(57)【要約】  本発明は、皮膚の張りの喪失を予防することまたは皮膚の張りを強化することを目的とした、ルピンペプチド抽出物の使用に関する。有利には、ルピンペプチド抽出物は、セルライトの出現を予防、および／またはセルライトを軽減することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくは体の皮膚である、皮膚の張りの喪失を予防または皮膚の張りを強化するための、ルピンペプチド抽出物の使用。
【請求項２】
さらに皮膚のくぼみの出現を予防するか、または皮膚のくぼみを減少させる、請求項１に記載のルピンペプチド抽出物の使用。
【請求項３】
体のシルエットを再形成するための、ルピンペプチド抽出物の使用。
【請求項４】
前記ルピンペプチド抽出物が、ペプチド抽出物の全乾燥重量に対して、少なくとも８０重量％のペプチドを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記ルピンペプチド抽出物のペプチドが、１０，０００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチド抽出物が、４重量％未満の糖および／または１重量％未満の脂質を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記ペプチド抽出物のペプチドが、１３０Ｄａを超える分子量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記ペプチド抽出物が、白花ルピナス（lupinus albus）のペプチド抽出物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記ルピンペプチド抽出物が、下記のステップを含んでなる方法によって得られる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用：
（ａ）ルピンタンパク質フラクションの抽出、
（ｂ）ステップａ）で得られたタンパク質フラクションの、好ましくは酵素加水分解による加水分解、
（ｃ）加水分解されたペプチド抽出物の回収。
【請求項１０】
局所適用における、または経口経路によって摂取される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
好ましくは体の皮膚である、皮膚の張りの喪失を予防するため、または皮膚の張りを強化するための、０．００１〜３０乾燥重量％、有利には０．０５〜０．２重量％のルピンペプチド抽出物を含んでなる、化粧料組成物の使用。
【請求項１２】
前記化粧料組成物が、さらにゲル化剤、保存料、酸化防止剤、溶剤、香料、充填剤、化学的または鉱物フィルター、顔料、キレート剤、臭気吸収剤、熱水泉および／または着色材を含んでなる、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、皮膚の張りの喪失を予防することまたは皮膚の張りを強化することを目的とした、ルピンペプチド抽出物の使用に関する。有利には、ルピンペプチド抽出物は、くぼみ（凹み）の出現を予防、および／または皮膚のくぼみを軽減することができる。
【０００２】
背景技術
真皮とは、表皮および皮下組織の間に含まれている、皮膚の３つの構成層のうちの１つである。真皮は、皮膚を下から支える結合組織であり、真皮の主要細胞集団である線維芽細胞から生成された、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）から主になる。
【０００３】
細胞外マトリックスは、タンパク質繊維（コラーゲンおよびエラスチン）、ならびにとりわけ糖タンパク質（フィブロネクチン）およびプロテオグリカン／グリコサミノグリカンを含んでなる、基本物質としても知られる線維外マトリックスからなる。コラーゲンは、主としてＩ型コラーゲン（真皮コラーゲンの８５〜９０％）およびＩＩＩ型コラーゲン（真皮コラーゲンの１０〜１５％）を有する、約７０％のＥＣＭ成分を示す。コラーゲンは、真皮に、圧力に対する耐性（皮膚の機械的強度）を伴う張りを与える。エラスチン線維は、それに弾力特性を与える。
【０００４】
コラーゲンは、皮膚の張りを維持するために必須である一方で、表皮真皮接合部（ＥＤＪ）の役割を軽視してはならない。ＥＤＪは、表皮から真皮を分離する複雑構造である。その主となる機能は、真皮への表皮の接着のために機械的支持を提供すること、および２つの区画間の、拡散バリヤーおよび領域交換の機能を果たすことである。真皮への表皮の接着は、とりわけ、ＩＶ型コラーゲンまたはラミニン５などのアンカリングタンパク質によって確保されている。真皮の表皮への接着が弱い場合、皮膚は張りを失い、表皮は緩み、しわになる。
【０００５】
糖化は、皮膚レベル、特に真皮、での公知の現象である。それは、アミン基、特にタンパク質を形成するアミノ酸のアミン基（例えば、リジン）とグルコースまたはリボースなどの還元糖間の、自然発生的な非酵素的反応である。
【０００６】
真皮では、特にグルコースがコラーゲンおよび／またはエラスチンと反応し、略称「ＡＧＥ」として公知である、いわゆる「糖化最終産物」を引き起こす化合物を産出する。これら化学的修飾は、コラーゲンおよび／またはエラスチンの特性に対して影響が無い訳ではない。例えば、ＡＧＥは、コラーゲン繊維間に分子架橋を形成する。これら架橋は、コラーゲン繊維の機械的特性を、それらをより硬直にすることによって、劣化させる。
【０００７】
従って、糖化現象は、コラーゲン等の真皮の細胞外マトリックスのタンパク質に影響するかもしれず、それによってそれらの代謝性および機械的特性を劣化させるかもしれない。
【０００８】
皮膚レベルでは、糖化が、コラーゲン繊維の組織および真皮線維芽細胞の機能（コラーゲンラティス内で収縮する能力など）を劣化させるため、組織の張りおよび弾力性の喪失が観察される。皮膚は、その張りを失い、緩んだ状態となる。従って、タンパク質、特にコラーゲンの糖化は、皮膚への悪影響へとつながる。これらの影響は目で確認でき、多少醜いかもしれない。特に、真皮組織の構造が弱まり、張りが弱まると、皮下内にある含脂肪細胞の増殖への耐性が一層弱まり、「オレンジピール」として知られる凹んだ外観を作り出す。
【０００９】
従って、皮膚の張りの喪失を予防し、または皮膚の張りを強化することを可能とする薬剤を見出すことが必要とされている。有利には、当該薬剤は、特にセルライトを有する人間において、皮膚のくぼみの抑制された出現または皮膚のオレンジピールの外観の軽減を可能とするであろう。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、特に体の皮膚である、皮膚の張り(firmness)の喪失を予防または皮膚の張りを強化するための、ルピンペプチド(lupin peptide)抽出物の使用に向けられている。
【００１１】
本発明は、特に体の皮膚である、皮膚の張りの喪失を予防または皮膚の張りを強化するための、０．００１〜３０乾燥重量％のルピンペプチド抽出物を含んでなる、化粧料組成物の使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】GlasBox（商標）システム内で同等に引っ張られた真皮内の線維芽細胞によって発達した収縮力。
【図２】GlasBox（商標）システム内で同等に引っ張られた真皮内の線維芽細胞によって発達した収縮力。
【図３】Ｉ型コラーゲンの発現（真皮）。
【図４】ＩＩＩ型コラーゲンの発現（真皮）。
【図５】ＩＶ型コラーゲンの発現（ＥＤＪ）。
【図６】ラミニン５の発現（ＥＤＪ）。
【発明の具体的説明】
【００１３】
ルピンペプチド抽出物は、抗メタロプロテアーゼ活性、特に抗コラゲナーゼおよび抗ゼラチナーゼ活性を有することが知られている。この活性に基づき、コラーゲンの過剰な破壊および／または支持組織の過剰な破壊に関連する疾患を治療するためにその使用を活用することが提案されてきた。例えば、ルピンペプチド抽出物を、関節炎、歯周病、皮膚損傷、炎症性疾患、治癒力の不足に関連する疾患、歯のエナメル質への浸食、腫瘍のまたは病的な血管形成への治療するため、または、太陽放射線の作用またはタバコ、汚染およびストレスの劣化的影響による老化、皮膚の本質的老化による皮膚損傷の治療に使用することが提案されてきた。
【００１４】
予想外にも、本発明者らは、ルピンペプチド抽出物が、タンパク質糖化、特にコラーゲンの糖化を減少させ、かつ阻害さえする特性、真皮細胞外マトリックスおよび真皮表皮接合部の３つの主要高分子であるＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型コラーゲンを刺激する特性および線維芽細胞の収縮力刺激する特性を有することを見出した。
【００１５】
本発明は、これらの新しい特性から有利性を引き出し、従って、皮膚の張りの喪失を予防または皮膚の張りを強化するためのルピンペプチド抽出物の使用に関係する。有利には、本発明のルピンペプチド抽出物は、抗糖化剤として用いられる。
【００１６】
コラーゲンの糖化を阻害することによって、かつＩおよびＩＩＩ型コラーゲンの発現を刺激することによって、ルピンペプチド抽出物は、細胞外マトリックスの強化に寄与する。細胞外マトリックスが強化されると、皮膚は、張りを得る。また、コラーゲンＩＴＱ−２の合成の合成を刺激することによって、ルピンペプチド抽出物は、真皮および表皮の接着強化に寄与する。最後に、収縮線維の収縮喪失から真皮を保護することによって、ルピンペプチド抽出物は、皮膚の張りを強化することに寄与する。従って、ルピンペプチド抽出物は、特に顔の皮膚とは対照的に体の皮膚の張りである、皮膚の張りの喪失を予防または皮膚の張りを強化することにおいて特に効果的である。体の皮膚は、顔の皮膚より外的刺激に曝されないが、次の害悪(enemies)を有している：座りがちな生活様式、体重の変化、妊娠、ホルモン変化。これら現象は、皮膚の張りまたは弾力性の喪失につながるかもしれず、しわのある皮膚、くぼみ(dimpling)、セルライト等の魅力的でない疾患が出現する。
【００１７】
用語「セルライト」とは、真皮内へ突き出ている皮下脂肪に起因する、不規則的なくぼみによって視覚的に特徴付けられた構造的および構成的変化をもたらす、局所的皮膚疾患を指す。
【００１８】
本発明のペプチド抽出物は、特異的ボディケア製品、特にスリミング製品として、または体の張りおよびシルエット再形成効果、弾力および抗弛緩効果、抗セルライトおよび／または抗くぼみ効果用に、有利に使用される。
【００１９】
また、細胞外マトリックスが強化されると、真皮組織が、含脂肪細胞の増殖に対してより耐性となる。くぼみの出現は、それによって阻止される。従って、ルピンペプチド抽出物は、皮膚のくぼみの出現の予防および／または皮膚のくぼみの軽減に特に効果的であると証明されている。
【００２０】
セルライトに対するレチノールの効果を評価している、Kligman et al [J Dermatolog Treat, 1999; 10 119-25]の研究によると、この効果は、主として真皮の再構築および増加した微小血管形成に関連している。
【００２１】
従って、皮膚再構築の強化および皮膚の張りの促進のための真皮への働きかけが、セルライトの出現を改善するために第一に重要であると思われる。
【００２２】
本発明に有用なルピンペプチド抽出物は、ペプチド抽出物の全乾燥重量に対して、少なくとも８０重量％のペプチド、典型的には、ペプチド抽出物の全乾燥重量に対して、８０〜１００重量％のペプチドを含んでなる。
【００２３】
ペプチド抽出物は、本質的に糖および脂質を含まない。
【００２４】
糖含有量は、典型的には、ペプチド抽出物の全乾燥重量に対して、４乾燥重量％未満、好ましくは０、さらに１と、３重量％との間である。
【００２５】
脂質含有量は、典型的には、ペプチド抽出物の全乾燥重量に対して、１乾燥重量％未満である。
【００２６】
ルピンペプチド抽出物は、白花ルピナス（lupinus albus）、黄花ルピナス（lupinus luteus）、ザッショクノボリフジ（lupinus mutabilis）に属するルピンに由来するペプチド抽出物およびこれらの混合物の中から選択することができる。好ましくは、ペプチド抽出物は、スイート・ホワイト・ルピン（白花ルピナス（lupinus albus））のペプチド抽出物、例えばアレス（Ares）種である。アレス種のルピンは、低いアルカロイド含有量を有する。
【００２７】
ルピンペプチド抽出物は、以下のステップを含んでなる方法によって得ることができる。
（ａ）ルピンタンパク質フラクションの抽出；
（ｂ）ステップ（ａ）−で得られたタンパク質フラクションの加水分解；
（ｃ）ペプチド抽出物の回収。
【００２８】
加水分解は、典型的には酵素加水分解を通して実行される。特に、酵素加水分解は、プロテアーゼ（例えば、Alcalase（商標）（NOVO NORDISK）またはProlyve 1000 (LYVEN)）を用いて実施することができる。酵素加水分解は、２〜４時間の変動する時間、５０〜６０℃の温度で実施することができる。ペプチド抽出物のペプチドは、有利には、１３０〜１０、０００Ｄａ、好ましくは１３０〜３５００Ｄａ、より好ましくは３００〜３５００Ｄａの分子量を有する。
【００２９】
本発明の一つの具体的特性によると、ペプチド抽出物の４０〜５５％のペプチドが、３００〜１２００Ｄａの分子量を有し、および／またはペプチド抽出物の２５〜４０％のペプチドが、１２００〜３５００Ｄａの分子量を有する。
【００３０】
ステップ（ｂ）で得られたペプチド抽出物は、好ましくは、１０，０００ダルトン〜１５，０００ダルトンの下限値を有する限外濾過モジュールで、透析濾過によって精製することができる。限外濾過によって、タンパク質の除去が可能となる。従って、ペプチド抽出物の調整方法は、限外濾過ステップを含んでもよい。同様に、ナノ濾過ステップ（例えば、１００〜３００Ｄａ、または１３０〜３００Ｄａの下限値を有するナノ濾過モジュールによる）を含んでもよい。ナノ濾過によって、遊離アミノ酸または無機塩の除去が可能となる。
【００３１】
包装前に、ペプチド抽出物を、滅菌して精密濾過（０．２μｍ）することができ、次いで、以下を行うことができる：
−保存料なく、滅菌容器内に層流下で分配する；または
−「清潔」な容器に分配する前に、保存料の添加を経て微生物学的に安定化させる。潜在的に使用することがきる保存料として、パラベンおよび／またはフェノキシエタノールの混合物（例えば、０．５％のPhenonip）が挙げられる。パラベンを含まない混合物が好ましい（例えば、フェノキシエタノール（１％）、クエン酸（０．５％）、アスコルビン酸（０．０８％）の混合物）；または
−噴霧乾燥または凍結乾燥を介して乾燥させることによって安定化させ、湿度および微生物汚染から保護された密封袋に包装することができる、乾燥形態でペプチド抽出物を得る。
【００３２】
従って、ペプチド抽出物の調整方法は、さらに、水の全体的または部分的蒸発を介した、ステップ（ｃ）で得た加水分解されたペプチド抽出物の濃縮ステップを含んでもよい。
【００３３】
乾燥は、マルトデキストリン等の基質の存在にかかわらず、噴霧乾燥または凍結乾燥によって実施することができる。好ましくは、乾燥は、基質なしで、凍結乾燥によって得られる。
【００３４】
タンパク質フラクションの抽出は、以下の様式で得ることができる：
ｉ）  好適な溶剤を用いて、ルピン種子から脂質を抽出し、かつルピンタンパク質および単糖類フラクションを回収する；
ｉｉ）  限外濾過によってタンパク質フラクションを抽出し、当該タンパク質フラクションを回収する。
【００３５】
ステップi)で用いられる溶剤は、有利には、無毒食物溶剤の群（具体的には、エタノール）から選択される。脂質の抽出は、好ましくは、粉砕ルピンまたは微粉化されたルピン粉末のケーキ形態のルピン種子から得られる。抽出は、ヘキサンを用いて実施することもできる。
【００３６】
幾つかの態様において、ルピンペプチド抽出物は、下記表Ａに記載された、アミノ酸組成物を有する（アミノ酸の全重量に対する重量パーセンテージ）。
【００３７】
【表１】
2017519787.tif 000002
【００３８】
ルピンペプチド抽出物は、好ましくは皮膚への局所的適用における、または経口経路を介して摂取される、化粧料用（非治療的）使用を目的としている。
【００３９】
ルピンペプチド抽出物は、化粧料組成物の形態に剤型化できる。従って、本発明は、特に、顔の皮膚とは対照的に体の皮膚である、皮膚の張りの喪失を予防または皮膚の張りを強化するための、ルピンペプチド抽出物を含んでなる、化粧料組成物の使用にも関係する。有利には、ルピンペプチド抽出を含んでなる化粧料組成物は、特に、セルライトを有する人間において、皮膚のくぼみの出現を予防または皮膚のくぼみを軽減するために使用することができる。
【００４０】
化粧料組成物は、組成物の全重量に対して、０．００１〜３０％、好ましくは０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜５乾燥重量％のルピンペプチド抽出物を含んでもよい。有利には、本発明の組成物は、組成物の全重量に対して、０．０１〜０．２重量％、より有利には０．０５〜０．２重量％、典型的には０．０１〜０．１５重量％、特に０．０５〜０．１５重量％のルピンペプチド抽出物を含む。当該濃度は、ルピンペプチド抽出物の効果的濃度を形成することができる。
【００４１】
また、化粧料組成物は、ゲル化剤（例えば、親水性または親油性ゲル化剤）、保存料、抗酸化剤、溶剤、香料、充填剤、化学的または鉱物フィルター、顔料、キレート剤、臭気吸収剤、熱泉水(thermal water)および／または着色材(colouring material)等の、化粧料分野において用いられる、通常のアジュバントを含んでもよい。これら異なるアジュバントの量は、化粧料において従来的に用いられてきた量である。例えば、各アジュバントの量は、化粧料組成物の全重量に対して、０．０１重量％〜２０重量％で変化してもよい。
【００４２】
化粧料組成物は、さらに、安定剤、脱水剤、調色剤、引き締め剤(tightening agent)の中から選択される有効成分またはこれらの混合物を含んでもよい。各有効成分の個別の量は、化粧料組成物の全重量に対して、０．０１重量％〜２０重量％で変化してもよい。
【００４３】
化粧料組成物は、化粧料分野において通常用いられる任意の形態、特に外的局所適用に適合した任意の形態であってもよい。従って、化粧料組成物は、含水アルコール溶液または油剤、水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンまたは多相エマルジョン、水性ゲルまたは油性ゲル、液体、ペーストまたは個体の無水生成物、または小球体による水相内での油の分散（小球体は、可能であれば、ナノ粒子またはナノカプセル等のポリマーナノ粒子である）、またはイオン型および／または非イオン型の脂質小胞の形態であってもよい。化粧料組成物は、クリーム、オイントメント、ミルク、ローション、軟膏、美容液、ペースト、泡、エアロゾルまたはスティックの形態で、多少流動的であってもよい。
【００４４】
化粧料組成物がエマルジョンの場合、脂肪相の割合は、化粧料組成物の全重量に対して、５重量％〜８０重量％、好ましくは５重量％〜５０重量％で変動する。化粧料組成物において用いられる油、乳化剤および補助乳化剤は、化粧料分野において伝統的に用いられてきたものの中から選択される。乳化剤および補助乳化剤は、化粧料組成物の全重量に対して、０．３重量％〜３０重量％、好ましくは０．５重量％〜２０重量％で変動する割合において、組成物に含有され得る。油は、鉱油、植物油（アプリコット、ヒマワリの種、プラムのオイル）、動物油、合成油、シリコーン油、フッ素化油（パーフルオロポリエーテル）の中から選択することができる。セチルアルコール等の脂肪アルコール、脂肪酸または蜜ろう等のろうも脂肪として用いることができる。乳化剤および補助乳化剤は、ＰＥＧ−４０ステアリン酸またはＰＥＧ−１００のステアリン酸等の脂肪酸のエステルおよびポリエチレングリコール、グリセロールステアリン酸およびトリステアリン酸塩ソルビタン等の脂肪酸およびポリオールの中から選択することができる。
【００４５】
幾つかの態様において、化粧料組成物は、ゲル形態であってもよい。当該ゲルは、抗くぼみスリミングゲルとして特に有用となり得る。例えば、本発明のゲルは、下記の組成を有してもよい。
【００４６】
【表２】
2017519787.tif 000003
【００４７】
幾つかの態様において、化粧料組成物は、体の引き締めのためのケアに用いることができる。例えば、当該組成物は、下記の組成を有してもよい。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
ルピンペプチド抽出物および当該抽出物を含んでなる化粧料組成物は、皮膚の張りの喪失を予防または皮膚の張りを強化するために使用することができる。例えば、ルピンペプチド抽出物および当該抽出物を含んでなる化粧料組成物は、皮膚、とりわけ体の皮膚へ、ルピンペプチド抽出物、特にルピンペプチド抽出物の効果的濃度または当該抽出物を含んでなる組成物を適用することを含んでなる、皮膚の張りの喪失を予防または皮膚の張りを強化するための美容療法において使用することができる。
【００５０】
ルピンペプチド抽出物および当該抽出物を含んでなる化粧料組成物は、皮膚へ、ルピンペプチド抽出物、特にルピンペプチド抽出物の効果的濃度または当該抽出物を含んでなる組成物を適用することを含んでなる、体の張り用美容療法においても使用することができる。得られた張りによって、シルエットの再形成(remodel)が可能となる。
【００５１】
ルピンペプチド抽出物および当該抽出物を含んでなる化粧料組成物は、皮膚のくぼみの出現を予防および／または皮膚の凹んだ外観を軽減するために使用することができる。換言すると、ルピンペプチド抽出物は、セルライトを有する人間の皮膚に存在し得る「オレンジピール」外観の軽減を可能とする。それによって、皮膚は滑らかになる。例えば、ルピンペプチド抽出物および当該抽出物を含んでなる化粧料組成物は、ルピンペプチド抽出物または当該抽出物を含んでなる組成物の効果的な濃度で、ルピンペプチド抽出物を、皮膚、特に体の皮膚へ適用することを含んでなる、皮膚のくぼみの出現を予防および／または皮膚の凹んだ外観を軽減するための、美容療法において使用することができる。
【００５２】
上記のような美容療法は、本発明の主題でもある。
【実施例】
【００５３】
下記実施例において用いられたペプチド抽出物は、商品名ACTIMP（商標）(粉末)またはACTIMP（商標）1.9.3（液体）の、Laboratoires Expanscienceによって供給されたものである。
【００５４】
それは、下記様式にて調製することができる。
【００５５】
１．ルピンペプチド抽出物の調製
粉砕、脱脂ルピンケーキの調製
ルピン種子を粉砕し、エタノールを用いて脂質を抽出した。
【００５６】
ルピンタンパク質の抽出および精製
このステップは、アルカリｐＨでの可溶性フラクションの水性可溶化、続く不溶性物質の分離を含んでなる。
【００５７】
粉砕脱脂ルピンケーキから、ｐＨ９．０（ｐＨは、水酸化ナトリウムの添加によって調節した）で、粉末／水の比が１／１０（ｗ／ｗ）であるタンパク質を抽出した。溶液を、１時間、大気温度にて、撹拌下で培養した。ケーキの不溶性物質の部分は、脱水によって可溶性部分から分離した。得られたケーキを洗浄した。タンパク質および可溶性糖質を含む可溶性フラクションを、可溶性糖（限外濾過液）からタンパク質（未透過物）を分離するために、１００００ダルトンの下限値を有する、限外濾過モジュールで透析濾過した。
【００５８】
酵素加水分解によるペプチドの生成および精製：
タンパク質を含有する限外濾過未透過物を、１００ｇ／１の濃度に調製し、次いで、約３時間、５５℃にて、Alcalase# (NOVO NORDISK)の存在下で、ｐＨ８．０に加水分解した。加水分解後、８５℃で、１５分間、加水分解によって酵素を変性させた。溶液が冷却されると直ちに、塩酸の添加を経て中性化させた。得られたペプチドを、１０，０００ダルトンの下限値を有する限外濾過モジュールで透析濾過によって精製した。得られた水溶液を、脱塩（塩化ナトリウムの除去）およびペプチドフラクションの濃縮のためにナノ濾過した。ペプチドの溶液を、３％の活性炭素を用いて脱色し（５０℃で１時間）、炭素を濾過によって除去した。
【００５９】
ペプチドフラクションの滅菌および安定化：
梱包の前に、溶液は、滅菌して精密濾過（０．２μｍ）され、次いで以下を行うことができる：
−「清潔な」容器（Laboratoires Expanscienceによって販売されているActimp（商標）１．９．３（１０％のルピンペプチドから作られている））に分配する前に、パラベンを含まない混合物（フェノキシエタノール（１％）、クエン酸（０．５％）、ソルビン酸（０．０８％））の添加を介して、微生物学的に安定化させる。
−乾燥形態のペプチドを得るために、凍結乾燥によって安定化させ、湿度および微生物汚染から保護された密封袋に包装する(Laboratoires Expanscienceによって販売されているActimp（商標）粉末)。
【００６０】
乾燥抽出物およびこのような有効分は、下記の特性を有する：
−外観：  均質的、非吸湿性粉末；
−色：オフホワイト；
化学的組成：
−糖の総含有量（アントロンとのアッセイ）：＜４  ％
−塩素含有量（ＳＩＧＭＡキット整理番号：  ９５５-３０）：＜６％
−含水量（１００℃、４時間）：＜８％
−ペプチド含有量：＞８０％
−ｐＨ（２０ｇ／ｌの溶液）：７．０６
−可溶性（浸透水）：＞１００ｇ／Ｌ
【００６１】
【表４】
2017519787.tif 000005
【００６２】
上記の試験において、ペプチド抽出物は、細胞および外植片への適用を可能とするために、０．１％、０．２％および／または２％の濃度にて、培養培地で溶解させた。
【００６３】
２．ルピンペプチド抽出物の糖化に対する効果の証明
in vitroで培養したヒト線維芽細胞から寄託された合成コラーゲン線維中へのＡＧＥの非酵素的挿入を観察した。トリチウム化したグルコースの細胞外マトリックスのタンパク質への組込に基づく、放射能検出法を用いた。
【００６４】
正常ヒト真皮線維芽細胞を、コラーゲンの合成を刺激するために、ビタミンＣの存在下で培養した。細胞は、次いで、全ての酵素活性を不活性化するために、異なる処理（凍結／解凍／加熱）を受けた。
【００６５】
このように得られたマトリックス層を、酸素の非存在下（７日間の治療日後に迅速な再酸素化を実行した）で、３７℃で、１５日間、０．２および２％の上記のルピンペプチド抽出物、１ｍｇ／ｍｌ（コントロール）のアミノグアニジンＨＣｌ、０．２％のグルコース、および［３Ｈ］−グルコース放射性マーカーの存在下で処理した。
【００６６】
培養後、細胞外マトリックスのタンパク質（主として、コラーゲン）を、カオトロピック緩衝剤を用いて抽出し、トリクロロ酢酸で沈殿させ、フィルター上に回収した。ＥＣＭ線維に組み込まれた放射能を、液体シンチレーションによって測定した。
【００６７】
結果を、分散の一因子分析、続くダネット検定を用いて統計的に分析し、下記の表に示した。
【００６８】
【表５】
2017519787.tif 000006
【００６９】
結果は、糖化に対するルピンペプチド抽出物の保護的効果を示す。
【００７０】
ルピンペプチド抽出物は、真皮の細胞外マトリックスを糖化から保護する。従って、スピンペプチド抽出物は、マトリックスの硬直化を予防することができ、皮膚の弾力性および張りを保持する（コラーゲンの生体力学的特性の保護）。
【００７１】
３．収縮力へのルピンペプチド抽出物の効果の証明
線維芽細胞を含有する真皮同等物のモデルは、線維芽細胞とコラーゲン線維の間における相互作用の質の評価を可能とする。これら真皮同等物の自由な収縮／反応は、コラーゲンネットワークに張力をかける、細胞の動力学的活性に起因する。
【００７２】
真皮同等物の収縮への、ルピンペプチド抽出物の効果を評価した。線維芽細胞が収縮力を失った状態を誘発するために、真皮同等物に、老化したいわゆる「老化」線維芽細胞（ヘイフリックモデルに従い、連続継代によって得た）を播種した。
【００７３】
「老化」または正常真皮同等物を、線維芽細胞（正常真皮同等物用に８代継代、または「老化」真皮同等物用に１７代継代）をコラーゲン溶液と混合することによって調製した。
【００７４】
完全ゲル化後、真皮同等物を、１０ｎｇ／ｍｌ（コントロール）のTGFβまたは０．１％ルピンペプチド抽出物で処理し、４日間培養した。
【００７５】
真皮同等物を、収縮の決定を目的として、表面積を測定するために、Ｄ１、Ｄ３およびＤ４で撮影した。
【００７６】
結果を、スチューデントｔ検定（Student’s t test）を用いて統計的に分析し、下記の表に示した。
【００７７】
【表６】
2017519787.tif 000007
【００７８】
全体として、「老化」真皮同等物（ＤＥｓ）の収縮は、正常ＤＥｓの収縮と比較して低く（「老化」ＤＥｓの表面積の方が大きい）、細胞の老化による、誘発された線維芽細胞／コラーゲン線維の相互作用の低下を示している。
【００７９】
ＴＧＦβは、「老化」ＤＥｓの収縮を刺激し、この刺激は、４日間の治療期間後に顕著となる。この結果は、アッセイを有効とする。
【００８０】
０．１％のルピンペプチド抽出物は、治療の初日後直ちに、「老化」Ｄｅｓの収縮を顕著に刺激する。それは、真皮同等物の「緩み」に対する老化の影響に対する早い反作用を可能とする。
【００８１】
ルピンペプチド抽出物は、ここで、細胞の老化によって誘発された「緩み」を阻害する。
【００８２】
収縮の喪失から真皮を保護することによって、ルピンペプチド抽出物は、「引き締まった」効果を得るために皮膚の弾性特性を維持し、皮膚の張りを維持することに寄与する。
【００８３】
４．等尺性力へのルピンペプチド抽出物の効果の証明
張力をかけた真皮同等物中の線維芽細胞によって発達した等尺性力でルピンペプチド抽出物の効果を研究した（GlasBox（商標）モデル）。
【００８４】
GlasBox（商標）システム（Growing LAttice Study BOX）は、線維芽細胞によって発達した収縮力の、張力をかけた真皮同等物中での、測定を可能とする。これらは、マトリックスを再組織するための、線維芽細胞の活性を示す。
【００８５】
GlasBox（商標）システムにおいて、真皮同等物は、センサーとしても機能する、２つのスライド間の張力下で発達する：線維芽細胞によって発達した収縮力の影響下でスライドは変形する。これは、ひずみゲージの電気抵抗における変動として言い換えられる。真皮同等物内で発展した力を示すこの変動は、リアルタイムで測定される。
【００８６】
真皮同等物を、正常ヒト真皮線維芽細胞をコラーゲン溶液と混合することによって調製した。この混合物を、GlasBox（商標）の三角ウェルに流し入れた。ゲルの形成後、０．１％のルピンペプチド抽出物を含有したまたは含有していない培地を添加した。等尺性力を２４時間測定した。
【００８７】
結果を、分散の二因子分析、続くフィッシャーテストを用いて、統計的に分析し、図１および２に示した。
【００８８】
全体として、０．１％のルピンペプチド抽出物は、線維芽細胞によって発達した力を顕著に増大させた。この増大は、曲線の最初の部分における方が、特に顕著である（１時間〜最大５．７５の測定時間後）。
【００８９】
これは、特に線維芽細胞によるマトリックスの再組織化の早い段階の間において、ルピンペプチド抽出物の引き締め効果を示している。
【００９０】
張力がかかった真皮同等物中の線維芽細胞によって発達した力は、ルピンペプチド抽出物によって顕著に刺激された。これらの結果は、皮膚の張りおよび弾力性の喪失に対抗するためのルピンペプチド抽出物の引き締め効果を証明する。
【００９１】
５．Ｉ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンおよびラミニン５の発現へのルピンペプチド抽出物の効果の証明
ヒトの皮膚の外植片でルピンペプチド抽出物の活性を評価した：細胞外マトリックス（Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲン）および表皮真皮接合部（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン５）のマーカーを免疫染色によって分析した。
【００９２】
０．２％のルピンペプチド抽出物を、生きたままのヒト皮膚外植片の表面に適用した。
【００９３】
７〜１０日間の治療後、皮膚外植片を回収し、−８０℃に凍結またはパラフィン内に固定して含ませた。
【００９４】
真皮マトリックスまたは表皮真皮接合部の異なるマーカーの免疫染色を以下の皮膚部分に実施した。
Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンならびにラミニン５を凍結部分に染色し、蛍光（ＦＩＴＣ）下で検出し、細胞核を、プロピジウムヨウ化物で対比染色した。
ＩＩＩ型コラーゲンは、パラフィン部分を染色し、ペルオキシダーゼを用いて検出した。
【００９５】
染色は、顕微鏡検査において視覚化され、画像分析によって定量化された。染色強度における変動を、スチューデントｔ検定を用いて統計的に分析した。結果を図３〜５に示した。
【００９６】
ルピンペプチド抽出物は、７および１０日の治療日後（図３）、Ｉ型コラーゲンの染色の増大を誘発した。
【００９７】
【表７】
2017519787.tif 000008
【００９８】
ルピンペプチド抽出物は、７および１０日の治療日後（図４）、ＩＩＩ型コラーゲンの染色の増大を誘発した。
【００９９】
【表８】
2017519787.tif 000009
【０１００】
ルピンペプチド抽出物は、７および１０日の治療日後（図５）、ＥＤＪでのＩＶ型コラーゲンの染色の増大を誘発した。
【０１０１】
【表９】
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【０１０２】
ルピンペプチド抽出物は、７および１０日の治療日後（図６）、ＥＤＪでのラミニン５の染色の増大を誘発した。
【０１０３】
【表１０】
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【０１０４】
皮膚外植片へのルピンペプチド抽出物の局所適用は、真皮細胞外マトリックスの２つの主要高分子である、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンの発現を刺激し、表皮真皮接合部のマーカーである、ＩＶ型コラーゲンおよびラミニン５の発現を刺激した。従って、ルピンペプチド抽出物は、表皮真皮接合部および真皮細胞外マトリックスを強化することができ、皮膚の張りおよび弾力性の特性を促進する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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