(57)【要約】  本発明は、非エラスターゼ依存性であるトロポニンレベルの増加に関連する疾患又は障害の治療及び/又は予防のためのエラフィンの使用に関する。好ましい実施形態では、本発明は、例えば心筋梗塞の結果生じ得る異常な血流及び/又は炎症によって引き起こされる損傷から心筋又は他の筋肉を保護するための、エラフィンを用いた方法及び組成物に関する。本発明は、追加的に又は同時に、トロポニンI及び/又はTのレベルの上昇に関連する障害又は疾患の治療及び/又は予防のためのエラフィンの使用に関する。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロポニンI及び/若しくはトロポニンIの放出につながる細胞損傷及び/若しくは細胞死、並びに/又は血漿トロポニンI及び/トロポニンTの上昇と関連する、障害又は疾患の予防及び/又は治療に使用するための、配列番号1の配列又はそのホモログ、断片、若しくは誘導体を含むポリペプチド。
【請求項２】
トロポニンI及び/又はトロポニンTの上昇がエラスターゼ活性の増加と関連しない、項1に記載の使用のための配列番号1の配列又はそのホモログ若しくは誘導体若しくは断片を含むポリペプチド。
【請求項３】
前記障害又は疾患がさらにセリンプロテアーゼであるプロテイナーゼ3の増加と関連しない、請求項1又は2に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項４】
前記障害又は疾患が、筋肉損傷又は筋肉の細胞死を伴う障害又は疾患、すなわち
(続発性)心臓疾患又は障害:
安定型冠動脈疾患、
慢性心不全、
心房細動、
心筋梗塞、
心筋炎、
狭心症、
急性肺塞栓症、
肺動脈高血圧、
冠動脈バイパス手術、
心臓血管手術、
腎不全、
心臓移植患者の急性拒絶反応、
筋疾患:
皮膚筋炎、
多発性筋炎、
封入体筋炎、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、
横紋筋融解症
手術又は事故後の筋肉損傷、
肺動脈高血圧
から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項５】
前記ホモログが配列番号1に示されたポリペプチドと比較して60%超、好ましくは70%超、80%超、90%超、95%超、さらにいっそう好ましくは98%超の配列相同性を有すると定義される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項６】
前記誘導体が、配列番号1に示されたポリペプチド又はそれに由来するホモログ及び断片とは、グリコシル化、PEG化、ビオチン化、環化及び/又は酸化などのアミノ酸修飾によって異なる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項７】
非経口的に、例えば静脈内、皮下、吸入により、筋肉内又は動脈内、好ましくは静脈内又は皮下に投与される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項８】
予防的使用のためのものであり、移植片及び/又はステントに対するコーティングとして適用される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項９】
手術前、手術中又は手術直後に投与される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスターゼ依存的ではないトロポニンレベルの増加に関連する疾患又は障害の治療及び/又は予防のためのエラフィンの使用に関する。好ましい実施形態では、本発明は、例えば心筋梗塞の結果生じ得る異常な血流及び/又は炎症によって引き起こされる損傷から心筋又は他の筋肉を保護するための、エラフィンを用いた方法及び組成物に関する。本発明は、追加的に又は同時に、トロポニンI及び/又はTのレベルの上昇に関連する障害又は疾患の治療及び/又は予防のためのエラフィンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エラフィンは、エラスターゼ及び密接に関連するセリンプロテアーゼであるプロテイナーゼ3の可逆的な強力結合阻害剤として働くことが知られている、組換えヒトタンパク質である。
【０００３】
エラフィンは細胞外培地から、単球[Butlerら、2006]及び血管内皮細胞[Nickelら、2013]によって取り込むことができる。完全な引用を、背景技術の節の最後に示す。
【０００４】
エラフィンは、細胞内シグナル伝達事象を妨害することができる。単球細胞株U937において、エラフィンはユビキチン-プロテアソーム経路に影響を及ぼすことによって、20Sプロテアソームに関連するペプチダーゼ活性を阻害せずに、転写因子AP-1及びNF-κBのLPS誘導型活性化を阻害した。このことは、強力な炎症誘発性因子マクロファージケモカインMCP-1(マクロファージ走化性タンパク質-1、CCL2)の産生の阻害を導いた[Butlerら、2006]。
【０００５】
遺伝子導入によるエラフィンの過剰発現は、培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)における炎症性応答を抑制した。酸化型低密度リポタンパク質、LPS及びTNFαでのチャレンジに応答したHUVECによるIL-8の放出は、エラフィンの過剰発現によって減少した。さらに、マクロファージにおけるエラフィン過剰発現は、炎症誘発性サイトカインTNFαのLPS刺激放出を低減した。両細胞タイプにおいて、これらの効果は、IκBαの上方調節による炎症性転写因子NF-κBの活性化の減少と関連していた[Henriksenら、2004]。
【０００６】
エラフィンについて多くの科学研究がなされているにもかかわらず、一般に知られかつ確立された1つの作用は、エラスターゼ(並びに、炎症性応答の開始及び持続に同様の積極的役割を有するセリンプロテアーゼであるプロテイナーゼ3)への作用である。障害の治療又は予防において、特定のさらなる目的化合物へのエラフィンの効果について確認された兆候はない。特に、心臓及び/又は手術中（特に心臓の）に遭遇する障害又は疾患の治療に関して知られているエラフィンの唯一の効果は、エラスターゼがそのような障害又は疾患の原因物質であることが知られているというものである。実際に、このことは、心筋の疾患ばかりでなく、ヒト/動物の体におけるさらなる筋肉が関与する全ての障害についていえる。
【０００７】
さらに、トロポニン、特に心筋トロポニンI、又は心筋トロポニンT又は骨格筋トロポニンTの放出と、エラフィンとの間に既知の関係はない。
【０００８】
現在まで、エラフィンは、好中球由来のエラスターゼ及びプロテイナーゼ3への特異性が高く、強力かつ可逆的な阻害剤であることが特に知られてきた。その活性は、主に上皮組織に限定されることが示された。
【０００９】
その結果、エラフィンは、例えば、大量のエラスターゼの結果であることが示された炎症性疾患、例えばSIRS(全身性炎症応答症候群)又はMODS(多臓器不全症候群)の治療又は予防に適した薬剤として提案されてきた。
【００１０】
エラフィンレベルとトロポニンレベルの関連性についての報告はない。
【００１１】
心筋は、心臓のポンプ機能を担う何百万もの収縮性心筋細胞から構成される。
【００１２】
トロポニンは、3種の調節タンパク質(トロポニンC、トロポニンI、及びトロポニンT)の複合体であり、心筋(cardiac muscle)の筋肉収縮で不可欠である。トロポニンは、細胞内タンパク質複合体であり、通常は血清中に存在しない。
【００１３】
トロポニンIは、心筋細胞に特異的であり、さまざまな心臓障害の診断マーカー又は治療標的、特に、心筋梗塞又は心筋細胞死の特異性の高いマーカーとして有用である。
【００１４】
心筋細胞の損傷の際、収縮性機能の喪失とともに、トロポニンIが血液循環に放出される。
【００１５】
血液中の異常に高いトロポニンIレベルは、幅広い心臓疾患における心筋細胞の損傷を示す。これらは、不安定狭心症[Bonacaら、2013]、心筋梗塞[Mueller、2013]、心筋炎[Elammら、2012]、心臓移植の急性拒絶反応[Labarrereら、2000]、ステント移植から生じる心筋梗塞[Zimarinoら、2011]、並びに冠動脈バイパス移植などの外傷性外科手術[Moonら、2012]を含む。
【００１６】
基準集団の99パーセンタイルを示す診断カットオフを上回るトロポニンI血液レベルは、心筋梗塞を高度に示す[Thomasら、2013]。
【００１７】
心筋細胞損傷につながる病態生理学的過程は、冠状動脈炎及び/又は相伴う心臓炎症による不十分な血液供給で見られる。
【００１８】
主に血餅溶解による不十分な血流の回復を意図した薬物療法、ステント移植及び冠動脈バイパス手術は、不十分な血液供給の場合にさらなる心筋細胞損傷を防止する強力な治療であるが、心筋細胞損傷を促進する心臓炎症の結果は、なおも高い疾患負荷の源である。
【００１９】
白血球枯渇などの抗炎症性戦略を用いて心臓炎症を抑制する試みがなされた。これらは心筋損傷を低下させる納得のいく療法をもたらさなかった[Lobergら、2010]。
【００２０】
さらにトロポニンTも幅広く用いられ、心筋並びにさらなる筋肉の両方への損傷のマーカーとして認められている。
【００２１】
文献
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Bonaca MP, Ruff CT, Kosowsky J, Conrad MJ, Murphy SA, Sabatine MS, Jarolim P, Morrow DA. Evaluation of the diagnostic performance of current and next-generation assays for cardiac troponin I in the BWH-TIMI ED Chest Pain Study. Eur Heart J Acute Cardiovasc Care. (2013) 2(3):195-202
【非特許文献２】Butler MW, Robertson I, Greene CM, O'Neill SJ, Taggart CC, McElvaney NG. elafin prevents lipopolysaccharide-induced AP-1 and NF-kappaB activation via an effect on the ubiquitin-proteasome pathway. J Biol Chem. (2006) 281(46):34730-5
【非特許文献３】Doucet A, Bouchard D, Janelle MF, Bellemare A, Gagne S, Tremblay GM, Bourbonnais Y. Characterization of human pre-elafin mutants: full antipeptidase activity is essential to preserve lung tissue integrity in experimentalemphysema. Biochem J. (2007) 405(3):455-63
【非特許文献４】Elamm C, Fairweather D, Cooper LT. Pathogenesis and diagnosis of myocarditis.  Heart. (2012) 98(11):835-40
【非特許文献５】Henriksen PA, Hitt M, Xing Z, Wang J, Haslett C, Riemersma RA, Webb DJ, Kotelevtsev YV, Sallenave JM. Adenoviral gene delivery of elafin and secretory leukocyte protease inhibitor attenuates NF-kappa B-dependent inflammatory responses of human endothelial cells and macrophages to atherogenic stimuli. J. Immunol. (2004)172(7):4535-44
【非特許文献６】Labarrere CA, Nelson DR, Cox CJ, Pitts D, Kirlin P, Halbrook H. Cardiac-specific troponin I levels and risk of coronary artery disease and graft failure following heart transplantation. JAMA. (2000) 284(4):457-64
【非特許文献７】Loberg AG, Stallard J, Dunning J, Dark J. Can leucocyte depletion reduce reperfusion injury following cardiopulmonary bypass? Interact Cardiovasc Thorac Surg. (2011) 12(2):232-7
【非特許文献８】Moon MH, Song H, Wang YP, Jo KH, Kim CK, Cho KD. Changes of cardiac troponin I and operative mortality of coronary artery bypass. Asian Cardiovasc Thorac Ann. (2014) 22(1):40-5.
【非特許文献９】Mueller C. Use of high-sensitivity troponin for the diagnosis of acute myocardial infarction. Coron Artery Dis. (2013) 24(8):710-2
【非特許文献１０】Nickel NP, Wang L, Li GG, Spiekerkoetter E., Rabinovitch M. The elastase inhibitor elafin restores endothelial cell homeostasis In pulmonary arterial hypertension and attenuates vascular remodeling In the Sugen/hypoxia rat model. Am J Respir Crit Care Med (2013) 187:A1031
【非特許文献１１】Thomas S, Kavsak P,  Devereaux PJ.  Cardiac Troponin. Clinical Considerations for High-Sensitivity Assays. Clinical Laboratory News (2013) 39(4):8-10
【非特許文献１２】Vanek T, Jares M, Straka Z; MSM0021620817 Study Group. Aprotinin reduces troponin I levels in OPCABG. Ann Thorac Surg. (2006) 82(5):1950-1
【非特許文献１３】Zimarino M, Cicchitti V, Genovesi E, Rotondo D, De Caterina R. Isolated troponin increase after percutaneous coronary interventions: does it have prognostic relevance?  Atherosclerosis (2012) 221(2):297-302
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明はトロポニンI及び/又はTの増加に関連する疾患又は障害の治療及び/又は予防のためのエラフィンの使用に関する。このトロポニンI及び/又はTの上昇は、前記疾患又は障害におけるエラスターゼ活性のどんな増加又は減少とも関連しない。それにもかかわらず、一般に、エラフィンはエラスターゼの増加と関連する疾患に関連してのみ有用であると信じられていたが、エラフィンをこれらの疾患の治療に用いることができる、。好ましい実施形態では、本発明は、例えば心筋梗塞の結果生じ得る異常な血流、手術、筋肉損傷を伴う事故及び/又は炎症によって引き起こされる損傷から心筋又は他の筋肉を保護するためのエラフィンを用いた方法及び組成物に関する。
【００２４】
本発明者によって、エラフィン治療は筋細胞損傷を減じることが示された。この効果はエラスターゼ活性から独立であることがもされたので、このことは特に驚くべきである。エラフィンの作用は、エラスターゼ及びプロテイナーゼ3の阻害に基づいた、そのよく知られた抗炎症特性から独立していることを本発明者は示すことができたので、さらにいっそう驚くべきである。
【００２５】
本発明は、正常範囲の99%パーセンタイルを上回るトロポニンレベル(特に、トロポニンI又はT、特に好ましくはトロポニンI)の上昇と関連する疾患又は障害の治療及び/又は予防のためのエラフィンの使用にも関する。
【００２６】
トロポニンI又はTの上昇は、上記障害のいずれか1つを有する被験体におけるエラスターゼ活性の増加の出現とは独立して起きることが本発明者らによって示された。
【００２７】
本明細書に記載の、トロポニン、特に、心筋トロポニンIの上昇が高頻度で予後不良と関連することは注目に値する。このことは、例えば一次心筋梗塞の全てのタイプばかりでなく、例えば冠動脈内皮機能障害、冠動脈攣縮、冠動脈塞栓症、頻脈性/徐脈性不整脈、貧血、呼吸不全、低血圧及び高血圧などの、心筋の酸素供給及び/又は需要の間の不均衡と関連する全てのこれらの状態のような他の疾患の後に続発性状態として起きる続発性心筋梗塞においても見られる(例えばthe Third Universal Definition of Myocardial Infarction、Thygesenら、Eur. Heart J. 2012を参照されたい)。
【００２８】
冠動脈バイパス手術は、手術中の不十分な血液供給による心筋細胞損傷と、外科手術及び再かん流の結果の心筋炎症の影響とを兼ね備えるので、心筋細胞保護の原理を研究するために適したモデルである。
【００２９】
本発明者は、既によく知られた外科手術中のエラスターゼの放出は、酵素的に不活性なエラスターゼ-α-1-プロテイナーゼ阻害剤複合体の増加だけを引き起こし、血液循環中の遊離の酵素的に活性なエラスターゼの上昇は引き起こさないということを明らかにした。
【００３０】
すなわち、そのような状況では、エラフィンを治療及び/又は予防に用いることができなかったと考えられていた。
【００３１】
本発明者は、しかし非常に明瞭に、エラフィンは有益な効果を異なる経路で媒介することができ、したがって、血液循環中の活性エラスターゼの上昇に媒介されないすなわち依存しないそのような障害又は疾患の治療及び/又は予防に用いることもできると示すことに成功した。
【００３２】
エラスターゼ活性の決定は、当技術分野でよく知られている。Nakajimaは1979年にエラスターゼ活性アッセイに適した基質、すなわちMeO-Suc-Ala-ALa-Pro-Val-pNA(NA=p-ニトロアニリン)について記載した(J. Biol. Chem. 1979、254:4027〜4032)。この基質は、例えばウサギの血清エラスターゼ活性の決定に成功裏に用いられた(Yoshimura K、Nakagawa S、Koyama S、Kobayashi T、Homma T. Roles of neutrophil elastase and superoxide anion in leukotriene B4-induced lung injury in rabbit. J Appl Physiol (1985)、1994年1月、76(1):91〜6)。例えば1mMの基質を、1.0mlの最終体積に0.5M NaClを含有するpH8.0の0.1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン-HCl緩衝液中の0.1mlの試料と25℃でインキュベートすることで、エラスターゼによる基質の加水分解を、既知の分光光度法によって測定することができる。
【００３３】
37℃で24時間インキュベーション後、405nmの吸光度の増加が得られ、1ユニットのエラスターゼ活性を、24時間に1μmolのp-ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義することができる。例えば上記と同一方法を用いたNagamatsuらが示したように、エラスターゼ活性をヒト血清において決定することができる。
【００３４】
エラスターゼは、疾患、特に心臓疾患のマーカーとして、及びここでは特に心臓手術中又は手術後に生じるSIRS及びMODSのような障害のマーカーとして用いられており、したがってエラスターゼ活性を検出する方法及び結果を評価する方法は当業者によく知られている。
【００３５】
上記参考文献は、その内容全体、特に、エラスターゼ基質及び前記基質でエラスターゼ活性を決定するためのアッセイを記載する部分について、参考として本明細書に明確に組み込まれる。
【００３６】
本発明は付随の実施例及び図によってさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】エラスターゼ及びその生理的阻害剤であるα-1-プロテアーゼ阻害剤の血中複合体が約7倍増加することを示す図である。
【図２】冠動脈バイパス手術中及び手術後に、血清中で遊離の活性エラスターゼが上昇しなかったことを示す図である。
【図３】炎症誘発性サイトカインIL-6の手術後の上昇は、エラフィンを用いた治療の影響を受けなかったことを示す図である。
【図４】C反応性タンパク質の手術後の上昇は、エラフィンを用いた治療の影響を受けなかったことを示す図である。
【図５】プラセボに対してエラフィンで治療した患者の冠動脈バイパス手術の開始後の血漿トロポニンIの経時変化を示す図である(平均、SD)。
【図６】冠動脈バイパス手術後に、血清中の遊離の活性エラスターゼが血漿トロポニンIと相関しないことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、以下のように定義されることが好ましい。
1.トロポニンI及び/若しくはトロポニンIの放出につながる細胞損傷及び/若しくは細胞死、並びに/又は血漿トロポニンI及び/トロポニンTの上昇と関連する、障害又は疾患の予防及び/又は治療に使用するための、配列番号1の配列又はそのホモログ、断片、若しくは誘導体を含むポリペプチド。
2.トロポニンI及び/又はトロポニンTの上昇がエラスターゼ活性の増加と関連しない、項1に記載の使用のための配列番号1の配列又はそのホモログ若しくは誘導体若しくは断片を含むポリペプチド。
3.前記障害又は疾患がさらにセリンプロテアーゼであるプロテイナーゼ3の増加と関連しない、項1又は2に記載の使用のためのポリペプチド。
4.前記障害又は疾患が、筋肉損傷又は筋肉の細胞死を伴う障害又は疾患、すなわち
心臓疾患又は実質的な続発性心臓関与を伴う障害又は疾患:
安定型冠動脈疾患、
慢性心不全、
心房細動
心筋梗塞
心筋炎、
狭心症、
急性肺塞栓症、
肺動脈高血圧
冠動脈バイパス手術
心臓血管手術
腎不全
心臓移植患者の急性拒絶反応、
筋疾患:
皮膚筋炎、
多発性筋炎、
封入体筋炎、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、
横紋筋融解症、
手術又は事故後の筋肉損傷、
肺動脈高血圧
から選択される、項1から3のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
5.前記ホモログが配列番号1に示されたポリペプチドと比較して60%超、好ましくは70%超、80%超、90%超、95%超、さらにいっそう好ましくは98%超の配列相同性を有すると定義された、項1から4のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
6.前記誘導体が、配列番号1に示されたポリペプチド又はそれに由来するホモログ及び断片とは、グリコシル化、PEG化、ビオチン化、環化及び/又は酸化などのアミノ酸修飾によって異なる、項1から4のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
7.非経口的に、例えば静脈内、皮下、吸入により、筋肉内又は動脈内、好ましくは静脈内又は皮下に投与される、項1から6のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
8.予防的使用のためのものであり、移植片及び/又はステントに対するコーティングとして適用される、項1から7のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
9.手術前、手術中又は手術直後に投与される、項1から8のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【００３９】
本発明の1つの好ましい態様に従って、心筋細胞損傷を減少させる方法/使用が提供され、その方法はそれを必要とする被験体に治療有効量のエラフィン(例えば200mg)及び例えば薬学的に許容される担体を投与することを含む。
【００４０】
好ましい実施形態では、その方法は、トロポニンI又はトロポニンTレベルをエラフィンの投与前に決定する、及び/又はエラスターゼ活性をエラフィン投与前に決定する、さらなるステップを含む。
【００４１】
本ポリペプチド、そのホモログ、誘導体又は断片を、反復投与の必要なしに、手術前、手術中、手術後にボーラス投与で与えることができ、それでもなお記載された疾患の発生を防止する。本文脈の「ボーラス」投与は、上記の所望の効果を達成するために、1回又は2回のみ、好ましくは1回、実行される投与を意味するものとする。静脈内ボーラスに関して、投与は好ましくは約60分(点滴)以下、好ましくは30分以下の時間であるべきである。しかし、他の実施形態では、点滴を12時間まで又は24時間まで継続することができる。
【００４２】
具体的な実施形態では、安定型冠動脈疾患、慢性心不全、及び(慢性)肺動脈高血圧のように、上記の時間枠を超えてエラフィン治療を継続することが必要である可能性がある。実際の投与時間及び投薬計画は医師によって決定され、それは残る筋肉損傷並びに/又はトロポニンI及び/若しくはTレベルの上昇に依存する。
【００４３】
その事実から、本ポリペプチド、そのホモログ、誘導体又は断片は、エラスターゼ活性の増加と関連しない障害及び/又は疾患の予防及び/又は治療のための医薬組成物の調製に特に有用である。本発明は、さらなる実施形態では、創傷包帯の作製のための及び/又は臓器かん流培地への添加物としての上記化合物の使用を企図する。
【００４４】
好ましい実施形態では、上記のエラフィン化合物は静脈内に投与される。別の実施形態では、エラフィン化合物を皮下に投与することができる。
【００４５】
典型的なエラフィンの用量は、当業者によく知られており、医師が決定することができる。
【００４６】
さらに好ましい実施形態では、例えば手術前、手術中又は手術直後に、予防投与として投与を行うことができる。その場合、好ましい投与は手術前、さらにいっそう好ましいのはボーラスで(好ましくは1回又は2回、及びより好ましくは1回)静脈内又は皮下である。
【００４７】
手術「前」は本発明に従えば、手術開始前の10時間以内、好ましくは6時間、さらにいっそう好ましくは4時間、さらに好ましくは2時間、又は最も好ましくは1分から1時間以内、又は手術開始時に実行される投与を意味する。
【００４８】
本文脈において、手術「直後」は、トロポニンI及び/又はTの放出が観察できない時間までを意味する。このことは、手術終了後数週間まで、例えば4週まで、又は2週まで、又は1週までの時間とすることができ、手術後、好ましくは3日以内、より好ましくは2日以内、及びさらにいっそう好ましくは6時間以内である。
【００４９】
したがって、本発明は初めて、上述の疾患の発生を防止する又は重症度を軽減する可能性を提供する。特に、外科的介入後又は筋肉細胞の損傷を伴う事故後、好ましくはトロポニンI又はトロポニンT又はその両方の放出によって示される、及びさらにいっそう好ましくはエラスターゼ活性が観察できない又はエラスターゼ活性の増加が観察できない、筋肉損傷又は筋肉細胞死と関連する障害又は疾患を、エラフィンを用いて防止又は治療することができる。
【００５０】
上記の実施形態に従って、本エラフィン化合物を医療機器の作製のための有利な添加物として用いることができる。そのような医療機器の1つの例があるならば、臓器かん流培地であり、同様に前記エラフィン化合物を、創傷包帯の作製、臓器かん流培地への添加物の調製、医療用シーラントの作製、移植片又はステントのコーティングに適したコーティングの調製、及び移植片又はステントそれ自体のために用いることができる。
【００５１】
上述及び後述のとおり用いられる「エラフィン化合物」又は「エラフィン」は、互換性がであり、配列番号1の配列並びにそのホモログ、誘導体又は断片を含むポリペプチドを常に包含する。
【００５２】
「トロポニン」という記載は、明確に別な方法で名前を挙げない限り、本出願ではトロポニンT、トロポニンI、並びにその心筋又は骨格筋亜型を包含するものとする。
【００５３】
エラフィン化合物は、筋肉細胞からトロポニンI及び/又はトロポニンTの放出を阻害する機能性を含むことを、さらに特徴とする。このことは、以下に記載するように、患者のトロポニンレベルを試験することによって測定可能である。例えばトロポニンのレベルが、上昇する、又は99パーセンタイルを上回って若しくは0.04μg/mlを上回って上昇することが予測され、かつ予防的又は治療的にエラフィンが適用されない状況と比較して、少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%下がる場合には、トロポニン放出の阻害が推測される。もし筋肉が損傷した状態でトロポニンのレベルが99パーセンタイル以下又は0.04μg/ml以下に留まる場合は、トロポニン放出の阻害が例えば存在すると決定することもできる。
【００５４】
配列番号1は以下の配列である:Ala Gln Glu Pro Val Lys Gly Pro Val Ser Thr Lys Pro Gly Ser Cys Pro Ile Ile Leu Ile Arg Cys Ala Met Leu Asn Pro Pro Asn Arg Cys Leu Lys Asp Thr Asp Cys Pro Gly Ile Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser Cys Gly Met Ala Cys Phe Val Pro Gln
【００５５】
エラフィンは、炎症性皮膚疾患である乾癬の患者の皮膚から最初に単離された。それは57アミノ酸で、分子量が約6kDaの可溶性タンパク質である。エラフィンcDNAのクローニングで、エラフィンは、12.3kDaの前駆体(117残基)として合成され、N末端22残基のシグナル配列の切断によって細胞内でプロセシングされて、プロエラフィン(又はトラッピン-2、以下を参照)と呼ばれる9.9kDaのタンパク質が得られ、それが分泌されることが明らかになった[Molhuizen HO、Alkemade HA、Zeeuwen PL、de Jongh GJ、Wieringa B、Schalkwijk J (1993) SKALP/elafin: an elastase inhibitor from cultured human keratinocytes. Purification, cDNA sequence, and evidence for transglutaminase cross-linking. J Biol Chem. 268(16):12028〜32、Sallenave JM、Silva A (1993) Characterization and gene sequence of the precursor of elafin, an elastase-specific inhibitor in bronchial secretions. Am J Respir Cell Mol Biol. 8、439〜45、Schalkwijk J、Wiedow O、Hirose S (1999) The trappin gene family: proteins defined by an N-terminal transglutaminase substrate domain and a C-terminal four-disulphide core. Biochem J. 340、569〜77]。
【００５６】
現在までに、プロエラフィンの一次構造の分析で、2個の機能性ドメインの存在が明らかになった。N末端ドメイン(残基1〜60)は、トランスグルタミナーゼ基質に特徴的な配列-Gly-Gln-Asp-X-Val-Lys-(配列番号4)の4個の反復配列を含有する。トランスグルタミナーゼが媒介するイソペプチドタンパク質間架橋の形成で、グルタミン及びリシン残基は、それぞれアシルドナー及びアクセプターとしての機能を果たす[Molhuizen HO、Alkemade HA、Zeeuwen PL、de Jongh GJ、Wieringa B、Schalkwijk J (1993) SKALP/elafin: an elastase inhibitor from cultured human keratinocytes. Purification, cDNA sequence, and evidence for transglutaminase cross-linking. J Biol Chem. 268(16):12028〜32]。分子のこの部分は、しばしばセメントイン(cementoin)ドメインと呼ばれる。組織トランスグルタミナーゼは、このドメインを介して、角質層のさまざまな細胞外マトリックスタンパク質へプロエラフィンを架橋することができる。
【００５７】
C末端57残基からなる第2のドメインは、プロエラフィンのプロテアーゼ阻害機能を有し、当該分子の6kDa可溶型、すなわち、もともと乾癬皮膚から単離されたエラフィンと同一である。このドメインは、その配列、タンパク質折り畳み、及び4つの特徴的なジスルフィド架橋の配置の点で、乳清酸性タンパク質(WAPと略す)ファミリーのメンバーと類似性を示す[Tamechika I、Itakura M、Saruta Y、Furukawa M、Kato A、Tachibana S、Hirose S (1996) Accelerated evolution in inhibitor domains of porcine elafin family members. J Biol Chem. 271、7012〜8、Tsunemi M、Matsuura Y、Sakakibara S、Katsube Y (1996) Crystal structure of an elastase-specific inhibitor elafin complexed with porcine pancreatic elastase determined at 1.9Å resolution. Biochemistry 35、11570〜6]。トランスグルタミナーゼ基質とWAPドメインとの組合せは他のタンパク質で後に実証され、一般名「トラッピンファミリー」が作られた。このタンパク質ファミリーへの所属を明らかにするために、9.9kDaプロエラフィンは、トラッピン-2と命名された。細胞外マトリックスタンパク質へのプロエラフィンの共有結合は、エラスターゼ及びプロテイナーゼ-3を阻害する能力に対してほとんど効果がなく[Guyot N、Zani ML、Maurel MC、Dallet-Choisy S、Moreau T (2005) Elafin and its precursor trappin-2 still inhibit neutrophil serine proteinases when they are covalently bound to extracellular matrix proteins by tissue transglutaminase, Biochemistry 44、15610〜8]、グルタミン転移は、この活性型のプロテアーゼ阻害剤を固定化する手段であることを示唆する。
【００５８】
プロエラフィンからエラフィンが放出される機構は明白に解明されていない。タイプIIの肺細胞の細胞株によって培養中に産生されたプロエラフィンは、血清の存在下でのみエラフィンへプロセシングされ、それは、おそらくトランスグルタミナーゼによる固定化の前に、細胞外で切断が起きることを示す[Sallenave JM、Silva A (1993) Characterization and gene sequence of the precursor of elafin, an elastase-specific inhibitor in bronchial secretions. Am J Respir Cell Mol Biol. 8、439〜45]。このことと一致して、肥満細胞プロテアーゼであるトリプターゼは、可溶性プロエラフィンからエラフィンを選択的に放出することができた[Guyot N、Zani ML、Berger P、Dallet-Choisy S、Moreau T (2005) Proteolytic susceptibility of the serine protease inhibitor trappin-2 (pre-elafin): evidence for tryptase-mediated generation of elafin. Biol Chem. 386、391〜9]。しかし、トリプターゼは、フィブロネクチンへ架橋したプロエラフィンには不活性であった[Guyot N、Zani ML、Maurel MC、Dallet-Choisy S、Moreau T (2005). Elafin and its precursor trappin-2 still inhibit neutrophil serine proteinases when they are covalently bound to extracellular matrix proteins by tissue transglutaminase. Biochemistry 44、15610〜8]。それにもかかわらず乾癬の鱗屑の酸抽出物のみがエラフィンを生成しセメントインドメインを含まないという事実は、in vivoのエラフィンは、皮膚マトリックスタンパク質へ架橋したプロエラフィンから切断されるということを示唆する。さらに尿中のプロエラフィン分解産物の分析は、C末端配列の存在のみを明らかにし、これは再び架橋されたプロエラフィンのin vivoでのプロセシングによるエラフィンの放出を指し示した[Streit V、Wiedow O、Bartels J、Christophers E (1995) Antiprotease activity in urine of patients with inflammatory skin disorders. J Invest Dermatol. 105、562〜6]。固定化プロエラフィンからのエラフィン脱離を触媒する酵素は、まだ同定されないままである。
【００５９】
プロエラフィンの生合成は転写レベルで調節され、リンパ球性肺胞炎及び乾癬などの上皮炎症性疾患の存在に応答して非常に高められる。物理的な傷害、感染、刺激及び紫外線放射への曝露も皮膚におけるエラフィン発現を誘導する。その結果、サイトカインIL-1β及びTNFαなどの炎症誘発性刺激は、呼吸細胞及び角化細胞を含むさまざまな培養細胞においてプロエラフィン及びエラフィンの発現を誘導する。
【００６０】
エラフィンの構造、その調製方法、及びいくつかの障害を治療するためのその使用も、先行技術、特に、欧州特許第0402068号、米国特許第5,464,822号及び第6,245,739号並びに米国特許出願公開第2002/0187535号で取り組まれてきた。これらの参考文献も、配列番号1に図示されるヒトエラフィンの一次構造、及びその白血球エラスターゼ、特に、ヒト白血球エラスターゼ及びブタ膵臓エラスターゼを阻害する機能を開示する。さらに、エラフィンの調製方法もこれらの参考文献に記載される。誘導体の調製及びエラフィンの異型も欧州特許第0662516号及び米国特許第5,734,014号に記載される。全ての上記参考文献は、明確にその内容全体を参考として本明細書に組み込まれる。
【００６１】
エラフィンに関する多量の文献及びよく研究されたそのエラスターゼへの効果にもかかわらず、現在まで、本明細書で定義された障害及び疾患の治療のために有用で、かつ筋肉細胞損傷に直接関連し、エラスターゼ活性と独立しておりかつトロポニンI又はトロポニンTの放出と相関する、というさらなる活性をエラフィンが持つという証拠はない。
【００６２】
エラフィンを、ラットなどの動物に副作用なしで静脈内に投与することができることも既に示されている。
【００６３】
本発明は全体として、上記及び下記に定義されたように、エラフィンの使用がまだ企図されてこなかった病状の治療のための、配列番号1に図示された配列又は配列番号1に図示された配列のホモログ、誘導体、又は断片を含むポリペプチドの新規使用に関する。
【００６４】
特に、エラスターゼ活性又はエラスターゼ活性の増加が観察できないこれらの疾患及び/又は障害にエラフィンを用いることができる。特に、「エラスターゼ活性が観察できない」又は「エラスターゼ活性の増加が観察できない」とは、本出願の目的のため、「活性エラスターゼの増加と関連しない」又は「血液循環中の活性エラスターゼの上昇と関連しない」と同じであるものとし、上記のように、すなわちエラスターゼ活性の検出のためのよく知られたアッセイに基づいて、本出願に関連して定義されたものとする。患者の血清中のエラスターゼ活性は、好ましい実施形態では、当業者によく知られ、上記により詳細に記載されたように、発色基質MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNAの切断によって決定される。
【００６５】
冠動脈バイパス手術中、好中球の活性化が白血球エラスターゼの同時放出を伴って起こる。ヒト血清中の一定割合のエラスターゼは阻害されず、酵素的に活性のままである。
【００６６】
興味深いことに、以前の予想に反して、本発明者はエラスターゼ活性と関連しない多数の障害及び疾患があることを示すことができた。エラスターゼレベルそれ自体は、そのような状況(例えば、心臓手術後又は心筋梗塞)で上昇するかもしれないが、このエラスターゼが活性ではない症例がある。先行技術では、そのような症例は、そのエラスターゼ活性への効果が単に知られていたエラフィンでは間違いなく治療されることがなかった患者群を構成する。
【００６７】
心筋傷害は、血液循環へのトロポニンの放出につながる。このことは、例えば虚血性心疾患、及び安定型冠動脈疾患、慢性心不全、急性肺塞栓症、又は慢性肺動脈高血圧などの心筋傷害に付随して起こる他の疾患において起きる。トロポニンT放出は同様にこれらの疾患で見られるが、一般的に、すなわち体のさらなる部分で、筋肉細胞損傷のマーカーとしてとしての役割も果たす。
【００６８】
さらに、「障害又は疾患は、トロポニンI(又はT)放出(につながる細胞損傷)及び/又は血漿トロポニンI(又はT)の上昇と関連する又は相関する」という用語は、本出願に関して、正常範囲の99%パーセンタイルを超えて上昇したトロポニン(I又はT、好ましくはI、さらにいっそう好ましくは、心筋(c)トロポニンI及び/又は心筋(c)トロポニンT、心筋(cardiac muscle)への損傷を伴う全ての障害について)レベルを有する被験体/患者を含めるということを意味するものとする。このことは、「上昇したトロポニンレベル」のよく確立された定義であり、医学界全体で用いられる。例えば「心筋梗塞の第３の普遍的定義(Third Universal Definition of Myocardial Infarction)」というタイトルのThygesen K.ら、European Heart Journal (2012)、33、2551〜2567、又はThygesen K.ら、European Heart Journal (2012) 33、2252〜2257の「急性心臓ケアにおける高感度心臓トロポニンの使用方法(How to use high-sensitivity cardiac troponins in acute cardiac care)」を参照されたい。特にその表1は日常診断のために認可された心筋トロポニンアッセイに関する論文審査された分析的評価データを紹介及び概説し、両者はその内容全体が参照によって本明細書に含まれる。好ましい実施形態では、cトロポニンIは、トロポニンのためのAbbot Architectアッセイによって測定される。測定の単位はng/mlである。参照範囲は0.05μg/l未満である。このアッセイでは、正常な99パーセンタイルは、0.012から0.04μg/lの範囲であると報告された。0.04μg/lの99パーセンタイルカットオフが実証された。したがって、このアッセイで0.04μg/lを超える全てのトロポニンIの結果は、異常であると警告が与えられる。
【００６９】
したがって、最も好ましい実施形態では、認可されたトロポニン-Iアッセイ、例えばAbbottのArchitectIについてのSTATトロポニン-Iにおいて、0.04μg/mlを超えるcトロポニンIレベルと関連していれば、本発明に記載の疾患又は障害を、エラフィンで治療することができる。
【００７０】
本発明に関して治療された又は防止されるべき障害及び/又は疾患は、全て、上記に定義されたようにエラスターゼの増加と関連しないことを特徴とし、好ましくは、血漿中のトロポニンI(及び/又はT)の増加につながる細胞損傷とさらに関連する。
【００７１】
そのような疾患が包含するのは、
心臓疾患、又は続発性心臓関与を伴う疾患若しくは障害:
安定型冠動脈疾患、
慢性心不全、
心房細動
心筋梗塞
心筋炎
狭心症、
急性肺塞栓症、
肺動脈高血圧
冠動脈バイパス手術
心臓血管手術
腎不全
心臓移植患者の急性拒絶反応、
筋疾患:
皮膚筋炎、
多発性筋炎、
封入体筋炎、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、
横紋筋融解症、
腎不全、
手術又は事故後の筋肉損傷、
肺動脈高血圧である。
【００７２】
特に好ましい実施形態では、疾患は、
手術又は事故後の筋肉損傷、
冠動脈バイパス手術、
安定型冠動脈疾患、
慢性心不全、
心房細動
心筋梗塞、
心筋炎、
狭心症、
心臓血管手術、
心臓移植患者の急性拒絶反応、又は
肺動脈高血圧
からなる群から選択されるが、
それによって本リストは、例となるのみであり、網羅的であると解釈されないものとする。
【００７３】
これらの疾患の全ては、トロポニンI-及び/又はT-レベルの増加によって特徴付けられる。
【００７４】
上記障害又は疾患のいくつかは、本発明の日付以前に既にエラフィンで治療されたが、もし、エラスターゼ活性のレベルが増加しなければ、医師はそのような治療を考慮しなかったはずである。したがって、本発明は、今やエラフィンで治療できる全く新しい患者群を提示する。エラフィンのよく知られた以前の機能性に基づくと除外されることになったであろうこれらの患者をまさに標的にするので、本治療計画は、以前のエラフィンの治療計画に対して実際に完全に直観に反するものである。
【００７５】
本明細書で用いられる「ホモログ」という用語は、その一次構造のある一続きにわたって、配列番号1の配列とアミノ酸レベルでかなりの程度の相同性を共有するペプチド又はポリペプチドを指す。特に、「ホモログ」という用語は、1つ以上の単一アミノ酸の置換(又は欠失)によって配列番号1に示された配列とは異なる配列(又はそのような配列を含む)を有するポリペプチドに関する。一般に、ポリペプチドのトロポニン上昇に対する阻害活性が失われない限りは、配列番号1に示された配列の任意のアミノ酸を削除する又は他のアミノ酸に置換することができる。さらに1つ以上の追加のアミノ酸の挿入により配列番号1の配列とは異なるポリペプチドも含まれる。上記文脈における「1つ以上の」は、常に1〜50、好ましくは1〜20、さらにいっそう好ましくは1〜10、最も好ましくは1〜5を指す。
【００７６】
同一アミノ酸の量に基づいて、本発明に記載のホモログの配列相同性は、配列番号1に示されたポリペプチドと比較して、通常60%超、好ましくは70%超、80%超、90%超、95%超、さらにいっそう好ましくは98%超である。アミノ酸相同性の程度を、GCGプログラムパッケージなどの当技術分野で知られた、適したコンピュータプログラムを用いて評価してよい。本明細書全体にわたり、「同一性」と互換的に用いられる相同性の程度は、当業者によく知られたハイブリダイゼーション技術によって決定することもできる。同一性の上記パーセンテージは、したがって、好ましい実施形態では厳しいハイブリダイゼーション条件で決定される。配列解析ソフトウェア(例えば、PBIL(Pole Bioinformatique Lyonnais) http://npsa-pbil.ibcp.frのClustalW)を用いて同一性を測定してよい。
【００７７】
当技術分野で知られているように、多数の異なるプログラムを用いて、核酸又はアミノ酸配列が、既知の配列に対して同一性又は類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性又は類似性を、当技術分野で既知の標準技術を用いて決定してよく、そのような技術としては、以下に限定されないが、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2、482 (1981)の局所的配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch、J. Mol., Biol. 48、443 (1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85、2444 (1988)の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューター実装(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics computer Group、575 Science Drive、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)、Devereuxら、Nucl. Acid Res. 12、387〜395 (1984)に記載されたBestFit配列プログラムが挙げられ、好ましくは初期設定を用いるか、又は検査によって行う。
【００７８】
本発明も、対応するポリヌクレオチドから、適した宿主で組換え技術によって発現された、本発明のポリペプチドを提供する。本発明は特に、ストリンジェントな条件下で、対応するポリヌクレオチドとハイブリダイズするそのようなポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いられるように、「ストリンジェントな条件」という用語は、少なくとも約60%、好ましくは70%超、80%超、90%超、95%超、さらにいっそう好ましくは98%超の同一性がある場合に、ポリヌクレオチド配列と配列番号1のポリヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。
【００７９】
適切にストリンジェントな条件は、例えばプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション溶液中の塩又はホルムアミドの濃度、又はハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、当技術分野でよく知られている。特に、ストリンジェンシーは、塩濃度を下げることによって、ホルムアミド濃度を上げることによって、及び/又はハイブリダイゼーション温度を上げることによって高めることができる。
【００８０】
例えば、ストリンジェンシーの高い条件下でのハイブリダイゼーションは、約50%ホルムアミド中、約37℃〜42℃を用いてもよく、一方ストリンジェンシーを下げた条件下でのハイブリダイゼーションならば、約35%〜25%ホルムアミド中、約30℃〜35℃を用いてもよい。ストリンジェンシーの高い条件下でのハイブリダイゼーションの1つの特定の条件セットは、42℃、50%ホルムアミド中、5×SSPE、0.3%SDS、及び200pg/mlせん断及び変性したサケ精子DNAを用いる。ストリンジェンシーを下げたハイブリダイゼーションでは、35%ホルムアミド中、35℃に下げた温度で、上記と類似の条件を用いてよい。ストリンジェンシーの個別のレベルに対応する温度範囲は、目的の核酸のプリン対ピリミジン比を計算し、それに応じて温度を調整することによってさらに狭めることができる。上記範囲及び条件の変形は、当技術分野でよく知られている。
【００８１】
したがって、アミノ酸配列の一部が配列番号1のポリペプチドとかなりの相同性を共有する限りでは、ホモログという用語も、配列番号1の配列より長く、したがってより多いアミノ酸を含むポリペプチドを含む。本発明に従って用いることができる配列番号1に示された配列を含むポリペプチドは、例えば、配列番号2に示されたプレプロエラフィンである(Met Arg Ala Ser Ser Phe Leu Ile Val Val Val Phe Leu Ile Ala Gly Thr Leu Val Leu Glu Ala Ala Val Thr Gly Val Pro Val Lys Gly Gln Asp Thr Val Lys Gly Arg Val Pro Phe Asn Gly Gln Asp Pro Val Lys Gly Gln Val Ser Val Lys Gly Gln Asp Lys Val Lys Ala Gln Glu Pro Val Lys Gly Pro Val Ser Thr Lys Pro Gly Ser Cys Pro Ile Ile Leu Ile Arg Cys Ala Met Leu Asn Pro Pro Asn Arg Cys Leu Lys Asp Thr Asp Cys Pro Gly Ile Lys Lys Cys Cys Glu Gly Ser Cys Gly Met Ala Cys Phe Val Pro Gln(Moihuizen, H.O.ら、J. Biol. Chem. 268 (16)、12028〜12032 (1993))。その配列から明らかなように、プレプロエラフィンはN末端に追加のN末端伸長を含み、翻訳後に切断されて成熟型をもたらす。プレプロエラフィン(117アミノ酸)はまず、プロエラフィン(95アミノ酸)及びN末端シグナルペプチド(22アミノ酸)に切断される。角化細胞の末端分化の際(角質層の形成)、プロエラフィンは、表皮トランスグルタミナーゼによって角化膜タンパク質と架橋されるようになる。成熟エラフィンは、いまだ不明な機構によって、明らかに、これらの角化膜タンパク質から放出され、ヒト皮膚の角質層から、特に乾癬を患う患者の鱗屑から抽出することができる。
【００８２】
本発明によれば、「断片」という用語は、トロポニンの上昇の阻害についての所望の酵素活性を有する、配列番号1のポリペプチドの生物学的に活性な任意の部分を指す。エラフィンの断片は、N末端及び/又はC末端での1つ以上のアミノ酸の欠失により、配列番号1のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなる可能性がある。例えば、本発明に記載の断片は、ポリペプチドのN末端で、アミノ酸残基(複数可)1、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜10又は1〜20個が欠けていてもよい。同様に、C末端で対応する残基が欠けていてもよい。また、エラフィン断片は、エラフィンのN末端からなる可能性がある。
【００８３】
さらに断片は、N末端及びC末端の両方で、アミノ酸残基を欠くことによって、配列番号1のアミノ酸配列とは異なってもよい。例えば断片は、配列番号1に示されたポリペプチドのアミノ酸6〜30からなってもよい。さらに、配列番号1に示されたポリペプチドの断片のホモログの使用が、本発明に含まれる。
【００８４】
「誘導体」という用語は、配列番号1に示されたポリペプチド又はそれに由来するホモログ及び断片とは、グリコシル化、PEG化、ビオチン化、環化及び/又は酸化などのよく知られたアミノ酸修飾によって異なるペプチド又はポリペプチドを指す。
【００８５】
配列番号1のポリペプチドと比較した本発明の上記断片、ホモログ及び誘導体の全ては、上記に定義されたように、トロポニンの放出を阻害する機能を有することが好ましい。
【００８６】
本発明のポリペプチドは、先行技術(例えば、欧州特許第0402068号を参照されたい)に記載されたように得ることができ、又はSallenave, J.M.及びSilva, A(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 8 (4)、439〜445 (1993))によって記載されたようにコード配列の組換え発現によって調製することができる。またコード配列が配列番号3(aggccaagct ggactgcata aagattggta tggccttagc tcttagccaa acaccttcct  gacaccatga gggccagcag cttcttgatc gtggtggtgt tcctcatcgc tgggacgctg  gttctagagg cagctgtcac gggagttcct gttaaaggtc aagacactgt caaaggccgt  gttccattca atggacaaga tcccgttaaa ggacaagttt cagttaaagg tcaagataaa gtcaaagcgc aagagccagt caaaggtcca gtctccacta agcctggctc ctgccccatt atcttgatcc ggtgcgccat gttgaatccc cctaaccgct gcttgaaaga tactgactgc  ccaggaatca agaagtgctg tgaaggctct tgcgggatgg cctgtttcgt tccccagtga  gagggagccg gtccttgctg cacctgtgcc gtccccagag ctacaggccc catctggtcc taagtccctg ctgcccttcc ccttcccaca ctgtccattc ttcctcccat tcaggatgcc  cacggctgga gctgcctctc tcatccactt tccaataaag agttccttct gctccaaaaa  aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa)に提供される。
【００８７】
本明細書で定義されたポリペプチド、ホモログ、誘導体及び断片は、既知かつ適した方法で得られた又は精製され、例えば薬学的に許容される希釈剤又は担体との混合により、医薬組成物へ製剤化して用いてよい。投与は、当技術分野で既知のさまざまな経路を経由してよい。特に、投与は、非経口的に、例えば鼻腔内に、静脈内に、直腸内に、肺に、及び筋肉内又は皮下注射によるなどの注射によってもたらされてよい。医薬組成物は、用いられる投与の様式に従って製剤化される。例えば、組成物が経口経路又は例えば鼻腔内を介した吸入によって投与される場合、組成物を粉末エアロゾルとして製剤化してよく、組成物が注射を通じて投与される場合、組成物を滅菌溶液又は懸濁液として製剤化してよい。
【００８８】
緩衝液及び界面活性剤などの水性溶液及び添加物を含む、適した希釈剤を添加してよい。本発明の医薬組成物はまた制御放出製剤を含む。例えば、ポリマーマトリックスの分解が進行するにつれてポリペプチドが放出されるように、本発明のポリペプチドを生分解性ポリマーに封入してよく、又はそのようなポリマーのマトリックス中に分散させてもよい。
【００８９】
持続放出製剤での使用に適した生分解性ポリマーは、水性の生理学的環境に置かれた場合、加水分解によって徐々に分解されるようになるポリエステルを含む。ポリペプチドの延長放出を提供する特定の医薬組成物は、欧州特許第0058481号に記載される。本組成物では、ポリラクチドが用いられ、水性の生理学的タイプの環境に置かれた場合、ポリペプチドは、基本的にポリペプチドの全てが放出されるまで、連続的に組成物から放出される。したがってそのようなポリマーは、非常に局所的な標的領域での利点を提供し、したがって用量及び潜在的副作用を最小限にする。このことは特に、筋肉の傷害後、損傷細胞の領域にエラフィンを連続的に投与することが可能であるので望ましい。このことは、例えば、細胞損傷の一定のリスクを常に伴う外科手術で挿入されてきたステントに当てはまる。エラフィンでステントをコーティングすることで、エラフィンの連続放出が可能になり、細胞損傷に関連する障害を、適したやり方で治療することを確実にすることができる。当然ながら、同じことは、筋肉損傷を治療する場合に用いられる全てのさらなるデバイス、例えば天然若しくは合成の血管移植片、天然若しくは合成の心臓弁、透析用留置カテーテル、歯科及び整形外科用移植片、人工関節、骨接合術用材料、心臓ペースメーカーのプローブ、フィブリンシーラント若しくは骨セメントのような医療用シーラント、又は長期かん流その他若しくは外用創傷包帯についても当てはまる。
【００９０】
本出願において、「エラフィン」についての言及は、上記のように常に「ホモログ、誘導体及び断片」を包含するものとする。
【００９１】
エラフィンを、全身に、又はそれを組み込んだ微小球を用いて、例えば医療デバイス中、例えばステント若しくは移植片中に、又はコーティングされ、又は創傷包帯の一部として投与してよく、それはエラフィンを制御された方式で放出する。エラフィンを制御された方式で放出するエラフィン含有ポリマーの形で、エラフィンを用いることもできる。エチレンオキシド滅菌へのエラフィンの高い安定性は、この文脈で、特にそれが徐放薬として、又は医療デバイスコーティング中の成分として活性のままである場合は、その治療適用のさらに重要な側面である。エラフィンの生物学的適合性は証明されている。
【実施例】
【００９２】
術後炎症の抑制の欠如にもかかわらず、エラフィンは、冠動脈バイパス移植術と関連する心臓血管の損傷に対して顕著な影響を有していた。心臓血管損傷を心筋細胞からのトロポニンI放出によって評価した。トロポニンIの血漿レベル、心筋細胞収縮の調節タンパク質は、心筋損傷の特異的なマーカーである。手術開始時にエラフィンで治療した患者は、手術開始後6時間でトロポニンI放出の有意な減少、及び48時間にわたって20〜40%のトロポニンI放出の全体的な減少(曲線下面積)を示した。
【００９３】
[実施例1]
オンポンプ冠動脈バイパス移植術を受ける43人の患者は、静脈内注入による250mLの生理食塩水からなるプラセボ治療を受け、その治療は最初の皮膚切開時に開始され、心肺バイパス法が開始される少なくとも20分前に完了した。
【００９４】
手術開始前(0時間)及び手術開始の6時間後にこれらの患者から採血した。免疫反応性エラスターゼの血漿レベルを、製造業者の取扱説明書に従って、ヒトエラスターゼELISAキット(Hycult、Uden、Netherlands)を用いて定量した。ヒト好中球エラスターゼELISAは、0.4ng/mlというより低い検出レベルでの血漿中の遊離及び結合の天然ヒト好中球エラスターゼの定量的測定のために開発された。
【００９５】
ヒト好中球エラスターゼELISAは、サンドイッチ原理に基づいた固相酵素結合免疫吸着アッセイである。試料及び標準品は、固相結合の特異的抗体によって捕捉された。捕捉されたヒト好中球エラスターゼは、ビオチン化トレーサー抗体、ビオチン化トレーサー抗体に結合するストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲート、及びテトラメチルベンジジンを用いたペルオキシダーゼ触媒反応によって検出された。シュウ酸の添加によって、酵素反応を停止した。450nmの吸光度を、分光光度計で測定した。ヒト好中球エラスターゼ標準品の対応する濃度に対して吸光度をプロットすることによって、標準曲線を得た。試料のヒト好中球エラスターゼ濃度は、標準品と並行して試験し、標準曲線から決定した。
【００９６】
結果は、遊離かつα-1-プロテアーゼ阻害剤結合性の不活性エラスターゼを示す免疫反応性ヒト好中球エラスターゼが、術前レベルと比較して顕著に増加した(約7倍)ことを実証する。(図1)
【００９７】
[実施例2]
オンポンプ冠動脈バイパス移植術を受ける43人の患者(実施例1と同一)は、静脈内注入による250mLの生理食塩水からなるプラセボ治療を受け、その治療は最初の皮膚切開時に開始され、心肺バイパス法が開始される少なくとも20分前に完了した。手術開始前(0時間)及び手術開始の6時間後にこれらの患者から採血した。試料から血清を調製し、Nakajima、1979（上記を参照）によって記載された方法に基づいて、発色基質MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNAを切断することによって、血清エラスターゼ活性を決定した。
【００９８】
ヒトエラスターゼは、合成基質MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNAを加水分解し、黄色色素のp-ニトロアニリンを放出する。p-ニトロアニリン放出の程度を分光光度法で定量し、ヒト好中球エラスターゼの酵素活性を決定するために用いた。好中球エラスターゼ活性単位は、37℃で24時間反応後のデルタOD 405nmで表す。
【００９９】
結果は、酵素的に活性な好中球エラスターゼの血清レベルが手術中に増加しないことを実証する(図2)。免疫反応性好中球エラスターゼが増加する(実施例1)という知見により、放出された好中球エラスターゼは酵素的に不活性であり、α1-プロテイナーゼ阻害剤に完全に結合し得ると結論づけられる。
【０１００】
[実施例3]
オンポンプ冠動脈バイパス移植術を受ける44人の患者は、静脈内注入により250mLの生理食塩水中、200mg用量のエラフィンを投与され、その投与は最初の皮膚切開時に開始され、心肺バイパス法が開始される少なくとも20分前に完了した。同一外科手術を受ける第2群の42人の患者は、代わりに点滴で250ml生理食塩水(プラセボ)を投与された。
【０１０１】
患者から採血し、血液試料から血清を調製した。インターロイキン6の血清レベルを、製造業者の取扱説明書に従って、Human Interleukin 6 Immunoassay (R&D Systems Europe、Abingdon、UK)を用いて決定した。本アッセイは、定量的サンドイッチ酵素イムノアッセイ技術を用いる。IL-6に特異的なモノクローナル抗体が、マイクロプレートにプレコートされている。インターロイキン6標準品及び試料をウエルにピペットで入れ、存在するIL-6を固定化抗体に結合した。全ての非結合物質を洗い流した後、IL-6に特異的な酵素結合ポリクローナル抗体をウエルに添加した。全ての非結合の抗体-酵素試薬を除去するための洗浄に続いて、基質溶液をウエルに添加した。インキュベーション時間の後、増幅溶液をウエルに添加すると、最初の段階で結合したIL-6の量に比例して発色した。発色を停止し、色強度を測定する。
【０１０２】
結果は、プラセボ治療と比較して、エラフィン点滴がIL-6の血清レベルに影響を及ぼさないことを実証する(図3)。このことは、エラフィン点滴が全身炎症の本マーカーに影響を及ぼさないことを示す。
【０１０３】
[実施例4]
オンポンプ冠動脈バイパス移植術を受ける44人の患者は、静脈内注入により250mLの生理食塩水中、200mg用量のエラフィンを投与され、その投与は最初の皮膚切開時に開始され、心肺バイパス法が開始される少なくとも20分前に完了した。同一外科手術を受ける第2群の42人の患者は、代わりに点滴で250ml生理食塩水(プラセボ)を投与された。
【０１０４】
患者から採血し、血液試料から血清を調製した。6時間の時点で、炎症性マーカーC反応性タンパク質(CRP)の血清レベルを測定した(図4)。結果は、プラセボ治療と比較して、エラフィン点滴がCRPの血清レベルに影響を及ぼさないことを実証する。このことは、エラフィン点滴が全身炎症の本マーカーに影響を及ぼさないことを示す。
【０１０５】
その結果、エラスターゼ阻害剤エラフィンを用いた患者の周術期治療は、プラセボ対照と比較して、エラスターゼ-媒介術後炎症に影響を及ぼさなかった。炎症誘発性サイトカインIL-6(図3)やC反応性タンパク質(図4)の手術後の上昇はいずれも、エラフィンを用いた治療によって影響を受けなかった。
【０１０６】
術後炎症の抑制の欠如にもかかわらず、エラフィンは、冠動脈バイパス移植術と関連する心臓血管の損傷に対する顕著な影響を有していた。(以下の実施例5を参照されたい)。
【０１０７】
[実施例5]
ランダム化二重盲検臨床試験で、冠動脈バイパス移植術を受ける患者を、250mLの生理食塩水中に200mg用量のエラフィンの静脈内注入(エラフィン群、n=44)、又は250mLの生理食塩水(プラセボ群、n=42)で治療した。静脈内注入は最初の皮膚切開時に開始され、心肺バイパス法が開始される少なくとも20分前に完了した。
【０１０８】
血液試料を、ベースライン(0時間、皮膚切開時)及び手術の2、6、24及び48時間後に採取した。血漿cトロポニンI濃度を、Abbott Architect高感度アッセイ(Abbott Laboratories、ILL)を用い、製造業者の取扱説明書に従って定量した。本アッセイは、0.032ng/mLの10%変動係数及び0.012ng/mLの99パーセンタイル(男性及び女性)で0.01ng/mL以下の感度を有する。cトロポニンIは、心筋細胞収縮の調節タンパク質であり、その血漿中での存在は、心筋細胞傷害の特異的な兆候である。
【０１０９】
手術開始時にエラフィンで治療した患者は、手術開始後6時間でcトロポニンI放出の顕著な減少、及び48時間にわたってトロポニンI放出の全体的な減少(曲線下面積)を示した(図5)。このことは、エラフィンが心筋細胞傷害を減じることを明らかに示す。
【０１１０】
[実施例6]
オンポンプ冠動脈バイパス移植術を受け、250mLの生理食塩水からなるプラセボ治療を受けた42人の患者(実施例2より)において、患者血清中のエラスターゼ活性を発色基質MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNAの切断により決定し(実施例2に示すように)、血漿cトロポニンIレベルを決定した(実施例5に示すように)。
【０１１１】
結果は、酵素的に活性なエラスターゼの血清レベルが、cトロポニンIと相関しない(ピアソンr相関係数=0.02)ことを実証し、このことは、トロポニンIの放出につながる心筋損傷が、エラスターゼ活性と独立していることを示す(図6)。このことは、心筋細胞傷害につながる機構が、血清エラスターゼ活性と独立したものであることを明らかに示す。
【０１１２】
結論
総合すると、上記結果は、冠動脈バイパス移植がエラスターゼレベルの上昇につながる一方で、基本的に全ての放出された酵素はα-1-プロテアーゼ阻害剤によって捕捉され(図1)、結果として血中エラスターゼ活性が増加せず(図2)、IL-6(図3)及びCRP(図4)などの炎症のマーカーに影響を及ぼさないことを示す。血中エラスターゼ活性は、トロポニンI放出と相関しなかった。心筋傷害は、部分的にエラスターゼ活性の増加によって引き起こされる、炎症の結果であることが予測される。観察された心筋傷害の予防は、トロポニンI放出によって評価されるように、よく知られたエラフィンのエラスターゼ阻害機能とは明らかに独立している。
【０１１３】
そこで、心臓血管損傷を心筋細胞からのトロポニンI放出によって評価した。心筋細胞収縮の調節タンパク質であるトロポニンIの血漿レベルは、心筋損傷の特異的なマーカーである。手術開始時にエラフィンで治療した患者は、手術開始後6時間でトロポニンI放出の顕著な減少、及び48時間にわたって20〜40%のトロポニンI放出の全体的な減少(曲線下面積)を示した。
【０１１４】
したがって、エラフィン治療は心筋細胞損傷を減じる。その機構は、エラスターゼ及びプロテイナーゼ3の阻害に基づいた、そのよく知られた抗炎症特性とは独立している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年12月23日(2015.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロポニンI及び/若しくはトロポニンTの放出につながる細胞損傷及び/若しくは細胞死、並びに/又は血漿トロポニンI及び/トロポニンTの上昇と関連する、障害又は疾患の予防及び/又は治療に使用するための、配列番号1の配列又はそのホモログ、断片、若しくは誘導体を含むポリペプチドであって、前記誘導体が、グリコシル化、PEG化、ビオチン化、環化及び/又は酸化された配列番号1のポリペプチドであり、「トロポニンI(又はT)放出につながる細胞損傷及び/若しくは血漿トロポニンI(又はT)の上昇と関連する」という用語は、正常範囲の99%パーセンタイルを超えるレベルの心筋への損傷を伴う全ての障害について上昇したトロポニン(I又はT)を有する患者を含むように定義される、ポリペプチド。
【請求項２】
トロポニンI及び/又はトロポニンTの上昇がエラスターゼ活性の増加と関連しない、項1に記載の使用のための配列番号1の配列又はそのホモログ若しくは誘導体若しくは断片を含むポリペプチド。
【請求項３】
前記障害又は疾患がさらにセリンプロテアーゼであるプロテイナーゼ3の増加と関連しない、請求項1又は2に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項４】
前記障害又は疾患が、筋肉損傷又は筋肉の細胞死を伴う障害又は疾患、すなわち
(続発性)心臓疾患又は障害:
安定型冠動脈疾患、
慢性心不全、
心房細動、
心筋梗塞、
心筋炎、
狭心症、
急性肺塞栓症、
肺動脈高血圧、
冠動脈バイパス手術、
心臓血管手術、
腎不全、
心臓移植患者の急性拒絶反応、
筋疾患:
皮膚筋炎、
多発性筋炎、
封入体筋炎、
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、
横紋筋融解症
手術又は事故後の筋肉損傷、
肺動脈高血圧
から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項５】
前記ホモログが配列番号1に示されたポリペプチドと比較して60%超、好ましくは70%超、80%超、90%超、95%超、さらにいっそう好ましくは98%超の配列相同性を有すると定義される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項６】
非経口的に、例えば静脈内、皮下、吸入により、筋肉内又は動脈内、好ましくは静脈内又は皮下に投与される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項７】
予防的使用のためのものであり、移植片及び/又はステントに対するコーティングとして適用される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【請求項８】
手術前、手術中又は手術直後に投与される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
【国際調査報告】
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