(57)【要約】  本開示は、遊離の天然ＨＳＡに比べてアルブミンマイクロバブルに対する結合優先性を示す、１以上の原子団が結合したアルブミンマイクロバブルの組成物に関する。アルブミンマイクロバブル組成物の製造及び治療薬又は診断薬の超音波媒介送達におけるアルブミンマイクロバブル組成物の使用についても考察する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンシェルを含むマイクロバブルと、
マイクロバブルに結合した原子団であって、天然アルブミンに比べてマイクロバブルに優先的に結合する原子団と
を含む組成物。
【請求項２】
各原子団が治療薬の官能基として設けられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
治療薬が低分子薬物、オリゴヌクレオチド又は大分子を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
各原子団が治療薬の一部である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
各原子団が診断薬の官能基として設けられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
原子団が蛍光色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
アルブミンシェルが、部分変性・部分架橋ヒト血清アルブミンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
マイクロバブルがペルフルオロプロパンコアを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
マイクロバブルが、約１μｍ〜約１０μｍの直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
原子団がシアニン５誘導体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
アルブミンシェルを含むアルブミンマイクロバブルと、
治療薬又は診断薬と、
アルブミンマイクロバブルと治療薬又は診断薬とを連結するシアニン５誘導体と
を含む組成物。
【請求項１２】
アルブミンシェルが、部分変性・部分架橋ヒト血清アルブミンを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
治療薬又は診断薬が低分子薬物又は核酸構造を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
シアニン５誘導体がポリエチレングリコール単位を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
アルブミンマイクロバブルが約１μｍ〜約１０μｍの直径を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
超音波式治療方法であって、
患者にアルブミンマイクロバブル組成物を導入するステップであって、アルブミンマイクロバブル組成物が、アルブミンシェルと、目的分子と、目的分子をアルブミンシェルに結合させる原子団であって、遊離の天然ヒト血清アルブミンに比べてアルブミンシェルに優先的に結合する原子団とを含んでいる、ステップと、
目的の解剖学的領域に超音波エネルギーを指向させ、目的の解剖学的領域においてアルブミンマイクロバブルのキャビテーションを引き起こすステップと
を含む方法。
【請求項１７】
原子団の蛍光に基づいて、目的の解剖学的領域におけるアルブミンマイクロバブルの存在を可視化するステップをさらに含む、請求項１６に記載の超音波式治療方法。
【請求項１８】
目的分子が低分子薬物又は核酸構造を含む、請求項１６に記載の超音波式治療方法。
【請求項１９】
原子団がシアニン５誘導体を含む、請求項１６に記載の超音波式治療方法。
【請求項２０】
原子団が、遊離の天然ヒト血清アルブミンに比べて２より大きい比でアルブミンシェルに優先的に結合する、請求項１６に記載の超音波式治療方法。
【請求項２１】
原子団が、遊離の天然ヒト血清アルブミンに比べて４．０より大きい比でアルブミンシェルに優先的に結合する、請求項１６に記載の超音波式治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示する主題は、診断又は治療用途におけるマイクロバブル組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
有害な副作用、血液中の難溶性、又は高コストの１以上に起因して、様々な治療薬又は薬物が商業的又は医学的に実用不可である。これらの欠点のいくつかに対処するために、超音波マイクロバブル（ＵＳＭＢ）媒介送達システムなどの送達システムが開発されている。このようなシステムにおいて、ガス充填マイクロバブルは、目的の治療薬と会合している。治療条件の下で、ガス充填マイクロバブルは、目的の標的部位（すなわち、解剖学的領域）における超音波エネルギーの適用に応答してキャビテーションを受ける。このキャビテーション事象は、マイクロバブル破壊（慣性キャビテーション）をもたらし、おそらく周囲の組織及び細胞の膜に一時的な細孔を形成する衝撃波を伴う。一時的な細孔は、治療薬が、治療される組織へのアクセスを得ることを可能にする。他のシナリオでは、超音波は、慣性キャビテーションではなく安定したキャビテーションをもたらし、組織又は細胞への薬物の送達を増強することもできる。このようなアプローチは、低分子薬物、オリゴヌクレオチド、及びプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の患者などへの標的送達を含む、将来の適用可能性について調査されている。
【０００３】
治療薬の送達は、超音波の適用時にマイクロバブルの存在下で有意に増強することができる。概して、薬剤の薬物動態特性及びクリアランス機序は、組織及び細胞への送達の背後にある重要な要因である。マイクロバブルと目的の薬剤との結合は、例えば、インビボ安定性の向上、薬剤の体内分布特性の操作、又は他の機序によって、目的の部位への薬剤送達の効率に影響を与える可能性がある。しかし、このような結合関係の性質及び程度、並びにそれらの送達への影響は、一般的に十分に研究されておらず、あまり理解されていない。したがって、より適切なＵＳＭＢ媒介薬物送達システム及び会合送達薬剤を開発することが望ましいと思われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０５５２５３号パンフレット
【発明の概要】
【０００５】
一実施形態では、組成物が提供される。本組成物は、アルブミンシェルを含むマイクロバブル及びマイクロバブルに結合した原子団を含む。この原子団は、天然アルブミンに比べてマイクロバブルに優先的に結合する。
【０００６】
別の実施形態では、組成物が提供される。組成物は、アルブミンシェルを含むアルブミンマイクロバブルを含む。この組成物はまた、治療薬又は診断薬、及びアルブミンマイクロバブルと治療薬又は診断薬とを連結するシアニン５誘導体を含む。
【０００７】
別の実施形態では、方法が提供される。本方法は、アルブミンマイクロバブル組成物と、天然アルブミンに比べてマイクロバブルに優先的に結合する薬剤又は原子団結合薬剤との室温における混合を含む。
【０００８】
さらに別の実施形態では、超音波式治療方法が提供される。この方法は、アルブミンマイクロバブル組成物を患者に導入する行為を含む。アルブミンマイクロバブル組成物は、アルブミンシェル、目的分子、及び目的分子をアルブミンシェルに結合する原子団を含む。この原子団は、遊離の天然ヒト血清アルブミンに比べてアルブミンシェルに優先的に結合する。この方法のさらなる行為は、その後、目的の解剖学的領域に超音波エネルギーを指向させ、目的の解剖学的領域においてアルブミンマイクロバブルのキャビテーションを引き起こすことである。
【０００９】
本発明の上記その他の特色、態様及び有利性は、図面全体において数字により相当するパーツが表される添付の図面を参照しながら下記の詳細な説明を読んだ場合、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本開示の態様による、超音波マイクロバブル媒介薬物送達システムへの使用に適切な超音波システムを示す。
【図２】本開示の一態様による試料調製プロセスの流れを示す。
【図３】本開示の態様による、研究中の分子の化学構造を示す。
【図４】図３の特定の分子を生成するために使用される化学反応を示す。
【図５】本開示の一態様による、さらなる試料調製プロセスの流れを示す。
【図６】本開示の態様による、第１の組成物についての明視野及び蛍光顕微鏡検査結果のグレースケール表現を示す。
【図７】本開示の態様による、第２の組成物についての明視野及び蛍光顕微鏡検査結果のグレースケール表現を示す。
【図８】本開示の態様による、第３の組成物についての明視野及び蛍光顕微鏡検査結果のグレースケール表現を示す。
【図９】本開示の態様による、第４の組成物についての明視野及び蛍光顕微鏡検査結果のグレースケール表現を示す。
【図１０】本開示の態様による、第５の組成物についての明視野及び蛍光顕微鏡検査結果のグレースケール表現を示す。
【図１１】本開示の態様による、蛍光顕微鏡検査結果のグラフ表示を示す。
【図１２】本開示の態様による、フローサイトメトリー結果のグラフ表示を示す。
【図１３】本開示の態様によるさらなる試料調製プロセスの流れを示す。
【図１４】本開示の態様による、ネイティブＨＳＡ濃度の関数としての、及びマイクロバブルアルブミン濃度の関数としての、色素結合分画プロファイルのグラフ表示を示す。並びに
【図１５】本開示の態様による治療用組成物を調製するために使用可能な別の試料調製プロセスの流れを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示の特定の態様は、アルブミンマイクロバブルへの結合テザーとして機能する原子団を含む、診断用又は治療用のマイクロバブル組成物に関する。この原子団は、薬物又は診断薬、例えば、標的部位において画像化又は他の診断手順を容易にし得る治療薬又は診断用組成物などに結合させることができる。さらに、特定の実施形態では、この原子団は、光学トレーサーとして機能することができ（例えば、蛍光を発することができる）、このような実施形態では、光学追跡は診断目的、例えば光学プローブとして活用することができる。したがって、このような組成物とのインビボ用途に適切な媒介薬剤送達システムは、１）アルブミンマイクロバブル、２）遊離の天然ヒト血清アルブミンに比べてアルブミンマイクロバブルに対する結合優先性を示す、１以上の原子団（ここで、アルブミンマイクロバブルは、例えば、Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標）であってよい）、及び３）治療用又は診断用組成物の標的送達のための超音波エネルギー、を含むことができる。いくつかの実施形態では、１以上の原子団は、目的の治療用又は診断用組成物を官能化するために使用される分子であり得る。他の実施形態では、この原子団は、組成物自体が遊離の天然ヒト血清アルブミンに比べてアルブミンマイクロバブルに対して結合優先性を示すように、目的の治療用又は診断用組成物の固有の基であってもよい。
【００１２】
アルブミンマイクロバブルに関しては、これらのマイクロバブルは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）から、又は合成もしくは合成アルブミンを含む他の適切な生体適合性アルブミン源から誘導され得る。このようなアルブミンマイクロバブル源の１つの例は、Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標）アルブミン・シェル・マイクロスフェア（一般にＯｐｔｉｓｏｎ（商標）「マイクロバブル」とも呼ばれる）である。Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標）、又は他の適切なマイクロバブル形成媒体は、ＨＳＡに由来してもよいが、体内でｉｎ  ｖｉｖｏで見出される遊離の天然ＨＳＡとは異なるものである。一例として、Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標）マイクロバブルに関して、これらのマイクロバブルは、ペルフルオロプロパンコアを取り囲むＨＳＡシェルを有する。いくつかの実施形態では、適切なマイクロバブルは、約３から４．５μｍ（例えば、約１μｍ〜約１０μｍ）の範囲の平均直径を有することができる。Ｏｐｔｉｓｏｎ（登録商標）又は他の適切な組成物などのガス充填アルブミンマイクロバブル組成物中に存在するアルブミンは、以下の理由の１以上のためにｉｎ  ｖｉｖｏで見出されるＨＳＡとは異なる場合がある：部分的に変性していてもよく、部分的に架橋していてもよく、又はアルブミンは天然ＨＳＡに比べて、１以上のタンパク質構造が異なる比率で存在してもよい。
【００１３】
上述の通り、特定の実施形態では、マイクロバブルに結合する１以上の原子団は、遊離の天然ヒト血清アルブミンに比べてアルブミンマイクロバブルに対する結合優先性を示すことができる。本明細書で述べるように、特定の実施形態では、遊離の天然ＨＳＡに比べてアルブミンマイクロバブルに対する結合優先性を示す分子は、薬物上の官能基として設けられ、マイクロバブルに結合し、超音波エネルギーの適用時にｉｎ  ｖｉｖｏで効率的な薬物送達を可能にする。特定の例において、この原子団は、本質的に目的の薬物上に存在してもよく、したがって、別のステップで付加する必要はない。一実施形態では、原子団成分は、治療薬又は診断薬をマイクロバブルに「つなぐ（ｔｅｔｈｅｒ）」ために使用することができるペグ化又は非ＰＥＧ化シアニン５（Ｃｙ５）誘導体であってもよい。例えば、マイクロバブルへのテザーとして作用するＣｙ５誘導体は、低分子薬物、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡなど）、又は大分子（プラスミドＤＮＡなど）などの治療薬を用いて官能化することができる。
【００１４】
先のことを念頭に置いて、有害な副作用、血液への難溶性、又は高コストに関連する薬物送達問題に取り組むために、現在のアプローチを使用することができる。一実施形態では、（テザーを使用するなどして）治療薬をマイクロバブル物に結合させることによって、超音波処理の際に標的部位で放出されるまでｉｎ  ｖｉｖｏで循環する薬物の生物学的利用能を低下させる複合体が形成される。これは有害な副作用を減らす効果がある。マイクロバブルは、難溶性を示し得る薬物の複数のコピーを担持できるので、複合体形成は溶解性を高めることもできる。バブルへの結合で超音波送達の部位における局所薬物濃度を増加させることによって、薬物送達の効率を、原理上有意に増強することができるので、全体のコストが低減される。
【００１５】
さらに、上述の通り、特定の実施形態では、原子団（例えば、Ｃｙ５誘導体）は、それらが結合しているマイクロバブルを蛍光タグ付けする。このような実施形態では、Ｃｙ５誘導体は、代替的に又は付加的に、光学トレーサーとして機能し、当業者に周知の非侵襲的光学イメージング手順を介してマイクロバブルの局在化又は可視化を可能にする。
【００１６】
先のことを念頭に置いて、図１を参照すると、ＵＳＭＢ媒介薬物送達システム１００に存在し得る超音波システム構成要素の例が示されている。理解されるように、このような構成要素は、従来の超音波イメージングシステムに見られるものに対応してもよく、システムは、媒介された治療薬の送達と併せて実際に標的組織を画像化するために使用されてもよい。図示された実施例において、超音波システムは、プローブ１０２を介して超音波信号の発生及び受信に適切な超音波プローブ１０２及び超音波コンソール１０４を備える。特定の実施形態では、超音波コンソール１０４は、超音波エネルギー１０６を患者の組織１０８に誘導し、プローブ１０２で測定された帰還信号を再構成するために使用されるビーム形成器及び画像再構成及び処理回路を備えることができる。例えば、超音波コンソール１０４は、超音波プローブ１０２によって送信された超音波信号の強度、ビームの焦点又は形成、持続時間、位相、及び周波数を制御し、組織からの複数の反射超音波信号に含まれる情報を、複数の識別可能な電気信号及び電子信号に復号することができる。ＵＳＭＢの実施形態では、超音波エネルギー１０６は、標的組織１０８内で、目的の解剖学的位置で治療薬又は診断薬の放出を促進することができる。帰還信号は、コンソール１０４で処理されて、プローブ１０２の下にある目的の解剖学的領域の画像を生成することができる。
【００１７】
超音波システム１００はまた、ユーザがコンソール１０４と対話して制御することを可能にするオペレータインタフェース１１０を含むことができる。オペレータインタフェース１１０は、キーボード、マウス、及び他のユーザインタラクションデバイスを含むことができる。オペレータインタフェース１１０は、ＵＳＭＢ手順のための複数の設定をカスタマイズし、システムレベルの構成変更を行い、オペレータが超音波システム１００を作動させ、動作させるために使用することができる。
【００１８】
図示された実施例において、オペレータインタフェース１１０は、超音波コンソール１０４、表示モジュール１１２、及びプリンタモジュール１１４に接続され、その一部又は全部が超音波ワークステーションとして提供されてもよい。表示モジュール１１２は、超音波コンソール１０４から画像情報を受け取り、超音波プローブ１０２の下にある物体の画像を提示する。プリンタモジュール１１４は、グレースケール又はカラーのいずれかの超音波画像のハードコピーを生成するために使用される。一般に、反射された超音波信号及び対応する画像は、送信された超音波信号に関連して、様々な組織、器官、腫瘍、及び解剖学的構造の厚さ、サイズ、及び位置に関する情報を伝達する。
【００１９】
先のことを念頭に置いて、本主題に関連するいくつかの研究を以下で論じる。遊離の天然ＨＳＡに比べてアルブミンマイクロバブルに対する結合優先性を有する原子団の存在に関して、ＡｐｏＡ−ＩｐＤＮＡとアルブミンマイクロバブル（例えば、Ｏｐｔｉｓｏｎ（商標）バブル）との結合親和性を特徴付けるための研究を行った。図２は、本研究で使用した試料調製方法を例示する。この実施例において、３つの別個の操作が示されている。第１の操作（ステップ２００）では、バブルの分離と遊離アルブミンを除去するための洗浄を行った。第２の操作（ステップ２１８）では、洗浄したバブルをｐＤＮＡ／色素結合溶液と混合した。第３の操作（ステップ２０２）では、２回の生理食塩水又は２回の天然ヒト血清アルブミン洗浄を行い、続いて生理食塩水による再構成を行い、分析用の最終組成物を得た。
【００２０】
第１の操作に関して、この実施例では、マイクロバブル組成物としてＯｐｔｉｓｏｎ（商標）を使用し、それを生理食塩水で１回洗浄して（ステップ２１２）、市販品中に存在する遊離ＨＳＡを除去した。特に、図示された実施例において、マイクロバブル生成物２０６を最初に遠心分離し（ステップ２０８）、底層を除去し（ステップ２１０）、生理食塩水を添加して混合し（ステップ２１２）、続いて追加の遠心分離を行った（ステップ２１４）。遠心分離後、底層を再度除去し、残ったアルブミンマイクロバブルにＤＮＡ／色素組成物を混合した（ステップ２１８）。
【００２１】
この研究では、ＤＮＡ／色素組成物に関して、ｐＤＮＡを最初にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と混合したが、このＰＩはＤＮＡ構造にインターカレートしたときには蛍光を発するが、マイクロバブルとの相互作用の結果として蛍光を発しない（ＰＩの存在は必要である）。上述の通り、ｐＤＮＡ／色素溶液をアルブミンマイクロバブルと混合し（ステップ２１８）、生成物を遠心分離した（ステップ２２０）。得られたマイクロバブル／ＤＮＡ／色素生成物を、９．５ｍｇ／ｍＬの天然ＨＳＡ溶液で２回洗浄し、続いて生理食塩水により再構成し（ステップ２２８）、最終分析生成物２３０を得た（ステップ２２４及び２２６）。他の実験では、異なる洗浄手順を使用した。
【００２２】
この研究では、バブル洗浄の関数としてのマイクロバブルに対するｐＤＮＡの親和性を、蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーを使用して評価した。ｐＤＮＡとアルブミンマイクロバブルとの間の統計的に関連する結合の証拠は観察されなかった。特に、ｐＤＮＡとマイクロバブルとの結合相互作用はいずれも十分に弱く、単純なマイクロバブル分離に続いて生理食塩水洗浄がｐＤＮＡを除去するのに十分であった。
【００２３】
対照的に、問題の薬剤がマイクロバブルに結合することが見出された他の研究を行った。例えば、一組の研究において、調査されたモデル薬剤は、ペグ化Ｃｙ５色素のようなシアニン５（Ｃｙ５）の誘導体であった。一般に、疎水性Ｃｙ５原子団を含むペグ化及び非ＰＥＧ化剤は、アルブミンマイクロバブルに対する良好な結合剤であることが観察されたが、高度にスルホン化されたＣｙ５基を含む薬剤（Ｃｙ５＊＊）は、アルブミンマイクロバブルに対する不十分な結合剤であることが観察された。
【００２４】
図３を参照すると、調査した分子の例が示されている。調査した分子には、Ｃｙ５及びＣｙ５＊＊遊離酸（Ｃｙ５ＣＯＯＨ及びＣｙ５＊＊ＣＯＯＨと呼ばれる）並びに平均分子量５５０ｇ／モル及び２０，０００ｇ／モルを有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で置換された誘導体（標的のサイズを変更するための）が含まれた。Ｃｙ５ＣＯＯＨは市販されており、Ｃｙ５＊＊ＣＯＯＨはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって合成された。ペグ化された分子は、図４の式１及び２に示されるように、それぞれの遊離酸から合成された。吸収極大は、Ｃｙ５色素の２つのクラスについて異なると決定された。研究により、非スルホン化Ｃｙ５の最大蛍光強度を達成する最適な励起波長は６４０ｎｍ（６５５ｎｍでの発光）であり、Ｃｙ５＊＊では６５０ｎｍ（６７０ｎｍでの発光）であることが示された。非スルホン化Ｃｙ５の量子収率は、Ｃｙ５＊＊の１．６倍であると決定されている。
【００２５】
この研究では、図５に示すように、Ｃｙ５を用いた色素／バブル混合物を調製した。図示されたプロセスにおいて、３つの操作が示されている。第１の操作（ステップ２００）では、バブルの分離と遊離アルブミンを除去するための洗浄を行った。第２の操作（ステップ２４０）では、洗浄したバブルを色素結合溶液と混合した。第３の操作（ステップ２４２）では、一連の洗浄ステップが実行された後、生理食塩水による再構成（ステップ２５０）を行い、分析用の最終組成物を得た。
【００２６】
第１の操作に関して、この実施例では、マイクロバブル組成物２０６としてＯｐｔｉｓｏｎ（商標）を使用し、それを生理食塩水で１回洗浄して（ステップ２１２）、市販品中に存在する遊離ＨＳＡを除去した。特に、図示された実施例において、マイクロバブル生成物２０６を最初に遠心分離し（ステップ２０８）、底層を除去し（ステップ２１０）、生理食塩水を添加して混合し（ステップ２１２）、続いて追加の遠心分離を行った（ステップ２１４）。遠心分離後、底層を再度除去し、残ったアルブミンマイクロバブルにＣｙ５色素組成物を混合した（ステップ２４０）。試験したシナリオでは、目的のＣｙ５誘導体及びアルブミンマイクロバブル製剤を室温で混合した。色素溶液とマイクロバブルを混合して得られた生成物を遠心分離した（ステップ２２０）。
【００２７】
得られたマイクロバブル／色素生成物を、１以上の洗浄溶液で洗浄した（ステップ２４４、２４６、２４８）。様々な洗浄シナリオを試験した。第１のシナリオでは、３回の生理食塩水洗浄を行った。第２のシナリオでは、２回の変性ＨＳＡ洗浄及び１回の生理食塩水洗浄を行った。第３のシナリオでは、２回の天然ＨＳＡ洗浄及び１回の生理食塩水洗浄を行った。タンパク質洗浄液には９．５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡが含まれていた。これらの実験で使用された変性ＨＳＡは、市販のＯｐｔｉｓｏｎ（登録商標）製品から単離された可溶性の均質ＨＳＡであった。洗浄した生成物を生理食塩水で再構成し（ステップ２５０）、最終分析生成物２５２を得た。
【００２８】
得られた分析生成物２５２を使用して、Ｃｙ５誘導体とアルブミンマイクロバブルとの結合親和性を評価した。特に、特定の研究において、最終的な色素／マイクロバブル混合物における結合を特徴付けるために、２つの補完的な蛍光ベースのアプローチ：蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーが使用された。
【００２９】
蛍光顕微鏡アプローチでは、複数の視野からの画像を取得し、セグメント化し、バックグラウンド強度を減算し、残りの特徴の数、サイズ及び輝度を計算した。これらの測定値は、画像化されたマイクロバブルに結合したＣｙ５色素に対応すると考えられた。
【００３０】
フローサイトメトリーアプローチでは、流体力学的集束の結果として、マイクロバブルは一度に１つずつレーザーを遮って通過する。マイクロバブルは、事象として登録されたレーザー光を散乱させる。所与のマイクロバブルに関連する任意の蛍光分子（例えば、Ｃｙ５色素誘導体）は、レーザー光を吸収し、得られた蛍光が測定される。蛍光は、対応する散乱事象がある場合にのみ測定される。本研究では、用いた励起波長は６３３ｎｍであり、Ｃｙ５分子とＣｙ５＊＊化合物との量子収率の差を考慮した。
【００３１】
図６から１０は、アルブミンマイクロバブル及びＣｙ５色素の混合物の得られた明視野及び蛍光画像を示す。蛍光画像（下段の画像）は、上述の通り、バックグラウンド信号を差し引いた後に取り込んだ。図６は、２０ｋＰＥＧＣｙ５原子団を使用して得られた画像を示し、図７は、５５０ＰＥＧＣｙ５原子団を使用して得られた画像を示し、図８は、Ｃｙ５ＣＯＯＨ原子団を使用して得られた画像を示し、図９は、２０ｋＰＥＧＣｙ５＊＊原子団を使用して得られた画像を示し、並びに図１０は、５５０ＰＥＧＣｙ５＊＊原子団を使用して得られた画像を示す。
【００３２】
示したように、各蛍光画像は、その上の対応する明視野画像と同じ視野において取り込んだ。複数の視野において取り込まれた画像を使用して、バックグラウンド信号を差し引いた後の各バブルの平均蛍光強度を、各混合／洗浄シナリオについて計算した。計算された値のグラフによる概要を図１１に示す。グラフによる概要では、それぞれのエラーバーは標準偏差±１に対応する。再生画像に見られるように、Ｃｙ５誘導体は持続的結合を示した。逆に、結合がより弱いＣｙ５＊＊化合物は、バブルから容易に洗い流された。
【００３３】
フローサイトメトリーの結果に関して、フローサイトメトリーを使用して、上述の通り様々な洗浄ルーチンの前後両方に、アルブミンマイクロバブルとＣｙ５色素誘導体との混合物における結合を特徴付けた。フローサイトメトリー研究の結果を図１２にグラフで要約しており、マイクロバブル／色素混合物の特徴付けは洗浄サイクルの関数として示され、「ｎＨＳＡ」は天然ヒト血清アルブミンに対応し、「ｄＨＳＡ」は変性ヒト血清アルブミンに対応する。
【００３４】
蛍光顕微鏡検査の研究と一致して、フローサイトメトリーの結果は、疎水性Ｃｙ５を含む誘導体が、生理食塩水及びタンパク質洗浄を通してマイクロバブルへの持続結合を示すことを示している。逆に、親水性Ｃｙ５＊＊誘導体は、はるかに低い濃度で洗浄された試料中に存在する。特に、フローサイトメトリーの結果において、すべての洗浄条件下で、最も小さな最も疎水性の色素であるＣｙ５ＣＯＯＨが、バブルとの最も高いレベルの結合を示した。蛍光顕微鏡検査結果と一致して、２０ｋＰＥＧＣγ５は、生理食塩水洗浄後の５５０ＰＥＧＣγ５よりも強い結合を示したが、タンパク質洗浄後は本質的に同等であった。
【００３５】
理解されるように、記載された蛍光顕微鏡検査及びフローサイトメトリー研究のすべてにおいて、生理食塩水又はＨＳＡの溶液のいずれかを用いて色素／マイクロバブルの洗浄を行った。概して、Ｃｙ５誘導体は、生理食塩水だけでなく、天然及び変性ＨＳＡも用いる洗浄サイクルを通してバブルに持続的に結合することが観察された。さらに、ヒト血清又は全血（ラット）を使用して洗浄した場合、Ｃｙ５誘導体の持続的な結合が観察された。特に、非スルホン化Ｃｙ５がアルブミンマイクロバブルに測定可能かつ永続的に結合することが全体的に観察された。
【００３６】
本明細書に記載の実施例において、アルブミン結合原子団を、マイクロバブル製造後にアルブミンマイクロバブルと混合した。しかし、理解されるように、アルブミン結合原子団は、マイクロバブル生成物中に存在するか、又は結合されるように、マイクロバブル製造プロセスに存在しても、又は含まれてもよい。すなわち、これらのステップは、説明を簡略化するために、本明細書ではそのように説明されているが、別個で離散的である必要はない。したがって、アルブミン結合原子団がバブル製造プロセスに組み込まれる実装もまた、本開示の範囲内にあると考えられる。
【００３７】
Ｃｙ５及びＣｙ５＊＊誘導体がアルブミンマイクロバブルに結合する程度についてのさらなる洞察を得るために、一連の平衡研究を行った。これらの研究の態様は、（１）ｉｎ  ｖｉｖｏ実験により適切な条件下、すなわち大過剰のネイティブＨＳＡの存在下でシステム挙動を特徴付けること、及び（２）目的の蛍光剤が、天然ＨＳＡに比べてマイクロバブル中のＨＳＡに対して有する相対親和性を特徴付けること。これらの実験において、異なるアルブミン濃度（天然又はマイクロバブル中に存在する）を固定濃度の色素（すなわち、Ｃｙ５誘導体）で処理した。アルブミン／色素混合物を遠心ろ過して結合色素を未結合から分離し、未結合色素の蛍光をプレートリーダーを使用して測定した。
【００３８】
バブルを使用した実験のための試料調製方法を図１３に要約する。試料調製ステップに関して、バブル分離及び遊離アルブミンを除去するための洗浄（ステップ２００）を行った。この実施例において、マイクロバブル生成物２０６を最初に遠心分離し（ステップ２０８）、底層を除去し（ステップ２１０）、生理食塩水を添加して混合し（ステップ２１２）、続いて追加の遠心分離を行った（ステップ２１４）。遠心分離後、底層を再度除去し（ステップ２８０）、マイクロバブル生成物２８２を得た。平衡計算を行うために、マイクロバブル生成物２８２について定量ステップ２８４を実施し、その後調査中の個々のＣｙ５誘導体を添加した（ステップ２９０）。得られたマイクロバブル／色素組成物２９２を遠心分離し、ろ過し、プレートリーダーで分析した（ステップ２９４）。
【００３９】
色素とマイクロバブルとの結合平衡に関して、平衡方程式：
（１）Ｘ＝Ｎ×［ＨＳＡ］／（Ｋd＋［ＨＳＡ］）
（式中、Ｘは、（観察された蛍光に基づく）結合したリガンドの割合であり、ｎはＨＳＡ当たりの結合部位の数である）を用いた。平衡式において、ｎ（例えば、Ｃｙ５又はＣｙ５＊＊結合部位の数）は１と仮定される。
【００４０】
先のことを念頭に置いて、天然ＨＳＡに結合した２０ｋＰＥＧＣｙ５色素の割合を様々なアルブミン濃度にわたって測定し、色素とアルブミンマイクロバブルとの混合物において測定した結合割合と比較した。結果は図１４にグラフで示されており、この図は天然ＨＳＡ濃度（左側）及びマイクロバブルアルブミン濃度（右側）の関数として色素（例えばＣｙ５）結合割合のプロファイルを示す。対応する計算された平衡定数を以下の表１に示す。この比は、マイクロバブルアルブミン対遊離の天然ＨＳＡの結合定数の比であり、ＨＳＡ（マイクロバブル）はアルブミンマイクロバブルを構成するアルブミンを指す。Ｋｄは解離定数、Ｋａは会合定数である。
【００４１】
【表１】
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図１４及び表１の両方に見られるように、［マイクロバブルシェル中の色素／アルブミン］の結合定数は、２０ｋＰＥＧＣｙ５及びより弱い結合剤２０ｋＰＥＧＣｙ５＊＊の両方に関して［色素／天然ＨＳＡ］の４．０倍以上である。これは、両方の場合の結合基質がアルブミンであり、唯一の違いは、マイクロバブルシェルの形態のアルブミンが遊離の天然ＨＳＡに比べて優先的に結合するという点で驚くべき結果である。これは、血流中のバブルと遊離アルブミンとの間の色素の平衡分布又は分配に影響を及ぼす可能性が高い。理解されるように、アルブミンマイクロバブルに治療薬又は診断薬を優先的に結合させるためには、他の程度の結合優先性（例えば、２．０超又は３．０超）も有意であり、有用であり得る。提示されたデータが示すように、２０ｋＰＥＧＣｙ５及び２０ｋＰＥＧＣｙ５＊＊の両方が、遊離天然アルブミンと対比してアルブミンマイクロバブルに結合優先性を示したが、これらは、例えば、洗浄後のマイクロバブルとの結合において同じ持続性を示さなかった（図６−１０）。いくつかの実施形態では、結合のより強い非スルホン化Ｃｙ５誘導体が好ましいと思われる。他の実施形態では、結合のより弱い高度にスルホン化されたＣｙ５＊＊誘導体も好ましいと思われる。
【００４２】
これらの結果に基づく計算は、容認可能なｉｎ  ｖｉｖｏ試験条件（例えば、１ｍＬのアルブミンマイクロバブル生成物と混合された２．５μＭの色素１ｍＬ）の下で、色素が２０ｋＰＥＧＣｙ５である場合、それぞれのマイクロバブルは平均して約４２０，０００の結合色素分子を含有することを示唆する。平均して、すべてのバブルアルブミン分子の約５．５％が２０ｋＰＥＧＣｙ５を結合している。対照的に、同じ条件下で、色素が２０ｋＰＥＧＣｙ５＊＊である場合、平均して約１６０，０００個の色素分子が各バブルに結合しており、全バブルアルブミンの約２．２％が色素と会合している。
【００４３】
これらの結果を考慮して、異なるサイズの治療薬及び／又は診断薬を、遊離の天然ＨＳＡに比べて、アルブミンマイクロバブル（例えば、非天然ＨＳＡ又は部分変性及び部分架橋ＨＳＡ）に対して結合優先性を示す原子団（例えば、「テザー」分子）を使用して、アルブミンマイクロバブルに結合させることができる。理論によって制限されることなく、分子内及び分子間の配置並びにバブルの表面形状によって駆動される、バブルシェル中のアルブミン分子の長距離構造も、観察される結合優先性において役割を果たす可能性がある。特定の実施形態では、原子団（例えば、Ｃｙ５又はＣｙ５誘導体）は、目的の治療薬又は診断薬の官能基として、付加された基又は目的の薬剤に本来存在する基のいずれかとして提供され得る。他の実施形態では、治療薬又は診断薬は、その化学構造の一部として、Ｃｙ５又はＣｙ５誘導体ではないが、遊離天然アルブミンと対比してマイクロバブル中のアルブミンに結合優先性を有する原子団を含む。アルブミンマイクロバブル、結合原子団（内因性又は付加物）、及び薬剤のこれらの組合せのいずれも、超音波マイクロバブル（ＵＳＭＢ）媒介薬剤送達システムに使用することができる。
【００４４】
このような治療用組成物を調製するための一実施形態を図１５に示す。図示された実施例において、遊離アルブミンを除去するために任意選択の洗浄ステップ２００を実施して、その後、薬剤／結合剤を添加してもよい（ステップ２６０）。次いで、生成物を、場合により生理食塩水などの別の組成物で任意に洗浄（ステップ２６２）し、未結合の薬剤／結合剤を実質的に除去して、その後、対象へ投与する（例えば、洗浄ステップ２６４及び分離ステップ２６６）。他の実施形態では、追加の洗浄を実施する。さらに他の実施形態では、洗浄は実施しない。薬剤／結合剤の添加後に洗浄を行う実施形態では、次いで、患者に投与するための治療用生成物２７０を生成するために、例えば生理食塩水を使用して組成物を再構成してもよい（ステップ２６８）。
【００４５】
本明細書において述べたように、特定の実施形態では、結合優先性を示す原子団は、光学トレーサー（例えば、蛍光タグ）として作用することができる。このような実施形態では、この原子団の光学的又は蛍光的特性は、診断用途、例えば、ＵＳＭＢ手順などの際に目的の解剖学的領域に対して結合したマイクロバブルの位置をモニター又は可視化するために使用することができる。アルブミンマイクロバブルに（遊離の天然ＨＳＡに比べて）結合優先性を示す原子団の例としては、限定するものではないが、Ｃｙ５誘導体が挙げられる。
【００４６】
本発明の技術的効果としては、遊離の天然ＨＳＡに比べてアルブミンマイクロバブルに対して結合優先性を示す１以上の原子団が結合したアルブミンマイクロバブルの組成物が挙げられる。１以上の原子団は、治療薬又は診断薬で官能化されてもよい。他の技術的効果としては、原子団と結合したアルブミンマイクロバブルを使用した超音波マイクロバブル媒介薬剤送達の実施が挙げられる。
【００４７】
本明細書は、最良の様式を含む本発明を開示するため、及びどのような当業者も、任意の装置又はシステムの製造及び使用並びに任意の組み込まれた方法の実行を含む本発明の実践を可能にするために、実施例を使用している。本発明の特許となり得る範囲は特許請求の範囲により規定され、当業者が思いつく他の実施例を含み得る。このような他の実施例は、特許請求の範囲の文面と異ならない構造要素を有する場合、又は特許請求の範囲の文面と非実質的な相違を有する等価の構造要素を含む場合、特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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