(57)【要約】  ＦＨＡ足場の非保存または非構造配列中のＦＨＡドメイン内のタンパク質バリエーションを作製するハイスループット方法を用いて、ライブラリータンパク質由来の標的分子と結合するためのＦＨＡドメインを含む組換えタンパク質を選択することによる、一般的な方法および組換え核酸配列であって、ライブラリーはファージミドまたはファージライブラリーの形態であってもよく、ＡＬＰ核酸配列はベクターおよび発現されたＡＬＰタンパク質をウイルス性パッケージングすることが可能なベクターに挿入され、組換え核酸配列は様々な非保存または非構造ＦＨＡドメイン配列でランダムに変異する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリアントタンパク質のライブラリーをコードする単離された核酸のライブラリーであって、各バリアントタンパク質は、
ａ）ＦＨＡドメインを含み、
ｂ）各バリアントタンパク質は、ＦＨＡドメインのアミノ酸配列における部分的なランダム改変によって互いに異なっており、ランダム改変がＦＨＡドメインの構造的足場を実質的に破壊せず、
ｃ）ランダム改変は、野生型ＦＨＡドメインを含む起源のタンパク質をコードする起源の核酸配列の単離された核酸のランダム改変に起因しており、
ｄ）ランダムに改変されたヌクレオチド配列は、最小２ヌクレオチド長で互いに隣接しており、ランダムに改変されたヌクレオチド配列は、ＦＨＡドメインの構造的足場を破壊しないアミノ酸をコードする、
単離された核酸のライブラリー。
【請求項２】
前記ランダム改変が、部位特異的変異誘発、制限エンドヌクレアーゼに基づくＤＮＡ組換え、または相同組換えを含む方法によって行われる、請求項１に記載の単離された核酸のライブラリー。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記部位特異的変異誘発が、配列番号３〜８に示されるヌクレオチド配列の群からなるプライマーを利用する、方法。
【請求項４】
前記ランダムに改変されたヌクレオチド配列が、ＦＨＡドメインのループドメインに向けられている、請求項１に記載の単離された核酸のライブラリー。
【請求項５】
コードされたバリアントタンパク質が、標的分子と結合する能力について選択される、請求項１に記載の単離された核酸のライブラリー。
【請求項６】
請求項５に記載の標的分子に結合するバリアントタンパク質を選択するために使用される方法であって、前記標的分子が選択のためのリガンドとして使用され、リガンドは単離のために使用される固相または液相支持体のいずれかに結合する、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の標的分子と結合する選択されたバリアントタンパク質であって、前記バリアントタンパク質の前記標的分子への結合を含む分取的、分析的または治療的方法に使用され得る、選択されたバリアントタンパク質。
【請求項８】
請求項５に記載の標的分子と結合する選択されたバリアントタンパク質であって、単離された核酸の配列が、宿主細胞にトランスフェクトされる選択されたバリアントタンパク質の１つをコードする、選択されたバリアントタンパク質。
【請求項９】
請求項８に記載の単離された核酸の配列であって、単離された核酸の配列の発現が、選択されたバリアントタンパク質の発現および前記標的分子への結合を可能にする、核酸の配列。
【請求項１０】
請求項５に記載の標的分子と結合する選択されたバリアントタンパク質であって、選択されたバリアントタンパク質の１つをコードする単離された核酸の配列が、第２の標的分子に対する特異的結合親和性を有する少なくとも第２のタンパク質をコードする第２の核酸配列と組み合わされ、組み合わされた核酸配列の発現は、同時に複数の標的分子に結合することができるオリゴマータンパク質をもたらす、選択されたバリアントタンパク質。
【請求項１１】
単離された核酸の各々が、タンパク質タグをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸のライブラリー。
【請求項１２】
請求項１に記載のバリアントタンパク質の１つの前記単離された核酸の配列の１つを含むベクター。
【請求項１３】
前記バリアントタンパク質の１つの前記単離された核酸の配列の１つが、発現コンピテント宿主細胞において前記タンパク質の発現を可能にする発現制御配列と動作可能に結合している、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
宿主細胞中で複製可能なＤＮＡを含む、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
宿主細胞にトランスフェクトされる、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の宿主細胞であって、細菌細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞からなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項１７】
ファージ形質導入が可能であり、前記ベクターが、子孫ファージ粒子内へのパッケージングが可能なＤＮＡを含む、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
ファージ形質導入が可能な細胞であり、前記バリアントタンパク質の１つが子孫ファージ粒子にパッケージングされており、前記ベクターが、子孫ファージ粒子への前記バリアントタンパク質のパッケージングが可能なＤＮＡを含む、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
各単離された核酸が、ファージ粒子中にパッケージングされ、ファージ粒子のコレクションの全体が、ファージライブラリーまたはファージミドライブラリーとして使用され得る、請求項１に記載の単離された核酸のライブラリー。
【請求項２０】
前記バリアントタンパク質が、それぞれ少なくとも２つ以上のＦＨＡドメインを含み、各ＦＨＡドメインが、前記ランダム改変を含む、請求項１に記載の単離された核酸のライブラリー。
【請求項２１】
標的分子に結合するバリアントタンパク質について選択され得る、請求項２０に記載のバリアントタンパク質。
【請求項２２】
前記バリアントタンパク質の前記標的分子への結合を含む分取的、分析的または治療的方法に使用され得る、請求項２１に記載の選択されたバリアントタンパク質。
【請求項２３】
前記バリアントタンパク質の前記標的分子への結合を含む分取的、分析的または治療的方法に使用され得る、請求項２２に記載の標的分子と結合する選択されたバリアントタンパク質。
【請求項２４】
ＦＨＡドメインに基づくタンパク質ライブラリーの調製方法であって、ＦＨＡ足場構造のアミノ酸配列およびＦＨＡループドメインのアミノ酸配列を有するＦＨＡドメインを含む、足場構造の配列を破壊しない残基を含むアミノ酸配列を提供すること、それによりタンパク質ライブラリーの一部である前記残基内に少なくとも１つのランダムに変異したアミノ酸の人工変異体アミノ酸配列を産生することを含む、方法。
【請求項２５】
人工変異体アミノ酸配列が、前記残基の置換または欠失を含み、少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、天然に存在しないアミノ酸配列を提供するように設計されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アミノ酸残基への人工変異の導入が、ＦＨＡドメインの天然に存在する遺伝子に対してプライマーを用いてＰＣＲを実施することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＨＡドメインに基づくタンパク質の天然に存在する遺伝子が、ＫＩＦ１Ｃ遺伝子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
プライマーが、配列番号３〜８からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＦＨＡドメインに基づく標的特異的タンパク質バリアントの産生方法であって、
ａ）請求項２４に記載の方法を実施することによって、ＦＨＡドメインに基づくタンパク質ライブラリーを調製すること、
ｂ）タンパク質ライブラリーをスクリーニングして、標的分子に対する特異的親和性を有するアミノ酸配列を同定すること、および
ｃ）同定されたアミノ酸配列を、ＦＨＡドメインに基づく標的特異的タンパク質バリアントとして単離すること
を含む、方法。
【請求項３０】
標的分子が、脂質、核酸、糖、またはタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーの調製方法であって、
ａ）請求項２８または２９に記載の方法を実施することによって、２つ以上のアミノ酸配列を提供すること、
ｂ）ここで２つ以上のアミノ酸配列は、単一の標的分子に対する特異的結合親和性を有し、および
ｃ）リンカーを使用して２つ以上のアミノ酸配列を組み合わせて、単一の標的分子に結合可能なオリゴマーを提供すること
を含む、方法。
【請求項３２】
ａ）請求項２８または２９に記載の方法を実施することによって、２つ以上のアミノ酸配列を提供すること、
ｂ）ここで２つ以上のアミノ酸配列は、２つ以上の異なる標的分子に対する特異的結合親和性を有する配列を含み、
ｃ）ここで２つ以上のアミノ酸配列は、単一の標的分子に対する特異的結合親和性を有し、および
ｄ）リンカーを使用して２つ以上のアミノ酸配列を組み合わせて、複数の標的分子に同時に結合可能なオリゴマーを提供すること
を含む、多価アミノ酸配列または多特異的アミノ酸配列の調製方法。
【請求項３３】
ＦＨＡドメインを有するタンパク質であって、
ａ）ＦＨＡドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸配列が変異し、アミノ酸配列の変異は、ＦＨＡドメインの構造的足場を実質的に破壊しないこと、
ｂ）アミノ酸配列の変異は、最低でも前記アミノ配列内の少なくとも２つのアミノ酸残基であり、アミノ酸の変異は、ＦＨＡドメインの構造的足場を破壊しないこと、
ｃ）少なくとも１つの変異アミノ酸配列は、野生型標的分子とは異なる標的分子に対する特異的結合親和性を有するタンパク質をもたらすこと、および
ｄ）変異アミノ酸配列は天然には存在しないこと
を含む、タンパク質。
【請求項３４】
少なくとも１つの変異アミノ酸配列の変異が、タンパク質をコードする単離された核酸の配列を変異させることによって作製される、請求項３３に記載のタンパク質。
【請求項３５】
請求項３４に記載の少なくとも１つの変異アミノ酸配列の変異であって、部位特異的変異誘発、制限エンドヌクレアーゼに基づくＤＮＡ組換え、または相同組換えを含む方法によって行われる、変異。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記部位特異的変異誘発が、配列番号３〜８に示されるヌクレオチド配列の群からなるプライマーを利用する、方法。
【請求項３７】
少なくとも１つのアミノ酸配列の変異が、アミノ酸残基の翻訳後修飾を含む、請求項３３に記載のタンパク質。
【請求項３８】
少なくとも１つのアミノ酸配列の変異が、アミノ酸残基の欠失を含む、請求項３３に記載のタンパク質。
【請求項３９】
少なくとも１つのアミノ酸配列に対する変異が、前記タンパク質のバリアントからなるタンパク質ライブラリー由来の前記標的分子の結合選択によって決定され、バリアントは、ＦＨＡドメインを有する前記少なくとも１つのアミノ酸配列に対するランダムに変異したバリエーションからなる、請求項３３に記載のタンパク質。
【請求項４０】
前記タンパク質の前記標的分子への結合を含む分取的、分析的または治療的方法に使用され得る、請求項３３に記載のタンパク質。
【請求項４１】
請求項３３に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸の配列。
【請求項４２】
前記タンパク質をコードしており、宿主細胞にトランスフェクトされる、請求項４１に記載の単離された核酸の配列。
【請求項４３】
単離された核酸の配列の発現が、選択されたバリアントタンパク質を宿主細胞から発現させて前記標的分子に結合させることを可能にする、請求項４２に記載の単離された核酸の配列。
【請求項４４】
第２の標的分子に対する特異的結合親和性を有する第２のタンパク質をコードする第２の核酸配列と組み合わされており、組み合わされた核酸配列の発現は、同時に複数の標的分子に結合することができるオリゴマータンパク質を作製する、請求項４１に記載の単離された核酸の配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質分子、すなわち様々な標的分子に対する修飾可能な結合特性を有する組換えタンパク質に関し、組換えタンパク質は、足場内のアミノ酸配列が特異的またはランダムに改変される抗体様足場部分を含んでいてもよく、前記アミノ酸配列のランダム改変は、１つまたは複数のタンパク質が１つまたは複数の標的分子に特異的に結合することができるバリアントタンパク質のライブラリーを生成することができ、結合特異的特性を有する組換えタンパク質の選択されたバリアントは、試薬、診断薬または治療薬として使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質精製法の有効性は、コストおよび時間の両方において、標的タンパク質の特異性および効率に依存する。効率的なタンパク質精製に対する必要性は、日常生活におけるタンパク質の科学的理解および社会的応用に必須である。
抗体は、非常に特異的な様式でそれらの抗原に結合する。したがって、幅広い応用を有する目的の特定のタンパク質に結合する抗体を産生することは、非常に求められている目標である。しかしながら、抗体の産生は、多くの場合、調製されたタンパク質の抗原を用いて動物に抗原に対する免疫性を与え、次いで、抗原特異的結合抗体を単離することを必要とするため、抗体産生には多くの費用および時間を必要とする。この方法は高価で時間がかかり、抗体の性質および純度に関して厳密に制御されていない。精製されたモノクローナル抗体の産生は、使用することでタンパク質単離または分析において生じ得る人工物を減少させ得る場合、標準ポリクローナル抗体産生よりもはるかに高価で時間がかかる。
【０００３】
組換え抗体は、スクリーニング可能なライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）から開発することができるが、大腸菌などの標準発現系におけるこのような組換え抗体の発現は、収率が最適に及ばない傾向があるという問題がある。その結果、標的に特異的に結合する能力を保持するが、大腸菌で高度に発現可能である代替的な抗体様足場が望ましい。
繊維状ファージ上のＦａｂ  ｓｃＦｖとしての抗体の提示は、１９９０年に最初に記載された(McCafferty et al. Nat. 348:552-54 (1990))。これは、抗体の混合集団から、特異的抗体をコードする遺伝子と共に特異的抗体を選択するための強力な技術を提供する。タンパク質およびそれらの遺伝子を同時に選択する能力は、未免疫化ヒト由来の再編成されたＶ遺伝子のレパートリーまたは「ライブラリー」から抗原特異的抗体を直接的に単離することができるように利用されている。
ヒトタンパク質に結合するヒト抗体を単離するこの能力は、治療法の創出にとって非常に重要である。治療法としてマウスモノクローナル抗体を使用する際の問題は、それらが患者の免疫系によって異物として高頻度で認識されることである。ヒト化マウス抗体はこの問題を解決することができる。
【０００４】
ライブラリーの範囲が広範であるほど、所与の標的に対する高親和性抗体を選択する確率が高くなる。大きなライブラリー(Vaughn et al.)は、所与の抗原に対する所与の抗原抗体に対する多様な高親和性を有するナノモル未満の抗体の大きなパネルを生成することができる。これにより、所望の特性を有する抗体を得ることがより容易になり、治療用抗体ならびに研究ツールおよび試薬として使用される抗体の両方に対して有用である。
抗体は、ｇＩＩＩタンパク質のＮ末端に融合した一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の形態でファージの表面上に提示される。次いで、選択のラウンドを繰り返した後、特異的結合活性を有するファージを抗体レパートリーから単離することができる。
組換え抗体は、科学的研究において重要であり慣用的に使用されているツールになりつつあり、様々な治療アプローチにおいても同様に疾患の診断に使用するために実用化されている。開発中の生物医薬品の３０％超は、大部分が腫瘍疾患および炎症に対する治療に適用される組換え抗体である(Holliger P. et. al. Nat. Biotechnol. 23(9):1126-36 (2005)、Adams GP. et. al. Nat. Biotechnol. 23(9):1147-57 (2005)、Chang JT et. al. Nat. Clin. Pract. Gastro. Hepa. 4:220-8 (2006)。特異的抗原を用いて動物に免疫性を与えることは、検出試薬および診断試薬として使用することができるポリクローナル抗体の産生および精製を可能にする。しかしながら、そのような動物産生抗体は、バッチ依存性のためにそれらの使用が限定され、ヒト内でのそれらの免疫原性のために治療応用が制限される。
【０００５】
ハイブリドーマ技術の本発明によるモノクローナル抗体の生成は、特定の抗体の特異性が所望の標的に向けられ得るポリクローナル抗体に関連する問題を回避することを助けた。ヒト化モノクローナル抗体の産生は、ミエローマ細胞株とヒトＢ細胞またはヒトＩｇＧのレパートリーを有するトランスジェニックマウスＢ細胞との融合を含む(Lonberg N. Nat. Biotechnol. 23(9):1117(2005)、Fishwild DM. et. al. Nat. Biotechnol. 14(7):845-51 (1996)、Jakobovits A. Curr. Opin. Biotechnol. 695):561-6 (1995))。しかしながら、ハイブリドーマからのモノクローナル免疫グロブリンの産生は、依然として、供与体を必要とする免疫化のインビボにおける方法に加えて免疫応答の成功に依存している。ファージディスプレイおよびリボソームディスプレイなどの技術は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成に関連する多くの問題を解決するだけでなく、抗体またはそれらの断片のヒト化バージョンを遺伝子操作することによって抗体を改善する手段を提供する(Hoogenbroom HR. Nat. Biotechnol. 9:1105-16 (2005)、Hust M. et. al. Mol. Biol. 295:71-96 (2005))。
【０００６】
残念なことに、抗体の複雑な構造はそれらの産生に課題をもたらす。抗体は、多数のジスルフィド架橋および非共有結合相互作用によって複雑な様式で互いに連結された２つの軽鎖ＬＣポリペプチドおよび２つの重鎖ＨＣポリペプチドを含む大きなタンパク質構造である(Elgert K. Immunolog: Understanding the Immune System, Chapter 4:Antibody Structure and Function (1998))。このような多面的なタンパク質構造は、適したフォールディングの達成を助けるために、酸化環境および適切な細胞内シャペロンを必要とする。したがって、真核生物起源の細胞は、抗体の正確なフォールディングを助けるために必要な優れた細胞内状態およびタンパク質基盤を提供する。
【０００７】
哺乳動物細胞は、全ての既知の承認された組換えタンパク質医薬品の６０〜７０％の製造に使用される(Schirrmann et. al. Front. Biosci. 13:4576-94 (2008))。抗体産生において哺乳動物細胞株を使用する利点は、高度なタンパク質のフォールディングおよび翻訳後修飾を媒介するそれらの能力である。しかしながら、免疫グロブリン産生哺乳動物細胞株は、産生および培養するためには高価である。さらに、増殖培地中で未定義のウシ血清を頻繁に使用することにより、ウイルス病原体またはウシ海綿状脳症などのプリオン病による汚染のリスクを高める。あるいは、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞株またはＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞株などの昆虫細胞は、複雑なタンパク質のフォールディングが可能であり、組換え抗体の産生のために使用され得る。しかしながら、それらの欠点は、高い産生コスト、タンパク質産物を得る前の長い期間、ならびにタンパク質グリコシル化パターンにおける観察可能な差にある(Hsu et. al. J. Biol. Chem. 272(14):9062-70 (1997))。
【０００８】
酵母は、短時間での増殖、安価な増殖条件の利点によって、組換え免疫グロブリンの産生のための魅力的な選択肢であり、遺伝子工学、ならびにそれらの翻訳後修飾能およびタンパク質分泌能によって簡単に改変することができる(Kim H. et. al. FEMS Yeast Res. (2014))。一方で、酵母は早くに転写が終結するため、ＡＴリッチ遺伝子を発現しない可能性がある(Ramanos M. et. al. Yeast 8:423-488 (1992))。また、異種タンパク質を高度にグリコシル化するという酵母の性質は、非免疫原性治療用組換え抗体を産生することに問題がある(Sethurman N. et. al. Curr. Opin. Biotechnol. 17:341-346 (2006))。
【０００９】
大腸菌などの細菌は、組換えタンパク質を過剰発現および産生するために使用される最も一般的な生物である。増殖の容易さおよび入手可能性、大量のタンパク質の迅速な産生、ならびに遺伝子操作の容易さにより、大腸菌は治療用組換え免疫グロブリンの産生のための魅力的な選択となる。細菌宿主株における全長免疫グロブリンの発現および修飾は非常に非効率的であるが、抗原結合特異性を維持するより小さい抗体断片は、大腸菌中で簡単に産生することができる(Fellhouse FA. et. al. Making and Using Antibodies Ch. 8 CRC Press (2006))。ファージライブラリーの表面上に提示され得るポリペプチドの中には、McCafferty et. al. Nat. 348(6301):552-554 (1990)、Barbas et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 88(18):7978-82 (1991)、Burton et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 88(22): 10134-7 (1991)、Barbas et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 89(10):4457-61 (1992)、およびGao et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 96(11): 6025-30 (1999)に記載されているように、ＦａｂおよびｓｃＦVなどの抗体および抗体断片がある。ファージまたはリボソームディスプレイのインビトロ選択性プロセスを小さい組換えタンパク質の産生と組み合わせることにより、大腸菌は抗体様断片の発現のための主要な供給源となる。さらに、合成ＤＮＡを使用して、本明細書に記載されている抗体様タンパク質内の抗原結合部位に多様性を導入することにより、天然供与体の必要性が回避される。
【００１０】
タンパク質のリン酸化は、多種多様なタンパク質の適した機能にとって不可欠である重要な翻訳後修飾である。典型的には、タンパク質内のセリン残基、スレオニン残基またはチロシン残基はリン酸化され得、これは次に構造変化を媒介し、タンパク質の機能の調節に影響を与え得る(Johnson LN. Biochem. Soc. Trans. 37(4)627-41 (2009))。前記リン酸化残基の認識はまた、エフェクタータンパク質の下流のシグナル伝達事象の中継においても重要である。Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）およびホスホチロシン結合ドメイン（ＰＴＢ）などのタンパク質ドメインはホスホチロシン残基を認識するが、一方で、ホスホセリンおよびホスホスレオニンは、トリプトファン−トリプトファン（ＷＷ）ドメインを含むタンパク質の１４−３−３ファミリーによって、ならびにホスホセリンおよびホスホチロシンに対する特異性の低いホスホスレオニンエピトープを主に認識するフォークヘッド関連（ＦＨＡ）ドメインによって認識され得る(Yaffe MB Structure 7;9(3):R33-8 (2001))。
【００１１】
ＦＨＡドメインは、シグナル伝達カスケード、遺伝子発現および転写、タンパク質転位、ＤＮＡ修復、ならびにタンパク質分解などの多様な機能に関与するタンパク質に関連する(Durocher D. et. al. FEBS 513:58-66 (2001))。例えば、酵母プロテインキナーゼＲａｄ５３のＦＨＡ１ドメインは、ＤＮＡ損傷および修復シグナル伝達に続いて、リン酸化Ｒａｄ９とのリン酸化依存性タンパク質間相互作用に関与する(Durocher D. et. al. Mol. Cell 4:387-94 (1999)、Lee SJ. Mol. Cell Biol. 23(17):6300-14 (2003))。ＫＩＦ１Ａ、ＫＩＦ１Ｂ、およびＫＩＦ１Ｃなどのタンパク質のＵＮＣ１０４キネシンファミリーのメンバー、ならびにヒトにおけるタンパク質のＫＩＦ１４ファミリー中のメンバーを含むＦＨＡドメインは、小胞輸送に関与する(Bloom GS. Curr. Opin. Cell Biol. 13:36-40 (2001)、Hall DH. et. al. Cell 65:837-847 (1991)、Yonekawa Y. et. al. J. cell Biol. 141:431-441 (1998)、Zhao C. et. al. Cell 105:587-597 (2001))。さらに、ＦＫｈ１およびＦｋｈ２などのＦＨＡ含有転写因子が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において同定されている。ＦＫｈ１およびＦｋｈ２の両方が、酵母出芽の間のＧ２転写の主要調節因子であることが示されており、酸化ストレス下での転写制御の手段としてＳｉｒ２と会合することも示されている(Durocher D. et. al. FEBS 513:58-66 (2001)、Linke C. et. a. Front Physiol. 4:173 (2013))。
【００１２】
ＦＨＡドメインは、約１００〜１４０アミノ酸長に及んでおり、２つの方向性に対向するβシートを含み、それぞれ５つおよび６つのβストランドを有し、αヘリックスループによって相互連結されるβサンドイッチ構造にフォールディングされる(Yaff MB. Structure 9:R33-38 (2001)、Huang YM. PlosOne 9:5 (2014))。ループ領域の変化は、様々な標的タンパク質に対するＦＨＡドメイン特異性を媒介する主要な差異である(Huang YM. PlosOne 9:5 (2014))。タンパク質構造データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）には、１００を超えるＦＨＡドメインの構造が蓄積されている。ＦＨＡドメインのタンパク質配列アライメントは、ＦＨＡファミリードメイン内に低い配列同一性があるが、ホスホペプチド認識に関与すると考えられるループ領域内に５つの重要な保存アミノ酸残基が存在することを明らかにする(Durocher D. et. al. Mol. Cell 6:1169-82 (2000))。ループ領域内の配列は変化するが、ループ領域の原則の配置はリン酸基結合に配位する(Huang YM. PlosOne 9:5 (2014))。
【００１３】
より安価で遅延が少ない抗体ベースの精製および特性決定技術において、同等の特異性を支持することができる分子は、現時点では存在しない。さらに、非常に特異的かつ均一なタンパク質単離または特性決定結果を得るための、より厳密に制御される分子は存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、タンパク質内に埋め込まれた配列が、単離または特性決定のための様々な標的タンパク質への特異的結合を支持することができる様々な配列で置換されている足場様抗体を含む、組換えタンパク質である。このような組換えタンパク質は、タンパク質を特異的に標的化し、特異的なタンパク質間相互作用および／またはタンパク質−核酸相互作用を妨害することによって、治療用分子としても使用することができる。抗体様タンパク質（本明細書では「ＡＬＰ」）は、タンパク質上のホスホスレオニンエピトープを認識することが天然に知られているフォークヘッド関連（「ＦＨＡ」）ドメインを含む。しかしながら、本発明では、ＦＨＡループドメイン（「ループドメイン」）部分はそのタンパク質構造に必須ではなく、広範囲の抗原結合を支持することができるように修飾され得る。次いで、様々な修飾ＦＨＡを使用して、抗原結合のハイスループットスクリーニングが可能な広範なライブラリーを生成してよい。
ＡＬＰは、その遺伝子配列のクローニングベクターへの挿入から構築される。足場の構造を支持するために特異的配列が必要でない足場から出現するループ内に入る配列、または高度に保存されておらず前記ループ領域内に入るもしくは隣接している配列内の配列は、ランダムセットのアミノ酸に基づいて選択された、またはソフトウェアアルゴリズムを使用して構築された様々な配列で置換される。ＡＬＰの各バリエーションが発現され、修飾ＡＬＰの多様性は、抗原特異的結合のハイスループットスクリーニングが可能なライブラリーを提供する。
【００１５】
ＡＬＰは樹脂に結合させてよく、樹脂は任意のタンパク質単離法に使用することができる。ＡＬＰは別のタンパク質にタグ付けまたは融合させてよい。ＡＬＰは、新規なＡＬＰ相互作用を単離するための任意のライブラリースクリーニング技術にて使用されてよい。ＡＬＰの任意の１つまたは複数のバリエーションについて、タンパク質への特異的結合が確立されると、ＡＬＰは任意のタンパク質特性決定法にて使用されてよい。ＡＬＰはウェスタンブロットにて使用されてよい。ＡＬＰは磁気ビーズと共に使用されてよい。ＡＬＰは、蛍光マーカーに融合させてもよく、放射性同位体を組み込んでもよい。ＡＬＰは、インビボでタンパク質を特異的に標的とし、そのタンパク質の機能を妨害し、またはその有害作用を中和するために使用されてよい。ＡＬＰは、治療応用の一部としてタンパク質結合を必要とする方法にて使用されてよい。
本発明の特性である新規な特徴は、それらの構造および操作方法の両方に関して、それらのさらなる目的および利点と共に、本発明の好ましい実施形態が例により図示されている添付図面に関連して考慮される以下の説明から理解されるであろう。しかしながら、図面は例示および説明のみを目的とし、それらは本発明の限定の定義として意図されるものではないことが明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＰＤＢファイル１Ｒ２１、３ＰＯＡ、３ＭＤＢ、および３ＫＴ９の重ね合わせ図である。可変配列を含むループは、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩとして示される。
【図２】箱で囲んだ領域に、可変ループＩ、ＩＩおよびＩＩＩを同定するＰＤＢファイル１Ｒ２１由来のＦＨＡドメインの一部とＫＩＦ１Ｃ中のＦＨＡドメインの一部との配列アラインメントを示した図である。
【図３】配列番号１および配列番号２のＰＣＲプライマーを使用して得られた増幅されたＫＩＦ１Ｃヌクレオチド配列のセグメントの図である。可変ループの少なくとも３つを表すヌクレオチド配列には、下線が引かれ、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩとして示される。
【図４】ヒトＫＩＦ１Ｃタンパク質（ＰＤＢファイル２Ｇ１Ｌ）の結晶構造のグラフィック表示である。Ｎ末端およびＣ末端ドメインは標識され、互いに極めて接近していることが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（ｉ）定義
以下の定義は、特に指示しない限り、本願の全ての態様および実施形態に適用する。
本発明は、組換えタンパク質核酸の産生を意図する。
「オリゴヌクレオチド」は、約１８〜３０ヌクレオチド長であり得る一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド核酸鎖を指す。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどの遺伝物質にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドは、アミノリンカーもしくはチオールリンカーを介してそれらの５’末端で、または、限定されるものではないが、Ｃｙ３（商標）、Ｃｙ５（商標）、フルオレセインなどのフルオロフォア、ダブシルもしくはＴ−ダブシルなどの消光物質、もしくはビオチンおよび放射性同位体などの別の標識とのアミノ結合を介して３’末端で標識され得る。標識オリゴヌクレオチドは、相補的核酸配列を有する核酸の存在を検出するプローブとして機能し得る。標識または未標識オリゴヌクレオチドは、遺伝子をクローニングするまたは存在を検出する際にＰＣＲを実施するために必要なプライマーとしても使用してよい。オリゴヌクレオチドは、修飾または非修飾２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ）またはリボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）を使用した固相合成によって合成的に調製される。
【００１８】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、少なくとも２つの天然または非天然アミノ酸がペプチド結合によって互いに共有結合した線状高分子ポリマーを指す。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、環状でない限り、またはＮ末端もしくはＣ末端に特異的にタグが付加されていない限り、Ｎ末端に遊離アミノ基およびＣ末端に遊離カルボキシル基を有する。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドのアミノ酸配列は、遺伝子のヌクレオチド配列によって決定される。タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは、一次、二次、および三次構造を有し得る。場合によっては、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、補欠分子族または補因子を用いて翻訳後修飾され得る。
用語「遺伝子」は、ＲＮＡに転写可能であり、その後、ペプチドまたはポリペプチドに翻訳可能な特異的ＤＮＡ配列を指す。遺伝子のＤＮＡ配列中の領域はまた、調節領域、ＲＮＡの転写配列、ならびにタンパク質に翻訳される開始コドンおよび終止コドンを有するコード配列を含み得る。遺伝子の発現を制御する転写および翻訳調節領域は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、および真核生物発現の場合にはポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００１９】
用語「クローニングベクター」は、生物内の異種ＤＮＡ断片の挿入および安定な保存のために使用することができる核酸断片を指す。クローニングベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってよい。クローニングベクターは、本明細書中の本発明のようなゲノムライブラリーを作製するために使用してよい。
「プラスミド」は、独立して複製される環状二本鎖ＤＮＡ断片を指すベクターである。プラスミドは、大腸菌ｏｒｉＣなどの複製開始点、限定されるものではないが、β−ラクタム、マクロライド、およびアミノグリコシド抗生物質に対する耐性を与える選択可能な抗生物質耐性遺伝子、発現制御下のプロモーター配列、ならびに本明細書に記載されている抗体様タンパク質のコード配列を含んでもよく含まなくてもよい制限部位を有する多重クローニング部位を含み得る。
【００２０】
プラスミドは、「発現プラスミド」であってよい。発現プラスミドは、クローニングされた遺伝子の発現を可能にする。発現プラスミドは、プラスミドの多重クローニング部位、リボソーム結合部位、開始コドン、終止コドン、および転写配列の終結にクローニングされた遺伝子の遺伝子発現の調節および誘導を可能にする誘導性プロモーター領域を含む。
用語「プロモーター配列」は、遺伝子の転写開始部位の上流または下流のいずれかのＤＮＡ領域である。本明細書で使用する場合、細菌プロモーターは、転写開始の上流の−３５位置にＴＴＧＡＣＡの必要なコンセンサス配列、および−１０位置にプリブノーボックスＴＡＴＡＡＴ配列を含み、−３５領域の上流にＵＰエレメントも含み得る。
【００２１】
用語「バクテリオファージ」は、Moat et. al Microbial Phys. 4th ed. Ch. 6 (2002)に記載されているように、細菌に感染する少なくとも１３のウイルスファミリーにおける５０００を超えるウイルスの広範なグループを指す。バクテリオファージのゲノム「コア」は、二本鎖または一本鎖、直鎖または環状、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであってよく、「カプシド」と呼ばれるタンパク質の殻によって取り囲まれている。単一の感染性バクテリオファージユニットは「ビリオン」と呼ばれる。本明細書に記載されているようなＭ１３、ｆｄ、およびｆ１などのファージは、大腸菌においてＦプラスミドで運ばれる性Ｆ線毛に付着し、「雄性特異的ファージ」と呼ばれる。Ｍ１３、ｆｄ、およびｆ１は、密接に関連する繊維状ファージであり、１１のタンパク質をコードする。５つのタンパク質がカプシド構造の形成に関与し、６つのタンパク質がウイルスの複製および組立てに関与する。遺伝子ＶＩＩＩは主要な外殻タンパク質をコードし、遺伝子ＩＩＩ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＩＸはファージ構造の先端部に見られる微量タンパク質をコードする。遺伝子ＩＩＩタンパク質産物のＮ末端は、大腸菌のＦ線毛に結合するが、Ｃ末端はファージ外殻に固定されたままである。遺伝子ＩＩＩタンパク質産物のＮ末端は、本明細書に記載されているファージディスプレイのように、ｓｃＦV断片に融合され得る。McGrath et. al. Bacteriophage: Genetics and Molecular Biology Acad. Press. (2007)。
【００２２】
用語「ファージディスプレイ」および「ファージライブラリー」は、Smith GP. Sci. 228(4705):1315-7 (1985)に最初に記載されたように、ファージウイルスの表面上のポリペプチドの提示および産生のために使用される定義された周知の技術を指す。ファージライブラリーの表面上に提示され得るポリペプチドの中には、McCafferty et. al. Nat. 348(6301):552-554 (1990)、Barbas et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 88(18):7978-82 (1991)、Burton et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 88(22): 10134-7 (1991)、Barbas et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 89(10):4457-61 (1992)、Gao et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 96(11): 6025-30 (1999)に記載されているように、ＦａｂおよびｓｃＦVなどの抗体および抗体断片がある。ファージディスプレイでは、バクテリオファージの非必須遺伝子が除去され、ｃＤＮＡ形態の目的の特有の遺伝子、本明細書では抗体様タンパク質をコードするｃＤＮＡが、ファージディスプレイベクターのファージ表面タンパク質をコードするファージ遺伝子配列に挿入される。大腸菌などの細菌は、ファージディスプレイベクターで形質転換されるだけでなく、バクテリオファージ表面上で、本明細書に記載されている抗体様タンパク質などのポリペプチド産物をコードする関連ｃＤＮＡの発現およびパッケージングを可能にするヘルパーファージに感染する。次いで、提示された抗体様タンパク質を有するファージのライブラリーをスクリーニングし、目的の特異的標的または分子に結合させることによって選択することができる。目的の標的の一例は抗原である。標的への結合を示すファージが同定されたら、次いで、ファージを単離し、感染およびスクリーニングの第２ラウンドに使用することができる。最適な標的結合ポリペプチドを同定するために、複数ラウンドのスクリーニングおよび選択を実施することができる。
【００２３】
用語「リボソームディスプレイ」は、特異的標的に結合する選択タンパク質を同定および進化させるために使用される技術を指す。リボソームディスプレイでは、オリゴヌクレオチドライブラリー由来のＤＮＡをリボソームディスプレイベクターに挿入し連結する。次いで、挿入された目的の遺伝子をＰＣＲにより増幅する。増幅されたＰＣＲ産物は、インビトロ転写によりｍＲＮＡに転写され、その後インビトロで翻訳される。次いで、ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド複合体を、複合体を固定化された標的に結合させることによって親和性アッセイに使用する。非結合ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド複合体を洗浄によって除去し、標的結合ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド複合体を回収する。回収したｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド複合体由来のｍＲＮＡは、ＰＣＲによって増幅してよく、次いで、増強された標的特異性を有する遺伝子産物を濃縮するために、ディスプレイ選択プロセスを繰り返してよい。各ラウンドの選択の後にランダム変異を導入して、増強された標的特異性を有する遺伝子産物をさらに濃縮してよい。
【００２４】
用語「フォークヘッド関連ドメイン」（ＦＨＡ）は、タンパク質上のエピトープであるホスホスレオニン、およびより少ない程度ではあるが、ホスホセリンおよびホスホチロシンを主に認識するモジュラーホスホペプチド認識ドメインを指す。ＦＨＡドメインは、キナーゼ、ホスファターゼ、キネシン、転写因子、ＲＮＡ結合タンパク質、および代謝酵素を含む様々なタンパク質上に存在してよく、シグナル伝達、転写、タンパク質輸送、ＤＮＡ修復、およびタンパク質分解などのリン酸化依存性タンパク質間相互作用に関与する。ＦＨＡドメインは、約１００〜１４０アミノ酸残基長であってよく、αヘリックスループによって相互連結された、方向性に対向するβシートのβサンドイッチ構造にフォールディングされる。
【００２５】
用語「組換えタンパク質」は、設計された「組換えＤＮＡ」コード配列から発現されるタンパク質を指す。組換えＤＮＡは、少なくとも２つの別個のＤＮＡ鎖を、天然では通常作られていない１つの鎖に結合する。分子クローニングは、組換えＤＮＡを構築するために使用され、目的のＤＮＡ断片の増幅、次いでその断片をクローニングベクターに挿入することを含み得る。次いで、組換えＤＮＡを宿主生物に導入し、次いで、挿入された組換えＤＮＡの存在についてスクリーニングおよび選択する。
【００２６】
用語「増幅」は、遺伝子配列の大量複製の動作を指す。遺伝子配列の増幅は、目的の遺伝子配列のフランキング末端にハイブリダイズするプライマーを使用するＰＣＲによって実施してよい。遺伝子配列の増幅は、プラスミドで細菌を形質転換することによって、または目的の組換え遺伝子配列を保有するウイルスで宿主細胞をトランスフェクトすることによってインビボで実施してもよい。
用語「タンパク質発現」は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞または動物細胞などの宿主細胞内でのタンパク質の産生を指す。発現プラスミドなどのプロモーターの制御下にある組換えタンパク質のコード配列を保有するベクターを宿主細胞に挿入する。次いで、組換え遺伝子の発現を制御するプロモーターが誘導され、組換え遺伝子によってコードされたタンパク質が宿主細胞内で産生される。
【００２７】
用語「タンパク質精製」は、タンパク質を精製するプロセスを指し、目的のタンパク質を満足できるレベルの純度で分離および単離するために使用される任意の技術を用いてよい。タンパク質精製は、サイズ、電荷、結合親和性、および生物学的活性などのタンパク質の様々な性質を利用する。液体カラムクロマトグラフィーは、発現されたタンパク質を含む細胞溶解物が、目的のタンパク質に対して特定の結合親和性を有する「樹脂」上を通過するタンパク質精製において、一般に使用される。樹脂は、イオン交換、疎水性相互作用、サイズ排除、逆相、または親和性タグクロマトグラフィーを介してタンパク質の精製を支持する化学的性質を有する化合物またはポリマーである。タンパク質はまた、目的のタンパク質試料を含むポリアクリルアミドゲルの切除片由来のタンパク質のエレクトロポレーションなどの非クロマトグラフィー技術によって精製してもよい。
【００２８】
用語「ＭＡＬＤＩ」は、化合物ならびにポリペプチドおよびタンパク質などの生体分子をそれらの分子量を決定することによって分析するために使用される質量分析技術であるマトリックス支援レーザー脱離イオン化を指す。トリプシンなどのプロテアーゼによる酵素消化によって、ＭＡＬＤＩのためにタンパク質試料を最初に調製する。次いで、試料をマトリックスに化学的に結合させ、次いで、質量分析計に導入する。パルスレーザービームは試料を標的にし、その結果、固相から気相へのポリペプチドの脱着およびイオン化が起こる。気化イオンは検出器に向かって電界中で加速する。次いで、ペプチド断片を、それらの質量電荷比に基づいて、ペプチドマスフィンガープリンティングまたはタンデム質量分析によって同定する。ペプチド質量は分子量ピークの一覧表として表示され、次いで、元々のタンパク質試料の統計学的同定が可能となるＳｗｉｓｓｐｒｏｔなどの既知のペプチド質量のデータベースと比較される。
【００２９】
「タンパク質タグ」は、タグの特性および親和性に基づくタンパク質精製、同定、または活性を助ける組換えタンパク質に、新たな特性を提供する組換えタンパク質内のアミノ酸配列を指す。タンパク質タグは、ビオチンタグなどの新規な酵素特性を組換えタンパク質に提供し得、またはタグは、緑色蛍光タンパク質もしくは赤色蛍光タンパク質をコードする蛍光タグなどを用いたタンパク質同定手段を提供し得る。タンパク質タグは、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加され得る。タンパク質精製に使用される一般的なタンパク質タグは、タンパク質がニッケルまたはコバルトなどの金属イオンにキレートされたタンパク質精製マトリックスに結合することを可能にする、一連の約６個のヒスチジンアミノ酸残基が付加されるポリＨｉｓタグである。タンパク質精製に一般に使用される他のタグとしては、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、およびＦＬＡＧタグが挙げられる。「エピトープタグ」などのタグはまた、タンパク質が抗体に対する親和性を有するようにすることができる。一般的な抗体エピトープタグとしては、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、およびＨＡタグが挙げられる。
【００３０】
用語「融合タンパク質」または「融合したタンパク質」は、単一の遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、単一の遺伝子は、少なくとも２つ以上の別個のタンパク質を元々コードするコード配列で構成される。融合タンパク質は、２つ以上の別個のタンパク質の機能的ドメインを保持し得る。融合タンパク質のコード配列の一部は、エピトープタグをコードし得る。抗体様タンパク質に関して本明細書に記載されているように、融合タンパク質はまた、その用途に基づいて変化する機能的役割を有する様々なタンパク質をコードする配列を含み得る。
用語「タンパク質コード配列」は、ポリペプチドをコードする遺伝子の一部を指す。コード配列は、ＡＴＧ翻訳開始コドンと、ＴＡＧ、ＴＡＡ、またはＴＧＡ翻訳終止コドンの位置との間に位置する。真核生物遺伝子に典型的なものとして、コード配列は、転写されてポリペプチドに翻訳される遺伝子配列である遺伝子の「エクソン」を含んでよく、転写されるがポリペプチドに翻訳されない遺伝子配列である遺伝子の「イントロン」を除外してよい。
【００３１】
用語「形質転換」は、化学的または電気的手段を介する膜透過性を用いる方法によって、細菌に外因性遺伝物質を導入するプロセスを指す。形質転換の実施には、大腸菌などのコンピテント細菌細胞のアリコートにプラスミドなどの遺伝物質を添加し、混合物を氷上でインキュベートすることを伴う。次いで、細菌細胞をエレクトロポレーションするか、または４２℃で約１分間置いた後、氷上でインキュベートするために戻す。次いで、コロニーが目に見えるようになるまで、細菌細胞を寒天プレート上で一晩増殖させる。寒天プレートは、コロニー選択のための抗生物質または栄養条件を含んでよい。
用語「トランスフェクション」は、意図的に核酸を細胞に導入するプロセスを指す。この用語は、多くの場合、真核細胞における非ウイルス性の方法に使用される。他の方法および細胞型を指してもよいが、他の用語が好ましい：「形質転換」は、より多くの場合、植物細胞を含む非動物真核細胞である細菌における非ウイルス性のＤＮＡ転移を記載するために使用される。動物細胞では、形質転換はこれらの細胞における癌状態（発癌）の進行を指すためにも使用されるため、トランスフェクションが好ましい用語である。「形質導入」は、多くの場合、ウイルス媒介性のＤＮＡ転移を記載するために使用される。Nature Methods 2, 875-883 (2005)。
【００３２】
用語「ウェスタンブロット」は、ポリペプチドの存在を決定するために使用される分析技術を指す。ウェスタンブロットは、最初にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上でタンパク質を分離し、次いで、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜のニトロセルロースなどの濾過膜上に電気転移させることによって実施する。次いで、膜をウシ血清アルブミンまたは脱脂粉乳などのブロッキング剤を含有し得るブロッキング緩衝液と共にインキュベートする。次いで、膜を目的のポリペプチドに特異的な一次抗体と共にインキュベートする。一次抗体を膜から洗浄除去し、次いで、膜を検出および可視化可能にする化合物または酵素にコンジュゲートさせた二次抗体と共にインキュベートする。
【００３３】
用語「相同配列」は、対応する参照配列と少なくとも７０％〜９９％相同であるアミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。９０％同一である配列は、参照配列中の１０アミノ酸あたり１つ以下の異なるアミノ酸を有する。２つ以上の配列間の相同性の百分率は、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math2:482c、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:433、またはPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Sci. 85:2444の相同性アルゴリズムを使用して同定され得る。配列アラインメントの方法は、当業者には知られている。ＮＣＢＩハンドブック(2002)に記載されているようなＢＬＡＳＴ、またはSievers et. al. Mol. Sys. Bio. 7:539 (2011)に記載されているようなＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａなどの、上述または別の配列比較アルゴリズムを用いるコンピュータベースプログラムを使用してよい。
【００３４】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は互換可能であり、高親和性および高精度で、「抗原」と呼ばれる抗体標的分子上の「エピトープ」と呼ばれる結合部位を認識して結合するポリペプチド四量体巨大分子を指す。抗体は、抗体の個々のポリペプチド構成成分のそれぞれのサイズを指す２つの同一の「重鎖」および２つの同一の「軽鎖」で構成される。各鎖は、可変ドメインおよび定常ドメイン、例えば、可変重鎖および可変軽鎖、それぞれＶHおよびＶL、ならびに定常重鎖および定常軽鎖、それぞれＣHおよびＣLで構成される。重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合で相互連結されてＹ様構造を形成する。抗体Ｙ様構造は、上部のＦａｂ領域および下部のＦｃ領域の２つの領域に分離することができる。Ｆａｂ領域は可変ドメインを含み抗原認識に関与し、Ｆｃ領域はエフェクター機能および細胞応答の誘導に関与する。抗体特性および抗体構造の概説は、Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring harbor Laboratory Press (2013)で提供されている。
【００３５】
用語「ｓｃＦV」は、単一のポリペプチドを形成するために可撓性リンカーによって一緒に連結された重鎖可変ドメインＶHおよび軽鎖可変ドメインＶLからなる一本鎖ＦV抗体を指す。ｓｃＦＶ抗体断片は、抗体様タンパク質ファージライブラリーにて本明細書に記載されているようなバクテリオファージの表面上に提示することができる。
【００３６】
ｐＳＡＮＧ４ファージミドディスプレイベクターは、特許ＵＳ５５６５３３２ＡおよびHoogenboom et. al. Nuc. Aci. Res. 19:15 4133-4137 (1991)に最初に記載されている親ｐＨＥＮ１ファージミドベクターの修飾バージョンである。ｐＳＡＮＧ４は、新規なクローニングリンカー領域をｐＨＥＮ１に挿入することによって構築した。ｐＳＡＮＧ４を構築するために、プライマーＮｃＮｏｔｌｉｎｋＳ（ＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧ−ＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴ）およびＮｃＮｏｔｌｉｎｋＡ（ＴＴＴＴ−ＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＡＣＣ）をアニーリングさせ、ＰＣＲを介して増幅させ、次いで、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで切断し、その後ｐＨＥＮ１のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位の間にクローニングして、ｐＳＡＮＧ３を生成した。次いで、抗体の軽鎖および重鎖を、それぞれＮｈｅＩ／ＮｏｔＩおよびＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位の間にクローニングした。次いで、ｐｅｌＢ配列を、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ由来のシグナル配列と置換して、ｐＳＡＮＧ４を作製した。Ｍ１３リーダーおよび５’ＵＴＲはまた、プライマーＧ３ｈｉｎｄＮｄｅＳ（ＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＣＡ−ＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴ）およびＧ３ＮｃｏＡ（ＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＴ−ＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＴＡＧＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡ）を使用して、ＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｏＩ部位との間にクローニングした。ｐＳＡＮＧ４の設計は、Schofield et. al. Gen. Bio. 8:R254 (2007)に詳細に記載されている。
【００３７】
用語「蛍光標識」は、ポリペプチドまたは核酸に共有結合し得る「フルオロフォア」を指す。フルオロフォアは、Lakowicz JR. in Principles of Fluorescence Spectroscopy 3rd ed. Springer Publishing (2006)に記載されているように、特定の励起波長で光エネルギーを吸収し、特定のより低い発光波長で光エネルギーを再放出する。蛍光標識は、蛍光を検出する顕微鏡、フローサイトメーター、または蛍光を検出可能な任意の他の器具を使用することによって、標識ポリペプチドまたは核酸の検出および局在化を可能にする。蛍光標識タンパク質の標識、検出、および局在化は、Modesti M., Meth. in Mol. Bio. 783:101-20 (2011)およびGiepmans et. al., Science 312:5771 (2006)に詳細に記載されている。一般的なフルオロフォアとしては、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのフルオロフォア選択ガイド（ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ）により提供されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、ＤＡＰＩ、ＡＰＣ、Ｒ−ＰＥおよびＱｄｏｔ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「治療用分子」は、医薬的目的を提供する化合物を指す。治療用分子は、当該技術分野において公知の任意の薬物、麻酔薬、ビタミンもしくは栄養補助剤であってよく、米国食品医薬品局（ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ）により提供される治療学的同等性評価を有する承認医薬品のオレンジブックにて列挙されてよく、またはメルクインデックス（ｗｗｗ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｍｅｒｃｋ−ｉｎｄｅｘ）に列挙されている任意の化学物質、薬物、もしくは生物学的分子であってよい。
【００３８】
用語「保存配列」は、広範囲の種にわたって類似している、ＤＮＡもしくはＲＮＡのヌクレオチド配列、またはポリペプチドのアミノ酸配列を指す。保存配列は、同種または異種由来の相同遺伝子またはタンパク質の特定の部位で最も高頻度で生じるヌクレオチドまたはアミノ酸によって表される。用語「非保存配列」は、保存されておらず、保存配列よりも高い可変性を有する遺伝子またはタンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。
【００３９】
（ｉｉ）本願の配列および薬剤
本発明は、各ＡＬＰがＦＨＡドメインの実質的に全ての保存された足場配列を含み得るが、保存された足場配列の間に入る配列が異なる様々なＡＬＰをコードする新規な遺伝子配列を提供する。図１は、保存配列およびあまり保存されていない配列を同定するアノテーションを有するＡＬＰに使用され得るＦＨＡドメインの三次元モデルを示す。起源配列は、ヒトキネシンファミリーメンバー１Ｃ（ＫＩＦ１Ｃ）の染色体位置１７ｐ１３．２から得られ得る（配列番号９を参照）。実質的に全ての足場構造が保持されている限り、保存された足場配列にさらなる改変を導入してよい。このような改変は、ＦＨＡ保存領域が、様々なタンパク質に対する様々なレベルのＡＬＰの親和性を提供することを可能にし得る。
【００４０】
ＡＬＰの遺伝子のあまり保存されていない領域または非保存領域の少なくとも１つまたは複数は、典型的には、図１に示すように、ＦＨＡドメインの３つのあまり保存されていないループドメイン：ループＩ、ＩＩおよびＩＩＩにおいて見出され、図２のアミノ酸アライメント配列において同定される。足場構造が標的結合を可能にするために十分に維持されている限り、他の領域において他の置換または改変を用いてよい。これらの領域は、変異していてもよく、部分的にもしくは完全に欠失していてもよく、または様々な配列で置換されていてもよい。さらに、ＡＬＰ発現に続いて翻訳後修飾を用いてよい。
ＡＬＰのＦＨＡループドメインの修飾は、制限エンドヌクレアーゼに基づく挿入および連結などの組換えＤＮＡ法によって、またはＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）に記載されているように、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングなどのエンドヌクレアーゼを必要としない方法によって達成され得る。代替では、部位特異的変異誘発を使用して、変異を組み込んでよい。ＡＬＰのライブラリーは、部位特異的変異誘発を伴うセミランダムプライマーを使用して構築してよい。ＡＬＰライブラリーを発現させ、得られたタンパク質をタンパク質／抗原特異的結合のハイスループットスクリーニングの一部として用いてよい。次いで、特異的結合を示すＡＬＰを選択して、研究目的および治療目的の両方に利用してよい。
【００４１】
代替的な実施形態では、ＡＬＰ遺伝子のあまり保存されていない領域または非保存領域は、特定のタンパク質またはタンパク質のクラスまたは他の分子を特異的に認識するＡＬＰをコードするように特異的に改変され得る。例えば、配列は、ＤＮＡ結合タンパク質に選択的に結合し得る多数の負に荷電したアミノ酸をコードし得る。挿入配列はまた、別の分子を特異的に認識する別のタンパク質の既知結合ドメインをコードしてもよい。別の実施形態では、ループ部分は、ＡＬＰが標的の個々の分子または金属イオン（すなわち、キレート化剤）に特異的になるように設計してよい。
代表的な実施形態では、ＦＨＡドメインＤＮＡ配列は、ヒトキネシンファミリーメンバー１Ｃ（ＫＩＦ１Ｃ）を使用するＰＣＲによって増幅してよい。配列番号９を参照。配列番号９のＫＩＦ１Ｃ遺伝子由来のＦＨＡドメイン断片を増幅するために使用されるプライマー配列は、増幅されたＦＨＡドメイン配列を生成するために使用され得る配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーであってよい。配列番号１０を参照。増幅は、フォワードプライマーによるＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびリバースプライマーによるＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入してよい。
【００４２】
配列１および配列２に列挙されているプライマーと同様のプライマーを使用して増幅され得るＦＨＡドメインの他の供給源は、ヒトに存在するキネシン様タンパク質をコードするＫＩＦ１ＡおよびＫＩＦ１Ｂ遺伝子由来、または線虫のキネシン様タンパク質ＵＮＣ−１０４由来、またはシロイヌナズナ種由来のＫＡＰＰ、またはKim et. al. J. Bio. Chem. 277:38781-90 (2002)に記載されているようなサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａ）などの酵母種由来のＲａｄ５３、Ｆｈ１、Ｈｃｍ１、Ｆｋｈ１、Ｆｋｈ２、Ｄｕｎ１、Ｓｐｋ１およびＭｅｋ１などの配列を含むＦＨＡドメインのいずれか由来であってよい。ＦＨＡドメインの他の供給源は、ヒトＣＨＦＲまたはＭＫＩ６７遺伝子由来であってよい(Durocher et. al. FEBS 513:58-66 (2001))。当業者に知られているように、類似のまたは新たに合成されたプライマーを構築して、他の供給源由来の他の遺伝子に見出されるＦＨＡドメインのホモログを含む他のＤＮＡの複製コピーを増幅し単離してよい。
【００４３】
非修飾ＡＬＰを形成するＦＨＡドメインを含む増幅された配列は、プラスミドがＡＬＰの発現ベクターとしても機能し得る遺伝子の組換えクローニングのためにプラスミドに挿入してよい。プラスミドへの挿入は、最初に、親プラスミドおよびＰＣＲ断片の両方を適切な制限酵素で消化することによって実施してよい。次いで、切断されたＤＮＡを精製し、リガーゼでインキュベートし、続いて精製する。
増幅された配列はまた、別のタンパク質をコードする別の遺伝子に隣接して挿入し、それによって融合タンパク質を作製してよい。ＦＨＡ遺伝子を含む配列の挿入およびクローニングに続いて、特異的標的分子と結合するためのＡＬＰを作製するためにＦＨＡループドメイン配列ならびに他の可能な可変配列の修飾を実施してよい。
【００４４】
組換えベクターのクローニングおよび発現のために使用してよい可能な細菌は、Ｄ５α、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＨＢ１０１またはそれらの誘導体であってよい。前記細菌における遺伝子修飾およびタンパク質発現の可能なプラスミドは、ＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴシステムマニュアル（ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／）に記載されているようなｐＥＴベクター、またはＩｎｖｉｔｏｒｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ）によって提供される任意のｐＢＡＤ発現ベクターのいずれかであってよい。代替では、タンパク質は、ループドメイン内の挿入に翻訳後修飾を必要とし得る哺乳動物細胞で発現され得る。哺乳動物細胞発現系にて使用するための可能な［プラスミド］は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ）によって提供されるようなｐｃＤＮＡ３．１＋などのＣＭＶプロモーターの制御下のｐｃＤＮＡ発現ベクター、またはMizushima et. al. Nuc. Adi. Res. 18:17 (1990)に記載されているように、このようなｐＥＦ−ＢＯＳもしくはｐＥＦ−ＢＯＳ誘導体である高発現ベクターであってよい。
【００４５】
代表的な実施形態では、増幅されたＦＨＡドメイン配列は、ｐＳＡＮＧ４の特有のＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位に挿入されてよい(Schofield DJ. et. al. Gen. Bio. 8:R254 (2007))。ＫＩＦ１Ｃ遺伝子由来のこの配列を増幅する配列番号１および配列番号２のプライマーは、ｐＳＡＮＧ４ベクターにＡＬＰ配列を一方向に挿入することを可能にする相補的オーバーハングを提供するＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位を含む。ＡＬＰの発現は、ＮｃｏＩ部位の上流に位置するｌａｃプロモーターによって制御される。
さらに、本発明では、ＡＬＰ遺伝子は、他のタンパク質またはタンパク質ドメインでコードされた他の配列に隣接して挿入されてよい。そのようなタンパク質配列は、ＧＦＰ、転写因子、タンパク質輸送のためのシグナルペプチド、またはｇｅｎｅＩＩＩタンパク質などのファージディスプレイタンパク質などのマーカータンパク質をコードし得るが、これらに限定されるものではない。他の配列は、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、または当該技術分野において公知の任意の他のタンパク質タグなどのタグをコードし得るが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
ＡＬＰと隣接タンパク質との間の介在配列はリンカー配列を含んでよく、さらにＡＬＰまたは他の隣接タンパク質上の任意の立体障害を欠いているペプチド配列を含み得るコード配列にも使用してよい。介在配列はまた、プロテアーゼによって容易に認識および接近される残基を含んでもよい。介在配列はまた、終止コドン、ＡＬＰのプロモーター、アンチセンス配列、細菌のｒｈｏ認識配列、またはリボザイムコード配列などのヌクレオチドレベルで機能する他の配列を含んでもよい。このような配列を使用して、発現および遺伝子安定性を調節してよい。
【００４７】
ｐＳＡＮＧ４ファージミドのＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位へのＡＬＰの代表的な挿入では、上流に存在するｌａｃプロモーターによって発現が制御される。ＡＬＰ配列の下流は、ＰＩＩＩコード配列である。発現された場合、融合タンパク質ＡＬＰ−ＰＩＩＩが産生される。リンカー配列はまた、２つのタンパク質コード配列の間に介在し、トリプシン消化部位、ＭＹＣタグ、およびアンバー終止コドンを含む。ペリプラズムへの融合タンパク質の輸送を導くように、ＡＬＰコード配列の上流はＭ１３リーダーコード配列である。他の実施形態はタグおよびリーダー配列を含んでよく、組換えＡＬＰの構築は融合したＰＩＩＩに限定されるものではないことは、当業者によって理解されている。
【００４８】
タンパク質は、Ｎ末端およびＣ末端が極めて近接しているまたは互いに直接接触している、２状態の速度論様式でフォールディングされ得る。対照的に、２状態ではない速度論によりフォールディングされるタンパク質は、それらのＮ末端およびＣ末端が接触しておらず、Ｎ−Ｃ非接触タンパク質と呼ばれることもある。タンパク質構造データバンク内の全ての既知のタンパク質構造のうち約５０％は、タンパク質構造のＮ末端およびＣ末端がそれらの間に少なくとも１つの接触を有する２状態のフォールディングされたタンパク質であり、それらのうち３７％は、少なくとも２つの末端残基の接触を有することが以前に報告されている(Krishna M. et. al. PNAS (2005))。Ｎ末端およびＣ末端の接触を有するタンパク質の高頻度は、タンパク質の安定性を媒介するタンパク質の特性であり得る。例えば、Ｎ末端およびＣ末端の接触は、高温、アルカリ性のｐＨ、プロテアーゼ、およびＳＤＳ処理の条件下で、バチルス属種におけるキシラナーゼのＧＨ１０ファミリーのタンパク質の安定性に重要な役割を果たしていることが示されている(Bhardwaj A. 5:6 (2010))。同様に、ヒトおよびマウスアポリポタンパク質Ａ−Ｉの安定性は、Koyama A. et. al. Biochem. 48(11): 2529-37 (2009)によって示されるように、Ｎ末端とＣ末端ドメインとの間の分子間相互作用に起因している。したがって、組換えタンパク質においてＮ末端とＣ末端との相互作用を維持または実行することは、Bhardwaj et. al. Comp. Struc. Biotech. 2:3 (2012)に議論されるように、組換えタンパク質構造の安定性を付与するための戦略であり得る。そのようなタンパク質工学の実践は、Doi N. et. al. FEBS 457:1-4 (1999)に記載されているように、ドメインの挿入および遺伝子融合技術に用いられており、タンパク質融合の成功は、一見するとＮ末端およびＣ末端の近接に部分的に依存している(Ostermeier M. Pro. Eng. Des. Selec. 18:8 (2005))。
【００４９】
ＡＬＰの別の実施形態では、複数のＦＨＡドメインが構築されてよく、タンパク質は１つまたは複数のＦＨＡドメインを有してよい。Ｎ末端およびＣ末端が互いに極めて近接しているため、少なくとも２つのＦＨＡドメインが融合され得る。次いで、互いに連結した複数のＦＨＡドメインは、その集合したループで標的分子と結合し得る。ループドメインは、特異的標的または標的分子の一般的クラスのために設計されてよい。複数のＦＨＡドメインを有するＡＬＰは、特異的分子または繰り返し構造を有するポリマー巨大分子を標的としてよい。一実施形態では、ループドメインが複数個の正電荷を有し、複数個の負電荷を示す分子と結合可能な複数のＦＨＡドメインを有するＡＬＰであってよい。
【００５０】
さらに、複数のＦＨＡドメインを含むＡＬＰの実施形態では、ＦＨＡドメイン間のリンカー配列は、ドメインの自由回転を可能にする、またはループドメインが特定配向に保持されるように、ＦＨＡドメインの移動を制限するタンパク質をコードし得る。この実施形態は、図４を参照して、Ｎ末端およびＣ末端が、繰り返しＦＨＡドメインの間にリンカー配列が設計されることを可能にする互いに極めて近接したＦＨＡドメインの天然構造内に位置することを考慮すると可能である。このような配向は、安定な標的分子認識および結合を提供し得る。標的ＤＮＡ配列の場合には、タンデムＦＨＡは、回文配列を認識し、ｌａｃリプレッサー型構築物と同様にヘリックス上の回文構造の三次元配向を説明するように特定配向でドメインを保持するであろうリンカー配列を必要とするように設計することができる。
ＡＬＰは別々に発現させてもよいが、それらの天然立体構造で多量体タンパク質を形成し得る。一実施形態では、ＡＬＰはまた、個々のＦＨＡドメインがホモ二量体を形成し得るように、ＣＣ１ドメインを含んでもよい。Huo et al., Cell Struc., 20, 1550-1561, (2012)を参照。
【００５１】
代表的な実施形態では、ファージディスプレイを目的とするｐＳＡＮＧ４ベクターからの融合タンパク質ＡＬＰ−ＰＩＩＩの発現は、Schofield et. al., Gen. Bio., 8, (R254)1-18 (2007)に記載された方法に基づいてよい。ＡＬＰ−ＰＩＩＩプラスミドは、エレクトロポレーションまたは他の同等の方法によって細菌細胞に形質転換されてよい。ファージが細胞内へ侵入できるようにするために、細菌細胞はＦ線毛を発現している。典型的には、低コピー数Ｆプラスミドを保有する可能な細胞株が好ましく、Ｋ１２誘導体、ＴＧ１であり得るが、これらに限定されるものではない。成功した形質転換およびコロニー選択の後、ＡＬＰ−ＰＩＩＩの発現は、グルコース非存在下で行われる。ｌａｃプロモーターの制御下で誘導性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する細胞株において、ＡＬＰ−ＰＩＩＩバリアントの発現を誘導するのに、ＩＰＴＧを使用してもよい。
【００５２】
さらに、本代表的な実施形態では、次いで、形質転換された細菌細胞は、組換えファージ粒子を産生するために重複感染を施してよい。Ｍ１３ＫＯ７またはＫＭ１３などのヘルパーファージは、ＡＬＰ−ＰＩＩＩタンパク質を提示するファージ粒子へのファージミドＤＮＡの優先的パッケージングをもたらす。
特定の標的分子に対するＡＬＰ親和性は、設計されたＡＬＰの融合したタグの使用によって、または固相法もしくは液相法のいずれかを使用してＡＬＰに対して直接的に標的分子をモニタリングすることによって決定してよい。問題のＡＬＰタンパク質は、最初に過剰発現させ、融合したタグによって、または何らかの他の同等の手段を介してのいずれかで単離されるであろう。次いで、結合親和性は、固相もしくは液相支持体へ固定され得る、または共溶出法によって固定され得る標的分子への直接結合に基づいて評価されてよい。代表的な共溶出法の実施形態では、修飾ＦＨＡループドメインを有するＡＬＰおよび融合したＨｉｓタグをＩＭＡＣカラムに適用してよい。次いで、ＡＬＰおよび標的分子の両方の抗体検出を介して、ＩＭＡＣカラムからの溶出画分についてウェスタンブロット分析を介して、結合をモニターしてよい。
【００５３】
あるいは、標的分子へのＡＬＰ結合は、樹脂に抗原を固定することによって直接決定することができる。ファージミドＡＬＰｐＳＡＮＧ４の代表的な実施形態では、コードされたタンパク質中にＨｉｓタグが存在せず、標的分子はＨｉｓタグを含むことができる。これは、固相支持体または液相支持体（例えば、磁気ビーズ）のいずれかに結合した固定化金属親和性樹脂に抗原を結合させ、続いて、ＡＬＰ結合を評価し、ＡＬＰ結合について選択するのに効果的な方法である。
【００５４】
ＡＬＰファージライブラリーは、ＦＨＡループドメインを標的とするセミランダム化プライマーを使用して、ファージミドに挿入された修飾ＡＬＰのサブクローニングにより構築されてよい。代表的な実施形態では、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のプライマーは、１０10を超えるファージライブラリーを生成するｐＳＡＮＧ４を含む親ＡＬＰ上で使用してよい。次いで、ＡＬＰファージライブラリーは、固相または液相樹脂上に固定化された標的分子への結合について選択されてよい。次いで、結合したＡＬＰファージを溶出し、さらなる分析および適用を施す。好ましい１つの方法は、特異的標的分子（すなわち、抗原）がチューブまたはマイクロタイタープレートウェルの表面にコーティングされている固相選択（「パニング」）である。過剰の抗原を除去し、脱脂乳を使用して残りの露出面をブロッキングした後、ファージ抗体ライブラリーを適用し、非結合ファージを洗浄除去する。残りのファージは、低ｐＨ緩衝液（クエン酸）または高ｐＨ緩衝液（トリエチルアミン）、あるいは、トリプシン感受性部位がＡＬＰとＰＩＩＩとの間に組み込まれた場合、トリプシン依存性切断溶出などの様々な技術によって溶出され得る。パニングのいくつかのラウンドが必要とされることがある。
【００５５】
本明細書に記載されている抗体様タンパク質では、配列可変性は、ホスホスレオニンエピトープの認識に関与するＫＩＦ１Ｃ  ＦＨＡループ領域内に導入してよい。前記ＦＨＡドメインのループ領域は、タンパク質構造データバンクに蓄積されたＦＨＡドメイン含有タンパク質（１Ｒ２１、３ＫＴ９、３ＭＤＢ、および３ＰＯＡ）の４つの独立した三次元構造の重複画像であり、図１に表されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）。ＫＩＦ１Ｃ中の３つのループ領域を同定する１Ｒ２１およびＫＩＦ１Ｃのタンパク質配列アライメントを図２に示す。ＫＩＦ１Ｃ中の３つのループ領域をコードする遺伝子配列を図３に示す。ＮｃｏＩとＮｏｔＩ制限部位との間のｐＳＡＮＧ４ベクターにクローニングしたＫＩＦ１Ｃ  ＦＨＡドメインのＤＮＡヌクレオチド配列は、配列番号１０である。ＫＩＦ１Ｃ  ＦＨＡドメインのループ領域内のアミノ酸配列の可変性は、配列番号３〜８に列挙されたプライマーのいずれかを使用して変異誘発を介して導入されてよく、「ａ」はアデニンを指し、「ｇ」はグアニンを指し、「ｃ」はシトシンを指し、「ｔ」はチミンを指し、「ｋ」はグアニンまたはチミンのいずれかであり得るケトヌクレオチドを指し、「ｎ」は任意のヌクレオチドを指す。
【００５６】
前記プライマーの各々の５’末端および３’末端は、ＫＩＦ１Ｃと相補的配列を有し、ＫＩＦ１Ｃは前記相補的配列間のＫＩＦ１Ｃループ領域のコード配列に対応する可変ヌクレオチドの配列を有する。前記プライマーの各々における可変ヌクレオチド配列は、１つまたは複数のＦＨＡループドメインおよびＦＨＡループドメインに隣接するヌクレオチドのヌクレオチド配列を改変するように設計されている。配列番号３のプライマーは、ほぼループＩＩＩ内に位置する１２個の可変ヌクレオチドを有してよく、ＫＩＦ１Ｃヌクレオチド配列と相補的な１８および２４個のヌクレオチドに隣接してよい。配列番号４のプライマーは、ほぼループＩＩ内に位置する１５個の可変ヌクレオチドを有してよく、ＫＩＦ１Ｃヌクレオチド配列と相補的な２４および２４個のヌクレオチドに隣接してよい。配列番号５のプライマーは、ほぼループＩ内に位置する２４個の可変ヌクレオチドを有してよく、ＫＩＦ１Ｃヌクレオチド配列と相補的な２４および２４個のヌクレオチドに隣接してよい。配列番号６のプライマーは、ループＩの上流に位置する３３個の可変ヌクレオチドを有してよく、ＫＩＦ１Ｃヌクレオチド配列と相補的な２４および１８個のヌクレオチドに隣接してよい。配列番号７のプライマーは、ほぼループＩＩとループＩＩＩとの間に位置する１８個の可変ヌクレオチドを有してよく、ＫＩＦ１Ｃヌクレオチド配列と相補的な２４および２４個のヌクレオチドに隣接してよい。配列番号８のプライマーは、ＫＩＦ１Ｃヌクレオチド配列と相補的な１２個のヌクレオチドに分離され得る１８および１５個ヌクレオチドの２つの可変ヌクレオチド領域を有してよく、第１の可変ヌクレオチド領域は、ほぼループＩＩ内に位置してよく、第２の可変ヌクレオチド領域は、ループＩＩとループＩＩＩとの間に位置してよく、２つの可変ヌクレオチド配列は、ＫＩＦ１Ｃヌクレオチド配列と相補的な２４および２５個のヌクレオチドに隣接してよい。配列番号１０のクローニングされたＦＨＡドメインは、前記プライマーおよび類似したプライマーのいずれかによって改変してよい。ＫＩＦ１Ｃ  ＦＨＡドメインループ領域中のヌクレオチド、またはＦＨＡドメインループ領域に隣接するもしくは近いヌクレオチドのいずれかは、当該技術分野において公知の任意の既知の変異誘発技術によって変異させてよい。
【００５７】
標的分子結合の別の方法は、液相選択を使用してよい。一代表的な実施形態では、抗原は、Ｈｉｓタグなどの固定されたタグを介して、磁気ビーズ（例えば、ＤｙｎａｌのＴａｌｏｎ  Ｂｅａｄ）に結合させてよく、磁気ビーズはＮｉキレートを含む。抗原の濃度は、特定の抗原またはＡＬＰバリアントの変性を回避することと同様に、より容易に制御されるため、このような方法は、固相選択よりも好ましいことがある。
複数の選択のラウンドを使用する場合、最初の選択のラウンドは、ＰＥＧ沈殿およびＣｓＣｌ勾配精製などの方法を用いて精製してよい。その後の選択のラウンドは、２０℃〜−８０℃でそれぞれ５０〜１０％のグリセロール（ｇｌｙｅｒｃｏｌ）を含む適切な溶液中で保存してよい。次いで、選択されたファージを新鮮な大腸菌に形質導入し、その後の増幅のためにヘルパーファージで重複感染させてよい。
【００５８】
ＫＭ１３などのヘルパーファージを使用してよく、ＰＩＩＩはそれがプロテアーゼで切断可能となるように改変されている(Kristensen and Winter 1998, Folding & Design 3.)。トリプシン感受性部位をＰＩＩＩ上のドメインＤ２とＤ３との間に挿入した。次いで、この代表的なヘルパーファージは、救出されたヘルパーファージおよびＡＬＰファージにトリプシン消化を施すことによって選択から排除してよい。トリプシン消化は、ＫＭ１３ヘルパーファージ上でＰＩＩＩを切断し、それによってＡＬＰファージの選択を向上させる。トリプシンによる消化はまた、２つの残基間にあるリンカー配列中のトリプシン感受性部位の存在を介して、樹脂に固定化された抗原に特異的に結合している機能的ＡＬＰ部分を有するファージを特異的に溶出する。
【００５９】
抗原結合のための代表的な実施形態では、タンパク質抗原の純度および活性が非常に重要である。抗原調製物は、ウシ血清アルブミンなどの担体タンパク質の存在、または、可溶性もしくは「ビオチン選択」もしくは抗原の誘導体化表面への共有結合を適用する場合、抗原のビオチンへの共有結合を阻害する緩衝液であるトリスもしくはグリシンベースの緩衝液の存在を回避すべきである。抗原の品質管理は、ゲル電気泳動または質量分析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｏｃｐｙ）を使用して行ってよい。治療的使用のために、抗原の生物活性はまた、そのような場合には、液相選択を用いてよいことも重要である。
本発明は、ＡＬＰタンパク質の新規なセットのタンパク質配列を提供する。代表的な実施形態では、モノマーＡＬＰはＰＩＩＩと融合し、ＦＨＡループドメイン残基でペプチドをランダム化する。さらに、本代表的な実施形態は、Ｍ１３リーダーペプチドの配列、およびＭＹＣタグを含むＡＬＰとＰＩＩＩとの間のリンカー配列である。
【００６０】
ＡＬＰ含有構築物はまた、一過性トランスフェクションを使用して哺乳動物細胞系で発現させてもよい。可能な細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｅ懸濁細胞であってよい。発現ベクターは、翻訳後修飾されたＡＬＰを産生するために使用され得る、Schofield et al. (2007)で使用されるものと同様であってよい。いくつかの例は、カルボキシ末端Ｈｉｓ１０タグまたはＨｉｓ１０ラットＣｄｙ（ドメイン３および４）融合を付加してよい。得られたタンパク質は、ＦＰＬＣシステムまたはＱｉａｇｅｎ８０００ロボットまたは当業者によって知られている任意の他の同等の手段を使用して精製してよい。
（ｉｉｉ）使用
本発明は、他の分子を特異的な標的とする修飾ＦＨＡループドメイン領域を有するＡＬＰタンパク質を構築するために使用してよい。ＡＬＰは、試薬、診断、および治療応用に使用してよい。
ＡＬＰ−ＰＩＩＩ融合タンパク質を使用するファージミドの代表的な実施形態では、分子または抗原を選択的に標的とするＡＬＰバリアントを得るために、ファージライブラリーを構築してよい。標的分子または抗原結合について陽性であるＡＬＰバリアントは、その後、研究または診断目的のために使用してよい。選択されたＡＬＰバリアントを使用して、分析的および分取的方法の両方について標的分子を単離してよい。
【００６１】
１つの可能な使用に関して、選択されたＡＬＰバリアントを切断し、融合したタグまたは同等の支持体相を通して樹脂に固定してよく、標的分子を含む研究試料を抽出してよい。そのような使用は、クロマトグラフィー、マイクロタイタープレート、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または磁気ビーズに基づく単離に用いてよいが、これらに限定されるものではない。
あるいは、選択されたＡＬＰを、標的分子の作用に機能的に使用してよい。標的分子は活性を有し得、ＡＬＰ結合はそのような活性を阻害し得る。例えば、選択されたＡＬＰは、基質結合を防止するように酵素に結合し得る。代替では、選択されたＡＬＰは、分子の活性化を防止するまたは特定の生化学的経路のための基質として作用するシグナル伝達分子に結合し得る。
【００６２】
Brekke & Sandie, Nature Reviews Drug Discovery 2, 52-62 (2003)で議論されたように、ファージライブラリーから選択された抗体と同様に、ファージライブラリー由来の選択されたＡＬＰは、特異的分子の作用を遮断することによって、特異的細胞を標的とすることによって、またはシグナル伝達分子として機能することによって、３つの異なる治療的使用を有し得る。治療的ＡＬＰの遮断活性は、成長因子、サイトカインまたは他の可溶性メディエーターが、それらの標的受容体へ到達することを防止することによって達成され、因子自体へのＡＬＰ結合またはその受容体へのＡＬＰ結合のいずれかによって達成可能である。
【００６３】
特異的細胞を標的とすることは、ＡＬＰを細胞の特異的集団に向けて導くことを伴う。選択されたＡＬＰは、酵素、毒素、放射性ヌクレオチド、サイトカインあるいはＤＮＡ分子などのエフェクター部分を標的細胞へ運ぶように設計することができ、次いで、結合した部分は、その効果を発揮することができる（例えば、毒素または放射性ヌクレオチドは、標的癌細胞を排除することができる）。選択されたＡＬＰ遺伝子は、ＡＬＰ結合がＦｃ受容体へ結合すること、または補体タンパク質へ結合すること、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することも可能にし得る抗体と融合させてよい。
【００６４】
あるいは、選択されたＡＬＰを組換えウイルスにクローンニングし、ウイルスタンパク質因子と融合させてよい。Ｎ末端およびＣ末端は極めて近接しているため、選択されたＡＬＰを別のタンパク質と容易に融合させることを可能にする。本実施形態では、ＡＬＰ遺伝子は、ウイルスカプシドタンパク質のコード配列内に挿入してよく、したがって、ＡＬＰが融合したタンパク質は、ウイルスカプシド上に提示される。ウイルスカプシドは、罹患細胞へ送達される治療的遺伝物質を含んでよい。アデノ随伴ウイルスの場合などのウイルスカプシドは、遺伝物質を欠いており、代わりに治療のための薬物分子を含んでいてよい。ＡＬＰの直接的薬物送達は、付帯的な毒性を減少させつつ、特異的治療を提供することによって、医薬治療の有効性を著しく増加させ得る。
ＡＬＰのシグナル伝達効果は、順番に、細胞分裂もしくはプログラム細胞死のメディエーターに連結している受容体の架橋を誘導すること、または特異的細胞集団の活性化のための作用物質として作用する特異的受容体に向けてそれらを導くことに依存する。別のアプローチとしては、ＤＮＡのための、またはプロセシングされた抗原ペプチドもしくはエピトープをＴ細胞に提示して、抗原に対する特異的免疫応答を活性化させる特定の免疫細胞に対する抗原などの他の分子のための送達担体としてＡＬＰを使用することである。
【００６５】
ＡＬＰは他のタンパク質と、Ｎ末端およびＣ末端のそれらが極めて近接していることに基づいて、容易に融合され得るため、ＡＬＰと他のタンパク質との融合は上記で提供した代表的な応用に限定されるものではない。ＡＬＰと融合したタンパク質は、直接的または間接的な標識、認識可能なタンパク質タグ、酵素、転写因子または構造タンパク質として機能することができるポリペプチドの範囲であってよい。
【００６６】
ＡＬＰはまた、精製法のための樹脂または支持体に融合されてよい。ＡＬＰは、ＤＮＡ分子に結合する。ＡＬＰを治療的に使用する場合、薬物送達を助ける脂質などの他の分子にＡＬＰを連結してよい。
【００６７】
本明細書は本発明の特定の実施形態を説明しているが、当業者は、本発明の概念を逸脱することなく本発明の変化形を考案することができる。
【００６８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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