(57)【要約】  本発明は、特定の細胞型を標的とする常磁性ナノ粒子を励起する磁界の使用に基づいて、細胞機能の遠隔制御を行うための方法および組成物を提供する。目的の細胞型は、常磁性ナノ粒子の励起により、細胞応答に変換される物理的変化が生じるイオンチャネルを発現する。このような細胞応答には、例えば、１種または複数の生理学的に活性なタンパク質の産生をもたらす遺伝子発現の増加を含んでよい。このようなタンパク質の発現を使って、対象の種々の異なる遺伝性または後天性の疾患または障害を処置することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団の活性を調節する方法であって、
（ａ）組み換え細胞集団を用意するステップであって、前記細胞が、第１のポリペプチドに融合した金属結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列および第２のポリペプチドに融合したイオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクト、および前記イオンチャネルの活性化により誘導されるプロモーターに機能的に連結された前記タンパク質、ペプチドまたは核酸をコードする組み換え遺伝子を含み、前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドの結合相手であるステップと、
（ｂ）前記細胞を磁界に暴露し、それにより、前記イオンチャネルを活性化して、前記細胞の活性を調節するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記方法が細胞活性を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が細胞活性を高める、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イオンチャネルが機械感受性イオンチャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イオンチャネルが陽イオンチャネルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記チャネルがカルシウムチャネルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記イオンチャネルが陰イオンチャネルである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記イオンチャネルがクロライドチャネルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記イオンチャネルが、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ７、ＴＲＰＮ１、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＹ１、ＴＲＰＰ１、ＴＲＰＰ２、ＴＲＰＶ１、Ｉ６７９Ｋ−ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ４、ＴＲＥＫ、ＴＲＡＡＫ、Ｐｉｅｚｏ、ＡＳＩＣ１，２，３、ＭＥＣ−４／ＭＥＣ−１０、ＭｓｃＬ、またはＭｓｃＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がニューロンであり、前記イオンチャネルがクロライドチャネルであり、前記ニューロンを不活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記イオンチャネルがＴＲＰＶ１変異体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記金属結合タンパク質が、フェリチン、フェリチン変異体、細菌性磁気粒子、バクテリオフェリチン、および飢餓細胞由来のＤＮＡ結合タンパク質、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記金属結合タンパク質がフェリチンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記調節された細胞活性が、細胞増殖および／または分化、アポトーシス、１種または複数のシグナル伝達経路、ニューロン活性化、または遺伝子発現の長期増強および／または調節の発生である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
標的遺伝子によりコードされたタンパク質、ペプチドまたは核酸を産生する方法であって、
（ａ）組み換え細胞集団を用意するステップであって、前記細胞が、第１のポリペプチドに融合した金属結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列および第２のポリペプチドに融合した機械感受性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクトを含み、前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドの結合相手であり、前記イオンチャネルの活性化が前記タンパク質、ペプチドまたは核酸の産生を誘導するステップと、
（ｂ）前記細胞を磁界に暴露し、それにより、前記イオンチャネルを活性化して、前記標的遺伝子の発現を誘導し、それにより、前記タンパク質、ペプチドまたは核酸を産生するステップと、
（ｃ）前記タンパク質、ペプチドまたは核酸を単離するステップと、を含む方法。
【請求項１６】
前記チャネルがカルシウムチャネルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記イオンチャネルが、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ７、ＴＲＰＮ１、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＹ１、ＴＲＰＰ１、ＴＲＰＰ２、ＴＲＰＶ１、Ｉ６７９Ｋ−ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ４、ＴＲＥＫ、ＴＲＡＡＫ、Ｐｉｅｚｏ、ＡＳＩＣ１，２，３、ＭＥＣ−４／ＭＥＣ−１０、ＭｓｃＬ、またはＭｓｃＳである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記金属結合タンパク質が、フェリチン、フェリチン変異体、細菌性磁気粒子、バクテリオフェリチン、および飢餓細胞由来のＤＮＡ結合タンパク質、からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記金属結合タンパク質がフェリチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的遺伝子が内在性遺伝子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的遺伝子が、前記イオンチャネルの活性化時に誘導される転写制御配列に機能的に連結された組み換え遺伝子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
治療または予防活性を有するタンパク質、ペプチドまたは核酸を、それを必要としている対象に投与する方法であって、
（ａ）前記対象に有効量の組み換え細胞を投与するステップであって、前記細胞が、第１のポリペプチドに融合した金属結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列および第２のポリペプチドに融合したイオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクトを含み、前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドの結合相手であるステップと、
（ｂ）前記タンパク質、ペプチドまたは核酸の発現を誘導する条件下で、前記対象を磁界に暴露し、それにより、前記タンパク質、ペプチドまたは核酸を前記対象に投与するステップと、を含む。
【請求項２３】
治療薬または予防薬活性を有する前記タンパク質、ペプチドまたは核酸が、前記チャネルの活性化時に活性化される遺伝子によりコードされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的のタンパク質またはペプチドをコードする前記遺伝子が、内在性遺伝子または組み換え遺伝子であり、前記内在性遺伝子または前記組み換え遺伝子が、前記イオンチャネルによりゲート制御される前記イオンにより活性化される調節配列に機能的に連結される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
治療または予防活性を有するタンパク質、ペプチドまたは核酸を、それを必要としている対象に投与する方法であって、
（ａ）前記対象にベクターを投与するステップであって、前記ベクターが、第１のポリペプチドに融合した金属結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列および第２のポリペプチドに融合したイオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクトを含み、前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドの結合相手であるステップと、
（ｂ）前記タンパク質、ペプチドまたは核酸の発現を誘導する条件下で、前記対象を磁界に暴露し、それにより、前記タンパク質、ペプチドまたは核酸を前記対象に投与するステップと、を含む。
【請求項２６】
前記対象が、前記タンパク質、ペプチドまたは核酸により処置可能である疾患に罹患している、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組み換え細胞が自己細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
対象の標的細胞の前記活性を調節する方法であって、
（ａ）前記対象にベクターを投与するステップであって、前記ベクターが、第１のポリペプチドに融合した金属結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列および第２のポリペプチドに融合したイオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクトを含み、前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドの結合相手であるステップと、
（ｂ）前記対象を磁界に暴露し、それにより、前記標的細胞の活性を調節するステップと、を含む方法。
【請求項２９】
前記標的細胞が不活化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的細胞がニューロンであり、前記イオンチャネルがクロライドチャネルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記クロライドチャネルがＴＲＰＶ１変異体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）前記第１のポリペプチドがエピトープを含み、前記第２のポリペプチドが前記エピトープに結合する抗体であるか、または
（ｂ）前記第２のポリペプチドが、エピトープを含み、前記第２のポリペプチドが、前記エピトープに結合する抗体である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、ヒト、マウスもしくはその他の哺乳動物抗体、またはヒト化抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、ラクダ抗体またはラクダ重鎖抗体から産生された単一ドメイン抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）前記エピトープを含む前記ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）であり、前記抗体が抗ＧＦＰであるか、
（ｂ）前記エピトープを含む前記ポリペプチドがＦＬＡＧであり、前記抗体が抗ＦＬＡＧであるか、
（ｃ）前記エピトープを含む前記ポリペプチドがポリＨｉｓであり、前記抗体が抗ポリＨｉｓであるか、
（ｄ）前記エピトープを含む前記ポリペプチドがＭｙｃであり、前記抗体が抗Ｍｙｃであるか、または
（ｅ）前記エピトープを含む前記ポリペプチドがヘマグルチニンであり、前記抗体が抗ヘマグルチニンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記遺伝的コンストラクトが５キロベース以下である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記イオンチャネルが、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ７、ＴＲＰＮ１、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＹ１、ＴＲＰＰ１、ＴＲＰＰ２、ＴＲＰＶ１、Ｉ６７９Ｋ−ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ４、ＴＲＥＫ、ＴＲＡＡＫ、Ｐｉｅｚｏ、ＡＳＩＣ１，２，３、ＭＥＣ−４／ＭＥＣ−１０、ＭｓｃＬ、またはＭｓｃＳ、からなる群から選択される、請求項２２または２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が、１型糖尿病に罹患しており、前記タンパク質がインスリンまたはプロインスリンである、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年９月２２日に出願の米国特許仮出願第６２／０５３，６０２号の利益を主張する。上記出願の全教示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＮＩＨ認可番号第Ｒ０１  ＧＭ０９５６５４号に基づく政府の支援によりなされた。政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、高周波または磁界を使用して、特定の細胞型により産生される内在性常磁性ナノ粒子を励起することにより、細胞機能の遠隔制御を行うための方法および組成物を提供する。細胞は、温度感受性および／または機械感受性チャネルの発現を指示する一連のＤＮＡコンストラクトを発現する。このチャネルでは、常磁性金属ナノ粒子が励起されて物理的変化が生じ、これが、Ｃａ２＋もしくはＮａ＋などの陽イオンまたはＣｌなどの陰イオンを含むイオンの流入を誘導することにより細胞応答に変換される。内在性ナノ粒子と、他のチャネルとの共発現は、他のシグナル伝達経路の調節も同様に可能とすると思われる。このような誘導可能な細胞応答には、例えば、１種または複数の生理学的に活性なタンパク質の産生をもたらす遺伝子発現の増加を含んでよい。このようなタンパク質の発現を使って、ヒトまたは動物対象の種々の異なる遺伝性または後天性の疾患または障害を処置することができる。また、該方法を使って、イオンの流れにより活性を調節することが可能な内在性細胞を活性化または抑制することができる。したがって、該システムを使って、ニューロン、内分泌細胞、分泌細胞、収縮細胞およびイオン流の変化が細胞の活性を変える任意の他の細胞型の活性を調節することも可能である。
【背景技術】
【０００４】
ここ数年、生理学的機能および特定の作用に対する特定細胞の寄与を解析するツールが発達してきた。初期の研究では、特定の領域のニューロンおよび線維の両方を切断するために、電気的および化学的障害が使用された。その後の研究では、移植した電極による直接刺激を利用したが、しかし、これらの調査は活性化の変動、永続的移植の必要性、および組織損傷により妨害された。これらの手法の代替法として、最近の技術は、遺伝子発現またはイオンチャネルを変えて細胞活性を調節する薬物誘導系を利用する（Ｌｅｒｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２００７，５４：３５−４９）。陽イオンまたは陰イオンの選択的通過を可能とすることにより、イオンチャネルファミリーは、細胞内のイオン濃度を調節し、これが次に、細胞型に応じて細胞内機能を調節する。イオンチャネルの使用は、多くの利点があり、それらの構造および機能は、比較的よく記述されており、それらは、活性化の急速な経時変化を起こし、また、多様なチャネルが哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞に存在し、これらは細胞活性を調節する最適手段を求めて活用され得る。この手法は、最初は、行動を変化させるための薬物ゲート制御チャネルのトランスジェニック発現により確認されたが、効果の経時変化は比較的緩やかであった（数時間から数日）。近年、光活性化陽イオンチャネルをコードする非哺乳動物チャネルロドプシン（ＣｈＲ２）遺伝子が、青色光に暴露されると、分子的に定義されたニューロンを迅速に活性化するために採用された（Ｂｏｙｄｅｎ，ＥＳ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ８：１２６３−１２６８）。この系は、解剖学的特異性および経時的制御を与えるが、限界も有している。例えば、インビボ活性化は、侵襲的である移植デバイスを介した光ファイバーによる光送達が必要で、行動と干渉する場合がある。移植デバイスに対する要件はまた、同時に調節することができる解剖部位の数を制限する。
【０００５】
本発明は、高周波または磁界を使用して、内在性ナノ粒子を発現する細胞を励起または抑制することに基づいて、細胞機能の遠隔制御を行うための方法および組成物を提供する。本発明は、例えば、１つの部位または複数部位において、特定細胞の活性を刺激または抑制する手段として、遠隔操作によりおよび非侵襲的にイオンチャネルを調節するために、ナノ粒子誘導細胞調節（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（ＮＩＣＲ）を使用する。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書で記載される発明は、ナノ粒子誘導細胞調節（ＮＩＣＲ）を利用し、これは、遠隔操作によりおよび非侵襲的に、特定細胞の活性を高めるまたは低減させるなどの細胞活性を調節するために開発された組成物および方法を包含する。本発明は、高周波または磁界を使用して、特定の細胞型内で産生される内在性常磁性ナノ粒子に機械的な力を働かせることによる方法および組成物を提供する。目的の細胞型は、常磁性ナノ粒子を組み込んだ金属結合タンパク質に係留されたイオンチャネルを発現し、常磁性ナノ粒子の電磁界または磁界への暴露により物理的変化が生じ、これが細胞膜を横切るイオン流の変化を介して細胞応答に変換される。常磁性ナノ粒子励起は、電波または磁石を使った機械的な力を使って、局在型温度上昇および／または機械的な力をもたらし、これが、例えば、１種または複数の標的遺伝子の発現の増加または神経活動の調節などの細胞応答に変換される。このような遺伝子発現の増加は、１種または複数の生理学的に活性なタンパク質の産生をもたらすことができる。このようなタンパク質の発現を使って、対象の種々の異なる遺伝性または後天性の疾患または障害を処置することができる。本発明の方法をさらに使って、神経活動を調節することができ、それにより、特異的神経回路の機能障害に起因する種々の神経疾患を処置することができる。
【０００７】
刺激され得る細胞の他の活性には、例えば、細胞増殖および／または分化などの細胞応答、アポトーシス、シグナル伝達経路の活性化、ニューロン活性化もしくは抑制、または遺伝子発現の長期増強および／または調節の発生が挙げられる。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、第１のポリペプチドに融合したフェリチンまたはフェリチン変異体などの金属結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列などのヌクレオチド配列、および第２のポリペプチドに融合したイオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクトを提供する。第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドの結合相手である。遺伝的コンストラクトは、片方または両方のコードヌクレオチド配列に機能的に連結された１種または複数のプロモーターをさらに含むのが好ましい。好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列であり、より好ましくは、配列は二本鎖ＤＮＡである。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、本発明の遺伝的コンストラクトを含むベクターを提供する
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、幹細胞もしくは他の細胞型などの組み換え細胞、または幹細胞もしくは他の細胞型などの組み換え細胞集団を提供し、これらは、本発明の遺伝的コンストラクトを含み、遺伝的コンストラクトによりコードされたタンパク質を発現するまたは発現するように誘導され得る。一実施形態では、組み換え細胞は、チャネルによりゲート制御されるイオンに依存するプロモーターなどの、イオンチャネルの活性化により誘導されるプロモーターに機能的に連結された目的のタンパク質、ペプチドまたはヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクトをさらに含む。一実施形態では、チャネルはカルシウムチャネルであり、目的のタンパク質用の組み換え遺伝子は、Ｃａ２＋誘導性プロモーターに機能的に連結される。
【００１１】
別の実施形態では、組み換え細胞は、本発明の遺伝的コンストラクトを細胞集団に導入するステップを含む方法により産生される。遺伝的コンストラクトは、例えば、エレクトロポレーションまたはリポフェクタミン２０００（商標）媒介遺伝子導入により直接導入することができる。遺伝的コンストラクトは、細胞を、本発明の遺伝的コンストラクトを含むベクターと接触させることにより導入されるのが好ましい。必要に応じて、方法は、細胞に、タンパク質、ペプチドまたはヌクレオチドをコードし、そのコード配列に機能的に連結されたプロモーターをさらに含むヌクレオチド配列を導入することを含むことができ、チャネルによりゲート制御されるイオンに依存するプロモーターなどのプロモーターが、イオンチャネルの活性化により誘導される。この核酸配列は、直接にまたはそのヌクレオチド配列を含むベクターと細胞を接触させることにより導入することができ、該ヌクレオチド配列は、チャネルによりゲート制御されるイオンに依存するプロモーターなどの、イオンチャネルの活性化により誘導されるプロモーターに機能的に連結された目的のタンパク質、ペプチドまたはヌクレオチドをコードする。一実施形態では、遺伝的コンストラクトおよび目的のタンパク質、ペプチドまたはヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列は、同じベクター中に存在する。別の実施形態では、遺伝的コンストラクトおよび目的のタンパク質、ペプチドまたはヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列は、別々のベクター中に存在する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた、本発明のベクターを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた、本発明の組み換え細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、細胞または細胞集団の活性を調節する方法を提供し、該方法は、（１）本発明の遺伝的コンストラクトを含む組み換え細胞または組み換え細胞集団を用意するステップと、（２）該細胞（単一または複数）を高周波照射または磁界に暴露し、それにより、該細胞（単一または複数）の活性を調節するステップとを含む。特定の実施形態では、方法は、パーキンソン病などにおけるような重要な細胞型の消失により、または慢性疼痛、振戦、てんかん発作などにおけるような神経回路の異常活性により、活性が変化している神経回路の活性を正常化するなどのために、細胞の活性を高めるまたは低減させる。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、タンパク質、ペプチドまたはヌクレオチドの産生方法を提供し、該方法は、（１）本発明の遺伝的コンストラクトを含む組み換え細胞集団を用意するステップと、（２）該細胞を高周波照射または磁界に暴露し、それにより、遺伝的コンストラクトによりコードされたイオンチャネルを活性化し、該タンパク質、ペプチドまたは核酸を産生するように細胞を誘導するステップと、（３）該タンパク質またはペプチドを単離するステップとを含む。該タンパク質、ペプチドまたは核酸は、内在性遺伝子により、または組み換え遺伝子によりコードすることができる。一実施形態では、組み換え細胞は、遺伝的コンストラクトによりコードされたイオンチャネルの活性化により誘導される調節核酸配列に機能的に連結された該タンパク質、ペプチドまたは核酸をコードする組み換え遺伝子をさらに含む。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、治療または予防活性を有するタンパク質、ペプチドまたは核酸を、それを必要としている対象に投与する方法を提供する。一実施形態では、方法は、（１）対象に有効量の本発明の医薬組成物を投与するステップと、（２）対象を高周波照射または磁界に暴露し、それにより、該タンパク質、ペプチドまたは核酸の発現を誘導するステップとを含む。
【００１７】
一実施形態では、医薬組成物は組み換え細胞を含む。好ましくは、組み換え細胞は、自己細胞である。一実施形態では、組み換え自己細胞は、（１）対象から細胞を取り出すステップと、（２）細胞に本発明の遺伝的コンストラクト、および場合により、遺伝的コンストラクトによりコードされたイオンチャネルの活性化により誘導されるプロモーターに機能的に連結された治療用タンパク質、ペプチドまたは核酸をコードするヌクレオチド配列を遺伝子導入するステップとを含む方法により産生される。
【００１８】
別の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた、本発明のベクターを含む。好適なベクターとしては、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス、およびコンストラクトを導入する当技術分野において既知の他の手段が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、標的細胞部位またはその近傍での局所注射などの注入または例えば、周辺部神経のための経皮送達により投与される。
【００１９】
タンパク質、ペプチドまたは核酸を産生するための本発明の方法では、目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸は、チャネルの活性化時に活性化される遺伝子によりコードされる。目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子は、例えば、イオンチャネルによりゲート制御されるイオンに依存する内在性遺伝子または調節配列に機能的に連結され、イオンチャネルによりゲート制御されるイオンにより活性化される、組み換え遺伝子とすることができる。例えば、イオンチャネルはカルシウムチャネルであり、目的のタンパク質またはペプチドは、Ｃａ２＋依存性内在性遺伝子またはＣａ２＋依存性プロモーターに機能的に連結された組み換え遺伝子によりコードされ得る。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、対象の標的細胞の活性を調節する方法を提供する。該方法は、（１）対象に本発明の医薬組成物を投与するステップと、（２）対象を高周波照射または磁界に暴露し、それにより、標的細胞の活性を調節するステップとを含む。
【００２１】
特定の実施形態では、対象は障害を罹患しており、標的細胞活性の調節により、それに対する治療または予防効果が得られる。
【００２２】
一実施形態では、医薬組成物は本発明の組み換え細胞を含み、これらの組み換え細胞は標的細胞である。
【００２３】
別の実施形態では、医薬組成物は、本発明のベクターを含み、標的細胞は内在性細胞である。
【００２４】
一実施形態では、対象は神経疾患を罹患しており、医薬組成物は、本発明のベクターを含み、標的細胞は内在性ニューロンである。
【００２５】
前述の実施形態では、遺伝的コンストラクトによりコードされるイオンチャネルは、イオンチャネルの活性化が所望の標的の調節に繋がるように選択される。一実施形態では、細胞はニューロンであり、イオンチャネルはクロライドチャネルである。別の実施形態では、細胞はニューロンであり、チャネルはカルシウムチャネルなどの陽イオンチャネルである。
【００２６】
本発明は、種々の異なる臨床状況において使用することができる。例えば、この技術は、種々の遺伝性または後天性障害または疾患の処置に使用するために、生理学的に活性なタンパク質の発現を制御するように使用することができる。例えば、一実施形態では、本発明の遺伝的コンストラクトを発現するように遺伝子操作された誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または自己間葉系幹細胞は、細胞機能の外部制御を可能とする自家移植片として機能する。したがって、ＮＩＣＲ依存性カルシウム流入を使用して、ホルモン放出、筋肉収縮または神経活動などを含む機能を調節することができる。調節されたホルモンの発現および放出は、糖尿病などのいくつかの内分泌状態の処置を促進することができる。ニューロン刺激は、パーキンソン病（視床下核刺激）および脳卒中（経頭蓋直流刺激）などの衰弱状態の治療に、ならびに疼痛緩和および胃不全麻痺（Ｂｅｎａｂｉｄ，ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ８，６７−８１；Ｓｃｈｌａｕｇ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００８  Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６５：１５７１−１５７６；Ｎｎｏａｈａｍ  ＫＥ，Ｋｕｍｂａｎｇ  Ｊ，２００８  Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔ  Ｒｅｖ  ＣＤ  ００３２２２；Ｍａｒａｎｋ，Ｊ；Ｐａｒｋｍａｎ  ＨＰ，２００７  Ｃｕｒｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｒｅｐ  ９：２８６−２９４）のために使用することができる。これらの応用および手法は、ＮＩＣＲ技術を使って、ヒトおよび非ヒト対象に応用できる。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、カルシウムチャネルの１種または複数のアミノ酸残基の変異から生じる変異イオンチャネルを提供する。好ましくは、変異チャネルはクロライドチャネルである。好ましくは、変異チャネルは点変異から生ずる。一実施形態では、変異チャネルは、カルシウムチャネルＴＲＶ１のＩｌｅ６７９、Ｉｌｅ６８０、または対応するＩｌｅ残基のＬｙｓによる置換（以降では、「ＴＲＶ１変異体」）から生ずる。この単一アミノ酸置換により、カルシウムではなくクロライドのゲート制御をする変異チャネルを生ずる。したがって、ニューロンなどの細胞中で細胞活性を抑制するためにクロライドチャネルが望ましいいくつかの実施形態では、本発明の遺伝的コンストラクトは、ＴＲＰＶ１変異体をコードすることができる。さらに、本発明は、ＴＲＰＶ１変異体タンパク質；変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列；これらのヌクレオチド配列を含み、必要に応じてプロモーター配列に機能的に連結されたベクター；およびこのようなヌクレオチド配列を含む組み換え細胞を提供する。好ましい実施態様では、ＴＲＰＶ１変異体は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物ＴＲＰＶ１、およびより好ましくはヒトＴＲＰＶ１由来のネイティブＴＲＰＶ１の変異からもたらされる。一実施形態では、変異ＴＲＰＶ１チャネルは、図１８（配列番号１）で示されるアミノ酸配列（本明細書においては、ラットＩ６７９Ｋ−ＴＲＰＶ１としても参照される）またはそのアイソフォームを含む変異ラットＴＲＰＶ１チャネルである。特定の哺乳動物ＴＲＰＶ１チャネルにおいて、Ｌｙｓで置換されたネイティブＩｌｅ残基は、ラット配列のＩｌｅ６７９の配列に相当するが、哺乳動物配列の位置６７９ではない場合がある。例えば、対応する変異体ヒトＴＲＰＶ１は、例えば、野生型配列ユニプロット受入番号Ｑ８ＮＥＲ１またはそのアイソフォームを基準にすると、ヒトＩ６８０Ｋ−ＴＲＰＶ１であり、また、対応する変異体マウスＴＲＰＶ１は、例えば、野生型配列ユニプロット受入番号Ｑ７０４Ｙ３またはそのアイソフォームを基準にすると、マウスＩ６８０Ｋ−ＴＲＰＶ１である。本明細書の実施例および図中のＴＲＰＶ１変異体チャネルは、ラットＩ６７９Ｋ−ＴＲＰＶ１である。
【００２８】
さらに、本発明の方法および組成物は、所定の細胞集団の生理機能に対する寄与を解析する手段を提供する。本発明により、種々の細胞型においてフェリチンコアを発現させることが可能となる。本発明は、インビトロおよびインビボの両方で、細胞機能の非侵襲的、選択的変更を提供する。このような技術により、生理学的プロセスにおける細胞集団の役割、特に、侵襲的方法により乱されるまたはその可能性のある機能を調査するのが可能となる。
【００２９】
さらに、本発明は、前記細胞中の内在性常磁性ナノ粒子を標的として、高周波照射または磁界を介した遠隔操作で活性化可能な異なる細胞型を含む非ヒト遺伝子導入動物を提供する。遺伝子導入動物は、所定の細胞集団または所定のペプチド集団の生理機能に対する寄与を調査するためのインビボ手段を提供する。さらに、本発明の遺伝子導入動物は、有用な治療化合物の選別、特定および試験のための動物モデル系として使用し得る。
【００３０】
特定の実施形態では、本明細書で記載の本発明は、例えば、遠隔操作により脊椎動物の細胞機能を調節する方法を提供し、（ｉ）グルコース代謝を調節するために、（ｉｉ）報償を制御する中脳でドーパミン作動性ニューロンを活性化するために、（ｉｉｉ）摂食行動を調節するためのコンビナトリアル活性化スキームを使用するために、ＮＩＣＲを適用する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】ＲＦに応答して温度感受性チャネルＴＲＰＶ１を開かせる酸化鉄ナノ粒子を生成するための、遺伝的にコードされたフェリチンの３種の異なる位置：細胞質フェリチン（左パネル、ＴＲＰＶ１／フェリチン）、Ｎ−末端ミリストイル化シグナルの付加により実現される膜に係留されたフェリチン（中央パネル、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン）およびＧＦＰ結合ドメインをＴＲＰＶ１のＮ−末端におよびＧＦＰをフェリチンのＮ−末端に付加することにより実現されるチャネル結合フェリチン（右パネル、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン）の試験系の図である。
【図１Ｂ】ＴＲＰＶ１の膜発現およびフェリチンの細胞質発現が確認されたＴＲＰＶ１／フェリチン遺伝子導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（上段パネル）、ＴＲＰＶ１およびフェリチン両方の膜発現がＩＨＣにより確認されたＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン遺伝子導入細胞（中断パネル）およびＴＲＰＶ１、ＧＦＰおよびフェリチンの膜発現がＩＨＣにより確認されたαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン遺伝子導入細胞（下段パネル）におけるＴＲＰＶ１、ＧＦＰおよびＨＡタグフェリチンキメラの免疫組織化学を示す。
【図１Ｃ】ＴＲＰアゴニスト２ＡＰＢのαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン遺伝子導入ＨＥＫ細胞への適用後のＦｌｕｏ−４蛍光の代表的変化を示す図である。
【図１Ｄ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン遺伝子導入ＨＥＫ細胞へのＲＦの適用後のＦｌｕｏ−４蛍光の代表的変化を示す図である。
【図１Ｅ】ＲＦ処理が、ＴＲＰＶ１／フェリチン、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンおよびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現ＨＥＫ細胞のインスリン遺伝子発現を高めることを示すグラフである。
【図１Ｆ】ＲＦ処理が、ＴＲＰＶ１／フェリチン、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンおよびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現ＨＥＫ細胞からのプロインスリン放出を増やすことを示すグラフである。全ての場合について、同じ英文字で標識のバーは、ｐ＜０．０５の有意性を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図２Ａ】ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性ヒトインスリン発現間葉系幹細胞移植マウスにおけるＲＦ処理の血糖に対する効果の導入および評価の図である。
【図２Ｂ】ＴＲＰＶ１およびミリストイル化フェリチン（上段パネル）またはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１およびＧＦＰ−フェリチン（下段パネル）を安定に発現している間葉系幹細胞を播種したゼラチン足場移植切片のＴＲＰＶ１、ＥＧＦＰおよびＨＡタグフェリチンの免疫組織化学の図である。
【図２Ｃ】対照、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンおよびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現ＭＳＣ移植におけるインスリン遺伝子発現に対するＲＦ処理の効果を示すグラフである。ＲＦ処理は、ＴＲＰＶ１および遺伝的にコードされたナノ粒子を発現しているＭＳＣにおけるインスリン遺伝子発現を有意に増加させる。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図２Ｄ】血漿中インスリンは、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現ＭＳＣを移植したマウスのＲＦ処理により有意に増加したが、対照マウスではそうでなかったことを示すグラフである。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図２Ｅ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現ＭＳＣを移植したマウスのＲＦ処理では、対照マウスに比べて、血糖が有意に低下することを示すグラフである。アスタリスクはｐ＜０．０５を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。
【図２Ｆ】対照ＭＳＣ移植をしたマウスのＲＦ処理に比べて、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現ＭＳＣを移植したマウスのＲＦ処理では、調査の間の血糖が有意に低下することを示すグラフである。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図３Ａ】ＬａｃＺ、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性ヒトインスリン発現複製欠損アデノウイルスを注入したＣ５７Ｂｌ６マウスにおけるＲＦ処理の血糖に対する効果の導入および評価の図である。
【図３Ｂ】ＴＲＰＶ１およびミリストイル化フェリチン（上段パネル）またはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１およびＧＦＰ−フェリチン（下段パネル）を発現している肝臓組織におけるＴＲＰＶ１、ＥＧＦＰおよびＨＡタグフェリチンの免疫組織化学を示す。
【図３Ｃ】ＬａｃＺ、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性ヒトインスリン発現アデノウイルスで処理したマウスにおける肝臓インスリン遺伝子発現に対するＲＦ処理の効果を示すグラフである。ＲＦ処理は、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現している肝臓組織におけるインスリン遺伝子発現を有意に増加させる。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図３Ｄ】血漿中インスリンは、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現マウスのＲＦ処理により有意に増加したが、対照マウスではそうでなかったことを示すグラフである。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図３Ｅ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現アデノウイルスを注入したマウスのＲＦ処理では、対照マウスに比べて、血糖が有意に低下することを示すグラフである。アスタリスクはｐ＜０．０５を示し、エラーバーはＳＥＭを示した。
【図３Ｆ】ＬａｃＺ発現マウスのＲＦ処理に比べて、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現マウスのＲＦ処理では、調査の間の血糖が有意に低下することを示すグラフである。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図４Ａ】対照またはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現アデノウイルス（「ナノＶ１  ｅｇｆｐフェリチン」と標識）を注入したＣ５７Ｂｌ６マウスの累積血糖に与えるウイルス注入の２、３、４、５および６週後のＲＦ処理の効果を示すグラフである。ＲＦ処理は、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現マウスにおける各評価での累積血糖を有意に低下させた。
【図４Ｂ】血漿中インスリンは、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン（「ナノＴＲＰＶ１、ｅｇｆｐフェリチン」と標識）発現マウスのＲＦ処理により有意に増加したが、２週目の対照マウスではそうでなかったことを示すグラフである。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図４Ｃ】血漿中インスリンは、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン（「ナノＴＲＰＶ１、ｅｇｆｐフェリチン」と標識）発現マウスのＲＦ処理により有意に増加したが、６週目の対照マウスではそうでなかったことを示すグラフである。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図５Ａ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン遺伝子導入ＨＥＫ細胞または対照細胞におけるＦｌｕｏ−４蛍光の累積変化に対する磁界の効果を示す図である。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図５Ｂ】磁界処理が、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性ヒトインスリン発現ＨＥＫ細胞からのプロインスリン放出を増やすことを示すグラフである。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図５Ｃ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性ヒトインスリン発現複製欠損アデノウイルスを注入したＣ５７Ｂｌ６マウスにおける磁石処理の血糖に対する効果の導入および評価の図である。
【図５Ｄ】血漿中インスリンは、磁石処理なしの場合に比較して、間欠的磁界で処理したαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性ヒトインスリン発現マウスにおいて有意に減少することを示すグラフである。アスタリスクは、Ｐ＜０．０５を示す。
【図５Ｅ】磁石処理なしの場合に比べて、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現マウスの磁石処理により、調査の間の血糖が有意に低下することを示すグラフである。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図５Ｆ】磁石処理なしの場合に比べて、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現マウスの磁石処理により、調査の間の累積血糖が有意に低下することを示すグラフである。同じ英文字は、Ｐ＜０．０５を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図６Ａ】Ｎ−末端抗ＧＦＰ−ＴＲＰＶ１融合タンパク質に係留されたＧＦＰタグフェリチンキメラを含む神経活性化系の図である。
【図６Ｂ】ＶＨＭにαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンが発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスのＲＦ処理（ｎ＝１３）は、ＲＦ処理なしの場合に比べて、ｉ）血糖およびｉｉ）累積血糖変化を有意に増加させ、これは、ＶＭＨにＣｈＲ２が発現しているＧＫ−ｃｒｅマウス（ｎ＝４）の青色光刺激の効果と類似していることを示すグラフである。データは平均およびＳＥＭとして示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。ＲＦ処理と未処理群間で、＊および＃は、Ｐ＜０．０５を示し、＃＃は、Ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１を示す。
【図６Ｃ】ＶＭＨにＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを注入したＧＫ−ｃｒｅマウス（ｎ＝８〜１０）のＲＦ処理が、ＷＴマウスの場合（ｎ＝９〜１２）に比べて、ｉ）血漿中インスリンを有意に低下させ、ｉｉ）血漿中グルカゴンを有意に増加させ、かつｉｉｉ）グルコース−６−ホスファターゼの肝臓での発現を有意に高めたことを示すグラフである。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。両側独立スチューデントｔ−検定またはマンホイットニー検定によりデータの分析を行った。＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊＊は、Ｐ＜０．００５を示す。
【図７Ａ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞の２ＡＰＢによる処理（ｎ＝４ケース）は、未処理細胞（ｎ＝４ケース）に比べて、応答細胞のパーセンテージを有意に増加させ（１０％を超えるクロライド標識、ＭＱＡＥ蛍光の減少）、これは、ルテニウムレッドにより低減された（各処理条件に対し、ｎ＝２ケース）ことを示すグラフである。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データをダンの多重比較検定を用いてクラスカル・ワリス検定により分析した。未処理群に対して、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す。
【図７Ｂ】（ｉ）ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンのコンストラクト設計および注入部位を示す。ＣＭＶ−サイトメガロウィルスプロモーター、ｌｏｘＮとｌｏｘ２２７２は、直交組換え部位である；ＶＭＨにαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンが発現しているＧＫ３１  ｃｒｅマウスのＲＦ処理は、ＲＦ処理なしの場合に比べて、ｉｉ）血糖を有意に低下させ、ｉｉｉ）調査期間中の累積血糖変化を有意に低下させる（ｎ＝１３）ことを示すグラフである。データは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定および両側スチューデントのｔ検定により分析した。ＲＦ処理と未処理群間で、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。
【図７Ｃ】ＶＭＨにＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを注入したＧＫ−ｃｒｅマウス（ｎ＝８）のＲＦ処理が、ＷＴマウスの場合に比べて、ｉ）血漿中インスリンを有意に増加させ（ＧＫ−ｃｒｅ＝９、ＷＴ＝９）、ｉｉ）血漿中グルカゴンを有意に変化させず（ＧＫ−ｃｒｅ＝５、ＷＴ＝９）およびｉｉｉ）グルコース−６−ホスファターゼの肝臓での発現を有意に低減した（ｎ＝４）ことを示すグラフである。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは両側独立スチューデントｔ−検定により分析した。＊は、Ｐ＜０．０５を示す。
【図７Ｄ】低血糖症を模倣するための２−デオキシグルコースの投与後のＲＦ処理により、ＶＭＨにαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンが発現しているＧＫ−ｃｒｅマウス（ｎ＝６）では、ＶＭＨにＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを注入したＷＴマウス（ｎ＝９）に比べて、調査期間中、血糖が有意に低下することを示すグラフである。バーは平均で示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図８Ａ】（ｉ）磁石（５秒）による過分極ニューロンの脱分極および増加した発火頻度を示すαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＧＫ  ＶＭＨニューロン由来のホールセル電流クランプ波形；（ｉｉ）磁石（５秒）によるニューロンの過分極を示すαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＧＫ  ＶＭＨニューロン由来のホールセル電流クランプ波形；（ｉｉｉ）磁石活性化による、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＶＭＨニューロンの膜電位変化のバーチャートによる要約および（ｉｖ）磁石活性化によるαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンおよびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＶＭＨニューロンの発火頻度の変化のバーチャートによる要約を示す。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＶＭＨニューロンに関しては、平均膜電位は、−７０．２０±７．２４６ｍＶから、−５３．８１±５．３４９ｍＶ（ｎ＝１４、ｐ＜０．０００１、対応のあるｔ検定）に、有意に増加した。平均発火頻度は、０．７０８４±０．２３１１から、３．０６３±０．５６３２に、有意に増加した（ｎ＝１６、ｐ＜０．００２、対応のあるｔ検定。２つのセルアタッチ記録由来のデータを含む）。  αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＶＭＨニューロンに関しては、平均膜電位は、−５１．２±５．５１９ｍＶから、−５５．９３±５．６３６ｍＶに有意に増加した（ｎ＝６、ｐ＝０．０３、ウィルコクソンマッチドペア）。平均発火頻度は、２．８６８±１．１７７から、０．３１６７±０．２６８５に、有意に減少した（ｎ＝６  ｐ＝０．０３、ウィルコクソンマッチドペア）。
【図８Ｂ】（ｉ）３Ｔ電磁石を使った低および高強度磁界のインビボ送達システムの模式図；（ｉｉ）静磁界による神経活性化の食物摂取量に与える影響を調査するために使用されるプロトコルの模式図；（ｉｉｉ）ＶＭＨにαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスの食物摂取量に与える磁界強度の増加の効果を示すグラフを表す。低磁界強度磁石処理に比べて、ＶＭＨにαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスの磁界処理により、期間２で食物摂取量が有意に増加する（ｎ＝６）。食物摂取量の増加は、ＶＭＨにＣｈＲ２が発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスの青色光刺激で見られるのと類似である（ｎ＝４）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。処理と未処理群間で、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す。
【図８Ｃ】（ｉ）静磁界による神経抑制の食物摂取量に与える効果を調査するために使用されるプロトコルの模式図；および（ｉｉ）低磁界強度磁石処理に比べて、ＶＭＨにαＧＦＰ２３−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスの磁界処理により、期間１の食物摂取量が有意に低減されることを示すグラフを表す。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。処理と未処理群間で、＊は、Ｐ＜０．０５を示す。
【図９Ａ】ｉ）Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンのコンストラクト設計（ＣＭＶ−サイトメガロウィルスプロモーター、ｌｏｘＮとｌｏｘ２２７２は直交組換え部位である）；およびｉｉ）Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンのＶＭＨ注入後、グルコキナーゼニューロン中でＧＦＰの発現を示すＧＫ−ｃｒｅ／Ｔｄ−ｔｏｍａｔｏマウス中のＥＧＦＰの免疫染色を示す。倍率パネル中のスケールバー：１００μｍおよび５０ｕｍ。
【図９Ｂ】線条体中にＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを注入したＮｅｓｔｉｎ−Ｃｒｅ（上段パネル）または野生型マウス（中断パネル）（スケールバー８０（μｍ））およびＶＭＨ中にＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを注入したＧＫ−ｃｒｅマウス（下段パネル）のＲＦ処理後のＥＧＦＰおよびｃ−Ｆｏｓの間の共局在化を示す。スケールバー１００μｍ。
【図９Ｃ】Ａｄ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンまたはＡｄ−ＧＦＰ（１μｌ）の野生型マウス（ＷＴ）の線条体中への注入後またはＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンのＧＫ−ｃｒｅマウスのＶＭＨ中への注入後の、マウスのｉ）ＧＦＰおよびｉｉ）活性化カスパーゼ３免疫染色の定量化を示すグラフを表す。いずれの場合も、バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは、ダンの事後調整を用いてクラスカル・ワリス検定により分析した。ｎ＝４匹のマウス／群。
【図１０Ａ】増加するＲＦ電磁界強度が、Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンをＶＭＨに注入したＧＫ−ｃｒｅマウスの、（ｉ）血糖の変化、および（ｉｉ）累積血糖変化に与える効果を示すグラフを表す。データは平均で示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。処理と未処理群間で、＊または＃はＰ＜０．０５を示し、＊＊または＃＃はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊または＃＃＃はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊または＃＃＃＃はＰ＜０．０００１を示す。
【図１０Ｂ】増加するＲＦ処理期間の、Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンをＶＭＨに注入したＧＫ−ｃｒｅマウスの、（ｉ）血糖の変化、および（ｉｉ）累積血糖変化に与える効果を示すグラフを表す。データは平均で示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。処理と未処理群間で、＊または＃はＰ＜０．０５を示し、＊＊または＃＃はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊または＃＃＃はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊または＃＃＃＃はＰ＜０．０００１を示す。
【図１１Ａ】視床下部腹内側核（ＶＭＨ）でαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているグルコキナーゼｃｒｅ（ＧＫ−ｃｒｅ）マウスのＲＦ処理では、ＲＦ処理なしマウスに比べて、血糖が有意に増加することを示すグラフである（ｎ＝１３）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。処理と未処理群間で、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。
【図１１Ｂ】視床下部腹内側核（ＶＭＨ）にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを注入した野生型マウスのＲＦ処理の、血糖の経時的変化に対する効果を示すグラフである（ｎ＝１０）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。
【図１１Ｃ】視床下部腹内側核（ＶＭＨ）にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを注入した野生型マウスのＲＦ処理の、経時的な血糖に対する効果を示すグラフである（ｎ＝１０）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。
【図１１Ｄ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンをＶＭＨに注入したＷＴマウスにおける、調査期間中のＲＦ処理の血糖に対する効果を示すグラフである（ｎ＝１０）。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは両側対応のあるスチューデントｔ−検定により分析した。
【図１２Ａ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＲＦ処理Ｎ３８細胞のカルシウムイメージングの結果のグラフを示す。ｉ）無処理、ＲＦまたは２ＡＰＢに応答している細胞（２０％超の蛍光の増加）のパーセンテージ（ｎ＝それぞれ、８、９または２ケース）、ｉｉ）ＲＦまたは２ＡＰＢ処理による蛍光シグナルの増加（ルテニウムレッドで抑制される）、およびｉｉｉ）ＲＦ処理に対する応答時間（蛍光が２０％増加するまでの時間）を示す。データは平均で表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データをダンの多重比較検定を用いてクラスカル・ワリス検定により分析した。未処理群に対して、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。
【図１２Ｂ】安定に遺伝子導入され、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞のカルシウムイメージングにより、未処理細胞に比較して、（ｉ）応答細胞（２０％超の蛍光の増加）のパーセンテージおよび（ｉｉ）蛍光シグナル、の磁界強度依存性増加が実証されることを示すグラフを表す。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。処理と未処理群間で、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。安定に遺伝子導入され、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞の１０秒間のＲＦ処理により、未処理細胞に比べて、（ｉｉｉ）応答細胞のパーセンテージおよび（ｉｖ）蛍光シグナルが有意に増加する。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。独立スチューデントｔ−検定によりデータの分析を行った。処理と未処理群間で、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図１２Ｃ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞のＲＦ処理により、（ｉ）ホスホＣＲＥＢレベルおよび（ｉｉ）相対的ｃ−ｆｏｓ遺伝子発現（定量的ＰＣＲで測定）が有意に増加し、また、これらの増加がルテニウムレッド（３０および１００μＭ）により阻止されることを示すグラフを表す。いずれの場合も、バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とテューキーの事後検定により分析した。＊＊、＃、ａまたは＆で標識したバーは、Ｐ＜０．０１を示す。各調査は、３つのケースについてそれぞれ４回繰り返した。
【図１２Ｄ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているアデノウイルスに感染したＮ３８細胞のＴＲＰＶ１（青）、ＧＦＰ（緑）およびＦＬＡＧタグフェリチンキメラ（赤）に対する免疫組織化学を示す。スケールバーは、２０μｍである。
【図１２Ｅ】非注入側（右）にはない、注入側由来のＧＦＰタグフェリチン（左）を示すαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンが片側性発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスから採取した視床下部切片の免疫電子顕微鏡像を示す。スケールバーは、２５０ｎｍである。
【図１３Ａ】Ｎ３８細胞のＲＦ処理が、ホスホＣＲＥＢレベルを変えないことを示すグラフである。いずれの場合も、バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。各調査は、３つのケースについてそれぞれ４回繰り返した。
【図１３Ｂ】ＲＦ処理が、相対的ｃ−ｆｏｓ遺伝子発現を有意に増加させることを示すグラフである。いずれの場合も、バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは両側独立スチューデントｔ−検定により分析した。＊で標識したバーは、Ｐ＜０．０１を示す。各調査は、３つのケースについてそれぞれ４回繰り返した。
【図１４Ａ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞のＲＦ処理の、ｐＣＲＥＢレベルおよびｃ−Ｆｏｓ発現に与える効果を示すグラフである。いずれの場合も、バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは両側マンホイットニー検定により分析した。＊は、Ｐ＜０．０５を示す。各調査は、３つのケースについてそれぞれ４回繰り返した。
【図１４Ｂ】視床下部腹内側核（ＶＭＨ）にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているグルコキナーゼｃｒｅ（ＧＫ−ｃｒｅ）マウスのＲＦ処理では、ＲＦ処理なしマウスに比べて、血糖が有意に増加することを示すグラフである（ｎ＝１３）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検により分析した。処理と未処理群間で、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。
【図１４Ｃ】低血糖症を模倣するための２−デオキシグルコースの投与後のＲＦ処理により、ＶＭＨにαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンが発現しているＧＫ−ｃｒｅマウス（ｎ＝６）では、ＶＭＨにＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを注入したＷＴマウス（ｎ＝９）に比べて、調査期間中、累積血糖変化が有意に低下することを示すグラフである。データは平均で示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは不対スチューデント検定により分析した。＊は、Ｐ＜０．０５を示す。
【図１４Ｄ】ｉ）視床下部腹内側核（ＶＭＨ）にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを注入した野生型マウスのＲＦ処理の、血糖の経時的変化に対する効果を示すグラフである（ｎ＝８）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。ｉｉ）視床下部腹内側核（ＶＭＨ）にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを注入した野生型マウスのＲＦ処理の、累積血糖の経時的変化に対する効果（ｎ＝８）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。ｉｉｉ）αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンをＶＭＨに注入したＷＴマウスにおける、調査期間中のＲＦ処理の血糖に対する効果（ｎ＝８）。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。
【図１５Ａ】培養細胞の電気生理学的記録を示す。（ｉ）ホールセル電圧クランプ記録（−６０ｍＶ）由来の電流波形で、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＨＥＫ細胞中で、ＴＲＰＶ１アゴニスト（２ＡＰＢ  ２００μＭ）に誘導された内向き電流を示す。（ｉｉ）ホールセル電圧クランプ記録（−６０ｍＶ）由来の、磁石（５秒）に誘導された電流波形で、安定に遺伝子導入され、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞中の内向き電流を示す。（ｉｉｉ）αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現している培養細胞中で、ＴＲＰＶ１アゴニスト２ＡＰＢ（２００ｎＭ）および磁石活性化により誘導された平均ピーク電流のバーチャート要約。
【図１５Ｂ】培養細胞の電気生理学的記録を示す。（ｉ）ホールセル電圧クランプ記録（−６０ｍＶ）由来の電流波形で、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＨＥＫ細胞中で、ＴＲＰＶ１アゴニスト（２ＡＰＢ  ２００μＭ）に誘導された外向き電流を示す。（ｉｉ）ホールセル電圧クランプ記録（−６０ｍＶ）由来の、磁石（５秒）に誘導された電流波形で、安定に遺伝子導入され、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞中の外向き電流を示す。（ｉｉｉ）αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現している培養細胞中で、ＴＲＰＶ１アゴニスト２ＡＰＢ（２００ｎＭ）および磁石活性化により誘導された平均ピーク電流のバーチャート要約。
【図１５Ｃ】２ＡＰＢ活性化ＴＲＰＶ１変異体チャネルの電流−電圧関係は、限られた陽イオン透過度および向上したクロライド透過度を示す。（ｉ）支配的内部イオンがＫおよびグルコネートである場合、野生型に比べて、ＴＲＰＶ１変異体チャネルの限られたコンダクタンス。（ｉｉ）優勢な内部イオンがＣｓおよびＣｌ（等軸クロライド）の場合、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体チャネルのコンダクタンスは増加する。
【図１５Ｄ】安定に遺伝子導入され、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞のカルシウムイメージングの結果から、未処理細胞に比較して、（ｉ）応答細胞（２０％を超える蛍光の増加）のパーセンテージおよび（ｉｉ）蛍光シグナル、の磁界強度依存性増加が実証されることを示す。磁石刺激の効果は、ルテニウムレッドにより阻止された。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データを２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。処理と未処理群間で、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。（ｉｉｉ）αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現している、磁石で処理したＮ３８細胞の応答時間（蛍光の２０％の増加に到達するまで）を表すヒストグラム。
【図１５Ｅ】αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞の磁石による処理（ｎ＝６ケース）は、未処理細胞（ｎ＝４ケース）に比べて、応答細胞のパーセンテージを有意に増加させ（１０％を超えるクロライド標識、ＭＱＡＥ蛍光の減少）、およびｉｉ）ＭＱＡＥシグナルの減少を大きくしたことを示すグラフである。ルテニウムレッドは、応答細胞のパーセンテージおよび応答の大きさの両方を低減した（ｎ＝２ケース）。いずれの場合も、バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データをクラスカル・ワリス検定とダンの多重比較検定により分析した。未処理群に対して、＊＊で標識したバーは、Ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊＊で標識したバーは、Ｐ＜０．００１を示す。
【図１６Ａ】中等度（０．２〜０．５Ｔ）の磁界強度の、ＶＭＨにαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスの食物摂取量に対する効果を示すグラフである。
【図１６Ｂ】ｉ）静磁界による神経活性化の、血糖に対する効果を調べるために使用されるクロスオーバープロトコルの模式図を示す。ｉｉ）視床下部腹内側核（ＶＭＨ）でαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているグルコキナーゼｃｒｅ（ＧＫ−ｃｒｅ）マウスの磁界処理では、磁石処理なしマウスに比べて、血糖が有意に増加する（ｎ＝６）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。ｉｉｉ）ＶＭＨにαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンが発現しているＧＫ−ｃｒｅマウス（ｎ＝６）では、磁石処理のない同じマウスに比べて、磁石処理では、調査期間中に累積血糖変化が有意に増加する。いずれの場合も、バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを示す。データはウィルコクソンマッチドペア符号付順位検定により分析した。＊は、Ｐ＜０．０５を示す。
【図１６Ｃ】（ｉ）視床下部腹内側核（ＶＭＨ）にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを注入した野生型マウスの静磁界処理の、血糖の経時的変化に対する効果を示すグラフである（ｎ＝６）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。（ｉｉ）視床下部腹内側核（ＶＭＨ）にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを注入した野生型マウスの静磁界処理の、食物摂取量に対する効果（ｎ＝６）。データポイントは平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。データは２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により分析した。
【図１７Ａ】非絶食時血糖は、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを注入されたＷＴ、ＧＫ−ｃｒｅ、ＧＫ−ｃｒｅマウスの間で有意に異ならなかったことを示すグラフである。
【図１７Ｂ】絶食の４時間後の食物摂取量は、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを注入されたＷＴ、ＧＫ−ｃｒｅ、ＧＫ−ｃｒｅマウスの間で有意に異ならなかったことを示すグラフである。
【図１８】ラットＩ６７９Ｋ−ＴＲＰＶ１のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、高周波または磁界を使用して、特定の細胞型で発現される常磁性ナノ粒子を励起することにより、細胞機能の遠隔制御を行うための方法および組成物を提供する。目的の細胞型は、常磁性ナノ粒子を形成する金属結合タンパク質に係留されたイオンチャネルを発現し、常磁性ナノ粒子の励起により、局在型温度上昇または機械的な力などの物理的変化が生じ、この物理的変化がイオンチャネルを活性化し、その結果、細胞応答に変換される。このような細胞応答には、例えば、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、遺伝子発現の調節、１種または複数の細胞プロセスの活性化または抑制および／または１種または複数のシグナル伝達経路の活性化または抑制が挙げられる。特定の実施形態では、目的の細胞はニューロンである。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、細胞応答は、１種または複数の生理学的に活性なタンパク質の産生をもたらす遺伝子発現の増加である。このようなタンパク質の発現を使って、例えば、心血管障害、末梢および中枢神経系の障害を含む神経疾患、自己免疫疾患、腫瘍疾患、ホルモン障害、代謝疾患、血液障害または免疫異常などの種々の遺伝性または後天性障害を処置し得る。さらに、タンパク質を発現させて、例えば、ウイルス、細菌、寄生、および真菌感染を含む種々の感染症を処置し得る。ナノ粒子励起から生じる細胞応答はまた、１種または複数の目的の核酸分子の産生をもたらす遺伝子発現の増加を生じるように設計されてもよい。このような核酸分子には、アンチセンスおよびｓｉＲＮＡ分子などのタンパク質発現を調節できる分子が含まれる。
【００３４】
本発明の組成物および方法は、金属結合タンパク質を利用する。本明細書で使用される場合、「金属結合タンパク質」という用語は、常磁性金属含有ナノ粒子を組み込んだタンパク質である。金属結合タンパク質は、例えば、細胞中で発現後にこのようなナノ粒子を形成することができる。好適な金属結合タンパク質には、フェリチン、フェリチン変異体、ＭａｇＡおよびＭｍｓなどの細菌性磁気粒子、バクテリオフェリチン、飢餓細胞由来のＤＮＡ結合タンパク質（Ｐｒｏｚｏｒｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２００７，１７：９５１−９５７；Ｚｅｔｈ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０１２，４４５：２９７−３１１）、および当該技術分野において既知のその他のタンパク質が含まれる。好ましくは、金属結合タンパク質は、フェリチン、例えば、哺乳動物、特にヒトフェリチン、またはフェリチン変異体である。フェリチンは、軽鎖および重鎖を含むヘテロマルチマータンパク質で、複雑な結晶質磁気構造を有する５〜１２ｎｍの酸化鉄コアを作り出す。
【００３５】
本発明の遺伝的コンストラクトは、フェリチンまたはフェリチン変異体などの、第１のポリペプチドに融合した金属結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。遺伝的コンストラクトは、第２のポリペプチドに融合したイオンチャネルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドの結合相手である。一実施形態では、ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列、好ましくは、二本鎖ＤＮＡ配列であり、これは融合タンパク質をコードする。
【００３６】
一実施形態では、第２のポリペプチドがエピトープを含み、第１のポリペプチドが該エピトープに結合する抗体である。好ましい実施形態では、第１のポリペプチドが、エピトープを含み、第２のポリペプチドまたはタンパク質が該エピトープに結合する抗体である。
【００３７】
エピトープを含むポリペプチドは、エピトープそれ自体に限定するかまたはエピトープを含むポリペプチドとすることができる。エピトープは、線形または非線形エピトープとすることができるが、好ましくは、線形エピトープである。
【００３８】
抗体は、ヒト、マウスもしくはその他の哺乳動物抗体、またはヒト化抗体とすることができる。抗体は、多量体またはモノマー抗体、例えば、単鎖抗体とすることができる。好ましい実施形態では、抗体は、ラクダ抗体またはラクダ重鎖抗体から産生された単一ドメイン抗体である。
【００３９】
第１と第２のポリペプチドは、任意の好適なエピトープ／抗体対を含むことができる。特定の実施形態では、エピトープ／抗体対は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）／抗ＧＦＰ抗体；高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）／抗ＧＦＰ抗体；ＦＬＡＧ／抗ＦＬＡＧ抗体；ポリＨｉｓ／抗ポリＨｉｓ抗体；Ｍｙｃ／抗Ｍｙｃ抗体；ヘマグルチニン／抗ヘマグルチニン抗体および当技術分野において既知のその他の抗体から選択されるが、これらに限定されない。本発明の好ましい遺伝的コンストラクトには、約５キロベースまでのものが含まれる。
【００４０】
本発明のベクターは、インビトロまたはインビボでの細胞の遺伝子導入に好適な形態の本発明の遺伝的コンストラクトを含む。好適するベクターには、環状プラスミドおよび直線状プラスミドなどのプラスミド、リポソーム、アデノウイルス、好ましくは複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、および当技術分野において既知のその他のベクターが含まれる。
【００４１】
本発明の発現系は、実質上、細菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、特にヒト細胞を含む任意のタイプの生物学的細胞集団と共に使用することができる。使用される特定細胞型は通常、調節しようとしている細胞応答の種類に応じて変化することになる。例えば、治療薬として使用する目的の生理学的タンパク質の発現を増加させるためには、動物細胞および特に、ヒト細胞または非ヒト哺乳動物細胞が通常好ましい。
【００４２】
本発明の一実施形態では、目的の細胞型は、幹細胞、好ましくは哺乳動物幹細胞である。例えば、本発明のコンストラクトを発現するように遺伝子操作された幹細胞は、細胞機能の外部制御を可能とする自家移植片として機能することが可能である。本明細書で使用される場合、用語の「幹細胞」は、１種または複数の異なる細胞型に分化する潜在能力を有する、多能性幹細胞を含む任意の細胞を意味する。このような細胞としては、例えば、骨髄、胎仔胚盤胞または卵黄嚢、脾臓、末梢血および臍帯血を含む血液、脂肪組織およびその他の組織および臓器を含む種々の異なる由来源からの幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞、内皮前駆細胞または胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の特定の実施形態では、イオンチャネルは、温度感受性イオンチャネルであり、常磁性ナノ粒子を高周波照射に暴露することにより、イオンチャネルを介して細胞応答に変換される局在型温度上昇を生ずる。このような温度感受性イオンチャネルとしては、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＶＡ１、キメラＴＲＰチャネル、ＴＲＥＫ−２、およびＴＲＥＫ１、ＴＲＥＫ２およびＴＡＳＫなどのタンデムポア型カリウムチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、チャネルがＴＲＰＶ１の場合、常磁性ナノ粒子の励起により媒介される局在型温度上昇がチャネルの活性化に繋がり、Ｃａ２＋を流入させる。イオンチャネルは、任意の動物またはプラント種由来であってよいが、好ましくは、哺乳動物起源、より好ましくは、ヒト起源である。
【００４４】
一実施形態では、温度感受性イオンチャネルは、陽イオンチャネル、例えば、カルシウムまたはナトリウムチャネルである。
【００４５】
別の実施形態では、温度感受性イオンチャネルは、陰イオンチャネル、例えば、クロライドチャネルである。一実施形態では、イオンチャネルはＴＲＰＶ１変異体である。ラットカルシウムチャネルＴＲＰＶ１のＩｌｅ６７９、または別の哺乳動物ＴＲＰＶ１の対応する残基のＬｙｓへの変異は、カルシウムではなくクロライドを通過させる変異チャネルを生ずる。したがって、クロライドチャネルが望ましいいくつかの実施形態では、本発明の遺伝的コンストラクトは、ＴＲＰＶ１変異体をコードすることができる。さらに、本発明は、ＴＲＰＶ１変異体タンパク質；この変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列、これらのヌクレオチド配列を含み、必要に応じてプロモーター配列に機能的に連結されたベクター；およびこのようなヌクレオチド配列を含む組み換え細胞を提供する。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、イオンチャネルは、機械感受性イオンチャネルであり、常磁性ナノ粒子を磁界に暴露することにより、ナノ粒子の運動を生じ、それが、イオンチャネルの活性化を介して細胞応答に変換される。このような機械感受性イオンチャネルとしては、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ７、ＴＲＰＮ１、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＹ１、ＴＲＰＰ１、ＴＲＰＰ２、ＴＲＰＶ１、Ｉ６７９Ｋ−ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ４、ＴＲＥＫ、ＴＲＡＡＫ、Ｐｉｅｚｏ、ＡＳＩＣ１，２，３、ＭＥＣ−４／ＭＥＣ−１０、ＭｓｃＬ、ＭｓｃＳ、および当技術分野において既知のその他のイオンチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。局在型ナノ粒子運動の増加は、チャネルの活性化をもたらし、細胞活性の調節を生ずる。例えば、チャネルがＴＲＰＶ１の場合、常磁性ナノ粒子の運動がチャネルの活性化に繋がり、Ｃａ２＋を流入させる。逆に、チャネルがＩ６７９ＫタイプのＴＲＰＶ１の場合、常磁性ナノ粒子の運動がチャネルの活性化に繋がり、Ｃｌ−を流入させる。
【００４７】
本発明の遺伝的コンストラクトによりコードされるイオンチャネルは、任意の動物または植物種由来であってよいが、好ましくは、哺乳動物起源、より好ましくは、ヒト起源である。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、タンパク質、ペプチドまたはヌクレオチドの産生方法を提供し、該方法は、（１）本発明の遺伝的コンストラクトを含み、イオンチャネルの活性化により誘導されるプロモーターに機能的に連結された目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸をコードするＤＮＡ配列などのヌクレオチドをさらに含む組み換え細胞集団を用意するステップと、（２）該細胞を高周波照射または磁界に暴露し、それにより、目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸を産生するように細胞を誘導するステップと、（３）目的のタンパク質またはペプチドを単離するステップとを含む。
【００４９】
本発明の方法の特定の実施形態では、組み換え細胞をエクスビボで産生するまたは宿主細胞にインビボで形質導入する方法は、鉄源を細胞に供給するステップさらに含む。例えば、特定の実施形態では、標的細胞は、中枢神経系中に存在し、鉄イオン源は、中枢神経系、例えば、脳脊髄液に投与される。鉄源は、当技術分野において既知の任意の生理学的に許容可能な、Ｆｅ（ＩＩ）またはＦｅ（ＩＩＩ）塩などの鉄イオン源とすることができる。
【００５０】
特定の実施形態では、組み換え細胞を使って、工業規模で所望の産物を産生できる細胞バンクが樹立される。一実施形態では、組み換え細胞は細胞培養で増殖される。ある実施形態では、細胞は、細胞の増殖に適する条件下、バイオリアクタ中で維持される。好ましくは、高周波照射または磁界が細胞の成長周期の指定時点で投入され、タンパク質産生が最適化される。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、治療または予防活性を有するタンパク質、ペプチドまたは核酸を、それを必要としている対象に投与する方法を提供する。一実施形態では、方法は、（１）対象に有効量の本発明の医薬組成物を投与するステップであって、前記細胞が、高周波照射または磁界への暴露時に、治療用タンパク質、ペプチドまたは核酸を発現するように誘導され得るステップと、（２）該タンパク質、ペプチドまたは核酸の発現を誘導する条件下で、高周波照射または磁界に対象を暴露し、それにより、該タンパク質、ペプチドまたは核酸を対象に投与するステップとを含む。
【００５２】
別の実施形態では、方法は、（１）対象に本発明のベクターを投与するステップであって、前記ベクターが、本発明の遺伝的コンストラクトを含むステップと、（２）該タンパク質、ペプチドまたは核酸の発現を誘導する条件下で、高周波照射または磁界に対象を暴露し、それにより、該タンパク質、ペプチドまたは核酸を対象に投与するステップとを含む。
【００５３】
タンパク質、ペプチドまたは核酸を産生するまたは投与するための本発明の方法では、目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸は、チャネルの活性化時に賦活化される遺伝子によりコードされる。目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子は、例えば、発現がイオンチャネルによりゲート制御されるイオンに依存する内在性遺伝子または調節配列に機能的に連結され、イオンチャネルによりゲート制御されるイオンにより活性化される、組み換え遺伝子とすることができる。例えば、イオンチャネルはカルシウムチャネルであり、目的のタンパク質またはペプチドは、Ｃａ２＋依存性内在性遺伝子またはＣａ２＋依存性プロモーターに機能的に連結された組み換え遺伝子によりコードされ得る。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明の方法は、治療または予防活性を有するタンパク質、ペプチドまたはヌクレオチドで処置可能な疾患を有する対象の処置を含む。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、活性タンパク質またはペプチドの産生欠陥を特徴とする疾病または障害の処置方法を提供する。例えば、該方法を使って、リソソーム性蓄積症などのペプチドホルモンまたは酵素の欠陥を特徴とする疾患を処置することができる。例としては、限定されないが、次の疾患が挙げられる。括弧中には、これらの疾患に対する治療用タンパク質またはペプチドを示す：１型および２型糖尿病（インスリン／プロインスリン）；貧血（エリスロポエチン）；Ｇ−ＣＳＦ（好中球減少症）；ポンペ病（アルファ−グルコシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ファブリー病（アルファ−ガラクトシダーゼＡ）；ムコ多糖症（アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミダーゼ、ヘパラン−アルファ−グルコサミジン６−スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ）、血友病Ａ（因子ＸＩＩＩ）、血友病Ｂ（因子ＩＸ）、レット症候群（メチル化ＣｐＧ結合タンパク質２、ＭｅＣＰ２）、網膜血管新（抗ＶＥＧＦ）、関節リウマチ（抗ＴＮＦ）、炎症性腸疾患（抗ＴＮＦ）。
【００５６】
一実施形態では、イオンチャネルの活性化により、目的のタンパク質またはペプチドをコードする内在性遺伝子の発現または発現の増加が誘導される。例えば、遺伝子の発現は、イオンチャネルによりゲート制御されるイオンにより誘導するまたは増やすことができる。例えば、チャネルがカルシウムチャネルである場合、遺伝子は、血清応答エレメント、ｃＡＭＰ応答エレメント、またはＮＦＡＴ応答エレメントなどのカルシウム感知経路により調節される任意の内在性遺伝子とすることができる。内在性カルシウム依存性遺伝子には、ｃ−ｆｏｓ、ＢＤＮＦ、Ａｒｃ、Ｃｐｇ１５、Ｈｏｍｅｒ１ａ、クラス１ＭＨＣ分子をコードする遺伝子が含まれる。さらに、細胞脱分極に依存するシグナル伝達経路はまた、この方法で活性化することができる。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、イオンチャネルの活性化により、目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸をコードする組み換え遺伝子の発現または発現の増加が誘導される。この実施形態では、組み換え細胞は、例えば、治療効果を与えるタンパク質などの、目的の生理学的に活性なタンパク質、ペプチドまたはヌクレオチドの内の少なくとも１種をコードするヌクレオチド、好ましくはＤＮＡを含む遺伝的コンストラクトをさらに含む。細胞は、イオンチャネルの活性化時に、目的のタンパク質の発現が細胞中で誘導されるような方法で遺伝子組み換えされる。あるいは、細胞は、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子などの目的の非コード核酸分子を発現するように遺伝子操作してもよい。本発明の一実施形態では、目的のタンパク質もしくはペプチドまたはアンチセンスまたはＲＮＡｉ分子などの目的の核酸分子を発現するように設計された組換え体発現ベクターが、特定の活性を抑制するのに最適の細胞中に導入される。
【００５８】
産生されるタンパク質、ペプチドまたは核酸が組み換え遺伝子によりコードされる本発明の実施形態では、該遺伝子は、目的のタンパク質または核酸をコードする核酸を含むことに加えて、イオンチャネルの活性化時に誘導される少なくとも１種の転写制御配列を含む発現ベクター中に存在し、目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸分子の発現がもたらされる。このような転写制御配列には、イオンチャネル活性化に応答して遺伝子発現を誘導するプロモーターおよび／またはエンハンサー配列が挙げられるが、これらに限定されない。このような調節配列としては、本明細書においては、ＳＲＥ、ＣＲＥおよびＮＦＡＴ  ＲＥと称するカルシウム応答エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
目的のタンパク質またはペプチドは、任意のタンパク質またはペプチドとすることができ、好ましくは、治療または予防活性を有するタンパク質またはペプチドである。このようなタンパク質は当技術分野において既知であり、これらには、アルツハイマー病のプラーク形成を阻止し得るタンパク質、治療薬や抗体として使用するために現在使用中または研究中であるタンパク質が含まれる。好適なタンパク質およびペプチドとしては、インスリン、プロインスリン、アルファ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミダーゼ、ヘパリン−アルファ−グルコサミジン６−スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルクロニダーゼおよびヒアルロニダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。対象にすべきその他のタンパク質には、ペプチドホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、メチル化ＣｐＧ結合タンパク質２、ＭｅＣＰ２および抗ＶＥＧＦ、抗ＥＧ、抗ＴＮＦおよび抗ＨＥＲ２などの治療抗体が含まれる。
【００６０】
別の実施形態では、本発明は、細胞の活性を調節する方法、例えば、１種または複数の細胞の活性を高めるまたは抑制する方法を提供する。該方法は、本発明の組み換え細胞を高周波照射または磁界に暴露し、それにより、細胞の活性を調節するステップを含む。この実施形態では、イオンチャネルは、チャネルによりゲート制御されるイオンが細胞活性を調節するように選択される。
【００６１】
例えば、細胞は、ニューロンなどの神経細胞とすることができ、イオンチャネルはクロライドチャネルとすることができる。イオンチャネルの活性化により、クロライドイオンの細胞中への流入が生じ、それにより、細胞が不活化される。別の実施形態では、クロライドチャネルは本明細書で開示のＴＲＰＶ１変異体などの変異チャネルであり、ラットＩ６７９Ｋ−ＴＲＰＶ１、ヒトＩ６８０Ｋ−ＴＲＰＶ１またはマウスＩ６８０Ｋ−ＴＲＰＶ１を含む。
【００６２】
本発明は、対象の標的細胞の活性を調節する方法をさらに提供する。該方法は、（１）対象に本発明の医薬組成物を投与するステップと、（２）対象を高周波照射または磁界に暴露し、それにより、標的細胞の活性を調節するステップとを含む。この実施形態では、イオンチャネルは、チャネルによりゲート制御されるイオンが細胞活性を調節するように選択される。
【００６３】
標的細胞の細胞活性を調節する方法の好ましい実施形態では、医薬組成物は、本発明のベクターを含み、標的細胞は内在性細胞であり、該方法は細胞活性の抑制をもたらす。この実施形態では、イオンチャネルは、チャネルによりゲート制御されるイオンが細胞活性を低減するように選択される。例えば、標的細胞はニューロンなどの神経細胞とすることができ、イオンチャネルはクロライドチャネルとすることができる。イオンチャネルの活性化により、クロライドイオンの細胞中への流入が生じ、それにより、細胞の活性が低減される。一実施形態では、クロライドチャネルはＴＲＰＶ１変異体などの変異チャネルである。
【００６４】
本発明の方法は、細胞活性の非侵襲的調節を可能とし、疾患および障害の処置に使用することができる。例えば、本発明の遺伝的コンストラクトの活性化または不活化による異なる部位のニューロンの標的化を使って、１種または複数の部位の神経活動を同時に調節することができ、特にパーキンソン病、神経性食欲不振症、振戦、てんかん、などを含む神経疾患の治療を可能にすることができる。この実施形態では、選択部位のニューロンを、標的細胞の解剖学部位にまたはその近傍に、本発明のベクターを投与することにより、標的化することができる。本発明の方法を使って、２箇所以上の部位のニューロンを不活化または活性化することができる。あるいは、１つまたは複数の選択部位のニューロンを不活化することができ、同時に、１つまたは複数の追加の部位のニューロンを活性化することができる。神経疾患で治療効果を得るために活性化および／または不活化することが可能な神経部位は、上述の侵襲的技術を利用する調査により知られている。
【００６５】
その他の細胞型も同様に、本発明の方法を使って活性化または不活化することができる。好ましい実施態様では、本発明の方法を使った細胞の活性化または不活化により、対象に対して、治療的、対症療法的または予防的効果が得られる。例えば、ある実施形態では、標的細胞は筋細胞であり、イオンチャネルはカルシウムチャネルである。この実施形態では、筋細胞は、イオンチャネルの活性により活性化される。別の実施形態では、標的細胞は免疫細胞であり、イオンチャネルはカルシウムチャネルである。この実施形態では、得られた組換え型免疫細胞を、癌または別の状態の処置を必要としている対象に投与することができる。対象を高周波照射または磁界に暴露することにより、移植免疫細胞の活性化がもたらされる。
【００６６】
別の実施形態では、標的細胞は肺上皮細胞であり、イオンチャネルは、ＴＲＰＶ１変異体などのクロライドチャネルである。この実施形態では、対象は、嚢胞性繊維症の処置を必要としている。組換え型肺上皮細胞の活性化により、組み換え細胞中でクロライドイオン流の増加が生じ、それにより、嚢胞性繊維症の１つまたは複数の症状を回復させる。
【００６７】
上記で考察したように、特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明の遺伝的コンストラクトおよび場合により、目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸をコードする組み換え遺伝子を含む細胞のエクスビボ遺伝子導入を含む。細胞は、任意に細胞型または異なる細胞型の組み合わせとすることができる。一実施形態では、細胞は自己細胞である。別の実施形態では、細胞は異種細胞である。細胞は、幹細胞であるのが好ましい。
【００６８】
細胞は、当該技術分野において周知の技術を使って、遺伝子組み換えを行うことができる。このような技術としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換えが挙げられる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、に記載の技術を参照されたい）。遺伝子の宿主細胞中への送達のための当該技術分野で利用可能ないずれかの方法を本発明に従って使用して、遺伝子を細胞集団に送達することができる。そのような方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介遺伝子導入、またはウイルス感染が挙げられる。特定の実施形態では、常磁性粒子の励起時に誘導することができる目的のタンパク質または核酸をコードする核酸および転写制御配列を含むウイルスベクターを使用することができる。このようなウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。（アデノウイルス系遺伝子送達の概説については、Ｋｏｚａｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３、を参照されたい）。
【００６９】
遺伝子送達方法の一般的概説については、Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．，１９９７，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｂｙ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ＆  Ｃｏ．，Ｂｅｒｌｉｎ；Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３３：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；１９９３，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５を参照されたい。
【００７０】
別の実施形態では、本発明の治療方法は、対象に本発明のベクターを投与することを含む。この実施形態では、本発明のベクターは、エクスビボまたはインビボでの細胞の遺伝子導入に好適な形態の、本発明の遺伝的コンストラクトおよび場合により、目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸をコードする組み換え遺伝子を含む。好適なベクターには、環状プラスミドおよび直線状プラスミドなどのプラスミド、およびアデノウイルス、好ましくは複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクター、リポソーム、ならびに当技術分野において既知のその他のベクターが含まれる。好ましくは、ベクターはウイルスベクターである。より好ましくは、ベクターはアデノ随伴ウイルスである。一実施形態では、ベクターは、標的細胞の部位に局所投与される、例えば、ウイルスベクターは、標的細胞の解剖学的部位に、またはその近傍に注入により投与することができる。
【００７１】
神経疾患を治療するための本発明の好ましい実施態様では、ウイルスベクターなどの本発明のベクターは、対象の活性化または不活化される細胞の部位に投与される。侵襲的デバイスを使った神経回路の所定のノードの不活化または活性化による特定の神経疾患の処置は、当該技術分野において公知である。これらの調査に由来する知識により、ニューロンの活性化または不活性化のための中枢または末梢神経系部位の選択をガイドすることができる。
【００７２】
異なる臓器に非侵襲的にアクセスするためには、系の一部として組織を通過でき、一部の細胞を活性化させ、同時に大部分を活性化させない電磁界を備える必要がある。したがって、この目的のために、高周波（ＲＦ）電磁界が使用される。低および中周波数のＲＦシグナルは、組織に自由に、大きなエネルギー吸収なしに侵入し、今では、このシステムをインビボでの使用に適応させることを可能にしている（Ｊｏｋｅｌａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８）。組織と対照的に、交番ＲＦ電磁界中に置いた金属ナノ粒子／金属酸化物ナノ粒子は、電磁界の強度に応じて制御された方式でエネルギーおよび熱を吸収する（誘導加熱として知られたプロセス）（Ｆｏｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：２６２８−２６３５）。加熱容量は、ナノ粒子組成、サイズ、形状、ならびにＲＦ電磁界の周波数および出力に依存し、従って、生理学的温度範囲内で生成された熱を調節することが可能である。
【００７３】
インビトロでは、達成される温度応答は、高速で、また、急速に消滅し（距離の２乗の逆数）、その結果、迅速な機能的「オン−オフ」スイッチが可能となる。用いたナノ粒子、例えば、磁性酸化鉄および金球体、は容易に調製され、固有の細胞毒性はほとんどまたは全くなく、ストレプトアビジン、抗体、または薬理学的薬剤を組み込むことにより標的細胞に容易に適合させることができる（Ｓａｍａｎｔａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｃｈｅｍ  １８：１２０４−１２０８；Ｗａｎｇ  ＡＺ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８：１０６３−１０７０）。したがって、それらは、インビトロおよびインビボで細胞応答に変換可能な局在型温度変化を誘導するのに適している。
【００７４】
細胞または対象に印加される磁界は、静的または振動磁界である。一実施形態では、磁界は静的である。特定の実施形態では、磁界は、電磁放射線の成分ではない。細胞または対象は、磁石の近傍に存在することにより磁界にさらされるのが好ましい。磁界は一定の期間にわたり連続的にまたは間隔を置いて印加することができる。例えば、間隔スケジュール、例えば、５秒間オンで２分間オフを繰り返すスケジュールを使用することができ、これにより、チャネル活性化を可能とするが、その後、刺激を除去して、チャネルの機械的な脱感作を防ぐ。このような間隔は、１Ｈｚの範囲からとすることができる。最適磁気処理スケジュールは、使用した特定のチャネルおよび局所的な細胞環境に依存し、当業者により決定することができる。一実施形態では、磁石は高磁束永久磁石、例えば、表面磁束５ｋＧのＮＩＢマグネットである。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、組み換え細胞は幹細胞である。所望のタンパク質、または目的の核酸を発現するように遺伝子組み換えされた細胞もまた、本発明の範囲内にある。例えば、特定の実施形態では、本発明の組み換え細胞は、治療効果を与えることができる１種または複数のタンパク質を発現するように遺伝子操作される。
【００７６】
一実施形態では、対象に投与される組み換え細胞は自己細胞である。
【００７７】
好ましくは、組み換え細胞は、（１）対象から細胞を取り出すステップと、（２）細胞に本発明の遺伝的コンストラクト、および場合により、調節配列に機能的に連結された目的のタンパク質、ペプチドまたは核酸をコードし、イオンチャネルの活性化により誘導される遺伝子を遺伝子導入するステップとを含む方法により産生される。
【００７８】
種々の送達システムが知られており、組み換え細胞を対象に送達するために使用することができる。このような組成物は、必要に応じて賦形剤および助剤を含む、１種または複数の生理学的に許容可能なキャリアを使って、任意の従来方式で処方することができる。適切な処方は、選ばれた投与経路に依存する。
【００７９】
本発明の方法は、種々の障害または疾患の処置のための、薬学的に許容可能なキャリア中の本発明の組み換え細胞および／またはベクターの対象への投与を含む。「投与すること」は、当業者に既知のいずれかの方法および送達システムを使って達成または実施されるように送達することを意味する。投与は、例えば、心臓の周囲に、心臓内に、心外膜下に、経心内膜的に、移植物を介して、カテーテルを介して、冠状動脈内に、静脈内に、筋肉内に、皮下に、非経口的に、局所に、経口的に、経粘膜的に、経皮的に、皮内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、リンパ内に、病巣内に、硬膜外に、またはインビボエレクトロポレーションにより、実施することができる。投与はまた、例えば、１回、複数回、および／または１回または複数回の長期間にわたり、実施することができる。
【００８０】
「薬学的に許容可能な」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局により承認されているまたは米国薬局方にリストされている、またはその他の一般に認められている、動物およびさらに限定すればヒトに使用される薬局方にリストされていることを意味する。「キャリア」という用語は、治療薬が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビークルを意味する。このような医薬キャリアは、石油、動物、植物、または人工起源のもの、例えば、ピーナッツオイル、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む無菌の液体、例えば、水および油などとすることができる。医薬組成物が静脈内に投与される場合には水が好ましいキャリアである。食塩水と水性デキストロース、グリセリン溶液はまた、液体キャリア、特に注入可能溶液として用いることができる。組成物は、従来のバインダーおよびトリグリセリドなどのキャリアとともに坐剤として処方することができる。経口製剤には、標準的なキャリア、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム、などを含めることができる。適切な医薬キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。このような組成物は、治療有効量の治療化合物を、好ましくは精製された形態で、適量のキャリアと共に含み、患者に適切に投与される形態を提供することになる。製剤は、投与方法に適合する必要がある。
【００８１】
特定の障害または疾患の処置に効果的な本発明の組成物の適切な濃度は、障害または疾患の性質に依存すると思われるが、標準的臨床技術を使って、当業者により決定することができる。さらに、所望により、インビトロアッセイを用いて最適な投与量範囲の特定を支援することができる。製剤に使用される正確な用量は投与経路、および疾患または障害の重篤度にも依存し、開業医の判断およびそれぞれの患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から外挿してもよい。さらに、インビトロおよびインビボ試験で、組み合わせの投与が相乗的または付加的治療効果を示す場合には、化合物の投与の際に、その他の既知の効果的薬剤と組み合わせることも可能であろう。
【００８２】
さらに、処置を受けている患者の経過を、生理学的に活性な、組み換え細胞により発現されたタンパク質を検出するように設計されているアッセイを使って測定してよい。
【００８３】
本発明は、所望の方式による高周波照射または磁界により、常磁性ナノ粒子の励起に応答する細胞を産生するように遺伝子操作され得る遺伝子導入非ヒト動物にさらに関する。例えば、遺伝子導入動物は、本発明のフェリチンおよびイオンチャネル融合タンパク質を発現するように遺伝子操作され得る。前記標的細胞は、常磁性ナノ粒子励起時に、天然で、または遺伝子操作により、目的のタンパク質または核酸分子を発現し得る。このような遺伝子導入動物は、正常な生理学的プロセスならびに疾患プロセスを調査するためのインビボモデル系を提供する。本発明の遺伝子導入動物は、目的の新規治療化合物の特定と試験に使用するためのインビボモデル系としても有用であり得る。
【００８４】
本発明は、複雑な生物における異なる細胞型の役割を調査するための方法および組成物を提供する。細胞機能の確定試験は、生きている動物の単一細胞型の活性を選択的にオンまたはオフし、生理学的機能に対するその効果を調査することである。本発明は、電波または磁界を使った遠隔操作により所定の細胞集団を活性化するためのナノ粒子の使用を提供する。特定の実施形態では、これらの細胞は、ＴＲＰＶ１、すなわち、単一成分の、温度上昇または分子運動に応答して立体構造変化を受けて段階的カルシウム流入を可能とする温度感受性イオンチャネルも発現するように遺伝子操作されている。これらの細胞を高周波照射または磁界に暴露することにより、ＴＲＰＶ１チャネルが活性化され、Ｃａ２＋電流および細胞の活性化が生じる。この方法の効力をインビトロおよびインビボで確証するデータは以下に示されている。この技術を使って、ホルモン放出および神経活動などの機能を調節することができる。
【００８５】
本発明は本明細書で記載の特定の実施形態により範囲が限定されるべきではない。これらの実施形態は、本発明の個々の態様の単なる実例として示すことが意図されており、機能上等価な方法および要素は、本発明の範囲内にある。実際に、本明細書で示され、記載されたものに加えて、本発明に関する種々の変更が、前出の説明ならびに添付図面から当業者には明らかであろう。このような変更は、請求項の範囲内に入ることが意図されている。本明細書に引用されている様々な刊行物は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８６】
実施例
実施例１  遺伝的にコードされたナノ粒子を使ったマウスのグルコース恒常性の遠隔調節
方法
高周波電磁界
信号発生器により４６５Ｈｚ正弦波信号を供給し、増幅器（信号発生器、増幅器の両方とも、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ製）を介して、半径２．５ｃｍの２ターンソレノイドに印加し、５ｍＴ以上の磁界強度を生成した。試料をソレノイド内に配置した。
【００８７】
静磁力の印加
２４Ｇ銅線を１／４”パーマロイ−８０ロッドの周りに１２００回巻き付け、先端を直径１００ｕｍの半球に旋盤加工することにより、ソレノイド磁気マイクロニードルを作製した。コイルを通る電流は、Ｂｅｃｋｍａｎ３Ａ／３０Ｖ調節可能電源により制御した。ニードル先端を引き寄せられる細胞から約３０ｕｍの位置に配置し、磁力は１．８Ａの電流により生成した。
【００８８】
力の較正：
イオンチャネルを機械的に開かせる力は、約０．２〜０．４ｐＮ３１であると推定された。したがって、我々は、Ｋｉｍらにより記載の方法を使って、磁気処理に由来する細胞に与える力を測定した。簡単に説明すると、鉄をロードされ、フェリチンを発現している細胞をパラホルムアルデヒドで固定後、緩衝水溶液に加え、静磁界に供した。細胞は磁石に向けて加速され、その速度は磁力の大きさに比例する。これは、球体の周りのクリープ波としてモデル化され、粒子に加わる流体の抗力は、細胞に加わる磁力に等しい３２。Ｕを細胞速度、μを緩衝液の動粘度、Ｄ細胞を細胞の直径として、この直線関係は、次のようになる。
Ｆ抗力＝Ｆ磁力＝３πＵμＤ細胞
【００８９】
ＨＥＫ細胞にトランスフェリンを３日間ロードした後、遺伝子導入し、２４時間後収集した。固定後、細胞を緩衝液に加え、磁界に暴露した。細胞の動きを５秒間、２回繰り返して記録した。これら２つの画像スタックから、３個の細胞の位置を１０フレームにわたり追跡し、合計約６０の細胞速度を記録した。フェリチンを発現している全細胞で、磁力は１０ｐＮ超であった。鉄をロードされているがフェリチンを発現していない細胞は、１ｐＮ未満の磁力を示し、これはおそらく、液体中の固定細胞のランダムブラウン運動に起因するのであろう。１０ｐＮは、イオンチャネルを開くのに必要な力より大きいので、この実験は、磁気処理が、チャネル開口を観察するのに十分な力を印加していることを示す。
【００９０】
プラスミド
Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｌｉｅｄｋｔｅ（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮＣ）から送呈されたＴＲＰＶ１（ｐｃＤＮＡ３．１中の）を、ｐＥＧＦＰＮ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）に挿入した。ＧＦＰ結合ナノボディ配列をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）で合成して、ＴＲＰＶ１のＮ末端に融合し、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１を生成した。ミリストイル化シグナルをフェリチン軽鎖のＮ末端に挿入することにより、ＥＦ１ａｌｐｈａ−フェリチンキメラ含有ｐＣＲ２．１を改変してミリストイル化フェリチンを生成、またはＰｅｇｆｐ−ｎ１由来のＧＦＰ配列をフェリチン軽鎖のＮ末端に付加することによりＧＦＰ−フェリチンを生成した。ｐｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞を使ったレトロウイルス産生のために、ＴＲＰＶ１の後に２Ａ配列およびフェリチンもしくはミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１の後に２Ａ配列およびＧＦＰ−フェリチンをＭＳＣＶ−ｈｙｇｒｏプラスミドに挿入し、カルシウム応答性フューリンインスリンをＭＳＣＶ−ｐｕｒｏプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。複製欠損アデノウイルスの生成のために、これらの配列をまた、ｐＶＱ  Ａｄ  ＣＭＶ  ＫＮｐＡに挿入した。ＰＣＲ産物の正確さおよびクローニングは、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
【００９１】
細胞培養およびインビトロ調査
ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を１０％のウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用い、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。Ｐｈｏｅｎｉｘエコトロピックパッケージング細胞（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を１０％のウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）を用い、５％ＣＯ２下、３７℃で増殖させた。マウス間葉系幹細胞（Ｇｉｂｃｏ）を１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用い、５％ＣＯ２下、３７℃で増殖させた。Ｐｈｏｅｎｉｘシステムを使って、ＭＳＣのレトロウイルス感染により安定な細胞株を産生した。簡単に説明すると、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｅｃｏ細胞（６ｃｍディッシュ当たり２ｘ１０６細胞）に、ＭＳＣＶ−ｐｕｒｏまたはｈｙｇｒｏプラスミドを遺伝子導入した。２４時間後、培地を置換し、細胞を３２℃に置いた。さらに２４時間後、培地を吸引し、遠心分離して細胞残屑を除去した。ポリブレン（４μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）含有ＲＰＭＩ培地／１０％ＦＢＳ中の１：２希釈を使って、ｐｈｏｅｎｉｘ細胞上清をＭＳＣに加えた（６ｃｍディッシュ当たり１ｘ１０６細胞で播種）。細胞を３２℃でさらに２４時間インキュベートした後、培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地／１０％ＦＢＳで置換した。感染の４８時間後に選択培地を加えた。安定に遺伝子導入されたＭＳＣを、ＰＢＳ中でプレインキュベーションした５ｘ５ｘ５ｍｍゼラチンスポンジ足場（Ｇｅｌｆｏａｍ）上に、６０μｌの培地に再懸濁した２ｘ１０６細胞を足場に直接添加することにより播種した。
【００９２】
細胞を３７℃で４時間維持した後、４５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地／１０％ＦＢＳを添加した。次に、細胞足場コンストラクトを３７℃で５日間維持した後、移植した。免疫細胞化学およびＲＦによる調査では、細胞をコラーゲン（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）およびポリ−Ｄ−リシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で被覆した１２ｍｍのカバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上で培養した。播種の２４時間後、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使って、細胞に遺伝子導入した。
【００９３】
遺伝子導入の１８時間後、培地を置換し、ホロトランスフェリン（２ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を細胞に加えた。遺伝子導入または継代培養後、７２〜９６時間にわたり細胞を調査した。
【００９４】
カルシウム依存性ヒトインスリンのＲＦ依存性放出：調査の２４時間前に、細胞を３２℃で１％ＦＢＳ培地中に置いて、ＴＲＰＶ１およびカルシウム依存性経路の最小限の活性化を確実にした。調査の日に、細胞を５００μｌのＰＢＳ中で３０分間プレインキュベーションした。細胞を、３００μｌのカルシウムイメージングバッファー中、室温で（対照）またはＲＦ電磁界中、室温でインキュベートした。６０分後、上清を取り出し、遠心分離して細胞残屑を除去し、アッセイまで−８０℃で凍結した。遺伝子発現分析のために、上清およびカバーガラス由来の細胞を溶解し、ＲＮＡ精製まで、ライセートを８０℃で保存した。
【００９５】
カルシウム依存性ヒトインスリンの磁石依存性放出：細胞を上述のように調製した。細胞を、３００μｌのカルシウムイメージングバッファー中、室温で（対照）または２分毎に５秒間の静磁界での処理を１時間にわたり室温で行った。一定の磁界を生成するために、ネオジウム鉄ボロン永久磁石を使用した（Ｋ＆Ｊ  ｍａｇｎｅｔｉｃｓ  Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）。これにより、細胞表面近傍で約５キロガウスの強力な磁束密度を生成することができた。６０分後、上清を取り出し、遠心分離して細胞残屑を除去し、アッセイまで−８０℃で凍結した。遺伝子発現分析のために、上清およびカバーガラス由来の細胞を溶解し、ＲＮＡ精製まで、ライセートを８０℃で保存した。
【００９６】
カルシウムイメージング
遺伝子導入細胞をＰＢＳで３回洗浄し、その後、スルフィンピラゾン５００μＭ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、Ｆｌｕｏ−４  ３μＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で６０分間ロードした。細胞をＰＢＳで再度洗浄後、スルフィンピラゾンを含むＰＢＳ中で、３０分間インキュベートした。細胞を洗浄後、カルシウムイメージングバッファー中で画像形成した。イメージングは、特注のセラミックレンズを備えたＤｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ＤＶイメージングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｗａｑ，ＷＡ）を使って行った。ＲＦ処理の前および処理中、磁石処理の前もしくは処理中にまたは２００μＭの２−アミノエトキシジフェニルボレート（２−ＡＰＢ）による処理の前および処理の後で、細胞の画像形成を行った。
【００９７】
免疫細胞化学および免疫組織化学
免疫細胞化学（ＩＣＣ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）を使って、ＴＲＰＶ１、ＧＦＰおよびＨＡタグフェリチンの発現を検出し、細胞および組織中のアポトーシス細胞を定量した。細胞をＰＢＳで洗浄後、２％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）で１５分間固定した。組織を１０％のホルマリン（Ｓｉｇｍａ）中、４℃で一晩固定し、ＰＢＳ中３０％のスクロース中に、４℃で、さらに２４時間置いた。組織をＯＣＴコンパウンドに包埋し、凍結後、２０μｍの凍結切片を切りだし、スライドガラス上に直接配置する。スライドを５５℃で１時間置いた後、染色する前に、−８０℃で保存する。細胞または組織切片を洗浄し、上記のように固定後、ブロッキング緩衝液（０．１％のトリトンＸ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）および２％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ））中で１時間インキュベートした。その後、細胞をブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（ウサギ抗ＴＲＰＶ１  １：５００、マウス抗Ｈａ  １：１０００（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ニワトリ抗ＧＦＰ  １：１０００（Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗活性化カスパーゼ３  １：２５０（Ｐｒｏｍｅｇａ））中、４℃で一晩インキュベートした。細胞または組織をＰＢＳ中で３回洗浄後、ブロッキング緩衝液中で２時間希釈した二次抗体（ヤギ抗ウサギ５９４またはヤギ抗ウサギ４８８、ヤギ抗ニワトリ４８８、ヤギ抗マウス３６０、全て１：１０００）中でインキュベートした。細胞または組織をＰＢＳ中でさらに３回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使ってマウントした。
【００９８】
Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎｅ顕微鏡を使って画像を取得し、別個の帯域フィルターを使い、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｚｅｉｓｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅのマルチチャネルモジュールを用いてデジタルキャプチャーした。共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０レーザー走査型共焦点顕微鏡；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を使って、追加の画像を取得した。活性カスパーゼ３免疫染色の定量化を、処理群に対し評価者盲検方式で実施した。
【００９９】
動物およびインビボ調査
雄無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウス（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、６〜８週齡）の非近交種、または雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスを使用し、制御された照明条件下（１２時間の明／１２時間の暗）、および温度（２２℃）で、単一ケージに収容し、標準的マウス固形飼料を自由に摂取させた。動物飼育および実験手順は、既定ガイドラインに基づいて、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの実験動物委員会の承認を得て実施した（プロトコル１１４２１）。
【０１００】
調査１：ヌードマウスを低用量のストレプトゾトシンで５日間処理した。２日後、上述のように調製したゼラチン足場上に播種したＭＳＣを麻酔したヌードマウスの両側腹部に移植した。高周波調査を４週後に実施した。マウスは、２回分の腹腔内の鉄デキストラン（１００ｍｇ／ｍｌの５０μｌ）を調査の５および３日前に受けた。全調査前に、マウスを一晩絶食させた。調査の日に、ＭＳＣ移植物（カルシウム依存性インスリン単独（対照）、カルシウム依存性インスリンと共にＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはカルシウム依存性インスリンと共にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン、ｎ＝６〜８／群）を有するマウスを吸入イソフルランを使って麻酔した。３０分後、マウスを、高周波発振器に接続されたソレノイド中に配置することにより、ＲＦ電磁界で６０分間処理した。ＲＦ電磁界処理の−３０分および０分前およびＲＦ処理開始後１５、３０、４５、６０、７５、９０および１２０分に尾静脈試料を採取した。血漿中インスリン測定のために、ＥＤＴＡ被覆毛細管を使って、−３０および６０分に後眼窩血液を採取した。１２０分後、各群の半分のマウスを屠殺し、移植物を取り出した。各腫瘍を２つに分け、半分をＲＮＡ抽出用に液体窒素中で急速凍結させ、半分を免疫組織化学のために１０％のホルマリン中に入れた。ＲＦ処理なしであるが同一の麻酔を行った２４時間後に残りのマウスから組織を採取した。
【０１０１】
調査２：Ｃ５７Ｂｌ６マウスを低用量のストレプトゾトシンで５日間処理した。２日後、ＬａｃＺ、カルシウム依存性インスリンと共にＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはカルシウム依存性インスリンと共にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現している複製欠損アデノウイルスを麻酔したＣ５７Ｂｌ６マウスの頸静脈に注入した（ｎ＝６〜８匹／群）。鉄補充は上記のように行われた。４週間後、調査１と同じプロトコルを使って、マウスを調査した。
【０１０２】
調査３：ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン群のないこと以外は上記のようにして、Ｃ５７Ｂｌ６マウスを準備した。マウスは、２回分の腹腔内の鉄デキストラン（１００ｍｇ／ｍｌの５０μｌ）を、最初の調査の５および３日前、以降、それぞれのその後の調査の３日前に受けた。第１のＲＦ調査をウイルス注入の２週後、およびそれ以降毎週、６週まで実施した。調査プロトコルは、それぞれの場合で、調査１に対し記載の通りとした。
【０１０３】
調査４：ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン群のないこと以外は調査２と同様にしてＣ５７Ｂｌ６マウスを準備した。鉄補充を上記と同様に行い、４週間後、磁石刺激を使って、上記のように２分毎に５秒間の静磁界の印加を１時間にわたり行うこと以外は調査１と同じプロトコルにより、マウスを調査した。
【０１０４】
アッセイ
製造業者のプロトコルに従って、細胞上清中のプロインスリンをＥＬＩＳＡ（Ａｌｐｃｏ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）により測定した。Ｂｒｅｅｚｅ２血糖計（Ｂａｙｅｒ；Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って、血糖を測定した。血液を１０分間遠心分離し、血漿を収集した。ヒト特異的ＥＬＩＳＡ（Ａｌｐｃｏ）により、マウス血漿中のヒトインスリンの血漿中濃度を測定した。
【０１０５】
リアルタイムＰＣＲ
組織をトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、または細胞を緩衝液ＲＬＴ中でホモジナイジングし、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡプレップキットを使ってＲＮＡを精製することにより全ＲＮＡを単離した。Ｑｉａｇｅｎ  ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキットを使って、相補ＤＮＡを合成した。製造業者のプロトコルに従い、ＴａｑＭａｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使って、リアルタイムＰＣＲを行った。
【０１０６】
統計
全データに対し、スチューデントｔ検定を使って、統計的有意性を分析した。Ｐ値は、示した通りである。
【０１０７】
遺伝子発現のインビトロ最適化および遺伝的にコードされたナノ粒子を使ったタンパク質放出
我々は、最初に、フェリチンナノ粒子のＴＲＰＶ１チャネルへの近接度に関して異なる３つの別々のコンストラクトを試験することにより、ＲＦを使って遺伝子発現を調節するための遺伝的にコードされた発現系を最適化することに着手した。第１のコンストラクトでは、野生型温度感受性一過性受容器電位バニロイド１（ＴＲＰＶ１）陽イオンチャネルを、細胞質中で発現する、フェリチン軽鎖、可動性リンカー領域およびフェリチン重鎖１２からなるフェリチンキメラタンパク質（ＴＲＰＶ１／フェリチン）と共発現させた（図１Ａ左パネル）。第２のコンストラクトでは、野生型ＴＲＰＶ１チャネルを、細胞膜の方向にフェリチンを向けるミリストイル化シグナルとのキメラフェリチン融合タンパク質と共発現させた（ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン）（図１Ａ、中央パネル）。第３のコンストラクトでは、単一ドメイン抗ＧＦＰラクダ抗体１３へのＮ末端融合により改変されたＴＲＰＶ１チャネルを、ＧＦＰへのＮ末端融合を有するキメラフェリチンタンパク質と共発現させた。これにより、ＧＦＰタグフェリチンキメラの修飾ＴＲＰＶ１への係留が生じ、それにより、その成分が細胞膜に並置される（αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン）（図１Ａ、右パネル）。遺伝子導入されたＨＥＫ細胞のＴＲＰＶ１、ＧＦＰおよびＨＡタグ（フェリチンキメラの可動性リンカー領域の）に対する免疫組織化学により、発現成分の予測された位置が確認された（図１Ｂ）。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１を遺伝子導入したＨＥＫ細胞は、２ＡＰＢによる細胞内カルシウムの有意な増加を示した（Ｆｌｕｏ−４蛍光の２．０倍の変化に対する０．８５倍の変化（図１Ｃ））ので、ＴＲＰＶ１のＮ末端修飾は、ＴＲＰアゴニスト２ＡＰＢに対して応答する能力を妨害することはなかった。さらに、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＨＥＫ細胞のＲＦ（４６５ｋＨｚ）による処理は、非遺伝子導入対照に比較して、細胞内カルシウムの有意な増加を生じた（Ｆｌｕｏ−４蛍光の２．９倍の変化に対する０．８倍の変化、図１Ｄ）。
【０１０８】
次に、我々は、カルシウム応答性レポーター遺伝子を使って、インビトロでのＲＦシグナルの遺伝子発現への変換時の３つのコンストラクトの効率を試験した。前に報告９のように、プロモーターは、３つの血清応答エレメント（ＳＲＥ）の５’調節領域、３つの環状アデノシンモノリン酸応答エレメント（ＣＲＥ）および最小限のプロモーターの上流に配置された３つの活性化Ｔ細胞応答エレメントの核内転写因子からなり、フューリン修飾インスリンのＣａ２＋依存性発現を進行させる。それぞれの３つのコンストラクトのインスリン遺伝子発現を、遺伝子導入ＨＥＫ細胞のＲＦ処理後に１時間にわたりアッセイした。ＴＲＰＶ１／フェリチン、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンは全て、ＲＦ処理によりカルシウム依存性インスリン遺伝子発現を有意に高めた（ＴＲＰＶ１／フェリチン：ＲＦ処理１．５８±０．１９相対的インスリン遺伝子発現ｖｓ．未処理１．０±０．１９；ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン：ＲＦ処理２．３７±０．８３相対的インスリン遺伝子発現ｖｓ．未処理１．０±０．２；およびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン：ＲＦ処理２．４０±０．９６相対的インスリン遺伝子発現ｖｓ．未処理１．０±０．４７、全てｐ＜０．０５）（図１Ｅ）。ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンおよびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンは、細胞質中でのフェリチンの発現を指示するＴＲＰＶ１／フェリチンコンストラクトより大きな遺伝子発現の誘導を示した。同様に、ＲＦ処理は、未処理に比べて、遺伝子導入ＨＥＫ細胞からのプロインスリン放出を有意に増加させた（ＴＲＰＶ１／フェリチン：ＲＦ処理４５７±１０２％基準ｖｓ．未処理１００±１４．９％基準；ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン：ＲＦ処理４２３±５５．９％基準ｖｓ．未処理１００±１３．７％基準；およびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン：ＲＦ処理７４３±２５４％基準ｖｓ．未処理１００±６．２％基準、全てｐ＜０．０５）（図１Ｆ）。この場合、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンコンストラクトを使ったフェリチンのＴＲＰＶ１への係留により、その他の２つのコンストラクトに比べて、より大きなプロインスリン放出を誘導した。これらのデータは、フェリチンのＴＲＰＶ１への直接係留により、ＲＦシグナルを、フェリチンの細胞質中での発現または細胞膜での発現より効率的に変換することができることを示唆する。
【０１０９】
これらのインビトロデータに基づき、遺伝的にコードされたナノ粒子を使って、ＲＦによりインビボ遺伝子発現が調節されたので、我々は、遺伝子操作した幹細胞を移植することにより、または組換え型アデノウイルスを使ってコンストラクトをウイルス送達することにより、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンおよびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンコンストラクトのインビボ効率を試験することにした。マウス間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性インスリン導入遺伝子を安定に遺伝子導入された。安定に遺伝子導入された、いずれかのコンストラクトを発現しているＭＳＣ細胞のＲＦ処理は、インビトロでのインスリン遺伝子発現およびプロインスリン放出を有意に高めた（図１ＡおよびＢ）。安定に遺伝子導入されたＭＳＣをゼラチン足場１４上で増殖させ、その後、ストレプトゾシン（ＳＴＺ）処理ヌードマウス中に移植した（図２Ａ）。ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンおよびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現ＭＳＣは、ゼラチン足場上で容易に可視化された（図２Ｂ）。ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現ＭＳＣを移植された絶食マウスのＲＦ処理により、ＴＲＰＶ１／フェリチンコンストラクト発現移植細胞のインスリン遺伝子発現を有意に高めたが、対照細胞ではそうはならなかった（図２Ｃ）（ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン：１．８±０．３相対的インスリン遺伝子発現ｖｓ．１．０±０．１基準、ｐ＜０．０５、またはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン：１．４±０．１相対的インスリン遺伝子発現ｖｓ．１．０±０．１基準、ｐ＜０．０５）。血漿中インスリンは、ＲＦ処理後、いずれかのＴＲＰＶ１／フェリチンコンストラクトを移植したマウスで有意に増加した（図２Ｄ）（ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン：ＲＦ後２００±３３％基準ｖｓ．ＲＦ前１００±２１％基準、ｐ＜０．０５、またはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン：ＲＦ後１５３±１９％基準ｖｓ．ＲＦ前１００±１０％基準、ｐ＜０．０５）。これらのマウスではＲＦ処理により血糖値（図２Ｅ）は有意に低下し、血糖の累積変化（曲線下面積、ＡＵＣ（０〜１２０分））に関しては、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンを移植されたマウスでは低減され（ｐ＝０．０８）、またαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンコンストラクトを発現している幹細胞を移植されたマウスでは有意に低減された（ｐ＜０．０５）（図２Ｆ）。これらのデータは、改変ＴＲＰＶ１および内在性酸化鉄ナノ粒子コンストラクトを発現するように遺伝子操作された幹細胞のＲＦ処理により、インビボ遺伝子発現およびタンパク質放出を調節でき、タンパク質放出をインビボで調節するために、このシステムを遺伝子操作された幹細胞と一緒に使用可能であることを示唆する。このデータはまた、フェリチン粒子を温度感受性チャネルに直接係留することにより、システムの感受性を改善し得ることを示唆する。
【０１１０】
次に、我々は、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、停止カセットおよびカルシウム依存性インスリン導入遺伝子の制御下で、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現している複製欠損アデノウイルスを生成した（図２ＡおよびＢ）。これらのアデノウイルスをＳＴＺ処理Ｃ５７Ｂｌ６マウスの静脈内に注入し、コンストラクトを肝臓で発現させた（図３ＡおよびＢ）。両方のＴＲＰＶ１／フェリチンコンストラクトを発現している絶食マウスのＲＦ処理により、肝臓インスリン遺伝子発現が有意に増加した（図３Ｃ）。（ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチン：２．３±０．４相対的インスリン遺伝子発現ｖｓ．１．０±０．４基準、ｐ＜０．０５、およびαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン：４．１±０．８相対的インスリン遺伝子発現ｖｓ．１．０±０．１基準、ｐ＜０．０５）。血漿中インスリンはまた、ＲＦ処理によりこれらのマウス中で有意に上昇したが、対照マウスではそうはならなかった（図３Ｄ）。対照は、調査期間中、血漿中グルコースを上昇させる十分に確立された麻酔の効果１５の結果としての実質的増加を示したが、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているマウスのＲＦ処理は、血糖を有意に低減し（図３Ｅ）、調査期間中の血糖の累積変化を低下させた（図３Ｆ）（ＡＵＣ（０〜１２０分））。ＲＦ処理肝臓中のアポトーシス性タンパク質カスパーゼ３の発現は、変化しなかった（図２Ｃ）。したがって、ＴＲＰＶ１／フェリチンコンストラクトがウイルス性媒介発現のマウスのＲＦ処理はまた、インビボでの遺伝子発現およびタンパク質放出の調節に効果的である。ここで、再度αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンは、ＴＲＰＶ１／ミリストイル化フェリチンコンストラクトに比べて、ＲＦ処理に対しより大きい感受性を示した。
【０１１１】
反復ＲＦ処理を行ってタンパク質送達を調節することにより、ＴＲＰＶ１および遺伝的にコードされたナノ粒子の組み合わせが、一定の期間にわたり効果的であることを確実にするために、我々は、ＬａｃＺまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性インスリンを発現しているＳＴＺ処理Ｃ５７Ｂｌ６マウスの週１回のＲＦ処理に対する応答を評価した。ＬａｃＺまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性インスリンを発現しているアデノウイルスをマウスに注入し、ウイルス注入の２〜６週目にＲＦで週１回、１時間処理した。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現マウスのＲＦ処理は、全ての時点で、血糖および血糖の累積変化（ＡＵＣ（０〜１２０分））を有意に低減した（図４Ａおよび３）。さらに、ＲＦは、２週目および６週目（これらの時点のみで、動物が採血され、血漿中インスリンが測定可能であった）の両方で、血漿中インスリンの有意な増加を誘導した（４ＢおよびＣ）。
【０１１２】
静磁界を使った遺伝子発現の遠隔活性化。原理的には、フェリチンナノ粒子のＲＦへの暴露は、粒子加熱の結果として、もしくは機械的な刺激をチャネルに与えるブラウン運動を高めることにより１６ＴＲＰＶ１のゲート制御が可能である。後者の可能性は、ＴＲＰＶファミリーのいくつかのイオンチャネルが機械感受性１７に関わり、また、ナノ粒子からの熱伝達がチャネルのゲート制御に必要な熱伝達１０と類似の範囲にあるように見えることを示す計算により示唆される。したがって、我々は、超常磁性特性１８を有する係留されたフェリチン酸化鉄ナノ粒子は、隣接粒子が磁界と整列するのに伴い、外側磁界を機械的な力に変換することができるという可能性を検討した１９。したがって、我々は、外側磁界がＧＦＰ−フェリチンに係留されたαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１チャネルを活性化して、インビトロおよびインビボで遺伝子発現およびタンパク質合成を調節することが可能かどうかを試験した。
【０１１３】
標準的固定磁石（Ｋ＆Ｊ  ｍａｇｎｅｔｉｃｓ  Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を使って静磁界を印加し、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを遺伝子導入されたＨＥＫ細胞中の細胞内カルシウムの有意な増加をもたらした。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン遺伝子導入細胞のイメージング（ΔＦ／Ｆ（ＳＵＣ（０〜１８０秒）））の１８０秒間にわたる相対的蛍光の累積変化は、２５５±８．６であり、対照細胞では、１５９±０．６、ｐ＜０．０５であった（図５Ａ）。間欠的磁界による１時間処理（２分毎に５秒処理を１時間）はまた、磁石に暴露されなかった対照細胞のプロインスリン放出に比べて、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性インスリンを遺伝子導入されたＨＥＫ細胞で、有意により多くのプロインスリン放出を生じた（ｐ＜０．００１）（図５Ｂ）。
【０１１４】
次に、我々は、標準的クロスオーバー調査によりインビボ遺伝子発現に与える磁気活性化の効果を評価した（図５Ｃ）。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびカルシウム依存性インスリンを発現しているアデノウイルスを注入したＳＴＺ処理Ｃ５７Ｂｌ６マウスを、間欠的磁界で１時間処理した（または磁石処理なし）。血糖は、同じ時間処理した対照マウスに比べて、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンアデノウイルスを発現している磁石処理マウスで有意に低かった（ｐ＜０．０５）（図５Ｄ）。調査期間中の累積血糖（ＡＵＣ（０〜１２０分））は、対照マウスに比べて、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン発現マウスで磁石処理により有意に低下した（ｐ＜０．０５）（図５Ｅ）（ＡＵＣ（０〜１２０分））。これらのデータは、ＲＦまたは磁界を使って、フェリチン係留ＴＲＰＶ１チャネルのゲート制御を、インビトロおよびインビボで行うことができることを示す。
【０１１５】
結果および考察
ここで、我々は、電波または磁界を使って、インビボで遺伝子発現を調節する遺伝的にコードされた系の開発につて報告する。以前の調査で、我々は、外部から送達された機能化ナノ粒子がエピトープタグＴＲＰＶ１チャネルに結合し、遠隔操作によるＲＦシグナルをインビボでカルシウム流入および遺伝子発現に変換することを示した。しかし、この系を使って調節された遺伝子発現は、局所的細胞集団において達成できるのみであり、粒子の内部移行の結果として連続的応答を誘発するためには、反復ナノ粒子投与が必要である。遺伝的にコードされたフェリチン係留ＴＲＰＶ１系の使用は、それが、モノマー結合タンパク質を介して酸化鉄ナノ粒子封入ＧＦＰタグフェリチンに結合したＴＲＰＶ１を活性化するために、非侵襲的低周波数ＲＦ電磁界または間欠的磁界を使って遠隔操作によりインビボで確実に反復される遺伝子発現の時間的制御を可能とする限り優れている。我々は、インビボでのインスリン遺伝子発現および放出を制御することにより、この遺伝的にコードされた系が、効果的に、繰り返して血糖を調節することができることを示すことにより、この系を検証する。我々はまた、この方法を移植幹細胞に使って、潜在的に、遺伝子操作された幹細胞中の重要なタンパク質発現の調節を可能とすることを示す。
【０１１６】
フェリチンは、軽鎖および重鎖からなるヘテロマルチマーで、複雑な結晶質磁気構造１８を有する５〜１２ｎｍの酸化鉄コア２０を作り出す。酸化鉄コアはＲＦ処理に応答して発熱し２１、ＴＲＰＶ１を活性化する。我々は、３つのフェリチン位置によるＲＦ電磁界をチャネル活性化ならびに細胞質内での膜係留およびチャネル結合遺伝子発現に変換する効率を試験した。
【０１１７】
我々は、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１に結合したＧＦＰタグフェリチンがインスリン遺伝子発現をインビトロおよびインビボで最も確実に刺激することを見出した。粒子からの熱伝達の量は、１／ｒ２に従って距離と共に減少する。フェリチンが抗体−抗原相互作用を介して直接に係留される場合に、ＴＲＰＶ１活性化の効率が最大になるという観察は、粒子が離れた所（細胞質中または細胞膜のどこか）にある場合には、粒子への熱伝達の量が限られており、チャネルの開口が減少することを示唆している。あるいは、係留されたチャネルのより大きな効率は、チャネルゲートの開閉は機械的シグナル伝達の結果であることを示唆していると思われる。我々は、この可能性を、加熱なしに機械的な力を働かせると思われる磁界にフェリチン係留ＴＲＰＶ１を暴露することにより試験した。フェリチンナノ粒子は常磁性であり、そのため、それらのナノ粒子を外部磁界に整列させる。コアは、反強磁性スピン配列１８を有する超常磁性のオキシ水酸化第二鉄の単結晶に類似しており、最近の研究では、フェリチンを過剰発現している細胞は、印加外部磁界と相互作用できる２２ことが明らかになっている。このような研究は、磁界中に係留フェリチンが機械的な力を働かせることを示唆している。さらに、ＴＲＰＶ１は、４つの係留フェリチン粒子を有するテトラマーであり、磁界に対するそれ粒子の配向によりそれらを一緒に引っ張る、またはそれらを離す方向に押すように機械的な力を働かせることが可能である１９。したがって、我々のデータは、ＴＲＰＶ１が機械的な力に応答することを示唆している。これらのデータはまた、ＲＦにより生成されるような振動磁界が、チャネルを局所的加熱により活性化するのか、または機械的なトルクにより同様に活性化するのかという疑問が生ずる。ＲＦが、フェリチンで修飾されたＴＲＰＶ１チャネルのゲート制御をする機構を決定するには、さらなる調査が必要であろう。
【０１１８】
導入遺伝子発現制御のための遠隔システムは、多くの基礎的目的、バイオマニュファクチャリングおよび治療目的に対する大きな潜在能力を有する。特定の発育層における遺伝子産物の役割の調査は、非侵襲的に調節できる、時間的に制御された遺伝子発現が必要である。薬剤誘導遺伝子発現の場合には、エストロゲン２３およびテトラサイクリン２４は、胎仔中毒を生ずる場合がある。ＲＦと磁界の両方は、組織に自由に侵入し、胎児発生時における導入遺伝子発現の制御に有用となり得る。同様に、厳密に調節された遺伝子発現を必要とするバイオマニュファクチャリングプロセスは、化学的な遺伝子発現調節２５ではなく、遠隔操作による遺伝子発現調節から恩恵を受けるであろう。最後に、特定の障害に対する遺伝子治療は、厳格な調節２６、または生物学的応答に対する導入遺伝子発現の量を決める能力２７が必要である。この場合、遺伝子発現を調節する非侵襲的ツールが好ましいと思われ、我々は、この系が、幹細胞移植における導入遺伝子発現およびウイルス媒介導入遺伝子送達による組織における導入遺伝子発現の調節に効果的であることを示した。ＲＦと磁界の両方が、診療で使用されており、前者は、ペースメーカーの設定８に、後者は、うつ病の処置２８に使われている。最後に、Ｃａ２＋がＴＲＰＶ１の動作をゲート制御するので、データは、この系をニューロンおよびその他の細胞型の活性を調節するように適合させることができることをさらに示す。この考えに一致して、ＴＲＰＶ１活性化は、特異的化学リガンドに応答して神経活動を調節することが以前に示された２９。この遺伝的にコードされたフェリチン係留ＴＲＰＶ１の使用により、ＲＦまたは磁界を使って、非侵襲的に局在または分散細胞をインビボで活性化することができる。まとめると、我々は、インビボ遺伝子発現の非侵襲的調節のために完全に遺伝的にコードされた系を開発し、検証した。これらの調査は、ＴＲＰＶ１チャネル活性化は機械的刺激により達成可能で、導入遺伝子発現の非侵襲的制御のための、インビボで内在性に発現したナノ粒子の、電波および磁界の両方の伝達における有用性を示す。
【０１１９】
実施例２  視床下部ニューロンの双方向電磁制御により、血糖および摂食が調節される
方法
高周波電磁界および静磁界
信号発生器により４６５ｋＨｚ正弦波信号を供給し、増幅器（信号発生器、増幅器の両方とも、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ製）を介して、半径２．５ｃｍの２ターンソレノイドに印加し、電磁界を生成した。試験した電磁界強度は、３１ｍＴ、２７ｍＴおよび２３ｍＴであった。試料をソレノイド内に配置した。
【０１２０】
ネオジウム鉄ボロン永久磁石（０．２５ｘ１インチ、軸方向磁化、Ｋ＆Ｊ  ｍａｇｎｅｔｉｃｓ  Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を使って、イメージング実験用の静磁界を生成した。これにより、磁石表面で５キロガウスを超える磁束密度を生成することができた。２８０ｍＴおよび１３０ｍＴの磁界強度を、細胞から磁石表面までの距離（それぞれ、２ｍｍおよび５ｍｍ）を離すことにより生成した。Ｎ５２グレードのネオジウム磁石（０．０６ｘ０．２５インチ、軸方向磁化、Ｋ＆Ｊ  ｍａｇｎｅｔｉｃｓ  Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を電気生理学的調査に使用した。ＧＥ３．０Ｔｅｓｌａ  Ｅｘｃｉｔｅ  ＨＤｘ  ＭＲＩ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）からの超伝導電磁ＭＲＩ磁界により、インビボ調査用の磁界を生成した。磁界強度を測定し、０．５〜１Ｔまたは０．２〜０．５Ｔの強度をインビボ調査に使用した。
【０１２１】
プラスミド
ｐＥＧＦＰＮ１およびＭＳＣＶ−ｈｙｇｒｏ中の抗ＧＦＰナノボディ−ＴＲＰＶ１−２Ａ−ＧＦＰフェリチンを以前に記載３０のように生成した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使って、部位特異的変異誘発により、ラットＴＲＰＶ１中の残基Ｉ６７９のＫへの変異を導入した。複製欠損アデノウイルスの生成のために、これらの配列を、ｐＶＱ  Ａｄ  ＣＭＶ  ＫＮｐＡに挿入した。Ｃｒｅ活性化組換え型アデノウイルスベクターを構築するために、２対の互換性のないｌｏｘ部位、ｌｏｘＮとｌｏｘ２７２２、を有するＤＮＡコンストラクトを合成し、抗ＧＦＰナノボディ−ＴＲＰＶ１−２Ａ−ＧＦＰフェリチンを２つの対の間に、アンチセンスの向きに挿入した。その後、複製欠損アデノウイルスの生成のために、ｆｌｏｘ化した逆転抗ＧＦＰナノボディ−ＴＲＰＶ１−２Ａ−ＧＦＰフェリチンカセットをｐＶＱ  Ａｄ  ＣＭＶ  ＫＮｐＡに挿入した。ＰＣＲ産物の正確さおよびクローニングは、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認された。
【０１２２】
ウイルス
組換え型アデノウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ、Ａｄ−ＣＭＶ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン、Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンおよびＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチン）をＶｉｒａｑｕｅｓｔ（Ｉｏｗａ）でパッケージングした。最終の力価は、４ｘ１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌであった。ＡＡＶ−ＥＦ１ａ−ＤＩＯ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰをＵＮＣ  Ｖｉｒａｌ  Ｃｏｒｅから購入した。
【０１２３】
細胞培養およびインビトロ調査
ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−３２１６（商標）、マイコプラズマ試験およびＳＴＲプロファイリングはＡＴＣＣで実施）を１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用い、５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。Ｐｈｏｅｎｉｘエコトロピックパッケージング細胞（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を１０％のウシ胎仔血清を加えたダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）を用い、５％ＣＯ２下、３７℃で増殖させた。胎仔マウス視床下部Ｎ３８細胞（Ｃｅｌｌｕｔｉｏｎｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）を１０％のウシ胎仔血清を加えたダルベッコ改変イーグル培地を用い、５％ＣＯ２下、３７℃で増殖させた。
【０１２４】
Ｐｈｏｅｎｉｘシステムを使ったＮ３８細胞のレトロウイルス感染により安定な細胞株を産生した。簡単に説明すると、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｅｃｏ細胞（６ｃｍディッシュ当たり２ｘ１０６細胞）に、ＭＳＣＶ−ｈｙｇｒｏ  αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンまたはＭＳＣＶ−ｈｙｇｒｏ  αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを遺伝子導入した。２４時間後、培地を置換し、細胞を３２℃に置いた。さらに２４時間後、培地を吸引し、遠心分離して細胞残屑を除去した。ポリブレン（４μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）含有ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中の１：２希釈を使って、ｐｈｏｅｎｉｘ細胞上清をＮ３８細胞に加えた（６ｃｍディッシュ当たり１ｘ１０６細胞で播種）。細胞を３２℃でさらに２４時間インキュベートした後、培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで置換した。感染の４８時間後に選択培地を加えた。安定に遺伝子導入されたＮ３８細胞を３２℃で維持した。
【０１２５】
免疫細胞化学、電気生理学、ＲＦおよび磁石による調査では、安定に遺伝子導入されたＮ３８細胞またはＨＥＫ細胞をフィブロネクチン（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で被覆した１２ｍｍのカバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上で培養した。播種の２４時間後、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使って、適切なコンストラクトをＨＥＫ細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入の１８時間後、培地を置換し、ホロトランスフェリン（２ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を細胞に加えた。遺伝子導入または継代培養後、７２〜９６時間にわたり細胞を調査した。
【０１２６】
ｐＣＲＥＢおよびｃＦｏｓに対するＲＦまたは磁石の効果：調査の２４時間前に、細胞を３２℃の１％ＦＢＳ培地中に置いて、ＴＲＰＶ１およびカルシウム依存性経路の最小限の活性化を確実にした。調査の日に、細胞を、５００μｌのカルシウムイメージングバッファー中、室温で（対照）またはＲＦ電磁界（３１ｍＴ）中、室温でインキュベートした。磁石処理では、静磁界（２８０ｍＴ）を使って、２分間毎に５秒間の細胞の処理を１時間にわたり室温で行った。６０分後、細胞を氷上に置き、上清を除去し、細胞をＲＩＰＡ緩衝液（４０μｌ、ｐＣＲＥＢ）またはリシスバッファー（１００μｌ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ  ｋｉｔ）で溶解し、アッセイまたはＲＮＡ精製まで、−８０℃で凍結した。各調査は、３つのケースについてそれぞれ４回繰り返した。Ｎ３８細胞単独を使った対照調査は、２つのケースについて４回の反復実験を行った。
【０１２７】
カルシウムイメージング
ＴＲＰＶ１は、非選択的陽イオンチャネルであり、２価陽イオン、特にカルシウムに対する比較的高い透過性を有する（Ｃａ２＋＞Ｍｇ２＋＞Ｎａ＋  Ｋ＋  Ｃｓ＋）５５。ルテニウムレッドのある場合とない場合について、ＲＦ（３１ｍＴ）または磁石（２８０ｍＴ）の効果を調査するために、安定に遺伝子導入した細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、スルフィンピラゾン５００μＭの存在下、室温で、４５〜６０分間、Ｆｌｕｏ−４  ３μＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をロードした。細胞をＰＢＳで再度洗浄後、スルフィンピラゾンを含むＰＢＳ中で、１５〜３０分間インキュベートした。細胞を洗浄後、カルシウムイメージングバッファー中で画像形成した。イメージングは、特注のセラミックレンズを備えたＤｅｌｔａｖｉｓｉｏｎ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ＤＶイメージングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｗａｑ，ＷＡ）を使って行った。３秒毎に３分間、画像を取得した。処理なし（８つのケース）、ＲＦ処理の前および処理中（９つのケース）、ネオジウム磁石の適用の前および適用中（４５秒間、３つのケース）または２００μＭの２−アミノエトキシジフェニルボレートによる処理の前および処理の後（２−ＡＰＢ、２つのケース）で、細胞の画像形成を行った。ルテニウムレッド（１００μＭ）の存在下でイメージングを繰り返した（条件毎に２つのケース）。画像をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使って解析した。
【０１２８】
ＲＦまたは磁石磁界強度を増加させた効果の調査では、短時間ＲＦ処理（１０秒）のカルシウム応答に対する効果を評価するため、およびカルシウム応答の動力学を調べるために、プルロニックＦ−１２７（０．０２％ｖｏｌ／ｖｏｌ）およびスルフィンピラゾン５００μＭの存在下、細胞にＦｌｕｏＦｏｒｔｅ  ２０μＭ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｏｒｒａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をロードした。細胞を洗浄後、カルシウムイメージングバッファー中で画像形成した。イメージングを行い、１秒毎に１分間にわたり、上記のように画像を取得した。処理なし（４つのケース）、ＲＦ処理の前および３１、２７および２３ｍＴで処理中（それぞれ４つのケース）、ネオジウム磁石の２８０もしくは１３０ｍＴで適用前および適用中（それぞれ細胞から２ｍｍまたは５ｍｍ離れた磁石、それぞれ４つのケース）ならびにＲＦ（３１ｍＴ）による処理前、１０秒の処理中および処理後（３１ｍＴ）（４つのケース）で、細胞の画像形成を行った。画像をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使って解析した。
【０１２９】
多光子クロライドイメージング
安定に遺伝子導入した細胞をＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄後、ＭＱＡＥ（Ｎ−（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウムブロミド、５ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で６０分間ロードした。細胞をＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した後、イメージング前に緩衝液中で１５分間インキュベートした。イメージングを、７５０ｎｍでの２光子励起による、４０ｘ対物レンズを用いたＬＳＭ５１０ＮＬＯ多光子共焦点倒立システム（Ｚｅｉｓｓ）を使って行った。処理なし（４つのケース）、ネオジウム磁石の２０秒間の適用の前および適用中（２８０ｍＴ）（６つのケース）、２００μＭの２−アミノエトキシジフェニルボレートによる処理の前および処理の後（２−ＡＰＢ、２つのケース）で、細胞の画像形成を行った。ルテニウムレッド（１００μＭ）の存在下でイメージングを繰り返した（条件毎に２つのケース）。画像をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使って解析した。
【０１３０】
免疫細胞化学および免疫組織化学
免疫細胞化学（ＩＣＣ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）を使って、ＴＲＰＶ１、ＧＦＰおよびＦＬＡＧタグフェリチンの発現を検出し、ｃ−ｆｏｓ発現場所を特定し、細胞および組織中のアポトーシスを定量化した。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、２％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）で１５分間固定した。組織を１０％のホルマリン（Ｓｉｇｍａ）中、４℃で一晩固定し、振動ミクロトームで４０μｍ切片を切り出した。固定細胞または組織切片を洗浄後、ブロッキング緩衝液（０．１％のトリトンＸ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）および２％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ））中で１時間インキュベートした。その後、細胞および組織を、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（ウサギ抗ＴＲＰＶ１  １：５００（ＡＢ９５５４１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、マウス抗ＦＬＡＧ  １：１０００（ＦＬＡＧタグマウスｍＡｂ  ＃８１４６、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ニワトリ抗ＧＦＰ  １：１０００（ｂ１３９７０３、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗活性化カスパーゼ３  １：２５０（Ｇ７４８１、Ｐｒｏｍｅｇａ４））またはウサギ抗ｃＦｏｓ１：（ＰＣ３８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中、４℃で一晩インキュベートした。細胞または組織をＰＢＳ／０．１％トリトンＸ中で３回洗浄後、ブロッキング緩衝液中で２時間希釈した二次抗体（ヤギ抗ウサギ５９４（Ａ１０１２）またはヤギ抗ウサギ４８８（Ａ１１００８）、ヤギ抗ニワトリ４８８（Ａ１１０３９）、ヤギ抗マウス３５０（Ａ１１０４５）、全て１：１０００）中でインキュベートした。細胞または組織をＰＢＳ／０．１％トリトンＸ中でさらに３回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使ってマウントした。
【０１３１】
共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０レーザー走査型共焦点顕微鏡；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を使って、画像を取得した。２０Ｘ／０．７０ＮＡ対物レンズを使って、走査型レーザー顕微鏡で共焦点蛍光像を取得した。ＧＦＰ陽性細胞および活性化カスパーゼ−３陽性細胞を定量化するために、中心として採取した注入部位を含む脳の１２８０μｍ切片を、３２０μｍ毎に４０μｍの深さをカバーするタイル状の連続的積層画像を採取することにより、画像形成した。ＧＦＰおよび活性カスパーゼ３免疫染色の定量化を、Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ定量化ソフトウェア（Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使って、処理群に対し評価者盲検方式で実施した。画像解析ソフトウェアを使って、バックグラウンドレベルを超える免疫反応性を閾値処理することにより、体積当たりのＧＦＰまたは活性化カスパーゼ−３陽性細胞の数が計算された。ＴＲＰＶ１、ＧＦＰおよびＦＬＡＧタグフェリチンの共局在化を調べるための共焦点画像を４０ｘ対物レンズを使って取得した。
【０１３２】
免疫電子顕微鏡
マウス脳を４％ＰＦＡで潅流し、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ  １００Ｓ）で５０μｍの切片を作成した。切片を、２０ｍＭトリス緩衝液中の４％ＢＳＡおよび０．１５％サポニン（ｐＨ７．４）により室温で、２時間、ブロッキングした。その後、抗ＧＦＰ（１：１０００）（Ａｖｅｓ  Ｌａｂ  Ｉｎｃ．）と共に一晩４℃でインキュベートし、続けて、ビオチン化抗ニワトリ（１：１０００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、ＧｏｌｄＥｎｈａｎｃｅ（＃２１１４、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）で処理したＮａｎｏｇｏｌｄストレプトアビジン（１：１００、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ）と共にインキュベートした。一次抗体インキュベーションを除いた以外は、陰性対照を同一手順を用いて行った。組織切片をカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２％グルタルアルデヒドでの固定、１５分間の軽いオスミウム酸染色（０．５％四酸化オスミウム）および１％酢酸ウラニウムによる３０分のブロック染色を行った。その後、組織をエタノール系を通して脱水し、続けて、Ｅｐｏｎａｔｅ１２（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ  Ｉｎｃ．）と共にインキュベートした。試料をレジンに埋め込み、６０℃で４８時間重合させた。極薄（７０ｎｍ）の切片を切り出し、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ電子顕微鏡センターのＪＥＯＬ  ＪＥＸ１００ＣＸ透過型電子顕微鏡下で検査した。
【０１３３】
電気生理学
細胞培養
室温下、−６０ｍＶで、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンコンストラクトを発現しているＨＥＫ細胞およびＮ３８細胞からホールセル電圧クランプ記録を作成した。落射蛍光を使って、Ｈａｍａｍｔｓｕ  ＣＣＤカメラを備えた直立型Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２ＦＳ  Ｐｌｕｓ顕微鏡でＧＦＰを発現しているニューロンを可視化した。外液には、次を含めた（ｍＭ単位）：１４０ＮａＣｌ、２．８ＫＣｌ、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１ＨＥＰＥＳ、１０グルコース、ｐＨ７．４。ボロシリケートガラスから引いたパッチピペット（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）は、チップ抵抗５〜１０オームで、１３５グルコン酸カリウム、４ＫＣｌ、０．０５ＥＧＴＡ、１０Ｈｅｐｅｓ、４ＭｇＡＴＰ、１０ホスホクレアチンナトリウム（ｍＭ単位）（ｐＨはＫＯＨで７．３に調節、特に指示がない限り、浸透圧は、２９０ＯＳＭである）を含むグルコン酸カリウム内部溶液を充填した。浸透圧が２９０ＯＳＭ以外の場合は、次のＣｓＣｌ内部溶液を使用した（ｍＭ単位）：１２５ＣｓＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、４ＭｇＡＴＰ、０．５ＣａＣｌ２。２ＡＰＢ（２００μＭ）を１０ｍＭのＤＭＳＯストックから調製し、記載がある場合は、浴を通して潅流した。２００μＭの２ＡＰＢの存在下、５ｍＶステップによる電圧増加に対する電流応答を測定することにより、Ｉ−Ｖ関係を得た。細胞を−６０ｍＶに保持した。ミクロマニピュレーターを使って、記録対象細胞の５００ミクロン以内に永久磁石を５秒間配置することにより磁気活性化を適用した。記録をＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器で取得し、２ｋＨｚに濾波し、１０ｋＨｚでデジタル化する（ｐＣｌａｍｐ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。ＩＧＯＲ  Ｐｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ）およびＮｅｕｒｏＭａｔｉｃ．（ｎｅｕｒｏｍａｔｉｃ．ｔｈｉｎｋｒａｎｄｏｍ．ｃｏｍ）を使って、データを解析した。直列抵抗をモニターしたが、補償はしなかった。直列抵抗に２０％を超える変化があった場合は、記録から除外した。
【０１３４】
切片の電気生理学
ＶＭＨにＡｄ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンまたはＡｄ−αＧＦＰ７  ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを注入したグルコキナーゼ−ｃｒｅ  Ｒｏｓａ−ＴｄＴｏｍａｔｏマウスに、イソフルランで深く麻酔をかけた後に、断頭し、全体脳を取り出して、８５ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、０．５ＣａＣｌ２、４ＭｇＣｌ２、２５ＮａＨＣＯ３、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、６４スクロース、２５グルコースおよび０．０２Ｄ−２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（Ｄ−ＡＰ５，Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（ｍＭ単位）を含む氷冷「切断」溶液中に直ちに浸漬した。これを９５％Ｏ２、５％ＣＯ２でバブリングした（ｐＨ７．４）。ムービングブレードミクロトーム（ＶＴ１０００Ｓ，Ｌｅｉｃａ）を使って、冠状視床下部切片（２００μｍ）を作製した。１２５ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、２６ＮａＨＣＯ３、１０グルコース、２ＣａＣｌ２および１ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．４）（ｍＭ単位）を含む記録溶液中で、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２でバブリングし、切片を３２℃で４０分保持した。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンまたはαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンコンストラクトの発現を示すｔｄ−ｔｏｍａｔｏおよびＧＦＰの両方を発現しているＶＭＨ中のニューロンからのホールセル電流クランプモードのパッチクランプ記録を室温で行った。ニューロンを可視化し、上述のように記録した。ニューロンの活性化を観察するために、ニューロンを閾値未満に過分極させた。
【０１３５】
視床下部ニューロンのベースライン特性は以下の通りである。コンストラクトを発現しているニューロンの平均直列抵抗は、１８．４±１．１ＭΩ（ｎ＝３７）で、コンストラクトを発現していない視床下部ニューロン（１８．０±１、ｎ＝７）から有意に異なっていなかった。平均静電容量は、５．１±０．５５ｐＦで、チャネルを発現していないニューロン（６．７±０．８）とは有意に異なっていなかった。ナイーブ視床下部ニューロンの平均静止膜電位は、−４８．２１±４．７ｍＶ（ｎ＝１５）であり、操作前のコンストラクトを発現している細胞では、−５２ｍＶ±１．９ｍＶ（ｎ＝３７、ｐ＞０．５）であった。入力抵抗は、視床下部ニューロンで有意に異ならなかった；対照ニューロン（コンストラクト発現なし）＝７０３±１２８ＭΩ（ｎ＝１３）、野生型チャネルニューロン＝５５５±１１０ＭΩ（ｎ＝７）、変異ニューロン＝８６６±２２０ＭΩ（ｎ＝１４）。
【０１３６】
動物およびインビボ調査
Ｃ５７Ｂｌ６マウス（８〜９週齡、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）、Ｎｅｓｔｉｎ  ｃｒｅ（８〜９週齡、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）およびグルコキナーゼｃｒｅ（８〜１６週齡）を使用し、制御された照明条件下（１２時間の明／１２時間の暗）、および温度（２２℃）で、単一ケージに収容し、標準的マウス固形飼料を自由に摂取させた。動物飼育および実験手順は、既定ガイドラインに基づいて、Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの実験動物委員会の承認を得て実施した（プロトコル１２５６１および１４７１２）。いずれの場合も、体重に従ってマウスを無作為化した。処理群に対する評価者盲検方式とはしなかった。
【０１３７】
必要な標本数は、ＲＦ処理の遺伝子発現およびタンパク質放出に与える影響を調べた以前の調査に基づいて、ｎ＝８〜１０／群と推定された。全ての手術は、無菌条件下で実施した。１．５％イソフルランを使ってマウスを麻酔し、頭頂を剪毛した後、７０％エタノールで洗浄した。正中線で切開し、歯科用ドリルを使って小さい開頭術を行った。
【０１３８】
調査１：野生型マウスの線条体（座標：＋１ＡＰ、２．３ＭＬ、−３．３ＤＶ）にＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰまたはＡｄ−ＣＭＶ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン（４ｘ１０８ｐｆｕ／注入）の定位注入を１０分間にわたり行った。ニードルは、取り出す前にさらに５分間、所定位置に残した。マウスはまた、鉄デキストランの側脳室注入（４ｕｌ、座標：−０．４６ＡＰ、１．２ＭＬ、−２．０ＤＶ）も受けた。
【０１３９】
一週間又は四週間後、Ａｄ−ＣＭＶ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを注入したマウスを、ＲＦ処理またはＲＦ処理なしに無作為化した（各時点および処理群当たりｎ＝４）。Ａｄ−ＣＭＶ２  ＧＦＰで処理した全てのマウスをＲＦで処理した（ｎ＝４／時点）。トリブロモエタノール（２００ｍｇ／ｋｇ）でマウスを麻酔し、１５分後、ＲＦソレノイド中に配置することにより、マウスをＲＦで３０分間処理した（Ａｄ−ＧＦＰおよびＡｄ−ＣＭＶ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン、ＲＦ処理群）。Ａｄ−ＣＭＶ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン、未処理群を麻酔し、麻酔誘導の１５分後、ＲＦソレノイド中に、電力を加えずに３０分間配置した。ソレノイド中に配置した１時間後、マウスを潅流し、脳を取り出し、上述のように、ＧＦＰおよび活性化カスパーゼ−３免疫染色のために処理した。
【０１４０】
我々は、ＲＦの不存在下での基礎活性または著しい毒性とアポトーシスが、容易に検出可能な運動の変化をもたらすであろうと考えたということが主な理由で、片側線条体注入を使って、我々のコンストラクトの試験をした。さらに、線条体は、ＴＲＰＶ１を発現せず、われわれは、全ての効果が、内在性ＴＲＰＶ１の効果の結果ではなく、我々のコンストラクトの発現の結果であることを確かなものにすることを望んだ。
【０１４１】
最終的に、ＲＦ処理のために、マウスは、麻酔する必要があり、予備的研究において、我々は、麻酔剤は、多くのＣＮＳ領域で、高レベルのｃ−ｆｏｓ活性化をもたらすことが多いが、線条体ではそれがないことを見出した。したがって、麻酔剤が毒性または非特異的染色に寄与する可能性を最小化するために、我々は、ＶＭＨを評価することに加えて、線条体注入を使用した。
【０１４２】
調査２：Ｎｅｓｔｉｎ  ｃｒｅまたは野生型マウスは、上述のように、Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン（４ｘ１０８ｐｆｕ／注入）およびＩＣＶ鉄デキストランの線条体注入を受けた。１週間後、マウスを麻酔し、ＲＦで３０分間処理し、１時間後、上述のように潅流した。組織をＧＦＰおよびｃ−Ｆｏｓ免疫染色のために、上述のように処理した。
【０１４３】
調査３：グルコキナーゼｃｒｅまたは野生型マウスをイソフルランで麻酔し、鉄デキストランの側脳室への定位注入、およびＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ２３  ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン（４ｘ１０８ｐｆｕ／注入）の視床下部腹内側核（座標：−０．９ＡＰ、０．３２ＭＬおよび−５．４８ＤＶ）への定位注入を行った。１週間後、各群の半分のマウスを、ＲＦ刺激（３１ｍＴ）を使って調査し、半分を未処理で残した。１週間後、前に処理したマウスをＲＦ処理なしで評価し、また、前に未処理であったマウスをＲＦで処理した（ＧＫ−ｃｒｅ、ｎ＝１３およびＷＴ、ｎ＝１０）。ＲＦ処理開始後−５、０、５、１０、２０、３０、４５、６０および９０分に血糖調査用の尾静脈試料を採取した。さらに１週間後、ＲＦ処理の開始後６０分に行ったこと以外は、マウスを上述のように処理し、マウスを屠殺して、心臓穿刺を行ってホルモン評価用血液を採取した。また、肝臓組織を採取し、さらに後で行う糖新生酵素発現の評価のために、液体窒素中で急速凍結した。脳を固定し、切片を作成し、ＧＦＰで染色して注入位置を調べた。ＶＭＨの外側に注入部位を有するマウスを、解析から除外した。
【０１４４】
調査４：ＧＫ−ｃｒｅマウス（ｎ＝４）を麻酔し、上記の座標を使用して、ＡＡＶ−ＥＦ１ａ−ＤＩＯ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰ（１ｕｌ）をＶＭＨ中に注入した。その後、光ファイバーを注入部位の上２００ｎｍに配置し、接着セメント、続けて、歯科用セメントで固定し、次に、頭皮を組織接着剤を使って密閉した。４週間後、半分のマウスを４７３ｎｍレーザー刺激（５Ｈｚ、１５ｍｓパルス幅）で３０分間処理し、半分を光学ケーブルに取り付けたが光刺激はしなかった。１週間後、前に処理したマウスを光処理なしで評価し、また、前に未処理であったマウスを光で処理した。光処理開始後−５、０、５、１０、２０、３０、４５、６０および９０分に血糖調査用の尾静脈試料を採取した。脳を固定し、切片を作成し、ＧＦＰで染色して注入位置を調べた。ＶＭＨの外側に注入部位を有するマウスを、解析から除外した。
【０１４５】
調査５：グルコキナーゼｃｒｅまたは野生型マウスをイソフルランで麻酔し、鉄デキストランの側脳室への定位注入、およびＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ  ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチン（４ｘ１０８ｐｆｕ／注入）のＶＭＨへの定位注入を行った。１週間後、各群の半分のマウスを、ＲＦ刺激（３１ｍＴ）を使って調査し、半分を未処理で残した。１週間後、前に処理したマウスをＲＦ処理なしで評価し、また、前に未処理であったマウスをＲＦで処理した（ＧＫ−ｃｒｅ、ｎ＝１３およびＷＴ、ｎ＝８）。ＲＦ処理開始後−５、０、５、１０、２０、３０、４５、６０および９０分に血糖調査用の尾静脈試料を採取した。さらに３日後、マウスを麻酔し、時間０で２−デオキシグルコース（４００ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で処理した後、ＲＦで４５分間処理した。ＲＦ処理開始後−５、０、５、１０、２０、３０、４５、６０および９０分に血糖調査用の尾静脈試料を採取した。１週間後、マウスを麻酔し、ＲＦ処理（３１ｍＴ）を行い、ＲＦ処理の開始後６０分にマウスを屠殺して、心臓穿刺を行ってホルモン評価用の血液を採取した。また、肝臓組織を採取し、さらに後で行う糖新生酵素発現の評価のために、液体窒素中で急速凍結した。脳を固定し、切片を作成し、ＧＦＰで染色して注入位置を調べた。ＶＭＨの外側に注入部位を有するマウスを、解析から除外した。
【０１４６】
調査６：グルコキナーゼｃｒｅまたは野生型マウスをイソフルランで麻酔し、鉄デキストランの側脳室への定位注入、およびＡｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン（４ｘ１０８ｐｆｕ／注入）の視床下部腹内側核への定位注入を行った（上記のように）（ｎ＝６）。１週間後、マウスを低強度磁界（＜０．００５Ｔ）中のプラスチックチャンバー中に環境順化期間の１５分間置き、その後、半分のマウスを、高強度磁界（＞０．５Ｔ）に３０分間移動し、半分を低強度磁界中に残した。３０分後、全マウスを低強度磁界中にさらに３０分間置いた。
【０１４７】
環境順化期間後、−５、０、１５、３０、４５、および６０分に血糖調査用の尾静脈試料を採取した。１週間後、群を交差させ、それにより、前に高強度磁界で処理されたマウスが低強度磁界で処理され、前に低強度磁界で処理されたマウスが高強度磁界で処理された。調査の最後に、マウスを屠殺し、潅流した。
【０１４８】
脳を固定し、切片を作成し、ＧＦＰで染色して注入位置を調べた。ＶＭＨの外側に注入部位を有するマウスを、解析から除外した。
【０１４９】
調査７：グルコキナーゼｃｒｅまたは野生型マウスを調査６のように、注入および回収した（ｎ＝６）。１週間後、磁界刺激が食物摂取量に与える影響を調べた。マウスをそれらのチャンバーに２０分間順化させた後、低強度磁界で２０分置いた後、食物摂取量を評価した。その後、高強度磁界（０．５〜１Ｔ）に置いた半分のマウス、および低強度磁界中に置いた半分のマウスの食物摂取量を２０分間測定した。低強度磁界中での最終２０分間の食物摂取量を測定した。１週間後、群を交差させ、それにより、前に高強度磁界で処理されたマウスが低強度磁界で処理され、前に低強度磁界で処理されたマウスが高強度磁界で処理された。調査の最後に、マウスを屠殺し、潅流した。脳を固定し、切片を作成し、ＧＦＰで染色して注入位置を調べた。ＶＭＨの外側に注入部位を有するマウスを、解析から除外した。
【０１５０】
調査８：グルコキナーゼｃｒｅマウス（ｎ＝６）に、調査３に記載のように、定位注入を行った。１週間後、マウスを麻酔し、麻酔誘導の１５分後、ＲＦソレノイド中に、電力を加えずに３０分間配置した（ＲＦ処理なし）。３日後、マウスを２つの等価な群に分割し、１つの群を２７ｍＴの磁界強度で３０分過処理し、その他の群を２３ｍＴの磁界強度で３０分間処理した。さらに４日後、処理群を逆転させた。１週間後、第１の群のマウスをＲＦ（３１ｍＴ）で２０分間処理し、第２の群のマウスをＲＦ（３１ｍＴ）で１０分間処理した。さらに３日後、処理群を逆転させた。全調査に対し、ＲＦ処理開始後、−５、０、５、１０、２０、３０、４５、６０および９０分に血糖調査用の尾静脈試料を採取した。さらに１週間後、半分のマウスをＲＦ（３１ｍＴ）で２０分間処理し、半分のマウスを未処理のまま残した。ＲＦ処理の開始６０分後、マウスを屠殺し、脳を固定、切片を作成し、ＧＦＰおよび活性化カスパーゼ３のために染色し、ＶＭＨでのアポトーシスを評価した。
【０１５１】
調査９：グルコキナーゼｃｒｅマウス（ｎ＝６）に、調査３に記載のように、定位注入を行った。２週間後、低磁気強度（０．２〜０．５ｍＴ）が食物摂取量に与える影響を評価した。マウスをそれらのチャンバーに２０分間順化させた後、低強度磁界で２０分置き、続けて、０．２〜０．５Ｔの磁界で２０分間処理した後、食物摂取量を測定した。低強度磁界中での最終２０分間の食物摂取量を測定した。調査の最後に、マウスを屠殺し、潅流した。脳を固定し、切片を作成し、ＧＦＰで染色して注入位置を調べた。
【０１５２】
調査１０：グルコキナーゼｃｒｅマウス（ｎ＝４）に、Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンのＶＭＨ中への両側注入を行った以外は、調査５に記載のようにして、定位注入を行った。１週間後、低磁界処理に対応する食物摂取量を評価した。マウスをそれらのチャンバーに２０分間順化させた後、低磁界強度で２０分ずつ３回の期間にわたり、食物摂取量を測定した。１週間後、２０分の順化期間後、高強度磁界（０．５〜１Ｔ）で２０分間処理したマウスの食物摂取量を測定する調査を繰り返して行った。低強度磁界中で、さらに２回の２０分間の食物摂取量を測定した。調査の最後に、マウスを屠殺し、潅流した。脳を固定し、切片を作成し、ＧＦＰで染色して注入位置を調べた。
【０１５３】
調査１１：グルコキナーゼｃｒｅ／Ｒｏｓａ  Ｔｄ−ｔｏｍａｔｏマウス（ｎ＝４）に、調査３に記載のように、定位注入を行った。１週間後、３匹のマウスを麻酔し、麻酔誘導の１５分後、ＲＦ（３１ｍＴ）で３０分間処理した。ＲＦ処理の開始６０分後、マウスを屠殺した。３匹のマウスからの脳を固定、切片作成し、ＧＦＰおよびｃ−ｆｏｓのために染色した。４匹目のマウスをＲＦ処理せずに潅流し、脳を免疫電子顕微鏡用に使用した。
【０１５４】
アッセイ
Ｂｒｅｅｚｅ２血糖計（Ｂａｙｅｒ；Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って、血糖を測定した。血液を１０分間遠心分離し、血漿を収集した。インスリンの血漿中濃度（Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｓａｌｅｍ，ＮＣ）およびグルカゴン濃度（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１５５】
ウエスタンブロット。
ＲＩＰＡ中に溶解することによりタンパク質を単離し、４℃で１６０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、４ｘＬａｅｍｅｌｉ緩衝液を添加した。試料を９５℃で５分間変性し、アッセイまで−２０℃で凍結した。試料（１５ｕｌ）を４〜１５％ゲルで泳動させた後、ＰＶｄＦ膜に転写した。膜を室温で１時間ブロッキングし（ＴＢＳＴ緩衝液中の３％ドライミルク）、その後、ＴＢＳＴ中の一次抗体（ホスホＣＲＥＢ（Ｓｅｒ１３３）（８７Ｇ３）ウサギｍＡｂ（１：１０００）またはベータアクチンウサギＡｂ（１：１０００）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）中で一晩４℃でインキュベートした。膜をＴＢＳＴ中で３回洗浄後、ブロック中の二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、１：５０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）中で、室温で２時間インキュベートした。膜をさらに５回洗浄した後、基質（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ最大感度基質、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５分間現像し、イメージングした（Ｃ−ＤｉＧｉｔ  ｂｌｏｔ  ｓｃａｎｎｅｒ，Ｌｉｃｏｒ）。ｐＣＲＥＢ密度シグナルを、ハウスキーピング遺伝子の密度シグナルで除算することにより、生じ得るタンパク質添加量の変動に関し補正した。
【０１５６】
リアルタイムＰＣＲ
組織をトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、または細胞を緩衝液ＲＬＴ中でホモジナイジングし、Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡマイクロプレップキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使ってＲＮＡを精製することにより全ＲＮＡを単離した。Ｑｉａｇｅｎ  ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキットを使って、相補ＤＮＡを合成した。製造業者のプロトコルに従い、ＴａｑＭａｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使って、リアルタイムＰＣＲを行った。
【０１５７】
統計
調査の前に決めたように、２ＳＤを超えて平均の外側にあるデータは、さらなる分析から除外した。全データをガウス分布および分散に対し試験した。別段の指示がない限り、対応のない両側スチューデントｔ検定を使って、正規分布および類似の分散のデータを統計的有意性について分析した。正規変動および不等分散を有するデータは両側ウェルチのｔ検定により解析した。対応のあるデータは対応のあるｔ検定により解析した。３つ以上の群のあるデータは、パラメトリックデータに対して、１元配置分散分析とテューキーの事後解析により解析した。正規分布ではないデータは、事後的ダンの調整を使って、両側マンホイットニー検定またはクラスカル・ワリス検定により解析した。Ｐ値は、示した通りである。経時変化データは、２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により、または対応のあるデータに対する反復測定２元配置分散分析とシダックの多重比較検定により解析した。別に定める場合を除き、データは平均±ＳＥＭをして示す。
【０１５８】
結果および考察
我々は、神経活動のインビボでの非侵襲的、時間的制御のための系およびグルコース恒常性の中枢神経系（ＣＮＳ）制御を調査するためのその使用について記載する。ニューロン活性化は、ラクダ抗ＧＦＰ抗体により陽イオン伝導性一過性受容器電位バニロイド１（αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１）に係留されたＧＦＰ−フェリチン融合タンパク質（ＧＦＰ−フェリチン）の標的発現を介して、電波（ＲＦ）または磁界を使った遠隔操作により達成された。同じ刺激を介した神経性抑制は、ＴＲＰＶ１ポアを変異させて、チャネルをクロライド透過性にすることにより達成された。この系を使った視床下部腹内側核（ＶＭＨ）中のグルコース感知ニューロンの活性化は、血漿中ブドウ糖およびグルカゴンを増やし、インスリンおよび刺激を受けた摂食を減らし、一方、これらのニューロンを抑制すると、血糖が低下し、血漿中インスリンが増え、摂食が抑えられた。これらの結果は、ＶＭＨ中のグルコース感知ニューロンが、インスリンおよびグルカゴン分泌に対する効果を介して、グルコース恒常性を制御することができ、これは膵臓ホルモンが、血糖および行動を制御するＣＮＳ回路のエフェクター機構として機能することを示唆していることを示す。我々が採用した方法はまた、永久的移植物を不要にし、その他の神経プロセスを研究するのに適用される可能性があり、または他の細胞、分散細胞型を調節するためでさえ使用されるであろう。
【０１５９】
多くの研究により、ＣＮＳによる周辺部代謝の調節について確立されてきた２，３。ＶＭＨは、食物摂取量および体重の制御に重要な役割を演ずることが示唆されてきたが４、電極刺激および神経障害による調査では、局所的細胞または神経線維の通路３１，３４−３６に与える効果の間で識別が行えず、または寄与細胞型を特定できなかった３７。我々は、前に、Ｃａ２＋の流入および遺伝子発現が、フェリチンナノ粒子の温度感受性ＴＲＰＶ１チャネルへの係留によって、電波または磁界により制御される可能性があることを示した３０。しかし、これらの前の調査では、この手法の神経活動に対する効率を試験しなかった（図６Ａ）。したがって、我々は、ＶＭＨ中の特定のグルコース感知ニューロンのインビボで血糖を制御する役割に関して我々の手法を試験した。
【０１６０】
αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンがｃｒｅ依存性発現の複製欠損アデノウイルス（Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチン）を、グルコース感知ニューロン中にｃｒｅを発現するグルコキナーゼ−ｃｒｅ（ＧＫ−ｃｒｅ）マウス３８のＶＭＨに注入した（図９Ａ）。ＶＭＨでαＧＦＰ−１  ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスでは、血糖（３０分でのΔ血糖：ＲＦ処理  ４８．９±１６．９ｍｇｄｌ−１、対する、未処理  −０．７±１２．９ｍｇｄｌ−１、ｐ＜０．０５。４５分でのΔ血糖：ＲＦ処理  ９１．３±２８．２ｍｇｄｌ−１、対する、未処理  ８．７±１１．１ｍｇｄｌ−１、ｐ＜０．０５）および  血糖の累積変化（ＡＵＣ（０〜９０分）：ＲＦ処理  ５５６２±１９７７ｍｇｄｌ−１分、対する、未処理  ６２±１１８４ｍｇｄｌ−１分、ｐ＜０．０５）が有意に増加した（図６Ｂ）。ＲＦ活性化の経時変化と程度は、ＶＭＨグルコース検知ニューロンの光遺伝学的活性化で認められるものとほぼ重ねることが出来る（図６Ｂ）。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンがＶＭＨで発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスのＲＦ処理は、血漿中インスリンを半減させ、血漿グルカゴンを３倍増加させ、肝臓糖新生酵素１０、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐ）の発現を有意に誘導した（図６Ｃ）。したがって、ＶＭＨグルコース感知ニューロンの遠隔活性化は、膵臓ホルモンの変化を誘導することにより、血糖を増加させる。
【０１６１】
血糖の上昇は、ＲＦ電磁界強度および処理の長さに依存する（図１０Ａおよび１０Ｂ）。Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンのＶＭＨへの注入を受けたＷＴマウスのＲＦ処理は、血糖を変化させなかった（図１１Ｂ〜１１Ｄ）。ＲＦ処理は、ＧＦＰ発現ニューロンにおいてのみｃ−ｆｏｓ発現を誘導し、ＲＦ処理野生型（ＷＴ）マウスにおいてはその誘導はなかった。また、ＲＦ処理のある場合とない場合での、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰフェリチンの発現は、ＧＦＰ発現対照ウイルスに比べて、アポトーシス細胞数の変化はなかった（図９Ｂおよび９Ｃ）。
【０１６２】
これらのインビボデータと一致して、電波も同様に、遠隔操作により、Ｎ３８細胞中のＣａ２＋のインビボ流入を刺激した（図１２Ａ）。これにより、我々が活性化動力学を試験することを可能とした。安定にこれらのコンストラクトを発現している視床下部細胞（Ｎ３８）クローンでは、細胞内のカルシウムの上昇に伴い、ＲＦ処理（４６５ｋＨｚ）により細胞数が有意に増加し、これはおそらく、電位作動型カルシウムチャネルの開口に繋がるＴＲＰＶ１チャネル媒介脱分極によると思われる。これらの効果は、ＴＲＰチャネル阻害剤であるルテニウムレッドにより阻止された。モード応答時間は、ＲＦ発生後、１１〜１５秒であった（図１２Ａ（ｉｉｉ））。カルシウム応答は、ＲＦ電磁界強度に比例し、１０秒ＲＦパルスで、細胞内のカルシウムを有意に増加させるのに十分であった（図１２Ｂ）。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞のＲＦ処理はまた、カルシウムシグナル伝達の標準ターゲット４０であるホスホｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ｐＣＲＥＢ）のレベルならびにカルシウム、活動応答癌原遺伝子およびｃ−ｆｏｓ発現のレベルを有意に高めたが、これらの効果は、ルテニウムレッドにより阻止された（図１２Ｃ）。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンのないＮ３８細胞のＲＦ処理で、ｃ−ｆｏｓのわずかな増加およびｐＣＲＥＢの非増加が観察された（図１３Ａおよび１３Ｂ）。脳切片の免疫組織化学および免疫電子顕微鏡により、ニューロン中におけるそれらのインビボ同時発現がさらに確認された（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。
【０１６３】
非侵襲的神経抑制方法により、特定の神経細胞集団の生理学的役割のさらなる分析が可能となり、局所的神経抑制により作用すると考えられる深部脳刺激に対する代替手段を提供する可能性がある。したがって、我々は、遠隔操作による神経サイレンシングを可能とするために、我々の技術を修正した。ＴＲＰファミリーチャネル、Ｍ２およびＭ８のＳ６ポア領域のイソロイシンからリシンへのアミノ酸置換により、イオン選択性が陽イオンからクロライドイオンに変わることが示された４２。我々は、ＴＲＰＶ１変異体チャネルを生成するために、ＴＲＰＶ１のＳ６領域への類似の変異（Ｉ６７９Ｋ）（図１８）の効果を導入し、ＭＱＡＥを使ってクロライド流入のイメージングにより試験した。安定にαＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを遺伝子導入したＮ３８細胞では、ＴＲＰアゴニスト２ＡＰＢが、ＭＱＡＥ消光により測定した細胞内のクロライドのレベルを有意に増加させた。この効果は、ルテニウムレッドにより阻止された（図７Ｂおよび図１５Ｅ（ｉｉ））。野生型ＴＲＰＶ１とは対照的に、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞のＲＦ処理は、ｐＣＲＥＢレベルを有意に低減させ、ｃ−ｆｏｓ発現を増やすことができなかった（図１４Ａ）。
【０１６４】
次に、我々は、遠隔操作によるＶＭＨグルコース感知ニューロンの抑制により、インビボでのグルコース代謝を変えることが可能か否かを試験した。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンがｃｒｅ依存性発現のアデノウイルス（Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰフェリチン）のＶＭＨ注入後の、絶食ＧＫ−ｃｒｅマウスのＲＦ処理は、血糖（２０分のΔ血糖：ＲＦ処理  −２２．５±５．５ｍｇｄｌ−１、対する、未処理  ６．８±４．１ｍｇｄｌ−１、ｐ＜０．０１。３０分でのΔ血糖：ＲＦ処理  −２６．５±７．８ｍｇｄｌ−１、対する、未処理  ９．９±１３．１ｍｇｄｌ−１、ｐ＜０．００１。４５分でのΔ血糖：ＲＦ処理  −２０．３±８．２ｍｇｄｌ−１、対する、未処理  ２０．６±１２．９ｍｇｄｌ−１、ｐ＜０．０００１）ならびに血糖の累積変化を有意に低減した（図７Ｃ）。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンがＶＭＨで発現しているＧＫ−ｃｒｅマウスは、グルカゴンの代償性上昇もなく、インスリンを有意に高め、肝臓Ｇ６Ｐの発現を有意に低下させた（図７Ｄ）。Ａｄ−ＦＬＥＸ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンのＶＭＨ注入後のＷＴマウスに対するＲＦ処理の効果はなかった（図１４Ｄ）。さらに、遠隔操作によるＶＭＨグルコース感知ニューロンのＲＦ抑制は、細胞内の解糖を抑制する代謝可能でない形態のグルコースである、２−デオキシグルコースにより誘発される低血糖症に対する応答を低減させた（図７Ｅおよび図１４Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＶＭＨグルコース感知ニューロンは、低血糖症に対する完全な対抗制御的応答に必要であり、また、一晩絶食後の血糖の正常レベルの維持に必要であることを示唆している。
【０１６５】
我々は、前に、フェリチンが超常磁性であるという事実のために、フェリチン係留ＴＲＰＶ１は、磁界中で遺伝子発現を活性化することが可能であろうということを示した２２，３０。したがって、我々は、永久磁石の印加が、ホールセル電圧および電流クランプ記録を作成することにより、神経活動を同様に調節可能であるか否かを試験した。電波が電極を加熱し、磁石を使った場合には認められない別のアーチファクトを記録する原因になるため、電波を使った電気生理学的記録は作成できなかったことに留意されたい。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＨＥＫまたはＮ３８細胞の静磁石を使った磁界への暴露（５秒）は顕著な内向き電流を誘導した。対照的に、磁石処理（５秒）は、ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＨＥＫまたはＮ３８細胞では、外向き電流を誘導した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。磁石誘導ピーク電流は、活性化チャネルで、０．６２±０．４秒の立ち上がり時間および１．１±０．７４秒の３７％減衰時間、ならびに変異チャネルで、それぞれ、２．２９±１．８秒および１１．７±４．９秒を示した。異なる細胞内陰イオン（図１５Ｃ）を有する変異チャネルのＩ−Ｖ関係は、ＴＲＰＭ２およびＴＲＰＭ８１３の類似したポアループ変異と一致した。αＧＦＰ２  ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞の磁石処理は、磁界依存的に細胞内カルシウムを増加させたが、他方、αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＮ３８細胞の磁石処理は、細胞内のクロライドを増加させ、また、これらの効果は、ルテニウムレッドにより阻止された（図１５Ｄおよび１５Ｅ）。
【０１６６】
次に、我々は、磁石処理の視床下部切片の神経活動に与える効果を試験した。ＧＫニューロンを標識するために、グルコキナーゼｃｒｅ（ＧＫ−ｃｒｅ）マウスを、レポーター系統Ｒｏｓａ−ＴｄＴｏｍａｔｏと交配させた後、Ａｄ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンまたはＡｄ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンのＶＭＨへの注入を行った。Ａｄ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを注入したマウスでは、切片の磁石処理（５秒）により、Ｔｄ−ｔｏｍａｔｏおよびＧＦＰを発現しているニューロンを脱分極させ、７６％のニューロンで、膜電位の有意な増加１５．７±２．８ｍＶ（Ｐ＜０．００１、ｎ＝１６）および発火頻度の有意な増加２．６０±０．８Ｈｚ（Ｐ＜０．００１、ｎ＝１２）を生じる（図８Ａ（ｉ、ｉｉｉおよびｉｖ））。Ａｄ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンを注入したマウスでは、切片の磁石処理（５秒）により、７１％のニューロンで、膜電位の有意な過分極−９．５±２．６ｍＶ（Ｐ＜０．０５、ｎ＝６、ウィルコクソンマッチドペア）を生じ、また、発火頻度の有意な減少−２．９０±１．７０Ｈｚ（Ｐ＜０．０５、ｎ＝６、ウィルコクソンマッチドペア）を生じる（図８Ａ（ｉｉ、ｉｉｉおよびｉｖ））。磁石誘導ピーク電流は、活性化チャネルで、０．６２±０．４秒の立ち上がり時間および１．１±０．７４秒の３７％減衰時間、ならびに変異チャネルで、それぞれ、２．２９±１．８秒および１１．７±４．９秒を示した。コンストラクトを発現している視床下部細胞のベースライン特性は、影響を受けなかった（方法を参照されたい）。
【０１６７】
次に我々は、標準的ＭＲＩ装置の電磁コイルにより生成された外部磁界が、遠隔操作によりニューロンを調節してインビボで行動を制御可能であるか否かを試験した（図８Ｂ（ｉ））。低血糖症は、強力な行動反応の引き金となるので、我々は、同じ内分泌応答を誘起するＶＭＨ中のグルコキナーゼニューロンの活性化が食物摂取量を増やす可能性があると判断した。ＶＭＨグルコース感知ニューロンが糖欠乏性摂食応答に寄与するか否かを評価するために、我々は、動物を磁界（ＭＲＩ装置に隣接した）で、絶食後２０分間隔で３回処理した４４。αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンを発現しているＶＭＨ  ＧＫニューロンの磁石活性化は、血糖を上昇させた（図１６Ｂ）だけでなく、食物摂取量も有意に増加させた（図８Ｂ（ｉｉｉ））。摂食応答は、ＶＭＨ  ＧＫ−ｃｒｅニューロンの光遺伝学的活性化と類似であった。次に我々は、これらのニューロンの抑制が、食物摂取量を減少させる可能性があるか否かを、Ａｄ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１変異体／ＧＦＰ−フェリチンをＧＫ−ｃｒｅマウスのＶＭＨに注入することにより、試験した。神経の励起と対照的に、磁界中でのこれらのニューロンの抑制は、絶食の直後、極めて大きな摂食の減少をもたらした（図８Ｃ）。これらのデータは、ＶＭＨニューロンの抑制が、血糖の低下および摂食の減少の両方の、代謝疾患の処置のために有益であると思われる効果をもたらした。活性化および抑制性コンストラクトの両方で、処理のない場合には、コンストラクト発現がベースライン血糖または食物摂取量に与える効果がなく（図１７）、また、Ａｄ−αＧＦＰ−ＴＲＰＶ１／ＧＦＰ−フェリチンのいずれかをＶＭＨ注入後のＷＴマウスにおいて、磁界の血糖または摂食のいずれに対しても効果が認められなかった（図１６Ｃ）。
【０１６８】
この報告では、我々は、ＶＭＨグルコース感知ニューロンの遠隔操作による調節が、膵臓ホルモン、グルカゴンおよびインスリンのレベルを調節することにより、いずれの方向にしても、血糖を変化させることができ、また、神経活性化が摂食を高め、他方で、神経抑制が摂食を低減させることを示す。ＶＭＨ活性化が食物摂取量を高めることができるという知見は、意外であった。理由は、従来からこの核が満腹中枢と考えられてきたためである４５，４６。これらのニューロンの抑制がグルコースを低下させ、絶食４時間後の摂食を減らすという知見は、これらの細胞もまた、１日の流れの中で、食物摂取量を維持する役割を果たしており、また、これらのニューロンの抑制が代謝疾患という状況下で有益な効果があると思われることがさらに示唆される。ＶＭＨ  ＧＫニューロンの活性化が、低グルコースに対する応答によく似ており、また、それらの抑制が、この応答を低減させることから、我々は、グルコース抑制性ニューロンを標的としていたと想定している。グルコースがニューロンを抑制する機構は、明確ではなく、いくつかの機構が提案されている４７，４８。粒子の局所的加熱がミトコンドリアＵＣＰ２またはその他の機構を介して、独立した効果を有していたのではないかということは考えられるが、我々は、これはありそうもないと考えている。理由は、熱の距離よる消失および野生型と変異ＴＲＰＶ１は逆の効果４９を有していたという知見による。
【０１６９】
電波または磁界を用いた神経活動の制御は、光遺伝学的またはＤＲＥＡＤＤに比べて、有用な特徴を有する、神経調節に対する新しい手段を提供する。光遺伝学的と異なり、この手法は、永久的移植を必要とせず、移植が機能と干渉する可能性があるまたは固定できない部位に好適することが明らかになるであろう。さらに、光遺伝学的方法および外来性のナノ粒子を使ったその他の方法９，５０の両方は、局所的集団を標的とし、一方、我々の遺伝的にコードされた系は、複数の移植または注入を行うことなく、回路中の分散した集団および／または複数の異なる部位を同時に調節可能な潜在力を有する。実際に、ＴＲＰＶ１およびフェリチンコンストラクトの遺伝子導入マウス中への組み込みにより、注入の必要性を全く不要にし得る（最大でも単回の鉄の注入以外は）。本明細書で記載の系はまた、遅いため迅速な行動制御に対する有用性が制限されることがある５２，５３ＤＲＥＡＤＤ５１より迅速な応答を可能とする。カルシウムおよび／またはクロライド電流は多くの細胞型の活性を調節するので、我々の方法はまた、分散している物も含む、多くの他の集団、例えば、免疫、上皮および内分泌細胞（およびその他）の活性を調節するのに適用することができる。
【０１７０】
本発明をその好ましい実施形態に言及しながら具体的に示し、記載してきたが、請求項に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態や詳細を様々に変更してよいことを当業者なら理解するであろう。
【０１７１】
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３４．Ｐｅｎｉｃａｕｄ，Ｌ．，Ｒｏｈｎｅｒ−Ｊｅａｎｒｅｎａｕｄ，Ｆ．＆  Ｊｅａｎｒｅｎａｕｄ，Ｂ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌｌｙ  ａｆｔｅｒ  ｖｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５０，Ｅ６６２−６６８（１９８６）．
３５．Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｔ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ａ．＆  Ｂａｎ，Ｔ．Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌ  ａｎｄ  ｌａｔｅｒａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｎｕｃｌｅｉ  ｏｎ  ｂｌｏｏｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ２１０，１１７８−１１７９（１９６６）．
３６．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｉｓｌｅｔ  ｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０３，５９−６６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２７０９（２０１３）．
３７．Ｋａｎｇ，Ｌ．，Ｒｏｕｔｈ，Ｖ．Ｈ．，Ｋｕｚｈｉｋａｎｄａｔｈｉｌ，Ｅ．Ｖ．，Ｇａｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｄ．＆  Ｌｅｖｉｎ，Ｂ．Ｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｒａｔ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｖｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｇｌｕｃｏｓｅｎｓｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３，５４９−５５９（２００４）．
３８．Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  ＧＨＲＨ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  Ａｒｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １８，５９６−６０７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｍｅｔ．２０１３．０９．００２（２０１３）．
３９．Ｎｏｒｄｌｉｅ，Ｒ．Ｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｊ．Ｄ．＆  Ｌａｎｇｅ，Ａ．Ｊ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １９，３７９−４０６，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｎｕｔｒ．１９．１．３７９（１９９９）．
４０．Ｂｉｔｏ，Ｈ．，Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ，Ｋ．＆  Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｗ．ＣＲＥＢ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：ａ  Ｃａ（２＋）−  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ  ｄｕｒａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ８７，１２０３−１２１４（１９９６）．
４１．Ｇｈｏｓｈ，Ａ．，Ｇｉｎｔｙ，Ｄ．Ｄ．，Ｂａｄｉｎｇ，Ｈ．＆  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．Ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５，２９４−３０３，ｄｏｉ：１０．１００２／ｎｅｕ．４８０２５０３０９（１９９４）．
４２．Ｋｕｈｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｋｎｏｐ，Ｇ．＆  Ｌｕｃｋｈｏｆｆ，Ａ．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｓ６  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｃａｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ａｎｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＴＲＰＭ２  ａｎｄ  ＴＲＰＭ８．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８２，２７５９８−２７６０９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ７０２２４７２００（２００７）．
４３．Ｌａｎｄａｕ，Ｂ．Ｒ．＆  Ｌｕｂｓ，Ｈ．Ａ．Ａｎｉｍａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９９，１２４−１２７（１９５８）．
４４．Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｎ．Ｅ．，Ｂｅｌｌｕｓｈ，Ｌ．Ｌ．＆  Ｃａｒｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｐｒｉｖｉｃ  ｆｅｅｄｉｎｇ．Ｂｒａｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １４，６１７−６２４（１９８５）．
４５．Ｒｕｆｆｉｎ，Ｍ．＆  Ｎｉｃｏｌａｉｄｉｓ，Ｓ．Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｂｏｔｈ  ｆａｔ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒａｔｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｃｅｄｅ  ａｎｄ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ８４６，２３−２９（１９９９）．
４６．Ｋｉｎｇ，Ｂ．Ｍ．Ｔｈｅ  ｒｉｓｅ，ｆａｌｌ，ａｎｄ  ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ＆  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ８７，２２１−２４４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｈｙｓｂｅｈ．２００５．１０．００７（２００６）．
４７．Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ＡＴＰ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｋ  ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｐｌａｙ  ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３，２５４２−２５５１（２００４）．
４８．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ａ．，Ｆａｋｉｒａ，Ｋ．Ａ．，Ｓｏｎｇ，Ｚ．，Ｂｅｕｖｅ，Ａ．＆  Ｒｏｕｔｈ，Ｖ．Ｈ．ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｅｌｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９７，Ｃ７５０−７５８，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｃｅｌｌ．００１２７．２００９（２００９）．
４９．Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ  ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２：ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｉｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｃｅｎｔｅｒｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９，１０４１７−１０４２７（１９９９）．
５０．Ｃｈｅｎ，Ｒ．，Ｒｏｍｅｒｏ，Ｇ．，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｍｏｈｒ，Ａ．＆  Ａｎｉｋｅｅｖａ，Ｐ．Ｗｉｒｅｌｅｓｓ  ｍａｇｎｅｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｄｅｅｐ  ｂｒａｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４７，１４７７−１４８０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２６１８２１（２０１５）．
５１．Ａｇｕｌｈｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  Ｇｑ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５９１，５５９９−５６０９，
ｄｏｉ：１０．１１１３／ｊｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３．２６１２８９（２０１３）．
５２．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｍｏｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｖｏｌｖｅｄ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ６３，２７−３９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２００９．０６．０１４（２００９）．
５３．Ｎａｗａｒａｔｎｅ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍ４  ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｇａｉｎｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  ＤＲＥＡＤＤ（ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｄｒｕｇ）．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７４，１１１９−１１３１（２００８）．
５４．Ｆａｌｏｗｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．，Ｏｏｉ，Ｙ．Ｃ．＆  Ｂａｋａｙ，Ｒ．Ａ．Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｄｗａｒｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｄｅｅｐ  Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．
Ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ：ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｎｅｒ．１２３３５（２０１５）．
５５．Ｃａｔｅｒｉｎａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ  ｈｅａｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，８１６−８２４，ｄｏｉ：１０．１０３８／３９８０７（１９９７）．
【図１Ａ】
2017529105.tif 000002
【図１Ｂ】
2017529105.tif 000003
【図１Ｃ】
2017529105.tif 000004
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【国際調査報告】
2017529105.tif 000070
2017529105.tif 000071
2017529105.tif 000072