(57)【要約】腫瘍に送達されると、腫瘍内の細胞において自然免疫を生じさせるオリゴヌクレオチド配列が本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞表面上の受容体へのナノ粒子の特異的結合をもたらし、腫瘍細胞中へのナノ粒子の取込みを可能にする標的化ペプチドを提示するナノ粒子を介して、腫瘍中に特異的に送達される。一態様では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物が、本明細書に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物であって、
腫瘍内の自然免疫応答を活性化することが可能な単離されたオリゴヌクレオチド；
腫瘍細胞標的化部分；および
その薬学的に許容される塩
を含む、組成物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数のＵＧリッチモチーフを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、３’末端近傍に高い割合のグアノシンおよびウリジン残基を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１の核酸配列を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが二本鎖である、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、
配列番号１の核酸配列を含む鎖、および
配列番号２の核酸配列を含む鎖
を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、
配列番号３の核酸配列を含む鎖、および
配列番号４の核酸配列を含む鎖
を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、
配列番号５の核酸配列を含む鎖、および
配列番号６の核酸配列を含む鎖
を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、細胞において前記自然免疫系の活性化を促進する少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記修飾されたヌクレオチドが、修飾されたリボースを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記修飾されたヌクレオチドが、Ｏ−メチルまたはフルオロ修飾を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記修飾されたヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの５’末端から２番目の位置に配置されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記腫瘍細胞標的化部分が、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
ナノ粒子をさらに含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマー（ＥＬＰ）、リン酸カルシウムポリマーまたはそれらの組合せを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ナノ粒子がＰＥＧ化されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ナノ粒子がＥＬＰ−Ｌである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
リポソームにカプセル化されている、上記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記リポソームがＰＥＧ化されている、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
上記請求項のいずれかに記載の組成物；および
薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバント
を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
化学療法薬または化学療法剤をさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、
前記腫瘍細胞において自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供するステップ、および
前記腫瘍細胞を、腫瘍細胞増殖を阻害するのに十分な量の前記組成物と接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項２５】
前記組成物が、上記請求項のいずれかに記載の組成物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象の自然免疫応答を前記対象の腫瘍細胞において特異的に活性化するための方法であって、
腫瘍細胞において前記自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドを取得するステップ；
前記オリゴヌクレオチドを腫瘍細胞標的化部分と接触させて、前記対象中の腫瘍細胞に前記オリゴヌクレオチドを特異的に送達するような組成物を形成するステップ；および
薬学的有効量の前記組成物を前記対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞が、ヒト膀胱細胞、ヒト乳房細胞、ヒト結腸細胞、ヒト肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト神経芽腫細胞、ヒト卵巣細胞、ヒト膵細胞、ヒト前立腺細胞またはヒト皮膚細胞である、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、医学および分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、腫瘍に標的化された場合に、ヒトまたは動物において抗腫瘍自然免疫応答を活性化するオリゴヌクレオチド、およびその使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一部の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、インターフェロンおよびサイトカイン産生の刺激、タンパク質合成の全体的シャットダウン、ｍＲＮＡの非特異的分解、ならびに遺伝子の発現の非特異的低減を生じるオフターゲット効果を含む、種々の非特異的副作用を引き起こし得る（Ｒｏｂｂｉｎｓら、２００９年）。多くのｓｉＲＮＡ適用について、特異的遺伝子サイレンシングが好ましく、ｓｉＲＮＡの投与後の対象における自然免疫の活性化は、望ましくない副作用とみなされる。
【０００３】
しかし、がん治療では、これらの免疫賦活性ｓｉＲＮＡまたは「ｉｓＲＮＡ」は、がん細胞において望ましい増殖の阻止、分化およびアポトーシスを含む有益な効果を活性化するために、強力な免疫調節剤として使用され得る。したがって、自然免疫系は、腫瘍サプレッサーとして機能し得（Ｓｈａｎｋａｒａｎら、２００１年；ＢｕｉおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、２００７年；Ｋｏｅｂｅｌら、２００７年）、免疫賦活剤は、抗腫瘍治療において使用され得る。
【０００４】
しかし、ヒトまたは動物において腫瘍細胞に対する自然免疫応答のｉｓＲＮＡ活性化を制限することが可能であるが、非腫瘍細胞において一般に可能ではない有効な技術が、未だ必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本出願人らは、ヒトまたは動物中の腫瘍細胞にｉｓＲＮＡ複合体を特異的に送達するための組成物および方法を、本明細書に開示する。これらの複合体が腫瘍細胞に送達されると、ｉｓＲＮＡ複合体は、腫瘍細胞における対象の自然免疫応答を特異的に活性化でき、そうすることで、これらに限定されないが、とりわけ増殖の阻止、分化およびアポトーシスなどの有益な効果を誘導する。
【０００６】
一態様では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物が、本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、組成物は、腫瘍内で自然免疫応答を活性化することが可能な単離されたオリゴヌクレオチド；腫瘍細胞標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）；およびその薬学的に許容される塩を含む。
【０００７】
一態様では、腫瘍内の自然免疫応答を活性化することが可能な単離されたオリゴヌクレオチドを含む、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物が、本明細書に開示される。一実施形態では、組成物のオリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、一方の鎖は、配列番号１の核酸配列を含み、一方の鎖は、配列番号２の核酸配列を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、一方の鎖は、配列番号３の核酸配列を含み、一方の鎖は、配列番号４の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖であり、一方の鎖は、配列番号５の核酸配列を含み、一方の鎖は、配列番号６の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、組成物のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のＵＧモチーフを含む。一部の実施形態では、組成物のオリゴヌクレオチドの核酸配列は、１つもしくは複数のＵＧモチーフを含むかまたはＵＧリッチである。
【０００８】
他の実施形態では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための開示される組成物のオリゴヌクレオチドは、細胞において自然免疫系の活性化を促進する少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。一実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、修飾されたリボースを含む。別の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、Ｏ−メチルまたはフルオロ修飾を含む。ある特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、開示される組成物のオリゴヌクレオチドの５’末端から２番目の位置に配置されている。
【０００９】
別の態様では、腫瘍細胞標的化部分を含む、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための組成物が、本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞標的化部分は、タンパク質、ペプチドまたはアプタマーである。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞標的化部分は、任意の目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６８０，０４５号に開示されるような、細胞標的化部分またはドメインのいずれかを含む。
【００１０】
別の態様では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための本明細書に開示される組成物は、ナノ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマー（ＥＬＰ）、リン酸カルシウムポリマーまたはそれらの組合せを含む。一実施形態では、ナノ粒子はＰＥＧ化されている。具体的な一実施形態では、ナノ粒子はＥＬＰ−Ｌである。
【００１１】
別の実施形態では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための本明細書に開示される組成物は、リポソームにカプセル化されている。一実施形態では、リポソームはＰＥＧ化されている。
【００１２】
別の態様では、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための開示される組成物を含む医薬組成物が、本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される組成物、および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される組成物、および化学療法薬または化学療法剤を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される組成物および免疫チェックポイント阻害剤を含む。
【００１３】
別の態様では、腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法が、本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、方法は、腫瘍細胞において自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供するステップ、および腫瘍細胞を、腫瘍細胞増殖を阻害するのに十分な量の組成物と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、組成物は、腫瘍細胞増殖を標的化および阻害するための本明細書に開示される組成物である。
【００１４】
別の態様では、対象の自然免疫応答を対象の腫瘍細胞において特異的に活性化するための方法が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、方法は、腫瘍細胞において自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドを取得するステップ；オリゴヌクレオチドを腫瘍細胞標的化部分と接触させて、対象中の腫瘍細胞にオリゴヌクレオチドを特異的に送達するような組成物を形成するステップ；および薬学的有効量の組成物を対象に投与するステップを含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、開示される方法のいずれかの腫瘍細胞は、ヒト膀胱細胞、ヒト乳房細胞、ヒト結腸細胞、ヒト肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト神経芽腫細胞、ヒト卵巣細胞、ヒト膵細胞、ヒト前立腺細胞またはヒト皮膚細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング経路とのｓｉＲＮＡの相互作用を示す図である。種々のＴＬＲが示される。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）モチーフを認識するが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）中のある特定のモチーフもまた認識し得る。ＴＬＲ３は、ｄｓＲＮＡに結合し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８とは異なる経路を介してシグナル伝達する。ＲＩＧ−１は、三リン酸含有ＲＮＡを認識する。エンドソームを逃れたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路に入り得、ここで、２つの鎖のうち一方が、ガイド鎖として選択され、相補的ＲＮＡの配列特異的メッセージ分解を指向させる。
【００１７】
【図２】図２は、ＤＦ４またはＥＬＰ−Ｌのいずれかと複合体化した場合の、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中へのｓｉＧＬＯの取込みを示す図である。ＰＢＭＣに、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（ＤＦ４）またはＥＬＰ−Ｌナノ粒子を使用して、５０ｎＭのｓｉＧＬＯ対照を１６時間にわたってトランスフェクトした。
【００１８】
【図３】図３は、ＤＦ４またはＥＬＰ−Ｌのいずれかと複合体化したｉｓＲＮＡまたはｓｉＧＬＯによる処理の後に末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共培養したＳＫＯＶ−３  ＧＬ３細胞（ルシフェラーゼを安定に発現する卵巣がん細胞株）の生存度を示す図である。ＳＫ−ＯＶ−３  ＧＬ３細胞のルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ；相対光単位）を、ＳＫＯＶ−３  ＧＬ３細胞にＰＢＭＣを添加した（共培養）４日後に測定した（図３、グラフＡ）。対照として、ＳＫ−ＯＶ−３  ＧＬ３細胞のルシフェラーゼ活性を、ＰＢＭＣ細胞の添加なしの同じ条件下で測定した（図３、グラフＢ）。＊ｓｉＧＬＯ処理した共培養の平均生存度とｉｓＲＮＡ処理した共培養の平均生存度との間の有意性が、４日目の時点におけるＴ検定によってＰ＝０．０５と決定された。＊＊ｓｉＧＬＯ処理した共培養の平均生存度とｉｓＲＮＡ処理した共培養の平均生存度との間の有意性が、４日目の時点におけるＴ検定によってＰ＝０．０００５と決定された。
【００１９】
【図４】図４は、ＤＦ４またはＥＬＰ−Ｌのいずれかと複合体化したｉｓＲＮＡまたはｓｉＧＬＯによる処理の後に末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共培養したＰａｎｃ１  ＧＬ３細胞（ルシフェラーゼを安定に発現する膵がん細胞株）の生存度を示す図である。Ｐａｎｃ１  ＧＬ３細胞のルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ；相対光単位）を、Ｐａｎｃ１  ＧＬ３細胞にＰＢＭＣを添加した（共培養）４日後に測定した（図４、グラフＡ）。対照として、Ｐａｎｃ１  ＧＬ３細胞のルシフェラーゼ活性を、ＰＢＭＣ細胞の添加なしの同じ条件下で測定した（図４、グラフＢ）。
【００２０】
【図５】図５は、ｉｓＲＮＡ複合体またはｓｉＧＬＯ複合体のいずれかで処理したＰＢＭＣを使用した逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）実験を示す図である。ＲＮＡを、共培養したＳＫ−ＯＶ−３  ＧＬ３／ＰＢＭＣ細胞から精製し、ＩＮＦ−αおよびＩＬ−６の発現を、各試料について測定した。β−アクチンを、標準化対照として測定した。
【００２１】
【図６】図６は、マウスモデルにおける卵巣腫瘍の増殖に対するｉｓＲＮＡ：ＥＬＰ−Ｌナノ複合体の効力を示す図である。注射されたＳＫ−ＯＶ−３  ＧＬ３細胞から発達した胸腺欠損マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）における腫瘍の増殖を、ビヒクル（ＶＥＨ；５％デキストロース）、または２ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇのｉｓＲＮＡ／ＥＬＰ−Ｌ（ｉｓＲＮＡ、ｎ＝１０）を４週間にわたって１週間に２回投薬したマウスにおける生物発光によって測定した。パートＡは、２ｍｇ／ｋｇの投薬プロトコールの２８日目における生存マウス中の腫瘍の生物発光を示す。パートＢは、２ｍｇ／ｋｇの投薬プロトコールについての、７日毎の平均生物発光のグラフを示す。示されるデータは、各時点についてｎ＝１０の平均である。＊ＶＥＨとｉｓＲＮＡとの間の有意性が、２８日目の時点におけるＴ検定によってＰ＝０．００５と決定された。＊＊ＶＥＨとｉｓＲＮＡとの間の有意性が、２８日目の時点におけるＴ検定によってＰ＝０．００１と決定された。
【００２２】
【図７】図７は、ビヒクル（ＶＥＨ）、２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのｉｓＲＮＡ：ＥＬＰ−Ｌを投薬したマウスから切除した腫瘍の重量（グラフＡ）および数（グラフＢ）を示す図である。
【００２３】
【図８】図８は、ｉｓＲＮＡ：ＥＬＰ−Ｌまたは５％デキストロース（ビヒクル）で処置したマウス腫瘍試料からのサイトカイン発現のＲＴ−ＰＣＲを示す図である。腫瘍試料を、注射後２８日目にマウスから切除し、ＩＮＦ−αおよびＩＬ−６の発現を、各試料について測定した。β−アクチンを、標準化対照として測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
一態様では、腫瘍細胞において自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドが、本明細書に開示される。本明細書で使用する場合、用語「自然免疫応答」とは、ヒトまたは動物中の細胞および組織における、好ましくは、腫瘍細胞において示差的にまたは優先的に誘導される、非抗原特異的応答を指す。これは、細胞が抗原提示細胞として作用する能力および／または抗原特異的適応免疫応答をモジュレートする能力に影響を与える細胞性変化もまた指す。一実施形態では、自然免疫応答は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の活性化を含む。ＮＫ細胞は、病原体に対する第一線の防御に関与する。別の実施形態では、自然免疫応答は、１つまたは複数のサイトカインまたは増殖因子、例えば、非限定的な例では、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生および／または分泌を含む。自然免疫は、マクロファージ、樹状細胞および単球の関与をさらに含み得る。
【００２５】
免疫系は、腫瘍特異的抗原または細胞性ストレスによって誘導される分子の発現に基づいて腫瘍細胞を同定および排除することが可能である。しかし、腫瘍細胞は、腫瘍免疫監視から逃れることができ、抗腫瘍免疫を増強することを標的化する治療が、現在開発されている（ＳｗａｎｎおよびＳｍｙｔｈ、２００７年）。
【００２６】
本明細書に記載されるｉｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ある特定の実施形態では、化学的に合成されたオリゴリボヌクレオチドの二重鎖である。これらのｉｓＲＮＡ二重鎖は、免疫系に対する有益な効果を有する。いずれかの特定の理論または機構によって束縛されることは意図しないが、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞上および腫瘍細胞内のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を活性化することによって、自然免疫応答を活性化すると考えられる。一旦活性化されると、サイトカインおよび他の細胞傷害性酵素が、樹状細胞、単球／マクロファージおよびナチュラルキラー細胞から放出される。通常、この効果は、とりわけ治療剤としての従来のｓｉＲＮＡ分子の投与が特に関与する臨床実務においては、有害事象とみなされる。
【００２７】
哺乳動物自然免疫系は、潜在的病原体のシグネチャーとして、いくつかの核酸種を認識する。ヒトおよびマウスの両方において、二本鎖ＲＮＡを認識する特異的ＴＬＲ（ＴＬＲ３）（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ、Ｈｏｌｔら、２００１年）および一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を認識する特異的ＴＬＲ（ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）（Ｄｉｅｂｏｌｄ、Ｋａｉｓｈｏら、２００４年；Ｈｅｉｌ、Ｈｅｍｍｉら、２００４年；Ｌｕｎｄ、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら、２００４年）が、同定されている。これらの核酸感知性ＴＬＲは、細胞内に局在し、活性化の際に、Ｉ型インターフェロン、例えばＩＦＮ−α、および炎症性サイトカインを誘導する。ＴＬＲ７は、典型的には、形質細胞様樹状細胞およびＢ細胞によって発現され、ｓｓＲＮＡウイルス、ならびにグアノシンおよびウリジンがリッチな合成ｓｓＲＮＡによって活性化される。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、典型的には、別個の免疫細胞型上で発現されるが、これらのＴＬＲは、類似の核酸を認識する。マウスＴＬＲ８は、従来のＴＬＲ７／８リガンドに対しては応答せず、最近まで、マウスにおいて非機能的であると考えられていた（Ｄｉｅｂｏｌｄ、Ｋａｉｓｈｏら、２００４年）。ＲＮＡは、細胞質ＲＮＡ受容体ＲＩＧ−１およびＭｄａ−５を含むＴＬＲおよびｄｓＲＮＡ依存的タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）非依存的機構を介して、インターフェロン応答を生じることもできる（Ｙｏｎｅｙａｍａ、Ｋｉｋｕｃｈｉら、２００４年）。
【００２８】
リガンドがＴＬＲに結合する場合、シグナルが核に伝達され、細胞内調節分子の合成をコードする遺伝子が発現される（Ｕｌｅｖｉｔｃｈ、２００４年）。ＴＬＲを介した免疫系の活性化は、感染に対する自然免疫応答および適応免疫応答の発達を組織化する炎症促進性サイトカインおよびインターフェロンの迅速な産生を引き起こす。これらの経路の異常なまたは過剰な刺激が、多くの炎症性障害および自己免疫障害の根底にあると考えられている。例えば、全身性エリテマトーデスにおけるＲＮＡ関連およびＤＮＡ関連自己抗原は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９の活性化を介して、病的自己抗体およびインターフェロンの産生を駆動することが示されている（Ｌａｕ、Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎら、２００５年；Ｖｏｌｌｍｅｒ、Ｔｌｕｋら、２００５年；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｓｈｕｐｅら、２００６年；Ｐｉｓｉｔｋｕｎ、Ｄｅａｎｅら、２００６年；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｔｕｓら、２００６年）。
【００２９】
ＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡに対する公知の受容体である。ＴＬＲ３は、樹状細胞、線維芽細胞、マクロファージおよび上皮細胞上で発現される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｆｕｎａｍｉら、２００４年）。ＴＬＲ３に対するアダプター分子は、ＴＩＣＡＭ−Ｉであり、ここで、ＴＬＲ３のＴＩＣＡＭ−Ｉへの結合は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−αβ）の産生を最終的にもたらす複数のシグナル伝達カスケードを誘導する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｆｕｎａｍｉら、２００４年）。これらのインターフェロンは、ＲＮＡを分解することが可能な、したがって、ウイルス複製を防止することが可能な酵素を産生するように非感染細胞を誘導するサイトカインである。インターフェロンはまた、細胞傷害性Ｔリンパ球、マクロファージおよびＮＫ細胞を含む、防御にとって重要な種々の細胞を活性化する。
【００３０】
一本鎖ＲＮＡ認識は、マウスではＴｏｌｌ様受容体７によって媒介され、ヒトではＴＬＲ−８によって媒介される。マウスでは、ＴＬＲ７は、アダプターＭｙＤ８８に結合し、ＩＦＮ−αの活性化をもたらす。Ｄｉｅｂｏｌｄら（Ｄｉｅｂｏｌｄ、Ｋａｉｓｈｏら、２００４年）は、インフルエンザウイルスＲＮＡ、ポリウリジル酸およびインビトロで合成されたｍＲＮＡが全て、形質細胞様樹状細胞においてＩＦＮ−α産生を誘導したことを示した。Ｈｅｉｌら（Ｈｅｉｌ、Ｈｅｍｍｉら、２００４年）は、ホスホロチオエート末端を有する２０残基のグアニンおよびウリジンリッチなＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＩＮＦ−αならびに炎症促進性および調節性サイトカインを分泌するように、樹状細胞およびマクロファージを刺激することを示した。ＴＬＲ欠損マウスを使用して、これらの著者は、マウスＴＬＲ−７およびヒトＴＬＲ−８が、一本鎖ＲＮＡへの結合を担ったこともまた示した。ヒトＴＬＲ−７は、グアニンヌクレオチドアナログによっても活性化される（Ｌｅｅ、Ｃｈｕａｎｇら、２００３年）。
【００３１】
二本鎖ＲＮＡもまた、ＰＫＲと呼ばれる遍在的に発現されるセリン／スレオニンタンパク質キナーゼとの相互作用を介して、自然免疫系を活性化できる。ＰＫＲは、細菌ＬＰＳのＴＬＲ４結合によって活性化されるＴＬＲ４カスケードの一部である。ＰＫＲは、インターフェロンによって誘導され、ｄｓＲＮＡ、サイトカイン、増殖因子およびストレスシグナルによって活性化される。ＰＫＲは、ｄｓＲＮＡへの結合の際に自己リン酸化され、活性化される。活性化は、ｅＩＦ２ａリン酸化を介したタンパク質合成の阻害を生じ、また、異なる転写因子の活性化のＰＫＲ依存的シグナル伝達によって、炎症性遺伝子の転写を誘導する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９９９年）。ＰＫＲは、ＮＦ−κＢ発現をその阻害因子ＩｋＢのリン酸化を介して上方調節する（Ｋｕｍａｒ、Ｈａｑｕｅら、１９９４年）。１１塩基対ほどの小さなｄｓＲＮＡはＰＫＲに結合し、活性を誘導できるが、最大の活性化は、少なくとも３０塩基対を必要とする（Ｍａｎｃｈｅ、Ｇｒｅｅｎら、１９９２年）。
【００３２】
本明細書に記載されるｉｓＲＮＡ剤は、核酸またはヌクレオチドアナログに結合することが公知の受容体のうち１つを介して、自然免疫系を活性化し得る。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ある特定の条件下でヒト細胞において免疫応答を誘発できることが報告されている。Ｓｌｅｄｚら（ＳｌｅｄｚおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、２００３年）は、試験した６つの異なるｓｉＲＮＡ二重鎖の各々によるインターフェロン系の誘導を報告した。Ｂｒｉｄｇｅら（Ｂｒｉｄｇｅ、Ｐｅｂｅｒｎａｒｄら、２００３年）は、ウイルスベクターを使用して送達されたいくつかのｓｈＲＮＡが、インターフェロン刺激された遺伝子の発現を誘導することを報告した。これら２つの報告は、ｓｉＲＮＡ二重鎖がＰＫＲを活性化することを示した。対照的に、Ｋａｒｉｋｏらからのデータは、ＴＬＲ３経路およびＴＬＲ３活性化が、濃度依存的であったことを暗示した（Ｋａｒｉｋｏ、Ｂｈｕｙａｎら、２００４年）。
【００３３】
自然免疫応答の活性化は、ウイルス感染からがんまでの範囲の疾患において有利である（Ｗｈｉｔｍｏｒｅ、ＤｅＶｅｅｒら、２００４年）。ｉｓＲＮＡ剤は、自然免疫を活性化すると予想され、それに続いて適応免疫応答を形成すると予想される。いくつかのｉｓＲＮＡ配列および修飾は、他のものよりも自然免疫応答をより良好に活性化することができる。この活性化は、核酸に結合することが公知の任意のＴｏｌｌ様受容体経路：二本鎖ＲＮＡに対する受容体であるＴＬＲ３；一本鎖ＲＮＡに対する受容体であるＴＬＲ８；またはｄｓＲＮＡによって活性化されるタンパク質キナーゼであるＰＫＲを介して起こる可能性がある。これらのタンパク質の各々は、記載されるｉｓＲＮＡ剤に類似した分子に結合することが公知である。
【００３４】
修飾されていないか、または対象の免疫系に対して影響を有するように、もしくは対象の免疫系に対して影響を有することを特異的に回避するように修飾されたかのいずれかであるｉｓＲＮＡオリゴヌクレオチド剤が、本明細書にさらに開示される。理論に束縛されることは望まないが、免疫系活性のモジュレーションは、ｉｓＲＮＡ剤と免疫系の構成要素との相互作用から生じ得ると考えられ、この相互作用は、この構成要素の活性を邪魔または刺激する。これらの効果は、ＲＮＡｉ適用のためのｓｉＲＮＡ分子の伝統的な使用におけるようなＲＩＳＣ媒介性の遺伝子サイレンシングとは独立している。対照的に、本明細書に開示されるｉｓＲＮＡ分子は、一本鎖または二本鎖ＲＮＡと免疫系のタンパク質構成要素との相互作用を介して作用すると考えられる。
【００３５】
本開示の別の態様では、腫瘍内の自然免疫応答を活性化することが可能なオリゴヌクレオチドは、特異的ヌクレオチド配列を含む。ｉｓＲＮＡ二重鎖の腫瘍細胞への特異的送達の効果を実証するために使用したオリゴヌクレオチド配列が、以下の表１に示され、ここで、表１の配列中に出現する「ｍ」は、示されたヌクレオシド塩基の２’リボース位置の修飾を示し、ｄＴはデオキシリボチミジンを示す。
【表１】
2017530948.tif 000002
【００３６】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、ｉｓＲＮＡの二本鎖二重鎖を形成するようにアニーリングされる。一実施形態では、本明細書に開示される二本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸配列を含む鎖および配列番号２の核酸配列を含む鎖を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される二本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号３の核酸配列を含む鎖および配列番号４の核酸配列を含む鎖を含む。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される二本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号５の核酸配列を含む鎖および配列番号６の核酸配列を含む鎖を含む。
【００３７】
本明細書に開示される単離されたオリゴヌクレオチドおよびｉｓＲＮＡ二重鎖は、従来の分子生物学技術によって産生され得る。例えば、対象のｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の産生は、化学的合成方法または組換え核酸技術によって実施され得る。用語「ｄｓＲＮＡ」とは、本明細書で使用する場合、ｓｉＲＮＡを含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が可能な二本鎖ＲＮＡ分子を指す。二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成する方法および他のｉｓＲＮＡ調製技術は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＪｕｄｇｅ、２００６年に開示されている。処理された細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼが、インビボで転写を媒介してもよいし、またはクローニングされたＲＮＡポリメラーゼをインビトロで転写に使用してもよい。
【００３８】
本明細書で使用する場合、本出願のｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含し得る。例えば、本明細書に開示されるｄｓＲＮＡは、例えば、細胞性ヌクレアーゼに対する感受性を低減させるため、バイオアベイラビリティを改善するため、製剤特徴を改善するため、および／または他の薬物動態学的特性を変化させるために、リン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含み得る。例示であるが、天然ＲＮＡのホスホジエステル連結は、少なくとも１つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含むように修飾され得る。ＲＮＡ構造における修飾は、ｄｓＲＮＡに対する全般的な応答を回避しつつ、特異的な遺伝子阻害を可能にするために行われ得る。同様に、塩基は、とりわけアデノシンデアミナーゼ活性を遮断するように、修飾され得る。ｄｓＲＮＡは、酵素的に、または部分的もしくは全体的な有機合成によって産生され得、ここで、任意の修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロの酵素的合成または有機合成によって導入され得る。ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法が、ｄｓＲＮＡを修飾するために適応され得る。単なる例示であるが、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの骨格は、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、キメラメチルホスホネート−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジン含有オリゴマーまたは糖修飾（例えば、２’−置換リボヌクレオシド、ａ−立体配置）で修飾され得る。ある特定の場合、本出願のｄｓＲＮＡは、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ホスホロチオエートセンス鎖を含む。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ホスホジエステルアンチセンス鎖を含む。修飾されたＲＮＡ分子を生成するための１つの例示的な方法は、その全体が参照により組み込まれるＲｏｂｂｉｎｓ、２００８年に開示されている。
【００３９】
特記しない限り、本明細書に示される配列は、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端が５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向が５’方向と称される慣習に従う。新生ＲＮＡ転写物の、５’から３’の付加の方向は、転写方向と称される；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【００４０】
用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書で使用する場合、少なくとも１０塩基長であるヌクレオチドのポリマー形態を意味する。ある特定の実施形態では、これらの塩基は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾形態であり得る。この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を含む。
【００４１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、天然に存在するおよび／または天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００ヌクレオチド以下を含むポリヌクレオチドサブセットである。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または３０〜４０塩基長である。
【００４２】
オリゴヌクレオチドは、例えばアンチセンスＲＮＡとしての使用のための一本鎖、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子（もしくはショート）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）としての二本鎖であり得る。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識、例えば、放射能標識、蛍光標識、抗原性標識またはハプテンを含み得る。
【００４４】
用語「取得する」とは、生理学的検体を物理的に所有することを意味する。材料が獲得される様式は、いずれかの具体的なプロセスに限定されない。
【００４５】
用語「天然に存在するヌクレオチド」には、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。用語「修飾されたヌクレオチド」には、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドが含まれる。用語「オリゴヌクレオチド連結」には、例えば、ホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド連結が含まれる。例えば、任意の目的のためにそれらの各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４巻：９０８１頁；Ｓｔｅｃら、１９８４年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０６巻：６０７７頁；Ｓｔｅｉｎら、１９８８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６巻：３２０９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６巻：５３９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ、８７〜１０８頁；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、１９９０年、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０巻：５４３頁を参照のこと。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源またはそれらの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その供給源によって、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）ポリヌクレオチドであって、その中に「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全てもしくは部分を伴わないか、（２）天然では連結されていないポリヌクレオチドに連結されているか、または（３）より大きい配列の一部として天然に存在しない。
【００４７】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来または外因性ヌクレオチドの取込みを指すために使用され、細胞は、外因性ヌクレオチドが細胞の内側に導入された場合、「トランスフェクト」される。いくつかのトランスフェクション技術が、当該分野で周知であり、本明細書に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２巻：４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）；ならびにＣｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ  １３巻：１９７頁を参照のこと。
【００４８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、対象への投与のための、リポソームおよびナノ粒子を含む送達ビヒクル；担体および希釈剤ならびにそれらの塩を含み得；医薬組成物中に存在し得る。特定の実施形態では、ｉｓＲＮＡは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６８０，０４５号に開示されるように、ＥＬＰ−Ｌナノ粒子と会合して送達される。核酸分子の送達のための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒら、１９９２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．  ２巻：１３９頁；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ａｋｈｔａｒ編、１９９５年、Ｍａｕｒｅｒら、１９９９年、Ｍｏｌ．  Ｍｅｍｂｒ．  Ｂｉｏｌ．  １６巻：１２９〜１４０頁；ＨｏｆｌａｎｄおよびＨｕａｎｇ、１９９９年、Ｈａｎｄｂ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１３７巻：１６５〜１９２頁；ならびにＬｅｅら、２０００年、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ７５２巻：１８４〜１９２頁に記載されており、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、米国特許第６，３９５，７１３号およびＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５は、細胞および組織中への核酸分子の送達のための一般的な方法をさらに記載している。これらのプロトコルは、細胞中への事実上任意の核酸分子の送達のために利用され得る。核酸分子は、これに限定されないがリポソームにおけるカプセル化など当業者に公知の種々の方法によって、イオン導入によって、または他の送達ビヒクル、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）ミクロスフェア中への取込みによって、またはタンパク質性ベクターによって、細胞に投与され得る（例えば、Ｏ’ＨａｒｅおよびＮｏｒｍａｎｄ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５３７２２を参照のこと）。
【００４９】
本明細書に開示されるナノ粒子は、典型的には、ヌクレオチドまたは薬物剤を束ね、血液中で分子を安定化する、化学的ベースのシェル構造である。ナノ粒子は、糖、デキストラン、リン酸カルシウム、キトサン、ペプチドおよび／またはプラスチックポリマーを含む場合が多い。がん薬物送達のための薬物剤がロードされたナノ粒子は、好ましくは、以下の特性を有する：１）高い純度および収量で、数ステップで合成することが容易である；２）１００ｎｍ未満のサイズを有する、単分散の、薬物がロードされたナノ粒子へとアセンブルする；３）多様な薬物のカプセル化を可能にする；４）好都合な薬物動態および腫瘍蓄積を示す；５）制御された調節可能な速度論で薬物を放出する；６）治療応答をもたらす；ならびに７）有害な毒性なしに身体からのクリアランスを可能にするように、非毒性構成要素へと分解する。いくつかの異なるナノスケールの送達系が、がん治療のために提案されてきたが、ほとんどは、系を臨床実施へと移すために重要なこれらの基準を満たしていない。
【００５０】
ＥＬＰ薬物送達ナノ粒子は、腫瘍血管およびリンパ脈管構造の異常から生じる血管透過性・滞留性亢進（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）（ＥＰＲ）効果に起因して、腫瘍に特異的に進入すると考えられる。本明細書に開示されるＥＬＰナノ粒子を使用することによって、自然免疫系は、腫瘍内でのみ活性化され、自然免疫系の全身性の活性化が防止される。しかし、本発明は、ＥＬＰナノ粒子に限定されない。本発明の他の実施形態は、（１）ヌクレオチド分子を運搬できる、（２）従来の化学療法剤を運搬できるまたは運搬できない、および（３）特定の腫瘍型を標的化するペプチド分子を収納できる、リポソーム、ポリデキストランまたは他のポリマーを利用し得る。
【００５１】
あるいは、核酸／ビヒクルの組合せは、直接注射によって、または注入ポンプの使用によって、局所的に送達され得る。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋内または真皮内のいずれであれ、標準的な針およびシリンジの方法を使用して、またはＣｏｎｒｙら、１９９９年、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５巻：２３３０〜２３３７頁およびＢａｒｒｙら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３１２６２に記載されるものなどの針を使用しないテクノロジーによって、行われ得る。当該分野における多くの例が、浸透圧ポンプ（Ｃｈｕｎら、１９９８年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５７巻：１３５〜１３８頁、Ｄ’Ａｌｄｉｎら、１９９８年、Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５巻：１５１〜１６４頁、Ｄｒｙｄｅｎら、１９９８年、Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １５７巻：１６９〜１７５頁、Ｇｈｉｒｎｉｋａｒら、１９９８年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４７巻：２１〜２４頁を参照のこと）または直接注入（Ｂｒｏａｄｄｕｓら、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｆｏｃｕｓ  ３巻、論文４）による、オリゴヌクレオチドの送達方法を記載している。他の送達経路には、経口送達（例えば、錠剤または丸剤形態）および／またはくも膜下腔内送達（Ｇｏｌｄ、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７６巻：１１５３〜１１５８頁）が含まれるがこれらに限定されない。核酸の送達および投与のより詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９４／０２５９５、Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら、ＰＣＴ  ＷＯ９９／０５０９４およびＫｌｉｍｕｋら、ＰＣＴ  ＷＯ９９／０４８１９中に提供され、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、オリゴヌクレオチドおよび細胞標的化部分（細胞標的化ドメインまたはＣＴＤとも呼ばれる）を含む。ある特定の実施形態では、細胞標的化部分は、ポリペプチドである。例示的な細胞標的化ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６８０，０４５号に開示されている。
【００５３】
ＣＴＤは、任意の特定のポリペプチド配列に限定されない。これは、任意の所望の生物学的分子を標的化するように設計され得る。特定の実施形態では、生物学的分子は、所望の細胞型において特異的に発現される。任意の細胞が、標的化のために選択され得る。ある特定の実施形態では、標的細胞は、真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはげっ歯類またはヒト細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。本発明によって企図される腫瘍細胞の非限定的な例には、ヒト膀胱細胞、ヒト乳房細胞、ヒト結腸細胞、ヒト肝臓細胞、ヒト肺細胞、ヒト神経芽腫細胞、ヒト卵巣細胞、ヒト膵細胞、ヒト前立腺細胞またはヒト皮膚細胞である腫瘍細胞が含まれる。さらに、標的細胞は、本発明の方法によって処置される患者に影響を与える疾患または状態に基づいて選択され得る。
【００５４】
一態様では、ＣＴＤを、腫瘍細胞において発現されるが非腫瘍細胞では発現されない生物学的分子を標的化するように、本明細書に開示されるように設計した（例えば、腫瘍細胞標的化部分）。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、細胞標的化部分を提示するナノ粒子を使用して、腫瘍中に特異的に送達されるように設計される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドのＣＴＤは、腫瘍細胞に対して特異的なペプチドリガンドを含む。これらの細胞標的化部分は、腫瘍細胞表面上の受容体へのナノ粒子の特異的結合を付与し得、エンドサイトーシス、ピノサイトーシスまたは他の細胞膜関与機構による腫瘍細胞中へのナノ粒子の特異的取込みを可能にする。一実施形態では、ＣＴＤは、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）に結合するペプチドリガンドを含む。特異的腫瘍細胞を標的化することは、腫瘍探索性ＥＬＰナノ粒子において送達される薬物の特異的標的化によるがん治療の副作用の低減に起因して、有利である。本明細書に開示されるように、ｉｓＲＮＡ分子とのＣＴＤの使用は、非腫瘍細胞における自然免疫応答の活性化を低減させ得、したがって、ｉｓＲＮＡが投与された対象における望ましくない副作用を低減させる。
【００５５】
他の実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子が細胞膜に透過できるように縮合していてもよい。かかる代替的実施形態では、ナノ粒子は、細胞の内側の生物学的分子、例えば、エンドソーム中のＴＬＲ、および細胞質中の他の自然免疫活性化因子と接触し得る。
【００５６】
本発明のさらなる実施形態では、さらなる標的化リガンドが、薬物剤を含有するリポソームまたはナノ粒子と会合され、これはアポトーシス破壊のために指定された腫瘍細胞上の受容体を標的化する。リポソームはまた、循環中でのリポソームの寿命を延長させるために、ポリエチレングリコールでコーティングされ得る（即ち、ＰＥＧ化される）。同様に、ナノ粒子もそのようにコーティングされ得る。
【００５７】
標的化分子は、標的細胞表面上の受容体に特異的に結合する、アプタマーと称される有機の化学的リンカーであり得る。これらのアプタマーは、リポソームの脂質またはナノ粒子のポリマーに共有結合的に連結され得る。リポソームまたはナノ粒子を腫瘍細胞へと標的化するために使用され得る他の分子は、腫瘍細胞表面上の特定の受容体に対して指向される、ペプチド、タンパク質または抗体である。
【００５８】
ある特定の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと一緒に、治療有効量の本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド、ナノ粒子および／または薬物剤を含む医薬組成物が、本明細書に開示される。用語「医薬組成物」とは、本明細書で使用する場合、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤、および患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することが可能な本明細書に記載される化合物、ペプチドまたは組成物を含む、組成物を指す。用語「治療有効量」とは、哺乳動物において治療応答を生じるように決定された、本発明のスクリーニング方法において同定された本発明の医薬組成物または化合物の量を指す。かかる治療有効量は、本明細書に記載される方法を使用して、当業者に容易に確認される。
【００５９】
本発明は、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ナノ粒子または薬物剤を含む医薬組成物をさらに提供する。特に、ｉｓＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび他の薬物剤は、ＥＬＰナノ粒子、例えば、ＥＬＰ−Ｌナノ粒子と会合させて送達される。
【００６０】
許容される製剤材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度において、レシピエントにとって非毒性である。医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を修飾、維持または保存するための製剤材料を含有し得る。適切な製剤材料には、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）；抗菌薬；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；充填剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；フィラー；単糖、二糖および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香味剤および希釈化剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０、Ｔｒｉｔｏｎ、トリメタミン（ｔｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン、コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；浸透圧増強剤（例えば、アルカリ金属ハライド、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトールまたはソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤ならびに／または医薬品アジュバントが含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編）、１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。
【００６１】
別の態様では、本明細書に開示されるｉｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、化学療法剤、抗生物質または第２のＲＮＡ剤であり得る第２の治療薬と併せても使用され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるｉｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて医薬組成物中で使用される。薬物のこの組合せは、免疫チェックポイント阻害剤によって付与されるように、腫瘍細胞における免疫応答の遮断を除去することが可能であり、一方で本明細書に開示されるｉｓＲＮＡは、自然免疫系を活性化する。このように、免疫応答活性化に対する相乗効果が、薬剤のこの組合せを使用して観察され得る。例示的な免疫チェックポイント標的は、表２中に列挙される。
【表２】
2017530948.tif 000003
【００６２】
免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、治療抗体、阻害的ヌクレオチドまたは小分子阻害剤であり得る。例えば、免疫チェックポイント阻害剤として作用する多くの抗体、例えば、ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣｕｒｅＴｅｃｈ  Ｌｔｄ．）、ＡＭＰ−２２４（Ｍｅｒｃｋ）、ＭＤＸ−１１０５（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）が、当該分野で公知である。免疫系を抑制する他の化合物もまた、ＰＫＲ経路の妨害を含め、がんを処置する際に有用であり得る（Ｐｉｋａｒｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４３１巻、４６１〜４６６頁；Ｈｕｂｅｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、２００４年、１１４巻、５６９〜５８１頁）。
【００６３】
持続送達性製剤または制御送達性製剤において本発明のナノ粒子または化合物を含む製剤を含むさらなる医薬組成物が、当業者に明らかである。種々の他の持続送達手段または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体浸食性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射を製剤化するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載するＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。持続放出性調製物として、成型物品、例えば、フィルムもしくはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックス、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号およびＥＰ０５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２巻：５４７〜５５６頁）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１年、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５巻：１６７〜２７７頁）およびＬａｎｇｅｒ、１９８２年、Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２巻：９８〜１０５頁）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、同上）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３．９８８）が挙げられ得る。徐放性組成物として、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得るリポソームが挙げられ得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：３６８８〜３６９２頁；ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６およびＥＰ１４３，９４９を参照のこと。
【実施例】
【００６４】
本発明は、さらなる限定として解釈すべきではない以下の実施例によって、さらに説明される。配列表、図面、ならびに本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許および特許出願公開の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００６５】
さらに、本発明によれば、当業者の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。かかる技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書で「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６年）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６年）］；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９４年）を参照のこと。
（実施例１）
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）へのｉｓＲＮＡ送達および取込みの評価
【００６６】
全血由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を購入し（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）、６ウェルプレート中で培養した。一般に、ＰＢＭＣは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などが含まれる）および単球から構成される。
【００６７】
ＰＢＭＣ中へのｉｓＲＮＡの取込みを評価するために、蛍光標識した非標的化ｓｉＧＬＯ対照ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、市販のリポソーム製剤ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ  ４（ＤＦ４）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）または任意の目的のためにその全体が参照により組み込まれる米国特許第８，６８０，０４５号に記載されるポリペプチドベースのナノ粒子ＥＬＰ−Ｌのいずれかと縮合させた。
【００６８】
ｉｓＲＮＡ：ＥＬＰ−Ｌナノ複合体を、１００ｐｍｏｌ（１．３３μｇ）のｉｓＲＮＡを漸増濃度のＥＬＰ−Ｌタンパク質と共に室温で３０分間にわたってインキュベートすることによって確認した。次いで、これらの産物を、１×ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上での、１２０Ｖで３０分間の電気泳動分離に供した。ＥＬＰ−Ｌナノ粒子へのｉｓＲＮＡの特異的結合は、そのサイズを、３５，０００ダルトンからおよそ５００倍増加させる。したがって、ｉｓＲＮＡ／ＥＬＰ−Ｌナノ複合体の形成を、その高い分子量に起因する、アガロースゲルのウェル内でのナノ複合体の観察された保持によって確認した（データ示さず）。ｉｓＲＮＡ／ＥＬＰ−Ｌのナノ複合体は、全てのインビトロおよびインビボ研究について、この様式で組み立てた。
【００６９】
ＰＢＭＣ中への縮合ｓｉＧＬＯ  ｓｉＲＮＡの取込みを、フローサイトメトリーによって定量化し、４０×の倍率でＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＭＴ−２蛍光顕微鏡を使用して観察した。図２に示されるように、ＤＦ４のナノ複合体よりも、ＥＬＰ−Ｌナノ複合体に曝露された細胞においてｓｉＧＬＯのはるかに多い取込みが存在した。
（実施例２）
ＰＢＭＣによって活性化された、ヒト卵巣がん細胞に対するｉｓＲＮＡの効果
【００７０】
ホタルルシフェラーゼを安定に発現するＳＫＯＶ−３細胞株（ヒト卵巣がん細胞）を、従来の分子生物学技術を使用して、ｐＧＬ−３プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）から生成した。この細胞株（ＳＫＯＶ−３  ＧＬ３と呼ばれる）からのルシフェラーゼ発現を、以下の研究において、細胞生存度のサロゲートとして使用した。
【００７１】
ｉｓＲＮＡ二重鎖は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）によって生成された。簡潔に述べると、配列番号１および配列番号２に従うオリゴヌクレオチドを合成し、２’−ヒドロキシル形態に変換し、アニーリングし、脱塩し、透析し、無菌濾過し、こうしてｉｓＲＮＡ二重鎖を生成した。二本鎖ＲＮＡ二重鎖の形成および他のｉｓＲＮＡ調製技術に関するさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＪｕｄｇｅ、２００６年に開示されている。二重鎖の正体を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して確認した。次いで、このｉｓＲＮＡ二重鎖を、上記のようにＤＦ４またはＥＬＰ−Ｌのいずれかと縮合させ、ｓｉＧＬＯを対照ｓｉＲＮＡ分子とした。
【００７２】
ＰＢＭＣを、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（ＤＦ４）またはＥＬＰ−Ｌナノ粒子を使用して、５０ｎＭの、ＤＦ４またはＥＬＰ−Ｌのいずれかと複合体化したｉｓＲＮＡまたはｓｉＧＬＯで１６時間にわたって処理した。ＳＫＯＶ−３  ＧＬ３細胞を、２４ウェルプレートの１ウェル当たり２，０００細胞の密度で播種し、１６時間にわたってインキュベートし、その後、処理されたＰＢＭＣを、１ウェル当たり２０，０００の細胞密度で添加した。ＳＫ−ＯＶ−３  ＧＬ３細胞のルシフェラーゼ活性を、４日間の共培養の後に測定した（図３、グラフＡ）。
【００７３】
サロゲートとしてルシフェラーゼ発現を使用して、これらの研究は、縮合ｉｓＲＮＡ二重鎖が、ＰＢＭＣと共培養したＳＫＯＶ−３細胞において、細胞生存度を低減できることを実証した。これらの生存度の減少は、ＥＬＰ−Ｌナノ粒子を使用して送達されたｉｓＲＮＡオリゴヌクレオチドが、共培養された腫瘍細胞の生存度を低減または排除することが可能な種を生じるＰＢＭＣの活性化を可能とすることを示した。
【００７４】
図３（グラフＡ）に示されるように、１６時間にわたって５０ｎＭのｉｓＲＮＡ二重鎖に曝露させたＰＢＭＣと共培養したＳＫ−ＯＶ−３  ＧＬ−３細胞は、対照ｓｉＧＬＯ  ｓｉＲＮＡに曝露させた細胞よりも、有意に低量のルシフェラーゼを発現した。具体的には、ｉｓＲＮＡ：ＤＦ４複合体に曝露させたＰＢＭＣと共培養したＳＫ−ＯＶ−３  ＧＬ−３細胞は、ｓｉＧＬＯ：ＤＦ４複合体に曝露させたＰＢＭＣと共培養したＳＫ−ＯＶ−３  ＧＬ−３細胞よりも、９５％低いＲＬＵを生じ、ｉｓＲＮＡ：ＥＬＰ−Ｌ複合体に曝露させた細胞は、ｓｉＧＬＯ：ＥＬＰ−Ｌ複合体に曝露させた細胞よりも、３０％低いＲＬＵを生じた。対照として、ＰＢＭＣ共培養なしで、５０ｎＭのｉｓＲＮＡ：ＤＦ４二重鎖または５０ｎＭのｓｉＧＬＯ：ＤＦ４二重鎖に曝露させたＳＫＯＶ−３  ＧＬ３細胞では、ルシフェラーゼ活性に対する影響は存在しなかった（図３、グラフＢ）。
（実施例３）
ＰＢＭＣによって活性化された、ヒト膵がん細胞に対するｉｓＲＮＡの効果
【００７５】
前の実施例（実施例２）の実験を、ヒト膵がん細胞株（Ｐａｎｃ１）を使用して繰り返した。ホタルルシフェラーゼを安定に発現するＰａｎｃ１細胞株を、従来の分子生物学技術を使用して、ｐＧＬ−３プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）から生成し、したがって、これを本明細書でＰａｎｃ１  ＧＬ３と称した。ｉｓＲＮＡ投与およびＰＢＭＣの共培養の時間経過は、実施例２で使用したものと同一であった。Ｐａｎｃ１  ＧＬ３細胞株からのルシフェラーゼ発現を、実質的に実施例２において上に示されるように実施した以下の研究において、細胞生存度のサロゲートとして使用した。
【００７６】
図４（グラフＡ）に示されるように、１６時間にわたって５０ｎＭのｉｓＲＮＡ二重鎖に曝露させたＰＢＭＣと共培養したＰａｎｃ１  ＧＬ−３細胞は、５０ｎＭの対照ｓｉＧＬＯ  ｓｉＲＮＡに曝露させたＰＢＭＣと共培養したＰａｎｃ１  ＧＬ−３細胞よりも、有意に低い量のルシフェラーゼを発現した。対照として、ＰＢＭＣ共培養なしで、５０ｎＭのｉｓＲＮＡ：ＤＦ４二重鎖または５０ｎＭのｓｉＧＬＯ：ＤＦ４二重鎖に曝露させたＰａｎｃ１  ＧＬ３細胞では、ルシフェラーゼ発現に対する影響は存在しなかった（図４、グラフＢ）。
【００７７】
これらの結果は、本明細書に提供されるｉｓＲＮＡ試薬による処理後にＰＢＭＣにおいて誘導される腫瘍細胞死滅能の普遍性、および実施例２に示される抗腫瘍効果がヒト卵巣がん細胞だけに限定されなかいことを確認した。
（実施例４）
ＲＴ−ＰＣＲによる、処理されたＰＢＭＣにおけるサイトカインの発現の測定
【００７８】
ＰＢＭＣは、自然免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞および単球細胞ならびに細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するサイトカインを産生および放出して対象からがん細胞を除去する。ｉｓＲＮＡ複合体がＰＢＭＣを活性化してサイトカインを産生させるかどうかを評価するために、ＲＴ−ＰＣＲを、共培養した細胞に対して実施して、ＴＬＲ活性化に応答する代表的サイトカインの産生を評価した。ＩＬ−６およびインターフェロンアルファ（ＩＮＦ−α）を、ＲＴ−ＰＣＲ分析のための代表的サイトカインとして選択した。
【００７９】
実施例２および３に示されるようにｉｓＲＮＡ複合体で処理した共培養したＰＢＭＣ由来のＲＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して精製し、定量化した。各試料由来のＲＮＡおよそ１００ｎｇを、Ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、ＭＡ）を使用する第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用した。第１鎖ｃＤＮＡのごく一部（試料のおよそ１／２５）を、ＤｒｅａｍＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用し、ＩＬ−６またはＩＮＦ−αを増幅するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたＰＣＲに使用した。β−アクチンの発現もまた増幅し、標準化対照として測定した。記載したとおりのＲＴ−ＰＣＲを、さらなる対照としてｓｉＧＬＯで処理したＰＢＭＣに対しても実施した。ＩＬ−６、ＩＮＦ−αおよびβ−アクチンｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用したプライマーを、以下の表３に列挙する。
【表３】
2017530948.tif 000004
【００８０】
図５に示されるように、ＩＮＦ−αおよびＩＬ−６  ｍＲＮＡの増加した発現が、ｓｉＧＬＯ処理したＰＢＭＣと比較して、ｉｓＲＮＡ処理したＰＢＭＣにおいて観察された。これらの結果は、ｉｓＲＮＡがＰＢＭＣにおいてサイトカイン産生を増加させることを示し、これは、自然免疫系の細胞、例えば、ＮＫ細胞、樹状細胞および単球細胞ならびに細胞傷害性Ｔ細胞の増加した活性化を示す。
（実施例５）
腫瘍小結節のサイズおよび数に対するｉｓＲＮＡの効果
【００８１】
ｉｓＲＮＡの効果をインビボで試験するために、胸腺欠損Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＳＫＯＶ−３  ＧＬ３細胞（ルシフェラーゼを発現するヒト卵巣がん細胞）を注射し、腫瘍を、４週間にわたって増殖させた。次いで、マウスに、ビヒクル（５％デキストロース）、または２ｍｇ／ｋｇ（１用量当たり約０．４ｍｇ）もしくは１０ｍｇ／ｋｇ（１用量当たり約１．２ｍｇ）の濃度で、ＥＬＰ−Ｌと縮合したｉｓＲＮＡ二重鎖を、４週間にわたって１週間に２回投薬した。ｉｓＲＮＡ：ＥＬＰ−Ｌ複合体を、上記のように調製した。
【００８２】
図６（パートＡ）に示されるように、ルシフェラーゼ発光を、生きたマウスにおいて測定した。生物発光を定量化したところ、最後の用量の後に、生物発光における５０％超の減少が示された（図６、パートＢ）。
【００８３】
腫瘍を、マウスから摘除し、計数し、計量した。結果を表４および図７に示す。示されるように、腫瘍の重量（図７、グラフＡ）および腫瘍小結節の数（図７、グラフＢ）は、用量依存的様式で減少した。これらの結果は、実施例１で調製した、ＥＬＰ−Ｌと縮合したｉｓＲＮＡ二重鎖が、インビボで抗腫瘍活性を示すことを示している。
【表４】
2017530948.tif 000005
（実施例６）
ｉｓＲＮＡ二重鎖による腫瘍の処置後のマウスにおけるサイトカインの発現の測定
【００８４】
マウスに投与された場合にｉｓＲＮＡ二重鎖が自然免疫応答を活性化できるかどうかを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、１０ｍｇ／ｍｌのｉｓＲＮＡ二重鎖で処置したマウスから摘除した腫瘍におけるＩＬ−６およびＩＮＦ−αの発現を測定した。ビヒクル（５％デキストロース）を投薬したマウスから摘除した腫瘍におけるＩＬ−６およびＩＮＦ−αの発現もまた、対照として測定した。ＲＴ−ＰＣＲを、実施例４に既に記載したように実施した。
【００８５】
図８に示されるように、１０ｍｇ／ｍｌのｉｓＲＮＡ二重鎖の投薬レジメンを受けたマウスは、ＩＮＦ−αの増加した発現を示した。この特定の実験では、２つの群間で、ＩＬ−６発現における有意差は観察されなかった。
（実施例７）
ｉｓＲＮＡ処置を受けているマウスにおける肝臓および腎臓の損傷の評価
【００８６】
ｉｓＲＮＡおよびビヒクルを投薬したマウスにおける肝臓および腎臓の損傷の評価を、肝臓および腎臓の機能の従来のバイオマーカーを測定することによって実施した。結果を以下の表５に示す。１０ｍｇ／ｋｇのｉｓＲＮＡ投薬レジメンを受けたマウスは、ビヒクルを投薬したマウスより、約６７％の平均ＡＳＴ増加および約１２８％の平均ＡＬＴ増加を示した（表５、列１〜２を参照のこと）。この増加にもかかわらず、１０ｍｇ／ｋｇのｉｓＲＮＡを投薬したマウスについてのＡＳＴおよびＡＬＴの数字は、正常な許容範囲内に入った。血中尿素窒素（ＢＵＮ）対クレアチニンの比率は、ｉｓＲＮＡ投薬群とビヒクル投薬群との間で、いずれの有意な増加も示さなかった（表５、列３〜５を参照のこと）。肝臓および腎臓毒性のこの欠如は、ｉｓＲＮＡが腫瘍細胞に首尾よく送達されたが、正常な健康細胞には影響を与えなかったことを示した。これらの結果は、安全かつ有効な抗腫瘍剤である、ＥＬＰ−Ｌナノ粒子を使用したｉｓＲＮＡの送達と一致している。
【表５】
2017530948.tif 000006
【００８７】
本発明を、その具体的実施形態を参照して詳細に記載してきたが、改変およびバリエーションが、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱することなしに可能であることが明らかである。より具体的には、本発明の一部の態様は、特に有利であるとして本明細書で特定されているが、本発明は、本発明のこれらの特定の態様に必ずしも限定されないことが企図される。
引用文献
【数１】
2017530948.tif 000007
【数２】
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【数３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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