(57)【要約】本発明は、封入体から可溶化されるバイオマス分解活性を有し、バイオマス分解活性を保持するポリペプチドまたは複数のポリペプチドを含む混合物と、同混合物の生成方法および使用方法とに関する。本明細書中記載される発明は、宿主細胞から単離できるバイオマス分解活性を伴う組み換えタンパク質の収率を上げる方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマス分解活性を有する複数のポリペプチドおよび可溶化剤を含む混合物であって、前記ポリペプチドが、バイオマス分解活性を有する天然のポリペプチドと比較して、少なくとも８〜１０％のバイオマス分解活性を有する、混合物。
【請求項２】
封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
前記混合物が、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質を含まない、請求項１に記載の混合物
【請求項４】
細胞のデブリ、１つもしくは複数のリボソームの成分、１つもしくは複数の宿主タンパク質、ならびに／またはＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを含む宿主の核酸をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項５】
前記バイオマス分解活性が、セロビアーゼ活性、リグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、またはキシラナーゼ活性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、部分的にアンフォールドされており、部分的にミスフォールドされており、または部分的に変性されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の混合物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ酵素、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項９】
前記Ｃｅｌ３Ａ酵素が、前記アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の混合物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列によりコードされている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがアグリコシル化されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１２】
前記可溶化剤が尿素を含み、任意に０．２〜６Ｍの濃度で存在する、請求項１〜３または７のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１３】
バイオマス分解活性を有する少なくとも１つの追加的なポリペプチド、またはバイオマス分解活性を有する１つもしくは複数の酵素を産生する微生物をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１４】
前記追加的なポリペプチドが、リグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セロビアーゼ、およびキシラナーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項１３に記載の混合物。
【請求項１５】
前記追加的なポリペプチドが、
ａ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ酵素、もしくはその機能的なバリアントもしくは断片、または
ｃ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む（たとえばからなる）核酸配列によりコードされているポリペプチド
から選択される、請求項１３または１４に記載の混合物。
【請求項１６】
前記追加的なポリペプチドがアグリコシル化されている、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１７】
前記追加的なポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する複数のポリペプチドと可溶化剤とを含む混合物であって、前記複数のポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む天然のポリペプチドの活性の少なくとも２０〜４０％を有する、混合物。
【請求項１９】
封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質をさらに含む、請求項１８に記載の混合物。
【請求項２０】
前記混合物が、封入体に結合した１つまたは複数のタンパク質を含まない、請求項１８に記載の混合物。
【請求項２１】
細胞のデブリ、１つもしくは複数のリボソームの成分、１つもしくは複数の宿主タンパク質、ならびに／またはＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを含む宿主の核酸をさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、部分的にアンフォールドされている、部分的にミスフォールドされている、または部分的に変性されている、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９０％の同一性を含む核酸配列によりコードされている、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２４】
前記ポリペプチドがアグリコシル化されている、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２５】
前記可溶化剤が尿素を含み、任意に０．２Ｍ〜６Ｍの濃度で存在する、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２６】
バイオマス分解活性を有する少なくとも１つの追加的なポリペプチド、またはバイオマス分解活性を有する１つもしくは複数の酵素を産生する微生物をさらに含む、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項２７】
前記追加的なポリペプチドが、リグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セロビアーゼ、およびキシラナーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項２６に記載の混合物。
【請求項２８】
前記追加的なポリペプチドが、
ａ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ酵素、もしくはその機能的なバリアントもしくは断片、または
ｃ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む（たとえばからなる）核酸配列によりコードされているポリペプチド
から選択される、請求項２６または２７に記載の混合物。
【請求項２９】
前記追加的なポリペプチドがアグリコシル化されている、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項３０】
前記追加的なポリペプチドがグリコシル化されている、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項３１】
バイオマス分解活性を有するポリペプチドを発現する細胞またはそのライセートを、前記ポリペプチドを可溶化させるのに適した濃度の可溶化剤と接触させることを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の混合物を生成する方法。
【請求項３２】
前記細胞を溶解してライセートを得ることと、前記ライセートの不溶性分画から可溶性分画を分離することと、前記可溶化剤に前記不溶性分画を再懸濁することとをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記可溶化剤が尿素であり、任意に前記可溶化剤の濃度が０．２Ｍ〜６Ｍである、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記バイオマス分解活性が、セロビアーゼ活性、リグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ、またはキシラナーゼ活性である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａｍまたはその機能的なバリアントもしくは断片を含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドがアグリコシル化されている、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
バイオマス分解活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、細胞で前記ポリペプチドを発現させることと、前記細胞またはそのライセートを、前記ポリペプチドを可溶化させるのに適した濃度の可溶化剤と接触させることとを含む、方法。
【請求項３９】
バイオマス分解活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、バイオマス分解活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを産生するように遺伝的に改変された細胞を準備することであって、前記バイオマス分解活性を有するポリペプチドの少なくとも一部が封入体で見いだされる、ことと、前記封入体を含む前記細胞またはそのライセートを、前記ポリペプチドを可溶化させるのに適した濃度の可溶化剤と接触させることとを含む、方法。
【請求項４０】
前記可溶化剤が尿素を含む、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記可溶化剤の濃度が０．２Ｍ〜６Ｍである、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞を溶解してライセートを得ることと、前記ライセートの不溶性分画から可溶性分画を分離することと、前記可溶化剤に前記不溶性分画を再懸濁することとをさらに含む、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記バイオマス分解活性が、セロビアーゼ活性、リグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、キシラナーゼ活性である、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ、またはその機能的なバリアントもしくは断片を含む、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が、原核細胞または細菌細胞、たとえば大腸菌細胞、ｏｒｉｇａｍｉ大腸菌細胞である、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドがアグリコシル化されている、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
バイオマスから生成物を生成する方法であって、前記生成物の生成に適した条件下で、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の混合物、ならびに任意に１つもしくは複数のバイオマス分解酵素および／またはバイオマス分解酵素を含む酵素混合物を産生する微生物の混合物と、バイオマスを接触させることを含む、方法。
【請求項４９】
前記混合物と前記バイオマスを接触させる前に、電子ビームで前記バイオマスを処理することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記生成物が糖生成物である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記糖生成物が、グルコースおよび／またはキシロースである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
さらに、前記生成物を単離することを含む、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記生成物の単離が、沈殿、結晶化、クロマトグラフィー、遠心分離、および／または抽出を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記酵素混合物が、Ｂ２ＡＦ０３、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、Ｃｅｌ１ａ、Ｃｅｌ３ａ、Ｃｅｌ５ａ、Ｃｅｌ６ａ、Ｃｅｌ７ａ、Ｃｅｌ７ｂ、Ｃｅｌ１２ａ、Ｃｅｌ４５ａ、Ｃｅｌ７４ａ、ｐａＭａｎ５ａ、ｐａＭａｎ２６ａ、およびスウォレニンから選択される酵素のうち少なくとも２つを含む、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記バイオマスが、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙屑、林産物、もしくは一般廃棄物、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み；ここで：
ａ）農産物または農業廃棄物が、サトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせを含み；
ｂ）紙製品または紙屑が、紙、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせを含み；
ｃ）林産物が、アスペン材、パーティクルボード，木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせを含み；ならびに
ｄ）一般廃棄物が、堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせを含む、
４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
さらに、前記微生物または前記酵素混合物を導入する前に前記バイオマスを処理して、前記バイオマスの不応性を低減させるステップを含み、前記処理が、電子による照射、超音波処理、酸化、熱分解、蒸気爆発、化学的処理、機械的処理、または凍結粉砕を含む、請求項４８〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記バイオマス分解酵素を産生する微生物が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、ミセリオフソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）から選択される属の種に由来する、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記バイオマス分解酵素を産生する微生物が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ヒュミコラ・インソレンス（スキタリジウム・サーモフィルム）コプリヌス・シネレウス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ  （Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）  Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ミセリオフソラ・サーモヒラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、メリピウス・ギガンテウス（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、アクレモニウム・ペルシシナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｉｃｉｎｕｍ）、アクレモニウム・アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アクレモニウム・ブラシペニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｂｒａｃｈｙｐｅｎｉｕｍ）、アクレモニウム・ジクロモスポルム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｄｉｃｈｒｏｍｏｓｐｏｒｕｍ）、アクレモニウム・オブクラバタム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｏｂｃｌａｖａｔｕｍ）、アクレモニウム・ピンケルトニエ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｐｉｎｋｅｒｔｏｎｉａｅ）、アクレモニウム・ロセオグリセウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｒｏｓｅｏｇｒｉｓｅｕｍ）、アクレモニウム・インコロラタム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｉｎｃｏｌｏｒａｔｕｍ）、アクレモニウム・フラタム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｆｕｒａｔｕｍ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）から選択される、請求項４８〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記微生物が、非誘導微生物と比べてバイオマス分解酵素の生成を増加させるのに好適な条件下で、前記微生物を誘導バイオマス試料と組み合わせることにより、バイオマス分解酵素を産生するように誘導されている、請求項４８〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記誘導バイオマス試料が、農産物もしくは農業廃棄物、紙製品もしくは紙屑、林産物もしくは一般廃棄物、またはそれらのいずれかの組み合わせのうちの１つまたは複数を含み、
ａ）農産物または農業廃棄物が、サトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせを含み；
ｂ）紙製品または紙屑が、紙、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせを含み；
ｃ）林産物が、アスペン材、パーティクルボード、木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせを含み；ならびに
ｄ）一般廃棄物が、堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせを含む、
請求項４８〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／０５５，７０２号の恩典を主張し；その全内容はこれにより、参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を含み、これはＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、これによりその全体が参照により組み込まれる。２０１５年９月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＸ２００２−７００３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは７６，９４６バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に、封入体から可溶化したバイオマス分解活性を有するポリペプチドを含み、バイオマス分解活性を有する混合物、ならびに本明細書中記載される混合物を生成する方法に関する。本発明はまた、例えばバイオマス材料を加工処理するために、当該混合物を使用するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
バイオマス分解酵素、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、およびリグニナーゼは原料などのバイオマスの分解にとって重要である。セルロースおよびリグノセルロース材料は、大量に多くの用途で、生成され、加工処理され、使用される。しばしば、このような材料は１度使用され、その後廃棄物として捨てられるか、または廃棄材料、例えば、下水、バガス、おがくず、およびストーバーであると単純に考えられる。
【発明の概要】
【０００５】
大腸菌などの宿主細胞における組み換えタンパク質の高レベルの発現は、宿主細胞の中で組み換えタンパク質の集積物を不溶性の凝集体にする場合がある。これらの不溶性の凝集体は、封入体と呼ばれており、宿主細胞に内因性のタンパク質、リボソームの成分、核酸、および細胞のデブリなどの他の成分をも含む場合がある。封入体からの組み換えタンパク質の可溶化は、水素結合および疎水性相互作用を妨害する高濃度の尿素などの可溶化剤での処理を介して、達成することができる。しかしながら、尿素などの可溶化剤での処理は、タンパク質の変性および酵素活性の喪失をもたらす場合がある。よって、封入体への組み換えタンパク質の凝集は、宿主細胞から単離できる酵素活性を伴う組み換えタンパク質の収率を下げる場合がある。
【０００６】
本発明は、尿素などの可溶化剤により封入体から可溶化された異種的に発現されたセロビアーゼが、セロビアーゼ活性を保持するという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づくものである。よって、異種的に発現したセロビアーゼまたは他のバイオマス分解酵素の可溶化のための本明細書中に記載される方法は、バイオマス分解活性を有する異種的に発現した酵素の収率を、たとえば３０〜４０％上げるために有益である。さらに、可溶化したバイオマス分解酵素、たとえばセロビアーゼの添加に由来する可溶化剤、たとえば尿素の存在は、バイオマスを糖生成物に変換するための糖化反応および／または生成物の収率に不利に影響するものではない。
【０００７】
よって、一態様では、本開示は、バイオマス分解活性を有するポリペプチドまたは複数のポリペプチドと、可溶化剤、たとえば尿素とを含む混合物であって、上記ポリペプチドまたは複数のポリペプチドが、天然のポリペプチドと比較して少なくとも８〜１０％のバイオマス分解活性を有する、混合物を特徴とする。
【０００８】
一実施形態では、混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質をさらに含む。あるいは一実施形態では、混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質を含まない。一実施形態では、混合物は、細胞のデブリ、１つもしくは複数のリボソームの成分、１つもしくは複数の宿主タンパク質、たとえば宿主細胞により内因的に発現したタンパク質、ならびに／または宿主の核酸、たとえばＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡをさらに含む。
【０００９】
一実施形態では、バイオマス分解活性は、セロビアーゼ活性、リグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、またはキシラナーゼ活性である。
【００１０】
一実施形態では、ポリペプチドは部分的にアンフォールド、部分的にミスフォールド、または部分的に変性されている。
【００１１】
別の態様では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは複数のポリペプチドと、可溶化剤、たとえば尿素とを含む混合物であって、上記ポリペプチドまたは複数のポリペプチドが、天然のポリペプチド、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＴ．リーセイ由来のＣｅｌ３ａの活性の少なくとも２０％を有する、混合物を特徴とする。たとえば混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質をさらに含む。あるいは混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質を含まない。混合物はさらに、以下：細胞のデブリ、１つもしくは複数のリボソームの成分、１つもしくは複数の宿主タンパク質、たとえば宿主細胞により内因的に発現したタンパク質、および／または宿主の核酸、たとえばＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡのうちの１つまたは複数を含んでもよい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドは、部分的にアンフォールド、部分的にミスフォールド、または部分的に変性されていてもよい。
【００１２】
一実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ、またはその機能的なバリアントもしくは断片を含む。一実施形態では、Ｃｅｌ３Ａ酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む（たとえばからなる）。一実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９０％の同一性を含む（たとえばからなる）核酸配列によりコードされている。
【００１３】
一実施形態では、ポリペプチドはアグリコシル化されている。
【００１４】
一実施形態では、可溶化剤、たとえば尿素は、０．２Ｍ〜６Ｍの濃度で混合物中に存在する。
【００１５】
一実施形態では、混合物は、バイオマス分解活性を有する少なくとも１つの追加的なポリペプチド、またはバイオマス分解活性を有する１つもしくは複数の酵素を産生する微生物をさらに含む。一実施形態では、追加的なポリペプチドは、リグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セロビアーゼ、およびキシラナーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される。一実施形態では、追加的なポリペプチドは、
ａ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（たとえばからなる）ポリペプチド、
ｂ．Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ、またはその機能的なバリアントもしくは断片、または
ｃ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む（たとえばからなる）核酸配列によりコードされるポリペプチド
から選択される。
【００１６】
一実施形態では、追加的なポリペプチドがアグリコシル化されている。
【００１７】
一実施形態では、追加的なポリペプチドがグリコシル化されている。
【００１８】
一態様では、本開示は、バイオマス分解活性を有するポリペプチド、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質、および可溶化剤、たとえば尿素を含む本明細書中記載される混合物を生成する方法であって、上記方法が、バイオマス分解活性を有するポリペプチドを発現する細胞またはそのライセートを、ポリペプチドを可溶化するのに適した濃度の可溶化剤、たとえば尿素と接触させることを含む、方法を特徴とする。一実施形態では、本方法は、さらに、ライセートの不溶性分画から可溶性分画を分離することと、可溶化剤、たとえば尿素に不溶性分画を再懸濁することとを含む。一実施形態では、可溶化剤、たとえば尿素の濃度は、０．２Ｍ〜６Ｍ、たとえば６Ｍである。
【００１９】
一実施形態では、バイオマス分解活性は、セロビアーゼ活性、リグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、またはキシラナーゼ活性である。
【００２０】
一実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ、またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【００２１】
一実施形態では、ポリペプチドはアグリコシル化されている。
【００２２】
一態様では、本開示は、バイオマス分解活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、細胞中で上記ポリペプチドを発現させることと、上記細胞またはそのライセートを、上記ポリペプチドの可溶化に適した濃度の可溶化剤、たとえば尿素と接触させることとを含む、方法を特徴とする。
【００２３】
別の態様では、本開示は、バイオマス分解活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、バイオマス分解活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを産生するように遺伝的に改変した細胞を準備することであって、上記バイオマス分解活性を有するポリペプチドの少なくとも一部が封入体で見いだされる、ことと、封入体を含む細胞またはそのライセートを、上記ポリペプチドを可溶化するのに適した濃度の可溶化剤、たとえば尿素と接触させることとを含む、方法を特徴とする。
【００２４】
一実施形態では、本明細書中開示される方法は、細胞を溶解してライセートを得ることと、ライセートの不溶性分画から可溶性分画を分離することと、可溶化剤、たとえば尿素に不溶性分画を再懸濁することとをさらに含む。一実施形態では、可溶化剤、たとえば尿素の濃度は、０．２Ｍ〜６Ｍ、たとえば６Ｍである。
【００２５】
一実施形態では、バイオマス分解活性は、セロビアーゼ活性、リグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼの活性、またはキシラナーゼ活性である。
【００２６】
一実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（たとえばからなる）。一実施形態では、アグリコシル化されたポリペプチドは、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３Ａ、またはその機能的なバリアントもしくは断片を含む。
【００２７】
一実施形態では、細胞は、原核細胞または細菌細胞、たとえば大腸菌細胞、ｏｒｉｇａｍｉ大腸菌細胞である。
【００２８】
一実施形態では、ポリペプチドは、アグリコシル化されている。
【００２９】
一態様では、本開示は、バイオマスから生成物（例えば、水素、糖、アルコール）を生成させる（またはバイオマスを生成物に変換させる）方法であって、生成物を生成するのに適した条件下で、バイオマス分解活性を有するポリペプチド、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質、および可溶化剤、たとえば尿素を含む本明細書中記載される混合物と、任意に１つもしくは複数のバイオマス分解酵素および／またはバイオマス分解酵素を含む酵素混合物を産生する微生物と、バイオマスを接触させることを含む、方法を特徴とする。
【００３０】
一実施形態では、本方法は、バイオマス分解活性を有するポリペプチド、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質、および可溶化剤、たとえば尿素を含む本明細書中記載される混合物とバイオマスを接触させる前に、電子線でバイオマスを処理するステップをさらに含む。
【００３１】
一実施形態では、生成物は糖生成物である。一実施形態では、糖生成物はグルコースおよび／またはキシロースである。
【００３２】
一実施形態では、方法はさらに、糖生成物を単離するステップを含む。一実施形態では、生成物を単離するステップは沈殿、結晶化、クロマトグラフィー、遠心分離、および／または抽出を含む。
【００３３】
一実施形態では、酵素混合物は、Ｂ２ＡＦ０３、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、Ｃｅｌ１ａ、Ｃｅｌ３ａ、Ｃｅｌ５ａ、Ｃｅｌ６ａ、Ｃｅｌ７ａ、Ｃｅｌ７ｂ、Ｃｅｌ１２ａ、Ｃｅｌ４５ａ、Ｃｅｌ７４ａ、ｐａＭａｎ５ａ、ｐａＭａｎ２６ａ、スウォレニン（Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ）から選択される酵素のうち少なくとも２つを含む。
【００３４】
一実施形態では、バイオマスは、澱粉質材料、サトウキビ、農業廃棄物、紙、紙製品、紙屑、紙パルプ、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、綿、木材、パーティクルボード、林業廃棄物、おがくず、アスペン材、木材チップ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、農業廃棄物、サイレージ、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アバカ、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、ダイズストーバー、コーンファイバ、アルファルファ、干し草、ココナツヘア、糖加工残渣、バガス、ビートパルプ、リュウゼツランバガス、藻類、海藻、堆肥、下水、くず、農業もしくは産業廃棄物、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む。
【００３５】
一実施形態では、バイオマスは澱粉質材料またはセルロース成分を含む澱粉質材料を含む。いくつかの実施形態では、バイオマスは、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙屑、林産物、もしくは一般廃棄物、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み；ここで：ａ）農産物または農業廃棄物はサトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせを含み；ｂ）紙製品または紙屑は、紙、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせを含み；ｃ）林産物はアスペン材、パーティクルボード、木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせを含み；ならびにｄ）一般廃棄物は、堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３６】
一実施形態では、方法はさらに、例えば、バイオマスを、電子による照射、超音波処理、酸化、熱分解、蒸気爆発、化学的処理、機械的処理、および／または凍結粉砕により処理することにより、微生物または酵素混合物を導入する前にバイオマスを処理して、バイオマスの不応性を低減させる工程を含む。
【００３７】
一実施形態では、バイオマス分解酵素を生成する微生物は、バチルス、コプリナス、ミセリオフソラ、セファロスポリウム、スキタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、ヒュミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウムまたはトリコデルマから選択される属の種に由来する。一実施形態では、バイオマス分解酵素を生成する微生物は、アスペルギルス、ヒュミコラ・インソレンス（スキタリジウム・サーモフィルム）、コプリヌス・シネレウス、フサリウム・オキシスポルム、ミセリオフソラ・サーモヒラ、メリピウス・ギガンテウス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム・ペルシシナム、アクレモニウム・アクレモニウム、アクレモニウム・ブラシペニウム、アクレモニウム・ジクロモスポルム、アクレモニウム・オブクラバタム、アクレモニウム・ピンケルトニエ、アクレモニウム・ロセオグリセウム、アクレモニウム・インコロラタム、アクレモニウム・フラタム、クリソスポリウム・ラクノウェンス、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・リーセイ、またはトリコデルマ・コニンギイから選択される。
【００３８】
一実施形態では、微生物は、非誘導微生物と比べて、バイオマス分解酵素の生成を増加させるのに好適な条件下で、微生物を誘導バイオマス試料と組み合わせることにより、バイオマス分解酵素を生成するように誘導されている。一実施形態では、誘導バイオマス試料は澱粉質材料、サトウキビ、紙、紙製品、紙屑、紙パルプ、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、綿、木材、パーティクルボード、林業廃棄物、おがくず、アスペン材、木材チップ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、農業廃棄物、サイレージ、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アバカ、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、ダイズストーバー、コーンファイバ、アルファルファ、干し草、ココナツヘア、糖加工残渣、バガス、ビートパルプ、リュウゼツランバガス、藻類、海藻、堆肥、下水、くず、農業もしくは産業廃棄物、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００３９】
一実施形態では、誘導バイオマスは、澱粉質材料、またはセルロース由来成分を含む澱粉質材料を含む。一部の実施形態では、誘導バイオマスは、農業製品もしくは廃棄物、紙製品もしくは紙屑、林業製品もしくは一般廃棄物、またはそれらのいずれかの組み合わせのうちの１つまたは複数を含み、ここでａ）農業製品または廃棄物が、サトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、またはビーズウイング、またはそれらの組み合わせを含み、ｂ）紙製品または紙屑が、紙、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、または紙パルプ、またはそれらの組み合わせを含み、ｃ）林業製品が、アスペン材、パーティクルボード、木材チップ、またはおがくず、またはそれらの組み合わせを含み、ｄ）一般廃棄物が、堆肥、下水、またはくず、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、当該分野で現在使用される方法に利点を提供する。これらの利点は、通常廃棄される不溶性酵素へのアクセスを提供すること、酵素活性を保持する所望のタンパク質の収率を上げること、より清浄なダウンストリームの処理のため精製した酵素、および生物の選択（たとえば、封入体を発達させる性質により使用から従来除外される場合があった生物の利用可能性の増大）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】可溶化したＣｅｌ３ａのＩＭＡＣ精製の結果を示すクロマトグラムである。精製し可溶化したＣｅｌ３ａのピークが矢印により示されている。
【図２】ＩＭＡＣ精製の異なる分画中のタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。レーン１は、分子量の基準を示す。レーン２は、可溶性分画由来の精製したＣｅｌ３ａを示す。レーン３は、不溶性分画のＩＭＡＣ精製由来の流れを示す。レーン４は、不溶性分画由来の精製し可溶化したＣｅｌ３ａを示す。
【図３】精製した可溶性Ｃｅｌ３ａ、および不溶性分画由来の精製し可溶化したＣｅｌ３ａのセロビアーゼ活性を比較したグラフである。
【図４】精製した可溶性Ｃｅｌ３ａ、不溶性分画の洗浄分画、および精製しなかった不溶性分画から可溶化したＣｅｌ３ａのセロビアーゼ活性を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
定義
別に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、発明が属する当分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４３】
「１つの（ａ、ａｎ）」という用語は、１つまたは１を超える（すなわち、少なくとも１つの）、物品の文法的対象を示す。例として、「１つの要素」は１つの要素または１を超える要素を意味する。
【００４４】
「アグリコシル化された」という用語は、本明細書では、分子がその自然の環境で生成された場合、グリカンが付着されている１つ以上の部位でグリコシル化されていない分子、例えば、ポリペプチドを示す（すなわち、それは、グリコシレート基（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）に付着されていないヒドロキシル基または他の官能基を含む）。いくつかの実施形態では、アグリコシル化された分子は付着されたグリカンを有さない。一実施形態では、分子は分子がグリコシル化され得ないように変化または突然変異されており、例えば、１つ以上のグリコシル化部位は、グリカンがグリコシル化部位に付着され得ないように突然変異される。別の実施形態では、付着されたグリカンは、例えば、酵素プロセスにより、例えば、グリカンを除去するまたは脱グリコシル化活性を有する酵素とインキュベートすることにより分子から除去することができる。さらに別の実施形態では、例えば、グリコシル化阻害剤（グリコシル化酵素を阻害する）の使用により分子のグリコシル化を阻害することができる。別の実施形態では、分子、例えば、ポリペプチドは、グリコシル化しない宿主細胞、例えば、大腸菌により生成させることができる。例えば、Ｃｅｌ３Ａ酵素は、Ｃｅｌ３Ａ酵素がＴ．リーセイにおいて生成された時に、普通それに付着されたグリカン基を有するタンパク質における１つ以上の部位がその部位に付着されたグリカンを有さない時に、アグリコシル化される。
【００４５】
「バイオマス」という用語は、本明細書では、任意の非石化した有機物質を示す。様々な種類のバイオマスは、植物由来バイオマス（たとえばリグノセルロース系およびセルロース系バイオマス）、微生物由来バイオマス、動物由来バイオマス（いずれかの動物由来副生成物、動物由来廃棄物など）、ならびに自治体廃棄物バイオマス（除去される金属およびガラスなどの再生利用可能な住居および軽作業のごみ）を含む。植物由来バイオマスは、いずれかの植物由来の有機物質（木材または非木材）を表す。植物由来バイオマスとして、限定するものではないが、農業用または食品用作物（たとえばサトウキビ、サトウダイコン、もしくはトウモロコシ穀粒）、またはそれらの抽出物（たとえばサトウキビ由来の糖およびトウモロコシ由来のコーンスターチ）、コーン・ストーバー、麦わら、コメわら、サトウキビ  バガスなどの農業用作物の廃棄物および残渣などを挙げることができる。植物由来バイオマスは、さらに、限定するものではないが、針葉樹林、樹皮の廃棄物、おがくず、紙、およびパルプ工業廃棄物ストリーム、木材ファイバなどの木、木材エネルギー用作物、木材廃棄物、および残渣などが挙げられる。さらに、スイッチグラスなどの草の作物などは、別の植物性バイオマス供給源としてラージスケールで生成される可能性を有する。都市部では、最も可能性のある植物性バイオマスの材料は、芝地の廃棄物（たとえば刈り取られた草、葉、刈り取られた木、および低木）、ならびに植物性加工廃棄物が挙げられる。
【００４６】
「バイオマス分解酵素」という用語は、本明細書では、本明細書で記載されるバイオマス物質の成分を中間体または最終生成物に分解する酵素を示す。例えば、バイオマス分解酵素としては、少なくともリグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビアーゼ、キシラナーゼ、およびセロビオヒドロラーゼが挙げられる。バイオマス分解酵素は、多種多様の微生物により生成され、Ｔ．リーセイなどの微生物から単離することができる。
【００４７】
「バイオマス分解活性」という用語は、本明細書では、本明細書中記載されるバイオマス物質の成分を中間体または最終生成物に分解する酵素活性を表す。バイオマス分解活性は、少なくともリグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビアーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、およびキシラナーゼ活性を含む。たとえばバイオマス分解活性を有するポリペプチドは、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３ａなどのセロビアーゼである。
【００４８】
「セロビアーゼ」という用語は、本明細書では、グルコースの二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、またはオリゴマ、またはグルコースおよびキシロースのオリゴマの、グルコースおよび／またはキシロースへの加水分解を触媒する酵素を示す。例えば、セロビアーゼはβ−グルコシダーゼであり、これは、セロビオース中のβ−１，４結合を触媒し、２つのグルコース分子を放出させる。
【００４９】
「セロビアーゼ活性」という用語は、本明細書では、セロビオースのグルコースへの加水分解を触媒する、例えば、β−Ｄ−グルコースを放出するβ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒するカテゴリのセルラーゼの活性を示す。セロビアーゼ活性は、本明細書、例えば、実施例４で記載されるアッセイに従い決定することができる。セロビアーゼ活性の１単位は、［グルコース］ｇ／Ｌ／［Ｃｅｌ３ａ］ｇ／Ｌ／３０分として規定することができる。
【００５０】
「セロビオヒドロラーゼ」という用語は、本明細書では、セルロース中のグリコシド結合を加水分解する酵素を示す。例えば、セロビオヒドロラーゼは１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼであり、これは、セルロース、セロオリゴ糖、または任意のβ−１，４−連結グルコース含有ポリマー中の１，４−β−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒し、ポリマー鎖からオリゴ糖を放出させる。
【００５１】
「セロビオヒドロラーゼ活性」という用語は、本明細書では、セルロースにおけるグリコシド結合の加水分解、具体的にはセルロース、セロオリゴ糖、またはいずれかのβ‐１，４結合したグルコース含有ポリマーの１，４−β−Ｄ−グリコシド結合の加水分解を触媒して、単糖鎖の末端から、たとえば鎖の還元端または非還元端からセロビオースを放出する酵素の活性を表す。セロビオヒドロラーゼ活性は、本明細書中記載されるアッセイにより決定することができる。セロビオヒドロラーゼ活性の１つの単位は、たとえば１分あたりの基質（たとえばＡｖｉｃｅｌ）から１μＭのグルコース等価物を放出する酵素の量として定義することができる。
【００５２】
「エンドグルカナーゼ」という用語は、本明細書では、内部β−１，４グリコシド結合の加水分解を触媒する酵素を示す。例えば、エンドグルカナーゼはエンド−１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼであり、これは、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）、リケナン中の１，４−β−Ｄ−グリコシド結合、混合β−１、３グルカン、例えば穀類β−Ｄ−グルカンまたはキシログルカン、およびセルロース成分を含む他の植物材料中のβ−１，４結合のエンド加水分解を触媒する。
【００５３】
「エンドグルカナーゼ活性」という用語は、本明細書では、内部のグリコシド結合、たとえばセルロース、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロースなど）、リケナンの内部のβ‐１，４グリコシド結合、混合β−１、３グルカン、例えば穀類β−Ｄ−グルカンまたはキシログルカン、およびセルロース成分を含む他の植物材料中のβ−１，４結合のエンド加水分解を触媒する酵素の活性を表す。エンドグルカナーゼ活性は、本明細書中記載されるアッセイにより決定することができる。エンドグルカナーゼ活性の１つの単位は、１分あたりの基質から１μＭ還元端の濃度を増加させる酵素の量として定義することができる。
【００５４】
「酵素混合物」という用語は、本明細書では、少なくとも２つの異なる酵素、または酵素の２つの異なるバリアント（例えば、酵素のグリコシル化された、およびアグリコシル化されたバージョン）の組み合わせを示す。本明細書で言及される酵素混合物は、少なくとも、本明細書で記載されるセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを含む。一実施形態では、酵素混合物は、セロビアーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、リグニナーゼ、および／またはキシラナーゼの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、酵素混合物は、その酵素の１つ以上を発現する、例えば、分泌する細胞、例えば、微生物を含む。例えば、酵素混合物は、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドおよび、１つ以上の追加の酵素および／またはポリペプチドのバリアントを発現する、例えば、分泌する細胞、例えば、微生物を含むことができる。
【００５５】
「封入体」という用語は、本明細書では、たとえば以下：異種的に発現したポリペプチド、たとえばバイオ分解活性を有するポリペプチド、細胞のデブリ、１つもしくは複数のリボソームの成分、宿主細胞から内因的に発現した１つもしくは複数のタンパク質、１つもしくは複数の核酸（ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡ）、またはそれらのいずれかの組み合わせのうちの１つまたは複数の含む微生物、たとえば宿主細胞により産生される不溶性の凝集体を表す。封入体は、一般的に、高レベルの組み換えタンパク質の発現の間、宿主細胞、たとえば細菌細胞で発生する。封入体で見いだされる異種的に発現したポリペプチドは、部分的にアンフォールド、部分的にミスフォールド、または部分的に変性されていてもよい。
【００５６】
「リグニナーゼ」という用語は、本明細書では、例えば酸化反応による、植物の細胞壁において普通に見られるリグニンの分解を触媒する酵素を示す。リグニナーゼは、リグニン修飾酵素、リグニンペルオキシダーゼおよびラッカーゼを含む。
【００５７】
「リグニナーゼ活性」という用語は、本明細書では、酸化反応によりリグニンおよびリグニン様ポリマーの分解を触媒する酵素の活性を表す。リグニナーゼ活性は、本明細書中記載されるアッセイにより決定することができる。
【００５８】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は同じ意味で使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびその一本鎖または二本鎖形態のポリマーを示す。特に限定されない限り、その用語は、基本核酸と同様の結合特性を有し、天然起源のヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。別記されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾バリアント（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列ならびに明確に指定された配列を暗に包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：５０８１  （１９９１）；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５−２６０８  （１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８  （１９９４））。
【００５９】
「作動可能に連結された」という用語は、本明細書では、制御または調節配列がポリペプチドをコードする核酸配列に関連する位置に配置され、そのため、制御配列は、ポリペプチド（ＤＮＡ配列によりコードされる）の発現に影響する構成を示す。一実施形態では、制御または調節配列は、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の上流にある。一実施形態では、制御または調節配列はセロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の下流にある。
【００６０】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同じ意味で使用され、ペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を示す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を占めることができるアミノ酸の最大数には制限はない。ポリペプチドとしては、互いにペプチド結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。「ポリペプチド」は、例えば、生物活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質などを含む。ポリペプチドは天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。「複数のポリペプチド」は、２つ以上のポリペプチド、たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、２００、または５００、またはそれ以上のポリペプチドを表す。
【００６１】
「プロモーター」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構、または導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列を示す。
【００６２】
「調節配列」または「制御配列」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、核酸産物の発現に必要とされる核酸配列を示す。場合によっては、この配列はプロモーター配列であってもよく、他の場合には、この配列はまた、エンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントを含んでもよい。調節／制御配列は、例えば、核酸産物を調節された様式で、例えば、誘導様式で発現するものであってもよい。
【００６３】
「構成的」プロモーターという用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、細胞のほとんどまたは全ての生理的条件下で細胞においてポリペプチドを生成させるヌクレオチド配列を示す。一実施形態では、ポリペプチドはセロビアーゼ活性を有するポリペプチドである。
【００６４】
「誘導性」プロモーターという用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞中に存在する場合のみ、細胞においてポリペプチドを生成させるヌクレオチド配列を示す。一実施形態では、ポリペプチドはセロビアーゼ活性を有するポリペプチドである。
【００６５】
「抑制」プロモーターという用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、実質的にプロモーターに対応するリプレッサーが細胞内に存在するまでのみ、細胞においてポリペプチドを生成させるヌクレオチド配列を示す。一実施形態では、ポリペプチドはセロビアーゼ活性を有するポリペプチドである。
【００６６】
「可溶化剤」という用語は、非共有結合、たとえば水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極子間相互作用、イオン相互作用、πスタッキング、またはそれらのいずれかの組み合わせを妨害する特性を有する薬剤を表す。非共有結合の妨害は、あらかじめ不溶性の物質の溶液中での可溶化または分解をもたらす。具体的には、本明細書中使用される可溶化剤は、封入体へと凝集された本明細書中に記載されるバイオマス分解活性を有するポリペプチドの、溶液、たとえば水系溶液またはバッファーに溶解する特性を増大させる。適切な可溶化剤の例は、本明細書中に記載されている。
【００６７】
「キシラナーゼ」という用語は、本明細書では、キシラン含有材料を加水分解する酵素を示す。キシランはキシロース単位を含む多糖である。キシラナーゼは、エンドキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、またはα−グルクロニルエステラーゼとすることができる。
【００６８】
「キシラナーゼ活性」という用語は、本明細書では、キシランおよびキシラン様ポリマーの１，４−β‐Ｄ−キシロシド結合のエンド加水分解を触媒する酵素活性を表す。キシラナーゼ活性は、本明細書中記載されるアッセイにより決定することができる。キシラナーゼ活性の１つの単位は、１分あたりキシランから１μＭのキシロース等価物を放出する。
【００６９】
説明
大腸菌などの宿主細胞中の組み換えタンパク質の高レベルの発現は、多くの場合、宿主細胞において、組み換えタンパク質の集積物を、不活性であり、ミスフォールドされた不溶性の凝集体にする。これらの不溶性の凝集体は封入体と呼ばれており、タンパク質、リボソームの成分、核酸、および細胞のデブリなどの宿主細胞にとって内因性の他の成分をも含む可能性がある。組み換え技術により生成されるタンパク質のうち最大７０〜８０％が、封入体を形成し、それにより、宿主細胞から容易に単離できる活性組み換えタンパク質の収率が有意に下がる可能性がある。
【００７０】
封入体からの組み換えタンパク質の可溶化は、水素結合および疎水性相互作用を妨害するカオトリピック剤、たとえば高濃度の尿素での処理を介して達成することができる。しかしながらこのような可溶化工程は、多くの場合、タンパク質の変性および天然の機能または酵素活性の喪失をもたらす。可溶性の変性したタンパク質は、カオトリピック剤の除去の後に天然の状態にリフォールディングすることができるが、酵素活性を伴う生活性形態への組み換えタンパク質のリフォールディングは厄介であり、費用が高く、最終生成物の回収は少なくなる。
【００７１】
本発明は、尿素により封入体から可溶化された異種的に発現したセロビアーゼがセロビアーゼ活性を保持するという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づくものである。封入体からの異種的に発現したセロビアーゼの回収は、セロビアーゼの全収率を３０〜４０％上げる。さらに、可溶化したバイオマス分解酵素、たとえばセロビアーゼの添加からの可溶化剤、たとえば尿素の存在は、バイオマスを糖生成物へ変換する糖化反応、および／または生成物の収率に不利に影響しない。
【００７２】
よって本発明は、バイオマス分解活性を有するポリペプチドを封入体から可溶化する方法であって、上記得られた可溶化したポリペプチドがバイオマス分解活性を保持しており、それにより、ポリペプチドをリフォールディングし、可溶化剤を除去する追加的な処理ステップを必要としない、方法を提供する。本発明は、酵素活性を保持しつつ、封入体からの異種的に発現したバイオマス分解酵素の回収を増大させる方法、ならびにバイオマスを生成物に変換する方法において、たとえば糖化により回収したバイオマス分解酵素の使用を提供する。
【００７３】
バイオマス分解活性を有するポリペプチド
本発明は、バイオマス分解活性を有するポリペプチド、複数のポリペプチドを提供する。複数の実施形態では、バイオマス分解活性を有するポリペプチドまたは複数のポリペプチドは、１つまたは複数の可溶化剤との混合物中に存在する。一部の混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質をも含み得る。他の実施形態では、混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質を含まず、たとえばバイオマス分解活性を有するポリペプチドまたは複数のポリペプチドは、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質から精製されたものである。
【００７４】
たとえばポリペプチドは、セロビアーゼ活性、リグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、またはキシラナーゼ活性を有する。
【００７５】
一実施形態では、ポリペプチドはセロビアーゼである。セロビアーゼは、その基質、たとえばセロビオース中のβ−１，４結合を加水分解し、２つのグルコース分子を放出させる酵素である。セロビオースは水溶性のグルコースの１，４−連結二量体である。一実施形態では、ポリペプチドはＣｅｌ３ａである。Ｃｅｌ３ａ（ＢｇｌＩとしても知られている）は、トリコデルマ・リーセイにおいて同定されたセロビアーゼである。Ｃｅｌ３ａに対するアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＷ＿００６７１１１５３）は、以下に提供される：
【化１】
2017530702.tif 000002
【００７６】
一実施形態では、ポリペプチドはリグニナーゼである。リグニナーゼは、モノリグノールとして知られている芳香族アルコールの複合ポリマーであり、植物および一部の藻類の二次的な細胞壁の重要な部分として作用するリグニンを分解する酵素である。リグニナーゼは、リグニンペルオキシダーゼ、１，２−ビス（３，４−ジメトキシフェニル）プロパン―１，３−ジオール：過酸化水素オキシドレダクターゼ、ジアリールプロパンオキシゲナーゼ、リグニナーゼＩ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、ＬｉＰ、過酸化水素オキシドレダクターゼ（Ｃ―Ｃ結合の切断）、および一部のラッカーゼが挙げられる。リグニナーゼの例として、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のＣＩＰ２；Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のＬＰＯＡ、ＧＬＧ２、ＧＬＧ４、ＬＩＰＡ、ＧＬＧ５、ＧＬＧ３、ＧＬＧ６、およびＬＩＰＢ；Ｐｈｅｌｂｉａ  ｒａｄｉａｔｅ由来のリグニナーゼ３；Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ由来のリグニナーゼＡおよびＢ；ならびにＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ由来のＬＰＧＩおよびＬＰＧＩＶが挙げられる。
【００７７】
一実施形態では、ポリペプチドはエンドグルカナーゼである。エンドグルカナーゼは、セルロースの加水分解を触媒する酵素である。具体的には、エンドグルカナーゼは、セルロース鎖の内部の結合を切断する。エンドグルカナーゼは、真菌、細菌、および原生動物により産生される。またエンドグルカナーゼは、β‐１−４エンドグルカナーゼ、４−β‐Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、エキソ―セロビオヒドロラーゼ、β‐１，４−グルカンセロビオヒドロラーゼ、β‐１，４−グルカンセロビオシルヒドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、１，４−β‐グルカンセロビオシダーゼ、エキソグルカナーゼ、アビセラーゼ、ＣＢＨ  １、Ｃ１セルラーゼ、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼ、エキソ―β‐１，４−グルカンセロビオヒドロラーゼ、１，４−β‐Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、またはセロビオシダーゼとしても知られている。エンドグルカナーゼの例として、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のＣｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ７Ｂ、Ｃｅｌ１２Ａ、Ｃｅｌ４５Ａ、Ｃｅｌ６１Ａ、Ｃｅｌ６１Ｂ、およびＣｅｌ７４Ａが挙げられる。
【００７８】
一実施形態では、ポリペプチドは、エキソグルカナーゼとしても知られているセロビオヒドロラーゼである。セロビオヒドロラーゼは、結合を含むオリゴ糖、たとえばセルロースおよびセロテトラオース中の１−４−β‐Ｄ−グリコシド結合の加水分解を触媒し、これにより鎖の非還元端からセロビオースを放出する。セロビオヒドロラーゼの例として、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）およびセロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩ）が挙げられる。
【００７９】
一実施形態では、ポリペプチドはキシラナーゼである。キシラナーゼは、エンド−（１−４）−β−キシラン  ４−キシラノヒドロラーゼ、エンド−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−β−Ｄ−キシラナーゼ、１，４−β−キシラン  キシラノヒドロラーゼ、β−キシラナーゼ、β−１，４−キシラン  キシラノヒドロラーゼ、β−Ｄ−キシラナーゼとしても知られている。キシラナーゼは、ヘミセルロースと呼ばれる植物細胞壁の成分を分解し、キシラン、たとえばβ‐１，４−キシラン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、およびキシログルカンなどのポリ多糖を分解し、キシロースを放出する。キシラナーゼの例として、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のＸｙｎ１、Ｘｙｎ２、およびＸｙｎ３；Ｔｅｒｅｎｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｕｒｎｅｒａｅ  Ｔ７９０１由来のＴＥＲＴＵ＿１５９９、ＴＥＲＴＵ＿３６０３、ＴＥＲＴＵ＿２５４６、およびＴＥＲＴＵ＿４５０６が挙げられる。
【００８０】
本開示はまた、本明細書で記載されるバイオマス分解活性を有するポリペプチドの機能的バリアントを提供する。一実施形態では、機能的バリアントは、本明細書で記載されるバイオマス分解酵素、またはその機能的断片に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性、例えば、本明細書で記載されるバイオマス分解酵素、またはその機能的断片に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８１】
一実施形態では、機能的バリアントは、Ｔ．リーセイにより産生されるＣｅｌ３ａ、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、またはその機能的断片に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％同一性、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８２】
２つ以上のアミノ酸または核酸配列との関連でのパーセント同一性は、同じである２つ以上の配列を示す。２つの配列は、２つの配列が、下記配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動整列および目視検査により測定される、比較窓、または指定された領域にわたって最大一致に対し比較、整列された場合、同じである特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチド（例えば、特定の領域にわたって、または、特定されない場合、全配列にわたって、６０％同一性、任意で７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性）を有する場合、「実質的に同一」である。任意で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチドの長さである領域にわたって存在する。より好ましくは、同一性は、少なくとも約２００またはそれ以上のアミノ酸、または少なくとも約５００もしくは１０００またはそれ以上のヌクレオチドの長さである領域にわたって存在する。
【００８３】
配列比較では、１つの配列は典型的には、参照配列として機能し、これに対して１つ以上の試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または別のパラメータを指定することができる。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の整列化の方法は当技術分野でよく知られている。配列比較のための最適整列化は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  （１９７０）  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３の相同性整列化アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性法のための検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行により（ＧＡＰ，  ＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡ，  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、または手動整列および目視検査により（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照）実施することができる。
【００８４】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７７）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０において記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センターを介して公的に入手可能である。
【００８５】
機能的バリアントは、本明細書中に記載されるバイオマス分解酵素の由来となる微生物により産生される当該バイオマス分解酵素のバイオマス分解活性よりも良好なバイオマス分解活性を保持する。一実施形態では、機能的なバリアントは、大腸菌により産生されるバイオマス分解酵素としてのバイオマス分解活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくと７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（たとえば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）を有する。複数の実施形態では、機能的なバリアントは、大腸菌または当該バイオマス分解酵素の由来となる微生物により産生されるバイオマス分解酵素としてのバイオマス分解活性の少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、またはそれ以上を有する。バイオマス分解活性は、本明細書中記載される機能的なアッセイを使用して試験することができる。一実施形態では、機能的なバリアントは、Ｔ．リーセイにより生成されるＣｅｌ３ａのセロビアーゼ活性よりも良好であるセロビアーゼ活性を保持する。別の実施形態では、機能的バリアントは、Ｃｅｌ３ａまたは大腸菌により生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む酵素としてのセロビアーゼ活性の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）を有する。複数の実施形態では、機能的なバリアントは、本明細書中記載されるバイオマス分解酵素と比較して増大したバイオマス分解活性、たとえば本明細書中記載されるバイオマス分解酵素のバイオマス活性、たとえば、Ｃｅｌａ、または大腸菌もしくは当該酵素の由来となる微生物により産生されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む酵素としてのセロビアーゼ活性の、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、またはそれ以上のバイオマス分解活性を有する。
【００８６】
機能的バリアント中に存在する突然変異は、アミノ酸置換、付加、および欠失を含む。突然変異は、当技術分野で知られている標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発により導入することができる。突然変異は保存的アミノ酸置換とすることができ、この場合、アミノ酸残基は同様の側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。このように、本開示のセロビアーゼ活性を有するポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸により置き換えることができ、得られたポリペプチドは、野生型ポリペプチドに匹敵するセロビアーゼ活性（例えば、そのセロビアーゼ活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）を保持する。あるいは、突然変異は、アミノ酸残基が異なる側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられるアミノ酸置換であってもよい。
【００８７】
このような突然変異はバイオマス分解酵素、たとえばセロビアーゼ、リグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、またはセロビオヒドロラーゼの様々な酵素特性を変化させ、またはこれに影響を与え得る。例えば、このような突然変異は、バイオマス分解活性、熱安定性、反応のための最適ｐＨ、酵素動力学、またはバイオマス分解酵素の基質認識を変化させ、またはこれに影響を与え得る。いくつかの実施形態では、突然変異は、バイオマス分解酵素、たとえばＴ．リーセイにより生成されるセロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、バリアントのバイオマス分解活性を増加させる。いくつかの実施形態では、突然変異は、野生型のバイオマス分解酵素、たとえばセロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、バリアントの熱安定性を増加または減少させる。一実施形態では、突然変異は、野生型のバイオマス分解酵素、たとえば野生型のセロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、バリアントが最適にバイオマス分解反応を実施するｐＨ範囲を変化させる。一実施形態では、突然変異は、野生型のバイオマス分解酵素、たとえば野生型のセロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、バイオマス分解反応の動力学（例えば、ｋｃａｔ、ＫＭまたはＫＤ）を増加または減少させる。一実施形態では、突然変異は、野生型セロビアーゼおよび／または大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と比べて、基質（例えば、セロビオース）を認識する、またはこれに結合するセロビアーゼの能力を増加または減少させる。
【００８８】
本発明はまた、本明細書で記載されるバイオマス分解活性、たとえばセロビアーゼ活性を有するポリペプチド、例えば、Ｃｅｌ３ａまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の機能的断片を提供する。当業者であれば、酵素活性に関与する機能ドメインを含む、本明細書で記載されるバイオマス分解活性を有するポリペプチドの断片は機能活性、例えば、バイオマス分解活性を保持することは容易に想定することができるであろう。そのため、このような断片は本発明に包含される。一実施形態では、機能的断片は少なくとも７００アミノ酸、少なくとも６５０アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも５５０アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも４５０アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、または少なくとも５０アミノ酸の長さである。一実施形態では、機能的断片は７００〜７４４アミノ酸、６５０〜６９９アミノ酸、６００〜６４９アミノ酸、５５０〜５９９アミノ酸、５００〜５４９アミノ酸、４５０〜４９９アミノ酸、４００〜４４９アミノ酸、３５０〜３９９アミノ酸、３００〜３４９アミノ酸、２５０〜２９９アミノ酸、２００〜２４９アミノ酸、１５０〜１９９アミノ酸、１００〜１４９アミノ酸、または５０〜９９アミノ酸である。上記のアミノ酸長さの範囲に関しては、アミノ酸長さの最小および最高値は、各開示範囲内に含まれる。一実施形態では、機能的な断片は、本明細書中に記載される野生型のバイオマス分解酵素または大腸菌で産生されるバイオマス分解酵素としてのバイオマス分解活性の、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％を有する。一実施形態では、機能的断片は、野生型Ｃｅｌ３ａまたは大腸菌において生成されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むポリペプチドとしてのセロビアーゼ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を有する。
【００８９】
セロビアーゼ活性を検出するためのアッセイは当技術分野で知られている。例えば、セロビオースから放出されるグルコースの量の検出は、精製セロビアーゼを基質、例えば、セロビオース、Ｄ−（＋）−セロビオースと共にインキュベートし、反応の完了後に得られた遊離グルコースの量を検出することにより決定することができる。遊離グルコースの量は、当技術分野で知られている様々な方法を用いて決定することができる。例えば、精製セロビアーゼの希釈物が、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０  ＮａＯＨを含む緩衝液中で調製される。セロビオース基質が精製セロビアーゼに、反応混合物中のセロビオースの最終濃度が３０ｍＭとなるような量で添加される。反応混合物は、反応が起こるのに好適な条件下で、例えば、振盪機（７００ｒｐｍ）にて、４８℃で３０分間インキュベートされる。反応を停止させるために、反応混合物は５分間１００℃で加熱される。反応混合物は、０．４５μｍフィルタに通して濾過され、濾液が分析され、グルコースおよび／またはセロビアーゼの量が定量される。グルコースなどの分析物を測定するＹＳＩ機器を使用して、反応から生成されたグルコースの濃度を決定することができる。あるいは、ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）を使用して、反応からのグルコースおよびセロビオースの濃度を決定することができる。このアッセイは単一反応または多段反応フォーマット、例えば、９６ウェルフォーマットでフォーマットすることができる。いくつかの実施形態では、多段反応フォーマットが、精製セロビアーゼの異なる濃度に対するセロビアーゼ活性を表す活性曲線を作成するのに好ましい可能性がある。精製セロビアーゼの濃度は、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて決定することができる。精製セロビアーゼアッセイの希釈物は、例えば、２倍希釈で調製され、９６ウェルプレート、例えば、１２ウェルの２倍希釈にアリコートされる。セロビオース基質が前述したように添加され、そのため、反応物中のセロビアーゼの最終濃度は３０ｍＭとなる。プレートは密閉され、セロビアーゼ反応が起こるのに十分な条件下で、その後、反応を停止させる条件下で処理される。反応物はその後、９６ウェルフォーマット０．４５μｍメンブレン（例えば、Ｄｕｒａｐｏｒｅ）に通して濾過され、ＹＳＩおよび／またはＨＰＬＣ法、例えば、ＵＰＬＣにより分析される。
【００９０】
この活性アッセイはまた、濃度がわかっていない試料に関して濃度を推定するためにセロビアーゼの既知の濃度活性の検量線を作成することにより、知られていない濃度の試料中のセロビアーゼの濃度または力価を決定するために使用することもできる。たとえば、既知の濃度のセロビアーゼの２倍の段階希釈物を、９６ウェルプレートのうちの１列で調製し、たとえば１２個の２倍の段階希釈物を調製する。他の列は、力価が決定されている他の残りの試料、たとえば粗製ライセート試料または可溶化した封入体の試料の２倍の段階希釈物を含む。希釈物を、５０ｍＭクエン酸二水素ナトリウム緩衝液中のＤ−（＋）−セロビオース（Ｆｌｕｋａ）基質溶液（ｐＨ５．０）と、４８℃で３０分間インキュベートする。３０分後、試料を１００℃まで１０分間加熱し、反応を停止させる。試料をグルコースおよびセロビオースに対して、ＹＳＩ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ分析計（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および／またはＨＰＬＣ方法を用いて分析する。既知の濃度の試料を使用して、検量線を、アッセイの直線範囲内のデータ点を用いて作成する。未知の力価を伴う試料から検出したセロビアーゼ活性を検量線と比較して、これら試料中のセロビアーゼの力価を決定することができる。
【００９１】
活性の単位は、アッセイの直線範囲内の値を使用して計算した場合の相対的なものにすぎない。アッセイの直線範囲は、元の可溶性基質ロードの３０％未満であるグルコース値を用いて規定される。加えて、０．０５ｇ／Ｌ未満のグルコース値は計測手段報告レベルのために省略される。１単位のセロビアーゼ活性は、３０分あたりのＣｅｌ３ａの量あたりのグルコースの量として規定される：［グルコース］ｇ／Ｌ／［Ｃｅｌ３ａ］ｇ／Ｌ／３０分。
【００９２】
他の実施形態では、比色分析／蛍光定量的アッセイが使用され得る。精製セロビアーゼが基質セロビオースと共に、反応が起こる条件下でインキュベートされる。生成グルコースの検出は次の通りである。グルコースオキシダーゼが混合物に添加され、グルコースオキシダーゼはグルコース（生成物）を酸化してグルコン酸および過酸化水素にする。ペルオキシダーゼおよびｏ−ジアニシジンがその後に添加される。ｏ−ジアニシジンは過酸化水素と、ペルオキシダーゼの存在下で反応し、着色生成物を形成する。硫酸を添加し、これは酸化ｏ−ジアニシジンと反応し、より安定な着色生成物を形成する。色の強度は、例えば、分光光度計または比色計により、例えば、５４０ｎｍで測定すると、グルコース濃度に正比例する。このような比色分析／蛍光定量的グルコースアッセイは、例えばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログＮｏ．ＧＡＧＯ−２０から市販されている。
【００９３】
リグニナーゼ活性を検出するアッセイは、当該分野で知られている。リグニナーゼ活性は、ベラトリルアルコールのベラトリルアルデヒド（ｖｅｒａｔｒｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ）（ベラトリルアルコールはＶＡＯと略記される）への酸化の比率を決定することにより測定することができる。反応混合物が調製されており、これは、最終容量が０．５ｍｌで酵素の希釈物、２ｍＭのベラトリルアルコール、０．４ｍＭのＨ２Ｏ２、および２０または１００ｍＭの酒石酸ナトリウム（ｐＨ２．９）を含む。この反応を、Ｈ２Ｏ２の添加により開始し、３１０ｎｍで分光光度法によりモニタリングした。標準物質としてウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（ミズーリ州セントルイス））を使用することにより、またはタンパク質溶液の４０９ｎｍでの吸光度を使用し、かつリグニナーゼの吸光係数からタンパク質量を計算することにより、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．Ｍ．，  （１９７６）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２：２４８−２５４にしたがってタンパク質を決定した。
【００９４】
エンドグルカナーゼ活性を検出する方法は当該分野で知られている。たとえば、エンドグルカナーゼ活性は、基質のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の加水分解を測定し、ＢＣＡ法により還元端の濃度を定量化することにより決定することができ、ここでは、還元端の総濃度は、還元端の濃度に比例した試料溶液の色の変化により提示されている。第１に、バイオマス分解活性を有するポリペプチドを、ｐＨ４．８、５０ｍＭのクエン酸塩バッファーに希釈する。ＣＭＣ溶液（クエン酸ナトリウム緩衝液中０．０５％ｗ／ｖのＣＭＣ）を反応チューブに添加し、５０Ｃで平衡化する。希釈した酵素試料を反応物に添加し、５０℃で１０分間インキュベートする。ＢＣＡ試薬を添加し、７５℃で３０分間インキュベートする。酵素のブランクおよび基質のブランクの読み取り値を減算した後に、吸光度を５６０ｎｍで読み取る。酵素の活性を、還元端の濃度と酵素の濃度との間の直線状の範囲に基づき計算することができる。他のエンドグルカナーゼ活性のアッセイは、たとえば基質の粘度の低下を決定することによるといったアッセイ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ，  ２００６，  ２４：４５２−４８１）が、当該分野で知られている。
【００９５】
セオビオヒドロラーゼ活性を検出するアッセイは当該分野で知られている。セロビオヒドロラーゼ活性は、フェノール‐硫酸アッセイにおける基質Ａｖｉｃｅｌから放出した可溶性基質を測定することにより決定することができる。Ａｖｉｃｅｌ溶液（酢酸緩衝液中１．２５％ｗ／ｖ）を反応チューブにアリコートし、酵素の希釈物を調製する。基質溶液および酵素の溶液を両方とも５０℃で平衡化する。希釈した酵素溶液を基質に添加し、反応を起こすために十分な時間、たとえば５０℃で２時間インキュベートする。氷冷したウォーターバスへ試料を沈めることにより反応を停止する。試料を遠心して、試料を可溶性分画および不溶性分画に分離する。可溶性分画中の可溶性糖の総濃度を、フェノール―硫酸アッセイにより決定する。具体的には、可溶性分画のアリコートを、５％のフェノールと混合し、濃硫酸を添加する。反応物を室温に冷却し（約２０〜３０分）、試料の吸光度を４９０ｎｍで読み取る。全体の可溶性の糖の放出と酵素の希釈との間の直線状の関係に基づき、酵素の活性を計算する。他のセロビオヒドロラーゼ活性アッセイが、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｖｏｌ．  ５８１，  ｐａｇｅｓ  ２１３−２３１に記載されている。
【００９６】
キシラナーゼ活性を検出するアッセイは当該分野に知られている。キシラナーゼ活性は、発色アッセイによるキシランの基質から放出されたキシロースのレベルを測定することにより決定できる。キシランの基質を、ｐＨ４．５の５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中１．０％ｗ／ｖの溶液として調製する。調製した酵素の希釈物。キシランおよび酵素の希釈物を混合し、反応が起こるために十分な条件下、たとえば３０℃で１０分間インキュベートする。次に、１６ｍＭの硫酸銅、１．３Ｍの硫酸ナトリウム、２２６ｍＭの炭酸ナトリウム、１９０ｍＭの重炭酸ナトリウム、および４３ｍＭの酒石酸カリウムナトリウムを含む溶液を反応物に添加する。次に反応物を１０分間煮沸し、室温に冷却する。４０ｍＭのモリブデン酸、１９ｍＭのヒ酸、および７５６ｍＭの硫酸を含む溶液を添加する。泡形成が停止し、存在するいずれかの沈殿物が溶解するまで、反応物を震盪またはボルテックスする。反応物を明瞭になるまで遠心し、次に溶液を、５４０ｎＭの分光光度計により読み取り（ｒｅａｄｙ）、全体の可溶性の糖の放出と酵素の希釈との間の直線状の関係に基づき酵素活性を計算する。
【００９７】
アグリコシル化したポリペプチド
本明細書中に記載されるバイオマス分解活性、たとえばセロビアーゼ活性を有するポリペプチドのいずれかは、グリコシル化またはアグリコシル化することができる。バイオマス分解活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドは、本明細書中に記載されるように封入体から可溶化されてもよい。あるいは、バイオマス分解活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドは、封入体から可溶化されたバイオマス分解活性を有するポリペプチドを含む混合物に添加してもよく、ここで封入体から可溶化されたポリペプチドはグリコシル化またはアグリコシル化することができる
【００９８】
グリコシル化は酵素プロセスであり、これにより、炭水化物がグリコシル受容体、例えば、アルギニンまたはアスパルギニン（ａｓｐａｒｇｉｎｉｎｅ）側鎖の窒素あるいはセリン、スレオニン、またはチロシン側鎖のヒドロキシル酸素に付着される。Ｎ−連結およびＯ−連結グリコシル化の２つの型のグリコシル化が存在する。Ｎ−連結グリコシル化は、コンセンサス部位Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒで起こり、ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸とすることができる。Ｏ−連結グリコシル化はＳｅｒ／Ｔｈｒ残基で起こる。グリコシル化部位は、当技術分野で知られている様々なアルゴリズム、例えば、スイスバイオインフォマティクス研究所により公的に入手可能なＰｒｏｓｉｔｅ、および、生化学配列分析センターにより公的に入手可能なＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０またはＮｅｔＯＧｌｙｃ４．０を使用して予測することができる。
【００９９】
本発明は、バイオマス分解活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを生成する方法を提供する。一実施形態では、このポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドがグリコシル化できないように変質または変異されており、たとえば１つまたは複数のグリコシル化部位が、グリカンがグリコシル化部位に結合できないように変異している。たとえば本明細書中に記載される核酸配列によりコードされるバイオマス分解活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドは、グリカンがもはやグリコシル化部位に付着または結合できないように変異した１つまたは複数のグリコシル化部位での１つまたは複数の変異を含む。別の例では、本明細書中に記載される核酸配列によりコードされるバイオマス分解活性を有するポリペプチドは、グリカンがもはやグリコシル化部位に付着または結合できないように変異した１つまたは複数のグリコシル化部位の近くの１つまたは複数の変異を含む。例えば、グリコシル化部位の近位での突然変異はグリコシル化酵素により認識されるコンセンサスモチーフを変異させ、またはポリペプチドのコンフォメーションを変化させ、そのため、ポリペプチドはグリコシル化され得ず、例えば、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｌａｔｉｏｎ）部位は隠され、または新しいコンフォメーションによる立体障害は、グリコシル化酵素がグリコシル化部位にアクセスしないように防止する。バイオマス分解活性を有するポリペプチドにおけるグリコシル化部位の近位の突然変異はグリコシル化部位からすぐ隣、または少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも４０アミノ酸にあり、グリコシル化部位は近位突然変異の結果として、グリコシル化されない。
【０１００】
一実施形態では、セロビアーゼ、たとえばＣｅｌ３ａ、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の次のグリコシル化部位の１つ以上が変異される：アミノ酸位置７８のスレオニン、アミノ酸位置２４１のスレオニン、アミノ酸位置３４３のセリン、アミノ酸位置４５０のセリン、アミノ酸位置５９９のスレオニン、アミノ酸位置６１６のセリン、アミノ酸位置６９１のスレオニン、アミノ酸位置２１のセリン、アミノ酸位置２４のスレオニン、アミノ酸位置２５のセリン、アミノ酸位置２８のセリン、アミノ酸位置３８のスレオニン、アミノ酸位置４２のスレオニン、アミノ酸位置３０３のスレオニン、アミノ酸位置３９８のセリン、アミノ酸位置４３５のセリン、アミノ酸位置４３６のセリン、アミノ酸位置４３９のスレオニン、アミノ酸位置４４２のスレオニン、アミノ酸位置４４６のスレオニン、アミノ酸位置４５１のセリン、アミノ酸位置６１９のセリン、アミノ酸位置６２２のセリン、アミノ酸位置６２３のスレオニン、アミノ酸位置６２６のセリン、またはアミノ酸位置６３０のスレオニン、またはそれらの任意の組み合わせ。複数の実施形態では、グリコシル化部位はセリンまたはスレオニンからアラニンに変異される。例えば、本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドは次の突然変異の１つ以上を有する：Ｔ７８Ａ、Ｔ２４１Ａ、Ｓ３４３Ａ、Ｓ４５０Ａ、Ｔ５９９Ａ、Ｓ６１６Ａ、Ｔ６９１Ａ、Ｓ２１Ａ、Ｔ２４Ａ、Ｓ２５Ａ、Ｓ２８Ａ、Ｔ３８Ａ、Ｔ４２Ａ、Ｔ３０３Ａ、Ｔ３９８Ａ、Ｓ４３５Ａ、Ｓ４３６Ａ、Ｔ４３９Ａ、Ｔ４４２Ａ、Ｔ４４６Ａ、Ｓ４５１Ａ、Ｓ６１９Ａ、Ｓ６２２Ａ、Ｔ６２３Ａ、Ｓ６２６Ａ、もしくはＴ６３０Ａ、またはそれらの任意の組み合わせ。あるいは、上記のグリコシル化部位の近位の１つ以上のアミノ酸が変異される。
【０１０１】
ポリペプチドがグリカンにより修飾されたかどうか（例えば、ポリペプチドがグリコシル化されたか、またはアグリコシル化されたか）を検出するためのアッセイは当技術分野で知られている。ポリペプチドは精製または単離することができ、グリカン部分の検出および定量化のために染色することができ、またはポリペプチドは質量分析により分析することができ、対応する参照ポリペプチドと比較することができる。参照ポリペプチドは試験ポリペプチド（そのグリコシル化状態が決定される）と同じ一次配列を有するが、グリコシル化されているか、またはアグリコシル化されている。
【０１０２】
本明細書で記載されるアグリコシル化されたポリペプチドは、対応するグリコシル化されたポリペプチド、例えば、グリコシル化されたＣｅｌ３ａポリペプチドと比べて増加したバイオマス分解活性、たとえばセロビアーゼ活性を有する。例えば、バイオマス分解活性、たとえばセロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドは、グリコシル化された（ｇｌｙｏｃｙｏｓｙｌａｔｅｄ）ポリペプチドと比べて、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または２００％のバイオマス分解活性、たとえばセロビアーゼ活性を有する。
【０１０３】
核酸、発現ベクター、および宿主細胞
本明細書中記載されるバイオマス分解活性を有するポリペプチドは、宿主細胞で発現されている。一実施形態では、バイオマス分解活性を有する本明細書中記載されるポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を、バイオマス分解活性を有するポリペプチドの発現に適切な条件下で培養する。複数の実施形態では、バイオマス分解活性を有するポリペプチドの発現は、封入体、またはバイオマス分解活性を有するポリペプチドを含む凝集物が形成されるようなレベルである。また、宿主細胞で発現したバイオマス分解活性を有する可溶性ポリペプチドを発現し単離する方法が、本明細書中に記載される。封入体からバイオマス分解活性を有するポリペプチドを可溶化し、単離する方法が、「封入体からの可溶化」という名称のセクションでさらに記載されている。
【０１０４】
また本発明は、バイオ分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。一実施形態では、核酸配列は、本明細書中記載されるリグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、またはセロビアーゼをコードする。バイオマス分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、宿主細胞における発現を増加させるためにコドン−最適化させることができる。コドン最適化は、コドン利用バイアス、潜在スプライシング部位、ｍＲＮＡ二次構造、未熟ポリＡ部位、コドンとアンチコドンの相互作用、およびＲＮＡ不安定性モチーフを含む要因を考慮して、コードされるポリペプチドの宿主における発現を増加させるために核酸配列を変化させることを含む。コドン−最適化のための様々なアルゴリズムおよび商業サービスは当技術分野で知られており、使用可能である。
【０１０５】
一実施形態では、核酸配列は、本明細書で記載されるアミノ酸配列、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するＴ．リーセイ由来のＣｅｌ３ａ酵素をコードする。一実施形態では、Ｃｅｌ３ａをコードする核酸配列は以下の通りである。
【化２】
2017530702.tif 000003
Ｃｅｌ３ａをコードするコドン−最適化核酸配列は以下の通りである。
【化３】
2017530702.tif 000004
【０１０６】
一実施形態では、Ｃｅｌ３ａ酵素またはその機能的バリアントをコードする核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対し少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を含む。一実施形態では、Ｃｅｌ３ａ酵素またはその機能的バリアントをコードする核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を含む。
【０１０７】
また本明細書では、本明細書中に記載されるバイオマス分解活性を有するアグリコシル化されたポリペプチド、例えば、Ｃｅｌ３ａポリペプチドをコードする核酸配列が提供され、この場合、ポリペプチド中に存在する１つ以上のグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｌｙａｔｉｏｎ）部位は、グリカンがもはや、グリコシル化部位に付着または連結することはできないように、変異されている。別の実施形態では、上記のアグリコシル化されたポリペプチド、例えば、Ｃｅｌ３ａポリペプチドをコードする、本明細書で記載される核酸配列が提供され、この場合、ポリペプチド中に存在する１つ以上のグリコシル化部位の近位での１つ以上の突然変異は、前述したように、グリカンがもはや、グリコシル化部位に付着または連結することはできないように、変異されている。
【０１０８】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離またはクローン化するために使用される技術は当技術分野で知られており、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、またはそれらの組み合わせが含まれる。このようなゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば、よく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または共通構造特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用することにより実施することができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  ＰＣＲ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）およびヌクレオチド配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の増幅手順が使用され得る。核酸配列は、トリコデルマ・リーセイ、例えば、野生型Ｔ．リーセイ、またはＴ．リーセイＲＵＴＣ３０の株、または別のもしくは関連生物からクローン化され得、よって、例えば、核酸配列のポリペプチドコード領域のアレルまたは種バリアントであってもよい。
【０１０９】
核酸配列は、核酸配列をその自然の位置から異なる部位へ再配置する、遺伝子操作において使用される標準クローニング手順により得られ得、この場合、それは複製され得る。クローニング手順は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む所望の断片の切除および単離、断片のベクター分子中への挿入、および組換えベクターの宿主細胞中への組み込みを含むことができ、この場合、ヌクレオチド配列の複数のコピーまたはクローンが複製される。ヌクレオチド配列はゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０１１０】
本明細書では、「発現ベクター」とは、対象となる核酸配列を宿主細胞中に導入し、発現させるための核酸コンストラクトである。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書中記載される核酸配列に作動可能に連結され、これによりコードされるポリペプチドの発現を実行することができる好適な制御配列を含む。制御配列は、核酸配列の発現のために宿主細胞により認識される適切なプロモーター配列であってもよい。一実施形態では、対象となる核酸配列は、本明細書で記載されるバイオマス分解活性、たとえばセロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列である。
【０１１１】
本明細書中記載される発現ベクターにおけるプロモーターは、宿主細胞に対して同種または異種の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られるプロモーター、変異プロモーター、切断型プロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含むことができる。
【０１１２】
細菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を管理するための好適なプロモーターの例は、大腸菌ｌａｃオペロン、大腸菌ｔａｃプロモーター（ハイブリッドプロモーター、ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ，  １９８３，  ８０：２１−２５）、大腸菌ｒｅｃ  Ａ、大腸菌ａｒａＢＡＤ、大腸菌ｔｅｔＡ、および原核生物β−ラクタマーゼから得られるプロモーターである。好適なプロモーターの他の例としては、ウイルスプロモーター、例えばバクテリオファージ由来のプロモーター、例として、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｍ１３プロモーター、およびＳＰ６プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、１を超えるプロモーター、例えば、大腸菌ｌａｃプロモーターおよびＴ７プロモーターが、対象となる核酸配列の発現を制御する。本発明において使用するのに好適となり得るさらなるプロモーターは、“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，  １９８０，  ２４２：７４−９４、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８９において記載される。いくつかの好ましい実施形態では、プロモーターは誘導性であり、この場合、分子の添加は下流読み枠の転写および発現を刺激する。
【０１１３】
真核宿主細胞、例えば、真菌または酵母細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を管理するための好適なプロモーターの例は、トリコデルマ・リーセイ、メタノール−誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸプロモーター）、アスペルギルス・ニデュランストリプトファン生合成（ｔｒｐＣプロモーター）、クロコウジカビ変種アワモリフルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、サッカロマイセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、またはクルイベロミセス・ラクチスＰｌａｃ４−ＰＢＩプロモーターの遺伝子から得られるプロモーターである。
【０１１４】
本明細書中記載される発現ベクター中に存在する制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせるシグナル配列であってもよく、例えば、分泌シグナル配列である。シグナル配列は内在性シグナル配列であってもよく、例えば、対象となるポリペプチドの起源である生物により内因的に発現される時に、シグナル配列が野生型ポリペプチドのＮ末端に存在する場合である。シグナル配列は、外来性、または異種性、シグナルペプチドであってもよく、この場合、シグナル配列は、発現される対象となるポリペプチドとは異なる生物または異なるポリペプチドに由来する。発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路中に向かわせる任意のシグナル配列が本発明で使用され得る。典型的には、シグナル配列は、６〜１３６の塩基性および／または疎水性（ｈｙｃｒｏｐｈｏｂｉｃ）アミノ酸から構成される。
【０１１５】
本発明に好適なシグナル配列の例としては、サッカロマイセス・セレビシエα−因子由来のシグナル配列が挙げられる。
【０１１６】
融合タグもまた、本明細書中記載される発現ベクターにおいて、発現されるポリペプチドの検出および精製を促進するために使用され得る。好適な融合タグの例としては、Ｈｉｓ−タグ（例えば、３×Ｈｉｓ、６×Ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、または８×Ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１））、ＧＳＴ−タグ、ＨＳＶ−タグ、Ｓ−タグ、Ｔ７タグが挙げられる。他の好適な融合タグとしては、ｍｙｃタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、および蛍光タンパク質タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質）が挙げられる。融合タグは、典型的には、発現されるポリペプチドのＮまたはＣ末端に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、融合タグ配列と発現されるポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の間にリンカー領域が存在してもよい。一実施形態では、リンカー領域は、１〜２０アミノ酸の配列を含み、これは発現されるポリペプチドの発現または機能に影響せず、またはこれを変化させない。
【０１１７】
本明細書で記載される融合タグの利用は、発現されたタンパク質の検出を、例えば、ウエスタンブロットにより、タグを特異的に認識する抗体を使用することにより可能にする。タグはまた、発現されたポリペプチドの宿主細胞からの、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にする。例えば、Ｈｉｓ−タグに融合された発現されたポリペプチドは、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用することにより精製することができる。Ｈｉｓタグは、ニッケルイオンに対して親和性を有し、およびニッケルカラムはｈｉｓ−タグ付けされたポリペプチドを保持し、一方、他のタンパク質および細胞のデブリは全てカラムを通って流れることができる。例えば、イミダゾールを含む溶離緩衝液を使用する、Ｈｉｓ−タグ付けされたポリペプチドの溶離により、Ｈｉｓ−タグ付けされたポリペプチドがカラムから放出され、実質的に精製されたポリペプチドが得られる。
【０１１８】
本明細書中記載される発現ベクターはさらに、当業者に一般に知られているコンストラクトで形質転換された遺伝子改変微生物の単離を可能にする、選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質に対する抵抗性、または、そうでなければ、これらの条件下で増殖することができない宿主生物への特定の栄養分が欠如した培地で増殖する能力を付与し得る。本発明は、選択可能なマーカー遺伝子の選択により限定されず、当業者は容易に適切な遺伝子を決定し得る。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ジェネテシン、またはＧ４１８に対する耐性を付与することができ、またはｔｒｐ、ａｒｇ、ｌｅｕ、ｐｙｒ４、ｐｙｒ、ｕｒａ３、ｕｒａ５、ｈｉｓ、またはａｄｅ遺伝子の１つにおける宿主微生物の欠損を補完することができ、またはアセトアミドを唯一の窒素源として増殖する能力を付与することができる。
【０１１９】
本明細書中記載される発現ベクターはさらに、当業者に一般に知られている、他の核酸配列、例えば、追加の制御配列、例えば、転写ターミネーター、様々な他の核酸配列を一緒に連結するための合成配列、複製開始点、リボソーム結合部位、マルチクローニング部位（またはポリリンカー部位）、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターに好適なリボソーム結合部位は使用される宿主細胞に依存し、例えば、原核宿主細胞における発現では、原核ＲＢＳ、例えば、Ｔ７ファージＲＢＳが使用され得る。マルチクローニング部位、またはポリリンカー部位は、１つ以上の制限酵素部位を含み、それらは、好ましくは発現ベクターの残りの配列中には存在しない。制限酵素部位は、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列または他の所望の制御配列の挿入のために使用される。本発明の実施は、これらの他の核酸配列の任意の１つ以上、例えば、他の制御配列の存在により限定されない。
【０１２０】
本発明において使用するための好適な発現ベクターの例としては、原核生物における発現のためのベクター、例えば、細菌発現ベクターが挙げられる。本発明において使用するのに好適な細菌発現ベクターはｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）であり、これは次を含む：ウイルスＴ７プロモーター（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのみに特異的であり（細菌ＲＮＡポリメラーゼではない）、原核生物ゲノムのいずれにおいても起こらない）、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃリプレッサータンパク質に対するコード配列を含むｌａｃオペレーター（ｌａｃＩ遺伝子）、ポリリンカー、ｆ１複製開始点（そのため、Ｍ１３ヘルパーファージに同時感染した場合に、一本鎖プラスミドが生成され得る）、アンピシリン耐性遺伝子、およびＣｏｌＥ１複製開始点（Ｂｌａｂｅｒ、１９９８）。プロモーターおよびｌａｃオペレーターのどちらもポリリンカーの５’、または上流に位置し、ここで、本明細書で記載されるポリペプチドをコードする核酸配列が挿入される。ｌａｃオペレーターは、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の誘導発現を付与する。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）、ラクトース代謝産物の添加は、ｌａｃオペロンの転写を誘発し、ｌａｃオペレーターの制御下で、核酸配列のタンパク質発現を誘導する。この系の使用には、ベクター発現のためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの宿主細胞への添加が必要とされる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは第２の発現ベクターを介して導入することができ、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するように遺伝子操作された宿主細胞株が使用され得る。
【０１２１】
本発明と共に使用するための例示的な発現ベクターは、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されているｐＥＴベクターである。ｐＥＴ発現系は、米国特許第４，９５２，４９６号；５，６９３，４８９号；ならびに５，８６９，３２０号に記載される。一実施形態では、ｐＥＴベクターはＮｏｖａｇｅｎから市販されているｐＥＴ−ＤＵＥＴベクター、例えば、ｐＥＴ−Ｄｕｅｔ１である。本発明において使用するのに好適な他のベクターとしては、Ｈｉｓ−タグ配列を含むベクター、例えば、米国特許第５，３１０，６６３号および５，２８４，９３３号；ならびに欧州特許第２８２０４２号に記載されるものが挙げられる。
【０１２２】
本発明はまた、本発明の核酸配列または発現ベクターを含む宿主細胞に関し、それらはバイオマス分解活性を有するポリペプチドの組換え生成において使用される。
【０１２３】
本発明の核酸配列を含む発現ベクターは宿主細胞中に導入され、そのため、ベクターは維持され（例えば、染色体組込みにより、または自己複製染色体外ベクターとして）、そのため、ポリペプチドが発現される。
【０１２４】
宿主細胞は原核生物または真核生物であってもよい。宿主細胞は細菌、例えば大腸菌株、例えば、Ｋ１２株ＮｏｖａＢｌｕｅ、ＮｏｖａＢｌｕｅＴ１Ｒ、ＪＭ１０９、およびＤＨ５αであってもよい。好ましくは、細菌細胞は、外因的に発現されたタンパク質を折り畳む、または部分的に折り畳む能力を有し、例えば大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ株、例えば、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ、Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ２、およびＯｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）株である。いくつかの実施形態では、グリコシル化が欠失した、またはグリコシル化経路が障害された宿主細胞を使用することが好ましく、そのため、宿主細胞により発現されたタンパク質は著しくグリコシル化されていない。
【０１２５】
宿主細胞は酵母または糸状菌、特に子嚢菌として分類されるものであってもよい。本発明の修飾されたＴｒＣｅｌ３Ａβ−グルコシダーゼの発現のための宿主微生物として有用な酵母の属としてはサッカロマイセス、ピキア、ハンゼヌラ、クリベロミセス、ヤロウイア、およびアルクスラが挙げられる。本発明のポリペプチドの発現のための微生物として有用な真菌の属としては、トリコデルマ、ヒポクレア、アスペルギルス、フサリウム、ヒュミコラ、ニューロスポラ、クリソスポリウム、ミセリオフソラ、チエラビア、スポロトリカムおよびペニシリウムが挙げられる。例えば、宿主細胞はピキア・パストリスであってもよい。例えば、宿主細胞はトリコデルマ・リーセイの工業菌株、またはそのバリアント、例えば、Ｔ．リーセイＲＵＴＣ３０であってもよい。典型的には、宿主細胞は親バイオマス分解酵素、たとえばセロビアーゼまたはＣｅｌ３ａを発現しないものである。
【０１２６】
特定の宿主細胞、例えば、細菌細胞または真菌細胞の選択は、発現ベクター（例えば、制御配列）および／または以下にさらに詳細に記載される本発明のアグリコシル化されたポリペプチドを生成するために使用される方法に依存する。
【０１２７】
本発明の発現ベクターは宿主細胞に、微生物の形質転換の当業者に知られている多くの方法、例えば、限定はされないが、形質転換、細胞のＣａＣｌ２、電気穿孔、微粒子銃照射、リポフェクション、およびプロトプラストのＰＥＧ媒介融合による処理（例えばＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ２００５／０９３０７２号（参照により本明細書に組み込まれる））により、導入され得る。発現ベクターを含む組換え宿主細胞を選択した後（例えば、発現ベクターの選択可能なマーカーを使用する選択による）、組換え宿主細胞は、本発明のバイオマス分解活性を有するポリペプチドの発現を誘導する条件下で培養され得る。
【０１２８】
原核細胞および真核細胞から発現されたバイオマス分解活性を有する可溶性ポリペプチドを回収するための方法は当技術分野で知られている。複数の実施形態では、ポリペプチドを回収するための方法は、たとえば遠心分離または濾過により細胞を回収することと、細胞を、例えば、機械的、化学的、または酵素的手段により溶解することとを含む。例えば、細胞は、例えば、超音波処理、ミリング（ビーズと共に振盪）、またはせん断力により、物理的に破砕することができる。細胞膜は、透過性にし、細胞の内容物が放出されるように処理することができ、例えば、洗浄剤、例えば、トリトン、ＮＰ−４０、またはＳＤＳによる処理である。細胞壁を有する細胞、例えば、細菌細胞は、酵素、例えばリゾチームまたはリゾナーゼを使用して透過性にすることができる。上記の機械的、化学的、および酵素的技術の任意の組み合わせもまた、この発明との関連で、対象となる発現されたポリペプチドを宿主細胞から回収するのに好適である。例えば、本明細書で記載されるバイオマス分解活性を有するポリペプチドを細菌細胞、例えば、大腸菌細胞において発現させる場合、細胞は典型的には、細胞培養物を遠心分離し、ペレット化することにより回収され、リゾチームを含む溶解緩衝液中に細胞ペレット再懸濁させることにより溶解される。完全な溶解を確保するために、再懸濁させた細胞を次の方法の１つに供する：超音波処理、ミリング、または均質化。遠心の後、バイオマス分解活性を有する可溶性ポリペプチドは上清に存在し、バイオマス分解活性を有する不溶性ポリペプチド、たとえば封入体中のポリペプチドはペレットで見いだされる。たとえば封入体から、バイオマス分解活性を有する不溶性ポリペプチドを回収する方法は、以下の「封入体からの可溶化」という表題のセクションでさらに説明されている。
【０１２９】
次に、バイオマス分解活性を有する可溶性ポリペプチドを、当該分野で知られている標準的な方法を使用して細胞のライセートから精製または単離することができる。タグ、たとえばＨｉｓタグを含むバイオマス分解活性を有するポリペプチドでは、ライセートの可溶性分画の残りから可溶性ポリペプチドを分離するために、アフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。
【０１３０】
一実施形態では、本明細書中記載されるバイオマス分解活性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞は、糖化反応のためにバイオマスに添加される前には溶解されない。場合によっては、宿主細胞を溶解し、バイオマス分解活性を有するポリペプチドを抽出する方法は、タンパク質変性および／または酵素活性の減少を引き起こすことがあり、下流加工処理のコストの増加につながる。よって、本発明はまた、本明細書で記載されるバイオマス分解活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを発現する宿主細胞をバイオマスに、糖化工程前に直接添加するための方法を提供する。
【０１３１】
一実施形態では、本明細書で記載されるバイオマス分解活性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞、例えば、大腸菌細胞は、例えば遠心分離により単離され、糖化反応、例えば、バイオマスを含む糖化反応器に添加される。細胞はバイオマスからのせん断、羽根車、および上昇した温度の組み合わせにより溶解される。一実施形態では、本明細書で記載されるバイオマス分解活性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞、例えば、大腸菌細胞の培養物は発酵槽から直接糖化槽に直接添加され、遠心分離により細胞をペレット化する必要性が排除される。一実施形態では、ポリペプチドはグリコシル化またはアグリコシル化されている。
【０１３２】
封入体からの可溶化
複数の実施形態では、本明細書中に開示される細胞、たとえば微生物は、バイオマス分解活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを生成するように本明細書中に記載される方法を使用して遺伝的に改変されている。バイオマス分解活性を有するポリペプチドの少なくとも一部、たとえば少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、遺伝的に改変した細胞中の封入体で見いだされる。封入体からバイオマス分解活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを可溶化する方法が、本明細書中開示される。
【０１３３】
封入体は、高レベルで発現する場合の異種的に発現したタンパク質、たとえばバイオマス分解活性を有するポリペプチドを含む、宿主細胞中の不溶性の凝集体である。封入体は、核または細胞質で見出すことができる。また封入体は、宿主細胞に対して内因性の他のタンパク質、たとえば宿主のタンパク質、リボソームの成分、核酸（たとえばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、および細胞のデブリ（たとえば細胞壁のデブリ、脂質、代謝物）などの他の成分をも含み得る。宿主細胞に内因性のタンパク質は、宿主細胞のゲノムＤＮＡによりコードされているいずれかのタンパク質を含む。宿主細胞に内因性のタンパク質は、細胞質に局在し得る、または異種的に発現したタンパク質と相互作用し得る。封入体で見出すことのできるリボソームの成分の例として、リボソーム、リボソームサブユニットの断片（たとえば５０Ｓサブユニットまたは３０Ｓサブユニット）、部分的に翻訳されたポリペプチド、転移ＲＮＡ、伸長因子、および／またはメッセンジャーＲＮＡが挙げられる。封入体で見出すことのできる核酸の例として、宿主のゲノムＤＮＡ、外来性ＤＮＡ（たとえばプラスミド由来、または宿主細胞に導入した発現ベクター）、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、またはそれらのいずれかの断片が挙げられる。封入体で見出すことのできる細胞のデブリの例として、細胞壁もしくは細胞膜のデブリ（たとえば細胞壁もしくは細胞膜の断片もしくは成分）、核膜のデブリ（たとえば核膜の断片もしくは成分）、他の宿主のオルガネラの断片もしくは成分、エンドトキシン、脂質、ならびに／または代謝物が挙げられる。
【０１３４】
封入体の凝集を低減するさらなる方法として、超音波処理、様々な温度でのインキュベーション、酸／塩基処理、プロテアーゼ処理、電気的な処理、機械的な処理、およびプロテアーゼを産生する生物の添加が挙げられる。たとえば、封入体を含む細胞またはそのライセートを、−２０℃〜０℃、０℃〜４℃、４℃〜２０℃、２０℃〜４０℃、および４０℃〜８０℃の範囲の温度でインキュベートする。
【０１３５】
封入体を単離するために、バイオマス分解活性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞を、まず、リゾチームまたは他の変性剤、超音波処理（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、または高圧ホモジネーションによる溶解などの当該分野の標準的な方法を使用して溶解する。宿主細胞は、封入体の可溶化をもたらさない条件下で溶解される。封入体は、当該分野で知られている技術を使用して宿主細胞から単離される。たとえば細胞のライセートを、バイオマス分解活性を有するポリペプチドおよび他の不溶性物質を含むポリペプチドを含む封入体が不溶性画分に存在し、可溶性分画が、バイオマス分解活性を有する可溶性ポリペプチドを含むように分離されている。このような分離は遠心を介して達成することができ、これにより封入体は、ペレット、たとえば不溶性分画で見いだされ、可溶性ポリペプチドが上清、たとえば可溶性分画で見いだされる。可溶性分画から不溶性分画を分離するために適切な他の方法として、ろ過が挙げられる。
【０１３６】
バイオマス分解活性を有するポリペプチドを放出するための封入体の可溶化は、不溶性分画または封入体に可溶化剤を添加することを含む。一部の実施形態では、可溶化剤は、タンパク質の凝集もしくは沈殿を防止し、またはタンパク質の凝集物を溶解する薬剤とすることができる。一部の実施形態では、可溶化剤は、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、水素結合、双極子間相互作用、イオン相互作用、πスタッキング、またはそれらのいずれかの組み合わせを妨害する薬剤を含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、可溶化剤は、たとえば界面活性剤などの疎水性相互作用を妨害する薬剤とすることができる。例示的な界面活性剤として、非イオン性、双性イオン性、陰イオン性、および陽イオン性の界面活性剤が挙げられる。一部の実施形態では、可溶化剤は、非イオン性、たとえばＮＰ−４０およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とすることができる。一部の実施形態では、可溶化剤は双性イオン性、たとえばＣＨＡＰＳおよびスルホベタイン、たとえばＳＢ３−１０またはＡＳＢ１４とすることができる。一部の実施形態では、タンパク質の薬剤は、陰イオン性、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とすることができる。
【０１３８】
一部の実施形態では、可溶化剤は、ジスルフィド結合を還元する薬剤、たとえばチオール還元剤とすることができる。例示的なチオール還元剤として、２−メルカプトエタノールβＭＥおよびジチオスレイトール（ＤＴＴ）が挙げられる。一部の実施形態では、ジスルフィド結合を還元する可溶化剤は、ホスフィン、たとえばトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、またはトリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）とすることができる。
【０１３９】
一部の実施形態では、可溶化剤は、水素結合および疎水性相互作用を妨害する薬剤とすることができる。一部の実施形態では、可溶化剤は、カオトロピック化合物、たとえば尿素および置換された尿素（たとえばチオウレア）、ならびに塩化グアニジニウムとすることができる。
【０１４０】
一部の実施形態では、可溶化剤は、非極性溶媒である薬剤とすることができる。非極性溶媒は、炭素および水素などの類似の電気陰性度を有する原子の間に結合を含み、非常に低い誘電率を有する。たとえば非極性溶媒は、５未満の誘電率を有する。非極性溶媒の例として、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、ジエチルエーテルが挙げられる。
【０１４１】
一部の実施形態では、可溶化剤は、極性溶媒である薬剤とすることができる。極性溶媒は、大きな双極子モーメント（または「部分的な電荷」）を有することを特徴とし、これらは、酸素および水素などの非常に異なる電気陰性度を有する原子間の結合を含む。一実施形態では、本明細書中の本発明での使用に適した極性溶媒は、少なくとも５または少なくとも２０の誘電率を有する。好ましい実施形態では、極性溶媒は高い誘電率、たとえば２５超の誘電率を有する。一部の実施形態では、可溶化剤は、プロトン性の極性溶媒であり、Ｏ−ＨまたはＮ−Ｈ結合を有し、高い誘電率、たとえば２０超、２５超の誘電率を有し、良好な水素結合の供与体、たとえばギ酸、ｎ−ブタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、エタノール、メタノール、またはニトロメタンである。一部の実施形態では、可溶化剤は、極性の非プロトン性溶媒であり、Ｏ−ＨまたはＮ−Ｈ結合を欠いており、５〜２０の誘電率を有し、たとえばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、アセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはアセトニトリル（ＭｅＣＮ）である。
【０１４２】
一部の実施形態では、可溶化剤は、正の電荷を有する薬剤とすることができ、正味の負に荷電した分子のイオン相互作用を妨害するのに適し得る。例示的な正に荷電した可溶化剤として、Ｎ−メチル  Ｄ−グルカミン、コリン、アルギニン、リジン、プロカイン、トロメタミン（ＴＲＩＳ）、スペルミン、Ｎ−メチル−モルフォリン、グルコサミン、Ｎ，Ｎ−ビス  ２−ヒドロキシエチルグリシン、ジアザビシクロウンデセン、クレアチン、アルギニンエチルエステル、アマンタジン、リマンタジン、オルニチン、タウリン、およびシトルリンが挙げられる。陽イオン部分は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、モルフォリン、メチルグルカミン、およびグルコサミンを追加的に含んでもよい。
【０１４３】
一部の実施形態では、可溶化剤は、負の電荷を有する薬剤とすることができ、正味の正に荷電した分子のイオン相互作用を妨害するのに適切であり得る。例示的な負に荷電した可溶化剤として、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、ヘキサン酸塩、ヘプタン酸塩、レブリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、クエン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、３−ヒドロキシイソ酪酸塩、２−ヒドロキシイソ酪酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、ピルビン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、タルトロナート、硝酸塩、リン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、酢酸、アダマンタン酸（ａｄａｍａｎｔｏｉｃ  ａｃｉｄ）、αケトグルタル酸、Ｄ−またはＬ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、１０−カンファースルホン酸、クエン酸、１，２−エタンジスルホン酸、フマル酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルクロン酸、グルカル酸、Ｄ−またはＬ−グルタミン酸、グルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、臭化水素酸、塩酸、１−ヒドロキシル−２−ナフトエ酸（ｎａｐｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ラクトビオン酸（ｌａｃｔｏｂｉｏｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、マレイン酸、Ｌ−リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、１，５ナフタレンジスルホン酸四水和物、２−ナフタレンスルホン酸（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、硝酸、オレイン酸、パモ酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸水和物、Ｄ−サッカリン酸（ｓａｃｃｈａｒｉｄ  ａｃｉｄ）一カリウム塩、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、およびＤ−またはＬ−酒石酸が挙げられる。
【０１４４】
可溶化剤は、封入体からバイオマス分解活性を有するポリペプチドを可溶化するのに十分な濃度、たとえば約０．０１〜１０Ｍ、約０．０５〜１０Ｍ、約０．１〜１０Ｍ、約０．２〜１０Ｍ、約０．５〜１０Ｍ、約１〜１０Ｍ、約２〜１０Ｍ、約５〜１０Ｍ、約８〜１０Ｍ、約０．０１〜６Ｍ、約０．０５〜６Ｍ、約０．１〜６Ｍ、約０．２〜６Ｍ、約０．５〜６Ｍ、約１〜６Ｍ、約２〜６Ｍ、約４〜６Ｍ、または約５〜６Ｍの濃度で、封入体または封入体を含む分画に添加する。一実施形態では、可溶化剤は、約０．０１Ｍ、約０．０２Ｍ、約０．０５Ｍ、約０．１Ｍ、約０．２Ｍ、約０．５Ｍ、約１Ｍ、約２Ｍ、約３Ｍ、約４Ｍ、約５Ｍ、約６Ｍ、約７Ｍ、約８Ｍ、約９Ｍ、または約１０Ｍの濃度で封入体または封入体を含む分画に添加する。
【０１４５】
好ましい実施形態では、可溶化剤は尿素であり、約０．０１〜１０Ｍ、約０．０５〜１０Ｍ、約０．１〜１０Ｍ、約０．２〜１０Ｍ、約０．５〜１０Ｍ、約１〜１０Ｍ、約２〜１０Ｍ、約５〜１０Ｍ、約８〜１０Ｍ、約０．０１〜６Ｍ、約０．０５〜６Ｍ、約０．１〜６Ｍ、約０．２〜６Ｍ、約０．５〜６Ｍ、約１〜６Ｍ、約２〜６Ｍ、約４〜６Ｍ、または約５〜６Ｍの濃度で、封入体または封入体を含む分画に添加する。一実施形態では、尿素を、約０．０１Ｍ、約０．０２Ｍ、約０．０５Ｍ、約０．１Ｍ、約０．２Ｍ、約０．５Ｍ、約１Ｍ、約２Ｍ、約３Ｍ、約４Ｍ、約５Ｍ、約６Ｍ、約７Ｍ、約８Ｍ、約９Ｍ、または約１０Ｍの濃度で、封入体または封入体を含む分画に添加する。好ましい実施形態では、６Ｍの濃度の尿素を封入体または封入体を含む分画に添加する。
【０１４６】
可溶化剤を使用して可溶化を行った後、得られた混合物は、本明細書中記載されるように、バイオマス分解活性を有する可溶化されたポリペプチドを含む。得られた混合物は、生成物を生成するための反応、たとえば「可溶化酵素を使用して生成物を生成する方法」との表題のセクションにさらに詳細に記載される糖化反応などの酵素処理に、直接使用することができる。この実施形態では、混合物は、宿主細胞に内因性の他のタンパク質、リボソームの成分、核酸（たとえばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、ならびに細胞のデブリ（たとえば細胞壁のデブリ、脂質、代謝物）などの封入体の他の成分を含んでもよい。
【０１４７】
他の実施形態では、バイオマス分解活性を有する可溶化したポリペプチドを含む得られた混合物を、封入体の他の可溶化した成分からバイオマス分解活性を有する可溶化したポリペプチドを精製または単離するようさらに処理する。バイオマス分解活性を有する可溶化したポリペプチドを単離または精製する適切な方法は、アフィニティ精製技術を含む。たとえばバイオマス分解活性を有するポリペプチドは、好ましくはアフィニティ精製に利用できるタグまたは融合ペプチドを含む。一実施形態では、バイオマス分解活性を有するポリペプチドは、Ｈｉｓタグ、たとえば８ＸＨｉｓタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を含み、バイオマス分解活性を有する可溶化したポリペプチドは、ニッケルアフィニティクロマトグラフィー、たとえば固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）系を使用して精製することができる。一実施形態では、全ての精製ステップは、封入体からポリペプチドを可溶化するために使用される可溶化剤の存在下で行われ、これは精製処理の洗浄ステップおよび溶出ステップに含まれる。よって一実施形態では、得られた、精製し可溶化したバイオマス分解活性を有するポリペプチドは、可溶化剤をも含む。
【０１４８】
本発明は、バイオマス分解活性を有するポリペプチドおよび可溶化剤を含む混合物を提供する。この混合物は、上述のように封入体の可溶化を介して得られる。また、得られた混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質をさらに含んでもよい。またバイオマス分解活性を有する可溶化したポリペプチドは、アフィニティ精製技術により精製してもよい。この場合、得られた混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質を含まない。混合物は、宿主細胞に内因性のタンパク質、リボソームの成分、核酸（たとえばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、および細胞のデブリ（たとえば細胞壁のデブリ、脂質、代謝物）などの封入体で見いだされる他の成分を含むことができる。
【０１４９】
一実施形態では、バイオマス分解活性を有する可溶化したポリペプチドは、部分的にアンフォールド、部分的にミスフォールド、または部分的に変性している。一実施形態では、バイオマス分解活性を有する可溶化したポリペプチドは、バイオマス分解活性を有する天然のポリペプチドと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも８〜１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％のバイオマス分解活性を有する。一実施形態では、バイオマス分解活性を有する可溶化したポリペプチドは、バイオマス分解活性を有する天然のポリペプチドと比較して、約１〜１０％、１〜２０％、１〜３０％、１〜４０％、１〜５０％、１〜６０％、１〜７０％、１〜８０％、１〜９０％、１〜１００％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１０〜６０％、１０〜７０％、１０〜８０％、１０〜９０％、１０〜１００％、２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜１００％、または９０〜１００％のバイオマス分解活性を有する。好ましい実施形態では、バイオマス分解活性を有する可溶化したポリペプチドは、天然のポリペプチドの活性の少なくとも８〜１０％を有する。バイオマス分解活性を有する天然のポリペプチドは、たとえば、可溶性分画から単離したバイオマス分解活性を有する対応するポリペプチド、天然の形態で適切にフォールディングされている（それにより１００％のバイオマス分解活性を有する）バイオマス分解活性を有する対応するポリペプチド、またはポリペプチドを産生する微生物から内因的に発現したバイオマス分解活性を有する対応するポリペプチドを表す。バイオマス分解活性は、たとえばリグニナーゼ活性アッセイ、エンドグルカナーゼ活性アッセイ、セロビオヒドロラーゼ活性、セロビアーゼ活性アッセイ、またはキシラナーゼ活性アッセイといった本明細書中に記載されるアッセイのいずれかにより、決定することができる。
【０１５０】
一態様では、混合物は、セロビアーゼ活性を有するポリペプチド、たとえばＴ．リーセイ由来のＣｅｌ３ａまたはその機能的なバリアント、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドと、可溶化剤、たとえば尿素とを含む。一実施形態では、混合物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドと、可溶化剤、たとえば尿素とを含み、ここでポリペプチドは、天然のポリペプチド、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＴ．リーセイ由来のＣｅｌ３ａと比較して少なくとも２０％のセロビアーゼ活性を有する。この混合物は、上述のように、封入体の可溶化を介して得られる。得られる混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質をもさらに含んでもよい。セロビアーゼ活性を有する可溶化したポリペプチド、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドはまた、アフィニティ精製技術により精製することもできる。この場合、得られた混合物は、封入体と結合した１つまたは複数のタンパク質を含まない。混合物は、宿主細胞に内因性の他のタンパク質、リボソームの成分、核酸（たとえばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、ならびに細胞のデブリ（たとえば細胞壁のデブリ、脂質、代謝物）などの封入体で見いだされる他の成分を含むことができる。一実施形態では、可溶化剤は尿素であり、尿素は０．２〜６Ｍで存在する。
【０１５１】
一実施形態では、セロビアーゼ活性またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有する可溶化したポリペプチドは、部分的にアンフォールド、部分的にミスフォールド、または部分的に変性されている。一実施形態では、セロビアーゼ活性またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有する可溶化したポリペプチドは、天然のポリペプチドと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも８〜１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％のセロビアーゼ活性を有する。一実施形態では、セロビアーゼ活性を有するまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の同一性を有する可溶化したポリペプチドは、天然のポリペプチドと比較して、約１〜１０％、１〜２０％、１〜３０％、１〜４０％、１〜５０％、１〜６０％、１〜７０％、１〜８０％、１〜９０％、１〜１００％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１０〜６０％、１０〜７０％、１０〜８０％、１０〜９０％、１０〜１００％、２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜１００％、または９０〜１００％のセロビアーゼ活性を有する。天然のポリペプチドは、たとえば適切にフォールディングされた（たとえば１００％フォールディングされた）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、Ｔ．リーセイから単離されたＣｅｌ３ａ、またはそれらの機能的なバリアントである。セロビアーゼ活性は、本明細書中に記載されるアッセイを使用して測定することができ、３０分後に放出されるグルコースの濃度（ｇ／Ｌ）、または３０分以内にグルコースに変換されるセロビオースの％として定量化することができる。
【０１５２】
アグリコシル化されたポリペプチドを生成する方法
さらに本発明は、宿主細胞においてバイオマス分解活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを生成する方法であって、上記宿主細胞およびそのライセートを、本明細書中記載されるアグリコシル化されたポリペプチドを可溶化するのに適した濃度の可溶化剤で処理する、方法を提供する。本方法は、ポリペプチドの発現に適した条件下で、バイオマス分解活性を有するポリペプチドを発現する宿主細胞を培養することを含む。また本方法は、宿主細胞からバイオマス分解活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを回収することをさらに含んでもよい。以下にさらに詳細に説明される方法では、バイオマス分解活性を有するポリペプチドは、たとえばリグニナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、セロビアーゼ活性、またはキシラナーゼ活性を有する。一実施形態では、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３ａまたはそれらの機能的な断片を含む。別の実施形態では、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む。
【０１５３】
グリコシル化が欠損した宿主細胞の使用
複数の実施形態では、発現ベクターは融合タグに作動可能に連結された、本明細書で記載される、バイオマス分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、細胞、例えば、細菌宿主細胞において発現されるタンパク質を著しくはグリコシル化しない細胞中に導入され、発現される。組換え宿主細胞はポリペプチドの発現のための条件下で培養され、バイオマス分解活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドが生成される。アグリコシル化されたポリペプチドは宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。
【０１５４】
例えば、この実施形態では、発現ベクターはｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターを、バイオマス分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の上流に含み、宿主細胞はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する能力を有する。バイオマス分解活性を有するポリペプチドの発現はＩＰＴＧの添加により誘導される。好ましくは、宿主細胞は大腸菌細胞、好ましくは大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ細胞である。この実施形態では、融合タグはＨｉｓ−タグであり、発現されたアグリコシル化されたポリペプチドの精製はニッケルアフィニティークロマトグラフィーを含む。
【０１５５】
グリコシル化能力を有する宿主細胞の使用
別の実施形態では、本明細書で記載されるように、ポリペプチドがグリコシル化されないように、１つ以上のグリコシル化部位突然変異を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターが宿主細胞において発現され、ここで、宿主細胞は細胞、例えば、酵母または真菌宿主細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができる。あるいは、宿主細胞は、細胞、例えば、細菌宿主細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができない。この実施形態では、ポリペプチドは融合タグに作動可能に連結されている。アグリコシル化されたポリペプチドは細菌宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。
【０１５６】
さらに別の実施形態では、本明細書で記載される、バイオマス分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターは宿主細胞で発現され、この場合、宿主細胞は細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができる。細胞は、ポリペプチドの発現およびグリコシル化に十分な条件下で培養される。この実施形態では、ポリペプチドは融合タグに作動可能に連結されている。グリコシル化されたポリペプチドは細菌宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。宿主細胞および他の内在性宿主酵素、例えば、グリコシル化酵素からの精製後、単離されたグリコシル化されたポリペプチドのグリカンは脱グリコシル化酵素とのインキュベーションにより除去することができる。脱グリコシル化酵素としてはＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ、ＥｎｄｏＨ（エンドグリコシダーゼＨ）、ＥｎｄｏＳ（エンドグリコシダーゼＳ）、ＥｎｄｏＤ（エンドグリコシダーゼＤ）、ＥｎｄｏＦ（エンドグリコシダーゼＦ）、ＥｎｄｏＦ１（エンドグリコシダーゼＦ１）、またはＥｎｄｏＦ２（エンドグリコシダーゼＦ２）が挙げられる。グリカンの完全除去に十分な酵素を含むタンパク質脱グリコシル化混合物は、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。単離されたポリペプチドは、１つ以上の脱グリコシル化酵素と共に、全てのグリカンをポリペプチドから除去するのに十分な条件下でインキュベートされる。グリカンをポリペプチドから除去するための他の方法が当技術分野で知られており、例えば、弱アルカリまたは弱ヒドラジン分解によるβ−脱離がある。ポリペプチドのグリコシル化状態の評価は、当技術分野で知られているグリカンの染色および可視化のための方法、または質量分析を使用して決定することができる。
【０１５７】
さらに別の実施形態では、本明細書で記載される、バイオマス分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターは宿主細胞で発現され、この場合、宿主細胞は細胞内で発現されたタンパク質をグリコシル化することができる。細胞は、ポリペプチドの発現に十分な条件下であるが、グリコシル化阻害剤の存在下で培養される。グリコシル化阻害剤は、発現されたポリペプチドがアグリコシル化されるような濃度で、十分な時間存在する。この実施形態では、ポリペプチドは融合タグに作動可能に連結されている。得られたアグリコシル化されたポリペプチドは細菌宿主細胞から、本明細書で記載される融合タグに対するアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精製または単離することができる。
【０１５８】
この実施形態で使用するのに好適なグリコシル化阻害剤の例としては、ツニカマイシン、ベンジル−ＧａｌＮＡｃ（ベンジル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）、２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース、および５’ＣＤＰ（５’シチジラート二リン酸）が挙げられる。いくつかの実施形態では、グリコシル化阻害剤の組み合わせが使用される。好ましくは、この実施形態で使用されるグリコシル化阻害剤の濃度はポリペプチドのグリコシル化を阻害するのに十分であるが、宿主細胞の細胞毒性またはタンパク質発現の阻害を引き起こさない。
【０１５９】
バイオマスを生成物に変換する方法
本発明は、本明細書で記載される、セロビアーゼ活性を有するアグリコシル化されたポリペプチドを使用して、バイオマスを生成物に変換または加工処理するための方法および組成物を提供する。バイオマスを生成物、例えば糖生成物に変換するための方法は、例えば、米国特許出願２０１４／００１１２５８号（その内容は、その全体として参照により組み込まれる）に記載されるように、当技術分野で知られている。簡単に言うと、バイオマスは、例えば、不応性を低減させるために、最適に前処理され、被処理バイオマスをバイオマス分解、またはセルロース分解性酵素と共にインキュベートし、糖（例えば、グルコースおよび／またはキシロース）を生成させることを含む糖化プロセスにより糖化される。糖生成物はその後、さらに、例えば、発酵または蒸留により加工処理することができ、最終生成物が生成される。最終生成物としては、アルコール（例えば、エタノール、イソブタノール、またはｎ−ブタノール）、糖アルコール（例えば、エリスリトール、キシリトール、またはソルビトール）、または有機酸（例えば、乳酸、ピルビン酸（ｐｙｕｒｖｉｃ  ａｃｉｄ）、コハク酸）が挙げられる。
【０１６０】
本明細書で記載されるプロセスを使用して、バイオマス材料を、１つ以上の生成物、例えばエネルギー、燃料、食品および材料に変換させることができる。生成物の具体例としては、次に挙げられるが、それらに限定されない：水素、糖（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、果糖、セロビオース、二糖、オリゴ糖および多糖）、アルコール（例えば、一価アルコールまたは二価アルコール、例えばエタノール、ｎ−プロパノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールまたはｎ−ブタノール）、水和または含水アルコール（例えば、１０％、２０％、３０％を超える、またはさらに４０％を超える水を含む）、バイオディーゼル、有機酸、炭化水素（例えば、メタン、エタン、プロパン、イソブテン、ペンタン、ｎ−ヘキサン、バイオディーゼル、バイオガソリンおよびそれらの混合物）、共生成物（例えば、タンパク質、例えばセルロース分解性タンパク質（酵素）または単細胞タンパク質）、ならびに、任意の組み合わせまたは相対濃度での、任意で、任意の添加物（例えば、燃料添加物）と組み合わされた、これらのいずれかの混合物。他の例としては、カルボン酸、カルボン酸の塩、カルボン酸およびカルボン酸の塩の混合物およびカルボン酸のエステル（例えば、メチル、エチルおよびｎ−プロピルエステル）、ケトン（例えば、アセトン）、アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド）、αおよびβ不飽和酸（例えば、アクリル酸）およびオレフィン（例えば、エチレン）が挙げられる。他のアルコールおよびアルコール誘導体としては、プロパノール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，３−プロパンジオール、糖アルコールおよびポリオール（例えば、グリコール、グリセロール、エリスリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール、およびポリグリシトールおよび他のポリオール）、ならびにこれらのアルコールのいずれかのメチルまたはエチルエステルが挙げられる。他の生成物としては、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、乳酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、吉草酸、カプロン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、シュウ酸、マロン酸、グルタル酸、オレイン酸、リノール酸、グリコール酸、γ−ヒドロキシ酪酸、およびそれらの混合物、これらの酸のいずれかの塩、それらの酸およびそれらの個々の塩のいずれかの混合物が挙げられる。
【０１６１】
バイオマス
本明細書で記載される方法を用いて加工処理されるバイオマスは澱粉質材料および／またはセルロースを含むセルロース材料、例えば、リグノセルロース材料である。バイオマスはまた、ヘミセルロースおよび／またはリグニンを含み得る。バイオマスは、農産物または農業廃棄物、紙製品または紙屑、林産物、もしくは一般廃棄物、またはそれらの任意の組み合わせの１つ以上を含むことができる。農産物または農業廃棄物は、例えば、栽培され、収穫され、または使用もしくはヒトまたは動物による消費のために加工処理され得る材料、または栽培、収穫、または加工処理法から生成される任意の中間体、副産物、または廃棄物を含む。農産物または廃棄物としてはサトウキビ、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アルファルファ、干し草、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、コーンファイバ、ココナツヘア、ビートパルプ、バガス、ダイズストーバー、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、もしくはビーズウイング、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。紙製品または紙屑は、紙製品を製造するために使用される材料、任意の紙製品、または紙製品の製造または分解から生成される任意の中間体、副産物もしくは廃棄物を含む。紙製品または廃棄物としては、紙、着色紙、塗被紙、コート紙、段ボール紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、もしくは紙パルプ、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。林産物または廃棄物は木材の栽培、収穫、または加工処理により生成される材料、または木材の栽培、収穫、または加工処理から生成される任意の中間体、副産物、もしくは廃棄物を含む。林産物または廃棄物としては、アスペン材、任意の属または種の木由来の木材、パーティクルボード、木材チップ、もしくはおがくず、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。一般廃棄物としては、堆肥、下水、もしくはくず、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６２】
バイオマスは、限定するものではないが、澱粉質材料、サトウキビ、農業廃棄物、紙、紙製品、紙屑、紙パルプ、着色紙、塗被紙、コート紙、充填紙、雑誌、印刷物、プリンター用紙、ポリコート紙、カード用紙、ボール紙、板紙、綿、木材、パーティクルボード、林業廃棄物、おがくず、アスペン材、木材チップ、草、スイッチグラス、ススキ、スパルティナ、クサヨシ、穀粒残渣、もみ殻、カラスムギ殻、コムギもみ殻、オオムギ殻、農業廃棄物、サイレージ、キャノーラわら、麦わら、オオムギわら、カラスムギわら、コメわら、ジュート、ヘンプ、亜麻、竹、サイザル麻、アバカ、トウモロコシ穂軸、コーン・ストーバー、ダイズストーバー、コーンファイバ、アルファルファ、干し草、ココナツヘア、糖加工残渣、バガス、ビートパルプ、リュウゼツランバガス、藻類、海藻、プランクトン、堆肥、下水、くず、農業もしくは産業廃棄物、アラカチャ、ソバ、バナナ、オオムギ、キャッサバ、クズ、オカ、サゴ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、ヤム、マメ、ソラマメ、レンズマメ、エンドウマメ、またはこれらのいずれかの混合物を含んでもよい。好ましい実施形態では、バイオマスは農業廃棄物、例えばトウモロコシ穂軸、例えば、コーン・ストーバーを含む。別の実施形態では、バイオマスは草を含む。
【０１６３】
一実施形態では、バイオマスは、本明細書で記載される組成物との接触前に処理される。例えば、バイオマスは、バイオマスの不応性を低減させるために、その嵩密度を低減させるために、および／またはその表面積を増加させるために処理される。好適なバイオマス処理プロセスとしては、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：電子による照射、超音波処理、酸化、熱分解、蒸気爆発、化学的処理、機械的処理、および凍結粉砕。好ましくは、処理方法は電子による照射である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、電子照射は、バイオマスが少なくとも０．５Ｍｒａｄ、例えば少なくとも５、１０、２０、３０、または少なくとも４０Ｍｒａｄの総線量を受けるまで実施される。いくつかの実施形態では、処理は、バイオマスが、約０．５Ｍｒａｄ〜約１５０Ｍｒａｄ、約１Ｍｒａｄ〜約１００Ｍｒａｄ、約５Ｍｒａｄ〜約７５Ｍｒａｄ、約２Ｍｒａｄ〜約７５Ｍｒａｄ、約１０Ｍｒａｄ〜約５０Ｍｒａｄ、例えば、約５Ｍｒａｄ〜約５０Ｍｒａｄ、約２０Ｍｒａｄ〜約４０Ｍｒａｄ、約１０Ｍｒａｄ〜約３５Ｍｒａｄ、または約２０Ｍｒａｄ〜約３０Ｍｒａｄの線量を受けるまで実施される。いくつかの実行では、２５〜３５Ｍｒａｄの総線量が好ましく、理想的には数秒にわたって、例えば、５Ｍｒａｄ／パスで適用され、各パスは約１秒間適用される。７〜９Ｍｒａｄ／パスを超える線量の適用は、場合によっては原材料の熱分解を引き起こす。
【０１６５】
バイオマス材料（例えば、植物バイオマス、動物バイオマス、紙、および自治体廃棄バイオマス）が、有用な中間体および生成物、例えば有機酸、有機酸の塩、無水物、有機酸のエステルおよび燃料、例えば、内燃機関のための燃料または燃料電池のための供給原料を製造するための原料として使用され得る。原料として、容易に入手できるが、しばしば、加工処理するのが困難となり得るセルロースおよび／またはリグノセルロース材料、例えば、自治体廃棄物ストリームおよび紙屑ストリーム、例えば新聞紙、クラフト紙、段ボール紙またはこれらの混合物を含むストリームを使用することができるシステムおよびプロセスが本明細書で記載される。
【０１６６】
原料を、容易に加工処理することができる形態に変換させるために、原料中のグルカンまたはキシラン含有セルロースを、低分子量炭水化物、例えば糖に、糖化剤、例えば、酵素または酸、糖化と呼ばれるプロセスにより加水分解することができる。低分子量炭水化物はその後、例えば、既存の製造プラント、例として単細胞タンパク質プラント、酵素製造プラント、または燃料プラント、例えば、エタノール製造施設において使用することができる。
【０１６７】
原料を、酵素、例えば、バイオマス分解酵素を使用して、材料と酵素を溶媒、例えば、水溶液中で合わせることにより加水分解することができる。酵素は、本明細書で記載される方法に従い生成／誘導することができる。
【０１６８】
具体的には、酵素は、バイオマス（例えば、バイオマスのセルロースおよび／またはリグニン部分）を分解することができる、または様々なセルロース分解酵素（セルラーゼ）、リグニナーゼまたは様々な小分子バイオマス分解性代謝産物を含むまたは生成させる生物により供給させることができる。これらの酵素は相乗的に、バイオマスの結晶セルロースまたはリグニン部分を分解するように作用する酵素の複合物であってもよい。セルロース分解酵素の例としては次のものが挙げられる：エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびセロビアーゼ（β−グルコシダーゼ）。
【０１６９】
糖化中、セルロース基質は最初に、エンドグルカナーゼによりランダムな位置で加水分解させることができ、オリゴマ中間体が生成される。これらの中間体はその後、エキソ開裂グルカナーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼのための基質となり、セロビオースがセルロースポリマーの端から生成される。セロビオースはグルコースの水溶性１，４−連結二量体である。最後に、セロビアーゼはセロビオースを切断し、グルコースが得られる。このプロセスの効率（例えば、加水分解および／または加水分解の完了までの時間）は、セルロース材料の不応性に依存する。
【０１７０】
糖化
不応性が低減されたバイオマスは、上記のバイオマス分解酵素により、一般に、不応性が低減されたバイオマスとバイオマス分解酵素を流体媒質、例えば、水溶液中で合わせることにより処理される。場合によっては、原料は糖化前に、２０１２年４月２６日に公開されたＭｅｄｏｆｆおよびＭａｓｔｅｒｍａｎによる米国特許出願公開２０１２／０１００５７７  Ａ１号（その全内容は本明細書に組み込まれる）に記載されるように、熱水中で煮沸され、浸され、加熱処理される。
【０１７１】
本明細書で記載される糖化プロセスで使用するための、バイオマスを分解することができる酵素の混合物、例えば、バイオマス分解酵素の酵素混合物が、本明細書で提供される。
【０１７２】
糖化プロセスは部分的に、または完全に製造プラントにおける槽（例えば、少なくとも４０００Ｌ、４０，０００Ｌ、または５００，０００Ｌ、２，０００，０００Ｌ、４，０００，０００Ｌ、または６，０００，０００Ｌ、またはそれ以上の体積を有する槽）中で実施することができ、および／または、部分的に、または完全に、輸送中、例えば、鉄道車両、タンクローリ、または超大型タンカーまたは船倉において実施することができる。完全な糖化に必要とされる時間は、プロセス条件ならびに使用されるバイオマス材料および酵素に依存するであろう。糖化が製造プラントにおいて制御された条件下で実施される場合、セルロースは、糖、例えば、グルコースに約１２〜９６時間で実質的に完全に変換され得る。糖化が部分的に、または完全に輸送中に実施される場合、糖化にはより長い時間がかかり得る。
【０１７３】
好ましい実施形態では、糖化反応は、酵素反応が起こるのに最適なｐＨ、例えば、バイオマス分解酵素の活性に最適なｐＨで起こる。好ましくは、糖化反応のｐＨはｐＨ４〜４．５である。好ましい実施形態では、糖化反応は、酵素反応が起こるのに最適な温度、例えば、バイオマス分解酵素の活性に最適な温度で起こる。好ましくは、糖化反応の温度は４２℃〜５２℃である。
【０１７４】
槽内容物は糖化中に、例えば、２０１０年５月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５３３１号（英語でＷＯ２０１０／１３５３８０号として公開され、米国を指定しており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ジェット混合を使用して混合されることが一般に好ましい。
【０１７５】
界面活性剤の添加は糖化速度を増強することができる。界面活性剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０ポリエチレングリコール界面活性剤、イオン性界面活性剤、または両性界面活性剤が挙げられる。
【０１７６】
糖化から得られる糖溶液の濃度は比較的に高く、例えば、５重量％、７．５重量％、１０重量％、１０．５重量％を超える、または４０重量％を超える、または５０、６０、７０重量％を超える、またはさらに８０重量％を超えることが一般に好ましい。水は、例えば、蒸発により除去され得、糖溶液の濃度が増加する。これにより、輸送される体積が低減し、また、溶液中での微生物増殖が阻害される。
【０１７７】
あるいは、より低い濃度の糖溶液が使用され得、この場合、抗菌添加物、例えば、広域スペクトル抗生物質を、低濃度、例えば、５０〜１５０ｐｐｍで添加することが望ましい可能性がある。他の好適な抗生物質としては、アンホテリシンＢ、アンピシリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシンＢ、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、ストレプトマイシンが挙げられる。抗生物質は、輸送および貯蔵中の微生物の増殖を阻害し、適切な濃度、例えば、重量で１５〜１０，０００ｐｐｍ、例えば、２５〜５００ｐｐｍ、または５０〜１５０ｐｐｍで使用することができる。所望であれば、たとえ、糖濃度が比較的に高くても抗生物質を含有させることができる。あるいは、抗菌または保存特性を有する他の添加物が使用され得る。好ましくは、抗菌添加物（複数可）は食品グレードである。
【０１７８】
バイオマス材料に酵素と共に添加する水の量を制限することにより、比較的に高い濃度の溶液を得ることができる。濃度は、例えば、どのくらいの糖化が起こるかを制御することにより制御することができる。例えば、濃度は、より多くのバイオマス材料を溶液に添加することにより増加させることができる。溶液中で生成される糖を保持するために、界面活性剤、例えば、上記のもののうちの１つを添加することができる。溶解度はまた、溶液の温度を増加させることにより増加させることができる。例えば、溶液は４０〜５０℃、６０〜８０℃、またはさらにそれ以上の温度で維持することができる。
【０１７９】
本明細書で記載されるプロセスでは、例えば糖化後、糖（例えば、グルコースおよびキシロース）は単離することができる。例えば、糖は、沈殿、結晶化、クロマトグラフィー（例えば、疑似移動床クロマトグラフィー、高圧クロマトグラフィー）、遠心分離、抽出、当技術分野で知られている任意の他の単離方法、およびそれらの組み合わせにより単離することができる。
【０１８０】
糖化に使用するための混合物
一態様では、本発明は、本明細書中に記載されるように封入体から可溶化されたバイオマス分解活性を有するポリペプチドと、封入体に結合した１つまたは複数のタンパク質と、可溶化剤とを含む、糖化に使用するための混合物を特徴とする。一実施形態では、混合物は、宿主細胞に内因性の他のタンパク質、リボソームの成分、核酸（たとえばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）、ならびに細胞のデブリ（たとえば細胞壁のデブリ、脂質、代謝物）などの封入体の他の成分を含んでもよい。バイオマス分解活性を有するポリペプチドは、グリコシル化またはアグリコシル化することができる。
【０１８１】
一実施形態では、混合物は、セロビアーゼ活性を有するポリペプチドと尿素とを含む。一実施形態では、尿素は０．２〜６Ｍで存在する。一実施形態では、混合物は、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３ａまたはそれらの機能的なバリアントもしくは断片を含む。一実施形態では、混合物は、Ｔ．リーセイ由来のＣｅｌ３ａと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むポリペプチドを含む。別の実施形態では、混合物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を含むポリペプチドを含む。
【０１８２】
複数の実施形態では、本明細書中に記載の混合物はさらに、微生物に由来する少なくとも１つの追加の酵素を含み、ここで、追加の酵素は、バイオマスまたはセルロース系材料分解活性を有する。例えば、追加の酵素はリグニナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、またはセロビアーゼである。一実施形態では、混合物はさらに、１つ以上のリグニナーゼ、１つ以上のエンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃｏｎａｓｅ）、１つ以上のセロビオヒドロラーゼ、１つ以上のキシラナーゼ、または１つ以上のセロビアーゼを含む。複数の実施形態では、追加のバイオマス分解酵素はグリコシル化されている。複数の実施形態では、酵素混合物はさらに、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、ま少なくとも１０、または少なくとも２０個、またはそれ以上の、本明細書で記載される追加のバイオマス分解酵素を含む。いくつかのバイオマス分解酵素の典型的な一次アミノ酸配列が以下に示されている。
【０１８３】
例えば、混合物はさらに、微生物、例えば、真菌細胞、例えば野生型Ｔ．リーセイ、またはそのバリアント、例えば、Ｔ．リーセイＲＵＴＣ３０により生成される追加のバイオマス分解酵素の混合物を含む。一実施形態では、追加のバイオマス分解酵素は、微生物から単離される。一実施形態では、混合物は、次のバイオマス分解酵素の１つ以上を含む：Ｂ２ＡＦ０３、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、Ｃｅｌ１ａ、Ｃｅｌ３ａ、Ｃｅｌ５ａ、Ｃｅｌ６ａ、Ｃｅｌ７ａ、Ｃｅｌ７ｂ、Ｃｅｌ１２ａ、Ｃｅｌ４５ａ、Ｃｅｌ７４ａ、ｐａＭａｎ５ａ、ｐａＭａｎ２６ａ、またはスウォレニン、またはそれらの任意の組み合わせ。例えば、上記に列挙される、追加のバイオマス分解酵素は、酵素（下記表１で列挙される）の起源となる微生物、例えば、真菌細胞から、内因的に発現され、単離され得る。あるいは、例えば、上記に列挙される、追加のバイオマス分解酵素は、本明細書で記載される宿主細胞において同様の発現方法を使用して異種的に発現され、宿主細胞から単離され得る。一実施形態では、異種的に発現された追加のバイオマス分解酵素は、酵素のＣまたはＮ末端でＨｉｓタグによりタグ付けされ、当技術分野で知られているニッケルアフィニティークロマトグラフィー技術により単離される。例えば、追加のバイオマス分解酵素は下記表１から選択される。
【表１】
2017530702.tif 000005
【０１８４】
表１に列挙されるバイオマス分解酵素に対するアミノ酸配列は、以下の通りである。
【化４】
2017530702.tif 000006
2017530702.tif 000007
2017530702.tif 000008
【０１８５】
本発明の酵素混合物で使用するための好適なバイオマス分解酵素の他の例としては、バチルス、コプリナス、ミセリオフソラ、セファロスポリウム、スキタリジウム、ペニシリウム、アスペルギルス、シュードモナス、ヒュミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム、クリソスポリウムおよびトリコデルマ属における種由来の酵素が挙げられ、とりわけ、アスペルギルス種（例えば、欧州特許公開第０  ４５８  １６２号を参照）、ヒュミコラ・インソレンス（スキタリジウム・サーモフィルムとして再分類、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照）、コプリヌス・シネレウス、フサリウム・オキシスポルム、ミセリオフソラ・サーモヒラ、メリピウス・ギガンテウス、チエラビア・テレストリス、アクレモニウム種（限定はされないが、Ａ．ペルシシナム、Ａ．アクレモニウム、Ａ．ブラキペニウム、Ａ．ジクロモスポルム、Ａ．オブクラバタム、Ａ．ピンケルトニエ、Ａ．ロセオグリセウム、Ａ．インコロラタム、およびＡ．フラタムが含まれる）から選択される株により生成されるものである。好ましい株としては、ヒュミコラ・インソレンスＤＳＭ１８００、フサリウム・オキシスポルムＤＳＭ２６７２、ミセリオフソラ・サーモヒラＣＢＳ１１７．６５、セファロスポリウム種ＲＹＭ−２０２、アクレモニウム種ＣＢＳ４７８．９４、アクレモニウム種ＣＢＳ２６５．９５、アクレモニウム・ペルシシナムＣＢＳ１６９．６５、アクレモニウム・アクレモニウムＡＨＵ９５１９、セファロスポリウム種ＣＢＳ５３５．７１、アクレモニウム・ブラシペニウムＣＢＳ８６６．７３、アクレモニウム・ジクロモスポルムＣＢＳ６８３．７３、アクレモニウム・オブクラバタムＣＢＳ３１１．７４、アクレモニウム・ピンケルトニエＣＢＳ１５７．７０、アクレモニウム・ロセオグリセウムＣＢＳ１３４．５６、アクレモニウム・インコロラタムＣＢＳ１４６．６２、およびアクレモニウム・フラタムＣＢＳ２９９．７０Ｈが挙げられる。バイオマス分解酵素はまた、クリソスポリウム、好ましくはクリソスポリウム・ラクノウェンスの株から得ることができる。使用することができる追加の株としては、トリコデルマ（特に、Ｔ．ビリデ、Ｔ．リーセイ、およびＴ．コニンギイ）、好アルカリ性バチルス（例えば、米国特許第３，８４４，８９０号および欧州特許公開第０  ４５８  １６２号を参照）、およびストレプトマイセス（例えば、欧州特許公開第０  ４５８  １６２号を参照）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８６】
複数の実施形態では、微生物は、非誘導微生物と比べて、バイオマス分解酵素の生成を増加させるのに好適な条件下で、本明細書で記載されるバイオマス分解酵素を生成するように誘導される。例えば、本明細書で記載されるバイオマスを含む誘導バイオマス試料は、バイオマス分解酵素の生成を増加させるために微生物と共にインキュベートされる。誘導プロセスのさらなる説明は米国２０１４／００１１２５８号（その内容は、これによりその全体が参照により組み込まれる）において見出すことができる。
【０１８７】
前記微生物により生成および／または分泌されるバイオマス分解酵素は単離することができ、本発明の混合物に添加することができ、または糖化反応物に直接添加することができる。あるいは、一実施形態では、本明細書および上記のバイオマス分解酵素を発現する、前記微生物または宿主細胞は糖化反応の追加前に溶解されない。
【０１８８】
一実施形態では、本明細書で記載される１つまたは複数の追加的なバイオマス分解酵素を発現する宿主細胞を含む酵素混合物を、本明細書中に記載のバイオマス分解活性を有する可溶化されたポリペプチドを含む混合物と共に使用することができる。
【０１８９】
封入体から可溶化したバイオマス分解活性を有するポリペプチドと可溶化剤とを含む本明細書中に記載の混合物の使用は、可溶化ポリペプチドを添加することのない糖化と比較して、糖化からの糖生成物の収率を阻害、防止、または減少させるものではない。一部の実施形態では、糖生成物の収率は、封入体から可溶化したバイオマス分解活性を有するポリペプチドと可溶化剤とを含む本明細書中に記載の混合物の使用時に、増大する。糖生成物の収率は、バイオマス分解酵素の標準的な混合物を可溶化したポリペプチドと可溶化剤とを含む混合物を用いることなく糖化物に添加する場合と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％増加する。
【０１９０】
さらなる加工処理
別の生成物を生成させるために、糖化により生成された糖に対しさらなる加工処理工程が実施され得る。例えば、糖は、水素化され、発酵され、または他の化学薬品で処理され、他の生成物を生成させることができる。
【０１９１】
グルコースは、ソルビトールに水素化することができる。キシロースは、キシリトールに水素化することができる。水素化は、触媒（例えば、Ｐｔ／γ−Ａｌ２Ｏ３、Ｒｕ／Ｃ、ラネーニッケル、または当技術分野において知られている他の触媒）をＨ２と組み合わせて、高圧（例えば、１０〜１２０００ｐｓｉ）下で使用することにより達成することができる。ソルビトールおよび／またはキシリトール生成物は、当技術分野で知られている方法を使用して、単離および精製することができる。
【０１９２】
糖化からの糖生成物はまた、発酵させることができ、アルコール、糖アルコール、例えばエリスリトール、または有機酸、例えば、乳酸、グルタミン酸もしくはクエン酸またはアミノ酸が生成される。
【０１９３】
例えば、酵母およびザイモモナス細菌は、糖（複数可）のアルコール（複数可）への発酵または変換のために使用することができる。他の微生物は以下に記載される。発酵のための最適ｐＨは約ｐＨ４〜７である。例えば、酵母のための最適ｐＨは約ｐＨ４〜５であり、一方、ザイモモナスのための最適ｐＨは約ｐＨ５〜６である。典型的な発酵時間は約２４〜１６８時間（例えば、２４〜９６時間）であり、温度は２０℃〜４０℃（例えば、２６℃〜４０℃）の範囲であるが、しかしながら、好熱性微生物はより高い温度を好む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、例えば、嫌気性生物が使用される場合、発酵の少なくとも一部は酸素なしで、例えば、Ｎ２、Ａｒ、Ｈｅ、ＣＯ２またはそれらの混合物などの不活性ガスのブランケット下で実施される。加えて、混合物は、発酵の一部または全ての間、槽を通って流れる不活性ガスの一定パージを有し得る。場合によっては、嫌気性条件は、発酵中の二酸化炭素生成により達成し、維持することができ、追加の不活性ガスは必要とされない。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、発酵プロセスの全てまたは一部は、低分子量糖が完全に生成物（例えば、エタノール）に変換される前に中断させることができる。中間発酵生成物は、糖および炭水化物を高濃度で含む。糖および炭水化物は、当技術分野で知られている任意の手段により単離することができる。これらの中間発酵生成物は、ヒトまたは動物消費のための食品の調製において使用され得る。加えてまたはその代わりに、中間発酵生成物は、ステンレス鋼ラボラトリミルにおいて微粒子サイズに粉砕することができ、小麦粉様物質が生成される。
【０１９６】
ジェット混合が発酵中に使用され得、場合によっては、糖化および発酵は同じ槽で実施される。
【０１９７】
微生物のための栄養分、例えば、２０１１年７月１５日に出願された米国特許出願公開２０１２／００５２５３６号（その全開示は参照により本明細書に組み込まれる）において記載される食品系栄養分パッケージは、糖化および／または発酵中に添加されてもよい。
【０１９８】
「発酵」は、２０１２年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５７９，５５９号、および２０１２年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５７９，５７６号（そのどちらの内容も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において開示される方法および生成物を含む。
【０１９９】
可動性発酵槽は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７４０２８号（２００７年７月２０日に出願され、英語でＷＯ２００８／０１１５９８号として公開され、米国を指定した）（その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる）において記載されるように、使用することができる。同様に、糖化設備は可動性とすることができる。さらに、糖化および／または発酵は、一部または完全に、輸送中に実施され得る。
【０２００】
発酵において使用される微生物（複数可）は、天然起源微生物および／または操作微生物とすることができる。例えば、微生物は、細菌（限定はされないが、例えば、セルロース分解性細菌が挙げられる）、真菌、（限定はされないが、例えば、酵母が挙げられる）、植物、原生生物、例えば、原虫または真菌様原生生物（限定はされないが、例えば、粘菌が挙げられる）、または藻類とすることができる。生物が適合する場合、生物の混合物が使用され得る。
【０２０１】
好適な発酵微生物は、炭水化物、例えばグルコース、果糖、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、オリゴ糖または多糖を発酵生成物に変換する能力を有する。発酵微生物は、サッカロマイセス属種（限定はされないが、Ｓ．セレビシエ（パン酵母）、Ｓ．ジアスタティカス（ｄｉｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ウバラムが挙げられる）、クリベロミセス属（限定はされないが、Ｋ．マルキシアヌス、Ｋ．フラジリスが挙げられる）、カンジダ属（限定はされないが、Ｃ．シュードトロピカリス、およびＣ．ブラシカが挙げられる）、ピキア・スティピティス（カンジダ・シハタエの近縁種）、クラビスポラ属（限定はされないが、Ｃ．ルシタニエおよびＣ．オプンティアエが挙げられる）、パキソレン属（限定はされないが、Ｐ．タンノフィルスが挙げられる）、ブレタノミセス属（限定はされないが、例えば、Ｂ．クラウセニイが挙げられる（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，  Ｇ．  Ｐ．，  １９９６，  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｗｙｍａｎ，  Ｃ．  Ｅ．，  ｅｄ．，  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  １７９−２１２））の株を含む。他の好適な微生物としては、例えば、ザイモモナス・モビリス、クロストリジウム種（限定はされないが、Ｃ．サーモセラム（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ、１９９６、上記）、Ｃ．サッカロブチルアセトニカム、Ｃ．サッカロブチリカム、Ｃ．パニセウム、Ｃ．ベイジェリンキ（ｂｅｉｊｅｒｎｃｋｉｉ）、およびＣ．アセトブチリカムが挙げられる）、モニリエラ・ポリニス、モニリエラ・メガチリエンシス、ラクトバチルス種ヤロウイア・リポリティカ、アウレオバシジウム種、トリコスポロノイデス種、トリゴノプシス・バリアビリス、トリコスポロン種、モニリエラ・アセトアブタンス種、チフラ・バリアビリス、カンジダ・マグノリアエ、ウスチラジノマイシーテス種、シュードジーマ・ツクバエンシス、ザイゴサッカロミセス属の酵母種、デバリオマイセス、ハンゼヌラおよびピキア、および黒色（ｄｅｍａｔｉｏｉｄ）トルラ属の真菌が挙げられる。
【０２０２】
例えば、クロストリジウム種が、エタノール、ブタノール、酪酸、酢酸、およびアセトンを生成させるために使用され得る。ラクトバチルス種が乳酸を生成させるために使用され得る。
【０２０３】
多くのこのような微生物株が、商業的にまたは保管所、例えば、数例を挙げると、ＡＴＣＣ（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、ＵＳＡ）、ＮＲＲＬ（農業研究サービス系統保存機関、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）、またはＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  ドイツ）を介して公的に入手可能である。
【０２０４】
市販の酵母としては、例えば、Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ（登録商標）／Ｌｅｓａｆｆｒｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ／Ｌｅｓａｆｆｒｅ、ＵＳＡから入手可能）、ＦＡＬＩ（登録商標）（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ  Ｙｅａｓｔ、Ｂｕｒｎｓ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｃ．の部、ＵＳＡから入手可能）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（登録商標）（Ａｌｌｔｅｃｈ、現在Ｌａｌｅｍａｎｄから入手可能）、ＧＥＲＴ  ＳＴＲＡＮＤ（登録商標）（Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、スウェーデンから入手可能）およびＦＥＲＭＯＬ（登録商標）（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓから入手可能）が挙げられる。
【０２０５】
バイオマス材料を糖化し、糖を生成させるために使用することができる多くの微生物はまた、それらの糖を発酵させ、有用な生成物に変換するために使用することができる。
【０２０６】
発酵後、得られた流体は、例えば、「ビールカラム」を使用して蒸留することができ、エタノールおよび他のアルコールが大部分の水および残留固体から分離される。ビールカラムから出て行く蒸気は、例えば、３５重量％エタノールとすることができ、精留カラムに送ることができる。精留カラムからの共沸に近い（９２．５％）エタノールおよび水の混合物は、気相モレキュラーシーブを用いて純粋（９９．５％）エタノールに精製することができる。ビールカラム底部は、３効用蒸発器の第１のエフェクトに送ることができる。精留カラム還流冷却器は、この第１のエフェクトのために熱を提供することができる。第１のエフェクト後、固体は遠心分離機を用いて分離することができ、回転乾燥機内で乾燥させることができる。遠心分離機排出物の一部（２５％）は、発酵にリサイクルさせることができ、残りは、第２および第３の蒸発器エフェクトに送ることができる。蒸発器凝縮物のほとんどはかなり清浄な凝縮物として、プロセスに戻すことができ、ごく一部が廃水処理に分離され、低沸点化合物の蓄積が防止される。
【０２０７】
本明細書で記載されるプロセスからの生成物の他の型の化学変換、例えば、有機糖由来生成物（例えば、フルフラールおよびフルフラール由来生成物）の生成が使用され得る。糖由来生成物の化学変換は２０１２年７月３日に出願された米国仮特許出願第６１／６６７，４８１号（その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載される。
【０２０８】
実施例
本発明についてさらに、下記実験例を参照することにより詳細に記載する。これらの実施例は説明目的のためだけに提供され、他に特に規定がなければ、限定することを意図しない。よって、本発明は決して、下記実施例に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のおよび全ての変形を包含するものと解釈されるべきである。
【０２０９】
さらなる説明なしで、当業者は、前の説明および下記例示的な例を使用して、本発明の化合物を生成させ、利用することができ、特許請求される方法を実施することができると考えられる。下記実用的実施例は具体的に、本発明の様々な態様を指摘しており、決して本開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２１０】
実施例１：大腸菌におけるＣｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓの発現
Ｃｅｌ３ａの成熟配列（アミノ酸２０−７４４）を合成し、Ｇｅｎｅｗｉｚにより大腸菌発現に対してコドン−最適化した。下記実施例において言及されるＣｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓは、８×Ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）タグをＣ末端に有するＣｅｌ３ａのコドン−最適化成熟配列（ａａｓ２０−７４４）を示す。下記プライマーを使用して、Ｃｅｌ３ａ−Ｃ’ＨｉｓをｐＥＴ−Ｄｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログＮｏ．７１１４６）にクローン化した：
【化５】
2017530702.tif 000009
（ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位には下線が施されており；開始および終止コドンは太字であり；ポリヒスチジン（８−Ｈｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１））タグ；ならびにグリシン−セリン（ＧＳＧＳ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）リンカーがイタリックである）。
増幅反応を、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログＮｏ．６００６７２）を使用して実施した。
【０２１１】
増幅されたＤＮＡを制限消化により、ＮｃｏＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒ３１９３）およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒ３１０４）を用いて、製造者により示唆された条件下でクローン化させた。消化され、増幅されたＤＮＡをｐＥＴＤｕｅｔベクター内のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位中に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２０２）を使用して連結させ、続いて、大腸菌クローニング宿主Ｔｏｐ１０  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。プラスミド精製を、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製キットを用いて実施した。
【０２１２】
Ｃｅｌ３Ａ−Ｃ’Ｈｉｓコンストラクトを、大腸菌発現宿主Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログＮｏ．７０８３７）に形質転換させ、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ１７６０）、１５μｇ／ｍｌカナマイシン（ｋａｎａｍｙｓｉｎ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ９０６）および１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｅｄ、カタログＮｏ．ＢＰ９１２）を含むプレート上でストリークさせた。組換えＤＮＡを有するコロニーを２ｍｌ種菌の接種のためにプレートから選び取り、一晩３７℃で増殖させ、そうしてその後、適切な抗生物質を含むＬＢ培地１００ｍｌに接種するために使用した。培養物を３７℃でＯＤ６００が０．８に達するまで増殖させた。
【０２１３】
タンパク質発現を誘導するために、５００μＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＮｏ．ＢＰ１７５５）を添加した。発現培養物をもう４時間３７℃で、さらに増殖させた。細胞を、４２００、室温（ＲＴ）での３０分間の遠心分離により、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｓｔ１６ローターＴＸ４００を使用して収集した。
【０２１４】
実施例２：不溶性分画からのＣｅｌ３ａの可溶化
バイオマス分解活性を有する酵素、Ｃｅｌ３ａを発現する大腸菌の培養物を培養し、実施例１に記載のように酵素発現を誘導した。可溶性および不溶性分画から、Ｃ末端で、Ｈｉｓタグでタグ付けされたＣｅｌ３ａ（Ｃｅｌ３ａ−Ｃ’Ｈｉｓ）の単離を以下のように行った。細胞培養物を、４２００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清を廃棄し、細胞のペレットを１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む溶解バッファーに再懸濁した。Ｌｙｓｏｎａｓｅ、たとえば細胞のペースト１ｇあたり１０μｌのＬｙｓｏｎａｓｅ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ７１３２０）を添加し、大気温度で１時間試料をインキュベートした。１時間後、３０秒間隔で合計２分間試料を超音波処理した。超音波処理の後、試料を１００００ｒｐｍで３０分間遠心した。上清、または可溶性分画は可溶化したＣｅｌ３ａを含み、残りのペレットまたは不溶性分画は、封入体および不溶性のＣｅｌ３ａを含む。
【０２１５】
不溶性分画を、可溶化剤を含むバッファーに１５分間再度懸濁し、室温でボルテックスにかけた（具体的には６Ｍの尿素のｐＨ８  ＩＭＡＣ結合バッファー）。次に試料を、ＩＭＡＣ精製用に調製するために０．４５μｍの膜を介してろ過した。添加した６Ｍの尿素のｐＨ８  ＩＭＡＣ結合バッファーの量は、細胞の質量の量に比例していた（たとえば１容量の細胞の質量に対して２または３容量のバッファー）。結合バッファーの量は、試料の濾過を可能にするために細胞の質量が増加するにつれて増加する。
【０２１６】
実施例３：Ｃｅｌ３ａの精製
可溶性Ｃｅｌ３ａの精製
実施例２からの可溶性分画を、あらかじめ平衡化したＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ（商標）Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ（Ｂｉｏｒａｄ）Ｎｉで荷電したＩＭＡＣ樹脂のスラリー（ＢｉｏＲａｄ，カタログＮｏ．７３２−４６１４）１００μｌを含む新鮮なチューブに移した。天然の結合バッファーは、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および５μＭのイミダゾールを含むものであった。タンパク質を室温（ＲＴ）で１時間バッチ結合させ、次に２５μＭのイミダゾールを含む天然のバッファーで洗浄した。タンパク質を、２００μＭのイミダゾールを含む天然のバッファー３００μｌ中に溶出した。
【０２１７】
不溶性Ｃｅｌ３ａの精製
Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ（商標）Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣの５ｍｌのカートリッジ（ＢｉｏＲａｄ，カタログＮｏ．７３２−４６１４）を、５カラム容量の６Ｍの尿素のｐＨ８  ＩＭＡＣ結合バッファーを用いて、流速５ｍｌ／分で平衡化した。カラムを平衡化した後、実施例２からの再懸濁した不溶性分画を、流速１ｍｌ／分で充填した。次にカラムは、６Ｍの尿素のｐＨ８  ＩＭＡＣ結合バッファーの１５カラム容量の洗浄を、流速５ｍｌ／分で受領した。可溶化したＣｅｌ３ａを、１０カラム容量の６Ｍの尿素  ｐＨ４  ＩＭＡ溶出バッファーを用いて、流速５ｍｌ／分でカラムから溶出した。得られた可溶化したＣｅｌ３ａの試料は６Ｍの尿素を含む。
【０２１８】
ＩＭＡＣクロマトグラフィー解析を行い（ＩＭＡＣカラム、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ（商標）Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ（商標）ＩＭＡＣカートリッジ５ｍＬ、Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ７３２−４６１４を使用）、図１に示されるように、精製した可溶化Ｃｅｌ３ａを検出した。
【０２１９】
以下の分画：精製した可溶性Ｃｅｌ３ａ（図２のレーン２）；不溶性分画のＩＭＡＣ精製からの流れ（図２のレーン３）；および不溶性分画由来の精製したＣｅｌ３ａ（可溶化したＣｅｌ３ａ）（図２のレーン４）において上述の精製からのＣｅｌ３ａの量を評価するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。図２に示されるように、上述の方法を使用して、不溶性分画の封入体からＣｅｌ３ａがうまく単離した。
【０２２０】
実施例４：可溶化したＣｅｌ３ａのセロビアーゼ活性アッセイの解析
Ｃｅｌ３ａを実施例３に記載されるようにＩＭＡＣ技術を用いて精製した。活性アッセイを行う前に、精製されたＣｅｌ３ａの量（力価）を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイおよび／またはｎａｎｏｄｒｏｐを用いて決定した。ｎａｎｏｄｒｏｐ定量では、モル吸光係数を、標的形態のＣｅｌ３ａのアミノ酸配列をＥｘＰＡＳｙ  ＰｒｏｔＰａｒａｍオンラインツールに挿入することにより推定した。
【０２２１】
活性アッセイでは、精製したＣｅｌ３ａを含む試料の２倍段階希釈を、バッファーとして５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０のＮａＯＨを使用して調製した。希釈物を９６ウェルプレートのうちの１列にわたりアリコートした。希釈物を、５０ｍＭクエン酸二水素ナトリウム緩衝液中のＤ−（＋）−セロビオース（Ｆｌｕｋａ）基質溶液と、ｐＨ５．０、４８℃で３０分間インキュベートした。すぐにプレートを、接着プレートシールを使用して密閉し、４８℃、７００ｒｐｍに設定したマイクロプレートインキュベーター震盪機上に配置した。３０分後、試料を１００℃で５分間、加熱乾燥槽上で加熱し、反応を停止させた。次にプレートを、９６ウェルプレート形式の０．４５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ膜を介してろ過した。濾過した試料をグルコースおよびセロビオースに対して、ＹＳＩ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ分析計（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および／またはＨＰＬＣ方法（ＵＰＬＣ）を用いて分析した。可溶性分画および不溶性分画から精製したＣｅｌ３ａのセロビアーゼ活性をグラフにプロットした。この結果は図３に示されている。図３は、可溶化したＣｅｌ３ａが尿素の存在下であってもセロビアーゼ活性を有することを示す。
【０２２２】
またセロビアーゼ活性を、実施例３に記載されるＩＭＡＣ精製法により精製されていない可溶化Ｃｅｌ３ａに関してアッセイした。Ｃｅｌ３ａを発現する細胞のペレットを溶解バッファーで洗浄した後、６Ｍの尿素を含む可溶化バッファーで可溶化した。６Ｍの尿素のバッファー中の可溶化したＣｅｌ３ａを含む粗製ライセート試料のセロビアーゼ活性を、上述のセロビアーゼアッセイによりアッセイした。３０分以内にグルコースに変換したセロビオースのパーセンテージを、可溶性Ｃｅｌ３ａ、可溶性洗浄物、および粗製ライセートから可溶化したＣｅｌ３ａの間で比較した（図４）。精製することなく可溶化したＣｅｌ３ａもまた、セロビアーゼ活性を有した。
【０２２３】
等価物
本明細書で引用される各および全ての特許、特許出願、および出版物の開示は、これにより、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。この発明について特定の態様を参照して開示してきたが、この発明の他の態様および変更は、当業者により、発明の真の精神および範囲から逸脱せずに考案することができることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、このような態様および等価の変更を全て含むと解釈されることが意図される。
【図１】
2017530702.tif 000010
【図２】
2017530702.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月5日(2017.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017530702000001.app
【国際調査報告】
2017530702.tif 000014
2017530702.tif 000015
2017530702.tif 000016