(57)【要約】  本発明は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインおよび改変された免疫グロブリンＦｃ領域から構成される融合タンパク質に関する。ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインおよびその断片は、優れた免疫調節活性を有し、改変された免疫グロブリンＦｃ領域がそれにカップリングされる場合、免疫調節剤として使用され得る。従って、本発明に従うＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、炎症性腸疾患、大腸炎、乾癬、喘息および関節炎の疾患モデルにおいてその優れた効果を示し、従って、かかる疾患の処置のために非常に有効に使用され得る。
2017519520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片、および改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、以下の式（Ｉ）または（Ｉ’）：
（ＦＴ）w1−Ｘ１−（Ｌ１）w2−（Ｘ２）w3−（Ｌ２）w4−ＩｇＦｃ    （Ｉ）
ＩｇＦｃ−（Ｌ２）w4−（ＦＴ）w1−Ｘ１−（Ｌ１）w2−（Ｘ２）w3    （Ｉ’）
によって示され、
式中、ＦＴは、フェニルアラニンおよびスレオニンからなるジペプチドであり；
ｗ１、ｗ２、ｗ３およびｗ４は各々、０または１であり；
Ｘ１は、配列番号４８または５０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ＰＤ−Ｌ１の前記細胞外ドメインのＩｇ  Ｖ様ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２は各々、リンカーであり；
Ｘ２は、ＰＤ−Ｌ１の前記細胞外ドメインの免疫グロブリンＣ（Ｉｇ  Ｃ）様ドメインを含むポリペプチド、またはその断片であり；ならびに
ＩｇＦｃは、改変された免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＰＤ−Ｌ１の前記細胞外ドメインの前記Ｉｇ  Ｖ様ドメインが、配列番号３９または４０の配列を有する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＰＤ−Ｌ１の前記細胞外ドメインの前記Ｉｇ  Ｃ様ドメインを含む前記ポリペプチドが、配列番号４７または４９の配列を有する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
Ｌ１が、１〜１０アミノ酸からなる、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記アミノ酸が、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）からなる群から選択される、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ｌ１が、配列番号９、４５または４６の配列を有する、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ｌ２が、
グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）およびセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）残基からなる１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチド；または
ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）からなる群から選択される１〜１０アミノ酸からなるポリペプチド、
である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
Ｌ２が、配列番号８、９、４５または４６のアミノ酸配列である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ｗ２が０である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）または（Ｉ’）が、以下の式（Ｉ−ａ）または（Ｉ’−ａ）：
（ＦＴ）w1−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−（Ｌ２）w4−ＩｇＦｃ    （Ｉ−ａ）、または
ＩｇＦｃ−（Ｌ２）w4−（ＦＴ）w1−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２    （Ｉ’−ａ）
によって示され、
式中、ＦＴ−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２は、配列番号４１のアミノ酸配列である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記改変された免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＤおよびＩｇＧ４のＦｃ領域、ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記改変された免疫グロブリンＦｃ領域が、Ｎ末端からＣ末端の方向で配置された、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、
ここで、
前記ヒンジ領域は、ヒトＩｇＤヒンジ領域を含み；
前記ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＤのＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分およびヒトＩｇＧ４のＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含み；ならびに
前記ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基部分を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記改変された免疫グロブリンＦｃ領域が、以下の式（ＩＩ）：
Ｎ’−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’    （ＩＩ）
によって示され、
式中、Ｎ’は、ポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’は、ポリペプチドのＣ末端であり；
ｐは、０または１の整数であり；ならびに
Ｚ１は、配列番号４の９０位〜９８位におけるアミノ酸残基の中で、Ｎ末端に向かう方向で９８位から数えて５〜９連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり、
Ｙは、配列番号４の９９位〜１６２位におけるアミノ酸残基の中で、Ｎ末端に向かう方向で１６２位から数えて５〜６４連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり、
Ｚ２は、配列番号４の１６３位〜１９９位におけるアミノ酸残基の中で、Ｃ末端に向かう方向で１６３位から数えて４〜３７連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり、
Ｚ３は、配列番号５の１１５位〜２２０位におけるアミノ酸残基の中で、Ｎ末端に向かう方向で２２０位から数えて７１〜１０６連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり、および
Ｚ４は、配列番号５の２２１位〜３２７位におけるアミノ酸残基の中で、Ｃ末端に向かう方向で２２１位から数えて８０〜１０７連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列である、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記改変された免疫グロブリンＦｃ領域が、配列番号６、７、４２、４３または４４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記改変された免疫グロブリンＦｃ領域が、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１８】
前記核酸分子が、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１７に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
前記核酸分子が、配列番号２４〜３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
前記核酸分子が、シグナル配列またはリーダー配列をさらに含む、請求項１９に記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
前記シグナル配列が、ｔＰａシグナル配列である、請求項２０に記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
前記ｔＰａシグナル配列が、配列番号３８の核酸配列を含む、請求項２１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、免疫疾患を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項２６】
医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記免疫疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、および細胞、組織または臓器の移植拒絶疾患からなる群から選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記自己免疫疾患が、関節炎、乾癬、自己免疫性糖尿病および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、免疫寛容を誘導するための組成物。
【請求項３０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質および医薬的に許容される担体を対象に投与することを含む、免疫疾患を予防または処置するための方法。
【請求項３１】
前記免疫疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、および細胞、組織または臓器の移植拒絶疾患からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患が、関節炎、乾癬、自己免疫性糖尿病および炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質および医薬的に許容される担体を対象に投与することを含む、免疫寛容を誘導するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤ−Ｌ１を免疫グロブリンＦｃ領域にカップリングさせることによって調製される、安定性および活性が増加しているＰＤ−Ｌ１融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、ＰＤ−Ｌ１またはその特定の断片を含む医薬組成物、より特に、ＰＤ−Ｌ１またはその特定の断片を含む、免疫疾患を処置するための医薬組成物に関する。
【背景分野】
【０００２】
ヒトｈＰＤ−Ｌ１（ヒトプログラム細胞死リガンド１）、ＰＤ−１（プログラム死−１）に対するリガンドは、造血細胞、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞またはマクロファージにおいて発現するだけでなく、非造血細胞、例えば、ケラチノサイト、島細胞または肝細胞においても発現する１型膜貫通タンパク質である。
【０００３】
ＰＤ−Ｌ１に結合するＰＤ−１は、活性化されたＴ細胞およびＢ細胞、マクロファージまたは樹状細胞において主に発現し、ＰＤ−Ｌ１に結合して、Ｔ細胞のサイトカイン産生および細胞増殖を阻害することが公知である。ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１だけでなくＢ７−１にも結合することが報告されており（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００７  Ｊｕｌ；２７（１）：１１１−２２）、これはＢ７−１：ＣＤ２８結合の遮断をもたらしてＴ細胞活性を抑制するだけでなく、Ｂ７−１を介したＴ細胞中への阻害シグナルの伝達もまたもたらす。
【０００４】
その一方、Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞受容体を介した抗原特異的シグナル（シグナル１）と共刺激シグナル（シグナル２）の両方を必要とする。２つのシグナルのうちいずれか一方が存在しない場合、Ｔ細胞はアネルギー性になる。プログラム細胞死１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞に対する共刺激活性を調節する共刺激因子（免疫チェックポイントまたは免疫モジュレーター）である。これは、細胞、例えば、活性化されたＴ細胞（ＣＤ８および／またはＣＤ４）または樹状細胞の表面上で発現するプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７．１（ＣＤ８０）などに結合して、例えばＴ細胞増殖を阻害しＴ細胞におけるサイトカイン発現を低減させるなど、Ｔ細胞の機能を阻害し得る。
【０００５】
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の結合は、調節性Ｔ細胞の活性を誘導することが公知である（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２０１０  Ｊｕｌ；２３６：２１９−４２）。ＰＤ−Ｌ１の免疫寛容誘導機能を試験するために、ＩｇＧ１  ＦｃをＰＤ−Ｌ１に融合させることによって得られたＰＤ−Ｌ１−Ｉｇタンパク質をコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）マウスモデル中に注射したとき、このマウスモデルにおいて関節炎の症状が軽減されたことが観察された（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｉｎｔ．２０１１  Ａｐｒ；３１（４）：５１３−９）。ＰＤ−１は、活性化されたＴ細胞において発現するので、ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、自己免疫疾患だけでなく臓器移植においても免疫寛容を誘導するための、活性化された免疫細胞を特異的に標的化する治療剤として有効に使用され得ると予測される。
【０００６】
今日まで、アンタゴニストとして免疫寛容を破り、それによってＴ細胞活性を増加させるような、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達に関する治療剤が開発されてきた。しかし、アゴニストを使用する、Ｔ細胞免疫寛容ベースの免疫療法剤はいまだ開発されていない。これは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アゴニストが特に、可溶型タンパク質として開発される必要がある一方で、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナルアンタゴニストは、抗体融合テクノロジーを使用して容易に開発され得るからである。
【０００７】
免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ融合テクノロジーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質治療剤の半減期を増加させるために使用され得る。しかし、従来のＩｇ融合テクノロジーで使用されるＩｇＧ１は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をｉｎ  ｖｉｖｏで引き起こす。従って、Ｉｇ融合タンパク質が、自己免疫疾患を処置するための薬剤としてまたは臓器移植において免疫寛容を誘導するための薬剤として使用される場合、それらは、炎症応答を阻害する役割を果たすことができず、むしろ炎症を悪化させる可能性がある。
【０００８】
従って、ＰＤ−Ｌ１の半減期を従来のＩｇ融合タンパク質治療剤と類似のレベルに維持しつつ、ＰＤ−Ｌ１がＡＤＣＣおよびＣＤＣを引き起こすのを防止することによって、免疫抑制剤としてのＰＤ−Ｌ１の治療効果を増加させるテクノロジーを開発する必要がある。
【開示】
【０００９】
【技術的課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＰＤ−Ｌ１の治療効果を増加させるために、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片および改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質を提供することである。本発明の別の目的は、優れた治療効果および高い生産性を示す、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞外ドメイン断片、かかる断片を含む医薬組成物、ならびにそれらの使用を提供することである。
【技術的解決法】
【００１１】
本発明の目的によれば、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片および改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質が提供される。
【００１２】
本発明の別の目的によれば、この融合タンパク質をコードする核酸、この核酸を含むベクター、およびこのベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００１３】
本発明の別の目的によれば、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を哺乳動物宿主細胞中に導入する工程；宿主細胞において融合タンパク質を発現させる工程；および発現させたタンパク質を回収する工程を含む、融合タンパク質を産生するための方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の目的によれば、この融合タンパク質を含む、免疫疾患を予防または処置するための医薬組成物、および免疫寛容を誘導するための組成物が提供される。
【００１５】
本発明の別の目的によれば、この融合タンパク質を投与することを含む、免疫疾患を予防または処置するための方法、および免疫寛容を誘導するための方法が提供される。
【有利な効果】
【００１６】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片および改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む、本発明の融合タンパク質は、従来のＩｇ融合タンパク質よりも高い安定性を有し、大量に産生できるという点で特徴がある。さらに、これはＴ細胞のサイトカイン産生および細胞増殖を阻害でき、また異常に活性化された免疫細胞の機能を阻害し炎症応答を制御できる調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を制御する効果を有する。
【００１７】
従って、本発明の融合タンパク質は、免疫応答の異常な調節によって引き起こされる自己免疫疾患、炎症性疾患および免疫疾患、例えば移植片拒絶疾患を予防もしくは処置するための医薬組成物として、または免疫寛容誘導剤として、有効に使用され得る。具体的には、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片および改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む、本発明の融合タンパク質は、炎症性腸疾患、大腸炎、乾癬、喘息および関節炎の疾患モデルにおいてその優れた効果を示し、従って、かかる疾患の処置のために非常に有効に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を産生するための遺伝子構築物およびそれを使用してｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を産生するための方法を示す。
【図２】図２は、細胞株スクリーニングおよび細胞株の生産性を示す。図２（ａ）は、細胞株スクリーニングのために懸濁細胞株の生産性を比較した結果を示し、図２（ｂ）は、細胞株の培養物生産性を試験し、標的タンパク質を同定するためのＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す。
【図３】図３は、ＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の精製後に、精製産物を同定し、純度を試験するために実施した、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３（ａ））およびＳＥ−ＨＰＬＣ分析（図３（ｂ））の結果を示す。
【図４】図４は、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ組換えタンパク質についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験方法の中の、Ｔ細胞増殖アッセイ方法を示す。
【図５】図５は、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１組換えタンパク質についてのＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。本発明の融合タンパク質による処置は、Ｔ細胞の刺激誘導性増殖を阻害したことが観察された。
【図６】図６は、ＤＳＳ誘導性炎症性腸疾患動物モデルにおける重量減少（図６（ａ））および結腸長低減（図６（ｂ））に対するｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質の阻害効果を観察した結果を示すグラフを示す。
【図７】図７は、ＤＳＳ誘導性炎症性腸疾患動物モデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質の治療効果を分析するために実施した組織学的染色（図７（ａ））および組織学的スコアリング分析（図７（ｂ））の結果を示す。
【図８】図８は、Ｔ細胞誘導性炎症性腸疾患動物モデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質の治療効果を試験した結果を示す。図８（ａ）は、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの投与後の体重における変化を測定した結果を示し、図８（ｂ）は、病変に従って症状スコアリングを比較する。
【図９】図９は、Ｔ細胞誘導性炎症性腸疾患動物モデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質の治療効果を分析するために実施した組織学的染色（図９（ａ））および組織学的スコアリング分析（図９（ｂ））の結果を示す。
【図１０】図１０は、Ｔ細胞誘導性炎症性腸疾患動物モデルにおける重量減少に対するｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質の阻害効果を観察した結果を示す。
【図１１】図１１は、Ｔ細胞誘導性炎症性腸疾患動物モデルにおいてｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質の投与後に結腸ＬＰ細胞によって分泌された炎症性サイトカインの量を測定した結果を示す。
【図１２】図１２は、急性乾癬マウスモデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質の効果を試験するための、組織学的染色を実施した結果（図１２（ａ））および表皮厚さを測定した結果（図１２（ｂ））を示す。
【図１３】図１３は、急性乾癬マウスモデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの効果を試験するために耳厚さを測定した結果を示す。
【図１４】図１４は、急性乾癬マウスモデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの効果を試験するための組織学的染色の結果を示す。
【図１５】図１５は、急性乾癬マウスモデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの処置の後の、表皮厚さにおける変化を測定した結果を示す。
【図１６】図１６は、膵臓移植モデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの免疫拒絶阻害能（免疫寛容）を試験した結果を示す。図１６（ａ）および図１６（ｂ）は、それぞれ、未処置の移植モデルおよびｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質を投与した群における、血中ブドウ糖および体重における変化を観察した結果を示す。
【図１７】図１７は、ｈＰＤ−Ｌ１およびｈｙＦｃ融合タンパク質バリアントの例示的構造を示す模式図である。
【図１８】図１８は、ｈＰＤ−Ｌ１およびｈｙＦｃを含む融合タンパク質バリアントの生産性を比較した結果を示す。図１８（ａ）および図１８（ｂ）は、それぞれ、１９位から開始するアミノ酸残基を有するＮ末端配列の、および２１位から開始するアミノ酸残基を有するＮ末端配列の、ＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す。
【図１９】図１９は、ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の遺伝子構築物およびそれを産生するためのプロセスを示す。
【図２０】図２０は、ｈＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインまたはその断片をｈｙＦｃに融合させることによって得られた組換えタンパク質（ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ）の生産性を示すグラフである（§：ＣＨＯ細胞株から産生された融合タンパク質）。
【図２１】図２１は、産生されたｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質を同定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２２】図２２は、産生されたｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質を同定するためのＨＰＬＣの結果を示す。
【図２３】図２３は、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖に対するｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１の阻害能を試験するためのＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２４】図２４は、ＣＤ８+Ｔ細胞増殖に対するｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１の阻害能を試験するためのＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２５】図２５は、いくつかの細胞株から回収されたｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質のＰＤ−１結合親和性を分析するためのＥＬＩＳＡアッセイ（図２４（ａ））およびＳＰＲアッセイ（図２４（ｂ））の結果を示す。
【図２６】図２６は、正常ホワイトラット（white rat）モデルにおけるｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ＩｇＧ１（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質のｐＫ値を測定した結果を示す。
【図２７】図２７は、種々の濃度のｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１を用いた処置によるＩＬ−２産生阻害を試験した結果を示す。
【図２８】図２８は、Ｔ細胞増殖に対するｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１の阻害能を試験した結果を示す。
【図２９】図２９は、種々の濃度のｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１によるＩＬ−６発現阻害を試験した結果を示す。
【図３０】図３０は、マウス細胞におけるＩＬ−２産生およびＩＦＮ−ガンマ産生に対するｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１の阻害能を試験した結果を示す。
【図３１】図３１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性に対する、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈｙＦｃＭ１の阻害効果を試験した結果を示す。
【図３２】図３２は、濃度に従う、Ｔ細胞におけるＩＦＮ−ガンマ分泌に対する、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１の阻害能を試験した結果を示す。
【図３３】図３３は、濃度に従う、Ｔ細胞増殖に対する、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１の阻害能を測定するためのＭＴＴアッセイの結果を示す。
【図３４】図３４は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＩＬ−２分泌に対する、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１の阻害能を試験した結果を示す。
【図３５】図３５は、Ｔ細胞誘導性炎症性腸疾患動物モデルにおけるｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃの治療効果を試験した結果を示す。図３５（ａ）および図３５（ｂ）は、それぞれ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１の投与後の、症状スコアリング、および体重における変化の結果を示す。
【図３６】図３６は、Ｔ細胞誘導性炎症性腸疾患動物モデルにおける、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１を投与したマウスの生存率を比較した結果を示す。
【図３７】図３７は、急性乾癬マウス動物モデルにおけるｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１の効果を試験するために耳厚さを測定した結果を示す。
【図３８】図３８は、急性乾癬マウス動物モデルにおけるｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１の効果を試験するための組織学的染色の結果を示す。
【図３９】図３９は、急性乾癬マウス動物モデルにおけるｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１の処置後の、表皮組織厚さにおける変化を測定した結果を示す。
【図４０】図４０は、関節リウマチモデルにおける表現型観察の結果をスコアリングすることによって、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質の効果を検証した結果を示す。
【最良の形態】
【００１９】
本発明の目的によれば、一側面では、ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）タンパク質の細胞外ドメインまたはその断片および改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質（「ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質」、「ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質」、「ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質」または「融合タンパク質」）が提供される。
【００２０】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、ＰＤ−Ｌ１の免疫グロブリンＶ（Ｉｇ  Ｖ）様ドメインおよびＰＤ−Ｌ１の免疫グロブリンＣ（Ｉｇ  Ｃ）様ドメインを含むポリペプチドであってもよい。
【００２１】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、細胞膜の外側に曝露されるドメインであり、配列番号３の１９位〜２３８位におけるアミノ酸を含むポリペプチドまたは配列番号３の１９位〜２３９位におけるアミノ酸を含むポリペプチドであってもよい。
【００２２】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）のアミノ酸配列と類似の保存された配列であるＩｇ  Ｖ様配列（Ｉｇ  Ｖ配列）を含み、高度に保存されたＩｇ  Ｖ様配列は、配列番号３の６８位〜１１４位におけるアミノ酸からなる。さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、Ｉｇ  Ｃ様配列（Ｉｇ  Ｃ配列）を含み、高度に保存されたＩｇ  Ｃ様配列は、配列番号３の１５３位〜２１０位におけるアミノ酸からなる。さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン断片は、ＰＤ−Ｌ１のＩｇ  Ｖ様配列を含むＩｇ  Ｖ様ドメインの少なくとも一部を含んでいてもよい。
【００２３】
さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインまたはその断片は、ヒトまたはマウス起源のものであってもよい。
【００２４】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、配列番号３の１９位〜２３９位におけるアミノ酸からなるポリペプチド（配列番号４１）または配列番号１の１９位〜２３９位におけるアミノ酸からなるポリペプチドを含んでいてもよい。さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、配列番号４１または１の１９位〜２３９位におけるアミノ酸からなるポリペプチド配列に対して、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超の相同性を有していてもよい。
【００２５】
さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインのＩｇ  Ｖ様ドメインは、ＰＤ−１と相互作用するドメインであり、配列番号３の２１位〜１１４位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の１９位〜１１４位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の２１位〜１２０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の１９位〜１２０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の２１位〜１２７位におけるアミノ酸を有するポリペプチド（配列番号４８）、配列番号３の１９位〜１２７位におけるアミノ酸を有するポリペプチド（配列番号３９）、配列番号３の２１位〜１３０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の１９位〜１３０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の２１位〜１３１位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の１９位〜１３１位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の２１位〜１３３位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の１９位〜１３３位におけるアミノ酸を有するポリペプチド（配列番号４０）、配列番号３の２１位〜２３９位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、または配列番号３の１９位〜２３９位におけるアミノ酸を有するポリペプチド（配列番号４１）であってもよい。
【００２６】
さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインのＩｇ  Ｖ様ドメインは、配列番号１の２１位〜１１４位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の１９位〜１１４位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の２１位〜１２０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の１９位〜１２０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の２１位〜１２７位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の１９位〜１２７位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の２１位〜１３０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の１９位〜１３０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の２１位〜１３１位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の１９位〜１３１位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の２１位〜１３３位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の１９位〜１３３位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号１の２１位〜２３９位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、または配列番号１の１９位〜２３９位におけるアミノ酸を有するポリペプチドであってもよい。
【００２７】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン断片が、Ｉｇ  Ｖ様ドメインまたはその断片を含む場合、これは、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインの免疫グロブリンＣ（Ｉｇ  Ｃ）様ドメインをさらに含んでいてもよい。このＩｇ  Ｃ様ドメインは、配列番号３の１３３位〜２２５位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、または配列番号３の１３４位〜２２５位におけるアミノ酸を有するポリペプチドであってもよい。
【００２８】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン断片が、Ｉｇ  Ｖ様ドメインまたはその断片を含む場合、これは、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインのＩｇ  Ｃ様ドメインを含むポリペプチドまたはその断片をさらに含んでいてもよい。Ｉｇ  Ｃ様ドメインを含むポリペプチドは、Ｉｇ  Ｖドメインを除いたＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを指し、配列番号３の１３４位〜２３９位におけるアミノ酸を有するポリペプチド（配列番号４７）、または配列番号３の１３４位〜２３８位におけるアミノ酸を有するポリペプチド（配列番号４９）であってもよい。
【００２９】
特に、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質は、２９０アミノ酸残基を有し、配列番号３によって示されるアミノ酸配列（アクセッション番号：Ｑ９ＮＺＱ７）を有する。配列番号３のアミノ酸配列中のＮ末端の１位〜１８位におけるアミノ酸残基からなる配列は、シグナル配列である。成熟ヒトＰＤ−Ｌ１は、配列番号３の１９位〜２９０位におけるアミノ酸からなるタンパク質である。ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、配列番号３の１９位〜２３８位におけるアミノ酸残基または配列番号３の１９位〜２３９位におけるアミノ酸残基を含む。
【００３０】
ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質は、配列番号３の１９位〜１２７位におけるアミノ酸からなるＩｇ  Ｖ様ドメインおよび配列番号３の１３４位〜２２６位におけるアミノ酸からなるＩｇ  Ｖ様ドメインを含む。
【００３１】
マウスＰＤ−Ｌ１は、２９０アミノ酸を含み、配列番号１によって示されるアミノ酸配列（アクセッション番号：Ｑ９ＥＰ７３）を有すると報告された。配列番号１の１位〜１８位におけるアミノ酸残基からなる配列は、シグナル配列であり、成熟マウスＰＤ−Ｌ１タンパク質は、配列番号１の１９位〜２９０位におけるアミノ酸からなる。
【００３２】
配列番号１の１９位〜２３９位におけるアミノ酸からなる配列は、細胞外ドメインである。マウスＰＤ−Ｌ１タンパク質は、配列番号１の１９位〜１２７位におけるアミノ酸からなるＩｇ  Ｖ様タンパク質および配列番号１の１３３位〜２２４位におけるアミノ酸からなるＩｇ  Ｃ様ドメインからなる。
【００３３】
一態様では、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン断片は、Ｉｇ  Ｖ様ドメインまたはその断片を含んでいてもよい。さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン断片は、Ｉｇ  Ｃ様ドメイン、またはＩｇ  Ｃ様ドメイン（即ち、Ｉｇ  Ｖ様ドメインを除いたＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン）を含むポリペプチドをさらに含んでいてもよい。
【００３４】
ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインまたはその断片は、種々の改変されたタンパク質またはペプチドを含んでいてもよい。この改変は、ＰＤ−Ｌ１の機能を変化させない限り、野生型ＰＤ−Ｌ１における少なくとも１アミノ酸の、置換、欠失または付加であってもよい。かかる種々のタンパク質またはペプチドは、野生型タンパク質に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有していてもよい。
【００３５】
慣習的に、野生型タンパク質のアミノ酸残基は、アラニン、またはタンパク質全体の正味の電荷、極性もしくは疎水性に対してほとんどもしくは全く影響を与えない保存的アミノ酸で、置換されてもよい。
【００３６】
保存的アミノ酸置換は、参照のために以下の表１に示される。
【００３７】
【表１】
2017519520.tif 000003
【００３８】
各アミノ酸について、さらなる保存的置換は、アミノ酸のホモログを含む。ここで使用する場合、用語「ホモログ」とは、アミノ酸の側鎖のベータ位置に挿入されたメチレン基（ＣＨ2）を有するアミノ酸を指す。
【００３９】
かかる「ホモログ」の例には、ホモフェニルアラニン、ホモアルギニン、ホモセリンなどが含まれるがこれらに限定されない。ここで使用する場合、用語「ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン」は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインおよびその断片を含む意図である。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、特記しない限り、互いに相互交換可能に使用され得る。
【００４０】
ここで使用する場合、用語「ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質」および「ＰＤ−Ｌ１−改変された免疫グロブリンのＦｃ領域融合タンパク質」の各々は、融合タンパク質を指し、このとき、ＰＤ−Ｌ１タンパク質、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン、またはそれらの断片は、改変された免疫グロブリンＦｃ領域とカップリングされる。
【００４１】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、配列番号４１の配列を有していてもよい。
【００４２】
さらに、２つのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃコンジュゲートは、ダイマーを形成してもよい。ここで、各Ｆｃドメインは、ダイマーを形成するためにＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインに連結されてもよい。ＰＤ−Ｌ１は、Ｆｃドメインに直接、またはリンカーを介して連結されてもよい。
【００４３】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、配列番号３の１９位〜１３３位におけるアミノ酸残基の中で、Ｃ末端に向かう方向でＮ末端の１９位から数えて９６〜１１５連続するアミノ酸残基を有するポリペプチドを含んでいてもよい。
【００４４】
好ましくは、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、配列番号３の１９位〜１３３位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の１９位〜１３１位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の１９位〜１３０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の１９位〜１２７位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、配列番号３の１９位〜１２０位におけるアミノ酸を有するポリペプチド、および配列番号３の１９位〜１１４位におけるアミノ酸を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【００４５】
さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、配列番号１の１９位〜２３９位におけるアミノ酸からなるポリペプチドを含んでいてもよい。さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、配列番号１の１９位〜１３３位におけるアミノ酸からなるポリペプチドを含んでいてもよい。
【００４６】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、配列番号１または３の配列に対して、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超の相同性を有していてもよい。
【００４７】
さらに、ＰＤ−Ｌ１のＩｇＣ様ドメイン、またはＩｇ  Ｃ様ドメインを含むポリペプチドは、リンカーを介してＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインまたはその断片に連結されてもよい。
【００４８】
リンカーは、１〜１０アミノ酸、好ましくは３〜６アミノ酸からなるポリペプチドであってもよい。リンカーのアミノ酸は、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）からなる群から選択されてもよい。
【００４９】
リンカーは、ＶＫＶ、ＫＶＮ、ＶＮＡおよびＮＡＰのアミノ酸配列を含んでいてもよい。好ましくは、リンカーは、配列番号９、４５または４６のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００５０】
さらに、リンカーは、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）およびセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）残基からなる３〜１５アミノ酸、好ましくは６〜１１アミノ酸からなるポリペプチドであってもよい。本発明の一態様では、リンカーは、ＧＳＧＧＧＳまたはＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳのアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００５１】
本発明の融合タンパク質は、リンカーをさらに含んでいてもよい。ここで、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインおよび改変された免疫グロブリンＦｃは、リンカーを介して互いに連結してもよい。リンカーは、Ｆｃ断片のＮ末端、Ｃ末端またはフリーのラジカルに連結してもよく、また、ＰＤ−Ｌ１のＮ末端、Ｃ末端またはフリーのラジカルに連結してもよい。リンカーがペプチドリンカーである場合、連結は、特定の連結部位において生じてもよい。リンカーおよびＦｃを別々に発現させた後に互いにカップリングさせる場合、このカップリングは、当該分野で公知の特定の架橋剤を使用して実施してもよい。架橋剤の例には、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸、ジスクシンイミジルエステルを含むイミドエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）および二官能性マレイミド、例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが含まれるがこれらに限定されない。
【００５２】
さらに、リンカーはまた、アルブミンリンカーまたはペプチドリンカーであってもよい。ペプチドリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基からなる１０〜２０アミノ酸残基からなるペプチドであってもよい。ペプチドリンカーはまた、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）からなる群から選択される１〜１０アミノ酸からなるペプチドであってもよい。
【００５３】
リンカーは、配列番号８、９、４５または４６のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００５４】
一態様では、この融合タンパク質は、式（Ｉ）または（Ｉ’）：
（ＦＴ）w1−Ｘ１−（Ｌ１）w2−（Ｘ２）w3−（Ｌ２）w4−ＩｇＦｃ    （Ｉ）
ＩｇＦｃ−（Ｌ２）w4−（ＦＴ）w1−Ｘ１−（Ｌ１）w2−（Ｘ２）w3    （Ｉ’）
によって示されてもよく、
式中、ＦＴは、フェニルアラニンおよびスレオニンからなるジペプチドであり；
ｗ１、ｗ２、ｗ３およびｗ４は各々、０または１であり；
Ｘ１は、配列番号４８または５０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ＰＤ−Ｌ１のＩｇ  Ｖ様ドメインであり；
Ｌ１およびＬ２は各々、リンカーであり；
Ｘ２は、ＰＤ−Ｌ１の免疫グロブリンＣ（Ｉｇ  Ｃ）様ドメインを含むポリペプチド、またはその断片であり；ならびに
ＩｇＦｃは、改変された免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００５５】
さらに、ＰＤ−Ｌ１のＩｇ  Ｃ様ドメインを含むポリペプチドは、配列番号４７または４９のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００５６】
この式中のＬ１は、１〜１０アミノ酸、好ましくは３〜６アミノ酸からなっていてもよい。アミノ酸は、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）からなる群から選択されてもよい。Ｌ１は、配列番号９、４５または４６のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００５７】
この式中のＬ２は、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）およびセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）残基からなる１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチド；またはロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）からなる群から選択される１〜１０アミノ酸からなるポリペプチド、であってもよい。Ｌ２は、配列番号８、９、４５または４６のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００５８】
ここで、ｗ１、ｗ２、ｗ３またはｗ４は、０または１であってもよい。具体的には、ｗ２が０である場合、ＰＤ−Ｌ１のＩｇ  Ｖ様ドメインは、Ｉｇ  Ｃ様ドメインを含むペプチドまたはその断片に直接カップリングされ得る。ｗ２およびｗ３が各々１である場合、この融合タンパク質は、式（Ｉ−ａ）または（Ｉ’−ａ）：
（ＦＴ）w1−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−（Ｌ２）w4−ＩｇＦｃ    （Ｉ−ａ）、または
ＩｇＦｃ−（Ｌ２）w4−（ＦＴ）w1−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２    （Ｉ’−ａ）
によって示される構造式を有していてもよい。
【００５９】
ここで、ＦＴ−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２は、配列番号４１のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００６０】
さらに、ｗ３およびｗ４が各々０である場合、この融合タンパク質は、式（Ｉ−ｂ）または（Ｉ’−ｂ）：
（ＦＴ）w1−Ｘ１−Ｌ１−ＩｇＦｃ    （Ｉ−ｂ）、または
ＩｇＦｃ−（ＦＴ）w1−Ｘ１−Ｌ１    （Ｉ’−ｂ）
によって示される構造式を有していてもよい。
【００６１】
ここで、ＦＴ−Ｘ１−Ｌ１は、配列番号４０のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００６２】
さらに、ｗ２、ｗ３およびｗ４が各々０である場合、この融合タンパク質は、式（Ｉ−ｃ）または（Ｉ’−ｃ）：
（ＦＴ）w1−Ｘ１−ＩｇＦｃ    （Ｉ−ｃ）、または
ＩｇＦｃ−（ＦＴ）w1−Ｘ１    （Ｉ’−ｃ）
によって示される構造式を有していてもよい。
【００６３】
ここで、ＦＴ−Ｘ１は、配列番号３９のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００６４】
さらに、改変された免疫グロブリンＦｃ領域（式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ’−ａ）、（Ｉ−ｂ）および（Ｉ’−ｂ）中の「ＩｇＦｃ」）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＤおよびＩｇＧ４のＦｃ領域のいずれか１つ、ならびにそれらの組み合わせであってもよい。
【００６５】
Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域がＦｃ受容体および／または補体に結合しないように、改変される。特に、改変された免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｎ末端からＣ末端へと配置された、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ヒンジ領域は、ヒトＩｇＤヒンジ領域を含んでいてもよく、ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＤおよびヒトＩｇＧ４のＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含んでいてもよく、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基部分を含んでいてもよい。
【００６６】
ここで使用する場合、用語「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ」とは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）および重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むが、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域ならびに軽鎖定常領域１（ＣＬ１）は含まない、タンパク質を指す。このタンパク質は、重鎖定常領域のヒンジ領域をさらに含んでいてもよい。「ハイブリッドＦｃ」または「ハイブリッドＦｃ断片」はまた、ここで、「ｈＦｃ」または「ｈｙＦｃ」と呼ばれてもよい。ここで使用する場合、用語「Ｆｃ領域バリアント」とは、Ｆｃ領域のアミノ酸の一部を置換することまたは異なる型のＦｃ領域を組み合わせることによって調製されたＦｃ領域を指す。Ｆｃ領域バリアントは、ヒンジ領域における切断を防止するために改変されてもよい。具体的には、配列番号４の１４４位および／または１４５位におけるアミノ酸が変異されてもよい。好ましくは、これは、配列番号４の１４４位におけるアミノ酸ＫがＧまたはＳで置換され、配列番号４の１４５位におけるアミノ酸ＥがＧまたはＳで置換された、バリアントであってもよい。
【００６７】
改変された免疫グロブリンＦｃ領域またはＦｃ領域バリアントは、式：
Ｎ’−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’
によって示されてもよく、
式中、Ｎ’は、ポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’は、ポリペプチドのＣ末端であり；
ｐは、０または１の整数であり；ならびに
Ｚ１は、配列番号４の９０位〜９８位におけるアミノ酸残基の中で、Ｎ末端に向かう方向で９８位から数えて５〜９連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり、
Ｙは、配列番号４の９９位〜１６２位におけるアミノ酸残基の中で、Ｎ末端に向かう方向で１６２位から数えて５〜６４連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり、
Ｚ２は、配列番号４の１６３位〜１９９位におけるアミノ酸残基の中で、Ｃ末端に向かう方向で１６３位から数えて４〜３７連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり、
Ｚ３は、配列番号５の１１５位〜２２０位におけるアミノ酸残基の中で、Ｎ末端に向かう方向で２２０位から数えて７１〜１０６連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列であり、および
Ｚ４は、配列番号５の２２１位〜３２７位におけるアミノ酸残基の中で、Ｃ末端に向かう方向で２２１位から数えて８０〜１０７連続するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。
【００６８】
改変されたＩｇ  Ｆｃドメインは、米国特許第７，８６７，４９１号に開示されるものであってもよく、改変されたＩｇ  Ｆｃドメインの産生は、米国特許第７，８６７，４９１号の開示を参照して実施されてもよい。
【００６９】
さらに、本発明におけるＦｃ断片は、ネイティブ糖鎖、ネイティブ形態と比較して増加した糖鎖、もしくはネイティブ形態と比較して減少した糖鎖を有する形態であってもよく、または脱グリコシル化形態であってもよい。免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増加、減少または除去は、当該分野で公知の従来の方法、例えば、化学的方法、酵素的方法および微生物を使用する遺伝子操作方法などによって、達成されてもよい。Ｆｃ領域からの糖鎖の除去は、Ｃ１ｑに対する、第１の補体成分Ｃ１の結合親和性の激減、および抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）における減少または喪失を生じ、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで不必要な免疫応答を誘導しない。これに関して、脱グリコシル化または非グリコシル化形態の免疫グロブリンＦｃ断片は、薬物担体として、本発明の目的のためにより適切であり得る。ここで使用する場合、用語「脱グリコシル化」とは、Ｆｃ断片からの糖部分の酵素的除去を意味し、用語「非グリコシル化」とは、Ｆｃ断片が、原核生物、好ましくは大腸菌（E. coli）によって、グリコシル化されていない形態で産生されることを意味する。
【００７０】
さらに、改変された免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号６（ｈｙＦｃ）、７（ｈｙＦｃＭ１）、４２（ｈｙＦｃＭ２）、４３（ｈｙＦｃＭ３）または４４（ｈｙＦｃＭ４）のアミノ酸配列を含んでいてもよい。さらに、改変された免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号２のアミノ酸配列（非溶解性マウスＦｃ）を含んでいてもよい。
【００７１】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、改変された免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端にカップリングされてもよい。ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン−改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質は、配列番号１０〜２３のアミノ酸配列を有していてもよい。一態様では、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン−改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質は、配列番号１２、１３、１８または１９のアミノ酸配列を有していてもよい。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン−改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質は、配列番号１４、１５、１６、１７、２０、２１、２２または２３のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００７２】
なお別の態様では、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン−改変された免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質は、配列番号１０〜２３のアミノ酸配列に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超の配列相同性を有する配列を有していてもよい。
【００７３】
本発明の別の側面では、この融合タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。
【００７４】
この核酸分子は、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。この核酸分子は、配列番号２４〜３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００７５】
この核酸分子は、シグナル配列またはリーダー配列をさらに含んでいてもよい。
【００７６】
ここで使用する場合、用語「シグナル配列」とは、宿主細胞におけるその翻訳後に切断される、生物学的に活性な分子薬剤または融合タンパク質の分泌を指向させる断片を指す。本発明におけるシグナル配列は、小胞体（ＥＲ）の膜を横切るタンパク質の輸送を開始させるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明において有用なシグナル配列には、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ  １９８９．１２５：１９１−２０２）、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  １９８０．２８６：６７６−６８３）、および当該分野で公知の他のシグナル配列（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８４．１２：５１４５−５１６４を例えば参照のこと）が含まれる。
【００７７】
シグナルペプチドは、当該分野で十分に特徴付けられており、１６〜３０アミノ酸残基を含むことが一般に公知であるが、より多いまたは少ない数のアミノ酸残基を含んでいてもよい。典型的なシグナルペプチドは、３つの領域からなる：塩基性Ｎ末端領域、疎水性中心領域およびより極性の高いＣ末端領域。
【００７８】
疎水性中心領域は、未成熟ポリペプチドの輸送の間に膜脂質二重層を横切ってシグナル配列をアンカリングする、４〜１２の疎水性残基を含む。開始後、シグナル配列は、通常、シグナルペプチダーゼとして公知の細胞性酵素によって、小胞体の内腔内で切断される。このシグナル配列は、ｔＰａ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）、ＨＳＶ  ｇＤまたは成長ホルモンの分泌シグナル配列であってもよい。好ましくは、このシグナル配列は、哺乳動物細胞を含む高等真核生物細胞において使用される分泌シグナル配列であってもよい。より好ましくは、これは、ｔＰａ配列、または配列番号１もしくは３の１位〜１８位におけるアミノ酸からなるアミノ酸配列であってもよい。最も好ましくは、このシグナル配列は、配列番号３８のＤＮＡ配列を含んでいてもよい。さらに、本発明において使用される分泌シグナル配列のコドンは、宿主細胞において高い発現頻度を有するコドンで置換されてもよい。
【００７９】
本発明のなお別の側面では、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインおよび改変された免疫グロブリンＦｃ領域から構成される融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターが提供される。
【００８０】
ここで使用する場合、用語「ベクター」は、宿主細胞ゲノムと組換えられ宿主細胞ゲノム中に組み込まれるように宿主細胞中に導入され得る、またはエピソームとして自律的に複製することが可能なヌクレオチド配列を含む核酸（nuclear acid）ビヒクルを指すと理解される。かかるベクターには、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどが含まれる。ウイルスベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれるがこれらに限定されない。
【００８１】
ここで使用する場合、用語「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターが導入され得る原核生物または真核生物細胞を指す。ここで使用する場合、用語「形質転換された」および「トランスフェクトされた」は、当該分野で公知のいくつかの技術による、細胞中への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含する意図である。
【００８２】
ここで使用する場合、用語「遺伝子発現」または標的タンパク質の「発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質産物または抗体もしくは抗体断片の分泌を意味すると理解される。
【００８３】
有用な発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）またはそのバリアントであってもよい。有用な発現ベクターは、哺乳動物細胞における標的遺伝子の構成的転写のためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、および転写後のＲＮＡの定常状態レベルを増加させるためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を保有していてもよい。本発明の一態様では、発現ベクターは、ＲｃＣＭＶの改変されたベクターであるｐＡＤ１５である。
【００８４】
本発明のなお別の側面では、この発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。適切な宿主細胞は、本発明のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトされ得、標的タンパク質の発現および／または分泌のために利用され得る。本発明における使用のための現在好ましい宿主細胞には、不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣａｐＴ細胞（ヒト羊水由来細胞）およびＣＯＳ細胞が含まれる。
【００８５】
哺乳動物細胞における融合タンパク質または抗体もしくは抗体断片の高レベル発現のために使用される１つの発現系は、５’から３’の方向で、シグナル配列および免疫グロブリンＦｃ領域を含む分泌カセットをコードするＤＮＡ構築物である。
【００８６】
本発明のなお別の側面では、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインまたはその断片および改変された免疫グロブリンＦｃ領域から構成される融合タンパク質を含む、免疫疾患を予防または処置するための医薬組成物が提供される。
【００８７】
ここで、この免疫疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、および細胞、組織または臓器の移植拒絶疾患からなる群から選択されてもよい。
【００８８】
この自己免疫疾患は、関節炎［急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症（degenerative arthritis）、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、椎骨関節炎（vertebral arthritis）、および関節リウマチ、例えば、若年発症型関節リウマチ（juvenile-onset rhematoid arthritis）、変形性関節炎（osteoarthritis）、慢性進行性関節炎（arthritis chronica progrediente）、変形性関節症（arthritis deformans）、慢性原発性多発性関節炎（polyarthritis chronica primaria）、反応性関節炎、および強直性脊椎炎］、乾癬、例えば、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、尋常性乾癬、滴状乾癬（gutatte psoriasis）、膿疱性乾癬、および爪の乾癬、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎（herpetiformis dermatitis）、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、じんま疹、例えば、慢性アレルギー性じんま疹および慢性自己免疫性じんま疹を含む慢性特発性じんま疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症（全身性強皮症を含む）、全身性強皮症、多発性硬化症（ＭＳ）を含む硬化症、例えば、脊髄視神経ＭＳ（spino-optical MS）、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症（sclerosis disseminata）、および失調性硬化症（ataxic sclerosis）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）［例えば、クローン病、自己免疫介在性消化管疾患、大腸炎、例えば、潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis）、潰瘍性大腸炎（colitis ulcerosa）、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン大腸炎、ポリープ性大腸炎（colitis polyposa）、壊死性腸炎、および全層性大腸炎（transmural colitis）、および自己免疫性炎症性腸疾患］、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎（上強膜炎）
、成人または急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸促迫症候群、髄膜炎、ブドウ膜の全てまたは一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、リウマチ性脊椎炎、急性難聴、ＩｇＥ介在性疾患、例えば、アナフィラキシーならびにアレルギー性およびアトピー性鼻炎、脳炎（encephalitis）、例えば、ラスムッセン脳炎ならびに辺縁系および／または脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例えば、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎（phacoantigenic uveitis）、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群ありまたはなしの糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば、慢性または急性糸球体腎炎、例えば、原発性ＧＮ、免疫介在性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性腎症または特発性膜性ＧＮ、Ｉ型およびＩＩ型を含む膜性増殖性（membrano-またはmembranous proliferative）ＧＮ（ＭＰＧＮ）、および急速進行性ＧＮ、アレルギー性疾患、アレルギー性反応、アレルギー性またはアトピー性湿疹を含む湿疹、喘息、例えば、気管支喘息（asthma bronchiale）、気管支喘息（bronchial asthma）および自己免疫性喘息、Ｔ細胞浸潤および慢性炎症応答と関連する疾患、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球粘着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または全身性エリテマトーデス、例えば、皮膚ＳＬＥ、亜急性皮膚エリテマトーデス、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡（lupus erythematosus disseminatus）、ループス[腎炎、脳炎（cerebritis）、小児、非腎、腎外、円板状、および脱毛症を含む]、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年発症型（Ｉ型）糖尿病、成人発症型（ＩＩ型）糖尿病、自己免疫性糖尿病、特発性尿崩症、Ｔリンパ球およびサイトカインによって媒介される急性および遅延型過敏症と関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症、無顆粒球症を含む肉芽腫症、血管炎［大型血管炎（giant vessel vasculitis）（リウマチ性多発筋痛および高安動脈炎を含む］、川崎病、結節性多発動脈炎を含む中型血管炎、顕微鏡的多発動脈炎、ＣＮＳ関節炎、壊死性、皮膚または過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、ＡＮＣＡ関連血管炎を含む血管炎、例えば、チャーグ・ストラウス血管炎または症候群（ＣＳＳ）、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス良性貧血（coombs benign anemia）、ダイアモンド・ブラックファン貧血、溶血性貧血または自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫−溶血性貧血、悪性貧血（pernicious anemia）（悪性貧血（anemia perniciosa））、アジソン病、純赤血球性貧血無形成症（pure red cell anemia aplasia）（ＰＲＣＡ）、第ＶＨＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外漏出関連疾患、ＣＮＳ炎症性障害、多臓器損傷症候群（multiple organ injury syndrome）、例えば、敗血症、外傷または出血に対して二次的なもの、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット（Bechet'sまたはBehcet's）病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群（Goodpasture's syndrom）、レイノー症候群（Reynaud's syndrome）、シェーグレン症候群、スティ��ブンス・ジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば、水疱性類天疱瘡および皮膚類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡（pemphigus mucus-membrane pemphigoid）、および紅斑性天疱瘡を含む）、多腺性自己免疫内分泌障害、ライター病または症候群、免疫複合体腎炎、抗体介在性腎炎、視神経脊髄炎、多発ニューロパチー、慢性ニューロパチー、例えば、ＩｇＭ多発ニューロパチーまたはＩｇＭ介在性ニューロパチー、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および自己免疫性または免疫介在性血小板減少症、例えば、慢性または急性ＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含む血小板減少症（例えば、心筋梗塞患者において発症するもの）、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫性障害、原発性甲状腺機能低下症、甲状腺炎を含む甲状腺機能低下症、例えば、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性内分泌疾患、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）または亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、多腺性症候群、例えば、多腺性自己免疫症候群（または多腺性内分泌症候群（polyglandular endocrinopathy syndrome））、傍腫瘍性神経症候群を含む傍腫瘍性症候群、例えば、ランバート・イートン筋無力症症候群またはイートン・ランバート症候群、スティッフ・マンまたはスティッフ・パーソン症候群、脳脊髄炎、例えば、アレルギー性脳脊髄炎（allergic encephalomyelitis）またはアレルギー性脳脊髄炎（encephalomyelitis allergica）、および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、重症筋無力症、例えば、胸腺腫関連重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋強直症、眼球クローヌスまたは眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、および感覚性ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球様間質性肺炎（lymphoid interstitial pneumonitis）、閉塞性細気管支炎（非移植片）対ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、鎖状ＩｇＡ皮膚症、原発性胆汁性肝硬変、肺硬変（pneumonocirrhosis）、自己免疫性腸症症候群、セリアック病（Celiac disease）、セリアック病（Coeliac disease）、セリアックスプルー（グルテン腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例えば、自己免疫性内耳疾患（ＡＧＥＤ：autoimmune inner ear disease）、自己免疫性難聴、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、多発性軟骨炎、例えば、難治性または再発性多発性軟骨炎、肺胞蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増加症、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症（例えば、良性単クローン性γグロブリン血症および意義不明の単クローン性γグロブリン血症；ＭＧＵＳ）を含む原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパチー、傍腫瘍性症候群、てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、聴覚消失、失明、周期性四肢麻痺、チャネル病、例えば、ＣＮＳチャネル病、自閉症、炎症性ミオパチー、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌眼症（endocrine opthalmopathy）、網膜ブドウ���炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病学的障害、線維筋痛症、多発性内分泌不全（multiple endocrine failure）、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症（gastric atrophy）、初老期認知症、脱髄疾患、例えば、自己免疫性脱髄疾患、糖尿病性腎症、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症）、レイノー現象、食道蠕動低下、強指症、および毛細血管拡張性運動失調症、男性および女性不妊症、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、鳥飼病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎（benign lymphocytic angiitis）、アルポート症候群、肺胞炎、例えば、アレルギー性肺胞炎および線維性骨膜炎（fibrous periostitis）、間質性肺疾患、輸血疾患（transfusion diseases）、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス（kypanosomiasis）、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サムター症候群（Sampter's syndrome）、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑（erythema elevatum et diutinum）、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群（Shulman's syndrome）、フェルティー症候群、フィラリア症、毛様体炎、例えば、慢性毛様体炎、異色症慢性毛様体炎（heterochromia chronic cyclitis）、虹彩毛様体炎またはフックス毛様体炎（Fuch's cyclitis）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＥＣＨＯウイルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、予防接種後症候群、先天性風疹感染、エプスタイン・バーウイルス感染、ムンプス、エバンス症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎（poststreptococcal nephritis）、閉塞性血栓血管炎（thromboangitis obliterans）、甲状腺中毒症、脊髄ろう、脈絡膜炎（chorioiditis）、巨細胞性多発性筋痛（giant cell polymyalgia）、内分泌眼症（endocrine ophthamopathy）、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型ネフローゼ、良性家族性および虚血再灌流障害（ischemia-reperfusion injury）、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、無精子形成（aspermiogenese）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎（endophthalmia phacoanaphylactica）、アレルギー性腸炎（enteritis allergica）、らい性結節性紅斑（erythema nodosum leprosum）、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱（febris rheumatica）、ハンマン・リッチ病（Hamman-Rich's disease）、感音難聴、血色素尿症発作（haemoglobinuria paroxysmatica）、性腺機能低下症、限局性回腸炎（ileitis regionalis）、白血球減少症、伝染性単核症（mononucleosis infectiosa）、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎（ophthalmia symphatica）、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発神経根炎（polyradiculitis acuta）、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎（Quervain's thyroiditis）、後天性脾臓萎縮症（acquired spenic atrophy）、抗精子（antispermatozoan）抗体に起因する不妊症、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤおよびエプスタイン・バーウイル���関連疾患、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、寄生生物疾患、例えば、リーシュマニア症（Lesihmaniasis）、毒素ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞浸潤と関連する疾患、白血球粘着不全症、サイトカインおよびＴ細胞によって媒介される急性および遅延型過敏症と関連する免疫応答、白血球血管外漏出関連疾患、多臓器損傷症候群、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、多腺性自己免疫内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎（sympathetic ophthalmia）、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全（polyendocrine failure）、末梢性ニューロパチー、Ｉ型多腺性自己免疫症候群、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ：adult-onset idiopathic hypoparathyroidism）、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎、または蝶形骨洞炎、好酸球性障害、例えば、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増多筋痛症候群、レフレル症候群（Loffler's syndrome）、慢性好酸球性肺炎、局所肺好酸球増多症、気管支肺アスペルギルス症（bronchopneumonic aspergillosis）、アスペルギルス腫、または好酸球を含む肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎（seronegative spondyloarthritides）、多内分泌（polyendocrine）自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルトン症候群（Bruton's syndrome）、乳児期の一過性低γグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、膠原病と関連する自己免疫性障害、リウマチ、神経学的疾患、虚血再灌流障害（ischemic reperfusion disorder）、血圧応答における低減、血管機
能不全、血管拡張症、組織傷害、心血管虚血、痛覚過敏、脳虚血、および血管新生を伴う疾患、アレルギー性過敏性障害、糸球体腎炎（glomerulonephritides）、再潅流障害、心筋または他の組織の再潅流障害、急性炎症性成分を有する皮膚症、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性障害、眼および眼窩の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導性毒性、急性重篤炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺硬変、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈障害（diabetic large-artery disorder）、動脈内過形成（endarterial hyperplasia）、消化性潰瘍、弁膜炎、および子宮内膜症からなる群から選択されてもよい。
【００８９】
炎症性疾患は、リウマチ性疾患（関節リウマチ、変形性関節炎および乾癬性関節炎が含まれるがこれらに限定されない）、脊椎関節症（強直性脊椎炎、反応性関節炎およびライター症候群が含まれるがこれらに限定されない）、結晶性関節炎（痛風、偽痛風およびピロリン酸カルシウム沈着疾患が含まれるがこれらに限定されない）、ライム病、リウマチ性多発筋痛；結合組織疾患（全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群が含まれるがこれらに限定されない）；血管炎（結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群が含まれるがこれらに限定されない）；外傷または虚血の結果を含む炎症性疾患；サルコイドーシス；アテローム硬化性血管疾患、アテローム動脈硬化症、血管閉塞性疾患（アテローム動脈硬化症および虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中および末梢血管疾患が含まれるがこれらに限定されない）、および血管ステント再狭窄を含む血管疾患；ならびにブドウ膜炎、角膜疾患、虹彩炎、虹彩毛様体炎および白内障を含む眼疾患からなる群から選択されてもよい。
【００９０】
好ましくは、免疫疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、移植拒絶疾患、大腸炎、乾癬、喘息、自己免疫性糖尿病、炎症性腸疾患および関節炎からなる群から選択されてもよい。
【００９１】
本発明のなお別の側面では、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインおよび改変された免疫グロブリンＦｃ領域から構成される融合タンパク質を含む、免疫寛容を誘導するための組成物が提供される。ここで使用する場合、用語「免疫寛容」とは、継続的な免疫抑制状態ではない状態であって、免疫系が特異的抗原に対する組織破壊応答を示さない状態を指す。特に、この融合タンパク質は、調節性Ｔ細胞が関与する免疫寛容のために使用され得る。好ましくは、この融合タンパク質は、組織移植の際に生じる免疫応答を阻害するために使用され得る。
【００９２】
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインまたはその断片を含む融合タンパク質は、医薬的に許容される担体を含んでいてもよい。医薬的に許容される担体は、それが抗体を患者に送達するのに適切な非毒性物質である限り、任意の担体であってもよい。担体の例には、滅菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性固体が含まれる。医薬的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）もまた、医薬組成物中に含まれていてもよい。
【００９３】
さらに、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインまたはその断片を含む融合タンパク質は、種々の方法で対象に投与されてもよい。例えば、医薬組成物は、非経口、例えば、皮下、筋内または静脈内投与されてもよい。かかる組成物は、当該分野で周知の従来の無菌化技術を使用して無菌化されてもよい。この組成物は、生理学的条件、例えばｐＨを調整するために必要に応じて、医薬的に許容される補助的物質、緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでいてもよい。投薬形態中の融合タンパク質の濃度は、広く、例えば、約０．５重量％未満、通常または少なくとも約１重量％から、１５重量％または２０重量％もの多くまで変動してもよく、選択された投与の特定の様式に従って、流体の体積、粘度などに主に基づいて選択されてもよい。
【００９４】
本発明のなお別の側面では、薬理学的に活性な成分としてＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を含む組成物を投与することによって疾患を処置するための方法が提供される。
【００９５】
かかる方法は、目的の疾患に直接関連していてもしていなくてもよい健康状態を有する哺乳動物に有効量のＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を投与することを含む。例えば、所望のＰＤ−Ｌ１融合タンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡが、対象、好ましくは哺乳動物に、治療剤として投与され得る。さらに、ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞が、対象、好ましくは哺乳動物に、治療剤として投与され得る。さらに、ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質は、治療有効量で、対象、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物に投与され得る。このキメラポリペプチドは、静脈内、皮下、経口的、経口、舌下、経鼻、非経口、直腸、膣または肺経路を介して投与されてもよい。
【００９６】
本発明の組成物は、任意の経路で投与されてもよい。本発明の組成物は、任意の適切な手段によって、直接的に（例えば、局所的に、組織座位への注射、インプラント術または外用投与によって）または全身的に（例えば、非経口または経口的に）によって、動物に提供されてもよい。本発明の組成物が、非経口で、例えば、静脈内、皮下、点眼、腹腔内、筋内、経口、直腸、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、脳室内、くも膜下腔内、大槽内、関節内、鼻腔内によって、またはエアロゾル投与によって提供される場合、この組成物は、好ましくは、水性または生理学的に適合性の流体懸濁物または溶液の部分を含む。従って、患者の電解質および／または体積バランスに対して有害な影響を与えることがない、組成物への添加剤として患者に送達され得る担体またはビヒクルは、生理学的に許容される。従って、製剤化のための流体媒体は、一般に、生理的食塩水を含んでいてもよい。
【００９７】
本発明のＰＤ−Ｌ１融合タンパク質をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物（または遺伝子構築物）は、ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質をコードする核酸を送達するために、遺伝子治療プロトコールの一部として使用され得る。
【００９８】
本発明では、特定の型の細胞におけるＰＤ−Ｌ１融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスフェクションおよび発現のための発現ベクターは、所望のＰＤ−Ｌ１の機能を再構築または補完するために、特定の生物学的に有効な担体と共に投与され得る。例えば、ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質コード遺伝子またはその融合タンパク質構築物をｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に有効に送達することが可能な特定の投薬形態または組成物が、使用され得る。
【００９９】
ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質をコードする核酸を使用する遺伝子治療のために、標的遺伝子は、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス−１を含むウイルスベクター、または組換え細菌もしくは真核生物プラスミド中に挿入されてもよい。本発明の融合タンパク質をコードする核酸の投与のための投薬量は、ヒトについて、０．１〜１００ｍｇの範囲である。一例では、本発明の融合タンパク質をコードする核酸の投与のための好ましい投薬量は、ヒトについて、１〜１０ｍｇの範囲である。別の例では、本発明の融合タンパク質をコードする核酸の投与のための好ましい投薬量は、ヒトについて、２〜１０ｍｇの範囲である。投与の最適な投薬量および様式は、当業者の技術範囲内の慣用的な実験によって決定されてもよい。
【０１００】
本発明の融合タンパク質の投与のための好ましい単位投薬量は、ヒトについて、０．１〜１，５００ｍｇ／ｋｇの範囲である。一例では、融合タンパク質の投与のための好ましい単位投薬量は、ヒトについて、１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。別の例では、融合タンパク質の投与のための好ましい単位投薬量は、ヒトについて、５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与の最適な投薬量は、慣用的実験によって決定されてもよいことが理解される。融合タンパク質の投与は、周期的ボーラス注射によって、または外部（例えば、静脈内バッグから）もしくは内部（例えば、生体分解性（bioerodable）インプラントから）レザバからの継続的な静脈内、皮下もしくは腹腔内投与によって、実施されてもよい。
【０１０１】
本発明の組成物は、この組成物によって予防もしくは処置される疾患を予防もしくは処置する効果を有する１以上の他の薬物もしくは生理学的に活性な物質と組み合わせて投与されてもよく、またはかかる他の薬物もしくは物質との組み合わせ製剤の形態で製剤化されてもよい。
【０１０２】
本発明の融合タンパク質または組成物を使用して目的の疾患を予防または処置するための方法は、本発明の融合タンパク質または組成物と組み合わせて、その疾患を予防または処置する効果を有する１以上の他の薬物または生理学的に活性な物質を投与することもまた含んでいてもよい。ここで、投与の経路、タイミングおよび投薬量は、疾患の型、患者の疾患状態、処置または予防の目的、および組み合わせて使用される他の薬物または生理学的に活性な物質に依存して、決定されてもよい。
【０１０３】
発明のための様式
以下、本発明は、諸例によって詳細に説明される。以下の例は、その範囲を限定することなく、本発明をさらに例示する意図である。
【０１０４】
Ｉ．マウスＰＤ−Ｌ１およびマウスＦｃ領域を使用したＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質の調製、ならびにその活性の分析
例１：ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ（マウスＰＤ−Ｌ１−マウス非溶解性ＩｇＧ２ａ）遺伝子構築物の調製
マウスＰＤ−Ｌ１タンパク質（ｍＰＤ−Ｌ１）およびヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質（ｈＰＤ−Ｌ１）は、約７０％の配列相同性を有する。従って、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質がマウスに反復して投与される場合、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）が発生する可能性があり、これにより、一部の場合には、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の正確な効力を予測することが困難になり得る。
【０１０５】
従って、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用して実験を実施する前に、マウスＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質の効果を、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験によって分析した。非溶解性Ｆｃ（以下で「ｍＦｃ」と呼ぶ）を構築して、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを産生することが可能な遺伝子構築物を提供し、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを発現する細胞株を構築した。この組換えタンパク質発現細胞株を、懸濁培養し、培養培地を収集し、その後、組換えタンパク質を、カラム精製によって回収した。得られたｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価した。
【０１０６】
特に、マウスＰＤ−Ｌ１遺伝子を含むベクターを構築するために、既知のアミノ酸配列（アクセッション番号：Ｑ９ＥＰ７３、配列番号１）の細胞外ドメインを、マウスＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１、ｍＰＤ−Ｌ１）遺伝子として使用した。さらに、融合パートナーＦｃ領域として、それがＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）を引き起こさなように、バリアント配列を使用した。マウスＩｇＧ２ａの構築されたバリアントＦｃ領域（配列番号２）を、ｍＰＤ−Ｌ１と融合させて、組換えタンパク質の産生のための発現ベクターを得た。
【０１０７】
ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ遺伝子（配列番号２４）を含むｐＡＤ１５−ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃプラスミドを、この遺伝子が動物細胞株において発現し得るように、図１に示したように構築した。構築された発現ベクターを、エレクトロポレーションによって、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）−ＤＧ４４細胞株中に形質転換した。形質転換された細胞株の中で、遺伝子の高い発現レベルを示す細胞を、ＥＬＩＳＡ定量分析によって選択した。「ＭＴＸ増幅−単クローン性選択−生産性測定」プロセスを、メトトレキサート（ＭＴＸ）の量を段階的に増加させながら反復して、高発現細胞株を選択した（図２（ａ））。選択された最終細胞株を懸濁培養し、標的タンパク質を、ＳＥ−ＨＰＬＣによって検証した（図２（ｂ））。
【０１０８】
例２：ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質の産生
ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ（マウスＰＤ−Ｌ１−マウス非溶解性ＩｇＧ２ａ）タンパク質（配列番号１０）を大量に産生するために、標的タンパク質を、例１において得られたｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ懸濁細胞株によって産生された細胞培養培地から分離および精製した。
【０１０９】
タンパク質を精製するために、タンパク質精製プロセスを、２８０ｎｍのＵＶ波長において経時的にモニタリングした。結果として、標的タンパク質の溶出が、溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０）がプロテインＡ樹脂カラムを通過したときに出現したピークによって検証された（図３）。さらに、精製されたｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、結果として、タンパク質サイズは、非還元条件において約１５０ＫＤａおよび還元条件において約７５ＫＤａであり、これは、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃがホモダイマーの形態であることを示している（図３ａ）。さらに、精製産物を、ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析してその純度を決定し（図３ｂ）、不純物エンドトキシンのレベルを測定し、それによって、効果の評価における使用のための精製された標的タンパク質を得た。
【０１１０】
例３：ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の評価
例２において精製されたｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質（配列番号１０）の活性を評価するために、このタンパク質の免疫抑制効果を、マウス脾細胞を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した。
【０１１１】
図４に模式的に示すように、抗ＣＤ３およびｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を、１：１または１：４の比で、マイクロビーズ上にコートした。さらに、ビーズおよびマウス脾細胞を１０：１の比で使用して、脾細胞を刺激した（５×１０6ビーズ：５×１０5脾細胞）。
【０１１２】
抗ＣＤ３抗体およびｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質でコートしたマイクロビーズを使用して、マウス脾細胞を、マイクロウェルプレートにおいて刺激した。４８時間後、マウス脾細胞における細胞増殖因子Ｋｉ−６７の発現レベルを分析した。
【０１１３】
結果として、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質によるマウス脾細胞の増殖の阻害（Ｋｉ−６７発現における低減）が観察され、これは、このｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質が免疫抑制活性を有することを示している（図５）。
【０１１４】
例４：ＩＢＤ（炎症性腸疾患）マウスモデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質の効果の評価
例４−１：ＤＳＳ誘導性腸炎モデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの効果の評価
ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価するために、ヒト急性炎症性腸疾患モデルと類似したＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）誘導性マウス腸炎モデルを、ＩＢＤ（炎症性腸疾患）モデルとして使用した。
【０１１５】
ＤＳＳ誘導性腸炎では、炎症細胞が結腸中に浸潤することが公知である。結腸への自然免疫細胞の遊走に対するｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質の効果を試験するために、Ｔ細胞およびＢ細胞を欠くＲａｇ−１ノックアウト（ＫＯ）マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳ）を使用したＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）誘導性マウス腸炎モデルにおいて、評価を実施した。ＤＳＳを含む飲用水の供給の開始後２日目に、３０μｇのｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質（例２において得られた）を、各マウスに腹腔内で１回投与した。
【０１１６】
結果として、図６に示されるように、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を投与した群における重量減少（図６（ａ））および結腸長低減（図６（ｂ））は、ＤＳＳ含有飲用水単独を供給したコントロール群と比較して軽減された。その一方、ＤＳＳの供給後９日目に、結腸を単離し、ＨＥ（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色に供した（図７ａ）。単離された組織の組織学的分析を、盲検様式で実施し、結果として、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を投与したマウスは、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を投与していないマウスと比較して、より低い程度の結腸組織損傷を示し、組織構造を維持した（図７（ｂ））。
【０１１７】
ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質は、急性炎症性腸疾患に対して治療効果を有し、腸の非リンパ系細胞の保護および処置において重要な役割りもまた果たすことが確認された。
【０１１８】
例４−２：Ｔ細胞によって誘導された腸炎モデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの効果の評価
Ｔ細胞によって誘導された慢性マウス腸炎モデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を試験した。
【０１１９】
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢ高Ｔ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞から分離した。次に、５×１０5の分離されたＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢ高Ｔ細胞を、Ｔ細胞およびＢ細胞を欠くＲａｇ−１  ＫＯマウスに腹腔内注射した。Ｔ細胞注射の３週間後から、２０μｇの例２において得られたｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を、合計４回にわたって、１週間間隔で各マウスに腹腔内注射した。コントロールとして、２００μｇのＣＴＬＡ４−ＩｇＧ１融合タンパク質（Ｏｒｅｎｃｉａ）を、１週間に３回（合計１２回）、各マウスに腹腔内注射した。コントロールの投薬量および投与の様式については、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、２０１２：４１２１７８を参照した。全実験期間を通じて、マウスの体重における変化を観察し、マウスにおける臨床的スコアを記録した。
【０１２０】
臨床的スコアを、猫背の姿勢（０または１）、便（０〜３）および結腸厚さ（０〜３）の項目に基づいて決定した。
【０１２１】
結果として、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを投与した実験群の場合、重量減少は、有意に低減され（図８（ａ））、臨床的スコアもまた、コントロール群からの有意差を示した（図８（ｂ））。さらに、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質の総投薬量は、コントロールＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１（Ｏｒｅｎｃｉａ）の約１／３０であったものの、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質は、コントロールのものと類似の効果を示した。
【０１２２】
さらに、組織学的分析を、ＨＥ（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色（図９（ａ））後に盲検様式で実施したところ、結果として、組織への損傷の程度は、コントロール群においてよりも、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を投与した実験群において、より低かったことが示された（図９（ｂ））。
【０１２３】
実験を、上記と同じ方法によって反復した。結果として、Ｔ細胞によって誘導された慢性マウス腸炎モデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質の投与による腸炎の軽減に起因する重量減少の低減（図１０）が確認された。さらに、結腸における炎症性サイトカインの発現を測定したところ、結果として、ＩＮＦ−ｇ、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０の分泌が阻害されたことが示された（図１１）。
【０１２４】
上の例に示したように、マウスＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖を阻害する効果を有し、急性および慢性の炎症性疾患に有効であり、病変において見出される炎症性サイトカインの発現を阻害する。即ち、上の結果は、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質が、ＩＢＤおよびＩＢＤ関連炎症性疾患に対する治療剤として使用される可能性が高いことを示している。
【０１２５】
例５：乾癬の処置におけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質の効果の試験
４０ｍｇのイミキモド（ＩＭＱ；ＡＬＤＡＲＡ  ＣＲＥＡＭ、３Ｍ）を、６日間にわたって実験マウスの両耳に適用して、急性乾癬を誘導した。マウスを、正常マウス群、乾癬の誘導後に処置しない群、および乾癬の誘導と共にｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を投与する群に分割し、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの治療効果を試験した。１、２、４および６日目に、２００μｇのｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを、各マウスに腹腔内投与した。
【０１２６】
最初の投与後７日目に、耳を病理組織学的に試験し（図１２（ａ））、ＩＭＱ誘導性乾癬群における乾癬の病理学的組織知見、例えば、表皮厚さなどを、比較観察した（図１２（ｂ））。結果として、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを投与した群における表皮厚さは、コントロール群と比較して、統計的に有意なレベルにまで低減された。
【０１２７】
さらに、急性乾癬マウスモデルにおけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの効果を試験するために、４０ｍｇのイミキモド（ＩＭＱ）を、６日間にわたって実験マウスの両耳に適用して、急性乾癬を誘導した。マウスを、正常マウス群、乾癬の誘導後に処置しない群、マウス抗ｐ４０抗体を投与した群、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質を投与した群、ならびに抗Ｐ４０抗体およびｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃで同時処置した群に分割し、次いで、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質の治療効果を試験した。１および４日目に、１００μｇの抗Ｐ４０抗体を、各マウスに腹腔内投与した。２００μｇのｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを、１、２、４および６日目に、各マウスに腹腔内投与した。
【０１２８】
最初の投与後に、耳の厚さを毎日観察して、乾癬の表現型を試験した。
【０１２９】
結果として、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃまたは抗Ｐ４０抗体を投与した群は、未処置の群と比較して、乾癬の発症を遅延させる統計的に有意な効果を示した（図１３）。
【０１３０】
さらに、７日目に、耳を病理組織学的に試験し、ＩＭＱ誘導性乾癬群における乾癬の病理学的組織、例えば、表皮厚さを、比較観察した。結果として、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを投与した群における表皮厚さは、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを投与していない他の群と比較して、統計的に有意なレベルにまで低減されたことが示された（図１４）。
【０１３１】
さらに、表皮厚さはまた、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを投与していない他の群と比較して、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを投与した群において、統計的に有意なレベルにまで低減されたことが示された（図１５）。
【０１３２】
これらの結果は、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質が、乾癬に対する治療効果を有すること、および特に、抗Ｐ４０抗体と組み合わせたｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの使用が最良の効果を示すことを示している。
【０１３３】
例６：関節リウマチ（ＲＡ）の処置におけるｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質の効果の観察
ＣＩＡ（コラーゲン誘導性関節炎）マウスモデルを関節リウマチ（ＲＡ）モデルとして使用して、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの治療効果を試験した。ＣＩＡマウスを、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびコラーゲンの１：１混合物を正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳ）に２週間間隔で投与してＲＡを誘導することによって得た。ＣＩＡマウスモデルにおけるマウスを、薬物投与なしの群、１００μｇまたは３００μｇのｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ（例２において得られた）を投与した群、および３００μｇの抗ＴＮＦ−アルファ抗体を投与した群に分割した。各々の薬物を、４週間にわたって１週間に３回腹腔内投与し、次いで、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの治療効果を試験した。
【０１３４】
最初の投与後３７日目に、表現型を、臨床的スコア、足首厚さにおける変化などを測定することによって観察した。これらの結果を合わせて、関節炎スコアを決定した。結果として、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを投与した群における臨床的スコアは、他の群と比較して統計的に有意なレベルにまで低減されたことが示された。さらに、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ融合タンパク質は、市販の抗ＴＮＦ−アルファ抗体と類似の効果を示したことが観察された（図４０）。
【０１３５】
例７：免疫寛容に対するｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質の効果の観察
ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃタンパク質が移植拒絶応答を阻害できるかどうかを試験するために、島（ｉｓｌｅｔ）同種移植片マウスモデルを使用して、以下の実験を実施した。
【０１３６】
最初に、他のマウス種（Ｃ５７／ＢＬ６）由来の健康な島を、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性膵臓破壊を有するマウス（ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ））に移植した。このマウスモデルのマウスを、薬物投与なしの群および１００μｇのｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ（例２において得られた）を投与した群に分割した。次いで、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを、移植の０日目（島を移植した日）ならびに７および１４日目に、各マウスに投与した。各マウスの血中ブドウ糖レベルおよび体重を、島移植の２週間前から実験の最後までの範囲の期間の間に測定し、結果をグラフによって示した。ここで、参照血中ブドウ糖レベルは、点線として示し、参照体重は、灰色の領域として示した。
【０１３７】
結果として、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを投与していない群では、血中ブドウ糖レベルは、参照血中ブドウ糖レベルを上回って持続的に増加したこと、および体重もまた減少したことが観察された（図１６（ａ））。しかし、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃを投与した群（図１６（ｂ））では、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの最初の投与後１７日間にわたって、血中ブドウ糖レベルは、移植拒絶応答についての参照血中ブドウ糖レベルである２００ｍｇ／ｄｌ以下に維持され、体重もまた徐々に増加した。即ち、他の種由来の移植された島は、ｍＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃによって誘導された、移植に対する免疫寛容に起因して、免疫拒絶反応なしに血中ブドウ糖制御の機能を果たし得ることが見出された。
【０１３８】
ＩＩ．ヒトＰＤ−Ｌ１またはその断片および免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の試験
例８：ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ（ヒトＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ）遺伝子構築物の調製
ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質を得るために、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを引き起こさず、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させ得る、改変されたＦｃ領域を、ヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子に融合させて、組換えタンパク質を産生した。
【０１３９】
具体的には、ヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子を含む発現ベクターを調製するために、ヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子の公知のアミノ酸配列（アクセッション番号：Ｑ９ＮＺＱ７）を使用した。さらに、細胞外ドメイン単独を含む構築物を調製した。ＰＤ−Ｌ１遺伝子を、改変されたＦｃドメインに融合させて、組換えタンパク質発現ベクターを得た。
【０１４０】
改変されたＦｃドメインは、米国特許第７，８６７，４９１号においてｈｙＦｃ（ハイブリッドＦｃ）として記載されている。ｈｙＦｃタンパク質は、ヒトＩｇＤ  ＦｃおよびヒトＩｇＧ４  Ｆｃのハイブリッドであり、生理学的に活性なタンパク質にカップリングされる場合、既存の改変された免疫グロブリンＦｃ領域と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有意に増加させることができる。種々の型のｈｙＦｃタンパク質の中で、配列番号６（ｈｙＦｃ）のアミノ酸配列または配列番号７（ｈｙＦｃＭ１）のアミノ酸配列を、この実験において使用して、組換えタンパク質発現ベクターを調製した。
【０１４１】
種々のｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質およびｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質は、配列番号１２〜２３によって示されるアミノ酸配列を有する。さらに、ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質およびｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２６〜３７によって示される。
【０１４２】
さらに、ｈＰＤ−Ｌ１−リンカー−ｈｙＦｃ融合タンパク質を調製した。この例では、ＧＳ６またはＧＳ１１をリンカーとして使用した。ＧＳ６とは、ＧＳＧＧＧＳのアミノ酸配列からなるペプチドを指し、ＧＳ１１とは、ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳのアミノ酸配列からなるペプチドを指す。
【０１４３】
最初に、Ｎ末端配列の開始コドンを決定するために、ＰＤ−Ｌ１  ＶドメインのＮ末端領域中に２アミノ酸の欠失を有する断片（２１〜２３９）を融合させることによって得られた組換えタンパク質（アミノ酸配列については配列番号１３および１９を参照のこと；ならびに組換えタンパク質をコードする核酸配列については配列番号２７および３３を参照のこと）の評価を実施した。結果として、Ｎ末端領域中に２アミノ酸の欠失を有する組換えタンパク質は、比較的低い生産性を有することが見出された（図１７および１８）。
【０１４４】
さらに、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインの種々の断片（１９〜２３９、１９〜１３３、１９〜１２７、１９〜１２０および１９〜１１４）（アミノ酸配列については配列番号１２、１４〜１８および２０〜２３を参照のこと；ならびに断片をコードする核酸配列については配列番号２６、２８〜３２および３４〜３７を参照のこと）をｈｙＦｃのＮ末端に融合させた遺伝子を含む組換え発現ベクターを構築した（図１９）。構築された発現ベクターの各々を、ＣＡＰ−Ｔ細胞株（ＣＡＰ−Ｔ（商標）産生系）またはＣＨＯ細胞株中にトランスフェクトした。次に、細胞を、７日間培養し、各細胞株の生産性を、収集した培養培地を使用して試験した。
【０１４５】
例９：ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ（ヒトＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ）タンパク質の単離
上記例８においてＣＡＰ−ＴおよびＣＨＯ産生系を使用して産生された種々のＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃタンパク質の発現レベルを、ＥＬＩＳＡアッセイによって試験した（図２０）。培養培地から種々のｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃタンパク質を単離および精製するために、タンパク質精製プロセスを、２８０ｎｍのＵＶ波長において、プロテインＡ樹脂を使用して、時間の経過によってモニタリングした。図２２に示されるように、標的タンパク質の溶出が、溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０）がＳＥ−ＨＰＬＣ分析において精製カラムを通過したときに出現したピークを分析することによって検証された。さらに、タンパク質のサイズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に分析した（図２１）。
【０１４６】
結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ＧＳ６−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ＧＳ１１−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質は、ＣＡＰ−Ｔ細胞株から高収量で得ることができ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞株から高収量で得ることができた。
【０１４７】
例１０：ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の試験
例１０−１：Ｔ細胞増殖阻害および炎症性サイトカイン発現の比較
ＰＤ−Ｌ１のＶ様ドメインならびにＰＤ−Ｌ１のＶおよびＣ様ドメインを含む種々の形態のｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質の活性を試験した。
【０１４８】
２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および各融合タンパク質（ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ）を、１：１または１：４の比で混合して、混合物溶液を調製し、これを、５×１０5細胞／ウェルのマウス脾細胞に与えた。
【０１４９】
抗ＣＤ３抗体による脾細胞の刺激の７２時間後、マウス脾細胞における細胞増殖因子Ｋｉ−６７の発現レベルを、ＦＡＣＳによって分析して、細胞増殖に対するｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃの効果を決定した。
【０１５０】
結果として、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン（ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１）およびその断片（ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１）は、マウス脾細胞においてＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞増殖を阻害したことが示された（低減されたＫｉ−６７発現；図２３および２４）。特に、ＣＤ８+Ｔ細胞増殖に対するこのタンパク質の濃度依存的阻害効果は、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖に対するものよりも有意であった。
【０１５１】
例１０−２：結合親和性の測定
ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１に結合して、Ｔ細胞増殖または炎症性サイトカイン分泌を阻害することが公知である。従って、図１６に示されるようにＰＤ−１と種々のＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質との間の結合親和性を測定して、融合タンパク質の薬理学的活性を予測した。
【０１５２】
マウスＰＤ−１（ｍＰＤ−１）およびヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）の結合配列は、十分に保存されており、従って、ヒトＰＤ−Ｌ１はマウスＰＤ−１に結合し得ることが公知である。ｍＰＤ−１を、プレート表面上にコートし、次いで、種々の濃度のｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質で処理し、その後、ｍＰＤ−１と融合タンパク質との間の結合親和性を、ＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。
【０１５３】
結果として、ＰＤ−Ｌ１のＶドメイン単独を含む融合タンパク質（ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１）だけでなく、ＰＤ−Ｌ１のＶおよびＣドメインを含む融合タンパク質（ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１）もまた、ＰＤ−１への優れた結合能を有していたことが示された（図２５（ａ））。
【０１５４】
さらに、結合親和性を、ＳＰＲアッセイによって評価した。最初に、ｈＰＤ−１でコートしたＰｒｏｔｅｉｎ  ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７６−５０１１）を調製した。コーティングの完了後、チップを、それぞれ、１０００、５００、２５０、１００および５０ｎＭの濃度の、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１で処理した。融合タンパク質の各々を、４０または５０μｌ／分の量で２４０秒間または３００秒間にわたって、ｈＰＤ−Ｌ１コートしたチップ上を流れさせた。次に、ベースライン値を、再生緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＯＨ）を使用して決定し、上記工程を反復した。次に、結合曲線を、タンパク質結合分析デバイス（Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６、ＢＩＯ−ＲＡＤ、ＵＳＡ）を使用して得た。
【０１５５】
結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１は全て、濃度依存的様式でｈＰＤ−１に結合したことが示された（図２５（ｂ））。さらに、会合定数（Ｋａ）値および解離定数（Ｋｄ）値に基づいて、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１が、類似の結合親和性を有していたこと、ならびにＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性が、Ｆｃがカップリングされていない単一タンパク質のものと大きくは異ならなかったことが示された。
【０１５６】
例１１：ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の測定（ＫＲ１０−２００８−００９４７８１Ａを参照のこと）
本発明に従う融合タンパク質の薬物動態を試験するために、融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を、ＫＲ１０−２００８−００９４７８１Ａの開示を参照して測定した。
【０１５７】
例１１−１：融合タンパク質の調製
ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインまたはその断片を免疫グロブリンＦｃと融合させることによって調製した。融合パートナーＦｃとして、ヒト起源の野生型ＩｇＧ  Ｆｃの各々、ならびに例９において調製したｈｙＦｃおよびｈｙＦｃＭ１を使用した。
【０１５８】
ここで、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインとして、全長ペプチド（ＶＣ、１９−２３９）、配列番号３の２１位〜２３９位におけるアミノ酸を含むｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）断片、配列番号３の１９位〜１３３位におけるアミノ酸を含むｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）断片、配列番号３の１９位〜１３０位におけるアミノ酸を含むｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）断片、配列番号３の１９位〜１２７位におけるアミノ酸を含むｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−１２７）断片、配列番号３の１９位〜１２０位におけるアミノ酸を含むｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２０）断片、および配列番号３の１９位〜１１４位におけるアミノ酸を含むｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１１４）断片を使用した。調製を、例５および６に記載したのと同じ方法によって実施した。
【０１５９】
結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２０）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１１４）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈＦｃ（ＩｇＧ１）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２０）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１１４）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）−ｈｙＦｃＭ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２０）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１１４）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ＧＳ６−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ＧＳ１１−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２０）−ｈｙＦｃＭ１、およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１１４）−ｈｙＦｃＭ１が得られた。この例では、ＧＳ６とは、ＧＳＧＧＧＳのアミノ酸配列からなるペプチドを指し、ＧＳ１１とは、ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳのアミノ酸配列からなるペプチドを指す。
【０１６０】
例１１−２：融合タンパク質の薬物動態学的研究
ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン断片の半減期を、その細胞外ドメインを含む融合タンパク質のものと比較するために、コントロールとして、２ｍｇ／ｋｇのＦｃフリーのＰＤ−Ｌ１タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号１００８４−Ｈ０８Ｈ）を、動物群に静脈内投与し、各群は、２匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）からなった。注射前、ならびに注射の５分、３０分、２時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間および３３６時間後に、血液を、動物からサンプリングした。血液サンプルを、室温で３０分間インキュベートして凝血させた。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、血清を各サンプルから収集し、超低温冷凍庫中で貯蔵した。各サンプルを、ＰＤ−Ｌ１を特異的に検出することが可能な試験方法を使用して、いくつかの希釈比率で定量した。
【０１６１】
ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２０）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１１４）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈＦｃ（ＩｇＧ１）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２０）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１１４）−ｈＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）−ｈｙＦｃＭ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２０）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１１４）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３０）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２０）−ｈｙＦｃＭ１、またはｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１１４）−ｈｙＦｃＭ１を、皮下または静脈内注射した。
【０１６２】
結果として、Ｆｃ、ｈｙＦｃまたはｈｙＦｃＭ１をカップリングさせたＰＤ−Ｌ１の半減期は、ＰＤ−Ｌ１単一タンパク質よりも長かったことが示された。さらに、ｈｙＦｃまたはｈｙＦｃＭ１をカップリングさせたＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインまたはその断片を含む融合タンパク質の半減期は、Ｆｃ（ＩｇＧ１）をカップリングさせたＰＤ−Ｌ１のものよりも有意に長かったことが示された（図２６）。
【０１６３】
例１２：ＰＤ−Ｌ１もしくはその断片、またはそれを含む融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の比較−Ｔ細胞増殖阻害および炎症性サイトカイン発現の比較
精製されたｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）（配列番号４１）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）（配列番号４０）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）（配列番号３９）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃ（配列番号１２）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃ（配列番号１４）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈｙＦｃ（配列番号１５）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１（配列番号１８）、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、２１−２３９）−ｈｙＦｃＭ１（配列番号１９）、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１（配列番号２０）、およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）−ｈｙＦｃＭ１（配列番号２１）の活性を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞を使用して、ヒトＰＤ−Ｌ１のＴ細胞増殖阻害効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで比較した。
【０１６４】
抗ＣＤ３および各ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質を、１：１または１：４の比でマイクロビーズ上にコートした。さらに、ビーズおよびマウス脾細胞を１０：１の比で使用して、脾細胞を刺激した（５×１０6ビーズ：５×１０5脾細胞）。
【０１６５】
マウス脾細胞を、マイクロウェルプレートにおいて刺激した。４８時間の刺激後、マウス脾細胞における細胞増殖因子Ｋｉ−６７の発現レベルを、ＦＡＣＳによって分析して、細胞増殖に対するｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃの効果を測定した。
【０１６６】
結果として、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインおよびその断片、ＦｃをカップリングさせたＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインおよびその断片、ならびにｈｙＦｃまたはｈｙＦｃＭ１をカップリングさせたＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインおよびその断片は、マウス脾細胞においてＣＤ４+／ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を阻害したこと（低減された発現のＫｉ−６７）が示された（図５）。抗マウスＣＤ３抗体で刺激した脾細胞の約３０．１％は、Ｋｉ−６７を発現したが、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１（配列番号１８）で処理した実験群では、Ｔ細胞増殖は阻害され、Ｋｉ−６７発現細胞の比率における減少をもたらした。特に、１：４の比で処理した場合、脾細胞の増殖は低減され、従って、Ｋｉ−６７発現細胞の比率は、６．９％にまで減少した。
【０１６７】
例１３：ＰＤ−Ｌ１もしくはその断片、またはそれを含む融合タンパク質のＩＬ−２産生阻害活性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質がヒトＴ細胞を阻害する能力を試験するために、ＲＡ（関節リウマチ）患者から得たＰＢＭＣを、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１で処理し、次いで、これらの細胞におけるＩＬ−２の発現レベルを分析した。ＩＬ−２は、活性化されたＴ細胞において発現する典型的なサイトカインである。ＰＢＭＣの活性化のために、これらの細胞を、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（植物性血球凝集素）で処理し、同時に、０、１０および５０μｇ／ｍｌの濃度のｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１で処理した。処理の４８時間後に、細胞におけるＩＬ−２の発現レベルを、ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０１６８】
結果として、５０μｇ／ｍｌのｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１を投与した群におけるＬＩ−２の産生は、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１を投与していない群と比較して、有意に阻害されたことが示された（図２７）。
【０１６９】
さらに、ヒトＴ細胞増殖阻害を試験するために、ＲＡ患者から得たＰＢＭＣに、２μｇのｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ）（コントロール）をそれぞれ投与し、７２時間後、Ｔ細胞の増殖を、ＣＦＳＥ染色によって評価した。
【０１７０】
結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１を投与した群におけるＴ細胞増殖は、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１を投与していない群と比較して、高度に有意に阻害されたことが示された（図２８）。
【０１７１】
上記の結果は、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ）−ｈｙＦｃタンパク質が、ヒトＴ細胞に対してだけでなく、Ｔ細胞活性化に関連するサイトカインに対しても阻害効果を示したことを示しており、これは、このタンパク質が、種々の免疫疾患を引き起こす可能性があるＴ細胞を有効に阻害できることを示している。
【０１７２】
例１４：ＰＤ−Ｌ１もしくはその断片、またはそれを含む融合タンパク質のＩＬ−６産生阻害活性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
ＰＤ−１は、ヒト樹状細胞および単球ならびにＴ細胞において発現するので、本発明の組換えタンパク質の活性を、これらの細胞を使用して試験した。樹状細胞（ＤＣ）を、ＧＭ−ＣＳＦを使用することによってヒトＰＢＭＣから分化させ、次いで、精製されたｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ）−ｈｙＦｃＭ１およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇタンパク質で処理し、タンパク質の活性を試験した。具体的には、ＩＬ−６は、活性化されたＤＣから分泌される典型的な炎症促進性サイトカインであることが公知である。従って、ＩＬ−６の発現レベルを、評価のためのマーカーとして使用した。
【０１７３】
単離されたｈＰＢＭＣから誘導されたＤＣを活性化するために、ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよび５μｇ／ｍｌのＩＬ−４で処理し、ＬＰＳ刺激の条件下で６日間インキュベートした。活性化手順後、細胞を、２、１０および５０μｇ／ｍｌのｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１またはＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ）で、それぞれ処理した。２４時間後、細胞におけるヒトＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルを、定量リアルタイムＰＣＲによって測定した。結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１は、濃度依存的様式で、ＤＣ細胞におけるＩＬ−６の発現レベルを低減させたことが示された（図２９）。
【０１７４】
さらに、サイトカイン産生の分析結果は、炎症促進性サイトカインＩＬ−６の産生が、ＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃＭ１タンパク質によって低減されたことを示している。さらに、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１による処理は、同じ濃度のＣＴＬＡ−４−Ｉｇによる処理と比較して、ｍＲＮＡの発現をより有効に阻害したことが示された（図２９）。
【０１７５】
例１５：免疫疾患の処置における、ＰＤ−Ｌ１もしくはその断片、またはそれを含む融合タンパク質の効果についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
例１５−１：ＩＬ−２産生に対するｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の濃度依存的阻害効果の試験
マウス脾臓から単離された細胞を使用して、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ）−ｈｙＦｃＭ１およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇタンパク質がＴ細胞活性を阻害する能力を、ＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマを測定することによって試験した。具体的には、単離されたマウス脾細胞を、抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８でコートしたプレートにおいて培養し、次いで、０、１０および５０μｇ／ｍｌのｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１でそれぞれ処理し、その後、４８時間培養した。次に、培養培地を使用して、Ｔ細胞活性のマーカーであるＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【０１７６】
結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１による処理は、脾細胞において、ＩＬ−２とＩＦＮ−ガンマの両方の発現レベルを高度に有意に低減させたことが示された（図３０）。
【０１７７】
例１５−２：ＩＦＮ−ガンマに対するｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の阻害効果の試験
マウス膵臓から単離されたＴ細胞を、ｈＰＤ−Ｌ１（１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１またはｈＰＤ−Ｌ１（１９−１２７）−ｈｙＦｃＭ１組換えタンパク質で処理し、膵臓細胞からのＩＦＮ−ガンマ分泌を測定して、総Ｔ細胞およびＣＤ４+Ｔ細胞に対する組換えタンパク質の阻害効果を評価した。さらに、同じ方法によって、Ｖドメイン断片を含むｈＰＤ−Ｌ１（１９−１１４）−ｈｙＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ１（１９−１２０）−ｈｙＦｃを使用する実験もまた実施した。
【０１７８】
特に、単離されたマウス脾細胞を、抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８でコートしたプレートにおいて培養し、次いで、２μｇのｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１２７）でそれぞれ処理し、その後、４８時間培養した。次に、培養培地を取集し、培養培地におけるＴ細胞活性化サイトカインＩＦＮ−ガンマのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。
【０１７９】
結果として、全てのＰＤ−Ｌ１融合タンパク質が、ＩＦＮ−ガンマの産生を阻害したことが示された（図３１）。ＰＤ−Ｌ１  ＩｇＶドメイン断片（１９〜１２７、１９〜１２０および１９〜１１４）を含む融合タンパク質の効果を比較したところ、結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（１９−１２７）−ｈｙＦｃＭ１のサイトカイン阻害効果は、ｈＰＤ−Ｌ１（１９−１１４）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（１９−１２０）−ｈｙＦｃＭ１よりも優れていたことが示された。この結果は、配列番号３の１９位〜１２７位におけるアミノ酸からなる断片が、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインの免疫抑制効果を示すことにおいて重要な役割を果たすことを示した。さらに、配列番号３の１９位〜１２７位におけるアミノ酸からなる断片よりも短い断片は、融合タンパク質の生産性に関して僅かに効果が低かったことが示された（図２０）。従って、配列番号３の１９位〜１２７位におけるアミノ酸からなる断片と等しいまたはそれよりも長い長さを有するポリペプチドの使用が、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインを含むＦｃ融合タンパク質治療剤を開発する際に好ましいと思われる。
【０１８０】
例１５−３：ＩＦＮ−ガンマに対するｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の濃度依存的阻害効果の試験
マウス膵臓から単離されたＴ細胞の活性を阻害する能力を試験するために、Ｔ細胞を、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１またはｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質で処理した。融合タンパク質のＴ細胞活性阻害能を、細胞におけるＩＦＮ−ガンマの発現レベルを測定することによって比較した。具体的には、単離されたマウス脾細胞を、抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）でコートしたプレートにおいて培養し、次いで、２５０、５００または１０００ｎＭのｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１またはｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１で処理した。処理後、細胞を４８時間培養し、培養培地を収集し、培養培地におけるＩＦＮ−ガンマのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【０１８１】
結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１とｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１の両方が、濃度依存的様式でＩＦＮ−ガンマの産生を阻害したことが示され、これは、これらの融合タンパク質が、Ｔ細胞活性を阻害するのに有効であることを示唆している（図３２）。
【０１８２】
例１５−４：Ｔ細胞増殖に対するｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の阻害効果の試験
マウス膵臓から単離されたＴ細胞を使用して、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ）タンパク質の細胞増殖阻害能を、ＭＴＴアッセイによって比較した。
【０１８３】
具体的には、単離されたマウス脾細胞を、抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）でコートしたプレートにおいて培養し、次いで、２５０、５００または１０００ｎＭのｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１またはＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ）で処理した。次に、細胞を、７２時間培養し、次いで、ＭＴＴアッセイでＴ細胞の増殖を測定することとした。
【０１８４】
結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ）は全て、濃度依存的様式でＴ細胞の増殖を阻害したこと、およびＴ細胞増殖に対する全ての型のｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ融合タンパク質の阻害能は、同じ濃度のコントロールＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ）よりも優れていた（図３３）ことが示された。
【０１８５】
例１５−５：Ｔ細胞活性に対するｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の阻害効果の試験
不死化ヒトＴ細胞株の１つの型Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳ）を使用して、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ）の活性を測定した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、それらがＩＬ−２を発現すると蛍光（ルシフェラーゼ）シグナルを発するように設計された細胞株である。この例では、市販のＪｕｒｋａｔ細胞を使用した。
【０１８６】
具体的には、２．５×１０4細胞／１５μｌ／ウェルを、１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで事前処理し、２４時間活性化した。次に、タンパク質を、０、１、１．９、３．９、７．８、１５．５、３１、６２および１２４μＭの最終濃度になるように、細胞にそれぞれ添加した。再活性化のために、細胞を、１μｇ／ｍｌのＰＨＡで処理し、次いで、４〜５時間インキュベートし、その後、細胞をルミノメーター中に配置して、蛍光シグナル強度を測定した。
【０１８７】
ＩＬ−２分泌の比較の結果は、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃ、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１およびＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｏｒｅｎｃｉａ）の全てが、濃度依存的様式でＴ細胞のＩＬ−２分泌を阻害したことを示しており、これは、ヒトＴ細胞株におけるＴ細胞阻害効果を実証している（図３４）。
【０１８８】
ＩＩＩ．ヒトＰＤ−Ｌ１またはその断片および免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性の試験
例１６：ＩＢＤ（炎症性腸疾患）モデルにおけるｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の効果の評価
例１６−１：慢性炎症性腸炎モデルにおけるｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の効果の評価
Ｔ細胞移植によって誘導された慢性マウス腸炎モデルにおいて、炎症性腸炎に対するｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質の効果を試験した。
【０１８９】
ＣＤ４+ＣＤ２５-ＣＤ４５ＲＢ高Ｔ細胞を、ＦＡＣＳによってＣ５７ＢＬ／６マウス脾細胞から単離した。５×１０5の単離されたＣＤ４+ＣＤ２５-ＣＤ４５ＲＢ高Ｔ細胞を、Ｔ細胞およびＢ細胞を欠くＲａｇ−１  ＫＯマウスに腹腔内注射した。
【０１９０】
評価を、例４−１に記載したのと同じ方法によって実施した。結果として、図３５に示されるように、マウスの臨床的スコアは有意に改善し（図３５ａ）、実験群の重量減少症状は、コントロール群と比較して、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質で処置した実験群において軽減された（図３５ｂ）。さらに、ｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質は、それをＣＴＬＡ４−Ｉｇの３０分の１の量で使用した場合であっても、コントロールとして使用したＣＴＬＡ４−Ｉｇと等しいまたはそれよりも高い効果を示した。
【０１９１】
例１６−２：慢性炎症性腸疾患モデルにおける生存率の分析による、ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の評価
ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１およびｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価するために、腸炎の軽減および阻害に対するＰＤ−Ｌ１タンパク質投与の効果を、Ｔ細胞によって誘導された慢性マウス腸炎モデルにおいて評価した。
【０１９２】
具体的には、ＣＤ４+ＣＤ２５-ＣＤ４５ＲＢ高Ｔ細胞を、ＦＡＣＳによってＣ５７ＢＬ／６マウス脾細胞から単離した。５×１０5の単離されたＣＤ４+ＣＤ２５-ＣＤ４５ＲＢ高Ｔ細胞を、ＴおよびＢ細胞を欠くＲａｇ−１  ＫＯマウスに腹腔内注射した。Ｔ細胞注射の３週間後の日から、２０または２００μｇのｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１またはｈＰＤ−Ｌ１（Ｖ、１９−１３３）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質を、合計３回にわたって１週間間隔で各マウスに腹腔内注射した。実験期間を通じて、生存マウスの数を記録した。
【０１９３】
結果として、腸炎の誘導後にＰＢＳを投与したコントロール群および２０μｇ（有効な量よりも低い）のＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を投与した群を除く全ての実験群において、全てのマウスが、Ｔ細胞移植の最大６０日後まで生存し、これは、ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質の効力を実証している（図３６）。
【０１９４】
例１７：乾癬の処置におけるｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃ組換えタンパク質の効果の評価
急性乾癬マウスモデルにおけるｈＰＤ−Ｌ１−ｈｙＦｃの効果を評価するために、４０ｍｇのイミキモド（ＩＭＱ）を、６日間にわたって各実験マウスの両耳に適用して、急性乾癬を誘導した。このマウスモデルのマウスを、正常マウス群、乾癬の誘導後に処置しない群、および乾癬の誘導と共に抗Ｐ４０抗体またはｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１融合タンパク質を投与した群に分割し、次いで、融合タンパク質の治療効果を試験した。２５μｇの抗Ｐ４０抗体を、１および４日目に各マウスに腹腔内投与した。２００μｇのｈＰＤ−Ｌ１（Ｆ）−ｈｙＦｃを、１、２、４および６日目に、各マウスに腹腔内投与した。
【０１９５】
最初の投与後に、耳の厚さを毎日観察して、乾癬の表現型を試験した。
【０１９６】
結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１および抗Ｐ４０抗体を投与した群は、未処置の群と比較して、乾癬を発症させることにおいて統計的に有意な遅延を示した（図３７）。７日目に、耳を病理組織学的に試験し、ＩＭＱ誘導性乾癬群における乾癬の病理学的組織知見、例えば、表皮厚さを、比較観察した。結果として、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１を投与した群における表皮厚さは、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１を投与していない他の群と比較して、統計的に有意なレベルにまで低減されたことが示された（図３８）。
【０１９７】
表皮厚さはまた、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１を投与していない他の群と比較して、ｈＰＤ−Ｌ１（ＶＣ、１９−２３９）−ｈｙＦｃＭ１を投与した群において、統計的に有意なレベルにまで低減された（図３９）。
【０１９８】
上記結果は、ｈＰＤ−Ｌ１融合タンパク質が、乾癬に対する治療効果を有し、従来の治療剤である抗Ｐ４０抗体と匹敵する効果を示すことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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