(57)【要約】本出願は、前駆細胞およびそれらの調製方法を提供する。本調製方法は、子宮由来の子宮筋を含有する組織サンプルを取得すること、前記組織サンプルをコラゲナーゼで処理すること、および前記処理済みの組織サンプルを培養して前駆細胞を取得することを含み、前記前駆細胞は多能性かつ免疫調節性であること特徴とする。本出願はまた、変性疾患、虚血性疾患または異常な免疫応答により引き起こされる疾患を治療するための方法であって、前記疾患を被っている患者に前記前駆細胞を投与することを含む方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮由来の子宮筋を含有する組織サンプルを取得すること、
前記組織サンプルを酵素で処理して線維組織を除去すること、および、
前記処理済みの組織サンプルを培養して前駆細胞を取得すること、を含み、
前記前駆細胞は多能性かつ免疫調節剤性であり、かつ、細胞表面マーカーＣＤ３４陰性発現を示すことを特徴とする、
前駆細胞の調製方法。
【請求項２】
前記子宮は子宮摘出術からのものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織サンプルは生検サンプルまたは剥離サンプルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織サンプルをコラゲナーゼで処理する前に前記組織サンプル由来の子宮内膜および漿膜を除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素はコラゲナーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記処理済みの組織サンプルは血清添加培地で培養されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記前駆細胞は細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、またはそれらの任意の組合せの陽性発現を示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記前駆細胞は細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＳｉｄｅＰｏｐまたはそれらの任意の組合せの陰性発現を示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の陽性発現、ならびに細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲおよびＳｉｄｅＰｏｐの陰性発現を示すことを特徴とする、請求項１に従って調製された、
前駆細胞。
【請求項１０】
骨形成、脂肪生成、軟骨形成、および神経新生能があることを特徴とする、請求項９に記載の前駆細胞。
【請求項１１】
ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔリンパ球に対して抑制効果を有することを特徴とする、請求項９に記載の前駆細胞。
【請求項１２】
変性疾患、虚血性疾患または異常な免疫応答により引き起こされる疾患を治療するための方法であって、
前記疾患を被っている患者に請求項１に従って調製された前駆細胞を投与することを含む、
方法。
【請求項１３】
前記変性疾患はパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、大脳萎縮症、小脳萎縮症、統合失調症および認知症を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記虚血性疾患は脳卒中、脳溢血、脳出血、脳梗塞、頭部外傷、血管性認知症および心筋梗塞を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記異常な免疫応答により引き起こされる疾患は自己免疫疾患または臓器移植の移植片拒絶を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記自己免疫疾患は全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、１型真性糖尿病、小児脂肪便症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、および特発性血小板減少性紫斑病を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記前駆細胞はＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の陽性発現、ならびにＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲおよびＳｉｄｅＰｏｐの陰性発現を示すことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／０５２，０８８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、多能性前駆細胞、子宮体から前駆細胞を調製するための方法、および前記前駆細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
前駆細胞療法は、パーキンソン病などの変性疾患ならびに脳卒中および心筋梗塞などの虚血性疾患（全ての疾患実体が加齢集団と高い相関がある）を治癒させる最良の解決策である可能性がある。
ヒト前駆細胞（幹細胞としても知られる）の現在の供給源には、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）などの多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＰＳＣ）、ならびに骨髄間葉幹細胞（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＢＭＭＳＣ）および神経幹細胞などの成体幹細胞（ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＡＳＣ）が含まれる。しかしながら、各供給源に臨床使用に関する欠点がないかわけではなく、ＰＳＣには倫理的問題および腫瘍形成の問題があり（非特許文献１、非特許文献２）、一方、ＡＳＣは取得に侵襲的処置（細胞数および幹細胞機能は年齢とともに低下する）（非特許文献３）およびｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大培養（非特許文献４）を必要とする極めて希少な細胞である。
【０００４】
子宮は女性の生殖管内の器官であり、その機能は満期までヒト胎児を保持して栄養を与えることである。妊娠の生理的要求に合わせて著しく成長できるように、子宮体は主として平滑筋細胞、すなわち、子宮筋からなり、活発な血管形成が見られる。子宮の除去、または子宮摘出術は非妊娠女性で最もよく行われる外科術であり、米国では６０歳を過ぎた女性の３人に１人が子宮摘出術を受けている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。
【０００５】
Ｏｎｏらは、「子宮筋層サイドポピュレーション幹細胞（ｍｙｏｍｅｔｒｉａｌ  ｓｉｄｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）（ｍｙｏＳＰｓ）」と呼ばれる細胞がヒト子宮から単離可能であることを報告している（非特許文献８）。子宮筋層組織は、最小限の酵素（０．０２％）を添加した培地で４〜１６時間インキュベートし、続いて濾過（２回）および勾配選択（フィコールパーク）を行い、その後、さらにトリプシン処理を行わなければならない。ｍｙｏＳＰはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素排除能を特徴とし、これはフローサイトメトリー分析で「サイドポピュレーション」として現れ、また、ＣＤ３１（＋）、ＣＤ３４（＋）、およびＣＤ４４（−）も示す。しかしながら、ｍｙｏＳＰは、軟骨形成細胞には分化できず、神経細胞に分化するという報告もない。
【０００６】
Ｇａｌｖｅｚら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ２００９の特許文献１および特許文献２は、子宮筋層由来の間葉幹細胞およびその単離方法を開示している。単離された細胞は「成体子宮筋層前駆体（ａｄｕｌｔ  ｍｙｏｍｅｔｒｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）（ＡＭＰ）」と呼ばれ、子宮筋層組織から単離されたものである。子宮筋層組織は無血清培地中でインキュベートされ、小血管を有する断片だけがさらなる培養のために選択された。従って、この方法は内皮様細胞を選択するためのものであり、これらの単離されたＡＭＰのＣＤ３１（＋）パーセンテージが高い（マウスＡＭＰでは＞９９．７％、ヒトＡＭＰでは＞９０％）ことを示す結果も相応に解釈できる。
ＡＭＰの細胞表面マーカープロフィールは、ＣＤ７３（−）、ＣＤ３１（＋）およびＨＬＡ−ＤＲ（＋）である。マウスＡＭＰの分化能だけが開示されており、マウスＡＭＰは骨形成、脂肪生成および神経新生を有するが、軟骨形成は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０５７９６５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１１／０４２５４７Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｊ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｓ．Ｓ．，Ｗａｋｎｉｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ，Ｊ．Ｊ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｖ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｍ．（１９９８）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１１４５−１１４７
【非特許文献２】Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００９）．Ａ  ｆｒｅｓｈ  ｌｏｏｋ  ａｔ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １３７，１３−１７
【非特許文献３】Ｒａｏ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｍａｔｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．（２００１）．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ  １２２，７１３−７３４
【非特許文献４】Ｈｏ，Ｐ．Ｊ．，Ｙｅｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｔａｎｇ，Ｂ．Ｃ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．（２０１３）．Ｈ２Ｏ２  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｅｃｌｉｎｅ，ｉｎ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  １８，１８９５−１９０５）（「Ｈｏら」）
【非特許文献５】Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｗｏｒｄ，Ａ．（２００２）．Ｈｙｓｔｅｒｅｃｔｏｍｙ−−ｓｔｉｌｌ  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４７，１３６０−１３６２
【非特許文献６】Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｉｆｆ，Ｉ．（１９９３）．Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈｙｓｔｅｒｅｃｔｏｍｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２８，８５６−８６０
【非特許文献７】Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  Ａｓｋｅｄ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ：Ｈｙｓｔｅｒｅｃｔｏｍｙ．（２００９）．Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｎ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ＆Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ
【非特許文献８】Ｏｎｏ，Ｍ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｈ．，Ｋａｊｉｔａｎｉ，Ｔ．，Ｎａｇａｓｈｉｍａ，Ｔ．，Ａｒａｓｅ，Ｔ．，Ｉｔｏ，Ｍ．，Ｏｈｔａ，Ｋ．，Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．，Ａｓａｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｍｙｏｍｅｔｒｉａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４，１８７００−１８７０５（「Ｏｎｏら，ＰＮＡＳ  ２００７」）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
よって、前駆細胞を取得するための別の供給源および前駆細胞の調製方法がなお必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
概要
本出願は、子宮由来の子宮筋を含有する組織サンプルを取得すること、前記組織サンプルを酵素で処理して繊維組織を除去すること、および前記処理済みの組織サンプルを培養して前駆細胞を取得することを含み、前記前駆細胞は多能性かつ免疫調節性であること特徴とする、前駆細胞の調製方法を記載する。
【００１１】
本出願はまた、上記の方法から得られた前駆細胞を提供する。
【００１２】
本出願はさらに、変性疾患、虚血性疾患または異常な免疫応答により引き起こされる疾患を治療するための方法であって、前記疾患を被っている患者に上記の方法に従って調製された前駆細胞を投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】子宮筋由来多能性前記細胞（ｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）（ＭＤＭＰ）の特徴を示す。（Ａ）脂肪組織由来幹細胞と比較したＭＤＭＰの増殖能。（Ｂ）ＭＤＭＰは、サイドポピュレーション（ＳＰ）細胞陰性である。ＳＰ細胞に関してアッセイするために、ＭＤＭＰを、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素の排除、すなわち、ＳＰ細胞の活性を遮断するベラパミルの存在下または不在下で、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素とともにインキュベートした。生細胞にゲートをかけるためにこれらの細胞に終濃度２Ａｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを加え、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素を３５７ｎｍで励起してフローサイトメトリー分析を行い、その蛍光を二重波長で分析した（青４０２〜４４６ｎｍ、赤６５０〜６７０ｎｍ）。（Ｃ）フローサイトメトリーによるＭＤＭＰの表面マーカープロファイリング（グレーで塗りつぶした曲線はアイソタイプ対照、塗りつぶしていない黒い線は示された抗体）。（Ｃ）ＭＤＭＰにおける種々のマーカーの免疫蛍光染色、スケールバーは１００μｍ。
【図２】ＭＤＭＰの多系譜分化能を示す。（Ａ）ＭＤＭＰの骨系譜（アリザリンレッド染色）、軟骨系譜（アルシアンブルー染色）、脂肪系譜（オイルレッドＯ染色）、および神経系譜（位相差）への分化能。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）ＭＤＭＰの神経分化能のさらなる特性評価。レチノイン酸を含む無血清培地（ＲＡ、０．１μＭ）またはＲｈｏＡキナーゼの阻害剤Ｙ２７６３２を含む完全培地（Ｙ、１０μＭ）の２種類の神経誘導条件でＭＤＭＰを培養した後にリアルタイムＰＣＲにより、神経系譜遺伝子の遺伝子発現（グラフで表示）を分析した。Ｃｔｌ、対照（完全培地）、＊はｃｔｌと比較した場合のｐ＜０．０５。
【図３】ＭＤＭＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫調節特性を示す。（Ａ）ＭＤＭＰは、刺激されたヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）（ＰＢＭＣ）増殖を、骨髄間葉幹細胞（ＢＭＭＳＣ）よりも顕著に抑制する。ヒトＰＢＭＣをまず、Ｔリンパ球をより特異的に刺激するフィトアグルチニン（ＰＨＡ）または抗ＣＤ３／２８ビーズ（α−ＣＤ３／２８）で刺激した後に細胞分裂を追跡するために緑色蛍光色素であるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色した。活性化されたＣＦＳＥ染色ＰＢＭＣを次に単独で培養するか、またはＢＭＭＳＣもしくはＭＤＭＰと共培養し、低増殖のＰＢＭＣを表す低ＣＦＳＥ染色の細胞分裂を評価するためにフローサイトメトリーにより分析した（青で表す％）。左側のヒストグラムは代表的なデータを示し、右側のグラフはプールした結果を表す。（Ｂ）ＭＤＭＰはＣＤ４  Ｔリンパ球とＣＤ８  Ｔリンパ球の両方の増殖を、ＢＭＭＳＣよりも有意に抑制できる。ＣＤ４  Ｔリンパ球およびＣＤ８  Ｔリンパ球をまず磁性ビーズを用いて選択し、ＣＦＳＥに関して染色し、α−ＣＤ３／２８で刺激し、単独で培養するか、またはＢＭＭＳＣもしくはＭＤＭＰと共培養し、低ＣＦＳＥ染色Ｔ細胞に関してフローサイトメトリーにより分析した（青で表す％）。左側のヒストグラムは代表的なデータを示し、右側のグラフは、各群ｎ＝４の結果をプールしたものを示す。（Ｃ）野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおいてヒトＢＭＭＳＣまたはＭＤＭＰの養子免疫細胞移入を用いてｉｎ  ｖｉｖｏ炎症状態を確立するための実験戦略。リポ多糖（ＬＰＳ）投与は腹膜内に（ｉ．ｐ．）行い、その後、細胞を移入した。ＬＰＳ投与後３日目にマウスを犠牲にし、１型ＣＤ４細胞（Ｔｈ１）および制御性Ｔ細胞のＴ細胞の部分集団の評価のために、脾臓および所属リンパ節からリンパ球を単離した。（Ｄ）ＭＤＭＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＢＭＭＳＣよりも有意に、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）発現Ｔｈ１細胞を抑制し、（Ｅ）ＣＤ２５高／Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を抑制する。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
実施形態の詳細な説明
本出願は、子宮由来の子宮筋を含有する組織サンプルを取得することを含む、前駆細胞の調製方法を記載する。単離される前駆細胞は、多能性かつ免疫調節性である。
【００１５】
本明細書で使用する場合、用語「子宮筋」は、子宮壁の中間層に由来する組織を指す。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「子宮」は、子宮頚管および子宮腔を包含する。
【００１７】
本出願の多能性および免疫調節性前駆細胞は、任意の好適な動物からの任意の好適な供給源の子宮筋を含有する任意の組織サンプルから取得できる。一実施形態では、好適な動物は齧歯類、霊長類、食肉類、および偶蹄類などの哺乳動物、好ましくは霊長類である。
【００１８】
一実施形態では、組織サンプルは、無病の出生後子宮から入手できる。
【００１９】
好ましい一実施形態では、組織サンプルは、ヒト子宮体から取得される。
【００２０】
一実施形態では、子宮は、子宮摘出術からのものであり得る。子宮摘出術は、非妊娠女性で最もよく行われる外科術である。本出願の方法は、廃棄される子宮摘出術後検体からの、多系譜分化能、免疫調節、および高増殖能を有する子宮筋由来多能性前駆細胞（ＭＤＭＰ）の効率的単離を可能とする。加えて、本出願の方法は、商業的に入手可能な「廃棄物」から前駆細胞を調製するためのものであり、さらなる侵襲的処置を行う必要が無く、倫理的問題も持ち上がらないことから、高い治療適用性を持つ。
【００２１】
本出願の方法では、子宮筋を含有する組織サンプルは、線維組織を除去するために酵素で処理される。これは一工程の酵素処理であり、濾過および勾配選択などのさらなる工程は必要とされない。一実施形態では、酵素としては、コラゲナーゼが含まれる。この酵素処理組織サンプルを次に、血清添加培地で培養して前駆細胞を取得する。一実施形態では、処理済みの組織サンプルを、血清および抗生物質を添加した完全培地で培養する。
【００２２】
本出願はまた、上記の方法から取得された前駆細胞を提供する。これらの前駆細胞は、独特で、単離方法、分化能および細胞表面マーカー発現プロフィールの点で従来技術とは異なる。
【００２３】
これらの前駆細胞は、細胞表面マーカーＣＤ３４の陰性発現、すなわち、ＣＤ３４（−）を示す。一実施形態では、前駆細胞は、細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、またはそれらの任意の組合せの陽性発現を示す。一実施形態では、前駆細胞は、細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ、サイドポピュレーション（ＳｉｄｅＰｏｐ）またはそれらの任意の組合せの陰性発現を示す。好ましい一実施形態では、前駆細胞は、細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の陽性発現、ならびに細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲおよびＳｉｄｅＰｏｐの陰性発現を示す。
【００２４】
本出願の前駆細胞は、骨形成、脂肪生成、軟骨形成、および神経新生を受けることが可能である。
【００２５】
本出願の前駆細胞は、強い免疫調節特性を有し、これはＣＤ４  Ｔリンパ球およびＣＤ８  Ｔリンパ球の両方で抑制効果を有する。
【００２６】
本出願の前駆細胞は、広い臨床適用性のために、倫理的問題無く高容量で単離可能なヒト幹細胞の新たな供給源といえる。これらの前駆細胞の臨床適用としては、限定されるものではないが、変性疾患、虚血性疾患、異常な免疫応答により引き起こされる疾患などが含まれる。
【００２７】
従って、本出願はさらに、変性疾患、虚血性疾患または異常な免疫応答により引き起こされる疾患を治療するための方法であって、前記疾患を被っている患者に前記前駆細胞を投与することを含む方法を提供する。
【００２８】
一実施形態では、変性疾患としては、限定されるものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、大脳萎縮症、小脳萎縮症、統合失調症および認知症が含まれる。
【００２９】
一実施形態では、虚血性疾患としては、限定されるものではないが、脳卒中、脳溢血、脳出血、脳梗塞、頭部外傷、血管性認知症および心筋梗塞が含まれる。
【００３０】
一実施形態では、異常な免疫応答により引き起こされる疾患としては、限定されるものではないが、自己免疫疾患または臓器移植の移植片拒絶が含まれる。自己免疫疾患としては、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、１型真性糖尿病、小児脂肪便症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、および特発性血小板減少性紫斑病などが含まれる。
【００３１】
本方法では、患者は、齧歯類、霊長類、食肉類、および偶蹄類などの哺乳動物、好ましくは霊長類であり得る。一実施形態では、患者はヒトである。
【００３２】
前駆細胞を調製するための例を以下に記載する。
【実施例】
【００３３】
方法および材料
細胞の単離および培養
良性疾患の子宮摘出術からの子宮を、治験審査委員会により承認されたインフォームド・コンセントとともに取得した。子宮筋を切開し、子宮内膜および漿膜から分離した後、コラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間消化した。次に、サンプルおよび上清を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、選択されたロット、ＨｙＣｌｏｎｅ、ローガン、ＵＴ、ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）を添加した低グルコースダルベッコの改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、グランドアイランド、ＵＳＡ）からなる完全培地中で培養した。細胞培養は水飽和雰囲気、５％ＣＯ２にて３７℃で維持した。培地を毎週１〜２回交換し、８０％コンフルエントの際に細胞を１：３比で継代培養した。
【００３４】
免疫表現型検査
表面抗原を検出するために、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで解離させた後、細胞のアリコートを、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄した。抗体は全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（フランクリンレイクス、ＮＪ）から購入した。細胞をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗体またはフィコエリトリン)（ＰＥ）結合抗体で染色し、適当なアイソタイプ対照と比較した。
本発明者らが従前に報告したように（Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｉ．，Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｊｕｉ，Ｈ．Ｙ．，Ｋｏ，Ｂ．Ｓ．，Ｙａｏ，Ｍ．，Ｓｈｕｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｙｅｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃ．（２００５）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｒｍ  ｐｌａｃｅｎｔａ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３，３−９、Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．，Ｙｅｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｋ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｂａｉ，Ｃ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｙｔｗｕ，Ｈ．Ｋ．（２０１３）．Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｃ−Ｍｅｔ  ａｎｄ  ＳＴＡＴ３．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １，１３９−１５１）、フローサイトメトリー分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローを用いて行った。サイドポピュレーション細胞は、ヘキスト３３３４２色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の排除を遮断するために５０μｍベラパミルを使用して（Ｇｏｏｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．，Ｂｒｏｓｅ，Ｋ．，Ｐａｒａｄｉｓ，Ｇ．，Ｃｏｎｎｅｒ，Ａ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９６）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３，１７９７−１８０６）、従前に報告されているように決定した（Ｏｎｏら、ＰＮＡＳ  ２００７）。
【００３５】
分化試験および特性評価
脂肪系譜、骨芽細胞系譜、および軟骨系譜への分化は、本発明者および他が従前に報告しているように（Ｌｉｕ，Ｋ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｈｕ，Ｈ．Ｉ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｂａｉ，Ｃ．Ｈ．，Ｓｙｔｗｕ，Ｈ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．（２０１１）．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｇ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｃｅｎｔａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（ＰＤＭＣｓ）ｔｏｗａｒｄｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０，１７２１−１７３０、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｍａｃｋａｙ，Ａ．Ｍ．，Ｂｅｃｋ，  Ｓ．Ｃ．，Ｊａｉｓｗａｌ，Ｒ．Ｋ．，Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｒ．，Ｍｏｓｃａ，Ｊ．Ｄ．，Ｍｏｏｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｒａｉｇ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｋ，Ｄ．Ｒ．（１９９９）．Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，１４３−１４７）行い、特性評価した。
神経分化は標準的な方法により、簡単に述べれば、細胞を、０．５μｍレチノイン酸を添加した無血清培地（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｏｎｇ，Ｓ．，Ｋａｍａｔｈ，Ｓ．Ｇ．，Ｚｉｇｏｖａ，Ｔ．，Ｗｉｌｌｉｎｇ，Ａ．，Ｃａｒｄｏｚｏ−Ｐｅｌａｅｚ，Ｆ．，Ｓｔｅｄｅｆｏｒｄ，Ｔ．，Ｃｈｏｐｐ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓａｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｒ．（２００１）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １７１，１０９−１１５）、または本発明者らが従前に報告したように（Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｕ，Ｃ．Ｃ．，Ｈｓｕ，Ｓ．Ｈ．，Ｌｉｏｕ，Ｊ．Ｙ．，Ｌｉ，Ｙ．Ｗ．，Ｗｕ，Ｋ．Ｋ．，Ｌａｉ，Ｙ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲｈｏＡ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３４，３２２３−３２３０（「Ｗａｎｇら」）１０μｍ  Ｙ−２７６３２を添加した完全培地中、低密度（１０００細胞／ｃｍ３）で培養することによって誘導した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ＭＮ）から入手した軟骨分化用のＴＧＦ−β３を除く全ての試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【００３６】
免疫蛍光染色
神経同定のための免疫蛍光染色は従前に報告したように（Ｗａｎｇら）行った。簡単に述べれば、培養細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温にて１０分間固定し、０．１％トリトン−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間透過処理を施した。ヒト抗原ネスチンおよびグリア線維酸性タンパク質に対する一次抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）から購入し、α−ＳＭＡについてはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
まず、サンプルを一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、次に、ＰＢＳで３回すすぎ、１：１００希釈のＦＩＴＣ結合二次抗体とともに室温で６０分間インキュベートした。全てのサンプルを４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１：２０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。染色を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ(登録商標)、東京、日本）下で可視化した。
【００３７】
細胞増殖評価
２代目の継代（Ｐ２）から始め、まず、細胞を１．５×１０４細胞／ｃｍ２で播種した。８０％密度のサブコンフルエント増殖の際に、細胞を通常通りにトリプシンで処理し、初期密度で再び播種した。本発明者らが従前に記載したように（Ｈｏら）、増殖曲線を求めた。
【００３８】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）
本発明者らが従前に記載したように（Ｈｏら）、ＲＮＡを単離し、ＲＴＰＣＲを行った。プライマーは次の通り。
ニューロＤ：フォワードプライマーＣＴＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＴＡＣＡＧ、リバースプライマーＧＡＴＧＣＧＡＡＴＧＧＣＴＡＴＣＧＡＡＡＧ、
Ｓｏｘ１：フォワードプライマーＡＡＡＧＴＣＡＡＡＡＣＧＡＧＧＣＧＡＧＡ、リバースプライマーＡＡＧＴＧＣＴＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＴＡ、および
ネスチン：フォワードプライマーＡＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＧＴＣＴＣＴＡ、リバースプライマーＴＴＣＴＣＴＴＧＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴ。
定量は、β−アクチン（プライマー：フォワードＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣ、リバースＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣ）の遺伝子産物に対する正規化の後に行った。
【００３９】
前駆細胞／幹細胞およびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）／リンパ球の共培養実験
ＰＢＭＣ関連実験は、本発明者らの従前に記載した方法と同様に行った（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｙｅｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃ．，Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｃ．，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｉ．，Ｂａｉ，Ｃ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．（２００６）．Ｐｌａｃｅｎｔａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４，２４６６−２４７７（「Ｃｈａｎｇら」）、Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｋ．Ｊ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｊ．，Ｗｅｉ，Ｃ．Ｆ．，Ｂａｉ，Ｃ．Ｈ．，Ｈｏ，Ｌ．Ｊ．，Ｓｙｔｗｕ，  Ｈ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．（２０１４）  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  （ＭＳＣ）−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＨＧＦ）ｔｈｒｏｕｇｈ  ＥＲＫ１／２．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ９５，２９５−３０３（「Ｃｈｅｎら」）。
簡単に述べれば、従前に報告されているように、ヒトＰＢＭＣを、治験審査委員会の手続きに従って承認されたインフォームド・コンセントとともに入手した健康なドナーの血液サンプル（Ｔａｉｗａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｔａｉｐｅｉ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ、台北、台湾）のバフィーコートから単離し、培養した。単離されたＰＢＭＣをまず、Ｔリンパ球をより特異的に刺激するフィトアグルチニン（ＰＨＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または抗ＣＤ３／２８ビーズ（α−ＣＤ３／２８、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）で刺激した後に細胞分裂を追跡するために緑色蛍光色素であるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。前駆細胞／幹細胞（ＭＤＭＰまたはＢＭＭＳＣ）を６ウェルプレートにウェル当たり３．５×１０４細胞で播種し、刺激したＰＢＭＣ（１×１０５）との共培養前に３７℃で２４時間インキュベートした。さらに３日間の培養の後、細胞を採取し、ＣＦＳＥ染色強度または種々のタンパク質（表面マーカー、サイトカイン、転写因子など）発現に関してフローサイトメトリー分析によって評価した。
【００４０】
マウスｉｎ  ｖｉｖｏ実験
全ての動物研究は、所内動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従って行った。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、台湾国家実験動物センター（台北、台湾）から購入した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける炎症性白血球の誘導は従前の報告と同様に行った（Ｓｈｉ，Ｇ．，Ｖｉｓｔｉｃａ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｇｅｎｔ，Ｌ．Ｆ．，Ｔａｎ，Ｃ．，Ｗａｗｒｏｕｓｅｋ，Ｅ．Ｆ．，Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｅｒｙ，Ｉ．（２０１３）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ１７  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＴＬＲ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９１，４１５−４２３）。
簡単に述べれば、リポ多糖（ＬＰＳ、１００μｇ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）０００４１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を８〜１２週齢のマウスの腹膜内に注射し、２時間後、ＭＤＭＰまたはＢＭＭＳＣのいずれか（１×１０５細胞／マウス）を移入した。マウスを３日目に犠牲にし、従前に報告されているように（Ｃｈｅｎら、Ｃｈａｎｇら）Ｔｈ１細胞およびＴｒｅｇの評価のために脾臓および所属リンパ節から白血球を採取した。
【００４１】
結果
ヒト子宮体由来の多能性前駆細胞の特性評価
子宮筋層由来多能性前駆細胞（ＭＤＭＰ）を良性診断の子宮摘出術後検体から単離した。これらのＭＤＭＰは、ヒト治療用前駆細胞の単離の現在一般的な供給源である脂肪組織から単離された体細胞性前駆細胞と比較しても高増殖性である（図１Ａ）。これらのＭＤＭＰの特性評価では、これらの前駆細胞はヘキスト色素を排除せず、従って、サイドポピュレーション細胞のプロフィールに適合しないことが示された（図１Ｂ）。
表面マーカー発現に関しては、ＭＤＭＰはＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ４４陽性であるが、内皮マーカーＣＤ３１ならびにＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、およびＨＬＡ−ＤＲを含むいくつかの造血マーカーに関しては陰性である（図１Ｃ）。興味深いことに、ＭＤＭＰは、２つの神経幹細胞マーカー、ネスチンおよびＧＦＡＰに関しては陽性である（図１Ｄ）。さらに、ＭＤＭＰは平滑筋からなる器官から単離されるが、それらは平滑筋α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）陰性であり（図１Ｄ）、このことは、ＭＤＭＰは最終分化状態の子宮体平滑筋細胞からならないことを示す。
【００４２】
ＭＤＭＰは多系譜能を有する
次に、ＭＤＭＰの分化能を評価した。ＭＤＭＰは骨系譜、軟骨系譜、脂肪系譜、および神経系譜を含む複数の細胞系譜に分化可能であることが判明した（図２Ａ）。ＭＤＭＰの神経分化能のさらなる特性評価では、様々な神経誘導条件で培養した場合に、これらの前駆細胞はＳｏｘ１、ネスチン、およびニューロＤなどのいくつかの神経幹細胞関連遺伝子の発現を高めることが示される（図２Ｂ）。従って、ＭＤＭＰは多系譜分化能を有し、骨折、骨粗鬆症、骨形成不全症を含む骨疾患、骨関節炎および関節リウマチを含む軟骨疾患、ならびに脳卒中、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および認知症を含む神経疾患に対して広い適用性を有する。
【００４３】
ＭＤＭＰはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＢＭＭＳＣよりも重要な免疫調節性を有する
増えつつあるエビデンスが、これまで炎症プロセスを含むとは考えられなかった複数の疾患実体に炎症が含まれることを示し、これには神経変性疾患、虚血性疾患および癌を含む、このような疫学的に目立った疾患が含まれる。子宮は独特な免疫環境を有すると仮定されている（Ｍｏｆｆｅｔｔ−Ｋｉｎｇ，Ａ．（２００２）．Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，６５６−６６３）。従って、ＭＤＭＰが免疫調節効果を有するかどうかを評価した。ＭＤＭＰが免疫抑制性であるかどうかを評価するため、刺激したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて混合リンパ球反応を行い、同時に、既知の免疫調節タイプの幹細胞／前駆細胞であるＭＤＭＰまたはＢＭＭＳＣのいずれかと共培養した。
ＭＤＭＰの共培養はフィトアグルチニンまたは抗ＣＤ３／２８ビーズのいずれかで刺激されたＰＢＭＣの増殖を抑制するだけでなく、従って、ＭＤＭＰが共培養される場合にＢＭＭＳＣよりも強く有意に抑制され得ることが判明した（図３Ａ）。さらに、いくつかの免疫関連疾患の媒介に重要な２つの白血球集団であるＣＤ４  Ｔリンパ球およびＣＤ８  Ｔリンパ球の両方に対するＭＤＭＰの抑制効果はＢＭＭＳＣよりも有意である。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏ炎症モデルでは、ＢＭＭＳＣよりも有意に、ＭＤＭＰは型インターフェロン−ｇ分泌ＣＤ４細胞（Ｔｈ１細胞）が呈するようなエフェクターＴ細胞機能を有意に阻害でき、ＣＤ４＋／ＣＤ２５高／Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞が呈するような免疫調節を増強する（図３ＣおよびＤ）。従って、ＭＤＭＰは高免疫調節性であり、自己免疫疾患、炎症性大腸炎、臓器拒絶、神経変性疾患、および虚血性疾患などの免疫および炎症関連疾患の治療に適用できる可能性がある。
【００４４】
ＭＤＭＰと従来技術の比較
表１を参照し、比較の概要を示す。
【００４５】
Ｏｎｏら（Ｏｎｏら，  ＰＮＡＳ  ２００７）は、子宮筋層組織を、最少量（０．０２％）の酵素を添加した培地で４〜１６時間インキュベートし、続いて濾過（２回）および勾配選択（フィコールパーク）を行うことによってＭｙｏＳＰが単離され、その後、組織をさらにトリプシン処理したことを開示している。
【００４６】
Ｇａｌｖｅｚら，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ２００９のＷＯ２０１０／０５７９６５およびＷＯ２０１１／０４２５４７Ａ１は、子宮筋層組織を無血清培地でインキュベートし、小血管を有する断片だけをさらなる培養のために選択することによりＡＭＰが単離されたことを開示している。この方法はおそらく内皮様細胞を選択し、これらの単離されたＡＭＰのＣＤ３１（＋）パーセンテージが高い（マウスＡＭＰでは＞９９．７％、ヒトＡＭＰでは＞９０％）ことを示す結果も相応に解釈できる。
【００４７】
本出願の方法では、濾過または勾配選択を行わずに、血清添加培地中で培養し、１時間未満の一工程の酵素処理が適用される。加えて、本出願でのさらなる培養に血管を含む部分を使用する必要はない。
【００４８】
ＭｙｏＳＰはヘキスト３３３４２色素排除能を特徴とし、フローサイトメトリー分析で、本出願では取得しない「サイドポピュレーション」として現れる（図１Ｂ参照）。ＭｙｏＳＰはＣＤ３１（＋）、ＣＤ３４（＋）およびＣＤ４４（−）を示し、ＡＭＰはＣＤ３１（＋）、ＣＤ７３（−）およびＨＬＡ−ＤＲ（＋）を示すが、本出願のＭＤＭＰはＣＤ３１（−）、ＣＤ３４（−）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ７３（＋）およびＨＬＡ−ＤＲ（−）である（図１Ｃ参照）。
【００４９】
加えて、ＭＤＭＰでは可能であるが、ＭｙｏＳＰは、軟骨形成細胞には分化できず、神経細胞に分化するという報告もない。ＭｙｏＳＰの免疫調節能についてＯｎｏらは述べていないが、ＭｙｏＳＰはＣＤ３４（＋）ＣＤ３１（＋）であり、造血バックグラウンドおよびおそらくは免疫原性を示すので、この能力を備えているとは考えにくい。
【００５０】
マウスＡＭＰのみで分化能の試験が行われ、ヒトＡＭＰでは行われなかった。マウスＡＭＰは骨形成、脂肪生成および神経新生を有していたが、軟骨形成は報告されていない。ＡＭＰの免疫調節能は上記の開示には述べられていないが、ＡＭＰは、ベースラインにおいてＨＬＡ−ＤＲ（＋）であるために免疫原性がある可能性があった。
【００５１】
明らかに、ＭＤＭＰはＭｙｏＳＰおよびＡＭＰと異なる特徴を有する。
【００５２】
【表１】
2017529101.tif 000003
【００５３】
本発明は上記で詳細に述べた好ましい実施形態および実施例に関して開示されるが、これらの例は限定の意味ではなく例示を意図すると理解されるべきである。当業者ならば改変および組合せに容易に想到し、これらの改変および組合せは本発明の趣旨ならびに以下の特許請求の範囲、その等価な系および方法の範囲内であると考えられる。
【図１】
2017529101.tif 000004
【図２】
2017529101.tif 000005
【図３】
2017529101.tif 000006
【国際調査報告】
2017529101.tif 000007