすることができる。例えば、ＣＩＴ５５が検出されれば、ＦＢＧの免疫原性活性を治療薬によってブロックできるであろう。インテグリン結合部位がシトルリン化されていれば（例えばＣＩＴ１６９および／またはＣＩＴ１７３）、当該ドメインの作用を治療薬によってブロックできるであろう。
【００５０】
本発明の方法はまた、関節リウマチのような炎症性疾病の進行をモニターするために、および／または対象に行った治療の有効性をモニターするために、用いられてもよい。このことは、対象から得られたサンプルを、最初の診断後の様々な時点で解析し、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体のレベルの変化をモニターし、これらのレベルを正常値および／または基準値と比較することによって達成されてもよい。この場合、基準値は、対象のシトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメント、および／またはシトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の初期レベルを含んでもよく；または、対象のシトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメント、および／またはシトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の最後に試験した際のレベルを含んでもよく、またはその両方を含んでもよい。
【００５１】
本発明の方法はまた、対象に対する適切な治療を決定するために用いられてもよい。本方法は、オーダーメイド医療の解決策を提供するために用いられてもよい。ある実施形態において、サンプル中のｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在が、関節リウマチのような炎症性疾患の診断をもたらすのに十分であり、最適な治療とは何かを示すのに用いられうる。
【００５２】
抗ＴＮＦ薬；抗ＩＬ１７治療；Ｔ細胞同時刺激修飾薬（例えばOrencia(商標)−アバタセプト）：インターロイキン６（ＩＬ−６）阻害薬（例えばActemra(商標)−トシリズマブ）；抗ＣＤ２０抗体（例えばRituxan(商標)−リツキシマブ）；Ｂ細胞活性化因子（例えば抗ＢＡＦＦ）、のうち一つまたは複数の治療的に有効な量を使用することは、対象が、対象由来のサンプル中にｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体を有していれば、適しているであろう。他の代替可能な治療には、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害薬（例えばTofacitinib(商標)）、脾臓チロシンキナーゼ（Syk）阻害薬（例えばFostamatinib(商標)）、抗ＴＮＣ抗体またはシトルリン化テネイシンＣドメインの抗体が含まれる。
【００５３】
あるいは、または、さらに、治療は、シトルリン化テネイシンＣまたはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントの生物学的活性を調節する薬剤の治療的に有効な量を投与することであってもよい。薬剤は、シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの生物学的活性を、次のうちの一つまたは複数の方法で、調節してもよい：
・シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの、一つまたは複数の物理的特性を変化させること；
・シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの、結合特性を変化させること：
・シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの、抗原性を変化させること；
・シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの、シトルリン化のレベルを変化させること；
・非シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントに対する、シトルリン化テネイシンＣの比を変化させること、例えば一つまたは複数の特異的ドメイン（例えばＦＢＧドメイン）のシトルリン化を変化させること；
・テネイシンＣまたはそのフラグメントの、一つまたは複数の特異的シトルリン化残基を、非シトルリン化残基の形態に変化させることであって、特異的シトルリン化残基は、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０残基を含む群のいずれか；またはその組み合わせから選択されてもよい；または、
・テネイシンＣまたはそのフラグメントの、一つまたは複数の特異的シトルリン化残基を、非シトルリン化残基の形態に変化させることであって、特異的シトルリン化残基は、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２残基を含む群のいずれか；またはその組み合わせから選択されてもよい。
【００５４】
特異的シトルリン化残基は、一つまたは複数のＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９およびＣＩＴ２２０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ５０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ５１を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ５５を含んでもよい。ある実施形態において、特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含んでもよい。あるいは、特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ２２２を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、エピトープの形態で検出されてもよい。例えば、本方法は、エピトープの検出を含んでもよく、エピトープはＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９およびＣＩＴ２２０から選択される少なくとも一つのシトルリン化残基；またはその組み合わせを含む。エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５０を含んでもよい。エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５１を含んでもよい。エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５５を含んでもよい。エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２０９を含んでもよい。エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１４を含んでもよい。エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１９を含んでもよい。エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２０を含んでもよい。エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２２を含んでもよい。
【００５５】
シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの生物学的活性を調節する薬剤は、シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの生物学的活性を、下方制御または上方制御してもよい。
【００５６】
シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの生物学的活性を調節する薬剤は、テネイシンＣのシトルリン化の阻害薬；または、シトルリン化テネイシンＣの結合特性の阻害薬；または、シトルリン化テネイシンＣの競合的結合の阻害薬であってもよい。
【００５７】
シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの生物学的活性を調節する薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体４および／またはＦｃγ受容体のアンタゴニストであってもよい。
【００５８】
シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの生物学的活性を調節する薬剤は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、シトルリン化テネイシンＣに結合親和性を持つ化合物、抗体（ポリクローナル、またはモノクローナル）およびその抗原結合性フラグメント、阻害薬の低分子化合物、シトルリン化テネイシンＣまたはその変異体のドメイン、ポリペプチドおよびタンパク質からなる群から選択されてもよい。薬剤が抗体または抗原結合性フラグメントである場合、薬剤はＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、シトルリン化テネイシンＣもしくはそのフラグメント／ドメインに特異性があってもよく；またはシトルリン化テネイシンＣのＦＢＧドメインに結合親和性があってもよい。
【００５９】
シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの生物学的活性を調節する薬剤は、シトルリン化テネイシンＣのＦＢＧドメインの生物学的活性を調節してもよい。
【００６０】
シトルリン化テネイシンＣまたはその一つまたは複数のフラグメントの生物学的活性を調節する薬剤は、少なくともＦＢＧドメインがシトルリン化された；ＦＢＧドメインのみがシトルリン化された；またはＦＢＧドメインの他に一つまたは複数のドメインがシトルリン化された（例えばフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（fibronectin type III like repeats））、シトルリン化テネイシンＣの活性を調製してもよい。シトルリン化テネイシンＣまたはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントは、一つまたは複数の特異的残基でシトルリン化されてもよく、特異的残基は、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０、２２２残基（配列番号７０から決定される残基番号）を含む群のいずれか；またはその組み合わせから選択されてもよい。シトルリン化テネイシンＣまたはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントは、一つまたは複数の特異的残基でシトルリン化されてもよく、特異的残基は５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０（配列番号７０から決定される残基番号）を含む群のいずれか；またはその組み合わせから選択されてもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、および／またはＣＩＴ２２０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ５０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基はＣＩＴ５１を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ５５を含んでもよい。ある実施形態において、特異的シトルリン化残基はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含んでもよい。あるいは、特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ２２２を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、エピトープの形態で検出されてもよい。例えば、本方法は、エピトープの検出を含んでもよく、エピトープは、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９およびＣＩＴ２２０から選択される少なくとも一つのシトルリン化残基；またはその組み合わせを含む。あるいは、本方法は、エピトープの検出を含んでよく、エピトープはＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２およびＣＩＴ２２２から選択される少なくとも一つのシトルリン化残基；またはその組み合わせを含む。エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５０を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ５１を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ５５を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ２０９を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ２１４を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ２１９を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ２２０を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ２２２を含んでもよい。
【００６１】
サンプルは、対象由来の血液、血清、血漿、滑液および／または関節組織のサンプルであってもよい。
【００６２】
好ましくは、本発明の方法は、インビトロで行われる。
【００６３】
対象は哺乳類であってよく、好ましくはヒトであるが、代わりにサル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギまたはげっ歯類であってもよい。
【００６４】
対象の炎症性疾患の状態に関する情報は、医者、他の医療従事者、薬剤師、または他の関係者のような第三者に伝達されてもよい。当該情報は、例えば電子メール、ＳＭＳ、または他のデジタル手段のような、デジタルな方法で、伝達されてもよい。
【００６５】
本発明の別の局面によると、対象によって提供されたサンプル中の（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在またはレベルを検出するための少なくとも一つの薬剤を含む、対象の炎症性疾患の状態の決定に使用するためのキットが提供される。
【００６６】
好ましい実施形態において、当該キットは、対象の関節リウマチの状態を決定するために使用する。
【００６７】
シトルリン化テネイシンＣまたはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントの、存在またはレベルを検出／測定するのであれば、薬剤は抗体であってもよい。あるいは、シトルリン化テネイシンＣまたはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在またはレベルを検出／測定するのであれば、薬剤はシトルリン化テネイシンＣ、またはシトルリン化テネイシンＣの抗原性のフラグメントもしくはペプチドであってもよい。あるいは、抗体が、シトルリン化テネイシンＣまたはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の、存在またはレベルを決定するのに使われてもよい。
【００６８】
キットは、適切な操作上のパラメーターの説明書を、ラベルまたは折り込みの形態で含んでもよい。説明書は、使用者に、サンプルの収集方法について情報を与えてもよい。
【００６９】
キットは、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体、キャリブレーションおよび比較の基準として使用するサンプルを含んでもよい。キットはまた、サンプル中において検出された（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体のレベルと、キャリブレーションサンプルまたはチャートとを比較するための説明書を含んでもよい。キットはまた、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体のどのレベルが炎症性疾患の徴候であるかを示す説明書を含んでもよい。説明書は、いかなる（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在が炎症性疾患の徴候であることを示してもよい。
【００７０】
よりさらなる局面によると、本発明は、対象から得られたサンプル中のｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在またはレベルの決定の、対象の炎症性疾患の状態を評価する手段としての利用を提供する。サンプルは、血液、血清、血漿、滑液および／または関節組織であってもよい。
【００７１】
好ましい実施形態において、本発明は、血液または血清中の（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在またはレベルの決定の、個体における関節リウマチの状態を評価する手段としての利用を提供する。
【００７２】
別の局面によると、本発明は（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の、炎症性疾患のバイオマーカーとしての利用を提供する。
【００７３】
さらなる局面によると、本発明は、炎症性疾患を有する対象に対して適切な治療を決定する方法に用いられる、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体を提供する。
【００７４】
さらなる局面によると、本発明は、以下を含むアッセイを提供する：
ｉ）患者の関節リウマチの可能性を決定するために、関節リウマチの症状を少なくとも一つ示す患者のサンプルにおいて、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在を測定すること；および
ｉｉ）（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体がサンプルに存在した場合、患者が関節リウマチの可能性があることが示唆されると結論付けること。
【００７５】
本発明の該局面のアッセイは、患者のサンプル中の（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体のレベルを測定するステップ、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の測定もしくは定量した量を、基準値と比較するステップ、および（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の量が基準値と比較して増加していれば、対象が関節リウマチである確率が上昇していると同定するステップを含んでもよい。好ましくは、基準値は、関節リウマチでないコントロールの対象由来である。
【００７６】
本発明は、対象由来のサンプル中の（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在またはレベルを検出すること、および観察される（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在またはレベルに基づいた治療を行うこと、を含む対象の炎症性疾患を治療する方法を提供してもよい。
【００７７】
本発明のさらなる局面によると、炎症性疾患を有する対象に対する適切な治療を決定する方法が提供される。
【００７８】
ある実施形態において、本方法は以下のステップを含む：
（ｉ）対象由来のサンプルを提供すること；および
（ｉｉ）（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在についてサンプルを試験すること、ここで、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の有無が、適切な治療を示唆する。
【００７９】
好ましい実施形態において、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在によって、有効な量の薬剤または組成物が対象に投与されるべきであることが決定する。薬剤または組成物は、抗ＴＮＦ薬；抗ＩＬ１７治療；Ｔ細胞同時刺激修飾薬（例えばOrencia(商標)−アバタセプト）：インターロイキン６（ＩＬ−６）阻害薬（例えばActemra(商標)−トシリズマブ）；抗ＣＤ２０抗体（例えばRituxan(商標)−リツキシマブ）；Ｂ細胞活性化因子（例えば抗ＢＡＦＦ）；ヤヌスキナーゼ阻害薬（ＪＡＫ）（例えばTofacitinib(商標)）；脾臓チロシンキナーゼの阻害薬（Ｓｙｋ）（例えばFostamatinib(商標)）；抗ＴＮＣ抗体またはシトルリン化テネイシンＣドメインの抗体、およびシトルリン化および／または非シトルリン化テネイシンＣの生物学的活性を調節する薬剤のうちの一つまたは複数であってもよい。
【００８０】
本発明はまた、以下を含む、対象の炎症性疾患を治療する方法を提供してもよい；
ｉ）対象からサンプルを取得すること；
ｉｉ）サンプルの（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の有無を解析すること；
ｉｉｉ）（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体が存在すれば、対象を炎症性疾患であると診断すること；および
ｉｖ）診断を行った対象に対して抗炎症性治療を行うこと。
【００８１】
炎症性疾患は、本明細書に記載されている通りであってよく、例えば、関節リウマチであってよい。
【００８２】
抗炎症性治療は、本発明の任意の局面または実施形態を参照して本明細書に記載されているいずれの治療であってよい。
【００８３】
別の局面によると、本発明は、以下を含む、炎症性疾患の治療対象を選択する方法を提供する：
ｉ）対象からサンプルを取得すること；
ｉｉ）サンプルの（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の有無またはレベルを解析すること；
ｉｉｉ）（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体が存在する、または正常なコントロールと比較して上昇している場合、炎症性疾患の治療対象として選択すること。
【００８４】
さらなる局面によると、本発明は、対象の炎症状態を決定する装置を提供し、当該装置は、対象の炎症状態を示す外部信号を発することができる。好ましくは、装置は対象から取得したサンプルを受け入れることができ、サンプルの（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の存在を解析することができ；その後、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント；および／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体がサンプル中に検出された場合に、外部信号を発することができる。外部信号は、可聴ノイズ、視覚変化、プリントアウト、ユーザーへのデジタルメッセージ、ユーザーまたは第三者への電子メール、または他の任意の好適なシグナルの形態であってもよい。
【００８５】
本発明の方法、キット、アッセイまたは装置において、シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントの有無またはレベルを検出することは、一つまたは複数の特異的シトルリン化残基を含む、テネイシンＣまたはそのフラグメントを検出することを含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２残基（配列番号７０から決定される残基番号）を含む群のいずれか；またはその組み合わせから選択されてもよい。あるいは、特異的シトルリン化残基は、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０残基（配列番号７０から決定される残基番号）を含む群のいずれか；またはその組み合わせから選択されてもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基はＣＩＴ５０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基はＣＩＴ５１を含んでもよい。特異的シトルリン化残基はＣＩＴ５５を含んでもよい。ある実施形態において、特異的シトルリン化残基はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含んでもよい。あるいは、特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基はＣＩＴ２２２を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、エピトープの形態で検出されてもよい。例えば、本方法は、エピトープの検出を含んでもよく、エピトープは、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９およびＣＩＴ２２０から選択される少なくとも一つのシトルリン化残基；またはその組み合わせを含む。エピトープは、ＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２０およびＣＩＴ２２２から選択される少なくとも一つのシトルリン化残基；またはその組み合わせを含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ５０を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ５１を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ５５を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ２０９を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ２１４を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ２１９を含んでもよい。エピトープは、シトルリン化残基ＣＩＴ２２０を含んでもよい。シトルリン化残基ＣＩＴ２２２を含んでもよい。
【００８６】
本発明の方法、キット、アッセイまたは装置において、シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメントに特異性のある自己抗体の有無またはレベルを検出することは、一つまたは複数の特異的シトルリン化残基を含むエピトープに特異的親和性を持つ自己抗体を検出することを含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２残基（配列番号７０から決定される残基番号）を含む群のいずれか；またはその組み合わせから選択されてもよい。あるいは、特異的シトルリン化残基は、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０残基（配列番号７０から決定される残基番号）を含む群のいずれか；またはその組み合わせから選択されてもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基は、ＣＩＴ５０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基はＣＩＴ５１を含んでもよい。特異的シトルリン化残基はＣＩＴ５５を含んでもよい。ある実施形態において、特異的シトルリン化残基はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含んでもよい。あるいは、特異的シトルリン化残基はＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含んでもよい。特異的シトルリン化残基はＣＩＴ２２２を含んでもよい。
【００８７】
当業者は、本発明のいずれか一つの実施形態および／または局面の好ましい特徴が、本発明の他の全ての実施形態および／または局面に適用されうることは、理解するであろう。
【００８８】
定義
「炎症」とは、組織損傷、感染、または局所免疫応答によって惹起される、体液、血漿タンパク質、および白血球の局所的蓄積という意味を含む。
【００８９】
「急性炎症」とは、炎症の初期段階（initiation）および、損傷、感染または局所免疫応答の直後の、短期間で一過性の炎症性応答という意味を含む。典型的には、急性炎症は迅速に消散し、わずか数分から長くても数日の持続である。
【００９０】
「慢性炎症」とは、持続性のおよび／または非消散性の炎症という意味を含む。慢性炎症は、しばしば健常な組織の不適切な破壊と関連している。慢性炎症は進行性であってよく、数週間もしくはそれ以上の期間を超えて続いてもよい。慢性炎症は、典型的には、限定されないが、自己免疫症状を含む、持続性の感染症または疾病と関連している。
【００９１】
「慢性関節炎」とは、数週間から数ヶ月の間、進行し、軽減されることなく、ヒトの疾病で観察されるように、発症している関節のゆがみを引き起こしたり、Ｘ線検査によって証明される軟骨や骨の破壊を引き起こす、持続性の炎症の意味を含む（Kelly, Harris, Ruddy and Sledge, Textbook of Rheumatology 4th Edition）。
【００９２】
実験マウスモデルにおいて、慢性関節炎は、鎮静しない炎症によって特徴づけられ、比較的短期間で、不適切な組織破壊を引き起こす。慢性関節炎は、滑膜、および関節腔に炎症性細胞が長く存在すること、軟骨細胞の死、および軟骨びらんと骨びらんによって、組織学的に特徴づけられる（および同定することができる）。
【００９３】
「薬剤」とは、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬および小分子化合物のような、全ての化学物質を含む。
【００９４】
「シトルリン化」とは、タンパク質中の一つまたは複数のアルギニンアミノ酸をシトルリンアミノ酸に変換することを意味する。
【００９５】
「シトルリン化テネイシンＣのフラグメント」または「シトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数のフラグメント」とは、シトルリン化テネイシンＣ由来のシトルリン化ペプチドまたはドメインを意味する。シトルリン化テネイシンＣのフラグメントは、シトルリン化ＦＢＧドメイン、シトルリン化ＴＡドメイン、シトルリン化ＥＧＦ−Ｌドメイン、シトルリン化ＴＮＩＩＩドメイン、またはシトルリン化テネイシンＣ内の他の任意の配列であってもよい。
【００９６】
「フラグメント」とは、少なくとも１０個のヌクレオチドを意味し、例えば少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のヌクレオチドを意味する。
【００９７】
「変異体」とは、ヌクレオチド配列が、少なくとも９０％の配列同一性を、着目する全長配列と共有することを意味する。例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性である。
【００９８】
二つのポリヌクレオチドの配列同一性の割合は、好適なコンピュータープログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのGAP programを用いて決定されてもよい。また、同一性の割合は、最適に整列された配列を有するポリヌクレオチドとの関連で計算されることは、理解されるであろう。
【００９９】
あるいは、アライメントは、Clustal W programを用いて実行されてもよい（Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680に記載されているように）。パラメーターは、以下のように用いられてもよい：
【０１００】
Fast pairwise alignmentのパラメーター: K-tuple(word) size; 1、 window size; 5、 gap penalty; 3、 number of top diagonals; 5。Scoring method: x percent。
【０１０１】
Multiple alignmentのパラメーター: gap open penalty; 10、 gap extension penalty; 0.05。
【０１０２】
Scoring matrix: BLOSUM。
【０１０３】
あるいは、BESTFIT programが、局所的な配列アライメントを決定するのに用いられてもよい。
【０１０４】
「抗体」とは、実質的に完全な抗体分子と同様に、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（天然のヒト抗体と比較して、少なくとも一つのアミノ酸が変異している）、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、および抗原結合フラグメントおよびそれらの誘導体を含む。
【０１０５】
「自己抗体」とは、対象自身の一つまたは複数のタンパク質に対して、対象の免疫系によって生産された、任意の抗体を意味する。
【０１０６】
「自己抗原」は自己抗体の産生を刺激する、内在性の抗原である。
【０１０７】
「抗原結合フラグメント」とは、シトルリン化テネイシンＣに結合可能な、抗体中の機能的フラグメントを意味する。
【０１０８】
「対象」とは、ヒトを含む全ての動物を意味する。対象の例には、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、およびブタが含まれる。「患者」という用語は、治療の必要がある疾患を有する対象を意味する。
【０１０９】
本明細書で用いられる「治療的に有効な量」、または「有効な量」、または「治療的に有効な」、という用語は、一定の症状および投与計画に対して治療効果を与える量のことを指す。本用語は、必要な添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与媒体とともに期待される治療効果を生みだすために算出された有効物質（active material）の所定量のことである。さらに、本用語は、活性、機能およびホストの応答において、臨床的に重要な不足を減らす、かつ、最も好ましくは、回避する上で十分な量を意味している。あるいは、治療的に有効な量は、ホストの臨床的に重要な症状を改善する上で十分である。当業者には理解されることであるが、化合物の量は、その特異的な活性に応じて変化してもよい。好適な投与量は、必要な希釈剤とともに期待される治療効果を生みだすために算出された有効組成物の所定の量を含んでもよい。本方法および本発明の組成物の製造のための使用において、有効成分の治療的に有効な量が提供される。治療的に有効な量は、通常の熟練した医療従事者または獣医従事者が、当業界ではよく知られているように、患者の特性、例えば年齢、体重、性別、症状、合併症、他の疾病など、に基づいて決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
本発明の局面を例示する実施例は、以下の図面を参照して、本明細書に記載されている：
【図１】テネイシンＣ欠損マウスにおける、急性炎症の迅速な消散。  （ａ）ザイモサン注射後の経時の野生型マウス（＋／＋）（白いバー）およびテネイシンＣ欠損マウス（−／−）（黒いバー）における脚の腫れ。データは、注射前の脚の直径と比較した脚の直径の増加の平均値＋／−ＳＥＭとして表している（遺伝子型当たりｎ＝２４のマウス）。＊＊＝ｐ＜０．０１。（ｂ−ｅ）ヘマトキシリンかつエオシン（ｂ、ｄ）およびサフラニン−Ｏ（ｃ、ｅ）で染色した、ザイモサン注射４日後の、野生型マウス（ｂ、ｃ）およびテネイシンＣ欠損マウス（ｄ、ｅ）由来の足首関節の代表的な切片。ボックスは、関節滑膜（ｓ）および軟骨プロテオグリカン（ｃｐ）を強調している。倍率×１０。野生型マウス（白いバー）およびテネイシンＣ欠損マウス（黒いバー）由来の、ザイモサン注射４日後の膝関節における、関節炎（ｆ）および軟骨細胞死（ｇ）の定量。データは平均値（＋／−ＳＤ）として表している（遺伝子型当たりｎ＝２４のマウス）。＊＝ｐ＜０．０５。
【図２】テネイシンＣ欠損マウスにおいて、抗原注射により、滑膜炎が誘導される。  （ａ−ｂ、ｇ）偽注射した野生型マウスの膝関節の代表的な切片。（ｃ−ｆ、ｈ−ｉ）ｍＢＳＡの関節内注射２４時間後の、野生型マウス（ｃ、ｄ、ｈ）またはテネイシンＣ欠損マウス（ｅ、ｆ、ｉ）の膝関節の代表的な切片。野生型マウスおよびテネイシンＣ欠損マウスの両方の、嚢、半月板、および関節腔の炎症性細胞の浸潤は、それぞれ（ｃａｐ）、（Ｍ）および（Ｊ）によって、強調されている。（Ｓ）は、骨表面全体に沿って１−３細胞のみの厚さの、偽注射されたマウスの健常な滑膜を強調しており、（ＳＴ）は有意に厚みを増した野生型マウスおよびテネイシンＣ欠損マウス両方の滑膜を強調している。切片は、ヘマトキシリンかつエオシン（ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｈ、ｉ）およびサフラニン−Ｏ（ｂ、ｄ、ｆ）で染色している。倍率×１０（ａ−ｆ）または×４０（ｇ−ｉ）。（遺伝子型当たりｎ＝５のマウス）。
【図３】滑膜炎は、テネイシンＣ欠損マウスにおいて、迅速に鎮静する。  ｍＢＳＡの関節内注射３日後の、野生型マウス（ａ、ｂ、ｆ）またはテネイシンＣ欠損マウス（ｃ、ｄ、ｅ）の膝関節の代表的な切片。（ａ、ｃ）直線は、テネイシンＣ欠損マウスと比較した野生型マウスにおける嚢の炎症の増加を強調している。（ｂ、ｄ）（ｃｐ）は、テネイシンＣ欠損マウスと比較した野生型マウスにおける、軟骨プロテオグリカンの損失の増加を強調している。（ｅ、ｆ）有意な滑膜肥厚（直線）、関節腔での細胞およびフィブリンの沈着（矢印）、およびパンヌスの浸潤（矢じり）が、テネイシンＣ欠損マウスと比較して野生型マウスにおいて、観察される。切片は、ヘマトキシリンかつエオシン（ａ、ｃ、ｅ、ｆ）およびサフラニン−Ｏ（ｂ、ｄ）で染色している。倍率×１０（ａ−ｄ）または×２０（ｅ−ｆ）。（遺伝子型当たりｎ＝５のマウス）。
【図４】テネイシンＣ欠損マウスは、抗原が関節炎を誘導している間、組織破壊から保護されている。  （ａ−ｂ）ヘマトキシリンかつエオシン（ａ）およびサフラニン−Ｏ（ｂ）で染色した、ｍＢＳＡの関節内注射７日後の、野生型マウスの膝関節の代表的な切片。倍率×１０。（遺伝子型当たりｎ＝２４のマウス）。矢じりは、骨びらんの領域を強調している。矢印は、関節軟骨へのパンヌス浸潤を強調している。（ｃ−ｄ）ヘマトキシリンかつエオシン（ｃ）およびサフラニン−Ｏ（ｄ）で染色した、ｍＢＳＡの関節内注射７日後のテネイシンＣ欠損型マウスの膝関節における代表的な切片。倍率×１０。（遺伝子型当たりｎ＝２４のマウス）。Ｊは関節腔を強調し、ＡＣは損傷のない関節軟骨を強調している。（ｅ）ｍＢＳＡの注射２４時間後、３日後、７日後の、野生型マウス（白いバー）およびテネイシンＣ欠損マウス（黒いバー）由来の膝関節炎の組織学的なスコア。データは、平均値＋／−ＳＤを表している。（遺伝子型当たりｎ＝５（２４時間後、３日後）または遺伝子型当たりｎ＝２４（７日後））。（ｆ）ｍＢＳＡによる注射後の、野生型マウス（白いバー）およびテネイシンＣ欠損マウス（黒いバー）由来膝関節の、軟骨細胞死、軟骨表面びらんおよび骨びらんの定量。軟骨細胞死は２４時間後、３日後、および７日後で示しており、軟骨表面びらんおよび骨びらんは、７日後で示している。データは、平均値＋／−ＳＤを示している（遺伝子型当たりｎ＝５（２４時間後、３日後）または遺伝子型当たりｎ＝２４（７日後））。
【図５】テネイシンＣは、初代ヒトマクロファージおよびＲＡ滑膜繊維芽細胞において、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８合成を誘導する。  （ａ−ｂ）初代ヒトマクロファージ（ａ）およびＲＡ滑膜繊維芽細胞（ｂ）を、２４時間に渡って、刺激しないか（添加なし）、ＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ（ａ）または１０ｎｇ／ｍｌ（ｂ））で刺激するか、または組換えテネイシンＣ（１．０μＭ−１．０ｎＭ）で刺激した。示したデータは、代表的な三つの実験の一つからの３回の値の平均値（＋／−ＳＤ）である。（ｃ）初代ヒトマクロファージを、２４時間に渡って、刺激しないか（添加なし）、ＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激するか、組換えテネイシンＣ（１．０μＭ）で刺激した。（−）は、細胞を培地のみとプレインキュベートしたことを示す。（Ｐ）細胞を、刺激の前に、２５μｇ／ｍｌポリミキシンＢで３０分、プレインキュベートした。（Ｈ）添加なしの培地、または細胞に添加する前に１５分間沸騰させたＬＰＳまたはテネイシンＣを含む培地とともに、細胞を培養した。データは、代表的な三つの実験の一つからの３回の値の平均値（＋／−ＳＤ）である。
【図６】テネイシンＣのＦＢＧドメインは、インビボおよびインビトロにおいて、サイトカイン合成の刺激を媒介する。  （ａ）初代ヒトマクロファージを、刺激しなかった（添加なし）、またはＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）、組換えテネイシンＣ（ＴＮＣ）、または１．０μＭテネイシンＣドメイン（ＴＡ、ＥＧＦ−Ｌ、ＴＮＩＩＩ１−５、ＴＮＩＩＩ１−３、ＴＮＩＩＩ３−５、ＴＮＩＩＩ５−７、ＴＮＩＩＩ６−８およびＦＢＧ）で２４時間刺激した。示したデータは、代表的な三つの実験の一つからの３回の値の平均値（＋／−ＳＤ）である。（ｂ）ＲＡ滑膜細胞を、刺激しなかった（添加なし）、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）もしくは組換えＦＢＧ（１．０−０．０１μＭ）で２４時間刺激した。示したデータは、５人の異なる患者の非刺激細胞と比較した、サイトカインレベルの平均％の変化である。（ｃ−ｈ）ＰＢＳ（ｃ−ｅ）または１μｇＦＢＧ（ｆ−ｈ）の関節内注射３日後の、野生型マウスの膝関節の代表的な切片。切片は、ヘマトキシリンかつエオシン（ｃ、ｄ、ｆ、ｇ）またはサフラニン−Ｏ（ｅ、ｈ）で染色した。倍率×１０（ｃ、ｆ）または×２５（ｄ、ｅ、ｇ、ｈ）（遺伝子型当たりｎ＝５マウス）。（ｉ）ＰＢＳ（黒いバー）または１μｇＦＢＧ（白いバー）による関節内注射３日後の野生型マウス膝関節における、関節炎、骨びらん、軟骨表面びらんおよび軟骨細胞死の定量。データは、平均値＋／−ＳＤを表している（遺伝子型当たりｎ＝５）。
【図７】サイトカイン合成を媒介するＦＢＧは、ＭｙＤ８８依存性である。  （ａ）ヒトＲＡ滑膜繊維芽細胞は、感染させなかった、またはＧＦＰのみを発現するアデノウイルス（ＡｄＧＦＰ）で感染させた、またはドミナントネガティブなＭｙＤ８８を発現するアデノウイルス（ＡｄＭｙＤ８８ｄｎ）で感染させた。細胞は、刺激しなかった、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で、またはＦＢＧ（１μＭ）で２４時間刺激した。示したデータは、三つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。（ｂ）野生型（＋／＋）またはＭｙＤ８８欠損（−／−）マウスから単離したマウス胚線維芽細胞は、刺激しなかった（−）、またはＰＡＭ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１（５ｎｇ／ｍｌ）およびＦＢＧ（１μＭ）で２４時間刺激した。示したデータは、三つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。
【図８】サイトカイン合成を媒介するＦＢＧは、ＴＬＲ４依存性であるが、ＣＤ１４またはＭＤ−２を必要としない。  （ａ）初代ヒトマクロファージは、刺激前の３０分間、培地のみと、またはＴＬＲ２（１０μｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ４（２５μｇ／ｍｌ）に対する機能遮断抗体もしくはアイソタイプコントロール抗体（２５μｇ／ｍｌ）を含む培地と、プレインキュベートした。細胞は、刺激しなかった、または、ＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）、ＦＢＧ（１μＭ）もしくはＰＡＭ３（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。示したデータは三つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。（ｂ）野生型、ＴＬＲ２（ＴＬＲ２−／−）またはＴＬＲ４（ＴＬＲ４−／−）欠損マウスから単離したマウス胚線維芽細胞は、刺激しなかった、またはＰＡＭ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１（５ｎｇ／ｍｌ）およびＦＢＧ（１μＭ）で２４時間刺激した。示したデータは、三つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。（ｃ）野生型、ＴＬＲ２（ＴＬＲ２−／−）またはＴＬＲ４（ＴＬＲ４−／−）欠損マウスから単離した骨髄由来マクロファージは、刺激しなかった、またはＰＡＭ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）もしくはＦＢＧ（１μＭ）で２４時間刺激した。示したデータは三つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。（ｄ）ヒトマクロファージは、ＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）、ＦＢＧ（１μＭ）またはＰＡＭ３（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激する前に、阻害薬なしで、または１μｇ／ｍｌ ｍｓｂＢＬＰＳ並びに１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ１４抗体で３０分プレインキュベートした。示したデータは、三つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。
【図９】ザイモサン注射後の経時での、脚の腫脹。  非注射テネイシンＣ欠損マウスの脚（ａ、ｅ）（直径１．６ｍｍ）、テネイシンＣ欠損マウスのザイモサン注射２４時間後の脚（ｄ、ｆ）（直径２．５ｍｍ）および４日後の脚（ｂ、ｈ）（直径１．７ｍｍ）、および野生型マウスのザイモサン注射４日後の脚（ｃ、ｇ）（直径２．１ｍｍ）の代表的な画像。
【図１０】組換えタンパク質の合成。  （ａ）アセンブリドメイン（ＴＡ）、１４個半のＥＧＦ様リピート（ＥＧＦ−Ｌ）、１７個のフィブロネクチンタイプＩＩＩ様リピート（ＴＮＩＩＩ）（８個の恒常的に発現されたリピート（１−８）および９個の選択的にスプライシングされ得るリピート）、およびフィブリノーゲン様グローブ（ＦＢＧ）を含む、複数のドメインを含有するテネイシンＣモノマーのドメイン構造。（ｂ）合成された組換えタンパク質によってカバーされる領域、対応するアミノ酸残基、および各タンパク質の分子量。
【図１１】タンパク質の純度の解析。  還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された、各組換えタンパク質１μｇを示す、銀染色ゲル。レーン：１（ＴＡ）、２（ＥＧＦ−Ｌ）、３（ＴＮＩＩＩ１−５）、４（ＴＮＩＩＩ５−７）、５（ＴＮＩＩＩ６−８）、６（ＴＮＩＩＩ１−３）、７（ＴＮＩＩＩ３−５）および８（ＦＢＧ）。
【図１２】ＦＢＧが媒介する関節炎は、インビボにおいてＴＬＲ４の発現を必要とする。  １μｇＦＢＧの関節内注射３日後のＴＬＲ２（ａ）およびＴＬＲ４（ｂ）欠損マウスの膝関節における代表的な切片。切片は、ヘマトキシリンかつエオシンによって染色している。倍率×１０（遺伝子型当たりｎ＝５マウス）。（ｃ）１μｇＦＢＧの関節内注射３日後の、ＴＬＲ２（白いバー）およびＴＬＲ４（黒いバー）欠損マウスの膝関節における、関節炎、骨びらん、軟骨表面びらんおよび軟骨細胞死の定量。データは、平均値＋／−ＳＤ（遺伝子型当たりｎ＝５）を表している。
【図１３】ヒトテネイシンＣおよびそのドメインのアミノ酸配列［配列番号６５−６７］。
【図１４】ヒトテネイシンＣのヌクレオチド配列［配列番号６８］。
【図１５】特異的なＦＢＧペプチドに応答する、ＴＮＦ合成。  添加なしまたは１００μＭの各ＦＢＧペプチド（Ｐ１、Ｐ３−Ｐ９）で２４時間培養した、ＲＡ膜培養物によるＴＮＦ合成。
【図１６】様々な濃度の特異的ＦＢＧペプチドに応答する、ＴＮＦおよびＩＬ８合成。  添加なしまたは２５、１００もしくは２５０μＭのＦＢＧペプチドで２４時間培養した、ＲＡ膜培養物による、ＴＮＦおよびＩＬ８合成。
【図１７】ＬＰＳ、ＦＢＧドメイン全体、または特異的ＦＢＧペプチドに応答する、ＩＬ８合成。  添加なし、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、１μＭのＦＢＧドメイン全体（ＦＢＧ）、または１もしくは２０μＭのＦＢＧペプチド（Ｐ１、Ｐ３−Ｐ９）で２４時間培養した後の、マクロファージによるＩＬ８の合成。
【図１８】ＦＢＧペプチドとのプレインキュベーション後の、ＬＰＳおよびＦＢＧに応答するＩＬ８およびＴＮＦ合成。  ２０μＭのＦＢＧペプチドによるプレインキュベーションを伴って、または伴わず、添加なし、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、または１μＭのＦＢＧドメイン全体（ＦＢＧ）で２４時間培養した後の、マクロファージによるＴＮＦおよびＩＬ８の合成。
【図１９】テネイシンＣを標的としたｓｉＲＮＡに応答する、ＩＬ８およびＴＮＦの合成。  ルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（コントロール）、またはテネイシンＣを標的とするｓｉＲＮＡ：オリゴ１（ｓｉ １）、オリゴ２（ｓｉ ２）またはオリゴ１＋２の組み合わせ（ｓｉ １＋２）によって形質転換されたＲＡ繊維芽細胞における、テネイシンＣｍＲＮＡのレベル。１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの有無での、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（コントロール）、またはテネイシンＣ標的オリゴ１＋２（ｓｉＲＮＡ）の組み合わせによって２４時間形質転換されたＲＡ繊維芽細胞における、ＩＬ６合成。
【図２０】精製したフィブリノーゲンおよびＦＢＧは、インビトロでシトルリン化できる。  精製したフィブリノーゲン（レーン２−５）およびＦＢＧ（レーン６−９）を示すクマシー染色ゲル。（レーン２、６）は修飾されておらず、（レーン３、７）はシトルリン化バッファー、ＰＡＤおよびＣａＣｌと培養することによってシトルリン化されている。フィブリノーゲンのシトルリン化は、タンパク質の分子量の増加を観察することによって確認した。しかしながら、ＦＢＧのサイズの変化は、ほとんど見られなかった。ＣａＣｌ非存在下でＰＡＤとタンパク質を培養すること、またはＰＡＤ非存在下でＣａＣｌとタンパク質を培養することは、タンパク質のサイズに影響を与えなかった（レーン４、５および８、９）。
【図２１】精製した全長テネイシンＣはインビトロでシトルリン化できる。  修飾されていない精製全長テネイシンＣ（レーン９）またはシトルリン化バッファー、ＰＡＤおよびＣａＣｌで培養することによってシトルリン化された精製全長テネイシンＣ（レーン６）を示す、クマシー染色ゲル。テネイシンＣのシトルリン化は、当該タンパク質の分子量の増加を観察することによって確認した。ＣａＣｌ非存在下でＰＡＤとテネイシンを培養すること、またはＰＡＤ非存在下でＣａＣｌとテネイシンを培養することは、タンパク質のサイズに影響を与えなかった（レーン７、８）。精製フィブロネクチンは、ローディングコントロールとして、含まれた（レーン２）。
【図２２】ＦＢＧおよびテネイシンＣのシトルリン化の、ウエスタンブロットによる確認。  ＡＭＣ検出キットを用いて探索した、天然およびシトルリン化テネイシンＣ（レーン８、９）と、天然およびシトルリン化ＦＢＧ（レーン４、５）のウエスタンブロット。天然およびシトルリン化フィブロネクチン（レーン２、３）と、天然およびシトルリン化フィブリノーゲン（レーン６、７）と、天然およびシトルリン化エノラーゼ（レーン１１、１０）とは、シトルリン化されていることが明らかであるポジティブコントロールとして組み入れた。
【図２３】ＦＢＧはインビトロでＰＡＤによってシトルリン化される。  精製した組換えＦＢＧを、シトルリン化バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ）中で、複数の濃度（タンパク質１ｍｇ当たり、２、７および２０ユニット）のウサギＰＡＤ２、ヒトＰＡＤ２およびヒトＰＡＤ４と、３７℃で３時間、８時間、および２４時間培養することによって、インビトロでシトルリン化させた。ネガティブコントロールとして、ＦＢＧ−Ｃを、カルシウム非存在下で（−Ｃａ２＋）、または酵素非存在下で（−ＰＡＤ）、シトルリン化バッファー中で培養した。（Ａ）各サンプル１μｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、クマシーブルーで染色した。ＰＡＤによりシトルリン化されたＦＢＧは、非シトルリン化ＦＢＧより、わずかに大きい分子量の位置に移動した。（Ｂ）タンパク質はニトロセルロース膜に移され、化学修飾ミックス（０．０１２５％ ＦｅＣｌ３、２．３Ｍ Ｈ２ＳＯ４、１．５２Ｍ Ｈ３ＰＯ４、０．２５Ｍ 酢酸、０．２５％ ２、３−ブタンジオンモノオキシム、０．１２５％ アンチピリン）中で培養した。シトルリン化タンパク質は、抗修飾シトルリン特異的抗体によって検出した。
【図２４】シトルリン化は、ＦＢＧによって刺激されるサイトカイン産生を増強する。  初代マクロファージにおけるＴＮＦ合成を、刺激しないか（ＵＮ）、または０．１−１．０μＭ非シトルリン化ＦＢＧ（ｎＦＢＧ）もしくはシトルリン化ＦＢＧ（ｃＦＢＧ）で刺激した。シトルリン化バッファーのみ（ＣＩＴ）、およびバッファーとＰＡＤ（ＣＩＴ＋ＰＡＤ）を、コントロールとして組み入れた。ＰＡＤ非存在下でシトルリン化バッファーと培養したＦＢＧまたは、カルシウム非存在下でＰＡＤと培養したＦＢＧは、シトルリン化されず、またサイトカイン合成の増強を示さなかった（非掲載）。
【図２５】ウエスタンブロットにおいて、５０人のＲＡ患者のうち１０人（２０％）がシトルリン化テネイシンＣに反応し、５０人の健常対象は誰もシトルリン化テネイシンＣに反応しない。  （Ａ）天然（ｎＴＮＣ）およびシトルリン化（ｃＴＮＣ）精製ヒト組換えテネイシンＣのクマシー染色ゲル（上図）。ＡＭＣ（抗修飾シトルリン）キットによるウエスタンブロットによって証明された、テネイシンＣのシトルリン化（下図）。（Ｂ）ＲＡ患者（ＲＡ）または健常対象（ＮＨ）由来の血清で探索された、代表的なｃＴＮＣのウエスタンブロット（ｎ＝５０）。ｎＴＮＣのブロットにおいては、いずれの血清でも、反応性は観察されなかった（非掲載）。
【図２６】ＲＡ患者のサブセット由来の血清は、ｃｉｔＴＮＣに反応性を示す。  異なる７人のＲＡ患者由来の血清で探索した、ｃＴＮＣのウエスタンブロットであり、一人の陽性患者を示す（レーン４）。
【図２７】ＲＡ患者のサブセット由来の血清は、ｃｉｔＴＮＣに反応性を示す。  さらに８人のＲＡ患者由来の血清で探索した、ｃＴＮＣのウエスタンブロットであり、一人の陽性患者を示す（レーン４）。
【図２８】健常対照由来の血清は、ｃｉｔＴＮＣに反応性を示さない。  異なる８人の健常対象由来の血清で探索した、ｃＴＮＣのウエスタンブロットであり、陽性患者を示さない。
【図２９】シトルリン化テネイシンＣに加えてシトルリン化ＦＢＧに反応するＲＡ血清を示す。  ｃＦＢＧを加えたｃＴＮＣのウエスタンブロットを、同じウェルで一緒に行い、異なる７人のＲＡ患者由来の血清で探索した。全長テネイシンＣ（３２０ｋＤ）に反応するがＦＢＧには反応しない患者サブセット（レーン４、５）または、ｃｉｔＦＢＧ（２７ｋｄ）に反応するが全長テネイシンＣには反応しない患者（レーン６）が観察された。
【図３０】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるシトルリン化部位の明確化。  （Ａ）ｒＰＡＤ２（丸）、ｈＰＡＤ２（四角）およびｈＰＡＤ４（三角）によってシトルリン化されたアルギニン残基は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。シトルリン化部位は下線を引き、非シトルリン化部位は破線を引き、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析によって網羅されなかった部位は、＊で印をつけている。（Ｂ）ＦＢＧドメインの配列。全てのアルギニン残基を示している。シトルリン残基に変換されたアルギニン残基は下線を引いている。＊で印をしたアルギニンは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析で網羅されなかった残基である。
【図３１】シトルリン化抗体エピトープの同定。  （Ａ）ＦＢＧのアミノ酸配列に対応する配列を持つペプチドは、アミノ末端およびカルボキシ末端へのシステイン残基の付加、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定されたアルギニン残基のシトルリン残基への変換によって、設計した。（Ｂ）関節リウマチ患者（ＲＡ；ｎ＝２０）および健常対象（ｎ＝２０）における、シトルリン化ＦＢＧペプチドおよびアルギニン含有コントロールペプチドに対する、ＩｇＧ応答。コントロール血清の第９５百分位数が陽性を決定するために使用された（破線）。グループ間の差異に対してｐ値を計算するために、マンホイットニーＵ検定が用いられた。（n.s.＝有意差なし、＊＝ｐ＜０．０５および＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．００１）
【図３２】ＦＢＧのシトルリン化は、ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）および滑膜繊維芽細胞（ＲＡＦ）の細胞接着を減らす。  （Ａ）インテグリンαｖβ３に結合すると同定された配列は、白で示している（Yokoyamaetal.,2000）。本配列中で、二つのアルギニン（黒で示す）は、シトルリン化されていると同定された。（Ｂ）９６穴プレートのウェルを、複数の濃度の、ＦＢＧ、シトルリン化ＦＢＧ（ｃＦＢＧ）、カルシウム非存在下のバッファーで培養されたＦＢＧ（ＦＢＧ−Ｃａ２＋）、またはＰＡＤ非存在下で培養されたＦＢＧ（ＦＢＧ−ＰＡＤ）で覆った。ポジティブコントロールとして、ウェルはフィブロネクチン（ＦＮ）（１μｇ／ｍｌ）で覆い、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）で覆ったウェルはネガティブコントロールとして使用した。プレートを、ＲＡ患者由来のＨＤＦまたはＲＡＦと一緒に４５分培養し、クリスタルバイオレット（０．１％）で染色後に接着細胞の吸収を測定することによって、接着を測定した。データは、少なくとも４つの独立した実験の平均値＋s.e.m.として示している。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。
【実施例】
【０１１１】
実施例１−一般的な方法
試薬
ザイモサン、メチル化ＢＳＡ並びにフロイント完全アジュバント、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（マウスモノクローナル抗体）、ブラストサイジン、およびアイソタイプコントロール抗体（マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１）は、Sigma-Aldrich（Dorset,UK）から購入した。Hypnormは、VetaPharma Ltd.（Leeds,UK）から購入した。リムルスアメボサイトライセートアッセイは、Associates of Cape Cod（Liverpool,UK）から入手した。野生型ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ）細胞は、Invitrogen（Groningen,Netherlands）から入手した。Ｍ−ＣＳＦおよびマウスＩＬ−１βは、PeproTech（Neuilly-Sur-Seine,France）から入手した。ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、抗菌−抗真菌溶液ＰＳＡおよびβ−メルカプトエタノールは、PAA Laboratories（Yeovil,UK）から入手した。ヒトＴＬＲ２およびＴＬＲ４／ＣＤ１４／ＭＤ−２を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞株、ポリミキシンＢ、ｍｓｂＢＬＰＳおよび機能遮断ＴＬＲ２（クローン：ＴＬ２．１アイソタイプ：マウスＩｇＧ２ａ）およびＴＬＲ４抗体（クローン：ＨＴＡ１２５アイソタイプ：マウスＩｇＧ２ａ）は、Invivogen（Calne,UK）から入手した。フェノールクロロホルム精製した、大腸菌（Escherichia coli）リポ多糖（ＬＰＳ）（粗面および滑面）および、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ４（Ｐａｍ３Ｃ）は、Alexis（Birmingham,UK）から入手した。マウスＴＮＦ−αおよびＩＬ−１受容体アンタゴニスト（IL-1ra-IL-1F3）は、R&D Systems（Abingdon,UK）から入手した。機能遮断抗−ＣＤ１４抗体（アイソタイプ：マウスＩｇＧ１）は、Abcam（Cambridge,UK）から入手した。ヒトまたはマウスのＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８ＥＬＩＳＡは、Pharmingen（Oxford,UK）から入手した。
【０１１２】
全長テネイシンＣの精製
サイトカイン産生が、ＬＰＳやＬＰＳ関連分子のような、細菌の夾雑物に起因しないことを保証するために、（Lange (2007)）に記載されたように、Ｈｉｓタグ付きのヒトテネイシンＣを組み入れたpCEP-puベクターを遺伝子導入された哺乳類細胞株ＨＥＫ２９３のならし培地より、組換え全長ヒトテネイシンＣを精製した。テネイシンＣは、（Lange (2007）に記載されたように均一に精製され、製造業者の使用説明書に従いリムルスアメボサイトライセートアッセイを用いて、ＬＰＳのコンタミネーションがないことを決定した。
【０１１３】
組換えタンパク質の合成
テネイシンＣの各ドメインに対応するタンパク質（ＴＡ、ＥＧＦ−Ｌ、複数のＴＮＩＩＩリピートおよびＦＢＧ）を合成して、精製した。実施例２参照。
【０１１４】
組換えタンパク質のＬＰＳによるコンタミネーションの測定
各組換えタンパク質のＬＰＳのレベルを確認するために、リムルスアメボサイトライセートアッセイを製造業者の使用説明書に従って用いた（感度は、タンパク質１ｍｇ当たり、〜０．７±０．５ｐｇのＬＰＳ）。本研究で用いた全ての組換えタンパク質は、１０ｐｇ／ｍｌより少ないレベルのＬＰＳであった。
【０１１５】
アデノウイルスベクターおよびその増殖
野生型ＭｙＤ８８（ＡｄＭｙＤ８８ｗｔ）、ドミナントネガティブなＭｙＤ８８（ＡｄＭｙＤ８８ｄｎ）およびＧＦＰコントロール（ＡｄＧＦＰ）をコードする、複製欠損アデノウイルス組換えベクターは、社内で構築した。当該ウイルスの合成については、in Andreakos (2004)に記載されている。本研究で用いた全てのウイルスは、Ｅ１／Ｅ３欠損で、Ａｄ５血清型に属する。ウイルスは２９３ヒト胎児腎臓細胞で増殖され、二つの塩化セシウム勾配による超遠心分離法で精製し、ウイルスの力価を、既に記載されているように（Sacre (2007））、プラークアッセイで測定した。
【０１１６】
動物
Saga (1992)によって記載された元の系統であり、白い腹部とアゴーチの毛色のバックグラウンドを持つ近交系マウスの１２９／ｓｖ由来の、ホモテネイシンＣ欠損マウスは、Ｐrof. Charles French-Constant （University of Edinburgh, UK）から提供された。年齢を適合させた、コンジェニックの近交系野生型１２９／ｓｖマウスは、Charles River （Margate, UK）から入手した。全てのテネイシンＣ欠損マウスおよび野生型１２９／ｓｖマウスは、雄であり、実験時に８−１０週齢であった。
【０１１７】
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（黒い毛色の近交系マウス）のホモＴＬＲ２およびＴＬＲ４欠損マウスは、B&K Universal （Hull, UK） Hoshino (1999) および Takeuchi (1999)から入手した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのホモＭｙＤ８８欠損マウスは、Sanger Institute （Cambridge, UK）によって提供された。年齢を適合させた、コンジェニックの近交系野生型Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスは、Charles River （Margate, UK）から入手した。マウス胚繊維芽細胞の単離のために、８−１０週齢の一匹の雌を、８−１０週齢の２匹の雄と交配させた。骨髄由来マクロファージを単離するために、マウスは雌であり、実験時に１０−１２週齢であった。
【０１１８】
全てのマウスは、標準的なげっ歯類の固形飼料および水を適宜与え、１２時間の明暗周期で、空調された環境において、おがくずで覆ったケージにいれて、飼育した（＜６マウス／ケージ）。全てのマウスの処置は、機関倫理委員会の承認を受けた。
【０１１９】
統計手法
平均値（Ｍｅａｎ）、ＳＤ、ＳＥＭ、および統計検定は、GraphPad version 3 （GraphPad Software Inc., San Diego, CA）を用いて計算した。複数のグループの平均値を、適当な場合にダネット多重比較検定を伴う、一元配置分散分析によって解析した。独立ｔ検定は、二つのグループのみを含む実験の場合に使用した。
【０１２０】
実施例２−組換えタンパク質の合成
テネイシンＣの各ドメインに対応するタンパク質（ＴＡ、ＥＧＦ−Ｌ、複数のＴＮＩＩＩリピートおよびＦＢＧ）を合成し、精製した。合成した組換えタンパク質は図９に図示した。
【０１２１】
試薬
Pfu Turboポリメラーゼは、Stratagene（Amsterdam, Netherlands）から入手した。Easy mix 50 PCR tube は、Molecular Bioproducts（Lutterworth, UK）から入手した。RNeasyキットおよびＮｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムは、Qiagen（Crawley, UK）から入手した。pCR Bluntベクター、pCEP4プラスミドベクター、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ）細胞および４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲルは、Invitrogen（Groningen, Netherlands）から入手した。pET32bベクターおよびＢＬ２１（ＤＥ３）Rosetta細胞は、Novagen（Kent, UK）から入手した。HiTrap Qカラム、HiTrap Sカラム、Sephacryl S500 HR カラムおよびヘパリンセファロースカラムは、Amersham(Buckinghamshire, UK）から入手した。
【０１２２】
制限酵素は、New England BioLabs（Hitchin, UK）から入手した。ＤＭＥＭ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンは、PAA laboratories（Yeovil, UK）から入手した。ＦｕＧＥＮＥ６遺伝子導入試薬は、Roche Applied Science （Basel, Switzerland）から入手した。
【０１２３】
抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（マウスモノクローナル抗体）、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロース、ＦＬＡＧペプチドは、Sigma-Aldrich（Dorset, UK）から入手した。抗テトラＨｉｓ抗体（マウスモノクローナル抗体）は、Qiagen（Crawley, UK）から入手した。アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗（マウスＩｇＧ）ＩｇＧおよびアルカリフォスファターゼのWestern Blue 安定化基質は、Promega（Southampton, UK）から入手した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための高精度なタンパク質標準物質は、BioRad（Hemel Hempstead, UK）から入手した。
【０１２４】
プライマー設計
ドメインの境界は、ヒトテネイシンＣ配列として公開されているアライメント（Siri (1991) アクセッション番号Ｐ２４８２１（Swiss-Prot））を用いて決定した。各ドメインをクローン化するために、フォワードおよびリバースプライマーの両方において必要とされるコード配列の５’および３’末端配列に対応する１８−２１塩基を含む、ＰＣＲプライマーを設計した。フォワードプライマーは、コード配列の直前に、ＮｄｅＩ制限酵素サイトとそれに続くＮ末端Ｈｉsタグを含んだ。ＮｄｅＩサイトの最後の３塩基は、ＡＴＣのメチオニン開始コードを形成している。リバースプライマーはpET32b発現ベクターへの一方向性のクローニングを可能にするために、コード配列の直後にＴＴＡ停止コドンとそれに続くＢａｍＨ１またはＫｐｎ１サイトを含んだ。
【表１−１】
2017507337.tif 000003
【表１−２】
2017507337.tif 000004
【０１２５】
前記のプライマーは全て、５’から３’に記載している。標識となる配列は太字、Ｈｉｓタグ（ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ［配列番号１９］）は下線、制限酵素切断部位（ＣＡＴＡＴＧ＝Ｎｄｅ１サイト、ＧＧＡＴＣＣ＝ＢａｍＨ１、ＧＧＴＡＣＣ＝Ｋｐｎ１サイト）は太字の斜体で記載している。
【０１２６】
ＰＣＲ
ＰＣＲ増幅は、１０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー、１μｇの鋳型、５μｌＤＭＳＯ、および１．２５ユニットのPfu Turbo polymeraseを用いて、最終容量２５μｌで行った。これを、５０チューブのEasy mixに入った、バッファーおよびデオキシヌクレオチド三リン酸に添加した。全ての反応に使用した鋳型は、RNeasy kitで単離したＲＮＡを用いて、Ｕ８７ＭＧヒトグリオーマ細胞から調整したｃＤＮＡだった。反応は、変性、アニーリング、および伸長を、それぞれ９５ｏＣ、５５−６５ｏＣ（プライマーの融解温度（Ｔｍ）による）、および７２ｏＣで、４０サイクル繰り返した。
【０１２７】
クローニング
ＰＣＲ産物は、pCR Bluntベクターに連結させ、ＰＣＲによりエラーが導入されていないかを確かめるために、配列決定を行った。エラーまたはサイレント変異がないクローンを選択した。インサートは、その後、プライマー（ＴＮ５−７およびＴＮ６−８）内に設計された制限酵素サイトＮｄｅ１およびＢａｍＨ１を用いて、pET32bに連結させた。ヒトテネイシンＣは、ＴＡドメイン内（４９４の位置）およびＴＮＩＩＩ２内（２５０９の位置）に、ＢａｍＨ１内部サイトを持っている。それゆえ、ＴＡおよびＴＮ１−８は、ＦＷプライマーのＮｄｅ１サイトおよびpCR BluntのクローニングサイトのＫｐｎ１サイトを用いて、クローニングした。ヒトテネイシンＣは、Ｋｐｎ１の内部サイトを持っていない。ＴＮ１−５、ＴＮ１−３およびＴＮ３−５は、プライマーのＮｄｅ１およびＫｐｎ１サイトを用いてクローニングした。ＦＢＧは、ＮｄｅＩ内部サイトを含んでおり（６４３９の位置）、それゆえ、Ｎｄｅ１およびＢａｍＨ１による切断と、それに続くＮｄｅ１による切断という二段階のライゲーションを用いて、クローニングした（位置は、図１４で示した、テネイシンＣの全長ヌクレオチド配列内のサイトを指す）。
【０１２８】
細菌の増殖、誘導、および溶解
プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）Rosetta細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む３ＬのＬＢ（Luria-Bertani）培地で培養し、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドによって誘導した。３時間後、細胞を４，０００ｒｐｍ、２０分遠心分離することによって回収し、氷冷した洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、フレンチプレスで溶解した。インクルージョンボディーを、１２，０００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心分離して、回収した。ＴＡおよびＦＢＧを除いて、タンパク質は全て上清に存在した。組換えＴＡおよびＦＢＧタンパク質は、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および１０ｍＭβ−メルカプトエタノールを用いて、室温で２時間一定の攪拌を行うことによって、インクルージョンボディーから抽出した。
【０１２９】
細菌のタンパク質の精製
組換えタンパク質を含む溶液を、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムにアプライし、２０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄した。続いて、カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、タンパク質を、６０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で溶出した。ＴＡおよびＦＢＧに対しては、各洗浄バッファーおよび溶出バッファーに６Ｍ塩酸グアニジンが含まれた。Ｎｉクロマトグラフィーの後、ＴＡおよびＦＢＧは、その後の精製を必要としなかった。ＴＮ１−３およびＴＮ６−８はさらに、HiTrap Qカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製され、ＴＮ１−５、ＴＮ３−５およびＴＮ５−７は、HiTrap Sカラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製され、ＴＮ１−８はHiTrap Sカラムを用いた後Sephacryl S500 HR カラムを用いたゲル濾過を用いることによって、精製された。
【０１３０】
不溶性タンパク質のリフォールディング
ＴＡおよびＦＢＧは、６Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で、２０μｇ／ｍｌに希釈し、その後２０ｍＭシスタミンで処理して４℃で１６時間攪拌することによって、リフォールディングした。当該溶液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび１ｍＭ２−ヒドロキシエチルジスルフィドを含む、１５ボリュームの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０によって４℃２４時間の透析を二回行い、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０によって４℃２４時間の透析を二回行い、その後４℃、１２，０００ｒｐｍで３０分、遠心分離した。リフォールディングは、還元条件下および非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、サイズ変化を見ることによって評価した。タンパク質の活性は、ＴＡドメイン重合およびヘパリンセファロースカラムへのＦＢＧの結合によって、確認した。
【０１３１】
哺乳類細胞を用いたＥＧＦ−Ｌドメインの合成
大腸菌（E.coli）発現システムを用いたＥＧＦ−Ｌリピート領域の発現および精製の最初の試みは、失敗に終わった。これは、当該領域にある全部で９１個のシステインのために、タンパク質フォールディングの達成が困難であることに起因しうる可能性が最も高い。それゆえに、ＴＮ−ＣのＥＧＦ様ドメインは、ＨＥＫ２９３細胞を用いて発現させた。
【０１３２】
二つのＰＣＲ反応を行った。一つ目のＰＣＲ産物は、ＫｐｎＩ制限酵素サイト、およびＴＮ−Ｃシグナル配列が続くＫｏｚａｋ配列から構成された。二つ目のＰＣＲ産物は、ＦＬＡＧペプチド、並びに、ヒスチジンタグおよびＢａｍＨ１制限酵素配列が続くＥＧＦ−様ドメイン配列から構成された。
【０１３３】
二つのＰＣＲ産物は、Ho(1989)によって記述されたように、互いに連結された。ＰＣＲ反応は、前記のように行った。構築物全体を、ＰＣＲブラントベクターにクローニングし、配列決定した。その後、pCEP4ベクターにサブクローニングした。当該ＤＮＡは、Fugeneを用いてＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入され、細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胚血清、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、ハイグロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）として選択した。安定的に遺伝子導入された細胞由来の２リットルのならし培地を回収し（細胞を培地で培養後に回収した）、貯蔵した。貯蔵したならし培地（２リットル）は、３０００ｒｐｍで遠心分離し、培地から細胞片を分離した。
【０１３４】
培地はその後、抗ＦＬＡＧカラムにアプライされた。物質は、５０ｍｌの素通り画分にて回収された。カラムは１０カラムボリュームの１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄した後、ＬＰＳの除去を確認するために、１０カラムボリュームの６０％イソプロパノールで洗浄した。カラムはその後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５で洗浄し、最後にタンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５中の２００μｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチドを用いて溶出した。
【０１３５】
タンパク質の純度の解析
各タンパク質は、１０００ボリュームの１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で、透析した。タンパク質の純度は、還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、１μｇの精製組換えタンパク質を、４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲルに流し、続いて、単一バンドであることを証明するために、ゲルを銀染色した（図１０）。ウエスタンブロット解析もまた、行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質は、フッ化ポリビニリデン膜に電気泳動で転写した。当該膜は、トリス緩衝の生理食塩水中の５％ＢＳＡでブロックされ、その後ＦＬＡＧ Ｍ２を認識する一次抗体（１：２０００希釈）（ＥＧＦ−Ｌ）または、テトラＨｉｓ抗体（１：２０００）（他の全てのタンパク質）と培養した。その後、ブロットは、アルカリフォスファターゼと結合した二次抗体と培養させ、タンパク質のバントは、Western Blue 安定化基質を用いて可視化させた。これにより、ゲルは、予想分子量（Mw）の位置に各抗体が認識する特異的な単一バンドを示す（非掲載）。
【０１３６】
実施例３−動物モデル
ザイモサン誘導関節炎
ザイモサン誘導関節炎（ＺＩＡ）は、テネイシンＣ欠損マウスおよび野生型マウスにおいて、Keystone (1977)に記載されたように、ザイモサン（サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））注射によって誘導された。ザイモサンは、１ｍｌの滅菌ＰＢＳ中に、１５ｍｇのザイモサンを溶解させて、調製した。調製した溶液は、２回沸騰させ、超音波処理した。マウスは、滅菌水で１：１０に希釈した１５０μｌのHypnormを腹腔内注射することによって麻酔をかけ、その後、ザイモサン（１０μｌ）を右の足蹠に注射した（d=0）。
【０１３７】
コントロールマウスは１０μｌのＰＢＳのみの注射を受けるか、または注射されなかった。肉眼での関節炎の判定のために、それぞれの後脚の厚さを毎日ノギス（microcaliper）で計測し（Kroeplin, Schluchlem, Germany）、直径は、マウスごとのそれぞれの炎症性の後脚の平均値として表した。
【０１３８】
実験完了後（day=4）、マウスを安楽死させ、後脚を１０％（ｖ／ｖ）の緩衝ホルマリンで固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰して、パラフィンで処理した。
【０１３９】
抗原誘導関節炎
抗原誘導関節炎（ＡＩＡ）は、テネイシンＣ欠損マウスおよび野生型マウスにおいて、すでにBrackertz (1977)によって記載されたように、誘導された。簡潔に言えば、０日目に、滅菌水で１：１０に希釈した１５０μｌのHypnormをマウスに腹腔内注射して麻酔をかけ、その後２００μｇのメチル化ＢＳＡで免疫化した。ｍＢＳＡは０．２ｍｌのフロイント完全アジュバントに乳化させて、尾底部に皮内注射した。
【０１４０】
７日目に、滅菌した３３−ゲージのマイクロカニューレ（33-gauge microcannula）を用いて、ｍＢＳＡ（１０μｌの滅菌ＰＢＳ中に１００μｇ存在）の関節内注射により、関節炎を右膝関節に誘導した。コントロールマウスは、１０μｌのＰＢＳのみの注射を受けるか、または注射されなかった。
【０１４１】
１４日目に、マウスを安楽死させ、膝関節を切除し、１０％（volume/volume）の緩衝ホルマリンで固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰して、パラフィンで処理した。
【０１４２】
ＦＢＧ注射
野生型マウスは、滅菌水で１：１０に希釈した１５０μｌのHypnormを腹腔内注射することによって麻酔をかけ、その後、滅菌した３３−ゲージのマイクロカニューレ（33-gauge microcannula）を用いて、１０μｌの滅菌ＰＢＳ中の１００ｎｇ、１μｇまたは３μｇのＦＢＧを右膝関節に注射した。コントロールマウスは、１０μｌのＰＢＳのみの注射を受けるか、または注射されなかった。
【０１４３】
３日目および７日目に、マウスを安楽死させ、膝関節を切除し、１０％（volume/volume）の緩衝ホルマリンで固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰して、パラフィンで処理した。
【０１４４】
膝関節の組織診断
冠状の組織切片（４μｍ）を、関節の至るところから７深度で切断した；８０μｍ離れており、ヘマトキシリン・エオシンまたはサフラニン−Ｏで染色して、関節病理を評価した。病理組織学的な変化は、Van Lent (2006)に記載されているように、次のパラメーターを使用して、点数化した。
【０１４５】
炎症（炎症性細胞の滑膜への流入（浸潤物）および関節腔への流入（滲出物））は、０（炎症なし）から３（重度の炎症）の、任意のスケールを用いて段階分けした。軟骨細胞死は、全領域との関連で、empty lacunaeを含む軟骨領域の割合で、決定された。軟骨表面びらんは、全軟骨領域との関連で、損失した軟骨の量で、決定された。骨破壊は、全膝関節切片の１０個の異なる領域において、決定された。破壊は、スケール０（損傷なし）から３（骨の構造の完全な損失）に段階分けされた。組織学的解析は、実験群を知らされていない研究所によって、行われた。実験群の各マウスに対する平均値のスコアは、関節当たり少なくとも５切片の深度の病理学的なスコアの平均値によって、計算した。
【０１４６】
結果
ザイモサン誘導関節炎はテネイシンＣ欠損マウスにおいて持続しない
足蹠へのザイモサン注射は、マウスの急性滑膜炎を誘導するために用いられた。野生型マウスは、２４時間で最大の脚直径に達する、急速な脚の腫脹を示した（最初の脚の直径の６２％の増加である、２．５６ｍｍ）。これは、さらに２４時間、維持された。２日後、脚の直径は減少したが、脚は４日目まで、腫脹したままであった（３２％の増加である、２．０８ｍｍ）（図１ａ）。テネイシンＣ欠損マウスは、注射２４時間後に、野生型マウスと同程度の脚の腫脹を示した（最初の脚の直径の５７％の増加である、２．４１ｍｍ）。しかしながら、テネイシンＣ欠損マウスの腫脹は、野生型マウスに比べ、早く沈静した；脚の直径は、２日で顕著に減少し、４日目に１．７ｍｍに減少した（わずか１１％の増加）（図１ａ）。しかしながら、注射後４日まで、野生型マウスの脚は、依然として目に見えて腫れて赤く、一方、テネイシンＣ欠損マウスの脚は、見た目には腫れても赤くもなく、注射をしていない脚に似ていた（図９）。
【０１４７】
この違いは４日目に組織学的に反映された。野生型マウスの滑膜は、顕著に炎症性であり、細胞浸潤を示しており、軟骨プロテオグリカンの損失が観察された（図１ｂ、ｃ）。対照的に、テネイシンＣ欠損マウスの滑膜は、滑膜炎、細胞浸潤、または軟骨プロテオグリカンの損失を示さず（図１ｄ、ｅ）、偽注射されたマウスおよび注射されていないマウスの関節に似ていた（非掲載）。関節炎の定量により、滲出物（関節腔における細胞集団）は、野生型マウスまたはテネイシンＣ欠損マウスのどちらにおいてもほとんどないが、浸潤物（滑膜層における細胞集団）のレベルは、テネイシンＣ欠損マウスにおいて顕著に減少したことが明らかになった（図１ｆ）。どちらの遺伝子型においても、マウスにおいて軟骨びらんまたは骨びらんは発症しなかったが、低レベルの軟骨細胞死が野生型マウスで起こった。テネイシンＣ欠損マウスでは、見られなかった（図１ｇ）。従って、テネイシンＣの発現は、急性炎症の維持を促進していると考えられる。
【０１４８】
テネイシンＣ欠損マウスは、抗原誘導関節炎の間、持続性の炎症および構造的損傷から保護されている
テネイシンＣが、より破壊性の炎症性関節炎にもまた寄与しているかどうかを判断するために、びらん性関節炎を、ｍＢＳＡによる免疫化に続く、ｍＢＳＡの膝関節への関節内注射によって誘導した。当該モデルは、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を包含し、ヒトＲＡと同様の病理学的な変化を誘導する（Brackertz (1977)）。ｍＢＳＡ注射は、テネイシンＣ欠損マウスおよび野生型マウスの両方において、同様の炎症性応答を誘導した。細胞浸潤および滑膜肥厚は、偽注射されたマウス（図２ａ、ｂ、ｇ）、または注射されていないマウス（非掲載）と比較したところ、両遺伝子型のマウスにおいて、２４時間までに表れた（図２ｃ−ｆ、ｈ、ｉ）。
【０１４９】
しかしながら、これらの症状は、テネイシンＣ欠損マウスでは、野生型マウスのようには持続しなかった。注射後３日目までに、野生型マウスは、半月板および嚢の炎症の増加、滑膜肥厚、関節腔への細胞およびフィブリンの沈着、パンヌスの形成、局在的な軟骨プロテオグリカンの損失を示す（図３ａ、ｂ、ｆ）。対照的に、テネイシンＣ欠損マウスにおいては、３日目までに、炎症が嚢に限定され、滑膜炎は鎮静し、フィブリン／細胞集合体が関節腔に存在せず、パンヌス形成も、軟骨プロテオグリカンの損失も見られない（図３ｃ、ｄ、ｅ）。
【０１５０】
７日目までに、野生型マウスは、持続性の炎症性細胞浸潤および関節腔滲出物、広範囲の滑膜炎、パンヌス形成、関節軟骨の破壊、および骨びらんを示した（図４ａ、ｂ）。偽注射された膝および注射されていないマウスの膝は、健常であり、炎症も関節破壊も示さなかった（非掲載）。テネイシンＣ欠損マウスはまた、軽度の炎症性細胞浸潤のみ示し、関節腔滲出物、滑膜炎、パンヌス形成、関節軟骨の破壊、または骨びらんを示さない、健常な関節であった（図４ｃ、ｄ）。偽注射された、および／または注射されていないテネイシンＣ欠損マウス由来の関節もまた、健常であった（非掲載）。
【０１５１】
これらの組織学的なデータは、材料と方法に記載されたように、関節疾病の点数化に反映させる。注射２４時間後の、野生型マウスおよびテネイシンＣ欠損マウスの両方で観察された細胞浸潤物および滲出物のレベルは、顕著に異なってはいなかった。しかしながら、細胞集団が野生型マウスにおいて経時的に増加し続けた一方、テネイシンＣ欠損マウスにおける当該応答は減弱化し、関節の細胞数は経時的に減少した（図４ｅ）。野生型マウスの軟骨において、経時的にますます高レベルの軟骨細胞死が生じたが、テネイシンＣ欠損マウスにおいて顕著な軟骨細胞死は見られなかった（図４ｆ）。２４時間、または３日目において、軟骨表面びらんおよび骨びらんは、野生型マウスにおいて明白ではなかったが（非掲載）、７日目までに、顕著な組織破壊が生じた。対照的に、テネイシンＣ欠損マウスは、２４時間、３日目（非掲載）、または７日目（図４ｆ）に、組織破壊を示さなかった。これらのデータは、野生型マウスとは異なり、テネイシンＣ欠損マウスにおいて関節炎の開始（滑膜および関節腔への細胞流入）は影響を受けず、疾病が組織破壊および細胞死まで進行していないことを示している。これらの結果は、テネイシンＣの発現が、当該モデルにおいて持続性の滑膜炎および関節破壊に必要であることを証明する。
【０１５２】
実施例４−細胞培養
患者の検体
ヒト単核球は、末梢血液（London Blood Bank）から単離され、マクロファージは、既に記載されている通り（Foxwell (1998)）、１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦで４日間分化後の単核球に由来した。
【０１５３】
ＲＡ膜細胞（全ての滑膜細胞型の混合群を表す）は、既に記載されている通り（Brennan(1989)）、関節置換手術を受けた患者から取得した滑膜から単離された。ＲＡ滑膜繊維芽細胞は、既に記載されている通り（Brennan(1989)）、ＲＡ膜細胞の混合群から単離された。本研究は、地域の信頼のおける倫理委員会（Riverside NHS Research Committee）によって承認され、廃棄組織（関節置換手術後の滑膜）は、署名されたインフォームドコンセントを患者から受け取り、患者の身元を保護するために匿名化した後にのみ、入手した。
【０１５４】
単離した直後、ＲＡ膜細胞およびマクロファージは、刺激前の２４時間、９６穴組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌ（ユニット／ｍｌ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０中にて、ウェル当たり１×１０５個の細胞で培養した。滑膜繊維芽細胞（継代数２または３のみ使用される）は、刺激前の２４時間、９６穴組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中にて、ウェル当たり１×１０４個の細胞で培養した。
【０１５５】
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）および骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）
ＭＥＦは、マウスの全９個のＴＬＲのｍＲＮＡを高レベルで発現し、ＴＬＲリガンドの活性化に特異的かつ高度に応答する。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８を標的とした欠失を有するマウス由来のＭＥＦは、特異的リガンドに対するＩＬ−６応答において重度の欠損を示す（Kurt-Jones(2004))。ＭＥＦは、年齢を適合させた、妊娠中の雌の、野生型マウス、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４欠損マウスから回収した１３日目の胚から単離した（Todaro(1963)に記載されたように）。繊維芽細胞は、刺激前の２４時間、９６穴組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中にて、ウェル当たり２×１０４個の細胞で培養した。
【０１５６】
ＢＭＤＭは、年齢を適合させた雌の、野生型マウス、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４欠損マウスの大腿骨を吸引して（Butler(1999)に記載されたように）、ＤＭＥＭ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍｌ／Ｌ（ｖ／ｖ）抗菌抗真菌溶液ＰＳＡ、５０μＭβ−メルカプトエタノールおよび１０ｎｇ／ｍｌＭ−ＣＳＦで７日間細胞を培養することによって、導き出された。その後、マクロファージは、刺激前の２４時間、９６穴組織培養プレートにおいて、ＤＭＥＭ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍｌ／Ｌ（ｖ／ｖ）抗菌抗真菌溶液ＰＳＡ、５０μＭβ−メルカプトエタノール中にて、ウェル当たり１×１０５個の細胞で培養した。
【０１５７】
ＨＥＫ２９３細胞株
ＴＬＲ２およびＴＬＲ４／ＣＤ１４／ＭＤ−２を発現するＨＥＫ２９３細胞株は、刺激前の２４時間、９６穴組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍｌブラストサイジンを含むＤＭＥＭ中にて、ウェル当たり１×１０４個の細胞で培養した。
【０１５８】
細胞刺激およびサイトカイン合成の評価
細胞は、示された容量のテネイシンＣおよび組換えテネイシンＣフラグメント（１．０μＭ−１．０ｎＭ）と共に、２４時間３７℃で培養した。細胞はまた、記載がある場合、ＬＰＳ（ヒトマクロファージに対しては１ｎｇ／ｍｌ、ヒト繊維芽細胞およびＨＥＫに対しては１０ｎｇ／ｍｌ、ＭＥＦＳおよびＢＭＤＭに対しては１００ｎｇ／ｍｌ、およびＨＥＫＳに対しては１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＡＭ３（ヒトマクロファージ、ヒト繊維芽細胞、およびＨＥＫに対しては１０ｎｇ／ｍｌ、ＭＥＦおよびＢＭＤＭに対しては１００ｎｇ／ｍｌ）、マウスＩＬ−１（ＭＥＦＳに対しては５ｎｇ／ｍｌ）およびマウスＴＮＦ−α（ＭＥＦＳに対しては１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激された。他に特に記載されない限り、粗面ＬＰＳが、インビトロの研究に使用された。
【０１５９】
アデノウイルス遺伝子導入実験のために、ヒトＲＡ滑膜繊維芽細胞をアデノウイルスベクターと感染効率１００で培養して、２時間後に洗浄し、完全培地で２４時間培養して、２４時間刺激した。各工程後に、上清を回収した。
【０１６０】
記述がある場合、細胞は刺激前に３７℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ１４抗体、１０μｇ／ｍｌ ＩＬ１受容体アンタゴニスト、１０μｇ／ｍｌ抗ＴＬＲ２抗体、２５μｇ／ｍｌ抗ＴＬＲ４抗体、１０並びに２５μｇ／ｍｌアイソタイプコントロール抗体、２５μｇ／ｍｌポリミキシンＢ、または１μｇ／ｍｌ ｍｓｂＢ ＬＰＳでプレインキュベートした。記述がある場合、組換えテネイシンＣおよびＦＢＧ、ＬＰＳは、細胞に添加する前に１５分間沸騰させた。
【０１６１】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ（Sigma, Poole, UK）によって調べたところ、全ての場合において、細胞の生存率は、実験中を通して顕著に影響を受けていなかった。
【０１６２】
上清はその後、製造業者の使用説明書に従い酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８の存在を調べた。吸光度は、分光光度法ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Labsystems Multiscan Biochromic, Vantaa, Finland）で読み取り、Ascent software program （Thermo Labsystems, Altrincham, UK）を用いて解析した。
【０１６３】
結果
テネイシンＣは、初代ヒトＲＡ滑膜繊維芽細胞およびマクロファージにおいて、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８合成を誘導する
次に、テネイシンＣが自然免疫応答を活性化するかどうかを調べた。テネイシンＣを、初代ヒトマクロファージおよびＲＡ滑膜繊維芽細胞を刺激するために使用し、炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８の産生を調べた。細菌の細胞壁成分、ＬＰＳを、ポジティブコントロールとして用いた。テネイシンＣは、ＬＰＳとは顕著に異なり、細胞型特異的なサイトカイン特性を誘導した。テネイシンＣは、ヒトマクロファージにおいてＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８の産生を用量依存的に刺激した（図５ａ）。しかしながら、テネイシンＣは滑膜繊維芽細胞においてＩＬ−６合成のみを誘導し、一方ＬＰＳは、ＩＬ−６およびＩＬ−８の両方を誘導した（図５ｂ）。ＬＰＳおよびテネイシンＣはどちらも、繊維芽細胞のＴＮＦ−α合成を誘導しなかった（データ非掲載）。テネイシンＣによるヒトマクロファージにおけるＩＬ−６の刺激（図５ｃ）、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αの刺激、滑膜繊維芽細胞におけるＩＬ−６の刺激（非掲載）は、熱感受性であり、ＬＰＳ阻害薬、ポリミキシンＢによって影響されなかった。これらの結果は共に、テネイシンＣによるサイトカイン誘導が、ＬＰＳのコンタミネーションに起因しない事に対して、強力な証拠を提供する。
【０１６４】
フィブリノーゲン様グローブ（ＦＢＧ）は、テネイシンＣの細胞活性化を媒介する。
テネイシンＣは、大きな六量体の分子であり、その各ドメインは異なる細胞表面受容体に結合する（Orend (2005)に報告されているように）。テネイシンＣの作用機構を理解することは、どのドメインがサイトカイン産生を促進する上で重要であるかを同定することを必要とするであろう。異なる分子のドメインを含む組換えタンパク質を合成した（図１０）。各ドメインは、大腸菌（E.coli）で作成して精製し（図１１）、適切なタンパク質をリムルスアメボサイトライセートアッセイに供することによって、＜１０ｐｇ／ｍｌ ＬＰＳを含むことが分かった。テネイシンＣの一つのドメインのみに活性があった。フィブリノーゲン様グローブ（ＦＢＧ）は、全長テネイシンＣと同程度、ヒトマクロファージのＴＮＦ−α合成を刺激し（図６ａ）、ヒトマクロファージのＩＬ−６およびＩＬ−８合成を刺激し（非掲載）、ＲＡ滑膜繊維芽細胞のＩＬ−６を刺激した（非掲載）。ＦＢＧは、全長テネイシンＣと同様に、ＬＰＳが誘導するようにはＲＡ滑膜繊維芽細胞のＩＬ−８合成を誘導しなかった（データ非掲載）。ＦＢＧが誘導するサイトカイン合成はまた、熱感受性であり、ポリミキシンＢによって影響されなかった（データ非掲載）。
【０１６５】
テネイシンＣのＦＢＧドメインは、ヒトＲＡ滑膜でのサイトカイン産生、およびマウスの関節炎を誘導する。
ＦＢＧが、ＲＡ患者の滑膜での炎症性サイトカインの発現を促進できるかどうかを調べた。当該ＲＡ組織モデル（全ての滑膜細胞型の混合群を含む）は、自発的に高レベルのＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αを産生する（Brennan (1989)）（図６ｂ）。ＦＢＧはさらに、これら全てのサイトカインの合成を増強させた（図６ｂ）。ＦＢＧが、インビボでの炎症を誘導できるかどうかを測定するために、野生型マウスに対しＦＢＧを関節内に注射した。一過性かつ用量依存的な関節炎の刺激が観察された。炎症もプロテオグリカンの損失も、注射されていないマウス、またはＰＢＳ（図６ｃ−ｅ）もしくは１００ｎｇのＦＢＧ（データ非掲載）によって注射されたマウスにおいては、生じなかった。１μｇのＦＢＧで注射したマウスにおいて、炎症性細胞浸潤（図６ｆ）、軽度の滑膜炎、パンヌス形成（図６ｇ）およびプロテオグリカン損失（図６ｈ）が観察された。３μｇのＦＢＧで注射したマウスにおいて、同様の応答が見られた（データ非掲載）。組織学的定量によると、ＦＢＧで注射したマウスにおいて、高レベルの細胞浸潤物、滲出物および軟骨細胞死が、中程度の軟骨表面びらんおよび骨損傷とともに観察された（図６ｉ）。
【０１６６】
ＦＢＧ媒介サイトカイン合成は、Ｍｙｄ８８に依存している
フィブリノーゲンを含む多くのＤＡＭＰが（Smiley (2001)）、ＴＬＲの活性化により、自然免疫応答を刺激することが明らかになってきている。それゆえ、ＴＬＲもまたテネイシンＣ誘導サイトカイン産生を媒介するかどうかを調べた。ミエロイド系分化因子８８（ＭｙＤ８８）は、ＴＬＲ３を除く全てのＴＬＲによるシグナル伝達に必要である（O'Neill (2008)）。ドミナントネガティブなＭｙＤ８８を発現するアデノウイルスによる滑膜繊維芽細胞の感染は、ＦＢＧのＩＬ−６誘導を消失させたが、ＧＦＰコントロールウイルスは消失させなかった（図７ａ）。これらのデータは、ＦＢＧ誘導性炎症が、機能性ＭｙＤ８８に依存していることを示唆している。ＩＬ−１受容体アンタゴニストの添加がサイトカインの誘導を阻害しなかったため、ＦＢＧの当該効果はＩＬ−１によって媒介されるのではないようである（データ非掲載）。ＦＢＧの作用がＭｙＤ８８依存的であることを確認するために、ＭｙＤ８８遺伝子を標的として欠失させたマウスから単離された胚繊維芽細胞において、ＦＢＧがサイトカイン合成を刺激しないことを証明した。ＴＬＲ２リガンドであるＰＡＭ３、ＴＬＲ４リガンドであるＬＰＳ、およびＩＬ−１はいずれも、ＭｙＤ８８を介してシグナルを伝達する。これらによる刺激はまた、欠損マウス由来ＭＥＦにおいては、消失していた。しかしながら、ＭｙＤ８８を介してシグナルを伝達しない、ＴＮＦ−αは、影響を受けなかった（図７ｂ）。野生型ＭｙＤ８８の再遺伝子導入は、これらの細胞のＦＢＧ、ＰＡＭ３、ＬＰＳおよびＩＬ−１への応答性を回復させた（データ非掲載）。
【０１６７】
ＦＢＧはＴＬＲ４を介してシグナルを伝達する
ＴＬＲは、内在性のリガンドに対し、特異性を示す；タンパク質はＴＬＲ２およびＴＬＲ４のうちの一つまたは両方によって、認識される（O'Neill (2008)に概説されている）。ＴＬＲ４の中和抗体は、ＦＢＧおよびＬＰＳによって誘導されるヒトマクロファージでのＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αの合成、並びにＲＡ滑膜繊維芽細胞でのＩＬ−６の合成を阻害したが、ＴＬＲ２リガンドであるＰＡＭ３の機能には影響を与えなかった。アイソタイプに適合するコントロールは、いずれのリガンドによって誘導されるサイトカイン合成にも影響を与えなかった（ヒトマクロファージによるＴＮＦ−α合成を図８ａに示す）。ＦＢＧの作用がＴＬＲ４に依存していることを確認するために、ＴＬＲ４遺伝子を標的として欠失させたマウスから単離された胚繊維芽細胞またはマクロファージにおけるサイトカイン合成を、ＦＢＧが刺激しないことを証明した。ＦＢＧ媒介サイトカイン合成は、ＴＬＲ２遺伝子を標的として欠失させたマウスから単離された胚繊維芽細胞またはマクロファージにおいて、影響されなかった。ＴＬＲ２欠損マウスから単離された細胞は、ＰＡＭ３には非応答性であったが、ＬＰＳおよびＩＬ−１には応答性であった。ＴＬＲ４欠損マウスから単離された細胞は、ＬＰＳに非応答性であったが、ＰＡＭ３およびＩＬ−１には応答した（図８ｂ、ｃ）。さらに、ＴＬＲ４の発現は、インビボでのＦＢＧによる関節炎誘発性作用に必要であった；ＦＢＧはＴＬＲ２欠損マウスにおいて関節炎を誘導可能であったが、ＴＬＲ４欠損マウスにおいては不可能であった（図１２）。
【０１６８】
ＦＢＧおよびＬＰＳに対する異なる共役受容体の必要性
ＴＬＲ４を介したＬＰＳのシグナル伝達は、可溶性タンパク質ＭＤ−２と、ＧＰＩ結合細胞表面ＣＤ１４または可溶性ＣＤ１４とを含む、受容体複合体によって媒介される（Fitzgerald (2004)に概説されている）。次に、ＴＬＲ４のＦＢＧ活性化にＣＤ１４およびＭＤ−２が必要かどうかを調べた。本実験でのポジティブコントロールとして、ＭＤ−２およびＣＤ１４の両方を必要とする、滑面グリコシル化ＬＰＳの活性を調べた（Jiang (2005)）。ＬＰＳが媒介する、ヒトマクロファージによるＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−α合成、並びにＲＡ滑膜繊維芽細胞によるＩＬ−６合成は、抗ＣＤ１４抗体と、ＭＤ−２に結合するＬＰＳを求めて競いあう、ｍｓｂＢ変異大腸菌（E.coli）由来のアンタゴニストのＬＰＳ(Coats(2007))とによって、阻害された。反対に、ＴＬＲ２活性化のためにこれらの共役受容体を必要としないＰＡＭ３を介するサイトカイン合成も、ＦＢＧを介するサイトカイン合成も、抗ＣＤ１４抗体またはｍｓｂＢ変異ＬＰＳによって、影響を受けなかった（図８ｄは、ヒトマクロファージによるＴＮＦ−α合成を示す）。これらのデータは、ＣＤ１４もＭＤ−２も、ＦＢＧ媒介サイトカイン合成に必要ではないことを示唆している。それゆえ、ＬＰＳおよびＦＢＧは共にＴＬＲ４の活性化を介してシグナルを伝達するが、異なる共役受容体を必要としてもよい。
【０１６９】
実施例５−ヒト組織における、テネイシンＣの作用および合成の阻害
本実施例では、ヒトＲＡ滑膜における、（１）テネイシンＣの炎症促進性作用の阻止、および（２）テネイシンＣの発現の阻害の影響を調べる。
【０１７０】
方法
ペプチド合成
ＦＢＧドメイン全体を含む、９個の重複ペプチド（表２）は、Biogenes, Germanyによって合成された。ペプチドは、室温で切断され（切断混合物：９０％トリフルオロ酢酸、５％チオアニソール、３％エタンジチオール、２％アニソール）、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製され、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトル分析で特徴を明らかにした。ペプチドの純度は、高速液体クロマトグラフィーによって測定し、＞８５％であった。
【０１７１】
当該機関は、ペプチド７を合成できなかった。おそらく、ペプチド鎖の伸長を妨げる二次構造が形成されたからであろう（(LaFleur (1997)に既報であるように）。
【表２】
2017507337.tif 000005
【０１７２】
患者の検体および細胞培養液
ＲＡ膜細胞（全ての滑膜細胞型の混合群を表す）は、関節置換手術を受けた患者から取得した滑膜から単離された（Brennan(1989)）。滑膜組織は、５％ウシ胚血清（ＦＣＳ）（ＧＩＢＣＯ）、５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Sigma）および０．１５ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡ分解酵素Ｉ（Sigma）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）中で分解し、３７℃２時間培養した。
【０１７３】
培養後、滑膜組織は、ナイロンメッシュを通過させて、滅菌ビーカーへピペッティングした。細胞はその後、完全培地（１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ１６４０）で三回洗浄した。ＲＡ滑膜繊維芽細胞は、１０％ＦＢＳ、１μＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、およびストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ（Bio-Whittaker）中での選抜によって、ＲＡ膜細胞の混合群から単離された。ヒト単核球は、末梢血液（London Blood Bank）から単離され、マクロファージは、１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦで４日間分化後の単核球に由来した。
【０１７４】
本研究は、地域の信頼のおける倫理委員会によって承認され、廃棄組織（関節置換手術後の滑膜）は、署名されたインフォームドコンセントを患者から受け取り、患者の身元を保護するために匿名化した後にのみ、入手した。
【０１７５】
細胞刺激およびサイトカイン合成の評価
単離した直後に、ＲＡ膜細胞は、９６穴組織培養プレートにおいて、1０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０中にて、ウェルあたり１×１０５個の細胞で培養した。細胞は、添加なしのバッファーコントロール（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）と、または２５μｍ、１００μＭもしくは２５０μＭの各ＦＢＧスパニングペプチドと、３７℃で２４時間培養した。
【０１７６】
滑膜繊維芽細胞（継代数２または３のいずれかのみ使用）は３．５−ｃｍディッシュに５×１０４細胞の濃度で蒔いた。ｓｉＲＮＡは、最終濃度１０ｎＭで、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて無血清のＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ中で４時間、遺伝子導入された。ヒトテネイシンＣに対する二つの異なるｓｉＲＮＡが使用された（ｓ７０６９およびｓ２２９４９１）（Applied Biosystems）。
【０１７７】
ｓ７０６９のｓｉＲＮＡ配列は：（センス５’ＣＧＣＧＡＧＡＡＣＵＵＣＵＡＣＣＡＡＡｔｔ３’［配列番号２９］、アンチセンス５’ＵＵＵＧＧＵＡＧＡＡＧＵＵＣＵＣＧＣＧｔｃ３’［配列番号３０］）であり、ｓ２２９４９１のｓｉＲＮＡ配列は（５’ＧＧＡＡＵＡＵＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＡｔｔ３’［配列番号３１］、アンチセンス５’ＵＣＵＵＣＵＵＵＡＵＵＣＡＵＡＵＵＣＣｇｇ３’［配列番号３２］）である。ルシフェラーゼ（Dharmacon）に対するｓｉＲＮＡは、非標的コントロールとして遺伝子導入された。
【０１７８】
遺伝子導入の４時間後に、培地を、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）を含む予め平衡化したダルベッコ変法イーグル培地に交換し、細胞をさらに４８時間および７２時間、培養した。細胞はその後、１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳで、３７℃で２４時間刺激した。テネイシンＣのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、それぞれＰＣＲおよびウエスタンブロッティングによって、定量した。全ＲＮＡは、QiaAmp RNA Blood mini kit（Qiagen,Germany）を用いて、細胞から抽出した。ｃＤＮＡは、SuperScript（登録商標）III Reverse Transcriptase（Invitrogen）および18-mer oligo dTs（Eurofins MWG Operon）を用いて、等量の全ＲＮＡから合成した。
【０１７９】
遺伝子発現は、ＴａｑＭａｎプライマーセットヒトテネイシンＣ（Ｈｓ０１１１５６６３−ｍ１）およびCorbett Rotor-gene 6000 machine（Corbett Research Ltd）のヒトリボソームタンパク質の内在性コントロール（ＲＰＬＰＯ）（４３１０８７９Ｅ）（Applied Biosystems）を使用した、定量的リアルタイムＰＣＲに基づく、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）によって分析した。テネイシンＣタンパク質は、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび抗体ＭＡＢ１９０８（Millipore）を用いたウエスタンブロッティングによって、細胞上清および細胞可溶化物中に、検出された。
【０１８０】
マクロファージは、９６穴組織培養プレートにおいて、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０中で、刺激前の２４時間、ウェル当たり１×１０５個の細胞で、培養した。細胞は、添加なし、１．０μＭ ＦＢＧ、１ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳまたは１μＭもしくは２０μＭ ＦＢＧペプチドで、３７℃２４時間培養した。記述がある場合、細胞は２０μＭ ＦＢＧペプチドと１５分、プレインキュベートした。
【０１８１】
細胞の生存率は、MTT cell viability assay（Sigma, Poole, UK）によって調べたところ、実験中を通して、顕著に影響を受けなかった。上清について、製造業者（R&D systems）の使用説明書に従い酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８の存在を調べた。吸光度は、分光光度法ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Labsystems Multiscan Biochromic, Vantaa, Finland）で読み取り、Ascent software program（Thermo Labsystems, Altrincham, UK）を用いて解析した。
【０１８２】
統計手法
平均値（Ｍｅａｎ）、ＳＤおよびＳＥＭは、GraphPad（GraphPad Software Inc., San Diego, CA）を用いて計算した。
【０１８３】
結果
特異的ＦＢＧペプチドによる、ＲＡ膜培養物中のサイトカイン合成の遮断
ペプチド阻害の手法は、テネイシンＣのＦＢＧドメイン中のαｖβ３インテグリン結合部位を特定して、テネイシンＣのＦＢＧドメインに応答する細胞接着を回避するために使用することに、成功している（Lafleur (1997) and Yokoyama (2000)）。
【０１８４】
ＦＢＧの全配列に及ぶ、３０以下のアミノ酸からなる、一連の８つの重複ペプチドを合成した（表２）。ペプチドに対し、ＲＡ滑膜培養物において自発的サイトカイン合成を遮断する能力を試験した。ＴＮＦおよびＩＬ８合成は、ペプチド３および８によって阻害されたが、他のいずれのペプチドによっても阻害されなかった（図１５で示したＴＮＦ）。ペプチド３および８は、最高濃度において、それぞれ９５％および５６％に達する阻害で、サイトカイン合成を用量依存的に阻害した（図１６）。ペプチド５は、ＴＮＦ合成には影響を与えなかったが、ＲＡ膜細胞のＩＬ８合成は、最大８１％の阻害で、用量依存的に遮断した（図１６）。
【０１８５】
サイトカイン産生誘導の原因となるＦＢＧ内の活性ドメインを位置決定するために、各ＦＢＧペプチドで、初代マクロファージを刺激した。ペプチド１、５、および６は全て、用量依存的に、サイトカイン合成を誘導した（図１７）。
【０１８６】
ヒトマクロファージにおいて、いずれのペプチドがＦＢＧ誘導サイトカイン合成を遮断し得るかを測定するために、ＦＢＧ全体またはＬＰＳのどちらかで刺激する前に、各ＦＢＧペプチドで細胞をプレインキュベートした。ペプチド５は特異的にＦＢＧ媒介サイトカイン合成を遮断し、ペプチド８はＬＰＳおよびＦＢＧの両方に応答するサイトカイン合成を遮断した（図１８）。
【０１８７】
従って、ペプチド８は、任意の刺激によって誘導されたサイトカイン産生を、非特異的に遮断する。当該ドメインは、細胞接着を媒介するＦＢＧのインテグリン結合ドメインであり、従って、組織培養プレートへの細胞付着を防ぐよう、作用している可能性がある。ペプチド５はＦＢＧ誘導サイトカイン合成を特異的に遮断し、このことは、当該ドメインを標的とすることがテネイシンＣ誘導性炎症を防ぐ上で有用である可能性があることを示唆している。
【０１８８】
テネイシンＣ遺伝子発現のサイレンシングが、ＲＡ滑膜繊維芽細胞におけるサイトカイン合成を阻害する
ヒトＲＡ滑膜におけるテネイシンＣの発現を阻害する効果を調べることにより、滑膜繊維芽細胞を、ＲＡにおけるテネイシンＣの主要な供給源として同定した（図１Ｃ？）（in Goh 2010）。
【０１８９】
ｓｉＲＮＡが媒介する、これらの細胞におけるテネイシンＣの発現のノックダウンは、最大効率９４−９６％の間で出現した（図１９）。テネイシンＣのｓｉＲＮＡを遺伝子導入した細胞において、サイトカイン合成およびＬＰＳ誘導サイトカイン産生の両方の基礎レベルは、コントロール細胞と比較して、それぞれ３８％および４４％阻害された（図１９）。
【０１９０】
これらのデータによって、ＲＡ滑膜繊維芽細胞におけるテネイシンＣのサイレンシングが、炎症性サイトカインの合成を減少させることが明らかになり、また、テネイシンＣの発現の消失が、滑膜における炎症を抑制する実践可能な戦略であることが示唆される。
【０１９１】
本研究によって、（ペプチドによる）テネイシンＣ活性の遮断および（ｓｉＲＮＡによる）テネイシンＣの発現の遮断が、ヒトＲＡ滑膜における炎症性サイトカインを減少させることが確証された。これらのデータは、ＲＡおよび他の炎症性疾患を治療する上で、テネイシンＣの遮断が、潜在的かつ臨床的に有効であることを示している。
【０１９２】
実施例６−インビトロでのシトルリン化
等量の、タンパク質と２×シトルリン化バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ）とを混合させた。基質タンパク質１ｍｇ当たり８．７５Ｕのウサギ骨格ＰＡＤ（製品番号Ｐ１５８４、Sigma）を添加し、３７℃で３時間、または５０℃で２時間培養した。シトルリン化は、ＳＤＳ ＰＡＧＥのクマシーブルー染色によって可視化されたサイズシフト、またはＡＭＣ検出によって確認した。
【０１９３】
図２０に示された結果は、精製したフィブリノーゲンおよびＦＢＧが、インビトロでシトルリン化され得ることを証明している。
【０１９４】
精製した全長テネイシンＣのインビトロでのシトルリン化は、図２１の結果によって示されている。
【０１９５】
実施例７−シトルリン化タンパク質のＡＭＣ（抗修飾シトルリン）検出
シトルリン化は、抗シトルリン（Modified）Detection Kit（Millipore （カタログ：１７−３４７））のプロトコールを用いて検出した。
Ａ．ニトロセルロースブロットの調製
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロースに転写する。ブロットを、水で５分×２回洗浄する。
２．ブロットを、室温で１５分間、ＴＢＳ中の０．１％オボアルブミン１０ｍｌで培養する。
３．水で１０分×２回洗浄する。
Ｂ．シトルリン残基の修飾
１．３ｍｌの試薬Ａと３ｍｌの試薬Ｂとを混合する。用時調製する。
２．光を通さない容器で、ブロットに修飾バッファーを添加し、３７℃で５−７時間培養する。
３．水で４−５回ブロットをリンスする。
Ｃ．修飾シトルリン残基の検出
１．ＴＭＳ中で新たに調製された３％脱脂粉乳において、３０分−１時間、ブロットをブロックする。
２．ブロットを、ＴＢＳ−ＭＬＫで１：１０００に希釈した抗修飾シトルリン抗体５−８ｍｌで、４℃で振とうしながら一晩中培養する（室温で２−３時間培養するのと同様の働きと思われる）
３．ブロットを水で３回洗浄し、その後１５分×１回、その後５分×３回洗浄する。
４．ブロットを、ＴＢＳ−ＭＬＫで１：５０００に希釈したヤギ抗ウサギＨＲＰ結合ＩｇＧ５−８ｍｌで、室温で振とうしながら１時間培養する。
５．ステップ３と同様に、ブロットを洗浄する。
６．ＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３−５分、ブロットを洗浄する。
７．ブロットを、水を４−５回交換して、リンスする。
８．検出にＥＣＬプラスを使用する。
【０１９６】
図２２は、ウエスタンブロットによる、ＦＢＧおよびテネイシンＣのシトルリン化の確認を示している。
【０１９７】
実施例８−ＦＢＧは、インビトロで、ＰＡＤによってシトルリン化される。
図２３は、ＦＢＧが、インビトロで、ＰＡＤによってシトルリン化されていることを示す。特に、クマシーブルー染色ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび抗修飾シトルリン特異的抗体によるウエスタンブロッティングにおける、ＦＢＧの分子量の増加は、ＦＢＧが用量依存的および時間依存的にｒＰＡＤ２、ｈＰＡＤ２およびｈＰＡＤ４によってシトルリン化されることを証明している。
【０１９８】
実施例９−シトルリン化がテネイシンＣの炎症促進性活性を調節することの証明
初代ヒトマクロファージは、上述のように単離され、９６穴組織培養プレートにおいて、刺激前に２４時間、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０中で、ウェル当たり１×１０５個の細胞で、培養した。細胞は、添加なし（ＵＮ）、異なる濃度（μＭ）の天然のＦＢＧ（ｎＦＢＧ）もしくはｃｉｔＦＢＧ（ｃＦＢＧ）、シトルリン化バッファー単独（ＣＩＴ）、またはＰＡＤ酵素を添加したｃｉｔバッファー（ＣＩＴ＋ＰＡＤ）で、３７℃２４時間培養した。
【０１９９】
細胞の生存率は、MTT cell viability assay（Sigma,Poole,UK）によって調べたところ、実験中を通して、顕著な影響を受けていなかった。上清に対して、製造業者（R&D systems）の使用説明書に従い酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、サイトカインＴＮＦ−αの存在を調べた。吸光度は、分光光度法ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Labsystems Multiscan Biochromic, Vantaa, Finland）で読み取り、Ascent software program（Thermo Labsystems, Altrincham, UK）を用いて解析した。
【０２００】
図２４は、シトルリン化が、ＦＢＧによって刺激されるサイトカイン産生を増強することを示している。
【０２０１】
実施例１０−健常コントロールとは異なり、ＲＡ患者の血清は、シトルリン化テネイシンＣおよびシトルリン化ＦＢＧに応答する
シトルリン化タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
３３．３３μｌのシトルリン化反応液（ｃｉｔ−ＴＮＣ単独または、ｃｉｔ−ＦＢＧと組み合わせたｃｉｔ−ＴＮＣ）を、１．０ｍｍの二次元単一レーンウェルを使用したＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ Ｂｉｓ−ｔｒｉｓゲルに流した。
【０２０２】
ＲＡ血清による、ウエスタンブロット検出
電気泳動後、タンパク質はニトロセルロースに転写され、ニトロセルロース膜はブロックし、その後ストライプにカットした（最大８本のストライプ、〜０．７ｃｍ幅）。ストライプは、５％ミルクＴＢＳ−ｔｗｅｅｎに１：１００で希釈した、ＲＡ患者の血清または健常個体の血清で、培養した。ストライプを１５ｍｌのファルコンチューブに入れて、室温で１時間、回転培養装置で培養し、その後ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎのチューブ内で５分×３回、１５分×１回、洗浄した。ストライプは、その後、１：５０００で希釈したマウス抗ヒトＩｇ二次抗体で、室温で１時間培養し、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎのディッシュ内で５分×３回、１５分×１回洗浄した。ストライプは最後にＥＣＬ試薬と培養し、フィルムに曝した。
【０２０３】
図２５Ａは、天然（ｎＴＮＣ）およびシトルリン化（ｃＴＮＣ）精製ヒト組換えテネイシンＣのクマシー染色ゲル（上図）と、ＡＭＣ（抗修飾シトルリン）ｋｉｔを用いたウエスタンブロットにより証明したテネイシンＣのシトルリン化（下図）を示している。
【０２０４】
図２５Ｂは、ＲＡ患者（ＲＡ）または健常コントロール（ＮＨ）（ｎ＝５０）由来の血清で標識したｃＴＮＣの代表的なウエスタンブロットを表している。ｎＴＮＣのブロットにおいて、いずれの血清に対しても、反応性は観察されなかった（非掲載）。
【０２０５】
図２６および２７は、ＲＡ患者のサブセット由来の血清が、ｃｉｔＴＮＣに反応性を示すことを、表している（レーン４のＲＡ患者のサンプルを参照）。
【０２０６】
図２８は、健常対象由来の血清が、ｃｉｔＴＮＣに対して反応性を示さないことを表している。
【０２０７】
図２９は、シトルリン化テネイシンＣおよびシトルリン化ＦＢＧに対するＲＡ血清を示している。ｃＦＢＧを加えたｃＴＮＣのウエスタンブロットを、同じウェルで行い、７人の異なるＲＡ患者由来の血清で標識した。全長テネイシンＣ（３２０ｋＤ）に反応するがＦＢＧには反応しない患者サブセット（レーン４、５）、またはシトルリン化ＦＢＧ（２７ｋｄ）に反応するが全長テネイシンＣには反応しない患者（レーン６）が観察された。
【０２０８】
全長シトルリン化テネイシンＣおよびシトルリン化ＦＢＧを同じレーンで流したゲルは、複数の患者が全長テネイシンＣに反応することを示す。テネイシンＣに反応する患者の中で、一つのサブセットのみ、ＦＢＧにもまた反応し、従って、それらは当然のことながら異なるドメインを認識しているに違いない。
【０２０９】
実施例１１−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、シトルリン化部位の明確化
図３０および表３を参照すると、シトルリン化アルギニン残基は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定された。１７個のアルギニンのうち、５個はシトルリン化されず、３個のアルギニンは当該ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では網羅されず、シトルリン化に使用される酵素とは無関係に９個のアルギニン残基がシトルリン残基へと修飾されている。
【表３−１】
2017507337.tif 000006
【表３−２】
2017507337.tif 000007
【０２１０】
実施例１２−シトルリン化抗体エピトープの同定
図３１を参照して、シトルリン残基を包含する６個のシトルリン化ＦＢＧペプチドに対する、２０個のＲＡ血清および２０個のコントロール血清における抗体応答を評価した。
【０２１１】
ここで評価されたペプチドは次の通りである：
Ｒ５５：ＣＶＦＬＲＲＫＮＧ−Ｒ−ＥＮＦＹＱＮＷＣ［配列番号５４］
ＣＩＴ５５：ＣＶＦＬＲＲＫＮＧ−Ｃｉｔ−ＥＮＦＹＱＮＷＣ［配列番号５５］
Ｒ７２：ＣＡＹＡＡＧＦＧＤ−Ｒ−ＲＥＥＦＷＬＧＬＣ［配列番号５６］
ＣＩＴ７２：ＣＡＹＡＡＧＦＧＤ−Ｃｉｔ−ＲＥＥＦＷＬＧＬＣ［配列番号５７］
Ｒ１２０：ＣＦＳＶＧＤＡＫＴ−Ｒ−ＹＫＬＫＶＥＧＹＣ［配列番号５８］
ＣＩＴ１２０：ＣＦＳＶＧＤＡＫＴ−Ｃｉｔ−ＹＫＬＫＶＥＧＹＣ［配列番号５９］
Ｒ１６９／１７３：ＣＫＧＡＦＷＹ−Ｒ−ＮＣＨ−Ｒ−ＶＮＬＭＧＲＣ［配列番号６０］
ＣＩＴ１６９／１７３：ＣＫＧＡＦＷＹ−Ｃｉｔ−ＮＣＨ−Ｃｉｔ−ＶＮＬＭＧＲＣ［配列番号６１］
Ｒ２０９／２１４／２１９／２２０：ＣＥＭＫＬ−Ｒ−ＰＳＮＦ−Ｒ−ＮＬＥＧ−Ｒ−Ｒ−ＫＲＣ［配列番号６２］
ＣＩＴ２０９／２１４：ＣＥＭＫＬ−Ｃｉｔ−ＰＳＮＦ−Ｃｉｔ−ＮＬＥＧＲＲＫＲＣ［配列番号６３］
ＣＩＴ２１９／２２０：ＣＥＭＫＬＲＰＳＮＦＲＮＬＥＧ−Ｃｉｔ−Ｃｉｔ−ＫＲＣ［配列番号６４］
【０２１２】
シトルリン含有ペプチドＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９／２１４およびＣＩＴ２１９／２２０に対する強力な抗体応答が、ＲＡ血清において検出されたが、コントロール血清においては検出されず、アルギニンを含むコントロールペプチドに対しては、応答は観察されなかった。当該小コホートからのデータは、健常コントロールがいずれも陽性（健常群の第９５百分位数を使用して決定）を示さなかったが、約３５％のＲＡ患者がＣＩＴ５５エピトープに対して陽性であり、２０％のＲＡ患者がＣＩＴ２０９／２１４に対して陽性であり、３０％の患者がＣＩＴ２１９／２２０に対して陽性であるだろうことを示す。同じ計算を、健常コントロール群と比較してＲＡを診断するために用いることができ、これらの群において同様の割合が期待される。
【０２１３】
本データは、患者を、ｃｉｔＦＢＧ抗体陽性またはｃｉｔＦＢＧ陽性に基づいて、階層化することを可能にするであろう。これらの陽性を示した患者は、シトルリン化ＦＢＧの活性を標的として設計された任意の薬剤による治療の候補となるであろう。複数のエピトープの存在はまた、ｃｉｔＦＢＧを標的とする方法について情報を提供する−例えば、仮にＣＩＴ５５が存在すれば、治療はＦＢＧの免疫原性の活性を遮断することを含んでもよく、仮にインテグリン結合部位がシトルリン化されれば、治療は当該ドメインの作用を遮断することを含んでもよい。
【０２１４】
実施例１３−ＦＢＧのシトルリン化は、ＨＤＦおよびＲＡＦの細胞接着を減少させる
図３２を参照すると、ＦＢＧはヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）およびＲＡ関節由来の滑膜繊維芽細胞（ＲＡＦ）への接着促進性がある。ＦＢＧのシトルリン化は、ＨＤＦおよびＲＡＦへの接着を減少させる。インテグリンαｖβ３に結合することが知られている配列内の２つのアルギニンがシトルリン化されるため、接着の減少は、ｃＦＢＧのインテグリンαｖβ３への結合の減少によるものであろう。Yokoyama et al.は、ＦＢＧ内の当該ペプチド配列が、細胞表面のａｖｂ３インテグリンへの結合を介して、細胞接着を媒介することを特定した。ここに示されるように、１）シトルリン化は、インテグリン結合部位においてインビトロで生じ、２）これによって細胞接着は減少し、３）これはＲＡＳＦにおいて起こる。このことは、ＲＡ関節において、当該部位におけるＦＢＧのシトルリン化がＲＡＳＦの接着を減少させ得ることを意味する。ＲＡＳＦの接着の減少は、疾病の進行のために多くの意味を有し得る。例えば、細胞遊走を促進可能であり（例えば、健常な関節組織への浸潤やその分解）、かつ、ＲＡＳＦの増殖（上述のように、持続的な滑膜肥厚）を促進可能である。
【０２１５】
参考文献
1.            Smolen, J.S. & Maini, R.N. Interleukin-6: a new therapeutic target. Arthritis Res Ther 8 Suppl 2, S5 (2006).
2.            Williams, R.O., Paleolog, E. & Feldmann, M. Cytokine inhibitors in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases. Curr Opin Pharmacol 7, 412-417 (2007).
3.            Brentano, F., Kyburz, D., Schorr, O., Gay, R. & Gay, S. The role of Toll-like receptor signalling in the pathogenesis of arthritis. Cell Immunol 233, 90-96 (2005).
4.            O'Neill, L.A. Primer: Toll-like receptor signaling pathways-what do rheumatologists need to know? Nat Clin Pract Rheumatol (2008).
5.            Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science 296, 301-305 (2002).
6.            Bianchi, M.E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. J Leukoc Biol 81, 1-5 (2007).
7.            Gordon, S. Pattern recognition receptors: doubling up for the innate immune response. Cell 111, 927-930 (2002).
8.            Medzhitov, R. & Janeway, C.A., Jr. Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. Science 296, 298-300 (2002).
9.            Radstake, T.R., et al. Expression of toll-like receptors 2 and 4 in rheumatoid synovial tissue and regulation by proinflammatory cytokines interleukin-12 and interleukin-18 via interferon-gamma. Arthritis Rheum 50, 3856-3865 (2004).
10.            Roelofs, M.F., et al. The expression of toll-like receptors 3 and 7 in rheumatoid arthritis synovium is increased and costimulation of toll-like receptors 3, 4, and 7/8 results in synergistic cytokine production by dendritic cells. Arthritis Rheum 52, 2313-2322 (2005).
11.            Sacre, S.M., et al. The Toll-like receptor adaptor proteins MyD88 and Mal/TIRAP contribute to the inflammatory and destructive processes in a human model of rheumatoid arthritis. Am J Pathol 170, 518-525 (2007).
12.            Choe, J.Y., Crain, B., Wu, S.R. & Corr, M. Interleukin 1 receptor dependence of serum transferred arthritis can be circumvented by toll-like receptor 4 signaling. J Exp Med 197, 537-542 (2003).
13.            Lee, E.K., Kang, S.M., Paik, D.J., Kim, J.M. & Youn, J. Essential roles of Toll-like receptor-4 signaling in arthritis induced by type II collagen antibody and LPS. Int Immunol 17, 325-333 (2005).
14.            Abdollahi-Roodsaz, S., et al. Inhibition of Toll-like receptor 4 breaks the inflammatory loop in autoimmune destructive arthritis. Arthritis Rheum 56, 2957-2967 (2007).
15.            Vanags, D., et al. Therapeutic efficacy and safety of chaperonin 10 in patients with rheumatoid arthritis: a double-blind randomised trial. Lancet 368, 855-863 (2006).
16.            Chiquet-Ehrismann, R. & Chiquet, M. Tenascins: regulation and putative functions during pathological stress. J Pathol 200, 488-499 (2003).
17.            Cutolo, M., Picasso, M., Ponassi, M., Sun, M.Z. & Balza, E. Tenascin and fibronectin distribution in human normal and pathological synovium. J Rheumatol 19, 1439-1447 (1992).
18.            McCachren, S.S. & Lightner, V.A. Expression of human tenascin in synovitis and its regulation by interleukin-1. Arthritis Rheum 35, 1185-1196 (1992).
19.            Salter, D.M. Tenascin is increased in cartilage and synovium from arthritic knees. Br J Rheumatol 32, 780-786 (1993).
20.            Chevalier, X., Groult, N., Larget-Piet, B., Zardi, L. & Hornebeck, W. Tenascin distribution in articular cartilage from normal subjects and from patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 37, 1013-1022 (1994).
21.            Hasegawa, M., et al. Expression of large tenascin-C splice variants in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. J Orthop Res 25, 563-568 (2007).
22.            Orend, G. Potential oncogenic action of tenascin-C in tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol 37, 1066-1083 (2005).
23.            Brackertz, D., Mitchell, G.F. & Mackay, I.R. Antigen-induced arthritis in mice. I. Induction of arthritis in various strains of mice. Arthritis Rheum 20, 841-850 (1977).
24.            Brennan, F.M., Chantry, D., Jackson, A., Maini, R. & Feldmann, M. Inhibitory effect of TNF alpha antibodies on synovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis. Lancet 2, 244-247 (1989).
25.            Smiley, S.T., King, J.A. & Hancock, W.W. Fibrinogen stimulates macrophage chemokine secretion through toll-like receptor 4. J Immunol 167, 2887-2894 (2001).
26.            Fitzgerald, K.A., Rowe, D.C. & Golenbock, D.T. Endotoxin recognition and signal transduction by the TLR4/MD2-complex. Microbes Infect 6, 1361-1367 (2004).
27.            Jiang, Z., et al. CD14 is required for MyD88-independent LPS signaling. Nat Immunol 6, 565-570 (2005).
28.            Coats, S.R., Do, C.T., Karimi-Naser, L.M., Braham, P.H. & Darveau, R.P. Antagonistic lipopolysaccharides block E. coli lipopolysaccharide function at human TLR4 via interaction with the human MD-2 lipopolysaccharide binding site. Cell Microbiol 9, 1191-1202 (2007).
29.            Siri, A., et al. Human tenascin: primary structure, pre-mRNA splicing patterns and localization of the epitopes recognized by two monoclonal antibodies. Nucleic Acids Res 19, 525-531 (1991).
30.            Gondokaryono, S.P., et al. The extra domain A of fibronectin stimulates murine mast cells via toll-like receptor 4. J Leukoc Biol 82, 657-665 (2007).
31.            Taylor, K.R., et al. Recognition of hyaluronan released in sterile injury involves a unique receptor complex dependent on Toll-like receptor 4, CD44, and MD-2. J Biol Chem 282, 18265-18275 (2007).
32.            Kim, H.M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell 130, 906-917 (2007).
33.            Schaefer, L., et al. The matrix component biglycan is proinflammatory and signals through Toll-like receptors 4 and 2 in macrophages. J Clin Invest 115, 2223-2233 (2005).
34.            Foell, D., Wittkowski, H. & Roth, J. Mechanisms of disease: a 'DAMP' view of inflammatory arthritis. Nat Clin Pract Rheumatol 3, 382-390 (2007).
35.            Taniguchi, N., et al. High mobility group box chromosomal protein 1 plays a role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis as a novel cytokine. Arthritis Rheum 48, 971-981 (2003).
36.            Pullerits, R., et al. High mobility group box chromosomal protein 1, a DNA binding cytokine, induces arthritis. Arthritis Rheum 48, 1693-1700 (2003).
37.            Kokkola, R., et al. Successful treatment of collagen-induced arthritis in mice and rats by targeting extracellular high mobility group box chromosomal protein 1 activity. Arthritis Rheum 48, 2052-2058 (2003).
38.            Gutowski, N.J., Newcombe, J. & Cuzner, M.L. Tenascin-R and C in multiple sclerosis lesions: relevance to extracellular matrix remodelling. Neuropathol Appl Neurobiol 25, 207-214 (1999).
39.            Amin, K., et al. Inflammation and structural changes in the airways of patients with primary Sjogren's syndrome. Respir Med 95, 904-910 (2001).
40.            Loots, M.A., et al. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. J Invest Dermatol 111, 850-857 (1998).
41.            Lange, K., et al. Endothelin receptor type B counteracts tenascin-C-induced endothelin receptor type A-dependent focal adhesion and actin stress fiber disorganization. Cancer Res 67, 6163-6173 (2007).
42.            Saga, Y., Yagi, T., Ikawa, Y., Sakakura, T. & Aizawa, S. Mice develop normally without tenascin. Genes Dev 6, 1821-1831 (1992).
43.            Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol 162, 3749-3752 (1999).
44.            Takeuchi, O., et al. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components. Immunity 11, 443-451 (1999).
45.            Keystone, E.C., Schorlemmer, H.U., Pope, C. & Allison, A.C. Zymosan-induced arthritis: a model of chronic proliferative arthritis following activation of the alternative pathway of complement. Arthritis Rheum 20, 1396-1401 (1977).
46.            van Lent, P.L., et al. Fcgamma receptors directly mediate cartilage, but not bone, destruction in murine antigen-induced arthritis: uncoupling of cartilage damage from bone erosion and joint inflammation. Arthritis Rheum 54, 3868-3877 (2006).
47.            Foxwell, B., et al. Efficient adenoviral infection with IkappaB alpha reveals that macrophage tumor necrosis factor alpha production in rheumatoid arthritis is NF-kappaB dependent. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 8211-8215 (1998).
48.            Kurt-Jones, E.A., et al. Use of murine embryonic fibroblasts to define Toll-like receptor activation and specificity. J Endotoxin Res 10, 419-424 (2004).
49.            Todaro, G.J. & Green, H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. J Cell Biol 17, 299-313 (1963).
50.            Butler, D.M., Malfait, A.M., Maini, R.N., Brennan, F.M. & Feldmann, M. Anti-IL-12 and anti-TNF antibodies synergistically suppress the progression of murine collagen-induced arthritis. Eur J Immunol 29, 2205-2212 (1999).
51.            Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K. & Pease, L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77, 51-59 (1989).
52.            Clark, R.A., Erickson, H.P. & Springer, T.A. Tenascin supports lymphocyte rolling. J Cell Biol 137, 755-765 (1997).
53.            El-Karef, A., et al. Deficiency of tenascin-C attenuates liver fibrosis in immune-mediated chronic hepatitis in mice. J Pathol 211, 86-94 (2007).
54.            Loike, J.D., Cao, L., Budhu, S., Hoffman, S. & Silverstein, S.C. Blockade of alpha 5 beta 1 integrins reverses the inhibitory effect of tenascin on chemotaxis of human monocytes and polymorphonuclear leukocytes through three-dimensional gels of extracellular matrix proteins. J Immunol 166, 7534-7542 (2001).
55.            Talts, J.F., Wirl, G., Dictor, M., Muller, W.J. & Fassler, R. tenascin-C modulates tumor stroma and monocyte/macrophage recruitment but not tumor growth or metastasis in a mouse strain with spontaneous mammary cancer. J Cell Sci 112 ( Pt 12), 1855-1864 (1999).
56.            Jones (2000) Matrix Biol.,19, 581-96
57.            HarandI (2009) Expert Review of Vaccines, 8, 293-298 
58.            McIntyre (2006) BMC Biotechnol. 6: 1
59.            Paddison (2002) Genes Dev. 16 (8): 948-58
60.            Andreakos (2004) Blood, 103, 2229-37
61.           Goh, F.G., Piccinini, A.M., Krausgruber, T., Udalova, I.A. & Midwood, K.S. Transcriptional regulation of the endogenous danger signal tenascin-C: a novel autocrine loop in inflammation. J Immunol 184, 2655-2662 (2010). 
62.            Midwood, K. et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nat Med 15, 774-780 (2009).
63.            LaFleur, D.W. et al. Aortic smooth muscle cells interact with tenascin-C through its fibrinogen-like domain. J Biol Chem 272, 32798-32803 (1997).
64.            Taylor, P.C. & Feldmann, M. Anti-TNF biologic agents: still the therapy of choice for rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol 5, 578-582 (2009).
65.            Yokoyama, K., Erickson, H.P., Ikeda, Y. & Takada, Y. Identification of amino acid sequences in fibrinogen gamma -chain and tenascin C C-terminal domains critical for binding to integrin alpha vbeta 3. J Biol Chem 275, 16891-16898 (2000).
66.            Sacre SM, Lo A, Gregory B, Simmonds RE, Williams L, Feldmann M, Brennan FM, Foxwell BM.  J Immunol. 2008 Dec 1;181(11):8002-9.
67.            Wegner N, Lundberg K, Kinloch A, Fisher B, Malmstrom V, Feldmann M, Venables PJ: Autoimmunity to specific citrullinated proteins gives the first clues to the etiology of rheumatoid arthritis. Immunol Rev 2010, 233:34-54. 
68.            Fisher BA, Plant D, Brode M, van Vollenhoven RF, Mathsson L, Symmons D, Lundberg K, Ronnelid J, Venables PJ: Antibodies to citrullinated alpha-enolase peptide 1 and clinical and radiological outcomes in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2011, 70:1095-1098. 
69.            Kinloch A, Tatzer V, Wait R, Peston D, Lundberg K, Donatien P, Moyes D, Taylor PC, Venables PJ: Identification of citrullinated alpha-enolase as a candidate autoantigen in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2005, 7:R1421-1429. 
70.            Kinloch AJ, Alzabin S, Brintnell W, Wilson E, Barra L, Wegner N, Bell DA, Cairns E, Venables PJ: Immunization with Porphyromonas gingivalis enolase induces autoimmunity to mammalian alpha-enolase and arthritis in DR4-IE-transgenic mice. Arthritis Rheum 2011, 63:3818-3823. 
71.            Lundberg K, Kinloch A, Fisher BA, Wegner N, Wait R, Charles P, Mikuls TR, Venables PJ: Antibodies to citrullinated alpha-enolase peptide 1 are specific for rheumatoid arthritis and cross-react with bacterial enolase. Arthritis Rheum 2008, 58:3009-3019. 
72.            Snir O, Widhe M, Hermansson M, von Spee C, Lindberg J, Hensen S, Lundberg K, Engstrom A, Venables PJ, Toes RE, Holmdahl R, Klareskog L, Malmstrom V: Antibodies to several citrullinated antigens are enriched in the joints of rheumatoid arthritis patients. Arthritis Rheum 2010, 62:44-52. 
73.            Snir O, Widhe M, von Spee C, Lindberg J, Padyukov L, Lundberg K, Engstrom A, Venables PJ, Lundeberg J, Holmdahl R, Klareskog L, Malmstrom V: Multiple antibody reactivities to citrullinated antigens in sera from patients with rheumatoid arthritis: association with HLA-DRB1 alleles. Ann Rheum Dis 2009, 68:736-743. 
74.            Wegner N, Wait R, Sroka A, Eick S, Nguyen KA, Lundberg K, Kinloch A, Culshaw S, Potempa J, Venables PJ: Peptidylarginine deiminase from Porphyromonas gingivalis citrullinates human fibrinogen and alpha-enolase: implications for autoimmunity in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2010, 62:2662-2672. 
75.            Kuhn KA, Kulik L, Tomooka B, Braschler KJ, Arend WP, Robinson WH, Holers VM: Antibodies against citrullinated proteins enhance tissue injury in experimental autoimmune arthritis. J Clin Invest 2006, 116:961-973. 
76.            Uysal H, Bockermann R, Nandakumar KS, Sehnert B, Bajtner E, Engstrom A, Serre G, Burkhardt H, Thunnissen MM, Holmdahl R: Structure and pathogenicity of antibodies specific for citrullinated collagen type II in experimental arthritis. J Exp Med 2009, 206:449-462. 
77.            Clavel C, Nogueira L, Laurent L, Iobagiu C, Vincent C, Sebbag M, Serre G: Induction of macrophage secretion of tumor necrosis factor alpha through Fcgamma receptor IIa engagement by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies to citrullinated proteins complexed with fibrinogen. Arthritis Rheum 2008, 58:678-688. Page 10 of 10 
78.            Sokolove J, Zhao X, Chandra PE, Robinson WH: Immune complexes containing citrullinated fibrinogen costimulate macrophages via Toll-like receptor 4 and Fcgamma receptor. Arthritis Rheum 2011, 63:53-62. 
79.            Midwood K, Sacre S, Piccinini AM, Inglis J, Trebaul A, Chan E, Drexler S, Sofat N, Kashiwagi M, Orend G, Brennan F, Foxwell B: Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nat Med 2009, 15:774-780. 
80.            Ruhmann M, Piccinini AM, Kong PL, Midwood KS: Endogenous activation of adaptive immunity: tenascin-C drives interleukin-17 synthesis in murine arthritic joint disease. Arthritis Rheum 2012, 64:2179-2190. 
81.            Goh FG, Piccinini AM, Krausgruber T, Udalova IA, Midwood KS: Transcriptional regulation of the endogenous danger signal tenascin-C: a novel autocrine loop in inflammation. J Immunol 2010, 184:2655-2662. 
82.            Page TH, Charles PJ, Piccinini AM, Nicolaidou V, Taylor PC, Midwood KS: Raised circulating tenascin-C in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2012, 14:R260.
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６−１】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３１−４】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【配列表】
2017507337000001.app
【国際調査報告】
2017507337.tif 000063
2017507337.tif 000064
2017507337.tif 000065