(57)【要約】  ヒアルロン酸生成物は、架橋ヒアルロン酸と、１以上のデキストラン分子とを含む。ヒアルロン酸は、エーテル結合によって架橋され、１以上のデキストラン分子は、架橋ヒアルロン酸に、共有結合的にグラフト化されている。
2017517601.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ヒアルロン酸と１以上のデキストラン分子とを含むヒアルロン酸生成物であって、前記ヒアルロン酸はエーテル結合によって架橋され、前記１以上のデキストラン分子は前記架橋ヒアルロン酸に共有結合的にグラフト化されている、ヒアルロン酸生成物。
【請求項２】
前記架橋ヒアルロン酸はゲルの形態にある、請求項１に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項３】
前記架橋ヒアルロン酸は、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍの範囲の平均径を有するゲル粒子の形態にある、請求項１または２に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項４】
ヒアルロン酸鎖は、二または多官能性架橋剤から誘導されたリンカーを介して互いに架橋されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項５】
前記二または多官能性架橋剤は、ビスまたはポリエポキシドである、請求項４に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項６】
前記二または多官能性架橋剤は、ジグリシジルエーテルである、請求項５に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項７】
前記二または多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）およびエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）およびジエポキシオクタンからなる群から選択される、請求項６に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項８】
前記二または多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、請求項７に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項９】
前記１以上のデキストラン分子と、前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、０．１〜９９％のモル比を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１０】
前記１以上のデキストラン分子と、前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、１〜６０％のモル比を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１１】
前記デキストラン分子は、１０ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１２】
前記デキストラン分子は、５ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１３】
前記デキストラン分子は、単一の端点結合によって前記架橋ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１４】
前記デキストラン分子は、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼートまたはアミノオキシ官能基を有するリンカーを含み、前記リンカーの前記官能基は、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と共有結合を形成する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１５】
前記デキストラン分子は、前記デキストランの還元末端とヒアルロン酸のカルボキシル基との間で二または多官能性リンカーを介して、単一の端点結合によって前記ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１６】
前記二または多官能性リンカーは、ジアミンまたはジヒドラジドを含む、請求項１５に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１７】
前記１以上のデキストラン分子は、アミド結合によって、前記架橋ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１８】
架橋ヒアルロン酸と１以上のデキストラン分子とを含むヒアルロン酸生成物を調製する方法であって、
（ａ）架橋ヒアルロン酸と、１以上の官能化デキストラン分子とを用意する工程と、
（ｂ）１以上の官能化デキストラン分子を、前記架橋ヒアルロン酸に、共有結合的にグラフト化させる工程と
を含む方法。
【請求項１９】
工程（ａ）の前記架橋ヒアルロン酸は、ゲルの形態にある、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ａ）の前記架橋ヒアルロン酸は、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍの範囲の平均径を有するゲル粒子の形態にある、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
得られたヒアルロン酸生成物の、前記１以上のデキストラン分子と前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、０．１〜９９％のモル比を有する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
得られたヒアルロン酸生成物の、前記１以上のデキストラン分子と前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、１〜６０％のモル比を有する、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）で用意した前記デキストラン分子は、１０ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ａ）で用意した前記デキストラン分子は、５ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）の前記官能化デキストラン分子は、単一の端点結合によって、前記ヒアルロン酸に共有結合的にグラフト化されている、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）の前記１以上の官能化デキストラン分子は、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼートまたはアミノオキシ官能基を有するリンカーを含み、前記リンカーの前記官能基は、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と共有結合を形成する、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）で用意した前記官能化デキストラン分子は、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基に前記デキストラン分子を連結するのに利用可能な少なくとも１つの官能基を有する二または多官能性リンカーにより、還元末端で官能化されている、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記二または多官能性リンカーは、ジアミンまたはジヒドラジドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）の共有結合的なグラフト化は、
（ｉ）前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基をカップリング剤で活性化して、活性化架橋ヒアルロン酸を形成し、
（ｉｉ）前記１以上の官能化デキストラン分子のリンカーを、前記活性化架橋ヒアルロン酸の前記カルボキシル基にカップリングする
ことを含む、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記架橋ヒアルロン酸の前記活性化および前記活性化架橋ヒアルロン酸への前記デキストラン分子の前記カップリングは、工程（ｂ）において同時に起こる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記架橋ヒアルロン酸の前記活性化は、工程（ｂ）における前記活性化架橋ヒアルロン酸への前記１以上のデキストラン分子の前記カップリングの前に別途に起こる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記カップリング剤は、トリアジン系カップリング剤、カルボジイミドカップリング剤、イミダゾリウム誘導カップリング剤、ＯｘｙｍａおよびＣＯＭＵからなる群から選択される、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記カップリング剤は、トリアジン系カップリング剤である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記トリアジン系カップリング剤は、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）および２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記トリアジン系カップリング剤は、ＤＭＴＭＭである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１８〜３５のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ヒアルロン酸生成物。
【請求項３７】
皮膚充填剤として使用するための、請求項１〜１７または３６のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、架橋多糖を含有するヒドロゲルの分野、そのようなヒドロゲルの医学および／または化粧品用途での使用に関する。より具体的には、本発明は、デキストランによりグラフト化された架橋ヒアルロン酸を扱う。
【０００２】
発明の背景
医療用途に最も広く使用されている生体適合性ポリマーの１つは、ヒアルロン酸（ＨＡ）である。これは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の群に属する、天然起源の多糖である。ヒアルロン酸およびその他のＧＡＧは、多量の水を吸収する能力を有する、負に帯電したヘテロ多糖鎖である。ヒアルロン酸およびヒアルロン酸から誘導される生成物は、生体医療および化粧品の分野で、たとえばビ粘弾性液手術においておよび皮膚充填剤として広く使用されている。
【０００３】
水吸収ゲル、すなわちヒドロゲルは、生体医療分野で広く使用されている。これらは一般に、ポリマーを化学架橋して無限の網状構造にすることよって調製される。天然ヒアルロン酸およびある種の架橋ヒアルロン酸生成物はそれらが完全に溶解するまで水を吸収する一方で、架橋ヒアルロン酸ゲルはそれらが飽和するまである量の水を典型的には吸収する、すなわち、それらは有限の液体保持容量または膨潤度を有する。
【０００４】
ヒアルロン酸は、その分子質量を除けばほとんどの生物において同一の化学構造で存在するので、最小限の反応性を示し、先進的な医療用途を可能にする。ヒアルロン酸分子の架橋および／またはその他の修飾は、そのインビボ持続時間を改善するのに必要である。さらに、そのような修飾は、ヒアルロン酸分子の液体保持能力に影響を及ぼす。その結果、ヒアルロン酸は、多くの修飾の試みの対象とされてきた。
【０００５】
発明の概要
本発明の目的は、皮膚充填剤として使用するのに適切な、架橋ヒアルロン酸生成物を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、皮膚充填剤として使用するに際して耐久性を改善させた、適切な架橋ヒアルロン酸生成物を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、膨潤を低減させた適切な架橋ヒアルロン酸生成物を提供することである。
【０００８】
この開示によって明らかになる、これらのおよびその他の目的のために、本発明は、第１の態様によれば、架橋ヒアルロン酸と１以上のデキストラン分子とを含むヒアルロン酸生成物であって、ヒアルロン酸はエーテル結合によって架橋され、１以上のデキストラン分子は架橋ヒアルロン酸に共有結合的にグラフト化されている、ヒアルロン酸生成物を提供する。
【０００９】
架橋という用語は、本明細書において使用する限り、既存の高分子上の部位もしくは基が関与する反応、または既存の高分子間の相互作用であって、そこから少なくとも４本の鎖が出る、高分子内の小領域の形成をもたらす反応または相互作用をいう。線状高分子の反応性鎖末端と、別の線状高分子の内部反応性部位との反応は、分枝点またはグラフトの形成をもたらすが、架橋反応とは見なさない。
【００１０】
グラフト化という用語は、本明細書において使用する限り、１以上のブロック種が、高分子の主鎖のものとは異なる、構造的または立体配置的特徴を有する側鎖として、高分子の主鎖に接続される反応をいう。
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、高い変換率でヒアルロナンヒドロゲルにデキストランをグラフト化できることを見出した。架橋ヒアルロン酸網状構造がデキストランの拡散を妨げて低減したグラフト化効率をもたらであろうと予測されていたため、この知見は予測できなかった。
【００１２】
１以上のデキストラン分子がグラフト化された架橋ヒアルロン酸を含む、本発明によるヒアルロン酸生成物は、いくつかの有利で驚くべき性質、たとえば、皮膚充填剤としての使用中に改善された耐久性をもたらす、熱、加水分解、ラジカルおよび酵素による分解に対する改善された安定性と、低下した膨潤容量とを含む性質を示す。低減した膨潤容量は、ヒアルロン酸中の架橋剤の量を増加させることなく、より硬いゲルを生成できることを意味する。
【００１３】
本発明による架橋ヒアルロン酸生成物は、たとえば、皮膚充填および体形矯正のような化粧品または医療手術用の注射可能な組成物として使用することができる。ヒアルロン酸とデキストランとを組み合わせた本発明による架橋ヒアルロン酸生成物は、デキストランを含まないヒアルロン酸生成物に比べて、低下した膨潤を示す。これは、ヒアルロン酸中の架橋剤の量を増加させることなく、より硬いゲルを生成できることを意味するので、有用である。本発明による架橋ヒアルロン酸生成物は、デキストランを含まないヒアルロン酸生成物に比べ、より良好な熱安定性ならびにラジカルおよび酵素による分解に対するより良好な安定性を有することもわかっている。考えられる説明は、ヒアルロン酸の骨格がデキストランによって保護されていることである。このことは、デキストランを含まないヒアルロン酸生成物に比べ、本発明による架橋ヒアルロン酸生成物の改善されたインビボ耐久性をもたらす。
【００１４】
好ましい実施形態では、デキストランがアミド結合によってヒアルロン酸に結合される。デキストラン−ヒアルロン酸グラフトにおけるアミド結合の使用は、インビボでの分解に対してより安定であるので、たとえばエステル結合に比べて有利であることがわかっている。
【００１５】
明確な物理化学的性質を有する所望の形態に既に調製されていてもよい、既に架橋されたヒアルロン酸に、デキストラン分子をグラフト化することが有利である。これは、架橋ＨＡの解重合を誘発させることなく、架橋ＨＡのデキストランによる有意な修飾を可能にする。
【００１６】
本明細書において説明する第２の態様によれば、架橋ヒアルロン酸と１以上の官能化デキストラン分子とを含むヒアルロン酸生成物を調製する方法であって、
（ａ）架橋ヒアルロン酸と、１以上の官能化デキストラン分子とを用意する工程と、
（ｂ）１以上の官能化デキストラン分子を、架橋ヒアルロン酸に、共有結合的にグラフト化させる工程と
を含む方法を提供する。
【００１７】
デキストラン分子は、架橋ヒアルロン酸に、共有結合的にグラフト化されている。好ましい実施形態では、デキストラン分子は、単一の端点結合によって架橋ヒアルロン酸にグラフト化されている。共有結合的なグラフト化を可能にするために、デキストラン分子を、適切な反応性官能基で官能化する。デキストラン分子には、アミド結合によって架橋ヒアルロン酸へのグラフト化を可能にするために、たとえば、アミノ基を有するリンカーを備えていてもよい。
【００１８】
本発明による方法によって得ることができる生成物の性質は複雑であるので、生成物はこれらの方法の結果としても定義されるであろう。本明細書において説明する別の態様によれば、本明細書に記載した方法によって得ることができる、ヒアルロン酸およびデキストランを含む架橋ヒアルロン酸生成物を提供する。
【００１９】
本開示の架橋ヒアルロン酸生成物は、たとえば、矯正的および審美的な治療を含むがこれらに限定されない、軟組織障害を治療するための注射可能な製剤に使用してもよい。
【００２０】
本開示の架橋ヒアルロン酸生成物は、たとえば、美容外科、たとえば皮膚充填、体形矯正、および顔面輪郭矯正のための注射可能な製剤に用いてもよいし、医療外科、たとえば皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネルの形成、失禁治療、および整形外科用途に用いてもよいし、ならびに皮膚の水分補給および／または活性化のために用いてもよい。
【００２１】
本明細書において説明する態様によれば、本明細書に記載した架橋ヒアルロン酸生成物を皮膚に投与することを含む、皮膚を美容的に治療する方法を提供する。
【００２２】
架橋ヒアルロン酸生成物は、注射可能な皮膚用の審美的または医薬製剤に備えてもよい。
【００２３】
本発明の他の態様および好ましい実施形態は、以下の本発明の詳細な開示および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ヒアルロン酸ゲルの膨潤が、デキストランによるグラフト化を増加するとともに減少する様子を示す図。
【図２】ＨＡ−デキストラン混合ヒドロゲルの熱重量分析。
【図３】デキストラン−リンカー／ＨＡ比の関数としての、ＨＡ上のグラフト化デキストラン。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明のヒアルロン酸（本明細書においては、ヒアルロン酸を「ＨＡ」または「ヒアルロナン」ともいう）生成物は、架橋ヒアルロン酸と１以上のデキストラン分子とを含み、ヒアルロン酸はエーテル結合により架橋されており、１以上のデキストラン分子は架橋ヒアルロン酸に共有結合的にグラフト化されている。
【００２６】
ヒアルロン酸生成物は水溶液中に存在していてもよいが、乾燥または沈殿形態で、たとえばエタノール中に存在していてもよい。ヒアルロン酸生成物は、好ましくは注射可能である。
【００２７】
ヒアルロン酸生成物は、ゲル（本明細書においては、「ヒドロゲル」ともいう）の形で存在していてもよい。ゲル中の多糖の総量は、好ましくは５〜１５０ｍｇ／ｍＬの範囲、より好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲にある。
【００２８】
架橋ヒアルロン酸にグラフト化されたデキストランのモル量は、０．１〜９９％の範囲、好ましくは１〜６０％の範囲にある。
【００２９】
ヒアルロン酸生成物は、その膨潤によって、すなわち、その水を吸収する能力によって評価される。膨潤は、乾燥生成物１グラムが吸収することのできる、ｍＬでの水（または生理食塩液）の量として表される。膨潤は、ゲルに関して測定することもでき、ゲルのグラム当たりのｍＬとして表すことができる。ヒアルロン酸生成物の膨潤は、好ましくは０．５〜１０ｍＬ／ｇの範囲、より好ましくは１〜５ｍＬ／ｇの範囲である。
【００３０】
本発明のヒアルロン酸生成物は、ゲル粒子、ストリング、ディスクなどの形態にあってもよい。好ましい実施形態では、架橋ヒアルロン酸はゲル粒子の形態にある。ゲル粒子は、好ましくは、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍ、たとえば０．２〜０．５ｍｍ、または０．５〜０．８ｍｍの範囲の平均膨潤粒径（他に指示しない限り、本明細書において示した全ての粒径は重量平均粒径をいう）を有する。いくつかの実施形態によれば、架橋ヒアルロン酸は、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍの範囲の平均径を有するゲル粒子の形態にある。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、１以上のデキストラン分子と二糖の架橋ヒアルロン酸はと、０．１〜９９％、たとえば０．１〜６０％、たとえば１〜６０％、またはたとえば１〜２０％のモル比を有する。５０％のモル比は、ＨＡ二糖の半分がグラフト化されたデキストラン鎖を有することを意味する。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、デキストラン分子は、１０ｋＤａ未満、好ましくは５ｋＤａ未満の平均分子量を有する。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、デキストラン分子は、単一の端点結合によってヒアルロン酸に共有結合的に連結されている。単一の端点結合は、デキストランが、デキストラン分子の末端残基のみを介して、好ましくはデキストラン分子の還元末端を介して、ヒアルロン酸に結合されていることを意味する。いくつかの実施形態によれば、デキストラン分子は、デキストランの還元末端とヒアルロン酸のカルボキシル基との間の二または多官能性リンカーを介した単一の端点結合によって、ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、デキストラン分子は、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼート、またはアミノオキシ官能基を有するリンカーを含有し、リンカーの官能基は、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と共有結合を形成する。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、二または多官能性リンカーは、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼート、またはアミノオキシから独立して選択された少なくとも２つの官能基を含む。いくつかの実施形態によれば、二または多官能性リンカーは、ジアミンまたはジヒドラジドである。いくつかの実施形態によれば、二または多官能性リンカーは、ヘキサメチレンジアミン、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）、Ｏ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビス−ヒドロキシルアミン、アジピン酸ジヒドラジド、またはスペルミジンである。
【００３６】
他に規定しない限り、「ヒアルロン酸」という用語は、様々な鎖長および電荷状態の、ならびに様々な化学修飾を持つ、ヒアルロン酸、ヒアルロネート、またはヒアルロナンの、全ての変種および変種の組合せを包含する。すなわち、この用語は、様々な対イオンを持つヒアルロン酸の様々なヒアルロン酸塩、たとえばヒアルロン酸ナトリウムも包含する。ヒアルロン酸の様々な修飾もこの用語に包含され、たとえば酸化、たとえば−ＣＨ2ＯＨ基から−ＣＨＯおよび／または−ＣＯＯＨへの酸化；ビシナルヒドロキシル基の過ヨウ素酸酸化、その後に任意に続く還元、たとえば−ＣＨＯから−ＣＨ2ＯＨへの還元、またはイミンを形成するアミンによるカップリング、その後の第２級アミンへの還元；硫酸化；脱アミド、その後に任意に続く脱アミノまたは新しい酸によるアミド形成；エステル化；および脱アセチル化である。修飾のその他の例は、イソ尿素、ヒドラジド、ブロモシアン、モノエポキシド、およびモノスルホンカップリングである。
【００３７】
ヒアルロン酸は、動物および非動物由来の様々な供給源から得ることができる。非動物由来の供給源は、酵母、好ましくは細菌を含む。単一のヒアルロン酸分子の分子量は、典型的には０．１〜１０ＭＤａの範囲であるが、その他の分子量がありうる。
【００３８】
ある実施形態では、架橋ヒアルロン酸の濃度が１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態では、架橋ヒアルロン酸の濃度が２〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、架橋ヒアルロン酸の濃度が５〜３０ｍｇ／ｍｌ範囲または１０〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００３９】
架橋ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸鎖の間に架橋を含み、共有結合的な架橋、ヒアルロン酸鎖の物理的絡み合い、および様々な相互作用、たとえば静電相互作用、水素結合、およびファンデルワールス力によって、一緒に保持されるヒアルロン酸分子の連続網状構造を作る。
【００４０】
架橋ヒアルロン酸生成物は、好ましくは生体適合性である。これは、免疫応答が、治療された個体において全くまたは非常に軽度にしか生じないことを示唆する。すなわち、治療した個体では、望ましくない局所または全身作用が全くまたは非常に軽度にしか生じない。
【００４１】
本発明による架橋ヒアルロン酸生成物は、ゲルまたはヒドロゲルであってもよい。すなわち、水不溶性と見なすことができるが、液体、典型的には水性液体にさらされたとき、実質的にはヒアルロン酸分子の希薄架橋系と見なすことができる。
【００４２】
ゲルは、重量で主として液体を含有し、たとえば９０〜９９．９％の水を含有することができるが、液体中の三次元架橋ヒアルロン酸網状構造に起因して、固体のように挙動する。その有意な液体含量に起因して、ゲルは、構造的に柔軟でありかつ天然組織に類似しており、したがって組織工学における足場としておよび組織増強のために非常に有用になる。
【００４３】
ヒアルロン酸の架橋は、架橋剤を用いた修飾によって実現してもよい。ヒアルロン酸の濃度および架橋の度合は、機械的性質、たとえば弾性率Ｇ’、およびゲルの安定性に影響を及ぼす。架橋ヒアルロン酸ゲルは、しばしば「修飾の度合」によって特徴付けられる。ヒアルロン酸ゲルの修飾の度合は、一般に０．１〜１５ｍｏｌ％の範囲である。修飾の度合（ｍｏｌ％）は、ＨＡに結合した架橋剤（１以上）の量であり、すなわち繰り返しＨＡ二糖単位の全モル量に対する、結合した架橋剤（１以上）のモル量である。修飾の度合は、ＨＡが架橋剤によって化学修飾された度合を反映する。修飾の度合を決定するための架橋の反応条件および適切な分析技法は、すべて当業者に周知であり、当業者は、これらおよびその他の関連ある因子を容易に調節することができ、それによって適切な条件を与えて０．１〜２％の範囲の修飾の度合を得ることができ、修飾の度合に対して得られる生成物特性を検証することができる。ＢＤＤＥ（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）架橋ヒアルロン酸ゲルは、たとえば、公開された国際特許出願ＷＯ  ９７０４０１２の例１および２に記載されている方法によって調製してもよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、架橋ヒアルロン酸は、架橋剤によって架橋されたゲルの形で存在し、前記ヒアルロン酸の濃度は１０〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、前記架橋剤による修飾の度合は０．１〜０．２ｍｏｌ％の範囲である。
【００４５】
ヒアルロン酸ゲルは、架橋されていない、すなわち三次元架橋ヒアルロン酸網状構造に結合されていない、ヒアルロン酸の一部を含んでいてもよい。しかし、ゲル組成物中の少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７０重量％、最も好ましくは少なくとも８０重量％のヒアルロン酸が、架橋ヒアルロン酸網状構造の部分を形成することが好ましい。
【００４６】
ヒアルロン酸は、粒子、ストリング、ディスクなどの形で存在していてもよい。好ましい実施形態では、架橋ヒアルロン酸はゲル粒子の形態にある。ゲル粒子は、好ましくは、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍ、たとえば０．２〜０．５ｍｍ、または０．５〜０．８ｍｍの範囲の平均径を有する。
【００４７】
ヒアルロン酸鎖は、二または多官能性架橋剤から誘導されたリンカーを介して互いに架橋している。ヒアルロン酸組成物の二または多官能性架橋剤は、ヒアルロン酸鎖を互いに接続する。二または多官能性架橋剤はさらに、ヒアルロン酸鎖の間のスペーサーとして作用する。
【００４８】
二または多官能性架橋剤は、ヒアルロン酸の官能基と反応することができる２以上の官能基を含み、共有結合の形成をもたらす。二または多官能性架橋剤は、たとえば、ジビニルスルホン、ジエポキシド、およびマルチエポキシドからなる群から選択してもよい。
【００４９】
好ましいタイプの二または多官能性架橋剤は、ビスまたはポリエポキシド、たとえばジグリシジルエーテルである。実施形態によれば、二または多官能性架橋剤は、２以上のグリシジルエーテル官能基を含む。グリシジルエーテル官能基は、ヒアルロン酸の第１級ヒドロキシル基と反応し、エーテル結合の形成をもたらす。この結果、ジグリシジルエーテル架橋剤がヒアルロナンの第１級ヒドロキシル基と反応すると、架橋剤から中間スペーサーが残って、２つのエーテル結合が形成される。
【００５０】
ヒアルロン酸鎖を架橋するのに好ましい、二または多官能性架橋剤には、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）、およびエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンが含まれる。特に好ましい二または多官能性架橋剤は、ＢＤＤＥである。
【００５１】
デキストランは、任意の平均分子量（他に特定しない限り、本明細書において示したデキストランの全ての平均分子量は、数平均分子量、Ｍnをいう）でよく、典型的には０．２〜３０００ｋＤａの範囲である。いくつかの実施形態では、デキストランは、より低い分子量、たとえば１００ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満、または５ｋＤａ未満を有することが好ましい。デキストランは、０．２ｋＤａ超、好ましくは０．５ｋＤａ超の分子量を有する。いくつかの実施形態では、デキストランは、１０〜１００ｋＤａの範囲、または１０〜５０ｋＤａの範囲の分子量を有する。いくつかの好ましい実施形態では、デキストランは、０．５〜１０ｋＤａの範囲または０．５〜５ｋＤａの範囲の分子量を有する。ある好ましい実施形態では、デキストランは、０．５〜３ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
【００５２】
デキストランは、その水中への溶解度を改善するために、および／またはその特殊な適用での性能を最適化するために、しばしば化学修飾する。デキストランという用語は、本明細書において使用する限り、その官能性が同等な変種または誘導体も包含するものとする。
【００５３】
本発明による架橋ヒアルロン酸生成物は、好ましくは生体適合性である。これは、生成物を個体の組織内に導入したとき、免疫応答が全くまたは非常に軽度にしか生じないことを示唆する。すなわち、治療した個体において、望ましくない局所または全身作用が全くまたは非常に軽度にしか生じない。
【００５４】
本開示の架橋ヒアルロン酸生成物は、たとえば、矯正的および審美的な治療を含むがこれらに限定されない軟組織障害を治療するための、注射可能な製剤で使用してもよい。
【００５５】
本開示の架橋ヒアルロン酸生成物は、たとえば、美容外科、たとえば皮膚充填、体形矯正、および顔面輪郭矯正、医療外科、たとえば皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネルの形成、失禁治療、および整形外科用途に用いられる注射可能な製剤、ならびに皮膚の水分補給および／または活性化のために使用してもよい。
【００５６】
架橋ヒアルロン酸生成物は、注射可能な皮膚科のエステティックまたは医薬製剤中に与えてもよい。
【００５７】
本開示の架橋ヒアルロン酸生成物は、様々な医薬または化粧品物質を、輸送しまたは投与し、および持続または制御放出するための、注射可能な製剤中に使用してもよい。
【００５８】
注射可能な製剤は、緩衝剤、保存剤、等張性調節剤、塩、酸化防止剤、浸透圧調節剤、乳化剤、湿潤剤、甘味剤、または着香剤、および同様のものを含むがこれらに限定することのない、１以上のその他の医薬として許容される成分を、任意に含んでいてもよい。
【００５９】
注射可能な製剤は、医薬として有効な量の麻酔剤を、任意に含んでいてもよい。麻酔剤は、局所麻酔剤、たとえばアミノアミド局所麻酔またはアミノエステル局所麻酔剤であってもよい。麻酔剤の例は、リドカイン、アンブカイン、アモラノン、アミロカイン、ベノキシネート、ベンゾカイン、ベトキシカイン、ビフェナミン、ブピバカイン、ブタカイン、ブタムベン、ブタニリカイン、ブテタミン、ブトキシカイン、カルチカイン、クロロプロカイン、コカエチレン、シクロメチカイン、ジブカイン、ジメチソキン、ジメトカイン、ジペロドン、ジシクロミン、エクゴニジン、エクゴニン、塩化エチル、エチドカイン、β−ユーカイン、ユープロシン、フェナルコミン、ホルモカイン、ヘキシルカイン、ヒドロキシテトラカイン、ｐ−アミノ安息香酸イソブチル、メシル酸ロイシノカイン、レボキサドロール、リドカイン、メピバカイン、メプリルカイン、メタブトキシカイン、塩化メチル、ミルテカイン、ナエパイン、オクタカイン、オルトカイン、オキセタザイン、パレトキシカイン、フェナカイン、フェノール、ピペロカイン、ピリドカイン、ポリドカノール、プラモキシン、プリロカイン、プロカイン、プロパノカイン、プロパラカイン、プロピポカイン、プロポキシカイン、プソイドコカイン、ピロカイン、ロピバカイン、サリチルアルコール、テトラカイン、トリカイン、トリメカイン、ゾルアミン、これらの組合せ、およびこれらの塩を含むが、これらに限定するものではない。アミノエステル局所麻酔剤の例には、プロカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン（ラロカイン）、プロポキシカイン、プロカイン（ノボカイン）、プロパラカイン、テトラカイン（アメトカイン）を含むが、これらに限定するものではない。アミノアミド局所麻酔剤の非限定的な例は、アルチカイン、ブピバカイン、シンコカイン（ジブカイン）、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン（リグノカイン）、メピバカイン、ピペロカイン、プリロカイン、ロピバカイン、トリメカイン、またはこれらの組合せを含む。
【００６０】
本明細書において記載した、架橋ヒアルロン酸生成物または架橋ヒアルロン酸生成物を含む注射可能な医薬製剤は、対象の顔面または身体の皮膚の外観を改善し、皺に充填し、または輪郭を形成するために、使用してもよい。
【００６１】
本明細書において記載した、架橋ヒアルロン酸生成物または架橋ヒアルロン酸生成物を含む注射可能な医薬製剤は、皮膚充填剤として有利に使用してもよい。
【００６２】
本明細書において記載した、架橋ヒアルロン酸生成物または架橋ヒアルロン酸生成物を含む注射可能な医薬製剤は、本明細書において記載した架橋ヒアルロン酸生成物を皮膚に投与することを含む、皮膚を美容的に治療する方法で使用してもよい。
【００６３】
本明細書において記載した、架橋ヒアルロン酸生成物または架橋ヒアルロン酸生成物を含む注射可能な医薬製剤は、関節内注射による関節障害の治療で使用してもよい。
【００６４】
架橋ヒアルロン酸生成物または架橋ヒアルロン酸生成物を含む注射可能な医薬製剤の前述した使用は、医療処置であっても純粋に美容的な非医療処置であってもよい。
【００６５】
好ましい実施形態では、デキストラン分子が、アミド結合によって架橋ヒアルロン酸にグラフト化されている。デキストラン分子は、アミド結合による架橋ヒアルロン酸へのグラフト化を可能にするために、官能化され、たとえばアミノ化される。したがって本発明は、穏やかなカップリング反応を可能にし、デキストランと架橋ヒアルロン酸との間にアミド結合を生成し、これらは一定の物理化学的性質を備え、たとえば粒子形態にある。デキストラン−ヒアルロン酸の連結（グラフト）におけるアミド結合の使用は、このアミド結合がインビボでの分解に対してより安定であるので、たとえばエステル結合に比べて有利であることがわかっている。得られる架橋ヒアルロン酸生成物は、有用な安定性を有し、したがって皮膚充填剤として、ならびに持続放出用途に適切である。別の利点は、エーテル架橋ヒアルロン酸に対するアミド結合を介したデキストラン分子のグラフト化によって、その解重合を誘発させることなく、デキストランを用いた架橋ヒアルロン酸の有意な修飾が可能になることである。
【００６６】
ヒアルロン酸生成物は：
（ａ）架橋ヒアルロン酸と、１以上の官能化デキストラン分子とを用意する工程と、
（ｂ）１以上の官能化デキストラン分子を、架橋ヒアルロン酸に、共有結合的にグラフト化させる工程と
を含む方法によって調製することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態によれば、工程（ａ）における架橋ヒアルロン酸は、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍの範囲の平均径を有するゲル粒子の形態にある。
【００６８】
いくつかの実施形態によれば、得られたヒアルロン酸生成物の、１以上のデキストラン分子と架橋ヒアルロン酸の二糖とが、０．１〜９９％、好ましくは１〜６０％のモル比を有する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）で用意したデキストラン分子は、１０ｋＤａ未満、好ましくは５ｋＤａ未満の平均分子量を有する。
【００７０】
いくつかの実施形態によれば、デキストラン分子は、単一の端点結合によって、ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている。いくつかの実施形態によれば、デキストラン分子は、デキストランの還元末端とヒアルロン酸のカルボキシル基との間の二または多官能性リンカーを介した単一の端点結合によって、ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている。
【００７１】
いくつかの実施形態によれば、工程（ａ）で用意した官能化デキストラン分子は、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基にデキストラン分子を連結するのに利用可能な少なくとも１つの官能基を有する二または多官能性リンカーにより、還元末端で官能化されている。
【００７２】
いくつかの実施形態によれば、二または多官能性リンカーは、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼート、またはアミノオキシから独立して選択される、少なくとも２つの官能基を含む。いくつかの実施形態によれば、二または多官能性リンカーは、ジアミンまたはジヒドラジドである。いくつかの実施形態によれば、二または多官能性リンカーは、ヘキサメチレンジアミン、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）、Ｏ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビス−ヒドロキシルアミン、アジピン酸ジヒドラジド、またはスペルミジンである。
【００７３】
いくつかの実施形態によれば、工程（ａ）の１以上の官能化デキストラン分子は、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼート、またはアミノオキシ官能基を有するリンカーを含有し、リンカーの官能基は、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と共有結合を形成する。
【００７４】
いくつかの実施形態によれば、方法の工程（ａ）はさらに、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基にデキストラン分子を連結させるのに利用可能な少なくとも１つの官能基を有する二または多官能性リンカーにより、還元末端でデキストラン分子を官能化することを含む。この方法を、反応スキーム１で一般的に記述する。
【００７５】
【化１】
2017517601.tif 000003
【００７６】
二または多官能性リンカーは、一般式Ｘ−Ｒ−Ｙを有することができ、式中、Ｘは、デキストランの還元末端と結合を形成することができる官能基であり、ＸおよびＹは、同じ官能基、または２つの異なる官能基とすることができる。Ｒは、適切なスペーサー基であり、たとえば、アルキル、アルコキシ、エーテル、またはチオエーテルなどを含んでいてもよいがこれらに限定するものではない。官能基Ｘは、安定な結合を形成するよう、後に還元剤によって還元することができるイミンを形成するために、デキストランの開環形態のアルデヒド基と反応できる。リンカーは、還元末端基に１つのアルデヒド基しか持っていないので、デキストラン上の１つの部位でしか反応することができず、したがって反応が非常に特異的なものになる。官能基Ｘは、たとえばアミン、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼート、またはアミノオキシであってもよい。還元剤は、たとえばＮａＣＮＢＨ3、ＮａＢＨ4、ＳＴＡＢ（トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）、または２−ピコリンボラン錯体であってもよい。官能基Ｙは、デキストランの還元末端との反応中に、適切な保護基（たとえば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｏｃ））で任意に保護することができ、架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基とのカップリング前に脱保護することができる。デキストラン分子を官能化するのに適切な反応条件は、３〜１１の範囲のｐＨ、１〜４８時間の範囲の反応時間、２０〜６０℃の範囲の反応温度、１：１〜５０：１の範囲のリンカーとデキストランとのモル比、および１：１〜５０：１の範囲の還元剤とデキストランとのモル比を含む。
【００７７】
官能化デキストラン（デキストラン−リンカー）は、リンカーの遊離官能基Ｙを介して、たとえばトリアジンまたはカルボジイミド媒介型アミド化を使用して、架橋ヒアルロン酸にグラフト化することができる。方法を、反応スキーム２において一般的に記述する。
【００７８】
【化２】
2017517601.tif 000004
【００７９】
架橋ヒアルロンのカルボキシル基は、活性化剤と反応して、活性エステルを形成する。官能基Ｙは、活性エステルと反応することができる官能基である。官能基Ｙは、たとえばアミン、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼート、またはアミノオキシであってもよい。活性化剤は、適切なカップリング剤（たとえば、カルボジイミドカップリング剤であって、活性化剤、たとえばヒドロキシルアミン誘導体、またはトリアジンを一緒に含むもの）である。官能基Ｙは、活性エステルと反応して、デキストランを架橋ヒアルロン酸にグラフト化する。官能化デキストラン（デキストラン−リンカー）を架橋ヒアルロン酸にグラフト化するのに適切な反応条件は、３〜１２の範囲のｐＨ、１〜４８時間の範囲の反応時間、１５〜７０℃の範囲の反応温度、０．１：１〜１０：１の範囲のカップリング剤とヒアルロン酸カルボキシル基とのモル比、０．０５：１〜５：１の範囲のデキストラン−リンカーとヒアルロン酸カルボキシル基とのモル比、１〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲の架橋ヒアルロン酸の濃度を含む。
【００８０】
方法のいくつかの実施形態によれば、工程（ｂ）のグラフト化は：
（ｉ）架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基をカップリング剤で活性化して、活性化架橋ヒアルロン酸を形成し、
（ｉｉ）１以上の官能化デキストラン分子のリンカーを、活性化架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基にカップリングする
ことを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態によれば、架橋ヒアルロン酸の活性化および活性化架橋ヒアルロン酸へのデキストラン分子のカップリングは、工程（ｂ）で同時に起こる。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、架橋ヒアルロン酸の活性化は、工程（ｂ）における活性化架橋ヒアルロン酸へのデキストラン分子のカップリングの前に別途に起こる。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、カップリング剤は、トリアジン系カップリング剤、カルボジイミドカップリング剤、イミダゾリウム誘導型カップリング剤、Ｏｘｙｍａ、およびＣＯＭＵからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、カップリング剤は、トリアジン系カップリング剤である。いくつかの実施形態によれば、トリアジン系カップリング剤は、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）および２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）からなる群から選択される。好ましい実施形態では、トリアジン系カップリング剤はＤＭＴＭＭである。
【００８４】
工程（ａ）および（ｂ）のさらに好ましい実施形態は、得られるヒアルロン酸生成物に関する上記内容から明らかである。特に、工程（ｂ）はさらに、架橋ヒアルロン酸から粒子、ストリング、ディスクなどへのサイズ減少を含んでいてもよい。
【００８５】
本発明による方法によって得ることができる生成物の性質は複雑であるので、生成物は、これらの方法の結果として定義してもよい。
【００８６】
本発明者らは、驚くべきことに、高い変換率で架橋ヒアルロン酸ゲルに直接デキストランをグラフト化できることを見出した。グラフト化は、好ましくは、適切なリンカーを介したヒアルロン酸へのデキストランの共有結合による単一の端点結合によって行われる。架橋ヒアルロン酸および１以上のデキストラン分子を含む、本発明によるヒアルロン酸生成物は、いくつかの利点および驚くべき性質を示す。
【００８７】
膨潤容量、したがって水を吸収する能力は、ヒアルロン酸ゲルのカルボキシル基にデキストランをグラフト化することによって、驚くほど低減した。この膨潤容量の低減を、図１に示す。低減した膨潤は、ヒアルロン酸中の架橋剤の量を増加させることなく、より硬いゲルを生成できることを意味するので、有用である。
【００８８】
デキストラングラフトは、デキストランがヒアルロン酸よりも分解に対して安定であるので、ヒドロゲル骨格を熱分解から保護することが予測される。ヒアルロン酸およびデキストランの混合型ヒドロゲルの熱重量分析の結果に基づけば、デキストランの熱安定性はヒアルロン酸のそれよりも非常に高いことを示した（図２）。
【００８９】
デキストランをグラフト化させると、立体障害および／または利用可能なカルボキシル基（酵素機能に必須）の数が低減したことに起因して、たとえばコンドロイチナーゼおよびヒアルロニダーゼによる酵素分解から架橋ヒアルロン酸を保護する。
【００９０】
デキストラングラフトは、デキストラン中の１〜６のグリコシド結合がヒアルロン酸中の１〜３および１〜４のグリコシド結合よりも耐性があるので、ヒドロゲル骨格を加水分解から保護することが予測される。
【００９１】
アミド結合によってヒアルロン酸にデキストランをグラフト化するのに用いられる合成プロトコルは、穏やかな中性条件を含み、したがってヒアルロナンの骨格の望ましくない分解を回避する。
【００９２】
本発明による方法は、添加する官能化デキストランの量を様々に変えることによる、高度に制御可能な、ＨＡ網状構造のグラフト化の比、置換または修飾度合をも可能にする（図３）。
【００９３】
デキストラングラフトは、デキストランがＨＡヒドロゲル網状構造よりも好ましくラジカルと反応し得るので、ヒドロゲル骨格をラジカル分解から保護すると考えられる。単一の端点結合によりＨＡヒドロゲルに結合したデキストランは、ラジカルに対してもより利用可能になる。
【００９４】
最後に、二官能性リンカーは、単一の端点結合によってデキストランの還元末端、およびＨＡヒドロゲル網状構造内のヒアルロナンのカルボン酸とのみ反応するので、グラフト化は高度に化学選択性がありかつ位置特異的であり、高度に規定された構造をもたらす。
【００９５】
これらに限定しようと望むことなく、以下において、本発明を例として説明する。
【００９６】
［実施例］
特性解析
デキストランにおける還元的アミノ化
リンカーによるデキストランの修飾を、1Ｈ  ＮＭＲおよびＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで分析した。
【００９７】
ヒアルロナンゲルへのデキストランのグラフト化
ヒドロゲルを、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはＨＣｌで分解してから分析した。ヒアルロナンにグラフト化されたデキストランの量を、1Ｈ  ＮＭＲ分光法で分析した。
【００９８】
材料を酵素で分解できた場合に限るが、ＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳ分析を行って、デキストラン−リンカー−ヒアルロナンの間の連結を確認した。
【００９９】
膨潤を、生理食塩液中で行った。
【０１００】
例１−デキストランの還元的アミノ化
【０１０１】
【化３】
2017517601.tif 000005
【０１０２】
数平均分子量（Ｍn）が７５０Ｄａのデキストラン５０．０ｇ、ヘキサメチレンジアミン二塩酸塩１１８．４ｇ、およびＮａＣＮＢＨ3  ３９．４ｇを、５００ｍＬのガラス瓶に量り取った。試薬を、５０ｍＭ  四ホウ酸ナトリウム緩衝液２５０ｇに溶解した。ｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ９．８に調節した。瓶を、６０℃の水浴中に３時間置いた。
【０１０３】
反応粗生成物を、希ＨＣｌでｐＨ７に中和し、３Ｌのプラスチックビーカーに移した。オーバーヘッドスターラーで撹拌し、蠕動ポンプを使用して最終エタノール濃度９０％までエタノールをゆっくり添加しながら、反応粗生成物を沈殿させた。沈殿物を、９０％エタノールで多数回洗浄して、結合していない反応化学物質を完全に除去し、真空乾燥機で乾燥した。
【０１０４】
乾燥粉末をＤ2Ｏに溶解し、1Ｈ  ＮＭＲにより分析した。デキストランのアノマープロトンからのシグナル（４．９４ｐｐｍ）がヘキサメチレンジアミンのシグナル（１．３３ｐｐｍ）と比較することによって、サンプル中の全デキストランの８７％がヘキサメチレンジアミンと結合したことがわかった。
【０１０５】
例２−マルトトリオースの還元的アミノ化
【０１０６】
【化４】
2017517601.tif 000006
【０１０７】
マルトトリオース１．０ｇ、ヘキサメチレンジアミン二塩酸塩１．９ｇ、およびＮａＣＮＢＨ3  ０．７ｇを、アルミニウムの蓋が付いた２０ｍＬのガラスバイアルに量り取った。試薬を、５０ｍＭ  四ホウ酸ナトリウム緩衝液５ｇに溶解した。ｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨで１０に調節した。その後、バイアルを、６０℃の水浴中に３時間置いた。
【０１０８】
反応粗生成物を、希ＨＣｌでｐＨ７に中和した。粗生成物を希釈した後、ネガティブエレクトロスプレーを使用してＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで分析した。溶液は、８０面積％のマルトトリオース−ＨＭＤＡ（ｍ／ｚ  ６０３．３０）、１０面積％のマルトトリオース−ＨＭＤＡ−マルトトリオース（ｍ／ｚ  １０９１．４７）、および１０面積％の還元マルトトリオース（ｍ／ｚ  ５０５．１８）から構成されることがわかった。
【０１０９】
例３−デキストランの還元的アミノ化
【０１１０】
【化５】
2017517601.tif 000007
【０１１１】
Ｍn  １１００Ｄａのデキストラン５．０ｇ、スペルミジン三塩酸塩５．４ｇ、およびＮａＣＮＢＨ3  １．６ｇを、５０ｍＬのガラス瓶に量り取った。試薬を、５０ｍＭ  四ホウ酸ナトリウム緩衝液１４．３ｇに溶解した。ｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ９．３に調節した。瓶を、６０℃の水浴中に２時間置いた。
【０１１２】
反応粗生成物を、希ＨＣｌでｐＨ７に中和し、３Ｌのプラスチックビーカーに移した。オーバーヘッドスターラーで撹拌し、蠕動ポンプを使用してエタノールを最終エタノール濃度９０％までゆっくり添加しながら、反応粗生成物を沈殿させた。沈殿物を、９０％エタノールで多数回洗浄して、結合していない反応化学物質を完全に除去し、真空乾燥機で乾燥した。
【０１１３】
乾燥粉末をＤ2Ｏに溶解し、1Ｈ  ＮＭＲにより分析した。デキストランのアノマープロトンからのシグナル（４．９４ｐｐｍ）をスペルミジンのシグナル（１．７６ｐｐｍ）と比較したときに、デキストランがスペルミジンで修飾されたことを確認した。
【０１１４】
例４−デキストランの還元的アミノ化
【０１１５】
【化６】
2017517601.tif 000008
【０１１６】
Ｍn  １１００Ｄａのデキストラン５．０ｇ、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）３．４ｇ、およびＮａＣＮＢＨ3  １．５ｇを、５０ｍＬのガラス瓶に量り取った。試薬を、５０ｍＭ  四ホウ酸ナトリウム緩衝液１５．０ｇに溶解した。ｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨで１０．３に調節した。瓶を、６０℃の水浴中に２時間置いた。
【０１１７】
反応粗生成物を、希ＨＣｌでｐＨ７に中和し、３Ｌのプラスチックビーカーに移した。オーバーヘッドスターラーで撹拌し、蠕動ポンプを使用してエタノールを最終エタノール濃度９０％までゆっくり添加しながら、反応粗生成物を沈殿させた。沈殿物を、９０％エタノールで多数回洗浄して、結合していない反応化学物質を完全に除去し、真空乾燥機で乾燥した。
【０１１８】
乾燥粉末をＤ2Ｏに溶解し、1Ｈ  ＮＭＲにより分析した。デキストランのアノマープロトンからのシグナル（４．９４ｐｐｍ）を２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）のシグナル（３．２０ｐｐｍ）と比較したときに、デキストランが２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）で修飾されたことを確認した。
【０１１９】
例５−デキストランの還元的アミノ化
【０１２０】
【化７】
2017517601.tif 000009
【０１２１】
Ｍn  １１００Ｄａのデキストラン５．１ｇ、Ｏ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミン二塩酸塩４．１ｇ、およびＮａＣＮＢＨ3  １．５ｇを、５０ｍＬのガラス瓶に量り取った。試薬を、５０ｍＭ  四ホウ酸ナトリウム緩衝液１３．４ｇに溶解した。ｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨで９．７に調節した。瓶を、６０℃の水浴中に２時間置いた。
【０１２２】
反応粗生成物を、希ＨＣｌでｐＨ７に中和し、３Ｌのプラスチックビーカーに移した。オーバーヘッドスターラーで撹拌し、蠕動ポンプを使用してエタノールを最終エタノール濃度９０％までゆっくり添加しながら、反応粗生成物を沈殿させた。沈殿物を、９０％エタノールで多数回洗浄して、結合していない反応化学物質を完全に除去し、真空乾燥機で乾燥した。
【０１２３】
乾燥粉末をＤ2Ｏに溶解し、1Ｈ  ＮＭＲにより分析した。デキストランのアノマープロトンからのシグナル（４．９４ｐｐｍ）をＯ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミンのシグナル（４．１８ｐｐｍ）と比較したときに、デキストランがＯ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミンで修飾されたことを確認した。
【０１２４】
例６−デキストランの還元的アミノ化
【０１２５】
【化８】
2017517601.tif 000010
【０１２６】
Ｍn  １１００Ｄａのデキストラン５．０ｇ、アジピン酸ジヒドラジド４．１ｇ、およびＮａＣＮＢＨ3  １．７ｇを、５０ｍＬのガラス瓶に量り取った。試薬を、５０ｍＭ  四ホウ酸ナトリウム緩衝液１３．５ｇに溶解した。ｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨで９．５に調節した。瓶を、６０℃の水浴中に２時間置いた。
【０１２７】
反応粗生成物を、希ＨＣｌでｐＨ７に中和し、３Ｌのプラスチックビーカーに移した。オーバーヘッドスターラーで撹拌し、蠕動ポンプを使用してエタノールを最終エタノール濃度９０％までゆっくり添加して、反応粗生成物を沈殿させた。沈殿物を、９０％エタノールで多数回洗浄して、結合していない反応化学物質を完全に除去し、真空乾燥機で乾燥した。
【０１２８】
乾燥粉末をＤ2Ｏに溶解し、1Ｈ  ＮＭＲにより分析した。デキストランのアノマープロトンからのシグナル（４．９４ｐｐｍ）をアジピン酸ジヒドラジドのシグナル（１．６０ｐｐｍ）と比較したときに、デキストランがアジピン酸ジヒドラジドで修飾されたことを確認した。
【０１２９】
例７〜１３−ヒアルロナンゲルへの官能化デキストランのグラフト化
例７〜１３では、官能化デキストラン分子をヒアルロン酸ヒドロゲルにグラフト化させた。ヒアルロン酸ゲルは、国際特許出願ＷＯ  ９７／０４０１２（Åｇｅｒｕｐら）の例１および２に記載されている一般的手順に従い調製した。
【０１３０】
例７〜１３で使用する変換率という用語は、グラフト化された修飾デキストランのモル数を、反応で使用された修飾デキストランの全モル数で割った値として定義する。
【０１３１】
例７−ヒドロゲルへのヘキサメチレンジアミンをよるデキストラン（１ｋＤａ）のグラフト化
【０１３２】
【化９】
2017517601.tif 000011
【０１３３】
ヘキサメチレンジアミンにより還元末端で修飾した１ｋＤａのデキストラン１．１ｇ、およびＤＭＴＭＭ  ５．６ｇを、１００ｍＬのガラス瓶に量り取った。１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４  ８０ｇを添加して、試薬を溶解した。沈殿したヒアルロナンヒドロゲル１．６ｇを、反応溶液に、撹拌しながら添加し、２０ｍｇ／ｍＬヒアルロナンの濃度を得た。サンプルを、５０℃の水浴中に置き、１日反応させた。
【０１３４】
ヒドロゲルの粒径を減少させ、０．２μｍフィルター上で、０．９％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。ｐＨを、０．２５Ｍ  ＮａＯＨで１３に上昇させた。ヒドロゲルを、９０分後に希ＨＣｌで中性ｐＨに中和した。ゲルを、０．９％  ＮａＣｌで連続して洗浄し、次いでオーバーヘッドスターラーで撹拌し、蠕動ポンプでエタノールを７０％エタノールまでゆっくり添加することによって、ゲルを沈殿させた。沈殿物を、７０％エタノールで多数回洗浄した。次いで沈殿したヒドロゲルを真空乾燥機で乾燥した。
【０１３５】
1Ｈ  ＮＭＲは、デキストランのアノマープロトン（４．９４ｐｐｍ）とＨＡのＮ−アセチルプロトン（２．０２ｐｐｍ）とを比較することによって、修飾の度合（デキストラン鎖のモル／ＨＡ二糖繰り返し単位のモル）が２７％であることを示す。反応におけるデキストランの変換率は、８５％であった。デキストラン−リンカー−ＨＡのカップリングを、ＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで確認した。ゲルの初期膨潤率は１．６ｍＬ／ｇであり、反応後、その値は０．９ｍＬ／ｇに低下した。
【０１３６】
例８−ヒドロゲルへのヘキサメチレンジアミンによるデキストラン（１ｋＤａ）のグラフト化
【０１３７】
【化１０】
2017517601.tif 000012
【０１３８】
ヘキサメチレンジアミンにより還元末端で修飾した１ｋＤａのデキストラン３．５ｇ、およびＤＭＴＭＭ  ５．６ｇを、１００ｍＬのガラス瓶に量り取った。１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４  ８０ｇを添加して、試薬を溶解した。沈殿したヒアルロナンヒドロゲル１．６ｇを、反応溶液に撹拌しながら添加し、２０ｍｇ／ｍＬヒアルロナンの濃度を得た。サンプルを、５０℃の水浴中に置き、１日反応させた。
【０１３９】
ヒドロゲルの粒径を減少させ、０．２μｍフィルター上で、０．９％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。ｐＨを、０．２５Ｍ  ＮａＯＨで１３に上昇させた。ヒドロゲルを、９０分後に希ＨＣｌで中性ｐＨに中和した。ゲルを、０．９％  ＮａＣｌで連続して洗浄し、次いでオーバーヘッドスターラーで撹拌し、蠕動ポンプでエタノールを７０％エタノールまでゆっくり添加することによって、ゲルを沈殿させた。沈殿物を、７０％エタノールで２回洗浄した。次いで沈殿したヒドロゲルを真空乾燥機で乾燥した。
【０１４０】
1Ｈ  ＮＭＲは、デキストランのアノマープロトン（４．９４ｐｐｍ）とＨＡのＮ−アセチルプロトン（２．０２ｐｐｍ）とを比較することによって、修飾の度合（デキストラン鎖のモル／ＨＡ二糖繰り返し単位のモル）が４７％であることを示している。反応におけるデキストランの変換率は、４６％であった。デキストラン−リンカー−ＨＡのカップリングを、ＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで確認した。ゲルの初期膨潤率は５．１ｍＬ／ｇであり、反応後、その値は２．７ｍＬ／ｇに低下した。
【０１４１】
例９−ヒドロゲルへのスペルミジンによるデキストラン（１ｋＤａ）のグラフト化
【０１４２】
【化１１】
2017517601.tif 000013
【０１４３】
スペルミジンにより還元末端で修飾した１ｋＤａのデキストラン０．５ｇ、およびＤＭＴＭＭ  ０．６ｇを、５０ｍＬのプラスチック瓶に量り取った。１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４  ２０ｇを添加して、試薬を溶解した。溶液のｐＨを、希ＨＣｌで７．０になるよう調節した。沈殿したヒアルロナンヒドロゲル０．４ｇを、反応溶液に撹拌しながら添加し、２０ｍｇ／ｍＬヒアルロナンの濃度を得た。サンプルを、５０℃の水浴中に置き、１日反応させた。
【０１４４】
ヒドロゲルの粒径を減少させ、０．２μｍフィルター上で、０．９％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。ｐＨを、０．２５Ｍ  ＮａＯＨで１３に上昇させた。ヒドロゲルを、７０分後に希ＨＣｌで中性ｐＨに中和した。ゲルを、蠕動ポンプに連結されたカラムに移した。底部から上部へ０．９％ＮａＣｌ  ２．５Ｌをポンプ送出することによって、ヒドロゲルを連続して洗浄した。次いでゲルをカラムから取り出し、分析した。
【０１４５】
1Ｈ  ＮＭＲは、デキストランのアノマープロトン（４．９４ｐｐｍ）とＨＡのＮ−アセチルプロトン（２．０２ｐｐｍ）とを比較することによって、修飾の度合（デキストラン鎖のモル／ＨＡ二糖繰り返し単位のモル）が１８％であることを示している。反応におけるデキストランの変換率は、７８％であった。材料がコンドロイチナーゼＡＢＣにより完全には分解しなかったので、デキストラン−リンカー−ＨＡのカップリングをＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで確認できなかった。
【０１４６】
例１０−ヒドロゲルへの２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）によるデキストラン（１ｋＤａ）のグラフト化
【０１４７】
【化１２】
2017517601.tif 000014
【０１４８】
２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）により還元末端で修飾した１ｋＤａのデキストラン０．５ｇ、およびＤＭＴＭＭ  ０．６ｇを、５０ｍＬのプラスチック瓶に量り取った。１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４  ２０ｇを添加して、試薬を溶解した。溶液のｐＨを、希ＨＣｌで７．１になるよう調節した。沈殿したヒアルロナンヒドロゲル０．４ｇを、反応溶液に撹拌しながら添加し、２０ｍｇ／ｍＬヒアルロナンの濃度を得た。サンプルを、５０℃の水浴中に置き、１日反応させた。
【０１４９】
ヒドロゲルの粒径を減少させ、０．２μｍフィルター上で、０．９％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。ｐＨを、０．２５Ｍ  ＮａＯＨで１３に上昇させた。ヒドロゲルを、７０分後に希ＨＣｌで中性ｐＨに中和した。ヒドロゲルを、蠕動ポンプに連結されたカラムに移した。底部から上部へ０．９％ＮａＣｌ  ２．５Ｌをポンプ送出することによって、ゲルを連続して洗浄した。次いでゲルをカラムから取り出し、分析した。
【０１５０】
1Ｈ  ＮＭＲは、デキストランのアノマープロトン（４．９４ｐｐｍ）とＨＡのＮ−アセチルプロトン（２．０２ｐｐｍ）とを比較することによって、修飾の度合（デキストラン鎖のモル／ＨＡ二糖繰り返し単位のモル）が２１％であることを示している。反応におけるデキストランの変換率は、９０％であった。デキストラン−リンカー−ＨＡのカップリングを、ＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで確認した。
【０１５１】
例１１−ヒドロゲルへのＯ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミンによるデキストラン（１ｋＤａ）のグラフト化
【０１５２】
【化１３】
2017517601.tif 000015
【０１５３】
Ｏ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミンにより還元末端で修飾した１ｋＤａのデキストラン０．５ｇ、およびＤＭＴＭＭ  ０．６ｇを、５０ｍＬのプラスチック瓶に量り取った。１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４  ２０ｇを添加して、試薬を溶解した。溶液のｐＨを、希ＨＣｌで６．９になるよう調節した。沈殿したヒアルロナンヒドロゲル０．４ｇを、反応溶液に撹拌しながら添加し、２０ｍｇ／ｍＬヒアルロナンの濃度を得た。サンプルを、５０℃の水浴中に置き、１日反応させた。
【０１５４】
ヒドロゲルの粒径を減少させ、０．２μｍフィルター上で、０．９％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。ｐＨを、０．２５Ｍ  ＮａＯＨで１３に上昇させた。ヒドロゲルを、７５分後に希ＨＣｌで中性ｐＨに中和した。ヒドロゲルを、蠕動ポンプに連結されたカラムに移した。底部から上部へ０．９％ＮａＣｌ  ２．５Ｌをポンプ送出することによって、ゲルを連続して洗浄した。次いでゲルをカラムから取り出し、分析した。
【０１５５】
1Ｈ  ＮＭＲは、デキストランのアノマープロトン（４．９４ｐｐｍ）とＨＡのＮ−アセチルプロトン（２．０２ｐｐｍ）とを比較することによって、修飾の度合（デキストラン鎖のモル／ＨＡ二糖繰り返し単位のモル）が１１％であることを示している。反応におけるデキストランの変換率は、４９％であった。デキストラン−リンカー−ＨＡのカップリングを、ＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで確認した。
【０１５６】
例１２−ヒドロゲルへのアジピン酸ジヒドラジドによるデキストラン（１ｋＤａ）のグラフト化
【０１５７】
【化１４】
2017517601.tif 000016
【０１５８】
アジピン酸ジヒドラジドにより還元末端で修飾した１ｋＤａのデキストラン０．５ｇ、およびＤＭＴＭＭ  ０．６ｇを、５０ｍＬのプラスチック瓶に量り取った。１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４  ２０ｇを添加して、試薬を溶解した。溶液のｐＨを、希ＨＣｌで７．１になるよう調節した。沈殿したヒアルロナンヒドロゲル０．４ｇを、反応溶液に撹拌しながら添加し、２０ｍｇ／ｍＬヒアルロナンの濃度を得た。サンプルを、５０℃の水浴中に置き、１日反応させた。
【０１５９】
ヒドロゲルの粒径を減少させ、０．２μｍフィルター上で、０．９％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。ｐＨを、０．２５Ｍ  ＮａＯＨで１３に上昇させた。ヒドロゲルを、７５分後に希ＨＣｌで中性ｐＨに中和した。ヒドロゲルを、蠕動ポンプに連結されたカラムに移した。底部から上部へ０．９％ＮａＣｌ  ２．５Ｌをポンプ送出することによって、ゲルを連続して洗浄した。次いでゲルをカラムから取り出し、分析した。
【０１６０】
1Ｈ  ＮＭＲは、デキストランのアノマープロトン（４．９４ｐｐｍ）とＨＡのＮ−アセチルプロトン（２．０２ｐｐｍ）とを比較することによって、修飾の度合（デキストラン鎖のモル／ＨＡ二糖繰り返し単位のモル）が５％であることを示している。反応におけるデキストランの変換率は、２０％であった。材料がコンドロイチナーゼＡＢＣで完全には分解されなかったので、デキストラン−リンカー−ＨＡのカップリングをＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで確認できなかった。
【０１６１】
例１３−ヒドロゲルへのヘキサメチレンジアミンによるマルトトリオースのグラフト化
【０１６２】
【化１５】
2017517601.tif 000017
【０１６３】
ヘキサメチレンジアミンにより還元末端で修飾したマルトトリオース０．３ｇ、およびＤＭＴＭＭ  ０．６ｇを、５０ｍＬのプラスチック瓶に量り取った。１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４  ２０ｇを添加して、試薬を溶解した。溶液のｐＨを、希ＨＣｌで７．０になるよう調節した。沈殿したヒアルロナンヒドロゲル０．４ｇを、反応溶液に撹拌しながら添加し、２０ｍｇ／ｍＬヒアルロナンの濃度を得た。サンプルを、５０℃の水浴中に置き、１日反応させた。
【０１６４】
ヒドロゲルの粒径を減少させ、０．２μｍフィルター上で、０．９％ＮａＣｌを用いて１回洗浄した。ｐＨを、０．２５Ｍ  ＮａＯＨで１３に上昇させた。ヒドロゲルを、８０分後に希ＨＣｌで中性ｐＨに中和した。ヒドロゲルを、蠕動ポンプに連結されたカラムに移した。底部から上部へ０．９％ＮａＣｌ  ２．５Ｌをポンプ送出することによって、ゲルを連続して洗浄した。次いでゲルをカラムから取り出し、分析した。
【０１６５】
1Ｈ  ＮＭＲは、マルトトリオースのアノマープロトン（４．９４ｐｐｍ）とＨＡのＮ−アセチルプロトン（２．０２ｐｐｍ）とを比較することによって、修飾の度合（マルトトリオース鎖のモル／ＨＡ二糖繰り返し単位のモル）が１０％であることを示している。反応におけるマルトトリオースの変換率は、４３％であった。マルトトリオース−リンカー−ＨＡのカップリングを、ＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで確認した。
【図１】
2017517601.tif 000018
【図２】
2017517601.tif 000019
【図３】
2017517601.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月3日(2017.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ヒアルロン酸と１以上のデキストラン分子とを含むヒアルロン酸生成物であって、前記ヒアルロン酸はエーテル結合によって架橋され、前記１以上のデキストラン分子は前記架橋ヒアルロン酸に共有結合的にグラフト化され、
前記デキストラン分子は、前記デキストランの還元末端とヒアルロン酸のカルボキシル基との間で二または多官能性リンカーを介して、単一の端点結合によって前記ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている、ヒアルロン酸生成物。
【請求項２】
前記架橋ヒアルロン酸はゲルの形態にある、請求項１に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項３】
前記架橋ヒアルロン酸は、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍの範囲の平均径を有するゲル粒子の形態にある、請求項１または２に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項４】
ヒアルロン酸鎖は、二または多官能性架橋剤から誘導されたリンカーを介して互いに架橋されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項５】
前記二または多官能性架橋剤は、ビスまたはポリエポキシドである、請求項４に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項６】
前記二または多官能性架橋剤は、ジグリシジルエーテルである、請求項５に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項７】
前記二または多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）およびエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）およびジエポキシオクタンからなる群から選択される、請求項６に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項８】
前記二または多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、請求項７に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項９】
前記１以上のデキストラン分子と、前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、０．１〜９９％のモル比を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１０】
前記１以上のデキストラン分子と、前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、１〜６０％のモル比を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１１】
前記デキストラン分子は、１０ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１２】
前記デキストラン分子は、５ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１３】
前記デキストラン分子は、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼートまたはアミノオキシ官能基を有するリンカーを含み、前記リンカーの前記官能基は、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と共有結合を形成する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１４】
前記二または多官能性リンカーは、ジアミンまたはジヒドラジドを含む、請求項１３に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１５】
前記１以上のデキストラン分子は、アミド結合によって、前記架橋ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【請求項１６】
架橋ヒアルロン酸と１以上のデキストラン分子とを含むヒアルロン酸生成物を調製する方法であって、
（ａ）架橋ヒアルロン酸と、１以上の官能化デキストラン分子とを用意する工程と、
（ｂ）１以上の官能化デキストラン分子を、前記架橋ヒアルロン酸に、共有結合的にグラフト化させる工程とを含み、
工程（ａ）で用意した前記官能化デキストラン分子は、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基に前記デキストラン分子を連結するのに利用可能な少なくとも１つの官能基を有する二または多官能性リンカーにより、還元末端で官能化されている、方法。
【請求項１７】
工程（ａ）の前記架橋ヒアルロン酸は、ゲルの形態にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）の前記架橋ヒアルロン酸は、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍの範囲の平均径を有するゲル粒子の形態にある、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
得られたヒアルロン酸生成物の、前記１以上のデキストラン分子と前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、０．１〜９９％のモル比を有する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
得られたヒアルロン酸生成物の、前記１以上のデキストラン分子と前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、１〜６０％のモル比を有する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ａ）で用意した前記デキストラン分子は、１０ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）で用意した前記デキストラン分子は、５ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）の前記１以上の官能化デキストラン分子は、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼートまたはアミノオキシ官能基を有するリンカーを含み、前記リンカーの前記官能基は、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と共有結合を形成する、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記二または多官能性リンカーは、ジアミンまたはジヒドラジドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）の共有結合的なグラフト化は、
（ｉ）前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基をカップリング剤で活性化して、活性化架橋ヒアルロン酸を形成し、
（ｉｉ）前記１以上の官能化デキストラン分子のリンカーを、前記活性化架橋ヒアルロン酸の前記カルボキシル基にカップリングする
ことを含む、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記架橋ヒアルロン酸の前記活性化および前記活性化架橋ヒアルロン酸への前記デキストラン分子の前記カップリングは、工程（ｂ）において同時に起こる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記架橋ヒアルロン酸の前記活性化は、工程（ｂ）における前記活性化架橋ヒアルロン酸への前記１以上のデキストラン分子の前記カップリングの前に別途に起こる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記カップリング剤は、トリアジン系カップリング剤、カルボジイミドカップリング剤、イミダゾリウム誘導カップリング剤、ＯｘｙｍａおよびＣＯＭＵからなる群から選択される、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記カップリング剤は、トリアジン系カップリング剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記トリアジン系カップリング剤は、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）および２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記トリアジン系カップリング剤は、ＤＭＴＭＭである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１６〜３１のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ヒアルロン酸生成物。
【請求項３３】
皮膚充填剤として使用するための、請求項１〜１５または３２のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
1Ｈ  ＮＭＲは、マルトトリオースのアノマープロトン（４．９４ｐｐｍ）とＨＡのＮ−アセチルプロトン（２．０２ｐｐｍ）とを比較することによって、修飾の度合（マルトトリオース鎖のモル／ＨＡ二糖繰り返し単位のモル）が１０％であることを示している。反応におけるマルトトリオースの変換率は、４３％であった。マルトトリオース−リンカー−ＨＡのカップリングを、ＬＣ−ＱＴｏＦ−ＭＳで確認した。  
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  架橋ヒアルロン酸と１以上のデキストラン分子とを含むヒアルロン酸生成物であって、前記ヒアルロン酸はエーテル結合によって架橋され、前記１以上のデキストラン分子は前記架橋ヒアルロン酸に共有結合的にグラフト化されている、ヒアルロン酸生成物。
［２］  前記架橋ヒアルロン酸はゲルの形態にある、［１］に記載のヒアルロン酸生成物。
［３］  前記架橋ヒアルロン酸は、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍの範囲の平均径を有するゲル粒子の形態にある、［１］または［２］に記載のヒアルロン酸生成物。
［４］  ヒアルロン酸鎖は、二または多官能性架橋剤から誘導されたリンカーを介して互いに架橋されている、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
［５］  前記二または多官能性架橋剤は、ビスまたはポリエポキシドである、［４］に記載のヒアルロン酸生成物。
［６］  前記二または多官能性架橋剤は、ジグリシジルエーテルである、［５］に記載のヒアルロン酸生成物。
［７］  前記二または多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）エチレン（ＥＧＤＧＥ）およびエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）およびジエポキシオクタンからなる群から選択される、［６］に記載のヒアルロン酸生成物。
［８］  前記二または多官能性架橋剤は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、［７］に記載のヒアルロン酸生成物。
［９］  前記１以上のデキストラン分子と、前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、０．１〜９９％のモル比を有する、［１］〜［８］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
［１０］  前記１以上のデキストラン分子と、前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、１〜６０％のモル比を有する、［１］〜［９］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
［１１］  前記デキストラン分子は、１０ｋＤａ未満の平均分子量を有する、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
［１２］  前記デキストラン分子は、５ｋＤａ未満の平均分子量を有する、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
［１３］  前記デキストラン分子は、単一の端点結合によって前記架橋ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
［１４］  前記デキストラン分子は、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼートまたはアミノオキシ官能基を有するリンカーを含み、前記リンカーの前記官能基は、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と共有結合を形成する、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
［１５］  前記デキストラン分子は、前記デキストランの還元末端とヒアルロン酸のカルボキシル基との間で二または多官能性リンカーを介して、単一の端点結合によって前記ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
［１６］  前記二または多官能性リンカーは、ジアミンまたはジヒドラジドを含む、［１５］に記載のヒアルロン酸生成物。
［１７］  前記１以上のデキストラン分子は、アミド結合によって、前記架橋ヒアルロン酸に共有結合的に連結されている、［１］〜［１６］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
［１８］  架橋ヒアルロン酸と１以上のデキストラン分子とを含むヒアルロン酸生成物を調製する方法であって、
（ａ）架橋ヒアルロン酸と、１以上の官能化デキストラン分子とを用意する工程と、
（ｂ）１以上の官能化デキストラン分子を、前記架橋ヒアルロン酸に、共有結合的にグラフト化させる工程と
を含む方法。
［１９］  工程（ａ）の前記架橋ヒアルロン酸は、ゲルの形態にある、［１８］に記載の方法。
［２０］  工程（ａ）の前記架橋ヒアルロン酸は、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍの範囲の平均径を有するゲル粒子の形態にある、［１８］〜［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］  得られたヒアルロン酸生成物の、前記１以上のデキストラン分子と前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、０．１〜９９％のモル比を有する、［１８］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］  得られたヒアルロン酸生成物の、前記１以上のデキストラン分子と前記架橋ヒアルロン酸の二糖とが、１〜６０％のモル比を有する、［１８］〜［２１］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］  工程（ａ）で用意した前記デキストラン分子は、１０ｋＤａ未満の平均分子量を有する、［１８］〜［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］  工程（ａ）で用意した前記デキストラン分子は、５ｋＤａ未満の平均分子量を有する、［１８］〜［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］  工程（ｂ）の前記官能化デキストラン分子は、単一の端点結合によって、前記ヒアルロン酸に共有結合的にグラフト化されている、［１８］〜［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］  工程（ａ）の前記１以上の官能化デキストラン分子は、アミノ、ヒドラジド、カルバゼート、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカルバゼートまたはアミノオキシ官能基を有するリンカーを含み、前記リンカーの前記官能基は、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基と共有結合を形成する、［１８］〜［２５］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］  工程（ａ）で用意した前記官能化デキストラン分子は、前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基に前記デキストラン分子を連結するのに利用可能な少なくとも１つの官能基を有する二または多官能性リンカーにより、還元末端で官能化されている、［１８］〜［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］  前記二または多官能性リンカーは、ジアミンまたはジヒドラジドを含む、［２７］に記載の方法。
［２９］  工程（ｂ）の共有結合的なグラフト化は、
（ｉ）前記架橋ヒアルロン酸のカルボキシル基をカップリング剤で活性化して、活性化架橋ヒアルロン酸を形成し、
（ｉｉ）前記１以上の官能化デキストラン分子のリンカーを、前記活性化架橋ヒアルロン酸の前記カルボキシル基にカップリングする
ことを含む、［１８］〜［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］  前記架橋ヒアルロン酸の前記活性化および前記活性化架橋ヒアルロン酸への前記デキストラン分子の前記カップリングは、工程（ｂ）において同時に起こる、［２９］に記載の方法。
［３１］  前記架橋ヒアルロン酸の前記活性化は、工程（ｂ）における前記活性化架橋ヒアルロン酸への前記１以上のデキストラン分子の前記カップリングの前に別途に起こる、［２９］に記載の方法。
［３２］  前記カップリング剤は、トリアジン系カップリング剤、カルボジイミドカップリング剤、イミダゾリウム誘導カップリング剤、ＯｘｙｍａおよびＣＯＭＵからなる群から選択される、［２９］〜［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３３］  前記カップリング剤は、トリアジン系カップリング剤である、［３２］に記載の方法。
［３４］  前記トリアジン系カップリング剤は、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）および２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）からなる群から選択される、［３３］に記載の方法。
［３５］  前記トリアジン系カップリング剤は、ＤＭＴＭＭである、［３４］に記載の方法。
［３６］  ［１８］〜［３５］のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ヒアルロン酸生成物。
［３７］  皮膚充填剤として使用するための、［１］〜［１７］または［３６］のいずれか一項に記載のヒアルロン酸生成物。
【国際調査報告】
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