(57)【要約】単一細胞からＲＮＡ及びＤＮＡを調製するためのデバイス及び方法を開示する。特に、本発明は、電気泳動的に単一細胞からＲＮＡ及びＤＮＡを同時に抽出し、核酸を分離する方法に関する。核膜を破壊することなく原形質膜が選択的に破壊されるように、電場を用いて単一標的細胞を破壊する。核の移動度を選択的に低下させる篩いマトリックスの存在下で等速電気泳動（ＩＴＰ）を行うことにより核から細胞質ＲＮＡを分離する。ＩＴＰ中、細胞質ＲＮＡは、リーディング電解質とトレーリング電解質の間のＩＴＰ界面に蓄積され、後で核ＤＮＡが含まれないように抽出することができる。方法は、プロセスの全ステップが完全に自動化されたマイクロ流体デバイス中で行うことができる。【選択図】図１Ｃ
2017505610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞からＲＮＡ及びＤＮＡを調製する方法であって、
（ａ）流体チャネル中に前記細胞を単離すること；
（ｂ）前記流体チャネルに電場を印加することにより、核膜を破壊することなく前記細胞の原形質膜を破壊すること；並びに
（ｃ）下記（ｉ）及び（ｉｉ）を用いて、前記細胞の内容物に対する等速電気泳動（ＩＴＰ）を行うこと
（ｉ）リーディング電解質（ＬＥ）及びトレーリング電解質（ＴＥ）；細胞質ＲＮＡはリーディング電解質−トレーリング電解質界面に濃縮される、並びに
（ｉｉ）核を遅らせる篩いマトリックス；この遅れにより前記細胞質ＲＮＡは前記細胞の核ＤＮＡから分離される、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記流体チャネルへの電場の印加が、前記細胞の前記原形質膜を破壊する両極性電圧パルスを生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個々のパルスの持続時間がそれぞれ約１００ミリ秒である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の原形質膜に誘導される電位が約３ボルトである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記流体チャネル中の前記電場が約２７０ｋＶ／ｍである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞質ＲＮＡから細胞片を除去することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記等速電気泳動後に、核を除去することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＥ−ＴＥ界面から前記細胞質ＲＮＡを除去することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核の核膜を破壊することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核膜の破壊が、化学的、機械的、電気的、又は熱的破壊方法を用いて行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡ又は前記ＤＮＡに検出可能な標識を加えることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能な標識が蛍光色素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞質ＲＮＡの量を計量することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核ＤＮＡの量を計量することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記篩いマトリックスが、ブロックコポリマー、線状ポリマー、又は架橋ポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記篩いマトリックスがポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＶＰの濃度が０．２％より高い、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＶＰの濃度が約０．４％である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記流体チャネル中の電気浸透流を抑制するための薬剤を加えることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記電気浸透流を抑制するための薬剤が、ポリラクタム、置換ポリアクリルアミド誘導体、セルロースの水溶性メチルヒドロキシエチル誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリラクタムがポリビニルピロリドンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞内媒質と細胞外媒質との浸透圧の差を相殺するために浸透圧剤を加えることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記浸透圧剤がスクロースである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記等速電気泳動が、Ｔｒｉｓ及びＨＣｌを含むリーディング電解質含有溶液を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記等速電気泳動が、Ｔｒｉｓ及びＨＥＰＥＳを含むトレーリング電解質含有溶液を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記リーディング電解質及び前記トレーリング電解質が、ｐＨ４〜１０の溶液に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｐＨが約８．０〜約８．３である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのＲＮＡ又はＤＮＡを増幅することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つのＲＮＡ又はＤＮＡを単離することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
電場に基づく方法によりＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を分離することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記電場に基づく方法が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びパルスフィールド電気泳動からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、前記流体チャネルを備えたマイクロ流体デバイス中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記マイクロ流体デバイスが、接合部で連結された少なくとも第１の流体チャネルと第２の流体チャネルとを備え、
前記流体チャネルのそれぞれが、第１のリザーバーに連結された第１の末端と、第２のリザーバーに連結された第２の末端と、を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の流体チャネルが、少なくとも１つのチャネル分岐点で２つ以上のチャネルに分かれ、前記核と前記細胞質ＲＮＡとを別個のチャネルに分配することができる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）前記篩いマトリックス及び前記リーディング電解質を含む溶液を前記第１の流体チャネルに充填すること；
（ｂ）前記第１の流体チャネルの前記第１のリザーバー中に細胞群を含むサンプルを導入し、前記第２の流体チャネルのリザーバーに真空を印加して単一細胞を前記第１の流体チャネル中へと移動させることにより前記細胞を単離することによって、前記第１の流体チャネル中に細胞を単離すること；
（ｃ）前記単一細胞付近に前記第１の流体チャネルを通じた電場を印加することにより、前記核膜を破壊することなく前記単一細胞の原形質膜を破壊すること；
（ｄ）前記第１の流体チャネルの前記第１のリザーバーにトレーリング電解質を加えること；及び
（ｅ）前記第１の流体チャネル中の前記単一細胞の内容物に対する等速電気泳動（ＩＴＰ）を行うこと
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記核と前記細胞質ＲＮＡとを前記マイクロ流体デバイス中の別個の位置に到達させることを更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記核及び前記細胞質ＲＮＡが、前記デバイス内の別個のリザーバー又はチャネルに分配される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞から核ＲＮＡ及び細胞質ＲＮＡを調製する方法であって、
（ａ）流体チャネル中に前記細胞を単離すること；
（ｂ）前記流体チャネルに電場を印加することにより、核膜を破壊することなく前記細胞の原形質膜を破壊すること；並びに
（ｃ）下記（ｉ）及び（ｉｉ）を用いて、前記細胞の内容物に対する等速電気泳動（ＩＴＰ）を行うこと
（ｉ）リーディング電解質（ＬＥ）及びトレーリング電解質（ＴＥ）；前記細胞質ＲＮＡはリーディング電解質−トレーリング電解質界面に濃縮される、
（ｉｉ）核を遅らせる篩いマトリックス；この遅れにより前記細胞質ＲＮＡは前記核に含まれる核ＲＮＡから分離される、
を含む方法。
【請求項３９】
前記核から前記核ＲＮＡを分離することを更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
核ＤＮＡから前記核ＲＮＡを分離することを更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
デオキシリボヌクレアーゼを用いて酵素的に前記ＤＮＡを消化することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、前記流体チャネルを備えたマイクロ流体デバイス中で行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記マイクロ流体デバイス中の別個の位置に前記核と前記細胞質ＲＮＡとを到達させることを更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記核及び前記細胞質ＲＮＡが、前記デバイス内の別個のリザーバー又はチャネルに分配される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記篩いマトリックスが、ブロックコポリマー、線状ポリマー、又は架橋ポリマーを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記篩いマトリックスがポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＰＶＰの濃度が０．２％より高い、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰＶＰの濃度が約０．４％である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記流体チャネル中の電気浸透流を抑制するための薬剤を加えることを更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記電気浸透流を抑制するための薬剤が、ポリラクタム、置換ポリアクリルアミド誘導体、セルロースの水溶性メチルヒドロキシエチル誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリラクタムがポリビニルピロリドンである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
細胞内媒質と細胞外媒質との浸透圧の差を相殺するために浸透圧剤を加えることを更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５３】
前記浸透圧剤がスクロースである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記等速電気泳動が、Ｔｒｉｓ及びＨＣｌを含むリーディング電解質含有溶液を用いて行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項５５】
前記等速電気泳動が、Ｔｒｉｓ及びＨＥＰＥＳを含むトレーリング電解質含有溶液を用いて行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項５６】
前記リーディング電解質及び前記トレーリング電解質が、ｐＨ４〜１０の溶液に含まれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項５７】
前記ｐＨが約８．０〜約８．３である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
（ａ）第１のリザーバーに連結された第１の末端と、第２のリザーバーに連結された第２の末端と、を備える第１の流体チャネル；及び
（ｂ）第１のリザーバーに連結された第１の末端と、第２のリザーバーに連結された第２の末端と、を備え、接合部で前記第１の流体チャネルに連結されている、第２の流体チャネル
を備えるマイクロ流体デバイス。
【請求項５９】
電圧源を更に備える、請求項５８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６０】
前記第１の流体チャネルが、少なくとも１つのチャネル分岐点で２つ以上のチャネルに分かれる、請求項５８に記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ＲＮＡ及びＤＮＡを調製するためのデバイス及び方法に関する。特に、本発明は、選択的細胞溶解（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ）及び等速電気泳動を用いて単一細胞からＲＮＡ及びＤＮＡを同時に抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単一細胞レベルでのＲＮＡ及びＤＮＡ分析は、細胞集団内の不均一性（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を理解するために重要であり、この研究のための新しいツールが登場しつつある（非特許文献１）。マイクロフルイディクスにおける近年の進歩はこの領域を改革し、単一細胞分析のための新たな能力を創出した（非特許文献２）。例えば、非特許文献３は、単一細胞溶解、ＲＮＡ精製、及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成を行う一体型マイクロ流体チップを実証した。これ以降、この技術は改良され（非特許文献４）、同様な技術が単一細胞の測定に用いられてきた（非特許文献５）。この技術は現在ではよく確立されているが、特別なシステム（例えば、液体をポンピングする及びバルビングする）を必要とする。更に、ＲＮＡ量の計量という基本的考えは、ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換、及びその後の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）等の酵素的プロセスによる増幅に頼っている。このような基本的アプローチは有効であるが、ＰＣＲは配列特異的偏りを導入することがよく知られているので（前述の非特許文献１）、最適でないかも知れない。このため、ほとんどの知見はｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーション又は染色による検証が必要である。
【０００３】
従来の自立型キャピラリー又はオンチップＣＥのいずれかを用いたキャピラリー電気泳動（ＣＥ）法も、単一細胞に由来する分子の取扱い及び分析に用いられてきた（非特許文献６）。しかし、増幅を用いないＲＮＡの直接的検出に焦点を合わせた研究はほとんどない。非特許文献７は、単一細胞からのＲＮＡの直接的測定を実証し、リボソームＲＮＡの電気泳動図を得た。非特許文献７は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて分離に用いたのと同じキャピラリー中で細胞溶解を行った。非特許文献７のプロトコールは、ＣＥによりＲＮＡを分離し、臭化エチジウム標識及びレーザー励起蛍光検出を用いてＲＮＡを定量化した。その後の研究で、非特許文献７のグループは、細胞周期の種々の相（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、及びＭ）におけるＲＮＡ発現を調べ、各相にわたるＲＮＡの総量及び個々のＲＮＡ配列の変化を報告している（非特許文献８）。彼らのＣＥの検出限界は単一細胞レベルよりはるかに低かった。しかし、彼らのプロトコールは、ＲＮＡの相対量のみを提供するものであり、ＲＮＡ及びＤＮＡの情報を同時に提供するものではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋａｌｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４５：４３１−４４５
【非特許文献２】Ｚａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１２：１８７−２０１
【非特許文献３】Ｍａｒｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）７８：９５６−９５８）
【非特許文献４】Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０８：１３９９９−１４００４
【非特許文献５】Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ  ８：６８−７４
【非特許文献６】Ｂｏｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１：１９１−２２７
【非特許文献７】Ｈａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌａｒｄ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）７２：４０７３−４０７９）
【非特許文献８】Ｈａｎ  ＆  Ｌｉｌｌａｒｄ（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０２：１３６−１４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、単一細胞から全細胞質ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ）及び核ＤＮＡを抽出及び測定するより良い方法に対するニーズが残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一部、単一細胞からＲＮＡ及びＤＮＡを同時に調製するための新規な方法の発見に基づく。特に、この方法は、細胞の原形質膜を選択的に破壊するために電場を利用し、細胞質ＲＮＡを核から分離するために等速電気泳動を利用する。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、細胞からＲＮＡ及びＤＮＡを調製する方法を含み、この方法は：（ａ）流体チャネル（ｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌ）中に細胞を単離すること；（ｂ）流体チャネルに電場を印加することにより、核膜を破壊することなく細胞の原形質膜を破壊すること；並びに、（ｃ）下記（ｉ）及び（ｉｉ）を用いて、細胞の内容物に対する等速電気泳動（ＩＴＰ）をおこなうこと、を含む：（ｉ）リーディング電解質（ＬＥ）及びトレーリング電解質（ＴＥ）；細胞質ＲＮＡはリーディング電解質−トレーリング電解質界面に濃縮される、並びに（ｉｉ）核を遅らせる篩いマトリックス（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）；この遅れにより、細胞質ＲＮＡは細胞の核ＤＮＡから分離される。流体チャネルは、キャピラリーチューブ又はマイクロ流体デバイス中のエッチング形成されたチャネル（ｅｔｃｈｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ）であり得る。一実施形態では、細胞の原形質膜を破壊する両極性電圧パルスを生成することにより流体チャネルに電場が印加される。ＩＴＰを行った後、上記方法は、流体チャネルから核を除去すること、ＬＥ−ＴＥ界面から細胞質ＲＮＡを除去すること、及び／又は細胞質ＲＮＡから細胞片を除去することを更に含み得る。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、細胞から核ＲＮＡ及び細胞質ＲＮＡを調製する方法を含み、この方法は、（ａ）流体チャネル中に細胞を単離すること；（ｂ）流体チャネルに電場を印加することにより、核膜を破壊することなく細胞の原形質膜を破壊すること、及び（ｃ）下記（ｉ）及び（ｉｉ）を用いて、細胞の内容物に対する等速電気泳動（ＩＴＰ）を行うこと、を含む：（ｉ）リーディング電解質（ＬＥ）及びトレーリング電解質（ＴＥ）；細胞質ＲＮＡはリーディング電解質−トレーリング電解質界面に濃縮される、並びに（ｉｉ）核を遅らせる篩いマトリックス；この遅れにより、細胞質ＲＮＡは核に含まれる核ＲＮＡから分離される。特定の実施形態では、上記方法は、核から核ＲＮＡを分離することを更に含む。一実施形態では、（例えばデオキシリボヌクレアーゼを用いて）酵素的にＤＮＡを消化することにより核ＤＮＡが除去される。
【０００９】
特定の実施形態では、篩いマトリックスは、ブロックコポリマー、線状ポリマー、又は架橋ポリマーを含む。一実施形態では、篩いマトリックスはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を０．２％を超える濃度で含む。一実施形態では、ＰＶＰの濃度は約０．４％である。
【００１０】
特定の実施形態では、ＩＴＰは、ｐＨ４〜１０の溶液中のＬＥ及びＴＥを用いて行われる。一実施形態では、ｐＨは約８．０〜約８．３である。例えば、ＩＴＰは、Ｔｒｉｓ及びＨＣｌを含むリーディング電解質（ＬＥ）含有溶液、並びにＴｒｉｓ及びＨＥＰＥＳを含むトレーリング電解質（ＴＥ）含有溶液を用いて行われ得る（実施例１参照）。
【００１１】
別の実施形態では、上記方法は、流体チャネル中の電気浸透流を抑制するための薬剤を加えることを更に含む。電気浸透流を抑制するための薬剤としては、限定されるものではないが、ポリラクタム、置換ポリアクリルアミド誘導体、セルロースの水溶性メチルヒドロキシエチル誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコールが含まれる。一実施形態では、ポリラクタムはポリビニルピロリドンである。
【００１２】
別の実施形態では、上記方法は、細胞内と細胞外の媒質間の浸透圧の差を相殺するための浸透圧剤（ｏｓｍｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）を添加することを更に含む。一実施形態では、浸透圧剤はスクロースである。
【００１３】
別の実施形態では、上記方法は核の核膜を破壊することを更に含む。核膜は、任意の化学的、機械的、電気的、又は熱的破壊方法を用いて破壊され得る。
【００１４】
別の実施形態では、上記方法は、ＲＮＡ又はＤＮＡに検出可能な標識を加えることを更に含む。一実施形態では、検出可能な標識は蛍光色素である。
【００１５】
本発明の方法は、細菌、真菌、植物、原生生物、又は動物を含む任意の原核生物又は真核生物に由来する任意の細胞からＤＮＡ及びＲＮＡを調製するために用いることができる。細胞は、組織液又は体液等の細胞を含む生物学的サンプルから得ることができ、例えば、限定されるものではないが、血液、唾液；口腔スワブ検体（ｂｕｃｃａｌ  ｓｗａｂｂｉｎｇ）、糞便、尿、骨髄、髄液、リンパ液、皮膚、器官、及び生検に由来する細胞；又は培養培地中で生育した組換え細胞及び組織を含むインビトロ細胞培養物成分に由来し得る。
【００１６】
本明細書に記載の手法は、単独で用いられてもよく、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を単離又は精製するための任意の他の方法と組み合わせて用いられてもよい。例えば、個々の核酸を、固体支持体、例えば、限定されるものではないが、吸着ビーズ、磁気ビーズ、若しくはシリカ上での固定化により、又はゲル濾過、逆相、イオン交換、若しくはアフィニティークロマトグラフィーにより、更に精製してよい。または、電場に基づく方法を用いて所望の核酸分子を他の分子から分離することができる。電場に基づく方法の例としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びパルスフィールド電気泳動が含まれる。
【００１７】
別の実施形態では、上記方法は、細胞から抽出された細胞質ＲＮＡ、核ＲＮＡ、又は核ＤＮＡの量を計量することを更に含む。
【００１８】
別の実施形態では、上記方法は、少なくとも１つのＲＮＡ又はＤＮＡ分子を増幅することを更に含む。
【００１９】
本明細書に記載の方法は、プロセスの全ステップを完全に自動化したマイクロ流体デバイス中で行うことができる。マイクロ流体デバイスの例の説明については、例えば、実施例１並びに図１Ａ〜１Ｃ、３Ａ、及び３Ｂを参照されたい。一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、接合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）で連結された第１の流体チャネル及び第２の流体チャネルを少なくとも備え、各流体チャネルは、第１のリザーバーに連結された第１の末端及び第２のリザーバーに連結された第２の末端を有する。このようなデバイスを用いて、（ａ）篩いマトリックス及びリーディング電解質を含む溶液を第１のチャネルに充填すること；（ｂ）第１のチャネルの第１のリザーバー中に細胞群を含むサンプルを導入し、第２のチャネルのリザーバーに真空を印加して単一細胞を第１のチャネル中へと移動させることにより、細胞を単離することによって、第１のチャネル中に細胞を単離すること；（ｃ）単一細胞付近に第１のチャネルを通じた電場を印加することにより、核膜を破壊することなく単一細胞の原形質膜を破壊すること；（ｄ）第１のチャネルの第１のリザーバーにトレーリング電解質を添加すること；及び（ｅ）第１のチャネル中の単一細胞の内容物に対して等速電気泳動（ＩＴＰ）を行うこと、を含む方法により、細胞を含む生物学的サンプルからＤＮＡ及びＲＮＡを調製することができる。特定の実施形態では、上記方法は、デバイス中の別個の位置に核及び細胞質ＲＮＡを到達させることを更に含む。例えば、核及び細胞質ＲＮＡは、デバイス内の別個のリザーバー又はチャネルに分配され得る。一実施形態では、デバイスの第１の流体チャネルは、少なくとも１つのチャネル分岐点で２つ以上のチャネルに分かれており、核及び細胞質ＲＮＡが別個のチャネルに分配される。更に、細胞の内容物（例えば、核酸、タンパク質、脂質、小分子等）が、種々の別個のチャネル又はリザーバーへと更に分画及び分配されてもよい。
【００２０】
当業者は、本明細書の開示に鑑みて、本発明のこれら及び他の実施形態を容易に思いつくであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｆは、単一細胞ＲＮＡ抽出及び定量方法の模式図である。図１Ａは、Ｗリザーバーから導入され、真空を印加することによりインジェクションチャネル中に単離される単一細胞を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＮリザーバーとＷリザーバーの間に印加された両極性電圧パルスによって各細胞が電気的に破壊されたことを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、破壊された細胞から全細胞質ＲＮＡが抽出されてＩＴＰ界面内に蓄積されたことを示す。残りの細胞残渣（核を含む）はＲＮＡから分離された。
【図１Ｄ】図１Ｄは、インジェクションチャネル中の単離された単一細胞の明視野像を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは個々の細胞の破壊を示す。細胞１及び２はそれぞれ破壊電場の内部及び外部にある。細胞１のみが破壊される。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＩＴＰ界面の単一細胞に由来する抽出されたＲＮＡ及び細胞核（残されている）の典型的実験画像を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｆは、個々の単一細胞に由来するＲＮＡ及びＤＮＡの測定に対する統計を示す。図２Ａ〜２Ｃは、本発明者らの方法から得られたデータを要約しており、図２Ｄ〜２Ｆは、比較のためのＦＡＣＳデータを示す。図２Ａは、抽出されたＲＮＡ質量の絶対量のヒストグラムを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＤＮＡの相対量のヒストグラムを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、生きた単一細胞に由来するＲＮＡの絶対量とＤＮＡの相対量の関係を示す。等高線（ｃｏｎｔｏｕｒ）は、２次元ガウス分析の結果を示している。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＦＡＣＳによるＲＮＡの相対量のヒストグラムを示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＦＡＣＳによるＤＮＡの相対量のヒストグラムを示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＲＮＡとＤＮＡの相関を示す等高線を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、マイクロ流体チップの配置を示す。ＩＴＰプロセス中の電流を測定するために、本発明者らは、ＤＡＱ（ＮＩ  ＵＳＢ−６００９、ナショナルインスツルメンツ社（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））の入力をＳリザーバー中に配置された電極に直列に連結した。本発明者らは、ＤＡＱの入力抵抗１４４ｋΩで電圧を割ることにより電流を推定した。入力抵抗は、約１００ＭΩであったマイクロチャネル抵抗と比べて無視できる程小さかった。
【図３Ｂ】図３Ｂは、電気破壊及びＩＴＰの電圧シーケンスを示す。
【図４】図４は、以下の３種類のバッファーに懸濁したＡ２０細胞の明視野（上）及び蛍光顕微鏡画像（下）を示す：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（左）；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、及び１７５ｍＭスクロース（中央）；ＰＢＳ（右）。本発明者らは、細胞をカルセインで染色して細胞生存率を調べた。スクロースを含むバッファーに懸濁した細胞はＰＢＳ中のものと同様な形態を示し、このことは、浸透圧相殺の成功を示している。
【図５】図５は、ＤＮＡ特異的色素Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて可視化したＩＴＰ界面の蛍光シグナルを示す。単一細胞でのシグナルは対照と有意な差を示さなかった（ｐ＝０．５７）。核は対照と比べて有意に高い蛍光シグナルを示した（ｐ＝０．００６３）。本発明者らは、ＩＴＰ界面に抽出されたＤＮＡは無視可能であると結論付けた。
【図６】図６は、ＩＴＰ界面の蛍光の時間分解画像を示す。単一細胞を用いた実験に由来するＲＮＡ蛍光は陰性対照を用いたものよりも有意に高かった。ＬＥにＲＮａｓｅを加えた場合には、ＩＴＰ界面の蛍光は細胞無しのものに近付き、このことは、ＩＴＰ界面中の集中及び可視化された分子がＲＮＡであったことを示している。
【図７Ａ】図７Ａは、ＲＮＡ計量のための較正曲線を示す。本発明者らは、インジェクションチャネル中のＴＥ中にスパイクされたＲＮＡの量と蛍光シグナルの間の関係として曲線を得た。
【図７Ｂ】図７Ｂは、１００個の単一細胞から抽出されたＲＮＡの量を時系列で示す。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、画像処理による核の検出を示す。図８Ａは、核の２次元蛍光画像を示す。図８Ｂは、線Ｘ−Ｘ’に沿った蛍光強度の空間的分布及び区別（ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）の閾値を示す。
【図９Ａ】図９Ａ及び９Ｂは、抽出されたＲＮＡ量と核の蛍光シグナルとの関係の２次元ガウス混合分析を示す。図９Ａは、２つの２次元ガウス分布を用いたフィッティングを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、３つの２次元ガウス分布を用いたフィッティングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の実施には、特に断りのない限り、当該技術分野の技能に含まれる化学、生化学、細胞生物学、分子生物学、及び組換えＤＮＡ技術の従来の方法が用いられる。このような技術は文献に充分に説明されている。例えば、ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｄ．  Ａｎｓｅｌｍｅｔｔｉｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２００９）；Ｔ．Ｋ．Ｋｈｕｒａｎａ  Ｏｎ−ｃｈｉｐ  ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＰｒｏＱｕｅｓｔ，ＵＭＩ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ２０１１）；Ｆ．Ｍ．Ｅｖｅｒａｅｒｔｓ，Ｊ．Ｌ．Ｂｅｃｋｅｒｓ  Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｔｈｅｏｒｙ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９７６）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；ＲＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０）；Ｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０）；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）参照。
【００２３】
前述又は後述に関わらず、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願の全体を参照により援用する。
【００２４】
Ｉ．定義
本発明の説明において、以下の用語を使用し、これらの用語は以下に示すように定義されるものとする。
【００２５】
単数形は、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈中で明白に単数でないと記載がない限り、複数の指示物を包含することに留意しなければならない。従って、例えば「ＲＮＡ（ａｎ  ＲＮＡ）」への言及は、２つ以上のＲＮＡ分子の混合物等を含む。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「生物学的サンプル」という用語は、細菌、真菌、原生生物、植物、及び動物に由来する細胞等の、原核生物又は真核生物に由来する任意の細胞、組織又は当該細胞を含む体液を含む。生物学的サンプルには、組織又は体液に由来する細胞、例えば、限定されるものではないが、血液、唾液、口腔スワブ検体により得られる細胞、糞便、尿、骨髄、髄液、リンパ液、皮膚、器官、及び生検が含まれ、並びに培養培地中で生育した組換え細胞及び組織を含むインビトロ細胞培養成分が含まれ得る。
【００２７】
「電気浸透流」という用語は、多孔性材料、キャピラリーチューブ、マイクロチャネル、又は他の流路（ｆｌｕｉｄ  ｃｏｎｄｕｉｔ）にかかる印加電位によって誘導される液体の動きを指す。
特に所与の量に関連して「約」という用語は、プラス又はマイナス５パーセントの偏差を包含することが意図されている。
【００２８】
ＩＩ．発明を実施するための形態
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定の調合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）又はプロセスパラメーターに限定されず、改変され得ると理解されるべきである。更に、本明細書で使用される用語は、発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図していないと理解されるべきである。
【００２９】
本明細書に記載のものと同様又は同等な様々な方法及び材料が本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。
【００３０】
本発明は、単一細胞からＲＮＡ及びＤＮＡを同時に調製するための新規な方法の発見に基づく。特に、単一細胞をサンプルから単離し、電場を用いて細胞を破壊し、その結果、核膜を破壊することなく原形質膜が選択的に破壊される。核の移動度を選択的に低下する篩いマトリックスの存在下で等速電気泳動（ＩＴＰ）を行うことにより、核から細胞質ＲＮＡが分離される。ＩＴＰ中、細胞質ＲＮＡは、リーディング電解質とトレーリング電解質との間のＩＴＰ界面に蓄積し、後で、核ＤＮＡを含まないように抽出することができる。この方法は、プロセスの全ステップが完全に自動化されたマイクロ流体デバイス中で行うことができる（実施例１参照）。
【００３１】
本発明の理解を促進するために、この新規なＲＮＡ及びＤＮＡの調製方法に関して以下により具体的に説明する。
【００３２】
本発明の等速電気泳動法は、単一細胞からのＤＮＡ及びＲＮＡの同時抽出に用いられる。最初に、単一細胞が流体チャネル中に単離される。単一細胞は、サンプルを適切に希釈し、流体チャネル中に低単離体積で細胞をインジェクトすることにより、他の細胞を含む生物学的サンプルから単離することができる。細胞は、チャネル中に細胞を引っ張りこむために圧力又は真空を印加する等の任意の好適な手段によってチャネル中へと移動させることができる。次に、細胞付近にチャネルを通じた電場を印加して、核膜を破壊することなく原形質膜を選択的に破壊する。実施例１に記載されているように、電場は、細胞の原形質膜を選択的に破壊する両極性電圧パルスを生成することにより流体チャネルに印加され得る。その後、ＴＥ−ＬＥ界面に細胞質ＲＮＡが集中するように選択されるトレーリング電解質及びリーディング電解質を用いて細胞の内容物に対してＩＴＰを行う。好ましくは、ＴＥ及びＬＥは、混入種（例えば、破壊した細胞膜、タンパク質等）がトレーリングイオンより小さい又はリーディングイオンより大きい電気泳動移動度を有し、且つ細胞質ＲＮＡと一緒にＴＥ−ＬＥ界面に集中しないように選択される。細胞質ＲＮＡを核から分離するために、核を遅らせ、核がＴＥ−ＬＥ界面に集中することを防ぐ篩いマトリックスの存在下でＩＴＰを行う。ＩＴＰ後、核及び細胞質ＲＮＡは流体チャネルから別個に除去することができ、所望であれば下流での用途（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）のために更に処理することができる。
【００３３】
方法のバリエーションにおいて、単一細胞から核ＲＮＡ及び細胞質ＲＮＡを同時に抽出するために等速電気泳動が用いられる。同様に、流体チャネル中に細胞が単離され、流体チャネルに電場が印加されることにより、核膜を破壊することなく細胞の原形質膜が破壊される。核を遅らせる篩いマトリックスの存在下で細胞の内容物に対して等速電気泳動を行うことにより、核に含まれる核ＲＮＡから細胞質ＲＮＡが分離される。特定の実施形態では、上記方法は、核から核ＲＮＡを分離することを更に含む。例えば酵素的に（例えばデオキシリボヌクレアーゼを用いて）ＤＮＡを消化することにより、核ＤＮＡを核ＲＮＡから除去することができる。
【００３４】
本発明の方法は、細菌、真菌、植物、原生生物、又は動物を含む任意の原核生物又は真核生物に由来する任意の細胞から、ＤＮＡ及びＲＮＡを調製するために用いることができる。細胞は、細胞を含む生物学的サンプル、例えば組織又は体液から得ることができ、例えば、限定されるものではないが、血液、唾液、口腔スワブ検体から得られる細胞、糞便、尿、骨髄、髄液、リンパ液、皮膚、器官、及び生検；又は培養培地中で生育した組換え細胞及び組織を含むインビトロ細胞培養成分に由来し得る。上記方法は、生細胞又は固定細胞に適用することができる。
【００３５】
特定の実施形態では、流体チャネルは、マイクロ流体デバイス中又はキャピラリーチューブ中のエッチング形成されたチャネルである。チャネルは、シリケート又はボロシリケート等の非導電性材料で構成され得る。チャネルは、電気浸透流抑制のため、又はその他の有益な流れ改変効果のために処理されていてもよい。例えば、チャネルは、シラン処理剤（ｓｉｌａｎｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、アルコール、酸、又は水を含む１又は複数の薬剤で前処理され得る。
【００３６】
本明細書に記載の方法は、プロセスの全ステップが完全に自動化されているマイクロ流体デバイス中で行うことができる。交差形状で形成された複数のマイクロチャネルを備えた例示的なマイクロ流体デバイスが実施例１に記載されている（図１Ａ〜図１Ｃ、図３Ａ、及び図３Ｂ参照）。一実施形態では、本発明は、接合部１３０で連結された第１の流体チャネル１１０及び第２の流体チャネル１２０を少なくとも備えるマイクロ流体デバイス１００を含み、ここで、各流体チャネルは第１のリザーバーに連結された第１の末端及び第２のリザーバーに連結された第２の末端を有する（Ｎリザーバー１４０及びＳリザーバー１５０が第１の流体チャネル１１０に連結され、Ｗリザーバー１６０及びＥリザーバー１７０が第２の流体チャネル１２０に連結された、４個のリザーバーを備えたこのようなデバイスの模式図を示す図３Ａ参照）。チャネルを通じた電場を印加するために電圧源１８０をデバイスに連結することができる。
【００３７】
特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、デバイス中の別個の位置への核及び細胞質ＲＮＡの送達を可能にするようにデザインされている。一実施形態では、核と細胞質ＲＮＡとが等速電気泳動的に分離される流体チャネルは、１又は複数のチャネル分岐点を備え、ここでチャネルが２つ以上のチャネルに分かれ、核と細胞質ＲＮＡとが別個のチャネルに分配されることを可能にする。更に、デバイスは、細胞の他の成分（例えば、核ＲＮＡ、タンパク質、脂質、小分子等）を別個のチャネル又はリザーバーへと分画及び分配することを可能にするための１又は複数の追加的なチャネル又はリザーバーを備えてよい。
【００３８】
このようなデバイスを用いて、（ａ）篩いマトリックス及びリーディング電解質を含む溶液を第１のチャネルに充填すること；（ｂ）第１のチャネルの第１のリザーバー中に細胞群を含むサンプルを導入し、第２のチャネルのリザーバーに真空を印加して単一細胞を第１のチャネル中へと移動させることにより細胞を単離することによって、第１のチャネル中に細胞を単離すること；（ｃ）単一細胞付近に第１のチャネルを通じた電場を印加することにより、核膜を破壊することなく単一細胞の原形質膜を破壊すること；（ｄ）第１のチャネルの第１のリザーバーにトレーリング電解質を添加すること；及び（ｅ）第１のチャネル中の単一細胞の内容物に対して等速電気泳動（ＩＴＰ）を行うこと、を含む方法により、細胞を含む生物学的サンプルからＤＮＡ及びＲＮＡが調製され得る。特定の実施形態では、上記方法は、デバイス中の別個の位置に核及び細胞質ＲＮＡを到達させることを更に含む。例えば、核及び細胞質ＲＮＡは、デバイス内の別個のリザーバー又はチャネルに分配され得る。一実施形態では、デバイスの第１の流体チャネルは、少なくとも１つのチャネル分岐点で２つ以上のチャネルに分かれ、ここで核と細胞質ＲＮＡとは別個のチャネルに分配される。更に、細胞の内容物（例えば、核酸、タンパク質、脂質、小分子等）が、種々の別個のチャネル又はリザーバーに更に分画及び分配され得る。
【００３９】
特定の実施形態では、ｐＨ４〜１０のＬＥ及びＴＥを含む溶液を用いてＩＴＰを行う。電解質としては、限定されるものではないが、ＬＥとしての塩素イオン及びＴＥとしての６−アミノカプロン酸；ＬＥとしてのＴｒｉｓ及びＨＣｌ並びにＴＥとしてのＴｒｉｓ及びＨＥＰＥＳ；ＬＥとしての６−アミノカプロン酸及びＨＣｌ並びにＴＥとしての６−アミノカプロン酸及びカプロン酸、又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓ及びジヒドロキシ安息香酸；並びにＬＥとしてのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及びＴＥとしてのグリシン又はＴＲＩＳ−グリシンが含まれ得る。イオン及びバッファーの濃度は適切な有効移動度が得られるように調整され得る。ＬＥ及びＴＥ溶液の例としては、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び２５ｍＭ  ＨＣｌを含むｐＨ８．１のＬＥ溶液、並びに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むｐＨ８．３のＴＥ溶液が挙げられる（実施例１参照）。
【００４０】
破壊により生じた核及び細胞片から細胞質ＲＮＡを分離するために篩いマトリックスの存在下でＩＴＰを行う。特定の実施形態では、篩いマトリックスは、ブロックコポリマー、線状ポリマー、又は架橋ポリマーを含む。共有結合により連結された２以上のホモポリマーサブユニットを含むブロックコポリマーが用いられ得る。あるいは、ホモポリマーサブユニットは、接続ブロック（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋ）として知られる介在非繰り返しサブユニットによって連結されていてもよい。ジブロックコポリマー及びトリブロックコポリマーを含むブロックコポリマーが用いられ得る。篩いマトリックスは、単一主鎖からなる線状コポリマー、又は１若しくは複数のポリマー側鎖を有する主鎖からなる分岐コポリマーを含み得る。イソプレン及びスチレンを含む複数の異なるモノマーがブロックコポリマーの調製における使用に知られている。好適な篩いポリマーとしては、線状低分子量ポリアクリルアミド又は低分子量ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）等の親水性ポリマーが挙げられる。特に、０．２％を超える濃度のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む篩いマトリックスが核の泳動を遅らせるのに有効であることが見出された（実施例１参照）。一実施形態では、篩いマトリックスはＰＶＰを約０．４％の濃度で含む。
【００４１】
更に、電気浸透流を抑制するための薬剤を流体チャネルに加えてもよい。電気浸透流を抑制するための薬剤としては、限定されるものではないが、ポリラクタム（例えば、ポリビニルピロリドン）、置換ポリアクリルアミド誘導体、セルロースの水溶性メチルヒドロキシエチル誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００４２】
細胞内の媒質と細胞外の媒質と間の浸透圧の差を相殺するため、破壊前の細胞生存率を保つため、及び破壊後の核を損傷をうけていない状態に維持するために、浸透圧剤（例えば、スクロース）を更に加えてもよい。
【００４３】
ＩＴＰを行った後、ＤＮＡ及び／又は核ＲＮＡを含む核の内容物を抽出するために、核の核膜を別個に破壊してもよい。核膜は、任意の化学的、機械的、電気的、又は熱的破壊法を用いて破壊され得る。一般的に用いられる方法としては、凍結融解サイクル；超音波処理；エレクトロポレーション；圧力；酵素的破壊；又は例えば乳鉢及び乳棒を用いた（典型的には洗剤又は液体Ｎ２の存在下で）又はビーズ式破砕機（ｂｅａｄ  ｂｅａｔｅｒ）若しくは回転羽根を用いた粉砕による機械的破壊が挙げられる。化学的破壊剤の例としては、洗剤及び界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及びドデシル硫酸ナトリウム）、並びにポリアニオン（例えば、ヘパリン）が挙げられる。更に、酵素的又は化学的方法を、混入核成分（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、又はその他の巨大分子）を除去するために用いてもよい。例えば、ＤＮＡを単離する場合、混入ＲＮＡを除去するためにＲＮＡヌクレアーゼを使用することができ；核ＲＮＡを単離する場合、混入ＤＮＡを除去するためにＤＮＡヌクレアーゼを使用することができ；混入タンパク質を除去するためにプロテアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼ阻害剤を用いて核酸の分解を防いでもよい。
【００４４】
所望であれば、核と細胞質ＲＮＡとの分離後、当該技術分野で周知の方法を用いて特定の目的のために個々の核酸分子（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）を単離又は精製してもよい。例えば、シリカ、吸着ビーズ（例えば、オリゴ（ｄＴ）被服ビーズ、又はポリスチレン−ラテックス、ガラス繊維、セルロース、若しくはシリカから成るビーズ）、磁気ビーズ等の固体支持体上での固定化により、又は逆相、ゲル濾過、イオン交換、若しくはアフィニティークロマトグラフィーにより、核酸を精製してもよい。また、フェノール−クロロホルム抽出又はアルコール沈殿等の従来の方法により、核酸を懸濁液から単離することもできる。あるいは、電場に基づく方法を用いて、所望のＲＮＡ又はＤＮＡ分子をその他の分子から分離することができる。電場に基づく方法の例としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びパルスフィールド電気泳動が挙げられる。例えば、全体を参照により本明細書に援用する以下の文献を参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；ＲＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０）；Ｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ＲＮＡ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０）；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９）；Ｚａｈｒｉｎｇｅｒ（２０１２）Ｌａｂ  Ｔｉｍｅｓ（２−２０１２）：５２−６３；Ｇａｒｃｉａ−Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ６１：ｅ３８９０；Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．８１（１３）：５２４９−５２５６; Ｒｉｇｈｅｔｔｉ（２００５）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ１０  ７９（１−２）：２４−４０；Ｇｅｂａｕｅｒｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３２（１）：８３−８９。
【００４５】
本発明の方法は、単一細胞に由来するＲＮＡ及びＤＮＡの絶対的計量（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び分析に用いることができる。分離後、本明細書に記載の方法によって調製されたＲＮＡ及びＤＮＡ分子は、種々の目的、限定されるものではないが例えばシークエンシング、ＰＣＲ、ライゲーション、トランスクリプトーム分析、マイクロアレイ分析、ノーザン分析、及びライブラリー構築に用いることができる。
【実施例】
【００４６】
ＩＩＩ．実験
本発明を実施するための具体的実施形態の例を以下に示す。例は説明のみを目的として提供するものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００４７】
使用される数（例えば、量、温度等）に関して正確さが確保されるように努力したが、当然、いくらかの実験的誤差及び偏差が考慮されるべきである。
【００４８】
実施例１：単一細胞に由来するＲＮＡ及びＤＮＡのオンチップ分離及び分析
単一細胞レベルでＲＮＡ及びＤＮＡを同時に分析するための、電気泳動技術を用いて単一細胞からＲＮＡ及びＤＮＡを抽出する技術を記載する。オンチップ電気破壊と等速電気泳動（ＩＴＰ）との組合せを用いて単一生細胞を単離する。細胞を破壊し、全細胞質ＲＮＡ及び核ＤＮＡを個々に抽出、濃縮、及び測定し、これらの全てが５分以内に行われる。ＩＴＰ界面中へＲＮＡを集中させることによりプロセスを分散に対して強く（ｒｏｂｕｓｔ）し、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びｃＤＮＡハイブリダイゼーションに基づくアッセイ（Ｂａｈｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：６１５４−６１６２；Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｔ  １３８：３１１７−３１２０；及びＧａｒｃｉａ−Ｓｃｈｗａｒｚ  ＆  Ｓａｎｔｉａｇｏ（２０１３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５２（４４）：１１５３４−１１５３７）等の下流分析との統合に適合する。
【００４９】
方法
ＩＴＰ化学
リーディング電解質（ＬＥ）は、０．４％ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）及び１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び２５ｍＭ  ＨＣｌとした（計算上のｐＨ＝８．１）。トレーリング電解質（ＴＥ）は、０．４％ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳとした（最初の計算上のｐＨ＝８．３）。電気浸透流を抑制するため及びＰＶＰの篩い効果により細胞片から抽出ＲＮＡを分離するためにＰＶＰを含めた（適切なＰＶＰ濃度の選択についてはＳＩセクションＳ−２を参照）。Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、及びＨＣｌはシグマ  アルドリッチ社（セントルイス、ミズーリ州）から、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩはインビトロジェン社（カールズバッド、カリフォルニア州）から、ＰＶＰ（ＭＷ  １ＭＤａ）をアクロスオーガニック社（ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ニュージャージー州）から入手した。全ての溶液はＵｌｔｒａＰｕｒｅ  ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー脱イオン（ＤＩ）水（ギブコインビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）で調製した。
【００５０】
細胞調製
１０％ウシ胎仔血清（ギブコ社）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（ギブコ社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ社）中で、３７℃、５％ＣＯ２にてＡ２０細胞系（マウスリンパ球細胞）を培養した。上記細胞をリン酸緩衝食塩水で１回洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、及び１７５ｍＭスクロースを含むサンプルバッファー溶液に約５細胞／μＬの濃度で懸濁し、実験まで氷上で保存した。サンプルバッファーに１７５ｍＭスクロースを加えたのは、浸透圧を相殺するため、及び破壊まで細胞生存率を保つためである。少なくとも３時間はサンプルバッファーが細胞生存率に有意な悪影響を与えないことを確認した（図４参照）。全てのケースにおいて、調製した細胞サンプルは３時間以内に用いた。
【００５１】
チャネル調製
図３Ａは、マイクロ流体チップの形状を示す図である。各実験の前に、Ｅ及びＳリザーバーに充填し、シングルスプリット真空ライン（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｐｌｉｔ  ｖａｃｕｕｍ  ｌｉｎｅ）を用いてＮ及びＷリザーバーに真空を印加することにより、マイクロチャネルを予め調整した。以下の洗浄化学を用いた：１Ｍ  ＮａＯＨで１０分、脱イオン（ＤＩ）水で３分、その後、Ｗ及びＮリザーバーに真空を印加することにより１分間乾燥。その後、Ｅ及びＳリザーバーにＬＥ溶液を充填し、マイクロチャネルに充填するために約１．５分間Ｎ及びＷリザーバーに真空を印加した。真空ラインを用いてＮ及びＷリザーバーを空にし、細胞を含むサンプル溶液２μＬをＷリザーバー中に、ＴＥ溶液２０μＬをＮリザーバー中にピペッティングした。その後、インジェクションチャネル中に単一細胞を単離するためにＳリザーバーに真空を印加した。インジェクションチャネル中に単一細胞を単離した後、真空を解除し、すぐに２０μＬのＴＥ溶液をＷリザーバーに入れた。
【００５２】
可視化
２０Ｘ（ＵＰｌａｎＦｌ）、青色ＬＥＤ（ＬＥＤＣ７、Ｔｈｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ニュートン、ニュージャージー州）；フィルターキューブ（ＸＦ２３、オメガオプティカル社（Ｏｍｅｇａ  ｏｐｔｉｃａｌ）、バーモント州）；及び０．６ｘ縮小レンズ（ＴＶ  Ｌｅｎｓ  Ｃ−０．６ｘ、ニコン社）を備えた倒立落射蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００、ニコン社）を用いて抽出ＲＮＡのオンチップ可視化を行った。ＣＣＤカメラ（ＭｉｃｒｏＭＡＸ−１３００Ｙ、プリンストン・インスツルメンツ社）を用いて、１００ｍｓ（ミリ秒）の露出時間及び２×２のビニングで画像を得た。
【００５３】
細胞の電気破壊
Ｓリザーバーに真空を印加することにより、Ｗリザーバーから、Ｗリザーバーと交差部との間のインジェクションチャネル中に単一細胞を導入した。インジェクションチャネルの長さは７．３８ｍｍである。Ｎリザーバーと交差部との間の長さは３．９２５ｍｍである。ＮリザーバーとＷリザーバーとの間の比較的短い長さを利用して、ＮとＷの間に両極性電圧パルスを印加して高く強い電場を付与した。インジェクションチャネル中の単離した単一細胞を１０ｍｓ以内に電気的及び選択的に破壊した（細胞破壊プロセスのハイスピード観察についてはマルチメディアＳＩ参照）。
【００５４】
ＦＡＣＳ分析のプロトコール
７０％エタノールにより約２３℃で１６時間、Ａ２０細胞を固定した。固定した細胞を１回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（２０μｇ／ｍｌ、シグマ  アルドリッチ社）を含むＨＢＳＳ及び２％ＦＢＳを用いて３７℃で４５分間染色した。その後、ピロニンＹ（１μｇ／ｍｌ、シグマ  アルドリッチ社）を染色液に加え、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。スタンフォード共用ＦＡＣＳ施設のＬＳＲ−ＩＩ−ＵＶフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）により全サンプルを分析した。
【００５５】
補足方法
Ｓ−１．単一細胞の電気破壊
オンチップ電気破壊は、６７５Ｖｃｍ−１のＤＣオフセット、７５Ｈｚ及び９００Ｖｃｍ−１のＡＣ電場を用いてＭａｃＣｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）７５：５６４６−５６５５）によって最初に実証された。種々のオンチップ電気破壊がある。例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ（２００４）４：４７−５２）及びＭｕｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）７６：４９８３−４９８９）ではそれぞれ、高ｐＨバッファー（ｐＨ＝９．２）及び細胞捕捉微小構造によって誘発される機械的剪断の補助を用いて、比較的低いＤＣ電場での電気細胞破壊が実証された。これらの研究では、細胞浸透圧を相殺するために高い塩濃度（１００ｍＭオーダー）の食塩水ベースのバッファーが用いられた。今回、本発明者らは、ＩＴＰに適合する細胞破壊バッファーを実現しつつオスモル濃度を上げるためにスクロースを用いたＩＴＰ化学を提供する（図４参照）。
【００５６】
図３Ｂは、ＩＴＰの前に行われる電気破壊のための電圧シーケンスを示す。本発明者らは、各々の持続時間が１００ｍｓの２つの個々のパルスを有する両極性パルスを用いた。パルスの両極的性質は、破壊中の細胞の移動を最小限に抑えるのに役立ち、これは破壊を可視化するのを助けた。その後すぐに、ＩＴＰを開始するため及び破壊細胞からＲＮＡを抽出するために、電圧ＶＷ及びＶＮをＤＣ電圧に切り替えることにより電位を印加した。
【００５７】
図１Ｄを実証するために、カルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ  ８０１１、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ）で染めた細胞を用いて膜透過性を可視化した（図４も参照）。どちらの細胞も最初、カルセインによる蛍光を示した。パルス電場に晒された細胞（細胞１）は、細胞膜の破壊と一致して、その後のフレーム中で蛍光を急速に失った。対照的に、電場外のチャネル分岐部に位置した細胞（接合部とＳリザーバーの間の細胞２）は蛍光を維持し、無傷のままであった。この選択的破壊は、非標的細胞からの混入を避けるために重要であった。
【００５８】
本発明者らは、高速カメラ（Ｐｈａｎｔｏｍ  Ｍｉｃｒｏ−４Ｍ、ビジョンリサーチ社（Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いて単一細胞の電気破壊の高速時間分解イメージングを行った。これらの画像は、１０ｍｓ以内に細胞膜が破壊されることを示した（高フレームレート動画についてはマルチメディアＳＩ参照）。本発明者らは、インジェクションチャネル中の電場を２７０ｋＶ／ｍと推定した。従って、細胞の特徴的な直径１４μｍから、細胞膜に誘導された電位は約３Ｖオーダーであったと推定した。これは典型的な細胞膜の破壊電圧である約１Ｖと比べて充分高かった。
【００５９】
Ｓ−２．ＲＮＡを単離するためのＰＶＰ濃度の選択
全ての単一細胞実験において２つの（蛍光）核酸領域を観察した。第１の領域は、ＩＴＰ界面に常に集中する高移動度ゾーンであった。本発明者らは、これは全細胞質ＲＮＡに起因すると考える。第２の領域は、およそ８μｍ及び１０μｍの特徴的な長軸半径及び短軸半径を有するほぼ楕円体であった（図１Ｆ参照）。第２の領域は、約０．２％以下のＰＶＰ濃度でのみＩＴＰ界面に集中した。より高いＰＶＰ濃度では、第２の領域は決してＩＴＰ界面に集中しなかった。本発明者らは、第２の領域は細胞核に起因すると考える。一連の予備実験の後、本発明者らは、ＰＶＰ濃度が０．４％であると、細胞核がＩＴＰ界面に一緒に集中することがないように細胞核の動きが充分に且つ繰り返し停止される、と決定した。低ＰＶＴ及び高ＰＶＰでの分離及び集中の可視化を含む更なる情報についてはマルチメディアＳＩを参照されたい。
【００６０】
本発明者らは、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素（Ｂ２２６１、シグマ  アルドリッチ社；ＲＮＡではなくＤＮＡに選択的）を用いた及びＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ａ、キアゲン社）を用いた一連の実験により、２つの蛍光領域を細胞核及び全細胞質ＲＮＡに起因するとした本発明者らの推定を確認した。第１に、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＲＮａｓｅは不使用）を用いた実験により、細胞核は有意な蛍光強度を示すが、ＩＴＰ界面は陰性対照と比べて無視可能な蛍光しか示さないことが明らかになった（図５参照）。これは当然、細胞核がＤＮＡを常に含むことと合致し、ＤＮＡはＩＴＰ界面に集中していなかった。第２に、ＬＥ中に混合したＲＮａｓｅを用いて行った実験を示す（図６参照）。ＲＮａｓｅを用いた場合、ＩＴＰ集中ゾーンのシグナルは陰性対照のオーダーの値まで減少した（シグナル・ノイズ比、ＳＮＲ＝０．４オーダー）。これらの観察結果は、本発明者らの方法が、細胞核を後ろに残しつつ、ＩＴＰで細胞質ＲＮＡを集中させる、という結論を支持する。本発明者らによる細胞核対ＲＮＡの同定は、重ねた透過光及び蛍光の視覚化の使用を含む破壊前後の細胞形態の本発明者らの観察とも一致した。
【００６１】
Ｓ−３．実験較正曲線の作製
本発明者らは、ＲＮＡ質量の絶対的計量のための較正曲線を構築するためにスパイク合成ＲＮＡを用いた一連のＩＴＰ実験を用いた。本発明者らの較正プロセスは、Ｐｅｒｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）８１：９５０７−９５１１；その全体を参照により本明細書に援用する）が用いたものと同様であった。本発明者らは、細胞実験と同じ条件及び溶液を用い、既知の濃度のＲＮＡラダー（０．５〜１０Ｋｂ  ＲＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、インビトロジェン社）でスパイクした。Ｗリザーバーに２μＬのサンプル溶液を加え、Ｓリザーバーに真空を印加することによってこれをインジェクションチャネル中にインジェクトした。Ｗリザーバー中の分注されたサンプル溶液の全部をマイクロチャネル中へとインジェクトし、その後、Ｓリザーバーから真空を解除し、Ｗリザーバー中にＴＥ溶液を分注した。この方法により、本発明者らは、インジェクションチャネル中の溶液の１２ｎＬをサンプル溶液と交換した。その後、Ｗ、Ｎ、及びＥリザーバーに電極を挿入し、ＩＴＰ界面にＲＮＡを集中させるためにＩＴＰプロセスを開始した。本発明者らは、ＩＴＰピークＳＮＲを計量し、図７Ａに示す較正曲線を構築した。データの平均で標準化した標準偏差は約１２％であった。本発明者らは、この変動の少なくとも一部はピペッティング及び吸引を含む流体取扱いにおける誤差に起因すると考える。実線は、係数Ｒ２＝０．９８の線形回帰を示している。本発明者らは、この較正曲線を用いて、積分蛍光シグナルと絶対ＲＮＡ量を０〜６０ｐｇの範囲で関係付けた。
【００６２】
Ｓ−４．細胞核の画像処理
核の境界を同定するため及び核中の蛍光強度を積分するために、核の画像を分析した。そのために、各核について、焦平面を最高強度に定めた。特定された閾値より高い蛍光強度の領域として核を検出した。閾値の設定を自動化するために、閾値をＩｂｋ＋σに設定した。式中、Ｉｂｋは、チャネル内の背景蛍光の平均強度であり、σは、この背景の標準偏差である。図８Ａの蛍光画像は、細胞核及びこの閾値によって決定された境界の画像を示している。図８Ｂは、Ｘ−Ｘ’線に沿った強度のプロットを示している。閾値は、直線状の水平線として後者のプロット中に示されている。核のパラメーターは、ＭＡＴＬＡＢ中の「ｒｅｇｉｏｎｐｒｏｐｓ」の関数を用いて得た。核中のＤＮＡのこれらの積分強度測定値は、質量の絶対的計量ではなく相対質量値として表わされている。核の内側のＤＮＡの絶対的計量は３つの理由から困難である。第１に、細胞核中への輸送に関連する標識効率及び細胞核中の色素の量子収率を絶対的な意味で決定するのは困難である。第２に、核中の絶対的ＤＮＡ量の対照値を得ることが困難である。これは、（ＩＴＰゾーン中に集中したスパイクされたＲＮＡを対照として使える）ＩＴＰゾーンに集中される遊離ＲＮＡのケースとは異なる。第３に、チャネル深さ内の焦平面の位置に応じて積分蛍光強度が約１５％の変動を示したことに留意されたい。この変動は細胞核の３次元構造に関連していると考えられる。
【００６３】
Ｓ−５．抽出ＲＮＡの絶対量とＤＮＡの相対量の相関
図２Ｃに示すように、抽出ＲＮＡ質量の計量された量と、対応する個々の細胞核の積分蛍光シグナルとの間の相関を調べた。有意な正の相関を示す０．６２の相関係数（相関なしの帰無仮説に対してｐ＝５．５×１０−１２）が得られた。セクションＳ−３に記載したように、本発明者らは、較正曲線を作製するために用いた実験間の変動係数として１２％を得た。この変動は、それぞれ３９％及び３４％であるＲＮＡ及びＤＮＡの計量の変動係数よりはるかに低い。従って、この強い正の相関は、抽出ＲＮＡの量で見られた変動が抽出効率の変動によるものではなかったことを示唆している。更に、正の相関及び較正実験の細胞データに対する相対的変動のこれらの観察の各々は、単一細胞データにおいて観察された変動が単なる測定上の実験的不確実性ではなく、生物学的変動に起因し得るという結論を支持する。
【００６４】
図９は、抽出ＲＮＡ量と核の相対積分蛍光を関連付けるデータの２次元ガウス混合分析を示す。本発明者らはＭＡＴＬＡＢの関数「ｇｍｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．ｆｉｔ」を用いてこの分析を行った。データのフィッティングのために１、２、３、及び４つの２次元ガウス分布を調べた。表１に記載されているように赤池の情報量基準（ＡＩＣ）及びベイズ情報量基準（ＢＩＣ）の値に基づいてフィッティング結果を評価した。２次元ガウス分布の最小のＡＩＣ及びＢＩＣ値から、２つのガウス分布がデータのオーバーフィッティングのない最良のフィットをもたらすことが示唆された。
【００６５】
表１．１００個の単一細胞から得られた１、２、３、及び４つの２次元ガウス分布を用いたフィットに対応するＡＩＣ及びＢＩＣ値。２つの２次元ガウス分布でＡＩＣ及びＢＩＣの両方が最小値となることから、２つのガウスフィットが適合度とオーバーフィッティングの最も良いトレードオフを提供することが示唆される。３及び４つのガウス分布を用いたフィッティングはオーバーフィッティングとなった。
【００６６】
【表１】
2017505610.tif 000003
【００６７】
結果
今回の研究で、本発明者らは、最初の単一細胞の単離後の末端チャネル電極の使用を除いて動く部品のない標準的な流体チップ中でプロセス全体を制御するために電場を用いた単一細胞アッセイにフォーカスした。本発明者らは、単一細胞の制御された操作及び破壊を実証した。破壊単一細胞の細胞質に由来するＲＮＡはＩＴＰにより選択的に抽出、計量された。本発明者らのプロトコールは、ＲＮＡの絶対的計量、単一細胞に由来する半定量的ＤＮＡ量を用いた相関分析、並びに単一細胞中のＲＮＡ及びＤＮＡの量の不均一性の評価に用いることができる。
【００６８】
図１Ａ〜図１Ｃは、本発明者らのアッセイの模式図を示している。本発明者らは、交差形状の既製のマイクロ流体チップ（モデルＮＳ１２Ａ、キャリパーライフサイエンス社（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カリフォルニア州）を用いた。このマイクロ流体チップは、幅９０μｍ、深さ２０μｍのホウケイ酸ガラスマイクロチャネルからなる（図３Ａ参照）。マイクロチャネルにＬＥバッファーを予め充填し、２μＬのＴＥバッファー中の細胞懸濁液（およそ５細胞／μＬ）を西（Ｗ）リザーバーに添加した。南（Ｓ）リザーバーに真空を印加することによりこの低濃度溶液から個々の細胞を導入した。直径１０〜１５μｍのほぼ球体として、インジェクションチャネル中に単離された生きた単一細胞が観察された（図１Ｄ）。単一細胞がインジェクションチャネル中、Ｗリザーバーと交差接合部との間に単離されたことを視覚的に確認した後、真空を解除し、２０μＬのＴＥバッファーをＷ及び北（Ｎ）リザーバーに加えた。白金ワイヤー電極をＷ、Ｎ、及び東（Ｅ）リザーバーに入れ、高電圧シーケンサー（ＨＶＳ４４８  ３０００Ｄ、ラボスミス社（ＬａｂＳｍｉｔｈ））を用いて電極に電圧を印加した。最初に、単一細胞を破壊するために、ＷリザーバーとＮリザーバーとの間に両極性電圧パルスを印加した（各パルス１００ｍｓ幅、３０００Ｖ振幅）。その後すぐに、ＤＣ電場を印加することによりＩＴＰを開始し、破壊細胞からＲＮＡを抽出した。電圧シーケンスを図３Ｂに模式的に示す。ＲＮＡは同時に、ＬＥに均一に混合したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩと複合体を形成し、本発明者らはそれを交差接合部の下流４０ｍｍで検出する。
【００６９】
本発明者らのインジェクションプロトコール及び末端チャネル電極は、インジェクションチャネルに位置した細胞のみを破壊した（補足情報（ＳＩ）セクションＳ−１参照）。細胞破壊プロセスは高い再現性があり、全ての観察において収率１００％を示した。
【００７０】
本発明者らの破壊パルス完了後すぐのＤＣ電場の印加は、個々の細胞由来のＲＮＡをＩＴＰにおいて迅速に集中させた。図１Ｆは、単一細胞に由来するＩＴＰ界面中の抽出ＲＮＡの代表的画像を示している。この画像は細胞破壊時から２２０秒後に得られた。本発明者らは、ＩＴＰゾーン中のＲＮＡ蛍光のシグナル・ノイズ比（ＳＮＲ）を、背景を超える蛍光強度を陰性対照の標準偏差で割ったものと定義した。本発明者らの典型的なＳＮＲは７．６であり、最小ＳＮＲは１．５であった。
【００７１】
全ての実験において、ＩＴＰで集中ＲＮＡゾーン、及び本発明者らによって細胞核に起因するとされた楕円体跡（ｔｒａｉｌｉｎｇ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌ  ｂｏｄｙ）が得られた（図１Ｆ及びＳＩセクションＳ−２参照）。核はＩＴＰ界面と同じ方向に泳動し、このことは正味の負電荷を示しているが、核の流動速度は一連の実験間で有意に異なっていた。本発明者らは、この変動は、サイズ及び形態のばらつき並びにその他の差（例えば、表面タンパク質の数及びイオン化状態）に起因すると考える。対照的に、ＩＴＰ集中ゾーンは常に、ＩＴＰの動力学から予想される流動速度（Ｃｒｉｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：５６４６−５６５５）で動き続けた。
【００７２】
本発明者らは、単一細胞を破壊し、全細胞質ＲＮＡから核を分離し、細胞質ＲＮＡを集中させて計量し、個々の核中の全ＤＮＡの相対測定値を得る実験を１００回行った。本発明者らは、積分強度を用いてＩＴＰ界面中のＲＮＡの絶対量を計量するために、スパイク合成ＲＮＡ（０．５〜１０Ｋｂ  ＲＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、インビトロジェン社）を用いた実験を用いて構築された較正曲線を用いた（ＳＩセクションＳ−３参照）。図２Ａは、測定された絶対ＲＮＡ質量のヒストグラムを示す。更に、一連の実験に対して経時的に並べたＲＮＡデータについては図７Ｂを参照されたい。ヒストグラムは、最も頻度の高い値が約１１．０ｐｇであることを示しており、平均は１４．１ｐｇであった。これらの測定値は、報告されている哺乳動物単一細胞に由来する全ＲＮＡ（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８０：６４７２−６４７９）と一致する。平均値で標準化した標準偏差は３９％であった（較正データにおける一連の実験間で観察された１２％という値より有意に大きい。ＳＩセクションＳ−３参照）。較正の繰り返しでの変動に対する変動の大きさから、本発明者らの細胞データにおいて観察された大きな変動は細胞集団の不均一性によるものであると結論付けられる（以下の更なる考察参照）。
【００７３】
これらの実験全てにおいて、本発明者らは、各細胞に特異的な更なる相関する測定値として細胞核の蛍光強度を積分した（ＳＩセクションＳ−４の画像分析の詳細参照）。ＳＩセクションＳ−２で考察したように、本発明者らのプロトコールにより破壊細胞から細胞質ＲＮＡのみが抽出され、ＤＮＡは核中に維持されることが確認された。細胞核に由来する積分蛍光強度は、単一細胞中のＤＮＡの相対量の基準を提供する。ＤＮＡの相対量は更に、平均で標準化した標準偏差が３４％である大きな変動を示した（推定される測定不確実性より有意に大きい。図２Ｂ参照）。ＤＮＡ量分布は２個の別個のピークを示した：第１のピークは約４．５ａ．ｕ．であり、第２のピークは約７．８ａ．ｕ．であった（局所極大比１．７）。本発明者らは、これら２個のピークは、単一細胞がそれぞれシングルコピー及びダブルコピーのＤＮＡを含むＧ０／Ｇ１及びＧ２／Ｍの細胞分裂相３０に起因するものと考えた。細胞がＤＮＡを合成するＳ期による寄与のため、ヒストグラム中の局所極大間の比は２より小さかったと考えられる。
【００７４】
本発明者らは、図２Ｃに示されるようにＲＮＡの絶対量とＤＮＡの相対量との間の相関を調べた。正の係数０．６２の有意な相関が観察された（相関が観察されない帰無仮説に対してｐ値は５．５×１０−１２）。正の係数は、より多量のＤＮＡがより多量のＲＮＡと同時に発生することを示している。従って、本発明者らは、各測定の変動は、ＲＮＡの抽出効率ではなく細胞周期に起因すると考えた。更なる詳細についてはＳＩセクションＳ−５も参照されたい。
【００７５】
本発明者らは更に、図２Ｃのデータへの２次元ガウス分布のフィッティングに基づく分析も行った。２つの２次元ガウス分布で最良のフィッティング結果が観察され、このことは、１００個の単一細胞が２つの別個の集団に由来したことを示唆している（ＳＩセクションＳ−５も参照）。本発明者らは、図２Ａ及び図２Ｂ中に線として２次元フィッティングの投影（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を示した。図２Ｂ中、本発明者らは、各集団がそれぞれ２個の別個のピークを有することを見出した。これは、Ｇ０／Ｇ１及びＧ２／Ｍ期に関連する２個の別個の集団が観察されたという結論を支持する。更に、図２Ａに示されているように、抽出されたＲＮＡの量について一致したフィッティング結果が観察された。
【００７６】
本発明者らは更に、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）を用いて同じ細胞培養に由来する細胞の分析を行うことにより本発明者らの技術を評価した。ＲＮＡ及びＤＮＡの相対的計量には、それぞれピロニンＹ及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２蛍光色素を用いたプロトコール（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ  ４：４７−５２）を用いた。図２Ｄ〜図２ＦにＦＡＣＳ分析を要約する。本発明者らのアッセイとＦＡＣＳの間に良好な定性的一致が観察された。本発明者らは、ＦＡＣＳによって提供される相対的ＲＮＡ及び相対的ＤＮＡ量の測定も、本発明者らのデータ同様、相関した二峰性分布を示すことを見出した。図２Ｆの相関図は５１０９個の細胞から得られたものであり、従って、本発明者らのアッセイより多くの詳細を示している。ＦＡＣＳは成熟したハイスループット技術であるので、はるかに多くの数の測定を提供する。しかし、ＦＡＣＳと異なり、本発明者らのアッセイは、ＲＮＡの絶対的計量を提供し、更に、チップ上で物理的に破壊してＤＮＡをＲＮＡから分離する。後者は、ＣＥ及びｃＤＮＡハイブリダイゼーションベースのアッセイ（Ｂａｈｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：６１５４−６１６２；Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｔ  １３８：３１１７−３１２０；Ｇａｒｃｉａ−Ｓｃｈｗａｒｚ  ＆  Ｓａｎｔｉａｇｏ（２０１３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５２（４４）：１１５３４−１１５３７）等の下流分析との統合に好都合である。対照的に、ＦＡＣＳで得られる相対的ＤＮＡ及び相対的ＲＮＡ量は、保存、分画できず、個々の分析に利用できるようにすることはできない。本発明者らは、分析される細胞の数を増やすため及び更なる下流の相関分析を統合するために、将来、本発明者らの方法を更に自動化することを望む。
【００７７】
要約すると、本発明者らは、迅速且つ選択的な細胞破壊、核ＤＮＡからの細胞質ＲＮＡの分離；ＲＮＡの回収、集中、及び絶対的計量；並びに生きた単一細胞に由来するＤＮＡの同時な相対的計量のための電気運動的方法を開発した。ＦＡＣＳとは異なり、本発明者らの技術は、絶対的ＲＮＡ計量を実現し、物理的に破壊して、ＲＮＡをＤＮＡから分離する。また、このアプローチは、ＤＮＡ及びＲＮＡを他の下流の関連する分析へと分画及び送達する機会も作り出す。本発明者らは、このような更なる統合を実証すること並びに本発明者らのアッセイを自動化して細胞、ＲＮＡ、及び核の完全な電場制御並びに画像分析に基づく細胞の同定及び制御を含めることを望む。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態を図解及び説明したが、その中で本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の変更が可能であることが理解されよう。
【図１Ａ】
2017505610.tif 000004
【図１Ｂ】
2017505610.tif 000005
【図１Ｃ】
2017505610.tif 000006
【図１Ｄ】
2017505610.tif 000007
【図１Ｅ】
2017505610.tif 000008
【図１Ｆ】
2017505610.tif 000009
【図２Ａ】
2017505610.tif 000010
【図２Ｂ】
2017505610.tif 000011
【図２Ｃ】
2017505610.tif 000012
【図２Ｄ】
2017505610.tif 000013
【図２Ｅ】
2017505610.tif 000014
【図２Ｆ】
2017505610.tif 000015
【図３Ａ】
2017505610.tif 000016
【図３Ｂ】
2017505610.tif 000017
【図４】
2017505610.tif 000018
【図５】
2017505610.tif 000019
【図６】
2017505610.tif 000020
【図７Ａ】
2017505610.tif 000021
【図７Ｂ】
2017505610.tif 000022
【図８】
2017505610.tif 000023
【図９Ａ】
2017505610.tif 000024
【図９Ｂ】
2017505610.tif 000025
【国際調査報告】
2017505610.tif 000026