(57)【要約】  本発明は生物医学分野に属し、極体ゲノム及びその用途に関連し、具体的には極体ゲノム再プログラム卵子とその製造方法及び用途に及ぶ。本発明は、極体が卵細胞質と同じく女性遺伝物質（ｆｅｍａｌｅ  ＤＮＡ）を含むと同時に、携帯の細胞質物質（ミトコンドリア）が極めて少ない更には無いという特徴を利用して、極体ゲノム再プログラム卵子及びそれらがミトコンドリア母性遺伝性疾病の発生を予防することに用いられる材料の製造における用途を提供する。動物モデル試験により、本発明が製造した再プログラム卵子及び後代に、患者のミトコンドリアＤＮＡを含めない、細胞質に関する疾病の発生を有効に遮断し、自主的にミトコンドリア母性遺伝性疾病の発生を徹底的に予防することができる。
2017507658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
極体ゲノム再プログラム卵子であって、患者の卵子と受精卵の第一及び／又は第二極体が提供したゲノムと健康者の卵子の細胞質から構成され、該再プログラム卵子の中には健康者の卵子のミトコンドリアのみを含む、ことを特徴とする極体ゲノム再プログラム卵子。
【請求項２】
前記第一極体はミトコンドリア疾病を患う女性患者の減数分裂中期の卵子から生まれる、ことを特徴とする請求項１に記載の極体ゲノム再プログラム卵子。
【請求項３】
前記第二極体はミトコンドリア疾病を患う女性患者の減数分裂中期の卵子が配偶者と受精した受精卵から生まれる、ことを特徴とする請求項１に記載の極体ゲノム再プログラム卵子。
【請求項４】
極体ゲノム再プログラム卵子の調製方法であって、顕微操作の方法を採用し、インビトロで、患者の卵子と受精卵の第一及び／又は第二極体を雌性遺伝物質が取り除かれた健康者の卵子又は受精卵の細胞質の中に移入しており、それは、下記のプロセスにより行われることを特徴とする極体ゲノム再プログラム卵子の調製方法。
（１）ミトコンドリア疾病を患う女性患者の第一極体ゲノムと健康女性の卵細胞質を再プログラム卵子に再編成するステップ、
（２）ミトコンドリア疾病を患う女性患者の第二極体ゲノムを健康女性と患者配偶者の受精卵の女性前核に取って代わって、再プログラム胎芽に再編成するステップ、
（３）再プログラム卵子・再プログラム受精卵に発育する胎芽の中の二種類由来のミトコンドリアの含有量を測定するステップ、及び
（４）動物モデル試験により、得られた胎芽に３種類の遺伝物質を含め、ミトコンドリア疾病の母性遺伝効果を遮断するステップ。
【請求項５】
前記３種類の遺伝物質は、父、母核ＤＮＡ及び健康者が提供したミトコンドリアＤＮＡである、ことを特徴とする請求項４に記載の極体ゲノム再プログラム卵子の調製方法。
【請求項６】
前記ミトコンドリアの含有量を測定するにはピロ燐酸シーケンシング法を採用する、ことを特徴とする請求項４に記載の極体ゲノム再プログラム卵子の調製方法。
【請求項７】
極体ゲノム再プログラム卵子がミトコンドリア母性遺伝性疾病の発生を予防することに用いられる材料の製造における用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医学分野に属し、極体ゲノム及びその用途に関連し、具体的には極体ゲノム再プログラム卵子とその製造方法及び用途に及び、特に母性ミトコンドリア遺伝性疾病を治療することに用いられる材料の製造における用途である。
【背景技術】
【０００２】
研究報道によれば、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ，ｍｔＤＮＡ）は細胞核染色体から独立した別のゲノムであり、人類第２５番目の染色体と呼ばれて、遺伝の特徴は非メンデル遺伝パターンに表現され、母性遺伝（ｍａｔｅｒｎａｌ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）とも呼ばれる。即ち、母親はｍｔＤＮＡを息子と娘に渡すが、娘のみがそのｍｔＤＮＡを次の世代に渡すことができる。ミトコンドリア疾病（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｐａｔｈｙ）は、遺伝破損に起因するミトコンドリア代謝酵素の破損が原因で、ＡＴＰ合成障害、エネルギー由来の不足を引き起こし、これによって発生する一組の多系統疾病を指す。ここで、卵子の中に発生するｍｔＤＮＡの突然変異が母性家族性疾病を引き起こし、即ち母性ミトコンドリア疾病である。不完全な統計によると、ミトコンドリア疾病を患う筋無力症の患者の中で、２００人の女性に一人がミトコンドリア筋無力を次の世代に遺伝する。
【０００３】
一方、人体の重要な器官（エネルギーニーズが高い部位、例えば脳、心臓、腎臓、横紋筋及び内分泌腺など）がもっと影響を受け易い。研究によれば、圧倒的多数のミトコンドリア疾病は、多器官系統の正常な機能に影響を与えることが明らかに示されている。疾病の臨床表現型は非常に広く、ミトコンドリア脳ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、胃腸総合症、筋緊張異常、糖尿病、心筋症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、痴呆及び聴覚障害等を含む。現在、多くの上記種目のミトコンドリア疾病に対する有効な臨床治療法はない。患者は薬物に依存し、短期間に症状を和らげて、生活の質を保証することはできない。その上、ミトコンドリアＤＮＡは卵細胞質を通じて、母性遺伝の方式で次の世代に遺伝するため、一般的に患者は不妊を提案される。そのため、家庭に苦しみ及び不幸がもたらされる。
【０００４】
卵子・胎芽顕微操作技術（核移植）の発展は、ミトコンドリア疾病の治療に希望をもたらす。ミトコンドリア遺伝物質は母性遺伝方式を呈し、即ち母親が次の世代に遺伝するため、卵子・胎芽顕微操作技術を利用して、ミトコンドリア疾病を患う母親の卵子に対して、ミトコンドリアの置換（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ＭＲ）を行い、機能が正常なミトコンドリアを獲得させる。これによって置換後の卵子が生み出す後代ミトコンドリアの機能を改善することができるし、又は完全に回復できる。現在、ＭＲ技術は中期紡錘体―染色体複合物移植（Ｓｐｉｎｌｄｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，  ＳＴ）――患者卵子の遺伝物質を遺伝物質が取り除かれた健康な卵子の細胞質の中に移動する、及び前核移植（ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＰＮＴ）――患者夫婦の受精卵の前核を前核を取り除いた健康な受精卵の細胞質の中に移動する等の技術手段を含む。
【０００５】
近年では、研究により、動物試験において、上記二種類のＭＲ技術手段を利用して、ミトコンドリアが置換された後に生み出された後代を得ることができた。そのため、２０１１年イギリス人類受精及び胎芽機構（ＨＦＥＡ，  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｒｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）  が近年のミトコンドリア置換調査研究結果を纏めはじめ、相応な政策を立て、臨床試験研究を更に激励する趨勢がある。該機構はヒト―ヒトミトコンドリア置換再プログラム卵の安全性に対して評価を行う。該技術は卵子の主要な遺伝物質―核ＤＮＡを変更せず、クローン生物の目的と異なり、はっきりした潜在的な安全上の問題が発見されない。報道によると、該機構は大衆の世論と意見を広く聴取した上で、ヒトミトコンドリア置換に関する政策を公布する。（  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｒｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｐｕｂｌｉｃ  ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ２０１２：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｆｅａ．ｇｏｖ．ｕｋ／６８９６．ｈｔｍｌ）。
【０００６】
ＨＦＥＡは上記ミトコンドリア置換技術の安全性に対して評価を行い、該技術は安全であると考えているが、ミトコンドリアＤＮＡ遺伝のボトルネック効果に起因して、上記技術は徹底的にミトコンドリア母性遺伝疾病の発生を予防することが実際にやり遂げることはできない。ヒトの卵細胞ごとに１０万個のミトコンドリアＤＮＡがあるが、その中のランダムなわずか一部分（２〜２００個）が成熟した卵細胞に入り、後代に移動することができる。この種類の卵細胞の形成期に、ミトコンドリアＤＮＡの数量が激しく減少する過程は「遺伝ボトルネック効果」と業界内が呼ばれる。「ボトルネック」を通過するミトコンドリアＤＮＡが複製され増加し、子の代のミトコンドリアＤＮＡの種群類型になる。
【０００７】
そのため、ミトコンドリア疾病を後代に遺伝することを最大限度で予防するために、置換後の再プログラム卵子の中に患者のミトコンドリアＤＮＡが含まれないことを確保しなければならない。しかし、研究実践により、中期染色体であろうと前核であろうと、エネルギーのニーズで、彼らの周りに大量のミトコンドリアが含められ、細胞質のミトコンドリア総量のおよそ４０％を占める。核置換の過程で、これらのミトコンドリアは核に従って新しい卵細胞質の中に入り、置換後の再プログラム卵子の中に一定量の突然変異ｍｔＤＮＡを含めさせ、これらのｍｔＤＮＡは「遺伝ボトルネック」を通過する可能性があり、子の代の中で複製拡大し、一定の閾値まで累計すれば、子の代を発病させる可能性がある。
【０００８】
本出願の発明者は上記問題に対して、極体ゲノム再プログラム卵子とその製造方法及び用途を提供する。特に、母性ミトコンドリア遺伝性疾病を治療することに用いられる材料の製造における用途である。本発明の方法によって製造される再プログラム卵子の中には、患者のミトコンドリアＤＮＡは含まれず、自主的にミトコンドリア母性遺伝性疾病の発生を徹底的に予防することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、現有技術の欠陥及び不足を克服し、極体ゲノム再プログラム卵子及びその製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明の更なる目的は、前記再プログラム卵子がミトコンドリア母性遺伝性疾病の発生を予防することに用いられる材料の製造における用途を提供することである。本発明によって製造される再プログラム卵子の中に、患者のミトコンドリアＤＮＡは含まれず、細胞質に関する疾病の発生を有効に遮断し、特にミトコンドリア置換術に用いられ、母性ミトコンドリア遺伝性疾病を治療する効果を獲得し、自主的にミトコンドリア母性遺伝性疾病の発生を徹底的に予防することができる。
【００１１】
本発明の理論的根拠は、雌性生殖細胞が形成される過程で、二回の減数分裂を経て、一つの大きい単相体即ち卵細胞及び２つ〜３つの小さい細胞が形成され、これらの小さい細胞は極体と呼ばれる。第一回減数分裂の時、一つの大きい二次卵母細胞と一つの小さい第一極体（Ｆｉｒｓｔ  Ｐｏｌａｒ  Ｂｏｄｙ，  ＰＢ１）が形成され；第二回減数分裂のとき、同じく一つの小さい第二極体（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｐｏｌａｒ  Ｂｏｄｙ，  ＰＢ２）を生み出し、第一極体であろうと第二極体であろうと、下記のいくつかの特徴を有する。（１）極体の体積は卵細胞よりはるかに小さいが、極体が得られた遺伝物質と卵細胞は等しい；（２）極体の中に細胞質（ミトコンドリア）は極めて少ないため、ゲノムを提供し再プログラム卵子を再編成するとき、再プログラム卵子の中にもたらす疾病ミトコンドリアは極めて少ない、あるいは無い。
【００１２】
本発明は、極体が卵細胞質と同じく女性遺伝物質（ｆｅｍａｌｅ  ＤＮＡ）を含むと同時に、携帯の細胞質物質（ミトコンドリア）が極めて少ない、あるいは無いという二つの特徴を利用して、極体ゲノム再プログラム卵子及びそれらがミトコンドリア母性遺伝性疾病の発生を予防することに用いられる材料の製造における用途を提供する。
【００１３】
本発明の目的は、下記の技術的手段を通じて実現する。
【００１４】
患者の卵子と受精卵の第一及び／又は第二極体が提供するゲノムと、健康者の卵子の細胞質が構成される再プログラム卵子を再編成し、該再プログラム卵子の中に健康者の卵子のミトコンドリアのみを含む；
本発明では、前記第一極体はミトコンドリア疾病を患う女性患者の減数分裂中期の卵子から生まれる。
前記第二極体は、ミトコンドリア疾病を患う女性患者の減数分裂中期の卵子が配偶者と受精した受精卵から生まれる。
【００１５】
本発明では、顕微操作の方法を採用し、インビトロで、患者の卵子と受精卵の第一及び／又は第二極体を雌性遺伝物質が取り除かれた健康者の卵子又は受精卵の細胞質の中に移入し、下記プロセスを進める。
（１）ミトコンドリア疾病を患う女性患者の第一極体ゲノムと健康女性の卵細胞質を再プログラム卵子に再編成する。
（２）ミトコンドリア疾病を患う女性患者の第二極体ゲノムを健康女性と患者配偶者の受精卵の女性前核に取って代わって、再プログラム胎芽に再編成する。
（３）再プログラム卵子・再プログラム受精卵に発育する胎芽の中の二種類由来のミトコンドリアの含有量（ミトコンドリア異質性）を測定する。
（４）動物モデル試験により、得られた胎芽に３種類の遺伝物質を含め（父、母核ＤＮＡ及び健康者が提供したミトコンドリアＤＮＡ）、ミトコンドリア疾病の母性遺伝効果を有効に遮断する。
【００１６】
より具体的には、本発明では、重要な技術的手段は、ミトコンドリア置換の再プログラム卵子及び再プログラム胎芽をインビトロで製造する。下記内容を含む。
（１）ミトコンドリア疾病を患う女性患者の第一極体ゲノムと健康女性の卵細胞質を再プログラム卵子に再編成する。
【００１７】
卵子細胞質の中の中二期遺伝物質の代わりに、ミトコンドリア疾病を患う女性患者の卵子から排出した第一極体の遺伝物質を使って、遺伝物質を取り除いた健康女性の卵子細胞質と再プログラム卵子を編成する；この種類の再プログラム卵子は正常な卵子と同じく受精発育能力を有し、得られる後代が徹底的にミトコンドリア疾病の発生を免れることができる。
【００１８】
前記患者と健康女性の卵子を顕微作業室内のＣＢを含有するＧ−ｇａｍｅｔｅ操作液の中に入れて、１０分後、採卵針で患者の一枚の卵子（生きており且つたっぷりつまっている極体を含む）を持ち、極体を１２時の位置に置く。Ｐｉｅｚｏパルスがコントロールする８μｍの除核針を使ってＰＢ１を吸収し、７％のＰＶＰの中で簡単に破膜した後に、除核した健康女性の卵子の中に注ぎ、操作を完成した再プログラム卵子はＨＴＦの中で十分に洗浄した後、ＨＴＦの中に移入し、体外受精を待つ。
【００１９】
患者の配偶者の精子をＨＴＦの中に入れて受精能獲得１時間後、再プログラム卵子液滴の中に適量の精子を入れて、体外受精を行う。受精した６時間後に、双前核の受精卵が生み出せ、それを拾い出し、Ｇ１培養液の中に入れて７２時間を培養する。毎日顕微鏡で胎芽の発育状況を観察し、臨床ニーズに基づいて、更に胎芽をＧ２に移動し胞胚段階まで培養して、分裂の各段階で胎芽を移植又は冷凍保存することができる。
【００２０】
前記製造方法において、前記再編成は、顕微操作システムが媒介する核移植技術を採用し、患者の遺伝物質と健康な卵子の細胞質を再プログラム卵子・受精卵に編成する。
【００２１】
（２）ミトコンドリア疾病を患う女性患者の第二極体ゲノムを健康女性と患者配偶者の受精卵の女性前核に取って代わって、再プログラム胎芽に再編成する。
【００２２】
患者と健康女性と患者配偶者の受精卵を顕微オフィスのＣＢを含有するＧ−ｇａｍｅｔｅ操作液の中に入れて、１０分後、採卵針で患者の一枚の受精卵を持ち、極体を１２時の位置に置く。Ｐｉｅｚｏパルスがコントロールする８μｍの除核針を使ってＰＢ２（質膜に十分留意のこと）を吸収し、１５μｍの斜め口除核針でＰＢ２を不活化センダイウイルスの中に移動し、数秒の処理をした後、女性前核を取り除いた健康女性の受精卵の透明帯の下に移動する。卵質膜と密接に接触させ、両者の融合を促進する。融合した再編成融合体はＧ１液滴で徹底的に洗浄した後、Ｇ１に入れて培養する。臨床ニーズに基づいて、更に胎芽をＧ２に移動し胞胚段階まで培養して、分裂の各段階で胎芽を移植又は冷凍保存することができる。
【００２３】
（３）再プログラム卵子・再プログラム受精卵に発育する胎芽の中の二種類由来のミトコンドリアの含有量（ミトコンドリア異質性）を測定する。
【００２４】
各段階の胎芽を分解し、全ゲノム試薬キット（ＴＩＡＮＧＥＮ，  ＢＥＩＪＩＮＧ）がＤＮＡを抽出した後、患者と健康卵子を提供する女性のミトコンドリアＤＮＡの配列に対して、両者に差異があるＤＮＡ遺伝子座の存在する一区切りの配列を選んで、プライマーを設け、両者のミトコンドリアの上の一区切りの序列の産物を増加させる。差異ＤＮＡ遺伝子座によって生物素を設計し、プライマー増加の第二回の産物をマークし、ピロ燐酸シーケンシングに用いる。
【００２５】
前記子の代に関するミトコンドリアの含有量を測定するにはピロ燐酸シーケンシング法を採用する。
【００２６】
（４）動物モデル試験により、得られた胎芽に３種類の遺伝物質を含め（父、母核ＤＮＡ及び健康者が提供したミトコンドリアＤＮＡ）、ミトコンドリア疾病の母性遺伝効果を有効に遮断する。
【００２７】
異なるミトコンドリアを含んでいる二種類のマウスモデルを採用し、前記再プログラム卵子を製造し、偽妊娠雌性マウス体内に移植し、極体ゲノム移植のミトコンドリア置換マウスを生み出せると同時に、現有技術（紡錘体、前核置換）条件の下のミトコンドリア置換マウスを生み出し、本発明によって得られる再プログラム卵子はミトコンドリア疾病の母性遺伝を遮断できる効果を検証する。
【００２８】
本発明の極体ゲノム再プログラム卵子は、ミトコンドリア母性遺伝性疾病の予防と治療に用いられる材料を更に製造することができる。
【００２９】
本発明の極体ゲノム再プログラム卵子は下記の長所がある。
（１）極体の中にミトコンドリアが極めて少なく（ＰＢ２）、更にミトコンドリアが完全に欠けている（ＰＢ１）。自主的にミトコンドリア母性遺伝性疾病の発生を徹底的に予防することに、新しい治療ルート及び手段を切り開いた。
（２）極体ゲノムの外に質膜が被覆し、且つ体積が極めて小さい、操作が容易で、外被質膜は操作する過程でゲノムが失われないことを保証できる。
（３）本発明によって再編成した卵子は、正常な卵子の体外受精、卵割及び生育能力を有する；
（４）本発明によって再編成した受精卵は、正常な受精卵の卵割及び生育能力を有する；
（５）本発明では、第一極体から得られる全ての子の代の中に細胞質が提供したミトコンドリアのみを含み、即ち健康女性のミトコンドリアであり、核ドナー即ちミトコンドリア疾病患者のミトコンドリアの存在を検出できず、即ち本発明はミトコンドリア疾病患者から完全に健康な後代を得られた；
（６）本発明が構築したピロ燐酸シーケンシング法は、検出したミトコンドリアの異質性、敏感性、特異性が高い。
【００３０】
本発明の極体ゲノム再プログラム卵子は、ミトコンドリア置換術に用いられ、母性ミトコンドリア遺伝性疾病を治療する効果を得る。本発明によって製造した再プログラム卵子の中に患者のミトコンドリアＤＮＡは含まれず、細胞質に関する疾病の発生を有効に遮断し、自主的にミトコンドリア母性遺伝性疾病の発生を徹底的に予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の技術ロードマップであって、下記のとおりである：  Ｄｏｎｏｒ  ｏｏｃｙｔｅ／  ｚｙｇｏｔｅ：核ドナー卵子／受精卵（ミトコンドリア病の女性患者から）；Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｏｏｃｙｔｅ／ｚｙｇｏｔｅ：細胞質ドナー卵子／受精卵（健康的な女性から）；ｆｉｒｓｔ  ｐｏｌａｒ  ｂｏｄｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：第一極体移植；Ｓｐｉｎｄｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：紡錘体移植；ｓｅｃｏｎｄ  ｐｏｌａｒ  ｂｏｄｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：第二極体移植；ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：前核移植；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ミトコンドリア置換；ｕｎｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｄｏｎｏｒ  ｍｔＤＮＡ  ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ：核ドナーミトコンドリアＤＮＡの存在が検出されない；ｌｏｗ  ｔｏ  ｍｅｄｉｕｍ  ｄｏｎｏｒ  ｍｔＤＮＡ  ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ：少量から中等量の核ドナーミトコンドリアＤＮＡが存在している；ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｄｏｎｏｒ  ｍｔＤＮＡ  ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ：極少量の核ドナーミトコンドリアＤＮＡが存在している；  ｍｅｄｉｕｍ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｄｏｎｏｒ  ｍｔＤＮＡ  ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ：中等量から大量の核ドナーミトコンドリアＤＮＡが存在している。
【図２】ＰＢ１、Ｓｐｉｎｄｌｅ、ＰＢ２、ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ周囲のミトコンドリア分布を示すものであって、  ここで、  Ａ：卵子細胞質及び第一極体中のミトコンドリア分布；Ｂ：受精卵細胞質内及び第二極体中のミトコンドリア分布；Ｃ：第一極体、紡錘体−染色体複合体周囲に存在しているミトコンドリア，第二極体、前核周囲に存在しているミトコンドリア；Ｄ：第一極体、紡錘体−染色体複合体、第二極体、前核周囲のミトコンドリア蛍光密度測定。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｏｒ：ミトコンドリア蛍光プローブ；Ｈｏｃｈｅｓｔ：核蛍光プローブ。
【図３】ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅのエピジェネティクス特徴が一致しており、ＰＢ１がｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅに代わり、母性遺伝ミトコンドリア病を治療できることを示すものである。  ここで、  Ａ、Ｂ：α−ｔｕｂｕｌｉｎ染色はＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅの形態特徴が一致していることを示す；Ｃ、Ｄ、Ｅ：５−ヒドロキシメチルシトシンのメチル化、ヒストンＨ３のメチル化、ヒストンＨ３リン酸化抗体の染色はＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅのエピジェネティクス特徴が一致していることを示す；Ｆ：第一極体置換の模式及び実物図；Ｇ：紡錘体置換の模式及び実物図。
【図４】ＰＢ２とＦｅｍａｌｅ  Ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓのエピジェネティクス特徴が一致しており、ＰＢ２がｆｅｍａｌｅ  ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓに代わり、母性遺伝ミトコンドリア病を治療できることを示すものであって、  ここで、  Ａ、Ｂ：ｌａｍｉｎ  Ｂ１染色ＰＢ２とｆｅｍａｌｅ  ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓの形態特徴が一致していることを示す；Ｃ、Ｄ、Ｅ：５−ヒドロキシメチルシトシンのメチル化、ヒストンＨ３のメチル化、ヒストンＨ３ アセチル化抗体の染色はＰＢ２とｆｅｍａｌｅ  ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓのエピジェネティクス特徴が一致していることを示す；Ｆ：第二極体置換の模式及び実物図；Ｇ：前核置換の模式及び実物図。
【図５】ＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴが生じた４つのミトコンドリア置換ネズミ及びその効率を示すものであり、  ここで、    Ａ、Ｂ：ＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴ  ４つのミトコンドリア置換技術の効率であり、ＩＶＦ技術がその４つの技術の比較となる；Ｃ：ＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴ  ４つのミトコンドリア置換されたネズミが生まれた時の重さ及び胎盤の重さはＩＶＦネズミとは大きな違いがないこと；Ｄ：ＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴ  ４つのミトコンドリアで置換された胚子、幼年体、成年体。
【図６】ＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴが生じた４つのミトコンドリア置換ネズミの体内の核ドナーと細胞質ドナーのミトコンドリア異型遺伝子性であって、  ここで、  Ａ：核ドナー（ＮＺＷネズミ）と細胞質ドナー（ＢＤＦ１ネズミ）のミトコンドリアが測定される遺伝子座 ；Ｂ：Ｃ、Ｔが１００％時のパイロシーケンス図である；Ｃ：ＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴ  ４つのミトコンドリア置換ネズミの体内の核ドナーと細胞質ドナーのミトコンドリア異型遺伝子性の比較である；Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ：順にＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴの４つのミトコンドリア置換ネズミの脳、心臓、肺、肝臓、腎臓など重要な器官中の核ドナーと細胞質ドナーのミトコンドリア異型遺伝子性配置である；Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ：ＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴの４つのミトコンドリア置換ネズミの脳、心臓、肺、肝臓、腎臓など重要な器官中の核ドナーと細胞質ドナーのミトコンドリア異型遺伝子性測定の代表的図鑑である。
【図７】ヒトの卵子ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、受精卵ＰＢ２とＦｅｍａｌｅ  Ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓのエピジェネティクス特徴が一致していることを示し、  ここで、  Ａ：ヒトの卵子及びその第一極体；Ｂ：比較ゲノム学によってこの卵子第一極体はその細胞質内の染色体とのエピジェネティクス特徴が一致していることが分かった；Ｃ：ヒトの精卵及びその第二極体；Ｄ：比較ゲノム学解析によってこの卵子第二極體はその細胞質内の染色体とのエピジェネティクス特徴が一致していることが分かった。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
次は動物モデルの具体的な実施例を用い、そして従来のミトコンドリア置換技術（ＳＴ，ＰＮＴ）と比較しながら（図１は本発明の研究見取図である）、本発明の更なる説明をする。理解すべきは、これらの実施例は本発明の説明にだけ用いられ、本発明の範囲を限定するものではないことである。
【００３３】
研究材料と方法
（一）研究材料
ＮＺＷネズミであって、本発明ではミトコンドリア病の女性患者に該当する。Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ２の交雑から生じたＢＤＦ１ネズミであって、本発明では卵細胞質を提供する健康な女性に該当する。ＩＣＲネズミであって、本発明では代理の母に該当する。
【００３４】
（二）研究方法
１．ＰＢ１、ＰＢ２を母性遺伝ミトコンドリア病の治療に用いる実行可能性分析
（１）ＰＢ１、ｓｐｉｎｄｌｅ、ＰＢ２、Ｐｒｏｎｕｃｌｅｉが持つミトコンドリアの比較
ミトコンドリア蛍光プローブＭｉｔｏＴｒａｃｋｏｒ（２５０ｎＭ）を用いて卵子、受精卵を１０分間，Ｈｏｃｈｅｓｔ３３３４２で細胞核を１０分間染め直す。染色された卵子及び胚子を５μｇ／ｍｌのＣＢを含む操作液に置き、１５μｍの除核針でＰＢ１、Ｓｐｉｎｄｌｅ、ＰＢ２、Ｐｒｏｎｕｃｌｅｉを摘出し、共焦点顕微鏡専用の培養ウェルの培養液内に移転させ、共焦点顕微鏡でミトコンドリアの配置状況を観察する。
【００３５】
（２）ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ、ＰＢ２とＰｒｏｎｕｌｃｅｉのエピジェネティクス特徴の比較
新鮮な卵子、受精卵を４％のパラホルムアルデヒドで固着及び透過、封孔処理後、エピジェネティクス免疫組織化学測定を行い、測定される一次抗体はａｎｔｉ−ｔｕｂｕｌｉｎ  （１／２００，  Ｓｉｇｍａ，  Ｔ８２０３），  ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎ  Ｂ１（１：５０，  Ａｂｃａｍ，  ａｂ８９８２），  ａｎｔｉ−Ｈ３Ｋ９ｍｅ３  （１／２００，  Ａｂｃａｍ，  ａｂ８８９８），  ａｎｔｉ−Ｈ３Ｐ  （１／１００，  Ａｂｃａｍ，  ａｂ７０３１），  ａｎｔｉ−ａｃｅｔｙｌ  Ｈ３  （１：２５０，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０６５９９  ）  ，５ｍＣ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （１：２００，  Ａｂｃａｍ，  ａｂ１０８０５）を含む。全部の一次抗体は一晩 ４℃でインキュベーションする。翌日、ＰＢＳを用いて卵子、受精卵を充分に洗浄し，異なる一次抗体に対して、蛍光二次抗体ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８ロバ抗マウス抗体ＩｇＧ  （１：５００，  Ｊａｃｋｓｏｎ）又はＡｌｅｘａ４８８ロバ抗ウサギ抗体ＩｇＧ  （１：５００，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  をそれぞれ用い、蛍光標識をする（３７℃インキュベーション１．５  ｈ）。二次抗体の標識が終わったら、ＰＩで細胞核を染め直す。染色された卵子、受精卵を共焦点顕微鏡専用の培養ウェルの培養液内に移転させ、共焦点顕微鏡でエピジェネティクスの相違点を観察する。
【００３６】
２．ＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴの４つのミトコンドリアネズミの造り方及びその後代繁殖
（１）ＰＢ１Ｔ及びＳＴネズミの造り方
６−８週のＮＺＷ、ＢＤＦ１雌性ネズミの腹腔に５ＩＵ  ＰＭＳＧを注射し、４８ｈを隔てて腹腔に５ＩＵ  ＨＣＧを注射する。ＨＣＧ注射が終わって１３時間後卵管膨大部から卵丘細胞が囲まれる成熟卵母細胞を回収し、 ０．１％ヒアルロニダーゼのＧ−ｇａｍｅｔｅ操作液に置き，卵丘細胞が抜け落ちる（２〜３ｍｉｎ）まで３７℃、５％ＣＯ２  飽和湿度インキュベーター内に置き、脱果粒した卵子をインキュベーターに３０ｍｉｎ置いて回復させる。
【００３７】
ＮＺＷとＢＤＦ１の卵子を顕微操作室内のＣＢを含有するＧ−ｇａｍｅｔｅ操作液に置き、１０分後に挟卵針で一個のＮＺＷ卵子（新鮮で生きた極体が含まれる）を持ち、極体を１２時方向に置く。ピエゾパルス制御の８μｍの除核針でＰＢ１を吸い出し、除核されたＢＤＦ１卵子に導入する。操作が終わった再構築卵をＨＴＦ中で充分洗浄し、ＨＴＦに移入して体外受精を待つ。
【００３８】
ピエゾパルス制御の８μｍの除核針でＮＺＷ卵子の紡錘体−染色体複合体及び少量の細胞質を一緒に吸い出し（略してｋａｒｏｐｌａｓｔと言う）、続いて１５μｍの斜め口除核針でｋａｒｏｐｌａｓｔを 不活性化ＨＶＪに移転して処理して数秒後に除核されたＢＤＦ１卵子の透明帯下に移入し、ＢＤＦ１形質膜と密着接触させて両者を融合させる。融合した再構築卵をＨＴＦ液で徹底的に洗浄し、ＨＴＦに移入して体外受精を待つ。
【００３９】
１２週の雄性ネズミの脊椎骨を取り出して殺し、副睾丸の精子をＨＴＦに入れて１時間 受精能獲得後、適当な精子を再構築卵液に入れて体外受精を行う。受精６時間後二重奇核が現れた受精卵を選出し、Ｇ１培養液に移入して７２時間培養し、毎日顕微鏡で胚子の発育状況を観察する。７２時間後、胞胚になる再構築胚を同時発情の偽妊娠の雌性ネズミ体内に移入して子ネズミを造る。１６日後、妊娠した雌性ネズミに対して帝王切開を行い、生き残った子ネズミに乳を飲ませる。
【００４０】
（２）ＰＢ２Ｔ及びＰＮＴネズミの造り方
６−８週のＮＺＷ、ＢＤＦ１雌性ネズミの腹腔に５ＩＵ  ＰＭＳＧを注射し（ＮＺＷネズミのＢＤＦ注射時間はＢＤＦより約２時間早い）、４８ｈを隔てて腹腔に５ＩＵ  ＨＣＧを注射し、１２週の雄性ネズミがいる箱に入れて交配させる。ＨＣＧ注射後１８時間経つと卵管膨大部から卵丘細胞が囲まれる接合子を回収し、 ０．１％ヒアルロニダーゼのＧ−ｇａｍｅｔｅ操作液に置き，卵丘細胞が抜け落ちる（２〜３ｍｉｎ）まで３７℃、５％ＣＯ２  飽和湿度インキュベーター内に置き、脱果粒した接合子をインキュベーターに３０ｍｉｎ置いて回復させる。
【００４１】
ＮＺＷとＢＤＦ１の接合子を顕微操作室内のＣＢを含有するＧ−ｇａｍｅｔｅ操作液に置き、１０分後に挟卵針で一個のＮＺＷ接合子を持ち、極体を１２時方向に置く。ピエゾパルス制御の８μｍの除核針でＰＢ２を吸い取る（細胞膜が破れないように注意する）。続いて１５μｍの斜め口除核針でＰＢ２を不活性化ＨＶＪに移転して処理して数秒後に雌性前核が除去されたＢＤＦ１卵子の透明帯下に移入し、ＢＤＦ１形質膜と密着接触させて両者を融合させる。融合した再構築接合子をＧ１液で徹底的に洗浄し、Ｇ１に移入して培養する。
【００４２】
挟卵針で第二極体のＮＺＷ接合子を除去し、１５μｍの斜め口除核針で雌雄二重奇核を軽く吸い出し、不活性化ＨＶＪに移転して処理して数秒後に雌雄二重奇核が除去されたＢＤＦ１卵子の透明帯下に移入し、ＢＤＦ１形質膜と密着接触させて両者を融合させる。融合した再構築接合子をＧ１液で徹底的に洗浄し、Ｇ１に移入して培養する。
【００４３】
毎日顕微鏡で胚子の発育状況を観察する。７２時間後、胞胚になる再構築胚を同時発情の偽妊娠の雌性ネズミ体内に移入して子ネズミを造る。１６日後、妊娠した雌性ネズミに対して帝王切開を行い、生き残った子ネズミに乳を飲ませる。
【００４４】
３．ＰＢ１Ｔ、ＳＴ、ＰＢ２Ｔ、ＰＮＴの４つのミトコンドリア置換ネズミ（♀）及びその後代の異型遺伝子性レベルの比較
【００４５】
４つのミトコンドリア置換ネズミ及びその後代の尾部を取り、全ゲノム試薬ケース（ＴＩＡＮＧＥＮ，  ＢＥＩＪＩＮＧ）でＤＮＡを抽出した後、設計プライマー５'−  ａｔｇｇｃｔａｃｔｇｇａｔｔｃｃａｔｇｇ−３'ａｎｄ  ３'−  ｇｃｔｃｃｔａｔｇａａｇｃｔｔｃａｔｇｇ−５'ミトコンドリア上の９２０１〜１１１０２配列産物を増幅する。合成ビオチン標識プライマーＴＴＴＧＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＡ  （ｆｏｒｗａｒｄ），  ＡＴＴＴＡＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＣ  （ｒｅｖｅｒｓｅ−ｂｉｏｔｉｎ）二次産物を増幅してパイロシーケンスに用いる。パイロシーケンスプライマーはＧＡＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＴであり、パイロシーケンスの操作は機器の操作規則と順序によって行われる。
【００４６】
４．ヒトの卵子ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ、受精卵ＰＢ２とＰｒｏｎｕｌｃｅｉのエピジェネティクス特徴の比較
新鮮な卵子、受精卵を５μｇ／ｍｌのＣＢを含む操作液に置き、１５μｍの除核?でＰＢ１、Ｓｐｉｎｄｌｅ、ＰＢ２、Ｐｒｏｎｕｃｌｅｉを取出し、ＰＣＲチューブに移転し、全ゲノム試薬ケースで単細胞増幅を行い、増幅された産物に比較ゲノム学チップ（ｃＧＨ）解析を行い、ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ、ＰＢ２とＰｒｏｎｕｌｃｅｉが一致しているか否かを比較する。
【００４７】
結果は以下のとおりである：
１．ＰＢ１、ＰＢ２を母性遺伝ミトコンドリア病の治療に用いる基礎と優勢（ＳＴ及びＰＮＴと対照して）
（１）Ｓｐｉｎｄｌｅ及びＰｒｏｎｕｃｌｅｉと対照してみると、ＰＢ１、ＰＢ２が持っているミトコンドリアは極少量である。
【００４８】
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｏｒ蛍光プローブ標識の染色は（図２）、ＰＢ１、ＰＢ２が持っているミトコンドリアは極少量であり、特にＰＢ１中にミトコンドリアの存在がほとんど検測されないことを示す；しかし、ＰＢ１の対応物であるＳｐｉｎｄｌｅの周囲に大量のミトコンドリアが囲まれており、それはＳｐｉｎｄｌｅの運動は大量のエネルギーが必要なためである；ＰＢ２の対応物であるＰｒｏｎｕｃｌｅｉ周囲のミトコンドリアが一層多く、それは卵子受精後ミトコンドリアが急速に増え、同時に雌雄前核がどんどん近づいて分裂し、この過程はミトコンドリアが産出した大量のエネルギーが必要である。そのため、ＰＢ１がＳＴに代わり、ＰＢ２がＰＮＴに代わるようにすることで、再構築卵子／胚子に持ち込まれる病原性ミトコンドリアの数は著しく減少する。
【００４９】
（２）ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、ＰＢ２とＦｅｍａｌｅ  Ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓのエピジェネティクスが一致している。
【００５０】
免疫組織化学染色分析の結果、ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅのエピジェネティクスが一致しており、ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅの中にエピジェネティクス標識物であるＨ３Ｋ９ｍｅ３，  Ｈ３Ｐ，５ｍＣ  ａｎｔｉｂｏｄｙの発現 が検測されることがわかった（図３）；ＰＢ２とＦｅｍａｌｅ  Ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓのエピジェネティクスが一致しており、ＰＢ２とＦｅｍａｌｅ  Ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓの中にＨ３Ｋ９ｍｅ３，  ａｃｅｔｙｌ  Ｈ３，５ｍＣ  の発現が検測されることがわかった（図４）；
【００５１】
２．ＰＢ１、ＰＢ２が提供するゲノムで誕生したミトコンドリア置換後代の効率はＳＴ、ＰＮＴ及びＩＶＦとは大きな違いがない
【００５２】
本発明は子ネズミを模型とするミトコンドリア置換研究で、ＰＢ１、ＰＢ２の再構築子ネズミを獲得することに成功し、その獲得効率は従来のミトコンドリア置換技術ＳＴ、ＰＮＴ及び通常のＩＶＦと比較しても効率には大きな違いがなく、後代の重さ及び胎盤の重さもＳＴ、ＰＮＴ及び通常のＩＶＦの後代とは大きな違いがない（図５が示すように）。
【００５３】
３．ＰＢ１Ｔミトコンドリア置換ネズミは細胞質ドナー（すなわち健康な卵子細胞質ドナー）のミトコンドリアだけを持っている
【００５４】
パイロシーケンスの結果からみると、ＰＢ１Ｔミトコンドリア置換ネズミの体内に細胞質ドナーのミトコンドリアだけを持っており、ゲノムドナーのミトコンドリアを持っていないことがわかった。すなわちこの子ネズミの異型遺伝子性は０％であり、ＳＴミトコンドリア置換ネズミの異型遺伝子性（５％）より著しく低い；ＰＢ２Ｔミトコンドリア置換ネズミの体内にゲノムドナーすなわち患者由来のミトコンドリア（１％）を持っており、ＰＮＴミトコンドリア置換ネズミの異型遺伝子性（２５％）より著しく低い。
【００５５】
４．ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、ＰＢ２とＦｅｍａｌｅ  Ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓのエピジェネティクスが一致している
比較ゲノム学チップでヒトの卵子／受精卵を測定した結果によると、ＰＢ１とｓｐｉｎｄｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、ＰＢ２とＦｅｍａｌｅ  Ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓのエピジェネティクスが一致しており、２３本の染色体を持っており、ＤＮＡ断片又は増幅はないことがわかった（図７）。本発明の極体ゲノム再構築卵子をミトコンドリア置換技術に用いて母性遺伝ミトコンドリア病を治療する実行可能性のあることを証明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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