(57)【要約】  調製物の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用が提供され、前記調製物は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するための医薬品、食品または食品添加物である。【選択図】図５
2017530113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するための調製物の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用。
【請求項２】
前記調製物は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４およびＥＺＨ２の発現を阻害し、それにより癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するためのものである、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞、鼻咽頭癌幹細胞、食道癌幹細胞、骨髄腫幹細胞、皮膚癌幹細胞、メラノーマ幹細胞、甲状腺癌幹細胞、リンパ腫幹細胞、白血病幹細胞、乳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、子宮頸癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、胃癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、結腸癌幹細胞、直腸癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、胆嚢癌幹細胞、腎臓癌幹細胞、膠芽細胞腫幹細胞、胸腺悪性腫瘍幹細胞、横紋筋肉腫幹細胞、脳腫瘍幹細胞および髄芽細胞腫幹細胞の少なくとも１つである、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞、膵臓癌幹細胞および／または脳腫瘍幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、膵臓癌幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、脳腫瘍幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記調製物は、医薬品、食品または食品添加物である、
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記調製物は、１日あたり（ＢＰとして）約３０ｍｇ／ｋｇ−体重から（ＢＰとして）約５００ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、
ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記調製物は、１日あたり（ＢＰとして）約４０ｍｇ／ｋｇ−体重から（ＢＰとして）約１２０ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、
ことを特徴とする請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用に関し、それには、癌幹細胞（ＣＳＣ）、特に口腔癌幹細胞、鼻咽頭癌幹細胞、食道癌幹細胞、骨髄腫幹細胞、皮膚癌幹細胞、メラノーマ幹細胞、甲状腺癌幹細胞、リンパ腫幹細胞、白血病幹細胞、乳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、子宮頸癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、胃癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、結腸癌幹細胞、直腸癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、胆嚢癌幹細胞、腎臓癌幹細胞、膠芽細胞腫幹細胞、胸腺悪性腫瘍幹細胞、横紋筋肉腫幹細胞、脳腫瘍幹細胞および髄芽細胞腫幹細胞、特に口腔癌幹細胞、膵臓癌幹細胞および脳腫瘍幹細胞の増殖、遊走、浸潤および／または転移の予防、緩和および／または阻害が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
医学において、腫瘍とは、局所的な体組織の細胞に対して遺伝子レベルで正常な成長調節を失わせ、異常な細胞増殖を引き起こす種々の発癌性因子の反応によって引き起こされる異常な細胞変性作用をいう。これらの異常増殖した細胞は集合体となり、これを「腫瘍」と称する。「癌」は最も一般的なタイプの腫瘍である。異常に増殖した「癌細胞」は、集合体となるだけでなく、他の組織または器官に広がって転移する。従って、癌は悪性腫瘍としても知られている。癌細胞の増殖および転移は、生理学的機能の重度の異常を引き起こし、治癒することは非常に困難である。したがって、癌は現在、世界的に第一位の死因である。
【０００３】
癌を治療する従来の方法には、外科手術、化学療法および放射線療法などが含まれる。しかし、癌は、正確に切断されない癌細胞が連続的に増殖し、患者の状態を悪化させるため、外科的切除によって完全に治癒することはできない。したがって、外科的切除は、癌の治療において単独では使用されず、通常、化学療法および／または放射線療法のような他の治療方法と組み合わせられる。化学療法では、増殖速度の速い癌細胞を死滅させるために化学薬品（アルキル化剤など）が使用される。しかし、化学療法に使用されるほとんどの化学薬品は正常細胞にも作用し、癌患者に重度の副作用（嘔吐、脱毛症、疲労、出血、貧血など）をもたらす。放射線療法（例えば、ガンマナイフ放射線療法）は、急速に分裂する癌細胞が正常細胞よりも放射線に対してより感受性があるという原則に基づいて、癌細胞のＤＮＡを分解する。しかし、高エネルギー放射線が癌細胞を破壊すると、正常細胞にも同時に放射され、白血球の喪失、疲労、不眠症、痛みおよび食欲不振などの副作用を生じることがある。さらに、化学療法および放射線療法は、後期の癌患者の一部には有効ではない。
【０００４】
研究により、ほとんどの癌細胞は腫瘍を誘導する能力を有さず、腫瘍形成能を有する癌細胞はごくわずかであることが示されている。これらの腫瘍形成能を有する癌細胞は、幹細胞の特徴を有し（例えば、自己複製能および分化能を有する）、異なる種類またはタイプの腫瘍細胞に連続的に増殖および分化することができるため、「癌幹細胞（ＣＳＣ）」または「腫瘍幹細胞」と称される。研究により、癌幹細胞が腫瘍を形成し、癌に発展させる能力を有することも示されている。特に、癌幹細胞は、身体の他の組織または器官に転移すると、他の種類の癌に発展するであろう。さらに、癌幹細胞は、白血病、乳癌、脳腫瘍、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌または口腔癌といった組織において、他の細胞よりも化学療法または放射線療法に対して耐性が高い。このような耐性は、腫瘍の再発、浸潤および転移ならびに患者の生存率と高度に相関する。したがって、癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤および／または転移を効果的に予防、緩和または阻害することができれば、腫瘍および癌の治療成功率および患者の生存率を改善することができる。
【０００５】
現在、病院における癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤または転移を予防、緩和または阻害するための治療法（手術、化学療法および放射線療法などを含む）はすべて非効率的である。したがって、発症率、再発率および死亡率を効果的に減少させ、治癒率を改善し、副作用を減少させるための、癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤または転移を予防、緩和、または阻害するための方法または薬物の開発が必要かつ急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ＢＰが、成長関連因子、幹細胞因子、上皮間葉移行（ＥＭＴ）因子、および癌幹細胞のゼラチナーゼの発現を抑制するのに有効であること、特にＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４およびＥＺＨ２の発現を抑制するのに有効であり、したがって、癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤および転移を阻害することができ、癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するための医薬品、食品または食品添加物を提供するために用いられることができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）を必要な対象に投与することを含む、癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するための方法を提供することである。
【０００８】
具体的には、本発明の目的は、調製物の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用を提供することであり、該調製物は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するためのものである。
【０００９】
好ましくは、該調製物は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４およびＥＺＨ２の発現を阻害し、それによって癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するためのものである。
【００１０】
好ましくは、癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞、鼻咽頭癌幹細胞、食道癌幹細胞、骨髄腫幹細胞、皮膚癌幹細胞、メラノーマ幹細胞、甲状腺癌幹細胞、リンパ腫幹細胞、白血病幹細胞、乳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、子宮頸癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、胃癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、結腸癌幹細胞、直腸癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、胆嚢癌幹細胞、腎臓癌幹細胞、膠芽細胞腫幹細胞、胸腺悪性腫瘍幹細胞、横紋筋肉腫幹細胞、脳腫瘍幹細胞および髄芽細胞腫幹細胞のうち少なくとも１つである。
【００１１】
好ましくは、癌幹細胞（ＣＳＣ）は、経口癌幹細胞である。
【００１２】
好ましくは、癌幹細胞（ＣＳＣ）は、膵臓癌幹細胞である。
【００１３】
好ましくは、癌幹細胞（ＣＳＣ）は脳腫瘍幹細胞である。
【００１４】
好ましくは、調製物は、医薬、食品または食品添加物である。
【００１５】
好ましくは、調製物は医薬であり、１日あたり約３０ｍｇ／ｋｇ−体重から約５００ｍｇ／ｋｇ−体重／日の範囲の量で投与される。
【００１６】
好ましくは、調製物は、１日あたり約４０ｍｇ／ｋｇ−体重から約１２０ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される。
【００１７】
本発明のために実施される詳細な技術および好ましい実施形態は、特許請求の範囲に記載された発明の特徴を十分に理解するために、当業者のために添付の図面を伴う以下の段落で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】ＣＤ１３３＋脳腫瘍幹細胞（以下、「脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋」と称する）の相対生存率を示す棒グラフの図であり、異なる濃度のブチリデンフタリド（ＢＰ）で処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の結果を示す。
【図１Ｂ】ＣＤ１３３＋脳腫瘍幹細胞（以下、「脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋」と称する）の相対的な生存率を示す棒グラフの図であり、異なる濃度のビス−クロロエチルニトロソウレア（ＢＣＮＵ）で処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の結果を示す。
【図２】異なる濃度のＢＰで処理したＮＨＯＫ（正常ヒト口腔ケラチノサイト（ダイヤ型））の相対生存率および異なる濃度のＢＰで処理したＨＮＣ−ＴＩＣ（頭頸部癌由来腫瘍開始細胞）様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株（正方形）またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株（三角形））の相対生存率を示す曲線グラフの図である。
【図３】異なる濃度のＢＰで処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋における幹維持マーカーの発現を示すウェスタンブロッティングの結果を示す図であり、ＥＺＨ２およびアクチンのタンパク質発現を示す写真である。
【図４】異なる濃度のＢＰで処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋における幹維持マーカーの発現を示すウェスタンブロッティングの結果を示す図であり、脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＣＤ１３３およびアクチンのタンパク質発現を示す写真である。
【図５】異なる濃度のＢＰで処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋における幹維持マーカーの発現を示すウェスタンブロッティングの結果を示す図であり、脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４およびβ−アクチンのタンパク質発現を示す写真である。
【図６】異なる濃度のＢＰで処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞（すなわち、膵臓癌細胞の細胞株）におけるＳｏｘ−２、ＣＤ１３３、ＣＤ４４およびβ−アクチンのタンパク質発現を示すウェスタンブロッティングの結果を示す写真の図である。
【図７】異なる濃度のＢＰで処理したＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）におけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ−２およびＧＡＰＤＨのタンパク質発現を示すウェスタンブロッティングの結果を示す写真の図である。
【図８】Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）の存在下または非存在下における異なる濃度のＢＰで処理したＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）のＡＬＤＨ活性を示すフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図９Ａ】異なる濃度のＢＰで処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＡｘｌ、Ｇａｓ６およびアクチンのタンパク質発現を示すウエスタンブロッティングの結果を示す写真の図である。
【図９Ｂ】異なる濃度のＢＰで処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＡｘｌおよびＧＡＰＤＨの遺伝子発現を示す逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示す写真の図である。
【図１０】異なる濃度のＢＰで処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＭＭＰ−２およびアクチンのタンパク質発現を示すウェスタンブロッティングの写真の図である。
【図１１Ａ】異なる濃度のＢＰで処理したＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）の浸潤能を示すトランスウェル浸潤アッセイ系の結果を示す図であり、下部チャンバー内のポリカーボネートフィルター膜の染色結果を示す写真である。
【図１１Ｂ】異なる濃度のＢＰで処理したＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）の浸潤能を示すトランスウェル浸潤アッセイ系の結果を示す図であり、相対浸潤能の定量結果を示す棒グラフである。
【図１２】異なる濃度のＢＰで処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＥ−カドヘリン、ＴＧＦβ−１、Ｓｌｕｇおよびβ−アクチンのタンパク質発現を示すウェスタンブロッティングの写真の図である。
【図１３】脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋における遊走能を示す創傷治癒アッセイの結果を示す図であり、上段は、異なる濃度のＢＰで処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の結果を示す写真であり、下段は、異なる濃度のＢＣＮＵで処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の結果を示す。
【図１４Ａ】ｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌプラスミドを有する脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋（以下、「ｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋」という）またはｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏプラスミドを有する脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋（以下、「ｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋」という）を示す顕微鏡を用いて撮影した写真の図である。
【図１４Ｂ】ｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋またはｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＡｘｌ−１およびβ−アクチンのタンパク質発現を示すウェスタンブロッティングの写真の図である。
【図１４Ｃ】異なる濃度のＢＰで処理したｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の遊走能または異なる濃度のＢＰで処理したｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の遊走能を示す創傷治癒アッセイの結果を示す図である。
【図１５Ａ】異なる濃度のＢＰで処理した口腔癌幹細胞のコロニー形成能を示す軟寒天コロニー形成アッセイの結果の図であり、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株およびＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株のコロニー形成を示す写真である。
【図１５Ｂ】異なる濃度のＢＰで処理した口腔癌幹細胞のコロニー形成能を示す軟寒天コロニー形成アッセイの結果の図であり、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株およびＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株の相対コロニー形成を示す棒グラフである。
【図１６Ａ】ＢＰ処理を受けていないマウス（すなわち、「対照群」、黒丸）、１００ｍｇ／ｋｇのＢＰで処理したマウス（すなわち、「１００ｍｇ／ｋｇ群」、白丸）および２００ｍｇ／ｋｇのＢＰで処理したマウス（すなわち、「２００ｍｇ／ｋｇ群」、黒三角）を含む、ＢＰの幹細胞の腫瘍開始活性の阻害能を示す動物実験の結果を示す図であり、一定期間にわたる各マウス群の平均体重（ｇ）を示す。
【図１６Ｂ】ＢＰ処理を受けていないマウス（すなわち、「対照群」、黒丸）、１００ｍｇ／ｋｇのＢＰで処理したマウス（すなわち、「１００ｍｇ／ｋｇ群」、白丸）および２００ｍｇ／ｋｇのＢＰで処理したマウス（すなわち、「２００ｍｇ／ｋｇ群」、黒三角）を含む、ＢＰの幹細胞の腫瘍開始活性の阻害能を示す動物実験の結果を示す図であり、一定期間にわたる各マウス群の平均腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。
【図１６Ｃ】ＢＰ処理を受けていないマウス（すなわち、「対照群」、黒丸）、１００ｍｇ／ｋｇのＢＰで処理したマウス（すなわち、「１００ｍｇ／ｋｇ群」、白丸）および２００ｍｇ／ｋｇのＢＰで処理したマウス（すなわち、「２００ｍｇ／ｋｇ群」、黒三角）を含む、ＢＰの幹細胞の腫瘍開始活性の阻害能を示す動物実験の結果を示す図であり、各マウス群におけるＧＦＰ強度（すなわち、緑色蛍光）を示す写真である。
【図１６Ｄ】ＢＰ処理を受けていないマウス（すなわち、「対照群」、黒丸）、１００ｍｇ／ｋｇのＢＰで処理したマウス（すなわち、「１００ｍｇ／ｋｇ群」、白丸）および２００ｍｇ／ｋｇのＢＰで処理したマウス（すなわち、「２００ｍｇ／ｋｇ群」、黒三角）を含む、ＢＰの幹細胞の腫瘍開始活性の阻害能を示す動物実験の結果を示す図であり、各マウス群におけるＧＦＰ強度を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、詳細における本発明のいくつかの実施の形態について記載する。しかし、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は様々な実施の形態において具体化され得るし、本明細書に記載される実施の形態に限定されるべきではない。さらに、本明細書において他に言及のない限り、本発明の明細書において（特に、特許請求の範囲において）用いられる“１”、“当該”および同様の用語は、単数形式および複数形式の両方を包含すべきである。本明細書において使用されている“有効量”という用語は、対象に投与される場合、被疑対象において治療されている状態を少なくとも部分的に軽減することができる成分（化合物）の量を示している。本明細書において使用されている“対象”という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む、哺乳動物を示している。
【００２０】
本発明者らは、ブチリデンフタリド（ＢＰ）が、癌幹細胞の生存を阻害し、癌幹細胞の増殖関連因子（例えば、ＥＺＨ２）の発現を抑制し、癌幹細胞の幹維持マーカー（例えば、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４）の発現を阻害し、癌幹細胞の増殖、抗アポトーシス、遊走及び浸潤に関連する遺伝子（例えば、ＡＸＬ）又はタンパク質（Ａｘｌ、Ｇａｓ６、ＭＭＰ−２）の発現を阻害し、癌幹細胞のＥＭＴ（上皮間葉移行）（例えば、Ｅ−カドヘリン、ＴＧＦβ−１およびＳｌｕｇ）に関連するタンパク質の発現を阻害し、癌幹細胞の創傷に遊走する能力を阻害するのに有効であることを見出した。本発明のいくつかの実施形態では、ＢＰは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４およびＥＺＨ２の発現を阻害することによって、癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害した。
【００２１】
したがって、本発明は、癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するための調製物の製造におけるＢＰの使用に関する。
【００２２】
本発明の調製物は、任意の適切な癌幹細胞において用いられ得、癌幹細胞としては、例えば、口腔癌幹細胞、鼻咽頭癌幹細胞、食道癌幹細胞、骨髄腫幹細胞、皮膚癌幹細胞、メラノーマ幹細胞、甲状腺癌幹細胞、リンパ腫幹細胞、白血病幹細胞、乳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、子宮頸癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、胃癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、結腸癌幹細胞、直腸癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、胆嚢癌幹細胞、腎臓癌幹細胞、膠芽細胞腫幹細胞、胸腺悪性腫瘍幹細胞、横紋筋肉腫幹細胞、脳腫瘍幹細胞および髄芽細胞腫幹細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態において、調製物は、口腔癌幹細胞、膵臓癌幹細胞および／または脳腫瘍幹細胞の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するために使用される。
【００２３】
本発明による調製物は、特に限定されない任意の適切な形態で提供することができる。例えば、調製物は医薬品として提供することができるが、これに限定されない。調製物はまた、食品または食品添加物として液体または固体形態で提供され得る。
【００２４】
本発明による調製物が医薬品として提供される場合、医薬品は、所望の投与様式に応じて任意の適切な剤形で調製され得る。例えば、医薬品は、必要とする対象への経口または非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔または鼻腔）経路によって投与することができるが、これに限定されない。形態及び目的に応じて、適切な担体が選択または使用されて医薬品を提供することができ、適切な担体の例には、賦形剤、希釈剤、助剤、安定剤、吸収遅延剤、崩壊剤、ヒドロトロピー剤、乳化剤、酸化防止剤、接着剤、結合剤、粘着付与剤、分散剤、懸濁化剤、潤滑剤、吸湿剤などが含まれる。
【００２５】
経口投与に適した剤形として、本発明により提供される医薬品は、ＢＰの所望の効果に悪影響を及ぼさないであろう薬学的に許容可能な担体（例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたはその類似体、セルロース、デンプン、糖ベントナイトまたはそれらの組み合わせ）を含み得る。医薬品は、錠剤（例えば、糖衣錠）、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、パウダー、フルイド抽出物、溶液、シロップ、懸濁液、エマルジョン、チンキーなどのような経口投与に適した任意の剤形で提供され得る。  
【００２６】
皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内投与または点滴形態のための注射剤形態に関して、本発明により提供される医薬品は、等張液、塩緩衝生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水またはクエン酸緩衝生理食塩水）、ヒドロトロープ剤、乳化剤、５％糖液およびその他の担体といった１または２以上の成分を含み、静脈内注入剤、乳化静脈内注入剤、注射用粉末剤、注射用懸濁剤または注射用粉末懸濁液といった医薬品を提供することができる。あるいは、医薬品は、プレ注射用固体として調製され得る。プレ注射用固体は、他の溶液もしくは懸濁液に可溶な形態で、または乳化可能な形態で提供され得る。所望の注射剤は、必要な対象に投与する前に溶液または懸濁液にプレ注射用固体を溶解するまたは乳化させることで提供される。また、経鼻投与または経皮投与に適した外用剤形の例としては、エマルジョン、クリーム、ゲル（例えばヒドロゲル）、ペースト（例えば、分散ペースト、軟膏）、スプレーまたは溶液（例えば、ローション、懸濁液）を含む。
【００２７】
場合によって、本発明によって提供される医薬品は、医薬品の嗜好性および視覚を増強するための香味剤、トナーまたは着色剤および／または薬剤の安定性および保存性を改良するための緩衝剤、添加剤、防腐剤、抗菌剤または抗真菌剤といった適切な量の添加剤をさらに含み得る。さらに、医薬品は、他の活性成分がＢＰの所望の効果に悪影響を及ぼさない限り、任意にさらに１または２以上の他の活性成分を含み得、１または２以上の他の活性成分を含む医薬品と組み合わせて使用され得、医薬品の効果をさらに増強させ、または提供される製剤の適用柔軟性および適応性を増加させることができる。
【００２８】
本発明により提供される医薬品は、投与される対象の年齢、体重および健康状態（治療される疾患およびその重症度など）に依存して、１日１回、１日複数回または数日に１回といった種々の投与頻度で適用され得る。例えば、癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するために薬剤を対象に経口投与する場合には、医薬品の投与量は、１日あたり（ＢＰとして）約３０ｍｇ／ｋｇ−体重から（ＢＰとして）約５００ｍｇ／ｋｇ−体重、好ましくは１日あたり（ＢＰとして）約４０ｍｇ／ｋｇ−体重から（ＢＰとして）約１２０ｍｇ／ｋｇ−体重、より好ましくは１日あたり（ＢＰとして）約５０ｍｇ／ｋｇ−体重から（ＢＰとして）約９０ｍｇ／ｋｇ−体重であり、“ｍｇ／ｋｇ−体重”は、対象の体重１ｋｇあたりに必要とされる投与量を指す。しかし、急性の患者では、用量は、実際の必要条件に応じて、例えば数倍または数十倍まで任意に増加させることができる。
【００２９】
必要に応じて、本発明の医薬品は、癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するために、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法、免疫療法、抗血管新生療法、表現型転換および／または分化療法と組み合わせて用いられ得る。
【００３０】
本発明による調製物が食品添加物として提供される場合、食品添加物は、例えば粉末、液体、懸濁液または顆粒の形態で、食品製造プロセス中に、都合よく添加され得る形態であり得る。本発明による調製物が食品として提供される場合、食品は、乳製品、加工肉、パン、パスタ製品、ビスケット、トローチ、ジュース、茶、スポーツ飲料、栄養ドリンクなどであってもよく、健康食品（例えば、手術後の栄養補助食品）であってもよいが、これに限定されない。
【００３１】
投与対象の年齢、体重および健康状態に応じて、本発明が提供する健康食品は、１日１回、１日数回、または数日に１回など、様々な頻度で服用され得る。本発明によって提供される健康食品中のＢＰの量は、好ましくは、特定の集団に応じて、毎日摂取すべき量に調整され得る。例えば、対象への推奨１日量が約５０ｍｇであり、健康食品の各一食分に２５ｍｇのＢＰが含まれている場合、対象は１日あたり約２食分の健康食品を服用することができる。
【００３２】
特定の集団（例えば、妊婦および糖尿病患者）のための推奨される１日投与量、使用基準および使用条件、または別の食品または医薬品と併用するための推奨事項が、本発明の健康食品の外側パッケージに表示され得、医師、薬剤師または関連する行政の指示なしに安全かつ確実に自分自身で健康食品を服用することが好ましい。
【００３３】
本発明はまた、有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）を必要な対象に投与することを含む、癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するための方法を提供する。この方法では、適用される形態および適切な用量のＢＰおよび適切な癌幹細胞は、全て、本発明の調製物に関する上記の記載と一致する。
【００３４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲に示されている。
【実施例】
【００３５】
（実施例１）
癌幹細胞の増殖阻害に対するＢＰの影響
（１−１）
癌幹細胞の増殖を阻害するＢＰの効果を調べるために、脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋または悪性神経膠腫ＤＢＴＲＧ細胞を、２４時間または４８時間、異なる濃度（０，２５，５０，６２．５，７５および１００μｇ／ｍｌ）のＢＰ、異なる濃度（０，２５，１２５，２５０，５００及び１０００μＭ）のビス−クロロエチルニトロソウレア（ＢＣＮＵ、現在臨床で使用されている悪性神経膠腫を治療するための化学療法薬）または異なる濃度（０，１００，２００，４００，８００及び１６００μＭ）のテモゾロミド（ＴＭＺ、現在臨床で使用されている悪性神経膠腫を治療するための化学療法薬）で処理した。その後、細胞生存率アッセイ、ＭＴＴアッセイを利用して、脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋および悪性神経膠腫ＤＢＴＲＧ細胞の生存率を分析した。各実験群の生存率を、対照群、すなわちＢＰ、ＢＣＮＵまたはＴＭＺで処理されていない群の結果に基づいて計算した。結果を、２４時間群および４８時間群（すなわち、２４時間および４８時間の治療）については図１Ａおよび図１Ｂに、および２４時間群については表１に示す。
【００３６】
【表１】
2017530113.tif 000003
【００３７】
図１Ａおよび図１Ｂに示すように、２４時間群および４８時間群の両方において、脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の生存率は、ＢＰまたはＢＣＮＵの濃度の増加とともに有意に減少した。一方、表１に示すように、２４時間群の脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋に対するＢＰ、ＢＣＮＵ、またはＴＭＺの半最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、各々、４０６μＭ（すなわち、７６．５μｇ／ｍｌ）、３７７．６μＭ（すなわち、８０．８μｇ／ｍｌ）および１，６００μＭより大きかった（すなわち、＞３１０．６μｇ／ｍｌ）。これらの結果は、ＢＰが癌幹細胞の増殖を阻害するのに有効であり、その効果が現在使用されている化学療法薬の効果よりも優れていることを示している。
【００３８】
（１−２）
ＮＨＯＫ（正常ヒト口腔ケラチノサイト）およびＨＮＣ−ＴＩＣ（頭頸部癌由来腫瘍開始細胞）様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）を、２４時間にわたって異なる濃度（０，２５，５０および１００μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理して、その後、ＭＴＴアッセイを利用して、ＮＨＯＫおよびＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）の生存率を分析した。結果を図２に示す。
【００３９】
図２に示すように、ＮＨＯＫの生存率は、ＢＰの濃度の増加に伴って低下しなかった一方で、ＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）は、ＢＰの濃度の増加とともに減少した。これらの結果は再び、ＢＰが癌幹細胞の増殖を阻害するのに有効であり、正常細胞に対して細胞傷害性を有しないことを示す。したがって、ＢＰは細胞傷害性に起因する副作用を引き起こさず、したがって、癌幹細胞の増殖を阻害するための高品質の薬剤を提供するために使用され得る。
【００４０】
（実施例２）
ＢＰの癌幹細胞の増殖関連因子の発現を阻害する効果
ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー）遺伝子は、癌幹細胞の重要な増殖関連因子であり、癌幹細胞の増殖および増殖特性に影響を与えることが知られている。脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋を異なる濃度（０，１２．５，２５，５０，６２．５および７５μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した後、タンパク質を細胞から抽出してウェスタンブロッティングを行い、ＢＰ処理された脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋中のＥＺＨ２タンパク質の発現を決定した。結果を図３に示す。
【００４１】
図３に示すように、脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＥＺＨ２タンパク質の発現は、ＢＰの濃度の増加に伴って有意に減少した。これらの結果は、ＢＰが癌幹細胞の増殖を阻害するのに有効であることを再度示している。
【００４２】
（実施例３）
ＢＰの癌細胞および癌幹細胞の幹細胞性を阻害する効果
（３−１）
ＣＤ４４、ＣＤ１３３、Ｓｏｘ−２（性決定領域Ｙタンパク質（ＳＲＹ）関連高遊走度群ボックス２）およびＯｃｔ４（八量体結合転写因子４）タンパク質はすべて、癌幹細胞の幹細胞性維持マーカーであり、癌幹細胞の自己再生および分化の調節に関わることが知られている。脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋を２４時間、異なる濃度（０，１２．５，２５，５０，６２．５および７５μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した後、タンパク質を細胞から抽出してウェスタンブロッティングを行い、ＢＰ処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋中のＣＤ１３３、Ｓｏｘ−２およびＯｃｔ４タンパク質の発現を決定した。結果を図４および図５に示す。さらに、ＭｉａＰａＣａ−２細胞株（すなわち、膵臓癌細胞の細胞株）を２４時間、異なる濃度（０，１２．５，２５および５０μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した後、タンパク質を細胞から抽出してウェスタンブロッティングを行い、ＢＰ処理したＭｉａＰａＣａ−２細胞株中のＳｏｘ−２、ＣＤ１３３およびＣＤ４４タンパク質の発現を決定した。結果を図６に示す。さらに、ＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）を２４時間、異なる濃度（０，１２．５，２５および５０μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した後、タンパク質を細胞から抽出してウェスタンブロッティングを行い、ＢＰ処理したＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）におけるＳｏｘ−２およびＯｃｔ４タンパク質の発現を決定した。結果を図７に示す。
【００４３】
図４および図５に示すように、脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＣＤ１３３、Ｓｏｘ−２およびＯｃｔ４タンパク質の発現は、ＢＰの濃度の増加に伴って有意に減少した。図６に示すように、ＭｉａＰａＣａ−２細胞におけるＳｏｘ−２、ＣＤ１３３およびＣＤ４４タンパク質の発現は、ＢＰ濃度の増加に伴って有意に減少した。図７に示すように、ＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）におけるＳｏｘ−２およびＯｃｔ４タンパク質の発現は、ＢＰ濃度の増加に伴って有意に減少した。これらの結果は、ＢＰが癌細胞および癌幹細胞の幹細胞性を阻害するのに有効であることを示している。
【００４４】
（３−２）
ＡＬＤＨタンパク質はまた、癌幹細胞の重要な幹細胞性維持マーカーであり、癌幹細胞の自己再生および分化の調節に関与する。ＨＮＣ−ＴＩＣ様経口幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）を２４時間、異なる濃度（０，２５および５０μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した後、各群から得た１×１０５個の細胞を、５０μｌの幹細胞検出キット（すなわち、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、カナダから購入したＡＬＤＥＦＬＵＯＲアレイキット）緩衝液に別々に懸濁し、各群の細胞懸濁液を別々にＡＬＤＥＦＬＵＯＲに加えて、最終濃度１μＭとした。その後、各群の試料を７−ＡＤＤで染色し、次いでフローサイトメトリー分析によって分析して、ＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）のＡＬＤＨ活性を決定した。結果を図８に示す。
【００４５】
上記の実験手順を反復したが、各群の細胞懸濁液に、さらにＮ，Ｎ−ジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ、すなわちＡＬＤＨの阻害剤）を別々に添加し、ＤＥＡＢ最終濃度１５０μＭとした。結果を図８に示す。
【００４６】
図８に示すように、ＤＥＡＢを添加した群では、ＢＰの治療の有無にかかわらず、ＡＬＤＨ活性を有する生存細胞は、全生存細胞のわずか０．１％であった。一方、ＤＥＡＢが添加されていない群では、ＡＬＤＨ活性を有する生存細胞の数は、ＢＰ濃度の増加とともに増加した。これらの結果は、ＢＰが癌幹細胞のＡＬＤＨ活性を阻害するのに有効であることを示し、ＢＰが癌幹細胞の幹細胞性の抑制に有効であることを再度証明する。
【００４７】
（実施例４）
癌幹細胞の増殖、抗アポトーシス、遊走および浸潤を阻害するＢＰの効果
（４−１）
Ａｘｌ（すなわち、受容体チロシンキナーゼ）の発現は、増殖、抗アポトーシス、遊走および浸潤における癌幹細胞の能力に関連することが知られている。脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋を２４時間、異なる濃度（０，１２．５，２５，５０，６２．５および７５μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した後、タンパク質および全ＲＮＡを細胞から抽出して、ウェスタンブロッティングおよび逆転写酵素反応ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、ＢＰ処理された脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＡｘｌおよびＧａｓ６（すなわち、Ａｘｌのリガンド）タンパク質の発現ならびにＡｘｌ遺伝子の発現を決定した。結果を図９Ａおよび図９Ｂに示す。
【００４８】
図９Ａおよび図９Ｂに示すように、ＡｘｌおよびＧａｓ６タンパク質の発現ならびにＡｘｌ遺伝子の発現はすべて、ＢＰの濃度の増加とともに有意に減少した。これらの結果は、ＢＰが癌幹細胞の増殖、抗アポトーシス、遊走および浸潤の阻害に有効であることを示す。
【００４９】
（４−２）
癌幹細胞の浸潤の開始時に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって分解されることが知られている。ここで、ゼラチナーゼ−Ａ（すなわち、ＭＭＰ−２）およびゼラチナーゼ−Ｂ（すなわち、ＭＭＰ−９）などのゼラチナーゼの発現は、腫瘍転移の組織病理学と深く関連している。脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋を２４時間、異なる濃度（０，１２．５，２５，５０，６２．５および７５μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した後、タンパク質を細胞から抽出してウェスタンブロッティングを行い、ＢＰ処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＭＭＰ−２タンパク質の発現を決定した。結果を図１０に示す。
【００５０】
図１０に示すように、ＭＭＰ−２タンパク質の発現は、ＢＰの濃度の増加に伴って有意に減少した。これらの結果は、ＢＰが癌幹細胞の遊走および浸潤を阻害するのに有効であることを再度示している。
【００５１】
（４−３）
この研究では、癌幹細胞の遊走および浸潤を阻害するＢＰの効果を、８μｍの孔サイズのポリカーボネートフィルター膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ社（英国）から購入）を有するトランスウェル浸潤アッセイシステム（すなわち、トランスウェル（登録商標）システム、Ｃｏｒｎｉｎｇ社（英国）から購入）によってさらに調査した。最初に、ポリカーボネートフィルター膜をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（米国）から購入）でコーティングし、次いで、コーティングした膜をトランスウェル浸潤アッセイシステムの下部チャンバーに入れた。次いで、下部チャンバーを１０％血清含有培地で満たした。一方、ＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）を２４時間、異なる濃度（０，２５および５０μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した後、２４時間、１×１０５細胞／１００μｌの細胞密度で、無血清培地で満たした上部チャンバーにおいて各群の処理された細胞を培養した。最後に、下部チャンバーの培地を除去し、下部チャンバー内のポリカーボネートフィルター膜を取り出し、４％ホルマリンで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。各群の浸潤癌細胞を計数し、顕微鏡下で１００倍の倍率を用いて膜の５つの視野にわたって撮影した。結果を図１１Ａに示す。各実験群の細胞の相対浸潤能は、０μｇ／ｍｌのＢＰで処理した群の結果に基づいて計算した。結果を図１１Ｂに示す。
【００５２】
図１１Ａに示されるように、ポリカーボネートフィルター膜上の細胞の数は、ＢＰの濃度の増加に伴って有意に減少した。図１１Ｂに示されるように、癌幹細胞の相対浸潤能もまた、ＢＰの濃度の増加と共に減少した。これらの結果は、ＢＰが癌幹細胞の遊走および浸潤を阻害するのに有効であることを再度示している。
【００５３】
（実施例５）
ＢＰが癌幹細胞の転移を阻害する効果
（５−１）
癌幹細胞の上皮間葉移行（ＥＭＴ）の開始時に、Ｅ−カドヘリンの発現が減少し、癌幹細胞間の凝集力が低下し、癌幹細胞が高度な浸潤および遊走能を獲得し原発腫瘍から離れ、転移し得るということが知られている。脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋を２４時間、異なる濃度（０，１２．５，２５，５０，６２．５および７５μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した後、タンパク質を細胞から抽出してウェスタンブロッティングを行い、ＢＰ処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＥ−カドヘリン、ＴＧＦβ−１（ＥＭＴを誘導する能力を有する）およびＳｌｕｇ（すなわち、癌細胞の転移を促進する性質を有するＳｎａｉｌファミリーの転写リプレッサーの１つ）タンパク質の発現を決定した。結果を図１２に示す。
【００５４】
図１２に示されるように、ＴＧＦβ−１およびＳｌｕｇタンパク質の発現は、ＢＰの濃度の増加に伴って有意に減少したが、Ｅ−カドヘリンタンパク質の発現は、ＢＰの濃度の増加と共に有意に増加した。これらの結果は、ＢＰがＴＧＦβ−１およびＳｌｕｇタンパク質の発現を阻害することによってＥ−カドヘリンタンパク質の発現をアップレギュレートし、したがって、ＢＰは、癌幹細胞のＥＭＴの発症を阻害し、癌幹細胞の転移を阻害するために使用され得ることを示す。
【００５５】
（５−２）
この研究では、創傷治癒アッセイを用いて、ＢＰの癌幹細胞の転移を阻害する効果をさらに調査した。最初に、脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋を２４時間、異なる濃度（０，１２．５，２５，５０，６２．５および７５μｇ／ｍｌ）のＢＰまたは異なる濃度（０，２５，５０，１００，２００および４００μＭ）のＢＣＮＵで処理した。同時に、脳のＣＳＣｓＣＤ１３３＋の創傷への遊走を観察し、ＢＰ処理またはＢＣＮＵ処理中、０時間および２４時間で各々撮影した。結果を図１３に示す。
【００５６】
図１３に示すように、ＢＣＮＵ処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の創傷への遊走数は、ＢＣＮＵ濃度の増加に伴って減少しなかった。ＢＣＮＵ処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋と比較して、ＢＰ処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の創傷への遊走数は、ＢＰ濃度の増加に伴って有意に減少した。これらの結果は、ＢＰが癌幹細胞の転移を阻害することができることを示している。
【００５７】
（５−３）
本研究では、ＢＰの癌幹細胞の転移阻害能がＡｘｌに関連するかどうかをさらに調べるために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬を用いて、脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋にｐｃＤＮＡ３．０−ＡｘｌプラスミドおよびｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏプラスミドをそれぞれトランスフェクトした。次に、トランスフェクトされた脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋およびトランスフェクトされていない脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋を同時に２００〜６００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択し、ｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌプラスミド（以下、「ｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋」と称する）またはｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏプラスミド（以下、「ｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋」と称する）を有する脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋を得た。ｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋およびｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の両方を観察し、顕微鏡を用いて撮影した。結果を図１４Ａに示す。次に、両方の細胞からタンパク質を抽出してウェスタンブロッティングを行い、ＢＰ処理した脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋におけるＡｘｌタンパク質およびβ−アクチンの発現を決定した。結果を図１４Ｂに示す。さらに、ｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋およびｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋を２４時間、異なる濃度（０，２５，５０，６２．５，７５および１００μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理した。同時に、ｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋およびｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋の創傷への遊走現象を観察し、ＢＰ処理中、０時間および２４時間で撮影した。結果を図１４Ｃに示す。
【００５８】
図１４Ｃに示すように、創傷に遊走したｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋（すなわち、Ａｘｌ過剰発現のない脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋）の数は、ＢＰ濃度の増加と共に有意に減少した。一方、ｐｃＤＮＡ３．０−ｎｅｏ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋と比較して、ＢＰが創傷に遊走したｐｃＤＮＡ３．０−Ａｘｌ脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋（すなわち、Ａｘｌ過剰発現を伴う脳ＣＳＣｓＣＤ１３３＋）の数を抑制するという現象には、有意差はなかった。これらの結果および実施例４の結果は、ＢＰがＡｘｌの発現を阻害することによって癌幹細胞の転移を阻害することができることを示す。
【００５９】
（実施例６）
ＢＰの癌幹細胞の腫瘍開始活性を阻害する効果
（６−１）
この研究では、軟寒天コロニー形成アッセイを用いて、ＢＰの癌幹細胞の腫瘍開始活性を阻害する効果を調べた。まず、ＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞（すなわち、ＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−１細胞株またはＡＬＤＨ１＋ＣＤ４４＋−２細胞株）を２４時間、異なる濃度（０，２５および５０μｇ／ｍｌ）のＢＰで処理し、その後、各群の処理した細胞を別々に、寒天（ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、１０％（ｖ／ｖ）胎仔牛血清（ＦＣＳ）および０．３％（ｗ／ｖ）寒天を含む）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入）上に初期細胞数２×１０４で播種した。他方、６ウェル培養ディッシュを、各ウェルにつき２ｍｌの下部寒天（ＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび０．６％（ｗ／ｖ）寒天を含む）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入）でコーティングした。下部寒天が固化した後、各群の上部寒天（口腔癌幹細胞を含む）を、各ウェルにつき２ｍｌ、ディッシュの異なるウェルにおける下部寒天上にそれぞれ添加した。その後、培養ディッシュを３７℃のインキュベーターに４週間入れた。最後に、下部寒天を０．００５％クリスタルバイオレットで染色し、顕微鏡を用いて１ウェルあたり５個のフィールドにわたってコロニー（直径≧１００μｍ）数を計数し、それらのフィールドを撮影した。結果を図１５Ａに示す。各実験群の細胞の相対コロニー形成能を、０μｇ／ｍｌのＢＰで処理した群の結果に基づいて計算した。結果を図１５Ｂに示す。
【００６０】
図１５Ａに示すように、下部寒天のコロニー数は、ＢＰの濃度の増加に伴って有意に減少した。図１５Ｂに示すように、癌幹細胞の相対コロニー形成能もまた、ＢＰの濃度の増加と共に減少した。これらの結果は、ＢＰが癌幹細胞の腫瘍開始活性を阻害するのに有効であることを示している。
【００６１】
（６−２）
この研究では、癌幹細胞の腫瘍開始活性を阻害するＢＰの効果を、動物実験によってさらに調査した。まず、５〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（体重１８〜２２ｇ）を同じ条件下で４週間飼育した。次に、ＧＦＰタグ付きコンストラクトで安定的にトランスフェクトしたＨＮＣ−ＴＩＣ様口腔幹細胞を、マウスの腋窩に皮下注射した（１×１０４細胞／０．１ｍＬ／マウス）。腫瘍が１００ｍｍ３に達した後、マウスを１つの対照群と２つの実験群（合計３群、１群当たり３匹）とに群分けした。次いで、１つの実験群に１００ｍｇ／ｋｇのＢＰを６日間注射し、別の実験群に２００ｍｇ／ｋｇのＢＰを６日間毎日注射した。対照群には、ビヒクル（ＢＰなし）を６日間毎日注射した。ＢＰまたはビヒクルの注射の１０日後、２日ごと（合計２２日間）に長さおよび幅を測定し、平均腫瘍体積を下記の式１に従って計算した。その結果を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。同時に、各群のＧＦＰシグナル（すなわち、緑色蛍光）を検出し、ＩＶＩＳイメージングシステムによって撮影した。結果を図１６Ｃに示す。各群のＧＦＰ強度をＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアで分析した。結果を図１６Ｄに示す。
式１：［長さ×幅２］／２（単位：ｍｍ３）
【００６２】
図１６Ａ〜図１６Ｄに示すように、マウスの体重がＢＰ注射を受けていない対照群と比較して有意に変化しない条件下では、２つの実験群のＧＦＰ強度は有意に低下し、２つの実験群の腫瘍体積は、ＢＰ注入後一定期間にわたって減少した。これらの結果は、ＢＰが癌幹細胞の腫瘍開始活性を阻害するのに有効であることを再び示す。
【００６３】
上記の実験結果に示されるように、ＢＰは、癌幹細胞の生存を阻害し、癌幹細胞の増殖関連因子の発現を阻害し、癌幹細胞の幹細胞性維持マーカーの発現を阻害し、癌幹細胞の増殖、抗アポトーシス、遊走および浸潤に関連する遺伝子／タンパク質の発現を阻害し、癌幹細胞の転移に関連する遺伝子／タンパク質の発現を阻害し、癌幹細胞の創傷への遊走能を阻害するのに有効である。特に、ＢＰは、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４およびＥＺＨ２の発現を阻害するのに有効であり、したがって、癌幹細胞の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するために使用され得る。
【００６４】
（付記）
（付記１）
癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するための調製物の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用。
【００６５】
（付記２）
前記調製物は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４およびＥＺＨ２の発現を阻害し、それにより癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するためのものである、
ことを特徴とする付記１に記載の使用。
【００６６】
（付記３）
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞、鼻咽頭癌幹細胞、食道癌幹細胞、骨髄腫幹細胞、皮膚癌幹細胞、メラノーマ幹細胞、甲状腺癌幹細胞、リンパ腫幹細胞、白血病幹細胞、乳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、子宮頸癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、胃癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、結腸癌幹細胞、直腸癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、胆嚢癌幹細胞、腎臓癌幹細胞、膠芽細胞腫幹細胞、胸腺悪性腫瘍幹細胞、横紋筋肉腫幹細胞、脳腫瘍幹細胞および髄芽細胞腫幹細胞の少なくとも１つである、
ことを特徴とする付記１に記載の使用。
【００６７】
（付記４）
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞、膵臓癌幹細胞および／または脳腫瘍幹細胞である、
ことを特徴とする付記１に記載の使用。
【００６８】
（付記５）
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞である、
ことを特徴とする付記１に記載の使用。
【００６９】
（付記６）
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、膵臓癌幹細胞である、
ことを特徴とする付記１に記載の使用。
【００７０】
（付記７）
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、脳腫瘍幹細胞である、
ことを特徴とする付記１に記載の使用。
【００７１】
（付記８）
前記調製物は、医薬品、食品または食品添加物である、
ことを特徴とする付記１乃至７のいずれか１項に記載の使用。
【００７２】
（付記９）
前記調製物は、１日あたり（ＢＰとして）約３０ｍｇ／ｋｇ−体重から（ＢＰとして）約５００ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、
ことを特徴とする付記８に記載の使用。
【００７３】
（付記１０）
前記調製物は、１日あたり（ＢＰとして）約４０ｍｇ／ｋｇ−体重から（ＢＰとして）約１２０ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、
ことを特徴とする付記９に記載の使用。
【図１Ａ】
2017530113.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017530113.tif 000011
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
2017530113.tif 000025
【図１６Ｂ】
2017530113.tif 000026
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月9日(2017.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）を含む、癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するための調製物。
【請求項２】
Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ４およびＥＺＨ２の発現を阻害し、それにより癌幹細胞（ＣＳＣ）の増殖、遊走、浸潤および／または転移を予防、緩和および／または阻害するためのものである、
ことを特徴とする請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞、鼻咽頭癌幹細胞、食道癌幹細胞、骨髄腫幹細胞、皮膚癌幹細胞、メラノーマ幹細胞、甲状腺癌幹細胞、リンパ腫幹細胞、白血病幹細胞、乳癌幹細胞、膀胱癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、子宮頸癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、胃癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、結腸癌幹細胞、直腸癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、胆嚢癌幹細胞、腎臓癌幹細胞、膠芽細胞腫幹細胞、胸腺悪性腫瘍幹細胞、横紋筋肉腫幹細胞、脳腫瘍幹細胞および髄芽細胞腫幹細胞の少なくとも１つである、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の調製物。
【請求項４】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞、膵臓癌幹細胞および／または脳腫瘍幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項５】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、口腔癌幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項６】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、膵臓癌幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項７】
前記癌幹細胞（ＣＳＣ）は、脳腫瘍幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項８】
医薬品、食品または食品添加物である、
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項９】
１日あたり（ＢＰとして）約３０ｍｇ／ｋｇ−体重から（ＢＰとして）約５００ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、
ことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１０】
１日あたり（ＢＰとして）約４０ｍｇ／ｋｇ−体重から（ＢＰとして）約１２０ｍｇ／ｋｇ−体重の範囲の量で投与される、
ことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の調製物。
【国際調査報告】
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