(57)【要約】  本開示は、鞘翅目および／または半翅目害虫を含む、害虫における標的コードおよび転写非コード配列のＲＮＡ干渉媒介阻害による害虫の防除のための核酸分子およびその使用の方法に関する。本開示はまた、害虫の防除に有用な核酸分子を発現するトランスジェニック植物を作製する方法ならびにそれにより得られる植物細胞および植物に関する。
2017530712.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種プロモーターに作動可能に連結した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む単離核酸であって、
前記ポリヌクレオチドが、
配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；ならびに
配列番号７１；配列番号７１の相補体；配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７１を含むエウスキスツス属（Euschistus）生物の天然コード配列；配列番号７１を含むエウスキスツス属（Euschistus）生物の天然コード配列の相補体；配列番号７１を含むエウスキスツス属（Euschistus）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１を含むエウスキスツス属（Euschistus）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体
からなる群から選択される、
単離核酸。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号７１、配列番号７３および前述のもののいずれかの相補体からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
【請求項４】
前記生物がＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコント；Ｄ．バルベリ（D. barberi）スミスおよびローレンス；Ｄ．ｕ．ホワルディ（D. u. howardi）；Ｄ．ｖ．ゼアエ（D. v. zeae）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマー；Ｄ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイム；エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）（Ｆａｂｒ．）（ネオトロピカルブラウンスティンクバグ）、ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）（Ｌ．）（ミナミアオカメムシ）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）（ウェストウッド）（レッドバンディッドスティンクバグ）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）（Ｓｔａｌ）（クサギカメムシ）；チナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）（セイ）（グリーンスティンクバグ）；エウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）（セイ）（ブラウンスティンクバグ）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）（ダラス）、ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus）（Ｆ．）、エデッサ・メジタブンダ（Edessa meditabunda）（Ｆ．）、チアンタ・ペルジトル（Thyanta perditor）（Ｆ．）（ネオトロピカルレッドショルダードスティンクバグ）、チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）（パリソ・ド・ボーヴォワ）、ホルシアス・ノビレルス（Horcias nobilellus）（ベルク）（コットンバグ）、テディア・スチグモサ（Taedia stigmosa）（ベルク）、ホシカメムシ（Dysdercus peruvianus）（Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）（ウェストウッド）、レプトグロスス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）（ダラス）、ニエストレア・シダエ（Niesthrea sidae）（Ｆ．）、カスミカメムシ（Lygus hesperus）（ナイト）（ウェスタンターニッシュドプラントバグ）およびサビイロメクラガメ（Lygus lineolaris）（パリソ・ド・ボーヴォワ）からなる群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドから転写されるリボ核酸（ＲＮＡ）分子。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現から産生される二本鎖リボ核酸分子。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド配列を鞘翅目または半翅目害虫と接触させることが、前記ポリヌクレオチドと特異的に相補的な内因性ヌクレオチド配列の発現を阻害する、請求項６に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項８】
リボヌクレオチド分子を鞘翅目または半翅目害虫と接触させることが、前記害虫を殺すまたはその成長および／もしくは摂食を阻害する、請求項７に記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項９】
第１、第２および第３のＲＮＡセグメントを含み、
前記第１のＲＮＡセグメントが前記ポリヌクレオチドを含み、
前記第３のＲＮＡセグメントが、第２のポリヌクレオチド配列により前記第１のＲＮＡセグメントに連結されており、
前記第１および前記第３のＲＮＡセグメントがリボ核酸に転写されたときにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成するように、前記第３のＲＮＡセグメントが実質的に前記第１のＲＮＡセグメントの逆相補体である、請求項６に記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項１０】
長さが約１５〜約３０ヌクレオチドの二本鎖リボ核酸分子および一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項５に記載のＲＮＡ。
【請求項１１】
前記異種プロモーターが、植物細胞中で機能的である、請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項１３】
原核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
真核細胞である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
植物細胞である、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドで形質転換された植物。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の植物の種子。
【請求項１８】
検出可能な量の前記ポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の植物から生産される商品生産物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが前記植物において二本鎖リボ核酸分子として発現する、請求項１６に記載の植物。
【請求項２０】
トウモロコシ、ダイズまたは綿細胞である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２１】
トウモロコシ、ダイズまたは綿である、請求項１６に記載の植物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが前記植物においてリボ核酸分子として発現し、鞘翅目または半翅目害虫が前記植物の一部を摂取したとき、前記リボ核酸分子が、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドと特異的に相補的である内因性ポリヌクレオチドの発現を阻害する、請求項１６に記載の植物。
【請求項２３】
内因性害虫遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの追加のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記追加のポリヌクレオチド（複数可）がそれぞれ植物細胞中で機能し得る異種プロモーターに作動可能に連結した、請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクター。
【請求項２５】
害虫集団を防除する方法であって、前記害虫内部の生物学的機能を阻害するために前記害虫との接触の際に機能するリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む作用物質を用意することを含み、前記ＲＮＡが、配列番号１および配列番号７１からなる群から選択されるポリヌクレオチド；配列番号１および配列番号７１からなる群から選択されるポリヌクレオチドの相補体；配列番号１および配列番号７１からなる群から選択されるポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１および配列番号７１からなる群から選択されるポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１および配列番号７１からなる群から選択されるポリヌクレオチドの転写物；ならびに配列番号１および配列番号７１からなる群から選択されるポリヌクレオチドの転写物の相補体と特異的にハイブリダイズ可能である、方法。
【請求項２６】
前記作用物質が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記害虫が鞘翅目または半翅目害虫である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
鞘翅目または半翅目害虫集団を防除する方法であって、
鞘翅目または半翅目害虫の宿主植物に請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換植物細胞を供給することを含み、前記集団に属する鞘翅目または半翅目害虫との接触により前記鞘翅目または半翅目害虫内部の標的配列の発現を阻害するように機能し、前記ポリヌクレオチドを含まない同じ宿主植物種の植物における同じ害虫種と比較して、前記鞘翅目もしくは半翅目害虫または害虫集団の成長および／または生存の低減をもたらすリボ核酸分子を生成するように前記ポリヌクレオチドを発現させる、方法。
【請求項２９】
前記リボ核酸分子が二本鎖リボ核酸分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記鞘翅目または半翅目害虫集団が、前記形質転換植物細胞を欠いている同じ宿主植物種の宿主植物に外寄生する同じ害虫種の集団と比較して減少する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記リボ核酸分子が二本鎖リボ核酸分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記鞘翅目または半翅目害虫集団が、前記形質転換植物細胞を欠いている同じ種の宿主植物に外寄生する鞘翅目または半翅目害虫集団と比較して減少する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
植物における害虫外寄生を防除する方法であって、
配列番号１または配列番号７１、
配列番号１または配列番号７１の相補体、
配列番号１または配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、
配列番号１または配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体、
配列番号１または配列番号７１の転写物、
配列番号１または配列番号７１の転写物の相補体、
配列番号１または配列番号７１の転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片、および
配列番号１または配列番号７１の転写物の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体
からなる群から選択されるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能であるリボ核酸（ＲＮＡ）を前記害虫の食餌に供給することを含む、方法。
【請求項３４】
前記食餌が前記ポリヌクレオチドを発現するように形質転換された植物細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記特異的にハイブリダイズ可能なＲＮＡが二本鎖ＲＮＡ分子に含まれる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
コーン作物の収量を向上する方法であって、
請求項１に記載の核酸をコーン植物に導入して、トランスジェニックコーン植物を産生することと、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現を可能にするために前記コーン植物を栽培することとを含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、鞘翅目および／または半翅目害虫の発育または成長ならびに前記鞘翅目および／または半翅目害虫による感染に起因する収量の損失を阻害する、方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現が、前記コーン植物の一部と接触した鞘翅目および／または半翅目害虫における少なくとも第１の標的遺伝子を抑制するＲＮＡ分子を生成する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
トランスジェニック植物細胞を産生する方法であって、
請求項１に記載の核酸を含むベクターで植物細胞を形質転換することと、
複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で前記形質転換植物細胞を培養することと、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドをそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされるリボ核酸（ＲＮＡ）分子の発現について前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
前記ＲＮＡを発現する植物細胞を選択することと
を含む、方法。
【請求項３９】
前記ＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
鞘翅目および／または半翅目害虫抵抗性トランスジェニック植物を産生する方法であって、
請求項３８に記載の方法により産生される前記トランスジェニック植物細胞を用意することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることとを含み、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドによりコードされる前記リボ核酸分子の発現が、形質転換植物に接触する鞘翅目および／または半翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節するのに十分である、方法。
【請求項４１】
トランスジェニック植物細胞を産生する方法であって、
鞘翅目害虫から植物を保護する手段を含むベクターで植物細胞を形質転換することと、
複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で前記形質転換植物細胞を培養することと、
植物に鞘翅目害虫抵抗性を与える手段をそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、
鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害するための手段の発現について前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段を発現する植物細胞を選択することと
を含む、方法。
【請求項４２】
鞘翅目害虫抵抗性トランスジェニック植物を産生する方法であって、
請求項４１に記載の方法により産生された前記トランスジェニック植物細胞を用意することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることとを含み、鞘翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する前記手段の発現が、形質転換植物に接触する鞘翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節するのに十分である、方法。
【請求項４３】
トランスジェニック植物細胞を産生する方法であって、
植物に半翅目害虫抵抗性を与える手段を含むベクターで植物細胞を形質転換することと、
複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で前記形質転換植物細胞を培養することと、
植物に半翅目害虫抵抗性を与える前記手段をそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、
半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害するための手段の発現について前記形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、
半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害するための前記手段を発現する植物細胞を選択することと
を含む、方法。
【請求項４４】
半翅目害虫抵抗性トランスジェニック植物を産生する方法であって、
請求項４３に記載の方法により産生された前記トランスジェニック植物細胞を用意することと、
前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることとを含み、半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する前記手段の発現が、形質転換植物に接触する半翅目害虫における標的遺伝子の発現を調節するのに十分である、方法。
【請求項４５】
バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属種またはシュードモナス（Pseudomonas）属種に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項４６】
Ｂ．ツリンギエンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１ＡおよびＣｙｔ２Ｃを含む群から選択される、請求項４５に記載の核酸。
【請求項４７】
バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属種またはシュードモナス（Pseudomonas）属種に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項４８】
Ｂ．ツリンギエンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１ＡおよびＣｙｔ２Ｃを含む群から選択される、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属種またはシュードモナス（Pseudomonas）属種に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の植物。
【請求項５０】
Ｂ．ツリンギエンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１ＡおよびＣｙｔ２Ｃを含む群から選択される、請求項４９に記載の植物。
【請求項５１】
前記形質転換植物細胞がバチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属種またはシュードモナス（Pseudomonas）属種に由来するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
Ｂ．ツリンギエンシス（B. thuringiensis）に由来する前記ポリペプチドが、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１ＡおよびＣｙｔ２Ｃを含む群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、「鞘翅目および半翅目害虫に対する抵抗性を付与するＣＯＰＩコートマーデルタサブユニット核酸分子」について２０１４年１０月１３日に出願した米国仮特許出願番号第６２／０６３２１６号の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
開示の分野
本発明は、一般的に、害虫（例えば、鞘翅目害虫および半翅目害虫）により引き起こされる植物被害の遺伝子防除に関する。特定の実施形態において、本発明は、植物保護効果を得るための害虫の細胞における標的コードおよび非コードポリヌクレオチドの同定ならびに標的コードおよび非コードポリヌクレオチドの発現を転写後に抑制または阻害するための組換えＤＮＡ技術の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ウェスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント（LeConte）は、北アメリカにおける最も破壊的なトウモロコシ根切り虫の種の１つであり、米国中西部のコーン栽培地域において特に問題となっている。ノーザンコーンルートワーム（ＮＣＲ）、ジアブロティカ・バルベリ（Diabrotica barberi）スミスおよびローレンス（Smith and Lawrence）は、ＷＣＲと同じ範囲の多くにおいてともに生息する密接に関連する種である。アメリカにおける重要な害虫であるジアブロティカ属（Diabrotica）種の次のいくつかの他の関連亜種：メキシカンコーンルートワーム（ＭＣＲ）、Ｄ．ヴィルギフェラ・ゼアエ（D. virgifera zeae）クリサンおよびスミス（Krysan and Smith）；サザンコーンルートワーム（ＳＣＲ）、Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ（D. undecimpunctata howardi）バーバー（Barbar）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ウンデシムプンクタータ・テネラ（D. undecimpunctata tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマー；ならびにＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイム（Mannerheim）が存在する。米国農務省は、トウモロコシ根切り虫が８億ドルの収量低下および２億ドルの処理費用を含む１０億ドルの収入減をもたらしていると推定している。
【０００４】
ＷＣＲおよびＮＣＲの両方は、夏に卵として土壌中に産み付けられる。該昆虫は、冬期に卵期に留まる。卵は、楕円形で、白く、長さが０．００４インチ未満である。幼虫は、５月後期または６月後期に孵化し、卵孵化の正確な時期は、温度差および場所により年ごとに異なる。新たに孵化した幼虫は、長さが０．１２５インチ未満の白色の虫である。孵化した時点に、幼虫は、コーンの根を常食とし始める。トウモロコシ根切り虫は、３つの幼虫齢を経る。数週間の摂食の後、幼虫は、脱皮して蛹期に入る。それらは、土壌中で蛹化し、その後、７月および８月に成虫として土壌から出てくる。根切り虫の成虫は、長さが約０．２５インチである。
【０００５】
トウモロコシ根切り虫の幼虫は、コーンおよび他のいくつかの草種を食して発育を完了する。スズメノテッポウを食して生育した幼虫は、後に出現し、コーンを食して生育した幼虫よりも成虫として小さい頭蓋サイズを有する（Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-634）。ＷＣＲ成虫は、コーンのひげ、花粉および露出した穂先の穀粒を常食とする。ＷＣＲ成虫がコーンの生殖組織が存在する前に出現する場合、それらは、葉組織を常食とし、それにより植物の成長を遅くし、さらに宿主植物を殺すこともあり得る。しかし、成虫は、得られるようになるとき、好ましいひげおよび花粉に速やかに移る。ＮＣＲ成虫もコーン植物体の生殖組織を常食とするが、対照的にめったにコーンの葉を常食としない。
【０００６】
コーンにおける根切り虫被害の大部分は、幼虫による摂食によって引き起こされる。新たに孵化した根切り虫は、最初に微細なコーン根毛を常食とし、根端に潜り込む。幼虫がさらに成長すると、一次根を常食とし、それに潜り込む。トウモロコシ根切り虫が多数である場合、幼虫による摂食により、コーンの茎の基部に至るまでの根の切り取りがしばしばもたらされる。重度の根の傷害は、水および栄養素を植物体に輸送する根の能力を妨げ、植物体の成長を低下させ、穀物の生産の減少をもたらし、それにより、全収率をしばしば大幅に減少させる。重度の根の傷害は、収穫をより困難にし、収量をさらに減少させる、コーン植物体の倒伏もしばしばもたらす。さらに、成虫によるコーンの生殖組織の常食により、穂先のひげの切り取りがもたらされ得る。この「ひげのクリッピング」が花粉飛散時に十分に高度である場合、授粉が妨げられる可能性がある。
【０００７】
トウモロコシ根切り虫の防除は、輪作、化学殺虫剤、生物農薬（例えば、胞子形成グラム陽性細菌、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ））、Ｂｔ毒素を発現するトランスジェニック植物、またはそれらの組合せにより試みることができる。輪作は、農地の使用に望まれない制限を設けるという著しい不利な状況に見舞われる。さらに、一部の根切り虫の種の産卵は、コーン以外の作物畑で起こり、あるいは長期の休眠期は、複数年にわたる卵の孵化をもたらし、それにより、コーンおよびダイズを用いて実施される輪作の有効性が減ずることがあり得る。
【０００８】
化学殺虫剤は、トウモロコシ根切り虫の防除を達成するための戦略に最も高度に依拠する。化学殺虫剤の使用は、不完全なトウモロコシ根切り虫防除戦略であるが、化学殺虫剤の費用が殺虫剤の使用にもかかわらず起こり得る根切り虫被害の費用に加えられる場合にトウモロコシ根切り虫により毎年米国で１０億ドル以上が失われ得る。幼虫の高個体数、多雨および殺虫剤（複数可）の不適切な散布はすべて、不十分なトウモロコシ根切り虫防除をもたらし得る。さらに、殺虫剤の連用は、非標的種に対するそれらの多くの毒性による重大な環境への懸念を生じさせるだけでなく、殺虫剤抵抗性の根切り虫の系統を選び出すこととなり得る。
【０００９】
カメムシおよび他の半翅目昆虫（異翅亜目）は、他の重要な農業害虫種群を構成する。世界的にカメムシの５０以上の密接に関連した種が作物被害を引き起こすことが公知である。McPherson & McPherson (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico CRC Press.これらの昆虫は、トウモロコシ、ダイズ、果実、野菜および穀物を含む多数の重要な作物に存在する。
【００１０】
カメムシは、成虫期に達する前に複数の若虫期を経る。卵から成虫に発育するまでの期間は、約３０〜４０日である。若虫および成虫の両方が、それらが口外組織の消化および壊死をもたらす消化酵素も注入する軟組織からの液汁を常食とする。消化された植物性物質および栄養物がその後摂取される。植物維管束系からの水および栄養物の枯渇により、植物組織の損傷が生ずる。発育中の穀類および種子の損傷は、収量および発芽が著しく低減するため、最も重大である。温暖な気候で複数の世代が発生して、著しい昆虫の押寄せをもたらす。カメムシの現在の管理は、個々の畑ごとの殺虫剤処理に依拠している。したがって、進行中の作物の損失を最小限にするために、代替管理戦略が緊急に必要である。
【００１１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子配列のすべて、またはその十分なサイズの任意の一部に対して特異的である干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）分子（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子）がそれによりコードされるｍＲＮＡの分解をもたらす、内因性細胞経路を利用する方法である。近年、ＲＮＡｉは、多くの種および実験系、例えば、エレガンス線虫、植物、昆虫胚および組織培養中細胞における遺伝子「ノックダウン」を実施するために用いられている。例えば、Fire et al. (1998) Nature 391:806-811; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-574; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747参照。
【００１２】
ＲＮＡｉは、ＤＩＣＥＲタンパク質複合体を含む内因性経路を経るｍＲＮＡの分解を伴う。ＤＩＣＥＲは、長いｄｓＲＮＡ分子を低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる、約２０ヌクレオチドの短い断片に切断する。ｓｉＲＮＡは、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の２つの一本鎖ＲＮＡに巻き戻される。パッセンジャー鎖は、分解され、ガイド鎖は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。
【００１３】
米国特許第７，６１２，１９４号明細書ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書、第２０１０／０１９２２６５号明細書および第２０１１／０１５４５４５号明細書は、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコントの蛹から単離された９１１２発現配列タグ（ＥＳＴ）配列のライブラリーを開示している。米国特許第７，６１２，１９４号明細書および米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書において植物細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現のためにそこに開示されたＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）液胞型プロトンＨ＋−ＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）のいくつかの特定の部分配列の１つと相補的である核酸分子をプロモーターに作動可能に連結することが示唆されている。米国特許出願公開第２０１０／０１９２２６５号明細書は、植物細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現のために未知および非開示機能のＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）遺伝子の特定の部分配列（部分配列は、エレガンス線虫（C. elegans）におけるＣ５６Ｃ１０．３遺伝子産物と５８％同一であると述べられている）と相補的である核酸分子にプロモーターを作動可能に連結することを示唆している。米国特許出願公開第２０１１／０１５４５４５号明細書は、植物細胞におけるアンチセンスＲＮＡの発現のためにＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）コートマーサブユニット遺伝子の２つの特定の部分配列と相補的である核酸分子にプロモーターを作動可能に連結することを示唆している。さらに、米国特許第７，９４３，８１９号明細書は、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコントの幼虫、蛹および切開中腸から単離された９０６の発現配列タグ（ＥＳＴ）のライブラリーを開示し、植物細胞における二本鎖ＲＮＡの発現のためにＤ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）負荷（charged）多胞体タンパク質４ｂ遺伝子の特定の部分配列と相補的である核酸分子にプロモーターを作動可能に連結することを示唆している。
【００１４】
Ｖ−ＡＴＰアーゼのいくつかの特定の部分配列および未知の機能の遺伝子の特定の部分配列以外には、ＲＮＡ干渉のためにそれらに示されている９千を超える配列のいずれかの特定の配列を使用するさらなる示唆は、米国特許第７，６１２，１９４号明細書ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書、第２０１０／０１９２２６５号明細書および第２０１１／０１５４５４５号明細書に示されていない。さらに、米国特許第７，６１２，１９４号明細書ならびに米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書、第２０１０／０１９２２６５号明細書および第２０１１／０１５４５４５号明細書のいずれも、示された９千を超える配列のどのその他のものがｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に、トウモロコシ根切り虫の種において致死性、または別の面では有用でさえあるかについての指針を記載していない。米国特許第７，９４３，８１９号明細書は、負荷多胞体タンパク質４ｂ遺伝子の特定の部分配列以外には、ＲＮＡ干渉のためにそれに示されている９千を超える配列のいずれかの特定の配列を使用する示唆を記載していない。さらに、米国特許第７，９４３，８１９号明細書は、示された９千を超える配列のどのその他のものがｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合に、トウモロコシ根切り虫の種において致死性、または別の面では有用でさえあるかについての指針を記載していない。米国特許出願公開第２０１３／０４０１７３号明細書およびＰＣＴ出願公開国際公開第２０１３／１６９９２３号パンフレットは、トウモロコシにおけるＲＮＡ干渉のためのジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）Ｓｎｆ７遺伝子由来の配列の使用を記載している。（Bolognesi et al. (2012) PLOS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534にも開示されている。）
【００１５】
トウモロコシ根切り虫ＤＮＡと相補的な配列（前述のような）の圧倒的大多数は、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとして用いた場合にトウモロコシ根切り虫の種からの植物保護効果をもたらさない。例えば、Baum et al.(2007), Natute Biotechnology 25:1322-1326は、ＲＮＡｉによりいくつかのＷＣＲ遺伝子標的を阻害する効果を記載している。これらの著者らは、彼らが試験した２６標的遺伝子のうちの８標的遺伝子が５２０ｎｇ／ｃｍ２を超える非常に高いｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）濃度で実験的に有意な鞘翅目害虫の死亡率をもたらすことができなかったことを報告した。
【００１６】
米国特許第７，６１２，１９４号明細書および米国特許出願公開第２００７／００５０８６０号明細書の著者らは、ウェスタンコーンルートワームを標的とするコーン植物におけるｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡｉの最初の報告を行った。Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6.これらの著者らは、トランスジェニックＲＮＡｉトウモロコシを開発するための可能な標的遺伝子をスクリーニングする高処理式ｉｎ  ｖｉｖｏ食餌ＲＮＡｉシステムを記載している。２９０の標的の最初の遺伝子プールのうち、１４のみが幼虫防除能を示した。最も有効な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のうちの１つは、液胞ＡＴＰアーゼサブユニットＡ（Ｖ−ＡＴＰアーゼ）をコードする遺伝子を標的とし、対応する内因性ｍＲＮＡの速やかな抑制をもたらし、低濃度のｄｓＲＮＡによる特異的ＲＮＡｉ反応を誘発した。このように、これらの著者らは、可能な害虫管理ツールとしてのｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ＲＮＡｉの可能性を最初に記録し、さらに候補遺伝子の比較的に小さい組からでさえも有効な標的を先験的に正確に特定することができないことを同時に示した。
【発明の概要】
【００１７】
開示
本明細書に開示するのは、核酸分子（例えば、標的遺伝子、ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）、ならびに例えば、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコント（ウェスタンコーンルートワーム、「ＷＣＲ」）；Ｄ．バルベリ（D. barberi）スミスおよびローレンス（ノーザンコーンルートワーム、「ＮＣＲ」）；Ｄ．ｕ．ホワルディ（D. u. howardi）バーバー（サザンコーンルートワーム、「ＳＣＲ」）；Ｄ．ｖ．ゼアエ（D. v. zeae）クリサンおよびスミス（メキシカンコーンルートワーム、「ＭＣＲ」）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマー；Ｄ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイム等の鞘翅目害虫、ならびにエウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）（Ｆａｂｒ．）（ネオトロピカルブラウンスティンクバグ、「ＢＳＢ」）、Ｅ．セルブス（E. servus）（セイ）（ブラウンスティンクバグ）；ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）（Ｌ．）（ミナミアオカメムシ）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）（ウェストウッド）（レッドバンディッドスティンクバグ）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）（Ｓｔａｌ）（クサギカメムシ）；チナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）（セイ）（グリーンスティンクバグ）；Ｃ．マルギナツム（C. marginatum）（パリソ・ド・ボーヴォワ）；ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）（ダラス）；Ｄ．フルカツス（D. furcatus）（Ｆ．）；エデッサ・メジタブンダ（Edessa meditabunda）（Ｆ．）；チアンタ・ペルジトル（Thyanta perditor）（Ｆ．）（ネオトロピカルレッドショルダードスティンクバグ）；ホルシアス・ノビレルス（Horcias nobilellus）（ベルク）（コットンバグ）；テディア・スチグモサ（Taedia stigmosa）（ベルク）；ホシカメムシ（Dysdercus peruvianus）（Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）；ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）（ウェストウッド）；レプトグロスス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）（ダラス）；ニエストレア・シダエ（Niesthrea sidae）（Ｆ．）；カスミカメムシ（Lygus hesperus）（ナイト）（ウェスタンターニッシュドプラントバグ）およびサビイロメクラガメ（L. lineolaris）（パリソ・ド・ボーヴォワ）等の半翅目害虫を含む、害虫の防除のためのそれらの使用の方法である。特定の例において、害虫における１つまたは複数の天然核酸の少なくとも一部と相同的であり得る例示的な核酸分子を開示する。
【００１８】
これらおよびさらなる例において、天然核酸は、標的遺伝子である可能性があり、その産物は、例えばかつ制限なしに、代謝プロセスまたは幼虫／若虫の発育に関与することがあり得る。いくつかの例において、それと相同的なポリヌクレオチドを含む核酸分子による標的遺伝子の発現の翻訳後阻害は、鞘翅目および／または半翅目害虫において致死性である、あるいはその成長および／または発育の低減をもたらすことがあり得る。特定の例において、外被タンパク質複合体デルタサブユニットからなる遺伝子（本明細書でＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａサブユニットおよびＣＯＰＩ  ＤＥＬＴＡと呼ぶ）は、転写後サイレンシングのための標的遺伝子として選択することができる。特定の例において、転写後阻害に有用な標的遺伝子は、本明細書でＣＯＰＩ  ＤＥＬＴＡと呼ぶ新たな遺伝子である。したがって、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａのヌクレオチド配列（配列番号１および配列番号７１）を含む単離核酸分子、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１および配列番号７１）の相補体および前述のもののいずれかの断片を本明細書で開示する。
【００１９】
標的遺伝子産物（例えば、ＣＯＰＩ  ＤＥＬＴＡと呼ばれる遺伝子の産物）内のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子も開示する。例えば、核酸分子は、配列番号２または配列番号７２（ＣＯＰＩ  ＤＥＬＴＡタンパク質）と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。特定の例において、核酸分子は、ＣＯＰＩ  ＤＥＬＴＡの産物内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。標的遺伝子産物内のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの逆相補体であるポリヌクレオチドを含む核酸分子をさらに開示する。
【００２０】
鞘翅目および／または半翅目害虫標的遺伝子、例えば、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａのすべてまたは一部と相補的であるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子の産生に用いることができるｃＤＮＡポリヌクレオチドも開示する。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡは、植物または細菌等の遺伝子操作生物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで産生され得る。特定の例において、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１および配列番号７１）のすべてまたは一部と相補的であるｉＲＮＡ分子を産生させるために用いることができるｃＤＮＡ分子を開示する。
【００２１】
鞘翅目および／または半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段、ならびに植物に鞘翅目および／または半翅目害虫抵抗性を与える手段をさらに開示する。鞘翅目および／または半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段は、配列番号３（ジアブロティカ属（Diabrotica）ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇｉｏｎ  １、本明細書で時にはＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ１と呼ぶ）または配列番号４（ジアブロティカ属（Diabrotica）ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １、本明細書で時にはＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｖ１と呼ぶ）または配列番号７３（エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇｉｏｎ  １、本明細書で時にはＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ−１と呼ぶ）またはその相補体の少なくとも１つからなる一本または二本鎖ＲＮＡ分子である。鞘翅目および／または半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段の機能的等価物は、配列番号１または配列番号７１を含むＷＣＲまたはＢＳＢ遺伝子のすべてまたは一部と実質的に相同である一本または二本鎖ＲＮＡ分子を含む。植物に鞘翅目および／または半翅目害虫抵抗性を与える手段は、プロモーターに作動可能に連結した鞘翅目および／または半翅目害虫における必須遺伝子の発現を阻害する手段をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子であり、該ＤＮＡ分子は、トウモロコシまたはダイズ植物体のゲノムに組み込まれることができる。
【００２２】
開示するのは、害虫内部の生物学的機能を阻害するために害虫により取り込まれるときに機能するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を害虫（例えば、鞘翅目または半翅目害虫）に与えることを含む、害虫（例えば、鞘翅目または半翅目害虫）の集団を防除する方法であり、ここで、ｉＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７１および配列番号７３；配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７１および配列番号７３の相補体；配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７１および配列番号７３のいずれかのすべてまたは一部を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）または半翅目生物（例えば、ＢＳＢ）の天然コード配列；配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７１および配列番号７３のいずれかのすべてまたは一部を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物または半翅目生物の天然コード配列の相補体；配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７１および配列番号７３のいずれかのすべてまたは一部を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物または半翅目生物の天然非コード配列；ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７１および配列番号７３のいずれかのすべてまたは一部を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物または半翅目生物の天然非コード配列の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む。
【００２３】
ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡを発現する飼料ベースのアッセイまたは複数の遺伝子組換え植物細胞における鞘翅目および／または半翅目害虫に与えることができる方法も本明細書に開示する。これらおよびさらなる例において、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡは、鞘翅目の幼虫および／または半翅目害虫の若虫により摂取させることができる。本発明のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡの摂取は、幼虫／若虫におけるＲＮＡｉをもたらす可能性があり、これがひいては鞘翅目および／または半翅目害虫の生存能力に必須な遺伝子のサイレンシングをもたらし、最終的に幼虫／若虫の死につながる可能性がある。したがって、鞘翅目および／または半翅目害虫の防除に有用な例示的な核酸配列（複数可）を含む核酸分子を鞘翅目および／または半翅目害虫に与える方法を開示する。特定の例において、本発明の核酸分子の使用により防除される鞘翅目および／または半翅目害虫は、ＷＣＲ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、ＭＣＲ、Ｄ．バルテアタ（D. balteata）、Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）、Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）、Ｄ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）、エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）、Ｅ．セルブス（E. servus）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）、ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）、チナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）、Ｃ．マルギナツム（C. marginatum）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）、Ｄ．フルカツス（D. furcatus）、エデッサ・メジタブンダ（Edessa meditabunda）、チアンタ・ペルジトル（Thyanta perditor）、ホルシアス・ノビレルス（Horcias nobilellus）、テディア・スチグモサ（Taedia stigmosa）、ホシカメムシ（Dysdercus peruvianus）、ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）、レプトグロスス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）、ニエストレア・シダエ（Niesthrea sidae）および／またはカスミカメムシ（Lygus hesperus）であり得る。
【００２４】
前述および他の特徴は、添付図面に準拠して進められる、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】プライマーの単一の対を用いて単一の転写鋳型からｄｓＲＮＡを生成するために用いた戦略の描写を含む図である。
【図２】２つの転写鋳型からｄｓＲＮＡを生成するために用いた戦略の描写を含む図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
配列一覧表
添付の配列一覧表に列挙した核酸配列を３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定の通りにヌクレオチド塩基の標準的文字略記を用いて示す。列挙した核酸およびアミノ酸配列は、記述されたように配列したヌクレオチドおよびアミノ酸モノマーを有する分子（すなわち、それぞれポリヌクレオチドおよびポリペプチド）を定義する。列挙した核酸およびアミノ酸配列は、記述されたように配列したヌクレオチドおよびアミノ酸モノマーを含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドの属もそれぞれ定義する。遺伝コードの重複性を考慮すると、コード配列を含むヌクレオチド配列も、参照配列からなるポリヌクレオチドと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの属を記述することが理解される。アミノ酸配列は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドＯＲＦの属を記述することがさらに理解される。
【００２７】
各核酸配列の１つの鎖のみを示すが、相補鎖は、表示鎖の記載により含められるものと理解される。一次核酸配列の相補体および逆相補体は、一次配列によって必然的に開示されるので、核酸配列の相補的配列および逆相補的配列は、他の状態であることが明確に述べられていない限り（または配列が出現する文脈から他の状態であることが明らかでない限り）、該核酸配列の任意の参照により含められる。さらに、ＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列は、それが転写されたＤＮＡの配列によって決定される（チミン（Ｔ）に対するウラシル（Ｕ）核酸塩基の置換を別にすれば）ことは、当技術分野で理解されているので、ＲＮＡ配列は、それをコードするＤＮＡ配列への参照により含められる。添付の配列一覧表において、
配列番号１は、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）に由来するＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａサブユニットを含むＤＮＡ配列を示す。
配列番号２は、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）に由来するＣＯＰＩ  Ｄｅｌｔａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ合成（５’および３’末端におけるＴ７プロモーター配列は示さず）に用いたジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）に由来するＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ１（ｒｅｇｉｏｎ  １）のＤＮＡ配列を示す。
配列番号４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ合成（５’および３’末端におけるＴ７プロモーター配列は示さず）に用いたジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）に由来するＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｖ１（ｖｅｒｓｉｏｎ  １）のＤＮＡ配列を示す。
配列番号５は、Ｔ７ファージプロモーターのＤＮＡ配列を示す。
配列番号６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ合成（５’および３’末端におけるＴ７プロモーター配列は示さず）に用いたＹＦＰコード領域セグメントのＤＮＡ配列を示す。
配列番号７〜１０は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ１およびＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ２を含むジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）に由来するＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａサブユニット配列の一部を増幅するために用いたプライマーを示す。
配列番号１１は、ｐＤＡＢ１１７２２０に見いだされるジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）に由来するＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａヘアピンｖ１−ＲＮＡ形成配列を示す。大文字で表示した塩基は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａセンス鎖であり、下線を引いた小文字で表示した塩基は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含み、下線を引いていない小文字で表示した塩基は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａアンチセンス鎖である。
【００２８】
【化１】
2017530712.tif 000003
配列番号１２は、ｐＤＡＢ１１０８５３に見いだされるＹＦＰヘアピンＲＮＡ形成配列ｖ２を示す。大文字で表示した塩基は、ＹＦＰセンス鎖であり、下線を引いた塩基は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含み、小文字で表示した下線を引いていない塩基は、ＹＦＰアンチセンス鎖である。
【００２９】
【化２】
2017530712.tif 000004
配列番号１３は、ＳＴ−ＬＳ１イントロンを含む配列を示す。
配列番号１４は、ｐＤＡＢ１０１５５６に見いだされるＹＦＰタンパク質コード配列を示す。
配列番号１５は、Ａｎｎｅｘｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ  １のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１６は、Ａｎｎｅｘｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ  ２のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１７は、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ２  ｒｅｇｉｏｎ  １のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８は、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ２  ｒｅｇｉｏｎ  ２のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９は、ｍｔＲＰ−Ｌ４  ｒｅｇｉｏｎ  １のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２０は、ｍｔＲＰ−Ｌ４  ｒｅｇｉｏｎ  ２のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１〜４８は、ｄｓＲＮＡ合成のためのＹＦＰ、Ａｎｎｅｘｉｎ、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ２およびｍｔＲＰ−Ｌ４の遺伝子領域を増幅するために用いたプライマーを示す。
配列番号４９は、ＴＩＰ４１様タンパク質をコードするトウモロコシＤＮＡ配列を示す。
配列番号５０は、オリゴヌクレオチドＴ２０ＮＶのＤＮＡ配列を示す。
配列番号５１〜５５は、トウモロコシ転写物レベルを測定するために用いたプライマーおよびプローブの配列を示す。
配列番号５６は、バイナリーベクター主鎖検出に用いたＳｐｅｃＲコード領域の一部のＤＮＡ配列を示す。
配列番号５７は、ゲノムコピー数解析に用いたＡＡＤＩコード領域の一部のＤＮＡ配列を示す。
配列番号５８は、トウモロコシインベルターゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号５９〜６７は、遺伝子コピー数解析に用いたプライマーおよびプローブの配列を示す。
配列番号６８〜７０は、トウモロコシ発現解析に用いたプライマーおよびプローブの配列を示す。
配列番号７１は、ネオトロピカルブラウンスティンクバグ（エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros））に由来するＢＳＢ  ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ転写物の例示的なＤＮＡ配列を示す。
配列番号７２は、エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）ＣＯＰＩ  ＤＥＬＴＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号７３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ合成（５’および３’末端におけるＴ７プロモーター配列は示さず）に用いたエウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）に由来するＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ−１のＤＮＡ配列を示す。
配列番号７４〜７５は、ＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ−１を含むエウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ配列の一部を増幅するために用いたプライマーを示す。
配列番号７６は、ＹＦＰ標的ｄｓＲＮＡ：ＹＦＰｖ２のセンス鎖である。
配列番号７７〜７８は、ＹＦＰ標的ｄｓＲＮＡ：ＹＦＰｖ２の一部を増幅するために用いたプライマーを示す。
【００３０】
詳細な説明
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）の外寄生の遺伝子防除のための方法および組成物を本明細書に開示する。害虫集団のＲＮＡｉ媒介防除のための標的遺伝子として用いる害虫の生活環に必須の１つまたは複数の遺伝子（複数可）を同定する方法も提供する。ＲＮＡ分子をコードＤＮＡプラスミドベクターは、成長、生存および／または発育に必須の１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）を抑制するように設計することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子を形成することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、害虫における標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子による標的遺伝子の発現の転写後抑制または阻害の方法を提供する。これらおよびさらなる実施形態では、害虫は、標的遺伝子のコードまたは非コード配列と相補的である核酸分子のすべてまたは一部から転写される１つまたは複数のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子を摂取し、それにより植物保護効果をもたらし得る。
【００３１】
したがって、いくつかの実施形態は、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）の少なくとも部分的な防除を達成するために標的遺伝子（複数可）のコードおよび／または非コード配列と相補的であるｉＲＮＡ（すなわち、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ）を用いる、標的遺伝子産物の発現の配列特異的阻害を含む。例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号７１、配列番号７３およびそれらの断片のいずれかに示す、ポリヌクレオチドを含む一組の単離および精製核酸分子を開示する。いくつかの実施形態では、安定化ｄｓＲＮＡ分子は、標的遺伝子の転写後サイレンシングまたは阻害のために、この配列、その断片、またはこれらの配列の１つを含む遺伝子から発現させることができる。特定の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号１のすべてまたは一部を含む。他の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号３のすべてまたは一部を含む。またさらなる実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号４のすべてまたは一部を含む。他の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号１１のすべてまたは一部を含む。またさらなる実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号７１のすべてまたは一部を含む。他の実施形態では、単離および精製核酸分子は、配列番号７３のすべてまたは一部を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子（複数可）をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡをそのゲノムに有する組換え宿主細胞（例えば、植物細胞）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子（複数可）は、害虫における標的遺伝子の発現を転写後に検出されなくするまたは阻害するために鞘翅目および／または半翅目害虫により摂取されたときに生成され得る。組換えＤＮＡは、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７１または配列番号７３のいずれか；配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７１または配列番号７３のいずれかの断片；または配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号７１または配列番号７３の１つもしくは複数のものを含む遺伝子の部分配列；またはそれらの相補体を含み得る。
【００３３】
いくつかの実施形態は、配列番号１および／または配列番号７１および／またはその相補体によってコードされるＲＮＡのすべてまたは一部を含む少なくとも１つのｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子（複数可）をコードする組換えＤＮＡをそのゲノムに有する組換え宿主細胞を含む。害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）によって摂取された場合、ｉＲＮＡ分子（複数可）は、鞘翅目および／または半翅目害虫における配列番号１および／または配列番号７１を含む標的遺伝子の発現をサイレンシングまたは阻害し、それにより、鞘翅目および／または半翅目害虫における成長、発育および／または摂食の停止をもたらし得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができる少なくとも１つのＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの組換えＤＮＡをそのゲノムに有する組換え宿主細胞は、形質転換植物細胞であり得る。いくつかの実施形態は、そのような形質転換植物細胞を含むトランスジェニック植物を含む。そのようなトランスジェニック植物に加えて、トランスジェニック植物世代の子孫植物、トランスジェニック種子およびトランスジェニック植物産物をすべて提供し、それらのそれぞれが組換えＤＮＡ（複数可）を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞において発現させることができる。したがって、これらおよび他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、トランスジェニック植物細胞から単離することができる。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、コーン（ゼア・マイス（Zea mays））、ダイズ（グリシン・マクス（Glycine max））およびイネ科（Poaceae）の植物からなる群から選択される植物である。
【００３５】
いくつかの実施形態は、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法を含む。これらおよび他の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子を提供することができる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結することができ、転写終結配列にも作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、害虫細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法は、（ａ）ｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより植物細胞に形質転換を起こさせることと、（ｂ）複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で形質転換植物細胞を培養することと、（ｃ）ベクターをそのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、（ｄ）選択された形質転換植物細胞がベクターのポリヌクレオチドによりコードされたｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子を含むことを判定することとを含み得る。植物は、そのゲノムに組み込まれたベクターを有し、ベクターのポリヌクレオチドによりコードされたｄｓＲＮＡ分子を含む植物細胞から再生させることができる。
【００３６】
したがって、そのゲノムに組み込まれたｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのポリヌクレオチドによりコードされたｄｓＲＮＡ分子を含むトランスジェニック植物も開示する。特定の実施形態では、植物におけるｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ分子の発現は、害虫の成長および／または生存が阻害されるように、形質転換植物または植物細胞と接触する（例えば、形質転換植物、植物の一部（例えば、根）または植物細胞を常食にすることにより）害虫（例えば、鞘翅目または半翅目）の細胞中の標的遺伝子の発現を調節するのに十分である。本明細書に開示するトランスジェニック植物は、害虫の外寄生に対する抵抗性および／または耐性の増大を示し得る。特定のトランスジェニック植物は、ＷＣＲ；ＮＣＲ；ＳＣＲ；ＭＣＲ；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマー；Ｄ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイム；エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）；ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）；ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）；ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）；チナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）；エウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）；ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）；ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus）；エデッサ・メジタブンダ（Edessa meditabunda）；チアンタ・ペルジトル（Thyanta perditor）；チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）；ホルシアス・ノビレルス（Horcias nobilellus）；テディア・スチグモサ（Taedia stigmosa）；ホシカメムシ（Dysdercus peruvianus）；ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）；レプトグロスス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）；ニエストレア・シダエ（Niesthrea sidae）；カスミカメムシ（Lygus hesperus）；およびサビイロメクラガメ（Lygus lineolaris）からなる群から選択される１つまたは複数の鞘翅目および／または半翅目害虫（複数可）に対する抵抗性および／または保護の増大を示し得る。
【００３７】
害虫（鞘翅目および／または半翅目）へのｉＲＮＡ分子等の防除剤の送達の方法も本明細書に開示する。そのような防除剤は、宿主において摂食する、成長する、または別の方法で被害を引き起こす害虫集団の能力の低下を直接的または間接的にもたらし得る。いくつかの実施形態では、害虫における少なくとも１つの標的遺伝子を抑制するための害虫への安定化ｄｓＲＮＡ分子の送達と、それにより、ＲＮＡｉを引き起こし、害虫宿主における植物被害を低減または排除することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、害虫における標的遺伝子の発現を阻害する方法は、害虫における成長、生存および／または発育の停止をもたらし得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、害虫（鞘翅目および／または半翅目）の外寄生の排除または低減を達成するために植物、動物および／または植物もしくは動物の環境に用いるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）分子を含む組成物（例えば、局所組成物）を提供する。特定の実施形態では、組成物は、害虫に食させる栄養組成物または食物源であり得る。いくつかの実施形態は、害虫が利用できる栄養組成物または食物源を作ることを含む。ｉＲＮＡ分子を含む組成物の摂取は、害虫の１つまたは複数の細胞による該分子の取込みをもたらし得、これがひいては害虫の細胞（複数可）における少なくとも１つの標的遺伝子の発現の阻害をもたらし得る。害虫の外寄生による植物または植物細胞の摂取または被害は、害虫の宿主にｉＲＮＡ分子を含む１つまたは複数の組成物を供給することにより、害虫が存在する宿主組織または環境中またはその上において制限または排除することができる。
【００３９】
本明細書に開示する組成物および方法は、異なる標的（例えば、ＲＡＳ  ＯｐｐｏｓｉｔｅまたはＲＯＰ）（米国特許出願公開第２０１５０１７６０２５号明細書）およびＲＮＡＰＩＩ（米国特許出願公開第２０１５０１７６００９号明細書）に向けられる他のｉＲＮＡ分子と組み合わせて一緒に用いることができる。害虫、例えば、幼虫における複数の標的配列に作用する可能性は、有効性を増大させ、またｉＲＮＡ技術を含む害虫管理への持続可能なアプローチを改善し得る。本明細書に開示する組成物および方法は、害虫（鞘翅目および／または半翅目）による被害を防除するための他の方法および組成物とも組み合わせて一緒に用いることができる。例えば、害虫から植物を保護するための本明細書で述べるｉＲＮＡ分子は、害虫に対して有効な１つもしくは複数の化学物質、そのような害虫に対して有効な生物農薬、輪作、ＲＮＡｉ媒介法およびＲＮＡｉ組成物（例えば、害虫に有害である植物におけるタンパク質（例えば、Ｂｔ毒素）の組換え産生）の特徴と異なる特徴を示す遺伝子組換え技術のさらなる使用を含む方法に用いることができる。
【００４０】
ＩＩ．略語
ＢＳＢ      ネオトロピカルブラウンスティンクバグ（エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros））
ｄｓＲＮＡ  二本鎖リボ核酸
ＥＳＴ        発現配列タグ
ＧＩ        成長阻害
ＮＣＢＩ    米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）
ｇＤＮＡ    ゲノムＤＮＡ
ｉＲＮＡ    阻害リボ核酸
ＯＲＦ      オープンリーディングフレーム
ＲＮＡｉ    リボ核酸干渉
ｍｉＲＮＡ  マイクロリボ核酸
ｓｉＲＮＡ  低分子阻害リボ核酸
ｓｈＲＮＡ  短ヘアピン型リボ核酸
ｈｐＲＮＡ  ヘアピンリボ核酸
ＵＴＲ      非翻訳領域
ＷＣＲ      ウェスタンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）
ＮＣＲ      ノーザンコーンルートワーム（ジアブロティカ・バルベリ（Diabrotica barberi）スミスおよびローレンス）
ＭＣＲ      メキシカンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Diabrotica virgifera zeae）クリサンおよびスミス）
ＰＣＲ      ポリメラーゼ連鎖反応
ｑＰＣＲ      定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＩＳＣ    ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体
ＳＣＲ      サザンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ウンデシムプンクタータ・ホワルディ（Diabrotica undecimpunctata howardi）バーバー）
ＳＥＭ        平均値の標準誤差
ＹＥＰ        黄色蛍光タンパク質
【００４１】
ＩＩＩ．用語
続く説明および表において、多くの用語が用いられている。そのような用語に与えるべき範囲を含む、明細書および特許請求の範囲の明確で、一貫した理解を可能にするために、以下の定義を記載する。
【００４２】
鞘翅目害虫：  本明細書で用いているように、「鞘翅目害虫」という用語は、コーンおよび他のイネ科植物を含む、農作物および農産物を常食とする、ジアブロティカ属（Diabrotica）の害虫を含む、鞘翅目（Coleoptera）の昆虫を意味する。特定の例において、鞘翅目害虫は、Ｄ．ｖ．ヴィルギフェラ（D. v. virgifera）ルコント（ＷＣＲ）；Ｄ．バルベリ（D. barberi）スミスおよびローレンス（ＮＣＲ）；Ｄ．ｕ．ホワルディ（D. u. howardi）（ＳＣＲ）；Ｄ．ｖ．ゼアエ（D. v. zeae）（ＭＣＲ）；Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント；Ｄ．ｕ．テネラ（D.u. tenella）；Ｄ．スペシオーサ（D. speciosa）ジャーマー；ならびにＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイムを含むリストから選択される。
【００４３】
（生物との）接触：  本明細書で用いているように、核酸分子に関する、生物（例えば、鞘翅目または半翅目害虫）「との接触」または「による取込み」という用語は、生物体内への核酸分子のインターナリゼーション、例えば、かつ制限なく、生物による分子の摂取（摂食による）；生物を核酸分子を含む組成物と接触させること；核酸分子を含む溶液による生物を漬けることを含む。
【００４４】
コンティグ：  本明細書で用いているように、「コンティグ」という用語は、単一遺伝源に由来する一組の重複ＤＮＡセグメントから再構築されているＤＮＡ配列を意味する。
【００４５】
コーン植物体：  本明細書で用いているように、「コーン植物体」という用語は、ゼア・マイス種（Zae mays）（トウモロコシ）の植物を意味する。
【００４６】
発現：  本明細書で用いているように、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子または導入遺伝子）の「発現」は、しばしばタンパク質の合成を含む、核酸転写単位のコード化情報（例えば、ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ）が細胞の作動、非作動または構造部分に変換されるプロセスを意味する。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加または減少させる作用因子への細胞、組織または生物体の曝露による影響を受け得る。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡを経てタンパク質までの経路のどこかで調節することもできる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解に作用するコントロールにより、またはそれらが行われた後に特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、画分化、もしくは分解により、またはそれらの組合せにより起こる。遺伝子発現は、制限なく、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕもしくはｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む、当技術分野で公知のいずれかの方法によりＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。
【００４７】
遺伝物質：  本明細書で用いているように、「遺伝物質」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の、すべての遺伝子および核酸分子を含む。
【００４８】
半翅目害虫：  本明細書で用いているように、「半翅目害虫」という用語は、広範囲の宿主植物を常食とし、刺して、吸う口器を有する、カメムシ科（Pentatomidae）、メクラカメムシ科（Miridae）、ホシカメムシ科（Pyrrhocoridae）、ヘリカメムシ科（Coreidae）、クモヘリカメムシ科（Alydidae）およびロパルス科（Rhopalidae）の昆虫を含むがこれに限定されない、半翅目（Hemiptera）の昆虫を意味する。特定の例において、半翅目害虫は、エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）（Ｆａｂｒ．）（ネオトロピカルブラウンスティンクバグ）、ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）（Ｌ．）（ミナミアオカメムシ）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）（ウェストウッド）（レッドバンディッドスティンクバグ）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）（Ｓｔａｌ）（クサギカメムシ）、チナビア・ヒラレ（Chinavia hilare）（セイ）（グリーンスティンクバグ）；エウスキツツス・セルブス（Euschistus servus）（セイ）（ブラウンスティンクバグ）、ディケロプス・メラカンツス（Dichelops melacanthus）（ダラス）、ディケロプス・フルカツス（Dichelops furcatus）（Ｆ．）；エデッサ・メジタブンダ（Edessa meditabunda）（Ｆ．）、チアンタ・ペルジトル（Thyanta perditor）（Ｆ．）（ネオトロピカルレッドショルダードスティンクバグ）、チナビア・マルギナツム（Chinavia marginatum）（パリソ・ド・ボーヴォワ）、ホルシアス・ノビレルス（Horcias nobilellus）（ベルク）（コットンバグ）、テディア・スチグモサ（Taedia stigmosa）（ベルク）；ホシカメムシ（Dysdercus peruvianus）（Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）；ネオメガロトムス・パルブス（Neomegalotomus parvus）（ウェストウッド）；レプトグロスス・ゾナツス（Leptoglossus zonatus）（ダラス）、ニエストレア・シダエ（Niesthrea sidae）（Ｆ．）、カスミカメムシ（Lygus hesperus）（ナイト）（ウェスタンターニッシュドプラントバグ）およびサビイロメクラガメ（Lygus lineolaris）（パリソ・ド・ボーヴォワ）を含むリストから選択される。
【００４９】
阻害：  本明細書で用いているように、「阻害」という用語は、コードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）に対する効果を記述するために用いる場合、コードポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡおよび／またはコードポリヌクレオチドのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質産物の細胞レベルの測定可能な低下を意味する。いくつかの例において、コードポリヌクレオチドの発現は、発現がほぼ無くなるように阻害することができる。「特異的阻害」は、特異的阻害が達成される細胞中の他のコードポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）の発現に後に影響を及ぼすことのない標的コードポリヌクレオチドの阻害を意味する。
【００５０】
昆虫：  害虫について本明細書で用いているように、「害虫」という用語は、具体的に鞘翅目害虫および半翅目害虫を含む。いくつかの実施形態では、該用語は、いくつかの他の害虫も含む。
【００５１】
単離された：  「単離（された）」生物学的構成成分（核酸またはタンパク質等）は、構成成分の化学的または機能的変化がもたらされるのと同時に、構成成分が天然に存在する生物体の細胞中の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離された、とは別に産生された、またはから精製された（例えば、核酸は、核酸を染色体における残りのＤＮＡに連結している化学結合を切断することによって染色体から単離することができる）。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準精製方法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。該用語は、宿主細胞中で組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドも含む。
【００５２】
核酸分子：  本明細書で用いているように、「核酸分子」という用語は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方を含み得る、ヌクレオチドの重合体、ならびに合成体および上記のものの混合重合体を意味し得る。ヌクレオチドまたは核酸塩基は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、いずれかの型のヌクレオチドの修飾体を意味し得る。「核酸分子」は、本明細書で用いているように、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義語である。核酸分子は、特に示さない限り、通常、長さが少なくとも１０塩基である。慣例により、核酸分子のヌクレオチド配列は、分子の５’末端から３’末端の方向に読み取られる。核酸分子の「相補体」は、核酸分子の核酸塩基と塩基対（すなわち、Ａ−Ｔ／ＵおよびＧ−Ｃ）を形成し得る核酸塩基を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００５３】
いくつかの実施形態は、ｍＲＮＡ分子の相補体であるＲＮＡ分子に転写される鋳型ＤＮＡを含む核酸を含む。これらの実施形態では、ｍＲＮＡ分子に転写される核酸の相補体は、ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを５’→３’方向に転写する）がｍＲＮＡ分子とハイブリダイズし得る相補体からの核酸を転写するように、５’→３’の配向で存在する。別途明確に述べない限り、または文脈から他の状態であることが明白でない限り、「相補体」という用語は、したがって、５’から３’まで、参照核酸の核酸塩基と塩基対を形成し得る核酸塩基を有するポリヌクレオチドを意味する。同様に、明示的に別の定めをした場合を除いて（または文脈から他の状態であることが明らかである場合を除いて）、核酸の「逆相補体」は、逆の配向の相補体を意味する。前述のことを以下の実例で示す。
５’ＡＴＧＡＴＧＡＴＧ  ３’ポリヌクレオチド
５’ＴＡＣＴＡＣＴＡＣ  ３’ポリヌクレオチドの「相補体」
５’ＣＡＴＣＡＴＣＡＴ  ３’ポリヌクレオチドの「逆相補体」
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態は、ヘアピンＲＮＡ形成ｉＲＮＡ分子を含む。これらのｉＲＮＡでは、以下の説明図に示すように、一本鎖ＲＮＡ分子が相補的および逆相補的ポリヌクレオチドを含む領域にわたって「折り重なり」、それ自体とハイブリダイズし得るように、ＲＮＡ干渉により標的とされる核酸の相補体および逆相補体の両方を同じ分子に見いだすことができる。
５’ＡＵＧＡＵＧＡＵＧ−リンカーポリヌクレオチド−ＣＡＵＣＡＵＣＡＵ  ３’、これがハイブリダイズして、以下を形成する。
【００５５】
【化３】
2017530712.tif 000005
【００５６】
「核酸分子」は、すべてのポリヌクレオチド、例えば、一本および二本鎖型のＤＮＡ；一本鎖型のＲＮＡ；ならびに二本鎖型のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、個々の一本鎖としての、または二重らせんにおける核酸のセンスおよびアンチセンス鎖の両方を意味する。「リボ核酸」（ＲＮＡ）という用語は、ｉＲＮＡ（阻害ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）、ｈｐＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ、対応するアシル化アミノ鎖を負荷されているか、または負荷されていないかを問わず）およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を含む。「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）という用語は、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。「ポリヌクレオチド」、「核酸」、その「セグメント」およびその「断片」という用語は、例えば、ｇＤＮＡ；リボソームＲＮＡ；転移ＲＮＡ；ＲＮＡ；メッセンジャーＲＮＡ；オペロン；ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするまたはコードするように適合させることができる工学的に操作したより小さいポリヌクレオチド；ならびにそれらの対応するヌクレオチド配列により示される核酸分子内の構造および／または機能要素を含むと当業者により理解される。
【００５７】
オリゴヌクレオチド：  オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントの切断により、または個々のヌクレオチド前駆体を重合させることにより、形成させることができる。自動合成器により、長さが数百塩基までのオリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは、相補的核酸に結合し得るので、それらは、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして用いることができる。ＤＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤＮＡへの逆転写）配列の増幅のための技術である、ＰＣＲに用いることができる。ＰＣＲにおいて、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を複製することを可能にする、「プライマー」と一般的に呼ばれる。
【００５８】
核酸分子は、天然および／または非天然ヌクレオチド結合により結合した天然および修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。核酸分子は、当業者により容易に理解されるように、化学的もしくは生化学的に修飾することができ、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。そのような修飾は、例えば、標識、メチル化、類似体による１つまたは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等；荷電結合：例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等；ペンダント部分：例えば、ペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソレラン等；キレート剤；アルキル化剤；修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸等）を含む。「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分二重らせん、三重らせん、ヘアピン、環状およびパドロック型立体配座を含む、任意の位相幾何学的立体配座も含む。
【００５９】
本明細書で用いているように、ＤＮＡに関しては、「コード配列」、「構造ヌクレオチド配列」または「構造核酸分子」という用語は、適切な調節配列の制御下におかれた場合、転写およびｍＲＮＡにより、ポリペプチドに最終的に翻訳されるヌクレオチド配列を意味する。ＲＮＡに関しては、「コード配列」という用語は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、５’末端における翻訳開始コドンおよび３’末端における翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ＥＳＴ；および組換えヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
ゲノム：  本明細書で用いているように、「ゲノム」という用語は、細胞の核内に見いだされる染色体ＤＮＡを意味し、細胞の細胞分画物内に見いだされるオルガネラＤＮＡも意味する。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子が植物細胞のゲノムに組み込まれるように、ＤＮＡ分子を植物細胞に導入することができる。これらおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、植物細胞の核ＤＮＡに組み込むか、または植物細胞の葉緑体もしくはミトコンドリアのＤＮＡに組み込むことができる。「ゲノム」という用語は、細菌に適用するとき、細菌細胞内の染色体およびプラスミドの両方を意味する。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子が細菌のゲノムに組み込まれるように、ＤＮＡ分子を細菌に導入することができる。これらおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、染色体に組み込むか、または安定プラスミドとしてもしくはそれに位置することができる。
【００６１】
配列同一性：  「配列同一性」または「同一性」という用語は、本明細書で用いているように、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において、規定の比較ウインドウにわたり最大の一致を得るようにアライメントした場合に同じである２つの配列における残基を意味する。
【００６２】
本明細書で用いているように、「配列同一性の百分率」という用語は、２つの最適にアライメントされた配列（例えば、核酸配列またはポリペプチド配列）を比較ウインドウにわたり比較することにより決定される値を意味し、比較ウインドウにおける配列の一部は、２つの配列の最適のアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を測定して、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって計算する。参照配列と比較してすべての位置で同一である配列は、参照配列と１００％同一であると言われ、またその逆も同じである。
【００６３】
比較のために配列をアライメントする方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-165; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250に記載されている。配列のアラインメントの方法および相同性の計算の詳細な考察は、例えばAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410において見いだすことができる。
【００６４】
米国国立生物技術情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990)）が、いくつかの配列解析プログラムに関連して使用するために、米国国立生物技術情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの情報源およびインターネット上で利用できる。このプログラムを用いて配列同一性をどのようにして決定するかの説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」セクションのもとにインターネット上で入手できる。核酸配列の比較のために、デフォルトパラメーターに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いてＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ  ２配列」関数（function）を用いることができる。参照配列とのより大きい類似性を有する核酸配列は、この方法により評価する場合、同一性の百分率の増加を示す。
【００６５】
特異的にハイブリダイズ可能な／特異的に相補的な：  本明細書で用いているように、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」という用語は、安定かつ特異的な結合が核酸分子と標的核酸分子との間で起こるように十分な程度の相補性を示す用語である。２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションは、２つの核酸分子の核酸配列間の逆平行アライメントの形成を伴う。２つの分子は、そのとき逆鎖上の対応する塩基との水素結合を形成して、それが十分に安定である場合、当技術分野で周知の方法を用いて検出できる二重らせん分子を形成することができる。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるにはその標的配列と１００％相補的である必要はない。しかし、ハイブリダイゼーションが特異的であるために存在しなければならない配列相補性の量は、用いるハイブリダイゼーション条件の関数である。
【００６６】
特定の厳密度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、最適なハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さによって異なる。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションのイオン強度（とりわけＮａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）は、ハイブリダイゼーションの厳密性を決定する。洗浄緩衝液のイオン強度および洗浄温度も厳密性に影響を及ぼす。特定の厳密度を達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapter 9 and 11, and updatesおよびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に述べられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および指針は、例えば、Tijssen, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993;およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995, and updatesに見いだすことができる。
【００６７】
本明細書で用いているように、「厳密条件」は、ハイブリダイゼーション分子間に８０％を超える配列マッチおよび標的核酸分子内に相同配列が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を含む。「厳密条件」は、厳密性のさらなる特定のレベルを含む。したがって、本明細書で用いているように、「中厳密性」条件は、８０％を超える配列マッチを有する（すなわち、２０％未満のミスマッチを有する）分子がハイブリダイズする条件であり、「高厳密性」の条件は、９０％を超えるマッチを有する（すなわち、１０％未満のミスマッチを有する）配列がハイブリダイズする条件であり、「超高厳密性」の条件は、９５％を超えるマッチを有する（すなわち、５％未満のミスマッチを有する）配列がハイブリダイズする条件である。
【００６８】
以下は、代表的で、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。
高厳密条件（少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：  ５ｘ  ＳＳＣ緩衝液中での６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温でそれぞれ１５分間２回洗浄する；および０．５ｘ  ＳＳＣ緩衝液で６５℃でそれぞれ２０分間２回洗浄する。
中厳密条件（少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：  ５ｘ〜６ｘＳＳＣ緩衝液中での６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温でそれぞれ５〜２０分間２回洗浄する；および１ｘ  ＳＳＣ緩衝液で５５〜７０℃でそれぞれ３０分間２回洗浄する。
非厳密対照条件（少なくとも５０％の配列同一性を共有する配列がハイブリダイズする）：  ６ｘ  ＳＳＣ緩衝液中での室温〜５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２ｘ〜３ｘ  ＳＳＣ緩衝液で室温〜５５℃でそれぞれ２０〜３０分間少なくとも２回洗浄する。
【００６９】
本明細書で用いているように、核酸に関する「実質的に相同」または「実質的相同性」という用語は、参照核酸と厳密条件下でハイブリダイズする連続した核酸塩基を有すポリヌクレオチドを意味する。例えば、配列番号１および／または配列番号７１の参照核酸配列と実質的に相同である核酸は、配列番号１および／または配列番号７１の参照核酸配列と厳密条件（例えば、上に示した中厳密条件）のもとでハイブリダイズする核酸である。実質的に相同であるポリヌクレオチドは、少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。例えば、実質的に相同であるポリヌクレオチドは、７９％、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％および約１００％等の、約８０％〜１００％の配列同一性を有し得る。実質的相同性の特性は、特異的ハイブリダイゼーションに密接に関連している。例えば、特異的結合が望まれる条件下、例えば、厳密ハイブリダイゼーション条件下で非標的ポリヌクレオチドに対する核酸の特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在する場合に、核酸分子は、特異的にハイブリダイズする。
【００７０】
本明細書で用いているように、「オルソログ」という用語は、共通の祖先の核酸から発生し、２つ以上の種において共通の機能を保持し得る２つ以上の種における遺伝子を意味する。
【００７１】
本明細書で用いているように、５’→３’方向に読み取られたポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが３’→５’方向に読み取られた場合の他のポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチドと相補的である場合、２つの核酸分子は、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの逆相補体と配列同一性を示す。これらの用語および記述は、当技術分野で十分に定義されており、当業者に容易に理解される。
【００７２】
作動可能に連結した：第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドと機能的関係にある場合、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結している。組換えよって産生させる場合、作動可能に連結したポリヌクレオチドは、一般的に連続しており、２つのコード領域を連結するために必要な場合、同じ読取枠に（例えば、翻訳段階で融合されるＯＲＦで）ある。しかし、核酸は、作動可能に連結されるのに連続している必要はない。
【００７３】
「作動可能に連結した」という用語は、調節遺伝エレメントおよびコードポリヌクレオチドに関連して用いる場合、調節エレメントが連結されたコードポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節エレメント」または「制御エレメント」は、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コードポリヌクレオチドの翻訳に影響を及ぼすポリヌクレオチドを意味する。調節エレメントは、プロモーター；翻訳リーダー；イントロン；エンハンサー；ステム−ループ構造；レプレッサー結合ポリヌクレオチド；終結配列を有するポリヌクレオチド；ポリアデニル化認識配列を有するポリヌクレオチド等を含み得る。特定の調節エレメントは、それと作動可能に連結したコードポリヌクレオチドの上流および／または下流に位置し得る。また、コードポリヌクレオチドと作動可能に連結した特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連相補鎖上に位置し得る。
【００７４】
プロモーター：  本明細書で用いているように、「プロモーター」という用語は、転写の開始の上流にあり、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与し得るＤＮＡの領域を意味する。プロモーターは、細胞中の発現のためにコードポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる、あるいはプロモーターは、細胞中の発現のためにコードポリヌクレオチドに作動可能に連結することができるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる。「植物プロモーター」は、植物細胞中の転写を開始することができるプロモーターであり得る。発育制御下のプロモーターの例としては、葉、根、種子、繊維、木質導管、仮導管または厚膜組織等の特定の組織における転写を優先的に開始するプロモーター等がある。そのようなプロモーターは、「組織優先的」と呼ばれる。特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型特異的」プロモーターは、１つまたは複数の器官における特定の細胞型、例えば、根または葉における維管束細胞における発現を主として推進する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあり得るプロモーターであり得る。誘導性プロモーターにより転写を開始させ得る環境条件の例としては、嫌気性条件および光の存在等がある。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的および誘導性プロモーターは、「非構成性」プロモーターのクラスを構成する。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境条件下またはほとんどの組織もしくは細胞型で活性であり得るプロモーターである。
【００７５】
任意の誘導性プロモーターを本発明のいくつかの実施形態で用いることができる。Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366を参照のこと。誘導性プロモーターにより、転写の速度は、誘導剤に応答して増大する。例示的な誘導性プロモーターは、銅に応答するＡＣＥＩシステムに由来するプロモーター；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシに由来するＩｎ２遺伝子；Ｔｎ１０のＴｅｔレプレッサー；およびその転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導され得る（Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421）、ステロイドホルモン遺伝子に由来する誘導性プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００７６】
例示的な構成性プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター等の、植物ウイルスに由来するプロモーター；イネアクチン遺伝子に由来するプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；およびＡＬＳプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５‘側のＸｂａｌ／ＮｃｏＩ断片（または前記Ｘｂａｌ／ＮｃｏＩ断片と類似のポリヌクレオチド）（国際ＰＣＴ公開国際公開第９６／３０５３０号パンフレット）を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
さらに、あらゆる組織特異的または組織優先的プロモーターは、本発明のいくつかの実施形態で用いることができる。組織特異的プロモーターに作動可能に連結したコードポリヌクレオチドを含む核酸分子を用いて形質転換した植物は、特定の組織において、もっぱら、または優先的にコードポリヌクレオチドの産物を産生し得る。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターは、インゲンマメ属に由来するもの等の、種子優先的プロモーター；キャブまたはルビスコに由来するもの等の葉特異的および光誘導性プロモーター；ＬＡＴ５２に由来するもの等の葯特異的プロモーター；Ｚｍ１３に由来するもの等の花粉特異的プロモーター；およびａｐｇに由来するもの等の小胞子優先的プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００７８】
ダイズ植物：  本明細書で用いているように、「ダイズ植物」という用語は、ダイズ（例えば、Ｇ．マクス（G. max））グリシン属種（Glycine sp.）の植物を意味する。
【００７９】
形質転換：  本明細書で用いているように、「形質転換」または「形質導入」という用語は、細胞への１つまたは複数の核酸分子（複数可）の移入を意味する。核酸分子の細胞ゲノムへの取込みにより、またはエピソーム複製により、核酸分子が細胞により安定に複製されるようになる場合、細胞は、細胞に形質導入された核酸分子によって「形質転換」される。本明細書で用いているように、「形質転換」という用語は、核酸分子をそのような細胞に導入することができるすべての技術を含む。例は、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）；リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）；マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）；直接ＤＮＡ取込み；および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
導入遺伝子：  外因性核酸。いくつかの例において、導入遺伝子は、鞘翅目および／または半翅目害虫に見いだされる核酸分子と相補的であるポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡの１つまたは両方の鎖（複数可）をコードするＤＮＡであり得る。さらなる例において、導入遺伝子は、遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子、産業的または薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業的形質をコードする遺伝子）であり得る。これらおよび他の例において、導入遺伝子は、導入遺伝子のコードポリヌクレオチド（例えば、プロモーター）と作動可能に連結した調節エレメントを含み得る。
【００８１】
ベクター：  例えば、形質転換細胞を生産するために細胞に導入する核酸分子。ベクターは、複製起点等の、宿主細胞中で複製することを可能にする遺伝エレメントを含み得る。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、または外因性ＤＮＡを細胞内に運ぶウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターは、アンチセンス分子、ならびに／または選択可能マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝エレメントを生産するものを含む、１つまたは複数の遺伝子も含み得る。ベクターは、細胞を形質導入、形質転換または感染させ、それにより、ベクターによりコードされる核酸分子および／またはタンパク質を細胞に発現させる。ベクターは、細胞への核酸分子の侵入を達成することを促進する物質を場合によって含む（例えば、リポソーム、タンパク質コーティング等）。
【００８２】
収量：  同時に同じ条件下で成長する同じ成長場所における基準品種の収量と比べて約１００％またはそれ以上の安定化収量。特定の実施形態では、「収量向上」または「収量の向上」は、栽培品種が、同時に同じ条件下で成長する当作物に害であり、本明細書における組成物および方法により標的にされる、著しい密度の鞘翅目および／または半翅目害虫を含む同じ成長場所における基準品種の収量と比べて１０５％またはそれ以上の安定化収量を有することを意味する。
【００８３】
特に示さないまたは黙示しない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、本明細書で用いているように、「少なくとも１つ」を意味する。
【００８４】
特に説明しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学における一般用語の定義は、例えば、Lewin’s Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。特に示さない限り、すべての百分率は、重量によるものであり、すべての溶媒の混合割合は、容積によるものである。すべての温度は、摂氏温度である。
【００８５】
ＩＶ．害虫ポリヌクレオチドを含む核酸分子
Ａ．概要
本明細書で述べるのは、害虫の防除に有用な核酸分子である。いくつかの例において、害虫は、鞘翅目または半翅目害虫である。述べる核酸分子は、標的ポリヌクレオチド（例えば、天然遺伝子および非コードポリヌクレオチド）、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｈｐＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む。例えば、鞘翅目および／または半翅目害虫における１つまたは複数の天然核酸のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であり得るｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子をいくつかの実施形態で述べる。これらおよびさらなる実施形態では、天然核酸（複数可）は、１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）であり得、その産物は、例えばかつ制限なく、幼虫／若虫の発育に関与し得る。本明細書で述べる核酸分子は、核酸分子が特異的に相補的である少なくとも１つの天然核酸（複数可）を含む細胞に導入した場合、細胞中でＲＮＡｉを開始し、結果として天然核酸（複数可）の発現を低減または排除し得る。いくつかの例において、それに対して特異的に相補的である核酸分子による標的遺伝子の発現の低減または排除は、害虫の成長、発育および／または摂食の低減または停止をもたらし得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、害虫における少なくとも１つの標的遺伝子を選択することができ、該標的遺伝子は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１または配列番号７１）を含む。特定の例において、鞘翅目および／または半翅目害虫における標的遺伝子が選択され、該標的遺伝子は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１または配列番号７１）を含む新たなヌクレオチド配列を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１または配列番号７１）のタンパク質産物のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一（例えば、少なくとも８４％、８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％または１００％同一）である連続したアミノ酸配列を含むポリペプチドにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで翻訳することができるポリヌクレオチドを含む核酸分子であり得る。標的遺伝子は、任意の害虫における核酸であり得、その転写後阻害は、例えば、害虫に対する保護効果を植物にもたらすための、害虫の成長および／または生存に対する有害効果を有する。特定の例において、標的遺伝子は、新たなヌクレオチド配列である配列番号１または配列番号７１のタンパク質産物のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９６％同一、約９７％同一、約９８％同一、約９９％同一、約１００％同一または１００％同一である連続したアミノ酸配列を含むポリペプチドにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで逆翻訳することができるポリヌクレオチドを含む核酸分子である。
【００８８】
いくつかの実施形態で提供するのは、その発現が、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）におけるコードポリヌクレオチドによりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部と特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子をもたらす、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、害虫による発現ＲＮＡ分子の摂取後に、害虫の細胞中のコードポリヌクレオチドの下方制御を得ることができる。特定の実施形態では、害虫の細胞中のコード配列の下方制御は、害虫の成長、発育および／または生存に対する有害効果をもたらし得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、標的害虫遺伝子の５’ＵＴＲ；３’ＵＴＲ；スプライスリーダー；イントロン；アウトロン（例えば、トランススプライシングでその後修飾される５’ＵＴＲ  ＲＮＡ）；ドナトロン（トランススプライシングのためのドナー配列を提供するのに必要な非コードＲＮＡ）等の転写非コードＲＮＡおよび他の非コード転写ＲＮＡを含む。そのようなポリヌクレオチドは、モノシストロン性およびポリシストロン性遺伝子の両方に由来し得る。
【００９０】
したがって、いくつかの実施形態に関連して害虫（鞘翅目および／または半翅目）における標的配列のすべてまたは一部に対して特異的に相補的である少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）についても本明細書で述べる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、複数の標的核酸、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の標的核酸のすべてまたは一部と相補的であるポリヌクレオチド（複数可）を含み得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、植物または細菌等の遺伝子組換え生物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで産生され得る。害虫における標的核酸のすべてまたは一部に対して特異的に相補的であるｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子および／またはｈｐＲＮＡ分子の産生に用いることができるｃＤＮＡも開示する。特定の宿主標的の安定な形質転換を達成するのに用いる組換えＤＮＡ構築物をさらに述べる。形質転換宿主標的は、組換えＤＮＡ構築物から有効レベルのｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｈｐＲＮＡ分子を発現し得る。したがって、植物細胞中で機能し得る異種プロモーターに作動可能に連結した、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベクターについても述べるものであり、該ポリヌクレオチド（複数可）の発現により、害虫における標的核酸のすべてまたは一部に特異的に相補的である連続した核酸塩基の連なりを含むＲＮＡ分子が結果として生じる。
【００９１】
特定の例において、害虫（鞘翅目および／または半翅目）の防除に有用な核酸分子は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１または配列番号７１）を含むジアブロティカ属（Diabrotica）または半翅目生物から単離された天然核酸のすべてもしくは一部；発現したとき、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１または配列番号７１）によりコードされる天然ＲＮＡ分子のすべてもしくは一部と特異的に相補的であるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子をもたらすヌクレオチド配列；ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１または配列番号７１）のすべてまたは一部と特異的に相補的である少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）；ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１または配列番号７１）のすべてもしくは一部と特異的に相補的であるｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子および／またはｈｐＲＮＡ分子の産生に用いることができるｃＤＮＡ配列；ならびに形質転換宿主標的が１つまたは複数の前述の核酸分子を含む、特定の宿主標的の安定な形質転換を達成するのに用いる組換えＤＮＡ構築物を含み得る。
【００９２】
Ｂ．核酸分子
本発明は、とりわけ、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子；ならびに害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子発現を阻害するために細胞もしくは微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができるＤＮＡ分子を提供する。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１または配列番号７１のいずれか；配列番号１または配列番号７１のいずれかの相補体；配列番号１または配列番号７１のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１または配列番号７１のいずれかの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コードポリヌクレオチド；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の相補体；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；および配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のポリヌクレオチド（複数可）を含む単離核酸分子を提供する。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドの鞘翅目および／または半翅目害虫との接触またはそれらによる取込みは、害虫の成長、発育および／または摂食を阻害する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、鞘翅目および／または半翅目害虫の細胞、組織または器官における標的遺伝子発現を阻害するように細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができる少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のＤＮＡ（複数可）を含み得る。そのようなＤＮＡ（複数可）は、ｄｓＲＮＡ分子（複数可）を形成することができるコード化ＲＮＡの転写を開始または増大させるようにＤＮＡ分子を含む細胞中で機能するプロモーターに作動可能に連結させることができる。一実施形態では、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたはそれ以上）のＤＮＡ（複数可）は、配列番号１または配列番号７１から選択されるポリヌクレオチドに由来し得る。配列番号１または配列番号７１の誘導体は、配列番号１または配列番号７１の断片を含む。いくつかの実施形態では、そのような断片は、例えば、配列番号１もしくは配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドまたはその相補体を含む。したがって、そのような断片は、例えば、配列番号１もしくは配列番号７１の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０．２００個もしくはそれ以上の連続したヌクレオチドまたはその相補体を含み得る。いくつかの例において、そのような断片は、例えば、配列番号１もしくは配列番号７１の少なくとも１９個の連続したヌクレオチドまたはその相補体を含み得る。したがって、配列番号１または配列番号７１の断片は、配列番号１もしくは配列番号７１の例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、約２５個（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９個）、約３０個、約４０個（例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４および４５個）、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個もしくはそれ以上の連続したヌクレオチドまたはその相補体を含み得る。
【００９５】
いくつかの実施形態は、鞘翅目および／または半翅目害虫の細胞、組織または器官における標的遺伝子の発現を阻害するために部分的または完全に安定化されたｄｓＲＮＡ分子を鞘翅目および／または半翅目害虫に導入することを含む。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）として発現させ、鞘翅目および／または半翅目害虫により取り込ませた場合、配列番号１または配列番号７１およびその相補体のいずれかの１つまたは複数の断片を含むポリヌクレオチドは、死、発育停止、成長阻害、性比の変化、一腹子数の減少、鞘翅目および／または半翅目害虫による感染の停止および／または摂食の停止の１つまたは複数をもたらし得る。例えば、いくつかの実施形態では、鞘翅目および／または半翅目害虫の標的遺伝子配列と実質的に相同であり、配列番号１または配列番号７１を含むヌクレオチド配列の１つまたは複数の断片を含む約１５〜約３００個または約１９〜約３００個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含むｄｓＲＮＡ分子を提供する。そのようなｄｓＲＮＡ分子の発現は、例えばｄｓＲＮＡ分子を取り込む鞘翅目および／または半翅目害虫における死および／または成長阻害をもたらす。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明により提供されるｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１もしくは配列番号７１および／または配列番号１もしくは配列番号７１の断片と相補的なヌクレオチド配列を含む標的遺伝子からの転写物と相補的なポリヌクレオチドを含み、害虫におけるその標的遺伝子の阻害は、害虫の成長、発育または他の生物学的機能に必須であるポリペプチドまたはポリヌクレオチド作用物質（agent）の低減または除去をもたらす。選択されるポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号７１、配列番号１または配列番号７１に示すヌクレオチド配列の連続した断片、あるいは前述のもののいずれかの相補体のいずれかと約８０％〜約１００％の配列同一性を示し得る。例えば、選択されるポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号７１、配列番号１または配列番号７１に示すヌクレオチド配列の連続した断片、あるいは前述のもののいずれかの相補体と７９％、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、または約１００％の配列同一性を示し得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現を阻害するように細胞または微生物においてｉＲＮＡ分子として発現することができるＤＮＡ分子は、１つまたは複数の標的害虫種（例えば、鞘翅目または半翅目害虫種）に見いだされる天然ポリヌクレオチドのすべてまたは一部に特異的に相補的である単一ポリヌクレオチドを含み得る。あるいは該ＤＮＡ分子は、複数のそのような特異的に相補的ポリヌクレオチドからキメラとして構築することができる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、「スペーサー」により分離された第１および第２のポリヌクレオチドを含み得る。スペーサーは、これが望ましい場合、第１および第２のポリヌクレオチドの間の二次構造の形成を促進するヌクレオチドの任意の配列を含む領域であり得る。一実施形態では、スペーサーは、ｍＲＮＡのセンスまたはアンチセンスコードポリヌクレオチドの一部である。スペーサーは、代わりになるべきものとして、核酸分子と共有結合することができるヌクレオチドまたはそのホモログの任意の組合せを含み得る。いくつかの例において、スペーサーは、イントロン（例えば、ＳＴ−ＬＳＩイントロンまたはＲＴＭ１イントロン）であり得る。
【００９９】
例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子は、異なるｉＲＮＡ分子のそれぞれが第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含み、第１および第２のポリヌクレオチドが互いに相補的である、１つまたは複数の異なるｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含み得る。第１および第２のポリヌクレオチド配列は、スペーサー配列によりＲＮＡ分子内でつなぐことができる。スペーサーは、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドの一部を構成し得る。第１および第２のポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子の発現は、第１および第２のポリヌクレオチドの特異的分子内塩基対合による、ｄｓＲＮＡ分子の形成につながり得る。第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドは、害虫（鞘翅目および／または半翅目害虫）の生得のポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または転写非コードポリヌクレオチド）、その誘導体、またはそれと相補的なポリヌクレオチドと実質的に同一であり得る。
【０１００】
ｄｓＲＮＡ核酸分子は、重合リボヌクレオチドの二本鎖を含み、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドの修飾を含み得る。ＲＮＡ構造の修飾は、特異的阻害を可能にするように調整することができる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を生成することができるように、ｄｓＲＮＡ分子をユビキタス酵素法により修飾することができる。この酵素法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、真核生物におけるＤＩＣＥＲ等のＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素を利用し得る。Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8;およびHamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2を参照のこと。ＤＩＣＥＲまたは機能的に同等のＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素は、より大きいｄｓＲＮＡ鎖および／またはｈｐＲＮＡ分子を、それぞれが長さが約１９〜２５ヌクレオチドである、より小さいオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）に切断する。これらの酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、２〜３ヌクレオチドの３’突出ならびに５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を有する。ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素から生成されたｓｉＲＮＡ分子は、細胞中の一本鎖ＲＮＡに巻き戻され、分離される。ｓｉＲＮＡ分子は、次に標的遺伝子から転写されたＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、両ＲＮＡ分子は、その後、固有の細胞ＲＮＡ分解メカニズムにより分解される。このプロセスは、標的生物における標的遺伝子によりコードされるＲＮＡの効果的な分解または除去をもたらし得る。その結果は、標的遺伝子の転写後サイレンシングである。いくつかの実施形態では、異種核酸分子から内因性ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素により生成されたｓｉＲＮＡ分子は、鞘翅目および／または半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御を効果的に媒介し得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、分子間ハイブリダイゼーションによりｉｎ  ｖｉｖｏでｄｓＲＮＡ分子を形成することができる一本鎖ＲＮＡ分子に転写され得る少なくとも１種の非天然ポリヌクレオチドを含み得る。そのようなｄｓＲＮＡは、一般的に自己集合性であり、標的遺伝子の転写後阻害を達成するために害虫（例えば、鞘翅目または半翅目）の栄養源に供給することができる。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子は、それぞれが害虫における異なる標的遺伝子と特異的に相補的である、２種の非天然ポリヌクレオチドを含み得る。そのような核酸分子をｄｓＲＮＡ分子として、例えば、鞘翅目および／または半翅目害虫に供給する場合、ｄｓＲＮＡ分子は、害虫における少なくとも２種の異なる標的遺伝子の発現を阻害する。
【０１０２】
Ｃ．核酸分子を得ること
害虫（鞘翅目および半翅目）における様々なポリヌクレオチドは、ｉＲＮＡおよびｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子等の、核酸分子の設計のための標的として用いることができる。しかし、天然ポリヌクレオチドの選択は、簡単なプロセスではない。例えば、鞘翅目または半翅目害虫における少数の天然ポリヌクレオチドのみが有効な標的となる。特定の天然ポリヌクレオチドを本発明の核酸分子により効果的に下方制御することができるかどうか、あるいは特定の天然ポリヌクレオチドの下方制御が害虫の成長、発育および／または生存に対して有害効果を有するかどうかを確実に予測することはできない。それらから単離されたＥＳＴ等の、天然鞘翅目および半翅目害虫ポリヌクレオチドの圧倒的大多数（例えば、米国特許第７，６１２，１９４号明細書に示されている鞘翅目害虫ポリヌクレオチド）は、害虫の成長、発育および／または生存に対する有害効果を有さない。害虫に対する有害作用を有し得る天然ポリヌクレオチドのどれを、宿主植物におけるそのような天然ポリヌクレオチドに対して相補的な核酸分子を発現させ、宿主植物に害をもたらすことなく、摂食により害虫に有害効果をもたらすための組換え技術に用いることができるかも予測できない。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、核酸分子（例えば、害虫（鞘翅目または半翅目）の宿主植物に供給すべきｄｓＲＮＡ分子）は、代謝または異化生化学的経路、細胞分裂、エネルギー代謝、消化、宿主植物認識等に関与するポリペプチド等の、害虫の発育に必須のタンパク質またはタンパク質の一部をコードするｃＤＮＡを標的とするように選択される。本明細書で述べたように、その少なくとも１つのセグメントが標的害虫生物の細胞中で産生されるＲＮＡの少なくとも実質的に同一のセグメントに特異的に相補的である１つまたは複数のｄｓＲＮＡを含む、標的害虫生物による組成物の摂取は、標的の死または他の阻害をもたらし得る。害虫に由来する、ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、害虫による外寄生に抵抗性の植物細胞を構築するために用いることができる。鞘翅目および／または半翅目害虫の宿主植物（例えば、Ｚ．マイス（Z. mays）またはＧ．マクス（G. max））は、例えば、本明細書に提供する鞘翅目および／または半翅目害虫に由来する１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むように形質転換を起こさせることができる。宿主に形質転換を起こさせたポリヌクレオチドは、形質転換宿主内の細胞または生体液中でｄｓＲＮＡ配列を形成する１つまたは複数のＲＮＡをコードし、ひいては害虫がトランスジェニック植物との栄養関係を結ぶ場合／時にｄｓＲＮＡを利用できるようにし得る。これは、害虫の細胞中の１つまたは複数の遺伝子の発現の抑制、ならびに最終的に死またはその成長もしくは発育の阻害をもたらし得る。
【０１０４】
したがって、いくつかの実施形態では、害虫（例えば、鞘翅目または半翅目）の成長および発育に本質的に関与する遺伝子を標的とする。本発明に用いる他の標的遺伝子は、例えば、害虫の運動、移動、成長、発育、感染能および餌場の確定に重要な役割を果たすものを含み得る。したがって、標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子または転写因子であり得る。さらに、本発明に用いる天然害虫ポリヌクレオチドは、その機能が当業者に公知であり、そのポリヌクレオチドが標的害虫のゲノムにおける標的遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能である、植物、ウイルス、細菌または昆虫遺伝子のホモログ（例えば、オルソログ）から得ることもできる。ハイブリダイゼーションにより既知のヌクレオチド配列を有する遺伝子のホモログを同定する方法は、当業者に公知である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子を生成するためのポリヌクレオチドを含む核酸分子を得る方法を提供する。１つのそのような実施形態は、（ａ）害虫（例えば、鞘翅目または半翅目）におけるｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制時に１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）をそれらの発現、機能および表現型について解析するステップと、（ｂ）ｄｓＲＮＡ媒介抑制解析で成長または発育表現型の変化（例えば、低下）を示す標的害虫のポリヌクレオチドまたはそのホモログのすべてもしくは一部を含むプローブによりｃＤＮＡまたはｇＤＮＡライブラリーを探査するステップと、（ｃ）プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定するステップと、（ｄ）ステップ（ｂ）で同定されたＤＮＡクローンを単離するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）で単離されたクローンを含むｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片の配列を決定するステップであって、配列決定された核酸分子がＲＮＡまたはそのホモログのすべてもしくは実質的な部分を含んでいるステップと、（ｆ）遺伝子、またはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのすべてもしくは実質的な部分を化学的に合成するステップとを含む。
【０１０６】
さらなる実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子の実質的な部分を生成するためのポリヌクレオチドを含む核酸断片を得る方法は、（ａ）標的害虫（例えば、鞘翅目または半翅目）の天然ポリヌクレオチドの一部と特異的に相補的である第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを合成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングベクターに存在するｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ挿入断片を増幅するステップとを含み、増幅核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ分子の実質的な部分を含む。
【０１０７】
核酸は、多くのアプローチにより単離し、増幅し、または生成することができる。例えば、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子は、ｇＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリー、またはその一部から得られた標的ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または標的転写非コードポリヌクレオチド）のＰＣＲ増幅により得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、標的生物から抽出することができ、核酸ライブラリーは、当業者に公知の方法を用いてそれから作製することができる。標的生物から得られたｇＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、標的遺伝子のＰＣＲ増幅および配列決定に用いることができる。確認済みのＰＣＲ産物は、最小プロモーターによりセンスおよびアンチセンスＲＮＡを生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型として用いることができる。あるいは、核酸分子は、ホスホルアミダイト化学等の標準的な化学を用いる自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置）の使用を含む、多くの技術（例えば、Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214;およびAgrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423）のいずれかにより合成することができる。例えば、Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311；米国特許第４，９８０，４６０号明細書、第４，７２５，６７７号明細書、第４，４１５，７３２号明細書、第４，４５８，０６６号明細書および第４，９７３，６７９号明細書を参照のこと。ホスホロチオエート、ホスホルアミデート等の非天然主鎖基をもたらす代替の化学も用いることができる。
【０１０８】
本発明のＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子は、手動または自動化反応により当業者により化学的もしくは酵素的に、あるいはＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む細胞中でｉｎ  ｖｉｖｏで生成することができる。ＲＮＡは、部分または完全有機合成によっても生成することができ、任意の修飾リボヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素または有機合成により導入することができる。ＲＮＡ分子は、細胞ＲＮＡポリメラーゼまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）により合成することができる。ポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な発現構築物は、当技術分野で公知である。例えば、国際ＰＣＴ公開国際公開第０９７／３２０１６号パンフレットならびに米国特許第５，５９３，８７４号明細書、第５，６９８，４２５号明細書、第５，７１２，１３５号明細書、第５，７８９，２１４号明細書および第５，８０４，６９３号明細書を参照のこと。化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素合成により合成されるＲＮＡ分子は、細胞に導入する前に精製することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはそれらの組合せにより混合物から精製することができる。あるいは、化学的にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素合成により合成されるＲＮＡ分子は、例えば、試料の処理による損失を避けるために、精製せずにまたは最小限の精製で用いることができる。ＲＮＡ分子は、保存のために乾燥するか、または水溶液に溶解することができる。溶液は、ｄｓＲＮＡ分子の二重らせん鎖のアニーリングおよび／または安定化を促進するための緩衝剤または塩を含んでいてもよい。
【０１０９】
実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、単一自己相補的ＲＮＡ鎖により、または２つの相補的ＲＮＡ鎖から形成させることができる。ｄｓＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏで１つまたは２つのＲＮＡ鎖の転写を媒介し得る。あるいはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を媒介するのにクローン化ＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。害虫における標的遺伝子の転写後阻害は、宿主の器官、組織もしくは細胞型における特異的転写（例えば、組織特異的プロモーターを用いることによる）；宿主における環境条件の刺激（例えば、感染、ストレス、温度および／または化学誘導物質に応答性である誘導性プロモーターを用いることによる）；および／または宿主の発育段階もしくは年齢における工学的転写（例えば、発育段階特異的プロモーターを用いることによる）により宿主標的化することができる。ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ鎖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで転写されるかどうかを問わず、ポリアデニル化され得るか、またはされ得ず、細胞の翻訳装置によりポリペプチドに翻訳されることができ得るか、またはでき得ない。
【０１１０】
Ｄ．組換えベクターおよび宿主細胞形質転換
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞または植物細胞）への導入のためのＤＮＡ分子であって、ＲＮＡへの発現ならびに害虫（鞘翅目および／または半翅目）による摂取により、害虫の細胞、組織もしくは器官における標的遺伝子の抑制を達成するポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子も提供する。したがって、いくつかの実施形態は、害虫における標的遺伝子発現を阻害するための植物細胞中でｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）分子として発現することができるポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を提供する。発現を開始または増大させるために、そのような組換え核酸分子は、１つまたは複数の調節エレメントを含んでいてもよく、調節エレメントは、ｉＲＮＡとして発現することができるポリヌクレオチドに作動可能に連結することができる。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は、公知であり、本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いることができる。例えば、国際ＰＣＴ公開国際公開第０６／０７３７２７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号明細書を参照のこと。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明の組換えＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み得る。そのような組換えＤＮＡ分子は、摂取により害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）細胞における内因性標的遺伝子（複数可）の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードし得る。多くの実施形態では、転写ＲＮＡは、安定化構造で、例えば、ヘアピンならびにステムおよびループ構造として提供することができるｄｓＲＮＡ分子を形成し得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子の１つの鎖は、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体のいずれかのポリヌクレオチドと実質的に相同であるポリヌクレオチドからの転写により形成させることができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子の１つの鎖は、配列番号７１；配列番号７１の相補体；配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の相補体；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと実質的に相同であるポリヌクレオチドからの転写により形成させることができる。
【０１１４】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子を形成し得るＲＮＡをコードする組換えＤＮＡ分子は、少なくとも１つのプロモーターに対して、１つのポリヌクレオチドがセンス配向をなし、他のポリヌクレオチドがアンチセンス配向をなすように、少なくとも２つのポリヌクレオチドが配列し、センスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドが、例えば、約５から約１０００ヌクレオチドのスペーサーにより連結またはつながれている、コード領域を含み得る。スペーサーは、センスおよびアンチセンスポリヌクレオチド間のループを形成する可能性がある。センスポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドは、標的遺伝子（例えば、配列番号１または配列番号７１を含む遺伝子）またはその断片と実質的に相同であり得る。しかし、いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、スペーサーなしにｄｓＲＮＡ分子を形成し得る、ＲＮＡをコードし得る。複数の実施形態では、センスコードポリヌクレオチドおよびアンチセンスコードポリヌクレオチドは、異なる長さであり得る。
【０１１５】
害虫に対する有害効果または害虫に対する植物保護効果を有すると同定されたポリヌクレオチドは、本発明の組換え核酸分子における適切な発現カセットの創製により発現ｄｓＲＮＡ分子に容易に取り込むことができる。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、標的遺伝子ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１または配列番号７１およびその断片）に対応する第１のセグメントを選択し、このポリヌクレオチドを第１のセグメントに相同または相補的でない第２のセグメントスペーサー領域に連結し、これを、少なくとも一部が第１のセグメントと実質的に相補的である第３のセグメントに連結することにより、ステムおよびループ構造を有するヘアピンとして発現させることができる。そのような構築物は、第１のセグメントと第３のセグメントとの分子内塩基対合によりステムおよびループ構造を形成し、ループ構造が生じ、第２のセグメントを含む。例えば、米国特許出願公開第２００２／００４８８１４号明細書および第２００３／００１８９９３号明細書ならびに国際ＰＣＴ公開国際公開第９４／０１５５０号パンフレットおよび国際公開第９８／０５７７０号パンフレットを参照のこと。ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、ステム−ループ構造（例えば、ヘアピン）等の二本鎖構造の形態で生成することができ、それにより、天然害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）ポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡの生成は、ｓｉＲＮＡの生成の増大をもたらす、またはｄｓＲＮＡヘアピンプロモーターの転写遺伝子サイレンシングを防ぐためにメチル化を低下させる、例えば、追加の植物発現性カセット上の標的遺伝子の断片の共発現により増大する。
【０１１６】
本発明の実施形態は、１つまたは複数のｉＲＮＡ分子の発現の害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）阻害レベルを達成するための植物への本発明の組換え核酸分子の導入（すなわち、形質転換）を含む。組換えＤＮＡ分子は、例えば、線状または閉環プラスミド等のベクターであり得る。ベクターシステムは、単一ベクターもしくはプラスミド、または宿主のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む２つ以上のベクターもしくはプラスミドであり得る。さらに、ベクターは、発現ベクターであり得る。本発明の核酸は、例えば、連結コードポリヌクレオチドまたは他のＤＮＡエレメントの発現を駆動するために１つまたは複数の宿主において機能する適切なプロモーターの制御下でベクターに適切に挿入することができる。多くのベクターがこの目的のために利用でき、適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズおよびベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に主として依存する。各ベクターは、その機能（例えば、ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが適合する個々の宿主細胞に依存する様々な構成成分を含む。
【０１１７】
トランスジェニック植物に害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）からの保護を与えるために、例えば、組換えＤＮＡを組換え植物の組織または液内でｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子を形成するＲＮＡ分子）に転写させることができる。ｉＲＮＡ分子は、宿主植物種に被害をもたらし得る害虫内部の対応する転写ポリヌクレオチドと実質的に相同であり、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み得る。害虫は、例えば、ｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック宿主植物の細胞または液を摂取することにより、トランスジェニック宿主植物の細胞中で転写されるｉＲＮＡ分子と接触し得る。したがって、特定の例において、標的遺伝子の発現は、トランスジェニック宿主植物に外寄生する鞘翅目および／または半翅目害虫体内のｉＲＮＡ分子により抑制される。いくつかの実施形態では、標的鞘翅目および／または半翅目害虫における標的遺伝子の発現の抑制により、植物が害虫による攻撃から保護することがもたらされ得る。
【０１１８】
本発明の組換え核酸分子により形質転換された植物細胞との栄養関係にある害虫へのｉＲＮＡ分子の送達を可能にするために、植物細胞中のｉＲＮＡ分子の発現（すなわち、転写）が必要である。したがって、組換え核酸分子は、核酸分子を増幅させる細菌細胞および核酸分子を発現させる植物細胞等の、宿主細胞中で機能する異種プロモーター配列等の１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結した本発明のポリヌクレオチドを含み得る。
【０１１９】
本発明の核酸分子に用いるのに適するプロモーター配列は、すべてが当技術分野で周知である、誘導性、ウイルス、合成または構成性であるものを含む。そのようなプロモーターを記載している非限定的な例としては、米国特許第６，４３７，２１７号明細書（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；第５，６４１，８７６号明細書（イネアクチンプロモーター）；第６，４２６，４４６号明細書（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；第６，４２９，３６２号明細書（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；第６，２３２，５２６号明細書（トウモロコシＡ３プロモーター）；第６，１７７，６１１号明細書（構成性トウモロコシプロモーター）；第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）；第６，４３３，２５２号明細書（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；第６，４２９，３５７号明細書（イネアクチン２プロモーターおよびイネアクチン２イントロン）；第６，２９４，７１４号明細書（光誘導性プロモーター）；第６，１４０，０７８号明細書（塩誘導性プロモーター）；第６，２５２，１３８号明細書（病原体誘導性プロモーター）；第６，１７５，０６０号明細書（リン欠乏誘導性プロモーター）；第６，３８８，１７０号明細書（二方向プロモーター）；第６，６３５，８０６号明細書（ガンマコイキシンプロモーター）；ならびに米国特許出願公開第２００９／７５７，０８９号明細書（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）等がある。追加のプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導プラスミド上で運ばれる）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター等のカリモウイルスプロモーター（Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24）；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-2）；ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号明細書、第５，３５２，６０５号明細書、第５，３５９，１４２号明細書および第５，５３０，１９６号明細書）；ＦＭＶ  ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号明細書および第５，３７８，６１９号明細書）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号明細書）；およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号Ｖ０００８７；Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7）等がある。
【０１２０】
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、根特異的プロモーター等の組織特異的プロモーターを含む。根特異的プロモーターは、作動可能に連結したコードポリヌクレオチドの発現を根組織においてもっぱらまたは優先的に駆動する。根特異的プロモーターの例は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，１１０，７３２号明細書、第５，４５９，２５２号明細書および第５，８３７，８４８号明細書ならびにOpperman et al. (1994) Science 263:221-3；およびHirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18を参照のこと。いくつかの実施形態では、本発明による鞘翅目および／または半翅目害虫の防除のためのポリヌクレオチドまたは断片は、該ポリヌクレオチドまたは断片に対して反対の転写方向に配向した２つの根特異的プロモーター間でクローニングされ得る。そして、それらは、トランスジェニック植物細胞中で作動可能であり、その中で発現して、上述のように、その後にｄｓＲＮＡ分子を形成し得るトランスジェニック植物細胞中のＲＮＡ分子を生成する。植物組織において発現したｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子発現の抑制が達成されるように害虫により摂取せることができる。
【０１２１】
核酸分子に任意選択的に作動可能に連結することができるさらなる調節エレメントとしては、プロモーターエレメントとコードポリヌクレオチドとの間に位置する翻訳リーダーエレメントとして機能する５’ＵＴＲ等がある。翻訳リーダーエレメントは、完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在し、それは、一次転写物のプロセシングおよび／またはＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例としては、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、植物ウイルス外被タンパク質、植物ルビスコリーダーおよびその他等がある。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照のこと。５’ＵＴＲの非限定的な例としては、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号明細書）；ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）；ＡｔＡｎｔｌ；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号Ｖ０００８７；およびBevan et al. (1983) Nature 304:184-7）等がある。
【０１２２】
核酸に任意選択的に作動可能に連結することができる追加の調節エレメントとしては、３’非翻訳配列、３’転写終結領域またはポリアデニル化領域等もある。これらは、ポリヌクレオチドの下流に位置する遺伝エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、および／または転写またはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができる他の調節シグナルをもたらすポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物においてｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすように機能する。ポリアデニル化エレメントは、様々な植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し得る。３’転写終結領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ３’領域（ｎｏｓ３’；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）である。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80に示されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ｐｓ．ＲＢｃＳ２−Ｅ９；Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号Ｅ０１３１２）からのもの等がある。
【０１２３】
いくつかの実施形態は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドに作動可能に連結した上述の調節配列の少なくとも１つを含む単離かつ精製ＤＮＡ分子を含む植物形質転換ベクターを含み得る。発現した場合、該１つまたは複数のポリヌクレオチドは、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）における天然ＲＮＡ分子のすべてまたは一部と特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含む１つまたは複数のｉＲＮＡ分子（複数可）を生じさせる。したがって、該ポリヌクレオチド（複数可）は、標的鞘翅目および／または半翅目害虫ＲＮＡ転写物内に存在するポリヌクレオチドのすべてまたは一部をコードするセグメントを含み得、標的害虫転写物のすべてまたは一部の逆向き反復配列を含み得る。植物形質転換ベクターは、複数の標的ポリヌクレオチドに特異的に相補的なポリヌクレオチドを含み、それにより、標的害虫の１つまたは複数の集団または種の細胞中の２つ以上の遺伝子の発現を阻害するための複数のｄｓＲＮＡの生成を可能にし得る。異なる遺伝子に存在するポリヌクレオチドに特異的に相補的なポリヌクレオチドのセグメントは、トランスジェニック植物における発現のための単一複合核酸分子中に組み合わせることができる。そのようなセグメントは、連続していても、またはスペーサーにより分離されていてもよい。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド（複数可）を既に含む本発明のプラスミドは、同じプラスミドにおける追加のポリヌクレオチド（複数可）の逐次的挿入により修飾することができ、追加のポリヌクレオチド（複数可）は、最初の少なくとも１つのポリヌクレオチド（複数可）と同じ調節エレメントに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、複数の標的遺伝子の阻害のために設計することができる。いくつかの実施形態では、阻害される複数の遺伝子は、同じ害虫（例えば、鞘翅目または半翅目）種から得ることができ、これにより、核酸分子の有効性が増大し得る。他の実施形態では、遺伝子は、異なる害虫から得ることができ、これにより、作用物質（複数可）が有効である害虫の範囲が拡大し得る。複数の遺伝子を抑制または発現と抑制の組合せの標的とする場合、ポリシストロン性ＤＮＡエレメントを作製することができる。
【０１２５】
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、植物細胞等の形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する選択可能マーカーを含み得る。選択可能マーカーは、本発明の組換え核酸分子を含む植物または植物細胞を選択するためにも用いることができる。マーカーは、殺生物剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、ジェネチシン（Ｇ４１８）、ブレオマイシン、ハイグロマイシン等）または除草剤耐性（例えば、グリホセート等）をコードし得る。選択可能マーカーの例は、カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８等を用いて選択することができるｎｅｏ遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするｂａｒ遺伝子；グリホセート耐性をコードする突然変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を付与する突然変異アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子：およびメトトレキセート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子であり得るが、これらに限定されない。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリン等に対する抵抗性を付与する複数の選択可能マーカーが利用できる。そのような選択可能マーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号明細書、第５，６３３，４３５号明細書、第５，７８０，７０８号明細書および第６，１１８，０４７号明細書に示されている。
【０１２６】
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、スクリーニング可能マーカーも含み得る。スクリーニング可能マーカーは、発現をモニターするために用いることができる。例示的なスクリーニング可能マーカーとしては、様々な色原性基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするＲ遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al. (1988) “Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.” In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp.263-82）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41）；様々な色原性基質が公知である酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、色原性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al. (1986) Science 234:856-9）；色原性カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2）；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化し、これが次にメラニンに縮合することを可能にする酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14）；およびα−ガラクトシダーゼ等がある。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、上述の組換え核酸分子は、トランスジェニック植物の創製ならびに害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）に対する感受性の低下を示すトランスジェニック植物を調製するための植物における異種核酸の発現の方法に用いることができる。植物形質転換ベクターは、例えば、ｉＲＮＡ分子をコードする核酸分子を植物形質転換ベクターに挿入し、これらを植物に導入することによって調製することができる。
【０１２８】
宿主細胞の形質転換の適切な方法としては、例えば、プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書参照）、乾燥／抑制媒介ＤＮＡ取込みによる（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8参照）、エレクトロポレーションによる（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書参照）、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌による（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書および第５，４６４，７６５号明細書参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号明細書、第５，５９１，６１６号明細書、第５，６９３，５１２号明細書、第５，８２４，８７７号明細書、第５，９８１，８４０号明細書および第６，３８４，３０１号明細書参照）およびＤＮＡコーティング粒子の促進による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書、第５，５５０，３１８号明細書、第５，５３８，８８０号明細書、第６，１６０，２０８号明細書、第６，３９９，８６１号明細書および第６，４０３，８６５号明細書参照）等の、ＤＮＡを細胞に導入することができる方法等がある。コーンを形質転換するのにとりわけ有用な技術は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号明細書および第５，５９１，６１６号明細書ならびに国際ＰＣＴ公開国際公開第９５／０６７２２号パンフレットに記載されている。これらのような技術の適用により、事実上あらゆる種の細胞を安定に形質転換させることができる。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込む。多細胞種の場合、トランスジェニック細胞をトランスジェニック生物に再生することができる。これらの技術のいずれも、例えば、トランスジェニック植物のゲノムに１つまたは複数のｉＲＮＡ分子をコードする１つまたは複数の核酸を含むトランスジェニック植物を産生するのに用いることができる。
【０１２９】
発現ベクターを植物に導入するために最も広く用いられている方法は、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）の天然の形質転換システムに基づいている。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞に遺伝的に形質転換を起こさせる植物病原性土壌細菌である。それぞれＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、植物の遺伝的形質転換に関与する遺伝子を運ぶ。Ｔｉ（腫瘍誘導）プラスミドは、形質転換植物に転移する、Ｔ−ＤＮＡとして公知である大きいセグメントを含む。Ｔｉプラスミドの他のセグメントである、Ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ転移に関与する。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端反復配列に隣接する。修飾バイナリーベクターにおいて、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、Ｖｉｒ領域の機能は、Ｔ−ＤＮＡ境界エレメントが隣接する外来ＤＮＡを導入するために用いられる。Ｔ領域は、トランスジェニック細胞および植物の効率的な回収のための選択可能マーカー、ならびに核酸をコードするｄｓＲＮＡ等の導入のためのポリヌクレオチドを挿入するための多重クローニング部位も含み得る。
【０１３０】
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号明細書、第４，６９３，９７７号明細書、第４，８８６，９３７号明細書および第５，５０１，９６７号明細書ならびに欧州特許第０１２２７９１号明細書参照）またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドに由来する。追加の植物形質転換ベクターとしては、例えば、および制限なく、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7；Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42により；および欧州特許第０１２０５１６号明細書に記載されているもの、ならびに前述のもののいずれかに由来するもの等がある。天然で植物と相互作用するシノリゾビウム属（Sinorhizobium）、リゾビウム属（Rhizobium）およびメソリゾビウム属（Mesorhizobium）等の他の細菌を、多くの多様な植物への遺伝子導入を媒介するように修飾することができる。これらの植物関連共生細菌は、非病害性Ｔｉプラスミドおよび適切なバイナリーベクターの両方の獲得により遺伝子導入に適格にすることができる。
【０１３１】
外因性ＤＮＡをエント細胞に供給した後、形質転換細胞は、一般的にさらなる培養および植物再生のために同定される。形質転換細胞を同定する能力を改善するために、前述の選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を形質転換体を生成するために用いる形質転換ベクターとともに用いることを望むことができる。選択可能マーカーを用いる場合、細胞を選択剤または複数の選択剤に曝露することにより、形質転換細胞は、形質転換された可能性のある細胞集団内で同定される。スクリーニング可能マーカーを用いる場合、所望のマーカー遺伝子形質について細胞をスクリーニングすることができる。
【０１３２】
選択剤への曝露で生残している細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性と評価された細胞は、植物の再生を補助する培地中で培養することができる。いくつかの実施形態では、任意の適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）は、成長調節剤等のさらなる物質を含めることにより改良することができる。植物再生努力を開始するのに十分な組織が利用できるまで、または手作業による選択を反復した後、組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）、組織を成長調節剤を含む基礎培地上に維持し、その後、芽条形成を促す培地に移す。十分な芽条形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。芽条が形成されたならば、それらを根形成を促す培地に移す。十分な根が形成されたならば、さらなる成長および成熟のために植物を土壌に移すことができる。
【０１３３】
再生植物における対象の核酸分子（例えば、鞘翅目および／または半翅目害虫における標的遺伝子発現を抑制する１つまたは複数のｉＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ）の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲならびに核酸配列決定等の分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロット）によるまたは酵素機能によるタンパク質産物の存在の検出等の生化学的アッセイ；葉部または根部アッセイ等の植物部位アッセイ；ならびに全再生植物の表現型の解析等がある。
【０１３４】
組込みイベントは、例えば、例えば対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅により解析することができる。ＰＣＲ遺伝子型決定は、ゲノムに組み込まれた対象の核酸分子を含むと予測された単離宿主植物カルス組織から得られたｇＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と、それに続くＰＣＲ増幅産物の標準クローニングおよび配列解析を含むが、これらに限定されないと理解される。ＰＣＲ遺伝子型決定の方法は、十分に記載され（例えば、Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53）、任意の植物種（例えば、Ｚ．マイス（Z. mays）またはＧ．マクス（G. max））または細胞培養物を含む組織型に由来するｇＤＮＡに適用することができる。
【０１３５】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、一般的に１つの染色体に挿入された単一組換えＤＮＡを含む。該単一組換えＤＮＡのポリヌクレオチドは、「トランスジェニックイベント」または「組込みイベント」と呼ばれる。そのようなトランスジェニック植物は、挿入外来ポリヌクレオチドに対して異型接合である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子に対して同型接合であるトランスジェニック植物は、単一外来遺伝子を含む独立分離トランスジェニック植物をそれ自体、例えば、Ｔ０植物と性的に交配（自殖）して、Ｔ１種子を産生することにより得ることができる。産生されたＴ１種子の４分の１は、導入遺伝子に対して同型接合となる。Ｔ１種子を発芽させることにより、一般的に異型接合体と同型接合体との区別を可能にするＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイ（すなわち、接合性アッセイ）を用いて異型接合性について試験することができる植物が得られる。
【０１３６】
特定の実施形態では、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）阻害効果を有する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０種またはそれ以上の異なるｉＲＮＡ分子が植物細胞中で産生される。ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）は、異なる形質転換イベントで導入された複数の核酸から、または単一形質転換イベントで導入された単一核酸から発現させることができる。いくつかの実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子が単一プロモーターの制御下で発現する。他の実施形態では、複数のｉＲＮＡ分子が複数のプロモーターの制御下で発現する。害虫の同じ種の異なる集団、あるいは害虫の異なる種の両方において、１つもしくは複数の害虫内部の異なる遺伝子座（例えば、配列番号１または配列番号７１で定義される遺伝子座）に対してそれぞれ相同である複数のポリヌクレオチドを含む単一ｉＲＮＡ分子を発現させることができる。
【０１３７】
組換え核酸分子による植物の直接形質転換に加えて、少なくとも１つのトランスジェニックイベントを有する第１の植物をそのようなイベントを欠いている第２の植物と交配することにより、トランスジェニック植物を作製することができる。例えば、ｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を形質転換に適用できる第１の植物系統に導入して、トランスジェニック植物を産生することができ、そのトランスジェニック植物を第２の植物系統と交配して、ｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを第２の植物系統に移入することができる。
【０１３８】
本発明はまた、本発明の１つまたは複数の配列を含む商品生産物を含む。特定の実施形態は、本発明の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む組換え植物または種子から生産された商品生産物を含む。本発明の１つまたは複数の配列を含む商品生産物は、本発明の１つまたは複数の配列を含む、植物の粗びき粉、油、粉砕もしくは全粒または種子、あるいは組換え植物または種子の粗びき粉、油、または粉砕もしくは全粒を含む食品または動物飼料生産物を含むと思われるが、これらに限定されないものとする。ここで企図した１つまたは複数の一次産品または商品生産物中の本発明の１つまたは複数の配列の検出は、一次産品または商品生産物が、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制法を用いて鞘翅目および／または半翅目害虫を防除する目的のために本発明の１つまたは複数のヌクレオチド配列を発現するように設計されたトランスジェニック植物から生産されるという事実上の証拠である。
【０１３９】
いくつかの態様では、形質転換植物細胞から得られたトランスジェニック植物により生産された種子および商品生産物が含まれ、種子または商品生産物は、検出可能な量の本発明の核酸を含む。いくつかの実施形態では、そのような商品生産物は、例えば、トランスジェニック植物を得て、それらから食品または飼料を調製することによって生産することができる。本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む商品生産物としては、例えば、および制限なく、本発明の１つまたは複数の核酸を含む、植物の粗びき粉、油、粉砕もしくは全粒または種子、ならびに組換え植物または種子の粗びき粉、油、または粉砕もしくは全粒を含むあらゆる食品等がある。１つまたは複数の一次産品または商品生産物中の本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドの検出は、一次産品または商品生産物が、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）を防除する目的のために本発明の１つまたは複数のｉＲＮＡ分子を発現するように設計されたトランスジェニック植物から生産されるという事実上の証拠である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子を含むトランスジェニック植物または種子は、制限なく、以下を含む、そのゲノムに少なくとも１つの他のトランスジェニックイベントも含み得る：例えば、Ｃａｆｌ−１８０（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５８号明細書）、ＶａｔｐａｓｅＣ（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５９号明細書）、Ｒｈｏ１（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２６０号明細書）、ＶａｔｐａｓｅＨ（米国特許出願公開第２０１２／０１９８５８６号明細書）、ＰＰＩ−８７Ｂ（米国特許出願公開第２０１３／００９１６００号明細書）、ＲＰＡ７０（米国特許出願公開第２０１３／００９１６０１号明細書）およびＲＰＳ６（米国特許出願公開第２０１３／００９７７３０号明細書）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子座等の、配列番号１または配列番号７１により定義されるもの以外の害虫における遺伝子座を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；鞘翅目および／または半翅目害虫以外の生物（例えば、植物寄生線虫）における遺伝子を標的とするｉＲＮＡ分子が転写されるトランスジェニックイベント；殺虫タンパク質（例えば、バチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属種（例えば、米国特許出願公開第２０１４／００３３３６１号明細書）またはシュードモナス（Pseudomonas）属種（例えば、ＰＣＴ出願公開国際公開第２０１５０３８７３４号パンフレット）殺虫タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホセートに対する耐性を与える遺伝子；ならびに収量の増加、脂肪酸代謝の変化または細胞質雄性不稔性の回復等のトランスジェニック植物における望ましい表現型に寄与する遺伝子。特定の実施形態では、植物病害および昆虫被害の防除の増大のための所望の形質を達成するために本発明のｉＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを植物における他の昆虫防除および病害抵抗性形質と組み合わせることができる。異なる作用機序を用いる昆虫防除形質を組み合わせることは、単一の防除形質を有する植物と比べて優れた耐久性を有する保護トランスジェニック植物をもたらし得る。その理由は、例えば、形質（複数可）に対する抵抗性が圃場で起こる可能性が低いためである。
【０１４１】
Ｖ．鞘翅目および／または半翅目害虫における標的遺伝子の抑制
Ａ．概要
本発明のいくつかの実施形態では、鞘翅目および／または半翅目害虫の防除に有用な少なくとも１つの核酸分子を鞘翅目および／または半翅目害虫に与えることができ、核酸分子は、害虫（複数可）におけるＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングをもたらす。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）を鞘翅目および／または半翅目宿主に与えることができる。いくつかの実施形態では、鞘翅目および／または半翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、核酸分子を害虫と接触させることによって害虫に与えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目および／または半翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、害虫の給餌基体、例えば、栄養組成物に加えることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目および／または半翅目害虫の防除に有用な核酸分子は、害虫により摂取される核酸分子を含む植物物質の摂取により与えることができる。特定の実施形態では、核酸分子は、植物物質に導入された組換え核酸の発現により、例えば、組換え核酸を含むベクターによる植物細胞の形質転換および形質転換植物細胞からの植物物質または全植物の再生により、植物物質中に存在する。
【０１４２】
Ｂ．ＲＮＡｉ媒介遺伝子抑制
複数の実施形態では、本発明は、例えば、標的ポリヌクレオチドと特異的に相補的であるポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの鎖を含むｉＲＮＡ分子を設計することにより、害虫（例えば、鞘翅目（例えば、ＷＣＲもしくはＮＣＲ）または半翅目（例えば、ＢＳＢ）害虫）のトランスクリプトームにおける必須天然ポリヌクレオチド（例えば、必須遺伝子）を標的とするように設計することができるｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｈｐＲＮＡ）を提供する。そのように設計されたｉＲＮＡ分子の配列は、標的ポリヌクレオチドと同一であり得るか、あるいはｉＲＮＡ分子とその標的ポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを妨げないミスマッチを取り込み得る。
【０１４３】
本発明のｉＲＮＡ分子を害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）における遺伝子抑制の方法に用い、それにより、植物（例えば、ｉＲＮＡ分子を含む保護形質転換植物）おける害虫によってもたらされる被害のレベルまたは発生率を低下させることができる。本明細書で用いているように、「遺伝子抑制」という用語は、発現の転写後抑制および転写抑制を含む遺伝子またはコードポリヌクレオチドからのタンパク質発現の低下を含む、ｍＲＮＡへの遺伝子転写およびｍＲＮＡのその後の翻訳の結果として産生されるタンパク質のレベルを低下させる周知の方法のいずれかを意味する。転写後抑制は、抑制の標的とする遺伝子から転写されたｍＲＮＡのすべてまたは一部と抑制のために用いる対応するｉＲＮＡ分子との間の特異的相同性によって媒介される。さらに、転写後抑制は、リポソームによる結合のために細胞中で利用できるｍＲＮＡの量の実質的かつ測定可能な低下を意味する。
【０１４４】
ｉＲＮＡ分子がｄｓＲＮＡ分子である実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、酵素であるＤＩＣＥＲによって短いｓｉＲＮＡ分子（長さが約２０ヌクレオチド）に切断され得る。ｄｓＲＮＡ分子に対するＤＩＣＥＲ活性により生じた二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、２つの一本鎖ｓｉＲＮＡ、すなわち「パッセンジャー鎖」と「ガイド鎖」に分離され得る。パッセンジャー鎖は、分解することができ、ガイド鎖は、ＲＩＳＣに取り込むことができる。転写後抑制は、ガイド鎖とｍＲＮＡ分子の特異的に相補的なポリヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションおよびその後のアルゴノート（ＲＩＳＣ複合体の触媒構成成分）酵素による切断によって起こる。
【０１４５】
本発明の実施形態では、あらゆる形態のｉＲＮＡ分子を用いることができる。当業者は、ｄｓＲＮＡ分子が、調製中および細胞にｉＲＮＡ分子を供給するステップ中に一般的に一本鎖ＲＮＡ分子よりも安定であり、細胞中でも一般的により安定であることを理解するであろう。したがって、例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子は、いくつかの実施形態では同等に有効であり得るが、ｄｓＲＮＡ分子をその安定性のため選択することができる。
【０１４６】
特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させて、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）のゲノム内のポリヌクレオチドによりコードされる核酸分子と実質的に相同であるｉＲＮＡ分子を生成することができる、ポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｉＲＮＡ分子は、ステム−ループ構造を含む安定化ｄｓＲＮＡ分子であり得る。害虫がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｉＲＮＡ分子と接触した後、害虫における標的遺伝子（例えば、必須遺伝子）の転写後阻害が起こり得る。
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも１９個の連続したヌクレオチド）を含む核酸分子の発現を害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）における標的遺伝子の転写後阻害の方法に用い、ポリヌクレオチドは、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドから発現したＲＮＡの相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチド；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドから発現したＲＮＡの相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コードポリヌクレオチドから発現したＲＮＡの相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される。特定の実施形態では、前述のもののいずれかと少なくとも約８０％同一（例えば、７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％および１００％）である核酸分子の発現を用いることができる。
【０１４８】
本発明の特定の実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子の発現を半翅目害虫における標的遺伝子の転写後阻害の方法に用い、ヌクレオチド配列は、配列番号７１；配列番号７１の相補体；配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の相補体；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される。特定の実施形態では、前述のもののいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％および１００％）である核酸分子の発現を用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）の少なくとも１つの細胞中に存在するＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む少なくとも１つの核酸分子の発現を鞘翅目害虫における標的遺伝子の転写後阻害の方法に用いることができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１；配列番号１の相補体；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の相補体；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物（例えば、ＷＣＲ）の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号１を含むジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号１を含む天然ＲＮＡ分子に転写されるジアブロティカ属（Diabrotica）生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される。特定の実施形態では、前述のもののいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％および１００％）である核酸分子の発現を用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、鞘翅目害虫の少なくとも１つの細胞中に存在するＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。特定の例において、そのような核酸分子は、配列番号１を含むヌクレオチド配列を含み得る。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子の発現を半翅目害虫における標的遺伝子の転写後阻害の方法に用いることができ、ヌクレオチド配列は、配列番号７１；配列番号７１の相補体；配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の相補体；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の相補体；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；配列番号７１を含む半翅目生物の天然コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体；配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片；および配列番号７１を含む天然ＲＮＡ分子に転写される半翅目生物の天然非コード配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの断片の相補体からなる群から選択される。特定の実施形態では、前述のもののいずれかと少なくとも８０％同一（例えば、８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％および１００％）である核酸分子の発現を用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、半翅目害虫の少なくとも１つの細胞中に存在するＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。特定の例において、そのような核酸分子は、配列番号７１を含むヌクレオチド配列を含み得る。
【０１５１】
ＲＮＡｉ転写後抑制システムが、遺伝子突然変異、系統多型または進化的分岐のため予想され得る標的遺伝子における配列変動に耐えることができることは、本明細書におけるいくつかの実施形態の重要な特徴である。導入される核酸分子が標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズされる限り、導入される核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡと絶対的に相同である必要はあり得ない。さらに、導入される核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡに対して、全長である必要はあり得ない。
【０１５２】
本発明のｉＲＮＡ技術を用いる標的遺伝子の阻害は、配列特異的である。すなわち、ｉＲＮＡ分子（複数可）と実質的に相同のポリヌクレオチドは、遺伝的阻害の標的となる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の一部と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を阻害のために用いることができる。これらおよびさらなる実施形態では、標的ポリヌクレオチドと比べて１つまたは複数の挿入、欠失および／または点突然変異を有するポリヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を用いることができる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ分子と標的遺伝子の一部は、例えば、少なくとも約８０％以上、少なくとも約８１％以上、少なくとも約８２％以上、少なくとも約８３％以上、少なくとも約８４％以上、少なくとも約８５％以上、少なくとも約８６％以上、少なくとも約８７％以上、少なくとも約８８％以上、少なくとも約８９％以上、少なくとも約９０％以上、少なくとも約９１％以上、少なくとも約９２％以上、少なくとも約９３％以上、少なくとも約９４％以上、少なくとも約９５％以上、少なくとも約９６％以上、少なくとも約９７％以上、少なくとも約９８％以上、少なくとも約９９％以上、少なくとも約１００％以上、および１００％の配列同一性を共有し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の二重らせん領域は、標的遺伝子転写物の一部と特異的にハイブリダイズ可能であり得る。特異的にハイブリダイズ可能な分子において、より大きい相同性を示す全長に満たないポリヌクレオチドは、より長く、より低い相同性のポリヌクレオチドを補う。標的遺伝子転写物の一部と同一であるｄｓＲＮＡ分子の二重らせん領域のポリヌクレオチドの長さは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００または少なくとも約１０００塩基であり得る。いくつかの実施形態では、２０〜１００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドを用いることができる。特定の実施形態では、約２００〜３００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドを用いることができる。特定の実施形態では、標的遺伝子のサイズによって、約５００〜１０００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドを用いることができる。
【０１５３】
特定の実施形態では、害虫（例えば、鞘翅目または半翅目）における標的遺伝子の発現は、著しい抑制が起こるように、害虫の細胞内で少なくとも１０％、少なくとも３３％、少なくとも５０％、または少なくとも８０％抑制され得る。著しい抑制は、検出可能な表現型をもたらす閾値を超える抑制（例えば、成長の停止、摂食の停止、発育の停止、死の誘発等）、あるいはＲＮＡの検出可能な減少および／または標的遺伝子に対応する遺伝子産物が抑制されることを意味する。本発明の特定の実施形態では、抑制は、害虫の実質的にすべての細胞で起こるが、他の実施形態では、抑制は、標的遺伝子を発現する細胞のサブセットでのみ起こる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、転写抑制は、「プロモータートランス抑制」と呼ばれることを達成するように、プロモーターＤＮＡまたはその相補体との実質的な配列同一性を示すｄｓＲＮＡ分子の細胞中の存在によって媒介される。遺伝子抑制は、例えば、ｄｓＲＮＡ分子を含む植物物質を摂取またはそれと接触することにより、そのようなｄｓＲＮＡ分子を摂取またはそれと接触し得る害虫における標的遺伝子に対して有効であり得る。プロモータートランス抑制に用いるｄｓＲＮＡ分子は、害虫の細胞中の１つまたは複数の相同または相補的ポリヌクレオチドの発現を阻害または抑制するように特別に設計することができる。植物細胞における遺伝子発現を調節するためのアンチセンスまたはセンス配向ＲＮＡによる転写後遺伝子抑制は、米国特許第５，１０７，０６５号明細書、第５，７５９，８２９号明細書、第５，２８３，１８４号明細書および第５，２３１，０２０号明細書に開示されている。
【０１５５】
Ｃ．害虫に与えるｉＲＮＡ分子の発現
害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）におけるＲＮＡｉ媒介遺伝子抑制のためのｉＲＮＡ分子の発現は、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ方式のいずれか１つにより行うことができる。ｉＲＮＡ分子は、次に、例えば、ｉＲＮＡ分子を害虫と接触させることにより、または害虫にｉＲＮＡ分子を摂取もしくは別の方法でインターナリゼーションさせることにより、害虫に与えることができる。いくつかの実施形態は、鞘翅目および／または半翅目害虫の形質転換宿主植物、形質転換植物細胞ならびに形質転換植物の子孫を含む。形質転換植物細胞および形質転換植物は、害虫保護効果をもたらすために、例えば、異種プロモーターの制御下で１つまたは複数のｉＲＮＡ分子を発現するように工学的に操作することができる。したがって、形質転換植物および植物細胞が摂食時に害虫により消費される場合、害虫は、トランスジェニック植物または細胞において発現したｉＲＮＡ分子を摂取し得る。本発明のポリヌクレオチドは、様々な原核および真核微生物宿主に導入して、ｉＲＮＡ分子を生成することもできる。「微生物」という用語は、細菌および菌類等の原核および真核種を含む。
【０１５６】
遺伝子発現の調節は、そのような発現の部分的または完全な抑制を含み得る。他の実施形態では、害虫（鞘翅目および／または半翅目）における遺伝子発現の抑制の方法は、その少なくとも１つのセグメントが害虫の細胞内のｍＲＮＡ配列と相補的である、本明細書で述べたポリヌクレオチドの転写後に形成された遺伝子抑制量の少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子を害虫の宿主の組織に供給することを含む。害虫により摂取された、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｈｐＲＮＡ分子等のその変形態様を含む、ｄｓＲＮＡ分子は、配列番号１または配列番号７１を含むヌクレオチド配列を含む分子から転写されたＲＮＡ分子と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％同一であり得る。したがって、それらに導入された場合、害虫における内因性コードポリヌクレオチドまたは標的コードポリヌクレオチドの発現を抑制または阻害する、ｄｓＲＮＡ分子を得るための非天然ポリヌクレオチドおよび組換えＤＮＡ構築物を含むが、これらに限定されない単離され、実質的に精製された核酸分子を提供する。
【０１５７】
特定の実施形態は、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）植物における１つまたは複数の標的遺伝子（複数可）の転写後阻害ならびに植物害虫の集団の防除のためのｉＲＮＡ分子の送達のための送達システムを提供する。いくつかの実施形態では、送達システムは、宿主細胞中で転写されたＲＮＡ分子を含む宿主トランスジェニック植物細胞または宿主細胞の内容物の摂取を含む。これらおよびさらなる実施形態では、本発明の安定化ｄｓＲＮＡ分子を供給する（providing）組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を創製する。特定のｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物は、組換えＤＮＡ技術（当技術分野で周知である基本技術）を用いて、本発明のｉＲＮＡ分子（例えば、安定化ｄｓＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチドを含む植物形質転換ベーターを構築し、植物細胞または植物を形質転換し、転写ｉＲＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物を生成することにより、産生することができる。
【０１５８】
トランスジェニック植物に害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）からの保護を与えるために、例えば、組換えＤＮＡ分子をｄｓＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子またはｈｐＲＮＡ分子等のｉＲＮＡ分子に転写することができる。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子は、組換え植物の組織または液内でｄｓＲＮＡ分子を形成し得る。そのようなｄｓＲＮＡ分子は、宿主植物に外寄生し得る種類の害虫体内のＤＮＡから転写される対応するポリヌクレオチドと同一であるポリヌクレオチドから一部構成され得る。害虫体内の標的遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡ分子により抑制され、害虫における標的遺伝子の発現の抑制は、トランスジェニック植物が害虫への抵抗をもたらす。ｄｓＲＮＡ分子の調節作用は、例えば、ハウスキーピング遺伝子を含む、細胞代謝または細胞形質転換に関与する内因性遺伝子；転写因子；脱皮関連遺伝子；ならびに細胞の代謝または正常な成長および発育に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子を含む、害虫において発現する様々な遺伝子に適用できることが示された。
【０１５９】
導入遺伝子からのｉｎ  ｖｉｖｏでの、または発現構築物からの転写のために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーおよびポリアデニル化シグナル）をいくつかの実施形態で用いて、ＲＮＡ鎖（または（複数の）鎖）を転写することができる。したがって、いくつかの実施形態では、上述のように、ｉＲＮＡ分子を生成するのに用いるポリヌクレオチドは、植物宿主細胞中の機能し得る１つまたは複数のプロモーターエレメントに作動可能に連結することができる。プロモーターは、通常、宿主ゲノムに常在する内因性プロモーターであり得る。本発明のポリヌクレオチドは、作動可能に連結したプロモーターエレメントの制御下で、その転写および／または得られる転写物の安定性に有利に作用するさらなるエレメントにより両側に隣接され得る。そのようなエレメントは、作動可能に連結したプロモーターの上流、発現構築物の３’末端の下流に位置し、プロモーターの上流と発現構築物の３’末端の下流の両方に存在し得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態は、植物を常食とする害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）により引き起こされる宿主植物（例えば、コーン植物体）の被害を低減する方法であって、本発明の少なくとも１つの核酸分子を発現する形質転換植物細胞を宿主植物に供給することを含み、核酸分子（複数可）が、害虫（複数可）により取り込まれることにより機能して、害虫（複数可）体内の標的ポリヌクレオチドの発現を抑制し、発現の抑制が、害虫（複数可）の死亡、および／または成長の低下をもたらし、それにより、害虫より引き起こされる宿主植物の被害を低減する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、ｄｓＲＮＡ分子を含む。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれが鞘翅目および／または半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子（複数可）は、害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な１つのポリヌクレオチドからなる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、コーン作物の収量を増加させる方法であって、本発明の少なくとも１つの核酸分子をコーン植物に導入することと、核酸を含むｉＲＮＡ分子の発現を可能にするためにコーン植物を培養することとを含み、核酸を含むｉＲＮＡ分子の発現が、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）の被害ならびに／あるいは成長を抑制し、それにより、害虫の外寄生による収量低下を低減または解消する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれ害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの例において、核酸分子（複数可）は、鞘翅目および／または半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、本発明の少なくとも１つのｉＲＮＡ分子をコードする、ポリヌクレオチドがプロモーターおよび転写終結エレメントに作動可能に連結されている、ポリヌクレオチドを含むベクターにより植物細胞を形質転換することと、複数の形質転換植物細胞を含む植物細胞培養の発育を可能にするのに十分な条件下で形質転換植物細胞を培養することと、ポリヌクレオチドをそれらのゲノムに組み込んだ形質転換植物細胞を選択することと、組み込まれたポリヌクレオチドによりコードされるｉＲＮＡ分子の発現について形質転換植物細胞をスクリーニングすることと、ｉＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック植物細胞を選択することと、害虫に選択されたトランスジェニック植物細胞を食餌として与えることとを含む、方法を提供する。植物も、組み込まれた核酸分子によりコードされるｉＲＮＡ分子を発現する形質転換植物細胞から再生させることができる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子である。これらおよびさらなる実施形態では、核酸分子（複数可）は、それぞれ害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含む。いくつかの例において、核酸分子（複数可）は、鞘翅目および／または半翅目害虫細胞中で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む。
【０１６３】
本発明のｉＲＮＡ分子は、植物細胞のゲノムに取り込まれた、または植え付けの前の種子に適用されるコーティングもしくは種子処理に取り込まれるような組換え遺伝子からの発現の産物として、植物種（例えば、コーン）の種子に取り込むことができる。組換え遺伝子を含む植物細胞は、トランスジェニックイベントであると考えられる。本発明の実施形態に害虫（例えば、鞘翅目および／または半翅目）へのｉＲＮＡ分子の送達のための送達システムも含まれる。例えば、本発明のｉＲＮＡ分子は、害虫（複数可）の細胞に直接導入することができる。導入の方法は、ｉＲＮＡと害虫（複数可）の宿主の植物組織との直接混合、ならびに宿主植物組織への本発明のｉＲＮＡ分子を含む組成物の施用を含み得る。例えば、ｉＲＮＡ分子は、植物表面上に噴霧することができる。あるいは、ｉＲＮＡ分子は、微生物により発現させることができ、微生物は、植物表面上に塗布することができ、または注入等の物理的手段により根もしくは幹に導入することができる。上で述べたように、トランスジェニック植物は、植物に外寄生することが公知の害虫を殺すのに十分な量で少なくとも１つのｉＲＮＡ分子を発現するように工学的に操作することもできる。化学または酵素合成により生成したｉＲＮＡ分子は、一般的農業慣行と調和した方法で製剤化することもでき、害虫による植物被害を防除するためのスプレー式製品として用いることができる。製剤は、効果的な葉の被覆に必要な適切なアジュバント（例えば、展着剤および湿潤剤）、ならびにＵＶ損傷からｉＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ分子）を保護するためのＵＶ保護剤を含み得る。そのような添加物は、生物殺虫剤産業で一般的に用いられており、当業者に周知である。そのような施用は、害虫からの植物の保護を向上させるために他のスプレー式殺虫剤施用（生物学的に基づくまたは別の方法）と組み合わせることができる。
【０１６４】
本明細書で引用した刊行物、特許および特許出願を含む、すべての参考文献は、本開示の明示的詳細と不一致でない程度まで、参照によって本明細書に組み込まれ、したがって、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個別かつ具体的に示され、本明細書にその全体が記載されていたかのようなことと同じ程度に組み込まれる。本明細書で述べた参考文献は、本出願の出願日の前のそれらの開示についてのみ記載する。本明細書における何物も、発明者らが先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことの容認と解釈すべきでない。
【０１６５】
以下の実施例は、特定の個別の特徴および／または態様を例示するために示す。これらの実施例は、述べる特定の特徴または態様に本開示を限定するものと解釈すべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【０１６６】
昆虫食餌バイオアッセイ
試料の調製およびバイオアッセイ  いくつかのｄｓＲＮＡ分子（ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ１（配列番号３）およびＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｖ１（配列番号４）に対応するものを含む）をＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＮＡｉキットを用いて合成し、精製した。精製ｄｓＲＮＡ分子は、ＴＥ緩衝液に入れて用意し、すべてのバイオアッセイは、ＷＣＲ（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）の死および成長阻害についてのバックグラウンド基準としての役割を果たした、この緩衝液からなる対照処理を含んでいた。バイオアッセイ緩衝液中のｄｓＲＮＡ分子の濃度は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定した。
【０１６７】
人工昆虫飼料を給餌した新生幼虫を用いて実施したバイオアッセイにおける昆虫活性について試料を試験した。ＷＣＲ卵は、ＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ，ＩＮＣ．（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から入手した。
【０１６８】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された（Ｃ−Ｄ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）１２８ウエルプラスチックトレーで実施した。各ウエルは、鞘翅目昆虫の成長用に設計された約１．０ｍＬの人工飼料を含んでいた。ｄｓＲＮＡ試料の６０μＬアリコートを各ウエルの飼料の表面上にピペットにより送達した（４０μＬ／ｃｍ２）。ｄｓＲＮＡ試料の濃度は、ウエルにおける表面積（１．５ｃｍ２）の１平方センチメートル当たりのｄｓＲＮＡの量（ｎｇ／ｃｍ２）として計算した。処理トレーは、飼料表面上の液体が蒸発するかまたは飼料中に吸収されるまで、フュームフード内に保持した。
【０１６９】
羽化の数時間以内に、個々の幼虫を湿らせたラクダ毛ブラシで捕捉し、処理飼料上にのせた（１ウエル当たり１または２匹の幼虫）。次いで、１２８ウエルプラスチックトレーの外寄生ウエルを透明プラスチックの粘着性シートで密封し、ガス交換を可能にするために通気孔をつけた。バイオアッセイトレーを制御された環境条件下（２８℃、相対湿度約４０％、１６：８（明／暗））で９日間保持し、その後、各試料に曝露した昆虫の総数、死亡昆虫の数および生存昆虫の体重を記録した。平均死亡百分率および平均成長阻害を各処理について計算した。成長阻害（ＧＩ）は、以下のように計算した。
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
ここで、ＴＷＩＴは、処理における生存昆虫の総体重であり、ＴＮＩＴは、処理における昆虫の総数であり、ＴＷＩＢＣは、バックグラウンド基準（緩衝液対照）における生存昆虫の総体重であり、ＴＮＩＢＣは、バックグラウンド基準（緩衝液対照）における昆虫の総数である。
【０１７０】
統計解析は、ＪＭＰ（商標）ソフトウエア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて行った。
【０１７１】
ＬＣ５０（致死濃度）は、試験昆虫の５０％が殺される用量と定義される。ＧＩ５０（成長阻害）は、試験昆虫の平均成長（例えば、生存体重）がバックグラウンド基準試料で認められる平均値の５０％である用量と定義される。
【０１７２】
反復したバイオアッセイで、個々の試料の摂取が、トウモロコシ根切り虫幼虫の驚くべきおよび予期しない死亡および成長阻害をもたらしたことが示された。
【実施例２】
【０１７３】
候補標的遺伝子の同定
ＲＮＡｉトランスジェニック植物昆虫抵抗性技術による防除のための候補標的遺伝子配列を得るためのプールされたトランスクリプトームの解析のためにＷＣＲ（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）の発育の複数の段階を選択した。
【０１７４】
一適例において、以下のフェノール／ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）に基づく方法（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＥＮＴＥＲ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いて、全ＲＮＡを約０．９ｇｍの全初齢ＷＣＲ幼虫（孵化後４〜５日；１６℃に保持）から単離し、精製した。
【０１７５】
幼虫を、均一な懸濁液が得られるまで、１０ｍＬのＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）を含む１５ｍＬホモジナイザーで室温でホモジナイズした。室温での５分のインキュベーションの後に、ホモジネートを１．５ｍＬ小遠心管に分配し（１本の管につき１ｍＬ）、２００μＬのクロロホルムを加え、混合物を１５秒間激しく振とうした。抽出物を室温で１０分間静置した後、４℃で１２０００ｘｇで遠心分離することにより相を分離した。上相（約０．６ｍＬを構成する）を他の滅菌済み１．５ｍＬ管に注意深く移し、等容積の室温のイソプロパノールを加えた。室温で５〜１０分間インキュベートした後、混合物を１２０００ｘｇ（４℃または２５℃）で８分間遠心分離した。
【０１７６】
上清を注意深く除去し、捨て、毎回の洗浄後に７５００ｘｇ（４℃または２５℃）で５分間の遠心分離により回収して、ＲＮＡペレットを７５％エタノールを用いてボルテックスすることにより２回洗浄した。エタノールを注意深く除去し、ペレットを３〜５分間風乾し、次いで、ヌクレアーゼ不含有滅菌水に溶解した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度（Ａ）を測定することにより決定した。約０．９ｇｍの幼虫からの一般的な抽出により、１．９のＡ２６０／Ａ２８０比を有する１ｍｇを超える全ＲＮＡが得られた。そのように抽出されたＲＮＡは、さらなる処理まで−８０℃で保存した。
【０１７７】
ＲＮＡの質は、アリコートを１％アガロースゲルに通すことにより判断した。アガロースゲル溶液は、高圧滅菌済み容器中でＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水で希釈した高圧滅菌済み１０ｘ  ＴＡＥ緩衝液（トリス・酢酸・ＥＤＴＡ；１ｘ濃度は０．０４Ｍトリス・酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）、ｐＨ８．０）を用いて調製した。１ｘ  ＴＡＥをランニング緩衝液として用いた。使用前に、電気泳動槽およびウエル形成コームをＲＮａｓｅ  ＡＷＡＹ（商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＩＮＣ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で清浄にした。２μＬのＲＮＡ試料を８μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）および１０μＬのＲＮＡ試料緩衝液（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標）カタログ番号７０６０６；ＥＭＤ４  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）と混合した。試料を７０℃で３分間加熱し、室温に冷却し、１ウエル当たり５μＬ（１μＬ〜２μＬのＲＮＡを含む）をロードした。分子の大きさの比較のために市販のＲＮＡ分子量マーカーを同時に別個のウエルで実験にかけた。ゲルは、６０ボルトで２時間実験にかけた。
【０１７８】
標準化ｃＤＮＡライブラリーは、商業サービス提供会社（ＥＵＲＯＦＩＮＳ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によってランダムプライミングを用いて幼虫の全ＲＮＡから作製された。標準化幼虫ｃＤＮＡライブラリーは、ＥＵＲＯＦＩＮＳ  ＭＷＧ  ＯｐｅｒｏｎにおいてＧＳ  ＦＬＸ  ４５４  Ｔｉｔａｎｉｕｍ（商標）シリーズ化学により１／２プレートスケールで配列決定がなされ、これにより、３４８ｂｐの平均リード長を有する６００，０００を超えるリードが得られた。３５０，０００リードが５０，０００を超えるコンティグにアセンブルされた。非アセンブルリードおよびコンティグの両方が公開プログラムであるＦＯＲＭＡＴＤＢ（ＮＣＢＩから入手できる）を用いてＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースに変換された。
【０１７９】
他のＷＣＲ発育段階で集められた物質から全ＲＮＡおよび標準化ｃＤＮＡライブラリーが同様に作製された。様々な発育段階を代表するｃＤＮＡライブラリーメンバーを合わせることによって標的遺伝子スクリーニング用のプールされたトランスクリプトームライブラリーが構築された。
【０１８０】
ショウジョウバエ属（Drosophila）およびコクヌストモドキ（Tribolium）等の他の昆虫における特定の遺伝子の致死性ＲＮＡｉ効果に関する情報を用いてＲＮＡｉターゲティングのための候補遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、鞘翅目昆虫における生存および成長に必須であるという仮説が立てられた。選択された標的遺伝子ホモログが下記のようにトランスクリプトーム配列データーベースにおいて同定された。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成のための鋳型を作製するために標的遺伝子の全長または部分配列をＰＣＲにより増幅した。
【０１８１】
候補タンパク質コード配列を用いたＴＢＬＡＳＴＮ検索を非アセンブルジアブロティカ属（Diabrotica）配列リードまたはアセンブルコンティグを含むＢＬＡＳＴａｂｌｅデータベースに対して行った。ＢＬＡＳＴＸを用いてジアブロティカ属（Diabrotica）配列への有意なヒット（コンティグ相同性についてはｅ−２０より良好、非アセンブル配列リード相同性についてはｅ−１０より良好と定義）がＮＣＢＩ非冗長データベースに対して確認された。このＢＬＡＳＴＸ検索の結果は、ＴＢＬＡＳＴＮ検索で同定されたジアブロティカ属（Diabrotica）ホモログ候補遺伝子配列が実際にジアブロティカ属（Diabrotica）遺伝子を含んでいたか、またはジアブロティカ属（Diabrotica）配列に存在する非ジアブロティカ属（Diabrotica）候補遺伝子配列へのベストヒットであったことを確認するものであった。ほとんどの場合に、タンパク質をコードすると注釈をつけられたコクヌストモドキ（Tribolium）候補遺伝子は、ジアブロティカ属（Diabrotica）トランスクリプトーム配列における配列または複数の配列との明確な配列相同性を示した。少数の場合に、ジアブロティカ属（Diabrotica）コンティグの一部または非ジアブロティカ属（Diabrotica）候補遺伝子との相同性により選択された非アセンブル配列が重複していたこと、およびコンティグのアセンブリがこれらの重複に加わらなかったことが明らかであった。これらの場合、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ｖ４．９（ＧＥＮＥ  ＣＯＤＥＳ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて、配列をより長いコンティグにアセンブルした。
【０１８２】
ジアブロティカ属（Diabrotica）ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａをコードする候補標的遺伝子（配列番号１）は、鞘翅目害虫の死、成長の抑制、発育の抑制またはＷＣＲにおける生殖の抑制をもたらし得る遺伝子として同定された。
【０１８３】
ＷＣＲ  ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａとの相同性を有する遺伝子
ＣＯＰＩは、シスゴルジ膜上の発芽過程を阻害する特異的な外被タンパク質複合体を意味する（Nickel, et al. 2002. Journal of Cell Science 115, 3235-3240）。ＣＯＰＩコートマー複合体は、７つのサブユニットからなる。ＣＯＰＩ  ｃｏａｔｏｍｅｒ  ｄｅｌｔａは、サブユニットの１つである。該複合体の機能は、ゴルジ複合体のシス末端から小胞を、それらが最初に合成された、粗面小胞体に運び戻すことである。このドメインも含む他のジアブロティカ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera）タンパク質は、構造および／または機能特性を共有する可能性があり、したがって、これらのタンパク質の１つをコードする遺伝子は、鞘翅目害虫の死、成長の抑制、発育の抑制またはＷＣＲにおける生殖の抑制をもたらし得る候補標的遺伝子を含む可能性がある。
【０１８４】
配列番号１の配列は、新規である。該配列は、公開データベースに収載されておらず、国際公開第２０１１／０２５８６０号パンフレット、米国特許出願公開第２００７０１２４８３６号明細書、米国特許出願公開第２００９０３０６１８９号明細書、米国特許出願公開第２００７００５０８６０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１９２２６５号明細書、または米国特許第７，６１２，１９４号明細書に開示されていない。ＧＥＮＢＡＮＫにおける検索により見いだされた重要な相同ヌクレオチド配列は、存在しなかった。ジアブロティカ属（Diabrotica）ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号２）の最も近いホモログは、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＸＰ＿９６７７２５．２を有するコクヌストモドキ（Tribolium casetanum）タンパク質（９４％類似；相同性領域にわたり８５％同一）である。
【０１８５】
ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｄｓＲＮＡ導入遺伝子は、冗長ＲＮＡｉターゲティングおよび相乗的ＲＮＡｉ効果をもたらすために他のｄｓＲＮＡ分子と組み合わせることができる。ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａを標的とするｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニックコーンイベントは、トウモロコシ根切り虫による根の食害を防止するのに有用である。ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｄｓＲＮＡ導入遺伝子は、これらの根切り虫防除技術のいずれかに対して抵抗性の根切り虫集団の発生を軽減するための昆虫抵抗性管理遺伝子ピラミッドにおけるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属種またはシュードモナス（Pseudomonas）属種殺虫タンパク質技術との併用のための新たな作用機序を提示している。
【０１８６】
本明細書でＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａと呼ぶ、ジアブロティカ属（Diabrotica）候補遺伝子の配列の全長または部分クローンを用いて、ｄｓＲＮＡの合成のためのＰＣＲアンプリコンを得た。
【０１８７】
配列番号１は、ジアブロティカ属（Diabrotica）ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａの１５３９ｂｐ  ＤＮＡ配列を示す。
配列番号３は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ１の６７２ｂｐ  ＤＮＡ配列を示す。
配列番号４は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｖ１の１００ｂｐ  ＤＮＡ配列を示す。
【実施例３】
【０１８８】
ｄｓＲＮＡを産生するための標的遺伝子の増幅
各標的遺伝子のコード領域の一部をＰＣＲにより増幅するためにプライマーを設計した。表１を参照のこと。適切な場合、Ｔ７ファージプロモーター配列（ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ；配列番号５）を増幅センスまたはアンチセンス鎖の５’末端に取り込んだ。表１を参照のこと。全ＲＮＡをＷＣＲから抽出し、第一鎖ｃＤＮＡを、天然標的遺伝子配列のすべてまたは一部を増幅するために配置された対向プライマーを用いたＰＣＲ反応用の鋳型として用いた。ｄｓＲＮＡは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のコード領域（配列番号６；Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50）を含むＤＮＡクローンからも増幅した。
【０１８９】
【表１】
2017530712.tif 000006
【実施例４】
【０１９０】
ＲＮＡｉ構築物
ＰＣＲによる鋳型の調製およびｄｓＲＮＡ合成。
ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａおよびＹＦＰ  ｄｓＲＮＡの産生のための特定の鋳型を得るために用いた戦略を図１に示す。ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｄｓＲＮＡ合成に用いることを目的とした鋳型ＤＮＡは、表１におけるプライマー対およびＷＣＲ初齢幼虫から単離した全ＲＮＡから作製した（ＰＣＲ鋳型としての）第一鎖ｃＤＮＡを用いたＰＣＲにより作製した。各選択されたＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａおよびＹＦＰ標的遺伝領域について、ＰＣＲ増幅により、増幅センスおよびアンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入された（ＹＦＰセグメントは、ＹＦＰコード領域のＤＮＡクローンから増幅された）。所定の遺伝子の各領域のセンスおよびアンチセンス鎖の両方のそれらの５’末端にＴ７プロモーター配列を有するＰＣＲ産物をｄｓＲＮＡの生成のために用いた。図１を参照のこと。特定のプライマー対により増幅されたｄｓＲＮＡ鋳型の配列は、配列番号３（ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ１）、配列番号４（ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｖ１）およびＹＦＰ（配列番号６）であった。昆虫バイオアッセイ用の二本鎖ＲＮＡは、ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＮＡｉキットを用いて製造業者の指示（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に従って合成し、精製した。ｄｓＲＮＡの濃度は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定した。
【０１９１】
植物形質転換ベクターの構築
ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１）のセグメントを含むヘアピン形成のための標的遺伝子構築物を含むエントリーベクター（ｐＤＡＢ１１７２１４）は、化学合成断片の組合せ（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）および標準分子クローニング法を用いてアセンブルした。ＲＮＡ一次転写物による分子内ヘアピン形成は、互いに反対の方向のＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ標的遺伝子配列のセグメントの２つのコピーを配列すること（単一転写単位内に）によって促進したが、２つのセグメントは、ＳＴ−ＬＳ１イントロン配列（配列番号１３；Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50））により分離されている。したがって、一次ｍＲＮＡ転写物は、イントロン配列によって分離された、互いの大きな逆方向反復配列としての２つのＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ遺伝子セグメント配列を含む。トウモロコシユビキチン１プロモーターのコピー（米国特許第５，５１０，４７４号明細書）を一次ｍＲＮＡヘアピン転写物の生成を駆動するために用い、トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子の３’非翻訳領域を含む断片（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ  ｖ２；米国特許第６，６９９，９８４号明細書）をヘアピンＲＮＡ発現遺伝子の転写を終結させるために用いた。
【０１９２】
エントリーベクターｐＤＡＢ１１７２１４は、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号１）のセグメントを含むＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａヘアピンｖ１−ＲＮＡ構築物（配列番号１１）を含む。
【０１９３】
上述のエントリーベクターｐＤＡＢ１１７２１４は、一般的なバイナリーデスティネーションベクター（ｐＤＡＢ１０９８０５）との標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応に用いて、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介トウモロコシ胚形質転換用のＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａヘアピンＲＮＡ発現形質転換ベクター（それぞれｐＤＡＢ１１４５１５およびｐＤＡＢ１１５７７０）を生成した。
【０１９４】
ＹＦＰヘアピンｄｓＲＮＡを発現する遺伝子を含む、陰性対照バイナリーベクターｐＤＡＢ１１０８５３は、一般的なバイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５およびエントリーベクターｐＤＡＢ１０１６７０を用いた標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築した。エントリーベクターｐＤＡＢ１０１６７０は、（上記のような）トウモロコシユビキチン１プロモーターの発現制御下のＹＦＰヘアピン配列（配列番号１２）およびトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子の３’非翻訳領域を含む（上記のような）断片を含む。
【０１９５】
バイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５は、サトウキビ桿状バドナウイルス（ＳｃＢＶ）プロモーター（Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39:1221-30）の調節下の除草剤抵抗性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＡＡＤ−１  ｖ３）（米国特許第７８３８７３３号（Ｂ２）およびWright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5）を含む。トウモロコシ縞葉ウイルス（ＭＳＶ）外被タンパク質遺伝子５’ＵＴＲおよびトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）遺伝子のイントロン６の配列から構成されている、合成５’ＵＴＲ配列は、ＳＣＢＶプロモーターセグメントの３’末端とＡＡＤ−１コード領域の開始コドンとの間に配置する。トウモロコシリパーゼ遺伝子の３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；米国特許第７，１７９，９０２号明細書）を含む断片をＡＡＤ−１  ｍＲＮＡの転写を終結させるために用いた。
【０１９６】
ＹＦＰタンパク質を発現する遺伝子を含む、さらなる陰性対照バイナリーベクターｐＤＡＢ１０１５５６を、一般的なバイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ９９８９およびエントリーベクターｐＤＡＢ１００２８７を用いた標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築した。バイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ９９８９は、（上記のような）トウモロコシユビキチン１プロモーターの調節発現下の（上記のような）除草剤抵抗性遺伝子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＡＡＤ−１  ｖ３）およびトウモロコシリパーゼ遺伝子の３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；上記のような）を含む断片を含む。エントリーベクターｐＤＡＢ１００２８７は、（上記のような）トウモロコシユビキチン１プロモーターの発現制御下のＹＦＰコード領域（配列番号１４）およびトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子の３’非翻訳領域を含む（上記のような）断片を含む。
【０１９７】
配列番号１１は、ｐＤＡＢ１１７２２０に見いだされるＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａヘアピンｖ１−ＲＮＡ形成配列を示す。
【実施例５】
【０１９８】
候補標的遺伝子のスクリーニング
実施例２で同定された標的遺伝子配列を阻害するように設計された合成ｄｓＲＮＡは、飼料ベースのアッセイにおいてＷＣＲに投与した場合、死亡および成長阻害を引き起こした。ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ１およびＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｖ１は、スクリーニングした他のｄｓＲＮＡと比べて、このアッセイにおける有効性の著しい増加を示すことが認められた。
【０１９９】
反復したバイオアッセイで、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ１およびＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｖ１に由来するｄｓＲＮＡ調製物の摂取が、それぞれウェスタンコーンルートワーム幼虫の死亡および／または成長阻害をもたらしたことが示された。表２および表３にこれらのｄｓＲＮＡへの９日間の曝露後のＷＣＲ幼虫の飼料ベースの摂食バイオアッセイの結果、ならびに黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）コード領域（配列番号６）から調製したｄｓＲＮＡの陰性対照試料を用いて得られた結果を示す。表３に示した定量的特性について、示された値が一般的な値であることが当業者によって十分に理解されるべきである。これらの値は、環境により変化する可能性があり、したがって、実質的に同等である他の値も本開示の実施形態の範囲内にある。
【０２００】
【表２】
2017530712.tif 000007
【０２０１】
【表３】
2017530712.tif 000008
【０２０２】
ジアブロティカ属（Diabrotica）種の特定の遺伝子をＲＮＡｉ媒介昆虫防除に活用することができることは、以前に示唆された。９０６配列を開示している、米国特許出願公開第２００７／０１２４８３６号明細書および９１１２配列開示している、米国特許第７，６１４，９２４号明細書を参照のこと。しかし、ＲＮＡｉ媒介昆虫防除に有用性を有すると示唆された多くの遺伝子がジアブロティカ属（Diabrotica）の防除に有効でないことが判定された。配列ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇ１およびＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｖ１が、それぞれＲＮＡｉ媒介昆虫防除に有用性を有すると示唆された他の遺伝子と比較して、ジアブロティカ属（Diabrotica）の驚くべきかつ予期しない優れた防除をもたらすことも判定された。
【０２０３】
例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ２およびｍｔＲＰ−Ｌ４は、米国特許第７，６１２，１９４号明細書においてそれぞれＲＮＡｉ媒介昆虫防除に有効であることが示唆された。配列番号１５は、Ａｎｎｅｘｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ  １（Ｒｅｇ１）のＤＮＡ配列であり、配列番号１６は、Ａｎｎｅｘｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ  ２（Ｒｅｇ２）のＤＮＡ配列である。配列番号１７は、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ２  ｒｅｇｉｏｎ  １（Ｒｅｇ１）のＤＮＡ配列であり、配列番号１８は、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ２  ｒｅｇｉｏｎ  ２（Ｒｅｇ２）のＤＮＡ配列である。配列番号１９は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域１（Ｒｅｇ１）のＤＮＡ配列であり、配列番号２０は、ｍｔＲＰ−Ｌ４領域２（Ｒｅｇ２）のＤＮＡ配列である。ＹＦＰ配列（配列番号６）も陰性対照としてｄｓＲＮＡを生成するためにも用いた。
【０２０４】
前述の配列のそれぞれを実施例３の方法によりｄｓＲＮＡを生成するために用いた。ｄｓＲＮＡの生成のための特定の鋳型を得るために用いた戦略を図２に示す。ｄｓＲＮＡ合成に用いることを目的としたＤＮＡ鋳型は、表４におけるプライマー対およびＷＣＲ初齢幼虫から単離された全ＲＮＡから調製した第一鎖ｃＤＮＡ（ＰＣＲ鋳型としての）を用いてＰＣＲにより作製した。（ＹＦＰは、ＤＮＡクローンから増幅した。）それぞれの選択した標的遺伝子領域について、２回の別個のＰＣＲ増幅を実施した。第１のＰＣＲ増幅で、増幅センス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が導入された。第２の反応で、アンチセンス鎖の５’末端にＴ７プロモーター配列が取り込まれた。標的遺伝子の各領域の２つのＰＣＲ増幅断片をほぼ等量で混合し、混合物をｄｓＲＮＡの生成のための転写鋳型として用いた。図２を参照のこと。ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉキットを用いて製造業者の指示（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に従って二本鎖ＲＮＡを合成し、精製した。ｄｓＲＮＡの濃度をＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて測定し、ｄｓＲＮＡをそれぞれ上述の同じ飼料ベースのバイオアッセイにより試験した。表４にＹＦＰ、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｒｅｇ１、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｒｅｇ２、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ２  Ｒｅｇ１、Ｂｅｔａ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ２  Ｒｅｇ２、ｍｔＲＰ−Ｌ４  Ｒｅｇ１およびｍｔＲＰ−Ｌ４  Ｒｅｇ２  ｄｓＲＮＡ分子を生成するために用いたプライマーの配列を示す。図２に示した方法に用いるＹＦＰプライマー配列も表４に挙げる。表５にこれらのｄｓＲＮＡ分子への９日間の曝露後のＷＣＲ幼虫の飼料ベースのバイオアッセイの結果を示す。反復したバイオアッセイで、これらのｄｓＲＮＡの摂取がＴＥ緩衝液、水またはＹＦＰタンパク質の対照試料について認められたものを上回るウェスタンコーンルートワーム幼虫の死亡または成長阻害をもたらさなかったことが示された。
【０２０５】
【表４−１】
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【０２０６】
【表４−２】
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【０２０７】
【表５】
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【実施例６】
【０２０８】
殺虫ヘアピンｄｓＲＮＡを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換
植物ゲノムに安定に組み込まれたキメラ遺伝子の発現により１つまたは複数の殺虫ｄｓＲＮＡ分子（例えば、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ；配列番号１を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を産生するトランスジェニックトウモロコシ細胞、組織および植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換の後に生成した。スーパーバイナリーまたはバイナリー形質転換ベクターを用いるトウモロコシ形質転換法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３０４，６０４号明細書に記載されているように、当技術分野で公知である。形質転換組織は、ハロキシホップ含有培地上で成長するそれらの能力により選択し、適宜、ｄｓＲＮＡの産生についてスクリーニングした。そのような形質転換組織培養の一部は、実施例１で述べたように本質的に、バイオアッセイのために新生トウモロコシ根切り虫幼虫に与えることができる。
【０２０９】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始  上（実施例４）で述べたバイナリー形質転換ベクターｐＤＡＢ１１４５１５、ｐＤＡＢ１１５７７０、ｐＤＡＢ１１０８５３またはｐＤＡＢ１０１５５６を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株ＤＡｔ１３１９２細胞（国際公開第２０１２／０１６２２２号パンフレット）のグリセロールストックを適切な抗生物質を含むＡＢ最少培地プレート（Watson, et al., (1975) J. Bacteriol. 123:255-264）に画線接種し、２０℃で３日間成長させた。次いで、培養物を同じ抗生物質を含むＹＥＰプレート（ｇｍ／Ｌ；酵母エキス、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）に画線接種し、２０℃で１日間インキュベートした。
【０２１０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養
実験当日に、接種培地およびアセトシリンゴンを含む保存溶液を実験における構築物の数に対して適切な容積で調製し、滅菌済みの使い捨て２５０ｍＬフラスコにピペットで移した。接種培地（Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341）は、２．２ｇｍ／Ｌ ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン（Frame et al., ibid.）；６８．４ｇｍ／Ｌスクロース；３６ｇｍ／Ｌグルコース；１１５ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；および１００ｍｇ／Ｌミオイノシトールを含んでいた（ｐＨ５．４）。アセトシリンゴンを接種培地を含むフラスコに１００％ジメチルスルホキシド中１Ｍ保存溶液から２００μＭの最終濃度になるまで加え、溶液を十分に混合した。
【０２１１】
各構築物について、ＹＥＰプレートからのアグロバクテリウム（Agrobacterium）を満たした１または２接種ループを滅菌済みの使い捨て５０ｍＬ遠心管中の１５ｍＬの接種培地／アセトシリンゴン保存溶液に懸濁し、５５０ｎｍでの溶液の光学濃度（ＯＤ５５０）を測定した。次いで、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合物を用いて懸濁液を０．３〜０．４のＯＤ５５０に希釈した。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液の管を、室温で約７５ｒｐｍに設定したプラットフォーム振とう機上に水平にのせ、胚切開を実施しながら１〜４時間振とうした。
【０２１２】
穂の滅菌および胚の単離  トウモロコシ未熟胚を温室内で成長させたゼア・マイス（Zea mays）近交系Ｂ１０４の植物（Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406）から入手し、自家または近縁授粉して、穂を産生させた。穂は、授粉後約１０〜１２日目に収穫した。実験日に、脱殻した穂を層流フード内で市販の漂白剤（ＵＬＴＲＡ  ＣＬＯＲＯＸ（登録商標）殺菌漂白剤、６．１５％次亜塩素酸ナトリウム；２滴のＴＷＥＥＮ２０を含む）の２０％溶液中に浸漬し、２０〜３０分間振とうした後、滅菌脱イオン水で３回すすぐことによって表面滅菌した。未熟接合胚（１．８〜２．２ｍｍ長）を各穂から無菌的に切り離し、２００μＭアセトシリンゴンを含む液体接種培地中適切なアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の２．０ｍＬ懸濁液を含む小遠心管に無作為に分配し、２μＬの１０％ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤（ＥＶＯＮＩＫ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ；Ｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。所与のセットの実験について、プールした穂由来の胚を各形質転換に使用した。
【０２１３】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養
単離後、胚をロッカープラットフォーム上に５分間置いた。次いで、管の内容物を、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌスクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／Ｌジカンバ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸または３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；ＤＭＳＯ中２００μＭアセトシリンゴン；および３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）を含むｐＨ５．８の共培養培地のプレート上に注いだ。液体アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を滅菌済みの使い捨てホールピペットにより除去した。次いで、胚を、顕微鏡を活用して滅菌済み鉗子を用いて胚盤を上向きにして配向させた。プレートを閉じ、３Ｍ（商標）ＭＩＣＲＯＰＯＲＥ（商標）医療用テープで密封し、約６０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光合成有効放射（ＰＡＲ）の連続光を用いた２５℃のインキュベーターに入れた。
【０２１４】
カルスの選択およびトランスジェニックイベントの再生  共培養期間の後、胚を、４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌスクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／Ｌジカンバ；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰＨＹＴＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＡＢＲ；Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）；２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン；および２．３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）から構成されていたｐＨ５．８の静止培地に移した。３６以下の胚を各プレートに除去した。プレートを透明プラスチックボックスに入れ、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で７〜１０日間インキュベートした。次いで、カルス化胚を、１００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．０３６２ｍｇ／Ｌ；ＡＡＤ−１遺伝子を含むカルスの選択用）を含む（上記）静止培地から構成されていた、選択培地１上に移した（＜１８／プレート）。プレートを透明ボックスに戻し、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で７日間インキュベートした。次いで、カルス化胚を、５００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．１８１ｍｇ／Ｌ）を含む（上記）静止培地から構成されていた、選択培地ＩＩ上に移した（＜１２／プレート）。プレートを透明ボックスに戻し、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で１４日間インキュベートした。この選択ステップは、トランスジェニックカルスがさらに増殖し、分化することを可能とした。
【０２１５】
増殖性の胚発生カルスを再生前培地に移した（＜９／プレート）。再生前培地は、ｐＨ５．８で４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；４５ｇｍ／Ｌスクロース；３５０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；５０ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物；１．０ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．２５ｇｍ／Ｌ  ＭＥＳ；ＮａＯＨ中０．５ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸；エタノール中２．５ｍｇ／Ｌアブシジン酸；１ｍｇ／Ｌ  ６−ベンジルアミノプリン；２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリン；２．５ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＺＡＮ（商標）；および０．１８１ｍｇ／Ｌ  Ｒ−ハロキシホップ酸を含んでいた。プレートを透明ボックス中に保存し、約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲの連続光を用いて２７℃で７日間インキュベートした。次いで、再生カルスをＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（商標）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）中の再生培地に移し（＜６／プレート）、１日当たり１６時間点灯／８時間消灯（約１６０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲで）で２８℃で１４日間または芽条および根が発生するまでインキュベートした。再生培地は、ｐＨ５．８で４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；６０ｇｍ／Ｌスクロース；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１２５ｍｇ／Ｌカルベニシリン；３ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＬＡＮ（商標）ゴム；および０．１８１ｍｇ／Ｌ  Ｒ−ハロキシホップ酸を含んでいた。次いで、一次根付きの小芽条を単離し、選択せずに伸長培地に移した。伸長培地は、ｐＨ５．８で４．３３ｇｍ／Ｌ  ＭＳ塩；１Ｘ  ＩＳＵ修飾ＭＳビタミン；３０ｇｍ／Ｌスクロース；および３．５ｇｍ／Ｌ  ＧＥＬＲＩＴＥ（商標）を含んでいた。
【０２１６】
ハロキシホップを含む培地上で成長するそれらの能力により選択した形質転換植物の芽条をＰＨＹＴＡＴＲＡＹＳ（商標）から成長培地（ＰＲＯＭＩＸ  ＢＸ；ＰＲＥＭＩＥＲ  ＴＥＣＨ  ＨＯＲＴＩＣＵＬＴＵＲＥ）を満たした小ポットに移植し、カップまたはＨＵＭＩ−ＤＯＭＥＳ（ＡＲＣＯ  ＰＬＡＳＴＩＣＳ）で覆い、次いで、ＣＯＮＶＩＲＯＮ成長チャンバー（２７℃昼間／２４℃夜間、１６時間明期、５０〜７０％ＲＨ、２００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１ＰＡＲ）内で環境に順化させた。場合によっては、推定トランスジェニック小植物を、トウモロコシゲノムに組み込まれたＡＡＤ１除草剤耐性遺伝子を検出するように設計されたプライマーを用いた定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにより導入遺伝子相対コピー数について解析した。さらに、ＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイを用いて、推定形質転換体の発現ｄｓＲＮＡにおけるＳＴ−ＬＳ１イントロン配列の存在を検出した。次いで、選択された形質転換小植物をさらなる成長および試験のために温室に移した。
【０２１７】
バイオアッセイおよび種子生産のための温室におけるＴ０植物の移動および樹立
植物がＶ３−Ｖ４段階に達した場合、それらをＩＥ  ＣＵＳＴＯＭ  ＢＬＥＮＤ（ＰＲＯＦＩＬＥ／ＭＥＴＲＯ  ＭＩＸ  １６０）土壌ミックスに移植し、温室内（光曝露の種類：光または同化；高照度限界：１２００ＰＡＲ；日照時間１６時間；２７℃昼間／２４℃夜間）で開花まで成長させた。
【０２１８】
昆虫バイオアッセイに用いるための植物を小ポットからＴＩＮＵＳ（商標）３５０−４  ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）（ＳＰＥＮＣＥＲ−ＬＥＭＡＩＲＥ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ、Ａｃｈｅｓｏｎ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）に移植した（ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）のイベントにつき１つの植物体）。ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）に移植してから約４日後に、バイオアッセイのために植物に外寄生させた。
【０２１９】
非トランスジェニックエリート近交系Ｂ１０４の植物または他の適切な花粉ドナーから採取した花粉をＴ０トランスジェニック植物のひげに授粉することにより、Ｔ１世代の植物を得た。可能な場合、逆交配も実施した。
【実施例７】
【０２２０】
トランスジェニックトウモロコシ組織の分子解析
トウモロコシ組織の分子解析（例えば、ＲＮＡ  ｑＰＣＲ）は、根の食害を評価したのと同じ日に温室成長植物から採取した葉および根の試料について実施した。
【０２２１】
Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲのＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイの結果は、ヘアピン導入遺伝子の発現をバリデートするために用いた。（内因性Ｐｅｒ５遺伝子の発現がトウモロコシ組織に通常存在するので、非形質転換トウモロコシ植物で低レベルのＰｅｒ５  ３’ＵＴＲの検出が予想される。）発現ＲＮＡにおけるＳＴ−ＬＳ１イントロン配列（ｄｓＲＮＡヘアピン分子の形成に不可欠である）のＲＮＡ  ｑＰＣＲアッセイの結果は、ヘアピン転写物の存在をバリデートするために用いた。導入遺伝子ＲＮＡレベルは、内因性トウモロコシ遺伝子のＲＮＡ発現レベルと比較して測定した。
【０２２２】
ゲノムＤＮＡにおけるＡＡＤ１コード領域の一部を検出するためのＤＮＡ  ｑＰＣＲ解析は、導入遺伝子挿入配列のコピー数を推定するために用いた。これらの解析用の試料は、環境チャンバー内で成長した植物から採取した。結果を単一コピー天然遺伝子の一部を検出するように設計されたアッセイのＤＮＡ  ｑＰＣＲ結果と比較し、単純イベント（ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ導入遺伝子の１つまたは２つのコピーを有する）を温室内のさらなる試験に進めた。
【０２２３】
さらに、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子（ＳｐｅｃＲ；Ｔ−ＤＮＡの外側のバイナリーベクタープラスミド上に存在）の一部を検出するように設計されたｑＰＣＲアッセイを用いて、トランスジェニック植物が外来組込みプラスミド主鎖配列を含んでいたかどうかを判断した。
【０２２４】
ヘアピンＲＮＡ転写物発現レベル：Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲのｑＰＣＲ
カルス細胞イベントまたはトランスジェニック植物をＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ配列のリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析して、ＴＩＰ４ｌ様タンパク質（すなわち、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＴ４Ｇ３４２７０のマイスホモログ；７４％同一性のｔＢＬＡＳＴＸスコアを有する）をコードする、内部トウモロコシ遺伝子（配列番号４９；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＴ０６９７３４）の転写物レベルと比較した、全長ヘアピン転写物の相対発現レベルを決定した。ＲＮＡは、ＲＮＡＥＡＳＹ（商標）９６キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて単離した。溶出後、全ＲＮＡをキットの提案プロトコールによるＤＮＡｓｅｌ処理にかけた。次いで、ＲＮＡをＮＡＮＯＤＲＯＰ８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で定量し、濃度を２５ｎｇ／μＬに対して標準化した。第一鎖ｃＤＮＡは、製造業者の推奨プロトコールに実質的に従って、５μＬ変性ＲＮＡを含む１０μＬ反応容積でＨＩＧＨ  ＣＡＰＡＣＩＴＹ  ｃＤＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＫＩＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて作製した。複合ランダムプライマーおよびオリゴｄＴの作業ストックを調製するために、ランダムプライマーストックミックスの１ｍＬ管への１０μＬの１００μＭ  Ｔ２０ＶＮオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）（配列番号５０；ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ、ここで、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕである）の添加を含めるように、プロトコールをわずかに修正した。
【０２２５】
ｃＤＮＡ合成の後に、試料をヌクレアーゼ不含有水で１：３に希釈し、アッセイに供するまで−２０℃で保存した。
【０２２６】
Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲおよびＴＩＰ４ｌ様転写物の別個のリアルタイムＰＣＲアッセイは、１０μＬ反応容積でＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）４８０（ＲＯＣＨＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて実施した。Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲアッセイについては、反応は、Ｐ５Ｕ７６Ｓ（Ｆ）（配列番号５１）およびＰ５Ｕ７６Ａ（Ｒ）（配列番号５２）プライマーならびにＲＯＣＨＥ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＲＯＢＥ（商標）（ＵＰＬ７６；カタログ番号４８８９９６０００１；ＦＡＭで標識した）を用いて行った。ＴＩＰ４ｌ様参照遺伝子アッセイについては、ＴＩＰｍｘＦ（配列番号５３）およびＴＩＰｍｘＲ（配列番号５４）プライマーおよびＨＥＸ（ヘキサクロロフルオロセイン）で標識したＨＸＴＩＰプローブ（配列番号５５）を用いた。
【０２２７】
すべてのアッセイに無鋳型（ミックスのみ）の陰性対照を含めた。標準曲線のために、試料の交差汚染の有無を確認するためにブランク（ソースウエル中水）もソースプレートに含めた。プライマーおよびプローブ配列を表６に示す。様々な転写物の検出のための反応成分処方を表７に開示し、ＰＣＲ反応条件を表８に要約する。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセインアミダイト）蛍光部分を４６５ｎｍで励起し、５１０ｎｍで蛍光を測定した。ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオロセイン）蛍光部分の対応する値は、５３３ｎｍおよび５８０ｎｍであった。
【０２２８】
【表６】
2017530712.tif 000012
【０２２９】
【表７】
2017530712.tif 000013
【０２３０】
【表８】
2017530712.tif 000014
【０２３１】
データは、供給業者の推奨に従ってＣｑ値の計算のための二次微分最大値アルゴリズムを用いた相対的定量によりＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）ソフトウエアｖ１．５を用いて解析した。発現解析については、発現値は、最適化ＰＣＲ反応について産物がサイクルごとに倍加するという仮定のもとに２の基準値が選択される、２つの標的間のＣｑ値の差の比較に依拠する、ΔΔＣｔ法（すなわち、２−（Ｃｑ  ＴＡＲＧＥＴ−Ｃｑ  ＲＥＦ））を用いて計算した。
【０２３２】
ヘアピン転写物のサイズおよび完全性：ノーザンブロットアッセイ
場合によって、ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａヘアピン  ｖ１  ｄｓＲＮＡを発現するトランスジェニック植物におけるＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａヘアピン  ｖ１  ＲＮＡの分子サイズを測定するためのノーザンブロット（ＲＮＡブロット）解析を用いることにより、トランスジェニック植物のさらなる分子的特徴付けが得られる。
【０２３３】
すべての材料および装置は、使用前にＲＮＡＺＡＰ（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）により処理する。組織試料（１００ｍｇ〜５００ｍｇ）は、２ｍＬ  ＳＡＦＥＬＯＣＫ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ管に採取し、１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中３個のタングステンビーズを含むＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機（ＧＡＲＣＩＡ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて５分間破壊し、次いで、室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。場合によって、試料を４℃で１１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を新しい２ｍＬ  ＳＡＦＥＬＯＣＫ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ管に移す。２００μＬのクロロホルムをホモジネートに加えた後、管を反転により２〜５分間混合し、室温で１０分間インキュベートし、４℃で１２，０００ｘｇで１５分間遠心分離する。上相を滅菌済みの１．５ｍＬ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ管に移し、６００μＬの１００％イソプロパノールを加えた後、室温で１０分〜２時間インキュベートし、次いで、４〜２５℃で１２，０００ｘｇで１０分間遠心分離する。上清を捨て、ＲＮＡペレットを１ｍＬの７０％エタノールで２回洗浄し、洗浄の間に４℃〜２５℃で７，５００ｘｇで１０分間遠心分離する。エタノールを捨て、ペレットを、５０μＬのヌクレアーゼ不含有水に再懸濁する前に３〜５分間短く風乾する。
【０２３４】
全ＲＮＡをＮＡＮＯＤＲＯＰ  ８０００（登録商標）（ＴＨＥＲＭＯ−ＦＩＳＨＥＲ）を用いて定量し、試料を５μｇ／１０μＬに標準化した。次いで、１０μＬのグリオキサール（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を各試料に加える。５〜１４ｎｇのＤＩＧ  ＲＮＡ標準マーカーミックス（ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を分配し、等容積のグリオキサールに加える。試料およびマーカーＲＮＡを５０℃で４５分間変性し、ＮＯＲＴＨＥＲＮＭＡＸ１０Ｘグリオキサールランニング緩衝液（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中１．２５％  ＳＥＡＫＥＭ  ＧＯＬＤアガロース（ＬＯＮＺＡ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）ゲル上にロードするまで、氷上で保存する。ＲＮＡは、６５ボルト／３０ｍＡで２時間１５分間の電気泳動により分離する。
【０２３５】
電気泳動の後、ゲルを２Ｘ  ＳＳＣで５分間すすぎ、ＧＥＬ  ＤＯＣステーション（ＢＩＯＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で撮像し、次いで、１０Ｘ  ＳＳＣを転移緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウムおよび３００ｍＭクエン酸三ナトリウムからなる２０Ｘ  ＳＳＣ、ｐＨ７．０）として用いてＲＮＡをナイロン膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に室温で一夜受動的に転移させる。転移後、膜を２Ｘ  ＳＳＣで５分間すすぎ、ＲＮＡを膜（ＡＧＩＬＥＮＴ／ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）にＵＶ架橋し、膜を室温で最長２日間乾燥する。
【０２３６】
膜をＵＬＴＲＡＨＹＢ緩衝液（ＡＭＢＩＯＮ／ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中で１〜２時間プレハイブリダイズする。プローブは、ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＤＩＧ法によりジゴキシゲニンで標識された対象の配列（適宜、例えば、配列番号１１のアンチセンス配列部分）を含むＰＣＲ増幅産物からなっている。推奨緩衝液中のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション管中６０℃の温度で一夜である。ハイブリダイゼーションの後、ブロットをＤＩＧ洗浄にかけ、包み、フィルムに１〜３０分間曝露し、次いで、フィルムを現像するが、すべてがＤＩＧキットの供給業者により推奨された方法による。
【０２３７】
導入遺伝子コピー数の決定。
２回の葉のパンチにほぼ相当するトウモロコシ葉片を９６ウエルコレクションプレート（ＱＩＡＧＥＮ）に収集した。組織の破壊は、１個のステンレススチールビーズを含むＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６ＡＰ１溶解緩衝液（ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６ＰＬＡＮＴ  ＫＩＴ；ＱＩＡＧＥＮから供給）中でＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機（ＧＡＲＣＩＡ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて実施した。組織の温浸の後、ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６ＰＬＡＮＴ  ＫＩＴおよびＢＩＯＳＰＲＩＮＴ９６抽出ロボットを用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を高処理式で単離した。ゲノムＤＮＡは、ｑＰＣＲ反応を始める前に２：３  ＤＮＡ：水に希釈した。
【０２３８】
ｑＰＣＲ解析
加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子検出は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムを用いてリアルタイムＰＣＲにより実施した。ＳＴ−ＬＳ１イントロン配列（配列番号１３）を検出するために、またはＳｐｅｃＲ遺伝子の一部（すなわち、バイナリーベクタープラスミド上で運ばれるスペクチオマイシン抵抗性遺伝子；配列番号６７；表９におけるＳＰＣ１オリゴヌクレオチド）を検出するために加水分解プローブアッセイに用いるオリゴヌクレオチドは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）  ＰＲＯＢＥ  ＤＥＳＩＧＮ  ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ２．０を用いて設計した。さらに、ＡＡＤ−１除草剤耐性遺伝子のセグメント（配列番号６１；表９におけるＧＡＡＤ１オリゴヌクレオチド）を検出するために加水分解プローブアッセイに用いるオリゴヌクレオチドは、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳソフトウエア（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて設計した。表９にプライマーおよびプローブの配列を示す。アッセイは、各アッセイにおいてｇＤＮＡが存在していたことを保証するための内部参照配列としての役割を果たした、内因性トウモロコシ染色体遺伝子（インベルターゼ（配列番号５８；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｕ１６１２３；ここでＩＶＲ１と呼ぶ）用試薬を用いて多重化した。増幅のために、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含む１０μＬ容積多重反応においてＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０  ＰＲＯＢＥＳ  ＭＡＳＴＥＲミックス（ＲＯＣＨＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を１ｘ最終濃度で調製した（表１０）。表１１に概要を示すように２段階増幅反応を実施した。ＦＡＭおよびＨＥＸ標識プローブの発蛍光団の活性化および発光は、上述の通りであり、ＣＹ５コンジュゲートは、６５０ｎｍで最大限に励起され、６７０ｎｍで最大限に蛍光を発する。
【０２３９】
Ｃｐスコア（蛍光シグナルがバックグラウンド閾値に交差する点）は、フィットポイントアルゴリズム（ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＳＯＦＴＷＡＲＥリリース１．５）およびＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔモジュール（ΔΔＣｔ法に基づく）を用いてリアルタイムＰＣＲデータから決定した。データは、上述のように処理した（上；ＲＮＡ  ｑＰＣＲ）。
【０２４０】
【表９】
2017530712.tif 000015
【０２４１】
【表１０】
2017530712.tif 000016
【０２４２】
【表１１】
2017530712.tif 000017
【実施例８】
【０２４３】
トランスジェニックトウモロコシのバイオアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ昆虫バイオアッセイ
植物細胞中で生成する対象発明のｄｓＲＮＡの生物活性は、バイオアッセイ法によって示される。例えば、Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326を参照のこと。例えば、殺虫ｄｓＲＮＡを生成する植物に由来する様々な植物組織または組織片を制御された摂食環境における標的昆虫に与えることによって、有効性を示すことができる。あるいは、殺虫ｄｓＲＮＡを生成する植物に由来する様々な植物組織から抽出物を調製し、抽出された核酸を本明細書で前述したようにバイオアッセイのための人工飼料の上に分配して加える。そのような摂食アッセイの結果は、殺虫ｄｓＲＮＡを生成しない宿主植物の適切な対照組織を用いる同様に実施されたバイオアッセイと、または他の対照試料と比較する。
【０２４４】
トランスジェニックトウモロコシイベントを用いた昆虫バイオアッセイ
洗浄卵から孵化した２匹のウェスタンコーンルートワーム幼虫（１〜３日齢）を選択し、バイオアッセイトレーの各ウエルに入れる。次いで、ウエルを「ＰＵＬＬ  Ｎ’  ＰＥＥＬ」タブカバー（ＢＩＯ−ＣＶ−１６、ＢＩＯ−ＳＥＲＶ）で覆い、１８時間／６時間  明／暗サイクルとした２８℃インキュベーターに入れた。最初の外寄生の９日後に、各処理における昆虫の総数のうちの死亡昆虫の百分率と計算される、死亡率について幼虫を評価した。昆虫試料を−２０℃で２日間凍結し、次いで、各処理の昆虫の幼虫をプールし、体重を測定する。成長阻害の百分率は、２つの対照ウエル処理の平均体重の平均値によって割った実験処理の平均体重として計算する。データは、成長阻害百分率（陰性対照の）として表す。対照平均体重を超える平均体重は、ゼロに標準化する。
【０２４５】
温室内の昆虫バイオアッセイ
ウェスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Diabrotica virgifera virgifera）ルコント）卵は、ＣＲＯＰ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から土壌入りで受領した。ＷＣＲ卵を２８℃で１０〜１１日間インキュベートした。土壌からの卵を洗浄し、０．１５％寒天溶液中に入れ、濃度を０．２５ｍＬアリコート当たり約７５〜１００個の卵に調整した。孵化速度をモニターするために卵懸濁液のアリコートを用いて孵化プレートをペトリ皿中にセットした。
【０２４６】
ＲＯＯＴＲＡＩＮＥＲＳ（登録商標）中で成育中のトウモロコシ植物体の周囲の土壌に１５０〜２００個のＷＣＲ卵を外寄生させた。昆虫に２週間摂食させ、その後、「根評点付け」を各植物に対して行った。Oleson et al.（2005, J. Econ. Entomol. 98:1-8）に本質的に準拠して等級付けに節損傷評価基準（Node-Injury Scale）を用いた。このバイオアッセイに合格した植物を種子生産のために５ガロンのポットに移植した。移植した植物を殺虫剤で処理して、さらなる根切り虫被害および温室内の昆虫の放出を防止した。種子生産のために植物に人工授粉した。これらの植物により産生された種子は、Ｔ１および植物のその後の世代における評価のために残した。
【０２４７】
温室バイオアッセイに２種の陰性対照植物を含めた。トランスジェニック陰性対照植物は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）またはＹＦＰヘアピンｄｓＲＮＡを産生するように設計された遺伝子を含むベクターによる形質転換により生成した（実施例４参照）。非形質転換陰性対照植物は、７ｓｈ３８２またはＢ１０４系の種子から成長させた。バイオアッセイを２つの別個の日に実施し、陰性対照を各組の植物物質に含めた。
【０２４８】
表１２にＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａヘアピン植物の分子解析およびバイオアッセイの組み合わせた結果を示す。表１２に要約したバイオアッセイの結果の検討により、例えば、配列番号１１に例示されるような、配列番号１のセグメントを含むＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａヘアピンｄｓＲＮＡを発現する構築物を含むトランスジェニックトウモロコシ植物の大多数がウェスタンコーンルートワームの幼虫の摂食によって招かれる根の損傷から保護されるという驚くべきかつ予期しない所見が明らかになる。３７の等級付けしたイベントのうちの２２が０．５以下の根評点を有していた。表１３に陰性対照植物の分子解析およびバイオアッセイの組み合わせた結果を示す。３４の等級付けした植物のうちの５つが０．７５以下の根評点を有していたが、ほとんどの植物がＷＣＲ幼虫摂食からの保護を有さなかった。陰性対照植物の組における低い根評点付けスコアを有するいくつかの植物の存在が時として認められ、温室環境でのこの種のバイオアッセイの変動および実施することの困難を反映している。
【０２４９】
【表１２】
2017530712.tif 000018
【０２５０】
【表１３−１】
2017530712.tif 000019
【０２５１】
【表１３−２】
2017530712.tif 000020
【０２５２】
【表１３−３】
2017530712.tif 000021
【実施例９】
【０２５３】
鞘翅目害虫配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
１０〜２０のトランスジェニックＴ０ゼア・マイス（Zea mays）植物を実施例６で述べたように生成する。ＲＮＡｉ構築物のヘアピンｄｓＲＮＡを発現するさらなる１０〜２０のＴ１ゼア・マイス（Zea mays）独立系をトウモロコシ根切り虫チャレンジのために得る。配列番号１１に示す、または他の場合さらに配列番号１を含む、ヘアピンｄｓＲＮＡが得られ得る。さらなるヘアピンｄｓＲＮＡは、例えば、Ｃａｆｌ−１８０（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５８号明細書）、ＶａｔｐａｓｅＣ（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２５９号明細書）、Ｒｈｏ１（米国特許出願公開第２０１２／０１７４２６０号明細書）、ＶａｔｐａｓｅＨ（米国特許出願公開第２０１２／０１９８５８６号明細書）、ＰＰＩ−８７Ｂ（米国特許出願公開第２０１３／００９１６００号明細書）、ＲＰＡ７０（米国特許出願公開第２０１３／００９１６０１号明細書）またはＲＰＳ６（米国特許出願公開第２０１３／００９７７３０号明細書）等の鞘翅目害虫配列から得られ得る。これらは、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の分子解析法により確認される。選択される独立Ｔ１系からの全ＲＮＡ調製物は、任意選択的に、ＲＮＡｉ構築物のそれぞれにおけるヘアピン発現カセットのＳＴ−ＬＳ１イントロンに結合するように設計されたプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲに用いられる。さらに、ＲＮＡｉ構築物における各標的遺伝子に対する特異的プライマーは、任意選択的に、植物体におけるｓｉＲＮＡ生成に必要なプロセシング前（pre-processed）ｍＲＮＡを増幅し、その生成を確認するために用いられる。各標的遺伝子の所望のバンドの増幅により、各トランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物におけるヘアピンＲＮＡの発現が確認される。標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセシングは、任意選択的に、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを用いて独立トランスジェニック系においてその後確認される。
【０２５４】
さらに、標的遺伝子との８０％を超える配列同一性を有するミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子との１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子について認められるものと同様の仕方でトウモロコシ根切り虫に作用する。同じＲＮＡｉ構築物におけるヘアピンｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列との対合により、摂食鞘翅目害虫の成長、発育および生存能力に影響を及ぼすことができる植物処理ｓｉＲＮＡがもたらされる。
【０２５５】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの植物体への送達および摂食による鞘翅目害虫によるその後の取込みにより、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる鞘翅目害虫における標的遺伝子の下方制御がもたらされる。標的遺伝子の機能が発育の１つまたは複数の段階で重要である場合、鞘翅目害虫の成長、発育および生殖が影響を受け、ＷＣＲ、ＮＣＲ、ＳＣＲ、ＭＣＲ、Ｄ．バルテアタ（D. balteata）ルコント、Ｄ．ｕ．テネラ（D. u. tenella）およびＤ．ｕ．ウンデシムプンクタータ（D. u. undecimpunctata）マンネルヘイムの少なくとも１つの場合、外寄生し、摂食し、発育し、かつ／または生殖することの不成功につながるか、あるいは鞘翅目害虫の死につながる。次いで、鞘翅目害虫を防除するために、標的遺伝子の選択およびＲＮＡｉの成功裏での適用を用いる。
【０２５６】
トランスジェニックＲＮＡｉ系および非形質転換ゼア・マイス（Zea mays）の表現型比較  ヘアピンｄｓＲＮＡを創製するために選択した標的鞘翅目害虫遺伝子または配列は、あらゆる公知の植物遺伝子配列との類似性がない。したがって、これらの鞘翅目害虫遺伝子または配列を標的とする構築物による（全身性）ＲＮＡｉの生成または活性化は、トランスジェニック植物に対してあらゆる有害な影響を及ぼすことは、予想されない。しかし、トランスジェニック系の発育および形態特性を非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有さない「空」のベクターにより形質転換したトランスジェニック系の植物と比較する。植物の根、芽条、茎葉および生殖特性を比較する。トランスジェニック植物および非形質転換植物の根の長さおよび成長パターンに観察可能な差はない。高さ等の植物の芽条の特性、葉の数およびサイズ、開花時期、花のサイズおよび外観は、同様である。温室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび土壌中で栽培した場合、一般的に、トランスジェニック系と標的ｉＲＮＡ分子の発現のないものとの間に観察可能な形態の差はない。
【実施例１０】
【０２５７】
鞘翅目害虫配列およびさらなるＲＮＡｉ構築物を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
鞘翅目害虫以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物を、１つまたは複数の殺虫ｄｓＲＮＡ分子（例えば、配列番号１を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）を生成するようにアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）方法論（Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67参照）により二次的に形質転換する。実施例４に述べたように本質的に調製される植物形質転換プラスミドベクターを、鞘翅目害虫以外の生物を標的とするｉＲＮＡ分子に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックＨｉ  ＩＩまたはＢ１０４ゼア・マイス（Zea mays）植物から得られたトウモロコシ懸濁細胞または未熟トウモロコシ胚にアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換法により送達する。
【実施例１１】
【０２５８】
ＲＮＡｉ構築物およびさらなる鞘翅目害虫防除配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
鞘翅目害虫生物を標的とするｉＲＮＡ分子（例えば、配列番号１を含む遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子を含む少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子）に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物を、１つまたは複数の殺虫タンパク質分子、例えば、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ７Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９Ｄ、Ｃｒｙ１４、Ｃｒｙ１８、Ｃｒｙ２２、Ｃｒｙ２３、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３６、Ｃｒｙ３７、Ｃｒｙ４３、Ｃｒｙ５５、Ｃｙｔ１Ａ、およびＣｙｔ２Ｃ殺虫タンパク質を生成するようにアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）方法論（Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67参照）により二次的に形質転換する。実施例４に述べたように本質的に調製される植物形質転換プラスミドベクターを、鞘翅目害虫生物を標的とするｉＲＮＡ分子に転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックＢ１０４ゼア・マイス（Zea mays）植物から得られたトウモロコシ懸濁細胞または未熟トウモロコシ胚にアグロバクテリウム（Agrobacterium）またはＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換法により送達する。鞘翅目害虫の防除のためのｉＲＮＡ分子および殺虫タンパク質を生成する二重形質転換植物が得られる。
【実施例１２】
【０２５９】
ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ＲＮＡｉ注入後のネオトロピカルブラウンスティンクバグ（エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros））の死亡
ネオトロピカルブラウンスティンクバグ（ＢＳＢ；エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros））は、６５％の相対湿度、１６：８時間明：暗サイクルの２７℃インキュベーター中で飼育した。２〜３日間にわたって採取した１グラムの卵を底に濾紙ディスクを備えた５Ｌ容器に播種し、換気のために容器を＃１８網で覆った。各飼育容器で約３００〜４００匹の成体ＢＳＢが得られた。すべての段階で、昆虫に週３回新鮮なサヤマメを与え、ヒマワリ種子、ダイズおよびラッカセイ（３：１：１重量比）を含む種子混合物の小袋を週１回交換した。ウィックとしての綿プラグを入れたバイアルに水を補給した。最初の２週間の後に、昆虫を週１回新しい容器に移した。
【０２６０】
ＢＳＢ人工飼料
以下のように調製したＢＳＢ人工飼料（調製してから２週間以内に用いた）。凍結乾燥サヤマメをＭＡＧＩＣ  ＢＵＬＬＥＴ（登録商標）配合機で微粉末まで配合し、一方、生（有機）落花生を別個のＭＡＧＩＣ  ＢＵＬＬＥＴ（登録商標）配合機で配合した。配合乾燥成分は、蓋をし、十分に振とうして成分を混合した、大規模ＭＡＧＩＣ  ＢＵＬＬＥＴ（登録商標）配合機で混ぜ合わせた（重量百分率：サヤマメ３５％、落花生３５％、スクロース５％、複合ビタミン（昆虫用Ｖａｎｄｅｒｚａｎｔ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、カタログ番号Ｖ１００７）０．９％）。次いで、混合した乾燥成分を混合ボウルに加えた。別個の容器中で、水およびベノミル抗真菌剤（５０ｐｐｍ；２５μＬの２００００ｐｐｍ溶液／５０ｍＬ飼料溶液）を十分に混合し、次いで乾燥成分混合物に加えた。溶液が十分に配合されるまで、すべての成分を手により混合した。飼料を所望の大きさに成形し、アルミニウムフォイルで緩やかに包み、６０℃で４時間加熱し、次いで冷却し、４℃で保存した。
【０２６１】
ＲＮＡｉ標的選択
ＢＳＢの発育の６段階をｍＲＮＡライブラリーの作製のために選択した。全ＲＮＡは、−７０℃で凍結し、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ）上Ｌｙｓｉｎｇ  ＭＡＴＲＩＸ  Ａ  ２ｍＬ管（ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）中１０容積のＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液中でホモジナイズした昆虫から抽出した。全ｍＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従ってｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＭＢＩＯＮ；ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて抽出した。ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＨｉＳｅｑ（商標）システム（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いたＲＮＡ配列決定により、ＲＮＡｉ昆虫防除技術に用いる候補標的遺伝子配列が得られた。ＨｉＳｅｑ（商標）により、６つの試料で合計で約３億７千８百万リードが得られた。ＴＲＩＮＩＴＹアセンブラーソフトウエア（Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652）を用いて各試料についてリードを個別にアセンブルした。アセンブルした転写物を組み合わせて、プールされたトランスクリプトームを生成した。このＢＳＢプールトランスクリプトームは、３７８，４５７配列を含む。
【０２６２】
ＢＳＢ  ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａオルソログの同定
ショウジョウバエ属（Drosophila）ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａタンパク質αＣＯＰ−ＰＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿００１１６２６４２）をクエリー配列として用いてＢＳＢプールトランスクリプトームのｔＢＬＡＳＴｎ検索を実施した。ＢＳＢ  ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号７１）が、予測ペプチド配列（配列番号７２）とともにエウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）候補標的遺伝子として同定された。
【０２６３】
配列番号７１の配列は、新規である。該配列は、公開データベースに収載されていない。エウスキスツス属（Euschistus）ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ配列（配列番号７１）は、キョウソヤドリコバチ（Nasonia vitripennis）（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＸＭ＿００１６０８０９５．２）に由来するｃｏａｔｏｍｅｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｌｐｈａ遺伝子の断片と多少関連する（７５％同一性）。エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）ＣＯＰＩ  ＤＥＬＴＡアミノ酸配列（配列番号７２）の最も近いホモログは、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＡＮ２０３８９．１を有するホソヘリカメムシ（Riptortus pedestris）タンパク質（９４％類似；相同性領域にわたり８９％同一）である。
【０２６４】
鋳型の作製およびｄｓＲＮＡ合成
ｃＤＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を用いて単一の若い成体昆虫（約９０ｍｇ）から抽出した全ＢＳＢ  ＲＮＡから作製した。昆虫を２００μＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を含む１．５ｍＬ小遠心管中でペレット乳棒（ＦＩＳＨＥＲＢＲＡＮＤカタログ番号１２−１４１−３６３）およびＰｅｓｔｌｅ  Ｍｏｔｏｒ  Ｍｉｘｅｒ（ＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ、Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）を用いて室温でホモジナイズした。ホモジナイズした後、追加の８００μＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を加え、ホモジネートをボルテックスミキサーで混合し、次いで室温で５分間インキュベートした。遠心分離により細胞デブリを除去し、上清を新しい管に移した。２００μＬのクロロホルムを加え、混合物をボルテックスミキサーで１５秒間混合した。抽出物を室温で２〜３分間静置した後、４℃で１２０００ｘｇでの１５分間の遠心分離により相を分離した。上水性相を他のヌクレアーゼ不含有１．５ｍＬ小遠心管に注意深く移し、ＲＮＡを５００μＬの室温イソプロパノールにより沈殿させた。室温で１０分間のインキュベーションの後、混合物を上記のように１０分間遠心分離した。ＲＮＡペレットを１ｍＬの室温７５％エタノールですすぎ、上記のようにさらに１０分間遠心分離した。１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）に関する製造業者推奨ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）抽出プロトコールに従って、ＲＮＡペレットを室温で乾燥し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔｙｐｅ４を用いたＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ＡＮＤ  ＧＥＬ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ  ＫＩＴ（Ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）；ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）からの２００μＬのＴｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（すなわち、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）に再懸濁した。ＲＮＡ濃度は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて決定した。
【０２６５】
ｃＤＮＡは、供給業者の推奨プロトコールに従って、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩＩ  ＦＩＲＳＴ−ＳＴＲＡＮＤ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＳＹＳＴＥＭ（商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて５μｇのＢＳＢ全ＲＮＡ鋳型およびオリゴｄＴプライマーから逆転写した。転写反応の最終容積は、ヌクレアーゼ不含有水で１００μＬとした。
【０２６６】
プライマーＢＳＢ＿αＣＯＰ−１−Ｆｏｒ（配列番号７４）およびＢＳＢ＿αＣＯＰ−１−Ｒｅｖ（配列番号７５）を用いて、ＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ−１鋳型とも呼ぶ、ＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ｒｅｇｉｏｎ  １を増幅した。ＤＮＡ鋳型は、１μＬのｃＤＮＡ（上記）を鋳型として用いてタッチダウンＰＣＲ（１℃／サイクル低下でアニール温度を６０℃から５０℃に低下させた）により増幅した。ＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ−１の４８５ｂｐセグメントを構成する断片（配列番号７３）が３５サイクルのＰＣＲ中に生成した。上記の手順は、ＹＦＰｖ２−Ｆ（配列番号７７）およびＹＦＰｖ２−Ｒ（配列番号７８）プライマーを用いて３０１ｂｐ陰性対照鋳型ＹＦＰｖ２（配列番号７６）を増幅するためにも用いた。ＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａおよびＹＦＰｖ２プライマーは、それらの５’末端におけるＴ７ファージプロモーター配列（配列番号５）を含んでおり、したがって、ｄｓＲＮＡ転写のためのＹＦＰｖ２およびＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ  ＤＮＡ断片の使用を可能にした。ｄｓＲＮＡは、製造業者の指示に従って用いたＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＮＡｉキット（ＡＭＢＩＯＮ）により２μＬのＰＣＲ産物（上記）を鋳型として用いて合成した。図１を参照のこと。ｄｓＲＮＡをＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）８０００分光光度計で定量し、ヌクレアーゼ不含有０．１Ｘ  ＴＥ緩衝液（１ｍＭ  トリスＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で５００ｎｇ／μＬに希釈した。
【０２６７】
ＢＳＢ血体腔へのｄｓＲＮＡの注射
ＢＳＢは、６５％相対湿度および１６：８時間明：暗の光周期の２７℃インキュベーター中で、人工飼料（上記）を与えて飼育した。二齢若虫（それぞれ体重１〜１．５ｍｇ）を傷害を防ぐために小ブラシを用いて緩やかに取り扱い、氷上のペトリ皿に入れて、昆虫を冷却し、静置した。各昆虫に５５．２ｎＬの５００ｎｇ／μＬ  ｄｓＲＮＡ溶液（すなわち、２７．６ｎｇ  ｄｓＲＮＡ；１８．４〜２７．６μｇ／ｇ体重の用量）を注射した。注射は、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ３．５インチ  ＃３−０００−２０３−Ｇ／Ｘガラス毛細管から引き抜いた注射針を取り付けたＮＡＮＯＪＥＣＴ（商標）ＩＩ注射器（ＤＲＵＭＭＯＮＤ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｂｒｏｏｍｈａｌｌ、ＰＡ）を用いて実施した。針の先端を折り、毛細管に軽油を入れ直し（backfilled）、次いで２〜３μＬのｄｓＲＮＡを満たした。ｄｓＲＮＡを若虫の腹部に注射し（試験当たりｄｓＲＮＡ当たり１０匹の昆虫に注射）、別の３日に試験を繰り返した。注射した昆虫（１ウエル当たり５匹）を、人工ＢＳＢ飼料のペレットを含み、Ｐｕｌｌ−Ｎ−Ｐｅｅｌ（商標）タブ（ＢＩＯ−ＣＶ−４；ＢＩＯ−ＳＥＲＶ）で覆った３２ウエルトレー（Ｂｉｏ−ＲＴ−３２飼育トレー；ＢＩＯ−ＳＥＲＶ、Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ、ＮＪ）に移した。水分は、綿芯を含む１．５ｍＬ小遠心管中の１．２５ｍＬの水により供給した。トレーを２６．５℃、６０％湿度および１６：８明：暗の光周期でインキュベートした。生存数および体重を注射後７日後に測定した。
【０２６８】
注射によりＢＳＢ  ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａが致死性ｄｓＲＮＡと同定された
ＹＦＰコード領域のセグメント、ＹＦＰｖ２を標的とするｄｓＲＮＡをＢＳＢ注射実験における陰性対照として用いた。表１４に要約するように、二齢ＢＳＢ若虫の血体腔に注射した２７．６ｎｇのＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ−１  ｄｓＲＮＡは、７日以内に高い死亡率をもたらした。ＢＳＢ＿ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ−１  ｄｓＲＮＡによりもたらされた死亡率は、ｐ＝０．０００９０４５（スチューデントのｔ検定）を有する同じ量の注射ＹＦＰｖ２  ｄｓＲＮＡ（陰性対照）で認められたものと有意に異なっていた。
【０２６９】
【表１４】
2017530712.tif 000022
【実施例１３】
【０２７０】
半翅目害虫配列を含むトランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）
配列番号７１および／または配列番号７３を含む核酸の発現ベクターを含む１０〜２０のトランスジェニックＴ０ゼア・マイス（Zea mays）植物を実施例７で述べたように生成する。ＲＮＡｉ構築物のヘアピンｄｓＲＮＡを発現するさらなる１０〜２０のＴ１ゼア・マイス（Zea mays）独立系をＢＳＢチャレンジのために得る。配列番号７３に示す、または他の場合、配列番号７１をさらに含むヘアピンｄｓＲＮＡが得られ得る。これらは、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の分子解析法により確認される。選択される独立Ｔ１系からの全ＲＮＡ調製物は、任意選択的に、ＲＮＡｉ構築物のそれぞれにおけるヘアピン発現カセットのＳＴ−ＬＳ１イントロンに結合するように設計されたプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲに用いられる。さらに、ＲＮＡｉ構築物における各標的遺伝子に対する特異的プライマーは、任意選択的に、植物体におけるｓｉＲＮＡ生成に必要なプロセシング前ｍＲＮＡを増幅し、その生成を確認するために用いられる。各標的遺伝子の所望のバンドの増幅により、各トランスジェニックゼア・マイス（Zea mays）植物におけるヘアピンＲＮＡの発現が確認される。標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセシングは、任意選択的に、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを用いて独立トランスジェニック系においてその後確認される。
【０２７１】
さらに、標的遺伝子との８０％を超える配列同一性を有するミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子との１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子について認められるものと同様の仕方でトウモロコシ根切り虫に作用する。同じＲＮＡｉ構築物におけるヘアピンｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列との対合により、摂食半翅目害虫の成長、発育および生存能力に影響を及ぼすことができる植物処理ｓｉＲＮＡがもたらされる。
【０２７２】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの植物体への送達および摂食による半翅目害虫によるその後の取込みにより、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御がもたらされる。標的遺伝子の機能が発育の１つまたは複数の段階で重要である場合、半翅目害虫の成長、発育および生殖が影響を受け、エウスキスツス・ヘロス（Euchistus heros）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）、ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）、アクロステルヌム・ヒラレ（Acrosternum hilare）およびエウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）の少なくとも１つの場合、外寄生し、摂食し、発育し、かつ／または生殖することの不成功につながるか、あるいは半翅目害虫の死につながる。次いで、半翅目害虫を防除するために、標的遺伝子の選択およびＲＮＡｉの成功裏での適用を用いる。
【０２７３】
トランスジェニックＲＮＡｉ系および非形質転換ゼア・マイス（Zea mays）の表現型比較
ヘアピンｄｓＲＮＡを創製するために選択した標的半翅目害虫遺伝子または配列は、あらゆる公知の植物遺伝子配列との類似性がない。したがって、これらの半翅目害虫遺伝子または配列を標的とする構築物による（全身性）ＲＮＡｉの生成または活性化は、トランスジェニック植物に対してあらゆる有害な影響を及ぼすことは、予想されない。しかし、トランスジェニック系の発育および形態特性を非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有さない「空」のベクターにより形質転換したトランスジェニック系の植物と比較する。植物の根、芽条、茎葉および生殖特性を比較する。トランスジェニック植物および非形質転換植物の根の長さおよび成長パターンに観察可能な差はない。高さ等の植物の芽条の特性、葉の数およびサイズ、開花時期、花のサイズおよび外観は、同様である。温室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび土壌中で栽培した場合、一般的に、トランスジェニック系と標的ｉＲＮＡ分子の発現のないものとの間に観察可能な形態の差はない。
【実施例１４】
【０２７４】
半翅目害虫配列を含むトランスジェニックグリシン・マクス（Glycine max）
配列番号７１および／または配列番号７３を含む核酸の発現ベクターを含む１０〜２０のトランスジェニックＴ０グリシン・マクス（Glycine max）植物を、以下のように、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換による等を含む、当技術分野で公知のように生成する。成熟ダイズ（グリシン・マクス（Glycine max））種子を塩素ガスで一夜１６時間滅菌する。塩素ガスによる滅菌後、種子を塩素ガスを消散させるためのＬＡＭＩＮＡＲ（商標）流フード内の開放容器に入れる。次に、滅菌済み種子をブラックボックスを用いた暗所で滅菌Ｈ２Ｏを１６時間、２４℃で吸収させる。
【０２７５】
分割種子ダイズの調製。
種子外被を分離し、除去し、種子を２つの子葉部分に分割するために種子のへそに沿って、スカルペルに取り付けられた＃１０ブレードを用いて縦方向に切断されているダイズ種子物質のプロトコールにより要求されている調製物である胚軸の一部を含む分割ダイズ種子。胚軸を部分的に除去することに十分な注意を払い、胚軸の約１／２〜１／３が子葉の節末端に付着したままとする。
【０２７６】
接種。
次いで、胚軸の一部を含む分割ダイズ種子を配列番号７１および／または配列番号７３を含むバイナリープラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（例えば、ＥＨＡ１０１またはＥＨＡ１０５株）の溶液中に約３０分間浸漬する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）溶液は、胚軸を含む子葉を浸漬する前にλ＝０．６  ＯＤ６５０の最終濃度に希釈する。
【０２７７】
共培養。
接種後、分割ダイズ種子をろ紙片で覆ったペトリ皿中の共培養培地上でアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）菌株とともに５日間共培養する（Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2.1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.）。
【０２７８】
芽条誘導。
共培養の５日後に、分割ダイズ種子をＢ５塩、Ｂ５ビタミン、２８ｍｇ／Ｌ第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌスクロース、０．６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１．１１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、１００ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌセホタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌバンコマイシン（ｐＨ５．７）を含む液体芽条誘導（ＳＩ）培地で洗浄する。次いで分割ダイズ種子をＢ５塩、Ｂ５ビタミン、７ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅ寒天、２８ｍｇ／Ｌ第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌスクロース、０．６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、１．１１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、５０ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌセホタキシム、５０ｍｇ／Ｌバンコマイシン（ｐＨ５．７）からなる芽条誘導Ｉ（ＳＩ  Ｉ）培地上で、子葉の平らな側を上向きにし、子葉の節末端を培地に埋め込んで培養する。２週間の培養の後に、形質転換分割ダイズ種子の外植体を６ｍｇ／Ｌグルホシネート（ＬＩＢＥＲＴＹ（登録商標））を添加したＳＩ  Ｉ培地を含む芽条誘導ＩＩ（ＳＩ  ＩＩ）培地上に移す。
【０２７９】
芽条伸長。
ＳＩ  ＩＩ培地上の２週間の培養の後に、子葉を外植体から除去し、子葉の基部で切断を行うことによって胚軸を含むフラッシュシュートパッド（flush shoot pad）を摘出する。子葉から単離したシュートパッドを芽条伸長（ＳＥ）培地に移す。ＳＥ培地は、ＭＳ塩、２８ｍｇ／Ｌ第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌスクロース、０．６ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌアスパラギン、１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ピログルタミン酸、０．１ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ、０．５ｍｇ／Ｌ  ＧＡ３、１ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド、５０ｍｇ／Ｌ  ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）、２００ｍｇ／Ｌセホタキシム、５０ｍｇ／Ｌバンコマイシン、６ｍｇ／Ｌグルホシネート、７ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅ寒天（ｐＨ５．７）からなっている。培養物を新鮮なＳＥ培地に２週間ごとに移す。培養物をＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）成長チャンバー内で８０〜９０μｍｏｌ／ｍ２秒の光度の１８時間明期で２４℃で成長させる。
【０２８０】
発根。
子葉シュートパッドの基部で伸長芽条を切断することによって、子葉シュートパッドから発生した伸長芽条を単離し、伸長芽条を１ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡ（インドール３−酪酸）に１〜３分間浸漬して、発根を促進した。次に、伸長芽条をｐｈｙｔａトレー中発根培地（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２８ｍｇ／Ｌ第一鉄、３８ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、２０ｇ／Ｌスクロースおよび０．５９ｇ／Ｌ  ＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌアスパラギン、１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ピログルタミン酸ならびに７ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅ寒天、ｐＨ５．６）に移す。
【０２８１】
栽培。
２４℃、１８時間明期のＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）成長チャンバー内での１〜２週間の培養の後、根を発生した芽条を被覆ｓｕｎｄａｅカップ中土壌ミックスに移し、小植物の順化のために一定温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）下での１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光度の長日条件下（１６時間明／８時間暗）のＣＯＮＶＩＲＯＮ（商標）成長チャンバー（モデルＣＭＰ４０３０およびＣＭＰ３２４４、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ）に入れた。発根小植物は、さらなる順化および頑健なトランスジェニックダイズ植物の樹立のために温室に移す前に、ｓｕｎｄａｅカップ中で数週間順化させる。
【０２８２】
ＲＮＡｉ構築物のヘアピンｄｓＲＮＡを発現するさらなる１０〜２０のＴ１グリシン・マクス（Glycine max）独立系をＢＳＢチャレンジのために得る。配列番号７３に示す、または他の場合、さらに配列番号７１を含むヘアピンｄｓＲＮＡが得られ得る。これらは、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の分子解析法により確認される。選択される独立Ｔ１系からの全ＲＮＡ調製物は、任意選択的に、ＲＮＡｉ構築物のそれぞれにおけるヘアピン発現カセットのＳＴ−ＬＳ１イントロンに結合するように設計されたプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲに用いられる。さらに、ＲＮＡｉ構築物における各標的遺伝子に対する特異的プライマーは、任意選択的に、植物体におけるｓｉＲＮＡ生成に必要なプロセシング前ｍＲＮＡを増幅し、その生成を確認するために用いられる。各標的遺伝子の所望のバンドの増幅により、各トランスジェニックグリシン・マクス（Glycine max）植物におけるヘアピンＲＮＡの発現が確認される。標的遺伝子のｄｓＲＮＡヘアピンのｓｉＲＮＡへのプロセシングは、任意選択的に、ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションを用いて独立トランスジェニック系においてその後確認される。
【０２８３】
さらに、標的遺伝子との８０％を超える配列同一性を有するミスマッチ配列を有するＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子との１００％の配列同一性を有するＲＮＡｉ分子について認められるものと同様の仕方でトウモロコシ根切り虫に作用する。同じＲＮＡｉ構築物におけるヘアピンｄｓＲＮＡを形成するミスマッチ配列と天然配列との対合により、摂食半翅目害虫の成長、発育および生存能力に影響を及ぼすことができる植物処理ｓｉＲＮＡがもたらされる。
【０２８４】
標的遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの植物体への送達および摂食による半翅目害虫によるその後の取込みにより、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによる半翅目害虫における標的遺伝子の下方制御がもたらされる。標的遺伝子の機能が発育の１つまたは複数の段階で重要である場合、半翅目害虫の成長、発育および生殖が影響を受け、エウスキスツス・ヘロス（Euschistus heros）、ピエゾドルス・グイルディニイ（Piezodorus guildinii）、ハリオモルファ・ハリス（Halyomorpha halys）、ネザラ・ビリデュラ（Nezara viridula）、アクロステルヌム・ヒラレ（Acrosternum hilare）およびエウスキスツス・セルブス（Euschistus servus）の少なくとも１つの場合、外寄生し、摂食し、発育し、かつ／または生殖することの不成功につながるか、あるいは半翅目害虫の死につながる。次いで、半翅目害虫を防除するために、標的遺伝子の選択およびＲＮＡｉの成功裏での適用を用いる。
【０２８５】
トランスジェニックＲＮＡｉ系および非形質転換グリシン・マクス（Glycine max）の表現型比較
ヘアピンｄｓＲＮＡを創製するために選択した標的半翅目害虫遺伝子または配列は、あらゆる公知の植物遺伝子配列との類似性がない。したがって、これらの半翅目害虫遺伝子または配列を標的とする構築物による（全身性）ＲＮＡｉの生成または活性化は、トランスジェニック植物に対してあらゆる有害な影響を及ぼすことは、予想されない。しかし、トランスジェニック系の発育および形態特性を非形質転換植物、ならびにヘアピン発現遺伝子を有さない「空」のベクターにより形質転換したトランスジェニック系の植物と比較する。植物の根、芽条、茎葉および生殖特性を比較する。トランスジェニック植物および非形質転換植物の根の長さおよび成長パターンに観察可能な差はない。高さ等の植物の芽条の特性、葉の数およびサイズ、開花時期、花のサイズおよび外観は、同様である。温室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび土壌中で栽培した場合、一般的に、トランスジェニック系と標的ｉＲＮＡ分子の発現のないものとの間に観察可能な形態の差はない。
【実施例１５】
【０２８６】
人工飼料でのエウスキスツス・ヘロス（E. heros）バイオアッセイ
人工飼料でのｄｓＲＮＡ摂食アッセイにおいて、注射実験（実施例１２）の場合と同様に、約１８ｍｇの人工飼料のペレットおよび水を含む３２ウエルトレーを準備する。２００ｎｇ／μｌの濃度のｄｓＲＮＡを食物ペレットおよび水試料の２つのウエルのそれぞれに１００μｌで加える。５匹の二齢エウスキスツス・ヘロス（E. heros）若虫を各ウエルに導入する。水試料およびＹＦＰ転写物を標的とするｄｓＲＮＡを陰性対照として用いる。実験は、異なる３日に反復する。８日間の処置の後に生存昆虫の体重を測定し、死亡率を決定する。
【実施例１６】
【０２８７】
鞘翅目害虫配列を含むトランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）
ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号７１）のセグメントを含むヘアピン形成のための標的遺伝子構築物を含むシロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換ベクターは、実施例４と同様な標準的分子法を用いて作製する。シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換は、標準的アグロバクテリウム（Agrobacterium）ベースの手順を用いて実施する。Ｔ１種子は、グルホシネート耐性選択可能マーカーを用いて選択する。トランスジェニックＴ１シロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物を作製し、同型接合単純コピーＴ２トランスジェニック植物を昆虫試験用に作製する。バイオアッセイは、花房を有する成長シロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物について実施する。５〜１０匹の昆虫を各植物に配置し、１４日以内に生存についてモニターする。
【０２８８】
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換ベクターの構築。
ＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ（配列番号７１）のセグメントを含むヘアピン形成のための標的遺伝子構築物を含むエントリーベクターｐＤＡＢ３９１６に基づくエントリークローンは、化学的に合成された断片（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）および標準分子クローニング法の組合せを用いてアセンブルする。ＲＮＡ一次転写物による分子内ヘアピン形成は、反対方向の標的遺伝子セグメントの２つのコピーを配列する（単一転写単位内で）ことによって促進され、２つのセグメントは、ＳＴ−ＬＳ１イントロン配列（配列番号１３）によって分離されている（Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50）。したがって、一次ｍＲＮＡ転写物は、２つのＣＯＰＩ  ｄｅｌｔａ遺伝子セグメント配列をイントロン配列によって分離された、互いの大きな逆方向反復配列として含む。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーターのコピー（Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493）は、一次ｍＲＮＡヘアピン転写物の産生を促進するために用い、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム２３の３’非翻訳領域を含む断片（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１；米国特許第５，４２８，１４７号明細書）は、ヘアピン−ＲＮＡ発現遺伝子の転写を終結させるために用いる。
【０２８９】
上述のエントリーベクターｐＤＡＢ３９１６内のヘアピンクローンは、一般的なバイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ１０１８３６との標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応に用いて、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換用のヘアピンＲＮＡ発現形質転換ベクターを産生する。
【０２９０】
バイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ１０１８３６は、キャッサバ葉脈ウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーターｖ２、米国特許第７６０１８８５号明細書；Verdaguer et al,(1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139）の調節下の除草剤耐性遺伝子ＤＳＭ−２ｖ２（米国特許出願公開第２０１１／０１０７４５５号明細書）を含む。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレーム１の３’非翻訳領域を含む断片（ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ６；Huang et al, (1990) J. Bacteriol, 172:1814-1822）は、ＤＳＭ２ｖ２  ｍＲＮＡの転写を終結させるために用いる。
【０２９１】
ＹＦＰヘアピンＲＮＡを発現する遺伝子を含む、陰性対照バイナリー構築物ｐＤＡＢ１１４５０７は、一般的なバイナリーデスティネーションベクター（ｐＤＡＢ１０１８３６）およびエントリーベクターｐＤＡＢ３９１６を用いた標準ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え反応により構築する。エントリー構築物ｐＤＡＢ１１２６４４は、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）ユビキチン１０プロモーター（上記のような）の発現制御下のＹＦＰヘアピン配列（ｈｐＹＦＰ  ｖ２−１、配列番号７９）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＯＲＦ２３  ３’非翻訳領域（上記のような）を含む断片を含む。
【０２９２】
殺虫性ヘアピンＲＮＡを含むトランスジェニックシロイヌナズナ属（Arabidopsis）の産生：アグロバクテリウム媒介形質転換。
ヘアピン配列を含むバイナリープラスミドをアグロバクテリウム属（Agrobacterium）菌株ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０ＲＫ）にエレクトロポレーションする。組換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）クローンは、組換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーのプラスミド調製物の制限解析により確認される。製造業者の推奨プロトコールに従ってＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２１６２）を用いて、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）培養からプラスミドを抽出する。
【０２９３】
シロイヌナズナ属（Arabidopsis）形質転換およびＴ１選択。
１２〜１５個のシロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物（ｃ．ｖ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を２５０μｍｏｌ／ｍ２の光度、２５℃および１８：６時間の明：暗条件を有する温室内の４”ポットで生育させる。形質転換の１週間前に一次花茎を切り取る。１０μｌの組換えアグロバクテリウム（Agrobacterium）グリセロールストックを１００ｍｌのＬＢブロス（Ｓｉｇｍａ  Ｌ３０２２）＋１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン＋５０ｍｇ／Ｌカナマイシン中で２８℃でインキュベートし、２２５ｒｐｍで７２時間振とうすることによって、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）接種物を調製する。アグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞を収穫し、花浸漬の前に５％スクロース＋０．０４％Ｓｉｌｗｅｔ−Ｌ７７（Ｌｅｈｌｅ  Ｓｅｅｄｓカタログ番号ＶＩＳ−０２）＋１０μｇ／Ｌベンゾアミノプリン（ＢＡ）溶液中にＯＤ６０００．８〜１．０まで懸濁する。植物の地上部をアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液中に緩やかに撹拌しながら５〜１０分間浸漬する。次いで、植物を、結実まで定期的な散水および施肥による正常な成長のために温室に移す。
【実施例１７】
【０２９４】
トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis）の成長およびバイオアッセイ。
ヘアピンＲＮＡｉ構築物で形質転換したＴ１シロイヌナズナ（Arabidopsis）の選択。
各形質転換からの最大２００ｍｇのＴ１種子を０．１％アガロース溶液中に層状にする。種子を＃５ｓｕｎｓｈｉｎｅ培地を含む発芽トレー（１０．５”ｘ２１”ｘ１”；Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、ＭＮ）に植え込む。形質転換体は、植え込みの６および９日後に２８０ｇ／ｈａのＩｇｎｉｔｅ（登録商標）（グリホシネート）に対する耐性に関して選択する。選択されたイベントを直径４”のポットに移植する。挿入コピー解析は、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０を用いた加水分解定量的実時間ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって移植の１週間以内に実施する。ＰＣＲプライマーおよび加水分解プローブは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＤＳＭ２ｖ２選択可能マーカーに対して設計する。植物は、２４℃で、１００〜１５０ｍＥ／ｍ２ｓの強度の蛍光および白熱電灯下で１６：８明：暗光周期で維持する。
【０２９５】
エウスキスツス・ヘロス（E. heros）植物摂食バイオアッセイ。
少なくとも４つの低コピー（１〜２挿入）、４つの中コピー（２〜３挿入）および４つの高コピー（≧４挿入）イベントを各構築物ごとに選択する。植物を開花期（植物が花および長角果を含む）まで成長させる。昆虫の同定を容易にするために土壌の表面を約５０ｍｌの白砂で覆う。５〜１０匹の二齢エウスキスツス・ヘロス（E. heros）若虫を各植物上に導入する。植物を直径が３”、高さが１６”で、０．０３”の壁厚を有するプラスチック管（品目番号４８４４８５、Ｖｉｓｉｐａｃｋ  Ｆｅｎｔｏｎ、ＭＯ）で覆い、昆虫を隔離するために管をナイロン網で覆う。植物をコンバイロン（conviron）内で通常の温度、光および散水条件下で保つ。１４日に、昆虫を収集し、体重を測定し、死亡百分率ならびに成長阻害（１−処理体重／対照体重）を計算する。ＹＦＰヘアピン発現植物を対照として用いる。
【０２９６】
Ｔ２シロイヌナズナ（Arabidopsis）種子の発生およびＴ２バイオアッセイ。
Ｔ２種子は、各構築物についての選択される低コピー（１〜２挿入）イベントから産生させる。植物（同型接合および／または異型接合）を上述のように、エウスキスツス・ヘロス（E. heros）バイオアッセイに供する。Ｔ３種子を同型接合体から収穫し、将来の解析のために保存する。
【０２９７】
本開示は、様々な修正および代替形態を受け入れる余地があり得るが、特定の実施形態を例として詳細に述べた。しかし、本開示は、開示した特定の形態に限定されるものでないことを理解すべきである。それどころか、本開示は、以下の添付の特許請求の範囲およびそれらの適法の等価物により規定される本開示の範囲内に入るすべての修正、等価物および代替手段を含むものとする。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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