(57)【要約】  ドナーから収集された細胞から誘導された人工多能性幹細胞またはそれから分化された細胞において刺激応答研究を行うためのプラットフォームおよび方法。試料は、種々の年齢において、および／または環境的条件への曝露前および後において採取される。プラットフォームを調製する方法も提供される。一実施形態では複数のドナーが関与する。別の実施形態では人工多能性幹細胞は分化される。任意で、人工多能性幹細胞またはその分化細胞は、後の分析のため保存される。
2017530717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激に対する2つ以上の試験試料の応答における年齢または環境的曝露の影響を決定する方法であって、
a. 第1の試験試料に前記刺激を適用する工程であって、前記試験試料は、1つ以上の人工多能性幹細胞、またはそれから分化された1つ以上の細胞を含み、前記人工多能性幹細胞は、ドナーから採取された細胞から誘導されたものである、工程と、
b. 前記刺激に対する前記第1の試験試料の応答を検出する工程と、
c. 前記刺激を第2の試験試料に適用する工程であって、前記第2の試験試料は、1つ以上の人工多能性幹細胞、またはそれから分化された1つ以上の細胞を含み、前記人工多能性幹細胞は、前記第1の試験試料が採取されたのと同じドナーから後に採取された細胞から誘導されたものであり、前記ドナーの年齢、または前記ドナーが曝露された環境が、前記第1の試験試料と前記第2の試験試料との間で異なっている、工程と、
d. 前記刺激に対する前記第2の試験試料の応答を検出する工程と、
e. 前記刺激に対する前記第1および第2の試験試料の応答を比較する工程と
を任意の順で含み、
応答における差異は、前記ドナーの年齢および／または前記ドナーへの環境的曝露における差異が、前記刺激に対する前記試験試料の応答に影響することを示す、方法。
【請求項２】
前記ドナーが曝露された環境が、食事的、化学的、生物学的、または環境的因子である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ドナーがヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記第1の試験試料を構成する前記人工多能性幹細胞となるように誘導される前記細胞は、無エクスポゾーム条件下で前記ドナーから取得される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
2以上のドナーを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
各ドナー由来の第1の試験試料を構成する前記人工多能性幹細胞となるように誘導される前記細胞が、無エクスポゾーム条件下で取得される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
10以上のドナーを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
各ドナー由来の第1の試験試料を構成する前記人工多能性幹細胞となるように誘導される前記細胞が、無エクスポゾーム条件下で取得される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
ドナーの試験試料を構成する前記人工多能性幹細胞となるように誘導される前記細胞の1つ以上が、前記刺激を適用することに先立って保存される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
刺激に対する2つ以上の試験試料の応答における年齢または環境的曝露の影響を決定するためのプラットフォームであって、人工多能性幹細胞またはそれから分化された細胞の2セット以上を含み、
各セットは、他のセットにおける細胞の採取時とは異なる所定の時において単一ドナーから採取された細胞から誘導されたものであり、
前記ドナーの年齢、または前記ドナーが曝露された環境が、第1の試験試料と第2の試験試料との間で異なっている、プラットフォーム。
【請求項１１】
前記ドナーが曝露された環境が、食事的、化学的、生物学的、または環境的因子である、請求項10に記載のプラットフォーム。
【請求項１２】
前記ドナーがヒトである、請求項10に記載のプラットフォーム。
【請求項１３】
前記試験試料の1つを構成する前記人工多能性幹細胞となるように誘導される細胞が、無エクスポゾーム条件下で前記ドナーから取得される、請求項10に記載のプラットフォーム。
【請求項１４】
2以上のドナーを含む、請求項10に記載のプラットフォーム。
【請求項１５】
各ドナー由来の前記試験試料の1つを構成する前記人工多能性幹細胞となるように誘導される細胞が、無エクスポゾーム条件下で取得される、請求項14に記載のプラットフォーム。
【請求項１６】
10以上のドナーを含む、請求項10に記載のプラットフォーム。
【請求項１７】
各ドナー由来の前記試験試料の1つを構成する前記人工多能性幹細胞となるように誘導される細胞が、無エクスポゾーム条件下で取得される、請求項16に記載のプラットフォーム。
【請求項１８】
試験試料を構成する前記人工多能性幹細胞となるように誘導される前記細胞の1つ以上が、前記刺激を適用することに先立って保存される、請求項10に記載のプラットフォーム。
【請求項１９】
請求項10に記載のプラットフォームの2つ以上を備える、システム。
【請求項２０】
刺激に対する2つ以上の試験試料の応答における年齢または環境的曝露の影響を決定する方法であって、
a. 特定のドナー由来の第1の試験試料を選択する工程であって、前記試験試料は、1つ以上の人工多能性幹細胞またはそれから分化された1つ以上の細胞を含み、前記人工多能性幹細胞は、ドナーから採取された細胞から誘導されたものである、工程と、
b. 任意で、前記第1の試験試料を2つ以上の二次試料に分ける工程と、
c. 任意で、第1の二次試料のうちの全てではないが少なくとも1つの、構造または生物学的挙動の1つ以上のパラメーターを測定する工程と、
d. 残された第1の二次試料（複数可）に前記刺激を適用する工程と、
e. 前記刺激が適用された第1の二次試料の構造または生物学的挙動の1つ以上のパラメーターを測定する工程と、
f. 後続の試料を選択する工程であって、前記後続の試験試料は、1つ以上の人工多能性幹細胞またはそれから分化された1つ以上の細胞を含み、前記人工多能性幹細胞は、前記第1の試験試料が採取されたのと同じドナーから後に採取された細胞から誘導されたものであり、前記ドナーの年齢、または前記ドナーが曝露された環境が、前記第1の試験試料と前記後続の試験試料との間で異なっている、工程と、
g. 任意で、前記後続の試験試料を2つ以上の二次試料に分ける工程と、
h. 任意で、前記後続の二次試料のうちの全てではないが少なくとも1つの、構造または生物学的挙動の1つ以上のパラメーターを測定する工程と、
i. 残された後続の二次試料（複数可）に前記刺激を適用する工程と、
j. 前記刺激が適用された後続の二次試料の構造または生物学的挙動の1つ以上のパラメーターを測定する工程と、
k. 前記刺激が適用された前記第1および第2の試験試料由来の二次試料の測定値を比較する工程と、
l. 任意で、第1の二次試料であるか後続の二次試料であるか、および、前記刺激が適用されたものであるか否かに関わらず、前記二次試料の一部または全ての測定値を比較する工程と
を任意の順で含み、
応答における差異は、前記ドナーの年齢、または前記ドナーへの環境的曝露が、前記刺激に対する前記試験試料の応答に影響することを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、人工多能性幹細胞、またはそれから分化した細胞を使用して刺激応答研究における遺伝学的性質、年齢、および環境の影響を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
科学界は、医薬の投与、ならびに化学物質、細菌、およびウイルスへの曝露のような、種々の刺激に対する細胞ならびに組織の生物学的応答の根本的な原因に長年興味を示してきた。科学者は、以下の因子：刺激の性質；試験対象の遺伝学的プロファイル；試験対象の年齢；ならびに対象がその生涯を通じて耐える、食事、疾患、化学物質、および環境的負荷のような、身体曝露の固有の経歴が、応答において鍵となる役割を果たすことを認識してきた。しかしながら、試験対象由来のあらゆる入手可能な細胞または組織、および関連する試験方法は、全4種の因子の特有の組み合わせを不可避的に示したので、科学者は、種々の因子の関与を分別するうえで困難に会ってきた。
【０００３】
医薬および環境毒性学のような、ある種の分野における科学者は、特定の刺激への試験対象の反応に対する、年齢の影響、および種々の曝露の経歴の影響を決定し、理解することに特に興味を示してきたが、これは、ヒトの健康に対して重要な作用を有するそのような影響について多数の例が存在するからである。例えば、研究により、喫煙が、石綿、アルコール、ヒ素、およびニッケルへの曝露の害をその後増大させることが示され、一方、他の研究により、喫煙が、後の肝炎BおよびHPV感染症の影響を悪化させることが示された。
【０００４】
曝露経歴が後続の刺激に対する生物学的応答を変化させることについての散発的な実証例にも関わらず、これらのタイプの影響についての科学界の知識は、範囲、および同定された影響の多くの側面についての信頼性レベルの両方において、明らかに不完全である。
【０００５】
これらの問題点を研究するための科学界の主なツールは、歴史的に、疫学的研究であったが、そのような研究はいくつかの限界に直面する。第1に、それらは、実際の事象を研究することに制限される。それ故に、知見は、回顧的事象に制限され、将来の事象ではない。第2に、あらゆる生物学的「応答」は、誘発刺激の混合の結果であるが、食事、化学的および生物学的曝露、環境的曝露などのような、経歴的曝露の結果でもある。各曝露の影響は、ドナーが経験した全ての他の曝露の影響から分離させることが困難である。曝露の性質および程度におけるあまりに多くの潜在的な相違が存在するため、同定された各「犠牲者」は、事実上、固有の「犠牲者」である。多数の観察された「犠牲者」（研究対象の刺激について多数の「犠牲者」が実際に存在するなら）に基づく統計上の分離は、わずかな相関性のみを生じる傾向にある。第3に、その刺激自体の1つの固有の態様の「ピンポイント的な」観察に結果が制限される。定義上、刺激の程度もしくは強度を増大させたり減少させたりするような、刺激自体の代替バージョンの試験は存在し得ない。
【０００６】
考慮され得る別のプラットフォームは、2つ以上の時点で単一ドナーから採取された初代細胞の使用である。このアプローチに始め興味を持つ科学者が一部いるとも思われるが、それは、医療的手順が有益であるか否かを決定するのを助けるために、その手順を取り巻く「事前および事後の」生検試料を採取するという通常の慣行に外見上類似しているからである。単一ドナー／複数時期／刺激応答（SD−MTP−SR）プラットフォームは、事前・事後の生検セット、あるいは生存対象の他の事前・事後試験とは根本的に異なるので、この類似は表面的なものにすぎない。事前・事後構成は、例えば、手順自体が、追い求めている変化を起こしたかどうかを問うことにより、刺激（例えば、医療的手順）の直接的影響の分析を補助する。定義上、事前・事後技法を使用する場合には、刺激は、最初の生検と後続の生検の間にインビボで起こる。対照的に、SD−MTP−SRプラットフォームは、外部刺激を第1の生検時の後（かつ第2の生検時の前）に加えた場合、第2の生検時の後だけに加えた場合と異なる影響を試験対象に対して及ぼすかどうかの分析を補助する。
【０００７】
死体が使用されるか生存対象が使用されるかに関わらず、刺激応答研究において生物学的反応に対する年齢および曝露経歴の影響を理解することを求める場合には、初代組織の使用には著しい問題点がある。
【０００８】
死体から初代組織を調達することは、通常、実施の目的、すなわち、同じ試験対象の経歴における2つの異なる時点の組織を得ることに直接反する（そこでは2回の試料採取間で曝露が変化している）。さらに、死体からの調達は、通常、試験対象の曝露経歴の完全な目録を得ることが不可能である状況下で起こる。
【０００９】
生存対象から適当な初代組織を調達することもまた、問題点を伴う。第1に、多くの初代組織は、生検に適当でなく（例えば、目、歯、脳）、一方、他のもの（例えば、心筋、肝細胞）は、ひどく侵襲的な手順を利用しなければアクセスできない（そして、当然ながら、ここで求められる比較は、最低2回のそのような侵襲を要求する）。加えて、生存対象から取得し得る組織の量は通常少なく、有用性を制限する。次に、初代細胞は、しばしば、凍結保存には不適な候補であり、実施者が、細胞の最初のセットに直ちに刺激を適用してから、ずっと後になってようやく細胞の第2のセットに同一の刺激を適用することが求められ、それにより、適用の一貫性が潜在的に低減される。最後に、定義上、入手可能な唯一の細胞型は、実際に収集される細胞型である。それ故、未収集の他の細胞型に対する刺激の「副作用」の分析はあり得ず、また、実施者が研究することを望む曝露の経歴に合致し、かつ複数の組織の2巡以上の生検を採取することにも進んで参加するドナーを見出すことは困難であろう。
【００１０】
それ故、必要とされるものは、特定の刺激に対する個体または集団の反応における、遺伝学的性質、年齢、および／または異なる時点での曝露の影響および相互作用を研究するための、信頼できる正確な方法である。
【発明の概要】
【００１１】
ドナーから収集された細胞からもたらされた、iPSC、またはiPSCから分化した細胞において刺激応答研究を行うためのプラットフォームおよび方法が、本明細書において提供される。試料は、種々の年齢において、ならびに／または環境上の条件への曝露前および後に採取される。次に、同一プロトコールの刺激応答研究が、2つ（またはそれ以上）のセットの細胞において行われ、結果が対比される。そのプラットフォームを調製する方法も提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、複数のドナーが関与する。いくつかの実施形態では、iPSCは分化される。いくつかの実施形態では、iPSC、またはその分化した細胞は、後の分析のため保存される。
【００１３】
加齢、ならびに／または食事、医薬、および環境のような因子への曝露における差異が、化学薬品もしくは生物学的因子への曝露のような後続の刺激に対する生物体の生物学的応答を一時的または永続的に変化させ得ることは、疫学的な研究を通じてよく知られている。しかしながら、今日まで、実験に基づいてそのような影響を試験するための、広く適用可能なプラットフォームは存在していなかった。
【００１４】
そのような広く適用可能なプラットフォームは、同じ個々のドナーから異なる時点において組織試料を得ること（従って、定義上、異なる年齢において組織試料を得ることとなり、および／または、より後の組織試料は曝露のさらなる経歴を組み込むこととなる）、ならびに、これらの組織試料由来の細胞を、人工多能性幹細胞（iPSC）となるように変換、再プログラミング、または誘導することにより創出することができる。種々のセットのドナーのiPSCが、目的の共通の機能的細胞型に変換され、続いて同一の刺激に曝露されるとき、先行セットおよび後行セットの細胞間の生物学的応答における差異は、与えられた刺激に対する機能的細胞の生物学的応答における年齢および曝露経歴の影響の直接的な実験証拠をもたらすことができる。これにより、実施者が、その個々のドナーの場合における、複数の刺激に渡る年齢および環境の影響のプロファイルを創出することが可能になる。特定のドナーの人生における追加的な、さらに後の時点での試料を採取するプロセスを繰り返すことにより、特定の刺激への応答に対する年齢および曝露の影響の進行を解明することができる。
【００１５】
単一ドナー／複数時期／刺激応答（SD−MTP−SR）プラットフォームはまた、複数ドナーの研究において使用するための複数の個別ドナーについても構築することできる。そのような場合において、実施者は、与えられた刺激への生物学的応答における遺伝学的性質、年齢、およびある種の曝露の各影響を、以前に可能であったよりも良好に分離するための実験データを展開することができる。
【００１６】
SD−MTP−SRプラットフォームは、様々な規格の下で創出することができ、そのそれぞれが、有用な比較をするための異なる機会をもたらす。例えば、実施者は、年齢の影響も曝露の影響も受けていない細胞に由来するベースライン細胞セットを創出するために、誕生時点またはその近くでSD−MTP−SRプラットフォームにおける第1の細胞セットを取得し得る。これにより、誕生時に収集された細胞に由来する細胞の反応を、そのドナーの人生における、より後の時点で収集された細胞に由来する他セットの細胞の反応と比較することを通じた「年齢および曝露の影響の全体」の理解を促進することができる。あるいは、実施者は、重要な曝露（例えば、癌患者のための化学療法または放射線処置の開始）の直後に採取された細胞に由来する細胞との比較を行うために、その重要な曝露の直前に採取された細胞に由来する細胞のベースラインセットを創出して、その特定の曝露の影響を単離することを試みることなどができる。
【００１７】
1つまたは複数の単一ドナー／複数時期／刺激応答（SD−MTP−SR）プラットフォームを含有するシステムが本明細書において提供され、個々のSD−MTP−SRプラットフォームは、（a）iPSC、またはそのiPSCからもたらされた細胞もしくは組織の2つ以上のセットであって、各セットが、他のセットにおいて同じドナーから細胞が収集された時とは異なる特定の時に単一ドナーから収集された、任意のタイプの細胞のセットからもたらされたもの；ならびに（b）収集間の時間差の長さもしくは形式、および／または、細胞の第1のセットの収集と細胞の後のセットの収集との間の時間にドナーが曝露された、対象となる少なくとも1つの食事的、化学的、生物学的、もしくは環境的因子の記載を含む。
【００１８】
異なる時点で収集されたiPSCの2つのセットが、目的の共通の機能的細胞型に変換され、同一の刺激に曝露されるとき、4種の条件（曝露前かつ刺激前、曝露前かつ刺激後、曝露後かつ刺激前、最後に、曝露後かつ刺激後）における細胞間での生物学的応答における差異が、与えられた刺激への応答における年齢および曝露経歴の影響の直接的な実験証拠をもたらすことができる。複数の実験に渡るこのプラットフォームの反復使用により、実施者が、この個体の場合において複数の刺激にわたる年齢および環境の影響のプロファイルを創出することが可能になる。さらに、特定の試験対象の人生におけるさらなる時点で単一ドナー／複数期間プラットフォームの構築を繰り返すことにより、特定の刺激への応答における年齢および曝露の影響の進行を解明することができる。
【００１９】
上で述べた通り、複数ドナーの研究において使用するために複数の個体を使用して構築されたSD−MTP−SRプラットフォームも提供される。そのような場合、実施者は、与えられた刺激への生物学的応答における遺伝学的性質、年齢、およびある種の曝露の各影響の、試料間の平均（すなわち、平均値、中央値、または他の任意の中心性尺度）、範囲、および／または分布を、以前に可能であったものより良好に分離するための実験データを展開することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、刺激応答研究の概略図であり、応答値、ならびに刺激前条件（pre-S）、刺激の適用、および刺激後条件（post-S）の時間的関係を示している。数値は、観察的データ点を示す。
【００２１】
【図２】図２は、刺激応答研究の概略図であり、エンドポイント応答値、ならびに種々の時点における刺激前条件（pre-S）、刺激の適用、刺激後条件（post-S）、曝露前条件（pre-E）、受けた曝露、および曝露後期間（post-E）の時間的関係を示している。数値は、観察的データ点を示す。
【００２２】
【図３】図３は、（異なる）刺激応答研究の概略図であり、エンドポイント応答値、ならびに種々の時点における刺激前条件（pre-S）、刺激の適用、刺激後条件（post-S）、曝露前条件（pre-E）、受けた曝露、および曝露後期間（post-E）の時間的関係を示している。数値は、観察的データ点を示す。
【００２３】
【図４】図４は、（さらに別の）刺激応答研究の概略図であり、エンドポイント応答値、ならびに複数の刺激についての種々の時点における刺激前条件（pre-S）、刺激の適用、刺激後条件（post-S）、曝露前条件（pre-E）、受けた曝露、および曝露後条件（post-E）の時間的関係を示している。数値は、観察的データ点を示す。
【００２４】
【図５】図５は、刺激応答研究の概略図であり、エンドポイント応答値、ならびに複数の試験対象についての種々の時点における刺激前条件（pre-S）、刺激の適用、刺激後条件（post-S）、曝露前条件（pre-E）、受けた曝露、および曝露後条件（post-E）の時間的関係を示している。数値は、観察的データ点を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
単一ドナー／複数時期／刺激応答研究を行うためのプラットフォームおよび方法が本明細書において示され、ここでは、人工多能性細胞（iPSC）、またはそれからもたらされた細胞が利用される。方法において使用されるiPSCは、2つ以上の時期からの1つ以上の予め選択されたドナー（複数可）から、および／または、所定の物質もしくは環境への曝露前および曝露後に取得された細胞から産生されたものである。いくつかの実施形態では、複数のドナーが関与する。いくつかの実施形態では、iPSCは分化される。場合により、プロセスにおける任意の適当な点で、細胞またはその後代もしくは派生細胞は、例えば凍結保存により保存され、その後解凍される。そのプラットフォームを調製する方法も提供される。
【００２６】
1つまたは複数の単一ドナー／複数時期／刺激応答（SD−MTP−SR）プラットフォームを含むシステムが本明細書において記載され、ここで、個々のSD−MTP−SRプラットフォームは、（a）iPSC（またはそのiPSCからもたらされた細胞もしくは組織）の2つ以上のセットであって、各セットが、他のセットにおける細胞の収集時とは異なる特定された時間に単一ドナーから収集された任意のタイプの細胞のセットからもたらされたもの；ならびに（b）収集間の時間差の長さもしくは形式、および／または、細胞の第1のセットの収集と細胞の第2の（および後続の）セットの収集との間の時間にドナーが曝露された、対象となる少なくとも1つの食事的、化学的、生物学的、もしくは環境的因子の記載を含有する。
【００２７】
この方法は、単一ドナー／複数時期／刺激応答（SD−MTP−SR）プラットフォームを利用し、ここで、以下の処置が、任意の適当な順で取られる：（a）細胞の集団が生存哺乳類ドナーから収集される；（b）その集団がiPSCに変換される；（c）任意で、iPSCが1つまたは複数の機能的細胞型に分化させられる；（d）任意で、収集された細胞、もしくはiPSC、もしくは機能的細胞、またはその3種のいずれかが凍結保存され、後でプロセスの任意の時点に解凍される；（e）1つまたは複数の細胞集団が、より後における1つまたは複数の時点において、同じドナーから収集される；（f）その集団がiPSCに変換される；（g）任意で、iPSCが、第1の集団の場合と同じ機能的細胞型に分化させられる；（h）任意で、後の方の収集された細胞、もしくはiPSC、もしくは機能的細胞、または3つのいずれかの集団（複数可）が、凍結保存され、後に解凍される；ならびに（i）収集間の時間差の長さもしくは形式、および／または、細胞の第1のセットの収集と細胞の第2の（および後続の）セットの収集との間の時間にドナーが曝露された、対象となる少なくとも1つの食事的、化学的、生物学的、もしくは環境的因子の記載が取得される。
【００２８】
定義
【００２９】
本明細書において使用される、用語「エクスポゾーム」は、行動、食事、疾患、細菌、ウイルス、医薬、化学物質、および環境に由来する曝露を含むが、これらに限定されない、ヒトまたは他の哺乳類の生涯を通じた生物学的応答への環境的影響、ならびに、後続の生物学的応答に永続的に影響する、これらの外的刺激に対する過去の内因的応答の、累積的尺度を意味する。したがって、この定義は、外的負荷の直接的影響だけでなく、エピジェネティックな変化、瘢痕、DNA変異、またはより大きな染色体損傷などの、そのような負荷の間接的影響も含む。
【００３０】
本明細書において使用される、用語「無エクスポゾーム条件」は、細胞の実験的応答が、細胞自体の年齢に関連する作用またはエクスポゾームへの細胞の曝露のいずれかによって（その実験について事前に定められた許容可能な耐容範囲内で）影響されていない細胞から、細胞、細胞のセット、または組織が完全にまたは部分的に構成された条件を意味する。複数の試験対象が関与する状況においては、無エクスポゾーム条件は、エクスポゾームへのいくらかの曝露を有した細胞を含むが、但し、（1）その曝露は、調査下の実験または研究における応答に対しては最小限の影響しか有さない可能性が高いと判断され；（2）試験対象間での曝露の差異を最小限化するステップが取られ；および（3）残された差異は、その実験または研究について事前に定められた許容可能な耐容範囲内に収まると明確に判断されることが条件となる。
【００３１】
本明細書において使用される用語「単一ドナー／複数時期／刺激応答プラットフォーム」、または「SD−MTR−SRプラットフォーム」は、特定の規格を満たす同じドナー由来の細胞の別々のセットからなるプラットフォームであって、それらセットを創出する目的が、刺激応答実験を行うことであり、その応答が、プラットフォームにおける単一ドナー由来の種々のセットについての供給源細胞の収集間の期間（複数可）中の、刺激とエクスポゾームへの曝露との両方の相関的要素であり得る、プラットフォームを意味する。
【００３２】
本明細書において使用される、用語「刺激または複数の刺激」は、単独で、複数で、または任意の組合せで適用され、調査中の細胞または組織の挙動または構造において反応を引き起こし得る、外部からの物理的な物質または力を意味する。刺激の例は、医薬化合物および産業化学物質を含む、化学物質；細菌、ウイルス、カビ、マイコプラズマ、アレルゲン、または他の病原体のような生物学的因子；光；熱；音；大気圧；電気インパルス；放射線；身体外傷；および、細胞自体の外因性の物理的活動から生じたものを含めた、身体的ストレスのあらゆる形態を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
方法の開発
【００３４】
本明細書において提供されるプラットフォームおよび方法は、1つ以上の刺激に対する、個々の試験対象もしくは複数の試験対象の細胞またはそれら細胞から作られた組織の、生物学的応答を研究することのために（それらの応答が、年齢、遺伝学的性質、または試験対象（複数可）が経験したエクスポゾームへの曝露により影響され得る場合に）有用である。
【００３５】
試験プラットフォームを構築するために、実施者は、細胞のドナー、細胞自体、ドナーの曝露についての情報等に関するいくつかの属性についての規格を開発し、同時に、その規格に合致する細胞試料を実際に得ることができることを確実にしなければならない。規格は、以下のものを含む。
【００３６】
（i）実験の目的に起因して要求されるドナーの数。例えば、実施者は、実験が、1つの特定の個体の応答を測定することを意図するのか、または、より大きな集団の代表的サンプルとすることを意図するのか、または集団内の応答の多様性を探ることを意図するのかを考慮する。
【００３７】
（ii）ドナープールへの包含についての基準。例えば、実施者は、年齢要件、遺伝学的要件、および細胞の初期試料採取に先立ち要求／禁止されるエクスポゾームへの曝露、ならびに、第1の細胞の収集と第2およびあらゆる後続の細胞の収集との間で要求／禁止される時間および／または曝露を決定する。
【００３８】
（iii）最終的な刺激応答実験における使用に必要な細胞型（複数可）。一実施形態において、要求される細胞型（複数可）は、ドナー（複数可）から収集された試験細胞あるいは試料からトランスフェクトされたiPSCから創出または形成される。
【００３９】
（iv）各ドナーおよび試料収集について蓄積される、年齢、遺伝学的性質および曝露に関する情報。
【００４０】
（v）実際の細胞収集、iPSCへのトランスフェクション、凍結保存および貯蔵、ならびに刺激応答実験のため特定されるタイプへの細胞の分化、ならびに、各段階を経る進行が要求された規格に合致する細胞をもたらしたことを検証するために各段階で適用されるべき試験についてのプロトコール。
【００４１】
次に、これらのステップの実際の遂行が、当業者に公知の科学的技術を使用して進む。
【００４２】
本明細書において提供されるプラットフォームおよび方法は、以下のいくつかの利点を提供する。（1）iPSC変換の使用；（2）最初の細胞収集の時と後続の細胞収集の時との間でのドナーの曝露についての情報の収集；（3）分析へのいずれか1つの数学的アプローチにより拘束されない、刺激応答実験における曝露の影響への新たな洞察；ならびに（4）多数の実施形態を利用する能力。これらの側面のそれぞれが、以下でより詳細に考察される。
【００４３】
1. iPSC変換
【００４４】
本明細書において提供される方法は、ドナーから収集された細胞（最初と、目的の曝露の後との両方）をiPSCに変換し、次に、目的の刺激応答実験にとって適当であれば、機能的細胞に変換するステップを含んでもよい。このステップは、少なくとも3つの理由のために有利である。
【００４５】
第1に、実施者が、応答における差を、根底にある細胞型における差異ではなく、介在する年齢および曝露に帰属させるのであれば、曝露前の細胞、および実際に刺激に晒された曝露後の細胞は、同一の細胞型のものであるべきである。実施者は、両方の収集時点で同じ細胞型を得ることができるとは限らないことがある。例えば、最初の細胞は、外科手術中に採取された場合もあるが、単に同じ細胞を収集する目的のためにドナーに次の外科手術を行うという行為は問題となるであろう。iPSCへの変換は、最初および後続の試験細胞セットが、比較可能性を確立するために、必要な限り同一に近づけられることを確かにする。
【００４６】
第2に、刺激応答実験において要求される細胞の数は、取得され得る初代細胞の数を上回るかもしれず、特に、実施者が、実験を（例えば、異なる刺激を用いて）繰り返すことを意図するならばそうである。iPSC変換により、実施者が、必要とするだけの数の細胞を利用できることが可能になる。
【００４７】
第3に、種々の刺激は、全ての細胞型において生物学的応答を引き起こすわけではない。初代細胞をiPSCに変換することにより、実施者は、次に、iPSCを、目的とする特定の刺激応答実験において応答すると見込まれる特定の細胞型に変換することができる。
【００４８】
2. 最初の細胞収集の時と後続の細胞収集の時との間のドナーの曝露についての情報の収集
【００４９】
細胞の最初のセットの収集と後続のセットの収集との間の時間の経過は、研究の対象であるものと、研究の対象ではないが刺激応答実験の結果に影響を有し得るものとの両方を含む、様々な曝露の可能性を必然的にもたらす。それ故に、実施者は、研究における直接的な関心であるエクスポゾームの要素、また、直接的な関心ではないが、やはり結果に影響する有意な可能性を有するエクスポゾームの要素の、認識、測定、および記録において努力し得る。
【００５０】
3. 方法は刺激応答実験における曝露の影響への新たな洞察を可能にするが、分析へのいずれの1つの数学的アプローチによって拘束されない
【００５１】
部分的に、この方法の価値は、曝露前（Pre-Exposure）と曝露後（Post-Exposure）の観察の対が無くとも入手可能であったであろうデータに対して、刺激応答実験の後続分析に情報を与えることができる追加のデータから導かれる。
【００５２】
説明のために、特定の刺激（S）への個々の試験対象の生物学的応答（R）に対する、特定の曝露（ここではEと称する）の影響を研究することを実施者が意図している、ある実験を想定する。実施者は全ての影響が厳密に相加的であると考えていると仮定する。
【００５３】
実施者が、曝露後のある時間からのみ細胞を収集するならば、実施者は、2つの観察データ点、Post-E／Pre-S（適当な尺度を使用して測定される場合に6単位の測定値を生じると仮定しよう）、およびPost-E／Post-S（8単位の測定値を生じると仮定しよう）のみに制限される。実施者は、1つの比較（Post-E／Post-SマイナスPost-E／Pre-S、あるいは8マイナス6で、2という値が得られる）を行うことができるのみである（図1参照）。両方の観察がPost-Eに起こるで、刺激応答における曝露の影響についての情報は存在しない。
【００５４】
もし代わりに、上記に加えて、実施者が、曝露前の時期（Pre-Eと称する）から細胞を収集するなら、実施者は、第3の条件（Pre-E／Pre-S）からのデータを有し、そして、もし実施者が、それらの細胞を刺激に曝露させるならば、実施者は、4つ目の条件（Pre-E／Post-S）からのデータを有することとなる。
【００５５】
このさらなるデータの利点は、容易に理解される。実施者が、目的の生物学的反応の以下の4つの測定値を収集すると仮定する：Pre-E／Pre-S＝3；Pre-E／Post-S＝5；Post-E／Pre-S＝6；およびPost-E／Post-S＝8（図2参照）。この場合において、実施者は、（相加的モデルを使用すると仮定すると）曝露が、刺激への応答において影響を有しないと決定することができる。これは、測定された数量の差が、曝露前と曝露後の状態の間で変動していないためである。すなわち、Pre-E／Post-S（すなわち5）引くPre-E／Pre-S（すなわち3）が2と等しく、Post-E／Post-S（すなわち8）引くPost-E／Pre-S（すなわち6）も2と等しい。従って、Post-E／Pre-Sの絶対的スコア（すなわち6）が、Pre-E／Pre-Sスコア（すなわち3）より3大きく、Post-E／Post-Sスコア（すなわち8）が、Pre-E／Post-Sスコア（すなわち5）より3大きかったので、曝露は個体に対して影響を有していた一方、これらの2つの影響が同じであったという事実は、曝露が、刺激の影響の程度には作用しなかったことを示している。刺激の影響は、どちらの場合においても2であった。
【００５６】
ここで、4つのスコアが前とほぼ同じであるが完全には同じではないという、別の状況を考慮する：Pre-E／Pre-Sは依然3であり；Pre-E／Post-S依然は5であり；Post-E／Pre-Sは依然6であり；しかしながら、Post-E／Post-Sはここでは8ではなく10である（図3参照）。この場合において、実施者は、曝露が、刺激への応答に対する影響を有することを決定することができる。これは、測定された数量の差が、曝露前と曝露後の状態の間で変動しているためである。すなわち、Pre-E／Post-S（すなわち5）引くPre-E／Pre-S（すなわち3）は依然2であるが、Post-E／Post-S（すなわち10）引くPost-E／Pre-S（すなわち6）は4である。すなわち、Sへの曝露は、差を2（4引く2）だけ増大させた。従って、曝露は、Sへの応答に対して影響を有した。実施者は、EおよびSの影響が、上記のように単純に相加的ではなく、相乗的な性質であったと結論を下す。
【００５７】
分析は、単一個体において複数の異なる刺激を分析すること（図4を参照のこと）、あるいは、遺伝学的多様性により引き起こされる差異に焦点を当てるために、同じ曝露を経験する複数の試験対象に対する1つの刺激を分析すること（図5を参照）などのように、さらなる次元に拡大することができる。
【００５８】
重要なことに、これらの例は洞察を可能にする方法の可能性を例示するものの、本方法は、データの分析への何らかの1つの数学的アプローチにより拘束されない。上のモデルは、複数の因子の影響に対して、そのような研究においてしばしば見出される「相加的」アプローチを使用したが、他のモデルも適用することができる。実際、各因子の影響は、遺伝学的な差異に渡って一定ではないかもしれない。エクスポゾームにおける各因子は、他の因子の影響の促進因子または遅延因子として作用し得る。さらに、その促進または遅延は、相加的、乗法的、指数関数的、または他の数学的性質のものであり得る。
【００５９】
4. 方法は多数の実施形態において実行され得る
【００６０】
本方法には単一の根幹的構造が存在するが（すなわち、2つ以上の時点でドナーから細胞を収集すること、およびそれらの細胞をiPSCへ変換すること）、本方法は、異なる目的のために複数の実施形態において行うことができる。これら実施形態は、多数の側面のうちのいずれにおいても変動し得るが、以下の3つの側面は特に言及に値する：（a）ドナー／試験対象の数；（b）ドナーから収集された細胞の最初のセットの、過去の曝露；および（c）以前に保存されていた細胞か新鮮な細胞かの選択。
【００６１】
a）ドナー／試験対象の数。その個体自体に特別な関心が存在する場合、またはその個体が集団を「代表」する単一点として作用している場合には、方法は、その単一個体について実施され得る。逆に、実施者が、集団全体についての規範的洞察を展開するために複数個体の反応間の共通性を見出すことを意図している場合、または、実施者が、個体間の差異を調べ遺伝学的な差異等の影響を推論することを意図する場合には、方法は、複数の個体において実施され得る。一実施形態において、ドナーの数は10以上である。
【００６２】
b）ドナーから収集された細胞の最初のセットの、過去の曝露。試験対象が、非常に著しい曝露（例えば高用量の放射線）をまさに経験しようとしており、プラットフォームの目的が、特定の刺激に対する試験対象のその後の応答におけるその特定の曝露の影響を特に調べることである場合のような、いくつかの場合には、実施者は、過去の曝露については比較的無関心であり得る。これらの場合には、細胞の最初のセットは、研究対象の曝露に先立つ任意の点で収集され得る。
【００６３】
他の場合においては、実施者は、一つの曝露源にもっぱら焦点を当てることは望まなく、後続の刺激応答結果における様々な未同定の曝露の影響を探ることを望み得る。この場合において、実施者は、結果に影響し得る全ての曝露の「完全な考慮」を好み得る。これは、無エクスポゾーム条件下で細胞の第1のセットを取得することにより促進され得る。実践的には、これは、参照により本明細書に組み込まれる特許出願第62／064067号において記述される周産期細胞の使用を含み得る。
【００６４】
c）以前に保存されていた細胞対新鮮な細胞。プラットフォームの1つのバージョンは、ドナーから細胞の最初のセットを直接収集すること、その細胞を低温貯蔵で保存すること（iPSCへの変換前または後のいずれか）、次に、細胞の後期セットを収集するために将来時まで（ドナーが曝露を受けた後まで）待つことを含む。
【００６５】
代替的な、しかし同等に有効な、バージョンは、以前に収集され凍結保存された細胞のセットを最初のセットとして利用すること、続いて、（1）以前に（ただし、ドナーの人生における、より後の時点で）収集され凍結保存された細胞の別のセットを利用するか（ドナーがその合間に経験した曝露に関してデータが入手可能であることを前提とする）、または、（2）同じドナーから現在または将来の日付において新たに収集される細胞のセットを利用すること（やはり、その合間に経験した曝露についての情報を伴う）のいずれかを含む。例えば、実施者は、後に新鮮な血液試料を取得するのと同じドナー由来の低温貯蔵臍帯血を使用し得る。
【００６６】
下記の実施例は、本明細書において記載される方法のある側面をさらに説明することを意図し、特許請求の範囲を限定することは意図しない。
【実施例】
【００６７】
実施例1：医薬化合物への生物学的応答における年齢およびエクスポゾームへの曝露の影響、ならびに、遺伝学的性質がいかにこれらの影響を変化させ得るかの分析
【００６８】
ある製薬会社が、成人用に現在市場に出ているいくつかの化合物について、小児対象市場での類似の適応症についての新規使用のために、FDA承認を求めるかどうかを検討している。承認プロセスの長さおよびコストを考慮して、会社は、進めるかどうかを決定する前に、それら化合物が、小児において有害な心臓副作用を示し得るかどうかを前もって研究することを望んでいる。会社は、作用（もしあるならば）が、年齢依存性であるのか、特定の遺伝学的性質の結果であるのか、および／またはある種の他の医薬への特定の曝露に関係するのかどうかにさらに興味がある。
【００６９】
会社は、比較的短い期間内に答えを求めている。それ故に、実施者は、（1）以前、出産時に収集し凍結保存した細胞の最初の収集物、および（2）その同じ個体由来の細胞の現在の収集物に基づいてプラットフォームを構築することを決定する。より具体的には、実施者は、10年以上に渡り臍帯血を受け入れてきた、民間の臍帯血バンクを探し出す。次に、実施者は、特定期間中に収集された試料であって、バンクに依然保存されているが両親により「放棄された」もののリストを得る。両親が細胞を維持するための支払いを停止することを選択すると、試料は放棄される。バンクは多くの場合その試料を物理的に除去はしないが、両親は、治療のためにその細胞を求める権利を失う。両親と接触し、適当な金銭的合意を交渉し、収集プロセスを実施することにより、実施者は、（i）保存された細胞を使用する権利、（ii）その子供の誕生以来の医薬およびワクチンへの曝露の経歴に関する記入済質問票、ならびに（iii）この時点で子供から採られた新鮮血のバイアルを得ることができる。
【００７０】
実施者は、臍帯血を解凍し、そこから血管内皮前駆細胞（EPC）を抽出する。それらのEPCを、市販のキット（Stemgent、Cambridge、MA）を使用してiPSCに変換する。次に、実施者は、採血にて得た新鮮抹消血からEPCを抽出する。これらもまたiPSCに変換する。iPSCのこれらの2つのセットは、曝露についての情報と共に、現方法のプラットフォームを形成する。
【００７１】
実施例2：潜在的汚染物質の間接的な健康影響の測定
【００７２】
空気中にある種の汚染物質を放出すると見込まれる、大きな化学工場が計画されている。地元の衛生担当官は、汚染物質が、地元住民の健康に直接影響したかどうかだけでなく、汚染物質への曝露が、他の汚染源および汎用の医薬などの、地元住民が曝露されるであろう他の化学物質に対する彼らの反応の変化を起こしたかどうかも、後で認識できることを望んでいる。
【００７３】
衛生担当官は、多数の地元住民から採取された凍結保存細胞のバイオバンクを構築することを決定し、同時に、試料が採取される人々に、年齢および以前の曝露（食習慣、摂取した医薬およびワクチン、ならびに生涯を通じてこの地域に住んできたかどうかなど）に関しての詳細な聞き取りを行う。さらに担当官は、これら住民の環境的曝露の確立された履歴を得るために、その地域の環境的履歴を記録する。この情報により、衛生担当官は、各個人について、ベースライン曝露、すなわちPre-E条件を後で確立できるようになる。
【００７４】
直接的に汚染の影響に関して、または、後続の刺激（追加の汚染源、または通常のワクチンおよび医薬など）を首尾よく吸収できる住民の能力が汚染によって変化したかどうかに関して、後でもし疑問が出てくれば、該衛生当局者は、Pre-E細胞を創出するための細胞のベースライン（同じ個人由来のPost-E細胞と比較するためのもの）、および、曝露のベースライン、ひいては2つの収集期間の間の正味曝露を確立するための文書記録を有するであろう。
【００７５】
実施例3：提案された癌治療に際した心臓用医薬の潜在的副作用の決定
【００７６】
肺癌患者の癌は、放射線および化学療法による処置が予定される状態まで進行していた。患者の医師は、それらの処置後に、過去にそのような処置後には投与されたことがない実験的医薬のセットを投与することを計画している。患者の医師は、それら医薬の投与に先立って、胸部放射線処置および化学療法が、特に不整脈の可能性に関して、患者の心臓の応答に影響し得るかどうかを知りたがっている。
【００７７】
実施者は、無エクスポゾーム条件下にある細胞を得るというオプションは有していない。しかしながら、処置前に細胞の最初のセットを収集することにより、実施者は、曝露前（すなわち、放射線および化学療法の前）かつ刺激前（すなわち、患者がまだ医薬を摂取し始めていない）であるベースラインを確立する。内部検討委員会（IRB）により監督される適切なプロトコール下で作業をしながら、実施者は、患者の腕の下から皮膚生検試料を採取する（身体のその領域は後で放射線および化学療法に曝露されることになるから）。その生検試料由来の細胞は、Stemgent Technologies（Stemgent、Cambridge、MA）の非組込み型技術を使用して、iPSCに変換される。iPSCはそれから凍結保存される。
【００７８】
医師は、それらの処置がなされる際に、放射線および化学療法への曝露の詳細（例えば、タイミング、持続時間、処置化学物質の正確な化学的性質など）を記録し、実施者にこれらの詳細を提供する。
【００７９】
放射線および化学療法処置後、実施者は、再び皮膚生検試料を採取し（今回は患者の他方の腕の下から）、以前と同一のプロトコールを使用して、得られた細胞をIPSCに変換する。次に、iPSCの最初のセットを解凍する。
【００８０】
次に、当該分野において周知のプロトコールにより、iPSCの両方のセットを心筋細胞に分化させる。これらの細胞は、ここで、曝露前／刺激前（Pre-E／Pre-S）および曝露後／刺激前（Post-E／Pre-S）条件を表す。細胞の両方のセットを、2つのサブセット、すなわち刺激前に測定されるべき1つ、および刺激後に測定されるべき1つに等分する。Pre-E／Pre-SおよびPost-E／Pre-Sアリコートの心構造ならびに挙動を、当業者に周知の染色試験および電気生理学的試験を介して測定する。Pre-E／Post-SおよびPost-E／Post-Sアリコートは、医師が患者に投与することを予測する用量レベルと相関する医薬の濃度で処理され、次に、それらの構造および挙動を、上記と同じプロトコールを使用して測定する。
【００８１】
結果は、心臓の挙動に対する医薬の影響が存在する可能性が高い（すなわち、Pre-SとPost-Sの結果の間で差異が存在した）一方で、その差異は、放射線および化学療法への曝露によって増幅されなかった（すなわち、Post-E／Post-SとPost-E／Pre-Sの間の差異は、Pre-E／Post-SとPre-E／Pre-Sの間の差異と同じであった）ことを示す。それ故に、医師は、相乗的作用が存在する可能性は低いと結論を出した。
【００８２】
添付の請求項のプラットフォームおよび方法は、本明細書において記載される特定のプラットフォームおよび方法により範囲が制限されず、それらは、請求項のいくつかの側面の説明として意図され、機能的に均等である任意のプラットフォームおよび方法は、本開示の範囲内にある。本明細書において示され記載されているものに加えて、プラットフォームおよび方法の種々の改変は、添付の請求項の範囲内にあることが意図される。さらに、ある特定の代表的なプラットフォームおよび方法、ならびにこれらの組成物および方法の側面のみが具体的に記載されているが、他のプラットフォームおよび方法、ならびに組成物および方法の種々の特徴の組み合わせは、たとえ具体的に列記されなくても、添付の請求項の範囲内にあることが意図される。したがって、ステップ、構成要素、成分、または構成物質の組み合わせは、本明細書において明示的に言及され得るが、たとえ明示的に言及されていなくても、他の全てのステップ、構成要素、成分、および構成物質の組み合わせが包含される。本明細書において引用される全ての公報、特許、および特許出願は、全ての目的のため全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
実施例4：ある種の化合物への応答における年齢進行の影響の研究
【００８４】
研究者は、化合物への個人の反応が年齢に伴っていかに進行するかについて、より包括的な描写を展開することに興味がある。これまで、科学者は、年齢が離れた個人の別々のコホートのインビボ反応を調べ、その結果を統計学的に比較することに制限されてきた。この方法は、コホート間およびコホートに渡る環境的曝露の個人的経歴の不一致、調査の一環として（倫理的に）試験できる投与回数の制限、試験参加者間での用量の不一致などのような、困難および制限を伴う。より重要なことに、そのような研究設計は、個人レベルでの長期変化データを提供しない。
他方、数十年間にわたり個人を追跡することによってそのような進行を展開させる試みは、定義上、長い時間の後でしか洞察をもたらさないであろう。
【００８５】
研究者は、2つの異なる時点で同じ個人から採取した細胞に由来するiPSCの、同じ用量濃度の同じ化合物への反応を比較することにより、種々の化合物に対する個人の反応をその個人の年齢の2つの異なる時点において比較する研究を設計する。開始年齢が互いに異なる種々の個人の結果をまとめることにより、研究者は、比較的短い期間内で、数十年間の加齢に渡る進行についての洞察を展開することを希望している。
【００８６】
研究者は、（1）既知の有害化学物質を全く利用しておらず、（2）人員転換がほどんどなく、（3）韓国の高い空気質および水質を有する隔離された街に位置する工場を同定する。したがって、研究者は、雇用を維持し続けるこの工場の労働者は、長期間に渡って類似しかつ無害な環境条件を経験するであろうと仮定する。
【００８７】
経営者と組合の協力を得て、研究者は、労働者の中から多数のボランティアを勧誘する。各ボランティアは、今、および続く5年間において参加することに合意する。それぞれの間隔で、ボランティアは、血液試料および医療情報を提供し、従って研究者は、以前の曝露または介在する曝露がそのボランティアの結果を非代表的なものにすると断定する場合にはサンプルから任意のボランティアを除外できる。
【００８８】
最初の収集後、研究者は、当業者に周知の技術を使用して血液試料から抽出した単核細胞（MNC）を単離し、低温貯蔵で保存し、提供された情報を分類して、経歴および医療状態に正当な理由があれば任意の参加者を将来の分析から除外する。次に、研究者は、ボランティアを25から65歳の間で狭い年齢幅（例えば、25〜28、29〜32、33〜36など）のコホートに分ける。
【００８９】
第2の収集の時点で、研究者は、第2の周期に参加するボランティアのサブセットから血液および情報を再度収集し、処理する。（彼女は、第2の周期に参加できない第1周期ボランティアの試料は捨てるが、この不参加は、雇用の中止、意思の欠如などに起因し得る。）彼女はさらに、以前の彼ら自身との比較を無効にするような介在曝露（第2の情報要求において報告されたもの）を有するボランティアを除外する。
【００９０】
したがって、研究者はこの時点で、各個人について2つの時期由来のMNCを解凍して、Reprocell-Stemgent（Lexington、Massachusetts）により提供されるもののような市販のキットを使用してそれらを（別々に）iPSCに再プログラミングすることができる。このようにして創出されたiPSC（またはそれらのiPSCから誘導された細胞）の貯蔵を使用して、同一の用量濃度の化合物を試験し、結果を比較することができる。このようにして、「個人特異的」な進行を計算することができる。年齢コホートにおける全ての個人についての結果をまとめることで、そのような進行についての年齢範囲特異的な標準を産生するだけでなく、その標準周辺の分布を解明することができる。
【００９１】
各コホートは、異なる開始（および終了）年齢を表し、第1と第2の収集の間の5年の期間は、1つのコホートの終了年齢を別のコホートの開始年齢と重複させるので、研究者は、提示された全ての年齢範囲に渡る進行を近似するモデル（複数可）を開発することができる。これらのモデルは、単一モデルから構成されるか、またはボランティア集団の重要なサブセット（例えば、性別、人種）についての別々のものから構成され得る。
【００９２】
さらに5年後、研究者は、第3の収集を行う。全3つの周期において参加したボランティアのサブセットについては、研究者は、彼らの5年目から10年目までの個々の進行を完了させ、このデータを使用して、上記第2の収集後に開発した進行モデル（複数可）を検証
および／または改善することができる。
【００９３】
この研究の成果は、化合物に対するヒトの応答が、個体の加齢に伴いいかに変化するかについてのより深い理解であり、それは、「標準」およびそのような進行の分布の理解の両方を含む。
【００９４】
実施例5：臨床試験中の有害反応の事後分析
【００９５】
第III相臨床試験の開始時には、しばしば、参加見込み者から血液が採られ、分析されて初期医学的状態が決定される。ある医薬化合物（「化合物A」）の特定の一試験のためのプロトコールの一環として、当業者によく知られているプロトコールを使用してその血液の一部を処理し、単核細胞（MNC）を単離する。次に、やはり当業者によく知られているプロトコールに従い、MNCを凍結保存する。
【００９６】
試験中、何らかの有害反応を経験する全ての参加者から、さらなる血液試料を採取する。再度、取られた血液の一部を処理してMNCを単離し、そのMNCを凍結保存する。
【００９７】
多数の参加者が、試験の後期段階中に、種々の有害な心臓状態（例えば、不整脈、心拍数減少など）を経験する。症例と対照の間のそのような事象の発生の比較分析の結論は断定的ではないが、そのような有害作用の発生率は試験が進むにつれ上昇したというある程度の示唆があると見られる。
【００９８】
研究者は、化合物Aへの曝露の延長が、心臓細胞中のDNAに対する影響を通じて、経時的に、個人をそのような状態により陥りやすくし得るかどうかをさらに調べることを課される。研究者は、化合物Aの静脈内投与が血液中に化合物Aの長期的存在をもたらしたことを決定し、また、化合物Aが何らかのDNAベースの心毒性作用を生じたならば、化合物Aは血中MNCのDNAにも同様に作用するであろうと考える理由を有している。従って、長期曝露された血液細胞からもたらされた細胞の心毒性試験は、心毒性作用に対する感受性の増大を示し得る。
【００９９】
研究者は、試験前に、作用を受けるそれぞれの個人からもたらされたMNC、および試験後期にその同じ個人からもたらされたMNCを選択し、Reprocell-Stemgent（Lexington、Massachusetts）から購入した市販のキットを使用して、それらを（別々に）iPSCに再プログラミングする。次に、研究者は、米国特許第8,951,798号のプロトコールを使用して、得られたiPSCを心筋細胞に分化させる。
【０１００】
次に、得られた心筋細胞（作用を受けるそれぞれの個人由来）の2つのセットを、様々な供給業者（例えば、Axion Biosystems、Atlanta Georgia）から入手可能な電気生理学的測定を含む、心臓挙動を測定するよう設計されたアッセイを使用して、化合物Aのいくつかの用量濃度（2セット間で同一とする）により検証する。実験の2つのセットに渡って用量応答曲線を比較することにより、研究者は、その特定の個人が、化合物Aへの延長した曝露後には、そのような曝露前と比べて、そのような心毒性作用（化合物Aにより誘起される）をより受けやすくなる可能性が高いかどうかを識別することができる。
【０１０１】
さらに、インビボでそのような作用を経験した参加者の全てにわたりそのような結果をまとめることにより、その現象が、集団全体に当てはまる可能性が高いか否かについての示唆が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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