(57)【要約】  本発明は、必要なコファクターを同時に再生するカップリングされた酵素的酸化および還元プロセスを含む、第1級および第2級アミンの製造のための新規生体触媒による方法；1ポットプロセス(すなわち、生体触媒カスケード)において同時に動作する2つの酵素、すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアミンデヒドロゲナーゼの利用に関する。さらに、第1の酸化ステップから生成される水素化物は第2の還元ステップにおいて内部的に再利用されるため、プロセス全体としてはレドックス中性である。本発明はまた、必要な酵素活性を生成する組換え発現系および微生物；ならびにそのような方法を実施するためのバイオリアクターにも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミンを調製する方法であって、
前記アミンが、一般式I：
(R1)(R2)HC-NH2(I)
(式中、R1およびR2は同一であるか、または異なり、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アルコキシアルキル、またはアリールオキシアルキルから選択されるが、但し、R1およびR2は同時にHではなく、アリール部分は置換されていてもよい）
のものであり、
a)コファクターNAD(P)+およびアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)(E.C.1.1.1.x)の存在下で前記アミンの対応するアルコールを酵素的に酸化して、前記アルコールの対応するカルボニル化合物を形成させるが、コファクターNAD(P)+を還元してNAD(P)Hを形成させること；ならびに
b)i)アンモニアまたはアンモニア源、および
ii)アミンデヒドロゲナーゼ(AmDH)
の存在下で前記カルボニル化合物を酵素的に還元して、所望のアミンを形成させるが、コファクターNAD(P)+をNAD(P)Hから再生させること；ならびに、必要に応じて、
c)前記アミンを単離すること
を含み、前記AmDHがフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(Ph-AmDH)(E.C.1.4.1.20)の突然変異体またはロイシンデヒドロゲナーゼ(L-AmDH)(E.C.1.4.1.9)の突然変異体である、前記方法。
【請求項２】
前記AmDHが、
a)配列番号１のアミノ酸配列を含むフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異体であって、二重突然変異K78S、N277Lを含み、配列番号１に対する少なくとも80％の配列同一性を有する、前記突然変異体、および
b)配列番号３のアミノ酸配列を含むロイシンデヒドロゲナーゼの突然変異体であって、4倍突然変異K68S、E114V、N262L、V291Cを含み、配列番号３に対する少なくとも80％の配列同一性を有する、前記突然変異体
から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記AmDHが、
a)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異体であり、配列番号２、もしくは配列番号２のアミノ酸残基21〜400のアミノ酸配列を含む、または
b)ロイシンアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異体であり、配列番号４のアミノ酸配列を含む、
請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ADHが、
a)配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むAA-ADH；
b)配列番号６のアミノ酸配列もしくは配列番号６に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLBv-ADH；
c)配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むHL-ADH；
d)配列番号９のアミノ酸配列もしくは配列番号９に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むADH-A；または
e)配列番号１０のアミノ酸配列もしくは配列番号１０に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むADH-hT
から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
水性または水性有機性混合物反応媒体中で実施される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
単離された形態の必要な酵素セット、必要な酵素セットの少なくとも1つの酵素を発現する1つ以上の組換え微生物、または必要な酵素セットもしくは必要な酵素セットの少なくとも1つの酵素を発現する1つ以上の微生物の細胞ホモジェネートもしくは細胞溶解物の存在下で実施される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
アルコール基質が、式II:
(R1)(R2)HC-OH (II)
(式中、R1およびR2は上記で定義された通りである)
の一価アルコールから選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
反応媒体から生成されたアミンを単離することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
コファクターが化学量論未満の量で用いられる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
反応が過剰のアンモニアまたは前記アンモニア源の存在下で実施される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
反応が9.6未満の範囲、特に、約8.0〜8.7のpHで実施される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
pHが金属キレート化特性を示さないバッファーによって制御される、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
用いられる酵素がNAD(H)依存的である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、請求項１〜３のいずれか１項に定義された少なくとも1つのADHおよび/または少なくとも1つのAmDHのコード配列を担持する組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の少なくとも1つの発現ベクターを担持し、前記コードされた酵素を機能的に発現する組換え微生物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法における、請求項１３記載の組換え発現ベクターまたは請求項１５記載の組換え微生物の使用。
【請求項１７】
反応媒体中に、遊離もしくは固定形態で、請求項１５記載の少なくとも1つの組換え微生物、または請求項１〜３のいずれか１項に定義された少なくとも1つの酵素を含有する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の生体触媒による方法を実施するためのバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、必要なコファクターを同時に再生するカップリングされた酵素的酸化および還元プロセスを含む、アミンの製造のための新規生体触媒による方法；1ポットプロセス(すなわち、生体触媒カスケード)において同時に動作する2つの酵素、すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼおよびアミンデヒドロゲナーゼの利用に関する。さらに、第1の酸化ステップから生成される水素化物は第2の還元ステップにおいて内部的に再利用されるため、プロセス全体としてはレドックス中性である。かくして、外部からの還元剤等価物は必要とされない；そのような系は、レドックス自給自足と定義される。本発明はまた、必要な酵素活性を生成する組換え発現系および微生物；ならびにそのような方法を実施するためのバイオリアクターにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシル官能基は再生可能資源および生物に基づく原料(例えば、アルコール、炭水化物)中に普遍的に見出されるが、アミン部分は自然ではより稀である。しかしながら、アミンは、医薬品、精製化学製品、農薬、ポリマー、染料、色素、乳化剤および可塑剤の製造において広く用いられる。様々な種類のアミンのうち、第1級アミンは、工業用途にとって特に有用な中間体である。したがって、対応する第1級アミンへのアルコール(第1級または第2級)の官能基相互変換は、有機合成において依然として重要である。事実、実験室規模ならびに工業規模でのアミンの製造は、対応するカルボニル化合物の還元的アミノ化に主に依拠する。対照的に、レドックス中性様式でのアルコールの直接的アミノ化は、外部からのレドックス等価物が必要とされないため、プロセスの原子効率を最大化させる。メタノールおよびエタノールなどの単純アルコールの不均一系触媒によるアミノ化は、数千トン規模で実施される(K. Weissermel, H.-J. Arpe, Industrial Organic Chemistry, 4th ed., Wiley-VCH, Weinheim, 2003, p. 51)。不均一系触媒の限られた活性のため、アルコールアミノ化のためには相対的に厳しい条件(200℃を超える)が必要である。さらに、より構造的に異なるアルコールは、極端に低い化学選択性で変換されるか、または全く変換されない。
【０００３】
アルコールから出発するアミンのレドックス中性直接合成は、溶媒としてtert-アミルアルコールを用いる均一系において[Ru(CO)CIH(PPh3)3]キサントホス触媒を用いることによって可能である(S. Imm, S. Bahn, M. Zhang, L. Neubert, H. Neumann, F. Klasovsky, J. Pfeffer, T. Haas、およびM. Beller, Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 7599-7603)。Ru触媒は、第1の酸化ステップにおいてアルコールから水素化物を除去して、中間体としてのカルボニル化合物およびRu-H種を得る。アンモニアの存在下では、カルボニル化合物は関連するイミンと平衡にある。したがって、Ru-H形態の触媒は、水素化物をイミン中間体に戻し、最終的にはアミン生成物を得る。化学触媒プロセスの主な欠点は、
1)低い化学選択性(すなわち、第1の触媒サイクル後に生成される第1級アミンは、以下のサイクルにおいてアンモニアと競合し、第1級、第2級およびさらには第3級アミンの混合物を誘導することができる)；
2)立体選択性の欠如；
3)極端に低い基質濃度(1mM)；
4)高い触媒量(3mol%)；
5)相対的に厳しい反応条件(150℃、圧力下での気体としてのアンモニア)；
6)アルゴン雰囲気の必要性
である。
【０００４】
この分野における多くの報告された研究は非キラル基質を含むが、アルコールの立体選択的水素借用アミノ化が最近公開された(Y. Zhang, C.-S. Lim, D. S. B. Sim, H.-J. Pan, Y. Zhao, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 126, 1423-1427)。しかしながら、この方法もまた、いくつかの経済的ならびに環境的な制限に悩まされている：
1)この方法は、複雑で高価な有機キラルリガンドに配位された大量(5mol%)のイリジウム触媒を必要とする；
2)この方法は、共触媒として大量(10mol%)の高価なビナフタレンキラルリン酸を必要とし、さもなければ変換が全く観察されない；
3)この方法は、窒素源としてアンモニアよりも複雑な第1級アミン(すなわち、パラ-アニシジンおよびいくつかの他のフェニル-アラニン誘導体)を必要とする；結果として、アルコールから第1級アミンを直接得ることができず、第2級フェニル置換アミンのみを得ることができる；興味深いことに、様々な種類のアミンのうち、第1級アミンが工業用途にとって特に有用な中間体である；
4)この方法は、パラ-アニシジンを用いるアミノ化のために1.5当量のアルコールを必要とする；したがって、理論定量収率が得られる場合であっても、少なくとも33%のアルコールが廃棄される；
5)鏡像体過剰率はほとんど例外なく中程度である。しかしながら、鏡像体過剰率は、決して97%より高くなかった。
【０００５】
最近、3つの酵素：アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、ω-トランスアミナーゼ(ω-TA)およびアラニンデヒドロゲナーゼ(Ala-DH)を用いる第1級アルコールの生体触媒による水素借用アミノ化が提唱された(スキーム1)(J. H. Sattler, M. Fuchs, K.Tauber, F. G. Mutti, K. Faber, J. Pfeffer, T. Haas, W. Kroutil, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 9156-9159)。
【０００６】
【化１】
2017519525.tif 000002
【０００７】
第1のステップにおいて、ADHはアルコールをアルデヒドに酸化し、還元型のNADコファクターを生成する。第2のステップにおいて、ω-TAはアミノ供与体(L-アラニン)からアミノ基をアルデヒド中間体に形式的に移動させる。所望のアミンの他に副生成物としてピルビン酸が産生される。最後に、Ala-DHは、アンモニアおよび第1のステップで生成された還元剤等価物(すなわち、NADH)を用いて、ピルビン酸を再利用してL-アラニンに戻すことによって平衡を移動させる。
【０００８】
それにもかかわらず、当業者であれば、以下のことに気づくはずである：
1)このサイクルは真に触媒的ではない。アミン生成物の形成を観察するためには、少なくとも5当量のL-アラニンが必要である。
【０００９】
2)この生体触媒ネットワークは第1級アルコールから出発する場合にのみ99%を超えるアミン変換率をもたらす。
【００１０】
3)第2級アルコールに適用される同じ概念は、より低い変換率(54%以下)をもたらした。さらに、エナンチオピュアなS-構成アルコールのみが、S-構成アミンに部分変換された(構成を保持するアミノ化のみ)。
【００１１】
4)ω-トランスアミナーゼは、基質(例えば、ケトン/アルデヒド、アラニン)と生成物(例えば、アミン、ピルビン酸)阻害に悩まされることが非常に多い(a) J.-S. Shin, B.-G. Kim, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65, 1782-1788; b) J.-S. Shin, B.-G. Kim, Biotechnol. Bioeng. 1999, 65, 206-211; c) J.-S. Shin, B.-G. Kim, Biotechnol. Bioeng. 2002, 77, 832-837)。
【００１２】
5)3つの酵素系の使用は、反応の設定を複雑化し、同じ宿主生物への複数の遺伝子のクローニングの可能性を複雑化する。さらに、L-アラニンは系に供給される必要がある。
【００１３】
6)(R)-選択的ω-TAを用いる場合、より高価なD-アラニンを用いなければならない。さらに、ピルビン酸を再利用してD-アラニンに戻すことができるアラニンデヒドロゲナーゼは公知ではない。L-アラニンのみが産生される。したがって、(R)-選択的ω-TAの場合、系は、ピルビン酸の再利用よりもむしろピルビン酸の除去によって機能する。この点はまた、「触媒プロセス」の定義と矛盾する。
【００１４】
アミンを調製するためのさらに改善された生体触媒方法が必要であることが明らかである。
【発明の概要】
【００１５】
連続的ならびに同時的様式での1ポットにおける複数ステップの化学反応は、中間体の単離および精製ステップの必要性を回避する。時間消費的な中間体ワークアップが必要とされず、抽出/精製のための有機溶媒の使用および蒸発/質量移動のためのエネルギーが最小化されるため、この手法は、経済的ならびに環境的な利益をもたらす。したがって、カスケード反応は一般に、高い原子効率およびより低い環境影響因子を有する。主な課題は、酸化および還元ステップが同時に実行されているカスケード反応を実施することである。さらにより困難なことは、第1の酸化ステップにおいて遊離される電子がその後の還元ステップにおいて量的に消費される同時に相互接続されるレドックス中性カスケードを実行することである。この概念は、アルコール(第1級または第2級)のアミンへの相互変換に関する本発明のための基礎である。
【００１６】
驚くべきことに、上記の課題は、添付の特許請求の範囲に定義される生体触媒方法を提供することによって解決することができた。
【００１７】
特に、課題は、ただ2つの生体触媒、すなわち、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)とアミンデヒドロゲナーゼ(AmDH)とを組み合わせることによる、アルコールのレドックス自給自足(すなわち、水素借用)アミノ化のための新規酵素触媒法を提供することによって解決された。
【００１８】
例えば、精製された酵素としてin vitroで前記酵素を適用することにより、94%を超える変換率および完全な化学および立体選択性が達成される(スキーム2)：
【００１９】
【化２】
2017519525.tif 000003
【００２０】
例えば、R=アルキル-、アリールアルキル-；およびR'=CH3-、H-である。
【００２１】
窒素源がアンモニアである、アルコールの直接アミノ化のためのこのレドックス自給自足ネットワークにおいて、唯一の副生成物は水である。アンモニア以外に他の化学種は必要とされない。したがって、以前に記載された生体触媒プロセス(スキーム1)とは対照的に、本発明のプロセスは、驚くべきことに、真に触媒的である。さらに、このプロセスは、
1)立体反転によるエナンチオピュアな第2級アルコールのアミノ化(例えば、(S)-フェニル-2-プロパノールから(R)-フェニル-2-プロピルアミンは99%を超える鏡像体過剰率である)；(AA-ADH)
2)構成の保持によるエナンチオピュアな第2級アルコールのアミノ化(例えば、(R)-フェニル-2-プロパノールから(R)-フェニル-2-プロピルアミンは99%を超える鏡像体過剰率である)；(LBv-ADH)
3)ラセミ体第2級アルコールの非対称性アミノ化(例えば、rac-フェニル-2-プロパノールから(R)-フェニル-2-プロピルアミンは99%を超える鏡像体過剰率である)
4)第1級アルコールのアミノ化(例えば、2-フェニル-エタノールから2-フェニル-エチルアミン)
を可能にするため、このプロセスは、さらなる驚くべき利点、特に、より広い適用性を有する。
【００２２】
アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)とアミンデヒドロゲナーゼ(AmDH)との組合せは、これまでのところ先行技術において記載されていない困難な仕事である。最適な反応条件、および/またはその反応条件下での2つの酵素間の適合性を確保するためには、単独の、または組み合わせた様々なパラメータを考慮する必要がある：
1)アミノ化は、反応を完了まで誘導するための窒素源として過剰のアンモニア/アンモニウム陽イオンを必要とする。かくして、高い変換率および反応速度の上昇を達成しなければならない場合、アンモニア/アンモニウム陽イオンの濃度は十分に高くなければならず、同時に2つの酵素の安定性にとって有害なものとなってはならない。
【００２３】
2)AmDHによるケトンの還元的アミノ化は、pH9.6で実行されると以前に報告された(Abrahamson, M.J.ら、Angew. Chem. Int Ed,2012, 51, 3969)。驚くべきことに、本発明は、これが還元的アミノ化にとっても、ADH/AmDHカスケードによるアルコールのアミノ化にとっても最適なpHではないことを示す。事実、改善された酵素およびコファクターの安定性のため、より低いpH(8〜8.7)により、変換率の上昇を得ることができる。
【００２４】
3)本発明は、好ましいAmDH酵素が広範囲のpHの下で活性であることを示す。しかしながら、いくつかのADH(ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)ADH、ウマ肝臓ADHなど)は、高濃度のアンモニア(例えば、2M)の存在下では、8.5を超えるpHで安定ではない。
【００２５】
4)バッファーの選択も重要である。AmDHは様々なバッファー(すなわち、塩化アンモニウム、ギ酸、ホウ酸、クエン酸、酢酸、シュウ酸など)を良好に許容する。しかしながら、本発明において用いられるADHは、いくつかの場合、さらなる構造部位としてMg2+を有するZn2+依存的酵素である；したがって、シュウ酸、クエン酸および酢酸などの強力なキレート剤はバッファー塩として回避しなければならない。
【００２６】
5)His末端タグは容易かつ効率的な酵素精製にとって好都合である。しかしながら、ポリ-ヒスチジン基は、Zn2+などの金属陽イオンを配位することができる。Zn2+は、本発明者らのADHの触媒金属部位である。それは堅く結合しないことが公知である。ADH活性部位の解離および再結合の機構が存在する(Jeremias H. R. KagiおよびBert L. Vallee J. Biol. Chem. 1960, 235:3188-3192)。金属依存的酵素を含むin vitroのカスケードを設定する場合(必要に応じて、タグを除去することによる)、この事実を考慮に入れる必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ph-AmDHおよび化学量論的NADHコファクターを用いる還元的アミノ化に関する相対的変換に対するpHおよびバッファーの種類の影響を示す図である。
【図２】Hisタグ付Ph-AmDH、触媒的NADHにより触媒され、pH8.7でパラ-フルオロ-フェニルアセトン(20mM)およびアンモニア(727mM)を用いる生体触媒による還元的アミノ化に関する時間試験の結果を示す図である。
【図３】Hisタグ付Ph-AmDHを用いる還元的アミノ化について試験された基質の化学式を示す図である。
【図４】触媒量のNAD+(1mM)の存在下でAA-ADHおよびPh-AmDH(Hisタグ付ではない)を用いて（R)-フェニル-2-プロピルアミンを得る（S)-フェニル-2-プロパノール(20mM)のアミノ化反応を示す図である。アミン生成物(実線)、ケトン中間体(点線)およびアルコール基質(破線)への変換を、時間経過中にモニタリングした。
【図５】触媒量のNAD+(0.5mM)の存在下でAA-ADHおよびPh-AmDH(Hisタグ付ではない)を用いて（R)-フェニル-2-プロピルアミンを得る（S)-フェニル-2-プロパノール(20mM)のアミノ化反応を示す図である。アミン生成物(実線)、ケトン中間体(点線)およびアルコール基質(破線)への変換を、時間中にモニタリングした。
【図６】触媒量のNAD+(0.2mM)の存在下でAA-ADHおよびPh-AmDHを用いて（R)-フェニル-2-プロピルアミンを得る（S)-フェニル-2-プロパノール(20mM)のアミノ化反応を示す図である。アミン生成物(実線)、ケトン中間体(点線)およびアルコール基質(破線)の変換を、時間中にモニタリングした。
【図７】触媒量のNAD+(0.1mM)の存在下でAA-ADHおよびPh-AmDHを用いて（R)-フェニル-2-プロピルアミンを得る（S)-フェニル-2-プロパノール(20mM)のアミノ化反応を示す図である。アミン生成物(実線)、ケトン中間体(点線)およびアルコール基質(破線)への変換を、時間中にモニタリングした。
【図８】B.badiusのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(Ph-DH)(上の行)、それから誘導されるPh-AmDH突然変異体(中央の行)およびそのコンセンサス配列(下の行)の配列アラインメントを示す図である。
【図９】B.stearothermophilusのLeuDH(上の行)、それから誘導されるLeu-AmDH突然変異体(中央の行)およびそのコンセンサス配列(下の行)の配列アラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
1. 特定の実施形態
本発明は、以下の特定の実施形態に関する：
1. ヒドロカルビルアミン、特に、脂肪族または芳香族アミンを調製する生体触媒による方法であって、
a)コファクターNAD(P)+、特に、NAD+、およびアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)(E.C.1.1.1.x)の存在下で前記アミンの対応する第1級または第2級アルコールを酵素的に酸化して、前記アルコールの対応するオキソ化合物を形成させるが、コファクターNAD(P)+、特に、NAD+を還元してNAD(P)H、特に、NADHを形成させること、および
b)i)アンモニアまたはアンモニア源、および
ii)アミンデヒドロゲナーゼ(AmDH)(E.C.1.4.1.x)
の存在下で前記オキソ化合物(すなわち、カルボニル化合物)を酵素的に還元して(還元的アミノ化)、所望のアミンを形成させるが、コファクターNAD(P)+、特に、NAD+をNAD(P)H、特に、NADHから再生させること、および必要に応じて、
c)前記アミンを単離すること
を含む、前記方法。
【００２９】
非対称的アルコール基質の場合、基質は立体異性体の混合物の形態にあってもよいか、または立体異性的に純粋な形態で用いてもよい。
【００３０】
さらに、立体異性的に純粋な基質の場合、反応生成物を、立体反転((R)から(S)もしくは(S)から(R))によって、または構成を保持したまま形成させることができる。
【００３１】
アルコールの種類(第1級または第2級)に応じて、異なるADHが用いられるのが好ましい。
【００３２】
好ましくは、用いられる酵素は、同じコファクター、特に、NAD(H)を使用する。
【００３３】
2. ステップa)およびb)が同時に実施される、実施形態1に記載の方法。
【００３４】
3. 前記AmDHが、アクセプターとしてのNADまたはNADPと共にドナー分子(基質)のCH-NH2基に対して作用するアミノ酸デヒドロゲナーゼ、特に、オキシドリダクターゼ(E.C.1.4.1.)のタンパク質操作によって得られる、実施形態1または2に記載の方法。
【００３５】
4. 前記AmDHがアミノ酸デヒドロゲナーゼ酵素の突然変異体であり、該突然変異体がアンモニアまたはアンモニア源およびNAD(P)Hの存在下で、オキソ化合物を対応する第1級ヒドロカルビルアミンに変換する能力を有する、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【００３６】
5. 前記AmDHがフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(Ph-AmDH)(E.C.1.4.1.20)の突然変異体またはロイシンデヒドロゲナーゼ(L-AmDH)(E.C.1.4.1.9)の突然変異体である、実施形態4または5に記載の方法。
【００３７】
6. 前記AmDHが、
a)配列番号1のアミノ酸配列を含むフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異体であって、二重突然変異K78S、N277Lを含み、配列番号1に対する、85、90、92、95、96、97、98または99%の配列同一性などの少なくとも80%の配列同一性を有する前記突然変異体、および
b)配列番号3のアミノ酸配列を含むロイシンデヒドロゲナーゼの突然変異体であって、4倍突然変異K68S、E114V、N262L、V291Cを含み、配列番号3に対する、85、90、92、95、96、97、98または99%の配列同一性などの少なくとも80%の配列同一性を有する前記突然変異体
から選択される、実施形態5に記載の方法。
【００３８】
7. a)前記AmDHが、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異体であり、配列番号2、もしくは配列番号2のアミノ酸残基21〜400のアミノ酸配列を含む、および/または
b)前記AmDHが、ロイシンアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異体であり、配列番号4のアミノ酸配列を含む、および/または
c)前記ADHが、配列番号5のアミノ酸配列もしくは配列番号5に対する、85、90、92、95、96、97、98もしくは99%の配列同一性などの少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むAA-ADH；配列番号6のアミノ酸配列もしくは配列番号6に対する、85、90、92、95、96、97、98もしくは99%の配列同一性などの少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLBv-ADH；配列番号8のアミノ酸配列もしくは配列番号8に対する、85、90、92、95、96、97、98もしくは99%の配列同一性などの少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むHL-ADH；配列番号9のアミノ酸配列もしくは配列番号9に対する、85、90、92、95、96、97、98もしくは99%の配列同一性などの少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むADH-A；または配列番号10のアミノ酸配列もしくは配列番号10に対する、85、90、92、95、96、97、98もしくは99%の配列同一性などの少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むADH-hTから選択される、
実施形態1〜6のいずれか1つに記載の方法。
【００３９】
第1級アルコールを変換するために、好ましくは、HL-ADHまたはADH-htなどの第1級ADHが用いられる。第2級アルコールを変換するために、好ましくは、ADH-A、LBv-ADHまたはAA-ADHなどの第2級ADHが用いられる。
【００４０】
8. 前記アミンが、一般式I：
(R1)(R2)HC-NH2  (I)
(式中、
R1およびR2は同一であるか、または異なり、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アルコキシアルキル、またはアリールオキシアルキルから選択されるが、但し、R1およびR2は同時にHではなく、アリール部分は置換されていてもよい)
のものである、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の方法。
【００４１】
好ましい生成物は、
a)残基R1およびR2の一方がHであり、他方が、
- 直鎖状または分枝状アルキル、特に、直鎖状または分枝状C1-C10アルキル；
- 置換されていてもよいアルキル、特に、置換されていてもよいフェニル-メチルなどの、置換されていてもよいフェニル-C1-C4アルキル；
- C1-C10アルコキシ-C1-C4アルキルなどまたはC1-C6アルコキシ-メチルなどのアルコキシアルキル；
- 置換されていてもよいフェニルオキシ-C1-C4アルキルまたは置換されていてもよいフェニルオキシ-メチルなどの、置換されていてもよいアリールオキシアルキル
から選択されるアミン；
b)R1およびR2が同じであるか、または異なり、
- 直鎖状または分枝状アルキル、特に、直鎖状または分枝状C1-C10アルキル、好ましくは、メチルまたはエチル；
- 置換されていてもよいアラルキル、特に、置換されていてもよいフェニル-メチルなどの、置換されていてもよいフェニル-C1-C4アルキル；
- C1-C10アルコキシ-C1-C4アルキルなどまたはC1-C6アルコキシ-メチルなどのアルコキシアルキル；
- 置換されていてもよいフェニルオキシ-C1-C4アルキルまたは置換されていてもよいフェニルオキシ-メチルなどの、置換されていてもよいアリールオキシアルキル
から選択されるアミン
である。
【００４２】
特に好ましいアミンは、残基R1およびR2の一方がメチルまたはエチルであり、他方が上記の好ましい意味から選択されるものである。
【００４３】
任意選択の置換基は、好ましくは、F、Cl、Brなどのハロゲン、場合により、NH-もしくは-NH2などの、末端もしくは鎖間ヘテロ原子を担持するC1-C4アルコキシ、C1-C4アルキルから選択されるか、または例えば、CF3などの、ハロゲンにより置換されていてもよい。
【００４４】
特に好ましい置換基は、図3に記載のオキソ化合物の対応するアルコールである。
【００４５】
9. 水性反応媒体中で実施される、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の方法。
【００４６】
10. 前記方法が単離された形態の必要な酵素セット、必要な酵素セットの少なくとも1つの酵素を発現する1つ以上の組換え微生物または必要な酵素セットもしくは必要な酵素セットの少なくとも1つの酵素を発現する1つ以上の微生物の細胞ホモジェネートもしくは細胞溶解物の存在下で実施される、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の方法。
【００４７】
11. アルコール基質が、式II:
(R1)(R2)HC-OH    (II)
(式中、
R1およびR2は上記で定義された通りである)
の一価アルコールから選択される、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の方法。
【００４８】
12. 反応媒体から生成されたアミンを単離することをさらに含む、実施形態1〜11のいずれか1つに記載の方法。
【００４９】
13. コファクターが化学量論未満、すなわち、触媒量で用いられる、実施形態1〜12のいずれか1つに記載の方法。
【００５０】
14. 反応が、アミノ化されるアルコールのモル数で算出される、モル濃度ベースで、過剰のアンモニアまたは前記アンモニア源の存在下で実施される、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。好ましくは、1〜200倍もしくは1〜100倍、例えば、2〜50倍もしくは5〜20倍、またはより好ましくは、50〜150倍または最も好ましくは80〜120倍モル過剰が存在する。
【００５１】
15. 反応が9.6未満の範囲、特に、約8〜8.7のpHで実施される、実施形態1〜14のいずれか1つに記載の方法。
【００５２】
16. pHが金属キレート化特性を示さない、すなわち、カルボン酸残基を含有しないバッファーを用いて制御される、実施形態1〜15のいずれか1つに記載の方法。すなわち、シュウ酸、クエン酸または酢酸バッファーは、あまり好適なバッファー物質ではない。
【００５３】
17. 用いられる酵素がNAD(H)依存的である、実施形態1〜16のいずれか1つに記載の方法。
【００５４】
18. 少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、実施形態1〜7のいずれか1つに定義された、少なくとも1つのADHおよび/または少なくとも1つのAmDHのコード配列を担持する組換え発現ベクター。
【００５５】
19. 実施形態18に記載の少なくとも1つの発現ベクターを担持し、前記コードされた酵素を機能的に発現する組換え微生物。
【００５６】
20. 実施形態1〜17のいずれか1つに記載の方法における、実施形態18に記載の組換え発現ベクター、または実施形態19に記載の組換え微生物の使用。
【００５７】
21. 反応媒体中に、遊離もしくは固定形態で、実施形態19に記載の少なくとも1つの組換え微生物、または実施形態1〜7のいずれか1つに定義された少なくとも1つの酵素を含有する、実施形態1〜17のいずれか1つに記載の生体触媒方法を実施するためのバイオリアクター。
【００５８】
2. 特定の用語の説明
別途記述しない限り、以下の意味が適用される。
【００５９】
多酵素レドックスプロセスが全体として「レドックス中性」である場合、外部からのレドックス等価物は必要とされない；およびそのような系は、レドックス自給自足と定義される。
【００６０】
用語「生体触媒による」または「酵素的に触媒される」方法とは、本明細書で定義される酵素の触媒活性の存在下、すなわち、単離された純粋な、もしくは未精製の酵素またはそのような酵素活性を含有するか、もしくは発現する(増殖している、休止している、不活化された、もしくは穿孔された)微生物細胞全体、または酵素活性の全セットが組合せによって提示されるような、少なくとも1つの意図された酵素活性を発現する全細胞および少なくとも1つの他の意図された酵素活性を含有する単離された純粋な、もしくは未精製の酵素調製物の組合せの存在下で実施される任意の方法を指す。
【００６１】
用語「立体特異的」とは、いくつかの立体異性体または鏡像異性体のうちの1つが、少なくとも90%の鏡像体過剰率、好ましくは、少なくとも95%の鏡像体過剰率、特に、少なくとも98%の鏡像体過剰率、または少なくとも99%の鏡像体過剰率の、高い鏡像異性体過剰または純度の酵素によって形成されることを意味する。鏡像体過剰率(%)の値は、以下の式：
鏡像体過剰率% = [XA-XB]/[XA+XB]*100
(式中、XAおよびXBはそれぞれ、鏡像異性体AまたはBのモル分率を指す)
にしたがって算出される。
【００６２】
用語「実質的に純粋な」とは、当業者によって用いられる1つ以上の純度または均一度特性によって均一である分子を記述することを意味する。
【００６３】
「実質的に純粋な」タンパク質または酵素は、所望の精製されたタンパク質が、ポリアクリルアミド-ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動(SDS-PAGE)後の単一のバンドにより示されるように、夾雑する細胞成分を本質的に含まないことを意味する。「実質的に純粋な」酵素またはタンパク質は、以下のもの：分子量、クロマトグラフィー移動度、アミノ酸組成、アミノ酸配列、ブロックされた、またはブロックされていないN末端、HPLC溶出プロファイル、生物活性、および他のそのようなパラメータなどのパラメータに関する標準的な実験的偏差内の定常的で再現可能な特徴を示す。例えば、「実質的に純粋な」タンパク質または酵素とは、所望の精製されたタンパク質は、ポリアクリルアミド-ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動(SDS-PAGE)後の単一のバンドにより示されるように、夾雑する細胞成分を本質的に含まないことを意味する。しかしながら、この用語は、前記酵素またはタンパク質と、他の化合物との人工または合成の混合物を排除することを意味しない。さらに、この用語は、必要に応じて組換え宿主から単離された融合タンパク質、またはヒスチジンアーチャー基などの機能的残基との融合タンパク質を排除することを意味しない。
【００６４】
「天然のアルファアミノ酸残基」は、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、Proから誘導される。
【００６５】
本明細書および添付の特許請求の範囲に定義される化合物内では、以下の意味が適用される。
【００６６】
ヒドロカルビルは、広く解釈することができ、OHまたはNH2などの1つの官能基に連結された、直鎖状および分枝状炭化水素ラジカルを含む。特に、これらの官能基は、末端基である。これらの残基は、本質的には炭素および水素原子から構成され、必要に応じて、その鎖内に、ヘテロ原子、例えば、O、N、NH、Sをさらに含んでもよく、1〜50、2〜30または3〜15個の連続する炭素原子の鎖長および必要に応じてヘテロ原子を有してもよい。
【００６７】
ヒドロカルビルは、-O-または-NH-、特に、-O-などの、1個以上、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヘテロ原子基により中断されていてもよい残基、特に、直鎖状または分枝状アルキル、アルケニルまたはアルキニルを特に表す。
【００６８】
特に、ヒドロカルビルは、水素および炭素原子から構成される芳香族および脂肪族残基のみ、特に、以下に定義されるアリール、アルキル、アルケニルおよびアルキニル残基などを包含すると理解することができる。
【００６９】
アルキルならびに例えば、アルコキシなどのそれから誘導される残基のアルキル断片は、1〜4、1〜6、1〜8、1〜10、1〜22または1〜30個の炭素原子を有する飽和した直鎖状または分枝状炭化水素鎖を表す。
【００７０】
例えば、メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル、ブチル、1-メチル-プロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、ペンチル、1-メチルブチル、3-メチルブチル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピルおよび1-エチル-2-メチルプロピルなどのC1-C4-アルキルなどのC1-C10-アルキル。
【００７１】
例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、1-メチルエトキシ、ブトキシ、1-メチルプロポキシ、2-メチルプロポキシまたは1,1-ジメチルエトキシ；ならびに例えば、ペントキシ、1-メチルブトキシ、2-メチルブトキシ、3-メチルブトキシ、1,1-ジメチルプロポキシ、1,2-ジメチルプロポキシ、2,2-ジメチルプロポキシ、1-エチルプロポキシ、ヘキソキシ、1-メチルペントキシ、2-メチルペントキシ、3-メチルペントキシ、4-メチルペントキシ、1,1-ジメチルブトキシ、1,2-ジメチルブトキシ、1,3-ジメチルブトキシ、2,2-ジメチルブトキシ、2,3-ジメチルブトキシ、3,3-ジメチルブトキシ、1-エチルブトキシ、2-エチルブトキシ、1,1,2-トリメチルプロポキシ、1,2,2-トリメチルプロポキシ、1-エチル-1-メチルプロポキシまたは1-エチル-2-メチルプロポキシなどのC1-C4-アルコキシなどのC1-C10-アルコキシ。
【００７２】
ヒドロキシ-C1-C10-アルキル、例えば、ヒドロキシ-C1-C6-アルキル、またはヒドロキシ-C1-C4-アルキル、またはヒドロキシ-C4-C10-アルキル：例えば、ヒドロキシメチル、1-もしくは2-ヒドロキシエチル、1-、2-もしくは3-ヒドロキシプロピル、1-ヒドロキシメチルエチル、1-、2-、3-もしくは4-ヒドロキシブチル、1-ヒドロキシメチルプロピルおよび2-ヒドロキシメチルプロピル；または特に、表4に与えられるRの意味などの、上記アルキル残基の他のヒドロキシ置換類似体、例えば、6-ヒドロキシ-6-メチルヘプタ-1-イル。
【００７３】
アルケニル：エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-メチルエテニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、1-メチル-1-プロペニル、2-メチル-1-プロペニル、1-メチル-2-プロペニル、2-メチル-2-プロペニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-ペンテニル、4-ペンテニル、1-メチル-1-ブテニル、2-メチル-1-ブテニル、3-メチル-1-ブテニル、1-メチル-2-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、3-メチル-2-ブテニル、1-メチル-3-ブテニル、2-メチル-3-ブテニル、3-メチル-3-ブテニル、1,1-ジメチル-2-プロペニル、1,2-ジメチル-1-プロペニル、1,2-ジメチル-2-プロペニル、1-エチル-1プロペニル、1-エチル-2-プロペニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、4-ヘキセニル、5-ヘキセニル、1-メチル-1-ペンテニル、2-メチル-1-ペンテニル、3-メチル-1-ペンテニル、4-メチル-1-ペンテニル、1-メチル-2-ペンテニル、2-メチル-2-ペンテニル、3-メチル-2-ペンテニル、4-メチル-2-ペンテニル、1-メチル-3-ペンテニル、2-メチル-3ペンテニル、3-メチル-3-ペンテニル、4-メチル-3-ペンテニル、1-メチル-4-ペンテニル、2-メチル-4-ペンテニル、3-メチル-4-ペンテニル、4-メチル-4-ペンテニル、1,1-ジメチル-2-ブテニル、1,1-ジメチル-3-ブテニル、1,2-ジメチル-1-ブテニル、1,2-ジメチル-2-ブテニル、1,2-ジメチル-3-ブテニル、1,3-ジメチル-1-ブテニル、1,3-ジメチル-2-ブテニル、1,3-ジメチル-3-ブテニル、2,2-ジメチル-3-ブテニル、2,3-ジメチル-1-ブテニル、2,3-ジメチル-2-ブテニル、2,3-ジメチル-3-ブテニル、3,3-ジメチル-1-ブテニル、3,3-ジメチル-2-ブテニル、1-エチル-1-ブテニル、1-エチル-2-ブテニル、1-エチル-3-ブテニル、2-エチル-1-ブテニル、2-エチル-2-ブテニル、2-エチル-3-ブテニル、1,1,2-トリメチル-2-プロペニル、1-エチル-1-メチル-2-プロペニル、1-エチル-2-メチル-1-プロペニルおよび1-エチル-2-メチル-2-プロペニルなどの、C2-C6-アルケニルなどの、2〜4、2〜6、2〜8、または2〜10個の炭素原子および任意の位置に二重結合を有する1倍または複数倍、特に、1倍の不飽和直鎖状または分枝状炭化水素残基。
【００７４】
アルケニルオキシ：対応するC2-C6-アルケニルオキシ基などの、上記のアルケニル基の酸素結合類似体。
【００７５】
アリール：例えば、フェニル、ビフェニル、1-または2-ナフチルなどのナフチル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インデニルおよびフェナントレニルなどの、例えば、6〜10個などの6〜20個の環炭素原子を有する、単核または多核、好ましくは、単核または二核の置換されていてもよい芳香族ラジカル。アリールラジカルは、必要に応じて、1、2、3、4、5または6個の同一の、または異なる置換基を担持してもよい。多核アリールラジカルの場合、少なくとも1個の環が芳香族特性を有する；しかしながら、いくつか、または全ての環が芳香族特性を有することも可能である。
【００７６】
アリールアルキル：例えば、フェニルメチルまたはフェニルエチルから選択されるフェニル-C1-C4-アルキルラジカルなどの、アリールが同様に上記の意味を有する、上記のアルキルラジカルのアリール置換類似体。
【００７７】
アリールオキシ：上記の置換されていてもよいアリールラジカルの酸素結合類似体。
【００７８】
シクロアルキル：例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシルおよびシクロドデシルなどの、C3-C12-シクロアルキルなどの3〜20個の炭素原子を有する炭素環式ラジカル；好ましくは、分子のラジカルへの結合が任意の好適な炭素原子を介するものであってもよい、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびまたシクロプロピルメチル、シクロプロピルエチル、シクロブチルメチル、シクロブチルエチル、シクロペンチルメチル、シクロペンチルエチル、シクロヘキシル-メチルまたはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロプロピルメチル、シクロプロピルエチル、シクロブチルメチル、 シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチルなどのC3-C7-シクロアルキルである。
【００７９】
シクロアルケニル：シクロペンテン-1-イル、シクロペンテン-3-イル、シクロヘキセン-1-イル、シクロヘキセン-3-イルおよびシクロヘキセン-4-イルなどの、5〜8個、好ましくは、6個までの炭素環員を有する単環式モノ不飽和炭化水素基。
【００８０】
任意選択の置換基を、上記で定義された通りである、-COOH、-OH、-SH、-CN、アミノ、-NO2、アルキル、またはアルケニル、アルキルまたはアルケニル、アルコキシ、ハロゲン化アルキルから選択することができる。
【００８１】
3. 本発明のさらなる実施形態
3.1 本発明によるタンパク質
本発明は、具体的に記載された酵素/タンパク質に限定されないだけでなく、その機能的等価物にも拡張される。
【００８２】
具体的に開示される酵素の「機能的等価物」または「類似体」または「機能的突然変異」は、本発明の範囲内で、所望の生物学的機能または活性、例えば、酵素活性をさらに有する、その様々なポリペプチドである。
【００８３】
例えば、「機能的等価物」は、酵素活性について用いられる試験において、本明細書に定義される酵素の少なくとも1〜10%、または少なくとも20%、または少なくとも50%、または少なくとも75%、または少なくとも90%より高いか、またはより低い活性を示す酵素を意味する。
【００８４】
本発明による「機能的等価物」はまた、特に、上述のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列部分において、具体的に記述されたものとは異なるが、それにも拘わらず、上記の生物活性の1つを有するアミノ酸を有する突然変異体を意味する。かくして、「機能的等価物」は、1〜20個、1〜15個、1〜10個または1〜5個などの1個以上のアミノ酸付加、置換、欠失および/または反転により得られる突然変異体を含み、記述される変化は、それらが本発明による特性のプロファイルを突然変異体にもたらすという条件で、任意の配列位置に存在してもよい。機能的等価性は、特に、反応パターンが突然変異体と未変化のポリペプチドとの間で質的に一致する場合、すなわち、例えば、同じ基質が異なる速度で変換される場合にも提供される。好適なアミノ酸置換の例を、以下の表中に示す。
2017519525.tif 000004
【００８５】
上記の意味における「機能的等価物」はまた、記載されるポリペプチドの「前駆体」、ならびに該ポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
【００８６】
「前駆体」は、その場合、所望の生物活性を有するか、または有さないポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
【００８７】
「塩」という表現は、本発明によるタンパク質分子のカルボキシル基の塩ならびにアミノ基の酸付加の塩を意味する。カルボキシル基の塩は、公知の方法で製造することができ、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩、ならびに有機塩基、例えば、トリエタノールアミンなどのアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンなどとの塩を含む。酸付加の塩、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸との塩ならびに酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩も、本発明によって包含される。
【００８８】
本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」を、公知の技術を用いて、機能的アミノ酸側基上で、またはそのN末端もしくはC末端で生成することもできる。そのような誘導体は、アンモニアまたは第1級もしくは第2級アミンとの反応により得られる、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド；アシル基との反応により生成される、遊離アミノ基のN-アシル誘導体；またはアシル基との反応により生成される、遊離ヒドロキシ基のO-アシル誘導体を含む。
【００８９】
「機能的等価物」は、他の生物から取得することができるポリペプチド、ならびに天然の変異体も天然に含む。例えば、相同な配列領域のエリアを、配列比較により確立し、等価な酵素を、本発明の具体的なパラメータに基づいて決定することができる。
【００９０】
「機能的等価物」はまた、例えば、所望の生物学的機能を示す、本発明によるポリペプチドの断片、好ましくは、個々のドメインまたは配列モチーフも含む。
【００９１】
「機能的等価物」は、さらに、上述のポリペプチド配列またはそれから誘導される機能的等価物および機能的なN末端もしくはC末端結合において少なくとも1つのさらなる機能的に異なる(すなわち、融合タンパク質部分の実質的な相互機能的な障害を有さない)異種配列のうちの1つを有する融合タンパク質である。これらの異種配列の非限定例は、例えば、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。
【００９２】
また、本発明にしたがって含まれる「機能的等価物」は、具体的に開示されるタンパク質の相同体である。これらのものは、上述のような同一性パーセント値を有する。前記値は、具体的に開示されるアミノ酸配列との同一性を指し、PearsonおよびLipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448のアルゴリズムにしたがって算出することができる。
【００９３】
同一性パーセント値を、BLASTアラインメント、blastpアルゴリズム(タンパク質-タンパク質BLAST)から、または以下に与えられるClustal設定を適用することにより算出することもできる。典型的な同一性パーセント値は、例えば、50%以上の範囲、例えば、少なくとも60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%にある。
【００９４】
本発明による相同ポリペプチドの同一性パーセンテージは、特に、本明細書に具体的に記載されるアミノ酸配列の1つの全長と比較したアミノ酸残基の同一性パーセンテージを意味する。
【００９５】
可能なタンパク質グリコシル化の場合、本発明による「機能的等価物」は、脱グリコシル化またはグリコシル化形態ならびにグリコシル化パターンを変化させることによって取得することができる改変形態の上記の型のタンパク質を含む。
【００９６】
本発明によるタンパク質またはポリペプチドのそのような機能的等価物または相同体を、突然変異誘発により、例えば、点突然変異、タンパク質の伸長または短縮により生成することができる。
【００９７】
本発明によるタンパク質のそのような機能的等価物または相同体を、突然変異体、例えば、短縮突然変異体の組合せデータベースをスクリーニングすることにより同定することができる。例えば、タンパク質変異体の多様化されたデータベースを、核酸レベルでの組合せ突然変異誘発により、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結により、生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からの潜在的な相同体のデータベースの生成のために用いることができる非常に多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を、自動DNA合成装置中で実行した後、合成遺伝子を好適な発現ベクターにライゲーションすることができる。縮重ゲノムの使用により、潜在的なタンパク質配列の所望のセットをコードする、混合物中の全ての配列を供給することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業者には公知である(例えば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraら(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraら(1984) Science 198:1056; Ikeら(1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
【００９８】
先行技術において、点突然変異または短縮により生成された組合せデータベースの遺伝子産物のスクリーニング、および選択された特性を有する遺伝子産物に関するcDNAライブラリーのスクリーニングのためのいくつかの技術が公知である。これらの技術を、本発明による相同体の組合せ突然変異誘発により生成された遺伝子バンクの迅速なスクリーニングのために適合化させることができる。高効率分析に基づく大きい遺伝子バンクのスクリーニングのために最もよく用いられる技術は、複製させることができる発現ベクターへの遺伝子バンクのクローニング、得られるベクターデータベースによる好適な細胞の形質転換および所望の活性の検出が、生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件での組合せ遺伝子の発現を含む。データベース中の機能的突然変異体の頻度を増加させる技術である再帰的アンサンブル突然変異誘発(REM)を、スクリーニング試験と組み合わせて用いて、相同体を同定することができる(ArkinおよびYourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgraveら(1993) Protein Engineering 6(3):327-331)。
【００９９】
3.2 コード核酸配列
本発明はまた、本明細書に定義される酵素/タンパク質をコードする核酸配列にも関する。
【０１００】
本発明はまた、本明細書に具体的に開示される配列に対してある特定の程度の「同一性」を有する核酸にも関する。2つの核酸間の「同一性」は、いずれの場合も、核酸の全長にわたる、ヌクレオチドの同一性を意味する。
【０１０１】
例えば、以下の設定でClustal Method (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151-1)を用いるInformax(USA)社のVector NTI Suite 7.1プログラムにより、同一性を算出することができる：
2017519525.tif 000005
【０１０２】
あるいは、Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500、ウェブページ: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#にしたがって、以下の設定で同一性を決定することができる：
2017519525.tif 000006
【０１０３】
本明細書に記載の全ての核酸配列(一本鎖および二本鎖DNAおよびRNA配列、例えば、cDNAおよびmRNA)を、ヌクレオチド構成要素からの化学合成、例えば、個々の重複する、二重らせんの相補的核酸構成要素の断片縮合による公知の方法で生成することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホラミダイト法(Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press, New York, pages 896-897)による公知の方法で実施することができる。DNAポリメラーゼのKlenow断片およびライゲーション反応ならびに一般的なクローニング技術による合成オリゴヌクレオチドの蓄積およびギャップの充填は、Sambrookら(1989)に記載されており、以下を参照されたい。
【０１０４】
本発明はまた、例えば、人工ヌクレオチド類似体を用いて取得することができる、上記のポリペプチドおよびその機能的等価物の1つをコードする、核酸配列(一本鎖および二本鎖DNAおよびRNA配列、例えば、cDNAおよびmRNA)にも関する。
【０１０５】
本発明は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物活性セグメントをコードする単離された核酸分子と、例えば、本発明によるコード核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして用いることができる核酸断片との両方に関する。
【０１０６】
本発明による核酸分子は、コード遺伝子領域の3'および/または5'末端に由来する非翻訳配列をさらに含有してもよい。
【０１０７】
本発明はさらに、具体的に記載されるヌクレオチド配列またはそのセグメントと相補的である核酸分子に関する。
【０１０８】
本発明によるヌクレオチド配列は、他の細胞型および生物における相同配列の同定および/またはクローニングのために用いることができるプローブおよびプライマーの生成を可能にする。そのようなプローブまたはプライマーは一般に、本発明による核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約12個、好ましくは少なくとも約25個、例えば、約40、50または75個の連続するヌクレオチドに「ストリンジェントな」条件下(以下を参照)でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１０９】
「単離された」核酸分子は、天然の核酸供給源中に存在する他の核酸分子から分離され、さらに、それが組換え技術により生成される場合、他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まないか、またはそれが化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を含まなくてもよい。
【０１１０】
本発明による核酸分子を、分子生物学の標準的な技術および本発明にしたがって供給される配列情報を用いて単離することができる。例えば、cDNAを、ハイブリダイゼーションプローブとしての具体的に開示される完全な配列またはそのセグメントの1つおよび標準的なハイブリダイゼーション技術(例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載のもの)を用いて、好適なcDNAライブラリーから単離することができる。さらに、開示される配列またはそのセグメントの1つを含む核酸分子を、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。この方法で増幅された核酸を、好適なベクター中にクローニングし、DNA配列決定により特徴付けることができる。また、本発明によるオリゴヌクレオチドを、標準的な合成方法により、例えば、自動DNA合成装置を用いて生成することもできる。
【０１１１】
本発明による核酸配列またはその誘導体、相同体またはこれらの配列の部分を、例えば、通常のハイブリダイゼーション技術またはPCR技術により、他の細菌から、例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリーを介して単離することができる。これらのDNA配列は、標準的な条件で、本発明による配列とハイブリダイズする。
【０１１２】
「ハイブリダイズする」とは、標準的な条件でほぼ相補的な配列に結合するが、これらの条件において非相補的パートナー間での非特異的結合が起こらないポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの能力を意味する。これについて、配列は、90〜100%相補的であってもよい。互いに特異的に結合することができる相補的配列の特性は、例えば、ノーザンブロッティングもしくはサザンブロッティングにおいて、またはPCRもしくはRT-PCRにおけるプライマー結合において用いられる。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションのために、保存された領域の短いオリゴヌクレオチドが有利に用いられる。しかしながら、ハイブリダイゼーションのために、本発明による核酸のより長い断片または完全な配列を使用することも可能である。これらの標準的な条件は、用いられる核酸(オリゴヌクレオチド、より長い断片もしくは完全な配列)に応じて、またはハイブリダイゼーションのために用いられる核酸の種類、DNAもしくはRNAに応じて変化する。例えば、DNA:DNAハイブリッドに融点は、同じ長さのDNA:RNAハイブリッドのものよりも約10℃低い。
【０１１４】
例えば、特定の核酸に応じて、標準的な条件は、0.1〜5xSSC(1xSSC=0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2)の濃度を有する水性バッファー溶液中で42〜58℃の温度、またはさらに、50%のホルムアミドの存在下では、例えば、5xSSC、50%ホルムアミド中、42℃の温度を意味する。有利には、DNA:DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、0.1xSSCおよび約20℃〜45℃、好ましくは、約30℃〜45℃の温度である。DNA:RNAハイブリッドについては、ハイブリダイゼーション条件は、有利には0.1xSSCおよび約30℃〜55℃、好ましくは約45℃〜55℃の温度である。ハイブリダイゼーションのためのこれらの記述された温度は、ホルムアミドの非存在下での約100ヌクレオチド長および50%のG+C含量を有する核酸について計算された融点値の例である。DNAハイブリダイゼーションのための実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えば、Sambrookら、1989に記載されており、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドの種類またはG+C含量に応じて、当業者には公知である式を用いて算出することができる。当業者であれば、以下の教科書：Ausubelら(編), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; HamesおよびHiggins (編), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (編), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxfordから、ハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を取得することができる。
【０１１５】
「ハイブリダイゼーション」は、特に、ストリンジェントな条件下で実行することができる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【０１１６】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は、特に、50%ホルムアミド、5xSSC(750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5x Denhardt液、10%硫酸デキストランおよび20g/ml変性、剪断サケ精子DNAからなる溶液中、42℃で一晩のインキュベーション、次いで、65℃の0.1xSSCを用いるフィルターの洗浄を意味する。
【０１１７】
本発明はまた、具体的に開示される、または誘導される核酸配列の誘導体にも関する。
【０１１８】
かくして、本発明によるさらなる核酸配列を、本明細書に具体的に開示される配列から誘導することができ、個々の、またはいくつかのヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失によってそれと異なってもよく、さらに、所望の特性プロファイルを有するポリペプチドをコードしてもよい。
【０１１９】
本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含むか、または特殊な元の、もしくは宿主生物のコドン使用にしたがって、具体的に記述された配列と比較して変化した核酸配列、ならびにその天然の変異体、例えば、スプライシング変異体または対立遺伝子変異体も包含する。
【０１２０】
それはまた、保存的ヌクレオチド置換(すなわち、問題のアミノ酸が同じ電荷、サイズ、極性および/または溶解度のアミノ酸により置換される)により取得することができる配列にも関する。
【０１２１】
本発明はまた、配列多型により具体的に開示される核酸から誘導される分子にも関する。これらの遺伝子多型は、天然の変異のため集団内の個体間に存在してもよい。これらの天然変異は通常、遺伝子のヌクレオチド配列の1〜5%の変動をもたらす。
【０１２２】
本発明による核酸配列の誘導体は、例えば、全配列範囲にわたって、誘導されるアミノ酸のレベルで少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも80%の相同性、特に好ましくは少なくとも90%の相同性を有する、対立遺伝子変異体を意味する(アミノ酸レベルでの相同性に関しては、ポリペプチドについて上記に与えられた詳細を参照すべきである)。有利には、相同性は、配列の部分領域よりも高くてもよい。
【０１２３】
さらに、誘導体は、本発明による核酸配列、例えば、動物、植物、真菌または細菌相同体、短縮された配列、コードおよび非コードDNA配列の一本鎖DNAまたはRNAの相同体でもあることも理解されるべきである。例えば、相同体は、本明細書に具体的に開示される配列中に与えられる全DNA領域にわたって、DNAレベルで、少なくとも40%、好ましくは少なくとも60%、特に好ましくは、少なくとも70%、さらに特に好ましくは少なくとも80%の相同性を有する。
【０１２４】
さらに、誘導体は、例えば、プロモーターとの融合物であることが理解されるべきである。記述されるヌクレオチド配列に付加されるプロモーターを、プロモーターの機能性または効力を損傷することなく、少なくとも1つのヌクレオチド交換、少なくとも1つの挿入、反転および/または欠失により改変することができる。さらに、プロモーターの効力を、その配列を変化させることによって増加させるか、または異なる属の生物のものであっても、より効率的なプロモーターと完全に交換することができる。
【０１２５】
3.3 機能的突然変異体の調製
また、当業者であれば、本明細書に開示される特定の配列の機能的突然変異体を作成する方法を知っている。
【０１２６】
適用される技術に応じて、当業者であれば、遺伝子または非コード核酸領域(例えば、遺伝子発現を調節するのに重要なものであってもよい)において任意的または特異的突然変異を作成した後、好適な遺伝子ライブラリーを作成することができる。したがって、必要な分子生物学的方法は、全て当業界で周知であり、例えば、SambrookおよびRussell, Molecular Cloning. 3. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001により記載されている。
【０１２７】
遺伝子を改変し、その結果、コードされるタンパク質を改変する方法は、例えば、
- 遺伝子の単一もしくは複数のヌクレオチドが特異的に置き換えられる部位特異的突然変異誘発(Trower MK (編) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、
- 遺伝子の任意の位置で、任意のアミノ酸のコドンを交換もしくは付加することができる飽和突然変異誘発(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1)、
- ヌクレオチド配列を不正確に機能するDNAポリメラーゼの作用によって突然変異させる変異性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739)、
- 好ましい置換をポリメラーゼにより回避する、SeSaM法(配列飽和法)(Schenkら、Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279)、
- 例えば、欠損DNA修復機構を考慮して、ヌクレオチド配列の突然変異の出現率の増大を示す、突然変異株における遺伝子の継代(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. Trower MK (Hrsg.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、または
- 密接に関連する遺伝子のプールを形成させ、消化し、その断片をPCR反応のための鋳型として使用し、完全長モザイク遺伝子を形成させるDNAシャッフリング(Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)
として、当業者には周知である。
【０１２８】
いわゆる指向進化技術(例えば、Reetz MTおよびJaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, Demain AL, Davies JE (Hrsg.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiologyを参照されたい)を適用することによって、当業者であれば、大規模に機能的突然変異体を特異的に調製することができる。第1のステップにおいて、特定のタンパク質のライブラリーを、例えば、上記の方法のいずれか1つを適用することによって作成する。その後、前記ライブラリーを、例えば、細菌またはファージディスプレイ系を適用することによって発現させる。
【０１２９】
所望の特徴プロファイルを示す機能的突然変異体を発現するこれらの遺伝子を選択し、さらなる突然変異にかけることができる。突然変異および選択またはスクリーニングのステップを、得られる突然変異体の1つが所望の特徴プロファイルを示すまで繰り返すことができる。
【０１３０】
反復手法により、例えば、1〜5個の突然変異などの限られた数の突然変異を実施し、問題の酵素特徴に対するそれらの影響を評価し、さらに改善された突然変異体を段階的に選択することができる。次いで、前記選択された突然変異体を、実質的に同じ方法でさらなる突然変異にかけることができる。評価される単一突然変異体の数を、この方法で有意に減少させることができる。
【０１３１】
本発明の教示は、所望の改変された特徴プロファイルを有するさらなる酵素/タンパク質を作成することができることに基づいて、問題の酵素/タンパク質の構造および配列に関する重要な情報を提供する。特に、いわゆるホットスポット、すなわち、所望の特徴の酵素/タンパク質を改変または作成するためのさらなる突然変異に適合させることができる配列領域を定義することができる。
【０１３２】
3.4 本発明にしたがって用いられる構築物
本発明はまた、調節核酸配列の遺伝子制御下で、本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現構築物；ならびにこれらの発現構築物のうちの少なくとも1つを含むベクターに関する。
【０１３３】
「発現ユニット」とは、本発明によれば、本明細書に定義されるプロモーターを含み、発現させようとする核酸または遺伝子との機能的結合の後に、この核酸またはこの遺伝子の発現、すなわち、転写および翻訳を調節する、発現活性を有する核酸を意味する。したがって、この文脈においては、それは「調節核酸配列」とも呼ばれる。プロモーターに加えて、他の調節エレメント、例えば、エンハンサーが存在してもよい。
【０１３４】
「発現カセット」または「発現構築物」は、本発明によれば、発現させようとする核酸または発現させようとする遺伝子と機能的に関連する発現ユニットを意味する。かくして、発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写および翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写および翻訳の結果としてタンパク質として発現される核酸配列も含む。
【０１３５】
用語「発現」または「過剰発現」は、本発明の文脈においては、対応するDNAによりコードされる、微生物中での1つ以上の酵素の細胞内活性の生成または増加を記載する。このために、例えば、遺伝子を生物中に挿入する、存在する遺伝子を別の遺伝子で置き換える、遺伝子のコピー数を増加させる、強力なプロモーターを使用する、または高い活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用することが可能であり、必要に応じて、これらの手段を組み合わせることができる。
【０１３６】
好ましくは、本発明によるそのような構築物は、いずれの場合も、コード配列と機能的に関連する、それぞれのコード配列から5'側上流にあるプロモーター、および3'側下流にあるターミネーター、必要に応じて、さらなる通常の調節エレメントを含む。
【０１３７】
「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」は、本発明によれば、転写される核酸と機能的に関連する、この核酸の転写を調節する核酸を意味する。
【０１３８】
「機能的」または「機能し得る」関連は、この文脈では、それぞれの調節エレメントが核酸配列の転写においてその機能を実行することができるような、例えば、プロモーター活性を有する核酸および転写される核酸配列の1つと、必要に応じて、さらなる調節エレメント、例えば、核酸の転写を可能にする核酸配列、および例えば、ターミネーターとの連続的配置を意味する。これは、化学的意味における直接的関連を必ずしも必要としない。エンハンサー配列などの遺伝子制御配列は、より遠い位置から、またはさらには他のDNA分子から標的配列に対してその機能を発揮することもできる。転写される核酸配列がプロモーター配列の後ろ(すなわち、3'末端)に位置し、2つの配列が互いに共有的に結合する配置が好ましい。プロモーター配列と、遺伝子組換え的に発現される核酸配列との距離は、200bp(塩基対)未満、または100bp未満または50bp未満であってもよい。
【０１３９】
プロモーターおよびターミネーターは別として、記載することができる他の調節エレメントの例は、標的配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【０１４０】
本発明による核酸構築物は、特に、本明細書で具体的に記載されるもの、またはその誘導体および相同体、ならびに遺伝子発現を制御する、例えば、増加させるための1つ以上の調節シグナルと機能し得る形で、または機能的に有利に結合する本明細書で具体的に記載されるアミノ酸配列から誘導することができる核酸配列から選択される配列を含む。
【０１４１】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然の調節は、依然として実際の構造遺伝子の前に存在してもよく、必要に応じて、自然の調節のスイッチが切られるように遺伝的に変化され、遺伝子の発現が増加していてもよい。核酸構築物は、より単純な設計のもの、すなわち、コード配列の前に挿入される任意のさらなる調節シグナルを含まない、およびその調節と共に自然のプロモーターを除去しないものであってもよい。その代わりに、調節が最早起こらず、遺伝子発現が増加するように、自然の調節配列がサイレンシングされる。
【０１４２】
好ましい核酸構築物は、有利には、核酸配列の発現増加を可能にする、プロモーターと機能的に関連する、1つ以上の上記のエンハンサー配列も含有する。他の調節エレメントまたはターミネーターなどのさらなる有利な配列を、DNA配列の3'末端に挿入することもできる。本発明による1以上のコピーの核酸を、構築物中に含有させることができる。構築物はまた、必要に応じて、構築物上での選択のための、抗生物質耐性または栄養要求補完遺伝子などの他のマーカーを含有してもよい。
【０１４３】
好適な調節配列の例は、cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP (rhaPBAD)SP6-、ラムダ-PR-などのプロモーター中またはグラム陰性細菌において有用であるラムダ-PLプロモーター中に含有される。他の有利な調節配列は、例えば、グラム陽性プロモーターace、amyおよびSPO2中に、酵母または真菌プロモーターADC1、MFアルファ、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中に含有される。人工プロモーターを調節のために用いることもできる。
【０１４４】
発現のために、核酸構築物を、宿主生物中に、有利には、宿主中での遺伝子の最適な発現を可能にするベクター、例えば、プラスミドまたはファージ中に挿入する。プラスミドおよびファージに加えて、ベクターはまた、当業者には公知の他の全てのベクター、例えば、SV40、CMV、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、および線状または環状DNAを意味すると理解される。これらのベクターは、宿主生物中で自己複製することができるか、または染色体的に複製することができる。これらのベクターは、本発明のさらなる実施形態である。
【０１４５】
好適なプラスミドは、例えば、大腸菌中では、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11もしくはpBdCI；ノカルジオ型放線菌中では、pJAM2；ストレプトミセス(Streptomyces)中では、pIJ101、pIJ364、pIJ702もしくはpIJ361; バチルス中では、pUB110、pC194もしくはpBD214; コリネバクテリウム(Corynebacterium)中では、pSA77もしくはpAJ667; 真菌中では、pALS1、pIL2もしくはpBB116; 酵母中では、2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13もしくはpEMBLYe23または植物中では、pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004もしくはpDH51である。上記のプラスミドは、可能なプラスミドの小選択である。他のプラスミドは当業者には周知であり、例えば、書籍Cloning Vectors (Pouwels P.H.ら(編), Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)中に見出すことができる。さらなる好適なプラスミドはまた、実験部分に記載される。
【０１４６】
ベクターのさらなる実施形態においては、本発明による核酸構築物または本発明による核酸を含有するベクターを、微生物中に線状DNAの形態で有利に挿入し、異種または相同組換えにより宿主生物のゲノム中に組み込むことができる。この線状DNAは、プラスミドなどの線状化ベクターまたは本発明による核酸構築物もしくは核酸のみを含んでもよい。
【０１４７】
生物中での異種遺伝子の最適な発現のために、生物中で用いられる特定のコドン使用にしたがって核酸配列を変化させることが有利である。問題の生物の他の公知の遺伝子のコンピュータ評価に基づいて、コドン使用を容易に決定することができる。
【０１４８】
本発明による発現カセットの生成は、好適なコードヌクレオチド配列を含む好適なプロモーターと、ターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルとの融合に基づく。このために、例えば、T. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)ならびにT.J. Silhavy, M.L. BermanおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)およびAusubel, F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載のような、一般的な組換えおよびクローニング技術が用いられる。
【０１４９】
組換え核酸構築物または遺伝子構築物を、有利には、好適な宿主生物中での発現のために宿主特異的ベクター中に挿入して、宿主中での遺伝子の最適な発現を可能にする。ベクターは当業者には周知であり、例えば、「Cloning Vectors」(Pouwels P.H.ら、Publ. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に見出すことができる。
【０１５０】
3.5 本発明に従って用いることができる宿主
文脈に応じて、用語「微生物」とは、本発明による出発微生物(野生型)または遺伝的に改変された微生物、またはその両方を意味する。
【０１５１】
用語「野生型」は、本発明によれば、対応する出発微生物を意味し、天然の生物に対応する必要はない。
【０１５２】
本発明によるベクターを用いて、例えば、少なくとも1つの本発明によるベクターを形質転換され、本発明による発酵生産のために用いることができる組換え微生物を生成することができる。
【０１５３】
有利には、上記の本発明による組換え構築物を、好適な宿主系に挿入し、発現させる。好ましくは、当業者にはよく知られている一般的なクローニングおよびトランスフェクション法、例えば、共沈降、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いて、それぞれの発現系における記述された核酸の発現を確保する。好適な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubelら、Publ. Wiley Interscience, New York 1997、またはSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【０１５４】
宿主生物または本発明による宿主生物は、好ましくは、上記の定義による酵素活性をコードする、本発明で記載される核酸配列、核酸構築物またはベクターのうちの少なくとも1つを含有する。
【０１５５】
3.6 本発明の生成物の酵素的生成
生体触媒変換反応は、変換させようとする基質(第1級または第2級アルコール)、必要な酵素活性(アミンデヒドロゲナーゼおよびアルコール基質の種類に適合した第1級または第2級ADH)、コファクターによる添加物、アンモニアまたはアンモニウム源、バッファー、および必要に応じて、例えば、酵素活性を安定化するのに好適なさらなる成分を含有する、液体、好ましくは、水性反応媒体中で実行することができる。
【０１５６】
反応混合物は、均一または非均一、好ましくは、均一であってもよい。
【０１５７】
有機共溶媒を、必要に応じて0.1〜80vol.%の好適な割合で添加してもよい。必要に応じて、基質を、有機共溶媒中に予め溶解した後、水性媒体に添加してもよい。
【０１５８】
反応混合物を、好適な期間にわたって、10〜80℃、10〜50℃、または25〜40℃、例えば、25〜30℃の範囲の好適な温度で、好適な強度で撹拌または振盪してもよい。例えば、1〜120hまたは10〜24hなどの十分な反応時間の後、生成物を抽出することができる。
【０１５９】
上記で定義された必要な酵素のアリコートを、適切な酵素濃度および活性ならびに生物形質転換を実施するための適切な相対割合で、溶解または分散、例えば、固定された形態で提供する。
【０１６０】
例えば、塩化アンモニウムのようなアンモニウム塩などのアンモニア源が存在してもよく(過剰量で、すなわち、基質よりも多い等モル量で)、これは例えば、塩化アンモニアバッファーなどのバッファー自体として役立ち得る。
【０１６１】
理想的には、実質的に唯一のアンモニア、アンモニア塩を、酵素、コファクターおよび基質に添加する。
【０１６２】
しかしながら、反応を、緩衝化系において実行することもできる。かくして、反応を、例えば、好ましくは8〜9などの、約7〜約10の範囲のpHの、リン酸またはホウ酸バッファーなどの好適なバッファーを含有する緩衝化反応媒体中で実施することもできる。
【０１６３】
さらなる反応の詳細を、実験セクションから取得することができる。
【０１６４】
3.7 本発明のアミンの生成方法
本発明はまた、特に、式(I)のアミンの生体触媒的または発酵的(全細胞)生成のための方法に関する。
【０１６５】
本発明にしたがって用いられる必要な酵素活性を発現する/担持する組換え微生物を、バッチプロセスまたはフェドバッチもしくは反復フェドバッチプロセスにおいて連続的または非連続的に培養することができる。公知の培養方法の概説を、Chmielにより教科書(Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))またはStorhasによる教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に見出すことができる。
【０１６６】
用いられる培養培地は、適切な様式で特定の株の要件を満たさなければならない。様々な微生物に関する培養培地の説明は、ハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)に与えられている。
【０１６７】
本発明にしたがって用いることができるこれらの培地は、一般に、発酵生産の場合、1つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび/または微量元素を含む。
【０１６８】
好ましい炭素源は、モノ-、ジ-またはポリサッカリドなどの糖である。非常に良好な炭素源は、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、スターチまたはセルロースである。糖蜜などの複合化合物、または精糖からの他の副生成物を介して糖を培地に添加することもできる。また、様々な炭素源の混合物を添加することが有利であってもよい。他の可能な炭素源は、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油などの油および脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸などの脂肪酸、グリセロール、メタノールまたはエタノールなどのアルコールおよび酢酸または乳酸などの有機酸である。
【０１６９】
窒素源は、通常、有機もしくは無機窒素化合物またはこれらの化合物を含有する材料である。窒素源の例としては、アンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸またはコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物その他などの複合窒素源が挙げられる。
【０１７０】
培地中に存在してもよい無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩を含む。
【０１７１】
無機硫黄含有化合物、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物だけでなく、メルカプタンおよびチオールなどの有機硫黄化合物も、硫黄源として用いることができる。
【０１７２】
リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸1水素2カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を、リン源として用いることができる。
【０１７３】
キレート剤を培地に添加して、溶液中の金属イオンを保持することができる。特に好適なキレート剤は、カテコールもしくはプロトカテクエートなどのジヒドロキシフェノール、またはクエン酸などの有機酸を含む。
【０１７４】
本発明にしたがって用いられる発酵培地はまた、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンを含む、ビタミンまたは増殖促進剤などの他の増殖因子を含有してもよい。増殖因子および塩は、酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地成分に由来することが多い。さらに、好適な前駆体を培養培地に添加することができる。培地中の化合物の正確な組成は、特定の実験に強く依存し、それぞれ特定の場合について個別に決定しなければならない。培地最適化に関する情報を、教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)に見出すことができる。増殖培地を、Standard 1(Merck)またはBHI(Brain heart infusion、DIFCO)などの供給業者から取得することもできる。
【０１７５】
培地の全ての成分を、加熱(2.0barおよび121℃で20min)または滅菌濾過によって滅菌する。成分を、一緒に、または必要に応じて別々に滅菌することができる。全ての培地成分は、増殖の開始時に存在するか、または必要に応じて、連続的に、もしくはバッチ供給によって添加してもよい。
【０１７６】
培養の温度は通常、15℃〜45℃、好ましくは、25℃〜40℃であり、一定に保持するか、または実験中に変化させてもよい。培地のpH値は、5〜8.5の範囲、好ましくは、約7.0であるべきである。増殖のためのpH値を、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を添加することによって増殖中に制御することができる。消泡剤、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルを、気泡形成を制御するために用いることができる。プラスミドの安定性を維持するために、選択作用を有する好適な物質、例えば、抗生物質を、培地に添加することができる。酸素または酸素含有気体混合物、例えば、外気を培養物中に供給して、好気状態を維持する。培養物の温度は通常、20℃〜45℃である。最大の所望の生成物が形成されるまで、培養を継続する。これは通常、10時間〜160時間以内に達成される。
【０１７７】
必要に応じて、高周波数の超音波により、例えば、French圧力セル中での高圧により、オスモライシスにより、界面活性剤、溶解酵素もしくは有機溶媒の作用により、ホモジェナイザーにより、または列挙された方法のいくつかの組合せにより、細胞を破壊することができる。
【０１７８】
意図される生物形質転換を実施するのに必要とされる酵素活性を、単一の、または2つ以上の、特に、2つまたは3つの組換え微生物により発現させる、すなわち、提供することができる。
【０１７９】
本発明の方法を実施するのに必要とされる1つ以上、またはさらには全ての酵素活性を担持し、発現する組換え微生物の調製に適合されたベクターおよび方法は、当業界で公知であり、例えば、1つの遺伝子については、pET系、NovagenまたはpBAD系、Invitrogen；2つの遺伝子のためのプラスミド系、例えば、pACYC-Duet1、Novagenがある。
【０１８０】
代替的な、より好ましい実施形態においては、本発明の製造方法は、古典的な発酵プロセスとしては実施されない。むしろ、必要な酵素活性(少なくとも1つ、または好ましくは全ての必要な酵素活性)を担持する(発現する)(組換え)細胞を、必要な基質と、NAD(H)および/またはNADP(H)のような共基質とを含有する反応媒体と接触させることができる。前記媒体は、バッファーなどの、意図される生成プロセスを支援する従来の添加物を含有し、プロセスの経過中の反応媒体のpHを制御することもできる。細胞を、そのまま(細胞培養物から得られたまま)用いるか、または基質、共基質および生成物分子に関する細胞の透過性を増加させるために予備処理することができる。例えば、細胞を、温度処理(例えば、必要に応じて、所望の透過性を達成するための反復的凍結/解凍サイクルおよび/または周囲温度での保存など)にかけることができる。
【０１８１】
そのようなプロセスを実施するための好適なプロトコールは、当業者には公知である。
【０１８２】
3.8 酵素固定化
本発明にしたがって請求される酵素を固定する場合、それは不活性担体に結合される。好適な担体材料は当業界で公知であり、例えば、EP-A-1149849、EP-A-1 069 183およびDE-OS 100193773ならびにそこに引用される参考文献(担体材料に関して特に同封されるもの全て)に開示されている。好適な担体の例は、粘土、粘土鉱物、例えば、カオリン、珪藻土、パーライト、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換材料、合成ポリマー、例えば、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタンならびにポリオレフィン、例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレンである。担体に結合した酵素を調製するために、担体材料は通常、多孔形態が好ましい微細粉末の形態で用いられる。担体材料の粒径は通常、5mm、特に、2mmを超えない。少なくとも1つの酵素が全細胞調製物中に存在する場合、前記全細胞調製物は、遊離または固定形態で存在してもよい。好適な担体材料は、例えば、Ca-アルギン酸またはカラゲナンである。酵素ならびに細胞を、グルタルアルデヒドによって直接連結することができる。様々な固定化方法が当業界で公知である(例えば、J. LalondeおよびA. Margolin、「Immobilization of Enzymes」in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim)。
【０１８３】
3.9 生成物の単離
本発明の方法は、本発明にしたがって生成される化合物を回収するステップをさらに含んでもよい。用語「回収すること」は、培養物または反応媒体から化合物を抽出すること、収獲すること、単離すること、または精製することを含む。化合物の回収を、限定されるものではないが、従来の樹脂(例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など)による処理、従来の吸着剤(例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど)による処理、pHの変化、溶媒抽出(例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒を用いる)、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥などの当業界で公知の任意の従来の単離または精製方法にしたがって実施することができる。
【０１８４】
3.10 特定のアミンデヒドロゲナーゼ
2つの特定のアミンデヒドロゲナーゼが好ましく用いられる：L-AmDHおよびPh-AmDH。
【０１８５】
a) L-AmDH：
L-AmDHは、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)(ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)とも呼ばれる)に由来するロイシンデヒドロゲナーゼを起源とするものであった。野生型酵素の配列は、以下の論文中に公開されている：S. Nagata, K. Tanizawa, N. Esaki, Y. Sakamoto, T. Ohshima, H. Tanaka, K. Soda, Biochemistry 1988, 27, 9056-9062。
【０１８６】
バチルス・ステアロサーモフィルスに由来する野生型ロイシンデヒドロゲナーゼの配列に関して、以下の突然変異を適用して、L-AmDH変異体を得た：K68S-E114V-N262L-V291C。
【０１８７】
バチルス・ステアロサーモフィルスに由来する野生型ロイシンデヒドロゲナーゼの結晶構造は入手できないため、類似する酵素：ロドコッカス(Rhodococcus)種M4に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの結晶構造を研究することによって、突然変異の機能を割り当てることができる。ロドコッカス種M4に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの結晶構造は、アポ型ならびにホロ型(PDB:1C1Dおよび1BW9)で入手できる。
【０１８８】
突然変異された4つのアミノ酸残基は全て、酵素の活性部位に位置する。リジンおよびアスパラギン残基(バチルス・ステアロサーモフィルスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼの配列中、それぞれ、K68およびN262)は、α-ケト酸基質のカルボキシル部分に属する2個の酸素原子と直接相互作用する。したがって、K68およびN262は、その荷電した側鎖を介する基質の結合において重要な役割を果たす。バチルス・ステアロサーモフィルスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼの足場から出発して、これらの2つの位置を、最初に以下のように突然変異させた：K68SおよびN262L。したがって、2つの荷電したアミノ酸残基を、セリンおよびロイシンなどの他の非荷電のより疎水性の残基と置き換えた。新しく導入された残基は、カルボキシル部分を欠く、非天然基質との疎水性相互作用を可能にする。結果として、L-AmDHは、メチルイソブチルケトンを優先的に受け入れ、天然の基質のカルボキシル部分とメチル基との置換に対応する。第3の突然変異は、バチルス・ステアロサーモフィルスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼの残基V291を含む。この残基は、ロドコッカス種M4に由来する野生型フェニルアラニンデヒドロゲナーゼのプロリンと関連する必要がある。かくして、V291は、活性部位におけるK68およびN262の位置に関して反対側からの基質の結合に関与する必要がある。文献データから、V291C突然変異は、kcat値に影響することなく、メチルイソブチルケトンのKm値を低下させるのに役立つと考えられる。第4の突然変異は、バリンに変化される残基E114を含む。この位置は、ロドコッカス種M4に由来する相同なフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ中のプロリンに対応する。残基E114は基質から有意に遠くに位置する必要があるため、この突然変異の影響は、相同な酵素の結晶構造に基づいて合理的に説明することは困難である。文献データから、この突然変異はメチルイソブチルケトンのkcatを増加させるのに寄与し得ると考えられる(約2桁規模)。しかしながら、近隣の残基の相乗効果も重要な役割を果たすはずである。基質受容性の変化は、以下のスキーム：
【０１８９】
【化３】
2017519525.tif 000007
【０１９０】
によって例示される。
【０１９１】
b) Ph-AmDH：
他の好ましい酵素は、バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを起源とするPh-AmDHである。野生型酵素の配列は、文献：A. Yamada, T. Dairi, Y. Ohno, X.-L. Huang, Y. Asano, Biosci. Biotech. Biochem. 1995, 59 (10), 1994-1995に報告されている。
【０１９２】
野生型フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの配列に関して、以下の突然変異を適用して、Ph-AmDH変異体を得た：K78S-N277L。
【０１９３】
バチルス・バディウスに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼとの関連する配列類似性を有する(48%の同一性、66%の類似性)。したがって、高度に保存された残基K78およびN277はまた、天然の基質のα-ケト酸のカルボキシル部分の結合にも関与する。L-AmDHの場合に以前に記載された通り、リジン(K78)のセリンへの、およびアスパラギン(N277)のロイシンへの2つの相乗的突然変異は、標的非天然基質の最良の変異体を生成した(フェニルアセトンおよびその誘導体)。この場合、酵素活性を増加させるために、さらなる突然変異は必要ではなかった。基質受容性の変化は、以下のスキーム：
【０１９４】
【化４】
2017519525.tif 000008
【０１９５】
によって例示される。
【実施例】
【０１９６】
実験部分
別途記述しない限り、以下の実験は、遺伝子工学、微生物の培養による化合物の発酵生産ならびに生成物の分析および単離において用いられる標準的な装備、方法、化学物質、および生化学物質を適用することによって実施されたものである。また、上記で引用されるSambrookらおよびChmielらも参照されたい。
【０１９７】
材料および方法
a)一般的方法
タンパク質濃度は、Uptima BCアッセイタンパク質精製キット(Interchim, Montlucon, France)を用いて、基準としてウシ血清アルブミンを用いて決定した。SDS-PAGEは、Mini-Sub Cell GT(Biorad, Munich)中で行った。タンパク質を、SimplyBlue(商標)Safe Stain (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて染色した。
【０１９８】
FID検出器を装備したAgilent 7890 A GCシステムを用いるGCによって分析を実施した。水素を、担体ガスとして用いた。
【０１９９】
単一ステップ還元的アミノ化(実施例6)に関して、関連するアミンへのケトンの変換を、Agilent J&W DB-1701カラム(30m, 250μm、0.25μm)を用いて、GCにより測定した。
【０２００】
化合物1〜13に関する反応(図3、実施例6)を、以下のGCプログラムパラメータを用いて分析した：注入250℃；定常圧力1bar；温度プログラム60℃/保持6.5min；100℃/速度20℃ min-1/保持1min；280℃/速度20℃ min-1/保持2min。
【０２０１】
光学的に活性なアミンの鏡像体過剰率を、対応するアセトアミドへのアミン生成物の誘導体化の後に、キラルGCカラム(Agilent Chrompack Chirasel Dex-CBカラム、25m、320μm、0.25μm)を用いるGCによって分析した。誘導体化は、無水酢酸(40μL)中に溶解された4-(N,N-ジメチルアミノ)ピリジン(2mg)を添加することによって実施した。試料を、約1hにわたって振盪した。次いで、試料を水で洗浄して、MgSO4を用いて乾燥した。次いで、誘導体化された化合物の鏡像体過剰率を以下のように測定した。
【０２０２】
化合物1〜9の還元的アミノ化から得られた誘導体化アミンの鏡像体過剰率(図3、実施例6)を、以下のGCプログラムパラメータを用いて分析した：注入200℃；定常流量1.7mL/min；温度プログラム100℃/保持2min；130℃/速度1℃ min-1/保持5min；170℃/速度10℃ min-1/保持10min；180℃/速度10℃ min-1/保持0min。
【０２０３】
化合物10〜13の還元的アミノ化から得られた誘導体化アミンの鏡像体過剰率(図3、実施例6)を、以下のGCプログラムパラメータを用いて分析した：注入200℃；定常流量1.7mL/min；温度プログラム60℃/保持2min；100℃/速度5℃ min-1/保持2min；118℃/速度1℃ min-1/保持5min；170℃/速度10℃ min-1/保持1min。
【０２０４】
立体反転によるアルコールの水素借用生体アミノ化(実施例7)および構成の保持によるアルコールの水素借用生体アミノ化(実施例8)に関して、関連するアミンへのケトンの変換を、1回の泳動でアルコール基質、ケトン中間体およびアミン生成物の分離を可能にする、より長いAgilent J&W DB-1701カラム(60m、250μm、0.25μm)を用いるGCによって測定した。以下のGCプログラムパラメータを用いた：80℃/保持6.5min；160℃/速度5℃ min-1/保持10min；280℃/速度10℃ min-1/保持2min。光学的に活性なアミンの鏡像体過剰率を、以前に記載されたように、誘導体化後に、キラルGCカラム(Agilent Chrompack Chirasel Dex-CBカラム、25m、320μm、0.25μm)を用いるGCによって分析した。以下のGCプログラムパラメータを用いた：注入200℃；定常流量1.7mL/min；温度プログラム100℃/保持2min；130℃/速度1℃ min-1/保持5min；170℃/速度10℃ min-1/保持10min；180℃/速度10℃ min-1/保持0min。
【０２０５】
b)化学物質
全ての化学物質を、Fluka-Sigma-Aldrich(Munich, Germany)またはAcros Organics(Geel, Belgium)から購入した。BDG-アルデヒドおよびBDG-アミンは、BASFにより提供されたものであった。
【０２０６】
c)酵素
GDH：酵素を、Codexisから購入した。以下の実験において用いられる反応(NADをNADHに同時に還元するための、グルコノラクトンへのグルコースの酸化)を、この型の任意の酵素を用いて実行する。あるいは、NAD(P)H再生のために、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)のGDH(Lampel, K.A.ら、Journal of Bacteriology, 1986, 166, (1), 238)を用いることができる。このアミノ酸配列は、AAA22463.1(配列番号7)の下でGenBankに預託されている。
【０２０７】
全てのタンパク質を、大腸菌中で組換え生産したが、必要に応じて、より容易な単離のためにHisタグを担持してもよい。
【０２０８】
Ph-AmDH(配列番号2)：Abrahamson, M.J.ら、Advanced Synthesis and Catalysis, 2013, 355, (9), 1780-1786およびAbrahamson, M.J.ら、Angew. Chem. Int Ed,2012, 51, 3969により記載されたB.badiusに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異タンパク質。野生型タンパク質(配列番号1)は、Asano, Y.ら、European Journal of Biochemistry, 1987, 188, (1), 153によっても記載されている。
【０２０９】
L-AmDH(配列番号4)：ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼの突然変異タンパク質。
【０２１０】
L-AmDHは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼを起源とするものであった。野生型酵素の配列は、以下の論文：S. Nagata, K. Tanizawa, N. Esaki, Y. Sakamoto, T. Ohshima, H. Tanaka, K. Soda, Biochemistry 1988, 27, 9056-9062に公開されている。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに由来する野生型ロイシンデヒドロゲナーゼの配列に関して、以下の突然変異を適用して、L-AmDH変異体を得た：K68S-E114V-N262L-V291C。
【０２１１】
L-AmDHおよびPh-AmDH遺伝子を、特注合成し(Carlson, R., Nat Biotechnol. 2009, 27, 1091を参照)、それぞれの発現ベクター中にクローニングした。
【０２１２】
AA-ADH(配列番号5)：BASF SEのWO2005/108590またはHoffken, H.W.ら、Biochemistry, 2006, 45, (1), 82を参照されたい。
【０２１３】
LBv-ADH(配列番号6)：本明細書で用いられる突然変異体は、文献で公知である：Schlieben, N.H.ら、Journal of Molecular Biology, 2005, 349, (4), 801。その野生型形態の生体触媒は、DE 19610984 A1に記載されている。
【０２１４】
HL-ADH(配列番号8)：アイソフォームSとは対照的に、エタノールとは反応するが、ステロイドとは反応しないアイソフォームEを用いた(Park, H.D.ら、J. boil. Chem. 1991 266, (20) 13296を参照されたい)。
【０２１５】
ADH-A(配列番号9)：Kosjekら、Biotechnol. Bioeng., (2004) 86, (1) 55；および米国特許第7,569,375号を参照されたい。
【０２１６】
(ADH-hT)：R. Cannio,M. Rossi, S. Bartolucci, Eur. J. Biochem. 1994, 222, 345-352; b) X. Zhang, T. C. Bruice, Biochemistry 2007, 46, 837-843を参照されたい。
【０２１７】
d)遺伝子のクローニング
DNAの日常的な操作、PCRおよび組換えプラスミドの構築を、(Sambrook J & Russell DW (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring. Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)に記載のように実施した。
【０２１８】
実施例１：酵素調製物
1.1 酸化ステップ(アルコール酸化)のための酵素
例示される酸化ステップを、NADH依存的であるアルコールデヒドロゲナーゼによって実施する。例示される反応カスケードのカップリングされた第2の還元ステップは、厳密にNADH依存的であるアミンデヒドロゲナーゼ(AmDH)により触媒されるため、NADPH依存的アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)を適用することはできない。
【０２１９】
第1級アルコールの酸化を、単一の第1級アルコールデヒドロゲナーゼによって実施する。好適な第1級アルコールデヒドロゲナーゼは、ウマ肝臓に由来するアルコールデヒドロゲナーゼ(HL-ADH)(a) D. H. Park, B. V. Plapp, J. Biol. Chem. 1991, 266, 13296-13302; b) S. Al-Karadaghi, E. S. Cedergren-Zeppezauer, S. Hovmoller, K. Petratos, H. Terry, K. S. Wilson, Acta Crystallogr. Sect. D 1994, 50, 793-807)またはゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH-hT)(a) R. Cannio,M. Rossi, S. Bartolucci, Eur. J. Biochem. 1994, 222, 345-352; b) X. Zhang, T. C. Bruice, Biochemistry 2007, 46, 837-843)である。
【０２２０】
第2級アルコールのラセミ混合物の酸化を、2つの立体相補的なアルコールデヒドロゲナーゼによって実施する。好適なPrelog(V. Prelog, Pure Appl. Chem. 1964, 9, 119-130)NADH依存的アルコールデヒドロゲナーゼは、ロドコッカス・ルーバー(Rhodococcus ruber)に由来するアルコールデヒドロゲナーゼ「A」である(B. Kosjek, W. Stampfer, M. Pogorevc, W. Goessler,K. Faber, W. Kroutil, Biotechnol. Bioeng. 2004, 86, 56-62)。原理的には、様々な他のPrelog ADHが好適である。
【０２２１】
抗Prelog NADH依存的アルコールデヒドロゲナーゼは、自然では稀である。レイフソニア種(Leifsonia sp.)およびラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)に由来する酵素は、文献に記載されている(a) K. Inoue, Y. Makino, T. Dairi, N Itoh, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70, 418-426. b) S. Leuchs, L. Greiner, Chem.Biochem.Eng.Q. 2011, 25 267-281)。しかしながら、本発明においては、ラクトバチルス・ブレビスに由来する操作されたADH(LBv-ADH)が、抗Prelog ADHとして用いられた(N. H. Schlieben, K. Niefind, J. Muller, B. Riebel, W. Hummel, D. Schomburg, J.Mol.Biol. 2005, 349 801-813)。
【０２２２】
1.1.1 ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ(HL-ADH)(配列番号8)
HL-ADHの遺伝子を、pET-28aベクター中にクローニングした。クローニングを、酵素がN末端His6タグ付酵素として過剰発現されるように実施した。プラスミドを、供給業者からの標準的なプロトコールにしたがって大腸菌BL21中に形質転換した。コロニーを、寒天プレートLB/カナマイシン(10g*L-1トリプトン、5g*L-1酵母抽出物、10g*L-1NaCl、20g*L-1寒天、50mg*L1カナマイシン)上で培養した。大腸菌BL21/HL-ADHの単一コロニーを、寒天プレートから取得し、それをLB/Kan(v.s. w/o寒天)中に接種し、37℃、170rpmで16h、一晩増殖させた。次いで、Zn2+(100mgL-1のZnCl2)を添加した、LB/Kan培地(50mgL-1)により構成された4つの大規模培養物(4x800mL)に、一晩培養物(それぞれ、15mL)を接種した。2h後にOD600をチェックしたところ、0.7よりわずかに高いことがわかった。次いで、培養物をIPTG(最終濃度0.5mM)で誘導した。培養物を20℃で24h、170rpmで振盪した。培養物を収獲し、遠心分離し、ペレットをNaClの水性溶液(5%w/w)で洗浄した。ペレットを凍結し、-20℃で保存した。
【０２２３】
1.1.2 ロドコッカス・ルーバーに由来するアルコールデヒドロゲナーゼ「A」(ADH-A)(配列番号9)
ロドコッカス・ルーバーに由来するADH-「A」の遺伝子を、pET-21aベクター中にクローニングした。クローニングを、酵素がC末端His6タグ付酵素として過剰発現されるように実施した。プラスミドを、供給業者からの標準的なプロトコールにしたがって大腸菌Tuner(DE3)中に形質転換した。コロニーを、寒天プレートLB/アンピシリン(100mgL-1)上で培養した。大腸菌BL21/ADH-「A」の単一コロニーを、寒天プレートから取得し、それをLB/Amp(10g*L-1トリプトン、5g*L-1酵母抽出物、10g*L-1NaCl、20g*L-1寒天、100mg*L1アンピシリン)中に接種し、37℃、170rpmで16h、一晩増殖させた。次いで、Zn2+(100mgL-1のZnCl2)を添加した、LB/Amp培地(100mgL-1)により構成された6つの大規模培養物(4x500mL)に、一晩培養物(それぞれ、10mL)を接種した。培養物を30℃および170rpmで24h増殖させた。次いで、培養物をIPTG(最終濃度2mM)で誘導し、20℃で24h、170rpmで振盪した。培養物を収獲し、遠心分離し、ペレットをNaClの水性溶液(5%w/w)で洗浄した。ペレットを凍結し、-20℃で保存した。
【０２２４】
1.1.3 ラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼ(LBv-ADH)(配列番号6)
調製を、Schlieben, N.H.ら、Journal of Molecular Biology, 2005, 349, (4), 801に開示されたように行った。
【０２２５】
1.1.4 アロマトレウム・アロマティカム(Aromatoleum aromaticum)に由来するアルコールデヒドロゲナーゼ(AA-ADH)(配列番号5)
調製を、H. W. Hoffken, Duong Minh, T. Friedrich, M. Breuer, B. Hauer, R. Reinhardt, R. Rabus, J. Heider, Biochemistry 2006, 45 82-93に開示されたように行った。
【０２２６】
1.2 還元ステップ(アミノ化)の酵素
例示される方法の還元的アミノ化ステップを、厳密にNADH依存的であるアミンデヒドロゲナーゼ(AmDH)によって実施する。これらの酵素は、ケトン(低級アルキル置換基を有する)ならびにアルデヒドを変換する。
【０２２７】
特に、2つのアミンデヒドロゲナーゼが用いられてきた。第1の酵素は、バチルス・バディウスに由来する野生型フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(Ph-AmDH)を起源とするK78S、N277L変異体である(EC 1.4.1.20 UniProt-ID: Q59224)。第2の酵素は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに由来する野生型ロイシンデヒドロゲナーゼ(L-AmDH)を起源とするK68S、E114V、N262L、V291C変異体である(EC 1.4.1.9、GenBank-ID: M22977)。
【０２２８】
両遺伝子を、化学的に特注合成し(Carlson, R.  Nat. Biotechnol., 2009, 27, 1091を参照)、それぞれの発現ベクター中にクローニングした。
【０２２９】
1.2.1 バチルス・バディウスに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(Ph-AmDH)を起源とするアミンデヒドロゲナーゼ変異体(配列番号2)
バチルス・バディウスに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを起源とするPh-AmDH変異体の遺伝子を、pET-28bベクター中にクローニングした。クローニングを、酵素がN末端His6タグ付酵素として過剰発現されるように実施した。プラスミドを、供給業者からの標準的なプロトコールにしたがって大腸菌BL21（DE3)中に形質転換した。コロニーを、寒天プレートLB/カナマイシン(50mgL-1)上で培養した。大腸菌BL21/Ph-AmDHの単一コロニーを、寒天プレートから取得し、それをLB/Kan(50mgL-1)中に接種し、37℃、170rpmで16h、一晩増殖させた。次いで、LB/Kan培地(50mgL-1)により構成された4つの大規模培養物(4x800mL)に、一晩培養物(それぞれ、15mL)を接種した。2h後にOD600をチェックしたところ、約0.7であることがわかった。次いで、培養物をIPTG(最終濃度0.5mM)で誘導し、20℃で24h、170rpmでさらに振盪した。培養物を収獲し、遠心分離し、ペレットをNaClの水性溶液(5%w/w)で洗浄した。ペレットを凍結し、-20℃で保存した。湿潤細胞の総量は15.2gであった。
【０２３０】
2つのNi2+カラム(5mL x2)を水(50mL)で洗浄し、2.4mL min-1の流量で溶解バッファー(10mMイミダゾール、pH8、50mM KH2PO4、300mM NaCl、50mL)で条件化した。AmDH変異体を含有する湿潤細胞(約9.2g)を、溶解バッファー(40mL、10mMイミダゾールバッファー、pH8、50mM KH2PO4、300mM NaCl)中に懸濁した。
【０２３１】
全細胞を、150rpm、20℃で30〜40分間振盪することにより、リゾチーム(1mg mL-1)で最初に破壊した。混合物を溶解バッファーで80mLまで希釈した。次いで、超音波処理(5min、振幅45%、パルスオン20s、パルスオフ40s)により、破壊を完了した。懸濁液を遠心分離(20000rpm、1h、4℃)し、上清を、最初は0.45μmフィルターを通して、次いで、0.20μmフィルターを通して濾過した。溶液を、予め条件化されたカラムにロードした(流量2mL min-1)。カラムを、2mL min-1の流量で洗浄バッファー(イミダゾール25mM、pH8、50mM KH2PO4、NaCl 300mM、75mL)を用いて洗浄した。次いで、カラムを、溶出バッファー1(5mL x 14画分、イミダゾール200mM、pH8、50mM KH2PO4、NaCl 300mM)で溶出させた。次いで、イミダゾールの濃度を、溶出バッファー2(7〜8mL x 5画分、イミダゾール350mM、pH8、50mM KH2PO4、NaCl 300mM)を用いて増大させた。BradfordアッセイならびにSDS-ゲルPAGEにより、AmDHが画分2から画分18まで溶出することが示された。SDS-ゲルPAGEにより、AmDHが高純度で得られることが示された(99%を超える)。
【０２３２】
精製された酵素溶液を、リン酸カリウムバッファー(8L、pH8、50mM)に対して一晩透析した。酵素は、40mLから9mLまで濃縮された。酵素濃度は53mg mL-1であった。得られたAmDHの最終量は従って、477mgであり、9.2gの湿潤細胞から得られ、1.9Lの培養物(最適化なし)と等しかった。
【０２３３】
1.2.2 ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼ(L-AmDH)を起源とするアミンデヒドロゲナーゼ変異体(配列番号4)
調製を、以下のように行った。
【０２３４】
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼを起源とするL-AmDH変異体の遺伝子を、pET-21aベクター中にクローニングした。クローニングを、酵素がC末端His6タグ付酵素として過剰発現されるように実施した。プラスミドを、供給業者からの標準的なプロトコールにしたがって大腸菌BL21(DE3)中に形質転換した。大腸菌BL21/L-AmDHの単一コロニーを、寒天プレート(LB-Amp)から取得し、それをLB/Amp培地(50mL、100mgL-1)中に接種し、37℃、170rpmで一晩増殖させた。次の日、4つの大規模培養物(4x800mL)に、一晩培養物(15mL)を接種した。OD600を2h後にチェックしたところ、0.7よりわずかに高いことがわかった。次いで、培養物をIPTG(0.5mM)で誘導し、20℃、170rpmで24h振盪した。培養物を収獲し、遠心分離し、培地を除去した。ペレットをNaClで洗浄した。
【０２３５】
5mLのNi2+カラムを、水(25mL)で洗浄し、3mL min-1の流量でイミダゾール溶解バッファー(10mMイミダゾール、pH8、50mM KH2PO4、300mM NaCl、25mL)で条件化した。
【０２３６】
L-AmDHを含有する湿潤ペレット(約6g)を、溶解バッファー(25mL、10mMイミダゾールバッファー、pH8、50mM KH2PO4、300mM NaCl)中に懸濁し、リゾチーム(1mg mL-1)を添加し、150rpm、20℃で30〜40分間振盪することによって破壊した。混合物を、溶解バッファーで50mLまで希釈した。次いで、超音波処理(5min、振幅45%、パルスオン20s、パルスオフ40s)により破壊を完了した。懸濁液を遠心分離(20000rpm、1h、4℃)し、上清を、最初に0.45μmフィルター、次いで、0.20μmフィルターを通して濾過した。溶液を、予め条件化されたカラム(流量2mL min-1)にロードした。カラムを、水(25mL)、次いで、洗浄バッファー(イミダゾール25mM、pH8、50mM KH2PO4、NaCl 300mM、75mL)で洗浄した。次いで、カラムを、溶出バッファー(3mL x 12画分、イミダゾール500mM、pH8、50mM KH2PO4、NaCl 300mM)で溶出した。BradfordアッセイならびにSDS-ゲルPAGEにより、L-AmDHが画分2から5まで溶出することが示された。また、SDS-ゲルPAGEにより、酵素が高度に精製された形態(99%を超える)で得られることも示された。
【０２３７】
精製された酵素溶液を、リン酸カリウムバッファー(8L、pH8、50mM)に対して一晩透析した。酵素は40mLから9mLまで濃縮された。酵素濃度は20mg mL-1であった。したがって、得られたL-AmDHの最終量は、180mgであり、6gの湿潤細胞から得られ、1.6Lの培養物(最適化なし)と等しかった。
【０２３８】
実施例２：アルコールのアミノ化のためのレドックス自給自足生体触媒カスケード
スキーム4に記載されるカスケードを実施した。
【０２３９】
【化５】
2017519525.tif 000009
【０２４０】
PrelogアルコールデヒドロゲナーゼADH-「A」と、アミンデヒドロゲナーゼPh-AmDHとを組み合わせる予備実験を実施した。ADH-「A」を、さらに精製することなく、触媒を過剰発現する大腸菌全細胞(約10mgの全細胞)の形態で用いた。AmDHを、精製された酵素(50または100μL、53mg mL-1)として用いた。AmDHを、以前に記載のように精製した。(S)-フェニル2-プロパノール(20mM)を、試験基質として用いた。反応を、以前に記載されたように調製された、アンモニア/塩化アンモニウムバッファー(1mL、240mM、pH9.6)中で実行した。触媒量のコファクターNAD+を用いた(1mM)。反応を、170rpmのオービタルシェーカー中、1日間、30℃で振盪した。KOH(100μL、10N)を添加した後、EtOAc(2x500μL)で抽出するワークアップを実施した。アミン生成物(R)-フェニル2-プロピルアミンが25%の変換率(わずか240mMの低いアンモニア濃度に留意されたい)、完全な化学選択性および光学的に純粋な形態(99%を超える鏡像体過剰率)で得られた。したがって、本発明者らは、2つの酵素カスケードの実現可能性を証明した。
【０２４１】
実施例３：Ph-AmDH N末端His6タグ付を用いるアミノ化のpH試験
酵素Ph-AmDH(バチルス・バディウスに由来するWTフェニルアラニンデヒドロゲナーゼに由来するAmDH変異体)を、異なるpHで、様々なバッファー系を用いてアミノ化について調査した(スキーム3)。
【０２４２】
【化６】
2017519525.tif 000010
【０２４３】
バッファーを、アンモニアおよびアンモニウム種によって構成させた。アンモニウム陽イオンに対する対抗陰イオンは、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩またはギ酸塩に由来するものであった。
【０２４４】
パラ-フルオロ-フェニル-アセトンを、試験基質として用いた(20mM)。この実験セットにおいて、NADHを、10%過剰の化学量論量で用いた(1.1当量、22mM)。
【０２４５】
バッファーを、蒸留水中のアンモニアの溶液(100mMのアンモニア濃度)から出発して調製した。初期のpHは約11.5であった。次いで、異なるイオン種を含み、異なるpHの様々なバッファー系を、このアンモニア溶液のアリコートを取得し、その後のアリコートの所与の酸(塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、ホウ酸、クエン酸、シュウ酸、ギ酸)の添加によりpHを異なる値に調整することによって調製した。調査されたpH範囲は、アンモニアと共に用いられた酸の性質に明らかに依存していた。例えば、塩化アンモニウムバッファー系は、pH8.2と初期pH約11.5の間に存在する。したがって、生体触媒還元的アミノ化を、塩化アンモニウムバッファー中でこのpH範囲で試験した。他のより弱い酸により、中性ならびに軽度に酸性のpHも試験することができる。
【０２４６】
結果を、図1にまとめる。選択されたバッファーの種類に関係なく、最も高い変換率は常に、8〜9のpHで観察された。試験した全てのバッファー系のうち、pH8.2〜8.7の塩化アンモニウムが、変換率に関して最良の結果を与えた。この理由から、pH8.7の塩化アンモニウムバッファーを、さらなる実験のためのバッファーとして開始時に選択した。
【０２４７】
生体アミノ化のための鏡像体過剰率も測定した。アミン生成物の鏡像体過剰率値(%)は、99%を超えていた(R)。
【０２４８】
実験の詳細：
特定のアンモニア/アンモニウムイオンバッファー(450μL)と、酵素溶液(50μL、20U、リン酸バッファーpH8中で保存、50mM)とを混合することによって、各試料を調製した。アンモニア/アンモニウムイオンバッファーのpHは、バッファー中のアンモニア/アンモニウムイオンの濃度が高いため、酵素溶液の添加の際に変化しなかった。NADHを、化学量論量(1.1当量、22mM、15.6mg mL-1)で使用し、アンモニアバッファー中に予め溶解した。基質パラ-フルオロ-フェニルアセトンを、最後に添加した(20mM、1.34μL)。反応物を150rpmでオービタルシェーカー中、30℃で38h振盪した。KOH(100μL、10N)を添加することにより反応を停止させ、EtOAc(2x300μL)で抽出し、GC-FIDにより分析した。
【０２４９】
アミンの鏡像体過剰率を、対応するアセトアミドへの誘導体化後にキラル相上でのGCにより分析した。無水酢酸(50mL)中に溶解した4-(N,N-ジメチルアミノ)ピリジン(3mg)を添加することにより、誘導体化を実施した。水で洗浄し、乾燥(MgSO4)した後、誘導体化された化合物の鏡像体過剰率を測定した。
【０２５０】
実施例４：様々な濃度のアンモニア/塩化アンモニウムバッファー中の触媒的NADHと共にPh-AmDHを用いる還元的アミノ化
試験基質パラ-フルオロ-フェニルアセトン(20mM)の還元的アミノ化を、様々なアンモニウム/アンモニア濃度の塩化アンモニウムバッファー(pH8.7)中で実行した(ここで、濃度は、溶液中に存在する遊離アンモニアおよびアンモニウム陽イオン種の合計を言う)。この実験セットにおいては、コファクターNADHを、触媒量(1mM)で使用し、それをグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)およびグルコースを用いて再利用した(スキーム4)。
【０２５１】
【化７】
2017519525.tif 000011
【０２５２】
反応を、pH8.7の以下の塩化アンモニウムバッファー：100mM - 200mM - 381mM - 566mM - 727mM - 893mM - 1293mM - 1695mMで実行した。反応を、30℃で16h実行した。結果を表1にまとめる。
【０２５３】
【表１】
2017519525.tif 000012
【０２５４】
パラ-フルオロ-フェニルアセトン(20mM)の生体触媒還元的アミノ化は、約700mMのアンモニア/アンモニウムを適用した場合、定量的変換(99.5を超える)をもたらした。コファクターNADHを、触媒量(1mM)で使用し、GDH/グルコースを用いて再利用した。アミン生成物の鏡像体過剰率は99%を超えていた(R)。
【０２５５】
実験の詳細：
触媒的NADH(1mM、0.76mg mL-1)、GDH(Codexis、5mg、未精製の凍結乾燥抽出物)およびグルコース(3当量、60mM、10.8mg mL-1)を含有する特定のアンモニア/塩化アンモニウムバッファー(450μL)を用いて、各試料を調製した。次いで、酵素溶液を添加した(50μL、20U、リン酸バッファーpH8中で保存、50mM)。アンモニア/塩化アンモニウムバッファーのpHは、バッファー中のアンモニウムの濃度が高いため、酵素溶液の添加の際に有意に変化しなかった。基質パラ-フルオロ-フェニルアセトンを最後に添加した(20mM、1.34μL)。反応物を、150rpmのオービタルシェーカー中、30℃で16h振盪した。KOH(100μL、10N)を添加することによって反応を停止させた。試料を、EtOAc(2x300μL)で抽出し、GC-FIDにより分析した。
【０２５６】
鏡像体過剰率を、以前に記載のように測定した。
【０２５７】
実施例５：塩化アンモニウム/アンモニアバッファー(pH8.7、727mM)を用いる還元的アミノ化のための時間試験
以前の実験セットにおいて、35倍過剰のアンモニア/アンモニウム種を適用した場合、パラ-フルオロ-フェニルアセトン(20mM)の生体触媒還元的アミノ化が16h以内に定量的変換をもたらすことが示された。このさらなる実験において、本発明者らは、同じ反応条件(pH8.7、727mMアンモニア/アンモニウム種、30℃)下で時間中のアミン生成物への基質の変換をモニタリングした。触媒的NADH(1mM)を、以前に記載のようにGDHおよびグルコースを用いて再利用した。
【０２５８】
【化８】
2017519525.tif 000013
【０２５９】
結果を、図2に記載する。これらの反応条件下で、定量的変換は12h後に達成された。アミン生成物の鏡像体過剰率は、99%を超えていた(R)。
【０２６０】
実験の詳細：
触媒的NADH(1mM、0.76mg mL-1)、GDH(Codexis、5mg、未精製の凍結乾燥抽出物)およびグルコース(3当量、60mM、10.8mg mL-1)を含有するアンモニア/塩化アンモニウムバッファー(450μL)を用いて、各試料を調製した。次いで、酵素溶液を添加した(50μL、20U、リン酸バッファーpH8中で保存、50mM)。酵素溶液の添加後、アンモニアとアンモニウム陽イオンの最終濃度は727mMであった。アンモニア/塩化アンモニウムバッファーのpHは、バッファー中のアンモニウムの濃度が高いため、酵素溶液の添加の際に有意に変化しなかった。基質パラ-フルオロ-フェニルアセトンを最後に添加した(20mM、1.34μL)。反応物を、150rpmのオービタルシェーカー中、30℃で振盪した。KOH(100μL、10N)を添加することによって反応を停止させた。試料を、EtOAc(2x300μL)で抽出し、GC-FIDにより分析した。
【０２６１】
鏡像体過剰率を、以前に記載のように測定した。
【０２６２】
実施例６：Ph-AmDHの基質範囲
ケトン基質のパネルの変換のためのPh-AmDHの基質範囲は、先行技術においては全く決定されていなかった。分光光度アッセイによってほんの少しの基質に関する初期反応速度が決定されているの過ぎない。したがって、Ph-AmDHによる触媒される生体触媒還元的アミノ化を、アリール-ならびにアルキル-ケトンを含む基質のパネルに対して調査した(図3)。
【０２６３】
基質濃度は20mMであった。アンモニア/塩化アンモニウムバッファー(pH8.7、727mM)を用いた。触媒的NADH(1mM)を、GDHおよびグルコースを用いて以前に記載のように再利用した。反応を、30℃で16h実施した。結果を、表2に報告する。
【０２６４】
【表２】
2017519525.tif 000014
【０２６５】
試験した基質は全て、アセトフェノンを除いて変換された。鏡像体過剰率を、基質1の変換について測定した。鏡像体過剰率は99%を超えていた(R)。
【０２６６】
実験の詳細：
触媒的NADH(1mM、0.76mg mL-1)、GDH(Codexis、5mg、未精製の凍結乾燥抽出物)およびグルコース(3当量、60mM、10.8mg mL-1)を含有するアンモニア/塩化アンモニウムバッファー(450μL)を用いて、各試料を調製した。次いで、酵素溶液を添加した(50μL、20U、リン酸バッファーpH8中で保存、50mM)。酵素溶液の添加後、アンモニアとアンモニウム陽イオンの最終濃度は727mMであった。アンモニア/塩化アンモニウムバッファーのpHは、バッファー中のアンモニウムの濃度が高いため、酵素溶液の添加の際に有意に変化しなかった。基質を最後に添加した(20mM)。反応物を、150rpmのオービタルシェーカー中、30℃で16h振盪した。KOH(100μL、10N)を添加することによって反応を停止させた。試料を、EtOAc(2x300μL)で抽出し、GC-FIDにより分析した。
【０２６７】
鏡像体過剰率を、以前に記載のように測定した。
【０２６８】
実施例７：立体反転によるアルコールの水素借用生体アミノ化
この実験セットにおいては、(S)-フェニル-2-プロパノール(20mM)のアミノ化を、アロマトレウム・アロマティカムに由来するPrelogアルコールデヒドロゲナーゼ(AA-ADH)と、Ph-AmDHとを組み合わせることによって実行した。Ph-AmDHは(R)-選択性であるため、生体アミノ化は全体として構成の反転と共に進行した。酵素を、その精製された形態で用いた。生体アミノ化を、pH8.7でアンモニア/塩化アンモニウムバッファー中で実行した。
【０２６９】
初期の実験を、(S)-フェニル-2-プロパノール(20mM)および1mM濃度(5mol%)の触媒的NAD+を用いて実施した。この第1の実験セットにおいて、アンモニア/塩化アンモニウムの濃度を、100mMから4860mMまで変化させて、30℃で24hの反応時間後に変換に対する影響を調査した。アンモニア/塩化アンモニウムバッファーを、以下の濃度：100mM - 200mM - 400mM - 1000mM -1500mM - 2000mM - 2500mM - 3000mM - 3500mM - 4000mM - 4680mMで用いた。結果を表3に報告する。
【０２７０】
【表３】
2017519525.tif 000015
【０２７１】
この第1の実験セットにおいて、24hの反応時間後に観察された最も高い変換率は87%であった。アミン生成物の鏡像体過剰率は99%を超えていた(R)。これを、2Mのアンモニア/塩化アンモニウムを用いて達成した。基質を、20mMの濃度で用いた。したがって、2Mのアンモニア/塩化アンモニウムバッファーを、さらなる実験のために用いた。
【０２７２】
第2の実験セットにおいては、アロマトレウム・アロマティカムに由来するPrelogアルコールデヒドロゲナーゼ(AA-ADH)と、Ph-AmDHとを組み合わせる(S)-フェニル-2-プロパノール(20mM)のアミノ化の変換率を、時間中にモニタリングした。様々な試料を、様々な時間で調製し、クエンチした：1h - 3h - 6h - 12h - 18h - 24h -48h - 終了(144h)。基質の濃度を20mMに保持したが、コファクターNAD+の濃度を変化させた：1mM - 0.5mM - 0.2mM - 0.1mM。これらの実験の結果を、表4ならびに図4、5、6および7に報告する。
【０２７３】
最終生成物の鏡像体過剰率は99%を超えていた(R)。
【０２７４】
【表４】
2017519525.tif 000016
【０２７５】
実験の詳細：
AA-ADHは、大腸菌中で過剰発現され、凍結未精製細胞抽出物としてBASFにより供給された。未精製細胞抽出物のアリコートを解凍し、遠心分離した。細胞破片を除去し、上清を、最初は脱塩カラムに通過させた。次いで、酵素溶液を、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製した。精製された酵素溶液を、PD10カラム中にロードし、保存バッファー(ZnSO4、0.1mMを含有するTris-HCl pH8、50mM)で溶出した。酵素溶液を濃縮し、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存した。
【０２７６】
N末端His6タグを担持するPh-AmDHを、大腸菌中で過剰発現させた。細胞破壊後、溶解物を遠心分離し、細胞破片を除去した。上清を濾過し、酵素溶液をNi2+アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。精製された酵素溶液を、リン酸バッファー(pH8、50mM)中で透析した。次いで、Ph-AmDHのN末端His6タグを、ビオチン化されたヒトトロンビン(GE Healthcare)を用いて切断した。残留トロンビンを、ストレプトアビジンアガロースビーズの添加、次いで、遠心分離および濾過により除去した。Ph-AmDHを、再度Ni2+アフィニティクロマトグラフィーを用いて切断されたHis6タグから分離した。最終酵素溶液を、リン酸バッファー(pH8、50mM)中で一晩透析し、濃縮し、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存した。
【０２７７】
それぞれの生体触媒によるアミノ化：触媒的NAD+(最終濃度1mM、0.76mg mL-1)を含有するアンモニア/塩化アンモニウムバッファー(430μL)を用いて、各試料を調製した。AA-ADH酵素溶液(Tris-HClバッファーpH8、50mM中の20μL、47mg mL-1)およびPh-AmDH溶液(リン酸バッファーpH8、50mM中で保存された50μL、20U)を添加した(塩化アンモニウムバッファーのpHは、バッファー中のアンモニア/アンモニウムイオンの濃度が高いため、酵素溶液の添加の際に有意に変化しなかった。溶液中のアンモニア/アンモニウムイオンの報告された濃度は、酵素溶液の添加のため希釈の効果を考慮に入れる)。基質を最後に添加した(20mM、1.34μL)。反応物を、150rpmのオービタルシェーカー中、30℃で24h振盪した。KOH(100μL、10N)を添加することによって反応を停止させた。試料を、EtOAc(2x300μL)で抽出し、GC-FIDにより分析した。
【０２７８】
同じプロトコールを、時間試験にも適用した。唯一の相違は、コファクターNAD+の濃度を変化させた(1mM、0.5mM、0.2mM、0.1mM)ことであった。
【０２７９】
鏡像体過剰率を、以前に記載のように決定した。
【０２８０】
実施例８：構成を保持したアルコールの水素借用生体アミノ化
この実験セットにおいては、(R)-フェニル-2-プロパノール(20mM)のアミノ化を、ラクトバチルス・ブレビスを起源とする抗Prelogアルコールデヒドロゲナーゼ変異体(LBv-ADH)と、Ph-AmDHとを組み合わせて実行した。Ph-AmDHは(R)-選択性であるため、生体アミノ化は全体として構成を保持しながら進行した。酵素を、その精製された形態で用いた。この生体アミノ化のための最初の試みを、以前に記載のようにpH8.7でアンモニア/塩化アンモニウムバッファー中で実行した。
【０２８１】
初期の実験を、(R)-フェニル-2-プロパノール(20mM)および1mM濃度(5mol%)の触媒的NAD+を用いて実施した。この第1の実験セットにおいて、アンモニア/塩化アンモニウムの濃度を、200mMから2500mMまで変化させて、30℃で24hの反応時間後に変換に対する影響を調査した。
【０２８２】
アンモニア/塩化アンモニウムバッファーを、以下の濃度： 200mM - 500mM - 1000mM -1500mM - 2000mM - 2500mMで用いた。結果を表5に報告する。
【０２８３】
【表５】
2017519525.tif 000017
【０２８４】
この第1の実験セットにおいては、24hの反応時間後に観察された最も高い変換率は、1.37%に過ぎなかった。事実、酵素沈降(おそらく、LBv-ADH)が、用いられた反応条件の下で生じた。
【０２８５】
アンモニウム種の存在下では8.5を超えるpHでLBv-ADHの安定性が低いため、本発明者らは、低い方のpHでこのカスケードを実施することを決定した。しかしながら、塩化アンモニウムバッファーの理論的な下側pH限界は、約8.2である。したがって、塩化アンモニウムバッファーのバッファー能力は、pH8.5では既に極端に低い。したがって、本発明者らは、このカスケードについてバッファーの種類を変更することを決定した。Ph-AmDHを用いる還元的アミノ化について試験されたバッファー系のうち(上記で報告されたもの)、最良のものはギ酸、シュウ酸、酢酸およびクエン酸であった。本発明者らは、pH約7で最も高いバッファー能力を示すため、バッファー系としてギ酸アンモニウムを選択した。さらに、シュウ酸、酢酸およびクエン酸はキレート剤として作用することができる。これは、Zn2+が本発明において用いられるアルコールデヒドロゲナーゼのための必須触媒イオンであるという事実のため、回避しなければならない。さらに、LBv-ADHは、その安定性にとって必須である配位したMg2+(すなわち、構造的Mg2+)を有する。さらに、外来性Mg2+も反応バッファー中に添加される。これは、精製中に野生型LB-ADHの安定性を増大させることが示された。
【０２８６】
Mg2+(1mM濃度のMgCl2六水和物として)を含有するHCOONH4/NH3バッファーを、この実験セットにおいて用いた。実験を、(R)-フェニル-2-プロパノール(20mM)および1mM濃度(5mol%)の触媒的NAD+を用いて実施した。pHを、7 - 7.5 - 8 - 8.5と変化させた。アンモニア/アンモニウムイオンの濃度を、0.5M - 1M - 2Mと変化させた。反応を、オービタルシェーカー上、30℃、180rpmで24h実行した。結果を表6に報告する。
【０２８７】
最終生成物の鏡像体過剰率は99%を超えていた(R)。
【０２８８】
【表６】
2017519525.tif 000018
【０２８９】
この実験セットにおいて、24h反応時間後に観察される最も高い変換率は93.80%であった。これを、pH8の2Mのアンモニア/ギ酸アンモニウムバッファーを用いて達成した。基質を、20mM濃度で用いた。
【０２９０】
実験の詳細：
LBv-ADHは、大腸菌中で過剰発現され、凍結未精製細胞抽出物としてBASFにより供給された。未精製細胞抽出物のアリコートを解凍し、遠心分離した。細胞破片を除去し、上清を、最初は脱塩カラムに通過させた。次いで、酵素溶液を、イオン交換クロマトグラフィー(IEC)およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製した。精製された酵素溶液を、PD10カラム中にロードし、保存バッファー(MgCl2 1mMおよびNAD+ 0.1mMを含有するTris-HCl pH8、50mM)で溶出した。酵素溶液を濃縮し、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存した。
【０２９１】
Ph-AmDHを以前に記載のように精製した。
【０２９２】
代表的な生体触媒によるアミノ化：触媒的NAD+(最終濃度1mM、0.76mg mL-1)を含有するアンモニア/ギ酸アンモニウムバッファー(425μL)を用いて、各試料を調製した。LBv-ADH酵素溶液(Tris-HClバッファーpH8、50mM中の25μL、38mg mL-1)およびPh-AmDH溶液(リン酸バッファーpH8、50mM中で保存された50μL、20U)を添加した(ギ酸アンモニウムバッファーのpHは、バッファー中のアンモニア/アンモニウムイオンの濃度が高いため、酵素溶液の添加の際に有意に変化しなかった。溶液中のアンモニア/アンモニウムイオンの報告された濃度は、酵素溶液の添加のため希釈の効果を考慮に入れる)。基質を最後に添加した(20mM、1.34μL)。反応物を、150rpmのオービタルシェーカー中、30℃で24h振盪した。KOH(100μL、10N)を添加することによって反応を停止させた。試料を、EtOAc(2x300μL)で抽出し、GC-FIDにより分析した。
【０２９３】
鏡像体過剰率を、以前に記載のように決定した。
【０２９４】
【表７】
2017519525.tif 000019
【０２９５】
本明細書に引用される文献は、参照により組み込まれる。
【図１】
2017519525.tif 000020
【図２】
2017519525.tif 000021
【図３】
2017519525.tif 000022
【図４】
2017519525.tif 000023
【図５】
2017519525.tif 000024
【図６】
2017519525.tif 000025
【図７】
2017519525.tif 000026
【図８】
2017519525.tif 000027
【図９】
2017519525.tif 000028
【配列表】
2017519525000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月13日(2016.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミンを調製する方法であって、
前記アミンが、一般式I：
(R1)(R2)HC-NH2(I)
(式中、R1及びR2は同一であるか又は異なり、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アルコキシアルキル又はアリールオキシアルキルから選択されるが、但し、R1及びR2は同時にHではなく、アリール部分は置換されていてもよい）
のものであり、
a)コファクターNAD(P)+及びアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)(E.C.1.1.1.x)の存在下で前記アミンの対応するアルコールを酵素的に酸化して、前記アルコールの対応するカルボニル化合物を形成させるが、コファクターNAD(P)+を還元してNAD(P)Hを形成させること；及び、同時に、
i)アンモニア又はアンモニア源、及び
ii)アミンデヒドロゲナーゼ(AmDH)
の存在下で前記カルボニル化合物を酵素的に還元して、所望のアミンを形成させるが、コファクターNAD(P)+をNAD(P)Hから再生させること；並びに、必要に応じて、
b)前記アミンを単離すること、
を含み、
前記AmDHがフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(Ph-AmDH)(E.C.1.4.1.20)の突然変異体又はロイシンデヒドロゲナーゼ(L-AmDH)(E.C.1.4.1.9)の突然変異体であり；
(1)配列番号１のアミノ酸配列を含むフェニルアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異体であって、二重突然変異K78S、N277Lを含み、配列番号１に対する少なくとも80％の配列同一性を有する、前記突然変異体、及び
(2)配列番号３のアミノ酸配列を含むロイシンデヒドロゲナーゼの突然変異体であって、4倍突然変異K68S、E114V、N262L、V291Cを含み、配列番号３に対する少なくとも80％の配列同一性を有する、前記突然変異体
から選択される、
前記方法。
【請求項２】
前記AmDHが、
a)フェニルアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異体であり、配列番号２、若しくは配列番号２のアミノ酸残基21〜400のアミノ酸配列を含む、又は
b)ロイシンアラニンデヒドロゲナーゼの突然変異体であり、配列番号４のアミノ酸配列を含む、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ADHが、
a)配列番号５のアミノ酸配列若しくは配列番号５に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むAA-ADH；
b)配列番号６のアミノ酸配列若しくは配列番号６に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLBv-ADH；
c)配列番号８のアミノ酸配列若しくは配列番号８に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むHL-ADH；
d)配列番号９のアミノ酸配列若しくは配列番号９に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むADH-A；又は
e)配列番号１０のアミノ酸配列若しくは配列番号１０に対する少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むADH-hT
から選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
水性又は水性有機性混合物反応媒体中で実施される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
単離された形態の必要な酵素セット、必要な酵素セットの少なくとも1つの酵素を発現する1つ以上の組換え微生物、又は必要な酵素セット若しくは必要な酵素セットの少なくとも1つの酵素を発現する1つ以上の微生物の細胞ホモジェネート若しくは細胞溶解物の存在下で実施される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
コファクターが化学量論未満の量で用いられる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
反応が過剰のアンモニア又は前記アンモニア源の存在下で実施される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
反応が9.6未満の範囲のpHで実施される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
反応が約8.0〜8.7の範囲のpHで実施される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
pHが金属キレート化特性を示さないバッファーによって制御される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
用いられる酵素がNAD(H)依存的である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、請求項１又は２に定義された少なくとも1つのADH及び少なくとも1つのAmDHのコード配列を担持する組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の少なくとも1つの発現ベクターを担持するか；又は少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、請求項１又は２に定義された少なくとも1つのADHのコード配列を含有する少なくとも1つの発現ベクターを担持し、且つ少なくとも1つの調節エレメントの制御下で、請求項１又は２に定義された少なくとも1つのAmDHのコード配列を担持し；且つ前記コードされた酵素を機能的に発現する、組換え微生物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法における、請求項１２記載の組換え発現ベクター又は請求項１３記載の組換え微生物の使用。
【請求項１５】
反応媒体中に、遊離又は固定形態で、請求項１３記載の少なくとも1つの組換え微生物、又は請求項１若しくは２に定義された少なくとも1つの酵素を含有する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の生体触媒による方法を実施するためのバイオリアクター。
【国際調査報告】
2017519525.tif 000029
2017519525.tif 000030
2017519525.tif 000031
2017519525.tif 000032
2017519525.tif 000033
2017519525.tif 000034