(57)【要約】本明細書には、ヒト補体成分３（Ｃ３）タンパク質に結合するアプタマー、Ｃ３−タンパク質とＣ３結合アプタマーを含む組成物、及び同じものを製作し使用する方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５２）を含む、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーであって、
Ｋが、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、
各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、
各Ｒが、各出現において、それぞれ独立して、ＡまたはＧであり、
Ｍが、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、
各Ｄが、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｃまたは３炭素スペーサーあり、
各Ｖが、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、
Ｌが、Ｕ、ＴまたはＣ−５修飾ピリミジンであり、
Ｗが、Ｇまたは３炭素スペーサーであり、
Ｓが、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、
Ｙが、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、
ｎが０または１である、前記Ｃ３タンパク質に結合するアプタマー。
【請求項２】
前記アプタマーが、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３１）を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記アプタマーが、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰＭ−３’（配列番号：１３５）または５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰＭ−３’（配列番号：１５３）を含む、請求項１または請求項２に記載のアプタマー。
【請求項４】
配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５４）を含む、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーであって、
Ｋが、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、
各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、
Ｒが、ＡまたはＧであり、
Ｍが、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、
Ｖが、Ａ、Ｇ、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、
Ｗが、Ｇまたは３炭素スペーサーであり、
Ｓが、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、
Ｙが、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、
Ｘが、置換または非置換のＣ２−Ｃ２０のリンカー、アルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから選択されるリンカーである、前記Ｃ３タンパク質に結合するアプタマー。
【請求項５】
前記アプタマーが、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３６）を含む、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
前記アプタマーが、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰＭ−３’（配列番号：１３７）または５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰＭ−３’（配列番号：１５５）を含む、請求項４または請求項５に記載のアプタマー。
【請求項７】
Ｋが、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、またはＧであり、
各Ｍが、各出現において、それぞれ独立して、ＣまたはＣ−５修飾ピリミジンであり、及び／または
Ｌが、ＡまたはＣ−５修飾ピリミジンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項８】
配列５’−ＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含む、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーであって、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｗが、Ｇまたは３炭素スペーサーであり、Ｓが、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、ＶがＡ、ＧまたはＣであり、ＹがＣ、ＵまたはＴであり、及びＲがＧまたはＡである、前記Ｃ３タンパク質に結合するアプタマー。
【請求項９】
配列５’−ＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３４）を含む、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーであって、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｗが、Ｇまたは３炭素スペーサーであり、及びＳが、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、ＶがＡ、ＧまたはＣである、前記Ｃ３タンパク質に結合するアプタマー。
【請求項１０】
配列番号：４〜２８、３２〜３４、３７〜７５、７８〜１１８、１２１〜１３０、及び１３９〜１５１から選択される、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーであって、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである、前記Ｃ３タンパク質に結合するアプタマー。
【請求項１１】
第１の領域及び第２の領域を含む、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーであって、前記第１の領域が、配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含み、前記第２の領域が、配列５’−ＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含み、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｙが、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＲがＧまたはＡである、前記Ｃ３タンパク質に結合するアプタマー。
【請求項１２】
第１の領域及び第２の領域を含む、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーであって、前記第１の領域が、配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含み、前記第２の領域が、配列５’−ＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３３）を含み、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである、前記Ｃ３タンパク質に結合するアプタマー。
【請求項１３】
前記第１の領域の前記３’末端が、前記第２の領域の前記５’末端に共有連結されている、請求項１１または請求項１２に記載のアプタマー。
【請求項１４】
前記第１領域及び前記第２領域が、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのリンカーによって共有連結されており、各リンカーが、ヌクレオチド、置換または非置換のＣ２−Ｃ２０リンカー、アルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから独立して選択される、請求項１３に記載のアプタマー。
【請求項１５】
各リンカーが、ヌクレオチド、３炭素スペーサー、及びヘキサエチレングリコールから独立して選択される、請求項１４に記載のアプタマー。
【請求項１６】
配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含む、Ｃ３に結合するアプタマーであって、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである、前記Ｃ３に結合するアプタマー。
【請求項１７】
配列５’−ＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含む、Ｃ３に結合するアプタマーであって、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｙが、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＲがＧまたはＡである、前記Ｃ３に結合するアプタマー。
【請求項１８】
配列５’−ＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３３）を含む、Ｃ３に結合するアプタマーであって、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである、前記Ｃ３に結合するアプタマー。
【請求項１９】
配列番号：１２５の配列を含む、Ｃ３に結合するアプタマーであって、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである、前記Ｃ３に結合するアプタマー。
【請求項２０】
各Ｃ−５修飾ピリミジンがそれぞれ独立して、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−３、４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２、３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項２１】
各Ｃ−５修飾ピリミジンがそれぞれ独立して、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項２２】
各Ｃ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項２３】
前記アプタマーが、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項２４】
前記アプタマーが、２４〜１００ヌクレオチドの長さ、または３０〜６０ヌクレオチドの長さ、または長さ２８〜６０ヌクレオチドの長さ、または２８〜５０ヌクレオチドの長さ、または２８〜４０ヌクレオチドの長さ、または４０〜５０ヌクレオチドの長さ、または２８〜３２ヌクレオチドの長さである、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項２５】
前記アプタマーが、Ｃ３タンパク質の切断を阻害する、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項２６】
前記Ｃ３タンパク質が、ヒトＣ３タンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項２７】
先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー及び補体成分３（Ｃ３）タンパク質を含む組成物。
【請求項２８】
前記補体成分３（Ｃ３）タンパク質が、ヒト補体成分３（Ｃ３）タンパク質である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアプタマーとＣ３タンパク質を接触させることを含む、補体成分３（Ｃ３）タンパク質の切断を阻害するための方法。
【請求項３０】
前記Ｃ３タンパク質が、インビトロ試料内にある、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｃ３タンパク質が、対象内にある、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜２６のずれか１項に記載のアプタマーを有する補体系の接触成分を含む、補体系の少なくとも１つの活性を阻害するための方法。
【請求項３３】
前記補体系の成分が、インビトロ試料内にある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記補体系の成分が、対象内にある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアプタマーの有効量を対象に投与することを含む、前記対象の前記補体成分３（Ｃ３）タンパク質の切断を阻害するための方法。
【請求項３６】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアプタマーの有効量を対象に投与することを含む、前記対象の前記補体系の少なくとも１つの活性を阻害する方法。
【請求項３７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアプタマーの有効量を対象に投与することを含む、加齢性黄斑変性症、自己免疫疾患、血液疾患、感染症、敗血症、炎症性疾患、または神経変性疾患を治療する方法。
【請求項３８】
前記自己免疫疾患が、エリテマトーデス及び関節リウマチから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記血液疾患が、発作性夜間血色素尿症である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記炎症性疾患が、虚血／再灌流傷害、関節炎、及び腎炎から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記神経変性疾患が、ハンチントン病及びパーキンソン病から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
Ｃ３タンパク質の切断を阻害するための請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアプタマーの使用。
【請求項４３】
前記補体系の少なくとも１つの活性を阻害するための請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアプタマーの使用。
【請求項４４】
加齢性黄斑変性症、自己免疫疾患、血液疾患、感染症、敗血症、炎症性疾患、または神経変性疾患を治療するための請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアプタマーの使用。
【請求項４５】
Ｃ３タンパク質の結合親和性を有するアプタマーを選択するための方法であって
（ａ）Ｃ３タンパク質と候補混合物を接触させることであって、前記候補混合物が、前記候補混合物の核酸の少なくとも１つ、またはそれぞれに含まれる１つ、いくつかまたはすべてのピリミジンがＣ―５修飾ピリミジンを含む修飾核酸を含み
（ｂ）遅いオフ速度の濃縮プロセスで前記候補混合物を露出することであって、前記候補混合物のその他の核酸に関連する標的分子からの遅いオフ速度を有する核酸が前記Ｃ３タンパク質に結合して、核酸−標的分子複合体を形成し
（ｃ）前記候補混合物からの遅いオフ速度の核酸を分離すること
（ｄ）遅いオフ速度を有する前記Ｃ３タンパク質に結合可能な核酸配列で濃縮された核酸の混合物を産生するために、前記遅いオフ速度の核酸を増幅することによって、前記Ｃ３タンパク質分子への遅いオフ速度のアプタマーが選択される、前記方法。
【請求項４６】
前記候補混合物が、前記配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含む核酸を含み、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記候補混合物が、前記配列５’−ＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）または５’−ＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３３）を含む核酸を含み、各Ｐが、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｙが、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＲが、ＧまたはＡである、請求項４５または請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
各核酸が独立して、約２４〜約１００ヌクレオチドの長さ、または約３０〜約６０ヌクレオチドの長さ、または約２８〜約６０ヌクレオチドの長さ、または約４０〜約５０ヌクレオチドの長さ、または約２８ヌクレオチドの長さである、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
各Ｃ−５修飾ピリミジンがそれぞれ独立して、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−３、４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２、３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
各Ｃ−５修飾ピリミジンがそれぞれ独立して、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
各Ｃ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記混合物の複数の核酸が、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項４５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記混合物の複数の核酸が、Ｃ３スペーサー、ＨＥＧリンカーまたはＰＥＧリンカーを含む、請求項４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｃ３タンパク質が、ヒトＣ３タンパク質である、請求項４５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／００５、３００号の利益を主張するものであり、その全体があらゆる目的のために参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、一般に核酸の分野に関し、より詳細には、ヒト補体成分３（Ｃ３またはＣ３−タンパク質）に結合することができるアプタマー、Ｃ３結合アプタマー及びＣ３を含む組成物、及びＣ３の生物学的機能を阻害する方法、及びそのようなアプタマーを使用してＣ３を検出する方法に関する。
【０００３】
補体系は、血液中に見られる可溶性タンパク質及び他の体液、ならびに細胞に結合したタンパク質を含む相互作用タンパク質の群を含む（Ｍａｋｒｉｄｅｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９８、５０（１）：５９−８８）。本系は、病原体に対する宿主防御に必要とされる自然免疫において重要な役割を果たし、病原体の細胞溶解、免疫細胞走化性、及び食作用を媒介する（Ｊａｎｅｗａｙら  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ及びＤｉｓｅａｓｅ．第５版．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌ及びＳｃｉｅｎｃｅ；２００１）。
【０００４】
補体成分３（Ｃ３）タンパク質（血液中に見出される糖タンパク質）は、本系のメンバーであり、経路において中心的な役割を果たしている（Ｌａｍｂｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９８８、９（１２）：３８７−３９３）。ヒト補体成分３（Ｃ３）の遺伝子は、１９番染色体の短腕上に位置しており（Ｌｕｓｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８６、８３：３９２９−３９３３）転写され、処理されてプロＣ３に翻訳される。プロＣ３は、分泌時に、部位特異的分子内切断を受け、循環Ｃ３を産生する。Ｃ３は、ジスルフィド結合により連結された２つのサブユニット（α鎖１１５ｋＤａ及びβ鎖７５ｋＤａ）を含むタンパク質として循環する。正常ヒト血清中のＣ３−タンパク質の濃度は、約１．１５ｍｇ／ｍｌである（Ｋａｓｐｅｒｓｋａ−Ｚａｊａｃら、Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ２０１３、１０：２２；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７６−９２５５−１０−２２）。
【０００５】
その活性化に続いて、表面へのＣ３−タンパク質の共有結合は、補体系の多くの効果を開始する。活性化は、Ｃ３ａ及びＣ３ｂと呼ばれる２つのタンパク質への可溶性Ｃ３−タンパク質の部位特異的タンパク質分解によって達成することができる。Ｃ３ｂが、食作用（オプソニン化）のための粒子を対象とするように作用する表面に共有結合するか、または病原体細胞の溶解をもたらす終末補体経路を開始する。Ｃ３ａは、いわゆるフィラトキシン、たとえば、平滑筋細胞の収縮、血管透過性、肥満細胞の脱顆粒及び免疫細胞の走化性などの多様な生理機能のメディエーターである。それらがＣ３ａ及びＣ３ｂの両方の生物学的機能と同様に、終末補体経路の活性化を阻害し得るように、部位特異的タンパク質分解の活性化イベントを阻害するＣ３の阻害剤が望ましい。
【０００６】
補体系は、一般に宿主の組織損傷を防止するために厳密に調節されている（Ｔｈｕｒｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６、１７６：１３０５−１３１０）。しかし、調節解除されると、１つまたは複数の制御機構が失敗したとき、または非定型免疫系の変調によって発生するように、生じた過剰な補体活性化が、病態生理学につながり得る。たとえば、非定型溶血性尿毒症症候群及び加齢黄斑変性の両方で、補体制御タンパク質因子Ｈの変化が、Ｃ３−転換活性を増加させ、そのため過剰な補体活性化につながることに関与している（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０、４７（１３）：２１８７-２１９７）。補体の過剰活性化は、これらの疾患において観察される組織損傷をもたらす、宿主自身の細胞を攻撃し得る。補体系は、多くの炎症性疾患及び虚血／再灌流傷害に起因する組織損傷にも関与し得る。したがって、Ｃ３の活性を阻害するものを含む、補体系を阻害することができる治療剤が、有益であることを証明し得る。本開示は、ヒトＣ３−タンパク質の生物活性を阻害してＣ３ａの放出を防止することができるアプタマーを提供することにより、そのような必要性を満たす。
【０００７】
体液中のＣ３濃度を測定することは、これらに限定されないが、急性の炎症状態、微生物感染症、先天Ｃ３欠乏症、急性糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、膜性増殖性糸球体腎炎及び免疫複合体病の診断を含む、いくつかの疾患及び状態の診断検査として有用である（Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．．２０１２、２０１２：Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９６２７０２、１１  ｐａｇｅｓ）。現時点では、抗体は、Ｃ３を検出するための最も一般的なツールである。しかし、抗体には、限られた貯蔵寿命、特殊な保管要件（たとえば、冷却）、凝集及び比較的高コストな生産と同等の安定性（変化する温度及びｐＨ条件の許容範囲、及び非理想的な条件から回復性の欠如の両方）を含むいくつかの欠点がある。本開示は、ヒトＣ３−タンパク質に結合特異性を有するアプタマーを提供することによって、抗体で発生する問題に対処する。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、ヒト補体成分３（Ｃ３）タンパク質に結合するアプタマーを記載する。これらのアプタマーは、Ｃ３の補体媒介活性化の阻害剤であることが示され、したがって、診断及び治療薬として有用であり得る。Ｃ３−タンパク質結合アプタマーを含む医薬組成物、ならびにその製造方法及び使用方法を記載する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５２）を含む。式中、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり、Ｍは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、各Ｄは、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、各Ｖは、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、Ｌは、Ａ、Ｕ、ＴまたはＣ−５修飾ピリミジンであり、ＷはＧまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、Ｙは、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びｎは０または１である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰＭ−３’（配列番号：１５３）を含む。式中、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３１）を含む。式中、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり、Ｍは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、各Ｄは、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、各Ｖは、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、Ｌは、Ａ、Ｕ、ＴまたはＣ−５修飾ピリミジンであり、ＷはＧまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、及びｎは０または１である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰＭ−３’（配列番号：１３５）を含む。式中、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５４）を含む。式中、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり、Ｍは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、Ｖは、Ａ、Ｇ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、ＷはＧまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、Ｙは、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＸは、置換または非置換のＣ２−Ｃ２０リンカー、アルキレングリコール、ポリアルキレングリコールから選択されるリンカーである。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰＭ−３’（配列番号：１５５）を含む。式中、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３６）を含む。式中、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり、Ｍは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、Ｖは、Ａ、Ｇ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、ＷはＧまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、及びＸは、置換または非置換のＣ２−Ｃ２０リンカー、アルキレングリコール、ポリアルキレングリコールから選択されるリンカーである。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰＭ−３’（配列番号：１３７）を含む。式中、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーである。
【００１３】
上述した実施形態のいずれにおいても、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、ＣまたはＧであっても良く、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、ＣまたはＣ−５修飾ピリミジンであっても良く、及び／またはＬは、ＡまたはＣ−５修飾ピリミジンであっても良い。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列５’−ＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｗは、Ｇまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、ＹはＣ、ＵまたはＴであり、及びＲはＧまたはＡである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列５’−ＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３４）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｗは、Ｇまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、及びＶはＡ、ＧまたはＣである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列番号：４〜１３０及び１３８〜１５１から選択される、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ここで、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列番号：４〜２８、３２〜３４、３７〜７５、７８〜１１８、１２１〜１３０、及び１３９〜１５１から選択される、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ここで、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、第１の領域及び第２の領域を含み、第１の領域は、配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含み、第２の領域は、配列５’−ＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｙは、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＲはＧまたはＡである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、第１の領域及び第２の領域を含み、第１の領域は、配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含み、第２の領域は、配列５’−ＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３３）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第１の領域の３’末端は、第２の領域の５’末端に共有連結されている。いくつかの実施形態では、第１領域及び第２領域は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのリンカーによって共有連結されており、各リンカーは、ヌクレオチド、置換または非置換のＣ２−Ｃ２０リンカーアルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各リンカーは、ヌクレオチド、３炭素スペーサー、及びヘキサエチレングリコールから独立して選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列５’−ＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３３）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列５’−ＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｙは、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＲはＧまたはＡである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーは、配列番号：１２５の配列を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。
【００２２】
本明細書に記載のアプタマーのいくつかの実施形態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−３、４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２、３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキ’ウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから独立して選択される。
【００２３】
本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００２４】
本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、約２４〜約１００ヌクレオチドの長さ、または約３０〜約６０ヌクレオチドの長さ、または約２８〜約６０ヌクレオチドの長さ、または約４０〜約５０ヌクレオチドの長さ、または約２８ヌクレオチドの長さでも良い。本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、２４〜１００ヌクレオチドの長さ、または３０〜６０ヌクレオチドの長さ、または長さ２８〜６０ヌクレオチドの長さ、または２８〜５０ヌクレオチドの長さ、または２８〜４０ヌクレオチドの長さ、または４０〜５０ヌクレオチドの長さ、または２８〜３２ヌクレオチドの長さでも良い。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマーは、Ｃ３タンパク質に結合し、Ｃ３タンパク質の切断を阻害する。いくつかの実施形態では、Ｃ３のタンパク質は、ヒトＣ３タンパク質である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマー及び補体成分３（Ｃ３）タンパク質を含む、組成物が提供される。このようないくつかの実施形態では、補体成分３（Ｃ３）タンパク質は、ヒト補体成分３（Ｃ３）タンパク質である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマーとＣ３タンパク質を接触させることを含む、補体成分３（Ｃ３）タンパク質の切断を阻害するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質は、インビトロ試料内にある。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質は、対象内にある。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマーを有する補体系の接触成分を含む、補体系の少なくとも１つの活性を阻害するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、補体系の成分は、インビトロ試料内にある。いくつかの実施形態では、補体系の成分は、対象内にある。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマーの有効量を対象に投与することを含む、補体成分３（Ｃ３）タンパク質の切断を阻害するための方法が提供される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマーの有効量を対象に投与することを含む、対象内の補体系の少なくとも１つの活性を阻害するための方法が提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマーの有効量を対象に投与することを含む、加齢性黄斑変性症、自己免疫疾患、血液疾患、感染症、敗血症、炎症性疾患、または神経変性疾患を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、エリテマトーデス及び関節リウマチから選択される。いくつかの実施形態では、血液疾患は、発作性夜間血色素尿症である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、虚血／再灌流傷害、関節炎、及び腎炎から選択される。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、ハンチントン病及びパーキンソン病から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質の切断を阻害するための、本明細書に記載のアプタマーの使用が提供される。いくつかの実施形態では、補体系の少なくとも１つの活性を阻害するための、本明細書に記載のアプタマーの使用が提供される。いくつかの実施形態では、加齢黄斑変性症、自己免疫疾患、血液疾患、感染症、敗血症、炎症性疾患、または神経変性疾患を治療するための本明細書に記載のアプタマーの使用が提供される。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、エリテマトーデス及び関節リウマチから選択される。いくつかの実施形態では、血液疾患は、発作性夜間血色素尿症である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、虚血／再灌流傷害、関節炎、及び腎炎から選択される。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、ハンチントン病及びパーキンソン病から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質の結合親和性を有するアプタマーを選択するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は以下を含む。（ａ）Ｃ３タンパク質と候補混合物を接触させることであって、候補混合物が、候補混合物の核酸の少なくとも１つ、またはそれぞれに含まれる１つ、いくつかまたはすべてのピリミジンがＣ―５修飾ピリミジンを含む修飾核酸を含み、（ｂ）遅いオフ速度の濃縮プロセスで候補混合物を露出することであって、候補混合物のその他の核酸に関連する標的分子からの遅いオフ速度を有する核酸がＣ３タンパク質に結合して、核酸−標的分子複合体を形成し、（ｃ）候補混合物からの遅いオフ速度の核酸を分離すること、及び（ｄ）遅いオフ速度を有するＣ３タンパク質に結合可能な核酸配列で濃縮された核酸の混合物を産生するために、遅いオフ速度の核酸を増幅することによって、Ｃ３タンパク質分子への遅いオフ速度のアプタマーが選択される。いくつかの実施形態では、候補混合物は、配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含む核酸を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、候補混合物は、配列５’−ＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３３）を含む核酸を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、候補混合物は、配列５’−ＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含む核酸を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｙは、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＲは、ＧまたはＡである。いくつかの実施形態では、各核酸は独立して、約２４〜約１００ヌクレオチドの長さ、または約３０〜約６０ヌクレオチドの長さ、または約２８〜約６０ヌクレオチドの長さ、または約４０〜約５０ヌクレオチドの長さ、または約２８ヌクレオチドの長さでも良い。いくつかの実施形態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−３、４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２、３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。いくつかの実施形態では、混合物の複数の核酸は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、混合物の複数の核酸は、Ｃ３スペーサー、ＨＥＧリンカーまたはＰＥＧリンカーを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ３のタンパク質は、ヒトＣ３タンパク質である。
【００３４】
本発明の前述及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面を参照しながら進める以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、（Ａ）２５個の独立して由来する活性パターン１アプタマー配列を示す。同一または同等の（５以下のヌクレオチド差異）アプタマーは、４０，０００を超える配列のラウンド９プールから配列決定された回数が表示される。パターン１の８４９１−３＿３の最も頻繁に配列決定されたアプタマーと同一のヌクレオチドが、各配列内で強調表示される。（Ｂ）アプタマーパターン１のヌクレオチド位置及びコンセンサス配列は、上の２つの列に示されている。列Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＰ（Ａはアデニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｇはグアニンであり、ＰはＮａｐｄＵである）は、これらのヌクレオチドが、コンセンサス配列を定義する２３ヌクレオチド位置の各々でアプタマーパターン１において観察される頻度を示す。コンセンサス配列では、複数のヌクレオチドのコンセンサスが、次の一文字コードで示されている。Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｍ＝ＰまたはＣ、Ｋ＝Ｃ、ＧまたはＰ、Ｌ＝ＡまたはＰ、Ｄ＝ＣまたはＡ、Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ。単一塩基の挿入は、位置８と９の間で可能である。この挿入は、０．１６の頻度で発生した。「挿入なし」頻度は０．８４だった。
【図２】タンパク質濃度（ｘ軸）の関数としてプロットする結合したＤＮＡ分子（ｙ軸）の画分のグラフ表示を示す。ヒトＣ３−タンパク質濃度は、１×１０−７Ｍから１×１０−１２Ｍまでの範囲にわたり、平衡結合定数（Ｋｄ）は、ｙ＝（最大−最小）（Ｐｔ）／（Ｋｄ＋Ｐｔ）＋最小を使用して計算した。アプタマー８４９１−９４＿３（配列番号：５）、８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）、及び８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）は、それぞれ、３．１３×１０−１１Ｍ、３．３４×１０−１１Ｍ及び５．４９×１０−１１ＭのＫｄでＣ３に結合する。
【図３】制御タンパク質のヒトＣ５濃度（ｘ軸）の関数としてプロットする結合したＤＮＡ分子（ｙ軸）の画分のグラフ表示を示す。Ｃ５タンパク質濃度は、１×１０−７Ｍから１×１０−１２Ｍの範囲にわたる。８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）または８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）は、ヒトＣ５タンパク質との識別可能な結合は検出されなかった。
【図４】パターン１の配列は、ヒト血清の抗体で覆われたヒツジ赤血球の補体媒介性溶血を阻害する。２５ｎＭのヒトＣ３−タンパク質及び指示されたアプタマーの１μＭを使用して、実施例３に記載したように実験を行った。各バーは、「阻害剤なしの制御」に関する２つの独立した実験の溶血パーセントの中央値を表示したものである。浸透溶解制御は、すべての赤血球が溶解されたときに４１２ｎｍでの吸光度の相対パーセントを示す。誤差バーは、２つの実験の範囲を示す。非結合アプタマーの８４９１−９４＿１４（配列番号：３５）、８４９１−９４＿１５（配列番号：３６）、８４９１−３９８＿３（配列番号：３０）及び８４９１−４０１＿３（配列番号：２９）は、２５％未満の溶解を阻害する。Ｃ３−タンパク質結合アプタマーの８４９１−３＿３（配列番号：４）、８４９１−９４＿３（配列番号：５）、８４９１−１８９＿３（配列番号：８）、８４９１−２８２＿３（配列番号：９）、８４９１−３８７＿３（配列番号：１６）、８４９１−３８８＿３（配列番号：１８）、８４９１−３８９＿３（配列番号：６）、８４９１−３９０＿３（配列番号：７）、８４９１−３９３＿３（配列番号：１４）、８４９１−３９４＿３（配列番号：１１）、８４９１−３９５＿３（配列番号：１０）、８４９１−３９６＿３（配列番号：１３）、８４９１−３９７＿３（配列番号：１２）、８４９１−３９９＿３（配列番号：２７）、８４９１−４００＿３（配列番号：２４）、８４９１−４０５＿３（配列番号：１７）、８４９１−４０６＿３（配列番号：１５）及び８４９１−４０９＿３（配列番号：２８）は、５０％超の溶解を阻害する。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、８４９１−９４＿３（配列番号：５）及びその誘導体によるヒト血清の抗体で覆われたヒツジ赤血球の補体媒介性溶血の阻害。図に示すように、ヒトＣ３−タンパク質の固定濃度（２０ｎＭ）を有するアプタマーの様々な濃度を使用して、実施例３に記載したように実験を行った。ＩＣ５０を決定するために、データを４パラメータ  ロジスティック方程式に当てはめる。パネル（Ａ）は、８４９１−９４＿３が、１４．８ｎＭのＩＣ５０で阻害することを示し、その一方で、８４９１−９４＿２６（配列番号：５４）、８４９１−９４＿２７（配列番号：５５）、８４９１−９４＿３０（配列番号：６０）、８４９１−９４＿３６（配列番号：６６）、８４９１＿９４＿３７（配列番号：６７）及び８４９１−９４＿４３（配列番号：７３）がそれぞれ、１５．１ｎＭ、２４．６ｎＭ、２０．９ｎＭ、２５．０ｎＭ、２４．７ｎｍ及び１９．２ｎＭのＩＣ５０値で阻害することを示す。パネル（Ｂ）は、アプタマー、８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）が、１７．１ｎＭのＩＣ５０で阻害することを示し、その一方で、アプタマー  ８４９１−９４＿９０（配列番号：１１８）、８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）及び８４９１−９４＿１００（配列番号：１２８）がそれぞれ、１８．９ｎＭ、１５．６ｎＭ、及び１９．７ｎＭのＩＣ５０値で阻害することを示す。
【図６】ザイモサンＡ誘発補体活性化後の８４９１−９４＿３（配列番号：５）、８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）及び８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）によるＣ３ａの放出（３４％の正常ヒト血清）の阻害。実施例４に記載したように実験を行った。８４９１−９４＿３（配列番号：５）、８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）及び８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）のそれぞれ、２μＭ、１．５μＭ、及び３μＭのＩＣ５０値を決定するためにデータを４パラメータ  ロジスティック方程式に当てはめる。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、アプタマーの８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）、８４９１−９４＿９０（配列番号：１１８）、８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）、８４９１−９４＿１００（配列番号：１２８）及び８４９１−９４＿１０２（配列番号：１３０）（２５０ｎＭ）は、実施例５に記載したように０．００２ｕｎｉｔｓ／μＬのＤＮアーゼＩ（Ａ）で指定された数時間、３７℃で消化され、消化産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。バンドはＳＹＢＲゴールドで可視化した。完全長（ＦＬ）アプタマー及びＮがヌクレオチドの数である選択された分子長マーカーのサイズを示す。（Ｂ）濃度測定によって測定される時間に対する各完全長アプタマー  バンド（ＳＯＭＡｍｅｒ）の残りのパーセント。接頭辞「ＯＨ」は、修飾されていない５’末端を示す。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、  アプタマーの８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）、８４９１−９４＿９０（配列番号：１１８）、８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）、８４９１−９４＿１００（配列番号：１２８）及び８４９１−９４＿１０２（配列番号：１３０）は、実施例５に記載したように０．０１４ｕｎｉｔｓ／μＬのＤＮアーゼＩＩで指定された数時間、３７℃で消化され、消化産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。消化産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。バンドはＳＹＢＲゴールドで可視化した。完全長（ＦＬ）アプタマー及びＮがヌクレオチドの数である選択された分子長マーカーのサイズを示す。（Ｂ）濃度測定によって測定される時間に対する各完全長アプタマー  バンド（ＳＯＭＡｍｅｒ）の残りのパーセント。接頭辞「ＯＨ」は、修飾されていない５’末端を示す。
【図９】実施例１５で説明するように、特定の例示的なＣ−５修飾ピリミジン（または５−ｄＵ修飾）を示す。たとえば、図１０に示すように、各修飾構造はｄＵに結合する。
【図１０】実施例の項で説明するように、特定のＣ−５ピリミジン及び骨格修飾を示す。
【図１１】遅いオフ速度のアプタマーなどのアプタマーに組み込み得る特定の例示的な修飾ピリミジン（またはＣ−５修飾ピリミジン）を示す。図１１は、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ’’’の定義を示す。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、（Ａ）ザイモサンＡ誘発補体活性化後のパターン１  ＳＯＭＡｍｅｒｓ８４９１−３＿３（配列番号：４）、８４９１−９４＿３（配列番号：５）、８４９１−１８９＿３（配列番号：８）、８４９１−３８７＿３（配列番号：１６）及び８４９１−３８９＿３（配列番号：６）による１０％正常ヒト血清のＣ３ａ放出の阻害。アプタマー濃度は２μＭで、実施例４に記載したように実験を行った。データは、阻害剤なしの制御から得られる信号のパーセントとして提示される。（Ｂ）８４９１−３＿３（配列番号：４）、（８４９１−９４＿３（配列番号：５）、８４９１−１８９＿３（配列番号：８）、８４９１−３８７＿３（配列番号：１６）及び８４９１−３８９＿３（配列番号：６）を実証する対照実験は、実質的にＣ３ａ放出のアッセイを妨害しない。データは、阻害剤なしの制御から得られる信号のパーセントとして提示される。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
Ｉ．用語及び方法
特に記載のない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４  （ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；  Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、１９９４  （ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；及びＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ及びＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、１９９５  （ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見られるものであっても良い。
【００３７】
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。
【００３８】
アプタマー：本明細書で使用する場合、用語のアプタマーは、標的分子に望ましい作用をもたらす天然には存在しない核酸を指す。望ましい作用としては、これらに限定されるものではないが、標的を結合させること、標的の活性を阻害すること、標的の活性を増強すること、標的の結合特性を変化させること（たとえば、リガンド、受容体、補因子などの標的の親和性を増減させることなど）、標的の処理を阻害すること（タンパク質標的のプロテアーゼ切断を阻害することなど）、標的の処理を増強すること（タンパク質標的のプロテアーゼ切断の速度または範囲を増加することなど）、及び標的と別の分子との間の反応を阻害または促進することを含む。アプタマーはまた、「核酸リガンド」と呼ばれることもある。いくつかの実施形態では、アプタマーはＳＯＭＡｍｅｒである。特に記載のない限り、本明細書で使用する場合、用語「アプタマー」は、アプタマー及びそれらの薬学的に許容可能な塩を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、標的分子に特異的に結合するものであり、標的分子は、ワトソン／クリック塩基対合または三重らせん形成とは独立した機構を介してアプタマーに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、アプタマーは、標的分子に結合される周知の生理学的機能を有する核酸ではない。いくつかの実施形態では、所定の標的に対するアプタマーは、以下の方法により、核酸の候補混合物から同定された核酸を含む。（ａ）標的と候補混合物を接触させることであって、候補混合物のその他の核酸に比べて標的に対して高い親和性を有する核酸を、候補混合物の残りから分けることができ、（ｂ）候補混合物の残りから高い親和性の核酸を分けること、及び（ｃ）高い親和性の核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得て、それにより、標的分子に対するアプタマーが同定される。親和性相互作用とは程度の問題だと認識されるが、本明細書中では、アプタマーのその標的に対する「特定の結合親和性」とは、通常、アプタマーがその標的に、混合物または試料のその他の非標的、成分に結合するよりも非常に高い程度の親和性で結合することを意味する。「アプタマー」または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つのタイプまたは種のコピーの組みである。アプタマーは、ヌクレオチドの任意の適切な数を含むことができる。「アプタマー」とは、２つ以上のそのような分子の組みを指す。異なるアプタマーはヌクレオチドの同一または異なる数のいずれかを有することができる。アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの両方、及びいずれかまたは両方の修飾された版を含み得て、一本鎖、二本鎖、または二本鎖領域もしくは三本鎖領域、または他の任意の三次元構造を含み得る。
【００４０】
生物活性：本明細書で使用する場合、生物活性という用語は、生理学的または病態生理学的プロセスに影響を及ぼす可能性がある、１つまたは複数の細胞間、細胞内または細胞外のプロセス（たとえば、細胞−細胞結合、リガンド受容体結合、細胞シグナリング、など）を指す。
【００４１】
Ｃ−５修飾ピリミジン：本明細書で使用する場合、Ｃ−５修飾ピリミジンは、Ｃ−５位での修飾ピリミジンを指す。Ｃ−５修飾ピリミジンの実施例には、米国特許第５，７１９，２７３号及び５，９４５，５２７号に記載のものを含む。Ｃ−５修飾ピリミジンの特定の非限定的な実施例は、本明細書に提供される。
【００４２】
Ｃ３アプタマー：本明細書で使用する場合、「Ｃ３アプタマー」は、Ｃ３−タンパク質に結合することができるアプタマーを指す。
【００４３】
Ｃ３−スペーサー：本明細書で使用する場合、「Ｃ３スペーサー」または「３炭素スペーサー」または「Ｃ３置換」は、ヌクレオチドと同じ距離に及ぶように設計された少なくとも３個の炭素を含むリンカーを指すが、リボース糖及びプリンまたはピリミジン塩基部分が欠損している。いくつかの実施形態では、Ｃ３スペーサーは、構造（ＣＨ２）３を有し、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドまたはその他の部分に共有結合されている。
【００４４】
補体系の成分：本明細書で使用する場合、補体系の成分は、補体経路において機能し、補体経路を開始、活性化、促進及び／または調節することができる１つまたは複数のタンパク質を指す。したがって、補体系の成分を含む試料を接触させた結果、補体系を阻害するかまたは実質的に阻害することができる試薬（たとえば、アプタマー）のコンテキストでは、試薬は、一例として、補体経路の１つまたは複数のタンパク質の活性、結合及び／または機能を相互作用、結合及び／または妨害し得る。
【００４５】
阻害：本明細書で使用する場合、阻害という用語は、標的が測定可能な活性量を失う範囲に標的の生物学的活性を低下させること、または標的がもはや測定可能な活性を有していない範囲に標的の安定性を減少させる及び／または標的の活性を減少させることを意味する。いくつかの実施形態では、そのような阻害は、他の部分を有する標的との相互作用に影響を及ぼす及び／または標的の処理に影響を及ぼすことによって発生し得る。本明細書に記載されているように、阻害され得る対象はＣ３である。
【００４６】
修飾：本明細書で使用する場合、用語「修飾」、「修飾した」、「修飾する」、及びそれらの任意の変形は、オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非天然の糖部分、少なくとも１つの非天然ヌクレオシド間結合、少なくとも１つの非天然ヌクレオチド塩基部分、及び／または（たとえば、３個の炭素スペーサーまたはヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）などの）オリゴヌクレオチドの天然には存在しない少なくとも１つの部分などの少なくとも１つの非天然の部分を含むことを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基の少なくとも１つ（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）が修飾ヌクレオチドである。いくつかのこのような実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在する塩基よりも疎水性である塩基部分を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、疎水性塩基部分を含む１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む場合、アプタマーは、主に疎水性相互作用を介して、タンパク質などの、アプタマーの標的に結合する。いくつかの実施形態では、そのような疎水性相互作用は、高結合効率で安定した共結晶複合体を生じる。Ｃ−５位の置換を持つピリミジンは、修飾ヌクレオチドの例である。修飾には、キャッピングなどの３’及び５’修飾も含めることができる。他の修飾には、天然に存在するヌクレオチドを１つまたは複数の類似体で置換したもの、ヌクレオチド間修飾で置換したものなど、たとえば、非荷電連結（たとえば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート、など）及び荷電連結（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、など）、インターカレーター（たとえば、アクリジン、ソラレン、など）、キレート剤（たとえば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属、など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾連結（たとえば、アルファ−アノマー核酸、など）を含むことができる。さらに、ヌクレオチドの糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、ホスホン酸基またはリン酸基で置換されていても、標準的な保護基で保護されていても、または追加のヌクレオチドまたは固体支持体に追加の結合を調製するように活性化されていても良い。５’及び３’末端のＯＨ基は、リン酸化することも、またはアミン類、約１〜約２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分、いくつかの実施形態では、約１０〜約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、いくつかの実施形態では、約２０〜約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、またはその他の親水性または疎水性の生体ポリマーまたは合成ポリマーで置換することができる。一実施形態では、修飾は、ピリミジンのＣ−５位である。これらの修飾は、直接Ｃ−５位で、または結合のその他の種類によって、アミド結合を介して製造することができる。
【００４７】
ポリヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖の類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリル酸類似体及びメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含む、当該分野において一般的に知られているリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態も含むことができる。上述のように、１つまたは複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えても良い。これらの代替の連結基は、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置換されており、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈまたは、必要に応じてエーテル（−Ｏ−）結合、アリル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルを含む、置換もしくは非置換アルキル（１−２０Ｃ）である実施形態を含む。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。類似形態の糖、プリン、及びピリミジンの置換は、たとえば、ポリアミド骨格のような別の骨格構造をとることができるため、最終産物の設計の点で有利になる場合がある。
【００４８】
調節：本明細書で使用する場合、「調節する」は、増加または減少させることによって、標的のレベル、安定性、処理、及び／または活性を変化させることを意味する。
【００４９】
核酸：本明細書で使用する場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、ヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド、及びそのようなエンティティの修飾された版を含む。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」は、二本鎖分子または一本鎖分子、ならびに三重らせん分子を含む。核酸という用語は、アプタマーを含むが、これに限定されない（すなわち、この用語は、ヌクレオチドのその他のポリマーを含む）。
【００５０】
ヌクレアーゼ：本明細書で使用する場合、用語「ヌクレアーゼ」は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を意味する。本明細書で使用する場合、用語「エンドヌクレアーゼ」は、オリゴヌクレオチドの内部部位でホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。本明細書で使用する場合、用語「エキソヌクレアーゼ」は、オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドを連結しているホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。生体液は、典型的には、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの両方の混合物を含む。
【００５１】
ヌクレアーゼ耐性：本明細書で使用する場合、用語「ヌクレアーゼ耐性」及び「ヌクレアーゼ耐性」は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの基質として機能するオリゴヌクレオチドの能力の低下を指す。そのため、そのような酵素と接触した場合、オリゴヌクレオチドは、分解されないかまたは類似の長さ及び配列だが、ヌクレアーゼ耐性を測定している１つまたは複数のオリゴヌクレオチドの修飾を欠損している対照オリゴヌクレオチドよりもゆっくりもしくはより少ない範囲で分解される。
【００５２】
ヌクレオチド：本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはその修飾形態を指す。ヌクレオチドは、プリン（たとえば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、など）、ならびにピリミジン（たとえば、シトシン、ウラシル、チミンなど）を含む種を含む。塩基が「Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｕ」、または「Ｔ」として示されている場合は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの両方を包含することを意図し、その形態が修飾される。
【００５３】
薬学的に許容可能：本明細書で使用する場合、薬学的に許容可能とは、動物に、より具体的にはヒトに使用することが、連邦または州政府の規制当局によって認可されているか、または米国薬局方またはその他の一般的に知られている薬局方で認められていることを意味する。
【００５４】
薬学的に許容可能な塩：本明細書で使用する場合、薬学的に許容可能な塩（たとえば、アプタマー）は、化合物及びイオン結合を介して化合物に結合した１つまたは複数の追加の薬学的に許容可能な原子または基を含む産物を意味する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な塩は、酸または塩基と化合物を接触させることによって生産される。薬学的に許容可能な塩は、これらに限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、及び酒石酸塩を含む酸付加塩、及びＬｉ、Ｎａ、Ｋ、ＭｇまたはＣａなどのアルカリ土類金属塩などのアルカリ金属カチオン、または有機アミン塩などを含む。特に記載のない限り、本明細書で使用する場合、用語「アプタマー」は、アプタマー及びそれらの薬学的に許容可能な塩を含む。
【００５５】
医薬組成物：本明細書で使用する場合、医薬組成物は、個体への投与に適した形態の化合物（アプタマーなど）を含む製剤を意味する。医薬組成物は、典型的には、その意図される投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、これらに限定されないが、たとえば、皮下注射または注入、静脈内注射または注入、関節内注射、動脈内注射及びび注入、房水内注射及び移植、及び硝子体内注射及び注入を含む、硝子体内、経腸及び非経口が含まれる。
【００５６】
タンパク質：本明細書で使用する場合、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「ペプチド断片」と同じ意味で使用される。「精製した」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、細胞物質、または精製したタンパク質を得た細胞、組織、もしくは無細胞供給源に由来する他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成する場合には、化学的な前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
【００５７】
ＳＥＬＥＸ：本明細書で使用する場合、ＳＥＬＥＸという用語は、通常、望ましい方法、たとえば、タンパク質と高親和性で結合する方法で、標的分子と相互作用する核酸の選択し、選択した核酸の増幅を指す。ＳＥＬＥＸは、特定の標的分子に対して高い親和性を有するアプタマーを同定しても良い。ＳＥＬＥＸ及び「ＳＥＬＥＸプロセス」という用語は、交換可能に使用されても良い。いくつかの実施形態では、標的分子に結合するアプタマーを選択する以下の方法を提供する。（ａ）核酸の候補混合物を調製することであって、候補混合物は、候補混合物の核酸の少なくとも１つ、またはそれぞれの少なくとも一つのピリミジンがＣ５位で化学的に修飾されている修飾された核酸を含み、（ｂ）標的分子と候補混合物を接触させることであって、候補混合物のその他の核酸と比べて標的分子に対して高い親和性を有する核酸が、標的分子に結合して、核酸−標的分子複合体を形成し、（ｃ）候補混合物の残りから高い親和性の核酸を分けること、及び（ｄ）高い親和性の核酸を増幅して、高い親和性で標的分子と結合することが可能な核酸配列に富んだ核酸混合物を得て、それにより、標的分子に対するアプタマーが同定される。特定の実施形態では、方法は、遅いオフ速度の濃縮プロセスを実行することをさらに含む。
【００５８】
配列同一性：本明細書で使用する場合、配列同一性は、２つ以上の核酸配列のコンテキストでは、配列によって共有される同一のヌクレオチド位置の数（すなわち、％同一性＝同一位置の数／比較された２つの配列のより短い位置の総数×１００）、ギャップの数、及び２つ以上の配列のアライメントを最適化するために導入する必要のあるそれぞれのギャップの長さを考慮する。配列の比較及び２つ以上の配列間の同一性パーセントの決定は、デフォルトのパラメータでのＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムなどの、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる（たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３、１９９０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴでＢＬＡＳＴＮも参照のこと）。配列比較のために、典型的には１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要であればサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズム  プログラム  パラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラム  パラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の最適整列は、たとえば、ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２、１９８１、ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｏｆ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３、１９７０、ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４、１９８８、ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  （ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、またはｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  （ｓｅｅ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｕｂ．  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ−  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７））により、実施することができる。本明細書で使用する場合、そのようなアプタマーなどの核酸のパーセント同一性を記述するときには、少なくとも、たとえば、参照ヌクレオチド配列に対して約９５％同一であるということは、その核酸配列が、参照核酸配列の１００個のヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得るということを除いて、参照配列と同一であるということを意図している。言い換えると、参照核酸配列と少なくとも約９５％同一の所望の核酸配列を得るためには、参照配列のヌクレオチドの５％までを欠損させても良いか、または別のヌクレオ��ドで置換しても良いか、あるいは参照配列のヌクレオチドの総数の５％までの数個のヌクレオチドを参照配列に挿入しても良いことを意図している（本明細書では挿入と呼ぶ）。所望の配列を生成する参照配列のこのような突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端で発生するか、またはそれらの末端位置の間のどこで生じても良く、参照配列のヌクレオチド間に個々に点在しても、または参照配列内の１つまたは複数の連続した基に点在しても良い。
【００５９】
ＳＯＭＡｍｅｒ：本明細書で使用する場合、「ＳＯＭＡｍｅｒ」または遅いオフ速度の修飾アプタマーは、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフ速度（ｔ１／２）のアプタマーを指す（疎水性修飾を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含むアプタマーを含む）。いくつかの実施形態では、「向上したオフ速度を有するアプタマーを生成するための方法」という名称の米国特許第７，９４７，４４７号に記載されている、向上したＳＥＬＥＸ法を使用してＳＯＭＡｍｅｒを生成する。
【００６０】
スペーサー：本明細書で使用する場合、スペーサーは、修飾オリゴヌクレオチドの一部を形成し、典型的には修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオシドに代わる非ヌクレオシド小分子を指す。例示的なスペーサー配列は、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、炭化水素鎖（３炭素スペーサーなど）、及びその他のポリマーまたはコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、アプタマーの活性を維持しながら、アプタマーの（２コンセンサスまたは保存領域などの）２つの領域を結合する共有結合性分子足場を提供する。特定の態様では、スペーサー配列は、ヌクレオチドの（修飾された糖部分を含む）糖部分の３’または５’位を介して隣接するヌクレオチドに共有結合しても良い。
【００６１】
実質的に阻害する：本明細書で使用する場合、実質的に阻害するとは、完全または部分的なブロック、たとえば、活性または制御に対する効果のあらゆる測定可能な減少または少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または９０％の阻害または減少を指す。いくつかの実施形態では、（標的の切断などの）標的または標的に対する効果の活性の阻害は、アプタマーの存在下で測定され、制御はアプタマーの非存在下で実質的に同様の条件である。いくつかの実施形態では、測定される活性は、補体系の活性である。当業者は、補体系の活性レベル、すなわち阻害を測定するために使用することができる異なるアッセイ及び方法を理解することができる。補体系の阻害の程度を決定するために使用することができる例示的な方法は、実施例３に詳細に記載されている補体媒介性溶血のための任意のアッセイを含む。別の例示的な方法は、実施例４に詳細に記載されるようにＣ３ａ及びＣ３ｂへのＣ３−タンパク質のタンパク質分解による切断の程度を測定することを含む。
【００６２】
標的分子：本明細書で使用する場合、標的分子（または標的）は、アプタマーが望ましい様式で作用することができるポリヌクレオチド以外の三次元化学構造を有する任意の化合物または分子を意味する。標的分子の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織、前述のいずれかの任意の部分または断片、などがある。実質的に任意の化学的または生物学的エフェクターは、適切な標的であり得る。どのような大きさの分子も標的となり得る。標的は、標的と核酸との間の相互作用の可能性または強度を高めるために特定の方法で変更することができる。標的は、特定の化合物または分子に任意のわずかな変異を含んでも良い。たとえば、タンパク質の場合では、たとえば、アミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または、分子の同一性に実質的な変化を及ぼさない、標識成分との結合を含む、任意のその他の操作または修飾などに、わずかな変異を含んでも良い。「標的分子」または「標的」は、アプタマーに結合することができる分子または多分子構造の１つの型または１つの種のコピーの組みである。「標的分子」または「標的」とは、２つ以上の分子のそのような組みを指す。
【００６３】
治療有効量：本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、一般に、本明細書に記載されるように、予防、軽減、または治療される疾患または状態の少なくとも１つの症状を改善するのに必要な量を意味する。本開示のアプタマーに関連する語句「治療有効量」は、アプタマーが、そのような治療を必要とする相当数の個体に投与される特定の薬理学的応答を提供するアプタマーの投与量を意味する。特定の固体に投与される薬物の治療的有効量は、たとえこのような投与量が当業者によって治療的有効量と見なされる場合であっても、本明細書に記載される状態／疾患を治療する際に常に有効であるとは限らないことが強調される。
【００６４】
単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から、そうでないことが明らかにでない限り、複数の対象を含む。「Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ」は、Ａ、またはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられたすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及びすべての分子量または分子質量値は概算であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。
【００６５】
さらに、本明細書に提供される範囲は、範囲内のすべての値の省略表現であることが理解される。たとえば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０（及び文脈から、そうでないことが明らかでない限り、その分数）からなる群から任意の数字、数字の組み合わせ、または副範囲を含むと理解される。任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲または整数範囲は、特に明記しない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を含み、必要に応じて、その分数（整数の１／１０及び１／１００など）を含むものと理解される。また、ポリマーのサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的性質に関係する、本明細書で列挙される任意の数字範囲は、特に明記しない限り、列挙される範囲内の任意の整数を含むものと理解される。本明細書で使用する場合、「約」または「から本質的になる」は、特に明記しない限り、指定の範囲、値又は構造の±２０％を意味する。本明細書で使用される、用語「ｉｎｃｌｕｄｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」は、同義的に使用される。本明細書で使用される、用語「ａ」及び「ａｎ」は、列挙される要素の「１以上」を指すことを理解されたい。選択肢（たとえば、「ｏｒ」）の使用は、選択肢の１つ、両方またはその任意の組み合わせのいずれかを意味することを理解されたい。
【００６６】
本明細書で記載したものと類似または同等の方法及び材料を、本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が基準となる。さらに、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【００６７】
ＩＩ．概要
本発明は、具体的にはＣ３タンパク質（「Ｃ３アプタマー」ということがある）に結合するアプタマーを提供する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、Ｃ３タンパク質の切断を阻害する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５２）を含む。式中、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり、Ｍは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、各Ｄは、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、各Ｖは、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、Ｌは、Ａ、Ｕ、ＴまたはＣ−５修飾ピリミジンであり、ＷはＧまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、Ｙは、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びｎは０または１である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰＭ−３’（配列番号：１５３）を含む。式中、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３１）を含む。式中、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり、Ｍは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、各Ｄは、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、各Ｖは、各出現において、それぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、Ｌは、Ａ、Ｕ、ＴまたはＣ−５修飾ピリミジンであり、ＷはＧまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、及びｎは０または１である。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＤＶＤｎＬＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰＭ−３’（配列番号：１３５）を含む。式中、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５４）を含む。式中、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり、Ｍは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、Ｖは、Ａ、Ｇ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、ＷはＧまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、Ｙは、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＸは、置換または非置換のＣ２−Ｃ２０リンカー、アルキレングリコール、ポリアルキレングリコールから選択されるリンカーである。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰＭ−３’（配列番号：１５５）を含む。式中、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３６）を含む。式中、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、または３炭素スペーサーであり、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり、Ｍは、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーであり、Ｖは、Ａ、Ｇ、Ｃ、または３炭素スペーサーであり、ＷはＧまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、及びＸは、置換または非置換のＣ２−Ｃ２０リンカー、アルキレングリコール、ポリアルキレングリコールから選択されるリンカーである。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＫＰＧＲＭＰＸＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰＭ−３’（配列番号：１３７）を含む。式中、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ、Ｕ、Ｔ、Ｃ−５修飾ピリミジン、または３炭素スペーサーである。
【００７２】
上述した実施形態のいずれにおいても、Ｋは、Ｃ−５修飾ピリミジン、ＣまたはＧであっても良く、各Ｍは、各出現において、それぞれ独立して、ＣまたはＣ−５修飾ピリミジンであっても良く、及び／またはＬは、ＡまたはＣ−５修飾ピリミジンであっても良い。
【００７３】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列５’−ＰＡＷＰＳＶＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｗは、Ｇまたは３炭素スペーサーであり、Ｓは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、ＹはＣ、ＵまたはＴであり、及びＲはＧまたはＡである。
【００７４】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列５’−ＰＡＷＰＳＶＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３４）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｗは、Ｇまたは３炭素スペーサーであり、及びＳは、Ｃまたは３炭素スペーサーであり、ＶはＡ、ＧまたはＣである。
【００７５】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列番号：４〜１３０及び１３８〜１５１から選択される、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ここで、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、各ＰはＮａｐｄＵである。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列番号：４〜２８、３２〜３４、３７〜７５、７８〜１１８、１２１〜１３０、及び１３９〜１５１から選択される、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。ここで、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、各ＰはＮａｐｄＵである。
【００７６】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、第１の領域及び第２の領域を含み、第１の領域は、配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含み、第２の領域は、配列５’−ＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｙは、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＲはＧまたはＡである。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、第１の領域及び第２の領域を含み、第１の領域は、配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含み、第２の領域は、配列５’−ＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３３）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、第１の領域の３’末端は、第２の領域の５’末端に共有連結されている。いくつかの実施形態では、第１領域及び第２領域は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのリンカーによって共有連結されており、各リンカーは、ヌクレオチド、置換または非置換のＣ２−Ｃ２０リンカーアルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各リンカーは、ヌクレオチド、３炭素スペーサー、及びヘキサエチレングリコールから独立して選択される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列５’−ＰＡＧＰＣ−３’（配列番号：１３２）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列５’−ＧＰＡＣＧＰＰ−３’（配列番号：１３３）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列５’−ＧＰＡＹＲＰＰ−３’（配列番号：１５６）を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンであり、Ｙは、Ｃ、Ｕ、またはＴであり、及びＲはＧまたはＡである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、Ｃ３タンパク質に結合するアプタマーが提供され、そのアプタマーは、配列番号：１２５の配列を含む。式中、各Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。いくつかの実施形態では、各ＰはＮａｐｄＵである。
【００８０】
本明細書に記載のアプタマーのいくつかの実施形態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−３、４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２、３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。
【００８１】
本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００８２】
本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、約２４〜約１００ヌクレオチドの長さ、または約３０〜約６０ヌクレオチドの長さ、または約２８〜約６０ヌクレオチドの長さ、または約４０〜約５０ヌクレオチドの長さ、または約２８ヌクレオチドの長さでも良い。本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、２４〜１００ヌクレオチドの長さ、または３０〜６０ヌクレオチドの長さ、または長さ２８〜６０ヌクレオチドの長さ、または２８〜５０ヌクレオチドの長さ、または２８〜４０ヌクレオチドの長さ、または４０〜５０ヌクレオチドの長さ、または２８〜３２ヌクレオチドの長さでも良い。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアプタマーは、Ｃ３タンパク質に結合し、Ｃ３タンパク質の切断を阻害する。いくつかの実施形態では、Ｃ３のタンパク質は、ヒトＣ３タンパク質である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約１００ヌクレオチドまで、約９５ヌクレオチドまで、約９０ヌクレオチドまで、約８５ヌクレオチドまで、約８０ヌクレオチドまで、約７５ヌクレオチドまで、約７０ヌクレオチドまで、約６５ヌクレオチドまで、約６０ヌクレオチドまで、約５５ヌクレオチドまで、約５０ヌクレオチドまで、約４５ヌクレオチドまで、約４０ヌクレオチドまで、約３５ヌクレオチドまで、約３０ヌクレオチドまで、最高約２５ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチドまでを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃ３アプタマーは、１００ヌクレオチドまで、９５ヌクレオチドまで、９０ヌクレオチドまで、８５ヌクレオチドまで、８０ヌクレオチドまで、７５ヌクレオチドまで、７０ヌクレオチドまで、６５ヌクレオチドまで、６０ヌクレオチドまで、５５ヌクレオチドまで、５０ヌクレオチドまで、４５ヌクレオチドまで、４０ヌクレオチドまで、３５ヌクレオチドまで、３０ヌクレオチドまで、２５ヌクレオチドまで、または２０ヌクレオチドまでからなり得る。
【００８５】
本開示の別の態様では、Ｃ３アプタマーは、配列番号：４〜１５１のいずれかと、少なくとも９９％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも７５％同一であっても良い。本開示の別の態様では、Ｃ３アプタマーは、配列番号：４〜２８、３２〜３４、３７〜７５、７８〜１１８、１２１〜１３０、及び１３９〜１５１のいずれかと、少なくとも９５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも８５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも７５％同一であっても良い。いくつかの実施形態では、Ｃ３に結合するアプタマーは、配列番号：４〜２８、３２〜３４、３７〜７５、７８〜１１８、１２１〜１３０、及び１３９〜１５１から選択される配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。関連する態様では、その断片は、２５〜４９ヌクレオチドの長さである（すなわち、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９のヌクレオチドの長さから２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチドの長さまで）。いくつかの実施形態では、Ｃ３に結合するアプタマーは、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチドの長さである。
【００８６】
本開示の別の態様では、Ｃ３アプタマーは、約１０ｎＭ以下のＣ３の解離定数（Ｋｄ）を有しても良い。別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約１５ｎＭ以下のＣ３の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約２０ｎＭ以下のＣ３の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約２５ｎＭ以下のＣ３の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約３０ｎＭ以下のＣ３の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約３５ｎＭ以下のＣ３の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約４０ｎＭ以下のＣ３の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約４５ｎＭ以下のＣ３の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約５０ｎＭ以下のＣ３の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、約２ｐＭ〜約１０ｎＭの範囲（すなわち、２ｐＭ、３ｐＭ、４ｐＭ、５ｐＭ、６ｐＭ、７ｐＭ、８ｐＭ、９ｐＭ、１０ｐＭ、１５ｐＭ、２０ｐＭ、２５ｐＭ、３０ｐＭ、３５ｐＭ、４０ｐＭ、４５ｐＭ、５０ｐＭ、６０ｐＭ、７０ｐＭ、８０ｐＭ、９０ｐＭ、１００ｐＭ、１５０ｐＭ、２００ｐＭ、２５０ｐＭ、３００ｐＭ、３５０ｐＭ、４００ｐＭ、４５０ｐＭ、５００ｐＭ、５５０ｐＭ、６００ｐＭ、６５０ｐＭ、７００ｐＭ、７５０ｐＭ、８００ｐＭ、８５０ｐＭ、９００ｐＭ、９５０ｐＭ、１０００ｐＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、または１０ｎＭ）のＣ３タンパク質の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的な実施形態では、Ｃ３アプタマーは、少なくとも２ｐＭの範囲（すなわち、少なくとも２ｐＭ、３ｐＭ、４ｐＭ、５ｐＭ、６ｐＭ、７ｐＭ、８ｐＭ、９ｐＭ、１０ｐＭ、１５ｐＭ、２０ｐＭ、２５ｐＭ、３０ｐＭ、３５ｐＭ、４０ｐＭ、４５ｐＭ、５０ｐＭ、６０ｐＭ、７０ｐＭ、８０ｐＭ、９０ｐＭ、１００ｐＭ、１５０ｐＭ、２００ｐＭ、２５０ｐＭ、３００ｐＭ、３５０ｐＭ、４００ｐＭ、４５０ｐＭ、５００ｐＭ、５５０ｐＭ、６００ｐＭ、６５０ｐＭ、７００ｐＭ、７５０ｐＭ、８００ｐＭ、８５０ｐＭ、９００ｐＭ、９５０ｐＭ、１０００ｐＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、または１０ｎＭ）のＣ３タンパク質の解離定数（Ｋｄ）を有する。実施例２に記載したように、適切な解離定数は、多点での力価測定を使用して結合アッセイを行い、式：ｙ＝（最大−最小）（タンパク質）／（Ｋｄ＋タンパク質）＋最小にフィッティングすることで決定することができる。解離定数の決定は、それらが測定される条件に大きく依存し、したがって、これらの数値は、平衡時間などの要因に関連して著しく変化しても良いことが理解されるべきである。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、アプタマー、核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせのヌクレオチドを含む。
【００８７】
ＳＥＬＥＸ
ＳＥＬＥＸには通常、核酸の候補混合物を調製すること、候補混合物を所望の標的分子に結合させて親和性複合体を形成させること、親和性複合体を結合しなかった候補核酸から分離すること、親和性複合体から核酸を分離・単離すること、核酸を精製すること、及び特定のアプタマー配列を同定すること、が含まれる。プロセスは、選択されたアプタマーの親和性をさらに向上するために複数のラウンドを含んでも良い。プロセスは、プロセス内の１つまたは複数のポイントで増幅ステップを含むことができる。たとえば、「核酸リガンド」という名称の、米国特許第５，４７５，０９６号を参照のこと。ＳＥＬＥＸプロセスは、標的と共有結合するアプタマー、ならびに標的と非共有結合するアプタマーを生成するために使用することができる。たとえば、「指数濃縮によるリガンドの体系的進化：ケミセレックス」という名称の、米国特許第５，７０５，３３７号を参照のこと。
【００８８】
ＳＥＬＥＸプロセスは、アプタマーの改善された特性、たとえば、改善されたインビボでの安定性または改善された送達特性などの特性を付与する修飾ヌクレオチドを含む、高親和性アプタマーを同定するために使用することができる。このような修飾の例には、リボース及び／またはリン酸及び／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸプロセスによって同定された、修飾ヌクレオチドを含むアプタマーについては「修飾されたヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド」という名称の米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、ここでは、ピリミジンの５’位及び２’位を化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが説明されている。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）では、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２）−２’−デ−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾したヌクレオチドを１つまたは複数含む、高度に特異的なアプタマーが説明されている。「ＳＥＬＥＸ及びＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」という名称の米国特許公開公報第２００９００９８５４９号も参照のこと。ここでは、多様な物理的及び化学的特性を有する核酸ライブラリー及びそれらのＳＥＬＥＸ及びｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸの使用が記載されている。
【００８９】
ＳＥＬＥＸは、所望のオフ速度特性を有するアプタマーを同定することに使用することもできる。標的分子に結合することができるアプタマーを生成するための改善されたＳＥＬＥＸ法を記載した、「向上したオフ速度を有するアプタマーを生成するための方法」という名称の米国特許出願公開第２００９０００４６６７号を参照のこと。前述したように、これらのオフ速度のアプタマーは、「ＳＯＭＡｍｅｒｓ」として知られている。それぞれの標的分子からの解離のより遅い速度を有するアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓ及び光アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓを製造するための方法が記載されている。この方法は、候補混合物と標的分子を接触させて、核酸−標的複合体の形成を可能にすること、及び遅いオフ速度の濃縮プロセスを実施することを含み、この遅いオフ速度の濃縮プロセスでは、速い解離速度を有する核酸−標的複合体は解離し、かつ、再形成されないが、遅い解離速度を有する複合体は完全な状態で維持される。さらに、この方法は、改善されたオフ速度性能を有するアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓを生成するための候補核酸混合物の製造における修飾ヌクレオチドの使用を含む。
【００９０】
このアッセイの変形は、それらの標的分子に対して共有結合または「光架橋」するアプタマーを有効にする光反応性官能基を含むアプタマーを使用する。たとえば、「診断用核酸リガンド  バイオチップ」という名称の米国特許第６，５４４，７７６号を参照のこと。これらの光反応性アプタマーは、光アプタマーとも呼ばれる。たとえば、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ及びＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ」と名称の米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７、及び米国特許第６，２９１，１８４号のそれぞれを参照のこと。また、たとえば、「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」という名称の米国特許第６，４５８，５３９号も参照のこと。マイクロアレイを試料と接触させ、光アプタマーがその標的分子と結合する機会を得た後、光アプタマーを光活性化し、固体支持体を洗浄して、いかなる非特異的結合分子も除去する。光アプタマーに結合した標的分子は、光アプタマー上の光活性化された官能基数によって生成される共有結合のために、一般的に、除去されないため、激しい洗浄条件を使用しても良い。
【００９１】
これらのアッセイ形式のどちらでも、試料と接触させる前に、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを固体支持体上に固定する。しかし、特定の状況下では、試料と接触させる前のアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの固定は、最適なアッセイを提供しない可能性もある。たとえば、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを予め固定した結果、固体支持体表面上で、ターゲット分子とアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒが不十分にしか混合されず、これがおそらく長い反応時間につながり、したがって、標的分子に対するアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの効率的な結合を可能にするためには、長時間のインキュベーション期間を要することになり得る。さらに、光アプタマーまたは光ＳＯＭＡｍｅｒがアッセイに使用され、固体支持体として利用する物質に依存しているとき、固体支持体は、光アプタマーまたは光ＳＯＭＡｍｅｒとその標的分子間に共有結合を形成するため使用される光を散乱または吸収する傾向があり得る。さらに、固体支持体の表面もまた、使用される任意の標識化剤に曝露されて影響を受け得るので、使用する方法によって、それらのアプタマーまたは光ＳＯＭＡｍｅｒｓに結合した標的分子の検出は不正確になる可能性がある。最後に、固体支持体上のアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの固定は、一般的に、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを試料に曝露する前に、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを調製する工程（たとえば、固定）を含み、この調製工程はアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの活性または機能に影響を与え得る。
【００９２】
ＳＯＭＡｍｅｒが溶液中の標的を捕捉することを可能にし、次いで、検出に先立ってＳＯＭＡｍｅｒ−標的混合物の特定の成分を除去するように設計される工程を使用するＳＯＭＡｍｅｒアッセイもまた記載されている（「試験試料の多重分析」という名称の米国特許出願公開第２００９００４２２０６号を参照のこと）。記載されるＳＯＭＡｍｅｒアッセイ法は、核酸（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒ）を検出及び定量化することによって、試験試料の非核酸標的（たとえば、タンパク質標的）の検出及び定量化を可能にする。記載される方法は、非核酸標的を検出及び定量化するための核酸代用物（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒ）を作製する。そのため、増幅を含む、多種多様な核酸技術を、タンパク質標的を含む、所望の標的のより広い範囲に適用することが可能になる。
【００９３】
標的がペプチドであるＳＥＬＥＸプロセスの実施形態は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」とう名称の米国特許第６，３７６，１９０号に記載されている。本件では、標的は、Ｃ３−タンパク質である。
【００９４】
補体成分３（Ｃ３）タンパク質
ＳＥＬＥＸプロセスで使用する天然ヒト循環Ｃ３−タンパク質は、血液から精製し、Ｑｕｉｄｅｌ（登録商標）社、サンディエゴ、カリフォルニア州（カタログ番号Ａ４０１）から入手した。Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、タイラー、テキサス州（カタログ番号Ａ１１３）から得られた循環ヒトＣ３−タンパク質と同様にＱｕｉｄｅｌからの循環天然Ｃ３−タンパク質は結合及び活性の研究のために使用される。
【００９５】
アプタマーの化学修飾
アプタマーは、その性質及び特性を改善する修飾ヌクレオチドを含んでいても良い。そのような改善の非限定的な例には、インビボ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び／または改善された送達特性が含まれる。
【００９６】
このような修飾の例には、リボース及び／またはリン酸及び／またはヌクレオチドの塩基の位置における化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸプロセスによって同定された、修飾ヌクレオチドを含むアプタマーについては「修飾されたヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド」という名称の米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、ここでは、ピリミジンの５’位及び２’位を化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが説明されている。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）では、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾したヌクレオチドを１つまたは複数含む、高度に特異的なアプタマーが説明されている。「ＳＥＬＥＸ及びＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」という名称の米国特許公開公報第２００９００９８５４９号も参照のこと。ここでは、多様な物理的及び化学的特性を有する核酸ライブラリー及びそれらのＳＥＬＥＸ及びｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸの使用が記載されている。
【００９７】
Ｃ−５修飾の特定の例には、Ｃ−５位に下記から独立して選択された置換基を有するデオキシウリジンの置換が含まれる。下記に示すように、ベンジルカルボキサミド（あるいは、ベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキサミド（あるいは、ナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキサミド（あるいは、トリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、及びイソブチルカルボキサミド（あるいは、イソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）である。
【化１】
2017517261.tif 000002
【００９８】
Ｃ−５修飾ピリミジンの化学修飾は、単独または任意の組み合わせ、２）−２’−デ−位の糖修飾、環外アミンでの修飾、及び４−チオウリジンの置換などと組み合わせることもできる。
【００９９】
代表的なＣ−５修飾ピリミジンには、下記のものが含まれる。５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジンまたは５−（Ｎ−［１−（２、３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン）。
【０１００】
いくつかの実施形態では、各Ｘ、Ｙ、及び／またはＺは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＰeｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２、３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジンから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｚは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。
【０１０１】
存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの組み立て前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって中断される可能性がある。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などによって、重合後にさらに修飾することができる。
【０１０２】
さらに、Ｃ−５修飾ピリミジンヌクレオチドには、次のものが含まれる。
【化２】
2017517261.tif 000003
【０１０３】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。Ｃ−５位の置換を持つピリミジンは、修飾ヌクレオチドの例である。修飾は、骨格修飾、メチル化、ならびにイソ塩基類、イソシチジン及びイソグアニジンなどの異常塩基対合の組み合わせを含むことができる。修飾には、キャッピングなどの３）−２’−デ及び５）−２’−デ修飾も含めることができる。他の修飾には、天然に存在するヌクレオチドを１つまたは複数の類似体で置換したもの、ヌクレオチド間修飾で置換したものなど、たとえば、非荷電連結（たとえば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート、など）及び荷電連結（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、など）、インターカレーター（たとえば、アクリジン、ソラレン、など）、キレート剤（たとえば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属、など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾連結（たとえば、アルファ−アノマー核酸、など）を含むことができる。さらに、ヌクレオチドの糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、ホスホン酸基またはリン酸基で置換されていても、標準的な保護基で保護されていても、または追加のヌクレオチドまたは固体支持体に追加の結合を調製するように活性化されていても良い。５）−２’−デ及び３）−２’−デ末端のＯＨ基は、リン酸化することも、またはアミン類、約１〜約２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分、一実施形態では、約１０〜約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、別の実施形態では、約２０〜約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、またはその他の親水性または疎水性の生体ポリマーまたは合成ポリマーで置換することができる。一実施形態では、修飾は、ピリミジンのＣ−５位である。これらの修飾は、直接Ｃ−５位で、または結合のその他の種類によって、アミド結合を介して製造することができる。
【０１０４】
ポリヌクレオチドは、２）−２’−デ−Ｏ−メチル−、２）−２’−デ−Ｏ−アリル、２）−２’−デ−フルオロ−または２）−２’−デ−アジド−リボース、炭素環糖の類似体、a−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリル酸類似体及びメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含む、当該分野において一般的に知られているリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態も含むことができる。上述のように、１つまたは複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えても良い。これらの代替の連結基は、リン酸塩がＰ（０）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（０）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（０）Ｒ、Ｐ（０）ＯＲ）−２’−デ、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置換されており、各ＲまたはＲ）−２’−デは、独立して、Ｈまたは、必要に応じてエーテル（−０−）結合、アリル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルを含む、置換もしくは非置換アルキル（１−２０Ｃ）である実施形態を含む。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。類似形態の糖、プリン、及びピリミジンの置換は、たとえば、ポリアミド骨格のような別の骨格構造をとることができるため、最終産物の設計の点で有利になる場合がある。
【０１０５】
本発明は、配列番号：４〜１３０及び１３８〜１５１からなる群から選択される２つ以上の核酸配列を含む製剤をさらに提供する。式中、Ｐは、各出現において、それぞれ独立して、Ｃ−５修飾ピリミジンである。
【０１０６】
別の様態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−３、４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−Ｒ−トレオニニルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプトアミノカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２、３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジンから独立して選択される。
【０１０７】
別の様態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジン、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−フルオロウリジンから独立して選択される。
【０１０８】
別の様態では、各Ｃ−５修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）である。
【０１０９】
別の態様では、製剤の２つ以上の核酸分子は、２）−２’−デ−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、Ｃ３スペーサー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の修飾をさらに含む。
【０１１０】
別の態様では、製剤の２つ以上の核酸分子は、ＨＥＧリンカーまたはＰＥＧリンカーで置換される少なくとも１つのヌクレオチド位置をさらに含み、及び／またはＨＥＧリンカーまたはＰＥＧリンカーをさらに含む。
【０１１１】
別の態様では、製剤の２つ以上の核酸分子は、それぞれ独立して、約２４〜約１００ヌクレオチドの長さ、または約３０〜約６０ヌクレオチドの長さ、または約４０〜約５０ヌクレオチドの長さであり、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の追加のヌクレオチドをさらに含む。
【０１１２】
別の様態では、補体成分３（Ｃ３）タンパク質は、ヒト補体成分３（Ｃ３）タンパク質である。
【０１１３】
アプタマーを含む医薬組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのアプタマー及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。好適な担体は、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓから出版されている「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  及びＰｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２１版」に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の少なくとも１つのアプタマー及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物は、Ｃ３の阻害剤ではない１つまたは複数の活性物質を含んでも良い。
【０１１４】
本明細書に記載のアプタマーを、薬学的に許容可能な剤形のいずれにおいて使用しても良く、そのような剤形には、注入可能な剤形、分散液、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、凍結乾燥製剤、乾燥粉末、錠剤、カプセル、制御放出性製剤、易溶性製剤、遅延放出性製剤、持続放出性製剤、律動的放出性製剤、即時放出性製剤及び制御放出性製剤の組み合わせ、などが含まれるがこれらには限定されない。具体的には、本明細書に記載のアプタマーは、（ａ）硝子体内、経口、経肺、静脈内、動脈内、鞘内、関節内、直腸内、眼内、結腸内、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局部、頬内、経鼻、及び局所投与のいずれかから選択される投与用；（ｂ）分散液、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、錠剤、サシェ及びカプセルのいずれかから選択される剤形；（ｃ）凍結乾燥製剤、乾燥粉末、易溶性製剤、制御放出性製剤、遅延放出性製剤、持続放出性製剤、律動的放出性製剤、及び即時放出性製剤と制御放出性製剤の組み合わせのいずれかから選択される剤形；または（ｄ）それらの任意の組み合わせ、として製剤化することができる。
【０１１５】
非経口、皮内、または皮下に使用するための溶液または懸濁液は、以下の成分を１つまたは複数を含むことができる。（１）注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌的な希釈剤（２）ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤（３）アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤（４）エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤（５）酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、及び（５）塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調節剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩で調整することができる。非経口用製剤は、アンプル、使い捨ての注射器または複数回投与用のガラス製もしくはプラスチック製のバイアルに封入することができる。
【０１１６】
注射用途に適した医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び無菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含んでも良い。静脈内投与に好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての例において、組成物は無菌、かつ、容易に注入できる程度の流体であるべきである。医薬組成物は、製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、「安定な」という用語は、対象への投与に適している状態または状況に維持されていることを意味する。
【０１１８】
担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒体でも良い。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合では、必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、たとえば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムなどの無機塩を含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０１１９】
滅菌注射用溶液は、活性薬剤（たとえば、アプタマー）を、所望の通り、上記に挙げた成分のうちの１つまたは成分の組み合わせと共に、適切な溶媒の適切な量に組み入れ、その後、濾過滅菌することで調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒及び任意の他の所望の成分を含む滅菌ビヒクル中に少なくとも１つのアプタマーを組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の例示的な方法は、真空乾燥及び凍結乾燥が含まれ、その両方とも、予め濾過滅菌したその溶液からアプタマーの粉末及び任意の追加の所望の成分を生じる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、硝子体内注射用に製剤化される。硝子体内注射用の好適な製剤は、たとえば、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓから出版されている「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  及びＰｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２１版」に記載されている。眼への薬剤送達については、たとえば、Ｒａｗａｓ−Ｑａｌａｊｉ  ら（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．３７：３４５；Ｂｏｃｈｏｔら（２０１２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６１：６２８；Ｙａｓｕｋａｗａら（２０１１）Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｆｏｒｍｕｌ．  ５：１；及びＤｏｓｈｉら（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２６：１０４で議論されている。いくつかの実施形態では、アプタマーを含む医薬組成物は、硝子体内注射により、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１１週間に１回、１２週間に１回、または１２週間に１回より少ない頻度で投与される。
【０１２１】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、たとえば、ゼラチンカプセルの中に封入するか、または錠剤として打錠することができる。経口治療投与の目的のために、アプタマーは、賦形剤と配合され、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、洗口剤として流体担体を使用して調製することができ、液体担体中の化合物は、口に入れられ、音をたててすすぐようにして使用され、その後、吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤及び／または補助的な物質を組成物の一部として含めることができる。
【０１２２】
吸入による投与の場合、化合物は、適切な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などのガス、霧状の液体、または適切なデバイスからの乾燥粉末を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。経粘膜または経皮投与の場合、浸透する障壁に適した浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は、一般に当技術分野で周知であり、たとえば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を介して達成することができる。経皮投与の場合、一般に当技術分野で知られているように、活性剤は、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。試薬は、直腸送達のために、坐剤（たとえば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤と共に）または保持浣腸の形態で調製することができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、身体からの急速な排泄から保護する担体を使用して調製される。たとえば、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤を使用することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性で、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。
【０１２４】
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いた、感染細胞を標的にするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容可能な担体として使用することができる。これらは、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、たとえば、当業者に知られている方法に従って調製することができる。
【０１２５】
さらに、アプタマーの懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製しても良い。適切な親油性溶媒または媒体は、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームなどの合成脂肪酸エステルを含む。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーを送達のために使用しても良い。任意で、懸濁液は、化合物の溶解度を高め、高濃度溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤を含んでも良い。
【０１２６】
場合によっては、投与を容易にし、かつ投薬量を均一化するために、用量単位形態で経口または非経口組成物を調製することは特に有効であり得る。本明細書で使用する場合、用量単位形態とは、治療する対象に対する単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された、所定量のアプタマーを含む。本明細書に記載のアプタマーの容量単位形態の仕様は、特定のアプタマーの特徴及び達成される特定の治療効果ならびに患者の治療の目的で、そのような活性薬剤を配合する分野に固有の制限によって規定され、それらに直接依存する。
【０１２７】
少なくとも１つのアプタマーを含む医薬組成物は、１つまたは複数の医薬賦形剤を含むことができる。このような賦形剤の例には、これらに限定されないが、結合剤、充填剤、潤滑剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、及びその他の賦形剤が含まれる。このような賦形剤は当技術分野において周知である。典型的な賦形剤には、以下のものが含まれる。（１）様々なセルロース及び架橋ポリビニルピロリドン、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１及びＡｖｉｃｅｌ  ＰＨＩ０２などの微結晶セルロース、ケイ化微結晶セルロース（ＰｒｏＳｏｌｖ  ＳＭＣＣ（商標））、トラガカントゴム及びゼラチンを含む結合剤（２）様々なデンプン、乳糖、乳糖一水和物、無水乳糖などの充填剤（３）アルギン酸、プリモゲル、コーンスターチ、軽度に架橋されたポリビニルピロリドン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、及び加工デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及びこれらの混合物などの崩壊剤（４）打錠する粉末の流動性に作用する薬剤、ステアリン酸マグネシウム、Ａｅｒｏｓｉｌ２００などのコロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、及びシリカゲルを含む、滑沢剤（５）コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤（６）ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸及びその塩、ブチルパラベンなどのパラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、エチルまたはベンジルアルコールなどのアルコール、フェノールなどのフェノール化合物、または塩化ベンザルコニウムなどの第四級化合物、などの防腐剤（７）微結晶セルロース、乳糖、二塩基性リン酸カルシウム、糖類、及び／または前述のいずれかの混合物などの薬学的に許容可能な不活性充填剤などの希釈剤。希釈剤の例には、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１及びＡｖｉｃｅｌ  ＰＨＩ０２などの微結晶セルロース、乳糖一水和物、無水乳糖、及びＰｈａｒｍａｔｏｓｅ  ＤＣＬ２１、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓなどの二塩基性リン酸カルシウム、マンニトール、デンプン、ソルビトール、スクロース、及びグルコースが含まれる（８）ショ糖、サッカリンショ糖、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラメート、アスパルテーム、及びアセスルファムなどの任意の天然または人工甘味料を含む甘味料（９）ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ（ＭＡＦＣＯの商標）、バブルガムフレーバー、フルーツフレーバーなどの香味剤、及び（１０）有機酸及び炭酸塩または重炭酸塩などの発泡性カップルを含む発泡剤。適切な有機酸には、たとえば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸、及びアルギン酸ならびに無水物及び酸性塩が含まれる。適切な炭酸塩及び重炭酸塩には、たとえば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウム、ナトリウムグリシン炭酸塩、Ｌ−リジン炭酸塩及びアルギニン炭酸塩が含まれる。あるいは、発泡性カップルの重炭酸ナトリウム成分のみが存在しても良い。
【０１２８】
様々な実施形態では、本明細書に記載の製剤は、実質的に純粋である。本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」とは、活性成分（たとえば、アプマー）が存在する主な種であること（すなわち、モル基準で、組成物中の他の個々の種よりも豊富であること）を意味している。いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分が組成物であり、その活性成分が存在するすべての高分子種の（モル基準で）少なくとも約５０％を含む。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％超を含む。様々な実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％を含む。様々な実施形態では、活性成分は、均一になる（汚染物質種が従来の検出方法によって組成物中に検出できない）まで精製され、その組成物は本質的に単一の高分子種からなる。
【０１２９】
アプタマーを含むキット
本開示は、本明細書に記載のアプタマーのいずれかを含むキットを提供する。このようなキットは、たとえば、（１）少なくとも一つのアプタマー、及び（２）溶媒または溶液などの、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含むことができる。追加のキット成分は、必要に応じて、たとえば、（１）安定剤、緩衝剤などの、本明細書中で同定された薬学的に許容可能な賦形剤のいずれか（２）キット部品を保持及び／または混合するための容器、バイアルまたは同様の装置の少なくとも１つ、及び（３）送達装置、を含むことができる。
【０１３０】
治療の方法
本開示は、本明細書に記載のアプタマーの使用を介して、病状を予防または治療（たとえば、１つまたは複数の症状を緩和）する方法を提供する。方法は、そのようなアプタマーの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。記載のアプタマーは、予防的治療のために使用することもできる。いくつかの実施形態では、アプタマーは、硝子体内に投与される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、経口または静脈内に投与される。
【０１３１】
治療の方法で使用されるアプタマーは、本明細書に記載のアプタマー、その薬学的に許容可能な塩、そのプロドラッグ、またはそのプロドラッグの薬学的に許容可能な塩であり得る。
【０１３２】
個体または対象は、これらに限定されないが、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ及びウシ、及び好ましくはヒトを含む、任意の動物（家庭用、家畜または野生）であり得る。本明細書で使用する場合、患者、個体、及び対象は互換的に使用することができる。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「治療する」とは、疾患、状態、または障害を治療する目的で患者の管理及びケアを説明するものであり、疾患、状態または障害の症状または合併症の発症を予防するために、疾患、状態、または障害の症状または合併症を軽減するために、または患者の疾患、状態または障害の存在を排除するためにアプタマーを投与することを含む。より具体的には、「治療」とは、疾患（障害）状態、疾患進行、疾患原因因子またはその他の異常な状態の少なくとも１つの有害な症状または影響を反転、減衰、軽減、最小化、抑制または停止することを含む。治療は、一般的に、症状及び／または病状が改善されるまでの間は継続される。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「予防する」とは、全体的にまたは部分的に予防することを意味し、改善することまたは制御すること、縮小させること、軽減させること、または減少させること、または遅延させることまたは停止させることを意味する。
【０１３５】
様々な実施形態では、開示される組成物及び方法が、加齢性黄斑変性症、自己免疫疾患、血液疾患、感染症、敗血症、炎症性疾患、または神経変性疾患を治療するために使用される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、開示された化合物またはその薬学的に許容可能な塩、またはプロドラッグは、上述の疾患状態を改善または根絶する他の治療と組み合わせて投与することができる。開示されたアプタマーを含む組成物は、たとえば、２つ以上のアプタマーを含んでも良い。いくつかの例では、１つまたは複数アプタマーを含む組成物は、疾患を治療するための別の有用な薬剤（たとえば、加齢黄斑変性症、自己免疫疾患、血液疾患、感染症、敗血症炎症性疾患、または神経変性疾患症を治療するための有用な薬剤）と併用して投与される。いくつかの実施形態では、このような併用で使用する周知の治療薬の現在利用可能な剤形が好適であろう。
【０１３７】
「併用療法」（または「共同治療」）は、これらの治療剤の相互作用による有益な効果を提供することを意図した特定の治療計画の一部として、アプタマー組成物と少なくとも１つの第２の薬剤の投与を含む。併用の有益な効果は、これらに限定されないが、治療薬の併用により生じる薬物動態学的または薬力学的な相互作用を含む。これらの治療薬の併用の投与は、典型的には、定義された期間（通常、選択した併用に応じて、数分、数時間、数日または数週間）にわたって行われる。
【０１３８】
「併用療法」は、一般的ではないが、偶然及び恣意的に本開示の併用を生じる別々の単独療法レジメンの一部として、これらの治療剤の２つ以上の投与を包含することを意図するものである。「併用療法」は、逐次的にこれらの治療剤の投与を包含することが意図される。すなわち、これらの治療剤、または少なくとも２つの治療薬を実質的に同時に投与するだけでなく、各治療剤を異なる時刻でも投与する。実質的に同時の投与は、たとえば、対象に、各治療薬の固定比率を有する単一用量を投与する、またはそれぞれの治療薬の複数の単一用量を投与することによって達成することができる。
【０１３９】
アプタマーを使用する投与計画は、たとえば、対象の型、種、年齢、体重、性別及び医学的状態、治療すべき症状の重症度、投与経路、対象の腎臓機能及び肝臓機能、及び使用される特定のアプタマーまたはその塩を含む様々な要因に従って選択される。通常の技能を有する医師または獣医は、状態の進行を阻止し、対処し、停止させるために必要な組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。
【０１４０】
一般に、投薬量、すなわち、治療有効量は、１日あたり、治療を受ける対象の体重１ｋｇに対して約１μｇ〜約１００ｍｇの範囲である。
【０１４１】
以下の実施例は、ある特定の特徴及び／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、記載された特定の特徴または実施形態に本開示を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：Ｃ３−タンパク質に対する結合特異性を有するアプタマーの選択及び同定
この実施例は、ヒトＣ３−タンパク質に対するＤＮＡアプタマーの選択及び製造のための代表的な方法を提供する。
【０１４３】
候補混合物の調製
部分的にランダム化されたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの候補混合物を、ビオチン化ｓｓＤＮＡ鋳型にアニーリングしたＤＮＡプライマーのポリメラーゼ伸長により調製した（以下の表１に示す）。候補混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２）−２’−デ−デオキシウリジン三リン酸（ＮａｐｄＵＴＰ）を含有する４０ヌクレオチドのランダム化カセットを含有した。
【表１】
2017517261.tif 000004
【０１４４】
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｌｕｓ  ＵｌｔｒａＬｉｎｋ  Ｒｅｓｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）の５０％スラリーの５ミリリットルを、ＳＢ１８Ｔ０．０５の２．５ｍＬ（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）緩衝液は、ＮａＯＨでｐＨ７．５、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．０５％ＴＷＥＥＮ２０に調製した）で１回洗浄し、１６ｍＭのＮａＣｌの２．５ｍＬで３回洗浄した。２つのビオチン残基（配列でＢ）−２’−デと示す）及び４０のランダム化位置（配列でＮ４０として示す）を有するテンプレート１の２０ナノモル（配列番号：１）は、洗浄されたＵＬＴＲＡＬＩＮＫ  ＳＡビーズに添加され、３０分間３７℃で回転させた。次いで、ビーズを１６ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄した。各洗浄の間に、ビーズを遠心分離により回収した。現在捕捉されたテンプレートを含む、ビーズは、プライマーの２４ナノモル（配列番号：２）を含む伸長の反応緩衝液の１．２５ｍＬ、１ＸＳＱ２０緩衝液（１２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭのＫＣｌ、７ｍＭのＭｇＳＯ４、６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．００１％のＢＳＡ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）の１８７．５ユニット、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＮａｐｄＵＴＰの各０．５ｍＭに懸濁した。ビーズを２時間６８℃でインキュベートした。次いで、ビーズを１６ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄した。アプタマーライブラリーを、２０ｍＭのＮａＯＨ  １ｍＬで、ビーズから溶出させた。溶出したライブラリーとすぐに１５μＬの１Ｎ  ＨＣｌ及び１０μＬのＨＥＰＥＳ  ｐＨは７．５及び１μＬの１０％のＴＷＥＥＮ−２０で中和した。ライブラリーは、アミコン  ウルトラセル  ＹＭ−１０フィルターで約０．２ｍＬに濃縮し、ライブラリーの濃度は、紫外線吸光分光法により決定する。
【０１４５】
固定化のための標的タンパク質の標識
標的タンパク質のＡｌｅｘａ４８８標識
正常血清（Ｑｕｉｄｅｌ社、カタログ番号Ａ４０１）から精製されたタグなしのヒトＣ３−タンパク質は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（商標））を第一級アミンに共有結合させることによって標識させた。Ｃ３−タンパク質（６８μＬ中２６３ピコモル）は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８反応性染料の１３７倍モル過剰と混合し、反応を室温で２時間インキュベートした。未反応の標識は、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて除去し、緩衝液をＳＢ１８Ｔ０．０５に交換した。
【０１４６】
ヒトＣ３−タンパク質のビオチン標識
正常血清Ｑｕｉｄｅｌ社、カタログ番号Ａ４０１）から精製されたタグなしのヒトＣ３−タンパク質は、第一級アミンを含む残基にＮＨＳ−ＰＥＯ４ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ、ＥＺ−ＬｉｎｋのＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン）の共有結合によりビオチン化した。タンパク質（７５μＬ中２００ピコモル）は、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンの７倍モル過剰量と混合し、反応物を１６時間４℃でインキュベートした。反応が完了した後、緩衝液を交換し、未反応のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンをＹＭ３フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて限外濾過によって除去した。交換緩衝液はＳＢ１８Ｔ０．０５であった。
【０１４７】
標的タンパク質の固定化
Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識された標的タンパク質を、ＳＥＬＥＸプロセスのラウンド４を介して第１ラウンドのためにプロテインＧ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ、または以下、プロテインＧビーズと記載する）上に固定化した。抗体被覆ビーズを、１ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０５緩衝液のウサギ  ＩｇＧ  ａｎｔｉ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ１１０９４）７０μｇでビーズ１０ｍｇを混合することによって調製した。混合物を３０分間、３７℃でインキュベートした。未結合の抗体を除去し、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０５の１４ｍＬで３回洗浄した。最後に、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０５の１ｍＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）中で懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
【０１４８】
ビオチン標識された標的タンパク質は、ＳＥＬＥＸプロセスのラウンド９を介してラウンド５のためにＭｙＯｎｅ−ＳＡ常磁性ビーズ（ＭｙＯｎｅ  ＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、または以下、ＳＡビーズと記載する）の上に固定化した。ビーズ（５０ｍｇｓ）は、ＳＢ１８Ｔ０．０５の１４ｍＬで３回洗浄することにより調製した。最後に、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０５の１０ｍｇｓ／ｍＬ中で懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
【０１４９】
遅いオフ速度の濃縮プロセスを有するアプタマーの選択
ＳＥＬＥＸプロセスの９ラウンドの合計は、親和性と遅いオフ速度の選択で完了した。各ラウンドの前に、バックグラウンドを低減させ、タンパク質への非特異的結合を有するアプタマーを得る可能性を低減するために対抗選択を実行した。次のように対抗選択を実行した。
【０１５０】
ラウンド１の場合、ＳＢ１８Ｔ０．０５のＤＮＡの約１ナノモルを含むＤＮＡ候補混合物の１００μＬを５分間９５℃で加熱し、次いで５分間７０℃まで冷却し、次いで５分間４８℃まで冷却し、次いで５分間３７℃のブロックに移した。次いで、試料を、タンパク質の競合混合物（０．１％ＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及びＳＢ１８Ｔ０．０５の１０μＭのプロトロンビン）の１０μＬ、及びプロテインＧビーズの１ｍｇ（１００μＬ）と組み合わせ、混合しながら１０分間３７℃でインキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去した。
【０１５１】
ラウンド２〜９の場合、前のラウンドから得られたＤＮＡの候補混合物の６５μＬアリコート（ｅＤＮＡの６５％は、前のラウンドから得た）を、５ｘＳＢ１８Ｔ０．０５の１６μＬと混合した。試料を３分間９５℃まで加熱し、０．１℃／秒の速度で３７℃まで冷却した。次いで、試料を、タンパク質競合混合物（０．１％ＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及びＳＢ１８Ｔ０．０５で１０μＭプロトロンビン）の９μＬ、及びプロテインＧビーズ（ラウンド５〜９）、またはＳＡビーズ（ラウンド２〜４）の０．１ｍｇ（１０μＬ）と組み合わせ、混合しながら１０分間３７℃までインキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去した。
【０１５２】
第１の対抗選択に続き、標的タンパク質は、ラウンド１選択プロセスのプロテインＧビーズに予め固定化される。これを達成するために、固定された抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗体をプロテインＧビーズの２ｍｇのＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識された標的タンパク質の５０ピコモルと混合し、３０分間３７℃でインキュベートした。未結合の標的は、ＳＢ１８Ｔ０．０５でビーズを洗浄することにより除去した。対抗選択されたＤＮＡの候補混合物（１００μＬ）をビーズに添加し、混合しながら６０分間３７℃でインキュベートした。遅いオフ速度の濃縮プロセスは、最初のラウンドでは使用せずに、ビーズは単純に１００μのＬＳＢ１８Ｔ０．０５で５回洗浄した。洗浄に続き、２０ｍＭのＮａＯＨの１７０μＬを添加し、混合しながら５分間３７℃でインキュベートすることによりビーズから結合したアプタマーを溶出した。アプタマー含有溶出液（１６５μＬ）は、ビーズの磁気分離後に、新しいチューブに移し、８０ｍＭのＨＣｌを含有する２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５の４１μＬを加えることによって溶液を中和した。
【０１５３】
ラウンド２〜９の場合、以下に説明するようにＤＮＡの候補混合物及び標的タンパク質を用いて選択を実施するとともに、並行して、ＤＮＡの候補混合物を用いるが、標的タンパク質は用いず、同一の選択を実行する。標的タンパク質（信号Ｓ）を用いた試料と標的タンパク質（バックグラウンドＢ）を用いない試料のＰＣＲから得られたＣｔ値の比較は、次のラウンドの標的の濃度を削減するための指針として使用した。デルタＣｔ値が、４よりも大きく８未満であった場合には、標的タンパク質は、次のラウンドで１／３になった。デルタＣｔ値が、８よりも大きい場合には、標的タンパク質は、次のラウンドで１／１０になった。
【０１５４】
ラウンド２の場合、標識された標的タンパク質（１０μＬ中５ピコモル）は、対抗選択されたＤＮＡ候補混合物の４０μＬと混合し、１５分間３７℃でインキュベーした。遅いオフ速度の濃縮プロセスは、１０ｍＭの硫酸デキストランの５０μＬを添加し、続いて固定された抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗体でプロテインＧビーズ０．２ｍｇを即時添加することにより開始された。これを、混合しながら１５分間３７℃でインキュベートした。次いで、ビーズを、ＳＢ１８Ｔ０．０５の３０％のグリセロールで１回洗浄し、ＳＢ１８Ｔ０．０５の１００μＬで５回洗浄した。２０ｍＭのＮａＯＨの８５μＬを添加し、混合しながら５分間３７℃でインキュベートすることによってビーズからアプタマー鎖を溶出した。ビーズを磁気分離によって除去し、アプタマー溶出液の８０μＬを新しいチューブに移し、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５及び８０ｍＭのＨＣｌからなる溶液２０μＬで中和した。
【０１５５】
ラウンド３及び４は、硫酸デキストランを、固定された抗Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗体を用いてプロテインＧビーズを添加する１５分前に添加した以外はラウンド２に記載したように実施した。また、グリセロール洗浄は実行しなかった。
【０１５６】
ラウンド５から９は、ビオチン標識された標的タンパク質を用いて実行した。ラウンド５の場合、標的（１０μＬ中１．６ピコモル）は、対抗選択されたＤＮＡ候補混合物の４０μＬと混合し、混合しながら１５分間３７℃でインキュベーした。次いで、遅いオフ速度の濃縮プロセスは、１０ｍＭの硫酸デキストランの５０μＬを添加し、混合物を混合しながらさらに１５分間インキュベートすることにより開始された。ＳＡビーズ（０．２ｍｇ）を標的タンパク質−アプタマー複合体を捕捉するために添加した（混合しながら３７℃で１５分間インキュベーションした）。次いで、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０５の１００μＬで５回洗浄した。２０ｍＭのＮａＯＨの８５μＬを添加し、混合しながら５分間３７℃でインキュベートすることによってビーズから結合したアプタマーを溶出した。ビーズを磁気分離によって除去し、アプタマー溶出液の８０μＬを新しいチューブに移し、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５及び８０ｍＭのＨＣｌからなる溶液２０μＬで中和した。
【０１５７】
ラウンド６は、３０分間のデキストランチャレンジを使用して、標識された標的タンパク質はＳＡビーズの０．０５ｍｇで補足すること以外は、ラウンド５のように実施した。ラウンド７及び８は、標的タンパク質の０．１６ピコモルのみを使用したことを以外はラウンド６と同様に実行した。９ラウンドのＳＥＬＥＸプロセスは、標的タンパク質の０．０５ピコモルのみを使用したこと以外はラウンド８と同様に実行した。
【０１５８】
アプタマー増幅及び精製
各ラウンドから選択されたアプタマーＤＮＡをＱＰＣＲにより増幅し定量化した。４８μＬのＤＮＡを、１２μＬのＱＰＣＲ混合物（１０Ｘ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、Ｎｏｖａｇｅｎ社＃７１１５７、５倍希釈、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、５μＭのフォワードＰＣＲプライマー（プライマー１、配列番号：２）、５μＭのビオチン化リバースＰＣＲプライマー（プライマー２、配列番号：３）、５Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、０．０７５Ｕ／μＬのＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各１ｍＭ）に添加し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社  ＭｙＩＱ  ＱＰＣＲ装置において以下のプロトコルで熱サイクルを行った。１サイクルの９６℃で１５秒間、５５℃で１０秒間、及び６９℃で３０分間、続いて３０サイクルの９６℃で１５秒間、６９℃で１分間。装置のソフトウェアを用いて定量化を行い、選択されたＤＮＡのコピー数を標的タンパク質の有無で比較してシグナル／バックグラウンド比を決定した。
【０１５９】
増幅後、ＰＣＲ産物は、ビオチン化アンチセンス鎖を介してＳＡビーズ上に捕捉した。１．２５ｍＬのＳＡビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、１４ｍＬの２０ｍＭのＮａＯＨで１回、１４ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０５で２回洗浄し、１．２５ｍＬの３ＭのＮａＣｌ＋０．０５％のＴＷＥＥＮ中で再懸濁し、４℃で保管した。２５μＬのＳＡビーズ（３ＭのＮａＣｌ中の１０ｍｇ／ｍＬ）を、５０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物に添加し、混合しながら１５分間２５℃でインキュベートした。ビーズを、１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄し、次いで、１００μＬの２０ｍＭのＮａＯＨを添加し、混合しながら１分間３７℃でインキュベートすることによって「センス」鎖をビーズから溶出した。溶出した鎖を廃棄し、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０５で３回、１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄した。
【０１６０】
ＮａｐｄＵを含むアプタマーセンス鎖は、固定されたアンチセンス鎖からのプライマー伸長によって調製した。ビーズを４０μＬのプライマー伸長反応混合物（１Ｘプライマー伸長緩衝液（１２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭのＫＣｌ、７ｍＭのＭｇＳＯ４、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、及び０．００１％のウシ血清アルブミン）、３μＭのフォワードプライマー（プライマー１、配列番号：２）、各０．５ｍのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＮａｐｄＵＴＰ、及び０．０１５Ｕ／μＬのＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ）中で懸濁し、混合しながら６０分間６８℃でインキュベートした。ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０５で３回洗浄し、２０ｍＭのＮａＯＨの８５μＬを添加し、混合しながら１分間３７℃でインキュベートすることによってビーズからアプタマー鎖を溶出した。磁気分離した後、８０μＬのアプタマー溶出物を新しいチューブに移し、２０μＬの８０ｍＭのＨＣｌで中和し、５μＬの０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５で緩衝した。
【０１６１】
選択ストリンジェンシー及びフィードバック
選択工程の相対的な標的タンパク質濃度は、以下のルールに従ってＱＰＣＲ信号（ΔＣｔ）に応じて、各ラウンドで低下させた。
ΔＣｔ＜４であれば、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）
４≦ΔＣｔ＜８であれば、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）／３．２
ΔＣｔ≧８であれば、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）／１０
式中、［Ｐ］＝タンパク質濃度であり、ｉ＝現在のラウンド数である。
【０１６２】
各選択ラウンド後、濃縮されたＤＮＡの混合物の収束状態を決定した。１０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物は、１Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含有する４ｍＭのＭｇＣｌ２で２００μＬに希釈した。試料は、二本鎖オリゴヌクレオチドの複合体混合物に関するハイブリダイゼーション時間を測定するＣ０ｔ分析を使用して、収束に関して分析した。以下のプロトコルで、試料に熱サイクルを行った。３サイクルの９８℃１分間、８５℃１分間、２サイクルの９８℃１分間、その後８５℃３０分間。８５℃で３０分間の間に、５秒間隔で蛍光画像を測定した。蛍光強度を時間の対数の関数としてプロットし、各ＳＥＬＥＸラウンドによるハイブリダイゼーションの増加率が観察され、配列の収束を示した。
【０１６３】
濃縮されたプールの配列決定及びアプタマーの同定
ＳＥＬＥＸプロセスの９ラウンドの後、収束したプールを配列決定した。次のように配列の準備を行った。プールは、一意のバーコード／インデックスシーケンス（各プールの一意のシーケンス識別子）を含むＳＥＬＥＸライブラリー特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。個々のＰＣＲ産物は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）のｄｓＤＮＡ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）アッセイを用いて定量化し、等モル濃度で組み合わせ、濃縮／緩衝液はアミコン  ウルトラ−０．５遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して交換した。次いで、混合物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製し、溶出液をアミコン  ウルトラ−０．５遠心フィルター装置を使用して濃縮し、最終混合物の大きさ、純度及び収率を確認するために、ＰＡＧＥによって可視化した。試料は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ配列決定のためにＳｅｑＷｒｉｇｈｔ  ゲノム  サービス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ヒューストン、ＴＸ）に提出した。４０，０００超の配列を含む配列のプールから、３８４個がランダムに選択され、配列カウント／コピー数を決定し、ローカルアラインメント  アルゴリズムを使用して共通の収束パターンを識別するカスタムソフトウェアを使用して、収束について分析した。プール内の最大の表現／コピー数を有する配列及びすべての収束パターンの少なくとも１つの配列を、さらなる特徴付けのために選択した。収束パターン１は、配列８４９１−３＿３（配列番号：４）、８４９１−９４＿３（配列番号：５）、８４９１−１８９＿３（配列番号：８）及び８４９１−２８２＿３（配列番号：９）から最初に同定した。これら４つの配列に由来するコンセンサス領域は、４０，０００超の配列の全ラウンド９配列プール内の収束パターン１の他のメンバーを同定するために使用した。
【０１６４】
アプタマーの合成
結合及び抑制ポテンシャルの決定のために、個々のアプタマーを固相合成によって調製した。固相合成に使用された修飾デオキシウリジン−５−カルボキサミドアミダイト試薬は以下により調製した。５）−２’−デ−Ｏ−（４，４）−２’−デ−ジメトキシトリチル）−５−トリフルオロエトキシカルボニル−２）−２’−デ−デオキシウリジン（Ｎｏｍｕｒａら。（１９９７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：２７８４）を適切な［１−ナフチルメチルアミン］一級アミンと濃縮し（ＲＮＨ２、１．２当量、Ｅｔ３Ｎ、３当量、アセトニトリル中６０℃、４時間）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイトと３）−２’−デ−Ｏ−ホスホフィチジル化し（１．２当量、ｉＰｒ２ＥｔＮ、３当量、ＣＨ２Ｃｌ２、−１０から０℃、４時間）、中性シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーで精製した（Ｓｔｉｌｌ、ら。  （１９７８）  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ４３：２９２３）。アプタマーはホスホラミダイトメソッド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ  （１９８１）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２２：１８５９）を用いた固相合成により調製された。本明細書で開示される独特の塩基修飾のためプロトコルをいくらか修正した。脱トリチル化はトルエン中１０％ジクロロ酢酸で４５秒行われた。カップリングは１：１アセトニトリル：ジクロロメタン０．１Ｍ中で５−ベンジルメルカプトテトラゾールにより活性化され、３回５分間反応させることで行われた。キャッピング及び酸化は装置ベンダーの推奨に従って行われた。脱保護は、パーステンレス鋼反応器内の最適化された圧力、時間、及び温度下で気体状アンモニアまたはメチルアミンで行われた。生成物を、脱イオン水を用いて適切な９６ウェルプレートに溶出し、ＬＣＭＳ特徴付けのために統計的にサンプリング (√N +1)し、ＵＶ分光光度法により定量化し、緩衝水溶液中のタンパク質結合親和性について試験した。
【０１６５】
実施例２：Ｃ３−タンパク質に対するアプタマーの平衡結合定数（Ｋｄ）
この実施例では、アプタマー−Ｃ３−タンパク質結合親和性を測定し、Ｋｄを決定するために本明細書で使用される方法を提供する。簡潔には、放射性標識ＤＮＡアプタマー（３２Ｐ）を、ＳＢ１８Ｔ０．０１緩衝液（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のＴＷＥＥＮ−２０）中で９５℃で３分間加熱し、ゆっくりと３７℃まで冷却した。複合体は、６０μＬの反応容量のＳＢ１８Ｔ０．０１緩衝液中、１×１０−７Ｍ〜１×１０−１２Ｍの濃度範囲で組換えＣ３−タンパク質を用いて約１×１０−１１Ｍで放射性標識されたＤＮＡを混合し、６０分間３７℃でインキュベートすることによって形成した。各反応（５μＬ）の一部は、ナイロン膜に移し、乾燥させ、各反応の総カウント数を決定した。複合体を、ＺＯＲＢＡＸ樹脂（３０ｎｇ／μＬ、ＡＧＩＬＥＮＴ）上に捕捉し、真空下でマルチスクリーンＨＶプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通過させ、非結合ＤＮＡからタンパク質に結合した複合体を分離するために１８０μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１緩衝液で洗浄した。ナイロン膜及びマルチスクリーンＨＶプレートをＦＵＪＩ  ＦＬＡ−３０００ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）で撮像し、各試料中の放射能の量をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）解析ソフトウェアを用いて定量化した。捕捉されたＤＮＡの画分は、Ｃ３−タンパク質濃度（Ｐｔ）の関数としてプロットし、平衡結合定数（Ｋｄ）は、以下の式を用いて決定した。ｙ＝（最大−最小）（Ｐｔ）／（Ｋｄ＋Ｐｔ）＋最小。
【０１６６】
図示の例のように、図２は、ヒトＣ３−タンパク質の結合曲線を示すグラフを示す。ＤＮＡアプタマー８４９１−９４＿３（配列番号：５）、８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）、及び８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）は、それぞれ、３．１３×１０−１１Ｍ、３．３４×１０−１１Ｍ及び５．４９×１０−１１ＭのＫｄでＣ３−タンパク質に結合した。図３は、アプタマー８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）及び８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）のヒトＣ５タンパク質への結合を示すグラフを示す。Ｃ３−タンパク質のこれらのアプタマーの特異性を示す、ヒトＣ５タンパク質への明らかな結合は検出されていない。
【０１６７】
表２は、収束パターン１のメンバーのＣ３のアプタマー配列との親和性を示す。
【表２】
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2017517261.tif 000006
【０１６８】
実施例３：補体媒介溶血の阻害。
この実施例では、抗体被覆されたヒツジ赤血球の補体媒介溶血のアプタマー阻害を測定するために本明細書で使用される方法を提供する。Ｃ３−タンパク質枯渇ヒト血清（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号Ａ３１４）の１：２０希釈は、示された最終濃度のアプタマーの有無にかかわらず、２０または２５ｎＭのヒトＣ３−タンパク質（図に示す）と抗体被覆ヒツジ赤血球（７×１０７細胞／ｍＬ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｂ２００）とを混合させたものである。アプタマーを添加しないまたはＣ３−タンパク質及びアプタマーを添加しない対照サンプルには、すべての赤血球が溶解された陽性対照もともに含まれている。試料は希釈され、アッセイは、ゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ＋＋；０．１％ゼラチン、０．１５ｍＭの塩化カルシウム、０．５ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのベロナール、１４５ｍＭのＮａＣｌ、０．０２５％のＮａＮ３、ｐＨ７．３、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号Ｂ１０２）の０．０７５ｍＬの総容量で行い、３７℃で３０分間インキュベートした。試料は（１０分間２００×ｇで）遠心分離し、４１２ｎｍで上清の吸光度をＧＶＢ＋＋緩衝液の４希釈中１希釈の後に測定した。補体媒介溶血を阻害する収束パターン１のアプタマーの能力は、図４及び図５に示されている。
【０１６９】
収束パターン１のアプタマーは、所望の高親和性結合（表２）及び阻害特性（図４）を有することが見出された。２７個の独立した配列は、４０，０００超の配列の元の配列プールからこのパターン内で同定された。２７個の配列すべてを、ヒトＣ３−タンパク質への結合について試験した。２５個は、高親和性（表２）を用いて、ヒトＣ３−タンパク質に結合することが見出された。抗体被覆されたヒツジ赤血球（図４）の補体媒介溶血を阻害する能力についてこれらの配列の２０個を試験した。溶血アッセイにおいて強力な阻害剤であった１８アプタマーは、高い親和性でＣ３−タンパク質に結合したものであった。Ｃ３−タンパク質に結合しなかったものは阻害剤（＜２５％阻害）ではなかった。さらなる対照として、８４９１−９４＿３配列（配列番号：５）内でヌクレオチドを修飾した単一のＮａｐｄＵをデオキシチミジンヌクレオチドで置換した、２つの配列をＣ３−タンパク質への結合について及びＣ３−タンパク質の阻害について試験した。これら２つの配列、８４９１−９４＿１４（配列番号：３５）及び８４９１−９４＿１５（配列番号：３６）は、高い親和性でＣ３−タンパク質に結合する（表３を参照）または溶血を阻害しなかった（図４）。これらのデータは、Ｃ３−タンパク質への高親和性結合が観察された阻害特性のために必要であり、修飾ＮａｐｄＵヌクレオチドが結合の全体的な親和性に大きく寄与することを示す。
【０１７０】
Ｃ３−タンパク質に結合するために図示しない２つの配列を除いた後、残りの２５個の配列は、コンセンサス領域の２３ヌクレオチドの長さを明らかにするために整列させた（図１）。各配列が同定された数字がこの図に示されている。任意の他の配列から５つ超のヌクレオチドの相違を有する配列は、独立して選択された配列であると見なした。図１に示される任意の特定配列から１〜５つのヌクレオチドの相違を有する配列は、その配列の総配列数に含まれている。この領域は、位置２、６、１０、１３、１７、２１及び２２で保存ＮａｐｄＵ塩基（Ｐ）を有することを特徴とする。位置１は、２５個の配列のうち２０個の配列でＰであり、３個の配列［８４９１−９４＿３（配列番号：５）、４９１−３９５＿３（配列番号：１０）及び８４９１−３８８＿３（配列番号：１８）］でグアニン（Ｇ）であり、２個の配列［８４９１−３９７（配列番号：１２）及び８４９１−３９９（配列番号：２７）］でシトシン（Ｃ）だった。位置３はＧであるが、位置４はＡが１９回出現しＧが６回出現するプリン塩基である。位置５は、１つの配列［８４９１−３９９＿３（配列番号：２７）］がＰである以外はすべてＣである。位置７は、配列の２３個でＣであり、２つの配列［８４９１−３９７＿３（配列番号：１２）及び８４９９−４０８＿３（配列番号：２３）］でＡである。位置８は、検討中の２５個の配列のうち１７個の配列でＡであり、５個の配列でＣ及び３個の配列でＧである。位置８と９の間のコンセンサスモチーフ内の単一塩基挿入（ＣまたはＡ）は、４つの配列［８４９１−３８７（配列番号：１６）、８４９１−３９６（配列番号：１３）、８４９１−３９７（配列番号：１２）、及び８４９１−４０４（配列番号：２５）］で観察される。位置９は、２つの配列［８４９１−４０４（配列番号：２５）及び８４９１−３９７（配列番号：１２）］がＰである以外はＡであるこれらの配列のうちの１つは、３．１ｎＭのＫｄを有するＣ３−タンパク質と結合することが示された。［８４９１−３９７＿３（配列番号：１２）］位置１０〜１４は、配列５）−２’−デ−Ｐ−Ａ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−３）−２’−デ（配列番号：１３２）で完全に保存されている。位置１５は、３つの配列［８４９１−３９０＿３（配列番号：７）、８４９１−２８２＿３（配列番号：９）及び８４９１−３９９＿３（配列番号：２７）］はＡ、１つの配列［８４９１−４０９＿３（配列番号：２８）］はＧ、それ以外はＣである。位置１６〜２２は、Ｃ３−タンパク質に結合するこれらの配列で完全に保存されている。これらの位置は、配列５）−２’−デ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−３）−２’−デ（配列番号：１３３）を含む。検討中の２５個の配列のうち、位置２３は、２０例でＰであるが、５例でＣである。
【０１７１】
ヒトＣ３−タンパク質のこれらの高親和性阻害剤のうち、配列８４９１−９４＿３（配列番号：５）は、改善された特性及び特徴を識別するために、ポストＳＥＬＥＸ修飾に選出した。図５Ａに示すように、この配列は、１４．８ｎＭでのＩＣ５０を用いて、この系における抗体コーティングしたヒツジ赤血球の溶血を阻害することができる。
【０１７２】
実施例４：Ｃ３ａの放出の阻害。
この実施例では、Ｃ３ａ及びＣ３ｂへのＣ３−タンパク質のタンパク質分解的切断を防止し、したがって、ヒトＣ３−タンパク質の活性化を防止するアプタマーの能力を測定するために本明細書で使用される方法を提供する。アッセイの主体は、アプタマーの存在下または非存在下で、予備活性化ザイモサンＡ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号Ｂ４００）を用いて、ヒト血清中の補体系の代替経路を開始することである。経路が開始されると、Ｃ３ａは解放され、次に、血清中にすでに存在するエンドペプチダーゼによってＣ３ａ  ｄｅｓＡｒｇに急速に代謝される。Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇの相対量を、メーカーの指示に従ってＤＢ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）ヒトＣ３ａ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ  カタログ番号５５０４９９）を用いて測定する。正常ヒト血清（ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＳ  カタログ番号ＮＨＳ）は、所定の濃度のアプタマーの添付の有無にかかわらず、１０ｎＭのマグネシウムＥＧＴＡ（ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＳ  カタログ番号Ｂ１０６）を含むゼラチンベロナール緩衝液（０．１％ゼラチン、５ｍＭのベロナール、１４５ｍＭのＮａＣｌ、０．０２５％のＮａＮ３、ｐＨ７．３、ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＳ  カタログ番号Ｂ１０１）に１０％または３４％まで希釈する。補体カスケードは、ザイモサンＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の添加によって開始され、補体カスケードは、３７℃で３０分間進行させる。次に、ザイモサンＡを、室温で遠心分離（４分間７、０００×ｇ）によって溶液から除去し、ヒトＣ３ａ  ＥＬＩＳＡキットで測定するために試料を適切に希釈する。Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ  ＥＬＩＳＡの性能を有するアプタマー干渉の可能性の対照として、アプタマーは、３０分間の反応の後に添加される。ザイモサンＡ誘導性の補体活性化後のＣ３ａの放出を阻害しない、代表的な収束パターン１の配列、８４９１−３＿３（配列番号：４）、（８４９１−９４＿３（配列番号：５）、８４９１−１８９＿３（配列番号：８）、８４９１−３８７＿３（配列番号：１６）及び８４９１−３８９＿３（配列番号：６）の能力が、図１２Ａに示されている。図１２Ｂに示すように、観察された阻害は、Ｃ３ａの検出系（Ｃ３ａ  ｄｅｓＡｒｇ  ＥＬＩＳＡ）のアプタマーの干渉によるものではない。この対照では、図１２Ａに示す対応する阻害実験と同じ濃度でアプタマーが存在するように補体カスケードを実行した後、アプタマーを添加する。図６のパターン１のメンバーでは、８４９１−９４＿３（配列番号：５）は、２μＭのＩＣ５０を用いて、３４％正常ヒト血清中のＣ３ａの放出を阻害することが示されている。
【０１７３】
８４９１−９４＿３（５０−ｍｅｒ）のＮａｐｄＵためのデオキシチミジン置換。
デオキシチミジン（ｄＴ）ウォークは、８４９１−９４＿３（配列番号：５）で実行される。単一のｄＴは、修飾ヌクレオチド（ＮａｐｄＵ）を含む８つの位置うちの１つと置換した。ｄＴウォークは、高親和性結合に必要ではない高親和性結合修飾ヌクレオチドのために、各修飾ヌクレオチドの寄与が、潜在的に非修飾塩基で置換するまたは削除することができると決定するためのものである。この表では、「Ｐ」はＮａｐｄＵを表し、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧは、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し、「ＮＢ」は最高１００ｎＭのヒトＣ３−タンパク質まで結合がなかったことを表す。このウォークの結果を表４に示す。修飾された最初の７つのヌクレオチド（５）−２’−デ末端に最も近い７つ）の置換は、いずれの置換もしない５０−ｍｅｒと比べてＣ３−タンパク質の相対的な親和性を減少させた。３）−２’−デ末端に最も近いＮａｐｄＵの置換は、結合に有意な影響を与えなかった。
【表３】
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【０１７４】
８４９１−９４＿３（配列番号：５）を５０−ｍｅｒに切断。
配列８４９１−９４＿３（配列番号：５）が、ポストＳＥＬＥＸ修飾及び分析のために選択され、一連の欠失実験で８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）は２８−ｍｅｒに切断された（表４）。切断された配列は、ヒトＣ３−タンパク質に対して高い親和性を維持し、上記のように、まだ２３ヌクレオチドのコンセンサスモチーフを含む。上記のように高い結合親和性に大きく寄与しなかった修飾ヌクレオチドは、この２８−ｍｅｒで除去される。２０ｎＭの（最終濃度）Ｃ３−タンパク質を用いて強化されたＣ３枯渇ヒト血清を用いて行った溶血アッセイのＣ３タンパク質を阻害するそれらの能力についても代表的な切断を試験した（図５）。８４９１−９４＿２６（配列番号：５４）、８４９１−９４＿２７（配列番号：５５）、及び８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）はそれぞれ、１５．１ｎＭ、２４．６ｎｍ及び１７．１ｎＭのＩＣ５０値で溶血を阻害することができた。８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）の２８−ｍｅｒの切断により、１．５μＭのＩＣ５０を用いて、３４％正常ヒト血清中のＣ３ａの放出が阻害されることも示された（図６）。
【表４】
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【０１７５】
８４９１−９４＿２６（配列番号：５４）でＣ３−スペーサー単一置換。
Ｃ３アプタマーのポストＳＥＬＥＸ修飾の最初のラウンドは、ＮａｐｄＵを含むそれらの位置を除く３０−ｍｅｒの８４９１−９４＿２６（配列番号：５４）のすべての位置でＣ３−スペーサーウォークだった。Ｃ３−スペーサーウォークは、３炭素スペーサー（Ｃ３−スペーサー）またはヘキサエチレングリコール（Ｈｅｇ）リンカーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーなどの他のリンカーで置き換えられ、潜在的に完全に除去することができる高親和性結合に必要ではない塩基を識別するためのものである。Ｃ３−スペーサー置換の結果を表５に示す。この表では、「Ｐ」はＮａｐｄＵを表し、「Ｃ３」は、Ｃ３−スペーサーを表し、Ａ、Ｃ及びＧは、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを表し、「ＮＢ」は最高１００ｎＭのＣ３−タンパク質まで結合がなかったことを表す。いくつかの部位は、Ｃ３−スペーサー置換を許容した。３つの内部位置のＣ３−スペーサーの置換は、８４９１−９４＿２６（配列番号：５４）と比較して、Ｃ３−タンパク質との結合強化を示した。これらは、８４９１−９４＿２６（配列番号：５４）の５）−２’−デ末端に相対する位置８、１８、及び２６であった。位置８の置換は、３１．５ｐＭの親和性解離定数（Ｋｄ）を有するＣ３−タンパク質に結合するアプタマー８４９１−９４＿３６（配列番号：６６）を作製し、位置１８または２６の置換は、それぞれ、１４．２ｐＭ及び３０．２ｐＭのＫｄ値を有するＣ３−タンパク質に結合するアプタマー８４９１−９４＿４３（配列番号：７３）及び［８４９１−９４＿４８（配列番号：７８）］を、それぞれ作製する。
【０１７６】
単一ＨｅｇまたはＣ３−スペーサー（「Ｃ３」）の置換または複数のＣ３−スペーサーの置換は、２８−ｍｅｒのアプタマー８４９１−９４＿５３の等価な位置で行われた（表６）。なお、位置７、１７及び２５（８４９１−９４＿５３の５）−２’−デ末端からの相対番号）の３つのＣ３−スペーサー基の置換は、８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）の３３．４ｐＭと比べて、２２．１ＰＭのＫｄでアプタマーにつながる。
【０１７７】
Ｃ３−スペーサー基を含有する個々の配列は、溶血アッセイでＣ３−タンパク質を阻害する能力を維持する（図５）。配列８４９１−９４＿３０（配列番号：６０）、８４９１−９４＿３６（配列番号：６６）、８４９１−９４＿３７（配列番号：６７）及び８４９１−９４＿４３（配列番号：７３）は、それぞれ２０．９ｎＭ、２５．０ｎＭ、２４．７、及び１９．２ｎＭのＩＣ５０値でこのアッセイで溶血を阻害することができた。
【表５】
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【表６】
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【０１７８】
８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）で２）−２’−デ−Ｏ−メチル単一置換。
切断されたＮａｐｄＵ含有の遅いオフ速度の修飾アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒ）８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）のヌクレアーゼ耐性を高めるために、２）−２’−デ−Ｏ−メチル（２）−２’−デ−ＯＭｅ）基は、Ｃ３−タンパク質への結合が有意に影響されなかったヌクレオチドの位置に組み込まれた。任意の個々の２）−２’−デ−ＯＭｅの追加のタンパク質結合への影響は、先験的に予測することはできない。したがって、アプタマー８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）のいくつかの変異体の「２）−２’−デ−ＯＭｅウォーク」が実行され、各変異体が単一の修飾ヌクレオチドのみを含む「２）−２’−デ−ＯＭｅウォーク」が作製された。各変異体の結合親和性が決定された（配列番号：８８〜１１５）。
【０１７９】
２）−２’−デ−Ｏ−メチル置換は、このヌクレアーゼ耐性置換を許容する可能性がある位置を同定するために行われた。配列及び各構築物の結合親和性は、表７に示す。この表では、上付き文字１（１）は、２）−２’−デ−Ｏ−メチル置換を有するヌクレオチドを表し、「Ｐ」はＮａｐｄＵを表し、「Ａ」、「Ｃ」及び「Ｇ」は、天然に存在する核酸塩基を表し、「ＮＢ」は最高１００ｎＭのヒトＣ３−タンパク質まで結合がなかったことを表す。１００ｐＭ未満のＫｄを維持する間に、置換が位置１８で行われる可能性がある。
【表７】
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【０１８０】
８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）のＣ３−スペーサー置換を有する複数の２）−２’−デ−Ｏ−メチル置換または複数の２）−２’−デ−Ｏ−メチル置換。
ヌクレアーゼ耐性を最大にするために、複数の２）−２’−デ−Ｏ−メチル置換を有するアプタマーが所望される。複数の２）−２’−デ−Ｏ−メチル置換と組み合わせたＣ３−スペーサーまたはＨＥＧ部分の添加は、潜在的にさらにヌクレアーゼ安定性を高め得る。上記の２）−２’−デ−ＯＭｅ  ウォークの結合情報に基づいて、いくつかの２）−２’−デ−ＯＭｅの添加が、このような置換（配列番号：１１６〜１３０）を可能にするためにすでに同定されたシトシンヌクレオチドのためのＣ３−スペーサーまたはＨｅｇ部分の同時置換の有無にかかわらず、各アプタマー内に組み込まれた、いくつかのアプタマーが作製された。さらに、特定の位置での塩基置換は、Ｃ３−スペーサー（配列番号：１３８〜１５１）の同時置換の有無にかかわらず、いくつかの２）−２’−デ−ＯＭｅ置換と組み合わせて探索された。作製される配列及び関連する結合親和性を表８に示す。この表では、上付き文字１（１）は、２）−２’−デ−Ｏ−メチル置換を有するヌクレオチドを表し、「Ｐ」はＮａｐｄＵを表し、「Ｃ３」は、３炭素スペーサーを表し、「Ｈｅｇ」はヘキサエチレングリコールを表し、「Ａ」、「Ｃ」、「Ｔ］、「Ｕ］及び「Ｇ」は、天然に存在する核酸塩基を表し、「ＮＢ」は最高１００ｎＭのヒトＣ３−タンパク質まで結合がなかったことを表す。すべての組み合わせが、高親和性結合を維持してはいない。たとえば、８４９１−９４＿９１（配列番号：１１９）、８４９１−９４＿９２（配列番号：１２０）、及び８４９１−９４＿１２６（配列番号：１３８）は、識別可能な結合活性をまったく示さなかった。しかし、２）−２’−デ−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する、８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）を含む他の組み合わせは、依然として、ヒトＣ３−タンパク質との高い親和性を維持している。溶血アッセイにおけるＣ３−タンパク質を阻害するそれらの能力について代表的な配列を試験した（図５ｂ）。アプタマーの８４９１−９４＿９０（配列番号：１１８）、８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）及び８４９１−９４＿１００（配列番号：１２８）は、それぞれ、１８．９ｎＭ、１５．６ｎＭ、及び１９．７ｎＭのＩＣ５０値で阻害した。さらに、アプタマーの８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）は、３μＭのＩＣ５０値で３４％正常ヒト血清中のＣ３ａの放出を阻害することが示されている（図６）。
【表８】
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【０１８１】
実施例５：ＤＮアーゼＩまたはＤＮアーゼＩＩによる消化にアプタマー感度の決定。
この実施例では、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）またはデオキシＩＩ（ＤＮアーゼＩＩ）による消化に対するアプタマーの感度を決定するために本明細書で使用される一般的な方法及び材料の概要を提供する。ＤＮアーゼＩのアプタマー安定性アッセイの場合、２５０ｎＭの終濃度のポリアクリルアミドゲル精製アプタマーを、１００μＬの全反応量で、ヌクレアーゼ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．６、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣａＣｌ２）において３７℃で、２ユニット／ｍＬの組換えヒトＤＮアーゼＩ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＣＳＩ１０７１９）とともにインキュベートした。様々な時間で、１５μＬのアリコートを収集し、等量の２×ゲルローディング緩衝液（９３．８５％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳ、２０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．０５％キシレンシラノール及び０．１％オレンジＧ）を添加して反応を停止し、２分間９５℃で加熱した。消化産物を１５％ポリアクリルアミド変性ゲル（８Ｍ尿素）を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により全長アプタマーから分離した。電気泳動は、トリスホウ酸緩衝液系中で２０分間２００Ｖで行った。約２μＭのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で１０分間ゲルを染色して、バンドを可視化した。ＦｌｏｕｒＣｈｅｍ（登録商標）Ｑ解析ソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して、各時点での残存全長アプタマーの量を定量化した。必要に応じて、バックグラウンド除去の後に各バンドの強度を測定し、データを、０時点での全長投入ＤＮＡの残存パーセンテージとして示す。３）−２’−デ−３）−２’−デ結合ｄＴの「キャップ」を有するアプタマーの版を含む５）−２’−デ−ヒドロキシルを、これらの実験に利用した。
【０１８２】
ＤＮアーゼＩＩのアプタマー安定性アッセイの場合、２５０ｎＭの終濃度のポリアクリルアミドゲル精製アプタマーを、１００μＬの全反応量で、ヌクレアーゼ緩衝液（０．１ＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ４．６、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのＮａＣｌ２）において３７℃で、１４０ユニット／ｍＬのブタＤＮアーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とともにインキュベートした。様々な時間で、１５μＬのアリコートを収集し、等量の２×ゲルローディング緩衝液（９３．８５％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳ、２０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．０５％キシレンシラノール及び０．１％オレンジＧ）を添加して反応を停止し、２分間９５℃で加熱した。試消化産物は、１５％ポリアクリルアミド変性ゲル（８Ｍ尿素）を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により全長アプタマーから分離し、電気泳動は、トリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液系中で２０分間２００Ｖで行った。約２μＭのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ１１４９４）で１０分間ゲルを染色して、バンドを可視化した。ＦｌｏｕｒＣｈｅｍ（登録商標）Ｑ解析ソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して、各時点での残存全長アプタマーの量を定量化した。必要に応じて、バックグラウンド除去の後に各バンドの強度を測定し、データを、０時点での全長投入ＤＮＡの残存パーセンテージとして示す。３）−２’−デ−３）−２’−デ結合ｄＴの「キャップ」を有するアプタマーの版を含む５）−２’−デ−ヒドロキシルを、これらの実験に利用した。
【０１８３】
これらのアッセイは、複数の２）−２’−デ−Ｏ−メチル置換を有するアプタマーが、２）−２’−デ−Ｏ−メチル置換を含有するアプタマーの２８−ｍｅｒの８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）と比較してヌクレアーゼ耐性が向上したかどうかを決定するために使用した。８４９１−９４＿５３における、ＮａｐｄＵヌクレオチド、２）−２’−デ−ＯＭｅ置換及び３）−２’−デ末端での反転デオキシチミジンの添加の使用は、共に、未修飾ＤＮＡと比較してかなりの程度のヌクレアーゼ保護を与え得る。それにもかかわらず、８４９１−９４＿５３は、ヌクレアーゼの存在下で、まだ完全に安定していない。たとえば、８４９１−９４＿５３（配列番号：５８）は、ヒト組換えＤＮアーゼＩ（図７）及びブタ膵臓ＤＮアーゼＩＩ（図８）により消化することができる。図７に示すように、全長８４９１−９４＿５３アプタマー（上のバンド）の強度は、２時間かけて約２０％の低下、図８では、強度は１２時間かけて約７５％の低下が、ＤＮアーゼＩ及びＤＮアーゼＩＩによる消化の感受性をそれぞれ示している。複数の２）−２’−デ−ＯＭｅ置換を有する４つのアプタマーは、ヌクレアーゼ耐性についても試験した。これらは、８４９１−９４＿９０（１０  ２）−２’−デ−ＯＭｅ置換）、８４９１−９４＿９７（１７  ２）−２’−デ−ＯＭｅ置換）、８４９１−９４＿１００（１５  ２）−２’−デ−ＯＭｅ置換及び３  Ｃ３−スペーサー置換）及び８４９１−９４＿１０２（９  ２）−２’−デ−ＯＭｅ置換及び３  Ｃ３−スペーサー置換）である。アプタマーの８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）及び８４９１−９４＿１０２（配列番号：１３０）は、ＤＮアーゼＩに対する安定性の高さを示し、アプタマーの８４９１−９４＿９０（配列番号：１１８）及び８４９１−９４＿１００（配列番号：１２８）は示さなかった（図７）。アプタマーの８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）及び８４９１−９４＿１００（配列番号：１２８）は、ＤＮアーゼＩＩに対する安定性の高さを示し、アプタマーの８４９１−９４＿９０（配列番号：１１８）及び８４９１−９４＿１０２（配列番号：１３０）は示さなかった（図８）。したがって、アプタマーの８４９１−９４＿９７（配列番号：１２５）は、ＤＮアーゼＩ及びＤＮアーゼＩＩの両方に対する安定性の高さを示した複数のヌクレアーゼ安定化置換で試験された４つのアプタマーのうちの１つだった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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