(57)【要約】本発明は一般的には核酸メチル化、特にＤＮＡ及びＲＮＡメチル化を評価するための方法に関する。より詳細には、本発明は、部分的にメチル化されたＤＮＡ又はＲＮＡのシトシンメチル化を改良された感度で定性的に又は定量的に評価する方法に関する。本発明の方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡメチル化変化により特徴付けられる状態の診断又は発生上の表現型のモニタリングを含むがこれらに限定されない応用範囲において有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、前記核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、前記方法が、
（ｉ）核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
患者における状態を診断する又はモニターするための方法であって、前記状態は対象の核酸標的のシトシンメチル化の調節により特徴付けられ、前記標的は部分的メチル化を受けた領域により特徴付けられ、前記方法が、
（ｉ）前記患者由来の核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）修飾された遺伝子の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む、方法。
【請求項３】
前記状態が新生物状態である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象の前記核酸標的がＤＮＡ若しくはＲＮＡ遺伝子又は遺伝子領域である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子領域がプロモーター領域である、請求項４又は請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が哺乳動物遺伝子である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子が大腸新生物マーカーである、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記大腸新生物マーカーが遺伝子ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、ＣＡＨＭ、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２であり、前記遺伝子は転写開始部位の５ｋｂ上流を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＫＺＦ１遺伝子のＣｈｒ７：５０３０４３２３〜５０３０４３４９、Ｃｈｒ７：５０３０３３００〜５０３０４９２３又はＣｈｒ７：５０３９９８６９〜５０４００７０２領域のうちの１つ又は複数のメチル化を検出することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤がメチル化されていないシトシン残基をウラシルへと修飾する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤が亜硫酸水素塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記亜硫酸水素塩が亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素アンモニウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーがメチル化特異的プライマーである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが加水分解プローブである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブが、一括して、前記領域の完全及び部分的メチル化パターンすべてにハイブリダイズする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、前記プライマーセットには
（ｉ）配列番号３及び配列番号４配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉ）配列番号４９〜６２及び配列番号６３〜７６配列若しくは実質的に類似した配列、又は
（ｉｉｉ）配列番号７７及び配列番号７８配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの１つ又は複数を含むプライマーが含まれる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、前記プローブセットには
（ｉ）配列番号５〜１２配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉ）配列番号１９配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉｉ）配列番号２０配列若しくは実質的に類似した配列、又は
（ｉｖ）配列番号２３〜３０配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの１つ又は複数を含むプローブが含まれる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、前記方法が配列番号１領域の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖を増幅させることを目的とし、前記プライマーセットには配列番号４７及び配列番号４８配列又は実質的に類似した配列のうちの１つ又は両方を含むプライマーが含まれる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、前記方法が配列番号１領域の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖を増幅させることを目的とし、前記プローブセットには、
（ｉ）配列番号２１配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉ）配列番号２２配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉｉ）配列番号３１〜３８配列若しくは実質的に類似した配列、及び／又は配列番号３９〜４６配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの１つ又は複数を含むプローブが含まれる、請求項１〜１７又は２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
対象の核酸標的の領域のシトシンメチル化を検出するための診断キットであって、
（ｉ）部分的シトシンメチル化を受けた前記核酸領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態のＤＮＡ形態であって、メチル化されていないシトシン残基が修飾されているＤＮＡ形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｉｉ）少なくとも２つの異なるメチル化パターンに一括してハイブリダイズすることができる、部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられた１つ又は複数のプローブ
を含む診断キット。
【請求項２３】
前記プライマーがメチル化特異的プライマーである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記プローブが加水分解プローブである、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記プローブが前記領域の完全及び部分的メチル化パターンのすべてに一括してハイブリダイズする、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記キットがメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤をさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
前記薬剤が亜硫酸水素塩である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記亜硫酸水素塩が亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素アンモニウムである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記キットがＤＮＡ増幅及び／又は検出を成し遂げる試薬をさらに含む、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
対象の前記核酸標的がＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、ＣＡＨＭ、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２のうちの１つ又は複数である、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
対象の前記核酸標的がＩＫＺＦ１である、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記プライマー及びプローブがＩＫＺＦ１遺伝子のＣｈｒ７：５０３０４３２３〜５０３０４３４９、Ｃｈｒ７：５０３０３３００〜５０３０４９２３又はＣｈｒ７：５０３９９８６９〜５０４００７０２領域のうちの１つ又は複数のメチル化を検出することを目的とする、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
プライマーセットが、
（ｉ）配列番号３及び配列番号４配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉ）配列番号４９〜６２及び配列番号６３〜７６配列若しくは実質的に類似した配列、又は
（ｉｉｉ）配列番号７７及び配列番号７８配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの１つ又は複数を含むプライマーを含む、請求項３１又は３２に記載のキット。
【請求項３４】
プローブセットが、
（ｉ）配列番号５〜１２配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉ）配列番号１９配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉｉ）配列番号２０配列若しくは実質的に類似した配列、又は
（ｉｖ）配列番号２３〜３０配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの１つ又は複数を含むプローブを含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、前記方法が配列番号１領域の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖を増幅させることを目的とし、前記プライマーセットには配列番号４７及び配列番号４８配列又は実質的に類似した配列のうちの１つ又は両方を含むプライマーが含まれる、請求項３１又は３２に記載のキット。
【請求項３６】
前記遺伝子がＩＫＺＦ１であり、前記方法が配列番号１領域の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖を増幅させることを目的とし、前記プローブセットには、
（ｉ）配列番号２１配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉ）配列番号２２配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉｉ）配列番号３１〜３８配列若しくは実質的に類似した配列、及び／又は配列番号３９〜４６配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの１つ又は複数を含むプローブが含まれる、請求項３１〜３２又は３５のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には核酸メチル化、特にＤＮＡ及びＲＮＡメチル化を評価するための方法に関する。より詳細には、本発明は、部分的にメチル化されたＤＮＡ又はＲＮＡのシトシンメチル化を改良された感度で定性的に又は定量的に評価する方法に関する。本発明の方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡメチル化変化により特徴付けられる状態の診断又は発生上の表現型のモニタリングを含むがこれらに限定されない応用範囲において有用である。
【背景技術】
【０００２】
任意の先行刊行物（又はその刊行物由来の情報）への、又は公知である任意の事柄への本明細書中での言及は、その先行刊行物（又はその刊行物由来の情報）又は公知の事柄が、本明細書が関係する努力分野の共通一般知識の一部を形成することを了承し若しくは認め又は何らかの形で示唆するものではないし、そう解釈するべきではない。
【０００３】
本明細書において筆者により言及される刊行物の文献詳細は本記述の最後にアルファベット順にまとめられている。
【０００４】
ＤＮＡメチル化は、哺乳動物において最も熱心に研究されているエピジェネティック修飾の１つであり、シトシン（Ｃ）又はアデニンヌクレオチドへのメチル（ＣＨ３）基の付加のことである。このメチル基は、シトシン塩基の５番目の炭素原子又はアデニン塩基の６番目の窒素原子に付加させることができる。
【０００５】
ＤＮＡメチル化は動物細胞において遺伝子調節に役割を果たしている。活性な遺伝子転写と低メチル化の間には相関があるだけではなく、トランスフェクション実験によればメチル部分の存在はｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現を阻害することも明らかにされている。さらに、遺伝子活性化は、強力な脱メチル化剤である５−アザシチジンを用いて細胞を処理することにより誘導することが可能である。メチル化は、クロマチンタンパク質と特定の転写因子の両方とＤＮＡの相互作用に影響を及ぼすことにより遺伝子発現に影響するように思われる。メチル化パターンは体細胞では非常に安定しているが、初期胚はＤＮＡメチル化の大きな変化によって特徴付けられる。
【０００６】
したがって、ＤＮＡメチル化は健康な増殖と発生にとって極めて重要であり、ゲノム刷り込み、発癌及び反復エレメントの抑制などの種々の過程に関連している。ＤＮＡメチル化は、宿主に入り込んでいて宿主を損傷する可能性のあるＤＮＡの他の潜在的に危険な配列と共に、レトロウイルス遺伝子の発現を抑制することもできる。さらに、ＤＮＡメチル化はがんの発生に重要な役割を果たしており、遺伝子転写の鍵となる制御因子である。研究によれば、高濃度の５−メチルシトシンを含有するプロモーター領域のある遺伝子は転写的にサイレントであることが明らかにされている。
【０００７】
全ＣｐＧの６０％〜９０％が哺乳動物ではメチル化されている。メチル化されたシトシン残基は時間をかけて自発的に脱アミノ化してＴ残基を形成し、したがって、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドは着実に脱アミノ化してＴｐＧジヌクレオチドになり、これはヒトゲノムにおけるＣｐＧジヌクレオチドが少ないことにより証明される（ＣｐＧジヌクレオチドは予想される頻度の２１％しか存在しない）。ＣｐＧはＣｐＧアイランドと呼ばれるクラスターにグループ化されていることが多く、このＣｐＧアイランドは典型的には多くの遺伝子の５’調節領域に存在している。
【０００８】
ＤＮＡメチル化レベルをモニターすることの診断的有用性の証拠が増えるに従って、ＤＮＡメチル化を確実に正確に評価するための手段はますます重要になってきている。現在、メチル化特異的ＰＣＲは亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ中でメチル化されたＤＮＡを検出するための一般的に使用されている方法である。この方法では、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、シトシンリン酸ジエステルグアニジン［ＣｐＧ］部位においてメチル化されたシトシン残基を調べる。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ  ＰＣＲは、メチル化されたＣｐＧ部位の調査のためにメチル化特異的プライマーに加えて、５’−３’加水分解プローブも使用して、それによって定量化を可能にするリアルタイムＰＣＲバリエーションである。
【０００９】
つい最近、ＲＮＡはメチル化されたシトシン残基、並びにメチル化されたアデニン残基を含有することも明らかにされた（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｊｉａ、２０１４；Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４１（１）：２１〜３３）。ＲＮＡ中のメチル化されたシトシンの生物学的役割は明らかではないが、メチル化されたシトシンはｍＲＮＡ中では豊富な修飾であり、それがＲＮＡエピジェネティックマーカーである可能性があることを示唆している。本発明に至った研究において、所与の遺伝子のメチル化パターンの変化を求めるスクリーニングに基づくいくつかの診断的適用という文脈では診断結果の正確さは、対象のＣｐＧリッチ標的領域にわたって部分的メチル化が存在する場合には著しく低下することが確定されている。これは一般的に使用されているメチル化特異的ＰＣＲが、すべての標的ＣｐＧ部位がメチル化されることを必要とするオリゴヌクレオチドに基づいている事実のせいである。例えば、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔなどのプローブベースの方法では、所与のメチル化されたＤＮＡ又はＲＮＡ標的が首尾よく検出されるためにはプローブがハイブリダイズするためにすべての調査されたＣｐＧ部位がメチル化されている必要がある。１つ又は複数のＣｐＧ部位がメチル化されていない場合、プローブは結合することができず、それによって得られる結果を歪め診断感度を著しく減少させる。例えば、本発明の一態様では、ＩＫＺＦ１遺伝子のプロモーター領域のメチル化は結腸直腸がん組織では高頻度で起きており、血液中に存在する無細胞ＤＮＡ中でメチル化されたＩＫＺＦ１  ＤＮＡが検出されると結腸直腸がんの存在が示されることが確定されている。しかし、さらなる研究では、ある種の結腸直腸がん患者は、すべての標的ＣｐＧ部位がメチル化されているわけではない循環している腫瘍由来ＩＫＺＦ１  ＤＮＡを含有していることが実証されている。したがって、ＩＫＺＦ１  ＤＮＡ内のメチル化されているＣｐＧ部位にまたがるように設計されている加水分解プローブなどのオリゴヌクレオチドでは、部分的にメチル化されているＩＫＺＦ１  ＤＮＡの検出は可能ではない。したがって、部分的にメチル化されているＩＫＺＦ１  ＤＮＡを有する結腸直腸がん患者は、結果的に陰性であると報告されることになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、ＤＮＡ又はＲＮＡメチル化の正確で感度の良い検出を可能にする改良された方法を開発し、それによって、新生物疾患の診断又はモニタリングなどのＤＮＡ又はＲＮＡメチル化分析のための適用感度を改良する必要性が存在する。さらなる研究では、偽陰性結果の問題は、対象の所与のＤＮＡ又はＲＮＡ領域内での少なくとも２つの異なるメチル化パターンを一括して検出するように設計されている１つ又は複数のプローブ及び／又はプライマーの使用によって減らす又は排除することが可能であることが確定された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書及びこれに続く特許請求の範囲において、文脈が他を要求しなければ、「含む(comprise)」、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などのその変形は、決められた整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を包含するが、他の任意の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を排除しないことを意味する。
【００１２】
本明細書で使用されるように、用語「に由来する」とは、特定の整数又は整数の群が明示されている種に由来しているが、必ずしも明示された供給源から直接入手したわけではないことを示していると解釈する。さらに、本明細書で使用されるように、単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎｄ）」、及び「それ（ｔｈｅ）」は文脈が他の方法で明確に指示していなければ、複数の参照対象を含む。
【００１３】
他の方法で定義されていなければ、本明細書で使用される専門及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００１４】
主題の明細書は、プログラムＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．５を使用して準備されたヌクレオチド配列情報を含有しており、本明細書の文献目録の後に提示されている。それぞれのヌクレオチド配列は、数字指標＜２１０＞とそれに続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２、等）により配列表において特定される。配列ごとの長さ、配列の種類（ＤＮＡ、等）及び供給源生物は、それぞれ数字指標分野＜２１１＞、＜２１２＞及び＜２１３＞で提供される情報により示される。明細書において言及されるヌクレオチド配列は、指標配列番号とそれに続く配列識別子（例えば、配列番号１、配列番号２、等）により特定される。明細書において言及される配列識別子は、配列表中の数字指標分野＜４００＞とそれに続く配列識別子（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２、等）で提供される情報と関連している。すなわち、明細書において詳述されている配列番号１は配列表中の＜４００＞１として示される配列に関連している。
【００１５】
本発明の一態様は、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
【００１６】
別の態様では、本発明は、対象のＤＮＡ又はＲＮＡ標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、そのＤＮＡ又はＲＮＡ標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）ＤＮＡ又はＲＮＡ試料をメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
【００１７】
さらに別の態様では、遺伝子標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その遺伝子標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された遺伝子領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、前記遺伝子標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００１８】
さらに別の態様では、遺伝子ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、ＣＡＨＭ、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その遺伝子は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）ＤＮＡ試料をメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を
（ａ）修飾された遺伝子の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、前記遺伝子に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００１９】
さらに別の態様では、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を亜硫酸水素塩薬剤に接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記ＤＮＡ標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００２０】
さらに別の態様では、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００２１】
さらなる態様では、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を亜硫酸水素塩薬剤に接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数の加水分解プローブであって、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズする加水分解プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の試料を増幅させ、対象の前記ＤＮＡ標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００２２】
別のさらなる態様では、本発明は、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の完全及び部分的メチル化パターンすべてにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
【００２３】
さらに別の態様では、遺伝子標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その遺伝子標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）ＤＮＡ試料を亜硫酸水素ナトリムに接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を
（ａ）修飾された遺伝子の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数の加水分解プローブであって、一括して、前記領域の少なくとも２つの領域の異なるメチル化パターンにハイブリダイズする加水分解プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記ＤＮＡ標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、患者における状態を診断する又はモニターするための方法であって、上記状態はＤＮＡ又はＲＮＡ標的のシトシンメチル化の調節により特徴付けられ、そのＤＮＡ又はＲＮＡ標的は部分的メチル化を受けた領域により特徴付けられ、
（ｉ）前記患者由来の核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の試料を
（ａ）修飾された遺伝子の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１のＡは、Ｃｈｒ７：５０３０４２７１〜５０３０４３６５に属する部分的にメチル化された形態の標的ＩＫＺＦ１領域の例を提供する図である。トップライン：基準となる、完全にメチル化されたＩＺＫＦ１標的配列（亜硫酸水素塩変換及びＰＣＲ増幅後）、メチル化されたシトシンは赤色で強調されている。フォワードプライマー（配列番号３）、リバースプライマー（配列番号４）及び３つの完全にメチル化されたＣｐＧ部位を必要とするプローブの位置が示されている。同定された部分的にメチル化された標的配列は緑色のＴで下に示されている。図１のＢは、ＩＫＺＦ１メチル化特異的ＰＣＲ（メチル化特異的プライマー）を使用して、３つの臨床血漿試料から抽出した亜硫酸水素塩変換ＤＮＡにおいて同定されたＩＫＺＦ１試料配列トレースの表示する図である。３つのトレースは完全にメチル化されたＩＫＺＦ１（左パネル）、まったくメチル化されていないＩＫＺＦ１（中央パネル）及び部分的にメチル化されたＩＫＺＦ１（右パネル）の存在を例証している。ピークは検出される塩基についてカラーコード化されている（赤＝Ｔ、黒＝Ｇ、緑＝Ａ，青＝Ｃ）。プローブ下のメチル化されたＣＧ塩基の位置はそれらのピーク上の「ＣＧ」で示されており、亜硫酸水素塩変換及びＰＣＲ増幅後ＴＧに変換するメチル化されていないＣＧは「ＴＧ」と示されている。
【図２−１】亜硫酸水素塩変換及びそれに続くＰＣＲ増幅を詳述しているフローチャートである。
【図２−２】亜硫酸水素塩変換及びそれに続くＰＣＲ増幅を詳述しているフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、一括して、対象のＤＮＡ領域の少なくとも２つの、しかし好ましくはすべての潜在的メチル化パターンにハイブリダイズするように設計されている１つ又は複数の検出プローブ又はプライマーを用いる増幅反応が設計されている場合には、部分的シトシンメチル化を示すＤＮＡ又はＲＮＡ試料の定量的ＰＣＲメチル化分析の感度を著しく改善することが可能であると確定されたことに一部基づいている。この方法の開発が必要になったのは、驚くべきことに、プローブ又はプライマーは他の点では高レベルの配列類似性を示すという事実にもかかわらず、対象のメチル化されたＤＮＡ領域に向けられた加水分解プローブ及びプライマーは増幅され亜硫酸水素塩変換され完全にメチル化された形態のＤＮＡのみにハイブリダイズし、増幅され亜硫酸水素塩変換され部分的にメチル化された形態のＤＮＡにはハイブリダイズしないという事実のせいで、部分的メチル化が存在すれば定量的ＰＣＲベースのメチル化検出アッセイの感度が著しく低下すると確定されたためであった。実際、いくつかの診断アッセイは、部分的にメチル化された形態のＤＮＡを検出するのは診断アッセイの特異性を不明瞭にすると考えられていたという見解を考慮して、完全にメチル化された形態のＤＮＡのみを検出するように今日まで設計された。しかし、結腸直腸がんマーカーのＩＫＺＦ１などのいくつかの診断メチル化遺伝子マーカーは実際、部分的にメチル化された形態を示すことが現在では確定されている。そのような形態は従来の定量的ＰＣＲ技術では検出されず、そのような形態の割合が多くて、先行技術を使用して得られる結果は感度が低下する可能性がある。
【００２７】
本発明の方法の開発により、以前は達成可能であった有意に高い感度を示すメチル化特異的増幅アッセイのルーチンな適用が今や可能になった。さらに具体的には、対象の領域の潜在的な部分的メチル化パターンの範囲に向けられるプローブ若しくはプライマーの異種プールを使用すれば、又は２つ若しくはそれよりも多い異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができるという点でそのハイブリダイゼーション機能性が無差別であるプローブ若しくはプライマーを使用すれば、試料中に存在する増幅され完全に及び部分的にメチル化されたＤＮＡ又はＲＮＡの両方を効率的に検出し、それによって試験の感度を改善することが可能であることが確定された。がん診断という文脈では、偽陰性結果は、部分的メチル化を検出することができない先行技術の方法の使用から生じるがこれは、患者に極めて深刻な結果をもたらすことがある。したがって、本発明の方法は、ＤＮＡメチル化を評価する場合、高レベルの感度を保証する簡単であるが頑強な手段を提供する。
【００２８】
したがって、本発明の一態様は、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
【００２９】
「対象の核酸標的」への言及は、そのメチル化状態を分析しようとしているＤＮＡ又はＲＮＡの任意の領域又は形態への言及と理解するべきである。これは、例えば、遺伝子、遺伝子の一部、遺伝子間領域又はプロモーターであってよい。この目的に向けて、「遺伝子」への言及は、それが完全長タンパク質であれタンパク質断片であれ、タンパク質産物をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子への言及として理解するべきである。しかし、同定されてはいるが、必ずしもタンパク質産物を産生するとは知られていない遺伝子がいくつか存在することは理解するべきである。したがって、本明細書での「遺伝子」への言及は、両方の種類の遺伝子への言及を含むと理解されるべきである。ゲノムＤＮＡ又はそこから転写されるＲＮＡに関しては、遺伝子は一般的に、イントロン領域とエキソン領域の両方を含むと予想される。対象の主題の核酸領域は、任意の特定の遺伝子と関連があるとは知られていないゲノムＤＮＡの一部であってもよい（一般に「ジャンク」と呼ばれるＤＮＡ領域などの）。対象の核酸標的は、ゲノムＤＮＡの２領域又はゲノムＤＮＡの１領域とウイルス又は導入された配列などの外来ＤＮＡの領域の間での組合せにより生成されるゲノムＤＮＡ（又はＲＮＡ転写産物）の任意の領域であってもよい。分析の対象であるＤＮＡは必ずしもゲノムＤＮＡでなくてもよいが、ｃＤＮＡなどの組換え的に発現されるＤＮＡはメチル化されないことは一般に理解されている。それにもかかわらず、本発明はメチル化することができるいかなる供給源又は形態のＤＮＡ又はＲＮＡの分析にも及ぶと理解するべきである。例えば、ＲＮＡに関しては、一次ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、非コードＲＮＡ又はウイルスＲＮＡを分析することがある。
【００３０】
したがって、本発明はより詳細には、対象のＤＮＡ又はＲＮＡ標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、そのＤＮＡ又はＲＮＡ標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）ＤＮＡ又はＲＮＡ試料をメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
【００３１】
本発明をいかなる一つの理論又は作用様式にも限定せずに、ＲＮＡメチル化はｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、非コードＲＮＡ及びウイルスＲＮＡを含む多くの異なるＲＮＡ種において起こる。種々のＲＮＡメチルトランスフェラーゼによるＲＮＡメチル化では異なる触媒戦略が用いられる。翻訳後修飾として、ＲＮＡメチル化はエピジェネティック機構において重要な役割を果たしている。Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）は真核生物に存在するＲＮＡ分子中で最も一般的で大量にあるメチル化修飾であるが、５−メチルシトシン（５−ｍＣ）も種々のＲＮＡ分子中に一般的に存在する。最近のデータによれば、ｍ６Ａ及び５−ｍＣ  ＲＮＡメチル化は、ＲＮＡ安定性及びｍＲＮＡ翻訳などの種々の生物学的過程の調節に影響を及ぼし、異常なＲＮＡメチル化はヒト疾患の原因の一因となることが示唆されている。ＲＮＡ中のメチル化されたシトシンの生物学的役割は完全には理解されていないが、メチル化されたシトシンはｍＲＮＡ中では大量にある修飾である。
【００３２】
それでも本発明を決して限定することなく、ＤＮＡメチル化は細菌、植物、及び動物で普遍的である。ＤＮＡメチル化は、細胞分裂の繰り返しを通して安定しているＤＮＡの一種の化学修飾であるが生物の根底にあるＤＮＡ配列の変化を伴わない。クロマチン及びＤＮＡ修飾はエピジェネティクスにおける２つの重要な特長であり、細胞分化の過程で役割を果たしており、細胞が同じゲノム材料を含有しているにもかかわらず異なる特徴を安定的に維持することを可能にしている。真核生物では、ＤＮＡメチル化はシトシンピリミジン環の番号５炭素でのみ起こる。哺乳動物では、ＤＮＡメチル化は大半がＣｐＧジヌクレオチドのシトシンの番号５炭素で起こる。ＣｐＧジヌクレオチドはヒトゲノムのおおよそ１％を占める。
【００３３】
全ＣｐＧの７０〜８０％はメチル化されている。ＣｐＧは、典型的には多くの遺伝子の調節領域の５’−末端に存在している「ＣｐＧアイランド」と呼ばれるクラスターでグループ化されていることがある。がんなどの多くの疾患過程では、遺伝子プロモーター及び／又はＣｐＧアイランドは異常な過剰メチル化を獲得し、これは遺伝性転写サイレンシングと関連している。ＤＮＡメチル化は２つの方法で遺伝子の転写に影響することがある。第１に、ＤＮＡのメチル化それ自体が転写タンパク質の遺伝子への結合を物理的に妨害し、こうして転写を遮断することがある。第２に、メチル化されたＤＮＡにはメチル−ＣｐＧ−結合ドメインタンパク質（ＭＢＤ）として知られるタンパク質が結合できる。次に、ＭＢＤタンパク質は、ヒストンデアセチラーゼ及びヒストンを修飾することが可能な他のクロマチンリモデリングタンパク質などの追加のタンパク質を遺伝子座に動員し、それによってサイレントクロマチンと名付けられた緻密で不活性なクロマチンを形成する。ＤＮＡメチル化とクロマチン構造の間のこの関連は非常に重要である。特に、メチル−ＣｐＧ−結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の消失はレット症候群と関連付けられており、メチル−ＣｐＧ−結合ドメインタンパク質２（ＭＢＤ２）はがんにおいて過剰メチル化遺伝子の転写サイレンシングを媒介する。
【００３４】
ヒトでは、ＤＮＡメチル化の過程は３つの酵素、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１、３ａ及び３ｂ（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ）により実行される。ＤＮＭＴ３ａ及びＤＮＭＴ３ｂは発生初期におけるＤＮＡメチル化パターンを樹立する新規のメチルトランスフェラーゼだと考えられている。ＤＮＭＴ１は、ＤＮＡ複製中にＤＮＡメチル化パターンを娘鎖にコピーする原因である提唱されているメンテナンスメチルトランスフェラーゼである。ＤＮＭＴ３Ｌは、その他のＤＮＭＴ３と相同であるが触媒活性がないタンパク質である。代わりに、ＤＮＭＴ３Ｌは、新規のメチルトランスフェラーゼを、ＤＮＡに結合するその能力を増加させその活性を刺激することにより支援する。最後に、ＤＮＭＴ２は「謎の」ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ相同体として同定されており、すべてのＤＮＡメチルトランスフェラーゼに共通の１０の配列モチーフすべてを含有しているが、ＤＮＭＴ２はＤＮＡをメチル化することはなく、代わりに小型ＲＮＡをメチル化することが明らかにされている。
【００３５】
したがって、用語「メチル化」は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の作用により核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡの領域中のシトシン又はアデノシン塩基に付加されるメチル基の存在を意味すると理解されるべきである。
【００３６】
一実施形態では、対象の前記核酸標的はＤＮＡ若しくはＲＮＡ遺伝子又はプロモーター領域などの遺伝子領域である。したがって、「遺伝子標的」への言及は、それに関してメチル化を調べることになっている遺伝子又は遺伝子の領域への言及として理解されるべきである。
【００３７】
「遺伝子の領域」への言及は、遺伝子の一部に対応しているが全遺伝子には対応していないＤＮＡ又はＲＮＡの任意の一続きへの言及として理解されるべきである。例えば、本発明の方法により分析されるＤＮＡは、その単離中などに、断片化されていてもよく、又は本発明の方法による分析に先立って予備ステップとして切断されていてもよい。例えば、ＧｌａＩはＩＫＺＦ１がメチル化されていれば、特定の部位で切断される。次に、生じたＧｌａＩ断片は適切なプライマーとメチル化を評価するのに使用する本発明の縮重プローブを使用して増幅することが可能である。
【００３８】
この実施形態に従って、遺伝子標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その遺伝子標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ＤＮＡの形態であるステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された遺伝子領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、前記遺伝子標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００３９】
別の実施形態では、前記遺伝子又は遺伝子領域は哺乳動物遺伝子又は遺伝子領域である。
【００４０】
さらなる実施形態では、前記遺伝子は大腸新生物マーカー、より詳細には、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＣＡＨＭ、ＧＲＡＳＰ、ＩＲＦ４、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２である。
【００４１】
これらの遺伝子は本明細書では遺伝子名とヒト染色体座標のセットの両方に言及することにより特定される。遺伝子名と染色体座標の両方は、当業者には周知であり、理解されていると考えられる。一般に、遺伝子は、それを介してその配列と染色体位置の両方を入手することが常に可能であるその名称に言及することにより、又はそれを介して遺伝子名とその配列の両方を入手することも常に可能であるその染色体座標に言及することにより常に特定することが可能である。
【００４２】
「遺伝子」への言及は、あらゆる形態のこれらの分子への及びその断片又はバリアントへの言及として理解されるべきである。当業者であれば認識すると考えられるように、一部の遺伝子は、個々の又は一塩基多型の間で対立遺伝子変異を示すことが知られている。そのような変異にはＳＮＰ、様々なサイズの挿入及び欠失並びにジヌクレオチド及びトリヌクレオチド繰り返しなどの単純な配列繰り返しが含まれる。変異には、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％配列同一性を共有する、すなわち、本明細書に記載される遺伝子と比べて、1つ又は複数の欠失、付加、置換、逆方向配列、等を有する同じ領域由来の核酸配列が含まれる。したがって、本発明は、実際の核酸配列間の小さな遺伝子変異が個体間に存在することがあるという事実にもかかわらず本診断適用に関して同じ結果を達成する変異にまで及ぶと理解するべきである。したがって、本発明は、他のいかなる突然変異、多形性の又は対立遺伝子変異からでも生じるあらゆる形態のＤＮＡ又はＲＮＡにまで及ぶと理解されるべきである。
【００４３】
上で詳述される遺伝子に対応するＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８染色体座標は以下の通りである。
(1)BCAT1:chr12:24810024-24949459
(2)IKZF1:chr7:50304083-50405100
(3)IRF4:chr6:391739-411443
(4)GRASP:chr12:52006945-52015889
(5)CAHM:chr6:163413065-163413950
(6)SOX21:chr13:94709625-94712135
(7)SLC6A15:chr12:84859488-84912829
(8)NPY:chr7:24284188-24291865
(9)ST8SIA1:chr12:22193391-22334714
(10)ZSCAN18:chr19:58083842-58098363
(11)COL4A2:chr13:110307284-110513026
(12)DLX5:chr7:97020390-97024831
(13)FGF5:chr4:80266588-80291017
(14)FOXF1:chr16:86510527-86514464
(15)FOXI2:chr10:127737274-127741186
(16)SDC2:chr8:96493654-96611809
【００４４】
これらの遺伝子への言及は、これらの遺伝子のそれぞれの転写開始部位の５ｋｂ上流を含むと理解されるべきである。本発明をいかなる一つの理論又は作用様式にも限定せずに、ＩＫＺＦ１は一般にｃｈｒ７：５０３０４７８２〜５０４０５１００（アセンブリーＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）にまたがると理解されている。これは転写開始部位からポリアデニル化部位まで続いている。しかし、ＩＫＺＦ１遺伝子はさらに５’転写開始部位を有しており、その座標はこの開始部位を含めて、Ｃｈｒ７：５０３０４０８３〜５０４０５１００である。上流ＣｐＧアイランドも含まれている場合には、座標は５０３０３３００〜５０４０５１００である。
【００４５】
今後より詳細に考察されるように、本発明の方法は１つの遺伝子のメチル化を求めてスクリーニングするのに適用することが可能である、そうでなければ本発明の方法は、最初の生体試料から別々のアリコートのＤＮＡ又はＲＮＡの増幅を介して、又は多重化増幅法を使用して増幅される単一アリコートという文脈で１つよりも多い遺伝子のメチル化を求めて所与の生体試料をスクリーニングするように構成することが可能である。
【００４６】
上文で詳述されたように、本発明の方法は、対象の部分的にメチル化されたＤＮＡ又はＲＮＡ標的を検出するための方法の開発に基づいている。「部分的メチル化」への言及は、そのＤＮＡ標的の完全にメチル化された形態で通常メチル化されている１つ又は複数のシトシンが部分的にメチル化された形態でメチル化されていないＣｐＧ含有ＤＮＡ標的への言及である。例えば、及び本発明の一実施形態では、Ｃｈｒ７：５０３０４３２３〜５０３０４３４９で完全にメチル化された形態の遺伝子ＩＫＺＦ１は
CCTGTAC mCGGAGCAG mCGATCmCGGGAGG
であり、ｍＣはメチル化されたシトシンを表し、Ｃはメチル化されていないシトシンを表す。
【００４７】
ＩＫＺＦ１  ＤＮＡ配列のこの領域の範囲の潜在的な部分的にメチル化された形態は、
CCTGTACCGGAGCAG mCGATCmCGGGAGG   （配列番号８０）
CCTGTAC mCGGAGCAGCGATCmCGGGAGG   （配列番号８１）
CCTGTAC mCGGAGCAGmCGATCCGGGAGG   （配列番号８２）
CCTGTACCGGAGCAGCGATCmCGGGAGG    （配列番号８３）
CCTGTACCGGAGCAG mCGATCCGGGAGG   （配列番号８４）
CCTGTAC mCGGAGCAGCGATCCGGGAGG   （配列番号８５）
CCTGTACCGGAGCAGCGATCCGGGAGG      （配列番号８６）
である。
【００４８】
任意の所与の生体試料は、これら部分的にメチル化された形態のＩＫＺＦ１のすべて又は一部のみを含むことができることは理解されるべきである。さらに、ＩＫＺＦ１実施形態という文脈では、上に同定されている配列は、ＩＫＺＦ１遺伝子のＣｈｒ７：５０３０４３２３〜５０３０４３４９領域のこれら潜在的な部分的にメチル化された形態を表す。しかし、ＩＫＺＦ１遺伝子の他の領域が、ＩＫＺＦ１遺伝子に属する他のＣｐＧアイランド（ｃｈｒ７：５０３０３３００〜５０３０４９２３及びｃｈｒ７：５０３９９８６９〜５０４００７０２）などの部分的メチル化を示すことがあることも理解されるべきである。「部分的メチル化」に対応する意味は、任意の遺伝子、転写産物若しくは他のＤＮＡなどの対象の任意の標的又はｍＲＮＡなどのＲＮＡ標的に当てはまることは理解されるべきである。本発明の方法を実施することに関して、分析に選ばれるＤＮＡ又はＲＮＡの領域は部分的メチル化を示すＤＮＡ又はＲＮＡ標的の別個の領域をおそらく反映することは、当業者であれば認識すると考えられる。ＤＮＡ又はＲＮＡ標的の部分的メチル化を受けたすべての領域が必ず分析する必要があるというわけではない。
【００４９】
本発明の方法により調べられる核酸標的は、部分的メチル化を受けた領域により特徴付けることが「できる」核酸標的である。「できる（ｍａｙ）」への言及は、試験の対象である核酸試料が実際に部分的にメチル化された配列を含むこともあれば含まないこともあることを意味すると理解されるべきである。本発明をいかなる一つの理論又は作用様式にも限定せずに、所与の遺伝子が部分的にメチル化された変異を示すことがあるという事実は、分析されるすべての生体試料で１つ又は複数の部分的にメチル化された形態の存在を観察することになるという意味ではない。むしろ、部分的メチル化の存在及び程度は、分析されている試料の性質、問題の疾患状態の性質、病期の重症度等の要因に依拠することがある。しかし、問題の遺伝子の部分的にメチル化した形態が試験している核酸試料中に存在するのかどうかを当業者が必ずしも前もって決定しておく必要はない。むしろ、本発明の方法を任意の試料に適用するだけでよい。なぜならば、プローブが向けられる配列は公知であり、したがって、理論的に可能である部分的メチル化のすべての並べ替えにハイブリダイズするプローブのプールを作製することが可能だからである。試験されているＤＮＡ試料が実際に完全にメチル化されているのか部分的にメチル化されているのかの点では（及び存在する可能性がある部分的にメチル化された形態の範囲に関わらず）、十分なプライマー及びプローブ量が使用されている限り、ハイブリダイズしていない過剰なプライマー又はプローブの存在は、ハイブリダイズしており測定されるプライマー及びプローブから得られる結果に影響を与えることはない。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、ＤＮＡ標的はＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、ＣＡＨＭ、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２である。
【００５１】
この実施形態に従えば、遺伝子ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、ＣＡＨＭ、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その遺伝子は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）ＤＮＡ試料をメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を
（ａ）修飾された遺伝子の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、前記遺伝子に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００５２】
別の実施形態では、前記遺伝子はＩＫＺＦ１である。
【００５３】
本発明の方法に従って試験される核酸は生体試料から単離することができる。「生体試料」への言及は、細胞物質、生体液（例えば、血液、尿、唾液）、糞便、組織生検標本、摘出標本又は身体内に導入されその後取り除かれる液体（例えば、浣腸洗浄から回収される溶液などの）を含むがこれらに限定されない、動物、植物又は細菌などの任意の供給源由来の生体物質の任意の試料への言及として理解されるべきである。本発明の方法に従って試験される生体試料は、直接試験することもあるし、又は試験に先立ってある形態の処置を必要とすることもある。例えば、生検又は摘出試料は試験に先立ってホモジナイズする必要があることがある。代わりに、細胞試料は試験に先立って透過処理を必要とすることがある。さらに、生体試料が液体形態ではない限り、（試験においてそのような形態が必要とされる場合）試料を動員するために緩衝液などの試薬の添加が必要になることがある。
【００５４】
対象の核酸領域が生体試料中に存在している限り、生体試料は直接試験することもあるし、そうでなければ、生体試料中に存在する核酸のすべて又は一部を試験に先立って単離することもある。さらに別の例では、試料は分析に先立って部分的に精製する、或いは濃縮することができる。例えば、生体試料が極めて多様な細胞集団を含む限り、特定の対象のサブ集団について濃縮することが好ましいことがある。標的生体試料又はそれに由来する分子を試験に先立って処理する、例えば、生ウイルスの不活性化は本発明の範囲内である。生体試料は新たに収穫してもよいし、試験に先立って保存されていてもよく（例えば、凍結により）、或いは試験に先立って処理されてもよい（培養を受けることによるなどの）ことも理解されるべきである。
【００５５】
本明細書に開示される方法に従った試験にどのような種類の試料が最も適しているかの選択は、状況の性質に依拠することになる。大腸新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングしている限り、例えば、前記試料は、糞便（大便）試料、浣腸洗浄、摘出試料、組織生検又は血液試料（例えば、全血、血清又は血漿）であることが好ましい。
【００５６】
前記生体試料は血液試料、生検試料又は大便試料であるのがより好ましい。
【００５７】
本発明の方法は、増幅ベースの方法を介して、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸標的のシトシンメチル化特徴を正確に定性的に又は定量的に分析する手段を提供する。本発明の方法を適用することにより、任意の所与の生体試料中の部分的メチル化の潜在的存在のせいで、特に、増幅プライマー又は検出プローブは完全にメチル化された核酸配列にしかハイブリダイズすることはできず、対応する部分的にメチル化された配列にはハイブリダイズできないという事実により引き起こされる偽陰性結果を生み出すせいで、結果が歪められることはない。この方法を適用することに関して、増幅とプロービングの組合せによりＤＮＡ配列のメチル化を調べるように設計されている既存の増幅方法のいずれも、本発明の方法に従って構成することが可能なことは当業者であれば認識するはずである。例えば、メチル化特異的プライマー又は非メチル化特異的プライマーのどちらかを使用する増幅方法（ＰＣＲなどの）を設計することが可能である。例証された実施形態に従えば、メチル化特異的プライマーを使用する（例えば、メチル化特異的ＰＣＲ）。しかし、非メチル化特異的プライマーも使用することができるだろうが、この場合、メチル化調査はプローブの使用から得られる結果のみに頼ることになる。同様に、使用されるプローブに関しては、例証される実施形態はリアルタイムＰＣＲ定量化を達成することができる加水分解プローブを使用する。しかし、そのようなプローブが使用される場合でも、得られる読み出し情報を定性的に分析するのに十分な場合がある。代わりに、定性的読み出し情報を提供するだけで、定量的分析は可能にしないプローブを使用することを選択してもよい。
【００５８】
第１ステップでは、分析の対象である核酸試料はメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させる。本明細書で使用される用語「修飾する」とは、薬剤によるメチル化されていないシトシンの別のヌクレオチドへの変換を意味しており、前記変換は最初の核酸試料中でメチル化されていないシトシンとメチル化されたシトシンを区別する。いかなる適切な薬剤でも使用することができる。一実施形態では、薬剤は、亜硫酸水素ナトリウムなどのメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する薬剤である。しかし、メチル化されていないシトシンは選択的に修飾し、メチル化されたシトシンは修飾しない他の等価な修飾剤を本発明の方法において使用することが可能である。例えば、亜硫酸水素アンモニウムなどの他のいかなる適切な形態の亜硫酸水素塩でも使用することが可能である。亜硫酸水素ナトリウムはシトシンの５，６二重結合と容易に反応するがメチル化されたシトシンとは反応せず、スルホン化シトシン中間体を生成して、これがアルカリ性又は高温条件下で脱アミノ化を受けてウラシルを生成する。Ｔａｑポリメラーゼはウラシルをチミンとして５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）をシトシンとして認識するので、亜硫酸水素ナトリウム処理とＰＣＲ増幅の順次組合せにより、メチル化されていないシトシン残基からチミンへ（Ｃ→Ｕ→Ｔ）及びメチル化されたシトシン残基（「ｍＣ」）からシトシンへ（ｍＣ→ｍＣ→Ｃ）最終変換する。このように、ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理は、メチル化されていないシトシンのウラシルへの変換によりメチル化依存性配列違いを作り出す。ステップ（ｉ）の核酸へのプライマーのハイブリダイズに関して、プライマーは修飾された（例えば、亜硫酸水素塩変換）ＤＮＡ、又はそれから増幅されるＤＮＡにハイブリダイズするように設計されていることは理解されるべきである。
【００５９】
この実施形態に従えば、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を亜硫酸水素塩薬剤に接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００６０】
別の実施形態では、前記亜硫酸水素塩薬剤は亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素アンモニウムなどの亜硫酸水素塩である。
【００６１】
さらに別の実施形態では、前記核酸標的は遺伝子であり、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ若しくはＣＡＨＭ、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２であるのがより好ましい。
【００６２】
さらに別の実施形態では、前記核酸標的はゲノムＩＫＺＦ１  ＤＮＡである。メチル化されていないシトシン残基の変換が成し遂げられた後は、試料は増幅の準備ができている。分析の対象である核酸試料が、ゲノムＤＮＡ試料などのＤＮＡ試料である場合、増幅反応は直接的に亜硫酸水素塩変換試料上で実施することが可能である。しかし、対象の核酸試料がｍＲＮＡ試料などのＲＮＡ試料である場合、ＲＮＡはステップ（ｉｉ）の増幅に先立ってＤＮＡに変換することが必要である。これは、ＲＴ−ＰＣＲなどの当業者には周知と考えられるいかなる都合の良い方法によっても実行することが可能である。本発明をいかなる一つの理論又は作用様式にも限定せずに、これは「１ステップ」反応（例えば、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有するＴｔｈポリメラーゼを使用して）、又は逆転写酵素及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなどの２つの個別の酵素を使用する「２ステップ反応」で実行することが可能である。「１ステップ」反応という文脈では、それでもこの方法を２段階で実施できることは当業者であれば理解すると考えられる。一般に、逆転写ステップは室温で、その後通常のＰＣＲステップを実施することが可能である。この実施形態に従って、典型的には、問題のＲＮＡ試料を適切な相補的プライマー（複数可）に接触させる１つの方法であって、ランダムプライマー、逆転写酵素活性を有する酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸並びに相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するのに適した緩衝液及びインキュベーション条件を含むことができる方法を設計してもよい。したがって、「ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料」を接触させることへの言及は、ステップ（ｉｉ）において増幅を受ける核酸試料はＤＮＡ形態であるという事実への言及として理解されるべきである。この目的に向けて、ステップ（ｉ）の核酸が最初はＤＮＡ試料であり、ステップ（ｉｉ）において直ちに使用することができる場合でも、それにもかかわらず、増幅ステップ（ｉｉ）を適用することに先立って、試料を増幅し、それによってその量を増加させるのが望ましいことがあることは理解されるべきである。試料がＲＮＡである場合、ステップ（ｉｉ）増幅に先立って、試料はＲＴ−ＰＣＲなどのステップにかけられそのＲＮＡをＤＮＡ形態に変換することになる。
【００６３】
ステップ（ｉｉ）の増幅はいくつかの適切な技法のいずれか一つを使用して達成することが可能である。例えば、２つ又はそれよりも多い個別の遺伝子又はメチル化領域を標的とすることを目的とする１つよりも多い対のフォワード／リバースプライマーを使用する場合、これらのプライマーすべてを単一の試料に導入し、多重化増幅技法を使用して試料を増幅させることができる。代わりに、ステップ（ｉ）の試料を、それぞれのアリコートを別個の対のプライマーを使用して増幅させる１つよりも多いアリコートに分割することを選択できる。当業者であれば、１つのメチル化領域のみを増幅させることを目的とするが、複数のプライマーがネステッドＰＣＲ反応の適用を反映している場合には複数セットのプライマーを使用するようにこの方法を構成することを選択できることも理解されるべきである。
【００６４】
「プライマー」への言及は、ヌクレオチドの配列、又はその機能的誘導体若しくは類似体を含む任意の分子であって、その機能には対象のメチル化領域に隣接する相補的ＤＮＡ配列へのアニーリングとアニーリング領域の下流のＤＮＡ配列の増幅の両方が含まれる任意の分子への言及として理解されるべきである。プライマーは非核酸成分を含んでいてもよいことは理解されるべきである。例えば、プライマーは蛍光若しくは酵素タグなどの非核酸タグ又は分子の使用若しくは検出を促進する何か他の非核酸成分も含むことができる。別の例では、プライマーは核酸側鎖を示すペプチド骨格を含むタンパク質核酸であってもよい。前記プライマーは一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００６５】
本発明において使用するのに適したプライマーの設計及び合成は当業者には周知であると考えられる。一実施形態では、主題のプライマーは４〜６０ヌクレオチド長であり、別の実施形態では、１０〜５０ヌクレオチド長であり、さらに別の実施形態では、１５〜４５ヌクレオチド長であり、さらに別の実施形態では、２０〜４０ヌクレオチド長である。
【００６６】
本発明の方法において使用されるプライマーの数に関して、これは当業者が決定することが可能である。プライマーの総数に関して、検討が必要な変数は、増幅されている核酸領域のサイズ及び数並びにプライマーがハイブリダイズする配列間の距離である。約１ｋｂよりも大きなＰＣＲ断片を増幅するためには、プライマーは、ネステッドＰＣＲ法において機能しおおよそ５００塩基の間隔でハイブリダイズするように設計することが可能である。
【００６７】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸の相補鎖との配列特異的ハイブリダイゼーションが可能である線形一本鎖オリゴマーのデオキシリボ核酸又はリボ核酸分子である。プライマーはＤＮＡであることが好ましい。本発明のプライマーは、増幅過程中に重合化の特異的で効率的な開始（プライマー伸長）を提供するのに十分な長さである。正確な長さは温度（増幅中）、緩衝液、及びヌクレオチド組成を含む複数の要因に依拠することになる。プライマーは一本鎖であるが、先ず鎖が分離されるのであれば二本鎖プライマーを使用することができることが好ましい。プライマーは、当技術分野では一般に知られている従来のホスホトリエステラーゼ及びリン酸ジエステル法又は自動実施形態などの任意の適切な方法を使用して調製することができる。
【００６８】
本明細書で使用されるように、特異的プライマーは対象のゲノム核酸のそれぞれの鎖に実質的に相補的であるように設計されることが好ましい。典型的には、一プライマーは遺伝子座のマイナス（−）鎖（水平に置かれた二本鎖ＤＮＡ分子の「下の」鎖）に相補的であり、もう一方のプライマーはプラス（＋）鎖（「上の」鎖）に相補的である。本発明の方法は、対象の遺伝子標的のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの関連する領域を増幅するように設計することが可能であることを理解するべきである。これに関する例証は本明細書においてＩＫＺＦ１という文脈で提供される。
【００６９】
上文で詳述されたように、本発明の方法において利用されるプライマーは、対象の核酸標的を増幅する任意の適切なプライマーであってもよい。例えば、プライマーはメチル化特異的プライマーでも非メチル化特異的プライマーでもよい。「メチル化特異的」プライマーとは、亜硫酸水素塩変換メチル化対非メチル化ＤＮＡなどのメチル化されたＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを区別することが可能なプライマーを意味する。そのようなメチル化特異的プライマーは、例えば、非変換５−メチルシトシンのみとハイブリダイズする（すなわち、プライマーが亜硫酸水素塩変換メチル化ＤＮＡとハイブリダイズする）、又は逆に、メチル化されていないシトシンから変換されるチミンにハイブリダイズする（すなわち、プライマーが亜硫酸水素塩変換された非メチル化ＤＮＡとハイブリダイズする）ことにより、メチル化されたＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを区別するように設計することが可能である。それによって、メチル化は増幅を達成する特異的なプライマーの能力により決定される。当業者であれば認識すると考えられるように、メチル化特異的区別を達成するためには、プライマーはＤＮＡメチル化の潜在的部位（ＣｐＧジヌクレオチド）に重なり、メチル化されたＤＮＡから修飾された非メチル化ＤＮＡを特異的に区別するように設計されることが好ましい。例えば、プライマーは、１〜数ＣｐＧ配列、好ましくは、１〜５ＣｐＧ配列、又は１〜４ＣｐＧ配列に重なるように設計することができる。本明細書で例証されるＩＫＺＦ１増幅という文脈では、フォワード及びリバースプライマーはそれぞれが、ＩＫＺＦ１配列のうち４ＣｐＧジヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするように設計されている。一好ましい実施形態では、プライマーはメチル化特異的である。
【００７０】
したがって、「部分的シトシンメチル化を受けた領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計」されている前記プライマーへの言及は、プライマーが、メチル化された形態の対象領域のすべて又はごく一部のいずれかの増幅を可能にし、これらの増幅がその後プローブにより調べられることを意味すると理解されるべきである。プライマーが非メチル化特異的である場合、プライマーは任意の程度のメチル化が存在しているかどうかとは無関係に、すべての形態の対象領域を増幅させることになる。例えば、プライマーが、部分的シトシンメチル化を受けた領域の一部を形成するＣｐＧの上流及び下流に位置する非メチル化ＤＮＡ領域にハイブリダイズするように、プライマーを設計することができる。この状況では、プライマーは試料中に存在するすべての核酸分子のこの領域を増幅させることになる。なぜならば、プライマーは、メチル化されていないがシトシンのメチル化された領域に近位に位置するＤＮＡ部位にハイブリダイズするように設計されているからである。この場合、本方法のメチル化特異性はプローブによってのみ提供されることになり、プローブのプールが、完全に非メチル化形態の標的領域に向けられているプローブを確実に含まないようにすることが重要だと考えられる。別の実施形態では、プライマーのうちの１つ又は複数はメチル化特異的であり、完全にメチル化されている及び部分的メチル化を受けた領域の上流及び／又は下流にあるシトシン残基のうちの１つ又は複数にハイブリダイズするように設計されていてもよい。メチル化特異的プライマーを設計することにより、メチル化特異的増幅を達成することが可能である。さらに別の例では、プライマーのうちの１つ又は両方は部分的にメチル化された残基自体に向けることができる。この状況では、良好な感度を達成するために、無差別にハイブリダイズするプライマー、又はできる限り多くの異なる部分的にメチル化された形態のＤＮＡ標的にハイブリダイズし、その増殖を可能にするプライマーのプールを設計し、それによって特異性を改善することが望ましい。これは、例えば、多重化アッセイの適用という文脈において達成することができる。適切な無差別なプライマー又はプライマーのプールのいずれかの設計に関して、プローブ配列設計との関連でその後提供される説明はこれらのプライマーの設計にも適用可能であり、両方の分子は標的ＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計されているオリゴヌクレオチドである。
【００７１】
非メチル化特異的プライマーを使用する場合、利用するプローブのパネルには非メチル化ＤＮＡを検出するプローブが含まれないことが好ましいことは認識されると考えられる。本発明に従って設定され、対象の核酸領域について２つ又はそれよりも多いメチル化パターンを検出するが非メチル化ＤＮＡは検出しないプローブを設計することは十分に当業者の技能の範囲内である。使用されるプライマーがメチル化特異的である場合、設定されるプローブが対象の核酸標的の非メチル化形態に向けられているプローブを含むかどうかという問題はそれほど重大ではない。
【００７２】
この実施形態に従えば、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００７３】
別の実施形態では、対象の前記標的はＤＮＡ遺伝子標的であり、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、ＣＡＨＭ、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２であるほうがより好ましく、ＩＫＺＦ１であることが好ましい。
【００７４】
さらに別の実施形態では、メチル化されていないシトシン残基を修飾する前記薬剤は亜硫酸水素ナトリウムである。
【００７５】
本発明の方法により増幅されるＤＮＡ領域のサイズは、当業者が決定することが可能であり、プローブが結合しなければならない領域のサイズ及びプライマーが向けられるＣｐＧジヌクレオチドクラスターのＤＮＡ標的配列に沿った分布などの要因に依拠することになる。この目的びために、本発明の増幅法は、プローブがプライマー間のＤＮＡ配列領域（すなわち、プライマー間配列）に向けられており、したがって、増幅の結果として生成される増幅産物に選択的にハイブリダイズするように設計されている。
【００７６】
対象の標的に「向けられている」フォワード及びリバースプライマーへの言及は、プライマーが問題の標的のすべて又は一部のいずれかにハイブリダイズして増幅させることを意味すると理解されるべきであることを理解するべきである。例えば、対象の標的が遺伝子標的である場合、プライマーは、プロモーター領域のすべて又は一部などの遺伝子の比較的小さなセクションサブ領域にハイブリダイズして増幅させるように設計することができる。当業者であれば認識すると考えられるように、一般に、大きな増幅産物よりは比較的小さなサイズの増幅産物を作製して分析するのが望ましい。
【００７７】
上文で詳述したように、本発明の方法は部分的メチル化が存在するメチル化されたＤＮＡ標的を求めて定量的に（又は定性的に）スクリーニングする確実で正確な手段を提供する。これが可能になるのは、対象の所与の領域について潜在的な部分的メチル化パターンすべてを検出するように設計されているプローブ又はプローブのプールの設計及び適用のおかげである。この種のプローブの不均一なプールを使用すれば、スクリーニングされているＤＮＡ試料中に存在する部分的にメチル化された形態のＤＮＡの全範囲に確かに効果的にハイブリダイズし、その検出が可能になることがさらに確定されている。
【００７８】
したがって、「プローブ」への言及は、ヌクレオチドの配列、又はその機能的誘導体若しくは類似体を含む任意の分子であって、その機能には前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つの領域と標的核酸分子、特に潜在的な部分的メチル化を受けた領域とのハイブリダイゼーションが含まれる任意の分子への言及として理解されるべきである。核酸プローブは非核酸成分を含むことができる。具体的には、核酸プローブは、蛍光タグなどの検出手段又は分子の検出若しくは固定化などの分子の機能を促進する何か他の成分も含む。「検出手段」への言及は、プローブの検出を可能にする任意の手段の組込みへの言及として理解されるべきである。検出手段は定性的又は定量的検出を促進することができるが、定量的検出が特に有用である。検出手段はフルオロフォア又は放射性同位元素などの検出可能部分又は作用剤の形態をとることができる。代わりに、検出手段は、磁気ビーズ又はビオチン−ストレプトアビジン系を介してなどの、分析のための反応混合物からのプローブの物理的単離を可能にすることができる。
【００７９】
本発明をいかなる点でも限定せずに、個々のプローブ成分は、すべて同じ検出剤（例えば、フルオロフォア）で標識することが可能である、又はそれぞれのプローブ成分は異なる薬剤（例えば、異なる発光波長フルオロフォア）で標識することが可能である。開示されている例は、すべてのプローブ成分が同じフルオロフォアで標識されるように縮重プローブ混合物を使用し、したがって、結合する（８つの）縮重プローブのうちのいずれか１つ又は複数はリアルタイムＰＣＲにおいて陽性シグナルを発することになる。標的領域にわたる部分的メチル化の正確なレベルは調べてはいない。代わりのアプローチは、異なるフルオロフォアを（８つの）プローブのそれぞれに結合させ、検出された波長（複数可）に基づいてメチル化されている（又はされていない）塩基を区別することである。このアプローチは、例えば、部分的メチル化が初期がんの特長であり、完全メチル化が後期がんの特長であるならば、がん進行度分類のための情報価値があることになる。現在のリアルタイムＰＣＲ装置は６つの異なるフルオロフォアまで検出することが可能であるが、１つの試料中の複数の特長を調べるには他の技法が利用可能である（例えば、ビーズベースの蛍光ソーティング）。そのような場合、それぞれのプローブは独立して識別できるビーズに結合させることができるであろう。
【００８０】
例えば、本発明は、この実施形態を実施するために例えばＴａｑＭａｎ（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、７２７６〜７２８０、１９９１；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２１、３７６１〜３７６６、１９９３）などのリアルタイム定量的形態のＰＣＲの使用を包含する。例えば、Ｅａｄｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：Ｅ３２、２０００のＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法は、改変されたＴａｑＭａｎ加水分解−プローブアッセイを使用してＣｐＧジヌクレオチドのメチル化を検出する。基本的に、この方法は、核酸試料を亜硫酸水素塩で処理し、増幅反応、例えば、ＰＣＲを使用して、新生物細胞においてメチル化されているが対照試料においてはメチル化されていない１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸を増幅させることを含む。増幅反応は３つのオリゴヌクレオチド、対象の領域に隣接しているフォワード及びリバースプライマー並びに２つのプライマー間の１つ又は複数のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドの部位にハイブリダイズするプローブの存在下で実施される。プローブは５’蛍光レポーターと３’クエンチャーで二重に標識されている（又は、逆もまた同じである）。プローブが無傷のとき、クエンチャー色素はその近接のせいでレポーターの蛍光を吸収する。ＰＣＲ産物へのアニーリングに続いて、プローブは、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性により切断される。この切断によりレポーターがクエンチャーから放出され、それによって、蛍光シグナルが増加し、これを使用して最初のテンプレートメチル化レベルを評価することが可能である。突然変異していない核酸（すなわち、メチル化された核酸）に選択的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを使用することにより、メチル化レベルを、例えば、標準曲線を使用して決定する。
【００８１】
代わりに、切断を必要とする標識されたプローブを使用するのではなく、例えば、分子ビーコンなどのプローブが使用される（例えば、Ｍｈｌａｎｇａ  ａｎｄ  Ｍａｌｍｂｅｒｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４６３〜４７１、２００１参照）。分子ビーコンは、ステム−ループ構造を有する一本鎖核酸分子である。ループ構造は新生物試料においてはメチル化されているが対照試料ではメチル化されていない１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドを囲む領域に相補的である。ステム構造は、プローブ（ループ）のどちら側にもある互いに相補的な２つの「アーム」をアニールすることにより形成される。蛍光部分は１つのアームに結合しており、分子ビーコンが標的配列に結合していないときはいかなる検出可能な蛍光をも抑制するクエンチング部分はもう一方のアームに結合している。ループ領域がその標的核酸に結合すると、アームは分離されて蛍光が検出可能になる。しかし、わずか１つの塩基ミスマッチでもあれば試料中で検出される蛍光のレベルを著しく変えてしまう。したがって、特定の塩基の存在又は非存在は検出される蛍光のレベルによって決定される。そのようなアッセイは核酸中での１つ又は複数の突然変異していない部位（すなわち、メチル化されたヌクレオチド）の検出を促進する。
【００８２】
蛍光的に標識されたロックド核酸（ＬＮＡ）分子又は蛍光的に標識されたタンパク質核酸（ＰＮＡ）分子はヌクレオチド違いの検出に有用である（例えば、Ｓｉｍｅｏｎｏｖ  ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０（１７）：１〜５、２００２に記載されている）。ＬＮＡ及びＰＮＡ分子は、核酸、特に、ＤＮＡに高親和性で結合する。ＬＮＡ又はＰＮＡプローブにコンジュゲートされたフルオロフォア（特に、ローダミン又はヘキサクロロフルオレセイン）は、プローブが標的核酸にハイブリダイズすると著しく大きなレベルで蛍光を発する。しかし、蛍光の増加のレベルは、わずか１つのヌクレオチドミスマッチがあるときには同じレベルにまで増強されない。したがって、試料中で検出される蛍光の程度が、ＣｐＧジヌクレオチド中でのメチル化されたシトシンの存在下でなどの、ＬＮＡ又はＰＮＡプローブと標的核酸の間のミスマッチの存在を示す。蛍光的に標識されたＬＮＡ又はＰＮＡ技術を使用して、例えば、当技術分野で公知の及び／又は本明細書に記載される増幅法を使用して予め増幅されている核酸中での少なくとも一塩基変化を検出することが好ましい。
【００８３】
当業者には明らかになるように、ＬＮＡ又はＰＮＡ検出技術は、Ｏｒｕｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１８９８〜１９０５、１９９９に記載されている通りに、ＬＮＡ又はＰＮＡプローブを固体支持体に固定化することによる１つ又は複数のマーカーのハイスループットな検出に適している。
【００８４】
メチル化依存性配列違いは蛍光ベースの定量的ＰＣＲ（リアルタイム定量的ＰＣＲ、Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６〜９９４、１９９６；Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９９５〜１００１、１９９６）に基づく方法（例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」及び「Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）」技術）により検出されることが好ましい。ＴａｑＭａｎ（登録商標）及びＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）技術では、配列識別は２つのステップ：（１）増幅ステップ、又は（２）蛍光検出ステップのうちのいずれか又は両方で行うことが可能である。ＦＲＥＴハイブリダイゼーションの場合には、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）上のプローブフォーマット、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのうちのいずれか又は両方を使用すれば配列違いを識別することが可能である。本明細書のすべての発明の実施形態において用いられる増幅過程は、蛍光ベースのリアルタイム定量的ＰＣＲ（Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６〜９９４、１９９６）の増幅過程であり、二重標識された蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを使用して）を用いるのが最も好ましい。
【００８５】
一実施形態では、検出手段は蛍光レポーター分子であり、加水分解プローブであればより好ましい。「加水分解プローブ」への言及は、二重標識化ＴａｑＭａｎ（登録商標）オリゴヌクレオチドへの言及として理解されるべきである。本発明をいかなる一つの理論又は作用様式にも限定せずに、オリゴヌクレオチドの５’末端は蛍光レポーター分子で標識され、３’末端はクエンチャー分子で標識される。プローブの配列は増幅された標的分子中の対象の領域に特異的である。加水分解プローブは、配列の長さが５’フルオロフォアと３’クエンチャーを蛍光を抑制するくらいすぐ近位に置くように設計されている。
【００８６】
加水分解プローブは、ＰＣＲ増幅プライマーの結合部位間で対象の領域に結合するように設計されている。ＰＣＲサイクルの伸長期中、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲプライマーの下流で相補鎖を合成する。伸長が結合している加水分解プローブに到達すると、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が加水分解プローブを分解する。プローブの切断により蛍光レポーター分子とプローブの残り（及びしたがってクエンチャー）が分離され、レポーター分子を発光させる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは新生鎖の残りを合成し続け、したがって、プローブのハイブリダイゼーションはＰＣＲ反応を阻害しない。引き続くＰＣＲサイクルと共に、放出される蛍光レポーター、したがって、蛍光の量は累積的に増加する。適切なレポーター分子及びクエンチャー分子の例は、５’蛍光レポーター色素６ＦＡＭ（「ＦＡＭ」；２，７ジメトキシ−４，５−ジクロロ−５−カルボキシ−フルオレセイン）、及びＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）；並びに３’クエンチャー色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）である（Ｌｉｖａｋら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：３５７〜３６２、１９９５；Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９９５〜１００１、１９９６；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６〜９９４、１９９６）。
【００８７】
したがって、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を亜硫酸水素塩薬剤に接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数の加水分解プローブであって、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズする加水分解プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００８８】
一実施形態では、前記核酸はＤＮＡである。
【００８９】
別の実施形態では、前記亜硫酸水素塩薬剤は、亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素アンモニウムなどの亜硫酸水素塩である。
【００９０】
さらに別の実施形態では、前記ＤＮＡはＩＫＺＦ１遺伝子である。
【００９１】
本発明のプローブは、少なくとも２つの異なるメチル化パターンを示すＤＮＡ配列に1回の反応内でハイブリダイズできるように設計されている。例えば、プローブは完全にメチル化された配列に及び１つ又は複数の部分的にメチル化された配列にハイブリダイズすることができる。別の例では、プローブは、少なくとも２つの異なる部分的にメチル化された形態のＤＮＡ配列を検出することができる。本発明の方法が完全にメチル化された形態と部分的にメチル化された形態の両方を示すＤＮＡ標的のメチル化を検出する正確で再現性のある手段を提供することを目的とする限り、この検出方法は、部分的にメチル化された形態を示す、又は示すと考えられているＤＮＡ配列の１つの分離した領域にプローブを集中させるように設計されていることは理解されるべきである。しかし、当業者であれば、ＤＮＡ標的はＤＮＡ配列のうちプローブが標的とする領域以外の領域で部分的メチル化パターンも示すことがあることは理解すると考えられる。したがって、本方法は、ＤＮＡ標的の他のいかなる領域でもなく、プローブが向けられているＤＮＡ領域で部分的メチル化を検出し評価することに限定されていることは理解されるべきである。したがって、特定の遺伝子標的をスクリーニングしている限り、本発明の方法は、プローブが向けられている部位で部分的メチル化を示す遺伝子の部分的にメチル化された形態すべてを検出するように設計されている。しかし、対象遺伝子がその配列に沿って他の部位で部分的メチル化も示すことができる限り、これらの部分的にメチル化された形態は、プローブがこれらのメチル化部位に向けられていなければ検出されないことになる。しかし、潜在的に部分的メチル化を受けた１つよりも多い領域が対象である限りでは、これらの領域が増幅プライマー対間に位置している限り、本方法は複数のそのような領域に向けられているプローブの使用を含むように構成させることが可能であることも当業者であれば認識するであろう。
【００９２】
「前記領域の」少なくとも２つの「異なるメチル化パターン」にハイブリダイズする対象プローブ（複数可）への本明細書での言及は、本発明の方法において使用されるプローブはすべて同じＤＮＡ配列領域にハイブリダイズするように設計されていることを意味すると理解されるべきである。しかし、このＤＮＡ配列領域は、メチル化されているが、完全なメチル化又は一定範囲の部分的にメチル化された形態のいずれかを示すことがあり、これは「異なるメチル化パターン」又は「差次的メチル化」と呼ばれる。この領域に存在するメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドの数が増加するに従って、潜在的に異なる部分的にメチル化されたパターンの数は増加する。例えば、及び前述のように、Ｃｈｒ７：５０３０４３２３〜５０３０４３４９での完全にメチル化された形態のＩＫＺＦ１に加えて、６つの部分的にメチル化された形態及び完全に非メチル化形態を含め、増幅プライマー間に７つの異なるメチル化パターンが存在する。本発明の方法は、対象のＤＮＡ標的の差次的にメチル化された形態すべての検出を可能にするように設計されていたが、状況の環境に応じて、特定のＤＮＡ標的のすべてではなく一部の部分的メチル化形態のみを求めてスクリーニングを試みてもよい。例えば、２つの優勢な部分的にメチル化された形態が存在することが知られていれば、この２つのみを求めてのスクリーニングは診断精度を十分に改善することができる。この評価を行いプローブセットを適切に設計することは十分に当業者の技能の範囲内である。
【００９３】
したがって、別の実施形態では、本発明は、対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の試料を
（ａ）部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の完全及び部分的メチル化パターンすべてにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
【００９４】
一実施形態では、前記ＤＮＡ標的は遺伝子標的であり、ＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ４、ＧＲＡＳＰ、ＣＡＨＭ、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２であることが好ましく、ＩＫＺＦ１であることが好ましい。
【００９５】
別の実施形態では、前記薬剤は亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素アンモニウムなどの亜硫酸水素塩である。
【００９６】
さらに別の実施形態では、前記プライマーはメチル化特異的プライマーである。
【００９７】
さらに別の実施形態では、前記プローブは加水分解プローブである。
【００９８】
したがって、遺伝子標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、その遺伝子標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、
（ｉ）ＤＮＡ試料を亜硫酸水素ナトリムに接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ試料を
（ａ）修飾された遺伝子の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数の加水分解プローブであって、一括して、前記領域の少なくとも２つの領域の異なるメチル化パターンにハイブリダイズする、加水分解プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記ＤＮＡ標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
【００９９】
さらに別の実施形態では、前記遺伝子はＩＫＺＦ１であり、前記プライマーは配列：
配列番号３（フォワードプライマー）：Ｃｈｒ７：  ５０３０４２７１  ＧＡＣＧＡＣＧＴＡＴ  ＴＴＴＴＴＴＣＧＴＧ  ＴＴＴＣ  ５０３０４２９４
配列番号４（リバースプライマー）：Ｃｈｒ７：  ５０３０４３６５  ＧＣＧＣＡＣＣＴＣＴ  ＣＧＡＣＣＧ    ５０３０４３５０
又は実質的に類似した配列を含み、前記プローブは配列：
配列番号５:Chr7:50304323     TTTGTATCGG AGTAGCGATT CGGGAGG50304349
配列番号６:Chr7:50304323     TTTGTATCGG AGTAGCGATT TGGGAGG50304349
配列番号７:Chr7:50304323     TTTGTATCGG AGTAGTGATT CGGGAGG50304349
配列番号８:Chr7:50304323     TTTGTATTGG AGTAGCGATT CGGGAGG50304349
配列番号９:Chr7:50304323     TTTGTATCGG AGTAGTGATT TGGGAGG50304349
配列番号１０: Chr7:50304323   TTTGTATTGGAGTAGCGATT TGGGAGG 50304349
配列番号１１: Chr7:50304323   TTTGTATTGGAGTAGTGATT CGGGAGG 50304349
配列番号１２: Chr7:50304323   TTTGTATTGGAGTAGTGATT TGGGAGG 50304349
又は実質的に類似した配列を含む。
【０１００】
さらに別の実施形態では、前記プライマーは配列番号３及び配列番号４の配列又は実質的に類似した配列を含み、前記プローブは配列番号１９の配列又は実質的に類似した配列を含む。
【０１０１】
さらに別の実施形態では、前記プライマーは配列番号３及び配列番号４の配列又は実質的に類似した配列を含み、前記プローブは配列番号２０の配列又は実質的に類似した配列を含む。
【０１０２】
さらに別の実施形態では、前記メチル化特異的増幅アッセイは配列番号１の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖に向けられており、前記プローブは配列番号２１若しくは配列番号２２の配列又は実質的に類似した配列を含む。
【０１０３】
さらに別の実施形態では、前記プライマーは配列番号３及び配列番号４の配列又は実質的に類似した配列を含み、プローブセットは配列番号２３〜３０又は実質的に類似した配列のうちの１つ又は複数を含む。
【０１０４】
さらなる実施形態では、前記メチル化特異的増幅アッセイは配列番号１の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖に向けられており、前記プライマーセットには配列番号４７及び配列番号４８の配列を含むプライマーが含まれ、前記プローブセットは配列番号３１〜３８及び／又は配列番号３９〜４６の配列を含む。
【０１０５】
さらに別の実施形態では、前記プローブは、一括して、前記領域の完全及び部分的メチル化パターンすべてにハイブリダイズする。さらに別のさらなる実施形態では、前記プライマーセットには配列番号４９〜６２及び配列番号６３〜７６配列又は実質的に類似した配列のうちの１つ又は複数を含むプライマーが含まれる。
【０１０６】
さらに別の実施形態では、前記プライマーセットには配列番号７７及び配列番号７８配列又は実質的に類似した配列のうちの１つ又は複数を含むプライマーが含まれる。
【０１０７】
対象のプライマーは上に開示される配列に一致していてもよく、又は実質的に類似していてもよいことは理解されるべきである。代わりに、これらの配列又は実質的に類似した配列はもっと大きなプライマー分子内のサブ領域を表していてもよい。「実質的に類似した配列」への言及は、配列にある小さな違いを示すことがあるにもかかわらず、それが実質的に類似している配列と同じＤＮＡ標的を増幅するように機能する配列への言及として理解されるべきである。
【０１０８】
本発明をいかなる一つの理論又は作用様式にも限定せずに、ＩＫＺＦ１の以下のＤＮＡ領域：
配列番号１（ＩＫＺＦ１診断用領域−野生型ＤＮＡ）：
Chr7: 50304271 GACGACGCACCCTCTCCGTG TCCCGCTCTG CGCCCTTCTG CGCGCCCCGC
TCCCTGTACC GGAGCAGCGA TCCGGGAGGC GGCCGAGAGGTGCGC     50304365
という文脈では、以下のシトシンは結腸由来新生物ＤＮＡ（Ｃｈｒ７、ＧＲＣｈ３８／Ｈｇ３８座標）：５０３０４２７３、５０３０４２７６、５０３０４２８７、５０３０４２９４、５０３０４３０１、５０３０４３１１、５０３０４３１３、５０３０４３１８、５０３０４３３０、５０３０４３３８、５０３０４３４３、５０３０４３５０、５０３０４３５４、５０３０４３６３、５０３０４３６５において高頻度でメチル化されていることが確定されている。本発明のこの実施形態は、シトシン残基５０３０４３３０、５０３０４３３８及び５０３０４３４３上での部分的メチル化を求めてスクリーニングすることを目的とする。血漿から単離され回収された亜硫酸水素塩変換ＤＮＡにおけるＩＫＺＦ１遺伝子座のこれら３つのＣｐＧ部位にわたるメチル化の任意の組合せを検出することを使用すれば、結腸直腸がんに対する診断感度を高めることが可能である。この実施形態に従って、ＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理するとシトシンはウラシルに変換されるが、５’メチルシトシン残基は影響を受けないままである。その疾患特異的メチル化がシトシン残基５０３０４２７３、５０３０４２７６、５０３０４２８７、５０３０４２９４、５０３０４３５０、５０３０４３５４、５０３０４３６３及び５０３０４３６５すべてに必要とされる配列番号２に特異的にプライムするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーが設計される（配列番号３及び４）。３つのシトシン残基５０３０４３３０、５０３０４３３８及び５０３０４３４３のいずれか（又はいずれでもない）のメチル化は縮重加水分解プローブ混合物（配列番号５〜１２）（例えば、ＴａｑＭａｎ縮重プローブ混合物）を使用して検出される。
【０１０９】
本発明のプローブは、検出しようとしている部分的に及び完全にメチル化された配列の範囲に「選択的に」結合する。「選択的に」は、使用するために選択されるコホートのプローブが、個々に又は個々のプローブのハイブリダイゼーションの無差別性のおかげで、ＤＮＡ標的のうち検出しようとしている部分的にメチル化された形態の範囲に結合することができることを意味する。本発明をいかなる一つの理論又は作用様式にも限定せずに、プローブにより調べられることになるＤＮＡ領域の配列は、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドの位置のように、当業者には公知であろう。この配列情報に基づいて、及びＩＫＺＦ１との関連で前に例証されているように、考えられる完全及び部分的メチル化パターンの全領域を予測することが可能である。次に、それぞれが個々に独特なメチル化パターンに結合する又は無差別性を示して１つよりも多いメチル化パターンに結合することが可能なプローブを設計することができる。確定されてきたように、完全にメチル化された配列と部分的にメチル化された配列の間の違いがわずか１つのシトシン残基のメチル化の欠如である場合でも、完全にメチル化された配列に向けられたプローブは部分的にメチル化された配列には結合しない。しかし、不均一なプールのメチル化特異的プローブ又はメチル化されたシトシンと非メチル化シトシンの両方にわたって無差別に結合するように設計されているプローブのいずれかが増幅アッセイにおいて使用されるならば、対象の標的のメチル化に関連して正確な結果が得られることも確定されている。
【０１１０】
１つの特異的な完全に又は部分的にメチル化された配列パターンにハイブリダイズするように設計されているプローブは、当業者に周知である方法によって作製することが可能である。１つよりも多いメチル化パターンに結合することが可能である点で、無差別性を示すプローブとの関連では、この設計は当業者には公知であるいくつかの方法によって達成することも可能である。例えば、プローブ（５’−加水分解プローブなどの）中の１つ又は複数の塩基位置は独特ではないが２つの塩基、すなわち、シトシン又はチミジンの混合物である。１つのＣｐＧ部位のみがメチル化（又は非メチル化）について調べられるのであれば、そのような縮重オリゴヌクレオチドは２つの異なるオリゴヌクレオチド配列、例えば、−ａｔＣＧａｔ−及び−ａｔＴＧａｔ−の混合物であると考えられる。２つのＣｐＧ部位が調べられるのであれば、縮重オリゴヌクレオチドカクテルは４つの異なる配列の混合物になると考えられる。本明細書で提供されるＩＫＺＦ１例は、３つのＣｐＧ部位の部分的メチル化が、８つの異なるオリゴヌクレオチド配列（配列番号５〜１２）からなる縮重５’−加水分解オリゴヌクレオチドプローブ混合物を使用することにより調査される例である。混合物はＣｈｒ７座標５０３０４３３０、５０３０４３３８及び５０３０４３４３に属する３つのＣｐＧ部位内のメチル化の考えられる組合せすべてを検出することが可能である。この例はＩＫＺＦ１メチル化アッセイの診断感度を改善する。
【０１１１】
前で詳述したように、プローブは、ＴａｑＭａｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、Ｂｅａｃｏｎ、等などの検出プローブのいかなる変化でも可能である。プローブ混合物は、
（ｉ）１つの合成における８倍重複（合成中にＣとＴを混ぜることにより）；
（ｉｉ）３つの異なる２倍重複プローブ及び混合された；
（ｉｉｉ）１つの２倍及び１つの４倍重複プローブ及び混合された；又は
（ｉｖ）８つの異なる独特のプローブ及び混合された
として合成することができる（ＩＫＺＦ１例という文脈において）。
【０１１２】
プローブは、それぞれの調査されたＣ／Ｔ塩基に脱塩基スペーサー（例えば、５−ニトロ−インドール又は３−ニトロ−ピロール）を有する、又はそれぞれの調査されたＣ／Ｔ塩基にイノシンを有する単一配列でも可能である。１つ又は複数の脱塩基スペーサー（複数可）を含有する単一配列「無差別」プローブのアニーリング温度は１つだけであると考えられるが、脱塩基スペーサー（複数可）含有プローブの融解温度は、すべての調査されたＣｐＧ部位上のメチル化を検出するプローブよりも有意に低いと考えられる。したがって、脱塩基スペーサー（複数可）を有する無差別プローブは、メチル化されたＣｐＧ部位のみを標的とするプローブよりも有意に長い必要があると考えられる。イノシンはいかなる塩基とも塩基対合を可能にするが、優先度はＣ＞Ａ＞Ｇ＞Ｔの順である。この配列はプローブにとっての反対鎖にあるので、この場合プローブはＡ（＝Ｔ、メチル化されていない）又はＧ（＝Ｃ、メチル化された）にアニールすると考えられる。これらの選択肢は両方とも無差別なプローブほど特異的ではない。これらの選択肢は３位での４塩基のうちの１つへの対合を可能にするので、実際には６４倍縮重（対８倍）であり、したがって、プライマーのメチル化特異性により大きく依存する。脱塩基スペーサー又はイノシン含有プローブは、８つのオリゴヌクレオチド成分の混合物ではなく、単一オリゴヌクレオチド成分であるという利点がある。
【０１１３】
プローブはそれぞれの潜在的な部分的にメチル化されたＣ位置にピリミジン（Ｃ又はＴ）類似体も有することがある。例えば、類似体、６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オンはＧともＡとも（反対鎖中の２つの選択肢である）塩基対合する単一「塩基」である。ある研究によれば、前記類似物はＡ（＝Ｔ＝メチル化されていない）に対し６０％優先度、Ｇ（＝Ｃ＝メチル化されている）に対して４０％の優先度を有する（Ｈｉｌｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、９５：４２５８〜４２６３、１９９８）。ここでの利点は、このプローブが８つの考えられるメチル化組合せすべてにおおよそ等しい親和性で結合する単一オリゴヌクレオチドであることである。個々のプローブ配列のいくつかは、シトシン塩基の代わりにアニーリング温度を下げるチミジンを含有することになるので、プローブ配列（複数可）のいくつかは低くなったアニーリング温度を埋め合わせるために長さを伸長する必要がある場合があることは認識されると考えられる。代わりのアプローチは、アニーリング温度を増加させる化学修飾（主溝結合塩基などの）を含むことになると考えられる。プローブの縮重位置（複数可）でのそれぞれの塩基の割合は必ずしも５０／５０である必要はないことも理解されるべきである。例えば、特定のＣ残基が本当のがん症例の８０％においてメチル化されているが、本当のがん症例の２０％においてはメチル化されていないことが確認されるならば、この位置に８０％Ｃ及び２０％Ｔを有するプローブを作製してメチル化発生率に適合させることができるであろう。
【０１１４】
当業者であれば認識すると考えられるように、及び前文で詳述したように、プローブ配列（複数可）は反対鎖にも同様にハイブリダイズするように設計することが可能である。反対鎖上でのこれらのプローブ配列設計は、部分的メチル化を調べるために、縮重位置にＧ又はＡ（又は上記のようにイノシン又は脱塩基スペーサー）を有すると考えられる。上記のピリミジン類似体はこの時点で、ＴにもＣにも結合することになるプリン類似体、Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリンに変化すると考えられる。
【０１１５】
本発明のプローブ及び／又はプライマーは、セルフプライムしないしプライマー二量体も形成しない（例えば、検出アッセイにおいて使用される別のプローブ又はプライマーと）ことを確定するためにも評価される。さらに、プローブ又はプライマー（又はその配列）は、それが標的核酸から変性する温度（すなわち、プローブ若しくはプライマーの溶融温度、すなわちＴｍ）を決定するために評価されることが多い。Ｔｍを推定するための方法は当技術分野では公知であり、例えば、Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１４６０〜１４６５、１９９５又はＢｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：３７４６〜３７５０、１９８６に記載されている。
【０１１６】
本発明のプローブ又はプライマーを生成する／合成するための方法は当技術分野では公知である。例えば、オリゴヌクレオチド合成はＧａｉｔ（Ｅｄ）（Ｉｎ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４）に記載されている。例えば、プローブ又はプライマーは生物学的合成により（例えば、核酸の制限エンドヌクレアーゼでの消化により）、又は化学的合成により入手することができる。短い配列（約１００ヌクレオチドまで）では、化学的合成が好ましい。
【０１１７】
さらに長い配列では、例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１０１、２０〜７８、１９８３により記載されている一本鎖ＤＮＡのためのＭ１３の使用などの、分子生物学で用いられる標準複製法が有用である。オリゴヌクレオチド合成のための他の方法には、例えば、リン酸トリエステルとリン酸ジエステル法（Ｎａｒａｎｇ、らＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：９０、１９７９）及び支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ、らＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９〜１８６２、１９８１）並びにホスホロアミド酸技法、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｈ．、ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．１５４、ｐｐ．２８７〜３１４（１９８８）、及び「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ」Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７、及びそこに引用されている参考文献に記載されている他の方法が含まれる。ロックド核酸（ＬＮＡ）を含むプローブは、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．、１：３４２３、１９９７；Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２４７、１９９８に記載される通りに合成される。一方、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むプローブは、例えば、Ｅｇｈｏｌｍら、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１８９５、１９９２；Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６、１９９３；及びＯｒｕｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１：５３３２、１９９３に記載される通りに合成される。
【０１１８】
本発明のＤＮＡ又はＲＮＡ試料は、対象のメチル化を受けた領域に隣接するプライマーを使用して増幅される。前文で詳述したように、この「領域」は遺伝子の長さの小部分又はかなりの部分を包含するように選択することができる。後者の場合では、生じる増幅産物はかなり長いと考えられる。しかし、特定の実施形態では、領域は、１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドがクラスター化されている遺伝子のはるかに短いストレッチに対応することがある。この場合では、生じる増幅産物は著しく短いと考えられる。
【０１１９】
プライマーとプローブの標的ＤＮＡとの相互作用を促進することは任意の適切な方法によって実施することができる。それらの方法は当業者には公知であろう。この目的に向けて、プライマーとプローブは任意の適切な時点で反応チューブ内に入れることが可能であることは理解されるべきである。一般には最初の増幅サイクルの開始に先立って含めるが、１つ又は複数の追加のプライマーの取込みは最初の増幅サイクルに続いて実施してもよい。プライマーの取込みの様式は当業者が増幅反応をどのように実施しようとしているのかに依拠することになるが、一般には、使用の簡便さ及び汚染の回避のために単一のチューブ中で全反応を実施することができることが通常は望ましい。にもかかわらず、本発明のスッテプを達成する他のいかなる方法でも使用することが可能である。したがって、試料をプライマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに「接触させること」への言及は、相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）が起こることができるようにプライマーと試料の混合を促進することへの言及として理解されるべきである。この目的を達成する手段は当業者には周知であると考えられる。
【０１２０】
前文で詳述したように、複数のメチル化されたＤＮＡ領域を増幅させることになる場合、当業者であれば多重化増幅反応を設計することができる。代わりに、それぞれが１つの独特なプライマー対を使用するいくつかの個々の増幅反応を実施することができる。これらの方法は、２つ若しくはそれよりも多い別々のメチル化領域を増幅している場合、又は１つよりも多い遺伝子のメチル化を分析することになる場合には適切になる。この場合、２つの遺伝子（ＢＣＡＴ１及びＩＫＺＦ１などの）を分析しようとしているのであれば、例えば、亜硫酸水素ナトリウム変換後に、試料を２つのアリコートに分けてもよく、次にそれぞれのアリコートはその遺伝子の関連するメチル化配列領域に向けられたフォワード及びリバースプライマーの１つ又は複数のセットを使用して増幅される。代わりに、多重化反応は単一試料上で実施することが可能であり、１つの遺伝子の選択されたメチル化配列領域に向けられたプライマー対と加水分解プローブセットの使用、並びに別の遺伝子の選択されたメチル化配列領域に向けられたプライマーの別のセットと加水分解プローブセットの使用に関して反応は多重化されている。当業者にはよく知られていると考えられるように、多重化反応は、２つ又はそれよりも多いメチル化配列領域及び／又は２つ又はそれよりも多い遺伝子という文脈で、２つ、３つ又はそれよりも多いセットのプライマーと加水分解プローブを用いて実施するように設計することが可能である。多重化又はネステッド増幅反応を適切に設計することは十分に当業者の技能の範囲内であると考えられると理解されるべきである。
【０１２１】
本発明の増幅ステップは対象のＤＮＡ標的に沿ったハイブリダイズしたプライマーの伸長をもたらす。前文で詳述したように、ハイブリダイズした二重標識加水分解プローブの検出を成し遂げるのはプライマー伸長分子の生成である。これを成し遂げることが可能な手段は、増幅産物の生成により発生する検出手段出力は定性的に又は定量的に分析可能であり、後者が特に好ましい手段であるという事実と同様に、当業者には周知であると考えられる。この目的に向けて、プローブがハイブリダイズされているＤＮＡ配列に沿ってプライマーが伸長し、プローブに取って代わり、切断し又はさもなければプローブへの修飾を成し遂げ、このおかげでその検出手段が機能的（例えば、活性化される又は曝露される）になり、それによって定性的又は定量的手段により検出可能になってはじめてプローブの検出が成し遂げられることは理解されるべきである。
【０１２２】
この方法の好ましい適用は、疾患発症（新生物発生又はその素因などの）を診断する目的でメチル化レベルを評価することであるが、前記メチル化レベルの逆の変化の検出は、例えば、アデノーマ又は腺癌発症などの新生物状態を調節することを目的とする治療又は予防処置の有効性をモニターするためのある種の状況下では望ましい場合がある。例えば、メチル化レベルが上昇すると個体がアデノーマ又は腺癌発症により特徴付けられる状態を発症していることを示す場合、治療処置計画の開始に続いてメチル化レベルの減少についてのスクリーニングを利用すれば新生物細胞の排除に成功していることを示すことができる。別の例では、この方法を使用すれば、腫瘍の全周辺が切除されたかどうかを確定するために腫瘍摘出の周辺の組織を試験することが可能である。
【０１２３】
したがって、本方法は、疾患リスクの診断、予後、分類、予測、疾患再発の検出、いくつかの種類の新生物の処置の選択及び新生物のモニタリングにおいて使用することが可能である。原発性、転移性、及び再発性がんなどのいかなる進行段階のがんでも検出することが可能である。さらに、この方法はＤＮＡ及びＲＮＡメチル化の分析が必要とされる他のいかなる文脈においても適用される。
【０１２４】
新生物発生を非限定的例として使用して、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）が新生物を有するのかどうか、哺乳動物から採取した生体試料が新生物細胞又は新生物細胞由来のＤＮＡを含有するかどうかを確定し、哺乳動物が新生物を発生しているリスク又は可能性を見積もり、抗がん処置の効力をモニターし、又はがんを抱えた哺乳動物において適切な抗がん処置を選択するための方法を提供する。そのような方法は、多くの新生物細胞が正常な細胞とは異なるメチル化状態を有すると確定されていることに基づいている。したがって、細胞が差次的にメチル化された配列を含有するかどうかを確定することにより、細胞が腫瘍性であることを確定することが可能である。
【０１２５】
本発明の方法を使用すれば、新生物を抱えていると分かっている若しくは疑われている個体、又はルーチンな臨床試験として、すなわち、新生物を抱えていると必ずしも疑われているわけではない個体において評価することが可能である。さらなる診断アッセイを実施すれば、個体において新生物の状態を確認することが可能である。
【０１２６】
さらに、本発明を使用すれば、処置過程の効力を評価することができる。例えば、抗がん処置の効力はがんを抱える哺乳動物において時間をかけてＤＮＡメチル化をモニターすることにより評価することが可能である。例えば、処置前に、又はもっと早期に哺乳動物から採取された試料中のレベルと比べて、処置に続いて哺乳動物から採取された生体試料において関連する診断配列のいずれでもメチル化が減少している又は存在しなければ、効果的な処置であることを示している。
【０１２７】
したがって、本発明の方法は、1回限りの検査として又は疾患発症のリスクを抱えていると考えられている個体の継続的モニターとして又は治療若しくは予防処置計画の有効性のモニターとして有用である。これらの状況では、生体試料のいずれか１つ又は複数のクラスにおいてメチル化レベルの調節をマッピングすることは、個体の状態又は現在使用されている治療若しくは予防計画の有効性についての価値ある指標となる。したがって、本発明の方法は、その正常なレベルと比べて、又は前記個体の生体試料から確定される１つ若しくは複数の早期のメチル化レベルと比べて、個体におけるメチル化レベルの増加又は減少についてのモニタリングにまで及ぶと理解されるべきである。
【０１２８】
関係する態様では、完全と部分的メチル化の両方を正確に検出するための方法を開発することに加えて、本発明者らは、診断プロトコールという文脈において、及び一般に受け入れられた定説に反して、患者又は他の試料においてあらゆる形態のメチル化についてスクリーニングするほうが、完全なメチル化のみについてスクリーニングするよりは実際に感度の良い結果を出すことが可能であることを思いがけず確定した。部分的メチル化についてスクリーニングすれば診断結果が事実上曖昧になるという以前の懸念は、本発明の方法を使用した場合にはいかなる問題も生じないことが明らかにされた。実際、診断結果の感度は改善される。
【０１２９】
したがって、別の態様では、本発明は、対象の核酸標的のシトシンメチル化の調節により特徴付けられる患者における状態を診断する又はモニターするための方法であって、上記標的は部分的メチル化を受けた領域により特徴付けられ、
（ｉ）前記患者由来の核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＤＮＡ形態の核酸試料を
（ａ）修飾された遺伝子の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
（ｂ）部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている１つ又は複数のプローブであって、前記１つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも２つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のＤＮＡ試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
【０１３０】
一実施形態では、前記標的はＤＮＡ又はＲＮＡであり、プロモーター領域であることが好ましい。
【０１３１】
別の実施形態では、前記状態は新生物状態である。
【０１３２】
別の実施形態では、前記ＤＮＡ又はＲＮＡ標的はＢＣＡＴ１、ＩＫＺＦ１、ＣＡＨＭ、ＧＲＡＳＰ、ＩＲＦ４、ＳＯＸ２１、ＳＬＣ６Ａ１５、ＮＰＹ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＺＳＣＡＮ１８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＬＸ５、ＦＧＦ５、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＩ２又はＳＤＣ２などの遺伝子である。
【０１３３】
さらに別の実施形態では、前記薬剤は亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素アンモニウムなどの亜硫酸水素塩である。
【０１３４】
さらに別の実施形態では、前記プローブは加水分解プローブである。
【０１３５】
さらなる態様では、対象の核酸標的の領域のシトシンメチル化を検出するための診断キットであって、
（ｉ）部分的シトシンメチル化を受けた前記核酸領域の、１つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態のＤＮＡ形態であって、メチル化されていないシトシン残基が修飾されているＤＮＡ形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、
（ｉｉ）少なくとも２つの異なるメチル化パターンに一括してハイブリダイズすることができる、部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられた1つ又は複数のプローブ
を含むキットが提供される。
【０１３６】
一実施形態では、前記プライマーはメチル化特異的プライマーである。
【０１３７】
別の実施形態では、前記プローブは加水分解プローブである。
【０１３８】
さらに別の実施形態では、前記薬剤はメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤である。
【０１３９】
さらに別の実施形態では、前記薬剤は亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素アンモニウムなどの亜硫酸水素塩である。
【０１４０】
さらなる実施形態では、前記キットはＤＮＡ増幅及び／又は検出を成し遂げる試薬をさらに含む。
【０１４１】
対象の前記遺伝子がＩＫＺＦ１である限り、前記プライマー及びプローブは、ＩＫＺＦ１遺伝子のＣｈｒ７：５０３０４３２３０〜５０３０４３４９、Ｃｈｒ７：５０３０３３００〜５０３０４９２３又はＣｈｒ７：５０３９９８６９〜５０４００７０２領域のうちの１つ又は複数のメチル化を検出することを目的とする。
【０１４２】
さらなる実施形態では、プライマーセットには、
（ｉ）配列番号３及び配列番号４配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉ）配列番号４９〜６２及び配列番号６３〜７６配列若しくは実質的に類似した配列、又は
（ｉｉｉ）配列番号７７及び配列番号７８配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの１つ又は複数を含むプライマーが含まれる。
【０１４３】
別のさらなる実施形態では、プローブセットには、
（ｉ）配列番号５〜１２配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉ）配列番号１９配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉｉ）配列番号２０配列若しくは実質的に類似した配列、又は
（ｉｖ）配列番号２３〜３０配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの１つ又は複数を含むプローブが含まれる。
【０１４４】
前記キットが、配列番号１領域の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖を増幅させることを目的とするさらに別の実施形態では、前記プライマーセットには配列番号４７及び配列番号４８配列又は実質的に類似した配列のうちの１つ又は両方を含むプライマーが含まれる。
【０１４５】
前記キットが、配列番号１領域の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖を増幅させることを目的とするさらに別の実施形態では、前記プローブセットには、
（ｉ）配列番号２１配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉ）配列番号２２配列若しくは実質的に類似した配列、
（ｉｉｉ）配列番号３１〜３８配列若しくは実質的に類似した配列、及び／又は配列番号３９〜４６配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの１つ又は複数を含むプローブが含まれる。
【０１４６】
本発明は以下の非限定的実施例を参照することによりさらに説明される。
【０１４７】
実施例１−結腸直腸がん患者の循環中での部分的にメチル化されたＩＫＺＦ１  ＤＮＡの同定
血漿は、１３４人のがん患者を含む２，１０９人の結腸内視鏡検査被検者から採取した。無細胞ＤＮＡはＱＳ  ＣＮＡ  ４ｍＬ血漿キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造業者が推奨する通りにＱＩＡＳｙｍｐｈｏｎｙ上で抽出した。こうして得られたＤＮＡは亜硫酸水素塩変換され、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｆａｓｔ及びＥｐｉＴｅｃｔ  Ｐｌｕｓキットを使用して製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）が推奨する通りにＱＩＡＣｕｂｅｓ上で精製した。回収した亜硫酸水素塩変換ＤＮＡを多重化リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、ＢＣＡＴ１亜硫酸水素塩変換及びメチル化特異的オリゴ（ｃｈｒ１２：２４９４９０５８〜２４９４９１５９上に存在する１０２ｎｔ増幅産物を標的とする配列番号１３、１４及び１５）及び第７染色体上の対照ＤＮＡ遺伝子、ＡＣＴＢを標的とした亜硫酸水素塩変換特異的オリゴヌクレオチド配列番号１６、１７、１８に加えて、オリゴヌクレオチド配列番号３、配列番号４及び配列番号５を含むマスターミックスＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＮｏＲＯＸを使用して製造業者が推奨する通りに３連で入力として分析した。
【０１４８】
メチル化されたＢＣＡＴ１及びＩＫＺＦ１の検出は、以下のＬＣ４８０ＩＩサイクリング条件：１×［９５℃、１５分］、５０×［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒（捕捉、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴｅｘＲｅｄ）］、１×［４０℃、１０秒、及び保持］を使用して、３０μＬの全ＰＣＲ反応において実施した。
配列番号１（ＩＫＺＦ１診断領域−野生型ＤＮＡ）
Chr7: 50304271   GACGACGCACCCTCTCCGTG TCCCGCTCTG CGCCCTTCTG CGCGCCCCGCTCCCTGTACC GGAGCAGCGA TCCGGGAGGC GGCCGAGAGGTGCGC  50304365
配列番号２（ＰＣＲ増幅後、亜硫酸水素塩変換され完全にメチル化されたバージョンの配列番号１）
Chr7: 50304271   GACGACGTATTTTTTTCGTG TTTCGTTTTG CGTTTTTTTG CGCGTTTCGC 
TTTTTGTATC GGAGTAGCGA TTCGGGAGGC GGTCGAGAGGTGCGC(G)   50304365
配列番号３  Chr7: 50304271  GACGACGTATTTTTTTCGTG TTTC  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号４  Chr7: 50304365  GCGCACCTCTCGACCG    50304350 (IKZF1 REV)
配列番号５  Chr7: 50304323  TTTGTATCGGAGTAGCGATT CGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブA)
配列番号６  Chr7: 50304323  TTTGTATCGGAGTAGCGATT TGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブB)
配列番号７  Chr7: 50304323  TTTGTATCGGAGTAGTGATT CGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブC)
配列番号８  Chr7: 50304323  TTTGTATTGGAGTAGCGATT CGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブD)
配列番号９  Chr7: 50304323  TTTGTATCGGAGTAGTGATT TGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブE)
配列番号１０ Chr7: 50304323  TTTGTATTGGAGTAGCGATT TGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブF)
配列番号１１ Chr7: 50304323  TTTGTATTGGAGTAGTGATT CGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブG)
配列番号１２ Chr7: 50304323  TTTGTATTGGAGTAGTGATT TGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブH)
配列番号１３: Chr12:24949058  GTTTTTTTGTTGATGTAATT CGTTAGGTC 24949086 (BCAT1 FWD)
配列番号１４: Chr12:24949159  CAATACCCGAAACGACGACG 24949140 (BCAT1 REV)
配列番号１５: Chr12:24949094  TTCGTCGCGAGAGGGTCGGTT 24949114 (BCAT1プローブ)
配列番号１６: Chr7:5532633  GGAGTTTTTGTTTTTTGGTT AGTTG 5532609 (ACTB FWD)
配列番号１７: Chr7:5532545  CAAAATAAAATACAAAACAA ACCTAATCC 5532573 (ACTB REV)
配列番号１８: Chr7:5532607  ATGGAGGTTTAGTGGTAATA TAGGTTTTGT TTGG 5532574 (ACTBプローブ)
１３４個のがんのうち、７４個及び６２個はそれぞれＢＣＡＴ１及びＩＫＺＦ１メチル化について陽性であった。ＢＣＡＴ１メチル化陽性であるがＩＫＺＦ１メチル化陰性であったＰＣＲ反応由来のＰＣＲ産物は希釈し、配列番号３及び配列番号４プライマーのみを含むＳＹＢＲ−グリーンＩＫＺＦ１アッセイを使用して再増幅した。生じたＰＣＲ産物は、約１００ｂｐのＰＣＲ産物が生成されたかどうかを明らかにするためにアガロースゲル上に流し、これが生成されていればメチル化されたＩＫＺＦ１  ＤＮＡが存在することが確認されると考えられ、しかし、その存在は、「完全にメチル化された」ＩＫＺＦ１プローブ（配列番号５）の下で３つのＣｐＧ部位を含めて、完全にメチル化されたＩＫＺＦ１標的を必要とする多重化ＰＣＲアッセイのせいで最初は検出されなかったと考えられる。実施例１において生じたアガロース分離されたＰＣＲ産物は精製され塩基配列決定され、メチル化されていないＣｐＧ残基５０３０４３３０、５０３０４３３８及び５０３０４３４３の２つの場合を含めていくつかのＰＣＲ産物において部分的メチル化の証拠が明らかになり、これは「完全メチル化」を必要とするＩＫＺＦ１プローブ（配列番号５）が他の点では結腸内視鏡検査で確認されたがんにおいて偽陰性ＩＫＺＦ１結果を生じた理由を説明すると考えられる。部分的メチル化はＩＫＺＦ１増幅産物において他のＣｐＧ部位でも観察された、図１。
【０１４９】
結論
ＩＫＺＦ１加水分解プローブ領域における部分的メチル化の明確な証拠は、塩基配列決定された増幅産物の３つについて得られた。これらのうちの２つは結腸内視鏡検査で確認されたがんであり、完全にメチル化されたＩＫＺＦ１  ＤＮＡを検出するように設計されたプローブを用いた最初のＩＫＺＦ１リアルタイムＰＣＲアッセイでは陰性であった。
【０１５０】
実施例２−結腸直腸がん患者における部分的メチル化ＩＫＺＦ１の検出
標的ＩＫＺＦ１増幅産物配列（配列番号２）に包埋された部分的にメチル化されたＣｐＧ部位の検出に続いて、ゲノム座標Ｃｈｒ７：５０３０４３３０、Ｃｈｒ７：５０３０４３３８及びＣｈｒ７：５０３０４３４３に対応する３つの残基位置のそれぞれにシトシン又はチミジン塩基のどちらかを有する８つの異なるオリゴヌクレオチド配列（配列番号５〜１２）からなる「縮重」ＩＫＺＦ１  ５’−加水分解プローブ混合物を作製した。オリゴヌクレオチド混合物は、２つの塩基の等しい混合物をそれぞれの位置に組み込むことによりオリゴヌクレオチドプローブ作製において得られた。
【０１５１】
ＤＮＡは、実施例１に記載される２，１０９患者のサブコホート（ｎ＝３０８）由来の追加の４ｍＬ血漿から抽出した。回収した亜硫酸水素塩ＤＮＡを多重化リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、オリゴヌクレオチド配列番号３〜１８を含むマスターミックスＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＮｏＲＯＸを使用して製造業者が推奨する通りに３連で入力として分析した。メチル化されたＢＣＡＴ１及び完全にメチル化された／部分的にメチル化されたＩＫＺＦ１の検出は、以下のＬＣ４８０ＩＩサイクリング条件：１×［９５℃、１５分］、５０×［９５℃、１５秒；６２℃、４０秒（捕捉、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴｅｘＲｅｄ）］、１×［４０℃、１０秒、及び保持］を使用して、３０μＬの全ＰＣＲ反応において実施した。ＰＣＲ結果は、完全にメチル化されたＢＣＡＴ１及びＩＫＺＦ１増幅産物のみを標的とする多重化ＰＣＲを使用する以前のデータセットと比べた。
【０１５２】
【表１】
2017517262.tif 000002
【０１５３】
結論
臨床患者試料で８倍縮重プローブを試験すると、結腸内視鏡検査で確認されたがん試料においてＢＣＡＴ１に類似した陽性率が得られ、部分的メチル化に起因する患者偽陰性呼出しの問題が克服されていることを示している、表１。
【０１５４】
実施例３−代わりの５’−加水分解プローブ
修飾された塩基／塩基類似体を有する「縮重」プローブ
上記実施例２において使用された８つのプローブは、８つの不定にメチル化されたＩＫＺＦ１プローブ標的領域すべてを検出するように設計された単一「無差別」オリゴヌクレオチドで置き換えることができた。配列番号１９はプライマーとしての配列番号３及び配列番号４と一緒に使用し、配列番号５〜１２に取って代わると考えられる。配列番号１９は配列番号２の不定にメチル化されたバージョンの相補鎖にアニールすると考えられる。配列番号２０も配列番号５〜１２に代わって使用することができ、配列番号２として示される鎖の不定にメチル化されたバージョンに結合すると考えられる。当業者であれば、メチル化特異的ＰＣＲアッセイは、配列番号１として示される鎖の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖から設計することができることも理解すると考えられる。そのようなアッセイは異なる「無差別な」オリゴヌクレオチドプローブを必要とすると考えられ、これら２つの選択肢は配列番号２１及び配列番号２２として示される。
配列番号１９: Chr7: 50304323 TTTGTATZGGAGTAGZGATT ZGGGAGG     50304349
配列番号２０: Chr7: 50304348 CTCCCXAATC XCTACTCCXATACAAAAAG   50304320
配列番号２１: Chr7: 50304349 TTTTTZGGATZGTTGTTTZG GTATAGGG    50304322
配列番号２２: Chr7: 50304322 CCCTATACCXAAACAACXAT CCXAAAAA    50304349
Ｚはイノシン、脱塩基スペーサー、又は６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（又は、その機能的類似体）のいずれかであり、Ｘはイノシン、脱塩基スペーサー、又はＮ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン（又は、その機能的類似体）のいずれかである。
【０１５５】
配列番号２のセンス鎖の検出のための代わりの「縮重」５’−加水分解プローブ
実施例１（配列番号５）又は実施例２（配列番号５〜１２）において使用されるＩＫＺＦ１プローブは、配列番号２の相補鎖にアニールするように設計される。当業者であれば、配列番号２に結合すると考えられる類似プローブを設計できることも理解するであろう。これらのプローブは配列番号３及び配列番号４を用いたメチル化特異的ＰＣＲアッセイにおいて使用されると考えられ、配列番号２３〜３０として下に収載されている。
配列番号２３: Chr7: 50304348 CTCCCGAATCGCTACTCCGA TACAAAAAG   50304320
配列番号２４: Chr7: 50304348 CTCCCAAATCGCTACTCCGA TACAAAAAG   50304320
配列番号２５: Chr7: 50304348 CTCCCGAATCACTACTCCGA TACAAAAAG   50304320
配列番号２６: Chr7: 50304348 CTCCCGAATCGCTACTCCAA TACAAAAAG   50304320
配列番号２７: Chr7: 50304348 CTCCCAAATCACTACTCCGA TACAAAAAG   50304320
配列番号２８: Chr7: 50304348 CTCCCAAATCGCTACTCCAA TACAAAAAG   50304320
配列番号２９: Chr7: 50304348 CTCCCGAATCACTACTCCAA TACAAAAAG   50304320
配列番号３０: Chr7: 50304348 CTCCCAAATCACTACTCCAA TACAAAAAG   50304320
【０１５６】
配列番号１の相補鎖の亜硫酸水素塩変換バージョンの検出のための「縮重」５’−加水分解プローブ
実施例１及び実施例２において使用されるメチル化特異的ＰＣＲアッセイは、配列番号１に対応する亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖に対して設計される。当業者であれば、メチル化特異的ＰＣＲアッセイは配列番号１として示される鎖の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖から設計することができることも理解すると考えられる。これは配列番号２の相補体ではないであろう。配列番号１として示される鎖の相補体である亜硫酸水素塩変換ＤＮＡ鎖から設計されるそのようなアッセイは、８つの考えうる不定にメチル化された形態のＩＫＺＦ１すべてを検出するためには異なるプローブが必要だと考えられる。これらのプローブは増幅されているＤＮＡのどちらの鎖が検出されているのかに応じて、上の配列番号２０及び２１に示される単一の「無差別な」オリゴヌクレオチドプローブであっても可能であり、又は下の配列番号３１〜３８、及び配列番号３９〜４６に示される８つのプローブの２セットでも可能である。そのようなアッセイは追加のメチル化特異的ＰＣＲプライマーも必要になると考えられ、それは配列番号４７及び４８として示されている。
配列番号３１: Chr7: 50304349 TTTTTCGGATCGTTGTTTCG GTATAGGG   50304322
配列番号３２: Chr7: 50304349 TTTTTCGGATCGTTGTTTTG GTATAGGG   50304322
配列番号３３: Chr7: 50304349 TTTTTCGGATTGTTGTTTCG GTATAGGG   50304322
配列番号３４: Chr7: 50304349 TTTTTTGGATCGTTGTTTCG GTATAGGG   50304322
配列番号３５: Chr7: 50304349 TTTTTCGGATTGTTGTTTTG GTATAGGG   50304322
配列番号３６: Chr7: 50304349 TTTTTTGGATCGTTGTTTTG GTATAGGG   50304322
配列番号３７: Chr7: 50304349 TTTTTTGGATTGTTGTTTCG GTATAGGG   50304322
配列番号３８: Chr7: 50304349 TTTTTTGGATTGTTGTTTTG GTATAGGG   50304322
配列番号３９: Chr7: 50304322 CCCTATACCGAAACAACGAT CCGAAAAA   50304349
配列番号４０: Chr7: 50304322 CCCTATACCAAAACAACGAT CCGAAAAA   50304349
配列番号４１: Chr7: 50304322 CCCTATACCGAAACAACAAT CCGAAAAA   50304349
配列番号４２: Chr7: 50304322 CCCTATACCGAAACAACGAT CCAAAAAA   50304349
配列番号４３: Chr7: 50304322 CCCTATACCAAAACAACAAT CCGAAAAA   50304349
配列番号４４: Chr7: 50304322 CCCTATACCAAAACAACGAT CCAAAAAA   50304349
配列番号４５: Chr7: 50304322 CCCTATACCGAAACAACAAT CCAAAAAA   50304349
配列番号４６: Chr7: 50304322 CCCTATACCAAAACAACAAT CCAAAAAA   50304349
配列番号４７: Chr7: 50304366 CGCGTATTTTTCGGTC              50304351
配列番号４８: Chr7: 50304273 CGACGCACCCTCTCCG              50304288
【０１５７】
部分的にメチル化されたＩＫＺＦ１を増幅させるように設計された「縮重」プライマーの例
配列番号４９  Chr7: 50304271 GATGACGTAT TTTTTTCGTG TTTC  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５０  Chr7: 50304271 GACGATGTAT TTTTTTCGTG TTTC  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５１  Chr7: 50304271 GACGACGTAT TTTTTTTGTG TTTC  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５２  Chr7: 50304271  GACGACGTATTTTTTTCGTG TTTT  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５３  Chr7: 50304271 GATGATGTAT TTTTTTCGTG TTTC  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５４  Chr7: 50304271 GACGATGTAT TTTTTTTGTG TTTC  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５５  Chr7: 50304271 GACGACGTAT TTTTTTTGTG TTTT  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５６  Chr7: 50304271 GATGACGTAT TTTTTTTGTG TTTC  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５７  Chr7: 50304271 GACGATGTAT TTTTTTCGTG TTTT  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５８  Chr7: 50304271 GATGACGTAT TTTTTTCGTG TTTT  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号５９  Chr7: 50304271  GATGATGTATTTTTTTTGTG TTTC  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号６０  Chr7: 50304271 GATGATGTAT TTTTTTCGTG TTTT  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号６１  Chr7: 50304271 GATGACGTAT TTTTTTTGTG TTTT  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号６２  Chr7: 50304271 GACGATGTAT TTTTTTTGTG TTTT  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号６３  Chr7: 50304365 ACGCACCTCT CGACCG    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号６４  Chr7: 50304365 GCACACCTCT CGACCG    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号６５  Chr7: 50304365 GCGCACCTCT CAACCG    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号６６  Chr7: 50304365 GCGCACCTCT CGACCA    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号６７  Chr7: 50304365 ACACACCTCT CGACCG    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号６８  Chr7: 50304365 GCACACCTCT CAACCG    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号６９  Chr7: 50304365 GCGCACCTCT CAACCA    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号７０  Chr7: 50304365 ACGCACCTCT CAACCG    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号７１  Chr7: 50304365 ACGCACCTCT CGACCA    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号７２  Chr7: 50304365 GCACACCTCT CGACCA    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号７３  Chr7: 50304365 ACACACCTCT CAACCG     50304350     (IKZF1 REV)
配列番号７４  Chr7: 50304365 ACACACCTCT CGACCA    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号７５  Chr7: 50304365 ACGCACCTCT CAACCA    50304350      (IKZF1 REV)
配列番号７６  Chr7: 50304365 GCACACCTCT CAACCA    50304350      (IKZF1 REV)
完全にメチル化されていないプライマー：
配列番号７７   Chr7: 50304271 GATGATGTAT TTTTTTTGTG TTTT  50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号７８   Chr7: 50304365 ACACACCTCT CAACCA      50304350    (IKZF1 REV)
【０１５８】
当業者であれば、本明細書に記載される本発明は具体的に記載されたもの以外の変更及び改変を受けやすいことは認識されるであろう。本発明にはそのような変更及び改変のすべてが含まれていると理解されるべきである。本発明は、本明細書において言及される又は示されるステップ、特長、組成物及び化合物のすべてを個別に又は集合的に、並びに前記ステップ又は特長の任意の２つ若しくはそれよりも多くのありとあらゆる組合せも含む。
【０１５９】
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【図１】
2017517262.tif 000003
【図２−１】
2017517262.tif 000004
【図２−２】
2017517262.tif 000005
【配列表】
2017517262000001.app
【国際調査報告】
2017517262.tif 000006
2017517262.tif 000007
2017517262.tif 000008
2017517262.tif 000009