(57)【要約】
2017509700.tif 000254Ｉ塩を含む式Ｉの化合物、並びに組成物、および当該化合物の使用方法が明記されている。当該化合物はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する活性を有し、またＨＣＶ感染者を治療するのに有用であり得る：（Ｉ）
2017509700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容される塩を含む式Ｉ：
【化１】
2017509700.tif 000207
Ｉ
［式中、
Ｚは、Ｃ−Ｒ５またはＮであり；
Ｒ０は、水素であり；
Ｒ１は、メチルであり；
Ｒ２は、独立して、０〜２のハロまたはメトキシで置換されているか、またはＷ−Ａｒでパラ置換されているフェニルであり；
Ｗは、−Ｏ−または-ＮＨ−であり；
Ａｒは、フェニルまたはパラ−ハロフェニルであり；
Ｒ３は、水素、フルオロまたはクロロであり；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立して、水素、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシおよび過重水素化アルコキシの群から選ばれ；
Ｒ７ａ、Ｒ７ｂは、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキルおよびＡｒ１の群から選ばれるか、または
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、一緒になって３〜７員炭素環式環を形成し；
Ｒ８は、水素であり、
Ａｒ１は、フェニル、５員ヘテロ芳香環または６員ヘテロ芳香環であり；
Ｒ９は、水素、ハロ、Ｒ２０１、ＯＲ２０２、ＮＲ２０３Ｒ２０４であり；
Ｒ２０１は、アルキル、アルケニル、または１〜全ての水素がフルオロに置き換えられたＣ１−Ｃ４アルキルであり；
Ｒ２０２は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、または１〜全ての水素がフルオロに置き換えられたＣ１−Ｃ３アルキルであり；
Ｒ２０３は、水素であり；
Ｒ２０４は、Ｃ１−Ｃ３アルキルまたはＣ１−Ｃ３ヒドロキシアルキルであるか、あるいは１〜全ての水素がフルオロに置き換えられたＣ１−Ｃ３アルキルである］
の化合物。
【請求項２】
Ｒ２がパラ−フルオロフェニルであり、Ｒ３が水素であり、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が、それぞれ独立して、水素、フルオロ、−ＯＣＨ３および−ＯＣＤ３から選ばれ、
Ｒ７ａが水素、メチル、フルオロメチルおよびシクロプロピルの群から選ばれ、
Ｒ７ｂが水素、メチル、フルオロメチル、シクロプロピルおよびＡｒ１の群から選ばれるか、
あるいはＲ７ａおよびＲ７ｂは、一緒になってシクロプロピルまたはシクロブチル環を形成し；
Ａｒ１がフェニルまたはピリミジルであり；
Ｒ９がＲ２０１またはＮＲ２０３Ｒ２０４であり；
Ｒ２０１が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３またはビニルであり；
Ｒ２０４が−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ３または−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである、
請求項１の化合物。
【請求項３】
Ｒ４が水素であり、Ｒ５が水素またはフルオロであり、Ｒ７ｂが水素、メチル、フルオロメチルおよびシクロプロピルの群から選ばれるか、
あるいはＲ７ａおよびＲ７ｂが一緒になってシクロプロピルまたはシクロブチル環を形成し；
Ｒ２０１が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３である、
請求項２の化合物。
【請求項４】
ＺがＮである、請求項２の化合物。
【請求項５】
ＺがＣＲ５である、請求項２の化合物。
【請求項６】
Ｒ４が水素であり、Ｒ６が−ＯＣＤ３である、請求項４の化合物。
【請求項７】
Ｒ４が水素であり、Ｒ５が水素またはフルオロであり、Ｒ６が水素、フルオロまたは−ＯＣＨ３であり、Ｒ７ａが水素、メチル、フルオロメチルおよびシクロプロピルの群から選ばれ、Ｒ７ｂが水素、メチル、フルオロメチルまたはシクロプロピルから選ばれるか、あるいはＲ７ａおよびＲ７ｂが一緒になってシクロプロピルまたはシクロブチル環を形成し；
Ｒ２０１が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３である、
請求項１の化合物。
【請求項８】
Ｒ５が水素であり、Ｒ６がフルオロであり、Ｒ７ａがメチルであり、Ｒ７ｂがシクロプロピルであり、Ｒ９がＲ２０１である、請求項７の化合物。
【請求項９】
単一のエナンチオマー（Ｒ）−５−（３−（（１−シアノ−１−シクロプロピルエチル）カルバモイル）−４−フルオロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−６−（３，３，３−トリフルオロプロピル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボキサミドとして存在する化合物。
【請求項１０】
単一のエナンチオマー（Ｓ）−５−（３−（（１−シアノ−１−シクロプロピルエチル）カルバモイル）−４−フルオロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−６−（３，３，３−トリフルオロプロピル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボキサミドとして存在する化合物。
【請求項１１】
旋光度を旋光計で標準法により測定するとマイナスの回転を示す単一のエナンチオマーとして存在する、請求項９または請求項１０の化合物。
【請求項１２】
以下の群から選ばれる、医薬的に許容される塩を含む化合物：
【化２】
2017509700.tif 000208
【化３】
2017509700.tif 000209
【化４】
2017509700.tif 000210
【化５】
2017509700.tif 000211
【化６】
2017509700.tif 000212
【化７】
2017509700.tif 000213
【化８】
2017509700.tif 000214
【化９】
2017509700.tif 000215
【化１０】
2017509700.tif 000216
【化１１】
2017509700.tif 000217
【化１２】
2017509700.tif 000218
【化１３】
2017509700.tif 000219
【化１４】
2017509700.tif 000220
【化１５】
2017509700.tif 000221
【化１６】
2017509700.tif 000222
【請求項１３】
以下の群から選ばれる、医薬的に許容される塩を含む化合物：
【化１７】
2017509700.tif 000223
【化１８】
2017509700.tif 000224
【化１９】
2017509700.tif 000225
【化２０】
2017509700.tif 000226
【化２１】
2017509700.tif 000227
【化２２】
2017509700.tif 000228
【化２３】
2017509700.tif 000229
【化２４】
2017509700.tif 000230
【化２５】
2017509700.tif 000231
【請求項１４】
以下の群から選ばれる、医薬的に許容される塩を含む化合物：
【化２６】
2017509700.tif 000232
【化２７】
2017509700.tif 000233
【化２８】
2017509700.tif 000234
【化２９】
2017509700.tif 000235
【化３０】
2017509700.tif 000236
【化３１】
2017509700.tif 000237
【化３２】
2017509700.tif 000238
【化３３】
2017509700.tif 000239
【化３４】
2017509700.tif 000240
【化３５】
2017509700.tif 000241
【化３６】
2017509700.tif 000242
【化３７】
2017509700.tif 000243
【化３８】
2017509700.tif 000244
【請求項１５】
以下の群から選ばれる、医薬的に許容される塩を含む化合物：
【化３９】
2017509700.tif 000245
【化４０】
2017509700.tif 000246
【化４１】
2017509700.tif 000247
【化４２】
2017509700.tif 000248
【化４３】
2017509700.tif 000249
【化４４】
2017509700.tif 000250
【請求項１６】
以下の群から選ばれる、医薬的に許容される塩を含む化合物：
【化４５】
2017509700.tif 000251
【化４６】
2017509700.tif 000252
【請求項１７】
以下の群から選ばれる、医薬的に許容される塩を含む化合物：
【化４７】
2017509700.tif 000253
【請求項１８】
請求項１の化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む組成物。
【請求項１９】
請求項３の化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む組成物。
【請求項２０】
請求項１２の化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む組成物。
【請求項２１】
請求項１６の化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む組成物。
【請求項２２】
請求項８の化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む組成物。
【請求項２３】
請求項１７の化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む組成物。
【請求項２４】
患者に、治療的有効量の請求項１の化合物を投与することを特徴とする、Ｃ型肝炎感染の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／９６８，７６３号の利益を主張するものであり、当該仮出願の全体は参照により本明細書に引用される。
【０００２】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対して活性を持ち、ＨＣＶ感染者を治療するのに有用な、塩を含む新規化合物に関する。本発明は、組成物、並びにこれらの化合物の製造および使用方法にも関する。
【０００３】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は主要なヒト病原体であり、世界中で推定１億７０００万人−ヒト免疫不全ウイルス１型感染数のおよそ５倍−に感染している。これらＨＣＶに感染した個体のかなりの割合が、重篤な肝硬変および肝細胞がんを含む進行性肝疾患を発症する（Lauer, G. M.; Walker, B. D. N. Engl. J. Med. 2001, 345, 41-52）。
【０００４】
ＨＣＶはプラス鎖ＲＮＡウイルスである。推定アミノ酸配列の比較、および５’−非翻訳領域における広範な類似性に基づいて、ＨＣＶはフラビウイルス科内の独立した属に分類されている。フラビウイルス科の全てのメンバーは、単一の途切れのないオープン・リーディング・フレームを翻訳することにより既知の全てのウイルス特異的タンパク質をコードするプラス鎖ＲＮＡゲノムを含むエンベロープビリオンを有する。
【０００５】
ＨＣＶゲノム全体にわたって、ヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列内にかなりの多様性が見られる。少なくとも６つの主要な遺伝子型が特徴付けられ、５０を上回るサブタイプが記載されている。ＨＣＶの主要な遺伝子型は世界的な分布が異なり、遺伝子型が病因および治療に及ぼす可能な影響について多数の研究がなされているにも関わらず、ＨＣＶの遺伝的多様性の臨床的な意義は、理解しにくいままである。
【０００６】
一本鎖ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムは長さが約９５００ヌクレオチドであり、約３０００アミノ酸の単一の巨大ポリタンパク質をコードする、単一のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を有する。感染細胞内では、このポリタンパク質は、細胞およびウイルスプロテアーゼにより複数の部位で切断され、構造および非構造（ＮＳ）タンパク質を産生する。ＨＣＶの場合、成熟非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ）の生成は、２つのウイルスプロテアーゼによりもたらされる。１つ目のものはメタロプロテアーゼであると考えられており、ＮＳ２−ＮＳ３接合部で切断する；２つ目のものは、ＮＳ３のＮ末端領域（ＮＳ３プロテアーゼとも称される）内に含まれるセリンプロテアーゼであり、それに続くＮＳ３の下流の全ての切断を、シス（ＮＳ３−ＮＳ４Ａ切断部位）とトランス（残りのＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ部位）の両方で仲介する。ＮＳ４Ａタンパク質は複数の機能を果たすように見え、ＮＳ３プロテアーゼの補因子として働き、ことによるとＮＳ３および他のウイルスレプリカーゼ構成要素の膜局在を補助する可能性がある。ＮＳ３タンパク質とＮＳ４Ａが複合体を形成することはプロセシング事象に必要なようであり、全ての部位でタンパク質分解効率を増強する。ＮＳ３タンパク質は、ヌクレオシドトリホスファターゼおよびＲＮＡヘリカーゼ活性も示す。ＮＳ５Ｂ（ＨＣＶポリメラーゼとも称される）は、ＨＣＶの複製に関与するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂタンパク質は、「Structural Analysis of the Hepatitis C Virus RNA Polymerase in Complex with Ribonucleotides」（Bressanelli; S. et al., Journal of Virology 2002, 3482-3492;およびDefrancesco and Rice, Clinics in Liver Disease 2003, 7, 211-242）に記載されている。
【０００７】
現在のところ、ＨＣＶの最も有効な治療法には、アルファ−インターフェロンおよびリバビリンの組み合わせが用いられており、４０％の患者において持続的な効能をもたらしている（Poynard, T. et al. Lancet 1998, 352, 1426-1432）。最近の臨床結果により、単剤療法として、ペグアルファ−インターフェロンが、修飾されていないアルファ−インターフェロンより優れていることが実証されている（Zeuzem, S. et al. N. Engl. J. Med. 2000, 343, 1666-1672）。しかしながら、ペグアルファ−インターフェロンおよびリバビリンの組み合わせを含む実験的な治療レジメンをもってしても、かなりの割合の患者では、ウイルス負荷は持続的に減少していない。従って、ＨＣＶ感染を治療するための有効な治療法を開発する、明確かつ重大なニーズがある。
【０００８】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ阻害剤ＨＣＶ−７９６は、患者においてＨＣＶ  ＲＮＡレベルを低下させる能力があることが示されている。化合物を単剤として用いて治療した場合、ウイルスＲＮＡレベルは一過的に低下した後、投与中に逆戻りしたが、インターフェロンおよびリバビリンの形態である標準治療と併用した場合、レベルはより確実に低下した。この化合物の開発は、併用レジメンを長期間投与している間に肝毒性が見られたため、一時中断された。米国特許第７，２６５，１５２号および対応するＰＣＴ特許出願ＷＯ  ２００４／０４１２０１には、ＨＣＶ−７９６クラスの化合物が記載されている。他の化合物も開示されており、例えばＷＯ  ２００９／１０１０２２およびＷＯ  ２０１２／０５８１２５を参照のこと。
【０００９】
従って、当該技術分野で必要とされているものは、新規でかつＣ型肝炎に対して有効なさらなる化合物である。加えて、これらの化合物は、例えば、作用機序、結合、阻害効果、標的選択性、溶解性、安全性プロファイルまたはバイオアベイラビリティの１つ以上に関して、医薬用途上の利点をもたらすはずである。新しい製剤およびこれらの化合物を用いる治療方法も必要である。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
発明の概要
本発明のある態様は、医薬的に許容される塩を含む式Ｉ：
【化１】
2017509700.tif 000003
Ｉ
［式中、
Ｚは、Ｃ−Ｒ５またはＮであり；
Ｒ０は、水素であり；
Ｒ１は、メチルであり；
Ｒ２は、独立して、０〜２のハロまたはメトキシで置換されているか、またはＷ−Ａｒでパラ置換されているフェニルであり；
Ｗは、−Ｏ−または-ＮＨ−であり；
Ａｒは、フェニルまたはパラ−ハロフェニルであり；
Ｒ３は、水素、フルオロまたはクロロであり；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立して、水素、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシおよび過重水素化アルコキシの群から選ばれ；
Ｒ７ａ、Ｒ７ｂは、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキルおよびＡｒ１の群から選ばれるか、または
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、一緒になって３〜７員炭素環式環を形成し；
Ｒ８は、水素であり、
Ａｒ１は、フェニル、５員ヘテロ芳香環または６員ヘテロ芳香環であり；
Ｒ９は、水素、ハロ、Ｒ２０１、ＯＲ２０２およびＮＲ２０３Ｒ２０４の群から選ばれ；
Ｒ２０１は、アルキル、アルケニル、または１〜全ての水素がフルオロに置き換えられたＣ１−Ｃ４アルキルであり；
Ｒ２０２は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、または１〜全ての水素がフルオロに置き換えられたＣ１−Ｃ３アルキルであり；
Ｒ２０３は、水素であり；
Ｒ２０４は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３ヒドロキシアルキルであるか、または１〜全ての水素がフルオロに置き換えられたＣ１−Ｃ３アルキルである］
の化合物である。
【００１１】
本発明は、医薬的に許容される塩を含む式Ｉの化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む医薬組成物にも関する。
【００１２】
さらに、本発明は、患者に、治療的有効量の式Ｉの化合物を投与することを特徴とする、Ｃ型肝炎感染の１つ以上の治療方法を提供する。
【００１３】
本発明の一部として、式Ｉの化合物の１つ以上の製造方法も提供する。
【００１４】
本発明は、これら、および以下に記載されている他の重要な目的を対象にしている。
【００１５】
態様の詳細な説明
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別段明確に指示していない限り、複数のものを含む。
【００１６】
本願中の他の部分で別段具体的に明記されない限り、以下の用語が本明細書で用いられることがあり、以下の意味を有するものとする：「水素」または「Ｈ」は、その同位体、例えば重水素を含む水素を指し、重水素は本明細書中で文字「Ｄ」で表されることがある。「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを指す。「アルキル」は、１〜６の炭素から成る直鎖または分岐したアルキル基を指す。「アルケニル」は、２〜６の炭素から成り少なくとも１の二重結合を有する直鎖または分岐したアルキル基を指す。「シクロアルキル」は、３〜７の炭素から成る単環式環系を指す。「ヒドロキシアルキル」、「アルコキシ」、および置換されたアルキル部分を含む他の用語は、アルキル部分が１〜６の炭素原子から成る直鎖および分岐した異性体を含む。「ハロ」は、ハロ、例えば、「ハロアルキル」および「ハロアルコキシ」、「ハロフェニル」、「ハロフェノキシ」で定義される置換基において、モノハロ置換からペルハロ置換まで、ハロゲン化された全ての異性体を含む。「アリール」は、６〜１２の炭素原子を有する単環式または二環式芳香族炭化水素基、あるいは一方または両方の環がフェニル基である二環式縮合環系を指す。二環式縮合環系は、４〜６員芳香族または非芳香族炭素環式環に縮合したフェニル基からなる。アリール基の代表例としては、これらに限定されないが、インダニル、インデニル、ナフチル、フェニルおよびテトラヒドロナフチルが挙げられる。「ヘテロアリール」は、独立して、窒素、酸素および硫黄から選ばれる１〜５のヘテロ原子を有する、５〜７員単環式または８〜１１員二環式芳香環系を指す。括弧および複数の括弧でくくられた用語は、結合関係を当業者に明確にすることを意図している。例えば、（（Ｒ）アルキル）のような用語は、置換基Ｒでさらに置換されているアルキル置換基を指す。化学式により、複数の環系（例えば二環式環系）上の可変の位置で結合するように図示されている置換基は、それらが付いているように描かれている環に結合すること意図している。
【００１７】
本発明は、化合物の医薬的に許容される全ての塩形態を含む。医薬的に許容される塩は、対イオンが化合物の生理学的活性または毒性に有意に寄与せず、またそれ自体が薬理学的均等物として機能するものである。これらの塩は、一般的な有機技術に従って、市販の試薬を用いて製造することができる。陰イオン塩形態の一部としては、酢酸塩、アシストレート（アシストラート）、ベシル酸塩、臭化物、カンシル酸塩、塩化物、クエン酸塩、フマル酸塩、グロコウロネート（ｇｌｕｃｏｕｒｏｎａｔｅ）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびキシノホエート（ｘｉｎｏｆｏａｔｅ）が挙げられる。陽イオン塩形態の一部としては、アンモニウム、アルミニウム、ベンザチン、ビスマス、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、リチウム、マグネシウム、メグルミン、４−フェニルシクロヘキシルアミン、ピペラジン、カリウム、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛が挙げられる。
【００１８】
本発明の化合物の一部は不斉炭素原子を有する。本発明は、エナンチオマーおよびジアステレオマー、並びにラセミ体のような立体異性体の混合物を含む、全ての立体異性体を含む。立体異性体の一部は、当該技術分野で既知の方法を用いて製造することができる。化合物および関連する中間体の立体異性体混合物は、当該技術分野で周知の方法に従って個々の異性体に分離することができる。以下のスキームおよび表中で、分子構造の描写にくさび（ｗｅｄｇｅ）またはハッシュ（ｈａｓｈ）を用いているのは、相対立体化学を示すことのみを意図しており、絶対立体化学の帰属を意味していると解釈されるべきではない。
【００１９】
本発明は、本発明の化合物中に出現する原子の全ての同位体を含むことを意図している。同位体は、原子番号は同じだが質量数が異なる原子を含む。一般的な例としては、これらに限定されないが、水素の同位体は重水素およびトリチウムを含む。炭素の同位体は１３Ｃおよび１４Ｃを含む。同位体で標識された本発明の化合物は、概して、他の方法で用いられる標識されていない試薬の代わりに適当な同位体で標識された試薬を用いて、当業者に既知の従来技術、または本明細書に記載されているものに類似の方法により調製することができる。そのような化合物は、例えば生物学的活性の測定において標準および試薬として、様々な潜在的な用途を有することがある。安定な同位体の場合、そのような化合物は、生物学的特性、薬理学的特性または薬物動態特性を好ましく変える可能性を有することがある。
【００２０】
上記のように、本発明は、１つ以上の医薬的に許容される塩を含む式Ｉ：
【化２】
2017509700.tif 000004
Ｉ
［式中、
Ｚは、Ｃ−Ｒ５またはＮであり；
Ｒ０は、水素であり；
Ｒ１は、メチルであり；
Ｒ２は、独立して、０〜２のハロまたはメトキシで置換されているか、またはＷ−Ａｒでパラ置換されているフェニルであり；
Ｗは、−Ｏ−または-ＮＨ−であり；
Ａｒは、フェニルまたはパラ−ハロフェニルであり；
Ｒ３は、水素、フルオロまたはクロロであり；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立して、水素、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシおよび過重水素化アルコキシの群から選ばれ；
Ｒ７ａ、Ｒ７ｂは、それぞれ独立して、水素、アルキル、シクロアルキルおよびＡｒ１の群から選ばれるか、または
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、一緒になって３〜７員炭素環式環を形成し；
Ｒ８は、水素であり；
Ａｒ１は、フェニル、５員ヘテロ芳香環または６員ヘテロ芳香環であり：
Ｒ９は、水素、ハロ、Ｒ２０１、ＯＲ２０２およびＮＲ２０３Ｒ２０４の群から選ばれ；
Ｒ２０１は、アルキル、アルケニル、または１〜全ての水素がフルオロに置き換えられたＣ１−Ｃ４アルキルであり；
Ｒ２０２は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、または１〜全ての水素がフルオロに置き換えられたＣ１−Ｃ３アルキルであり；
Ｒ２０３は、水素であり；
Ｒ２０４は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３ヒドロキシアルキルであるか、または１〜全ての水素がフルオロに置き換えられたＣ１−Ｃ３アルキルである］
の化合物を対象にしている。
【００２１】
上記の式Ｉの化合物において、Ｒ２がパラ−フルオロフェニルであることは好ましい。
【００２２】
Ｒ３が水素であることも好ましい。
【００２３】
さらに、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が、それぞれ独立して、水素、フルオロ、−ＯＣＨ３および−ＯＣＤ３の群から選ばれることは好ましい。
【００２４】
Ｒ７ａが水素、メチル、フルオロメチルおよびシクロプロピルの群から選ばれることはさらに好ましい。
【００２５】
Ｒ７ｂが水素、メチル、フルオロメチル、シクロプロピルおよびＡｒ１の群から選ばれることも好ましい。
【００２６】
いくつかの態様において、Ｒ７ａおよびＲ７ｂが一緒になってシクロプロピルまたはシクロブチル環を形成することも好ましい。
【００２７】
Ａｒ１がフェニルまたはピリミジルであることはさらに好ましい。
【００２８】
Ｒ９がＲ２０１またはＮＲ２０３Ｒ２０４であることも好ましい。
【００２９】
さらに、Ｒ２０１が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３またはビニルであることは好ましい。
【００３０】
Ｒ２０４が−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ３または−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであることも好ましい。
【００３１】
本発明のさらなる態様において、Ｒ２がパラ−フルオロフェニルであり、Ｒ３が水素であり、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が、それぞれ独立して、水素、フルオロ、−ＯＣＨ３および−ＯＣＤ３の群から選ばれ、
Ｒ７ａが水素、メチル、フルオロメチルおよびシクロプロピルの群から選ばれ、
Ｒ７ｂが水素、メチル、フルオロメチル、シクロプロピルおよびＡｒ１の群から選ばれるか、
あるいはＲ７ａおよびＲ７ｂが一緒になってシクロプロピルまたはシクロブチル環を形成し；
Ａｒ１がフェニルまたはピリミジルであり、
Ｒ９がＲ２０１またはＮＲ２０３Ｒ２０４であり；
Ｒ２０１が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３またはビニルであり；
Ｒ２０４が−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ２ＣＦ３または−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨである
ことは好ましい。
【００３２】
本発明のさらなる態様において、Ｒ４が水素であり、Ｒ５が水素またはフルオロであり、Ｒ７ｂが水素、メチル、フルオロメチルおよびシクロプロピルの群から選ばれるか、あるいはＲ７ａおよびＲ７ｂが一緒になってシクロプロピルまたはシクロブチル環を形成し；Ｒ２０１が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３であることは好ましい。
【００３３】
上記の式Ｉの化合物のいくつかの態様において、ＺがＮであることは好ましい。
【００３４】
ＺがＮであり、Ｒ４が水素であり、Ｒ６が−ＯＣＤ３である化合物も好ましい。
【００３５】
上記の式Ｉの化合物のいくつかの態様において、ＺがＣＲ５であることは好ましい。
【００３６】
他の好ましい化合物としては、ＺがＣＲ５であり、Ｒ４が水素であり、Ｒ５が水素またはフルオロであり、Ｒ６が水素、フルオロまたは−ＯＣＨ３であり、
Ｒ７ａが水素、メチル、フルオロメチルまたはシクロプロピルから選ばれ
Ｒ７ｂが水素、メチル、フルオロメチルまたはシクロプロピルから選ばれるか
あるいはＲ７ａおよびＲ７ｂが一緒になってシクロプロピルまたはシクロブチル環を形成し；
Ｒ２０１が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３である
ものが挙げられる。
【００３７】
Ｒ５が水素であり、Ｒ６がフルオロであり、Ｒ７ａがメチルであり、Ｒ７ｂがシクロプロピルであり、Ｒ９がＲ２０１である、式Ｉの化合物も好ましい。
【００３８】
他の好ましい化合物としては、化合物が、単一のエナンチオマー（Ｒ）−５−（３−（（１−シアノ−１−シクロプロピルエチル）カルバモイル）−４−フルオロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−６−（３，３，３−トリフルオロプロピル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボキサミド、または他の単一のエナンチオマー（Ｓ）−５−（３−（（１−シアノ−１−シクロプロピルエチル）カルバモイル）−４−フルオロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−６−（３，３，３−トリフルオロプロピル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボキサミドとして存在するものが挙げられる。
【００３９】
上記の２つの純粋なエナンチオマーの化合物はさらにより好ましく、当該化合物は、旋光度を旋光計で標準法により測定するとマイナスの回転を示す単一のエナンチオマーとして存在する。
【００４０】
医薬的に許容される塩を含む本発明の好ましい化合物は、以下の群から選ばれる：
【化３】
2017509700.tif 000005
【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【００４１】
以下の群から選ばれる、医薬的に許容される塩を含む化合物も好ましい：
【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【００４２】
以下の群から選ばれる、医薬的に許容される塩を含む化合物はさらに好ましい：
【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【００４３】
より好ましい医薬的に許容される塩を含む化合物は、以下の群から選ばれる：
【化４１】
2017509700.tif 000043
【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【００４４】
医薬的に許容される塩を含む他のより好ましい化合物は、以下の群から選ばれる：
【化４６】
2017509700.tif 000048
【００４５】
以下のものとして同定される医薬的に許容される塩を含む化合物は、さらに好ましい：
【化４７】
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【００４６】
さらに、以下のものとして同定される医薬的に許容される塩を含む化合物：
【化４８】
2017509700.tif 000050
【００４７】
医薬組成物および治療方法
本明細書に明記されている様々な態様の化合物はＨＣＶ  ＮＳ５Ｂに対する活性を示し、またＨＣＶおよびＨＣＶ感染を治療するのに有用であり得る。従って、本発明の別の態様は、医薬的に許容される塩を含む式Ｉの化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む組成物である。
【００４８】
本発明の別の態様は、抗ＨＣＶ活性を有するさらなる化合物をさらに含む組成物である。
【００４９】
本発明の別の態様は、抗ＨＣＶ活性を有するさらなる化合物がインターフェロンまたはリバビリンである組成物である。本発明の別の態様では、インターフェロンは、インターフェロンアルファ２Ｂ、ペグインターフェロンアルファ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンアルファ２Ａ、インターフェロンラムダおよびリンパ芽球様インターフェロンタウから選ばれる。
【００５０】
本発明の別の態様は、さらなる抗ＨＣＶ活性を有する化合物がシクロスポリンである組成物である。本発明の別の態様では、シクロスポリンはシクロスポリンＡである。
【００５１】
本発明の別の態様は、抗ＨＣＶ活性を有するさらなる化合物が、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１２、１型ヘルパーＴ細胞応答の進行を増強する化合物、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、イミキモド（Ｉｍｉｑｉｍｏｄ）、リバビリン、イノシン５’−リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、アマンタジンおよびリマンタジンから成る群から選ばれる組成物である。
【００５２】
本発明の別の態様は、抗ＨＣＶ活性を有するさらなる化合物が、ＨＣＶ感染を治療するために、ＨＣＶメタロプロテアーゼ、ＨＣＶセリンプロテアーゼ、ＨＣＶポリメラーゼ、ＨＣＶヘリカーゼ、ＨＣＶ  ＮＳ４Ｂタンパク質、ＨＣＶの侵入、ＨＣＶの組み立て、ＨＣＶの放出、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質、ＩＭＰＤＨおよびヌクレオシド類似体から選ばれる標的の機能を阻害するのに有効な組成物である。
【００５３】
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容される塩、医薬的に許容される担体、インターフェロンおよびリバビリンを含む組成物である。
【００５４】
本発明の別の態様は、ＨＣＶレプリコンを式Ｉの化合物またはその医薬的に許容される塩と接触させることを特徴とする、ＨＣＶレプリコンの機能の阻害方法である。
【００５５】
本発明の別の態様は、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂタンパク質を式Ｉの化合物またはその医薬的に許容される塩と接触させることを特徴とする、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂタンパク質の機能の阻害方法である。
【００５６】
本発明の別の態様は、患者に、治療的有効量の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容される塩を投与することを特徴とする、患者におけるＨＣＶ感染の治療方法である。別の態様において、化合物は、ＨＣＶレプリコンの機能を阻害するのに有効である。別の態様において、化合物は、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂタンパク質の機能を阻害するのに有効である。
【００５７】
本発明の別の態様は、抗ＨＣＶ活性を有する他の化合物抗と併用して（前、後または同時）、患者に、治療的有効量の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容される塩を投与することを特徴とする、患者におけるＨＣＶ感染の治療方法である。
【００５８】
本発明の別の態様は、抗ＨＣＶ活性を有する他の化合物がインターフェロンまたはリバビリンである方法である。
【００５９】
本発明の別の態様は、インターフェロンが、インターフェロンアルファ２Ｂ、ペグインターフェロンアルファ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンアルファ２Ａ、インターフェロンラムダおよびリンパ芽球様インターフェロンタウから選ばれる前記方法である。
【００６０】
本発明の別の態様は、抗ＨＣＶ活性を有する他の化合物がシクロスポリンである前記方法である。
【００６１】
本発明の別の態様は、シクロスポリンがシクロスポリンＡである前記方法である。
【００６２】
本発明の別の態様は、抗ＨＣＶ活性を有する他の化合物が、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１２、１型ヘルパーＴ細胞応答の進行を増強する化合物、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、イミキモド、リバビリン、イノシン５’−リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、アマンタジンおよびリマンタジンから選ばれる前記方法である。
【００６３】
本発明の別の態様は、ＨＣＶ感染を治療するために、抗ＨＣＶ活性を有する他の化合物が、ＨＣＶメタロプロテアーゼ、ＨＣＶセリンプロテアーゼ、ＨＣＶポリメラーゼ、ＨＣＶヘリカーゼ、ＨＣＶ  ＮＳ４Ｂタンパク質、ＨＣＶの侵入、ＨＣＶの組み立て、ＨＣＶの放出、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質、ＩＭＰＤＨおよびヌクレオシド類似体から成る群から選ばれる標的の機能を阻害するのに有効である前記方法である。
【００６４】
本発明の別の態様は、抗ＨＣＶ活性を有する他の化合物が、ＨＣＶ生活環にある、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂタンパク質以外の標的の機能を阻害するのに有効である前記方法である。
【００６５】
「治療的有効」は、肝炎およびＨＣＶ感染分野の開業医により理解されるように、十分に感染している個体に使用する場合に、患者に有意義な利益、例えば、ＨＣＶ感染により引き起こされる急性疾患の阻害、改善もしくは治癒、および／またはＨＣＶ感染それ自体の阻害、改善もしくは治癒をもたらすに必要な薬剤の量を指す。
【００６６】
「患者」は、肝炎およびＨＣＶ感染分野の開業医により理解されるように、ＨＣＶウイルスに感染しており、かつ治療に適している人を指す。
【００６７】
「治療」、「療法」、「レジメン」、「ＨＣＶ感染」および関連用語は、肝炎およびＨＣＶ感染分野の開業医により理解されるように用いられる。
【００６８】
本発明の化合物は、概して、治療的有効量の化合物またはその医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体から成る医薬組成物として投与され、慣習の賦形剤を含んでいてもよい。医薬的に許容される担体は、許容される安全性プロファイルを有する周知の担体である。組成物は、例えば、カプセル、錠剤、トローチおよび散剤、並びに液体懸濁液、シロップ、エリクサー（ｅｌｉｘｅｒ）および溶液を含む、一般的な全ての固体および液体形態を包含する。組成物は一般的な製剤技術を用いて製造され、また、概して、慣習の賦形剤（例えば結合剤および湿潤剤）および媒体（例えば水およびアルコール）が組成物に用いられる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 17th edition, 1985を参照のこと。
【００６９】
固体組成物は標準的に投与単位に製剤化され、また投与当たり約１〜１０００ｍｇの活性成分をもたらす組成物が好ましい。用量の例の一部は、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇおよび１０００ｍｇである。概して、他の薬剤は、臨床的に用いられているそのクラスの薬剤と同様の単位範囲内に含まれるであろう。典型的には、これは０．２５〜１０００ｍｇ／単位である。
【００７０】
液体組成物は通常、用量単位範囲内にある。概して、液体組成物は、１〜１００ｍｇ／ｍＬの単位用量範囲内にあるであろう。用量の例の一部は、１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬである。概して、他の薬剤は、臨床的に用いられているそのクラスの薬剤と同様の単位範囲内に含まれるであろう。典型的には、これは１〜１００ｍｇ／ｍＬである。
【００７１】
本発明は、慣習の全ての投与方法を包含するが、経口および非経口法が好ましい。概して、投与レジメンは、臨床的に用いられる他の薬剤と類似しているであろう。典型的には、１日用量は、１日当たり１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であろう。概して、経口投与にはより多くの、非経口投与にはより少ない化合物が必要とされる。しかしながら、具体的な投与レジメンは、医師により正しい医学的判断を用いて決定されるであろう。
【００７２】
本発明は、化合物が併用療法で投与されることを特徴とする方法も包含する。すなわち、化合物は、肝炎およびＨＣＶ感染を治療するのに有用である他の薬剤と、別々にではあるものの併用することができる。これらの併用法では、化合物は、概して、他の薬剤と併用して、１日当たり１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量で投与されるであろう。他の薬剤は、概して、治療的に用いられる量で投与されるであろう。しかしながら、具体的な投与レジメンは、医師により正しい医学的判断を用いて決定されるであろう。
【００７３】
組成物および方法に適している化合物の例の一部を表１に記載した。
【表１】
2017509700.tif 000051
2017509700.tif 000052
2017509700.tif 000053
2017509700.tif 000054
【００７４】
合成方法
化合物は、当該技術分野で利用可能な方法および下記のものにより製造してもよい。試薬および中間体の一部は当該技術分野で利用可能である。他の試薬および中間体は、当該技術分野で利用可能な方法により、市販の物質を用いて製造することができる。化合物の合成を記載するのに用いられる可変基（例えば番号が付けられた「Ｒ」置換基）は、製造方法を説明することのみを意図しており、請求項または明細書の他の項で用いられている可変基と混同されない。スキーム中で用いられる略語は、概して当該技術分野で用いられている慣習に従う。
【００７５】
スキーム中で用いられる略語は、概して当該技術分野で用いられている慣習に従う。明細書および実施例中で用いられる化学略語は、以下のように定義される：「ＮａＨＭＤＳ」はナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドであり；「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり；「ＭｅＯＨ」はメタノールであり；「ＮＢＳ」はＮ−ブロモスクシンイミドであり；「Ａｒ」はアリールであり；「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸であり；「ＬＡＨ」は水素化アルミニウムリチウムであり；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドであり；「ｈ」は時間であり；「ｒｔ」は室温または保持時間（文脈が指示するであろう）であり；「ｍｉｎ」は分であり；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルであり；「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランであり；「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミンテトラ酢酸であり；「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルであり；「ＤＭＡＰ」は４−ジメチルアミノピリジンであり；「ＤＣＥ」は１，２−ジクロロエタンであり；「ＡＣＮ」はアセトニトリルであり；「ＤＭＥ」は１，２−ジメトキシエタンであり；「ＨＯＢｔ」は１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物であり；「ＤＩＥＡ」はジイソプロピルエチルアミンである。
【００７６】
００００シリーズの化合物の項では、全ての液体クロマトグラフィー（ＬＣ）データは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０ＡＳまたはＬＣ−２０ＡＳ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈで、ＳＰＤ−１０ＡＶまたはＳＰＤ−２０Ａ  ＵＶ−Ｖｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて記録し、質量分析（ＭＳ）データは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＬＣを電気スプレーモードで用いて測定した。
【００７７】
ＨＰＬＣ法（すなわち化合物の単離）。分取ＨＰＬＣにより精製した化合物をメタノール（１．２ｍＬ）で希釈し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−８ＡもしくはＬＣ−１０Ａ、またはＤｉｏｎｅｘ  ＡＰＳ−３０００もしくはＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）自動分取ＨＰＬＣシステムを用いて精製した。
【実施例】
【００７８】
化合物１０００１の調製：
【化４９】
2017509700.tif 000055
工程１：化合物１（５ｇ）、５−ボロノ−２−メトキシ安息香酸（３．０７ｇ）およびＣｓ２ＣＯ３（８．４９ｇ）のジオキサン（１２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）混合物に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１．５１ｇ）を加えた。混合物を窒素でフラッシュし、次いで８５℃で１６時間加熱した。混合物を水で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌで酸性（ｐＨ〜３）にし、次いでＥｔＯＡｃ（２×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃで滴定することにより精製し、化合物２を得た。
2017509700.tif 000056
【００７９】
工程２：化合物２（３００ｍｇ）、２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル（６６．６ｍｇ）およびＨＡＴＵ（３７６ｍｇ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．４６ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃで滴定することにより精製し、化合物１０００１を得た。
2017509700.tif 000057
【００８０】
化合物１０００２の調製：
化合物１０００２は、化合物１０００１のものと同じ手順により、出発物質として１−アミノシクロブタンカルボニトリルを用いて調製した。
2017509700.tif 000058
【００８１】
化合物１０００３の調製：
化合物１０００３は、化合物１０００１のものと同じ手順により、出発物質として１−アミノシクロペンタンカルボニトリル塩酸塩を用いて調製した。
2017509700.tif 000059
【００８２】
化合物１０００４の調製：
化合物１０００４は、化合物１から化合物１０００１へのものと同じ手順により、工程１で出発物質として３−ボロノ−安息香酸を用いて調製した。
2017509700.tif 000060
【００８３】
化合物１０００５の調製：
化合物１０００５は、化合物１から化合物１０００２へのものと同じ手順により、工程１で出発物質として３−ボロノ−安息香酸を用いて調製した。
2017509700.tif 000061
【００８４】
化合物１０００６の調製：
化合物１０００６は、化合物１から化合物１０００３へのものと同じ手順により、工程１で出発物質として３−ボロノ−安息香酸を用いて調製した。
2017509700.tif 000062
【００８５】
化合物１１００１の調製：
【化５０】
2017509700.tif 000063
化合物１０００４（３０ｍｇ）、ＣＦ３ＣＨ２ＣＨ２ＢＦ３Ｋ（４３．６ｍｇ）、炭酸セシウム（５９．７ｍｇ）、ジシクロヘキシル（２’，６’−ジイソプロポキシ−［１，１’−ビフェニル］−２−イル）ホスフィン（１１．４１ｍｇ）および二酢酸パラジウム（２．７４ｍｇ）のトルエン（３ｍＬ）および水（０．３ｍＬ）混合物を、８０℃で１６時間加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣシステムにより精製した。
2017509700.tif 000064
【００８６】
化合物１１００２の調製：
化合物１１００２は、化合物１１００１のものと同じ手順により、出発物質として化合物１０００５を用いて調製した。
2017509700.tif 000065
【００８７】
化合物１１００３の調製：
化合物１１００３は、化合物１１００１のものと同じ手順により、出発物質として化合物１０００６を用いて調製した。
2017509700.tif 000066
【００８８】
中間体５の調製：
【化５１】
2017509700.tif 000067
工程１：化合物１（１００ｍｇ）、（３−（メトキシカルボニル）フェニル）ボロン酸（４６．９ｍｇ）およびＣｓ２ＣＯ３（１７０ｍｇ）のジオキサン（４ｍＬ）および水（１ｍＬ）混合物に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（３０．１ｍｇ）を加えた。混合物を窒素でフラッシュし、次いで８５℃で４時間加熱した。混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、ブライン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃで滴定することにより精製し、化合物３を得た。
2017509700.tif 000068
【００８９】
工程２：化合物３（１ｇ）、ＣＦ３ＣＨ２ＣＨ２ＢＦ３Ｋ（１．６３ｇ）、Ｃｓ２ＣＯ３（２．２３ｇ）、ジシクロヘキシル（２’，６’−ジイソプロポキシ−［１，１’−ビフェニル］−２−イル）ホスフィン（０．４３ｇ）および二酢酸パラジウム（０．１０ｇ）のトルエン（５０ｍＬ）および水（５．０ｍＬ）混合物を、９０℃で１６時間加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１〜１：２）により精製し、化合物４を得た。
2017509700.tif 000069
【００９０】
工程３：化合物４（４００ｍｇ）およびＮａＯＨ（４．０ｍＬ，１Ｎ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）および水（１５ｍＬ）混合物を、８０℃で６時間加熱した。混合物を１Ｎ  ＨＣｌで酸性（ｐＨ〜５）にし、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、ブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮し、化合物５を得て、そのまま用いた。
2017509700.tif 000070
【００９１】
化合物１１００４、１１００５、１１００８、１１０１１、１１０１２および１１０１３の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物５（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000071
2017509700.tif 000072
【００９２】
化合物１１００６および１１００７の調製：
【化５２】
2017509700.tif 000073
化合物１１００６および１１００７は、サンプル１１００５から分離された２つのエナンチオマーであった。絶対立体化学は決定していない。
【００９３】
化合物１１００９および１１０１０の調製：
【化５３】
2017509700.tif 000074
化合物１１００９および１１０１０は、サンプル１１００８から分離された２つのエナンチオマーであった。絶対立体化学は決定していない。
【００９４】
化合物１２００１の調製：
化合物１２００１は、化合物１１００１のものと同じ手順により、出発物質として化合物１０００１を用いて調製した。
2017509700.tif 000075
【００９５】
化合物１２００２の調製：
化合物１２００２は、化合物１１００１のものと同じ手順により、出発物質として化合物１０００２を用いて調製した。
2017509700.tif 000076
【００９６】
化合物１２００３の調製：
化合物１２００３は、化合物１１００１のものと同じ手順により、出発物質として化合物１０００３を用いて調製した。
2017509700.tif 000077
【００９７】
中間体６の調製：
【化５４】
2017509700.tif 000078
中間体６は、化合物１１００１のものと同じ手順により、出発物質として中間体２を用いて調製した。
2017509700.tif 000079
【００９８】
化合物１２００４および１２００５の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物６（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000080
2017509700.tif 000081
【００９９】
中間体９の調製：
【化５５】
2017509700.tif 000082
工程１：化合物１（１ｇ）、（４−フルオロ−３−（メトキシカルボニル）フェニル）ボロン酸（０．６２ｇ）およびＣｓ２ＣＯ３（１．７０ｇ）のジオキサン（４０ｍＬ）および水（４ｍＬ）混合物に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．３０ｇ）を加えた。混合物を窒素でフラッシュし、次いで８５℃で１６時間加熱した。混合物を水で希釈し、次いでＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃで滴定することにより精製し、化合物７を得た。
2017509700.tif 000083
【０１００】
工程２：化合物７（２７０ｍｇ）、カリウムトリフルオロ（３，３，３−トリフルオロプロピル）ボラート（４２２ｍｇ）、炭酸セシウム（５７８ｍｇ）、ジシクロヘキシル（２’，６’−ジイソプロポキシ−［１，１’−ビフェニル］−２−イル）ホスフィン（１１０ｍｇ）および二酢酸パラジウム（２６．５ｍｇ）のトルエン（１０ｍＬ）および水（１．０ｍＬ）混合物を、８０℃で１６時間加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮し、化合物８を得て、そのまま用いた。
2017509700.tif 000084
【０１０１】
工程３：化合物８（５０ｍｇ）のアセトン（３ｍＬ）および水（１ｍＬ）懸濁液に、ＮａＯＨ（１．９３ｍＬ，１Ｎ）を加えた。混合物を８０℃で４時間加熱した。混合物を１Ｎ  ＨＣｌで酸性（ｐＨ〜３）にした。沈殿をろ過により回収し、化合物９を得て、そのまま用いた。
2017509700.tif 000085
【０１０２】
化合物１１００４、１１００５、１１００８、１１０１１、１１０１２および１１０１３の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物９（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000086
2017509700.tif 000087
2017509700.tif 000088
【０１０３】
化合物１３００４および１３００５の調製：
【化５６】
2017509700.tif 000089
化合物１３００４および１３００５は、サンプル１３００３から分離された２つのエナンチオマーであった。絶対立体化学は決定していない。
【０１０４】
化合物１３００７および１３００８の調製：
【化５７】
2017509700.tif 000090
化合物１３００７および１３００８は、サンプル１３００６から分離された２つのエナンチオマーであった。絶対立体化学は決定していない。
化合物１３００７および１３００８のキラル分離および純度分析：
Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｕｍｎ，３０×２５０ｍｍ，５μｍ
移動相：１０％ＭｅＯＨ（０．１％ＤＥＡ）／ＣＯ２、１５０ｂａｒ
温度：３５℃
流速：７０．０ｍｌ／分で２２分間
３１６ｎｍでＵＶをモニター
注入：０．５ｍｌの〜４０ｍｇ／ｍＬ  １：１  ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３溶液
保持時間：１５．２５分（化合物１３００７）および１７．６８分（化合物１３００８）
【０１０５】
２つの分析用ＬＣ／ＭＳ注入を用いて最終的な純度を決定した。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：５０℃；グラジエント：０％Ｂ、３分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：５０℃；グラジエント：０％Ｂ、３分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。
【０１０６】
化合物１３３０８をＥｔＯＨおよびＨ２Ｏの混合溶液からさらに再結晶させ、白色固体を得た。
化合物１３３０８の特性評価：
ａ．旋光度
2017509700.tif 000091
ｂ．質量スペクトル：
質量範囲：ｍ／ｚ  １２０〜１２００
イオン化およびモード：エレクトロスプレーイオン化、ポジティブイオンモード
結果：ＥＳ＋＝５９７．３
ｃ．元素分析：％組成差（Δ）＝実験値−理論値（許容基準：Δ≦±０．４）
結果：Ｃ３１Ｈ２５Ｆ５Ｎ４Ｏ３０．０６  Ｈ２Ｏ：ΔＣ＝−０．０９％；ΔＨ＝−０．１９％；ΔＮ＝＋０．０６％
ｄ．プロトンスペクトル：
実験：６００μｌのＤＭＳＯ−ｄ６に溶解した７．３ｍｇのサンプル、４スキャン、３２Ｋ点、室温。１Ｈの化学シフトはＴＭＳを基準として０．０ｐｐｍにしている。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9.06 (s, 1H), 8.54 (q, J=4.4 Hz, 1H), 8.07 (dd, J=9.0, 5.5 Hz, 2H), 7.97 (s, 1H), 7.69 (m, 1H), 7.66 (m, 1H), 7.48 (t, J=8.5Hz, 1H), 7.43 (dd, J=8.8, 7.3 Hz, 2H), 3.03 (dd, J=9.1, 6.6 Hz, 2H), 2.83 (d, J=4.7 Hz, 3H), 2.79 (m, 2H), 1.67 (s, 3H), 1.50 (m, 1H), 0.64 (m, 3H), 0.53 (m, 1H)。
ｅ．炭素スペクトル：
実験：６００μｌのＤＭＳＯ−ｄ６に溶解した７．３ｍｇのサンプル。炭素共振周波数は１２５．７３ＭＨｚである。１０２４スキャン、３２Ｋ点、室温。１３Ｃの化学シフトはＴＭＳを基準として０．０ｐｐｍにしている。13C NMR (125.73MHz, DMSO-d6) δ 163.4, 162.4, 163.0 (d, J=248.9 Hz), 158.8, 158.7 (d, J=250.7 Hz), 152.0, 151.4, 135.0 (d, J=3.6 Hz), 133.6 (d, J=8.2 Hz), 131.9, 131.8, 130.8, 129.9 (d, J=9.1 Hz), 127.5 (q, J=277.0 Hz), 125.2 (d, J=2.7 Hz), 123.9 (d, J=15.4 Hz), 118.8, 117.5, 116.4 (d, J=22.7 Hz), 116.1 (d, J=22.7 Hz), 112.6, 52.2, 31.3 (q, J=27.3 Hz), 27.1, 26.2, 23.8, 18.6, 2.9, 1.7。
ｆ．フッ素スペクトル
実験：６００μｌのＤＭＳＯ−ｄ６に溶解した７．３ｍｇのサンプル、フッ素共振周波数は４７０．４５ＭＨｚであり、１６スキャン、６４Ｋ点、室温。１９Ｆの化学シフトはＣＦＣｌ３を基準として０．０ｐｐｍにしている。19F NMR (470.45 MHz, DMSO-d6) δ -64.74, -109.85, -115.68。
【０１０７】
中間体１０の調製：
【化５８】
2017509700.tif 000092
中間体１０は、中間体９のものと同じ手順により、工程１で出発物質としてメチル３−フルオロ−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）安息香酸塩を用いて調製した。
【０１０８】
化合物１４００１および１４００２の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物１０（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000093
2017509700.tif 000094
【０１０９】
中間体１４の調製：
【化５９】
2017509700.tif 000095
工程１：化合物１（５００ｍｇ）、３−ボロノ−４−フルオロ安息香酸（２６４ｍｇ）およびＣｓ２ＣＯ３（８４９ｍｇ）のＤＭＦ（１５ｍＬ）および水（１．５ｍＬ）混合物に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１５１ｍｇ）を加えた。混合物を窒素でフラッシュし、次いで８５℃で６時間加熱した。混合物を水で希釈し、次いでＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃで滴定することにより精製し、化合物１１を得た。
2017509700.tif 000096
【０１１０】
工程２：化合物２（７０ｍｇ）、ヨードメタン（０．０４９ｍＬ）およびＣｓ２ＣＯ３（１０３ｍｇ）のＭｅＯＨ（３ｍＬ）混合物を、シールド管内にて８０℃で６時間加熱した。混合物をＭｅＯＨで希釈した。固体をろ過により除去した。ろ液を濃縮し、残渣を得て、分取ＨＰＬＣシステムにより精製した。
2017509700.tif 000097
【０１１１】
工程３：化合物１２（２５ｍｇ）、カリウムトリフルオロ（３，３，３−トリフルオロプロピル）ボラート（３９．１ｍｇ）、炭酸セシウム（５３．５ｍｇ）、ジシクロヘキシル（２’，６’−ジイソプロポキシ−［１，１’−ビフェニル］−２−イル）ホスフィン（１０．２１ｍｇ）および二酢酸パラジウム（２．４６ｍｇ）のトルエン（２ｍＬ）／水（０．２ｍＬ）混合物を、脱気し、８０℃で１６時間加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、次いで水（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、真空下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃで滴定することにより精製し、化合物１３を得た。
2017509700.tif 000098
【０１１２】
工程４：化合物１３（１５ｍｇ）のＴＨＦ（３ｍＬ）および水（０．３ｍＬ）懸濁液に、ＮａＯＨ（０．５ｍＬ，１Ｎ）を加えた。混合物を８０℃で４時間加熱した。混合物を１Ｎ  ＨＣｌで酸性（ｐＨ〜３）にした。全ての溶媒を真空下で留去し、化合物１４を得て、そのまま用いた。
2017509700.tif 000099
【０１１３】
化合物１５００１および１５００２の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物１４（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000100
2017509700.tif 000101
【０１１４】
中間体１５の調製：
【化６０】
2017509700.tif 000102
中間体１５は、中間体９のものと同じ手順により、工程１で出発物質としてメチル２，３−ジクロロ−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）安息香酸塩を用いて調製した。
2017509700.tif 000103
【０１１５】
化合物１６００１の調製：
【化６１】
2017509700.tif 000104
化合物１５（８ｍｇ）、２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル（２．４２４ｍｇ，０．０２９ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（８．２２ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ｉＰｒ２ＮＥｔ（１０．０６μｌ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000105
【０１１６】
中間体１６の調製：
【化６２】
2017509700.tif 000106
中間体１６は、中間体９のものと同じ手順により、工程１で出発物質として（３，４−ジフルオロ−５−（メトキシカルボニル）フェニル）ボロン酸を用いて調製した。
2017509700.tif 000107
【０１１７】
化合物１７００１の調製：
【化６３】
2017509700.tif 000108
2017509700.tif 000109
【０１１８】
化合物１８００１の調製：
【化６４】
2017509700.tif 000110
化合物１７（１５ｍｇ）、２−アミノ−２−シクロプロピルプロパンニトリル（９．５２ｍｇ）およびＨＡＴＵ（１６．４４ｍｇ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．０２ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000111
【０１１９】
中間体１９の調製：
【化６５】
2017509700.tif 000112
工程１：化合物３（８００ｍｇ）およびＮａＯＨ（９．１２ｍＬ，１Ｎ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）および水（１５ｍＬ）混合物を、８０℃で６時間加熱した。混合物を１Ｎ  ＨＣｌで酸性（ｐＨ〜５）にし、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を集め、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮し、化合物１８を得た。
2017509700.tif 000113
【０１２０】
工程２：化合物１８（１７５ｍｇ）、クロロ［２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）−３，６−ジメトキシ−２’，４’，６’−トリ−ｉ−プロピル−１，１’−ビフェニル］［２−（２−アミノエチル）フェニル］パラジウム（ＩＩ）（２８．２ｍｇ）およびナトリウム２−メチルブタン−２−オレート（１９４ｍｇ）のジオキサン（１０ｍＬ）混合物を、９０℃で３０分間加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣシステムにより精製した。
2017509700.tif 000114
【０１２１】
化合物２０００１、２０００２、２０００５および２０００６の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物１９（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000115
2017509700.tif 000116
2017509700.tif 000117
【０１２２】
化合物２０００３および２０００４の調製：
【化６６】
2017509700.tif 000118
化合物２０００３および２０００４は、サンプル２０００２から分離された２つのエナンチオマーであった。絶対立体化学は決定していない。
【０１２３】
化合物２０００７および２０００８の調製：
【化６７】
2017509700.tif 000119
化合物２０００７および２０００８は、サンプル２０００６から分離された２つのエナンチオマーであった。絶対立体化学は決定していない。
【０１２４】
中間体２０の調製：
【化６８】
2017509700.tif 000120
中間体２０は、化合物１８から中間体１９へのものと同じ手順により、出発物質として化合物２を用いて調製した。
2017509700.tif 000121
【０１２５】
化合物２１００１の調製：
【化６９】
2017509700.tif 000122
化合物２０（２０ｍｇ）、２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル塩酸塩（９．３２ｍｇ，０．０７７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（２２．０５ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．０２７ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000123
【０１２６】
中間体２１の調製：
【化７０】
2017509700.tif 000124
中間体２１は、中間体１９のものと同じ手順により、工程１で出発物質として化合物７を用いて調製した。
2017509700.tif 000125
【０１２７】
化合物２２００１および２２００４の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物２１（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000126
2017509700.tif 000127
【０１２８】
化合物２２００２および２２００３の調製：
【化７１】
2017509700.tif 000128
化合物２２００２および２２００３は、サンプル２２００１から分離された２つのエナンチオマーであった。絶対立体化学は決定していない。
【０１２９】
化合物２２００５および２２００６の調製：
【化７２】
2017509700.tif 000129
化合物２２００５および２２００６は、サンプル２２００４から分離された２つのエナンチオマーであった。絶対立体化学は決定していない。
【０１３０】
中間体２３の調製：
【化７３】
2017509700.tif 000130
工程１：中間体２２は、中間体７のものと同じ手順により、出発物質としてメチル３−フルオロ−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）安息香酸塩を用いて調製した。
2017509700.tif 000131
【０１３１】
工程２：化合物２２（５０ｍｇ）、２，２，２−トリフルオロエタンアミン（５４．２ｍｇ）、クロロ［２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）−３，６−ジメトキシ−２’，４’，６’−トリ−ｉ−プロピル−１，１’−ビフェニル］［２−（２−アミノエチル）フェニル］パラジウム（ＩＩ）（１７．４９ｍｇ）およびナトリウム２−メチルブタン−２−オレート（４８．２ｍｇ）のジオキサン（３ｍＬ）混合物を、６５℃で２０分間加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣシステムにより精製し、化合物２３を得た。
2017509700.tif 000132
【０１３２】
化合物２３００１および２３００２の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物２３（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000133
2017509700.tif 000134
【０１３３】
中間体２６の調製：
【化７４】
2017509700.tif 000135
工程１：中間体２４は、中間体７のものと同じ手順により、出発物質としてメチル２，３−ジクロロ−５−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）安息香酸塩を用いて調製した。
2017509700.tif 000136
【０１３４】
工程２：化合物２４（４０ｍｇ）のＴＨＦ（３ｍＬ）および水（１ｍＬ）懸濁液に、ＮａＯＨ（１ｍＬ，１Ｎ）を加えた。混合物を８０℃で４時間加熱した。混合物を１Ｎ  ＨＣｌで酸性（ｐＨ〜３）にした。固体をろ過により回収し、化合物２５を得た。
2017509700.tif 000137
【０１３５】
工程３：化合物２５（３７ｍｇ）、２，２，２−トリフルオロエタンアミン（３７．１ｍｇ）、クロロ［２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）−３，６−ジメトキシ−２’，４’，６’−トリ−ｉ−プロピル−１，１’−ビフェニル］［２−（２−アミノエチル）フェニル］パラジウム（ＩＩ）（１１．９７ｍｇ）およびナトリウム２−メチルブタン−２−オレート（３３．０ｍｇ）のジオキサン（５ｍＬ）混合物を、８０℃で２０分間加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣシステムにより精製し、化合物２６を得た。
2017509700.tif 000138
【０１３６】
化合物２４００１の調製：
【化７５】
2017509700.tif 000139
化合物２６（１５ｍｇ）、２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル（４．０８ｍｇ）およびＨＡＴＵ（１３．８２ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．０１７ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000140
【０１３７】
中間体２７の調製：
【化７６】
2017509700.tif 000141
化合物２（４６０ｍｇ）、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロパン−１−アミン（７８１ｍｇ）、クロロ［２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）−３，６−ジメトキシ−２’，４’，６’−トリ−ｉ−プロピル−１，１’−ビフェニル］［２−（２−アミノエチル）フェニル］パラジウム（ＩＩ）（８４ｍｇ）およびナトリウム２−メチルブタン−２−オレート（５７７ｍｇ）のジオキサン（２５ｍＬ）混合物を、８５℃で３０分間加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮し、化合物２７を得た。
2017509700.tif 000142
【０１３８】
化合物３０００１〜３０００３の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物２７（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000143
2017509700.tif 000144
2017509700.tif 000145
【０１３９】
中間体２８の調製：
【化７７】
2017509700.tif 000146
中間体２８は、化合物２から中間体２０へのものと同じ手順により、出発物質として２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロパン−１−アミンを用いて調製した。
2017509700.tif 000147
【０１４０】
化合物３１００１および３１００２の調製：
ｉＰｒ２ＮＥｔまたはＥｔ３Ｎ（２当量）およびＨＡＴＵまたはＨＣＴＵまたはＤＥＢＰＴ（１．３当量）を、化合物２８（１当量）およびアミン（１．３当量）のＤＭＦまたはＴＨＦ溶液に加えた。反応液を室温または８５℃で３０分間〜７２時間撹拌した。所望の生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000148
2017509700.tif 000149
2017509700.tif 000150
【０１４１】
中間体２９の調製：
【化７８】
2017509700.tif 000151
中間体２９は、化合物１８から中間体１９へのものと同じ手順により、出発物質として２−アミノエタノールを用いて調製した。
2017509700.tif 000152
【０１４２】
化合物４０００１の調製：
【化７９】
2017509700.tif 000153
化合物２９（１０ｍｇ）、２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル（３．７４ｍｇ）およびＨＡＴＵ（１２．６９ｍｇ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液に、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．０１６ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。生成物を分取ＨＰＬＣシステムにより単離した。
2017509700.tif 000154
【０１４３】
化合物５０００１の調製：
【化８０】
2017509700.tif 000155
化合物１０００４（８０ｍｇ）、カリウムビニルトリフルオロボラート（７６ｍｇ）、炭酸セシウム（１５９ｍｇ）、ジシクロヘキシル（２’，６’−ジイソプロポキシ−［１，１’−ビフェニル］−２−イル）ホスフィン（３０．４ｍｇ）および二酢酸パラジウム（７．３２ｍｇ）のトルエン（８ｍＬ）および水（０．８ｍＬ）混合物を、８０℃で１６時間加熱した。混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、水（２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣにより精製した。
2017509700.tif 000156
【０１４４】
化合物Ｋ１００１〜Ｋ１００３の一般調製手順
ｉＰｒ２ＮＥｔ（３当量）およびＨＡＴＵ（１．５当量）を、２−フルオロ−５−（２−（４−フルオロフェニル）−３−（メチルカルバモイル）−６−（３，３，３−トリフルオロプロピル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）安息香酸（１当量）およびアミン（２当量）のＤＭＦ溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。全ての反応混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物を得た。
【０１４５】
化合物Ｋ１００１
【化８１】
2017509700.tif 000157
アミン求核剤＝１−アミノシクロプロパンカルボニトリル塩酸塩。ＬＣＭＳ：注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：２．９０分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５６９。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：３．９１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５６９。
【０１４６】
化合物Ｋ１００２
【化８２】
2017509700.tif 000158
アミン求核剤＝１−アミノシクロブタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：２．１１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８３。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：４．０１分、（Ｍ−Ｈ）＋：５８１。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9.43 (s, 1H), 8.54 - 8.48 (m, 1H), 8.06 (dd, J=8.9, 5.5 Hz, 2H), 7.97 (s, 1H), 7.74 - 7.65 (m, 2H), 7.49 (t, J=9.3 Hz, 1H), 7.41 (t, J=8.9 Hz, 2H), 3.05 - 2.97 (m, 2H), 2.85 - 2.64 (m, 7H), 2.47 (d, J=11.3 Hz, 2H), 2.11 - 2.00 (m, 2H)。
【０１４７】
化合物Ｋ１００３
【化８３】
2017509700.tif 000159
アミン求核剤＝２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．１×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：５０℃；グラジエント：３分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．７５分間ホールド；流速：１．１１ｍｌ／分。保持時間：４．０６分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５７１。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．１×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：０．０５％ＴＦＡを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：０．１％ＴＦＡを含む水；温度：５０℃；グラジエント：３分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．７５分間ホールド；流速：１．１１ｍｌ／分。保持時間：３．０８分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５７１。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 8.98 (s, 1H), 8.54 - 8.45 (m, 1H), 8.06 (dd, J=8.4, 5.6 Hz, 2H), 7.96 (s, 1H), 7.69 - 7.63 (m, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.41 (t, J=8.7 Hz, 2H), 3.06 - 2.98 (m, 2H), 2.85 - 2.72 (m, 5H), 1.73 - 1.65 (m, 6H)。
【０１４８】
化合物Ｋ２００１〜Ｋ２００５の一般調製手順：
ｉＰｒ２ＮＥｔ（８当量）およびＨＡＴＵ（１．５当量）を、２−フルオロ−５−（２−（４−フルオロフェニル）−３−（メチルカルバモイル）−６−（（２，２，２−トリフルオロエチル）アミノ）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）安息香酸（１当量）およびアミン（１当量）のＤＭＦ溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。全ての反応混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物を得た。
【０１４９】
化合物Ｋ２００１
【化８４】
2017509700.tif 000160
アミン求核剤＝２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：２．９２分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５７２。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．８６分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５７２。
【０１５０】
化合物Ｋ２００２
【化８５】
2017509700.tif 000161
アミン求核剤＝１−アミノシクロプロパンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：２．８６分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５７０。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．８１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５７０。
【０１５１】
化合物Ｋ２００３
【化８６】
2017509700.tif 000162
アミン求核剤＝１−アミノシクロブタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：２．９６分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８４。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．９０分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８４。
【０１５２】
化合物Ｋ２００４
【化８７】
2017509700.tif 000163
アミン求核剤＝１−アミノシクロペンタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．０５分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５９８。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．９８分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５９８。
【０１５３】
化合物Ｋ２００５
【化８８】
2017509700.tif 000164
アミン求核剤＝２−アミノ−２，３−ジメチルブタンニトリル。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．１０分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６００。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：４．０２分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６００。
【０１５４】
化合物Ｋ３００１の一般調製手順：
ｉＰｒ２ＮＥｔ（３当量）およびＨＡＴＵ（１．５当量）を、３−（２−（４−フルオロフェニル）−３−（メチルカルバモイル）−６−（３，３，３−トリフルオロプロピル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）安息香酸（１当量）およびアミン（２当量）のＤＭＦ溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。全ての反応混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物を得た。
【０１５５】
化合物Ｋ３００１
【化８９】
2017509700.tif 000165
アミン求核剤＝１−アミノシクロプロパンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：２．８７分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５５１。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：３．９３分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５５１。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9.43 (s, 1H), 8.54 - 8.44 (m, 1H), 8.10 - 8.00 (m, 2H), 7.97 (s, 2H), 7.90 (s, 1H), 7.74 - 7.60 (m, 2H), 7.42 (s, 2H), 3.05 - 2.96 (m, 2H), 2.84 - 2.69 (m, 5H), 1.63 - 1.52 (m, 2H), 1.34 - 1.26 (m, 2H)。
【０１５６】
化合物Ｋ４００１〜Ｋ４００３の一般調製手順：
ｉＰｒ２ＮＥｔ（８当量）およびＨＡＴＵ（１．５当量）を、３−（２−（４−フルオロフェニル）−３−（メチルカルバモイル）−６−（（２，２，２−トリフルオロエチル）アミノ）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）安息香酸（１当量）およびアミン（１当量）のＤＭＦ溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。全ての反応混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物を得た。
【０１５７】
化合物Ｋ４００１
【化９０】
2017509700.tif 000166
アミン求核剤＝１−アミノシクロペンタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：２．９４分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８０。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．９８分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８０。
【０１５８】
化合物Ｋ４００２
【化９１】
2017509700.tif 000167
１−アミノシクロブタンカルボニトリル塩酸塩が用いたアミンであった。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：２．８６分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５６６。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．９１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５６６。
【０１５９】
化合物Ｋ４００３
【化９２】
2017509700.tif 000168
アミン求核剤＝１−アミノシクロプロパンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：２．９９分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５５２。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．７８分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５５２。
【０１６０】
化合物Ｋ４００４
【化９３】
2017509700.tif 000169
アミン求核剤＝２−アミノ−２，３−ジメチルブタンニトリル。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．１８分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８２。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．９７分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８２。
【０１６１】
化合物Ｋ５００１〜Ｋ５００４の一般調製手順：
ｉＰｒ２ＮＥｔ（８当量）およびＨＡＴＵ（１．５当量）を、５−（２−（４−フルオロフェニル）−３−（メチルカルバモイル）−６−（（２，２，２−トリフルオロエチル）アミノ）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）−２−メトキシ安息香酸（１当量）およびアミン（１当量）のＤＭＦ溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。全ての反応混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物を得た。
【０１６２】
化合物Ｋ５００１
【化９４】
2017509700.tif 000170
アミン求核剤＝１−アミノシクロブタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．１５分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５９６。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．８８分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５９６。
【０１６３】
化合物Ｋ５００２
【化９５】
2017509700.tif 000171
アミン求核剤＝１−アミノシクロプロパンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：２．９１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８２。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．８１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８２。
【０１６４】
化合物Ｋ５００３
【化９６】
2017509700.tif 000172
アミン求核剤＝１−アミノシクロペンタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．０１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１０。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．９８分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１０。
【０１６５】
化合物Ｋ５００４
【化９７】
2017509700.tif 000173
アミン求核剤＝２−アミノ−２，３−ジメチルブタンニトリル。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：３．２０分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１２。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：４．０３分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１２。
【０１６６】
化合物Ｋ６００１の一般調製手順：
ｉＰｒ２ＮＥｔ（８当量）およびＨＡＴＵ（１．５当量）を、５−（２−（４−フルオロフェニル）−３−（メチルカルバモイル）−６−（３，３，３−トリフルオロプロピル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）−２−メトキシ安息香酸（１当量）およびアミン（１当量）のＤＭＦ溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。全ての反応混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物を得た。
【０１６７】
化合物Ｋ６００１
【化９８】
2017509700.tif 000174
アミン求核剤＝１−アミノシクロプロパンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：２．９５分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８１。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：３．９３分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８１。
【０１６８】
化合物Ｋ７００１〜Ｋ７００５の一般調製手順：
ｉＰｒ２ＮＥｔ（８当量）およびＨＡＴＵ（１．５当量）を、５−（２−（４−フルオロフェニル）−３−（メチルカルバモイル）−６−（３，３，３−トリフルオロプロピル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）−２−メトキシニコチン酸（１当量）およびアミン（１当量）のＤＭＳ溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。全ての反応混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物を得た。
【０１６９】
化合物Ｋ７００１
【化９９】
2017509700.tif 000175
アミン求核剤＝２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：３．１７分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８４。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：４．０９分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８４。
【０１７０】
化合物Ｋ７００２
【化１００】
2017509700.tif 000176
アミン求核剤＝１−アミノシクロブタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：３．２０分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５９６。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：４．１１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５９６。
【０１７１】
化合物Ｋ７００３
【化１０１】
2017509700.tif 000177
アミン求核剤＝１−アミノシクロプロパンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：２．９４分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８２。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：３．９９分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８２。
【０１７２】
化合物Ｋ７００４
【化１０２】
2017509700.tif 000178
アミン求核剤＝１−アミノシクロペンタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：３．１８分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１０。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：４．１６分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１０。
【０１７３】
化合物Ｋ７００５
【化１０３】
2017509700.tif 000179
アミン求核剤＝２−アミノ−２，３−ジメチルブタンニトリル。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．１×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：５０℃；グラジエント：３分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．７５分間ホールド；流速：１．１１ｍｌ／分。保持時間：３．３３分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１２。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．１×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：０．０５％ＴＦＡを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：０．１％ＴＦＡを含む水；温度：５０℃；グラジエント：３分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．７５分間ホールド；流速：１．１１ｍｌ／分。保持時間：４．３１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１２。
【０１７４】
化合物Ｋ８００１〜Ｋ８００５の一般調製手順：
ｉＰｒ２ＮＥｔ（８当量）およびＨＡＴＵ（１．５当量）を、５−（２−（４−フルオロフェニル）−３−（メチルカルバモイル）−６−（（２，２，２−トリフルオロエチル）アミノ）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）−２−メトキシニコチン酸（１当量）およびアミン（１当量）のＤＭＳ溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。全ての反応混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物を得た。
【０１７５】
化合物Ｋ８００１
【化１０４】
2017509700.tif 000180
アミン求核剤＝２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：２．９２分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８５。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：３．８８分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８５。
【０１７６】
化合物Ｋ８００２
【化１０５】
2017509700.tif 000181
アミン求核剤＝１−アミノシクロブタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：３．０５分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５９７。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：３．８７分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５９７。
【０１７７】
化合物Ｋ８００３
【化１０６】
2017509700.tif 000182
アミン求核剤＝１−アミノシクロプロパンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：２．８２分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８３。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：３．８３分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５８３。
【０１７８】
化合物Ｋ８００４
【化１０７】
2017509700.tif 000183
アミン求核剤＝１−アミノシクロペンタンカルボニトリル塩酸塩。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．１×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：５０℃；グラジエント：３分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．７５分間ホールド；流速：１．１１ｍｌ／分。保持時間：３．１４分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１１。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．１×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：０．０５％ＴＦＡを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：０．１％ＴＦＡを含む水；温度：５０℃；グラジエント：３分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．７５分間ホールド；流速：１．１１ｍｌ／分。保持時間：４．１５分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１１。
【０１７９】
化合物Ｋ８００５
【化１０８】
2017509700.tif 000184
アミン求核剤＝２−アミノ−２，３−ジメチルブタンニトリルであった。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分。保持時間：３．１１分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１３。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分。保持時間：４．０４分、（Ｍ＋Ｈ）＋：６１３。
【０１８０】
化合物Ｋ９００１の調製：
【化１０９】
2017509700.tif 000185
クロロ［２−（ジシクロヘキシルホスフィノ）−３，６−ジメトキシ−２’，４’、６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル］［２−（２−アミノエチル）フェニル］パラジウム（ＩＩ）（４．５ｍｇ，５．６μｍｏｌ）、５−（３−（（２−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）プロパン−２−イル）カルバモイル）フェニル）−６−クロロ−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチルフロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボキサミド（３０ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２’，４’，６’−トリイソプロピル−３−メトキシ−６−メチル−［１，１’−ビフェニル］−２−イル）ホスフィン（２．６ｍｇ，５．６μｍｏｌ）、ナトリウム２−メチルブタン−２−オレート（３０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）の混合物を、トリフルオロエタノール中で混合し、６５℃で２時間、次いで９０℃で１６時間加熱した。反応混合物を、逆相分取ＨＰＬＣにより、Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ上で、適切に緩衝化したＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエントを用いて精製し、濃縮した。副生成物は、ＬＣＭＳおよびＮＭＲで、５−（３−（（２−シアノプロパン−２−イル）カルバモイル）フェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−６−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボキサミド（１．０ｍｇ，１．７μｍｏｌ，３．０％収率）と一致する。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.31 - 8.28 (m, 1H), 7.96 - 7.89 (m, 4H), 7.77 - 7.73 (m, 1H), 7.61 - 7.55 (m, 1H), 7.26 - 7.21 (m, 2H), 6.22 - 6.17 (m, 1H), 5.88 - 5.80 (m, 1H), 4.95 - 4.86 (m, 2H), 3.01 (d, J=5.0 Hz, 3H), 1.85 (s, 6H)。ＬＣ−ＭＳ保持時間：１．７６分；ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：５５５。ＬＣデータは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ−Ｌｕｎａ  ３ｕ  Ｃ１８  ２．０×３０ｍｍ  ｃｏｌｕｍｎを搭載したＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０ＡＳ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈで、ＳＰＤ−１０ＡＶ  ＵＶ−Ｖｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを検出器波長２２０ｎＭで用いて記録した。流速が１ｍｌ／分であり、グラジエントが１００％溶媒Ａ／０％溶媒Ｂから０％溶媒Ａ／１００％溶媒Ｂであり、グラジエント時間が２分間であり、ホールド時間が１分間であり、分析時間が３分間である溶出条件（ここに、溶媒Ａは１０％アセトニトリル／９０％Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸であり、溶媒Ｂは１０％Ｈ２Ｏ／９０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸である）を用いた。ＭＳデータを、ＬＣにＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを電気スプレーモードで用いて測定した。
【０１８１】
化合物Ｋ１０００１の調製：
【化１１０】
2017509700.tif 000186
Ｐｄ／Ｃ（９．０ｍｇ，８．５μｍｏｌ）を、室温で、撹拌した（Ｅ）−５−（３−（（２−（１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）プロパン−２−イル）カルバモイル）フェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−６−（プロパ−１−エン−１−イル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボキサミド（２３ｍｇ，０．０４３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（８５３μｌ）溶液に加えた。反応混合物をパールボンブ内に置き、Ｈ２（ｇ）を２５ＰＳＩでチャージし、反応混合物を４時間撹拌した。ＬＣＭＳにより変換は示されなかった。Ｐｄ／Ｃ（９．０ｍｇ，８．５μｍｏｌ）を加え、反応混合物をパールボンブ内に置き、Ｈ２（ｇ）を５０ＰＳＩでチャージし、反応混合物を１６時間撹拌した。反応混合物をろ過し、逆相分取ＨＰＬＣにより、Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ上で、適切に緩衝化したＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエントを用いて精製し、濃縮し、ＬＣＭＳおよびＮＭＲで一致する、５−（３−（（２−シアノプロパン−２−イル）カルバモイル）フェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−６−プロピルフロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボキサミド（２．５ｍｇ，４．７μｍｏｌ，１１％収率）を得た。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.01 - 7.95 (m, 2H), 7.94 (s, 1H), 7.82 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.56 - 7.45 (m, 2H), 7.22 (t, J=8.7 Hz, 2H), 6.58 (s, 1H), 6.09 - 6.01 (m, 1H), 2.99 (d, J=5.0 Hz, 3H), 2.74 - 2.67 (m, 2H), 1.86 (s, 6H), 1.71 - 1.65 (m, 2H), 0.85 (t, J=7.4 Hz, 3H)。ＬＣ−ＭＳ保持時間：２．０５分；ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋：４９９。ＬＣデータは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ−Ｌｕｎａ  ３ｕ  Ｃ１８  ２．０×３０ｍｍ  ｃｏｌｕｍｎを搭載したＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−１０ＡＳ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈで、ＳＰＤ−１０ＡＶ  ＵＶ−Ｖｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを検出器波長２２０ｎＭで用いて記録した。流速が１ｍｌ／分であり、グラジエントが１００％溶媒Ａ／０％溶媒Ｂから０％溶媒Ａ／１００％溶媒Ｂであり、グラジエント時間が２分間であり、ホールド時間が１分間であり、分析時間が３分間である溶出条件（ここに、溶媒Ａは１０％メタノール／９０％Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸であり、溶媒Ｂは１０％Ｈ２Ｏ／９０％メタノール／０．１％トリフルオロ酢酸）を用いた。ＭＳデータを、ＬＣにＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを電気スプレーモードで用いて測定した。
【０１８２】
化合物Ｋ１１００１およびＫ１１００２の調製：
【化１１１】
2017509700.tif 000187
２−（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル）−１，１，３，３−テトラメチルイソウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（４５ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）を、室温で、撹拌した３−（６−（ｓｅｃ−ブチル）−２−（４−フルオロフェニル）−３−（メチルカルバモイル）フロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）安息香酸（３５ｍｇ，０．０７８ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（４１μｌ，０．２４ｍｍｏｌ）および２−アミノ−２−メチルプロパンニトリル塩酸塩（１１ｍｇ，０．０９４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．８μｌ）溶液に加えた。混合物を室温で３０分間撹拌した。全ての反応混合物を、分取ＬＣ／ＭＳにより以下の条件を用いて精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８，１９×２００ｍｍ，５−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；グラジエント：２０分間かけて４０〜８０％Ｂ、次いで１００％Ｂで７分間ホールド；流速：２０ｍｌ／分。所望の生成物を含むフラクションを集め、遠心蒸発（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）により乾燥した。物質をキラル分離によりさらに精製した。
１番目に溶出した異性体：生成物の収率は８．９ｍｇであり、その純度は１００％であった。２つの分析用ＬＣ／ＭＳ注入を用いて最終的な純度を決定した。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：２．９９分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５１３  注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：４．０４分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５１３。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) d 8.86 (s, 1H), 8.55 - 8.47 (m, 1H), 8.10 - 8.02 (m, 2H), 7.98 - 7.94 (m, 1H), 7.90 (s, 2H), 7.66 - 7.61 (m, 1H), 7.59 - 7.55 (m, 1H), 7.43 - 7.36 (m, 1H), 2.93 - 2.86 (m, 1H), 2.81 (d, J=4.3 Hz, 3H), 1.83 - 1.74 (m, 1H), 1.71 (s, 6H), 1.58 - 1.47 (m, 1H), 1.19 (d, J=6.7 Hz, 3H), 0.65 (s, 3H)。
２番目に溶出した異性体：生成物の収率は９．５ｍｇであり、その純度は１００％であった。２つの分析用ＬＣ／ＭＳ注入を用いて最終的な純度を決定した。注入１の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  アセトニトリル：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：１ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：２．９９分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５１３。注入２の条件：カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８，２．０×５０ｍｍ，１．７−μｍ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；移動相Ａ：５：９５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；移動相Ｂ：９５：５  メタノール：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムを含む水；温度：４０℃；グラジエント：０％Ｂで０．５分間ホールド、４分間かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０．５分間ホールド；流速：０．５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ。保持時間：４．０４分、（Ｍ＋Ｈ）＋：５１３。1H NMR (500MHz, DMSO-d6) d 8.82 (s, 1H), 8.50 - 8.45 (m, J=4.3 Hz, 1H), 8.06 (dd, J=8.9, 5.5 Hz, 2H), 7.96 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.92 - 7.85 (m, 2H), 7.67 - 7.60 (m, 1H), 7.60 - 7.54 (m, 1H), 7.41 (t, J=8.9 Hz, 2H), 2.93 - 2.86 (m, 1H), 2.81 (d, J=4.6 Hz, 2H), 1.84 - 1.75 (m, 1H), 1.71 (s, 6H), 1.58 - 1.49 (m, 1H), 1.20 (d, J=6.7 Hz, 3H), 0.66 (t, J=7.3 Hz, 3H)。
【０１８３】
生物学的方法
化合物は、以下のＨＣＶ  ＲｄＲｐアッセイで決定されるように、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂに対する活性を示した。
【０１８４】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲｄＲｐのクローニング、発現および精製。ＨＣＶの、遺伝子型１ｂ（Ｃｏｎ１）、アミノ酸３１６がシステインからアスパラギンに変異した遺伝子型１ｂ変異体、および遺伝子型２ａ（ＪＦＨ−１）、のＮＳ５Ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＴ２１ａ発現ベクターにクローニングした。各タグ無しタンパク質は、溶解性を高めるため、Ｃ末端の１８アミノ酸を短縮して発現させた。大腸菌コンピテント細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、タンパク質を発現させるために用いた。培養液の６００ｎｍにおける光学密度が２．０に達するまで、培養液を３７℃で４時間生育させた。培養液を２０℃に冷却し、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。新鮮なアンピシリンを、終濃度が５０μｇ／ｍＬになるように加え、細胞を２０℃で一晩生育させた。
【０１８５】
細胞ペレット（３Ｌ）を精製用に溶解し、１５〜２４ｍｇの精製ＮＳ５Ｂを得た。溶解緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、０．５ｍｇ／ｍＬ  リゾチーム、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｕｇ／ｍＬ  デオキシリボヌクレアーゼＩおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＴＭ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ）から構成した。溶解緩衝液を加えた後、凍結した細胞ペレットを、組織ホモジナイザーを用いて再懸濁した。サンプルの粘度を低下させるため、溶解物の一部を、ブランソン超音波破砕機に取り付けたマイクロチップを用いて、氷上で超音波破砕した。超音波破砕した溶解物を、１００，０００×ｇにて４℃で３０分間遠心分離し、０．２μｍ  ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通してろ過した。
【０１８６】
タンパク質を、連続する２つのクロマトグラフィー工程、すなわちヘパリンセファロースＣＬ−６ＢおよびポリＵセファロース４Ｂを用いて精製した。クロマトグラフィー緩衝液は溶解緩衝液と同一であるが、リゾチーム、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ＭｇＣｌ２またはプロテアーゼ阻害剤は含んでおらず、かつ緩衝液のＮａＣｌ濃度は、カラム上にタンパク質をチャージするのに必要な条件に従って調整した。各カラムは、カラムのタイプに応じて５から５０カラム体積まで長さが異なるＮａＣｌグラジエントで溶出した。最後のクロマトグラフィー工程の後、得られた酵素の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づくと＞９０％である。酵素を等分し、−８０℃で保存した。
【０１８７】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲｄＲｐ酵素アッセイ。ビーズ上固相均一アッセイ（ｏｎ−ｂｅａｄ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）を３８４ウェルフォーマットで用いて、ＮＳ５Ｂ阻害剤を評価した（WangY-K, Rigat K, Roberts S, and Gao M (2006) Anal Biochem, 359: 106-111）。ビオチニル化オリゴｄＴ１２プライマーを、プライマーおよびビーズを１×緩衝液中で混合することにより、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｅａｄｓ（ＧＥ，ＲＰＮＱ０２６１）上に捕捉し、室温で３時間インキュベートした。結合していないプライマーを遠心分離した後に取り除いた。プライマーを結合したビーズを、３×反応ミックス（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、ｄＴプライマー結合ビーズ、ポリＡテンプレート、３Ｈ−ＵＴＰおよびＲＮＡｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎ２５１５））に再懸濁した。化合物をＤＭＳＯで１：３に段階希釈し、アッセイプレートに等分した。等体積（５μＬ）の水、３×反応ミックスおよび酵素を含む３×アッセイ緩衝液（６０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＤＴＴ、０．０３ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、６％グリセロール）を、アッセイプレート上の希釈した化合物に加えた。３８４ウェルアッセイにおける成分の終濃度：０．３６ｎＭ  テンプレート、１５ｎＭ  プライマー、０．２９μＭ  ３Ｈ−ＵＴＰ（０．３μＣｉ）、１．６Ｕ／μＬ  ＲＮＡｓｅ阻害剤、７ｎＭ  ＮＳ５Ｂ酵素、０．０１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．３３μｇ／μＬビーズ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＫＣｌおよび０．１％ＤＭＳＯ。
【０１８８】
反応は、３０℃で２４時間進行させ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（５μＬ）を加えることにより終了させた。少なくとも１５分間インキュベートした後、プレートをＡｍｅｒｓｈａｍ  ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍで読み取った。
【０１８９】
化合物のＩＣ５０値を、１０の異なる［Ｉ］を用いて決定した。ＩＣ５０値は、阻害から、４パラメーターロジスティック方程式ｙ＝Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ）））を用いて算出し、ここに、ＡおよびＢはそれぞれ、最小および最大％阻害を意味し、ＣはＩＣ５０であり、Ｄは傾き（ｈｉｌｌ  ｓｌｏｐｅ）であり、ｘは化合物濃度を表す。
【０１９０】
細胞株。化合物を評価するのに用いた細胞株は、遺伝子型１ｂ（Ｃｏｎ−１）  ＨＣＶレプリコン、またはアミノ酸３１６のシステインをアスパラギンに置き換えた遺伝子型１ｂ（Ｃｏｎ−１）  ＨＣＶレプリコン、またはレニラルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む遺伝子型２ａ（ＪＦＨ−１）レプリコンを恒常的に発現するヒト肝細胞由来細胞株（Ｈｕｈ−７）から構成した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１．０ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
【０１９１】
ＨＣＶレプリコンルシフェラーゼアッセイ。化合物の有効性を評価するため、漸増させた化合物を、滅菌し組織培地で処理した３８４ウェルプレートに移し、プレートに、４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ＤＭＳＯ終濃度０．５％）に入れたＨＣＶレプリコン細胞（２．４×１０３細胞／ウェルの密度で５０μｌ）を播種した。３７℃で３日間インキュベートした後、細胞を、レニラルシフェラーゼ活性について、ＥｎｄｕＲｅｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ  ＃Ｅ６４８５）を製造業者の指示に従って用いて分析した。簡潔には、ＥｎｄｕＲｅｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅをＤＭＥＭで希釈し、次いで終濃度が７．５μＭになるようにプレートに加えた。プレートを３７℃で少なくとも１時間インキュベートし、次いで、Ｖｉｅｗｌｕｘ  Ｉｍａｇｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で発光プログラムを用いて読み取った。５０％有効濃度（ＥＣ５０）を、上記の４パラメーターロジスティック方程式を用いて算出した。
【０１９２】
化合物の細胞毒性を評価するため、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ＥｎｄｕＲｅｎを含むプレートに加え、３７℃で少なくとも４時間インキュベートした。各ウェルからの蛍光シグナルを、Ｖｉｅｗｌｕｘ  Ｉｍａｇｅｒを用いて読み取った。全てのＣＣ５０値を、４パラメーターロジスティック方程式を用いて算出した。
【０１９３】
化合物のＥＣ５０データを、Ａ：＜１００ｎＭ；Ｂ＝１００〜１０００ｎＭ；Ｃ＞１０００ｎＭ）として表した。化合物の代表的なデータを表２に報告した。
【表２】
2017509700.tif 000188
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【０１９４】
本開示は、上記の例示的実施例に制限されず、またその本質的な特性から逸脱することなく他の具体的な形態で具体化することができることは、当業者に明白であろう。従って、実施例は、全ての点で例示的であって制限的ではなく、言及は、上記の実施例よりはむしろ添付の請求項についてなされ、また従って、請求項の均等物の意味および範囲内に入る全ての変更は、そこに包含されることを意図していると考えられることが望ましい。
【国際調査報告】
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