(57)【要約】  本発明は、線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法、ならびに主に糖尿病性潰瘍、Ｉ度、ＩＩ度、およびＩＩＩ度熱傷における皮膚病変の再生剤として、また皮弁法の利用に代わるものとしてのその使用に関する。線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法には、真皮層と表皮層とを分離する工程と、表皮層をインキュベートする工程と、真皮層を粉砕し、線維芽細胞の増殖する工程と、表皮層を粉砕する工程と、懸濁液中でケラチノサイトを増殖する工程と、細胞スプレー溶液の架橋反応剤溶液を製造する工程と、細胞スプレー溶液を製造する工程とが含まれる。線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー用配合物は、その塗布効率および簡易性を向上させ、迅速かつ簡易に使用できる経済的な代替物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法であって：
ａ）真皮層と表皮層とを分離する工程と；
ｂ）前記表皮層をインキュベートしてトリプシン処理された表皮を得る工程と；
ｃ）前記真皮層を粉砕し、線維芽細胞を増殖する工程と；
ｄ）前記表皮層を分解する工程と；
ｅ）懸濁液中でケラチノサイトを増殖する工程と；
ｆ）前記細胞スプレー溶液の架橋反応剤溶液を製造する工程と；
ｇ）細胞スプレー溶液を製造する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
工程ａ）において、皮膚サンプルが、滅菌条件下でダーマトームを用いて皮膚シートを得ることにより、患者から得られ；前記皮膚シートを１０％ｖ／ｖの抗生物質／抗真菌剤を含む１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で少なくとも３回洗浄し；１％ｖ／ｖの抗生物質／抗真菌剤を含む１倍ＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄し；濃度１．７９単位／ｍｇの細胞分散タンパク質分解酵素とともに、温度４℃で少なくとも１６時間インキュベートして、前記表皮層および真皮層を得；１６時間後、滅菌ピンセットを用いて前記二層を分離し、前記層を別個の滅菌容器に入れる、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項３】
皮膚シートのサイズが０．０１５インチ（０．３８１ｍｍ）である、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項４】
前記抗生物質／抗真菌剤がペニシリン／ストレプトマイシンである、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項５】
前記酵素がディスパーゼである、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項６】
工程ｂ）が、前記別個の容器に前記表皮層を分離し、前記ＰＢＳ溶液（１倍）で少なくとも３回洗浄し、次いで前記表皮層をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の最終容量に０．０２５％トリプシンを加えた溶液中、温度３７℃で２０分間インキュベートして、トリプシン処理された表皮を得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項７】
工程ｃ）が、前記真皮層を前記容器に入れ、滅菌条件下でコンスタントパルスツール（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｐｕｌｓｅ  ｔｏｏｌ）で機械的に粉砕して最大サイズ１ｍｍ×１ｍｍの真皮片を得、次いで少なくとも１０分間インキュベートし、前記容器の容量の３３．３３％の線維芽細胞用細胞培地を前記容器の壁面に添加して前記真皮断片を動かさないようにし、次いで３７℃、９５％  ＲＨ、５％  ＣＯ２および２０％  Ｏ２でインキュベートして、単層の線維芽細胞を得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項８】
工程ｄ）が、１０％のウシ胎児血清を含む５０％のヒトケラチノサイト培地で前記トリプシン処理された表皮を中和し、少なくとも３０秒間激しく振盪して細胞溶液を作製し、次いで、細孔径４０μｍのニトロセルローｄスフィルタで前記細胞溶液を濾過して、濾過産物中に懸濁ヒトケラチノサイトを得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項９】
工程ｅ）が、細胞培地を入れた容器に無菌条件下で前記ケラチノサイト単層を播種し、３７℃、相対湿度９５％、５％  ＣＯ２および２０％  Ｏ２で２〜４週間インキュベートし、ケラチノサイトの１００％コンフルエンスに達するまで、３日または４日ごとに前記細胞培地を交換して、大量のケラチノサイトを単層で得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項１０】
工程ｆ）が、無菌条件で、０．９％ｖ／ｖ塩化ナトリウムに濃度１１Ｕ／ｍｌのウシ肺トロンビン２７％ｖ／ｖを加えたもの１５ｍｌを作製し、前記架橋反応剤１５ｍｌをシリンジに充填して、前記細胞スプレー溶液の前記架橋反応剤を得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項１１】
工程ｇ）が、５０ｃｃの自家末梢血を４００ｇで５分間遠心分離して、１５％ｖ／ｖの無細胞血漿血清を得、次いで単層の１０×１０６線維芽細胞および単層の１０×１０６ケラチノサイトで再懸濁させ、１５ｍｌの前記細胞スプレー溶液を１５ｃｃシリンジに充填し、次いでＦｉｂｒｉｊｅｔ噴霧器で前記細胞スプレー配合物を前記細胞スプレー溶液と混合して、線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項１２】
前記自家末梢血がヒト血小板または凍結保存血小板である、請求項１１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項１３】
皮膚病変の再生のための薬剤を製造するための、請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の方法で得られるヒトケラチノサイトおよびヒト線維芽細胞の細胞スプレー配合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法、ならびに主に糖尿病性潰瘍、Ｉ度、ＩＩ度、およびＩＩＩ度熱傷における皮膚病変の再生剤として、また皮弁法の利用に代わるものとしてのその使用である。該線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー用配合物は、塗布の効率および簡易性を向上させ、迅速かつ簡易に使用できる経済的な代替物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在のところ、同種異系移植片および異種移植片の利用は、ドナー由来の皮膚の使用または動物の毛皮の使用にともなう免疫拒絶反応により引き起こされる炎症過程によって、皮膚の再生を制限している。このことは皮膚創傷の処置でのそのような生体材料の可用性を低下させ、また感染症を起こしやすいという不都合もある。現在、線維芽細胞およびケラチノサイトが皮膚創傷上にプリントされる、バイオプリンティングという生きたヒト細胞をプリントする技術の特許が存在する。この技術は、ロボットアーム（三次元軸を自由に移動できる）により、創傷上に自家細胞を機械的に配置することに基づく。これに加え、脱細胞化したウシ由来の一連の皮膚上でのヒトケラチノサイトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に基づく代用皮膚も市場に出ている。使用は、その表面に前もって播種したヒトケラチノサイトを有するこのウシ由来の脱細胞化マトリックスの移植による創傷治癒時間の増加にのみ基づく。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、人間との適合性が１００％でない動物由来の製品（脱細胞化マトリックス）を使用することに加え、この製品の使用および移植は、上皮化および創傷再生の効果を向上させることにのみ基づくものであり、色素形成や発毛誘導を再び引き起こす皮膚機能の再生については無視している。これに加え、この器官（皮膚）に生じた重度の外傷は、ケラチノサイトを有するこれらのメッシュの使用による部分再生または不完全再生および萎縮、ならびに色素および毛髪の完全な発生不全を引き起こす可能性がある。研究室で開発された創傷の上皮化および再生のための他の手法は、高い増殖性を有するマウス胚由来の線維芽細胞層上でのヒトケラチノサイトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に基づく。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ系には、作成されたバイオグラフトの細胞外マトリックスの低い生産性、創傷の保護バリアとしての損傷範囲を覆う厚みおよび支持が非常に限られた二次元サイズなどの不利点があり、さらに創傷治癒における皮膚再生の機能を無視している（色素形成および発毛の誘導）。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、線維芽細胞およびヒトケラチノサイト、好ましくは線維芽細胞およびヒト自家ケラチノサイトおよび／または同種異系の溶液に懸濁した細胞スプレー配合物を得る方法、ならびに皮膚病変の再生剤としてのその使用に関し、これは以下の工程を含む：
【０００５】
（ａ）真皮と表皮との分離
滅菌条件下でダーマトームを用いて好ましくは０．０１５インチ（０．３８１ｍｍ）の皮膚シートを得ることにより、患者の皮膚の皮膚サンプルを得る。その後、１０％ｖ／ｖの抗生物質／抗真菌剤溶液を含む１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、この皮膚サンプルを少なくとも３回洗浄する。次いで、１％ｖ／ｖの抗生物質／抗真菌剤を含む1倍ＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄する。好ましくは、抗生物質／抗真菌剤溶液は、ストレプトマイシン／ペニシリンである。皮膚サンプルの洗浄後、濃度１．７９単位／ｍｇの細胞分散タンパク質分解酵素、好ましくはディスパーゼとともに、温度４℃の条件で少なくとも１６時間インキュベートして、表皮層および真皮層を得る。１６時間後、滅菌ピンセットを用いて二層を分離し、これらの層を別個の滅菌容器に入れる。
【０００６】
（ｂ）トリプシン処理された表皮を得るための表皮層のインキュベーション
別個の容器に表皮層を分離し、1倍ＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄し、この表皮層をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の最終容量に０．０２５％トリプシンを加えた溶液中、温度３７℃で２０分間インキュベートして、トリプシン処理された表皮を得る。
【０００７】
（ｃ）真皮層の粉砕および線維芽細胞の増殖
真皮層を容器に入れ、滅菌条件下、パルスカッティングツール（ｐｕｌｓｏ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｏｏｌ）で機械的に粉砕して最大１ｍｍ×１ｍｍの真皮片を得、少なくとも１０分間インキュベートし、容器容量の３３．３３％の線維芽細胞用細胞培地を容器の壁面に慎重に添加して真皮断片を動かさないようにし、３７℃、相対湿度９５％、５％  ＣＯ２および２０％  Ｏ２でインキュベートして、単層の線維芽細胞を得る。
【０００８】
（ｄ）表皮層の分解
ウシ胎児血清１０％を含む５０％のヒトケラチノサイト培地でトリプシン処理された表皮を中和し、少なくとも３０秒間激しく振盪して細胞溶液を得る。次いで、細孔径４０μｍのニトロセルロースフィルタでこの細胞溶液を濾過して、濾過産物中に懸濁したヒトケラチノサイトを得る。
【０００９】
（ｅ）懸濁ケラチノサイトの増殖
無菌条件下、細胞培地を入れた容器にケラチノサイト懸濁液を単層で播種し、３７℃、９５％  ＲＨ、５％  ＣＯ２および２０％  Ｏ２の無菌条件下で２〜４週間インキュベートし、ケラチノサイトの１００％コンフルエンスに達するまで、３日または４日ごとに細胞培地を交換して、ほとんどの量のケラチノサイトを単層で得る。
【００１０】
（ｆ）細胞スプレー溶液の架橋反応剤溶液の製造
無菌条件で、０．９％ｖ／ｖ塩化ナトリウムに濃度１１Ｕ／ｍｌのウシ肺トロンビン２７％ｖ／ｖを加えたもの１５ｍｌを作製し、この架橋反応剤１５ｍｌを１５ｃｃシリンジに充填して、細胞スプレー溶液の架橋反応剤を得る。
（ｇ）細胞スプレー溶液の製造
【００１１】
５０ｃｃの自家末梢血、好ましくはヒト血小板（患者から採取したもの）、または凍結保存された血小板（血液バンク）を４００ｇで５分間遠心分離して、１５％ｖ／ｖの無細胞血漿血清を得、単層の１０×１０６線維芽細胞および単層の１０×１０６ケラチノサイトで再懸濁させ、１５ｍｌの細胞スプレー溶液を１５ｃｃシリンジに充填し、Ｆｉｂｒｉｊｅｔ噴霧器を用いて細胞スプレー配合物を細胞スプレー溶液と混合して、線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
例１：ケラチノサイトおよびヒト線維芽細胞の細胞スプレー配合物の皮膚病変への利用の好ましい実施形態
【００１３】
細胞スプレー配合物を含む１５ｃｃシリンジおよびスプレー溶液の架橋反応剤の１５ｃｃシリンジをＦｉｂｒｉｊｅｔ噴霧器に接続する。Ｆｉｂｒｉｊｅｔ噴霧器を圧縮空気調節装置に接続する。圧縮空気調節装置を２５ＰＳＩ／１．７５バールで圧縮空気電源装置に接続する。Ｆｉｂｒｉｊｅｔを組織表面より上方３ｃｍ以上の距離に設置する。
圧縮空気源を開放し、両シリンジのプランジャーを同時に押して、ケラチノサイトおよびヒト線維芽細胞を微粉化する。
【００１４】
代替方法として、２２５ｇ／ｍｌのウシ血液フィブリノゲンを溶解した１倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水から構成される溶液の１５％ｖ／ｖで、線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物を製造する。
【００１５】
代替方法として、細胞スプレー用の線維芽細胞ヒトケラチノサイト配合物は、Ｂａｘｔｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の「Ｔｉｓｓｕｃｏｌ」という製剤により、ヒトドナー由来のフィブリノゲン製剤を用いて得ることもできる。
代替方法として、スプレー溶液の架橋反応剤は、１５ｃｃシリンジに１％ｖ／ｖ  ＣａＣｌ２を充填することによって得ることもできる。
【００１６】
代替方法として、スプレー溶液の架橋反応剤は、Ｂａｘｔｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の「Ｔｉｓｓｕｃｏｌ」というドナー由来のヒトトロンビンを用いて得ることもできる。
例２：本発明の好ましい形態
【００１７】
自家線維芽細胞およびヒトケラチノサイト配合物および／またはドナーは、細胞スプレー溶液および細胞スプレー溶液の架橋反応剤溶液を含み、これは加圧微粉化時に両分子を混合して生きた細胞を封入し、これが組織表面に配置され、その内部に生きた細胞を有するフィルムまたはゲルフィラーを形成して、新しい細胞外マトリックスを生成する。
例３：細胞スプレー配合物の取り扱い
【００１８】
手術室で実施される細胞スプレー法は、医療装置（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃｓ社製のＦｉｂｒｉｊｅｔガス式アプリケーター）によって２種類の溶液を同時にスプレーして、創傷または皮膚病変上に再上皮化処置としてゲル化フィルムおよび／またはフィラーを作製し、そのゲル化フィルムに生きた細胞を封入することで皮膚の再生を促進することによるものである。
例４：本発明の好適な使用
【００１９】
手術室で実施される細胞スプレー法は、生きた細胞を封入したゲル化フィルムおよび／またはフィラーを再上皮化処置として創傷または皮膚病変上に作製するために、医療装置（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃｓ社製のＦｉｂｒｉｊｅｔガス式アプリケーター）で同時にスプレーされる２種類の溶液を含む。
【００２０】
医療装置（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃｓ社製のＦｉｂｒｉｊｅｔガス式アプリケーター）は、２種類の反応溶液：細胞スプレー溶液（フィブリノゲン、線維芽細胞、およびケラチノサイト）および細胞スプレー溶液の架橋反応剤溶液（トロンビン）を有する２つの５ｃｃシリンジを含んだ。
【００２１】
スプレーは圧縮空気源に接続された医療装置（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃｓ社製のＦｉｂｒｉｊｅｔガス式アプリケーター）により、少なくとも３ｃｍ離れたところから皮膚創傷に直接行われる。スプレーを実施するのに必要な圧力は、２５ＰＳＩ／１．７５バールの圧縮空気であり、これは２つのシリンジを押して、それらの内容物を微細液滴として創傷上にスプレーして、線維芽細胞およびケラチノサイトを含むフィブリンのゲル形成フィルムを得、これは創傷上に新しい細胞外マトリックスの産生を促す。大粒液滴スプレー法を行うには、１５ＰＳＩ／１．０バールの圧縮空気でスプレーをおこなう。その結果、この方法は、短時間での創傷の再上皮化、組織の再構築、および病変の早期再生を実現し、感染症への暴露を回避する。
【００２２】
皮膚病変と接触した状態の線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物は、時間の経過とともに再上皮化およびより速い再生をもたらすが、これはこのフィブリンネットワーク（ヒトフィブリノゲン、ヒト無細胞血漿、ウシフィブリノゲン）内に組み込まれた生きた線維芽細胞が追加されて、細胞外マトリックスおよびコラーゲン線維の新規生成が刺激されることによる。
本発明者の発明を十分に説明したところで、これを新規の発明とみなし、よって以下の請求項の範囲に含まれる内容の本発明者の排他的所有権を主張する。
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月4日(2016.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法、ならびに主に糖尿病性潰瘍、Ｉ度、ＩＩ度、およびＩＩＩ度熱傷における皮膚病変の再生剤として、また皮弁法の利用に代わるものとしてのその使用である。該線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー用配合物は、塗布の効率および簡易性を向上させ、迅速かつ簡易に使用できる経済的な代替物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在のところ、同種異系移植片および異種移植片の利用は、ドナー由来の皮膚の使用または動物の毛皮の使用にともなう免疫拒絶反応により引き起こされる炎症過程によって、皮膚の再生を制限している。このことは皮膚創傷の処置でのそのような生体材料の可用性を低下させ、また感染症を起こしやすいという不都合もある。現在、線維芽細胞およびケラチノサイトが皮膚創傷上にプリントされる、バイオプリンティングという生きたヒト細胞をプリントする技術の特許が存在する。この技術は、ロボットアーム（三次元軸を自由に移動できる）により、創傷上に自家細胞を機械的に配置することに基づく。これに加え、脱細胞化したウシ由来の一連の皮膚上でのヒトケラチノサイトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に基づく代用皮膚も市場に出ている。使用は、その表面に前もって播種したヒトケラチノサイトを有するこのウシ由来の脱細胞化マトリックスの移植による創傷治癒時間の増加にのみ基づく。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、人間との適合性が１００％でない動物由来の製品（脱細胞化マトリックス）を使用することに加え、この製品の使用および移植は、上皮化および創傷再生の効果を向上させることにのみ基づくものであり、色素形成や発毛誘導を再び引き起こす皮膚機能の再生については無視している。これに加え、この器官（皮膚）に生じた重度の外傷は、ケラチノサイトを有するこれらのメッシュの使用による部分再生または不完全再生および萎縮、ならびに色素および毛髪の完全な発生不全を引き起こす可能性がある。研究室で開発された創傷の上皮化および再生のための他の手法は、高い増殖性を有するマウス胚由来の線維芽細胞層上でのヒトケラチノサイトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に基づく。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ系には、作成されたバイオグラフトの細胞外マトリックスの低い生産性、創傷の保護バリアとしての損傷範囲を覆う厚みおよび支持が非常に限られた二次元サイズなどの不利点があり、さらに創傷治癒における皮膚再生の機能を無視している（色素形成および発毛の誘導）。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、線維芽細胞およびヒトケラチノサイト、好ましくは線維芽細胞およびヒト自家ケラチノサイトおよび／または同種異系の溶液に懸濁した細胞スプレー配合物を得る方法、ならびに皮膚病変の再生剤としてのその使用に関し、これは以下の工程を含む：
【０００５】
（ａ）真皮と表皮との分離
滅菌条件下でダーマトームを用いて好ましくは０．０１５インチ（０．３８１ｍｍ）の皮膚シートを得ることにより、患者の皮膚の皮膚サンプルを得る。その後、１０％ｖ／ｖの抗生物質／抗真菌剤溶液を含む１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、この皮膚サンプルを少なくとも３回洗浄する。次いで、１％ｖ／ｖの抗生物質／抗真菌剤を含む１倍ＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄する。好ましくは、抗生物質／抗真菌剤溶液は、ストレプトマイシン／ペニシリンである。皮膚サンプルの洗浄後、濃度１．７９単位／ｍｇの細胞分散タンパク質分解酵素、好ましくはディスパーゼとともに、温度４℃の条件で少なくとも１６時間インキュベートして、表皮層および真皮層を得る。１６時間後、滅菌ピンセットを用いて二層を分離し、これらの層を別個の滅菌容器に入れる。
【０００６】
（ｂ）トリプシン処理された表皮を得るための表皮層のインキュベーション
別個の容器に表皮層を分離し、1倍ＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄し、この表皮層をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の最終容量に０．０２５％トリプシンを加えた溶液中、温度３７℃で２０分間インキュベートして、トリプシン処理された表皮を得る。
【０００７】
（ｃ）真皮層の粉砕および線維芽細胞の増殖
真皮層を容器に入れ、滅菌条件下、パルスカッティングツール（ｐｕｌｓｏ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｏｏｌ）で機械的に粉砕して最大１ｍｍ×１ｍｍの真皮片を得、少なくとも１０分間インキュベートし、容器容量の３３．３３％の線維芽細胞用細胞培地を容器の壁面に慎重に添加して真皮断片を動かさないようにし、３７℃、相対湿度９５％、５％  ＣＯ２および２０％  Ｏ２で２〜５日間インキュベートして、単層の線維芽細胞を得る。
【０００８】
（ｄ）表皮層の分解
ウシ胎児血清１０％を含む５０％のヒトケラチノサイト培地でトリプシン処理された表皮を中和し、少なくとも３０秒間激しく振盪して細胞溶液を得る。次いで、細孔径４０μｍのニトロセルロースフィルタでこの細胞溶液を濾過して、濾過産物中に懸濁したヒトケラチノサイトを得る。
【０００９】
（ｅ）懸濁ケラチノサイトの増殖
無菌条件下、細胞培地を入れた容器にケラチノサイト懸濁液を単層で播種し、３７℃、９５％  ＲＨ、５％  ＣＯ２および２０％  Ｏ２の無菌条件下で２〜４週間インキュベートし、ケラチノサイトの１００％コンフルエンスに達するまで、３日または４日ごとに細胞培地を交換して、ほとんどの量のケラチノサイトを単層で得る。
【００１０】
（ｆ）細胞スプレー溶液の架橋反応剤溶液の製造
無菌条件で、０．９％ｖ／ｖ塩化ナトリウムに濃度１１Ｕ／ｍｌのウシ肺トロンビン２７％ｖ／ｖを加えたもの１５ｍｌを作製し、この架橋反応剤１５ｍｌを１５ｃｃシリンジに充填して、細胞スプレー溶液の架橋反応剤を得る。
（ｇ）細胞スプレー溶液の製造
【００１１】
５０ｃｃの自家末梢血、好ましくはヒト血小板（患者から採取したもの）、または凍結保存された血小板（血液バンク）を４００ｇで５分間遠心分離して、１５％ｖ／ｖの無細胞血漿血清を得、単層の１０×１０６線維芽細胞および単層の１０×１０６ケラチノサイトで再懸濁させ、１５ｍｌの細胞スプレー溶液を１５ｃｃシリンジに充填し、Ｆｉｂｒｉｊｅｔ噴霧器を用いて細胞スプレー配合物を細胞スプレー溶液と混合して、線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
例１：ケラチノサイトおよびヒト線維芽細胞の細胞スプレー配合物の皮膚病変への利用の好ましい実施形態
【００１３】
細胞スプレー配合物を含む１５ｃｃシリンジおよびスプレー溶液の架橋反応剤の１５ｃｃシリンジをＦｉｂｒｉｊｅｔ噴霧器に接続する。Ｆｉｂｒｉｊｅｔ噴霧器を圧縮空気調節装置に接続する。圧縮空気調節装置を２５ＰＳＩ／１．７５バールで圧縮空気電源装置に接続する。Ｆｉｂｒｉｊｅｔを組織表面より上方３ｃｍ以上の距離に設置する。
圧縮空気源を開放し、両シリンジのプランジャーを同時に押して、ケラチノサイトおよびヒト線維芽細胞を微粉化する。
【００１４】
代替方法として、２２５ｇ／ｍｌのウシ血液フィブリノゲンを溶解した１倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水から構成される溶液の１５％ｖ／ｖで、線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物を製造する。
【００１５】
代替方法として、細胞スプレー用の線維芽細胞ヒトケラチノサイト配合物は、Ｂａｘｔｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の「Ｔｉｓｓｕｃｏｌ」という製剤により、ヒトドナー由来のフィブリノゲン製剤を用いて得ることもできる。
代替方法として、スプレー溶液の架橋反応剤は、１５ｃｃシリンジに１％ｖ／ｖ  ＣａＣｌ２を充填することによって得ることもできる。
【００１６】
代替方法として、スプレー溶液の架橋反応剤は、Ｂａｘｔｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の「Ｔｉｓｓｕｃｏｌ」というドナー由来のヒトトロンビンを用いて得ることもできる。
例２：本発明の好ましい形態
【００１７】
自家線維芽細胞およびヒトケラチノサイト配合物および／またはドナーは、細胞スプレー溶液および細胞スプレー溶液の架橋反応剤溶液を含み、これは加圧微粉化時に両分子を混合して生きた細胞を封入し、これが組織表面に配置され、その内部に生きた細胞を有するフィルムまたはゲルフィラーを形成して、新しい細胞外マトリックスを生成する。
例３：細胞スプレー配合物の取り扱い
【００１８】
手術室で実施される細胞スプレー法は、医療装置（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃｓ社製のＦｉｂｒｉｊｅｔガス式アプリケーター）によって２種類bの溶液を同時にスプレーして、創傷または皮膚病変上に再上皮化処置としてゲル化フィルムおよび／またはフィラーを作製し、そのゲル化フィルムに生きた細胞を封入することで皮膚の再生を促進することによるものである。
例４：本発明の好適な使用
【００１９】
手術室で実施される細胞スプレー法は、生きた細胞を封入したゲル化フィルムおよび／またはフィラーを再上皮化処置として創傷または皮膚病変上に作製するために、医療装置（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃｓ社製のＦｉｂｒｉｊｅｔガス式アプリケーター）で同時にスプレーされる２種類の溶液を含む。
【００２０】
医療装置（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃｓ社製のＦｉｂｒｉｊｅｔガス式アプリケーター）は、２種類の反応溶液：細胞スプレー溶液（フィブリノゲン、線維芽細胞、およびケラチノサイト）および細胞スプレー溶液の架橋反応剤溶液（トロンビン）を有する２つの５ｃｃシリンジを含んだ。
【００２１】
スプレーは圧縮空気源に接続された医療装置（Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃｓ社製のＦｉｂｒｉｊｅｔガス式アプリケーター）により、少なくとも３ｃｍ離れたところから皮膚創傷に直接行われる。スプレーを実施するのに必要な圧力は、２５ＰＳＩ／１．７５バールの圧縮空気であり、これは２つのシリンジを押して、それらの内容物を微細液滴として創傷上にスプレーして、線維芽細胞およびケラチノサイトを含むフィブリンのゲル形成フィルムを得、これは創傷上に新しい細胞外マトリックスの産生を促す。大粒液滴スプレー法を行うには、１５ＰＳＩ／１．０バールの圧縮空気でスプレーをおこなう。その結果、この方法は、短時間での創傷の再上皮化、組織の再構築、および病変の早期再生を実現し、感染症への暴露を回避する。
【００２２】
皮膚病変と接触した状態の線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞スプレー配合物は、時間の経過とともに再上皮化およびより速い再生をもたらすが、これはこのフィブリンネットワーク（ヒトフィブリノゲン、ヒト無細胞血漿、ウシフィブリノゲン）内に組み込まれた生きた線維芽細胞が追加されて、細胞外マトリックスおよびコラーゲン線維の新規生成が刺激されることによる。
本発明者の発明を十分に説明したところで、これを新規の発明とみなし、よって以下の請求項の範囲に含まれる内容の本発明者の排他的所有権を主張する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法であって：
ａ）真皮層と表皮層とを分離する工程と；
ｂ）前記表皮層をインキュベートしてトリプシン処理された表皮を得る工程と；
ｃ）前記真皮層を粉砕し、線維芽細胞を増殖する工程と；
ｄ）前記表皮層を分解する工程と；
ｅ）懸濁液中でケラチノサイトを増殖する工程と；
ｆ）前記細胞スプレー溶液の架橋反応剤溶液を製造する工程と；
ｇ）細胞スプレー溶液を製造する工程とを含み、工程ａ）において、皮膚サンプルが、滅菌条件下でダーマトームを用いて皮膚シートを得ることにより、患者から得られ；前記皮膚シートを１０％ｖ／ｖの抗生物質／抗真菌剤を含む１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で少なくとも３回洗浄し；１％ｖ／ｖの抗生物質／抗真菌剤を含む１倍ＰＢＳ溶液で少なくとも３回洗浄し；濃度１．７９単位／ｍｇの細胞分散タンパク質分解酵素とともに、温度４℃で少なくとも１６時間インキュベートして、前記表皮層および真皮層を得；１６時間後、滅菌ピンセットを用いて前記二層を分離し、前記層を別個の滅菌容器に入れる、線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項２】
皮膚シートのサイズが０．０１５インチ（０．３８１ｍｍ）である、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項３】
前記抗生物質／抗真菌剤がペニシリン／ストレプトマイシンである、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項４】
前記酵素がディスパーゼである、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項５】
工程ｂ）が、前記別個の容器に前記表皮層を分離し、前記ＰＢＳ溶液（１倍）で少なくとも３回洗浄し、次いで前記表皮層をエチレンジアミン四酢酸の最終容量に０．０２５％トリプシンを加えた溶液中、温度３７℃で２０分間インキュベートして、トリプシン処理された表皮を得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項６】
工程ｃ）が、前記真皮層を前記容器に入れ、滅菌条件下でコンスタントパルスツール（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｐｕｌｓｅ  ｔｏｏｌ）で機械的に粉砕して最大サイズ１ｍｍ×１ｍｍの真皮片を得、次いで少なくとも１０分間インキュベートし、前記容器の容量の３３．３３％の線維芽細胞用細胞培地を前記容器の壁面に添加して前記真皮断片を動かさないようにし、次いで３７℃、９５％  ＲＨ、５％  ＣＯ２および２０％  Ｏ２でインキュベートして、単層の線維芽細胞を得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項７】
工程ｄ）が、１０％のウシ胎児血清を含む５０％のヒトケラチノサイト培地で前記トリプシン処理された表皮を中和し、少なくとも３０秒間激しく振盪して細胞溶液を作製し、次いで、ニトロセルロースフィルタで前記細胞溶液を濾過して、濾過産物中に懸濁ヒトケラチノサイトを得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。  
【請求項８】
工程ｅ）が、細胞培地を入れた容器に無菌条件下で前記ケラチノサイト単層を播種し、３７℃、相対湿度９５％、５％  ＣＯ２および２０％  Ｏ２で２〜４週間インキュベートし、ケラチノサイトの１００％コンフルエンスに達するまで前記細胞培地を交換することを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項９】
工程ｆ）が、無菌条件で、０．９％ｖ／ｖ塩化ナトリウムに濃度１１Ｕ／ｍｌのウシ肺トロンビン２７％ｖ／ｖを加えたもの１５ｍｌを作製し、前記架橋反応剤１５ｍｌをシリンジに充填して、前記細胞スプレー溶液の前記架橋反応剤を得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項１０】
工程ｇ）が、５０ｃｃの自家末梢血を４００ｇで５分間遠心分離して、１５％ｖ／ｖの無細胞血漿血清を得、次いで単層の１０×１０６線維芽細胞および単層の１０×１０６ケラチノサイトで再懸濁させ、１５ｍｌの前記細胞スプレー溶液を１５ｃｃシリンジに充填し、次いで噴霧器で前記細胞スプレー配合物を前記細胞スプレー溶液と混合して、線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得ることを含む、請求項１に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項１１】
前記自家末梢血がヒト血小板または凍結保存血小板である、請求項１０に記載の線維芽細胞およびケラチノサイトの細胞スプレー配合物を得る方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法により得られる配合物の使用を含む、皮膚病変を処置するための薬剤を製造する方法。
【国際調査報告】
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