(57)【要約】本開示は、所定のエピジェネティック修飾を有する染色体に組み込まれた合成配列を含む遺伝的に操作された細胞株を提供するものであり、所定のエピジェネティック修飾は、既知の診断、予後、または疾病治療への感受性のレベルに関連する。また、前記エピジェネティック修飾合成核酸を含むキット、または、治療処置への反応性を予測すること、疾病を診断すること、または疾病予後を予測することに対する参照標準として用いることが可能な、前記エピジェネティック修飾合成核酸を含む細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定のシトシン修飾を有する、少なくとも１つの染色体に組み込まれた核酸を含む、遺伝子改変細胞株であって、前記シトシン修飾は、既知の診断、予後、または疾病治療に対する感受性のレベルに関連する、遺伝子改変細胞株。
【請求項２】
前記シトシン修飾が、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、３−メチルシトシン（３ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−フォルミルシトシン（５ｆＣ）または５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）から選択される、請求項１に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項３】
前記染色体に組み込まれた核酸が、疾病に関連する遺伝子の制御エレメント、制御エレメントの一部、コード領域、またはコード領域の一部のものと実質的配列同一性を有する配列を有する、請求項１または請求項２のいずれかに記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項４】
前記遺伝子が、表１に列挙される遺伝子である、請求項３に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項５】
前記遺伝子が、ＭＧＭＴ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＩＴＸ２、ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＳＳＦ１またはＨＥＲ２から選択される、請求項４に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項６】
前記染色体に組み込まれた核酸が、標的エンドヌクレアーゼを用いて、前記細胞内の染色体位置に挿入される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項７】
前記標的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲベースエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼ若しくは関連モノマーハイブリッド、または、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘発剤から選択される、請求項６に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項８】
前記染色体に組み込まれた核酸が、前記染色体に組み込まれた核酸が由来する内因性染色体配列を置き換える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項９】
前記染色体に組み込まれた核酸が、前記染色体に組み込まれた核酸の元のシトシン修飾状態を保持することを支援する隣接インスレーティングエレメントまたは他のエレメントを所有する遺伝子座で挿入される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項１０】
前記遺伝子座が、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴまたはＲＯＳＡ２６から選択される、請求項９に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項１１】
前記染色体に組み込まれた核酸に対応する内因性染色体配列が、不活性化される、または欠失される、請求項９に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項１２】
組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項１３】
前記細胞株がヒト細胞株である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項１４】
前記所定のシトシン修飾が安定性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項１５】
前記所定のシトシン修飾が準安定性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の遺伝子改変細胞株。
【請求項１６】
対象内の疾病の治療処置に対する反応性を予測するためのキットであって、前記キットは、参照標準としての使用のための所定のシトシン修飾を有する少なくとも１つの核酸を含み、前記シトシン修飾は、既知の診断、予後、または、疾病治療への感受性のレベルに関連する、キット。
【請求項１７】
対象内での疾病を診断するためのキットであって、前記キットは、参照標準としての使用のための所定のシトシン修飾を有する少なくとも１つの核酸を含み、前記シトシン修飾は、既知の診断、予後、または疾病治療への感受性のレベルに関連する、キット。
【請求項１８】
対象内の疾病の予後を予測するためのキットであって、前記キットは、参照標準としての使用のための所定のシトシン修飾を有する少なくとも１つの核酸を含み、前記シトシン修飾は、既知の診断、予後、または疾病治療への感受性のレベルに関連する、キット。
【請求項１９】
少なくとも２つの核酸を含み、各核酸は、異なる所定のシトシン修飾を有する、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
前記シトシン修飾が、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、３−メチルシトシン（３ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−フォルミルシトシン（５ｆＣ）または５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）から選択される、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
前記核酸が、疾病に関連する遺伝子の制御エレメント、制御エレメントの一部、コード領域、またはコード領域の一部のものと実質的配列同一性を有する配列を有する、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
前記遺伝子が、表１に列挙される遺伝子である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記遺伝子が、ＭＧＭＴ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＩＴＸ２、ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＳＳＦ１またはＨＥＲ２から選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記核酸が、細胞の染色体内に位置する、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
前記細胞が、固定細胞である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記核酸が、前記細胞から単離されるゲノムＤＮＡ内に存在する、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ゲノム配列のエピジェネティック修飾に関する。特に、本開示は、所定のエピジェネティック修飾を有する、染色体に組み込まれた核酸配列を含む、遺伝的に操作された細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の異常な遺伝子機能及びパターン変化は、多数の疾病及び条件の重要な特徴である。エピジェネティック変化が遺伝子異常に関与して、調節不全を引き起こすことを示す証拠が、増加している。ゲノムＤＮＡにおけるエピジェネティック修飾の検出及び定量化が、近年進歩し、数多くの疾病、例えば、癌に対する診断及び予測の分析の新世代を導いている。さらに、所定の疾病治療計画に対する感受性のレベルに対して、エピジェネティック変化が相関することが示され、その結果、これは処理決定に用いられる。
【０００３】
エピジェネティック修飾に基づいた、診断及び予測の分析ならびに処理手順の発展の進歩にもかかわらず、エピジェネティック変化状態の判断に利用可能な細胞比較基準が、現在、存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
近年、ゲノム編集技術の進歩を用いて、ヒト細胞のゲノムを組み換え、臨床サンプル内で観測される遺伝子型を反映する疾病モデルを作成することに関心がもたれている。研究目的のためのフェノタイプの分析に加えて、臨床分析のための遺伝子型比較または基準として、遺伝的にまたはエピジェネティックに操作された細胞をさらに用いることも可能である。その組換え比較細胞株の利益において、以下である。（１）これらは、天然細胞及びゲノム状況の範囲で、細胞溶解の全てのその後の診断処理工程（またはホルマリン固定、パラフィン埋設（ＦＦＰＥ）抽出）、ＤＮＡ隔離及び拡大を経るＤＮＡ分析テンプレートを提供し、及び（２）遺伝的なまたはエピジェネティックな変更により、安定かつ大量のゲノムＤＮＡを提供する細胞型にモデル化することが可能である。
【０００５】
本開示の１つの態様では、所定のエピジェネティック修飾を有する、少なくとも１つの染色体に組み込まれた核酸を含む、遺伝的に操作された細胞株であって、所定のエピジェネティック修飾は、既知の診断、予後、及び／または疾病治療に対する感受性のレベルに関連する、細胞株を提供するものである。ある態様では、エピジェネティック修飾は、シトシンの修飾、例えばシトシンのメチル化である。特定の態様では、エピジェネティック修飾核酸は、疾病に関連する遺伝子の制御エレメントまたは制御エレメントの一部のものと、実質的に配列が同一である。他の態様では、エピジェネティック修飾核酸は、疾病に関連する遺伝子のコード領域または遺伝子の一部のコード領域のものと、実質的に配列が同一である。疾病及び／または疾病処理予後に関連するエピジェネティック変化を有する遺伝子の例が、ここに提供される。ある態様では、エピジェネティック修飾核酸は、エピジェネティック修飾核酸が由来する内因性染色体配列を置き換えることが可能である。したがって、内因性染色体配列の天然エピジェネティック状態を、挿入した合成核酸の所定のエピジェネティック状態に変えることが可能である。あるいは、所定のエピジェネティック修飾を有している核酸を、挿入した核酸の所定のエピジェネティック修飾状態の保持を支援する隣接インスレーティングエレメントまたは他のエレメントを含む遺伝子座、例えばＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５またはＳＯＳＡ２６、で挿入することが可能である。この例では、合成エピジェネティック修飾配列に対応した内因性染色体配列を、不活性化することが可能であり、または欠失することが可能である。組み込まれた核酸のエピジェネティック修飾状態を、安定性（ｓｔａｂｌｅ）とすることができ、または準安定性（ｍｅｔａｓｔａｂｌｅ）とすることができる。標的とするエンドヌクレアーゼを用いて、エピジェネティック修飾を有する核酸を、関心の染色体場所に挿入することが可能である。標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼ若しくは関連モノマーハイブリッド、または人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘発剤とすることができる。任意に、組み込まれたエピジェネティック修飾配列を含む細胞は、組換えタンパク質をコードする核酸を少なくとも１つ、さらに含むことが可能である。組換え細胞株は、ヒト細胞株を含む哺乳類の細胞株とすることができる。
【０００６】
所定のエピジェネティック修飾を有する組み込まれた核酸を含む組換え細胞または細胞株は、数個の用途を有している。特定の態様では、調節領域のエピジェネティック状態を変更する合成配列の挿入を保有する改変細胞を用いて、遺伝子発現を支配または変更することができる。例えば、通常は修飾でない（すなわち通常はメチル化ではなくまたは高メチル化ではない）内因性調節染色体配列に加えて、またはこの代わりに、エピジェネティック修飾合成配列（例えばメチル化配列）の挿入を有する細胞を用いて、遺伝子発現を変更することが可能である。逆に、エピジェネティック修飾を有すると知られる内因性調節配列をエピジェネティック修飾が欠ける合成配列に置換すること、または、エピジェネティック修飾が欠ける合成配列を挿入することを用いて、遺伝子発現を変更することが可能である。別の態様では、エピジェネティック修飾配列の挿入を有する組換え細胞を用いて、エピジェネティック修飾パターンについての推測的な知識または挿入された配列の状態に基づき、細胞内での修飾配列のエピジェネティック安定性を分析することが可能である。他の態様では、エピジェネティック修飾配列の挿入を有する組換え細胞を、それらの既知または所定のエピジェネティック修飾状態の理由により、比較細胞株として、診断及び／または予測の分析に用いることが可能であり、これにより、この分析の診断及び／または予測の基準として役に立つ。さらなる態様では、エピジェネティック修飾配列の挿入を有する細胞を、分析に用いて、ドラッグ治療計画の適合性を判断することが可能である（図３を参照）。したがって、前記配列を含むエピジェネティック修飾配列及び細胞を、（癌などの）疾病診断の分析での参照規格として用いて、疾病予後を予測し、疾病挙動を監視し、そして標的治療への応答を測定することが、可能である。
【０００７】
本開示は、対象での疾病の治療処置への反応性を予測するための、対象での疾病を診断するための、または、対象での疾病の予後を予測するための、キットをさらに提供するものであり、ここで、キットは、既知の診断、予後、または疾病処理に対する感受性のレベルに関連する所定のエピジェネティック修飾を有する少なくとも１つの核酸を含んでいる。
【０００８】
本開示の追加の態様及び繰り返しを、以下でさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術を用いて合成メチル化ＤＮＡの標的組み込みを図解する図である。標的ＺＦＮによるＡＡＶＳ１標的部位の開裂、及び、細胞ＤＮＡ修復プロセスによる１９ｂｐのＭＧＭＴ遺伝子断片を含む供与体配列のターゲット場所への組み込みを、図解する。図１Ｂは、３つの異なる所定のメチル化パターン化を図解する。＊シンボルは、ＭＧＭＴ遺伝子断片内での４つのＣｐＧサイト（すなわち、１、２、３、４）のことをいう。
【図２】合成メチル化パターンの安定性を経時的に示す。培養の４９日後または８０日後の、コロニー＃１またはコロニー＃７のＭＧＭＴ遺伝子断片における各ＣｐＧサイトのメチル化割合をプロットする。
【図３】神経膠芽腫を処理するためにテモゾロマイドを処方するか否かを決定するための、ＭＧＭＴプロモーターメチル化状態の用途を示す概略図を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、エピジェネティック修飾を含む合成核酸と、ここに詳述する前記合成配列を含む組換え細胞または細胞株とを提供する。疾病フェノタイプ、特に癌に関しての、それらの影響のため、エピジェネティック修飾はますます評価されている。本開示に従ってエピジェネティック修飾を有する合成配列を含む細胞を、安定かつ研究及び臨床目的で利用可能な大量のゲノムＤＮＡを提供する細胞型にモデル化してもよい。本開示の細胞は、哺乳動物細胞内でエピジェネティック修飾を伴う、生理的に適切かつ強力な分析のための細胞参照規格として、さらに用いることが可能である。この基準は、診断及び予測の分析において、及び個々の対象の治療計画の評価において、有用である。
【００１１】
Ｉ．所定のエピジェネティック修飾を有する核酸
（ａ）エピジェネティック修飾
本開示は、所定のエピジェネティック修飾を有する核酸を提供し、ここで、所定のエピジェネティック修飾は、既知の診断、予後または疾病処理に対する感受性のレベルに関連する。一般に、エピジェネティック修飾核酸は、エピジェネティック修飾が化学的に生成される合成核酸である。一つの態様では、エピジェネティック修飾は、シトシン修飾である。シトシン修飾は、当業者に知られる前述の任意の修飾であってもよく、これは例えば、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、３−メチルシトシン（３ｍＣ）及び５−ヒドロキシメチルシトシンを含むシトシンのメチル化、５−フォルミルシトシン（５ｆＣ）、ならびに５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）である。一実施形態では、エピジェネティック修飾は、例えば５−メチルシトシン（５ｍＣ）、３−メチルシトシン（３ｍＣ）及び５−ヒドロキシメチルシトシンを含むシトシンのメチル化である。１つの例では、修飾シトシンは、５−メチルシトシンである。一実施形態では、メチル化シトシンがＣｐＧに存在し、個々のＣｐＧサイトに存在できるか、またはＣｐＧｓのクラスタにグループ化でき、ＣｐＧアイランドと呼ばれる。
【００１２】
一つの態様では、シトシン修飾は、メチル化及びヒドロキシメチル化の両方を含むメチル化状態シトシンの修飾である。メチル化状態は、配列内のメチル化シトシン残基の数または割合、すなわちメチル化量、または、配列内のメチル化残基のパターンなどの、特徴のことをいう。対象とする遺伝子ならびに出力の使用目的に基づき、所定のメチル化状態を調整してもよい。ある態様では、細胞参照規格はメチル化量が高いことを示すことが望ましく、またあるいは、メチル化が低いまたは不在であることを好んでもよい。メチル化の量を計算するための、当該技術分野の通常の知識を有する者に知られる異なる数個の基準が、理解されよう。例えば、メチル化量は、特定のＣｐＧアイランドのメチル化残基の割合でもよく、または、数個のＣｐＧアイランドにおけるメチル化の平均でもよい。一般に形態ＣＨＧ及びＣＨＨを有する配列等のＨがＡ、ＣまたはＴである（例えばＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＡＡ、ＣＡＴ等の）ような、ＣｐＧアイランド以外の特徴もまたメチル化してもよいことが、当業者により理解される。また、メチル化量を、染色体配列全体にわたって包括的に測定してもよい。
【００１３】
任意の適切な規則を用いて、メチル化または非メチル化であるように、核酸を記載してもよい。例えば、当業者は、ＣｐＧ残基の少なくとも１０％が特定のアイランドでメチル化される場合、メチル化核酸を考慮してもよく、そして、ＣｐＧ残基の１０％未満がメチル化される場合は、非メチル化を考慮してもよい。もちろん、ＣｐＧ残基以外の特徴がメチル化される場合は、必要に応じて、前述のメチル化を計算にさらに含んでもよい。あるいは、核酸は、所定の割合のメチル化量を有するように記載されてもよく、例えば、シトシン残基の約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、メチル化である。介在値が想定されることが、さらに理解される。メチル化が０％または約０％である核酸が、さらに想定される。質的にメチル化量を同定すること、例えば「高い」、「適度」、または、「低い」等は、当業者にさらに好都合であってよい。前述の用語は、（１）通常のまたは健康な細胞の内因性染色体配列に見出されるメチル化の量、（２）特定のフェノタイプを有する細胞の内因性染色体配列に見出されるメチル化の量であって、異常若しくは疾病フェノタイプ及び／またはドラッグ処理感度若しくは耐性のフェノタイプを含むが限定されない、（３）通常の遺伝子発現レベルに対応する内因性染色体配列に見出されるメチル化の量；及び、（４）異常遺伝子発現レベル（すなわち過剰発現または過小発現）に対応する内因性染色体配列に見出されるメチル化の量、を参照して、必要に応じて容易に定義されてもよい。
【００１４】
メチル化状態とは、単独で、またはメチル化残基の割合と組み合わせて、対象となる核酸のメチル化の特定のパターンを指してもよい。しかしながら、当業者は、本開示の核酸のメチル化と、対象から取得したサンプルで検出した内因性染色体配列のメチル化との間、ならびに以前に知られたまたは確立されたメチル化量及び／またはパターンとの間の、類似点及び差を解釈することができることを、理解するだろう。
【００１５】
メチル化の量及び／またはパターンを決定する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、デジタル定量化（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７：８５８−８６３（２００９）及び補助材料（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１５５９））；染色体配列を亜硫酸水素ナトリウムと反応させた後ＰＣＲが続くことが関与するメチル化特定ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９３：９８２１−９８２６（１９９６）；Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：５９４−５９９（１９９７）；Ｈｅｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０：１８７１−１８７４（２００４））；全ゲノム重硫酸塩配列決定（ＢＳ−Ｓｅｑ）；（メチル化過敏制限酵素またはメチル化依存制限酵素を用いた）メチル化及び非メチル化ＤＮＡを特異的に開裂する制限酵素の能力が関与するＨＥＬＰ分析；ＤＮＡ−メチル化−関連タンパク質に結合する抗体の能力に基づくＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ分析；ＨＥＬＰ分析に類似した制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１４：２５１−２５８（１９９３）；Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２４：１３２−１３８（２０００））；メチル化ＤＮＡ断片を単離するために用いられるメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）；重硫酸塩処理したＤＮＡのパイロシーケンス（Ｔｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３５：１５２−１５６（２００３））；ＭＳ−ｑＦＲＥＴ（Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，１９：１４５５−１４６１（２００９））；定量的な特異的メチル化領域（ＱＤＭＲ）；メチル過敏サザンブロッティング（ＨＥＬＰ分析に類似）；メチルライト、ＭＳ  ＨＲＭ、メチルメーター（商標）（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，「メチルメーター（商標）：ＤＮＡメチル化の分析のための、定量、過敏及び重硫酸塩フリーな方法」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第５章中の、「ＤＮＡメチル化−ゲノミクスから技術まで；ｅｄｓ  Ｔ．Ｔａｔａｒｉｎｏｖａ  ａｎｄ  Ｏ．Ｋｅｒｔｏｎ、Ｉｎ−Ｔｅｃｈ，Ｍａｒｃｈ  ２０１２，ｐｐ．９３−１１６）；ＧＬＩＢ（Ｐａｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７３：３９４−３９７（２０１１））；抗ＣＭＳ（Ｐａｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７３：３９４−３９７（２０１１））；及び、天然ＤＮＡの、メチル化及び非メチル化フラクションへの分離に用いられる、メチルＣｐＧ結合タンパク質の利用、が挙げられる。５−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡメチル化を検出する他の方法が、記載される（Ｓｚｗａｇｉｅｒｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８：ｅ１８１（２０１０）。
【００１６】
（ｂ）所定のエピジェネティック修飾を有する核酸の配列
ここに開示される所定のエピジェネティック修飾による核酸は一般に、対象とする遺伝子の、転写調節因子、一部の転写調節因子、コード領域、または一部のコード領域、のものとの実質的配列同一性を有するヌクレオチド配列を有しており、対象とする遺伝子は、疾病または疾患と関連する。ここに用いられる場合において、「実質的配列同一性」という語句とは、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列のことをいう。様々な態様では、エピジェネティック修飾を有する合成染色体配列は、対象とする遺伝子に対して、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の、配列同一性を有することができる。
【００１７】
ある態様では、所定のエピジェネティック修飾を有する核酸は、対象とする遺伝子に関連する転写調節因子のものと実質的配列同一性を有している。制御エレメントは、遺伝子の転写を調節するプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、遺伝子座制御エレメントまたは任意の配列とすることができる。転写調節因子は、対象とする遺伝子のコードまたは非コード（例えばイントロン）領域の上流、下流、またはその領域内に位置することができる。特定の態様では、制御エレメントは、その対象とする遺伝子の、転写開始部位の上流のまたは５’領域内の、プロモーターまたはプロモーターの部分である。ある態様では、制御エレメントのエピジェネティック修飾（例えば、シトシンメチル化）は、遺伝子の転写を、完全にまたは部分的に抑制する。
【００１８】
他の態様では、所定のエピジェネティック修飾を有する核酸は、疾病に関係した遺伝子のコード領域（すなわち１つ以上のエキソン）またはコード領域の一部のものと、実質的配列同一性を有している。一実施形態では、所定のエピジェネティック修飾を有する核酸は、対応する天然のまたは内因性染色体配列（すなわち通常の若しくは無病の細胞の対応する内因性配列または通常の遺伝子発現中に見出される対応する内因性配列（過剰発現または過小発現とは対照的に））と比較して、高メチル化である。別の実施形態では、所定のエピジェネティック修飾を有する核酸は、対応する天然のまたは内因性染色体配列と比較して、低メチル化である。エキソン及びイントロンを含む染色体領域は、ＣｐＧ位置（ＣｐＧアイランドとして存在してもよい、または存在しなくてもよい）のメチル化を通して、遺伝子発現を調節することが、知られている。既知のエキソン及びイントロンのメチル化応答による遺伝子の例は、ＭＧＭＴ及びＣＸＣＲ４をはじめとして、この他にここに定める多数の物が含まれる。
【００１９】
ある態様では、所定のエピジェネティック修飾を有する核酸は、疾病に関連する遺伝子に由来する。対象とする遺伝子は、エピジェネティック修飾配列を有することが知られる遺伝子及び疾病に関連する遺伝子を含むものであり、この疾病は、例えば癌、自己免疫性疾患（例えば１型糖尿病、炎症性腸疾患）、炎症疾病（例えば喘息）、代謝性疾患、自閉症スペクトラム疾患、及び異常な遺伝子発現に関連する他の条件等である。対象とする特定の遺伝子は、ＭＧＭＴ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、セプチン９、ＰＩＴＸ２、ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＳＳＦ１、ＨＥＲ２、Ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ、Ｒｂ、Ｅ−ｃａｄ、ならびにこの部分に記載される他の遺伝子を含む。さらに、対象とする遺伝子の非限定的なリストが、下記の表Ａに提供される。
【００２０】
ここに記載される遺伝子は、異常なＤＮＡメチル化による等のプロモーター領域内でのエピジェネティック修飾により、完全にまたは部分的に抑制されることが知られている遺伝子を含む（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２８：６８３−６９２（２００７）；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１６３−１６７（１９９９）；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３、４１５−４２８（２００２））。例えば、ハイパーメチル化は、５−メチルシトシンの量が非常に高い場合は、プロモーター領域を介して転写を抑制してこれにより疾患遺伝子の発現を防止する、主要エピジェネティック修飾の１つである。所定の癌が、遺伝子の高メチル化プロモーター領域に関連することが周知であり、この遺伝子は例えば、癌抑制遺伝子（例えばＲｂ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１５ｉｎｋ４ｂ、ｐ７３、ＡＰＣ及びＶＨＬ）、転写因子遺伝子（例えばＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−５、ＨＩＣ１及びＥ−カドヘリン）、ＤＮＡ修復遺伝子（例えばＢＲＣＡ１、ＷＲＮ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＮＥＩＬ１、ＦＡＮＣＢ、ＭＳＨ４、ＡＴＭ及びＧＳＴＰ１）、細胞サイクル調節に関係する遺伝子（例えばｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１５ｉｎｋ４ｂ、ｐ１４ａｒｆ及びＣＤＫＮ２Ｂ）、アポトーシスに関する遺伝子、転移及び侵入に関する遺伝子（例えばＣＤＨ１、ＴＩＭＰ３及びＤＡＰＫ）、及び、代謝酵素遺伝子が挙げられる。例えば、胸、卵巣、消化管（胃及び結腸）、膵臓、肝臓、腎臓、結腸直腸、肺、膀胱、頸部、脳、神経膠腫、白血病、メラノーマ、前立腺、及び頭頸部の癌は、ＢＲＣＡ１、ＷＲＮ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＮＥＩＬ１、ＦＡＮＣＢ、ＭＳＨ４、Ｒｂ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１５ｉｎｋ４ｂ、ｐ７３、ＡＰＣ、ＶＨＬ、ＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−５、ＨＩＣ１、Ｅ−カドヘリン、ｐ１４ａｒｆ、ＣＤＨ１、ＴＩＭＰ３、ＤＡＰＫ及びＡＴＭ（すなわち、胸−ＧＳＴＰ１、ＢＲＣＡ１、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ＷＲＮ；卵巣−ＢＲＣＡ１、ＷＲＮ、ＦＡＮＣＦ、ＧＳＴＰ１、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ＲＡＤ５１Ｃ；結腸直腸−ＭＧＭＴ、ＡＰＣ、ＷＲＮ、ＭＬＨ１、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ａｒｆ、ＭＳＨ２；頭頸部−ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＮＥＩＬ１、ＦＡＮＣＢ、ＭＳＨ４、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ＤＡＰＫ、ＡＴＭ；膀胱−ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ＤＡＰＫ；頸部−ｐ１６ｉｎｋ４ａ；メラノーマ−ｐ１６ｉｎｋ４ａ；神経膠腫−ｐ１６ｉｎｋ４ａ；消化管−ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ａｒｆ、ＭＬＨ１、ＭＧＭＴ、ＡＰＣ；肝臓−ＧＳＴＰ１；前立腺−ＧＳＴＰ１；肺−ＤＡＰＫ、ＭＧＭＴ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ）の高メチル化プロモーター領域に関連する。数多くのヒト腫瘍型にわたるいくつかの異なる遺伝子の遺伝子プロモーターハイパーメチル化のプロファイルは、Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１：３２２５−３２２９（２００１）、及びそこに引用された多くの文献に報告される。Ｂａｙｌｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２：Ｓ４−Ｓ１１（２００５）を、さらに参照されたい。
【００２１】
ここに記載される遺伝子は、異常なＤＮＡメチル化等のプロモーター領域のエピジェネティック修飾が、所定の化学療法剤等の所定の治療計画に対する特定の予後または感受性に関連するように示された遺伝子を、さらに含んでいる。例えば、ｍｇｍｔのプロモーターのメチル化が、テモゾロマイドへの反応性に関連した。例えば、Ｈｅｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０（６）：１８７１−４（２００４）；Ｈｅｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３５２（１０）：９９７−１００３（２００５）；  Ｂｏｏｔｓ−Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２６（７）：９２２−９（２０１３）を参照されたい。同様に、ｂｒｃａ１及びｂｒｃａ２プロモーターのメチル化が、乳癌予後を決定するために確立した診断手順の一部として、検討された。例えば、Ａｂｋｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０７（１０）：１７７６−８２（２０１２）を参照されたい。さらに、セプチン９のためのメチル化分析が、結腸直腸がんの病理評価に採用された。例えば、Ｇｒｕｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏｓ  ｏｎｅ，３（１１）：ｅ３７５９（２００８）を参照されたい。また、Ｅ−カドヘリンプロモーターのメチル化は、腫瘍抑制能力の低下及び転移可能性の増加に関連する。例えば、Ｇｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２２）：５１９５−９（１９９５）を参照されたい。
【００２２】
ここに提供される他の遺伝子は、包括的な低メチル化が癌の発展及び進行に関連する遺伝子を含んでいる。例えば、５−ヒドロキシメチルシトシンの喪失が、メラノーマのエピジェネティックの特質であり（Ｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ，１５０：１１３５−１１４６）；包括的な低メチル化が、乳癌において抑制クロマチン領域及び遺伝子サイレンシングの生成に関連づけられ（Ｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ２２（２）；２４６−５８）；包括的な低メチル化が、ヒト結腸癌組織で観測される（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｌａｚｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｕｔ４７：６８９−９３）。
【００２３】
また、対象とする遺伝子は、自閉症スペクトラム疾患（ＡＳＤ）の発生及び／または重症度に関連する遺伝子を含んでいる。ＡＳＤの遺伝性評価は高いものの、ＡＳＤが一致する一卵性双生児間における症状の重症度の明白な差が、ＡＳＤ病因論における非遺伝的なエピジェネティック因子の役割を示唆している（Ｃ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２０１３（１−９），先行オンライン出版  ２０１３年４月２３日；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｐ．２０１３．４１を参照）。このような遺伝子は、例えば、ＭＢＤ４、ＡＵＴＳ２、ＭＡＰ２、ＧＡＢＲＢ３、ＡＦＦ２、ＮＬＧＮ２、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＳＮＲＰＮ、ＳＮＵＲＦ、ＵＢＥ３Ａ、ＫＣＮＪ１０、ＮＦＹＣ、ＰＴＰＲＣＡＰ、ＲＮＦ１８５、ＴＩＮＦ２、ＡＦＦ２、ＧＮＢ２、ＧＲＢ２、ＭＡＰ４、ＰＤＨＸ、ＰＩＫ３Ｃ３、ＳＭＥＫ２、ＴＨＥＸ１、ＴＣＰ１、ＡＮＫＳ１Ａ、ＡＰＸＬ、ＢＰＩ、ＥＦＴＵＤ２、ＮＵＤＣＤ３、ＳＯＣＳ２、ＮＵＰ４３、ＣＣＴ６Ａ、ＣＥＰ５５、ＦＣＪ１２５０５、ＳＲＦ、ＤＮＰＥＰ、ＴＳＮＡＸ、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＲＣＮ２、ＭＢＴＰＳ２、ＰＫＩＡ、ＤＡＰＰ１、ＣＣＤＣ４１、ＨＯＸＣ５、ＲＰＬ１４、ＰＳＭＢ７、ＴＡＦ７、ＩＮＨＢＢ、ＨＮＲＰＡ０、ＭＣ３Ｒ２０、ＢＤＫＲＢ１、ＦＤＦＴ１、ＲＡＤ５０、２１ｃｇ０３６６０４５１、ＲＥＣＱＬ５、ＺＮＦ４９９、ＡＲＨＧＡＰ１５、ＰＴＰＲＣＡＰ、Ｃ１８ｏｒｆ２２、ＲＡＦＴＬＩＮ、Ｃ１４ｏｒｆ１４３、ＳＵＰＴ５Ｈ、ＡＮＸＡ１、Ｃ１６ｏｒｆ４６、ＧＡＰＤＨ、ＦＫＢＰ４、ＬＯＣ１１２９３７、ＳＬＣ３０Ａ３、ＺＮＦ６８１、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＥＬＡ２、ＤＵＳＰ２、ＣＤＣ４２ＳＥ１、ＰＮＭＡ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＤＩＤＯ１、ＳＣＵＢＥ３、ＣＡＳＰ８、ＴＨＲＡＰ５、ＥＴＳ１、ＰＸＤＮ、ＴＭＥＭ１６１Ａ、ＨＯＸＡ９、Ｃ１１ｏｒｆ１、ＭＧＣ３２０７、ＯＲ２Ｌ１３、Ｃ１９ｏｒｆ３３、Ｐ２ＲＹ１１、ＮＲＸＮ１及びＩＳＬ１を含んでいる。
【００２４】
表Ａは、例示的な遺伝子を列挙する。
表Ａ．対象とする遺伝子
【表１−１】
2017517250.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【００２５】
（ｃ）核酸の型
ここに開示される所定のエピジェネティック修飾を有する核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖、二本鎖、直鎖、または環状とすることができる。エピジェネティック修飾核酸が二本鎖である反復では、エピジェネティック修飾パターンは、二本の鎖上で同じものまたは異なるものとすることができる。ある実施形態では、両方の鎖が、エピジェネティック修飾を欠如していてもよい。他の実施形態では、二本鎖の一方が、エピジェネティック修飾を有していてもよい（すなわち半修飾（ｈｅｍｉ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ））。さらなる実施態様では、両方の鎖が、エピジェネティック修飾を有していてもよい（すなわち二本鎖修飾（ｄｕｐｌｅｘ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ））。一部の例では、所定のエピジェネティック修飾を有する核酸は、一本鎖の直鎖分子、例えばオリゴヌクレオチドなど、とすることができる。他の例では、エピジェネティック修飾核酸は、二本鎖の直鎖分子とすることができる。２つの補完的な一本鎖核酸をアニールすることにより、二本鎖の直鎖核酸を調製することができ、または、長い二本鎖核酸の酵素の開裂を通じて、前述の核酸を調製することができる。ある態様では、二本鎖の直鎖核酸は、標的エンドヌクレアーゼにより作成される突出部と両立する突出部を有することができる。（以下に詳述するように、細胞のゲノムの特定の標的位置に所定のエピジェネティック修飾を有する核酸を挿入するため、標的エンドヌクレアーゼを用いることができる。）突出部は、長さで１、２、３、４、５またはそれ以上のヌクレオチドとすることができる。他の反復では、エピジェネティック修飾を有する直鎖（一本鎖または二本鎖）核酸内でのヌクレオチドの一部または全部は、ホスホロチオ酸結合により関連づけることができる。例えば、一方の末端または両方の末端上の終末の２、３、４またはそれ以上のヌクレオチドは、ホスホロチオ酸結合を有することができる。他の態様では、エピジェネティック修飾核酸は、環状とすることができる。例えば、所定のエピジェネティック修飾を有する核種酸は、以下に詳細に説明するように、例えばプラスミドベクトルのように、大きなポリヌクレオチドの部分とすることができる。
【００２６】
エピジェネティック修飾を有する核酸の長さを、変えることが可能である。一般に、エピジェネティック修飾核酸の長さを、約５ヌクレオチド（ｎｔ）または塩基対（ｂｐ）から約２００，０００ｎｔ／ｂｐまで変化させることができる。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾核酸の長さを、約５ｎｔ／ｂｐから約２００ｎｔ／ｂｐまで、約２００ｎｔ／ｂｐから約１０００ｎｔ／ｂｐまで、約１０００ｎｔ／ｂｐから約５０００ｎｔ／ｂｐまで、約５，０００ｎｔ／ｂｐから約２０，０００ｎｔ／ｂｐまで、または、約２０，０００ｎｔ／ｂｐから約２００，０００ｎｔ／ｂｐまで、変化させることが可能である。
【００２７】
ある態様では、エピジェネティック修飾核酸は、少なくとも１つの隣接配列をさらに含んでいてもよい。隣接配列は、上流、下流、またはこれら両方にあってもよい。一つの態様では、エピジェネティック修飾核酸は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む上流及び／または下流配列に隣接することができる。上記のように、エピジェネティック修飾核酸は、標的エンドヌクレアーゼにより作成された突出部と適合性がある突出部に（上流、下流、またはこれら両方に）隣接することができる。追加の態様では、エピジェネティック修飾核酸は、エピジェネティック修飾核酸のエピジェネティック修飾を安定させることができる少なくとも１つのインスレーティングエレメントに（上流、下流、またはこれら両方に）隣接することができる。インスレーティングエレメントは、当該技術分野で知られており、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：２７１−８８（２００２）；Ｂａｒｋｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４（１）：６７−８０（２０１２）を参照されたい。
【００２８】
さらなる態様では、エピジェネティック修飾核酸は、標的エンドヌクレアーゼにより認識されるターゲット部位の一方上にある配列と、実質的配列同一性を有する配列に（上流、下流、またはこれら両方に）隣接することができる。例えば、エピジェネティック修飾核酸は、上流配列及び下流配列に隣接することができ、この上流配列及び下流配列のそれぞれは、標的エンドヌクレアーゼにより認識されるターゲット部位の上流または下流にそれぞれに位置する配列と、実質的配列同一性を有している。このような場合、エピジェネティック修飾核酸は、相同性指向プロセスにより、標的染色体位置に挿入することが可能である。上記のように、「実質的配列同一性」という語句は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列のことをいう。したがって、エピジェネティック修飾核酸に隣接する上流及び下流配列は、標的部位に対する上流または下流の配列に対して、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の、配列同一性を有することができる。非限定的な例では、エピジェネティック修飾核酸に隣接する上流及び下流配列は、標的部位の染色体配列上流または下流それぞれと、約９５％または１００％の配列同一性を有することができる。
【００２９】
ある態様では、上流配列は、標的部位のすぐ上流に位置（すなわち標的部位に隣接）する染色体配列と、実質的配列同一性を共有してもよい。他の態様では、上流配列は、標的部位からの約百（１００）個のヌクレオチドだけ上流に位置する染色体配列と、実質的配列同一性を共有する。したがって、例えば、上流配列は、約１〜約２０個、約２１〜約４０個、約４１〜約６０個、約６１〜約８０個、または約８１〜約１００個のヌクレオチドだけ、標的部位から上流の染色体配列と、実質的配列同一性を共有することができる。一実施形態では、下流配列は、標的部位のすぐ下流に位置（すなわち標的部位に隣接）する染色体配列と、実質的配列同一性を共有する。他の態様では、下流配列は、約百（１００）個のヌクレオチドだけ標的部位から下流に位置する染色体配列と、実質的配列同一性を共有する。したがって、例えば、下流配列は、約１〜約２０個、約２１〜約４０個、約４１〜約６０個、約６１〜約８０個、または約８１〜約１００個のヌクレオチドだけ、標的部位から下流に位置する染色体配列と、実質的配列同一性を共有することができる。各上流または下流配列は、約１０個のヌクレオチドから約５０００個のヌクレオチドまで、長さを変化できる。ある態様では、上流及び下流配列は、約１０〜約５０個、約５０〜約１００個、約１００〜約５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約２０００個、または約２０００〜のヌクレオチドを含むことができる。特定の態様では、上流及び下流配列は、約２０〜約５００個のヌクレオチドで長さを変化させることが可能である。
【００３０】
さらに他の態様では、エピジェネティック修飾核酸は、標的エンドヌクレアーゼにより認識される（そして開裂される）少なくとも１つの配列に（上流、下流、またはこれら両方に）隣接することが可能である。特定の態様では、エピジェネティック修飾核酸は、標的エンドヌクレアーゼにより認識されるターゲット部位に両側で隣接することができる。この例では、標的エンドヌクレアーゼは、エピジェネティック修飾核酸を含む大きなポリヌクレオチドを開裂することもでき、これにより、エピジェネティック修飾核酸を、標的エンドヌクレアーゼにより生成される染色体ＤＮＡの突出部と適合性を持つ突出部を有する直鎖分子として、解放する。その結果、エピジェネティック修飾核酸を含む解放配列を、直接ライゲーションにより、望ましい染色体位置に挿入することができる。したがって、ライゲーションされる配列の末端を、平滑末端または粘着性末端とすることができる。
【００３１】
エピジェネティック修飾核酸が、上述したような、少なくとも１つのさらなる配列に隣接する実施形態では、エピジェネティック修飾核酸を、大型ポリヌクレオチドの部分とすることができる。一部の例では、エピジェネティック修飾核酸と、さらなる配列とを含む大型ポリヌクレオチドを、直鎖とすることができる。他の例では、エピジェネティック修飾核酸と、さらなる配列とを含むポリヌクレオチドを、環状とすることができる。例えば、それはベクターの部分であってもよい。
【００３２】
エピジェネティック修飾核酸がベクターの部分である実施形態では、様々なベクターを用いることができる。適切なベクターとしては、制限なしに、プラスミドベクトル、ファージミド、コスミド、人工／小型染色体、トランスポゾン及びウイルスベクターを含む。一実施形態では、エピジェネティック修飾核酸は、プラスミドベクター内に存在する。適切なプラスミドベクターの非限定的な例としては、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びそれらの変異株を含む。ベクターは、例えば複製起点、選択可能マーカー配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）等の、さらなる配列を含んでいてもよい。さらなる情報は、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３、または、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１で見出することが可能である。
【００３３】
ある実施形態では、エピジェネティック修飾核酸を含むベクターは、マーカータンパク質をコードする配列をさらに含むことができる。一つの態様では、マーカータンパク質は、蛍光タンパク質である。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ（エメラルド）、ＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ（アザミグリーン）、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ（アザミグリーン単量体）、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ（シトリーン）、Ｖｅｎｕｓ（ビーナス）、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、）、青色蛍光タンパク質（例えばＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ（アジュライト）、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（サファイヤ）、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｔ−サファイヤ）、）、青緑色蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ（セルリアン）、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ（ミドリイシシアン））、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒ（ＤｓＲｅｄ単量体）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｓＲｅｄエクスプレス）、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−  Ｍｏｎｏｍｅｒ（ＤｓＲｅｄ−単量体）、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ（ＨｃＲｅｄタンデム）、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ（ｍラズベリー）、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ（ｍストロベリー）、Ｊｒｅｄ（Ｊレッド））、及び、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ（ｍオレンジ）、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（クサビラ−オレンジ）、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（クサビラオレンジ単量体）、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ（ｍタンジェリン）、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄトマト））を含む。
【００３４】
（ｄ）エピジェネティック修飾核酸の生成
エピジェネティック修飾核酸は、従来のホスホラミダイト固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができるが、そこでは、標準シトシンホスホラミダイトは、適切な位置で修飾シトシンホスホラミダイトに置換される。例えば５−メチルシトシンホスホラミダイト、５−ヒドロキシメチルシトシンホスホラミダイト、５−フォルミルシトシンホスホラミダイト、５−カルボキシルシトシンホスホラミダイト、３−メチルシトシンホスホラミダイト等の修飾シトシンホスホラミダイトは、商業的に入手可能である。当業者は、標準合成を組み換えるための適切な手段、及び、修飾シトシンホスホラミダイトを用いる際の脱保護ステップに、精通している。
【００３５】
ＩＩ．エピジェネティック修飾を有する核酸を含む細胞
また、上記セクションＩに詳述するように、本開示は、所定のエピジェネティック修飾を有する少なくとも１つの合成核酸を含む、遺伝的に操作された細胞または細胞株を提供する。一般に、遺伝的に操作された細胞または細胞株は、染色体に組み込まれたエピジェネティック修飾核酸を、少なくとも１つ含み、ここで、エピジェネティック修飾は、既知の診断、予後、または疾病処理に対する感受性のレベルに関連する。染色体に組み込まれたエピジェネティック修飾核酸を含む細胞または細胞株は、当業者に知られる任意の方法により調製されてもよい。例えば、遺伝子発現を制御する、診断及び予測の分析の参照標準として役に立つ、及び／または、治療計画を判断する等、細胞または細胞株がここに記載される利用のいずれかに対して確実に用いてもよくなるよう、エピジェネティック修飾が安定であることが好ましい。安定な修飾は、細胞成長及び培養の間の全てで保持されることが望ましく、安定なエピジェネティック修飾を有する染色体に組み込まれた核酸を含む細胞は、当業者に知られる技術を用いて、細胞株として調製されてもよい。しかしながら、一部の態様では、エピジェネティック修飾は準安定性でもよい。エピジェネティック修飾核酸に対応する内因性染色体配列におけるエピジェネティック修飾パターンまたは状態についての推測的な知識に基づき、準安定性修飾を保有する細胞を用いて、エピジェネティック安定性を正確に分析してもよい。下に記載される標的エンドヌクレアーゼ介在ゲノム編集を用いて、細胞のゲノムを修飾して、核酸に所定の修飾を含んでもよい。
【００３６】
ここに開示される細胞または細胞株では、未修飾のまたは天然のエピジェネティック状態を有した対応する内因性染色体配列の遺伝子座に、エピジェネティック修飾核酸を挿入することができ、ここでは、内因性染色体配列は欠失または不活性化されたものである。例えば、エピジェネティック修飾核酸を、エピジェネティック修飾核酸が由来する相同的内因性染色体配列に置き換えることができる。あるいは、エピジェネティック修飾が安定な遺伝子座、例えばＡＡＶＳ１、ＲＯＳＡ２６、ＨＰＲＴ及びＣＣＲ５の遺伝子座のようなゲノム安全領域のような隣接インスレーティングエレメントを所有する遺伝子座に、エピジェネティック修飾核酸を挿入することができる。この実施形態では、エピジェネティック修飾合成配列に対応する内因性染色体配列を、任意に不活性化または欠失させることが可能である。ここにさらに詳細に議論するように、エピジェネティック修飾合成核酸は、対象とする遺伝子の調節配列（すなわち調節エレメント）またはコード配列と、実質的配列同一性を有している。
【００３７】
（ａ）細胞型
本開示で想定される細胞を変化させることが可能であり、または変化する。一般に、細胞は真核生物の細胞である。様々な態様では、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、無脊椎細胞、昆虫細胞、植物細胞、イースト細胞、または単一細胞真核生物であってもよい。細胞は、成体細胞または胎生期細胞（例えば、胚）であってもよい。さらに他の態様では、細胞は、幹細胞でもよい。適切な幹細胞は、胚幹細胞、ＥＳ類似幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、多能性幹細胞、少能性幹細胞、分化単能幹細胞などを、制限なしに含む。例示的な態様では、細胞は、哺乳類細胞である。
【００３８】
一部の態様では、細胞は細胞株細胞である。適切な哺乳類細胞の非限定的な例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス胎生期繊維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウスメラノーマＢ１６細胞；マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚間充織Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞；マウス癌腫ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス胸ＥＭＴ６細胞；マウス肝癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞；マウスメラノーマＸ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞；ラット神経膠芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽Ｂ３５細胞；ラット肝癌細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳房（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単核細胞／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ−４０形質転換線維芽（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ−７６）細胞；ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ−４３１細胞、ヒトＳＷ４８細胞、ヒトＨＣＴ１１６細胞、及び、ヒトＫ５６２細胞、を含んでいる。哺乳類の細胞株の大規模なリストは、米国菌培養収集所カタログ（ＡＴＣＣ、マナサス、ヴァージニア州）で見出されてもよい。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞株細胞である。
【００３９】
（ｂ）任意の核酸
ある態様では、ここに開示されるエピジェネティック修飾核酸を含む細胞は、組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を、さらに含むことが可能である。組換えタンパク質をコードする核酸は、細胞の染色体内に位置することができ、または、それは染色体外とすることができる。一般に、コードされた組換えタンパク質は異種であり、これは、タンパク質が細胞に天然ではないことを意味する。ある態様では、組換えタンパク質は、治療的なタンパク質であってもよい。典型的な組換え型治療タンパク質は、抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、ヒト型抗体、ヒト型モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＭ分子、ワクチン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝固（または、凝結）因子、血液成分、酵素、機能性食品タンパク質、前述のいずれかの機能的断片若しくは機能的変異株、または、前述のタンパク質のいずれかを含む融合タンパク及び／若しくは機能的断片またはその変異株、を制限なしに含む。
【００４０】
他の態様では、組換えタンパク質は、改良された特性を細胞に、または改良された特性を第１の組換えタンパク質に与える、タンパク質であってもよい。改良された特性の非限定的な例は、ロバスト性増加、生存度増加、生残性増加、増殖増加、細胞サイクル進行増加（すなわちＧ１からＳ期への進行増加）、細胞成長増加、細胞サイズ増加、内因性タンパク質の生成増加、異種のタンパク質の生成増加、組換えタンパク質の安定性増加、組換えタンパク質の翻訳後プロセシング変化、及び、上記のいずれかの併用を含んでいる。ある態様では、細胞特性を改良するタンパク質が、過剰発現してもよい。適切なタンパク質の非限定的な例としては、セルピンタンパク質（例えばＳｅｒｐｉｎＢ１）、細胞調節タンパク質、細胞サイクル制御タンパク質、アポトーシス阻害剤、代謝経路タンパク質、ポスト翻訳修飾タンパク質、人工転写因子、転写活性化因子、転写阻害因子、及びエンハンサータンパク質を含んでいる。
【００４１】
さらなる実施態様では、組換えタンパク質は、蛍光タンパク質（例を上記に詳述する）等のマーカータンパク質、または、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉還元酵素（ＤＨＦＲ）、及び／またはグルタミン合成酵素（ＧＳ）、または、抗生物質耐性遺伝子によりコードされるタンパク質などの、選択可能なマーカータンパク質とすることができる。
【００４２】
ＩＩＩ．標的エンドヌクレアーゼを用いた、所定のエピジェネティック修飾を有する染色体に組み込まれた核酸を含む細胞の生成
本開示の他の態様として、セクションＩＩで上記に詳述した細胞を調製する方法を提供する。この方法は、所定のエピジェネティック修飾を有する合成核酸を細胞のゲノムに挿入すること、及び、対応する内因性配列を任意に抑制（不活性化）することまたは欠失させること、を含んでいる。エピジェネティック修飾核酸は、メチル化（５−メチルシトシン（５ｍＣ）、３−メチルシトシン（３ｍＣ）及び５−ヒドロキシメチルシトシンを含む）、５−フォルミルシトシン（５ｆＣ）及び、５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）等の、シトシン修飾を有することができる。特定の態様では、修飾はシトシンメチル化である。合成核酸は、正常細胞または特定のフェノタイプを有する細胞の対応する内因性配列内に見出されるメチル化量、または、通常の遺伝子発現レベル若しくは異常遺伝子発現レベル（すなわち過剰発現または過小発現）に対応する配列に見出されるメチル化の量と比較して、高メチル化または低メチル化を行うことができる。
【００４３】
エピジェネティック修飾核酸は、対応する内因性配列の遺伝子座で、または、異なる遺伝子座、例えばエピジェネティック修飾核酸に安定性をもたらす遺伝子座で、挿入することができる。
【００４４】
エピジェネティック修飾核酸は、例えば、対応する内因性染色体配列を、完全に置換することができる。この置換（内因性配列の欠失及び合成エピジェネティック修飾配列の挿入）は、標的エンドヌクレアーゼの利用等の、当該技術分野で知られる方法を用いて完了してもよい。あるいは、エピジェネティック修飾核酸は、染色体組み込みの前にエピジェネティック修飾核酸のエピジェネティック修飾状態（またはパターン）の保持を促進する隣接インスレーティングエレメントまたは他の遺伝因子を、所有する遺伝子座等、ゲノムの範囲内の好ましい遺伝子座で、挿入することができる。安定効果を所有する遺伝子座は、ゲノムのセーフハーバー部位として知られており、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ及びＲＯＳＡ２６等の遺伝子座を含んでいる。また、外因性インスレーティングエレメントを、エピジェネティック修飾核酸の近接に配置して、望ましい修飾状態の保持を援助してもよい。したがって、一つの態様では、エピジェネティック修飾核酸及びインスレーティングエレメントの両方を、対応する内因性染色体配列の遺伝子座に配置することができる。上記のように、標的エンドヌクレアーゼを、対象とするゲノム遺伝子座にエピジェネティック修飾核酸を組み込むために、用いることができる。
【００４５】
任意の適切な標的エンドヌクレアーゼを用いて、対応する内因性配列の遺伝子座または他の好ましい遺伝子座で、エピジェネティック修飾核酸を挿入してもよい。例えば、標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲベースエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼ若しくは関連モノマーハイブリッド、または、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘発剤であってもよい。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼの対は、同時に対象とするエピジェネティック修飾核酸を挿入しつつ、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）を達成する。例えば、Ｏｒｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３８（１５）：ｅ１５２（２０１０）を参照されたい。あるいは、改変ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いてもよい。Ｉ−ＴｅｖＩの触媒領域を用いて生成されたＴＡＬＥＮを調製してもよく、Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４：１７６２  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２（２０１３）に記載のように用いてもよい。また、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０９（２１）：８０６１−６（２０１２）に記載のように、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼまたはＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ骨格に融着されるＩ−Ｔｅｖヌクレアーゼ領域等、ハイブリッドエンドヌクレアーゼを用いてもよいことを、当業者は理解する。また、Ｋａｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４０（１１）：ｅ８１（２０１２）に記載のように、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘発剤を用い、ＡＲＣＵＴ（人工制限ＤＮＡカッター）等、現在の方法で相同組み換えを促進してもよい。
【００４６】
本開示は、ここに記載する標的エンドヌクレアーゼのいずれか等の標的エンドヌクレアーゼを用いて、所定のエピジェネティック修飾を有する合成核酸を真核細胞に挿入する方法を包含する。この方法は、（ｉ）少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼまたは少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、ここで、各標的エンドヌクレアーゼは、細胞の内因性染色体配列内の部位を標的とする、及び、（ｉｉ）所定のエピジェネティック修飾を有する少なくとも１つの合成核酸を、細胞に導入することを含む。ある態様では、エピジェネティック修飾核酸は、標的エンドヌクレアーゼにより生成されるものと適合性がある突出部を含む直鎖配列であってもよい。他の態様では、エピジェネティック修飾核酸は、細胞のゲノムの標的開裂部位の両側における配列と実質的配列同一性を有する上流及び下流配列に隣接することができる。さらなる態様では、エピジェネティック修飾核酸は、標的エンドヌクレアーゼにより認識される標的部位に隣接することができる。この方法はさらに、エピジェネティック修飾核酸の標的部位への挿入、及び／または、標的部位での内因性染色体配列の失活に導くＤＮＡ修復プロセスにより、修復される少なくとも１つの二本鎖切断を、標的エンドヌクレアーゼが導入するよう、細胞の培養を含む。例えば、標的エンドヌクレアーゼを用いて、１つの二本鎖切断を標的遺伝子座に作成することができ、ここでは、適合性がある突出部を含むエピジェネティック修飾核酸が、内因性染色体配列でライゲーションされ、それにより標的遺伝子座でエピジェネティック修飾核酸を挿入し、及び、内因性染色体配列を中断／不活性化する。標的遺伝子座は、エピジェネティック修飾核酸が由来する内因性染色体配列に対応することができ、または、標的遺伝子座は、ゲノムのセーフハーバー部位とすることができる。あるいは、標的エンドヌクレアーゼを用いて、１つの二本鎖切断を作成することができ、ここでは、相同上流及び下流配列を含むエピジェネティック修飾核酸は、相同性指向修復プロセスにより開裂部位に挿入される。別の態様では、２つの標的エンドヌクレアーゼを用いて、対象とする遺伝子座内の標的部位で２つの二本鎖切断を作成することができ、ここでは、エピジェネティック修飾核酸を、二本鎖切断の修復の間、内因性染色体配列と交換する。さらに別の特徴では、第１の標的エンドヌクレアーゼを用いて、二本鎖切断をエピジェネティック修飾核酸が挿入される第１の遺伝子座に作成することができ、第２の標的エンドヌクレアーゼを用いて、二本鎖切断を、第２の遺伝子座で不活性化変異を導入するよう、その破壊が誤りがちなＤＮＡ修復プロセスにより修復される第２の遺伝子座に作成することができる。例えば、第１の遺伝子座は、エピジェネティック修飾核酸に安定性をもたらす部位とすることができ、第２の遺伝子座は、エピジェネティック修飾核酸が由来する内因性染色体配列に対応することができる。
【００４７】
（ａ）標的エンドヌクレアーゼ
ここに開示される方法で用いられる種類の標的エンドヌクレアーゼは、変化することが可能であり、または変化する。上記のように、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼまたは関連モノマーハイブリッド、及び、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘発剤、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼとすることができる。標的エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質または組換えタンパク質とすることができる。
【００４８】
ある態様では、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼとすることができる。メガヌクレアーゼは、大型の認識部位を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、すなわち、認識部位は約１２塩基対から約４０塩基対まで一般に変化する。この要件の結果、認識部位は一般に、一回のみ、いずれかの所与のゲノムに生じる。メガヌクレアーゼの間、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノム及びゲノム工学の研究に対して価値のあるツールになった（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：３３−２７（２００５））。メガヌクレアーゼは、当業者に知られる技術を用いてそれらの認識配列を修飾することにより、特定の染色体配列に対するターゲットとすることができる。例えば、Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１（１）：１１−２７（２０１１）；Ｂａｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０（１６０：７９８５−８０００（２２０１２）を、参照されたい。
【００４９】
他の態様では、標的エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼとすることができる。ＴＡＬＥは、容易に操作して新ＤＮＡ標的を結合してもよい植物病原菌キサントモナス属からの転写因子である。ＴＡＬＥまたはその切断版を、ＦｏｋＩ等のエンドヌクレアーゼの触媒領域に結合して、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮと呼ばれる標的エンドヌクレアーゼを作成してもよい。さらなる情報について、Ｊｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：４９−５５（２０１３）を参照されたい。Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．４：１７６２ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２（２０１３）に記載されるように、Ｉ−ＴｅｖＩの触媒領域を用いて生成されたＴＡＬＥＮを調製及び使用してもよい。
【００５０】
さらなる態様では、標的エンドヌクレアーゼは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１０９（２１））：８０６１−６（２０１２）に記載のように、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼまたはＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ骨格に融着されるＩ−Ｔｅｖヌクレアーゼ領域等の、Ｉ−ＴｅｖＩヌクレアーゼまたは関連モノマーハイブリッドとしてもよい。
【００５１】
さらに他の態様では、標的ヌクレアーゼは、人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘発剤とすることができる。人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘発剤を用いて、Ｋａｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４０（１１）：ｅ８１（２０１２）に記載のようなＡＲＣＵＴ（人工限定ＤＮＡカッター）等の相同遺伝子組換えを、本方法では推進する。
【００５２】
（ｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ
さらなる態様では、標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）とすることができる。典型的には、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわちジンクフィンガー）及び開裂ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含むものであり、これら両方とも以下に記載される。
【００５３】
ジンクフィンガー結合ドメイン。
ジンクフィンガー結合ドメインを操作して、選択される任意の核酸配列を認識しかつこれに結合してもよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１−４１６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０−３３８６０；Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２−７０８；及び、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的設計及びさまざまな選択を含むが、これに限定されるものではない。合理的設計は、例えば、二重、三重、及び／または四重ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、そこでは、各二重、三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列を結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列に関連する。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号及び第６，５３４，２６１号を参照されたい。これらの開示は、参照によりここにその全体が組み込まれる。一例として、米国特許第６，４５３，２４２号に記載されるアルゴリズムを用いて、ジンクフィンガー結合ドメインを設計し、あらかじめ選択された配列を対象としてもよい。また、非縮重認識コード表を用いた合理的設計等の選択的方法を用いて、ジンクフィンガー結合ドメインを設計して特定の配列を対象としてもよい（Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−７０８１）。ＤＮＡ配列内の可能性のある標的部位を同定するため、及び、ジンクフィンガー結合ドメインを設計するための、一般公開されるウェブベースのツールは、ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇ、及び、ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉＴ／  でそれぞれ見出される（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３；Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔａｌ．（２００７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５）。
【００５４】
ジンクフィンガー結合ドメインは、長さ約３個のヌクレオチドから約２１個のヌクレオチドまでの範囲、例えば長さ約９個から約１８個までのヌクレオチドの、ＤＮＡ配列を認識及び結合するように設計されていてもよい。各ジンクフィンガー認識領域（すなわちジンクフィンガー）は、３個のヌクレオチドを認識し、かつ結合する。一般に、ここに開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも３つのジンクフィンガー認識領域（すなわちジンクフィンガー）を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、例えば、４つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインは、５つまたは６つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の適切なターゲットＤＮＡ配列に結合するように設計されてもよい。例えば参照、米国特許第６，６０７，８８２号；第６，５３４，２６１号及び第６，４５３，２４２号を参照されたい。これらの開示は、参照によりここにその全体が組み込まれる。
【００５５】
ジンクフィンガー認識領域を選択する典型的な方法は、ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含んでおり、これらは、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；及び、第６，２４２，５６８号；ならびに、ＷＯ９８／３７１８６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／８８１９７号、及び、ＧＢ２，３３８，２３７号に開示される。これらの各開示は、参照によりここにその全体が組み込まれる。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインのための結合特異性エンハンスメントは、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７号で記載されており、この開示は、参照によりここに組み込まれる。
【００５６】
融合タンパク（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構造のためのジンクフィンガー結合ドメイン及び方法は、当業者に知られており、そして米国特許出願公開公報第２００５００６４４７４号及び第２００６０１８８９８７号に詳細が記載されており、この開示は、参照によりここにその全体が組み込まれる。ジンクフィンガー認識領域及び／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は共に、例えば長さ５つまたはそれ以上のアミノ酸のリンカー等の、適切なリンカー配列を用いて、結合されてもよい。米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；及び、第７，１５３，９４９号を参照されたい。これらの開示は、長さ６つ以上のアミノ酸のリンカー配列の非限定的な例として、参照によりここにその全体が組み込まれる。ここに記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガー（及びさらなるドメイン）の間で、適切なリンカーの併用を含んでもよい。
【００５７】
開裂ドメイン。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、また、開裂ドメインを含んでいる。ジンクフィンガーヌクレアーゼの開裂ドメイン部分は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼのいずれから得られてもよい。開裂ドメインが由来してもよいエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これに限定されるものではない。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔａｌｏｇ（ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）及びＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が、知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；球菌ヌクレアーゼ；イーストＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３を参照されたい。これらの酵素（または、その機能的断片）の１つ以上を、開裂ドメインのソースとして用いてもよい。
【００５８】
また、開裂ドメインは、開裂活性のために二量体化を必要とする、上記のような、酵素またはその部分に由来してもよい。各ヌクレアーゼが活性酵素二量体のモノマーを含むよう、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを、開裂のために必要としてもよい。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼが両方のモノマーを含むことで、活性酵素二量体を作成することもできる。ここに用いられる場合において、「活性酵素二量体」は、核酸分子を開裂することができる酵素二量体である。２つの開裂モノマーが、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよく、または、各モノマーが、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよい。
【００５９】
２つの開裂モノマーを用いて活性酵素二量体を形成する際、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼのそれらの各認識部位との結合が、開裂モノマーが例えば二量体化等により活性酵素二量体を形成できるように、空間的定位で相互に開裂モノマーを配置するよう、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼに対する認識部位が配置されることが好ましい。その結果、認識部位の近端部は、約５個〜約１８個のヌクレオチドで分離されてもよい。例えば、近端部が、約５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個または１８個のヌクレオチドにより分離されてもよい。しかしながら、いくつかの整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの認識部位の間に介在することができる（例えば約２個から約５０までのヌクレオチド対またはそれ以上）ことを理解するだろう。ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近端部、例えばここに詳細に記載される部分が、６個のヌクレオチドにより分離されてもよい。一般に、開裂の部位が、認識部位の間に存在する。
【００６０】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）が、多くの種に存在すると共に、（認識部位で）ＤＮＡへ配列特異的に結合させること、及び、結合の部位でまたはその近くでＤＮＡを開裂することが可能である。所定の制限酵素（例えばタイプＩＩＳ）は、認識部位から除去される部位でＤＮＡを開裂すると共に、分離できる結合及び開裂ドメインを有している。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、１鎖上のその認識部位から９個のヌクレオチド及び他の部分上のその認識部位から１３個のヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖開裂を引き起こす。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号及び第５，４８７，９９４号；ならびに、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１、９７８−３１、９８２、を参照されたい。したがって、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素由来の開裂ドメイン、及び、操作されてもよい、または操作されなくてもよい、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含むことができる。例えば、例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、国際公開ＷＯ０７／０１４，２７５号に記載され、その開示は参照によりここにその全体が組み込まれる。また、さらなる制限酵素は、分離可能な結合及び開裂ドメインを含み、また、これらは本開示により想定される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
【００６１】
開裂ドメインが結合ドメインと分離可能である例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体としての活性を有している（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０、５７０−１０、５７５）。したがって、本開示の目的で、ジンクフィンガーヌクレアーゼに用いられるＦｏｋＩ酵素の部分は、開裂モノマーと考えられる。したがって、ＦｏｋＩ開裂ドメインを用いた標的二本鎖開裂のため、それぞれがＦｏｋＩ開裂モノマーを含む２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、活性酵素二量体を再組成してもよい。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ開裂モノマーを含む単一のポリペチド分子も、用いることができる。
【００６２】
開裂ドメインは、ホモ二量体化を最小にするまたは防止する、１つ以上の操作された開裂モノマーを含んでもよく、これは例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、第２００６０１８８９８７号及び第２００８０１３１９６２号に記載され、これらのそれぞれが、参照によりここにその全体が組み込まれる。非限定的な例として、ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７及び５３８のアミノ酸残基は、ＦｏｋＩ開裂ハーフ領域の二量体化に影響するための全ての標的である。必須のヘテロダイマーを形成するＦｏｋＩの例示的な操作された開裂モノマーは、対を含み、その対では、第１の開裂モノマーがＦｏｋＩのアミノ酸残基位置４９０及び５３８に変異を含み、第２の開裂モノマーがアミノ酸残基位置４８６及び４９９に変異を含む（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２５：７７８−７８５；Ｓｚｃｚｐｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２５：７８６−７９３）。例えば、位置４９０のＧｌｕ（Ｅ）は、Ｌｙｓ（Ｋ）に変更されてもよく、位置５３８のＩｌｅ（Ｉ）は、１つの領域（Ｅ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ）で、Ｋに変更されてもよく、位置４８６のＧｌｎ（Ｑ）は、Ｅに変更されてもよく、位置４９９のＩは、他の開裂ドメイン（Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ）で、Ｌｅｕ（Ｌ）に変更されてもよい。他の態様では、改変ＦｏｋＩ開裂ドメインは、３つのアミノ酸変化を含むことができる（Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７４−８１）。例えば、１つの改変ＦｏｋＩ領域（ＥＬＤと呼ばれる）は、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、Ｎ４９６Ｄの変異を含むことができ、他の改変ＦｏｋＩ領域（ＫＫＲと呼ばれる）は、Ｅ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、Ｈ５３７Ｒの変異を含むことができる。
【００６３】
さらなるドメイン。
ある態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つの核移行シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含んでいる。ＮＬＳは、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の真核細胞の核内への輸送を容易にするアミノ酸配列である。一般に、ＮＬＳは塩基性アミノ酸の伸長を含んでいる。核移行シグナルは、当該技術分野で知られている（Ｍａｋｋｅｒｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１０２５−１０２７；Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７，２８２：５１０１−５１０５を参照されたい）。例えば一実施形態では、ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：１）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号：２）等の単分裂配列とすることができる。別の実施形態では、ＮＬＳは、二分裂配列とすることができる。さらに別の実施形態では、ＮＬＳは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号：３）とすることができる。ＮＬＳは、Ｎ末端、Ｃ末端、または、ジンクフィンガーヌクレアーゼの内部位置内に、位置することができる。
【００６４】
他の態様では、また、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つの膜透過性領域を含むことができる。一実施形態では、膜透過性領域は、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する膜透過性ペプチド配列とすることができる。一例として、ＴＡＴ膜透過性配列は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：４）とすることができる。別の実施形態では、膜透過性領域は、ＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号：５）、ヒトＢ型肝炎ウイルスに由来する膜透過性ペプチド配列、とすることができる。さらに別の実施形態では、膜透過性領域は、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号：６またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号：７）とすることができる。さらなる実施形態では、膜透過性領域は、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号：８）、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの膜透過性ペプチド、または、ポリアルギニンペプチド配列とすることができる。膜透過性領域は、Ｎ末端に、Ｃ末端に、または、タンパク質の内部位置内に、位置することができる。
【００６５】
さらに他の態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのマーカー領域をさらに含むことができる。マーカー領域の非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製用タグ及びエピトープタグを含んでいる。一実施形態では、マーカー領域は、蛍光タンパク質とすることができる。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ターボＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体のアザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリーン、ビーナス、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えばＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アジュライト、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、サファイヤ、Ｔ−サファイヤ、）、青緑色蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ（セルリアン）、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ（ミドリイシシアン））、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒ（ＤｓＲｅｄ単量体）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｓＲｅｄエクスプレス）、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ（ＤｓＲｅｄ−単量体）、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ（ＨｃＲｅｄタンデム）、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ（ｍラズベリー）、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ（ｍストロベリー）、Ｊｒｅｄ（Ｊレッド））、及び、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ（ｍオレンジ）、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（クサビラ−オレンジ）、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（クサビラオレンジ単量体）、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ（ｍタンジェリン）、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄトマト））、または他のいずれの適切な蛍光タンパク質を含んでいる。別の実施形態では、マーカー領域は、精製用タグ及び／またはエピトープタグとすることができる。適切なタグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及び、カルモジュリンを含むが、これに限定されるものではない。マーカー領域は、Ｎ末端に、Ｃ末端に、または、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の内部位置内に、位置することができる。
【００６６】
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼ
さらに他の態様では、標的エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼの真核細胞の核への侵入を可能にする核移行シグナルを少なくとも１つ含むＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼとすることができる。ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、少なくとも１つのヌクレアーゼ領域を含むＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、及び、ガイドＲＮＡに相互作用する少なくとも１つの領域である。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼを核酸内の標的部位に向け、その部位では、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、標的核酸配列の少なくとも１つの鎖で開裂する。ガイドＲＮＡが標的開裂に対する特異性を提供するため、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは自在であり、異なるガイドＲＮＡで用いて異なる標的核酸配列を開裂してもよい。
【００６７】
ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。細菌及び古細菌は、ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスタ化された短鎖反復回文配列）及びＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質を利用したＲＮＡベースの適応免疫系を進化させて、ウイルスまたはプラスミドの侵略を検出及び破壊した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをプログラムして、ターゲット特定の合成ガイドＲＮＡを提供することにより、標的部位特異的二本鎖切断を導入することができる（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６−８２１）。
【００６８】
ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓタイプＩ、タイプＩＩまたはタイプＩＩＩシステムに由来することができる。適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕ１９６６を含む。
【００６９】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス好熱性、ストレプトコッカスｓｐ．ノカルジオプシスダッソンビエイ、ストレプトマイセスプリスチナスピラリス、ストレプトマイセスビリドクロモゲネス、ストレプトマイセスビリドクロモゲネス、ストレプトスポランギウム属ロセウム、ストレプトスポランギウム属ロセウム、アリサイクロバチルスアシドカルダリウス、バシラスシュードマイコイデス、バシラスセレニティレドセンス、イグジォバクテリウムシビリカム、ラクトバチスルデルブルエッキ、ラクトバシラスサリヴァリゥス、ミクロシラマリナ、バークホルデリア目バクテリア、ポラロモナスナフタレニボランス、ポラロモナスｓｐ．、クロコスファエラワトソニー、海産単細胞窒素固定シアノバクテリア、ミクロキスティスエルギノーサ、シネココッカス種、アセトハロビウムアラビティカム、アモニフェクスデゲンシイ、カルディセルロシルプターベシイ、キャンディデイタスデスルフォルディス、ボツリヌス菌、クロストリジウムディフィシレ、フィネゴルディアマグナ、ナトラナエロビウスサーモフィラス、ペロトマキュラムサーモプロピオニカム、アシドチオバシラスカルダス、鉄硫黄酸化細菌、アロクロマチウムビノスム、マリノバクターｓｐ．、ニトロソコッカスハロフィルス、ニトロソコッカスワッソニ、スードアルテロモナスハロプランクティス、クテドノバクテルラセミファ、メタノハロビウムエベスチガータム、アナベナバリアビリス、ノデュラリアスプミゲナ、アシツキ、アルスロスピラマキシマ、アルスロスピラプラテンシス、アルスロスピラｓｐ．、リングビアｓｐ．、ミクロコレスクソノプラステス、藍藻ユレモ属、ペトロトーガモビリス、テルモシポアフリカヌスまたはアカリオクロリスマリナに由来することができる。１つの特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９タンパク質に由来する。
【００７０】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＲＮＡ認識及び／またはＲＮＡ結合ドメインを含んでいる。ＲＮＡ認識及び／またはＲＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が特定のゲノムまたはゲノム配列に向けられるよう、ガイドＲＮＡと相互作用する。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ領域（すなわちＤＮアーゼ酵素またはＲＮアーゼ領域）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼ領域、タンパク質−タンパク質相互作用領域、二量体化領域、ならびに他の領域を含むことができる。
【００７１】
ここに用いられるＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または、野生型または改変ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の断片とすることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を改変することにより、核酸結合親和性や特異性を増加させ、酵素活性を変更し、及び／または、タンパク質の他の特性を変更することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ）領域を、改変、欠失、または不活性化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を切断して、タンパク質の機能に必須ではない領域を除去することができる。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を、切断または改変して、タンパク質の活性またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に融合するエフェクター領域を、最適化することができる。
【００７２】
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質またはその断片に由来することができる。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、改変Ｃａｓ９タンパク質に由来することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を改変して、タンパク質の１つ以上の特性（例えばヌクレアーゼ活性、親和性、安定性等）を変更することができる。あるいは、改変Ｃａｓ９タンパク質が野生型Ｃａｓ９タンパク質より小さくなるよう、ＲＮＡ誘導型開裂に関係しないＣａｓ９タンパク質の領域を、タンパク質から排除することができる。
【００７３】
一般に、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼ（すなわちＤＮアーゼ）領域を含んでいる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ類似ヌクレアーゼ領域及びＨＮＨ類似ヌクレアーゼ領域を含むことができる。ＲｕｖＣ及びＨＮＨ領域は、一本鎖を切断してＤＮＡで二本鎖切断を作製するためには、共に有効である（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６−８２１）。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来し、かつ、２つの機能ヌクレアーゼ領域を含んでおり、それらは共に二本鎖切断を標的部位に導入する。
【００７４】
標的部位は、典型的には約１４〜１５ｂｐの長さを有する天然に生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより認識される（Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９−８２３）。ターゲット部位は、ガイドＲＮＡの５’末端に相補的な配列（すなわちプロトスペーサー配列と呼ぶ）の直後に（３’または下流の）共通配列が続く以外は、配列限定を有しない。また、この共通配列は、プロトスペーサ隣接モチーフ（またはＰＡＭ）として知られている。ＰＡＭの例は、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ及びＮＮＡＧＡＡＷを含むが、これに限定されるものではない（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義される）。主要長さでは、標的部位の５〜７％についてのみ、ターゲットゲノム内でユニークであり、オフターゲット効果を顕著とすることができる事を示唆している。ターゲット部位の長さは、結合現象を２回必要とすることにより、増殖することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、それらが二本鎖配列の１つの鎖を開裂する（すなわちニッカーゼに変換される）のみであるよう、改変することができる。したがって、２本の異なるガイドＲＮＡとの併用でのＣＲＩＳＰＲベースのニッカーゼの利用は、二本鎖切断を今もなお生じさせつつ、ターゲット部位の長さを本質的に二倍にする。
【００７５】
ある実施形態では、Ｃａｓ９由来エンドヌクレアーゼを改変して、機能的ヌクレアーゼ領域（ＲｕｖＣ類似またはＨＮＨ類似ヌクレアーゼ領域）を１つのみ有することができる。例えば、Ｃａｓ９由来タンパク質は、ヌクレアーゼ領域の一方が、もはや機能的ではない（すなわちドメインがヌクレアーゼ活性を欠く）ように欠失または変異する方法で、改変することができる。ヌクレアーゼ領域の一方が不活発である一部の実施形態では、Ｃａｓ９由来タンパク質は、ニックを二本鎖核酸に導入することができる（このタンパク質は「ニッカーゼ」と呼ばれる）が、二本鎖ＤＮＡを開裂しない。例えば、ＲｕｖＣ類似領域内でのアスパルテートからアラニン（Ｄ１０Ａ）への変換は、Ｃａｓ９由来タンパク質を「ＨＮＨ」ニッカーゼに変換する。同様に、ＨＮＨ領域内でのヒスチジンからアラニン（Ｈ８４０Ａ）への変換（一部の例においてヒスチジンは位置８３９に位置される）は、Ｃａｓ９由来タンパク質を「ＲｕｖＣ」ニッカーゼに変換する。したがって、例えば、一実施形態では、Ｃａｓ９由来ニッカーゼは、ＲｕｖＣ類似領域内でのアスパルテートからアラニン（Ｄ１０Ａ）への変換を有している。別の実施形態では、Ｃａｓ９由来ニッカーゼは、ＨＮＨ領域でのヒスチジンからアラニン（Ｈ８４０ＡまたはＨ８３９Ａ）への変換を有している。Ｃａｓ９由来ニッカーゼのＲｕｖＣ類似またはＨＮＨ類似ヌクレアーゼ領域は、部位特異的突然変異、ＰＣＲ介在突然変異誘発、及び全遺伝子合成等の周知の方法、ならびに当該技術分野で知られる他の方法を用いて、改変することができる。
【００７６】
さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼの両方のヌクレアーゼ領域は、変異、不活性化、または、欠失することができ、また、得られたタンパク質を異種の開裂ドメインと併用して、ＣＲＩＳＰＲベースの融合タンパクを作成することができる。したがって、結果として生じる融合タンパクを、ガイドＲＮＡによりターゲット部位に案内し、異種の開裂ドメインにより開裂が媒介される。特定の実施形態では、異種の開裂ドメインは、タイプＩＩ−Ｓエンドヌクレアーゼに由来することができる。タイプＩＩ−Ｓエンドヌクレアーゼは、典型的に認識部位から離れた数個の塩基対である部位でＤＮＡを開裂し、このように、分離可能な認識領域及び開裂ドメインを有している。これらの酵素は、一般にモノマーであり、これらモノマーは、一時的に関係して二量体を形成し、互い違いの位置でＤＮＡの各鎖を開裂する。適切なタイプＩＩ−Ｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ及びＳａｐＩを含んでいる。例示的な態様では、融合タンパクの開裂ドメインは、ＦｏｋＩ開裂ドメインまたはその誘導体であり、これらは上記セクション（ＩＩＩ）（ａ）（ｉ）に詳述される。
【００７７】
一般に、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの核移行シグナルまたは配列（ＮＬＳ）を含んでいる。適切なＮＬＳは、制限なしに、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：１）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号：２）及びＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号：３）を含んでいる。ＮＬＳは、Ｎ末端に、Ｃ末端に、または、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼの内部位置に、位置することができる。
【００７８】
さらなるドメイン。
他の態様では、また、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの膜透過性領域を含むことができる。一実施形態では、膜透過性領域は、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する膜透過性ペプチド配列とすることができる。一例として、ＴＡＴ膜透過性配列は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：４）とすることができる。別の実施形態では、膜透過性領域は、ＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号：５）、ヒトＢ型肝炎ウイルスに由来する膜透過性ペプチド配列、とすることができる。さらに別の実施形態では、膜透過性領域は、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号：６またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号：７）とすることができる。さらなる実施形態では、膜透過性領域は、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号：８）、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの膜透過性ペプチド、または、ポリアルギニンペプチド配列、とすることができる。膜透過性領域は、Ｎ末端に、Ｃ末端に、または、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼの内部位置に位置することができる。
【００７９】
さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、少なくとも１つのマーカー領域を含むことができる。マーカー領域の非限定的な例は、蛍光タンパク質、精製用タグ及びエピトープタグを含む。一実施形態では、マーカー領域は、蛍光タンパク質とすることができる。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ターボＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体のアザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えばＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリーン、ビーナス、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えばＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アジュライト、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、サファイヤ、Ｔ−サファイヤ、）、青緑色蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ（セルリアン）、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ（ミドリイシシアン））、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒ（ＤｓＲｅｄ単量体）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｓＲｅｄエクスプレス）、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ（ＤｓＲｅｄ−単量体）、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ（ＨｃＲｅｄタンデム）、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ（ｍラズベリー）、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ（ｍストロベリー）、Ｊｒｅｄ（Ｊレッド））、及び、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ（ｍオレンジ）、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（クサビラ−オレンジ）、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（クサビラオレンジ単量体）、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ（ｍタンジェリン）、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄトマト））、または他のいずれの適切な蛍光タンパク質を、含んでいる。別の実施形態では、マーカー領域は、精製用タグ及び／またはエピトープタグとすることができる。適切なタグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及び、カルモジュリンを含むが、これに限定されるものではない。マーカー領域は、Ｎ末端に、Ｃ末端に、または、タンパク質の内部位置に位置することができる。
【００８０】
ガイドＲＮＡ。
ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、また、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼをＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼが標的配列の少なくとも１つの鎖を開裂する特定のターゲット部位に向ける、少なくとも１つのガイドＲＮＡを必要とする。ターゲット部位は、配列に共通配列がすぐに続く（下流）場合を除き、配列限定を有しない。この共通配列はまた、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られている。ＰＡＭの例は、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ及びＮＮＡＧＡＡＷを含むが、これに限定されるものではない（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義される）。ターゲット部位は、遺伝子のコード領域内、遺伝子のプロモーター制御エレメント、遺伝子のイントロン内、遺伝子間の制御領域内等であってもよい。
【００８１】
ガイドＲＮＡは、３つの領域を含む：ターゲット部位の配列に相補的な５’末端の第１の領域、ステムループ構造を形成する第２の内部領域、及び、本質的に一本鎖を残存する第３の３’領域である。各ガイドＲＮＡが特定のターゲット部位にＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼを誘導するよう、各ガイドＲＮＡの第１の領域は異なっている。各ガイドＲＮＡの第２および第３の領域は、全てのガイドＲＮＡの同じとすることができる。
【００８２】
ガイドＲＮＡの第１の領域がターゲット部位の配列との塩基となるよう、ガイドＲＮＡの第１の領域はターゲット部位で配列に相補的である。様々な実施形態において、ガイドＲＮＡの第１の領域は、約１０のヌクレオチドから約２６以上のヌクレオチドまでを含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域とゲノム配列のターゲット部位と間の塩基対の領域は、長さで約１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２２個、２３個、２４個、２５個、または２６個以上のヌクレオチド、とすることができる。典型的な実施形態では、ガイドＲＮＡの第１の領域は、長さ約２０個のヌクレオチドである。
【００８３】
ガイドＲＮＡはまた、二次構造を形成する第２の領域を含んでいる。ある実施形態では、二次構造は、ステム（または、ヘアピン）及びループを含んでいる。ループ及びステムの長さを、変化させることができる。例えば、ループは、長さで、約３個から約１０個までのヌクレオチドまで変化させることができ、ステムは、長さで、約６から約２０までの塩基対まで変化させることができる。ステムは、１個から約１０個までのヌクレオチドの１つ以上のバルジ（ｂｕｌｇｅ）を含むことができる。したがって、第２の領域の全体の長さは、長さで、約１６個から約６０個のヌクレオチドまで変化させることができる。例示的な実施形態では、ループは長さ約４個のヌクレオチドであり、ステムは約１２の塩基対を含む。
【００８４】
ガイドＲＮＡはまた、本質的に一本鎖を残存する第３の領域を３’末端に含んでいる。したがって、第３の領域は、対象とする細胞内の任意のゲノム配列内に相補性を有しないとともに、他のガイドＲＮＡに相補性を有しない。第３の領域の長さを、変化させることができる。一般に、第３の領域は、約４個のヌクレオチドによりも長さが長い。例えば、第３の領域の長さは、約５個から約３０個までのヌクレオチドの長さで変化させることができる。
【００８５】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１つの分子を含んでいる。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、２つの別々の分子を含むことができる。第１のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第１の領域と、ガイドＲＮＡの第２の領域の「ステム」の半分とを、含むことができる。第２のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第２の領域の「ステム」の他の半分と、ガイドＲＮＡの第３の領域とを含むことができる。したがって、この実施形態では、第１及び第２のＲＮＡ分子は、相互に相補的である一連のヌクレオチドを各々有している。例えば、一実施形態では、第１及び第２のＲＮＡ分子は、他の配列へ塩基対合させる（約６個から約２０個までのヌクレオチドの）配列を各々含むことにより、機能的ガイドＲＮＡを形成する。
【００８６】
（ｂ）標的エンドヌクレアーゼ及び合成ＤＮＡの細胞への送達
本方法は、少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼまたは少なくとも１つの標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に導入することを含む。適切な細胞は、上記のセクション（ＩＩ）（ａ）に詳述される。ある態様では、標的エンドヌクレアーゼは、精製された単離タンパク質として細胞に導入することができる。この例では、標的エンドヌクレアーゼは、少なくとも１つの膜透過性領域をさらに含むことができる。膜透過性領域の例は、上記のジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼを記載するセクションに詳述される。標的エンドヌクレアーゼは、当該技術分野で周知の技術を用いて、細菌細胞または真核生物細胞の中に発現することができ、及び、それらから精製できる。
【００８７】
他の態様では、標的エンドヌクレアーゼを核酸として細胞に導入することができる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができる。コードする核酸がｍＲＮＡである態様では、ｍＲＮＡは、５’キャップ及び／または３’ポリアデニル化であってもよい。標的エンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである実施形態において、コードする核酸は、ｍＲＮＡとすることができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、５’キャップ及び３’ポリアデニル化とすることができる。ＲＮＡを調製する方法、ならびにｍＲＮＡをキャッピング及びポリアデニル化するための方法は、当該技術分野で知られている。
【００８８】
さらなる態様では、標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡとすることができる。ＤＮＡは直鎖でもよく、または環状でもよい。特定の態様では、標的エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは、ベクターの部分とすることができる。適切なベクターとしては、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／小型染色体、トランスポゾン及びウイルスベクターを含む。非限定的な例では、標的エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡが、プラスミドベクター内に存在する。適切なプラスミドベクターの非限定的な例としては、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ及びその変異株を含む。標的エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは一般に、少なくとも１つの発現調節配列に操作可能に結合される。特に、ＤＮＡコード配列は、対象とする細胞での発現のため、プロモーター制御配列に操作可能に結合することができる。プロモーター制御配列は構成的、調節的、または組織特異的とすることができる。適切な構成的プロモーター制御配列は、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）−アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの断片、または、前述のいずれかの併用を含むが、これに限定されるものではない。適切な調節プロモーター制御配列の例としては、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質またはアルコールにより調節されるものを制限なしに含む。組織特異プロモーターの非限定的な例では、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ−１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ−２プロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、及び、ＷＡＳＰプロモーターを含む。プロモーター配列は、野生型とすることができ、または、より有効なまたは効果的な発現のために改変することができる。ベクターは、さらなる発現制御配列（例えばエンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終了配列等）、選択可能なマーカー配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）、複製起点等を含むことができる。当業者は、適切なベクター、プロモーター、他のベクター制御エレメントに精通している。
【００８９】
標的エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼであり、かつ、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼが核酸として細胞に導入される態様では、コードする核酸は、真核生物の対象とする細胞内でタンパク質への有効な翻訳のために最適化されるコドンとすることができる。例えば、コドンは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ブタ、ネコ、イヌ、魚、両生類、植物、イースト、昆虫等の発現のために、最適化することができる（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎにおけるコドン使用率データベースを参照）。コドン最適化のためのプログラムは、無料ソフトとして利用可能である（例えば、ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ；ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｃｏｄｏｎ＿ｏｐｔ．ｈｔｍｌにおけるＧｅｎＳｃｒｉｐｔからのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標））。商用コドン最適化プログラムもまた、利用可能である。
【００９０】
さらに、標的エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼである場合は、本方法は、少なくとも１つのガイドＲＮＡを細胞に送達することをさらに含む。一般に、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼ対ガイドＲＮＡの比は、約１：１である。ある態様では、ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ分子として導入することができる。例えば、エンドヌクレアーゼがタンパク質として導入される場合、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを、タンパク質／ＲＮＡ複合体として導入することができる。他の態様では、ガイドＲＮＡを、ＤＮＡ分子として細胞に導入することができる。この実施形態では、真核細胞のガイドＲＮＡの発現のため、ガイドＲＮＡコード配列を、プロモーター制御配列に操作可能に結合することができる。例えば、ＲＮＡコード配列を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）により認識されるプロモーター配列に、操作可能に結合することができる。適切なＰｏｌＩＩＩプロモーターの例は、哺乳類Ｕ６またはＨ１プロモーターを含むが、これに限定されるものではない。したがって、場合によっては、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを、ＤＮＡ配列として細胞に導入することができる。一部の反復では、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、同じベクターの部分とすることができる。
【００９１】
本方法はまた、所定のエピジェネティック修飾を有する少なくとも１つの合成ＤＮＡ配列を、細胞に導入することを含む。エピジェネティック修飾核酸は、上記セクション（Ｉ）に詳述される。ある態様では、エピジェネティック修飾核酸は、さらなる配列（例えば、終末の突出部、標的ゲノム遺伝子座近傍の配列と実質的に配列同一性の隣接配列、側面標的エンドヌクレアーゼ認識部位、制限エンドヌクレアーゼ部位、インスレーターエレメント等）を含むことができ、それらは上記セクション（Ｉ）に詳述される。
【００９２】
標的エンドヌクレアーゼ分子及びエピジェネティック修飾合成核酸は、様々な手段で細胞に送達することができる。一つの態様では、分子を、トランスフェクション方法で送達することができる。適切なトランスフェクション方法は、ヌクレオフェクション（またはエレクトロポーレーション）、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、カチオンポリマートランスフェクション（例えばＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルス形質導入、ウイロゾームトランスフェクション、ウィリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオンリポソームトランスフェクション、免疫リポソームトランスフェクション、非リポソーム型脂質トランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、遺伝子銃送出、インペールフェクション、ソノポレーション、光トランスフェクション、及び、専用薬剤増強の核酸の摂取を含んでいる。トランスフェクション方法は、当該技術分野で周知である（例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３、または、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、を参照されたい）。別の態様では、マイクロインジェクションにより分子を細胞に送達することができる。例えば、分子を、細胞の核または原形質に微量注入することができる。
【００９３】
標的エンドヌクレアーゼ分子及びエピジェネティック修飾合成核酸を、同時にまたは順に、細胞に送達することができる。標的エンドヌクレアーゼ分子のエピジェネティック修飾合成核酸に対する比は、約１：１０から約１０：１まで変化することができる。様々な態様では、標的エンドヌクレアーゼ分子のエピジェネティック修飾合成核酸に対する比は、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１、とすることができる。非限定的な典型的比は、約１：１である。
【００９４】
（Ｃ）ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた修飾
エピジェネティック修飾合成核酸を、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、細胞のゲノムに組み込むことができる。上記に詳述するように、本方法は、（ａ）（ｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは少なくとも１つのジンクフィンガーをコードする少なくとも１つの核酸、ここで各ジンクフィンガーは、細胞のゲノムの標的部位に二本鎖切断を認識及び導入するように操作されている、及び、（ｉｉ）ゲノムへの挿入のための少なくとも１つの合成エピジェネティック修飾合成核酸を、細胞に導入すること、ならびに、（ｂ）ジンクフィンガーヌクレアーゼにより作成される二本鎖切断の修復において、エピジェネティック修飾合成配列が細胞のゲノムに挿入されるように、細胞を培養することを含んでいる。
【００９５】
一つの態様では、エピジェネティック修飾合成核酸は、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって生成するものと適合性がある突出部に隣接される。例えば、突出部を含むエピジェネティック修飾合成核酸を、直鎖オリゴヌクレオチドとして導入することができ、または、エピジェネティック修飾合成核酸が、ジンクフィンガーヌクレアーゼにより認識される標的部位に隣接されるよう、エピジェネティック修飾合成核酸が大型のポリヌクレオチドの部分であるときにはそれをｉｎ  ｓｉｔｕで生成することができる。いずれの場合も、１つのジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、ゲノム内の標的部位で１本の二本鎖切断を導入することができ、及び、非相同の末端結合ＤＮＡ修復プロセスにより媒介される直接ライゲーションにより、エピジェネティック修飾合成核酸を、部位に挿入することができる。エピジェネティック修飾合成核酸の遺伝子位置への挿入は、内因性染色体配列を中断させまたは不活性化させる。あるいは、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて２本の二本鎖切断をゲノムに導入することができ、また、エピジェネティック修飾合成核酸は、（切除及び欠失される）内因性染色体配列と交換されることができる。
【００９６】
別の態様では、エピジェネティック修飾合成核酸は、標的開裂部位の上流及び下流配列とそれぞれ実質的配列同一性を有する上流及び下流配列に隣接される。例えば、１つのジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、１つの二本鎖切断をゲノム内の標的部位に導入することができ、ここで、相同性指向ＤＮＡ修復プロセスによる二本鎖切断の修復では、エピジェネティック修飾合成核酸は、内因性染色体配列の一部に挿入され、またはこれと交換される。あるいは、直上に詳述されるように、第１のジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、相同性指向プロセスにより第１の遺伝子座でエピジェネティック修飾合成核酸を挿入することができ、また、そして、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、第２の遺伝子座で二本鎖切断を導入することができ、ここで、第２の遺伝子座の破壊を、第２の遺伝子座で不活性化変異が導入される変異性の非相同末端結合修復プロセスにより修復することができる。不活性化変異は、少なくとも１つのヌクレオチドの、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入の、少なくとも１つのヌクレオチドの置換の、または、これらの組み合わせの欠失とすることができる。
【００９７】
上記の反復のいずれかでは、エピジェネティック修飾合成核酸が、対応する内因性染色体配列を置き換えることができる。あるいは、エピジェネティック修飾合成核酸は、安全な領域遺伝子座で、またはエピジェネティック修飾に安定性をもたらす部位で、挿入することができる。この反復では、エピジェネティック修飾合成核酸に対応する内因性染色体配列は（ここに詳述されるように）、欠失または不活性化が可能である。
【００９８】
（ｄ）ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼを用いた修飾
エピジェネティック修飾合成核酸はまた、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼを用いて、細胞のゲノムに挿入することができる。本方法は、（ａ）（ｉ）少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼまたは少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼをコードする核酸、ここで各ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼが、標的ゲノム配列の少なくとも１つの鎖を開裂することができる、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、ここで各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼをゲノム内の標的部位に向ける、及び、（ｉｉｉ）ゲノム内への挿入のための少なくとも１つのエピジェネティック修飾合成核酸を、細胞に導入すること、ならびに、（ｂ）ＤＮＡ修復の間、エピジェネティック修飾合成核酸がゲノムに挿入されるよう、細胞を培養することを含んでいる。
【００９９】
ある態様では、それが二本鎖配列の両方の鎖を開裂するよう、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼは、２つの機能的ヌクレアーゼ領域を含んでいる。例えば、１つのＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼ（またはコード核酸）及び１つのガイドＲＮＡ（またはコードするＤＮＡ）を、（エピジェネティック修飾合成核酸とともに）細胞に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼにより生成されるものと適合性がある突出部に、エピジェネティック修飾合成核酸が隣接する場合において、エピジェネティック修飾合成核酸は、非相同ベースの修復プロセスにより、染色体ＤＮＡと直接ライゲーションすることができる。エピジェネティック修飾によるエピジェネティック修飾合成核酸が、標的開裂部位の上流及び下流配列それぞれと実質的配列同一性を共有する上流及び下流配列に隣接される場合において、エピジェネティック修飾合成核酸は、相同性指向修復プロセスにより、内因性染色体配列の一部内に挿入することができ、またはそれと交換される。
【０１００】
他の態様では、二本鎖配列の１つの鎖（したがってそれはニッカーゼである）を開裂するよう、ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼを改変して、１つの機能的ヌクレアーゼ領域を含有することができる。ＣＲＩＳＰＲベースのニッカーゼを、２つの異なるガイドＲＮＡと共に用いて、ニックを二本鎖配列の逆の鎖に導入することができ、ここでは、この２つのニックは、二本鎖切断を構成するために、十分に近接している。この開裂を媒介するため、この２つのガイドＲＮＡは、５’−対向−５’設定で配向される（すなわち、上流ガイドＲＮＡは、ゲノム標的のセンス鎖に結合し、下流ガイドＲＮＡは、ゲノム標的のアンチセンス鎖に結合する）。したがって、本方法は、１つのＣＲＩＳＰＲベースのニッカーゼ（またはコードする核酸）、２つのガイドＲＮＡ（またはコードするＤＮＡ）、及び、エピジェネティック修飾合成核酸を、細胞内に導入することを含むことができる。エピジェネティック修飾合成核酸が、ＣＲＩＳＰＲベースのニッカーゼシステムにより生成するものと適合性のある突出部に隣接する場合は、エピジェネティック修飾合成核酸を、非相同ベースの修復プロセスにより、染色体ＤＮＡに直接ライゲーションすることができる。エピジェネティック修飾合成核酸は、標的開裂部位の上流及び下流配列のそれぞれと実質的配列同一性を共有する上流及び下流配列に隣接するケースでは、エピジェネティック修飾合成核酸は、相同性指向修復プロセスにより、一部の内因性染色体配列内に挿入することができ、またはこれと交換される。
【０１０１】
さらに他の態様では、ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼ（またはコードする核酸）及び２つのガイドＲＮＡ（またはコードするＤＮＡ）を、細胞内に導入して、２つの二本鎖切断をゲノム配列内に媒介することができる。同様に、ＣＲＩＳＰＲベースのニッカーゼ（またはコードする核酸）及び４つのガイドＲＮＡを細胞内に導入して、２つの二本鎖切断をゲノム配列内に媒介することができる。エピジェネティック修飾合成核酸が、ＣＲＩＳＰＲベースのタンパク質により生成されるものと適合性のある突出部に隣接する例では、エピジェネティック修飾合成核酸を、染色体配列に直接ライゲーションすることにより、内因性染色体配列をエピジェネティック修飾合成配列に置換することができる。エピジェネティック修飾合成核酸が、標的開裂部位の上流及び下流配列とそれぞれ実質的配列同一性を有する上流及び下流配列に隣接する反復では、エピジェネティック修飾合成核酸は、相同性指向修復プロセスにより、染色体配列内に挿入することができ、または交換することができる。あるいは、相同性指向修復プロセスにより、エピジェネティック修飾合成配列を二本鎖切断部位の１つに挿入することができ、また、不活性化変異（すなわち欠失、挿入、置換または少なくとも１つのヌクレオチド）の導入により、非相同修復プロセスにより二本鎖切断の他の部位を変異することができ、またはこれを不活性化することができる。
【０１０２】
ＣＲＩＳＰＲベースのエンドヌクレアーゼ介在反復のいずれかでは、エピジェネティック修飾合成核酸は、対応する内因性染色体配列を置き換えることができる。あるいは、エピジェネティック修飾合成核酸は、安全な領域遺伝子座で、または、エピジェネティック修飾に安定性をもたらす部位で、挿入することができる。この反復では、エピジェネティック修飾合成核酸に対応する内因性染色体配列を、（ここに詳述するように）欠失することができ、または不活性化することができる。
【０１０３】
ＩＶ．利用
所定のエピジェネティック修飾を有する合成核酸及び前記核酸を含む細胞は、数個の使用を有している。特定の態様では、調節領域のエピジェネティック状態を修飾するエピジェネティック修飾核酸の挿入を保有する操作された細胞を用いて、遺伝子発現を支配することができ、または変更することができる。例えば、通常修飾されない（すなわち通常はメチル化されないまたは高メチル化でない）調節染色体配列に加えて、または、その代わりに、エピジェネティック修飾核酸の挿入を有する細胞（メチル化核酸等）を用いて、遺伝子発現を変更することができる。逆に、エピジェネティック修飾を欠く合成核酸を有するエピジェネティック修飾、またはエピジェネティック修飾を欠く合成核酸の挿入を有することが知られる内因性調節配列の置換を用いて、遺伝子発現を変更することができる。
【０１０４】
別の態様では、エピジェネティック修飾が安定なエピジェネティック修飾合成配列を含む細胞は、診断または遺伝子型決定の標準として役立つことができる。例えば、エピジェネティック修飾合成核酸、または前記核酸を含む細胞を、疾病（癌等の）を診断するための分析の参照標準として用いることにより、疾病の予後を予測し、疾病挙動を監視し、疾病の適切な治療を決定し、及び、標的治療への応答を測定することが可能である。操作された細胞株におけるこの参照標準の供給は、（１）細胞溶解、（またはＦＦＰＥ抽出）、ＤＮＡ分離及び増幅の全ての二次的な診断処理工程を経る天然細胞環境及びゲノム環境の範囲内で、ＤＮＡ分析テンプレートを提供すること、及び、（２）遺伝子変化またはエピジェネティック変化を、安定かつ大量のゲノムＤＮＡを提供する細胞タイプにモデル化されることができるという点で、有利である。
【０１０５】
例えば、アルキル化剤による処理につき、神経膠芽腫患者には予測および／または予測マーカーとして有用であるＭＧＭＴ発現が、示された。ＭＧＭＴ酵素がアルキル化剤により引き起こされるＤＮＡの損傷に対抗するため、ＭＧＭＴの発現は、テモゾロマイド等のアルキル化剤による治療による予後不良と相関性がある。ＭＧＭＴプロモーターのメチル化パターンは、ＭＧＭＴ発現の指標として用いることができる。したがって、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化の量が多い患者は、テモゾロマイド治療から利益を得てもよく、一方、ＭＧＭＴプロモーターメチル化の量の低い患者は、テモゾロマイドに反応しないかもしれない（図３）。Ｈｅｇｉ  ｅｔａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０（６）：１８７１−４；Ｈｅｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３５２（１０）：９９７−１００３；Ｂｏｏｔｓ−Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２６（７）：９２２−９を参照されたい。さらに別の場合では、ヘテロ接合性（ＬＯＨ）測定をしないまま、ＢＲＣＡ１遺伝子のメチル化を用いて、所定の卵巣癌がＰＡＲＰ阻害剤または白金塩による処理の候補であるか否かを予測した（Ａｂｋｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０７（１０）：１７７６−８２）。したがって、過剰−または低−メチル化ＭＧＭＴまたはＢＲＣＡ１配列を含む操作された細胞を、メチル化状態を判断するために参照標準として用いることができる。さらに、特徴の十分にある量のメチル化物を有する患者のサンプルがない場合、標的メチル化パターンを有する操作された細胞は、新検出分析を開発及び特性化するコントロール試料として、または研究または診断研究室の配置または維持における品質管理処置として、有用とすることができる。
【０１０６】
さらなる態様では、エピジェネティック修飾が準安定性であるエピジェネティック修飾配列を含む操作された細胞を用いて、エピジェネティック修飾パターンの推測的な知識または挿入された配列の状態に基づいて、細胞内での修飾配列のエピジェネティック安定性を分析することができる。例えば、前記配列を用いて、薬品、環境または食事要因に応じて、遺伝子座のエピジェネティック安定性を分析することができる。特に、人工的にメチル化した遺伝子座は、メチル化パターンを「リセットする」出発点としての機能を果たすことができ、かつ、何の生体因子が二次的なメチル化及び遺伝子発現変化をもたらすかの検討を行うことができる。一例として、重量とコート体色変化の間のよく知られた関連、及び、食事の補充の後のマウスアグーチ遺伝子のメチル化状態が存在する（Ｄｏｌｉｎｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：３０Ｒ）。標的エンドヌクレアーゼを（上記に詳述するように）用いて化学修飾配列を厳密な位置に挿入することができるため、該修飾配列は、天然染色体環境内に配置することができ、これは、依然として、対象とする染色体領域に固有になりうる任意の遺伝子座特異的エピジェネティック調節因子下にある。異所性メチル化ＤＮＡ配列を用いたこのような遺伝子座特定実験は、可能ではない。
【０１０７】
さらに別の特徴では、エピジェネティック修飾合成配列を含む操作された細胞を、エピジェネティック修飾配列を含むゲノムＤＮＡのソースとして、用いることができる。例えば、ＤＮＡは、標準技術を用いて、生きた細胞または固定細胞からの抽出ができ、増幅ができ、及び、分析ができる。あるいは、エピジェネティック修飾を有する合成染色体配列は、細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕで、例えばｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ウェスタン、免疫組織化学、及び、他の適切な手順を介して、分析することができる。
【０１０８】
Ｖ．キット
本発明は、エピジェネティック修飾合成配列、及び／または、ここに記載される前記配列を含む細胞を含むキットを、さらに提供する。一実施形態では、キットは、対象内での疾病の癌治療等の治療処置または投薬計画への反応性を予測するために提供され、このキットは、対象から取得したサンプルと共に、参照標準（すなわちエピジェネティック修飾合成配列）の比較の解釈のための文書に加えて、既知の治療成果に関連する所定のシトシン修飾を有する少なくとも１つの合成核酸を含んでいる。キットは、制御染色体配列をさらに含んでいてもよい。別の実施形態では、キットは、対象サンプルでの疾病を診断するために提供され、このキットは、対象から取得されるサンプルとの参照標準と比較の解釈のための文書とともに、既知の病態に関連がある所定のシトシン修飾を有する少なくとも１つの合成核酸を含む。キットは、制御染色体配列をさらに含んでいてもよい。別の実施形態では、キットは、対象サンプル内の疾病の予後または重症度を予測するために提供され、このキットは、対象から取得したサンプルと共に、参照標準の比較の解釈のための文書に加えて、疾病の既知の予後に関連する所定のシトシン修飾を有する少なくとも１つの合成核酸を含んでいる。キットは、制御染色体配列をさらに含んでいてもよい。
【０１０９】
他の実施形態において、キットは、多数のエピジェネティック修飾合成配列のパネルを含んでおり、ここでキットの各合成配列は、異なる既知である（１）疾病処理に対する感受性のレベル、（２）疾病の診断、または、（３）疾病の予後、に関連する異なる所定のシトシン修飾を有している。このパネルは、多数の標準を提供するものであり、これに対し、対象のサンプルのシトシン修飾は、（１）疾病の診断を決定すること、または、（２）疾病の予後を決定すること、または、（３）治療計画の予後を判断すること、と比較することができる。これらの異なるキットのいずれかでは、キットは、１つ以上の制御染色体配列と、参照標準と対象から取得されるサンプルとの比較の解釈のための文書とを、さらに含んでいてもよい。
【０１１０】
ある態様では、エピジェネティック修飾合成配列またはこの複数の配列は、１つ以上の固定細胞内で提供される。多数のシトシン修飾を有する合成配列が提供される際、サンプルは、これらが細胞内で組み込まれるか否かを問わず、別個の、明確にラベルの付いた包装内で提供される。
【０１１１】
定義
他の定義がなされない限り、ここに用いられる全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する当業者により共通して理解される意味を有している。以下の参照は、本発明に用いられる用語の多くの一般的な定義を有する技術の１つを提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及び、Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。ここに用いられる場合において、以下の用語は、特に明記しない限りこれらの用語に付与された意味を有する。
【０１１２】
本開示またはその好ましい態様の要素を導入する場合、単語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「ｓａｉｄ」は、これらの要素の１つ以上があることを意味することを目的とする。用語、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」及び「ｈａｖｉｎｇ」は、包括的なことを目的とするものであり、また、列挙された要素以外のさらなる要素があってもよいことを意味するものである。
【０１１３】
ここに互換可能に用いられるように、用語「ＣｐＧ位置」及び「ＣｐＧ部位」は、その長さに沿った塩基の直鎖配列内でシトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドの隣に発生するＤＮＡの領域のことをいい、ここで「ＣｐＧ」は「−Ｃ−リン酸塩−Ｇ−」結合の略語であり、すなわち、シトシン及びグアニンは、単一のリン酸塩により分離される。用語「ＣｐＧアイランド」は、ＣｐＧ部位のクラスタのことをいう。
【０１１４】
ここに用いられる場合において、用語「内因性配列」は、細胞にとって天然の染色体配列のことをいう。
【０１１５】
用語「外因性配列」とは、ここに用いられる場合、細胞にとって天然ではない配列、または、細胞のゲノムの天然の位置が異なる染色体位置である、染色体配列のことをいう。
【０１１６】
「遺伝子」とは、ここに用いられる場合、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エキソン及びイントロンを含む）、及び、遺伝子産物の生成を調節する全てのＤＮＡ領域のことをいい、いずれにせよこれらの調節配列は、コード及び／または転写された配列に隣接する。したがって、遺伝子は、必ずしもこれに限定されないものの、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び内部リボソーム導入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界線エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び、遺伝子座制御領域を含んでいる。
【０１１７】
用語「異種」は、対象とする細胞に対して内在性でないまたは天然でない実体のことをいう。例えば、異種タンパク質は、外因的に導入された核酸配列等の外因性ソースに由来する、または元来由来する、タンパク質のことをいう。場合によっては、異種タンパク質は通常、対象とする細胞により生成されるものではない。
【０１１８】
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、直鎖または環状の配座での、及び一本鎖または二本鎖形態での、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーのことをいう。本開示において、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するとは解釈すべきでない。用語は、自然のヌクレオチドならびに塩基、糖及び／またはリン酸塩部分（例えばホスホロチオ酸骨格鎖）内で修飾されるヌクレオチドの、既知の類似体を含むことができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴを有する塩基対になりうる。
【０１１９】
用語「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのことをいう。ヌクレオチドは、標準ヌクレオチド（すなわちアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン及びウリジン）またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体は、修飾プリンまたはピリミジン塩基または修飾リボース部分を有するヌクレオチドのことをいう。ヌクレオチド類似体は、自然発生的なヌクレオチド（例えばイノシン）または非自然発生的なヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分上の修飾の非限定的な例としては、アセチル基の付加（または除去）、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、水酸基、メチル基、ホスホリル基、及び、チオール基、ならびに塩基の炭素及び窒素原子の他の原子（例えば７−デアザプリン）との置換を含んでいる。また、ヌクレオチド類似体は、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、固定核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び、モルホリノを含んでいる。
【０１２０】
用語「ポリペチド」及び「タンパク質」は、互換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーのことをいう。
【０１２１】
核酸及びアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は、当該技術分野で知られている。典型的には、この技術は、遺伝子に対してｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、及び／または、それによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、及び、これらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含んでいる。また、ゲノム配列はこの形態で決定することができ、比較することができる。一般に、同一性は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペチド配列それぞれの対応に対する、正確なヌクレオチド−ヌクレオチド、または、アミノ酸−アミノ酸のことをいう。２以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、これらのパーセント同一性を決定することにより、比較してもよい。２つの配列のパーセント同一性は、核酸かアミノ酸配列かにせよ、短い配列の長さで分割される２つの調製された配列の間に１００を掛けた完全一致の数である。核酸配列のための概算のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡにより開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により正規化される、重み行列を用いることにより、アミノ酸配列に適用されてもよい。配列のパーセント同一性を決定するこのアルゴリズムの例示的な実施態様は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」  ｕｔｉｌｉｔｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎにおけるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）により提供される。パーセント同一性または配列間の類似性を計算する他の適切なプログラムは、当該技術分野で一般に知られており、例えば、他のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータに用いられるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを使用して用いてもよい：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；分離＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０の配列；仕分け＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイトに見出されてもよい。
【０１２２】
様々な変化が、本発明の要旨を逸脱しない範囲で、上記の動物、細胞及び方法で作製可能であるが、上記の記載及び以下の実施例に含まれる全ての物質が、例示的であるように、かつ、限定的にでないように、解釈されることが意図される。
【実施例】
【０１２３】
以下の実施例は、本発明の所定の態様を例示する。
【０１２４】
実施例１：合成メチル化ＤＮＡの安定な組み込み
この研究の目的は、ＺＦＮ標的ゲノム修飾を用いて、合成的にメチル化したＤＮＡを、細胞の染色体に安定的に組み込むことができるか否かを決定することであった。異なるメチル化パターンを有するヒトＯ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子の断片が、ヒト細胞の１９番染色体上のＡＡＶＳ１遺伝子座の標的部位に挿入された。図１Ａは、この方策を図解する。
【０１２５】
ヒトＭＧＭＴ遺伝子（すなわち、
【化１】
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、配列番号：９）から１９番目の配列を含む２つの一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、及び、コロニースクリーニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）を、合成した。１から４まで（５’から３’まで）指定されるＣｐＧ部位が、配列番号：９で明白に示される。１つのｓｓＯＤＮは、ＣｐＧ部位で５−メチルシトシンを含んでいた。また、２つの補完的な（メチル化及び非メチル化）ｓｓＯＤＮを、合成した。ｓｓＯＤＮの様々な組み合わせを、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０，５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むアニールバッファ内で９５のμＭの終末濃度でアニールし、非メチル化、半メチル化及び二本鎖メチル化二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を形成した（図１Ｂを参照）。ｄｓＯＤＮの上の突出部を、ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座をターゲットするジンクフィンガーヌクレアーゼの開裂の部位でＦｏｋＩ酵素により作成される５’−ＧＣＣＡ−３’突出部と適合性があるように設計した。
【０１２６】
容量１００μｌのヒトＫ５６２細胞１００万個に対して、３倍の実験でのＡＡＶＳ１  ＺＦＮ  ＲＮＡ５．０μｇとともに、９５μＭのｄｓＯＤＮ３．２μＬでヌクレオフェクションを行った。ヌクレオフェクション後２日、６日、８日及び１０日に、細胞の均等量を採取し、ＰＣＲを用いて組み込まれた配列を保有する領域を増幅し、ＰＣＲ製品のＨｉｎｄＩＩＩ消化を行った。２６４ｂｐ及び１８０ｂｐの断片を、各条件（すなわち非メチル化ｄｓＯＤＮ＋ＺＦＮ、半メチル化ｄｓＯＤＮ＋ＺＦＮ及び二本鎖メチル化ｄｓＯＤＮ＋ＺＦＮ）の下、各日に検出した。
【０１２７】
培養の２０日後に、ヌクレオフェクションを行った細胞に対して、単一の生細胞のためにＦＡＣ分類を行い、９６−ウエルプレート上に接種した。ヌクレオフェクションの３５日後、各単一細胞コロニーに由来する細胞を、２つの部分に分割し：一方の部分を冷凍し、他方の部分を、ｄｓＯＤＮ配列の組み込みのため、スクリーンした。ゲノムＤＮＡを抽出し、組み込まれた配列を保有するＡＡＶＳ１領域をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ製品をＨｉｎｄＩＩＩ酵素消化によりＲＦＬＰ分析した。約１３００のコロニーをＨｉｎｄＩＩＩ消化によりスクリーニングし、正確なサイズのＨｉｎｄＩＩＩ断片によるそれらに、定期的なＤＮＡ塩基配列決定を行った。合計１８の単細胞クローンを、２５ｂｐ断片（すなわち１９ｂｐ  ＭＧＭＴ断片及びＨｉｎｄＩＩＩ部位）の正しい挿入で、ＡＡＶＳ１遺伝子座の３つの対立遺伝子のうちの１つに同定した。具体的に、５コロニーは、非メチル化挿入の正しい組み込みを有し；４コロニーは、半メチル化挿入の正しい組み込みを有し；９コロニーは、二本鎖メチル化挿入の正しい組み込みを有している。修飾ＡＡＶＳ１遺伝子座の配列は、
【化２】
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（配列番号：１０；太字体で示される２５ｂｐ挿入物、イタリックで示されるＨｉｎｄＩＩＩ部位）であった。合成メチル化ＤＮＡをヒト細胞のゲノムと安定的に組み込むことができることを、これらのデータは示している。
【０１２８】
実施例２：合成メチル化ＤＮＡの安定維持
この研究の目的は、ゲノムに組み込まれた合成メチル化ＤＮＡのメチル化状態を、安定的に保持することができるか否かを、決定することであった。ＭＧＭＴ断片の正しい挿入による９つの細胞コロニーを、ＡＡＶＳ１遺伝子座（実施例１を参照）の３つの対立遺伝子の各々において、２週間、再成長させた。各コロニーのメチル化状態を、パイロシーケンスにより決定した（ＥｐｉｇｅｎＤｘ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，マサチューセッツ州）。ヌクレオフェクション後４９日のメチル化分析を、表１に示す。
【表２】
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【０１２９】
コロニー＃１（非メチル化）及びコロニー＃７（二本鎖メチル化）の繰り返し（Ａ、Ｂ）を、さらに３１日間成長させた。各コロニーのメチル化状態（ヌクレオフェクション後８０日）をパイロシーケンスにより決定し、表２に示す。図２は、トランスフェクション後４９日及び８０日のこれらの２つの異なる対立遺伝子における各ＣｐＧ部位でのメチル化状態を要約する。これらのデータは、メチル化状態を、合成ＤＮＡからゲノム遺伝子座まで伝えることができる点と、ＤＮＡメチル化の所定のパターンを、世代ごとに大部分保持することができる点とを示す。
【表３】
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【０１３０】
実施例３：安定なＭＧＭＴメチル化パターンを有する細胞の使用
安定なＭＧＭＴメチル化パターン（上記に調製されるもののような）を有する細胞を、神経膠芽腫に罹患する患者のために適切な治療経過を決定するための分析の診断制御として、用いることができる。患者の腫瘍サンプルのＭＧＭＴプロモーターメチル化の量を、安定なＭＧＭＴを用いた制御（参照）細胞のものと、分析及び比較することができる。例えば、ＤＮＡを、標準手順を用いて、腫瘍及びコントロール試料から抽出することができる。抽出されたＤＮＡを、亜硫酸水素塩で処理し、メチル化特定のＰＣＲを用いて増幅し、そして、配列することができる。あるいは、抽出されたＤＮＡのメチル化状態を、パイロシーケンスを用いて決定することができる。あるいは、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化状態を、ＭＧＭＴに対して増加するメチル化特異抗体を用いて、固定細胞の免疫組織化学により分析することができる。患者のサンプルのメチル化状態をその後、対照細胞のものと比較することができる。患者から取得されるサンプルのメチル化量が対照細胞のものより低い場合は、その場合、腫瘍はＭＧＭＴメチル化に対して負であると考えられ、テモゾロマイドは投与されない。患者から取得されるサンプルのメチル化量が対照細胞のものと等しい、またはそれよりも大きい場合は、その場合、腫瘍はＭＧＭＴメチル化に対して陽性であると考えられ、テモゾロマイドが投与される（図３を参照）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017517250.tif 000021
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