(57)【要約】  本願は、いくつかの側面において、目的のタンパク質を安定化または不安定化する試験化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。
2017530711.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質を安定化または不安定化する試験化合物を同定するための方法であって、
（ｉｖ）ＤＮＡプラスミドを含む形質転換宿主細胞を試験化合物と接触させること、ここで、プラスミドは、作動可能な連結中に、
（ｆ）プロモーター；
（ｇ）第１の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；
（ｈ）第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）第２のＩＲＥＳ；および
（ｊ）第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列、
ここでオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合されており、および前記オープンリーディングフレームは、目的のタンパク質についてコードする；
を含む；
（ｖ）融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルの比を、試験化合物の存在および不在において決定すること；および
（ｖｉ）試験化合物の存在における融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比と比較して増加している場合に、前記試験化合物を安定化剤として同定すること、および、試験化合物の存在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比と比較して減少している場合に、前記試験化合物を不安定化剤として同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第１のおよび第２のレポータータンパク質が、識別可能で検出可能なレポーターシグナルを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のおよび第２のレポータータンパク質が、それらの生産物から生成された識別可能なシグナルを有する酵素タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のおよび第２のレポータータンパク質が、識別可能な生物発光シグナルを有する生物発光タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のおよび第２のレポータータンパク質が、識別可能な蛍光シグナルである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
第１のおよび第２のレポータータンパク質が、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
第１のおよび第２のレポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
プロモーターが、真核生物プロモーターまたは合成プロモーターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記オープンリーディングフレームが、生物のＯＲＦｅｏｍｅに由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オープンリーディングフレームが、がんタンパク質をコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんタンパク質が、ＭＹＣ、Ｉｋａｒｏｓファミリージンクフィンガータンパク質１（ＩＫＺＦ１）、Ｉｋａｒｏｓファミリージンクフィンガータンパク質３（ＩＫＺＦ３）、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、変異体ｐ５３、Ｎ−Ｒａｓ、ｃ−Ｆｏｓ、およびｃ−Ｊｕｎからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
プラスミドを含む形質転換宿主細胞を試験化合物と接触させることが、適切な時間、試験化合物の存在において、形質転換宿主細胞を増殖させることを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年１０月１０日に出願された米国仮出願第６２／０６２，２５７号に対する、米国特許法第１１９条（ｅ）の下の優先権を主張し、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究
本発明は、国立衛生研究所により付与された２Ｒ０１ＣＡ０６８４９０−１９および２Ｒ０１ＣＡ０７６１２０−１３に基づく政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
レポーターアッセイは、タンパク質機能に影響を与えるリード化合物を同定するために、製薬産業およびバイオテクノロジー産業において日常的に用いられている。この１０年間で、コンビナトリアル・ケミストリーなどの技術により、短時間で大量の化合物を合成する化学者の能力は著しく増大し、しばしば、目的のタンパク質への所望の作用を有するものを同定するために、何千〜何百万もの化合物をスクリーニングすることが必要となる。
【０００４】
典型的に、レポーターアッセイは、サンプル中の１つのレポータータンパク質の活性を測定するが、複数のレポーターを組み合わせてもよい。複数のレポーターの共発現のための１つの戦略は、バイシストロン性のコンストラクトの設計を含み、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列により分離されている２つの遺伝子は、共通の上流のプロモーターの制御下で、単一の転写カセット（またはバイシストロン性転写物）として発現される（Yen et al., Science. 2008 Nov 7;322(5903):918-23）。ＩＲＥＳ配列の介入は、翻訳の効率的なキャップ非依存性内部開始のためのリボソーム結合部位として機能する。かかる設計は、ＩＲＥＳ指向性キャップ非依存性翻訳による双方の遺伝子の転写を可能にする。このシステムは、それぞれの試験サンプルにおける対照において標準化される試験レポーターとともに、実験的処置に関して変化することを予測されない双方の対照レポーターの共発現を可能にする。しかしながら、細胞における多くの摂動は、キャップ非依存性翻訳と比較して、キャップ依存性翻訳に差次的に影響を与え得る。さらに、いくつかのＩＲＥＳは、下流遺伝子の可変的な発現を表すことを示している（Wong et al. Gene Ther. 2002 Mar;9(5):337-44）。これは、高い偽陽性および信頼できないレポーターアッセイを導く。したがって、レポーター活性における非特異的な改変が、細胞ベースタンパク質安定性アッセイにおける固有の変動性のための対照に用いられる場合に、タンパク質安定性の分析のための効率的なハイスループットアプローチの必要性が存在する。これは、ＨＴＳアッセイを効果的かつ効率的に実行するために要求される、データにおけるエラーを低下させることを可能にする。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本開示は、いくつかの側面において、特定の摂動後に、何千ものタンパク質の安定性を効率的にモニターするために用いることができるプラスミドの開発に関する。
【０００６】
いくつかの側面によれば、本開示は、目的のタンパク質を安定化または不安定化する試験化合物を同定するための方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）ＤＮＡプラスミドを含む形質転換宿主細胞を試験化合物と接触させること、ここで、前記プラスミドは、作動可能な連結中に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）第１の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；
（ｃ）第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）第２のＩＲＥＳ；および
（ｅ）第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列、
を含み、ここで、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合されており、および、ここで、前記オープンリーディングフレームは、目的のタンパク質についてコードする；
（ｉｉ）試験化合物の存在および不在において、融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比を決定すること；および
（ｉｉｉ）試験化合物の存在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比と比較して増加している場合に、前記試験化合物を安定化剤として同定すること、および、試験化合物の存在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比と比較して減少している場合に、前記試験化合物を不安定化剤として同定すること、
を含む。
【０００７】
いくつかの態様において、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、識別可能で検出可能なレポーターシグナルを有する。いくつかの態様において、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、それらの生産物から生成される、識別可能なシグナルを有する酵素タンパク質である。いくつかの態様において、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、識別可能な生物発光シグナルを有する生物発光タンパク質である。いくつかの態様において、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、識別可能な蛍光シグナルを有する蛍光タンパク質である。いくつかの態様において、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）およびホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）からなる群から選択される。いくつかの態様において、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される。いくつかの態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターまたは合成プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、生物のＯＲＦｅｏｍｅに由来する。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、がんタンパク質をコードする。いくつかの態様において、がんタンパク質は、ＭＹＣ、Ｉｋａｒｏｓファミリージンクフィンガータンパク質１（ＩＫＺＦ１）、Ｉｋａｒｏｓファミリージンクフィンガータンパク質３（ＩＫＺＦ３）、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、変異体ｐ５３、Ｎ−Ｒａｓ、ｃ−Ｆｏｓ、およびｃ−Ｊｕｎからなる群から選択される。いくつかの態様において、プラスミドを含む形質転換宿主細胞を試験化合物と接触させることは、適切な時間、試験化合物の存在において、形質転換宿主細胞を増殖させることを含む。
【０００８】
本発明の態様および側面のそれぞれは、独立して、または組み合わされて実施され得る。また、本明細書で用いられる言葉づかいおよび専門用語は、説明の目的のためのものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」または「有する」、「含有する」、「含む（involving）」、および本明細書におけるそれらの変形の使用は、以後に列挙される項目、およびそれらの等価物のみならず、さらなる項目を包含することを意味する。
【０００９】
本発明のこれらのおよび他の側面、ならびに様々な利点および有用性は、詳細な説明に関連して明らかであるだろう。本発明の側面のそれぞれは、理解されるように、様々な態様を包含し得る。
【００１０】
この出願において同定される全ての文献は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図面の簡単な説明
添付の図面は、縮尺どおりに描かれることを意図しない。図面において、様々な図面に例証されるそれぞれの同一のまたはほぼ同一の構成成分は、同様の数字により表される。明確性の目的のために、全ての構成要素が、全ての図面においてラベル付けされるとは限らない。
【図１】図１は、ｐＩＲＩＧＦコンストラクトが２９３ＦＴおよびＨＥＬＡ細胞において発現し（図１Ａ〜Ｃ）、ｐＵＧ−ＦＩＲＰコンストラクトがＵ−２  ＯＳ細胞において発現する（図１Ｄ）ことを確認する。数個の異なるバージョンの哺乳動物およびレンチウイルスプラスミドコンストラクトを、タグ付けされた標的タンパク質（例えば、ホタルまたはＮａｎｏＬｕｃタグ）を発現する、およびレポータールシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケまたはホタル）を共発現する細胞（例えば、２９３ＦＴ、ＨＥＬＡ、またはＵ−２  ＯＳ細胞）を生成するそれらの能力について試験した。
【００１２】
【図２】図２において、２９３ＦＴおよびＨＥＬＡ細胞をＩＫＺＦ１−ホタル、ＩＫＺＦ３−ホタルおよびＭＹＣ−ホタル融合タンパク質でトランスフェクトし、それぞれピューロマイシンとジェネテシンとを用いて選択した。これらのプールは、極めて不安定であり、１０〜３０日でシグナルを喪失し、一般的に、ＩＭｉＤに対する極めて小さな応答を有した（図２Ａ〜Ｃ）。したがって、個別のクローンを９６ウェルプレートにおいて限定的クローニング戦略を用いて単離した。生存する細胞をコロニーとして単離し、さらに拡大培養し、ルシフェラーゼシグナルおよびＩＭｉＤに対する応答について試験した。クローン２Ｂ４をレナリドマイドに対する強力なレスポンダー（responder）として同定した。ＨＥＬＡ細胞は、極めて低いレベルのルシフェラーゼを発現し、ＨＥＬＡクローンの単離を極めて困難にした。ホタル、ＩＫＺＦ１およびｍｙｃのウェスタンブロットによる検出は、融合タンパク質の発現を確認し、相対的な発現は、ホタルルシフェラーゼシグナルと相関した（図２Ｄ）。
【００１３】
【図３】図３において、指示されるホタル融合タンパク質を発現する細胞株クローン（ＩＫＺＦ１−２Ｂ４、ＩＫＺＦ１−２Ｂ１１、ｍｙｃ−１Ｃ３およびｍｙｃ−５Ｆ２）をdual-gloアッセイにおいて、再現性について評価した。ＩＭｉＤの有効性およびホタルルシフェラーゼシグナルの相対的低下は、予測される応答およびスクリーニングに十分なＺ’値を有する生成されたデータを確認した（図３Ａ〜Ｄ）。
【図４】図４は、ＩＫＺＦ１  ２Ｂ４細胞−活性化合物（Prestwickコレクション；図４Ａ）およびNCIコレクション；図４Ｂ）についてのパイロットスクリーニング結果を示す。
【図５】図５は、ＭＹＣ  ５Ｆ２細胞−活性化合物NCIコレクション）についてのパイロットスクリーニング結果を示す。
【００１４】
【図６】図６は、ＩＫＺＦ１  ２Ｂ４およびＭＹＣ  ５Ｆ２細胞株に関して試験したヒットを確認した（図６Ａ〜Ｃ）。市販化合物からの、およびＤＴＰ化合物からの再試験データを、図６Ｄ〜Ｅに示す。
【図７】図７は、ウェスタンブロットを用いた確認データを示す。ＩＫＺＦ１  ２Ｂ４細胞株例（図７Ａ〜Ｂ）、ＭＹＣ  ５Ｆ２例（図７Ｃ）。
【図８】図８は、ＨＳＰ９０阻害剤のさらなる評価を示す。図８Ａは、ＭＹＣ−ホタル融合タンパク質で一時的にトランスフェクトした細胞に関するＨＳＰ  ９０阻害剤ＣＣＴ０１８１５９およびゲルダナマイシンの試験を例証する。図８Ｂは、ＭＹＣ−ホタル融合タンパク質を安定的に発現する２９３ＦＴ細胞に関するＨＳＰ  ９０阻害剤ＣＣＴ０１８１５９およびゲルダナマイシンの試験を示す。図８Ｃは、ＭＹＣ−ホタル融合タンパク質を安定的に発現する５つの異なる細胞株に関する、様々な用量でのいくつかのＨＳＰ−９０阻害剤の試験を示す。図８Ｄは、ＩＫＺＦ１−ホタル融合タンパク質を一時的に発現する２９３ＦＴ細胞に関するＨＳＰ９０阻害剤ＢＩＩＢ０２１とポマリドマイドを比較する。
【００１５】
【図９】図９は、ＩＣＣＢスクリーニング結果の概要を示す。具体的には、それは、ＩＫＺＦ１  ＩＣＣＢスクリーニングについて任意に選択した（cherry pick）再試験を示す。
【図１０】図１０は、ＩＫＺＦ１対ＭＹＣ細胞株における活性の比較を示す。ＩＫＺＦ１およびＭＹＣ細胞株において任意に選択した１３３個を、再試験した。
【図１１】図１１は、ＨＳＰ９０阻害剤：ＢＩＩＢ０２１（図１１Ａ）およびＰＦ−０４９２９１１３（図１１Ｂ）について、１６時間における優れた用量応答を示す
【００１６】
【図１２】図１２は、ルシフェラーゼタグ付けされていないシクロヘキサミド（図１２Ａ）およびルシフェラーゼタグ付けされているシクロヘキサミド（図１２Ｂ）を含む、７つのＭＹＣ細胞株に関するシクロヘキサミド経時変化を示す。
【図１３】図１３は、ルシフェラーゼタグ付けされたＭＧ−１３２（図１３Ａ）およびルシフェラーゼタグ付けされていないＭＧ−１３２（図１３Ｂ）を含む、７つのＭＹＣ細胞株に関するＭＧ−１３２経時変化を示す。
【図１４】図１４は、ルシフェラーゼタグ付けされたＭＬＮ４９２４（図１４Ａ）およびルシフェラーゼタグ付けされていないＭＬＮ４９２４（図１４Ｂ）を含む、７つのＭＹＣ細胞株に関するＭＬＮ４９２４経時変化を示す。
【００１７】
【図１５】図１５は、ＭＹＣ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡでの４８時間処置を用いたＭＹＣノックダウン後のＡ５４９−ＭＹＣ−ホタルおよびＨ１２９９−ＭＹＣ−ホタルのウェスタンブロット確認を示す。ＭＹＣおよびホタルに対する抗体（図１５Ａ）を用いたウェスタンブロッティングにより観察されるような融合タンパク質の低下は、ルシフェラーゼシグナルの減少と比較される（comparted to）（図１５Ｂ）。ＭＹＣ抗体はまた、内因性ＭＹＣの減少を検出する。
【図１６】図１６は、Ａ５４９（図１６Ａ）、Ｈ１２９９（図１６Ｂ）、およびＭＹＣ−ホタルを発現するＨＥＫ２９３Ｔ（図１６Ｃ）細胞およびＭＹＣ−ｎａｎｏｌｕｃを発現するＵ２ＯＳ（図１６Ｄ）細胞を含む、ＤＵＢ酵素のファミリーに対するｓｉＲＮＡの市販ライブラリーからのスクリーニング結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本願は、いくつかの側面において、特定の摂動後に、何千ものタンパク質の安定性を効率的にモニターするために用いることができるプラスミドの開発に基づく。プラスミドは、そのそれぞれがＩＲＥＳの制御下に置かれる、２つのレポータータンパク質の共発現を可能にする。この方式において、双方のレポーターは、一緒に転写され（すなわち、同じｍＲＮＡによりコードされている）、そして双方は、ＩＲＥＳを用いて翻訳される。これは、ＩＲＥＳ非依存性翻訳に対してＲＥＳ依存性翻訳を差次的にもたらす、摂動（例えば、化合物）により引き起される２つのレポーターの比における偽の変化の問題を最小化し、したがって、偽陽性を最小化する。
【００１９】
いくつかの側面によれば、本開示は、目的のタンパク質を安定化または不安定化する試験化合物を同定するための方法を提供する。方法は、
（ｉ）ＤＮＡプラスミドを含む形質転換宿主細胞を試験化合物と接触させること、ここで、プラスミドは、作動可能な連結（operable linkage）中に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）第１の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；
（ｃ）第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）第２のＩＲＥＳ；および
（ｅ）第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列、
を含み、ここで、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合されており、および、ここで、前記オープンリーディングフレームは、目的のタンパク質についてコードする；
（ｉｉ）試験化合物の存在および不在において、融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルの比を決定すること；および
（ｉｉｉ）試験化合物の存在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比と比較して増加している場合に、前記試験化合物を安定化剤として同定すること、および、試験化合物の存在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比と比較して減少している場合に、前記試験化合物を不安定化剤として同定すること、
を含む。
【００２０】
本明細書で用いられる「作動可能な連結」は、転写制御エレメント（例えば、プロモーター）および連結された転写された配列などの２つの核酸配列間の機能的な連結を指す。したがって、それが遺伝子の転写を媒介する場合、プロモーターは、遺伝子と作動可能な連結中にある。
【００２１】
本明細書で用いられる「プロモーター」は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ、および行われる転写のための転写因子のための結合部位を提供する特異的なＤＮＡ配列（反応性エレメント）を含有する。いくつかの態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターまたは合成プロモーターである。プロモーターの例は、限定されないが、ＴＡＴＡボックス、シミアンウイルス４０からのＳＶ４０後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣプロモーター）およびＴ７プロモーターを含む。これらの、および他のプロモーター配列は、当該技術分野においてよく知られている。本発明の１つの例において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。本発明の１つの例において、プロモーターは、ＵｂＣプロモーターである。
【００２２】
本明細書で用いられる、「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＲＮＡ分子上のリボソームの内部進入を媒介し、これにより真核生物系において翻訳を調節する、シス作用核酸エレメントである。本発明の方法および組成物において、第１のおよび第２のＩＲＥＳエレメントは、プラスミド中に含有される。第１のおよび第２のＩＲＥＳエレメントは、レポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列、および単一のメッセンジャーＲＮＡからの別のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合されているオープンリーディングフレームの独立した翻訳を許容する。いくつかの態様において、第１のおよび第２のＩＲＥＳは、同じである（すなわち、それらは、同一の配列を有する）。いくつかの態様において、第１のおよび第２のＩＲＥＳは、同じではない（すなわち、それらは、同一の配列を有しない）。
【００２３】
多くのＩＲＥＳエレメントは、ウイルスおよび真核生物ゲノムの双方において同定されている。加えて、合成ＩＲＥＳエレメントもまた、開発されている。例えば、ＩＲＥＳエレメントは、エンテロウイルス（例えば、ヒトポリオウイルス１（Ishii et al. (1998) J Virol. 72:2398- 405 and Shiroki et al. (1997) J. Virol. 77:1-8）、ヒトコクサッキーウイルスＢ）；ライノウイルス（例えば、ヒトライノウイルス）；ヘパトウイルス（Ａ型肝炎ウイルス）；カルジオウイルス（脳心筋炎ウイルスＥＣＭＶ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０４１９２７のヌクレオチド２１３７−２７５２、およびKim et al. (1992) Mol Cell Biology 72：３６３６−４３）およびタイラー（Etheirler's）脳脊髄炎ウイルス）；アフトウイルス（口蹄疫ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３０８１５７のヌクレオチド６００−１０５８；Belsham et al. (1990) EMBO 77:1105-10; Poyry et al. (2001) RNA 7:647-60；およびStoneley et al. (2000) Nucleic Acid Research 25:687-94）、ウマ鼻炎Ａウイルス、ウマ（Ewuine）鼻炎Ｂ）；ペスチウイルス（例えば、ウシウイルス性下痢ウイルス（Poole et al. (1995) Virology 206:150-154）およびブタコレラウイルス（Rijnbrand et al. (1997) J. Virol 77:451-7）；ヘパシウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（Tsukiyama-Kohara et al. (1992) J. Virol. 66:1476-1483, Lemon et al. (1997) Semin. Virol. 5:274-288、およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２４２６５４のヌクレオチド１２０１−１８１２）およびＧＢウイルスＢ）属のメンバーを含む様々なウイルスにおいて発見されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
ＩＲＥＳエレメントはまた、レンチウイルス科（例えば、サル免疫不全ウイルス（Ohlmann et al. (2000) Journal of Biological Chemistry 275:11899-906）およびヒト免疫不全ウイルス１（Buck et s/. (2001) J Virol. 75:181-91）；ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス（例えば、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（Attal et al. (1996) EEES Letters 392:220-4）；および哺乳類Ｃ型レトロウイルス科（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Vagner et al. (1995) J. Biol. Chem 270:20316-83）、フレンドマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス（Avian retriculoendotheliosis )(Lopez-Lastra et al. (1997) Hum. Gene Ther 5:1855-65）、マウス白血病ウイルス（ｅｎｖ  ＲＮＡ）（Deffaud et al. (2000) J. Virol. 74:846-50）、ラウス肉腫ウイルス（Deffaud et al. (2000) J. Virol. 74:11581-8）のメンバーを含む、レトロウイルス科からのウイルスにおいて発見されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
真核生物のｍＲＮＡはまた、例えば、ＢｉＰ（Macejak et al. (1991) Nature 355:91）；ショウジョウバエのアンテナペディア（エクソンｄおよびｅ）（Oh et al. (1992) Genes and Development 6:1643-1653；ｃ−ｍｙｃ；およびアポトーシスのＸ連結阻害剤（ＸＩＡＰ）遺伝子（米国特許第６，１７１，８２１号）を含むＩＲＥＳエレメントを含有する。
【００２６】
様々な合成ＩＲＥＳエレメントは、生成されている。例えば、De Gregorio et al. (1999) EMBO J. 75:4865-74; Owens et al. (2001) PNAS 4:1471-6；およびVenkatesan et al. (2001) Molecular and cellular Biology 21:2826-37を参照。当該技術分野において知られているさらなるＩＲＥＳエレメントについては、例えば、rangueil.inserm.fr/IRESdatabaseを参照。
特定の態様において、ＩＲＥＳ配列は、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）に由来する。
【００２７】
本明細書で用いられるレポータータンパク質は、例えば、その蛍光または酵素活性を介して発現される場合に特異的に検出され得る（すなわち、発現される場合に検出可能なシグナルを有する）、任意のタンパク質である。プラスミドは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列および第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。オープンリーディングフレームは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列のいずれかと融合されている。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合されている。いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合されている。これは、異なる刺激に応答して、連結したオープンリーディングフレームの発現を研究することを可能にする。本明細書で用いられる「融合されている」は、ＯＲＦによりコードされているアミノ酸、およびレポータータンパク質が、連続したタンパク質配列を作り出すために、ペプチド結合により接続されていることを意味することを意図する。したがって、オープンリーディングフレームと融合されているレポータータンパク質は、融合されているオープンリーディングフレームの安定性のマーカーとして役割を果たす。オープンリーディングフレームと融合されていない他のレポータータンパク質（および、したがって、ＯＲＦによりコードされるアミノ酸を含む連続したタンパク質配列を作り出さない）は、細胞数および発現可変性に対して標準化するための内部対照として役割を果たす。
【００２８】
典型的に、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、識別可能で検出可能なレポーターシグナルを有する。例えば、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、それらの生産物から生成される識別可能なシグナルを有する酵素タンパク質である。いくつかの態様において、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、異なる波長において光を放射するおよび／または異なる基質を利用する生物発光タンパク質である。あるいは、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、異なる波長において蛍光を発する蛍光タンパク質である。
【００２９】
限定されないが、生物発光タンパク質、蛍光レポータータンパク質、および特異的な検出可能な生産物を生産する、ベータ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素タンパク質を含む当該技術分野において知られている多くのレポータータンパク質が用いられてもよい。蛍光レポータータンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ならびにそれらの改質された形態、例えば、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、増強ＲＦＰ（ＥＲＦＰ）、ｍＣＨＥＲＲＹ、および増強ＹＥＰ（ＥＹＥＰ）を含む。
【００３０】
限定されないが、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）およびＮａｎｏＬｕｃを含む、ルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質の例は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Fan, F. and Wood, K., Assay and drug development technologies V5 #1 (2007); Gupta, R. et al Nature Methods V8 #10 (2011)；Nano-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega）およびen.wikipedia.org/wiki/Bioluminescenceを参照）。
【００３１】
レポータータンパク質の他の非限定的な例は、以下に示される。
【表１】
2017530711.tif 000003
【００３２】
いくつかの態様において、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）およびＮａｎｏＬｕｃからなる群から選択される。いくつかの態様において、第１のおよび第２のレポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される。
【００３３】
オープンリーディングフレームは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列または第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列の何れかと融合されている。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド配列の５’または３’末端と融合されている。本明細書で用いられるオープンリーディングフレームまたはＯＲＦは、アミノ酸の連続した配列についてコードするヌクレオチドの配列を指す。翻訳されるオープンリーディングフレームは、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子の全てまたは一部であってもよい。
【００３４】
プラスミドのＯＲＦは、目的のタンパク質についてコードする。本明細書で用いられる「目的のタンパク質」は、例えば、研究、さもなければ特徴付けなどの目的のものであってもよい、任意の想定されるポリペプチドまたはタンパク質であり得る。いくつかの態様において、ＯＲＦは、生物のＯＲＦｅｏｍｅに由来してもよい。完全なＯＲＦｅｏｍｅは、所定の生物の全てのタンパク質をコードする核酸を含有する。全ＯＲＦｅｏｍｅの代表的な部分は、生物により発現される全てのタンパク質の少なくとも６０％である。いくつかの態様において、生物は哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。
【００３５】
いくつかの態様において、目的のタンパク質は、ヒトポリペプチドまたはタンパク質である。いくつかの態様において、目的のタンパク質は、限定されないが、ＲＡＳ、ＭＹＣ、ＳＲＣ、ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＭＹＢ、ＡＢＬ、ＢＣＬ２、ＨＯＸ１１、ＨＯＸ１１Ｌ２、ＴＡＬ１／ＳＣＬ、ＬＭＯｌ、ＬＭ０２、ＥＧＦＲ、ＭＹＣＮ、ＭＤＭ２、ＣＤＫ４、ＧＬＩ１、ＩＧＦ２、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＴＰ５３、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ＨＥＲ２  ＮＥＵ、ＦＬＴ３Ｒ、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＴＡＮ１、Ｂ−ＲＡＦ、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１、およびＮＰＭ−ＡＬＫなどのがんタンパク質、ならびに、ＰＡＸおよびＦＫＨＲ遺伝子ファミリーのメンバー、ＷＮＴ、ＭＹＣ、ＥＲＫ  ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ３、ＣＤＨ５、ＫＩＴ、ＲＥＴ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）およびＴＲＫの融合物である。他の例示的ながん遺伝子は、当該技術分野においてよく知られており、いくつかのかかる例は、例えば、The Genetic Basis of human Cancer (Vogelstein, B. and Kinzler, K. W. eds. McGraw-Hill, New York, N.Y., 1998)に記載されている。
【００３６】
いくつかの態様において、目的のタンパク質は、転写因子である。かかる転写因子のいくつかの例は、（限定されないが）ＳＴＡＴファミリー（ＳＴＡＴ１、２、３、４、５ａ、５ｂ、および６）、ＦＯＳ／ＪＵＮ、ＮＦ  κＢ、ＨＩＶ−ＴＡＴ、およびＥ２Ｆファミリーを含む。いくつかの態様において、目的のタンパク質は、ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガータンパク質である。いくつかの態様において、目的のタンパク質は、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＩＫＺＦ４、またはＩＫＺＦ５である。いくつかの態様において、目的のタンパク質は、ＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ３である。
【００３７】
レポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列および融合されているＯＲＦは、「インフレーム」、すなわち、レポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単一のポリヌクレオチドの連続するトリプレットコドンであり、融合されているオープンリーディングフレームは、単一の連続的なアミノ酸配列をコードする。
【００３８】
本明細書に記載される方法は、化合物のライブラリーをスクリーニングし、目的のタンパク質を安定化または不安定化する試験化合物を同定することを可能にする。化合物ライブラリーは、ハイスループットスクリーニングにおいて典型的に用いられる、保管されている化合物のコレクションである。ライブラリー化合物は、例えば、合成された有機分子、天然の有機分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子、およびこれらの構成要素を含んでもよい。化合物ライブラリーの例は、限定されないが、Screen-Well（登録商標）Compound Library（Enzo Life Sciences）、EXPRESS-Pick CollectionおよびＣＯＲＥ Library（Chem Bridge）、National Cancer Institute Library、Prestwick Chemical Library（登録商標）およびTocriscreen Compound Library Collectionsを含む。
【００３９】
本明細書に記載されるプラスミドは、当該技術分野において知られている任意の利用可能な技術を用いて宿主細胞に導入されてもよい。例えば、プラスミドは、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、ソノポレーション、感染、および光学トランスフェクションにより宿主細胞に導入されてもよい。好適な宿主細胞は、限定されないが、細菌細胞（例えば、E. coli、Bacillus subtilis、およびSalmonella typhimurium）、酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiaeおよびSchizosaccharomyces pombe）、植物細胞（例えば、Nicotiana tabacumおよびGossypium hirsutum）、および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、および３Ｔ３線維芽細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ−２  ＯＳ細胞）を含む。
【００４０】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるプラスミドで形質転換された宿主細胞と試験化合物を接触させることは、好適な培養条件下で、適切な時間、試験化合物の存在において形質転換宿主細胞を増殖させることを含む。培養の持続期間を含む好適な培養条件は、培養される細胞に依存して変更される。しかしながら、当業者は、一連のMethods in Microbiology, Academic Press Inc.に記載されるものなどの標準的なプロトコールに従うことにより、培養条件を容易に決定することができる。典型的に、細胞培養培地は、適切な量および組み合わせにおいて、任意の以下の栄養物を含有してもよい：塩、緩衝剤、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清置換物、および他の構成成分、例えば、限定されないが、ペプチド増殖因子、補因子、および微量元素。いくつかの態様において、トランスフェクトされた宿主細胞は、化合物の存在において、１５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２４時間、３０時間、４８時間、または７２時間、増殖される。
【００４１】
いくつかの態様において、単一の形質転換宿主細胞は、最初に、対照試験化合物に対する最適化された応答に基づいて、単離、クローン化および拡大培養され、ＨＴＳキャンペーンに要求される十分に低いエラーを提供することが確認される。適切なクローンの選択は、ハイスループットスクリーニングに要求される必要な応答安定性および再現性を有する、融合されていないレポーターと比べた融合されているレポーター目的のタンパク質の応答を決定することにより助けられる。有用なクローンの同定は、対照の融合されていないレポーターに対して、融合されているレポーターシグナルをさらに標準化することにより、助けられ、これは、融合されているレポーターからのみの応答を測定することと比べて、内在するエラーを著しく低下させることができる。このエラーの低下は、ハイスループットスクリーニングに十分なＺ因子（en.wikipedia.org/wiki/Z-factor）を提供するために、処置および未処置のサンプルから観察されるそれぞれのシグナルから得られる応答エラーと比べて、十分に大きい応答を有する試験化合物に対して応答する有用なクローン細胞株の同定に重要である。
【００４２】
本明細書で用いられる「融合されているレポータータンパク質シグナル」は、ＯＲＦと融合されているヌクレオチド配列によりコードされるレポータータンパク質の検出可能なシグナルを指す。本明細書で用いられる「融合されていないレポータータンパク質シグナル」は、ＯＲＦと融合されていないヌクレオチド配列によりコードされるレポータータンパク質の検出可能なシグナルを指す。試験化合物の存在および不在における融合されているおよび融合されていないレポータータンパク質シグナルは、当該技術分野において知られている方法を用いて決定される。限定されないが、ルミノメーター、分光光度計および蛍光光度計などの検出器、またはレポータータンパク質活性の変化を検出することができる任意の他のデバイスが、用いられ得る。単一のサンプル中の２つのレポーター遺伝子からの安定的なレポーターシグナルの定量を可能にする当該技術分野において知られているアッセイシステムが、用いられ得る。例は、限定されないが、単一のサンプルから順次、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を測定するDual-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega）を含む。
【００４３】
レポータータンパク質により生成されたシグナルを検出後、試験化合物の存在における融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比は、試験化合物の不在における融合されているレポータータンパク質シグナルと融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比と比較される。試験化合物の存在における融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比と比較して増加している場合に、試験化合物は、目的のタンパク質の安定化剤として同定される。これに対して、試験化合物の存在における融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における融合されているレポータータンパク質シグナルと、融合されていないレポータータンパク質シグナルとの比と比較して減少している場合に、試験化合物は、目的のタンパク質の不安定化剤として同定される。
【００４４】
いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、第１のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合されている。かかる態様において、第１のレポータータンパク質シグナルと第２のレポータータンパク質シグナルとの比は、化合物の存在および不在において決定される。試験化合物の存在における第１のレポータータンパク質シグナルと第２のレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における第１のレポータータンパク質シグナルと第２のレポータータンパク質シグナルとの比と比較して増加している場合に、試験化合物は安定化剤として同定される。試験化合物の存在における第１のレポータータンパク質シグナルと第２のレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における第１のレポータータンパク質シグナルと第２のレポータータンパク質シグナルとの比と比較して減少している場合に、試験化合物は不安定化剤として同定される。
【００４５】
いくつかの態様において、オープンリーディングフレームは、第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合されている。かかる態様において、第２のレポータータンパク質シグナルと第１のレポータータンパク質シグナルとの比は、化合物の存在および不在において決定される。試験化合物の存在における第２のレポータータンパク質シグナルと第１のレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における第２のレポータータンパク質シグナルと第１のレポータータンパク質シグナルとの比と比較して増加している場合に、試験化合物は安定化剤として同定される。試験化合物の存在における第２のレポータータンパク質シグナルと第１のレポータータンパク質シグナルとの比が、試験化合物の不在における第２のレポータータンパク質シグナルと第１のレポータータンパク質シグナルとの比と比較して減少している場合に、試験化合物は不安定化剤として同定される。
【００４６】
本発明は、以下の例によりさらに例証され、それは、決してさらなる限定として解釈されるべきではない。本願を通して引用される全ての参考文献（reference）（参考文献（literature reference）、交付済み特許、公表特許公報、および同時継続特許出願を含む）の全内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【００４７】
例
例１
ｐＩＲＩＧＦコンストラクトは、２９３ＦＴおよびＨＥＬＡ細胞において発現し（図１Ａ〜Ｃ）、ｐＵＧ−ＦＩＲＰコンストラクトは、Ｕ−２  ＯＳ細胞において発現する（図１Ｄ）。哺乳動物およびレンチウイルスプラスミドコンストラクトのいくつかの異なるバージョンを、タグ付けされた標的タンパク質（例えば、ホタルまたはＮａｎｏＬｕｃタグ）を発現する、およびレポータールシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケまたはホタル）を共発現する細胞（例えば、２９３ＦＴ、ＨＥＬＡ、またはＵ−２  ＯＳ細胞）を生成するそれらの能力について試験した。
【００４８】
２９３ＦＴおよびＨＥＬＡ細胞をＩＫＺＦ１−ホタル、ＩＫＺＦ３−ホタルおよびＭＹＣ−ホタル融合タンパク質でトランスフェクトし、それぞれピューロマイシンとジェネテシンとを用いて選択した。これらのプールは、極めて不安定であり、１０〜３０日でシグナルを喪失し、一般的に、ＩＭｉＤに対する大変小さい応答を有した（図２Ａ〜Ｃ）。したがって、個別のクローンを９６ウェルプレートにおいて限定的クローニング戦略を用いて単離した。生存する細胞をコロニーとして単離し、さらに拡大培養し、ルシフェラーゼシグナルおよびＩＭｉＤに対する応答について試験した。クローン２Ｂ４をレナリドマイドに対する強力なレスポンダーとして同定した。ＨＥＬＡ細胞は、極めて低いレベルのルシフェラーゼを発現し、ＨＥＬＡクローンの単離を極めて困難にした。ホタル、ＩＫＺＦ１およびｍｙｃのウェスタンブロットによる検出は、融合タンパク質の発現、およびホタルルシフェラーゼシグナルと相関した相対的な発現を確認した（図２Ｄ）。
【００４９】
指示されるホタル融合タンパク質を発現する細胞株クローン（ＩＫＺＦ１−２Ｂ４、ＩＫＺＦ１−２Ｂ１１、ｍｙｃ−１Ｃ３およびｍｙｃ−５Ｆ２）をdual-gloアッセイにおいて、再現性について評価した。ＩＭｉＤの有効性およびホタルルシフェラーゼシグナルの相対的な低下は、予測される応答を確認し、スクリーニングについて十分なＺ’値を有するデータを生成した（図３Ａ〜Ｄ）。
【００５０】
ＩＫＺＦ１  ２Ｂ４細胞−活性化合物（PrestwickコレクションおよびNCIコレクションについてのパイロットスクリーニング結果を、図４Ａおよび４Ｂに示す。
ＭＹＣ  ５Ｆ２細胞−活性化合物NCIコレクションについてのパイロットスクリーニング結果を、図５に示す。
ＩＫＺＦ１  ２Ｂ４およびＭＹＣ  ５Ｆ２細胞株に関して試験されたヒットを確認した（図６Ａ〜Ｃ）。市販化合物からの、およびＤＴＰ化合物からの概要再試験データを、図６Ｄ〜Ｅに示す。
図７は、ウェスタンブロットを用いた確認データを示す。ＩＫＺＦ１  ２Ｂ４細胞株例（図７Ａ〜Ｂ）、ＭＹＣ  ５Ｆ２例（図７Ｃ）。
【００５１】
図８は、ＨＳＰ９０阻害剤のさらなる評価を示す。図８Ａは、ＭＹＣ−ホタル融合タンパク質で一時的にトランスフェクトした細胞に関するＨＳＰ  ９０阻害剤ＣＣＴ０１８１５９およびゲルダナマイシンの試験を実証する。図８Ｂは、ＭＹＣ−ホタル融合タンパク質を安定的に発現する２９３ＦＴ細胞に関するＨＳＰ  ９０阻害剤ＣＣＴ０１８１５９およびゲルダナマイシンの試験を示す。図８Ｃは、ＭＹＣ−ホタル融合タンパク質を安定的に発現する５つの異なる細胞株に関する、様々な用量でのいくつかのＨＳＰ−９０阻害剤の試験を示す。図８Ｄは、ＩＫＺＦ１−ホタル融合タンパク質を一時的に発現する２９３ＦＴ細胞に関するＨＳＰ９０阻害剤ＢＩＩＢ０２１とポマリドマイドを比較する。
【００５２】
例２：ＩＫＺＦ１対ＭＹＣ細胞株における活性の比較
ＨＭＳスクリーニング施設ＩＣＣＢにおけるスクリーニングキャンペーン
ＩＫＺＦ１についての任意選択再試験をＩＣＣＢにおいてスクリーニングした（図９）。４４，４６０個の化合物中、スクリーニングされた０．６％の化合物が、プレート平均と比較して３５％超のＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃの減少に基づく、ヒットレートを有した。０．３％の化合物を任意に選択した。ヒットのうちの８１％（１０８／１３３）は、ＤＭＳＯ対照と比較して２５％超のＦｌｕｃ／Ｒｌｕｃの減少で繰り返した。おおよそ９０％（９７／１０８）が、双方の細胞株においてヒットした。ＩＫＺＦ１対ＭＹＣについての活性において、１１＞２５％の違いが存在した。上記の結果の全ては、中程度または弱いヒットであった。
【００５３】
ＩＣＣＢ任意選択ＩＫＺＦ１対ＭＹＣ選択性比較の結果は、ＩＫＺＦ１細胞株スクリーニングにおけるヒットの大部分が、カウンタースクリーニングアッセイにおいても活性であったことを示し、非特異的メカニズムを示唆する（図１０）。５つの化合物は、カウンタースクリーニングアッセイにおいて不活性であったが、ＩＫＺＦ１ルシフェラーゼシグナルを３５％超低下させ、いくらかの選択性を示した。
【００５４】
ＨＳＰ９０阻害剤についての用量応答
２つのＨＳＰ９０阻害剤、ＢＩＩＢ０２１（図１１Ａ）およびＰＦ−０４９２９１１３（図１１Ｂ）は、ＭＹＣ−ホタル：ウミシイタケを発現する２９３ＦＴ細胞株およびＭＹＣ−ホタル：ウミシイタケを発現するＵ２ＯＳ細胞株のカウンタースクリーニングと比較して、２９３ＦＴ  ＩＫＺＦ１細胞株において同様の活性を示し、ＩＫＺＦ１についての非選択的なメカニズムを示唆する。タンパク質レベルのノックダウンを、ルシフェラーゼレポーターシステムが、融合タンパク質低下を正確に反映していることを指し示すウェスタンブロットにより確認した。
【００５５】
７つのＭＹＣ−ルシフェラーゼ融合細胞株についての安定性経時変化
７つの細胞株を、シクロヘキサミドにより全てのタンパク質合成を遮断した後に、ルシフェラーゼの半減期を測定するために用いた。双方の融合されているルシフェラーゼ（ＭＹＣ−ホタルおよびＭＹＣ−ｎａｎｏｌｕｃ；図１２Ｂ）について観察される減衰は、ＭＹＣ−ホタル：ウミシイタケおよびＭＹＣ−ｎａｎｏｌｕｃ：ホタル細胞株２９３Ｔ、Ｕ２ＯＳおよびＭＹＣ−ホタル：ウミシイタケ細胞株Ａ５４９、Ｈ１２９９およびＬＳ１７４Ｔの双方を用いて、融合されていないルシフェラーゼ（ウミシイタケおよびホタル；図１２Ａ）について観察される減衰と比較した。予測されるように、タグ付けされていないホタルの半減期（おおよそ４時間）は、それがＰＥＳＴドメインを含有するので、タグ付けされていないウミシイタケ（おおよそ１２時間）よりも短かった。おおよそ２時間のＭＹＣ  ｎａｎｏｌｕｃの半減期は、１時間未満のＭＹＣ−ホタルの半減期よりも長く、タグ付けされていないホタルの半減期に近かった。ＭＹＣ−ｎａｎｏｌｕｃおよびタグ付けされていないホタルの平衡した半減期は、人工産物のヒットの数を低下させるべきである。
【００５６】
７つのＭＹＣ−ルシフェラーゼレポーター細胞株を、ＭＧ１３２によりプロテアソームを遮断した後、ＭＹＣ−ルシフェラーゼ発現における変化を測定するために用いた。融合されていないウミシイタケおよびホタルの発現は、約６時間変化しなかったが、１８時間後に細胞株間で変化する程度まで、減少した（図１３Ｂ）。全ての細胞株は、ＭＹＣ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の少なくとも５０％の増加を示したが、異なる経時変化を伴った。ＭＹＣ−ｎａｎｏｌｕｃは、約４倍のルシフェラーゼシグナルの増加を実証し、これらの融合タンパク質の大部分がプロテアソームにより分解されることを示唆する（図１３Ａ）。
【００５７】
７つのＭＹＣ−ルシフェラーゼレポーター細胞株を、ＮＥＤＤ化阻害剤ＭＬＮ−４９２４によりユビキチン依存性タンパク質分解の阻害後、ＭＹＣ−ルシフェラーゼ発現における変化を測定するために用いた（図１４Ａ〜Ｂ）。融合されていないウミシイタケおよびホタルの発現は、２９３ＴＭＹＣ−ホタル：ウミシイタケ細胞株を除いて、最小限の影響を与えた。全ての細胞株は、ＭＹＣ−ルシフェラーゼ融合タンパク質の少なくとも５０％の増加を示し、典型的には、処置の６時間後にピークを迎えた。これらの結果は、ユビキチン依存性タンパク質分解が、７つの細胞株全てにおいて、ＭＹＣ−融合タンパク質の安定性について、少なくとも部分的に信頼することができることを実証する。
【００５８】
ｓｉＭＹＣノックダウン後、Ａ５４９およびＨ１２９９細胞株はＭＹＣ−ホタルを発現する
ＭＲＣｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡでの４８時間の処置を用いて、ｓｉＲＮＡをＡ５４９およびＨ１２９９細胞株において、ＭＹＣ−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質をノックダウンするために用いた。
ＭＹＣおよびホタルに対する抗体によるウェスタンブロッティングにより観察される融合タンパク質の低下（図１５Ａ）は、ルシフェラーゼシグナルの減少と比較される（comparted to）（図１５Ｂ）。ＭＹＣ抗体はまた、内因性ＭＹＣの減少を検出する。有望なＭＹＣ−ＮＩＣＫバンドは、Ａ５４９細胞において観察される。
【００５９】
ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ｓｉＲＮＡライブラリー
図１６Ａ〜Ｄは、ＭＹＣ−ホタルを発現するＡ５４９、Ｈ１２９９およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ならびにＭＹＣ−ｎａｎｏｌｕｃを発現するＵ２ＯＳ細胞を用いた、ＤＵＢ酵素のファミリーに対するｓｉＲＮＡの市販ライブラリーからのスクリーニング結果を示す。
【００６０】
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【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１６Ｃ−Ｄ】
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【国際調査報告】
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