(57)【要約】  本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルの製造方法に関し、当該方法は：リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中でアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌を培養する工程を含み、当該細菌の培養により、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルが製造される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルの製造方法であって：
リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中でアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌を培養する工程、
を含み、当該細菌の培養により、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルが製造される、製造方法。
【請求項２】
前記３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルが、３−ヒドロキシプロピオン酸エチルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記増殖培地が、リン酸塩を１０ｇ／リットル以上含有する、請求項１又は２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４】
前記増殖培地が、リン酸塩を１３ｇ／リットル以上含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記増殖培地が、リン酸塩を１０〜３０ｇ／リットル含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記増殖培地が、窒素の外部的供給源を含有しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記増殖培地が、炭素の外部的供給源を含有しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記増殖培地がグリセロールを含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記増殖培地のｐＨが４〜７である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記細菌が、１５℃〜３０℃の温度で培養される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記細菌が、ＯＤ６００が０．７５〜１．００に達するまで培養される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記細菌が、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１８０８のＦＪ１株である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
更に、増殖培地から３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを分離する工程を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
更に、分離した３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを３−ヒドロキシプロピオン酸に変換する工程を含む、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
更に、３−ヒドロキシプロピオン酸を分離する工程を含む、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
更に、３−ヒドロキシプロピオン酸を脱水する工程を含む、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
更に、３−ヒドロキシプロピオン酸を、３−ヒドロキシプロピオン酸塩（アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカルシウム塩を含む）、３−ヒドロキシプロピオン酸エステル（メチル、プロピル及びブチルエステルを含む）、アクリル酸、アクリレート、ポリアクリル酸、アクリレートポリマー、アクリロニトリル、アクリルアミド、アクロレイン、１，３プロパンジオール及びロイテリン（Ｒｅｕｔｅｒｉｎ）に加工する工程を含む、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の製造方法であって、３−ヒドロキシプロピオン酸を製造するための方法であって：
受入番号ＮＣＩＭＢ  ４１８９８のアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌ＦＪ１株を、１０〜３０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する増殖培地中で培養する工程、ここで当該細菌の培養により、３−ヒドロキシプロピオン酸エステルが製造される；
当該増殖培地から３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを分離する工程；
３−ヒドロキシプロピオン酸エステルを３−ヒドロキシプロピオン酸に変換する工程；
３−ヒドロキシプロピオン酸を分離する工程；及び
任意で３−ヒドロキシプロピオン酸を脱水する工程；
を含む、製造方法。
【請求項１９】
３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法であって：
リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中で培養したアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌の無細胞抽出物を含有する水性媒体を提供する工程、ここで当該水性媒体中で３−ヒドロキシプロピオン酸が製造される；及び
任意で当該水性媒体から３−ヒドロキシプロピオン酸を分離する工程；
を含む、製造方法。
【請求項２０】
リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中で培養したアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌の無細胞抽出物を含有する水性媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の増殖条件下で、アセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌を培養することによる、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルの製造方法に関する。これらのエステルは、加水分解されて、３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）を形成する。
【背景技術】
【０００２】
多くの微生物が、３−ヒドロキシプロピオン酸（Ａｎｄｒｅｅｋｅｎ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，  Ａ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （２０１０），  ７６，  ４９１９−４９２５）、３−ヒドロキシ酪酸（Ａｓｌｉｍ，  Ｂ．，  Ｃａｌｉｓｋａｎ，  Ｆ．，  Ｂｅｙａｔｌｉ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｇｕｎｄｕｚ，  Ｕ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ  （１９９８），  １５９，  ２９３−２９７）、３−ヒドロキシ吉草酸（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，  Ａ．，  Ｄｅｂｚｉ，  Ｅ−Ｍ．，  Ｍａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ，  Ｒ．Ｈ  ａｎｄ  Ｔｉｍｍ，  Ａ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９９３），  ３９，  ４４３−４４９）、及びそれらのポリアルカノエートの形態でのポリマー（ＵＳ２０１２０１２９２３２）等の、ヒドロキシカルボン酸を生産することが示されている。一般に、ヒドロキシカルボン酸及びそれらの対応するポリアルカノエートは、栄養の制限された増殖条件に応答して生産される（Ｂｒｉｇｈａｍ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｋｕｒｏｓａｗａ，  Ｋ．，  Ｒｈａ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｓｉｎｓｋｅｙ，  Ａ．Ｊ．，  Ｓ３  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （２０１１））。ヒドロキシカルボン酸、特に３−ヒドロキシプロピオン酸の製造は、それがアクリル酸及び他の化合物に容易に変換されるため、商業的に重要である。故に、３−ヒドロキシプロピオン酸（ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ  ５０３−６６−２）は、有用なプラットフォーム化合物である。
【０００３】
遺伝子組み換え微生物による３−ヒドロキシプロピオン酸の生産は、多くの特許において取り上げられている（ＵＳ２００９０３２５２４８、ＵＳ２０１０００２１９７８、ＷＯ２０１２／０３０１９３５、ＵＳ２０１２２４４５８８及びＵＳ２０１１０１２５１１８）。これらの特許は、糖類又はグリセロー等の炭水化物の供給源を公知の改変経路を通じて３ＨＰに変換する発酵プロセスを記載している。収量は様々な形式で記載されており、ＷＯ２０１２／０３０１９３５は、添加したグリセロール１グラムあたり０．９７ｇの３ＨＰが得られたこと、ＵＳ２０１１０１２５１１８は、収量を、０．０５ｇ／乾燥細胞１ｇ／時間又は０．０５ｇ／リットル／時間で記載している。
【０００４】
近年、二酸化炭素の３−ヒドロキシプロピオン酸への変換が、パイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）において記載された（ＷＯ２０１３／０６７３２６）。この微生物は、その無細胞抽出物又は全形細胞のいずれかによって、二酸化炭素と水素ガスを使用して、３ＨＰを生産するように操作されている。しかしながら、この微生物は遺伝子改変生物であり、７０〜７３℃の増殖温度を要する。
【０００５】
回収された３ＨＰは、確立した化学プロセスを介してアクリル酸に変換される。しかしながら、全ての生物プロセスにおける主要な問題であるが、３ＨＰの収量が商業的に有用なレベルであっても、その分子を使用済み細菌培地中に存在する他の成分のバックグラウンドから分離することは困難であり、費用が掛かる。加えて、出発供給原料（ｓｔａｒｔｅｒ  ｆｅｅｄ  ｓｔｏｃｋ）のコストも、生物的３ＨＰ生産の商業化を阻害する。
【０００６】
ＷＯ２０１３／０１１２９２は、長鎖脂肪族カルボン酸を生産することが出来る微生物を記載している。この文献は、受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８（ブダペスト条約の規定の下、２０１１年１月１２日にＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．  （Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，  Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，  Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ，  ＡＢ２１  ９ＹＡ）によって寄託された）のアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）ＦＪ１という特定の株を記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
驚くべきことに、ＷＯ２０１３／０１１２９２に記載のアセトバクター・ロバニエンシス株は、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを生産し得ることが見出された。この微生物がそのような産物を生産し得ることは、従来知られていなかった。
【０００８】
本発明は、ＷＯ２０１３／０１１２９２に記載の微生物を用いて３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを製造する方法に関する。ＷＯ２０１３／０１１２９２の開示は、その全てが本明細書中に援用される。この微生物は、リン酸に富む増殖計画において、ヒドロキシカルボン酸及びそのエステルを生産する能力を有することが示されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第一の側面において、本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルの製造方法を提供し、当該方法は：リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中でアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌を培養する工程を含み、当該細菌の培養により、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルが製造される。
【００１０】
好ましくは、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルは、３−ヒドロキシプロピオン酸エチルである。その結果、本発明の方法は、３−ヒドロキシプロピオン酸エチルの製造方法を提供し、当該方法は：リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中でアセトバクター・ロバニエンシス細菌を培養する工程を含み、当該細菌の培養により、３−ヒドロキシプロピオン酸エチルが製造される。
【００１１】
アセトバクター・ロバニエンシス細菌は、リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中で培養される。１ｇ／リットルは、増殖培地中のリン酸含有化合物の量ではなく、増殖培地中のリン酸イオン（ＰＯ４３−）の量である。例えば、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の相対分子量は１３６である。このリン酸塩部分の相対分子量は９５である。従って、１００リットルの水に１３６ｇのＫＨ２ＰＯ４を添加すると、水の中には１．３６ｇ／リットルのＫＨ２ＰＯ４が存在するが、リン酸塩は０．９５ｇ／リットル存在することになる。
【００１２】
幾つかの態様において、増殖培地は好ましくは２ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は３ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は４ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は５ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は６ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は７ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は８ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は９ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は１０ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は１１ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は１２ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。好ましい態様において、増殖培地は１３ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は１４ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する。
【００１３】
幾つかの態様において、増殖培地は１５０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は１００ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は８０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。様々な態様において、増殖培地は７０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は６０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は５０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は４５ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は４０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は３５ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は３０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は２５ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は２０ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は１５ｇ／リットル未満のリン酸塩を含有する。
【００１４】
幾つかの態様において、増殖培地は１〜１５０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は２〜１００ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は３〜８０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。様々な態様において、増殖培地は４〜７０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は５〜６０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は６〜５０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は７〜４５ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は８〜４０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は９〜３５ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。幾つかの態様において、増殖培地は１０〜３０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。他の態様において、増殖培地は１１〜２５ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。更なる態様において、増殖培地は１２〜２０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。特定の態様において、増殖培地は１３〜１５ｇ／リットルのリン酸塩を含有する。
【００１５】
増殖培地は、アセトバクター・ロバニエンシス細菌が成長し、増殖し、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを生産することを可能とする、任意の適切な増殖培地であっても良い。増殖培地は、前記細菌が成長及び増殖出来る様々な成分／栄養素を含有し得る。増殖培地は、以下の添加物の１つ以上を含有し得る：カリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、銅塩、コバルト塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、カルシウム塩、モリブデン塩、塩化物、硫化物、モリブデン酸塩、炭酸塩。これらの添加物は、一般に、０．０１〜２ｇ／リットルの濃度で増殖培地中に存在する。
【００１６】
幾つかの態様において、増殖培地は、下記表に示す１つ以上の添加物を含有し得る。
【表１】
2017505133.tif 000003
【００１７】
特定の態様において、増殖培地は、下記の成分を含有する。
【表２】
2017505133.tif 000004
【００１８】
好ましくは、増殖培地は、窒素の外部的供給源を含有しない。前記細菌は大気から増殖培地中に溶存する窒素を固定できるため、外部からの窒素の供給を必要としない。
【００１９】
前記細菌は、二酸化炭素を固定し得る。故に、増殖培地は、大気から増殖培地中に溶存する二酸化炭素の他に炭素の外部的供給源を必要としない。しかしながら、幾つかの態様において、前記細菌の培養前又は培養中、増殖培地中に二酸化炭素を通気して、増殖培地中に溶存している二酸化炭素の量を増大し得る。前記細菌は、炭素の唯一の供給源として、二酸化炭素を使用し得る。
【００２０】
幾つかの態様において、炭素の追加的な供給源として、グリセロールが増殖培地中に添加される。好ましくは、これは、前記細菌の成長及び増殖の開始後になされる。
【００２１】
増殖培地のｐＨは、３．５〜９であり得る。好ましくは、増殖培地のｐＨは、４〜７である。増殖培地のｐＨは、好ましくは、酸性条件が、３ＨＰのエステルの回収量を減少させ得る、加水分解による３ＨＰへの変換を引き起こす程低くはない。特定の態様において、増殖培地のｐＨは、約４．５である。
【００２２】
増殖培地は、好ましくは、栄養素／添加物が水に溶けるように、水性である。
【００２３】
前記細菌は、一般に、０℃〜６０℃の温度で培養される。好ましくは、前記細菌は、１０℃〜４０℃の温度で培養される。幾つかの態様において、前記細菌は、１５℃〜３０℃の温度で培養される。
【００２４】
前記細菌は、一般に、６００ｎｍで測定した光学密度（ＯＤ６００）が０．７５〜１．００に達するまで培養される。
【００２５】
培養の過程で、培養の体積を増大させるために、追加の増殖培地で培養物が希釈され得る。従って、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルの抽出を要する場合、培養物の最終的な光学密度が０．７５〜１．００となるべきである。
【００２６】
前記細菌は、１２〜３６時間培養され得る。幾つかの態様において、前記細菌は、１８〜３０時間培養され得る。
【００２７】
３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルは、アセトバクター・ロバニエンシス細菌を培養することによって製造される。当該細菌は、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを生産し得る任意の適切なアセトバクター・ロバニエンシス細菌であってもよい。これは、ＦＪ１株（受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８）及びＦＪ１に由来し、又は関連する近縁の株を含む。「由来する」とは、ＦＪ１を改変又は突然変異させて作製した更なる細菌であることを意味する。例えば、ＦＪ１に遺伝子を挿入し、又は遺伝子を除去して作製される。ＦＪ１に由来する細菌は、機能的にＦＪ１と同等であり、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを生産し得るべきである。更に、当該由来する細菌は、ＦＪ１と同一の条件下で増殖し得るべきである。好ましくは、前記細菌は、受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８のＦＪ１株である。細菌は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析等、当業者に周知の方法によって、アセトバクター・ロバニエンシス細菌と同定されたものであってもよい。
【００２８】
前記細菌は、増殖しながら３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを生産するため、当該細菌の培養が完了すると、増殖培地中に３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルが存在しているはずである。３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルは、必要に応じて抽出されてもよい。
【００２９】
前記方法は、更に、増殖培地から３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを分離する工程を含む。これは、第一の分離工程で行われ得る。これは、任意の適切な方法で行われ、当業者にとって多くの方法が自明である。
【００３０】
例えば、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルは、蒸留によって分離されてもよく、蒸留は、標準的な蒸留、分別蒸留（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）、真空蒸留、添加溶剤（ｅｎｔｒａｉｎｅｒ）を用いた蒸留、溶媒抽出に続く蒸留による回収、及び連続蒸留を含む。他の分離方法として、膜かん流、電気化学分離、又は臨界二酸化炭素の使用を含む。
【００３１】
サイドアームコンデンサーのように、１気圧で蒸留が行われる（真空蒸留等減圧下ではなく）場合、３ＨＰエステルは、蒸留物の最初の１０〜１５％中に含有され得、９５℃〜１００℃、特に約９８℃の温度で回収され得る。一般に、３ＨＰエステルは、共沸混合物（ａｚｅｏｔｒｏｐｅ）として回収される。
【００３２】
３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルが分離された後、それは、３ＨＰに変換され得る。これは、エステル結合を切断して３ＨＰを生産することを含む。この適切な方法は、当業者に周知である。例えば、３ＨＰへの変換は、３−ヒドロキシプロピオン酸のエステルを含有する試料を酸性化してエステルの加水分解を引き起こすことによりなされ得る。これは、３ＨＰエステルに酸を添加することによりなされ得る。適切な酸は、塩酸及び硫酸である。あるいは、３ＨＰエステルは、アルカリを使用して加水分解され得る。これは、酸形態に変換され得る３−ヒドロキシプロピオン酸塩を、例えば濃縮された酸を使用して生産し得る。
【００３３】
３ＨＰへの変換後、第二の分離工程は、変換プロセスの後に存在している他の何らかの産物、例えばエタノールから３ＨＰを分離するために行われ得る。この第二の分離は、任意の適切な方法を使用して実施され得る。例えば、３ＨＰは、蒸留を用いて分離されてもよく、当該蒸留は、標準的な蒸留、分別蒸留（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）、真空蒸留、添加溶剤（ｅｎｔｒａｉｎｅｒ）を用いた蒸留、溶媒抽出に続く蒸留による回収、及び連続蒸留を含む。他の分離方法として、膜かん流、電気化学分離、又は臨界二酸化炭素の使用を含む。
【００３４】
分別カラムのように、１気圧で蒸留が行われる（真空蒸留等減圧下ではなく）場合、３ＨＰは、９５℃〜１００℃、特に約９８℃の温度で蒸留される。一般に、３ＨＰは、共沸混合物として回収される。
【００３５】
第二の分離工程の後、３ＨＰの相対的に純粋な試料が取得され、それは一般に水溶液である。
【００３６】
分離後、３ＨＰは脱水されて、水の一部が除去されてもよい。これは、限定されないが、塩化物塩（カルシウム又はナトリウム）等の薬剤、又は分子篩３Ａ等を用いて行われ得る。
【００３７】
上記のように、３ＨＰはプラットフォーム化合物であり、更に、３−ヒドロキシプロピオン酸塩（アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカルシウム塩を含む）、３−ヒドロキシプロピオン酸エステル（メチル、プロピル及びブチルエステルを含む）、アクリル酸、アクリレート、ポリアクリル酸、アクリレートポリマー、アクリロニトリル、アクリルアミド、アクロレイン、１，３プロパンジオール及びロイテリン（Ｒｅｕｔｅｒｉｎ）等の、他の化合物に加工されてもよい。
【００３８】
特定の態様において、本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法を提供し、当該方法は：
受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８のアセトバクター・ロバニエンシス株ＦＪ１を、１０〜３０ｇ／リットルのリン酸塩を含有する増殖培地中で培養する工程、当該細菌の培養により、３−ヒドロキシプロピオン酸エチルが製造される；
増殖培地から３−ヒドロキシプロピオン酸エチルを分離する工程；
３−ヒドロキシプロピオン酸エチルを３−ヒドロキシプロピオン酸に変換する工程；及び
３−ヒドロキシプロピオン酸を分離する工程；
を含む。
【００３９】
この態様において、リン酸塩の濃度は、１０〜３０ｇ／リットルと記載されている。しかしながら、この具体的な態様において、上記の任意のリン酸塩濃度が用いられ得る。例えば、リン酸塩濃度は、１ｇ／リットル以上、１３〜１５ｇ／リットル、又はそれらの間のいずれかの態様であってもよい。
【００４０】
３ＨＰエステルの生産に関与する酵素は、細菌の細胞外に存在すると考えられている。これらの酵素は、細菌の細胞の存在に拘らず機能する。従って、本発明の他の態様において、３ＨＰエステルを製造する方法が提供され、当該方法は、リン酸塩を１ｇ／リットル以上含有する増殖培地中で培養したアセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）細菌の無細胞抽出物を含有する水性媒体を提供する工程を含み、ここで当該水性媒体中で３ＨＰエステルが製造される。
【００４１】
３ＨＰエステルの分離等、上記の本発明の第一の側面の方法における工程は、本発明のこの側面に等しく適用される。
【００４２】
前記媒体は、酵素系が媒体中に生産されるのに十分な時間、その中で前記細菌を培養することによって製造され得る。この無細胞抽出物は、培養後に、超遠心分離の反復等により、媒体から細菌細胞を除去することによって調製され得る。
【００４３】
本発明の更なる側面において、１ｇ／リットル以上のリン酸塩を含有する増殖培地中で培養されたアセトバクター・ロバニエンシス細菌の無細胞抽出物を含有する水性媒体が提供される。
【００４４】
詳細な説明
本発明は、例示のみを目的とする下記図面を参照して、詳細に説明され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１（高レベルのリン酸塩の存在下、二酸化炭素を添加して増殖させた）による３ＨＰエステルの製造、及びその後の回収を示すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
概観
高濃度のリン酸塩の存在下、任意で窒素及び炭素の外部的供給源の非存在下、アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１は、限定されないがヒドロキシカルボン酸を含む、様々な代謝物のセットを生産する。３−ヒドロキシプロピオン酸は、商業的に有用なレベルで生産され（窒素の制限が無い）、これは、インビボでエチルエステルに変換される。
【００４７】
特定の理論に拘泥することを望まないが、高レベルのリン酸塩の存在下で、プロピオン酸ヒドロキシルサイクルを介した二酸化炭素固定に切り替わる、代謝スイッチが存在すると考えられている（Ｔａｂｉｔａ，  Ｆ．Ｊ．，  ＰＮＡＳ  （２００９），  １０６，  ２１０１５−２１０１６；  Ｓｔｒａｕｓｓ，  Ｇ．  Ａｎｄ  Ｆｕｃｈｓ．  Ｇ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （１９９３），  ２１５，  ６３３−６４３）。加えて、ニトロゲナーゼ酵素型複合体を介した窒素固定は、ヒドロゲナーゼ酵素により利用され、生物の酸化還元系を調整する、水素の生産をもたらす（Ｔａｍａｇｎｉｎｉ  Ｐ．，  Ａｘｅｌｓｓｅｎ  Ｒ．，  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  Ｐ．，  Ｏｘｅｌｆｅｌｔ  Ｆ．，  Ｗｅｎｓｃｈｉｅｒｓ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｂｌａｄ  Ｐ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００２），  ６６，  １１−２０）。炭素及び窒素の同化は他の生物においても示されているが（Ｌｅｖｉｃａｎ  Ｇ．，  Ｕｇａｌｄｅ  Ｊ．Ａ．，  Ｅｈｒｅｎｆｅｌｄ  Ｍ．，    Ｍａａｓｓ  Ａ．，  ａｎｄ  Ｐａｒａｄａ  Ｐ．，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  （２００８），  ５８１，  １１８６；  Ｄｕｂｂｓ  Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｔａｂｉｔａ  Ｆ．Ｒ．，  Ｆｅｍｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  （２００４），  ２８，  ３５３−３５６；  ＭｃＫｉｎｌａｙ  Ｊ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ｃ．Ｓ．，  ＰＮＡＳ  （２０１０），  １０７３，  １−７）、ニトロゲナーゼ系を介した酸化還元リサイクル機構としての二酸化炭素固定の使用は、非紅色硫黄細菌等の酸素非発生型光栄養細菌においてのみ従来示されており、当該細菌は、Ｃａｌｖｉｎ  Ｂｅｎｓｏｎ  Ｂａｓｈａｍサイクルを介して、二酸化炭素を還元する。アセトバクター種は、この効果を利用することが出来る。アセトバクター種は機能するＣａｌｖｉｎ  Ｂｅｎｓｏｎ  Ｂａｓｈａｍサイクルを有しないがその遺伝的要素は保持しており、又は３ＨＰサイクルが同一の効果の為に使用される。更に、３ＨＰにおけるプロトン駆動力依存的流出系は、アセトバクター・アセティ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）において見られるように動作し得る（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｋ．，  Ｉｎｏｕｅ  Ｔ．，  Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．，  ａｎｄ  Ｔｏｙａｍａ  Ｈ．Ｊ．，  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  （２００５），  １８７，  ４３４６−４３５２）。
【００４８】
エステルの生成は、アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１において示されている。更に、３ＨＰのエステル化は、アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１による酢酸のエタノールへの変換と、それに続く３ＨＰのエステル化によるものと考えられている。これは、３ＨＰのエチルエステルをもたらすエステル化の新しい経路である。この産物は３ＨＰ自体よりも、使用済みの細菌培地から回収するのに経済的である。例えば、回収は、９８度付近でエステルと水との間で形成される共沸混合物を利用する単純な蒸留によって実施できる。回収が容易であることにより、３ＨＰの抽出が相対的に安価になる。そして、３ＨＰのエステルは、更に、３ＨＰ、３ＨＰのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩、アクリル酸、アクリレート、アクリルアミド、アクロレイン及び１，３プロパンジオール等の、多くの化学的に有用な産物に変換され得る。
【００４９】
３−ヒドロキシプロピオン酸エチル（ＣＡＳ番号６２３−７２−３）を製造するプロセス
アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１（受入番号ＮＣＩＭＢ４１８０８）は、最小塩培地中で増殖し、当該培地において、窒素源は除外され、リン酸塩の濃度は増大されている。この培地の組成を下記表に示す。
表１：アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１の増殖に用いる最小塩培地の組成
【表３】
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【００５０】
前記培地を水に溶解し、濾過する。使用する水は、蒸留水や水道水であってもよい。この微生物は、非滅菌条件下で増殖出来、オートクレーブや他の適切な方法による、培地や設備の更なる滅菌を要しない。
【００５１】
前記微生物は、撹拌フラスコや他の適切な容器中の２リットル量の培地中に播種され、Ａ６００が０．７５〜１．００となるまで増殖させられる。２リットルの培養培地は、新鮮な培地で１０リットルに希釈され、再びＡ６００が０．７５〜１．００となるまで増殖させられる。この培養培地の体積は、培養物の分割を繰り返すことにより、所望の体積にまで増大させられる。
【００５２】
使用済みの細菌培地は、最長１２ヶ月の期間に渡り保管出来る。
【００５３】
使用済みの細菌培地は蒸留されて、図１に示す一般プロセスを使用して、所望の産物が回収される。
【００５４】
標準的な蒸留セットは、フラスコ、マントルヒーターを採用し、分別カラム及びコンデンサーを有する蒸留頭部を有する場合もある。しかしながら、真空蒸留、添加溶剤（ｅｎｔｒａｉｎｅｒ）を用いた蒸留、溶媒抽出に続く蒸留による回収、及び連続蒸留等の、他の蒸留方法も適用され得る。膜かん流、電気化学的分離、又は臨界二酸化炭素の使用による回収等の、代謝物を回収する他の手順が採用されてもよい。
【００５５】
３ＨＰエチルは、９８℃で水と形成する共沸混合物として回収され得る。プールした産物を、元の酸（３ＨＰ）とエステルに加水分解する。エタノールは約８４℃で蒸留させられる。３ＨＰは再び水と共沸混合物を形成し、この第一のフラクションの後、９８℃で第二のフラクションを蒸留する。当該産物は、限定されないが塩化物塩（カルシウム又はナトリウム）等の薬剤、又は分子篩３Ａを用いて、更に脱水され得る。
【００５６】
薄層クロマトグラフィーや、チューブ型の固相吸着剤等の、様々な前精製方法の後に、回収率が測定される。固相吸着剤チューブは、典型的には、様々なチューブサイズのＣｌａｎｅｒｔ  Ｃ１８吸着剤である。材料がＣ１８に吸着され、コンタミナントが洗浄され、そしてアセトン又は０．１％ＨＣｌ（ｖ／ｖ）含有エタノールを用いて溶出される。
【００５７】
３ＨＰエステルと３ＨＰの濃度は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定できる。典型的には、３ＨＰは、２５ｃｍ  ＯＤＳ−Ｈ、４．６ｍｍカラム、移動相９０％エタノール：１０％水を使用して、定組成的に（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）溶出される。
【００５８】
個々の産物は、質量分析器を使用して同定出来、試料の供給源及び種類に依存して、誘導体化を要し得る。誘導体化が必要な試料において、材料は適切な溶媒中に抽出され、ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミド）及びＴＭＳ（トリメチルシリル）で処理される。装置は、典型的には温度８０度で注入され、最高３００℃に達するまで、１分間に７℃ずつ上昇させられる。カラムは、この温度で５分間維持される。ピークを同定するために、通常のライブラリー検索が使用される。典型的なランにおいて、２０．８分での主要なピークが３ＨＰである。
【実施例】
【００５９】
実施例１：窒素の外部的添加無し、炭素供給源が二酸化炭素のみの、生物の増殖
当該生物は、高レベルのリン酸塩の存在下で典型的には７２時間の増殖サイクルを有し、２０℃で細胞乾燥重量０．０７ｇ／ｌ／ｈを達成する。３つの条件下で、当該生物は、０．１７８ｇ３ＨＰ／ｌ／ｈ／生物細胞乾燥重量ｇを達成する。
【００６０】
実施例２：単純な二段階の蒸留プロセスによる３ＨＰの製造
３Ｈは、単純な二段階の蒸留プロセスを用いて回収出来る。
【００６１】
１．使用済みの細菌培地を、分別カラム無しサイドアームコンデンサー付きの単純な蒸留ポット中で蒸留する。９８℃で共沸混合物を形成する３ＨＰエステルのフラクションとして、最初の１０％の蒸留物を回収する。これを「蒸留物Ａ」とする。
【００６２】
２．蒸留物Ａのプールされたフラクションを、１０リットル反応フラスコ及びパックされた分別カラムを採用する蒸留カラム中で再蒸留する。蒸留に先立ち、蒸留物Ａのプールされたフラクションを、適切な鉱酸を用いて酸性化して、エステル成分を加水分解する。蒸留物Ｂにおいて、エタノール及び他の揮発性フラクションを含む最初の５％は、７５℃〜８０℃で分離される（フラクション１）。３ＨＰに富んだ２０体積％の第二のフラクション（フラクション２）は、９８℃で蒸留された。フラクション２は、典型的には、８８％以上の純度で３ＨＰを３０％含有する。この材料は、商業的に利用可能な３ＨＰの濃度に対応する。この産物は、それから、下記例に示すような更なるプロセスに供され得る。
【００６３】
実施例３：３ＨＰのアルカリ土類塩の製造
実施例２で取得した３ＨＰ水溶液を、更に、水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウムにより、ナトリウム又はカルシウム塩に変換させられる。水溶性ナトリウム塩は、蒸発又は凍結乾燥により回収できる。不溶性カルシウム塩は、単純な濾過により回収できる。
【００６４】
実施例４：３ＨＰのアンモニウム塩の製造
３ＨＰのアンモニウム塩は、例えばＵＳ２０１０００９９９１０に記載される、塩分割プロセスにより調製され得る。
【００６５】
実施例５：３ＨＰのアクリル酸への変換
３ＨＰは、前記アンモニウム塩への変換に続いて、固体オキシド脱水触媒（例えば米国特許Ｎｏ．８３３８１４５）で処理することによって、又は反応性蒸留（例えば米国特許Ｎｏ．８１９８４８１）等の他の方法によって、アクリル酸に変換され得る。
【００６６】
実施例６：代替の基質の利用、グリセロールの３−ヒドロキシプロピオン酸エチルへの変換
バイオディーゼル製造におけるグリセロール排出物等のグリセロールは、外部的触媒として細菌培養物を利用して、３−ヒドロキシプロピオン酸又はアクリル酸に変換され得る。前記細菌をＡ６００の測定値が０．７５になるまで増殖させ、これを１０％グリセロールに添加する。グリセロールは、水に希釈した精製グリセロールでもよく、又は水で希釈して有効濃度１０％のグリセロールを含有するバイオディーゼル排出物でもよい。バイオディーゼル排出物は、前処理を要しない。グリセロールの３ＨＰへの変換は、ＵＶ可視分光法、ＩＲ分光法を使用してモニターされ、最終産物は、ＨＰＬＣ及びＧＣマススペクトロメトリーを使用して解析される。
【００６７】
実施例７：３ＨＰのロイテリンへの変換
ロイテリンは、幾つかの種類の細菌に対して阻害的な抗微生物剤である（３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、そのダイマー及び水和物）。この化合物は、一般に、グリセロール存在下でＬ．  ロイテリ（Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉ）を増殖させることにより製造される。アセトバクター・ロバニエンシスＦＪ１により生産された３−ヒドロキシプロピオン酸エチルエステル又は３−ヒドロキシプロピオン酸は、更に、適切な条件下、適切な触媒で処理することにより、又はアルコールデヒドロゲナーゼ等適切な酵素の作用により、この化合物に変換され得る。
【００６８】
実施例８：３ＨＰのアクリル酸及びアクリル酸エステルへの変換
上記プロセスにおいて生産された３−ヒドロキシプロピオン酸は、当業者が使用する適切な条件下デヒドラターゼ酵素を使用してアクリル酸に変換され得る。メチル、プロピル及びブチル等の３−ヒドロキシプロピオン酸のエステル産物は、当該酸及び僅かに過剰のモル比の各アルコールを添加して、続いて当業者が使用する適切な条件下、リパーゼ酵素で処理することにより、製造され得る。エチルエステルは、任意の適切な希釈法により、使用済みの細菌培地から回収され得る。
【図１】
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【国際調査報告】
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