(57)【要約】ウルバン含有組成物が記載されている。この組成物は、関節内補充組成物であり、関節炎の治療または予防に使用することができる。また、5つの関節炎などの筋骨格疾患を、ウルバン含有組成物を投与することにより治療する方法も記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節炎の治療または予防のための関節内補充組成物であって、ウルバンを含む該組成物。
【請求項２】
ウルバンの硫酸化度が0.1%〜75%である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ウルバンの硫酸化度が0.1%〜20%である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ウルバンの硫酸化度が0.1%〜6%である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
該ウルバンが100〜10,000kDaの平均分子量を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
該ウルバンが100〜3,000kDaの平均分子量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
該ウルバンが100〜600kDaの平均分子量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
該ウルバンが、5%〜50%のグルクロン酸および0〜50%のイズロン酸を、モノマーの相対モル百分率で含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
該ウルバンが、25%〜50%のグルクロン酸および0〜15%のイズロン酸を、モノマーの相対モル百分率で含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
該ウルバンが、25%〜100%の二糖単位［グルクロン酸-ラムノース硫酸］および25%〜100%の二糖単位［イズロン酸-ラムノース硫酸］を、単位の相対モル百分率で含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
該ウルバンが、40%〜100%の二糖単位［グルクロン酸-ラムノース硫酸］および25%〜50%の二糖単位［イズロン酸-ラムノース硫酸］を、単位の相対モル百分率で含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
該ウルバンが、25%〜100%のA3Sおよび25%〜100%のB3S二糖繰り返し単位を、単位の相対モル百分率で含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
該ウルバンが、40%〜100%のA3Sおよび25%〜50%のB3S二糖繰り返し単位を、単位の相対モル百分率で含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
該ウルバンが、メタクリル酸、アミン、アルデヒド、イタコン酸、アクリルアミド、またはアクリレートなどの追加の官能基を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
該ウルバン官能基の置換度が0.1%〜50%である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
該ウルバン官能基の置換度が0.1%〜30%である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
該ウルバンが、該組成物中で0.1%〜30%w/Vの濃度である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
該ウルバンが、該組成物中で0.4%〜12%w/Vの濃度である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
該組成物が緩衝液を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
該組成物が6〜8のpHを有する、請求項１〜１９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
特定の実施形態においては、該組成物が6.8〜7.4のpHを有する。
【請求項２２】
該組成物が細胞培地を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
該ウルバンに加えて、1つ以上の硫酸化多糖類をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
1つ以上の該硫酸化多糖が、ゲラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸およびキシロース硫酸からなる群より選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ヒアルロン酸をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
該ウルバン、およびヒアルロン酸に加えて、1つ以上の硫酸化多糖類をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
該組成物が固体形態である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
該組成物が液体形態である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
療法（セラピー）に使用するための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
関節炎などの筋骨格疾患の治療または予防に使用するための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
関節炎などの筋骨格疾患の治療または予防に使用するためのウルバン。
【請求項３２】
筋骨格疾患を患う患者を治療する方法であって、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む該方法。
【請求項３３】
該組成物が、関節内注射により患者の関節に投与される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウルバン含有組成物に関する。この組成物は関節内補充組成物であり、関節炎の治療に使用することができる。本発明は、ウルバン含有組成物を投与することにより関節炎を治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
関節炎は、関節の慢性炎症であり、通常痛み、周囲結合組織の腫れおよび動きの制限を伴う。関節炎で最も多いのは、変形性関節症および関節リウマチであり、その両方とも、様々な程度の障害につながる進行性変性疾患である。これら疾患の結果として、関節の軟骨および骨は進行性破壊を受け、運動機能の喪失および痛みの増強が続く。
【０００３】
変形性関節症（OA）は、変形性関節疾患または関節症とも呼ばれ、最も一般的な筋骨格系障害の1つである。OAの症状は、痛み、関節の腫れおよび硬直である。OAの発症は、その臨床診断の何年も前に始まる可能性があり、それは患部関節のほぼ全ての関節軟骨が失われる病気の末期まで続く。
【０００４】
変形性関節症は、生物学的または機械的な要因に起因する関節軟骨の破壊により特徴付けられ、それは膝の通常の荷重伝達を変化させ、痛みを生じさせる。滑膜の炎症は、痛みをさらに引き起こす可能性があり、それは軟骨粒子（半月板または関節）によりもたらされ得る。軟骨変性は、細胞外マトリックス分解酵素の産生を促進し、関節の炎症性メディエーターを産生し、これはさらに滑膜の炎症の一因となる。
【０００５】
OAは主に関節軟骨を侵し、それはアグリカンおよびII型コラーゲンを主成分とするその細胞外マトリックス（ECM）が徐々に失われることにより劣化する。プロテオグリカンアグリカン含有量の減少が最初に起こり、その結果圧縮剛性が付随して減少する。次いで、軟骨の引張特性を担う主成分であるコラーゲン線維ネットワークへの損傷が起こる。
【０００６】
アグリカン分解は、アグリカナーゼ、トロンボスポンジンモチーフ4および5を有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motif 4 and 5）（ADAMTS-4および-5）、ならびにマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）のアップレギュレーションと関連している。II型コラーゲンの過剰な切断は、メタロプロテアーゼ、特にMMP-13の合成および活性のアップレギュレーションにより引き起こされる。
【０００７】
関節リウマチは、広範囲の滑膜関節障害を伴う炎症状態である。これは慢性多発性関節炎の最も一般的な形態であり、全身性疾患ではあるが、主に末梢関節を侵す。持続的な滑膜炎は関節破壊につながり、長期的な罹患率および死亡率の増加につながる。その病因は依然として不明である。現代の治療は、疾患活動性を制御し、長期的な障害を減少させるのに効果がなく、疾患活動性を制御することを目的とした早期治療は、現在の予防戦略である。
【０００８】
関節内補充療法は、ゲル状高分子物質の関節への注射からなる。生体適合性潤滑剤は、軟骨界面を潤滑化することを目的とし、それにより痛みを軽減し、関節の柔軟性を向上させる。この治療方法は、メリットがほとんどが一時的なものであるため、通常複数の注射を必要とする。現在使用される物質は、ポリマー構造を分解する滑液中の酵素の作用により、数週間から数ヶ月以内に分解する。関節内補充療法に使用される物質には、ヒアルロン酸（HA）およびポリ硫酸化グリコサミノグリカン（PSGAGS）が挙げられる。
【０００９】
ヒアルロン酸（HA）は、グリコサミノグリカン（GAG）ファミリーの天然複合糖である。HAは、グルクロン酸とN-アセチルグルコサミンとの二糖単位を含有する長鎖ポリマーである。HAは滑膜（関節）液中に見出される天然物質であり、そこでそれは関節機能中に潤滑剤および衝撃吸収材として機能する。HAの関節内（IA）注射は、成功が疑わしい患者のOAを管理するために臨床的に使用されてきた。
【００１０】
ヒアルロン酸は、単独または他の化合物との混合での変形性関節症への適用のために広く研究されてきた。しかし、ヒアルロン酸の治療効果は、ポリマー鎖を広範囲に分解する天然ヒアルロニダーゼ酵素の作用のために比較的短期間のものであり、限られた臨床効果に至る。したがって、持続的な鎮痛のために作用部位での無傷ヒアルロン酸の許容レベルを維持する目的で、ヒアルロン酸の複数回注射が時間をかけて必要とされている。この投与計画は、追加費用ならびに患者および医師の両方に不便をもたらす。
【００１１】
臨床研究からの証拠は、HAの軟骨保護効果は、HA-治療を受けたOAを患う患者における、関節腔狭小化の大幅な減少、滑膜組織中のマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）の阻害、および滑液中のMMP-9の減少に起因することを示唆している。
【００１２】
高い硫酸基含量を有する多糖類は、一般的に硫酸化多糖（SPS）と表される。SPSは、それらの生物活性および物理化学的性能のため、医学の分野で関心を集めている。SPSは、その抗ウイルス、抗腫瘍、抗血管新生、抗凝固、抗酸化、抗炎症、抗増殖、抗寄生虫、抗転移、および免疫調節活性について、広く研究されてきた。
【００１３】
SPSは、天然物（植物、動物および微生物から抽出された）または合成物（化学的に修飾または合成された）として分類することができる。ほとんどの哺乳類のSPSはGAGであり、組織の細胞外マトリックスの一部である。SPSの生物活性は、分子量、硫酸化度、硫酸基の位置および水への溶解度に依存する。
【００１４】
いくつかのSPSは、変形性関節症の治療用の関節内補充剤として提案されている。コンドロイチン硫酸（CS）は、交互鎖の糖（N-アセチルガラクトサミンおよびグルクロン酸）から構成される硫酸化GAGである。実験的研究は、抗炎症、同化および抗異化特性を実証している。硫酸化は、変形性関節症におけるCSの治療特性に影響を与えると思われる。CSは、OA患者における関節腔狭小化の進行を減少させるのに効果的であると言われてきた。
【００１５】
SPSは、OAとの関連で高い適用可能性を有する。SPS固有の生物活性能は、HAに比べて改善した酵素分解に対する安定性と相まって、これらのポリマーを、関節内補充組成物に潜在的に適するようにする。OA治療との関連でのSPSの使用は、その広い生物活性スペクトルおよび固有の物理化学的特性のために潜在的なメリットがあるが、改善した長時間作用の関節内補充組成物の開発は、当業者にとって非常に困難である。
【００１６】
非特許文献１による評価では、ウルバンは、精製化学製品およびヘパリン類似体の合成用の希少糖供給源となり得ると記載されている。ウルバンはまた、血清コレステロールおよびトリグリセリドレベルを減少させるその能力だけでなく、その抗腫瘍、抗ウイルスおよび免疫調節活性などのために、薬学的関心となることが示唆されている。関節炎の状態での潜在的な適用は議論されていない。
【００１７】
特許文献１は、固形腫瘍、血管病変、皮膚、骨ならびに関節、生殖器、眼および肺疾患などの全身性疾患の治療用に、構成単糖の主成分としてラムノースまたはその塩を含む硫酸化多糖を含有する血管新生阻害剤の使用を主張する。そのような硫酸化多糖類は、緑色のアオサ（Ulva）を含むいくつかの海藻種から得ることができる。技術的効果をもたらすために、硫酸化多糖類は、血管新生阻害剤として機能しなければならない。関節炎の状態において血管新生阻害を介して作用する関節内補充組成物としてのウルバンの有用性については言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開2009-057285号公報
【特許文献２】国際公開第2011/119059号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Lahaye, M. & Robic, A. (2007) Structure and functiontional properties of ulvan, a polysaccharide from green seaweeds. Biomacromolecules, 8(6), 1765-1774.
【非特許文献２】Alves, A., Caridade, S. G., Mano, J. F., Sousa, R. A. & Reis, R. L. (2010) Extraction and physico-chemical characterization of a versatile biodegradable polysaccharide obtained from green algae. Carbohydrate Research 345: 2194-2200. doi:10.1016/j.carres.2010.07.039
【非特許文献３】Papy-Garcia, D., Barbier-Chassefiere, V., Rouet, V., Kerros, M-E., Klochendler, C., Tournaire, M-C., Barritault, D., Caruelle, J-P. & Petit, E. (2005) Nondegradative sulfation of polysaccharides. Synthesis and structure characterisation of biologically active heparin sulphate mimetics. Macromolecules, 38, 4647-4654.
【非特許文献４】Nagasawa, K., Inoue, Y. & Kamata, T. (1977) Solvolytic desulfation of glycosaminoglycuronan sulfates with dimethyl sulfoxide containing water or methanol. Carbohydrate Research, 58, 47-55.
【非特許文献５】Coimbra, M. A., Delgadillo, I., Waldron, K. W. & Selvendran, R. R. (1996). Isolation and Analysis of Cell Wall Polymers from Olive Pulp. In H.-F. Linskens & J. F. Jackson. Modern Methods of Plant Analysis (pp. 19-44). Berlin: Springer-Verlag.
【非特許文献６】Barros, A. A. A., Alves, A., Nunes, C., Coimbra, M. A., Pires, R. A. & Reis, R. L. (2013). Carboxymethylation of ulvan and chitosan and their use as polymeric components of bone cements. Acta Biomaterialia, (July), 1-12. doi:10.1016/j.actbio.2013.06.036
【非特許文献７】Lahaye, M., Inizan, F. & Vigouroux, J. (1998). NMR analysis of the chemical structure of ulvan and of ulvan-boron complex formation. Carbohydrate Polymers, 36, 239-249.
【非特許文献８】Robic, A., Sassi, J.-F. & Lahaye, M. (2008). Impact of stabilization treatments of the green seaweed Ulva rotundata (Chlorophyta) on the extraction yield, the physico-chemical and rheological properties of ulvan. Carbohydrate Polymers, 74(3), 344-352. doi:10.1016/j.carbpol.2008.02.020
【非特許文献９】Subhapradha N., Suman S., Ramasamy P., Saravanan R., Shanmugan V., Srinivasan A. & Shanmugan A. (2013) Anticoagulant and antioxidant activity of sulphated chitosan from the shell of donacid clam Donax scortum (Linnaeus, 1758); International Journal of Nutrition, Pharmacology, Neurological Diseases. 3(1):39-45.
【非特許文献１０】Hamcerencu, M., Desbrieres, J., Khoukh A., Popa M. & Riess G. (2008) Synthesis and characterization of new unsaturated esters of gellan gum. Carbohydrate Polymers, 71, 92-100.
【非特許文献１１】Masuda, K & Sah RL in “Culture of cells for tissue engineering”, Ed.: Vunjak-Novakovic G and Freshney RI, 2006
【非特許文献１２】Livak, K.J. & Schmittgen T.D., Methods 25, 402-408, 2011
【非特許文献１３】Smith M.M. & Little C.B. in “Osteoarthritis”Ed.: Moskowitz et al., Wolters Kluver, 2007.
【非特許文献１４】Goncalves, C., Rodriguez-Jasso, R. M., Gomes, N., Teixeira, J. A. & Belo, I. (2010). Adaptation of dinitrosalicylic acid method to microtiter plates. Analytical Methods, 2(12), 2046
【発明の概要】
【００２０】
SPSを包含するOA治療用の組成物の開発は、化学構造、硫酸化度および分子量などの多くの分子パラメータを考慮したSPSの選択を要求する。
【００２１】
本発明は、動物、好ましくはヒトにおける関節炎の治療および予防のための組成物の必要性に対処し、投与回数および投与1回当たりのそれぞれの投与量を減らす。本発明は、ウルバンを基とする代替関節内補充組成物に関する。ウルバンは、以前に関節内補充剤として使用されたことはなく、また関節炎、特に変形性関節症の治療または予防に使用されたこともない。
【００２２】
したがって、第1の態様では、本発明は、関節炎の治療または予防のための組成物を提供し、組成物はウルバンを含む。そのため、組成物は関節内補充組成物である。
【００２３】
ウルバン系関節内補充剤は、ウルバンの生物活性特性から恩恵を受け、ヒアルロン酸などの既存の関節内補充組成物と比較して改善した分解挙動を示す。
【００２４】
ウルバンは、ラムノース、キシロースならびにウロン酸、すなわちグルクロン酸およびイズロン酸で構成される硫酸化多糖である。ウルバンは、ラムノース、キシロース、グルクロン酸およびイズロン酸から選択された2つのモノマーからなる二糖繰り返し単位を含有する。ウルバン二糖繰り返し単位には、
（i）［グルクロン酸-ラムノース硫酸］；
（ii）［イズロン酸-ラムノース硫酸］；
（iii）［キシロース-ラムノース硫酸］；および
（iv）［キシロース硫酸-ラムノース硫酸］
が少なくとも挙げられる。
【００２５】
したがって、いくつかの実施形態では、ウルバンは、1つ以上の上記二糖単位のポリマーである。
【００２６】
特に、ウルバン二糖繰り返し単位には、
（I）A3S型［>4-β-D-グルクロン酸-(1>4)-α-L-ラムノース3-硫酸-1>］；
（ii）B3S型［>4-α-L-イズロン酸-(1>4)-α-L-ラムノース3-硫酸-1>］；
（iii）U3S型［>4-β-D-キシロース-(1>4)-α-L-ラムノース3-硫酸-1>］；
（iv）U2’S3S型［>4-β-D-キシロース2-硫酸-(1>4)-α-L-ラムノース3-硫酸-1>］
が挙げられる。
【００２７】
したがって、いくつかの実施形態では、ウルバンは、1つ以上の上記二糖単位のポリマーである。
【００２８】
ウルバンを、分子安定剤として作用する塩に関連付けることができる。
【００２９】
本発明で使用されるウルバンは、任意の適切な供給源から得ることができる。ウルバンは、植物種、例えば緑藻類から、例えば非特許文献２に記載されているように抽出することができるが、とはいえ細菌発酵または有機合成などの他の方法もその製造に使用することができる。
【００３０】
ウルバン中の一部または全てのモノマーが硫酸化されている。例えば、ウルバンは、1つ以上のキシロース硫酸、ラムノース硫酸、硫酸化グルクロン酸および硫酸化イズロン酸を含み得る。
【００３１】
天然に存在するウルバンの硫酸基含量は、典型的には0.1%〜25%の間で変動する。しかし、ウルバン中の遊離ヒドロキシル基の部分的または完全硫酸化によりこれを増加させることができ、それぞれ所望の硫酸化度を生じさせる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ウルバンの硫酸化度は0.1%〜75%である。これは、ラムノース、キシロース、グルクロン酸およびイズロン酸のヒドロキシル基の0.1%〜75%が硫酸化されていることを意味する。好ましくは、ウルバンの硫酸化度は0.1%〜40%である。より好ましくは、ウルバンの硫酸化度は0.1%〜30%である。さらに好ましくは、ウルバンの硫酸化度は0.1%〜20%である。最も好ましくは、ウルバンの硫酸化度は0.1%〜6%である。ウルバン硫酸化度は、当業者に知られている方法に従って化学修飾することにより調整することができる（非特許文献３および非特許文献４）。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ウルバンは100〜10,000kDaの平均分子量を有する。好ましくは、ウルバンは100〜5,000kDaの平均分子量を有する。より好ましくは、ウルバンは100〜3,000kDaの平均分子量を有する。さらにより好ましくは、ウルバンは100〜1,200kDaの平均分子量を有する。最も好ましくは、ウルバンは100〜600kDaの平均分子量を有する。
【００３４】
天然に存在するウルバンは、比較的高い平均分子量を有する。分子量が高すぎるとみなされる場合、オリゴ糖のような低分子量分子をウルバンから、出発分子の加水分解により誘導することができる。好ましくは、ウルバン由来の低分子量分子は、30〜100kDaの範囲である。必要であれば、低分子量ウルバン分子を共有結合で架橋し、分子量を増大させることができる。好ましくは、架橋ウルバン分子は、100〜10,000kDaの平均分子量を有する。
【００３５】
ウルバンの硫酸化度の調節は、加水分解工程の前および／または後に行うことができる。いくつかの実施形態では、加水分解により生成されるオリゴ糖は、100kDa未満の分子量を有する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ウルバンは、5%〜50%のグルクロン酸および0〜50%のイズロン酸を、モノマーの相対モル百分率で含む。好ましくは、ウルバンは、15%〜50%のグルクロン酸および0〜30%のイズロン酸を、モノマーの相対モル百分率で含む。より好ましくは、ウルバンは、25%〜50%のグルクロン酸および0〜15%のイズロン酸を、モノマーの相対モル百分率で含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ウルバンは、25%〜100%の二糖単位［グルクロン酸-ラムノース硫酸］および25%〜100%の二糖単位［イズロン酸-ラムノース硫酸］を、単位の相対モル百分率で含む。好ましくは、ウルバンは、40%〜100%の二糖単位［グルクロン酸-ラムノース硫酸］および25%〜70%の二糖単位［イズロン酸-ラムノース硫酸］を、単位の相対モル百分率で含む。より好ましくは、ウルバンは、40%〜100%の二糖単位［グルクロン酸-ラムノース硫酸］および25%〜50%の二糖単位［イズロン酸-ラムノース硫酸］を、単位の相対モル百分率で含む。
【００３８】
特定の実施形態では、ウルバンは、25%〜100%のA3Sおよび25%〜100%のB3S二糖繰り返し単位を、単位の相対モル百分率で含む。好ましくは、ウルバンは、40%〜100%のA3Sおよび25%〜70%のB3S二糖繰り返し単位を、単位の相対モル百分率で含む。より好ましくは、ウルバンは、40%〜100%のA3Sおよび25%〜50%のB3S二糖繰り返し単位を、単位の相対モル百分率で含む。
【００３９】
ウルバンは水溶液に可溶性であり、ほぼ全ての有機溶媒に不溶である。ウルバン分子の表面電荷は、溶液のpHおよびイオン強度に依存する。溶液浸透圧およびpH、ならびにウルバン濃度の変化により、異なる粘度の溶液が得られる。ウルバンは、ホウ素およびカルシウムなどの二価カチオンの存在下で弱いゲルを形成する能力を有する（非特許文献１）。
【００４０】
本発明の文脈では、ヒドロキシル、カルボキシル、および硫酸基などウルバン官能基を使用して、メタクリル酸、アミン、アルデヒド、イタコン酸、アクリルアミド、またはアクリレートなどの追加の官能基を組み込むことができる。この点において、ウルバン官能基の置換度は0.1%〜50%であり得る。好ましい実施形態では、ウルバン官能基の置換度は0.1%〜40%であり、好ましくは30%未満である。
【００４１】
組成物は、好ましくは液体形態である。好ましくは、組成物は水性組成物である。好ましくは、ウルバンは、組成物中で0.1%〜30%w/Vの濃度である。いくつかの実施形態では、ウルバンは、組成物中で0.2%〜20%w/Vの濃度である。他の実施形態では、ウルバンは、組成物中で0.3%〜15%w/Vの濃度である。特定の実施形態では、ウルバンは、組成物中で0.4%〜12%w/Vの濃度である。特定の実施形態では、ウルバンは、組成物中で0.5%〜10%w/Vの濃度である。
【００４２】
組成物は、組成物を特定のpHで維持するのに役立つ緩衝液を含み得る。緩衝液は、任意の適切な緩衝液、例えばリン酸緩衝液、またはトリス-HCl緩衝液であり得る。
【００４３】
組成物は4〜10のpHを有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は5〜9のpHを有する。他の実施形態では、組成物は6〜8のpHを有する。さらなる実施形態では、組成物は6.8〜7.4のpHを有する。特定の実施形態では、組成物は約7のpHを有する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、組成物は生理食塩水または細胞培地を含む。
【００４５】
組成物は、ウルバンに加えて、1つ以上の硫酸化多糖類を含み得る。好ましくは、硫酸化多糖類は、ゲラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸およびキシロース硫酸からなる群より選択される。これらは、次の優先順位に従って選択される（最も好ましいものから始まる）：コンドロイチン硫酸、ゲラン硫酸、キシロース硫酸、デキストラン硫酸、ケラタン硫酸、およびヘパリン硫酸。
【００４６】
いくつかの実施形態では、組成物はヒアルロン酸をさらに含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、組成物は、完全にまたは部分的に酸の形態である。あるいは、組成物（特に酸性基）は、完全にまたは部分的に塩の形態であってもよい。塩は、生理学的に許容される塩でなくてはならない。塩は、Na+、K+、Sr+、Ca2+、Ba2+、Mg2+などのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属、または第一級アミン、第二級アミンまたは第三級アミンなどの有機化合物と共に形成され得る。
【００４８】
組成物は0.1%〜10%w/Vの塩を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は0.2%〜8%w/Vの塩を含む。他の実施形態では、組成物は0.3%〜7%w/Vの塩を含む。様々な実施形態では、組成物は0.4%〜6%w/Vの塩を含む。特定の実施形態では、組成物は0.5%〜5%w/Vの塩を含む。塩は、上記で示されるような任意の適切な塩であってもよい。いくつかの実施形態では、塩はNaClである。
【００４９】
様々な実施形態では、組成物は、CuSO4および／またはH3BO4などの追加の塩を含む。
【００５０】
上記組成物を医薬組成物の調製に使用し、変形性関節症の治療および予防に使用することができる。組成物を、他の賦形剤または獣医学およびヒト医学の分野で使用される活性物質と組み合わせることができる。
【００５１】
組成物を、局所、経腸および非経口を含む様々な経路により投与することができる。非経口投与経路には、動脈内、関節内、腔内、皮内、リンパ管内、筋肉内、滑液嚢内、静脈内、および皮下が挙げられる。経腸経路には、経口および胃腸が挙げられる。局所経路には、皮膚および粘膜への塗布が挙げられる。
【００５２】
好ましい実施形態では、組成物は、罹患した関節への関節内注射により患者に投与され、これを臨床的な処方計画に応じて繰り返すことができる。さらにより好ましい実施形態では、組成物は、罹患した関節への単回関節内注射により投与される。
【００５３】
組成物の投与量は、投与経路、ならびに年齢、性別、状態、疾患の進行を含む患者のプロフィール、または任意の他の表現型もしくは環境パラメータに合わせることができる。
【００５４】
組成物は、非晶質、結晶性または半結晶性粉末、顆粒、フレーク、丸剤、スキャフォールド、カプセル剤および坐剤などの固体形態であってもよい。このような固体形態は、溶媒、溶液、懸濁液およびエマルジョンなどの生理学的に適切な液体と固体を混合させることにより、液体形態に変換することができる。
【００５５】
別の態様では、本発明は、筋骨格疾患を患う患者を治療する方法を提供し、その方法は上記組成物の有効量を患者に投与することを含む。
【００５６】
上述のように、組成物は、関節内注射により、例えば患者の関節に投与されてもよい。関節は、関節炎の関節であってもよい。
【００５７】
筋骨格疾患は、関節炎であってもよい。関節炎は、変形性関節症の関節炎（関節症）または関節リウマチであってもよい。いくつかの実施形態では、患者は、関節リウマチを患っている。他の実施形態では、患者は、変形性関節症を患っている。
【００５８】
さらなる態様では、本発明は、筋骨格疾患、例えば関節炎の治療または予防に使用するためのウルバンを提供する。さらに、本発明は、筋骨格疾患、例えば関節炎の治療または予防のための医薬の製造におけるウルバンの使用を提供する。
【００５９】
特定の態様では、本発明は、療法（セラピー）に使用するための上記組成物を提供する。さらに、本発明は、筋骨格疾患、例えば関節炎の治療または予防に使用するための上記組成物を提供する。また、本発明は、筋骨格疾患、例えば関節炎の治療または予防のための医薬の製造における上記組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
本発明を、ほんの一例として、以下の図面を参照して詳細に説明する：
【図１】4つの可能なウルバンの繰り返し単位の略図：2つのアルドビオウロン酸（A3SおよびB3S）、ならびに2つのウルバノビオセス（ulvanobioses）（U3SおよびU2S3S）。
【図２】酸化重水素に溶解したウルバンの60℃での1H NMRスペクトル。
【図３】酸化重水素に溶解したグルクロン酸の60℃での1H NMRスペクトル。
【図４】酸化重水素に溶解したラムノースの60℃での1H NMRスペクトル。
【図５】酸化重水素に溶解したキシロースの60℃での1H NMRスペクトル。
【図６】酸化重水素に溶解したメタクリレート化ウルバンの70℃での1H NMRスペクトル。矢印は、メタクリレート化反応から生じるウルバン骨格における新たなプロトンのピークを示している。
【図７】10分間の紫外線照射後にメタクリレート化ウルバンから生成されたヒドロゲルの画像。左：ヒドロゲルの正面画像；右：ヒドロゲルの上部画像。
【図８】未治療群に対して正規化された、II型コラーゲン、I型コラーゲンおよびX型コラーゲンの遺伝子発現比。
【図９】サフラニンOで染色したウサギの関節軟骨切片の顕微鏡イメージング（5x）。左：正常な関節軟骨および軟骨下骨の染色。中央：変形性関節症（OA）誘導の3週間後の関節軟骨の染色。右：ウルバン製剤（3%w/V）での治療の8週間後の変形性関節症の関節軟骨の染色。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
以下の実施例は単なる例示であり、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００６２】
（実施例１：ウルバン塩の特性評価）
ウルバン塩を、化学的特性評価用に、異なる溶媒中で調製した。
【００６３】
＜方法および結果＞
（モノマー組成）
ウルバンを、H2O中に室温で可溶化し、その後1MのH2SO4で、100℃で2.5時間かけて加水分解した。非特許文献５に記載されているように、中性糖を、アルジトールアセテートとして、ガスクロマトグラフィー分析を使用して測定した。ウロン酸を、非特許文献５に記載の適合3-フェニルフェノール比色法により測定した。結合解析を、メチル化により非特許文献５により適合されたように実行した。結果を表１に示す。
【００６４】
（繰り返し単位および硫酸基含量）
ウルバン（1%w/V）を、室温で酸化重水素に可溶化した。試料を、Varian Unity Plus（Varian、米国）分光計で60℃で得た1H NMRにより分析した（図２）。
【００６５】
1H-NMRスペクトルを、ウルバン組成物中に主に存在するモノマーについて得た（グルクロン酸、ラムノースおよびキシロース、図３〜５）。これらのモノマーを、1%w/V酸化重水素溶液で調製し、ウルバン液とした。生成されたウルバンの主要な繰り返し単位の化学シフトを、文献に基づいて同定した（非特許文献６：非特許文献７；非特許文献８）。アルドビオウロニンク（aldobiouroninc）A3S（>4-β-D-グルクロン酸-(1>4)-α-L-ラムノース3-硫酸-1>）などの繰り返し単位の相対百分率を同定するために、ラムノースおよびグルクロン酸のピーク強度を、スペクトルの残りのピークと比較した。モノマーの相対組成およびその結合の分析により、アルドビオウロン酸およびウルバノビオセス繰り返し単位の相対組成を決定することもできる。結果を表１に示す。
【００６６】
ウルバン試料の硫酸基含量を、1H NMRスペクトル解析に基づき、以下を仮定して計算した：（i）全てのラムノース単位が硫酸化されている；および（ii）グルクロン酸当たりラムノースの1単位が存在する。これらの仮定を考慮すると、計算は以下の構築した方程式1により行われる。結果を表１に示す。
【数１】
2017519731.tif 000002
方程式1 - 1H NMRスペクトルを用いてウルバン硫酸基百分率を計算するために構築された式。式中、wS：硫黄重量；wtotal：全重量；Mw：分子量；A：アノマーCピーク積分：RhmS：硫酸化ラムノース；GA：グルクロン酸；S：硫黄
【００６７】
（推定硫酸化度）
硫酸基含量およびウルバンの分子量に基づいて、硫酸化度を、方程式2を用いて推定した。結果を表１に示す。
【数２】
2017519731.tif 000003
方程式2 -ウルバン硫酸化度（SD）を推定するために構築された式。式中、ST：分子中の全硫黄質量；Mw：ウルバンの分子量；S%：ウルバンの硫酸基含量；ns：硫黄原子の推定数；Mws：硫黄分子量；OT：分子中の全酸素質量；Mwo：酸素分子量；OHT：分子中のヒドロキシル基の総数；MwA：硫黄のない繰り返し単位の分子量；A3SおよびB3S繰り返し単位の分子量は等価であり、式は両方に等しく適用されることに留意。
【００６８】
（分子量）
ウルバンを、0.3MのNaCl（溶出液）に可溶化し、0.1%w/Vの最終濃度とした。溶液を、装置Viscotek TDA 305のゲル浸透クロマトグラフィーにより、3つの検出器：光散乱、屈折率および粘度計を用いて分析した。カラムセットは、ガードプレカラムAq. Guard（Viscotek）およびPLaquagel-OH Mixed 8 μm（Polymer Laboratories）で構成されていた。溶出を、30℃で1ml/分の流速を用いて行った。ポリエチレンオキシドをナロースタンダードとして使用するトリプル検出較正を行い、分子量（Mw）を計算した。結果を表１に示す。
【００６９】
【表１】
2017519731.tif 000004
【００７０】
異なるプロセスから得られたウルバン試料を、その化学的性質について特性評価した。悪評の高い違いは、ウルバン試料の間で、特に平均分子量（Mw）で現れた。加えて、アルドビオウロン酸単位が分析した試料中に最も多く存在していた一方で、試験した試料の組成も著しく異なっていた。このことは、ウルバンPRFDがほぼ30モル%を提示する一方で、90%アルドビオウロン酸、1H NMR分析によるとおそらくA3Sのウルバン121314は、5モル%未満の単糖キシロースを示すことが予期されることを示している。
【００７１】
（実施例２：軟骨分解酵素によるウルバンの分解）
骨関節炎関節を、軟骨基質成分を分解する酵素、すなわちヒアルロニダーゼの発現について特性評価した。加えて、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸系関節内補充剤の急速な分解を促進し、その除去を加速させる。
【００７２】
＜方法＞
（ヒアルロニダーゼへの耐性）
ウルバンをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に室温で溶解させ、0.5、1.0および3.0%w/Vの最終濃度にした。ヒアルロン酸（HA）をリン酸緩衝生理食塩水に室温で溶解させ、0.1、0.5および1.0%w/Vの最終濃度にした。溶液を最適な条件下（pH 7、37℃、48時間、75rpm）で、ヒアルロニダーゼ（EC 3.2.1.35）とインキュベートした。次いで溶液を、多糖分子量の変化について、ゲル浸透クロマトグラフィーにより上記のように評価した。結果を表２に示す。
【００７３】
＜結果＞
ヒアルロニダーゼとの最適条件での48時間のインキュベーション後のウルバンおよびヒアルロン酸の分子量。酵素なしでインキュベートした試料を、対照として使用した。
【００７４】
【表２】
2017519731.tif 000005
【００７５】
ウルバンの分子量は変化しなかったが、HA分子量は、ヒアルロニダーゼとのインキュベーションにより97.3±1%減少した。これらの結果は、ウルバンは最適条件でヒアルロニダーゼ分解に耐性があり、HAに対するヒアルロニダーゼ作用は劇的であることを実証する。HA粘度はその高い分子量に関連するものとして文献に記載されていることを考えると、HAに対するヒアルロニダーゼの分解力は、関節内補充剤としてのHAの効率を低下させる可能性がある。ウルバンのヒアルロニダーゼに対するより一層の安定性は、ウルバンがヒアルロン酸よりも長い時間枠で無傷で残り、結果として、ウルバンのより低い投与量およびより少ない注射が、効果的な痛みの軽減に必要とされるはずであることを意味する。
【００７６】
（実施例３：ウルバンの抗酸化剤および抗凝固剤可能性）
骨関節炎関節は酸化環境を提示し、これは炎症および痛みに関連している。加えて、関節内補充剤の非経口投与、例えば関節内注射による投与は、血流接触の高い危険性を示し、そのため、潜在的な血餅形成誘導を避けることが重要である。この実施例は、ウルバンの還元力能力を実証し、ウルバンは非血栓形成性であり、注射剤としての潜在的な適用に適していることを証明する。
【００７７】
＜方法＞
ウルバン試料およびヒアルロン酸を、実行された各分析に必須の溶媒中に0.5%w/Vで溶解させた。ヒアルロン酸は、変形性関節症の治療のゴールドスタンダードであり、したがって本実施例で比較の基準として使用した。ヘパリンは、抗凝固活性試験のよく知られている標準である。試料の還元力を、以下のプロトコールにより定量した。試料を、PBS中で調製し、フェリシアン化カリウムと混合させ、次いで50℃で20分間加熱した。反応を、トリクロロ酢酸溶液（10%w/V）の添加により停止させた。溶液を遠心分離し、上清を蒸留水および塩化第二鉄（0.1%w/V）と混合した。吸光度を700nmで測定した。アスコルビン酸を、還元力の標準として使用した。結果は表３にある。
【００７８】
抗凝固活性を、基準物質としてヘパリンを用いて定量した。プロトロンビン時間（PT）および活性化部分トロンボプラスチン時間（aTPP）の測定を、非特許文献９により以前から記載されているように行った。結果を表４に示す。
【００７９】
＜結果＞
アスコルビン酸を標準とした、ウルバン試料およびヒアルロン酸の還元力能力
【表３】
2017519731.tif 000006
【００８０】
ウルバンは、アスコルビン酸に比べて35%の還元力を示した。同じ条件で試験したヒアルロン酸は、大きな還元力を示さなかった。この結果は、ウルバンは、ヒアルロン酸とは異なり、骨関節環境における潜在的な抗酸化剤として作用することができることを示している。
【００８１】
【表４】
2017519731.tif 000007
【００８２】
ウルバンは、凝固時間をPT試験ではわずかに増加させることにより、aPTT試験では非常に有意に増加させることにより、抗凝固活性を示す。ヘパリンと比較した場合、ウルバンの抗凝固活性はヘパリンほど高くないことを確認することが可能である。この結果は、ウルバンが虚血反応を促進しないことを示し、これは、非経口経路によるその潜在的な投与を考慮すると、非常に適切である。
【００８３】
これらの結果は、ウルバンが血栓形成応答を誘発することなく、骨関節環境で抗酸化剤として作用することができることを示している。
【００８４】
（実施例４：ウルバンの化学修飾）
全てのウルバン繰り返し単位は、少なくとも1つの反応性基：ヒドロキシル基、カルボキシル基および硫酸基を与える。これらの利用可能な基は、ウルバン多糖類のさらなる化学修飾を可能にする。
【００８５】
＜方法＞
メタクリレート化ウルバンを、特許文献２に記載の方法の適用により作製した。メタクリレート化ウルバン、反応生成物を、酸化重水素に室温で溶解させた。試料を、Varian Unity Plus（Varian、米国）分光計で70℃で得た1H NMRにより分析した。置換度は、非特許文献１０からの方法に基づいて計算した。
【００８６】
メタクリレート化ウルバンを、2Mのトリス-HClおよび40mMのH3BO4中に溶解させ、4%w/Vの最終濃度にした。光開始剤メチルベンゾイルホルメート（MBF）を加えた。溶液をUV光に露出させ、メタクリレート化ウルバンヒドロゲルを作製した。
【００８７】
＜結果＞
図６は、酸化重水素に溶解した反応生成物の70℃での1H NMRスペクトルを表す。5.33-6.18ppmのスペクトル領域でのシグナルは、ビニル炭素結合水素（C=CH2）に帰属するものであった。1.90-1,97ppmに示されるピークは、二重結合（CH3-C=CH2）に隣接するメチル基に帰属された。これらのシグナルは、メタクリレート化ウルバンの形成に成功したこと示している。メタクリレート化ウルバンの置換度は17%±1であった。
【００８８】
図７は、光架橋により生成されたメタクリレート化ウルバンヒドロゲルを示している。ヒドロゲルは、使用する鋳型の形状および黄色がかった着色を示し、これはウルバン溶液の典型的なものである。
【００８９】
（実施例５：ヒト変形性関節症の関節軟骨細胞の初代培養へのウルバン製剤のin vitro効果の評価）
この手順は、本発明に記載の任意のウルバン製剤の評価に適用され得る。
【００９０】
＜方法＞
ヒト関節軟骨を、変形性関節症と診断され、人工膝関節置換を受けた患者から採取した。軟骨細胞を、非特許文献１１に記載の方法に従い単離および培養した。変形性関節症の軟骨細胞を、ウルバン製剤に（Z014、表５を参照）（治療群）、または培地のみに（未治療群）、24時間ばく露させた。細胞を、II型コラーゲン、I型コラーゲンおよびX型コラーゲンの遺伝子発現について、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）によりさらに収集した。非特許文献１２に従い、治療群の遺伝子発現を未治療対照群に対して正規化し、正規化された発現比として提示した。データを、平均値±SDとして提示する。
【００９１】
＜結果＞
図８は、リアルタイムPCR（qRT-PCR）により定量化した3つの遺伝子の正規化された発現比を表す - II型コラーゲン、I型コラーゲンおよびX型コラーゲンタンパク質をコードする遺伝子。治療後、ウルバン製剤は、未治療の細胞、健康な軟骨基質のマーカーと比較して、II型コラーゲン発現の2.9倍の増加を誘導した。不健康な軟骨基質に関連するタンパク質の発現に関して、未治療細胞と比較して、I型コラーゲンは1.7倍アップレギュレートされた一方で、X型コラーゲンは0.06倍ダウンレギュレートされた。この傾向は、OA軟骨細胞のウルバン製剤へのばく露が、II型コラーゲン発現に関連する遺伝子発現を最も顕著に促進することを示し、これは健全な細胞外発現の証拠である。
【００９２】
（実施例６：ウサギ変形性関節症の関節軟骨モデルへのウルバン製剤のin vivo効果の評価）
この手順は、本発明に記載の任意のウルバン製剤の評価に適用され得る。
【００９３】
＜材料および方法＞
ウサギ変形性関節症モデルを使用し、ウルバン製剤（A132、表５を参照）のOAの進行への効果を試験した。変形性関節症の症状を、非特許文献１３に記載の方法に従い、内側半月板切除により動物の膝に誘導した。8週間の治療を、2週間ごとのウルバン製剤の定期的な関節内注射により試験した。治療後、関節軟骨試料を、組織学的分析用に採取した。サフラニンO／ファストグリーン染色を行い、軟骨基質の状態を確認した。
【００９４】
＜結果＞
図９は、サフラニンO／ファストグリーンで染色したウサギ関節軟骨切片の顕微鏡画像を表す。左の画像は、正常な関節軟骨（赤色に染色）および軟骨下骨（青緑色に染色）の染色を示す。中央の画像は、変形性関節症誘導直後の関節軟骨の染色を示す。OAの兆候は、軟骨表面の剥離および線維化、基質内の亀裂、ならびに組織内のグリコサミノグリカンの損失などで明らかである。右の画像は、ウルバン製剤（3%w/V）での治療の8週間後の、変形性関節症の関節軟骨の染色を示す。関節軟骨の物理的状態の目に見える改善が観察される：軟骨基質の強い染色ならびに少ない線維化および亀裂。
【００９５】
（実施例７ - ウルバン製剤）
ウルバン製剤を、無菌環境下で製造する。粉末状ウルバンは、適切な液体中に溶解させることができる。表５は、ウルバン製剤およびその組成を提示する。
【００９６】
（ウルバン製剤A132の調製）
無菌環境下で、固体形態のウルバン30mgを、pH 7の滅菌リン酸緩衝生理食塩水1mLに溶解させた。溶解は、室温で30分後に、回転攪拌下で起こる。
【００９７】
【表５】
2017519731.tif 000008
【図１】
2017519731.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017519731.tif 000015
【図８】
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【図９】
2017519731.tif 000017
【国際調査報告】
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