(57)【要約】  本発明は、アシルグリシネートを製造するための細胞であって、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる少なくとも第２の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、グリシン開裂系の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）及びトレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異と、を含むように遺伝子組み換えされていることを特徴とする細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシルグリシネートを製造するための細胞であって、
野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異と、
野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる少なくとも第２の遺伝子突然変異と、
野生型細胞と比較して、グリシン開裂系の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ）、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｋｂｌ）及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼ（ＹｄｆＧ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異と、
を含むように遺伝子組み換えされていることを特徴とする細胞。
【請求項２】
前記グリシン開裂系の酵素が、グリシン開裂系のＴ−タンパク質、グリシン開裂系のＨ−タンパク質及びグリシン開裂系のＰ−タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記第３の遺伝子突然変異が、野生型細胞と比較して、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、グリシン開裂系のＴ−タンパク質、グリシン開裂系のＨ−タンパク質及びグリシン開裂系のＰ−タンパク質の発現を減少させることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記グリシン開裂系のＴ−タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８と８５％の配列相同性を有し、前記グリシン開裂系のＨ−タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９と８５％の配列相同性を有し、前記グリシン開裂系のＰ−タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０と８５％の配列相同性を有することを特徴とする、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１と８５％の配列相同性を有する、及び／又は前記トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２と８５％の配列相同性を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
野生型細胞と比較して、脂肪酸分解能力が低下していることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
前記脂肪酸分解能力の低下が、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現が減少していることによるものであることを特徴とする、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼが、ヒトアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
前記アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４と８５％の配列相同性を有する、及び／又は前記アシル−ＣｏＡシンテターゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５と８５％の配列相同性を有することを特徴とする、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
細菌細胞であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
Ｅ．ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
野生型細胞と比較して、少なくとも１種の輸送タンパク質の発現を増加させる第４の遺伝子突然変異を含むようにさらに遺伝子組み換えされており、前記輸送タンパク質がＦａｄＬ及びＡｌｋＬからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記アシルアミノ酸がラウロイルグリシネートであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４】
タンパク質を構成するアミノ酸及び／又は脂肪酸を生成することができることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
アシルアミノ酸の製造方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞の少なくとも１種の存在下において、アミノ酸と脂肪酸及び／又はそのアシル−ＣｏＡを接触させることを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種のアシルアミノ酸を製造するための生物工学的方法及び細胞に関する。具体的には、前記アシルアミノ酸は、少なくとも１種の脂肪酸に由来するアシルグリシネート（ａｃｙｌ  ｇｌｙｃｉｎａｔｅ）である。
【背景技術】
【０００２】
アシルアミノ酸は、例えば、洗浄剤、食品の乳化剤及びシャンプー、石鹸、保湿剤等の様々なパーソナルケア製品の必須成分等として使用することができる界面活性剤である。化合物を界面活性剤として使用するための前提条件としては、化合物が疎水性領域及び親水性領域の両方を有すると共に、無害であって、環境に優しく、安価な生物学的原料を使用して大規模で容易に製造することができる天然分子（アミノ酸及び脂肪酸）からなることが挙げられる。薬理学的研究では、アシルアミノ酸は神経修飾物質及び新薬ターゲットのプローブとして使用されている。
【０００３】
アシルアミノ酸は、多くの生物供給源（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｏｕｒｃｅ）から単離されており、例えば、ほ乳類の組織におけるシグナリング分子としての機能等の様々な機能を有すると考えられている。また、ターゲットリピドミクスに基づく内因性アシルアミノ酸の同定により、細菌培養物における抗生物質の構造単位として使用することができるようになっている。例えば、環状ＡＭＰはＮａｓＰ（β−プロテオバクテリアからクローニングされたＮ−アシルアミノ酸抗生物質生合成酵素）を直接活性化させるため、Ｎ−アシルアミノ酸は抗生物質の製造に容易に使用することができる。これらのＮ−アシルアミノ酸は、細菌タンパク質の選別のための化合物としても使用されている。
【０００４】
アシルアミノ酸は、工業規模においては石油化学製品に由来する材料から製造されている。具体的には、酸塩化物である活性脂肪酸を使用して水性アルカリ媒体中のアミノ酸をアシル化する（特許文献１を参照）。この方法には、硫酸又は無水硫酸等の有害化学物質を添加する必要があるという欠点がある。その他の合成方法には、界面活性に望ましくない影響を与える塩化物塩等の副生成物が蓄積するという問題がある。
【０００５】
有用なアシルアミノ酸の例としては、肌に対して有用であり、パーソナルケア用途において界面活性剤として使用される脂肪アシルグリシネート（ｆａｔｔｙ  ａｃｙｌ  ｇｌｙｃｉｎａｔｅ）が挙げられる。微生物発酵によって脂肪アシルグリシネートを合成することにより、脂肪アシルグリシネートを好適に製造することができると思われる。
【０００６】
アシルアミノ酸を製造するための生物工学的な方法としては、様々な方法が知られている。しかしながら、これらの方法は、収率（収量）及び得られる製品の純度が低く、多段階の精製プロセスが必要であるため、アシルアミノ酸の商業的な大量生産には不十分である。特に、生物工学的に有用な微生物に供給した炭素基質のほんの一部のみが所望の生成物（製品）に転化され、炭素基質の大部分が一次代謝の反応によって消費されてしまうという問題がある。
【０００７】
上述した生物工学的な方法の別の問題としては、生成物の混合物が得られるため、組成の制御が困難であることが挙げられる。より具体的には、単一の付加体を製造することが望ましい場合であっても、様々な脂肪酸がアシルアミノ酸に転化されてしまう場合がある。得られる混合物は化学構造が類似した化合物を含むため、単一の成分を効率的かつ容易に精製したり、少なくとも濃縮したりすることは技術的に困難である。
【０００８】
そのため、アシルアミノ酸を効率的かつ効果的に製造するための生物工学的な方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】英国特許出願公開第１４８３５００号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、所望のアシルアミノ酸を効率的かつ特異的に製造することができる生物工学的方法を使用してアシルアミノ酸を製造する少なくとも１つの方法を提供することにより、上記問題を解決することを目的とする。具体的には、アシルアミノ酸を遺伝子組み換え微生物から製造する。より具体的には、少なくとも１種のアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼと少なくとも１種のアシル−ＣｏＡシンテターゼを発現し、グリシン代謝に関与する少なくとも１種の酵素を発現しないか、グリシン代謝に関与する少なくとも１種の酵素の発現が減少するように遺伝子組み換えされた微生物を培養することによってアシルアミノ酸を製造する。グリシン代謝に関与する酵素は、グリシン開裂系の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ）、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｋｂｌ）及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼ（ＹｄｆＧ）からなる群から選択されてもよい。例えば、アシルアミノ酸は、少なくとも１種の脂肪アシルグリシネートである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題は、請求項に記載されている主題によって達成される。
【００１２】
本発明の一態様は、アシルアミノ酸を製造するための細胞であって、
野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異と、
野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる少なくとも第２の遺伝子突然変異と、
野生型細胞と比較して、グリシン開裂系の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ）、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｋｂｌ）及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼ（ＹｄｆＧ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異と、
を含むように遺伝子組み換えされていることを特徴とする細胞を提供する。
【００１３】
具体的には、本発明の各態様に係る細胞及び方法により、アシルアミノ酸を生物工学的な方法で効率的に製造することができる。本発明の各態様に係る細胞及び方法は、従来の方法と比較して、触媒又は望ましくない副生成物の点において、得られる生成物の収率（収量）及び純度を高めることができる。
【００１４】
また、本発明の各態様に係る細胞及び方法によれば、アシルアミノ酸の製造方法であって、従来の方法と比較して、様々な脂肪酸をアシルアミノ酸に転化させることができる方法を提供することができる。例えば、本発明の各態様に係る細胞及び方法は、短鎖の不飽和脂肪酸をアシルアミノ酸に転化させる場合に適している場合がある。また、本発明の各態様に係る細胞及び方法によれば、アシルアミノ酸の生物工学的な製造方法であって、アシルアミノ酸生成物中のアシル残基の長さを制御することができる（例えば、ラウリル濃度を高めることができる）方法を提供することができる。
【００１５】
本発明の各態様に係る細胞及び方法は、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼと、アシル−ＣｏＡシンテターゼと、グリシン代謝に関与する少なくとも１種の酵素の発現の減少の組み合わせを、様々な脂肪酸からアシルアミノ酸への転化に使用することができるという予期せぬ知見に基づくものである。具体的には、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼは、ラウロレイン酸等の短鎖不飽和脂肪酸をアシルアミノ酸に転化させるために使用することができる。より具体的には、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼは、従来の方法と比較して、ラウロレイン酸等の短鎖不飽和脂肪酸をアシルアミノ酸に高い収率で転化させることができる場合がある。さらに具体的には、本発明の各態様に係る細胞によって生成されるアシルアミノ酸の組成は、アシルアミノ酸に組み込まれる脂肪酸の長さを変化させることによって調節することができる。例えば、本発明の各態様に係る細胞によって生成されるアシルアミノ酸の組成は、１種以上の特定のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼを細胞に導入するか、細胞が内因的に発現する１種以上のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼの発現を調節することによって制御することができる。野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させ、野生型細胞と比較して、グリシン代謝に関与する少なくとも１種の酵素の発現を減少させることにより、従来の方法と比較してアシルアミノ酸の収率が増加するという相乗効果が得られる。例えば、生成されるアシルアミノ酸はラウロイルグリシネート（ｌａｕｒｏｙｌ  ｇｌｙｃｉｎａｔｅ）であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本願明細書において使用する「アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ」という用語は、アシル−ＣｏＡ（ラウロレイン酸のＣｏＡエステル等）及びアミノ酸（タンパク質を構成するアミノ酸等）（特にグリシン）からアシルアミノ酸への転化を触媒することができる酵素を意味する。適当なアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼは、例えば、Ｗａｌｕｋ，Ｄ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１０に記載されている。例えば、本発明の各態様において使用するアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又は５で表されるヌクレオチド配列を含むことができる。特に、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、
ＮＰ＿００１０１０９０４．１,  ＮＰ＿６５９４５３．３，  ＸＰ＿００１１４７０５４．１，  ＡＡＨ１６７８９．１， ＡＡＯ７３１３９．１，  ＸＰ＿００３２７５３９２．１，  ＸＰ＿００２７５５３５６．１，  ＸＰ＿００３９２０２０８．１，  ＸＰ＿００４０５１２７８．１，  ＸＰ＿００６１４７４５６．１，  ＸＰ＿００６２１４９７０．１，  ＸＰ＿００３８０１４１３．１，  ＸＰ＿００６１８９７０４．１，  ＸＰ＿００３９９３５１２．１，  ＸＰ＿００５８６２１８１．１，  ＸＰ＿００７０９２７０８．１，  ＸＰ＿００６７７２１６７．１，  ＸＰ＿００６０９１８９２．１，  ＸＰ＿００５６６０９３６．１，  ＸＰ＿００５９１１０２９．１，  ＮＰ＿００１１７８２５９．１，  ＸＰ＿００４０１６５４７．１，  ＸＰ＿００５９５４６８４．１，  ＥＬＲ４５０６１．１，  ＸＰ＿００５６９０３５４．１，  ＸＰ＿００４４０９３５２．１，  ＸＰ＿００７５１９５５３．１，  ＸＰ＿００４７７７７２９．１，  ＸＰ＿００５６６０９３５．１，  ＸＰ＿００４８２４０５８．１，  ＸＰ＿００６０６８１４１．１，  ＸＰ＿００６９００４８６．１，  ＸＰ＿００７４９７５８５．１，  ＸＰ＿００２８２１８０１．２，  ＸＰ＿００７４９７５８３．１，  ＸＰ＿００３７７４２６０．１，  ＸＰ＿００１３７７６４８．２，  ＸＰ＿００３９０９８４３．１，  ＸＰ＿００３８０１４４８．１，  ＸＰ＿００１０９１９５８．１，  ＸＰ＿００２８２１７９８．１，  ＸＰ＿００５５７７８４０．１，  ＸＰ＿００１０９２１９７．１，  ＮＰ＿００１２０７４２３．１，  ＮＰ＿００１２０７４２５．１，  ＸＰ＿００３９５４２８７．１，  ＮＰ＿００１２７１５９５．１，  ＸＰ＿００３９０９８４８．１，  ＸＰ＿００４０８７８５０．１，  ＸＰ＿００４０５１２７９．１，  ＸＰ＿００３９２０２０９．１，  ＸＰ＿００５５７７８３５．１，  ＸＰ＿００３７７４４０２．１，  ＸＰ＿００３９０９８４６．１，  ＸＰ＿００４３８９４０１．１，  ＸＰ＿００２８２１８０２．１，  ＸＰ＿００３７７４４０１．１，  ＸＰ＿００７４９７５８１．１，  ＥＨＨ２１８１４．１，  ＸＰ＿００３９０９８４５．１，  ＸＰ＿００５５７７８３９．１，  ＸＰ＿００３７７４４０３．１，  ＸＰ＿００１０９２４２７．１，  ＸＰ＿００３２７５３９５．２，  ＮＰ＿５４２３９２．２，  ＸＰ＿００１１４７２７１．１，  ＸＰ＿００５５７７８３７．１，  ＸＰ＿００３８２６４２０．１，  ＸＰ＿００４０５１２８１．１，  ＸＰ＿００１１４７６４９．２，  ＸＰ＿００３８２６６７８．１，  ＸＰ＿００３９０９８４７．１，  ＸＰ＿００４６８２８１２．１，  ＸＰ＿００４６８２８１１．１，  ＸＰ＿００３７３４３１５．１，  ＸＰ＿００４７１５０５２．１，  ＢＡＧ６２１９５．１，  ＸＰ＿００３７７７８０４．１，  ＸＰ＿００３９０９８４９．１，  ＸＰ＿００１０９２３１６．２，  ＸＰ＿００６１６７８９１．１，  ＸＰ＿５４０５８０．２，  ＸＰ＿００１５１２４２６．１，  ＥＡＷ７３８３３．１，  ＸＰ＿００３４６４２１７．１，  ＸＰ＿００７５１９５５１．１，  ＸＰ＿００３７７４０３７．１，  ＸＰ＿００５９５４６８０．１，  ＸＰ＿００３８０１４１１．１，  ＮＰ＿８��３４７９．１，  ＸＰ＿００４４３７４６０．１，  ＸＰ＿００６８７５８３０．１，  ＸＰ＿００４３２８９６９．１，  ＸＰ＿００４２６４２０６．１，  ＸＰ＿００４６８３４９０．１，  ＸＰ＿００４７７７６８３．１，  ＸＰ＿００５９５４６８１．１，  ＸＰ＿００３４８０７４５．１，  ＸＰ＿００４７７７６８２．１，  ＸＰ＿００４８７８０９３．１，  ＸＰ＿００７５１９５５０．１，  ＸＰ＿００３４２１３９９．１，  ＥＨＨ５３１６７．１， ＸＰ＿００６１７２２１４．１  ，ＸＰ＿００３９９３４５３．１  ，ＡＡＩ１２５３７．１，  ＸＰ＿００６１８９７０５．１  ，Ｑ２ＫＩＲ７．２，  ＸＰ＿００３４２１４６５．１，  ＮＰ＿００１００９６４８．１，  ＸＰ＿００３４６４３２８．１，  ＸＰ＿００１５０４７４５．１，  ＥＬＶ１１０３６．１，  ＸＰ＿００５６９０３５１．１，  ＸＰ＿００５２１６６３２．１，  ＥＰＹ７７４６５．１，  ＸＰ＿００５６９０３５２．１，  ＸＰ＿００４０１６５４４．１，  ＸＰ＿００１４９８２７６．２，  ＸＰ＿００４２６４２０５．１，  ＸＰ＿００５６９０３５３．１，  ＸＰ＿００５９５４６８３．１，  ＸＰ＿００４６６７７５９．１，  ＸＰ＿００４４７９３０６．１，  ＸＰ＿００４６４５８４３．１，  ＸＰ＿００４０１６５４３．１，  ＸＰ＿００２９２８２６８．１，  ＸＰ＿００６０９１９０４．１，  ＸＰ＿００５３３１６１４．１，  ＸＰ＿００７１９６５４９．１，  ＸＰ＿００７０９２７０５．１，  ＸＰ＿００４６２０５３２．１，  ＸＰ＿００４８６９７８９．１，  ＥＨＡ９８８００．１，  ＸＰ＿００４０１６５４５．１，  ＸＰ＿００４４７９３０７．１，  ＸＰ＿００４０９３１０５．１，  ＮＰ＿００１０９５５１８．１，  ＸＰ＿００５４０８１０１．１，  ＸＰ＿００４４０９３５０．１，  ＸＰ＿００１４９８２９０．１，  ＸＰ＿００６０５６６９３．１，  ＸＰ＿００５２１６６３９．１，  ＸＰ＿００７４５５７４５．１，  ＸＰ＿００５３５２０４９．１，  ＸＰ＿００４３２８９７０．１，  ＸＰ＿００２７０９２２０．１，  ＸＰ＿００４８７８０９２．１，  ＸＰ＿００７１９６５５３．１，  ＸＰ＿００６９９６８１６．１，  ＸＰ＿００５３３１６１５．１，  ＸＰ＿００６７７２１５７．１，  ＸＰ＿００７１９６５５２．１，  ＸＰ＿００４０１６５４６．１，  ＸＰ＿００７６２８７２１．１，  ＮＰ＿８０３４５２．１，  ＸＰ＿００４４７９３０４．１，  ＤＡＡ２１６０１．１，  ＸＰ＿００３９２０２０７．１，  ＸＰ＿００６０９１９０６．１，  ＸＰ＿００３４６４２２７．１，  ＸＰ＿００６０９１９０３．１，  ＸＰ＿００６１８９７０６．１，  ＸＰ＿００７４５５７４４．１，  ＸＰ＿００４５８５５４４．１，  ＸＰ＿００３８０１４１０．１，  ＸＰ＿００７１２４８１２．１，  ＸＰ＿００６９００４８８．１，  ＸＰ＿００４７７７６８０．１，  ＸＰ＿００５９０７４３６．１，  ＸＰ＿００４３８９３５６．１，  ＸＰ＿００７１２４８１１．１，  ＸＰ＿００５６６０９３７．１，  ＸＰ＿００７６２８７２４．１，  ＸＰ＿００３５１３５１２．１，  ＸＰ＿００４４３７８１３．１，  ＸＰ＿００７６２８７２３．１，  ＥＲＥ７８８５８．１，  ＥＰＱ１５３８０．１，  ＸＰ＿００５８６２１７８．１，  ＸＰ＿００５８７８６７２．１，  ＸＰ＿５４０５８１．１，  ＸＰ＿００２９２８２６７．１，  ＸＰ＿００４６４５８４５．１，  ＥＰＱ０５１８４．１，  ＸＰ＿００３５１３５１１．１，  ＸＰ＿００６２１４９７２．１，  ＸＰ＿００７１９６５４５．１，  ＸＰ＿００７１９６５４７．１，  ＸＰ＿００６７７２１６０．１，  ＸＰ＿００３８０１４０９．１，  ＮＰ＿００１１１９７５０．１，  ＸＰ＿００３８０１４１２．１，  ＸＰ＿００６７７２１５９．１，  ＥＡＷ７３８３２．１，  ＸＰ＿００６０９１８９７．１，  ＸＰ＿００６７７２１６３．１，  ＸＰ＿００６０９１８９８．１，  ＸＰ＿００５４０８１０５．１，  ＸＰ＿００６９００４８７．１，  ＸＰ＿００３９９３４５４．１，  ＸＰ＿００３１２２７５４．３，  ＸＰ＿００７４５５７４６．１，  ＸＰ＿００５３３１６１８．１，  ＸＰ＿００４５８５３３７．１，  ＸＰ＿００５０６３３０５．１，  ＸＰ＿００６０９１８９５．１，  ＸＰ＿００６７７２１５６．１，  ＸＰ＿００４０５１２７６．１，  ＸＰ＿００４６８３４８８．１，  ＮＰ＿６６６０４７．１，  ＮＰ＿００１０１３７８４．２，  ＸＰ＿００６９９６８１５．１，  ＸＰ＿００６９９６８２１．１，  ＸＰ＿００６０９１８９３．１，  ＸＰ＿００６１７３０３６．１，  ＸＰ＿００６２１４９７１．１，  ＥＰＹ８９８４５．１，  ＸＰ＿００３８２６４２３．１，  ＮＰ＿９６４０１１．２，  ＸＰ＿００７０９２７０７．１，  ＸＰ＿００５０６３８５８．１，  ＢＡＬ４３１７４．１，  ＸＰ＿００１１６１１５４．２，  ＸＰ＿００７１２４８１３．１，  ＮＰ＿０８３８２６．１ＸＰ＿００３４６４２３９．１，  ＸＰ＿００３２７５３９４．１，  ＥＬＫ２３９７８．１，  ＸＰ＿００４８７８０９７．１，  ＸＰ＿００４８７８０９８．１，  ＸＰ＿００４４３７４５９．１，  ＸＰ＿００４２６４２０４．１，  ＸＰ＿００４４０９３５１．１，  ＸＰ＿００５３５２０４７．１，  Ｑ５ＲＦＰ０．１，  ＸＰ＿００５４０８１０７．１，  ＸＰ＿００７６５９１６４．１，  ＸＰ＿００３９０９８５２．１，  ＸＰ＿００２７５５３５５．１，  ＮＰ＿００１１２６８０６．１，  ＡＡＰ９２５９３．１，  ＮＰ＿００１２４４１９９．１，  ＢＡＡ３４４２７．１，  ＸＰ＿００５０６３８５９．１，  ＮＰ＿５９９１５７．２，  ＸＰ＿００４６６７７６１．１，  ＸＰ＿００６９００４８９．１，  ＸＰ＿００６２１５０１３．１，  ＸＰ＿００５４０８１００．１，  ＸＰ＿００７６２８７１８．１，  ＸＰ＿００３５１４７６９．１，  ＸＰ＿００６１６０９３５．１，  ＸＰ＿００４６８３４８９．１，  ＸＰ＿００３４６４３２９．１，  ＸＰ＿００４９２１２５８．１，  ＸＰ＿００３８０１４４７．１，  ＸＰ＿００６１６７８９２．１，  ＸＰ＿００４９２１３０５．１，  ＡＡＨ８９６１９．１，  ＸＰ＿００４７０６１６２．１，  ＸＰ＿００３５８３２４３．１，  ＥＦＢ１６８０４．１，  ＸＰ＿００６７２８６０３．１，  ＥＰＱ０５１８５．１，  ＸＰ＿００２７０９０４０．１，  ＸＰ＿００６８７５８６１．１，  ＸＰ＿００５４０８１０３．１，  ＸＰ＿００４３９１４２５．１，  ＥＤＬ４１４７７．１，  ＸＰ＿００６７７２１５８．１，  ＥＧＷ０６５２７．１，  ＡＡＨ１５２９４．１，  ＸＰ＿００６７７２１６２．１，  ＸＰ＿００５６６０９３９．１，  ＸＰ＿００５３５２０５０．１，  ＸＰ＿００６０９１９０１．１，  ＸＰ＿００５８７８６７５．１，  ＸＰ＿００４０５１３２３．１，  ＥＨＡ９８８０３．１，  ＸＰ＿００３７７９９２５．１，  ＥＤＭ１２９２４．１，  ＸＰ＿００３４２１４００．１，  ＸＰ＿００６１６０９３９．１，  ＸＰ＿００６１６０９３８．１，  ＸＰ＿００６１６０９３７．１，  ＸＰ＿００６１６０９３６．１，  ＸＰ＿００５７０２１８５．１，  ＸＰ＿００５３１３０２３．１，  ＸＰ＿００３７６９１９０．１，  ＸＰ＿００２７１４４２４．１，  ＸＰ＿００４７１５０５１．１，  ＸＰ＿００７６６１５９３．１，  ＸＰ＿００４５９０５９４．１，  ＥＬＫ２３９７５．１，  ＸＰ＿００４６７４０８５．１，  ＸＰ＿００４７８０４７７．１，  ＸＰ＿００６２３１１８６．１，  ＸＰ＿００３８０３５７３．１，  ＸＰ＿００４８０３１７６．１，  ＥＦＢ１６８０３．１，  ＸＰ＿００６０５６６９４．１，  ＸＰ＿００５４４１６２６．１，  ＸＰ＿００５３１８６４７．１ＸＰ＿００４６０５９０４．１，  ＸＰ＿００５８６２１８２．１，  ＸＰ＿００３４３０６８２．１，  ＸＰ＿００４７８０４７８．１，  ＸＰ＿００５２３９２７８．１，  ＸＰ＿００３８９７７６０．１，  ＸＰ＿００７４８４１２１．１，  ＸＰ＿００４８９２６８３．１，  ＸＰ＿００４４１４２８６．１，  ＸＰ＿００６９２７０１３．１，  ＸＰ＿００３９２３１４５．１，  ＸＰ＿８５２５８７．２，  ＡＡＰ９７１７８．１，  ＥＨＨ５３１０５．１，  ＸＰ＿００５４０８１１３．１，  ＸＰ＿００２９１５４７４．１，  ＸＰ＿００５３７７５９０．１，  ＸＰ＿５２７４０４．２，  ＸＰ＿００５５５２８３０．１，  ＸＰ＿００４０４４２１１．１，  ＮＰ＿００１１８０９９６．１，  ＸＰ＿００３５１３５１３．２，  ＸＰ＿００１４９８５９９．２，  ＸＰ＿００２７４６６５４．１，  ＸＰ＿００５０７２３４９．１，  ＸＰ＿００６１４９１８１．１，  ＥＡＸ０４３３４．１，  ＸＰ＿００３８３３２３０．１
，  ＸＰ＿００５２１６６３５．１，  ＸＰ＿００３４０４１９７．１，  ＸＰ＿００７５２３３６３．１，  ＸＰ＿００７４３３９０２．１，  ＸＰ＿００３２５４２３５．１，  ＸＰ＿００４４７１２４２．１，  ＸＰ＿００５２１６６３４．１，  ＸＰ＿００６８６０６７５．１，  ＸＰ＿００４７７１９５６．１，  ＸＰ＿００６０３８８３３．１，  ＮＰ＿００１１３８５３４．１，  ＸＰ＿００７０６８５３２．１，  ＸＰ＿００３５１０７１４．１，  ＥＲＥ８７９５０．１，  ＸＰ＿００３９８６３１３．１，  ＸＰ＿００６７２８６４４．１，  ＸＰ＿００４８７８０９９．１，  ＸＰ＿００３４６８０１４．１，  ＸＰ＿００７０９５６１４．１，  ＸＰ＿００４６４８８４９．１，  ＸＰ＿００４８６９７９５．１，  ＸＰ＿００４０１８９２７．１，  ＸＰ＿００５６９６４５４．１，  ＸＰ＿００６２０１９８５．１，  ＸＰ＿００５９６０６９７．１，  ＸＰ＿００４８１３７２５．１，  ＸＰ＿００５４９６９２６．１，  ＥＬＲ４５０８８．１，  ＸＰ＿００４６９６６２５．１，  ＸＰ＿００５８６０９８２．１，  ＸＰ＿００５９１１００３．１，  ＸＰ＿００６２６０１６２．１，  ＥＰＱ０４４１４．１，  ＸＰ＿００６０９９７７５．１，  ＮＰ＿００１１３８５３２．１，  ＸＰ＿００６１９０７９５．１，  ＸＰ＿００４６４９７７５．１，  ＸＰ＿００４４２４４９７．１，  ＸＰ＿００４３９０８８５．１，  ＸＰ＿００５９１１００４．１，  ＸＰ＿００３７７７８０３．１，  ＸＰ＿００４３１２２５９．１，  ＸＰ＿００５５２９１４０．１，  ＸＰ＿００５３１４５８２．１，  ＸＰ＿００６９２６５２３．１，  ＸＰ＿００６９２６５２２．１，  ＸＰ＿００４６８３４９１．１，  ＸＰ＿００３８２６６８０．１，  ＸＰ＿００３２１５０１８．１，  ＸＰ＿００３２１５０８７．１，  ＥＧＷ１２６１１．１，  ＸＰ＿００６１１３０２３．１，  ＸＰ＿００６８８２１８２．１，  ＸＰ＿００７４２５２００．１，  ＸＰ＿００６０４１３４２．１，  ＮＰ＿００１１３８５３３．１，  ＥＭＰ２７６９４．１，  ＸＰ＿００７４９７７５３．１，  ＸＰ＿００６０３４２５２．１、及びその変異体のみから成る群から選択されてよい。本願明細書においてアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼに関連して使用する「変異体」という用語は、上記アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの少なくとも１種のアミノ酸配列を実質的に有するが、従来の方法によって１以上の挿入、欠失、付加及び／又は置換が意図的になされたポリペプチドを意味する。変異体は、上記アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼと比較して配列が異なる場合があるが、上記アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼと同一の機能を有する。例えば、変異体は、上記アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼのいずれかに対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８又は９９％の配列相同性を有する。具体的には、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの各変異体は、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼと同一の機能を有する。具体的には、本発明の各態様において使用するアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４に対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８又は９９％の配列相同性を有することができる。
【００１７】
本発明の各態様において、「変異体」という用語は、機能に不可欠なアミノ酸以外のアミノ酸の差異を含むポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを意味する。例えば、特定の酵素の変異体は、当該酵素の触媒活性又は構造をもたらす配列／部分を含む。変異は、酵素における不可欠ではない部分のみに存在する。不可欠ではないアミノ酸は、削除又は挿入によって置換されていてもよく、不可欠なアミノ酸は、参照配列又はそれに由来する分子の生物学的活性が保存されるように置換（保存的置換）されていてもよい。例えば、２つの所与の核酸又はアミノ酸配列をアライメントし、相同性を算出するために使用することができるアルゴリズムが知られている（例えば、Ｌｅｓｋ，２００８、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４及びＫａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５を参照）。「変異体」という用語は、「同族体」という用語と同義に使用する。変異体は、アミノ酸又は核酸配列に対して欠失、挿入又は置換操作を行ったり、そのような巨大分子又はその変異体を含む融合操作を行ったりすることにより得ることができる。例えば、アミノ酸配列に関連して使用する「変異体」という用語は、配列相同性に加えて、各参照配列又は野生型配列に対して１以上の保存的なアミノ酸の変化を含むアミノ酸配列又は１以上の保存的なアミノ酸の変化を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。あるいは、アミノ酸配列又は核酸配列に関連して使用する「変異体」という用語は、配列相同性に加えて、アミノ酸配列又は核酸配列の活性部分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）及び／又はフラグメント又はアミノ酸配列の活性部分及び／又はフラグメントをコードする核酸配列を含む。好適な実施形態では、本願明細書において使用する「活性部分」という用語は、完全なアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列又は完全なアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列をコードする核酸配列であって、完全なアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列が、本質的な生物学的活性の少なくとも一部を保持しているアミノ酸配列又は核酸配列を意味する。例えば、プロテアーゼの活性部分及び／又はフラグメントは、ポリペプチドのペプチド結合を加水分解することができる。例えば、本願明細書において使用する「本質的な生物学的活性の少なくとも一部を保持している」という表現は、当該アミノ酸配列がバックグラウンド活性とは異なる（バックグラウンド活性を超える）生物学的活性を有し、活性を特徴付ける動力学的パラメータ（より具体的にはｋｃａｔ及びＫＭ）が、特定の基質に対する参照分子の値と比較して３、２又は１桁の範囲にあることを意味する。例えば、核酸の「変異体」は、ストリンジェントな条件下でその相補鎖が参照又は野生型核酸にハイブリダイズする核酸を含む。アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの変異体の例を図３に示す。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者であれば容易に決定することができ、通常は、プローブ長、洗浄温度及び塩濃度に依存する実験的な計算である。通常、プローブ長が長いと適切なアニーリングのために高い温度が必要となり、プローブ長が短い場合には必要とされる温度は低くなる。通常、ハイブリダイゼーシ��ンは、融点未満の温度の環境に存在する相補鎖への変性ＤＮＡの再アニーリング能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列と間の所望の相同性の度合いが高くなると、使用する相対的な温度が高くなる。相対的な温度が高くなると、反応条件はよりストリンジェントとなる傾向があり、相対的な温度が低くなると、反応条件はよりストリンジェントではなくなる傾向がある。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関する詳細及び説明については、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）を参照されたい。ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列を特定する方法に関しては、「Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」，１９９３及びＬｉｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）を参照されたい。
【００１８】
ストリンジェントな条件は、プローブがターゲット配列と７０％以上同じである場合にのみハイブリダイゼーションが生じる場合に適用することができる。ターゲット配列との相同性が低いプローブもハイブリダイズする場合があるが、そのようなハイブリッドは不安定であり、ストリンジェントな条件下（例えば、塩濃度が２×ＳＳＣ又は５×ＳＳＣ、温度が約５０〜６８℃、約５２〜６８℃、約５４〜６８℃、約５６〜６８℃、約５８〜６８℃、約６０〜６８℃、約６２〜６８℃、約６４〜６８℃又は約６６〜６８℃（例えば、約６４〜６８℃又は約６６〜６８℃））における洗浄工程で除去される。塩濃度は、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣに調節することができる。参照又は野生型配列に対して少なくとも７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の相同性を有するポリヌクレオチドフラグメントを単離することができる。例えば、本願明細書において核酸配列に関連して使用する「同族体」という用語は、遺伝コードの縮退に応じて参照核酸配列と同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を意味する。
【００１９】
当業者であれば、タンパク質を構成するアミノ酸及び／又は脂肪酸を生成することができるアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼを容易に決定することができる。具体的には、変異体は、例えば、Ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ（Ｎｌ，ＸＰ＿００３２７５３９２．１）、Ｓａｉｍｉｒｉ  ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ（Ｓｂ，ＸＰ＿００３９２０２０８．１）、Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ（Ｆｃ，ＸＰ＿００３９９３５１２．１）、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（Ｂｔ，ＮＰ＿００１１７８２５９．１）及びＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｍｍ，ＮＰ＿６６６０４７．１）からなる生物群から選択される生物に由来するアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼを含むことができる。
【００２０】
本願明細書において使用する「アシルアミノ酸」という用語は、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼによって触媒された反応の生成物、具体的には、アシル−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨ（式中、Ｒはタンパク質を構成するアミノ酸の側鎖であり、「アシル」は脂肪酸のアシル残基である）で表される化合物を意味する。本発明の各態様において、本願明細書において使用する「脂肪酸」という用語は、カルボン酸を意味する。例えば、脂肪酸は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の炭素原子を含む。具体的には、脂肪酸は、少なくとも６、８、１０又は１２個の炭素原子を含むアルカン酸であってもよい。より具体的には、脂肪酸は１２個の炭素原子を含む。例えば、直鎖状の脂肪酸を使用することができる。あるいは、脂肪酸は分岐鎖状であってもよい。例えば、本発明の各態様において使用する脂肪酸は、飽和脂肪酸であってもよい。あるいは、脂肪酸は不飽和脂肪酸であってもよい。例えば、本発明の各態様において使用する脂肪酸は、少なくとも１２個の炭素原子を含み、例えば９位に二重結合を含む直鎖状の脂肪酸であってもよい。あるいは、脂肪酸は、９又は１１位に１個の二重結合を含む不飽和脂肪酸であってもよい。より具体的には、本発明の各態様において使用する脂肪酸は、ラウロレイン酸（９−ドデセン酸）であってもよい。
【００２１】
例えば、アシルアミノ酸は、脂肪アシルグリシネートであってもよい。例えば、任意の脂肪酸をアミノ酸グリシンと共に使用することができる。具体的には、脂肪酸は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の炭素原子を含む。より具体的には、脂肪アシルグリシネートは、Ｃ６〜Ｃ２４アシルグリシネートから選択される任意のグリシネートであってもよい。例えば、グリシネートは、Ｃ６アシルグリシネート、Ｃ７アシルグリシネート、Ｃ８アシルグリシネート、Ｃ９アシルグリシネート、Ｃ１０アシルグリシネート、Ｃ１１アシルグリシネート、Ｃ１２アシルグリシネート、Ｃ１３アシルグリシネート、Ｃ１４アシルグリシネート、Ｃ１５アシルグリシネート、Ｃ１６アシルグリシネート、Ｃ１７アシルグリシネート、Ｃ１８アシルグリシネート、Ｃ１９アシルグリシネート、Ｃ２０アシルグリシネート、Ｃ２１アシルグリシネート、Ｃ２２アシルグリシネート、Ｃ２３アシルグリシネート、Ｃ２４アシルグリシネート等であってもよい。
【００２２】
本発明の各態様において、水溶液中で解離可能な化合物の解離した状態又は解離していない状態を表す化学基を示す式は、解離した状態又は解離していない状態の両方を含み、前記基の各種の塩形態を含む。例えば、残基−ＣＯＯＨは、プロトン化（−ＣＯＯＨ）及び非プロトン化（−ＣＯＯ−）カルボン酸の両方を含む。
【００２３】
本発明の各態様において使用するアシル−ＣｏＡ基質は、少なくとも１種の細胞から精製したり、化学的に合成したり、及び／又はアシル−ＣｏＡシンテターゼを使用して製造することができる。具体的には、本発明の各態様において使用するアシル−ＣｏＡ基質は、アシル−ＣｏＡシンテターゼを使用して製造することができる。
【００２４】
本願明細書において使用する「アシル−ＣｏＡシンテターゼ」という用語は、脂肪酸及びＣｏＡからアシル−ＣｏＡへのＡＴＰ依存転化（ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を触媒することができる酵素を意味する。具体的には、「アシル−ＣｏＡシンテターゼ」という用語は、アシルグリシネートを生成及び／又は以下の反応を触媒することができるアシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼを意味する。
【００２５】
脂肪酸＋ＣｏＡ／ＡＣＰ＋ＡＴＰ→アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰ＋ＡＤＰ＋Ｐｉ
【００２６】
アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼの例としては、例えば、ＥＣ  ６．２．１．３、ＥＣ  ６．２．１．１０、ＥＣ  ６．２．１．１５、ＥＣ  ６．２．１．２０等が挙げられる。本発明の各態様において使用するアシル−ＣｏＡシンテターゼは、ＹＰ＿００１７２４８０４．１、ＷＰ＿００１５６３４８９．１、ＮＰ＿７０７３１７．１等からなる群から選択されてもよい。例えば、アシル−ＣｏＡシンテターゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５又はＹＰ＿００１７２４８０４．１又はその変異体を含むことができる。本願明細書においてアシル−ＣｏＡシンテターゼに関連して使用する「変異体」という用語は、上記アシル−ＣｏＡシンテターゼの少なくとも１種のアミノ酸配列を実質的に有するが、従来の方法によって１以上の挿入、欠失、付加及び／又は置換がなされたポリペプチドを意味する。変異体は、上記アシル−ＣｏＡシンテターゼと比較して配列が異なる場合があるが、上記アシル−ＣｏＡシンテターゼと同一の機能を有する。例えば、変異体は、上記アシル−ＣｏＡシンテターゼのいずれかに対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８又は９９％の配列相同性を有する。
【００２７】
アシル−ＣｏＡシンテターゼの活性を検出するための様々な方法が知られている。例えば、アシル−ＣｏＡシンテターゼの活性は、２５０μＭラウロイル−ＣｏＡ、５００μＭグリシン及びＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（エルマン試薬ともいう））の存在下においてサンプルを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ内において培養し（ｐＨ：８）、遊離チオール基のＣｏＡＳＨとしての放出及びエルマン試薬との反応後の４１０ｎｍでの吸光度を分光光度分析によってモニタリングすることによって評価することができる。アシル−ＣｏＡシンテターゼの活性は、例えば、Ｋａｎｇ，Ｙ．，２０１０に記載されている方法によって評価することができる。簡単に説明すると、エルマン試薬を添加し、好ましくは、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ：７．２）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  ＡＴＰ、０．５ｍＭ補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）及び脂肪酸（３０〜３００ｍＭ）を含む反応緩衝液内において４１０ｎｍでの吸光度を分光光度分析によって監視することによって未反応のＣｏＡＳＨの形態の遊離チオールの量を測定する。
【００２８】
例えば、本発明の各態様に係る細胞は、少なくともアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させるように遺伝子組み換えされていてもよい。具体的には、細胞は、グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ及びアシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼを過剰発現してもよい。本願明細書において使用する「酵素に関して高い活性を示す」及び「酵素を過剰発現する」という表現は、当該酵素に関して高い細胞内活性を示すことを意味する。基本的に、酵素活性は、強力なプロモーターを使用するか、高い活性を有する酵素をコードする遺伝子又は対立遺伝子を使用するか、これらの手段を組み合わせることにより、酵素をコードする遺伝子配列のコピー数を増加させることによって高めることができる。本発明の各態様に使用する遺伝子組み換え細胞は、例えば、所望の遺伝子、所望の遺伝子の対立遺伝子又はその一部を含むベクター及び遺伝子の発現を可能とするベクターを使用した形質転換、形質導入、接合又はこれらの組み合わせによって得ることができる。異種発現は、遺伝子又は対立遺伝子を、細胞の染色体又は染色体外複製ベクターに導入することによって実施する。
【００２９】
本願明細書において使用する「グリシン代謝に関与する酵素」という用語は、グリシンの分解を触媒及び／又はグリシンから他のアミノ酸への転化を触媒することにより、細胞中におけるグリシンの量を減少させることができる少なくとも１種の酵素を意味する。例えば、グリシンは、二酸化炭素及び／又はアンモニアに分解される場合がある。あるいは、グリシンは、セリン及び／又はトレオニンに転化される場合がある。また、グリシンは、二酸化炭素及び／又はアンモニアへの分解並びにセリン及び／又はトレオニンへの転化によって細胞内において代謝されてもよい。図７は、考えられ得るグリシン代謝経路の概要を示す。具体的には、グリシン代謝に関与する酵素は、グリシン開裂系の少なくとも１種の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ）、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｋｂｌ）及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼ（ＹｄｆＧ）からなる群から選択されてもよい。
【００３０】
本発明の各態様において使用する「グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ」という用語は、以下の化学反応を触媒する酵素を意味する。
【００３１】
【化１】
2017517258.tif 000002
【００３２】
グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．２．１）は、１つの炭素を有する基（ヒドロキシメチル基又はホルミル基）を移動させるトランスフェラーゼ及び関連するトランスフェラーゼを意味する。具体的には、本発明の各態様において使用するＧｌｙＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１で表されるポリペプチド配列又はその変異体を含むことができる。本願明細書においてＧｌｙＡに関連して使用する「変異体」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１と実質的に同一の配列を有するが、従来の方法によって１以上の挿入、欠失、付加及び／又は置換が意図的になされたポリペプチドを意味する。変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１と比較して配列が異なる場合があるが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１と同一の機能を有する。例えば、変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８又は９９％の配列相同性を有する。同様に、本発明の各態様において使用するＬｔａＥは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２で表されるポリペプチド配列又はその変異体を含むことができる。本願明細書においてＬｔａＥに関連して使用する「変異体」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２と実質的に同一の配列を有するが、従来の方法によって１以上の挿入、欠失、付加及び／又は置換が意図的になされたポリペプチドを意味する。変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２と比較して配列が異なる場合があるが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２と同一の機能を有する。具体的には、ＬｔａＥの変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２に対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８又は９９％の配列相同性を有することができる。同様に、本発明の各態様において使用するＴｄｈは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１で表されるポリペプチド配列又はその変異体を含むことができる。本願明細書においてＴｄｈに関連して使用する「変異体」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１と実質的に同一の配列を有するが、従来の方法によって１以上の挿入、欠失、付加及び／又は置換が意図的になされたポリペプチドを意味する。変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１と比較して配列が異なる場合があるが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１と同一の機能を有する。具体的には、Ｔｄｈの変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１に対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８又は９９％の配列相同性を有することができる。本発明の各態様において使用するＫｂｌは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０で表されるポリペプチド配列又はその変異体を含むことができる。本願明細書においてＫｂｌに関連して使用する「変異体」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０と実質的に同一の配列を有するが、従来の方法によって１以上の挿入、欠失、付加及び／又は置換が意図的になされたポリペプチドを意味する。変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０と比較して配列が異なる場合があるが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０と同一の機能を有する。具体的には、Ｋｂｌの変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０に対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８又は９９％の配列相同性を有することが��きる。同様に、本発明の各態様において使用するＹｄｆＧは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２で表されるポリペプチド配列又はその変異体を含むことができる。本願明細書においてＫｂｌに関連して使用する「変異体」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２と実質的に同一の配列を有するが、従来の方法によって１以上の挿入、欠失、付加及び／又は置換が意図的になされたポリペプチドを意味する。変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２と比較して配列が異なる場合があるが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２と同一の機能を有する。具体的には、ＹｄｆＧの変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２に対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８又は９９％の配列相同性を有することができる。
【００３３】
「グリシン開裂系の少なくとも１種の酵素」とは、高濃度のアミノ酸グリシンによってトリガーされる一連の酵素を意味する。グリシン開裂系は、Ｔ−タンパク質（ＧｃｖＴ）、Ｐ−タンパク質（ＧｃｖＰ）、Ｌ−タンパク質（ＧｃｖＬ）及びＨ−タンパク質（ＧｃｖＨ）からなる。Ｈ−タンパク質は、その他の３種類のタンパク質と相互作用し、グリシン脱炭酸におけるいくつかの中間生成物のシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）として作用する。動物及び植物において、グリシン開裂系はミトコンドリアの内膜に軽く付着している。本発明の各態様によれば、これらの酵素のいずれかの発現を減少させることができる。より具体的には、グリシン開裂系のＨ−タンパク質はリポ酸を有し、グリシン開裂系のタンパク質Ｐ、Ｌ及びＴと相互作用する；グリシン開裂系のＰ−タンパク質（ＥＣ  １．４．４．２）は、「グリシン＋［グリシン開裂複合Ｈ−タンパク質］−Ｎ（６）−リポイル−Ｌ−リシン→［グリシン開裂複合Ｈ−タンパク質］−Ｓ−アミノメチル−Ｎ（６）−ジヒドロリポイル−Ｌ−リシン＋ＣＯ２」で表される反応を触媒する；グリシン開裂系のＬ−タンパク質（ＥＣ  １．８．１．４）は、「タンパク質Ｎ６−（ジヒドロリポイル）リシン＋ＮＡＤ＋→タンパク質Ｎ６−（リポイル）リシン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋」で表される反応を触媒する；グリシン開裂系のＴ−タンパク質（ＥＣ２．１．２．１０）は、「［タンパク質］−Ｓ８−アミノメチルジヒドロリポイルリシン＋テトラヒドロ葉酸→［タンパク質］−ジヒドロリポイルリシン＋５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸＋ＮＨ３」で表される反応を触媒する；トレオニンアルドラーゼ（ＥＣ  ４．２．１．４８）は、「Ｌ−トレオニン→グリシン＋アセトアルデヒド」で表される反応を触媒する；セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．２．１）は、「５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸＋グリシン＋Ｈ２Ｏ＋テトラヒドロ葉酸＋Ｌ−セリン」で表される反応を触媒する。
【００３４】
本発明の各態様において使用するグリシン開裂系の酵素は、表１に示す配列及びそれらの変異体から選択されてもよい。本願明細書においてグリシン開裂系の酵素に関連して使用する「変異体」という用語は、表１に示すグリシン開裂系の酵素の少なくとも１種のアミノ酸配列を実質的に有するが、従来の方法によって１以上の挿入、欠失、付加及び／又は置換が意図的になされたポリペプチドを意味する。変異体は、表１に示すグリシン開裂系の酵素のいずれかと比較して配列が異なる場合があるが、表１に示すグリシン開裂系の酵素のいずれかと同一の機能を有する。例えば、変異体は、表１に示すグリシン開裂系の酵素のいずれかに対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列相同性を有する。より具体的には、ＧｃｖＴの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８であってもよい。ＧｃｖＰの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０であってもよい。ＧｃｖＨの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９であってもよい。より具体的には、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ及びＧｃｖＨの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９をそれぞれ含むことができる。本願明細書において、データベースコードは、特記しない限りにおいて、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列、より具体的には２０１４年８月６日のオンラインバージョンを意味し、配列がヌクレオチド配列である場合には、ヌクレオチド配列を翻訳することによって得られたポリペプチド配列を含む。
【００３５】
【表１】
2017517258.tif 000003
【００３６】
【表１−２】
2017517258.tif 000004
【００３７】
【表１−３】
2017517258.tif 000005
【００３８】
【表１−４】
2017517258.tif 000006
【００３９】
【表１−５】
2017517258.tif 000007
【００４０】
【表１−６】
2017517258.tif 000008
【００４１】
【表１−７】
2017517258.tif 000009
【００４２】
【表１−８】
2017517258.tif 000010
【００４３】
【表１−９】
2017517258.tif 000011
【００４４】
【表１−１０】
2017517258.tif 000012
【００４５】
【表１−１１】
2017517258.tif 000013
【００４６】
例えば、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる第２の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、グリシン開裂系の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ）、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｋｂｌ）及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼ（ＹｄｆＧ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異と、を含むことができる。グリシン開裂系の酵素は、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＬ又はＧｃｖＨであってもよい。具体的には、ＧｃｖＴ及びＧｃｖＰ又はＧｃｖＴ及びＧｃｖＨ又はＧｃｖＰ及びＧｃｖＨの発現を減少させる。例えば、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ及びＧｃｖＨの発現を減少させることができる。より具体的には、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ及びＧｃｖＨの配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９であってもよい。ＧｌｙＡの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１であってもよく、ＬｔａＥの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２であってもよく、Ｔｄｈの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１であってもよく、Ｋｂｌの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０であってもよく、ＹｄｆＧの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２であってもよい。
【００４７】
あるいは、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる第２の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及びＬｔａＥ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ａｎｄ  ＧｌｙＡ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ及びＬｔａＥ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及び／又はＬｔａＥ；又はＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及び／又はＬｔａＥ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｌｙＡ及び／又はＬｔａＥ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及びＴｄｈ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ａｎｄ  Ｔｄｈ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及び／又はＴｄｈ；又はＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及び／又はＴｄｈ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｌｙＡ及び／又はＴｄｈ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及びＫｂｌ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ａｎｄ  Ｋｂｌ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及び／又はＫｂｌ；又はＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及び／又はＫｂｌ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｌｙＡ及び／又はＫｂｌ又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及びＹｄｆＧ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ及びＹｄｆＧ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及び／又はＹｄｆＧ；又はＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及び／又はＹｄｆＧ；又はＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｌｙＡ及び／又はＹｄｆＧの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異と、を含むことができる。
【００４８】
例えば、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる第２の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ並びにＬｔａＥ、Ｔｄｈ、Ｋｂｌ及びＹｄｆＧからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異と、を含むことができる。あるいは、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる第２の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、ＧｌｙＡ並びにＬｔａＥ、Ｔｄｈ、Ｋｂｌ及びＹｄｆＧからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異と、を含むことができる。具体的には、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる第２の遺伝子突然変異と、野生型細胞と比較して、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ並びにＬｔａＥ、Ｔｄｈ、Ｋｂｌ及びＹｄｆＧからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異と、を含むことができる。例えば、本発明の各態様に係る細胞は、以下の遺伝子突然変異を含むことができる：
・野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異；
・野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる少なくとも第２の遺伝子突然変異；及び
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ及びＬｔａＥの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ及びＴｄｈの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ及びＫｂｌの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ及びＹｄｆＧの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｌｙ及びＬｔａＥの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｌｙＡ及びＴｄｈの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｌｙＡ及びＫｂｌの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｌｙＡ及びＹｄｆＧの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及びＬｔａＥの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及びＴｄｈの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及びＫｂｌの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ及びＹｄｆＧの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異；又は
・野生型細胞と比較して、少なくともＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ、ＬｔａＥ及びＫｂｌの発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異。
【００４９】
本発明の各態様では、ＧｃｖＬの発現を維持又は減少させることができる。本願明細書において使用する「酵素に関して低い活性を示す」とは、当該酵素に関して低い細胞内活性を示すことを意味する。基本的に、酵素活性は、弱いプロモーターを使用するか、各酵素をブロックして活性を低下させる遺伝子又は対立遺伝子を使用するか、これらの手段を組み合わせることにより、酵素をコードする遺伝子配列のコピー数を増加させることによって低下させることができる。本発明の各態様に使用する遺伝子組み換え細胞は、例えば、遺伝子又はその一部に結合するサイレンサーを含むベクター及び遺伝子のスイッチオフを可能とするベクターを使用した形質転換、形質導入、接合又はこれらの組み合わせによって得ることができる。
【００５０】
本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、細胞の脂肪酸分解能力を低下させるさらなる遺伝子突然変異を含むことができる。具体的には、脂肪酸分解能力の低下は、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現が減少していることによるものであってもよい。
【００５１】
本願明細書において使用する「脂肪酸分解能力を低下させる」という表現は、各細胞が、同一の条件下において、通常の脂肪酸分解能力を有する同等の細胞又は野生型細胞よりも低い割合で、脂肪酸、特に環境中に存在する脂肪酸を分解することを意味する。より具体的には、各細胞の脂肪酸分解能力は、β酸化経路に関与する酵素をコードする少なくとも１種の遺伝子の欠失、阻害又は不活性化によって低下している。例えば、β酸化経路に関与する少なくとも１種の酵素は、同等な条件下での各野生型微生物における同一の酵素と比較して、活性の５、１０、２０、４０、５０、７５、９０又は９９％が失われている。酵素をコードする遺伝子を削除するか、細胞内におけるそのような酵素の活性を減少させるために使用することができる様々な手法が知られており、例えば、細胞を放射線に暴露し、得られた突然変異体を蓄積又はスクリーニングし、点突然変異の部位特異的導入又は活性酵素をコードする染色体性統合遺伝子のノックアウトによって実施することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ／Ｆｒｉｔｓｃｈ／Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）を参照）。また、転写レプレッサーＦａｄＲを過剰発現させ、β酸化経路に関与する酵素の発現を減少させることもできる（Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．，２００７）。
【００５２】
本願明細書において使用する「遺伝子の欠失」とは、遺伝子をコードする核酸配列が、遺伝子によってコードされた活性ポリペプチドの発現が減少するように組み換えられていてもよいことを意味する。例えば、遺伝子は、ポリペプチドの触媒活性中心をコードする配列を含む配列の一部をインフレーム除去することによって欠失させることができる。あるいは、リボソームが対応するＲＮＡを翻訳しないようにリボソーム結合部位が変性されていてもよい。当業者であれば、標準的なアッセイを使用することにより、生細胞によって発現された酵素の活性を測定することができる（例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ（１９９５）（酵素学教科書）を参照）。
【００５３】
脂肪酸は、酵素触媒反応によって分解させることができる。具体的には、脂肪酸を、少なくとも１種の外膜タンパク質及び脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を有する１種の内膜関連タンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉの場合にはＦａｄＬ及びＦａｄＤ／ＦａｄＫ）を介して細胞膜内を移動させる。細胞内では、分解させる脂肪酸は、β酸化経路の他の反応を触媒する酵素と接触する。第１の細胞内工程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｅｐ）では、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉの場合にはＦａｄＥ）によってアシル−ＣｏＡからエノイル−ＣｏＡへの転化が生じる。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性は、公知の方法を使用して評価することができる。例えば、ＮＡＤＨの濃度を分光学的にモニタリングする（３４０ｎｍ、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ：７．４、０．２ｍＭエノイル−ＣｏＡ、０．４ｍＭ  ＮＡＤ＋）。得られたエノイル−ＣｏＡを、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉの場合にはＦａｄＢ及びＦａｄＪ）の触媒による水和及び酸化によって、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを介して３−ケトアシル−ＣｏＡに転化させる。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性（より具体的には、生成物ＮＡＤＨの生成）は、例えば、ＦａｄＥに関連して文献に記載されている方法によって分光学的に評価することができる。最後に、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ内のＦａｄＡ及びＦａｄＩ）の触媒により３−ケトアシル−ＣｏＡを切断してアセチル−ＣｏＡと炭素原子２個分短くなったアシル−ＣｏＡを得る。３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼの活性は、例えば、Ａｎｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ｖ．，１９９７に記載されている方法によって評価することができる。
【００５４】
具体的には、本願明細書における「脂肪酸分解能力が低下している細胞」とは、脂肪酸、特に少なくとも８個の炭素原子を有する脂肪酸を処理及び／又は分解する能力が低下している細胞を意味する。細胞の脂肪酸分解能力は、様々な方法によって低下させることができる。例えば、細胞は、野生型細胞と比較して、β酸化経路に関与する酵素の活性が低い。例えば、本願明細書において使用する「β酸化経路に関与する酵素」という用語は、脂肪酸と直接相互作用するか、β酸化経路による当該脂肪酸の分解によって形成された誘導体と相互作用する酵素を意味し、一連の反応（好ましくは、脂肪酸又はその誘導体を基質として認識し、β酸化経路の一部として形成された代謝産物に転化させる）により、脂肪酸からアセチル−ＣｏＡ及び分子鎖が短くなった脂肪酸のＣｏＡエステルへの転化が生じる。例えば、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、β酸化経路に関与する酵素であり、脂肪酸−ＣｏＡと相互作用して、脂肪酸−ＣｏＡエステルをエノイルＣｏＡ（β酸化の一部として形成された代謝産物）に転化させる。例えば、本願明細書において使用する「β酸化経路に関与する酵素」という用語は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択されるポリペプチドを含む。アシル−ＣｏＡシンテターゼは、脂肪酸から脂肪酸のＣｏＡエステル（分子）への転化を触媒し、（好ましくは、脂肪酸をβ酸化経路に導入するために）カルボキシル基の官能基−ＯＨはＳ−ＣｏＡによって置換される。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのポリペプチドＦａｄＤ及びＦａｄＫ（受託番号：ＢＡＡ１５６０９．１）はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。例えば、本願明細書において使用する「アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、好ましくはβ酸化経路の一部としてアシル−ＣｏＡからエノイル−ＣｏＡへの転化を触媒することができるポリペプチドを意味する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのポリペプチドＦａｄＥ（受託番号：ＢＡＡ７７８９１．２）はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。具体的には、本願明細書において使用する「２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ」という用語は、具体的にはβ酸化経路の一部として、不飽和脂肪酸に由来する２，４−ジエノイル−ＣｏＡからエノイル−ＣｏＡへの転化を触媒することができるポリペプチドを意味する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのポリペプチドＦａｄＨは２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼである。例えば、本願明細書において使用する「エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ」（「３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」ともいう）という用語は、好ましくはβ酸化経路の一部として、水和及び酸化によってエノイル−ＣｏＡから３−ケトアシル−ＣｏＡへの転化を触媒することができるポリペプチドを意味する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのポリペプチドＦａｄＢ及びＦａｄＪ（受託番号：ＢＡＥ７７４５７．１）はエノイル−ＣｏＡヒドラターゼである。具体的には、本願明細書において使用する「ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ」という用語は、β酸化経路の最終工程として、３−ケトアシル−ＣｏＡの切断を触媒して炭素原子２個分短くなったアシル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡとすることができるポリペプチドを意味する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのポリペプチドＦａｄＡ及びＦａｄＩ（受託番号：ＡＰ００９０４８．１）はケトアシル−ＣｏＡチオラーゼである。
【００５５】
例えば、本発明の各態様に係る細胞は、少なくとも１種のアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの活性が増加し、少なくとも１種のアシル−ＣｏＡシンテターゼの活性が増加し、ＦａｄＬ及び／又はＡｌｋＬの少なくとも１種の輸送タンパク質の活性が増加するように遺伝子組み換えされていてもよい。具体的には、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼ及び輸送タンパク質ＦａｄＬ及びＡｌｋＬを過剰発現するように遺伝子組み換えされていてもよい。このような細胞は、アシルグリシネートを生成することができる。あるいは、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−ｃｉｓ−Δ２−ｔｒａｎｓ−エノイルＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ及び電子伝達フラビンタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性を減少させるように遺伝子組み換えされていてもよい。
【００５６】
あるいは、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ及びＦａｄＬ及び／又はＡｌｋＬの少なくとも１種の輸送タンパク質の発現を増加させ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−ｃｉｓ−Δ２−ｔｒａｎｓ−エノイルＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ及び電子伝達フラビンタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性を減少させるように遺伝子組み換えされていてもよい。
【００５７】
具体的には、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ（ＥＣ１．３．８．７、ＥＣ１．３．８．８又はＥＣ１．３．８．９）は、「アシル−ＣｏＡ＋電子伝達フラビンタンパク質＝ｔｒａｎｓ−２，３−デヒドロアシル−ＣｏＡ＋還元電子伝達フラビンタンパク質」で表される反応を触媒し、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ（ＥＣ  ５．１．２．３）、Δ３−ｃｉｓ−Δ２−ｔｒａｎｓ−エノイルＣｏＡイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．３．８）、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ  ４．２．１．１７）及び３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．３５）ＦａｄＢは、「（Ｓ）−３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡ→（Ｒ）−３−ヒドロキシブタノイル−ＣｏＡ，（３Ｚ）−３−エノイル−ＣｏＡ→（２Ｅ）−２−エノイル−ＣｏＡ，（３Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ→ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ，（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤ＋＝３−オキソアシル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋」で表される反応を触媒し、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１６）は、「アシル−ＣｏＡ＋アセチル−ＣｏＡ→ＣｏＡ＋３−オキソアシル−ＣｏＡ」で表される反応を触媒し、電子伝達フラビンタンパク質（ＥＣ１．５．５．１）は、「還元電子伝達フラビンタンパク質＋ユビキノン→電子伝達フラビンタンパク質＋ユビキノール」で表される反応を触媒を触媒することができる。
【００５８】
より具体的には、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼ及び輸送タンパク質ＦａｄＬ及びＡｌｋＬの発現を増加させ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−ｃｉｓ−Δ２−ｔｒａｎｓ−エノイルＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ及び電子伝達フラビンタンパク質の活性を減少させるように遺伝子組み換えされていてもよい。
【００５９】
例えば、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させ、グリシン開裂系のＨ−タンパク質、グリシン開裂系のＰ−タンパク質、グリシン開裂系のＬ−タンパク質、グリシン開裂系のＴ−タンパク質、トレオニンアルドラーゼ、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、トレオニンデヒドロゲナーゼ、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性を減少させるように遺伝子組み換えされていてもよい。
【００６０】
あるいは、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ及びＦａｄＬ及び／又はＡｌｋＬの少なくとも１種の輸送タンパク質の発現を増加させ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−ｃｉｓ−Δ２−ｔｒａｎｓ−エノイルＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ及び電子伝達フラビンタンパク質の活性からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性を減少させるように遺伝子組み換えされていてもよい。
【００６１】
あるいは、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ及びＦａｄＬ及び／又はＡｌｋＬの少なくとも１種の輸送タンパク質の発現を増加させ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−ｃｉｓ−Δ２−ｔｒａｎｓ−エノイルＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ及び電子伝達フラビンタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性を減少させ、グリシン開裂系のＨ−タンパク質、グリシン開裂系のＰ−タンパク質、グリシン開裂系のＬ−タンパク質、グリシン開裂系のＴ−タンパク質、トレオニンアルドラーゼ、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、トレオニンデヒドロゲナーゼ、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の活性を減少させるように遺伝子組み換えされていてもよい。
【００６２】
具体的には、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、グリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼ及び輸送タンパク質ＦａｄＬ及びＡｌｋＬの発現を増加させ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−ｃｉｓ−Δ２−ｔｒａｎｓ−エノイルＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ及び電子伝達フラビンタンパク質の活性を減少させ、グリシン開裂系のＨ−タンパク質、グリシン開裂系のＰ−タンパク質、グリシン開裂系のＬ−タンパク質、グリシン開裂系のＴ−タンパク質、トレオニンアルドラーゼ、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、トレオニンデヒドロゲナーゼ、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼの活性を減少させるように遺伝子組み換えされていてもよい。
【００６３】
より具体的には、グリシン開裂系のＨ−タンパク質はリポ酸を有し、グリシン開裂系のタンパク質Ｐ、Ｌ及びＴと相互作用する；グリシン開裂系のＰ−タンパク質（ＥＣ  １．４．４．２）は、「グリシン＋［グリシン開裂複合Ｈ−タンパク質］−Ｎ（６）−リポイル−Ｌ−リシン→［グリシン開裂複合Ｈ−タンパク質］−Ｓ−アミノメチル−Ｎ（６）−ジヒドロリポイル−Ｌ−リシン＋ＣＯ２」で表される反応を触媒する；グリシン開裂系のＬ−タンパク質（ＥＣ  １．８．１．４）は、「タンパク質Ｎ６−（ジヒドロリポイル）リシン＋ＮＡＤ＋→タンパク質Ｎ６−（リポイル）リシン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋」で表される反応を触媒する；グリシン開裂系のＴ−タンパク質（ＥＣ２．１．２．１０）は、「［タンパク質］−Ｓ８−アミノメチルジヒドロリポイルリシン＋テトラヒドロ葉酸→［タンパク質］−ジヒドロリポイルリシン＋５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸＋ＮＨ３」で表される反応を触媒する；トレオニンアルドラーゼ（ＥＣ  ４．２．１．４８）は、「Ｌ−トレオニン→グリシン＋アセトアルデヒド」で表される反応を触媒する；セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．２．１）は、「５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸＋グリシン＋Ｈ２Ｏ＋テトラヒドロ葉酸＋Ｌ−セリン」で表される反応を触媒する。
【００６４】
アシルアミノ酸に転化される脂肪酸は、本発明の各態様に係る細胞によって生成することができる。例えば、アシルアミノ酸を生成する細胞は、アシルアミノ酸を生成することができる脂肪酸を生成することができる細胞であってもよい。具体的には、細胞は、脂肪酸を生成することができるように遺伝子組み換えされていてもよい。例えば、遺伝子組み換えは、特定の酵素活性を減少させるものであり、遺伝子破壊又は遺伝子組み換えによってなされてもよい。また、遺伝子組み換えは、特定の酵素活性を増加させてもよい。具体的には、遺伝子組み換えは、選択された脂肪酸又は脂肪酸に由来する化学製品の微生物合成を、対照又は野生型細胞よりも高い割合（速度）で増加させてもよい。対照又は野生型細胞は、選択された化学生成物を生成するように遺伝子組み換えされていない。脂肪酸及び／又はタンパク質を構成するアミノ酸を生成することができる細胞は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／００５１１３６号に記載されている。脂肪酸は、不飽和脂肪酸であってもよく、ミリストレイン酸、ラウロレイン酸、パルミトオレイン酸及びｃｉｓ−バクセン酸からなる群から選択されてもよい。あるいは、脂肪酸は、飽和脂肪酸であってもよく、ラウレート、ミリステート及びパルミテートからなる群から選択されてもよい。本発明の各態様に係る脂肪酸は、液体有機溶媒と脂肪酸を含む有機相であってもよく、有機溶媒は脂肪酸のエステルであってもよい。
【００６５】
例えば、本発明の各態様に係る細胞は、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させるように遺伝子組み換えされており、少なくとも１種の炭水化物から少なくとも１種の脂肪酸を生成することができるように遺伝子組み換えされていてもよい。酵素又は酵素活性に関する遺伝子組み換えの例を表２に示す。本発明の各態様に係る細胞は、脂肪酸を生成し、脂肪酸をＮ−アシルアミノ酸に転化させる遺伝子組み換えの組み合わせを含むことができる。具体的には、本発明の各態様に係る細胞は、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させるように遺伝子組み換えされていてもよく、表２に記載されている遺伝子組み換えのうちの任意の遺伝子組み換えを含むことができる。より具体的には、細胞は、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ及び輸送タンパク質ＦａｄＬ及びＡｌｋＬの発現を増加させるように遺伝子組み換えされていてもよく、表２に記載されている遺伝子組み換えのうちの任意の遺伝子組み換えを含むことができる。さらに具体的には、細胞は、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ及び輸送タンパク質ＦａｄＬ及びＡｌｋＬの発現を増加させ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ、多機能性３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡエピメラーゼ、Δ３−ｃｉｓ−Δ２−ｔｒａｎｓ−エノイルＣｏＡイソメラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＢ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ及び電子伝達フラビンタンパク質の活性を減少させ、グリシン開裂系のＨ−タンパク質、グリシン開裂系のＰ−タンパク質、グリシン開裂系のＬ−タンパク質、グリシン開裂系のＴ−タンパク質、トレオニンアルドラーゼ、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、トレオニンデヒドロゲナーゼ、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼの活性を減少させるように遺伝子組み換えされていてもよく、表２に記載されている遺伝子組み換えのうちの任意の遺伝子組み換えを含むことができる。
【００６６】
例えば、ＡｌｋＬは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８に対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、及び／又は、ＦａｄＬは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９に対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００６７】
例えば、本発明の各態様に係る細胞は、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼの発現を増加させ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、３−オキソアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ、エノイル−ＡＣＰレダクターゼ及びβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を減少させるように遺伝子組み換えされていてもよい。具体的には、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアシル−ＣｏＡ／ＡＣＰシンテターゼの発現を増加させ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、３−オキソアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ、エノイル−ＡＣＰレダクターゼ及びβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩの発現を減少させるものであってもよい。
【００６８】
従って、本発明の細胞及び方法は、脂肪酸又は脂肪酸に由来する生成物及び低下した活性を示すマロニル−ＡＣＰ依存脂肪酸シンテターゼ系の酵素をコードする遺伝子組み換えポリヌクレオチドへの生成経路を含む遺伝子組み換え微生物を用意することを含み、マロニル−ＣｏＡの使用により、遺伝子組み換えが行われていない同等の（対照）微生物と比較して生成経路に向かってシフトしていてもよい。方法は、栄養培地を含む容器内においてそのような遺伝子組み換え微生物を使用して化学製品を製造することを含む。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ及び／又はＮＡＤＰＨ依存トランスヒドロゲナーゼ等のその他の酵素に関連する遺伝子組み換えが行われていてもよい。これらの酵素活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコピーを使用することにより、脂肪酸又は脂肪酸に由来する生成物の生成量を増加させることができることが判明している。各酵素活性を増加させるための他の方法も知られており、本発明の様々な例に適用することができる。
【００６９】
また、脂肪酸を生成するための多段階方法の第１の工程では、例えば、培養容器又はバイオリアクター容器等の容器内に栄養培地（当業者に公知の最少培地等）を入れ、遺伝子組み換え微生物（細菌（腸内細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ）等）を播種してもよく、遺伝子組み換え微生物はマロニル−ＣｏＡを脂肪酸に転化させる代謝経路を含む。次に、微生物を容器内で培養し、方法の次の工程を考慮に入れた全体の生産性マトリックスを満たす脂肪酸又は脂肪酸に由来する生成物の生成レベルを達成するために適した細胞密度まで増加させる。別の実施態様では、遺伝子組み換え微生物を第１の容器内において第１の細胞密度まで培養した後、選択された細胞密度となるように前記容器に移してもよい。複数の容器を使用する多くの培養方法が知られている。そのような方法のいずれかを使用して本発明の各態様に係る選択された細胞密度とすることができる。
【００７０】
次の工程では、例えば、２つの方法を使用することができ、これらの方法は各種実施形態において組み合わせて使用することもできる。第１の方法では、エノイル−ＡＣＰレダクターゼ酵素活性を制御するように、遺伝子組み換え微生物を遺伝子組み換えする。例えば、天然のエノイル−ＡＣＰレダクターゼを温度感受性変異エノイル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｆａｂＩＴＳ）で置換するように遺伝子組み換えを行う。温度感受性変異エノイル−ＡＣＰレダクターゼは、３０℃より高い温度で低い酵素活性を示す場合があるが、３０℃では通常の酵素活性を示し、例えば、培養温度を３４℃、３５℃、３６℃、３７℃又は４２℃まで上昇させることにより、エノイル−ＡＣＰレダクターゼの酵素活性を減少させることができる。この場合、３０℃の場合よりも多くのマロニル−ＣｏＡが脂肪酸又は脂肪酸に由来する生成物又はその他の化学的生成物に転化され、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸への転化は、有効性が低いエノイル−ＡＣＰレダクターゼによって阻害されることはない。
【００７１】
本発明の各態様に係る細胞には、脂肪酸及び／又はアミノ酸の生成に有用である可能性のあるその他の遺伝子組み換えを行うこともできる。例えば、スクロースを利用する能力を与え、脂肪酸又は脂肪酸に由来する生成物又はその他の化学的生成物を製造するために使用することができる原料の範囲を広めることができる。研究及び工業において一般的に使用されているＥ．ｃｏｌｉ株（本願明細書に記載する株等）は、スクロースを単一の炭素源として利用することはできない。スクロース及び糖蜜等のスクロース含有原料は豊富に存在し、微生物発酵による製造プロセスにおいて原料として使用される場合が多いため、スクロースの取り込み及び使用を可能とする適切な遺伝子組み換えを、その他の特徴を有する株に対して実施することができる。様々なスクロース取り込み・代謝系が知られている（例えば、米国特許第６，９６０，４５５号を参照）。
【００７２】
また、より複雑な炭素源、例えば、セルロースバイオマス又はその生成物の分解、取り込み及び／又は使用に関する機能を付加する遺伝子組み換えを行うこともできる。例えば、多くのセルラーゼ及びセルラーゼ系セルロース分解系が研究され、特性分析が行われている（Ｂｅｇｕｉｎ，Ｐ  １９９４及びＯｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００７３】
例えば、補因子ＮＡＤＰＨのプール及び利用可能性及び／又はＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比を高める遺伝子組み換えにを行うこともできる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの場合には、遺伝子組み換え等によって、以下の遺伝子の１種以上の活性を高めることができる（ｐｇｉ（突然変異型）、ｐｎｔＡＢ、過剰発現、ｇａｐＡ：ｇａｐＮ置換／置き換え、可溶性トランスヒドロゲナーゼ、例えばｓｔｈＡの破壊又は変性及び／又はｚｗｆ、ｇｎｄ及びｅｄｄの１種以上の遺伝子組み換え）。
【００７４】
このような遺伝子組み換えは、上記機能性を有していないか、上記機能性が所望のレベルよりも低い種に実施することができる。一般的には、遺伝子組み換えのために選択された微生物の特定の代謝経路に応じて、遺伝子組み換えの任意の下位群を実施して、アセテート、アセトイン、アセトン、アクリル、マレート、脂肪酸エチルエステル、イソプレノイド、グリセリン、エチレングリコール、エチレン、ポルピレン、ブチレン、イソブチレン、酢酸エチル、酢酸ビニル、その他のアセテート、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ブチレート、イソブチレート、２−ＯＨ−イソブチレート、３−ＯＨ−ブチレート、エタノール、イソプロパノール、Ｄ−ラクテート、Ｌ−ラクテート、ピルベート、イタコネート、レブリネート、グルカレート、グルタレート、カプロラクタム、アジピン酸、プロパノール、イソプロパノール、フーゼルアルコール、及び１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、ホルメート、フマル酸、プロピオン酸、コハク酸、吉草酸及びマレイン酸からなる群から選択される発酵生成物の細胞内生成を減少させることができる。遺伝子の欠失は本願明細書に記載するように実施してもよく、他の方法を使用して選択された発酵生成物の細胞内生成を所望のレベルまで減少させてもよい。
【００７５】
具体的には、本発明の各態様に係る細胞は、少なくとも以下の遺伝子突然変異を含むことができる：
・野生型細胞と比較して、ヒトアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼであってもよいアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼの発現を増加させる少なくとも第１の遺伝子突然変異；
・野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡシンテターゼの発現を増加させる少なくとも第２の遺伝子突然変異；及び
・野生型細胞と比較して、グリシン開裂系の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ）、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｋｂｌ）及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼ（ＹｄｆＧ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を減少させる少なくとも第３の遺伝子突然変異。
【００７６】
具体的には、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３及び６４に対して、５０、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９７、９８又は９９％の配列相同性を有する。より具体的には、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３及び６４に対して８５％の配列相同性を有する。
【００７７】
【表２】
2017517258.tif 000014
【００７８】
【表２−２】
2017517258.tif 000015
【００７９】
本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、少なくとも１種の輸送タンパク質の発現を増加させる第４の遺伝子突然変異を含むようにさらに遺伝子組み換えされていてもよい。輸送タンパク質は、ＦａｄＬ及びＡｌｋＬであってもよい。例えば、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、ＦａｄＬ又はＡｌｋＬを発現／過剰発現してもよい。あるいは、本発明の各態様に係る細胞は、野生型細胞と比較して、ＦａｄＬ及びＡｌｋＬを発現／過剰発現してもよい。
【００８０】
本願明細書において使用する「細胞」という用語は、細菌、古細菌、菌類、藻類等を含む永久的に単細胞の微生物を意味する。具体的には、本発明の各態様において使用する細胞は、細菌細胞であってもよい。より具体的には、細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａからなる群から選択されてもよい。より具体的には、細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであってもよい。例えば、細胞は、下等真核生物、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＹａｒｒｏｗｉａからなる群から選択される菌類、具体的にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであってもよい。微生物は、単離細胞（単一株の純粋培養物）であってもよく、少なくとも２種類の株の混合物であってもよい。生物工学的に関連する細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）又はＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）から市販されている。細胞を維持及び変性するための粒子は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ／Ｆｒｉｔｓｃｈ／Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）等に記載されている。「野生型と比較して活性が高い又は低い」とは、高い又は低い活性を有するように微生物が遺伝子組み換えされていることを意味する。当業者であれば、細胞における酵素の過剰発現又は外因性酵素の発現を適用することができることを理解されるだろう。
【００８１】
本発明の各態様は、野生型細胞又は遺伝子組み換え細胞を使用して実施することができる。具体的には、本発明の各態様に関連して述べた酵素の少なくとも１種、より具体的には、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシルーＣｏＡシンテターゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、グリシン開裂系の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ）、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｋｂｌ）及び／又はアロトレオニンデヒドロゲナーゼ（ＹｄｆＧ）からなる群から選択される酵素は、遺伝子組み換えされていてもよい。本願明細書において使用する「遺伝子組み換えされている（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」という用語は、天然には存在せず、遺伝子工学によって得られた分子（又はそのような分子でコードされている状態）、例えば、ポリペプチド又は核酸、又は遺伝子組み換え分子を含む細胞を意味する。例えば、核酸分子は、触媒的に活性なポリペプチドをコードする配列に機能的に結合したプロモーターを含み、前記プロモーターが、変性されていない核酸分子を含む対応する野生型細胞におけるポリペプチドのレべルと比較して触媒的に活性なポリペプチドが過剰発現されるように遺伝子組み換えされている場合には、遺伝子組み換えされているといえる。
【００８２】
本発明の各態様において必要な核酸分子、ポリペプチド、より具体的には酵素が遺伝子組み換えされているか否かは、必ずしもその発現レべルに影響を与えるものではない。ただし、本発明の各態様においては、酵素の発現を所望のレベルに増加又は減少させるために、１種以上の遺伝子組み換えされた核酸分子、ポリペプチド又は酵素が必要な場合がある。例えば、本願明細書において使用する「過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」という用語は、コード又は発現対象のポリペプチドが、発現を増加させる遺伝子組み換えが行われていない場合に、同一の条件下において細胞（野生型細胞）において通常見られるレベルよりも高いレベル又は活性で発現することを意味する。過剰発現を生じさせる多くの方法が知られている。例えば、過剰発現させる核酸分子又は過剰発現させるポリペプチド又は酵素をコードする核酸分子をｌａｃプロモータ等の強力な誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。公知の標準的なプラスミド、例えば、ｐＥＴ−３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社から市販）等のベクターのｐＥＴシステムを使用することができる。核酸又はポリペプチドが過剰発現しているか否かは、核酸分子の場合には定量的ＰＣＲ反応によって判定することができ、ポリペプチドの場合にはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動、ウェスタンブロッティング又は比較活性アッセイによって判定することができる。遺伝子組み換えは、酵素活性及び／又は選択された及び／又は特定の培養条件における選択性を変化させる転写、翻訳及び／又は翻訳後遺伝子組み換えであってもよい。従って、本発明の様々な例において、微生物は、より効率的に機能するように１以上の遺伝子欠失を含むことができる。遺伝子は、突然変異的遺伝子欠失法及び／又は酵素の１種以上の発現が減少しているか、酵素の１種以上を発現しない突然変異株の使用及び／又は当業者に公知のその他の方法によって欠失させることができる。
【００８３】
例えば、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ、グリシン開裂系の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ）、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｋｂｌ）及びアロトレオニンデヒドロゲナーゼ（ＹｄｆＧ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素又はこれらの酵素の全ては、単離酵素（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ）であってもよい。本発明の各態様に係る酵素は、活性状態において、全ての補助因子、基質、補助及び／又は活性化ポリペプチド又は活性に不可欠の因子の存在下で使用することができる。本願明細書において、「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、対象となる酵素が、当該酵素が天然に生じる細胞と比較して濃縮されていることを意味する。酵素が濃縮されているか否かは、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動及び／又は活性アッセイによって判定することができる。例えば、ポリアクリルアミドゲルの目視検査及びクマシーブルー染料による染色によって判定した場合に、対象となる酵素は、調製物中に存在する全てのポリペプチドの５、１０、２０、５０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％超を構成していてもよい。
【００８４】
アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアシルーＣｏＡシンテターゼの発現が増加し、グリシン開裂系の酵素、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、トレオニンアルドラーゼ（ＬｔａＥ）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（Ｔｄｈ）、２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼ（Ｋｂｌ）及び／又はアロトレオニンデヒドロゲナーゼ（ＹｄｆＧ）からなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現が減少し、必要に応じて脂肪酸分解能力が低下している本発明の各態様に係る細胞は、タンパク質を構成するアミノ酸及び／又は脂肪酸を生成することができる細胞であってもよい。例えば、本願明細書において使用する「タンパク質を構成するアミノ酸」という用語は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群から選択されるアミノ酸を意味する。タンパク質を構成するアミノ酸及び脂肪酸は、例えば、Ｊｅｒｅｍｙ  Ｍ  Ｂｅｒｇ，２００２（生物化学教科書）で詳細に記載されている酵素を使用し、多くの野生型細胞の一次代謝の一部として合成される。
【００８５】
例えば、本発明の各態様に係る細胞は、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼを発現する。具体的には、本願明細書において使用する「アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ」という用語は、アシル−ＣｏＡを加水分解することができる酵素を意味する。例えば、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＡＥＭ７２５２１．１及びＡＡＣ４９１８０．１又はその変異体からなる群から選択される配列を含む。具体的には、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む。アシル−ＣｏＡチオエステラーゼの活性は、公知の方法を使用して評価することができる。簡単に説明すると、４１２ｎｍにおける吸光度を分光学的にモニタリングすることにより、アシル−ＣｏＡの加水分解時に形成されるＣｏＡＳＨに関連する遊離チオール基と反応するエルマン試薬の反応を検出することができる。
【００８６】
本発明の別の態様は、アシルアミノ酸の製造方法であって、本発明の各態様に係る細胞の少なくとも１種の存在下において、アミノ酸と脂肪酸及び／又はそのアシル−ＣｏＡを接触させることを含むことを特徴とする方法を提供する。アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼは、単離酵素及び／又はアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼがヒトアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼであってもよい遺伝子組み換え酵素であってもよく、具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４又はその変異体であってもよく、アシル−ＣｏＡシンテターゼは、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５又はその変異体であってもよく、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ及びＧｃｖＨは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９であってもよく、ＧｌｙＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１であってもよく、ＬｔａＥは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２であってもよく、本発明の各態様に係る細胞の培養によるものであってもよい。
【００８７】
本発明の各態様に係る方法は、アシル−ＣｏＡシンテターゼを使用して脂肪酸をアシル−ＣｏＡに転化させ、アシル−ＣｏＡを単離及び／又は遺伝子組み換えする工程及び／又は水素化工程をさらに含むことができる。
【００８８】
本発明の各態様に係る全ての酵素、具体的には、アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＨ、ＧｌｙＡ、ＬｔａＥ、Ｔｄｈ、Ｋｂｌ及びＹｄｆＧからなる群から選択される酵素は、当該酵素を発現する細胞として用意することができる。
【００８９】
本願明細書において使用する「接触」という用語は、アミノ酸と、アシル−ＣｏＡと、本発明の各態様に係る細胞とを直接的に接触させることを意味する。例えば、アミノ酸と、アシル−ＣｏＡと、本発明の各態様に係る細胞とを水溶液中で接触させる。例えば、細胞、アミノ酸及びアシル−ＣｏＡは、無機膜等の障壁によって分離された異なる区画内に存在しなくともよい。アミノ酸又は脂肪酸が可溶性であり、細胞に取り込まれるか、生体膜を通過して拡散することができる場合には、水溶液中に含まれる本発明の各態様に係る細胞に単純に添加することができる。アミノ酸又は脂肪酸の可溶性が不十分な場合には、水溶液に添加する前に、適当な有機溶媒に溶解させることができる。適当な有機及び／又は極性溶媒を添加することにより、可溶性が不十分なアミノ酸又は脂肪酸の水溶液を調製することができる。溶媒は、液体有機溶媒を含む有機相として使用することができる。例えば、有機溶媒又は相は、２５℃及び標準気圧において液体である場合に液体であるとみなすことができる。あるいは、脂肪酸は、メチル又はエチルエステル等の脂肪酸エステルとして使用することができる。例えば、脂肪酸ラウレートを、欧州特許出願公開第１１１９１５２０．３号に記載されているように、ラウリン酸メチルエステルに溶解させることができる。本発明の各態様では、化合物と触媒は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（濃縮又は精製された状態で）接触させてもよく、ｉｎ  ｓｉｔｕで接触させてもよい（細胞の代謝の一部とし、細胞内で反応させてもよい）。
【００９０】
「水溶液」という用語は、水を含む溶液、具体的には、溶媒として水を主に含む溶液であって、本発明の各態様に係る細胞を、少なくとも一時的に、代謝的に活性及び／又は生存可能な状態に維持するために使用することができ、必要に応じてさらなる基質を含む溶液を含む。本発明の各態様に係る細胞を維持するために使用することができる多くの水溶液（培地）（Ｅ．ｃｏｌｉの場合にはＬＢ培地）を調製する方法は公知である。水溶液としては、望ましくない副生成物による生成物の汚染を防止するために、複合培地ではなく、最少培地（細胞を代謝的に活性及び／又は生存可能な状態に維持するために必須な最小の塩及び栄養分のみを含む合理的に単純な組成の培地）を使用することが有利である。例えば、Ｍ９培地を最少培地として使用することができる。
【００９１】
本発明の各態様に係る細胞及び方法は、飽和脂肪酸のみを使用するのではなく、不飽和脂肪酸もアシルアミノ酸に転化させることが有利である。最終生成物が、本発明の各態様に係る方法の開始時と比較して大量の飽和アシル残基を含む場合には、アシルアミノ酸のアシル残基を水素化することができる。水素化は、公知の方法（例えば、米国特許第５，７３４，０７０号に記載の方法）を使用して実施することができる。簡単に説明すると、水素化対象の化合物を、水素及び適当な触媒（ニッケル触媒等、担体：酸化ケイ素）の存在下において１００℃で培養することができる。
【００９２】
本発明の別の態様は、単離及び／又は組み換えされていてもよいアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、単離及び／又は組み換えされていてもよいアシル−ＣｏＡシンテターゼ、アミノ酸及び／又はアシル−ＣｏＡ又は脂肪酸及びアシル−ＣｏＡシンテターゼを含む反応混合物であって、
前記アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼは、ヒトアミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５又はその変異体であってもよく、
前記アシル−ＣｏＡシンテターゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はその変異体であってもよく、
前記ＧｃｖＴ、ＧｃｖＰ及びＧｃｖＨは、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９又はその変異体であってもよく、
前記ＧｌｙＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１であってもよく、
前記ＬｔａＥは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２であってもよく、
前記Ｔｄｈは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１であってもよく、
前記Ｋｂｌは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０であってもよく、
前記ＹｄｆＧは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２であってもよい反応混合物を提供する。
【００９３】
本発明の別の態様は、炭素原子数が８〜１６の飽和アシル及びグリシンからなる第１のアシルアミノ酸と、炭素原子数が１０〜１８の不飽和アシル及びグリシンからなる第２のアシルアミノ酸と、必要に応じて、炭素原子数が１２の飽和又は不飽和アシル及びグルタミン、グルタミン酸、アラニン及びアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸からなる任意の第３のアシルアミノ酸と、を含む組成物を提供する。
【００９４】
本発明の各態様に係る組成物は、炭素原子数が１２の飽和アシル（具体的にはラウリル）及びグリシンを含む第１のアシルアミノ酸を含むことができる。第２のアシルアミノ酸は、炭素原子数が１２又は１４の不飽和アシル及びグリシンを含むことができる。具体的には、アシルアミノ酸はアミノ酸の混合物であってもよい。アミノ酸の混合物は、少なくとも２種類のタンパク質を構成するアミノ酸を含むことができる。具体的には、アミノ酸の混合物は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１種類のタンパク質を構成するアミノ酸を含むことができる。例えば、アミノ酸の混合物は、ココイルグリシン及びその塩を生成するために使用することができる。
【００９５】
本発明の各態様に従って製造されるアシルアミノ酸の組成（アシルアミノ酸に導入される脂肪酸の長さ）は、１種以上の特定のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼを細胞に導入するか、細胞が内因的に発現する１種以上のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼの発現を調節することによって制御することができる。
【００９６】
以下、添付図面及び本発明を限定するものではない実施例を参照して、本発明の実施形態、態様及び利点について詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］の発酵から４８時間経過後に得たサンプルのトータルイオンクロマトグラムを示すグラフである。
【図２】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］の発酵から４８時間経過後に得たサンプルのトータルイオンクロマトグラムを示すグラフである。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（陰性対照）の発酵から４８時間経過後に得たサンプルのトータルイオンクロマトグラムを示すグラフである。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］によるラウロイルグリシネートの生成を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］によるラウロイルグリシネートの生成を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例１８において試験を行った各微生物におけるＧＬＹＡＴ２の配列相同性を示すツリーである。
【図７】図７は、グリシンの代謝経路を示す。
【実施例】
【００９８】
好適な実施形態について説明したが、好適な実施形態には、請求項の範囲から逸脱することなく、設計、構成又は操作に関して様々な変更又は変形を行うことができる。これらの変更又は変形も請求項の範囲に含まれる。
【００９９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：
本願明細書では、配列番号には「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：」を使用する。配列番号を表３に示す。
【０１００】
【表３】
2017517258.tif 000016
【０１０１】
実施例１
Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ遺伝子ｓｙｎＵｃＴＥの発現ベクターの作製
Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのアシル−ＣｏＡチオエステラーゼをコードするＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｓｙｎＵｃＴＥ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の発現ベクターを作製するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ内における発現のために遺伝子をコドン最適化した。遺伝子をｔａｃプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と共に合成すると共に、プロモーターの上流に１つの切断部位を導入し、ターミネーターの下流に１つの切断部位を導入した。合成したＤＮＡフラグメントＰｔａｃ  ｓｙｎＵｃＴＥを制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化させ、ライゲーションを行って対応する切断ベクターｐＪ２９４（ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．、（米国カリフォルニア州メンローパーク））を得た。得られた大腸菌発現ベクターを「ｐＪ２９４［Ｐｔａｃ−ｓｙｎＵｃＴＥ］」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）と呼ぶ。
【０１０２】
実施例２
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤとヒト遺伝子ｈＧＬＹＡＴ３又はｈＧＬＹＡＴ２の共発現のためのベクターの作製
ヒトグリシンＮ−アシル転位酵素をコードするヒト遺伝子ｈＧＬＹＡＴ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）又はｈＧＹＬＡＴ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と、Ｅ．ｃｏｌｉアシル−ＣｏＡシンテターゼをコードするＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の共発現のためのベクターを作製するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ内における発現のために遺伝子ｈＧＬＹＡＴ２及びｈＧＬＹＡＴ３をコドン最適化及び合成した。合成したＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｃＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩで消化させ、ライゲーションを行って対応する切断ｐＣＤＦ［ａｔｆＡ１＿Ａｂ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（ａｆｔＡ１遺伝子を削除）を得た。この処理によって除去した配列セグメントを遺伝子合成時に共合成した。ベクターとしては、合成ｔａｃプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ遺伝子を含むｐＣＤＦ誘導体を使用した。得られた発現ベクターを「ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び「ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）と呼ぶ。
【０１０３】
実施例３
ヒトｈＧＬＹＡＴ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ａｌｋＬ遺伝子の共発現のためのベクターの作製
ｈＧＬＹＡＴ遺伝子とＡｌｋＬ（細胞内への疎水性基質の導入を促進する外膜タンパク質）をコードする組み換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ａｌｋＬ遺伝子の共発現のためのベクターを作製するために、配列特異的オリゴヌクレオチドにより、ａｌｋＬ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を、プラスミドｐＣＤＦ［ａｌｋＬｍｏｄ１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）に由来するｌａｃｕｖ５プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）と共に増幅した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｓｉＩで切断し、ライゲーションを行って対応する切断ベクターｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を得た。切断解析によって標的遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、導入遺伝子の信頼性（ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ）はＤＮＡシークエンシングによって確認した。得られた発現ベクターを「ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）と呼ぶ。
【０１０４】
ＰＣＲに使用したパラメータは、１×：初期変性、９８℃、３：００分；３５×変性、９８℃、０：１０分；アニーリング、６５℃、０：２０分；伸長、７２℃、０：１７分；１×：最終伸長、７２℃、１０分である。増幅は、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（フランクフルト）製）をマニュアルに従って使用して行った。１％ＴＡＥアガロースゲル上で５０μＬのＰＣＲ反応生成物を分析した。ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡの臭化エチジウム染色及びＰＣＲフラグメントのサイズの測定は公知の方法に従って行った。
【０１０５】
実施例４
Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｓｙｎＵｃＴＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ及びヒトｈＧＬＹＡＴ２及びｈＧＬＹＡＴ３遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株（ｆａｄＥ遺伝子が欠失）の作製
Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｓｙｎＵｃＴＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ及びヒトｈＧＬＹＡＴ２又はｈＧＬＹＡＴ３遺伝子を共発現するＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ株を、エレクトロポレーションにより、プラスミドｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］及びｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］又はｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］によって形質転換し、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れた。プラスミド調製及び制限解析によって形質転換体を調べ、適切なプラスミドが存在することを確認した。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］及びＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］を作製した。
【０１０６】
実施例５
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ及びヒトｈＧＬＹＡＴ２及びｈＧＬＹＡＴ３遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株（ｆａｄＥ遺伝子が欠失）の作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ遺伝子及びヒトｈＧＬＹＡＴ２及びｈＧＬＹＡＴ３遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株を作製するために、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥのエレクトロコンピテントセルを作製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥをプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］を使用して形質転換し、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れた。プラスミド調製及び制限解析によって形質転換体を調べ、適切なプラスミドが存在することを確認した。得られた株を「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］」と呼ぶ。
【０１０７】
実施例６
ｓｙｎＵｃＴＥ及びｆａｄＤ遺伝子及びヒトｈＧＬＹＡＴ２又はｈＧＬＹＡＴ３遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株（ｆａｄＥ遺伝子が欠失）による脂肪酸／アミノ酸付加体の生成
実施例４で作製した株が脂肪酸／アミノ酸付加体を生成する能力について調べた。株（−８０℃のグリセリン培養物）を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れ、３７℃で一晩培養した。次に、株（シングルコロニー）を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地（「Ｍｉｌｌｅｒ」、（Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ・ダルムシュタット）製）内で培養し、５ｍＬの前培養物を得た。細胞をＭ９培地内においてさらに培養した。３８ｍＭリン酸水素二ナトリウム二水和物、２２ｍＭリン酸二水素カリウム、８．６ｍＭ塩化ナトリウム、３７ｍＭ塩化アンモニウム、２％（ｗ／ｖ）グルコース、２ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物（以上、Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ・ダルムシュタット）製）及び０．１％（ｖ／ｖ）微量元素溶液からなる培地のｐＨを２５％水酸化アンモニウム溶液で７．４に調節した。微量元素溶液は、９．７ｍ塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、６．５ｍＭ硫酸亜鉛七水和物、２．５ｍＭナトリウム−ＥＤＴＡ（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ  ＩＩＩ）、４．９ｍＭホウ酸、１ｍＭモリブデン酸ナトリウム二水和物、３２ｍＭ塩化カルシウム二水和物、６４Ｍ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物及び０．９ｍＭ塩化銅（ＩＩ）二水和物（１Ｍ塩酸に溶解）（以上、Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ・ダルムシュタット）製）からなり、Ｍ９培地に添加する前にフィルターで殺菌処理した。スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した２０ｍＬのＭ９培地をバッフル付きの三角フラスコ（１００ｍＬ）に入れ、０．５ｍＬの前培養物を播種した。振盪培養器内において、３７℃、２００ｒｐｍで培養を行った。８時間後、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した５０ｍＬのＭ９培地をバッフル付きの三角フラスコ（２５０ｍＬ）に入れ、１０ｍＬの培養物を播種して光学濃度（６００ｎｍ）を０．２とした。振盪培養器内において、３７℃、２００ｒｐｍで培養を行った。光学濃度（６００ｎｍ）が０．７〜０．８となった時に、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘発した。その後、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間にわたってさらに培養を行った。遺伝子発現を誘発する際に、１ｇ／Ｌのグリシンを培養物に添加した。培養時にサンプルを採取し、サンプルに含まれる脂肪酸／アミノ酸付加体を分析した。結果を図１及び図２に示す。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］及びＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］は、グルコースから脂肪酸／アミノ酸付加体（ラウロイル−グルタミン酸等）を生成することができることが分かった。一方、プラスミドを有していない細胞（陰性対照）はそのような付加体を生成しなかった（図３）。わずかな配列の変化、例えば、ｈＧＬＹＡＴ３とｈＧＬＹＡＴ２を区別するアミノ酸置換は、脂肪酸／アシルアミノ酸付加���を生成する細胞の能力に影響を与えるものではないと思われる。
【０１０８】
【表４】
2017517258.tif 000017
【０１０９】
実施例７
ＨＰＬＣ／ＭＳによる生成物のクロマトグラフィー定量化
ＨＰＬＣ  ＥＳＩ／ＭＳにより、Ｎ−ラウロイルグリシン、Ｎ−ミリストイルグリシン及びＮ−パルミトイルグリシンの定量化並びに発酵サンプル中のその他のアシルアミノ酸の検出を行った。定量化は、外部較正（約０．１〜５０ｍｇ／Ｌ）を使用し、「ｓｉｎｇｌｅ  ｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ」（ＳＩＭ）モードにおいて３つのターゲット化合物について行った。質量範囲ｍ／ｚ＝１００〜１０００においてスキャンを行ってその他のアシルアミノ酸を特定した。
【０１１０】
脂肪酸グリシネートの測定のためのサンプルは以下のようにして用意した。ピペットを使用し、８００μＬの溶媒（アセトン）と２００μＬのサンプルを反応容器（２ｍＬ）に入れた。混合物をＲｅｔｓｃｈミルを使用して３０Ｈｚで１分間振盪した後、約１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。ピペットを使用して透明な上清を除去した後、希釈剤（８０％アセトニトリル／２０％水＋０．１％ギ酸）で希釈を行い、分析した。較正標準も同様に溶解及び希釈した。
【０１１１】
以下の装置を使用した。
・Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国マサチューセッツ州ウォルサム）製）（ＭＳポンプ、Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ  Ｐｌｕｓ及びＰＤＡ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｐｌｕｓからなるシステム）
・質量分析計ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ（ＨＥＳＩ  ＩＩ  ｓｏｕｒｃｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国マサチューセッツ州ウォルサム）製）
・ＨＰＬＣカラム：１００×２ｍｍ  Ｐｕｒｓｕｉｔ  ＸＲＳ  Ｕｌｔｒａ  Ｃ８；２．８μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社（米国カリフォルニア州サンタクララ）製）
化学物質：
・水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅシステムを使用）
・ＨＰＬＣ用アセトニトリル（Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ・ダルムシュタット）製）
・ギ酸（ｐ．ａ．グレード）（Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ・ダルムシュタット）製）
・ｎ−プロパノール「Ｌｉｃｈｒｏｓｏｌｖ」（Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ・ダルムシュタット）製）
・Ｎ−ラウロイルグリシン（９９％）（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（米国イリノイ州ウッドデール）製）
・Ｎ−ミリストイルグリシン（＞９８％）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国テキサス州）製）
・Ｎ−パルミトイルグリシン（＞９９％）（製造元は不明）
【０１１２】
ＨＰＬＣ分離は、上記ＨＰＬＣカラムを使用して行った。注入量は２μＬ、カラム温度は４０℃、流量は０．３ｍＬ／ｍｉｎとした。移動相としては、溶離液Ａ（０．１％（ｖ／ｖ）含水ギ酸）及び溶離液Ｂ（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む７５％アセトニトリル／２５％ｎ−プロパノール（ｖ／ｖ））を使用した。以下の勾配プロファイルを使用した。
【０１１３】
【表５】
2017517258.tif 000018
【０１１４】
ＨＰＬＣ／ＭＳ分析は、ポジティブイオンモードで行った。ＥＳＩ源のパラメータを以下に示す。
スプレー電圧：３５００Ｖ
気化器温度：５０℃
シースガス圧：４０
補助ガス圧：１０
キャピラリー温度：２５０℃
スプレイヤー間隔：Ｒｉｎｇ  Ｃ
【０１１５】
３種類の分析物の検出及び定量化は、「ｓｉｎｇｌｅ  ｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ」（ＳＩＭ）モードにおいて行った。使用したパラメータを表６に示す。
【０１１６】
【表６】
2017517258.tif 000019
【０１１７】
実施例８
パラレル発酵システム（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）におけるｓｙｎＵｃＴＥ及びｆａｄＤ遺伝子及びヒトｈＧＬＹＡＴ２又はｈＧＬＹＡＴ３遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株（ｆａｄＥ遺伝子が欠失）による脂肪酸／アミノ酸付加体の生成
実施例４で作製した株がグルコースから脂肪酸／アミノ酸付加体を生成する能力について調べた。株は、振盪フラスコ内及び流加培養発酵によって培養した。発酵は、８個のバイオリアクターを備えたＤＡＳＧＩＰパラレル発酵システムにおいて実施した。
【０１１８】
生成用細胞は、実施例６に記載するようにして用意した。
【０１１９】
発酵は、オーバーヘッド撹拌器及び撹拌翼を備えた１ｌ反応器を使用して行った。プロセスをモニタリングするために、ｐＨ及びｐＯ２をオンラインで測定した。ＯＴＲ／ＣＴＲ測定により、代謝活性及び細胞適応度（ｃｅｌｌ  ｆｉｔｎｅｓｓ）を推定した。
【０１２０】
ｐＨ電極は、ＤＡＳＧＩＰの技術指示に従って、ｐＨ４．０及びｐＨ７．０の標準溶液を使用した２点較正によって較正した。反応器には、技術指示に従って必要なセンサーと接続部を取り付けた後、撹拌器の軸を取り付けた。次に、３００ｍＬの水を反応器に入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理を行って無菌状態とした。ｐＯ２電極を計測用増幅器に接続し、一晩（少なくとも６時間）にわたって分極させた。次に、クリーンベンチ下で水を除去し、Ｍ９培地（ｐＨ：７．４）（ＫＨ２ＰＯ４（３．０ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（６．７９ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（２．０ｇ／Ｌ））、２ｍＬの無菌１Ｍ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ溶液、１ｍＬ／Ｌのフィルター滅菌微量元素溶液（ＨＣｌ（３７％）（３６．５０ｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ（１．９１ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（１．８７ｇ／Ｌ）、エチレンジアミン四酢酸二水和物（０．８４ｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．３０ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ（０．２５ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ（４．７０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（１７．８０ｇ／Ｌ）、ＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏ（０．１５ｇ／Ｌ））、１５ｇ／Ｌのグルコース（炭素源）（３０ｍＬ／Ｌの無菌原料溶液（５００ｇ／Ｌのグルコース、１．３％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）で計量）、１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン及び３ｍＬ／ＬのＤＯＷ１５００を反応器に入れた。
【０１２１】
次に、ｐＯ２電極を１点較正によって１００％に較正し（撹拌器：４００ｒｐｍ／通気：１０ｓｌ／ｈ空気）、原料、補正及び誘導ラインを技術指示に従って「ｃｌｅａｎｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｃｅ」によってクリーニングした。チューブは、７０％エタノール、１Ｍ  ＮａＯＨ及び無菌完全脱ミネラル水で順次洗浄した後、各培地を充填した。
【０１２２】
実施例４のＥ．ｃｏｌｉ株を使用し、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢ寒天培地において凍結培養物で希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｅａｋ）した後、３７℃で約１６時間培養を行った。次に、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢ培地（１０ｍＬ、１００ｍＬのバッフル付きフラスコ内）にシングルコロニーを播種し、培養物を３７℃、２００ｒｐｍで約１６時間成長させた。次に、得られた培養物を第２の前培養物段階に使用した（初期ＯＤ：０．２）。５０ｍＬのＭ９培地（ＫＨ２ＰＯ４（３．０ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（６．７９ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（２．０ｇ／Ｌ））、２ｍＬの無菌１Ｍ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ溶液、１ｍＬ／Ｌのフィルター滅菌微量元素溶液（ＨＣｌ（３７％）（３６．５０ｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ（１．９１ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（１．８７ｇ／Ｌ）、エチレンジアミン四酢酸二水和物（０．８４ｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．３０ｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ（０．２５ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ（４．７０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（１７．８０ｇ／Ｌ）、ＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏ（０．１５ｇ／Ｌ））、２０ｇ／Ｌのグルコース（炭素源）（４０ｍＬ／Ｌの無菌原料溶液（５００ｇ／Ｌのグルコース）で計量）及び上記抗生物質を５００ｍＬのバッフル付きフラスコに入れ、３７℃／２００ｒｐｍで８〜１２時間培養を行った。
【０１２３】
反応器に０．１の光学濃度で播種するために、第２の前培養物段階のＯＤ６００を測定し、播種に必要な培養物の量は算出した。必要な量の培養物を、５ｍＬの注射器を使用し、セプタムを介して加熱・通気した反応器に入れた。
【０１２４】
表７ａ〜表７ｃに示す標準プログラムを使用した。
【０１２５】
【表７ａ】
2017517258.tif 000020
【０１２６】
【表７ｂ】
2017517258.tif 000021
【０１２７】
【表７ｃ】
2017517258.tif 000022
【０１２８】
１２．５％アンモニア溶液を使用してｐＨを７．０に調節した。増殖及び生体内変換時には、撹拌器の速度及び通気速度を調節して培養物中の溶存酸素（ｐＯ２又はＤＯ）は少なくとも３０％に調節した。播種後、ＤＯは１００％から３０％に低下し、発酵中は安定して３０％に保たれた。
【０１２９】
発酵は流加培養によって実施し、供給段階では、５ｇ／Ｌ＊ｈのグルコース原料（５００ｇ／Ｌのグルコース、１．３％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）を供給した（流加段階の終了を示すＤＯピークによってトリガー）。供給開始後、温度を３７℃から３０℃に低下させた。供給開始から２時間後、１ｍＭ  ＩＰＴＧによって発現を誘発した。
【０１３０】
ラウロイル、ミリストイル及びパルミトイルグリシネートの定量を行うために、発酵の開始から４７時間及び６４時間経過後にサンプルを採取した。サンプルを分析用に調製し、実施例７と同様にして分析した。
【０１３１】
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＪ２９４｛Ｐｔａｃ｝［ｓｙｎＵｃＴＥ］／ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］は、グルコースからラウロイルグリシネートを生成することができることが分かった。
【０１３２】
【表８】
2017517258.tif 000023
【０１３３】
【表９】
2017517258.tif 000024
【０１３４】
実施例９
実施例５で作製した株を流加培養発酵によって発酵させ、ラウリン酸とグリシンを結合させてラウロイルグリシネートを生成する能力について調べた。発酵は、８個のバイオリアクターを備えたＤＡＳＧＩＰパラレル発酵システムにおいて実施した。
【０１３５】
実験条件は、グルコースの代わりに、脱イオン水に添加した１００ｇ／Ｌのグリシン及びラウリン酸メチルエステルに添加した１００ｇ／Ｌのラウレートを使用した以外は実施例８と同様である。発酵サンプル中のラウロイル、ミリストイル及びパルミトイルグリシネートの定量を行うために、発酵の開始から２３時間及び４２時間経過後にサンプルを採取した。サンプルを分析用に調製し、実施例７と同様にして分析した。結果を表１０及び表１１に示す。
【０１３６】
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）＿ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｖｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］は、ラウリン酸とグリシンを結合させてラウロイルグリシネートを生成することができることが分かった。
【０１３７】
【表１０】
2017517258.tif 000025
【０１３８】
【表１１】
2017517258.tif 000026
【０１３９】
実施例１０
マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡを介して脂肪酸を生成するＥ．ｃｏｌｉ株におけるヒトｈＧＬＹＡＴ３及びｈＧＬＹＡＴ２遺伝子の発現のためのベクターの作製
表３（国際公開第２０１４／０２６１６２Ａ１号の表３．２に対応）に記載する脂肪酸生成株におけるヒトｈＧＬＹＡＴ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）又はｈＧＹＬＡＴ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）遺伝子の発現のためのベクターを作製するために、ｈＧＬＹＡＴ２及びｈＧＹＬＡＴ３遺伝子を増幅した。ｈＧＬＹＡＴ２遺伝子は、プラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）から増幅し、ｈＧＹＬＡＴ３遺伝子は、プラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）から増幅した（配列特異的オリゴヌクレオチドを使用）。ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｃＩで切断し、ライゲーションを行って対応する切断ベクターｐＥＴ−２８ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を得た。切断解析によって標的遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、導入遺伝子の信頼性はＤＮＡシークエンシングによって確認した。得られた発現ベクターを「ｐＥＴ−２８ｂ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）］」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）及び「ｐＥＴ−２８ｂ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）］」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）と呼ぶ。
【０１４０】
実施例１１
振盪フラスコ実験における、ｈＧＬＹＡＴ２又はｈＧＬＹＡＴ３を過剰発現する株によるマロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡを介した脂肪酸アミノ酸付加体の生成
公知の形質転換法を使用して表１２に示す微生物株（ＯＰＸ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国））を作製するために実施例６で作製したベクターを使用した。具体的には、国際公開第２０１４／０２６１６２Ａ１号のセクションＩＶに記載されている方法を使用した。
【０１４１】
公知の形質転換法を使用して表１２に示す微生物株（ＯＰＸ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）製）を作製するために実施例６で作製したベクターを使用した。得られた株を使用してグルコースから脂肪酸（具体的にはアミノ酸付加体）を生成する能力について調べた。株をベクターｐＥＴ−２８ｂ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）及びｐＥＴ−２８ｂ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ３（ｃｏ＿Ｅｃ）］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）によって形質転換し、振盪フラスコ内で培養した（国際公開第２０１４／０２６１６２Ａ１号のセクションＩＶのサブセクションＣを参照）。空のベクターｐＥＴ−２８ｂを有する株ＢＸＦ＿０３１（ＯＰＸ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）製）を対照として使用した。
【０１４２】
トリプリケートで評価を行った。簡単に説明すると、適切な抗生物質を含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（５０ｍＬ）内でスターター培養物を調製し、２２５ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で１６〜２４時間培養した。各株の培養物（１５０ｍＬ）をＳＭ１１最少培地にＯＤ６００が０．８となるように播種した（５％ＴＢ培養物キャリーオーバー及び抗生物質）。１Ｌ  ＳＭ１１培地は、２ｍＬのＦＭ１０微量ミネラル原料、２．２６ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４、３０ｇのグルコース、２００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ：７．４）、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、１．２５ｍＬのＶＭ１ビタミン混合物、０．３２９ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．１７３ｇのＫＨ２ＰＯ４、３ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び０．１５ｇのクエン酸（無水物）からなり、ＦＭ１０微量ミネラル原料は、１ｍＬの濃塩酸、４．９ｇのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．９７ｇのＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ、０．０４ｇのＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．２７ｇのＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＺｎＣｌ２、０．０２４ｇのＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．００７ｇのＨ３ＢＯ３、０．０３６ｇのＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、Ｑ．Ｓ．及び脱イオン水（１００ｍＬに調節）からなり、ＶＭ１ビタミン混合物は、５ｇのチアミン、５．４ｇのパントテン酸、６．０ｇのナイアシン、０．０６ｇのＱ．Ｓ．及び脱イオン水（１０００ｍＬに調節）からなる  実施例１１に使用した培地の成分は、国際公開第２０１４／０２６１６２Ａ１号のセクションＩＶのサブセクションＡに記載されている。
【０１４３】
２２５ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で２時間培養を行った。２時間後、細胞をＳＭ１１（リン酸塩を含まないＳＭ１１培地）で洗浄した。細胞を二回沈降させ（４，０００ｒｐｍ、１５分）、上清をデカントし、ペレットを１５０ｍＬのＳＭ１１（リン酸塩を含まないＳＭ１１培地）中に再懸濁させた。培養物を使用して各株（３×５０ｍＬ）をＳＭ１１（リン酸塩を含まない）に播種した。培養物を３０℃で約２時間成長させてＯＤ６００を１．０〜１．５とし、３５℃とした後、７２時間の期間にわたって生成物を測定するためのサンプルを定期的に採取した。
【０１４４】
ＨＰＬＣ  ＥＳＩ／ＭＳにより、Ｎ−ラウロイルグリシン、Ｎ−ミリストイルグリシン及びＮ−パルミトイルグリシンの定量化並びに発酵サンプル中のその他のアシルアミノ酸の検出を行った。
【０１４５】
【表１２】
2017517258.tif 000027
【０１４６】
実施例１２
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥにおけるｇｃｖＴＨＰオペロンの欠失のためのベクターの作製
グリシン開裂系（ＧｃｖＴ：アミノメチルトランスフェラーゼ（テトラヒドロ葉酸依存性）、グリシン開裂複合体のサブユニット（Ｔ−タンパク質）；ＧｃｖＨ：グリシン開裂複合体リポイルタンパク質；ＧｃｖＰ：グリシンデカルボキシラーゼ（ＰＬＰ依存性）、グリシン開裂複合体のサブユニット（Ｐ−タンパク質））をコードするＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０のｇｃｖＴＨＰオペロンの欠失のためのベクターを作製するために、ＧｃｖＴＨＰオペロンの約５００ｂｐ上流及び下流をＰＣＲで増幅した。ＧｃｖＴＨＰの上流領域は、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）及びｏ−ＭＯ−４１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を使用して増幅した。ｇｃｖＴＨＰの下流領域は、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）及びｏ−ＭＯ−４３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）を使用して増幅した。ＰＣＲ手順は、実施例３と同様にして行った。
【０１４７】
いずれの場合にも、予想サイズのＰＣＲフラグメントを増幅することができた（ＰＣＲ  １，５５３ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）；ＰＣＲ  ２，５４７ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７））。ＰＣＲサンプルをアガロースゲル電気泳動法によって分離し、ＤＮＡフラグメントをＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社（ヒルデン）製）によって単離した。精製したＰＣＲフラグメントをベクターｐＫＯ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）にクローニングし、Ｇｅｎｅａｒｔ（登録商標）  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国カリフォルニア州カールスバッド））を使用してＢａｍＨＩで切断した。得られた生成物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（フランクフルト）製）に形質転換した。ＰＣＲ精製、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニング及び形質転換は、製造者のマニュアルに従って行った。切断解析によって標的遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、導入ＤＮＡフラグメントの信頼性はＤＮＡシークエンシングによって確認した。得られたノックアウトベクターを「ｐＫＯ３  ΔｇｃｖＴＨＰ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）と呼ぶ。
【０１４８】
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰは、ｐＫＯ３  ΔｇｃｖＴＨＰを使用し、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７に記載されている方法に従って作製した。ｇｃｖＴＨＰの欠失後のＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０である。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥΔｇｃｖＴＨＰをプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、実施例３）を使用してエレクトロポレーションによって形質転換し、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れた。プラスミド調製及び制限解析によって形質転換体を調べ、適切なプラスミドが存在することを確認した。得られた株を「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥΔΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］」と呼ぶ。
【０１４９】
実施例１３
ｆａｄＥ又はｆａｄＥ／ｇｃｖＴＨＰ遺伝子が欠失し、ｈＧＬＹＡＴ２、ｆａｄＤ及びａｌｋＬ遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株によるラウロイルグリシネートの生成
実施例１で作製した株がラウロイルグリシネートを生成する能力（ｇｃｖＴＨＰ欠失を有していない参照株と比較）について調べた。
【０１５０】
株（−８０℃のグリセリン培養物）を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れ、３７℃で一晩培養した。次に、株（シングルコロニー）を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地（「Ｍｉｌｌｅｒ」、（Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ・ダルムシュタット）製）内で培養し、５ｍＬの前培養物を得た。細胞をＭ９−ＦＩＴ培地内においてさらに培養した。３８ｍＭリン酸水素二ナトリウム二水和物、２２ｍＭリン酸二水素カリウム、８．６ｍＭ塩化ナトリウム、３７ｍＭ塩化アンモニウム、２ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物（以上、Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ・ダルムシュタット）製）５％（ｗ／ｖ）マルトデキストリン溶液（デキストロース当量：１３．０〜１７．０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（タウフキルヘン）製）、１％（ｗ／ｖ）アミログルコシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（タウフキルヘン）製）、１滴のＤｅｌａｍｅｘ  １８０（Ｂｕｓｓｅｔｔｉ社（ウィーン）製）及び０．１％（ｖ／ｖ）微量元素溶液からなる培地のｐＨを２５％水酸化アンモニウム溶液で７．４に調節した。微量元素溶液は、９．７ｍ塩化マンガン（ＩＩ）四水和物、６．５ｍＭ硫酸亜鉛七水和物、２．５ｍＭナトリウム−ＥＤＴＡ（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ  ＩＩＩ）、４．９ｍＭホウ酸、１ｍＭモリブデン酸ナトリウム二水和物、３２ｍＭ塩化カルシウム二水和物、６４Ｍ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物及び０．９ｍＭ塩化銅（ＩＩ）二水和物（１Ｍ塩酸に溶解）（以上、Ｍｅｒｃｋ社（ドイツ・ダルムシュタット）製）からなり、Ｍ９培地に添加する前にフィルターで殺菌処理した。スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した２０ｍＬのＭ９培地をバッフル付きの三角フラスコ（１００ｍＬ）に入れ、０．５ｍＬの前培養物を播種した。振盪培養器内において、３７℃、２００ｒｐｍで培養を行った。８時間後、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した５０ｍＬのＭ９培地をバッフル付きの三角フラスコ（２５０ｍＬ）に入れ、１０ｍＬの培養物を播種して光学濃度（６００ｎｍ）を０．１とした。振盪培養器内において、３７℃、２００ｒｐｍで培養を行った。光学濃度（６００ｎｍ）が０．６〜０．８となった時に、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘発した。その後、３７℃、２００ｒｐｍで４８時間にわたってさらに培養を行った。誘発から１〜３時間後、６ｇ／Ｌのグリシン及び６ｇ／Ｌのラウリン酸（ラウリン酸メチルエステルに溶解）を培養物に添加した。０時間及び２４時間経過後にサンプルを採取し、サンプルに含まれるラウロイルグリシネート、ラウリン酸及びグリシンを分析した。結果を図４及び図５に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］及びＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］は、ラウロイルグリシネートを生成することができることが分かった。一方、株ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰの場合には、より多くのラウロイルグリシネートが合成され、より多くのグリシンが検出された。ΔｇｃｖＴＨＰではグリシンの代謝はより少量であり、ラウロイルグリシネートの合成にグリシンを使用することができるように思われる。
【０１５１】
実施例１４
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥにおけるｇｌｙＡ遺伝子の欠失のためのベクターの作製
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０のグリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの成分をコードするｇｌｙＡ遺伝子の欠失のためのベクターを作製するために、ｇｌｙＡ遺伝子の約５００ｂｐ上流及び下流をＰＣＲで増幅した。ｇｌｙＡの上流領域は、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−４４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）及びｏ−ＭＯ−４５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）を使用して増幅した。ｇｌｙＡの下流領域は、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）及びｏ−ＭＯ−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）を使用して増幅した。
【０１５２】
いずれの場合にも、予想サイズのＰＣＲフラグメントを増幅することができた（ＰＣＲ  １，５４６ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）；ＰＣＲ  ２，５２０ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６））。ＰＣＲサンプルをアガロースゲル電気泳動法によって分離し、ＤＮＡフラグメントをＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（ヒルデン）社製）によって単離した。精製したＰＣＲフラグメントは、クロスオーバーＰＣＲ（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ＰＣＲ）によって得た。得られたフラグメントを精製し、製造者のマニュアルに従ってクローニングベクターｐＣＲＲ（登録商標）  ＩＩＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にサブクローニングした。フラグメントをターゲットプラスミドｐＫＯ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）にクローニングするために、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）及びｏ−ＭＯ−５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を使用し、フランキングＢａｍＨＩ制限部位によって増幅した。精製したＢａｍＨＩ切断ＰＣＲ３フラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）に対してライゲーションを行って対応する切断ベクターｐＫＯ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を得た。得られた生成物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（フランクフルト）製）に形質転換した。ＰＣＲ精製、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニング及び形質転換は、製造者のマニュアルに従って行った。切断解析によって標的遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、導入遺伝子の信頼性はＤＮＡシークエンシングによって確認した。得られたノックアウトベクターを「ｐＫＯ３  ΔｇｌｙＡ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）と呼ぶ。
【０１５３】
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｌｙＡは、ｐＫＯ３  ΔｇｌｙＡを使用し、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７に記載されている方法に従って作製した。ｇｌｙＡの欠失後のＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１である。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰをプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、実施例３）を使用してエレクトロポレーションによって形質転換し、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れた。プラスミド調製及び制限解析によって形質転換体を調べ、適切なプラスミドが存在することを確認した。得られた株を「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｌｙＡ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］」と呼ぶ。
【０１５４】
実施例１５
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥにおけるｔａＥ遺伝子の欠失のためのベクターの作製
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０のＬ−アロトレオニンアルドラーゼをコードするｌｔａＥ遺伝子の欠失のためのベクターを作製するために、ｌｔａＥ遺伝子の約５００ｂｐ上流及び下流をＰＣＲで増幅した。ｌｔａＥの上流領域は、オリゴヌクレオチドｌｔａＥ−ＵＰ＿ｆｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）及びｌｔａＥ−ＵＰ−ＸｈｏＩ＿ｒｅｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）を使用して増幅した。ｌｔａＥの下流領域は、オリゴヌクレオチドｌｔａＥ−ＤＯＷＮ＿ｆｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）及びｌｔａＥ−ＤＯＷＮ＿ｒｅｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）を使用して増幅した。
【０１５５】
いずれの場合にも、予想サイズのＰＣＲフラグメントを増幅することができた（ＰＣＲ  ４，５５０ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）；ＰＣＲ  ５，５３６ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７））。ＰＣＲサンプルをアガロースゲル電気泳動法によって分離し、ＤＮＡフラグメントをＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社（ヒルデン）製）によって単離した。精製したＰＣＲフラグメントは、クロスオーバーＰＣＲ（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ＰＣＲ）によって得た。得られたフラグメントを精製し、製造者のマニュアルに従ってクローニングベクターｐＣＲＲ（登録商標）  ＩＩＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にクローニングした。フラグメントをターゲットプラスミドｐＫＯ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）にクローニングするために、オリゴヌクレオチドｏ−ＭＯ−５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）及びｏ−ＭＯ−５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）を使用し、フランキングＢａｍＨＩ制限部位によって増幅した。精製したＢａｍＨＩ切断ＰＣＲ６フラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）に対してライゲーションを行って対応する切断ベクターｐＫＯ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を得た。得られた生成物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（フランクフルト）製）に形質転換した。ＰＣＲ精製、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニング及び形質転換は、製造者のマニュアルに従って行った。切断解析によって標的遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、導入遺伝子の信頼性はＤＮＡシークエンシングによって確認した。得られたノックアウトベクターを「ｐＫＯ３  ΔｌｔａＥ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）と呼ぶ。
【０１５６】
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｌｔａＥは、ｐＫＯ３  ΔｌｔａＥを使用し、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７に記載されている方法に従って作製した。ｌｔａＥの欠失後のＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２である。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｌｔａＥをプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、実施例３）を使用してエレクトロポレーションによって形質転換し、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れた。プラスミド調製及び制限解析によって形質転換体を調べ、適切なプラスミドが存在することを確認した。得られた株を「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥΔｌｔａＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］」と呼ぶ。
【０１５７】
実施例１６
ラウリン酸のＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ２による定量化
発酵サンプル中のラウリン酸を、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ２により、内部標準ｄ３−ＬＳを使用し、ラウリン酸（０．１〜５０ｍｇ／Ｌ）の外部較正に基づいて定量化した。
【０１５８】
以下の機器を使用した。
・ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ社（ベーブリンゲン）製）（Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（Ｇ１３６７Ｅ）、バイナリポンプ（Ｇ１３１２Ｂ）及びサーモスタットカラム（Ｇ１３１６Ａ）を備える）
・質量分析計「ＴｒｉｐｅｌＱｕａｄ  ６４１０」（Ａｇｉｌｅｎｔ社（ベーブリンゲン）製）（ＥＳＩ源を備える）
・ＨＰＬＣカラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８、１００×２．１ｍｍ、粒径：２．６μｍ、孔径：１００Å（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社（アシャッフェンブルク）製）
・プレカラム：ＫｒｕｄＫａｔｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａ  ＨＰＬＣ  Ｉｎ−Ｌｉｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ、フィルターの深さ：０．５μｍ、内径：０．００４ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社（アシャッフェンブルク）製）
【０１５９】
ピペットを使用し、８００μＬの溶媒（８０％（ｖ／ｖ）  ＡＣＮ、２０％蒸留（二回）Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）、０．１％ギ酸）と２００μＬのサンプルを反応容器（２ｍＬ）に入れた。混合物を約１０分間ボルテックスした後、約１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。ピペットを使用して透明な上清を除去した後、希釈剤（８０％（ｖ／ｖ）  ＡＣＮ、２０％蒸留（二回）Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）、０．１％ギ酸）で希釈を行い、分析した。いずれの場合でも、１００μＬのＩＳＴＤを９００μＬのサンプル（１０μＬ＋９０μＬ（サンプル量））に添加した。
【０１６０】
ＨＰＬＣ分離は、上記カラム及びプレカラムを使用して行った。注入量は１．０μＬ、カラム温度は５０℃、流量は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。移動相としては、溶離液Ａ（０．１％（ｖ／ｖ）含水ギ酸）及び溶離液Ｂ（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含むアセトニトリル）を使用した。表４に示す勾配を使用した。
【０１６１】
【表１３】
2017517258.tif 000028
【０１６２】
ＥＳＩ−ＭＳ２分析は、ポジティブイオンモードで行った。ＥＳＩ源のパラメータを以下に示す。
ガス温度：３２０℃
ガス流量：１１Ｌ／分
ネブライザー圧力：５０ｐｓｉ
キャピラリー電圧：４，０００Ｖ
ラウリン酸の検出及び定量化は、以下のＭＲＭパラメータを使用して行った。
【０１６３】
【表１４】
2017517258.tif 000029
【０１６４】
実施例１７
グリシンの検出
グリシンの検出は、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）による誘導体化及びＵＶ／ＶＩＳ検出（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムを使用）によって行った。
【０１６５】
２００μＬの均一な発酵液を１，８００μＬの３０％（ｖ／ｖ）  １−プロパノールと混合し、１０秒間ボルテックスした後、１３，０００×ｇで５分間遠心分離を行った。上清を除去し、以下のパラメータを使用してＨＰＬＣ分析を行った。
【０１６６】
移動相：溶離液Ａ
酢酸（２．５ｍＬ／Ｌ（蒸留水））、ｐＨ：６．０（ＮａＯＨで調節）
溶離液Ｂ
メタノール
【０１６７】
【表１４−２】
2017517258.tif 000030
【０１６８】
誘導体化：インジェクションプログラムを使用して自動的に行った。
インジェクションプログラム
＃Ｃｏｍｍａｎｄ
１  ＤＲＡＷ  ４．５μＬ  ｆｒｏｍ  Ｖｉａｌ  １＊，ｄｅｆ．ｓｐｅｅｄ，ｄｅｆ．ｏｆｆｓｅｔ
２  ＤＲＡＷ  １．５μＬ  ｆｒｏｍ  ｓａｍｐｌｅ，ｄｅｆ．ｓｐｅｅｄ，ｄｅｆ．ｏｆｆｓｅｔ
３  ＤＲＡＷ  ０．５μＬ  ｆｒｏｍ  ａｉｒ，ｄｅｆ．ｓｐｅｅｄ
４  ＮＥＥＤＬＥ  ｗａｓｈ  ｉｎ  ｆｌｕｓｈ  Ｐｏｒｔ．１５．０秒
５  ＤＲＡＷ  ４．５μＬ  ｆｒｏｍ  Ｖｉａｌ  １，ｄｅｆ．ｓｐｅｅｄ，ｄｅｆ．ｏｆｆｓｅｔ
６  ＭＩＸ  １１．０μＬ  ｉｎ  ｓｅａｔ，ｄｅｆ．ｓｐｅｅｄ，１  ｔｉｍｅｓ
７  ＷＡＩＴ  １．００  ｍｉｎ
８  ＩＮＪＥＣＴ
９  ＷＡＩＴ  ０．５０  ｍｉｎ
１０  ＶＡＬＶＥ  ｂｙｐａｓｓ
１１  Ｄｒａｗ  １００．０μＬ  ｆｒｏｍ  Ｖｉａｌ  ２＊，ｄｅｆ．ｓｐｅｅｄ，ｄｅｆ．ｏｆｆｓｅｔ
１２  Ｅｊｅｃｔ  １００．０μＬ  ｆｒｏｍ  Ｖｉａｌ  ２，ｄｅｆ．ｓｐｅｅｄ，ｄｅｆ．ｏｆｆｓｅｔ
１３  Ｖａｌｖｅ  ｍａｉｎｐａｓｓ
＊バイアル１はＯＰＡ試薬を含む（以下を参照）；バイアル２は水を含む。
【０１６９】
ＯＰＡ試薬の調製
１００ｍｇのｏ−フタルジアルデヒドを１ｍＬのメタノールに溶解させ、０．４ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ：１０．４）を添加して１０ｍＬとした。次に、５０μＬのメルカプトエタノールを添加し、得られた試薬を４℃で保管した。使用前に１０μＬのメルカプトエタノールを添加した。
【０１７０】
ホウ酸緩衝液（０．４ｍＭ  Ｈ３ＢＯ４）の調製：
３８．１ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７×１０Ｈ２Ｏ（０．１ｍｏｌ）を１Ｌの蒸留水に溶解させ、ＮａＯＨによってｐＨを１０．４に調節した。その後、１ｍＬの２５％  Ｂｒｉｊ３５（ｖ／ｖ）を添加した。
保持時間：グリシン：７．１５３分
【０１７１】
実施例１８
ｈＧＬＹＡＴ２−同族体の発現のためのベクターの作製
異なる微生物のＮ−アシルトランスフェラーゼの発現のためのベクターを作製するために、ＮＣＢＩデータベースで見つかったＨＧＬＹＡＴ２と同族関係を有する変異体を合成し、Ｅ．ｃｏｌｉに対してコドン最適化した。これらの変異体は、Ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ（Ｎｌ、ＸＰ＿００３２７５３９２．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）のグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ様タンパク質２アイソフォーム１、Ｓａｉｍｉｒｉ  ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ（Ｓｂ、ＸＰ＿００３９２０２０８．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）のグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ様タンパク質２、Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ（Ｆｃ、ＸＰ＿００３９９３５１２．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）のグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ様タンパク質２、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（Ｂｔ、ＮＰ＿００１１７８２５９．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）のグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ様タンパク質２及びＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｍｍ、ＮＰ＿６６６０４７．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）のグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼである。
【０１７２】
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、実施例３）のｈＧＬＹＡＴ２−遺伝子を変異体で置換した。合成したＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｓｉＳＩで消化させ、ライゲーションを行って対応する切断ベクターｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］を得た。
【０１７３】
切断解析によって標的遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、導入遺伝子の信頼性はＤＮＡシークエンシングによって確認した。以下の発現ベクターが得られた。
【０１７４】
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｎｌ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｓｂ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｆｃ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｂｔ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ＧＬＹＡＴ＿Ｍｍ（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
【０１７５】
実施例１９
ｆａｄＥ遺伝子が欠失し、ｈＧＬＹＡＴ−変異体及びｆａｄＤ及びａｌｋＬ遺伝子を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株によるラウロイルグリシネートの生成
実施例１８で得られた株を使用し、プラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］を有するｈＧＬＹＡＴ２を発現する参照株と比較した場合の、ラウロイルグリシネートの生成能力について調べた。
【０１７６】
誘発から１〜３時間後、６ｇ／Ｌのグリシン及び６ｇ／Ｌのラウリン酸（ラウリン酸メチルエステルに溶解）を培養物に添加した。４８時間培養を行った後、振盪フラスコの培養液をアセトン（１：２）で抽出した。サンプルの処理は、実施例７と同様にして行った。サンプルを採取し、サンプルに含まれるラウロイルグリシネート、ラウリン酸及びグリシンを分析した。結果を表１５に示す。
【０１７７】
プラスミドを含まない対照を除く全ての株は、０．４４〜２１０９．８ｍｇ／Ｌの量でラウロイルグリシネートを生成した。
【０１７８】
【表１５】
2017517258.tif 000031
【０１７９】
実施例２０
異なるグリシン代謝経路における突然変異欠損の作製
実施例１２、１４及び１５に記載したノックアウトプラスミドを使用して異なる突然変異体を作製した。プラスミドｐＫＯ３  ΔｌｔａＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ｐＫＯ３  ΔＧｌｙＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４０）及びｐＫＯ３  ΔｇｃｖＴＨＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）並びにＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥを使用し、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７に記載されている方法に従って各株を作製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｌｔａＥ、Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｇｌｙＡ、Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｌｙＡ  ΔｌｔａＥ及びＷ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｌｔａＥ  ΔｇｌｙＡををプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、実施例３）を使用してエレクトロポレーションによって形質転換し、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れた。プラスミド調製及び制限解析によって形質転換体を調べ、適切なプラスミドが存在することを確認した。得られた株を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｌｔａＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｇｌｙＡ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｌｙＡ  ΔｌｔａＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｌｔａＥ  ΔｇｌｙＡ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］と呼ぶ。
【０１８０】
実施例２１
ｈＧＬＹＡＴ２及びｆａｄＤを過剰発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥにおいてａｌｋＬの代わりにポーリン遺伝子ｆａｄＬを発現するためのベクターの作製
ａｌｋＬの代わりにｆａｄＬを発現するためのベクターを作製するために、配列特異的オリゴヌクレオチドｆａｄＬ＿ｅｃ−ｆｐ及びｆａｄＬ＿ＥＣ＿ｒｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）により、ｆａｄＬ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡから増幅した。オリゴヌクレオチドｕｐｓｔｒｅａｍ＿ｆｐ及びｕｐｓｔｒｅａｍ＿ｒｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）を使用して標的ベクターｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）からプロモーター領域（Ｐｌａｃｕｖ５）を増幅した。フラグメントをＰＣＲを使用して融合し、標的ベクターにクローニングし、Ｇｅｎｅａｒｔ（登録商標）  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国カリフォルニア州カールスバッド））を使用してＮｓｉＩ／ＢａｍＨＩで切断した。得られた生成物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（フランクフルト）製）に形質転換した。
【０１８１】
切断解析によって標的遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、導入遺伝子の信頼性はＤＮＡシークエンシングによって確認した。得られた発現ベクターを「ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｆａｄＬ］」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）と呼ぶ。
【０１８２】
実施例１２で作製したＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥΔｇｃｖＴＨＰをプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｆａｄＬ］を使用してエレクトロポレーションによって形質転換し、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れた。プラスミド調製及び制限解析によって形質転換体を調べ、適切なプラスミドが存在することを確認した。得られた株を「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｆａｄＬ］」と呼ぶ。
【０１８３】
実施例２２
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥにおけるｋｂｌ遺伝子の欠失のためのベクターの作製
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の２−アミノ−３−ケト酪酸ＣｏＡリガーゼをコードするｋｂｌ遺伝子の欠失のためのベクターを作製するために、ｋｂｌ遺伝子の約５００ｂｐ上流及び下流をＰＣＲで増幅した。ｋｂｌの上流領域は、オリゴヌクレオチド１９６０＿ｕｐ＿ｆｐ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）及び１９６０＿ｕｐ＿ｒｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）を使用して増幅した。ｋｂｌの下流領域は、オリゴヌクレオチド１９６０＿ｄｏｗｎ＿ｆｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）及び１９６０＿ｄｏｗｎ＿ｒｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）を使用して増幅した。
【０１８４】
いずれの場合にも、予想サイズのＰＣＲフラグメントを増幅することができた。ＰＣＲサンプルをアガロースゲル電気泳動法によって分離し、ＤＮＡフラグメントをＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社（ヒルデン）製）によって単離した。精製したＰＣＲフラグメントは、クロスオーバーＰＣＲによって得た。得られたフラグメントを精製し、ＢｓａＩ及びＳａｌＩで切断し、ライゲーションを行って対応する切断ベクターｐＫＯ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を得た。得られた生成物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（フランクフルト）製）に形質転換した。ＰＣＲ精製、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニング及び形質転換は、製造者のマニュアルに従って行った。切断解析によって標的遺伝子が正しく挿入されたことを確認し、導入遺伝子の信頼性はＤＮＡシークエンシングによって確認した。得られたノックアウトベクターを「ｐＫＯ３  Δｋｂｌ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）と呼ぶ。
【０１８５】
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  Δｋｂｌは、ｐＫＯ３  Δｋｂｌを使用し、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７に記載されている方法に従って作製した。ｋｂｌの欠失後のＤＮＡ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６である。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰをプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、実施例３）を使用してエレクトロポレーションによって形質転換し、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地に入れた。プラスミド調製及び制限解析によって形質転換体を調べ、適切なプラスミドが存在することを確認した。得られた株を「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  Δｋｂｌ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］」と呼ぶ。
【０１８６】
実施例２３
Ｐｔａｃの代わりにＰｔｒｃプロモーターの制御下においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ及びヒトｈＧＬＹＡＴ２を過剰発現する株の作製
Ｐｔｒｃプロモーターの制御下においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ及びヒトｈＧＬＹＡＴ２を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株（Ｂｒｏｓｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を作製するために、ＰＣＲ及び配列特異的オリゴヌクレオチドを使用してプラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］のプロモーター領域をｔｒｃプロモーターの配列に変更した。得られたプラスミドを「ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）と呼ぶ。
【０１８７】
実施例１２及び２０と同様にして、以下のＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を作製した。
ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ΔｆａｄＥΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｌｔａＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ΔｆａｄＥ  ΔｇｌｙＡ  ΔｌｔａＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  Δｋｂｌ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｌｔａＥ  Δｋｂｌ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｌｔａＥ  ΔｇｌｙＡ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
【０１８８】
実施例２４
Ｅ．ｃｏｌｉ株による加水分解ココナツ油及びグリシンからのアシルグリシネートの生成
実施例５に記載したように作製したＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］を流加培養発酵によって発酵させ、加水分解ココナツ油からの脂肪酸とグリシンを結合させてアシルアミノ酸、例えばラウロイルグリシネートを生成する能力について調べた。発酵は、８個のバイオリアクターを備えたＤＡＳＧＩＰパラレル発酵システムにおいて実施した。
【０１８９】
実験条件は、以下の点を除いて実施例８と同じである。すなわち、加水分解ココナツ油からの脂肪酸は３０℃で固体であり、微生物発酵プロセスでは流体として使用することができない。そのため、異種遺伝子の誘導前の３７℃から３０℃への温度変更は省略した。全プロセスは３７℃で実施した。誘導は供給開始から２時間経過後に行った。
【０１９０】
誘導から７時間経過後に加水分解ココナツ油からの脂肪酸（１０ｇ）及び１００ｇ／Ｌグリシン水溶液（１００ｍＬ）を添加して生体内変化を生じさせ、発酵液全体に対して２４ｇ／Ｌの各基質を得た。
【０１９１】
転化をモニタリングするために、生体内変化から４７時間及び６５時間経過後にサンプルを採取し、実施例７と同様にして分析した。結果を表１６に示す。
【０１９２】
【表１６】
2017517258.tif 000032
【０１９３】
Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］は、ラウリン酸だけではなく、分子鎖長が異なる加水分解ココナツ油からの脂肪酸もグリシンに結合させてアシルグリシネートを生成することができることが分かった。
【０１９４】
実施例２５
グリシン代謝経路に欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ株による加水分解ココナツ油及びグリシンからのアシルグリシネートの生成
実施例１２及び２３と同様にして、以下のＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を作製した。
ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）／ｆａｄＤ＿Ｅｃ］  ｛Ｐｌａｖｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ΔｌｔａＥ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
ΔｆａｄＥ  ΔｇｌｙＡ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔｒｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ａｌｋＬｍｏｄ１］
実施例２４と同様にしてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を培養し、生体内変化を生じさせ、実施例２４の結果と比較した。転化をモニタリングするために、生体内変化から４７時間及び６５時間経過後にサンプルを採取し、実施例７と同様にして分析した。結果を表１７〜表２０に示す。
【０１９５】
【表１７】
2017517258.tif 000033
【０１９６】
【表１８】
2017517258.tif 000034
【０１９７】
【表１９】
2017517258.tif 000035
【０１９８】
【表２０】
2017517258.tif 000036
【０１９９】
ΔｇｃｖＴＨＰ突然変異により、Ｅ．ｃｏｌｉの代謝によって引き起こされるグリシンの損失は有意に減少した（実施例１３も参照）。表１７に示す突然変異体の場合には、生体内変化の終了時におけるグリシン濃度は＞７ｇ／Ｌ（表１８に示す突然変異体の場合は＞８ｇ／Ｌ）だった。表１６に示すように、突然変異体ではないＥ．ｃｏｌｉの場合には、生体内変化の終了時におけるグリシン濃度は０ｇ／Ｌだった。
【０２００】
第２のグリシン代謝経路（ΔｌｔａＥ）を阻害する付加的な突然変異では、ΔｇｃｖＴＨＰ突然変異の効果は向上しなかった。予期せぬことに、ΔｌｔａＥは、ΔｇｃｖＴＨＰの所望の効果をを抑制した（表１９を参照）。
【０２０１】
また、ΔｇｌｙＡ突然変異により、Ｅ．ｃｏｌｉの代謝によって引き起こされるグリシンの損失は有意に減少した。表２０に示す突然変異体の場合には、生体内変化の終了時におけるグリシン濃度は＞８ｇ／Ｌだった。
【０２０２】
実施例２６
別のポーリンＦａｄＬを使用したＥ．ｃｏｌｉ株による加水分解ココナツ油及びグリシンからのアシルグリシネートの生成
実施例１２及び２３と同様にして、以下のＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を作製した。
ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］
ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｆａｄＬ］
実施例２４と同様にしてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を培養し、生体内変化を生じさせた。生体内変化から４７時間及び６５時間経過後に転化サンプルを採取し、実施例７と同様にして分析した。結果を表２１及び表２２に示す。
【０２０３】
【表２１】
2017517258.tif 000037
【０２０４】
【表２２】
2017517258.tif 000038
【０２０５】
ポーリンは良好な生体触媒性能に重要であることが分かった。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０  ΔｆａｄＥ  ΔｇｃｖＴＨＰ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｈＧＬＹＡＴ２（ｃｏ＿Ｅｃ）−ｆａｄＤ＿Ｅｃ］のようにポーリンが存在しない場合には、生体内変化の終了時において発酵液中に残っている脂肪酸は有意に増加した（同一の条件で測定）（表２１）。ポーリンとして使用したＡｌｋＬにより、加水分解ココナツ油からの脂肪酸はほぼ完全に転化された（表１７）。また、ＦａｄＬもＡｌｋＬと同様にポーリンとして使用することができ、生体内変化によって脂肪酸をほぼ完全に転化させることができることが分かった。
【０２０６】
参考文献
Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ，  ２００８，  Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ．
Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  （１９９５），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．
Ａｎｔｏｎｅｎｋｏｖ，  Ｖ．，  Ｄ．．  Ｖａｎ  Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎ，  Ｐ．，  Ｐ．，  Ｗａｅｌｋｅｎｓ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｎａｅｒｔｓ，  Ｇ．Ｐ．  （１９９７）
Ａｒｔｈｕｒ  Ｌｅｓｋ  （２００８），  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．
Ｂｅｇｕｉｎ，  Ｐ  ａｎｄ  Ａｕｂｅｒｔ，  Ｊ−Ｐ  （１９９４）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  Ｒｅｖ．  １３：  ２５−５８．
Ｂｒｏｓｉｕｓ  Ｊ，  Ｅｒｆｌｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｊ  Ｓｔｏｒｅｌｌａ  （１９８５）．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｍａｒ  ２５；２６０（６）：３５３９−４１
Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ  （１９９５），  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，  Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  １９９５．
Ｆｕｊｉｔａ，  Ｙ．，  Ｍａｔｓｕｏｋａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｈｉｒｏｏｋａ，  Ｋ．  （２００７）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６６（４），  ８２９−８３９．
Ｊｅｒｅｍｙ  Ｍ  Ｂｅｒｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｌ  Ｔｙｍｏｃｚｋｏ，  ａｎｄ  Ｌｕｂｅｒｔ  Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  ２００２．
Ｋａｎｇ，  Ｙ  （２０１０），  ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ５  （１０），  ｅ１３５５７．
Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  １６（１），  ２２−３３，  ２００５．
Ｌｉｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ４１：  ２５５−２６０．
Ｌｉｎｋ  ＡＪ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｄ，  Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９７．  １７９（２０）
Ｏｈｉｍａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇ．  Ｒｅｖ．  １４：  ３６５４１４．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ／Ｆｒｉｔｓｃｈ／Ｍａｎｉａｔｉｓ  （１９８９）：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  -  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  
“Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  １９９３  
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，  ４６３７−４６８０．  
Ｗａｌｕｋ，  Ｄ．  Ｐ．，  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｈｕｎｔ，  Ｍ．  Ｃ．  （２０１０），  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２４，  ２７９５−２８０３．
ＥＰ１１１９１５２０．３，  ＵＳ５７３４０７０，  ＵＳ２０１４００５１１３６，  ＧＢ１４８３５００．  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，９６０，４５５
【図１】
2017517258.tif 000039
【図２】
2017517258.tif 000040
【図３】
2017517258.tif 000041
【図４】
2017517258.tif 000042
【図５】
2017517258.tif 000043
【図６】
2017517258.tif 000044
【図７】
2017517258.tif 000045
【配列表】
2017517258000001.app
【国際調査報告】
2017517258.tif 000046
2017517258.tif 000047
2017517258.tif 000048
2017517258.tif 000049
2017517258.tif 000050