(57)【要約】  本発明は、ＣＰＮＥ７タンパク質を含む非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化用組成物及び前記組成物を利用したイン・ビトロで非歯系中間葉幹細胞の分化方法及びその用途に関する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子を含む非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化用組成物。
【請求項２】
前記非歯系中間葉幹細胞は、骨髄中肝葉幹細胞または脂肪幹細胞を含むものである、請求項１に記載の象牙芽細胞への分化用組成物。
【請求項３】
前記非歯系中間葉幹細胞は、自己、同種または異種由来である、請求項２に記載の象牙芽細胞への分化用組成物。
【請求項４】
前記ＣＰＮＥ７による象牙芽細胞への分化は、ヌクレオリンと相互作用によるＤｓｐｐ発現調節によるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一つに記載の組成物を利用したイン・ビトロで非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化方法。
【請求項６】
ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子を非歯系中間葉幹細胞に処理する段階を含むイン・ビトロで非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化方法。
【請求項７】
前記非歯系中間葉幹細胞は、自己、同種または異種由来である、請求項６に記載のイン・ビトロで非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化方法。
【請求項８】
ＣＰＮＥ７を過発現する中間葉幹細胞、前記中間葉幹細胞から由来した象牙芽細胞に分化することができる前駆細胞または前記中間葉幹細胞から分化した象牙芽細胞を有効性分として含む、象牙質または歯髄組織再生用細胞治療剤。
【請求項９】
前記細胞治療剤は、象牙質知覚過敏症、歯髄充血、歯髄炎、歯髄変性、歯髄の壊死及び壊疽治療用である、請求項８に記載の象牙質または歯髄組織再生用細胞治療剤。
【請求項１０】
前記細胞治療剤は、露出した歯髄部位や、病変歯髄が除去された空いた歯髄腔に投与されるものである、請求項８に記載の象牙質または歯髄組織再生用細胞治療剤。
【請求項１１】
ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子を含む非歯系中間葉幹細胞の分化促進による象牙質または歯髄組織再生用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非歯系中間葉幹細胞から象牙芽細胞への分化方法及びこれを利用した歯髄組織再生及び象牙質知覚過敏症治療分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯髄とは、歯の内部にある歯髄腔を満たしているやわらかい結合組織で、神経と血管が豊富に分布していて、象牙質の表層にまで至る所をいう。このような歯髄に生じる病変を歯髄疾患という。
【０００３】
歯髄疾患の原因は、非常に多様であるが、多くの場合は、虫歯による細菌感染と歯の穿孔、歯の破折、亀裂、歯周ポケットを介して歯髄内部への感染によって発生する。また、外傷、摩耗、歯亀裂、治療時歯科用器具から出る熱と摩擦などによっても誘発される。細菌感染による歯髄炎は、歯根端疾患と歯周疾患に拡大され得る。歯髄疾患が発生した時、歯髄充血、歯髄炎、歯髄壊死の順に進行される。歯髄壊死の場合、歯髄が死んで歯髄に血液供給が全く行われないため、全体歯周組織がなくなってしまい後には歯根端疾患または歯全体の異常を招くことになる。
【０００４】
歯髄、歯根端疾患の治療は、歯髄複製剤と歯根管充填材を使用するが、一般にカルシウムヒドロキシド、ＭＴＡ（Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｔｒｉｏｘｉｄｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ガタパーチャ（Ｇｕｔｔａ−ｐｅｒｃｈａ）等が利用されてきた。ＭＴＡの場合、密封力と生体親和的な性質を有していて、治療に効果を表すか、相対的に歯科治療剤として高費用問題が発生して、変色されて審美的な問題が発生する。ガタパーチャの場合、費用が経済的で流動性が良いが、慢性炎症反応や象牙質に接着し難く、損傷した組織の再生誘導力が落ちて何より歯髄生活力を喪失することになる、生理的でない治療方法である。現在まで象牙質−歯髄疾患を治療する保存的な治療方法は、治療した歯が弱くなったり、脆弱であり、再感染の恐れがある。
【０００５】
特許文献１には、エナメル芽細胞、アピカル・バッド細胞またはこれらの培養液を有効性分として含有する硬組織形成及び、象牙質または歯髄組織再生用組成物について記載している。また、特許文献２には、新しい歯小嚢由来の歯幹細胞及びその培養方法について記載している。
【０００６】
しかし、これまでのところ歯系（ｄｅｎｔａｌ）中間葉幹細胞だけでなく非歯系（ｎｏｎ−ｄｅｎｔａｌ）中間葉幹細胞を象牙芽細胞に分化させることで象牙質を再生したりまたは歯髄組織を再生する方法及びこれを利用した歯髄疾患の治療については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国公開特許番号第２０１２−００８９５４７号
【特許文献２】大韓民国公開特許番号第２００９−００３３６４３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願は、ＣＰＮＥ７タンパク質を含む非歯系中間葉幹細胞分化及び象牙質または歯髄組織再生用薬学的組成物、方法及びその用途を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一様態で本願は、ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子を含む非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化用組成物または用途を提供する。
【００１０】
本願に係る組成物は、非歯系自己、同種または異種由来の中間葉幹細胞、例えば骨髄中肝葉幹細胞または脂肪幹細胞などを歯系幹細胞に分化させることができる。
【００１１】
本願に係るＣＰＮＥ７タンパク質による象牙芽細胞への分化は、これのヌクレオリンと相互作用によるＤｓｐｐ発現調節によるものであるが、これに制限されない。
【００１２】
他の様態で本願はまた、本願に係る組成物を利用したイン・ビトロで非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化方法を提供して、前記方法は、ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子を非歯系中間葉幹細胞に処理する段階を含む。
【００１３】
他の様態で本願はまた、ＣＰＮＥ７を過発現または発現する中間葉幹細胞、前記中間葉幹細胞から由来した象牙芽細胞に分化することができる前駆細胞または前記中間葉幹細胞から分化した象牙芽細胞を有効性分として含む、象牙質または歯髄組織再生用細胞治療剤を提供する。
【００１４】
本願に係る細胞治療剤は、象牙質知覚過敏症、歯髄充血、歯髄炎、歯髄変性、歯髄の壊死及び壊疽疾患などで象牙質または歯髄組織再生に使用されてこれらの疾患を治療することができる。
【００１５】
本願に係る細胞治療剤は、露出された歯髄部位または病変歯髄が除去された空いた歯髄腔に投与されて象牙質または歯髄組織再生に使用できる。
【００１６】
他の様態で本願のＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子を含む象牙質または歯髄組織再生用組成物を提供する。
【００１７】
さらに他の様態で本願は、ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子の非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化用用途を提供する。
【００１８】
さらに他の様態で本願は、ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子の象牙質または歯髄組織再生用用途を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のＣＰＮＥ７を含む非歯系中間葉幹細胞分化組成物または方法は、歯系中間葉幹細胞だけでなく非歯系中間葉幹細胞のＤＳＰＰ発現を増加させて、象牙芽細胞分化を誘導して象牙質形成を促進して、歯内環境で歯髄組織再生を誘導して、生体内では硬組織形成を促進させて、象牙質または歯髄組織再生用として歯周疾患または歯根端疾患の治療に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】ＣＰＮＥ７がエナメル芽細胞分化の間発現することを示す。ＡＬＣ（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌ）ラインを分化培地で２週間以上培養した。図１ａはＡＬＣにあるＣＰＮＥ７、Ｏｄａｍ、及びＭｍｐ−２０  ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで測定したものである。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照群として使用された。
【図１ｂ】ＣＰＮＥ７がエナメル芽細胞分化の間発現することを示す。ＡＬＣ（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌ）ラインを分化培地で２週間以上培養した。図１ｂは、指示された日のＡＬＣｓにあるＣＰＮＥ７、Ｏｄａｍ、及びＭｍｐ−２０の発現をウェスタンブロット分析で測定した。ＣＰＮＥ７、Ｏｄａｍ、及びＭｍｐ−２０は、全細胞融解物で探知された。
【図１ｃ】ＣＰＮＥ７がエナメル芽細胞分化の間発現することを示す。ＡＬＣ（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌ）ラインを分化培地で２週間以上培養した。図１ｃは、ＡＬＣｓにあるＣＰＮＥ７の位置は、免疫蛍光で調べた。２次抗体単独を陰性対照群として使用した。細胞は、ＤＡＰＩで対照染色した。スケールバーは、２０μｍを示す。
【図２ａ】ＣＰＮＥ７がエナメル芽細胞から象牙芽細胞に転座することを示す。図２ａは、胚１９日（Ｅ１９）及び生後７日（Ｐ７）及び１０日（Ｐ１０）にマウス歯発達の間ＣＰＮＥ７発現を免疫組織化学に探知した。ＣＰＮＥ７タンパク質は、Ｅ１９日には内部エナメル内皮及び基質中間体に；Ｐ７には分化する象牙芽細胞に；そしてＰ１０には象牙質、予備象牙質及び分化した象牙芽細胞にあった（矢印）。ＩＥＥ：内部象牙質内皮（ｉｎｎｅｒ  ｅｎａｍｅｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、ＳＩ：基質中間体（ｓｔｒａｔｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）、Ｏｄ：象牙芽細胞（ｏｄｏｎｔｏｂｌａｓｔ）、Ａｍ：エナメル芽細胞（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｓ）、Ｅ：エナメル（ｅｎａｍｅｌ）、Ｄ：象牙質（ｄｅｎｔｉｎ）。スケールバーは、２００μｍを示す。
【図２ｂ】ＣＰＮＥ７がエナメル芽細胞から象牙芽細胞に転座することを示す。図２ｂは、共同培養システムの系統図（Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ  ｄｉａｇｒａｍ）。フラッグタグされたＣＰＮＥ７と共にＡＬＣを上部チャンバーにシードして象牙芽細胞ＭＤＰＣ−２３細胞は底チャンバーにシードした。Ｅｐｉ：内皮細胞、Ｍｅｓ：中間葉細胞。共同培養システムでＡＬＣｓによって合成されたフラッグ−タグされたＣＰＮＥ７のＭＤＰＣ−２３細胞への転座は、ウェスタンブロットで探知した。ＧＡＰＤＨをローディング対照群として使用した。
【図３ａ】ＣＰＮＥ７が象牙芽細胞分化の間発現することを示す。象牙芽細胞細胞ラインＭＤＰＣ−２３を分化培地で２週以上培養した。図３ａは、ＭＤＰＣ−２３細胞でＣＰＮＥ７の位置は免疫蛍光で探知した。２次抗体単独を陰性対照群として使用した。細胞は、ＤＡＰＩで対照染色した。スケールバーは、２０μｍを示す。
【図３ｂ】ＣＰＮＥ７が象牙芽細胞分化の間発現することを示す。象牙芽細胞細胞ラインＭＤＰＣ−２３を分化培地で２週以上培養した。図３ｂは、ＭＤＰＣ−２３細胞で決まった日にＣＰＮＥ７、Ｄｓｐｐ、及びＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ  ｍＲＮＡのレベルを定量的リアルタイムＰＣＲで測定した。すべての数値は、３回実験の平均±標準偏差（ＳＤ）で示した。＊Ｐ＜０．０１対照群と比較。
【図３ｃ】ＣＰＮＥ７が象牙芽細胞分化の間発現することを示す。象牙芽細胞細胞ラインＭＤＰＣ−２３を分化培地で２週以上培養した。図３ｃは、決まった日にＭＤＰＣ−２３細胞でＣＰＮＥ７、Ｄｓｐ、及びＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎレベルをウェスタンブロットで測定した。ＧＡＰＤＨをローディング対照群として使用した。サイトゾルＧＡＰＤＨ及び核ラミナＢを細胞分画対照群として使用した。Ｔｏｔａｌ：全細胞抽出物、Ｃｙｔｏ：サイトゾル分画、Ｎｕ：核分画。
【図４ａ】ＣＰＮＥ７刺激及び不活性化は、象牙芽細胞分化を調節することを示す。ＭＤＰＣ−２３細胞をＣＰＮＥ７過発現またはｓｉＲＮＡコンストラクトと共にトランスフェクトした。図４ａは、Ｄｓｐｐ  ｍＲＮＡ発現はリアルタイムＰＣＲで分析した。すべての数値は、３回実験の平均±標準偏差（ＳＤ）で示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対照群と比較した。
【図４ｂ】ＣＰＮＥ７刺激及び不活性化は、象牙芽細胞分化を調節することを示す。ＭＤＰＣ−２３細胞をＣＰＮＥ７過発現またはｓｉＲＮＡコンストラクトと共にトランスフェクトした。図４ｂは、ＣＰＮＥ７及びＤｓｐ発現をウェスタンブロットで分析した。ＧＡＰＤＢをローディング対照群として使用した。（Ｃ及びＤ）ＭＤＰＣ−２３細胞を１００ｎｇ／ｍｌ  ｒＣＰＮＥ７で処理した。
【図４ｃ】ＣＰＮＥ７刺激及び不活性化は、象牙芽細胞分化を調節することを示す。ＭＤＰＣ−２３細胞をＣＰＮＥ７過発現またはｓｉＲＮＡコンストラクトと共にトランスフェクトした。図４ｃは、ＣＰＮＥ７及びＤｓｐｐ  ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで測定した。すべての数値は、３回実験の平均±標準偏差（ＳＤ）で示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対照群と比較した。
【図４ｄ】ＣＰＮＥ７刺激及び不活性化は、象牙芽細胞分化を調節することを示す。ＭＤＰＣ−２３細胞をＣＰＮＥ７過発現またはｓｉＲＮＡコンストラクトと共にトランスフェクトした。図４ｄは、ＣＰＮＥ７及びＤｓｐタンパク質発現をウェスタンブロットで測定した。
【図４ｅ】ＣＰＮＥ７刺激及び不活性化は、象牙芽細胞分化を調節することを示す。ＭＤＰＣ−２３細胞をＣＰＮＥ７過発現またはｓｉＲＮＡコンストラクトと共にトランスフェクトした。図４ｅは、共同培養システムでＭＤＰＣ０２３細胞でＣＰＮＥ７及びＤｓｐ発現をウェスタンブロットで探知した。
【図４ｆ】ＣＰＮＥ７刺激及び不活性化は、象牙芽細胞分化を調節することを示す。ＭＤＰＣ−２３細胞をＣＰＮＥ７過発現またはｓｉＲＮＡコンストラクトと共にトランスフェクトした。図４ｆは、ＣＭでＣＰＮＥ７不活性化後ＭＤＰＣ−２３細胞でＤｓｐ発現をウェスタンブロットで分析した。Ｄｓｐｐプロモーターの転写活性をＭＤＰＣ−２３細胞内ＣＰＮＥ７またはＣＰＮＥ７  ｓｉＲＮＡ過発現を利用してルシフェラーゼアッセイで測定した。
【図４ｇ】ＣＰＮＥ７刺激及び不活性化は、象牙芽細胞分化を調節することを示す。ＭＤＰＣ−２３細胞をＣＰＮＥ７過発現またはｓｉＲＮＡコンストラクトと共にトランスフェクトした。図４ｇは、Ｄｓｐｐ転写活性がＣＰＮＥ７の過発現によって有意に促進されたが、ｓｉＲＮＡ−媒介されたＣＰＮＥ７ノックダウンによって抑制されることを測定した結果である。すべての数値は、３回実験の平均±標準偏差（ＳＤ）で示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対照群と比較した。
【図５】イン・ビボでヒト歯髄組織細胞（ｈＤＰＣｓ）を使用して再生した象牙質／歯髄組織複合体を組織学的分析したものを示す。（Ａ−Ｈ）ｈＤＰＣｓを１００ｍｇ ＨＡ／ＴＣＰ単独（Ａ及びＥ）、またはＣＭ（Ｂ及びＦ）、ＣＰＮＥ７抗体−処理されたＣＭ（Ｃ及びＧ）、またはｒＣＰＮＥ７（Ｄ及びＨ）と共に０．５％フィブリンゲルで混合して免疫システムが弱化されたマウスで６週間皮下に移植した。サンプルは、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ−Ｅ）で染色した（Ｅ−Ｈ）。Ａ−Ｄにあるボックス領域は、Ｅ−Ｈにあるものよりさらに拡大して示した。スケールバーは２００μｍである。
【図６】ＣＰＮＥ７がイン・ビボで過発現されるか不活性化されたｈＤＰＣｓで石灰化された組織形成の組織形態学的分析を示す（Ａ−Ｈ）。ｈＤＰＣｓは、トランスフェクトされなかったか（Ａ及びＥ）またはＣＰＮＥ７過発現（Ｂ及びＦ）、ＣＰＮＥ７  ｓｉＲＮＡ（Ｃ及びＧ）、対照群ｓｉＲＮＡ（Ｄ及びＨ）コンストラクトとトランスフェクトされて２週間免疫システムが弱化されたマウスで皮下に移植されたものである。再生した組織は、Ｈ−Ｅで染色した（Ｅ−Ｈ）。Ａ−Ｄにあるボックス領域は、Ｅ−Ｈにあるものよりさらに拡大して示した。スケールバーは２００μｍである（Ｉ）。４つのグループで生成された石灰化組織の総面積は、ＬＳスタータープログラムを使用して分析した。すべての数値は３回実験の平均±標準偏差（ＳＤ）で示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対照群と比較した。
【図７】移植１０週後ヒト歯の歯根管空間（ｒｏｏｔ  ｃａｎａｌ  ｓｐａｃｅ）での象牙質／歯髄組織−様組織形成を示したものである（Ａ−Ｉ）。０．５％フィブリンゲル内にｈＤＰＣ単独（Ａ、Ｄ、Ｇ）またはＣＭと共に（Ｂ、Ｅ、Ｈ）またはＣＰＮＥ７抗体処理されたＣＭと共に（Ｃ、Ｆ、Ｉ）１２週間ヒト歯セグメントの歯根管空間に注入した。再生した組織をＨ−Ｅで染色して（Ａ−Ｃ）抗−ＢＳＰ（Ｄ−Ｆ）及び抗−ＤＳＰ（Ｇ−Ｉ）で免疫染色した。Ｂ、Ｅ及びＨにある矢印は、象牙芽細胞突起と共に象牙質様細胞再生したものを示す。Ｐ：再生した歯髄組織、Ｄ：ｐｒｅ−既存象牙質壁、ＲＤ：新しく形成された代表的象牙質。スケールバーは１００μｍである。
【図８】イン・ビトロで及びイン・ビボで非歯系中間葉細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２及びｈＢＭＳＣに対するＣＰＮＥ７の影響を示したものである。（Ａ）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を誘導培地またはＡＬＣと共に共同培養で培養したものである。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞でＣＰＮＥ７、Ｄｍｐ１、及びＤｓｐ発現は、ウェスタンブロットで測定した。ＧＡＰＤＨをローディング対照群として使用した。（Ｂ）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＣＰＮＥ７過発現コンストラクトと共にトランスフェクトした。ＣＰＮＥ７及びＤｓｐ発現は、ウェスタンブロットで分析した。（Ｃ−Ｋ）０．５％フィブリンゲル内のｈＢＭＳＣｓ単独（Ｃ、Ｆ、Ｉ）またはｒＣＰＮＥ７と共に（５μｇ；Ｄ、Ｇ、Ｊ）またはｒＢＭＰ２（５μｇ；Ｅ、Ｈ、Ｋ）をイン・ビボで１２週間ヒト歯セグメントの歯根管空間に注入した。再生した組織は、Ｈ−Ｅ（Ｃ−Ｅ）で染色して抗−ＤＳＰ（Ｆ−Ｈ）及び抗−Ｎｅｓｔｉｎ（Ｉ−Ｋ）と共に免疫染色した。Ｄ、Ｇ及びＪにある点線は、象牙質細管構造を含む新しく形成された象牙質のマージン（ｍａｒｇｉｎ）を示す。Ｐ：再生したパルプ、Ｄ：ｐｒｅ−既存の象牙質壁、ＮＤ：新しく形成された生理学的象牙質。スケールバーは５０μｍである。
【図９ａ】ＣＰＮＥ７及びヌクレオリン複合体によってＤｓｐｐが調節されることを示す。図９ａは、ＣＰＮＥ７及びヌクレオリンの共同−位置化をＭＤＰＣ−２３細胞で蛍光顕微鏡で探知した。Ｃｙ３（２ｎｄ Ｃｙ３）及びＦＩＴＣ（２ｎｄ ＦＩＴＣ）に接合された２次抗体を陰性対照群として使用した。細胞は、ＤＡＰＩで対照染色した。スケールバーは２０μｍである。
【図９ｂ】ＣＰＮＥ７及びヌクレオリン複合体によってＤｓｐｐが調節されることを示す。図９ｂは、ＭＤＰＣ−２３細胞をフラッグ−タグされたＣＰＮＥ７発現またはＣＰＮＥ７  ｓｉＲＮＡコンストラクトと共にトランスフェクトした。免疫沈降された（ＩＰ）ＣＰＮＥ７及び全細胞融解物（Ｉｎｐｕｔ）を抗−ヌクレオリン抗体と共にウェスタンブロット（ＩＢ）で分析した。
【図９ｃ】ＣＰＮＥ７及びヌクレオリン複合体によってＤｓｐｐが調節されることを示す。図９ｃは、交差連結されたクロマチンを製造してＭＤＰＣ−２３細胞でｐｒｅ−免疫血清（ＩｇＧ）またはＮｆｉｃ−特異的抗体と共に免疫沈降した（上部）。交差連結された、せん断した（ｓｈｅａｒｅｄ）クロマチンは、ＣＰＮＥ７過発現と共にトランスフェクトされたＭＤＰＣ−２３細胞またはヌクレオリンｓｉＲＮＡコンストラクトから製造した。ＣｈＩＰアッセイは、ヌクレオリン、抗−ＣＰＮＥ７、またはＩｇＧ抗体を使用して行った。クロマチンサンプルは、ＤｓｐｐプロモーターにあるプライマーペアスパーニングＡＰ−１サイトを使用してＰＣＲ分析を行った。Ｉｎｐｕｔ：免疫沈降前に得たクロマチンのＰＣＲ生成物、ＩｇＧ：ｐｒｅ−免疫血清、ｐｏｓ１：ＣｈＩＰ陽性（抗−Ｎｆｉｃ）、ｎｅｇ：ＰＣＲ陰性、ｐｏｓ２：ＰＣＲ陽性、ｃｏｎ：対照群、ｓｉＮｕ：ヌクレオリンｓｉＲＮＡ。
【図９ｄ】ＣＰＮＥ７及びヌクレオリン複合体によってＤｓｐｐが調節されることを示す。図９ｄは、ＭＤＰＣ−２３細胞を指示されたベクターと共に共同トランスフェクトした。Ｄｓｐｐプロモーターの転写活性は、ルシフェラーゼアッセイで測定した。ＭＤＰＣ−２３細胞でのＣＰＮＥ７、Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ、及びＤｓｐの発現レベルは、ウェスタンブロットで測定した。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照群として使用した。すべての数値は、３回実験の平均±標準偏差（ＳＤ）で示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１対照群と比較した。
【図１０】ＣＰＮＥ７がＡＬＣからＭＤＰＣ−２３細胞に転座したことを示す。ＧＦＰ−タグされたＣＰＮＥ７と共にトランスフェクトされたＡＬＣを上部チャンバーにシードして、ＭＤＰＣ−２３細胞は、底チャンバーにシードした。ＡＬＣからＭＤＰＣ−２３細胞へのＧＦＰ−タグされたＣＰＮＥ７の移動は、蛍光顕微鏡で探知した。細胞は、ＤＡＰＩで対照染色した。スケールバーは１００μｍである。
【図１１】ＣＰＮＥ７発現がＨＥＫ２９３及びＭＤＰＣ−２３細胞でのＣｐｎｅ７過発現及びＣＰＮＥ７  ｓｉＲＮＡによって調節されることを示す。ＣＰＮＥ７、ＣＰＮＥ７  ｓｉＲＮＡ、及び対照群ｓｉＲＮＡをエンコードするコンストラクトをＨＥＫ２９３及びＭＤＰＣ−２３細胞にトランスフェクトした。（上部）ＭＤＰＣ−２３細胞でのＣＰＮＥ７発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した。（下部）ＨＥＫ２９３細胞でのＣＰＮＥ７発現をＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロットで分析した。
【図１２】イン・ビトロで石灰化された細管形成に対するｒＣＰＮＥ７の効果を示したものである。ｒＣＰＮＥ７処理存在または不存在時に２週間ＭＤＰＣ−２３細胞を培養した。石灰化されたノジュール形成に対するｒＣＰＮＥ７の効果を決まった日にアリザリンレッドＳ染色で分析した。
【図１３】ヌクレオリンがＤｓｐｐプロモーターに結合したことを示す。ＭＤＰＣ−２３細胞をヌクレオリンｓｉＲＮＡと共にトランスフェクトして、核抽出物を製造して、野生型（ＷＴ）及び突然変異（ＭＴ）ＡＰ−１部位を含有するビオチン化されたＤｓｐｐプロモータープローブと混合した。複合体のヌクレオリンはウェスタンブロットで探知した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本願は、ＣＰＮＥ７が非歯系（ｎｏｎ  ｄｅｎｔａｌ）中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化を誘導して、象牙芽細胞の生成を促進することで、象牙芽細胞への分化方法または象牙芽細胞の生成が必要な疾患の治療に使用きるとの発見に基づいている。
【００２２】
一様態で本願は、ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子含む非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化方法または組成物または用途に関する。
【００２３】
本願の「ＣＰＮＥ７タンパク質」とは、ＣＰＮＥ７遺伝子によってコードされる、カルシウム−依存性メンブレン結合タンパク質であるコピン（ｃｏｐｉｎｅ）ファミリーの一つをいう。前記タンパク質は、二つのＮ−末端Ｃ２ドメイン及び一つのフォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ  ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子Ａドメインを含有する。本願発明の目的達成のために、本願発明の効果を達成する限り、種々の由来及び／または形態のＣＰＮＥ７遺伝子及び／またはタンパク質が使用できる。野生型配列はもちろん、細胞内での発現またはタンパク質の安定性などのような特徴が有利になるように塩基配列の一部が人為的に変形された遺伝子、及び自然に発見される塩基配列の一部が変形された遺伝子またはこれらの全ての断片を含むものである。遺伝子塩基配列の変形は、相応するアミノ酸の変形を伴うこともあれば、伴わないこともあり、アミノ酸の変形を伴う場合にはこのような変形が誘発された遺伝子はこれによってコードされるタンパク質で一つ以上のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質を暗号化することで、突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）、誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅｓ）、変形体（ｖａｒｉａｎｔｓ）及び相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）を含むものである。遺伝子塩基配列の変異がタンパク質中のアミノ酸の変形を伴わない場合は、例えば縮重変異があり、このような縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ  ｍｕｔａｎｔｓ）も本発明の前記遺伝子に含まれる。
【００２４】
人為的遺伝子塩基配列の変形は、当業者に周知の方法、例えば、部位−誘導性突然変異法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８７）、エラー誘発ＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｇ．Ｆ．Ｊｏｙｃｅ．１９９２．ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，２：２８−３３．）、点突然変異法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．）等によって製造できる。
【００２５】
本願に使用されるタンパク質は、当業界に公示された方法を使用して製造できる。一実現例ではタンパク質の製造方法は、遺伝子組換え技術を利用するものである。例えば、前記タンパク質をコードする相応する遺伝子を含むベクターを原核または、真核細胞細胞、例えば昆虫細胞、ほ乳類細胞に伝達して発現させた後、精製して称することができる。前記プラスミドは、例えばｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような発現ベクターに該当遺伝子をクローニングして細胞株にトランスフェクトした後、発現したタンパク質を精製して使用することができるが、これに制限されない。合成されたタンパク質は、沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィーＨＰＬＣ、逆相−ＨＰＬＣ、プレップ用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗−スクリーニングタンパク質抗体を利用した親和性カラムなどを含むカラムクロマトグラフィーで分離精製できる。
【００２６】
本願に係る一実現例で、ＣＰＮＥ７遺伝子及びタンパク質は類人猿、ヒトなどのようなほ乳動物由来であり、特にヒト由来である。ＣＰＮＥ７遺伝子及びタンパク質は、その全長または本願の効果を達成する限りその断片がさらに使用でき、全長配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号でマウスの場合、ＮＭ１７０６８４（アミノ酸）、ＮＰ７３３７８５（核酸）、ヒトの場合、ＮＭ０１４４２７（アミノ酸）、ＮＰ０５５２４２（核酸）を参照することができるが、これに制限されない。
【００２７】
本願に係る一実現例で、上述した遺伝子は、本願の組成物が使用される細胞内で発現可能にプロモーターに作動可能に連結されたベクターの形態で提供されてもよい。
【００２８】
本願に係るＣＰＮＥ７は、非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化を誘導する。ヒトの親知らずなどから分離できる歯髄幹細胞（ｈＤＰＳＣ）は、象牙芽細胞と骨芽細胞に分化可能であるが、本願に係る組成物及び方法は、入手し易い非歯系幹細胞も象牙芽細胞または骨芽細胞に分化できる長所がある。今まで歯髄−象牙質再生及び象牙芽細胞分化誘導に関する研究の多くは歯系中間葉幹細胞を利用して進行されてきたが、歯系中間葉幹細胞は、発生学的に以前に既に歯系上皮と相互誘導信号をやりとりする中間葉幹細胞である。しかし、本願によって非歯系中間葉幹細胞までも利用可能になるのであれば、歯髄−象牙質再生及び象牙芽細胞分化において、このような特殊誘導信号を受けた歯系幹細胞はもちろん非歯系中間葉幹細胞までも使用可能であり、すなわち利用可能な幹細胞の種類と範囲がさらに広くなり、従って実際のヒトへの臨床的適用において長所及び便利性が増大する。また、非歯系幹細胞までも象牙芽細胞に分化させることができることは、中間葉幹細胞から歯系象牙芽細胞への根本的な分化メカニズムを理解するのに有用に使用することができる。
【００２９】
本願で象牙芽細胞は象牙質と当たっていて、象牙質を形成する円柱型の細胞で機能的に歯の主な構成成分である象牙質を直接的に作る役割をして、この細胞自体は象牙質内側に存在する「歯髄」という組織の一構成成分として歯の内部の歯髄腔壁に配列されて存在している（Ｖｉｃｔｏｒ，Ｅ．；Ａｒａｎａ−Ｃｈａｖｅｚ，Ｖ．Ｅ．；Ｍａｓｓａ，ＬＦ．Ｏｄｏｎｔｏｂｌａｓｔｓ：ｔｈｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｅｎｔｉｎｅ．Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４  ３６：１３６７７３）。
【００３０】
本願で歯系（ｄｅｎｔａｌ  ｏｒｉｇｉｎ）中間葉幹細胞とは、「歯系上皮細胞の影響を受けた（一部分の）幹細胞を意味して、中胚葉性起源で歯の内部の歯髄と歯の周囲組織に分布する幹細胞をいうが、歯髄幹細胞（ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ（ＤＰＳＣ））、脱落乳歯幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆｒｏｍ  ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ  ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ  ｔｅｅｔｈ（ＳＨＥＤ））、歯周靭帯幹細胞（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ（ＰＤＬＳＣ））、歯根端乳頭幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｐｉｃａｌ  ｐａｐｉｌｌａ（ＳＣＡＰ）、及び歯胚幹細胞（ｄｅｎｔａｌ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ（ＤＦＰＣ））の５種類が知られている。
【００３１】
本願の非歯系中間葉幹細胞は、歯系幹細胞と同等な線上の歯系でない他の組織起源の幹細胞という概念を含み、歯系幹細胞よりも上位の概念であり、さらに広い範囲の歯系上皮細胞の影響を受けなかったいずれの幹細胞を含むことができる。例えば、歯の内部の歯髄及び歯の周囲組織から由来しないものとして、次のような中間葉幹細胞をいう。本願で、中間葉幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）とは、臍帯血、脂肪、骨髄（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）、血液、真皮または骨膜から分離される幹細胞として、種々の細胞、例えば脂肪細胞、軟骨細胞及び骨細胞などに分化できる万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を意味する。また、中間葉幹細胞は、免疫抑制剤の使用なくても同種または異種受恵者に効果的に生着できる特徴がある。
【００３２】
一実現例で本願の組成物または方法に使用することができる中間葉幹細胞は、動物の中間葉幹細胞であり、好ましくはほ乳動物、より好ましくはヒトの中間葉幹細胞であってもよい。また、本発明の中間葉幹細胞は、骨髄、脂肪組織、末梢血液、肝由来であってもよい。本願の一実現例で、骨髄由来幹細胞または脂肪幹細胞が使用される。本願の治療用組成物に使用される細胞は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞であり、特に自己細胞である。
【００３３】
中間葉幹細胞は、骨髄などに少量存在するが、これを分離及び培養する過程は、当業界に周知して、例えば米国特許第５４８６３５９号を参照することができる。また、本願の中間葉幹細胞は、公示された方法により骨髄の造血幹細胞から付着特性によって分離した後、分化能力を失わなかった状態で増殖させて得られる。
【００３４】
例えば、中間葉幹細胞を得る過程を具体的に説明すると次のとおりである：（１）ヒトまたはマウスを含むほ乳動物、好ましくは、ヒトの中間葉幹細胞、例えば、血液または骨髄から中間葉幹細胞を分離する段階（前記骨髄は、脛骨、大腿骨、脊髄または、腸骨から抽出することができる。）；分離した細胞を適切な培地で培養する段階及び培養過程で浮遊細胞を除去して培養プレートに付着した細胞を継代培養して、最終的に構築された中間葉幹細胞を収得する段階を介して得ることができる。
【００３５】
前記過程で利用される培地としては、幹細胞の培養に利用される一般的ないかなる培地も利用することができる。好ましくは、血清（例えば、牛胎児血清、馬血清及びヒト血清）が含まれた培地である。本発明で利用できる培地は、例えば、ＲＰＭＩシリーズ、Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ，Ｅａｇｌｅ，Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３０：４３２（１９５９））、α−ＭＥＭ（Ｓｔａｎｎｅｒ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．２３０：５２（１９７１））、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：９２３（１９７８））、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，７３：１（１９５０））、ＣＭＲＬ  １０６６、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９：５１９（１９６７））、Ｆ１２（Ｈａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５３：２８８（１９６５））、Ｆ１０（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２９：５１５（１９６３））、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８：３９６（１９５９））、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物（Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０））、Ｗａｙ−ｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｃ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２２：１００３（１９５９））、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ（ＭｃＣｏｙ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１００：１１５（１９５９））及びＭＣＤＢシリーズ（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １４：１１（１９７８））を含むが、これらに限定されない。前記培地には、他の成分、例えば、抗生剤または抗真菌剤（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）及びグルタミンなどが含まれてもよい。
【００３６】
他の例で中間葉幹細胞の確認は、フローサイトメトリーを介して行うことができる。このようなフローサイトメトリーは、中間葉幹細胞の特異な表面マーカーを利用して実施される。例えば、中間葉幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ２９及び／またはＭＨＣクラスＩに対し陽性反応を示すので、これによって中間葉幹細胞を確認することができる。
【００３７】
一実現例で本願に係る組成物は、非歯系中間葉幹細胞に処理されて非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化に使用することができる。この場合、本願に係る組成物は、ＣＰＮＥ７遺伝子またはこれを含むベクターを適切な細胞にトランスフェクトのような後述する方法によって導入して、過発現して達成でき、象牙芽細胞への分化のための組成物は、当業者水準で適切なものが選択できて、本願の実施例に記載されたのを参照することができる。
【００３８】
このような側面で本願は、本願に係る組成物、またはＣＰＮＥ７遺伝子を利用した非歯系由来中間葉幹細胞の象牙芽細胞へのイン・ビトロでまたはイン・ビボでの分化方法に関する。
【００３９】
本願に係る方法でイン・ビトロで分化した象牙芽細胞は分離された後、それ自体で使用されたり（本願の図８のＤ、Ｇ、及びＪなど参照）または、フローサイトメーターなどを利用した分離方法を介して分離した後、後述する細胞治療剤、または薬学組成物の有効性分として使用できる。例えば、象牙芽細胞の分化マーカーとしては、ＤＳＰ、ＤＭＰ１、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、Ｎｅｓｔｉｎタンパク質などと、Ｄｓｐｐ遺伝子などがあって、これらを公示された方法で利用して検出分離することができる。
【００４０】
本願に係るＣＮＰＥ７タンパク質またはその遺伝子は、患部に直接処理して使用でき、また患者の内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）非歯系幹細胞の分化に影響を及ぼして再生治療効果を示すことができる。
【００４１】
このような側面から、他の様態で本願はさらに本願の方法または組成物を使用して分化した象牙芽細胞またはＣＰＮＥ７を過発現する中間葉幹細胞、前記中間葉幹細胞から由来した象牙芽細胞に分化することができる前駆細胞または前記中間葉幹細胞から分化した象牙芽細胞を有効性分として含む象牙質または歯髄組織再生用細胞治療剤または前記細胞を含む象牙質または歯髄組織再生用薬学組成物、またはＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子を含む象牙質または歯髄組織再生用薬学組成物に関する。
【００４２】
本願で「細胞治療剤」とは、細胞と組織の機能を復元させるために生きている自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞を体外で増殖または選別したり、その他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の方法を介して治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品をいう。米国では１９９３年から、韓国では２００２年から細胞治療剤を医薬品として管理している。このような細胞治療剤は、組織再生または特定臓器機能回復のための幹細胞治療剤を含むが、これに制限されない。
【００４３】
本願に係る薬学組成物に含まれるＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子は、先述したとおりである。
【００４４】
本願に係る一実現例で、細胞治療剤に含まれる細胞は、ＣＰＮＥ７を過発現する。細胞でタンパク質を過発現する方法は公示されている。ＣＰＮＥ７遺伝子を適切な真核細胞発現ベクター、例えばファージ、ウィルスまたはレトロウィルス由来のベクターまたはプラズミドに発現プロモーターに作動可能に連結されるようにクローニングして、発現ベクターを構築した後、これを本願に係る細胞に導入することができる。導入方法は公示されていて、例えばリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストリン媒介トランスフェクト、陽荷電脂質媒介トランスフェクト法、電気穿孔、ファージシステムを利用したトランスダクションまたはウィルスを利用した感染方法などを含むが、これに制限されない。
【００４５】
本願に係る細胞治療剤または細胞を含む薬学組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限りいかなる一般的な経路を介して投与され得る。非経口投与、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、血内投与されるが、これに制限されない。
【００４６】
本願に係る治療剤または組成物は、一般に使用される薬学的に許容可能な担体と共に適した形態で剤形化される。薬学的に許容される担体としては、例えば、水、適したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどのような非経口投与用担体などがあって、安定化剤及び保存剤を追加で含むことができる。適した安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適した保存剤としては、ベンザルコニウムクロリド、メチル−または、プロピル−パラベン及びクロロブタノルがある。また、本発明に係る細胞治療用組成物は、その投与方法や剤形により必要な場合、懸濁剤、溶解補助制、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、酸化防止制などを適宜含むことができる。前記で例示されたものなどをはじめとして本発明に適した薬学的に許容される担体及び製剤は、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版］に詳細に記載されている。
【００４７】
本発明の細胞治療用組成物は、当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することによって、単位容量形態で製造されたり、または多用量容器内に内入させて製造できる。
【００４８】
また、前記組成物は、細胞治療剤が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてもよい。本発明の細胞治療剤組成物は、疾患の治療のために治療学的に有効な量の細胞治療剤を含むことができる。用語「治療的に有効な量」とは、研究者、獣医師、医師または、その他臨床により考えられる組織系、動物またはヒトで生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味するもので、これは治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量を含む。本発明の組成物に含まれる細胞治療剤は、所望の効果により変化することは当業者に自明である。
【００４９】
従って、最適な細胞治療剤の含有量は、当業者によって容易に決定でき、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれた他の成分の含有量、剤形の種類、及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬品をはじめとする様々な因子により調節できる。
【００５０】
本願に係る一実現例で細胞治療剤または薬学的組成物は、歯髄露出による歯髄充血／歯髄炎にも適用させて、歯髄が露出した部分を歯髄−象牙質を再生できたりまたは歯髄変性、歯髄壊死及び壊疽など病変歯髄が除去された空歯髄腔またはその他病理学的に損傷した組織の周りに局所投与できる。
【００５１】
本願に係る細胞治療剤または薬学的組成物は、象牙質または歯髄組織再生用に使用される。象牙質または歯髄組織再生を介して、種々の歯髄疾患の治療が可能である。歯髄疾患は、歯髄は、歯の内部にある歯髄腔を満たしている柔らかい結合組織で、神経と血管が豊富に分布していて、象牙質の表層にまで至る歯髄組織に生じる病変をいう。歯髄に物理的化学的または細菌性の刺激が加えられると、最初は歯髄の血管が拡張されて充血が見られ（歯髄充血）、この刺激が続くと、歯髄に炎症が生じる（歯髄炎）。刺激の強度、細菌感染の有無により炎症に程度の差があるが、歯髄が硬い象牙質によって包まれている解剖学的特徴のために、炎症が生じると、循環障害が起きやすく、そのまま放っておくと歯髄が壊死し易くなる。歯髄疾患の原因は、非常に様々であるが、多くの場合は、虫歯による細菌感染と歯の穿孔、歯折、亀裂、歯周ポケットを介して歯髄内部への感染によって発生する。また、外傷、摩耗、歯の亀裂、治療時歯科用器具から出る熱と摩擦などによっても誘発され得る。細菌感染による歯髄炎は、歯根端疾患と歯周疾患に拡大され得る。
【００５２】
このよう様々な原因及び症状を示す歯髄疾患が本願の範囲に含まれ、歯髄疾患の例としては、象牙質知覚過敏症、歯髄充血・歯髄炎・歯髄変性、歯髄の壊死及び壊疽を含むが、これに制限されない。
【００５３】
本願に係る細胞治療剤は、前記要素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を含むことが重要である。例えば、本発明の細胞治療剤または組成物の投与量は、有効性分である幹細胞から分化した骨芽細胞を基準に１．０×１０７乃至１．０×１０８細胞／ｋｇ（体重）、より好ましくは１．０×１０５乃至１．０×１０８細胞／ｋｇ（体重）である。但し、投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方できて、当業者ならこのような要因を考慮して投与量を適切に調節することができる。投与回数は、１回または臨床的に容認可能な副作用の範囲内で２回以上が可能で、投与部位に対しても一つの部位または二つの部位以上に投与することができる。ヒト以外の動物に対しても、ｋｇ当りヒトと同じ投与量にしたり、または、例えば目的動物とヒトとの虚血器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）等で前記投与量を換算した量を投与することができる。本発明に係る治療の対象動物としては、ヒト及びその他の目的とするほ乳動物を挙げることができ、具体的には、ヒト、猿、マウス、ラット、ウサギ、羊、牛、犬、馬、豚などが含まれる。
【００５４】
さらに他の様態で本願は、ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子の非歯系中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化用用途に関し、先に記載したものを参照することができる。
【００５５】
さらに他の様態で本願は、ＣＰＮＥ７タンパク質またはその遺伝子の象牙質または歯髄組織再生用用途に関し、前記したものを参照することができる。
【００５６】
以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし下記の実施例は、本発明をより理解し易くするために提供されるだけであって、本発明が下記の実施例に限定されるのではない。
【実施例】
【００５７】
実験方法及び材料
【００５８】
１．細胞株培養及び分化
５％のＣＯ２を含む湿潤な空気３７℃条件で培養された細胞が実験に使用された。マウス胚中間葉細胞株（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）、マウス骨髄由来中間葉細胞株（ＢＭＳＣ）を使用し、１０％熱不活性化された牛の血清が添加されたＤＭＥＭ培地に培養した。マウスエナメル芽細胞株（ＡＬＣ）は１０％熱不活性化された牛の血清が添加されたＭＥＭ培地に培養した。５０ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸、１０ｍＭβ−グリセロホスフェートを含む分化培地を利用して１４日間分化させた。
【００５９】
２．細胞同時培養
エナメル芽細胞株と胚中間葉細胞株を同時に培養するために、トランスウェルディッシュ（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｄｉｓｈｅｓ）を使用した。エナメル芽細胞株は、トランスウェルディッシュ上層チャンバーに育てて、胚中肝葉細胞は、トランスウェルディッシュ下層チャンバーにそれぞれ培養した。細胞が８０〜９０％コンフルエンスに達した時、上層と下層チャンバーを組み立てて各培地で培養した。
【００６０】
３．ウェスタン分析
タンパク質を分離するために細胞をＰＢＳで洗浄して、１，０００ｘｇで５分間低温で遠心分離して細胞を集めた。上澄み液を除去した後、ペレットは溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、１ｘ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ））に溶かして氷で１５分間反応した。細胞破壊片（Ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）は、１６，０００ｘｇ、１５分間低温で、遠心分離して除去して上澄み液だけ取った。３０μｇのタンパク質を電気泳動で分離してＰＶＤＦメンブレンに移した。メンブレンを０．１％ツイン２０が含まれたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に５％脱脂粉乳でブロッキングしてＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、Ａｎｔｉ−ＣＰＮＥ７、ＧＡＰＤＨ、ＤＳＰ、ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ、ＤＭＰ１抗体に１：１０００で反応させた。洗浄後メンブレンは、抗−ラビット、マウスＩｇＧ接合されたホースラディッシュ過酸化酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（１：５０００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に一時間反応した後、増強された化学発光システム（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でバンドを確認した。
【００６１】
４．ＤＳＰＰプロモーターレポーター分析
ルシフェラーゼ分析は、ＭＤＰＣ−２３細胞を２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでプレーティングして、２４時間後リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＰｌｕｓＴＭ試薬にトランスフェクトした。それぞれのトランスフェクトに、それぞれ０．５ｇのｐＧＬ３ｂａｓｉｃ（対照群）、ｐＧＬ３  ＤＳＰＰプロモーター（−１０００〜＋１）、ＣＰＮＥ７発現プラスミド、ＣＰＮＥ７  ｓｉＲＮＡ、ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ  ｓｉＲＮＡ、対照群ｓｉＲＮＡを使用した。トランスフェクトされた細胞は４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６２】
５．クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析
ＭＤＰＣ−２３細胞を各指定されたベクターをトランスフェクトさせた後、ＰＢＳで水洗した後回収して超音波機器を利用して細胞のクロマチンを約１，０００ｂｐの大きさに粉砕した。クロマチン免疫沈降は、Ｎｆｉｃ、ＣＰＮＥ７、ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ抗体（３０ｕｌ）を添加して４℃で４時間反応させた後、ＤＮＡペレットを回収した後、ＰＣＲを利用して各タンパク質がプロモーター領域に結合したかを確認した。ＰＣＲプライマー塩基配列は、ＤＳＰＰ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ領域（３９０ｂｐ）、ｍｏｕｓｅ  ＤＳＰＰ−４００領域：ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ｇｇｇｔｃｔｔａａａｔａｇｃｃａｇｔｃｇ−３’とｍｏｕｓｅ  ＤＳＰＰ−１０領域：ＲＥＶＥＲＥＳ、５’−ｃｔｇａｇａｇｔｇｇｃａｃａｃｔｇｔ−３’である。ＰＣＲ条件は、下記のとおりである：９４℃ ｆｏｒ ３０ｓ；６０℃  ｆｏｒ  ３０ｓ；７２℃ ｆｏｒ ３０ｓ計３５ｃｙｃｌｅｓ。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルで電気泳動下で、エチジウムブロマイドで染色して赤外線で確認した。
【００６３】
６．マウス生体内移植と組織学的分析
ヒト骨髄中間葉幹細胞を１ｘ１０７個とヒト歯根切片の空歯髄腔に０．５％フィブリンゲルと共に入れてヌードマウスの皮下に移植した。移植したサンプルは１２週に分離して４％パラホルムアルデヒドで固定して、１０％エチレンジアミンテトラ酢酸溶液を利用して一週間脱灰して、水洗、脱水などの過程を経た後、パラフィンに包埋して５μｍ厚さに切断した。切断した組織はヘマトキシリン−エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ；Ｈ−Ｅ）染色を行った。
【００６４】
７．免疫組織化学分析
採取したサンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定して、脱灰、水洗、脱水などの過程を経た後パラフィンに包埋して５μｍ厚さに切断した。ＤＳＰ、Ｎｅｓｔｉｎを利用して免疫組織化学染色を進めた。
【００６５】
８．免疫蛍光染色法
ＭＤＰＣ−２３細胞を３０分間４℃で４％パラホルムアルデヒドに固定して、０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで透過性化した後２％牛血清を利用して非特異的な結合を除去した。細胞は、ＣＰＮＥ７、ｎｕｃｅｌｏｌｉｎ抗体を４時間反応させて、ＰＢＳで三回洗浄した後、蛍光性ラベルされた２次抗−マウス、ラビット抗体を２時間光が遮断された所で反応させた。細胞の核は、ＤＡＰＩを利用して染色した。洗浄後サンプルを固定して、蛍光顕微鏡で観察した。
【００６６】
９．Ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（Ｃｏ−ＩＰ）分析
ＭＤＰＣ−２３細胞を各指定されたベクターをトランスフェクトさせた後、ＰＢＳで水洗した後、溶解バッファーに溶かして氷で１５分間反応した。細胞破壊片は、１６，０００ｘｇ、１５分間低温で、遠心分離して除去して上澄み液だけ取った。免疫沈降のために、ＣＰＮＥ７、ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ抗体（３０ｕｌ）を添加して４℃で４時間反応させた後、アガロースビーズ（２０ｕｌ）を添加して４℃で４時間反応させる。アガロースビーズを利用して遠心分離後、ウェスタンブロット法を進めた。
【００６７】
１０．細胞培養及び共培養システム
ＭＤＰＣ−２３細胞は、ジェイーノル（Ｊ．Ｅ．Ｎｏｒ）博士（ミシガン大学、アナーバー、ＭＩ）から提供を受けた。ＡＬＣｓはティースギヤマ（Ｔ．Ｓｕｇｉｙａｍａ）博士（秋田大学薬学大学、秋田、日本）から提供を受けた。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２及びＨＥＫ２９３ヒト胚腎臓細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、ＶＡ）から得た。ヒトＢＭＳＣ（ＰＴ−２５０１）はロンザ（ＵＳＡ）から購入した。ＭＤＰＣ−２３、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、ｈＢＭＳＣｓ、及びＨＥＫ２９３細胞は、ドゥルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）で培養して、ＡＬＣｓは最小必須培地（ＭＥＭ：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で培養したが、前記培地には１０％熱不活性化された牛胎児血清（ＦＢＳ：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗生剤−抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）が添加されていて、３７℃で５％ＣＯ２大気下で培養した。細胞分化及び石灰化された結節形成を誘導するために、融合性細胞は、誘導培地（５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸及び１０ｍＭβ−グリセロルホスフェートを含有するＤＭＥＭ）で２週以上処理した。
【００６８】
ＡＬＣをＭＤＰＣ−２３細胞と共培養するために、トランスウェルＲ透過性支持台（ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ）を使用した。ＡＬＣはトランスウェルの上部チャンバーで培養した。ＭＤＰＣ−２３細胞は、前記ディッシュの下部チャンバーで培養した。細胞が８０〜９０％コンフルエンスに達した時、上部チャンバーを下部チャンバーと合わせた。
【００６９】
１１．プラスミド
全長マウスＣＰＮＥ７（ｍＣＰＮＥ７，ＮＭ＿１７０６８４）ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡターゲッティングＣＰＮＥ７、及びｐＧＬ３−Ｄｓｐｐベクターを作った。全長ヒトＣＰＮＥ７をエンコードする発現ベクター、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−ＣＰＮＥ７（ＮＭ＿１５３６３６）、及びＤＤＫ（フラッグ）−タグされたＣＰＮＥ７（ＮＭ＿１５３６３６）は、オリジン（Ｏｒｉｇｅｎｅ，ＵＳＡ）から購入した。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＰＮＥ７（ＮＰ  ７０５９００）はオリジンから購入した。対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｃ−３７００７）及びｓｉＲＮＡターゲッティングヌクレオリン（ｓｃ−２９２３０）は、サンタクルーズバイオテクノロジー（ＵＳＡ）から購入した。
【００７０】
１２．逆転写−ポリメラーゼチェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及びリアルタイムＰＣＲ分析
製造者の方法に従って、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞でトータルＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用してトータルＲＮＡ（３μｇ）を逆転写した。下記のプライマー対を使用してＲＴ生成物中１マイクロリットルをＰＣＲで増幅させた：Ｏｄａｍ（４６２ｂｐ，ｆｏｒｗａｒｄ［Ｆ］５’−ａｔｇｔｃｃｔａｔｇｔｇｇｔｔｃｃｔｇｔ−３’，ｒｅｖｅｒｓｅ［Ｒ］５’−ｔｔａｔｇｇｔｔｃｔｃｔｔａｇｇｃｔａｔｃ−３’）、ＣＰＮＥ７（１７８ｂｐ，［Ｆ］５’−ｃｃｃｇａｃｃｃａｔｔｇａｃｃａａｇｔｃ−３’，［Ｒ］５’−ｃａｔａｃａｃｃｔｃａａａｃｃｇｔａｇｃｔｔｃ−３’）、Ｍｍｐ−２０（４５８ｂｐ，［Ｆ］５’−ａｇｃｔｇｔｇａｇｃａａｃｔｇａｔｇａｃｔｇｇａ−３’，［Ｒ］５’−ａｃａｇｃｔａｇａｇｃｃａａｇａａｃａｃａｃｃｔ−３’）、ＧＡＰＤＨ（４５２ｂｐ，［Ｆ］５’−ａｃｃａｃａｇｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃａｃ−３’，［Ｒ］５’−ｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｇｃｔｇｔ−３’）、Ｄｓｐｐ（１４１ｂｐ，［Ｆ］５’−ｇｔｇａｇｇａｃａａｇｇａｃｇａａｔｃｔｇａ−３’，［Ｒ］５’−ｃａｃｔａｃｔｇｔｃａｃｔｇｃｔｇｔｃａｃｔ−３’）、及びＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ（２８３ｂｐ，［Ｆ］５’−ｃｃａｃａｇｃｃｔｔｃａｔｇｔｃｃａａｇ−３’，［Ｒ］５’−ｇｇｃａｇａｇａｇａｇａｇｇａｃａｇｇｇ−３’）。オリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。下記のプライマー対を使用してＲＴ生成物１マイクロリットルをＰＣＲで増幅させた：Ｏｄａｍ（４６２ｂｐ，ｆｏｒｗａｒｄ［Ｆ］５’−ａｔｇｔｃｃｔａｔｇｔｇｇｔｔｃｃｔｇｔ−３’，ｒｅｖｅｒｓｅ［Ｒ］５’−ｔｔａｔｇｇｔｔｃｔｃｔｔａｇｇｃｔａｔｃ−３’）、ＣＰＮＥ７（１７８ｂｐ，［Ｆ］５’−ｃｃｃｇａｃｃｃａｔｔｇａｃｃａａｇｔｃ−３’，［Ｒ］５’−ｃａｔａｃａｃｃｔｃａａａｃｃｇｔａｇｃｔｔｃ−３’）、Ｍｍｐ−２０（４５８ｂｐ，［Ｆ］５’−ａｇｃｔｇｔｇａｇｃａａｃｔｇａｔｇａｃｔｇｇａ−３’，［Ｒ］５’−ａｃａｇｃｔａｇａｇｃｃａａｇａａｃａｃａｃｃｔ−３’）、ＧＡＰＤＨ（４５２ｂｐ，［Ｆ］５’−ａｃｃａｃａｇｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃａｃ−３’，［Ｒ］５’−ｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｇｃｔｇｔ−３’）、Ｄｓｐｐ（１４１ｂｐ，［Ｆ］５’−ｇｔｇａｇｇａｃａａｇｇａｃｇａａｔｃｔｇａ−３’，［Ｒ］５’−ｃａｃｔａｃｔｇｔｃａｃｔｇｃｔｇｔｃａｃｔ−３’）、及びＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ（２８３ｂｐ，［Ｆ］５’−ｃｃａｃａｇｃｃｔｔｃａｔｇｔｃｃａａｇ−３’，［Ｒ］５’−ｇｇｃａｇａｇａｇａｇａｇｇａｃａｇｇｇ−３’）。９４℃で３０ｓ、５５℃で３０ｓ、７２℃で１分間３０サイクル条件下でＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイドで染色した後、紫外線下で確認した。
【００７１】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｊａｐａｎ）を使用したＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７５００配列探知システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）でマニュアルに従って、リアルタイムＰＣＲを行った。９５℃で１分、９４℃で１５ｓ、及び６０℃で３４分間４０サイクルの条件でＰＣＲを行った。すべての反応は、三倍数に進行され、ＰＣＲ生成物のレベルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを基準としてノーマライズした。遺伝子発現での相対的変化は比較閾値サイクル（ＣＴ）方法を使用して計算した。
【００７２】
１３．細胞質及び核タンパク質抽出物の製造
４℃で５分間３０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を集めた。プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が補充された氷のように冷たい保存溶解バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０［ＮＰ−４０］）で１５分間細胞溶解を行った。４℃で５分間３０００ｒｐｍで遠心分離して核及び細胞質分画を分離した。得られた上澄み液（細胞質分画）は、追加分析時まで４℃で保存した。プロテアーゼ阻害剤が補充された氷のように冷たい保存溶解バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０［ＮＰ−４０］、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１０％グリセロール）でメンブレンペレットを再懸濁させた。得られた上澄み液（核の部分）は追加分析時まで４℃で保存した。
【００７３】
１４．ＣＭ製造及びＣＰＮＥ７の不活性化
ＣＭを下記のように収得した。ＡＬＣ細胞を７．５ｘ１０５細胞／１００−ｍｍディッシュにシードした。細胞が８０％コンフルエンスに達した時分化培地に入れ替えた。分化してから３日後に細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で二回洗浄してＦＢＳがない分化培地で２４時間培養した。無血清調整培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）をハーベストしてアンモニウムサルフェート沈殿で１μｇ／ｕｌまで濃縮した。ＣＭでＣＰＮＥ７を不活性化するために２０または４０μｇ／ｍｌ抗−ＣＰＮＥ７抗体を４℃で２時間回転させてＣＭと混合した。
【００７４】
１５．ウェスタンブロット分析
【００７５】
トータル細胞抽出物を製造するために、前記細胞をＰＢＳで３度洗浄して１．５ｍｌチューブ内にスクラップした後、４℃で２分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離してペレットにした。上澄み液を除去した後、前記ペレットを溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）に再懸濁させて氷で１５分間培養した。細胞破壊片は、遠心分離で除去した。１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で３０マイクログラムタンパク質を分離してニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含有するＰＢＳ内の５％脱脂粉乳で１時間メンブレンをブロックして、４℃でＰＢＳ−Ｔ（１：１０００）に希釈された１次抗体と共に一夜培養した。
【００７６】
ラビット及び親和性が前提されたポリクロン抗−Ｏｄａｍ、抗−ＣＰＮＥ７、及び抗−Ｄｓｐ抗体を製造した。フラッグ（Ｆ３１６５）抗体は、シグマ−アルドリッチから購入した。Ｍｍｐ−２０（ｓｃ−２６９２６）、Ｌａｍｉｎ  Ｂ（ｓｃ−６２１６）、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ（ｓｃ−３００４４）、Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ（ｓｃ−８０３１）、及びＧＡＰＤＨ（ｓｃ−２５７７８）抗体は、サンタクルーズテクノロジーから購入した。Ｄｍｐ１抗体（ａｂ１０３２０３）は、アブカム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。洗浄後、過酸化酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）がコンジュゲート（１：５０００）された抗−マウス（ｓｃ−２０３１）、抗−ラビット（ｓｃ−２００４）、または抗−ヤギ（ｓｃ−２７６８）ＩｇＧ  ２次抗原（いずれもＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入）と共に前記メンブレンを１時間培養した。ラベルされたタンパク質バンドは、増強された化学発光システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を使用して探知して、前記バンドは、前記デベロップされた自己放射フィルムの濃度分析で測定した。
【００７７】
１６．蛍光顕微鏡分析
カバーグラス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）にあるＮｕｎｃＴＭ  Ｌａｂ−ＴｅｋＴＭ  ＩＩの細胞をＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ内の４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定させた後、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで１０分間透過性にした。洗浄後、前記細胞を抗−ＣＰＮＥ７（１：２００）及び抗−Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ（１：２００）抗体と共にブロッキングバッファー（ＰＢＳ及び１％牛血清アルブミン）で１時間培養した後、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）−またはＣｙ３−コンジュゲーティドされた抗−マウスまたは抗−ラビットＩｇＧ抗体（１：２００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を追加した。洗浄後、前記細胞をオリンパスＡＸ７０蛍光顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ，ｊａｐａｎ）で確認した。核内の染色体ＤＮＡは、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；シグマ−アルドリッチ）で染色した。
【００７８】
１７．一時的形質転換及びルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３またはＭＤＰＣ−２３細胞をウェル当たり１．５Ｘ１０５細胞の密度で１２−ウェル培養プレートにシードした。前記細胞をＭｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ  Ｐｒｏ試薬（Ｂｉｏｎｔｅｘ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して前記コンストラクトと共に一時的に形質転換させた。ＣＰＮＥ７発現ベクターまたはＣＰＮＥ７またはヌクレオリンｓｉＲＮＡベクターと共にＭＤＰＣ−２３細胞内にコンストラクトｐＧＬ３−Ｄｓｐｐを同時形質移入（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。続いて５０ｕｌルシフェリンを５０ｕｌの細胞融解物に添加して、ルシフェラーゼ活性を発光測定装置（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使用してマニュアルに従って測定した。
【００７９】
１８．Ｃｏ−ＩＰ（ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｃｉｐｉｔａｉｔｏｎ）アッセイ
Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ  Ｐｒｏ試薬を使用して指示されたプラスミドＤＮＡと共にトランスフェクトした後、ＭＤＰＣ−２３細胞をＰＢＳで洗浄して、プロテアーゼ阻害剤を補充したｃｏ−ＩＰバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ＮＰ−４０，５ｍＭ  ＥＤＴＡ）１ｍｌを添加して前記細胞融解物を製造した。前記融解物を４℃で２時間１：２００希薄の抗体と共に培養した。３０マイクロリットルのタンパク質Ａ／Ｇ  ＰＬＵＳ−アガロース（ｓｃ−２００３，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加して４℃で１時間回転しながら培養した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで５分間沸騰してビーズから免疫複合体を放出させた。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、抗−ヌクレオリンと共にウェスタンブロットして免疫沈降物を分析した。
【００８０】
１９．ＣｈＩＰアッセイ
Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ  Ｐｒｏ試薬を使用して指示されたプラスミドＤＮＡと共にトランスフェクトした後、ＭＤＰＣ−２３細胞を３７℃で１０分間１％ホルムアルデヒドで交差結合をさせた後、冷たいＰＢＳで二回リンスして、ＳＤＳ溶解バッファー（１％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１）で１０分間氷上で膨張させた。前記核を氷上で超音波処理した。１０分間遠心分離して上澄み液を得てＣｈＩＰ希薄バッファー（０．０１％ＳＤＳ，１．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１６.７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１，及び１６７ｍＭ  ＮａＣｌ）で１０倍希釈した。断片染色質混合物を抗−Ｎｆｉｃ、抗−ヌクレオリン、抗−ＣＰＮＥ７、またはＩｇＧ（１：２５０）と共に４℃で４時間回転させて培養した。３０マイクロリットルのタンパク質Ａ／Ｇ  ＰＬＵＳ−アガロースを添加して４℃で１時間回転させながら培養して抗体／染色質混合物を集めた。前記沈殿した染色質混合物をマニュアルに従って復旧させて解離させた（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）。最終ＤＮＡペレットを復旧してプライマーを使用してＰＣＲで分析したが、前記プライマーは、Ｄｓｐｐプロモーター部位（３９０ｂｐ）、マウスＤｓｐｐ−４００部位：正方向５’−ｇｇｇｔｃｔｔａａａｔａｇｃｃａｇｔｃｇ−３’及びマウスＤｓｐｐ−１０ｒｅｇｉｏｎ：逆方向、５’−ｃｔｇａｇａｇｔｇｇｃａｃａｃｔｇｔ−３’を含む。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間５５℃で３０秒間、そして７２℃で１分間３５サイクルの条件で行った。ＰＣＲ生成物は、１％アガロースゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイドで染色して紫外線で確認した。
【００８１】
２０．ＤＡＰＡ
６００μｇの核抽出物タンパク質、Ｄｓｐｐプロモーターのビオチン化された特異的野生型でありながら変異されたＡＰ−１サイトオリゴヌクレオチド６μｇ、及び６０ｕｌのストレプトアビジン−アガロースビーズを混合して結合アッセイを行った。前記混合物を４℃で２時間回転させながら培養した。ピーズをペレットにしてＰＢＳで３回洗浄した。結合タンパク質がローディングバッファーと共に湧出されて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してウェスタンブロットで分析した。
【００８２】
２１．アリザリンレッドＳ染色
ＭＤＰＣ−２３細胞をＰＢＳ内４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。０．１％ＮＨ４ＯＨ（ｐＨ４．２）内の１％アリザリンレッドＳ（シグマ−アルドリッチ）溶液で室温で２０分間染色した。
【００８３】
２２．動物、組織製造及び免疫組織化学分析
動物を使用する全ての実験は、ソウル国立大学のＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）が承認したプロトコル（ＳＮＵ−１１１０１３−２）に従った。胚１９日（Ｅ１９）、出生後７日（Ｐ７）及び１０日（Ｐ１０）のマウスの頭を１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で脱灰して、パラフィンに包埋して、免疫組織化学分析を進めた。１次抗原としてはラビット抗−ＣＰＮＥ７及び２次抗原としてはビオチン化されたヤギ抗−ラビットＩｇＧ（１：２００，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用してＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，ＵＳＡ）でＣＰＮＥ７を発現した。
【００８４】
２３．１次細胞培養、イン・ビトロで移植及び組織学的分析
本発明者はソウル国立大学歯科病院で損傷したヒトの三番目の奥歯を収集した。実験プロトコルは、ＩＲＢ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）から承認を受けた。患者の同意を受けた。ヒトＤＰＣを分離してイン・ビボ移植実験に使用した。ｈＤＰＣｓ（２ｘ１０６）を１００ｍｇのヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙ  ａｐａｔｉｔｅ）／トリカルシウムホスフェート（ＨＡ／ＴＣＰ）セラミックパウダー（Ｚｉｍｍｅｒ，ＵＳＡ）単独、またはＣＭ（３０μｇ）と共に、またはＣＰＮＥ７抗体−処理されたＣＭと共に、または０．５％フィブリンゲル内のｒＣＰＮＥ７（５μｇ）と共に混合した後、免疫システムが損傷したマウス（ＮＩＨ−ｂｇ−ｎｕ−ｘｉｄ；Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に６週間皮下移植させた。ＣＭ内ＣＰＮＥ７を不活性化させるために、ＣＰＮＥ７抗体処理されたＣＭグループにイン・ビボで移植する前に４℃で２４時間ＣＰＮＥ７抗体（５ｕｌ）をＣＭと回転しながら混合した。新しく形成された石灰化された組織を組織形態学的に分析するために、過発現されたＣＰＮＥ７で感染したｈＤＰＣｓまたは不活性コンストラクトをＨＡ／ＴＣＰと共に１２週間移植した。根管空間（ｒｏｏｔ  ｃａｎａｌ  ｓｐａｃｅｓ）での象牙質／歯髄組織−様組織形成を評価するために、ＣＭ（１０μｇ）または０．５％ピブリンゲル内のＣＰＮＥ７抗体−処理されたＣＭとｈＤＰＣｓ（２ｘ１０６）を混合して、１２週間ヒト歯の部分の空の根管空間に挿入した。ヒト歯の部分は、文献（Ｃｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｅａｍｅｌｏｂｌａｓｔ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｉｎ  ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｈｉｓｔ．４４：７１５−７２１）に記載されたプロトコルにより製作した。また、ｒＣＰＮＥ７（５μｇ）またはｒＢｍｐ２（５μｇ；Ｃｏｗｅｌｌｍｅｄｉ，Ｋｏｒｅａ）と共にｈＢＭＳＣｓも空の根管空間に６週間挿入した。
【００８５】
サンプルをハーベストして４％パラホルムアルデヒドに固定して、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で脱灰させて、パラフィンに包埋して、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ−Ｅ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で染色したり、または免疫組織化学的分析を進行させた。免疫組織化学的分析を行うために、１次抗原で１：１００で希釈した抗−ＤＳＰ、抗−ＢＳＰ（１）、または、抗−ＮＥＳＴＩＮ（ＭＡＢ３５３，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に、そして２次抗原でビオチンラベルをしたヤギ抗−ラビットＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）と共にタンパク質を探知した。生成された石灰化された組織のトータル面積はＬＳ  ｓｔａｒｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。
【００８６】
２４．統計分析
スチューデントｔ−検定を使用して統計分析を行った。すべての統計分析は、ＳＰＳＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ．１９．０を使用して行った。
【００８７】
実験結果
１．ＣＰＮＥ７による成熟した象牙芽細胞への分化調節
１８−１９胎児期ＣＤ−１マウスの歯乳頭（ｄｅｎｔａｌ ｐａｐｉｌｌａ）から由来したＭＤＰＣ−２３（Ｈａｎｋｓ  ＣＴ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７（３−４）：２３３−２４９.）細胞を本実験に使用した。象牙芽細胞分化で転座されたＣＰＮＥ７の機能的役割を明らかにするために、内因性象牙芽細胞ＣＰＮＥ７の発現パターンを象牙芽細胞ＭＤＰＣ−２３細胞で測定した。ＣＰＮＥ７は、ＭＤＰＣ−２３細胞の核に主に位置していた（図３ａ）。象牙芽細胞分化でＣＰＮＥ７タンパク質の発現レベルは、０日から７日（象牙芽細胞分化の初期〜中間段階）までには増加して、その後１０日から１４日（象牙芽細胞分化の末期段階及び石灰化）までには減少した。Ｄｓｐ及びオステオカルシンを含む象牙芽細胞分化マーカーの発現は、７日から１４日まで象牙芽細胞で増加したが、これはＣＰＮＥ７での増加より遅れた（図３ｂ及び図３ｃ）。このような発見は、象牙芽細胞での核ＣＰＮＥ７が、象牙芽細胞分化、特に初期〜中間段階で機能的役割をすることを有意に証明するものである。
【００８８】
Ｄｓｐｐ上方調節がＣＰＮＥ７が象牙芽細胞に分化するのに影響を及ぼすか否かを調べるために、ＣＰＮＥ７及びＣＰＮＥ７ｓｉＲＮＡをエンコードするコンストラクトと共にＭＤＰＣ−２３細胞をトランスフェクトした後、Ｄｓｐｐ  ｍＲＮＡ及びＤｓｐタンパク質の発現レベルを測定した。ＣＰＮＥ７の発現レベルは、ＣＰＮＥ７−エンコードコンストラクトと共にトランスフェクトすることによって増加して、対照群及び対照群ｓｉＲＮＡと共にトランスフェクトされた細胞と比較する時、ＭＤＰＣ−２３及びＨＥＫ２９３細胞でＣＰＮＥ７ｓｉＲＮＡによって効果的に阻害された（図１１及び４Ｂ）。ＣＰＮＥ７過発現は、Ｄｓｐｐ  ｍＲＮＡ及びＤｓｐタンパク質の発現レベルを有意に増加させて、一方ｓｉＲＮＡ−媒介ＣＰＮＥ７ノックダウンは、ＭＤＰＣ−２３細胞で前記レベルを下方調節した（図４ａ及び４ｂ）。外因性ＣＰＮＥ７もＤｓｐｐ発現を増加させるか否かを確認するために、本発明者はＭＤＰＣ−２３細胞でのＤｓｐｐ発現に対する組換えＣＰＮＥ７（ｒＣＰＮＥ７）の影響を調べた。予想した通り、ｒＣＰＮＥ７処理は、ＭＤＰＣ−２３細胞でＤｓｐｐ  ｍＲＮＡ及びＤｓｐタンパク質の発現レベルも増加させた（図４ｃ及び４ｄ）。イン・ビトロで象牙芽細胞分化の間、対照群と比較して、組換えＣＰＮＥ７処理によって石灰化された結節形成が増加した（図１２）。このようなデータから、ＣＰＮＥ７は、Ｄｓｐｐ発現を調節して象牙芽細胞分化及び石灰化を調節することが分かる。
【００８９】
次に、ＣＰＮＥ７及びＤｓｐｐ遺伝子発現の機能的連続性を確認しようとした。前記結果と類似するように、ＡＬＣと共同培養すると、ＭＤＰＣ−２３細胞でＣＰＮＥ７及びＤｓｐタンパク質の発現レベルが増加した（図４ｅ）。Ｄｓｐタンパク質は、ＰＡ−ＣＭ処理によって容量依存的方式で増加したが、不活性化のためのＣＰＮＥ７−特異的抗体の濃度を増加させて処理した時には減少した（図４ｆ）。また、Ｄｓｐｐ転写活性は、ＣＰＮＥ７の過発現によって有意に促進されたが、ｓｉＲＮＡ−媒介されたＣＰＮＥ７ノックダウンによって抑制された（図４ｇ）。
【００９０】
以上をまとめると、このような結果は、ＣＰＮＥ７がＤｓｐｐ発現調節を介して象牙芽細胞分化及び石灰化を調節することを示す。
【００９１】
２．ＣＰＮＥ７によるイン・ビボでヒト歯髄細胞（ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ  ｃｅｌｌｓ（ｈＤＰＣｓ））のような歯中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化及び象牙質形成誘導
【００９２】
イン・ビボでの象牙芽細胞分化及び象牙質形成でのＣＰＮＥ７の役割を糾明するために、４つの異なる条件、すなわちｈＤＰＣｓ単独、ＰＡ−ＣＭと共にｈＤＰＣｓ、ＰＡ−ＣＭ及びＣＰＮＥ７抗体と共にｈＤＰＣｓ、そしてｒＣＰＮＥ７と共にｈＤＰＣｓの条件で、ヒドロキシアパタイト／トリカルシウムホスフェート（ＨＡ／ＴＣＰ）の存在下で、ｈＤＰＣを免疫システムが損傷したマウスの皮下組織に移植した。移植６週後に、全グループでＨＡ／ＴＣＰ粒子の周辺に象牙質／歯髄組織様組織が形成された（図５のＡ〜Ｈ）。ＰＡ−ＣＭ−またはｒＣＰＮＥ７−処理したグループでは、ｈＤＰＣｓ−単独グループより象牙芽細胞と象牙質／歯髄組織複合体特徴がさらに典型的に現れた（図５のＥ、Ｆ及びＨ）。しかし、不活性化のためＣＰＮＥ７抗体処理したＰＡ−ＣＭと共に処理されたグループでは、石灰化組織形成がほとんど見られなかった（図５のＦ及びＧ）。
【００９３】
図４に示されるイン・ビトロ実験結果に基づいて、イン・ビボで象牙質／歯髄組織−様組織形成に対するＣＰＮＥ７遺伝子の影響を測定するために、ＣＰＮＥ７−コード、ＣＰＮＥ７ｓｉＲＮＡ、または、対照群ｓｉＲＮＡコンストラクトと共にトランスフェクトしたｈＤＰＣを皮下組織に移植した。移植１２週後、ｈＤＰＣ−単独、ＣＰＮＥ７過発現、及び対照群ｓｉＲＮＡグループは、ＨＡ／ＴＣＰ粒子の周辺に象牙質−様石灰化された組織の発生が現れ、一方ＣＰＮＥ７ｓｉＲＮＡグループは、石灰化に対する証拠がほとんど現れなかった（図６のＡ〜Ｈ）。各グループの組織形態学的分析によると、ｈＤＰＣでのＣＰＮＥ７の過発現は、イン・ビボ象牙質−様石灰化組織形成と最も高いレベルで関連があり、ＣＰＮＥ７のｓｉＲＮＡ−媒介ノックダウンは、最小の関連があった。ｈＤＰＣｓ単独及び対照群ｓｉＲＮＡグループ間に有意な差はなかった（図６のＩ）。
【００９４】
自然的象牙質壁及び空の歯髄空間から構成された歯の部分は、歯幹細胞による象牙質／歯髄組織−様組織の再生に特異的局所環境を作る（Ｈｕａｎｇ  ＧＴ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐａｒｔ  Ａ  １６（２）：６０５−６１５）。歯根管空間での象牙質−歯髄組織様組織形成を評価するために、ＰＡ−ＣＭまたはＣＰＮＥ７抗体処理されたＰＡ−ＣＭなしにまたは前記と共にｈＤＰＣを混合して、免疫システムが損傷したマウスの皮下組織に移植した。移植１２週後に、全グループで歯根管空間内部に血管が発達した歯髄組織−様組織が再生された（図７のＡ〜Ｃ）。ＰＡ−ＣＭ処理されたグループで、既存の象牙質壁に象牙芽細胞−様細胞が垣根配列で存在し、これらの細胞突起は、増えた核と共に、既存の象牙質細管に向かって拡張された（図７のＢ、Ｅ及びＨ）。しかし、ＣＰＮＥ７抗体−処理されたＰＡ−ＣＭグループで、新しく形成された歯髄組織−様組織及び既存の象牙質の間で、閉じ込められた細胞（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ  ｃｅｌｌ）がある相対的象牙質−様石灰化組織が見られた。ｈＤＰＣ単独及びＰＡ−ＣＭ−処理されたグループと比較してＣＰＮＥ７抗体処理されたＰＡ−ＣＭグループの新しく形成された相対的象牙質領域でＢＳＰが明確に発現された（図７のＤ〜Ｆ）。しかし、ＣＰＮＥ７抗体処理されたＣＭグループで、ＤＳＰの微かな染色が見られただけでなく、ＰＡ−ＣＭグループでＤＳＰが明確に探知された（図７のＧ〜I）。
【００９５】
以上をまとめると、このような結果は、予備エナメル芽細胞−由来因子の間で、象牙質／歯髄組織複合体の再生にＣＰＮＥ７が重要な機能的な役割をして、ｈＤＰＣのような歯由来中間葉幹細胞の象牙芽細胞分化を誘導することが分かる。
【００９６】
３．ＣＰＮＥ７によるイン・ビボ及びイン・ビトロで非歯系（ｎｏｎ ｄｅｎｔａｌ）由来の中間葉幹細胞の象牙芽細胞への分化を誘導
【００９７】
本実施例では、歯内皮で誘導されたものではない非歯系由来中間葉幹細胞でのＣＰＮＥ７の役割を糾明した。この実験ではマウス胚連結組織から作られ、誘導なしには象牙芽細胞−様細胞に分化しないＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、及びヒト骨髄中間葉幹細胞（ｈＢＭＳＣ）を使用した。
【００９８】
最初に、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞でのＣＰＮＥ７過発現またはＡＬＣ共培養の効果を調べた。対照群Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞及び分化培地で５日間培養した前記細胞共にＣＰＮＥ７が発現しなかった。しかし、ＡＬＣと共培養したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞で、たとえ発現レベルは低いが、ウェスタンブロットでＣＰＮＥ７発現を確認した。ＡＬＣもＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞でＤｍｐ１及びＤｓｐ発現を誘導した（図８のＢ）。
【００９９】
次に、空の歯根管空間でｒＣＰＮＥ７またはｒＢＭＰ２タンパク質の存在または非存在下でｈＢＭＳＣｓを使用してイン・ビボ実験を行った。ｒＣＰＮＥ７−処理されたｈＢＭＳＣｓグループでは、前記非歯系中間葉幹細胞が象牙芽細胞細胞突起及び象牙質−様石灰化組織を有する象牙質−様細胞に分化して、既存の象牙質壁に象牙質細管の構造を再生することができた（図８のＣ〜Ｅ）。象牙芽細胞−様細胞の細胞突起は、新しく形成された象牙質−様組織の象牙質細管に向かって伸びて、ＤＳＰ及びＮＥＳＴIＮを発現した（図８のＦ〜Ｋ）。一方、ｈＢＭＳＣ単独及びｒＢＭＰ２−処理されたｈＢＭＳＣグループでは、象牙質−様構造またはＤＳＰまたはＮＥＳＴIＮ発現が見られなかった。
【０１００】
以上をまとめると、このような結果は、予備象牙芽細胞から由来したＣＰＮＥ７は歯原（ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ）の誘導過程でシグナル分子として作用して、これによりイン・ビボ及びイン・ビトロで歯系（ｄｅｎｔａｌ）だけでなく非歯系由来の中間葉幹細胞を象牙芽細胞−様細胞にプログラミングする可能性があることを示す。
【０１０１】
４．ＣＰＮＥ７による象牙芽細胞分化調節機序糾明
【０１０２】
前記結果から、ＣＰＮＥ７は、象牙芽細胞ＭＤＰＣ−２３細胞でＤｓｐｐ遺伝子発現を調節することが分かる。しかし、コピンファミリーメンバーの構造にはＤＮＡ−結合モチーフはない（Ｃｒｅｕｔｚ ＣＥ，ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３（３）：１３９３−１４０２；Ｔｏｍｓｉｇ ＪＬ，Ｓｏｈｍａ Ｈ，＆  Ｃｒｅｕｔｚ  ＣＥ（２００４）  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ ３７８（Ｐｔ ３）：１０８９−１０９４）。従って、コピンファミリータンパク質が二つの明確なドメイン、すなわちホスホリピッド−結合ドメイン及びタンパク質相互作用ドメインを含有しているため、ＣＰＮＥ７−媒介Ｄｓｐｐ発現の他の潜在的効能子に対しさらに研究した。ヌクレオリンは、細胞増殖、胚形成、及び細胞死滅を含む多くの細胞活性に関与する多機能タンパク質である。ヌクレオリンは、歯発達に重要な役割をしてＣＰＮＥ７と相互作用する。
【０１０３】
ＣＰＮＥ７とヌクレオリンとの間の相互作用に対する証拠をさらに調べてみるために、本発明者は、ＭＤＰＣ−２３細胞の免疫細胞化学及び同時−免疫沈降（ｃｏ−IＰ）分析を行った。明確に、内因性及び外因性ＣＰＮＥ７タンパク質共に象牙芽細胞の核でヌクレオリンタンパク質と強い共同−位置化を示して（図９ａ）、ヌクレオリンと相互作用した（図９ｂ）。次に、本発明者は、ＣＰＮＥ７−ヌクレオリン複合体がＤｓｐｐプロモーターと特異に結合するか否かを研究した。ＤＳＰＰプロモーターに対する特性化（wｅｌｌ−ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）核因子I−Ｃ抗体を使用して陽性対照群を設計した。クロマチン免疫沈降（ＣｈIＰ）アッセイはヌクレオリンがＤｓｐｐプロモーターに結合したのを示して、一方陰性対照群（予備−免疫血清）またはヌクレオリンｓｉＲＮＡは、Ｄｓｐｐプロモーター分画を沈殿させなかった（図９ｃ、中間）。またＣＰＮＥ７は、Ｄｓｐｐプロモーターに結合して残っていた（図９ｃ、下側）。ヌクレオリンは、ＤｓｐｐプロモーターのＡＰ−１部位と相互作用するのに充分であることを確認するために、本発明者は、ビオチン−ラベルされたＡＰ−１部位を有するＤＮＡ親和性タンパク質−結合アッセイ（ＤＡＰＡ）を使用した。ヌクレオリンは、野生型ＡＰ−１部位と関連があったが、突然変異配列とは関連がなかった（図１３）。
【０１０４】
最終的に、ＣＰＮＥ７−媒介Ｄｓｐｐ転写に対するヌクレオリンの影響をさらに調べるために、本発明者は、ＭＤＰＣ−２３細胞をヌクレオリンｓｉＲＮＡコンストラクトでＭＤＰＣ−２３細胞をトランスフェクトして、Ｄｓｐｐ−反応性リポーターを使用してルシフェラーゼリポーターアッセイを行った。前記細胞でＣＰＮＥ７レベルの変化なしにヌクレオリンｓｉＲＮＡによりヌクレオリンレベルが減少した（図９ｄ、下側）。ＣＰＮＥ７は、Ｄｓｐｐプロモーター活性を刺激させて、この相互作用は、ヌクレオリンのノックダウンと共になくなった（図９ｄ、上側）。前記データにより、ヌクレオリンが、ＣＰＮＥ７−依存性Ｄｓｐｐ転写に決定的であることが分かる。まとめてみると、前記結果から、共同調節子としてＣＰＮＥ７は、ヌクレオリンタンパク質と物理的に関連があって、ＣＰＮＥ７−ヌクレオリン複合体は、Ｄｓｐｐ遺伝子転写を調節することが分かる。
【０１０５】
以上で、本願の例示的な実施例に対して詳細に説明したが、本願の権利範囲は、これに限定されるのではなく、次の請求範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の様々な変形及び改良形態も本願の権利範囲に属するものである。
【０１０６】
本発明で使用される全ての技術用語は、特別に定義されない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味で使用される。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は本発明に取り込まれる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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