(57)【要約】  【解決手段】  単鎖インスリンは、Ｃ領域のＮ末端側で少なくとも２つの酸性残基およびＣ領域ペプチドのＣ末端側で少なくとも２つの塩基性残基を有する６〜１１のアミノ酸残基のＣ領域、ヒトインスリンのＡ８に相当する位置の塩基性アミノ酸残基、およびヒトインスリンのＡ１４に相当する位置の酸性アミノ酸残基を有する。Ｃ領域は、酸性と塩基性残基との間で、２〜４つのアミノ酸連結領域を含み得る。残基Ｃ１およびＣ２は、−１または−２の正味負電荷を有することができ、残りのＣ領域部分は、２つの塩基性残基で終わっても良い。医薬組成物は単鎖インスリンを有し、７．０〜８．０の範囲のｐＨで投与され、０．６ｍＭ〜５．０ｍＭの濃度で、および／またはＵ−１００〜Ｕ−１０００の強度で投与され得る。  【選択図】      なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単鎖インスリンであって、
Ｃ領域のＮ末端側に少なくとも２つの酸性残基およびＣ領域ペプチドのＣ末端側に少なくとも２つの塩基性残基を有する６〜１１のアミノ酸残基のＣ領域と、
ヒトインスリンのＡ８に相当する位置の塩基性アミノ酸残基と、
ヒトインスリンのＡ１４に相当する位置の酸性アミノ酸残基と
を有する、単鎖インスリン。
【請求項２】
請求項１記載の単鎖インスリンにおいて、前記Ｃ領域は、当該Ｃ領域のＮ末端側にアミノ酸Ｇｌｕ−Ｇｌｕを有する、単鎖インスリン。
【請求項３】
請求項１または２記載の単鎖インスリンにおいて、前記Ｃ領域は、当該Ｃ領域のＣ末端側にアミノ酸Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、またはＬｙｓ−Ａｒｇを有する、単鎖インスリン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つ記載の単鎖インスリンにおいて、前記Ｃ領域は、前記酸性残基と前記塩基性残基との間に２〜４のアミノ酸連結領域を含む、単鎖インスリン。
【請求項５】
請求項４記載の単鎖インスリンにおいて、前記連結領域は、基本的に１若しくはそれ以上のグリシン、セリン、およびプロリン残基から成る、単鎖インスリン。
【請求項６】
請求項５記載の単鎖インスリンにおいて、前記連結領域はＧｌｙ−Ｐｒｏを有し、またはＧｌｙ−Ｐｒｏから成る、単鎖インスリン。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つ記載の単鎖インスリンにおいて、Ａ８に相当する位置の前記アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓｔ、またはＯｒｎである、単鎖インスリン。
【請求項８】
請求項７記載の単鎖インスリンにおいて、Ａ８に相当する位置の前記アミノ酸は、ＬｙｓまたはＡｒｇである、単鎖インスリン。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１つ記載の単鎖インスリンにおいて、Ａ１４に相当する位置の前記アミノ酸はＧｌｕである、単鎖インスリン。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１つ記載の単鎖インスリンにおいて、前記単鎖インスリンは、Ｂ２８および／またはＢ２９に相当する位置にアミノ酸置換を有する、単鎖インスリン。
【請求項１１】
請求項１０記載の単鎖インスリンにおいて、Ｂ２８および／またはＢ２９に相当する位置の前記置換は、酸性アミノ酸である、単鎖インスリン。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１つ記載の単鎖インスリンであって、Ｂ１０に相当する位置にヒスチジン置換を有する、単鎖インスリン。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１つ記載の単鎖インスリンにおいて、前記単鎖インスリンは、位置Ａ２１のＡｓｎがＧｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒで置換されている、単鎖インスリン。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１つ記載の単鎖インスリンにおいて、前記単鎖インスリンは、配列ＩＤ番号６〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、単鎖インスリン。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１つ記載の単鎖インスリンにおいて、前記単鎖インスリンは、５．０以下の予測等電点を有する、単鎖インスリン。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１つ記載の単鎖インスリンを有する医薬組成物であって、７．０〜８．０のｐＨで製剤化される、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６記載の医薬組成物であって、さらに、ｐＨ緩衝液を有する、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１６または１７記載の医薬組成物において、前記単鎖インスリンは、０．６ｍＭ〜５．０ｍＭの濃度で製剤化される、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１６または１７記載の医薬組成物において、前記単鎖インスリンは、Ｕ−１００、Ｕ−２００、Ｕ−３００、Ｕ−４００、またはＵ−５００の強度で製剤化される、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１６または１７記載の医薬組成物において、前記単鎖インスリンは、Ｕ−５００〜Ｕ−１０００の強度で製剤化される、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか１つ記載の医薬組成物であって、さらに、インスリン六量体につき２〜４の亜鉛イオンを有する、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１６〜２０のいずれか１つ記載の医薬組成物であって、さらに、インスリン六量体につき２未満の亜鉛イオンを有する、医薬組成物。
【請求項２３】
糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項１６〜２２のいずれか１つ記載の医薬組成物を皮下投与する工程を有する、方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、前記医薬組成物は１日２回投与される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の支援を受けた研究又は開発に関する記述
本発明は、国立衛生研究によって授与された研究助成金番号ＤＫ０４０９４９およびＤＫ０７４１７６のもと、共同契約下で政府の支援を得てなされた。米国政府は、本発明に対する特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、増強した熱力学安定性、室温以上の熱によるフィブリル化に対する増強された抵抗性、減少した細胞分裂促進性、および／または改変した薬物動態学および薬力学的特性、すなわち、（ａ）食前または野生型ヒトホルモンに一致する可溶性の製剤に類似する速効性の成分、および（ｂ）野生型インスリンまたはインスリン類似体の微結晶性のＮＰＨ製剤に類似する持続性の成分と相対的な二相性の経時的作用の付与のような、強化された薬剤学的特性を示すポリペプチドホルモン類似体に関するものである。より詳しくは、本発明は（ｉ）第１および第２の位置において酸性残基でＡとＢ領域との間の短縮化した結合（Ｃ）領域の新規のクラスを含み、（ｉｉ）位置Ａ８でアミノ酸置換を含み、（ｉｉｉ）位置Ａ１４で酸性残基を含む単一ポリペプチド鎖から成るインスリン類似体に関するものである。長さ６〜１１残基のうち、このクラスのＣ領域は、野生型プロインスリンのそれに類似し、Ｎ末端酸性エレメントおよびＣ末端部分塩基性エレメントから成る。本発明の単鎖インスリン類似体は、当技術分野で周知のように超速効性作用を与える位置Ｂ２８およびＢ２９のような、ＡまたはＢ領域における他の部位で標準または非標準アミノ酸置換を選択的に含み得る。
【０００３】
治療剤およびワクチンを含む非標準タンパク質の設計は、広範な医学的および社会的利益を有し得る。ヒト、他の哺乳類、脊椎動物、無脊椎動物、または一般に真核細胞のゲノムにコードされる天然に生じるタンパク質は、しばしば複数の生物活性をもたらす。非標準タンパク質の利点は、がん細胞の成長の促進のような意図しない不都合な副作用と関連した相同細胞受容体への減少した結合のような選択的な活性をもたらすことである。社会的利益のさらに別の実施例は、室温以上の分解に対する強化された抵抗性であり、輸送、配布、および使用を容易にする。治療的なタンパク質の実施例は、インスリンにより提供される。ＲＮＡスプライシングの選択的方式によって、または翻訳後のグリコシル化の選択式様式によって生ずる受容体アイソフォームにかかわりなく、野生型ヒトインスリンおよびインスリン受容体に結合する他の哺乳類のゲノムにコードされるインスリン分子は、複数の組織および多様な種類の細胞に存在する。野生型インスリンはまた、相同１型インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に、より低い親和性で結合する。
【０００４】
インスリン作用の経時的変化に２つの相、即時相および遅発相があるように、さらなる医学的利益の例は、可溶性製剤の薬物動態学的特性の最適化である（図１）。即時相および遅発相のそのような組合せは、亜鉛イオンおよびプロタミンまたはプロタミン関連の塩基性ペプチドとの組み合わせで調製した同じ類似体の微結晶性の懸濁液で亜鉛インスリン類似体六量体（これに限定されるものではないが、インスリンリスプロおよびインスリンアスパルトにより提供されるように）溶液の混合物によって与えられることは、当技術分野で周知であり、後者の成分は中性プロタミンハーゲドルン微結晶懸濁液（ＮＰＨ）として称される。当技術分野で周知のように混合型インスリン製剤は、これらの２つの成分を、２５％の可溶性相および７５％の微結晶性相、３０％の可溶性相および７０％の微結晶性相、または各相５０％のような様々な比率で含有する。そのような混合型製剤は、食前（超速効型）インスリン製剤（または食前インスリン類似体製剤）、および野生型インスリンまたはインスリン類似体のＮＰＨ微結晶性の懸濁液の個別の投与と比較して１日の皮下注射の回数の軽減によるそれらの使いやすさのため、発展途上国の真性糖尿病患者によって広く使用されている。混合型二相性インスリン製剤により提供されるインスリンのインスリン療法の簡略化はまた（ｉ）準最適な血糖制御または過度の体重増加をもたらす食前インスリン類似体製剤のみによる治療を受け、（ｉｉ）食後３時間の間における血糖濃度の上昇変動のため準最適血糖制御をもたらすＮＰＨインスリン製剤または基礎インスリン類似体製剤のみによる治療を受ける豊かな社会における真性糖尿病患者、または（ｉｉｉ）（メトホルミンのような）経口薬剤の追加で十分な血糖の制御に至らない上記２つのクラスの患者にとり利益となることが証明された。
【０００５】
既存の二相性インスリン製剤は、ＮＰＨ微結晶を生成するために必要とされる発酵後および浄化後の工程により、複雑で費用のかかる製造方法を必要とする。さらに、そのような製剤は、室温以上で、可溶性および微結晶性両方の成分の固有の感受性で物理的および科学的な分解にさらされる。これらの混合型製剤の二相性薬物動態学的特性は、可溶性と微結晶性相との間のインスリン分子の交換のために、室温以上でのバイアルの貯蔵で変化し得る。最終的に、注射器に引き入れられる微結晶の数が同じバイアルからでさえ引き入れごとに変化することがあり、微結晶性の懸濁液の使用は投与における不確実性と関連していることがある。
【０００６】
既存の二相性インスリン製剤の上記のデメリットを考慮し、二相性インスリン製剤の治療的かつ社会的な利益は、インスリン作用の二相性パターンを与える単一成分可溶性溶液としての薬物動態学的特性を有するインスリン類似体を設計することによって強化される。新規可溶性インスリン類似体がより単純で製造コストが低い場合（すなわち、微結晶化の必要を回避することによって）、および／または、新規可溶性インスリン類似体が野生型インスリンに比べ室温以上の化学的または物理的な分解に対し、より耐熱性を有する場合、付加的な利益が生じる。室温以上での分解に対するそのような抵抗性は、電気および冷凍が安定して利用できない発展途上世界の地域における使用を促進することが期待される。そのような分解によって生じる難題は、アフリカおよびアジアにおいて真性糖尿病の差し迫った流行によって深刻となっている。フィブリル化が室温以上での分解の主要な経路をもたらすので、フィブリル化耐性製剤の設計はインスリン補充療法の安全性および有効性をそのような障害がある領域で増強することができる。可溶性二相性インスリン類似体がヒトがん細胞株のインスリン誘導性の増殖をモニターするため開発された分析において減少した細胞分裂促進性を示すならば、さらに付加的な治療的および社会的利益が生じるであろう。
【０００７】
インスリンの投与は、真性糖尿病の治療として、長年にわたり確立されてきた。真性糖尿病患者における従来のインスリン補充療法の主要なゴールは、健康な被験者に特有の正常範囲の上下に生じるその変動を抑えるための血糖濃度の厳重な制御である。正常範囲の下に生じる変動は即時型アドレナリン性または神経系糖欠乏の症状と関与しており、重症発作では痙攣、昏睡、および死に至る。正常範囲より上に生じる変動は、網膜症、失明、および腎不全を含む微小血管疾患の長期的なリスクの増加と関与している。インスリンは、脊椎動物の代謝において中心的な役割を担う小さな球状タンパク質である。インスリンは２つの鎖、２１残基を含むＡ鎖、および３０残基を含むＢ鎖を含む。ホルモンはＺｎ２＋安定化六量体として膵臓β−細胞に貯蔵されるが、血流中においてはＺｎ２＋を含まない単量体として機能する。インスリンは単鎖前駆体、プロインスリンの生成物であり、そこで結合領域（３５残基）はＢ鎖（残基Ｂ３０）のＣ末端残基をＡ鎖のＮ末端残基と接続する。様々な証拠より、それがインスリン様コアおよび整列せず不規則な結合ペプチドから成ることが示されている。３つの特定のジスルフィド架橋（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、およびＡ２０−Ｂ１９）の形成は、プロインスリンを粗面小胞体（ＥＲ）において酸化的な折り畳み結合させるものと考えられる。プロインスリンは、ＥＲからゴルジ装置まで輸送直後、可溶性Ｚｎ２＋調整六量体を形成するため凝集する。インスリンへの細胞内タンパク質分解消化および変換は、形態的な凝縮が続く未熟な分泌顆粒で生じる。成熟貯蔵顆粒の範囲内の亜鉛インスリン六量体の結晶様配列を電子顕微鏡検査（ＥＭ）によって視覚化した。個々の残基は、（標準的な３文字のコードを典型的に用いて）アミノ酸、鎖、および（典型的に上付き文字として）配列位置の識別によって示す。本発明に関係したものは、ヒトプロインスリンに特有の３６残基野生型Ｃ領域の代わりに、Ａ鎖の位置Ａ８およびＡ１４および選択的にＢ鎖の位置Ｂ２８およびＢ２９でのアミノ酸置換と組み合わせたＮ末端酸性のモチーフおよびＣ末端塩基性のモチーフを含む、長さ６〜１１残基の新規の短縮化したＣ領域の発明である。
【０００８】
真性糖尿病の治療のためのインスリンおよびインスリン類似体の製造、保管、および使用において重大な懸念であるフィブリル化は、より高い温度、より低いｐＨ、撹拌、または尿素、グアニジン、エタノール共溶媒、または疎水性表面の存在下で増大される。現在の米国の薬剤規制は、フィブリル化が１パーセント以上のレベルで生じる場合、インスリンは破棄されるよう要求されている。フィブリル化はより高い温度で強化されるので、真性糖尿病患者はインスリンを最適に、使用の前には冷蔵しておかなければならない。インスリンは、２５℃以上の温度において１０℃増加する毎に、１０倍以上の分解率の増加を示し、したがって、ガイドラインは３０℃以下の温度で、望ましくは冷凍での保管を求めている。既存の二相性インスリン製剤のＮＰＨ微結晶性の成分は、Ａ鎖内でタンパク質分解的切断による化学的分解の特徴的な様式と同様に、室温以上でのフィブリル化に影響を受けやすく、そのような切断は、インスリンまたはインスリン類似体を不活性化する。
【０００９】
ＮＰＨ微結晶のインスリンＡ鎖の上記の切断は、化学結合の切断を含むプロセスの代表例である。そのような切断はインスリン分子または異なるインスリン分子間の化学結合の形成の範囲内で原子の損失または再編成を誘導することが可能であり、重合体の形成に至る。ＮＰＨ微結晶におけるＡ鎖の切断は、折り畳み状態の表面に生じるものと考えられるのに対して、化学結合の他の変化はタンパク質が折り畳まれていない状態で、または、タンパク質の部分的に折り畳まれていない形で介在し、その熱力学安定性を強化させるインスリンの改変はまた化学分解を遅延または阻害する可能性が高い。したがって、変性のその（化学変性剤の濃度の機能として、ヘリックス感受性の波長で円偏光二色性で典型的に測定される）自由エネルギーが現在の臨床使用において、野生型インスリンと同等またはそれより大きい、または食前（超速効型）インスリン類似体のそれと同等またはそれより大きくなければならないことが、インスリン類似体の望ましい特性である。
【００１０】
インスリンはまた、物理的な分解に影響を受けやすい。タンパク質フィブリル化の現在の理論ではフィブリル化の機序は部分的に折り畳まれた中間の状態で進行すると推測されており、そこではアミロイド生成性の核を形成するために次々に凝集する。この理論において、天然の状態を安定化させるアミノ酸置換が部分的に折り畳まれた中間の状態を安定させ、または安定させない可能性があり、天然の状態と中間の状態との間の自由エネルギー障壁を増加させ、または増加させない（または減少させる）可能性がある。したがって、本理論は、フィブリル化の危険性を増減させる２鎖インスリン分子の所定のアミノ酸置換の傾向の予測は非常に困難であることを示す。インスリン分子構造のモデルは、Ｂ鎖の連続したスタッキングおよびＡ鎖の連続したスタッキングを形成するβシートの並列配置を有する（天然の状態において見られるような）３つのα−ヘリックスのほぼ完全なアンフォールディングを想定し、鎖の間およびＡ鎖内の天然のジスルフィドペアリングが維持される。そのような平行したクロスβシートは、通常インスリン単量体の天然の状態において末端は隣接している（<１０オングストローム）が、Ａ鎖のＮ末端とＢ鎖のＣ末端との間で相当な分離（>３０オングストローム）を必要とする。短縮化したＣ領域を有する単鎖インスリン類似体のフィブリル化に対する顕著な抵抗性は当技術分野で周知であり、インスリンプロトフィラメントの平行したクロスβシートの広がった構造と、天然のジスルフィドペアリングを有し、そこで短縮化したＣ領域がプロトフィラメントで不都合となるＡ鎖のＮ末端とＢ鎖のＣ末端との間の距離を抑制する、単鎖インスリン類似体の構造との間での位相的な不和合性を反映するものと考えられている。単鎖インスリン類似体のリボンモデルが図２に示され、インスリン部分の空間充填モデルは設計した結合領域（Ｃ領域、図３における棒による表示）の役割を強調するため図３に示される。
【００１１】
本発明は、医学的および社会的ニーズにより、中性ｐＨで可溶性で単相性である製剤において、日に２回、すなわち現在の混合型速効型ＮＰＨ二相性インスリン製剤のそれと類似したスケジュールでの注射を目的とする、二相性単鎖インスリン類似体を設計する動機が与えられた。我々の単鎖の設計は、微結晶性の懸濁液から成る成分の非存在下において（ｉ）分解に対する抵抗性と、（ｉｉ）インビボでの十分な血糖降下能と、（ｉｉｉ）ＩＧＦ１Ｒとの減少したクロス結合と、（ｉｖ）固有の二相性薬物動態学および薬力学とを結合することを目的とする。したがって、中性ｐＨの可溶性タンパク質溶液として、「ヒューマログ（登録商標）ミックス７５／２５」または「ノボミックス（登録商標）３０」によって例証されるように、混合型製剤のそれらに類似する全体的なプロファイルの誘導をもたらす超速効型発現および作用の後部を延長した持続型作用両方のような、皮下注射に関して二相性薬物動態学的および薬力学的特性を示す単鎖インスリン類似体を発明することが望まれる。したがって、本発明の二相性インスリン類似体製剤は、先進および発展途上の世界において臨床的な利点となる単純化した１日に２回の基礎―追加療法を提供する。単鎖二相性インスリン類似体製剤はまた、Ｔ２ＤＭの治療において広く使用されている第一選択の経口薬であるメトホルミンでは十分に制御されないインスリン投与を受けていない患者において開始されても良い。２つの成分の薬物動態学的特性に基づく、現在の速効型ＮＰＨ混合型製剤の二相性作用の機序は、図４Ａに概略図の形として示す。理論に束縛されるものではないが、本発明の類似体による二相性薬物動態学の可能性がある機序を図４Ｂに概略図の形で示す。
【００１２】
我々は、本発明の製剤が、より複雑な療法での服薬順守は不確かである西洋社会における患者にとり過度に利益となるものと想定する。ヘルスケアの結果、および、Ｔ２ＤＭおよびメタボリック症候群のような慢性疾患において処方された投与計画の長期に渡る固守が、社会的経済状態、正規の教育、家族の構造、および文化的な信念体系において複雑な機能を果たすことは当技術分野で周知である。実際にこれらの社会の問題は標本として不十分であるアフリカ系アメリカ人、ヒスパニック系、およびアメリカの先住民を含む少数民族における肥満およびＴ２ＤＭの負担の増加をもたらすという懸念を増加させている。したがって、本発明の単鎖二相性インスリン類似体製剤は、基礎のみのインスリン治療で不十分な血糖制御を有するが、完全な基礎−追加療法が不可能であるインスリン依存型Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭ患者の利益となることを目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、皮下注射において二相性薬物動態学的および薬力学的特性を提供する単鎖インスリン類似体を提供することは、本発明の１態様である。本発明の類似体は、位置Ｂ１０でヒスチジンを含み、この位置での酸の置換（アスパラギン酸またはグルタミン酸）と関連する発がんに関する懸念を回避する。ＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｂの単鎖インスリン類似体のインビトロでの完全な親和性が野生型ヒトインスリンと比較し５〜１００％の範囲であり、ホルモン受容体複合体において滞留時間の延長をとても示しそうにないことは、本発明のさらなる１態様である。
【００１４】
上記の特徴をもつものの組合せは、新規Ｃ領域の設計によりもたらされ、そこで短縮化した結合ポリペプチド（長さ６〜１１残基）はＮ末端酸性エレメント（残基Ｃ１およびＣ２）、柔軟性のある連結またはヒンジ部位（Ｃ３およびＣ４）、および天然プロインスリン（Ｃ５およびＣ６）で観察されるそれらに類似した一対の塩基性残基を含むＣ末端部位を含む。Ｃ領域の長さの上限１１は、強化されたＩＧＦ１Ｒ結合活性を有するキメラインスリン類似体において記述される１２残基のＩＧＦＩ由来のリンカー（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．１９９５）より下となるよう選択された。下限４は、結合領域（これに制限されるものではないが、Ｇｌｕ−Ｇｌｕのような）のＮ末端部分の酸性モチーフおよび結合領域（これに制限されるものではないが、Ａｒｇ−Ａｒｇのような）のＣ末端部分の塩基性モチーフを保存するため選択された。理論に束縛されるものではないが、我々は、２残基酸性残基はＩＧＦ１Ｒへの類似体の結合に不都合な静電反発力を誘導するが、インスリン受容体アイソフォームによって十分に耐性があるものと推測する。また、理論に束縛されるものではないが、我々はさらに、Ｃ末端の塩基性モチーフが単なるテザーまたはスペースエレメントよりもむしろ部分的な皮下凝集に関与するものと推測する。
【００１５】
一般に、本発明は、本発明のＣ領域を有する単鎖インスリン類似体および位置Ａ８およびＡ１４で置換を有する改変されたＡ鎖を提供する。したがって、本発明は単鎖インスリン類似体の新規クラスに関係するものであり、そこで結合領域（Ｃ領域）は長さ４〜１１であり、２つのエレメントから成る。Ｎ末端エレメントは、最初の２つの残基（Ｃ１およびＣ２として示され、拡張インスリンＢ鎖の残基Ｂ３１−Ｂ３２に相当する）から成り、そこでＣ１およびＣ２は少なくとも１つの酸性側鎖およびｐＨ７．４で−１または−２の正味形式帯電を含む。Ｃ末端エレメントはＡｒｇ−Ａｒｇ、ＬｙｓＬｙｓ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、またはＬｙｓ−Ａｒｇのような２つの塩基性残基を含む。４残基結合領域の場合、本発明の配列は、これに限定されるものではないが、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓをこのように含む。４より大きい（すなわち、範囲５〜１１で）長さの結合領域の場合において、ＮとＣ末端エレメントとの間で、結合領域は柔軟性のある連結を含む。６残基結合領域の実施例において、そのような配列は位置Ｃ３およびＣ４で、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、またはＡｌａ−Ａｌａを含み得るが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。Ａ鎖は、酸性触媒によるアミド分解またはＡｓｎ関連の化学分解の他の状態を避けるため、Ａ８（リジン、アルギニン、またはヒスチジン）において塩基性置換およびＡ２１（Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒ）において置換を含む。１実施例において、Ｂ鎖はまた酵母での生合成経路において、Ｌｙｓ特異的タンパク質分解的切断を避けるために、置換ＬｙｓＢ２９→Ａｒｇを含む。本発明の類似体はまた、安定性および活性を増強することを目的とした、位置Ａ８（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇ）での置換、および、おそらく野生型ＴｙｒＡ１４によって生じる逆疎水的な影響を避けることおよび付加的な負電荷を提供することを目的とした、Ａ１４（Ｇｌｕ）での置換を含む。位置Ａ１４での他の可能性がある置換もまた想定される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】二相性インスリン製剤の概略的な目的。現在の製剤が食前インスリン類似体を使用するのに対して、元来の実施では野生型インスリン（速効型およびＮＰＨ）を用いた。本図は、Ｒ．Ｂｅａｓｅｒ&Ｓ．Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ，ＭｅｄＳｃａｐｅ  Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ（Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＣＭＥ  ｓｅｃｔｉｏｎ；２００９）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｏｒｇ／ｖｉｅｗａｒｔｉｃｌｅ／７０８７８４）から得た。
【図２】５７残基ＳＣＩのリボンモデル。α−ヘリックスは赤色（外側）および黄色（内側）で、Ｂ２４−Ｂ２８β−ストランドは青色（矢印）により示される。３つのジスルフィド架橋（シスチン）は、（星印）で示される。Ｃ領域（配列ＧＧＧＰＲＲ）は整列している。（Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１４７０３−１６（２００８））。
【図３】５７残基ＳＣＩプラットホームの分子構造。６残基Ｃ領域（棒、青緑色）は、ＡとＢ領域の間にテザーを提供する（空間充填による表示）。表面は標準的なＧＲＡＳＰフォーマット（赤色、陰性；紫色、陽性；、および白色、中性）で静電ポテンシャルによって色分けされる。この画像はＰＤＢ  Ｅｎｔｒｙ  ２ｊｚｑにより得られ、Ｗｅｉｓｓの研究室におけるＮＭＲ研究に基づく（Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１４７０３−１６（２００８））。
【図４】新旧の実例。（Ａ）本発明の二相性インスリン製剤は、可溶性相（亜鉛六量体、緑色）および不可溶性相（ＮＰＨ微結晶性の懸濁液、青色）を含む。（Ｂ）提案された新規の実例は、単量体インスリン類似体（Ｉ）、亜鉛を含まない二量体（Ｉ２）、亜鉛が安定化された、および／または亜鉛を含まない六量体（Ｉ６）、および可用性凝集体（Ｉ６ｎ）の間の結合平衡を利用しようとするものである。図示せず：ＴＲ移行。
【図５】酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＴｈｅｒｍａｌｉｎ二相性（バージョン１および２）の過剰発現。クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル：（Ａ）分子量マーカー（ａ）と比較したＳＣＩ−５７ＰＥ（レーンｂ〜ｄ）。（Ｂ）ポジティブコントロールとしてのＨｉｓＡ８−ミニプロインスリン（ＭＰＩ）（ｆ）および標準（ｅ）と比較したＳＣＩ−５７ＤＰ（レーンｇ）。ＳＣＩは、＝６キロダルトン（Ｋｄ）を移動する。ミニプロインスリン近傍の５．８Ｋｄ。
【図６】糖尿病ラット（時間０における血糖４００±２０ｍｇ／ｄｌ）に、示したインスリン類似体／３００ｇ体重の１単位を皮下注射した。Ａ．（×）ヒューマログ（リスプロ）対（△）ヒューマログ２５／７５−混合型対（▲）新鮮なＳＣＩ−５７ＰＥ（図中においてＳＣＩ−１とラベルされるもの）対（◆）新鮮なＳＣＩ−５７ＤＰ（ＳＣＩ−２とラベルされる）対（●）希釈剤。Ｂ．注射後最初の１時間における血糖の減少（同一の記号コード）。各々のグループのラットの数（ｎ）を示す。エラーバーは標準誤差。
【図７】示したインスリン類似体の１単位の皮下注射の後の［血糖］における最初の減少率。＋は、２５日間４５℃で撹拌したＳＣＩ−５７ＰＥ（ＳＣＩ−１とラベルされる）を意味する。＋＋は、５７日間４５℃で撹拌したＳＣＩ−５７ＤＰ（ＳＣＩ−２とラベルされる）を意味する。＊ｐ<０．０５は他の全てのインスリンと比較したもの。＊＊ｐ<０．０５は混合型リスプロ７５／２５と比較したもの。データは注射後最初の１時間（図８Ｂを参照）に関連する。エラーバーは標準誤差。
【図８】糖尿病ラット（時間０における血糖４１０±２０ｍｇ／ｄｌ）に、示した類似体／３００ｇ体重の１単位を皮下注射した。Ａ．新鮮なサンプル：（◆）ＳＣＩ−５７ＤＰ（ＳＣＩ−２とラベルされる）、（△）ランタス（グラルギン）、（×）ヒューマログ（リスプロ）、および（●）希釈剤。Ａ．新鮮なインスリン。Ｂ．高温での撹拌の影響：（◆）新鮮なＳＣＩ−５７ＤＰ対（□）５７日間４５℃で撹拌したＳＣＩ−５７ＤＰ対（○）１１日間４５℃で撹拌したランタス（グラルギン）。
【図９】リリーＣｏ２＋−ＥＤＴＡ金属イオン封鎖分析：可視波長５７４ｎｍの標準化した吸光度を、２５℃でＲ６コバルトインスリン六量体またはＳＣＩ−１六量体の溶液へのＥＤＴＡ（１０倍のモル過剰で）の添加に続く時間の関数として示す。野生型インスリン（黒線）：時間定数６．３（±０．１）分を有する単一指数関数的な移行。ＳＣＩ−１（緑線）：時間定数０．９（±０．１）分（即時相）および１４．１（±０．１）分（遅発相）を有する二相性移行。；ｒ２＝０．９９８。タンパク質は、１ｍＭ  ＮａＳＣＮ、０．２ｍＭ  ＣｏＣｌ２、および５０ｍＭ  フェノールを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）において３．５ｍｇ／ｍｌであった。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＩＲＡ／ＩＲＢ受容体結合の親和性の比率が（プロインスリンと一致するために選択される下限）５〜１００％の範囲で完全な親和性を有する野生型インスリンのそれに類似し、ＩＧＦ１Ｒに対する識別を強化し、位置Ａ２１での（Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒによるＡｓｎの置換のために）化学分解に対する増大された抵抗性が推定され、室温以上での（単鎖トポロジーによる）フィブリル化に対する増大された抵抗性が推定され、および（１つには、塩基性側鎖、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＯｒｎによるＴｈｒＡ８の置換により）増大された熱力学活性を推定される単鎖インスリン類似体が持続的な活性の継続を提供することを目的としている。
【００１８】
タンパク質の透明な可溶性単相溶液として投与される場合、皮下デポーからの二相性吸収動態が単鎖インスリン類似体によって生じ得ることが本発明の特徴である。当技術分野で周知のように、従来の混合型製剤は、自己集合の状態の間で結合平衡の可能性がある連続体の最端部を表す（図４Ａ）。即時および遅発吸収の組合せを提供するための他の戦略が想定され、それはこれらの結合平衡を制御する速度定数および概略形図４Ｂで例示されるように相対的な熱力学安定性に依存する。本戦略の分子実施には、（ｉ）亜鉛を含まない単量体および二量体として超安定である、または（ｉｉ）（バイアルまたはペンで可溶であるが、おそらくデポーで可溶でない）高次凝集体の影響を受けやすい安定な亜鉛媒介六量体の形成に適しているインスリン類似体を必要とする。理論に束縛されるものではないが、亜鉛を含まない単量体および二量体は食前成分を提供することが可能であり、亜鉛安定化六量体凝集体は持続型成分を提供する。また、理論に束縛されるものではないが、単鎖インスリン類似体が血流中の単量体タンパク質分子として存在する場合、それらの薬力学的特性がこの方法で既存の速効型ＮＰＨ混合型製剤の二相性薬物動態学的特性を模倣し得るように、それらのホルモン受容体シグナリング複合体の固有の特徴を介して、標的細胞で二相性シグナリング特性を示し得ることはさらなる可能性である。
【００１９】
六量体凝集が不完全であるような可溶性製剤が、６つのタンパク質単量体につき２〜３の亜鉛イオンの存在下で、または６つのタンパク質単量体につき２つ未満の亜鉛イオンの存在下で中性条件下（ｐＨ７．０〜８．０）で可能であるように、単鎖類似体の等電点が６．８〜７．８であることは、本発明の特徴である。したがって、単鎖インスリン類似体が、Ｔ６インスリン六量体、Ｔ３Ｒｆ３インスリン六量体、またはＲ６インスリン六量体として当技術分野で周知のように古典的な亜鉛インスリン六量体に類似したタンパク質六量体の亜鉛イオン依存的な形成を経る能力を保持することは、本発明の特徴である。
【００２０】
単鎖の類似体はまた、これに制限されるものではないが、ブタ、ウシ、ウマ、およびイヌインスリンのような動物のインスリン由来のＡおよびＢ領域配列で作られ得ることが想定される。それに加え、または選択的に、本発明のインスリン類似体は、残基Ｂ１〜Ｂ３の欠失を含むことができ、またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｃｉａｅ、または他の酵母発現種または系統において酵母生合成の前駆体ポリペプチドのＬｙｓ誘導タンパク質分解を回避するためリジン（例えば、野生型ヒトインスリンのＬｙｓＢ２９）を欠く変異Ｂ鎖と結合されても良い。本発明の単鎖インスリンのＢ領域は、（熱力学安定性、受容体結合親和性、およびフィブリル化に対する抵抗性を強化することを目的とする）位置Ｂ２０および／またはＢ２３のＤ−アミノ酸のような非標準置換、ＰｈｅＢ２４（すなわち、熱力学安定性およびフィブリル化に対する抵抗性を強化することを目的とする、オルト−Ｆ−ＰｈｅＢ２４、オルト−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４、またはオルト−Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４）の２つのリング位置のハロゲンの改変、および／または（受容体結合親和性を強化することを目的とする）ＰｈｅＢ２４の２メチル環の改変、および／またはＴｙｒＢ１６および／またはＴｙｒＢ２６（熱力学安定性および受容体結合活性を増大することを目的とする、３−モノ−ヨード−Ｔｙｒまたは［３、５］−ジ−ヨード−Ｔｙｒ）の芳香環の範囲内のヨード置換の誘導を選択的に含み得る。Ｃ領域においてＴｈｒＢ２７、ＴｈｒＢ３０、または１若しくはそれ以上のセリン残基が、単独または組合わせで、単糖付加物によって改変され得ることがまた想像され、例えば、Ｏ結合型Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＧａｌＮＡｃ−Ｏβ−セリンまたはＧａｌＮＡｃ−Ｏβ−Ｔｈｒとして示される）、Ｏ結合型α−Ｄ−マンノピラノシド（マンノース−Ｏβ−セリンまたはマンノース−Ｏβ−Ｔｈｒ）、および／またはα−Ｄ−グルコピラノシド（グルコース−Ｏβ−セリンまたはグルコース−Ｏβ−Ｔｈｒ）によって提供される。
【００２１】
さらにまた、ヒトと動物インスリンとの間の類似性、および過去におけるヒト真性糖尿病患者への動物インスリンの使用からみれば、インスリンの配列における他の若干の改変が導入され得ることがまた想像され、特にそれらの置換が、「保存的である」と考えられる。例えば、本発明を逸脱しない範囲で、アミノ酸のさらなる置換は、類似した側鎖でアミノ酸のグループ内でなされても良い。これらは、中性の疎水性アミノ酸を含む：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、およびメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）。同様に、中性の極性アミノ酸は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｕまたはＱ）、およびアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）のそれらのグループ内で、互いに置換されても良い。塩基性アミノ酸は、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）とヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含むことが考慮される。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。別段の明記がない限り、または文脈から明らかな場合は、本明細書に記載されるアミノ酸はＬ−アミノ酸であると考えられなければならない。標準アミノ酸はまた、同一の化学クラスに属する非標準アミノ酸に置換され得る。これに制限されるものではないが、塩基性側鎖Ｌｙｓは、より短い側鎖長（オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸）の塩基性アミノ酸と置換され得る。Ｌｙｓはまた中性脂肪族化合物アイソステア等電子体ノルルシン（Ｎｌｅ）と置換される可能性があり、それはより短い脂肪族側鎖（アミノ酪酸またはアミノプロピオン酸）を含む類似体によって同様に置換され得る。
【００２２】
ヒトプロインスリンのアミノ酸配列は、比較の目的で、配列ＩＤ番号１として提供される。  
配列ＩＤ番号  １（ヒトプロインスリン）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００２３】
ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号２として提供される。  
配列ＩＤ番号２（ヒトＡ鎖）
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ
【００２４】
ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号３として提供される。  
配列ＩＤ番号３（ヒトＢ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ
【００２５】
ＫＰインスリン（インスリンリスプロ、ヒューマログ（登録商標）の活性成分、イーライ・リリー社）の改変されたＢ鎖のアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号４として提供される。  
配列ＩＤ番号４（ヒト「ＫＰ」Ｂ鎖）
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
【００２６】
配列ＩＤ番号５は、これまでに開示された（Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１４７０３−１６（２００８））単鎖インスリン類似体のアミノ酸配列を提供し、その構造は図１および２に示される。本発明の類似体とは異なり、この配列は位置Ａ１４、Ｃ１、およびＣ２で酸性残基を欠き、位置Ｂ１０で酸性残基を含み、結果として生じる単鎖インスリン類似体は、本発明の望ましい二相性薬力学特性を示さない。
【００２７】
本発明の単鎖インスリン類似体のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号６〜１９で一部与えられ、単鎖インスリン類似体と一致する。これらの配列は標準的な単一文字コードを使用し、当技術分野で周知のように、ＡｌａはＡとして表され、システインはＣとして表され、アスパラギン酸はＤとして表され、グルタミン酸はＥとしてなどのように表される。赤色のエレメントは、野生型インスリンまたは野生型プロインスリンに存在しない配列または置換を示す。配列ＩＤ番号１３および１９のダッシュ記号は、Ｎ末端残基Ｂ１〜Ｂ３の欠失を示す（ｄｅｓ−Ｂ１〜Ｂ３類似体として示される）。
2017536337.tif 000003
2017536337.tif 000004
【００２８】
本発明の単鎖インスリン類似体のアミノ酸配列はまた配列ＩＤ番号２０〜３４で与えられ、Ｘ１、Ｘ２などによって示される位置で選択的なエレメントを有する単鎖インスリン類似体に対応し、これらの位置は緑色で示される。上記のように、赤色のエレメントは、さもなければ野生型インスリンまたは野生型プロインスリンに存在しない配列または置換を示す。配列ＩＤ番号１３および１９のダッシュ記号は、Ｎ末端残基Ｂ１〜Ｂ３の欠失を示す（ｄｅｓ−Ｂ１〜Ｂ３類似体として示される）。
2017536337.tif 000005
2017536337.tif 000006
【００２９】
本発明の単鎖インスリン類似体のアミノ酸配列はまた配列ＩＤ番号３５〜４９で与えられ、Ｙ１、Ｙ２など（赤紫色）によって示される結合領域の位置で選択的なエレメントを有する単鎖インスリン類似体に対応し、緑色で示されるように、上記の選択的なＸ１、Ｘ２などの配列特性を含む。上記のように、赤色のエレメントは、さもなければ野生型インスリンまたは野生型プロインスリンに存在しない配列または置換を示す。配列ＩＤ番号１３および１９のダッシュ記号は、Ｎ末端残基Ｂ１〜Ｂ３の欠失を示す（ｄｅｓ−Ｂ１〜Ｂ３類似体として示される）。
2017536337.tif 000007
2017536337.tif 000008
【００３０】
本発明の単鎖インスリン類似体のアミノ酸配列はまた配列ＩＤ番号５０〜６４で与えられ、付加的な１〜５のアミノ酸残基（下記の青色のＢ１〜５として示される）を有し、Ｙ１、Ｙ２など（赤紫色）によって示される結合領域の位置で選択的なエレメントを有する単鎖インスリン類似体に対応し、緑色で示されるように、上記の選択的なＸ１、Ｘ２などの配列特性を含む。上記のように、赤色のエレメントは、さもなければ野生型インスリンまたは野生型プロインスリンに存在しない配列または置換を示す。配列ＩＤ番号１３および１９のダッシュ記号は、Ｎ末端残基Ｂ１〜Ｂ３の欠失を示す（ｄｅｓ−Ｂ１〜Ｂ３類似体として示される）。
2017536337.tif 000009
2017536337.tif 000010
【００３１】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号６（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号６５
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＴＣＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＣＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
【００３２】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号７（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号６６
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＴＣＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＡＣＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡ
【００３３】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号８（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号６７
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡ
【００３４】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号９（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号６８
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡ
【００３５】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号１０（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号６９
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡ
【００３６】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号１１（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号７０
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡ
【００３７】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号１２（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号７１
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡ
【００３８】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号１３（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号７２
ＴＴＣＧＴＣＡＡＡＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡ
【００３９】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号１５（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号７３
ＴＴＣＧＴＴＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＡＡ
【００４０】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号１６（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号７４
ＴＴＣＧＴＴＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＡＡ
【００４１】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号１７（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号７５
ＴＴＣＧＴＴＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＡＡ
【００４２】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号１８（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号７６
ＴＴＣＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡ
【００４３】
以下のＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける使用パターンのために最適化したコドンを用い、配列ＩＤ番号１９（上記参照）で明記されている単鎖インスリン類似体をコードするものである。  
配列ＩＤ番号７７
ＴＴＣＧＴＣＡＡＡＣＡＧＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡ  
【００４４】
配列ＩＤ番号３１〜３７において表されるように、類似体の合成遺伝子はＳＣＩ−５９Ａ（下記参照）およびさらなる置換ＧｌｕＢ１３→Ｇｌｎを含むＳＣＩ−５９ＡおよびＳＣＩ−５９Ｂの派生物をコードするＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて調製され、クローン化された。
【００４５】
本発明の２つの単鎖インスリン類似体は（配列ＩＤ番号８および配列ＩＤ番号１０によってコードされ、それぞれＳＣＩ−５７ＤＰおよびＳＣＩ−５７ＰＥとして示される）Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける前駆体ポリペプチドの生合成によって準備し、このシステムは、切断Ｎ末端拡張ペプチドを有する天然のジスルフィド架橋を含む折り畳みタンパク質を分泌する。過剰発現（発酵培養における>２００ｍｇ／ｌ）の効率は、図５に図示される。切断された単鎖インスリン製剤は、３０残基Ｂ領域、６残基Ｃ領域（各々の場合の配列ＥＥＧＰＲＲ）、および２１残基Ａ領域の合計５７の長さを有した。ＳＣＩ−５７ＤＰおよびＳＣＩ−５７ＰＥの形式的等電点（ｐＩ）は、野生型位置Ｂ２９（ＬｙｓＢ２９）の正電荷の除去によって、Ｂ２８またはＢ２９の酸の置換によって、Ａ１４（ＴｙｒＡ１４→Ｇｌｕ）の酸の置換によって、およびＣ領域で塩基性および酸性側鎖を相殺することによって５．０以下にそれぞれの場合においてシフトするものと予測された。
【００４６】
解説される（Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１４７０３−１６（２００８））ように、単鎖の類似体の熱力学安定性をＣＤモニターしたグアニジン変性によって精査した。結果（表１の縦列２）は、野生型インスリンまたはＫＰインスリンである場合より、ＳＣＩ−５７ＤＰおよびＳＣＩ−５７ＰＥ各々が化学変性に対し安定なことを示す。各々の場合において、タンパク質のアンフォールディング５０％を達成するために、より高濃度のグアニジン−ＨＣｌが求められ（表１の縦列３）、その傾向はより大きい値に向かうｍ値として観察され（縦列４）、折り畳み状態における無極性表面のより効果的な脱溶媒和を示唆する。３７℃で穏やかに撹拌する場合、フィブリル化へのＳＣＩ−５７ＰＥの感受性が、野生型インスリンまたはＫＰインスリンと比較し顕著に長期化することが明らかとなった（表１の縦列５）。野生型インスリンおよびＫＰインスリンがこれらの条件下で１０日以内にフィブリルを形成するのに対し、ＳＣＩ−５７ＰＥは少なくとも９ヵ月間フィブリル化が困難である。
【００４７】
ＳＣＩ−５７ＤＰおよびＳＣＩ−５７ＰＥの受容体結合親和性は、野生型ヒトインスリンと比較し決定された。分析にはインスリン受容体のＡアイソフォームを用いた。ヒトインスリン（平衡解離定数０．０５（±０．０１）ｎＭ）と比較して、ＳＣＩ−５７ＤＰおよびＳＣＩ−５７ＰＥは、０．０６（±０．０１）ｎＭおよび０．０８（±０．０１）ｎＭのそれぞれの結合定数を示した。分裂促進性１型ＩＧＦＩ受容体のＳＣＩ−５７ＤＰの親和性は、野生型ヒトインスリンのそれより少なくとも５倍低かった。受容体結合活性の分析のためのプロトコルは、以下の通りであった。マイクロタイターストリッププレート（ヌンクマキシソープ）を、ＡＵ５  ＩｇＧ（リン酸緩衝生理食塩水における濃度４０ｍｇ／ｍｌを１００μｌ／ウェル）とともに、４℃で一晩中インキュベートした。結合データは２部位連続モデルで分析した。データは非特異的結合のために修正した（１μＭヒトインスリンの存在下において関連する膜残留放射能の量）。リガンド枯渇の人為的な影響を避けるため検討した、競合リガンド非存在下で結合したトレーサーのパーセンテージはすべての分析において１５％未満であった。解離定数（Ｋｄ）はＷｈｉｔｔａｋｅｒおよびＷｈｉｔｔａｋｅｒ（２００５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２０９３２−２０９３６）によって解説されるように、数学モデルに当てはめることによって決定し、モデルは、非相同競合の仮定で非線形回帰を使用した（Ｗａｎｇ，１９９５，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６０：１１１−１１４）。
【００４８】
【表１】
2017536337.tif 000011
【００４９】
生物活性および薬力学は、ストレプトゾトシンによる糖尿病に罹患した雄のスピローグドーリーラット（およそ３００のｇ）でテストした（図６）。Ｕ−１００（０．６ｍＭ）の皮下注射ＳＣＩ−５７ＰＥおよびＳＣＩ−５７ＤＰのＰＤ効果は、ヒューマログ（登録商標）および２５−７５ヒューマログ（登録商標）混合型に関して評価し、結果として生じる血糖濃度の全体的なプロファイル（図６Ａ）は、我々の２つの候補のＰＤ特性が混合型リリー製剤と類似していることを示し、その持続型（１２０〜５４０分）および超速効型の両方の成分を要約する（図６Ｂ）。注射後最初の１時間についての血糖濃度の最初の低下率は、図７に示す。
【００５０】
ＳＣＩの熱安定性。ＳＣＩ−５７ＤＰの効力の保持または喪失は、現在のインスリン製剤の急速な分解に好都合な条件下（すなわち、気液界面の存在下、ガラスのバイアルにおける４５℃での穏やかな撹拌；図８）で、上記のラットにおいて評価された。新鮮な試料を図８Ａにおいて使用した。コントロールはヒューマログ（登録商標）およびランタス（登録商標）により提供された。ランタス（登録商標）は１１日後（図８Ｂ中の○）、ヒューマログ（登録商標）は５日以内（図示せず）に不活化されたのに対し、ＳＣＩ−２（◆および□）は５７日後に透明な溶液としてテストした時、完全な活性を維持していた（図８Ｂ）。ＳＣＩ−５７ＰＥ（そのＧｕはＳＣＩ−ＤＰのそれより大きい。表１上）は、分解に対し類似した抵抗性を示す（図示せず）。
【００５１】
構造研究には円偏光二色性（ＣＤ）およびＮＭＲ分光法を用いた。ＳＣＩ−５７ＤＰおよびＳＣＩ−５７ＰＥの遠紫外ＣＤスペクトルは、ヒトインスリンの天然構造および単鎖インスリン類似体の溶液構造と一致し、α−ヘリックスの優位性を示した（Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１４７０３−１６（２００８））。ＮＭＲ研究は、タンパク質濃度１ｍＭ以下でのその単量体の状態を考慮して、亜鉛イオンが存在しない場合の水溶液（ｐＨ７〜８）におけるＳＣＩ−５７ＤＰに着目した。スペクトルは、７００ＭＨｚの陽子周波数で得られた。２Ｄ−ＮＭＲ  ＮＯＥＳＹスペクトルおよび１Ｈ−１５Ｎ異核単一量子干渉性（ＨＳＱＣ）２Ｄ「フィンガープリント」スペクトルは、折り畳み構造の証拠を提供し、ＮＯＥｓおよび化学シフトのパターンは、５７残基単鎖インスリン類似体のこれまでの解析と一致する（Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１４７０３−１６（２００８））。
【００５２】
六量体分解の速度を、可視吸収分光学によって２５℃およびｐＨ７．４におけるＳＣＩ−１のＲ６コバルト六量体で評価した。本分析は、過剰なキレート化剤ＥＤＴＡによって金属イオン放出および金属イオン封鎖の率をモニターするために、Ｒ６インスリン六量体で２つの四面体Ｃｏ２＋部位の青色ｄ−ｄ吸収バンドを利用する。八面体Ｃｏ２＋−ＥＤＴＡ複合体は無色である。野生型インスリンのリリーＣｏ２＋−ＥＤＴＡ金属イオン封鎖分析が５７４ｎｍで（図９中の黒線）吸光度の単一指数関数的な消失にこれらの条件下で誘導するのに対し、顕著に、ＳＣＩ−１は即時相（インスリンリスプロより速い、図示せず）および遅発相（野生型インスリンより遅い、図９中の緑線）で双指数関数的な移行を示す。ＣＷＲＵのワイスの研究グループによってテストされた２鎖インスリン類似体のポートフォリオの中で、ＥＤＴＡ分析においてそのような二相性動力学性反応は前例がない。本分析は、動物（およびその後ヒト）におけるＰＫ研究と相関し、これらの分光結果は、現在のＳＣＩが（ラットの場合のように）皮下デポーで二相性ＰＫ特性を示すという我々の需要な仮説を動機づけしている。この二相性反応の分子機構は決定されていないが、インスリンデグルデク（ノボノルディスク社からの新規基礎類似体）で認められるように、フェノール依存的なＲＴ移行を含み得る。
【００５３】
本明細書に解説がなされるように、真性糖尿病を有する患者のこの治療方法は単鎖インスリン類似体を投与することを含む。単鎖インスリン類似体が酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）または天然の断片連結反応による完全な化学合成に依存し調製され得ることは、本発明の別の態様である。製剤の合成経路は、Ｄ−アミノ酸置換、ＰｈｅまたはＴｙｒの芳香環の範囲内のハロゲン置換、または炭水化物によるセリンまたはトレオニンのＯ結合型の改変のような非標準改変の場合好まれる。しかしながら、拡張遺伝暗号技術または４塩基コドン技術の方法によって非標準改変を含む単鎖の類似体の一部を製造することは可能である（評価のため、Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．，&Ｓｉｓｉｄｏ，Ｍ．，２０１２を参照のこと）。非標準アミノ酸置換の使用で化学分解に対し、または、物理的な分解に対し単鎖インスリン類似体の抵抗性を強化することが可能であることは本発明のさらに別の態様である。我々はさらに真性糖尿病またはメタボリックシンドロームの治療法を提供する本発明の類似体を想定する。インスリン類似体の送達の経路は注射器またはペン装置を用いることによる皮下注射によるものである。
【００５４】
本発明の単鎖インスリン類似体はまた、同時係属の米国特許出願第１３／０１８０１１号においてさらに十分に記述されるように、位置Ｂ２４、Ｂ３５、またはＢ２６のハロゲン原子のような他の改変を含むことができ、その開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。同時係属の米国特許出願第６１／５８９，０１２号においてさらに十分に記述されるように、本発明のインスリン類似体はまた残基Ｂ１〜Ｂ３の欠失により短縮化したＢ鎖を含み得る。
【００５５】
医薬組成物はそのようなインスリン類似体から成ってもよく、選択的に亜鉛を含む可能性がある。亜鉛イオンは、様々な亜鉛イオンとして、インスリン類似体六量体につき２．２の亜鉛原子からインスリン類似体六量体につき１０の亜鉛原子にわたる範囲のタンパク質比率で含まれ得る。製剤のｐＨはｐＨ７．０〜８．０の範囲であり、緩衝液（一般的にリン酸ナトリウムまたはトリス−塩酸塩）が存在する場合、または存在しない場合がある。そのような製剤において、インスリン類似体の濃度は、一般的におよそ０．６〜５．０ｍＭであり、最大５ｍＭまでの濃度が、バイアルまたはペンで用いられても良く、より濃縮された製剤（Ｕ−２００またはそれ以上）は、著しいインスリン抵抗性を有する患者において特定の利益となり得る。賦形剤は、グリセロール、グリシン、アルギニン、トリス、他の緩衝液、および塩類、およびフェノールおよびメタクレゾールのような抗菌性防腐剤を含んでも良く、後者の防腐剤はインスリン六量体の安定性を強化するということが知られている。そのような医薬組成物は、患者に生理的に効果的な量の組成物を投与することによって真性糖尿病または他の病状を有する患者を治療するのに用いられても良い。
【００５６】
前述の開示に基づいて、提供される単鎖インスリン類似体が本明細書において先述する対象を実行することは、現在明白であろう。すなわち、望ましい薬物動態学的および薬力学的特徴（二相性作用の付与）を保持し、野生型インスリンの少なくともわずかな生物活性を維持しているが、これらのインスリン類似体はフィブリル化に対し強化された抵抗性を示す。したがって、任意の明白な変化が請求した発明の範囲内に含まれるものと理解され、したがって、特定の成分要素の選択は、本明細書において開示および記述される本発明の趣旨を逸脱しない範囲で決定されることが可能である。
【００５７】
以下の論文は、本明細書に記述されるテストおよび分析方法が当技術分野の当業者によって理解されることを証明するために引用される。
【００５８】
Ｂｒａｎｇｅ  Ｊ，ｅｄｉｔｏｒ．（１９８７）Ｇａｌｅｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．
Ｈｏｈｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｉｓｉｄｏ，Ｍ．（２０１２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６，８０９−１５．
Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｓ．Ｈ．，Ｊｉａ，Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｋ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎ．Ｂ．，Ｈｕ，Ｓ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ａ．（２００８）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｕｌｔｒａｓｔａｂｌｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１４７０３−１４７１６．
Ｉｌａｇ，Ｌ．Ｌ．，Ｋｅｒｒ，Ｌ．，Ｍａｌｏｎｅ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｔａｎ，Ｍ．Ｈ．（２００７）Ｐｒａｎｄｉａｌ  ｐｒｅｍｉｘｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｂａｓａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａｎ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２９，１２５４−７０．
Ｊａｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｇｕｌｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｓｔａｋｏｖａ，Ｍ．（２００８）Ｗｈｅｎ  ｇｌｙｃａｅｍｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｃａｎ  ｎｏ  ｌｏｎｇｅｒ  ｂｅ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂａｓａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ｃａｎ  ｓｉｍｐｌｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｏｄｅｒｎ  ｐｒｅｍｉｘｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｈｅｌｐ？  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｕｂａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＲＥＳＥＮＴ  ｓｔｕｄｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．６２，１０１３−８．
Ｋａｌｒａ，Ｓ．，Ｂａｌｈａｒａ，Ｙ．，Ｓａｈａｙ，Ｂ．，Ｇａｎａｐａｔｈｙ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｄａｓ，Ａ．（２０１３）Ｗｈｙ  ｉｓ  ｐｒｅｍｉｘｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ？  Ｎｏｖｅｌ  ａｎｓｗｅｒｓ  ｔｏ  ａ  ｄｅｃａｄｅ−ｏｌｄ  ｑｕｅｓｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｓｓoc．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｉｎｄｉａ６１，９−１１．
Ｌｅｅ，Ｈ．Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｓ．，Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｗ．（２０００）Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，４８３−８．Ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ：Ｌｅｅ  ＨＣ，Ｋｉｍ  ＫＳ，Ｓｈｉｎ  ＨＣ．２００９．Ｎａｔｕｒｅ  ４５８，６００．
Ｍｏｓｅｎｚｏｎ，Ｏ．，ａｎｄ  Ｒａｚ，Ｉ．（２０１３）Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃａｒｅ：ｂａｓａｌ−ｂｏｌｕｓ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｐｒｅｍｉｘ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｓ：  ｗｈｅｎ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｗｈｏｍ？  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ３６  Ｓｕｐｐｌ  ２，  Ｓ２１２−８．
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎ．Ｂ．，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．，Ｉｓｍａｉｌ−Ｂｅｉｇｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ａ．（２０１２）Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａ  ｐｕｍｐ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ．Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６，２７７−２８８．
Ｑａｙｙｕｍ，Ｒ．，Ｂｏｌｅｎ，Ｓ．，Ｍａｒｕｔｈｕｒ，Ｎ．，Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｌ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｍａｒｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｐｒｅｍｉｘｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４９，５４９−５９．
Ｒｏｌｌａ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｒａｋｅｌ，Ｒ．Ｅ．（２００５）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｍｉｘｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２７，１１１３−２５．
Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｘ．（１９９５）Ａｎ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｂｉｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６０：１１１−１１４．
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｌ．（２００５）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２０９３２−２０９３６．
【図１】
2017536337.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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