(57)【要約】  低減された硝酸塩レベルを持つ修飾たばこ植物および低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）を持つ修飾たばこ植物から作ったたばこ製品を提供する。また、 硝酸同化経路の遺伝子発現を変えることによってたばこ製品のTSNAを低減させる方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
たばこ植物から生成される低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）を持つたばこ製品であって、前記たばこ植物が、
（i）緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリヌクレオチド、
（ii）（i）に記載した前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（iii）緩和した硝酸レダクターゼ酵素を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素から本質的に成るポリペプチド、または
（iv）（i）に記載した前記ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターを含み、
前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照非修飾たばこ植物と比較して緩和され、
かつ、緩和した硝酸レダクターゼ酵素が、
（a）配列番号4の位置523に相当する位置にアミノ酸置換を含む硝酸レダクターゼポリペプチド または
（b）配列番号4の位置523に相当する位置にアミノ酸置換を含む硝酸レダクターゼポリペプチドであって、配列番号4の位置523のアミノ酸が アスパラギン酸に置換されているように修飾された、たばこ製品。
【請求項２】
前記緩和した硝酸レダクターゼ酵素が構成的に活性な硝酸レダクターゼ酵素である、請求項１に記載のたばこ製品。
【請求項３】
たばこ製品が種Nicotiana tabacumのたばこ植物由来の植物材料を備える、請求項1または2に記載のたばこ製品。
【請求項４】
緩和した硝酸レダクターゼをコードする前記ポリヌクレオチドが修飾硝酸レダクターゼポリペプチドをコードする非相同ポリヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項５】
前記非相同ポリヌクレオチドが内在性硝酸レダクターゼ遺伝子と生来的に関連付けられていないプロモーターに連結する、請求項4に記載のたばこ製品。
【請求項６】
前記プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターである、請求項5に記載のたばこ製品。
【請求項７】
緩和した硝酸レダクターゼをコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号5のポリヌクレオチド配列を備える、請求項1〜6のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項８】
緩和した硝酸レダクターゼをコードする前記ポリヌクレオチドがゲノム編集システムまたは突然変異原によって修飾された内在性硝酸レダクターゼ遺伝子である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項９】
前記ゲノム編集システムが改変CRISPR/Cas系システム、改変転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ 、または改変メガヌクレアーゼを備える、請求項8に記載のたばこ製品。
【請求項１０】
前記たばこがバーレーたばこである、請求項1〜9のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項１１】
前記硝酸レダクターゼ酵素が緩和されていない対照たばこ植物由来のたばこ製品と比較して低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）レベルを持つ、請求項1〜10のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項１２】
全TSNAレベルが前記たばこ植物の葉で測定され、
（a）前記葉が新鮮に収穫され、
（b）前記葉が乾燥、保存もしくは加工され、または 
（c）前記葉が空気乾燥されている、請求項11に記載のたばこ製品。
【請求項１３】
前記たばこ製品の少なくとも1つのTSNAのレベルが、少なくとも1つのTSNAの対照レベルと比較して低減され、少なくとも1つのTSNAがN-ニトロソノルニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項11または12に記載のたばこ製品。
【請求項１４】
全TSNAレベルが少なくとも50%減少する、請求項11〜13のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項１５】
TSNAレベルが前記たばこ植物の葉の燃焼から得られる煙で測定される、請求項11に記載のたばこ製品。
【請求項１６】
煙の全TSNAレベルが少なくとも70%減少する、請求項15に記載のたばこ製品。
【請求項１７】
NNNのレベルが約90%減少する、請求項13〜16のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項１８】
NNKのレベルが約66%減少する、請求項13〜17のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項１９】
NABのレベルが約92%減少する、請求項13〜18のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項２０】
NATのレベルが約88%減少する、請求項13〜19のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項２１】
前記たばこ植物が修飾ノルニコチン経路遺伝子をさらに備える、請求項1〜20のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【請求項２２】
修飾ノルニコチン経路遺伝子が修飾ニコチンデメチラーゼ遺伝子またはチトクロームP450遺伝子を備える、請求項21に記載のたばこ製品。
【請求項２３】
前記たばこ植物が修飾CYP82E4または修飾CYP82E10遺伝子を備える、請求項21または22に記載のたばこ製品。
【請求項２４】
前記修飾CYP82E4遺伝子または修飾CYP82E10遺伝子が不活性化される、請求項23に記載のたばこ製品。
【請求項２５】
たばこ製品の製造方法であって、修飾たばこ植物の葉の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルが非修飾たばこ植物の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルと比較して低減され、
（a）たばこ植物を
（i）緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリヌクレオチド、
（ii）（i）に記載した前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（iii）緩和した硝酸レダクターゼ酵素を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素から本質的に成るポリペプチド、または
（iv）（i）に記載した前記ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターを含み、
前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照非修飾たばこ植物と比較して緩和され、
かつ、前記緩和した硝酸レダクターゼ酵素が、
（Ｉ）配列番号4の位置523に相当する位置にアミノ酸置換を含む硝酸レダクターゼポリペプチド、または
（ＩＩ）配列番号4の位置523に相当する位置にアミノ酸置換を含み、配列番号4の位置523のアミノ酸が アスパラギン酸に置換されている、硝酸レダクターゼポリペプチドを備えるように修飾すること、
（b）前記修飾したたばこ植物からたばこ葉を収穫すること、
（c）および前記収穫した葉からたばこ製品を製造することを備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低減された硝酸塩レベルを持つ修飾たばこ植物、低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）を持つ修飾たばこ植物から作ったたばこ製品、および硝酸同化経路の遺伝子発現を変えることによるたばこ製品のTSNA低減方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バーレーたばこ等の商用たばこ植物は葉に高レベルの遊離硝酸塩を蓄積する。このことは高レベルの硝酸塩がタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）と称される発がん性化合物の形成に関係するので好ましくない。TSNAは主にたばこ葉の乾燥時に生成される化合物のクラスであるが、葉のその後の加工および保存で発生し得、また燃焼の間で熱合成を介して生成する可能性がある。乾燥葉で発見される2つのTSNA、N-ニトロソノルニコチン(NNN）および4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK）は国際がん研究機関によるグループＩ発がん物質（最高表示）に分類される。様々なたばこ関連がんとこれらの化合物を意味づける証拠を理由に、世界保健機関および他の当該分野の専門家が将来のたばこ製品がこれらの毒物の低減されたレベルを有することを確保する実施を強制することを推奨した。TSNAは代表的なタバコアルカロイドのニトロソ化産物である。空気乾燥したたばこでは亜硝酸塩がTSNA形成の直接的に関与する物質であるとした一般的合意がある。しかし、その細胞毒性から、一般的に植物組織の内因性亜硝酸塩レベルは非常に低い。代わりに、TSNA形成に関与する大部分の亜硝酸塩は、6〜10週間の乾燥工程の間に葉面に生息する微生物の硝酸レダクターゼ（NR）活性から誘導されると考えられており、この間に細胞膜およびオルガネラが分解されてくるにつれて葉の硝酸塩プールの一部が亜硝酸塩に変換する。
【０００３】
TSNAは主に葉の乾燥処理の間に形成され、タバコアルカロイドのニトロソ化を伴う。乾燥葉のTSNA含量およびレベルを下げる遺伝的戦略は、（１）アルカロイド前駆体(複数)、または（２）含まれるニトロソ化剤（複数）のいずれかを標的化することに焦点を当ててきた。たばこの遺伝学を変えるレベルでTSNAを低減する取り組みのほとんどがTSNAへのアルカロイド前駆体を標的化してきた。そのような戦略は、アルカロイド前駆体ノルニコチン合成に関与する遺伝子ファミリーのダウンレギュレーションによってNNNの大幅な減少を提供する。しかし、このような戦略はたばこ製品で発見される全TSNAレベルを低減しない。したがって、たばこ製品の全TSNAレベルを低減させるニーズは依然として大きい。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、一態様では、たばこ植物から産生される低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA)レベルを持つたばこ製品を目指すことであり、前記たばこ植物が （ｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成る、（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素から本質的に成るポリペプチド、または（ｉｖ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを備え、前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照の非修飾たばこ植物と比較して緩和され、かつ、緩和した硝酸レダクターゼ酵素が、（ａ）配列番号4の位置523に相当する位置でアミノ酸置換を含む硝酸レダクターゼポリペプチド または（ｂ）配列番号4の位置523に相当する位置でアミノ酸置換を含み、配列番号4の位置523のアミノ酸が アスパラギン酸に置換されている硝酸レダクターゼポリペプチドを備えるように修飾される。緩和した硝酸レダクターゼ酵素は、構成的に活性な硝酸レダクターゼ酵素とすることができる。たばこ植物はNicotiana tabacum種に由来し、例えばたばこ製品が種Nicotiana tabacumのたばこ植物由来の植物材料を備えることができる。緩和した硝酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、修飾硝酸レダクターゼポリペプチドをコードする非相同性ポリヌクレオチドとすることができる。非相同性ポリヌクレオチドは内因性硝酸レダクターゼ遺伝子と生来的に関連がないプロモーターに連結させることができる。プロモーターはカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターとすることができる。緩和された硝酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドは配列番号5のポリヌクレオチド配列を備えることができる。緩和した硝酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、ゲノム編集システムまたは突然変異原によって改質された内因性硝酸レダクターゼ遺伝子をコードすることができる。ゲノム編集システムは、改変CRISPR/Cas系システム、改変転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ 、または改変メガヌクレアーゼを備えることができる。たばこはバーレーたばこもありうる。たばこ製品は硝酸レダクターゼ酵素が緩和されていない対照たばこ植物に由来するたばこ製品と比較して低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）レベルを持つことができる。全TSNAレベルは、（ａ）葉が新鮮に収穫され、（ｂ）葉が乾燥、保存または加工され、または（ｃ）葉が空気乾燥されているたばこ植物の葉で測定できる。たばこ製品の少なくとも１つのTSNAのレベルが、少なくとも１つのTSNAの対照レベルと比較して低減され、少なくとも１つのTSNAがN-ニトロソノルニコチン(NNN）、4-（メチルニトロソアミノ)-1-（3-ピリジル）-1-ブタノン（ＮＮＫ）、N-ニトロソアナバシン(NAB)、Ｎ-ニトロソアナタビン(NAT)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択することができる。TSNAの合計レベルを少なくとも50%低減することができる。TSNAレベルを、たばこ植物の葉の��焼から得られる煙で測定することができる。合計のTSNAレベルを少なくとも70%低減することができる。NNNレベルを少なくとも90%低減することができる。NNKレベルを少なくとも66%低減することができる。NABレベルを少なくとも92%低減することができる。NATレベルを少なくとも88%低減することができる。たばこ植物は修飾ノルニコチン経路遺伝子をさらに備えることができる。修飾ノルニコチン経路遺伝子は修飾ニコチンデメチラーゼ遺伝子またはチトクロームP450遺伝子を備えることができる。たばこ植物は修飾CYP82E4または修飾CYP82E10遺伝子を備えることができる。修飾CYP82E4遺伝子または修飾CYP82E10遺伝子は不活性もありうる。
【０００５】
本発明は、一態様では、修飾たばこ植物の葉の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルが非修飾たばこ植物の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルと比較して低減されたたばこ製品の製造方法を目指す。前記方法は、（ａ）（ｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素から本質的に成るポリペプチド、または（ｉｖ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを備え、前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照の非修飾たばこ植物と比較して緩和されており、緩和された硝酸レダクターゼ酵素が、（Ｉ）配列番号4の位置523に相当する位置でアミノ酸置換を含む硝酸レダクターゼポリペプチド、または（ＩＩ）配列番号4の位置523に相当する位置でアミノ酸置換を含み、配列番号4の位置523のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている硝酸レダクターゼポリペプチドを備えるようにたばこ植物を修飾すること、（ｂ）前記修飾たばこ植物からタバコ葉を収穫すること、および（ｃ）収穫した葉からたばこ製品を製造することを備える。
【０００６】
また、本明細書に開示した別の態様では、たばこ植物から産生される低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）レベルを持つたばこ製品であって、前記たばこ植物が（ｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素から本質的に成るポリペプチド、または（ｉｖ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを備え、前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照の非修飾たばこ植物と比較して緩和されており、かつ、緩和した硝酸レダクターゼ酵素が（ａ）切断型硝酸レダクターゼポリペプチド、（ｂ）N-末端切断を含む硝酸レダクターゼポリペプチド、または（ｃ）56個のアミノ酸のN-末端切断を含む硝酸レダクターゼポリペプチドを備えるように修飾される。
【０００７】
また、本明細書に開示した別の態様は、たばこ製品の製造方法であって、修飾たばこ植物の葉の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルが非修飾たばこ植物の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルと比較して低減され、前記方法が（ａ）（ｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素から本質的に成るポリペプチド、または（ｉｖ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを備え、前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照の非修飾たばこ植物と比較して緩和されており、かつ、緩和された硝酸レダクターゼ酵素が（Ｉ）切断型硝酸レダクターゼポリペプチド、（ＩＩ）N-末端切断を含む硝酸レダクターゼポリペプチド、または（III）56個のアミノ酸のN-末端切断を含む硝酸レダクターゼポリペプチドを備えるようにたばこ植物を修飾すること、（ｂ）前記修飾たばこ植物からタバコ葉を収穫すること、および（ｃ）収穫した葉からたばこ製品を製造することを備える。
【０００８】
緩和した硝酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドが配列番号７のポリヌクレオチド配列を備えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1は、高等植物における窒素同化経路の概要を示す。一次硝酸(N)同化経路では、硝酸塩(NO3-)は亜硝酸塩(NO2-)、次いでアンモニウム(NH4+)とグルタミンに変換され、これらの反応に関与する一次酵素は、硝酸レダクターゼと亜硝酸レダクターゼ (それぞれNRとNiR)、グルタミンシンテターゼ（GS）およびグルタミン酸シンターゼ(GOGAT)である。AMT、アンモニウムトランスポーター；AS、アスパラギンシンテターゼ；GDH、NADH-依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ；ICDH、NADP-依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ）；NRT、硝酸トランスポーター；TCA、トリカルボン酸回路。
【図２】図2は、種々の植物種の硝酸レダクターゼアミノ酸配列の位置523を含む領域の配列を示す。
【図３Ａ】図3Aは、35S:GS1、35S:ICDH、35S:GOGAT、E4:GOGAT、35S:tr-NR、E4:tr-NR、35S:S523D-NRおよびE4:S523D-NR構築物の構築物マップを示す。
【図３Ｂ】図3Bは、35S:GS1、35S:ICDH、35S:GOGAT、E4:GOGAT、35S:tr-NR、E4:tr-NR、35S:S523D-NRおよびE4:S523D-NR構築物の構築物マップを示す。
【図４】図4は、3レベルの硝酸塩(N)施肥下で栽培した野生型（WT）植物並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、および35S:ICDHトランスジェニック系統の未乾燥質量を示す。
【図５Ａ】図5Aは、3レベルの硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGATおよび35S:ICDHトランスジェニック系統のクロロフィルａ（Ca、図5A）含量を示す。
【図５Ｂ】図5Bは、3レベルの硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGATおよび35S:ICDHトランスジェニック系統のクロロフィルｂ（Cb、図5B）含量を示す。
【図５Ｃ】図5Cは、3レベルの硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGATおよび35S:ICDHトランスジェニック系統のクロロフィルａ＋ｂ（Ca+ｂ、図5C）含量を示す。
【図６Ａ】図6Aは、3レベルの硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物の葉並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、および35S:ICDHトランスジェニック系統の葉の合計の硝酸塩含量を示す。
【図６Ｂ】図6Bは、3レベルの硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物の葉並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、および35S:ICDHトランスジェニック系統の葉の合計の硝酸塩含量を示す。
【図７】図7は、3レベルの硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物の葉並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、および35S:ICDHトランスジェニック系統の葉の平均アンモニア含量を示す
【図８】図8は、中（8mM)および高（19mM)硝酸塩(N)施肥下で栽培した35S:GOGAT、35S:ICDH、35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1およびＷＴ植物の葉の合計の遊離アミノ酸含量を示す。
【図９Ａ】図9Aは、中(8mM)および高(19mM)硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、および35S:ICDHトランスジェニック系統のタバコ葉のアルギニン(Arg)（図9A）含量を示す。
【図９Ｂ】図9Bは、中(8mM)および高(19mM)硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、および35S:ICDHトランスジェニック系統のタバコ葉のグルタミン(Gln)（図9B）含量を示す。
【図９Ｃ】図9Cは、中(8mM)および高(19mM)硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、および35S:ICDHトランスジェニック系統のタバコ葉のアスパラギン(Asn)(図9C)含量を示す。
【図９Ｄ】図9Dは、中(8mM)および高(19mM)硝酸塩(N)施肥下で栽培したWT植物並びに35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、および35S:ICDHトランスジェニック系統のタバコ葉のグルタミン酸(Glu)（図9D）含量を示す。
【図１０】図10は、WTおよび35S:S523D-NR遺伝子型の葉身に由来する刻みたばこフィラーの平均硝酸塩およびニコチン含量を示す
【図１１Ａ】図11Aは、WTおよび35S:S523D-NRの葉の葉身から作った葉巻たばこのカットフィラーおよび煙のNAB(図11A)の平均含量を示す。
【図１１Ｂ】図11Bは、WTおよび35S:S523D-NRの葉の葉身から作った葉巻たばこのカットフィラーおよび煙のNAT(図11B)の平均含量を示す。
【図１１Ｃ】図11Cは、WTおよび35S:S523D-NRの葉の葉身から作った葉巻たばこのカットフィラーおよび煙のNNK(図11C)の平均含量を示す。
【図１１Ｄ】図11Dは、WTおよび35S:S523D-NRの葉の葉身から作った葉巻たばこのカットフィラーおよび煙のNNN(図11D)の平均含量を示す。
【図１１Ｅ】図11Eは、WTおよび35S:S523D-NRの葉の葉身から作った葉巻たばこのカットフィラーおよび煙のTSNAの合計含量（図11E）を示す。
【図１２】図12は、35SCaMVプロモーターおよび／またはエテフォン誘導性CYP82E4（E4）プロモーターの転写制御下、S523D-NR構築物を含むエテフォン処理タバコ葉の硝酸塩濃度および相対NR転写産物レベルを示す。
【図１３】図13は、35S:S523D-NRおよび35S:S523D-NR/E4:S523D-NRトランスジェニック系統、GH3-1、GH8-1およびGH8-5それぞれの合計のアルカロイド含量(TA % DW)を示す。
【図１４】図14は、3つの35S:S523D-NRおよび35S:S523D-NR/E4:S523D-NRトランスジェニック系統、GH3-1、GH8-1およびGH8-5それぞれの合計の硝酸塩含量（NO3 % DW）を示す
【図１５】図15は、3つの35S:S523D-NRおよび35S:S523D-NR/E4:S523D-NRトランスジェニック系統、GH3-1、GH8-1およびGH8-5それぞれのカットフィラーのTSNA(NNN、NNK、NATおよびNAB、ng/g)含量を示す。
【図１６】図16は、3つの35S:S523D-NRおよび35S:S523D-NR/E4:S523D-NRトランスジェニック系統、GH3-1、GH8-1およびGH8-5それぞれのカットフィラーで作った葉巻たばこの煙のTSNA(NNN、NNK、NATおよびNAB、ng/g）含量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、一態様では、硝酸同化経路の変更によって改質したたばこ植物葉の遊離硝酸塩レベルを低減し、それによって修飾たばこ植物の乾燥葉の全TSNAレベルを低減させる新規な戦略を目指す。タバコ葉の遊離硝酸塩レベルおよびTSNA含量とレベルが、合計のTSNAおよび／または特定のTSNAを含め、緩和した硝酸レダクターゼを使用して減少した。葉内部に保存されているニトロソ化剤の標的化、および遊離硝酸塩量の低減化によって、たばこ製品の発がん性TSNAの産生が最小化する。この技術は、たばこ産業が慣行的施策で可能なレベルより低レベルのTSNAを持つたばこ製品を製造するのに役立つであろう新規なTSNA低減手法を示す。
【００１１】
緩和した硝酸レダクターゼは、例えばNussaume et al. Plant Cell 7:611-621 (1995)並びにLea et al., Plant Physiology 140:1085-1094 (2006)によるNicotiana plumbaginofoliaに記載されている。N. plumbaginofoliaで観測された硝酸塩レベルの減少は、本明明細書に提示したデータのN. tabacumで観測された減少より著しく劣る。さらに、緩和した硝酸レダクターゼで得られたTSNAレベルの減少はこれまで示されていない。
【００１２】
本項で使用される段落の見出しおよび明細書の開示全体は目的の組織化に過ぎず、限定することを意図していない。
【００１３】
１．定義
他に断りがない限り、本明細書で使用される全技術および科学用語は、当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。矛盾がある場合は定義を含めて本文書が適用される。好ましい方法と材料が以下に記載されているが、本明細書に記載したものと類似または同等の方法および材料は、本発明の実施または試験で使用しうる。本明細書に記述した全公報、特許出願、特許および他の文献はその全てが参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書で開示された材料、方法および例は単なる例示であり、制限することを意図していない。
【００１４】
本明細書で使用されるとき、用語「comprise（s）］、「include（s)］、「having］、「has」「can」、「contain（s）」およびその変形は、付加的な作用または構成の可能性を除外しないオープンエンド移行句、用語または言葉であることを意図する。単数形「a」、「and」および「the」は文脈に別段の表示がある場合を除き複数の意味を含む。また、本開示は、明示的な記載または非記載にかかわらず、本明細書に提示した実施形態または要素を「備える」、「から成る」および「から本質的に成る」他の実施形態も意図する。本明細書の数値範囲の詳細説明として、その間の中間の各数字も同程度の精度で明確に意図される。例えば、6-9の範囲では、数字6と9に加えて数字7と8が意図されており、6.0-7.0の範囲では、数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9および7.0が明確に意図される。
【００１５】
明細書および特許請求の範囲全体で使用される以下の用語は次の意味を有する。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、「コーディング配列」または「コード化核酸」は、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を備える核酸(RNAまたはDNA分子)を意味する。さらに、コーディング配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞で発現を導くことができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含め、制御要素に作用できるように連結される開始および終結シグナルを含むことができる。コーディング配列は最適化コドンとすることができる。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、「相補」または「補完的」は、核酸が、核酸分子のヌクレオチド間またはヌクレオチド類似体間でワトソン‐クリック型(例えば、A-T/UおよびC-G)またはフーグスティーン型塩基対を形成しうることを意味する。「相補性」は、例えば、相互に逆平行に整列するときに各位置のヌクレオチド塩基が補完的であるなど、二つの核酸配列の間で共有される特性を意味する。
【００１８】
本明細書で使用される「構築物」は、一つ以上のポリヌクレオチドを含む二本鎖の組み換え体核酸断片を意味する。構築物は、補完的「センス鎖またはコード鎖」と対になった「テンプレート鎖」塩基を含む。所定の構築物を、ベクター（発現ベクターなど）内に位置するプロモーターの向きに対して同一（またはセンス）または反対（またはアンチセンス）のいずれかの方向に、可能性のある2つの方向でベクターに挿入できる。
【００１９】
対照植物体または対照植物体細胞の文脈での「対照」という用語は、硝酸レダクターゼの発現または活性が変化しておらず（例えば、増大または減少）、またそれゆえに酵素の発現または活性が変化した植物体との比較を提供できる、植物体または植物体細胞を意味する。本明細書で使用されるとき、「対照植物体」は、試験パラメーター以外の全パラメーターで試験植物体または改質した植物体と実質的に等価な植物である。例えば、特定の実施形態において、本発明に従ってポリヌクレオチドが導入された植物体に言及するとき、対照植物体はそのようなポリヌクレオチドが導入されていない等価な植物である。特定の実施形態では、対照植物体は対照ポリヌクレオチドが導入された等価な植物である。そのような例では、対照ポリヌクレオチドは、植物体にほとんどまたは全く表現型効果をもたらさないことが期待されているものである。対照植物体は、空のベクターを備えうる。対照植物体は、野生型植物に相当しうる。対照植物体は、T1分離体が導入遺伝子をもはや持たないヌル分離体でもあり得る。
【００２０】
本明細書で交互に使用されるとき、「ドナーDNA」または「ドナー鋳型」は、少なくとも対象の一部の遺伝子を含む二本鎖DNA断片または分子を意味する。ドナーDNAは、完全機能タンパク質または部分機能タンパク質をコードすることができる。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、「内在性遺伝子」は、有機体のゲノムに起源し、遺伝子材料の欠失、獲得、交換等の変化を受けない遺伝子を意味する。内在性遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を経る。
【００２２】
本明細書で使用する「エンハンサー配列」は、遺伝子発現を増大させることができる配列を意味する。これらの配列は、上流、イントロン内または転写領域の下流に位置することができる。転写領域は、プロモーターから転写終結領域までのエクソンと介在イントロンから成る。遺伝子発現の増大は、限定はされないが、転写効率の増加、成熟mRNAの安定化および翻訳亢進を含む様々な機構によってできる。
【００２３】
本明細書で使用する「発現」は、機能的産物の生成を意味する。例えば、核酸断片の発現は、核酸断片の転写（例えば、mRNAまたは機能性RNAが生じる転写）および／またはmRNAの前駆体または成熟タンパク質への翻訳を意味する。「過剰発現」は、同じ実験のヌル分離（または非トランスジェニック）有機体での産生レベルを超えるトランスジェニック有機体における遺伝子産物の生成を意味する。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、「機能的」および「完全機能的」は、生物活性を有するタンパク質を表現する。「機能遺伝子」は、機能タンパク質に翻訳されるmRNAへ転写される遺伝子を意味する。
【００２５】
本明細書で使用する「遺伝子構築物」は、タンパク質をコードする分子配列を含むDNAまたはRNA分子を意味する。コーディング配列は、核酸分子が投与される個体の細胞で発現を導くことができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御要素に、作用できるように連結される開始および終結シグナルを含む。
【００２６】
本明細書で使用する「ゲノム編集」は、アミノ酸置換を有する切断型内在性タンパク質または内在性タンパク質のタンパク質発現が得られるなど、内在性ポリペプチドまたはタンパク質をコードする内在性遺伝子の変化を意味する。ゲノム編集は、相同組み換え修復(HDR)等の修復機構による切断またはアミノ酸置換を持つコピー遺伝子を用いて、標的化内在性遺伝子領域を置換する、または内在性遺伝子全体を置換することを含むことができる。ゲノム編集は、その後に非相同末端結合(NHEJ)によって修復される内在性遺伝子二本鎖切断の発生による内在性遺伝子のアミノ酸置換の生成も含めることができる。NHEJは、アミノ酸置換が起き得る修復の間に少なくとも1つの塩基対を追加または削除できる。ゲノム編集は、2つのヌクレアーゼ標的部位間の切断とNHEJによるDNA切断の修復を作り出すために、同じDNA鎖で2つのヌクレアーゼの同時作用による遺伝子セグメントの削除も含めることができる。
【００２７】
配列に関して本明細書で使用されるとき、「非相同性」は、外来種を起源とする配列、または同種に由来する場合は慎重な人の介入によって構成および／またはゲノム遺伝子座が生来の形態から大幅に改変される配列を意味する。
【００２８】
本明細書で交互に使用されるとき、「相同組み換え修復」または「HDR」は、１片の相同DNAが、主に細胞周期のG2およびS期に核中に存在するとき、二本鎖DNA損傷を修復する細胞機構を意味する。HDRはドナーDNAまたはドナー鋳型を使って修復を案内し、また遺伝子全体の選択的付加を含め、ゲノムへの特異的配列変化を作り出すことができる。ドナー鋳型が部位特異的ヌクレアーゼと共に提供される場合、その後の細胞機構が相同組み換えによって切断を修復するが、これはDNA切断の存在下で桁違いに増大する。相同DNA片が存在しないと、代わりに非相同末端結合が行われうる。
【００２９】
「相同性、同一性または類似性」という用語は、配列の整列によって比較した2個のポリペプチド間または2個の核酸分子間の配列の類似性の度合いを意味する。比較対象の2個の不連続な核酸配列間の相同性の度合いは、比較可能な位置での同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。
【００３０】
2つまたはそれ以上の核酸もしくはポリヌクレオチド配列の文脈で使用される「同一」または「同一性」は、配列が特定領域にわたり同じ残基を一定比率有することを意味する。同一配列の比率は、2つの配列を最適に整列し、特定領域で2つの配列を比較し、両配列で存在する同一残基の位置の数を測定して順序が一致した位置数を得て、特定領域の合計位置数で除し、その結果に100を乗じて算出することができる。2つの配列が異なる長さを持つ場合、あるいは整列によって一つ以上の互い違いの末端が生じ、比較対象の特定領域が単一配列しか含まない場合は、単一配列の残基は計算の分母に含め、分子に含めない。DNAとRNAを比較するとき、チミン(T)とウラシル(U)は等価とみなしうる。同一性は、ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTAまたは Smith-Waterman等のコンピュータ配列アルゴリズムを用いて手動で計算することができる。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「増大する」または「増大した」という用語は、限定はされないが、硝酸塩レベルまたはTSNAレベルなどの、量もしくは活性の約10%〜約99%の増加、または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも100%、少なくとも150%もしくは少なくとも200%以上またはそれ以上の増大を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される「抑制する」または「抑制された」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写性の活性およびタンパク質発現などの、量または活性の、約98%〜約100%の減少、または少なくとも98%、少なくとも99%、特に100%の減少を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される「導入される」という用語は、核酸（例えば、発現構築物）またはタンパク質を細胞に供給することを意味する。「導入される」は、核酸を細胞のゲノムに組み込むことができる真核細胞への核酸の合体への言及、および細胞への核酸またはタンパク質の過渡的な供給への言及を含む。「導入される」は、安定的または過渡的な形質転換方法並びに性的交雑への言及を含む。従って、核酸断片（例えば、組み換え体DNA構築物／発現構築物）を細胞に挿入する文脈での「導入される」は、「遺伝子導入」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、また核酸断片が細胞ゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアDNA）に組み込まれ、自律レプリコンに変換され、または過渡的に発現（例えば、トランスフェクトされたmRNA）し得る真核細胞への核酸断片の合体の意味を含む。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「単離される」「精製される」または「生物学的に純粋」という用語は、天然の状態で発見されたときに、正常に同伴する成分を実質的または本質的に含まない材料を意味する。純粋および均一性は、一般的にポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を使用して測定される。調製では存在する優勢種のタンパク質が十分に精製される。特に、本発明の単離された核酸は、所望の遺伝子に隣接し、所望のタンパク質より他のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。本明細書で使用されるとき、「精製される」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルで本質的に1つのバンドの速度が上昇することを意味する。具体的には、これは核酸またはタンパク質が少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを意味する。
【００３５】
単離されるポリヌクレオチドは、天然に存在する宿主細胞から精製することができる。当業者に公知な従来型の核酸精製方法を使用して、単離されたポリヌクレオチドを得ることができる。また、この用語は組み換え体ポリヌクレオチドおよび化学的に合成したポリヌクレオチドも包含しうる。
【００３６】
本明細書で使用する「硝酸レダクターゼ」は、硝酸(NO3-)を亜硝酸(NO2-)に還元する酵素を意味する。「緩和した硝酸レダクターゼ酵素」という用語は、一般的に対照の非修飾たばこ植物における硝酸レダクターゼの発現または活性を制御または制限する一つ以上の調節機構（例えば、転写、転写後または翻訳後調節機構）を受けない硝酸レダクターゼ酵素を意味する。従って、「前記硝酸レダクターゼの発現または活性が制御緩和される」とは、一般的に硝酸レダクターゼ発現または活性が修飾たばこ植物では対照の非修飾たばこ植物と比較して増大することを意味する。「緩和した硝酸レダクターゼポリヌクレオチド」という用語は、Nicotiana tabacum由来の修飾硝酸レダクターゼ（NR）をコードするポリヌクレオチドを含み、また配列番号5または7の配列に少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80％、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%配列同一性を有する 配列番号5または7のポリヌクレオチド変異体に対し実質的相同性（配列類似である） または実質的同一性を持つポリヌクレオチドを含む、同ポリヌクレオチドから成るもしくは同ポリヌクレオチドから本質的に成るポリヌクレオチド、並びに配列番号5または7の相当断片に少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有し、それに対して実質的相同性または実質同一性を有する 配列番号5または7の断片を含む。断片は、長さが少なくとも約20、50、70、100、200、300、500、1000または2000ヌクレオチドでもよく、例えば緩和した硝酸レダクターゼポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号5または7の少なくとも約20、50、70、100、200、300、500、1000もしくは2000ヌクレオチド、または（ｉｉ）配列番号5または7の少なくとも約20、50、70、100、200、300、500、1000または2000ヌクレオチドに対し、少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むことができる。または（ｉｉ）配列番号5または7の少なくとも約20、50、70、100、200、300、500、1000または2000ヌクレオチドに対し、少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を 有する配列を含むことができる。一般的に、断片は完全長配列の生物活性を保持することができ、例えば、断片は硝酸レダクターゼ活性、典型的には修飾または緩和した硝酸レダクターゼ活性をコードする。また、硝酸レダクターゼヌクレオチドは、硝酸レダクターゼとして機能するポリペプチドをコードする 配列番号5または7に十分または実質的な同一度または類似度を含む配列を備える。1つの実施形態では、「硝酸レダクターゼポリヌクレオチド」という用語は、配列番号1または3として本明細書で示したポリヌクレオチドを含み、同ポリヌクレオチドから成るもしくは同ポリヌクレオチドから本質的に成るポリヌクレオチドの高分子を意味する。
【００３７】
「緩和した硝酸レダクターゼポリペプチド」という用語は、Nicotiana tabacum由来の修飾硝酸レダクターゼ（NR）を含み、また配列番号6または8に実質的相同性（配列類似である）または実質的同一性を持つポリヌクレオチドを持つポリペプチドを含む、同ポリペプチドから成るもしくは同ポリペプチドから本質的に成るポリペプチド、あるいは配列番号6または8の配列に対し、少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するポリペプチド変異体；配列番号6または8の断片を含むポリペプチドの断片；配列番号6または8の相当断片に対し、少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有し、それに対して実質的相同性（配列類似である）または実質同一性を有する 配列番号6または8の断片を含む。断片は、長さが少なくとも約10、30、50、100、200、300、500、600または900のアミノ酸残基であってもよく、例えば緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、（ｉ）配列番号6または8の少なくとも約10、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800または900のアミノ酸、または（ｉｉ）配列番号6または8の少なくとも約10、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800または900のアミノ酸に対し、少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%配列同一性 を有する配列を含むことができる。一般的に、断片は完全長配列の生物活性を保持することができ、例えば、断片は硝酸レダクターゼ活性、典型的には修飾または緩和した硝酸レダクターゼ活性を備える。また、硝酸レダクターゼポリペプチドは、硝酸レダクターゼとして機能する配列番号6または8に十分または実質的な同一度または類似度を備える配列を含む。１つの実施形態では、「硝酸レダクターゼポリペプチド」という用語は、配列番号2または4として本明細書で示したポリペプチドを含み、同ポリペプチドから成るもしくは同ポリペプチドから本質的に成るアミノ酸の高分子を意味する。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「非相同末端結合(NHEJ)経路」は、相同的鋳型を必要としないで切断末端を直接ライゲーションすることによってDNA中の二重鎖切断を修復する経路を意味する。NHEJによるDNA末端の鋳型非依存性連結反応は、DNA切断点にランダムな微小挿入と微小欠失(indel)を導入する確率的、エラー誘発修復プロセスである。この方法を使用して、標的遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、削除または変化させることができる。NHEJは、一般的に微小相同と呼ばれる短い相同DNA配列を使用して修復を案内する。これらの微小相同は、しばしば二重鎖切断の末端上の一本鎖オーバーハングに存在する。オーバーハングが完全に相溶性であるときに、通常、NHEJが正確に切断を修復するが、ヌクレオチドの損失に至る不正確な修復が起きる可能性があり、オーバーハングが相溶性でないときがはるかに一般的である。本明細書で使用する「ヌクレアーゼ介在性NHEJ」は、ヌクレアーゼが二本鎖DNAを切断した後に開始されるNHEJを意味する。
【００３９】
本明細書で使用する「N-末端切断」は、N-末端位または近くのアミノ酸の欠失を意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸の欠失がポリヌクレオチドのN-末端で起き得、例えば、欠失は、転写タンパク質または成熟タンパク質の第一アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸の欠失がポリペプチドのN-末端以内で起き得、例えば、欠失は、ポリペプチドの前半に発生し、転写タンパク質または成熟タンパク質の第一アミノ酸を含まない。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「核酸」または「「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合で共に結合される少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。従って、核酸は、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。多くの核酸の変異体を所定の核酸と同じ目的で使用することができる。従って、一つの核酸が実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。従って、核酸は緊縮分子交雑形成条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００４１】
核酸は一本鎖または二本鎖でもよく、あるいは二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。核酸は、DNA、ゲノムDNAおよびcDNA、RNAまたはハイブリッドとすることができ、その場合、核酸はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は化学的合成法または組み換え法によって得られる。
【００４２】
相補的断片をハイブリダイズするための一本鎖DNAの特異性は、反応条件の「厳密さ」によって決定される(Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989))。ハイブリダイゼーション厳密性はDNA二重鎖を形成する傾向が減少するにつれて増加する。核酸ハイブリッド形成反応で、厳密さを選択することで、例えば、ライブラリから完全長クローンを同定する特異的ハイブリダイゼーション（高度な厳密性）を支持することができる。特異性が低いハイブリダイゼーション（低い厳密性）を使用してDNA分子またはセグメントを正確ではないが関連を確認する（相同であるが同一ではない）ことができる。
【００４３】
DNA二重鎖は、（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対のタイプ、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度および（５）特定な有機溶媒の存在（例えばDNA二重鎖の安定性を減少させるホルムアミド等）によって安定化される。一般に、プローブが長くなると、適当なアニーリングに必要な温度が高くなる。一般的な手法は温度を変えることであり、相対温度が高くなると反応条件がより厳しくなる。
【００４４】
「厳密な条件下」でハイブリダイズするためには、相互に少なくとも60%相同なヌクレオチド配列がハイブリッド化されたままであることがハイブリダイゼーションプロトコルに記載されている。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびpHで、特定配列の融点(Tm)より約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列に相補なプローブの50%が標的配列に平衡でハイブリッド化する温度（定義されたイオン強度、pHおよび核酸濃度下）である。標的配列はTmで通常過剰に存在するため、50%のプローブが平衡状態にある。
【００４５】
「緊縮分子交雑形成条件」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドをその標的配列(例えば、配列番号1、3、5または7)だけにハイブリッド化することを可能にする条件である。厳密な条件は配列依存的であり、かつ相違する。厳密な条件としては、（1）低イオン強度および高温洗浄、例えば50℃で15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、（２）ハイブリッド化の間の変性剤、例えば、42℃で50%(v/v)ホルムアミド、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%Ficoll、0.1%ポリビニルピロリドン、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウム、pH6.5）、または(3)50%ホルムアミドが含まれる。また、一般的に洗浄液は、42℃、5xSSC(0.75MのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5xDenhardt's溶液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/mL）、0.1%のSDS、および10%硫酸デキストランを含み、42℃で0.2xSSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および55℃で50%ホルムアミド洗浄し、次いで55℃でEDTA含有の0.1xSSCから成る高厳密洗浄液で洗浄する。好ましくは、この条件は、例えば相互に少なくとも約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%、または99%相同の配列が通常、相互にハイブリダイズされた状態で維持される。これらの条件は、例として提示するものであり、制限することを意味していない。
【００４６】
「中度の緊縮条件」は、ポリヌクレオチドが標的配列（例えば、配列番号1、3、5または7）の全体、断片、誘導体または類似体にハイブリダイズするなど、厳密さが低いハイブリダイゼーション条件および洗浄溶液を使用する。1例は、55℃で6xSSC、5xDenhardt's液、0.5%のSDSおよび100μg/mLの変性サケ精子DNA中のハイブリダイゼーション、続く37℃、1xSSC、0.1%のSDSで１回または複数回洗浄する。温度、イオン強度等はプローブの長さ等の実験的要因に適合するように調節することができる。他の中度厳密条件は、(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J. (1993)、Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, N.Y. (1990)、Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1988))に記載されている。
【００４７】
「低度緊縮条件」は、ポリヌクレオチドが 標的配列（例えば、配列番号1、3、5または7）の全体、断片、誘導体または類似体にハイブリダイズするなど、中度緊縮より厳密さが低いハイブリダイゼーション条件および洗浄溶液を使用する。低度緊縮ハイブリダイゼーション条件の非限定例としては、35%ホルムアミド、5xSSC、50mMのTris HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSA、100μg/mLの変性サケ精子DNA、10%(wt/vol)硫酸デキストラン中40℃でハイブリダイゼーションし、次いで、50℃で2xSSC、25mMのTris HCl(pH7.4）、5mMのEDTAおよび0.1%sds中で１回以上の洗浄が含まれる。交差種ハイブリダイゼーションのような他の低度緊縮条件は、(Ausubel et al., 1993; Kriegler, 1990)に十分記載されている。
【００４８】
本明細書で使用する「作用できるように連結される」は、遺伝子発現が空間的に結合されるプロモーター制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下で遺伝子の5'（上流）または5'（下流）に位置しうる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーター由来の遺伝子で調節する、遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同じとすることができる。当該技術分野で公知なように、プロモーター機能の喪失せずにこの距離の変更を行うことができる。「作用できるように連結される」とは、一つの機能が他によって調節されるように単一断片での核酸断片の接続を意味する。例えば、プロモーターは核酸断片の転写を調節することが可能なときに作用できるように核酸断片に連結される。
【００４９】
「植物体」という用語は、そのライフサイクルまたは発育の任意の段階にある任意の植物体、およびその子孫を意味する。一つの実施形態では、植物はたばこ植物であり、これはたばこ属（Nicotiana）に属する植物を意味する。「植物体」は、植物全体、植物器官、植物組織、植物珠芽、種子および植物細胞並びに前記の子孫の言及を含む。植物体細胞として、限定はされないが、種子、懸濁培養、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および花粉粒の細胞が挙げられる。好ましい種、品種、雑種および種々のたばこ植物が本明細書で記載されている。
【００５０】
「ポリヌクレオチド」「核酸配列」「ヌクレオチド配列」または「核酸断片」を本明細書で交互に使用し、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を任意選択で含む一本鎖または二本鎖の高分子RNAまたはDNAを言及する。ヌクレオチド（通常、5'‐一リン酸塩形態で発見される）は、下記の一文字表示、アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれRNAまたはDNA）に対しては「A」、シチジレートまたはデオキシシチジル酸に対しては「C」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に対しては「G」、ウリジル酸に対しては「U」、デオキシチミジル酸に対しては「T」、プリン（AまたはG）の対しては「R」、ピリミジン（CまたはT）に対しては「Y」、GまたはTに対しては「K」、AまたはCまたはTに対しては「H」、イノシンに対しては「I」、および任意のヌクレオチドに対しては「N」で示される。従って、ポリヌクレオチドは、限定はされないが、ゲノムDNA、補完的DNA（cDNA）、mRNA、またはアンチセンスRNAまたはその断片とすることができる。その上、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNA、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるDNA、DNAおよびRNAを含む混成体分子、または一本鎖のおよび二本鎖の領域またはその断片の混合物を持つ混成体分子とすることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、またはその両方またはその断片を含む、三重鎖領域で構成されることもできる。ポリヌクレオチドは、ホスホチオアートなどの一つ以上の変性塩基を含むことができ、またペプチド核酸(PNA)とすることができる。一般的に、ポリヌクレオチドは、単離したかまたはクローン化したcDNAの断片、ゲノムDNA、オリゴヌクレオチド、または個別ヌクレオチド、上記の組み合わせから組み立てることができる。本明細書で説明したポリヌクレオチド配列は、DNA配列として示しているが、配列には、それらの対応するRNA配列、およびその逆相補を含む、それらの補完的（例えば、完全に補完的な）DNAまたはRNA配列が含まれる。
【００５１】
「ポリペプチド」「ペプチド」「アミノ酸配列」および「タンパク質」を本明細書で交互に使用してアミノ酸残基のポリマーを示す。当該用語は、一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、および天然のアミノ酸ポリマーに適用する。「ポリペプチド」「ペプチド」「アミノ酸配列」および「タンパク質」という用語には、限定はされないが、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、水酸化およびADPリボシル化を含む修飾も含まれる。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、「プロモーター」は、細胞における核酸の付与、活性化または発現上昇を可能にする合成または天然由来分子を意味する。「プロモーター」は、一般に上流に位置し、二本鎖核酸断片に作用できるように連結された核酸の要素/配列を意味する。プロモーターは、所定の未変性遺伝子に最も近い領域に完全に由来することも、または異なる未変性のプロモーターまたは合成核酸セグメントに由来する異なる要素から構成することもできる。プロモーターは、さらに発現を高めたり、および／またはその空間的発現および／または過渡的発現を変えたりするために、一つ以上の特異的転写制御配列を備えることができる。プロモーターは、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を備えてもよく、転写の開始部位から数千程の塩基対を配置することができる。プロモーターはウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含む発生源を由来にできる。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織または器官に対して、または発現が起こる成長段階に対して、あるいは生理的ストレス、病原体、金属イオンまたは誘発剤等の外部刺激に応じて構成的または差別的に遺伝子成分の発現を調節することができる。本明細書で交互に使用されるとき、「組織特異的プロモーター」および「組織好適プロモーター」は、必ずしも一つの組織または器官だけで発現するのではなく、一つの特定の細胞でも発現するプロモーターを意味する。本明細書で使用されるとき、「発生的に制御されるプロモーター」は、その活性が発生事象によって決定されるプロモーターを意味する。大部分の細胞型に最多で発現を誘導するプロモーターは通常、構成的プロモーターと呼ばれる。誘導プロモーターは、例えば化合物（化学誘導物質）等の内因的または外因的刺激の存在に応じて、または環境、ホルモン、化学および／または成長シグナルに応じて作用できるように連結されたDNA配列を選択的に発現させる。誘導または制御プロモーターの例として、限定はされないが、光、熱、ストレス、冠水もしくは乾燥、病原体、植物ホルモン、損傷またはエタノール、サリチル酸もしくは薬害軽減剤等の化学物質によって制御されるプロモーターが挙げられる。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「組み換え体」は、例えば化学合成または遺伝子組み替え技術による核酸の単離セグメントの操作によって２つの他の分離した配列セグメントの人工的組み合わせを意味する。また、「組み換え体」は、非相同核酸または超修飾細胞から誘導された細胞の導入によって改質される細胞またはベクターへの言及も含むが、慎重な人の介入になしに発生するものなど、天然の事象（例えば、自然突然変異、自然形質転換／形質導入／転位）による細胞またはベクターの改変を包含しない。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「組み換え体DNA構築物」は、通常天然には一緒に発見されない核酸断片の組み合わせを意味する。従って、組み換え体DNA構築物は、異なるソースに由来する調節配列およびコーディング配列、または同じソースに由来する調節配列およびコーディング配列であるが、一般に天然で発見されるものとは異なる様式で配列されたものを備えることができる。「組み換え体DNA構築物」および「組み換え体構築物」という用語は本明細書で交互に使用される。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「低減する」または「低減される」という用語は、限定はされないが、硝酸塩レベルまたはタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）レベルなどの、量または活性の約10%〜約99%の減少、または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%以上の減少を意味する。用語「低減される」または句「低減される量」は、修飾たばこ植物または修飾たばこ植物から製造したたばこ製品のTSNA量を意味し、修飾されていないたばこ植物または、修飾されていない同様式で加工された同品種のたばこから製造したたばこ製品で発見されるTSNA量より少ない。従って、いくつかの文脈では、同じ様式で加工された同品種の野生型たばこが、硝酸塩またはTSNAの減少が本明細書に記載した発明の方法によって得られるかどうかを測定するための対照として使用される。
【００５６】
本明細書で交互に使用されるとき、「調節配列」および「調節要素」は、コーディング配列の上流（5’非コーディング配列）、内部、または下流（3’非コーディング配列）に位置し、転写、RNAプロセッシングもしくは安定性、または関連コーディング配列の翻訳に影響を及ぼす核酸配列を意味する。調節配列として、限定はされないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を挙げることができる。「調節配列」および「調節要素」という用語は本明細書で交互に使用される。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「部位特異的ヌクレアーゼ」は、DNA配列を特異的に認識または開裂することができる酵素を意味する。部位特異的ヌクレアーゼを改変することができる。改変した部位特異的ヌクレアーゼの例として、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TAL、エフェクターヌクレアーゼ（TALEN)、CRISPR/Cas9系システム、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「たばこ」という用語は、いくつかの文脈では、たばこ作物、（例えば、圃場で栽培した複数のたばこ植物、すなわち、水耕で栽培したたばこ植物ではない）たばこ植物およびその一部を意味し、これらに限定されないが、本明細書に記載したように調製および／または取得された根、葉柄、葉、花および種子が含まれる。「たばこ」は、Nicotiana tabacum植物およびその産物を意味することが理解されよう。「たばこ製品」という用語は、いくつかの文脈では、限定はされないが、タバコ材料（例えば、巻きたばこ、シガー、キセルたばこ）、嗅ぎたばこ、かみたばこ、チューインガムおよびトローチ剤並びに消費者たばこ製品の製造のための成分、材料および原料を含めた消費者たばこ製品を意味する。好ましくは、これらのたばこ製品は、上述通りに処理されたたばこから収穫したたばこ(Nicotiana tabacum)葉および葉柄から製造され、タバコ調製で従来型技術に従って切断、乾燥および／または発酵させる。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「転写ターミネーター」「終止配列」または「ターミネーター」は、コーディング配列の下流に位置するDNA配列を意味し、mRNAプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができるポリアデニル化認識配列および制御的な情報をコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆体の3'末端へのポリアデニル酸配列の付加に影響を与える特徴がある。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「トランスジェニック」は、組み換え体DNA構築物などの非相同核酸の存在によって変えられた任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分または植物体、ゲノムを意味し、これらの最初のトランスジェニック事象並びに最初のトランスジェニック事象から性的交雑または無性繁殖によって作出されるものが含まれる。本明細書で使用されるとき、「トランスジェニック」という用語は、在来型植物育種方法または天然の事象（例えば無作為他家受精、非組み換え型ウイルス感染、非組み換え型細菌形質転換、非組み換え型転位または自然的変異など）によるゲノム（染色体または染色体外）の変化は含まれない。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、「トランスジェニック植物」は、ゲノム内に非相同ポリヌクレオチドを含む植物体を意味し、すなわち、人為的操作によって問題の植物（またはその植物の祖先）に導入され、通常、このタイプの植物では発見されない組み換え体遺伝子材料を含む植物体または樹木を指す。例えば、非相同ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドが継続世代に伝わるように安定的にゲノム内に統合される。非相同ポリヌクレオチドは、単独で、または組み換え体DNA構築物の一部としてゲノムに統合することができる。また、遺伝的改良生殖質の商業開発は、複数形質を導入する段階まで進み、しばしば遺伝子スタッキング手法と呼ばれている。当該手法では、対象の異なる特性を付与する複数遺伝子を植物に導入することができる。遺伝子スタッキングは、限定はされないが、同時形質転換、再形質転換、および異なる導入遺伝子を持つ交雑系統を含む多くの手段によって達成することができる。従って、組み換え体DNAが形質転換によって導入された物細胞から栽培した植物はトランスジェニック植物であり、導入した導入遺伝子を含む植物の全子孫（有性生殖または無性生殖にかかわらず）も同様である。トランスジェニック植物という用語は、植物または樹木の全体および植物または樹木の部分、例えば、穀粒、種子、花、葉、根、果実、花粉、葉柄等を包含することが理解されよう。
【００６２】
また、「トランスジェニック植物」は、ゲノム内に1つ以上の非相同ポリヌクレオチドを備える植物への言及も含まれる。各非相同ポリヌクレオチドがトランスジェニック植物に異なる形質を付与することができる。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「転写活性化因子様エフェクター」または「TALE」は、特定のDNA配列を認識して結合するタンパク質構造を意味する。「TALE DNA‐結合ドメイン」は、RVDモジュールとしても知られ、各RVDモジュールがDNAの単一塩基対を特異的に認識する縦列33-35アミノ酸反復配列を含むDNA結合ドメインを意味する。定義された配列を認識するアレイを組み立てるためにRVDモジュールを任意の順序で配置することができる。
【００６４】
RVDアレイに続いて20個のアミノ酸の単一短縮型反復によってTALE DNA−結合ドメインの結合特異性が決定される。TALE DNA結合ドメインは12〜27RVDモジュールを持つことができ、各モジュールがRVDを含み、単一のDNA塩基対を認識する。4つの可能なDNAヌクレオチド(A、T、CおよびG)を個々に認識する特異的RVDが同定されている。TALE DNA結合ドメインがモジュールのため、任意の特定のDNA配列を認識するために4つの異なるDNAヌクレオチド認識する反復を一緒に連結させることができる。次に、これらの標的化DNA結合ドメインを人工転写因子は触媒ドメインに結合し、メチルトランスフェラーゼ、インテグラーゼ、ヌクレアーゼおよびリコンビナーゼを含め、機能的酵素を作り出すことができる。
【００６５】
本明細書で交互に使用されるとき、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「TALEN」は、エンドヌクレアーゼFokIなどのヌクレアーゼの触媒ドメイン、および通常のDNA配列を標的化し得る設計TALE DNA‐結合ドメインの遺伝子組み換え融合蛋白質を意味する。「TALENモノマー」は、触媒ヌクレアーゼドメインおよび設計TALE DNA‐結合ドメインを持つ組み換え融合蛋白質を意味する。TALEN標的領域を標的化し、切断する２つのTALENモノマーを設計することができる。
【００６６】
本明細書で使用する「導入遺伝子」は、１つの生命体から単離され、異なる生命体に導入される遺伝子配列を含む遺伝子または遺伝子材料を意味する。この非天然のDNAセグメントは、トランスジェニック生命体でRNAまたはタンパク質を産生する能力を保持し、またトランスジェニック有機体の遺伝子コードの正常機能を変化させることができる。導入遺伝子の導入は有機体の表現型を変える可能性がある。
【００６７】
核酸に関して本明細書で使用されるとき、「変異体」は、（ｉ）標準ヌクレオチド配列の一部または断片、（ｉｉ）標準ヌクレオチド配列またはその一部の相補体、（ｉｉｉ）標準核酸またはその相補体に実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）標準核酸、その相補体またはそれに対し実質的に同一な配列に厳密条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。
【００６８】
ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が相違するが少なくとも１つの生物活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。また、変異体は、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する標準タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を持つタンパク質も意味する。アミノ酸の保存的置換、すなわち、特定のアミノ酸を類似特性（(例えば、荷電領域の親水性、大きさと分布）の異なるアミノ酸で置換することは、一般的に微小変化を伴うと当該技術分野で認識されている。
【００６９】
「品種」という用語は、同じ種の他の植物体と区別する一定の特性を共有する植物体の母集団を意味する。一つ以上の特有の形質を有しながらも、品種は、その品種内の個体間で非常に些細な全体的変化によって特性付けられる。品種は、しばしば市販されていることがある。
【００７０】
「ベクター」は、核酸、核酸構築物および核酸結合体、およびこれに類するものの運搬を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む、核酸媒体を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、染色体または酵母人工染色体とすることができる。ベクターはDNAまたはRNAベクターとすることができる。適切なベクターには、円形の二本鎖核酸プラスミド、線形の二本鎖核酸プラスミド、およびその他の任意の起源のベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。例えば、ベクターは配列番号5または7の任意の１つのアミノ酸配列を含む緩和した硝酸レダクターゼタンパク質をコードすることができる。「ベクター」は、核酸、核酸構築物および核酸結合体、およびこれに類するものの運搬を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む、核酸媒体を意味する。適切な発現ベクターには、円形の二本鎖核酸プラスミド、線形の二本鎖核酸プラスミド、およびその他の任意の起源の機能的に等価な発現ベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。発現ベクターは、上流に位置し、下記に定義する通り、核酸、核酸構築物または核酸結合体に作用できるように連結された、少なくともプロモーターを含む。
【００７１】
本明細書で使用する「ジンクフィンガー」はDNA配列を認識し、結合するタンパク質構造を意味する。ジンクフィンガードメインはヒトプロテオームにおける最も一般的なDNA結合モチーフである。単一ジンクフィンガーは約30のアミノ酸を含み、ドメインは一般的に、1塩基対あたり1個のアミノ酸側鎖の相互作用を介して3つの連続するDNA塩基対に結合することによって機能する。
【００７２】
本明細書で交互に使用する「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ZFN」は、DNAを切断できる少なくとも1つのヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの一部に効果的に結合する少なくとも1つのジンクフィンガーDNA結合ドメインを備えるキメラタンパク質分子を意味する。
【００７３】
他に断りがない限り、本開示に関連して使用される化学的および技術的用語は当業者が通常理解している意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載した細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質および核酸化学および交雑に関連して使用される任意の命名および技術は、当該技術分野で周知であり一般に使用されるものである。用語の意味と範囲は明確でなければならないが、任意の潜在的な曖昧性の事実が発生した場合には、本明細書で提供した定義が任意の辞書または外部定義を越えて優先される。さらに、別段の指示がない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含むものとする。
【００７４】
２．低減された硝酸塩を持つ修飾たばこ植物 
本発明は、一態様では、葉に低減された遊離硝酸レベルを持つ修飾たばこ植物を目指す。遊離硝酸レベルは硝酸同化経路を介して低減される  植物の硝酸同化経路の簡易図を図1に示す。植物が土壌硝酸塩に曝露された後、吸収、同化、転流および再移動を含め、硝酸塩（N）の取り込みに関与する幾つかの工程がある。根細胞膜に位置する特定の輸送体による取り込みの後、硝酸塩は特定の同化経路に入る。最初、硝酸塩は酵素硝酸レダクターゼ(NR;EC1.7.1.1-3)により亜硝酸塩(NO2-)に還元される。その後、亜硝酸塩は硝酸レダクターゼ(NiR)酵素によってアンモニアに還元される。植物では後の工程が効率性が高い傾向があり、結果として、一般的に植物細胞は非常に低レベルの亜硝酸塩を含む。亜硝酸塩からアンモニアへの還元の後、酵素グルタミンシンテターゼ(GS)が有機分子グルタミン(Gln)に窒素を取り込む。GS酵素は酵素グルタミン酸シンターゼ(GOGAT)と結合して作用し、GS/GOGATサイクルを形成し、アミノ基をGlnからグルタミン酸(Glu)へ移動させ、他のアミノ酸、最終的にはタンパク質および窒素含有高分子への後続の窒素再分布の出入り口として機能する。当該工程における別の重要な段階は、GOGATによるGlu生成に必要な2-オキソグルタル酸炭素骨格の提供に関与すると考えられている酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(ICDH)による触媒作用を受ける。
【００７５】
たばこ((Nicotiana tabacum)は、Nia1とNia2と称される2つの高相同性たばこNR遺伝子を有する。本明細書で開示した、葉に低減された遊離硝酸塩レベルを持つ修飾たばこ植物は、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチド、すなわち、緩和したNia1およびNia2遺伝子産物をコードする修飾硝酸レダクターゼポリヌクレオチドを有する。硝酸レダクターゼは、転写および転写後レベルの両方で高度に調節される。リン酸化を介した明／暗調節を含む転写後調節機構のため、トランスジェニック植物におけるNR遺伝子の過剰発現による細胞のNR活性の増加は一般的にごく限られる。いくつかの実施形態では、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、構成的に活性な内因性または非相同性硝酸レダクターゼポリペプチドである。緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、硝酸レダクターゼポリペプチド内のリン酸化部位欠失のためリン酸化で調節される能力を喪失することができ、この結果明暗によって調節されない。修飾たばこ植物は、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチド、または配列番号5もしくは配列番号7の緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドまたはその変異体もしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを持つことができる。例えば、緩和した硝酸レダクターゼは、切断硝酸レダクターゼポリペプチドまたはアミノ酸置換を有し、リン酸化部位が除去されている硝酸レダクターゼポリペプチドとすることができる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、非修飾対照植物体と比較して、修飾たばこ植物は実質的に正常な植物成長および発育を示す。例えば、修飾たばこ植物は正常に老化し得、すなわち修飾たばこ植物の老化は実質的に非修飾対照植物体と同じである。いくつかの実施形態では、修飾たばこ植物の外観は、例えば圃場移植の3か月または6か月後で非修飾対照植物体と実質的に同じであることができる。例えば、葉のクロロフィル含量、葉の着色、成熟度、１植物体あたりの葉数、茎高、葉の着生角度、葉のサイズ（幅と長さ）、節間距離および／または葉身‐主脈比は、非修飾対照植物体と比較して修飾たばこ植物で実質的に同じであることができる。
【００７７】
（１）切断型硝酸レダクターゼ
緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、N‐末端切断、すなわちN‐末端位または近くに欠失を持つ硝酸レダクターゼポリペプチドとすることができる。N末端ドメインに56個のアミノ酸欠失を持つNRタンパク質をコードする切断型たばこNia2遺伝子は、多くの酵素の翻訳後調節が破壊されている。リン酸化を介して暗周期で不活性化になる野生型（ＷＴ）酵素と比較して、56個のアミノ酸欠失が硝酸レダクターゼ酵素を明暗の両方で均等に活性化することを可能にする。強力な構成的プロモーターと結合したとき、切断型硝酸レダクターゼ遺伝子の発現が植物体での全体のN硝酸レダクターゼＲ活性を高めるが、グルタミン(Gln)およびアスパラギン(Asn)の生成の緩和も増大させうる。
【００７８】
緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、配列番号4と比較して、約10のアミノ酸〜約100のアミノ酸、約10のアミノ酸〜約90のアミノ酸、約10のアミノ酸〜約80のアミノ酸、約10のアミノ酸〜約70のアミノ酸、約10のアミノ酸〜約60のアミノ酸、約10のアミノ酸〜約55のアミノ酸、約10のアミノ酸〜約50のアミノ酸、約10のアミノ酸〜約40のアミノ酸、約10のアミノ酸〜約30のアミノ酸、約10のアミノ酸〜約20のアミノ酸、約20のアミノ酸〜約100のアミノ酸、約20のアミノ酸〜約90のアミノ酸、約20のアミノ酸〜約80のアミノ酸、約20のアミノ酸〜約70のアミノ酸、約20のアミノ酸〜約60のアミノ酸、約20のアミノ酸〜約55のアミノ酸、約20のアミノ酸〜約50のアミノ酸、約20のアミノ酸〜約40のアミノ酸、約20のアミノ酸〜約30のアミノ酸、約30のアミノ酸〜約10０のアミノ酸、約30のアミノ酸〜約90のアミノ酸、約30のアミノ酸〜約80のアミノ酸、約30のアミノ酸〜約70のアミノ酸、約30のアミノ酸〜約60のアミノ酸、約30のアミノ酸〜約55のアミノ酸、約30のアミノ酸〜約50のアミノ酸、約30のアミノ酸〜約40のアミノ酸、約40のアミノ酸〜約100のアミノ酸、約40のアミノ酸〜約90のアミノ酸、約40のアミノ酸〜約80のアミノ酸、約40のアミノ酸〜約70のアミノ酸、約40のアミノ酸〜約60のアミノ酸、約40のアミノ酸〜約55のアミノ酸、約40のアミノ酸〜約50のアミノ酸、約50のアミノ酸〜約100のアミノ酸、約50のアミノ酸〜約90のアミノ酸、約50のアミノ酸〜約80のアミノ酸、約50のアミノ酸〜約70のアミノ酸、約50のアミノ酸〜約60のアミノ酸、約50のアミノ酸〜約55のアミノ酸、約55のアミノ酸〜約100のアミノ酸、約55のアミノ酸〜約90のアミノ酸、約55のアミノ酸〜約80のアミノ酸、約55のアミノ酸〜約70のアミノ酸、約55のアミノ酸〜約60のアミノ酸、または少なくとも約10のアミノ酸、少なくとも約20のアミノ酸、少なくとも約30のアミノ酸、少なくとも約40のアミノ酸、少なくとも約50のアミノ酸、少なくとも約51のアミノ酸、少なくとも約52のアミノ酸、少なくとも約53のアミノ酸、少なくとも約54のアミノ酸、少なくとも約55のアミノ酸、少なくとも約56のアミノ酸、少なくとも約57のアミノ酸、少なくとも約58のアミノ酸、少なくとも約59のアミノ酸、少なくとも約60アミノ酸もしくは少なくとも約65のアミノ酸のN‐末端切断を有する硝酸レダクターゼポリペプチドとすることができる。緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、56個のアミノ酸N‐末端切断を有する硝酸レダクターゼポリペプチドとすることができる。
【００７９】
（２）アミノ酸置換
緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、配列番号4の位置523に相当する位置にアミノ酸置換を有する硝酸レダクターゼポリペプチドとすることができる。推定上のリン酸化部位（図2を参照）におけるセリン残基の突然変異が、結果的に明暗を介した翻訳後の調節を除去し、トランスジェニック植物での高レベルの硝酸レダクターゼ活性形態を増加、維持し、硝酸同化を促進する。部位特異的突然変異誘発によって配列番号4の位置523のセリン残基をアスパラギン酸(Asp)に変えることによって、硝酸レダクターゼポリペプチドがもはやセリン残基のリン酸化を介して暗期に酵素を正常に不活性化するタンパク質キナーゼの基質として機能しない。いくつかの実施形態では、緩和した硝酸レダクターゼには、配列番号４の位置523に相当する位置にアミノ酸置換を含むポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、緩和した硝酸レダクターゼには、配列番号4の位置523に相当する位置にセリン以外のアミノ酸を備えたポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、緩和した硝酸レダクターゼには、配列番号4の位置523に相当する位置にアスパラギン酸を含むポリペプチドが含まれる。
【００８０】
ａ．低減された硝酸塩レベル
修飾たばこ植物は、野生型たばこ植物対照などの対照たばこ植物と比較して低減された硝酸塩レベルを持つことができる。いくつかの実施形態では、修飾たばこ植物は、19mMの硝酸塩などの高レベル、または8mM硝酸塩などの中レベルの硝酸塩施肥処理で栽培したときに、対照たばこ植物と比較して葉に低減された硝酸塩レベルを持つことができる。いくつかの実施形態では、修飾たばこ植物は、圃場条件下で栽培したときに、対照たばこ植物と比較して、葉に低減された硝酸塩レベルを持つことができる。いくつかの実施形態では、葉が新鮮に収穫される。いくつかの実施形態では、葉が乾燥、保存または加工される。いくつかの実施形態では、葉が空気乾燥される。
【００８１】
修飾たばこ植物は、対照たばこ植物から新鮮に収穫した葉と比較して、高レベルの硝酸塩施肥処理で栽培した修飾たばこ植物から新鮮に収穫した葉の硝酸塩レベルで、少なくとも約1倍の減少、少なくとも約2倍の減少、少なくとも約3倍の減少、少なくとも約4倍の減少、少なくとも約5倍の減少、少なくとも約6倍の減少、少なくとも約7倍の減少、少なくとも約8倍の減少、少なくとも約9倍の減少、少なくとも約10倍の減少、少なくとも約15倍の減少、少なくとも約20倍の減少、少なくとも約25倍の減少、少なくとも約30倍の減少を持つことができる。修飾たばこ植物から新鮮に収穫した葉は、高レベルの硝酸塩施肥処理で栽培したときに、野生型たばこ植物などの対照たばこ植物から新鮮に収穫した葉で発見される硝酸塩レベルの約0.5％〜約99％、約0.5％〜約95％、約0.5％〜約90％、約0.5%〜約85%、約0.5%〜約80%、約0.5%〜約75%、約0.5%〜約70%、約0.5%〜約65%、約0.5%〜約60%、約0.5%〜約55%、約0.5%〜約50%、約0.5%〜約45%、約0.5%〜約40%、約0.5%〜約35%、約0.5%〜約30%、約0.5%〜約25%、約0.5%〜約20%、約0.5%〜約15%、約0.5%〜約13%、約0.5%〜約10%、約0.5%〜約5%、約1%〜約99%、約1%〜約95%、約1%〜約90%、約1%〜約85%、約1%〜約80%、約1%〜約75%、約1%〜約70%、約1%〜約65%、約1%〜約60%、約1%〜約55%、約1%〜約50%、約1%〜約45%、約1%〜約40%、約1%〜約35%、約1%〜約30%、約1%〜約25%、約1%〜約20%、約1%〜約15%、約1%〜約13%、約1%〜約10%、約1%〜約5%、約5%〜約99%、約5%〜約95%、約5%〜約90%、約5%〜約85%、約5%〜約80%、約5%〜約75%、約5%〜約70%、約5%〜約65%、約5%〜約60%、約5%〜約55%、約5%〜約50%、約5%〜約45%、約5%〜約40%、約5%〜約35%、約5%〜約30%、約5%〜約25%、約5%〜約20%、約5%〜約15%、約5%〜約13%、約5%〜約10%、約10%〜約99%、約10%〜約95%、約10%〜約90%、約10%〜約85%、約10%〜約80%、約10%〜約75%、約10%〜約70%、約10%〜約65%、約10%〜約60%、約10%〜約55%、約10%〜約50%、約10%〜約45%、約10%〜約40%、約10%〜約35%、約10%〜約30%、約10%〜約25%、約10%〜約20%、約10%〜約15%、約10%〜約13%、約20%〜約99%、約20%〜約95%、約20%〜約90%、約20%〜約85%、約20%〜約80%、約20%〜約75%、約20%〜約70%、約20%〜約65%、約20%〜約60%、約20%〜約55%、約20%〜約50%、約20%〜約45%、約20%〜約40%、約20%〜約35%、約20%〜約30%、約20%〜約25%、約30%〜約99%、約30%〜約95%、約30%〜約90%、約30%〜約85%、約30%〜約80%、約30%〜約75%、約30%〜約70%、約30%〜約65%、約30%〜約60%、約30%〜約55%、約30%〜約50%、約30%〜約45%、約30%〜約40%、約30%〜約35%、約40%〜約99%、約40%〜約95%、約40%〜約90%、約40%〜約85%、約40%〜約80%、約40%〜約75%、約40%〜約70%、約40%〜約65%、約40%〜約60%、約40%〜約55%、約40%〜約50%、約40%〜約45%、約50%〜約99%、約50%〜約95%、約50%〜約90%、約50%〜約85%、約50%〜約80%、約50%〜約75%、約50%〜約70%、約50%〜約65%、約50%〜約60%、約50%〜約55%、約60%〜約99%、約60%〜約95%、約60%〜約90%、約60%〜約85%、約60%〜約80%、約60%〜約75%、約60%〜約70%、約60%〜約65%、または、少なくとも約0.5%、少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約13%、少なくとも約14%、少なくとも約15%、少なくとも約16%、少なくとも約17%、少なくとも約18%、少なくとも約19%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なく��も約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%もしくは少なくとも約99%を持つことができる。修飾たばこ植物は、対照たばこ植物から新鮮に収穫した葉と比較して、中レベルの硝酸塩施肥処理で栽培した修飾たばこ植物から新鮮に収穫した葉で、少なくとも約50ppm、少なくとも約100ppm、少なくとも約500ppm、少なくとも約1000ppm、少なくとも約1500ppm、少なくとも約2000ppm、少なくとも約2500ppm、少なくとも約3000ppm、少なくとも約3500ppm、少なくとも約4000ppm、少なくとも約5000ppmの硝酸塩を持つことができる。
【００８２】
修飾たばこ植物は、対照たばこ植物から新鮮に収穫した葉と比較して、中レベルの硝酸塩施肥処理で栽培した修飾たばこ植物から新鮮に収穫した葉の硝酸塩レベルで、少なくとも約1倍の減少、少なくとも約2倍の減少、少なくとも約3倍の減少、少なくとも約4倍の減少、少なくとも約5倍の減少、少なくとも約6倍の減少、少なくとも約7倍の減少、少なくとも約8倍の減少、少なくとも約9倍の減少、少なくとも約10倍の減少、少なくとも約15倍の減少、少なくとも約20倍の減少、少なくとも約25倍の減少、少なくとも約30倍の減少を持つことができる。修飾たばこ植物から新鮮に収穫した葉は、中レベルの硝酸塩施肥処理で栽培したときに、野生型たばこ植物などの対照たばこ植物から新鮮に収穫した葉で発見された硝酸塩レベルの約0.5%〜約99%、約0.5%〜約95%、約0.5%〜約90%、約0.5%〜約85%、約0.5%〜約80%、約0.5%〜約75%、約0.5%〜約70%、約0.5%〜約65%、約0.5%〜約60%、約0.5%〜約55%、約0.5%〜約50%、約0.5%〜約45%、約0.5%〜約40%、約0.5%〜約35%、約0.5%〜約30%、約0.5%〜約25%、約0.5%〜約20%、約0.5%〜約15%、約0.5%〜約13%、約0.5%〜約10%、約0.5%〜約5%、約1%〜約99%、約1%〜約95%、約1%〜約90%、約1%〜約85%、約1%〜約80%、約1%〜約75%、約1%〜約70%、約1%〜約65%、約1%〜約60%、約1%〜約55%、約1%〜約50%、約1%〜約45%、約1%〜約40%、約1%〜約35%、約1%〜約30%、約1%〜約25%、約1%〜約20%、約1%〜約15%、約1%〜約13%、約1%〜約10%、約1%〜約5%、約5%〜約99%、約5%〜約95%、約5%〜約90%、約5%〜約85%、約5%〜約80%、約5%〜約75%、約5%〜約70%、約5%〜約65%、約5%〜約60%、約5%〜約55%、約5%〜約50%、約5%〜約45%、約5%〜約40%、約5%〜約35%、約5%〜約30%、約5%〜約25%、約5%〜約20%、約5%〜約15%、約5%〜約13%、約5%〜約10%、約10%〜約99%、約10%〜約95%、約10%〜約90%、約10%〜約85%、約10%〜約80%、約10%〜約75%、約10%〜約70%、約10%〜約65%、約10%〜約60%、約10%〜約55%、約10%〜約50%、約10%〜約45%、約10%〜約40%、約10%〜約35%、約10%〜約30%、約10%〜約25%、約10%〜約20%、約10%〜約15%、約10%〜約13%、約20%〜約99%、約20%〜約95%、約20%〜約90%、約20%〜約85%、約20%〜約80%、約20%〜約75%、約20%〜約70%、約20%〜約65%、約20%〜約60%、約20%〜約55%、約20%〜約50%、約20%〜約45%、約20%〜約40%、約20%〜約35%、約20%〜約30%、約20%〜約25%、約30%〜約99%、約30%〜約95%、約30%〜約90%、約30%〜約85%、約30%〜約80%、約30%〜約75%、約30%〜約70%、約30%〜約65%、約30%〜約60%、約30%〜約55%、約30%〜約50%、約30%〜約45%、約30%〜約40%、約30%〜約35%、約40%〜約99%、約40%〜約95%、約40%〜約90%、約40%〜約85%、約40%〜約80%、約40%〜約75%、約40%〜約70%、約40%〜約65%、約40%〜約60%、約40%〜約55%、約40%〜約50%、約40%〜約45%、約50%〜約99%、約50%〜約95%、約50%〜約90%、約50%〜約85%、約50%〜約80%、約50%〜約75%、約50%〜約70%、約50%〜約65%、約50%〜約60%、約50%〜約55%、約60%〜約99%、約60%〜約95%、約60%〜約90%、約60%〜約85%、約60%〜約80%、約60%〜約75%、約60%〜約70%、約60%〜約65%、または、少なくとも約0.5%、少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約13%、少なくとも約14%、少なくとも約15%、少なくとも約16%、少なくとも約17%、少なくとも約18%、少なくとも約19%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約37%��少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%もしくは少なくとも約99%を持つことができる。修飾たばこ植物は、対照たばこ植物から新鮮に収穫した葉と比較して、中レベルの硝酸塩施肥処理で栽培した修飾たばこ植物から新鮮に収穫した葉で、少なくとも約50ppm、少なくとも約100ppm、少なくとも約150ppm、少なくとも約200ppm、少なくとも約250ppm、少なくとも約300ppm、少なくとも約350ppm、少なくとも約400ppm、少なくとも約450ppm、少なくとも約500ppm、少なくとも約550ppm、少なくとも約600ppm、少なくとも約650ppm、少なくとも約700ppm、少なくとも約750ppm、少なくとも約800ppm、少なくとも約850ppm、少なくとも約900ppm、少なくとも約950ppm、少なくとも約1000 ppmの硝酸塩を持つことができる。
【００８３】
修飾たばこ植物から新鮮に収穫した葉または乾燥した葉は、圃場で栽培した修飾たばこ植物から新鮮に収穫した葉または乾燥した葉の硝酸塩レベルで、少なくとも約1倍の減少、少なくとも約2倍の減少、少なくとも約3倍の減少、少なくとも約4倍の減少、少なくとも約5倍の減少、少なくとも約6倍の減少、少なくとも約7倍の減少、少なくとも約8倍の減少、少なくとも約9倍の減少、少なくとも約10倍の減少、少なくとも約15倍の減少、少なくとも約20倍の減少、少なくとも約25倍の減少、少なくとも約30倍の減少を持つことができる。修飾たばこ植物から新鮮に収穫した葉または乾燥した葉は、圃場で栽培したときに、野生型たばこ植物などの対照たばこ植物から新鮮に収穫した葉または乾燥した葉で発見される硝酸塩レベルの約0.5%〜約99%、約0.5%〜約95%、約0.5%〜約90%、約0.5%〜約85%、約0.5%〜約80%、約0.5%〜約75%、約0.5%〜約70%、約0.5%〜約65%、約0.5%〜約60%、約0.5%〜約55%、約0.5%〜約50%、約0.5%〜約45%、約0.5%〜約40%、約0.5%〜約35%、約0.5%〜約30%、約0.5%〜約25%、約0.5%〜約20%、約0.5%〜約15%、約0.5%〜約13%、約0.5%〜約10%、約0.5%〜約5%、約1%〜約99%、約1%〜約95%、約1%〜約90%、約1%〜約85%、約1%〜約80%、約1%〜約75%、約1%〜約70%、約1%〜約65%、約1%〜約60%、約1%〜約55%、約1%〜約50%、約1%〜約45%、約1%〜約40%、約1%〜約35%、約1%〜約30%、約1%〜約25%、約1%〜約20%、約1%〜約15%、約1%〜約13%、約1%〜約10%、約1%〜約5%、約5%〜約99%、約5%〜約95%、約5%〜約90%、約5%〜約85%、約5%〜約80%、約5%〜約75%、約5%〜約70%、約5%〜約65%、約5%〜約60%、約5%〜約55%、約5%〜約50%、約5%〜約45%、約5%〜約40%、約5%〜約35%、約5%〜約30%、約5%〜約25%、約5%〜約20%、約5%〜約15%、約5%〜約13%、約5%〜約10%、約10%〜約99%、約10%〜約95%、約10%〜約90%、約10%〜約85%、約10%〜約80%、約10%〜約75%、約10%〜約70%、約10%〜約65%、約10%〜約60%、約10%〜約55%、約10%〜約50%、約10%〜約45%、約10%〜約40%、約10%〜約35%、約10%〜約30%、約10%〜約25%、約10%〜約20%、約10%〜約15%、約10%〜約13%、約20%〜約99%、約20%〜約95%、約20%〜約90%、約20%〜約85%、約20%〜約80%、約20%〜約75%、約20%〜約70%、約20%〜約65%、約20%〜約60%、約20%〜約55%、約20%〜約50%、約20%〜約45%、約20%〜約40%、約20%〜約35%、約20%〜約30%、約20%〜約25%、約30%〜約99%、約30%〜約95%、約30%〜約90%、約30%〜約85%、約30%〜約80%、約30%〜約75%、約30%〜約70%、約30%〜約65%、約30%〜約60%、約30%〜約55%、約30%〜約50%、約30%〜約45%、約30%〜約40%、約30%〜約35%、約40%〜約99%、約40%〜約95%、約40%〜約90%、約40%〜約85%、約40%〜約80%、約40%〜約75%、約40%〜約70%、約40%〜約65%、約40%〜約60%、約40%〜約55%、約40%〜約50%、約40%〜約45%、約50%〜約99%、約50%〜約95%、約50%〜約90%、約50%〜約85%、約50%〜約80%、約50%〜約75%、約50%〜約70%、約50%〜約65%、約50%〜約60%、約50%〜約55%、約60%〜約99%、約60%〜約95%、約60%〜約90%、約60%〜約85%、約60%〜約80%、約60%〜約75%、約60%〜約70%、約60%〜約65%、または、少なくとも約0.5%、少なくとも約1.0%、少なくとも約2.0%、少なくとも約3.0%、少なくとも約4.0%、少なくとも約4.1%、少なくとも約4.2%、少なくとも約4.3%、少なくとも約4.4%、少なくとも約4.5%、少なくとも約5.0%、少なくとも約5.1%、少なくとも約5.2%、少なくとも約5.3%、少なくとも約5.4%、少なくとも約5.5%、少なくとも約5.6%、少なくとも約5.7%、少なくとも約5.8%、少なくとも約5.9%、少なくとも約6.0%、少なくとも約7.0%、少なくとも約8.0%、少なくとも約9.0%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約13%、少なくとも約14%、少なくとも約15%、少なくとも約16%、少なくとも約17%、少なくとも約18%、少なくとも約19%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約37%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%もしくは少なくとも約99%を持つことができる。
【００８４】
ｂ．非相同性硝酸レダクターゼ 
緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、非相同性硝酸レダクターゼポリヌクレオチドまたは遺伝子、すなわち修飾たばこ植物に内在しない硝酸レダクターゼ遺伝子によってコードされうる。非相同性硝酸レダクターゼ遺伝子を、以下に記述したように、植物形質転換によって修飾たばこ植物のゲノムに導入することができる。例えば、非相同性硝酸レダクターゼ遺伝子を、安定な形質転換または過渡的な形質転換方法によって修飾たばこ植物に導入することができる。
【００８５】
非相同性硝酸レダクターゼ遺伝子は植物、真菌または藻類の硝酸レダクターゼ遺伝子とすることができる。例えば、非相同性硝酸レダクターゼ遺伝子は、Ricinus communis, Ricinus communis, Vitis vinifera, Populus trichocarpa, Selaginella moellendorffii, Selaginella moellendorffii, Cucumis sativus, Cucurbita maxima, Cucumis sativus, Brassica napus, Populus trichocarpa, Betula pendula, Solanum tuberosum, Nicotiana tomentosiformis, Nicotiana tabacum, Solanum lycopersicum, Nicotiana benthamiana, Medicago truncatula, Nicotiana benthamiana, Brassica rapa亜種. chinenis, Beta vulgaris, Nicotiana sylvestris, 異品種Nicotiana tabacum, Nicotiana plumbaginifolia, Glycine max, Solanum tuberosum, Solanum tuberosum, Brassica napus, Arabidopsis lyrata 亜種. lyrata, Arabidopsis thaliana, Phaseolus vulgaris, Medicago truncatula, Petunia x hybrid, Spinacia oleracea, Lotus japonicas, Cichorium intybus, Petuniax hybrid, Spinacia oleracea, Thellungiella halophile, Oryza sativa Japonica Group, Zea Mays, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata 亜種. lyrata, Phaseolus vulgaris, Sorghum bicolor, Oryza sativa Indica Group,  Oryza sativa  Japonica Group,  Hordeum vulgare 亜種. vulgare, Sorghum bicolor, Oryza sativa Japonica Group, Glycine max, Hordeum vulgare 亜種. vulgare, Sorghum bicolor, Zea mays, Heterosignma akashiwo, Chlorella vulgaris UTEX259, Chlorella vulgaris NJ-7, Chlorella variabilis, Ectocarpus siliculosus, Volvox carteri f. nagariensis, Gracilaria tenuistipitata, Dunaliella tertiolecta, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella viridis, Thalassiosira pseudonana CCMP1335, Dunaliella salina, Phaeodactylum tricornutum, またはOstreococcus lucimarinus CCE9901由来とすることができる。
【００８６】
非相同性硝酸レダクターゼ遺伝子は、GenBank登録番号XP_002513830.1、AAG30576.1、XP_002285831.1、XP_002307415.1、XP_002984312.1、XP_002972481.1、ADN96689.1、P17569.1、ADK77877.1、P39867.1、XP_002301015.1、P27783.1、BAB93534.1、227925、P11605.1、P17570.1、BAE46746.1、ADV03139.1、BAE96752.1、ACF93242.1、ABW05098.1、227926、P08509.2、P39870.1、AAB18985.1、AAB52786.1、P39868.1、XP_002889158.1、NP_177899.1、P39866.1、ADV03138.1、P36859.1、P23312.1、P39869.1、P43101.1、AAA33712.1、BAA13047.1、BAJ33682.1、NP_001062006.1、AAD38068.1、NP_174901.1、XP_002891229.1、P39865.1、XP_002444490.1、EEC74079.1、NP_001048253.1、P27967.1、XP_002454625.1、NP_001062009.1、P54233.1、P27968.1、XP_002454083.1、P49102.1、ACS44801.1、ABP97095.1、ABJ91208.4、EFN52691.1、CBN78746.1、XP_002955156.1、ACX31652.1、AAL79356.1、AAF17595.1、 AAT72293.1、XP_002294410.1、AAP75705.1、AAV66996.1または XP_001420098.1の配列を持つ硝酸レダクターゼ遺伝子とすることができる。
【００８７】
ｃ．内在性硝酸レダクターゼ遺伝子の修飾
たばこ(Nicotiana tabacum)は、Nia1およびNia2と称される2つの高相同性NR遺伝子、すなわち2つの内在性硝酸レダクターゼ遺伝子を有する。緩和した硝酸レダクターゼ遺伝子は、ゲノム編集システムまたは突然変異原によって改変または変異誘発する内在性硝酸レダクターゼ遺伝子とすることができる。本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、人造の突然変異または合成的な突然変異または遺伝子組み換えの突然変異を含むことができる。本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、生体外または生体内の操作手順を含む工程によって獲得されるか、または獲得可能な突然変異とすることができる。本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、人による介入を含む工程によって獲得されるか、または獲得可能な突然変異とすることができる。
【００８８】
突然変異体を準備するための工程は、当業界で周知であり、遺伝子材料内で無作為な突然変異を生成する、変異原性、催奇性、または発がん性の有機化合物（例えば、エチルメタンスルホン酸塩（EMS））などの外因的に追加した化学物質を使用した突然変異誘発が含まれうる。さらなる例として、工程は、一つ以上の遺伝子工学工程（本明細書で説明されている一つ以上の遺伝子工学工程など）またはその組み合わせを含みうる。また、ゲノムにおける標的誘導の局部病変(TILLING)も各所に記載した通りに使用しうる。
【００８９】
さらなる例として、工程は一つ以上の植物体交雑工程を含みうる。一つの実施形態で、植物体からの種子は突然変異誘発された後、第一世代突然変異体の植物体に栽培される。次に、第一世代の植物体は、自家受粉がなされ、第一世代植物体からの種子が第二世代の植物体に栽培され、次にこれがその座位で突然変異についてスクリーニングされる。突然変異について突然変異を誘発する植物材料をスクリーニングすることはできるが、第二世代の植物体をスクリーニングすることの利点は、細胞体のすべての突然変異が生殖細胞系列変異に対応することである。当業者であれば、突然変異体である植物体を生成するために、種子、花粉、植物体組織または植物体細胞を含むがこれに限定されない様々な植物材料が突然変異誘発しうることを理解することになる。ただし、突然変異誘発した植物材料のタイプは、植物体の核酸がいつ突然変異についてスクリーニングを受けるかに影響しうる。例えば、非突然変異誘発性植物体の受粉前に花粉が突然変異誘発の対象となるとき、その受粉の結果生じる種子は第一世代植物体に栽培される。第一世代の植物体の各細胞は、花粉内で生成された突然変異を含むことになり、こうしてこれらの第一世代の植物体はその後、第二世代まで待たずに突然変異についてスクリーニングを受けうる。
【００９０】
（１）ゲノム編集システム
ゲノム編集システムは、アミノ酸置換を有する切断硝酸レダクターゼポリペプチドまたは硝酸レダクターゼポリペプチドを作るためにある位置で内在性硝酸レダクターゼ遺伝子を結合または切断できる。内在性硝酸レダクターゼ遺伝子は、内在性硝酸レダクターゼ遺伝子を結合および切断する部位特異的ヌクレアーゼを含むゲノム編集システムによって修飾されうる。ゲノム編集システムは、ヌクレアーゼ介在型非相同末端結合または相同組み換え修復を利用することもできる。ゲノム編集システムを、安定な形質転換または過渡的な形質転換の方法で修飾たばこ植物に導入することができる。
【００９１】
部位特異的ヌクレアーゼを改変することができる。例えば、改変部位特異的ヌクレアーゼはCRISPR/Cas9系システム、ZFN、またはTALENとすることができる。部位特異的ヌクレアーゼは内在性硝酸レダクターゼ遺伝子を結合および切断することができる。ゲノム編集システムとして、改変CRISPR/Cas-9システム、改変転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、改変ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは改変メガヌクレアーゼなどの改変CRISPR/Casシステムを挙げることができる。
【００９２】
（２）突然変異原
化学的突然変異原または放射線を含め、主に点突然変異および短い欠失、挿入、塩基転換、および／または転移を作り出す突然変異原を使って硝酸レダクターゼ遺伝子に突然変異を作り出すことができる。突然変異原は、エチルメタンスルホン酸塩、メチルメタンスルホン酸塩、N-エチル-N-ニトロソウレア、トリエチルメラミン、N-メチル-N-ニトロソウレア、プロカルバジン、クロランブシル、シクロホスファミド、ジエチル硫酸塩、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェン・マスタードカラシナ、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、N-メチル-N'-ニトロ-ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、2-アミノプリン、7,12ジメチル-ベンズ（a）アントラセン、酸化エチレン酸化物、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン、およびこれに類するもの）、2-メトキシ-6-クロロ-9[3-(エチル-2-クロロ-エチル）アミノプロピルアミノ]アクリジン二塩酸塩およびホルムアルデヒドを含むが、これに限定されない。
【００９３】
ｄ.アルカロイド前駆体遺伝子との組み合わせ
ニトロソ化剤を標的とする緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、ノルニコチンアルカロイド前駆体の産生を阻害する修飾アルカロイド前駆体遺伝子と併用で使用することができる。緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドと修飾アルカロイド前駆体遺伝子の併用は、緩和した硝酸レダクターゼまたは修飾アルカロイド前駆体の単独使用と比較して、NNN蓄積で一層大きな減少を生み出すことができる。修飾アルカロイド前駆体遺伝子は、前駆体アルカロイドニコチンレベルをより低位の低ノルニコチンまで下げることで、N'-ニトロソノルニコチン等の特定のTSNAを抑制することができる。修飾アルカロイド前駆体遺伝子は修飾ニコチンデメチラーゼ遺伝子またはチトクロームP450遺伝子とすることができる。修飾アルカロイド前駆体遺伝子は修飾CYP82E4遺伝子、修飾CYP82E5v2遺伝子または修飾CYP82E10遺伝子およびその組み合わせとすることができる。いくつかの実施形態では、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、DH98-325-6#775育種系統(Lewis et al. Phytochem. 71:1988-1998 (2010))または三重変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝的背景を持つたばこ植物など、内在性ニコチンデメチラーゼ遺伝子にノックアウト変異を有するたばこ植物に導入することができる。いくつかの実施形態では、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドは、戻し交配で誘導した代表的な商業品種TN90変異体であって、その全てが参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願番号第20120216822号に記載されているバーレー種TN90e4e5など、CYP82E4とCYP82E5 ニコチンデメチラーゼ遺伝子の両方にノックアウト変異を有するたばこ植物に導入することができる。
【００９４】
３．構築物、ベクターおよび発現ベクター
特定の実施形態において、植物に導入されるポリヌクレオチドはプロモーター配列に作用できるように連結され、構築物として提供することができる。本明細書で使用するとき、ポリヌクレオチドが「作用できるように連結される」のは第二ポリヌクレオチドと機能的関連性に置かれるときである。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写に影響を与え得るようにコーディング配列に結合される場合、プロモーターがコーディング配列に作用できるように連結される。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つまたは少なくとも10のプロモーターに作用できるように連結されうる。
【００９５】
核酸配列は、ベクターとなり得る遺伝子構築物を作ることができる。ベクターは、植物細胞で、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドまたはゲノム編集システムを発現することができる。ベクターは組み換え体とすることができる。ベクターは、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドまたはゲノム編集システムをコードする非相同性核酸を備えることができる。適切なベクターはプラスミドおよびウイルス由来ベクターである。植物への形質転換、クローン化およびタンパク質発現に適した当該技術分野で公知のベクターを使用することができる。ベクターは、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドまたはゲノム編集システムをコードする核酸で細胞にトランスフェクトするのに有用であり、形質転換宿主細胞は、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドの発現またはゲノム編集システムが起こる条件下で培養し、維持することができる。
【００９６】
遺伝子構築物は、本明細書で開示した緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドまたはゲノム編集システムをコードする核酸配列を備えうる。染色体外分子が機能するように遺伝子構築物を細胞に配置することができる。遺伝子構築物は、セントロメア、テロメアまたはプラスミドまたはコスミドを含め、線形微小染色体とすることができる。また、遺伝子構築物は、組み換え体カリフラワーモザイクウイルス、組み換え体タバコモザイクウイルスおよび組み換え体ジャガイモウイルスX系ベクターを含め、組み換え体ウイルスベクターのゲノムの一部とすることができる。遺伝子構築物は、弱毒化した生きた微生物または細胞で生存する組み換え体微生物ベクターの遺伝子材料の一部とすることができる。遺伝子構築物は、核酸コーディング配列の遺伝子発現の調節要素を備えることができる。調節要素は、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドンまたはポリアデニル化シグナルとすることができる。
【００９７】
ベクターは、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドをコードする非相同性核酸を含み、さらに、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドコーディング配列の上流にある開始コドン、および硝酸レダクターゼポリペプチドコーディング配列の下流にある終止コドンを含むことができる。開始および終止コドンは、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドコーディング配列を持つフレーム内にあってもよい。また、ベクターは、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドコーディング配列に作用できるように連結されるプロモーターを備えうる。緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドコーディング配列に作用できるように連結されるプロモーターは、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと生来的に関連しなくてもよい。本発明の実施に有用なプロモーターとして、これらに限定されるものではないが、構成的プロモーター、誘発性プロモーター、時間的に調節されたプロモーター、発生学的に調節されたプロモーター、化学的に調節されたプロモーター、組織好適プロモーターおよび組織特異的プロモーターが挙げられる。好適には、プロモーターは本明細書に記載した表現型を作るため植物で十分に発現を誘導する。適切なプロモーターとしては、限定されないが、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター、CYP82E4プロモーター、ユビキチン、tCUP潜在的構成的プロモーター、Rsyn7プロモーター、 病原体誘導性プロモーター、トウモロコシIn2-2プロモーター、タバコPR-1aプロモーター、グルココルチコイド誘導性プロモーターおよびテトラサイクリン誘導性プロモーターおよびテトラサイクリン抑制性プロモーターが挙げられる。
【００９８】
また、ベクターは、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドコーディング配列下流のポリアデニル化シグナルを備えることができる。また、ベクターは、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドコーディング配列の上流にエンハンサーを備えることができる。エンハンサーはDNA発現に必要かもしれない。また、ベクターは染色体外にベクターを維持するために植物の複製起点を備えてもよく、細胞内に複数の複製を作ることができる。また、ベクターは、ベクターが投与される植物細胞に遺伝子発現に好適な調節配列も備えうる。また、ベクターは、緑色蛍光タンパク質(「GFP」)および／またはハイグロマイシン (「Hygro」)など、選択可能なマーカー等のレポーター遺伝子も備えうる。
【００９９】
コーディング配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化しうる。いくつかの例では、分子内結合に起因した形成等、RNAの二次構造形成を抑制するためにコドンが選別される。
【０１００】
ベクターは、習慣的技術によって、また、その全てが参照によって本明細書に組み込まれるSambrook et al., 1989に含まれ、容易に入手できる出発物質によってタンパク質を作る発現ベクターまたはシステムとすることができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドをコードする核酸配列を備え得る。ベクターはpBI121でもよい。
【０１０１】
４．植物形質転換
緩和した硝酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、トランスジェニック植物を作出することができる。本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドに関して「植物に導入される」は、ポリヌクレオチドの任意の適切な送達方法による植物、植物組織または植物細胞へのポリヌクレオチドの送達を包含する。本発明の実施に有用な植物にポリヌクレオチドを導入する適切な方法として、限定はされないが、凍結融解法、微粒子銃法、直接ＤＮＡ取り込み、電気穿孔法、超音波処理、マイクロインジェクション、植物ウイルス介在、および植物へのアグロバクテリウム媒介導入が挙げられる。植物を形質転換するための任意の適切なアグロバクテリウム株、ベクターまたはベクターシステムを本発明に従って使用することができる。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを安定な形質転換法、過渡的形質転換法またはウイルス媒介法の少なくとも1つを使用して導入する。
【０１０２】
「安定な形質転換」では、植物に導入したヌクレオチド構築物が植物ゲノムに統合され、それらの子孫によって遺伝できることが意図される。例えば、ゲノム編集システムなど、導入したヌクレオチドおよび／または連結した選択可能なマーカー遺伝子は、従来型育種技術を使用して後続植物作出で分離することができる。
【０１０３】
「過渡的形質転換」では、植物体に導入されたヌクレオチド構築物が植物のゲノムに統合されないことが意図される。植物体または植物体細胞はまた、組み換え体ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み入れられないように、過渡的に転換させることもできる。過渡的に転換された細胞は通常、十分な数の細胞分裂の後で、導入された組み換え体ポリヌクレオチドが娘細胞内で検出されないように、導入された組み換え体ポリヌクレオチドのすべてまたは一部を毎回の細胞分裂で失う。例えば、植物体細胞を最初に選択可能マーカーを除いたゲノム編集システムで形質転換し、選択物質を欠く培養液で培養しうる。そのような条件下、処理細胞の画分がゲノム編集システムを獲得し、ゲノムにゲノム編集システムを統合することなく一時的にゲノム編集システムを発現するであろう。形質転換の効率は考慮されていないため、この後者の形質転換処置では、望ましいゲノム修飾を獲得するためにより多くの数の処理済み細胞のスクリーニングが要求される。
【０１０４】
植物細胞にヌクレオチド配列を導入し、後続の植物ゲノムに挿入する好適な方法は、マイクロインジェクション(Crossway et al., Biotechniques 4:320-334 (1986))、電気穿孔法(Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986))、アグロバクテリウム媒介導入 (米国特許第5,981,840号および第5,563,055号)、直接遺伝子導入 (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984))および弾道粒子加速法 (例えば、米国特許第4,945,050号、第5,879,918号、第5,886,244号、第5,932,782号、Tomes et al., in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin) (1995);およびMcCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)を参照)が挙げられ、これらの全部が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、植物は、植物、植物組織または植物細胞から再生または栽培することができる。植物細胞または植物組織から植物を再生または栽培する任意の適切な方法は、例えば、限定されないが、組織培養またはプロトプラストからの再生等が使用できる。好適には、カルス誘導培地、シュート誘導培地および／または根誘導培地で形質転換植物細胞を培養することによって植物を再生することができる。例えば、McCormick et al., Plant Cell Reports 5:81-84 (1986).を参照のこと。次に、これらの植物を栽培し、同じ形質転換系統または異なる系統のいずれかで受粉し、所望の表現型特性の発現を有する結果物の雑種を同定する。所望の表現型特性の発現が安定的に維持、継承されるのを確実にするために2世代以上栽培し、所望の表現型特性の発現の達成を保証するために種子を収穫することができる。従って、本明細書で使用されるとき、「形質転換種子」は、植物ゲノムに安定的に統合されたヌクレオチド構築物を含む種子を意味する。
【０１０６】
５．たばこ品種
【０１０７】
開示した方法に従って修飾し得るたばこの品種としては、限定はされないが、ダーク品種（例えば、バーレー）、火力乾燥（Flue）またはブライト品種（バージニア火力乾燥）、ラタキア等のオリエンタルまたはトルコ品種および遺伝子組み換え品種（例えば、ベクター2141）が挙げられる。バーレーたばこは、概して他のたばこ種より高レベルの硝酸塩を蓄積し、一般の巻きたばこ（火力乾燥たばこおよびオリエント葉たばこ）の「アメリカンブレンド」様式で発見されるTSNAの不均衡な配分に寄与する傾向がある。
【０１０８】
６．低減されたタバコ特異的ニトロソアミンを持つたばこ製品
本発明は、一態様では、低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）を持つたばこ製品を目指す。TSNAは乾燥処理および喫煙の間に生成される。TSNAは、タバコで自然に発見されるニトロソ化剤とアルカロイドとの反応によって形成され、たばこの煙の発がん性物質でもある。たばこ製品は、上述したように修飾たばこ植物から製造される。
【０１０９】
修飾たばこ植物は、新鮮に収穫、乾燥してたばこ製品することができ、たばこ製品が低減された発がん能を示す。葉は、空気乾燥、火力乾燥、火力乾燥または日光乾燥することができる。空気乾燥処理たばこは、十分に換気した納屋で吊り下げ、放置して4〜8週間乾燥する。空気乾燥処理したたばこは、糖分が低いためたばこの煙が軽く、甘い風味で、かつニコチンが高い。葉巻たばこおよびバーレーたばこは暗色空気乾燥種である。火力乾燥処理たばこは、大きな納屋で吊り下げ、工程およびたばこに依って3日間〜10週間、広葉樹の火を連続的または断続的に燻焼する。火力乾燥は、糖分が低く、ニコチンが高いたばこを生成する。火力乾燥たばこは、元々はたばこ枝上に一列に並べ、乾燥小屋で階段状の柱から吊り下げた。これらの納屋は、外部から供給される乾燥薪からの煙道を有し、煙に曝露しないでたばこを熱乾燥し、乾燥過程を通じて温度をゆっくり上昇させる。工程は通常1週間かかり、糖分が高く、中高レベルのニコチンを有する紙巻たばこが作られる。大部分の巻きたばこは火力乾燥を取り入れ、よりマイルドでより吸い込める煙を産み出す。日光乾燥処理たばこは日向で覆われずに乾燥される。この方法は、トルコ、ギリシャ、および他の地中海諸国でオリエント葉たばこを製造するために使用される。日光乾燥処理したたばこは糖分およびニコチンが低く、紙巻たばこに使用される。
【０１１０】
たばこ製品としては、限定はされないが、前記の処理された修飾たばこ植物から調製した、タバコ材料(例えば葉巻たばこ、シガー、煙管たばこ、香り付きshishaたばこ)、嗅ぎたばこ、ディップたばこ、たばこ代用品、例えばニコチンパッチ、ニコチンマウスウォッシュ、推進剤と一緒に高圧ガスタンクに充填された噴霧剤、ニコチンチューインガム、およびニコチン飲料並びにトローチ剤が挙げられる。電子たばこ、高機能電子たばこ（personal vaporizer）として利用されるたばこ製品および電子ニコチン送達システムも実施形態である。
【０１１１】
本明細書に記載した修飾たばこ植物から製造したたばこ製品は、野生型たばこ植物対照など、対照たばこ植物から製造したたばこ製品と比較して低減されたTSNAレベルを持つことができる。いくつかの実施形態では、修飾たばこ植物から作ったたばこ製品は、野生型たばこ植物対照など、対照たばこ植物から作ったたばこ製品と比較して、低減された合計のTSNAレベルを持つことができる。いくつかの実施形態では、修飾たばこ植物から作ったたばこ製品は、従来型技術で栽培された同品種のタバコとまたは従来型タバコから調製したたばこ製品と比較して、限定はされないが、N-ニトロソノルニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT)、およびそれらの組み合わせを含め、低減された少なくとも1つのTSNAレベルを持つことができる。
【０１１２】
修飾たばこ植物の乾燥葉から作ったたばこ製品は、対照たばこ植物の乾燥葉から作られる対照たばこ製品と比較して、合計のTSNAレベルで、少なくとも約5.0%減少、少なくとも約10.0%減少、少なくとも約15.0%減少、少なくとも約20.0%減少、少なくとも約25.0%減少、少なくとも約30.0%減少、少なくとも約35.0%減少、少なくとも約40.0%減少、少なくとも約45.0%減少、少なくとも約50.0%減少、少なくとも約55.0%減少、少なくとも約60.0%減少、少なくとも約65.0%減少、少なくとも約70.0%減少、少なくとも約75.0%減少、少なくとも約80.0%減少、少なくとも約85.0%減少、少なくとも約90.0%減少、少なくとも約95.0%減少、少なくとも約99.0%減少を持つことができる。修飾たばこ植物の乾燥葉から作ったたばこ製品は、対照たばこ植物の乾燥葉から作られる対照たばこ製品と比較して、合計のTSNAレベルで、約5.0%〜約99.0%、約5.0%〜約95.0%、約5.0%〜約90.0%、約5.0%〜約85.0%、約5.0%〜約80.0%、約5.0%〜約75.0%、約5.0%〜約70.0%、約5.0%〜約65.0%、約5.0%〜約60.0%、約5.0%〜約55.0%、約5.0%〜約50.0%、約5.0%〜約45.0%、約5.0%〜約40.0%、約10.0%〜約99.0%、約10.0%〜約95.0%、約10.0%〜約90.0%、約10.0%〜約85.0%、約10.0%〜約80.0%、約10.0%〜約75.0%、約10.0%〜約70.0%、約10.0%〜約65.0%、約10.0%〜約60.0%、約10.0%〜約55.0%、約10.0%〜約50.0%、約10.0%〜約45.0%、約10.0%〜約40.0%、約20.0%〜約99.0%、約20.0%〜約95.0%、約20.0%〜約90.0%、約20.0%〜約85.0%、約20.0%〜約80.0%、約20.0%〜約75.0%、約20.0%〜約70.0%、約20.0%〜約65.0%、約20.0%〜約60.0%、約20.0%〜約55.0%、約20.0%〜約50.0%、約20.0%〜約45.0%、約20.0%〜約40.0%、約30.0%〜約99.0%、約30.0%〜約95.0%、約30.0%〜約90.0%、約30.0%〜約85.0%、約30.0%〜約80.0%、約30.0%〜約75.0%、約30.0%〜約70.0%、約30.0%〜約65.0%、約30.0%〜約60.0%、約30.0%〜約55.0%、約30.0%〜約50.0%、約30.0%〜約45.0%、約30.0%〜約40.0%、約40.0%〜約99.0%、約40.0%〜約95.0%、約40.0%〜約90.0%、約40.0%〜約85.0%、約40.0%〜約80.0%、約40.0%〜約75.0%、約40.0%〜約70.0%、約40.0%〜約65.0%、約40.0%〜約60.0%、約40.0%〜約55.0%、約40.0%〜約50.0%、約50.0%〜約99.0%、約50.0%〜約95.0%、約50.0%〜約90.0%、約50.0%〜約85.0%、約50.0%〜約80.0%、約50.0%〜約75.0%、約50.0%〜約70.0%、約50.0%〜約65.0%、約50.0%〜約60.0%、約50.0%〜約55.0%、約60.0%〜約99.0%、約60.0%〜約95.0%、約60.0%〜約90.0%、約60.0%〜約85.0%、約60.0%〜約80.0%、約60.0%〜約75.0%、約60.0%〜約70.0%、もしくは約60.0%〜約65.0%減少を持つことができる。
【０１１３】
修飾たばこ植物の乾燥葉から作ったたばこ製品は、対照たばこ植物の乾燥葉から作られる対照たばこ製品と比較して、限定はされないが、N-ニトロソノルニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT）およびそれらの組み合わせを含む少なくとも1つのTSNAのレベルで、少なくとも約5.0%減少、少なくとも約10.0% 減少、少なくとも約15.0%減少、少なくとも約20.0%減少、少なくとも約25.0%減少、少なくとも約30.0%減少、少なくとも約35.0%減少、少なくとも約40.0%減少、少なくとも約45.0%減少、少なくとも約50.0%減少、少なくとも約55.0%減少、少なくとも約60.0%減少、少なくとも約65.0%減少、少なくとも約70.0%減少、少なくとも約72.0%減少、少なくとも約72.5%減少、少なくとも約73.0%減少、少なくとも約75.0%減少、少なくとも約80.0%減少、少なくとも約85.0%減少、少なくとも約90.0%減少、少なくとも約95.0%減少、少なくとも約99.0%減少を持つことができる。修飾たばこ植物の乾燥葉から作ったたばこ製品は、対照たばこ植物の乾燥葉から作られる対照たばこ製品と比較して、限定されないが、N-ニトロソノルニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT)、およびそれらの組み合わせを含む少なくとも1つのTSNAのレベルで、約5.0%〜約99.0%、約5.0%〜約95.0%、約5.0%〜約90.0%、約5.0%〜約85.0%、約5.0%〜約80.0%、約5.0%〜約75.0%、約5.0%〜約70.0%、約5.0%〜約65.0%、約5.0%〜約60.0%、約5.0%〜約55.0%、約5.0%〜約50.0%、約5.0%〜約45.0%、約5.0%〜約40.0%、約10.0%〜約99.0%、約10.0%〜約95.0%、約10.0%〜約90.0%、約10.0%〜約85.0%、約10.0%〜約80.0%、約10.0%〜約75.0%、約10.0%〜約70.0%、約10.0%〜約65.0%、約10.0%〜約60.0%、約10.0%〜約55.0%、約10.0%〜約50.0%、約10.0%〜約45.0%、約10.0%〜約40.0%、約20.0%〜約99.0%、約20.0%〜約95.0%、約20.0%〜約90.0%、約20.0%〜約85.0%、約20.0%〜約80.0%、約20.0%〜約75.0%、約20.0%〜約70.0%、約20.0%〜約65.0%、約20.0%〜約60.0%、約20.0%〜約55.0%、約20.0%〜約50.0%、約20.0%〜約45.0%、約20.0%〜約40.0%、約30.0%〜約99.0%、約30.0%〜約95.0%、約30.0%〜約90.0%、約30.0%〜約85.0%、約30.0%〜約80.0%、約30.0%〜約75.0%、約30.0%〜約70.0%、約30.0%〜約65.0%、約30.0%〜約60.0%、約30.0%〜約55.0%、約30.0%〜約50.0%、約30.0%〜約45.0%、約30.0%〜約40.0%、約40.0%〜約99.0%、約40.0%〜約95.0%、約40.0%〜約90.0%、約40.0%〜約85.0%、約40.0%〜約80.0%、約40.0%〜約75.0%、約40.0%〜約70.0%、約40.0%〜約65.0%、約40.0%〜約60.0%、約40.0%〜約55.0%、約40.0%〜約50.0%、約50.0%〜約99.0%、約50.0%〜約95.0%、約50.0%〜約90.0%、約50.0%〜約85.0%、約50.0%〜約80.0%、約50.0%〜約75.0%、約50.0%〜約70.0%、約50.0%〜約65.0%、約50.0%〜約60.0%、約50.0%〜約55.0%、約60.0%〜約99.0%、約60.0%〜約95.0%、約60.0%〜約90.0%、約60.0%〜約85.0%、約60.0%〜約80.0%、約60.0%〜約75.0%、約60.0%〜約70.0%、もしくは約60.0%〜約65.0%を持つことができる。
【０１１４】
７．低減されたタバコ特異的ニトロソアミンを持つ刻みフィラーたばことたばこの煙
本発明は、１態様では、喫煙したときの葉の燃焼から得られる煙、すなわちたばこの煙で、低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）を持つたばこ製品を目指す。燃焼後の葉巻たばこの主流煙のTSNA含量は、下記の要素、（１）カットフィラーの既存TSNA量、（２）カットフィルタから煙への既存TSNAの移動効率、（３）熱分解による既存TSNAの破壊量、および（４）熱合成による新たなTSNA生成度によって決まる。上述したように、野生型たばこ植物対照などの対照たばこ植物と比較して低減された遊離硝酸塩レベルを持つ修飾たばこ植物からたばこの煙が作られる。
【０１１５】
本明細書に記載した修飾たばこ植物から作った刻みフィラーたばこまたはたばこの煙は、野生型たばこ植物対照などの対照たばこ植物から作った刻みフィラーたばこまたはたばこの煙と比較して、低減されたTSNAレベルレベルを持つことができる。いくつかの実施形態では、修飾たばこ植物から製造した刻みフィラーたばこまたはたばこの煙は、野生型たばこ植物対照などの対照たばこ植物から製造した刻みフィラーたばこまたはたばこの煙と比較して低減された総TSNAレベルを持つことができる。いくつかの実施形態では、修飾たばこ植物から作った刻みフィラーたばこまたはたばこの煙は、従来型技術によって栽培した同品種のタバコまたは従来型タバコから作られる刻みフィラーたばこまたはたばこの煙と比較して、限定されないが、N-ニトロソノルニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT)およびそれらの組み合わせを含む少なくとも1つの低減されたTSNAレベルを持つことができる。
【０１１６】
修飾たばこ植物から作った刻みフィラーたばこは、対照たばこ植物の乾燥葉から作った刻みフィラーたばこと比較して、限定されないが、N-ニトロソノルニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT)およびそれらの組み合わせを含む総TSNAレベルまたは少なくとも1つのTSNAのレベルで、少なくとも約5.0%減少、少なくとも約10.0%減少、少なくとも約15.0% 減少、少なくとも約20.0%減少、少なくとも約25.0%減少、少なくとも約30.0%減少、少なくとも約32.0%減少、少なくとも約35.0%減少、少なくとも約40.0%減少、少なくとも約44.0%減少、少なくとも約45.0%減少、少なくとも約50.0%減少、少なくとも約52.0%減少、少なくとも約55.0%減少、少なくとも約60.0%減少、少なくとも約64.0%減少、少なくとも約65.0%減少、少なくとも約70.0%減少、少なくとも約72.0%減少、少なくとも約72.5%減少、少なくとも約73.0%減少、少なくとも約75.0%減少、少なくとも約80.0%減少、少なくとも約85.0%減少、少なくとも約90.0%減少、少なくとも約95.0%減少、もしくは少なくとも約99.0%減少を持つことができる。
【０１１７】
たばこ製品から作った刻みフィラータバコは、対照たばこ植物から作られる対照刻みフィラーたばこから作った刻みフィラーたばこと比較して、限定されないが、N-ニトロソノルニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT)およびそれらの組み合わせを含む合計TSNAレベルまたは少なくとも1つのTSNAレベルで、約5.0%〜約99.0%、約5.0%〜約95.0%、約5.0%〜約90.0%、約5.0%〜約85.0%、約5.0%〜約80.0%、約5.0%〜約75.0%、約5.0%〜約70.0%、約5.0%〜約65.0%、約5.0%〜約60.0%、約5.0%〜約55.0%、約5.0%〜約50.0%、約5.0%〜約45.0%、約5.0%〜約40.0%、約10.0%〜約99.0%、約10.0%〜約95.0%、約10.0%〜約90.0%、約10.0%〜約85.0%、約10.0%〜約80.0%、約10.0%〜約75.0%、約10.0%〜約70.0%、約10.0%〜約65.0%、約10.0%〜約60.0%、約10.0%〜約55.0%、約10.0%〜約50.0%、約10.0%〜約45.0%、約10.0%〜約40.0%、約20.0%〜約99.0%、約20.0%〜約95.0%、約20.0%〜約90.0%、約20.0%〜約85.0%、約20.0%〜約80.0%、約20.0%〜約75.0%、約20.0%〜約70.0%、約20.0%〜約65.0%、約20.0%〜約60.0%、約20.0%〜約55.0%、約20.0%〜約50.0%、約20.0%〜約45.0%、約20.0%〜約40.0%、約30.0%〜約99.0%、約30.0%〜約95.0%、約30.0%〜約90.0%、約30.0%〜約85.0%、約30.0%〜約80.0%、約30.0%〜約75.0%、約30.0%〜約70.0%、約30.0%〜約65.0%、約30.0%〜約60.0%、約30.0%〜約55.0%、約30.0%〜約50.0%、約30.0%〜約45.0%、約30.0%〜約40.0%、約40.0%〜約99.0%、約40.0%〜約95.0%、約40.0%〜約90.0%、約40.0%〜約85.0%、約40.0%〜約80.0%、約40.0%〜約75.0%、約40.0%〜約70.0%、約40.0%〜約65.0%、約40.0%〜約60.0%、約40.0%〜約55.0%、約40.0%〜約50.0%、約50.0%〜約99.0%、約50.0%〜約95.0%、約50.0%〜約90.0%、約50.0%〜約85.0%、約50.0%〜約80.0%、約50.0%〜約75.0%、約50.0%〜約70.0%、約50.0%〜約65.0%、約50.0%〜約60.0%、約50.0%〜約55.0%、約60.0%〜約99.0%、約60.0%〜約95.0%、約60.0%〜約90.0%、約60.0%〜約85.0%、約60.0%〜約80.0%、約60.0%〜約75.0%、約60.0%〜約70.0%もしくは約60.0%〜約65.0%の減少を持つことができる。
【０１１８】
たばこ製品から作ったたばこの煙は、対照たばこ植物から作られる対照たばこ製品のたばこの煙と比較して、限定はされないが、N-ニトロソノルニコチン(NNN）、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT）およびそれらの組み合わせを含む合計TSNAレベルまたは少なくとも1つのTSNAのレベルで、少なくとも約5.0%減少、少なくとも約10.0%減少、少なくとも約15.0% 減少、少なくとも約20.0%減少、少なくとも約25.0%減少、少なくとも約30.0%減少、少なくとも約32.0%減少、少なくとも約35.0%減少、少なくとも約40.0%減少、少なくとも約44.0%減少、少なくとも約45.0%減少、少なくとも約50.0%減少、少なくとも約52.0%減少、少なくとも約55.0%減少、少なくとも約60.0%減少、少なくとも約64.0%減少、少なくとも約65.0%減少、少なくとも約70.0%減少、少なくとも約72.0%減少、少なくとも約72.5%減少、少なくとも約73.0%減少、少なくとも約75.0%減少、少なくとも約80.0%減少、少なくとも約85.0%減少、少なくとも約90.0%減少、少なくとも約95.0%減少もしくは少なくとも約99.0%減少を持つことができる。
【０１１９】
たばこ製品から作ったたばこの煙は、対照たばこ植物から作られる対照たばこ製品のたばこの煙と比較して、限定されないが、N-ニトロソノルニコチン(NNN）、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT）およびそれらの組み合わせを含む合計TSNAレベルまたは少なくとも1つのTSNAレベルで、約5.0%〜約99.0%、約5.0%〜約95.0%、約5.0%〜約90.0%、約5.0%〜約85.0%、約5.0%〜約80.0%、約5.0%〜約75.0%、約5.0%〜約70.0%、約5.0%〜約65.0%、約5.0%〜約60.0%、約5.0%〜約55.0%、約5.0%〜約50.0%、約5.0%〜約45.0%、約5.0%〜約40.0%、約10.0%〜約99.0%、約10.0%〜約95.0%、約10.0%〜約90.0%、約10.0%〜約85.0%、約10.0%〜約80.0%、約10.0%〜約75.0%、約10.0%〜約70.0%、約10.0%〜約65.0%、約10.0%〜約60.0%、約10.0%〜約55.0%、約10.0%〜約50.0%、約10.0%〜約45.0%、約10.0%〜約40.0%、約20.0%〜約99.0%、約20.0%〜約95.0%、約20.0%〜約90.0%、約20.0%〜約85.0%、約20.0%〜約80.0%、約20.0%〜約75.0%、約20.0%〜約70.0%、約20.0%〜約65.0%、約20.0%〜約60.0%、約20.0%〜約55.0%、約20.0%〜約50.0%、約20.0%〜約45.0%、約20.0%〜約40.0%、約30.0%〜約99.0%、約30.0%〜約95.0%、約30.0%〜約90.0%、約30.0%〜約85.0%、約30.0%〜約80.0%、約30.0%〜約75.0%、約30.0%〜約70.0%、約30.0%〜約65.0%、約30.0%〜約60.0%、約30.0%〜約55.0%、約30.0%〜約50.0%、約30.0%〜約45.0%、約30.0%〜約40.0%、約40.0%〜約99.0%、約40.0%〜約95.0%、約40.0%〜約90.0%、約40.0%〜約85.0%、約40.0%〜約80.0%、約40.0%〜約75.0%、約40.0%〜約70.0%、約40.0%〜約65.0%、約40.0%〜約60.0%、約40.0%〜約55.0%、約40.0%〜約50.0%、約50.0%〜約99.0%、約50.0%〜約95.0%、約50.0%〜約90.0%、約50.0%〜約85.0%、約50.0%〜約80.0%、約50.0%〜約75.0%、約50.0%〜約70.0%、約50.0%〜約65.0%、約50.0%〜約60.0%、約50.0%〜約55.0%、約60.0%〜約99.0%、約60.0%〜約95.0%、約60.0%〜約90.0%、約60.0%〜約85.0%、約60.0%〜約80.0%、約60.0%〜約75.0%、約60.0%〜約70.0%もしくは約60.0%〜約65.0%の減少を持つことができる。
【０１２０】
８．低減されたTSNAを持つたばこ製品の製造方法
本発明は、低減されたTSNAレベルを持つたばこ製品の製造方法も目指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載した方法を、緩和した硝酸レダクターゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを植物細胞に導入すること；形質転換細胞を再生してトランスジェニック植物を作出すること；およびトランスジェニック植物の葉からたばこ製品を製造することに使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載した方法を、内在性硝酸レダクターゼ遺伝子を標的とするゲノム編集システムを植物細胞に導入すること；形質転換細胞を再生してトランスジェニック植物を作出すること、およびトランスジェニック植物の葉からたばこ製品を製造することに使用することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、植物は、植物、植物組織または植物細胞から再生または栽培することができる。植物細胞または植物組織から植物を再生、または栽培する任意の適切な方法は、限定はされないが、組織培養またはプロトプラストからの再生等が使用できる。好適には、カルス誘導培地、シュート誘導培地および／または根誘導培地上で形質転換した植物細胞を栽培することによって植物を再生することができる。再生植物は修飾たばこ植物の全ての形態的および生理的特性を実質的に有する。
【０１２２】
９．たばこ製品のタバコ特異的ニトロソアミン低減方法
本発明は、1つの態様では、非修飾たばこ植物のTSNAと比較して低減されたTSNAレベルを持つたばこ製品の製造方法を目指す。当該方法は、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリヌクレオチド、（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリペプチド；または（ｉ）に記載したポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを備え、前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照非修飾たばこ植物と比較して緩和されるようにたばこ植物を修飾すること；前記修飾たばこ植物のたばこ葉を収穫すること；および収穫した葉からたばこ製品を作ることを備える。
【０１２３】
１０．たばこ製品の煙のタバコ特異的ニトロソアミン低減方法
本発明は、一態様では、修飾たばこ植物の葉の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルが非修飾たばこ植物の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルと比較して低減されたたばこ製品の製造方法を目指す。当該方法は、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリヌクレオチド、（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリペプチド；または（ｉ）に記載したポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを備え、前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照非修飾たばこ植物と比較して緩和されているようにたばこ植物を修飾すること；前記修飾たばこ植物のたばこ葉を収穫すること；、および収穫した葉からたばこ製品を製造することを備える。
【０１２４】
本明細書に記載した本開示の方法の他の適切な修飾および改変は容易に利用および感知されること、また本発明の開示範囲または本明細書に開示した態様および実施形態を逸脱しないで適切な等価物の使用が実施され得ることは当業者には容易に明らかであろう。ここで本開示を詳細に記載したが、それは開示の一部の態様および実施形態を説明するに過ぎないことが意図されていることは、以下の例を参照することによってより明確に理解されるであろうし、開示の範囲を制限するとして見なされるべきではない。本明細書で言及した全雑誌文献、米国特許および公開の開示は、これによって全部が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
本発明は以下の非限定例によって説明される複数の態様を有する。
【実施例】
【０１２６】
実施例１
材料および方法
プラスミド構築物  硝酸同化(N-同化)経路に関与する以下の5つの遺伝子、すなわち部位特異的突然変異誘発法(Lillo et al. Plant J. 35:566-573(2003))によってコドン523に導入されたSerからAspへの置換変異を含むタバコNia2 cDNA、「S523D-NR」(Vaucheret et al. Plant Mol. Biol. 12:597-200(1989))；部位特異的突然変異誘発法によってコドン2-56が除去されたNia2 cDNAのN-末端切断、「tr-NR」(Nussaume et al. Plant Cell 7:611-621 (1995))；たばこGln1-3 遺伝子の完全長cDNA、「GS1」(Dubois et al. Plant Mol. Biol. 31:803-817 (1996))；Arabidopsis thalianaのGLT1遺伝子の完全長cDNA、「GOGAT」（Lancien et al. Plant J. 29:347-358(2002))；タバコ細胞質イソクエン酸デヒドロゲナーゼの完全長cDNA、「ICDH」(GenBank登録番号77944)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってクローン化した。
【０１２７】
タバコで種々の構築物を発現させるために、個別の硝酸(N)同化経路cDNAでベクター内のGUSレポーター遺伝子を置換し、バイナリーベクターpBI121 (Chen et al. Mol. Breed. 11:287-293 (2003))に各cDNAを挿入した。これによって、強力なCaMVの構成的35Sプロモーターの転写制御下で構築物が配置された。植物発現ベクターpBI121は、抗生物質カナマイシンを使用して形質転換細胞の選別を可能にするnptII 遺伝子を含む。CYP82E4 (E4)プロモーターを含む構築物のために、35Sプロモーターを含むベクターの〜850bp領域を切断し、CYP82E4 開始コドンのすぐ上流の2.2 kb領域と置き換えた (Chakrabarti et al. Plant Mol. Biol. 66:415-427 (2008))。得られた植物発現ベクターをAgrobacterium tumefaciens 株 EHA105に導入し、カナマイシン (50 mg/L)とリファンピシン (20 mg/L)を補充したYEP培地(1% Bacto-Peptone, 1% Bacto-Yeast Extractおよび0.5% NaCl) で増殖した。
【０１２８】
植物材料  バーレー育種系統DH98-325-6#775を35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGAT, 35S:ICDH, E4:tr-NR, E4:S523D-NRおよびE4:GOGAT構築物で個別に形質転換した。各構築物幾について幾つかの独立のトランスジェニック系統を半定量RT-PCR法で評価し、タバコアクチン遺伝子に対して最も高い導入遺伝子発現レベルを示す個別の植物を特定した。35SCaMVプロモーターの転写制御下、構築物を含む植物の発現解析に緑色葉組織を使用した。E4プロモーターを含む植物に関して、Chakrabarti et al. (2008)による記述通りに分離し、エテフォン処理した葉上で発現解析を実行した。高発現する各T0個体について、幾つかのT1植物を栽培し、同族の導入遺伝子の診断プライマーを使用して遺伝子型を決定し、ヌル分離体と導入遺伝子を継承する子孫を区別した。所定の導入遺伝子を保持する陽性評価の各T0植物の多数のT1子孫を、再度半定量RT-PCR法で測定し、高発現表現型が忠実に次世代に伝達されたどうかを試験した。高発現表現型を均一に伝達したことがわかった系統を使用してT2世代の子孫を作出した。
【０１２９】
バーレー品種TN90e4e5を35S:S523D-NRとE4:S523D-NR構築物を用いて同時形質転換した。S523D-NR構築物の1つをそれぞれ搭載した2つのアグロバクテリウム培養液の等量を合わせて使用し、TN90e4e5葉ディスクを形質転換した。PCRに基づく分子遺伝子型決定を行い、各T0個体内の導入遺伝の相補鎖を識別した。35SまたはE4プロモーター領域に特異的なプライマーをS523D-NRに相当するプライマーと塩基対を形成し、2つの構築物を識別した。E4:GUS構築物でTN90e4e5を形質転換し、ベクターコントロール植物体を作出した(Chakrabarti et al., 2008)。各T0植物の導入遺伝子発現レベルを、製作者 (Agilent Technologies)のプロトコルに従ってMx3000P QPCR機器によるRT-PCR法で測定した。S523D-NRに相当するプライマーを使用したRT-PCRデータを延長因子‐1α制御遺伝子の発現に従って正規化した。
【０１３０】
制御環境チャンバー実験の成長条件  35S:tr-NR、35S:S523D-NR、35S:GS1、35S:GOGAT、 35S:ICDHからのT2トランスジェニックたばこ植物およびWTコントロールをノースカロライナ州立大学ファイトトロン施設の制御環境チャンバーで栽培した。種子を2:1のピートと砂の混合上で発芽させた。４週齢の実生を個別のセルに移植し、12時間26℃昼間／12時間22℃夜間形態で栽培した。メタルハライドランプと高圧ナトリウムランプ（1:1の割合）と白熱灯で1500μmol m2s-1 の光合成光量子束密度を提供した。脱イオン水で一日一回、106.23mg/Lの窒素、10.41mg/Lのリン、111.03mg/Lのカリウム、54.4mg/Lのカルシウム、12.4mg/Lのマグネシウム、5mg/Lの鉄、13.13mg/Lの硫黄、0.113mg/Lのマンガン、0.24mg/Lのホウ素、0.013mg/Lの亜鉛、0.005mg/Lの銅、0.00003mg/Lのコバルト、0.05mg/Lのモリブデンおよび11.04mg/Lのナトリウムから成る栄養溶液で一日一回植物を灌漑した。
【０１３１】
植え付けのおよそ2か月後に、遺伝子型あたり18体の植物を蒸気滅菌した川砂を充填した6インチポットに移植した。注意深く類似サイズの個体を選別した。遺伝子型あたり6体の植物を各硝酸塩施肥処理に曝露した。植物死および／または異常に成長不良の表現型の観察結果から4体の35S:ICDH、2体の35S:S523D-NRおよび1体の35S:GS1の損害が生じた。
【０１３２】
6インチポットへの移植後、最初の7日間、移植ショックに順応できるように全植物に過剰な硝酸塩 (19 mM NO3- )を含む栄養溶液を灌漑した。19mMの硝酸塩栄養溶液の構成は、5 mM Ca(NO3) )2、2 mM Mg(NO3) 2、5 mM KNO3、1mM KH2PO4、0.5mM K2SO4、19μM H3BO3、3.7 μM MnCl2、0.3 μM ZnSO4、0.13 μM CuSO4、0.05μM Na2MoO4、および10.0 μM 330 Fe-Sequestreneであった。7日の調整期間の後、各遺伝子型グループの植物を3グループに均等に分割し、次の16日間の経過を通して非常に低い硝酸塩 (0.2 mM NO3- )、中度の硝酸塩 (8 mM NO3- )または高Ｎ(19 mM NO3 - ) 栄養溶液のいずれかで灌漑した。イオンおよび浸透圧の平衡を維持するため、必要に応じて低および中溶液全体のNO3-をSO42-に置換した。従って、低(0.2 mM NO3- ) Ｎ栄養の構成は、0.1 mM Ca(NO3) 2、3 mM K2SO4、2 mM MgSO4、および4.9 mM CaSO4・2H2O (Mg(NO3)2 またはKNO3を含まない）であり、また中(8 mM NO3- ) Ｎ栄養は、4mM Ca(NO3)2、3 mM K2SO4、2 mM MgSO4および1mM CaSO4・2H2O(Mg(NO3)2またはKNO3を含まない)を含有した。
【０１３３】
16日の実験経過の間、各植物に1日3回、午前に200 mLの適切な栄養溶液、昼に200 mL DI水、午後に1000 mL DI 水で灌漑して養分を洗脱し、次いで後200 mLの適切な栄養溶液を供給した。チャンバー条件は26℃／22℃の昼／夜、１２時間／１２時間の昼間／夜間とした。
【０１３４】
クロロフィルアッセイ  処理期間の最後にDU（登録商標）640分光光度計 (Beckman（商標）Coulter)を使用してProtocol Exchange  (Ni et al. (2009) doi:10.1038/nprot.2009.12)発行のプロトコルに従ってクロロフィルアッセイを実行した。クロロフィルａ(Ca)、クロロフィルｂ(Cb)およびクロロフィルa+b (Ca+b)濃度を以下の式（Arnon Plant Physiol24:1-15(1949))に従って計算した。式中、Vは抽出物の体積(mL)およびWは新鮮葉重(g)である。
【０１３５】
Ca (mg/g) = (12.7 × A663 - 2.69 × A645) × V / (1000 × W)
【０１３６】
Ca (mg/g) = (22.9 × A645 - 4.68 × A663) × V / (1000 × W)
【０１３７】
Ca+b (mg/g) = (8.02 × A663 + 20.20 × A645) × V / (1000 × W)
【０１３８】
未乾燥質量分析と試料調製  16日の処理の後、基部で各植物を切り、未乾燥質量を記録して全植物バイオマスを測定した。各試料を計量した直後に、アミノ酸分析のために各植物の類似位置の単葉（頂上から第4葉または第5葉）を切除し、主脈を除去し、残りの葉身を液体窒素で凍結して-80℃で保存した。また、クロロフィル測定のために各植物の類似位置から小さい葉の試料 (〜300mg)も収集した。その後、各植物の残りの葉を主葉柄から剥いで、紙袋に入れて、２日間乾燥器に65℃で温置した。その後、硝酸塩およびアンモニア分析のために乾燥葉の試料を挽いて粉末にした。
【０１３９】
硝酸塩、亜硝酸塩およびアンモニアアッセイ  栽培チャンバー実験では各試料の約100 mgの乾燥葉の粉末を計量し、10mL脱イオン水で抽出した。#4 Whatman(商標)ろ紙に通してろ過した後、ノースカロライナ州立大学Environmental and Agricultural Testing Service (EATS)実験室の多チャンネル自動分析器を使用して上澄み液を硝酸塩とアンモニア濃度について測定した。硝酸塩とアンモニアの量をLachat Instruments Handbookのプロトコルに従って計算した。
【０１４０】
圃場で栽培した試料および温室で栽培したT0材料の粉末葉組織について、ケンタッキー州立大学タバコ分析実験室で硝酸塩を分析した。Crutchfield and Grove(J. AOAC International 94:1898-1905 (2011))に概説されているプロトコルに従って硝酸塩量を決定した。Crutchfield and Burton (Anal. Letters 22:555-571 (1989))に記載された方法によって粉末の空気乾燥圃場試料で硝酸塩を分析した。
【０１４１】
アミノ酸アッセイ  栽培チャンバーで発育した植物（液体窒素で凍結）の葉の試料を2日間凍結乾燥機内に置いて完全に乾燥させた。次に、乾燥葉をすり鉢とすりこぎを使って液体窒素中で粉末にした。アミノ酸含量の測定のために約100mgの乾燥葉の粉末を計量し、ノースカロライナ州立大学のバイオマニュファクチャリングトレーニングエデュケーションセンターの分析実験室に提供した。簡単には、各試料を1.0 mLの80%MeOH-20% H2Oで抽出し、試験管を旋回させた後20,000 xgで遠心分離した。澄明な上清の一定分量200-μLを約-80℃で約２時間冷却した後、一晩凍結乾燥した。乾燥した材料を200 μLのホウ酸塩緩衝剤 (pH 8.0)に溶解した後、ホウ酸塩緩衝剤で再度1:10に希釈した。10 μLの抽出試料を70μLのホウ酸塩緩衝剤および20 μLの誘導体化試薬に加えて試料を誘導体化した。バイアル瓶を55℃で10分間加熱し、室温まで冷却し、内容物を旋回した。誘導体化した試料を高速液体クロマトグラフィーを使用して分析した。
【０１４２】
空気乾燥した葉のアルカロイドとTSNA分析  以前に確立したプロトコル (Jack et al. Rec. Adv. Tob. Sci. 33:58-79 (2007))に従って乾燥葉中のニコチン、ノルニコチン、アナタビンおよびアナバシンレベルをPerkin-Elmer Autosystem XLガスクロマトグラフィーを使用して定量した。総アルカロイドをニコチン、ノルニコチン、アナタビンおよびアナバシンの合計として計算した。NNN、NNK、NATおよびNABの定量分析をMorgan et al. (Beit. Tabakforschung 23:192-203 (2004))の「Method 1」に従って行った。総TSNAをNNN、NNK、NATおよびNABの合計として示した。
【０１４３】
刻みフィラーたばこと煙のTSNA抽出と分析  刻みフィラーたばこの試料を定量化が可能な重水素化内部標準を含有する100 mM の酢酸アンモニウム溶液で抽出した。抽出液をPVDF シリンジフィルター(細孔径0.45μm)を使用してろ過し、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を組み合わせた液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（LC-MS/MS）で分析した。D4-Nニトロソノルニコチン(D4-NNN)をNNN用の内部標準として使用した一方で、D4-4-(メチルニトロソアミン)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(D4-NNK）をNNK、NATおよびNAB用の内部標準として使用した。
【０１４４】
刻みフィラーから作った試験用の巻きたばこを条件付けし、Health Canada Method No. T-115で特定されている喫煙手順に従って喫煙した。主流煙をケンブリッジフィルタ上で収集し、D4-NNNおよびD4-NNK標準を含有する100 mM の酢酸アンモニウムで抽出し、続いて細孔径0.45μmのPVDF シリンジフィルターでろ過した。酢酸アンモニウム抽出物をESIを組み合わせたLC-MS/MSで分析し、D4-NNNおよびD4-NNK標準に従って定量した。
【０１４５】
統計分析  SAS 9.1 (SAS Institute, Cary, NC) のPROC GLM手順を使って分散分析を行い、トランスジェニックおよびWT系統およびWT系統の包含の平均を計算した。不均一な分散のため自然対数データに変換し、栽培チャンバー実験で収集した未乾燥質量、硝酸塩およびアンモニアデータの正規分布を概算した。他の全てのデータセットに非変換値を使用した。有意水準をRyan-Einot-Gabriel-Welsch (REGWQ)多重範囲検定に従って設定した。
【０１４６】
実施例２
バーレーたばこでの硝酸(N)同化遺伝子の過剰発現
バーレーたばこ植物でGS1、NADH-GOGAT、ICDHまたは緩和NR酵素（56アミノ酸切断突然変異またはS523D点突然変異のいずれか）を過剰発現し、これらの任意の硝酸(N)同化経路遺伝子の異所性発現が、１）バーレーたばこのクロロフィル欠乏および／または硝酸塩(N)施肥関連発育異常特性を補償するかどうか、および／または２）葉に蓄積する遊離硝酸塩レベルを低減し、この種のたばこ植物の特徴である高硝酸塩を蓄積する表現型の反転に有用であるかどうか決定した。カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の強力な構成的35Sプロモーター、およびAgrobacterium tumefaciens (Chen et al. Mol. Breed. 11:287-293 (2003))のノパリンシンターゼ遺伝子の3’nos終了配列の調節制御下、植物の発現ベクターpBI121のGUSレポーター遺伝子を各構築物を配置した硝酸(N)同化経路遺伝子で置換した。使用した構築物の略図を図3A-3Bに示す。
【０１４７】
バーレーたばこ系統DH98-325-6#775を標準アグロバクテリウム媒介形質転換プロトコルを使用して5つの各構築物で個別に形質転換した。DH98-325-6#775はエチルメタンスルホネート(EMS)変異誘発させたバーレー集団の選抜を表し、たばこの主要ニコチンデメチラーゼ遺伝子、CYP83E4のノックアウト変異を含む (Lewis et al. Phytochem. 71:1988-1998 (2010))。バーレーたばこは、通常、不活性なCYP82E4 遺伝子が自然に活性化状態となるニコチン変換と呼ばれる現象傾向があり、高レベルのTSNA前駆体ノルニコチンを例外的に蓄積する高率の子孫の割合を高める。DH98-325-6#775のCYP82E4 ノックアウト突然変異はニコチン変換を防ぐ。この系統を選択し、標準バーレー品種を使用した場合に一因子（正常なバーレー品種の使用で観察されることが予測されているノルニコチンレベルの大きな変化ため）となる可能性がある種々の トランスジェニック材料間でのTSNAのデータ解釈で起き得る潜在的な複雑要素を回避した。
【０１４８】
それぞれの導入遺伝子を高レベルで発現する植物の選別を可能にするために、各構築物に対して少なくとも10体の独立T0植物を半定量RT-PCR法で試験した。最大レベルの導入遺伝子の蓄積を示した各構築物の3体のT0系統から種子を収穫した。導入遺伝子サイレンシングなどの現象、あるいは弱く発現する導入遺伝子と強く発現する導入遺伝子が同じT0植物内の独立した遺伝子座で統合された状態にあるため、高い導入遺伝子発現を示す一部のT0系統が導入遺伝子発現の強弱両方を分離する子孫を作る可能性がある。従って、導入遺伝子（複数）を継承したT1子孫が高レベルでそれを発現し続けるかどうかを試験するために、選別した各高発現T0植物の多数の子孫についても半定量RT-PCR法を実行した。その後の調査で使用した植物は全て、全子孫が導入遺伝子の陽性結果（分子遺伝子型決定による）が出たT1種子ロットから採取したT2植物であり、高レベルで導入遺伝子を発現し続けた。導入遺伝子をもはや持たないT1分離体は、WT（ヌル分離体）コントロール源として使用した。
【０１４９】
実施例３
制御栽培チャンバー実験でのトランスジェニック植物の分析
硝酸塩可用性が変化する条件下で栽培したバーレー植物体の硝酸(N)同化経路遺伝子過剰発現の影響を調査するために、各導入遺伝子の遺伝子型（35S:tr-NR, 35S:S523D-NR, 35S:GS1, 35S:GOGATおよび35S:ICDH）およびWTコントロールについて、6つの若いT2植物から成る3組の植物を制御環境栽培チャンバーで栽培した。各植物セットを16日間、0.2 mM, 8 mMまたは19 mMの硝酸塩を含む栄養溶液で灌漑した。しかし、実験を実行する間に少数の植物が乾燥し、成長不良を示したため分析に含めなかった。16日の処理期間の終わりに、異なる硝酸塩レベルに曝露した植物セット間で劇的な相違が観測された。予想した通り、0.2mMの硝酸塩を含有する媒体で灌漑したたばこ植物は萎黄病になり、最小の成長量を示した一方で、19mMの硝酸塩を供給した植物は最大かつ深緑色であった。しかし、所定の硝酸塩(N)施肥処理ではいずれもWTコントロールとの比較で任意の特定の導入遺伝子を含む植物の全体の成長表現型に明らかな相違は観察されなかった。
【０１５０】
処理期間の最後で全植物の地上部の未乾燥質量測定を行い、表1と図4に示した。図４に示した値は、各遺伝子型について4-6体の植物の未変換平均±標準誤差を表す。統計的検定は変換データ（自然対数変換）で実行した。各硝酸塩処理レベルに対し、同じ文字を共有する平均は相互に統計的有意差がなかった(P<0.5)。例えば、文字「a」は19mMで処理した植物だけに適用し、文字「b」および「c」は8 mMの硝酸塩培地で灌漑した植物だけに適用し、「d」および「e」は0.2mMの硝酸塩で処理した植物だけに適用する。表1は、3つの硝酸塩(N)施肥条件下で栽培した硝酸(N)同化経路遺伝子を発現する植物の平均未乾燥質量、クロロフィル、硝酸塩およびアンモニアの測定値を示し、「Ca」はクロロフィルａ、「Cb」はクロロフィルｂである。8 mMと19 mMの硝酸塩処理が与えられた植物について、WT コントロールと対比した種々のトランスジェニック遺伝子型間で有意差が観測されなかった。しかし、非常に低い硝酸塩処理では、35S:tr-NR構築物を発現する植物の未乾燥質量がWTより適度に大きく、統計的有意差とみなせた。
【表１】
2017529850.tif 000002
【０１５１】
バーレーたばこ植物はクロロフィル欠乏を示し、より薄い緑の外観によって他のたばこ種と明確に区別される。過剰発現した任意の導入遺伝子がバーレー種を特徴付けるyb1および／またはyb2 突然変異を補償することができれば、これらの植物でクロロフィル含量の増加が見られることが期待できる。WTコントロールと、試験した種々のトランスジェニック遺伝子型間の単なる目視観察では明らかな相違は観察されなかったが、より微妙な差異が存在する事象でクロロフィルａ、ｂおよびa+b量の直接測定を行った（表1）。未乾燥質量測定と類似して、クロロフィル含量が硝酸塩施肥の増加と正相関性を示す非常に強い処理効果があった。しかし、3つの任意の硝酸塩処理内で任意の導入遺伝子の遺伝子型とWTコントロールの間にクロロフィル濃度に有意差は観測されなかった(図5A-5C)。図5A-5Cに示した値は、各遺伝子型の4-6体の植物の平均±標準誤差を表す。各硝酸塩処理レベルに対し、同じ文字を共有する平均は相互に有意差がなかった(P<0.5)。
【０１５２】
各硝酸塩施肥レベルでの種々の遺伝子型に対する平均硝酸塩およびアンモニア濃度も表１に示す。0.2 mMの硝酸塩処理レベルで全植物が例外的に低硝酸塩蓄積を示し、任意の導入遺伝子遺伝子型とWTコントロールとの間で有意差は観測されなかった（図6）。図 6Aは、19 mM NO3-および8 mM NO3-処理で栽培した植物のデータを示し、0.2 mM NO3-処理の結果を図6Bに示す。示した値は、各遺伝子型に対して4-6体の植物の未変換平均±標準誤差を表す。統計的検定は変換データ（自然対数変換）で実行した。各硝酸塩処理レベルに対し、同じ文字を共有する平均は相互に有意差がなかった(P<0.5)。
【０１５３】
8 mMと19 mMの硝酸塩処理下で、35S:tr-NR植物で測定された平均硝酸塩濃度はWTコントロールで観測された値のそれぞれ37%と60%に過ぎなかった。8 mMまたは19 mMの硝酸塩で施肥したときに35S:S523D-NR構築物を発現する植物の葉で測定された硝酸塩に劇的な減少があった。平均では、緩和したNR構築物を含む植物は、8 mMの硝酸塩施肥形態で灌漑したとき、対照植物体に存在する硝酸塩量の約5%しか蓄積しなかった。19mMの硝酸塩(N)施肥処理下で、WT植物が約14,900ppmの硝酸塩の平均値に対して、35S:S523D-NR植物では僅か〜2000ppmの平均値を示し、トランスジェニック個体で8倍近く減少した(図6A)。
【０１５４】
この実験で測定した植物体のアンモニア濃度を図7に示す。図7に示した値は各遺伝子型に対して4-6体の植物の未変換平均±標準誤差を表す。統計的検定は変換データ（自然対数変換）で実行した。各硝酸塩処理レベルに対し、同じ文字を共有する平均は相互に有意差がなかった(P<0.5)。アンモニアレベルは硝酸塩ほど大きく変化しなかったが、35S:S523D-NR植物は、19 mM硝酸塩処理レベルで、対照植物体の約2倍の硝酸(N)同化経路代謝産物を蓄積した。しかし、低および中Ｎ処理レベルで、所定のトランスジェニック遺伝子型がWTコントロールまたは任意の他のトランスジェニック遺伝子型と平均アンモニア含量で統計的に相違しなかった。
【０１５５】
硝酸(N)同化経路がアミノ酸生合成に直接供給されるため、トランスジェニック植物で遊離アミノ酸濃度が変化している度合い確定した。導入遺伝子の遺伝子型にかかわらず、0.2mMの硝酸塩媒体で施肥した植物に硝酸塩およびアンモニアレベルでほんのわずかな差異が観測された(図6および7)。従って、遊離アミノ酸含量の定量化は8 mMおよび19mMの硝酸塩で処理した植物だけで実行した。表２は、中 (8 mM)および高(19 mM)硝酸塩条件下で栽培した各トランスジェニックおよび対照遺伝子型全体の20個の全アミノ酸の平均濃度（μmol/g乾燥質量）を示す。
【表２−１】
2017529850.tif 000003
【表２−２】
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【０１５６】
19mMの硝酸塩で処理した35S:S523D-NR構築物を持つ植物の全遊離アミノ酸に大きな増加があった(図8)。図8で示した値は各遺伝子型に対し4-6体の植物の平均±標準誤差を表す。各硝酸塩処理レベルに対し同文字を共有する平均は相互に有意差がない(P<0.5)。この構築物を発現するたばこ植物はWT植物より平均3.7倍以上の全遊離アミノ酸を蓄積した。高Ｎ処理では、全アミノ酸が事実上、WT群と対比して35S:S523D-NR群が高かったが、特にGln、AsnおよびArgレベルが上昇し、それぞれ8.5倍, 5.5倍および5.3倍の増加を示した（図9）。図9で示した値は、各遺伝子型に対して4-６体の植物の平均±標準誤差を表す。各硝酸塩処理レベルに対し、同文字を共有する平均は相互に有意差がない(P<0.5)。8mMの硝酸塩栄養溶液を使って栽培したとき、GlnおよびAsnのレベルも対照より35S:S523D-NR植物で有意に高かったが（それぞれ2倍と3.4倍）、2つの系統間の全アミノ酸濃度はほぼ同一(図8）であり、これは、WT(表２）と比較して35S:S523D-NR植物の幾つかの他のアミノ酸レベルが平均で減少したことに起因した。全体として、他の緩和したNR遺伝子構築物 (35S:tr-NR)を発現する植物のアミノ酸プロファイルはWT植物と類似した。
【０１５７】
グルタミンはGS酵素の反応産物である。従って、GlnレベルがGS遺伝子を過剰発現する植物で増加しなかったのは興味深い（図9B）。これは、アルファルファGScDNAがたばこ植物で過剰発現し、高硝酸塩溶液で施肥されたときに観測されたGlnの２倍の増加と対照的であった。同様に、Gluレベルは、合成に直接関与するGOGAT酵素をコードする遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物で有意な増加がなかった（図9）。8mMの硝酸塩施肥レベルで、ICDHを過剰発現する植物が合計でより低いアミノ酸を示し(図8）、特にGlu量が他の各遺伝子型より低かった(図9D)。
【０１５８】
クロロフィル欠乏はバーレーたばこの特質の1つを表し、具体的にはyb1およびyb2 遺伝子座に帰属する形質である。栽培チャンバー、温室または圃場環境での栽培にかかわらず、全植物がこのたばこ種に特徴的な同じ薄緑の表現型を示した。栽培チャンバー実験で、WTおよびトランスジェニック系統のクロロフィル含量を直接的に測定し、これらの任意の材料間に差異は観測されなかった。これらの結果は、硝酸(N)同化経路関連遺伝子 (tr-NR, S523D-NR, GS1, GOGATおよびICDH)の過剰発現が相補的でないか、そうでなければ機能的バイパス形成、バーレー表現型を定義するyb1および／またはyb2の遺伝子座突然変異であることを示唆する。
【０１５９】
試験した任意の硝酸(N)同化経路導入遺伝子の過剰発現が硝酸塩(N)施肥関連発育異常またはバーレーたばこの特徴であるクロロフィル欠乏を克服できる証拠は発見されなかったが、緩和したNR活性の過剰発現は、遊離硝酸塩レベルの低下に明らかに有効であった。
【０１６０】
実施例４
圃場条件下で栽培したトランスジェニック植物の分析
中または高硝酸塩(N)施肥の条件下で栽培したとき、緩和したS523D-NR構築物の構成的発現が葉の遊離硝酸塩蓄積で劇的な減少を媒介した。緩和したtr-NR構築物が硝酸塩含量に適度な減少を付与できることも明らかであった。圃場環境で栽培したとき、葉の硝酸塩濃度に及ぼす35S:S523D-NRおよび35S:tr-NRの影響を調査するために、栽培チャンバー実験で使用した同ロットの種子のT2植物をフロート式トレイ上で発芽させ、圃場に移植した。TSNA形成に関して、葉内の過剰遊離硝酸塩の影響は主に葉の老化および乾燥の間で示されるため、緩和したNR構築物を強い老化特異的プロモーターの転写制御下に置いた。CYP82E4 ニコチンデメチラーゼ遺伝子を制御するプロモーターは、特に老化および空気乾燥の間で高遺伝子発現レベルを媒介する。CYP82E4 (E4) プロモーター制御下にS532D-NRおよびtr-NR cDNAsを配置した構築物を、最初に、植物発現ベクターpBI121のCaMV 35SプロモーターをCYP82E4 翻訳開始Metコドンのすぐ上流 2.2 kb領域で置き換え、次いでE4プロモーターの下流にNR cDNAを挿入して作製した。葉の硝酸塩含量に影響しない硝酸(N)同化経路遺伝子の過剰発現を表すコントロールとして、35S:GOGATおよびE4:GOGATトランスジェニック植物も圃場実験に含めた。これらのベクターの略図を図3A-3Bに示す。圃場で試験した特定のT2集団は、E4プロモーター駆動性構築物を持ち、老化誘導化合物エテフォン処理したときに、導入遺伝子を高レベルで発現することが知られているT1植物の種子ロットに由来した(Chakrabarti et al., 2008)。栽培チャンバー実験と同様に、導入遺伝子をもはや持たないT1植物からのヌル分離体を圃場実験のWTコントロール源として使用した。
【０１６１】
約100体の若い植物を、試験を行った7つの各遺伝子型(WT、35S:S523D-NR、 E4:S523D-NR、35S:tr-NR、E4:tr-NR、35S:GOGATおよび E4:GOGAT)について完全乱塊法で均等に分割し、2つのノースカロライナ圃場に移植した。ノースカロライナ州クレイトンの町またはノースカロライナ州ロッキーマウントの町近郊の現地研究所で植物を栽培した。移植後に相当な数の植物が枯れたため、十分に成長した植物の総数は１遺伝子型あたり60〜79体の範囲であった。バーレーたばこ産業の慣行に従って、たばこ植物を栽培し、被覆（topped）して収穫した。成熟時に、植物の葉柄を収穫し、頂上から約3分の1の葉柄の位置から2つの葉を各植物から剥ぎ取り、中央脈を除去し、残りの葉身組織を紙袋に入れた。次いで、植物を棒に吊り下げて、空気乾燥用の雨除け構造体に移した。紙袋の葉の材料を乾燥器に入れて65℃で完全に乾燥させた。乾燥葉の試料を粉砕し、硝酸塩量を分析した。
【０１６２】
硝酸同化に関与する異なる遺伝子を発現するT2植物の平均硝酸塩濃度を表３に示す。表3に示すように、異なる遺伝子型全体の分析で観測された硝酸塩レベルの平均値は2つの圃場地（1つがノースカロライナ州クレイトン近郊、その他がノースカロライナ州ロッキーマウント近郊）の間で非常に類似した。データセットで最も劇的な観測は35S:S523D-NR植物葉の硝酸塩の大幅な減少であった。平均で、35S:S523D-NR構築物を含むたばこ植物は、クレイトンとロッキーマウントの各地で観測されたWTコントロールの硝酸塩量の4.2%と5.6%しか示さなかった。
【表３】
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【０１６３】
両地を合せたデータセットの統計分析を表4に示す。表４は、成熟時のT2世代トランスジェニックバーレー植物の葉のNO3- (N) 含量（乾燥質量ppm）への硝酸塩関連遺伝子構築物の影響を示す。35S:S523D-NR群が他の任意の遺伝子型より硝酸塩の蓄積が有意に少なかった。劇的な減少には程遠いが、緩和した硝酸レダクターゼcDNA (35S:tr-NR、E4:tr-NRおよびE4:S532D-NR)を含む他植物の遺伝子型の遊離硝酸塩レベルもWT群より硝酸塩の蓄積が少なかった。しかし、35S:tr-NR構築物を含む植物だけがGOGAT発現コントロール遺伝子型と有意差があるとみなせた。E4:GOGATおよび35S:GOGAT群の硝酸塩含量はWTと有意差があるとみなせなかった。
【表４】
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【０１６４】
茎状の収穫植物を乾燥納屋に移し、約10週間放置して空気乾燥させた。この期間の最後に上部の第3葉柄位から2枚の葉をさらに収集し、中央脈を除去して紙袋に入れた。材料は乾燥後の収集時点で非常に乾燥していたが、袋を室温で乾燥器内に置いて、完全な乾燥を確保するため送風機を稼働させた（高温がTSNAの生成に影響を与える可能性があるため加熱しなかった）。乾燥試料を粉砕し、硝酸塩分析にかけた。表5は、8週間の空気乾燥後にT2世代トランスジェニックバーレー植物の葉のNO3-Ｎ含量（乾燥質量ppm）に及ぼす硝酸塩関連遺伝子構築物の影響を示す。表4のデータと表5に提示したデータの比較で、全遺伝子型の葉の葉身の硝酸塩含量が空気乾燥後に〜2倍高いことがわかった。機序は不明であるが、バーレーたばこでは通常、葉の硝酸塩濃度の増加が空気乾燥後に観測される。成熟、非乾燥組織を使って得られた結果と同様、35S:S523D-NR遺伝子型の植物は任意の他の遺伝子型群より遊離硝酸塩の蓄積がはるかに少なく、WT植物で観測された蓄積の〜4%に過ぎなかった（表５）。緩和したNR構築物を含む他の遺伝子型の乾燥葉の試料もWT植物と比較して硝酸塩含量が統計的に有意な減少を示し続け、WT群で観測された硝酸塩濃度の70%〜77%の範囲であった。
【表５】
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【０１６５】
植物の硝酸塩レベルは一般に非常に低く、これは多分内因性硝酸レダクターゼ活性の効率に起因するが、構成的に発現したS523D-NR酵素によって媒介される細胞の硝酸塩貯蔵の劇的な代謝が最終産物亜硝酸塩レベルの増加をもたらしうる。亜硝酸塩が究極的に空気乾燥時のTSNA形成の原因化合物と考える前提では、硝酸塩プールの減少につながる遺伝子修飾が乾燥葉内の亜硝酸塩レベルの増加をもたらさないことが重要である。任意の導入遺伝子構築物の過剰発現が葉の亜硝酸塩含量の変化と関連するかどうかを決定するために、収集した空気乾燥葉の全試料で亜硝酸塩アッセイを実行した。全体的に、種々の遺伝子型間の亜硝酸塩レベルは類似した（表6）。表6は、8週間の空気乾燥後にT2世代トランスジェニックバーレー植物の葉のNO2-含量（乾燥質量ppm）に及ぼす硝酸塩関連遺伝子構築物の影響を示す。
【表６】
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【０１６６】
35S:S523D-NR群の数値平均は全遺伝子型のうち最小であったが、WTコントロールから統計的有意（E4:GOGAT系統より有意に低いとみなせたが）とはみなされなかった。これらの結果は、緩和したS523D-NR構築物の構成的発現は亜硝酸塩レベルに増加をもたらさず、代わりにこの導入遺伝子が乾燥葉の亜硝酸塩濃度の適度な減少を媒介しうる可能性を示す。
【０１６７】
葉の硝酸塩量含量の減少がTSNAまたはアルカロイド蓄積に影響を及ぼすかどうかを試験するために、さらなる分析のため、上述のWT、35S:S523D-NRおよび35S:GOGAT遺伝子型の乾燥葉試料のサブセットを選別した。各遺伝子型に対して、33個の葉の全試料を2つの場所間で均等に分配し（クレイトンから16個、ロッキーマウントから17個）、3つの全遺伝子型を表す個別の列から選別した（3つの遺伝子型の選別した列に枯れた植物はなかった）。TSNAおよびアルカロイド分析の結果を表７に示す。表７は、WT、35S:GOGATおよび35S:S523D-NR植物の乾燥葉のTSNAとアルカロイド含量を示す。累積的に、WTと比較して35S:S523D-NR遺伝子型のTSNA含量の合計減少率は77.5%であった。WT植物対35S:GOGAT植物で任意の個別TSNA含量または全TSNA含量の間に統計的有意差は観測されなかった。これらの結果は、S523D-NRの構成的発現が空気乾燥たばこ葉のTSNA含量に大幅な減少をもたらし、葉内部の遊離硝酸塩レベルを劇的に減少させる能力に帰属する可能性が最も高い現象であることを明らかに示す。
【表７】
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【０１６８】
全アルカロイド含量または任意の測定した個別アルカロイド（ニコチン、ノルニコチン、アナバシンおよびアナタビン）のいずれも3つの遺伝子間で有意差は観測されなかった。対照的に、TSNA含量で大きな差異が、低い硝酸塩を含む35S:S523D-NR葉の材料で明らかであった。WTコントロールと比較して35S:S523D-NR群でNNNレベルの90%減少が観測された。N-ニトロソアナタビン(NAT)およびNNKの蓄積がWT植物対35S:S523D-NRでそれぞれ72.5%と55%減少した。N-ニトロソアナバシン(NAB)が一般的に乾燥したたばこ葉で最小量のTSNAであるが、35S:S523D-NR植物では、この化合物はほとんど検出されなかった(表７)。
【０１６９】
35S:S523D-NR構築物によって媒介される低硝酸塩表現型は乾燥葉のTSNA含量の大幅な減少と関連し、葉面微生物が葉の硝酸塩プールを利用し、タバコアルカロイドのニトロソ化に直接関与する亜硝酸塩を産生することを前提とした空気乾燥たばこ葉におけるTSNA形成モデルと一致した。たばこ植物は硝酸塩、アルカロイドおよびTSNAの濃度が葉の葉柄位置によって相当変化するが、選択した上位葉と、低位の葉柄葉に多い植物残渣の大きく曲がった葉で製造した刻みフィラーたばこ試料の両方でこれらの化合物の大幅な減少が観測されたことから、35S:S523D-NR構築物が植物全体の硝酸塩とTSNAの減少媒介に効果的であった。対照的に、ニコチンレベルは35S:S523D-NRの媒介による硝酸塩低下の結果として有意な変化がなかった。
【０１７０】
実施例５
低硝酸塩たばこ植物で作った葉巻タバコのカットフィラーと煙の分析
減少した硝酸塩表現型の主流煙のTSNA増加に及ぼす影響を決定するために、35S:S523-NR植物とWTコントロールの残りの乾燥葉材料のプール試料から葉巻たばこを作った。前のセクションで記載した最初の2つの葉のサンプリングを上部第3葉柄位から行い、カットフィラーを作るのに使用した残りの葉組織は植物の下位葉柄位の葉に非常に偏った。硝酸塩、ニコチンおよびTSNAの相対濃度は葉柄位置によって異なるため、カットフィラーで表示されるこれらの化合物レベルを独立で測定することは、相当する煙データを正確に解釈するために重要であった。
【０１７１】
図10に示すように、WT葉の葉身から作ったカットフィラーの硝酸塩濃度は平均15,800ｐｐｍであった。対照的に、35S:S523D-NR植物から作ったカットフィラーは硝酸塩レベルが平均930ppmであり、WTフィラーで観測された値の約5.9%の値であり、乾燥した上部葉柄の葉でのこれらの2つの遺伝子型間で観測された比率と一致した（図5）。上部葉の測定値と比較してWTおよび35S:S523D-NR植物のカットフィラーで測定された全体的に比較的高い硝酸塩濃度（表5と図10を比較）は、たばこの底部の葉の硝酸塩レベルが頂上の葉で発見された値より非常に高いとした以前の観測と一致した。図10では、各遺伝子型の全植物材料を場所（35S:S523D-NRはクレイトンとロッキーマウントから各々約30体、WTは各地から約40体）に従ってプールした。    示したデータは両方の場所全体の平均誤差と標準誤差を表す。たばこ葉のニコチン濃度は反対の傾向を示し、上部の葉が下部の葉より高濃度であったが、差異の大きさは硝酸塩で観測されたほど極端ではなかった。WTと35S:S523D-NR植物のカットフィラーの硝酸塩含量は乾燥質量で1.6%と1.7%（図10）であったのに対し、上位葉の硝酸塩含量は2.5%と2.4%（表7）であった。いずれのケースも、葉の硝酸塩含量への非常に大きな影響響にもかかわらず、S523D-NR構築物の構成的発現は葉のニコチンレベルを著しく変えなかった。
【０１７２】
刻みフィラーたばこのTSNA分析結果を図11A-11Eに示す。    乾燥した上位葉の材料を使用した観測（図７）と類似して、低硝酸塩植物の葉材料を使った4つの各TSNA種で大幅な減少が観測されたが、それぞれの相対的減少度に若干の相違が観測された。35S:S523D-NR植物由来のカットフィラーはWTコントロールから作ったフィラーより44%、64%、65%および32%少ないNNN、NNK、NATおよびNABを含み、観測された全TSNA減少率は52%であった。全体のTSNAレベルは、上部の乾燥葉と比較してカットフィラー材で幾分高かった（表７と図11を比較）。この結果は、TSNA蓄積が頂上位置の葉より低い葉柄位置の葉で高いとした以前の観測と一致した。図11では、 各遺伝子型の葉の材料を図10に記載したように２つの各場所に従ってプールした。示したデータは、カットフィラーのTSNA含量に関して1場所あたり2反復、主流煙のTSNA含量に関して3反復の合体平均および標準誤差を表す。
【０１７３】
WTおよび35S:S523D-NRカットフィラーで作った葉巻たばこの主流煙のTSNAデータも図11に示す。驚いたことに、低硝酸塩表現型に起因する全TSNAの減少量は、相当のカットフィラーで観測された量より主流煙で一層大きかった。35S:S523D-NR葉巻たばこの主流煙は、WT葉巻たばこと比較して全TSNAで76%の減少を示し、刻みフィラーたばこで観測された52%の減少と反対であった（図11E）。相当の主流煙と対比した、35S:S523D-NRとWTの刻みフィラーたばこ間のTSNA含量の減少度合の相違はNNNとNABが顕著であった。35S:S523D-NR植物の未燃焼たばこフィラーのNNN含量はWTフィラーより44%少なかったが、主流煙での差異は78%まで増加した（図11D）。同様に、フィラーでは、35S:S523D-NR植物のNABレベルがWTより32%低かったのに比較して、主流煙では86%減少した（図11A）。WTと35S:S523D-NRの葉巻たばこの結果を比較すると、測定した４つのTSNAのうちNNKだけが、カットフィラー対主流煙での相対的減少で統計的有意差を示さなかった。カットフィラーと主流煙の両方とも、たばこWTコントロールと比較して、低硝酸塩35S:S523D-NRたばこを使って作った葉巻たばこでNNKが約67%減少した（図11C）。NNKを除く全TSNA種レベルの相対的減少は、相当の未燃焼カットフィラーより低硝酸塩葉巻たばこの主流煙で一層大きかった。
【０１７４】
35S:S523D-NRによって媒介される硝酸塩レベルの減少は、たばこ製品のTSNAの問題を以下の２レベル、（１）本質的に乾燥葉内のTSNA生成を低減させることにより、（２）TSNAが主流煙に現れる工程をさらに抑制することにより軽減することができる。
【０１７５】
実施例６
追加的バーレー背景でのS523D-NR過剰発現は葉の硝酸塩蓄積を劇的に低減させる
35S:S523D-NRとE4:S523D-NR構築物を含む植物発現ベクターを使用してバーレー品種TN90e4e5を形質転換した。35S:S523D-NRとE4:S523D-NR構築物を個別に含む植物を作出するのに加えて、両方の構築物を同じ植物中で混合し、単独構築物で得られる以上の硝酸塩のさらなる減少が得られるどうかを決定した。各々の導入遺伝子と導入遺伝子組合せを持つT0植物を得るために、同時形質転換法を用いた。回収した各T0植物で導入遺伝子の相補鎖を識別するために、構築物のS523D-NR領域の塩基配列から設定した3’プライマーとペアを形成する35SまたはE4プロモーター領域のいずれかに特異的な5’プライマーを使用してPCRベースのジェノタイピングを実行した。ベクターコントロールとして、TN90e4e5葉片をGUSレポーター遺伝子を含む構築物によってE4プロモーターの転写制御下で形質転換した。
【０１７６】
土壌へ移すのに植物が十分な大きさになった時点、以下のT0系統、E4:GUSベクターコントロール(12事象)、35S:S523D-NR (10事象); E4:S523D-NR (11事象)および35S:S523D-NR + E4:S523D-NR (7事象)を温室で栽培し成熟させた。    Multicote4、放出制御肥料 (14-14-16 NPK + 微量栄養素)を施肥した標準混合土壌で植物を栽培した。開花開始の直前に、各植物の中上部位から2つの葉を収集し、中央脈を除去して残りの葉身を65℃で乾燥した。同収集日に、さらなる２枚の葉を各植物の同部位から収集し、Jack et al. (Rec. Adv. Tob. Sci. 33:58-79 (2007))の記載通りエテフォンで処理し、老化を誘導した。    エテフォン処理葉が完全に黄色（処理後7-8日）になった時点で、各葉の一部をリアルタイムPCR(RT-PCR) 用に凍結させる一方で、残りの葉組織をその後の硝酸塩分析のために完全に乾燥させた。
【０１７７】
表8は、T0植物（すなわち、TN90 e4e5 T0植物）の緑色葉の試料と「人為的老化」葉の試料の硝酸塩含量を示す。全部で12の独立E4:GUSベクターコントロール植物が葉で高い硝酸塩レベルを示し、3,938〜12,730ppmの範囲であった。概して、緑色葉の硝酸塩濃度はエテフォン処理葉で観測された濃度と非常に類似した。E4:GUSコントロールと異なり、10の独立35S:S523D-NR T0事象のうち5つが1000ppm以下を蓄積し、緑色およびエテフォン処理試料の両方で3つの個体が300ppm以下を蓄積した。全ての11 E4:S523D-NR個体が緑色葉で高い硝酸塩蓄積（3,987ppmより大きい）を示した。
【表８】
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【０１７８】
しかし、同じ植物に由来するエテフォン処理葉では、2〜3倍の硝酸塩レベルの減少が観測された（図8）。これらの植物でのS523D-NR発現を調節するE4プロモーターは緑色葉では不活性であるが、エテフォン処理、老化および空気乾燥の間に高発現となる。35S:S523D-NRとE4:S523D-NR構築物の両方を含む七つのT0植物のうち二つが緑色葉で非常に低い硝酸塩レベル(146と238 ppm)を示した。これらの植物の緑色組織における低い硝酸塩レベルは、35S:S523D-NR構築物がこれらの2つの個体で活発に発現することを示唆する。これらの植物(35S+E4:S523D-NR 5-2)の1つで、緑色葉対エテフォン処理葉の硝酸塩レベルは事実上同じままだった。しかし、他の植物 (35S+E4:S523D-NR 8-1)では、遊離硝酸塩がエテフォン処理葉で不検出であった。硝酸塩蓄積の最大の減少が、S523D-NRの強い構成的発現を誘導する構築物とS523D-NRの強い老化／乾燥特異的発現を媒介する構築物との組合せによって達成できる。特に、例外的に低レベルの遊離硝酸塩を持つT0植物と正常な硝酸塩レベルを示すT0個体の間に明らかな表現型の相違が観察されなかった。
【０１７９】
「位置効果」および遺伝子サイレンシング等の現象に起因して、任意の所定の形質転換実験では一般に、異なるT0事象の間で転写産物蓄積レベルに大きな変化が観察される。T0植物での硝酸塩アッセイの結果は、一部の個体ではS523D-NR導入遺伝子が効果的に発現するが、他では、そうでない（特に、35S:S523D-NR構築物に関して）ことを示唆した。これを検証するために、RT-PCR分析を上述の黄化したエテフォン処理試料で実行した。緑色葉組織を使用したRT-PCR分析は、前記アッセイが内因性Nia2転写産物とS523D-NR誘導性転写産物を識別しなかった（コーディング領域が1コドンしか相違しないため）こと、また生来の高レベルのNR転写産物がコントロール植物の緑色組織で検出された事実から混乱した。対照的に、最小の内因性NR転写産物の蓄積が人為的に老化させたエテフォン処理葉で検出された。図 12は、表8に記載した各T0植物のエテフォン処理葉における相対NR転写産物レベル（タバコ伸長因子1α遺伝子に対し正規化）を示す。図12では、RT-PCRデータ（黄色バー、左側の目盛）は、タバコ伸長因子1α参照転写産物に対して正規化した後のNR転写産物（内因性NRとS523D-NRの両方）の相対蓄積を示す。赤い箱は硝酸塩濃度（右側の目盛）を示す。内因性NR転写産物の蓄積は全ベクターコントロール植物で相対的に低く、硝酸塩含量が高い（5,000ｐｐｍより大きい）。35S:S523D-NR構築物だけを含むT0植物では、高いNR転写産物蓄積と低い硝酸塩表現型の間で非常に高い相関性がある。E4:S523D-NR導入遺伝子だけを持つ全T0植物がベクターコントロールより高レベルのNR転写産物蓄積を示し、相当する硝酸塩レベルも一様に低かった。E4:S523D-NR植物が高発現35S:S523D-NR植物と比較して硝酸塩レベルが低く駆動されないのは、緩和したＮＲ酵素が、前者植物では後者植物で予測されている植物のライフサイクル全体ではなく、エテフォン処理の後だけ硝酸塩プールを減少させる方向に寄与することが予測されていることを考慮すれば、驚くことではない。このグループ内の植物5-2と8-1のNR転写産物の相当な割合が35S:S523D-NR構築物から開始し得ることが、これらの植物の緑色とエテフォン処理葉の両試料で例外的に低レベルの硝酸塩が観察されたこと(表８）を前提にすると可能である。
【０１８０】
実施例７
T1植物でのS523D-NRの過剰発現は葉の硝酸塩蓄積で劇的な減少を示す
フロート式トレイのTN90e4e5背景のT1トランスジェニック植物（対照、1920植物体含む）について遺伝子型決定を行い、2つの圃場に移植した（十分にランダム化された圃場計画）。各植物の葉組織の試料（葉身）を硝酸塩分析用に収集し、次に、該植物を空気乾燥器内に置いて紙巻たばこの煙の分析用カットフィラーを作った。
【０１８１】
2つの圃場で中位置の葉柄で集めた緑色葉の硝酸塩データを表9および10に提示する。データは両ケースで、導入遺伝子の存在に起因する強い硝酸塩の減少を示した。
【表９】
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【表１０】
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【０１８２】
本研究は、より活性なTN90e4e5背景での35S:S523D-NR導入遺伝子の発現は、より劣勢系統DH98 325-6#775で観測される葉の硝酸塩含量の減少と同等に効果的であると結論付けることができる。
【０１８３】
一部の系統(GH3-1、GH8-1およびGH8-5)を選択し、乾燥葉（中位置の葉柄、植栽地の代表的原末）の硝酸塩および全アルカロイドを分析した。概して、以前観測されたように全アルカロイドとニコチンは導入遺伝子 (35S:S523D-NR)の存在に影響を受けなかった。しかし、TN90e4e5背景ではわずかな減少(15%) がGH8-5の１系統で観測された（図13）。
【０１８４】
以前の結果から予測されるように、より活性な硝酸同化に起因して葉の硝酸塩が葉身で強く減少した(>95%)。老化プロモーターE4で制御される導入遺伝子の添加はデータに影響を与えなかったが、これにより、構成的プロモーター35S制御下のトランスジェニック硝酸レダクターゼ活性は緑色で非常に効率的（表9と10参照）であり、葉の葉身に保存された硝酸塩の減少に十分であることが示唆される。（図14）
【０１８５】
乾燥葉からカットフィラーを作り、TSNAを分析した。興味深いことに、TSNAが顕著に減少(NNNが〜72% 、NNKが〜45%、NATが〜76%およびNABが〜78%）したが、これは緑色葉の硝酸塩の減少がカットフィラー材でのTSNA生成に強く影響を及ぼすことを示す（図15）。
【０１８６】
35S:S523D-NRで形質転換した劣勢系統DH98 325-6#775の場合（実施例2参照）と全く同様に、葉巻たばこを図15で分析した材料で作り、喫煙した。煙のＴSNAを測定し、データを図16に報告した。TSNAが煙でカットフィラーより一層減少(NNNは〜90%、NNKは〜66%、NATは〜88%およびNABは〜92%)したが、これは熱分解の間のニトロソ化低下の影響によることはほぼ間違いない。従って、全体的に、このことは硝酸レダクターゼの緩和形態の過剰発現による緑色葉の硝酸塩の減少が商用たばこ（TN90e4e5など）の煙のＴSNA生成を強く抑制することを示す。
【０１８７】
先の詳細な記載および付随の実施例は、単なる説明であり、本発明の範囲を限定するもとして受け取られるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれの均等物によってのみ定義される。
【０１８８】
開示した実施形態への様々な変化および修飾は当業者には明白であろう。これらに限定されるものではないが、化学構造、置換、誘導体、中間体、合成、成分、製剤または発明の使用方法に関するものを含めて、そのような変化および修飾は本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われる。
【０１８９】
完全のために、以下の番号をつけた節（clause）で発明の種々の態様を提示する。
【０１９０】
節１  たばこ植物から作られる低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）レベルを持つたばこ製品であって、前記たばこ植物が （ｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素から本質的に成るポリペプチド、または（ｉｖ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを備え、かつ前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照の非修飾たばこ植物と比較して緩和されるように修飾される、前記たばこ製品。
【０１９１】
節2  緩和した硝酸レダクターゼ酵素が構成的に活性な硝酸レダクターゼ酵素である、節1に記載のたばこ製品。
【０１９２】
節3  緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列が、（ｉ）切断型硝酸レダクターゼポリペプチド、（ｉｉ）N-末端切断を含む硝酸レダクターゼポリペプチド、（ｉｉｉ）56個のアミノ酸のN-末端切断を含む硝酸レダクターゼポリペプチド、（ｉｖ）配列番号4の位置523に相当する位置でアミノ酸置換を含む硝酸レダクターゼポリペプチド、または（ｖ）配列番号4の位置523に相当する位置でアミノ酸置換を含み、配列番号4の位置523のアミノ酸が アスパラギン酸に置換されている硝酸レダクターゼポリペプチドをコードする、節1または2に記載のたばこ製品。
【０１９３】
節4  緩和した硝酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドが修飾硝酸レダクターゼポリペプチドをコードする非相同ポリヌクレオチドである、節1〜3のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【０１９４】
節5  非相同ポリヌクレオチドが内在性硝酸レダクターゼ遺伝子と生来的に関連付けられていないプロモーターに連結する、節4に記載のたばこ製品。
【０１９５】
節6  プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターまたはCYP82E4プロモーターである、節5に記載のたばこ製品。
【０１９６】
節7  緩和した硝酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドが配列番号5または配列番号7のポリヌクレオチド配列を備える、節1〜6のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【０１９７】
節8  緩和した硝酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチドがゲノム編集システムまたは突然変異原によって修飾された内在性硝酸レダクターゼ遺伝子である、節1〜3のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【０１９８】
節9  ゲノム編集システムが改変CRISPR/Cas系システム、改変転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ 、または改変メガヌクレアーゼを備える、節8に記載のたばこ製品。
【０１９９】
節10  たばこがバーレー、オリエンタル、ダーク、シガータイプ、および火力乾燥たばこである、節1〜9のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【０２００】
節11  硝酸レダクターゼ酵素が緩和されていない対照たばこ植物由来のたばこ製品と比較して低減されたタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）レベルを持つ、節1〜10のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【０２０１】
節12  全TSNAレベルがたばこ植物の葉で測定され、（ａ）前記葉が新鮮に収穫され、（ｂ）前記葉が乾燥、保存または加工され、または（ｃ）前記葉が空気乾燥される、節11に記載のたばこ製品。
【０２０２】
節13  たばこ製品の少なくとも1つのTSNAのレベルが、少なくとも1つのTSNAの対照レベルと比較して低減され、少なくとも1つのTSNAがN-ニトロソノルニコチン(NNN）、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)、N-ニトロソアナタビン(NAT)、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、節11または12に記載のたばこ製品。
【０２０３】
節14  全TSNAレベルが少なくとも50%低減される、節11〜13のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【０２０４】
節15  TSNAレベルがたばこ植物の葉の燃焼から得られる煙で測定される、節11に記載のたばこ製品。
【０２０５】
節16  煙の全TSNAレベルが少なくとも70%低減される、節15に記載のたばこ製品。
【０２０６】
節17  修飾たばこ植物の葉の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルが非修飾たばこ植物の燃焼から得られる煙で測定されるTSNAレベルと比較して低減されるたばこ製品の製造方法であって、（ａ）たばこ植物を （ｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素をコードする配列から本質的に成るポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）緩和した硝酸レダクターゼ酵素を含む、緩和した硝酸レダクターゼ酵素から成るもしくは緩和した硝酸レダクターゼ酵素から本質的に成るポリペプチド、または（ｉｖ）（ｉ）に記載したポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを備え、かつ前記硝酸レダクターゼの発現または活性が対照非修飾たばこ植物と比較して緩和されるように修飾すること、（ｂ）前記修飾たばこ植物からたばこ葉を収穫すること、および（ｃ）収穫した葉からたばこ製品を製造することを備える、前記方法。
【０２０７】
節18  たばこ植物が修飾ノルニコチン経路遺伝子をさらに備える、節1〜17のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【０２０８】
節19  修飾ノルニコチン経路遺伝子が修飾ニコチンデメチラーゼ遺伝子またはチトクロームP450遺伝子を備える、節18に記載の方法。
【０２０９】
節20  たばこ植物が修飾CYP82E4または修飾CYP82E10遺伝子を備える、節18または19に記載の方法。
【０２１０】
節21  修飾CYP82E4遺伝子または修飾CYP82E10遺伝子が不活性化される、節20に記載のたばこ製品。
【０２１１】
節22  たばこ植物がバーレー、オリエンタル、ダーク、シガータイプ、および火力乾燥たばこから成る群から選択される品種である、節1〜21のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【０２１２】
節23  たばこ製品がタバコ材料、嗅ぎたばこ、かみたばこ、ガム、トローチ剤またはニコチン溶液である、節1〜22のいずれか一項に記載のたばこ製品。
【０２１３】
節24  方法が、（ａ）修飾硝酸レダクターゼ遺伝子または修飾硝酸トランスポーター遺伝子をコードする単離されたポリヌクレオチドを植物細胞に導入する、（ｂ）形質転換細胞を再生してトランスジェニック植物を作出する、および（ｃ）トランスジェニック植物の葉からたばこ製品を製造することを備える、節1〜23のいずれか一項に記載のたばこ製品の製造方法。
【０２１４】
節25  方法が、（ａ）内在性硝酸レダクターゼ遺伝子を標的とするゲノム編集システムを植物細胞に導入し、（ｂ）形質転換細胞を再生してトランスジェニック植物を作出する、および（ｃ）トランスジェニック植物の葉からたばこ製品を製造することを備える、節1〜23のいずれか一項に記載のたばこ製品の製造方法。
【０２１５】
節26  ゲノム編集システムが内在性硝酸レダクターゼ遺伝子を結合および切断し、修飾硝酸レダクターゼ遺伝子を生成する、節25に記載の方法。
【０２１６】
節27  ゲノム編集システムが改変CRISPR/Cas系システム、改変転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ 、または改変メガヌクレアーゼを備える、節25または26に記載の方法。
【０２１７】
節28  ゲノム編集システムがたばこ植物で過渡的に発現する、節25〜27のいずれか一項に記載の方法。
【０２１８】
節29  ゲノム編集システムがたばこ植物のゲノムに導入される、節25〜27のいずれか一項に記載の方法。
【０２１９】
節30  たばこ植物が修飾ノルニコチン経路遺伝子をさらに含む、節25〜29のいずれか一項に記載の方法。
【０２２０】
節31  修飾ノルニコチン経路遺伝子が修飾ニコチンデメチラーゼ遺伝子またはチトクロームP450遺伝子を備える、節30に記載の方法。
【０２２１】
節32  たばこ植物が修飾CYP82E4または修飾CYP82E10遺伝子を備える、節30または31に記載の方法。
【０２２２】
節33  修飾CYP82E4遺伝子または修飾CYP82E10遺伝子が不活性化される、節32に記載の方法。
【０２２３】
節34  植物細胞がバーレー、オリエンタル、ダーク、シガータイプ、および火力乾燥たばこから成る群から選択されるたばこ品種系である、節25〜33のいずれか一項に記載の方法。
【０２２４】
節35  たばこ製品がタバコ材料、嗅ぎたばこ、かみたばこ、ガム、トローチ剤またはニコチン溶液である、節25〜34のいずれか一項に記載の方法。
【０２２５】
以下の核酸およびアミノ酸が本書に添付の配列表に開示されている。
配列番号1-Nia1 cDNAのコーディング領域
配列番号2-Nia1pの予測タンパク質配列
配列番号3-Nia2 cDNAのコーディング領域（位置523にセリン残基を含む）
配列番号4-Nia2pの予測タンパク質配列
配列番号5-Nia2 S523D-NR cDNAのコーディング領域
配列番号6-S523D-NRp（位置523にアスパラギン酸残基を含む）の予測蛋白質配列
配列番号7-tr-NR cDNAのコーディング領域
【図１】
2017529850.tif 000013
【図２】
2017529850.tif 000014
【図３Ａ】
2017529850.tif 000015
【図３Ｂ】
2017529850.tif 000016
【図４】
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【図５Ａ】
2017529850.tif 000018
【図５Ｂ】
2017529850.tif 000019
【図５Ｃ】
2017529850.tif 000020
【図６Ａ】
2017529850.tif 000021
【図６Ｂ】
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【図７】
2017529850.tif 000023
【図８】
2017529850.tif 000024
【図９Ａ】
2017529850.tif 000025
【図９Ｂ】
2017529850.tif 000026
【図９Ｃ】
2017529850.tif 000027
【図９Ｄ】
2017529850.tif 000028
【図１０】
2017529850.tif 000029
【図１１Ａ】
2017529850.tif 000030
【図１１Ｂ】
2017529850.tif 000031
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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