(57)【要約】  本発明は、第VII因子ポリペプチドとヘパロサンポリマーとのコンジュゲーションに関する。得られるコンジュゲートは、例えば、出血障害の治療又は予防において、第VII因子を送達するために使用できる。
2017507133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第VII因子ポリペプチド、連結部分、及びヘパロサンポリマーを含むコンジュゲートであって、第VII因子ポリペプチドとヘパロサンポリマーとの間の連結部分が、以下のX
[ヘパロサンポリマー]-[X]-[第VII因子ポリペプチド]
[式中、Xは、以下の式1:
【化１】
2017507133.tif 000041
による部分に連結されたシアル酸誘導体を含む]
を含む、コンジュゲート。
【請求項２】
前記シアル酸誘導体が、以下の式2:
【化２】
2017507133.tif 000042
[式中、R1は、-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPrから選択され、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は、-H、-NH2、-SH、-N3、-OH、及び-Fから独立に選択される]
によるシアル酸誘導体である、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記シアル酸誘導体が、以下の式3:
【化３】
2017507133.tif 000043
によるグリシルシアル酸であり、前記式1の部分が、式3の末端-NH基に連結されている、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
[ヘパロサンポリマー]-[X]-
が、以下の式4:
【化４】
2017507133.tif 000044
[式中、nは、5から450までの整数である]
による構造を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記ヘパロサンポリマーが、5〜100kDa、13〜60kDa、又は27〜45kDaの範囲の分子量を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記ヘパロサンポリマーの分子量が、40kDa+/-10%である、請求項5に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記第VII因子ポリペプチドが、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列ID NO:1)に対して2つ以上の置換を含む第VII因子変異体であり、T293が、Lys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)によって置き換えられており;L288が、Phe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)又はTrp Wによって置き換えられており、且つ/又はW201が、Arg(R)、Met(M)又はLys(K)によって置き換えられており、且つ/又はK337が、Ala(A)又はGly(G)によって置き換えられている、請求項1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記第VII因子ポリペプチドが、T293のLys(K)との置換及びL288のPhe(F)との置換、T293のLys(K)との置換及びL288のTyr(Y)との置換、T293のArg(R)との置換及びL288のPhe(F)との置換、T293のArg(R)との置換及びL288のTyr(Y)との置換、又はT293のLys(K)との置換及びW201のArg(R)との置換を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項１０】
aPTTに基づいた凝固アッセイにおいてアッセイ間の変動を減少させるための、第VII因子ポリペプチドにコンジュゲートされているヘパロサンポリマーの使用。
【請求項１１】
医薬品としての使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
凝固障害の治療における使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
血友病A又はBの予防的な又は必要に応じた治療における使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
ヘパロサンポリマーを第VII因子ポリペプチドにコンジュゲートさせる方法であって、
a)反応性アミン[HEP-NH]を含むヘパロサンポリマーを、活性化された4-ホルミル安息香酸と反応させて、以下の式5、
【化５】
2017507133.tif 000045
[式中、[HEP-NH]は、末端の第1級アミンで官能化されたHEPポリマーである]
の化合物を生成する工程と、
b)還元条件下で式5の化合物を、CMPによって活性化されたシアル酸誘導体と反応させる工程と、
c)工程b)において得られた化合物を、第VII因子ポリペプチド上のグリカンにコンジュゲートさせる工程と
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法を用いて得ることができる、コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第VII因子ポリペプチドとヘパロサンポリマーとのコンジュゲーションに関する。
【０００２】
配列表
配列番号1:野生型ヒト凝固第VII因子。
【背景技術】
【０００３】
血管に対する傷害によって、細胞及び分子の構成成分間の複合体交互作用に関与する止血系が活性化される。失血を止めるために最終的に起こる過程は、止血として知られている。止血の重要な部分は、傷害の部位における血液の凝固及び血餅の形成である。凝固過程は、いくつかのタンパク質分子の機能に大いに依存する。これらは、凝固因子として知られている。凝固因子の一部はプロテアーゼであり、これらは、不活性チモーゲンとして又は酵素活性のある形態で存在することができる。チモーゲンの形態は、別のタンパク質分解活性凝固因子によって触媒されるポリペプチド鎖の特異的な切断により、その酵素活性のある形態に転換することができる。第VII因子は、肝臓で合成され、単鎖の糖タンパク質として血液に分泌される、ビタミンK依存性血漿タンパク質である。第VII因子チモーゲンは、一部位で、すなわち、単一のジスルフィド結合により連結された2つの鎖状分子になる、第VII因子配列(野生型ヒト凝固第VII因子)のR152とI153との間で、特異的なタンパク質切断により、活性化された形態(第VIIa因子)に転換される。第VIIa因子における2本のポリペプチド鎖は、第VII因子配列の1〜152残基及び153〜406残基に対応して、それぞれ軽鎖及び重鎖と称される。第VII因子は、主としてチモーゲンとして循環するが、微量の画分は、活性化された形態(第VIIa因子)上にある。
【０００４】
血液凝固過程は、開始、増幅及び増殖の3つの相に分けることができる。開始相及び増殖相は、止血において多くの重要な機能を有する凝固因子であるトロンビンの形成に寄与する。血管の内面を覆う内皮細胞の単層の障壁が損傷した場合に、凝固カスケードは開始される。これによって、内皮下細胞及び血管外の基質タンパク質が露出され、そこに血液中の血小板が固着する。これが起こると、内皮下細胞の表面に存在する組織因子(TF)は、血液中で循環している第VIIa因子に曝露されるようになる。TFは、膜結合タンパク質であり、第VIIa因子の受容体として働く。第VIIa因子は、本質的に活性が低い、セリンプロテアーゼという酵素である。しかしながら、第VIIa因子がTFに結合する場合、その活性は大いに高まる。TFとの第VIIa因子交互作用はまた、TFを有する細胞のリン脂質表面において第VIIa因子を局在させ、第X因子の第Xa因子への活性化のために最適に第VIIa因子を位置づける。これが起こると、第Xa因子は、第Va因子と合わせて、TFを有する細胞の表面で、いわゆる「プロトロンビナーゼ(prothombinase)」複合体を形成することができる。したがって、プロトロンビナーゼ複合体は、プロトロンビンの切断によってトロンビンを産生する。
【０００５】
TFを循環第VIIa因子に曝露し、トロンビンを最初に産生させることにより活性化される経路は、TF経路として知られている。TF:第VIIa因子複合体はまた、第IX因子の第IXa因子への活性化をも触媒する。次いで、活性化された第IXa因子は、傷害の部位に付着し、活性化されている血小板の表面に拡散することができる。これによって、第IXa因子が、FVIIIaと合わせて、活性化された血小板の表面に「テナーゼ」複合体を形成することが可能になる。この複合体は、第X因子を第Xa因子に活性化するその注目すべき効率により増殖相において最重要な役割を果たす。効率的なテナーゼによって触媒される第Xa因子活性の生成によって、プロトロンビンをプロトロンビナーゼ複合体によって触媒されるトロンビンに効率的に切断させる。
【０００６】
第IX因子又は第VIII因子の任意の欠乏がある場合、重要なテナーゼ活性が損なわれ、凝固に必要とされるトロンビンの産生が減少する。TF経路により最初に形成されたトロンビンは、傷害部位において血小板の動員、活性化及び凝集を促進する凝血原シグナルとして働く。これによって、血小板の緩い1次プラグを形成する。しかしながら、血小板のこの1次プラグは不安定であり、止血を持続させるために強化することが必要である。プラグの安定化は、フィブリン線維の網に血小板をつなぎ止め、絡ませるものである。
【０００７】
強力な及び安定した血餅の形成は、局所トロンビン活性の頑健なバーストの発生に依存している。したがって、血管傷害後にトロンビン産生をもたらす過程が欠如すると、出血障害、例えば、血友病A及びBをもたらす恐れがある。血友病A及びBを伴う者は、機能性第VIIIa因子又は第IXa因子をそれぞれ欠損している。増殖相におけるトロンビン産生は、テナーゼ活性に大いに依存している、すなわち、第VIIIa因子及び第IXa因子を要する。したがって、血友病A又はBを伴う者において、1次血小板プラグの適切な硬化は失敗し、失血は続く。
【０００８】
補充療法は、血友病A及びBのための従来の治療であり、第VIII因子又は第IX因子の静脈内投与を含む。しかしながら、多くの症例では、患者は、注入されたタンパク質に対する(インヒビターとしても公知の)抗体を発現し、これによって、治療の効果が下がる又は無効になる。
【０００９】
組換え型第VIIa因子(Novoseven(登録商標))は、インヒビターを有する血友病A又はB患者の治療用に認可されており、失血エピソードを止める又は外傷及び/又は手術に伴う失血を予防するためにやはり用いられる。組換え型第VIIa因子はまた、先天性第VII因子欠損症を伴う患者の治療用に認可されている。
【００１０】
組換え型FVIIaが、TF-非依存性の機序によって作用するモデルによれば、組換え型FVIIaは、そのGla-ドメインによって活性化される血小板の表面を対象にしており、したがって、第X因子を第Xa因子へとタンパク質分解によって活性化し、したがって、機能性テナーゼ複合体の必要性を回避する。TFの非存在下におけるFVIIaの低い酵素活性並びに膜に対するGla-ドメインの低親和性は、止血を達成するために必要とされる循環FVIIaの超生理学的レベルの必要性を説明し得る。
【００１１】
組換え型第VIIa因子は、薬理学的な半減期が2〜3時間であり、患者において失血を解決するために頻回の投与を必要とし得る。更に、患者はしばしば、予備的手段としてではなく、失血が開始されてから第VIIa因子療法を受けるにすぎず、このことが、患者の全般的な生活の質にしばしば影響を与える。循環半減期がより長期の組換え型第VIIa因子の変異体によって、必要な投与数が減り、したがって、担体の投与回数を少なくすることは、患者及び看護者(care-holder)の利益のために第VIIa因子療法を著しく改善する見込みを持つはずである。
【００１２】
一般に、凝固障害を伴う者における医学的必要性に対応していないものが多い。血餅形成を促進するための組換え型第VIIa因子の使用は、治療薬としてその重要性が高まっていることが明白に示される。しかしながら、組換え型第VIIa因子療法は、依然として医学的必要性にそれほど対応しておらず、医薬品特性が改善されている、例えば、in vivoにおいて機能性半減期を増加させ、活性を改善し、且つ望ましくない副作用を減少させる、組換え型第VIIa因子ポリペプチドが必要とされる。
【００１３】
例えば、親水性ポリマーの形態の、ペプチド又はポリペプチドとの半減期延長部分のコンジュゲーションは、酵素方法の使用により実施することができる。これらの方法は、タンパク質配列中の特異的なペプチドコンセンサスモチーフの存在又はグリカン等の翻訳後の部分の存在を要する、選択性となり得る。血液凝固因子においてN-及びO-グリカンを修飾するための選択的な酵素方法が記載されている。例えば、化学修飾されたシアル酸基質(Malmstrom、J、Anal Bioanal Chem.2012年;403巻:1167〜1177頁)では、シアル酸転移酵素T3GalIIIを用いてN-グリカンにおいて(Stennicke、HR.ら  Thromb Haemost.2008年11月;100巻(5号):920-8)、及びST3GalIを用いて第VIII因子上のO-グリカンにおいて(Stennicke、HR.ら、Blood.2013年3月14日;121巻(11号):2108-16)、第VIIa因子を糖PEG化するために用いることができるということが記載されている。上記に挙げた方法のよく知られている特徴は、修飾されたシアル酸基質、グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)、及び半減期延長部分を有するGSCの化学アシル化の使用である。
【００１４】
例えば、ニトロフェニル-又はN-ヒドロキシ-スクシンイミドエステルとして活性化されるPEGポリマーは、GSCのグリシルアミノ基においてアシル化して、糖タンパク質のN-及びO-グリカンに酵素的に転移することができるPEG置換シアル酸基質を生成することができる(WO2006127896、WO2007022512、US2006040856を参照のこと)。類似の方法で、脂肪酸は、N-ヒドロキシ-スクシンイミドによって活性化されたエステル化学を用いてGSCのグリシルアミノ基においてアシル化することができる(WO2011101277)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】WO2006127896
【特許文献２】WO2007022512
【特許文献３】US2006040856
【特許文献４】WO2011101277
【特許文献５】米国特許第4,784,950号
【特許文献６】WO01/83725
【特許文献７】WO02/22776
【特許文献８】米国特許第5,580,560号
【特許文献９】PCT出願公開EP2014/072076
【特許文献１０】WO2007/031559
【特許文献１１】WO2009/126307
【特許文献１２】米国特許第5,997,864号
【特許文献１３】WO92/15686
【特許文献１４】欧州特許第200.421号
【特許文献１５】米国特許第4,456,591号
【特許文献１６】US2010/0036001
【特許文献１７】WO03/031464
【特許文献１８】WO2005/014035
【特許文献１９】WO2008/025856
【特許文献２０】WO2011012850
【特許文献２１】WO2006094810
【特許文献２２】WO2007056191
【特許文献２３】US8088604
【特許文献２４】WO2011101267
【特許文献２５】WO07056191
【特許文献２６】US4837028
【特許文献２７】US4501728
【特許文献２８】US4975282
【特許文献２９】WO92/16640
【特許文献３０】US20090041744
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Malmstrom、J、Anal Bioanal Chem.2012年;403巻:1167〜1177頁
【非特許文献２】Stennicke、HR.ら、Thromb Haemost.2008年11月;100巻(5号):920-8
【非特許文献３】Stennicke、HR.ら、Blood.2013年3月14日;121巻(11号):2108-16
【非特許文献４】Thompsonら、1994年、Nucleic Acid Research、22巻:4673〜4680頁
【非特許文献５】linoら、Arch. Biochem.Biophys.352巻:182〜192頁、1998年
【非特許文献６】Mollerupら、Biotechnol.Bioeng.48巻:501〜505頁、1995年
【非特許文献７】Kornfeltら、Arch.Biochem.Biophys.363巻:43〜54頁、1999年
【非特許文献８】Persson、FEBS Letts.413巻:359〜363頁、1997年
【非特許文献９】J.H.Morrisseyら、Blood.81巻:734〜744頁(1993年)
【非特許文献１０】Monroeら(1997年)Brit.J.Haematol.99巻、542〜547頁の543頁
【非特許文献１１】Hagenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83巻:2412〜2416頁、1986年
【非特許文献１２】Broze and Majerus、J.Biol.Chem.255巻(4号):1242〜1247頁、1980年
【非特許文献１３】Hedner and Kisiel、J.Clin.Invest.71巻:1836〜1841頁、1983年
【非特許文献１４】Bjoernら(Research Disclosure、269巻、1986年9月、564〜565頁)
【非特許文献１５】Wakabayashiら、J.Biol.Chem.261巻:11097頁、1986年
【非特許文献１６】Thimら、Biochem.27巻:7785頁、1988年
【非特許文献１７】Scopes、Protein Purification、Springer-Verlag、New York、1982年
【非特許文献１８】Protein Purification、J.C.Janson and Lars Ryden編、VCH Publishers、New York、1989年
【非特許文献１９】Osterudら、Biochem.11巻:2853頁(1972年)
【非特許文献２０】Kalia and Raines、Angew Chem Int Ed Engl.2008年;47巻(39号):7523〜7526頁
【非特許文献２１】Bioconjugation Techniques、G.T.Hermanson、Academic Press、第3版、2013年、309頁
【非特許文献２２】Eur.J.Biochem 168巻、594〜602頁(1987年)
【非特許文献２３】Eur.J.Org.Chem.2000年、1467〜1482頁
【非特許文献２４】Dufner, G.Eur.J Org Chem 2000年、1467〜1482頁
【非特許文献２５】Sismey-Ragatzら、2007年  J Biol Chem
【非特許文献２６】JC.Gildersleeve、Bioconjug Chem.2008年7月;19巻(7号):1485〜1490頁
【非特許文献２７】Yasuhiro Kajiharaら、Chem Eur J 2011年、17巻、7645〜7655頁
【非特許文献２８】Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、Easton、PA(1990年)
【非特許文献２９】Kielyら、1976年;Glabeら、1980年
【非特許文献３０】Nadanoら(1986年)J.Biol.Chem.261巻:11550〜11557頁
【非特許文献３１】Kanamoriら、J.Biol.Chem.265巻:21811〜21819頁(1990年)
【非特許文献３２】Bitter T、Muir HM.Anal Biochem 1962年10月;4:330-4
【非特許文献３３】Nano Letters(2007年)7巻(8号)、2207〜2210頁
【非特許文献３４】Fujiwara,K.ら、(1988年)J Immunol Meth 112巻、77〜83頁
【非特許文献３５】Thim,Lら、Biochemistry(1988年)27巻、7785〜779
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、本発明者らは、以前に発表された方法が、高機能化された半減期延長部分、例えば、炭水化物ポリマー等を、GSCに結合させるのに適していないことを見出している。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
一般に、本発明は、ポリマーヘパロサンを、第VII因子(FVII)に結合して、その半減期を延長することができるという知見に由来する。ヘパロサンが持つ利点は、ヘパロサンポリマーが生分解性であり、非生分解性ポリマーに関連する任意の潜在的な蓄積の問題を回避するということである。このやり方におけるヘパロサンポリマーの使用によって、例えば、FIXa及びFXa産生の可能性を高める並びに血餅活性を改善させる等の第VII因子ポリペプチドコンジュゲートの特性を改善することができる。
【００１９】
したがって、本発明は、第VII因子ポリペプチドとヘパロサンポリマーとのコンジュゲートを提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ポリマーは、多分散インデックス(Mw/Mn)が1.10未満又は1.05未満である。
【００２１】
他の実施形態では、ポリマーは、サイズが、13kDaから65kDaの間、例えば、38 kDa及び44kDa等である。
【００２２】
本明細書に記載したヘパロサン第VII因子ポリペプチドコンジュゲートは、コンジュゲートされていない第VII因子ポリペプチドと比較して、循環半減期を増加させることができる;又はコンジュゲートされていない第VII因子ポリペプチドと比較して、機能性半減期を増加させることができる。
【００２３】
本明細書に記載したヘパロサン第VII因子ポリペプチドコンジュゲートは、コンジュゲートされていない第VII因子ポリペプチドと比較して、平均滞留時間を増加させることができる;又はコンジュゲートされていない第VII因子ポリペプチドと比較して、機能性平均滞留時間を増加させることができる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載したヘパロサン(HEP)第VII因子ポリペプチドコンジュゲートは、特性(例えば、安定性)を改善したリンカーを用いて生成される。かかる一実施形態において、HEP-FVIIポリペプチドコンジュゲートが提供され、HEP部分は、安定した及び異性体がないコンジュゲートが得られるこのような方式で第VII因子に連結される。かかる一実施形態において、HEPポリマーは、グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)等のシアル酸誘導体に連結される4-メチルベンゾイルを含む化学リンカーを用いて第VII因子に連結される。
【００２５】
第VII因子ポリペプチドは、FVIIa-407C等の遊離システインを運搬する第VII因子ポリペプチドの変異体となり得、ヘパロサンポリマーは、前記第VII因子ポリペプチドの407位のシステインに結合することができる。ポリマーは、N-若しくはO-グリカンを介してポリペプチドに結合することができる。
【００２６】
第VII因子ポリペプチドは、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列ID NO:1)に対して2つ以上の置換を含む第VII因子ポリペプチドの変異体となり得、T293は、Lys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)によって置き換えられており、L288は、Phe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、又はAla(A)によって置き換えられており、且つ/又はW201は、Arg(R)、Met(M)又はLys(K)によって置き換えられており、且つ/又はK337は、Ala(A)又はGly(G)によって置き換えられている。
【００２７】
第VII因子ポリペプチドは、T293のLys(K)との置換及びL288のPhe(F)との置換を含むことができる。第VII因子ポリペプチドは、T293のLys(K)との置換及びL288のTyr(Y)との置換を含むことができる。第VII因子ポリペプチドは、T293のArg(R)との置換及びL288のPhe(F)との置換を含むことができる。第VII因子ポリペプチドは、T293のArg(R)との置換及びL288のTyr(Y)との置換を含むことができる。第VII因子ポリペプチドは、K337のAla(A)との置換を含むことも、それらを更に含むこともできる。第VII因子ポリペプチドは、T293のLys(K)との置換及びW201のArg(R)との置換を含むことができる。
【００２８】
本発明はまた、本明細書に記載したコンジュゲート及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物等の、本明細書に記載したコンジュゲートを含む組成物を提供する。
【００２９】
本明細書に記載したコンジュゲート又は組成物は、出血障害を治療する又は予防する方法における使用のために提供することができる。すなわち、本発明は、出血障害を治療する又は予防する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載したコンジュゲートの適当な用量を、それを必要とする患者、例えば、第VII因子を必要とする個体、例えば、血友病A又は血友病Bを有する個体に投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１ａは、ヘパロサンの構造を示す図である。図１ｂは、還元末端にマレイミド官能基を有するヘパロサンポリマーの構造を示す図である。
【図２】図２ａは、SDS-PAGEによるコンジュゲートの純度の評価を示す図である。最終FVIIaコンジュゲートのSDS-PAGE分析。ゲルに、HiMark HMW標準(レーン1);FVIIa(レーン2);13k-HEP-[C]-FVIIa(レーン3);27k-HEP-[C]-FVIIa(レーン4);40k-HEP-[C]-FVIIa(レーン5);52k-HEP-[C]-FVIIa(レーン6);60k-HEP-[C]-FVIIa(レーン7);65k-HEP-[C]-FVIIa(レーン8);108k-HEP-[C]-FVIIa(レーン9)及び157k-HEP-[C]-FVIIa407C(レーン10)を負荷した。  図２ｂは、SDS-PAGEによるコンジュゲートの純度の評価を示す図である。糖コンジュゲート(glycoconjugated)52k-HEP-[N]-FVIIaのSDS-PAGE。ゲルにHiMark HMW標準(レーン1)、ST3Gal3(レーン2)、FVIIa(レーン3)、アシアロFVIIa(レーン4)、及び52k-HEP-[N]-FVIIa(レーン5)を負荷した。
【図３】ヘパロサンコンジュゲート及び糖PEG化されたFVIIa参照のFVIIa凝固活性レベルの分析を示すグラフである。
【図４】ヘパロサンコンジュゲート及び糖PEG化されたFVIIa参照のタンパク質分解活性を示すグラフである。
【図５】スプラーグドーリーラットにおけるPK結果(LOCI)を示すグラフである。未修飾FVIIa(2試験)、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C及び157k-HEP-[C]-FVIIa407C、糖コンジュゲート52k-HEP-[N]-FVIIa及び参照分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa(2試験)及び40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)の比較。データを片対数プロットで平均±SD(n=3〜6)として示す。
【図６】スプラーグドーリーラットにおけるPK結果(血餅活性)を示すグラフである。未修飾FVIIa(2試験)、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C及び157k-HEP-[C]-FVIIa407C、糖コンジュゲート52k-HEP-[N]-FVIIa及び参照分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa(2試験)及び40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)の比較。データを、片対数プロットで示す。
【図７】いくつかのHEP-[C]-FVIIa407Cコンジュゲートの場合のHEP-サイズと平均滞留時間(MRT)の関連性を示すグラフである。PK試験から得られたMRT値を、コンジュゲートのヘパロサンポリマーサイズに対してプロットする。プロットは、非コンジュゲート型FVIIa、13k-HEP-[C]-FVIIa407C、27k-HEP-[C]-FVIIa407C、40k-HEP-[C]-FVIIa407C、52k-HEP-[C]-FVIIa407C、65k-HEP-[C]-FVIIa407C、108k-HEP-[C]-FVIIa407C及び157k-HEP-[C]-FVIIa407Cについての値を表す。MRT(LOCI)をPhoenix WinNonlin 6.0(Pharsight Corporation社)を用いた非区画方法によって算出した。
【図８】ベンズアルデヒド基によるグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の機能付与を示す図である。GSCは、4-ホルミル安息香酸でアシル化され、続いて、還元的アミノ化反応によるヘパロサン(HEP)-アミンと反応させる。
【図９】ベンズアルデヒド基によるヘパロサン(HEP)ポリマーの機能付与、還元的アミノ化反応におけるグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)とのその後の反応を示す図である。
【図１０】チオ基によるグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)の機能付与、マレイミドによって官能化されたヘパロサン(HEP)ポリマーとのその後の反応を示す図である。
【図１１】ヘパロサン(HEP)-グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)を示す図である。
【図１２】スプラーグドーリーラットにおけるPK結果(LOCI)を示すグラフである。糖コンジュゲート2×20k-HEP-[N]-FVIIa、1×40k-HEP-[N]-FVIIa及び参照分子1×40k-PEG-[N]-FVIIaの比較。データを、片対数プロットで平均±SD(n=3〜6)として示す。
【図１３】スプラーグドーリーラットにおけるPK結果(血餅活性)を示すグラフである。糖コンジュゲート2×20k-HEP-[N]-FVIIa、1×40k-HEP-[N]-FVIIa及び参照分子1×40k-PEG-[N]-FVIIaの比較。データを片対数プロットで平均±SD(n=3〜6)として示す。
【図１４】アシアロ第VII因子糖タンパク質が、ST3GalIIIシアル酸転移酵素の存在下でHEP-GSCと反応する反応スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、第VII因子(FVII)ポリペプチドとヘパロサン(HEP)ポリマーとのコンジュゲート、並びにかかるコンジュゲートを調製するための方法及びかかるコンジュゲートについての使用に関する。本発明者らは、第VII因子-ヘパロサンコンジュゲートが、改善された特性を有することを驚くべきことに見出している。
【００３２】
第VII因子ポリペプチド
用語「第VII因子」又は「FVII」とは、第VII因子ポリペプチドを意味する。適当なポリペプチドは、天然資源の抽出及び精製を含めた方法によって並びに組換え型細胞培養系によって生成することができる。野生型ヒト第VII因子の配列及び特性は、例えば、米国特許第4,784,950号に記載されている。
【００３３】
また、用語「第VII因子ポリペプチド」の中に包含されるのは、生物活性がある第VII因子相当物及び例えば、全配列中の1種又は複数のアミノ酸で異なる第VII因子の修飾された形態である。更に、本出願において用いる用語は、第VII因子のアミノ酸変異体の置換、欠失及び挿入又は翻訳後修飾を包含するものとする。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「第VII因子ポリペプチド」は、それだけには限らないが、第VII因子、並びに第VII因子関連ポリペプチドを包含する。第VII因子関連ポリペプチドには、それだけには限らないが、ヒト第VII因子に対して化学修飾されている且つ/又はヒト第VII因子(すなわち、第VII因子変異体)に対して1種又は複数のアミノ酸配列の変更を含む、及び/又はヒト第VII因子(すなわち、第VII因子断片)に対して、切断されたアミノ酸配列を含む第VII因子ポリペプチドが含まれる。かかる第VII因子関連ポリペプチドは、安定性、リン脂質結合、改変された特異的な活性等を含めて、ヒト第VII因子に対して異なる特性を示し得る。
【００３５】
用語「第VII因子」とは、それが切断されない(チモーゲン)形態の第VII因子ポリペプチド、並びに第VIIa因子と称し得る、それぞれの生物活性の形態をもたらすためにタンパク質分解によって処理されたものを包含するものとする。通常、第VII因子は、152残基と153残基との間で切断されて、第VIIa因子を生成する。
【００３６】
用語「第VII因子」とはまた、それだけには限らないが、アミノ酸配列1〜406の野生型ヒト第VII因子(米国特許第4,784,950号に開示されている)、並びに他の種に由来する野生型第VII因子、例えば、ウシ、ブタ、イヌ、ネズミ、及びサケの第VII因子等を有するポリペプチドを包含するのとする。ある個体から別の個体まで存在し発生し得る第VII因子の天然の対立遺伝子の変異を更に包含する。また、糖鎖修飾又は他の翻訳後修飾の程度及び位置は、選ばれた宿主細胞及び宿主細胞の環境の性質に応じて変わり得る。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「第VII因子関連ポリペプチド」は、それだけには限らないが、野生型ヒト第VII因子に対して実質的に同じ又は改善された生物活性を示すポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドには、それだけには限らないが、化学修飾されている第VII因子又は第VIIa因子及びポリペプチドの生物活性を修飾する若しくは中断する特異的なアミノ酸配列の変更が導入されている第VII因子変異体が含まれる。
【００３８】
包含されるのはやはり、修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、N-末端のアミノ酸の欠失又は付加を含めた、修飾されたN-末端を有するポリペプチド、及び/又はヒト第VIIa因子に対して化学修飾されているポリペプチドである。
【００３９】
包含されるのはやはり、修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、C-末端のアミノ酸の欠失又は付加を含めた修飾されたC-末端を有するポリペプチド、及び/又はヒト第VIIa因子に対して化学修飾されているポリペプチドである。
【００４０】
第VII因子の変異体を含め、野生型第VII因子と実質的に同じ又は野生型第VII因子より優れた生物活性を示す第VII因子関連ポリペプチドには、それだけには限らないが、1種若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換により、野生型第VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００４１】
野生型第VIIa因子に対して生物活性が実質的に同じ又は改善された変異体を含めた、第VII因子関連ポリペプチドは、凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、又はTF結合アッセイの1つ若しくは複数において試験される場合、同じ細胞タイプにおいて生成されている野生型第VIIa因子の特異的な活性の少なくとも約25%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約100%、より好ましくは少なくとも約110%、より好ましくは少なくとも約120%、最も好ましくは少なくとも約130%を示すものを包含する。
【００４２】
第VII因子ポリペプチドは、第VII因子関連ポリペプチド、特に、変異体となり得、in vitro加水分解アッセイにおいて試験した場合、前記第VII因子ポリペプチドの活性と未変性のヒト第VIIa因子(野生型FVIIa)の活性との間の比は、少なくとも約1.25であり;他の実施形態では、この比は、少なくとも約2.0であり;更なる実施形態では、この比は、少なくとも約4.0である。第VII因子ポリペプチドは、第VII因子類似体、特に、変異体となり得、in vitroタンパク質分解アッセイにおいて試験した場合、前記第VII因子ポリペプチドの活性と未変性のヒト第VIIa因子(野生型FVIIa)の活性との間の比は、少なくとも約1.25であり;この比は、少なくとも約2.0となり得;この比は、少なくとも約4.0となり得;この比は少なくとも約8.0となり得る。
【００４３】
第VII因子ポリペプチドは、例えば、米国特許第4,784,950号(野生型第VII因子)において開示されている通り、ヒト第VII因子となり得る。第VII因子ポリペプチドは、ヒト第VIIa因子となり得る。第VII因子ポリペプチドには、ヒト第VIIa因子の特異的な生物活性を少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約100%、好ましくは少なくとも約120%、より好ましくは少なくとも約140%、及び最も好ましくは少なくとも約160%示す、ポリペプチドが含まれる。
【００４４】
第VII因子ポリペプチドは、ヒト第VIIa因子のアンチトロンビンIIIとの交互作用と比較した場合、アンチトロンビンIIIとの交互作用が低下する変異体第VII因子ポリペプチドとなり得る。例えば、第VII因子ポリペプチドは、野生型ヒト第VIIa因子のアンチトロンビンIIIとの交互作用が100%未満、95%未満、90%未満、80%未満、70%未満又は50%未満となり得る。アンチトロンビンIIIとの交互作用の低下は、タンパク質分解活性の改善等、本明細書に記載した通り、他の生物活性の改善と組み合わせて存在し得る。
【００４５】
第VII因子ポリペプチドは、1種若しくは複数のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって野生型第VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有し得る。
【００４６】
第VII因子ポリペプチドは、米国特許第4,784,950号(配列番号1:野生型ヒト凝固第VII因子)に開示されている通り、野生型第VII因子の配列とのアミノ酸配列の同一性を少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%示すポリペプチドとなり得る。アミノ酸配列の相同性/同一性は、配列アラインメントのための適当なコンピュータプログラム、例えば、ClustalWプログラム、バージョン1.8、1999年(Thompsonら、1994年、Nucleic Acid Research、22巻:4673〜4680頁)等を用いて、好都合には整列された配列から決定される。
【００４７】
野生型第VII因子として生物活性が実質的に同じ又は改善された第VII変異体の限定しない例には、S52A-FVII、S60A-FVII(linoら、Arch. Biochem.Biophys.352巻:182〜192頁、1998年);L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、及びS336G-FVII;WO01/83725及びWO02/22776に開示されている通り、TF-非依存性活性の増加を示しているFVIIa変異体;米国特許第5,580,560号に開示されている通りタンパク質分解性の安定性の増加を示すFVIIa変異体;290残基と291残基との間又は315残基と316残基との間でタンパク質分解により切断された(proteolytically cleaved)第VIIa因子(Mollerupら、Biotechnol.Bioeng.48巻:501〜505頁、1995年);第VIIa因子の酸化型(Kornfeltら、Arch.Biochem.Biophys.363巻:43〜54頁、1999年);及びPCT出願公開EP2014/072076に開示されている通り、FVII変異ポリペプチド、例えば、変異体ポリペプチドFVIIaが含まれ、ポリペプチドは、次の置換:L288F/T293K、L288F/T293K/K337A、L288F/T293R、L288F/T293R/K337A、L288Y/T293K、L288Y/T293K/K337A、L288Y/T293R、L288Y/T293R/K337A、L288N/T293K、L288N/T293K/K337A、L288N/T2
93R、L288N/T293R/K337A、W201R/T293K、W201R/T293K/K337A、W201R/T293R、W201R/T293R/K337A、W201R/T293Y、W201R/T293F、W201K/T293K又はW201M/T293Kを含む。
【００４８】
本明細書において第VII因子ポリペプチドの範囲内に収まる更なる第VII変異体は、WO2007/031559及びWO2009/126307に記載されているものである。
【００４９】
本発明に従って用いるための好ましい第VII因子ポリペプチドは、既存のFVII配列、例えば、野生型FVII配列等と比較して、追加のシステイン残基が付加されているものである。システインは、C-末端の第VII因子ポリペプチドに付加することができる。システインは、FVIIa 407Cをもたらす野生型ヒト第VII因子のアミノ酸配列のC-末端残基406における第VIIa因子ポリペプチドに付加することができる。システインは、組織因子結合、第X因子結合又はリン脂質への結合をあまり妨げない表面が露出された位置に第VII因子分子のアミノ酸配列を配置することができる。第VIIa因子の構造は、公知であり、したがって、これらの要件を満たす適当な位置は、当業者によって同定することができる。
【００５０】
本明細書に記載された第VII因子ポリペプチドにおけるアミノ酸の番号列は、米国特許第4,784,950号(配列番号1:野生型ヒト凝固第VII因子)に開示されている通り野生型ヒト第VII因子についてのアミノ酸配列に基づいている。他の第VII因子ポリペプチドにおける対応する位置は、関連する配列のアラインメントを行うことにより、当業者によって容易に同定することができるということが明らかである。
【００５１】
血液凝固における第VIIa因子の生物活性は、それが、(i)組織因子(TF)に結合し、(ii)第IX因子又は第X因子のタンパク質切断を触媒して、活性化された第IX因子又は第X因子(それぞれ、第IXa因子又は第Xa因子)を生成する能力に由来する。
【００５２】
第VII因子ポリペプチドの生物活性は、後述の通り多くのやり方によって測定することができる。
【００５３】
発色基質(S-2288)を用いたペプチド分解活性
FVIIポリペプチド又はFVIIコンジュゲートのペプチド分解活性は、基質として発色ペプチド(S-2288;Chromogenix社)を用いて推定することができる。本アッセイを実施するやり方は、以下の通りである。FVIIポリペプチド及び適切なFVIIa参照タンパク質を、50mMヘペス、5mM CaCl2、100mM NaCl、0.01% Tween80(pH7.4)に希釈する。次いで、発色基質S-2288の切断のための動力学的パラメータを、96穴プレート(n=3)中で決定する。典型的な実験では、ヘペス緩衝液135ul、200nM FVIIa試験物質溶液10μl及び200nM組織因子原液50μlをウェルに加える。マイクロプレートを5分間放置する。次いで、10mM S-2288保存溶液10μlを加えることにより反応を開始する。SpectraMax 190マイクロプレートリーダーにおいて405nmで室温で15分間連続的に吸収度の増加を測定する。転換された基質の量を、pNA(パラニトロアニリン)検量線に基づいて決定する。相対活量を初速度から算出し、FVIIa速度と比較する。次いで、FVIIaコンジュゲートについての活量を、FVIIa参照の活性の百分率として報告することができる。
【００５４】
基質としての血漿由来第X因子を用いたタンパク質分解活性
FVIIポリペプチド又はFVIIコンジュゲートのタンパク質分解活性は、基質として血漿由来第X因子(FX)を用いて推定することができる。アッセイを実施するやり方は、以下の通りである。すべてのタンパク質を、最初に50mMヘペス(pH7.4)、100mM NaCl、10mM CaCl2、BSA1mg/mL、及び0.1%(w/v)PEG8000に希釈する。次いで、FX活性化のための動力学的パラメータを、96穴プレート(n=2)中で全反応容積100μLで25uM PC:PSリン脂質(Haematologic technologies社)の存在下で室温で30分間、FVIIポリペプチド又はコンジュゲート各10nMを40nM FXでインキュベートすることにより決定する。可溶性組織因子(sTF)の存在下のFX活性化を、全反応容積100μL(n=2)で25μM PC:PSリン脂質の存在下で室温で20分間、FVIIポリペプチド又はFVIIコンジュゲート各5pMを、30nM FXでインキュベートすることにより決定する。インキュベーション後、停止緩衝液(stop buffer)50μL[50mMヘペス(pH7.4)、100mM NaCl、80mM EDTA]を加え、その後、2mM発色ペプチドS-2765(Chromogenix社)50μLを加えることにより反応を急冷する。最後に、吸収度の増加を、Spectramax 190マイクロプレートリーダーで405nmで連続的に測定する。直線回帰を用いてミハエリス-メンテンの式([S]<Km)の改訂された形態にデータを適合することにより、触媒効率(kcat/Km)を決定する。生成されたFXaの量をFXa検量線から推定する。
【００５５】
凝固時間を測定するためのアッセイ:
本発明の目的の場合、本発明の第VII因子ポリペプチド(「第VII因子生物活性」)又はコンジュゲートの生物活性はまた、例えば、米国特許第5,997,864号又はWO92/15686に記載されている通り、調製が第VII因子-欠乏性血漿及びトロンボプラスチンを用いて血液凝固を促進する能力を測定することにより、定量することもできる。本アッセイにおいて、生物活性は、対照試料に対する凝固時間の短縮として表され、第VII因子活性1単位/mlを含有する標準的なヒトのプール血清と比較することにより「第VII因子単位」に変換される。
【００５６】
組織因子への結合を決定するためのアッセイ:
或いは、第VIIa因子生物活性は、表面プラスモン共鳴に基づいた装置を用いて、第VIIa因子又は第VII因子関連ポリペプチドのTFへの物理的結合を測定することにより定量することができる(Persson、FEBS Letts.413巻:359〜363頁、1997年)。
【００５７】
可溶性TF依存性血漿に基づいたFVIIa血餅アッセイによって測定される力価
市販のFVIIa特異的凝固アッセイ;Diagnostica Stago社製のSTACLOT(登録商標)VIIa-rTFを用いて力価を推定することができる。本アッセイは、J.H.Morrisseyら、Blood.81巻:734〜744頁(1993年)によって発表された方法に基づいている。本方法によって、リン脂質の存在下でFVII欠乏血漿中のフィブリン血餅形成に対するsTFによって開始されたFVIIa活性依存時間を測定する。試験化合物を、Pipes+1% BSAアッセイ希釈緩衝液に希釈し、4種の別々のアッセイ内で4通りの希釈で試験する。凝固時間は、ACL9000(ILS)凝固装置で測定することができ、検量線に基づき両対数スケール(bilogarithmic scale)の直線回帰を用いて結果を算出する。
【００５８】
スプラーグドーリーラットにおける薬物動態評価
FVIIポリペプチド又はFVIIコンジュゲートの薬物動態特性は、スプラーグドーリーラットにおいて推定することができる。このような動物試験を実施する一方法は、以下の通りである。FVIIポリペプチド又はFVIIコンジュゲートを、10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01%Tween80 80(pH6.0)等の適当な緩衝液に最初に配合し、配合物緩衝液中のFVIIポリペプチド又はFVIIコンジュゲート濃度を、HPLCにおける軽鎖定量によって決定する。雄のスプラーグドーリーラットを本試験のために入手する。これらの動物を、少なくとも1週間の順化期間放置し、実験開始前に飼料及び水へのアクセスを自由にさせる。次いで、FVIIポリペプチド又はFVIIコンジュゲート配合物を、単回ivボーラス注入として尾静脈に投与する。このとき、血液は、予定されたスケジュールによる試料である。血液は、次のやり方で採取することができる。Stabilyte5μlを含有するエッペンドルフ管に血液45μlを移し;PIPES緩衝液200μl(0.050M Pipes、0.10M塩化ナトリウム、0.002M EDTA、1%(w/v)BSA(pH7.2))を加え、静かに5回反転させる。室温で10分間4000Gで遠心するまで、希釈されたクエン酸塩によって安定化された血液を室温で維持する。遠心後、上澄みを、3つのMicronic管(それぞれ血餅活性用70ul、抗原分析用70ul及び余分の試料としての残分)に分ける。これらの試料をドライアイスですぐに凍結し、例えば、後述の血漿分析まで-80℃の貯蔵を行うことができる。
【００５９】
血漿分析;FVIIa-血餅活性レベル
ラット血漿におけるFVIIポリペプチド又はFVIIコンジュゲートのFVIIa凝固活性レベルを、例えばDiagnostica Stago社製のSTACLOT(登録商標)VIIa-rTF等の市販のFVIIa特異的凝固アッセイを用いて推定することができる。本アッセイは、J.H.Morrisseyら、Blood.81巻:734〜744頁(1993年)によって発表された方法に基づいている。本方法によって、FVII欠乏血漿リン脂質の存在下におけるフィブリン血餅形成に対する可溶性組織因子(sTF)によって開始されたFVIIa活性依存時間を測定する。試料は、希釈された試料と同じ基質(等量対等量)のFVIIa検量線に対してACL9000凝固装置で測定することができる。
【００６０】
血漿分析;抗原濃度
血漿中のFVIIポリペプチド又はFVIIコンジュゲート抗原濃度は、LOCI技術を用いて決定することができる。この方法では、ヒトFVIIに対する2つのモノクローナル抗体を、検出用に用いる。原理は、Thromb Haemost 100巻(5号):920-8(2008年)に記載されている。試料を、原薬検量線に対して測定する。
【００６１】
薬物動態分析
例えば、WinNonlin(Pharsight Corporation社、St.Louis、Missouri)ソフトウェアを用いて非区画法(NCA)によって薬物動態分析を行うことができる。データから、次のパラメータを推定することができる。Cmax(最高血中濃度)、Tmax(最高血中濃度の時間)、AUC(ゼロから無限大までの曲線下面積)、AUCextrap(最終濃度から無限大まで外挿されるAUCの百分率)、T1/2(半減期)、Cl(クリアランス)Vz(分布容積)、及びMRT(平均滞留時間)。
【００６２】
これらの方法は、第VII因子ポリペプチドと野生型第VIIa因子との間の比較を設定している。しかしながら、同じ方法を用いて、目的とする第VII因子ポリペプチドの活性を、任意の他の第VII因子ポリペプチドと比較することもできるということが明らかである。例えば、このような方法を用いて、本明細書に記載したコンジュゲートの活性を、例えば、非コンジュゲート型の第VII因子ポリペプチド、ヘパロサン以外の水溶性ポリマーとコンジュゲートされている第VII因子ポリペプチド、又はヘパロサンにコンジュゲートされているのではなく、40kDa PEG等のPEGにコンジュゲートされている第VII因子ポリペプチド等の適当な対照分子と比較することができる。したがって、in vitro加水分解アッセイ又はin vitroタンパク質分解アッセイ等の本明細書に記載した方法を、上記方法における第VIIa因子野生型ポリペプチドを、目的とする対照分子で置換することにより適用させることができる。
【００６３】
第VIIa因子又は第VII因子ポリペプチドがトロンビンを生成する能力を、すべての関連する凝固因子及び生理的濃度のインヒビター(血友病A状態を模倣する場合マイナス第VIII因子)並びに活性化される血小板を含むアッセイ(参照として本明細書に組み込まれるMonroeら(1997年)Brit.J.Haematol.99巻、542〜547頁の543頁に記載される)において用いることもできる。
【００６４】
第VII因子ポリペプチドの活性はまた、WO92/15686又は米国特許第5,997,864号に記載されている通り、基本的に一段階血餅アッセイ(アッセイ4)を用いて測定することもできる。簡単にいうと、試験される試料を50mMトリス(pH7.5)に希釈し、0.1%BSA及び100μlを、第VII因子欠乏血漿100μl及び10mM Ca2+を含有するトロンボプラスチンC200μlと共にインキュベートする。凝固時間を測定し、段階希釈において標準物質又は正常なヒトクエン酸血漿のプールを使用した検量線と比較する。
【００６５】
本発明における使用のために適当な精製されたヒト第VIIa因子は、例えば、Hagenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83巻:2412〜2416頁、1986年によって記載される通り、又は欧州特許第200.421号(ZymoGenetics、Inc.社)に記載されている通りDNA組換え技術によって作製することができる。第VII因子はまた、Broze and Majerus、J.Biol.Chem.255巻(4号):1242〜1247頁、1980年及びHedner and Kisiel、J.Clin.Invest.71巻:1836〜1841頁、1983年によって記載される方法によって生成することもできる。これらの方法によって、検出可能な量の他の血液凝固因子を含まず第VII因子が生成される。更に精製される第VII因子調製は、最終の精製工程として追加のゲルろ過を含むことによって得ることができる。次いで、第VII因子を、公知の手段により、例えば、第XIIa因子、第IXa因子又は第Xa因子等のいくつかの異なる血漿タンパク質により、活性化された第VIIa因子に転換される。或いは、Bjoernら(Research Disclosure、269巻、1986年9月、564〜565頁)によって記載される通り、第VII因子は、Mono Q(R)(Pharmacia fine Chemicals社)等のイオン交換クロマトグラフィーカラムに通すことにより、又は溶液中での自己活性化により活性化することができる。
【００６６】
第VII因子関連ポリペプチドは、野生型第VII因子の修正形態により又は組換え技術により生成することができる。野生型第VII因子と比較した場合、アミノ酸コドンを変更することにより又は公知の手段、例えば、部位特異的な突然変異誘発により天然の第VII因子をコードする核酸中のアミノ酸コドンの一部を除去することにより、野生型第VII因子をコードする核酸配列を修飾することにより、アミノ酸配列が変更された第VII因子関連ポリペプチドを生成することができる。
【００６７】
一方のヌクレオチドを別のヌクレオチドに交換するための核酸配列への突然変異の導入は、当技術分野で公知の方法のいずれかを用いて特定部位の突然変異誘発によって達成することができる。特に有用なのは、目的とする挿入を有するスーパーコイルの、二本鎖DNAベクター及び所望の突然変異を含む2つの合成プライマーを利用する手順である。ベクターの反対側の鎖にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Pfu DNAポリメラーゼによる温度サイクル中に伸展する。プライマーの取り込み後、ねじれ形のニックを含む突然変異したプラスミドが生成される。温度サイクル後、生成物をDpnlで処理し、Dpnlは、親DNA鋳型を消化し、突然変異含有合成DNAについて選択するメチル化及びヘミメチル化DNAに特異的である。変異体を生成する、同定する及び単離するために当技術分野で公知の他の手順はまた、例えば、遺伝子混合又はファージディスプレイ技法等を用いることもできる。
【００６８】
由来するこれらの細胞からのポリペプチドの分離は、それだけには限らないが、接着細胞培養から得られた所望の生成物を含有する細胞培養培地の除去;非接着細胞を除去するための遠心又はろ過等を含めた、当技術分野で公知の任意の方法によって達成することができる。
【００６９】
場合によっては、第VII因子ポリペプチドは、更に精製することができる。精製は、それだけには限らないが、例えば、抗第VII因子抗体カラム等(例えば、Wakabayashiら、J.Biol.Chem.261巻:11097頁、1986年;及びThimら、Biochem.27巻:7785頁、1988年を参照のこと)の親和性クロマトグラフィー;疎水的相互作用クロマトグラフィー;イオン交換クロマトグラフィー;サイズ排除クロマトグラフィー;電気泳動手順(例えば、調製用等電点電気泳動(IEF)、差次的な溶解性(例えば、硫酸アンモニウム沈澱)、又は抽出等を含めた、当技術分野で公知の任意の方法を用いて達成することができる。一般に、Scopes、Protein Purification、Springer-Verlag、New York、1982年;及びProtein Purification、J.C.Janson and Lars Ryden編、VCH Publishers、New York、1989年を参照のこと。精製後、調製は、約10質量%未満、より好ましくは約5質量%未満、最も好ましくは約1質量%未満の宿主細胞に由来する非第VII因子ポリペプチドを好ましくは含有する。
【００７０】
第VII因子ポリペプチドは、第XIIa因子又はトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば、第IXa因子、カリクレイン、第Xa因子、及びトロンビン等を用いたタンパク質切断によって活性化することができる。例えば、Osterudら、Biochem.11巻:2853頁(1972年);Thomasの米国特許第4,456,591号;及びHednerら、J.Clin.Invest.71巻:1836頁(1983年)を参照のこと。或いは、第VII因子ポリペプチドは、Mono Q(R)(Pharmacia社)等のイオン交換クロマトグラフィーカラムを通すことにより、又は溶液中の自己活性化により活性化することができる。次いで、得られた活性化された第VII因子ポリペプチドは、ヘパロサンポリマーとコンジュゲートさせ、本出願に記載されている通り配合し投与することができる。
【００７１】
ヘパロサンポリマー
ヘパロサン(HEP)は、(-GlcUA-β1,4-GlcNAc-α1,4-)繰り返しを含む天然の糖ポリマーである(図1Aを参照のこと)。HEPは、グリコサミノグリカン多糖類ファミリーに属し、生理的pHで負の電荷を持つポリマーである。HEPは、ある種の細菌の莢膜において見出すことができるが、これは、天然ポリマーであるヘパリン及びヘパラン硫酸の前駆物質として働く場合高等脊椎動物においても見出される。HEPは、N-アセチル-a-D-グルコサミニダーゼ(NAGLU)及びβ-グルクロニダーゼ(GUSB)等のリソソーム酵素によって分解することができる。Bolton-Hunter試薬で標識された100kDaのヘパロサンポリマーの注射では、ヘパロサンが、体液/老廃物中のより小型の断片として分泌されることが示されている(US2010/0036001)。
【００７２】
ヘパロサンポリマー及びかかるポリマーを作製する方法は、US2010/0036001に記載されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。本発明によれば、ヘパロサンポリマーは、US2010/0036001に記載される又は開示されている任意のヘパロサンポリマーとなり得る。
【００７３】
本発明において用いるために、ヘパロサンポリマーは、任意の適当な方法、US2010/0036001又はUS2008/0109236に記載されている方法のいずれか等によって生成することができる。ヘパロサンは、細菌由来の酵素を用いて生成することができる。例えば、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella mutocida)タイプDのヘパロサンシンターゼPmHS1は、GlcUA及びGlcNAcを転移することによりヘパロサン糖鎖を重合する。エシェリキア・コリ(Escherichia coli)K5酵素KfiA(αGlcNAcトランスフェラーゼ)及びKfiC(βGlcUAトランスフェラーゼ)はまた、ヘパロサンの二糖類繰り返しを一緒になって形成することができる。
【００７４】
本発明において用いるためのヘパロサンポリマーは、通常、式(-GlcUA-β1,4-GlcNAc-α1,4-)nのポリマーである。ヘパロサンポリマーのサイズは、この式において繰り返しnの数によって定義することができる。前記繰り返しnの数は、例えば、2から約5000までとなり得る。繰り返しの数は、例えば50〜2000単位、100〜1000単位又は200〜700単位となり得る。繰り返しの数は、200〜250単位、500〜550単位又は350〜400単位となり得る。これらの範囲の下限のいずれかは、これらの範囲の任意のより高い上限と合わせて、ヘパロサンポリマーにおける単位数の適当な範囲を形成することができる。
【００７５】
ヘパロサンポリマーのサイズは、その分子量によって定義することができる。分子量は、ヘパロサンポリマー分子の母集団についての平均分子量、例えば、質量平均分子量等となり得る。
【００７６】
ヘパロサンポリマーのサイズに関して本明細書に記載した分子量の値は、実際、列挙したサイズには正確にはなり得ない。ヘパロサンポリマー生成中のロット間の変動により、いくつかの変動が推定されるべきである。したがって、ロット間の変動を包含するために、標的HEPポリマーサイズの周りでおよそ+/-10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%の変動が推定されることが理解されるべきである。例えば、HEPポリマーサイズ40kDaは、40kDa+/-10%を意味し、例えば、40kDaは、例えば、実際には平均38.8kDa又は41.5kDaを意味することもあり、どちらも40kDaの+/-10%の36〜44kDaの範囲内に入る。
【００７７】
ヘパロサンポリマーは、分子量が、例えば、500Da〜1,000kDaとなり得る。ポリマーの分子量は、500Da〜650kDa、5kDa〜750kDa、10kDa〜500kDa、15kDa〜550kDa又は25kDa〜250kDaとなり得る。
【００７８】
第VII因子ポリペプチドの活性とコンジュゲートの半減期又は平均滞留時間との間の適当な平衡を達成するために、分子量は、これらの範囲内のある特定のレベルで選択することができる。例えば、ポリマーの分子量は、15〜25kDa、25〜35kDa、35〜45kDa、45〜55kDa、55〜65kDa又は65〜75kDaから選択される範囲となり得る。
【００７９】
分子量のより詳細な範囲を選択することができる。例えば、分子量は、20kDa〜35kDa、例えば22kDa〜32kDa等、25kDa〜30kDa等、約27kDa等となり得る。分子量は、35〜65kDa、例えば40kDa〜60kDa等、47kDa〜57kDa等、50kDa〜55kDa等、約52kDa等となり得る。分子量は、50〜75kD、例えば60〜70kDa等、63〜67kDa等、約65kDa等となり得る。
【００８０】
他の実施形態では、本発明の第VII因子コンジュゲートのヘパロサンポリマーは、サイズが13〜65kDa、13〜55kDa、25〜55kDa、25〜50kDa、25〜45kDa、30〜45kDa及び38〜42kDaから選択される範囲内である。
【００８１】
分子量のこれらの範囲の下限のいずれかは、これらの範囲から任意のより高い上限と合わせて、本明細書に記載したヘパロサンポリマーの分子量についての適当な範囲を形成することができる。
【００８２】
ヘパロサンポリマーは、狭いサイズ分布(すなわち、単分散)又は広いサイズ分布(すなわち、多分散)を有し得る。多分散(PDI)のレベルは、式Mw/Mn(式中、Mw=質量平均分子量であり、Mn=数平均分子量である)に基づいて、数値で表すことができる。理想的な単分散ポリマーのこの等式を用いた多分散値は、1である。好ましくは、本発明において用いるためのヘパロサンポリマーは、単分散である。したがって、ポリマーは、約1である多分散となり得、多分散は、1.25未満、好ましくは、1.20未満、好ましくは、1.15未満、好ましくは1.10未満、好ましくは1.09未満、好ましくは1.08未満、好ましくは1.07未満、好ましくは1.06未満、好ましくは1.05未満となり得る。
【００８３】
ヘパロサンの分子量サイズ分布は、アガロースゲルで行うことができる単分散サイズ標準(HA Lo-Ladder、Hyalose LLC社)との比較によって測定することができる。
【００８４】
或いは、ヘパロサンポリマーのサイズ分布は、高速サイズ排除クロマトグラフィー-マルチアングルレーザー光散乱(SEC-MALLS)によって決定することができる。このような方法は、ヘパロサンポリマーの分子量及び多分散を評価するために用いることができる。
【００８５】
ポリマーサイズは、生成の酵素方法において調整することができる。ヘパロサンアクセプター鎖のUDP糖に対するモル比を制御することにより、所望の最終ヘパロサンポリマーサイズを選択することが可能である。
【００８６】
ヘパロサンポリマーは、それが第VII因子ポリペプチドへの結合を可能にする反応性基を更に含むことができる。適当な反応性基は、例えば、アルデヒド、アルキン、ケトン、マレイミド、チオール、アジド、アミノ、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、炭酸エステル、キレーター又はそのいずれかの組合せとなり得る。例えば、図1Bでは、マレイミド基を含むヘパロサンポリマーを例示している。
【００８７】
ヘパロサンポリマーに付加することができる反応性基の更なる例は、以下の通りである。
-  アミンと反応性の還元末端に付加されたアルデヒド反応基、
-  スルフヒドリルと反応性の還元末端に付加されたマレイミド基、
-  スルフヒドリルと反応性の還元末端に付加されたピリジルチオ基、
-  アセチレンと反応性の非還元末端で又は糖鎖内に付加されたアジド基、
-  アルデヒドと反応性の還元末端で、非還元末端に又は糖鎖内に付加されたアミノ基、
-  アミンと反応性の還元又は非還元末端に付加されたN-ヒドロキシスクシンイミド基。
【００８８】
-  アルデヒド及びケトンと反応する還元又は非還元末端に付加されたヒドロキシルアミン基。
-  アルデヒド(aldehydre)又はケトンと反応性の還元末端に付加されたヒドラジド。
【００８９】
実施例に記載する通り、定義されたサイズのマレイミドによって官能化されたヘパロサンポリマーは、二糖ヌクレオチドUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAを等モル量で用いて酵素(PmHS1)重合反応によって調製することができる。プライミング三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2は、反応を開始するために用いることができ、重合は、糖ヌクレオチド基本単位が欠乏するまで行う。次いで、(プライマーから生じる)末端アミンは、適当な反応性基、例えば、上記の反応性基等、例えば、遊離システインへのコンジュゲーションのために設計されたマレイミド官能基等で官能化することができる。ヘパロサンポリマーのサイズは、糖ヌクレオチドの変異:プライマー化学量論によって予め決定することができる。この技法は、US2010/0036001に詳細に記載されている。
【００９０】
反応性基は、還元又は非還元末端で又は糖鎖を通して存在することができる。ヘパロサンポリマーをポリペプチドにコンジュゲートさせる場合、唯一のかかる反応性基の存在が好ましい。
【００９１】
FVII-HEPコンジュゲートを調製するための方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載した第VII因子ポリペプチドは、本明細書に記載されるヘパロサンポリマーにコンジュゲートされる。本明細書に記載した任意の第VII因子ポリペプチドは、本明細書に記載した任意のヘパロサンポリマーと合わせることができる。
【００９２】
ヘパロサンポリマーは、ポリペプチド上の単一の位置で結合させてもよいしき、又はヘパロサンポリマーは、ポリペプチド上の複数の位置で結合させてもよい。
【００９３】
ポリペプチドへのポリマーの結合位置は、用いている特定のポリペプチド分子に依存し得る。ポリペプチドへのポリマーの結合位置は、それが存在する場合、ポリマー上で存在している反応性基のタイプに依存し得る。上記で説明される通り、異なる反応性基は、ポリペプチド分子において異なる基と反応する。
【００９４】
ポリマーをポリペプチドに結合させる様々な方法が存在し、任意の適当な方法は、本発明に従って用いることができる。ヘパロサンポリマーは、US2010/0036001、WO03/031464、WO2005/014035又はWO2008/025856のいずれかに記載される(そのそれぞれの内容が参照によって本明細書に含まれる)結合技術を用いて、第VII因子ポリペプチドのグリカンに結合させることができる。
【００９５】
例えば、WO03/031464には、第VII因子又は第VIIa因子ポリペプチド等のポリペプチドのグリカン構造をリモデリングするための方法、及び水溶性ポリマー等の修飾基をこのようなポリペプチドに付加するための方法が記載されている。かかる方法を用いて、ヘパロサンポリマーを本発明による第VII因子ポリペプチドに結合させることができる。
【００９６】
本実施例に記載される通り、第VII因子ポリペプチドを、シアル酸転移酵素を用いてそのグリカン部分にコンジュゲートさせることができる。本手法の実施可能要件の場合、HEPポリマーは、シアル酸シチジン一リン酸に連結するためにまず必要である。グリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)は、かかる化学のための適当な出発点であるが、他のシアル酸シチジン一リン酸又はその断片を用いることができる。例では、HEPポリマーをGSC分子に共有結合するための方法が記載されている。共有結合によって、HEP-GSC(HEPコンジュゲート型グリシルシアル酸シチジン一リン酸)分子は、FVIIaのグリカン部分に転移することができるものを生成する。
【００９７】
WO2005/014035には、末端ガラクトース含有糖タンパク質と組み合わせたガラクトースオキシダーゼ、例えば、糖タンパク質又はアシアロ糖タンパク質で処理したシアリダーゼを利用する化学的コンジュゲーションが記載されている。かかる方法は、シアリダーゼ及びガラクトースオキシダーゼの反応を利用して、求核反応性基に化学的にコンジュゲートさせて、ポリマーを糖タンパク質に結合させることができる反応性アルデヒド基を生成することができる。かかる方法を用いて、ヘパロサンポリマーを第VII因子糖タンパク質に結合させることができる。かかる方法において用いるための適当な第VII因子ポリペプチドは、末端ガラクトースを含む任意の第VII因子グリコペプチドとなり得る。このような糖タンパク質は、第VII因子ポリペプチドをシアリダーゼで処理して、末端シアル酸を除去することにより生成することができる。
【００９８】
WO2011012850には、糖タンパク質におけるポリマー基のグリコシル基への結合が記載されている。かかる方法は、本発明に従って用いて、ヘパロサンポリマーを第VII因子ポリペプチドに結合させることができる。
【００９９】
ヘパロサンは、ポリペプチド中の改変された追加のシステイン又は露出されたスルフヒドリル基を介して、ポリペプチドに結合させることができる。スルフヒドリル、システイン基は、例えば、マレイミド-ヘパロサンポリマー等の官能化されたヘパロサンポリマーにカップリングさせて、ヘパロサン-ポリペプチドコンジュゲートを得ることができる。
【０１００】
一態様では、ヘパロサンポリマーは、FVII分子上でシステインにコンジュゲートさせることにより、FVIIポリペプチドに結合させる。システインは、野生型第VII因子ポリペプチドのアミノ酸配列に付加される等、第VII因子ポリペプチドに作製することができる。システインは、第VII因子ポリペプチドのC-末端に、例えば、407位に、又は組織因子結合、FX結合若しくはリン脂質への結合をひどく妨げることのない表面が露出した位置の鎖に位置することができる。
【０１０１】
407位にシステイン残基が付加されることにより修飾されている第VII因子ポリペプチドにおいて、Cys407は、ヘパロサンポリマーの結合部位として作用することができる(例えば、マレイミドで官能化されているヘパロサンポリマー13kDa、27kDa、40kDa、52kDa、60kDa、65kDa、108kDa又は157kDa)。
【０１０２】
本実施例に記載される通り、システインがブロックされない第VII因子ポリペプチド、例えばFVIIa-407C等は、ヘペス等の適当な緩衝液中で及び中性に近いpHでHEP-マレイミド反応させることができる。反応は、室温で、例えば、3〜4時間放置してもよい。このような反応によって、ヘパロサンポリマーの第VII因子ポリペプチドへのコンジュゲーションを達成することができる。
【０１０３】
第VII因子-ヘパロサンコンジュゲートは、これらが生成されてから精製することができる。例えば、精製は、第VII因子ポリペプチドを通して方向づけられた固定化mAb、例えば、FVIIaにおいて石灰化gla-ドメインに対して方向づけられたmAb等を用いた親和性クロマトグラフィーにより含むことができる。このような親和性クロマトグラフィー法では、非コンジュゲート型HEP-マレイミドは、カラムの広範な洗浄により除去することができる。抗体からFVIIを放出することにより、FVIIを、カラムから放出することができる。例えば、抗体が石灰化gla-ドメインに特異的である場合、カラムからの放出は、EDTAを含む緩衝液で洗浄することにより達成することができる。
【０１０４】
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、非コンジュゲート型第VII因子から第VII因子-ヘパロサンコンジュゲートを分離することができる。
【０１０５】
純粋なコンジュゲートは、限外ろ過により濃縮することができる。
【０１０６】
生成の過程により得られた第VII因子-ヘパロサンコンジュゲートの最終濃度は、例えば、FVII軽鎖のHPLC定量等のHPLC定量によって決定することができる。
【０１０７】
炭水化物ポリマー等の半減期延長部分を糖タンパク質に連結するためのよく知られている方法は、オキシム、ヒドラゾン又はヒドラジド結合形成を含む。WO2006094810には、活性化エステル化学反応を用いて連結される問題を回避する、ヒドロキシエチルデンプンポリマーを糖タンパク質、例えば、エリスロポエチンに結合させるための方法が記載されている。これらの方法では、ヒドロキシエチルデンプン及びエリスロポエチンは、炭水化物部分の過ヨウ素酸塩、及びビス-ヒドロキシルアミン連結剤を一緒に用いて結合された反応性カルボニル基と個別に酸化させる。本方法は、オキシム結合によってエリスロポエチンに連結されたヒドロキシエチルデンプンを生成する。
【０１０８】
炭水化物ポリマーをGSCに結合させるための類似のオキシムに基づいた連結法  (WO2011101267)を推測できるが、かかるオキシム結合はsyn-異性体及びanti-異性体の両形態で存在することが公知であるため、ポリマーとタンパク質との連結は、syn-異性体及びanti-異性体の組合せを含む。リンカーの不均質性が抗体産生のリスクをもたらす恐れがあるため、かかる異性体混合物は、長期反復投与のために用いられるタンパク質性の薬剤において通常望ましくない。オキシム及びヒドラゾン結合はまた、水溶液中で不安定であることが示されている(例えば、Kalia and Raines、Angew Chem Int Ed Engl.2008年;47巻(39号):7523〜7526頁を参照のこと)。上記の方法は、更に欠点がある。糖タンパク質を活性化するために必要とされる酸化的方法において、炭水化物残インタクトな形態で存在しない。多くの場合において、酸化剤、すなわち、過ヨウ素酸塩が、グリカン残基が酸化されることに関して非特異的であるため、酸化的方法によって、更に、生成物異型遺伝子性(product heterogenicity)が生成される。生成物異型遺伝子性及び最終の薬剤コンジュゲート中にインタクトでないグリカン残基が存在することによって、免疫原性リスクを与える恐れがある。
【０１０９】
炭水化物ポリマーを糖タンパク質に連結するための代替法は、マレイミド化学(WO2006094810)の使用を含む。例えば、炭水化物ポリマーに、マレイミド基を取り付けることができ、選択的に標的タンパク質においてスルフヒドリル基と反応することができる。次いで、連結は、環式スクシンイミド基を含む。
【０１１０】
マレイミド基を介してHEP等の炭水化物ポリマーを、チオ-によって修飾されたGSC分子に連結し、シアル酸転移酵素によって糖タンパク質において試薬をインタクトなグリコシル基に転換し、それによって、環式スクシンイミド基を含む連結を生成することが可能であるということが示されている。
【０１１１】
しかしながら、コンジュゲートが長期間水溶液で保存される場合、スクシンイミドに基づいた連結は、加水分解性の開環を起こすことがあり(Bioconjugation Techniques、G.T.Hermanson、Academic Press、第3版、2013年、309頁)、連結は依然としてインタクトである得るが、開環反応によって、最終コンジュゲートに、位置異性体及び立体異性体の形態で望ましくない異質性が加わる。
【０１１２】
上記から、1)糖タンパク質のグリカン残基が、インタクトな形態で保存され、2)異型遺伝子性がインタクトなグリコシル残基と半減期延長部分との間のリンカー部分に存在しないような方法で、半減期延長部分を糖タンパク質に連結することが好ましいということになる。
【０１１３】
2つの化合物、HEP等の半減期延長部分等を、タンパク質又はタンパク質グリカンにコンジュゲートさせる方法が当技術分野において必要とされ、その方法においては、安定性がある及び異性体が存在しないコンジュゲートが得られるように、化合物は連結される。
【０１１４】
一態様では、本発明は、HEPのFVIIへのシアル酸に基づいたコンジュゲーションにおいて用いるための安定性がある及び異性体が存在しないリンカーであって、HEPポリマーを、誘導体化のために適切な位置でシアル酸に結合させることができる、リンカーを提供する。適切な部位は、当業者に公知であり、又はWO03031464(その全体を参照により本明細書に組み込む)から推論することができ、PEGポリマーは、複数のやり方でシアル酸シチジン一リン酸に結合される。
【０１１５】
HEPポリマーは、誘導体化のために適切な位置でシアル酸に結合させることができる。適切な部位は、当業者に公知である、又はWO03031464(その全体を参照により本明細書に組み込む)から推論することができ、ポリエチレングリコールポリマーは、複数のやり方でシアル酸シチジン一リン酸に結合される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、シアル酸ピラノース環のC4位及びC5位、並びに側鎖のC7位、C8位及びC9位は、誘導体化の点として働くことができる。誘導体化には、好ましくは、シアル酸の既存のヘテロ原子、例えばヒドロキシル基又はアミン基等が関与するが、シアル酸において適切な結合点を与える官能基の転換も可能性がある。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、シアル酸N-アセチルノイラミン酸の9-ヒドロキシ基は、当技術分野で公知の方法によりアミノ基に転換することができる。Eur.J.Biochem 168巻、594〜602頁(1987年)。以下に示される得られた9-デオキシ-アミノN-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸は、GSCの代替として働くことができる活性化されたシアル酸誘導体である。
【０１１８】
【化１】
2017507133.tif 000003
【０１１９】
いくつかの実施形態において、KDNとしても公知の2-ケト-3-デオキシ-ノン酸等の非アミン含有シアル酸はまた、以下の同じスキームの9-アミノによって誘導体化されたシアル酸に転換することもできる。
【０１２０】
【化２】
2017507133.tif 000004
【０１２１】
類似のスキームは、シアル酸ファミリーに属するより短いC8-糖類似体のために用いることができる。したがって、シアル酸より短い種類、例えば、KDOとしても公知の2-ケト-3-デオキシオクトネート等は、8-デオキシ-8-アミノ-2-ケト-3-デオキシオクトネートシチジン一リン酸に転換することができ、C9炭素原子が欠けていないシアル酸の代替として用いられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ノイラミン酸シチジン一リン酸は、本発明において用いることができる。この材料は、Eur.J.Org.Chem.2000年、1467〜1482頁に記載されている通り調製することができる。
【０１２３】
【化３】
2017507133.tif 000005
【０１２４】
いくつかの実施形態において、HEPの第VII因子へのグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)に基づいたコンジュゲーションにおける使用のための安定性がある及び異性体が存在しないリンカーを提供する。
【０１２５】
本発明において用いられるGSC出発材料は、化学合成することができ(Dufner, G.Eur.J Org Chem 2000年、1467〜1482頁)又はこれはWO2007056191に記載されている化学酵素経路により得ることができる。GSC構造を以下に示す:
【０１２６】
【化４】
2017507133.tif 000006
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載したコンジュゲートは、以下の構造を含むリンカーを含む。
【０１２８】
【化５】
2017507133.tif 000007
【０１２９】
-  以下、サブリンカー又はサブリンケージとも称され、次のやり方の1つでHEP-アミン及びGSCを連結させる。
【０１３０】
【化６】
2017507133.tif 000008
【０１３１】
したがって、範囲指定された4-メチルベンゾイルサブリンカーは、半減期延長部分を標的タンパク質に連結する完全な連結構造の部分を作製している。コンジュゲートが水溶液に長期間保存される場合、環式連結の後者のタイプが加水分解性の開環を起こす傾向があるため、サブリンカーは、代替物と比較したこのような安定性がある構造、例えば、(スルフヒドリル基とのマレイミド反応から調製される)スクシンイミドに基づいたリンカー等と同様である(Bioconjugation Techniques、G.T.Hermanson、Academic Press、第3版2013年、309頁)。このような場合の連結(例えば、糖タンパク質におけるHEPとシアル酸との間の連結)が依然としてインタクトであり得るとしても、開環反応によって、最終コンジュゲート組成物に位置異性体及び立体異性体の形態の異質性が加わる。
【０１３２】
したがって、本明細書に記載したコンジュゲートに関連するある利点は、均質な組成物が得られること、すなわち、リンカー構造及び安定性による異性体形成の傾向が、有意に減少することである。別の利点は、本発明によるリンカー及びコンジュゲートが、単純な方法、好ましくは、1工程の方法において生成することができることである。
【０１３３】
生成物が不均質になり、ヒトにおける望まれない免疫応答のリスクが高まる恐れがあるため、異性体は望ましくない。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、HEPとGSCとの間の4-メチルベンゾイルサブリンケージは、立体異性体又は位置異性体を形成することができない。HEPポリマーは、同期化された酵素重合反応(US20100036001)によって調製することができる。本方法は、マルトース結合タンパク質融解構成体としてE.コリにおいて発現し得る、パスツレラ・マルトシダ(PmHS1)から得られたヘパラン合成酵素Iを用いる。糖ヌクレオチド(GlcNAc-UDP及びGlcUA-UDP)の等モル混合物に加える場合、精製されたMBP-PmHS1は、同期化された、化学量論的に制御された反応において単分散ポリマーを生成することが可能である。三糖開始剤(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)を用いて反応を刺激し、ポリマーの長さを、プライマー:糖ヌクレオチド比によって決定する。糖ヌクレオチドの約90%が消費されるまで、重合反応を行う。陰イオン交換クロマトグラフィーにより反応混合物からポリマーを単離し、続いて、安定した粉末に凍結乾燥する。
【０１３５】
機能性HEPポリマーの調製のための方法は、US20100036001に記載されており、例えば、アルデヒド-、アミン-及びマレイミドによって官能化されたHEP試薬を列挙している。US20100036001は、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。機能的に修飾された他のHEP誘導体の範囲は、類似の化学を用いて利用可能である。本発明のいくつかの実施形態において用いられるHEPポリマーを、US20100036001に記載されている方法に従って還元末端の第1級アミン部分（又は「第1級アミンハンドル部分」若しくは「第1級アミンハンドル」とも言う）で最初に生成する。第1級アミン部分(HEP-NH2)を有するHEPポリマーは、例えば、Sismey-Ragatzら、2007年  J Biol Chem及びUS8088604に記載されている通り調製することができる。簡単にいうと、エシェリキア・コリマルトース結合タンパク質のPmHS1による融解を触媒として用いて、UDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA前駆体を有するより長い鎖中で還元末端において遊離アミンでヘパロサンオリゴ糖アクセプターを伸長させる。アクセプターは、反応を同期化し、したがって、すべての鎖は、同じ長さ(準単分散サイズ分布)であり、これはまた、その後の修正形態又はカップリング反応のために遊離アミン基を糖鎖に与える。US20100036001に従って調製したアミンによって官能化されたHEPポリマー(すなわち、末端アミン基（アミンハンドル）を有するHEP)は、N-スクシンイミジル4-ホルミルベンゾアートとの反応によってHEP-ベンズアルデヒドに転換し、続いて、還元的アミノ化反応によりGSCのグリシルアミノ基にカップリングさせることができる。続いて、得られたHEP-GSC生成物は、シアル酸転移酵素を用いて糖タンパク質に酵素的にコンジュゲートさせることができる。
【０１３６】
例えば、HEPにおける前記アミンハンドルは、以下のスキームに従ってN-スクシンイミジル4-ホルミルベンゾアートと反応させることによりベンズアルデヒド官能基に転換することができる。
【０１３７】
【化７】
2017507133.tif 000009
【０１３８】
上記スキーム中のHEPアミン(1)の4-ホルミルベンズアミド化合物(2)への転換を、4-ホルミル安息香酸のアシルによって活性化された形態との反応により行うことができる。
【０１３９】
N-ヒドロキシスクシンイミジルは、アシル活性化基として選ぶことができるが、他の多くのアシル活性化基は、当業者に公知である。限定されない例には、ペプチド化学から知られる通り1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール-、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール-、ペンタフルオロフェニル-エステルが含まれる。
【０１４０】
ベンズアルデヒド官能基で修飾されたHEP試薬は、乾燥形態で凍結して(-80℃)保存される場合、長期間安定を保つことができる。或いは、ベンズアルデヒド部分は、GSC化合物に結合させ、それによって、アミンによって官能化された半減期延長部分にコンジュゲートさせるために適したGSC-ベンズアルデヒド化合物をもたらすことができる。この合成の経路を、図8に示す。
【０１４１】
例えば、GSCを、pH中性条件下で、N-スクシンイミジル4-ホルミルベンゾアートと反応させて、反応性アルデヒド基を含むGSC化合物を生成することができる(例えば、WO2011101267を参照のこと)。次いで、アルデヒドによって誘導体化されたGSC化合物(GSC-ベンズアルデヒド)は、HEP-アミン及び還元剤と反応させて、HEP-GSC試薬を形成することができる。
【０１４２】
HEP-アミンをN-スクシンイミジル4-ホルミルベンゾアートと最初に反応させて、アルデヒドによって誘導体化されたHEP-ポリマーを形成させ、続いて、還元剤の存在下でGSCと直接反応させるために、上記の反応は逆転させることができる。実際には、これによって、GSC-CHOの時間のかかるクロマトグラフの処理が省かれる。この合成の経路を、図9に示す。
【０１４３】
したがって、いくつかの実施形態において、HEP-ベンズアルデヒドは、還元的アミノ化によってGSCにカップリングされる。
【０１４４】
還元的アミノ化は、2段階の反応であり、以下の通り進行する。最初に、(シッフ塩基としても公知の)イミンが、アルデヒド成分とアミン成分との間で形成される(本実施形態では、GSCのグリシルアミノ基)。次いで、第2の工程でイミンはアミンに還元される。形成されたイミンをアミン誘導体に選択的に還元するため、還元剤が選ばれる。
【０１４５】
多くの適当な還元試薬は、当業者に利用可能である。限定しない例には、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN)、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)、ピリジンボラン複合体(BH3:Py)、ジメチルスルフィドボラン複合体(Me2S:BH3)及びピコリンボラン複合体が含まれる。
【０１４６】
炭水化物の還元末端への(例えば、HEPポリマーの還元末端への)還元的アミノ化が可能であるが、これは、遅く非効率的な反応として一般に記載されている(JC.Gildersleeve、Bioconjug Chem.2008年7月;19巻(7号):1485〜1490頁)。副反応、例えば、最初に形成されたイミンがケトアミンに再配列するアマドリ反応等もまた起こり得ることがあり、
前もって論じられている通り、本文脈上望ましくない異型遺伝子性をもたらす。
【０１４７】
イミンがエノール化することができず、また炭水化物由来イミンに通常見出される、必要とされる隣接するヒドロキシ基が欠けているため、ベンズアルデヒド誘導体等の芳香族アルデヒドは、かかる再配列反応を形成することができない。したがって、ベンズアルデヒド誘導体等の芳香族アルデヒドは、異性体が存在しないHEP-GSC試薬を生成するための還元的アミノ化反応に特に有用である。
【０１４８】
還元的アミノ化化学を速く完成させるために、GSC及び還元試薬の余りを、場合によっては用いる。続いて、反応を終了する場合、過剰な(反応しない)GSC試薬及び他の小分子の構成成分、例えば、過剰な還元試薬は、透析、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション又はサイズ排除クロマトグラフィーによって除去することができる。
【０１４９】
シアル酸転移酵素、Sia-CMP、及びGSC誘導体についての天然基質は、荷電し、高親水性である多機能性分子である。更に、これらは、特にpHが6.0未満である場合、長期間溶液中で安定しない。かかる低pHにおいて、基質転移のために必要なCMP活性化基は、酸によって触媒されたリン酸ジエステル加水分解により喪失する(Yasuhiro Kajiharaら、Chem Eur J 2011年、17巻、7645〜7655頁)。したがって、GSC及びSia-CMP誘導体の選択的な修飾及び単離は、CMP-加水分解を避けるために、pHの注意深い調節、並びに高速且つ効率的な単離方法が求められる。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、大型の半減期延長部分は、還元的アミノ化化学を用いてGSCにコンジュゲートされる。ベンズアルデヒド等のアリールアルデヒドによって修飾された半減期延長部分は、還元的アミノ化条件下でGSCと効率的に反応させることができるため、このタイプの修飾に最適であることが判明している。
【０１５１】
GSCが酸媒体中で加水分解を起こし得るため、HEP-ベンズアルデヒドへのカップリング中、中性に近い又はわずかに塩基性の環境を維持することが重要である。HEPポリマー及びGSCは、非常に水に溶けやすく、したがって、水性の緩衝液の系は、中性に近いレベルでpHを維持することが好ましい。多くの有機及び無機緩衝液を用いることができるが、緩衝液構成成分は、好ましくは、還元的アミノ化条件下で反応性であるべきではない。これは、例えば、第一級アミノ基、及び(程度はより少ないが)第二級アミノ基を含有する有機緩衝系を除外する。当業者は、緩衝液が適当であるか適当でないか知っているはずである。適当な緩衝液のいくつかの例を、以下の表1に示す。
【０１５２】
【表１】
2017507133.tif 000010
【０１５３】
本方法を適用することにより、異性体が存在しない安定性がある連結を有する、半減期延長部分で修飾されたGSC試薬は、効率的に調製し、CMP活性化基の加水分解の確率を最小限にする単純な方法で単離することができる。
【０１５４】
互いに前記化合物のどちらかを反応させることにより、4-メチルベンゾイルサブリンカー部分を含むHEP-GSCコンジュゲートを生成することができる。
【０１５５】
GSCはまた、チオブチロラクトンと反応させ、それによって、チオールによって修飾されたGSC分子(GSC-SH)を生成することができる。本発明において実証されている通り、かかる試薬は、マレイミドによって官能化されたHEPポリマーと反応させて、HEP-GSC試薬を形成することができる。この合成経路を、図10に示す。得られた生成物は、スクシンイミドを含む連結構造を有する。
【０１５６】
【化８】
2017507133.tif 000011
【０１５７】
しかしながら、スクシンイミドに基づいた連結(サブリンケージ)は、特に、修飾されたGSC試薬が長期間水溶液において保存される場合、加水分解性の開環を起こすことがあり、この連結はインタクトであり得るが、開環反応によって、位置異性体及び立体異性体の形態で望ましくない異質性が加えられる。
【０１５８】
糖コンジュゲーション(glycoconjugation)の方法
HEP-GSCコンジュゲートの(ポリ)-ペプチドとのコンジュゲーションは、(ポリ)-ペプチド主鎖中の残基に存在するグリカンによって行うことができる。コンジュゲーションのこの形態はまた、糖コンジュゲーションと称される。
【０１５９】
HEPポリマーの糖コンジュゲーションのための方法は、ガラクトースオキシダーゼに基づいたコンジュゲーション(WO2005014035)及び過ヨウ素酸塩に基づいたコンジュゲーション(WO2008025856)が含まれる。シアル酸転移酵素に基づいた方法は、凝固因子FVII等の血液凝固因子において、N-グリカン又はO-グルシアン(glcyan)を修飾するために穏やかに及び高度に選択できることが長期にわたって証明されてきた。
【０１６０】
システインアルキル化に基づいたコンジュゲーション方法に対して、リジンアシル化及びタンパク質主鎖においてアミノ酸が関与する類似のコンジュゲーション、グリカンによるコンジュゲーションは、タンパク質/ペプチド断片のポリマー等のより大型の構造を、生物活性が妨げられにくい生物活性タンパク質に結合させる魅力的な方法である。これは、高親水性のグリカンが、一般に、タンパク質活性がないことが重要である結合表面を残し、タンパク質表面から離れて及び溶液の中で方向づけられる傾向にあるためである。
【０１６１】
グリカンは、天然に存在することができる又は例えば、当技術分野で周知の方法を用いてN-結合型グリカンの挿入によって挿入することができる。
【０１６２】
GSCは、シアル酸転移酵素の使用により糖タンパク質に転移することができるシアル酸誘導体である。GSCは、グリシルアミノ基においてPEG等の置換基で選択的に修飾することができ、更に、シアル酸転移酵素の使用により糖タンパク質に酵素的に転移することができる。GSCは、大規模で酵素方法により効率的に調製することができる(WO07056191)。
【０１６３】
シアル酸転移酵素
シアル酸転移酵素は、例えば、タンパク質における自然に活性化されるシアル酸(Sia)-CMP(シチジン一リン酸)化合物から得られたシアル酸を、ガラクトシル-部分に転移する糖転移酵素の1クラスである。多くのシアル酸転移酵素(ST3GalIII、ST3GalI、ST6GalNAcI)は、C5アセトアミド基において、特に、PEG40kDa等の大型の基で修飾されているシアル酸-CMP(Sia-CMP)誘導体を転移することが可能である(WO03031464)。本発明で用いることができる、関連するシアル酸転移酵素の、広範であるが限定されないリストは、WO2006094810に開示され、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、糖タンパク質における末端のシアル酸は、シアリダーゼ処理によって除去して、アシアロ糖タンパク質を生成することができる。アシアロ糖タンパク質及び半減期延長部分で一緒に修飾されたGSCは、シアル酸転移酵素のために基質として働く。反応の生成物は、インタクトなグリコシル連結基、この場合では、インタクトなシアル酸リンカー基によって連結された半減期延長部分を有する糖タンパク質コンジュゲートである。アシアロ第VII因子糖タンパク質をシアル酸転移酵素の存在下でHEP-GSCと反応させる反応スキームを、図14に示す。
【０１６５】
FVII-HEPコンジュゲートの特性
いくつかの実施形態において、本明細書に記載したコンジュゲートには、様々な利点がある。例えば、コンジュゲートは、適当な第VII制御因子分子と比較した場合、以下の利点の1つ又は複数(one of more)を示すことができる。
-  in vivoでの循環半減期の改善
-  in vivoでの平均滞留時間の改善
-  in vivoでの生分解性の改善
-  本明細書に記載したin vitroタンパク質分解アッセイ等のタンパク質分解アッセイにおいて測定される場合の生物活性の改善、
-  凝固アッセイにおいて測定される場合の生物活性の改善、
-  本明細書に記載したin vitro加水分解アッセイにおいて測定される場合の生物活性の改善、
-  組織因子結合アッセイにおいて測定される場合の生物活性の改善、
-  トロンビン生成アッセイにおいて測定される場合の生物活性の改善、
-  第Xa因子を生成する能力の改善。
【０１６６】
コンジュゲートは、本明細書に記載される第VII因子の任意の生物活性の改善を示すことができ、これは、本明細書に記載される任意のアッセイ又は方法、例えば、第VII因子の活性に関して上記の方法等を用いて測定することができる。
【０１６７】
本発明のコンジュゲート、すなわち、目的とするコンジュゲートは、適当な第VII制御因子分子と比較する場合、利点が示され得る。対照分子は、例えば、非コンジュゲート型第VII因子ポリペプチドであっても、コンジュゲート型第VII因子ポリペプチドであってもよい。コンジュゲート型対照は、水溶性ポリマーにコンジュゲートされたFVIIaポリペプチドであっても、タンパク質に化学的に連結されたFVIIaポリペプチドであってもよい。
【０１６８】
コンジュゲート型第VII因子対照は、目的とするコンジュゲートにおいてヘパロサン分子と類似のサイズの(タンパク質又は水溶性ポリマーである)化学部分にコンジュゲートされる第VII因子ポリペプチドとなり得る。水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、分枝PEG、デキストラン、ポリ(1-ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマル)、2-メタクリロイルオキシ-2'-エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)となり得る。
【０１６９】
第VII制御因子分子中の第VII因子ポリペプチドは、好ましくは、目的とするコンジュゲート中に存在する同じ第VII因子ポリペプチドである。例えば、第VII制御因子分子は、目的とするコンジュゲートにおいて第VII因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有し得る。第VII制御因子は、目的とするコンジュゲートにおいて第VII因子ポリペプチドと同じ糖鎖修飾パターンとなり得る。
【０１７０】
例えば、コンジュゲートが、407位に追加のシステインを有する第VII因子を含み、ヘパロサンポリマーがその追加のシステインに結合されている場合、第VII制御因子分子は、好ましくは、407位に追加のシステインを有するが、ヘパロサンが結合されていない同じ第VII因子分子である。
【０１７１】
比較されている活性が循環半減期である場合、比較のために用いられている対照は、前述した通りの適当な、第VII因子によってコンジュゲートている分子となり得る。本発明のコンジュゲートは、適当な対照と比較した場合、好ましくは、循環半減期又は平均滞留時間の改善を示す。
【０１７２】
比較されている活性が第VII因子の生物活性、例えば、凝固活性又はタンパク質分解等である場合、対照は、好ましくは、本発明のヘパロサンコンジュゲートと同様のサイズの水溶性ポリマーにコンジュゲートされている適当な第VII因子ポリペプチドである。
【０１７３】
コンジュゲートは、ヘパロサンの付加によって修飾されていない第VII因子において示される生物活性のレベルを保持しないことがある。好ましくは、本発明のコンジュゲートは、可能な限り多くの非コンジュゲート型第VII因子の生物活性を保持する。例えば、コンジュゲートは、非コンジュゲート型第VII因子対照の生物活性の少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%又は少なくとも60%を保持することができる。先に論じた通り、対照は、コンジュゲートにおいて第VII因子ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するが、ヘパロサンが欠けている第VII因子分子となり得る。しかしながら、コンジュゲートは、適当な対照と比較した場合、生物活性の改善を示し得る。ここで、生物活性は、凝固活性又はタンパク質分解活性等の本明細書に記載される第VII因子の任意の生物活性となり得る。
【０１７４】
本明細書に記載される適当な対照と比較した場合、生物活性の改善は、生物活性の任意の測定可能な又は統計的に有意な増加となり得る。生物活性は、凝固活性、タンパク質分解活性等、本明細書に記載される第VII因子の任意の生物活性となり得る。この増加は、例えば、適当な対照における同じ活性と比較した場合、関連する生物活性において、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%又はそれ以上の増加となり得る。
【０１７５】
本発明のコンジュゲートの利点は、ヘパロサンポリマーが酵素的に生分解性であるということである。したがって、本発明のコンジュゲートは、好ましくは、in vivo及び/又はin vitroで酵素的に分解性である。
【０１７６】
本発明のコンジュゲートの利点は、第VII因子に連結したヘパロサンポリマーは、PTTに基づいたアッセイにおいてアッセイ間の変動を低下させる、又はそれらを生じない可能性があることであり得る。
【０１７７】
組成物及び配合物
他の態様では、本発明は、本明細書に記載したコンジュゲートを含む組成物及び配合物を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に配合される1つ又は複数のコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、任意及びすべての溶媒、分散体媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、生理的に適合性のあるもの等が含まれる。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、水性担体又は賦形剤を含む。本発明の医薬組成物において使用することができる適当な水性担体の例には、水、緩衝された水及び食塩水が含まれる。他の担体の例には、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、及びそれらの適当な混合物、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが含まれる。固有の流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材料を用いることにより、分散体の場合において必要とされる粒径を維持することによって、及び界面活性剤を用いることにより維持することができる。多くの場合において、組成物中で、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウム等の糖類、ポリアルコール等の等張剤を含むことが好ましい。
【０１８０】
医薬組成物は、主に、予防的及び/又は治療上の処置のための非経口投与を目的とする。好ましくは、医薬組成物は、非経口、すなわち、静脈内、皮下、若しくは筋肉内に投与される、又は連続若しくは拍動性注入によって投与することができる。非経口投与のための組成物は、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に、好ましくは溶解したものと組み合わせて、本発明の第VII因子コンジュゲートを含む。種々の水性担体は、例えば、水、緩衝された水、0.4%食塩水、0.3%グリシン等を用いることができる。本発明の第VII因子コンジュゲートはまた、傷害の部位への送達又は標的指向化のためのリポソーム製剤に配合することもできる。リポソーム製剤は、一般に、例えば、US4837028、US4501728及びUS4975282に記載されている。組成物は、従来の周知の減菌技法により無菌化することができる。得られた水溶液は、無菌条件下での使用又はろ過、及び凍結乾燥用に包装することができ、凍結乾燥された製剤は、投与前に無菌の水溶液と合わせる。pH調整剤及び緩衝剤、張度調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の生理的条件に近いことが必要とされる場合、組成物は、薬学的に許容される補助物質を含有することができる。
【０１８１】
これらの配合物中の第VII因子コンジュゲートの濃度は、広範囲に変えることができる、すなわち、約0.5質量%未満、通常約1質量%又は少なくとも約1質量%から15又は20質量%と同量まで変えることができ、選択された投与の特定のモードに従って、主として液量、粘度等によって選択される。したがって、静脈内注入のための典型的な医薬組成物は、無菌のリンゲル液250ml及び第VII因子コンジュゲート10mgを含有するよう作製することができる。非経口で投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知又は明らかであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、Easton、PA(1990年)により詳細に記載されている。
【０１８２】
治療用組成物は、通常、製造及び貯蔵の条件下で無菌であり且つ安定していなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度に適した他の規則正しい構造として配合することができる。
【０１８３】
無菌の注射剤は、必要とされる量で本明細書に記載したコンジュゲートを、必要な場合、上記で列挙した成分のうちの1種又は組合せを含む適切な溶媒に取り込み、その後、滅菌精密ろ過を行うことによって調製することができる。一般に、分散体は、塩基性分散媒及び上記で列挙したものから得られた必要とされる他の成分を含有する無菌のビヒクルに有効な薬剤を取り込むことにより調製される。本組成物は、無菌であるべきであり、容易に注射針通過可能な程度までの流体であるべきである。これは、製造及び貯蔵の条件下で安定性があるべきであり、細菌及び真菌類等の微生物の汚染作用に対して保護することができる。無菌の注射剤の調製のための無菌の粉末の場合では、調製の好ましい方法は、前もって無菌ろ過されたその溶液から、活性剤+任意の所望の追加成分の粉末を生成する真空乾燥及び冷凍乾燥(凍結乾燥)である。
【０１８４】
コンジュゲートは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリ[エチレングリコール]等)、それらの適当な混合物、植物油、及びそれらの組合せを含有する溶媒又は分散媒と併せて用いることができる。
【０１８５】
コンジュゲートの固有の流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを用いることにより、分散体の場合において必要とされる粒径を維持することにより、及び/又は界面活性剤を用いることにより維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合では、組成物中で、等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム、又はマンニトール及びソルビトール等のポリアルコールを含むことが好ましい。組成物中で、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含むことにより、注射用組成物の長期の吸収をもたらすことができる。
【０１８６】
無菌の注射剤は、必要とされる量で本明細書に記載したコンジュゲートを、必要な場合、上記で列挙した成分のうちの1種又は組合せを含む適切な溶媒に取り込み、その後、ろ過して滅菌することにより調製することができる。一般に、分散体は、塩基性分散媒及び上記で列挙したものから得られた必要とされる他の成分を含有する無菌の担体にヘパロサンコンジュゲートを取り込むことにより調製される。無菌の注射剤の調製のための無菌の粉末の場合では、調製の方法は、前もって無菌ろ過されたその溶液から、任意の所望の追加成分を加えた有効成分(すなわち、ヘパロサンコンジュゲート)の粉末を生成する、真空乾燥、スプレー乾燥、スプレー冷凍及び冷凍乾燥を含むことができる。
【０１８７】
組成物は、投与の容易性及び用量の均一性のために投与単位形態で配合することができる。本明細書で使用される場合、投与単位形態は、治療しようとする対象用の単位用量として適した物理的に分離した単位を意味し;各単位は、所望の治療効果をもたらすように算出されたコンジュゲートの予定された量を含有する。現在特許請求される及び開示された発明の投与単位形態に関する明細書は、(a)ヘパロサンコンジュゲートの固有の特性及び達成しようとする特定の治療効果並びに(b)対象における選択された条件の治療のためのこのような治療用化合物を混合する当技術分野で固有の制限により影響され、これらに直接依存している。
【０１８８】
本明細書に記載した医薬組成物は、本明細書に記載したコンジュゲートに加えて追加の有効成分を含むことができる。例えば、医薬組成物は、追加の治療剤又は予防剤を含むことができる。例えば、本発明の医薬組成物が、出血障害の治療における使用を目的とする場合、これは、出血障害の症状を減らすことを目的とした1種又は複数の薬剤を更に含むことができる。例えば、本組成物は、1種又は複数の追加の凝固因子を含むことができる。本組成物は、患者の状態を改善することを目的とした1種又は複数の他の構成成分を含むことができる。例えば、本組成物が、望まれない失血に苦しんでいる患者、例えば、手術を行っている患者又は外傷を受けている患者等の治療における使用を目的とする場合、本組成物は、1種若しくは複数の鎮痛薬、麻酔薬、免疫抑制薬又は抗炎症薬を含むことができる。
【０１８９】
本組成物は、ある特定の方法において用いるために又は特定の経路により投与するために配合することができる。本発明のコンジュゲート又は組成物は、非経口で、腹腔内、脊髄内、静脈内、筋肉内、膣内、皮下、鼻腔内、直腸、又は大脳内に投与することができる。
【０１９０】
本発明の、第VII因子ポリペプチド及びヘパロサンポリマーコンジュゲートの有利な特性は,ポリマーが、およそ13〜65kDaの範囲内(例えば13〜55kDa、25〜55kDa、25〜50kDa、25〜45kDa、30〜45kDa又は38〜42kDa)のポリマーサイズを有する場合であり、これによって、溶液で適当な粘度をも有しながらin vivoで有用な半減期又は平均滞留時間が可能になり得る。
【０１９１】
コンジュゲートの使用
本発明のコンジュゲートは、第VII因子をその個体に送達するために、それを必要とする個体に投与することができる。個体は、任意の第VII因子を必要とする個体となり得る。
【０１９２】
本明細書に記載した第VII因子コンジュゲートは、例えば、凝固因子欠損症(例えば、血友病A及びB又は第XI若しくは第VII凝固因子の欠損症)又は凝固因子インヒビターによって引き起こされ得る出血障害を制御するために用いることができる、或いはこれらは、本来なら機能する血液凝固カスケードを有する(凝固因子欠損症又は凝固因子のいずれかに対するインヒビターがない)対象に起こっている、過剰な失血を制御するために用いることができる。失血は、欠陥のある血小板機能、血小板減少症又はフォンヴィルブラント病により引き起こされ得る。これらはまた、線維素溶解活性の増加が、様々な刺激によって誘導されている対象において示され得る。
【０１９３】
計画的な介入に関連した治療の場合、本発明の第VII因子コンジュゲートは、通常、介入を行う前の約24時間以内に、及びその後7日ほど又はそれ以上投与される。凝固薬としての投与は、本明細書に記載した通り種々の経路により行うことができる。
【０１９４】
第VII因子コンジュゲートの用量は、対象の体重及び状態の重症度に応じて、負荷量及び維持量として、対象70kgの場合、第VII因子ポリペプチド約0.05mg〜500mg/日、好ましくは約1mg〜200mg/日、より好ましくは約10mg〜約175mg/日を送達する。適当な用量はまた、そのin vivo半減期又は平均滞留時間及びその生物活性を含めた、ある特定のコンジュゲートの特性に基づいた本発明のそのコンジュゲートについて調整することができる。例えば、半減期がより長いコンジュゲートは、用量を減らして投与することができ、且つ/又は野生型第VII因子と比較して活性が低い組成物は、用量を増やして投与することができる。
【０１９５】
本発明の第VII因子コンジュゲートを含有する組成物は、予防上及び/又は治療上の処置のために投与することができる。治療への適用において、組成物は、疾患及びその合併症を治癒する、緩和する又は部分的に停止させるのに十分な量で、上記の任意の出血障害等の疾患にすでに罹患している対象に投与される。これを達成するのに適した量は、「治療有効量」と定義される。当業者によって理解される通り、こうした目的のために有効な量は、疾患若しくは傷害の重症度並びに対象の体重及び全身状態に依存する。しかしながら、一般に、有効な送達量は、対象70kgの場合第VII因子ポリペプチド1日約0.05mg〜約500mgの範囲に及び、1日に送達される第VII因子の用量約1.0mg〜約200mgがより一般的に用いられる。
【０１９６】
本明細書に記載したコンジュゲートは、一般に、重篤な疾患又は傷害の状態、すなわち、生命を脅かす又は生命を脅かす可能性がある状態に用いることができる。かかる場合では、外来性物質の最小化及びヒトにおけるヒト第VII因子ポリペプチド変異体の免疫原性の全体的な欠如を考慮して、これは、治療に当たる医師によって、かなり過量のこれらの第VII因子コンジュゲート組成物を投与することが望まれると感じられることもある。予防的な適用において、本発明の第VII因子コンジュゲートを含有する組成物は、対象自身の凝固能力を増強するために、疾患状態又は傷害に感受性である対象に投与される、又はそうでない場合、それらのリスクがある対象に投与される。このような量は、「予防上有効な用量」と定義される。予防的な適用において、再度送達される第VII因子ポリペプチドの正確な量は、対象の健康状態及び体重に依存するが、用量は、一般に、70キログラムの対象の場合1日約0.05mg〜約500mg、より一般的には70キログラムの対象の場合1日約1.0mg〜約200mgの範囲に及ぶ。
【０１９７】
本組成物の単回又は多回投与は、治療に当たる医師によって選択される用量レベル及びパターンで行うことができる。日常のメンテナンスレベルを要する外来の対象の場合、第VII因子ポリペプチドコンジュゲートは、例えば、ポータブルポンプ系を用いた連続的な注入により投与することができる。
【０１９８】
本発明の第VII因子コンジュゲートの局所送達、例えば、局所適用等は、例えば、スプレー、灌流、ダブルバルーンカテーテル、代用血管又は血管ステントに組み込まれるステント、バルーンカテーテルをコーティングするために用いられるヒドロゲル、又は他の十分に確立された方法によって行うことができる。任意のイベントにおいて、医薬組成物は、対象を有効に治療するのに十分な第VII因子コンジュゲートの含量を提供すべきである。
【０１９９】
本発明は、以下の例によって更に例示されるが、これらは、保護の範囲を限定するものと解釈されるものではない。前述の説明及び以下の例において開示される特徴は、別々に及びその任意のその組合せにおいて、その多様な形態で本発明を実現するための材料となり得る。
【０２００】
構造式の破線は、開いた原子価結合(open valence bond)(すなわち、他の化学部分に構造を連結させる結合)を示す。
【０２０１】
定義
別段定義されない限り、本明細書に用いられるすべての専門用語及び科学用語は、一般に、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、用語「凝固障害」とは、正常な凝固カスケードの任意の凝固性促進(pro-coagulative)成分の任意の定性的な若しくは定量的な欠損又は線維素溶解の任意のアップレギュレーションによって引き起こされ得る出血傾向の増加を意味する。かかる凝固障害は、先天性及び/又は後天性及び/又は医原性となり得、当業者によって同定される。
【０２０３】
用語「グリカン」は、単一のアミノ酸残基に共有結合されるオリゴ糖構造全体を意味する。グリカンは、普通ならN-結合型又はO-結合型であり、例えば、グリカンは、アスパラギン残基(N-結合型糖鎖修飾)又はセリン若しくはトレオニン残基(O-結合型糖鎖修飾)に連結される。N-結合型オリゴ糖鎖は、複数の枝分かれ構造の(multi-antennary)、例えば、2つ、3つ、又は4つ等の枝分かれ構造となり得、Man3-GlcNAc-GlcNAc-のコア構造を最もよく含有する。N-グリカン及びO-グリカンは、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に結合される。新生タンパク質がリボソームから小胞体に転座されるため、細胞のN-糖鎖修飾機構は、アミノ酸鎖中で、N-糖鎖修飾コンセンサスモチーフ(N-X-SITモチーフ)を認識しグリコシル化する(Kielyら、1976年;Glabeら、1980年)。in situでヒトにおいて産生される場合、一部の糖タンパク質は、末端、又は「キャッピング」、シアル酸残基を持つグリカン構造を有する、すなわち、各アンテナの末端糖は、2->3又は2->6連結によってガラクトースに連結したN-アセチルノイラミン酸である。他の糖タンパク質は、末端が他の糖残基でキャッピングされたグリカンを有する。しかしながら、他の状況において産生される場合、糖タンパク質は、例えば、N-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)残基を含有する又はガラクトースの代わりに末端のN-アセチルガラクトサミン(GaINAc)残基を含有する等、これらのアンテナの1種若しくは複数で、異なる末端構造を有するオリゴ糖鎖を含むことができる。
【０２０４】
用語「シアル酸」とは、9個の炭素によってカルボキシル化された糖類のファミリーの任意のメンバーを意味する。シアル酸ファミリーの最もよく知られるメンバーは、N-アセチルノイラミン酸(2-ケト-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノス-1-オン酸(しばしば、Neu5Ac、NeuAc、NeuNAc、又はNANAと略される)である。このファミリーの第2のメンバーは、N-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5Gc又はNeuGc)であり、NeuNAcのN-アセチル基は、ヒドロキシル化される。第3のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸(KDN)である(Nadanoら(1986年)J.Biol.Chem.261巻:11550〜11557頁;Kanamoriら、J.Biol.Chem.265巻:21811〜21819頁(1990年))。9-O-ラクチル-Neu5Ac又は9-O-アセチル-Neu5Acのような9-O-C1〜C6アシル-Neu5Ac等の9置換シアル酸もまた含まれる。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成及び使用は、1992年10月1日に公開された国際出願WO92/16640に開示されている。
【０２０５】
用語「シアル酸誘導体」とは、1種又は複数の化学部分で修飾される上記で定義したシアル酸を意味する。修飾基は、例えば、メチル基、アジド-及びフルオロ基等のアルキル基、又は他の化学部分を結合させるためのハンドルとして機能することができるアミノ若しくはチオール基等の官能基となり得る。例には、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Ac及び9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acが含まれる。用語はまた、1つ若しくは複数の官能基、例えば、カルボキシル基又は1つ若しくは複数のヒドロキシル基が欠けているシアル酸を包含する。カルボキシル基が、カルボキサミド基又はエステル基と置換される誘導体は、用語によってやはり包含される。本用語はまた、1つ若しくは複数のヒドロキシル基がカルボニル基に酸化されているシアル酸を意味する。更に、本用語は、例えば、過ヨウ素酸塩で酸化処理後、C9炭素原子又はC9〜C8炭素鎖の両方を喪失するシアル酸を意味する。
【０２０６】
グリシルシアル酸は、上記の定義によるシアル酸誘導体であり、NeuNAcのN-アセチル基は、アミノアセチル基としても公知のグリシル基で置換される。グリシルシアル酸は、以下の構造で表すことができる。
【０２０７】
【化９】
2017507133.tif 000012
【０２０８】
用語「CMPによって活性化された」シアル酸又はシアル酸誘導体は、シアル酸部分及びシチジン一リン酸(CMP)を含有する糖ヌクレオチドを意味する。
【０２０９】
本説明において、用語「グリシルシアル酸シチジン一リン酸」は、GSCについて記述するために用いられ、同じCMPによって活性化されたグリシルシアル酸を代わりに呼ぶための別称である。代わりの呼称には、CMP-5'-グリシルシアル酸、シチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルノイラミン酸、シチジン-5'-モノホスホ-N-グリシルシアル酸が含まれる。用語「シアル酸」とは、9個の炭素によってカルボキシル化された糖類のファミリーの任意のメンバーを意味する。シアル酸ファミリーの最もよく知られるメンバーは、N-アセチルノイラミン酸(2-ケト-5-アセトアミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノス-1-オン酸(しばしば、NeuSAc、NeuAc、又はNANAと略される)である。このファミリーの第2のメンバーは、N-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5Gc又はNeuGc)であり、NeuAcのN-アセチル基は、ヒドロキシル化される。第3のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸(KDN)である(Nadanoら(1986年)J.Bioi.Chern.261巻:11550〜11557頁;Kanamoriら、J.Bioi.Chern.265巻:21811〜21819頁(1990年))。9-0-ラクチルNeuSAc又は9-0-アセチル-NeuSAc、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Ac及び9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acのような9-0-C1〜C6アシル-NeuSAc等の9-置換シアル酸もまた含まれる。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成及び使用は、1992年10月1日に公開された国際出願WO92/16640に開示されている。
【０２１０】
用語「インタクトなグリコシル連結基」とは、ポリペプチドとHEP部分との間に挿入されて、ポリペプチド及びHEP部分に共有結合された糖モノマーが、例えば、コンジュゲート形成中にメタ過ヨウ素酸ナトリウムにより、分解されない、例えば、酸化されないグリコシル部分から得ることができる、連結基を意味する。「インタクトなグリコシル連結基」は、グリコシル単位の付加又は親糖構造からの1つ若しくは複数のグリコシル単位の除去により、天然に存在するオリゴ糖から得ることができる。
【０２１１】
用語「アシアロ糖タンパク質」は、1つ若しくは複数の末端シアル酸残基が、例えば、シアリダーゼで処理することにより又はガラクトース若しくはN-アセチルガラクトサミンの基礎となる「層」から少なくとも1種のガラクトース又はN-アセチルガラクトサミン残基を露出させる(「露出されたガラクトース残基」)化学的処理により除去されている、糖タンパク質を含むものとする。
【０２１２】
構造式中の破線は、開いた原子価結合(すなわち、この構造を他の化学部分に連結させる結合)を表す。
【実施例】
【０２１３】
実施例において用いられる略語:
CMP:シチジン一リン酸
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
Gla:γ-カルボキシグルタミン酸
GlcUA:グルクロン酸
GlcNAc:N-アセチルグルコサミン
Grx2:グルタレドキシンII
GSC:グリシルシアル酸シチジン一リン酸
GSC-SH:[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸
GSH:グルタチオン
GSSG:グルタチオンジスルフィド
HEP:ヘパロサンポリマー
HEP-GSC:GSCによって官能化されたヘパロサンポリマー
HEP-[C]-FVIIa407C:システインによってFVIIa407Cにコンジュゲートされているヘパロサン
HEP-[N]-FVIIa:N-グリカンによってFVIIaにコンジュゲートされているヘパロサン
HEPES:2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸
His:ヒスチジン
PmHS1:パスツレラ・マルトシダヘパロサンシンターゼI
sTF:可溶性組織因子
TCEP:トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
UDP:ウリジン二リン酸
【０２１４】
定量方法
本発明のコンジュゲートをHPLCによって純度について分析した。HPLCをまた用いて、FVIIa参照分子に基づいて単離したコンジュゲートの量を定量した。試料を、非還元型又は還元型で分析した。Zorbax 300SB-C3カラム(4.6×50mm;3.5μm Agilent、Cat.No.:865973-909)を用いた。カラムを30℃で操作した。5μg試料を注入し、カラムを、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水(A)-アセトニトリル(B)溶媒系で溶出させた。勾配プログラムは以下の通りである。0分(B25%);4分(B25%);14分(B46%);35分(B52%);40分(B90%);40.1分(B25%)。10ul TCEP/ギ酸溶液(水中の70mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン及び10%ギ酸)を、25μl/30ug FVIIa(又はコンジュゲート)に加えることにより、還元された試料を調製した。HPLC(5μlの注射)の分析前に、反応を70℃で10分間放置した。Bitter T、Muir HM.Anal Biochem 1962年10月;4:330-4による方法に従ってカルバゾールアッセイによりヘパロサンポリマーを定量した。
【０２１５】
SDS-PAGE分析
SDS PAGE分析を、すべてInvitrogen社製のプレキャストNupage 7%トリス-酢酸ゲル、NuPageトリス-酢酸SDS電気泳動用緩衝液及びNuPage LDS試料緩衝液を用いて行った。試料を分析前に変性させた(70℃、10分間)。HiMark HMW(Invitrogen社)を、標準として用いた。電気泳動を、動力装置付きXCell Surelock Complete(Invitrogen社)で150V、120mAで80分間行った。Invitrogen社製のSimplyBlue SafeStainを用いてゲルを染色した。
【０２１６】
(実施例1)
HEP-マレイミド及びHEP-アルデヒドポリマーの合成
定義済みサイズのマレイミド及びアルデヒドによって官能化されたHEPポリマーを、二糖ヌクレオチドUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAを用いて酵素の(PmHS1)重合反応によって調製する。プライミング三糖(GlcUA-GlcNAc-GlcUA)NH2を、反応を開始するために用い、糖ヌクレオチド基本単位が枯渇するまで重合を行う。次いで、(プライマーから生じる)末端アミンを、適当な反応性基、この場合では、遊離システイン及びチオGSC誘導体へのコンジュゲーションのために設計されたマレイミド官能基、又はGSCへの還元的アミノ化化学のために設計されたベンズアルデヒド官能基によって官能化させる。HEPポリマーのサイズは、糖ヌクレオチド:プライマー化学量論の変形法によって予め決定することができる。この技法は、US2010/0036001に詳細に記載されている。
【０２１７】
三糖プライマーを以下の通り合成する。
工程1:(2-Fmoc-アミノ)エチル2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルクロン酸メチルエステルの合成
【０２１８】
【化１０】
2017507133.tif 000013
【０２１９】
粉末化分子ふるい(1.18g、4Å)を、電磁撹拌棒を取り付けた50mlの丸底フラスコに終夜110℃で加熱し、アルゴンでフラッシュし、室温まで放冷した。アセト-ブロモ-β-D-グルクロン酸メチルエステル900mg(2.19mmol)及び2-(Fmoc-アミノ)エタノール748.5mg(2.64mmol、1.2eq)をアルゴン下で加え、その後ジクロロメタン28mlを加えた。懸濁液を、室温で15分間撹拌し、次いで、氷/NaCl-スラリで30分間冷却した。冷却過程中白色沈殿物が形成された。トリフルオロメタンスルホン酸銀(AgOTf)676.3mg(2.63mmol、1.2eq)を、約5分にわたって3回に分けて加えた。20分後、氷浴を除去した。先に述べた白色沈殿物は、溶解を開始しながら、同時に、灰色の沈殿物を形成し始めた。反応を、終夜室温で撹拌し、次いで、トリエチルアミン190μL(2.63mmol、1.2eq)を加えることにより急冷した。薄いセライト521パッド(深さ約0.1〜0.2cm)でろ過してから、その後、ジクロロメタン20mlでろ過ケークを洗浄した後、合わせたろ液を、ジクロロメタンで150mlに希釈した。有機相を、5% NaHCO3(1×50mL)及び水(1×50mL)で洗浄し、次いで、硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過した。ろ液を、ロータリーエバポレーター(40℃以下の水浴)で真空中で濃縮して乾燥させ、次いで、ジクロロメタン2mLに再び溶解した。溶液をVersaPakシリカゲルフラッシュカラム(23×110mm、23g)に注入し、生成物をヘキサン中の50%酢酸エチルで溶出した。生成物含有画分をTLC(酢酸エチル:ヘキサン、1:1)により同定し、ロータリーエバポレーター(40℃以下の水浴)で真空中で濃縮して乾燥させた。ジエチルエーテル約10mLを含む、得られた残留物の倍散により、白色結晶のフォームとして表題材料を得た。収率:293mg(0.49mmol、22.4%)。
【０２２０】
工程2:(2-Fmoc-アミノ)エチルβ-D-グルクロン酸、ナトリウム塩の合成
【０２２１】
【化１１】
2017507133.tif 000014
【０２２２】
工程1で得られた(2-Fmoc-アミノ)エチル2,3,4-トリ-O-アセチル-β-D-グルクロン酸メチルエステル490mg(0.817mmol、1eq)を、メタノール47.5mLに溶解し、1M NaOH-溶液2.5mL(2.45mmol、3eq)を撹拌しながらゆっくりと加えた。反応を、溶出液として1-ブタノール:酢酸:水=1:1:1を用いてTLCによってモニターした。TLCによってメチルエステルを完全に消費したことが示された後、1N HClを加えることにより反応混合物のpHをpH8〜9まで下げた。次いで、固体のNaHCO3204mg(2.45mmol、3eq)、その後、Fmoc-塩化物241.7mg(0.899mmol、1.1eq)を加えた。TLC分析によって反応の終了が示されたとき、反応混合物を水約150mLで希釈し、酢酸エチル(2×30mL)で2回抽出し、次いで、40℃の水浴で真空中で約20mLまで濃縮して、任意の残りの有機溶媒を除去した。溶液を、約5%(v:v)の含有率に酢酸を加えることにより酸性にし、5グラムのStrata C-18E SPE管(メタノールに予め湿らせ、製造業者の使用説明書に従って5%酢酸中で平衡化させた)に通した。樹脂を、5%酢酸で洗浄し、生成物を、90%メタノールの10%トリス.HCl(pH7.2)(v:v)の混合物で溶出させた。真空中で(40℃以下の水浴)濃縮して乾燥させた後、残留物を再び溶解させ、pHを水酸化ナトリウムを用いてpH7.2まで調整した。この溶液を、更なる精製をせずに以下の(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸の合成において原液として直接用いた。
【０２２３】
工程3:(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸、ナトリウム塩の合成
【０２２４】
【化１２】
2017507133.tif 000015
【０２２５】
工程2で得られた(2-Fmoc-アミノ)エチルβ-D-グルクロン酸380mg(0.83mmole、1eq)の水100.8mL中溶液に、1MトリスHCl5.6mL(pH7.2)、100mM MnCl25.6mL、及びUDP-GlcNAc1.8g(2.79mmole、3.4eq)を加えた。MBP-PmHS1酵素5.1mL(15.47mg/mL;78.9mg)を約1分にわたってゆっくりと加えた後、TLC分析(1-ブタノール:酢酸:水=2:1:1)によって、出発材料のほぼ完全な転換が示されるまで、反応を室温でゆっくりと撹拌させた。溶液を、酢酸2.8mLを加えることにより酸性にして、使用済みのMBP-PmHS1を沈殿させ、50mL遠心ボトルに移した。次いで、溶液を、JM-12ローター(約16,000×g)に室温で10,000rpmで30分間遠心した。上澄みをデカントし、メタノール160mLを加えた。ペレットを、水:メタノール:酢酸=45:50:5(v:v:v)の溶液で4×25mL抽出した。合わせた上澄み及び抽出物を、2gのStrata-SAX管(水:メタノール:酢酸=45:50:5(v:v:v)で平衡化させた)に通して、任意のUDP & UDP-GlcNAcを除去した(完全な除去には樹脂28グラムを要する)。標的分子を保持せず、これらの条件下で樹脂に通し;より高く荷電したUDP & UDP-GlcNAcを保持した。合わせた溶出液を、真空中で(水バッチ;40℃以下)濃縮し、水に再び溶解し、水酸化ナトリウムを用いてpHをpH7.2に調整した。この溶液を、更なる精製をせずに次の工程に直接用いた。
【０２２６】
工程4:(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸、二ナトリウム塩の合成
【０２２７】
【化１３】
2017507133.tif 000016
【０２２８】
9mM(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸、30mM UDP-GlcUA、50mMトリス.HCl、及び5mM MnCl2を含有する水溶液(38ml)を、スピナーフラスコに入れた。約1分間にわたって、MBP-PmHS1 9.5mLをゆっくりと撹拌しながら滴下した。反応混合物を放置して終夜撹拌し、その後、TLC分析(溶出液:n-BuOH:AcOH:H2O=4:1:1(v:v:v))によって、出発材料の完全な転換が示された。反応混合物を、1μmのガラス繊維製シリンジフィルターによってろ過し、5グラムのC18-E SPE管(製造業者の使用説明書に従って、水において平衡化させた)に通した。樹脂を、水で洗浄し、その後、90%水性MeOH、1mMトリス.HCl(pH7.2)の混合物で標的分子を溶出させた。溶出液を、真空中で(40℃以下の水浴)濃縮し、次いで、10mMトリス.HCl25mL(pH7.2)に再び溶解し、0.2μm SFCAシリンジフィルターでろ過した。標的分子を含有するろ液を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって更に精製した。2.6×13cm Q Sepharose HPカラムを装備し、Unicorn 5.11ソフトウェアで操作されるAkta Explorer 100を用いた。2つの緩衝系(緩衝液A:10mMトリス.HCl(pH7.2)及び緩衝液B:10mMトリス.HCl(pH7.2)、1M NaCl)を溶出に用いた。標的分子を175分にわたってBの0〜20%勾配を用いて;流速10ml/分で溶出した。10mlの画分を収集した。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレーターにおいて真空中で(<40℃の水浴)濃縮して乾燥させ、更なる精製をせずに次の工程において用いた。
【０２２９】
工程5:(2-アミノエチル)4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸、二ナトリウム塩の合成
【０２３０】
【化１４】
2017507133.tif 000017
【０２３１】
工程4に記載されている通り得られた(2-Fmoc-アミノ)エチル4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸、二ナトリウム塩を、水4mLに溶解し、氷浴で冷却した。容積が4mLのニートモルホリンを撹拌しながら加え、氷浴を除去した。UV254nm検出を用いたTLC分析(n-BuOH:AcOH:H2O=3:1:1(v:v:v))によって、出発材料を完全に消費することが示されるまで、撹拌を室温で続けた。反応は、1時間30分未満で終了した。反応混合物を、水約50mLで希釈し、EtOAc50mLで3回抽出した。標的分子を含有する水性相を、ロータリーエバポレーターにおいて真空中で(<40℃の水浴)濃縮し、水で3回同時蒸発させた。残留物を、水10mLに再び溶解し、水に予め平衡化させた1グラムのSDB-L SPEカラムに通した。標的を、保持されないカラムに通した。カラムを水10mLで洗浄し、標的を含む合わせた画分を真空中で濃縮して乾燥した(水浴;40℃以下)。得られた残留物を、1M NaOAc1.5mL(pH7.5)に溶解し、0.2μmスピンフィルターでろ過し、溶出液として水を用いてSephadex G-10カラム(2×75cm、235mL)のサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩した。表題材料の構造を、MALDI-TOF MS(基質:ATT5mg/mL;50%アセトニトリル/0.05%トリフルオロ酢酸):636.83[M+Na+]によって確認した。凍結乾燥後、表題材料を水に溶解し、得られた溶液のpHを、水酸化ナトリウムを加えることによりpH7.0〜7.5に調整し、三糖の含有量を、カルバゾールアッセイ(Bitter T、Muir HM.Anal Biochem 1962年10月;4巻:330-4)によって決定した。得られた保存溶液を分注し、必要になるまで、しっかりと密封された容器で-80℃で貯蔵した。
【０２３２】
(2-Fmoc-アミノ)エチルβ-D-グルクロン酸から開始する(2-アミノエチル)4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸の単離された全収率は、210mg(0.34mmole、41%)であった。
【０２３３】
アミン末端を有するヘパロサン多糖類の生成
【０２３４】
【化１５】
2017507133.tif 000018
【０２３５】
遊離アミン基(HEP-NH2)を有するヘパロサンポリマー誘導体を得るために、パスツレラ・マルトシダヘパロサンシンターゼ1(PmHS1;DeAngelis & White、2002年  J Biol Chem)を用いて、in vitroで並行したやり方でポリマー鎖を化学酵素的に合成した(Sismey-Ragatzら、2007年  J Biol Chem及びUS8088604)。E.コリマルトース結合タンパク質のPmHS1による融解を、工程5で得られた(2-アミノエチル)4-O-(2-デオキシ-2-アセトアミド-4-O-(β-D-グルコピラノシルウロン酸)-α-D-グルコピラノシル)-β-D-グルクロン酸(HEP3-NH2)を、UDP-GlcNAc及びUDP-GlcUA前駆体並びにUS2010036001に記載されるMnCl2触媒作用を用いて、より長いポリマー鎖に伸長するための触媒として用いた。
【０２３６】
HEP-マレイミド及びHEP-ベンズアルデヒドポリマーの合成:
HEP-ベンズアルデヒドは、アミンによって官能化されたHEPポリマーを、中性水溶液中で、N-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸(Nano Letters(2007年)7巻(8号)、2207〜2210頁)の余剰分と反応させることにより調製することができる。ベンズアルデヒドによって官能化されたポリマーを、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はHPLCによって単離することができる。
【０２３７】
HEP-マレイミドを、アミンによって官能化されたHEPポリマーを、N-マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステルの余剰分(GMBS;Fujiwara,K.ら、(1988年)J Immunol Meth 112巻、77〜83頁)と反応させることにより調製することができる。
【０２３８】
より詳細には、還元的アミノ化等によって、標的薬物化合物上の到達可能なアミノ官能基にカップリングするためのヘパロサンポリマー誘導体を得るために、ヘパロサン-NH2をN-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸とカップリングさせて、ベンズアルデヒドによって修飾されたヘパロサンポリマーを形成した。基本的に、一例では、ジメチルスルホキシド(205mL中11.94mg)に溶解されたN-スクシンイミジル-4-ホルミル安息香酸(Chem-Impex,Inc)を、1Mリン酸ナトリウム380mL(pH7.0)、水2180ml、及びジメチルスルホキシド1040mLに溶解した43.8kDaヘパロサンポリマー-NH262.7gの撹拌した溶液にゆっくりと加えた。反応混合物を放置して、室温で終夜撹拌し、その後、室温でアルコール沈澱した。生成物を含むペレットを溶解し、500mM酢酸ナトリウム3L(pH6.8)に溶解し、更に精製し、次いで、クロスフローろ過により濃縮した。ベンズアルデヒド若しくはマレイミドによって官能化されたポリマーは、或いは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はHPLCによって単離することができる。
【０２３９】
末端の第1級アミン官能基(HEP-NH2)で官能化された任意のHEPポリマーは、本例において用いることができる。以下に2つの選択肢を示す。
【０２４０】
【化１６】
2017507133.tif 000019
【０２４１】
更に、多糖類の非還元末端における末端の糖残留物は、N-アセチルグルコサミン又はグルクロン酸となり得る(グルクロン酸は上記で引用する)。通常、2つの混合物は、等モル量のUDP-GlcNAc及びUDP-GlcUAが重合反応に用いられている場合、予想されるべきである。nは、5〜450となり得、例えば、50〜400;100〜200;又は150〜190等となり得る。
【０２４２】
(実施例2)
FVIIa407Cの選択的な還元
FVIIa407Cを、グルタチオンに基づいた酸化還元緩衝液系を用いて、US20090041744に記載されている通り還元した。非還元FVIIa 407C(15.5mg)を、0.5mM GSH、15uM GSSG、25mM p-アミノベンズアミジン及び3μM Grx2を含有する50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)を全体積41mlで室温で17時間インキュベートした。次いで、反応混合物を、氷で冷却し、pHを7.0に維持しながら、100mM EDTA溶液8.3mlを加えた。次いで、全含有量を緩衝液A(50mMヘペス、100mM NaCl、1mM EDTA(pH7.0))に平衡化させた、5ml HiTrap Q FFカラム(Amersham Biosciences、GE Healthcare社)に添加して、FVIIa 407Cを捕捉した。緩衝液Aで洗浄して、非結合のグルタチオン緩衝液及びGrx2を除去した後、FVIIa 407Cを、緩衝液B(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0))により1ステップで溶出させた。溶出液中のFVIIa 407C濃度を、HPLCにより決定した。単一のシステインによって還元されたFVIIa407C 12.6mgを、50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)で単離した。
【０２４３】
(実施例3)
38.8kDa HEP-[C]-FVIIa407Cの合成
38.8k HEP-[C]-FVIIa 407Cの合成:単一のシステインによって還元されたFVIIa 407C(25mg)を、50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)緩衝液(8.5ml)中で22時間5℃で38.8K HEP-マレイミド(26.8mg)と反応させた。次いで、反応混合物を、Gla-ドメイン特異的抗体で修飾されたFVIIa特異的親和性カラム(CV=64ml)及び最初に、2カラム体積の緩衝液A(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.4))で溶出し、次いで、2カラム体積の緩衝液B(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM EDTA(pH7.4))で溶出した工程に添加した。本方法は、基本的にThim,Lら、Biochemistry(1988年)27巻、7785〜779によって記載される原理に従う。折り畳まれていないGla-ドメインを有する生成物を収集し、10mM His、100mM NaCl(pH7.5)で予め平衡化させた3×5mlのHiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences、GE Healthcare社、CV=15ml)に直接適用した。このカラムを、4カラム体積の10mM His、100mM NaCl(pH7.5)及び15カラム体積の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.5)で洗浄して、未修飾FVIIa 407Cを溶出した。次いで、pHを、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(12カラム体積)で6.0まで低下させた。38.8k-HEP-[C]-FVIIa407Cを、A60%(10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0))及びB40%(10mM His、1M NaCl、10mM CaCl2(pH6.0))緩衝液混合物15カラム体積で溶出した。コンジュゲートを含有する画分を合わせ、カットオフが10kDのSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を用いて10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)に対して透析した。最終体積を、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)を加えることにより0.4mg/ml(8uM)に調整した。収率(16.1mg、64%)を、逆相HPLCを用いてTCEP還元後にFVIIa標準に対してFVIIa軽鎖含有量を定量することにより決定した。
【０２４４】
(実施例4)
65kDa HEP-[C]-FVIIa407Cの合成
単一のシステインによって還元されたFVIIa 407C(8mg)を、50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)緩衝液(8ml)中で室温で3時間65kDa HEP-マレイミド(42mg、比1:4)と反応させた。次いで、反応混合物を、Gla-ドメイン特異的抗体で修飾されたFVIIa特異的親和性カラム(CV=24ml)及び最初に、緩衝液A(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.4))で溶出し、次いで緩衝液B(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM EDTA(pH7.4))で溶出させる工程に適用した。本方法は、基本的に、Thim,Lら、Biochemistry(1988年)27巻、7785〜779によって記載される原理に従う。折り畳まれていないGla-ドメインを有する生成物を収集し、10mM His、100mM NaCl(pH7.5)で予め平衡化させたHiTrap Q FFイオン交換カラム(Amersham Biosciences、GE Healthcare社)に直接適用させた。未修飾FVIIa 407Cを、5カラム体積の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.5)で溶出させた。次いで、2カラム体積の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)でpHを6.0まで低下させた。65kDa HEP-[C]-FVIIa407Cを、線形の勾配を用いて溶出させた。緩衝液A(10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0))及び緩衝液B(10mM His、1M NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0))を溶出に用いた。勾配は、流速0.5ml/分で10カラム体積に対して緩衝液B0〜100%であった。65kDa HEP-[C]-FVIIa 407Cを、およそ10mMヒスチジン、約300mM NaCl、10mM CaCl2、0,01% Tween80(pH6.0)で溶出させた。収率及び濃度を、上記の逆相HPLCを用いてTCEP還元後にFVIIa標準に対してFVIIa軽鎖含有量を定量することにより決定した。65kDa HEP-[C]-FVIIa 407Cコンジュゲート3.10mg(38%)の総量を、10mM His、約300mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0)中で0.57mg/mlの濃度で得た。純粋なコンジュゲートを、限外ろ過によって0.4mg/ml(8μM)まで希釈し、緩衝液を、透析によって10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0)に交換した。
【０２４５】
(実施例5)
13kDa HEP-[C]-FVIIa407Cの合成
このコンジュゲートを、FVIIa 407C(17mg)及び13kDa HEP-マレイミド(8.5mg)を用いて実施例3に記載されている通り調製した。13kDa HEP-[C]-FVIIa407C7.1mg(41%)を、10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0)中の0.4mg/ml(8μM)溶液として得た。
【０２４６】
(実施例6)
27kDa HEP-[C]-FVIIa407Cの合成
このコンジュゲートを、FVIIa 407C(15.7mg)及び27kDa HEP-マレイミド(11.2mg)を用いて実施例3に記載されている通り調製した。27kDa HEP-[C]-FVIIa407C6.9mg(44%)を、10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0)中の0.4mg/ml(8uM)溶液として得た。
【０２４７】
(実施例7)
52kDa HEP-[C]-FVIIa407Cの合成
このコンジュゲートを、FVIIa 407C(8.3mg)及び52kDa HEP-マレイミド(27mg)を用いて実施例3に記載されている通り調製した。52kDa HEP-[C]-FVIIa407C6.15mg(71%)を、10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0)中の0.4mg/ml(8uM)溶液として得た。
【０２４８】
(実施例8)
60kDa HEP-[C]-FVIIa407Cの合成
このコンジュゲートを、FVIIa 407C(14.3mg)及び60kDa HEP-マレイミド(68mg)を用いて実施例3に記載されている通り調製した。60kDa HEP-[C]-FVIIa407C8.60mg(60%)を、10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0)中の0.4mg/ml(8μM)溶液として得た。
【０２４９】
(実施例9)
108kDa HEP-[C]-FVIIa407Cの合成
このコンジュゲートを、FVIIa 407C(20.0mg)及び108kDa HEP-マレイミド(174mg)を用いて実施例3に記載されている通り調製した。108kDa HEP-[C]-FVIIa407C3.75mg(19%)を、10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0)中の0.4mg/ml(8μM)溶液として得た。
【０２５０】
(実施例10)
157kDa HEP-[C]-FVIIa407Cの合成
このコンジュゲートを、FVIIa 407C(14.5mg)及び157kDa HEP-マレイミド(180mg)を用いて実施例3に記載されている通り調製した。157k-HEP-[C]-FVIIa407C4.93mg(34%)を、10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0)中の0.3mg/ml(6μM)溶液として得た。
【０２５１】
(実施例11)
[(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸(GSC-SH)の合成
【０２５２】
【化１７】
2017507133.tif 000020
【０２５３】
グリシルシアル酸シチジン一リン酸(200mg;0.318mmol)を、水(2ml)に溶解し、チオブチロラクトン(325mg;3.18mmol)を加えた。2相溶液を室温で21時間静かに混合した。次いで、反応混合物を、水(10ml)で希釈し、逆相HPLCカラム(C18、50mm×200mm)に適用した。カラムを、以下の通りの水(A)、アセトニトリル(B)及び250mM炭酸水素アンモニウム(C)の勾配系:0分(A:90%、B:0%、C:10%);12分(A:90%、B:0%、C:10%);48分(A:70%、B:20%、C:10%)で流速50ml/分で溶出させた。画分(20mlサイズ)を収集し、LC-MSによって分析した。純粋な画分を、プールし、乾燥粉末に凍結乾燥する前に、ナトリウムの形態のDowex 50W×2(100〜200メッシュ)樹脂の短いパッドにゆっくりと通した。次いで、冷凍乾燥した粉末中の表題材料の含有量を、260nmの吸収度、及び参照材料としてグリシルシアル酸シチジン一リン酸を用いてHPLCによって決定した。HPLC分析の場合、Waters X-Bridgeフェニルカラム(5μm 4.6mm×250mm)及び水アセトニトリル系(30分にわたる0.1%リン酸を含有するアセトニトリル0〜85%の線形の勾配)を用いた。収率:61.6mg(26%)。LCMS:732.18(MH+);427.14(MH+-CMP)。化合物は、-80℃で貯蔵された場合長期間(>12カ月)安定した。
【０２５４】
(実施例12)
スクシンイミド連結による38.8kDa HEP-GSC試薬の合成
【０２５５】
【化１８】
2017507133.tif 000021
【０２５６】
このHEP-GSC試薬を、実施例11において調製されたGSC-SH([(4-メルカプトブタノイル)グリシル]シアル酸シチジン一リン酸を、HEP-マレイミドとモル比1:1で以下の通りカップリングすることにより調製し:50mMヘペス、100mM NaCl(pH7.0)(50μl)に溶解したGSC-SH(0.50mg)に、50mMヘペス、100mM NaCl(pH7.0)(1350μl)に溶解した38.8kDa HEP-マレイミド26.38mgを加えた。澄明な溶液を25℃で2時間放置した。過量のGSC-SHを、カットオフが10kDaのSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を用いて、透析によって除去した。透析緩衝液は、50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)であった。反応混合物を2.5時間2回透析した。回収された材料を、GSC-SHとHEP-マレイミドとの間の定量的な反応を想定する等として用いた。本手順によって作製されたHEP-GSC試薬は、スクシンイミド連結によってシアル酸シチジン一リン酸に結合されているHEPポリマーを含有する。
【０２５７】
(実施例13)
スクシンイミド連結による60kDa HEP-GSC試薬の合成
上記の38.8kDa HEP-GSCについて記載されたものと類似のやり方で、60kDa HEP-マレイミド及び[(4-メルカプトブタノイル)-グリシル]シアル酸シチジン一リン酸を用いてこの分子を調製した。
【０２５８】
(実施例14)
スクシンイミド連結による52kDa HEP-GSC試薬の合成
【０２５９】
【化１９】
2017507133.tif 000022
【０２６０】
この分子を、上記の38.8kDa HEP-GSCについて記載されたものと類似のやり方で、52kDa HEP-マレイミド及び[(4-メルカプトブタノイル)-グリシル]シアル酸シチジン一リン酸を用いて調製した。
【０２６１】
(実施例15)
FVIIaの脱シアリル化(Desialylation)
50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(18ml)中でシアリダーゼ(アルスロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)、200μl、0.3mg/ml、200U/ml)をFVIIa(28mg)に加え、室温で1時間放置した。次いで、反応混合物を、50mMヘペス、150mM NaCl(pH7.0)(30ml)で希釈し、氷上で冷却した。100mM EDTA溶液(6ml)を、少量ずつ加えた。それぞれ加えた後、pHを測定した。pHは、9を超えず又は5.5に達しないようにするべきである。次いで、EDTAによって処理された試料を、50mMヘペス、150mM NaCl(pH7.0)中で予め平衡化させた2×5mlの相互接続されたHiTrap Q FFイオン交換カラム(合わせたCV=10ml)に適用させた。シアリダーゼを、50mMヘペス、150mM NaCl(pH7.0)(4CV)で溶出させた。次いで、アシアロFVIIaを、50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(10CV)で溶出させた。収率(24mg)及び濃度(3.0mg/ml)を、前述の通り逆相HPLCを用いてトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン還元後、FVIIa標準に対してFVIIa軽鎖の含有量を定量することにより決定した。
【０２６２】
(実施例16)
スクシンイミド連結による52kDa HEP-[N]-FVIIaの合成
50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(2.5ml)中のアシアロFVIIa(7.2mg)に、20mMヘペス、120mM NaCl、50%グリセロール(pH7.0)(2ml)中の、実施例14から得られた52kDa-HEP-GSC(15.8mg)、及びラットST3GalIII酵素(1mg;1.1単位/mg)を加えた。反応混合物を、ゆっくりと撹拌しながら32℃で18時間インキュベートした。次いで、157mM CMP-NANの50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(0.2ml)溶液を加え、反応を、32℃で更なる時間インキュベートした。次いで、反応混合物を、Gla-ドメイン特異的抗体で修飾されたFVIIa特異的親和性カラム(CV=25ml)及び最初に、2カラム体積の緩衝液A(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.4))、次いで2カラム体積の緩衝液B(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM EDTA(pH7.4))で溶出させる工程に適用した。本方法は、基本的に、Thim,Lら、Biochemistry(1988年)27巻、7785〜779によって記載される原理に従う。折り畳まれていないGla-ドメインを有する生成物を収集し、10mM His、100mM NaCl(pH7.5)で予め平衡化させたHiTrap Q FFイオン交換カラム(合わせたCV=5ml)に直接適用した。カラムを、4カラム体積の10mM His、100mM NaCl(pH=7.5)及び未修飾FVIIaを溶出させる5カラム体積の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.5)で洗浄した。次いで、pHを、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(4カラム体積)で6.0まで低下させた。HEP化された(HEPylated)FVIIaを、5カラム体積の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(60%)及び10mM His、1M NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(40%)緩衝液混合物で溶出させた。画分を合わせ、カットオフが10kDであるSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を用いて10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)に対して透析した。収率(1.4mg)を、上記の逆相HPLCを用いてFVIIa標準に対してFVIIaを定量することにより決定した。
【０２６３】
(実施例17)
4-メチルベンゾイル連結による41.5kDa HEP-GSC試薬の合成
【０２６４】
【化２０】
2017507133.tif 000023
【０２６５】
50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2緩衝液(pH7.0)5.0ml中のグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)(20mg;32μmol)を直接加えて、41.5kDa HEP-ベンズアルデヒド(99.7mg;2.5μmol、カルバゾール定量アッセイ)を乾燥した。すべてのHEP-ベンズアルデヒドが溶解するまで、混合物を静かに回転させた。次の2時間で、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのMilliQ水1M溶液を、分量毎に(5×50μl)加えて、最終濃度48mMにした。次いで、過量のGSCを、透析によって次の通り除去した。全反応容積(5250μl)を、透析カセット(Slide-A-Lyzer透析カセット、Thermo Scientific社、カットオフが10kDaのProd# 66810、容量:3〜12ml)に移した。溶液を、25mMヘペス緩衝液(pH7.2)2000mlに対して2時間透析し、再び、25mMヘペス緩衝液(pH7.2)2000mlに対して17時間透析した。内部チャンバーからの過剰なGSCの完全な除去は、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び参照としてGSCを用いた水アセトニトリル系(30分にわたる0.1%リン酸を含有するアセトニトリル0〜85%の線形の勾配)を用いたHPLCによって検証した。内部チャンバーの材料を収集し、凍結乾燥して、白色粉末として83%(カルバゾール定量アッセイ)41.5kDa HEP-GSCを得た。この手順により作製されたHEP-GSC試薬は、4-メチルベンゾイル連結によってシアル酸シチジン一リン酸に結合されているHEPポリマーを含有する。
【０２６６】
(実施例18)
4-メチルベンゾイル連結による21kDa HEP-GSC試薬の合成
この分子を、上記の41.5kDa HEP-GSCに記載されたものと類似のやり方で、21kDa-HEP-ベンズアルデヒド及びグリシルシアル酸シチジン一リン酸(GSC)を用いて調製した。収率は、冷凍乾燥後78%であった。
【０２６７】
(実施例19)
FVIIaの脱シアリル化
FVIIa(56.9mg)に、50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(36ml)中でシアリダーゼ(アルスロバクター・ウレアファシエンス、600μl、0.3mg/ml、200U/ml)を加え、室温で1時間放置した。次いで、反応混合物を、50mMヘペス、150mM NaCl(pH7.0)(40ml)で希釈し、氷上で冷却した。100mM EDTA溶液(6ml)を少量ずつ加えた。それぞれ加えた後、pHを測定した。pHは、9を超えず又は5.5まで低下しないようにするべきである。次いで、EDTAによって処理された試料を、50mMヘペス、150 mM NaCl(pH7.0)で予め平衡化させた2×5mlのHiTrap Q FFイオン交換カラム(合わせたCV=10ml)に適用させた。50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(10CV)でアシアロFVIIaを溶出する前に、シアリダーゼを、50mMヘペス、150mM NaCl(pH7.0)(4CV)で溶出させた。アシアロFVIIaを、50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)で単離した。収率(52.9mg)及び濃度(3.11mg/ml)を、上記の逆相HPLCを用いてトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン還元後FVIIa標準に対してFVIIa軽鎖含有量を定量することにより決定した。
【０２６８】
(実施例20)
メチルベンゾイル連結による41.5kDa-HEP-[N]-FVIIaの合成
50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(17ml)中のアシアロFVIIa(52.9mg)に、20mMヘペス、120mM NaCl、50%グリセロール(pH7.0)(14ml)中で41.5kDa-HEP-GSC(90mg)、及びラットST3GalIII酵素(7mg;1.1単位/mg)を加えた。次いで、100mM CaCl2(4ml)を加えて、10mMを超えるカルシウム濃度を上げた。反応混合物を32℃で終夜インキュベートした。157mM CMP-NANの50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(1.1ml)溶液を加え、反応を32℃で更なる時間インキュベートした。HPLC分析(前述の方法)では、未反応のFVIIa(47%)、モノHEP化FVIIa(40%)及びジHEP化FVIIa(15%)及びトリHEP化FVIIa(3%)を含有する生成物分布が示された。次いで、反応混合物を、Gla-ドメイン特異的抗体で修飾されたFVIIa特異的親和性カラム(CV=72ml)及び最初に2カラム体積の緩衝液A(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.4))、次いで2カラム体積の緩衝液B(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM EDTA(pH7.4))で溶出させる工程に適用した。本方法は、基本的にThim,Lら、Biochemistry(1988年)27巻、7785〜779によって記載される原理に従う。折り畳まれていないGla-ドメインを有する生成物を収集し、10mM His、100mM NaCl(pH7.5)を含有する緩衝液で平衡化させた4×5mlの相互接続されたHiTrap Q FFイオン交換カラム(合わせたCV=20ml)に直接適用した。カラムを、4カラム体積の10mM His、100mM NaCl(pH7.5)及び未修飾FVIIaを溶出させる20カラム体積の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.5)で洗浄した。次いで、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(16カラム体積)でpHを6.0まで低下させた。HEP化FVIIaを溶出工程によって次の通り精製した。すなわち、モノHEP化FVIIaを、20カラム体積の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(75%)及び10mM His、1M NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(25%)緩衝液混合物を有するカラムで溶出した。少量のモノHEP化FVIIaを含有するジHEP化FVIIaを、20カラム体積の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(70%)及び10mM His、1M NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(30%)緩衝液混合物で溶出させた。モノHEP化FVIIaを含有する画分を合わせ、カットオフが10kDのSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を用いて10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)に対して透析した。収率(7.7mg)及び濃度(0.40mg/ml)を、逆相HPLCを用いてトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン還元後、FVIIa標準に対してFVIIa軽鎖含有量を定量することにより決定した。
【０２６９】
(実施例21)
メチルベンゾイル連結による21kDa-HEP-[N]-FVIIaの合成
50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(16ml)中のアシアロFVIIa(49mg)に、20mMヘペス、120mM NaCl、50%グリセロール(pH7.0)(20ml)中の21kDa-HEP-GSC(72mg)、及びラットST3GalIII酵素(14mg;1.1単位/mg)を加えた。次いで、100mM CaCl2(4ml)を加えて、10mMを超えるカルシウム濃度に上げた。反応混合物を、ゆっくりと撹拌しながら32℃で18時間インキュベートした。次いで、157mM CMP-NANの50mMヘペス、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.0)(0.2ml)溶液を加え、反応を32℃で更なる時間インキュベートした。HPLC分析では、未反応のFVIIa(24%)、モノHEP化FVIIa(43%)及びジHEP化FVIIa(25%)及びトリHEP化FVIIa(8%)を含有する生成物分布が示された。反応混合物を、Gla-ドメイン特異的抗体で修飾されたFVIIa特異的親和性カラム(CV=95ml)及び最初に1 1/2カラム体積の緩衝液A(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.4))、次いで、2カラム体積の緩衝液B(50mMヘペス、100mM NaCl、10mM EDTA(pH7.4))で溶出させる工程に適用した。本方法は、基本的に、Thim,Lら、Biochemistry(1988年)27巻、7785〜779によって記載される原理に従う。折り畳まれていないGla-ドメインを有する生成物を収集し、10mM His、100mM NaCl(pH7.5)を含有する緩衝液で平衡化させた4×5mlの接続されたHiTrap Q FFイオン交換カラム(合わせたCV=20ml)に直接適用した。カラムを、4カラム体積の10mM His、100mM NaCl(pH7.5)及び未修飾FVIIaを溶出させる20カラム体積の10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.5)で洗浄した。次いで、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)(16カラム体積)でpHを6.0まで低下させた。モノ-、ジ-及びマルチHEP化FVIIaを、緩衝液A(10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0))及び緩衝液B(10mM His、1M NaCl、10mM CaCl2(pH6.0))を用いた溶出工程により分離した。溶出工程は、以下の通りであった。10カラム体積のB0%、20カラム体積のB20%、20カラム体積のB40%及び40カラム体積のB100%であった。主な画分をHPLCにより分析し、適切なモノ-、ジ-及びマルチHEP化形態を個別にプールした。モノ-/ジ-及びジ-/マルチHEP化FVIIaを含有する画分を、個別のHEP化形態の収率を最大限にするために、記載される通り2回目の陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。純粋な単離したものを合わせ、カットオフが10kDのSlide-A-Lyzerカセット(Thermo Scientific社)を用いて10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)に対して透析した。このやり方において、21kDa-HEP-[N]-FVIIa10.97mg及び2×21kDa-HEP-[N]-FVIIa4.68mgを単離することができた。
【０２７０】
(実施例22)
4-メチルベンゾイル連結による41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293Kの合成
この材料をFVIIa L288F T293K(32mg)を用いて調製した。タンパク質を、実施例15に記載されている通り最初に脱シアリル化し、次いで、実施例20に記載されているものと同じ手順を用いて41.5kDa HEP-GSC(42.0mg)及びST3GalIIIと反応させた。41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293K8.96mg(28%)を、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)で得た。未反応のFVIIa L288F T293K突然変異を、追加の6.34mgのコンジュゲートを生成する第2の周期にかけた。
【０２７１】
(実施例23)
4-メチルベンゾイル連結による41.5kDa HEP-[N]-FVIIa W201 T293Kの合成
この材料を、実施例15に記載されているFVIIa W201R T293K(40mg)突然変異の最初の脱シアリル化により調製した。したがって、得られたアシアロFVIIa W201R T293K突然変異(27.2mg)を、実施例20に記載されているものと同じ手順を用いて41.5kDa HEP-GSC(30.0mg)及びST3GalIIIと反応させた。41.5kDa HEP-[N]-FVIIa W201 T293K2.9mg(7.5%)を、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)で得た。
【０２７２】
(実施例24)
4-メチルベンゾイル連結による41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337Aの合成
この材料を、実施例15に記載されている脱シアリル化によりFVIIa L288F T293K K337A(18.8mg)から調製し、その後、41.5kDa HEP-GSC(30.0mg)及びST3GalIIIによる反応により調製した。生成物を、一般に、実施例20に記載されている通り、親和性クロマトグラフィー、それに続く陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。41.5kDa HEP-[N]-FVIIa L288F T293K K337A(3.35mg)を、10mM His、100mM NaCl、10mM CaCl2(pH6.0)で得た。
【０２７３】
(実施例25)
4-メチルベンゾイル連結によるノイラミン酸シチジン一リン酸に基づいた41.5kDa HEPコンジュゲートの合成
【０２７４】
【化２１】
2017507133.tif 000024
【０２７５】
ノイラミン酸シチジン一リン酸を、Eur.J.Org.Chem.2000年、1467〜1482頁に記載されている通り生成する。GSCをノイラミン酸シチジン一リン酸と置き換えて、実施例17に記載されている通りHEP-アルデヒドによる反応を行う。したがって、ノイラミン酸シチジン一リン酸(32μmol)を、50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2緩衝液、pH7.0緩衝液に溶解し、乾燥41.5kDa HEP-ベンズアルデヒド(2.5μmol)に直接加える。HEP-ベンズアルデヒドがすべて溶解するまで、混合物を静かに回転させる。その後2時間の間、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのMilliQ水1M溶液を、分量毎に加えて、最終濃度48mMにする。次いで、過量のノイラミン酸シチジン一リン酸を、実施例17に記載されている通り、透析により除去する。内部チャンバーからノイラミン酸シチジン一リン酸が完全に除去されていることを、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び参照としてノイラミン酸シチジン一リン酸を用いた水アセトニトリル系(30分にわたる0.1%リン酸を含有するアセトニトリル0〜85%の線形の勾配)を用いたHPLCにより検証する。次いで、内部チャンバーの材料を収集し、冷凍乾燥する。この手順により作製された試薬は、4-メチルベンゾイル連結によってシアル酸シチジン一リン酸に結合されているHEPポリマーを含み、アシアロFVIIa糖タンパク質への糖コンジュゲーションに適している。
【０２７６】
(実施例26)
4-メチルベンゾイル連結による9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸に基づいたHEPコンジュゲートの合成
【０２７７】
【化２２】
2017507133.tif 000025
【０２７８】
9-デオキシ-アミノN-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸を、Eur.J.Biochem 168巻、594〜602頁(1987年)に記載されている通り生成する。GSCを9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸と置き換えて、実施例17に記載されている通りHEP-アルデヒドによる反応を行う。9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸(32μmol)を、50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2緩衝液、pH7.0緩衝液に溶解し、乾燥41.5kDa HEP-ベンズアルデヒド(2.5μmol)に直接加える。HEP-ベンズアルデヒドがすべて溶解するまで、混合物を静かに回転させる。その後2時間の間、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのMilliQ水1M溶液を、分量毎に加えて最終濃度48mMにする。次いで、過量の9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸を、実施例17に記載されている通り透析により除去する。内部チャンバーから9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸が完全に除去されていることを、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び参照として9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸を用いた水アセトニトリル系(30分にわたる0.1%リン酸を含有するアセトニトリル0〜85%の線形の勾配)のHPLCにより検証する。内部チャンバーの材料を収集し、冷凍乾燥する。この手順により作製された試薬は、4-メチルベンゾイル連結によってシアル酸シチジン一リン酸に結合されているHEPポリマーを含み、アシアロFVIIa糖タンパク質への糖コンジュゲーションに適している。
【０２７９】
(実施例27)
4-メチルベンゾイル連結による2-ケト-3-デオキシ-ノン酸シチジン一リン酸に基づいたHEPコンジュゲートの合成
【０２８０】
【化２３】
2017507133.tif 000026
【０２８１】
実施例19及び20に示されるものと類似のやり方で、HEP-シアル酸シチジン一リン酸試薬は、シアル酸KDNから開始して作製することができる。9位の最初のアミノ誘導体化を、Eur.J.Org.Chem.2000年、1467〜1482頁に記載されている通り行う。GSCを9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシ-ノン酸シチジン一リン酸と置き換えて、実施例17に記載されている通りHEP-アルデヒドによる反応を行う。9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシ-ノン酸シチジン一リン酸(32μmol)を、50mMヘペス、100mM NaCl、10mM CaCl2緩衝液、pH7.0緩衝液に溶解し、乾燥41.5kDa HEP-ベンズアルデヒド(2.5μmol)に直接加える。HEP-ベンズアルデヒドがすべて溶解するまで、混合物を静かに回転させる。その後2時間の間、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのMilliQ水1M溶液を、分量毎に加えて最終濃度48mMにする。過量の9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシ-ノン酸シチジン一リン酸を、実施例17に記載されている通り透析により除去する。内部チャンバーから9-アミノ-9-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸シチジン一リン酸が完全に除去されていることを、Waters X-Bridgeフェニルカラム(4.6mm×250mm、5μm)及び参照として9-アミノ-9-デオキシ-2-ケト-3-デオキシ-ノン酸シチジン一リン酸を用いた水アセトニトリル系(30分にわたる0.1%リン酸を含有するアセトニトリル0〜85%の線形の勾配)のHPLCにより検証する。内部チャンバーの材料を収集し、冷凍乾燥する。この手順により作製された試薬は、4-メチルベンゾイル連結によってシアル酸シチジン一リン酸に結合されているHEPポリマーを含有し、アシアロFVIIa糖タンパク質への糖コンジュゲーションに適している。
【０２８２】
(実施例28)
スプラーグドーリーラットにおける薬物動態の評価
HEP-FVIIaコンジュゲートを、10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80 80(pH6.0)に配合した。スプラーグドーリーラット(1群当たり3匹から6匹)に、試験化合物20nmol/kgを静脈内に投与した。Stabylite(商標)(TriniLize Stabylite Tubes;Tcoag Ireland Ltd社、Ireland)によって安定化させた血漿試料を、適切な時点で完全なプロファイルとして収集し、更に分析するまで凍結した。血漿試料を、市販のFVIIa特異的凝固アッセイを用いてFVIIa血餅活性レベルについて分析し;Diagnostica Stago社製のSTACLOT(登録商標)VIIa-rTF及び血漿中の抗原濃度を、LOCI技術を用いて決定した。薬物動態分析を、Phoenix WinNonlin 6.0(Pharsight Corporation社)を用いた非区画方法により行った。選択されたパラメータを表2に示す。
【０２８３】
【表２】
2017507133.tif 000027
【０２８４】
40kDa HEP-[N]-FVIIa及び40kDa PEG-[N]-FVIIaについてのPK-プロファイル(LOCI及びFVIIa:血餅)を、図12及び図13に示す。
【０２８５】
(実施例29)
血漿分析
ラット血漿における65kDa HEP-FVIIa 407CコンジュゲートのFVIIa凝固活性レベルを、市販のFVIIa特異的凝固アッセイ;Diagnostica Stago社製のSTACLOT(登録商標)VIIa-rTFを用いて推定した。本アッセイは、J.H.Morrisseyら、Blood.81巻:734〜744頁(1993年)によって発表された方法に基づいている。本アッセイは、リン脂質の存在下でFVII欠乏血漿のフィブリン血餅形成のためのsTFによって開始されるFVIIa活性依存時間を測定する。試料を、希釈された試料と同じ基質(等量対等量)でFVIIa検量線に対してACL9000凝固装置において測定した。定量(LLOQ)の下限を0.25U/mlと推定した。
【０２８６】
システインによってコンジュゲートされている13kDa-、27kDa-、40kDa-、52kDa-、60kDa-、65kDa-、108kDa-、157kDa-HEP-[C]-FVIIa407C、糖コンジュゲート52kDa-HEP-[N]-FVIIaと参照分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa及び40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)間の比較分析を図3に示す。血漿分析から、ヘパロサンによってコンジュゲートされているFVIIa類似体は、PEG-FVIIa参照分子と類似である又はPEG-FVIIa参照分子よりも高い活性であることが判明している。
【０２８７】
(実施例30)
基質として血漿由来第X因子を用いたタンパク質分解活性
HEP-FVIIaコンジュゲートのタンパク質分解活性を、基質として血漿由来第X因子(FX)を用いて推定した。すべてのタンパク質を、50mMヘペス(pH7.4)、100mM NaCl、10mM CaCl2、1mg/mL BSA、及び0.1%(w/v)PEG8000で希釈した。FX活性化についての動力学的パラメータを、25μM PC:PSリン脂質(Haematologic technologies社)の存在下で96穴プレート(n=2)中で、全反応容積100μLで室温で30分間40nM FXを含む各FVIIaコンジュゲート10nMをインキュベートすることにより決定した。可溶性組織因子(sTF)の存在下におけるFX活性化を、25μM PC:PSリン脂質の存在下で、全反応容積100μL(n=2)で20分間室温で30nM FXを含む各FVIIaコンジュゲート5pMをインキュベートすることにより決定した。インキュベーション後、反応を、停止緩衝液50μL[50mMヘペス(pH7.4)、100mM NaCl、80mM EDTA]を加え、その後、2mM発色ペプチドS-2765(Chromogenix社)50μLを加えることにより急冷した。最後に、吸収度の増加を、Spectramax 190マイクロプレートリーダーにおいて405nmで連続的に測定した。直線回帰を用いたミハエリス-メンテンの式([S]<Km)の改訂した形態にデータを適合させることにより、触媒効率(kcat/Km)を決定した。生成されたFXaの量を、FXa検量線から推定した。
【０２８８】
13kDa、27kDa、40kDa、60kDa、65kDa、108kDa、157kDa-HEP-FVIIa 407Cと参照分子(40kDa-PEG-[N]-FVIIa及び40kDa-PEG-[C]-FVIIa407C)間の比較分析を、図4に示す。
【０２８９】
驚くべきことに、ヘパロサンによってコンジュゲートされたFVIIa類似体すべてが、FX活性化アッセイにおいてPEG-FVIIa対照より活性があることが判明している。いくつかの類似体(例えば、40kDa-HEP-FVIIa407C)の場合、活性は、対応する40kDa-PEG類似体の場合よりも2倍近く高い。
【０２９０】
(実施例31)
スプラーグドーリーラットにおける薬物動態の評価
HEP-FVIIaコンジュゲートを、10mMヒスチジン、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.01% Tween80(pH6.0)に配合した。スプラーグドーリーラット(1群当たり3匹から6匹)に、試験化合物20nmol/kgを静脈内に投与した。Stabylite(商標)(TriniLize Stabylite Tubes;Tcoag Ireland Ltd社、Ireland)によって安定化させた血漿試料を、適切な時点で完全なプロファイルとして収集し、更に分析するまで凍結した。血漿試料を、市販のFVIIa特異的凝固アッセイを用いてFVIIa血餅活性レベルについて分析し;Diagnostica Stago社製のSTACLOT(登録商標)VIIa-rTF及び血漿中の抗原濃度を、LOCI技術を用いて決定した。
【０２９１】
薬物動態分析を、Phoenix WinNonlin 6.0(Pharsight Corporation社)を用いた非区画方法により行った。次のパラメータ、すなわち、FVIIa-アンチトロンビン複合体のCmax(最高血中濃度)、並びに血餅活性についてのT1/2(機能性最終半減期)及びMRT(平均滞留時間)を推定した。PK-プロファイル(LOCI及びFVIIa:血餅)を図5及び図6に示す。
【０２９２】
非区画分析方法から得られた通り、すべてのLOCIに基づいた平均滞留時間のプロットを図7に示す。
【０２９３】
直線の相関によって、HEP-サイズとMRTとの間でおよそ13〜40kDaサイズの範囲であることが示された。プラトーは、HEP-サイズおよそ40kDaに及びそれ以上に達する。
【０２９４】
実施形態
本発明は、次の限定しない実施形態によって更に記載される。
一実施形態では、コンジュゲートは、FVIIポリペプチド及びヘパロサンポリマーを含む。
一実施形態では、ヘパロサンポリマーは、質量が5kDaから200kDaまでの間である。
一実施形態では、ヘパロサンポリマーは、多分散インデックス(Mw/Mn)が1.10未満である。
一実施形態では、ヘパロサンポリマーは、多分散インデックス(Mw/Mn)が1.07未満である。
一実施形態では、ヘパロサンポリマーは、多分散インデックス(Mw/Mn)が1.05未満である。
一実施形態では、FVIIポリペプチドは、サイズが10kDa±5kDaであるヘパロサンポリマーにコンジュゲートされている。
一実施形態では、FVIIポリペプチドは、サイズが20kDa±5kDaであるヘパロサンポリマーにコンジュゲートされている。
一実施形態では、FVIIポリペプチドは、サイズが30kDa±5kDaであるヘパロサンポリマーにコンジュゲートされている。
一実施形態では、FVIIポリペプチドは、サイズが40kDa±5kDaであるヘパロサンポリマーにコンジュゲートされている。
一実施形態では、FVIIポリペプチドは、サイズが50kDa±5kDaであるヘパロサンポリマーにコンジュゲートされている。
一実施形態では、ヘパロサンポリマーは、化学リンカーによって分枝状である。
一実施形態では、前記ヘパロサンポリマーはそれぞれ、サイズが20kDa±3kDaに等しい。
一実施形態では、前記ヘパロサンポリマーはそれぞれ、サイズが30kDa±5kDaに等しい。
一実施形態では、ヘパロサンポリマーは、N-グリカンによってFVIIポリペプチドに抱コンジュゲートされている。
一実施形態では、145位及び322位の2つのN-グリカンのうちの1つを、PNGase F処理によって除去し、残りのN-グリカンにヘパロサンをカップリングさせる。
他の実施形態では、ヘパロサンポリマーは、FVIIa上でシアル酸部分によっコンジュゲートされている。
一実施形態では、ヘパロサンは、単一の表面露出システイン残基によってFVIIポリペプチド突然変異にカップリングさせる。
一実施形態では、ヘパロサンポリマーは、4-メチルベンゾイル-GSCを含む化学リンカーを用いてFVIIに連結される。
一実施形態では、ヘパロサンポリマーは、FVII上でグリカンに連結される。
一実施形態では、ベンズアルデヒド部分は、GSC化合物に結合され、それによって、アミン基で官能化されたヘパロサンポリマーへのコンジュゲーションに適したGSC-ベンズアルデヒド化合物をもたらす(図8を参照のこと)。
一実施形態では、4-ホルミル安息香酸を、ヘパロサンに化学的にカップリングさせ、続いて、還元的アミノ化によってGSCにカップリングさせる(図9を参照のこと)。
好ましい実施形態において、本発明は、4-メチルベンゾイル部分が連結構造の一部である、GSCに基づいたコンジュゲーションを提供する(図11を参照のこと)。
一実施形態では、反応性アミンを含むヘパロサンは、ベンズアルデヒド部分で官能化されたGSC化合物にコンジュゲートされ、前記アミンは、ベンズアルデヒドと反応して、ヘパロサンとGSCとの間の(サブ)リンカーを生成し、これは4-メチルベンゾイルのサブ連結(sublinking)部分を含む。
他の実施形態では、反応性ベンズアルデヒドを含むヘパロサンは、GSC化合物のグリシルアミン部分にコンジュゲートされ、前記ベンズアルデヒドは、アミンと反応して、ヘパロサンとGSCとの間の(サブ)リンカーを生成し、これは、4-メチルベンゾイルのサブ連結部分を含む。
一実施形態では、ヘパロサンとGSCとのコンジュゲートを、FVIIで更にコンジュゲートさせて、コンジュゲートを生成し、ヘパロサンは、4-メチルベンゾイルのサブ連結部分及びシアル酸誘導体によってFVIIに連結する。
本発明の一実施形態では、ヘパロサンポリマーは、4-メチルベンゾイル-GSCに基づいたコンジュゲーションを用いてFVIIにコンジュゲートされる。
一実施形態では、アミノ基を含むヘパロサンポリマー部分を、4-ホルミル安息香酸と反応させ、続いて、還元的アミノ化によってGSCのグリシルアミノ基にカップリングさせる。
一実施形態では、WO07056191に記載されている化学酵素的経路によって調製されたGSCを、還元条件下でベンズアルデヒド部分を含むヘパロサンポリマー部分と反応させる。
一実施形態では、GSCへのカップリングに適した様々なヘパロサン-ベンズアルデヒド化合物を提供する。
一実施形態では、ヘパロサンとGSCとの間のサブリンカーは、立体異性体も位置異性体も形成することができない。
一実施形態では、ヘパロサンとGSCとの間のサブリンカーは、立体異性体も位置異性体も形成することができず、したがって、ヒトにおける免疫応答をもたらす可能性がより低い。
一実施形態では、ヘパロサン-GSCを、FVII N-グリカンHEPコンジュゲートを調製するために用いる。一実施形態では、ヘパロサン-GSCを、ST3GalIIIを用いてFVII N-グリカンヘパロサンコンジュゲートを調製するために用いる。
一実施形態では、HEP-GSCを、ST3GalIを用いてFVII O-グリカンHEPコンジュゲートを調製するために用いる。
一実施形態では、本発明において用いられるCMPによって活性化されたシアル酸誘導体は、以下の構造
【０２９５】
【化２４】
2017507133.tif 000028
【０２９６】
[式中、R1は、-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPrから選択され、R2、R3、R4、R5、R6及びR7は独立に、-H、-NH2、-SH、-N3、-OH、-Fから選択することができる]
によって表される。
【０２９７】
好ましい実施形態において、R1は、-COOHであり、R2は、-Hであり、R3=R5=R6=R7=-OHであり、R4は、グリシルアミド基(-NHC(O)CH2NH2)である。
【０２９８】
好ましい実施形態において、CMPによって活性化されたシアル酸は、以下の構造を有するGSCである。
【０２９９】
【化２５】
2017507133.tif 000029
【０３００】
一実施形態では、末端アミンを有するHEPを製造するための高収率の方法を開示している。
【０３０１】
一実施形態では、第VII因子ポリペプチドは、ヒト第VII因子のアミノ酸配列(配列ID NO:1)に対して2つ以上の置換を含む第VII因子変異体であり、T293は、Lys(K)、Arg(R)、Tyr(Y)又はPhe(F)によっており;L288は、Phe(F)、Tyr(Y)、Asn(N)、Ala(A)又はTrp Wによって置き換えられており、且つ/又はW201は、Arg(R)、Met(M)又はLys(K)によって置き換えられており、且つ/又はK337は、Ala(A)又はGly(G)によって置き換えられている。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、T293のLys(K)との置換及びL288のPhe(F)との置換を含むことができる。第VII因子ポリペプチドは、T293のLys(K)との置換及びL288のTyr(Y)との置換を含むことができる。第VII因子ポリペプチドは、T293のArg(R)との置換及びL288のPhe(F)との置換を含むことができる。第VII因子ポリペプチドは、T293のArg(R)との置換及びL288のTyr(Y)との置換を含むことができる。第VII因子ポリペプチドは、K337のAla(A)との置換を含むことができる、又はK337のAla(A)との置換を更に含むことができる。第VII因子ポリペプチドは、T293のLys(K)との置換及びW201のArg(R)との置換を含むことができる。
【０３０３】
本発明は、実施形態の次の限定しないリストによって更に記載される。
【０３０４】
1.第VII因子ポリペプチド、連結部分、及びヘパロサンポリマーを含むコンジュゲートであって、第VII因子ポリペプチドとヘパロサンポリマーとの間の連結部分が、Xを次の通り
[ヘパロサンポリマー]-[X]-[第VII因子ポリペプチド]
[式中、
Xは、以下の式E1
【０３０５】
【化２６】
2017507133.tif 000030
【０３０６】
による部分に連結されたシアル酸誘導体を含む]
を含むコンジュゲートである。
2.シアル酸誘導体が、以下の式E2
【０３０７】
【化２７】
2017507133.tif 000031
【０３０８】
[式中、R1の位置にある基は、-COOH、-CONH2、-COOMe、-COOEt、-COOPrを含む基から選択され、R2、R3、R4、R5、R6及びR7の位置にある基は、-H、-NH-、-NH2、-SH、-N3、-OH、-F又は-NHC(O)CH2NH-を含む基から独立に選択される]
によるシアル酸誘導体である、実施形態1に記載のコンジュゲート。
3.シアル酸誘導体が、以下の式E3
【０３０９】
【化２８】
2017507133.tif 000032
【０３１０】
によるグリシルシアル酸であり、式1の部分が、式E3の末端の-NH基（-NHハンドル）に連結されている、実施形態2に記載のコンジュゲート。
4.[ヘパロサンポリマー]-[X]-
が、以下の式E4
【０３１１】
【化２９】
2017507133.tif 000033
【０３１２】
[式中、nは、5から450までの整数である]
に示される構造上の断片を含む、実施形態1、2又は3に記載のコンジュゲート。
5.ヘパロサンポリマー分子量が、5〜100又は13〜60kDaの範囲である、実施形態1から4のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
6.ヘパロサンポリマー分子量が、27〜45kDaの範囲である、実施形態5によるコンジュゲート。
7.実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
8.aPTTに基づいたアッセイにおいてアッセイ間の変動を減少させるための、血液凝固因子にコンジュゲートされているヘパロサンポリマーの使用。
9.血液凝固因子が第VII因子である、実施形態8に記載の方法。
10.医薬品としての使用のための実施形態1〜6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
11.凝固障害の治療における使用のための実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
12.血友病の治療における使用のための実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
13.血友病患者の予防的治療における使用のための実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
14.ヘパロサンポリマーサイズが、5〜100kDaの範囲である、血友病の治療における使用のための実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
15.ヘパロサンポリマーサイズが、60kDaまでの範囲である、血友病の治療における使用のための実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
16.ヘパロサンポリマーサイズが、27〜40kDaの範囲である、血友病の治療における使用のための、実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
17.凝固障害を伴う対象に、実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与する工程を含む、前記対象を治療する方法。
18.ヘパロサンポリマー分子量が、13〜60kDaの範囲である、医薬品としての使用のための、実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
19.ヘパロサンポリマー分子量が、5〜100kDaの範囲である、凝固障害の治療における使用のための医薬品の製造のための、実施形態1から6のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
20.ヘパロサンポリマー分子量が、13〜60kDaの範囲である、凝固障害の治療における使用のための医薬品の製造のための、実施形態19に記載のコンジュゲートの使用。
21.ヘパロサンポリマー分子量が、27〜40kDaの範囲である、凝固障害の治療における使用のための医薬品の製造のための、実施形態20に記載のコンジュゲートの使用。
22.凝固障害が血友病である、実施形態19から21のいずれか一項に記載の使用。
23.凝固障害が血友病A又はBである、実施形態22に記載の方法。
24.第VII因子ポリペプチド及びヘパロサンポリマーを含むコンジュゲートであって、ヘパロサンポリマーが、5〜150kDaの範囲の分子量であるコンジュゲート。
25.ヘパロサンポリマー質量が、13〜60kDaである、実施形態24に記載のコンジュゲート。
26.ヘパロサンポリマー質量が、27〜40kDaである、実施形態25に記載のコンジュゲート。
27.ヘパロサンポリマー質量が、40〜60kDaである、実施形態26に記載のコンジュゲート。
28.反応性アミンを有する半減期延長部分を、反応性アミンを有するGSC部分に連結する方法であって、半減期延長部分における反応性アミンを、最初に、活性化された4-ホルミル安息香酸と反応させて、式E5
【０３１３】
【化３０】
2017507133.tif 000034
【０３１４】
の化合物を生成し、
続いて、還元条件下でGSC部分と反応させて、式E6
【０３１５】
【化３１】
2017507133.tif 000035
【０３１６】
による化合物を生成する方法。
29.反応性アミンを有する半減期延長部分を、反応性アミンを有するGSC部分に連結させる方法であって、GSC部分における反応性アミンを、最初に、活性化された4-ホルミル安息香酸と反応させて、式E7
【０３１７】
【化３２】
2017507133.tif 000036
【０３１８】
による化合物を生成し、続いて、還元条件下で半減期延長部分において反応性アミンと反応させて、式E8
【０３１９】
【化３３】
2017507133.tif 000037
【０３２０】
による化合物を生成する方法。
30.半減期延長部分が、ヘパロサンポリマーである、実施形態28又は29に記載の方法。
31.4-ホルミルベンゾイル基(A)
【０３２１】
【化３４】
2017507133.tif 000038
【０３２２】
で修飾されたヘパロサンポリマーが、
還元剤の存在下でGSC(B)
【０３２３】
【化３５】
2017507133.tif 000039
【０３２４】
と反応して、
コンジュゲート(C)
【０３２５】
【化３６】
2017507133.tif 000040
【０３２６】
[式中、n=5〜450である]
を生成する、実施形態28に記載の方法。
32.その後の工程を更に含み、GSCにコンジュゲートさせた半減期延長部分を、第VII因子に酵素的にコンジュゲートさせて、コンジュゲートを生成し、前記半減期延長部分を、4-メチルベンゾイルサブリンカーを含む及びGSCのシチジン一リン酸基が欠けているリンカーによってタンパク質に結合させる、実施形態28から31のいずれか一項に記載の方法。
33.実施形態28から32のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる生成物。
【図１ａ】
2017507133.tif 000046
【図１ｂ】
2017507133.tif 000047
【図２ａ】
2017507133.tif 000048
【図２ｂ】
2017507133.tif 000049
【図３】
2017507133.tif 000050
【図４】
2017507133.tif 000051
【図５】
2017507133.tif 000052
【図６】
2017507133.tif 000053
【図７】
2017507133.tif 000054
【図８】
2017507133.tif 000055
【図９】
2017507133.tif 000056
【図１０】
2017507133.tif 000057
【図１１】
2017507133.tif 000058
【図１２】
2017507133.tif 000059
【図１３】
2017507133.tif 000060
【図１４】
2017507133.tif 000061
【配列表】
2017507133000001.app
【国際調査報告】
2017507133.tif 000062
2017507133.tif 000063
2017507133.tif 000064