(57)【要約】本発明は、本発明の免疫結合体を用いて、対象にて急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（たとえば、新規に診断された、再発したまたは難治性のＡＭＬ）を特徴付け、治療する方法を特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における急性骨髄性白血病の治療方法であって、前記方法が予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与することを含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化１】
2017517507.tif 000114
または
【化２】
2017517507.tif 000115
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化３】
2017517507.tif 000116
【化４】
2017517507.tif 000117
【化５】
2017517507.tif 000118
または
【化６】
2017517507.tif 000119
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、予め選択することは対象の生体試料にてＣＤ３３を検出することを含む、前記治療方法。
【請求項２】
対象における急性骨髄性白血病の治療方法であって、前記方法が生体試料にて細胞当たり約１，０００のＣＤ３３抗原を有すると判定された対象に有効量の免疫結合体を投与することを含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化７】
2017517507.tif 000120
または
【化８】
2017517507.tif 000121
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化９】
2017517507.tif 000122
【化１０】
2017517507.tif 000123
【化１１】
2017517507.tif 000124
または
【化１２】
2017517507.tif 000125
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、予め選択することは対象の生体試料にてＣＤ３３を検出することを含む、前記治療方法。
【請求項３】
重鎖可変領域が、配列番号７または９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
軽鎖可変領域が、配列番号８または１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
抗体が、ヒト化されたＭｙ９−６抗体またはキメラＭｙ９−６抗体である請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
ヒト化された抗体がＣＤＲ移植抗体または再表面化抗体である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
免疫結合体が、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエートを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化Ｍｙ９−６抗体を含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化１３】
2017517507.tif 000126
【化１４】
2017517507.tif 000127
【化１５】
2017517507.tif 000128
【化１６】
2017517507.tif 000129
【化１７】
2017517507.tif 000130
【化１８】
2017517507.tif 000131
【化１９】
2017517507.tif 000132
【化２０】
2017517507.tif 000133
または
【化２１】
2017517507.tif 000134
の１つまたは薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは、各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
検出する工程が、対象の末梢血または骨髄の試料に存在するＣＤ３３のレベルを測定することを含み、細胞当たり約１，０００〜２５，０００の間の抗原を検出することが免疫結合体に応答しそうである対象を予め選択する請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
細胞当たり約３，０００〜２５，０００の間の抗原を検出することが免疫結合体に応答しそうである対象を予め選択する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞当たり約５，０００〜２５，０００の間の抗原を検出することが免疫結合体に応答しそうである対象を予め選択する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
検出する工程が、対象の末梢血または骨髄の試料に存在するＣＤ３３のレベルを測定することを含み、細胞当たり少なくとも約１，０００、３，０００または５，０００の抗原を検出することが免疫結合体に応答しそうである対象を予め選択する請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
対象が急性骨髄性白血病であると新規に診断される請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
対象が、急性骨髄性白血病の再発または難治性の急性骨髄性白血病であると診断される請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
急性骨髄性白血病の再発または難治性の急性骨髄性白血病であると診断された対象に由来する試料が細胞当たり少なくとも約３，０００の抗原を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象の治療方法であって、前記方法が予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与することを含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化２２】
2017517507.tif 000135
または
【化２３】
2017517507.tif 000136
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化２４】
2017517507.tif 000137
【化２５】
2017517507.tif 000138
【化２６】
2017517507.tif 000139
または
【化２７】
2017517507.tif 000140
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、予め選択することは対象の生体試料にてＦＬＴ３−ＩＴＤを検出することを含む、前記治療方法。
【請求項１６】
急性骨髄性白血病を有する対象の治療方法であって、前記方法がＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有すると判定された予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与することを含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化２８】
2017517507.tif 000141
または
【化２９】
2017517507.tif 000142
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化３０】
2017517507.tif 000143
【化３１】
2017517507.tif 000144
【化３２】
2017517507.tif 000145
または
【化３３】
2017517507.tif 000146
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、予め選択することは対象の生体試料にてＦＬＴ３−ＩＴＤの状況を判定することを含む、前記治療方法。
【請求項１７】
前記生体試料が前記対象に由来する末梢血または骨髄の試料である請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記判定することが核酸のハイブリッド形成法または核酸の配列決定法を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記判定することが、ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲ、またはそれらの組み合わせを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する前記対象についてＣＤ３３のレベルが判定される請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤ３３のレベルが細胞当たり１，０００〜２５，０００の間のＣＤ３３抗原であると判定される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＤ３３のレベルが細胞当たり３，０００〜２５，０００の間のＣＤ３３抗原であると判定される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＤ３３のレベルが細胞当たり５，０００〜１５，０００の間のＣＤ３３抗原であると判定される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
重鎖可変領域が、配列番号７または９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２５】
軽鎖可変領域が、配列番号８または１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２６】
抗体が、ヒト化されたＭｙ９−６抗体またはキメラＭｙ９−６抗体である請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト化された抗体がＣＤＲ移植抗体または再表面化抗体である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫結合体が、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエートを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化Ｍｙ９−６抗体を含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化３４】
2017517507.tif 000147
【化３５】
2017517507.tif 000148
【化３６】
2017517507.tif 000149
【化３７】
2017517507.tif 000150
【化３８】
2017517507.tif 000151
【化３９】
2017517507.tif 000152
【化４０】
2017517507.tif 000153
【化４１】
2017517507.tif 000154
または
【化４２】
2017517507.tif 000155
の１つまたは薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは、各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２９】
対象を免疫結合体による治療に応答性であると特定する方法であって、前記方法が
（ａ）前記対象に由来する生体試料にてＦＬＴ３−ＩＴＤを検出することと
（ｂ）ＦＬＴ３−ＩＴＤの検出を治療に対する対象の応答性に相関させることとを含み、前記生体試料におけるＦＬＴ３−ＩＴＤの存在が対象を前記免疫結合体による治療に応答性であると特定し、
前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化４３】
2017517507.tif 000156
または
【化４４】
2017517507.tif 000157
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化４５】
2017517507.tif 000158
【化４６】
2017517507.tif 000159
【化４７】
2017517507.tif 000160
または
【化４８】
2017517507.tif 000161
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンである、前記方法。
【請求項３０】
前記方法がさらに、前記対象の細胞にてＣＤ３３のレベルを検出することを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞当たり少なくとも約１，０００のＣＤ３３抗原を検出することが、対象を免疫結合体による治療に応答性であると特定する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞当たり少なくとも約３，０００のＣＤ３３抗原を検出することが、対象を免疫結合体による治療に応答性であると特定する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞当たり少なくとも約５，０００のＣＤ３３抗原を検出することが、対象を免疫結合体による治療に応答性であると特定する請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象が、急性骨髄性白血病であると新規に診断され、急性骨髄性白血病の再発を有すると特定され、または難治性の急性骨髄性白血病を有すると特定される請求項１５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象が、急性骨髄性白血病の再発であると診断され、チロシンキナーゼ阻害剤による以前の治療を受けていない請求項１５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
チロシンキナーゼ阻害剤がＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象が、チロシンキナーゼ阻害剤による以前の治療を受けた後に急性骨髄性白血病の再発であると診断される請求項１５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
チロシンキナーゼ阻害剤がＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象が、難治性の急性骨髄性白血病であると診断され、チロシンキナーゼ阻害剤による以前の治療を受けていない請求項１５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
チロシンキナーゼ阻害剤がＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象が、チロシンキナーゼ阻害剤による以前の治療を受けた後に難治性の急性骨髄性白血病であると診断される請求項１５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
チロシンキナーゼ阻害剤がＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
対象における急性骨髄性白血病の再発の治療方法または予防方法であって、前記方法が、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有すると判定され、且つチロシンキナーゼ阻害剤による以前の治療を受けていない予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与すること含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化４９】
2017517507.tif 000162
または
【化５０】
2017517507.tif 000163
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化５１】
2017517507.tif 000164
【化５２】
2017517507.tif 000165
【化５３】
2017517507.tif 000166
または
【化５４】
2017517507.tif 000167
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンである、前記治療方法または予防方法。
【請求項４４】
チロシンキナーゼ阻害剤がＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
対象における急性骨髄性白血病の再発の治療方法または予防方法であって、前記方法が、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有すると判定され、且つチロシンキナーゼ阻害剤による以前の治療を受けている予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与すること含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化５５】
2017517507.tif 000168
または
【化５６】
2017517507.tif 000169
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化５７】
2017517507.tif 000170
【化５８】
2017517507.tif 000171
【化５９】
2017517507.tif 000172
または
【化６０】
2017517507.tif 000173
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンである、前記治療方法または予防方法。
【請求項４６】
チロシンキナーゼ阻害剤がＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
多剤耐性の急性骨髄性白血病を有する対象の治療方法であって、前記方法が対象に有効量の免疫結合体を投与することを含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化６１】
2017517507.tif 000174
または
【化６２】
2017517507.tif 000175
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化６３】
2017517507.tif 000176
【化６４】
2017517507.tif 000177
【化６５】
2017517507.tif 000178
または
【化６６】
2017517507.tif 000179
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、それによって多剤耐性の急性骨髄性白血病を治療する、前記治療方法。
【請求項４８】
対象が多剤耐性の白血病を有すると特定される請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
重鎖可変領域が、配列番号７または９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
軽鎖可変領域が、配列番号８または１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
抗体が、ヒト化されたＭｙ９−６抗体である請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
ヒト化された抗体がキメラ抗体または再表面化抗体である請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
免疫結合体が、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエートを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化Ｍｙ９−６抗体を含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化６７】
2017517507.tif 000180
【化６８】
2017517507.tif 000181
【化６９】
2017517507.tif 000182
【化７０】
2017517507.tif 000183
【化７１】
2017517507.tif 000184
【化７２】
2017517507.tif 000185
【化７３】
2017517507.tif 000186
【化７４】
2017517507.tif 000187
または
【化７５】
2017517507.tif 000188
の１つまたは薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは、各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
対象の末梢血または骨髄の試料におけるＰ−糖タンパク質発現の存在を検出することによって前記対象が多剤耐性の白血病を有すると特定される請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
さらに、対象の末梢血または骨髄の試料においてＣＤ３３発現の存在を検出することを含む請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
細胞当たり約１，０００、３，０００または５，０００を超えるＣＤ３３抗原のレベルが免疫結合体による治療に応答性としてＡＭＬを特定する請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
対象に有効量の免疫結合体を投与することを含む前記対象において急性骨髄性白血病の再発の治療するまたは予防する方法であって、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化７６】
2017517507.tif 000189
または
【化７７】
2017517507.tif 000190
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化７８】
2017517507.tif 000191
【化７９】
2017517507.tif 000192
【化８０】
2017517507.tif 000193
または
【化８１】
2017517507.tif 000194
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、それによって前記急性骨髄性白血病の再発を治療する、前記方法。
【請求項５８】
重鎖可変領域が、配列番号７または９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
軽鎖可変領域が、配列番号８または１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
抗体が、ヒト化されたＭｙ９−６抗体である請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
ヒト化された抗体が再表面化抗体またはＣＤＲ移植抗体である請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
免疫結合体が、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエートを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化Ｍｙ９−６抗体を含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化８２】
2017517507.tif 000195
【化８３】
2017517507.tif 000196
【化８４】
2017517507.tif 000197
【化８５】
2017517507.tif 000198
【化８６】
2017517507.tif 000199
【化８７】
2017517507.tif 000200
【化８８】
2017517507.tif 000201
【化８９】
2017517507.tif 000202
または
【化９０】
2017517507.tif 000203
の１つまたは薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは、各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
方法が、最少残余疾患を防ぐ、軽減するまたは排除する請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
抗体が、ＣＤ３３を発現している白血病性前駆細胞及び／または白血病性幹細胞を特異的に結合する請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
方法が正常な造血幹細胞を見逃す請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
白血病性幹細胞にて細胞死を誘導する方法であって、前記方法が、以下の構造式：
【化９１】
2017517507.tif 000204
または
【化９２】
2017517507.tif 000205
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化９３】
2017517507.tif 000206
【化９４】
2017517507.tif 000207
【化９５】
2017517507.tif 000208
または
【化９６】
2017517507.tif 000209
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含む、有効量の免疫結合体に前記白血病性幹細胞を接触させることを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、それによって前記白血病性幹細胞にて細胞死を誘導する、前記方法。
【請求項６７】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の白血病性細胞にて細胞死を誘導する方法であって、前記方法が、以下の構造式：
【化９７】
2017517507.tif 000210
または
【化９８】
2017517507.tif 000211
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化抗体またはキメラ抗体またはその断片（前記抗体は、配列番号１〜３から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６から成る群から選択される１以上の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含む）と、
以下の構造式：
【化９９】
2017517507.tif 000212
【化１００】
2017517507.tif 000213
【化１０１】
2017517507.tif 000214
または
【化１０２】
2017517507.tif 000215
の１つによって表される前記細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含む、有効量の免疫結合体に前記白血病性幹細胞を接触させることを含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、それによって前記ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の白血病性細胞にて細胞死を誘導する、前記方法。
【請求項６８】
重鎖可変領域が、配列番号７または９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
軽鎖可変領域が、配列番号８または１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７０】
抗体が、ヒト化されたＭｙ９−６抗体である請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７１】
ヒト化された抗体が再表面化抗体またはＣＤＲ移植抗体である請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
免疫結合体が、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエートを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されたヒト化Ｍｙ９−６抗体を含み、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化１０３】
2017517507.tif 000216
【化１０４】
2017517507.tif 000217
【化１０５】
2017517507.tif 000218
【化１０６】
2017517507.tif 000219
【化１０７】
2017517507.tif 000220
【化１０８】
2017517507.tif 000221
【化１０９】
2017517507.tif 000222
【化１１０】
2017517507.tif 000223
または
【化１１１】
2017517507.tif 000224
の１つまたは薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは、各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７３】
方法が正常な造血幹細胞では細胞死を誘導しない請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７４】
接触させることが試験管内または生体内である請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７５】
白血病性幹細胞が、急性骨髄性白血病であると新規に診断された対象に、白血病性幹細胞の成長または増殖に関連する再発を有すると特定された対象に、または難治性の急性骨髄性白血病であると特定された対象に存在する請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項７６】
免疫結合体が約１０ｐＭ〜約２ｎＭのＩＣ５０値を有する請求項１〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
免疫結合体が約１１ｐＭ〜約１．６ｎＭのＩＣ５０値を有する請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
方法が白血病性幹細胞を優先的に殺傷する請求項１〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
抗体が、少なくとも１つの重鎖可変領域またはその断片と少なくとも１つの軽鎖可変領域またはその断片とを含み、前記少なくとも１つの重鎖可変領域またはその断片がそれぞれ配列番号１〜３にて示されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含み、且つ前記少なくとも１つの軽鎖可変領域またはその断片がそれぞれ配列番号４〜６にて示されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含む請求項１〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
抗体またはその断片が、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む請求項１〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
抗ＣＤ３３抗体と、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエートによって細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に連結された、有効量の免疫結合体を含むヒト化Ｍｙ９−６抗体を含む治療用組成物とを含むキットであって、前記免疫結合体が、以下の構造式：
【化１１２】
2017517507.tif 000225
【化１１３】
2017517507.tif 000226
【化１１４】
2017517507.tif 000227
【化１１５】
2017517507.tif 000228
【化１１６】
2017517507.tif 000229
【化１１７】
2017517507.tif 000230
【化１１８】
2017517507.tif 000231
【化１１９】
2017517507.tif 000232
または
【化１２０】
2017517507.tif 000233
の１つまたは薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは、各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである、前記キット。
【請求項８２】
キットがさらに、抗ＣＤ３３抗体を用いて対象に由来する試料にてＣＤ３３の発現のレベルを検出するための指示書を含む請求項８１に記載のキット。
【請求項８３】
さらに、細胞当たり少なくとも約１，０００の抗原を有すると特定された対象に免疫結合体を投与するための指示書を含む請求項８１に記載のキット。
【請求項８４】
対象が細胞当たり少なくとも約３，０００または５，０００の抗原を有すると特定される請求項８３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ２０１４年５月２０日に出願された米国特許出願番号第６２／００１，０１５号、２０１４年６月１２に出願された同第６２／０１１，４５６号及び２０１４年１１月５に出願された同第６２／０７５，７１５号に対する優先権及びその利益を主張する。これらの出願それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は骨髄における異常な芽細胞の蓄積に関連する。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は成人の間での最も一般的な型の白血病の１つである。米国だけでも毎年１８，０００を超えるＡＭＬの新しい症例が特定され、１０，０００を超える死亡がＡＭＬに関連している。化学療法に対する当初の高い応答率にもかかわらず、多くの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者は完全寛解を達成することができない。実際、ＡＭＬ患者の大半は診断から３〜５年以内に再発する。ＡＭＬの再発は持続性の白血病性幹細胞（ＬＳＣ）の増殖によると考えられる。従って、対象にてＡＭＬを特徴付け、有効な治療法を特定する改善された方法と同様にＡＭＬの再発を治療する改善された方法が緊急に求められている。
【発明の概要】
【０００３】
以下に記載されるように、本発明は、本発明の免疫結合体を用いて対象にて急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（たとえば、新しく診断された、再発した及び難治性のＡＭＬ）を特徴付け、治療する方法を特徴とする。
【０００４】
態様の１つでは、本発明は一般に対象（たとえば、ヒト）にて急性骨髄性白血病を治療する方法を特徴とし、該方法には、予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与することが関与し、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【０００５】
【化１】
2017517507.tif 000003
または
【０００６】
【化２】
2017517507.tif 000004
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【０００７】
【化３】
2017517507.tif 000005
【０００８】
【化４】
2017517507.tif 000006
【０００９】
【化５】
2017517507.tif 000007
または
【００１０】
【化６】
2017517507.tif 000008
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有し、
式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、予め選択することには対象の生体試料にてＣＤ３３を検出することが関与する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、対象にて急性骨髄性白血病を治療する方法を特徴とし、該方法には、生体試料における細胞当たり約１，０００のＣＤ３３抗原を有すると判定された対象に有効量の免疫結合体を投与することが関与し、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【００１２】
【化７】
2017517507.tif 000009
または
【００１３】
【化８】
2017517507.tif 000010
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００１４】
【化９】
2017517507.tif 000011
【００１５】
【化１０】
2017517507.tif 000012
【００１６】
【化１１】
2017517507.tif 000013
または
【００１７】
【化１２】
2017517507.tif 000014
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有し、
式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、予め選択することには対象の生体試料にてＣＤ３３を検出することが関与する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象を治療する方法を特徴とし、該方法には、予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与することが関与し、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【００１９】
【化１３】
2017517507.tif 000015
または
【００２０】
【化１４】
2017517507.tif 000016
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００２１】
【化１５−１】
2017517507.tif 000017
【化１５−２】
2017517507.tif 000018
【００２２】
【化１６】
2017517507.tif 000019
または
【００２３】
【化１７】
2017517507.tif 000020
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有し、
式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、予め選択することには対象の生体試料にてＦＬＴ３−ＩＴＤを検出することを含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は急性骨髄性白血病を有する対象を治療する方法を特徴とし、該方法はＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有すると判定された予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与することを含み、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【００２５】
【化１８】
2017517507.tif 000021
または
【００２６】
【化１９】
2017517507.tif 000022
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００２７】
【化２０】
2017517507.tif 000023
【００２８】
【化２１】
2017517507.tif 000024
【００２９】
【化２２】
2017517507.tif 000025
または
【００３０】
【化２３】
2017517507.tif 000026
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有し、
式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、予め選択することは対象の生体試料にてＦＬＴ３−ＩＴＤの状況を判定することを含む。
【００３１】
別の態様では、本発明は免疫結合体による治療に応答性である対象を特定する方法を特徴とし、該方法には、対象からの生体試料にてＦＬＴ３−ＩＴＤを検出することと、治療に対する対象の応答性とＦＬＴ３−ＩＴＤの検出を相関させることとが関与し、生体試料におけるＦＬＴ３−ＩＴＤの存在が免疫結合体による治療に対して応答性として患者を特定し、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【００３２】
【化２４】
2017517507.tif 000027
または
【００３３】
【化２５】
2017517507.tif 000028
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００３４】
【化２６】
2017517507.tif 000029
【００３５】
【化２７】
2017517507.tif 000030
【００３６】
【化２８】
2017517507.tif 000031
または
【００３７】
【化２９】
2017517507.tif 000032
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有し、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンである。
【００３８】
別の態様では、本発明は対象にて急性骨髄性白血病の再発を治療するまたは予防する方法を特徴とし、該方法には、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有すると判定され、チロシンキナーゼ阻害剤による以前の治療を受けていない予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与することが関与し、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【００３９】
【化３０】
2017517507.tif 000033
または
【００４０】
【化３１】
2017517507.tif 000034
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００４１】
【化３２】
2017517507.tif 000035
【００４２】
【化３３】
2017517507.tif 000036
【００４３】
【化３４】
2017517507.tif 000037
または
【００４４】
【化３５】
2017517507.tif 000038
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有し、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンである。
【００４５】
別の態様では、本発明は対象にて急性骨髄性白血病の再発を治療するまたは予防する方法を特徴とし、該方法には、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有すると判定され、チロシンキナーゼ阻害剤による以前の治療を受けている予め選択された対象に有効量の免疫結合体を投与することが関与し、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【００４６】
【化３６】
2017517507.tif 000039
または
【００４７】
【化３７】
2017517507.tif 000040
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００４８】
【化３８】
2017517507.tif 000041
【００４９】
【化３９】
2017517507.tif 000042
【００５０】
【化４０】
2017517507.tif 000043
または
【００５１】
【化４１】
2017517507.tif 000044
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有し、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンである。
【００５２】
別の態様では、本発明は多剤耐性の急性骨髄性白血病を有する対象を治療する方法を特徴とし、該方法には、対象に有効量の免疫結合体を投与することが関与し、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【００５３】
【化４２】
2017517507.tif 000045
または
【００５４】
【化４３】
2017517507.tif 000046
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００５５】
【化４４】
2017517507.tif 000047
【００５６】
【化４５】
2017517507.tif 000048
【００５７】
【化４６】
2017517507.tif 000049
または
【００５８】
【化４７】
2017517507.tif 000050
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有し、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、それによって多剤耐性の急性骨髄性白血病を治療する。一実施形態では、対象は多剤耐性の白血病を有すると特定される。別の実施形態では、対象は対象の末梢血または骨髄の試料にてＰ−糖タンパク質発現の存在を検出することによって多剤耐性の白血病を有すると特定される。さらに別の実施形態では、方法にはさらに、対象の末梢血または骨髄の試料にてＣＤ３３発現の存在を検出することが関与する。さらに別の実施形態では、細胞当たり約１，０００、３，０００または５，０００を超えるレベルのＣＤ３３抗原は免疫結合体による治療に対して応答性であるとＡＭＬを特定する。
【００５９】
さらに別の態様では、本発明は、対象に有効量の免疫結合体を投与することが関与する、対象にて急性骨髄性白血病の再発を治療するまたは予防する方法を特徴とし、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【００６０】
【化４８】
2017517507.tif 000051
または
【００６１】
【化４９】
2017517507.tif 000052
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００６２】
【化５０】
2017517507.tif 000053
【００６３】
【化５１】
2017517507.tif 000054
【００６４】
【化５２】
2017517507.tif 000055
または
【００６５】
【化５３】
2017517507.tif 000056
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有し、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、それによって急性骨髄性白血病の再発を治療する。一実施形態では、該方法は最少残存疾患を予防し、軽減し、または排除する。別の実施形態では、抗体はＣＤ３３を発現している白血病性前駆細胞及び／または白血病性幹細胞を特異的に結合する。別の実施形態では、方法は正常な造血幹細胞を見逃す。
【００６６】
別の態様では、本発明は白血病性幹細胞にて細胞死を誘導する方法を特徴とし、該方法には、以下の構造式：
【００６７】
【化５４】
2017517507.tif 000057
または
【００６８】
【化５５】
2017517507.tif 000058
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００６９】
【化５６】
2017517507.tif 000059
【００７０】
【化５７】
2017517507.tif 000060
【００７１】
【化５８】
2017517507.tif 000061
または
【００７２】
【化５９】
2017517507.tif 000062
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有する、有効量の免疫結合体に白血病性幹細胞を接触させることが関与し、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、それによって白血病性幹細胞にて細胞死を誘導する。一実施形態では、方法は正常な造血幹細胞にて細胞死を誘導しない。別の実施形態では、接触させることは試験管内または生体内である。別の実施形態では、白血病性幹細胞は急性骨髄性白血病と新規に診断された対象に、白血病性幹細胞の成長または増殖に関連する再発を有すると特定された対象に、または難治性急性骨髄性白血病を有すると特定された対象に存在する。
【００７３】
別の態様では、本発明はＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の白血病性細胞にて細胞死を誘導する方法を特徴とし、該方法には、以下の構造式：
【００７４】
【化６０】
2017517507.tif 000063
または
【００７５】
【化６１】
2017517507.tif 000064
によって表される切断可能なジスルフィドリンカーを介して細胞傷害性のベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化抗体またはキメラ抗体または断片（該抗体は、配列番号１〜３のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する重鎖可変領域及び／または配列番号４〜６のいずれか１以上である１以上の相補性決定領域を含有する軽鎖可変領域を含有する）と、
以下の構造式：
【００７６】
【化６２】
2017517507.tif 000065
【００７７】
【化６３】
2017517507.tif 000066
【００７８】
【化６４】
2017517507.tif 000067
または
【００７９】
【化６５】
2017517507.tif 000068
の１つによって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩とを含有する、有効量の免疫結合体に白血病性幹細胞を接触させることが関与し、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンであり、それによってＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の白血病性細胞にて細胞死を誘導する。一実施形態では、方法は正常な造血幹細胞にて細胞死を誘導しない。別の実施形態では、接触させることは試験管内または生体内である。別の実施形態では、白血病性幹細胞は急性骨髄性白血病であると新規に診断された対象に、白血病性幹細胞の成長または増殖に関連する再発を有すると特定された対象に、または難治性急性骨髄性白血病を有すると特定された対象に存在する。
【００８０】
別の態様では、本発明は、抗ＣＤ３３抗体と、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエートによって細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に連結されたヒト化Ｍｙ９−６抗体を含有する有効量の免疫結合体を含有する治療用組成物とを含有するキットを特徴とし、その際、該免疫結合体は、以下の構造式：
【００８１】
【化６６】
2017517507.tif 000069
【００８２】
【化６７】
2017517507.tif 000070
【００８３】
【化６８】
2017517507.tif 000071
【００８４】
【化６９】
2017517507.tif 000072
【００８５】
【化７０】
2017517507.tif 000073
【００８６】
【化７１】
2017517507.tif 000074
【００８７】
【化７２】
2017517507.tif 000075
【００８８】
【化７３】
2017517507.tif 000076
または
【００８９】
【化７４】
2017517507.tif 000077
【００９０】
【化７５】
2017517507.tif 000078
の１つまたは薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである。一実施形態では、キットはさらに対象に由来する試料にて抗ＣＤ３３抗体を用いてＣＤ３３発現のレベルを検出するための指示書を含有する。別の実施形態では、細胞当たり少なくとも約１，０００の抗原を有すると特定された対象に免疫結合体を投与するための指示書をさらに含有すること。別の実施形態では、対象は細胞当たり少なくとも約３，０００または５，０００の抗原を有すると特定される。
【００９１】
上記態様の、または本明細書で詳述される本発明の他の態様の種々の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号７または９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、軽鎖可変領域は、配列番号８または１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する。上記態様の種々の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含有する少なくとも１つの重鎖可変領域またはその断片、及びそれぞれ配列番号４〜６で示されるアミノ酸配列を有する３つの連続する相補性決定領域を含有する少なくとも１つの軽鎖可変領域またはその断片を有する。上記態様の種々の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を有する。上記態様の種々の実施形態では、抗体はヒト化Ｍｙ９−６抗体またはキメラＭｙ９−６抗体である。上記態様の種々の実施形態では、ヒト化抗体はＣＤＲ−移植または再表面化抗体である。上記態様の種々の実施形態では、免疫結合体は、Ｎ−（スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエートを介して細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物に結合されるヒト化Ｍｙ９−６抗体を含有し、その際、該免疫結合体は以下の構造式：
【００９２】
【化７６】
2017517507.tif 000079
【００９３】
【化７７】
2017517507.tif 000080
【００９４】
【化７８】
2017517507.tif 000081
【００９５】
【化７９】
2017517507.tif 000082
【００９６】
【化８０】
2017517507.tif 000083
【００９７】
【化８１】
2017517507.tif 000084
【００９８】
【化８２】
2017517507.tif 000085
【００９９】
【化８３】
2017517507.tif 000086
または
【０１００】
【化８４】
2017517507.tif 000087
【０１０１】
【化８５】
2017517507.tif 000088
の１つまたは薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである。
【０１０２】
上記態様の種々の実施形態では、検出する工程には、対象の末梢血または骨髄の試料に存在するＣＤ３３のレベルを測定することが関与し、その際、細胞当たり約１，０００〜２５，０００（たとえば、２，０００〜２０，０００；３，０００〜２５，０００；３，０００〜２０，０００；３，０００〜１８，０００；５，０００〜１８，０００；５，０００〜２０，０００；５，０００〜２５，０００）の間の抗原を検出することによって免疫結合体に応答する見込みがあるとして対象が予め選択される。上記態様の種々の実施形態では、細胞当たり約３，０００〜２５，０００の間の抗原を検出することによって免疫結合体に応答する見込みがあるとして対象が予め選択され、または細胞当たり約５，０００〜２５，０００の間の抗原を検出することによって免疫結合体に応答する見込みがあるとして対象が予め選択される。上記態様の種々の実施形態では、検出する工程には対象の末梢血または骨髄の試料に存在するＣＤ３３のレベルを測定することが関与し、その際、細胞当たり少なくとも約１，０００、３，０００または５，０００の抗原を検出することによって免疫結合体に応答する見込みがあるとして対象が予め選択される。上記態様の種々の実施形態では、対象は急性骨髄性白血病であると新規に診断される。上記態様の種々の実施形態では、対象は急性骨髄性白血病の再発または難治性の急性骨髄性白血病であると診断される。上記態様の種々の実施形態では、急性骨髄性白血病の再発または難治性の急性骨髄性白血病であると診断された対象に由来する試料は細胞当たり少なくとも約３，０００の抗原を含有する。上記態様の種々の実施形態では、免疫結合体は約１０ｐＭ〜約２ｎＭのＩＣ５０値を有する。上記態様の種々の実施形態では、免疫結合体は約１１ｐＭ〜約１．６ｎＭのＩＣ５０値を有する。上記態様の種々の実施形態では、方法は白血病性幹細胞を優先的に殺傷する。
【０１０３】
上記態様の、または本明細書で詳述される本発明の他の態様の種々の実施形態では、検出する工程には対象の生体（たとえば、末梢血または骨髄）試料にてＦＬＴ３−ＩＴＤの変異の存在を検出することが関与する。上記態様の種々の実施形態では、検出する工程には核酸のハイブリッド形成法または核酸の配列決定法が関与する。上記態様の種々の実施形態では、検出する工程にはＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲの１以上が関与する。上記態様の種々の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤はＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤である。上記態様の種々の実施形態では、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象は急性骨髄性白血病の再発であると診断され、チロシンキナーゼ阻害剤（たとえば、ＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤）による以前の治療を受けていない。上記態様の種々の実施形態では、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象はチロシンキナーゼ阻害剤（たとえば、ＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤）による以前の治療を受けた後、急性骨髄性白血病の再発であると診断される。上記態様の種々の実施形態では、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象は難治性の急性骨髄性白血病であると診断され、チロシンキナーゼ阻害剤（たとえば、ＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤）による以前の治療を受けていない。上記態様の種々の実施形態では、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性の急性骨髄性白血病を有する対象はチロシンキナーゼ阻害剤（たとえば、ＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤）による以前の治療を受けた後、難治性の急性骨髄性白血病であると診断される。
【０１０４】
上記態様のいずれかの特定の実施形態では、本明細書で記載される結合体を含む組成物は抗体分子当たり平均１〜１０の細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体分子を含んでもよい。抗体分子当たりの細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体分子の平均比率は本明細書では薬剤抗体比（ＤＡＲ）と呼ばれる。一実施形態では、ＤＡＲは２〜８、３〜７、３〜５または２．５〜３．５である。
【０１０５】
本発明の他の特徴及び利点は詳細な説明から、及びクレームから明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて本発明が属する技術の当業者によって共通して理解される意味を有する。以下の参考文献は本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら．（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ならびにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用されるとき、以下の用語は特定されない限り、以下でそれらに帰する意味を有する。
【０１０７】
「Ｐ−糖タンパク質」によって、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１０３５８３０で提供されるヒトの配列に対して少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、それが発現される細胞にて多剤耐性を付与するポリペプチドまたはその断片を意味する。例となるヒトＰ−糖タンパク質の配列は以下に提供される：
１  ｍａａａｅａｇｇｄｄ  ａｒｃｖｒｌｓａｅｒ  ａｑａｌｌａｄｖｄｔ  ｌｌｆｄｃｄｇｖｌｗ  ｒｇｅｔａｖｐｇａｐ  ｅａｌｒａｌｒａｒｇ
６１  ｋｒｌｇｆｉｔｎｎｓ  ｓｋｔｒａａｙａｅｋ  ｌｒｒｌｇｆｇｇｐａ  ｇｐｇａｓｌｅｖｆｇ  ｔａｙｃｔａｌｙｌｒ  ｑｒｌａｇａｐａｐｋ
１２１  ａｙｖｌｇｓｐａｌａ  ａｅｌｅａｖｇｖａｓ  ｖｇｖｇｐｅｐｌｑｇ  ｅｇｐｇｄｗｌｈａｐ  ｌｅｐｄｖｒａｖｖｖ  ｇｆｄｐｈｆｓｙｍｋ
１８１  ｌｔｋａｌｒｙｌｑｑ  ｐｇｃｌｌｖｇｔｎｍ  ｄｎｒｌｐｌｅｎｇｒ  ｆｉａｇｔｇｃｌｖｒ  ａｖｅｍａａｑｒｑａ  ｄｉｉｇｋｐｓｒｆｉ
２４１  ｆｄｃｖｓｑｅｙｇｉ  ｎｐｅｒｔｖｍｖｇｄ  ｒｌｄｔｄｉｌｌｇａ  ｔｃｇｌｋｔｉｌｔｌ  ｔｇｖｓｔｌｇｄｖｋ  ｎｎｑｅｓｄｃｖｓｋ
３０１  ｋｋｍｖｐｄｆｙｖｄ  ｓｉａｄｌｌｐａｌｑ  ｇ
【０１０８】
「Ｐ−糖タンパク質ポリヌクレオチド」によってＰ−糖タンパク質をコードする核酸分子を意味する。
【０１０９】
「ＣＤ３３タンパク質」によってＮＣＢＩ受入番号ＣＡＤ３６５０９で提供されるヒトの配列に対して少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、抗ＣＤ３３抗体の結合活性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。例となるヒトＣＤ３３のアミノ酸配列が以下で提供される：
１  ｍｐｌｌｌｌｌｐｌｌ  ｗａｇａｌａｍｄｐｎ  ｆｗｌｑｖｑｅｓｖｔ  ｖｑｅｇｌｃｖｌｖｐ  ｃｔｆｆｈｐｉｐｙｙ  ｄｋｎｓｐｖｈｇｙｗ
６１  ｆｒｅｇａｉｉｓｒｄ  ｓｐｖａｔｎｋｌｄｑ  ｅｖｑｅｅｔｑｇｒｆ  ｒｌｌｇｄｐｓｒｎｎ  ｃｓｌｓｉｖｄａｒｒ  ｒｄｎｇｓｙｆｆｒｍ
１２１  ｅｒｇｓｔｋｙｓｙｋ  ｓｐｑｌｓｖｈｖｔｄ  ｌｔｈｒｐｋｉｌｉｐ  ｇｔｌｅｐｇｈｓｋｎ  ｌｔｃｓｖｓｗａｃｅ  ｑｇｔｐｐｉｆｓｗｌ
１８１  ｓａａｐｔｓｌｇｐｒ  ｔｔｈｓｓｖｌｉｉｔ  ｐｒｐｑｄｈｇｔｎｌ  ｔｃｑｖｋｆａｇａｇ  ｖｔｔｅｒｔｉｑｌｎ  ｖｔｙｖｐｑｎｐｔｔ
２４１  ｇｉｆｐｇｄｇｓｇｋ  ｑｅｔｒａｇｖｖｈｇ  ａｉｇｇａｇｖｔａｌ  ｌａｌｃｌｃｌｉｆｆ  ｉｖｋｔｈｒｒｋａａ  ｒｔａｖｇｒｎｄｔｈ
３０１  ｐｔｔｇｓａｓｐｋｈ  ｑｋｋｓｋｌｈｇｐｔ  ｅｔｓｓｃｓｇａａｐ  ｔｖｅｍｄｅｅｌｈｙ  ａｓｌｎｆｈｇｍｎｐ  ｓｋｄｔｓｔｅｙｓｅ
３６１  ｖｒｔｑ
【０１１０】
「ＣＤ３３ポリヌクレオチド」によってＣＤ３３タンパク質をコードする核酸分子を意味する。
【０１１１】
「ＦＬＴ３タンパク質」、「ＦＬＴ３ポリペプチド」、「ＦＬＴ３」、「ＦＬＴ−３受容体」または「ＦＬＴ−３Ｒ」によって、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００４１１０で提供されるＦＬＫ−２及びＳＴＫ−１とも呼ばれるＦＬＴ３チロシンキナーゼ受容体のヒト配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、且つ受容体チロシンキナーゼ活性を含むチロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。一実施形態では、ＦＬＴ３のアミノ酸配列は以下で提供されるヒトＦＬＴ３のアミノ酸配列である：
１  ｍｐａｌａｒｄｇｇｑ  ｌｐｌｌｖｖｆｓａｍ  ｉｆｇｔｉｔｎｑｄｌ  ｐｖｉｋｃｖｌｉｎｈ  ｋｎｎｄｓｓｖｇｋｓ  ｓｓｙｐｍｖｓｅｓｐ
６１  ｅｄｌｇｃａｌｒｐｑ  ｓｓｇｔｖｙｅａａａ  ｖｅｖｄｖｓａｓｉｔ  ｌｑｖｌｖｄａｐｇｎ  ｉｓｃｌｗｖｆｋｈｓ  ｓｌｎｃｑｐｈｆｄｌ
１２１  ｑｎｒｇｖｖｓｍｖｉ  ｌｋｍｔｅｔｑａｇｅ  ｙｌｌｆｉｑｓｅａｔ  ｎｙｔｉｌｆｔｖｓｉ  ｒｎｔｌｌｙｔｌｒｒ  ｐｙｆｒｋｍｅｎｑｄ
１８１  ａｌｖｃｉｓｅｓｖｐ  ｅｐｉｖｅｗｖｌｃｄ  ｓｑｇｅｓｃｋｅｅｓ  ｐａｖｖｋｋｅｅｋｖ  ｌｈｅｌｆｇｔｄｉｒ  ｃｃａｒｎｅｌｇｒｅ
２４１  ｃｔｒｌｆｔｉｄｌｎ  ｑｔｐｑｔｔｌｐｑｌ  ｆｌｋｖｇｅｐｌｗｉ  ｒｃｋａｖｈｖｎｈｇ  ｆｇｌｔｗｅｌｅｎｋ  ａｌｅｅｇｎｙｆｅｍ
３０１  ｓｔｙｓｔｎｒｔｍｉ  ｒｉｌｆａｆｖｓｓｖ  ａｒｎｄｔｇｙｙｔｃ  ｓｓｓｋｈｐｓｑｓａ  ｌｖｔｉｖｅｋｇｆｉ  ｎａｔｎｓｓｅｄｙｅ
３６１  ｉｄｑｙｅｅｆｃｆｓ  ｖｒｆｋａｙｐｑｉｒ  ｃｔｗｔｆｓｒｋｓｆ  ｐｃｅｑｋｇｌｄｎｇ  ｙｓｉｓｋｆｃｎｈｋ  ｈｑｐｇｅｙｉｆｈａ
４２１  ｅｎｄｄａｑｆｔｋｍ  ｆｔｌｎｉｒｒｋｐｑ  ｖｌａｅａｓａｓｑａ  ｓｃｆｓｄｇｙｐｌｐ  ｓｗｔｗｋｋｃｓｄｋ  ｓｐｎｃｔｅｅｉｔｅ
４８１  ｇｖｗｎｒｋａｎｒｋ  ｖｆｇｑｗｖｓｓｓｔ  ｌｎｍｓｅａｉｋｇｆ  ｌｖｋｃｃａｙｎｓｌ  ｇｔｓｃｅｔｉｌｌｎ  ｓｐｇｐｆｐｆｉｑｄ
５４１  ｎｉｓｆｙａｔｉｇｖ  ｃｌｌｆｉｖｖｌｔｌ  ｌｉｃｈｋｙｋｋｑｆ  ｒｙｅｓｑｌｑｍｖｑ  ｖｔｇｓｓｄｎｅｙｆ  ｙｖｄｆｒｅｙｅｙｄ
６０１  ｌｋｗｅｆｐｒｅｎｌ  ｅｆｇｋｖｌｇｓｇａ  ｆｇｋｖｍｎａｔａｙ  ｇｉｓｋｔｇｖｓｉｑ  ｖａｖｋｍｌｋｅｋａ  ｄｓｓｅｒｅａｌｍｓ
６６１  ｅｌｋｍｍｔｑｌｇｓ  ｈｅｎｉｖｎｌｌｇａ  ｃｔｌｓｇｐｉｙｌｉ  ｆｅｙｃｃｙｇｄｌｌ  ｎｙｌｒｓｋｒｅｋｆ  ｈｒｔｗｔｅｉｆｋｅ
７２１  ｈｎｆｓｆｙｐｔｆｑ  ｓｈｐｎｓｓｍｐｇｓ  ｒｅｖｑｉｈｐｄｓｄ  ｑｉｓｇｌｈｇｎｓｆ  ｈｓｅｄｅｉｅｙｅｎ  ｑｋｒｌｅｅｅｅｄｌ
７８１  ｎｖｌｔｆｅｄｌｌｃ  ｆａｙｑｖａｋｇｍｅ  ｆｌｅｆｋｓｃｖｈｒ  ｄｌａａｒｎｖｌｖｔ  ｈｇｋｖｖｋｉｃｄｆ  ｇｌａｒｄｉｍｓｄｓ
８４１  ｎｙｖｖｒｇｎａｒｌ  ｐｖｋｗｍａｐｅｓｌ  ｆｅｇｉｙｔｉｋｓｄ  ｖｗｓｙｇｉｌｌｗｅ  ｉｆｓｌｇｖｎｐｙｐ  ｇｉｐｖｄａｎｆｙｋ
９０１  ｌｉｑｎｇｆｋｍｄｑ  ｐｆｙａｔｅｅｉｙｉ  ｉｍｑｓｃｗａｆｄｓ  ｒｋｒｐｓｆｐｎｌｔ  ｓｆｌｇｃｑｌａｄａ  ｅｅａｍｙｑｎｖｄｇ
９６１  ｒｖｓｅｃｐｈｔｙｑ  ｎｒｒｐｆｓｒｅｍｄ  ｌｇｌｌｓｐｑａｑｖ  ｅｄｓ
【０１１２】
「ＦＬＴ３−ＩＴＤ」によって単純な縦列重複及び／または挿入を伴った縦列重複を含むが、これらに限定されない内部縦列重複を有するＦＬＴ３ポリペプチドを意味する。種々の実施形態では、内部縦列重複を有するＦＬＴ３ポリペプチドは活性化されたＦＬＴ３変異体（たとえば、構成的に自己リン酸化された）である。一部の実施形態では、ＦＬＴ３−ＩＴＤには、たとえば、エクソン１１、エクソン１１〜イントロン１１、及びエクソン１２、エクソン１４、エクソン１４〜イントロン１４、及びエクソン１５を含むエクソンまたはイントロンにて縦列重複及び／または挿入を伴った縦列重複が含まれる。内部縦列重複の変異（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）はＡＭＬ症例の約２０〜２５％に存在する最も一般的なＦＬＴ３の変異である。ＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ患者は野生型（ＷＴ）ＦＬＴ３の患者よりも不良の予後を有し、高い再発率及び持続時間の短い化学療法への応答を伴う。
【０１１３】
「ＦＬＴ３ポリヌクレオチド」によってＦＬＴ３タンパク質をコードする核酸分子を意味する。
【０１１４】
「白血病性幹細胞」によって、対象にて自己再生をすることができる、白血病を発症することができる、及び／または急性骨髄性白血病の再発を引き起こすことができる白血病細胞を意味する。
【０１１５】
「多剤耐性細胞」によって、細胞が対照細胞の応答に比べて１以上の作用剤に対して低下した応答を有することを意味する。特に、Ｐ−糖タンパク質を発現している細胞は対照細胞よりも化学療法による治療に対して応答性が低いと予測される。
【０１１６】
「改善する」によって、疾患の発症または進行を少なくする、抑える、減衰する、縮小する、停止するまたは安定化することを意味する。
【０１１７】
「類似体」によって、同一ではないが、類似する機能的なまたは構造的な特徴を有する分子を意味する。たとえば、ポリペプチド類似体は対応する天然に存在するポリペプチドの生物活性を保持する一方で、天然に存在するポリペプチドに比べて類似体の機能を向上させる特定の生化学的な修飾を有する。そのような生化学的な修飾は、たとえば、リガンドの結合を変化させることなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を高め得る。類似体は非天然のアミノ酸を含んでもよい。
【０１１８】
本開示では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」及び「ｈａｖｉｎｇ」等は米国特許法におけるそれらに帰する意味を有することができ、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」等を意味することができ；「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ」は同様に米国特許法におけるそれらに帰する意味を有し、該用語は、制約がなく、引用されるものの基本的なまたは新規の特徴が引用されるものの他の存在によって変化しない限り引用されるものの他の存在を可能にするが、従来技術の実施形態を排除する。
【０１１９】
「検出する」は検出される検体の存在、非存在または量を特定することを指す。
【０１２０】
「疾患」によって、細胞、組織または臓器の正常な機能を損傷するまたは妨害する状態または障害を意味する。疾患の例は急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。
【０１２１】
「有効量」によって、未治療の患者に比べて疾患の症状を改善するのに必要とされる化合物または作用剤の量を意味する。疾患の治療上の処置について本発明を実践するのに使用される活性化合物の有効量は、投与の方法、対象の年齢、体重及び全身状態に応じて変化する。最終的には、主治医が適切な量及び投薬計画を決定するであろう。そのような量が「有効」量と呼ばれる。
【０１２２】
用語「単離される」、「精製される」または「生物学的に純粋な」は、ネイティブな状態で見いだされるような普通それに伴う成分を様々な程度に含まない物質を指す。「単離する」は元々の供給源または周囲からの分離の程度を示す。「精製する」は単離よりも高い分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、どんな不純物もタンパク質の生物特性に対して物質的に影響を与えず、他の有害な結末を引き起こさないように他の物質を十分含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ法で作出する場合は細胞性の物質、ウイルス性の物質もしくは培養培地を、または化学的に合成する場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなければ、精製されている。純度及び均質性は通常、分析化学の技法、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィを用いて測定される。用語「精製された」は核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル上で本質的に１本のバンドを生じることを示すことができる。修飾に供することができるタンパク質については、たとえば、リン酸化またはグリコシル化、異なる修飾は、別々に精製することができる異なる単離されたタンパク質を生じてもよい。
【０１２３】
「単離されたポリヌクレオチド」によって、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにて遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸分子（たとえば、ＤＮＡ）を意味する。従って、該用語には、たとえば、ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ、または他の配列とは無関係な別の分子（たとえば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって作出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの断片）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。加えて、該用語には、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子と同様に追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡが含まれる。
【０１２４】
「単離されたポリペプチド」によって、天然にそれを伴う成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。通常、ポリペプチドは、それが天然に関連するタンパク質及び天然に存在する有機分子を少なくとも６０重量％含まない場合、単離されている。好ましくは、調製物は少なくとも７５重量％、さらに好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは９９重量％、本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、たとえば、天然の供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質を化学的に合成することによって得られてもよい。純度は、適当な方法、たとえば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【０１２５】
「参照」によって標準のまたは対照の条件または試料を意味する。
【０１２６】
「参照配列」は配列比較のための基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、特定された配列のサブセットまたは全体であってもよく、たとえば、完全長のｃＤＮＡもしくは遺伝子の配列の断片または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子の配列であってもよい。ポリペプチドについては、参照ポリペプチド配列の長さは一般に少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、一層さらに好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、または約１００アミノ酸であろう。核酸については、参照核酸配列の長さは一般に少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、一層さらに好ましくは約１００ヌクレオチドまたは約３００ヌクレオチド、またはその辺りのもしくはその間の整数であろう。
【０１２７】
「特異的に結合する」によって、天然に本発明のポリペプチドを含む試料、たとえば、生体試料にて対象とするポリペプチドを認識し、結合するが、他の分子を実質的に認識せず、結合しない抗体またはその断片を意味する。
【０１２８】
本発明の方法で有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子またはその断片が挙げられる。そのような核酸分子は内在性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常、実質的な同一性を示すであろう。内在性の配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは通常、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリッド形成することができる。本発明の方法で有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子またはその断片が挙げられる。そのような核酸分子は内在性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常、実質的な同一性を示すであろう。内在性の配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは通常、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリッド形成することができる。「ハイブリッド形成する」によって、厳密性の種々の条件下で相補性のポリヌクレオチド配列（たとえば、本明細書で記載される遺伝子）間、またはその一部の間で二本鎖分子を形成する対を意味する。（たとえば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照のこと）
【０１２９】
たとえば、厳密な塩濃度は普通、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌ及び５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、さらに好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び２５ｍＭのクエン酸三ナトリウムであろう。低い厳密性のハイブリッド形成は有機溶媒、たとえば、ホルムアミドの非存在下で得ることができる一方で、高い厳密性のハイブリッド形成は少なくとも約３５％のホルムアミド、さらに好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。厳密な温度条件には普通、少なくとも約３０℃、さらに好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度が挙げられる。たとえば、ハイブリッド形成の時間、界面活性剤、たとえば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアＤＮＡの包含または排除のような様々な追加のパラメータは当業者に周知である。これらの種々の条件を必要に応じて組み合わせることによって種々のレベルの厳密性が達成される。好まれる実施形態では、ハイブリッド形成は７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び１％のＳＤＳにて３０℃で生じるであろう。さらに好まれる実施形態では、ハイブリッド形成は５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％ホルムアミド、及び１００μｇ/ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にて３７℃で生じるであろう。最も好まれる実施形態では、ハイブリッド形成は２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％ホルムアミド、及び２００μｇ/ｍｌのｓｓＤＮＡにて４２℃で生じるであろう。これらの条件における有用な変動は当業者に容易に明らかであろう。
【０１３０】
ほとんどの適用について、ハイブリッド形成に続く洗浄工程も厳密性で変化するであろう。洗浄の厳密性条件は塩濃度及び温度によって定義することができる。上記のように、洗浄の厳密性は塩濃度を下げることによって、または温度を上げることによって高めることができる。たとえば、洗浄工程について厳密な塩濃度は好ましくは約３０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び３ｍＭのクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌ及び１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムであろう。洗浄工程について厳密な温度条件には普通、少なくとも約２５℃、さらに好ましくは少なくとも約４２℃、一層さらに好ましくは少なくとも約６８℃の温度が挙げられるであろう。好まれる実施形態では、洗浄工程は３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳにて２５℃で発生するであろう。さらに好まれる実施形態では、洗浄工程は１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳにて４２℃で発生するであろう。さらに好まれる実施形態では、洗浄工程は１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳにて６８℃で発生するであろう。これらの条件における追加の変動は当業者に容易に明らかであろう。ハイブリッド形成の技法は当業者に周知であり、たとえば、Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにて記載されている。
【０１３１】
「実質的に同一の」によって、参照のアミノ酸配列（たとえば、本明細書で記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（たとえば、本明細書で記載される核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列に対してアミノ酸レベルでまたは核酸で少なくとも６０％、さらに好ましくは８０％または８５％、さらに好ましくは９０％、９５％またはさらに９９％同一である。
【０１３２】
配列の同一性は通常、配列解析ソフトウエア（たとえば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）の遺伝学コンピュータグループの配列解析ソフトウエアパッケージ，ＢＬＡＳＴ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＧＡＰ，またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。そのようなソフトウエアは、種々の置換、欠失及び／または他の修飾に対する相同性の程度を割り当てることによって同一のまたは類似する配列を一致させる。保存的な置換には通常、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシンの範囲内での置換が挙げられる。同一性の程度を判定する例となるアプローチでは、密接に関連する配列を示すｅ−３とｅ−１００の間の可能性スコアを伴ったＢＬＡＳＴプログラムが使用されてもよい。
【０１３３】
「対象」によって、ヒト、または、たとえば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジもしくはネコのような非ヒト哺乳類を含むが、これらに限定されない哺乳類を意味する。
【０１３４】
本明細書で提供される範囲は、その範囲内での値のすべてについてのショートハンドであると理解される。たとえば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０から成る群に由来する任意の数、数の組み合わせ、または部分的範囲を包含するように理解される。
【０１３５】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」等は疾病及び／またはそれに関連する症状を軽減することまたは改善することを指す。除外されないけれども、疾病または状態を治療することはその疾病、それに関連する状態または症状が完全に撲滅されることを必要としないことが十分に理解されるであろう。
【０１３６】
本明細書で使用されるとき、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」等は、疾病または状態を有してはいないが、それを発症するリスクがあるまたはそれを発症し易い対象にて疾病または状態を発症する確率を低下させることを指す。
【０１３７】
具体的に述べられない限り、または文脈から明白ではない限り、本明細書で使用されるとき、用語「または」は包含的であると理解される。具体的に述べられない限り、または文脈から明白ではない限り、本明細書で使用されるとき、用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は単数または複数であると理解される。
【０１３８】
具体的に述べられない限り、または文脈から明白ではない限り、本明細書で使用されるとき、用語「約」は、当該技術における正常な許容値の範囲内、たとえば、平均値の２標準偏差の範囲内として理解される。約は、述べられた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％の範囲内として理解することができる。文脈から明瞭ではない限り、本明細書で提供される数値はすべて用語、約によって修飾される。
【０１３９】
本明細書の変数の定義における化学基のリストの引用には、単一の基またはリストにした基の組み合わせとしてのその変数の定義が含まれる。本明細書の変数または態様についての実施形態の引用には、単一の実施形態としての、または他の実施形態もしくはその一部との組み合わせでのその実施形態が含まれる。
【０１４０】
本明細書で提供される任意の組成物または方法は、本明細書で提供される他の組成物または方法のいずれかの１以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の試料（ｎ＝５６）におけるＣＤ３３のレベルを示すグラフである。
【図２】図２は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の細胞に対するＣＤ３３を標的とするメイタンシノイド抗体薬剤結合体と比べたＩＭＧＮ７７９についての試験管内のＩＣ５０値及びＣＤ３３の発現レベルの依存性の比較を示す散布図を示す。
【図３】図３は細胞当たりのＣＤ３３抗原が５０００より多い（上）のに対して５０００より少ない（下）場合のＬｏｇＩＣ５０の統計的に有意な（ｐ＜０．０００１）分布を示す２つのグラフを提供する。
【図４Ａ】図４Ａは白血病性幹細胞及び正常な造血幹細胞に対するＩＭＧＮ７７９の効果を示すグラフである。
【図４Ｂ】図４ＢはＩＭＧＮ７７９が正常な造血幹細胞を見逃すことを示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＡＭＬ患者の初代細胞におけるＣＤ３３発現の関数としてのＰ−糖タンパク質（ＰＧＰ）の活性を示すドットプロットである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＡＭＬ患者の初代細胞におけるＰＧＰ活性の関数としてのＩＭＧＮ７７９の細胞傷害性を示すドットプロットである。
【図６】図６はＡＭＬ細胞株がＩＭＧＮ７７９及びＤＧＮ４６２に対して高度に感受性であることを示す表である。
【図７Ａ】図７ＡはＩＭＧＮ７７９の単回静脈内注射の後のＳＣＩＤマウスにおける皮下異種移植片での急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）ＥＯＬ−１に対するＩＭＧＮ７７９の抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７ＢはＩＭＧＮ７７９の単回静脈内注射の後のＳＣＩＤマウスにおける皮下異種移植片での前骨髄急性白血病（ＰＭＬ）ＨＬ６０／ＱＣに対するＩＭＧＮ７７９の抗腫瘍活性を示すグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＥＯＬ−１細胞及びＨＬ６０／ＱＣ細胞のヒトＡＭＬ異種移植片に対するＩＭＧＮ７７９または非標的化抗体薬剤結合体の効果を示す表である。「治療（Ｔ）／対照（Ｃ）（％）」は腫瘍増殖の阻害比率を指す。「ＣＲ」は完全応答を指す。
【図８】図８は１４ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇのＩＭＧＮ７７９で処理したマウスにおける長期にわたる平均体重変化の比率を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは総抗体と抗体結合体の経時的な血漿濃度を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９ＢはＥＬＩＳＡによって測定したインタクトなＩＭＧＮ７７９の血漿濃度及び細胞傷害性アッセイによって測定したＩＭＧＮ７７９の生物活性がある濃度を示すグラフである。
【図９Ｃ】図９ＣはＩＭＧＮ７７９の生体内での安定性及び薬物動態を示す表である。
【図１０Ａ−１】図１０Ａはヒト化Ｍｙ９−６軽鎖のアミノ酸配列を提供する。
【図１０Ａ−２】図１０Ａはヒト化Ｍｙ９−６軽鎖のアミノ酸配列を提供する。
【図１０Ａ−３】図１０Ａはヒト化Ｍｙ９−６軽鎖のアミノ酸配列を提供する。
【図１０Ｂ−１】図１０Ｂはヒト化Ｍｙ９−６重鎖のアミノ酸配列を提供する。
【図１０Ｂ−２】図１０Ｂはヒト化Ｍｙ９−６重鎖のアミノ酸配列を提供する。
【図１０Ｂ−３】図１０Ｂはヒト化Ｍｙ９−６重鎖のアミノ酸配列を提供する。
【図１１】図１１はＡＭＬ患者の試料におけるＩＭＧＮ７７９の細胞傷害性についての試験管内のＩＣ５０値及びＣＤ３３のＡＢＣ（抗体結合能）を示すグラフである。
【図１２】図１２はＦＬＴ３  ＷＴ及びＦＬＴ３−ＩＴＤ（内部縦列重複）のＡＭＬ患者の試料におけるＩＭＧＮ７７９の細胞傷害性についての試験管内のＩＣ５０値を示すグラフである。
【図１３】図１３はＦＬＴ３  ＷＴ及びＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ患者の試料における試験管内のＣＤ３３のＡＢＣを示すグラフである。
【図１４】図１４はＩＭＧＮ７７９がＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ細胞株に対して試験管内で高い細胞傷害性活性を有することを示す表である。
【図１５】図１５はＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＭＯＬＭ−１３ＡＭＬ細胞株におけるＩＭＧＮ７７９及びＦＬＴ３キナーゼ阻害剤の試験管内の細胞傷害性を示すグラフである。
【図１６】図１６は１０μｇ／ｋｇの最少有効用量（ＤＧＮ４６２用量）でのＭＶ４−１１  ＦＬＴ３−ＩＴＤ  ＡＭＬ異種移植片に対するＩＭＧＮ７７９の強力な、抗原を標的とする抗腫瘍活性を示すグラフである。Ｔ／Ｃ（％）＝腫瘍増殖阻害；ＰＲ＝部分的な腫瘍退縮；ＣＲ＝完全な腫瘍退縮
【図１７】図１７は抗体当たりおよそ３つの結合されたＤＧＮ４６２分子があること（薬剤対抗体比（ＤＡＲ））を示す質量分光分析を提供する。
【０１４２】
配列の簡単な説明
マウス重鎖ＣＤＲ１：ＳＹＹＩＨ（配列番号１）；
マウス重鎖ＣＤＲ２：ＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号２），その際、ＸはＫまたはＱである；
マウス重鎖ＣＤＲ３：ＥＶＲＬＲＹＦＤＶ（配列番号３）；
マウス軽鎖ＣＤＲ１：ＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡ（配列番号４）；
マウス軽鎖ＣＤＲ２：ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）；
マウス軽鎖ＣＤＲ３：ＨＱＹＬＳＳＲＴ（配列番号６）；
マウス重鎖可変領域：ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）；
マウス軽鎖可変領域：ＮＩＭＬＴＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＳＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号８）；
ヒト化重鎖可変領域：ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号９）；
ヒト化軽鎖可変領域：ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１０）
【０１４３】
特定の実施形態では、ヒト化抗体には再表面化抗体及び／またはＣＤＲ移植抗体が含まれる。
【０１４４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＡＭＬを特徴付け、有効な治療法を選択するのに有用である組成物及び方法と同様にＡＭＬであると新規に診断された患者、ＡＭＬの再発を経験している患者及び難治性ＡＭＬを有する患者を治療する方法を特徴とする。
【０１４５】
本発明は、新規のＤＮＡアルキル化剤であるＤＧＮ４６２を利用するＣＤ３３を標的とする抗体／薬剤結合体（ＡＤＣ）が生体内でＡＭＬ患者の初代細胞に対して、及び生体内でマウスにおけるＡＭＬ異種移植片に対して高度に活性があるという発見に少なくともある程度基づく。
【０１４６】
化学療法に対する約８０％の高い当初の応答率にもかかわらず、多数の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者は疾患の再発を経験する。理論によって束縛されることを意図しないで、これらの再発は持続する白血病性幹細胞の増殖によると考えられている。以下にて本明細書で報告されるように、本発明は、モノイミン部分を含有するインドリノ−ベンゾジアゼピン二量体を含む高度に強力なＤＮＡアルキル化剤であるＤＧＮ４６２を特徴とする。
【０１４７】
ＩＭＧＮ７７９は、切断可能なジスルフィドリンカーを介して新規のＤＮＡアルキル化剤であるＤＧＮ４６２に結合されたｈｕＭｙ９−６またはＺ４６８１Ａとしても知られる抗ｈｕＣＤ３３抗体を含むＣＤ３３を標的とする抗体薬剤結合体である。その好都合な前臨床の忍容性プロファイルは、ＩＭＧＮ７７９が活性を明示するが、有意な毒性を伴わない、ＡＭＬについての既存の臨床作用剤を超える治療上の利点を付与することを示唆している。試験管内でのＡＭＬ細胞株及びＡＭＬ患者の初代細胞に対するＩＭＧＮ７７９の高度に強力なＣＤ３３を標的とする活性、マウスにおけるＡＭＬ異種移植片に対して見られる抗腫瘍活性、及び好都合な安全性プロファイルはＡＭＬの治療としてのその発展を支えている。
【０１４８】
マウス及びヒト化されたＭｙ９−６抗体
マウスＭｙ９−６
本明細書では「Ｍｙ９−６」、「マウスＭｙ９−６」及び「ｍｕＭｙ９−６」と様々に呼ばれるマウス抗ＣＤ３３抗体は、軽鎖及び重鎖双方の可変領域の生殖細胞系列のアミノ酸配列、軽鎖及び重鎖双方の可変領域のアミノ酸配列、ＣＤＲの特定、表面アミノ酸の特定及び組換え形態における発現のための手段に関して十分に性状分析されている。たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，５５７，１８９；同第７，３４２，１１０号；同第８，１１９，７８７号；同第８，３３７，８５５号及び米国特許公開番号２０１２０２４４１７１号を参照のこと。
【０１４９】
Ｍｙ９−６抗体は機能的にも特徴付けられ、ＣＤ３３陽性細胞の表面上のＣＤ３３に高い親和性で結合することが示されている。
【０１５０】
用語「可変領域」は、抗体間で配列が異なり、その抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性で協力する抗体の重鎖及び軽鎖の特定の部分を記載するのに本明細書で使用される。変異性は抗体の可変領域全体にわたって普通均一には分布しない。それは通常、軽鎖及び重鎖の可変領域双方にて相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる可変領域の３つの断片の範囲内に濃縮される。可変領域のさらに高度に保存された部分はフレームワーク領域と呼ばれる。重鎖及び軽鎖の可変領域は主としてベータシート構造を採用する４つのフレームワーク領域を含み、各フレームワーク領域は３つのＣＤＲによって接続され、ベータシート構造を接続するループを形成し、場合によってはベータシート構造の一部を形成する。各鎖におけるＣＤＲはフレームワーク領域によってごく近接して保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，１９９１，ＮＩＨ）。
【０１５１】
「定常」領域は抗体の抗原への結合に直接関与することはないが、たとえば、抗体依存性の細胞傷害性における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を示す。
【０１５２】
ヒト化Ｍｙ９−６抗体
本明細書では「ｈｕＭｙ９−６」及び「ヒト化Ｍｙ９−６」と様々に呼ばれるＭｙ９−６のヒト化型も調製されている。
【０１５３】
ヒト化の目標は、ヒトへの導入のためにマウス抗体のような異種抗体の免疫原性を減らす一方で、抗体の完全な抗原結合の親和性及び特異性を維持することである。
【０１５４】
ヒト化抗体は、たとえば、再表面化及びＣＤＲ移植のような幾つかの技法を用いて作出されてもよい。本明細書で使用されるとき、再表面化法技術は分子モデル化、統計的解析及び変異誘発の組み合わせを用いて抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を変化させ、標的宿主の既知の抗体の表面に似る。
【０１５５】
抗体の再表面化の戦略及び方法、ならびに異なる宿主内での抗体の免疫原性を低減する他の方法は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，６３９，６４１号（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら）にて開示されている。手短には、好まれる方法では、（１）抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のプールの位置配列比較を生成して可変領域すべてについての配列比較の位置が少なくとも約９８％同一である重鎖及び軽鎖の可変領域のフレームワーク表面に露出した位置のセットを得る；（２）重鎖及び軽鎖の可変領域のフレームワーク表面に露出したアミノ酸残基のセットが齧歯類の抗体（またはその断片）について定義される；（３）齧歯類の表面に露出したアミノ酸残基のセットに対して最も同一に近い重鎖及び軽鎖の可変領域のフレームワーク表面に露出したアミノ酸残基のセットを特定する；（４）齧歯類抗体の相補性決定領域の残基の原子の５オングストローム以内にあるアミノ酸残基を除いて、工程（２）で定義された重鎖及び軽鎖の可変領域のフレームワーク表面に露出したアミノ酸残基のセットを工程（３）で特定された重鎖及び軽鎖の可変領域のフレームワーク表面に露出したアミノ酸残基のセットで置換する；及び（５）結合特異性を有するヒト化齧歯類抗体を作出する。
【０１５６】
抗体は、ＣＤＲ−移植（ＥＰ０２３９４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；及び同第５，５８５，０８９号）、ベニヤ化または再表面化（ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ，Ｇ．Ｍ．ら，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ，Ｍ．Ａ．ら，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３）、及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む種々の他の技法を用いてヒト化することができる。ヒト抗体はファージディスプレイ法を含む当該技術で既知の種々の方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号、及び同第５，８１４，３１８号；及び国際特許出願公開番号ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９１／１０７４１（その全体が参照によって組み入れられる前記参考文献）も参照のこと。
【０１５７】
本明細書でさらに記載されるように、Ｍｙ９−６のＣＤＲをモデル化によって特定し、その分子構造を予測した。次いで、たとえば、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開番号２００５０１１８１８３号にて記載されたようにヒト化Ｍｙ９−６抗体を調製し、完全に性状分析した。多数のｈｕＭｙ９−６抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を図５Ａ及び５Ｂに示す。たとえば、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，３３７，８５５号及び米国特許公開番号第２０１２０２４４１７１号を参照のこと。
【０１５８】
Ｍｙ９−６抗体のエピトープ結合断片
マウスＭｙ９−６抗体及びそのヒト化型Ｍｙ９−６抗体のエピトープ結合断片はマウスＭｙ９−６抗体及びそのヒト化型から分離して本明細書で議論されるが、本発明の用語「抗体」（単数）または「抗体」（複数）は完全長のｍｕＭｙ９−６及びｈｕＭｙ９−６抗体双方と同様にこれら抗体のエピトープ結合断片を含んでもよいことが理解される。
【０１５９】
さらなる実施形態では、配列番号１〜６：ＳＹＹＩＨ（配列番号１）、ＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号２）、その際ＸはＫまたはＱ、ＥＶＲＬＲＹＦＤＶ（配列番号３）、ＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡ（配列番号４）、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）、ＨＱＹＬＳＳＲＴ（配列番号６）から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含み、且つＣＤ３３を結合する能力を有する抗体またはそのエピトープ結合断片が提供される。
【０１６０】
さらなる実施形態では、少なくとも１つの重鎖可変領域と少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む抗体またはそのエピトープ結合断片が提供され、その際、前記重鎖可変領域はそれぞれ配列番号１〜３：ＳＹＹＩＨ（配列番号１）、ＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＸＧ（配列番号２）、その際ＸはＫまたはＱ、ＥＶＲＬＲＹＦＤＶ（配列番号３）によって表されるアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域を含み、前記軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号４〜６：ＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡ（配列番号４）、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）、ＨＱＹＬＳＳＲＴ（配列番号６）によって表されるアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域を含む。
【０１６１】
さらなる実施形態では、配列番号７：ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を共有する、さらに好ましくは配列番号７と９５％の配列同一性を共有する、最も好ましくは配列番号７と１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する抗体が提供される。
【０１６２】
同様に、配列番号８：ＮＩＭＬＴＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＳＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を共有する、さらに好ましくは配列番号８と９５％の配列同一性を共有する、最も好ましくは配列番号８と１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体が提供される。
【０１６３】
さらなる実施形態では、配列番号９：ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳによって表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を共有する、さらに好ましくは配列番号９と９５％の配列同一性を共有する、最も好ましくは配列番号９と１００％の配列同一性を共有するヒト化（たとえば、再表面化した、ＣＤＲ移植した）重鎖可変領域を有する抗体が提供される。
【０１６４】
同様に、配列番号１０：ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲに相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を共有する、さらに好ましくは配列番号１０と９５％の配列同一性を共有する、最も好ましくは配列番号１０と１００％の配列同一性を共有するヒト化（たとえば、再表面化した、ＣＤＲ移植した）軽鎖可変領域を有する抗体が提供される。特定の実施形態では、抗体にはＣＤＲの外側のフレームワーク領域における保存的変異が含まれる。
【０１６５】
本明細書で使用されるとき、「抗体断片」には、一般に「エピトープ結合断片」と呼ばれるＣＤ３３に結合する能力を保持する抗体の部分を含まれる。抗体断片の例には、好ましくは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、及びＶＬまたはＶＨのドメインを含む断片が挙げられるが、これらに限定されない。単鎖抗体を含むエピトープ結合断片は可変領域のみ、または以下の：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３のドメインの全体または一部との組み合わせを含んでもよい。
【０１６６】
そのような断片はＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片の一方または双方を含有してもよい。好ましくは、抗体断片は、そのような領域すべてより少ない、たとえば、３、４または５のＣＤＲを含有する断片も機能的ではあるが、全抗体の６つのＣＤＲすべてを含有する。さらに、機能的な同等物は、以下の免疫グロブリンのクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ及びそのサブクラスのいずれか１つのメンバーであってもよいし、メンバーを組み合わせてもよい。
【０１６７】
Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片は、たとえば、パパイン（Ｆａｂ断片）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片）のような酵素を用いたタンパク質分解による切断によって作出されてもよい。
【０１６８】
単鎖ＦＶｓ（ｓｃＦｖｓ）断片は、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも１つの断片に連結された抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも１つの断片を含有するエピトープ結合断片である。リンカーは、単鎖抗体断片が由来する抗体全体の標的分子結合特異性を維持するようにそれらがいったん連結されると（ＶＬ）及び（ＶＨ）の領域の適正な三次元の折り畳みが生じることを保証するように選択される短い、柔軟なペプチドであってもよい。（ＶＬ）または（ＶＨ）の配列のカルボキシル末端はリンカーによって相補性の（ＶＬ）及び（ＶＨ）の配列のアミノ酸末端に共有結合されてもよい。単鎖抗体断片は分子クローニング、抗体のファージディスプレイライブラリ、または技量のある熟練者に周知の類似の技法によって生成されてもよい。これらのタンパク質は、たとえば、真核細胞、または細菌を含む原核細胞にて作出されてもよい。
【０１６９】
本発明のエピトープ結合断片は当該技術で既知の種々のファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面上に表示される。特に、そのようなファージを利用してレパトアまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（たとえば、ヒトまたはマウス）から発現されるエピトープ結合ドメインを表示することができる。たとえば、標識されたＣＤ３３または固体表面もしくはビーズに結合させたもしくは捕捉したＣＤ３３を用いて抗原によって、対象とする抗原を結合するエピトープ結合ドメインを発現しているファージを選択し、特定することができる。これらの方法で使用されるファージは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのタンパク質に組換えで融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィドで安定化したＦｖ抗体ドメインと共にファージから発現されるｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含むフィラメント状のファージである。
【０１７０】
本発明のエピトープ結合断片を作製するのに使用することができるファージディスプレイ法の例には、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＢｒｉｎｋｍａｎら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０；Ａｍｅｓら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃら，１９９７，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎら，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及び米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８にて開示されたものが挙げられる。
【０１７１】
ファージ選択の後、断片をコードするファージの領域を単離し、それを用い、たとえば、以下で詳細に記載されるような組換えＤＮＡ法を用いて、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む選択された宿主にて発現を介してエピトープ結合断片を生成することができる。たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２の断片を組換えで作出する技法は、たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９；Ｓａｗａｉら，１９９５，ＡＪＲＩ３４：２６−３４；及びＢｅｔｔｅｒら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３にて開示されたもののような当該技術で既知の方法を用いて採用することができ；前記参考文献はその全体が参照によって組み入れられる。単鎖Ｆｖ及び抗体を作出するのに使用することができる技法の例には、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８；Ｓｈｕら，１９９３，ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９；Ｓｋｅｒｒａら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０にて記載されたものが挙げられる。
【０１７２】
機能的な同等物
本発明の範囲内に含められるのはまた、Ｍｙ９−６抗体及びヒト化Ｍｙ９−６抗体の機能的な同等物である。用語「機能的な同等物」には、相同配列を持つ抗体、キメラ抗体、修飾された抗体及び人工の抗体が挙げられ、たとえば、その際、各機能的な同等物はＣＤ３３に結合するその能力によって定義される。技量のある熟練者は、「抗体断片」と呼ばれる分子と「機能的な同等物」と呼ばれる群において重複があることを理解するであろう。
【０１７３】
相同配列を持つ抗体は、本発明のマウスＭｙ９−６抗体及びヒト化Ｍｙ９−６抗体のアミノ酸配列との配列の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を持つ抗体である。好ましくは、同一性は、本発明のマウスＭｙ９−６抗体及びヒト化Ｍｙ９−６抗体の可変領域のアミノ酸配列とのものである。「配列同一性」及び「配列相同性」は本明細書でアミノ酸配列に適用されるとき、たとえば、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４−２４４８（１９８８）に従ってＦＡＳＴＡ検索法によって測定されるような、もう１つのアミノ酸配列に対する少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％または９４％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を持つ配列として定義される。
【０１７４】
本明細書で使用されるとき、キメラ抗体は抗体の異なる部分が異なる動物種に由来するものである。たとえば、ヒトの免疫グロブリン定常領域と対合したマウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域を有する抗体。キメラ抗体を作出する方法は当該技術で既知である。たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２；Ｏｉら，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；及び同第４，８１６，３９７号を参照のこと。
【０１７５】
改善された抗体
ＣＤＲはエピトープ認識及び抗体結合にとって最重要である。しかしながら、その同族のエピトープを認識し、結合する抗体の能力を妨害することなくＣＤＲを構成する残基を変化させてもよい。たとえば、エピトープ認識に影響を与えないが、エピトープについての抗体の結合親和性を高める変更を行ってもよい。
【０１７６】
従って、本発明の範囲内に含められるのはまた、マウス抗体及びヒト化抗体双方の改善された型であり、それはまたＣＤ３３を特異的に認識し、好ましくは高い親和性でそれを結合する。
【０１７７】
幾つかの研究は、最初の抗体の配列の知識及び結合や発現のレベルのようなその特性に基づいて抗体の配列における種々の位置で１以上のアミノ酸の変化を導入する効果を調査している（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．ら，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３；Ｒａｄｅｒ，Ｃ．ら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，８９１０−８９１５；Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９）。
【０１７８】
これらの研究では、たとえば、オリゴヌクレオチドが介在する部位特異的な変異誘発、カセット変異誘発、変異性ＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング、または大腸菌の変異誘発因子株のような方法を用いてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３またはフレームワーク領域における重鎖及び軽鎖の遺伝子の配列を変化させることによって最初の抗体の同等物を生成している（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９；Ａｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．ら，１９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ，１６，ｐｐ．２７７−２９１，ｉｎ“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｅｄｓ．Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ら，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。最初の抗体の配列を変化させるこれらの方法は、派生的な抗体の親和性の改善を生じた（Ｇｒａｍ，Ｈ．ら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３５７６−３５８０；Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ら，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１０７０１−１０７０５；Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，２，１６９−１７９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．ら，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７−８８；Ｓｈｏｒｔ，Ｍ．Ｋ．ら，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，１６３６５−１６３７０；Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２７６２２−２７６２８）。
【０１７９】
抗体の１以上のアミノ酸残基を変化させる類似の方向性を持った戦略によって、本明細書で記載される抗体配列（図１０Ａ及び１０Ｂ）を用いて、ＣＤ３３についての親和性の改善を含む改善された機能を持つ抗ＣＤ３３抗体を生じることができる。
【０１８０】
改善された抗体には、動物の免疫、ハイブリドーマの形成、特定の特徴を持つ抗体の選択という常法によって調製される改善された特徴を有する抗体も挙げられる。
【０１８１】
患者の階層化
ｈｕＭｙ９−６抗体（「Ｚ４６８１Ａ」とも呼ばれる）は、たとえば、生検の間に対象に由来する細胞におけるＣＤ３３の発現を特徴付けるのに有用である。我々は、対象の細胞におけるＣＤ３３の発現のレベルがＩＭＧＮ７７９の有効性を示すので患者の階層化に有用であることを発見した。この発見は少なくともある程度、細胞当たり１，０００ほどの少ないＣＤ３３抗原を発現している患者の初代細胞がＩＭＧＮ７７９に高度に感受性だった（６０％の細胞が感受性）ことを示す患者のデータに基づく。＞３，０００のＣＤ３３のレベルの試料については、７５％を超えるものがＩＭＧＮ７７９に高度に感受性だった。５，０００を上回るＣＤ３３レベルの試料については、９０％を超える細胞がＩＭＧＮ７７９に対して高度に感受性だった。従って、細胞当たり少なくとも約１，０００〜２５，０００のＣＤ３３抗原（ＡＢＣ、すなわち、抗体結合能）（たとえば、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００のＡＢＣ）以上を持つ細胞を有する患者はＩＭＧＮ７７９による治療にさらに感受性である。
【０１８２】
特定の実施形態では、１，０００〜１８，０００、１，０００〜２０，０００もしくは１，０００〜２５，０００の範囲；または３，０００〜１８，０００、３，０００〜２０，０００もしくは３，０００〜２５，０００の範囲；または５，０００〜１８，０００、５，０００〜２０，０００もしくは５，０００〜２５，０００の範囲でのＡＢＣを持つ患者を選択し、本発明の治療に従って治療する。特定の実施形態では、患者が細胞当たり少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、４，５００、５，０００以上の抗原を有すると特定される場合、彼らをＩＭＧＮ７７９による治療のために選択する。他の実施形態では、ＡＢＣ範囲の下限が約１，０００〜５，０００の間、約２，０００〜４，０００の間または約２，５００〜３，０００の間であり、且つ範囲の上限が約１８,０００〜２５，０００、１８，０００〜２０，０００または２０，０００〜２５，０００の間である場合、本発明の方法に従って患者を選択し、治療する。ＩＭＧＮ７７９と、同じ抗ＣＤ３３抗体を含むが、異なるリンカー及び細胞毒素を含む別のＡＤＣについてのＩＣ５０値の比較は、細胞当たりの抗原の数が５，０００を超える場合でさえ、１０，０００倍高かった。
【０１８３】
さらに他の実施形態では、新しく診断された患者が細胞当たり少なくとも約５，０００、６，０００または７，０００以上の抗原を有すると特定される場合、彼らを治療のために選択する。再発したＡＭＬ患者が細胞当たり少なくとも約１，０００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００以上の抗原を有すると特定される場合、彼らはＩＭＧＮ７７９療法のために選択される。難治性疾患を伴ったＡＭＬ患者が細胞当たり少なくとも約１，０００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００以上の抗原を有すると特定される場合、彼らはＩＭＧＮ７７９療法のために選択される。特定の実施形態では、１，０００〜１８，０００、１，０００〜２０，０００もしくは１，０００〜２５，０００の範囲；または３，０００〜１８，０００、３，０００〜２０，０００もしくは３，０００〜２５，０００の範囲；または５，０００〜１８，０００、５，０００〜２０，０００もしくは５，０００〜２５，０００の範囲でのＡＢＣを持つ再発性または難治性のＡＭＬ患者が本発明の方法に従って選択され、治療される。特定の実施形態では、再発性または難治性のＡＭＬ患者が細胞当たり少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、４，５００、５，０００以上の抗原を有すると特定される場合、彼らをＩＭＧＮ７７９による治療のために選択する。他の実施形態では、ＡＢＣ範囲の下限が約１，０００〜５，０００の間、約２，０００〜４，０００の間または約２，５００〜３，０００の間であり、且つ範囲の上限が約１８,０００〜２５，０００、１８，０００〜２０，０００または２０，０００〜２５，０００の間である場合、再発性または難治性のＡＭＬ患者が本発明の方法に従って選択され、治療される。
【０１８４】
従って、ＩＭＧＮ７７９がそのように低いＣＤ３３の値及びそのように低い濃度で有効であることは全く予想外だった。ＡＭＬ患者の初代細胞におけるＣＤ３３の発現は較正されたフローサイトメトリー法を用いて測定した。フィコエリスリン（ＰＥ）を結合した抗ＣＤ３３抗体（クローンＷＮ５３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＡＭＬの試料を染色し、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（様々な標識対ビーズの比でのＰＥを結合したビーズ）を用いた較正曲線の蛍光シグナルと比較し、ＡＭＬ細胞当たりの結合したＣＤ３３抗体の総数（ＡＢＣ値）が測定されるのを可能にした。ＣＤ３３はＡＭＬ患者の細胞では比較的低レベルで発現され、最大の発現はおよそ１７，０００ＡＢＣだった。
【０１８５】
ＡＭＬ及び最少残余疾患の治療のためのＩＭＧＮ７７９の使用
多数のＡＭＬ患者は化学療法に応答するが、これらの患者の多数は結局再発する。ＡＭＬの再発は幾何かの数の白血病性幹細胞の持続性に関連すると考えられている。本発明は白血病性幹細胞を特異的に標的とすることを含むＡＭＬを治療する方法を提供する。従って、本発明はＡＭＬ患者にて完全寛解を達成する方法を提供する。有利なことに、ＩＭＧＮ７７９は白血病性幹細胞を特異的に標的とする一方で、正常な造血幹細胞は見逃される。従って、ＩＭＧＮは、正常な造血幹細胞を見逃さない他の化学療法に比べて改善された毒性プロファイルを有すると予測される。
【０１８６】
白血病性幹細胞についてのＩＭＧＮ７７９の特異性を考えると、ＩＭＧＮ７７９は最少残余疾患の可能性を低減することによって再発を経験している患者に恩恵を与えるようである。しかしながら、ＩＭＧＮ７７９は再発の治療に限定されない。それはＣＤ３３を発現している芽球だけでなく、再発に関与している可能性がある白血病性幹細胞も標的とするので従来の化学療法剤よりも優れていると予想される。従って、本発明は、新規に診断される、再発している及び難治性である患者におけるＡＭＬを治療する方法を提供する。
【０１８７】
結合体
ＩＭＧＮ７７９は、切断可能なジスルフィドリンカーを介して抗ｈｕＣＤ３３抗体であるＺ４６８１Ａに結合されたＤＧＮ４６２を含む抗体薬剤結合体である。ＤＧＮ４６２はモノイミン部分を含有するインドリノ−ベンゾジアゼピン二量体を含む。
【０１８８】
一実施形態では、本発明の結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）リンカーを介して、以下の構造：
【０１８９】
【化８６】
2017517507.tif 000089
によって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩にカップリングされた本明細書で記載されるモノクローナル抗体（たとえば、「Ｚ４６８１Ａ」とも呼ばれるｈｕＭｙ９−６）を含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、ＭはＨまたは薬学上許容可能なカチオンである。一実施形態では、ＭはＮａ＋またはＫ＋である。別の実施形態では、ＭはＮａ＋である。さらに別の実施形態では、ＭはＨである。
【０１９０】
スルホ−ＳＰＤＢリンカーは当該技術で既知であり、米国特許第８，２３６，３１９号に記載されている。スルホ−ＳＰＤＢリンカーは以下の構造式：
【０１９１】
【化８７】
2017517507.tif 000090
によって表すことができる。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明の結合体は、スルホ−ＳＰＤＢリンカーを介して以下の構造式：
【０１９３】
【化８８】
2017517507.tif 000091
によって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩にカップリングされた本明細書で記載されるモノクローナル抗体（たとえば、ｈｕＭｙ９−６）を含む。
【０１９４】
別の実施形態では、本発明の結合体は、スルホ−ＳＰＤＢリンカーを介して以下の構造式：
【０１９５】
【化８９】
2017517507.tif 000092
によって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩にカップリングされた本明細書で記載されるモノクローナル抗体（たとえば、ｈｕＭｙ９−６）を含む。
【０１９６】
別の実施形態では、本発明の結合体は、スルホ−ＳＰＤＢリンカーを介して以下の構造式：
【０１９７】
【化９０】
2017517507.tif 000093
によって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物または薬学上許容可能なその塩にカップリングされた本明細書で記載されるモノクローナル抗体（たとえば、ｈｕＭｙ９−６）を含む。
【０１９８】
さらに別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０１９９】
【化９１】
2017517507.tif 000094
または薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである。一実施形態では、ＭはＮａ＋またはＫ＋である。別の実施形態では、ＭはＮａ＋である。
【０２００】
別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２０１】
【化９２】
2017517507.tif 000095
または薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数である。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２０３】
【化９３】
2017517507.tif 000096
または薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数である。
【０２０４】
別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２０５】
【化９４】
2017517507.tif 000097
または薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｍは−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである。一実施形態では、ＭはＮａ＋またはＫ＋である。別の実施形態では、ＭはＮａ＋である。さらに別の実施形態では、ＭはＨである。
【０２０６】
別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２０７】
【化９５】
2017517507.tif 000098
または薬学上許容可能なその塩によって表される。
【０２０８】
別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２０９】
【化９６】
2017517507.tif 000099
または薬学上許容可能なその塩によって表される。
【０２１０】
別の実施形態では、本発明の結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）リンカーを介して以下の構造式：
【０２１１】
【化９７】
2017517507.tif 000100
によって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物にカップリングされた本明細書で記載されるモノクローナル抗体（たとえば、ｈｕＭｙ９−６）を含み、式中、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは各Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである。一実施形態では、ＭはＮａ＋またはＫ＋である。別の実施形態では、ＭはＮａ＋である。
【０２１２】
ＳＰＤＢリンカーは当該技術で既知であり、米国特許第６，９１３，７４８号に記載されている。ＳＰＤＢリンカーは以下の構造式：
【０２１３】
【化９８】
2017517507.tif 000101
によって表すことができる。
【０２１４】
別の実施形態では、本発明の結合体は、ＳＰＤＢリンカーを介して以下の構造式：
【０２１５】
【化９９】
2017517507.tif 000102
によって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物にカップリングされた本明細書で記載されるモノクローナル抗体（たとえば、ｈｕＭｙ９−６）を含む。
【０２１６】
別の実施形態では、本発明の結合体は、ＳＰＤＢリンカーを介して以下の構造式：
【０２１７】
【化１００】
2017517507.tif 000103
によって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物にカップリングされた本明細書で記載されるモノクローナル抗体（たとえば、ｈｕＭｙ９−６）を含む。
【０２１８】
別の実施形態では、本発明の結合体は、ＳＰＤＢリンカーを介して以下の構造式：
【０２１９】
【化１０１】
2017517507.tif 000104
によって表される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物にカップリングされた本明細書で記載されるモノクローナル抗体（たとえば、ｈｕＭｙ９−６）を含む。
【０２２０】
さらに別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２２１】
【化１０２】
2017517507.tif 000105
または薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−ＳＯ３Ｍであり、Ｍは各存在について独立して−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである。一実施形態では、ＭはＮａ＋またはＫ＋である。
【０２２２】
別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２２３】
【化１０３】
2017517507.tif 000106
または薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数である。
【０２２４】
別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２２５】
【化１０４】
2017517507.tif 000107
または薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数である。
【０２２６】
別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２２７】
【化１０５】
2017517507.tif 000108
または薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数である。
【０２２８】
さらに別の実施形態では、本発明の結合体は、以下の構造式：
【０２２９】
【化１０６】
2017517507.tif 000109
または薬学上許容可能なその塩によって表され、式中、ｒは１〜１０の整数である。
【０２３０】
特定の実施形態では、本明細書で記載される結合体は１〜１０の細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物、２〜９の細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物、３〜８の細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物、４〜７の細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物、または５〜６の細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物を含んでもよい。
【０２３１】
特定の実施形態では、本明細書で記載される結合体を含む組成物は抗体分子当たり平均１〜１０の細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体分子を含んでもよい。抗体分子当たりの細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体分子の平均比は本明細書では薬剤抗体比（ＤＡＲ）と呼ばれる。一実施形態では、ＤＡＲは２〜８、３〜７、３〜５または２．５〜３．５の間である。
【０２３２】
本明細書で記載される細胞傷害性ベンゾジアゼピン二量体化合物及び結合体は、たとえば、ＵＳ２０１２／０２４４１７１の段落［０３９５］〜［０３９７］及び［０５９８］〜［０６０７］、図１、１５、２２、２３、３８〜４１、４３、４８、５５及び６０、及び実施例１、６、１２、１３、２０、２１、２２、２３、２６〜３０及び３２、ならびにＵＳ２０１２／０２３８７３１の段落［０００７］〜［０１０５］、［０１９７］〜［０２９１］、図１〜１１、１６、２８及び実施例１〜７、９〜１３、１５及び１６、しかし、これらに限定されないＵＳ２０１２／０２４４１７１及びＵＳ２０１２／０２３８７３１にて記載された方法に従って調製することができる。
【０２３３】
用語「カチオン」は正の電荷を持つイオンを指す。カチオンは一価（たとえば、Ｎａ＋、Ｋ＋等）、二価（たとえば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋等）または多価（たとえば、Ａｌ３＋等）であることができる。好ましくは、カチオンは一価である。
【０２３４】
語句「薬学上許容可能な」は、物質または組成物が製剤を含む他の成分及び／またはそれで治療される哺乳類と化学的に及び／または毒性学的に適合性でなければならないことを示す。
【０２３５】
語句「薬学上許容可能な塩」は本明細書で使用されるとき、本発明の化合物の薬学上許容可能な有機塩または無機塩を指す。塩の例には、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチアニン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、蔗糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、「メシル酸塩」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（すなわち、１,１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩、アルカリ金属（たとえば、ナトリウム及びカリウム）塩、アルカリ土類金属（たとえば、マグネシウム）塩、及びアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学上許容可能な塩には、たとえば、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンのような別の分子の包含が関与してもよい。対イオンは親化合物にて電荷を安定化する有機または無機の部分であってもよい。さらに、薬学上許容可能な塩はその構造に１を超える荷電した原子を有してもよい。複数の荷電した原子が薬学上許容可能な塩の一部である例は複数の対イオンを有することができる。従って、薬学上許容可能な塩は１以上の荷電した原子及び／または１以上の対イオンを有することができる。
【０２３６】
本発明の化合物が塩基であるならば、所望の薬学上許容可能な塩は、当該技術で利用可能な好適な方法、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸等のような無機酸による、または、たとえば、酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸、たとえば、グルクロン酸またはガラクツロン酸、アルファヒドロキシ酸、たとえば、クエン酸または酒石酸、アミノ酸、たとえば、アスパラギン酸またはグルタミン酸、芳香族酸、たとえば、安息香酸または桂皮酸、スルホン酸、たとえば、ｐ−トルエンスルホン酸またはエタンスルホン酸等のような有機酸による遊離の塩基の処理によって調製されてもよい。
【０２３７】
本発明の化合物が酸であるならば、所望の薬学上許容可能な塩は、好適な方法、たとえば、アミン（１級、２級または３級）、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物等のような無機または有機の塩基による遊離の酸の処理によって調製されてもよい。好適な塩の説明に役立つ例には、グリシン及びアルギニンのようなアミノ酸、アンモニア、１級、２級及び３級のアミン、及び、たとえば、ピペリジン、モルフォリン及びピペラジンのような環状アミンに由来する有機塩、ならびにナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム及びリチウムに由来する無機塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３８】
ＩＭＧＮ７７９
一実施形態では、ＩＭＧＮ７７９は以下：
【０２３９】
【化１０７】
2017517507.tif 000110
に描かれるビス−酸または薬学上許容可能なその塩として表されてもよい。
【０２４０】
他の実施形態では、ＩＭＧＮ７７９は有効成分：
【０２４１】
【化１０８】
2017517507.tif 000111
または薬学上許容可能なその塩として表されてもよい。
【０２４２】
他の実施形態では、ビス−酸と同様に塩を包含する以下の式：
【０２４３】
【化１０９】
2017517507.tif 000112
が使用されてもよく、式中ｒは１〜１０の整数であり、Ｙは−Ｈまたは−ＳＯ３Ｍであり、好ましくは、Ｙが−ＳＯ３Ｍである場合、Ｍは−Ｈまたは薬学上許容可能なカチオンである。
【０２４４】
他の実施形態では、ビス−酸と同様に塩を包含する以下の式：
【０２４５】
【化１１０】
2017517507.tif 000113
が使用されてもよい。
【０２４６】
Ｐ−糖タンパク質
【０２４７】
ＭＤＲ１としても知られるＰ−糖タンパク質（ＰＧＰ）は１７０ｋＤのＡＴＰ依存性の薬剤排出ポンプである。それはＡＢＣスーパーファミリーのメンバーであり、多剤耐性（ＭＤＲ）細胞にて豊富に発現され、ＡＢＣＢ１遺伝子によって作られる。ＰＧＰを発現しているＡＭＬ細胞は少なくともある程度、従来の化学療法による治療には耐性である。重要なことに、本発明は多剤耐性のＡＭＬの治療を有利に提供する。特定の実施形態では、本発明はＰＧＰを発現しているＡＭＬを治療する方法を提供する。
【０２４８】
治療応用
本発明は、多剤耐性のＡＭＬを含むＡＭＬの治療のためにＩＭＧＮ７７９を投与する方法を提供する。特定の実施形態では、ＩＭＧＮ７７９は薬学上許容可能な剤形で対象に投与される。ＩＭＧＮ７７９は、ボーラスとしてまたは時間をかけた連続点滴によって静脈内に、筋肉内、皮下、関節内、滑膜内、クモ膜下、経口、局所、または吸入の経路によって投与されてもよい。ＩＭＧＮ７７９を含む医薬組成物は腫瘍内、腫瘍周囲、病変内または病変周囲への経路によって投与されて全身性の治療効果と同様に局所の治療効果を発揮する。
【０２４９】
薬学上許容可能な剤形は一般に薬学上許容可能な、たとえば、キャリア、希釈剤及び賦形剤のような作用剤を含むであろう。これらの作用剤は周知であり、最も適した作用剤は臨床状況の保証として当業者によって決定され得る。好適なキャリア、希釈剤及び／または賦形剤の例には、（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するｐＨ７．４のダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、（２）０．９％生理食塩水（０．９％  ｗ／ｖ  ＮａＣｌ）及び（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられる。
【０２５０】
凍結乾燥されるのではなく水性の剤形に存在する場合、ＩＭＧＮ７７９は、これらの範囲の外の広い変異が許容されるけれども、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で通常製剤化されるであろう。疾患の治療については、ＩＭＧＮ７７９の適切な投与量は、抗体が予防目的で投与されようと、治療目的で投与されようと、上記で定義されたような治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、以前の治療法の経過、患者の既往歴及び抗体への応答、及び主治医の裁量に左右されるであろう。抗体は、一度または数回の治療にわたって患者に好適に投与される。
【０２５１】
本発明の治療応用には疾患を有する対象を治療する方法が含まれる。本発明の方法によって治療される疾患はＣＤ３３の発現を特徴とするものである。そのような疾患には、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、及び、たとえば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）のような癌が挙げられる。技量のある熟練者は、本発明の方法がまだ記載されていないが、ＣＤ３３の発現を特徴とする他の疾患を治療するのにも使用されてもよいことを理解するであろう。
【０２５２】
本発明の治療応用は試験管内及び生体外でも実践することができる。
【０２５３】
抗体を作製するためのポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞及び方法
本発明はさらに、本発明の抗体またはそのエピトープ結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【０２５４】
当該技術で既知の方法によってポリヌクレオチドが得られてもよいし、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されてもよい。たとえば、抗体のヌクレオチド配列が既知であれば、抗体をコードするポリヌクレオチドは化学合成されたオリゴヌクレオチド（たとえば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：２４２にて記載されたような）から組み立てられてもよく、それには手短に、抗体をコードする配列の一部を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、ならびにライゲーションしたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が関与する。
【０２５５】
抗体のコーディング配列と適当な転写及び翻訳の制御シグナルとを含有する組換えベクターの構築方法は当該技術で周知である。これらの方法には、たとえば、試験管内の組換えＤＮＡ法、合成法、及び生体内の遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモータに操作可能に連結された本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変領域、またはそれらのエピトープ結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
【０２５６】
組換えベクターを従来の技法によって宿主細胞に移し、次いで形質移入された細胞を従来の技法によって培養して本発明の抗体を産生させる。従って、本発明は、異種プロモータに操作可能に連結された本発明の抗体またはそのエピトープ結合断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。好まれる実施形態では、重鎖及び軽鎖の双方をコードするベクターを免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞にて同時発現させてもよい。
【０２５７】
種々の宿主で発現するベクター系を利用して本発明の抗体分子を発現させてもよい。そのような宿主で発現する系は対象とするコーディング配列が産生され、その後精製されてもよい媒体を表すが、適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換された、または形質移入された場合、その場で本発明の抗体分子を発現してもよい、細胞も表す。これらには、抗体のコーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される細菌（たとえば、大腸菌、枯草菌）のような微生物；抗体のコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換される酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）で感染させる昆虫細胞系；抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させる、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換される植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノムに由来する（たとえば、メタロチオネインプロモータ）もしくは哺乳類ウイルスに由来する（たとえば、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）プロモータを含有する組換え発現構築物を抱く哺乳類細胞系（たとえば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
好ましくは、特に組換え抗体分子全体の発現のためには、大腸菌のような細菌細胞、さらに好ましくは真核細胞を組換え抗体分子の発現に使用する。たとえば、ヒトのサイトメガロウイルスに由来する主要中間初期遺伝子プロモータ要素のようなベクターと併せたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳類細胞は抗体にとって有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔら，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。
【０２５９】
組換えタンパク質の長期の高収率の産生には、安定な発現が好まれる。たとえば、抗体分子を安定して発現する細胞株が操作されてもよい。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現制御要素（たとえば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位等）と選択可能なマーカーによって制御されたＤＮＡによって宿主細胞を形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞を濃縮された培地で１〜２日間増殖させてもよく、次いで選抜培地に交換する。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選抜に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定して統合するのを可能にし、増殖して次々とクローン化し、細胞株へと増殖する細胞増殖巣を形成するのを可能にする。この方法を有利に用いて抗体分子を発現する細胞株を操作してもよい。そのような操作された細胞株は抗体分子と直接または間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価において特に有用である。
【０２６０】
本発明の抗体分子がいったん組換えで発現されると、それは、免疫グロブリン分子の精製について当該技術で既知の方法によって、たとえば、クロマトグラフィ（たとえば、イオン交換、アフィニティ、特にプロテインＡの後の特異的抗原についてのアフィニティ、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、差次的溶解性によって、またはタンパク質の精製についての他の標準的な技法によって精製されてもよい。
【０２６１】
キット
本発明は、患者の試料にてＣＤ３３発現のレベル（たとえば、細胞当たりの抗原の数）を検出する抗ＣＤ３３抗体（たとえば、クローンＷＭ５３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と有効量のＩＭＧＮ７７９を含む治療用組成物とを含むキットを提供する。所望であれば、キットはさらに、ＣＤ３３発現のレベルを検出するための及び患者に投与されればＩＭＧＮ７７９が有効であるか有効でないかを判定する指示書を含む。任意で、キットはさらにＩＭＧＮ７７９を服用するように選択された患者にＩＭＧＮ７７９を投与するための指示書を含む。
【０２６２】
本発明の実践は、特に指示されない限り、分子生物学（組換え法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技法を採用し、それらは技量のある熟練者の視野の範囲内に十分入っている。そのような技法は、たとえば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ及びＣａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）のような文献にて十分に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの作出に適用可能であり、従って本発明を為し、実践することにおいて考慮されてもよい。特定の実施形態に特に有用な技法を次に続く節で議論する。
【０２６３】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、治療方法をどのように行い、使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示されるのであって、本発明者らが彼らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２６４】
実施例１：ＩＭＧＮ７７９はＡＭＬ患者初代細胞に対してＣＤ３３特異的な試験管内の細胞傷害性を示した
ＣＤ３３のレベル及びＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）の活性をフローサイトメトリーによって測定した。７日間までの連続曝露を用いてＷＳＴ−８生存率染色によって、ＡＭＬ細胞株におけるＤＧＮ４６２及びＩＭＧＮ７７９の細胞傷害性能を評価した。初代ＡＭＬ試料及び正常骨髄（ＮＢＭ）に対するＩＭＧＮ７７９の効力は２４時間曝露の後、及び長期液体培養の後、コロニー形成アッセイを用いて評価し、それぞれ、白血病性前駆細胞及び白血病性幹細胞における効力を評価した。皮下のＨＬ６０／ＱＣ及びＥＯＬ−１異種移植片を持つＳＣＩＤマウスにてＩＭＧＮ７７９の抗腫瘍活性を評価した。
【０２６５】
ＣＤ−１マウスにおける薬物動態パラメータはＩＭＧＮ７７９結合体の血漿濃度から、及びＥＬＩＳＡによって測定された種々の時点での全Ｚ４６８１Ａ抗体成分から判定した。これらの血漿試料のサブセットの生物活性はＡＭＬ細胞に対する細胞傷害性能のアッセイによって確認した。ＩＭＧＮ７７９の忍容性は、体重測定、臨床所見及び臨床化学によってＣＤ−１マウスで評価した。
【０２６６】
ＩＭＧＮ７７９は、末梢血または骨髄の試料から単離されたＡＭＬ患者の初代細胞に対して高度に強力な且つＣＤ３３特異的な試験管内の細胞傷害性を実証した。ＩＣ５０値は１０〜１５００ｐＭの範囲であり、細胞当たり＞３０００または５０００の抗原のレベルでのＣＤ３３の発現を伴った試料にて最高の活性が一般に観察された。長期の培養では、ＩＭＧＮ７７９は、ＡＭＬ患者の試料にて白血病性コロニーの形成の用量依存性の減少を示した。対照的に、コロニー形成が正常骨髄で増加したということは、正常な造血幹細胞が見逃されたことを示している。
【０２６７】
ＰＧＰ活性はＣＤ３３発現レベル及びＩＭＧＮ７７９の細胞傷害性と逆相関した。ＩＭＧＮ７７９はＰＧＰを発現する細胞株を含めてＡＭＬの細胞株に対して高い活性があり、ＩＣ５０値は２〜３０００ｐＭの範囲だった。ＩＭＧＮ７７９はＡＭＬの異種移植片に対して高い活性を持ち、最少有効用量（ＭＥＤ）は０．６ｍｇ／ｋｇ（結合体の用量）だった。結合体の半減期はマウスにておよそ３〜４日間であり、生物活性が少なくとも３日間維持されたということは、結合体が循環の間、インタクトなままであり、活性があることを示している。ＩＭＧＮ７７９は、マウスにて毒性の遅延または肝毒性を伴うことなく好都合な忍容性を有した（最高の忍容用量は４０ｍｇ／ｋｇ）。
【０２６８】
実施例２：ＣＤ３３はＡＭＬ患者の初代細胞で発現される
較正されたフローサイトメトリー法を用いてＡＭＬ患者の初代細胞におけるＣＤ３３の発現を測定した（図１）。蛍光でタグを付けた抗ＣＤ３３抗体でＡＭＬ試料を染色し、種々の標識対ビーズの比での蛍光でタグを付けたビーズを用いた較正曲線の蛍光シグナルと比較して、測定されるＡＭＬ細胞当たりの結合したＣＤ３３抗体の総数（ＡＢＣ値）を得た。ＣＤ３３はＡＭＬ患者の細胞では相対的に低いレベルで発現され、最高発現は細胞当たりおよそ１７，０００の抗原だった（ＡＢＣ）。
【０２６９】
実施例３：ＩＭＧＮ７７９はＡＭＬ患者の初代細胞に対して高度に強力で且つＣＤ３３特異的な試験管内の細胞傷害性を明示する
２４時間の結合体への曝露の後のコロニー形成アッセイにてＡＭＬ患者の初代細胞のパネルに対してＩＭＧＮ７７９の細胞傷害性活性を評価した（図２）。
【０２７０】
これらの試料のサブセットにてＣＤ３３を標的とするメイタンシノイドＡＤＣ（ＩＭＧＮ７７９における同じ抗体を用いた）の活性を評価した。ＩＭＧＮ７７９はＡＭＬ患者の細胞に対して高い活性があり、ＩＣ５０値はＣＤ３３の発現レベルに応じて１１ｐＭ〜１．６ｎＭの範囲だった。ＣＤ３３のレベルは細胞当たり約２００〜１６，０００の抗原の範囲だった。対照的に、ＣＤ３３を標的とするメイタンシノイドＡＤＣはＩＭＧＮ７７９よりも６０〜９，０００倍の間で活性が低く、ＣＤ３３の発現レベルに無関係だった。図２はＡＭＬ患者の細胞に対するＣＤ３３を標的とするメイタンシノイドＡＤＣと比べたＩＭＧＮ７７９の試験管内の効力を示す。
【０２７１】
高いレベルの感受性を定義する０．３ｎＭのＩＣ５０カットオフ（ＣＤ３３を標的とするメイタンシノイドＡＤＣの中央値ＩＣ５０よりも５００倍低い）を用いて、ＣＤ３３発現のカットオフに基づいたＩＭＧＮ７７９に高度に感受性の患者細胞の比率を割り出した。１０００より高いＣＤ３３レベルを持つ試料については、６０％を超えるものが高度に感受性だった。＞３，０００のＣＤ３３レベルを持つ試料については、７５％を超えるものがＩＭＧＮ７７９に対して高度に感受性だった。５，０００を超えるＣＤ３３レベルを持つ試料については、試料の数が少ない（１５試料のうち１４）が、９０％を超える細胞がＩＭＧＮ７７９に対して高度に感受性だった。ＣＤ３３のレベルに無関係に試料をすべて含めると、試料すべての５６％が高度に感受性であるにすぎなかった。高度に感受性の試料の比率はＣＤ３３のレベルと共に増加した。５，０００を超えるＡＢＣのＣＤ３３レベルを発現するＡＭＬ患者の細胞は細胞当たり５，０００未満のＣＤ３３抗原を伴うものよりも有意に感受性だった（中央値ＩＣ５０値の比較）（ｐ＜０．００１）。
【０２７２】
非結合性キメラＩｇＧ１−ＤＧＮ４６２結合体の細胞傷害性活性も評価して、観察されたＩＭＧＮ７７９活性のＣＤ３３依存性を判定した。ＣＤ３３非結合性の結合体がこれらの細胞に対して一般に不活性であり、ほとんどの試料でＩＣ５０値が調べられた最高用量（１ｎＭ）に達しなかったということは、高度に強力なＩＭＧＮ７７９の活性はＣＤ３３標的化に依存性であることを実証している。細胞当たりのＣＤ３３抗原が５０００未満または５０００を超える場合の細胞におけるｌｏｇＩＣ５０の分布を図３にて示す。
【０２７３】
実施例４：ＩＭＧＮ７７９は正常な造血幹細胞を見逃す一方で白血病性幹細胞を特異的に標的とした。
ＩＭＧＮ７７９へのＡＭＬ細胞の曝露の後のコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイで形成されたコロニーを長期の液体培養（５〜７週間）の後回収し、白血病性コロニーの分子マーカーとしてのＦＬＴ３−ＩＴＤ（内部縦列重複）及び／または変異ＮＰＭ１の状況について解析した。１００ｐＭ及び１０００ｐＭの用量で対照（未処理）試料及びＩＭＧＮ７７９で処理した試料について、白血病性コロニー（ＦＬＴ３−ＩＴＤ及び／または変異ＮＰＭ１陽性）対野生型（正常、ＦＬＴ３−ＩＴＤ及び／または変異ＮＰＭ１について陰性）の比を測定した。１０００ｐＭ濃度でのＩＭＧＮ７７９による処理はＬＳＣを排除した一方で、正常なコロニーのみの存在によって示されるように造血幹細胞を見逃した（図４Ａ）。
【０２７４】
図４Ｂは、５週間後にてコロニー数に用量依存性の増加があったことを示す。ＡＭＬの分子マーカー（トリソミー８、ＦＬＴ３−ＩＴＤ及びＮＰＭ１）の存在について７週間後、コロニーを解析した。ＡＭＬ分子マーカーの非存在は、野生型（ＷＴ）コロニーが正常なＨＳＣに由来することを示した。ＩＭＧＮ７７９による処理の後の正常な骨髄の長期培養にてコロニー形成の増加も認められたということは、造血幹細胞（ＨＳＣ）が見逃されることを示している。従って、ＩＭＧＮ７７９は白血病性コロニー形成の用量依存性の低下及び白血病性幹細胞の長期培養にて正常なｈｓｃコロニーの増加を生じた。
【０２７５】
実施例５：Ｐ−糖タンパク質（ＰＧＰ）を発現している細胞はＩＭＧＮ７７９に感受性である
ＰＧＰの役割を評価するために、２μＭのＰＧＰ阻害剤であるＰＳＣ８３３を添加して及び添加しないでＩＭＧＮ７７９の試験管内の活性を調べた。ＰＧＰの阻害は０．８〜２９倍に及ぶＩＭＧＮ７７９についての試験管内活性の増強作用を生じ、ＩＭＧＮ７７９に最も感受性ではない２つのＡＭＬ試料で最高だった（５倍及び２９倍）。残りの試料では、増強作用は倍数５未満だった。ＰＧＰ活性はＣＤ３３の発現レベル（図５Ａ）及びＩＭＧＮ７７９の細胞傷害性（図５Ｂ）とは逆相関した。
【０２７６】
実施例６：ＩＭＧＮ７７９はＡＭＬ患者の初代細胞に対して高度に強力で且つＣＤ３３特異的な試験管内の細胞傷害性を明示する
ＡＭＬ患者の初代細胞に対するＩＭＧＮ７７９の細胞傷害性についてのアッセイを短期液体培養アッセイで実施した。最高のＩＭＧＮ７７９活性は一般に細胞当たり＞５０００抗原のＣＤ３３発現レベルで認められた（図２）。ＩＭＧＮ７７９活性はＣＤ３３特異的だった（図５Ａ）。非標的化ＤＧＮ４６２−ＡＤＣは活性がなかった（３５試料中３３でＩＣ５０が調べた最高用量に達しなかった）。ＣＤ３３のレベルは細胞当たり約２００〜１６，０００抗原の範囲だった。
【０２７７】
実施例７：ＡＭＬ細胞株はＩＭＧＮ７７９及びＤＧＮ４６２に高度に感受性である
２１のＡＭＬ細胞株のパネルを試験管内で評価した（図６）。ＣＤ３３の発現は細胞当たり１，０００〜５５，０００抗原の範囲だった。これらのレベルは患者の初代細胞で検出されたレベルよりはるかに高かった。遊離の薬剤ＤＧＮ４６２−ＳＭｅに対する感受性の中央値は３８ｐＭだった（ＩＣ５０は５〜３９００ｐＭに及ぶ）。ＩＭＧＮ７７９に対する感受性の中央値は７０ｐＭだった（ＩＣ５０は２〜３０００ｐＭに及ぶ）。
【０２７８】
較正された定量的フローサイトメトリー法を用いてＡＭＬ細胞株におけるＣＤ３３のレベルを測定した。フィコエリスリン（ＰＥ）を結合した抗ＣＤ３３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を染色し、ＢＤ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズの較正曲線と比較した。ウェル当たり２，０００〜５，０００個の細胞の密度で９６穴組織培養プレートに細胞を入れ、種々の濃度のＤＧＮ４６２−ＳＭｅまたはＩＭＧＮ７７９と共に３７℃で５日間インキュベートした。ＷＳＴ−８系の比色分析（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて細胞の生存を測定した。
【０２７９】
実施例８：ＩＭＧＮ７７９は０．６ｍｇ／ｋｇの最少有効用量でヒトＡＭＬ異種移植片に対して高い活性があり、且つ抗原特異的である
ＩＭＧＮ７７９の抗腫瘍活性を判定するために、皮下異種移植片（約１００ｍｍ３）にてＥＯＬ−１急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞（図７Ａ）またはＨＬ６０／ＱＣ前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）細胞（図７Ｂ）を持つＳＣＩＤマウスにＩＭＧＮ７７９を単回静脈注射した。対照腫瘍の中央値容積が約１０００ｍｍ３であった日の処理群（Ｔ）及び対照群（Ｃ）の腫瘍の中央値容積の比として腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）を算出した（Ｂｉｓｓｅｒｙ，Ｍ．ら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１，４８４５−４８５２，Ｓｅｐｔ．１９９１）。国立癌研究所の基準によれば、≦４２％のＴ／Ｃは抗腫瘍活性の最低レベルである。＜１０％のＴ／Ｃは高い抗腫瘍活性のレベルであると見なされる。図７Ｃは異種移植モデルから得られたデータを要約する表である。
【０２８０】
実施例９：ＩＭＧＮ７７９はＣＤ−１マウスにて上手く忍容され、肝毒性や遅延毒性はない
ＩＭＧＮ７７９の忍容性及び毒性を測定するために、メスＣＤ−１マウス（７週齢）に記載された用量でＩＭＧＮ７７９を静脈内注射した。毎日体重を測定した。肝臓の酵素、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む血清の化学的性質を投与後５日目（体重減少の底）で測定することによる最大忍容投与量（ＭＴＤ）及び約３０％ＭＴＤの用量で毒性を評価した。
【０２８１】
ＩＭＧＮ７７９は最大忍容（ＭＴＤ）の用量でマウスにて肝毒性を生じなかった。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）／アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の値はＣＤ−１マウスについて正常の参照範囲に匹敵した。ＤＮＡ架橋剤を含有する抗体薬剤結合体（ＡＤＣ）では遅延毒性の証拠は認められなかった。図８を参照のこと。
【０２８２】
実施例１０：ＩＭＧＮ７７９は切断可能なリンカーを伴う抗体薬剤結合体（ＡＤＣ）に匹敵する薬物動態プロファイルと生体内の安定性を有し、結合体の生物活性は少なくとも３日間維持される
ＩＭＧＮ７７９の薬物動態と生物活性を測定するために、ＣＤ−１マウスにおけるＩＭＧＮ７７９の単回静脈内注射（５ｍｇ／ｋｇ）の後、総抗体（Ａｂ）（未結合のＡｂ及びインタクトな抗体薬剤結合体の双方）（図９Ａ）及びインタクトな結合体の血漿濃度をＥＬＩＳＡ（図９Ｂ）によって測定した。非コンパートメント解析プログラム（２０１）、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ，Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌバージョン６．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて薬物動態（ＰＫ）解析を行った。マウスの血漿におけるＩＭＧＮ７７９の生物学的に活性のある濃度は細胞傷害性アッセイを用いて測定した。図９Ｂ及び９Ｃを参照のこと。標準のＩＭＧＮ７７９試料の連続希釈または結合体を投与したマウスに由来する漸増する血漿試料のいずれかに細胞を曝露した。マウス血漿におけるＩＭＧＮ７７９の生物学的に活性のある濃度は、各血漿試料のＩＣ５０希釈にＩＭＧＮ７７９標準のＩＣ５０を乗じることによって決定した。
【０２８３】
実施例１１：ＩＭＧＮ７７９はＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を持つＡＭＬ患者の初代細胞に対して試験官内の高い細胞傷害性を示した
患者の血液及び骨髄に由来する初代ＡＭＬ試料に対するＩＭＧＮ７７９の効力を評価した。２４時間暴露の後のコロニー形成アッセイを用いて白血病性前駆細胞におけるＩＭＧＮ７７９は細胞傷害性活性を評価した。較正されたフローサイトメトリー法を用いてＡＭＬ患者初代細胞におけるＣＤ３３の発現を測定した。蛍光タグを付けた抗ＣＤ３３抗体でＡＭＬ試料を染色し、較正曲線の蛍光シグナルと比較した。種々の標識対ビーズの比で蛍光タグを付けたビーズを用いて較正曲線を生成し、測定されるＡＭＬ細胞（ＡＢＣ値）当たりの結合したＣＤ３３抗体の総数を得た。ＳＳＣとＣＤ４５抗体の染色でＡＭＬ芽細胞にゲートをかけた。
【０２８４】
ＣＤ３３は、患者のＡＭＬ芽細胞において約２００〜１５，０００ＡＢＣに及ぶレベルで発現された。ＩＭＧＮ７７９はＡＭＬ患者の細胞に対して高い細胞傷害性活性を有し、ＩＣ５０値はＣＤ３３の発現レベルと関係して１１ｐＭ〜１．６ｎＭの範囲だった（図１１）。
【０２８５】
ゲノム試験の結果は生成されたＩＣ５０値を有する２１のＡＭＬ初代試料について利用可能だった。そのうちで１２がＦＬＴ３内部縦列重複変異（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）を持っていた。ＦＬＴ３−ＩＴＤ試料についての平均ＩＣ５０値は調べた他の試料よりも低かった（図１２）。これは、ＩＭＧＮ７７９がＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ患者の初代試料にて試験管内で高い活性があることを示していた。ＣＤ３３の平均ＡＢＣはＦＬＴ３−ＩＴＤ試料の方が調べた他の試料よりも高かった（図１３）。理論によって束縛されることを意図しないで、これはそれらの相対的な感受性にある程度寄与してもよい。
【０２８６】
実施例１２：ＩＭＧＮ７７９はＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を持つＡＭＬ細胞株に対して試験管内で高い細胞傷害性を示した
７日までの連続曝露を用いて、ＷＳＴ−８生存率染色によってＡＭＬ細胞株におけるＩＭＧＮ７７９の細胞傷害性能を評価した。較正されたフローサイトメトリー法を用いてＣＤ３３のＡＢＣレベルを測定した。調べた細胞株におけるＦＬＴ３の状況は癌（ＣＯＳＭＩＣ）データベースにおける体細胞変異のカタログで報告され、配列決定試験によって確認された。
【０２８７】
ＩＭＧＮ７７９はＡＭＬ細胞株に対して高い細胞傷害性活性を有し、ＩＣ５０値は２ｐＭ〜３ｎＭの範囲だった。ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を持つ２つの細胞株であるＭＶ４−１１及びＭＯＬＭ−１３についてＩＣ５０値がそれぞれ２及び５ｐＭだったということは、ＩＭＧＮ７７９がＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ細胞株に対して試験管内で高い活性があったことを示している（図１４）。
【０２８８】
ＩＭＧＮ７７９に加えて、７日までの連続曝露を用いた、ＷＳＴ−８生存率染色によるＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ細胞株における細胞傷害性能についてソラフェニブ及びキザルチニブも評価した。ソラフェニブは幾つかのチロシンタンパク質キナーゼの小分子阻害剤であり、キザルチニブはＦＬＴ３を含むクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼを特異的に標的とする小分子キナーゼ阻害剤である。双方とも臨床試験でＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ患者を治療するのに使用されている。ＩＭＧＮ７７９についてのＩＣ５０がＭＯＬＭ１３細胞株におけるソラフェニブ及びキザルチニブのＩＣ５０値よりも低かった（図１５）ということは、他の関連する化合物に比べてＩＭＧＮ７７９がＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ細胞株にて活性が高いことを示している。
【０２８９】
実施例１３：ＩＭＧＮ７７９は最少有効用量にてＭＶ４−１１  ＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ異種移植片に対して強力な、抗原を標的とする抗腫瘍活性を示した
ＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬの確立した皮下異種移植モデルにてＩＭＧＮ７７９の抗腫瘍活性を評価した。マウスの右脇腹に皮下注射したＭＶ４−１１ヒトＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ細胞（１×１０７個／動物）をＳＣＩＤマウス（ｎ＝２４）に播種した。腫瘍が約１００ｍｍ３のサイズに達したら（腫瘍細胞の播種後約１３日）、０日目に４００ｍｇ／ｋｇの用量で（播種の１３日後）及び５日目及び１０日目（播種の１８日後及び２３日後）に１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたｃｈＫＴｉ抗体を用いて過剰のヒトＩｇＧによるＦｃＲの遮断を開始した。マウスにおける約１２日の血漿循環半減期に基づいて、血漿ＩｇＧの濃度はおよそ１０ｍｇ／ｍＬで維持されるはずである。この血漿濃度はヒトの循環ＩｇＧレベルに匹敵し、ＭＶ４−１１細胞に存在するすべてのＦｃＲを遮断するのに十分なはずである。播種の１４日後、腫瘍の容積（およそ１００ｍｍ３）に基づいて６匹ずつの処理群にマウスを無作為に分け、ＤＧＮ４６２の濃度に基づいて１０μｇ／ｋｇの用量でのＩＭＧＮ７７９または非標的化対照ｃｈＫＴｉ−ｓｕｌｆｏ−ＳＰＤＢ−ＤＧＮ４６２の単回静脈内注射で処理した。対照腫瘍の容積中央値が約１０００ｍｍ３である日での処理群（Ｔ）と対照群（Ｃ）の腫瘍の容積中央値の比として腫瘍の増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）を算出した（Ｂｉｓｓｅｒｙ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１，４８４５−４８５２，Ｓｅｐｔ．１９９１）。ＮＣＩ標準に従って、Ｔ／Ｃ≦４２％を抗腫瘍活性の最低レベルとする。ＴＣ＜１０％は高い抗腫瘍活性レベルと見なす。
【０２９０】
１０μｇ／ｋｇでのＩＭＧＮ７７９による処理はＭＶ４−１１異種移植片に対して高い抗腫瘍活性を有し、（ＴＣ＝１％）で６／６の動物で部分退縮（ＰＲ）があり、３／６の動物で完全退縮（ＣＲ）があった（図１６）。非標的化対照結合体ｃｈＫＴｉ−ｓｕｌｆｏ−ＳＰＤＢ−ＤＧＮ４６２の一致させた用量による処理は不活性（Ｔ／Ｃ＝９５％）であり、腫瘍は退縮しなかった。
【０２９１】
この試験の結果は、ＣＤ３３を標的とするＩＭＧＮ７７９はＭＶ４−１１のＦＬＴ３−ＩＴＤのＡＭＬ異種移植片に対して１０μｇ／ｋｇの用量で高い活性があることを実証している。
【０２９２】
要するに、ＩＭＧＮ７７９は、新規のＤＮＡアルキル化剤であるＤＧＮ４６２を利用するＣＤ３３を標的とする抗体薬剤結合体（ＡＤＣ）である。質量分光分析のプロファイルは抗体当たりおよそ３つのＤＧＮ４６２分子があることを示している（図１７）。その好都合な前臨床忍容性のプロファイルはＩＭＧＮ７７９が、活性を実証するが、有意な毒性を有するＡＭＬ用の既存の臨床作用剤を超える治療上の利点を付与する可能性があることを示している。ＡＭＬ細胞株及びＡＭＬ患者の試験管内初代細胞に対する高度に強力な、ＣＤ３３を標的とするＩＭＧＮ７７９の活性、マウスにおけるＡＭＬ異種移植片に対して見られる抗腫瘍活性、及び好都合な安全性プロファイルはそれがＡＭＬに対する有望な治療であることを示している。
【０２９３】
上記の本明細書で記載された結果は以下の方法及び材料を用いて得られた。
【０２９４】
試験管内の方法
ＣＤ３３の定量及びＰｇｐの活性
骨髄または末梢血に由来するＡＭＬ患者の初代細胞をフローサイトメトリーによって解析した。ＡＭＬ試料（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋／ＣＤ３３＋前駆細胞区分）をフィコエリスリン（ＰＥ）を結合した抗ＣＤ３３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＢＤ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズの較正曲線と比較した。Ｐｇｐの機能的な活性はＳｙｔｏ１６±ＰＳＣ８３３Ｐｇｐ阻害剤の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比によって算出した。
【０２９５】
ＡＭＬ初代細胞における試験管内の効力
細胞（または正常なヒト骨髄試料）を種々の濃度のＩＭＧＮ７７９または非標的化ＡＤＣ対照に２４時間曝露した。試料を短期液体培養（ＳＴＬＣ）アッセイに分割してＡＭＬ前駆細胞に対する細胞傷害性を測定し、また長期液体培養（ＬＴＬＣ）アッセイに分割してＬＳＣ及び正常なＨＳＣに対する効果を測定した。ＳＴＬＣを用いて半固形のＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４２３０培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に播いた後の細胞で１０〜１４日間コロニー形成単位を測定した。長期培養５〜７週間のための増殖因子を加えてＬＴＬＣアッセイを同様に行った。双方のアッセイにてコロニーを数えて当初播いた細胞の数当たりのコロニー形成単位を割り出した。ＡＭＬの分子マーカーの存在についてＰＣＲまたはＦＩＳＨを用いてＬＴＬＣのコロニーをさらに解析した。
【０２９６】
細胞株に対する試験管内での効力
ウェル当たり２，０００〜５，０００個の細胞の密度で９６穴組織培養プレートに細胞を播き、種々の濃度のＤＧＮ４６２−ＳＭｅまたはＩＭＧＮ７７９と共に３７℃で５日間インキュベートした。ＷＳＴ−８系の比色分析（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて細胞の生存率を決定した。
【０２９７】
抗腫瘍活性
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）ＨＬ６０／ＱＣ及びＥＯＬ−１の皮下異種移植片（約１００ｍｍ３）を持つＳＣＩＤマウスにＩＭＧＮ７７９の単回ＩＶ注射を行った。対照腫瘍の中央値容積が約１０００ｍｍ３であった日の処理群（Ｔ）及び対照群（Ｃ）の腫瘍の中央値容積の比として腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）を算出した（Ｂｉｓｓｅｒｙ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１，４８４５−４８５２，Ｓｅｐｔ．１９９１）。ＮＣＩの基準によれば、≦４２％のＴ／Ｃは抗腫瘍活性の最低レベルである。＜１０％のＴ／Ｃは高い抗腫瘍活性のレベルであると見なされる。ＣＲ＝完全腫瘍退縮
【０２９８】
忍容性／毒性
メスＣＤ−１マウス（７週齢）に記載された用量でＩＭＧＮ７７９を静脈内（ＩＶ）注射した。毎日体重を測定した。肝臓の酵素、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む血清の化学的性質を投与後５日目（体重減少の底）で測定することによるＭＴＤ及び約３０％ＭＴＤの用量で毒性を評価した。
【０２９９】
薬物動態及び生物活性
ＣＤ−１マウスにおけるＩＭＧＮ７７９（５ｍｇ／ｋｇ）の単回ＩＶ注射の後、ＥＬＩＳＡによって総Ａｂ（未結合のＡｂ及びインタクトなＡＤＣの双方）及びインタクトな結合体の血漿濃度を測定した。非コンパートメント解析プログラム（２０１）、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ，Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌバージョン６．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて薬物動態（ＰＫ）解析を行った。細胞傷害性アッセイを用いてマウスの血漿におけるＩＭＧＮ７７９の生物学的に活性のある濃度を割り出した。標準のＩＭＧＮ７７９試料の連続希釈または結合体を投与したマウスに由来する漸増する血漿試料のいずれかに細胞を曝露した。マウス血漿におけるＩＭＧＮ７７９の生物学的に活性のある濃度は、各血漿試料のＩＣ５０希釈にＩＭＧＮ７７９標準のＩＣ５０を乗じることによって決定した。
【０３００】
他の実施形態
前述の記載から、本明細書で記載される本発明に対して変更及び改変を行ってそれを種々の用途及び状態に導入してもよいことが明らかであろう。そのような実施形態も以下のクレームの範囲内にある。
【０３０１】
本明細書の変数の定義における要素のリストの引用には、リストにされた要素の任意の単一の要素または組み合わせ（若しくは部分的組み合わせ）としてのその変数の定義が含まれる。本明細書における実施形態の引用には、単一の実施形態としてのまたは他の実施形態もしくはその一部との組み合わせでのその実施形態が含まれる。
【０３０２】
本発明は、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み入れられ、抗ＣＤ３３抗体（ｈｕＭｙ９−６）の完全な配列を開示している米国特許第７，５５７，１８９号；同第７，３４２，１１０号；同第８，１１９，７８７号；同第８，３３７，８５５号；及び米国特許出願番号１３／６８０，６１４号に記載された主題に関係してもよい。本明細書で言及された特許及び出版物はすべて、各無関係な特許及び出版物が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されるかのようにと同じ程度で参照によって本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ−１】
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【図１０Ａ−２】
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【図１０Ａ−３】
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【図１０Ｂ−１】
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【図１０Ｂ−２】
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【図１０Ｂ−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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