(57)【要約】  本開示は、限定はされないが敗血症を含む炎症性疾患の治療を意図して、幹細胞を用いるための方法および組成物を包含する。本開示はまた、幹細胞を固定化するためのマイクロカプセル化システム、炎症を有する被験者にカプセル化幹細胞を送達するための方法、ならびに急性および慢性感染用の治療としてのカプセル化幹細胞の使用に関する。
2017536127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の単離された集団であって、カプセル化幹細胞の前記単離された集団が、少なくとも１つの治療関連タンパク質をインビトロよりも少なくとも２倍多くインビボで分泌する、幹細胞の単離された集団。
【請求項２】
前記幹細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項１に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項３】
骨髄、脂肪組織、臍帯、胎盤、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）または多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）に由来する、請求項２に記載の間葉系幹細胞。
【請求項４】
前記少なくとも１つの治療関連タンパク質が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−Ｂ（ＴＧＦ−Ｂ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、および間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項５】
前記少なくとも１つの治療関連タンパク質が、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）、インターロイキン−１受容体拮抗剤（ＩＬ−１ＲＡ）、ガレクチン−１、ガレクチン−３、アディポネクチン、レゾルビンＤ１（ＲｖＤ１）またはレゾルビンＥ１（ＲｖＥ１）からなる群から選択される、請求項１に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項６】
前記少なくとも１つの治療関連タンパク質が、プロスタグランジン、好ましくはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）からなる群から選択される、請求項１に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項７】
前記カプセル化幹細胞の治療効果が、疾患に起因する損傷組織を修復し、疾患の進行を遅延させるか、または疾患の症状を軽減する、請求項１に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項８】
敗血症、急性肺損傷（ＡＬＩ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症虚血肢（ＣＬＩ）、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、エボラ、急性肺損傷（ＡＬＩ）、および急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）から選択される、請求項７に記載の疾患。
【請求項９】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、関節リウマチ（ＲＡ）、うっ血性心不全、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、黄斑変性症（ＭＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病および２型糖尿病のリストから選択される、請求項７に記載の疾患。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡ分子を発現する外来性ＤＮＡ配列を含む幹細胞の単離された集団であって、前記カプセル化幹細胞が、前記ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを、微小胞、エキソソーム、または細胞突起を介して標的細胞に送達する、幹細胞の単離された集団。
【請求項１１】
カプセル化幹細胞の前記単離された集団が、前記ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡポリヌクレオチドの標的細胞への微小胞、エキソソームまたは細胞突起を介する導入に適した条件下で、標的細胞とコミュニケーションする、請求項１０に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項１２】
カプセル化幹細胞の前記単離された集団が、前記外因性ＤＮＡ配列または前記ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｄｓＲＮＡ配列を微小胞、エキソソームまたは細胞突起により送達する、請求項１１に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項１３】
前記ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡがウイルス感染を媒介する遺伝子にて特異的である、請求項１２に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項１４】
エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）に起因する、請求項１３に記載のウイルス感染。
【請求項１５】
前記ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡが前記ＮＰＣ１受容体遺伝子にて特異的である、請求項１３に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項１６】
間葉系幹細胞の増殖されたクローン集団である、請求項１３に記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項１７】
動物またはヒト被験者における疾患またはその症状を軽減するため、請求項１に記載の幹細胞の単離された集団をアルギン酸微小環境内に固定化する一方、分子コミュニケーションを持続させることができる、アルギン酸マイクロカプセルを含むマイクロカプセル化システム。
【請求項１８】
前記アルギン酸ポリマーが約１．０％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度を有する、請求項１７に記載のマイクロカプセル化システム。
【請求項１９】
前記アルギン酸ポリマーが約２．５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する、請求項１８に記載のマイクロカプセル化システム。
【請求項２０】
前記マイクロカプセルが、ポリ−Ｌ−リジンのさらなる連続的な外表面コーティングを含む、請求項１７に記載のマイクロカプセル化システム。
【請求項２１】
前記マイクロカプセルが、アルギン酸ポリマーをマイクロカプセルに架橋するため、カルシウムまたはバリウムまたはカルシウムとバリウムとの混合物の群からの２価陽イオンを含む、請求項１７に記載のマイクロカプセル化システム。
【請求項２２】
前記２価陽イオンが、５０〜１００ｍＭのカルシウムと２〜５０ｍＭのバリウム、好ましくは５０ｍＭのカルシウムと５０ｍＭのバリウムとの混合物である、請求項１７に記載のマイクロカプセル化システム。
【請求項２３】
前記マイクロカプセルが、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ではなくアルブミンに対して極めて透過性が高い、請求項２２に記載のマイクロカプセル化システム。
【請求項２４】
疾患を治療する方法であって、疾患を軽減するため、疾患を患う被験者に請求項１７に記載のマイクロカプセル化システム中に固定化された幹細胞を有効量で投与し、前記被験者における免疫応答を調節するステップを含む、方法。
【請求項２５】
被験者に投与された幹細胞の前記用量が前記被験者の１０００万個の細胞／ｋｇ体重より少ない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
被験者に投与された幹細胞の前記用量が前記被験者の約６００万個の細胞／ｋｇ体重である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
マイクロカプセル化システム中に固定化された幹細胞が、静脈内注射、腹腔内注射、リンパ節注射、胸腺注射、脾臓注射、皮下注射またはその組み合わせにより被験者に有効量で投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
幹細胞が、疾患または状態に対する治療を必要とする被験者の診断から１日以内に有効量で投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
幹細胞が治療を必要とする被験者の診断から１日以内に有効量で投与され、続いて幹細胞が２〜７日後に第２の有効量で投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記幹細胞が、疾患に対する治療を必要とする前記被験者以外の非自家の被験者に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
血液または末梢組織における細菌のレベルの増加を伴う疾患を有する被験者における細菌のマクロファージ食作用を増強するため、幹細胞が有効量で投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患が敗血症、重度敗血症、または敗血症ショックである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
疾患を有する被験者の血液中または腹膜内の細菌のレベルを少なくとも１００倍減少させるため、幹細胞が有効量で投与される、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年１１月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０８３，５４６号明細書の優先権の利益を主張し、その開示は、あたかもその全体が本明細書で記載されるが如く本明細書で参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
炎症性疾患および障害における病理は、重篤症状に寄与する、「サイトカインストーム」における炎症性因子の不均衡に起因する。敗血症におけるサイトカインストームは、マクロファージ食作用を低下させ、極めて高レベルの有毒な細菌を生じさせる。サイトカインストームが多数の炎症性成分および経路を包含することから、既存の薬剤は、たとえ併用される場合であっても部分的に有効であるに過ぎない。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多数の炎症性疾患において生じるサイトカインストームを制御し得る。ＭＳＣは、成体骨髄から単離され、体内の炎症部位に移動するという利点を有し得る。ＭＳＣは、一般的には炎症性疾患に対して、特に敗血症において治療効果を有する可能性が高い、サイトカインストームを抑制し、細菌のレベルを減少させ得る抗炎症性因子を放出し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
静脈内に送達されるＭＳＣは安全であるが、炎症を抑制する場合のその有効性は、それらが血流から急速に排除され、それらの一部が最初に移動する疾患位置から消失することから、制限されるように思われる。ＭＳＣは、おそらくはその固有の抗炎症特性のため、制限された拒絶を示すが、通常、骨髄やＭＳＣの生存にとって支持的な微小環境を提供する幾つかの他の組織を除く成体組織への注射後、存続しない。インビボでＭＳＣの寿命を延長するため、発明者は、著しくより長期間生存しかつその有利な因子を体内の周囲領域に分泌し得るアルギン酸マイクロカプセルにＭＳＣをカプセル化している。カプセル化は、１）ＭＳＣが被験者において著しくより長く生存することを可能にする；２）ＭＳＣを活性化して、炎症を局在的かつ全身的に調節する因子をより高レベルに分泌する；３）ＭＳＣカプセルが、それらの運命が不確定である遠隔位置に移動するのではなく、維持可能な特定の領域内に置かれることを可能にする；４）治療関連パラメータを変更するように、疾患モデルにおいてＭＳＣを前報よりも低用量で用いることを可能にする；ならびに５）その機能を増強するために遺伝子改変される場合に懸念される、ＭＳＣが腫瘍化する可能性がある体内に逃避することから患者を保護する、という幾つかの利点を有する。本開示は、ＭＳＣが、免疫調節タンパク質および分子のその発現を改変することによって、炎症性疾患に対してインビボで応答するという発見に関する。したがって、本開示の態様によると、本明細書に提供されるのはカプセル化幹細胞であり、ここで幹細胞は、少なくとも１つの治療用タンパク質または分子をインビボで、インビトロで培養される幹細胞のカプセル化と比べて増加した量で発現する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、インビボで少なくとも１つの治療用タンパク質または分子を、インビトロで培養されたカプセル化間葉系幹細胞と比べて増加した量で発現する、カプセル化幹細胞の組成物を提供する。
【０００５】
本開示の一態様では、治療用タンパク質の組成物は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−Ｂ（ＴＧＦ−Ｂ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ−１）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、および間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０００６】
本開示の第２の態様では、治療用タンパク質の組成物は、腫瘍壊死因子誘導遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）、インターロイキン−１受容体拮抗剤（ＩＬ−１ＲＡ）、ガレクチン−１、ガレクチン−３、アディポネクチン、レゾルビンＤ１（ＲｖＤ１）またはレゾルビンＥ１（ＲｖＥ１）の群から選択される。
【０００７】
本開示の第３の態様では、治療用タンパク質の組成物は、プロスタグランジン、好ましくはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の群から選択される。
【０００８】
別の態様では、治療用タンパク質の組成物は、疾患、特に炎症性疾患に起因する損傷組織を修復し、かつ／または炎症性疾患もしくは障害の症状を軽減するような治療効果を有する。
【０００９】
さらなる別の態様では、疾患は、敗血症、エボラ、急性肺損傷（ＡＬＩ）、（ＡＲＤＳ）、重症虚血肢（ＣＬＩ）、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、および急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）のリストから選択される急性疾患、または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、関節リウマチ（ＲＡ）、うっ血性心不全、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、黄斑変性症（ＭＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および２型糖尿病のリストからの慢性疾患である。
【００１０】
一実施形態は、治療関連タンパク質または分子の分泌をインビボで、インビトロよりも少なくとも２倍高いレベルで呈する、カプセル化幹細胞の単離された集団である。
【００１１】
第２の実施形態では、単離された幹細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを発現する外来性ＤＮＡ配列を含む、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを標的細胞に送達するようにインビトロで修飾され、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡポリヌクレオチドを微小胞、エキソソーム、または細胞突起を介して標的細胞に送達する。
【００１２】
第３の実施形態では、単離された幹細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡポリヌクレオチドの標的細胞への微小胞、エキソソームまたは細胞突起を介した導入に適した条件下で、標的細胞とコミュニケーションするように配置される。
【００１３】
第４の実施形態では、単離された幹細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり、ＭＳＣは、外因性ＤＮＡ配列またはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｄｓＲＮＡ配列を、微小胞、エキソソーム、または細胞突起により送達する。
【００１４】
第５の実施形態では、ＭＳＣのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡは、ウイルス感染を媒介する遺伝子にて誘導される。
【００１５】
別の実施形態では、単離された間葉系幹細胞は、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）によって引き起こされるウイルス感染に対して特異的である。
【００１６】
さらなる別の実施形態では、単離された間葉系幹細胞では、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡは、ＮＰＣ１受容体遺伝子にて誘導される。
【００１７】
さらなる別の実施形態では、被験者に投与されるカプセル化ＭＳＣの用量は、被験者の１０，０００，０００個の細胞／ｋｇ体重より少ない。
【００１８】
本開示の別の実施形態では、ＭＳＣは、間葉系幹細胞の増殖されたクローン集団または非クローン集団である。
【００１９】
本開示のさらなる別の実施形態では、マイクロカプセル化システムはアルギン酸マイクロカプセルを含み、ここでマイクロカプセル化システムは、疾患またはその症状を軽減するため、ＭＳＣをアルギン酸微小環境内に固定化する一方、分子コミュニケーションを持続させることができる。
【００２０】
本開示の別の実施形態では、マイクロカプセル化システムはアルギン酸ポリマーを含み、ここでマイクロカプセルは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ではなく、血清アルブミンに対して極めて透過性が高い
【００２１】
本開示の別の実施形態では、マイクロカプセル化システムは、約１．０％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度を有するアルギン酸ポリマーを含む。
【００２２】
本開示の別の実施形態では、マイクロカプセル化システムは、約２．５％（ｗ／ｖ）の濃度を有するアルギン酸ポリマーを含み、ここでマイクロカプセルは、ポリ−Ｌ−リジンのさらなる連続的な外表面コーティング剤を含む。
【００２３】
別の実施形態は、疾患またはその症状を治療する方法であって、疾患またはその症状を軽減するため、疾患またはその症状を患う被験者にカプセル化間葉系幹細胞を有効量で投与し、前記被験者における免疫応答を調節するステップを含む、方法である。
【００２４】
別の実施形態では、本開示は、カプセル化幹細胞が被験者に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、リンパ節注射、胸腺注射、脾臓注射、静脈内注射、またはそれらの組み合わせによって有効量投与されることである。
【００２５】
別の実施形態では、本開示は、カプセル化幹細胞が、敗血症に対する治療を必要とする被験者の診断から１日以内に腹腔内注射によって有効量投与されることである。
【００２６】
別の実施形態では、本開示は、カプセル化間葉系幹細胞が敗血症に対する治療を必要とする被験者の診断から２〜７日後に静脈内または腹腔内注射によって有効量投与されることと相まって、カプセル化幹細胞が診断から１日以内に腹腔内注射によって有効量投与されることである。
【００２７】
別の実施形態では、本開示は、アルギン酸でのカプセル化幹細胞が、被験者に、静脈内注射、腹腔内注射、リンパ節注射、胸腺注射、脾臓注射、またはこれらの組み合わせによって有効量投与されることである。
【００２８】
別の実施形態では、本開示は、各被験者に注射されたカプセルの数を、注射されなかったカプセルを測定し、注射が意図された総数から減算することによって測定する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】約４００μｍの直径を有するカプセル化ｈＭＳＣ（ｅＭＳＣ）の同じフィールドの１０倍拡大画像。カルセイン／エチジウムホモ二量体染色後のカプセルの共焦点クロスセクショニングによって得られた蛍光画像の単一面投影。生細胞。
【図１Ｂ】約４００μｍの直径を有するカプセル化ｈＭＳＣ（ｅＭＳＣ）の同じフィールドの１０倍拡大画像。カルセイン／エチジウムホモ二量体染色後のカプセルの共焦点クロスセクショニングによって得られた蛍光画像の単一面投影。死細胞。
【図１Ｃ】約４００μｍの直径を有するカプセル化ｈＭＳＣ（ｅＭＳＣ）の同じフィールドの１０倍拡大画像。カルセイン／エチジウムホモ二量体染色後のカプセルの共焦点クロスセクショニングによって得られた蛍光画像の単一面投影。微分干渉観察（ＤＩＣ）。
【図２Ａ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは媒体対照としての生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の血液のコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図２Ｂ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは媒体対照としての生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の腹膜洗浄液のコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図３Ａ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の血液中で測定されたＩＬ−１０のレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図３Ｂ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の血液中で測定されたＩＬ−６のレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図３Ｃ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の血液中で測定されたＴＮＦαのレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図３Ｄ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の血液中で測定されたＩＬ−１βのレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図３Ｅ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の血液中で測定されたＭＣＰ−１のレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図３Ｆ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の血液中で測定されたＭＩＰ−１のレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図４Ａ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の腹膜洗浄液中で測定されたＩＬ−１０のレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図４Ｂ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の腹膜洗浄液中で測定されたＩＬ−６のレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図４Ｃ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の腹膜洗浄液中で測定されたＴＮＦαのレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図４Ｄ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の腹膜洗浄液中で測定されたＩＬ−１βのレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図４Ｅ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の腹膜洗浄液中で測定されたＭＣＰ−１のレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および**Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図４Ｆ】１４０，０００個のＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウス由来の腹膜洗浄液中で測定されたＭＩＰ−１のレベルを示す棒グラフ。データは、平均＋／−ＳＥＭとして表される。*Ｐ，０．０５および*Ｐ，０．０１対生理食塩水媒体（ｎ＝７マウス／群）。
【図５】各動物に注射されたカプセルの数を示す。カプセル化ＭＳＣ（ｅＭＳＣ）カプセル群および空のカプセル群における各動物に注射されないカプセルの総数についての測定値が得られた（ｎ＝７マウス／群）。
【図６Ａ】１４０，０００個のｅＭＳＣ／マウスまたは生理食塩水が注射されたＣＬＰマウスの生存を示す表（ｎ＝７マウス／群）。
【図６Ｂ】培地中でのインキュベーションの０〜２日後にインビトロで分析されたか、または敗血症マウスが注射を受けた翌日にそれらから回収された、マイクロカプセルにおける生ｅＭＳＣ／カプセルの数および生細胞の％を示す表。
【図７】敗血症マウスから回収された（生体外）か、または活性化を伴わない場合（点線）もしくはＬＰＳ活性化を伴う場合（実線）でのインビトロのみでインキュベートされたｅＭＳＣマイクロカプセルからのＩＬ−６分泌の平均レベルを示す。マウス＃１、＃２、＃４、＃５、および＃６からのレベルの平均が計算された。
【図８】活性化を伴わない場合またはＬＰＳ活性化を伴う場合でのインビトロでインキュベートされたｅＭＳＣからのＰＧＥ２分泌のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示は、限定はされないが敗血症を含む炎症性疾患の治療を意図したＭＳＣの使用を提供する。
【００３１】
広義の一態様では、本開示は、炎症性疾患における免疫応答を調節し、異なる免疫調節因子の発現を変化させる能力を有するＭＳＣを用いるための方法を提供する。
【００３２】
本開示の別の態様では、ＭＳＣの調節特性は、免疫抑制性を示し、細菌のレベルを減少させ、炎症に応答して免疫恒常性を回復させる。
【００３３】
本態様の別の実施形態では、本開示は、炎症を調節し、組織保護を促進し、かつ／または修復するＭＳＣを提供する。ＭＳＣは、サイトカインストームおよび細菌感染を制限し得る抗炎症性サイトカインを放出することによって、炎症促進性サイトカインに応答する。
【００３４】
本態様の別の実施形態では、本開示は、アルギン酸ポリマー微小環境内のカプセル化ＭＳＣの単離された細胞集団を提供する。
【００３５】
別の態様では、本開示は、アルギン酸ポリマーを含むマイクロカプセル化システムを提供し、同システムは、アルギン酸微小環境内に間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を固定化する一方で分子コミュニケーションを持続させることができ、ここでカプセル化ＭＳＣは、所定時間にわたりＭＳＣの生存度を持続させる能力がある。
【００３６】
別の態様では、本開示は、被験者における炎症性疾患または症状における組織保護、修復または治療を促進するための方法であって、被験者にアルギン酸ポリマー微小環境内のカプセル化ＭＳＣを有効用量で投与するステップを含み、カプセル化ＭＳＣは前記微小環境内で３か月以上にわたり生存する能力がある、方法を提供する。
【００３７】
別の態様では、本開示はキットを提供する。アルギン酸ポリマー微小環境内のカプセル化ＭＳＣのキットでは、カプセル化ＭＳＣ細胞は、前記微小環境内で３か月以上にわたり生存する能力がある。
【００３８】
別の態様では、本開示は、アルギン酸でのカプセル化ＭＳＣが組織修復を促進し、炎症を減弱させ得るか否かの判定を試みるものであった。本明細書に記載のデータによると、マイクロカプセル化プラットフォームが、サイトカインストームおよび細菌感染を制御するその能力に影響を及ぼすＭＳＣの分泌パターンをインビボで増強し得、この機能がカプセル化パラメータにも依存していることが示される。さらに、インビトロでの炎症促進性刺激の存在下でのカプセル化ＭＳＣは、これらの因子を増加した速度で分泌するように誘導され得る。敗血症のインビボモデルを通じて、発明者は、カプセル化ＭＳＣが炎症性因子の発現を軽減することで、サイトカインストームの間でのそれらの効果を低下させることができ、インビボで細菌のレベルを減少させることを実証している。
【００３９】
本開示は、一態様では、ＭＳＣが、インビボで炎症および細菌のレベルを、前報よりも低用量のＭＳＣを注射することにより減弱させるように誘導するため、スケーラブルで制御可能なアルギン酸微小環境培養系を用いることの実現可能性の検討を試みるものであった。
【００４０】
多数の細胞および組織工学用途として、例えばＭＳＣの懸濁液をカプセル化するため、アルギン酸、マンヌロン酸およびグルロン酸の生体適合性共重合体が用いられている。
【００４１】
本態様の好ましい実施形態では、アルギン酸ポリマーは、約６０％のグルロン酸濃度を有する。
【００４２】
本態様の別の好ましい実施形態では、アルギン酸ポリマーは、約１．０％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度を有する。
【００４３】
本態様のより好ましい実施形態では、アルギン酸ポリマーは、約２．５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する。
【００４４】
本態様の別の好ましい実施形態では、アルギン酸ポリマーは、約２．５％（ｗ／ｖ）の濃度を有し、ここでマイクロカプセルは、ポリ−Ｌ−リジンのさらなる連続的な外表面コーティングを含む。
【００４５】
本態様の別の好ましい実施形態では、マイクロカプセルは、アルギン酸ポリマーをマイクロカプセルに架橋するため、カルシウムまたはバリウムまたはカルシウムとバリウムの混合物の群からの２価陽イオンを含む。
【００４６】
別の態様では、本開示は、被験者における炎症性疾患または症状を治療するための方法であって、被験者にアルギン酸ポリマー微小環境内のカプセル化ＭＳＣを有効用量投与するステップを含み、ＭＳＣの用量は１０００万個の細胞／ｋｇより少ない、方法を提供する。
【００４７】
本態様の一実施形態では、炎症性疾患または症状は、アルギン酸でのカプセル化ＭＳＣを全身的に有効用量で送達することにより治療される。
【００４８】
本態様の別の実施形態では、炎症性疾患または症状は、アルギン酸でのカプセル化ＭＳＣを炎症部位またはその近隣に有効用量で送達することにより治療される。
【００４９】
好ましい実施形態では、被験者は哺乳動物である。
【００５０】
より好ましい実施形態では、被験者はヒトであり、ＭＳＣはヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）である。アルギン酸マイクロカプセルのＩｇＧではなくアルブミンへの透過性およびＭＳＣの低用量での使用を利用することによって、本発明者は、インビボで炎症に対する免疫応答および細菌クリアランスを調節するための方法を示した。さらに、ＭＳＣは、インビボで最適なＭＳＣの免疫調節機能を促進し得、それは、１）有効な送達媒体が設計される場合、２）持続的な生存度が確立される場合、３）遊走能が制御される場合、４）細胞の位置が確定される場合、および５）腫瘍形成が抑制される場合に達成され得る。本発明者は、これらの判定基準の各々に対処しかつインビボ移植に対する可能性を有するＭＳＣアルギン酸ポリマーのマイクロカプセル化手法を開発している。この手法は、ＭＳＣを培養し、移植するための制御可能な方法を提示することになり、急性および慢性の感染、疾患もしくは障害の治療のための診療への究極的な橋渡しとしての可能性を有する。したがって、本開示の１つの目的は、（ａ）炎症の全身性治療のための抗炎症性ＭＳＣの制御された送達用の固定化プラットフォームを開発し、かつ／または（ｂ）サイトカインストームを制御することを目的にＭＳＣの生存延長をもたらすため、アルギン酸でのＭＳＣのカプセル化を用いることである。
【００５１】
上で考察された様々な潜在的な問題を回避するため、本開示は、ＭＳＣを送達するための媒体としてアルギン酸マイクロカプセル化システムを提供する。結果によると、被験者への注射に先立って補給される分化因子の不在下で、アルギン酸微小環境が、１）抗炎症性メディエーターの分泌増加を支持し、２）免疫抑制性ＭＳＣ表現型を経時的に増強し、かつ３）少なくとも１つの治療関連タンパク質または分子の分泌をインビボで、インビトロよりも少なくとも２倍高いレベルで誘導するように、最適化され得ることが示される。最終的に、敗血症のインビボモデルを用いて、本開示は、カプセル化ＭＳＣが、血液中および腹膜内での細菌のレベルを１００倍より多く軽減し、かつ炎症性サイトカインのレベルを軽減し得ることを示している。細菌におけるこの顕著な減少は、ヒトＡＤＳＣと比べて２５倍多い数の遊離ヒトＭＳＣのＩＰ注射の場合にはるかに少ない細菌における効力低下が得られた先行実験を考慮すると、想定外であった。血液中および腹膜内における細菌力価のより同等な低下が、マウス敗血症における７倍高いレベルのマウスＭＳＣのＩＰ注射の場合に得られた（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＩＶ注射後の遊離ヒトＭＳＣの有効性が比較的弱いことは、少なくとも一部には、カプセル化細胞と比べての遊離細胞の迅速な減少（５０％超が生存した、図６Ｂ）、およびマウス（異種）におけるヒトＭＳＣ移植片の相対的不適合性に起因し得る。同種移植片（マウスへのマウス）では異種移植片に対して有効性が改善されたが、遊離ＭＳＣがマイクロカプセルにおける強固な生存と比べてクリアランスが迅速であることから、カプセル化細胞と比べてより高い遊離用の用量が要求される場合がある。
【００５２】
これらの試験により、様々な組織病理ならびに急性および慢性疾患の治療のため、アルギン酸マイクロカプセル化が持続的かつ長期的な機能を有する細胞由来の分子送達系として使用可能であることがもたらされる。
【００５３】
本開示の重要な態様は、本開示のアルギン酸でのカプセル化ＭＳＣが組織保護および抗炎症特性を有し、それらはカプセル化ＭＳＣからの分泌産物または細菌クリアランスを増強するための免疫細胞の調節を介して制御され、また外傷または病態の二次的結果を低下させるのに役立ち得る。本開示のカプセルは、限定はされないが、敗血症、エボラ、急性肺損傷（ＡＬＩ）、（ＡＲＤＳ）、重症虚血肢（ＣＬＩ）、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、および急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、関節リウマチ（ＲＡ）、うっ血性心不全、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、黄斑変性症（ＭＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および２型糖尿病を含む様々な状態の治療のためのインビボ注射向けに設計される。
【００５４】
本開示は、限定はされないが、１）外因性で高価なサイトカインおよび成長因子を要することなく危険にさらされた細胞を保護する、２）全身的に炎症を減弱させ、種々のインビボ用途において治癒を誘導するため、抗炎症および再生メディエーターの分泌を誘導し、制御すること（本開示はそれら双方における概念実証を少なくとも提供する）を含む広範な用途を有する。ＭＳＣは、炎症促進性シグナルに対して導入される場合、抗炎症応答を呈することが知られている。しかし、移植される細胞と宿主との間の直接的接触は、好ましくない免疫学的反応を誘導する場合があり、それはＭＳＣをカプセル化し、それにより宿主との直接的接触を防止することによって低下または除去される。これはまた、患者における非自家ＭＳＣの使用を可能にし、個別患者における自家細胞を収集し、処理するのに要求される遅延を回避する。アルギン酸中の孔がアルブミンなどのタンパク質や小分子がカプセル化細胞と宿主との間を通過可能にする程度に十分に大きいことから、移植されたＭＳＣが可溶性の炎症促進性シグナルにより活性化され、抗炎症分子を放出することが可能になる。しかし、それらの孔は、細胞を宿主抗体から保護するカプセルを越えるような免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の移動を制限するほど十分に小さい。ＭＳＣは、広範な生理学的効果を有する種々の可溶性メディエーターの分泌を介して、炎症を媒介し、組織修復を促進することが見出されている。
【００５５】
したがって、この特徴がカプセルプラットフォームによって支持されるか否かを評価するため、カプセル化ＭＳＣの分泌特性が分析された。ＭＳＣ活性化の早期指標であるＩＬ−６の評価によると、ＩＬ−６が、（敗血症マウスから回収された）生体外でのカプセル化ＭＳＣにより、インビトロでのカプセル化ＭＳＣにより分泌される場合よりも１０倍高く分泌され、またインビトロでのＬＰＳで活性化されたカプセル化ＭＳＣからよりも２倍高く分泌されることが示された。インビトロでのＬＰＳによる活性化の最大レベルよりも高レベルのＩＬ−６を放出するというインビボでのカプセル化ＭＳＣの過剰な活性化は想定外であった（図７）。これは、他のヒトＭＳＣのＩＰ注射後の治療と比べて、血液中および腹膜洗浄物中の細菌における著しい減少に寄与している可能性がある。
【００５６】
ここで本発明者はまた、カプセル化ＭＳＣの活性化を、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の分泌を測定することにより試験している。ＰＧＥ２の分泌は、ＬＰＳで処理される場合、カプセル化ＭＳＣにおいて上方制御された。ＰＧＥ２は、Ｍ１炎症促進性マクロファージの活性化を緩和し、Ｍ２抗炎症性マクロファージ表現型を促進するのに重要な役割を果たすことが知られている。このデータによると、カプセル化ＭＳＣの活性化がＰＧＥ２の分泌およびマクロファージのＭ２表現型への変化を促進し得ることが示唆される。活性化マクロファージのＭ２表現型は、細菌の食作用を増強し、敗血症における細菌のレベルを減少させ得ることが知られている。
【００５７】
本発明者はまた、ＣＬＰ誘導性の敗血症を有する被験者に以前に投与された場合（約４０００万個の細胞／ｋｇ）より低い、マイクロカプセル内の非自家ＭＳＣの用量（＜６００万個の細胞／ｋｇ）では、血液および腹膜の中の細菌レベルおよびサイトカインレベルが軽減されたことを見出している。これにより、インビボでの治療効果を得るため、前報でのＭＳＣが過剰に活性化される場合よりも少ないＭＳＣが必要とされ得ることが示唆される。全体としてこのデータは、カプセル化ＭＳＣをインビボでの免疫調節性バイオリアクターとして用いてもよいという事実を支持している。
【００５８】
カプセル化パラメータは、疾患における生存を最大化し、ＭＳＣタンパク質分泌を増強するように同定された。さらに、発明者は、カプセル化ＭＳＣが細菌およびサイトカインのレベルを減弱させ、インビボであれば組織保護を促進し得ることを示した。ここで開発された固定化系の場合、現行のＭＳＣ投与プラットフォームにおける欠点の多くを回避する必要があり、それと同時にＭＳＣの組織保護的挙動を増強するのに役立ち得る。
【００５９】
したがって、本開示によると、特に、１）アルギン酸微小環境が疾患環境下でＭＳＣの生存を支持し得ること；２）アルギン酸微小環境が疾患環境下でＭＳＣタンパク質分泌を増強すること；３）アルギン酸マイクロカプセル内で、ＭＳＣが免疫調節メディエーターを分泌し、カプセル化ＭＳＣが炎症促進性刺激に対してサイトカインストームを全身的に緩和することによって応答すること；４）感染における細菌のレベルがカプセル化ＭＳＣにより局在的かつ全身的に減弱され得ること；ならびに５）カプセル化ＭＳＣが前報よりも低い用量で有効であること、が判明している。
【００６０】
定義
本明細書で用いられるとき、以下の用語の各々は、このセクション中でそれに関連した意味を有する。
【００６１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指すように本明細書で用いられる。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００６２】
用語「約」は、当業者により理解されるであろうが、それが用いられる文脈に関連してある程度変化することになる。
【００６３】
本明細書で用いられるとき、用語「自家」は、同じ個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
【００６４】
本明細書で用いられるとき、用語「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、骨髄（Ｐｒｏｃｋｏｐ，１９９７でレビューされた）、末梢血｛Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、脂肪組織（Ｇｕｉｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、臍帯血（Ｒｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、滑膜（Ｄｅ  Ｂａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、および歯根膜（Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、皮膚、および血液（米国特許第５．４８６，３５９号明細書および米国特許第７，１５３，５００号明細書）、脂肪、および滑液に由来する細胞を指すことになる。ＭＳＣはまた、間葉系前駆細胞（ＭＰＣと称される）（Ｐｓａｌｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）または多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）（米国特許第８，０７５，８８１号明細書および米国特許第７，０１５，０３７号明細書）に由来し得る。ＭＳＣは、プラスチック組織培養表面に接着するその能力（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｏｗｅｎ  ＆  Ｆｒｉｃｄｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８にレビューされた）、および造血幹細胞にとって有効な支持細胞層であること（Ｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）によって特徴づけられる。さらに、ＭＳＣは、培養下およびインビボの双方で、骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞に分化され得、また骨軟骨、靱帯、腱、脂肪、筋肉、心組織、間質、真皮、および他の結合組織を含む間葉細胞系列における前駆細胞として役立ち得る（米国特許第６，３８７，３６９号明細書および米国特許第７，１０１，７０４号明細書を参照）。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、当該技術分野で公知の方法を用いて精製してもよい（Ｗａｋｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９５；Ｆｕｋｕｄａ  ａｎｄ  Ｙｕａｓａ，２００６；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２０００：Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｋｉｍｅｔ  ａｌ  ２００６；Ｍａｒｅｓｅｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｋｒａｍｐｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【００６５】
用語「成長因子」は、本明細書で用いられるとき、細胞分化および増殖に関与する物質を指す。同用語は、形態形成における任意の調節剤物質を含むことを意味する。
【００６６】
用語「サイトカイン」は、細胞間相互作用、細胞間コミュニケーションまたは細胞の挙動に対して特異的効果を有する細胞によって放出される低分子タンパク質である。腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）などの炎症を促進するサイトカインが存在する一方で、インターロイキン（ＩＬ−１０）などの、炎症を阻害し、修復およびリモデリングを促進するものも存在する。
【００６７】
用語「サイトカインストーム」は、失敗した免疫応答であり、暴走して制御不能になった炎症応答である。
【００６８】
用語「敗血症」は、感染の潜在的に重篤な合併症である。敗血症は、感染と戦うために血流に放出された化学物質が全身を通した炎症応答を引き起こす場合に生じる。この炎症は、多臓器系に損傷を与えることでそれらの機能不全を引き起こし得る変化のカスケードを誘発し得る。敗血症が敗血症ショックに進行する場合、血圧は著明に低下し、死に至る場合がある。用語「敗血症ショック」は、重症感染および敗血症の結果としての医学的状態であるが、微生物が全身性であるかまたは特定部位に局在化される場合がある。それは多臓器機能障害症候群（従来は多臓器不全として公知）および死を引き起こし得る。
【００６９】
診断または治療の「被験者」は、細胞または哺乳動物、例えばヒトである。診断または治療に対する非ヒト動物被験者として、例えば、サル、マウス、モルモット、イヌ（ｃａｎｉｎｅｓ）、例えばイヌ（ｄｏｇｓ）、ウサギ科、例えば、ウサギ、家畜、例えばウシまたはブタ、スポーツ動物、およびペットが挙げられる。
【００７０】
「有効量」は、有利な結果または所望される結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与、適用または用量で投与され得、当業者により経験的に決定され得る。
【００７１】
「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される配列特異的または遺伝子特異的な遺伝子発現（タンパク質合成）の抑制を指す。「短い干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、一般に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができる約１０〜約３０ヌクレオチド長、または１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、または２９ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）を指す。本明細書で用いられるとき、用語ｓｉＲＮＡは、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。遺伝子または遺伝子のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡは、遺伝子のｍＲＮＡを認識し、またＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）をｍＲＮＡに誘導し、ｍＲＮＡの分解をもたらすｓｉＲＮＡであってもよい。遺伝子または遺伝子のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡはまた、ｍＲＮＡを認識し、またｍＲＮＡの翻訳を阻害するｓｉＲＮＡであってもよい。「二本鎖ＲＮＡ」（ｄｓＲＮＡ）は、任意の長さを有する場合があり、細胞内でより小さいＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡに切断され得る二本鎖ＲＮＡ分子を指す。コンピテントなインターフェロン応答を有する細胞においては、より長いｄｓＲＮＡ、例えば約３０塩基対長より長いものが、インターフェロン応答を引き起こし得る。コンピテントなインターフェロン応答を有しない他の細胞においては、特異的なＲＮＡｉを引き起こすため、ｄｓＲＮＡを用いてもよい。ｓｉＲＮＡは、当該技術分野で公知の手順に従って設計され得る。例えば、Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ．（２００６）“Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ  ｔｏ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｒｕｇｓ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．８：３７７−４０２；Ｄｙｋｘｈｏｏｍ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｔｈｅ  ｓｉｌｅｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｓｉＲＮＡｓ  ａｓ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇｓ”，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：５４１−５２；Ａａｇａａｒｄ，Ｌ．ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．（２００７）“ＲＮＡｉ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．５９：７５−８６；ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｓｉＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ６：４４３−５３；Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ＲＮＡｉ  ｇａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｓｉＲＮＡ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １７：２３７−２５０；米国特許出願公開第２００８／０１８８４３０号明細書；および米国特許出願公開第２００８／０２４９０５５号明細書を参照のこと。
【００７２】
本開示の細胞を作製するためのｓｉＲＮＡの間葉系幹細胞への送達は、当該技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｄｙｋｘｈｏｒｎ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ．（２００６）“Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ  ｔｏ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｒｕｇｓ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．８：３７７−４０２；Ｄｙｋｘｈｏｒｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｔｈｅ  ｓｉｌｅｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｓｉＲＮＡｓ  ａｓ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇｓ”，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：５４１−５２；Ａａｇａａｒｄ，Ｌ．ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．（２００７）“ＲＮＡｉ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．５９：７５−８６；ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｓｉＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”  ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ６：４４３−５３；Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）  “Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ＲＮＡｉ  ｇａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｓｉＲＮＡ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １７：２３７−２５０；米国特許出願公開第２００８／０１８８４３０号明細書；および米国特許出願公開第２００８／０２４９０５５号明細書を参照のこと。
【００７３】
ｓｉＲＮＡは、その安定性および安全性を高めるため、化学修飾してもよい。例えば、Ｄｙｋｘｈｏｒｎ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ．（２００６）  “Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ  ｔｏ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ａｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｒｕｇｓ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．８：３７７−４０２および米国特許出願公開第２００８／０２４９０５５号明細書を参照のこと。
【００７４】
マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を調節する２１〜２３ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、そのＤＮＡからそれが転写される遺伝子によってコードされるが、ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されす（ノンコーディングＲＮＡ）、その代わり、各一次転写物（ａｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、プレｍｉＲＮＡと称される短いステムループ構造に、最終的には機能的ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、部分的には１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に相補的であり、その主な機能は遺伝子発現を下方制御することである。
【００７５】
ｓｉＲＮＡベクター、ｄｓＲＮＡベクターまたはｍｉＲＮＡベクターは、本明細書で用いられるとき、ＲＮＡの発現を調節するプロモーターを含むプラスミドまたはウイルスベクターを指す。「ｓｉＲＮＡプロモーター」またはｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡの発現を調節するプロモーター、例えば、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４９７−５００に記載のＵ６プロモーター、およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−３に記載のＨ１プロモーターは、当該技術分野で公知である。
【００７６】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）  多能性幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）はまた、当該技術分野で、骨髄間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、および胎盤由来間葉系幹細胞、ならびに骨髄間質細胞、脂肪間質細胞、臍帯間質細胞、および胎盤由来間質細胞と称される。ＭＳＣは、それらの組織培養プラスチックへの付着性に基づき、例えば、骨髄、臍帯血、脂肪組織、胎盤組織から当該技術分野で公知の方法を用いて単離され得る。例えば、ＭＳＣは、市販の骨髄吸引液（テキサスＡ＆Ｍ大学（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））から単離され得る。ＭＳＣはまた、インビトロで脂肪細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞を再現性をもって発生させるような固有の能力を有する（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１４３−１４７，１９９９）。ＭＳＣはまた、間葉系前駆細胞（ＭＰＣと称される）または多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）から誘導され得る。
【００７７】
成体骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、敗血症を治療するための好ましい特性を有する。ＭＳＣは、損傷組織に優先的に誘導されることで、治療可能性を有し得る。ＭＳＣは、臨床試験において、急性移植片対宿主病における移植を促進するとともに、炎症性／変性障害における、肝疾患および炎症性腸疾患における組織損傷を修復するのに安全かつ有効であることが見出されている。ＭＳＣは、好ましくは肺損傷を低減するように免疫応答を調節する一方、宿主の免疫コンピテンスを維持するとともに、活性化マクロファージを免疫調節することにより肺の再生および修復を促進する。骨髄ＭＳＣの静脈内注射は、敗血症に対する宿主免疫系の迅速な応答を有利に調節し、動物における生存を改善し得る。ＭＳＣによって分泌される因子は、循環型および組織の単球およびマクロファージと相互作用し、それらを再プログラム化する。ＭＳＣ治療により、ヒト敗血症における予後不良に関連した循環ＩＬ−１０およびＩＬ−６の量が減少した。これにより、宿主組織に対する抑制のきかない免疫応答によって引き起こされる弊害が低減される。したがって、ヒトＭＳＣは、臨床試験において安全であり、敗血症を含む幾つかの状態におけるサイトカインストームを低減させるのに有効であることが見出されている。ヒトＭＳＣは、損傷部位に迅速に移動し、活性化状態になり、より炎症促進性からより抗炎症性／修復状態へ環境を変化させる。ＴＮＦαを含む炎症促進性因子によるＭＳＣの活性化により、抗炎症性因子の分泌が誘導され、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１αを含む炎症促進性因子のマクロファージ分泌が低下する。これは、マクロファージの炎症促進性Ｍ１表現型からＭ２抗炎症性／修復表現型への再プログラム化を反映する。したがって、ヒトＭＳＣの静脈内注射は安全であり、かつ様々なヒト疾患におけるサイトカインストームを調節し得る。サイトカインストームの結果の１つは、血液からのタンパク質リッチな血漿および一部の白血球の放出を可能にする、損傷組織内での毛細血管床における内皮単層のバリア機能における破壊である。ＭＳＣは、内皮細胞に直接的に影響する、Ａｎｇ−１、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦおよびＴＧＦ−βのような様々な因子を産生する。これらのパラクリン栄養因子は、内皮細胞増殖および細胞外マトリックス産生を調節するか、内皮透過性を低下させるか、または白血球と内皮細胞との間の相互作用を阻止するそれらの能力を通じて、内皮完全性を維持しかつ血管新生を促進する点で潜在的に重要である。
【００７８】
ＭＳＣの免疫抑制特性  損傷組織は常に免疫細胞の浸潤を伴う。炎症は、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＣＸＣＲ３リガンド、ＣＣＲ５リガンド、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１を含む、免疫細胞における高レベルのサイトカイン、ケモカインおよび接着分子の産生を引き起こす。これらの分子は免疫細胞の蓄積を誘導し、注射されたＭＳＣの存在下で、（マウスにおける）高濃度の一酸化窒素または（ヒトにおける）トリプトファンの枯渇は免疫細胞の阻害をもたらす。ＩＬ−１０、ＴＳＧ６、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＩＬ−１ＲＡ、ＰＧＥ２、ＨＯ−１、切断されたＣＣＬ２およびＰＧＥ２などの他の免疫抑制因子であっても、免疫細胞の活性化、増殖および機能に影響し得る。組織常在性の前駆細胞または他の関連細胞が炎症を抑制し、組織修復を開始することを誘導する、ＭＳＣによって産生される多数のパラクリン因子は、宿主における局所的なＭＳＣ移植の不在下であっても、注射されたＭＳＣの一過性生存の宿主における組織修復に対する有益な効果を説明し得る。
【００７９】
肝臓におけるＭＳＣの免疫調節活性  ＭＳＣ由来分子は劇症肝不全を回復させるが、これはＭＳＣの免疫調節活性の多くがそれらの分泌された因子に存在することを示唆している。これらの結果によると、炎症促進性因子（例えば、ＬＰＳ、ＴＮＦα）に応答してＭＳＣによって分泌される因子がマクロファージを炎症促進性Ｍ１表現型からＭ２抗炎症性／修復表現型に変化させるのに有効であることが示唆された。ヒト骨髄ＭＳＣのカプセル化は、ＭＳＣセクレトームに改変されたアルギン酸マイクロカプセルであり、さらにＴＮＦαで処理することにより、インビトロおよびインビボの双方で、マクロファージを炎症促進性Ｍ１からＭ２抗炎症性／修復表現型に変化させるようなより強固な応答がもたらされた。したがって、ＭＳＣは、アルギン酸でカプセル化される場合、宿主から分離されることで、宿主におけるその生存を延長し、望ましくない分化を阻止する一方、免疫調節性の分泌性因子をもたらし得る。ＭＳＣから放出される免疫調節因子は、インビトロおよびインビボでの脊髄挫傷や肝細胞の死滅および再生におけるＭ１マクロファージからＭ２マクロファージへの変換において有効であることが見出されている。
【００８０】
エボラ  エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）は、感染したヒトまたは他の動物の血液もしくは他の体液との接触時に獲得され得る。診断を確定するため、血液試料が、ウイルス抗体、ウイルスＲＮＡ、またはウイルス自体について試験される。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での臨床検査は、感度および特異性が高く、数時間以内に結果を返すことができ、現在では患部に対してより広範に利用可能となりつつある。したがって、エボラ感染を比較的早期に診断することは可能である。感染者を助ける努力は支持的なものであり、経口補液療法（わずかに甘く塩辛い飲料水）または静脈内輸液のいずれかを与えることを含む。この支持的ケアは転帰を改善する。同疾患が有する死亡リスクは高く、同ウイルスの感染者の２５％〜９０％が死亡する（平均は５０％である）。
【００８１】
同疾患に特異的な治療はまだ利用できないが、ウイルスを中和するための様々な血液療法、免疫療法および薬物療法が開発されつつある。大流行のコントロールには、特定レベルのコミュニティーの関与とともに協調的な一連の医療サービスが必要とされる。要求される必要な医療サービスとして、迅速な検出および接触の追跡、適切な実験サービスへの迅速なアクセス、感染者の適切な管理、および死亡の適切な処理が挙げられる。予防は、疾患を有する者の周囲にいるときの適切な防護服着用や手洗いを含む。疾患を有する人々から得られた体液および組織の試料は、細心の注意を払って扱われる必要がある。
【００８２】
エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）感染は、異常なレベルのサイトカインの血液への分泌を誘導し、「サイトカインストーム」を生み出す。致死性症例では、活性化マクロファージによって分泌されるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８を含む非常に高レベルの炎症促進性サイトカインとともに、抗炎症性を示す非常に低濃度のＴ細胞サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、およびＩＬ−１３が見出された。エボラ生存者は、疾患早期における（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、（ＴＮＦα）、マクロファージ炎症性タンパク質−１ａ（ＭＩＰ−１α）およびＭＩＰ−１βの血漿中への一過性放出、その後の症候性段階の末期に向けてや回復後のＩＬ−１受容体拮抗剤（ＩＬ−１ＲＡ）の循環によって特徴づけられた。したがって、症候性段階中でのＩＬ−１βおよび血漿中のＩＬ−６の濃度上昇の存在は、非致死性感染のマーカーとして提唱されている。さらに、ＴＮＦαの持続的増加は致死性エボラ感染に関連している。
【００８３】
ヒトＭＳＣからの持続的なｓｉＲＮＡの産生は、急性および慢性感染を治療するため、特にエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）を治療するため、用いることができる。本開示の別の実施形態は、ニーマンピック病受容体（ＮＰＣ１）のレベルをノックダウンするための安全な送達媒体としてヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いることである。抗ＮＰＣ  ｓｉＲＮＡを産生するように改変されたヒトＭＳＣは、ＮＰＣ受容体タンパク質のレベルにおける有意な減少を達成するため、インビトロで十分なＲＮＡ干渉分子を細胞に直接的に導入し得る。導入は、ｓｉＲＮＡの直接的な細胞間移動を介してかまたはエキソソーム移行を介してなされる。
【００８４】
本開示は、以下の非限定例によって、より完全に説明される。
【実施例】
【００８５】
実施例１
ＭＳＣ細胞培養
ｈＭＳＣは、テキサスＡ＆Ｍ大学（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から購入した。細胞を１０％ＭＳＣ限定ＦＣＳ、２ｎｇ／ｍｌのＬ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔ）および１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したα−ＭＥＭ（完全培地）中で増殖させた。ＭＳＣをファルコンフラスコ内に５，０００細胞／ｃｍ２で播種し、培地を４日ごとに変更した。
【００８６】
実施例２
マイクロカプセルへのＭＳＣのマイクロカプセル化
アルギン酸溶液（２．５％）を、６５℃の温度で加熱した磁気撹拌プレートを用いて、２．５ｇのアルギン酸ナトリウム（Ｐｒｏｎｏｖａ  ＵＰ  ＬＶＧ、Ｇ含量：＞６０％、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ）を１００ｍＬのα−ＭＥＭに溶解することにより調製した。次に、４５μｍのシリンジフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）を用いて溶液を濾過した。マイクロカプセル内に細胞をカプセル化するため、０．９ｍＬの２．５％アルギン酸溶液を、６×１０７個の細胞／ｍＬの密度を有するＭＳＣ懸濁液の０．１ｍＬの一定分量と混合し、６×１０６個の細胞／ｍＬの最終細胞密度を得て、１０ｍＬのシリンジに移し、シリンジポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ）に接続した。アルギン酸マイクロカプセルを、５ｍＬ／時間の流速および６．４ｋＶの印加電圧で、ＰＥ−００９４０針（Ｎｉｓｃｏ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いる静電ビーズ発生器を用いて作製した。マイクロカプセルを、１４５ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＭＯＰＳを含有する２００ｍＬのＣａＣｌ２槽（１００ｍＭ）に押し出し（すべてはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）、室温で１０分間重合しておいた。管の底に定着させたマイクロカプセルおよび溶液をＰＢＳ中の０．０５％（ｗ／ｖ）ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）と交換し、１０分間インキュベートした。ポリ−Ｌ−リジン溶液を除去し、マイクロカプセルを洗浄するため、ヘペス溶液と交換した。ヘペスを除去し、マイクロカプセル（図１Ａ）を５ｍＬの完全培地に再懸濁した。
【００８７】
実施例３
インビトロでのマイクロカプセル内のＭＳＣの生存度についてのアッセイ
カルセインおよびエチジウムホモ二量体アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を用いて、カプセル内のＭＳＣ生存度を評価した（Ｍａｇｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。６．３８μｍの間隔でアルギン酸カプセルの断面画像を得るため、マイクロカプセルを共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ５１０  ＬＳＭ）で画像化した（図１Ａ、図１Ｂ）。次に、定量化のため、断面を単一面画像にコンパイルした。（緑色）の生細胞および赤色の死細胞を黒色および白色画像に変換した（各々、図１Ａおよび図１Ｂ）。ＩｍａｇｅＪソフトウェア上で細胞カウンタープラグインを用いて生細胞および死細胞を計数し、生細胞／カプセルのパーセントは、生細胞数／（すべての生細胞数＋死細胞数）であった。
【００８８】
実施例４
マイクロカプセルのサイズについてのアッセイ
カプセルの明視野画像（図１Ｃ）を、ＩｍａｇｅＪ画像分析ソフトウェアを用いて直径を測定するのに用いて、平均を計算した。
【００８９】
実施例５
カプセル注射の効率および再現性についてのアッセイ
内径が０．８ｍｍの薄壁針（２０ゲージ、ＮＩＰＲＯ）を通じてｅＭＳＣを注射する効率および再現性を、ＩＰマウス注射について分析した。２０ゲージ針を用いたが、より狭い直径を有する、より高いゲージを有する針がカプセルの再現性のある駆出ができなかったためである。本発明者は、マウスへのＩＰ注射後に管内およびシリンジ内に残存する数として注射されないカプセルの数を測定した。注射後、各管の内容物を組織培養皿に移し、カプセルの総数を明視野顕微鏡を用いて計数した（この画分を「管内残存」と称した）。針を取り付けたシリンジを生理食塩水で洗浄し、組織培養皿に移し、カプセルの総数を計数した（この画分を「シリンジ内残存」と称した）。「注射されない」カプセルと併せた総数を注射用に調製した全体（１６００カプセルであった）から差し引いたが、その差が「注射された」カプセルの算出数である。平均「％注射」は、注射の効率を表す、注射されたものの平均数／１６００として計算した（図５）。ＳＤは標準偏差である。
【００９０】
実施例６
マイクロカプセルによる敗血症の治療
敗血症は、マウスにおいて、盲腸の結紮および穿刺（ＣＬＰ）によって誘導した。成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８〜１２週齢）は、（Ｃｓｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２９：２５−３６，２０１５）に記載のように、ペントバルビタールの腹腔内注射（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。盲腸を隣接する腸に曝露できるように、無菌条件下で、２ｃｍ正中線開腹手術を実施した。盲腸の約３分の２を３．０絹縫合で堅く結紮し、盲腸の結紮部分を２０ゲージ針（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回（徹底的に）穿孔した。その後、小量の便を穿孔部位を通して押し出すため、結紮した盲腸を緩やかに圧迫し、次に腹膜腔に戻した。開腹手術を４．０絹縫合を用いて二層に閉じた。手術後、すべてのマウスを皮下注射した１ｍｌの生理食塩水で蘇生し、食料と水への自由なアクセスを伴うそれらのケージに戻した。ＣＬＰの１時間後、生理食塩水またはＭＳＣマイクロカプセルを、１ｍｌのシリンジに取り付けた薄壁２０Ｇ針（内径＝０．８ｍｍ，ＮＩＰＲＯ）を用いて腹腔内注射した。ＣＬＰ手術から１６時間後、マウスをペントバルビタールで再麻酔し（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、血液および腹膜洗浄物を収集した。
【００９１】
実施例７
ＣＬＰ誘導性敗血症における細菌のレベルに対するＭＳＣマイクロカプセルの効果
約１４０，０００個の生ＭＳＣ／マウスを含有するマイクロカプセルを、ＣＬＰから１時間後と１６時間後、マウスに腹腔内注射し、実施例６に記載のように血液および腹膜洗浄液を収集した。血液または腹膜洗浄液を滅菌生理食塩水で連続希釈した。５０μＬの各希釈物を無菌的に蒔き、トリプチカーゼ血液寒天プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上、３７℃で培養した。２４時間のインキュベーション後、細菌コロニーの数を計数した。細菌／培養物の数は、血液または腹膜洗浄液のＣＦＵ／ｍＬとして表す（図２）。
【００９２】
実施例８
敗血症マウス由来のマウスサイトカインに対するＭＳＣマイクロカプセルの効果
実施例６に記載のように収集した血液（図３）および腹膜洗浄液（図４）の中のＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、およびＭＣＰ−２の濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いて製造業者の使用説明書に従って測定した。
【００９３】
実施例９
敗血症マウスからのＭＳＣマイクロカプセルの回収
ＭＳＣマイクロカプセルを、１６時間後、注射したＣＬＰマウスの腹膜洗浄液から回収した。液は１．５ｍｌのマイクロチューブ内に収集し、２分後、液を除去し、沈殿物とともに約０．０５ｍＬが残存した。マイクロカプセルを含有する沈殿物を１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、培地に再懸濁した。生細胞および死細胞／カプセルの数を、実施例３における生存度アッセイを用いて測定した（図６）。
【００９４】
実施例１０
ＣＬＰマウスから回収したＭＳＣマイクロカプセルからのヒトＩＬ−６の分泌
培養下で維持されたか、または実施例９と同様に注射の１６時間後にＣＬＰマウスから回収された約５，０００個の細胞を含有するマイクロカプセルを、培地中で２４時間インキュベートした。培地を収集し、ヒトＩＬ−６用のＥｌｉｓａアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてヒトＩＬ−６の分泌を測定するために用いた（図７）。
【００９５】
実施例１１
ＭＳＣマイクロカプセルからのＰＧＥ２の分泌
培養下で維持された約５，０００個の細胞を含有するマイクロカプセルを、培地中で２４時間インキュベートした。培地を収集し、（ＢｉｏＲａｄ）用のＥｌｉｓａアッセイを用いてＰＧＥ２の分泌を測定するために用いた（図８）。
【図１Ａ−１Ｃ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【図４Ａ−４Ｆ】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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