(57)【要約】  本発明は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＭＥＰ／ＤＸＰ）経路の増強を示す組換えデイノコッカス細菌と、テルペン又はテルペノイド化合物の産生のためのその使用と、に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テルペン又はテルペノイドを産生する方法であって、
（ｉ）１−デオキシキシルロース５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）活性、及び／又はイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ（ＩＰＰイソメラーゼ)活性を増大させるように遺伝子的に改変された組換えデイノコッカス細菌を、前記テルペン又はテルペノイド産生に適切な条件下で培養するステップと、
任意的に、（ｉｉ）前記テルペン又はテルペノイドを回収するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記組換えデイノコッカス細菌は内在性、同種、又は異種のｉｄｉ遺伝子を過剰発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組換えデイノコッカス細菌は内在性、同種、又は異種のｄｘｓ遺伝子を過剰発現する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えデイノコッカス細菌は改良ＤＸＳ酵素を発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記改良ＤＸＳ酵素は、配列番号５２の２４４位の位置にてシステインを含む突然変異体ＤＸＳである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えデイノコッカス細菌は、Ｄ．ラディオピュグナンス（Ｄ．ｒａｄｉｏｐｕｇｎａｎｓ）のＤＸＰシンターゼのＲ２４４Ｃ突然変異体（配列番号８）をコードする遺伝子、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓのＤＸＰシンターゼのＲ２３８Ｃ突然変異体（配列番号１４）をコードする遺伝子、又はＤ．ジオサーマリス（Ｄ．ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）のＤＸＰシンターゼのＲ２４１Ｃ突然変異体（配列番号５６）をコードする遺伝子を発現する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えデイノコッカス細菌は改良ＤＸＳ酵素を発現し、且つ内在性、同種、又は異種のｉｄｉ遺伝子を過剰発現する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記組換えデイノコッカス細菌は、ＦＰＰシンターゼをコードする内在性、同種、又は異種の遺伝子を過剰発現する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＰＰシンターゼをコードする遺伝子は、
ａ）配列番号４７のアミノ酸配列のすベて若しくは活性部分を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号４７と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有してなるポリペプチド、
ｃ）配列番号４６と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、又は、
ｄ）（ｉ）配列番号４６に示される核酸配列、（ｉｉ）その相補鎖、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）と、中程度・高度の厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件、好ましくは高度若しくは非常に高度の厳密性条件において、ハイブリダイズが可能である核酸配列によってコードされるポリペプチド、
からなる群から選ばれるポリペプチドをコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＦＰＰシンターゼはジメチルアリルトランスフェラーゼ活性及び／又はゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性をさらに示す、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えデイノコッカス細菌において、内在性、同種、又は異種の、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、及びｉｓｐＨ遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子が過剰発現される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えデイノコッカス細菌は異種テルペンシンターゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種テルペンシンターゼは、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、及びセスキテルペンシンターゼからなる群より選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種テルペンシンターゼは、モノテルペンシンターゼ、好ましくはゲラニオールシンターゼ、シネオール（ｃｉｎｅｏｌｅ）シンターゼ、リモネンシンターゼ、又はリナロールシンターゼである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記異種テルペンシンターゼは、セスキテルペンシンターゼ、好ましくは（＋）−ｅｐｉ-α−ビサボロールシンターゼである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換えデイノコッカス細菌において、リコペンβ−シクラーゼをコードする遺伝子は不活性化される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記テルペン又はテルペノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、セスキテルペン、及びカロテノイドから選ばれる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記テルペン又はテルペノイドはセスキテルペンである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記テルペン又はテルペノイドはカロテノイドである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記カロテノイドはリコペン、又はリコペン由来の他の任意のカロテノイド化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記カロテノイドはデイノキサンチン（ｄｅｉｎｏｘａｎｔｈｉｎｅ）である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項において規定される組換えデイノコッカス細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物学の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、遺伝子的に改変された細菌におけるイソプレノイド化合物産生の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
テルペン又はテルペノイドとも呼称されるイソプレノイドは天然物の最も多様な類である。モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、及びトリテルペン、並びにカロテノイドを含むイソプレノイドは、例えば薬剤、栄養補助剤、香料、芳香剤、化粧料、着色料、農薬に見受けられるように、数多くの産業的適用の対象となっている。
【０００３】
すべてのイソプレノイド化合物は、その豊かな多様性にも関わらず、共通のＣ−５前駆体であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）から生合成される。この前駆体は、ＩＰＰとその異性体であるジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の生成をもたらすメバロン酸経路（ＭＥＶ）又は非メバロン酸経路（若しくは２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール  ４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース  ５−リン酸（ＭＥＰ／ＤＸＰ）経路）を介して合成可能である。そして、ＤＭＡＰＰとＩＰＰとは縮合されてゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を生成し、ゲラニル二リン酸はＩＰＰでファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）にさらに変換される。ＦＰＰはＩＰＰとさらに縮合されてゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を生成する。ＧＰＰ、ＦＰＰ、及びＧＧＰＰはモノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、及びカロテノイドの前駆体である。
【０００４】
現在のところ、イソプレノイドは植物から主に抽出されるか又は化学合成によって産生されるが、低収率や高生産コストの問題がある。
【０００５】
微生物の代謝改変により、安価な炭素源から大量のイソプレノイドを経済的に産生するための代替的で有望な手法が提示される。これに関し、組換え微生物によって多くのイソプレノイドが既に産生されている。至って容易に遺伝子操作可能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）やＳ．セレビシエは、宿主細胞としてよく用いられている。例として、アメリカオオモミのＧＰＰシンターゼ遺伝子及びスペアミントの（−）−リモネンシンターゼ遺伝子を発現する組換え大腸菌からリモネンが産生され（Ｃａｒｔｅｒ他、２００３年）、また、クラルキア・ブレウェリ（Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）の（Ｓ）−リナロールシンターゼ遺伝子を発現する組換えＳ．セレビシエにおいて、リナロールが産生された（Ｈｅｒｒｅｒｏ他、２００８年）。
【０００６】
イソプレノイドを産生するための微生物の改変は大変有望であるものの、利用可能なイソプレノイド前駆体、即ちＩＰＰとＤＭＡＰＰによってイソプレノイドの総量が限定されることが示されている。このように、イソプレノイド前駆体供給を増大させることは産生の増大に必要である。しかしながら、複合ＭＥＰ経路の遺伝子操作は、特に、ＩＰＰ又はＤＭＡＰＰなどの毒性代謝中間体の蓄積（例えば、Ｓｉｖｙ他、２０１１年）、又は細胞からのピルベートの欠乏により起こる宿主の代謝負担（Ｂｒｏｗｎ他、２０１０年）により、細胞成長率とイソプレン産生とに影響を与え得ることが観察された。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの炭素流を増大させるためにＭＥＰ経路が効果的に改変された、イソプレノイド過多産生デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）細菌を提供する。
【０００８】
従って、本発明は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール  ４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース  ５−リン酸（ＭＥＰ／ＤＸＰ）経路の増強を示す組換えデイノコッカス細菌に関し、特に、ＤＸＰシンターゼ（ＤＸＳ）、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨ、及びＩＰＰイソメラーゼ活性（ＩＤＩ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの酵素活性が増大される細菌に関する。好ましくは、該少なくとも１つの酵素活性は、内在性、同種、又は異種のｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の過剰発現によって増大される。
【０００９】
好ましくは、本発明の組換え細菌は、ＤＸＳ活性及び／又はＩＤＩ活性を増大させるように遺伝子的に改変される。特に、該組換え細菌は内在性、同種、又は異種のｉｄｉ遺伝子を過剰発現するか、及び／又は内在性、同種、又は異種のｄｘｓ遺伝子を過剰発現するとよい。
【００１０】
本発明の細菌は、ＦＰＰシンターゼ活性の増大をさらに示し得る。好ましくは、この増大は内在性、同種、又は異種のｉｓｐＡ遺伝子の過剰発現によるものである。
【００１１】
好ましくは、ｉｓｐＡ遺伝子は、
ａ）  配列番号４７のアミノ酸配列のすべてか若しくは活性部分を含むポリペプチド、
ｂ）  配列番号４７と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有してなるポリペプチド、
ｃ）  配列番号４６と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、又は、
ｄ）  （ｉ）配列番号４６に示される核酸配列、（ｉｉ）その相補鎖、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）と、中程度・高度の厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件、好ましくは高度若しくは非常に高度の厳密性条件において、ハイブリダイズが可能である核酸配列によってコードされるポリペプチド、からなる群から選ばれるポリペプチドをコードする。
【００１２】
好ましくは、ＦＰＰシンターゼは、ジメチルアリルトランスフェラーゼ活性及び／又はゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性、より好ましくはジメチルアリルトランスフェラーゼ活性及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を、さらに示す。
【００１３】
また、本発明の細菌は、配列番号５２の２２２位の位置にてアスパラギン及び／又は配列番号５２の２４４位の位置にてシステインを含む突然変異ＤＸＰシンターゼ、好ましくは、配列番号５２の２４４位の位置にてシステインを含む突然変異ＤＸＰシンターゼ、をさらに含んでもよい。特に、組換えデイノコッカス細菌は、Ｄ．ラディオピュグナンス（Ｄ．ｒａｄｉｏｐｕｇｎａｎｓ）のＤＸＰシンターゼのＲ２４４Ｃ突然変異体をコードする遺伝子（配列番号８）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓのＤＸＰシンターゼのＲ２３８Ｃ突然変異体をコードする遺伝子（配列番号１４）、及び／又は、Ｄ．ジオサーマリス（Ｄ．ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）のＤＸＰシンターゼのＲ２４１Ｃ突然変異体をコードする遺伝子（配列番号５６）、を発現するとよい。好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、改良された（変異された）ＤＸＳ酵素を発現し、内在性、同種、又は異種のｉｄｉ遺伝子を過剰発現する。
【００１４】
好ましくは、本発明の細菌は、異種テルペンシンターゼをコードする遺伝子をさらに含む。
【００１５】
異種テルペンシンターゼは、ゲラニオールシンターゼ、３Ｓ−リナロールシンターゼ、ミルセンシンターゼ、Ｒ−リナロールシンターゼ、１，８シネオール（ｃｉｎｅｏｌ）シンターゼ、４Ｓ−リモネンシンターゼ、Ｒ−リモネンシンターゼ、（−）−α−ピネンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、（−）−ｅｎｄｏ−フェンコールシンターゼ、及び（−）−α−テルピネオールシンターゼからなる群から好ましくは選ばれる、モノテルペンシンターゼであるとよい。より好ましくは、異種テルペンシンターゼは、ゲラニオールシンターゼ、シネオールシンターゼ、リモネンシンターゼ、又はリナロールシンターゼである。
【００１６】
また、異種テルペンシンターゼは、（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、（Ｅ，Ｅ）−ゲルマクレンＢシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（−）−ゲルマクレンＤシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（３Ｓ，６Ｅ）−ネロリドールシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、サンタレンシンターゼ、及びδ−カジネンシンターゼからなる群から好ましくは選ばれる、セスキテルペンシンターゼであってもよい。より好ましくは、異種セスキテルペンシンターゼは（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼである。
【００１７】
本発明の細菌において、リコペンβ−シクラーゼ活性の低減又は抑制をさらに示すとよい。
【００１８】
第２の態様において、本発明は、ＦＰＰシンターゼ活性が増大される組換えデイノコッカス細菌に関する。好ましくは、ＦＰＰシンターゼ活性は、内在性、同種、又は異種のｉｓｐＡ遺伝子の過剰発現によって増大される。好ましくは、ｉｓｐＡ遺伝子は、
ａ）  配列番号４７のアミノ酸配列のすべてか若しくは活性部分を含むポリペプチド、
ｂ）  配列番号４７と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有してなるポリペプチド、
ｃ）  配列番号４６と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、又は、
ｄ）  （ｉ）配列番号４６に示される核酸配列、（ｉｉ）その相補鎖、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）と、中程度・高度の厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件、好ましくは高度若しくは非常に高度の厳密性条件において、ハイブリダイズが可能である核酸配列によってコードされるポリペプチド、からなる群から選ばれるポリペプチドをコードする。
【００１９】
好ましくは、ＦＰＰシンターゼは、ジメチルアリルトランスフェラーゼ活性及び／又はゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性、より好ましくは、ジメチルアリルトランスフェラーゼ活性及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を、さらに示す。
【００２０】
第３の態様において、本発明は、配列番号５２の２２２位の位置にてアスパラギン及び／又は配列番号５２の２４４位の位置にてシステインを含む突然変異ＤＸＰシンターゼ、好ましくは、配列番号５２の２４４位の位置にてシステインを含む突然変異ＤＸＰシンターゼ、を含む組換えデイノコッカス細菌に関する。特に、組換えデイノコッカス細菌は、Ｄ．ラディオピュグナンスのＤＸＰシンターゼのＲ２４４Ｃ突然変異体をコードする遺伝子（配列番号８）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓのＤＸＰシンターゼのＲ２３８Ｃ突然変異体をコードする遺伝子（配列番号１４）、及び／又はＤ．ジオサーマリスのＤＸＰシンターゼのＲ２４１Ｃ突然変異体をコードする遺伝子（配列番号５６）を発現するとよい。
【００２１】
第４の態様において、本発明は、異種テルペンシンターゼ、好ましくはゲラニオールシンターゼ又は（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼをコードする遺伝子を発現する組換えデイノコッカス細菌に関する。
【００２２】
第５の態様において、本発明は、内在性リコペンβ−シクラーゼ活性が低減又は抑制される組換えデイノコッカス細菌に関する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、イソプレノイド、好ましくはモノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、セスキテルペン、又はカロテノイド、より好ましくはセスキテルペン又はカロテノイドを産生するための、本発明の組換えデイノコッカス細菌の使用に関する。一実施形態において、イソプレノイドは、ゲラニオール、ゲラン酸、及び／又はリコペンである。所定の実施形態において、イソプレノイドは、カロテノイド、好ましくはリコペン又はリコペン由来の他のカロテノイド化合物、特にデイノキサンチン（ｄｅｉｎｏｘａｎｔｈｉｎｅ）である。また、本発明は、（ｉ）イソプレノイド産生に適切な条件下で本発明に係る組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に（ｉｉ）イソプレノイドを回収するステップとを含む、イソプレノイドを産生する方法にも関する。好ましくは、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、セスキテルペン、又はカロテノイド、より好ましくはセスキテルペン又はカロテノイドである。一実施形態において、イソプレノイドは、ゲラニオール、ゲラン酸、及びリコペンからなる群から選ばれる。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、ゲラニルエステル（ｇｅｒａｎｙｌ  ｅｓｔｅｒ）を産生するための本発明の組換えデイノコッカス細菌の使用に関する。また、本発明は、（ｉ）ゲラニオール及び／又はゲラン酸産生に適切な条件下で本発明に係る組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、（ｉｉ）ゲラニオール及び／又はゲラン酸を回収するステップと、（ｉｉｉ）ゲラニオール及び／又はゲラン酸をゲラニルエステルに変換するステップと、任意的に（ｉｖ）ゲラニルエステルを回収するステップとを含む、ゲラニルエステルを産生する方法にも関する。好ましくは、ゲラニルエステルは、ゲラニルイソブチレート又はトランス−ゲラニルアセテートである。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、ダマスコン、ダマセノン、及び／又はイオノンを産生するための、本発明の組換えデイノコッカス細菌の使用に関する。また本発明は、（ｉ）ゲラニオール及び／又はゲラン酸産生に適切な条件下で本発明に係る組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、（ｉｉ）ゲラニオール及び／又はゲラン酸を回収するステップと、（ｉｉｉ）ゲラニオール及び／又はゲラン酸をダマスコン、ダマセノン、及び／又はイオノンに変換するステップと、任意的に（ｉｖ）ダマスコン、ダマセノン、及び／又はイオノンを回収するステップとを含む、ダマスコン、ダマセノン、及び／又はイオノンを産生する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、オシマム・バジリカム（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）ＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリス（Ｄ．ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）細菌を含む抽出物の、２４時間の培養におけるＧＣＭＳ分析である。
【図２】図２は、オシマム・バジリカムＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌を含む抽出物の、４８時間の培養におけるＧＣＭＳ分析である。
【図３】図３は、オシマム・バジリカムＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌を含む抽出物の、７２時間の培養におけるＧＣＭＳ分析である。
【図４】図４は、市販のゲラニオールの保持時間を示す。
【図５】図５は、市販のゲラン酸の保持時間を示す。
【図６】図６は、Ｄ．ジオサーマリスＷＴ、ｃｒｔｌｍ遺伝子ノックアウトの組換えＤ．ジオサーマリス細菌、リコペン標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ）のアセトン抽出の吸光度の違いを示す。
【図７】図７は、ＦＰＰシンターゼの過剰発現の有り無しにおける、ｃｒｔｌｍ遺伝子ノックアウトの組換えＤ．ジオサーマリス細菌のリコペン産生を示す。
【図８】図８は、ＦＰＰシンターゼの過剰発現の有り無しにおける、オシマム・バジリカムＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌のゲラニオール産生を示す。
【図９】図９は、オシマム・バジリカムＧＥＳを発現し、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓのＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨ、又はＩＤＩを過剰発現する、組換えＤ．ジオサーマリス細菌のゲラニオール産生を示す。
【図１０】図１０は、オシマム・バジリカムＧＥＳ、及びＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓの野生型ＤＸＳ酵素又はＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓの突然変異体Ｒ２３８Ｃを発現する、組換えＤ．ジオサーマリス細菌のゲラニオール産生を示す。
【図１１】図１１は、オシマム・バジリカムＧＥＳ、及びＤ．ラディオピュグナンスの野生型ＤＸＳ酵素又は突然変異体Ｒ２４４Ｃを発現する、組換えＤ．ジオサーマリス細菌のゲラニオール産生を示す。
【図１２】図１２は、オシマム・バジリカムＧＥＳ及びＤ．ジオサーマリスＦＰＰＳのＫ１７０Ｇ突然変異体を発現する、組換えＤ．ジオサーマリス細菌のゲラニオール産生を示す。
【図１３】図１３は、オシマム・バジリカムＧＥＳと突然変異ＤＸＳとを発現し、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓのＤＸＲ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨ、又はＩＤＩを過剰発現する、組換えＤ．ジオサーマリス細菌のゲラニオール産生を示す。
【図１４】図１４は、ストレプトマイセス・シトリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ）の（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌のビサボロール産生を示す。野生型細菌はビサボロールを産生しない（データは示されず）。
【図１５】図１５は、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓの突然変異体ＤＸＳ及びＩＤＩ過剰発現の有り無しにおける、ｃｒｔｌｍ遺伝子ノックアウトの組換えＤ．ジオサーマリス細菌のリコペン（カロテノイド）産生を示す。
【図１６】図１６は、内在性ＦＰＰシンターゼの過剰発現有り無しで、フィラ・ドゥルキス（Ｐｈｙｌａ  ｄｕｌｃｉｓ）又はヒヨコマメ（シサー・アリティナム（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ））のＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌のゲラニオール産生を示す。
【図１７】図１７は、３５０ｎｍ〜６００ｎｍの吸光度を測定し、野生型細菌とＦＰＰＳ過剰発現細菌について該吸光度を乾燥細胞重量（ｄｒｙ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ  （ＤＣＷ））でノーマライズすることによって得られたデイノキサンチン（ｄｅｉｎｏｘａｎｔｈｉｎ）のスペクトルを示す。薄いグレー色のスペクトルはデイノキサンチン標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ）（Ｄ．ラディオデュランスから抽出された精製デイノキサンチン）に相当する。
【図１８】図１８は、野生型Ｄ．ジオサーマリス細菌と内在性ＦＰＰＳを過剰発現するＤ．ジオサーマリス細菌との培養物の写真である。
【図１９】図１９は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）の１，８シネオールシンターゼ遺伝子を発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌のシネオール産生を示す。シネオールは矢印で示される。野生型細菌はシネオールを産生しない（データは示されず）。
【図２０】図２０は、ナガバハッカ（メンタ・ロンギフォリア（Ｍｅｎｔｈａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ））のリモネンシンターゼ遺伝子を発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌のリモネン産生を示す。リモネンは矢印で示される。野生型細菌はリモネンを産生しない（データは示されず）。
【図２１】図２１は、エゴマ（ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）のリナロールシンターゼを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌のリナロール産生（ｍｇ／Ｌ）を示す。野生型細菌はリナロールを産生しない（データは示されず）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、記載のように、イソプレノイド産生を向上させるために遺伝子的に改変されたデイノコッカス細菌に関する。
【００２８】
特に、本願は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの炭素流を増加させるように、デイノコッカス細菌のＭＥＰ経路を改変可能であることを示す。実際に、本発明者らは複数の律速酵素を同定し、これらの酵素が遺伝子学的に改変されるか又は過剰発現されることができることを示した。本発明者らは、組換え細菌におけるイソプレノイド産生が顕著に増大されたことを観察した。
【００２９】
さらに、本発明者等は、目的の化合物の産生及び／又は蓄積を促進するように、デイノコッカス細菌におけるイソプレノイド産生を制御可能であることを本明細書において示した。これに関して、発明者等は、ＦＰＰシンターゼを同定して過剰発現させ、この過剰発現が、モノテルペンを損なって、ジテルペン、トリテルペン、セスキテルペン、及びカロテノイドなどの１０を超えるＣ原子を有するイソプレノイドの産生を促進することを示した。また発明者等は、内在性リコペンβ−シクラーゼの不活性化がリコペンの過剰産生を誘導することも示した。
【００３０】
そしてまた本願は、デイノコッカス細菌、特に上述のような組換えデイノコッカス細菌が、異種テルペンシンターゼの発現を介して異種イソプレノイド化合物を産生するために効果的に用いられ得ることを提示する。
【００３１】
＜定義＞
本発明の文脈において、「デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）」という用語は、例えば進化促進、突然変異誘発や、ＤＮＡシャフリング技術によって取得された株、又は真核生物性、原核生物性、及び／若しくは合成性核酸の挿入により取得された組換え株である、デイノコッカスの野生型株又は自然変異株を含む。デイノコッカス細菌は、デイノコッカス属の任意の細菌を指し得り、Ｄ．ジオサーマリス（Ｄ．ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、Ｄ．セルロリシティカス（Ｄ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｓｉｔｉｃｕｓ）、Ｄ．ラディオデュランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、Ｄ．プロテオライティカス（Ｄ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｄ．ラディオピュグナンス（Ｄ．ｒａｄｉｏｐｕｇｎａｎｓ）、Ｄ．ラディオフィルス（Ｄ．ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｄ．グランディス（Ｄ．ｇｒａｎｄｉｓ）、Ｄ．インディカス（Ｄ．ｉｎｄｉｃｕｓ）、Ｄ．フリゲンス（Ｄ．ｆｒｉｇｅｎｓ）、Ｄ．サキシコーラ（Ｄ．ｓａｘｉｃｏｌａ）、Ｄ．マリコペンシス（Ｄ．ｍａｒｉｃｏｐｅｎｓｉｓ）、Ｄ．マルモリス（Ｄ．ｍａｒｍｏｒｉｓ）、Ｄ．デゼルティ（Ｄ．ｄｅｓｅｒｔｉ）、Ｄ．ムライ（Ｄ．ｍｕｒｒａｙｉ）、Ｄ．アエリウス（Ｄ．ａｅｒｉｕｓ）、Ｄ．ａｅｒｏｌａｔｕｓ、Ｄ．アエロフィルス（Ｄ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｄ．アエセリウス（Ｄ．ａｅｔｈｅｒｉｕｓ）、Ｄ．ａｌｐｉｎｉｔｕｎｄｒａｅ、Ｄ．アルティトゥディニス（Ｄ．ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ）、Ｄ．アンタルクティカス（Ｄ．ａｎｔａｒｔｉｃｕｓ）、Ｄ．アパチェンシス（Ｄ．ａｐａｃｈｅｎｓｉｓ）、Ｄ．アクアティカス（Ｄ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｄ．アクアティリス（Ｄ．ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、Ｄ．ａｑｕｉｒａｄｉｏｃｏｌａ、Ｄ．アクイビブス（Ｄ．ａｑｕｉｖｉｖｕｓ）、Ｄ．カエニ（Ｄ．ｃａｅｎｉ）、Ｄ．シトリ（Ｄ．ｃｉｔｒｉ）、Ｄ．ｃｌａｕｄｉｏｎｉｓ、Ｄ．テジョネンシス（Ｄ．ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｄ．デポリメランス（Ｄ．ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｎｓ）、Ｄ．ｅｎｃｌｅｎｓｉｓ、Ｄ．フィカス（Ｄ．ｆｉｃｕｓ）、Ｄ．ゴビエンシス（Ｄ．ｇｏｂｉｅｎｓｉｓ）、Ｄ．ｇｕａｎｇｒｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．ｇｕｉｌｈｅｍｅｎｓｉｓ、Ｄ．ホホカメンシス（Ｄ．ｈｏｈｏｋａｍｅｎｓｉｓ）、Ｄ．ホピエンシス（Ｄ．ｈｏｐｉｅｎｓｉｓ）、Ｄ．ヒュミ（Ｄ．ｈｕｍｉ）、Ｄ．ミサセンシス（Ｄ．ｍｉｓａｓｅｎｓｉｓ）、Ｄ．ナヴァホネンシス（Ｄ．  ｎａｖａｊｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｄ．パパゴネンシス（Ｄ．ｐａｐａｇｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ、Ｄ．フォエニシス（Ｄ．ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、Ｄ．ピメンシス（Ｄ．ｐｉｍｅｎｓｉｓ）、Ｄ．ピシス（Ｄ．ｐｉｓｃｉｓ）、Ｄ．プニセウス（Ｄ．ｐｕｎｉｃｅｕｓ）、Ｄ．ｒａｄｉｏｍｏｌｌｉｓ、Ｄ．ラディオレジステンス（Ｄ．ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ）、Ｄ．ラディオトレランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｄ．ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｉｔｉｓ、Ｄ．ロゼウス（Ｄ．ｒｏｓｅｕｓ）、Ｄ．ｓａｈａｒｉｅｎｓ、Ｄ．ソリ（Ｄ．ｓｏｌｉ）、Ｄ．ソノレンシス（Ｄ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｄ．ｓｗｕｅｎｓｉｓ、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．ｘｉｂｅｉ���ｎｓｉｓ、Ｄ．シンジャンゲンシス（Ｄ．ｘｉｎｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｄ．ヤバパイエンシス（Ｄ．ｙａｖａｐａｉｅｎｓｉｓ）、若しくはＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ細菌、又はそれらの任意の組合せ、などが限定されることなく挙げられる。好ましくは、「デイノコッカス」という用語は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ラディオピュグナンス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、及びＤ．ムライに関する。一部の実施形態において、「デイノコッカス」という用語は、Ｄ．グランディス、Ｄ．ラディオデュランス、Ｄ．ラディオピュグナンス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、及びＤ．アクアティカスから好ましくは選ばれる中温性デイノコッカス細菌に関する。一部の他の実施形態において、「デイノコッカス」という用語は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ムライ、及びＤ．マリコペンシスから好ましくは選ばれる好高温性デイノコッカス細菌に関する。好適な実施形態において、「デイノコッカス」という用語は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ムライ、Ｄ．マリコペンシス、Ｄ．グランディス、Ｄ．ラディオデュランス、Ｄ．ラディオピュグナンス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、及びＤ．アクアティカスに関する。さらに好ましくは、「デイノコッカス」という用語は、Ｄ．ジオサーマリスに関する。
【００３２】
「組換え細菌」又は「遺伝子的に改変された細菌」という用語は、遺伝要素の削除、挿入、又は改変の結果としての改変ゲノムを含む、自然にはない細菌を指す。故に、「組換え核酸」とは、改変され、それ自体野生型細菌には見受けられない核酸を指す。
【００３３】
「遺伝子」という用語はタンパク質をコードする任意の核酸を指す。遺伝子という用語には、ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡなどのＤＮＡやＲＮＡが含まれる。遺伝子は、例えば組換え、酵素、及び／又は化学技術によりまず調製され得、次に宿主細胞又はインビトロ系において複製され得る。遺伝子は、通常、所望のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを包含する。また遺伝子は、転写ターミネータ又はシグナルペプチドなどのさらなる配列を含み得る。
【００３４】
「発現カセット」という用語は、コード領域、つまり遺伝子と、調節領域、つまり操作可能に連結された１つ以上の制御配列を含むものと包含する核酸構築物を指す。好ましくは、制御配列はデイノコッカス宿主細胞に適する。
【００３５】
本明細書に用いられるように、「発現ベクター」という用語は、発現カセットを包含するＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。好ましくは、発現ベクターは直線状又は環状の二本鎖ＤＮＡ分子である。
【００３６】
「操作可能に連結された」という用語は、制御配列がコード配列による発現を制御するように、制御配列がコード配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
【００３７】
「制御配列」という用語は遺伝子の発現に必要な核酸配列を指す。制御配列は内在性、同種、又は異種であり得る。当業者が現在使用している既知の制御配列が好ましい。そのような制御配列は、リーダ、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネータを含むがこれらに限定されない。好ましくは、制御配列はプロモータと転写ターミネータとを含む。
【００３８】
本明細書に用いられるように、「内在性」という用語は、非改変デイノコッカス細菌又は同一の種のデイノコッカス細菌の遺伝要素又はタンパク質に関する。「同種」という用語は、組換えデイノコッカス細菌以外の他の種のデイノコッカス細菌の遺伝要素又はタンパク質に関する。「異種」という用語は、他の細菌、微生物、植物、ウイルスなど非デイノコッカス由来である遺伝要素又はタンパク質に関する。「内在性」、「同種」又は「異種」という用語は野生型又は突然変異の遺伝要素又はタンパク質に関し得る。一部の実施形態において、これらの用語は、例えばコードされるタンパク質の１以上の特性を向上するように（例として活性や安定性などの向上）本発明の組換え細菌において導入又は発現される前に、例えば突然変異誘発によって改変された遺伝要素に関する。
【００３９】
本明細書に用いられるような「過剰発現」、「発現の増大」、及び「発現を増大させる」という用語は互換的に用いられ、例えば野生型細菌、又はＭＥＰ／ＤＸＰ経路を増強するために遺伝子的に改変されていないとされる細菌などの非改変細菌と比較して遺伝子又は酵素の発現が増大されることを意味する。酵素発現は、通常、該酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることによって増大される。遺伝子又は酵素が本発明の細菌に自然に存在しない実施形態、つまり同種又は異種の遺伝子又は酵素において、「過剰発現」及び「発現」という用語は互換的に用いられ得る。
【００４０】
本明細書に用いられるような「ＭＥＰ経路」、「ＭＥＰ／ＤＸＰ経路」、「非メバロン酸経路」、又は「２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール  ４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース  ５−リン酸経路」という用語は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース  ５−リン酸（ＤＸＰ）へのピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸との縮合からＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの形成をもたらす生合成経路を指す。この経路は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（ＥＣ２．２．１．７）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＥＣ１．１．１．２６７）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．６０）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１４８）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＥＣ４．６．１．１２）、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イル二リン酸シンターゼ（ＥＣ１．１７．７．１）、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ１．１７．１．２）、及びイソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（ＥＣ５．３．３．２）である酵素に関わる。
【００４１】
「イソプレノイド」、「イソプレノイド化合物」、「テルペン」、「テルペン化合物」、「テルペノイド」及び「テルペノイド化合物」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、ＩＰＰから生じ得る任意の化合物を指す。イソプレノイドに存在するＣ原子の数は、通常、５で割り切れる（例えばＣ５、Ｃ１０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ２５、Ｃ３０、及びＣ４０）。不規則なイソプレノイドやポリテルペンが報告されており、これらも「イソプレノイド」の定義に含まれる。イソプレノイド化合物は、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、セスキテルペン、及びカロテノイドを含むがこれらに限定されない。
【００４２】
テルペンシンターゼという用語は、１つ以上の前駆体から、特にゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、及びそれらの２つ以上の任意の組合せから、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン又はカロテノイドなどのイソプレノイド化合物を合成可能な、酵素、複合体、及び／又は酵素群を含む。そうしたテルペンシンターゼの例は、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、及びセスキテルペンシンターゼを含むがこれらに限定されない。
【００４３】
「ピロリン酸」という用語は、本明細書において「二リン酸」と互換的に用いられる。
【００４４】
「ＤＸＳ」、「ＤＸＰシンターゼ」又は「ＤＸＰＳ」という用語は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）へのピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸との縮合を触媒するｄｘｓ遺伝子によってコードされる、酵素である１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（ＥＣ２．２．１．７）に関する。「ＤＸＰシンターゼ」、「ＤＸＳ」、又は「ＤＸＰＳ」という遺伝子産生物の名称は本願では互換的に用いられる。ＤＸＰシンターゼ活性は、Ｌｏｉｓ等（１９９８年）が記載する放射能標識された基質を用いて、或いは当業者に既知の他の任意の方法を用いて測定可能である。
【００４５】
「ＤＸＰレダクトイソメラーゼ」又は「ＩｓｐＣ」又は「ＤＸＲ」という用語は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸（ＭＥＰ）へのＤＸＰの同時的な還元と異性化とを触媒するｄｘｒ又はｉｓｐＣ遺伝子によってコードされる、酵素である１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＥＣ１．１．１．２６７）に関する。ｄｘｒ又はｉｓｐＣという遺伝子の名称は本願では互換的に用いられる。ＤＸＰレダクトイソメラーゼ又はＩｓｐＣという遺伝子産生物の名称は本願では互換的に用いられる。
【００４６】
「ＭＣＴ」又は「ＩｓｐＤ」又は「ＣＭＳ」という用語は、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）と２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸（ＭＥＰ）とから４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール（４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）とも呼称される）の生成を触媒するｉｓｐＤ遺伝子によってコードされる、酵素である２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．６０）に関する。ＭＣＴ、ＣＭＳ、又はＩｓｐＤである遺伝子産生物の名称は本願では互換的に用いられる。
【００４７】
「ＣＭＫ」又は「ＩｓｐＥ」という用語は、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸（４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸（ＣＤＰ−ＭＥＰ）とも呼称される）への４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）のＡＴＰ依存性リン酸化を触媒するＩｓｐＥ遺伝子によってコードされる、酵素である４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ（４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼとも呼称される）（ＥＣ２．７．１．１４８）に関する。ＣＭＫ又はＩｓｐＥという遺伝子産生物の名称は本願では互換的に用いられる。
【００４８】
「ＩｓｐＦ」、「ＭＥＣＤＰシンターゼ」、「ＭＥＣＰＰシンターゼ」、又は「ＭＥＣＰＳ」又は「ＭＣＳ」という用語は、シチジン５−モノリン酸（ＣＭＰ）の対応する放出を伴う、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）への４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸（ＣＤＰ−ＭＥＰ）の変換を触媒するＩｓｐＦ遺伝子によってコードされる、酵素である２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＥＣ４．６．１．１２）に関する。ＩｓｐＦ、ＭＥＣＤＰシンターゼ、ＭＥＣＰＰシンターゼ、ＭＣＳ、又はＭＥＣＰＳという遺伝子産生物の名称は本願では互換的に用いられる。
【００４９】
「ＩｓｐＧ」又は「ＨＤＳ」という用語は、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）への２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸（ｃＭＥＰＰ）の変換に関わるＩｓｐＧ遺伝子によってコードされる、酵素である４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イル二リン酸シンターゼ（ＥＣ１．１７．７．１）に関する。
【００５０】
「ＩｓｐＨ」又は「ＩＤＳ」という用語は、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）とに変換するＩｓｐＨ遺伝子によってコードされる、酵素である４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル二リン酸レダクターゼ（ヒドロキシメチルブテニルピロリン酸レダクターゼとも呼称される）（ＥＣ１．１７．１．２）に関する。
【００５１】
「ＩＤＩ」、「ＩＰＰイソメラーゼ」又は「イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ」という用語は、ホモアリル性基質イソペンテニル（ＩＰＰ）のそのアリル異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への１，３−アリル転位を触媒するｆｎｉ又はｉｄｉ遺伝子によってコードされる、酵素であるイソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼ（ＥＣ５．３．３．２）に関する。ｆｎｉ又はｉｄｉという遺伝子の名称は本願では互換的に用いられる。
【００５２】
「メバロン酸経路」又は「ＭＥＶ経路」という用語は、アセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換する生合性経路に関して本明細書では用いられる。メバロン酸経路は、（ａ）アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）の作用によって、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合するステップ、（ｂ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の作用によって、アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合してヒドロキシメチルグルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を生成するステップと、（ｃ）ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）（ＥＣ１．１．１．３４）の作用により、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換するステップと、（ｄ）メバロネートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３６）の作用により、メバロネートをメバロネート５−リン酸にリン酸化するステップと、（ｅ）ホスホメバロネートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．２）の作用により、メバロネート５−リン酸をメバロネート５−ピロリン酸に変換するステップと、（ｆ）ジホスホメバロネートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３３）の作用により、メバロネート５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換するステップとを触媒する酵素を含む。
【００５３】
「ＩｓｐＡ」、「ＦＤＰＳ」、「ＦＰＰＳ」又は「ＦＰＰシンターゼ」という用語は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）がアリルピロリン酸であるジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）と縮合し、そして得られたゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）と縮合して最終産生物であるファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を得るという連続的な縮合を触媒するＩｓｐＡ遺伝子によってコードされる、酵素であるファルネシル二リン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．１０、ＥＣ２．５．１．１）に関する。任意的に、好ましい実施形態において、この酵素は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性（２．５．１．２９）も示し得る。ＩｓｐＡ、ＦＤＰＳ、ＦＰＰＳ、又はＦＰＰシンターゼという遺伝子産生物の名称は本願では互換的に用いられる。
【００５４】
「イソプレンシンターゼ」という用語は、ジメチルアリル二リン酸（ＥＣ４．２．３．２７）からのイソプレンの生成を触媒する酵素に関する。
【００５５】
生物に関して、上述の酵素とコードする遺伝子の学名は異なり得る。しかし、明確にするために、本明細書において、これらの用語は酵素又は遺伝子の由来から独立して用いられる。
【００５６】
本明細書に用いられるような、酵素の「活性」という用語はその作用に関し、本発明の文脈において、酵素により触媒される反応を指す。酵素活性は当業者によって既知の任意の方法によって測定され得る。
【００５７】
本明細書に用いられるような、酵素の「活性増大」又は「活性増強」又は「活性向上」という用語は、特定の触媒活性の増大、基質に対する特異性の増大、タンパク質又はＲＮＡの安定性の増大、及び／又は酵素の細胞内濃度の増大に関する。好ましくは、活性増大とは、酵素をコードする遺伝子の過剰発現によって得られた該酵素の細胞内濃度の増大である。
【００５８】
本明細書に用いられるような「アポカロテノイド」という用語は、カロテノイド切断ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）によって触媒された酸化的切断によるところの、カロテノイド由来の有機化合物に関する。アポカロテノイドの一部は、食用植物の色や、味、香りの必須且つ重要な構成物質である。アポカロテノイドの例として、β−イオノン、α−イオノン、ゲラニルアセトン、プソイドヨノン、及びβ−ダマセノンを非限定的に含む。
【００５９】
本明細書に用いられるような「配列同一性」又は「同一性」という用語は、２つのポリぺプチド配列のアライメントからの位置の整合数（％）（同一のアミノ酸残基）に関する。配列同一性は、配列のギャップを最小化しながら重複と同一性とを最大化するようにアライメントされるときに配列を比較することで決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、多くの数学的グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムの任意のものを用いて決定され得る。同様の長さの配列は、長さ全体にわたり最適に配列をアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例として、ニードルマン・ウンシュアルゴリズム、ニードルマンとウンシュ、１９７０年）を用いて好ましくはアライメントされ、一方で、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例として、スミス・ウォーターマンアルゴリズム（スミスとウォーターマン、１９８１年）又はアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）アルゴリズム（アルトシュル他、１９９７年、アルトシュル他、２００５年））を用いて好ましくはアライメントされる。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアライメントは、当該技術の範囲内である種々の方法でおこなわれ得り、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネット上のウェブサイトにおいて公衆に利用可能なコンピュータソフトウエアが用いられる。当業者は、比較される配列全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的のため、アミノ酸配列同一性率値は、ニードルマン・ウンシュアルゴリズムを用いて２つの配列の最適なグローバルアライメントを創成する、ペアワイズシーケンスアライメントプログラムであるＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅを用いて生成された値に関し、全ての検索パラメータはデフォルト値、即ち、スコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップエクステンド＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０、及びエンドギャップエクステンド＝０．５に設定される。
【００６０】
＜ＭＥＰ経路の遺伝子学的改変＞
本発明者らは、ＭＥＰ経路に関連する酵素の中で律速酵素を特定し、その過剰発現がイソプレノイド産生を大きく増大させることを示した。
【００６１】
従って、第１の態様において、本発明は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール  ４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース  ５−リン酸（ＭＥＰ／ＤＸＰ）経路の増強を示す組換えデイノコッカス細菌、即ち、非改変デイノコッカス細菌と比較してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの炭素流が増加するように遺伝子的に改変されたデイノコッカス細菌に関する。
【００６２】
本発明の組換えデイノコッカス細菌において、ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨ、及びＩＰＰイソメラーゼからなる群から選択された少なくとも１つの酵素の活性が、非改変デイノコッカス細菌と比較して増大される。好ましくは、これらの活性のうち少なくとも２、３、４、５、６又は７つが増大される。さらに好ましくはこれらすべての活性が増大される。
【００６３】
これらの酵素の活性は、そのコード遺伝子の過剰発現により増大され得る。従って、一実施形態において、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が過剰発現される。好ましくは、これらの遺伝子のうち少なくとも２、３、４、５、６、又は７が過剰発現される。さらに好ましくは、これらすべての遺伝子が過剰発現される。
【００６４】
遺伝子発現を増大するために、当業者は、細菌における遺伝子コピー数の増加、遺伝子の高レベル発現を誘導するプロモータ、つまり強力なプロモータの使用、対応するメッセンジャーＲＮＡを安定化するか又はリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列やその周囲配列を改変する要素の使用など、任意の既知の技術を使用可能である。
【００６５】
一実施形態において、過剰発現は、細菌の遺伝子コピー数を増加させることとで得られる。遺伝子置換を含む、当業者に既知の組換え法によって、遺伝子の１以上のコピーがゲノムに導入され得る。好ましくは、遺伝子を含む発現カセットがゲノムに組込まれる。
【００６６】
代替的に、遺伝子は、目的の遺伝子を有する発現カセットを含む発現ベクター、好ましくはプラスミドに保持され得る。発現ベクターは、複製起点の性質に応じて、細菌内に１〜５、２０、１００、又は５００コピー存在するとよい。
【００６７】
他の実施形態において、遺伝子の過剰発現は、遺伝子の高レベル発現を誘導するプロモータの使用により得られる。例として、内在性遺伝子のプロモータは強力なプロモータ、つまり高レベル発現を誘導するプロモータにより置換され得る。本発明での使用に適するプロモータは当業者に既知であり、構成的又は誘導的、及び内在性、同種、又は異種であり得る。
【００６８】
本発明において有用な発現カセットは、遺伝子の発現をもたらす転写プロモータ及び転写ターミネータを通常含む１つ以上の制御配列に操作可能に連結された、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む。好ましくは、各発現カセットは、１つ以上の制御配列に操作可能に連結された１つの遺伝子のみを含む。このとき、複数の遺伝子が過剰発現される場合、複数の発現カセットが用いられ、そのそれぞれが１つの遺伝子のみを含む。代替的に、本発明において有用な発現カセットは、（ｉ）ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉ遺伝子から選択される少なくとも２つの遺伝子、又は（ｉｉ）ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子と例えばテルペンシンターゼ若しくはＦＰＰシンターゼをコードする遺伝子などの少なくとも１つの他の遺伝子、を含有するオペロンを含み得る。
【００６９】
制御配列は宿主細胞により認識されるプロモータを含み得る。プロモータは、酵素発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモータはデイノコッカス細菌において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり得る。プロモータは、内在性、同種又は異種プロモータであり得る。好ましいプロモータは内在性又は同種のものである。これに関して、種々のプロモータが研究されており、デイノコッカス細菌における遺伝子発現に使用されている。適切なプロモータの例として、翻訳伸張因子Ｔｕ遺伝子のｔｕｆＡ（ＤＲ０３０９）及びｔｕｆＢ（ＤＲ２０５０）からのＰｔｕｆＡ及びＰｔｕｆＢプロモータ、ｐＩ３に位置するｒｅｓＵ遺伝子のプロモータ、並びにｇｒｏＥＳＬオペロンのＰｇｒｏＥＳＬプロモーター領域（Ｌｅｃｏｉｎｔｅ他、２００４年；Ｍｅｉｍａ他、２００１年）、又はそのようなプロモーターの誘導体を含む。好ましくはプロモータは強力な構成的プロモータである。
【００７０】
制御配列は、デイノコッカス細菌により認識されて転写を終結する転写ターミネータであってもよい。ターミネータは、遺伝子の３’末端に操作可能に連結される。例としてＬｅｃｏｉｎｔｅ他（２００４年）が記載するターミネータであるターム１１６（ｔｅｒｍ１１６）など、デイノコッカス細菌において機能する任意のターミネータが本発明において用いられ得る。
【００７１】
任意的に、発現カセットは、組換え細菌の選択を容易にする選択可能マーカを含んでもよい。通常、選択可能マーカは、抗生物質耐性をコードするか又は独立栄養性を付与する遺伝子である。
【００７２】
所定の実施形態において、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、強力な構成的プロモータと操作可能に連結されたｄｘｓ遺伝子を含む発現カセット、強力な構成的プロモータと操作可能に連結されたｄｘｒ遺伝子を含む発現カセット、強力な構成的プロモータと操作可能に連結されたｉｓｐＤ遺伝子を含む発現カセット、強力な構成的プロモータと操作可能に連結されたｉｓｐＥ遺伝子を含む発現カセット、強力な構成的プロモータと操作可能に連結されたｉｓｐＦ遺伝子を含む発現カセット、強力な構成的プロモータと操作可能に連結されたｉｓｐＧ遺伝子を含む発現カセット、強力な構成的プロモータと操作可能に連結されたｉｓｐＨ遺伝子を含む発現カセット、及び／又は、強力な構成的プロモータと操作可能に連結されたｉｄｉ遺伝子を含む発現カセットを含有する。
【００７３】
これらの発現カセットは、細菌のゲノムに組込まれるか、及び／又はエピソーム形態で発現ベクターに保持され得る。好ましくは、発現カセットは細菌のゲノムに組込まれる。本発明の細菌は、（ｉ）ｄｘｓ（ａ）、ｄｘｒ（ｂ）、ｉｓｐＤ（ｃ）、ｉｓｐＥ（ｄ）、ｉｓｐＦ（ｅ）、ｉｓｐＧ（ｆ）、ｉｓｐＨ（ｇ）、若しくはｉｄｉ（ｈ）遺伝子、（ｉｉ）ａ，ｂ；ａ，ｃ；ａ，ｄ；ａ，ｅ；ａ，ｆ；ａ，ｇ；ａ，ｈ；ｂ，ｃ；ｂ，ｄ；ｂ，ｅ；ｂ，ｆ；ｂ，ｇ；ｂ，ｈ；ｃ，ｄ；ｃ，ｅ；ｃ，ｆ；ｃ，ｇ；ｃ，ｈ；ｄ，ｅ；ｄ，ｆ；ｄ，ｇ；ｄ，ｈ；ｅ，ｆ；ｅ，ｇ；ｅ，ｈ；ｆ，ｇ；ｆ，ｈ；及びｇ，ｈ；の２つの遺伝子の組合せのうちの１つ、（ｉｉｉ）ａ，ｂ，ｃ；ａ，ｂ，ｄ；ａ，ｂ，ｅ；ａ，ｂ，ｆ；ａ，ｂ，ｇ；ａ，ｂ，ｈ；ａ，ｃ，ｄ；ａ，ｃ，ｅ；ａ，ｃ，ｆ；ａ，ｃ，ｇ；ａ，ｃ，ｈ；ａ，ｄ，ｅ；ａ，ｄ，ｆ；ａ，ｄ，ｇ；ａ，ｄ，ｈ；ａ，ｅ，ｆ；ａ，ｅ，ｇ；ａ，ｅ，ｈ；ａ，ｆ，ｇ；ａ，ｆ，ｈ；ａ，ｇ，ｈ；ｂ，ｃ，ｄ；ｂ，ｃ，ｅ；ｂ，ｃ，ｆ；ｂ，ｃ，ｇ；ｂ，ｃ，ｈ；ｂ，ｄ，ｅ；ｂ，ｄ，ｆ；ｂ，ｄ，ｇ；ｂ，ｄ，ｈ；ｂ，ｅ，ｆ；ｂ，ｅ，ｇ；ｂ，ｅ，ｈ；ｂ，ｆ，ｇ；ｂ，ｆ，ｈ；ｂ，ｇ，ｈ；ｃ，ｄ，ｅ；ｃ，ｄ，ｆ；ｃ，ｄ，ｇ；ｃ，ｄ，ｈ；ｃ，ｅ，ｆ；ｃ，ｅ，ｇ；ｃ，ｅ，ｈ；ｃ，ｆ，ｇ；ｃ，ｆ，ｈ；ｃ，ｇ，ｈ；ｄ，ｅ，ｆ；ｄ，ｅ，ｇ；ｄ，ｅ，ｈ；ｄ，ｆ，ｇ；ｄ，ｆ，ｈ；ｄ，ｇ，ｈ；ｅ，ｆ，ｇ；ｅ，ｆ，ｈ；ｅ，ｇ，ｈ；及びｆ，ｇ，ｈ；の３つの遺伝子の組合せのうちの１つ、（ｉｖ）ａ，ｂ，ｃ，ｄ；ａ，ｂ，ｃ，ｅ；ａ，ｂ，ｃ，ｆ；ａ，ｂ，ｃ，ｇ；ａ，ｂ，ｃ，ｈ；ａ，ｂ，ｄ，ｅ；ａ，ｂ，ｄ，ｆ；ａ，ｂ，ｄ，ｇ；ａ，ｂ，ｄ，ｈ；ａ，ｂ，ｅ，ｆ；ａ，ｂ，ｅ，ｇ；ａ，ｂ，ｅ，ｈ；ａ，ｂ，ｆ，ｇ；ａ，ｂ，ｆ，ｈ；ａ，ｂ，ｇ，ｈ；ａ，ｃ，ｄ，ｅ；ａ，ｃ，ｄ，ｆ；ａ，ｃ，ｄ，ｇ；ａ，ｃ，ｄ，ｈ；ａ，ｃ，ｅ，ｆ；ａ，ｃ，ｅ，ｇ；ａ，ｃ，ｅ，ｈ；ａ，ｃ，ｆ，ｇ；ａ，ｃ，ｆ，ｈ；ａ，ｃ，ｇ，ｈ；ａ，ｄ，ｅ，ｆ；ａ，ｄ，ｅ，ｇ；ａ，ｄ，ｅ，ｈ；ａ，ｄ，ｆ，ｇ；ａ，ｄ，ｆ，ｈ；ａ，ｄ，ｇ，ｈ；ａ，ｅ，ｆ，ｇ；ａ，ｅ，ｆ，ｈ；ａ，ｅ，ｇ，ｈ；ａ，ｆ，ｇ，ｈ；ｂ，ｃ，ｄ，ｅ；ｂ，ｃ，ｄ，ｆ；ｂ，ｃ，ｄ，ｇ；ｂ，ｃ，ｄ，ｈ；ｂ，ｃ，ｅ，ｆ；ｂ，ｃ，ｅ，ｇ；ｂ，ｃ，ｅ，ｈ；ｂ，ｃ，ｆ，ｇ；ｂ，ｃ，ｆ，ｈ；ｂ，ｃ，ｇ，ｈ；ｂ，ｄ，ｅ，ｆ；ｂ，ｄ，ｅ，ｇ；ｂ，ｄ，ｅ，ｈ；ｂ，ｄ，ｆ，ｇ；ｂ，ｄ，ｆ，ｈ；ｂ，ｄ，ｇ，ｈ；ｂ，ｅ，ｆ，ｇ；ｂ，ｅ，ｆ，ｈ；ｂ，ｅ，ｇ，ｈ；ｂ，ｆ，ｇ，ｈ；ｃ，ｄ，ｅ，ｆ；ｃ，ｄ，ｅ，ｇ；ｃ，ｄ，ｅ，ｈ；ｃ，ｄ，ｆ，ｇ；ｃ，ｄ，ｆ，ｈ；ｃ，ｄ，ｇ，ｈ；ｃ，ｅ，ｆ，ｇ；ｃ，ｅ，ｆ，ｈ；ｃ，ｅ，ｇ，ｈ；ｃ，ｆ，ｇ，ｈ；ｄ，ｅ，ｆ，ｇ；ｄ，ｅ，ｆ，ｈ；ｄ，ｅ，ｇ，ｈ；ｄ，ｆ，ｇ，ｈ；及びｅ，ｆ，ｇ，ｈ；の４つの遺伝子の組合せのうちの１つ、（ｖ）ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｆ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｇ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｅ，ｆ；ａ，ｂ，ｃ，ｅ，ｇ；ａ，ｂ，ｃ，ｅ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｆ，ｇ；ａ，ｂ，ｃ，ｆ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ；ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｇ；ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｈ；ａ，ｂ，ｄ，ｆ，ｇ；ａ，ｂ，ｄ，ｆ，ｈ；ａ，ｂ，ｄ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｅ，ｆ，ｇ；ａ，ｂ，ｅ，ｆ，ｈ；ａ，ｂ，ｅ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ；ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｇ；ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｈ；ａ，ｃ，ｄ，ｆ，ｇ；ａ，ｃ，ｄ，ｆ，ｈ；ａ，ｃ，ｄ，ｇ，ｈ；ａ，ｃ，ｅ，ｆ，ｇ；ａ，ｃ，ｅ，ｆ，ｈ；ａ，ｃ，ｅ，ｇ，ｈ；ａ，ｃ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ；ａ，ｄ，ｅ，ｆ，ｈ；ａ，ｄ，ｅ，ｇ，ｈ；ａ，ｄ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ；ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｇ；ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｈ；ｂ，ｃ，ｄ，ｆ，ｇ；ｂ，ｃ，ｄ，ｆ，ｈ；ｂ，ｃ，ｄ，ｇ，ｈ；ｂ，ｃ，ｅ，ｆ，ｇ；ｂ，ｃ，ｅ，ｆ，ｈ；ｂ，ｃ，ｅ，ｇ，ｈ；ｂ，ｃ，ｆ，ｇ，ｈ；ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ；ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，ｈ；ｂ，ｄ，ｅ，ｇ，ｈ；ｂ，ｄ，ｆ，ｇ，ｈ；ｂ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ；ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｈ；ｃ，ｄ，ｅ，ｇ，ｈ；ｃ，ｄ，ｆ，ｇ，ｈ；ｃ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；及びｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；の５つの遺伝子の組合せのうちの１つ、（ｖｉ）ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｇ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｆ，ｇ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｆ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｅ，ｆ，ｇ；ａ，ｂ，ｃ，ｅ，ｆ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｅ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ；ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，ｈ；ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｄ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ；ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｈ；ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｇ，ｈ；ａ，ｃ，ｄ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｃ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ；ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｈ；ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｇ，ｈ；ｂ，ｃ，ｄ，ｆ，ｇ，ｈ；ｂ，ｃ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；及びｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈの６つの遺伝子の組合せのうちの１つ、（ｖｉｉ）ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｃ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ；及びｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈの７つの遺伝子の組合せのうちの１つ、又は（ｖｉｉｉ）８つの遺伝子の組合せ、を過剰発現するとよい。
【００７４】
一実施形態において、細菌は、少なくともｉｓｐＧ遺伝子と、任意的にｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉ遺伝子のうちの１以上とを過剰発現する。
【００７５】
過剰発現される遺伝子は、内在性、同種、又は異種の遺伝子であり得る。
【００７６】
ｄｘｓ遺伝子は、１−デオキシキシルロース５−リン酸シンターゼをコードする任意の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子であり得る。
【００７７】
好ましい実施形態において、ｄｘｓ遺伝子はデイノコッカス細菌からのものである。特に、ｄｘｓ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：
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）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号３）、Ｄ．アパチェンシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１９５８６００．１）、Ｄ．フォエニシス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＹＢ６６７２６．１；ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０３４３６０３７３．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ａ０Ａ０１６ＱＬ５９）、Ｄ．デゼルティ（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１２６９２９４４．１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＯ４５８２１．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｃ１Ｄ１Ｕ７）、Ｄ．アクアティリス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０２６２９８７４９．１若しくはＷＰ＿０１９００９６７０．１）、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０１７８６９２９８．１）、Ｄ．ラディオデュランス（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＲＵＢ５；ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１０８８８１１４．１）、Ｄ．ゴビエンシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１４６８４９２３．１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＤ２５４４０．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｈ８ＧＵＢ６）、Ｄ．ｓｐ．２００９（ＷＰ＿０２２８０１８０８．１）、Ｄ．マリコペンシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１３５５７３５０．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｅ８Ｕ９Ｖ６）、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１５２３４２９５．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｋ９ＺＸＲ０）、Ｄ．プロテオライティカス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１３６１４９５４．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｆ０ＲＮＬ９）、Ｄ．ラディオピュグナンス（配列番号５２に示されるタンパク質をコードする配列；配列番号５９）、Ｄ．ムライ（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０２７４６１３１６．１）、Ｄ．ｓｗｕｅｎｓｉｓ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ａ０Ａ０Ａ７ＫＫ２７ ；ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０３９６８６５１２．１）、Ｄ．ｓｏｌｉｓ（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０４６８４２９０２．１）、及びＤ．フィカス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０２７４６１７２５．１）のｄｘｓ遺伝子からなる群より選択されるとよい。好ましくは、ｄｘｓ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．アパチェンシス、Ｄ．フォエニシス、Ｄ．デゼルティ、Ｄ．アクアティリス、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．ラディオデュランス、Ｄ．ゴビエンシス、Ｄ．ｓｐ．２００９、Ｄ．マリコペンシス、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ、Ｄ．プロテオライティカス、及びＤ．ラディオピュグナンスのｄｘｓ遺伝子からなる群より選択される。さらに好ましくは、ｄｘｓ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、又はＤ．ラディオピュグナンスからのものであり、さらにより好ましくはＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ又はＤ．ラディオピュグナンスからのものである。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号２、４、又は５２のポリペプチド、より好ましくは配列番号２又は４のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌からの、任意のポリペプチドが用いられ得る。
【００７８】
ｄｘｒ遺伝子は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードする任意の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子であり得る。好ましい実施形態において、ｄｘｒ遺伝子はデイノコッカス細菌からのものである。特に、ｄｘｒ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号３４；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ１ＩＺＪ１）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号３６）、Ｄ．アパチェンシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１９５８４８２５．１）、Ｄ．ゴビエンシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１４６８５２５５．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｈ８ＧＷＷ６）、Ｄ．フォエニシス（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ａ０Ａ０１６ＱＫＨ６；ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＹＢ６６６４５．１）、Ｄ．ラディオデュランス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿１０８８８１４７．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＲＵ８４）、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１７８６９２６６．１）、Ｄ．デゼルティ（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１２６９３３８３．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｃ１ＣＶＰ３）、Ｄ．ｓｐ．２００９（ＷＰ＿０２２８０２１３２．１）、Ｄ．アクアティリス（ＷＰ＿０１９００９４５８．１）、Ｄ．マリコペンシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１３５５７７８１．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｅ８ＵＢ３８）、Ｄ．プロテオライティカス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１３６１４１４０．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｆ０ＲＪＱ５）、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１５２３７１６２．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｌ０Ａ５Ｚ１）、Ｄ．ｓｗｕｅｎｓｉｓ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ａ０Ａ０Ａ７ＫＦ７７；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＩＺ４４７６０．１）、Ｄ．ｓｏｌｉｓ（ＷＰ＿０４６８４２６６９．１）、Ｄ．マルモリス（ＷＰ＿０２９４８１０４０．１）、Ｄ．フィカス（ＷＰ＿０２７４６２５８４．１）、Ｄ．ラディオピュグナンス（配列番号６１）、及びＤ．ムライ（ＷＰ＿０２７４６０９１６．１）のｄｘｒ遺伝子からなる群より選択されるとよい。好ましくは、ｄｘｒ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．アパチェンシス、Ｄ．ゴビエンシス、Ｄ．フォエニシス、Ｄ．ラディオデュランス、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．デゼルティ、Ｄ．ｓｐ．２００９、Ｄ．アクアティリス、Ｄ．マリコペンシス、Ｄ．プロテオライティカス、及びＤ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓのｄｘｒ遺伝子からなる群より選択される。より好ましくは、ｄｘｒ遺伝子はＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓからのものである。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号３５又は３７のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌からの、任意のポリペプチドが用いられ得る。
【００７９】
ｉｓｐＤ遺伝子は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼをコードする任意の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子であり得る。好ましい実施形態において、ｉｓｐＤ遺伝子はデイノコッカス細菌からのものである。特に、ｉｓｐＤ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号１７；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ１Ｊ２００）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号１９）、Ｄ．アパチェンシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１９５８７１６１．１）、Ｄ．フォエニシス（ＥＹＢ６９５１４．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ａ０Ａ０１６ＱＵＲ２）、Ｄ．デゼルティ（ＷＰ＿０１２６９１９４６．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｃ１ＣＸＬ７）、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０１７８７１５６８．１）、Ｄ．ラディオデュランス（ＷＰ＿０１０８８９２２８．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＲＲ９０）、Ｄ．ｓｐ．２００９（ＷＰ＿０２２８００７１７．１）、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ（ＷＰ＿０１５２３６７１６．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｌ０Ａ４Ｐ７）、Ｄ．アクアティリス（ＷＰ＿０１９０１０９４９．１又はＷＰ＿０２６２９８９７２．１）、Ｄ．マリコペンシス（ＷＰ＿０１３５５６２０７．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｅ８Ｕ６Ｌ３）、Ｄ．プロテオライティカス（ＷＰ＿０１３６１５３６７．１又はＷＰ＿０４１２２２８０１．１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＹ２６７５９．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｆ０ＲＫＰ７）、Ｄ．ゴビエンシス（ＷＰ＿０１４６８６２００．１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＤ２６７２０．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｈ８ＧＶ４５）、Ｄ．マルモリス（ＷＰ＿０２９４８０４５１．１）、Ｄ．ソリ（ＡＫＨ１７１０１．１）、Ｄ．ｓｗｕｅｎｓｉｓ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ａ０Ａ０Ａ７ＫＬ８２）、Ｄ．ｍｉｓａｓｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０３４３４４３３９．１）、Ｄ．ラディオピュグナンス（配列番号：６３）、及びＤ．ムライ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＯ４４８２３．１；ＷＰ＿０２７４６０４５８．１）のｉｓｐＤ遺伝子からなる群より選択されるとよい。好ましくは、ｉｓｐＤ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．アパチェンシス、Ｄ．フォエニシス、Ｄ．デゼルティ、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．ラディオデュランス、Ｄ．ｓｐ．２００９、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ、Ｄ．アクアティリス、Ｄ．マリコペンシス、Ｄ．プロテオライティカス、及びＤ．ゴビエンシスのｉｓｐＤ遺伝子からなる群より選択される。より好ましくは、ｉｓｐＤ遺伝子はＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓからのものである。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号１８又は２０のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌からの、任意のポリペプチドが用いられ得る。
【００８０】
ｉｓｐＥ遺伝子は、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼをコードする任意の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子であり得る。好ましい実施形態において、ｉｓｐＥ遺伝子はデイノコッカス細菌からのものである。特に、ｉｓｐＥ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号３８；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ１Ｊ２０１；ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１１５２９３３０．１）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号４０）、Ｄ．フォエニシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＥＹＢ６９５１３．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ａ０Ａ０１６ＱＴＸ２）、Ｄ．アパチェンシス（ＷＰ＿０１９５８７１６２．１）、Ｄ．アクアティリス（ＷＰ＿０１９００９０８３．１）、Ｄ．マリコペンシス（ＷＰ＿０１３５５６２０６．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｅ８Ｕ６Ｌ２；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＶ６６７０１．１）、Ｄ．デゼルティ（ＷＰ＿０１２６９１９４７．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｃ１ＣＸＬ８）、Ｄ．ｓｐ．２００９（ＷＰ＿０２２８００７１６．１）、Ｄ．プロテオライティカス（ＷＰ＿０１３６１５３６４．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｆ０ＲＫＨ７）、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０１７８７１５６９．１）、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ（ＷＰ＿０１５２３６７１５．１又はＷＰ＿０２２８００７１６．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｌ０Ａ３Ｅ０）、Ｄ．ゴビエンシス（ＷＰ＿０１４６８６１９９．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｈ８ＧＶ４４）、Ｄ．ラディオデュランス（ＷＰ＿１０８８９２２９．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＲＲ８９）、Ｄ．ｓｗｕｅｎｓｉｓ（Ａ０Ａ０Ａ７ＫＧＮ１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＩＺ４５３２２．１）、Ｄ．ソリ（ＡＫＨ１７１０２．１）、Ｄ．ラディオピュグナンス（配列番号６５）、及びＤ．マルモリス（ＷＰ＿０２９４８０４５３．１）のｉｓｐＥ遺伝子からなる群より選択されるとよい。好ましくは、ｉｓｐＥ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．フォエニシス、Ｄ．アパチェンシス、Ｄ．アクアティリス、Ｄ．マリコペンシス、Ｄ．デゼルティ、Ｄ．ｓｐ．２００９、Ｄ．プロテオライティカス、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ、Ｄ．ゴビエンシス、及びＤ．ラディオデュランスのｉｓｐＥ遺伝子からなる群より選択される。より好ましくは、ｉｓｐＥ遺伝子はＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓからのものである。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号３９又は４１のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌からの、任意のポリペプチドが用いられ得る。
【００８１】
ｉｓｐＦ遺伝子は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼをコードする任意の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子であり得る。好ましい実施形態において、ｉｓｐＦ遺伝子はデイノコッカス細菌からのものである。特に、ｉｓｐＦ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号２１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ１Ｊ２Ａ８；ＷＰ＿０１１５２９２２３．１）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号２３）、Ｄ．フォエニシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＥＹＢ６９３８３．１，ＷＰ＿０３４３５３３６５．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ａ０Ａ０１６ＱＴＩ４）、Ｄ．アパチェンシス（ＷＰ＿０１９５８７１１９．１）、Ｄ．ｓｐ．２００９（ＷＰ＿０２２８００４３１．１）、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０１７８７１２５２．１）、Ｄ．マリコペンシス（ＷＰ＿０１３５５８００１．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｅ８ＵＢＱ８）、Ｄ．デゼルティ（ＷＰ＿０１２６９２１９４．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｃ１ＣＺ３３）、Ｄ．アクアティリス（ＷＰ＿０１９００９１１５．１）、Ｄ．ラディオデュランス（ＷＰ＿０１０８８６８７６．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＲＸＳ６）、Ｄ．プロテオライティカス（ＷＰ＿０１３６１５３２０．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｆ０ＲＫＤ３）、Ｄ．ゴビエンシス（ＷＰ＿０１４６８６２５９．１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｈ８ＧＶＡ４）、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ（ＷＰ＿０１５２３４９０５．１）、Ｄ．ｓｗｕｅｎｓｉｓ（Ａ０Ａ０Ａ７ＫＫＶ６）、Ｄ．ラディオピュグナンス（配列番号６７）、及びＤ．ムライ（ＷＰ＿０２７４６１４７３．１）のｉｓｐＦ遺伝子からなる群より選択されるとよい。好ましくは、ｉｓｐＦ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．フォエニシス、Ｄ．アパチェンシス、Ｄ．ｓｐ．２００９、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．マリコペンシス、Ｄ．デゼルティ、Ｄ．アクアティリス、Ｄ．ラディオデュランス、Ｄ．プロテオライティカス、Ｄ．ゴビエンシス、及びＤ．  ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓのｉｓｐＦ遺伝子からなる群より選択される。より好ましくは、ｉｓｐＦ遺伝子はＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓからのものである。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号２２又は２４のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌からの、任意のポリペプチドが用いられ得る。
【００８２】
ｉｓｐＧ遺伝子は、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イル二リン酸シンターゼをコードする任意の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子であり得る。好ましい実施形態において、ｉｓｐＧ遺伝子はデイノコッカス細菌からのものである。特に、ｉｓｐＧ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号２５）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号２７）、Ｄ．アパチェンシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１９５８４７３９．１又はＷＰ＿０４０３８２２６５．１）、Ｄ．フォエニシス（ＥＹＢ６７７５０．１）、Ｄ．アクアティリス（ＷＰ＿０１９００８２００．１）、Ｄ．ｓｐ．２００９（ＷＰ＿０２２８０１６３３．１）、Ｄ．ゴビエンシス（Ｄ．ｇｏｂｉｅｎｓｉｓ）（ＷＰ＿０１４６８４６３２．１）、Ｄ．ラディオデュランス（ＷＰ＿０１０８８７０３１．１）、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０１７８７１９４２．１）、Ｄ．デゼルティ（ＷＰ＿０１２６９３２５１．１）、Ｄ．プロテオライティカス（ＷＰ＿０１３６１５１７１．１）、Ｄ．マリコペンシス（ＷＰ＿０１３５５６９０７．１；ＥＹＢ６７７５０．１）、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ（ＷＰ＿０１５２３７０９４．１）、Ｄ．ラディオピュグナンス（配列番号６９）、及びＤ．ムライ（ＷＰ＿０２７４６０８６７．１）のｉｓｐＧ遺伝子からなる群より選択されるとよい。好ましくは、ｉｓｐＧ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．アパチェンシス、Ｄ．フォエニシス、Ｄ．アクアティリス、Ｄ．ｓｐ．２００９、Ｄ．ゴビエンシス、Ｄ．ラディオデュランス、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．デゼルティ、Ｄ．プロテオライティカス、Ｄ．マリコペンシス、及びＤ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓのｉｓｐＧ遺伝子からなる群より選択される。より好ましくは、ｉｓｐＧ遺伝子はＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓからのものである。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号２６又は２８のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌からの、任意のポリペプチドが用いられ得る。
【００８３】
ｉｓｐＨ遺伝子は、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル  二リン酸レダクターゼをコードする任意の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子であり得る。好ましい実施形態において、ｉｓｐＨ遺伝子はデイノコッカス細菌からのものである。特に、ｉｓｐＨ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号４２）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号４４）、Ｄ．フォエニシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＥＹＢ６８２３．１；ＷＰ＿０３４３５６４３４．１）、Ｄ．アパチェンシス（ＷＰ＿０１９５８５８９０．１）、Ｄ．ｓｐ．２００９（ＷＰ＿０２２８０１９２８．１）、Ｄ．ゴビエンシス（ＷＰ＿０１４６８５１７８．１）、Ｄ．アクアティリス（ＷＰ＿０１９００７８９３．１）、Ｄ．ラディオデュランス（ＷＰ＿１０８８８７９５．１）、Ｄ．デゼルティ（ＷＰ＿０１２６９３０５９．１；ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＡＣＯ４５９３６．１）、Ｄ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ（ＷＰ＿０１５２３６９３５．１）、Ｄ．プロテオライティカス（ＷＰ＿０１３６１４３６０．１）、Ｄ．マリコペンシス（ＷＰ＿０１３５５７６９１．１）、Ｄ．ラディオピュグナンス（配列番号７１）、及びＤ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０１７８６９８５１．１）のｉｓｐＨ遺伝子からなる群より選択されるとよい。好ましくは、ｉｓｐＨ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．アパチェンシス、Ｄ．フォエニシス、Ｄ．アクアティリス、Ｄ．ｓｐ．２００９、Ｄ．ゴビエンシス、Ｄ．ラディオデュランス、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．デゼルティ、Ｄ．プロテオライティカス、Ｄ．マリコペンシス、及びＤ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓのｉｓｐＨ遺伝子からなる群より選択される。より好ましくは、ｉｓｐＨ遺伝子はＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓからのものである。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号４３又は４５のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌からの、任意のポリペプチドが用いられ得る。
【００８４】
ｉｄｉ遺伝子は、イソペンテニル−二リン酸δ−イソメラーゼをコードする任意の遺伝子、好ましくは細菌遺伝子であり得る。好ましい実施形態において、ｉｄｉ遺伝子はデイノコッカス細菌からのものである。特に、ｉｄｉ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス（配列番号２９）、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ（配列番号３１）、Ｄ．アパチェンシス（ＮＣＢＩ受託番号：ＷＰ＿０１９５８５５６１．１）、Ｄ．フォエニシス（ＥＹＢ６７９１８．１）、Ｄ．アクアティリス（ＷＰ＿０１９０１０６３９．１又はＷＰ＿０４０３８０８４９．１）、Ｄ．ｓｐ．２００９（ＷＰ＿０２２８０２２３９．１）、Ｄ．デゼルティ（ＷＰ＿０１２６９２９３４．１）、Ｄ．ラディオデュランス（Ｑ９ＲＶＥ２．３）、Ｄ．マリコペンシス（ＷＰ＿０１３５５６０８５．１）、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０１７８７０８９４．１）、Ｄ．ゴビエンシス（ＷＰ＿０１４６８５６０２．１又はＷＰ＿０４３８０２１１６．１）、Ｄ．ラディオピュグナンス（配列番号７３）、及びＤ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓ（ＷＰ＿０１５２３６６５３．１）のｉｄｉ遺伝子からなる群より選択されるとよい。好ましくは、ｉｄｉ遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリス、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．アパチェンシス、Ｄ．フォエニシス、Ｄ．アクアティリス、Ｄ．ｓｐ．２００９、Ｄ．ゴビエンシス、Ｄ．ラディオデュランス、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ、Ｄ．デゼルティ、Ｄ．マリコペンシス、及びＤ．ｐｅｒａｒｉｄｉｌｉｔｏｒｉｓのｉｄｉ遺伝子からなる群より選択される。より好ましくは、ｉｄｉ遺伝子はＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓからのものである。それらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいずれか、好ましくは配列番号３０又は３２のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有する、好ましくはデイノコッカス細菌からの、任意のポリペプチドが用いられ得る。
【００８５】
好ましい実施形態において、細菌はＤＸＳ及びＩＤＩをコードする遺伝子を過剰発現する。好ましくは、過剰発現されたＤＸＳは以下に記載されるような改良ＤＸＳ酵素である。
【００８６】
―改良ＭＥＰ酵素―
本発明に用いられるｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉ遺伝子は、野生型酵素のアミノ酸配列との比較において、改良された酵素、つまり、活性増大をもたらす少なくとも１つの変異をその配列に有する酵素をもコードし得る。そうした改良酵素は当業者に既知の任意の技術により得られ得る。特に、改良ＤＸＰシンターゼ、また特に改良デイノコッカスＤＸＰシンターゼは、国際特許出願公開第２０１２／０５２１７１号に開示の技術により得られ得る。
【００８７】
このように、一実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、配列番号５２の２２２位の位置（若しくは配列番号４の２１６位の位置若しくは配列番号２の２１９位の位置）にてアスパラギン、及び／又は配列番号５２の２４４位の位置（若しくは配列番号４の２３８位の位置若しくは配列番号２の２４１位の位置）にてシステインを得るようにＤＸＰシンターゼを変異させることで取得される改良ＤＸＰシンターゼ、好ましくは改良デイノコッカスＤＸＰシンターゼをコードするｄｘｓ遺伝子を含む。好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、配列番号５２の２４４位の位置（若しくは配列番号４の２３８位の位置若しくは配列番号２の２４１位の位置）にてシステインを得るようにＤＸＰシンターゼを変異させることで取得される改良ＤＸＰシンターゼをコードするｄｘｓ遺伝子を含む。
【００８８】
２２２又は２４４位に相当する残基を特定する方法は当業者には既知であり、国際特許出願公開第２０１２／０５２１７１号に詳細に記載される。特に、これらの残基は、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＭＵＳＣＬＥ、又はニードルマンとウンシュのアルゴリズムを用いたプログラムなどの配列アライメントコンピュータプログラムを使用して特定されるとよい。
【００８９】
好ましい実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、Ｋ２２２Ｎ（配列番号６）、Ｒ２４４Ｃ（配列番号８）又はＫ２２２Ｎ／Ｒ２４４Ｃ（配列番号１０）の置換を有するＤ．ラディオピュグナンス（Ｄ．ｒａｄｉｏｐｕｇｎａｎｓ）の改良ＤＸＰシンターゼをコードする遺伝子を含む。これらの酵素をコードする遺伝子配列は、配列番号５、７、及び９にそれぞれ示される。より好ましくは、組換えデイノコッカス細菌はＤ．ラディオピュグナンスのＤＸＰシンターゼのＲ２４４Ｃ突然変異体（配列番号８）をコードする遺伝子を含む。
【００９０】
他の好ましい実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、Ｋ２１６Ｎ（配列番号１２）、Ｒ２３８Ｃ（配列番号１４）、又はＫ２１６Ｎ／Ｒ２３８Ｃ（配列番号１６）の置換を有するＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓの改良ＤＸＰシンターゼをコードする遺伝子を含む。これらの酵素をコードする遺伝子配列は、配列番号１１、１３、及び１５にそれぞれ示される。より好ましくは、組換えデイノコッカス細菌はＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓのＤＸＰシンターゼのＲ２３８Ｃ突然変異体（配列番号１４）をコードする遺伝子を含む。
【００９１】
さらに好ましい実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、Ｋ２１９Ｎ（配列番号５４）、Ｒ２４１Ｃ（配列番号５６）又はＫ２１９Ｎ／Ｒ２４１Ｃ（配列番号５８）の置換を有するＤ．ジオサーマリスの改良ＤＸＰシンターゼ（配列番号２）をコードする遺伝子を含む。より好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、Ｄ．ジオサーマリスのＤＸＰシンターゼのＲ２４１Ｃ突然変異体をコードする遺伝子を含む。
【００９２】
改良ＤＸＰシンターゼをコードする遺伝子は、組換え細菌において過剰発現され得る。好ましくは、この遺伝子は、構成的又は誘導的プロモータの制御下、より好ましくは強力な構成的プロモータの制御下で細菌のゲノムに組み込まれる。この遺伝子は、内在性ｄｘｓ遺伝子を置換可能であるか、又はｄｘｓ遺伝子のコピー数を増大させるために他の位置に組み込まれ得る。
【００９３】
このように他の態様において、本発明は、配列番号５２の２２２位の位置にてアスパラギン及び／又は配列番号５２の２４４位の位置にてシステインを含む、改良（又は変異）ＤＸＰシンターゼ、好ましくは改良デイノコッカスＤＸＰシンターゼを含む組換えデイノコッカス細菌にも関する。好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、配列番号５２の２４４位の位置にてシステインを含む改良（又は変異）ＤＸＰシンターゼを含む。対応する位置は、既知のアライメントアルゴリズムを使用することで当業者によって容易に特定可能である。特に、改良ＤＸＰシンターゼは、上記開示の改良ＤＸＳのいずれかであり得る。
【００９４】
任意的に、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が過剰発現される。好ましくは、少なくともＩＤＩコード遺伝子が過剰発現される。より好ましくは、少なくとも１つのｄｘｓ遺伝子と１つのｉｄｉ遺伝子とが過剰発現される。
【００９５】
本発明のその他の態様について明細書に記載されるすべての実施形態はこの態様にも包含される。特に、組換えデイノコッカス細菌は、（ｉ）上述のようなＭＥＰ経路の増強、（ｉｉ）異種ＭＥＶ経路、（ｉｉｉ）ＦＰＰシンターゼ活性の増大、（ｉｖ）リコペンβ−シクラーゼの不活性化、及び／又は（ｖ）本明細書に記載されるような異種テルペンシンターゼ又はイソプレンシンターゼの発現、をさらに示すとよい。
【００９６】
＜異種ＭＥＶ経路＞
他の態様において、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、異種ＭＥＶ経路を含む、即ち、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）（ＥＣ１．１．１．３４）、メバロネートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３６）、ホスホメバロネートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．２）、及びジホスホメバロネートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３３）をコードする異種遺伝子を発現する。
【００９７】
好ましくは、異種遺伝子は、植物、細菌、又は酵母の、より好ましくはサッカロマイセス・セレビシエの酵素をコードする。所定の実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、サッカロマイセス・セレビシエのヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ５４８３９）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ１２６８３）、メバロネートキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿０１３９３５．１）、ホスホメバロネートキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿０１３９４７．１）、及びジホスホメバロネートデカルボキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６６１５８．１）をコードする遺伝子を含む。
【００９８】
デイノコッカス細菌は内在性アセチル−ＣｏＡＣ−アセチルトランスフェラーゼ活性を示す。しかしながら、一部の実施形態において、組換えデイノコッカス細菌はアセチル−ＣｏＡＣ−アセチルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子をさらに含むとよい。この遺伝子は、内在性遺伝子を置換可能であり、又はこの遺伝子のコピー数を増大させるために他の位置に組み込まれ得る。この異種遺伝子は、植物、細菌、又は酵母由来であるとよい。好ましい実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、サッカロマイセス・セレビシエのアセチル−ＣｏＡＣ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿０１５２９７．１）をコードする遺伝子をさらに含む。
【００９９】
本発明の他の態様について本明細書に記載されるすべての実施形態は、この態様においても包含される。特に、組換えデイノコッカス細菌は、（ｉ）任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う、上述のような増強ＭＥＰ経路、（ｉｉ）ＦＰＰシンターゼ活性の増大、（ｉｉｉ）リコペンβ−シクラーゼの不活性化、及び／又は、（ｉｖ）本明細書に記載されるような異種テルペンシンターゼ又はイソプレンシンターゼの発現、をさらに示し得る。
【０１００】
＜異種テルペンシンターゼ＞
本願は、デイノコッカス細菌、及び特に上述のような組換えデイノコッカス細菌が、異種テルペンシンターゼの発現を介した異種イソプレノイド化合物産生に効果的に用いられ得ることも示す。このように、さらなる態様において、本発明は異種テルペンシンターゼをコードする遺伝子を含む組換えデイノコッカス細菌に関する。
【０１０１】
本発明のその他の態様について明細書に記載されるすべての実施形態はこの態様にも包含される。特に、組換えデイノコッカス細菌は、（ｉ）任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う、上述のような増強ＭＥＰ経路、（ｉｉ）異種ＭＥＶ経路、（ｉｉｉ）ＦＰＰシンターゼ活性の増大、（ｉｖ）リコペンβ−シクラーゼの不活性化、及び／又は（ｖ）本明細書に記載されるような異種イソプレンシンターゼの発現、をさらに示し得る。
【０１０２】
好ましくは、異種テルペンシンターゼは、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、及びセスキテルペンシンターゼからなる群から、より好ましくはモノテルペンシンターゼ及びセスキテルペンシンターゼから選択される。組換えデイノコッカス細菌は、１又は複数の異種テルペンシンターゼ、特に１又は複数のモノテルペンシンターゼ、及び／又は１又は複数のセスキテルペンシンターゼを発現するとよい。
【０１０３】
これらの酵素をコードする遺伝子を含み且つ細菌のゲノムに組み込まれた、上述のような発現カセットから、各異種テルペンシンターゼは好ましくは発現される。好ましくは、遺伝子は構成的プロモータ、より好ましくは強力な構成的プロモータの制御下にある。
【０１０４】
−異種モノテルペンシンターゼ−
所定の実施形態において、本発明の組換え細菌は、モノテルペン又はモノテルペノイドを産生するために異種モノテルペンシンターゼの発現を介して改変されたデイノコッカス細菌である。本発明の組換えデイノコッカス細菌において発現可能なモノテルペンシンターゼの例は、ゲラニオールシンターゼ（ＥＣ３．１．７．３）、３Ｓ−リナロールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２５）及びＲ−リナロールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２６）などのリナロールシンターゼ、１，８シネオール（ｃｉｎｅｏｌｅ）シンターゼ（ＥＣ４．２．３．１０８）、ミルセンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１５）、４Ｓ−リモネンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１６）、Ｒ−リモネンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２０）、α−ピネンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１１９）、β−ピネンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１２０）、（−）−ｅｎｄｏ−フェンコールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１０）、及び（−）−α−テルピネオールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１１１）、並びにそれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない。
【０１０５】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種ゲラニオールシンターゼ、即ち、ゲラニル二リン酸からのゲラニオールの生成を触媒する酵素、をコードする遺伝子を含む。異種ゲラニオールシンターゼの例は、オシマム・バジリカム（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）（配列番号４９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＲ１１７６５、Ｚｈｏｕ他、２０１３年；Ｌｉｕ他、２０１３年；Ｌｉｊｉｍａ他、２００４年）、セイヨウカノコソウ（バレリアナ・オフィシナリス（Ｖａｌｅｒｉａｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ））（ＡＨＥ４１０８４、Ｄｏｎｇ他、２０１３年）、リッピア・ドゥルキス（Ｌｉｐｐｉａ  ｄｕｌｃｉｓ）（Ｄｏｎｇ他、２０１３年）、レモンエゴマ（ぺリラ・シトリオドラ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）（ＡＡＹ８８９６５；Ｓｕｇｉｕｒａ他、２０１１年）、エゴマ（ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）（ＡＢＢ３０２１８；Ｓｈａｒｋｅｙ他、２００５年）、セトエゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｓｅｔｏｙｅｎｓｉｓ）（ＡＣＮ４２０１０．１）、シナモマム・テヌイピラム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｕｍ）（ＣＡＤ２９７３４）、フィラ・ドゥルキス（Ｐｈｙｌａ  ｄｕｌｃｉｓ）（ＡＤＫ６２５２４．１）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）（ＡＦＩ４７９２６．１）、ヨーロッパブドウ（ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ））（ＡＤＲ７４２１７）、ヒヨコマメ（シサー・アリティナム（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ））（ＸＰ＿００４４８７３８３．１）、コオウレン（Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  ｋｕｒｒｏｏａ）（ＡＨＸ９７７３９．１）、ラフレモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｊａｍｂｈｉｒｉ）（ＢＡＭ２９０４９．１）、シナモマム・テヌイピル（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｅ）（ＣＡＤ２９７３４．２；Ｙａｎｇ他、２００５年）、及びニチニチソウ（カサランサス・ロゼウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ））（ＡＦＤ６４７４４．１）のゲラニオールシンターゼを含むがこれらに限定されない。ゲラニオールシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、異種ゲラニオールシンターゼは、オシマム・バジリカム、セイヨウカノコソウ（バレリアナ・オフィシナリス）、フィラ・ドゥルキス、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、ヨーロッパブドウ（ヴィティス・ヴィニフェラ）、ヒヨコマメ（シサー・アリティナム）、及びニチニチソウ（カサランサス・ロゼウス）のゲラニオールシンターゼからなる群より選択される。より好ましくは、異種ゲラニオールシンターゼは、オシマム・バジリカム（配列番号４９）、ヒヨコマメ（シサー・アリティナム）、又はフィラ・ドゥルキスのゲラニオールシンターゼである。さらにより好ましくは、ゲラニオールシンターゼは、オシマム・バジリカムのゲラニオールシンターゼである。このゲラニオールシンターゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号���８に示されるものであり得る。
【０１０６】
任意的に、異種ゲラニオールシンターゼをコードする遺伝子を含む組換え細菌は、シトロネロール（ＥＣ１．６．９９．１）へのゲラニオールの還元を触媒するゲラニオールレダクターゼをさらに含む。異種ゲラニオールレダクターゼの例は、Ｓ．セレビシエ（Ｑ０３５５８．３）の旧黄色酵素２（ＯＹＥ２）、植物であるパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）の同種物、１２−オキソフィトジエノアートレダクターゼ（ＯＰＲ）、ＨｂＯＰＲ（ＤＱ００４６８５．１）を含むがこれらに限定されない。
【０１０７】
他の実施形態において、本発明の組換え細菌は異種リナロールシンターゼをコードする遺伝子を含む。リナロールシンターゼは、３Ｓ−リナロールシンターゼ、即ちゲラニル二リン酸からＳ−リナロールの生成を触媒する酵素、又はＲ−リナロールシンターゼ、即ちゲラニル二リン酸からＲ−リナロールの生成を触媒する酵素であるとよい。異種リナロールシンターゼの例は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）（Ｎａｋａｎｏ他、２０１１年）、レモン・マートル（Ｌｅｍｏｎ  Ｍｙｒｔｌｅ）（Ｓｕｇｉｕｒａ他、２０１１年）、レモンエゴマ（ぺリラ・シトリオドラ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ））（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨＹ３９２６６．１；Ｓｕｇｉｕｒａ他、２０１１年）、Ｍｙｚｕｓ  ｃｉｔｒａｔｅ（Ｓｕｇｉｕｒａ他、２０１１年）、クラルキア・ブレウェリ（Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）（ＡＡＤ１９８３８；ＡＡＤ１９８４０；ＡＡＣ４９３９５、Ｒｉｃｏ他、２０１０年；Ｈｅｒｒｅｏ他、２００８年；Ｄｕｄａｒｅｖａ他、１９９６年；Ｐｉｃｈｅｒｓｋｙ他、１９９５年）、クラルキア・コンシンネ（Ｃｌａｒｋｉａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ）（ＡＡＤ１９８３９）、Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｖｏｌｉａ（ＡＢＢ７３０４５．１；Ｌａｎｄｍａｎｎ他、２００７年）、ヨーロッパブドウ（ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ））（Ｍａｒｔｉｎ他、２０１０年）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｙｒａｔａ（ＥＦＨ６２７８２．１；ＸＰ＿００２８８６５２３．１）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（ＥＵ５９６４５３）、セレウス・ペルヴィアナス（Ｃｅｒｅｕｓ  ｐｅｒｕｖｉａｎｕｓ）（Ｓｉｔｒｉｔ他、２００４年）、ベルガモットハッカ（メンタ・シトラタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｃｉｔｒａｔａ））（ＡＡＬ９９３８１；Ｃｒｏｗｅｌｌ他、２００２年）、クソニンジン（アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ））（ＡＡＦ１３３５７；ＡＡＦ１３３５６；Ｊｉａ他、１９９９年）、オシマム・バジリカム（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）（ＡＡＶ６３７８９；Ｌｉｊｉｍａ他、２００４年）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＡＡＯ８５５３３；Ｃｈｅｎ他、２００３年）、オランダイチゴ（フラガリア・アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ））（ＣＡＤ５７０８１；ＣＡＤ５７１０６；Ａｈａｒｏｎｉ他、２００４年）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（ＸＰ＿００３５９３５０２．１）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）（ＡＢＲ２４４１８）、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））（ＡＡＸ６９０６３）、ヨーロッパトウヒ（ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）（ＡＡＳ４７６９３）、トラノオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．  ｈｉｒｔｅｌｌａ）（ＡＣＮ４２０１１；Ｍａｓｕｍｏｔｏ他、２０１０年）、コエンドロ（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（ＡＨＣ５４０５１；Ｇａｌａｔａ他、２０１４年）、シ��モマム・オスモフロエウム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｏｓｍｏｐｈｌｏｅｕｍ）（ＡＦＱ２０８１２．１）、カカオノキ（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ））（ＥＯＹ２０３１１．１）、Ｍｏｒｕｓ  ｎｏｔａｂｉｌｉｓ（ＥＸＣ２３１７６．１）、及びコーヒーノキ（コフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ  Ａｒａｂｉｃａ）（Ｄｅｌ  Ｔｅｒｒａ他、２０１３年）のリナロールシンターゼを含むがこれらに限定されない。リナロールシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、異種リナロールシンターゼは、クラルキア・コンシンネ、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、トラノオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．  ｈｉｒｔｅｌｌａ）、コエンドロ（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｖｏｌｉａ、クラルキア・ブレウェリ、シナモマム・オスモフロエウム、カカオノキ（テオブロマ・カカオ）、Ｍｏｒｕｓ  ｎｏｔａｂｉｌｉｓ、及びコーヒーノキ（コフィア・アラビカ）のリナロールシンターゼからなる群から選択される。より好ましくは、異種リナロールシンターゼは、ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）又はクラルキア・ブレウェリのリナロールシンターゼであり、さらにより好ましくは、ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）のリナロールシンターゼである。
【０１０８】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種ミルセンシンターゼ、即ちゲラニル二リン酸からのミルセンの生成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種ミルセンシンターゼの例は、アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＢ７１０８４）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）（ＡＡＯ４１７２７；ＡＡＯ４１７２６）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＮＰ＿１８９２０９；ＡＡＧ０９３１０）、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））（ＡＡＸ６９０６４）、オシマム・バジリカム（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）（ＡＡＶ６３７９１）、エゴマ（ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ））（ＡＡＦ７６１８６）、ヨーロッパトウヒ（ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ））（ＡＡＳ４７６９６）、Ｍｏｒｕｓ  ｎｏｔａｂｉｌｉｓ（ＥＸＢ９７３１６．１）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ） （ＡＥＳ６７３０５．１）、及びＱｕｅｒｃｕｓ  ｉｌｅｘ（ＣＡＣ４１０１２）のミルセンシンターゼを含むがこれらに限定されない。ミルセンシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、異種ミルセンシンターゼは、アビエス・グランディス、ヨーロッパトウヒ（ピセア・アビエス）、Ｍｏｒｕｓ  ｎｏｔａｂｉｌｉｓ、及びタルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）のミルセンシンターゼからなる群から選択される。
【０１０９】
他の実施形態において、本発明の組換え細菌は異種リモネンシンターゼをコードする遺伝子を含む。リモネンシンターゼは、４Ｓ−リモネンシンターゼ、即ちゲラニル二リン酸からの（−）−Ｓ−リモネンの生成を触媒する酵素、又はＲ−リモネンシンターゼ、即ちゲラニル二リン酸からの（＋）−Ｒ−リモネンの生成を触媒する酵素であるとよい。異種リモネンシンターゼの例は、オランダハッカ（メンタ・スピカタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ））（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＣ３７３６６）、ナガバハッカ（メンタ・ロンギフォリア（Ｍｅｎｔｈａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ））（ＡＡＤ５０３０４．１）、アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）（ＡＡＢ７０９０７；ＡＡＦ６１４５５）、カワミドリ（アガスタケ・ルゴーサ（Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕｇｏｓａ））（ＡＡＬ１７６３６）、アサ（カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））（ＡＢＩ２１８３７）、レモン（シトラス・リモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ））（ＡＡＭ５３９４４；ＡＡＭ５３９４６）、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）（ＢＡＤ２７２５６；ＢＡＤ２７２５７）、Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｖｏｌｉａ （ＡＢＢ７３０４４）、エゴマ（ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ））（ＡＡＧ３１４３８）、ヨーロッパトウヒ（ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）（ＡＡＳ４７６９４）、シトカトウヒ（ピセア・シトケンシス（Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）（ＡＢＡ８６２４８）、及びケイガイ（Ｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔａ  ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）（ＡＡＧ０１１４０）のリモネンシンターゼを含むがこれらに限定されない。リモネンシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、異種リモネンシンターゼは、オランダハッカ（メンタ・スピカタ）又はナガバハッカ（メンタ・ロンギフォリア）からのものであり、好ましくはナガバハッカ（メンタ・ロンギフォリア）からのものである。
【０１１０】
他の実施形態において、本発明の組換え細菌は異種シネオール（ｃｉｎｅｏｌｅ）シンターゼをコードする遺伝子を含む。異種シネオールシンターゼの例は、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＤＹ４７５０８．１；Ｎａｋａｎｏ他、２０１１年）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＭ０５８５７．１）、マンネンロウ（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＺ４１７９４．１）、サルビア・フルティコサ（Ｓａｌｖｉａ  ｆｒｕｔｉｃｏｓａ）（ＡＢＨ０７６７７．１）、及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＡＥＥ７７０７５．１；ＡＥＥ７７０７４．１）のシネオールシンターゼを含むがこれらに限定されない。シネオールシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、異種シネオールシンターゼはストレプトマイセス・クラブリゲルスからのものである。
【０１１１】
任意的に、異種リモネンシンターゼを含む本発明の組換え細菌は、（ｉ）Ｓ−リモネンを（−）−カルボン（ｃａｒｖｏｎｅ）に変換、（ｉｉ）Ｓ−リモネンをメントン、メントール、ネオメントール、若しくはイソメントンに変換、又は（ｉｉｉ）Ｒ−リモネンを（＋）カルボン（ｃａｒｖｏｎｅ）に変換する経路に属する１又は複数の追加酵素をさらに含むとよい。つまり、所定の実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、異種リモネンシンターゼと、（ｉ）（Ｓ）−リモネン６−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１３．４８）及びカルベオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２４３）；（ｉｉ）（Ｓ）−リモネン３−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１３．４７）、イソピペリテノールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２３）、（−）−イソピペリテノンレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．８２）、（＋）−シス−イソプレゴンイソメラーゼ、（＋）−プレゴンレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．８１）、（−）−メントールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２０７）、及び（＋）−ネオメントールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２０８）；並びに（ｉｉｉ）（Ｒ）−リモネン６−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ．１４．１３．８０）及び（＋）−トランス−カルベオールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２４３）からなる群から選択される１又は複数の追加異種酵素とを発現する。
【０１１２】
他の実施形態において、本発明の組換え細菌は異種ピネンシンターゼをコードする遺伝子を含む。ピネンシンターゼは、α−ピネンシンターゼ、即ちゲラニル二リン酸からのα−ピネン生成を触媒する酵素、又はβ−ピネンシンターゼ、即ちゲラニル二リン酸からのβ−ピネン生成を触媒する酵素であるとよい。異種ピネンシンターゼの例は、アビエス・グランディス（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＢ７１０８５）、クソニンジン（アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ））（ＡＡＫ５８７２３）、アサ（カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））（ＡＢＩ２１８３８）、レモン（シトラス・リモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ））（ＡＡＭ５３９４５）、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）（ＢＡＤ２７２６０）、エゾヘビイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ）（ＣＡＤ５７０９２）、ヨーロッパトウヒ（ピセア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）（ＡＡＳ４７６９２）、シトカトウヒ（ピセア・シトケンシス（Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）（ＡＡＰ７２０２０）、及びベイマツ（シュドツガ・メンツィエシ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））（ＡＡＸ０７２６７）からのピネンシンターゼを含むがこれらに限定されない。ピネンシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、異種ピネンシンターゼはクソニンジン（アルテミシア・アンヌア）からのものである。
【０１１３】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種（−）−ｅｎｄｏ−フェンコールシンターゼ、即ちゲラニル二リン酸からのフェンコール生成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種（−）−ｅｎｄｏ−フェンコールシンターゼの例は、オシマム・バジリカム（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＶ６３７９０）の（−）−ｅｎｄｏ−フェンコールシンターゼを含むがこれに限定されない。ｅｎｄｏ−フェンコールシンターゼ活性を示し、この酵素に少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこの酵素の変異体が用いられるとよい。
【０１１４】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種（−）−α−テルピネオールシンターゼ、即ちゲラニル二リン酸からのα−テルピネオール生成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種（−）−α−テルピネオールシンターゼの例は、ヨーロッパブドウ（ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ））（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＳ７９３５１；ＡＡＳ７９３５２）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（ＡＡＬ５９２３０；ＡＢＲ０９２９２）、ビャクダン（Ｓａｎｔａｌｕｍ  ａｌｂｕｍ）（ＡＣＦ２４７６７）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｄｅａ）（ＡＡＯ６１２２７）、及びタイサンボク（Ｍａｇｎｏｌｉａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）（ＡＣＣ６６２８２）の（−）−α−テルピネオールシンターゼを含むがこれらに限定されない。α−テルピネオールシンターゼ活性を示し、この酵素に少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、（−）−α−テルピネオールシンターゼはヨーロッパブドウ（ヴィティス・ヴィニフェラ）からのものである。
【０１１５】
−異種セスキテルペンシンターゼ−
他の実施形態において、本発明の組換え細菌は、セスキテルペノイドを産生するために異種セスキテルペンシンターゼの発現を介して改変されたデイノコッカス細菌である。本発明の組換えデイノコッカス細菌において発現可能なセスキテルペンシンターゼの例は、（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１３８）、ゲルマクレンＡシンターゼ（ＥＣ４．２．３．２３）、（Ｅ，Ｅ）−ゲルマクレンＢシンターゼ（ＥＣ４．２．３．７１）、ゲルマクレンＣシンターゼ（ＥＣ４．２．３．６０）、（−）−ゲルマクレンＤシンターゼ（ＥＣ４．２．３．７５）、バレンセンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．７３）、（３Ｓ，６Ｅ）−ネロリドールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．４８）、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．３９）、パチョロールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．７０）、サンタレンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．５０）、及びδ−カジネンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１３）を含むがこれらに限定されない。
【０１１６】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼ、即ち（２Ｅ，６Ｅ）−ファルネシル二リン酸からの（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロール生成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼの例は、ストレプトマイセス・シトリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＡＬ１４８６７．１；Ｎａｋａｎｏ他、２０１１年）及びフィラ・ドゥルキス（Ｐｈｙｌａ  ｄｕｌｃｉｓ）（Ａｔｔｉａ他、２０１２年）の（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼを含むがこれらに限定されない。（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼ活性を示し、この酵素に少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼはストレプトマイセス・シトリカラーからのものである。
【０１１７】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種ゲルマクレンＡシンターゼ、即ちセスキテルペンゲルマクレンＡへのファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の還化を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種ゲルマクレンＡシンターゼの例は、クソニンジン（アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ））（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＢＥ０３９８０）、キクニガナ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｉｎｔｙｂｕｓ）（ＡＡＭ２１６５８；ＡＡＭ２１６５９）、ニガナ（Ｉｘｅｒｉｓ  ｄｅｎｔａｔｅ）（ＡＡＬ９２４８１）、レタス（ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）（ＡＡＭ１１６２６）；ＡＡＭ１１６２７）、パチョリ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎ）（ＡＡＳ８６３２１）、及びソリダゴ・カナデンシス（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）（ＣＡＣ３６８９６）のゲルマクレンＡシンターゼを含むがこれらに限定されない。ゲルマクレンＡシンターゼ活性を示し、この酵素に少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、ゲルマクレンＡシンターゼは、クソニンジン（アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ））及びソリダゴ・カナデンシス（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）から選択される。
【０１１８】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種ゲルマクレンＢシンターゼ、即ちセスキテルペンゲルマクレンＢへのファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の還化を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種ゲルマクレンＢシンターゼの例は、リコペルシコン・ヒルスタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＧ４１８９１）のゲルマクレンＢシンターゼを含むがこれに限定されない。ゲルマクレンＢシンターゼ活性を示し、この酵素に少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこの酵素の変異体が用いられるとよい。
【０１１９】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種ゲルマクレンＣシンターゼ、即ちセスキテルペンゲルマクレンＣへのファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の還化を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種ゲルマクレンＣシンターゼの例は、トマト（リコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＣ３９４３２）のゲルマクレンＣシンターゼを含むがこれに限定されない。ゲルマクレンＣシンターゼ活性を示し、この酵素に少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこの酵素の変異体が用いられるとよい。
【０１２０】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種ゲルマクレンＤシンターゼ、即ちセスキテルペンゲルマクレンＤへのファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の還化を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種ゲルマクレンＤシンターゼの例は、リコペルシコン・ヒルスタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＧ４１８９２）、オシマム・バジリカム（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）（ＡＡＶ６３７８６）、パチョリ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎ）（ＡＡＳ８６３２０，ＡＡＳ８６３２２）、ブラックコットンウッド×ナミキドロ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ×Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）（ＡＡＲ９９０６１）、ソリダゴ・カナデンシス（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）（ＡＡＲ３１１４４，ＡＡＲ３１１４５）、ヨーロッパブドウ（ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ））（ＡＡＳ６６３５７）、及びショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）（ＡＡＸ４０６６５）のゲルマクレンＤシンターゼを含むがこれらに限定されない。ゲルマクレンＤシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。
【０１２１】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種バレンセンシンターゼ、即ちファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からのバレンセン生成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種バレンセンシンターゼの例は、ヨーロッパブドウ（ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ））（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号 Ｑ６Ｑ３Ｈ２）及びオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（Ｑ７１ＭＪ３）のバレンセンシンターゼを含むがこれらに限定されない。バレンセンシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。
【０１２２】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種パチョロールシンターゼ、即ちファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）からのパチョロール生成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種パチョロールシンターゼの例は、α−及びβ−パチョレン（ｐａｔｃｈｏｕｌｅｎｅ）、α−ブルネセン（ｂｕｌｎｅｓｅｎｅ）、セイケレン（ｓｅｙｃｈｅｌｌｅｎｅ）、ポゴストール（ｐｏｇｏｓｔｏｌ）、及びα−グアイエン（ｇｕｉａｅｎｅ）を含む付加的セスキテルペン産生物を産生するパチョリ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎ）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ４９ＳＰ３）のパチョロールシンターゼを含むがこれに限定されない。パチョロールシンターゼ活性を示し、この酵素に少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこの酵素の変異体が用いられるとよい。
【０１２３】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、即ちファルネシル二リン酸又はゲラニル二リン酸からの８−ｅｐｉ−セドロール生成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種ｅｐｉ−セドロールシンターゼの例は、クソニンジン（アルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ））（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＦ８０３３３、ＣＡＣ０８８０５）のｅｐｉ−セドロールシンターゼを含むがこれに限定されない。ｅｐｉ−セドロールシンターゼ活性を示し、この酵素に少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこの酵素の変異体が用いられるとよい。
【０１２４】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種（３Ｓ，６Ｅ）−ネロリドールシンターゼ、即ちファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）をネロリドールに変換する酵素をコードする遺伝子を含む。異種ネロリドールシンターゼの例は、イヌカタヒバ（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ  ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｄ８ＲＮＺ９）、ブラックコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（Ｆ８ＴＷＤ１）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（Ｑ５ＵＢ０６）、オランダイチゴ（フラガリア×アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ））（Ｐ０ＣＶ９４）、及びトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ及びＧｅｒｓｈｅｎｚｏｎ、２０００年）のネロリドールシンターゼを含むがこれらに限定されない。ネロリドールシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、異種ネロリドールシンターゼにはオランダイチゴ（フラガリア×アナナッサ）が選択される。
【０１２５】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、異種サンタレンシンターゼ、即ちファルネシル二リン酸からのα−サンタレン、β−サンタレン、ｅｐｉ−β−サンタレン、ｅｎｄｏ−β−ベルガモテン、及び／又はｅｘｏ−α−ベルガモテンの生成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種サンタレンシンターゼの例は、ソラナム・ハブロカイテス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｂ８ＸＡ４１）、サンタルム・スピカトゥム（Ｓａｎｔａｌｕｍ  ｓｐｉｃａｔｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｅ３Ｗ２０２）、サンタルム・アウストロカレドニクム（Ｓａｎｔａｌｕｍ  ａｕｓｔｒｏｃａｌｅｄｏｎｉｃｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｅ３Ｗ２０３）、サンタルム・スピカトゥム（Ｓａｎｔａｌｕｍ  ｓｐｉｃａｔｕｍ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｅ３Ｗ２０４）のサンタレンシンターゼを含むがこれらに限定されない。サンタレンシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。
【０１２６】
一実施形態において、本発明の組換え細菌は、δ−カジネンシンターゼ、即ち（＋）−δ  カジネンへのトランス,トランス−ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）の還化を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む。異種δ−カジネンシンターゼの例は、ケブカワタ（ゴシピウム・ヒルスタム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＦ７４９７７，ＡＡＣ１２７８４）、ゴシピウム・アルボレタム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｔｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ６５２８９、ＵｎｉｐｒｏｔＱ３９７６１）、及びヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（Ｑ４Ｕ３Ｆ６）のδ−カジネンシンターゼを含むがこれらに限定されない。δ−カジネンシンターゼ活性を示し、これらの酵素のいずれかに少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％の配列同一性を有する任意のポリペプチドが用いられるとよく、特に触媒活性、基質に対する特異性、及び／又は安定性の増大を示すこれらの酵素の変異体が用いられるとよい。所定の実施形態において、異種δ−カジネンシンターゼにはゴシピウム・アルボレタム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｔｕｍ）が選択される。
【０１２７】
＜異種イソプレンシンターゼ＞
他の態様において、本発明は異種イソプレンシンターゼをコードする遺伝子を含む組換えデイノコッカス細菌にも関する。
【０１２８】
本発明のその他の態様について明細書に記載されるすべての実施形態はこの態様にも包含される。特に、組換えデイノコッカス細菌は、（ｉ）任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う、上述のような増強ＭＥＰ経路、（ｉｉ）異種ＭＥＶ経路、（ｉｉｉ）ＦＰＰシンターゼ活性の増大、（ｉｖ）リコペンβ−シクラーゼの不活性化、及び／又は（ｖ）本明細書に記載されるような異種テルペンシンターゼの発現をさらに示し得る。
【０１２９】
好ましい実施形態において、異種イソプレンシンターゼをコードする遺伝子を含む組換えデイノコッカス細菌は、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、及びｉｓｐＧからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を過剰発現し、好ましくは、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、及びｉｓｐＧ遺伝子を過剰発現する。
【０１３０】
異種イソプレンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸からのイソプレン生成を触媒する任意の酵素であってよい。イソプレンシンターゼの例は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｈｅｓｓ他、２０１３年）、ギンドロ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）（Ｌｖ他、２０１３年；Ｙａｎｇ他、２０１２年；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ５０Ｌ３６）、アメリカヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ７ＸＡＳ７）、タイワンクズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）（Ｗｈｉｔｅｄ他、２０１０年；Ｍｉｌｌｅｒ他、２００１年；Ｓｈａｒｋｅｙ他、２００５年）、及びヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｒｏｂｕｒ）（Ｌｅｈｎｉｎｇ他、１９９９年）のイソプレンシンターゼを含むがこれらに限定されない。
【０１３１】
＜ファルネシル二リン酸シンターゼ＞
さらに、本発明者等は、デイノコッカス細菌におけるイソプレノイド産生が、目的の化合物の産生及び／又は蓄積を促進するように制御され得ることを本明細書において提示する。これに関して、本発明者等は、ファルネシル二リン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．１０）、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．５．１．１）、及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．２９）を示すデイノコッカス・ジオサーマリスの酵素を特定し、この酵素の過剰発現が、ジテルペン、トリテルペン、セスキテルペン、及びカロテノイドなどの、１０を超えるＣ原子を有するイソプレノイドの産生を、モノテルペンを損なって促進することを確認した。
【０１３２】
つまり、さらなる態様において、本発明はファルネシル二リン酸シンターゼ活性を有する単離ポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、
ａ）配列番号４７のアミノ酸配列のすべて若しくは活性部分を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号４７と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、配列番号４７と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有してなるポリペプチド、
ｃ）配列番号４６と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号４６と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、或いは、
ｄ）（ｉ）配列番号４６に示される核酸配列、（ｉｉ）その相補鎖、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）と、中程度・高度の厳密性、好ましくは高度若しくは非常に高度の厳密性条件下で、ハイブリダイズが可能な核酸配列によってコードされるポリペプチド、からなる群から選択される。
【０１３３】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．１）及び／又はゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．２９）活性、さらに好ましくはジメチルアリルトランストランスフェラーゼ及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性をさらに示す。
【０１３４】
ヌクレオチドプローブと相同的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションを測定するための適切な実験条件は、ハイブリダイズさせるＤＮＡ断片又はＲＮＡを含むフィルタを、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）において１０分間予浸すること、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの超音波処理及び変性されたサケ精子ＤＮＡの溶液においてフィルタをプレハイブリダイゼーションすること、次に、１０ｎｇ／ｍｌ濃度の、ランダムプライムによる３２Ｐ−ｄＣＴＰ−標識（比活性＞１×１０９ｃｐｍ／μｇ）プローブを含有する同じ溶液において、約４５℃で１２時間ハイブリダイゼーションすること（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、１９８３年）、に関する。種々の厳密性条件用に、フィルタは、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおいて、少なくとも５５℃（低厳密性）、より好ましくは少なくとも６０℃（中程度厳密性）、なおより好ましくは少なくとも６５℃（中程度・高度厳密性）、さらにより好ましくは少なくとも７０℃（高度厳密性）、及びさらにより好ましくは少なくとも７５℃（非常に高度の厳密性）で、３０分間、２回洗浄される。
【０１３５】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸にも関する。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ若しくはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、又はそれら２つの混合物であり得る。核酸は１本鎖形態又は２重鎖形態又はそれら２つの混合物であり得る。核酸は、例として修飾結合、修飾プリン若しくはピリミジン塩基、又は修飾糖を含む修飾ヌクレオチドを包含し得る。また核酸は、化学合成、組換え、及び突然変異誘発を含む、当業者には既知である任意の方法で作製可能である。本発明の核酸は本発明のポリペプチド配列から推定され得、コドン利用は核酸が転写される宿主細胞に応じて適応される。これらの段階は当業者には既知である方法に従っておこなわれ得、その一部はＳａｍｂｒｏｏｋ他による参考マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、２００１年）に記載される。
【０１３６】
本発明は、制御配列に対応した条件下で適切な宿主細胞において核酸を発現することを目的とする１以上の制御配列と操作可能に連結された、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットにさらに関する。
【０１３７】
制御配列は宿主細胞により認識されるプロモータを含み得る。プロモータは酵素発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモータは、デイノコッカス細菌において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり得、特に野生型、変異型、変性型、又は合成型プロモータであってよい。プロモータは内在性、同種又は異種プロモータであり得る。好ましいプロモータは内在性又は同種のものである。これに関して、デイノコッカス細菌の遺伝子発現のために、種々のプロモータが研究及び使用されてきている。適切なプロモータの例は、翻訳伸長因子Ｔｕ遺伝子のｔｕｆＡ（ＤＲ０３０９）及びｔｕｆＢ（ＤＲ２０５０）からのＰｔｕｆＡ及びＰｔｕｆＢプロモータ、ｐＩ３に位置するｒｅｓＵ遺伝子のプロモータ、ｇｒｏＥＳＬオペロンのプロモータ領域ＰｇｒｏＥＳＬ（Ｌｅｃｏｉｎｔｅ他、２００４年；Ｍｅｉｍａ他、２００１年）、又はそうしたプロモータの誘導体を含む。
【０１３８】
制御配列は、転写を終結するためにデイノコッカス細菌により認識される転写ターミネータであってもよい。ターミネータは、遺伝子の３’末端に操作可能に連結される。デイノコッカス細菌において機能する任意のターミネータが本発明に用いられ得る（Ｌｅｃｏｉｎｔｅ他、２００４年）。
【０１３９】
任意的に、発現カセットは、組換え細菌の選択を容易にする選択可能マーカを含んでもよい。通常、選択可能マーカは、抗生物質耐性をコードするか又は独立栄養性を付与する遺伝子である。
【０１４０】
本発明は、本発明の核酸又は発現カセットを含む発現ベクターにも関する。該発現ベクターは、宿主細胞、好ましくはデイノコッカス宿主細胞を形質転換するために用いられて、該細胞における本発明の核酸の発現を実現し得る。ベクターが導入される宿主細胞とベクターとの適合性に通常応じて、ベクターは選択される。ベクターは自己複製ベクター、即ちその複製が染色体の複製から独立的である染色体外成分として存在するベクターであるとよく、例えばプラスミド、染色体外因子、ミニ染色体、又は人工染色体などが挙げられる。ベクターは自己複製を確実にする任意の手段を含んでもよい。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれた染色体とともに複製されるものであってよい。
【０１４１】
好ましくは、ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を容易に選択可能にする１以上の選択可能マーカを含む。選択可能マーカは遺伝子であり、その産生物が、殺生物性、又はウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求性に対して原栄養性などを示す。
【０１４２】
ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノムにベクターを組み込むこと、又はゲノムから独立的して細胞においてベクターが自己複製すること、を可能にする要素を含む。宿主細胞ゲノムへの組込みがおこなわれるとき、ゲノムへの配列の組込みは相同組換え又は非相同組換えによっておこなわれ得る。ベクターは、一方で、相同組換えによって正確な位置で宿主のゲノムへの組込みをおこなうための追加ポリヌクレオチドを含み得る。これらの追加ポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムにおける標的配列と相同である任意の配列であり得る。他方で、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
【０１４３】
ベクターは、自己複製のために、対象の宿主細胞におけるベクターの自己複製を可能にする複製起点をさらに含むとよい。複製起点は、細胞で機能する自己複製を仲介する任意のプラスミドレプリケータであってよい。「複製起点」又は「プラスミドレプリケータ」という用語は、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能にするポリヌクレオチドを意味する。
【０１４４】
発現がおこなわれる宿主細胞に応じてこれらの要素を選択する方法は、当業者に既知である。ベクターは、当業者には既知である従来の分子生物学的技術によって構築されるとよい。
【０１４５】
本発明は、細胞、好ましくはデイノコッカス細菌を、形質転換、形質移入、又は形質導入するために、本発明の核酸、発現カセット、又は発現ベクターを使用することにさらに関する。本発明は、本発明の核酸、カセット、又は発現ベクターを含む宿主細胞、好ましくはデイノコッカス細菌にも関する。
【０１４６】
宿主細胞は、一時的又は安定的に、形質転換、形質移入、又は形質導入され得る。本発明の発現カセット又はベクターは、宿主細胞に導入されて、上述されたような染色体組込み体又は自己複製型染色体外ベクターとして保持される。「宿主細胞」という用語は、複製時に起こる突然変異のため親宿主細胞とは同一ではない、親宿主細胞の任意の子孫も包含する。
【０１４７】
本発明の核酸、発現カセット、又は発現ベクターは、電気穿孔、コンジュゲート、形質導入、コンピテント細胞形質転換、プロトプラスト形質転換、、プロトプラスト融合、微粒子銃による「遺伝子銃」形質転換、ＰＥＧ媒介形質転換、脂質補助形質転換又は形質移入、化学媒介形質移入、酢酸リチウム媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換など、当業者には既知である任意の方法により宿主細胞に導入されるとよい。
【０１４８】
任意的に、本発明の核酸、カセット、又はベクターの１を超えるコピーが宿主細胞に挿入されてもよい。
【０１４９】
上述されたように、ＦＰＰシンターゼの過剰発現は、モノテルペンを損なって、ジテルペン、トリテルペン、セスキテルペン、及びカロテノイドなどの１０を超えるＣ原子を有するイソプレノイドの産生を促進することを本発明者らは確認した。
【０１５０】
従って、本発明は、ＦＰＰシンターゼ活性が増大された組換えデイノコッカス細菌にも関する。好ましくは、ＦＰＰシンターゼ活性は、ＦＰＰシンターゼをコードする内在性、同種、又は異種の遺伝子、即ちｉｓｐＡ遺伝子の過剰発現により増大される。遺伝子の過剰発現は上述されたように得られ得る。
【０１５１】
過剰発現ＦＰＰシンターゼは任意の異種ＦＰＰシンターゼであってよい。異種ＦＰＰシンターゼの例は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ１２０５１）又は大腸菌（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２２９３９）からのＦＰＰシンターゼを含むがこれらに限定されない。所定の実施形態において、本発明の組換え細菌は大腸菌からのＦＰＰシンターゼを発現する。
【０１５２】
好ましい実施形態において、過剰発現ＦＰＰシンターゼはデイノコッカス細菌からのものである。特に、過剰発現ＦＰＰシンターゼは、ファルネシル二リン酸シンターゼ活性を有する、好ましくはファルネシル二リン酸シンターゼ、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有する、上述されたような本発明のポリペプチドである。好ましくは、過剰発現ＦＰＰシンターゼは、Ｄ．ジオサーマリスからのＦＰＰシンターゼ、特に、配列番号４７に示されるアミノ酸配列のすベて又は一部を有するＦＰＰシンターゼである。
【０１５３】
代替的に、ファルネシル二リン酸シンターゼ、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性は、個別のポリペプチドによってもたらされ、活性の増大が個別のコード遺伝子の過剰発現によるものであってもよい。
【０１５４】
また本発明者らは、配列番号４７に示されるＦＰＰシンターゼにおけるＫ１７０Ｇ置換が、ＧＰＰへ、つまりモノテルペン産生へと、炭素流のリダイレクションを誘導することも示した。実際に、ＦＰＰＳにおけるＫ１７０Ｇ突然変異により、モノテルペン生合成のためのＧＰＰ放出が可能になる（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ及びＫａｒｓｔ、１９９３年； Ｆｉｓｃｈｅｒ他、２０１１年）。このように、ゲラニオールなどのモノテルペン産生が所望されるとき、内在性ＦＰＰシンターゼはＫ１７０Ｇ突然変異体により置換されるとよい。本明細書において、用語法Ｋ１７０Ｇは配列番号４７の１７０位のアミノ酸残基（リジン、Ｋ）がグリシン（Ｇ）に変更されることを意味する置換を指すように使用される。
【０１５５】
このように、本発明はまた、配列番号４７の１７０位の位置のリジン残基がグリシンで置換される（対応する位置は既知のアライメントアルゴリズムを用いて当業者により容易に特定可能である）本発明のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含む発現カセット又はベクター、及び突然変異ＦＰＰシンターゼを発現する組換えデイノコッカス細菌にも関する。好ましくは、該組換え細菌は異種テルペンシンターゼ、好ましくはモノテルペンシンターゼをも発現する。この組換えは、モノテルペンを産生するために好ましくは用いられる。
【０１５６】
本発明のその他の態様について明細書に記載されるすべての実施形態はこの態様にも包含される。特に、組換えデイノコッカス細菌は、（ｉ）任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う、上述のような増強ＭＥＰ経路、（ｉｉ）異種ＭＥＶ経路、（ｉｉｉ）リコペンβ−シクラーゼの不活性化、及び／又は（ｉｖ）本明細書に記載されるような異種テルペンシンターゼ又はイソプレンシンターゼの発現、をさらに示すとよい。
【０１５７】
＜内在性リコペンβ−シクラーゼの不活性化＞
本発明者等はまた、内在性リコペンβ−シクラーゼの不活性化がリコペンの過多産生・蓄積をもたらすことも示した。
【０１５８】
このように、他の態様において、本発明は、内在性リコペンβ−シクラーゼが低減又は抑制された組換えデイノコッカス細菌に関する。
【０１５９】
つまり、リコペンβ−シクラーゼ（ＥＣ５．５．１．１９）は、リコペンから中間のγ−カロテンを介したβ−カロテンへの反応を触媒する。リコペンβ−シクラーゼの例は、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有するＤ．ジオサーマリス、Ｄ．フォエニシス（Ｄ．ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＹＢ６６９０８）、Ｄ．アパチェンシス（Ｄ．ａｐａｃｈｅｎｓｉｓ）（ＷＰ＿０１９５８５０５７）、Ｄ．アクアティリス（Ｄ．ａｑｕａｔｉｌｉｓ）（ＷＰ＿０１９００８０７８）、Ｄ．ゴビエンシス（Ｄ．ｇｏｂｉｅｎｓｉｓ）（ＷＰ＿０１４６８５７７９）、Ｄ．ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ（ＷＰ＿０１７８７０５４７）、Ｄ．マリコペンシス（Ｄ．ｍａｒｉｃｏｐｅｎｓｉｓ）（ＷＰ＿０１３５５６７３３）、及びＤ．ラディオデュランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）（ＷＰ＿０１０８８７４４７）のリコペンβ−シクラーゼを含むがこれらに限定されない。
【０１６０】
リコペンβ−シクラーゼをコードする遺伝子は、Ｄ．ジオサーマリスのリコペンβ−シクラーゼ（配列番号５０）をコードする核酸との相同性に基づいて容易に特定され得る。
【０１６１】
リコペンβ−シクラーゼ活性は、当業者には既知の任意の方法を用いて低減又は抑制されるとよい。好ましくは、リコペンβ−シクラーゼをコードする遺伝子は、例えばこの遺伝子のすべて又は一部を削除することによって、またナンセンスコドン、カセット、遺伝子、又はフレームシフトをもたらす突然変異を導入することによって、当業者には既知の任意の方法により不活性化される。好ましい実施形態において、リコペンβ−シクラーゼをコードする遺伝子は削除される。
【０１６２】
所定の実施形態において、フィトエンシンターゼ（ＥＣ２．５．１．３２）及びフィトエンデサチュラーゼ（ＥＣ１．３．９９．２８）をコードする遺伝子が、リコペン産生を増大させるために過剰発現される。遺伝子は内在性、同種、又は異種の遺伝子、好ましくは内在性又は同種の遺伝子であるとよい。
【０１６３】
別の所定の実施形態において、リコペンβ−シクラーゼ活性の低減又は抑制を示し、任意的にフィトエンシンターゼ及びフィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子を過剰発現する組換え細菌は、リコペンからのアポカロテノイド生成を触媒する異種カロテノイド切断ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）をコードする遺伝子をさらに含む。
【０１６４】
別の所定の実施形態において、リコペンβ−シクラーゼ活性の低減又は抑制を示し、任意的にフィトエンシンターゼ及びフィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子を過剰発現する組換え細菌は、リコペンからのδ−カロテン生成を触媒する異種リコペンエプシロンシクラーゼ（ＥＣ５．５．１．１８）をコードする遺伝子と、任意的に、δ−カロテンからのアポカロテノイド生成を触媒する異種カロテノイド切断ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）をコードする遺伝子とを、さらに含む。
【０１６５】
カロテノイド切断ジオキシゲナーゼの例は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ  ｉｄａｅｕｓ）、及びトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｉｓ）のＣＣＤなどＡｕｌｄｒｉｄｇｅ他（２００６年）の文献に開示されるＣＣＤを含むがこれらに限定されない。
【０１６６】
本発明のその他の態様について明細書に記載されるすべての実施形態はこの態様にも包含される。特に、組換えデイノコッカス細菌は、（ｉ）ＦＰＰシンターゼ活性の増大、及び（ｉｉ）任意的に上述のような改良ＤＸＰシンターゼを伴う、上述のような増強ＭＥＰ経路、（ｉｉｉ）異種ＭＥＶ経路、及び／又は（ｉｖ）上述のような異種テルペンシンターゼ若しくはイソプレンシンターゼの発現、をさらに示すとよい。
【０１６７】
＜イソプレノイド化合物産生方法＞
さらなる態様において、本発明は、テルペン又はテルペノイド化合物を産生するための上述のような組換えデイノコッカス細菌の使用に関する。本発明は、（ｉ）テルペン又はテルペノイド産生に適した条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に（ｉｉ）テルペン又はテルペノイドを回収するステップとを含む、テルペン又はテルペノイドを産生する方法にも関する。
【０１６８】
テルペン又はテルペノイド化合物は、上述のような組換えデイノコッカス細菌によって産生される任意のテルペン又はテルペノイド化合物であってよい。
【０１６９】
一実施形態において、本発明の組換えデイノコッカス細菌は、カロテノイド化合物（Ｃ４０）などの１０を超えるＣ原子を有するイソプレノイドを産生するために用いられる。特に、本発明は、（ｉ）カロテノイド化合物産生に適した条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に（ｉｉ）カロテノイド化合物を回収するステップとを含む、カロテノイド化合物を産生する方法に関する。カロテノイド化合物は、リコペン又はリコペン由来の他の任意のカロテノイド化合物、好ましくはデイノキサンチン（ｄｅｉｎｏｘａｎｔｈｉｎｅ）であるとよい。所定の実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、ＦＰＰシンターゼ、好ましくはデイノコッカスＦＰＰシンターゼ、より好ましくは上述のような本発明のＦＰＰシンターゼを過剰発現する。
【０１７０】
一実施形態において、組換えデイノコッカス細菌は、上述のような異種テルペンシンターゼを含み、ゲラニオール、（＋）−リナロール、（−）−リナロール、Ｓ−リモネン、Ｒ−リモネン、α−ピネン、β−ピネン、フェンコール、テルピネオール、（−）−カルボン、（＋）−（Ｓ）−カルボン、メントン、イソメントン、メントール、ネオメントール、（Ｓ，Ｅ）−ネロリドール、８−ｅｐｉ−セドロール、ビサボロール、ゲルマクレンＡ、ゲルマクレンＢ、ゲルマクレンＣ、ゲルマクレンＤ、バレンセン、パチョロール、サンタレン、及びδ−カジネンからなる群から選択されるテルペン又はテルペノイド化合物を産生し得る。
【０１７１】
本方法は、テルペン又はテルペノイドを、ミルセンから得られるミルセノール及びジヒドロミルセニルアセテート；フェンコールから得られるフェンチル及びボルネオール誘導体；バレンセン又は（−）−β−ピネンから得られるヌートカトン（Ｎｏｏｔｋａｔｏｎｅ）；リナリルホルマート、リナリルアセタート、リナリルプロピオナート、リナリルブチラート、リナリルイソブチラート、及びラバンズリルアセタートなど、リナロールから得られるリナリル及びラバンズリルエステル；シトロネリルホルマート、シトロネリルアセタート、シトロネリルプロピオナート、シトロネリルイソブチラート、シトロネリルイソバレラート、シトロネリルチグラート、シトロネル酸ニトリル（若しくはシトロネリルニトリル）など、シトロネロールから得られるシトロネリル及びジヒドロミルセニルエステル；ゲラニオールホルマート、ゲラニルアセタート、ゲラニルプロピオナート、ゲラニルイソブチラート、ネリルアセタート、メチルゲラナート（若しくはゲラン酸メチルエステル）、及びゲラン酸ニトリル（若しくはゲラノニトリル）など、ゲラニオールから得られるゲラニルエステル；などのテルペン誘導体に変換することをさらに含み得る。好ましくは、テルペン誘導体はテルペンエステル、より好ましくはゲラニルエステルである。
【０１７２】
テルペン又はテルペノイドからテルペン誘導体を得るための方法は当業者には既知である。例えば、そうした方法は、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｏｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ、第５版、Ｈ．Ｓｕｒｂｕｒｇ及びＪ．Ｐａｎｔｅｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、２００６年に開示される。
【０１７３】
テルペン又はテルペノイドを産生するのに適切な条件は、本発明に用いられるデイノコッカス細菌に応じて、当業者によって容易に決定され得る。特に、炭素源は、キシロースやアラビノースなどのＣ５糖、グルコース、セロビオース、ショ糖、及びデンプンなどのＣ６糖からなる群より選択されるとよい。デイノコッカス細菌がセルロース分解活性又はキシラン分解活性を示すとき、セルロース系又はリグノセルロース系バイオマスなど、より複合的な炭素源が用いられ得る。温度条件も、中温性又は好熱性のデイノコッカス細菌の使用に応じて適応可能である。
【０１７４】
他の態様において、本発明は、（ｉ）テルペン又はテルペノイド産生に適した条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、（ｉｉ）任意的に該テルペン又はテルペノイドを回収するステップと、（ｉｉｉ）該テルペン又はテルペノイドをテルペン誘導体に変換するステップと、任意的に（ｉｖ）テルペン誘導体を回収するステップとを含む、テルペン誘導体、特に上述のようなテルペン誘導体を産生する方法にも関する。ステップ（ｉｉｉ）は化学変換又は酵素変換であってよい。
【０１７５】
好ましくは、テルペン又はテルペノイドはゲラニオール及び／又はゲラン酸であり、テルペン誘導体はゲラニルエステルである。
【０１７６】
本発明者らは、非改変デイノコッカス細菌がゲラニオールをゲラニアール及びゲラン酸に変換可能であることを見出した。このように、所定の態様において、本発明は、ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸を産生するための本発明の組換えデイノコッカス細菌の使用に関する。本発明は、（ｉ）ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸の産生に適した条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に（ｉｉ）ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸を回収するステップとを含む、ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸を産生する方法にも関する。
【０１７７】
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、異種ゲラニオールシンターゼをコードする遺伝子を含み、上述のような、任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う増強ＭＥＰ経路、及び／又は、異種ＭＥＶ経路を、任意的に示す。
【０１７８】
他の態様において、本発明は、（ｉ）デイノコッカス細菌、好ましくは本発明の組換えデイノコッカス細菌、又はその抽出物を、ゲラニオールに接触させるステップと、任意的に（ｉｉ）ゲラニアール及び／又はゲラン酸を回収するステップとを含む、ゲラニアール及び／又はゲラン酸を産生する方法にも関する。
【０１７９】
他の所定の態様において、本発明は、ゲラニルエステルを産生するための本発明の組換えデイノコッカス細菌の使用に関する。本発明は、（ｉ）ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸の産生に適した条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に（ｉｉ）ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸を回収するステップと、（ｉｉｉ）ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸を、ゲラニルエステルに変換するステップと、任意的に（ｉｖ）ゲラニルエステルを回収するステップとを含む、ゲラニルエステルを産生する方法にも関する。ステップ（ｉｉｉ）は化学変換又は酵素変換であってよい。
【０１８０】
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、異種ゲラニオールシンターゼをコードする遺伝子を含み、上述のような、任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う増強ＭＥＰ経路、及び／又は、異種ＭＥＶ経路を、任意的に示す。
【０１８１】
好ましくは、ゲラニルエステルは、メチルゲラナート、ゲラニルホルマート、ゲラニルアセタート、ゲラニルプロピオナート、ゲラニルイソブチラート、トランス−ゲラニルアセタート、又はネリルアセタートである。これらのエステルは、当業者に既知の任意の方法にて、ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸から産生されるとよい。
【０１８２】
他の態様において、本発明は、アポカロテノイドを産生するための本発明の組換えデイノコッカス細菌の使用に関する。好ましくは、アポカロテノイドは、ダマスコン、ダマセノン、及びイオノンからなる群より選択される。ダマスコン、ダマセノン、及びイオノンの例は、β−ダマセノン、トランス−β−ダマセノン、γ−ダマスコン、α−ダマスコン、トランス−α−ダマスコン、シス−α−ダマスコン、シス−β−ダマスコン、トランス−β−ダマスコン、δ−ダマスコン、トランス，トランス−δ−ダマスコン、トランス−（２，４，４−トリメチル−２−シクロヘキセニル）−２−ブテノン、１−（２，４，４−トリメチル−２−シクロヘキセン−１−イル）−２−ブテン−１−オン、１−（２，４，４−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２−ブテノン、１−（２，２−ジメチル−６−メチレンシクロヘキシル）−２−ブテン−１−オン、α−イオノン、β−イオノン、及びプソイドイオノンを含むがこれらに限定されない。
【０１８３】
このように、本発明は、（ｉ）ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸の産生に適した条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に（ｉｉ）ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸を回収するステップと、（ｉｉｉ）ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸をアポカロテノイドに変換するステップと、任意的に（ｉｖ）該アポカロテノイドを回収するステップとを含む、アポカロテノイド、即ちダマスコン、ダマセノン、及び／又はイオノンを産生する方法に関する。
【０１８４】
ダマスコン、ダマセノン、及び／又はイオノンへのゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸の変換は、ゲラニルエステル、好ましくはメチルゲラナートへの、ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸の中間変換に関し得る。
【０１８５】
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、異種ゲラニオールシンターゼをコードする遺伝子を含み、上述のような、任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う増強ＭＥＰ経路、及び／又は、異種ＭＥＶ経路を、任意的に示す。ゲラニオール、ゲラニアール、及び／又はゲラン酸をダマスコン、ダマセノン、及び／又はイオノンに変換する方法は、当業者には既知である。
【０１８６】
また本発明は、（ｉ）アポカロテノイド産生に適した条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、任意的に（ｉｉ）アポカロテノイドを回収するステップとを含む、アポカロテノイドを産生する方法にも関する。
【０１８７】
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、リコペンβ−シクラーゼをコードする遺伝子が不活性化された上述のような組換え体であって、異種カロテノイド切断ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）をコードする遺伝子をさらに含む。該組換え体は、異種リコペンエプシロンシクラーゼをコードする遺伝子をさらに含んでもよい。任意的に、フィトエンシンターゼ及びフィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子も過剰発現され得る。組換えデイノコッカス細菌は、上述のような、任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う増強ＭＥＰ経路、及び／又は、異種ＭＥＶ経路、及び／又は、ＦＰＰシンターゼの過剰発現を、さらに示すとよい。
【０１８８】
また本発明は、（ｉ）β−カロテン産生に適した条件下で本発明の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、（ｉｉ）β−カロテンを回収するステップと、（ｉｉｉ）β−カロテンをアポカロテノイドに変換するステップと、任意的に（ｉｖ）該アポカロテノイドを回収するステップと、を含む、アポカロテノイド、即ちダマスコン、ダマセノン、及び／又はイオノンを産生する方法にも関する。
【０１８９】
ダマスコン、ダマセノン、プソイドイオノン、及び／又はイオノンなどのアポカロテノイドへの、β−カロテンの変換は、化学変換又は酵素変換であってよく、当業者には既知である。
【０１９０】
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は、任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う増強ＭＥＰ経路、及び／又は、異種ＭＥＶ経路、及び／又は、ＦＰＰシンターゼの過剰発現を示す上述されたような組換え体である。任意的に、フィトエンシンターゼ及びフィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子も過剰発現され得る。
【０１９１】
本発明は、（ｉ）リコペン、α−、β−、及び／又はγ−カロテン産生に適した条件下で請求項１３の組換えデイノコッカス細菌を培養するステップと、（ｉｉ）任意的にリコペン、α−、β−、及び／又はγ−カロテンを回収するステップと、（ｉｉｉ）リコペン、α−、β−、及び／又はγ−カロテンをアポカロテノイドに化学又は酵素変換するステップと、任意的に（ｉｖ）該アポカロテノイドを回収するステップと、を含む、アポカロテノイドを産生する方法にも関する。
【０１９２】
好ましくは、組換えデイノコッカス細菌は上述のような組換え体であり、特に、異種ＣＣＤをコードする遺伝子を含む組換え体である。該組換え体は、任意的に改良ＤＸＰシンターゼを伴う増強ＭＥＰ経路、及び／又は、異種ＭＥＶ経路、及び／又は、ＦＰＰシンターゼの過剰発現をさらに示し得る。任意的に、フィトエンシンターゼ及びフィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子も過剰発現され得る。
【０１９３】
本発明のさらなる態様や有利性は、例示的であり限定的するものではないと理解される以下の実施例に記載される。
【実施例】
【０１９４】
＜実施例１：ゲラニオール及びゲラン酸産生＞
ゲラニオール及びゲラン酸を産生するために、デイノコッカス・ジオサーマリス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）株を遺伝子的に改変した。オシマム・バジリカム（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）のゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）をコードする異種遺伝子を、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子に代えて染色体に挿入した。ＧＥＳ遺伝子の発現は強力な構成的プロモータの制御下にあった。
【０１９５】
種培養作製のため、個々のコロニーを採取し、主な炭素源として２％グルコースを含む２５ｍｌのＣＭＧ２％培地（ペプトン２ｇ／Ｌ；酵母抽出物５ｇ／Ｌ；グルコース５５ｍＭ（２０ｇ／Ｌ）；ＭＯＰＳ酸４０ｍＭ；ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍＭ；ＮａＯＨ  １０ｍＭ；ＫＯＨ  １０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０，５μＭ；Ｎａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏ  ０．２７６ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．５２８ｍＭ；（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ  ３ｎＭ；Ｈ３ＢＯ３  ０．４μＭ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ３０ｎＭ；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；ＭｎＣｌ２  ０．２５μＭ；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；Ｄ−ビオチン  １μｇ／Ｌ；ナイアシン（ニコチン酸）  １μｇ／Ｌ；Ｂ６ビタミン  １μｇ／Ｌ；Ｂ１ビタミン；ＦｅＣｌ３  ２０μＭ；クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ  ２０μＭ；Ｋ２ＨＰＯ４  ５，７ｍＭ）に播種し、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。そして、対数増殖期の種を、同様の２５ｍｌの新しい培地に、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、播種した。この第２の種培養を、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。
【０１９６】
ゲラニオール産生のための培養を、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、２５ｍｌのミネラル合成培地（ＮＨ４）２ＳＯ４＜１００ｍＭ；ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＫＣｌ＜１０ｍＭ；Ｎａ２ＳＯ４＜１０ｍＭ；クエン酸＜３０ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＺｎＣｌ２＜５０ｍｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３＜５ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ＜２００ｍＭ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ＜０，５ｍＭ；グルコース＜３０ｇ／Ｌ（１６６ｍＭ）に播種された対数増殖期から、４８時間、２５０ｒｐｍ、３７℃でおこなった。
【０１９７】
２４時間の培養後、ゲラニオールが産生された（力価：２．０１ｍｇ／Ｌ；１．５ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）；０．６ｍｇ／ｇのグルコース）（図１）。４８時間の培養後、ゲラニオールが産生され（力価：３．９ｍｇ／Ｌ；０．５ｍｇ／ｇＤＣＷ；０．３ｍｇ／ｇのグルコース）、ゲラン酸が検出された（図２）。７２時間の培養後、ゲラニオールが少々残存し、ゲラン酸の主要なピークが現れた（図３）。０．５ｍＬの酢酸エチルを１ｍＬの培養物と混合することで抽出をおこない、遠心分離により分離した。酢酸エチル相をＧＣ質量分析（ＧＣ-ＭＳ）にて分析した。
【０１９８】
このように、ゲラニオール産生を特定し、ＧＣ質量分析計において定量化した。検出装置として質量分析計を取り付けたＧＣ−ＭＳ［アジレント７８９０Ａ／５９７５、カラム：０．２５ｍｍ×３０ｍ、０．２５μｍ（ＨＰ−５ＭＳウルトライナート）］を用いて、ガスクロマトグラフィをおこなった。ＧＣＭＳ分析は電子衝撃（ＥＩ）モード（７０ｅＶ）のもとでおこなわれた。１μＬの抽出物をパルス式スプリットレスモード（０．７５分まで５０ｐｓｉ）で注入した。スキャン範囲は５０〜２５０ｍ／ｚにわたった。エクスキャリバー（Ｘｃａｌｉｂｕｒ）システムを用いてデータを処理した。ＮＩＳＴライブラリを使用して特定をおこなった。ゲラニオールの標準曲線（図４）を、上述と同じ方法を用いて構築した。
【０１９９】
ゲラン酸産生を特定し、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）において定量化した。アジレントＣ１８ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ、４．６×１５０ｍｍ−２．７μｍカラム（ＥＣ−Ｃ１８）とアセトニトリル／水（０．１％ぎ酸）移動相とを用いて、ＨＰＬＣをおこなった。１０μｍの抽出物を注入した。ゲラン酸の標準曲線（図５）を、上述と同じ方法を用いて構築した。
【０２００】
＜実施例２：リコペン産生＞
リコペンを産生するために、デイノコッカス・ジオサーマリス株を遺伝子的に改変した。野生型細菌は、ＭＥＰ経路を介してリコペンを合成するための関連遺伝子を含む。リコペンを産生する組換えＤ．ジオサーマリスを、カロテノイド経路の一部を妨害することで取得した、つまり、リコペンβ−シクラーゼ（ＥＣ５．５．１．１９）（ｃｒｔｌｍ）遺伝子をノックアウトした。得られた構築物をシーケンシングにより確認した。
【０２０１】
種培養作製のため、個々のコロニーを採取し、主な炭素源として２％グルコースを含む２５ｍｌのＣＭＧ２％培地（ペプトン２ｇ／Ｌ；酵母抽出物５ｇ／Ｌ；グルコース５５ｍＭ（２０ｇ／Ｌ）；ＭＯＰＳ酸４０ｍＭ；ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍＭ；ＮａＯＨ  １０ｍＭ；ＫＯＨ  １０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０，５μＭ；Ｎａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏ  ０．２７６ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．５２８ｍＭ；（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ  ３ｎＭ；Ｈ３ＢＯ３  ０．４μＭ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ３０ｎＭ；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；ＭｎＣｌ２  ０．２５μＭ；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；Ｄ−ビオチン  １μｇ／Ｌ；ナイアシン（ニコチン酸）１μｇ／Ｌ；Ｂ６ビタミン  １μｇ／Ｌ；Ｂ１ビタミン；ＦｅＣｌ３  ２０μＭ；クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ  ２０μＭ；Ｋ２ＨＰＯ４  ５，７ｍＭ）に播種し、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。そして、対数増殖期の種を、同様の２５ｍｌの新しい培地に、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、播種した。この第２の種培養を、２５０ｒｐｍ、３７℃又は４５℃で一晩培養した。
【０２０２】
リコペン産生のための培養を、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が１０で、２５ｍｌのミネラル合成培地（ＮＨ４）２ＳＯ４＜１００ｍＭ；ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＫＣｌ＜１０ｍＭ；Ｎａ２ＳＯ４＜１０ｍＭ；クエン酸＜３０ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＺｎＣｌ２＜５０ｍｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３＜５ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ＜２００ｍＭ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ＜０，５ｍＭ；グルコース＜３０ｇ／Ｌ（１６６ｍＭ）に播種された対数増殖期から、４８時間、２５０ｒｐｍ、３７℃又は４５℃でおこなった。
【０２０３】
２４時間の培養後、リコペン産生株は３１のＯＤ６００であった。リコペンは、力価４．２ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の収量、及び０．３ｍｇ／ｇのグルコースで産生された。１ｍＬの培養物を遠心分離し、０．９ｍＬのアセトンとペレットとを混合してリコペン抽出をおこなった。アセトン相をＯＤ４７２ｎｍでの吸光度により分析した（図６）。最後に、リコペン標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄ）の希釈により、リコペン濃度を測定した。
【０２０４】
＜実施例３：ＦＰＰシンターゼの過剰発現＞
デイノコッカス・ジオサーマリスのファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）遺伝子（配列番号４６）を、強力な構成的プロモータの制御下で、実施例１のオシマム・バジリカムのＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリスと実施例２のリコペンを産生する組換えＤ．ジオサーマリスとのゲノムに挿入した。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。
【０２０５】
種培養作製のため、個々のコロニーを採取し、主な炭素源として２％グルコースを含む２５ｍｌのＣＭＧ２％培地（ペプトン２ｇ／Ｌ；酵母抽出物５ｇ／Ｌ；グルコース５５ｍＭ（２０ｇ／Ｌ）；ＭＯＰＳ酸４０ｍＭ；ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍＭ；ＮａＯＨ  １０ｍＭ；ＫＯＨ  １０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０，５μＭ；Ｎａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏ  ０．２７６ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．５２８ｍＭ；（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ  ３ｎＭ；Ｈ３ＢＯ３  ０．４μＭ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ３０ｎＭ；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；ＭｎＣｌ２  ０．２５μＭ；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；Ｄ−ビオチン  １μｇ／Ｌ；ナイアシン（ニコチン酸）  １μｇ／Ｌ；Ｂ６ビタミン  １μｇ／Ｌ；Ｂ１ビタミン；ＦｅＣｌ３  ２０μＭ；クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ  ２０μＭ；Ｋ２ＨＰＯ４  ５，７ｍＭ）に播種し、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。そして、対数増殖期の種を、同様の２５ｍｌの新しい培地に、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、播種した。この第２の種培養を、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。
【０２０６】
ゲラニオール産生のための培養を、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で２５ｍｌのミネラル合成培地（ＮＨ４）２ＳＯ４＜１００ｍＭ；ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＫＣｌ＜１０ｍＭ；Ｎａ２ＳＯ４＜１０ｍＭ；クエン酸＜３０ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＺｎＣｌ２＜５０ｍｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３＜５ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ＜２００ｍＭ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ＜０，５ｍＭ；グルコース＜３０ｇ／Ｌ（１６６ｍＭ）に播種された対数増殖期から、２４時間及び４８時間、２５０ｒｐｍ、３７℃又は４５℃でおこなった。
【０２０７】
リコペン産生のための培養を、上述と同様のプロトコルに従っておこなった。６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が１０であることが違いである。
【０２０８】
発明者等は、ＦＰＰシンターゼの過剰発現がリコペン産生を大きく増大させた（図７）ことを確認した。反対に、ゲラニオール産生は著しく低下した（図８）。
【０２０９】
＜実施例４：ＭＥＰ酵素の過剰発現＞
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓからの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）遺伝子（配列番号３）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）遺伝子（配列番号３６）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸シチジルトランスフェラーゼ（ＩｓｐＤ）遺伝子（配列番号１９）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）遺伝子（配列番号４０）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）遺伝子（配列番号２３）、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）遺伝子（配列番号２７）、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル二リン酸レダクターゼ（ＩｓｐＨ）遺伝子（配列番号４４）、又は、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エニル−二リン酸レダクターゼ（ＩＤＩ）遺伝子（配列番号３１）を、強力な構成的プロモータの制御下において、実施例１に記載の、オシマム・バジリカムのＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌の染色体に挿入した。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。
【０２１０】
種培養作製のため、個々のコロニーを採取し、主な炭素源として２％グルコースを含む２５ｍｌのＣＭＧ２％培地（ペプトン２ｇ／Ｌ；酵母抽出物５ｇ／Ｌ；グルコース５５ｍＭ（２０ｇ／Ｌ）；ＭＯＰＳ酸４０ｍＭ；ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍＭ；ＮａＯＨ  １０ｍＭ；ＫＯＨ  １０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０，５μＭ；Ｎａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏ  ０．２７６ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．５２８ｍＭ；（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ  ３ｎＭ；Ｈ３ＢＯ３  ０．４μＭ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ３０ｎＭ；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；ＭｎＣｌ２  ０．２５μＭ；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；Ｄ−ビオチン  １μｇ／Ｌ；ナイアシン（ニコチン酸）  １μｇ／Ｌ；Ｂ６ビタミン  １μｇ／Ｌ；Ｂ１ビタミン；ＦｅＣｌ３  ２０μＭ；クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ  ２０μＭ；Ｋ２ＨＰＯ４  ５，７ｍＭ）に播種し、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。そして、対数増殖期の種を、同様である２５ｍｌの新しい培地に、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、播種した。この第２の種培養を、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。
【０２１１】
ゲラニオール産生のための培養を、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で２５ｍｌのミネラル合成培地（ＮＨ４）２ＳＯ４＜１００ｍＭ；ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＫＣｌ＜１０ｍＭ；Ｎａ２ＳＯ４＜１０ｍＭ；クエン酸＜３０ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＺｎＣｌ２＜５０ｍｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３＜５ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ＜２００ｍＭ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ＜０，５ｍＭ；グルコース＜３０ｇ／Ｌ（１６６ｍＭ）に播種された対数増殖期から、４８時間、２５０ｒｐｍ、３７℃でおこなった。
【０２１２】
発明者等は、少なくとも１つのＭＥＰ酵素の過剰発現が、本明細書においてイソプレノイド産生のマーカとして用いられるゲラニオール産生を大きく増大させたことを確認した（図９）。
【０２１３】
＜実施例５：Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓの改良ＤＸＳ酵素＞
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）遺伝子（配列番号３）を、強力な構成的プロモータの制御下において、実施例１に記載のオシマム・バジリカムのＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌の、内在性ｄｘｓ遺伝子に代えて染色体に挿入した。部位特異的突然変異誘発をおこなって、Ｒ２３８Ｃ突然変異体（配列番号１３及び１４）を取得した。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。
【０２１４】
種培養作製のため、個々のコロニーを採取し、主な炭素源として２％グルコースを含む２５ｍｌのＣＭＧ２％培地（ペプトン２ｇ／Ｌ；酵母抽出物５ｇ／Ｌ；グルコース５５ｍＭ（２０ｇ／Ｌ）；ＭＯＰＳ酸４０ｍＭ；ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍＭ；ＮａＯＨ  １０ｍＭ；ＫＯＨ  １０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０，５μＭ；Ｎａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏ  ０．２７６ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．５２８ｍＭ；（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ  ３ｎＭ；Ｈ３ＢＯ３  ０．４μＭ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ３０ｎＭ；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；ＭｎＣｌ２  ０．２５μＭ；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；Ｄ−ビオチン  １μｇ／Ｌ；ナイアシン（ニコチン酸）  １μｇ／Ｌ；Ｂ６ビタミン  １μｇ／Ｌ；Ｂ１ビタミン；ＦｅＣｌ３  ２０μＭ；クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ  ２０μＭ；Ｋ２ＨＰＯ４  ５，７ｍＭ）に播種し、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。そして、対数増殖期の種を、同様である２５ｍｌの新しい培地に、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、播種した。この第２の種培養を、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。
【０２１５】
ゲラニオール産生のための培養を、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、２５ｍｌのミネラル合成培地（ＮＨ４）２ＳＯ４＜１００ｍＭ；ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＫＣｌ＜１０ｍＭ；Ｎａ２ＳＯ４＜１０ｍＭ；クエン酸＜３０ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＺｎＣｌ２＜５０ｍｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３＜５ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ＜２００ｍＭ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ＜０，５ｍＭ；グルコース＜３０ｇ／Ｌ（１６６ｍＭ）に播種された対数増殖期から、４８時間、２５０ｒｐｍ、３７℃でおこなった。
【０２１６】
図１０に示されるように、突然変異Ｒ２３８Ｃの導入によるＤＸＳの改良が、本明細書においてイソプレノイド産生のマーカとして用いられるゲラニオール産生を著しく増大させる。
【０２１７】
＜実施例６：デイノコッカス・ラディオピュグナンス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｕｇｎａｎｓ）の改良ＤＸＳ酵素＞
デイノコッカス・ラディオピュグナンスの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）をコードする遺伝子（配列番号５２）、又は該酵素のＲ２４４Ｃ突然変異体（配列番号８）をコードする遺伝子を、強力な構成的プロモータの制御下において、実施例１に記載のオシマム・バジリカムのＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌の、内在性ｄｘｓ遺伝子に代えて染色体に挿入した。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。種培養とゲラニオール産生のための培養とは実施例５に詳細に記載されるようにおこなわれた。
【０２１８】
図１１に示されるように、突然変異Ｒ２４４Ｃの導入による、デイノコッカス・ラディオピュグナンスのＤＸＳの改良が、本明細書においてイソプレノイド産生のマーカとして用いられるゲラニオール産生を著しく増大させる。
【０２１９】
＜実施例７：Ｄ．ジオサーマリスのファルネシルピロリン酸シンターゼのＫ１７０Ｇ突然変異体＞
Ｄ．ジオサーマリスのファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）遺伝子、又は部位特異的突然変異誘発によって取得された、該酵素のＫ１７０Ｇ突然変異体をコードする遺伝子を、実施例１に記載のオシマム・バジリカムのＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリス細菌において、ＦＰＰＳをコードする内在性遺伝子に代えて染色体に挿入した。野生型及び突然変異型のＤ．ジオサーマリスＦＰＰＳ遺伝子を共に構成的プロモータの制御下に置いた。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。種培養とゲラニオール産生のための培養とは実施例５に詳細に記載されるようにおこなわれた。
【０２２０】
図１２に示されるように、Ｄ．ジオサーマリスＦＰＰＳの突然変異Ｋ１７０Ｇが、ＧＰＰを介した炭素流のリダイレクションをもたらし、ゲラニオール産生を大きく増大させる。
【０２２１】
＜実施例８：改良ＤＸＳ酵素との組合せにおけるＭＥＰ酵素の過剰発現＞
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓのＤＸＳ酵素のＲ２３８Ｃ突然変異体をコードする遺伝子を、構成的プロモータの制御下において、実施例１に記載のオシマム・バジリカムのＧＥＳを発現する組換えＤ．ジオサーマリスのアミラーゼ（ａｍｙ）遺伝子に代えて染色体に挿入した。Ｄ．ジオサーマリスのファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）遺伝子のＫ１７０Ｇ突然変異体をコードする遺伝子も、内在性ｉｓｐＡ遺伝子に代えて染色体に挿入された。ＦＤＰＳ遺伝子の過剰発現は構成的プロモータの制御下にあった。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。
【０２２２】
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓのＭＥＰ経路遺伝子、ｄｘｒ遺伝子（配列番号３６）、ｉｓｐＤ遺伝子（配列番号１９）、ｉｓｐＥ遺伝子（配列番号４０）、ｉｓｐＦ遺伝子（配列番号２３）、ｉｓｐＧ遺伝子（配列番号２７）、及びｉｄｉ遺伝子（配列番号３１）のそれぞれを、強力な構成的プロモータの制御下において、Ｄ．ジオサーマリスＦＤＰＳ（Ｋ１７０Ｇ突然変異体）とＤ．ｙｕｎｗｅｉｅｎｓｉｓＤＸＳ（Ｒ２３８Ｃ突然変異体）とを発現するＤ．ジオサーマリス株において発現させた。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。種培養とゲラニオール産生のための培養とは実施例５に詳細に記載されるようにおこなわれた。
【０２２３】
図１３に示されるように、突然変異されたＤＸＳ及びＩＤＩの過剰発現は、他の組合せと比較してゲラニオール産生を著しく増大させた。
【０２２４】
＜実施例９：ビサボロール産生＞
ビサボロールを産生するため、デイノコッカス・ジオサーマリス株を遺伝子的に改変した。ストレプトマイセス・シトリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ）の（＋）−ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼをコードする異種遺伝子を、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子に代えて染色体に挿入した。ｅｐｉ−α−ビサボロールシンターゼ遺伝子の発現を構成的プロモータの制御下でおこなった。
【０２２５】
種培養作製のため、個々のコロニーを採取し、主な炭素源として２％グルコースを含む２５ｍｌのＣＭＧ２％培地（ペプトン２ｇ／Ｌ；酵母抽出物５ｇ／Ｌ；グルコース５５ｍＭ（２０ｇ／Ｌ）；ＭＯＰＳ酸４０ｍＭ；ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍＭ；ＮａＯＨ  １０ｍＭ；ＫＯＨ  １０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０，５μＭ；Ｎａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏ  ０．２７６ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．５２８ｍＭ；（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ  ３ｎＭ；Ｈ３ＢＯ３  ０．４μＭ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ３０ｎＭ；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；ＭｎＣｌ２  ０．２５μＭ；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；Ｄ−ビオチン  １μｇ／Ｌ；ナイアシン（ニコチン酸）  １μｇ／Ｌ；Ｂ６ビタミン  １μｇ／Ｌ；Ｂ１ビタミン；ＦｅＣｌ３  ２０μＭ；クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ  ２０μＭ；Ｋ２ＨＰＯ４  ５，７ｍＭ）に播種し、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。そして、対数増殖期の種を、同様の２５ｍｌの新しい培地に、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、播種した。この第２の種培養を、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。ビサボロール産生のための培養を、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、２５ｍｌのミネラル合成培地（ＮＨ４）２ＳＯ４＜１００ｍＭ；ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＫＣｌ＜１０ｍＭ；Ｎａ２ＳＯ４＜１０ｍＭ；クエン酸＜３０ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＺｎＣｌ２＜５０ｍｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３＜５ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ＜２００ｍＭ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ＜０，５ｍＭ；グルコース＜３０ｇ／Ｌ（１６６ｍＭ）に播種された対数増殖期から、４８時間、２５０ｒｐｍ、３７℃でおこなった。
【０２２６】
ビサボロール産生を特定し、ゲラニオールについて実施例１に記載されたようにＧＣ質量分析計において定量化した。
【０２２７】
図１４に示されるように、Ｄ．ジオサーマリスにおけるストレプトマイセス・シトリカラーのビサボロールシンターゼの発現により、ビサボロール産生がもたらされた（３．６ｍｇ／Ｌ）。
【０２２８】
＜実施例１０：リコぺンの産生向上＞
実施例２に前述されたように、リコペン産生のためにデイノコッカス・ジオサーマリス株を遺伝子的に改変した。Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓのＤＸＳ酵素のＲ２３８Ｃ突然変異体をコードする遺伝子と、Ｄ．ｙｕｎｗｅｉｎｅｎｓｉｓのＩＤＩをコードする遺伝子とを、構成的プロモータの制御下において、Ｄ．ジオサーマリスｃｒｔｌｍ−株の染色体に導入した。種培養とリコペン産生のための培養とは実施例２に詳細に記載されたようにおこなわれた。
【０２２９】
図１５に示されるように、Ｄ．ジオサーマリスｃｒｔｌｍ−株がＩＤＩと突然変異体ＤＸＳとを過剰発現するときにリコペン産生は２倍多い。
【０２３０】
＜実施例１１：Ｄ．ジオサーマリスにおける異なる由来のＧＥＳの発現＞
デイノコッカス・ジオサーマリス株は、フィラ・ドゥルキス（Ｐｈｙｌａ  ｄｕｌｃｉｓ）又はヒヨコマメ（シサー・アリティナム（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ））のゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）をコードする異種遺伝子を、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子に代えて染色体に挿入することによって、実施例１に前述されたように遺伝子的に改変された。ＧＥＳ遺伝子の発現は強力な構成的プロモータの制御下にあった。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。種培養とゲラニオール産生のための培養とは実施例１に詳細に記載されるようにおこなわれた。
【０２３１】
図１６に示されるように、フィラ・ドゥルキス又はヒヨコマメ（シサー・アリティナム）のＧＥＳの発現もゲラニオール産生をもたらした。
【０２３２】
＜実施例１２：カロテノイド産生＞
強力なプロモータの制御下におけるデイノコッカス・ジオサーマリスのファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）遺伝子（配列番号４６）を含む発現カセットを、Ｄ．ジオサーマリス株のゲノムに挿入した。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。
【０２３３】
種培養作製のため、個々のコロニーを採取し、主な炭素源として２％グルコースを含む２５ｍｌのＣＭＧ２％培地（ペプトン２ｇ／Ｌ；酵母抽出物５ｇ／Ｌ；グルコース５５ｍＭ（２０ｇ／Ｌ）；ＭＯＰＳ酸４０ｍＭ；ＮＨ４Ｃｌ  ２０ｍＭ；ＮａＯＨ  １０ｍＭ；ＫＯＨ  １０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０，５μＭ；Ｎａ２ＳＯ４．１０Ｈ２Ｏ  ０．２７６ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ０．５２８ｍＭ；（ＮＨ４）６（Ｍｏ７）Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ  ３ｎＭ；Ｈ３ＢＯ３  ０．４μＭ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  ３０ｎＭ；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；ＭｎＣｌ２  ０．２５μＭ；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  １０ｎＭ；Ｄ−ビオチン  １μｇ／Ｌ；ナイアシン（ニコチン酸）  １μｇ／Ｌ；Ｂ６ビタミン  １μｇ／Ｌ；Ｂ１ビタミン；ＦｅＣｌ３  ２０μＭ；クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ  ２０μＭ；Ｋ２ＨＰＯ４  ５，７ｍＭ）に播種し、２５０ｒｐｍ、４５℃で一晩培養した。そして、対数増殖期の種を、同様である２５ｍｌの新しい培地に、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、播種した。この第２の種培養を、２５０ｒｐｍ、４５℃で一晩培養した。
【０２３４】
カロテノイド産生のための培養を、６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００）が０．４で、２５ｍｌのミネラル合成培地（ＮＨ４）２ＳＯ４＜１００ｍＭ；ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＫＣｌ＜１０ｍＭ；Ｎａ２ＳＯ４＜１０ｍＭ；クエン酸＜３０ｍＭ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ＜１０ｍＭ；ＺｎＣｌ２＜５０ｍｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４＜５０ｍｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ＜５０ｍｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３＜５ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ＜２００ｍＭ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ＜０，５ｍＭ；グルコース＜３０ｇ／Ｌ（１６６ｍＭ）に播種された対数増殖期から、４８時間、２５０ｒｐｍ、４５℃でおこなった。
【０２３５】
２５ｍＬの培養物を遠心分離して、ペレットと２５ｍＬのエタノールとを混合することでカロテノイド抽出をおこなった。デイノキサンチン（ｄｅｉｎｏｘａｎｔｈｉｎ）のスペクトルを３５０ｎｍ〜６００ｎｍの吸光度を測定することで取得し、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）でノーマライズした（図１７）。薄いグレー色のスペクトラムは、デイノキサンチン標準物質（Ｄ．ラディオデュランスから抽出された精製デイノキサンチン）に相当する。
【０２３６】
図１７及び図１８に示されるように、Ｄ．ジオサーマリスの内在性ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）の過剰発現は、野生型株（ＷＴ）と比較して２倍、デイノキサンチン産生を著しく増大させた。このデイノキサンチン産生の増大は、野生型株と比較してＦＰＰＳを過剰発現する濃いピンク色のＤ．ジオサーマリスと関連がある（図１８）。
【０２３７】
＜実施例１３：シネオール（ｃｉｎｅｏｌｅ）産生＞
シネオールを産生するため、デイノコッカス・ジオサーマリス株を遺伝子的に改変した。ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）の１，８シネオールシンターゼ（ＣｎｓＡ）をコードする異種遺伝子を、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子に代えて染色体に挿入した。１，８シネオールシンターゼ遺伝子の発現は構成的プロモータの制御下でおこなわれた。Ｄ．ジオサーマリスのファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）遺伝子のＫ１７０Ｇ突然変異体を、内在性ｆｄｐｓに代えて染色体に挿入した。ＦＤＰＳ遺伝子の過剰発現は構成的プロモータの制御下でおこなわれた。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。種培養とシネオール産生のための培養とは実施例１に詳細に記載されたようにおこなわれた。２４時間又は４８時間の成長後、１ｍＬの培養物を０．５ｍＬの酢酸エチルで抽出した。有機相をＧＣＭＳで分析した。シネオール産生を特定し、ゲラニオールについて実施例１に記載されたようにＧＣ質量分析計において定量化した。
【０２３８】
図１９に示されるように、１，８シネオールシンターゼを挿入することにより、組換えＤ．ジオサーマリスによるシネオール産生がもたらされた。
【０２３９】
＜実施例１４：リモネン産生＞
リモネン産生のため、デイノコッカス・ジオサーマリス株を遺伝子的に改変した。異種遺伝子は、ナガバハッカ（メンタ・ロンギフォリア（Ｍｅｎｔｈａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）のリモネンシンターゼ（ＬＳ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ５０３０４．１）遺伝子をコードする。ＧＦＰに融合されたナガバハッカ（Ｍ．ロンギフォリア）のＬＳｃＤＮＡを、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子に代えて染色体に挿入した。ＬＳ遺伝子の過剰発現は構成的プロモータの制御下でおこなわれた。Ｄ．ジオサーマリスのファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）遺伝子のＫ１７０Ｇ突然変異体を、内在性ｆｄｐｓに代えて染色体に挿入した。ＦＤＰＳ遺伝子の過剰発現は構成的プロモータの制御下でおこなわれた。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。種培養とリモネン産生のための培養とは実施例１に詳細に記載されたようにおこなわれた。２４時間又は４８時間の成長後、１ｍＬの培養物を０．５ｍＬの酢酸エチルで抽出した。有機相をＧＣＭＳで分析した。リモネン産生を特定し、ゲラニオールについて実施例１に記載されたようにＧＣ質量分析計において定量化した。
【０２４０】
図２０に示されるように、リモネンシンターゼを挿入することにより、組換えＤ．ジオサーマリスによるリモネンシ産生がもたらされた。
【０２４１】
＜実施例１５：リナロール産生＞
リナロール産生のため、デイノコッカス・ジオサーマリス株を遺伝子的に改変した。異種遺伝子は、エゴマ（ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）のリナロールシンターゼ（ＬＩＳ）遺伝子をコードする。ＧＦＰに融合されたＬＩＳのｃＤＮＡを、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子に代えて染色体に挿入した。ＬＩＳ遺伝子の過剰発現は構成的プロモータの制御下でおこなわれた。Ｄ．ジオサーマリスのファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）遺伝子のＫ１７０Ｇ突然変異体を、内在性ｆｄｐｓに代えて染色体に挿入した。ＦＤＰＳ遺伝子の過剰発現は構成的プロモータの制御下でおこなわれた。得られた構築物をシーケンシングにて確認した。種培養とリナロール産生のための培養とは実施例１に詳細に記載されたようにおこなわれた。リナロール産生を特定し、ゲラニオールについて実施例１に記載されたようにＧＣ質量分析計において定量化した。
【０２４２】
図２１に示されるように、リナロールシンターゼを挿入することにより、組換えＤ．ジオサーマリスによるリナロール産生がもたらされた。
【０２４３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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