(57)【要約】第1結合ドメインでFcε受容体（FcεR）に結合し、第2結合ドメインでFcγ受容体IIB（FcγRIIB）に結合する認識分子、およびそのような認識分子の使用を本明細書に開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1結合ドメインでFcε受容体（FcεR）に結合し、かつ第2結合ドメインでFcγ受容体IIB（FcγRIIB）に結合する、認識分子。
【請求項２】
抗体である、請求項1に記載の認識分子。
【請求項３】
前記抗体がFcγ受容体IIA（FcγRIIA）に結合しない、請求項2に記載の認識分子。
【請求項４】
前記抗体が、該抗体の可変領域を介するFc受容体への該抗体の結合が細胞への免疫複合体または凝集IgGの結合を妨げない非ブロッキング抗体である、請求項2または3に記載の認識分子。
【請求項５】
前記抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項4に記載の認識分子。
【請求項６】
前記第1結合ドメインがIgE定常領域の少なくとも一部を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項７】
前記第2ドメインがFabドメインの少なくとも一部を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項８】
前記第2結合ドメインが、少なくとも（i）アミノ酸配列SEQ ID NO: 1に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ii）アミノ酸配列SEQ ID NO: 2に対して少なくとも65％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項９】
前記第2結合ドメインが、（i）アミノ酸配列SEQ ID NO: 3に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ii）アミノ酸配列SEQ ID NO: 4に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、のうちの少なくとも1つを含有する、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項１０】
前記認識分子が、その第2結合ドメインにおいて、重鎖および軽鎖可変領域の以下のCDR配列：
（i）SEQ ID NO: 20に示されるH-CDR1配列と60％以上同一であるH-CDR1配列、
（ii）SEQ ID NO: 21に示されるH-CDR2配列と36％以上同一であるH-CDR2配列、
（iii）SEQ ID NO: 22に示されるH-CDR3配列と50％以上同一であるH-CDR3配列、
（iv）SEQ ID NO: 23に示されるL-CDR1配列と64％以上同一であるL-CDR1配列、
（v）SEQ ID NO: 24に示されるL-CDR2配列と29％以上同一であるL-CDR2配列、および
（vi）SEQ ID NO: 25に示されるL-CDR3配列と78％以上同一であるL-CDR3配列
を含み、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、該認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項１１】
前記認識分子が、その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 29、30および31に示されるH-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含み、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 32、33および34に示されるL-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含み、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、該認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる、請求項10に記載の認識分子。
【請求項１２】
その重鎖および軽鎖可変領域において、以下のCDR配列：
（a）その重鎖可変領域におけるSEQ ID NO: 14（CDR-H1）、SEQ ID NO: 15（CDR-H2）、およびSEQ ID NO: 16（CDR-H3）、ならびにその軽鎖可変領域におけるSEQ ID NO: 17（CDR-L1）、SEQ ID NO: 18（CDR-L2）、およびSEQ ID NO: 19（CDR-L3）；または
（b）その重鎖可変領域におけるSEQ ID NO: 20（CDR-H1）、SEQ ID NO: 21（CDR-H2）、およびSEQ ID NO: 22（CDR-H3）、ならびにその軽鎖可変領域におけるSEQ ID NO: 23(CDR-L1）、SEQ ID NO: 24（CDR-L2）、およびSEQ ID NO: 25（CDR-L3）
を含む、請求項10または11に記載の認識分子。
【請求項１３】
重鎖可変領域が、位置1のアミノ酸QのEへの置換、位置11のアミノ酸VのLへの置換、位置42のアミノ酸GのKへの置換、位置50のアミノ酸SのVへの置換、位置53のアミノ酸YのSへの置換、位置58のアミノ酸KのTへの置換、位置61のアミノ酸GのAへの置換、位置75のアミノ酸SのTへの置換、位置76のアミノ酸KのRへの置換、位置77のアミノ酸NのSへの置換、および位置78のアミノ酸TのNへの置換からなる群より選択される変異のうちの少なくとも1つを伴う、SEQ ID NO: 3に示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項１４】
軽鎖可変領域が、位置1のアミノ酸QのNへの置換、位置28のアミノ酸SのNへの置換、位置31のアミノ酸SのTへの置換、位置33のアミノ酸VのLへの置換、位置34のアミノ酸DのAへの置換、位置49のアミノ酸YのFへの置換、位置53のアミノ酸TのNへの置換、位置55のアミノ酸YのAへの置換、位置89のアミノ酸LのQへの置換、および位置93のアミノ酸NのYへの置換からなる群より選択される変異のうちの少なくとも1つを伴う、SEQ ID NO: 4に示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項１５】
Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項１６】
前記第2結合ドメインが、その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 1もしくは3に示されるアミノ酸配列を有し、かつ／またはその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 2もしくは4に示されるアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項１７】
前記IgE定常領域が、SEQ ID NO: 35、36、またはその一部のアミノ酸配列を有する、請求項6〜16のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項１８】
前記抗体がグリコシル化または脱グリコシル化されている、請求項2〜17のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項１９】
前記抗体が、インビトロで少なくとも4.9×10-4s-1の解離速度定数を有する親和性でヒトFcγRIIBに結合する、請求項2〜18のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項２０】
前記抗体が、インビトロで少なくとも1.2×10-7 Kd（M）を有する親和性でヒトFcεRIに結合する、請求項2〜19のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項２１】
SEQ ID NO: 7に記載のヒトFcγRIIBのアミノ酸20〜40を含むエピトープに特異的に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項２２】
請求項1〜21のいずれか一項に記載の認識分子をコードする核酸配列。
【請求項２３】
ベクター中に挿入された請求項22に記載の核酸配列のうちの少なくとも1つを含むベクター。
【請求項２４】
請求項22に記載の核酸配列または請求項23に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２５】
請求項1〜21のいずれか一項に記載の認識分子、請求項22に記載の核酸、請求項23に記載のベクター、または請求項24に記載の宿主細胞を有効成分として含む、薬学的組成物。
【請求項２６】
好塩基球と関連する疾患の治療または予防のための、請求項25に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
アレルギーの治療または予防のための、請求項26に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
治療における使用のための、請求項1〜21のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項２９】
好塩基球と関連する疾患の治療または予防のための使用のための、請求項1〜21のいずれか一項に記載の認識分子。
【請求項３０】
好塩基球と関連する前記疾患がアレルギー性疾患である、請求項29に記載の使用のための認識分子。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗体は、抗原に結合し、抗原がその内因性標的（例えば、受容体またはリガンド）に結合するのを妨げることによって、または抗原除去に至るエフェクター反応を誘導することによって、抗原を中和する。身体にとって異物である抗原を効率的に除去および／または破壊するために、抗体は、その抗原に対する高い親和性および効率的なエフェクター機能の両方を示すべきである。多重特異性を有する抗体（例えば、二重特異性抗体）は、複数の抗原の相補的または相乗的な反応の媒介に有用である。
【０００２】
抗体エフェクター機能は抗体Fc領域によって媒介される。エフェクター機能は次の2つのカテゴリーに分類される：（1）抗体の抗原への結合後に作動するエフェクター機能（当該機能には補体カスケードまたはFc受容体（FcR）保有細胞が関与する）；ならびに（2）抗原への結合とは無関係に作動するエフェクター機能（当該機能は、循環中の抗体の残存、およびトランスサイトーシスによって細胞バリアを横切って移動されるその能力を与える）。Fc受容体は、当該受容体のコグネイト抗体（cognate antibody）のFc領域に結合することによって抗体エフェクター機能を媒介するため、FcRは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性によって定義される：IgG抗体に対して特異的なFc受容体はFcγRと呼ばれ；IgE抗体に対するFc受容体はFcεRであり；IgA抗体に対するFc受容体はFcαRであるなどである。
【０００３】
FcγRの3つのサブクラスが同定されている：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）。FcγRIIBは、細胞質ドメイン中のITIMモチーフ（共通配列：V/I-X-Y-X2-V/L、Isakov (1997), Immunol Res. 16, 85-100（非特許文献1））の存在により特徴付けられ、Ig凝集体またはICの結合およびITAM保有活性型Fcγ受容体との共連結が起こるとLynキナーゼによりITIMモチーフがリン酸化される。リン酸化されたITIMはイノシトールポリホスフェート5’-ホスファターゼ（SHIP）のSH2ドメインを引き寄せ、これにより、ITAM含有FcγR媒介チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールメッセンジャーが加水分解され、結果的に細胞内Ca2+の流入が妨げられる。FcγRIIBの架橋はFcγR連結に対する活性化応答を抑制し、これにより、B細胞の活性化、増殖および抗体分泌が抑制される。
【０００４】
Fcε受容体（FcεR）は、ヒトにおいて肥満細胞および好塩基球の表面上、ならびに好酸球、単球、マクロファージおよび血小板上に見られる。高親和性IgE受容体であるFcεRI（I型Fcε受容体）、および低親和性IgE受容体であるCD23としても公知のFcεRII（II型Fcε受容体）という、2つのタイプのFcε受容体がある。IgEは、両方のタイプのFcε受容体の発現をアップレギュレートすることができる。
【０００５】
免疫グロブリンE（IgE）は、哺乳動物においてのみ見つかった抗体クラス（または免疫グロブリン（Ig）「アイソタイプ」）である。IgEは、2つの重鎖（ε鎖）および2つの軽鎖からなるモノマーとして存在し、ε鎖は4つのIg様定常ドメイン（Cε1〜Cε4）を含有する。IgEはまた、I型過敏症において必須の役割を果たし（Gould H et al. (2003), Annu. Rev. Immunol. 21: 579-628（非特許文献2））、これは、様々なアレルギー性疾患、例えば、アレルギー性喘息、大抵のタイプの副鼻腔炎、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、ならびにいくつかのタイプの慢性じんま疹およびアトピー性皮膚炎を示す。IgEはまた、アレルギー状態、例えば、特定の薬物、ハチ刺傷、および特定の脱感作免疫療法において使用される抗原調製物に対するアナフィラキシー反応において中心的な役割を果たす。
【０００６】
IgEは、肥満細胞および好塩基球の表面上に見られるFcεRに結合することによってIgE媒介アレルギー反応をプライミングする。肥満細胞上のFcεRIと既に結合しているIgEに抗原が結合すると、結合したIgEの架橋およびその下にあるFcεRIの凝集が誘導され、脱顆粒および細胞からのメディエーターの放出が誘導される。好塩基球は、その表面IgEが抗原により架橋されると、インターロイキン-4（IL-4）およびインターロイキン-13（IL-13）のような2型サイトカインならびに他の炎症性メディエーターを放出する。低親和性受容体（FcεRII）はB細胞上で常に発現されているが、その発現は、IL-4によってマクロファージ、好酸球、血小板、およびいくつかのT細胞の表面上で誘導され得る。
【０００７】
肥満細胞および好塩基球は、IgE依存性アレルギー反応および他の多くの急性または慢性炎症過程において重要な免疫調節細胞および中心的なエフェクター細胞である。これらの細胞タイプは、IgGに対する受容体およびIgEに対する受容体の両方を有する。肥満細胞および好塩基球などのアレルギー性エフェクター細胞上のIgEに対する高親和性受容体（FcεRI）の活性化は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）（ITAM）を介して多数のポジティブシグナルを誘発し、アレルギー性炎症反応の急速な発現を誘導する。それと拮抗するものとして、IgG受容体FcγRIIBの共凝集は、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）（ITIM）を介して抑制シグナルを媒介する。
【０００８】
Fc受容体発現およびシグナリングの正および負の調節における前進は、免疫系におけるFc受容体の役割に光を当て、それらが二機能性、抑制性および活性化性の構造体であることを示している。これらの知見に基づいて、FcεRIおよびFcγRIIBを同時に活性化するキメラ融合タンパク質の使用のような新しい治療戦略が開発された。これらの新しいアプローチは、Fc受容体の二価の特徴を利用し、アレルギー性免疫反応を調節するための革新的な戦略のための道を開く。そのようなキメラ融合タンパク質の例はWO2002/088317（特許文献1）に開示されている。
【０００９】
しかし、先行技術においてさらにより多くのそのようなキメラ融合タンパク質が公知であるという事実（WO2006/028956（特許文献2）も参照のこと）にもかかわらず、依然として、少なくとも2つの機能を発揮する（一方はFcε受容体に結合し、もう一方はFcγ受容体IIBに結合し、それによって両方の受容体を共凝集させる）改善されたキメラ融合タンパク質を提供することが非常に望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO2002/088317
【特許文献２】WO2006/028956
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Isakov (1997), Immunol Res. 16, 85-100
【非特許文献２】Gould H et al. (2003), Annu. Rev. Immunol. 21: 579-628
【発明の概要】
【００１２】
本開示は、本明細書の以下において記載され、特許請求の範囲において特徴付けられ、添付の実施例および図によって説明される、認識分子の提供によって、前記の需要を満たす。
【００１３】
好塩基球または肥満細胞上でのIgE受容体とIgG受容体（FcγRIIb）の凝集はアレルゲン誘発性の細胞脱顆粒を抑制することが公知であるため（Daeron (1997), Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 138-141）、本発明者らは、いわば、IgEにより媒介される肥満細胞および好塩基球の活性化を抑制する目的でこれらの2つの受容体を架橋するまたは共凝集させるだけでなく、好塩基球および／または肥満細胞と関連する疾患（例えば、アレルギー性疾患）の治療を改善する目的でFcγRIIBの負の調節機能を増強する、認識分子を提供する。本明細書において上述したように、肥満細胞および好塩基球などのアレルギー性エフェクター細胞上のIgEに対する高親和性受容体（FcεRI）の活性化は、アレルギー性炎症反応の急速な発現を誘導する。それと拮抗するものとして、IgG受容体FcγRIIBの共凝集は、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ITIM）を介して抑制シグナルを媒介する。従って、本発明者らは、理論によって拘束されないが、FcγRIIBおよびFcε受容体の共凝集によってもたらされるFcγRIIBの公知のITIMリン酸化（Zhu et al. (2002), Nat. Med. 8（5）, 518-521を参照のこと）を増強／強化することが、予め形成されたメディエーターの放出ならびに後に作用するロイコトリエンおよびケモカインの合成（これらは全て例えばアレルギー性疾患に寄与する）に至る、IgEの結合によるFcε受容体の活性化機能と拮抗するまたはさらには打ち勝つことにおいて有利であり得ると仮定した。
【００１４】
この目標を考慮したところ、大変驚いたことに、本発明者らは、本開示によって提供される認識分子（特に抗体）がFcγRIIBのITIMリン酸化を著しく増加させる（それに伴って恐らく、FcγRIIBおよびFcε受容体を共凝集させることによって既に達成されている抑制シグナルが増強され、その結果、それは理想的には、IgEの結合によるFcε受容体の活性化によってトリガーされる活性化シグナルに打ち勝つ）ことを観察した。従って、本明細書に開示される認識分子（特に抗体）は、2つの有利な機能（当該分子は、FcγRIIBおよびFcεRを架橋し、それによってITIMリン酸化およびそれに伴うFcεRシグナリングの抑制が誘導される；ならびに、当該分子は、FcγRIIBへの当該分子の結合を通してFcγRIIBのITIMリン酸化自体を増強し、それによって、好塩基球および肥満細胞におけるFcε受容体シグナリングが再度抑制される）を提供する。従って、本開示の認識分子（特に抗体）は、肥満細胞および／または好塩基球と関連する疾患に大きく寄与する細胞におけるFcγRIIB媒介シグナリングの抑制役割に対して2倍の効果を発揮する。好塩基球および肥満細胞におけるこのFcγRIIB媒介抑制シグナリングを利用するために、本発明者らは本開示の認識分子（特に抗体）を提供し、これらは驚くべきことに、ITIMリン酸化に対して、例えば先行技術におけるFcγRIIBに対する公知の抗体と比較して遥かに強い効果を示し、このことは予想することができなかった。そのようなより強い効果は有利であり、何故ならば、それは、肥満細胞および／または好塩基球における抑制シグナリングを助け、従って、肥満細胞および好塩基球（これらは両方とも例えばアレルギー性疾患の発症および発現において主要な役割を果たす）のIgE媒介活性化を抑制するためである。
【００１５】
図30から理解され得るように、本明細書に開示される抗-FcγIIB受容体-IgE抗体は実際に、花粉による好酸球活性化後の活性化好酸球の数（55.1％）を未処理好酸球に匹敵するレベル（10.6％；未処理好酸球の9.5％と比較して）まで減らすことができる。これは、例えばアレルギー性疾患に関与する細胞の負の調節（IgEのアレルゲンへの結合および該IgEのFcドメインによるFcε受容体への結合を介してアレルゲンによって当該細胞が活性化された後の当該細胞の負の調節）におけるそのような抗体の効力を示している。好酸球は肥満細胞および／または好塩基球と共にアレルギー性疾患に関与する。従って、FcγRIIBおよびFcε受容体の共凝集によってもたらされるFcγRIIBの公知のITIMリン酸化（Zhu et al. (2002), Nat. Med. 8（5）, 518-521を参照のこと）を増強／強化することが、IgEの結合によるFcε受容体の活性化機能と拮抗するまたはさらには打ち勝つことにおいて有利であり得るという本発明者らの仮定は、例えばアレルギー性疾患との戦いにおいて実際に有益であり得る。
【００１６】
FcγRIIBに結合する先行技術の認識分子からは、特に、本明細書に開示される認識分子（例えば抗体）について、ポリペプチドの有利な特性は予想されることも予見されることもできたものではなく、それどころか、それら（特に、本明細書において特徴付けられるような抗体のCDRまたは可変重鎖および／もしくは軽鎖）を提供する合理的な成功の期待はなかった。この改善された特性に加えて、本明細書に記載される認識分子はまた、有利なことに、ヒトFcγRIIBに対して高い特異性を有しかつ／または非ブロッキング性であり、即ち、それらの可変領域を介してのFc受容体へのそれらの結合は、細胞への免疫複合体（IC）または凝集IgGの結合を妨げない。
【００１７】
有利には、本明細書に開示される抗体などの認識分子は、Fcε受容体（FcεR）およびFcγ受容体IIB（FcγRIIB）を発現する細胞へ「シス」で結合する、即ち、前記認識分子は、FcεRおよびFcγRIIBを発現している同じ細胞上のFcεRおよびFcγRIIBに結合する。認識分子のこの特性は、ヘパリン添加全血へ抗原を添加しないことを除いては、実施例5に記載される好塩基球活性化試験に従って容易に試験することができる。簡潔には、ヘパリン添加全血を本明細書に開示される認識分子と接触させる。続いて、全血を、全血中の好塩基性細胞上の分子CD63に結合する検出抗体（検出可能な標識（例えば蛍光標識）によって特徴付けられる）と共にインキュベートし、閾値レベルを超えてCD63を発現する細胞の数を（例えばFACS技術（蛍光標識細胞分取）によって）測定する。閾値レベルは、前記認識分子と接触させていないヘパリン添加全血（これは対照に相当する）に基づいて決定され得る。細胞が閾値レベルを超えてCD63を発現しない場合、認識分子は優先的にシスで結合し、一方、閾値レベルを超えるCD63発現は、認識分子がトランスで細胞に結合すること、即ち、認識分子が、第1細胞上のFcεRおよび第2細胞上のFcγRIIBに、または第1細胞上のFcγRIIBおよび第2細胞上のFcεRに結合することを示す。しかし、述べたように、本開示の文脈においてはシス結合性の認識分子が好ましい。
【００１８】
従って、本開示は、第1結合ドメインでFcε受容体（FcεR）に結合し、第2結合ドメインでFcγ受容体IIB（FcγRIIB）に結合する、認識分子を提供する。
【００１９】
本開示の認識分子は、それらのFc部を介するFcε受容体RI（FcεRI）への結合について身体の自らの病原性IgE抗体と競合し、同時にFcεRIとFcγRIIBを架橋すると考えられる。この作用様式は、結合したIgEのアレルゲン特異性とは無関係に肥満細胞および／または好塩基球からのメディエーター放出を妨げると考えられる。この機序は、例えば、アトピー性ドナー（即ち、アレルゲンに反応して過敏性免疫反応を示す素因を有するドナー）に由来するFcεRI発現性好塩基球を使用することによって、本発明者らによって特徴付けられた。本明細書に開示される認識分子で処理された上述のアトピー性ドナーのアレルゲン負荷好塩基球は、添付の実施例において実証されるように、対照と比較して有意に減少した活性化を示した。
【００２０】
「認識分子」は、本明細書において使用される場合、第1結合ドメインでFcε受容体（FcεR）に結合し、第2結合ドメインでFcγ受容体IIB（FcγRIIB）に結合する、1つまたは複数の結合ドメインを含むポリペプチドである。認識分子は、前記1つまたは複数の結合ドメインについての足場を提供し、その結果、前記結合ドメインは、所定の標的構造体／抗原／エピトープと結合／相互作用することができる。例えば、そのような足場は、プロテインA、特にそのZドメイン（アフィボディ）、ImmE7（免疫タンパク質）、BPTI/APPI（Kunitzドメイン）、Ras結合タンパク質AF-6（PDZドメイン）、カリブドトキシン（サソリ毒）、CTLA-4、Min-23（ノッチン）、リポカリン（アンチカリン（anticalin））、ネオカルジノスタチン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、またはチオレドキシンによって提供され得る（Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004); Nygren and Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol. 7, 463-469 (1997)）。好ましい認識分子は抗体である。
本発明の認識分子の結合ドメインはリンカーを介して連結され得る。リンカーはペプチドリンカーであり得る。リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上のアミノ酸を含み（またはからなり）得る。ペプチドリンカーの好ましい例は、（G4S）n（nは1〜5の範囲内の整数）；（AP）2；（AP）4；（AP）5-7である。
用語「結合ドメイン」は、その標的分子（FcεRおよびFcγRIIBそれぞれ）上の所定の標的エピトープまたは所定の標的部位と特異的に結合／相互作用することができるドメインを本開示に関して特徴付ける。結合ドメインは、結合ドメインドナー（例えば、抗体または上述の足場のいずれか）に由来し得る。
用語「結合ドメイン」は、本明細書において使用される場合、結合ドメインが、能動的に標的に結合し得るか、または、例えば受容体によって、受動的に結合され得ることを包含する。従って、結合ドメインは、本発明の開示される分子の意味において、Fc受容体などの受容体のリガンドであり得る。
【００２１】
認識分子の好ましい結合ドメインはFabドメインの少なくとも一部である。「Fabドメイン」は、本明細書において使用される場合、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域、または、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域に由来するCDRおよび／もしくはフレームワーク領域を包含する。従って、可変領域、例えば重鎖および／もしくは軽鎖可変領域、または、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のCDRおよび／もしくはフレームワーク領域が、本明細書に記載される結合ドメインに含まれることが好ましい。従って、認識分子は、好ましくは、第1および第2結合ドメインとして、Fabドメイン、好ましくは、可変領域、例えば重鎖および／もしくは軽鎖可変領域、または、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のCDRおよび／もしくはフレームワーク領域を含む。
【００２２】
認識分子の別の言及される結合ドメインは、IgGもしくはIgE抗体の定常領域（もしくはドメイン）（Fcドメイン）またはその部分である。Fcドメインの「部分」は、本明細書において使用される場合、好ましくは、それがFcε受容体またはFcγIIB受容体などのそのコグネイトFc受容体によって結合されるような長さのものである。
【００２３】
従って、好ましい認識分子は、好ましくは、第1および第2結合ドメインとして、IgGもしくはIgE抗体のFcドメインまたはその部分を含み、当該部分は、それぞれ、FcγIIB受容体またはFcε受容体によって結合される。
【００２４】
また、本開示の認識分子が、第1結合ドメインとして、Fcε受容体に結合する、Fabドメイン、好ましくは可変領域、例えば重鎖および／もしくは軽鎖可変領域、または、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のCDRおよび／もしくはフレームワーク領域、ならびに、第2結合ドメインとして、FcγIIB受容体によって結合されるIgGのFcドメインまたはその部分を含むことが好ましい。
【００２５】
本開示の認識分子が、第1結合ドメインとして、Fcε受容体によって結合されるIgEのFcドメインまたはその部分、ならびに、第2結合ドメインとして、FcγIIB受容体に結合する、Fabドメイン、好ましくは可変領域、例えば重鎖および／もしくは軽鎖可変領域、または、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のCDRおよび／もしくはフレームワーク領域を含むことがより好ましい。
【００２６】
用語「エピトープ」は、抗原上の、結合ドメインが特異的に結合する部位を指す。「エピトープ」は抗原性であり、従って、エピトープという用語は、本明細書において「抗原構造」または「抗原決定基」と呼ばれることもある。従って、結合ドメインは「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用はまた「特異的認識」を定義すると理解される。好ましいエピトープは、本発明の意味において、それぞれ、Fcε受容体およびFcγIIB受容体内に位置している。好ましくは、そのようなエピトープは、これらの2つのFc受容体のいずれかの細胞外部分に位置している。
「エピトープ」は、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次元折り畳みによって並置される非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線形エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。線形エピトープは、典型的には、ユニーク配列中に少なくとも3個、または少なくとも4個、より通常は、少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、例えば、約8〜約10個のアミノ酸を含む。
「コンフォメーショナルエピトープ」は、線形エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。典型的には、コンフォメーショナルエピトープは、線形エピトープと比べて増加した数のアミノ酸を含む。コンフォメーショナルエピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原（好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそのフラグメント）の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造が形成されると、コンフォメーショナルエピトープを形成する特定のアミノ酸および／またはポリペプチド骨格は並置された状態になり、三次元構造でのみ存在する三次元エピトープを抗体が認識できるようになる。エピトープのコンフォメーションを決定する方法としては、X線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴（2D-NMR）分光分析および部位特異的スピンラベリングおよび電子常磁性共鳴（EPR）分光分析が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の認識分子（特に抗体）の結合ドメインは、FcεRおよびFcγRIIBに対し、有利にはそれぞれに特異的に結合する。用語「に結合する（ことができる）」、「特異的に認識する」、「に対する」および「と反応する」は、本発明によれば、結合ドメインが、エピトープの1つまたは複数（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、または少なくとも4個）のアミノ酸と特異的に相互作用できることを意味する。
【００２８】
用語「Fcγ受容体IIB」は、「FcgRIIB」または「Fcγ受容体IIB」または「Fcγ受容体IIB」または「FcγRIIB」と交換可能に本明細書において使用され、膜型FcγRIIBおよび可溶性FcγRIIB（即ち、FcγIIB受容体の細胞外部分）の両方を含む。前記用語はまた、FcγRIIBの変異体、例えば、FcγRIIB1およびFcγRIIB2を含み、これらはFcγRIIB1の細胞質ドメイン中の19アミノ酸配列挿入で互いに異なる。前記用語によって包含される別の変異体は、FcγRIIB2と同一であるが推定シグナルペプチダーゼ切断部位についての情報が欠落している、FcγRIIB3である。
FcγRIIBは「CD32B」と呼ばれる場合もある。従って、この用語および上述したようなFcγ受容体IIBを指定するために用いられる他の用語は、用語「CD32B」と交換可能に用いられ得る。Fcγ受容体IIBは、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーに属しており、多くの造血系の表面で見られる。その名称が示しているように、Fc受容体IIBは、抗体のFc（結晶化可能フラグメント）部、即ち、抗体の両重鎖の2つのC末端ドメインに対応し、典型的にはエフェクター分子および細胞と相互作用するフラグメントを認識して結合する。好ましいFcγRIIBはSEQ ID NO: 5に示される。好ましい可溶性FcγRIIBはSEQ ID NO: 12に示される。
【００２９】
「可溶性FcγRIIB」は「sFcγRIIB」とも呼ばれる。本明細書において使用されるように、用語「可溶性Fcγ受容体IIB」および類似の用語は、Fcγ受容体IIBの細胞外部分を指す。そのような部分は液体に溶解させることができる。一般に、任意のFcγRクラス、アイソフォームまたはアレルの可溶性形態は、先行する「s」により区別され得、例えば、sCD32またはsFcγRIIは可溶性FcγRII受容体を指す。典型的には、膜型（即ち、膜結合性）FcγRとは対照的に、可溶性FcγRは、膜貫通領域や細胞質内末端を含まない。
【００３０】
好ましくは、開示されるFcγRIIBは、ヒト起源のもの即ちヒトFcγRIIBである。用語「ヒト起源の」は、最も広い意味で解釈されるべきである。一般に、それは、FcγR（またはその領域もしくはフラグメント）が、アミノ酸配列および／または構造の点で、ヒトFcγR（即ち、人体において見られるタンパク質）に似ているかまたは同様であることを意味する。
【００３１】
あるいは、「ヒト起源の」FcγRIIBは、例えば、Sondermann and Jacob (1999), Biol. Chem. 380（6）, 717-721に記載されているように、宿主細胞中での組換え核酸の発現により得られる組換えFcγRIIBであり得る。簡潔には、関心対象の遺伝子は、生物から得られ、ベクター、例えばプラスミドまたはウィルス中に導入され、これは、次いで、組換え遺伝子を発現し組換えタンパク質産物を産生する宿主細胞中に遺伝子を移入するために用いられる。当業者は、例えば、薬学的組成物の作製に適しているFcγRIIBを得るためにどの宿主細胞を選択するかを容易に知るであろう。例えば、いくつかの態様において、グリコシル化されていないFcγRIIBが所望されてもよい。その場合、当業者は、タンパク質グリコシル化に必要な酵素機構を欠いているFcγRIIBの発現のために原核生物の宿主細胞を選択してもよい。一態様において、FcγRIIBは、WO00/32767の記載に従って、原核細胞中において発現され、続いて精製され再度折り畳まれてもよい。
【００３２】
別の態様において、FcγRIIBは、真核生物の発現システムにおいて産生され得る。適切なシステムは、細胞外タンパク質の産生用の特殊な器官を有する真核細胞、例えば、B細胞を含む。他に可能性のある真核生物の発現システムとしては、CHOまたはHEK細胞が挙げられるが、これらに限定されない。従って、前記可溶性FcγRIIBは、組換えの、可溶性で、グリコシル化されたFcγRIIBである。
【００３３】
本明細書において言及されるFcγRIIBは、野生型FcγRと比較して、アミノ酸配列に関して修飾または変更されている（例えば、追加のグリコシル化部位などを含む）FcγRIIBをさらに包含する。しかし、FcγRIIBの非グリコシル化形態も想定され、FcγRIIBの有用な態様である。
【００３４】
本開示の目的について、FcεRはFcεRIおよびFcεRIIの両方を含む。「FcεR」または「Fcε受容体」などの用語も本明細書において使用され、これらは全て、IgEの定常領域またはその部分に結合する受容体を示す。従って、これらの用語は全て交換可能に使用され得る。
【００３５】
本開示の認識分子の好ましい第1および第2結合ドメインは抗体に由来し、好ましくは、前記第1および／または第2結合ドメインは、抗体の部分、例えば、抗体の、Fabドメイン、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域、または、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域に由来するCDRおよび／もしくはフレームワークである。
【００３６】
あるいは、本明細書に開示される認識分子の意味における結合ドメインは、Fcε受容体またはFcγ受容体IIBなどのFc受容体によって結合される定常領域（定常ドメイン）または少なくともその部分であり得ることが好ましい。従って、第1および第2結合ドメインの両方が、抗体の定常領域または少なくともその部分、例えば、Fcε受容体またはFcγ受容体などのFc受容体によって結合されるIgGのFc領域またはIgEのFc領域であり得ることが、好ましい態様である。従って、第1結合ドメインは、好ましくは、Fcε受容体によって結合されるIgEのFc領域またはその部分であり得る。第2結合ドメインは、好ましくは、FcγRII受容体によって結合されるIgGのFc領域またはその部分であり得る。
【００３７】
あるいは、第1結合ドメインは、好ましくは、Fcε受容体に結合する抗体の少なくとも一部であり得、第2結合ドメインは、IgG定常領域の少なくとも一部、またはFcγIIB受容体によって結合されるその部分であり得る。そのような分子は有用な認識分子であり、一態様においては本明細書に開示される抗体と見なされ、即ち、それは、可変ドメインおよび定常領域、例えばIgG Fc領域を有する。
【００３８】
同様に、第1ドメインは、好ましくは、IgE定常領域の少なくとも一部、またはFcε受容体によって結合されるその部分であり得、第2ドメインは、FcγIIB受容体に結合する抗体の少なくとも一部であり得る。そのような分子は有用な認識分子であり、一態様においては本明細書に開示される抗体であり、即ち、それは、可変ドメインおよび定常領域、例えばIgE Fc領域を有する。
【００３９】
本明細書に記載されるような認識分子の（FcγIIB受容体に結合する）第2結合ドメインがFabドメインの部分である場合、好ましくは、当該ドメインは、その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 29、30および31に示されるH-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含み、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 32、33および34に示されるL-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含み、ここで、前に定義されるような第2結合ドメインを有する認識分子（好ましくは抗体）は、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる。
先行技術の抗体であるGB3（WO2005/051999を参照のこと）および2B6（WO2004/016750を参照のこと）は、本明細書に開示される認識分子（好ましくは抗体、例えば8A6（キメラまたはヒト化8A6抗体のいずれか））によって増加され得るようには、FcγRIIBのITIMリン酸化を増加させることができないことが、図7から明らかである。従って、FcγRIIBのITIMリン酸化を増加させる能力の有無は、それぞれ、8A6に存在するがGB3および／または2B6のそれぞれには存在しないCDR（特に、いくつかのキーとなるアミノ酸残基）に依存しているようである。従って、2B6またはGB3のCDR内のそれぞれの位置に対応する位置で8A6のCDRにのみ存在するアミノ酸は、「キー残基」とみなされ得る。
【００４０】
キー残基について、2B6、GB3および8A6のCDRの視覚的比較は、H-CDR1においてSEQ ID NO: 29に示されるアミノ酸配列、H-CDR2においてSEQ ID NO: 30に示されるアミノ酸配列、H-CDR3においてSEQ ID NO: 31に示されるアミノ酸配列、L-CDR1においてSEQ ID NO: 32に示されるアミノ酸配列、L-CDR2においてSEQ ID NO: 33に示されるアミノ酸配列、およびL-CDR3においてSEQ ID NO: 34に示されるアミノ酸配列の存在が有利であることを明らかにする。
8A6、GB3および2B6のCDRのアミノ酸配列間の差異はまた、同一性の程度として（％同一性で）表され得、これは、参照配列として8A6のCDRを用いる場合、本明細書に開示される抗体のCDRにおいて許容される。従って、本発明の第2結合ドメインのH-CDR1は、好ましくは、SEQ ID NO: 20に示されるH-CDR1と60％以上、例えば70％、80％または90％、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのH-CDR2は、SEQ ID NO: 21に示されるH-CDR2と36％以上、例えば40％、50％、60％、70％、80％、または90％、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのH-CDR3は、SEQ ID NO: 22に示されるH-CDR3と50％以上、例えば60％、70％、80％、または90％、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのL-CDR1は、SEQ ID NO: 23に示されるL-CDR1と64％以上、例えば70％、80％、または90％、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのL-CDR2は、SEQ ID NO: 24に示されるL-CDR2と29％以上、例えば30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％、同一であると特徴付けられる。
ある態様において、本明細書に開示される第2結合ドメインのL-CDR3は、SEQ ID NO: 25に示されるL-CDR3と78％以上、例えば80％、または90％、同一であると特徴付けられる。
【００４１】
従って、本開示は、ある態様において、（FcγIIB受容体に結合する）第2結合ドメインを有する認識分子を提供し、これは、その重鎖可変領域において、SEQ ID NO: 20に示されるH-CDR1配列と60％以上同一であるH-CDR1配列、SEQ ID NO: 21に示されるH-CDR2配列と36％以上同一であるH-CDR2配列、SEQ ID NO: 22に示されるH-CDR3配列と50％以上同一であるH-CDR3配列、SEQ ID NO: 23に示されるL-CDR1配列と64％以上同一であるL-CDR1配列、SEQ ID NO: 24に示されるL-CDR2配列と29％以上同一であるL-CDR2配列、およびSEQ ID NO: 25に示されるL-CDR3配列と78％以上同一であるL-CDR3配列を含む。
いくつかの態様において、認識分子（例えば抗体）は、その第2結合ドメインの重鎖および軽鎖可変領域CDR中において、SEQ ID NO: 29、30、31（H-CDR）ならびにSEQ ID NO: 32、33および34（L-CDR）において定義される「キー残基」を依然として含む。
そのような第2結合ドメインを有する認識分子は、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる。
【００４２】
本明細書において使用されるように、用語「％同一性」は、www.clustal.orgから入手可能なClustalWもしくはX技術または同等の技術によって例示されるように、最適な配列アラインメントで2つのアミノ酸配列を比較する場合の、配列内の対応する位置での同一のアミノ酸残基の割合（％）を指す。例えば、CDRアラインメントの場合、SEQ ID NO: 20〜25に示される（重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれからの）CDRのそれぞれは、重鎖または軽鎖可変領域のそれぞれにおける関心対象のCDR配列についての参照配列として役立ち、例えば、SEQ ID NO: 20のH-CDR1は関心対象のH-CDR1とアラインされる。従って、両配列（参照配列および関心対象の配列）がアラインされ、両配列間の同一のアミノ酸残基が同定され、同一のアミノ酸の総数が、H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2またはL-CDR3がアラインされているかに依存して、SEQ ID NO: 20、21、22、23、24または25のアミノ酸の総数（アミノ酸長）でそれぞれ除算される。この除算の結果が％値、つまり％同一性値／程度である。2つの可変領域をそれらの同一性の程度に関して比較するために、同じ手順が、変更すべきところは変更して適用される。
【００４３】
SEQ ID NO: 14および20に示されるH-CDR1配列は、SEQ ID NO: 29に示されるH-CDR1の例示的な種配列（species sequences）である。
SEQ ID NO: 15および21に示されるH-CDR2配列は、SEQ ID NO: 30に示されるH-CDR2の例示的な種配列である。
SEQ ID NO: 16および22に示されるH-CDR3配列は、SEQ ID NO: 31に示されるH-CDR3の例示的な種配列である。
SEQ ID NO: 17および23に示されるL-CDR1配列は、SEQ ID NO: 32に示されるL-CDR1の例示的な種配列である。
SEQ ID NO: 18および24に示されるL-CDR2配列は、SEQ ID NO: 33に示されるL-CDR2の例示的な種配列である。
SEQ ID NO: 19および25に示されるL-CDR3配列は、SEQ ID NO: 34に示されるL-CDR3の例示的な種配列である。
【００４４】
従って、本明細書において、（FcγIIB受容体に結合する）第2結合ドメインを有する認識分子であって、
（a）その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 14、15および16に示されるH-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含み、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 17、18および19に示されるL-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含むか；または
（b）その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 20、21および22に示されるH-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含み、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 23、24および25に示されるL-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含み、
ここで、前記認識分子は、好ましくは、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる、認識分子を提供する。
【００４５】
その重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 14、15および16に示されるH-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含み、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 17、18および19に示されるL-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含むか、またはその重鎖可変領域においてSEQ ID NO: 20、21および22に示されるH-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含み、かつその軽鎖可変領域においてSEQ ID NO: 23、24および25に示されるL-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を有する、第2結合ドメインを有する（FcγIIB受容体に結合する）認識分子は、例示的な認識分子である。そのような例示的な認識分子は、好ましくは、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる。
【００４６】
一態様において、（FcγIIB受容体に結合する）認識分子は、少なくとも（i）アミノ酸配列SEQ ID NO: 1に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ii）アミノ酸配列SEQ ID NO: 2に対して少なくとも65％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有する第2結合ドメインを有する。
【００４７】
さらに、（FcγIIB受容体に結合する）認識分子は、（i）アミノ酸配列SEQ ID NO: 3に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ii）アミノ酸配列SEQ ID NO: 4に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、のうちの少なくとも1つを含有する第2結合ドメインを有し得る。
【００４８】
そのような認識分子は、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して約4〜10倍増加させる。
【００４９】
上述したように、例示的な認識分子は抗体である。好ましい抗体は、Fabドメインの少なくとも一部である第1結合ドメインでFcε受容体に結合し（即ち、好ましくはIgGタイプの抗FcεR抗体である）、FcγIIB受容体によって結合されるIgGの定常領域またはその部分である第2結合ドメインでFcγIIB受容体に結合するものである。
【００５０】
別の例示的な抗体は、Fabドメインの少なくとも一部である第1結合ドメインでFcε受容体に結合し、Fabドメインの少なくとも一部である第2結合ドメインでFcγIIB受容体に結合する；即ち、二官能性または二重特異性の抗FcεR抗体×抗FcγRIIB抗体である。ある態様において、抗体はFcγ受容体IIA（FcγRIIA）に結合しない。
【００５１】
また、第1結合ドメインとしてIgEのFcドメインまたはその部分、第2結合ドメインとしてIgGのFcドメインまたはその部分を含む、抗体が想定される。
【００５２】
別の例示的な抗体は、Fcε受容体によって結合されるIgEの定常領域またはその部分である第1結合ドメインでFcε受容体に結合し、Fabドメインの少なくとも一部である第2結合ドメインでFcγIIB受容体に結合するものである（即ち、好ましくはIgGタイプの抗FcγRIIB抗体である）。ある態様において、抗体はFcγ受容体IIA（FcγRIIA）に結合しない。
【００５３】
「抗体」は、本明細書において使用される場合、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にまたは部分的にコードされる1つまたは複数のポリペプチド（1つまたは複数の結合ドメイン、好ましくは抗原結合ドメインを含む）を含むタンパク質である。用語「免疫グロブリン」（Ig）は、本明細書において「抗体」と交換可能に用いられる。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。特に、「抗体」は、本明細書において使用される場合、典型的には、それぞれおよそ25 kDaの2つの軽鎖（L）およびそれぞれおよそ50 kDaの2つの重鎖（H）から構成される四量体グリコシル化タンパク質である。λおよびκと称される軽鎖の2つのタイプが抗体に見られ得る。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、5つの主要クラス：A、D、E、G、およびMに割り当てられ得、これらのいくつかがさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、lgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分けられ得、本開示のある態様においてIgGまたはIgEが好ましい。IgM抗体は、J鎖と称される付加的なポリペプチドと共に、5個の基本ヘテロ四量体単位からなり、10個の抗原結合部位を含む一方、IgA抗体は、2〜5個の基本四本鎖単位から構成され、これらは、重合し、J鎖と組み合わせて多価集合体を形成し得る。IgGの場合、四本鎖単位は、一般に、約150,000ダルトンである。各軽鎖は、N末端可変（V）ドメイン（VL）および定常（C）ドメイン（CL）を含む。各重鎖は、N末端Vドメイン（VH）、3または4個のCドメイン（CH）、およびヒンジ領域を含む。
定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接的には関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ADCC）への関与を示すことができる。抗体がADCCを発揮するとすれば、それは好ましくはIgG1サブタイプのものであり、一方ではIgG4サブタイプはADCCを発揮する能力を有していない。認識分子（例えば抗体）の定常ドメインは、本明細書に記載されるような各サブタイプのものであり得、IgGまたはIgEサブタイプが好ましく、より好ましくはIgEサブタイプのものである。
【００５４】
本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（またはインタクトな抗体）を指すだけでなく、そのフラグメントも指し、抗原結合フラグメントまたは抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチド、例えば、Fab、F（ab'）、F（ab'）2、Fv、scFv、Fd、ジスルフィド結合されたFv（sdFv）、および、本明細書に記載されるような抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントを包含する。典型的には、そのようなフラグメントは、抗原結合ドメインを含み、本明細書に記載される抗体と同じ特性を有する。
【００５５】
用語「抗体」はまた、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体のような多特異性または多重特異性抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、グラフト化抗体、およびインビトロ生成抗体を含むが、これらに限定されず、キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。用語「ヒト化抗体」は、一般に、HCおよびLCのCDRをコードする特異性が、適切なヒト可変フレームワークに移植された抗体について定義される（「CDRグラフティング」）。用語「抗体」はまた、scFv、一本鎖抗体、ダイアボディまたはテトラボディ、ドメイン抗体（dAb）およびナノボディを含む。本発明の用語において、用語「抗体」はまた、いくつかの抗原結合部位を有する二、三もしくは多量体抗体または二、三もしくは多官能性抗体を含み、好ましくは、それらの少なくとも1つはFcγRIIB特異的結合部位である。
【００５６】
さらに、本明細書において用いられるような用語「抗体」は、本明細書に記載される抗体（フラグメントを含む）の誘導体にも関連する。抗体の「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入によって改変されたアミノ酸配列を含む。さらに、誘導体は、抗体またはタンパク質への任意のタイプの分子の共有結合的付加によって修飾された抗体を包含する。そのような分子の例は、糖、PEG、ヒドロキシル基、エトキシ基、カルボキシ基またはアミン基を含むが、これらに限定されない。実際には、抗体の共有結合修飾は、グリコシル化、ペグ化、アセチル化、リン酸化、アミド化となるが、これらに限定されない。
【００５７】
抗体は、好ましくは「単離された」抗体である。「単離された」は、本明細書に開示される抗体を記載するために使用される場合、その製造環境の成分から同定、分離および／または回収された抗体を意味する。好ましくは、単離された抗体は、その製造環境からの全ての他の成分との関連がないものである。組換えトランスフェクト細胞から得られるものなどの、その製造環境の混入成分は、典型的にはポリペプチドの診断的または治療的使用に支障となる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい態様において、抗体は、（1）スピニングカップ配列決定装置の使用によりN末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも15個の残基を得るために十分な程度まで、あるいは、（2）クマシーブルー染色または好ましくは銀染色を使用する非還元または還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで、精製される。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程により調製される。
【００５８】
本明細書において使用されるように、用語「特異的に結合する」は、FcγRIIBまたはそのフラグメントに特異的に結合し、他のFc受容体に特異的に結合しない、認識分子（好ましくは、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体）を指す。認識分子（好ましくは、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体）は、第2結合ドメイン（例えば抗体の可変ドメイン）を介してFcγRIIBに結合する。しかし、これらの認識分子（例えば抗体）は、例えばそれらのFcドメインを介して、FcγRIIBに結合されてもよい。
【００５９】
VHおよびVLの対は一緒に単一の抗原結合部位を形成する。VHに最も近いCHドメインは、CH1と称される。それぞれのL鎖は1つの共有ジスルフィド結合によってH鎖に連結されており、一方、2つのH鎖は、H鎖のアイソタイプに依存して1つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結されている。VHおよびVLドメインは、超可変配列の3つの領域（相補性決定領域、CDR）と、そのための足場を形成するフレームワーク領域（FR1、FR2、FR3およびFR4）と呼ばれる比較的配列が保存されている4つの領域からなる。CDRは、抗原との抗体の特異的相互作用を担う残基の大部分を含有する。CDRは、CDR1、CDR2およびCDR3と呼ばれる。従って、重鎖におけるCDR構成要素は、H1またはH-CDR1、H2またはH-CDR2、およびH3またはH-CDR3と呼ばれ、一方、軽鎖におけるCDR構成要素は、L1またはL-CDR1、L2またはL-CDR2、およびL3またはL-CDR3と呼ばれる。
【００６０】
用語「可変」は、それらの配列において可変性を表しかつ特定の抗体の特異性および結合親和性の決定に関与する、免疫グロブリンのドメインの部分を指す（即ち、「可変ドメイン」）。可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しておらず；それは、重鎖および軽鎖可変領域の各々の超可変サブドメインに集中している。これらの超可変サブドメインは、「相補性決定領域」（CDR）と呼ばれ、これらのうち、3つが軽鎖可変領域の結合特徴を構成し（L1-CDRL1、L2-CDRおよびL3-CDR）、3つが重鎖可変領域の結合特徴を構成する（H1-CDR、H2-CDRおよびH3-CDR）。CDRは、抗体分子の機能的活性に寄与し、足場領域またはフレームワーク領域を構成するアミノ酸配列によって分離されている。厳密な定義のCDRの境界および長さは、種々の分類およびナンバリングシステムに従う。従って、CDRは、Kabat、Chothia、コンタクト（contact）、または、本明細書に記載されたナンバリングシステムを含む任意の他の境界定義によって示されてもよい。境界が異なるにもかかわらず、これらのシステムのそれぞれは、可変配列内でいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいてある程度の重複を有している。従って、これらのシステムによるCDRの定義は、隣接するフレームワーク領域についての長さおよび境界領域において異なり得る。例えば、Kabat、Chothia、および／またはMacCallumらを参照のこと（Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. MoI. Biol, 1987, 196: 901; およびMacCallum et al, J. MoI. Biol, 1996, 262: 732）。しかし、いわゆるKabatシステムによるナンバリングが好ましい。
【００６１】
認識分子（例えば抗体）の（FcγIIB受容体に結合する）第2ドメインの例示的な可変領域は、SEQ ID NO: 1、2、3、および4に示される。
【００６２】
用語「フレームワーク領域」は、より多岐にわたる（即ち、超可変の）CDRの間に存在する、抗体可変領域の当技術分野において認識される部分を指す。そのようなフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク1〜4（FR1、FR2、FR3、およびFR4）と呼ばれ、三次元空間において6つのCDR（重鎖からの3つおよび軽鎖からの3つ）を提示して抗体結合表面を形成するための足場を提供する。
【００６３】
（FcγIIB受容体に結合する）認識分子、例えば抗体（そのフラグメントまたは誘導体を含む）は、有利なことに、Daudi細胞のFcγRIIBのITIMリン酸化を、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して、約1.5、2、3倍またはそれ以上、例えば、約4倍以上、約5倍以上、約6倍以上、約7倍以上、約8倍以上、約9倍以上、または約10倍（即ち、ほぼ10倍でさえ）増加させる。その比較のために、抗体は、5μg/ml〜50μg/mlの範囲内の量、例えば、10、15、20、または25μg/mlで使用される。
図6、7および8に示される結果から、キメラ8A6（ch8A6）抗体（ラット可変領域およびヒト定常領域を含む）またはヒト化8A6抗体（hu8A6）のいずれかが、先行技術の抗体GB3と比較してITIMリン酸化を著しく増加させることが明らかである。キメラ8A6抗体およびヒト化8A6抗体の間でフレームワーク領域（FR）は異なるがCDRはほぼ同一であり、両抗体のFcγRIIBのITIMリン酸化を増加させる効力がほぼ同じである（図8を参照のこと）ことを踏まえれば、CDRが、例えば先行技術の抗体GB3と比較してITIMリン酸化を著しく増加させる本明細書に開示される抗体の有利な特性の原因となると結論付けることが合理的である。
認識分子の第2結合ドメインについて本明細書に記載されるようなCDRを適切なフレームワーク中に移植すること、または、逆に、フレームワーク領域を本明細書に記載されるようなCDRを有する認識分子（例えば抗体）の第2結合ドメイン中に移植することは、当業者には容易であり、その結果、このように得られた認識分子（例えば抗体）は、有利な特性（特に、本明細書に記載されるようなCD32BのITIMリン酸化を増加させる特性）を有する。
【００６４】
述べたように、本明細書に開示される認識分子（例えば抗体）は、WO2005/051999のSEQ ID NO: 7に示される重鎖の可変領域（SEQ ID NO: 26を参照のこと）およびWO2005/051999のSEQ ID NO: 5に示される軽鎖の可変領域（SEQ ID NO: 27を参照のこと）を有するとして特徴付けられる、WO2005/051999に記載される先行技術の抗体GB3と比較して、Daudi細胞のFcγRIIB（CD32B）のITIMリン酸化を増加させる特性を有する。
認識分子（例えば抗体）によりもたらされるDaudi細胞のFcγRIIB（CD32B）のITIMリン酸化における増加は、前記認識分子で処理されていないDaudi細胞と比較して、約4倍以上、約5倍以上、約6倍以上、約7倍以上、約8倍以上、約9倍以上、または約10倍（即ち、ほぼ10倍でさえ）である。
Daudi細胞のCD32B（FcγIIB受容体）のITIMリン酸化は、好ましくは、以下のように決定される。
1％ FBS（ウシ胎仔血清）が補われたRPMI 1640培地中に懸濁させた3×105個のDaudi細胞を、未処理のままにする（対照）か、または、マウス抗ヒトIgM（αhIgM）およびウサギ抗マウスIgG（αmIgG）を含有する抗体混合物（2μg/ml αhIgM（mAB, クローンUHB）および20μg/ml αmIgGを含む）と共に37℃、5％ CO2で25分間インキュベートする。続いて、本明細書に開示される認識分子（例えば抗体）または本明細書において以下に定義される関心対象の分子（例えば、WO2005/051999のGB3抗体）、任意で対照としてのバッファ（w/o）で、それぞれ、37℃、5％ CO2にて20分間、細胞を処理する（認識分子および関心対象の分子の両方を、好ましくは等しい濃度で加える）。細胞を、4℃でのインキュベーション後に採取し、溶解させ、ウェスタンブロット分析に供し、それによって、抗ホスホチロシン抗体（抗CD32B（ホスホY292）抗体）でリン酸化を検出する。ウェスタンブロットは、例えば、ウェスタンブロット分析のためのローディング対照として役立つβ-アクチンを検出する抗体でプローブされてもよい。Daudi細胞の代替としてPBMCまたはRaji細胞を使用することができる。従って、Daudi細胞を適用する全ての態様において、ITIMリン酸化を決定する場合に、Daudi細胞をRaji細胞またはPBMCに置き換えることができる。
【００６５】
ホスホチロシン抗体は、好ましくはシグナル発生基にカップリングされている。シグナル発生基は、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識は、32P、35S、または125Iなどの放射標識；蛍光色素（例えば、Cy-3、Cy-5）；発色団（chromophore）、電子高密度試薬；検出可能なシグナルを発生させる酵素（例えば、ELISAに通常用いられるようなもの）；またはスピン標識を含む。標識または検出可能な部分は、放射性、発色性または蛍光性のシグナルなどの測定可能なシグナルを有するかまたは発生させ、これらは、サンプル中の結合された検出可能な部分の量を定量するために使用され得る。
シグナル発生基は、ホスホチロシン抗体へ共有結合的または非共有結合的に結合することができる。シグナルは、ホスホチロシン抗体のシグナル発生基によりもたらされるシグナルによって決定され得る。シグナルは、例えば、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能ないずれのシグナルであってもよい。
【００６６】
ITIMリン酸化の増加は、（i）処理されなかった細胞のCD32BのITIMモチーフに結合されたホスホチロシン抗体のシグナル発生基から発生されたシグナル（「参照値」）と、（ii）本明細書に開示される抗体などの認識分子で処理された細胞のCD32BのITIMモチーフに結合されたホスホチロシン抗体のシグナル発生基から発生されたシグナルとを比較することにより決定され、シグナル（ii）がシグナル（i）より高ければ、本明細書に開示される認識分子によりCD32BのITIMリン酸化の増加がもたらされたと決定される。その比較のために、認識分子を、約5μg/ml〜約50μg/mlの範囲内の量、例えば、10、15、20、または25μg/mlで使用する。例えば、CD32BのITIMリン酸化を増加させる、関心対象の分子および認識分子の能力を決定するために、先行技術の抗体GB3またはCD32Bに結合する抗体などの任意の他の分子（集合的に「関心対象の分子」と称される）、例えば、本明細書に記載されるようなCD32B上のエピトープに結合しかつ／または本明細書に記載されるような非ブロッキング性であるものと、認識分子とを比較する場合、関心対象の分子および認識分子について上述したようにITIMリン酸化を決定する。即ち、関心対象の分子と未処理細胞との比較のための値、および、認識分子と未処理細胞との比較のための値を得る。これらの値は、認識分子が関心対象の分子と比べて4〜10倍（4、5、6、7、8、9、10を含む）などのより高い程度へITIMリン酸化を増加させる能力を有しているかを決定するために、互いに比較され得る。その比較のために、関心対象の分子および認識分子は、5μg/ml〜50μg/mlの範囲内の量、例えば、10、15、20、または25μg/mlで使用される。
【００６７】
本明細書に開示される認識分子の（FcγIIB受容体に結合する）第2結合ドメインの重鎖可変領域に関して、ある態様においては、当該重鎖可変領域は、位置1のアミノ酸QのEへの置換、位置11のアミノ酸VのLへの置換、位置42のアミノ酸GのKへの置換、位置50のアミノ酸SのVへの置換、位置53のアミノ酸YのSへの置換、位置58のアミノ酸KのTへの置換、位置61のアミノ酸GのAへの置換、位置75のアミノ酸SのTへの置換、位置76のアミノ酸KのRへの置換、位置77のアミノ酸NのSへの置換、および位置78のアミノ酸TのNへの置換からなる群より選択される変異のうちの少なくとも1つを伴う、SEQ ID NO: 3に示されるアミノ酸配列を含む。そのような抗体は、第1結合ドメインとしてIgE定常ドメインを含むとして特徴付けられる。
【００６８】
認識分子の第2結合ドメインが、FcγIIB受容体によって結合されるIgGの定常ドメインまたはその部分である場合、認識分子は、SEQ ID NO: 6に示されるアミノ酸配列の重鎖定常領域および／またはSEQ ID NO: 7に示されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域を含むとして特徴付けられる。
【００６９】
本明細書に開示される抗体において、重鎖の定常領域は、Edelman et al. 1969によって記載されたようなEUタンパク質ナンバリングによる位置297でアラニン残基（N297A）を含有する（図2に示されるようなSEQ ID NO: 6によって示される配列のナンバリングに対応する）。位置297でアラニン残基（Ala、A）を含有する重鎖を有する抗体（N297A）は、本明細書において接尾語「_N297A」で示され、一方、前記位置でアスパラギン残基（Asn、N）を有する抗体は「野生型」であり、本明細書において接尾語「（wt）」で示される。図2において理解され得るように、ヒト化抗体8A6野生型の重鎖の可変領域は、EUタンパク質ナンバリングによる位置113でアミノ酸残基「S」で終わる。前記抗体の定常領域は、位置118で始まる。その結果である見かけ上の4アミノ酸残基のギャップは、定常領域についてのEUタンパク質ナンバリングシステムへのスイッチに起因するものであり、いずれかのアミノ酸残基が欠落していることを意味するものではない。
SEQ ID NO:6によって示されるアミノ酸配列の位置297でアラニン残基を有するそのような定常ドメインは、Fc受容体への抗体のFc部の結合が低減しているかまたは存在しないことに起因して、抗体依存性細胞傷害が低減しているかまたは有していない。そのようなN297A定常領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 28に示される。従って、本明細書に開示される認識分子は、定常領域として、SEQ ID NO: 28に示されるアミノ酸配列を含有してもよい。そのような抗体は、EUタンパク質ナンバリングによる位置297でグリコシル化を欠いている。従って、本明細書に開示されるのは、重鎖定常領域のEUタンパク質ナンバリングによる位置297でグリコシル化を欠いている抗体であり、重鎖定常領域のEUタンパク質ナンバリングによる位置297でグリコシル化されている抗体も包含される。
【００７０】
いくつかの態様において、本明細書に開示される抗体などの認識分子の定常ドメイン（Fcドメイン）は、位置214にアミノ酸K（Lys）、位置356にE（Glu）、位置358にM（Met）および位置431にA（Ala）を含有し、C末端のK（Lys）を欠失している、アロタイプG1m17を有する（Beck et al., 2010）。
【００７１】
認識分子の第2結合ドメインが、FcγIIB受容体によって結合されるIgGの定常ドメインまたはその部分である場合、軽鎖定常ドメインは、位置153にアミノ酸A（Ala）および位置191にV（Val）を含み得るKm3アロタイプのものである。
【００７２】
本明細書において使用されるように、用語「アロタイプ」は、本明細書に開示される抗体のヒトアロタイプを指す。アロタイプは、特定のアイソタイプの定常領域配列内の対立遺伝子／遺伝子の変異体である。アロタイプは、対立遺伝子の様式で遺伝される。従って、1つの種の異なるメンバーは、それらが所定のアイソタイプのどの特定の対立遺伝子を親から継承したかという点で、互いに異なっている。Km1およびKm2はヒトκ鎖のアロタイプであり；G1m（4）およびG1m（17）はヒトγ1鎖のアロタイプである。
【００７３】
認識分子の第2結合ドメインが、FcγIIB受容体によって結合されるIgGの定常ドメインまたはその部分である場合、認識分子は、SEQ ID NO: 6に示されるアミノ酸配列の重鎖定常領域、およびSEQ ID NO: 7に示されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域を含み得る。そのような認識分子は、第1結合ドメインが、Fcε受容体によって結合されるIgE定常ドメインまたはその部分であることによって特徴付けられる。
【００７４】
認識分子の（FcγIIB受容体に結合する）第2結合ドメインの軽鎖可変領域に関して、いくつかの態様において、当該領域は、位置1のアミノ酸QのNへの置換、位置28のアミノ酸SのNへの置換、位置31のアミノ酸SのTへの置換、位置33のアミノ酸VのLへの置換、位置34のアミノ酸DのAへの置換、位置49のアミノ酸YのFへの置換、位置53のアミノ酸TのNへの置換、位置55のアミノ酸YのAへの置換、位置89のアミノ酸LのQへの置換、および位置93のアミノ酸NのYへの置換からなる群より選択される変異のうちの少なくとも1つを伴うSEQ ID NO: 4に示されるアミノ酸配列を含む。そのような抗体は、SEQ ID NO: 6に示されるアミノ酸配列の重鎖定常領域および／またはSEQ ID NO: 7に示されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域を含むとして特徴付けられる。そのような認識分子は、第1結合ドメインが、Fcε受容体によって結合されるIgE定常ドメインまたはその部分であることによってさらに特徴付けられる。
【００７５】
（FcγIIB受容体に結合する）認識分子（例えば抗体）は、SEQ ID NO: 1もしくは3に示される重鎖可変領域および／またはSEQ ID NO: 2もしくは4に示される軽鎖可変領域を含む。従って、認識分子は、SEQ ID NO: 1に示される重鎖可変領域およびSEQ ID NO: 2に示される軽鎖可変領域を含み得るか、またはそれは、SEQ ID NO: 3に示される重鎖可変領およびSEQ ID NO: 4に示される軽鎖可変領域を含む。
【００７６】
本明細書に開示されている（FcγIIB受容体に結合する）認識分子（例えば、抗体）は、SEQ ID NO: 5に記載のヒトFcγRIIBのアミノ酸番号20〜40内のエピトープに特異的に結合する。
いくつかの態様において、認識分子は、SEQ ID NO: 5におけるモチーフGTHSPESを含むエピトープに特異的に結合する。このアミノ酸モチーフは、FcγRIIBの極めて特異的なエピトープであることが示されている。このエピトープに特異的に結合する抗体などの認識分子は、ヒトFcγRIIAに結合しない。このエピトープへの認識分子（例えば抗体）のその可変領域を介しての結合は、好ましくは、受容体への抗体のFc部の結合を妨げず、受容体の通常の生理学的機能をブロックしない。
【００７７】
いくつかの態様において、（FcγIIB受容体に結合する）認識分子（例えば抗体）は、少なくとも4.9×10-4s-1の解離速度定数（off-rate constant）を有する親和性で、ヒトFcγRIIbへインビトロにて結合する。解離速度定数（koff）は表面プラズモン共鳴実験によって測定することができる。特に、sFcγRIIBに結合する抗体は、BIAcore T200バイオセンサー（GE Healthcare / Biacore）を用いた表面プラズモン共鳴により分析することができる。
【００７８】
本明細書において使用されるように、用語「親和性」は、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の1つの重鎖および1つの軽鎖の可変領域と、それらの抗原（例えば、FcγRIIB受容体）との間の結合強度を指し、インビトロで測定される。親和性は、エピトープと抗体の抗原結合部位との間の相互作用の強度を決定する。親和性は、以下の式を用いて算出され得る：
KA ＝ [AB-AG]/[AB]*[AG] ＝ kon/koff
式中：
KA ＝ 親和性定数
[AB] ＝ 抗体上の非占有結合部位のモル濃度
[AG] ＝ 抗原上の非占有結合部位のモル濃度
[AB-AG] ＝ 抗体-抗原複合体のモル濃度
【００７９】
本明細書において使用されるように、用語「アビディティ」は、抗体-抗原複合体の全体の強度の測定値を指し、実際には、（1）エピトープに対する抗体の親和性、（2）抗体および抗原の結合価、ならびに（3）相互作用する部分の構造的配置、のパラメータに依存する。
【００８０】
好ましくは抗体である、認識分子は、グリコシル化または脱グリコシル化され得ることが想定される。
【００８１】
本明細書に開示される認識分子の第1結合ドメインが、Fcε受容体によって結合されるIgEの定常ドメインまたはその部分である場合、それはSEQ ID NO:35 もしくは36のアミノ酸配列またはその部分を有し得る。
【００８２】
Fc IgEドメインの好ましい部分は、ドメインCε3および／またはドメインCε4を含む（図15およびSEQ ID NO: 36を参照のこと）。これらのドメインはIgG-Cγ2およびCγ3と相同である。IgG抗体において、ヒンジ領域は、分子の必要とされる柔軟性を担い、ジスルフィド架橋を介して二量体を形成する。このヒンジ領域はIgE抗体には存在しない。それの代わりに、追加のドメインCε2がこの機能を採用する。
【００８３】
Fc IgEドメインの他の例示的な部分は、Cε2、Cε3および／またはCε4ドメインを含む（図15およびSEQ ID NO: 35を参照のこと）。
【００８４】
別のバリエーションは、Fcεドメイン中の異なる量のN-グリコシル化部位を考える。いくつかのグリコシル化部位をIgE分子について記載する：N265、N371、N383およびN394。これらの部位のうちの1つまたは複数は、そのままであり、またはもはやグリコシル化することができないように変異されていることが想定される。
【００８５】
さらに、いくつかの態様において、認識分子（例えば抗体）は、第1結合ドメインとしてIgEのFcドメインを含み、少なくとも1.2×10-7 Kd（M）を有する親和性で、インビトロにてヒトFcεRIに結合することができる。
【００８６】
また、本明細書に記載される認識分子をコードする核酸配列を本明細書に提供する。本明細書において使用されるように、用語「核酸」または「ヌクレオチド配列」は、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA（mRNA）、それらの組み合わせ、またはDNAおよびRNAから構成されるハイブリッド分子を指す。核酸は、二本鎖または一本鎖であり、二本鎖および一本鎖のフラグメントを同時に含有してもよい。最も好ましいのは、二本鎖DNA分子である。
従って、開示される認識分子をコードする核酸配列は、抗体の特異的結合特性を与える抗体の少なくとも一部をコードするヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、開示される核酸配列は、本明細書に記載される少なくともCDRなどの可変領域をコードする。例示的な核酸配列をSEQ ID NO: 8〜11によって示す。当業者は、これらのヌクレオチド配列が、使用される発現方法およびそのために使用さるシステムに依存して変化し得ることを承知している。
【００８７】
さらに、本明細書に開示される認識分子をコードする本明細書に記載される核酸配列のうちの少なくとも1つを含む核酸ベクターを本明細書において提供する。ベクターは、好ましくは、上記核酸配列がその制御下に置かれているプロモータを含む。ベクターは原核生物または真核生物の発現ベクターであり得、ここで、組換え核酸は、単独でまたは他のペプチドまたはタンパク質と融合して発現される。
【００８８】
また、上述したベクターでトランスフェクトされている宿主細胞を本明細書において開示する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞とすることもでき、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の少なくとも一部を産生するために用いられ得る。
【００８９】
また、認識分子の産生のための方法であって、核酸ベクターに含まれる核酸配列の発現を可能にする条件下で、本明細書に記載される宿主細胞を培養する工程、およびそれにより産生された認識分子を回収する工程を含む、方法を提供する。
【００９０】
本明細書に開示される認識分子は、有利なことに、薬学的組成物中に使用され得る。そのような薬学的組成物は、好塩基球と関連する疾患、好ましくはアレルギー性疾患の治療または予防のために適用され得る。
【００９１】
従って、好塩基球と関連する疾患、好ましくはアレルギー性疾患の治療または予防方法も提供し、前記方法は、その必要がある対象へ治療上有効量の本明細書に開示される認識分子を投与する工程を含む。
【００９２】
「アレルギー性疾患」または「アレルギー」は、環境抗原に対する免疫反応が組織炎症および臓器不全を引き起こす特定の疾患を指す。アレルゲンは、アレルギーを引き起こす任意の抗原である。従って、それは、抗原性分子自体またはその供給源、例えば、花粉粒、動物の鱗屑、昆虫毒、または食品であり得る。IgEは、アレルギー性障害において中心的な役割を果たす。IgE高親和性受容体（FcεRI）は肥満細胞および好塩基球上にあり、これらは、抗原性標的として役立ち、アレルギー性疾患の発現の多くをもたらす炎症性メディエーターのさらなる放出を刺激する。
【００９３】
用語「アレルギー性疾患」はIgE媒介炎症も包含する。「IgE媒介炎症」は、肥満細胞上のFcεRI受容体を占有するIgE抗体に抗原が結合する場合に生じる。この結合は、数分以内に、肥満細胞を脱顆粒させ、予め形成された特定のメディエーターが放出される。続いて、脱顆粒された細胞は、新たに追加のメディエーターを合成および放出し始める。結果は2段階反応である：血管、平滑筋、および腺分泌物に対する初期の迅速な効果（即時型過敏症）と、続いて数時間後の関連部位の細胞浸潤。IgE媒介炎症は、アトピー性アレルギー（例えば、枯草熱、喘息およびアトピー性皮膚炎）、全身性アナフィラキシー反応ならびにアレルギー性じんま疹（urticaria）（じんま疹（hives））の基礎となる機序である。それは、通常、免疫学的防御の最前線としての役割を果たし得、何故ならば、それは、急速な血管拡張を引き起こし、循環する可溶性因子および細胞が抗原接触部位へ侵入するのを促進するためである。アレルギー性疾患の最も破壊的な特質の多くは化学誘引された白血球の作用に起因する。
【００９４】
別の局面において、本開示は、有効成分として認識分子を含む薬学的組成物に関する。前記薬学的組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体またはアジュバントまたは賦形剤を含み得る。認識分子は、動物における（より具体的にはヒトにおける）使用のために、当技術分野において公知であるかまたは一般的に承認された薬局方に挙げられるような薬学的に許容される組成物で提供されてもよい。
【００９５】
組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物は、中性または塩の形態として製剤化することができる。
薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののようなアニオンと形成されるもの、および、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものようなカチオンと形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
上述の薬学的組成物は、任意の疾患または障害の、好ましくは、好塩基球と関連する疾患、好ましくはアレルギー性疾患の、治療または予防または診断のために用いられ得る。
【００９７】
投薬量および投与頻度は、治療上有効なおよび予防上有効なという用語によって包含される。さらに、投薬量および投与頻度は、典型的には、投与される特定の治療剤または予防剤、疾患タイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答および過去の病歴に依存する、それぞれの患者に特異的な因子によって異なる。適切なレジメンは当業者によって選択され得る。本明細書において使用されるように、用語「治療上有効量」は、疾患または障害を治療または改善するために、疾患の発症を遅らせるために十分であるか、または、疾患の治療または管理において治療的利益をもたらす、治療的に活性な成分または薬剤の量を指す。
本明細書において包含される例示的な認識分子である抗体について、患者に投与される投薬量は、典型的には、患者の体重当たり0.0001 mg/kg〜100 mg/kgである。例示的な投与される投薬量は、約0.1〜約30 mg/kg、約0.1 mg/kg〜約25 mg/kg、約0.5 mg/kg〜約25 mg/kg、約1 mg/kg〜約100 mg/kg、約1 mg/kg〜約75 mg/kg、約1 mg/kg〜約50 mg/kg、約5 mg/kg〜約50 mg/kg、約5 mg/kg〜約40 mg/kg、約5 mg/kg〜約30 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約12 mg/kg、約14 mg/kg、約15 mg/kg、約17 mg/kg、約20 mg/kg、または約25 mg/kgである。ヒト抗体が他の種に由来する抗体と比べて人体内でより長い半減期を有することが周知である。従って、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の投薬量および投与頻度は、他の種に由来する抗体の通常用いられる投薬量と比較して減少させてもよい。
【００９８】
抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の治療または予防上有効量での対象の治療は、単一の治療を含むことができ、または、好ましくは、一連の治療を含むことができる。ある態様において、対象は、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体により、上記に開示される用量の範囲で、約1〜約10週間の間、約2〜約8週間の間、より好ましくは約3〜約7週間の間、週1回、治療されてもよい。適用の最も有利な形態および様式は、治療される患者に最良の利益となるように選択され得る。
抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を投与する方法は、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、粘膜投与（例えば、鼻腔内および経口経路）を含むが、これらに限定されない。特定の態様において、抗体は、筋肉内、静脈内または皮下に投与される。組成物は、任意の好都合な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚の内層（口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通じた吸収により投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与されてもよい。投与は、全身または局所とすることができる。さらに、例えば、吸入器またはネブライザの使用、およびエアロゾル化剤での製剤化により、肺内投与を用ることも可能である。
本明細書において使用されるように、用語「治療する」および「治療」は、治療上有効量の薬学的組成物を対象に投与することを指す。「治療上有効量」は、疾患または障害を治療または改善するために、疾患の発症を遅らせるために、または、疾患の治療または管理において治療的利益をもたらすために十分である、薬学的組成物または抗体の量を指す。
本明細書において使用されるように、用語「予防」は、疾患または障害の発症の予防のための薬剤の使用を指す。「予防上有効量」は、疾患の発症または再発を予防するために十分な活性成分または薬学的薬剤の量を定義する。
本明細書において使用されるように、用語「障害」および「疾患」は、交換可能に用いられ、対象における状態を指す。特に、用語「自己免疫疾患」は、用語「自己免疫障害」と交換可能に用いられ、対象自身の細胞、組織および／または器官に対する対象の免疫反応にょり引き起こされる細胞、組織および／または器官の傷害により特徴付けられる、対象における状態を指す。
【００９９】
さらに、開示される抗体は、疾患または障害、特に自己免疫疾患を検出し、診断し、またはモニタリングするための診断的目的のために用いられ得る。抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体は、本明細書に記載されるような、または、当業者に公知の従来の免疫組織学的方法（例えば、Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096を参照のこと）を使用して、生物学的サンプル中のFcγRIIBレベルを評価するために用いられ得る。タンパク質遺伝子発現を検出するために有効な他の抗体ベースの方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）などのイムノアッセイを含む。
従って、本開示は、さらに、本明細書に開示される認識分子（好ましくは抗体）を含む診断用組成物に関する。
【０１００】
配列
SEQ ID NO: 1：ラット抗体8A6の重鎖可変領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 2：ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 3：ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 4：ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 5：ヒトFcγRIIBのアミノ酸配列
SEQ ID NO: 6：ヒト化抗体hu8A6_wtの重鎖定常領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 7：ヒト化抗体hu8A6_wtの軽鎖定常領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 8：ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 9：ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 10：ヒト化抗体hu8A6_wtの重鎖定常領域をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 11：ヒト化抗体hu8A6_wtの軽鎖定常領域をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 12：ヒト可溶性FcγRIIA（sFcγRIIA）のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 13：変異ヒト可溶性FcγRIIA（sFcγRIIAmut）のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 14：ラット抗体8A6の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 15：ラット抗体8A6の重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 16：ラット抗体8A6の重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 17：ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 18：ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 19：ラット抗体8A6の軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 20：ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 21：ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 22：ヒト化抗体hu8A6の重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 23：ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 24：ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 25：ヒト化抗体hu8A6の軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 26：抗体GB3の重鎖可変領域のアミノ酸配列（WO2005/051999のSEQ ID NO: 7も参照のこと）
SEQ ID NO: 27  抗体GB3の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（WO2005/051999のSEQ ID NO: 5も参照のこと）
SEQ ID NO: 28  位置297におけるNからAへの置換を含有する重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列表に示される配列の位置1が位置118であると仮定する）
SEQ ID NO: 29  キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 30  キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 31  キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 32  キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 33  キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 34  キメラおよびヒト化抗体8A6からのキーとなるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 35  ドメイン2、3および4を含有するIgEのFcドメインのアミノ酸配列
SEQ ID NO: 36  ドメイン3および4を含有するIgEのFcドメインのアミノ酸配列
SEQ ID NO: 37：sFcεRIαのプラスミドDNA配列
SEQ ID NO: 38：ホルミルメチオニン-ロイシン-フェニルアラニンというペプチドのアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】野生型またはN297A型のいずれかのSEQ ID NO: 3および4に記載のヒト化8A6、ch8A6_N297A（SEQ ID NO: 14および15に記載）ならびにchGB3_N297Aの表面プラズモン共鳴分析。
【図２】N297A型におけるNからAへのアミノ酸交換の位置を表すhu8A6_wtおよびhu8A6_N297Aの配列。
【図３】ch8A6_N297Aの非ブロッキング特徴。Raji細胞を、固定量の凝集ヒトIgGおよび異なる量のch8A6_N297A、chGB3_N297A、またはブロッキング抗体2B6もしくはR&D Abと共にインキュベートした。当該抗体は非ブロッキング性である。
【図４】Raji細胞上に発現した天然FcγRIIBへの15μg/ml〜0.005μg/mlのプロテインA精製抗体（hu8A6_VL + hu8A6_VHおよびch8A6_N297A）の結合。ヒト化8A6変異体は、Raji細胞上に発現したFcγRIIBに高アビディティで結合する。
【図５】K562細胞上に発現した天然FcγRIIAへの15μg/ml抗体（hu8A6_VH + hu8A6_VLおよびch8A6_N297A）の結合。当該抗体はK-562上のFcγRIIAに結合しない。
【図６】図6a：健康なドナー由来のPBMCにおけるキメラ8A6（ch8A6_N297A）により増加したITIMリン酸化。健康なドナー由来のPBMCをFicoll分離を用いて単離し、続いて、未処理のままにしたか、または、抗IgM（抗ヒト、マウス）および抗マウスIgG（ウサギ）を含有する抗体混合物と共に25分間インキュベートした。続いて、細胞を、5μg/mL ch8A6_N297Aまたは対照としてのバッファ（w/o）のいずれかで20分間処理した。インキュベーション後に細胞を採取し、プロトコルに従って溶解させた。溶解物をWB分析に供した。β-アクチン ＝ ローディング対照。図6b：ITIMリン酸化についての対照実験。Daudi細胞を、未処理のままにしたか、または、アイソタイプ対照抗体、ポリクローナル抗ヒト抗IgM（polycl. 抗hIgM）、モノクローナル抗ヒトIgM（抗hIgM）、抗hIgM + 5μg/mL ch8A6_N297A、ウサギ由来の抗マウスIgG（αマウスIgG）、αマウスIgG + 5μg/mL ch8A6_N297A、抗hIgMおよびαマウスIgGの混合物（Ab混合物）、またはAb混合物 + 5μg/mL ch8A6_N297A）で25分間処理した。β-アクチン ＝ ローディング対照。図6c：本発明の抗体は、初代PBMCにおいて、BCRおよびFcγRIIBの架橋／連結の有無に関わらず、ITIMリン酸化を増強する。
【図７】ch8A6_N297Aと技術水準の抗体（chGB3_N297A）との比較。ヒトDaudi細胞を、抗IgM（抗ヒト、マウス）および抗マウスIgG（ウサギ）を含有する抗体混合物と共に25分間インキュベートしたか、または未処理のままにした。続いて、細胞を、異なる量のchGB3_N297Aもしくはch8A6_N297A、または、対照としてのバッファ（w/o）のいずれかで20分間処理した。インキュベーション後に細胞を採取し、プロトコルに従って溶解させた。溶解物をWB分析に供した。β-アクチン ＝ ローディング対照。
【図８】初代PBMCにおけるITIMリン酸化に対するヒト化変異体hu8A6_N297Aならびにch8A6_N297AおよびchGB3_N297Aの効果の比較。抗体混合物によるBCRとFcγRIIBの架橋後、種々の抗体を5μg/mlで添加し、ITIMリン酸化についてのウェスタンブロット分析を行った。β-アクチン ＝ ローディング対照。
【図９】リン酸化SHIP-1とFcγRIIB ITIMの共免疫沈降。抗体混合物と、ch8A6_N297A、ブロッキング抗FcγRIIB抗体2B6またはchGB3_N297A（5μg /mL）のいずれかとによるDaudi細胞の刺激後に、細胞溶解物からFcγRIIBを沈降させ、ホスファターゼSHIP-1についてウェスタンブロット分析を行った。汎抗CD32抗体（AF1330）を用いる抗CD32 ＝ ローディング対照。
【図１０】ヒト化8A6変異体（hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7）とch8A6_N297Aとの比較。Daudi細胞を、バッファ（未処理）または抗IgM（抗ヒト、マウス）および抗マウスIgG（ウサギ）を含有する混合物（抗体混合物）と共に25分間インキュベートした。続いて、細胞を、0.25μg/mLのch8A6_N297Aまたはヒト化8A6変異体（hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7）のいずれかで20分間処理した。インキュベーション後に細胞を採取し、プロトコルに従って溶解させた。溶解物をWB分析に供した。β-アクチン ＝ ローディング対照。
【図１１】ヒト化8A6変異体（hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7）とch8A6_N297A、ブロッキング抗FcγRIIBおよびchGB3_N297Aとの比較。Daudi細胞を、バッファ（未処理）または抗IgM（抗ヒト、マウス）および抗マウスIgG（ウサギ）を含有する混合物（抗体混合物）と共に25分間インキュベートした。続いて、細胞を、0.25μg/mLのch8A6_N297A、ヒト化8A6変異体（hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7）、ブロッキング抗FcγRIIB抗体2B6またはchGB3_N297Aのいずれかで20分間処理した。インキュベーション後に細胞を採取し、プロトコルに従って溶解させ、ウェスタンブロットアッセイにて分析した。溶解物をWB分析に供した。β-アクチン ＝ ローディング対照。
【図１２】SLE-PBLマウスモデルについての実験セットアップ。ヒトSLE患者由来のPBLを免疫不全マウスに移植する。PBL細胞が生着し、続いてマウスを対照（PBS）または本発明の抗FcγRIIB ch8A6_N297A抗体で処置する。
【図１３】SLEに罹患しているヒトドナーに由来するPBLが移植されたマウスにおける総ヒトIgGレベル[μg/mL]。対照（#2, PBS）またはch8A6_N297A（#3および#4）で処置されたマウスを示す。
【図１４】SLEに罹患しているヒトドナーに由来するPBLを使用したSLE-PBL移植（transfer/grafting）後の第4週に始まる、ch8A6_N297Aで処置されたマウスにおける疾患特異的ヒト抗DNA IgGの減少。2つの異なるマウス、#3および#4（ch8A6_N297Aで処置）における抗DNA IgG力価を示し、#2はPBS対照を示す。
【図１５】キメラFcγRIIB特異的IgG抗体のFabドメインおよびIgE抗体のFcεドメインから構成される構築物。当該構築物は、IgGベースのFabおよびFcεドメインからの変更（B．Cε2ドメインを有する；C．Cε2を有さないがIgGヒンジ領域を有する）ならびにN-グリコシル化部位の量に関して異なる。比較のために、完全なIgGおよび完全なIgE分子の図を示す（A）。
【図１６】ELISAによって試験されたSM101（sFcγRIIB）への8A6-IgEの結合。図は代表的なELISAを示す。ch8A6-IgE変異体は、キメラ抗FcγRIIB抗体と同じ親和性を抗原SM101（可溶性FcγRIIB）に対して有する。
【図１７】ELISAによって決定されたsFcεRIαへの8A6_IgE変異体の結合。図は代表的なELISAを示す。ヒト化抗FcγRIIB-IgE変異体は、それぞれのキメラ抗FcγRIIB-IgEバージョンと同じ親和性でsFcεRIαに結合する。
【図１８】Raji上に発現したFcγRIIBへの抗FcγRIIB-IgE抗体の細胞結合。図は、ch8A6_N297Aと比較しての、変異体8A6_cε2-4deglyおよび8A6_cε3-4deglyで行われた、代表的なFACS実験を示す。8A6-IgE変異体ならびにch8A6_N297Aの両方は、天然抗原FcγRIIBに対して同じ親和性を有する。
【図１９】ELISAによって試験されたSM101への8A6-IgEの結合。図は代表的なELISAを示す。ヒト化8A6-IgE変異体は、キメラ抗FcγIIB受容体抗体と同じ親和性を抗原SM101（可溶性FcγRIIB）に対して有する。
【図２０】ELISAによって決定されたsFcεRIαへの8A6-IgE変異体の結合。図は代表的なELISAを示す。ヒト化抗FcγRIIB-IgE変異体は、それぞれのキメラ抗FcγRIIB-IgEバージョンと同じ親和性でsFcεRIαに結合する。
【図２１】Raji細胞上の標識8A6-IgE-Fluo488の結合試験。Raji細胞上のFcγRIIBへの蛍光標識構築物の結合を試験し、CHO細胞（FcγRIIB陰性）は対照として役立った。FITCチャネルにおける蛍光を評価した。
【図２２−１】PBMC中のB細胞へのch8A6_ce2-4-deglyおよびch8A6_N297Aの結合。B細胞への8A6-IgE（左の列）、SM101でマスクされた8A6-IgE（中央の列）および8A6-IgG（右の列）の結合のFACS分析。右側に示されている時点で、αhCD19-PeCy7による染色後に、FACS分析によって8A6-IgE結合についてB細胞を分析した。右上象限における数字は、示されている象限における平均蛍光強度を示す。
【図２２−２】図22-1の続きを示す。
【図２２−３】図22-2の続きを示す。
【図２２−４】図22-3の続きを示す。
【図２２−５】図22-4の続きを示す。
【図２３】好塩基球の検出のためのゲーティング戦略。低SSCを有するCD193陽性細胞を好塩基球としてゲートした。象限ゲートを適用し、ここで、未処理細胞のCD63発現は0に設定した。
【図２４−１】種々の濃度の8A6_N297Aおよび8A6_cε2-4-deglyで処理された好塩基球のCD63発現。8A6_N297Aおよび8A6_ce2-4-degly自体の潜在的な活性化効果を排除するために、8A6_N297Aおよび8A6_ce2-4-deglyと共に一晩インキュベートされたサンプルを、抗原によるさらなる活性化無しでそれらのCD63発現について分析した。
【図２４−２】図24-1の続きを示す。
【図２５】8A6_ce2-4-deglyインキュベーションについてのLPS対照。全血を、24時間、50 EU/ml LPSと共にインキュベートし、CD63発現を分析した。
【図２６】6時間後の対照の活性化。
【図２７−１】6時間後の8A6-IgGまたは8A6-IgE処理サンプルの活性化。
【図２７−２】図27-1の続きを示す。
【図２８】24時間後の対照の活性化。
【図２９−１】24時間後の8A6-IgGまたは8A6-IgE（8A6-cε2-cε4_脱グリコシル化）処理サンプルの活性化。
【図２９−２】図29-1の続きを示す。
【図３０−１】花粉活性化試験。
【図３０−２】花粉活性化試験。
【図３０−３】花粉活性化試験。
【実施例】
【０１０２】
実施例−抗FcγIIB受容体抗体の作製
実施例1．モノクローナル抗体8A6の作製
組換え可溶性ヒトFcγRllB受容体でLong-Evansラットを免疫することによって、モノクローナル抗体クローン8A6を作製した。ラット脾臓細胞からハイブリドーマ細胞株を作製し、FcγRllAに対してよりも大きな親和性でヒトFcγRllBに特異的に結合する抗体についてスクリーニングした。次に、上述のハイブリドーマによって産生された抗体を、当技術分野において公知の技術を使用して、非ブロッキング特徴についてスクリーニングした（即ち、これらの抗体は、膜結合性FcγRllBへのIgGまたはICの結合を依然として可能にする）。
50μgの精製組換え可溶性ヒトFcγRllB（sFcγRllB、SEQ ID NO: 5）を、5 nmol CpG 2006（TIB MOLBIOL, Berlin, Germany）が補われたフロイント不完全アジュバントを使用して、LOU/Cラット中へ腹腔内（i.p.）および皮下（s.c.）注射した。6週間のインターバル後に、50μg sFcγRllBおよびCpG 2006での最終的な追加免疫を、融合の3日前にi.p.およびs.c.で与えた。骨髄腫細胞株とラット免疫脾臓細胞との融合を標準的な手順により行った。ハイブリドーマ上清を、ELISAプレートへコーティングされたsFcγRllBまたは無関係のsFcγRllA（SEQ ID NO: 12）タンパク質での固相免疫アッセイにおいて試験した。タンパク質に結合された組織培養上清由来のMabを、ラットIgGアイソタイプに対するHRPコンジュゲート化mAbを用いて検出し（TIB173 抗IgG2a、TIB174 抗IgG2b、TIB170 抗IgG1（全てATCC製）、R-2c 抗IgG2c（自家製））、従って、IgMクラスのmAbを回避した。抗原特異的ELISAアッセイを用いたところ、mAb 8A6（ラットIgG2a）は、FcγRllBを認識し、FcγRllAには結合しなかった。FACSベースのアッセイを用いて、天然抗原の特異的結合について抗体をスクリーニングした。さらに、抗体を非ブロッキング特徴についてスクリーニングした（即ち、これらの抗体は、膜結合性FcγRllBへのIgGまたは免疫複合体の結合を依然として可能にする）。
キメラおよびヒト化構築物の特徴付けのために十分な量の抗体を産生するために、FreeStyle（商標）CHO-S細胞を一過性にトランスフェクトした。
トランスフェクションの前日に、細胞を0.5×106個/mlで播種した。細胞を遠心分離し、培地中に再懸濁し、20×106個/mlの最終細胞濃度を得た。各トランスフェクションについて、3 mlの細胞懸濁液を6ウェルプレートに移した。トランスフェクションのためのプラスミドDNAを、製造業者の説明書に従ってHiSpeed Plasmid Maxi Kit（Qiagen）を使用して単離し、内毒素フリーのH2O中に溶出させた。
各トランスフェクションについて、軽鎖をコードするプラスミドDNA 75μgおよび重鎖をコードするプラスミドDNA 75μgを細胞懸濁液に添加し、穏やかに混合した。その後、PEI（Polyplus）を添加し、穏やかに混合した。細胞を、連続的な振盪（100 rpm）下で37℃および5％ CO2にて3時間インキュベートした。細胞懸濁液を15 mlの最終体積まで培地で充填し、4×106個/mlの最終細胞濃度を達成し、125 mlフラスコ中に移した。細胞を連続的な振盪（100 rpm）下で37℃および5％ CO2にてインキュベートし、6日後、上清を、それを2回遠心分離する（4000 rpm, 5分間）ことによって採取した。上清を0.2μmフィルターで濾過し、抗体力価を決定した（下記を参照のこと）。
抗体力価決定を、2つの異なるHPLC法、逆相（RP）HPLCおよびプロテインA-HPLCによって行った。RP-HPLC分析をAgilent 1200 Series HPLCシステムで行った。データをソフトウェア「Chem Station for LC Systems」Rev. B.04.02で分析した。溶媒成分は以下であった：イソプロパノール（HPLC等級; Roth）、アセトニトリル（HPLC勾配等級; Roth）、H20（0.2μm濾過）およびテトラフルオロアセテート（tetrafluoracetate）（TFA）（ペプチド合成用; Sigma）。溶媒A: H2O, 0.1％ TFA；溶媒B: 60％イソプロパノール、30％アセトニトリル、9.9％ H2O、および0.1％ TFA。300 Åの多孔性および5μmの粒子直径を有する分離材料を含むPhenomenex Jupiterカラム（#525166-6）を使用した。結合した抗体を、30％から43％への溶媒Bの線形勾配で10分以内に溶出させた。検出をUV/VIS検出器でλ ＝ 210 nmにて行った。
プロテインA-HPLC分析をAgilent 1200 Series HPLCシステムで行った。データをソフトウェア「Chemstation」バージョン Rev. B.04.02で分析した。以下の溶媒を使用した；溶媒A: 0.05M Tris/HCl、0.1Mグリシン、0.15M NaCl、pH 8.0；溶媒B: 0.05M Tris/HCl、0.1Mグリシン、0.15M NaCl、pH 3.0。分析のために、Upchurch 2x 20 mm分析ガードカラムに、120μlのApplied Biosystems Poros（登録商標）20Aパーフュージョンクロマトグラフィー媒体（Life technologies）を詰めた。結合した抗体を100％溶媒Bで溶出させた。精製抗体を回収した場合、フラクションを56 mM Tris pH 8.0で中和した。
発現された抗体を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Akta Explorer）によって1 ml HiTrap（商標）rProtein A FFカラム（GE Healthcare）で精製した。ランニングバッファは10 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaClを含有し、溶出バッファは100 mMグリシン、150 mM NaCl、pH 2.7から構成された。溶出された抗体を60 mM Tris-HCl pH 8.0で中和し、濃縮し、滅菌濾過し、-80℃で保存した。
【０１０３】
実施例2．抗体スクリーニングおよび8A6の特徴付け
ハイブリドーマ上清のスクリーニングを、技術水準において公知の技術、例えば、ELISA結合アッセイ、Biacoreアッセイ、またはFACS結合分析を使用して行う。キメラ8A6またはヒト化変異体の抗原特異的結合を試験するために、ELISAプレート（Nunc-Immuno Plate, F96 Maxisorp）を、PBS中の1μg/ml sFcγRllB、sFcγRllA（SEQ ID NO: 12）またはsFcγRllAmut（SEQ ID NO: 13）（100μl/ウェル）で、4℃にて一晩コーティングした。PBS中0.01％ Tweenによる3回の洗浄工程後、PBS中2％ BSAによるブロッキング（300μl/ウェル）を室温で2時間行った。3回の洗浄工程後、精製抗体または上清の希釈系列をアプライし（100μl/ウェル）、室温で1時間インキュベートした。精製抗体をPBS, 2％ BSAにて希釈した。上清に10倍PBSおよび20％ BSAを補い、PBS中2％ BSAの最終濃度を得た。FcγRllAについての陽性対照として、ヤギ抗ヒトFcγRllA（R&D Systems, AF1875）を使用した。PBS中0.01％ Tweenによる3回の洗浄工程後、それぞれの二次抗体であるロバ抗ヤギ-HRP（F（ab’）2, Jackson-Immuno-Research）またはヤギ抗ヒト-HRP（F（ab’）2, Dianova）を室温で1時間インキュベートした（100μl/ウェル）。ウェルをPBS中の0.01％ Tweenにより6回洗浄した。基質（0.03％ H2O2を含有するOPD）を添加し（100μl/ウェル）、反応を4 M H2SO4 （50μl/ウェル）で停止させた。その後、分光計にて492 nmでの吸光度を測定した。
キメラ8A6またはヒト化変異体の天然抗原への特異的結合の分析を、Raji細胞（ATCC（登録商標）CCL-86（商標））およびK-562細胞（ATCC（登録商標）CCL-243（商標））上での細胞結合によって行った。
細胞を遠心分離（400 g, 5分間）によってペレット化し、FACSバッファ（ハンクス平衡塩類溶液, 1 ％ FCS, 0.01 ％ NaN3）により洗浄した。追加の遠心分離工程後、細胞をFACSバッファ中に再懸濁し、2×106個/mlの最終細胞濃度を得て、50μlの細胞懸濁液を96ウェルU底プレート中に等分した。ヒト化変異体およびch8A6の希釈系列をFACSバッファにて調製した。
K-562細胞上のFcγRllAの発現を確認するために、マウス抗ヒトCD32抗体（Stem Cell Technologies Inc., クローンVI.3）をFACSバッファにて希釈した。希釈された抗体50μlを細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。細胞をFACSバッファにより2回洗浄した。その後、50μlヤギ抗ヒトIgG-PEコンジュゲート化（F（ab’）2, Dianova）またはヤギ抗マウスIgG-PEコンジュゲート化（F（ab’）2, Dianova）二次抗体をFACSバッファにて希釈し、細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。FACSバッファによる2回の洗浄工程後、細胞を300μl FACSバッファ中に再懸濁し、BD FACSCanto（商標）II（Software: BD FACSDiva（商標））において測定した。
FcγRllB抗体が膜結合性FcγRllBへのIgGまたは免疫複合体の結合を依然として可能にするかどうかを決定するために、FACSベースのアッセイを行った。細胞を遠心分離（400 g, 5分間）によってペレット化し、FACSバッファ（ハンクス平衡塩類溶液, 1％ FCS, 0.01 ％ NaN3）により洗浄した。追加の遠心分離工程後、細胞をFACSバッファ中に再懸濁し、2×106個/mlの最終細胞濃度を得た。抗体（ch8A6_N297A、chGB3_N297A、R&D Ab mab1875）の希釈系列をFACSバッファにて調製した。希釈された抗体25μlを、Alexa488標識された凝集Beriglobin（2.5μl/ウェル）25μlと96ウェルU底プレート中において混合した。凝集ヒトIgGを、市販のプールされたIgG製品（Beriglobin）からSuperdex-200 (16/60)におけるサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。
50μlの細胞懸濁液を抗体-Beriglobin混合物に添加し、4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACSバッファにより2回洗浄した。その後、50μlヤギ抗ヒトIgG-PEコンジュゲート化（F（ab’）2, Dianova）または抗ラット-PE二次抗体をFACSバッファにて希釈し、細胞に添加し、4℃で30分間インキュベートした。FACSバッファによる2回の洗浄工程後、細胞を300μl FACSバッファ中に再懸濁し、BD FACSCanto（商標）II（Software: BD FACSDiva（商標））において測定した（図3）。
FACS結合アッセイ
キメラ8A6またはヒト化変異体の天然抗原への特異的結合の分析を、Raji細胞およびK-562細胞上での細胞結合によって行った。細胞を遠心分離（400 g, 5分間）によってペレット化し、FACSバッファ（ハンクス平衡塩類溶液, 1％ FCS, 0.01％ NaN3）により洗浄した。追加の遠心分離工程後、細胞をFACSバッファ中に再懸濁し、2×106個/mlの最終細胞濃度を得、50μlの細胞懸濁液を96ウェルU底プレート中に等分した。ヒト化変異体およびch8A6の希釈系列をFACSバッファにて調製した。Raji細胞およびK562細胞を、漸増濃度のヒト化抗体およびキメラ抗体（対照として）と共にインキュベートした。FcγRIIB上での結合を試験するためにRaji細胞を使用し（図4）、FcγRIIAへの非特異的結合を分析するためにK562細胞を使用した（図5）。細胞に結合した抗体をPEコンジュゲート化二次抗体で検出した。全てのヒト化変異体が、ch8A6_N297Aに匹敵する親和性でFcγRIIBに結合し、全てのヒト化変異体が依然として、FcγRIIAに対するよりも大きなアビディティでFcγRIIBに結合する。
sFcγRllBおよびsFcγRllAへの抗体結合を、Biacore T200バイオセンサー（GE Healthcare / Biacore）を使用して表面プラズモン共鳴によって分析した。実験はLMU, Department of Biology and Microbiology, Service Unit Bioanalyticで行われた。分析される抗体を、製造業者のプロトコルに従ってHuman Antibody Capture Kitを使用してSeries S Sensor Chip CM5センサーチップ上にキャプチャーした。Hu8A6変異体またはch8A6を10 nMの濃度で1分間キャプチャーした。分析物sFcγRllBを3分間様々な濃度で注入した。測定を25℃および連続的なフロー（10μl/分）で行った。データを、1:1結合を仮定して、Biacore T200 Evaluation Software（バージョン1.0）を使用して評価した。
【０１０４】
実施例3．8A6ラット抗体のキメラ化
抗FcγRIIBキメラモノクローナル抗体8A6を、ラット8A6 VH領域をシグナルペプチドおよびヒトIgG1定常領域と融合することによって構築した。さらに、N297A変異を含有するIgG1定常ドメインを使用して、重鎖の脱グリコシル化変異体を作製した。8A6軽鎖遺伝子を構築するために、ラット8A6 VL領域を、同様に、シグナル配列およびヒトκ定常領域の配列と融合し、続いて哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。
【０１０５】
インビトロアッセイ
細胞、試薬および抗体
ヒトバーキットリンパ腫細胞株DaudiおよびRamosをDSMZから購入し（ACC 78およびACC 603）、10％ FBS（Gibco/Invitrogen）、MEM NEAA（Gibco/Invitrogen）、1 mMピルビン酸ナトリウム（Gibco/Invitrogen）および2 mM L-グルタミン（Gibco/Invitrogen）が補われたRPMI 1640（Gibco/Invitrogen）中にて37℃および5％ CO2で維持した。Ficoll密度勾配（Leucosep, Greiner Bio-One, Biocoll分離溶液, Biochrom）およびネガティブ磁気分離（Dynabeads Untouched Human B Cells, Invitrogen）を使用して、健康なドナーのヘパリン添加血から初代ヒトB細胞を精製した。濃縮されたB細胞の純度を、抗hCD19-APC（BD Pharmingen #555415）、抗hCD3-PerCP-Cy5.5（BD Biosciences #332771）および抗hCD56-PE（BD Pharmingen #555515）での染色によりFACS分析によって試験した。初代B細胞をさらに培養することなく直接、実験に用いた。EP1534335に記載のブロッキング抗FcγRIIB抗体2B6。
可溶性抗体刺激混合物を使用する刺激プロトコル
BCRおよびFcγRllBの同時刺激のために、2μg/mlマウスモノクローナル抗hIgM（Southern Biotech #9022-01, クローンUHB）および20μg/mlウサギモノクローナル抗mIgG（1,2a,3）（Epitomics #3020-1, クローンM111-2）（このFc部はヒトFcγRllB受容体と交差反応する）の抗体混合物を用いて抗体システムをセットアップした。20μg/mlウサギポリクローナル抗hIgM（Antibodies online #ABIN117299）、または2μg/ml抗hIgMおよびアイソタイプ対照mIgG2b（クローンMPC-11, BD Pharmingen #557351）を含有する混合物を対照として用いた。3×105個のリンパ腫細胞株DaudiまたはRamosおよび初代B細胞を遠心分離によって採取し、アッセイ培地（RPMI 1640 + 1％ FBS）中において異なる刺激混合物と共に37℃で20分間インキュベートした。続いて、5μg/ml抗FcγRIIB抗体ch8A6（0.8μlの1:10希釈物）、2B6（1.5μlの1:10希釈物）またはchGB3_N297A（1.1μlの1:10希釈物）をサンプルに添加し、細胞をさらに25〜30分間インキュベートした。別に記載したように溶解を行った。
リン酸化パターンのウェスタンブロット分析
細胞溶解
細胞を4℃でペレット化し、氷冷PBSで洗浄し、ホスファターゼ阻害剤（PhosStop, Roche）、プロテアーゼ阻害剤（Complete Ultra Mini, EDTAフリー, Roche）および1 mM PMSF（Fluka Biochemica）が補われた10μL溶解バッファ（RIPAバッファ（Cell Signaling）中、氷上で30〜45分間インキュベートした。
SDS-PAGE
遠心分離後、上清をサンプルバッファ（NuPAGE LDSサンプルバッファ、NuPAGEサンプル還元剤、Invitrogen）と共にロードし、SDS PAGE（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gels、MES SDSランニングバッファー（Invitrogen））へアプライした。SDS-PAGEのために、LDSサンプルバッファおよび還元剤を添加し、サンプルを95℃で5分間加熱した。サンプルを-20℃で保存したか、またはSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって直接分析した。
タンパク質のPVDF膜への転写および検出
続いて、タンパク質をPVDF膜に転写した（Roti-PVDF, Roth, 転写バッファ 10 mM Tris、100 mMグリシン、10％メタノール、転写条件 240 mA一定、90分間、4℃）。膜をTBS-T（10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1％ Tween20）中5％ BSAでブロックし、抗FcγRllB/CD32 Phospho（pY292）（Cell Epitomics # 2308-1, 1:50000, 4℃一晩）または抗ホスホSHIP（1:1000, Cell Signaling #3941）および抗ウサギ-HRP（Jackson ImmunoResearch #111-036-045, TBS-T中 1:50,000, 1時間 RT）で染色した。化学発光（WesternLightning Plus, Perkin Elmerで現像）をX線フィルム上で検出した。
ストリッピング
他のリン酸化されたタンパク質に対する抗体による後続の分析のために、膜を10分間ストリップし（Re-Blot Plus, Millipore）、洗浄し、ブロックし、その後、抗β-アクチン抗体（Sigma-Aldrich # A1978, 1:50,000および抗マウスIgG-HRP, Sigma-Aldrich # A9044）または他のシグナリングタンパク質に対する抗体で染色した。
【０１０６】
開示される抗体によって著しく増加された、健康なドナー由来のPBMCにおけるFcγRIIB-ITIMリン酸化
健康なドナー由来のPBMCを単離し、未処理のままにしたか、または、刺激混合物（マウスモノクローナル抗hIgMおよびウサギモノクローナル抗mIgG）と共に25分間インキュベートした。続いて、細胞を、ch8A6または対照としてのバッファのいずれかで処理した。細胞溶解物を、上記で概説したように、適切な検出抗体を使用するウェスタンブロット分析に供した。細胞（PBMC、B細胞）のFcγRIIB-ITIMモチーフのリン酸化の著しい増加が検出された（図6a）。刺激混合物単独、または、マウスモノクローナル抗hIgMのみ、ch8A6と組み合わせてのウサギモノクローナル抗mIgGでの細胞の刺激による対照実験は、増加したFcγRIIB-ITIMリン酸化を示さなかった（図6b）。従って、開示される抗体は、架橋されたBCR（B細胞受容体）および（内因性発現された）膜結合性FcγRIIBでのヒト細胞のITIMリン酸化に対して著しい効果を示し、刺激されていない細胞、即ち、架橋されたBCRおよび膜結合性FcγRIIBを有さない細胞に対しては効果を示さない。自己免疫疾患の間、BCRおよび膜結合性FcγRIIBは、自己抗原または免疫複合体（IC）によって架橋される。抗体は、FcγRIIB-ITIMリン酸化を増加させることによって、自己免疫疾患における病原性自己反応性B細胞を抑制することができる。しかし、抗体はまた、架橋されたBCR無しでITIMリン酸化を増加させることができる（図6c）。
【０１０７】
ch8A6と抗体chGB3_N297Aとの効果の比較
ITIMリン酸化に対するクローンch8A6_N297AおよびクローンchGB3_N297Aの効果の比較。ヒトDaudi細胞を、上述したように、抗体混合物、続いて、ch8A6_N297A、chGB3_N297Aまたは2B6で処理した。抗体chGB3_N297Aは、ch8A6_N297Aと同様に、非ブロッキング抗FcγRIIB抗体であり、同様のエピトープを認識する。抗体混合物で処理した細胞へのch8A6_N297Aの添加は、既に0.05μg/mlの濃度でFcγRIIB-ITIMリン酸化の増加を示した。漸増濃度のchGB3_N297Aは抑制モチーフのリン酸化の用量依存的刺激を示したが、驚くべきことに、この抗体クローンは、8A6に匹敵するリン酸化レベルに到達できなかった。ソフトウェア「ImageJ」でのX線フィルムのデンシトメトリック定量化によって最大2.8倍のリン酸化シグナル値が算出されたが、hu8A6_N297Aは未処理細胞と比較して9.8倍増加をもたらす（図7）。従って、本発明の抗体は、抗体chGB3_N297Aと比較して、明らかにかつ驚くべきことに、増加したFcγRIIB-ITIMリン酸化を示す。
【０１０８】
初代PBMCにおけるITIMリン酸化に対するヒト化変異体hu8A6、キメラ8A6_N297AおよびchGB3_N297Aの効果の比較
抗体chGB3_N297A、ch8A6_N297Aおよびヒト化8A6を、初代ヒトPBMCのFcγRIIB-ITIMリン酸化に対するそれらの影響において比較した。抗体混合物によるBCRおよびFcγRIIBの架橋後、異なる抗体を5μg/mlで添加し、ITIMリン酸化についてウェスタンブロット分析を行った。この場合も、抗体は、驚くべきことに、技術水準の抗体と比較してFcγRIIB-ITIMリン酸化に対して著しく増加した効果を有する（図8）。
【０１０９】
リン酸化FcγRIIB-ITIMモチーフおよびSHIP-1の共免疫沈降
受容体の架橋に続いて、FcγRIIB-ITIMモチーフ中のリン酸化チロシンへのホスファターゼSHIPのSH2ドメインの結合によってホスファターゼSHIPが膜に動員され、続いて、SHIP-1のC末端ドメイン中のNPXYモチーフにおけるチロシンがリン酸化される。膜における再局在化およびそれに続くNPXYモチーフのリン酸化は、SHIP-1の調節機能に必須である。カルシウム流出、細胞生存、増殖、細胞周期停止およびアポトーシスに対するSHIP-1の効果は、PI3KおよびAkt経路を通じて媒介される。Tyr1021は、SHIP-1中のNPXYモチーフのうちの1つに位置しており、そのリン酸化はSHIP-1の機能に重要である（Nimmerjahn, Ravetch, 2008）。
ヒトDaudi細胞を、上記の段落[0105]において定義された抗体混合物で刺激し、マイルドな溶解バッファ（CoIP溶解バッファ）によって溶解した後、サンプルを、FcγRIIBをキャプチャーするために2B6と共にインキュベートした。複合体をプロテインG結合強磁性ビーズに結合させ、磁気ラックで単離した。
500μl CoIP溶解バッファにて1×107細胞/サンプルの溶解物を調製し、氷上で30分間細胞をインキュベートし、10分毎にボルテックスした。細胞残屑を13,000 rpmで4℃にて10分間遠沈させ、上清を新しいチューブに移した。500μlの溶解物を、10μg 2B6と共に4℃で2〜3時間回転させながらインキュベートした。プロテインG結合磁気ビーズを500μl溶解バッファで2回洗浄し、50μlビーズ（1.5 mg）を溶解物-抗体-複合体へ4℃で一晩添加した（回転ホイール）。200μl溶解バッファで2回洗浄し、還元剤を含有する25μl 1x LDSサンプルバッファ中においてビーズを5分間加熱することによって、複合体をビーズから溶出させた。4000 × gで30秒間遠心分離した後、10μlの上清をウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEにアプライした。
溶解物のウェスタンブロット分析は、抗体混合物およびch8A6_N297Aで処理された細胞のサンプル中のリン酸化SHIP-1の顕著に上昇したレベルを示す。FcγRIIB-特異的抗体2B6による沈降を行ったため、FcγRIIBに結合した、単離されたSHIP-1のみが共沈降した。ストリッピングおよび再染色後の膜は、ch8A6_N297Aで処理されたサンプル中のFcγRIIB-ITIMモチーフの増強されたリン酸化を示し、リン酸化SHIP1シグナルと相関した。αhFcγRIIB a, b, c （ヒトFcγRII/CD32 Ab, ポリクローナル, ヤギ IgG, R&D Systems, AF1330）による第2の再染色は、全てのサンプル中において等量の沈降した受容体FcγRIIBを示し、SDS-PAGEについてのローディング対照として役立った（図9）。
【０１１０】
実施例4．IgG型のch8A6のヒト化
ラット抗体由来の相補性決定領域配列をヒトフレームワークに移植することによって、ch8A6をヒト化した。ヒトフレームワークを選択するために、VHおよびVL配列を、公的に利用可能なデータベース（IMGT; V-BASE）から得られたヒトIg可変および連結領域生殖細胞系セグメントの配列と比較した。VH_3_30 plus IGHJ4ヒト生殖細胞系配列およびVK3_15 plus IGKJ2ヒト生殖細胞系配列をそれぞれ重鎖および軽鎖のために選択した。
ヒト化重鎖および軽鎖のためのいくつかの変異体を作製した。ヒト化VHおよびVLの設計した配列をコードする遺伝子を、続いて哺乳動物発現ベクターへサブクローニングした。抗体変異体のスクリーニング手順を、トランスフェクトされたCHO-S細胞（Invitrogen）の上清から直接行った。キメラ8A6抗体は、ヒト化変異体のスクリーニングの間、トランスフェクション対照および標準として役立った。sFcγRllBおよびsFcγRllAへのHu8A6変異体の結合をELISAによって分析し、天然FcγRllBへのHu8A6変異体の結合をRaji細胞上でのFACSによって分析した（上記を参照のこと）。さらに、抗体変異体の速度論特徴付けを表面プラズモン共鳴で行った。
【０１１１】
ヒト化8A6変異体の試験
8A6ヒト化変異体のリン酸化活性を試験するために、Daudi細胞を、抗体混合物で刺激し、0.5または5μg/mlの異なる8A6変異体で処理し、ITIMリン酸化についてウェスタンブロット分析を行った。
【０１１２】
ヒト化8A6変異体とch8A6_N297Aとの比較
試験した8A6のヒト化変異体の全てが受容体のリン酸化を誘導することができ、リン酸化レベルは、同じ精製バッチ由来のch8A6_N297Aによって誘導されたものに匹敵した。従って、第2のヒト化ラウンド後に活性の低下は検出されなかった。Biacoreデータは重鎖および軽鎖の異なる組み合わせについての異なる親和性を示唆したが、それらの差異はウェスタンブロット分析によって検出可能ではなかった（図10）。
【０１１３】
ヒト化8A6変異体とch8A6_N297A、ブロッキング抗FcγRIIB（2B6）およびchGB3_N297Aとの比較
最終のヒト化鎖組み合わせを選択した後、重鎖VH10と軽鎖VL6とを組み合わせた変異体を、抗体ch8A6_N297A、2B6およびchGB3_N297Aと比較した（図11）。
【０１１４】
インビボアッセイ
SLE-PBL-モデル
Rag2/γc/Fcγ-/-マウスに6 Gyの線量を照射し、500μl PBS中の異なる量のヒト末梢血白血球を腹腔内注射した。マウスへのヒトSLE患者PBLの移植がhIgMまたはhIgGの存在によって確認された後、細胞の注射の2週間後にマウスの処置を開始した。200μlバッファ（PBS）または200μl PBS中の20μg抗体（ch8A6_N297A）で、腹腔内に週2回で4週間マウスを処置した。マウスを週1回計量および採血し、血清を得た。血清サンプルをさらに使用するまで-80℃で凍結した（図12）。
ELISA
総ヒトIgG、IgMならびに抗DNA IgMおよびIgGの存在について、血清サンプルをELISAによって分析した。血清サンプル中の総血清IgMおよびIgGの定量化のために、Bethyl Human IgM ELISA Quantitation KitおよびHuman IgG ELISA Quantitation Kit（Biomol）を製造業者の説明書に従って使用した。ODを450および650 nmでVersaMaxチューナブルマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）によって測定した。
抗DNA抗体の検出のために、ELISAプレートをPBS中10μg/mLメチル化BSA（Sigma）で室温にて2時間コーティングした。洗浄後、プレートをPBS中50μg/mL仔牛胸腺DNA（Sigma）で4 ℃にて一晩コーティングした。非特異的結合のブロッキングをPBS/0.1％ゼラチン/3％ BSA/1mM EDTAで室温にて2時間行った。血清をブロッキング溶液中に1:100で希釈し、室温にて1時間インキュベートした。検出抗体として、ヒトIgM Quantitation Kit（Bethyl）のHRPコンジュゲート化抗体を使用し、ブロッキング溶液中に1:10,000で希釈し、続いて、室温にて1時間インキュベートした。PBSを全ての洗浄工程に使用した。検出のために、TMB溶液を添加し、反応を6％オルトリン酸で停止させた。
【０１１５】
SLE PBLモデル、総ヒト血清免疫グロブリン
SLEに罹患しているヒトドナー由来のPBLが移植されたマウスにおいて総ヒトIgGレベル[μg/mL]を分析した。PBSと抗FcγRIIBとの間で総ヒトIgGの有意差は検出されなかった。本発明の抗体は総ヒトIgGに有意な影響を与えなかった（図13）。
【０１１６】
SLE PBLモデル、抗DNA抗体（疾患特異的IgG）に対する影響
SLE-PBL移植後の第4週で開始する抗FcγRIIBマウス中における疾患特異的ヒト抗DNA IgGの著しい減少が観察された。開示される抗体は、疾患関連抗DNA抗体の量を特異的に減少させる（図14）。
【０１１７】
実施例5−FcγIIB受容体およびFcε受容体に結合する二重特異性抗体の作製
8A6-IgGおよび8A6-IgE構築物の命名の定義：
2017529832.tif 000002
異なるFcγRIIB IgE抗体の作製、発現および精製の説明。
構築物設計
図15に示されるように、全ての構築物は、ハイブリッド抗体のFabドメインがIgG分子（可変ドメインおよびCL/CH1ドメイン）に等しいという共通点を有する。さらに、全ての構築物はIgE定常ドメインCε3およびCε4を有する。これらのドメインはIgG-Cg2およびCg3と相同である。IgG抗体において、ヒンジ領域は、分子の必要とされる柔軟性を担い、ジスルフィド架橋を介して二量体を形成する。このヒンジ領域はIgE抗体には存在しない。ヒンジ領域の代わりに、追加のドメインCε2がこの機能を採用する。8A6-IgE抗体は、Cg1ドメインからCεドメインへの最適な変更と共に、Fabドメインの高い柔軟性を示す。従って、IgGのヒンジ領域（図15を参照のこと）またはIgEの完全なFcεドメイン（Cε2、Cε3、Cε4）（図15を参照のこと）のいずれかを保持する変異体を設計した。別のバリエーションは、Fcεドメイン中の異なる量のN-グリコシル化部位を考える。IgE-Fcドメインのグリコシル化は、FcεRIへの親和性に対して影響を有さなかったが、抗体の発現および安定性に対して影響を有した。これらの構築物を、標準実験手順に従ってプラスミドベクター中にクローニングした。
細胞株および培養条件
CHO-S細胞を供給業者の推奨に従って培養した。簡潔には、2 mM Glutamaxが補われたFreestyle CHO-S培地中で細胞を培養し、2〜3日毎に継代した。細胞を37℃、5％ CO2、100 rpmで培養した。トランスフェクションの1日前に、細胞を密度0.5×106 /mlで分割し、生存可能性を検査した（> 96％）。ヒトバーキットリンパ腫細胞株RajiおよびDaudiを、10％ FBS、MEM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウムおよび2 mM L-グルタミンが補われたRPMI 1640中にて37℃および5％ CO2で培養した。細胞を0.2〜1.0×106個/mlの密度で2〜3日毎に継代した。
FcγRIIB_IgE構築物によるCHO-Sのトランスフェクション
トランスフェクションの日に、細胞密度は1.0〜2.0×106/mlであった。8.0×108個の細胞を20 ml CHO Freestyle培地にて希釈した（40×106/ ml）。1000μgのプラスミドDNA（重鎖および軽鎖それぞれ500μg）を添加し（50μg DNA/mlトランスフェクション体積）、続いて2000μg PEI（00μg PEI/ mlトランスフェクション体積）を添加した。細胞を37℃、5％ CO2、100 rpmで3時間インキュベートした。この後、細胞懸濁液をCHO Freestyle培地にて1:10で希釈し、0.5 mMバルプロ酸を添加し、31℃、5％ CO2、100 rpmで10日間インキュベートした。4000 × gでの2 × 10分間の遠心分離によって上清を採取した。
力価決定、精製およびサイズ排除クロマトグラフィー
プロテインA-HPLCによる抗体力価決定
プロテインA-HPLC分析をAgilent 1200 Series HPLCシステムで行った。データをソフトウェア「Chemstation」バージョンRev. B.04.02で分析した。以下の溶媒を使用した；溶媒A: 0.05M Tris/HCl、0.1Mグリシン、0.15M NaCl、pH 8.0；溶媒B: 0.05M Tris/HCl、0.1M グリシン、0.15M NaCl、pH 3.0。分析のために、Upchurch 2x 20 mm分析ガードカラム（#C-130B）に、120μlのApplied Biosystems Poros（登録商標）20Aパーフュージョンクロマトグラフィー媒体（Life Technologies, #4374732）を詰めた。結合した抗体を100％溶媒Bで溶出させた。精製抗体を回収した場合、フラクションを56 mM Tris pH 8.0で中和した。
8A6-IgEの精製
6日間の培養後に細胞を採取し、4000 × gでの2 × 10分間の遠心分離によって抗体含有上清を得た。抗体を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Akta Explorer）によって5 ml High trap プロテインA FFカラム（GE Healthcare）で精製した。プロテインAへの抗体の結合は抗体のVH3フレームワークによって媒介される。ランニングバッファは10 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaClを含有し、溶出バッファは100 mMグリシン pH 2.7、150mM NaClから構成された。溶出された抗体を60 mM Tris-HCl, pH 8.0で中和し、およそ1.0 mg/mlへ濃縮し（Sartorius Vivaspin4）、0.2μmフィルターで滅菌濾過し、-80℃で保存した。
【０１１８】
実施例6：キメラ8A6-IgE構築物の特徴付け
サイズ排除-HPLC
精製された8A6-IgE変異体のオリゴマー状態および均質性を決定するために、サンプルをSE-HPLCに供した。SE-HPLCをAgilent 1200 Series HPLCシステムで行った。データをソフトウェア「Chemstation」バージョン Rev. B.04.02で分析した。分析をSuperdex 200 10/300 GLカラム（GE Healthcare）で行った。以下の溶媒を使用した；5mM His, 150 mM NaC, pH 6.5。25μgのタンパク質を0.5μg/μlの濃度でアプライした。
これにより、グリコシル化8A6-IgE変異体は、標準ch8A6_N297Aと比較してより多くの二量体を形成する傾向を有し得、一方、脱グリコシル化8A6-IgEは、標準ch8A6_N297Aと比較してより分解されそしてより高い割合のフラグメントを有するようであることが明らかとなった。
結合アッセイ
いくつかの結合アッセイを行い、抗体の結合親和性および特異性を分析した。これらの結合アッセイのために、可溶性FcεRIαを下記プロトコルに従って作製した。
可溶性FcεRIαの作製
sFcεRIαによるCHO-Sのトランスフェクション
トランスフェクションの日に、細胞密度は約1.0×106/mlであった。500 mlの細胞懸濁液を2個の1リットルフラスコに移した。Freestyle Max試薬を穏やかにひっくり返し、312.5μlを5 ml Optipro SFMにて希釈した（RT）。312.5μgのプラスミドDNA（pAC91, sFcεRIa-H6）（SEQ ID NO: 37）を5 ml OptiPro SFMにて希釈し、穏やかに混合した。希釈されたFreestyleMax試薬をDNA/ Optipro SFM混合物に添加し、RTで15分間インキュベートした。フラスコを徐々に回しながら、DNA-脂質混合物を細胞へ徐々に添加した。トランスフェクト細胞を37℃、5％ CO2、100 rpmで6日間インキュベートした。上清を4000 × gでの2 × 10分間の遠心分離によって採取した。
sFcεRIαの精製
組換え可溶性FcεRIαの産生のために、CHO-S細胞を、記載したように、ヒトFcεRIαのHisタグ化細胞外ドメイン（pAC91）でトランスフェクトした。細胞上清からのsFcεRIαの精製をAkta ExplorerでNiNTA-精製（Qiagen, #1018244）によって行った。以下のバッファを使用した：50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10 mM イミダゾール, pH8.0を含有する結合バッファ；50mM NaH2PO4、300mM NaCl、400 mMイミダゾール, pH 8.0を含有する溶出バッファ。結合したsFcεRIαを、0％から100％ Bへの線形勾配で溶出させた。sFcεRIαフラクションの濃縮後、10 mM His, pH 6.5でのバッファ交換を行った。これに続いて、Akta ExplorerでDEAE Sepharose FF（GE Healthcare, # 17-0709-10）で弱アニオン交換クロマトグラフィーを用いて、sFcεRIαを精製した。溶媒Aは10 mM His, pH 6.5から構成され；溶媒Bは10 mM His, 0.5 mM NaCl, pH 6.5を含有した。結合されたsFcεRIαを、2％から100％ Bへの線形勾配で溶出させた。濃縮されたタンパク質を10 mM His, 150 mM NaCl, pH6.5, -80℃中に保存した。
SDS-PAGE
SDS-PAGE分析のために、1μgの精製抗体またはTrenzyme材料をNuPAGE Bis-Tris（4〜12％）ゲルへアプライした。抗体を、製造業者の推奨に従って、NuPAGE LDSサンプルバッファ中に、または、サンプル還元試薬が添加されかつ75℃へ10分間予熱される還元条件下に、適用した。SDS-PAGEを200Vの定電力で30分間行った。その後、ゲルをH2Oで2回洗浄し、シンプリーブルー染色溶液（Life Technologies）で染色した。過剰な色素をH2Oで除去し、ゲルの可視化をTransilluminator（UV, 白色光）を使用して行った。
ELISA結合アッセイ
sFcγRIIBまたはsFcεRIαへの8A6-IgEの結合
sFcγRIIBおよびsFcεRIαの両方へのグリコシル化および非グリコシル化型の8A6_cε2-4／8A6_cε3-4抗体の結合効果を試験するために、ELISAアッセイを確立した。このために、96ウェルプレートを、RTで1時間、SM101またはsFcεRIα、PBS中1μg/ml（体積100μl）でコーティングした。プレートをPBS, 0.01％ Tween（登録商標）-20により2回洗浄し、RTで2時間、PBS, 2％ BSA, 250μl/ウェルによりブロックした。洗浄工程後、抗体サンプルを、RTで1時間、コーティングされたウェルへ、PBS, 2％ BSA中の適切な希釈系列で添加した。プレートをPBS, 0.01％ Tween（登録商標）-20により3回洗浄し、ヒトκ軽鎖に対する検出二次抗体（HRPコンジュゲート化）を、RTで1時間、PBS, 2％ BSA中1:8000で添加した。3回の洗浄工程後、結合したHRP-コンジュゲート化抗体をOPD, 0.03％ H2O2 100μl/ウェルで検出した。反応を50μlの4 M H2SO4で停止させ、ELISAリーダー（Tecan, Spectra FluorPlus）にて492 nmでの吸収を測定した。sFcγRIIBへの直接結合は、4つの8A6_IgE構築物の全てが、共有されるFabドメインに起因して、ch8A6_N297A抗体と同じ親和性をsFcγRIIBに対して有することを明らかにした（図16）。しかし、sFcεRIαへの8A6-IgE構築物の結合は、全長IgE Fc部を有する構築物（cε2-4）とより短いバージョン（cε3-4）との差異を実証した（図17）。
sFcγRIIBおよびsFcεRIαへの8A6-IgEの結合−サンドイッチELISA
サンドイッチELISAを行い、これは同時に両方の抗原への結合を示した。両方の標的sFcγRIIBおよびsFcεRIαへの作製した8A6_cε2-4／8A6_cε3-4変異体の結合効果を、このサンドイッチELISAアッセイにおいて試験した。このために、96ウェルプレートを、RTで1時間、可溶性FcγRIIB（SM101）, PBS中1μg/ml（体積100μl）でコーティングした。プレートをPBS, 0.01％ Tween（登録商標）-20により2回洗浄し、RTで2時間、PBS, 2％ BSA, 250μl/ウェルによりブロックした。洗浄工程後、コーティングされたウェルに、抗体サンプルを、RTで1時間、PBS, 2％ BSA中の適切な希釈系列で添加した。プレートをPBS, 0.01％ Tween（登録商標）-20により3回洗浄し、RTで1時間、sFcεRIα（PBS, 2％ BSA中0.005μg/ml）と共にインキュベートした。プレートをPBS, 0.01％ Tween（登録商標）-20により3回洗浄し、ヒトFcεRIαに対するビオチン化検出二次抗体CRA1を、RTで1時間、添加した（PBS, 2％ BSAにて希釈された0.5μg/ml）。プレートをPBS, 0.01％ Tween（登録商標）-20により3回洗浄し、HRP-コンジュゲート化ストレプトアビジンを、RTで20分間、PBS中1:200で添加した。3回の洗浄工程後、結合されたHRP-コンジュゲート化ストレプトアビジンを、OPD, 0.03％ H2O2 100μl/ウェルで検出した。反応を50μlの4 M H2SO4で停止させ、ELISAリーダーにて492 nmでの吸収を測定した。
サンドイッチELISAはELISAからの結果を確認した。この場合も、FcεRIαへの8A6_cε3-4構築物の低親和性が、抗体のFabフラグメントでのFcγRIIBへの同時結合と共に示された。
FACS結合分析
細胞の表面に発現した天然FcγRIIBへの抗体の結合をFACS分析によって決定した。Raji細胞を使用し、何故ならば、バーキットリンパ腫に由来するこのBリンパ球細胞株は高レベルのFcγRIIBを発現するためである。Raji細胞をペレット化し、1.0×105個/ウェルを、50μlのFACSバッファ（HBSS, 5％ FBS, 0.01％ NaN3）中の96ウェル丸底細胞培養プレート中に播種した。試験される抗体を、50μlのFACSバッファ中の適切な希釈系列でRaji細胞に加え、4℃で1時間インキュベートした。200μlのFACSバッファでの2回の洗浄工程後、細胞を、FACSバッファ中に1:200で希釈された、ヒトκ軽鎖に対するFITC-コンジュゲート化二次抗体（Fab）2と共に、4℃で30分間、インキュベートした。2回の洗浄工程後、細胞ペレットを150μlのFACSバッファ中に再懸濁し、FACS Canto II（BD Biosciences）でのフローサイトメトリーによって分析した。
アッセイは、全ての8A6変異体について、FcγRIIBへのFabフラグメントの結合能が、抗体のFc部に導入された変化に関係なく、ch8A6_N297Aと比較して残っていることを示した（図18）。
Biacore
FcγRIIBおよびFcεRIαへの抗体構築物の親和性を、Biacore（商標）T200システムを使用する表面プラズモン共鳴（SPR）によってさらに分析した。
sFcγRIIBを、標準アミンカップリングプロトコル（BIAsensor surface Handbook, Biacore）を使用して、Series S Sensor Chip CM5（Biacore, BR-1005-30）へ共有結合で固定した。抗体変異体を1分間50 nMの濃度でキャプチャーした。分析物sFcεRIαを3分間0.1〜25 nMの様々な濃度で注入し、続いて7分間の解離工程を行った。CM5チップを、3M MgCl2を含有するバッファでリガンドおよびSM101の相互作用を消滅させるによって再生し、従って、それを新しい分析サイクルのために準備した。測定を25℃および連続的なフロー（10μl/分）で行った。データ評価を、1:1結合を仮定して、Biacore T200 Evaluation Software（バージョン1.0）を使用して行った。
結合実験の概要：
全ての構築物のFcγRIIBに対する結合親和性は、オリジナルのIgG抗体の結合親和性と等しいことが分かった。FcεRIαへの結合に関しては、8A6-IgEの両方の抗原への結合特徴付けの結果は、短縮変異体8A6_cε3-4/deglyは、FcεRIに対して全長IgE構築物と同じ高い親和性を発揮しないかもしれないことを示唆している。
【０１１９】
実施例7：ヒト化8A6-IgE抗体の製造および特徴付け
8A6-IgEのヒト化
ch8A6-IgEのヒト化のために、抗体の可変重鎖を、SEQ ID NO: 3のヒト化可変重鎖10（VH10）と交換した。ヒト化8A6-IgE構築物の発現のために、ヒト化重鎖と一緒に可変軽鎖6（VL6；SEQ NO.4）を使用した。
可変重鎖の交換を標準クローニング手順によって行った。可変重鎖の交換を標準クローニング手順によって行った。挿入物の正しい挿入はDNA配列決定によって確認した。さらに、重鎖配列のC末端リジンを除去して終止コドンに交換した（AAA→TAA）。これは、荷電変異体の量を有意に減少させる。それは変異誘発PCRによって達成し、変異の成功は配列決定によって確認した。
ELISAによるヒト化8A6-IgEの抗原結合の特徴付け
実施例2と同じプロトコルを使用して、ELISAを行った。hu8A6-IgE変異体の結合をch8A6_N297Aと比較して試験した。ここで、可溶性FcγRIIBへの結合親和性の差異は検出されなかった（図19）。ヒト化およびキメラ8A6-IgE変異体のFc部におけるsFcεRIαへの結合を試験した。短縮されたFc部（cε3-4）を有するキメラおよびヒト化8A6-IgE変異体は両方とも、完全なFc部（cε2-4）を有する8A6-IgE変異体と比較して、FcεRIαに対するより低い親和性を示した。しかし、キメラ抗体およびヒト化抗体において差異は検出されなかった（図20）。
【０１２０】
実施例8：8A6-IgE標識化および末梢血単球（PBMC）上の結合速度論
全長ch8A6_cε2-4構築物の脱グリコシル化バージョンを用いてFcεRIに対する結合試験を行った。
方法：
8A6（IgE）および（IgG）を蛍光色素NHS-Fluo488で標識した。500μgの各抗体を、製造業者の説明書に従ってPD-10カラムによってPBS中へ脱塩した。溶出フラクションの吸光度を280 nm（参照：320 nm）で光度計によって測定し、最も高い抗体量を含有するフラクションをプールした。Vivaspin4カラムによる濃縮後、およそ400μgの抗体を取り戻すことができた。
蛍光色素Fluo488をDMSO中に再構成し、その濃度を、517 nmでのその発光最大値で蛍光を測定することによって計算した。
サンプルをボルテックスしながら色素を抗体溶液へ徐々に添加して、抗体および色素を1:10のモル比で混合した。抗体および色素の量についての正確な計算は付録に見られ得る。溶液を300 rpmでの一定の振盪下で25℃にて1時間インキュベートした（Eppendorf Thermomixer）。遊離色素分子をPD-10カラムによる精製によって分離した。280 nm（抗体）および510 nm（色素）で測定された、最も高い標識タンパク質量を含むフラクションをプールし、Vivaspin4カラムによって再び濃縮し、最終濃度および標識化の程度（D.O.L.）を計算した。
最終の標識抗体を計算した：
ch8A6 -cε2-4-degly-T：1.35μg/μl、D.O.L.：2.2
ch8A6_cε3-4-degly-T：1μg/μl、D.O.L.：2.86
蛍光色素および抗体量の計算：
・8A6（IgE）の分子量：およそ176,000 Da ＝ 176,000 g/mol
→350μg 抗体 ＝ 2 nmol
・Fluo488の分子量：およそ981 mol/l
→DMSO中の不定量の再懸濁
→希釈  水中に1:5,000およびOD517の測定（色素の発光最大値）
→濃度[μg/μl] ＝ 希釈係数 × OD517 × 918/ 80,000 ＝ 8.6 nmol/μl
・色素対抗体比の計算：
→色素:抗体の所望のモル比 ＝ 10:1
→抗体 2 nmol→色素 20 nmol 
→2.3μl色素
標識化の程度（D.O.L）の計算：
・タンパク質濃度およびD.O.Lの計算についての定義
→Amax ＝ 色素の発光最大値、Fluo488については517 nmでの吸光度
→A280 ＝ 280 nmでの吸光度（タンパク質）
→CF= 補正係数；タンパク質に結合される全ての色素について特異的にInterchimによって定義される；A280（遊離色素）/ Amax（遊離色素）
→MW：タンパク質の分子量
→ε：減衰係数
・c[タンパク質] ＝ 1.4 × （A280 - Amax x CF）
・D.O.L. ＝ （Amax × MW）/（c[タンパク質] × ε色素）
Ficoll密度勾配遠心分離によるPBMCの調製
健康なドナー由来の軟膜をHBSSで1:1に希釈し、30 mlを50 ml Falconチューブ中の15 ml Biocoll分離溶液上に重層した。破損させることなく1000 × gで20分間遠心分離した後、白血球フラクションをプラスチックピペットで回収した。細胞を完全増殖培地で2回洗浄し、Neubauerカウンティングチャンバ中においてカウントした。
PBMC上でのch8A6_cε2-4-degly-Tおよびch8A6_N297Aの結合速度論
100μl完全増殖培地中の0.5×106 PBMCを、以下の抗体希釈物と共に37℃でインキュベータ中の96ウェルプレート（平底）中においてインキュベートした：2μg/ml ch8A6_cε2-4-degly-T cFluo488、2μg/ml ch8A6_N297A -Fluo488、2μg/ml 8A6 cε2-4-degly-T。全ての時点について余分のウェルを準備した。対照として、ch8A6_cε2-4-degly-T -Fluo488を5倍モル過剰量のSM101と共にRTで30分間プレインキュベートすることによって、PBMC上のFcγRIIBへの結合をブロックした。FcγRIIB結合部位の遮断を、Raji細胞上でインキュベーション後にFACS分析によって試験した。
10、30、60、120および240分後、ならびに一晩インキュベーション後、細胞を400 × gで5分間遠沈させ、丸底96ウェルプレート中の、2.5μlのαhCD19-PeCy7、5μlのαhCD63-PerCPおよび2.5μlのαhCD193-APCを含有する100μlのFACSバッファ中に、氷上で30分間再懸濁した。FACSバッファでの2回の洗浄工程後、サンプルをFACS Canto IIで分析した。
Raji細胞へのFluo488-標識8A6-IgGおよび8A6-IgEの結合
Raji細胞を異なる濃度の標識抗体と共にインキュベートし、平均蛍光値を抗体濃度に対してプロットした。抗体8A6_cε2-4-deglyは、Raji細胞の表面でのその受容体FcγRIIBへの高親和性結合を示した（図21を参照のこと）。この結合の特異性を、同じ構築物と共にインキュベートされたCHO細胞の分析によって確認したところ、標識抗体についての表面シグナルは検出されず、何故ならば、それはCHO細胞がFcεRI受容体を欠いていることに起因すると予想されたためである。これらのデータは、抗体の結合は、標識プロセスによっても、結合された蛍光色素NHS-Fluo488によっても変更されなかったことを確認した。
8A6_cε2-4-deglyのFcγRIIB結合部位のSM101マスキングの対照
細胞への8A6-IgEのFc部の結合の検出を可能にするために、抗体をSM101と共にプレインキュベーションすることによって、F（ab）2ドメイン、FcγRIIB結合部位それぞれをブロックした。構築物の結合能をFACSで分析した。FACS分析は、5倍モル過剰量の可溶性受容体（SM101）と共にプレインキュベーションした後の、8A6_cε2-4-deglyのその受容体FcγRIIBへの遮断を明らかに示した。SM101と共にプレインキュベーションした後の平均蛍光値は、未処理抗体と比較して、11.8％へと減少した。従って、マスクされた8A6_cε2-4-degly抗体は、PBMCインキュベーションについての対照として使用することができた。
PBMC上における結合速度論
単離されたPBMC上での、Fluo488で標識された抗体8A6-IgEの結合を、FACS分析によって評価した。従って、B細胞（CD19）と好塩基球（CD193、低SSC）とを識別するために、細胞をαhCD193-APCおよびαhCD19-PeCy7で染色した。CD63を染色し、好塩基球の活性化を分析した。
好塩基球上のCD63発現は測定の間変化しなかった（示さず）。
図22は、αhCD19-PeCy7抗体によって検出された、B細胞上の蛍光シグナルを示す。緑色の数字は、Fluo488標識抗体についてのCD19陽性細胞の測定された平均蛍光値を反映する。
【０１２１】
実施例9：好塩基球活性化試験（BAT）
アッセイは、Sainte-Laudyらによって最初に1994年（Sainte-Laudy, J, et al., Analysis of membrane expression of the CD63 human basophil activation marker. Applications to allergologic diagnosis. Allerg. Immunol. (Paris) 26, 211-4）および1996年（Sabbah, A and Sainte-Laudy, J., Flow Cytometry applied to the analysis of Lymphocyte and Basophil activation. ACI International 8, 116-9）に記載された方法に基づき、ここで、アレルゲンまたは対照による好塩基球活性化は、細胞表面上のCD63（gp53）の増加を測定するフローサイトメトリーによって検出される。アレルゲンおよび陽性対照をヘパリン添加全血に添加し、好塩基球を同定するための抗hCD193と活性化を測定するための抗hCD63とを含有する特異的抗体染色によって、CD63表面発現を測定する。並行して、好塩基球活性化および脱顆粒についての第2のパラメータとして、ヒスタミン放出を測定することができる。
8A6-IgEによる好塩基球の表面におけるFcγRIIBとFcεRIの架橋によって、FcεRIを介するアレルゲンに対する細胞応答がダウンレギュレートされる。
公知の花粉アレルギー（または試験に利用可能なアレルゲンを有する他の定義されるアレルギー）を有するドナーに由来するヘパリン添加全血50μlを得た。
これらの実験において、ch8A6_cε2-4-degly抗体を、ch8A6_N297Aキメラ8A6（IgG）, N297A変異体と比較して使用した。
陽性対照および陰性対照について、キットのマニュアルに記載されているように、アレルゲンまたは対照とのインキュベーション時間15分間は、好塩基球の適切な活性化にとって十分であった。
50μlのヘパリン添加全血を、50μlの刺激物（アレルゲン、fMLP、または抗FcεRI対照抗体）および100μlの刺激バッファと共にインキュベートした。αFcεRIおよびfMLPは、キットのマニュアルに記載されているとおりに溶解し、希釈せずに使用した。アレルゲンは刺激バッファにて1:5に希釈した。Falconチューブにてバッファおよび刺激物を調製し、当該溶液に50μlの血液サンプルを（チューブ壁に接触させることなく）直接添加した。刺激バッファ中に溶解された20μlの染色試薬または市販の抗体（αhCD63-PEおよびαhCD193-Alexa647）を添加した。サンプルを穏やかにボルテックスし、37℃に予熱されたウォーターバス中にて15分間インキュベートした。溶解のために、2 ml溶解試薬を各チューブにアプライし、次いでサンプルをボルテックスし、暗所においてRTで10分間インキュベートした。500 × gで5分間の遠心分離後、上清を除去し、ペレットをキットの洗浄バッファ300μl中に再懸濁した。FACS分析を、以下の設定を使用してFACS Canto IIにおいて行った：
FSC  リニア電圧：269
SSC  リニア電圧：401
FITC  ログ電圧：447
PE  ログ電圧：379
αFcεRI抗体およびペプチドfMLP（ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン、SEQ ID NO: 38）はキットに含有されており、1サンプル当たり50μlで使用した。
ゲーティング戦略
図23は、溶解された全血におけるゲーティング戦略を示す。パラメータFSCおよびSSCをリニアに設定した。3つの集団が可視化された：リンパ球、単球および顆粒球。好塩基球は、リンパ球と同じSSCレベルで検出され得る。SSCに対してCD193発現をプロットすることは、CD193を発現する2つの別個の集団の検出をもたらす。SSCが低い集団は好塩基性顆粒球と同定された。CD193（Y軸）対CD63（X軸）発現を示すプロットに象限ゲートを適用した結果、未処理サンプル中のCD63蛍光はほぼゼロであった。
バックゲーティング戦略を使用して、細胞集団をさらに特徴付けた。CD63低発現集団を含むゲートおよびCD63高発現集団を含むゲートを、ゲーティングなしの全血溶解物のFSC-SSCプロットと重ね合わせた。低発現集団は、リンパ球集団の近くにあると分かり、このゲーティングされた集団は好塩基球であることが確認された。対照的に高発現集団は、SSC軸の非常に右の限界で見られ、このことは、当該細胞が高度に顆粒状であることおよび好酸性顆粒球であることを反映している。
陽性および陰性対照のCD63発現
未処理細胞のCD63発現を0％に設定するか、または好塩基球に設定された象限ゲートの下部象限中のごく僅かの陽性細胞に設定した。αFcεRI抗体は、CD63陽性細胞が90％のレベルへと再現性よく好塩基球を活性化したが、ペプチドfMLPは、中程度のCD63発現しか誘導しなかった（陽性細胞が25〜30％）。アレルギー反応を減少させる能力について試験されるべき抗体が好塩基球自体を活性化できるかを決定するために、ch8A6_N297Aおよびch8A6_cε2-4-deglyを、細胞のさらなる活性化無しに、2つの異なる濃度で投与した。
図24は、これらのサンプルについて得られたデータを示す。
上側の図に示されるように、全血サンプルを0.5または2μg/mlの8A6-IgGまたは8A6-IgEと共にインキュベーションしても、好塩基球自体は活性化されなかった。2つの独立した実験において、CD63の表面発現は変化せず、検出された陽性細胞は1％未満であった。
分析の次の段階では、内毒素の混入が好塩基球活性化に与える効果を試験した。8A6_cε2-4-deglyは製造プロセスに由来する約30 EU/mlの内毒素を含有するため、LPS対照を行い、混入物質に由来する効果を排除した。従って、別個の血液サンプルを、8A6_cε2-4-degly単独と並行して、50 EU/ml LPS（アッセイにおいて1:4に希釈）と共にインキュベートした。図25に示されるように、混入生産物において予想された濃度でのLPSによる好塩基球の処理は、細胞の非特異的活性化をもたらさなかった。従って、8A6_cε2-4-deglyによる処理後に測定された効果は、抗体の活性に直接相関し得る。
8A6_cε2-4-deglyによる好塩基球の予防的処理
全血サンプルを、異なる濃度の対照、8A6_N297Aおよび8A6_cε2-4-deglyと共にインキュベートした。サンプルを異なる時点で採取し、好塩基球が花粉によって活性化されるポテンシャルを測定した。
A）0時間時点
各抗体を全血アリコートに添加した直後に、0時点について最初のサンプルを採取し、当該サンプルについて、花粉刺激によって活性化されるポテンシャルを分析した。この時点を2つの独立した実験で測定した。抗体との約5分間のインキュベーション（ピペッティングからサンプルインキュベーションまでの時間）を表すこの時点で、8A6_N297Aまたは8A6_cε2-4-deglyの効果は認められなかった。全サンプル中の好塩基球は、花粉によって約90％のCD63発現細胞へと活性化され得た。
B）2時間時点
2時間のインキュベーション後、αFcεRI活性化（陽性細胞が92％）および花粉刺激を受けた未処理細胞（93.4％）によって見られたような活性の低下を伴わずに好塩基球活性化が検出された。0.5〜5μg/mlの範囲の濃度の8A6_N297Aとのインキュベーションは、花粉による好塩基球活性化に影響を与えなかった（陽性細胞が91〜91.6％）。この時点で、8A6_cε2-4-deglyで処理されていたサンプルにおいては、好塩基球活性化が減少したようであったが（84.4〜88％）、用量依存性は検出されなかった。
C）6時間時点
6時間のインキュベーション後、細胞が陽性対照によって活性化されるポテンシャルは、花粉による活性化の場合は約85％、αFcεRIによる処理の場合は87％へと減少した（図26）。8A6-IgGによる処理は陽性対照に匹敵する結果（85〜88％）を示したが、8A6-IgEと共にインキュベートされた細胞は減少した活性化ポテンシャル（76〜84％）を示した（図27）。0.5μg/ml 8A6_cε2-4-deglyと共のインキュベーション後、好塩基球の76.6％のみが花粉によって活性化され得た。しかし、用量依存性は検出されず、より多い投薬量は0.5μg/ml処理と比較して僅かに上昇したCD63発現を示した。
D）24時間時点
2つの独立した実験において測定された、最後の時点は、αFcεRI処理の場合の活性化におけるCD63発現75％への減少を示した（図28および図29）。
【０１２２】
実施例10：花粉活性化試験
花粉アトピーについて陽性と試験結果が出た健康なドナーに由来するヘパリン添加全血を、それぞれ5μg/mlの8A6_ce2-4脱グリコシル化または8A6_ce3-4脱グリコシル化（SM301 cε2-4またはcε3-4）と共に一晩インキュベートした。分析のために、50μl血液サンプルを、50μlの花粉（刺激バッファ中に1:5で予め希釈）、100μlの刺激バッファ（FlowCast Kit）および20μlの染色溶液（3μlのa-hCD193-Alexa647、3μlのa-hCD63-PerCP、3μlのa-hCD203c-PE、11μl刺激バッファ）と混合した。サンプルをボルテックスミキサーにおいて穏やかに混合し、37℃に予熱されたウォーターバス中において15分間インキュベートした。溶解のために、2 ml PharmLyse試薬（BD Biosciences）を各チューブにアプライし、次いでサンプルを再び混合し、暗所においてRTで10分間インキュベートした。500 × gで5分間の遠心分離後、上清を除去し、ペレットを300μlのFACSバッファ中に再懸濁した。好酸球を構成する、SSCが高くCD193陽性だがCD203c陰性の細胞に、ゲートを設定した。
【０１２３】
特に明記されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量のような特性、反応条件などを表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。本明細書において使用されるように、用語「約」および「およそ」は、10〜15％以内、好ましくは5〜10％以内を意味する。従って、それとは反対に指示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得ようとされる所望の特性に依存して変動し得る近似値である。最低限でも、かつ、特許請求の範囲の範囲への均等論の適用を制限しようとする試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効桁の数を考慮して、そして、通常の四捨五入技術を適用することによって、解釈されるべきである。本発明の広い範囲を記載している数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体例に記載されている数値は、できる限り正確に報告されている。しかし、いずれの数値も、本質的に、それらの個々の試験測定において見られる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を含んでいる。
【０１２４】
本発明を説明する文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、「その（the）」および同様の指示物は、本明細書中において特に指示されない限り、または明らかに文脈に矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内に入るそれぞれの別個の値に個々に言及する簡潔化した方法として役立つように意図されるに過ぎない。本明細書中において特に指示されない限り、それぞれの個々の値は、あたかもそれが個々に本明細書中に記載されているかのように、本明細書中に組み入れられる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書中において特に指示されない限り、または明らかに文脈に矛盾しない限り、任意の適切な順序において行われ得る。本明細書において提供されるありとあらゆる例、または例示的な言葉（例えば「など」）は、本発明をより一層わかりやすくすることだけを意図し、他の方法で特許請求される本発明の範囲に対する限定をもたらさない。本明細書中の言葉は、特許請求の範囲に記載されていない如何なる要素をも本発明の実施に必須であると示していると解釈されるべきではない。
【０１２５】
本明細書に開示される本発明の代替の要素または態様の群分けは、限定として解釈されるべきではない。各群メンバーは、個々に、または本明細書に見られる他の群メンバーまたは他の要素との任意の組み合わせで、言及および特許請求され得る。群の1つまたは複数のメンバーが、便宜および／または特許性の理由のために、群に包含されても群から削除されてもよいことが予想される。任意のそのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、変更された場合の群を含み、従って、添付の特許請求の範囲に用いられる全てのマーカッシュ群の記載要件を満たすものと見なされる。
【０１２６】
本発明を実施するために本発明者に知られているベストモードを含む、本発明のある態様が本明細書に記載される。当然ながら、これらの記載される態様に対するバリエーションは、前述の説明を読めば当業者に明らかとなるであろう。本発明者は、当業者が必要に応じてそのようなバリエーションを用いることを予期し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されるものとは異なる方法で本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、準拠法によって許容されるような、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される事項の全ての改変物および均等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上述の要素の任意の組み合わせが、本明細書中において特に指示されない限り、または明らかに文脈に矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【０１２７】
本明細書に開示される具体的な態様は、からなるまたはから本質的になるという言葉を使用して、特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲において使用される場合、出願時であるか補正による追加時であるかに関わらず、移行用語「からなる」は、特許請求の範囲において指定されていない任意の要素、ステップまたは成分を除外する。移行用語「から本質的になる」は、指定された物質またはステップ、および基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えないものに、請求項の範囲を限定する。このように特許請求される本発明の態様は、本明細書において本質的にまたは明確に記載され、使用可能にされている。
【０１２８】
さらに、本明細書全体にわたって特許および刊行物に対して多数の参照がなされた。上記で引用された参考文献および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に個々に組み入れられる。
【０１２９】
最後に、本明細書に開示される本発明の態様は本発明の原理を説明することが理解されるべきである。用いられ得る他の改変物は本発明の範囲内にある。従って、例として、しかし限定としてではなく、本発明の代替の構成が、本明細書中の教示に従って用いられ得る。従って、本発明は、厳密に表示および説明されるようなものに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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