(57)【要約】  本発明は、例えば臨床使用のためならびに他の適用のために、遺伝子および変異体を配列決定する目的で、核酸の複雑な混合物から関心対象の核酸分子を迅速に濃縮することに関する。内部チャネルの部分が多孔性固体支持体で完全に充填されている内部チャネルを含む、ハイブリダイゼーションカラムであって、該固体支持体が：（ａ）空隙およびチャネルの残りの間を流体が流動することを可能にする、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙、ならびに（ｂ）空隙を形成する固体支持体の表面に結合された複数のハイブリダイゼーションプローブを含む、前記ハイブリダイゼーションカラムを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部チャネルの部分が多孔性固体支持体で充填されている内部チャネルを含む、ハイブリダイゼーションカラムであって、該固体支持体が：
（ｉ）空隙およびチャネルの残りの間を流体が流動することを可能にする、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙、ならびに
（ｉｉ）空隙を形成する固体支持体の表面に結合された複数のハイブリダイゼーションプローブ
を含み、
該固体支持体の孔構造が、すべての次元で均一であり、該固体支持体がチャネルの全横断面を充填する
前記ハイブリダイゼーションカラム。
【請求項２】
空隙が、０．１〜１００μｍの平均孔サイズを有する、請求項１のハイブリダイゼーションカラム。
【請求項３】
固体支持体に占められるチャネルの部分が、０．１ｍｍ３〜１００ｍｍ３の範囲の体積を有する、請求項１または２のハイブリダイゼーションカラム。
【請求項４】
固体支持体内の空隙が、チャネル中の固体支持体によって占められる体積の約３０〜５０％を占める、先行する請求項のいずれか一項のハイブリダイゼーションカラム。
【請求項５】
チャネルの一端が、多孔性フィルター、フリットまたは透過性膜を含み、チャネルの前記端に吸引を適用するか、またはチャネルの反対端に圧を適用した際、カラム中に固体支持体を保持する、先行する請求項のいずれか一項のハイブリダイゼーションカラム。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラム、温度調節要素および温度センサーを含む微量流体デバイスであって、温度調節要素を用いて、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネル内の温度を調節することが可能である、前記微量流体デバイス。
【請求項７】
各リザーバーが、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの一端に連結された、１またはそれより多いリザーバーをさらに含み、各リザーバーが密封されそして加圧されることも可能である、請求項６の微量流体デバイス。
【請求項８】
チュービングを通じて１またはそれより多いリザーバーに連結されている圧縮ガス供給源によって圧を供給する、請求項７の微量流体デバイス。
【請求項９】
１またはそれより多い密封リザーバーに適用された圧が、固体支持体を通じて、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネル内に流体を押し込む、請求項８の微量流体デバイス。
【請求項１０】
圧縮ガス供給源を１またはそれより多いリザーバーにつなぐチュービング内にバルブをさらに含み、ここで１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節可能なコントローラーによって、バルブが開閉可能である、請求項８の微量流体デバイス。
【請求項１１】
ポンプによって圧を供給し、ポンプが、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節するようにプログラム可能である電子コントローラーに連結されている、請求項７の微量流体デバイス。
【請求項１２】
１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの他方の端に付着された１またはそれより多い収集チュービングをさらに含む、請求項７〜１１のいずれか一項の微量流体デバイス。
【請求項１３】
１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの一端が吸引ポンプに連結され、ここで吸引ポンプがコントローラーに連結され、該コントローラーが、吸引が適用された際に、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節することが可能である、請求項８の微量流体デバイス。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれか一項のデバイスを産生するため、請求項１〜５のいずれか一項のカラムを受け入れるよう適応させた微量流体デバイス。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項のカラムを挿入することによって、請求項６〜１３のいずれか一項の微量流体デバイスを調製する方法。
【請求項１６】
核酸の複雑な混合物から核酸分子を濃縮するための方法であって：
（ｉ）
（ａ）空隙間を流体が流動することを可能にする、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙、および
（ｂ）空隙を形成する固体支持体の表面に結合された複数のハイブリダイゼーションプローブ
を含む多孔性固体支持体を提供し、
（ｉｉ）核酸混合物を、固体支持体を通じて駆動し、それによってハイブリダイゼーションプローブの核酸配列に相補的な核酸配列を含む核酸分子がプローブにハイブリダイズすることを可能にし、ハイブリダイゼーションが１０時間未満進行することが可能になり、
（ｉｉｉ）固体支持体を洗浄して、プローブにハイブリダイズしていない、いかなる核酸も取り除き、そして
（ｉｖ）固体支持体から、ハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸分子を溶出させる
工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
各相補核酸配列に対する個々のハイブリダイゼーションプローブが、固体支持体表面上にランダムに分布している、請求項１６の方法。
【請求項１８】
混合物が、１〜１００μｌ／分の流速で、固体支持体を通じて駆動される、請求項１６または１７の方法。
【請求項１９】
ハイブリダイゼーションが５５〜６５℃の温度で行われる、請求項１６〜１８のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
洗浄工程が、ハイブリダイゼーションに用いた温度より５〜１０℃低い温度で行われる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
溶出が、約９０〜１００℃の温度まで固体支持体を加熱することによって達成される、請求項１４〜１８のいずれか一項の方法。
【請求項２２】
ハイブリダイゼーションプローブが同じ長さの５０〜２５０量体オリゴヌクレオチドであり、そして／または混合物中の核酸分子が１００〜３５０の長さを有する、請求項１６〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項２３】
より大きい核酸分子を得て、これを核酸断片に断片化し、そして断片をアダプター分子に連結することによって混合物を調製する、請求項１６〜２２のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
ハイスループット配列決定のための核酸分子混合物を含む試料を調製する方法であって：
（ｉ）核酸分子およびハイブリダイゼーションプローブの相補核酸配列が結合することを可能にする条件下で、１またはそれより多いハイブリダイゼーションプローブを含む固体支持体と、試料を接触させ；
（ｉｉ）未結合核酸分子を取り除き；
（ｉｉｉ）結合した核酸分子をアダプター分子と接触させ；
（ｉｖ）結合した核酸分子をアダプター分子に連結させて、アダプター末端を有する核酸分子を得て；そして
（ｖ）アダプター末端を有する核酸分子を固体支持体から放出させる；
工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
ハイスループット配列決定のための核酸分子混合物を含む試料を調製する方法であって：
（ｉ）核酸分子およびハイブリダイゼーションプローブの相補核酸配列が結合することを可能にする条件下で、１またはそれより多いハイブリダイゼーションプローブを含む固体支持体と、試料を接触させ；
（ｉｉ）未結合核酸分子を取り除き；
（ｉｉｉ）結合した核酸分子を固体支持体から放出させ；
（ｉｖ）放出された核酸分子をアダプター分子と接触させ；そして
（ｖ）核酸分子をアダプター分子に連結させて、アダプター末端を有する核酸分子を得る；
工程を含む、前記方法。
【請求項２６】
アダプター分子が二重鎖ＤＮＡを含有する、請求項２４または２５の方法。
【請求項２７】
アダプター分子がヘアピンを含有する、請求項２４または２５の方法。
【請求項２８】
核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、先行する請求項のいずれか一項のデバイスまたは方法。
【請求項２９】
固体支持体が複数のマイクロビーズで構成される、先行する請求項のいずれか一項のデバイスまたは方法。
【請求項３０】
内部チャネル（２）および多孔性フリット（３）を含むカラム（１）であって、前記内部チャネル（２）が段階的にテーパリングされ、カラム（１）をトップセクション（４）、ネックセクション（５）およびボトムセクション（６）に分割し、ここでフリット（３）はカラム（１）のボトムセクション（６）に位置し、そして内部チャネル（２）の全横断面をふさぎ、内部チャネル（２）は、ネックセクション（５）において、カラム（１）のトップセクション（４）の内部チャネル（２）直径の約３０％〜約５０％まで細くなり、そして内部チャネル（２）は、ボトムセクション（６）において、カラム（１）のトップセクション（４）の内部チャネル（２）直径の約２０％〜約３０％まで細くなる、前記カラム。
【請求項３１】
ボトムセクション（６）が約１０μｌ〜約３０μｌの体積を有する、請求項３０のカラム。
【請求項３２】
トップセクション（４）がカラム（１）の全長の約６０〜７５％を構成し、ネックセクション（５）がカラム（１）の全長の約５〜１０％を構成し、そしてボトムセクション（６）がカラム（１）の全長の約２０〜３０％を構成する、請求項３０または３１のカラム。
【請求項３３】
請求項１〜５のいずれか一項のハイブリダイゼーションカラムを調製する方法であって：
（ｉ）内部チャネルを含むカラムを提供し、そして
（ｉｉ）ほぼ同じ直径を有し、そしてその表面に複数のハイブリダイゼーションプローブが連結されている、複数のマイクロビーズでチャネルの全横断面を充填し、ここでマイクロビーズが多孔性固体支持体を形成する；
工程を含む、前記方法。
【請求項３４】
直径が０．５〜５００μｍである、請求項３３の方法。
【請求項３５】
（ｉ）内部チャネルを含む１またはそれより多いカラム、および（ｉ）ほぼ同じ直径を有し、そしてその表面に複数のハイブリダイゼーションプローブが連結されている、複数のマイクロビーズを含む容器を含む、請求項１〜５のいずれか一項のハイブリダイゼーションカラムを調製するためのキット。
【請求項３６】
カラムが請求項３０〜３２のいずれか一項記載のカラムである、請求項３３または３４の方法あるいは請求項３５のキット。
【請求項３７】
１セットより多いハイブリダイゼーションプローブを含むマイクロビーズであって、同じセット中の各ハイブリダイゼーションプローブが、生物ゲノムの同じ領域に結合し、そして各セットがゲノム中の異なる領域に結合する、前記マイクロビーズ。
【請求項３８】
異なる領域が、ゲノム内の異なるコードまたは非コード領域である、請求項３７のマイクロビーズ。
【請求項３９】
異なる領域の少なくとも１つが、異なる染色体上に位置する、請求項３７のマイクロビーズ。
【請求項４０】
異なる領域が同じ遺伝子内に位置する、請求項３７のマイクロビーズ。
【請求項４１】
異なる領域が互いに重複している、請求項３７のマイクロビーズ。
【請求項４２】
異なる領域が前記ゲノムのコード領域内に位置し、前記コード領域が疾患または障害と関連する、請求項３７〜４１のいずれか一項のマイクロビーズ。
【請求項４３】
疾患または障害が、新生物性疾患、神経学的疾患、自己免疫疾患、代謝疾患、遺伝子疾患または体質性障害より選択される、請求項４２のマイクロビーズ。
【請求項４４】
異なる領域が１またはそれより多い出生前疾患または障害に関連する、請求項３７〜４１のいずれか一項のマイクロビーズ。
【請求項４５】
請求項３７〜４４のいずれか一項記載の複数のマイクロビーズを含むライブラリー。
【請求項４６】
１セットより多いハイブリダイゼーションプローブを含むマイクロビーズであって、同じセット中の各ハイブリダイゼーションプローブが、ゲノムの同じ領域に結合し、そして各ハイブリダイゼーションプローブの相補性領域が、同じセット内の少なくとも１つの他のハイブリダイゼーションプローブと重複し、そして各セットがゲノムの異なる領域に相当する、前記マイクロビーズ。
【請求項４７】
少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０の異なるセットのハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項４６のマイクロビーズ。
【請求項４８】
重複が２ｘの最小タイリング深度を提供する、請求項４６または４７のマイクロビーズ。
【請求項４９】
第一のマイクロビーズおよび第二のマイクロビーズを含むライブラリーであって、前記の第一のマイクロビーズが、生物ゲノム中の第一の相補性領域に結合する複数のハイブリダイゼーションプローブに連結され、そして前記の第二のマイクロビーズがゲノム中の第二の相補性領域に結合し、前記の第一の領域および前記の第二の領域が、前記ゲノムの異なる領域に位置する、前記ライブラリー。
【請求項５０】
前記の第一の領域および前記の第二の領域が、ゲノムの異なるコードまたは非コード領域である、請求項４９のライブラリー。
【請求項５１】
第一の領域および第二の領域が異なる染色体上に位置する、請求項４９のライブラリー。
【請求項５２】
第一の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブおよび第二の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブが、すべて、同じ配列を有する、請求項４９〜５１のいずれか一項のライブラリー。
【請求項５３】
第一の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブおよび第二の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブが、すべて、異なる配列を有する、請求項４９〜５１のいずれか一項のライブラリー。
【請求項５４】
前記ゲノムの１０の異なる領域に結合する少なくとも１０の異なるマイクロビーズを含む、請求項４９〜５１のいずれか一項のライブラリー。
【請求項５５】
第一のマイクロビーズおよび第二のマイクロビーズを含むライブラリーであって、前記の第一のマイクロビーズが、生物ゲノム中の第一の癌遺伝子に結合する複数のハイブリダイゼーションプローブに連結され、そして前記の第二のマイクロビーズが、ゲノム中の第二の癌遺伝子に結合する複数のハイブリダイゼーションプローブに連結される、前記ライブラリー。
【請求項５６】
１００を超えるマイクロビーズを含むライブラリーであって、各マイクロビーズが生物ゲノム中の異なる領域に結合するハイブリダイゼーションプローブを含む、前記ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば臨床使用のためならびに他の適用のために、遺伝子および変異体を配列決定する目的で、核酸の複雑な混合物から関心対象の核酸分子を迅速に濃縮することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム技術をルーチンのヘルスケアに組み入れて、診断を改善し、そして階層化医療（個別医療または精密医療としても知られる）を推進することが強く求められている。いかなるターゲット配列決定アッセイでも、最初の工程は、全ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの混合物から、関心対象の配列を濃縮することである。診断で最優先されるのは、データの品質、ならびにアッセイのロバストネスおよびスピードである。現在の濃縮アッセイは、緩慢であるかまたは変異体を見逃すため、臨床目的には適合しない。
【０００３】
商業的に入手可能なアンプリコン（ＰＣＲ）に基づく濃縮法は、バイアスが掛かる傾向があり、変異体を検出する際に信頼性が低い可能性があり、そしてアッセイ可能な領域の総数が限られている。ベイトライブラリーを用いたハイブリダイゼーションに基づく濃縮法は、より優れた品質のデータおよびより高い柔軟性を提供するが、時間が掛かり；ゲノムＤＮＡ試料中の特定の遺伝子を配列決定するため、関心対象の遺伝子を含有する領域に対応する断片を抽出するかまたは濃縮しなければならない。典型的には、ハイブリダイゼーションに基づく濃縮法において、ビオチン化ハイブリダイゼーションプローブセット（ベイトライブラリー）を、溶液中で、ゲノムＤＮＡ試料とハイブリダイズさせる。続いて、ストレプトアビジン−コンジュゲート化マイクロビーズを用いて、ベイト−ターゲット二重鎖を溶液から捕捉する一方、非ターゲットＤＮＡを捕捉せず、そして洗い流す。次いで、ターゲットＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、そして配列決定する。ＤＮＡ試料調製から配列決定までの全ワークフローは、アンプリコンに基づく方法が数時間であるのに比較して、典型的には完了までに何日も掛かる。
【０００４】
ベイトライブラリーを使用するハイブリダイゼーションに基づく濃縮法において、最も長い期間を要する工程は、実際のハイブリダイゼーション工程である。水におけるＤＮＡの拡散定数は非常に低い。例えば、水中での８０ｂｐ断片の拡散長は、１日で１．９ｍｍである。プローブアレイ上のターゲット溶液の高さが数百ミクロンであるマイクロアレイ実験において、ハイブリダイゼーション反応が起こるために十分な数のターゲット分子がプローブに十分に近く拡散することを可能にするために、典型的には一晩インキュベーションが必要である。
【０００５】
本発明の目的は、アンプリコンに基づく方法と速さに関して競合可能でありつつ、これらの方法に関連する信頼性の低さの問題を回避するプロセスを提供することである。特に、本発明は、１日未満で、配列決定のための核酸試料のハイブリダイゼーションに基づく濃縮を可能にするための方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、核酸試料から特定の配列を迅速に濃縮するためのハイブリダイゼーションに基づく方法を提供することによって、当該技術分野における前述の欠点に取り組む。本発明は、微量流体工学（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）および表面ハイブリダイゼーションを利用して、核酸混合物からの核酸分子の選択的捕捉および核酸分子プロセシングを加速する。本発明のプロセスを用いると、ゲノムＤＮＡ由来の一団のＤＮＡ配列を非常に濃縮することが可能であり、生じたＤＮＡを迅速に、安価に、そして均一な被覆で配列決定することが可能になる。
【０００７】
先行技術において、ハイブリダイゼーションプローブを覆う液体層の高さを減少させることによって、ハイブリダイゼーション速度が加速し、そしてマイクロアレイ実験が数日ではなく、数分で完了することも可能であることが知られる（参考文献１、２、３を参照されたい）。拡散する長さを減少させることで、ターゲット分子がハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズする機会がより増える。チャネルが充填ベッド中のマイクロビーズ間の空隙として存在する場合、狭い微量流体チャネルもまた、蛍光オリゴヌクレオチドの検出を加速させるために利用されてきている（参考文献４を参照されたい）。この場合、プローブはマイクロビーズにコンジュゲート化され、そしてターゲット溶液をこの間に通過させ、数分の桁のハイブリダイゼーション時間を可能にする。
【０００８】
現在まで、続く配列決定のため、試料からの特定のＤＮＡ断片の固相捕捉を加速するためのミクロン規模の微量流体チャネルは開発されてきていない。参考文献４において、制約された拡散長を用いて、特定の配列の検出が加速されているが、他の目的、例えば配列決定のための濃縮は加速されない。配列決定前に、ＤＮＡ試料を濃縮するため、マイクロアレイが使用されている（参考文献５、６および７を参照されたい）が、ハイブリダイゼーションを駆動するミクロン規模の多数の空隙を持つ固相は用いられず、そしてしたがって一晩ハイブリダイゼーションが必要であった。
【０００９】
参考文献８は、ガラスマイクロファイバーフィルターにカップリングされたハイブリダイゼーションプローブを使用して、関心対象のエクソン性配列に関して断片化ゲノムＤＮＡを濃縮するマイクロスピンカラムを提供することによって、先行技術の方法の欠点に取り組むことを試みた。しかし、高い配列濃縮効率、濃縮能および高い特異性の利点が示唆されるにもかかわらず、参考文献８は、数時間ではなく数分の桁でのハイブリダイゼーション時間を必要とする、ハイブリダイゼーションに基づく濃縮法を提供するには至らない。
【００１０】
本発明者らは、断片化ゲノムＤＮＡ試料の迅速な濃縮が、表面にオリゴヌクレオチドプローブ混合物がカップリングされたマイクロビーズの充填ベッドを通じて試料を駆動することによって、達成可能であることを発見した。マイクロビーズの広い表面積およびこれらの間の狭いミクロン規模の空隙によって、ＤＮＡ断片が流動する間、プローブと緊密に接触したままであることが確実になり、迅速なハイブリダイゼーションが可能になる。非ターゲットＤＮＡは、プローブと弱くしか相互作用せず、そしてハイブリダイゼーション緩衝液、そして続いて、ストリンジェントな洗浄緩衝液の連続流によってマイクロビーズ・ベッドからフラッシュされる。洗浄後、温度を上昇させるか、または他の方法によって物理化学環境を修飾することによって、ターゲットＤＮＡをマイクロビーズから放出させる。この溶出したＤＮＡは、ゲノムの残りに比較して、ターゲット領域に関して濃縮されている。本発明者らは、このアプローチを用いて、ゲノムＤＮＡ試料中のターゲット分子を濃縮するために必要な時間を２時間未満に減少させることが可能であることを見出した。
【００１１】
本発明は、内部チャネルの部分が多孔性固体支持体で充填されている内部チャネルを含む、ハイブリダイゼーションカラムに関する。典型的には、チャネルの一端は、多孔性フィルター、フリットまたは透過性膜を含み、チャネルの前記端に吸引を適用するか、またはチャネルの反対端に圧を適用した際、固体支持体をカラム中に保持する。固体支持体は、チャネルの全横断面を充填する。固体支持体は、（ａ）空隙およびチャネルの残りの間を流体が流動することを可能にする、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙、ならびに（ｂ）空隙を形成する固体支持体の表面に結合された複数のハイブリダイゼーションプローブを含む。好ましくは、固体支持体の孔構造は、すべての次元で均一である。固体支持体内の空隙は、典型的には、０．１〜１００μｍの平均孔サイズを有する。
【００１２】
固体支持体は、０．１ｍｍ３〜１００ｍｍ３の範囲の体積を有することも可能である。いくつかの態様において、チャネルのかなりの部分は、固体支持体によって占められる。例えばチャネルの≧１０％、好ましくは≧３０％、より好ましくは≧６０％が固体支持体によって占められることも可能である。固体支持体内の空隙は、チャネル中の固体支持体によって占められる体積の約３０〜５０％を占めることも可能である。
【００１３】
ハイブリダイゼーションカラムを用いて、核酸混合物から関心対象の核酸分子を濃縮することも可能である。関心対象の核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブに特異的に結合する一方、流体中の残りの核酸は、カラム使用中にチャネルを流れる流体の流動によって洗い流される。
【００１４】
本発明はまた、１またはそれより多いこれらのハイブリダイゼーションカラム、温度調節要素および温度センサーを含む微量流体デバイスにも関し、ここで温度調節要素を用いて、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネル内の温度を調節することが可能である。
【００１５】
微量流体デバイスはまた、各リザーバーが、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの一端に連結された、１またはそれより多いリザーバーを含むことも可能である。例えば圧縮ガス供給源をチュービングを通じてリザーバーに連結して、供給することによって、リザーバーを密封しそしてこれに加圧することも可能である。デバイス操作中に密封リザーバーに圧を適用した際、リザーバーに適用されていた流体は、ハイブリダイゼーションカラムのチャネル内に押し込まれ、そしてハイブリダイゼーションカラム内に位置する固体支持体を通じて流れる。好適には、微量流体デバイスはまた、圧縮ガス供給源をリザーバーにつなぐチュービング内にバルブも含む。例えばプロブラム可能な電子コントローラーによって、バルブを開閉することによって、チャネルを通じて駆動する流体の流速を調整することも可能である。
【００１６】
あるいは、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルの一端を、吸引ポンプに連結し、ここで吸引ポンプをコントローラーに連結し、該コントローラーは、吸引が適用された際に、１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて駆動される流体の流速を調節することが可能である。例えば、デバイスには、ハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて、流速を調節するようにプログラム可能な、電子コントローラーが含まれることも可能である。
【００１７】
典型的には、微量流体デバイスにはまた、チャネルの他方の端、すなわち使用中の固体支持体の下流に、収集チュービングが含まれる。収集チュービングは、固体支持体を通過してきたいかなる流体も収集する収集容器に取り付けられていてもよい。
【００１８】
本発明はまた、上述のハイブリダイゼーションカラムを調製する方法も指す。該方法は、内部チャネルを含むカラムを提供し、そしてほぼ同じ直径を有し、そしてその表面に複数のハイブリダイゼーションプローブが連結されている、複数のマイクロビーズでチャネルの全横断面を充填し、ここでマイクロビーズが多孔性固体支持体を形成する工程を含む。内部チャネルを含むカラム、およびほぼ同じ直径を有し、そしてその表面に複数のハイブリダイゼーションプローブが連結されている、複数のマイクロビーズを含む容器を含有する、本発明のハイブリダイゼーションカラムを調製するためのキットを提供することも可能である。
【００１９】
別の側面において、本発明は、核酸の複雑な混合物から核酸分子を濃縮するための方法に関する。第一の工程において、該方法は、（ａ）空隙間を流体が流動することを可能にする、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙、および（ｂ）空隙を形成する固体支持体の表面に結合された複数のハイブリダイゼーションプローブを含む固体支持体を提供する工程を含む。第二の工程において、核酸混合物は、固体支持体を通じて駆動され、それによってハイブリダイゼーションプローブの核酸配列に相補的な核酸配列を含む核酸分子がプローブにハイブリダイズすることを可能にする。試料が固体支持体を通じて駆動される間、ハイブリダイゼーションが進行することが可能になる。典型的には、１０時間未満、好ましくは５時間未満、より好ましくは１時間未満のハイブリダイゼーション時間が必要とされる。好ましくは、ハイブリダイゼーション時間は、１秒間〜１時間、例えば約３０分間またはそれ未満、より好ましくは約５分間またはそれ未満、例えば３０秒間〜２分間の範囲である。混合物は、典型的には、１〜１００μｌ／分の流速で、固体支持体を通じて駆動される。ハイブリダイゼーションに関しては、流速は、固体支持体の体積に基づいて調整され、１分あたり１〜１０の体積変化を達成する一方、洗浄工程には、１分あたりより高い体積変化が望ましい。ひとたび試料を適用したら、洗浄緩衝液を固体支持体にフラッシュして、プローブにハイブリダイズしていない、いかなる核酸も取り除く。最終工程において、固体支持体からハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸分子を溶出させることによって、濃縮した核酸分子を回収する。
【００２０】
ハイブリダイゼーション、洗浄および溶出工程は、同じ温度で実行することも可能であるが、典型的には、温度が各工程に関して最適化されている方が、濃縮ははるかにより効率的である。例えば、ハイブリダイゼーションは、通常、５５〜６５℃の温度で行われる。洗浄工程は、ハイブリダイゼーションに用いた温度より５〜１０℃低い温度、または室温／周囲温度（１８〜２６℃）で実行可能である。ハイブリダイズした核酸分子の溶出は、固体支持体を約９０〜１００℃に加熱することによって達成可能である。あるいは、ハイブリダイゼーション二重鎖は、ｐＨの修飾などの物理化学的手段によって破壊可能である。
【００２１】
本発明のさらなる側面において、ハイスループット配列決定のための核酸分子の混合物を含む試料を調製する方法を提供する。該方法は、核酸分子およびハイブリダイゼーションプローブの相補核酸配列が結合することを可能にする条件下で、１またはそれより多いハイブリダイゼーションプローブを含む固体支持体と、試料を接触させ；未結合核酸分子を取り除き；結合した核酸分子をアダプター分子と接触させ；結合した核酸分子をアダプター分子に連結させて、アダプター末端を有する核酸分子を得て；そしてアダプター末端を有する核酸分子を固体支持体から放出させる工程を含む。
【００２２】
本発明の別の側面において、ハイスループット配列決定のための核酸分子混合物を含む試料を調製する方法を提供する。該方法は、核酸分子およびハイブリダイゼーションプローブの相補核酸配列が結合することを可能にする条件下で、１またはそれより多いハイブリダイゼーションプローブを含む固体支持体と、試料を接触させ；未結合核酸分子を取り除き；結合した核酸分子を固体支持体から放出させ；放出された核酸分子をアダプター分子と接触させ；そして核酸分子をアダプター分子に連結させて、アダプター末端を有する核酸分子を得る。
【００２３】
さらなる側面において、本発明は、１セットより多いハイブリダイゼーションプローブを含むマイクロビーズに関し、ここで、同じセット中の各ハイブリダイゼーションプローブは、生物ゲノムの同じ領域に結合し、そして各セットはゲノム中の異なる領域に結合する。異なる領域は、ゲノムの異なる部分（例えば異なるコードまたは非コード領域あるいは異なる染色体上）に位置していてもよい。異なる領域は異なる遺伝子中にあってもよいし、またはこれらは同じ遺伝子内に位置していてもよい。特定の態様において、異なる領域は互いに重複していてもよい。異なる領域は、典型的には、ゲノムのコード領域内に位置し、そしてコード領域は疾患または障害に関連していることも可能である。疾患または障害の例には、新生物性疾患、神経学的疾患、自己免疫疾患、代謝疾患または障害、遺伝子疾患および体質性障害が含まれる。あるいは、異なる領域は、例えば早期検出および介入を可能にするために出生前診断が望ましい、１またはそれより多い出生前疾患または障害、あるいは遺伝性または遺伝子障害と関連することも可能である。いくつかの態様において、複数のこれらのマイクロビーズを含むライブラリーを提供する。
【００２４】
さらなる側面において、本発明は、１（好ましくは１より多い）セットのハイブリダイゼーションプローブを含むマイクロビーズを提供し、ここでセット中の各ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムの同じ領域に結合し、そしてセット中のハイブリダイゼーションプローブの相補性領域は、同じセット内の少なくとも１つの他のハイブリダイゼーションプローブの相補性領域と重複し、ここで各セットはゲノム中の異なる領域に結合する。好ましくは、各ハイブリダイゼーションプローブ間の重複は、２ｘの最小タイリング深度を提供する。マイクロビーズは、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０の異なるセットのハイブリダイゼーションプローブを含むことも可能である。
【００２５】
いくつかの側面において、本発明は第一のマイクロビーズおよび第二のマイクロビーズを含むライブラリーに関し、ここで前記の第一のマイクロビーズは、生物ゲノム中の第一の相補性領域に結合する複数のハイブリダイゼーションプローブに連結され、そして前記の第二のマイクロビーズはゲノム中の第二の相補性領域に結合し、前記の第一の領域および前記の第二の領域は、前記ゲノムの異なる領域に位置する。第一の領域および第二の領域は、ゲノムの異なる部分（例えば異なるコードまたは非コード領域あるいは異なる染色体上）に位置していてもよい。異なる領域は異なる遺伝子中にあってもよい。第一の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブおよび第二の相補性領域に結合するハイブリダイゼーションプローブは、すべて、同じ配列を有してもよいし、またはこれらはすべて、異なる配列を有してもよい。ライブラリーは、ゲノムの２より多い異なる領域に結合する、２より多いマイクロビーズを含んでもよい。例えば、ライブラリーは、前記ゲノムの１０の異なる領域に結合する少なくとも１０のマイクロビーズ、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも５０のマイクロビーズを含んでもよい。
【００２６】
本発明はまた、第一のマイクロビーズおよび第二のマイクロビーズを含むライブラリーに関し、前記の第一のマイクロビーズは、生物ゲノム中の第一の癌遺伝子に結合する第一の複数のハイブリダイゼーションプローブに連結され、そして前記の第二のマイクロビーズは、ゲノム中の第二の癌遺伝子に結合する第二の複数のハイブリダイゼーションプローブに連結される。
【００２７】
本発明はさらに、１００を超えるマイクロビーズを含むライブラリーを提供し、ここで各マイクロビーズは生物ゲノム中の異なる領域に結合するハイブリダイゼーションプローブを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１：配列決定のためのＤＮＡ断片を迅速に濃縮するためのハイブリダイゼーションカラム中のマイクロビーズの配置。（Ａ）マイクロビーズ（円）を、多孔性フリット（波線で満たされた領域）を含むプラスチックカラム（ストライプ領域）内に、長さに沿ったあるポイントまで装填する。フリットの孔は、マイクロビーズよりも小さく、したがって、流体流動は、フリットに対して緊密なベッドになるようにマイクロビーズを充填する。（Ｂ）充填されたマイクロビーズは、これらの間を流体が流動する（矢印）ことを可能にする、狭いミクロンサイズの空隙を有する。（Ｃ）小さいチャネルは、流動中のＤＮＡ分子（ストライプの線）を、充填されたマイクロビーズの表面上に位置する、ターゲットＤＮＡ（実線）または他のターゲット（点線）に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの混合物と緊密に接触させる。（Ｃ）中のスケールバーは、マイクロビーズが直径５μｍである場合の空隙のおよそのサイズを示す。ＤＮＡ断片およびプローブが実際よりも５〜１０倍長く示されていることに注意されたい（断片は長さ＜３００ヌクレオチドであり、したがって＜１００ｎｍである）。
【図２】図２：ハイブリダイゼーションを加速するために微量流体流動を用いた、配列決定用のＤＮＡを濃縮するためのプロセス。マイクロビーズを、ゲノム、例えばヒトの特定の領域に対してターゲティングされる数十、数百、または数千の異なるオリゴヌクレオチド（６０〜１２０ｎｔ）で官能化し、各マイクロビーズは、これらのプローブの混合物をディスプレイする。マイクロビーズをデバイス内に装填し、そして流体流動によって、緊密なベッドに充填する。ゲノムＤＮＡ試料を、１５０〜２００ｂｐの小片に断片化し、配列決定用のアダプターを場合によって付加し、そしてＤＮＡを充填ベッド上流のデバイス内に装填する。ＤＮＡ試料は、調節された温度（６５℃）で、ハイブリダイゼーション緩衝液の緩慢な流動によって充填ベッドを通じて駆動される。オリゴヌクレオチドプローブに認識される試料中のＤＮＡ断片が、マイクロビーズ表面にハイブリダイズし、そして保持される。ＤＮＡ断片をプローブと緊密に接触させ、そして核形成反応速度を増加させることによって、マイクロビーズ間の狭いチャネルは、このプロセスを加速させる。非ターゲットＤＮＡ断片は、プローブにハイブリダイズせずに、または弱くしかハイブリダイズせずに通過する。洗浄緩衝液が、流動中のハイブリダイゼーション緩衝液と置き換わる１またはそれより多い洗浄工程は、いかなる残存非ターゲットＤＮＡも取り除く。この工程の温度を調整して、洗浄（単数または複数）のストリンジェンシーを調節する。最後に、プローブにハイブリダイズしたままであるターゲットＤＮＡを、洗浄緩衝液流動を続けながら、温度上昇によって溶出させる。次いで、この溶出したＤＮＡを配列決定のために収集する。断片がアダプターを欠く場合、配列決定前にアダプターを付加する必要がある。
【図３】図３：２つの混合物からの１つのオリゴヌクレオチドの選択的な濃縮を示す実験データ。この実行においては、５０ｐｍｏｌのプローブおよび５００ｆｍｏｌの各標識オリゴヌクレオチドがあった。
【図４】図４：ラムダファージの全ゲノムに渡る、塩基数に対する読み取り深度のプロット。塩基２１，９８６でピークになるスパイクは、マイクロビーズコンジュゲート化プローブによってターゲティングされるゲノム領域に対応する。
【図５】図５：実施例４に記載するセットアップを用いたＡＴＭ遺伝子被覆。ターゲット領域の特異的で再現可能、そして均一な濃縮が観察される。
【図６Ａ】図６：マイクロビーズベッドを調製するために用いるカラムのテーパリングが、どのように一貫した厚みおよび孔サイズのマイクロビーズベッドを達成し、そして試料添加およびマイクロビーズ洗浄などの続く工程中のマイクロビーズベッドのいかなる撹乱も最小限にするのを補助しうるかを例示する、カラム設計。カラム寸法をミリメートルで示す。パネルＡは、ＤＮＡ試料を装填するため、マイクロビーズベッドまで１〜４ｍｍ離れたレベルまでＰ２０の挿入を可能にしつつ、Ｐ１００チップの完全な挿入を防止する、狭い内部チャネルへとテーパリングするリザーバーを最上部に含むカラム設計を示す。パネルＢは、カラムの広い内部チャネルの最上部に配置したキャップ中にチップ・ガイダンス特徴を含むカラム設計を示す。ガイダンス特徴は、形成中および試料装填中の、マイクロビーズベッドのいかなる撹乱も最小限にするために十分な距離で、マイクロビーズベッドの位置の上に、Ｐ２０およびＰ１００チップ両方の中心を配置するフランジを含有する。さらに、パネルＢ中のカラム設計は、カラムの長さの約半分まで下る、カラムの内部チャネル中のリムを示す。リムは、カラムの最上部から十分な距離で配置され、ガイダンス特徴に挿入されるＰ２００チップは、リムが配置されるレベルで底に達する。Ｐ２００チップを用いて洗浄緩衝液をカラムに添加する場合、リムはチップを、緩衝液が壁の側面を伝い、マイクロビーズベッドのいかなる撹乱も最小限にするようにガイドする。
【図６Ｂ】図６：マイクロビーズベッドを調製するために用いるカラムのテーパリングが、どのように一貫した厚みおよび孔サイズのマイクロビーズベッドを達成し、そして試料添加およびマイクロビーズ洗浄などの続く工程中のマイクロビーズベッドのいかなる撹乱も最小限にするのを補助しうるかを例示する、カラム設計。カラム寸法をミリメートルで示す。パネルＡは、ＤＮＡ試料を装填するため、マイクロビーズベッドまで１〜４ｍｍ離れたレベルまでＰ２０の挿入を可能にしつつ、Ｐ１００チップの完全な挿入を防止する、狭い内部チャネルへとテーパリングするリザーバーを最上部に含むカラム設計を示す。パネルＢは、カラムの広い内部チャネルの最上部に配置したキャップ中にチップ・ガイダンス特徴を含むカラム設計を示す。ガイダンス特徴は、形成中および試料装填中の、マイクロビーズベッドのいかなる撹乱も最小限にするために十分な距離で、マイクロビーズベッドの位置の上に、Ｐ２０およびＰ１００チップ両方の中心を配置するフランジを含有する。さらに、パネルＢ中のカラム設計は、カラムの長さの約半分まで下る、カラムの内部チャネル中のリムを示す。リムは、カラムの最上部から十分な距離で配置され、ガイダンス特徴に挿入されるＰ２００チップは、リムが配置されるレベルで底に達する。Ｐ２００チップを用いて洗浄緩衝液をカラムに添加する場合、リムはチップを、緩衝液が壁の側面を伝い、マイクロビーズベッドのいかなる撹乱も最小限にするようにガイドする。
【図７】図７：本発明を実施するために適したカラムの模式図。カラム（１）は、内部チャネル（２）および多孔性フリット（３）を含む。内部チャネル（２）は段階的にテーパリングされ、カラム（１）をトップセクション（４）、ネックセクション（５）およびボトムセクション（６）に分割する。フリット（３）はボトムセクション（６）に位置し、そして内部チャネル（２）の全横断面をふさぐ。トップセクション（４）には取り外し可能キャップ（７）が取り付けられていてもよく、該キャップは、最上部に、カラム（１）内に挿入されたピペットチップを内部チャネル（２）の中心にガイドする開口部を含有する。トップセクション（４）は、リム（８）によって、上部トップセクションおよび下部トップセクションに分割される。左の挿入図は、成形カラムの完成予想図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、ハイブリダイゼーションを用いて、関心対象の核酸分子に関して試料を濃縮するプロセスに関する。該プロセスは、参考文献４に記載される研究の側面と、配列決定前にＤＮＡを濃縮するためのハイブリダイゼーションに基づく方法を組み合わせる。参考文献４に対する重要な相違は以下の通りである：
１．関心対象の核酸分子は、検出ではなく、増幅および／または配列決定のような下流適用のために濃縮され、そしてしたがって、該核酸分子は蛍光色素または類似の外因性検出可能標識を含有しない。
【００３０】
２．ハイブリダイゼーションプローブを含む固体支持体は、本発明の微量流体デバイス中のミリメートル規模のチャネル中に充填され、そしてしたがって関心対象の核酸分子がハイブリダイゼーションプローブに結合するために、参考文献４のミクロン規模のチャンバー中のマイクロビーズよりも、はるかにより広い表面積を提供する。
【００３１】
３．微量流体デバイスは、（ｉ）固体支持体を含むチャネル中の温度および（ｉｉ）固体支持体を通過する流体の流速を調節するための手段を提供することによって、ハイブリダイゼーション条件、そしてしたがってハイブリダイゼーション時間の正確な調節を可能にする。
【００３２】
４．ハイブリダイゼーションおよび洗浄が完了した後、濃縮した核酸分子を、例えば温度の増加によって、固体支持体から放出させ、そして配列決定などの下流適用のために収集する。
【００３３】
５．捕捉の特異性は、固体支持体内のハイブリダイゼーション条件の正確な調節を通じて、本発明の微量流体デバイスで達成される。参考文献４は、これを想定もせず、また可能にもしない。参考文献４に開示される微量流体デバイスによって提供されるハイブリダイゼーション条件は、特異的および非特異的両方のハイブリダイゼーションが起こる複雑なプールからの核酸の特異的捕捉には適していない。
【００３４】
本発明の微量流体デバイスは、ペーパーパンチを用いてより大きなフィルターからディスクを切り取ることによって、ハイブリダイゼーションプローブの付着のための固体支持体として働くガラスマイクロファイバーフィルターディスクが用意される、参考文献８のマイクロスピンカラムとは異なる。ディスクがマイクロスピンカラム内に容易に入れられるように、フィルターディスクは、マイクロスピンカラムの内部穿孔よりもわずかに小さい直径を持たなければならず、そしてしたがって全横断面を完全には満たさない。マイクロカラムに適用される試料の一部は、したがって、フィルターディスク内に進入せずにカラムを通過するであろう。効率的なハイブリダイゼーションを可能にするため、フィルターディスクを含むカラムを含有するチューブを、回転装置内に入れ、そして１６〜２０時間インキュベーションする。対照的に、本発明のハイブリダイゼーションカラムは、全試料を、ハイブリダイゼーションカラム内のチャネルの全横断面を充填する固体支持体と直接接触させるため、ハイブリダイゼーションが起こるために長期のインキュベーション時間を伴わずに、固体支持体に試料を適用することを可能にする。
【００３５】
マイクロアレイに基づく濃縮法に対する相違点は以下の通りである：
１．本発明の固体支持体は、マイクロアレイに用いられる典型的なガラススライドよりも、ハイブリダイゼーションプローブが付着するためのより広い表面積を提供し；
２．相互連結された微量流体チャネルのネットワークは、固体支持体内のミクロン規模の空隙として存在し、関心対象のハイブリダイゼーションプローブがハイブリダイゼーションプローブから非常に離れて拡散することを防ぐ一方、先行技術のマイクロアレイは、単一の深いチャネルまたはハイブリダイゼーションプローブを含有する表面上の空間のいずれかを含み；そして
３．関心対象のターゲット核酸分子に対するハイブリダイゼーションプローブが互いに混合され、そして個々のプローブスポットの秩序だったアレイではなく、固体支持体表面にランダムに付着している。
【００３６】
試料調製
関心対象の核酸分子を含む試料を、多様な供給源から得ることも可能であり、そして典型的にはプレプロセシングして、関心対象の核酸分子ではない、大部分の他の構成要素を取り除く。試料中の核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。例えば、関心対象の核酸分子がゲノムＤＮＡである場合、ＲＮＡ分子は任意のさらなるプロセシング工程の前に、取り除かれる。同様に、関心対象の核酸分子がＲＮＡである場合（例えばトランスクリプトームプロファイリングのため）、混入しているいかなる細胞性ＤＮＡも、また関心対象のＲＮＡ分子を分解させうるいかなるＲＮａｓｅも取り除かれる。さらに、ＲＮＡ分子を濃縮前にＤＮＡに逆転写してもよいし、またはあらかじめ逆転写することなく直接濃縮してもよい。いくつかの態様において、関心対象の核酸分子は、例えば関心対象の特定の転写因子によって結合されるものであってもよく、その場合、プレプロセシングは、ゲノムの他の部分から、転写因子に結合するＤＮＡ断片を単離するクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を伴ってもよい。
【００３７】
いくつかの態様において、試料中の核酸分子を濃縮プロセス前に修飾する。例えば、メチル化ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理してもよい。この処理は、シトシン残基をウラシルに変換するが、５−メチルシトシン残基が影響を受けないままにする。
【００３８】
リボース部分が２’酸素および４’炭素を連結する余分な架橋を含有するロック化核酸（ＬＮＡ）に、核酸分子を連結することによって、該核酸分子を修飾することも可能である。ロック化リボースコンホメーションは、塩基スタッキングおよび主鎖事前構築を増進させ、そして修飾核酸分子のターゲット特異性および安定性を改善することも可能である。
【００３９】
いくつかの例において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に連結することによって、核酸分子を修飾することもまた好適でありうる。ＰＮＡは、核酸分子の捕捉効率を増加させるタグとして働くことも可能である。
【００４０】
適用に応じて、より大きい核酸分子を、ハイブリダイゼーションによる濃縮、ならびに増幅および配列決定などの下流適用に適するように、より取り扱いやすい小片に断片化する必要がある可能性もある。本発明の濃縮プロセスに適切であるように、核酸は、典型的には、１０〜１，０００塩基の長さを有する。長さ５０〜５００塩基対の核酸分子が特に有用である。好ましい態様において、核酸分子は、１００〜３５０塩基（例えば１５０〜２００塩基）の長さを有する。より短い配列（＜１，０００塩基、好ましくは＜５００塩基、より好ましくは＜３００塩基）は、より効率的にハイブリダイズする。短すぎる配列（＜５０塩基、例えば＜２５塩基または＜１０塩基）は、配列決定などの下流プロセスを非効率的にする可能性もある。
【００４１】
一般的に、ターゲット長の制限は、空隙表面上でのハイブリダイゼーションプローブの結合能などの要因に応じる。核酸分子サイズはまた、望ましい適用に応じる可能性もある。例えば、１００〜３５０塩基の核酸サイズは、一塩基多型（ＳＮＰ）、一塩基多様性（ＳＮＶ）、および短い挿入または欠失（インデル）を分析する際に有用である可能性もあり、この場合、関心対象の配列には、典型的には、ＳＮＰ、ＳＮＶまたはインデル周囲の５０塩基が含まれる。
【００４２】
大きな核酸分子を、機械的剪断によって、例えば超音波によって、断片化することも可能である。いくつかの態様において、機械的に剪断され、断片化された核酸分子は、末端修復され、そしてハイブリダイゼーションによる濃縮の前にアダプター配列に連結される。アダプター分子は、増幅および配列決定のような下流適用に必要なプライミング部位を含有する。アダプター連結および適切なアダプター分子を以下に記載する。
【００４３】
ゲノムＤＮＡを、例えば超音波剪断または噴霧によって（参考文献９および１０を参照されたい）、二本鎖断片にランダムに断片化することも可能である。典型的には、ゲノムＤＮＡを長さ＜１０００塩基対（ｂｐ）の小片に断片化する。適切な長さは、５０〜５００ｂｐ、例えば１００〜３５０ｂｐの範囲である。１５０〜２００ｂｐの長さを有する断片が特に適切である。これらの断片を、増幅および配列決定に使用する前に、アダプターに連結する必要がある。あるいは、機械的剪断および連結の代わりに、酵素的方法を用いることも可能である（例えばＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔｅｒａ系、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＤＮａｓｅ  Ｉ断片化酵素）。あらかじめアダプター配列を装填しておいたトランスポザーゼ酵素を、ＤＮＡの大きな片に添加する。トランスポザーゼ酵素は、大きな片をはるかにより短い断片にランダムに切断しながら、同時に、アダプターでこれらにタグ付けする。アダプターは、順方向プライマー部位および逆方向プライマー部位を導入する。次いで、断片を関心対象のＤＮＡ分子に関して濃縮する前に清浄化して、試料中に残るいかなる未連結アダプタータンパク質およびいかなるリガーゼ／トランスポザーゼも取り除くことも可能である。濃縮前の場合による工程は、タグ化アダプター中のオーバーハングを埋め込むことである可能性もある。生じた断片を、濃縮前に連結されたＤＮＡ断片と同じ方式で濃縮することも可能である。
【００４４】
一本鎖核酸分子のみが、濃縮に用いるハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズ可能である。二本鎖核酸分子は、ハイブリダイゼーションによる濃縮前に変性させる必要がある。変性工程は、典型的には、９０〜１００℃、好ましくは約９５℃、より好ましくは約９８℃で行われる。ＤＮＡ試料に関する典型的な変性プロトコルは、試料が９８℃で５分間インキュベーションされ、６５℃に５分間冷却され、そして次いで試料を固体支持体に適用する前に、４℃で５分間保存されることを必要とする。
【００４５】
ハイブリダイゼーションによる濃縮
本発明の濃縮プロセスは、ストリンジェントな条件下で、第一の核酸分子が、高い特異性で第二の核酸分子に結合し、ここで第二の核酸分子が、第一の核酸分子の配列に相補的な配列を有するという原理に基づく。関心対象の核酸配列を濃縮するため、複数の核酸分子を含む試料を、関心対象の核酸配列に相補的な核酸配列を有するハイブリダイゼーションプローブと緊密に接触させる。ストリンジェントな条件下で、関心対象の核酸配列を含む核酸分子は、関心対象の核酸配列に相補的な配列を有するハイブリダイゼーションプローブに結合するであろう。ハイブリダイゼーションプローブを固体支持体に連結させる。試料を添加した後、洗浄緩衝液を固体支持体に適用して、ハイブリダイゼーションプローブに結合していないすべての核酸分子を洗い流す。関心対象の配列を含有する核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブを通じて、固体支持体に結合したままであり、そして例えば温度または洗浄緩衝液の温度または塩濃度を増加させることによって、固体支持体から溶出させることも可能である。溶出物は、関心対象の配列を含有する核酸分子に関して、非常に濃縮されている。
【００４６】
ハイブリダイゼーションカラム
本発明は、内部チャネルを含むハイブリダイゼーションカラムに関し、ここで、前記チャネルは、多孔性固体支持体で充填されている。カラム内の固体支持体によって占められる総体積は、最大１．５ｃｍ３であることも可能であるが、より一般的には、体積は０．１ｍｍ３〜１００ｍｍ３、より好ましくは０．２５〜１０ｍｍ３の範囲である。典型的な体積は０．５〜１．５ｍｍ３である。典型的には、固体支持体に取り込まれる体積の約３０〜５０％は空隙であり、これは本発明の固体支持体の多孔性の性質のためである。例えば、固体支持体に取り込まれる体積が１ｍｍ３である場合、固体支持体内の空隙は、約０．３〜０．５ｍｍ３である。
【００４７】
固体支持体は、完全に、ハイブリダイゼーションカラムの内部チャネルの全横断面を充填する。固体支持体は、チャネルの深さに沿ったかなりの部分の全体に広がることも可能であるし、またはチャネルの深さのわずかな部分のみを充填することも可能である。典型的には、固体支持体は、約０．１〜５０ｍｍ、好ましくは約０．３〜２０ｍｍの深さを有し、これによって深さは、チャネルを通じた流動方向に対して、チャネル内に広がる固体支持体の寸法を指す。チャネルの内部穿孔は、１００μｍ〜２０ｍｍ、好ましくは２００μｍ〜１０ｍｍ、より好ましくは３００μｍ〜２ｍｍであることも可能である。当業者は、チャネルの長さおよびその直径が、固体支持体を望ましい体積にするように選択されることを認識するであろう。
【００４８】
カラムの内部チャネルの形状は、多様であることも可能である。例えば、チャネルの内部穿孔は、一方の端で他方の端よりも広いことも可能であり、そしてテーパリングされていることも可能である。典型的には、内部チャネルの直径は、ハイブリダイゼーションカラム全体で同じであろう。円形の横断面が典型的である。
【００４９】
いくつかの態様において、チャネルはテーパリングされ、そしてテーパリングされた末端は、多孔性フィルターまたはフリットあるいは透過性膜によって閉鎖される（上に論じられる通り）。例えば、チャネルは、５〜１０ｍｍの内部穿孔から、５０μｍ〜１ｍｍの内部穿孔へと狭くなることも可能である。チャネルの狭窄は、より深い深さの固体支持体の形成を可能にし、そしてしたがって固体支持体を通過する核酸分子は、より多数のハイブリダイゼーションプローブと相互作用することが可能であり、捕捉事象成功の確率が増加する。チャネルのテーパリングされた部分にはより広いヘッドスペースが先行し、圧調節をより容易にする。
【００５０】
本発明記載のハイブリダイゼーションカラムは、多様な形状およびサイズを有することも可能である。例えば、ハイブリダイゼーションカラムは、本発明の固体支持体を含む、薄くそして伸長されたキャピラリーであることも可能である。あるいは、慣用的なスピンカラム、またはクロマトグラフィ分離および精製に慣用的に用いられる、任意の他のタイプのカラムに類似の形式を有することも可能である。本発明で用いる典型的なハイブリダイゼーションカラム（１）を図７に示し、そして該カラムは、内部チャネル（２）および多孔性フリット（３）を含み、ここで前記内部チャネル（２）は段階的にテーパリングされ、カラムをトップセクション（４）、ネックセクション（５）およびボトムセクション（６）に分割し、ここでフリット（３）はカラム（１）のボトムセクション（６）に位置し、そして内部チャネル（２）の全横断面をふさぐ。内部チャネル（２）は、ネックセクション（５）において、カラム（１）のトップセクション（４）の内部チャネル（２）直径の約３０％〜約５０％までテーパリングされることも可能である。内部チャネル（２）は、ボトムセクション（６）において、カラム（１）のトップセクション（４）の内部チャネル（２）直径の約２０％〜約３０％までさらにテーパリングされることも可能である。いくつかの態様において、トップセクション（４）は、内部チャネル（２）内に突き出すリム（８）によって、上部トップセクションおよび下部トップセクションに分割される。特定の態様において、ボトムセクション（６）は、約１０μｌ〜約３０μｌ（例えば約２０μｌ）の体積を有する。トップセクション（４）は、カラム（１）の全長の約６０〜７５％を占めることも可能である。ネックセクション（５）は、カラム（１）の全長の約５〜１０％を占めることも可能である。ボトムセクション（６）は、カラム（１）の全長の約２０〜３０％を占めることも可能である。
【００５１】
典型的には、カラムは、低いＤＮＡ結合能を持つ材料から調製される。ランダムプライマーを伴うｑＰＣＲを用いて、カラムが結合したＤＮＡを有するかどうかを評価することも可能である。カラム材料が熱を伝導することが望ましい。理想的には、ハイブリダイゼーションカラムは、使用前にＤＮａｓｅ不含およびＲＮａｓｅ不含にするために、オートクレーブ可能である。適切なカラム材料には、ポリプロピレンまたはポリアロマー製の低ＤＮＡ結合性プラスチックが含まれる。ポリプロピレンまたはポリアロマ−製のカラムはまた、これらを、本発明を実施するために適したものにする、熱伝導特性を有する。ポリエチレンに基づくカラムもまた、本発明で使用するために適している可能性もある。好ましくは、ハイブリダイゼーションカラムは、（ステンレス）スチール製または類似の金属製ではない。
【００５２】
ハイブリダイゼーション、洗浄および溶出中の固体支持体内の条件をよりよく調節するために、本発明のハイブリダイゼーションカラムは、好ましくは、本発明記載の微量流体デバイスとともに用いられる。しかし、本発明のいくつかの側面において、ハイブリダイゼーションカラムはまた、専用の微量流体デバイスを使用せずに、本発明の方法を実施するために用いられることも可能である。
【００５３】
例えば、関心対象の核酸分子を含有する試料を、ハイブリダイゼーションカラムに手動で、例えば試料を、ハイブリダイゼーションカラムの固体支持体上の内部チャネル内にピペッティングすることによって、適用することも可能である。ハイブリダイゼーション条件を調節するため、試料を含有するハイブリダイゼーション緩衝液をあらかじめ温め、そしてハイブリダイゼーションカラムをハイブリダイゼーションオーブン、加熱ブロック等に入れて、ハイブリダイゼーション工程を完了させることも可能である。関心対象の核酸分子が固体支持体上のハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズしたら、ハイブリダイゼーションカラムを、チューブ内に入れて、そして遠心力を適用し、固体支持体中に残ったいかなる流体もチューブ内に押し出すことによって、ハイブリダイゼーション緩衝液を取り除くことも可能である。続く洗浄工程を、同じ方式で、すなわち洗浄緩衝液を固体支持体に適用し、そして遠心力を適用することによって、洗浄緩衝液を取り除くことによって、実行することも可能である。各例において、チューブ中のフロースルーは廃棄されるであろう。洗浄が完了したら、ハイブリダイゼーションカラムを新鮮なチューブに入れ、そして溶出緩衝液を固体支持体に適用することも可能である。関心対象の核酸分子を含有する濃縮試料を、チューブ内のハイブリダイゼーションカラムを遠心装置に入れて、そして遠心力を適用することによって、溶出させることも可能である。濃縮試料はチューブ内に押し込まれ、次いでチューブが濃縮材料を含有するであろう。遠心装置の代わりに、ハイブリダイゼーションカラムの内部チャネルに圧または吸引を適用することによってもまた、試料ならびに洗浄および溶出緩衝液をカラムに通過させることも可能である。例えば、ハイブリダイゼーションカラムは、ルアーロックを取り付けられて、シリンジの連結を可能にしてもよく、これを用いて、固体支持体を通じて試料および緩衝液を駆動することも可能である。
【００５４】
固体支持体
本発明の固体支持体は多孔性であり、ハイブリダイゼーションプローブが結合する広い表面積を提供する。用語「多孔性」は、この文脈において、固体支持体内のミクロンサイズの空隙を指し、これらは、固体支持体を形成する材料内に何らかの孔があるのではなく、相互連結されて、これらの間で流体が流動することを可能にしている。固体支持体は、それ自体、多孔性であるかまたは非孔性である材料から形成されることも可能である。例えば、固体支持体は、それ自体多孔性でありうるガラス微小球体から形成されることも可能である。しかし、好ましくは、固体支持体は、金属製またはシリカマイクロビーズなどの非孔性材料から形成され、これは、固体支持体を形成する材料内に孔が存在すると、適用された核酸が固体支持体に捕捉され、濃縮プロセスが緩慢になり、そして固体支持体からの濃縮核酸の回収が減少する可能性もあるためである。本発明にしたがった典型的な固体支持体は、１ｍｍ３あたり、約６００〜８００ｍｍ２の表面積を提供する（６００〜８００の表面積対体積比に相当する）。
【００５５】
関心対象の核酸分子を含有する試料を固体支持体に適用したら、内部のミクロンスケールの空隙によって、核酸分子が固体支持体を通じて流動するにつれて、ハイブリダイゼーションプローブと緊密に接触することが確実になり、迅速なハイブリダイゼーションが可能になる。非ターゲット核酸分子は、ハイブリダイゼーションプローブと弱くしか相互作用せず、そしてハイブリダイゼーション緩衝液、そして続いてストリンジェントな洗浄緩衝液の連続流によって、固体支持体からフラッシュされる。
【００５６】
固体支持体内の空隙は、不規則な形状であってもよく、そしてこれらのサイズは、固体支持体全体でわずかに多様であることも可能である。多孔性材料に関しては、平均孔サイズを用いて、固体支持体内の空隙の特性を定義することも可能である。本発明記載の固体支持体の概念的な「平均孔サイズ」を決定するための現実的なアプローチは、固体支持体を含有する微量流体デバイスチャネルを通じた流動に対して、増加するサイズの粒子を段階的に添加することである。試験に用いる粒子は、平均直径によって定義されることが認識されるであろう。平均孔サイズを決定するため、試験集団中のすべての粒子は、ほぼ同じ直径を有するであろう。この文脈において、ほぼ同じ直径を持つ粒子集団は、８５％の数が、直径中央値の±１０％以内の直径を有する粒子集団を指す。
【００５７】
流動に添加される粒子の１０％未満が固体支持体から流出する流体中に回収されるような粒子サイズに到達したら、この粒子サイズを用いて、固体支持体の平均孔サイズを定義することも可能である。例えば、９μｍの平均サイズを有する微小球体を保持しないが、１０μｍの平均サイズを有する粒子の９０％より多くを保持する固体支持体は、１０μｍの平均孔サイズを有すると定義することも可能である。本発明の固体支持体中の空隙は、例えば５０μｍ、３０μｍまたは１０μｍの平均孔サイズを有することも可能である。典型的な平均孔サイズは、０．１〜１００μｍの範囲内に属する。いくつかの態様において、本発明の固体支持体内の空隙は、≦２μｍ、好ましくは≦１．５μｍ、より好ましくは≦１μｍの平均孔サイズを有する。
【００５８】
好ましくは、固体支持体の孔構造は、すべての次元で均一である。例えば、緊密に充填されたマイクロビーズのベッドまたはセラミックフィルターは、任意の横断面で同じ範囲の孔サイズを有する一方、マイクロファイバー製の固体支持体は、横断面が、マイクロファイバーが固体支持体内に配置される方向に垂直であるかまたは平行であるかに応じて、異なる範囲の孔サイズを有するであろう。固体支持体全体で同じ範囲の孔サイズを有することで、核酸分子が固体支持体内を移動する際に、いかなる箇所でも一定の結合条件が提供される。ミクロンサイズの空隙内では拡散距離が小さいため、関心対象の核酸分子のハイブリダイゼーションは、ほぼ確実に固体支持体を通じた経路上で、相補的ハイブリダイゼーションプローブと出会うため、実質的に保証される。
【００５９】
固体支持体内の空隙は、相互連結された微量流体経路を形成する。試料内のすべての核酸分子がハイブリダイゼーションプローブと接触する可能性を増加させるため、ハイブリダイゼーションプローブは、固体支持体表面上にランダムに分布する。好ましくは、関心対象の特定の核酸分子に対するハイブリダイゼーションプローブは、固体支持体内の空間的に定義された位置にはないが、固体支持体全体に、実質的に等しい密度で見出されうる。
【００６０】
ハイブリダイゼーションプローブが結合可能な広い表面積を達成するため、固体支持体は、マイクロファイバー（すなわち１または１．３デニールまたはデシテックス／スレッドより細い合成ファイバー）、多孔性ガラス微小球体（典型的には１μｍ〜１ｍｍの直径を有する）、マイクロビーズ（典型的には０．５〜５００μｍの直径を有する）、セラミックフィルター等で形成されることも可能であるが、ビーズまたは球体が好ましい。固体支持体は、ガラス、水晶、雲母、炭素、アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化シリコン、窒化シリコン、炭化ホウ素、グラファイト、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、塩化ポリビニル、フッ化ポリビニリデン、フッ化ポリエチレン、ポリイミド、アクリレート樹脂等を含む、多様な基質で作製可能である。固体支持体上の基質表面は、当該技術分野に周知の方法を用いて、直接またはリンカー基を通じてのいずれかで、ハイブリダイゼーションプローブの付着を可能にするために、官能化される必要がありうる。
【００６１】
典型的には、固体支持体は、ハイブリダイゼーションカラムの一部として提供され、ここで、カラムは、その全横断面が固体支持体で充填される内部チャネルを含む。いくつかの場合、固体支持体を調製するための材料（例えばハイブリダイゼーションプローブが付着しているマイクロビーズ）は、カラムとは別個に提供され、そして固体支持体を含むハイブリダイゼーションカラムは、最終使用者によって調製されるであろう。本発明の１つの側面において、本発明の固体支持体を含むハイブリダイゼーションカラムを調製する方法を提供する。該方法は、内部チャネルを含むカラムを提供し、そしてほぼ同じ直径を有する複数のマイクロビーズでチャネルの全横断面を充填し、マイクロビーズが多孔性固体支持体を形成するようにする工程を含む。
【００６２】
マイクロビーズ
好ましい態様において、固体支持体はマイクロビーズで形成される。いくつかの態様において、マイクロビーズは磁性である。他の態様において、マイクロビーズは非磁性である。マイクロビーズを用いると、いくつかの利点が提供される。マイクロビーズは商業的に容易に入手可能であり、そして多様な基を用い、そして多様なサイズで官能化される。当該技術分野に知られる方法を用いて、ハイブリダイゼーションプローブをマイクロビーズに付着させることも可能である。典型的には、ハイブリダイゼーションプローブを官能化マイクロビーズに共有結合させる。例えば、５’アミン修飾を有する核酸分子は、ＮＨＳ官能化マイクロビーズに容易に連結可能である。マイクロビーズに核酸分子を共有結合させる代わりに、高アフィニティ、非共有付着手段を用いて、マイクロビーズに核酸を連結させることも可能である。例えば、ストレプトアビジン官能化マイクロビーズは、ビオチンに連結された核酸分子にコンジュゲート化可能である。
【００６３】
マイクロビーズは、ミクロン規模の空隙を持つ多孔性固体支持体を形成するように緊密に充填可能である。空隙のサイズは、用いるマイクロビーズのサイズによって決定され、そしてしたがって、適用に応じて、例えばより大きいマイクロビーズを使用して、より大きい空隙を生成することによって、サイズを容易に変化させることも可能である。例えば、より大きい核酸断片（＞５００ｂｐ）、例えば断片化ゲノムＤＮＡを使用する適用は、より小さい断片サイズ（＜３００塩基）を用いる適用よりも、より大きい空隙を必要としうる。したがって、固体支持体を含有するハイブリダイゼーションカラムは、同じ材料のより大きいマイクロビーズを選択することによって、より大きい断片を用いた使用に容易に適応可能である。
【００６４】
典型的には、マイクロビーズは、０．５〜５００μｍの平均直径を有する。≦２０μｍの平均直径を有するマイクロビーズが特に有用である。本発明での使用のため、マイクロビーズは好ましくは平均直径２〜１０μｍ、より好ましくは４〜８μｍである。適切なマイクロビーズは、およそ５μｍの平均直径を有する。平均直径が与えられている場合、固体支持体中のすべてのマイクロビーズは、ほぼ同じ直径を有するであろう。ほぼ同じ平均直径を持つ複数のマイクロビーズに関して、８５％の数のマイクロビーズが、直径中央値の±１０％以内の直径を有する粒子集団を指す。例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）Ｍ−２８０ストレプトアビジン・マイクロビーズは、２．８μｍの直径およびＣＶ＜３％を有する。
【００６５】
マイクロビーズを用いるさらなる利点は、これらが、隣接するプローブとのハイブリダイゼーション反応を妨害することなく、数十、数百、または数千の異なるハイブリダイゼーションプローブに連結可能であることである。異なるハイブリダイゼーションプローブの混合物を、官能化マイクロビーズに連結した結果、ビーズ表面上の混合物中に、各個々のハイブリダイゼーションプローブがランダムに分布する。固体支持体が数百または数千のマイクロビーズで形成されると、固体支持体全体で個々のマイクロビーズプローブの均一な分布が達成される。
【００６６】
マイクロビーズは、１セットより多いハイブリダイゼーションプローブを含むことも可能である。同じセット中の各ハイブリダイゼーションプローブは、生物ゲノムの同じ領域に結合し、そして各セットはゲノム中の異なる領域に結合する。異なる領域は、ゲノムの別個の部分（例えば異なるコードまたは非コード領域または遺伝子中、あるいは異なる染色体上）に位置していてもよい。セット中のハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムの同じ領域に結合するが、すべてが同じ配列を持たなくてもよい。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、領域に渡ってタイリングされていることも可能であり、そして各ハイブリダイゼーションプローブは、隣接するプローブと、例えば１０またはそれより多い核酸分、重複して、少なくとも２ｘ、好ましくは少なくとも４ｘ、より好ましくは少なくとも８ｘ（例えば１０ｘまたはそれより多く）のタイリング深度まで、全領域を被覆することも可能である。代替法として、ハイブリダイゼーションプローブは、１０〜５０塩基またはさらに１００塩基または１０００塩基を超えて離れていることも可能である。プローブ間の間隔は、下流適用に応じることも可能である。例えば、ナノポア配列決定は、長さ最大１０キロ塩基の読み取りを達成し、この場合、ハイブリダイゼーションプローブは、約１０００塩基〜約１０，０００塩基離れ、例えば約２０００〜８０００塩基離れるか３０００〜５０００塩基離れた間隔を空けられることも可能である。
【００６７】
関心対象のゲノム内の相補性領域、特に疾患または障害と関連する可能性もあるゲノムのコード領域中に結合するように、ハイブリダイゼーションプローブを設計することも可能である。疾患または障害の例には、新生物性疾患、神経学的疾患、自己免疫疾患、代謝疾患または障害、遺伝子疾患および体質性障害が含まれる。あるいは、異なる領域は、例えば早期検出および介入を可能にするために出生前診断が望ましい、１またはそれより多い出生前疾患または障害、あるいは遺伝性または遺伝子障害と関連することも可能である。異数性、特にトリソミー１３、トリソミー１８およびトリソミー２１、ならびにターナー症候群の検出が特に有用である。いくつかの態様において、本発明のマイクロビーズは、癌遺伝子中の突然変異を検出するために、癌診断で用いられることも可能である。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、循環する腫瘍ＤＮＡ中で検出可能な、腫瘍進行に関連する遺伝子の突然変異型に結合することも可能である。マイクロビーズは、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０の異なるセットのハイブリダイゼーションプローブを含むことも可能である。いくつかの態様において、マイクロビーズは、１００、好ましくは５００、より好ましくは１０００の異なるセットのハイブリダイゼーションプローブを含むことも可能である。
【００６８】
あるいは、マイクロビーズは、数十、数百、または数千の同じハイブリダイゼーションプローブに連結されてもよく、そして個々のハイブリダイゼーションプローブに連結されたマイクロビーズを混合することによって、固体支持体を形成することも可能である。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションプローブはすべてが同じではないが、すべてゲノムの同じ領域に結合する。例えば、各ハイブリダイゼーションプローブは、隣接するプローブと、例えば１０またはそれより多い核酸分、重複して、少なくとも２ｘ、好ましくは少なくとも４ｘ、より好ましくは少なくとも８ｘ（例えば１０ｘまたはそれより多く）のタイリング深度まで、関心対象の全領域を被覆することも可能である。多数のマイクロビーズを混合することによって、固体支持体全体で個々のハイブリダイゼーションプローブの実質的に均一な分布を達成しつつ、固体支持体全体で、異なるハイブリダイゼーションプローブの実質的に等しい分布を維持することも可能である。
【００６９】
したがって、本発明はまた、第一のマイクロビーズおよび第二のマイクロビーズを含むライブラリーにも関し、ここで前記の第一のマイクロビーズは、生物ゲノム中の第一の領域に結合する複数のハイブリダイゼーションプローブに連結され、そして前記の第二のマイクロビーズはゲノム中の第二の領域に結合する複数のハイブリダイゼーションプローブに連結される。第一の領域の核酸配列および第二の領域の核酸配列は、典型的には、互いに異なる。第一の領域および第二の領域は、前記生物に影響を及ぼす疾患または障害に関連していてもよい。例えば、第一の領域および第二の領域は、異なる癌遺伝子中に位置していてもよい。あるいは、第一の領域および第二の領域は、出生前診断におけるライブラリーの使用を可能にするため、各々、体質性障害または遺伝病、例えば遺伝性代謝障害に関連する、異なるコードまたは非コード領域（例えばプロモーター領域、イントロンおよびエクソンを含む遺伝子）中に位置していてもよい。典型的には、ライブラリーは、ゲノムの２より多い異なる領域に結合する、２より多いマイクロビーズを含んでもよい。例えば、ライブラリーは、少なくとも１０のマイクロビーズ、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも５０のマイクロビーズ（例えば１００マイクロビーズより多く）を含んでもよい。マイクロビーズ上のハイブリダイゼーションプローブは、すべて同じ配列を有してもよいし、またはすべて異なる配列を有してもよい。
【００７０】
いくつかの態様において、形状が球状であるマイクロビーズの代わりに、形状が多角体であり、そしてほぼ球の形状である（例えば十二面体、二十・十二面体、菱形三十面体など）微小粒子によって形成可能である。
【００７１】
マイクロビーズベッド
いくつかの態様において、数百、数千、数万またはそれより多いマイクロビーズを、限定された空間中のマイクロビーズベッドに緊密に充填することによって（例えばビーズがチャネルの横断面を完全に充填し、そしてチャネルに適用されたいかなる流体も移動しなければならないマイクロビーズベッドを形成するように、カラムまたは微量流体デバイスのチャネル内にビーズを充填することによって）、固体支持体を形成する。例えば、ハイブリダイゼーションプローブに連結されたマイクロビーズの懸濁物を、長さに沿ったある箇所で、例えば多孔性フリットで閉塞されているカラムの内部チャネル内に装填することによって、マイクロビーズベッドを形成することも可能である。いくつかの態様において、フリットの孔はマイクロビーズより小さく、したがって、流体流動が、フリットに対して緊密なベッドになるようにマイクロビーズを充填する。他の態様において、フリットの孔の直径は、フリットが、マイクロビーズのカラムからの流出を防ぐ限り、マイクロビーズベッドを形成するマイクロビーズの平均直径より大きくてもよい。例えば、フリットの孔の直径は、マイクロビーズベッド中のマイクロビーズの平均直径よりも、４０〜３００％大きいことも可能である。これらのより大きい孔サイズを持つフリットは、５〜１００μｌ／分の流速を維持しながら、マイクロビーズベッドを保持可能であることが、実験的に示されてきている。フリットに対してマイクロビーズを充填すると、その間を流体が流動することが可能になる、マイクロビーズ間の狭いミクロンサイズの空隙が生成される。空隙は、マイクロビーズベッドが形成される微量流体チャネルで相互連結されている。マイクロビーズ間の狭い経路または空隙は、試料中の核酸分子を、ハイブリダイゼーションプローブと緊密に接触させ、そして核形成反応速度（すなわち最初の数塩基対が形成される速度）を増加させることによって、ハイブリダイゼーションプロセスを加速させる。
【００７２】
非特異的結合を最小限にするため、フリット材料は、低いＤＮＡ結合能を有する。ポリプロピレン、特にいかなる表面コーティングも含まないポリプロピレンは、低いＤＮＡ結合能を有する。理想的には、該材料は、ハイブリダイゼーション中の温度の迅速な変化に耐える。適切なフリット材料は、２０〜１００℃の範囲の温度で機能する。典型的には、フリット材料は、最大１００℃（例えば９５℃または９９℃）の温度に耐える。適切なフリット材料は、１２１℃の高圧飽和蒸気にほぼ１５〜２０分間耐えるならば、オートクレーブ可能である。フリット材料は、試料および洗浄緩衝液中、そして溶出緩衝液中に存在する多様な化学物質に耐える。特に、フリット材料は、９５％エタノールおよび０．１Ｎ  ＮａＯＨと化学適合性を有する。好ましいフリット材料は、ポリエチレン（例えば超高分子量ポリエチレンまたは高密度ポリエチレン）、ポリプロピレンまたはガラス（例えばホウケイ酸塩）である。シリカに基づくフリット材料もまた、本発明を実施するために適切でありうる。フリット材料を化学的に修飾して親水性にすることも可能である。親水性フリット材料は、湿潤であることを補助するために好ましい。適切な親水性フリット材料には、ポリテトラフルオロエチレンが含まれる。ポリエチレンまたはポリプロピレン焼結多孔性プラスチック材料（例えばＢｉｏＶｙｏｎＴＭ）はフリット材料として特に適切であり、そして５〜１００μｍ（平均流動孔）の孔サイズで入手可能である。
【００７３】
いくつかの態様において、圧を適用して、マイクロビーズベッドを通じて試料を駆動する。典型的には、圧は１０〜５００ミリバールの間、例えば２５〜３００ミリバールの間である。好ましくは、マイクロビーズベッドに適用される圧は、４０〜２５０ミリバールの間である。例えば、ハイブリダイゼーション中、圧は４０〜１００ミリバールの間、好ましくは４０〜６０ミリバールの間または約５０ミリバールである。洗浄中の圧は、典型的には、ハイブリダイゼーション工程（単数または複数）中より高く、例えば洗浄中の圧は、１００〜５００ミリバールの間、好ましくは１５０〜３００ミリバールの間または約２００ミリバールであることも可能である。マイクロビーズベッドを適所に保持するフリットは、望ましい圧で、５〜１００μｌ／分の流速を可能にするように選択される。好ましい流速は、２５〜８０μｌ／分の範囲、例えば３０〜７０μｌ／分の範囲である。流速は、フリットの厚さおよび平均孔サイズによって決定される。孔サイズは、マイクロビーズサイズと適合しなければならない。本発明者らは、５μｍまたはそれより大きい平均直径を有するビーズを保持するには、７〜２０μｍの孔サイズを有するフリット材料で十分であることを見出している。典型的には、フリットは、１ｍｍ〜４ｍｍの間の厚さを有するであろう。適切なフリットの平均体積多孔性は２０％〜５０％、好ましくは２５〜４０％または約３０％である。適切なフリットは、マイクロビーズベッドに適用された水が、圧の非存在下でカラムから流出することを防ぎ、すなわち重力流はまったく生じず、そしてマイクロビーズベッドに圧が適用されない場合、試料はカラムから滴り落ちない。
【００７４】
マイクロビーズベッドの調製に適したカラムを図７に示す。適切なカラム（１）は、内部チャネル（２）および多孔性フリット（３）を含み、ここで前記内部チャネル（２）は段階的にテーパリングされ、カラムをトップセクション（４）、ネックセクション（５）およびボトムセクション（６）に分割し、ここでフリット（３）はカラム（１）のボトムセクション（６）に位置し、そして内部チャネル（２）の全横断面をふさぐ。内部チャネル（２）は、ネックセクション（５）において、カラム（１）のトップセクション（４）の内部チャネル（２）直径の約３０％〜約５０％までテーパリングされることも可能である。内部チャネル（２）は、ボトムセクション（６）において、カラム（１）のトップセクション（４）の内部チャネル（２）直径の約２０％〜約３０％までテーパリングされることも可能である。いくつかの態様において、トップセクション（４）は、内部チャネル（２）内に突き出すリム（８）によって、上部トップセクションおよび下部トップセクションに分割される。特定の態様において、ボトムセクション（６）は、約１０μｌ〜約３０μｌ（例えば約２０μｌ）の体積を有する。トップセクション（４）は、カラム（１）の全長の約６０〜７５％を占めることも可能である。ネックセクション（５）は、カラム（１）の全長の約５〜１０％を占めることも可能である。ボトムセクション（６）は、カラム（１）の全長の約２０〜３０％を占めることも可能である。
【００７５】
マイクロビーズベッドが形成されるカラムの内部チャネルの形状は、一貫した厚さおよび孔サイズのマイクロビーズベッドを形成するために特に適合していることも可能である。この文脈において、フリットの最上部にマイクロビーズ懸濁物を添加するために用いるいかなるピペットチップも、空のチップが懸濁物に触れることなしに、マイクロビーズベッドの形成に必要な懸濁物の全体積がピペットチップから排出されることを可能にするために、フリット表面から十分な距離で、内部チャネルの中心部にガイドされることが重要である。これは、ピペットチップの完全な挿入が防止され、そしてテーパリングが、フリットから十分な距離で、チャネル中心部にチップを位置づけるように、内部チャネルをテーパリングすることによって、達成可能である。
【００７６】
マイクロビーズベッドが位置するカラムの内部チャネルは、試料適用および洗浄工程中、マイクロビーズベッドに対する撹乱を最小限にするように成形されていることも可能である。これは、例えば、内部チャネルに挿入されるピペットチップが、ベッドのいかなる撹乱も最小限にするため、マイクロビーズベッドから十分に離れた距離で（典型的には２〜５ｍｍ）、カラム中心部にガイドされるように、カラムの内部チャネルをテーパリングすることによって達成可能である。代替法として、フランジをカラムの最上部に加えることも可能である（フランジは典型的には、例えばヒンジによってカラムの最上部に付着するキャップの形で、取り外し可能である）。フランジは、カラムに挿入されるピペットチップが、カラムの内部チャネルの中心部にガイドされるように、最上部でチャネルの直径を狭め、そしてチップがカラムの内部チャネルに進入することを妨げ、ベッドのいかなる撹乱も最小限にするため、マイクロビーズベッドから十分に離れた距離にチップを維持する。
【００７７】
いくつかの態様において、カラムの内部チャネルの上半分または上１／３にリムを加えることも可能である（図７を参照されたい）。リムは、チップの出口を閉塞させることなく、該リムでピペットを支えるために十分に広い。その目的は、ピペットチップをカラムの壁にガイドし、洗浄工程中のマイクロビーズベッドのいかなる撹乱も最小限にするように、洗浄緩衝液が内部チャネルの側面に沿ってピペッティング可能であるようにすることである。さらに、懸濁物を含有するピペットチップをリムで支えることによって、マイクロビーズ懸濁物をカラムに適用することも可能であり、懸濁物がカラムの内部チャネルの壁に沿って流動し、そして懸濁物中に包埋されていると適切なマイクロビーズベッドの形成に干渉しうる泡の形成を伴わずに、カラムの底に充填されるため、該リムは、マイクロビーズベッドの形成を補助することも可能である。リムは、カラム最上部のフランジと組み合わされてもよく、この場合、フランジは、リムを越えたカラム内へのピペットチップの挿入を防止する。
【００７８】
さらなる態様において、カラムのボトムセクション（内部チャネルを含む）は、カラムに適用された流体がカラムの内部チャネルを出る部分であり、内部チャネルの最小の直径がカラムの底で見られるように、さらにテーパリングされている。カラムのボトムセクションの形状を適応させると、より優れたドリッピングが可能になり、そして隣接するカラム上の滴が接触するために十分に大きい（例えば９６ウェルプレート上に配置されたカラムアレイにおいて）場合には隣接試料、または例えばデバイスからのカラムの除去中にカラムが挿入された微量流体デバイスを汚染しうる、カラム底部での「懸滴」を防止する。さらに、発泡が減少する。理想的には、カラムのボトムセクションは、隣接するウェルのいかなる交差汚染も伴わずに、カラムのアレイの下に配置される例えば９６ウェルプレート内に、内部チャネルを出た流体を正確に配置することが可能な、ピペットチップのような形状であろう。いくつかの態様において、カラム壁は、ピペットチップと同様に、カラムの他の部分よりも、カラムのボトムセクションの先端でより薄く、例えば発泡および「懸滴」形成をさらに減少させる。
【００７９】
好ましくは、カラムの最大直径は、９６ウェルプレートの最上部に９６カラムのアレイが配置可能であり、そして好ましくはいかなるカラムも互いに接触することなく、９６ウェルプレート上の対応するウェルの中心部に、各カラムの先端が整列するようなものである。いくつかの態様において、カラムは、本発明の微量流体デバイスで使用するためのアレイに配置される。
【００８０】
カラムのボトムセクションもまた、フリットを収容し、これはマイクロビーズベッドのより低い境界を形成する。典型的には、カラムのボトムセクションはフリットを保持する。カラムのボトムセクションをテーパリングすると、フリットの緊密な適合が可能になり、そしてしたがって、フリットのリム周辺のビーズの漏洩が防止される。
【００８１】
いくつかの態様において、カラムは横断面の最も広い直径で外部フランジを有する。外部フランジを付加すると、以下に記載する微量流体デバイスとともにカラムを用いた際に、圧のバイパスが防止される。代替法として、カラムの外側がテーパリングされる（好ましくは、上述のような内部チャネルのテーパリングを反映する）。カラムのテーパリングは、摩擦適合を提供するために十分である可能性もあり、したがって、カラムの外部形状にあうようにテーパリングされた穿孔を含む加熱装置または加熱ブロック中にカラムを配置する場合、カラムおよび加熱ブロック間にシールを生成する。好ましくは、カラム外部はリブを持たず、したがって、カラムのテーパリングされた形状は、カラムおよび加熱ブロックの間の直径方向の干渉を生成しうる。
【００８２】
代表的なカラム設計を図６および７に示す。
ハイブリダイゼーションプローブでの官能化のために適したマイクロビーズベッドを含むカラムが商業的に入手可能である（参考文献１１を参照されたい）。しかし典型的には、ハイブリダイゼーションプローブでの官能化は、マイクロビーズベッドを形成する前に行われるであろう。
【００８３】
ハイブリダイゼーションプローブ
ハイブリダイゼーションプローブは、濃縮のためにターゲティングされる核酸分子中の関心対象の配列に相補的な核酸配列を含有する。ハイブリダイゼーションプローブは、関心対象の特定のターゲット配列の結合に特異性を与えるために十分に長い。ハイブリダイゼーションプローブは、１０〜５００量体オリゴヌクレオチドであることも可能である。好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブは、２０〜２５０量体オリゴヌクレオチドであり、そしてより好ましくは長さ３０〜１５０塩基である。特に適切なハイブリダイゼーションプローブは、８０〜１２０量体であることが見出されてきており、そして典型的には、ハイブリダイゼーションプローブは、１００〜１４０塩基または約１２０塩基の長さを有することも可能である。≧２５塩基、好ましくは≧５０塩基を含むハイブリダイゼーションプローブが好ましい。＜５００塩基、好ましくは＜４００塩基、より好ましくは＜３００塩基の長さを有するプローブが好ましい。典型的なハイブリダイゼーションプローブは５０〜２５０量体オリゴヌクレオチド（例えば１５０〜２００量体オリゴヌクレオチド）である。
【００８４】
いくつかの態様において、はるかに大きい核酸分子（長さ＞１０，０００塩基）をハイブリダイゼーションプローブとして用いる。例えば、いくつかの適用において、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、例えばさらなる下流分析のために試料から全染色体を単離することも可能である。ＢＡＣは、長さ１００〜１７５ｋｂを越える巨大ＤＮＡ挿入物を含有しうる。
【００８５】
ＢＡＣは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のプローブとして使用されてきている。この技術の１つの適用は、ときに、ＢＡＣオンビーズ（ＢｏＢ）と称される、染色体異常検出のための分子核型決定である（参考文献１２および１３を参照されたい）。試料からの単離後、ゲノム試料ＤＮＡを参照ＤＮＡと混合し、そして次いで、標識し、そして精製した後、ビーズにカップリングしたＢＡＣにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、特定のＢＡＣにハイブリダイズした試料に対する参照の比を検出する。こうしたアッセイに関して、溶液中のハイブリダイゼーション時間は、典型的には１６〜２０時間である。
【００８６】
本発明は、ハイブリダイゼーション時間を一桁以上減少させて、１日の労働時間内のアッセイの実行を容易にすることによって、この方法を有意に改善する。これは、ＢＡＣを固体支持体に付着させ、そして本明細書に記載するようなハイブリダイゼーションプローブとしてＢＡＣプローブを使用することによって達成される。これは、ターゲット断片の単離を可能にし、挿入、欠失、微小欠失、転位置、異数性、コピー数変動（ＣＮＶ）および他の染色体再編成などの染色体異常の検出を容易にする。こうしたゲノム事象は、より短いオリゴヌクレオチドプローブを用いた場合には見落とされる可能性もある［１４］。高解像度分子核型決定のためのオリゴヌクレオチドの使用は、表現型に対する不確かな寄与を伴うＣＮＶの検出増加を生じうることもまた報告されてきている［１５］。
【００８７】
ハイブリダイゼーションプローブとして用いるオリゴヌクレオチドが短ければ短いほど、未結合であり、試料中のいかなる相補体にも結合する、関心対象のハイブリダイズした一本鎖核酸分子の未結合領域は長くなる。利用可能な未結合領域を減少させるため、ハイブリダイゼーションプローブの長さは、好適には、試料中の核酸分子の平均断片長の≧４０％（例えば５０％〜６０％）である。しかし、大部分の適用に関しては、ハイブリダイゼーションプローブの長さは、試料中の核酸分子の平均断片長の≦３０％である。
【００８８】
固体支持体に付着したハイブリダイゼーションプローブは、特定の平均長の核酸分子を含有する試料で最適に働くように設計される。核酸分子の平均長は、典型的には、濃縮プロセスの下流の任意の適用に関する要件によって特定される。例えば、濃縮核酸を配列決定に用いる場合、選択する配列決定法の読み取り長が、固体支持体に適用される核酸分子の平均長を決定するであろう。
【００８９】
ハイブリダイゼーションプローブの長さは、典型的には、混合物中の核酸分子の平均断片長の≧４０％、≧５０％または≧６０％であるように設計される。例えば、ハイブリダイゼーションプローブが６０塩基の平均長を有する場合、微量流体デバイスは、１００〜１５０塩基の長さを有する核酸の濃縮に特によく適している。あるいは、固体支持体上のハイブリダイゼーションプローブは、濃縮のために微量流体デバイスに適用される混合物中の平均核酸分子よりも長いように設計される。ハイブリダイゼーションプローブは、混合物中の核酸分子の平均断片長よりも、≧１０塩基、好ましくは≧２０、より好ましくは≧５０塩基長いことも可能である。例えば、ハイブリダイゼーションカラムを用いて、１５０塩基の平均サイズを有する関心対象の核酸分子に関して試料を濃縮する場合、ハイブリダイゼーションプローブは、長さ１６０〜２００塩基であることも可能である。固体支持体に適用される試料中の核酸分子より長いハイブリダイゼーションプローブを用いると、一本鎖アダプター分子をｉｎ  ｓｉｔｕで、ハイブリダイズした核酸分子に連結させる場合には特に好適でありうる（以下を参照されたい）。
【００９０】
固体支持体にハイブリダイゼーションプローブを連結させるため、ハイブリダイゼーションプローブは、好ましくは、官能基を含有するが、官能基の付加は常に必要とされるわけではない。官能基は、官能化固体支持体と化学的に反応する能力に関して選択される。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションプローブは、官能基を含有するリンカー基に共有結合するが、連結が官能基を介して導かれることもまた可能である。例えば、５’アミン修飾を用いて、ＮＨＳ官能化固体支持体にハイブリダイゼーション基を連結させることも可能である。他の態様において、ハイブリダイゼーションプローブは、ハイブリダイゼーションプローブに共有結合する高アフィニティ非共有リンカー基を通じて固体支持体に連結される。こうした官能基またはリンカー基の一例はビオチンであり、これは、ストレプトアビジンで官能化されている固体支持体とともに使用可能である。一般的に、すべてのハイブリダイゼーションプローブは、同じ官能基を通じて固体支持体に連結される。
【００９１】
典型的には、固体支持体上のすべてのハイブリダイゼーションプローブは同じかまたはほぼ同じ長さを有する。例えば、平均ハイブリダイゼーションプローブは、１８０量体オリゴヌクレオチドであることも可能であるが、固体支持体は、例えば１７８量体オリゴヌクレオチド、１７９量体オリゴヌクレオチド、１８０量体オリゴヌクレオチド、１８１量体オリゴヌクレオチド、１８２量体オリゴヌクレオチド等を含むことも可能な、個々のハイブリダイゼーションプローブの混合物を含有することも可能である。これは、ハイブリダイゼーションプローブ混合物中の個々のプローブを、同じ効率で固体支持体に連結し、したがって、個々のプローブのいずれも、固体支持体表面上に過剰に存在しない可能性を増加させる。好ましくは、すべてのハイブリダイゼーションプローブは、正確に同じ長さを有し（すなわち同じ数のヌクレオチドで構成され）、そして同じ官能基を含有するであろう。
【００９２】
物理化学特性、例えば長さではなくプローブの融点（Ｔｍ）が一致しているいくつかのプローブ設計戦略に関して、ハイブリダイゼーションプローブは長さが異なることも可能である。こうした態様において、個々のハイブリダイゼーションプローブの長さは、２０〜２５０塩基、好ましくは３０〜１５０塩基、より好ましくは８０〜１２０塩基の範囲であることも可能である。
【００９３】
マイクロアレイ上に適合可能なハイブリダイゼーションプローブの数は、利用可能な表面積および関与するコストの両方によって制限される一方、本発明の固体支持体を濃縮に用いる場合には、こうした制限は同じ度合いでは存在せず、これは、ハイブリダイゼーションプローブが、官能化固体支持体の全表面にランダムに付着しており、固定された位置にプローブを配置するための特別な装置を必要としないためである。したがって、当該技術分野に周知の方法を用いて、固体支持体の全表面の高いプローブ密度が、容易にそして安価に達成可能である。多孔性固体支持体上では利用可能な表面積もはるかに広いため、ハイブリダイゼーションプローブの数もまた、比較的容易に増加させうる。例えば、最大核酸ハイブリダイゼーション効率のための最適表面ハイブリダイゼーションプローブ密度は、先行技術において、約１ｘ１０１２〜約９ｘ１０１２プローブ分子／ｃｍ２の範囲のハイブリダイゼーションプローブ密度で観察されてきている［４］。固体支持体がマイクロビーズベッドである場合、プローブ密度は、１ａｍｏｌ／ｍｇマイクロビーズ〜１μｍｏｌ／ｍｇマイクロビーズの範囲でありうる。典型的には、プローブ密度は０．０１ｐｍｏｌ／ｍｇ〜２５００ｐｍｏｌ／ｍｇの間、好ましくは０．１ｐｍｏｌ／ｍｇ〜１００ｐｍｏｌ／ｍｇの間または０．１ｐｍｏｌ／ｍｇ〜１０ｐｍｏｌ／ｍｇの間である。
【００９４】
ハイブリダイゼーション効率は、駆動因子を必要とする。駆動因子は、試料中の過剰な投入核酸または固体支持体上の過剰なハイブリダイゼーションプローブのいずれであることも可能である。捕捉効率は、関心対象の特定の配列に相補的な個々のハイブリダイゼーションプローブの数が、固体支持体に適用される典型的な試料中のこの特定の配列を所持する核酸分子の理論的な数値を超えるようなハイブリダイゼーションプローブ密度を持つ固体支持体を提供することによって増加させうる。例えば、典型的な試料が１００ｎｇのＤＮＡを含有し、したがって約１，０００，０００コピーの関心対象の特定のＤＮＡ配列が試料中に存在する場合、試料を分析するための固体支持体は、関心対象の特定のＤＮＡ配列に相補的なプローブが例えば１０倍または１００倍過剰であることを可能にするプローブ密度を有するべきである。これらの条件下で、過剰プローブ濃度は、ハイブリダイゼーションを駆動可能である。
【００９５】
単一のハイブリダイゼーションプローブを用いて、関心対象の核酸分子をターゲティングすることも可能である。しかし、より典型的には、１より多いハイブリダイゼーションプローブを用いて、関心対象の核酸分子をターゲティングする。典型的には、試料調製は、ターゲット核酸分子のランダム断片を生じる。したがって、関心対象の核酸分子が完全に提示される可能性を増加させるため、多数のプローブが必要である。
【００９６】
関心対象の配列が完全に提示される可能性を増加させるため、特定のターゲットテリトリーに対するハイブリダイゼーションプローブが互いに重複することが好ましい可能性もある。例えば、２ｘの深度、より好ましくは３ｘの深度、さらにより好ましくは４ｘ、８ｘまたは１２ｘの深度まで、ターゲットテリトリーをタイリングするように設計されることも可能である（詳細に関しては、例えば参考文献１６を参照されたい）。いくつかの態様において、塩基で示されるハイブリダイゼーションプローブの組み合わせた全長は、１０％、より好ましくは２０％、さらにより好ましくは３０％、ターゲット配列の組み合わせた全長を超える。
【００９７】
ターゲットテリトリーの中心から、そしてターゲットテリトリーの境界から生じる、関心対象の核酸分子が同等に提示される可能性を増加させるため、特定のターゲットテリトリーのハイブリダイゼーションプローブは、１０〜１００塩基、例えば２０塩基、好ましくは４０塩基、より好ましくは６０塩基、境界を越えて伸長するように設計される。例えば、ターゲットテリトリーが、遺伝子の特定のエクソンである場合、ターゲットテリトリーを被覆するハイブリダイゼーションプローブのあるものは、イントロン領域内に、例えば２５ｂｐ伸長する。
【００９８】
ハイブリダイゼーション条件
ハイブリダイゼーションプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試料中の関心対象の核酸分子に結合する。ハイブリダイゼーションプローブの核酸配列に相補的な配列を含有しない核酸分子の非特異的結合を減少させるため、試料添加前に、典型的にはブロッキング工程を実行する。試料添加前に、典型的にはブロッキングオリゴヌクレオチドを含有するブロッキング緩衝液を用いて、固体支持体を洗浄する。ハイブリダイゼーション緩衝液にブロッキングオリゴヌクレオチドを添加することによって、試料中の核酸分子と固体支持体の非特異的な相互作用をさらに最小限にすることも可能である。例えば、サケ精子ＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション緩衝液で固体支持体を洗浄することによって、試料ＤＮＡの非特異的相互作用をブロッキングすることも可能である。典型的なハイブリダイゼーション緩衝液は、５０ｎｇ／μｌサケ精子ＤＮＡを補充した１ｘＨｉ−ＲＰＭ緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）からなる。
【００９９】
固体支持体を通じた流体の流速は、１ｎｌ／分〜１ｌ／分の範囲であることも可能であるが、典型的には、微量流体デバイスの背景において、１〜１００μｌ／分、好ましくは２〜５０μｌ／分、より好ましくは４〜２５μｌ／分の流速を維持して、固体支持体を通じて流体を駆動する。例えば、約５μｌ／分の流速を用いて、固体支持体を通じてハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄緩衝液および溶出緩衝液を駆動することも可能である。重力流または拡散ではなく、固体支持体に試料を適用するために一定の流速を用いることで、固体支持体の各部分が、同じ条件下で試料と接触するようになるため、ハイブリダイゼーションが改善する可能性もある。
【０１００】
一般的に、所定の期間に渡って、固体支持体内で特定の回数の体積交換を達成するように、流速を選択する。例えば、ハイブリダイゼーションを達成するには、１分あたり１〜１０体積変化が適切である一方、洗浄工程中には、１分あたりより多数回の体積交換（例えば１分あたり２０またはそれより多く、好ましくは４０またはそれより多く、より好ましくは６０またはそれより多い体積交換）が望ましい可能性もある。例えば、本発明の固体支持体が約０．５ｍｍ３の空隙体積を有する場合、固体支持体を通じた５μｌ／分の流速は、１分あたり１０回の空隙体積変化に対応し、そして３０μｌ／分の流速は、１分あたり６０回の空隙体積交換に対応する。どの流速を選択するかは、試料中の核酸濃度および総試料体積に応じる可能性もある。例えば、比較的希薄な試料を大きな体積で適用するために、１分あたりより多くの体積変化が望ましい可能性もある。１分あたりの体積変化の上記範囲は、本発明の固体支持体に適用される試料中のＤＮＡ濃度が、約１ｎｇ／μｌ〜約１００ｎｇ／μｌである場合、特に適切である。
【０１０１】
関心対象の核酸分子を含有する混合物を、固体支持体と接触させる前に、ハイブリダイゼーション緩衝液中で希釈する。試料を固体支持体に接触させたら、典型的には５５〜６５℃の間まで温度を増加させて、核酸分子がハイブリダイゼーションプローブとアニーリングすることを可能にする。ミクロン規模の空隙を含む固体支持体にハイブリダイゼーションプローブが連結されていると、核酸分子がハイブリダイゼーションプローブから非常に遠くに拡散する（慣用的なマイクロアレイの場合のように）ことが妨げられるため、ハイブリダイゼーションプロセスは、非常に迅速でありうる。ハイブリダイゼーション工程を１秒間〜１時間の期間行うことも可能である。しかし、典型的には、ハイブリダイゼーション時間は１〜１５分間、例えば２〜１０分間の間である。一般的には、ハイブリダイゼーション緩衝液またはブロッキング緩衝液の連続流を全プロセスで維持して、固体支持体を通じて試料を駆動する。しかし、固体支持体に試料を適用して、そして次いで流動を停止し、ハイブリダイゼーションを可能にするか、または間隔を置いて固体支持体を通じて試料を駆動して、間隔の間の期間が試料内の核酸分子が固体支持体上のハイブリダイゼーションプローブと相互作用可能であるさらなる時間を可能にすることもまた可能である。相補配列を含有しない核酸分子は、未結合のままであり、そしてハイブリダイゼーション緩衝液の一定流によって取り除かれる。続いて、固体支持体をストリンジェントな洗浄緩衝液でフラッシュすることによって、いかなる非特異的結合核酸分子も取り除く。ストリンジェントな洗浄緩衝液の典型的な組成は、当業者に周知である。例えば、高ストリンジェンシーは、０．１ｘＳＳＰＥおよび０．００５％（ｖ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンまたは０．１％ＳＤＳおよび０．１ｘＳＳＣを緩衝液に含めることによって達成可能である。
【０１０２】
非特異的相互作用をさらに減少させ、そして洗浄工程の効率を増加させるため、洗浄緩衝液を固体支持体に適用しながら、ハイブリダイゼーションまたはアニーリング温度から、温度を約５〜１０％だけ減少させることも可能である。あるいは、洗浄工程中、温度を２０〜３０℃に減少させる。
【０１０３】
洗浄緩衝液を、ハイブリダイゼーション緩衝液またはブロッキング緩衝液よりも高い流速で適用することも可能である。例えば、洗浄工程中の流速を５〜１０倍に、例えば５μｌ／分から３０μｌ／分に、増加させることも可能である。洗浄緩衝液を、例えば５〜３０分間、連続適用することも可能であるし、または不連続に、例えば各洗浄工程の間に１分間の休止を伴い、５分間隔で複数回、適用することも可能である。
【０１０４】
洗浄後、核酸分子混合物は、関心対象の核酸配列が非常に濃縮されて、固体支持体上に保持される。
溶出
最後に、ハイブリダイゼーションプローブに結合したままである、非常に濃縮された関心対象の核酸分子を、例えば温度上昇、塩濃度減少または両方の組み合わせを通じて溶出させる。例えば、固体支持体温度を約９０〜１００℃、好ましくは約９５℃に上昇させて、いかなる結合した核酸も溶出させることも可能である。溶出が、温度増加によって開始される場合、洗浄緩衝液の流動を続けることも可能であるし、または溶出試料を保存するために使用可能な溶出緩衝液（例えばＴＥ）に、流動を切り替えることも可能である。
【０１０５】
あるいは、物理化学的手段、例えばｐＨ修飾によって、ハイブリダイゼーション二重鎖を破壊することも可能である。例えば、１００ｍＭ  ＮａＯＨを用いて、固体支持体からいかなる結合核酸も取り除くことも可能である。続く適用のため、溶出物のｐＨを、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の添加によって、中性に調整する必要がある。
【０１０６】
溶出核酸分子を、例えば固体支持体から収集チューブへの洗浄緩衝液の流出を流用することによって、収集する。試料をさらに濃縮するため、溶出した核酸分子を、１またはそれより多いさらなるハイブリダイゼーション周期のため、（必要な場合、ハイブリダイゼーション緩衝液に希釈した後）固体支持体に添加することも可能である。固体支持体は、先のハイブリダイゼーション工程中に用いたものと同じ固体支持体であってもよいし、または異なる固体支持体であってもよい。さらなるハイブリダイゼーション工程の前に、溶出した核酸分子を増幅し、そして場合によって精製することも可能である。代替法として、配列決定などの下流適用で使用するために、溶出した核酸分子を増幅し、そして続いて精製することも可能である。核酸分子が増幅のための適切な配列を欠く場合、溶出した核酸分子に、必要な配列を含有するアダプターを連結することも可能である。
【０１０７】
いくつかの態様において、溶出した核酸は、すでに、配列決定のためのアダプター分子を含有する。好適には、本発明は、非常に少量の体積（１０〜５０μｌ）を用いた溶出を可能にする。溶出し、そして濃縮された核酸分子は、下流適用、例えば配列決定に直接用いられるために十分に純粋である。
【０１０８】
アダプター分子の連結
特定の下流適用、例えば増幅およびＮＧＳのため、核酸分子が、各分子の両端に連結されるアダプター核酸を備えていることが好ましい。アダプター分子は、ＰＣＲによる続く増幅のためのプライミング部位、ならびに選択した配列決定法に特異的な配列、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定装置中のフローセル表面にハイブリダイズする配列を提供することも可能である。例えば、５’アダプターは、下流増幅および配列決定のための順方向プライマー部位を含有する一方、３’アダプター分子は逆方向プライマー部位を含有することも可能である。
【０１０９】
典型的には、濃縮前にこれらの配列を断片化核酸分子に連結し、したがってすべての断片がアダプター配列を所持し、したがって濃縮後のさらなる連結工程の必要性が回避される。本発明者らは、濃縮後にターゲット核酸分子に指標を付けそして配列決定するためのアダプター核酸を連結することで、必要な試薬の量を減少させることが可能であり、そして特にアダプター核酸を微量流体デバイスの固体支持体を通じて流動に添加した際には、配列決定のための濃縮核酸分子の調製をさらに加速することが可能であることを見出した。
【０１１０】
本発明のいくつかの態様において、固体支持体から溶出する関心対象の核酸分子の非常に濃縮した混合物を、下流適用、例えば増幅および／または配列決定のために必要な結合部位を提供するアダプター分子に連結する。
【０１１１】
あるいは、核酸分子を固体支持体のハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズさせながら、アダプター核酸に連結させることも可能である（ｉｎ  ｓｉｔｕ）。連結を含む、ハイブリダイズしたＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕ修飾は、以前示されてきており、そして参考文献１７に記載される。
【０１１２】
連結反応後、一本鎖アダプター末端核酸分子を、温度上昇、塩濃度減少または両方の組み合わせを通じて、固体支持体から溶出させる。
核酸分子の３’端および５’端へのアダプター連結を、同時にまたは連続して行ってもよい。一般的に、連結反応を、もっぱら二本鎖核酸配列を認識するリガーゼ、典型的にはＤＮＡリガーゼによって触媒する。核酸分子の３’端へのアダプター連結および５’端へのアダプター連結は、好ましくは連続的に（すなわち別個の工程で）行われる。これは、望ましくない連結産物の産生が減少する利点を有する。さらに、例えば微量流体デバイスの別個のカートリッジ中に配置することによって、配列決定プライマーを変化させるかまたは別個に補充することも可能である。
【０１１３】
例えば、連結工程が連続している場合、５’アダプターおよびリガーゼの混合物をまず添加することも可能である。順序は逆であることも可能であり、そして３’アダプターを、５’アダプターの連結前に、核酸分子に連結することも可能である。
【０１１４】
例えば、５’アダプターをハイブリダイゼーションプローブ（例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用い、そしてハイブリダイゼーションプローブが、試料中の平均核酸分子より長い場合）、または核酸分子（例えば二重鎖アダプターを一本鎖核酸分子に連結させる場合）にハイブリダイズさせることも可能であるし、そして核酸分子の５’端および５’アダプターの３’端の間のニックをリガーゼによって連結する。洗浄工程後、３’アダプターおよびリガーゼの混合物を添加する。３’アダプターもまた、ハイブリダイゼーションプローブ（例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用い、そしてハイブリダイゼーションプローブが、試料中の平均核酸分子より長い場合）、または核酸分子（例えば二重鎖アダプターを一本鎖核酸分子に連結させる場合）のいずれかにハイブリダイズし、そして核酸分子の３’端および３’アダプターの５’端の間のニックをリガーゼによって連結する。さらなる洗浄工程後、一本鎖アダプター末端核酸分子を下流適用（例えば増幅および配列決定）のために回収することも可能である。
【０１１５】
あるいは、核酸分子の３’端および５’端の両方へのアダプター連結は、単一工程で実行可能である。この態様において、５’アダプター、３’アダプターおよびリガーゼを含む混合物を核酸分子に添加する。核酸分子末端およびアダプターの間のニックを連結によって結合させる。連結混合物を除去する洗浄工程後、一本鎖アダプター末端核酸分子を、下流適用（例えば増幅および配列決定）のために回収することも可能である。
【０１１６】
核酸をともに連結するための連結の代替法が存在し、そしてこれを用いて、前述の態様を修飾することも可能である。例えば、トランスポザーゼなどの酵素を用いたアダプター分子の添加が成功裡に使用されてきている［１８］。
【０１１７】
適切なアダプター分子
適切なアダプター分子は、一本鎖または二本鎖のいずれかであることも可能である。ｉｎ  ｓｉｔｕ連結のため、アダプター分子の選択は、固体支持体に添加された混合物中の核酸分子の長さに対する、固体支持体に結合したハイブリダイゼーションプローブの長さに応じる可能性もある。
【０１１８】
好ましくは、アダプター分子には、末端ブロッキング基（例えばＣ３スペーサーまたはジグザグブロック）が含まれ、アダプター分子の一方の端のみが連結に感受性である。これは、望ましくない連結産物の産生を減少させることも可能である。
【０１１９】
一本鎖アダプター分子
本発明の１つの態様において、固体支持体上のハイブリダイゼーションプローブは、ハイブリダイズした核酸分子よりも長い。この態様において、一端に縮重塩基の短いストレッチを含有する一本鎖アダプター分子の混合物を用いて、固体支持体上のハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズさせることも可能である。これらのアダプター分子の小さいサブセットのみが、ハイブリダイズした核酸分子にすぐ隣接して結合するであろう。アダプター分子が、ハイブリダイズした核酸分子のいずれかの側のプローブにハイブリダイズしたら、もっぱら二本鎖核酸配列を認識するリガーゼが、５’および３’アダプター分子のそれぞれの端を、ハイブリダイズした核酸分子の３’および５’それぞれの端に連結させることも可能である。
【０１２０】
アダプター分子の１つの端上に縮重塩基の短いストレッチを、そしてアダプター分子の反対側にブロッキング基を配置することによって、もっぱら二本鎖核酸配列を認識するリガーゼを用いた連結反応は、アダプター分子が、ハイブリダイズした核酸分子にすぐ隣接するハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズした場合にのみ起こる。
【０１２１】
二本鎖アダプター分子
１つの態様において、二本鎖アダプター分子は、二本鎖または二重鎖領域を形成する２つのオリゴヌクレオチドで構成される。これらのアダプター分子はまた、アダプター二重鎖とも称される。オリゴヌクレオチドの１つは、これを通じてアダプター二重鎖が一本鎖核酸分子の末端にハイブリダイズ可能である縮重塩基の短いストレッチによって形成される一本鎖オーバーハング領域をさらに含む。オーバーハングの反対側のアダプター複合体中の両方のオリゴヌクレオチドの末端は、典型的にはブロッキング基で終結する。
【０１２２】
二本鎖アダプター分子を、ｉｎ  ｓｉｔｕで固体支持体上の核酸分子にハイブリダイズさせることも可能であり、この場合、固体支持体上のハイブリダイゼーションプローブは、ハイブリダイズした核酸分子より短い必要性がある。
【０１２３】
典型的には、縮重塩基のストレッチは、ブロッキング基によって終結し、したがって、連結は、アダプター二重鎖が核酸分子にハイブリダイズした場合にのみ起こりうる。さらに、連結反応は、一本鎖オーバーハングを欠くアダプター複合体の核酸分子およびオリゴヌクレオチド間でのみ起こりうる。
【０１２４】
ｉｎ  ｓｉｔｕ連結を用いる場合、末端ブロッキング基が存在するために連結されていない、各アダプター二重鎖中のオリゴヌクレオチドは、溶出（例えば温度上昇または塩濃度減少によって誘発可能）中に、一本鎖アダプター末端核酸分子から分離される。これらのオリゴヌクレオチドは、アダプター末端核酸分子より短いため、これらは固体支持体からより迅速に溶出する。一本鎖アダプター末端核酸分子は、より緩慢に溶出し、そして下流適用、例えば増幅および配列決定で使用するために別個に回収可能である。
【０１２５】
別の態様において、二本鎖アダプター分子は、それ自体塩基対形成して、短い相補領域（ステム）および一本鎖領域（ループ）を生成する、単一のオリゴヌクレオチドで構成される。これらのステム・ループアダプター（ヘアピンアダプターとも称される）をアダプター二重鎖の代替物として用いることも可能である。オリゴヌクレオチドの一端は、縮重塩基の短いストレッチによって形成される一本鎖オーバーハング領域を含み、この領域を介してヘアピンアダプターが一本鎖核酸分子の端にハイブリダイズ可能である。縮重塩基のストレッチは、ブロッキング基によって終結し、したがって、連結は、アダプター二重鎖が核酸分子にハイブリダイズした場合にのみ起こりうる。単一のオリゴヌクレオチドをアダプターとして用いる利点は、望ましくない連結産物を回避するため、縮重塩基のストレッチを終結させるために用いるブロッキング基が１つあればよいことである。
【０１２６】
下流適用
核酸分子を濃縮し、そして適切なアダプター配列でタグ付けしたら、例えば慣用的なＰＣＲを用いることによって、アダプター末端核酸分子を増幅することも可能であり、そして／または好ましくは次世代配列決定（ＮＧＳ）を用いて配列決定することも可能である。この文脈において、ＮＧＳは、サンガー配列決定［１９］またはマクサム・ギルバート配列決定［２０］とも称される、不可逆性鎖終結阻害剤を用いたＤＮＡ配列決定以外の方法によって配列決定を可能にする、任意の技術を指す。
【０１２７】
下流適用の前に、核酸分子の他の修飾を行うことも可能である。例えば、濃縮プロセス後に、メチル化ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理して、亜硫酸水素配列決定を可能にすることも可能である。
【０１２８】
ＮＧＳは、「大規模平行シグネチャー配列決定」（ＭＰＳＳ）、ポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）配列決定、ピロシーケンシング、クラスター配列決定または合成時配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＳｏｌｅｘａ配列決定とも称される）および連結時配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）（例えばＳＯＬｉＤ配列決定）、一分子リアルタイム（ＳＭＡＲＴ）配列決定、可逆性ターミネーターヌクレオチドを取り込むことによる配列決定、ナノポア配列決定（例えば溶血素ナノポア配列決定）、およびヌクレオチド取り込み中に放出された水素イオンの検出による配列決定（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）等の多様な配列決定技術を含む（参考文献２１および２２を参照されたい）。
【０１２９】
ＮＧＳによって２つの重要な利点が提供される。第一に、単一遺伝子から全ゲノムまでのいずれかの多数の遺伝子および変異体が、平行してスクリーニング可能である。ＮＧＳの第二の重要な利点は拡張性であり、これは、分子試験に対する要求が増加するにつれて必要とされている、多数の患者において、多数のターゲットを試験する能力である。
【０１３０】
特定のＮＧＳ技術と本発明の濃縮プロセスを組み合わせると特に好適でありうる。例えば、クラスター配列決定または合成時配列決定によって達成されるハイスループットは、これを本発明の濃縮プロセスと組み合わせることによって、さらに増加させることも可能であり、そしてしたがって、診断適用のより価値が高いツールとなる。同様に、本発明の濃縮プロセスをナノポア配列決定と組み合わせると、多数のＤＮＡ配列を配列決定する際の速度および費用に関して有意な利点を提供しうる。
【０１３１】
本発明の濃縮法を、ピロシーケンシング、ポロニー配列決定、可逆性ターミネーターヌクレオチドを取り込むことによる配列決定、ナノポア配列決定、連結時配列決定、およびイオン・トレント配列決定と組み合わせることも可能である。
【０１３２】
全ゲノムおよびエキソーム配列決定は、多くの疾患に関して、診断的価値を有するが、ターゲット配列決定アプローチは、典型的には、診断目的のためにはるかにより適切であり：偶発所見を減少させ、データ分析の複雑性を減少させ、そして試料あたりのコストを減少させる。
【０１３３】
多くの遺伝疾患に関して、臨床的に作用可能な遺伝子および変異体の小さいパネルを用いて、非常に高い診断量が達成可能である。癌に関しては、より小さいパネルで、低頻度の突然変異検出のための非常に高深度の配列決定が可能である。典型的には、パネルは５〜２０遺伝子からなるが、いくつかの場合、例えば３０、５０または１００遺伝子からなる、より大きいパネルが好ましい可能性もある。全遺伝子をターゲティングするよりも、「ホットエクソン」、「ホットスポット」および非コード配列を含む領域をターゲティングすることも可能である。遺伝子および領域は、本開示の文脈において、交換可能と見なされるべきである。
【０１３４】
微量流体デバイス
ハイブリダイゼーションによる濃縮プロセスを専用の微量流体デバイスで好適に行う。微量流体デバイスは、固体支持体が充填されるチャネルを含む。固体支持体は、複数の相互連結されたミクロンサイズの空隙を含み、該空隙は、それらの間を流体が流動することを可能にする。複数のハイブリダイゼーションプローブが、空隙を形成する表面に結合する。
【０１３５】
好ましくは、チャネルは、微量流体デバイスに挿入され、そしてそこから取り除くことも可能なハイブリダイゼーションカラムの一部を形成する。これは、ハイブリダイゼーションカラムを単純に交換することによって、異なる濃縮適用のためにデバイスを再度利用可能にするために好適である。いくつかの態様において、微量流体デバイスは、１より多いハイブリダイゼーションカラム、例えば６、８、１２、２４、４８、９６または３８４のハイブリダイゼーションカラムを収容可能である。例えば、デバイスは、２：３の長方形マトリックスで配置される、９６または３８４のハイブリダイゼーションカラムのアレイを保持するようセットアップ可能である。代替法として、デバイスは、８または１２カラムのアレイを保持するようセットアップ可能である。ハイブリダイゼーションカラムを個々に、またはあらかじめ配置したアレイ（例えば互いに連結された多数のカラム単位を含有するストリップまたはプレートの形で）のいずれかで提供することも可能である。例えば、ハイブリダイゼーションカラムを、８または１２カラムのストリップとして、あるいは８または１２カラムのストリップとして分割される８ｘ１２カラムの分割プレートとして、あるいは９６または３８４カラムアレイのプレートとして、提供することも可能である。単純なハイブリダイゼーションカラムに関連して以下に記載する多様な態様は、多数カラムのセットアップを収容するように、容易に適応可能である。
【０１３６】
典型的には、チャネルは、温度調節要素（例えば１またはそれより多いハイブリダイゼーションカラムを挿入可能である１またはそれより多い穿孔を含む、加熱要素または加熱ブロック）および温度センサー内に配置され、チャネル内の流体温度の正確な調節を可能にする。好ましくは、加熱要素には、温度の迅速な変化を達成するペルチェ要素が含まれる。
【０１３７】
いくつかの態様において、チャネルはリザーバーに連結される。リザーバーを密封して、リザーバーが、チュービングを通じてリザーバーに連結されている圧縮ガス（例えば窒素）供給源で加圧されるようにすることも可能である。リザーバーおよび下流チャネル間で生じる圧勾配によって、チャネル内のいかなる流体も、固体支持体を通じて駆動される。リザーバーにガス供給源を連結するチュービング内のバルブは、チャネルを通じて駆動される流体の流速を調節可能であるコントローラーによって開閉可能である。例えば、デバイスには、電子コントローラーが含まれることも可能であり、これは、ハイブリダイゼーションカラムのチャネルを通じて流速を調節するようプログラム可能である。いくつかの態様において、圧センサーは、リザーバー中に位置して、リザーバーにおける圧を測定する。
【０１３８】
チャネルを通じて流体を駆動するポンピング手段を含むセットアップによって、固体支持体を通じた流体の流速に対して調節することが可能になる。固体支持体を通じて流体をポンピングするため、先行するパラグラフ中に記載するもの以外の手段（例えば微量流体適用に適したシリンジポンプまたは蠕動もしくは隔膜ポンプ、あるいは吸引デバイス）は、当業者に容易に明らかである。典型的には、ポンプまたは任意の他の適切な圧勾配生成デバイスは、リザーバー内に１０〜５００ミリバール、例えば２５〜３００ミリバールの圧を生成する。好ましくは、例えば電子圧制御装置によって、マイクロビーズベッドに適用される圧を操作中に調節して異なる流速を生じる。適切な操作範囲は、４０〜２５０ミリバールの間である。例えば、ハイブリダイゼーション中、圧を４０〜１００ミリバールの間、好ましくは４０〜６０ミリバールの間、または約５０ミリバールに調節することも可能である。約５０ミリバールの圧は、試料変性およびハイブリダイゼーション中に遭遇する温度（９５℃および６５℃）でのガス形成を防止するために十分に高いことが見出されてきている。洗浄中の圧は、典型的には、ハイブリダイゼーション工程（単数または複数）中よりも高く、例えば洗浄中の圧は、１００〜５００ミリバールの間、好ましくは１５０〜３００ミリバールの間、または約２００ミリバールに調節されることも可能である。例えば、固体支持体を通じた流体の流速を、５０ｎｌ／分〜５ｍｌ／分に調節することも可能である。より典型的には、流速を１〜１００μｌ／分に調節することも可能であり、好ましくは２〜５０μｌ／分、より好ましくは４〜２５μｌ／分を維持して、固体支持体を通じた流動を駆動する。適切な流速には、２５〜８０μｌ／分、例えば３０〜７０μｌ／分が含まれる。例えば、約５μｌ／分の流速を用いて、固体支持体を通じて、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄緩衝液および溶出緩衝液を駆動することも可能である。あるいは、洗浄緩衝液を適用する流速は、ハイブリダイゼーション緩衝液を適用する流速よりも、５〜１０倍高いことも可能である。例えば、洗浄を流速３０μｌ／分で行う一方、ハイブリダイゼーション緩衝液を、５μｌ／分の流速で、固体支持体に適用することも可能である。
【０１３９】
微量流体デバイスを、上述のハイブリダイゼーションカラムで用いる場合、圧のバイパスを防止するため、カラムは、好ましくは、加熱ブロック内に摩擦適合している。加熱ブロック内へのカラムの緊密な適合は、カラム周囲の空気漏洩を防止する。
【０１４０】
一体型の温度調節および流速調節は、プロセスの自動化を可能にし、したがってハイブリダイゼーション条件の変動を最小限にし、そして濃縮プロセスの再現性を増加させるため、好適である。さらに、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーは緊密に制御可能であり、したがって濃縮プロセスの特異性および選択性を改善することも可能である。
【０１４１】
固体支持体を含むチャネルの一端をチュービングに連結することも可能である。チュービングを収集チューブに連結して、濃縮された関心対象の核酸分子を含有する固体支持体からの溶出物を収集することも可能である。いくつかの態様において、収集チューブは、検出チャンバーを通過する。検出チャンバーは、標識不含リアルタイム検出のための、そして場合によって、固体支持体からの流出物内の核酸の定量化のための、光学センサーを含む。検出チャンバーの存在は、一本鎖アダプター末端核酸分子がｉｎ  ｓｉｔｕ連結に用いたアダプター二重鎖の未連結オリゴヌクレオチドから区別する必要があるプロセスには、特に好適である。
【０１４２】
本発明のいくつかの態様において、関心対象の核酸分子を含有する試料をチャネルに適用して、そして固体支持体を通じて手動で駆動させることも可能である。これは、微量流動デバイスを単純化し、そしてコストを減少させる。手動介入は、本発明によって達成されるハイブリダイゼーション時間の劇的な減少のために可能である。例えば、試料をカラム内に直接ピペッティングすることによって、あるいはハイブリダイゼーションカラムの内部チャネルの一端に連結されているチュービングまたはキャピラリーに連結されている、試料含有シリンジによってのいずれかで、試料を、ハイブリダイゼーションカラムの内部チャネル内に位置する固体支持体に適用することも可能である。シリンジプランジャーが押圧されると、試料はチュービングまたはキャピラリー内に注射され、そしてチャネル中にそして固体支持体を通じて押し込まれるであろう。
【０１４３】
いくつかの態様において、微量流体デバイスを用いて、本発明の固体支持体を調製する。例えば、一端で部分的に閉鎖された内部チャネルを含む空のカラム（例えば多孔性フィルター、フリットまたは透過性膜の存在によって）をデバイスに入れることも可能である。固体支持体は、部分的に閉鎖された端より上のチャネル中にマイクロビーズ懸濁物を入れることによって、チャネル中に形成可能である。例えば、チャネルの上流のリザーバーに連結された圧縮ガスの供給源からの圧を適用して、懸濁物をチャネルに押し込むことも可能である。あるいは、吸引を用いて、チャネルを通じて懸濁物を駆動することも可能である。マイクロビーズはチャネルの部分的に閉鎖された部分を通過不能であるため、緊密に充填されたマイクロビーズベッドを形成する。懸濁物は、１μｇ〜１．５ｇの間のマイクロビーズを含有することも可能であるが、より典型的には、マイクロビーズの量は０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．２５〜１０ｍｇの間の範囲である。
【０１４４】
固体支持体を通じた微量流体流動に少量の必要な試薬を添加することによって、下流分子操作、例えば指標および配列決定アダプターの核酸分子への連結を行うことも可能である。これは、配列決定の準備が出来た濃縮核酸分子の調製をさらに加速させうる。
【０１４５】
いくつかの態様において、微量流体デバイスに適用される核酸分子の混合物は、すでに必要な指標および配列決定アダプターを含有し、そして溶出され、そして濃縮された核酸を下流適用、例えば配列決定に直接用いることも可能である。特定の態様において、本発明の微量流体デバイスは、したがって、配列決定装置にカップリングさせることも可能である。
【０１４６】
総則
用語「を含む」「含む」「含まれる」ならびに「からなる」、例えばＸ「を含む」組成物は、もっぱらＸからなることも可能であるし、またはさらなるものを含み、例えばＸ＋Ｙであることも可能である。
【０１４７】
語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないことも可能である。必要な場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省くことも可能である。
【０１４８】
用語「約」は、数値ｘと関連して、場合により、そして例えばｘ±１０％を意味する。
【実施例】
【０１４９】
関心対象のＤＮＡ分子中の特定の配列に対するハイブリダイゼーションプローブとコンジュゲート化されたマイクロビーズの充填ベッドを通じてＤＮＡ試料を通過させることによって、関心対象のＤＮＡ分子を迅速に濃縮することも可能である（図１）。マイクロビーズベッドの拡散長が制限されているため、ターゲットＤＮＡが捕捉され、そして数時間ではなくほんの数分で、非ターゲットＤＮＡに対して濃縮されることが可能になる。
【０１５０】
ＤＮＡ試料中の関心対象のＤＮＡ分子を濃縮するためのワークフローの概観を図２に提供する。マイクロビーズを、ゲノム、例えばヒトゲノムの特定の領域に対してターゲティングされた数十、数百、または数千の異なるオリゴヌクレオチド（典型的には６０〜１２０量体）で官能化し、各マイクロビーズはこれらプローブの混合物をディスプレイする。マイクロビーズを微量流体デバイス内に装填し、そして流体流動によって、緊密なベッドに充填する。
【０１５１】
ゲノムＤＮＡの試料を１５０〜２００ｂｐの小片に断片化し、配列決定のためのアダプターを場合によって付加し、そしてＤＮＡを充填ベッドの上流のデバイス内に装填する。調節された温度（６５℃）で、ハイブリダイゼーション緩衝液の緩慢な流動によって、充填ベッドを通じて、ＤＮＡ試料を駆動する。オリゴヌクレオチドプローブによって認識される試料中のＤＮＡ断片は、マイクロビーズ表面にハイブリダイズし、そして保持される。非ターゲットＤＮＡ断片は、ベッドを通過し、プローブには弱くしか結合しないかまたはまったく結合しない。
【０１５２】
洗浄緩衝液が、流動中のハイブリダイゼーション緩衝液に置き変わる、１またはそれより多い洗浄工程は、いかなる残存非ターゲットＤＮＡも排除する。この工程の温度は、洗浄（単数または複数）のストリンジェンシーを調節するように調整される。
【０１５３】
最後に、プローブになおハイブリダイズしているターゲットＤＮＡは、洗浄緩衝液の流動を続けながら、温度を上昇させることによって溶出される。この溶出ＤＮＡを次いで、下流適用、例えば配列決定のために収集する。断片がアダプターを欠く場合、配列決定前にこれらを付加する必要がある。
【０１５４】
実施例１：蛍光標識オリゴヌクレオチドの迅速な濃縮
核酸混合物中の特定の配列の迅速な濃縮を立証し、そして定量化するため、２つの蛍光標識オリゴヌクレオチドを組み合わせて、そしてこのうち一方に相補的なプローブで官能化されたマイクロビーズベッドを通過させた。
【０１５５】
プローブ官能化マイクロビーズの調製
１．  ５’アミン修飾を含む６０量体オリゴヌクレオチド（ＦＢ−ＡｍＣ６−プローブＡ：５’−ＴＧＡＧＧＣＴＴＧＣ  ＡＴＡＡＴＧＧＣＡＴ  ＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧ  ＴＧＡＡＣＡＡＣＣＡ  ＣＧＧＡＣＣＡＴＡＡ  ＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡ−３’（配列番号１）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を合成し、そしてヌクレアーゼ不含水中で、１μＭ濃度に希釈した。
【０１５６】
２．  ５μｍ直径ＮＨＳ官能化シリカマイクロビーズ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，  Ｉｎｃ．）を２ｘ懸濁緩衝液（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，  Ｉｎｃ．）中に、２００ｇ／ｌの密度まで再懸濁した。
【０１５７】
３．  １００μｌのオリゴヌクレオチド溶液を、１．５ｍｌ微量遠心管中で、１００μｌのマイクロビーズ懸濁物と組み合わせた。したがって、カップリング反応をマイクロビーズミリグラムあたり５ピコモルのプローブ密度で行った。
【０１５８】
４．  チューブを回転ハイブリダイゼーションオーブン中のロティサリーに乗せ、そして一定の回転を加えながら、５０℃で１６時間インキュベーションした。
５．  磁気ラックを用いて、上清からマイクロビーズを分離し、上清を廃棄した。
【０１５９】
６．  マイクロビーズを２００μｌの１ｘ洗浄緩衝液（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，  Ｉｎｃ．）中に再懸濁し、ボルテックスし、そして磁気ラックに戻した。再び、上清を廃棄した。この工程は１回の「洗浄」を構成した。
【０１６０】
７．  マイクロビーズを、２００μｌの１ｘ洗浄緩衝液（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ，  Ｉｎｃ．）中でさらに２回、そして５００μｌのヌクレアーゼ不含水中、９９℃で２回洗浄した。
【０１６１】
８．  ２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．０２％アジ化ナトリウム（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）を含有する保存緩衝液中、２０ｍｇ／ｍｌの密度でマイクロビーズを再懸濁した。
【０１６２】
上記工程を、マイクロビーズが１０倍高い密度（５０ｐｍｏｌ／ｍｇ）のプローブとカップリングするように、工程１のＦＢ−ＡｍＣ６−プローブＡの１０μＭ溶液で反復した。
【０１６３】
濃縮
１．  １ｍｇのプローブ官能化マイクロビーズを、３８１μｍの内部穿孔を有するＰＥＥＫキャピラリー（ＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐ．）内に装填した。キャピラリー末端の０．５μｍ孔ＰＥＥＫフィルター（ＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐ．）がマイクロビーズを捕捉し、これらを直径３８１μｍおよび長さ約１０ｍｍでベッド内に充填させた。
【０１６４】
２．  ５０ｎｇ／μｌサケ精子ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した１ｘＨｉ−ＲＰＭ緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）としてハイブリダイゼーション緩衝液を調製した。キャピラリーを水槽中で６５℃に加熱し、そしてＭｉｔｏｓ  Ｄｕｏ  ＸＳポンプ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｌｔｄ．）を用いて、１０μｌ／分で１０分間、マイクロビーズベッドを通じて、ハイブリダイゼーション緩衝液をポンピングした。このインキュベーションは、マイクロビーズおよびキャピラリー内部の他の表面をプレハイブリダイズする（ブロッキングする）ように働いた。
【０１６５】
３．  ９７２５ｉ  ＨＰＬＣ手動注入バルブ（ＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、同じハイブリダイゼーション緩衝液中に溶解した５μｌパルスの蛍光標識１００量体オリゴヌクレオチドを導入した。この等モル混合物は、以下の２種各々を５０、５００、または５，０００ｆｍｏｌ含有した：（ｉ）マイクロビーズ上のプローブに相補的なＣｙ３標識オリゴヌクレオチド（ＦＢ−Ｃｙ３−ターゲットＡ：５’−ＣＡＴＴＡＧＴＴＣＣ  ＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡ  ＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴ  ＴＴＡＴＧＧＴＣＣＧ  ＴＧＧＴＴＧＴＴＣＡ  ＣＴＣＡＴＴＣＴＧＡ  ＡＴＧＣＣＡＴＴＡＴ  ＧＣＡＡＧＣＣＴＣＡ  ＣＡＡＴＡＴＡＧＴＴ  ＡＡＡＴＧＣＡＡＴＧ−３’（配列番号２）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）および（ｉｉ）非相補配列を含むＣｙ５標識オリゴヌクレオチド（ＦＢ−Ｃｙ５−ターゲットＢ：５’−ＧＡＧＴＴＧＣＣＣＡ  ＴＣＧＡＴＡＴＧＧＧ  ＣＡＡＣＴＣＴＡＴＣ  ＴＧＣＡＣＴＧＣＴＣ  ＡＴＴＡＡＴＡＴＡＣ  ＴＴＣＴＧＧＧＴＴＣ  ＣＴＴＣＣＡＧＴＴＧ  ＴＴＴＴＴＧＣＡＴＡ  ＧＴＧＡＴＣＡＧＣＣ  ＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号３）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）。
【０１６６】
４．  マイクロビーズベッドを通じてパルスをポンピングし、そしてマイクロビーズベッドから流出する流れの蛍光を４７４  ＨＰＬＣスキャニング蛍光検出装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）で測定した。２つのオリゴヌクレオチド各々からの蛍光シグナルは、各種のフロースルーを測定することを可能にした。
【０１６７】
５．  キャピラリーの温度を２５℃に減少させ、そして５０μｌ／分でポンピングされる０．１ｘＳＳＰＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）および０．００５％（ｖ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）を含有する洗浄緩衝液に、可動相をスイッチした。この洗浄相は、非ハイブリダイズオリゴヌクレオチド除去を補助した。
【０１６８】
６．  洗浄が完了した後、洗浄緩衝液の流速を１０μｌ／分に戻し、そしてキャピラリー温度を６５℃に上昇させて、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをマイクロビーズ表面から遊離させた。２つのオリゴヌクレオチド種各々からの蛍光シグナルによって、特異的捕捉を定量化することが可能であった。
【０１６９】
結果
単一の１２０量体オリゴヌクレオチドを、ＮＨＳ／アミン化学反応を通じて、マイクロビーズアリコットにコンジュゲート化した。マイクロビーズより小さい孔サイズを持つ多孔性フリットが末端にある短いキャピラリー内に、マイクロビーズを充填し、マイクロビーズをキャピラリー内部に捕捉した。キャピラリーを通じてハイブリダイゼーション緩衝液をポンピングして、マイクロビーズをブロッキングした。
【０１７０】
ＨＰＬＣ注入バルブを用いて、２つの蛍光標識オリゴヌクレオチドのパルスをハイブリダイゼーション緩衝液流に導入した。ＨＰＬＣ蛍光検出装置を用いて、緑色および赤色蛍光チャネル中で、ベッドからの流出を監視した（図３）。緑色色素Ｃｙ３で標識された１つオリゴヌクレオチドは、マイクロビーズ上のプローブオリゴヌクレオチドに相補的であり、そしてその分子の大部分がハイブリダイズした。ある程度の分子は捕捉されず、そして０〜６００秒の間の流出蛍光中のピーク（ストライプ領域）によって例示されるように、ベッドをまっすぐ通過した。次いで、「洗浄」相中、可動相を低温だがストリンジェントな洗浄緩衝液にスイッチした。どのくらい多くの標識オリゴヌクレオチドが実際に結合したかを決定するため、１２００〜２０００秒の間の蛍光中のピーク（点描領域）によって例示されるように、温度を増加させ、そしてハイブリダイズした分子をプローブから融解させて、そしてベッドから流出させた。２つのピークの相対面積によって、マイクロビーズ表面に捕捉されたターゲットオリゴヌクレオチド分子の割合が示される。赤色色素Ｃｙ５で標識されたもう一方のオリゴヌクレオチドは、プローブに相補的ではなく、そしてハイブリダイズしなかった。ＤＮＡの大部分は、「ハイブリダイゼーション」工程中にまっすぐ流出し、表面にはほとんど結合していなかった。
【０１７１】
マイクロビーズ上のハイブリダイゼーションプローブの密度および注入パルス中のオリゴヌクレオチド濃度を変化させることによって、捕捉効率に対するこれらの変数各々の影響を調べることが可能であった（表１）。
【０１７２】
【表１】
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【０１７３】
表１．  異なるプローブ密度およびオリゴヌクレオチド濃度でのターゲットおよび非ターゲットオリゴヌクレオチドの捕捉効率。測定しなかった値を「ＮＭ」によって示す。
結果は、マイクロビーズに対するプローブの量および注入したオリゴヌクレオチドの量の両方が、ターゲットオリゴヌクレオチドの全体の捕捉に影響を及ぼしたことを示す。プローブの量が最高であり（５０ｐｍｏｌ）そして注入オリゴヌクレオチドの量が最低であった（５０ｆｍｏｌ）際に、捕捉効率が最高であった。捕捉プローブの量を減少させるか、または注入オリゴヌクレオチドの量を増加させると、ターゲットオリゴヌクレオチドの捕捉が減少する影響があった。非ターゲットオリゴヌクレオチドの捕捉もまた測定した場合、決定した値は、ターゲットオリゴヌクレオチドに関するものよりもはるかに低かった（０．４４対６４．５％）。これらの捕捉効率の比は、１４７倍の全体の濃縮係数が達成されたことを示す。すべての場合で、ハイブリダイゼーション工程は１０分しか続かなかった。
【０１７４】
実施例２：ラムダファージゲノムにおける単一ターゲットの迅速濃縮
生物の完全ゲノムからの特定の配列の濃縮を立証しそして定量化するため、ラムダファージゲノムＤＮＡから断片のライブラリーを生成し、そして１つの１２０ｂｐターゲットに相補的なプローブで官能化したマイクロビーズのベッドを通じて駆動した。
【０１７５】
プローブ官能化マイクロビーズの調製
５’アミン修飾を含む１２０量体オリゴヌクレオチド（ＦＢ−ＡｍＣ６−プローブＡ１２０：５’−ＣＣＧＴＣＡＡＡＡＡ  ＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴ  ＡＡＣＴＡＴＡＴＴＧ  ＴＧＡＧＧＣＴＴＧＣ  ＡＴＡＡＴＧＧＣＡＴ  ＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧ  ＴＧＡＡＣＡＡＣＣＡ  ＣＧＧＡＣＣＡＴＡＡ  ＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡ  ＴＣＴＧＣＴＧＧＣＣ  ＧＧＡＡＣＴＡＡＴＧ  ＡＡＴＴＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号４）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を、実施例１に記載するのと同じ方式で、５ｐｍｏｌ／ｍｇ密度でマイクロビーズにカップリングした。このプローブは、Ｊ０２４５９ラムダファージ参照ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ）中の単一の領域：塩基２１９３０−２２０４９に対してターゲティングされた。
【０１７６】
アダプター二重鎖の調製
１．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃによって、相補オリゴヌクレオチド対を合成した。５’  Ｃ３キャップおよび３’末端塩基上のホスホロチオエート結合を含む「上部」オリゴヌクレオチドを合成した（ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−Ａｄ−５’−Ｔ：５’−ＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣ  ＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ  ＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ  Ｔ−３’（配列番号５））。５’リン酸および３’  Ｃ３キャップを含む「下部」オリゴヌクレオチドを合成した（ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−Ａｄ−５’−Ｂ：５’−ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡ  ＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡ  ＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴ−３’（配列番号６））。
【０１７７】
２．  ５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１００μＭ  ＥＤＴＡ（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）を含有する５０μｌ体積のアニーリング緩衝液中に、３０μＭ濃度で、オリゴヌクレオチドを再懸濁した。
【０１７８】
３．  混合物を９５℃で２分間変性させ、ゆっくりと２５℃に冷却し（０．１℃／秒）、２５℃で５分間維持し、そして次いで４℃で保存した。オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−Ａｄ−５’アダプター二重鎖を生成した。
【０１７９】
４．  別のオリゴヌクレオチド対で上記工程を反復して、ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−Ａｄ−３’アダプター二重鎖を生成した。５’リン酸および３’  Ｃ３キャップを含む「上部」オリゴヌクレオチド（ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−Ａｄ−３’−Ｔ：５’−ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡ  ＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴ  ＧＡＡＣＴＣＣＡ−３’（配列番号７））を合成した。５’  Ｃ３キャップおよび３’末端塩基上のホスホロチオエート結合を含む「下部」オリゴヌクレオチド（ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−Ａｄ−３’−Ｂ：５’−ＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣ  ＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ  ＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ  Ｔ−３’（配列番号５））を合成した。
【０１８０】
濃縮用のＤＮＡの調製
１．  ２μｇのラムダファージゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を、製造者の指示にしたがって、Ｓ２集束超音波発生装置（Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、１８０ｂｐ二本鎖ＤＮＡ断片にランダムに剪断した。
【０１８１】
２．  製造者の指示にしたがって、１ｘ比のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．）で、剪断ＤＮＡを清浄化し、そしてサイズ選択した。溶出体積は、２７μｌのヌクレアーゼ不含水であった。
【０１８２】
３．  ２５μｌの清浄剪断ＤＮＡを、以下の構成要素で５０μｌに希釈することによって、末端修復し、そしてＡテール付加した：１ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭ  ｄＡＴＰ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、２００μＭ  ｄＮＴＰ混合物（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、１００Ｕ／ｍｌクレノウ断片（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、３０Ｕ／ｍｌ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、２２０Ｕ／ｍｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、および０．３Ｕ／μｌ  Ｔｏｐ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ  Ｃｏｒｐ．）。
【０１８３】
４．  試料を２５℃で３０分間インキュベーションし、７２℃に３０分間加熱し、そして次いで４℃に冷却した。
５．  １５μｌの試薬をＤＮＡ試料に添加し、添加される連結構成要素：２．３μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−Ａｄ−５’アダプター二重鎖、２．３μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−Ａｄ−３’アダプター二重鎖、および１８，５００Ｕ／ｍｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む６５μｌ反応を生じた。
【０１８４】
６．  試料を２０℃で１５分間インキュベーションした。
７．  製造者の指示にしたがって、１．８ｘ比のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズで、連結ＤＮＡを清浄化し、そしてサイズ選択した。溶出体積は、３０μｌのヌクレアーゼ不含水であった。
【０１８５】
８．  Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、清浄な連結されたＤＮＡ試料中のＤＮＡの濃度を決定した。
９．  以下を含有する５０μｌ「捕捉前」ＰＣＲで、アリコットＤＮＡを増幅した：３００ｎｇの清浄な連結されたＤＮＡ、１ｘＡｃｃｕＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、０．１／μｌ  ＡＣＣＵＺＹＭＥ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１μＭ順方向ＰＣＲプライマー（ＦＢ−ＰＣＲ１−５’：ＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣ  ＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ  ＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ  Ｔ（配列番号５）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、および１μＭ逆方向ＰＣＲプライマー（ＦＢ−ＰＣＲ１−３’：ＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧ  ＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣ  ＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号８）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）。
【０１８６】
１０．  試料を以下のように熱周期処理し：９８℃３分間のホットスタート；６周期の９８℃３０秒間、６５℃３０秒間、および７２℃１分間；７２℃１０分間の最終伸長工程；そして４℃に冷却した。
【０１８７】
１１．  Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、清浄な増幅ＤＮＡ試料中のＤＮＡの濃度を決定した。
濃縮
１．  中空シリンダーを直径１０ｍｍおよび長さ３１ｍｍでＰＴＦＥから圧延した。直径６ｍｍおよび長さ１０．７ｍｍの内部ウェルを、幅約１ｍｍおよび長さ約１０ｍｍの細いスロットにテーパリングした。０．５μｍ孔ＰＥＥＫフェルール中フリット（ＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐ．）をＰＴＦＥカラムの他方の側からねじ込んで、スロットの底部を密封した。１００μｍ穿孔、５０ｃｍ長のＦＥＰキャピラリーチュービング（ＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐ．）は、このフェルールを１．５ｍｌ微量遠心管に連結して、流出物の収集を可能にした。
【０１８８】
２．  カラムアセンブリをアルミニウムから圧延したカスタム・リグにはめ、そしてＣＰ−２００ＨＴ−ＴＴペルチェ温度コントローラー（ＴＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）に取り付けて、正確な温度調節を可能にした。やはりアルミニウムから圧延した蓋をリグ上にねじ込んで、カラム内容物が、圧縮ガス供給源で加圧されることを可能にしてもよい。
【０１８９】
３．  ０．１ｘＳＳＰＥおよび０．００５％（ｖ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンを含有する２５０μｌの洗浄緩衝液をカラム中のウェル内にピペッティングした。
４．  蓋を閉め、そしてカラム上部のヘッドスペースを窒素ガスで加圧し、緩衝液を、ウェル、スロット、フリット、およびキャピラリーチュービングから微量遠心管内に押し込んだ。約５μｌ／分の流速を２．５分間維持して、流動経路を完全にプライミングした。
【０１９０】
５．  ０．５ｍｇに同等である、２５μｌのあらかじめ調製したマイクロビーズ懸濁物を１０μｌの洗浄緩衝液に再懸濁し、そしてカラムアセンブリのスロット内、ウェル中の洗浄緩衝液表面より下にピペッティングした。
【０１９１】
６．  ヘッドスペースに再加圧して、約５μｌ／分の速度で２．５分間、マイクロビーズ懸濁物を駆動した。スロット基部のフリットは、マイクロビーズを捕捉し、これらを直径１ｍｍおよび深さ約０．７ｍｍのベッドに充填させた。
【０１９２】
７．  カラムアセンブリのウェル中に残った洗浄緩衝液を廃棄し、そして１ｘＨｉ−ＲＰＭ緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）および５０ｎｇ／μｌサケ精子ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなる２５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液と交換した。
【０１９３】
８．  カラムアセンブリをペルチェ系で６５℃に加熱し、そして上部のヘッドスペースを加圧して、約５μｌ／分の速度で、マイクロビーズベッドを通じてハイブリダイゼーション緩衝液を駆動した。この流動を１０分間維持して、マイクロビーズおよびカラムアセンブリ内部の他の表面をプレハイブリダイズした（ブロッキングした）。
【０１９４】
９．  ３００ｎｇの清浄な増幅ＤＮＡ試料を、３．１２５％（ｖ／ｖ）グリセロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）ならびに１０μＭの５’アダプターブロッキングオリゴヌクレオチド（ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−５’：５’−ＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣ  ＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ  ＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ  Ｔ−３’（配列番号５）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）および３’アダプターブロッキングオリゴヌクレオチド（ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−３’：５’−ＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧ  ＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣ  ＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’（配列番号８）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を補った８μｌハイブリダイゼーション緩衝液に溶解した。
【０１９５】
１０．  リグ温度を２５℃に減少させた。
１１．  このＤＮＡ試料を９８℃で５分間変性させ、６５℃に５分間冷却し、そして次いで４℃で５分間保存した。６５℃工程によって、ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ試料中のアダプター配列にハイブリダイズすることが可能になり、濃縮を妨げうる「デイジー・チェーン」の形成が防止される。
【０１９６】
１２．  ７５ｎｇのＤＮＡを含有する２μｌの変性ＤＮＡ試料を、ピペットを用いて、カラムアセンブリのスロット内にピペッティングした。試料中のグリセロールは、ハイブリダイゼーション緩衝液を通じてこれを沈め、そしてマイクロビーズベッド上に収集した。
【０１９７】
１３．  リグの温度を６５℃に増加させ、そしてヘッドスペースを再加圧し、ＤＮＡ試料を約５μｌ／分の流速で１０分間、マイクロビーズの充填ベッドに通した。
１４．  リグの温度を２５℃に減少させた。
【０１９８】
１５．  カラムアセンブリのウェル中の緩衝剤を、２５０μｌの洗浄緩衝剤と置き換え、そしてヘッドスペースを再加圧して、マイクロビーズを通じて緩衝剤を約３０μｌ／分で５分間、駆動した。
【０１９９】
１６．  先の工程を新鮮な洗浄緩衝液でさらに４回反復した。
１７．  新鮮な洗浄緩衝液をカラム内にピペッティングし、そしてマイクロビーズベッドを通じて、約１０μｌ／分、駆動した。緩衝液が流動する際、カラムアセンブリの温度を９５℃に上昇させて、マイクロビーズ表面からハイブリダイズしたＤＮＡを放出させた。この間、カラムアセンブリの流出物を、清浄な１．５ｍｌ微量遠心管に収集した。
【０２００】
濃縮ＤＮＡの回収および配列決定
１．  濃縮ＤＮＡを、以下を含有する５０μｌ「捕捉後」ＰＣＲで増幅した：１４μｌ溶出ＤＮＡ、１×ＡｃｃｕＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、０．１／μｌ  ＡＣＣＵＺＹＭＥ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２００ｎＭ順方向ＰＣＲプライマー（ＦＢ−ＰＣＲ２−５’：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧ  ＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ  ＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴ  ＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣ  ＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴ  ＴＣＣＧＡＴＣ−３’（配列番号９）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、および２００ｎＭ逆方向ＰＣＲプライマー（ＦＢ−ＰＣＲ２−３’−指標３９：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧ  ＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧ  ＡＧＡＴＧＣＡＣＴＴ  ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧ  ＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧ  ＴＧＣＴＣ−３’（配列番号１０）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）。
【０２０１】
２．  試料を以下のように熱周期処理し：９８℃３分間のホットスタート；１６周期の９８℃３０秒間、６５℃３０秒間、および７２℃１分間；７２℃１０分間の最終伸長工程；そして４℃に冷却した。
【０２０２】
３．  製造者の指示にしたがって、１．８ｘ比のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズで、増幅ＤＮＡを清浄化し、そしてサイズ選択した。溶出体積は３０μｌのヌクレアーゼ不含水であった。
【０２０３】
４．  清浄な増幅ＤＮＡを他の試料とプールし、そして製造者の指示にしたがって、ＭｉＳｅｑ卓上配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｒｐ．）および６００周期のＭｉＳｅｑ試薬キットｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｒｐ．）を用いて配列決定した。
【０２０４】
５．  読み取りを１００塩基にトリミングして、そして：ＢＷＡバージョン０．６．２［２３］、ＦａｓｔＱＣバージョン０．１０．１（Ｂａｂｒａｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ゲノム分析ツールキットバージョン１．６−１３［２４］、Ｐｉｃａｒｄバージョン１．１０４、およびＳＡＭｔｏｏｌｓバージョン０．１．１８［２５］に基づくバイオインフォマティクスパイプラインを用いて、Ｊ０２４５９ラムダファージ参照ゲノムに整列させた。
【０２０５】
結果
ラムダゲノムの１つの領域に相補的な単一の１２０量体オリゴヌクレオチドを、ＮＨＳ／アミン化学反応を通じて、マイクロビーズアリコットにコンジュゲート化した。これらのマイクロビーズをＰＴＦＥカラム内にパッキングし、これをマイクロビーズより小さい孔サイズを持つ多孔性フリットに組み込んだ。マイクロビーズベッドを通じてハイブリダイゼーション緩衝液をポンピングして、続く非特異的相互作用をブロッキングした。
【０２０６】
ラムダファージゲノムＤＮＡを超音波によって断片化し、末端修復し、そしてＡテール付けした。相補オリゴヌクレオチドをアニーリングして、そして次いで修復した断片に連結することによって、Ｔ−オーバーハングを含むアダプター二重鎖を調製した。これらの連結断片を、次いで、ＰＣＲによって増幅して、そしてハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁した。次いで、この試料をマイクロビーズベッド上にピペッティングして、そして流動を再開し、ＤＮＡをマイクロビーズの間に通し、そしてターゲット断片のハイブリダイゼーションを促進した。ハイブリダイゼーション後、充填ベッドを通じて洗浄緩衝液をポンピングすることによって、非ターゲットＤＮＡを洗い流した。温度を上昇させることによって、マイクロビーズにハイブリダイズしたＤＮＡを放出させた。この溶出工程中のカラムからの流出物を収集し、ＰＣＲによって増幅し、そして次いで、ＮＧＳによって配列決定した。
【０２０７】
４８６，０００対末端読み取りをラムダ参照ゲノムに整列させて、そしてこれを用いて濃縮計量を計算した。図４に示すように、ラムダゲノム中のすべての塩基に対する読み取り数をプロットすると、１２０ｂｐターゲット領域に対応するスパイクが明らかになった（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｊ０２４５９、２１９３０−２２０４９）。この領域の読み取り平均数＋／−２５０ｂｐ隣接は、残りのゲノムに関しては３２９であったのに比較して、３２，２９４読み取りであった。その結果、ベイト領域の濃縮は、９８倍であり、１０分間のハイブリダイゼーション工程で達成された。
【０２０８】
実施例３：ヒトゲノムにおける多数遺伝子の濃縮
プローブ官能化マイクロビーズの調製
以下の修飾を伴い、実施例１に記載するものと同じ方式でマイクロビーズを調製した：８７６の１２０量体オリゴヌクレオチドプローブを、各０．５ｐｍｏｌ／ｍｇの密度でマイクロビーズにカップリングした。これらのプローブを、ＧＲＣｈ３７ヒト参照ゲノム（ゲノム参照コンソーシアム）の５つの遺伝子：ＡＴＭ（ｃｈｒ１１：１０８０９８３２７−１０８２３６２６０）、ＢＲＣＡ１（ｃｈｒ１７：４１１９７６７０−４１２７６１３８）、ＢＲＣＡ２（ｃｈｒ１３：３２８９０５７３−３２９７２９３２）、ＰＡＬＢ２（ｃｈｒ１６：２３６１４７５５−２３６５２５０３）、およびＴＰ５３（ｃｈｒ１７：７５７２９０２−７５７９９３７）中の１３５領域に対して設計した。プローブは、２５ｂｐフランクを含めてすべてのエクソンを被覆し、そして３ｘの深度までタイリングされた。総ターゲットテリトリーは３６．８ｋｂであり、そして総ベイトテリトリーは４５．５ｋｂであった。
【０２０９】
濃縮のためのＤＮＡの調製
以下の修飾を伴い、ＤＮＡを実施例２に記載するものと同じ方式で調製した：ゲノムＤＮＡはヒトであった（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）。
【０２１０】
濃縮
１．  オリゴ・クリーン＆濃縮カラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を、アルミニウムから圧延したカスタムリグにはめ、そしてＣＰ−２００ＨＴ−ＴＴペルチェ温度コントローラー（ＴＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）に取り付けて、正確な温度調節を可能にした。やはりアルミニウムから圧延した蓋をリグ上にねじ込んで、カラム内容物が、圧縮ガス供給源で加圧されることを可能にしてもよい。
【０２１１】
２．  １ｍｇに同等である、５０μｌのあらかじめ調製したマイクロビーズ懸濁物をＺｙｍｏカラム内にピペッティングした。
３．  蓋を閉め、そしてＺｙｍｏカラム上部のヘッドスペースを５０ミリバールに加圧し、懸濁物をカラムに押し込んだ。Ｚｙｍｏカラム中のフリットは、直径約２ｍｍおよび深さ約０．３５ｍｍのベッド内にマイクロビーズを収集させた。カラムの流出物は、下に配置した１．５ｍｌ微量遠心管に滴り落ちた。圧を２．５分間維持し、緩衝液の全体積をカラム外に押し出したが、マイクロビーズベッド「ダンプ」は残った。
【０２１２】
４．  ５．３８ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、７５０ｎｇ／μｌサケ精子ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５．４４ｘデンハルト溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１１％ＳＤＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５．４３ｘＳＳＰＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）、１０μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−５’、および１０μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−３’を含有する、ブロッキング緩衝液を調製した。１００μｌをマイクロビーズベッド上にピペッティングした。
【０２１３】
５．  Ｚｙｍｏカラムを、ペルチェ系で６５℃に加熱し、そしてその上のヘッドスペースに５０ミリバールで２．５分間加圧して、マイクロビーズベッドを通じて、マイクロリットル／分の速度で、ブロッキング緩衝液を駆動した。この工程は、マイクロビーズおよびＺｙｍｏカラム内部の他の表面をプレハイブリダイズした（ブロッキングした）。
【０２１４】
６．  リグの温度を２５℃に減少させた。
７．  ブロッキング緩衝液と同じ構成要素を含有するが、１０倍高い濃度の２つのブロッキングオリゴヌクレオチド（各１００μＭ）を含む、ハイブリダイゼーション緩衝液を調製した。７５０ｎｇのあらかじめ調製したアダプター修飾ＤＮＡ試料を、この緩衝液５０μｌに溶解した。
【０２１５】
８．  試料を９８℃で５分間変性させ、６５℃に５分間冷却し、そして次いで、４℃で５分間保存した。
９．  ７５ｎｇのＤＮＡを含有する５μｌの変性ＤＮＡ試料を、マイクロビーズベッド上にピペッティングした。
【０２１６】
１０．  リグの温度を６５℃に上昇させ、そしてヘッドスペースを５０ミリバールに２．５分間再加圧し、マイクロリットル／分の速度で、マイクロビーズの充填ベッドを通じて、ＤＮＡ試料を押し出した。
【０２１７】
１１．  リグ温度を５５℃に減少させた。
１２．  ０．１％ＳＤＳおよび０．１ｘＳＳＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）を含有する洗浄緩衝液を調製した。
【０２１８】
１３．  １μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−５’および１μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−３’を補充した２００μｌの洗浄緩衝液をマイクロビーズベッド上にピペッティングした。ヘッドスペースを５０ミリバールに２．５分間再加圧して、マイクロリットル／分の速度で、マイクロビーズを通じて緩衝液を駆動した。
【０２１９】
１４．  ブロッキングオリゴヌクレオチドを補充しない洗浄緩衝液の２００μｌアリコットで、先の工程をさらに７回反復した。
１５．  リグの温度を２５℃に減少させた。
【０２２０】
１６．  １００μｌの１００ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）をマイクロビーズベッド上にピペッティングし、そしてこれらを５分間インキュベーションすることによって、マイクロビーズから、ハイブリダイズしたＤＮＡを溶出させた。
【０２２１】
１７．  ヘッドスペースに５０ミリバールで５分間再加圧し、そして溶出物を清浄な１．５ｍｌ微量遠心管中に収集した。
１８．  １００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）を溶出したＤＮＡに添加して、ｐＨを中和した。
【０２２２】
１９．  製造者の指示にしたがって、ＤＮＡクリーン＆濃縮装置−５カラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、濃縮したＤＮＡを清浄化した。用いたＤＮＡ結合緩衝液：ＤＮＡ比は７であり、そして溶出体積は、３２μｌのヌクレアーゼ不含水であった。
【０２２３】
濃縮ＤＮＡの回収および配列決定
１．  濃縮ＤＮＡを、以下を含有する５０μｌ「捕捉後」ＰＣＲで増幅した：３０μｌ清浄濃縮ＤＮＡ、１×ＡｃｃｕＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、０．１／μｌ  ＡＣＣＵＺＹＭＥ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２００ｎＭ順方向ＰＣＲプライマー（ＦＢ−ＰＣＲ２−５’：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧ  ＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ  ＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴ  ＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣ  ＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴ  ＴＣＣＧＡＴＣ−３’（配列番号９）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、および２００ｎＭ逆方向ＰＣＲプライマー（ＦＢ−ＰＣＲ２−３’−指標６：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧ  ＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧ  ＡＧＡＴＧＣＣＡＡＴ  ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧ  ＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧ  ＴＧＣＴＣ−３’（配列番号１０）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）。
【０２２４】
２．  試料を以下のように熱周期処理し：９８℃３分間のホットスタート；１６周期の９８℃３０秒間、６５℃３０秒間、および７２℃１分間；７２℃１０分間の最終伸長工程；そして４℃に冷却した。
【０２２５】
３．  増幅したＤＮＡを、製造者の指示にしたがって、ＤＮＡクリーン＆濃縮装置−５カラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を用いて清浄化した。用いたＤＮＡ結合緩衝液：ＤＮＡ比は５であり、そして溶出体積は、３０μｌのヌクレアーゼ不含水であった。
【０２２６】
４．  清浄な増幅ＤＮＡを他の試料とプールし、そして製造者の指示にしたがって、ＭｉＳｅｑ卓上配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｒｐ．）および１５０周期のＭｉＳｅｑ試薬キットｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｒｐ．）を用いて配列決定した。
【０２２７】
５．  ＢＷＡバージョン０．６．２［２３］、ｄｓＳＮＰビルド１３５［２６］、ＦａｓｔＱＣバージョン０．１０．１（Ｂａｂｒａｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ゲノム分析ツールキットバージョン１．６−１３［２４］、Ｐｉｃａｒｄバージョン１．１０７、およびＳＡＭｔｏｏｌｓバージョン０．１．１８［２５］、ＶＣＦｔｏｏｌｓバージョン０．１［２７］、ＶＥＰスクリプト［２８］に基づくバイオインフォマティクスパイプラインを用いて、７５塩基読み取りをＧＲＣｈ３７ヒト参照ゲノムに整列させた。
【０２２８】
結果
ヒトゲノムＤＮＡを超音波によって断片化し、末端修復し、そしてＡテール付けした。これらの断片に、アダプター二重鎖を連結し、これを次いで、ＰＣＲによって増幅して、そしてハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁した。次いで、フリットを取り込む使い捨て商業的ＤＮＡクリーンアップカラムに充填されたマイクロビーズベッドを通じて、この試料をポンピングした。ヒトゲノム中の５つの遺伝子：ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、およびＴＰ５３に対する８７６オリゴヌクレオチドプローブに、マイクロビーズをコンジュゲート化した。ハイブリダイゼーション後、充填ベッドを通じて洗浄緩衝液をポンピングすることによって、非ターゲットＤＮＡを洗い流した。水酸化ナトリウムでｐＨを上昇させることによって、なおマイクロビーズにハイブリダイズしているターゲットＤＮＡを放出させた。次いで、放出させたＤＮＡをカラムから収集し、ＰＣＲによって増幅し、そして次いで、ＮＧＳによって配列決定した。
【０２２９】
３，０３０，０００対末端読み取りをヒトゲノムに整列させて、そしてこれを用いて濃縮計量を計算した。ターゲット領域の平均被覆は２３６のユニーク読み取りであり、少なくとも５０読み取りを有するターゲット塩基が１００％であった。「選択された塩基」の割合、すなわちベイトされた領域およびほぼベイトされた領域（＋／−２５０ｂｐ）内の塩基読み取りは７．１６％であった。その結果、ベイトされた領域の濃縮は４０００倍であり、２．５分のハイブリダイゼーション工程で達成された。
【０２３０】
実施例４：２つのハイブリダイゼーション工程を用いたヒトゲノムにおける多数遺伝子の濃縮
プローブ官能化マイクロビーズの調製
実施例３に記載するものと同じ方式でマイクロビーズを調製した。
【０２３１】
濃縮用のＤＮＡの調製
実施例３に記載するものと同じ方式でＤＮＡを調製した。
ハイブリダイゼーション１
マイクロビーズの調製および装填
１．  カスタム設計ハイブリダイゼーションカラム（多孔性親水性／ポリエチレンフリットを含み、そして２．０ｍｍのカラム厚で孔サイズ７〜１２μｍ）をカスタムリグにはめ、そしてペルチェ温度コントローラーに取り付けて、正確な温度調節を可能にした。蓋をリグ上にねじ込んで、カラム内容物が、圧縮ガス供給源で加圧されることを可能にしてもよい。
【０２３２】
２．  ５０μｌのあらかじめ調製したマイクロビーズ懸濁物（２０ｍｇ／ｍｌ）をフリットのすぐ上の各ハイブリダイゼーションカラムの中心にピペッティングした。
３．  蓋を閉め、そしてカラム上部のヘッドスペースを５０ミリバールに加圧し、懸濁物をカラムに押し込んだ。カラムの流出物は、下に配置した微量遠心管または９６ウェルプレートに滴り落ちた。圧を２．５分間維持し、緩衝液の全体積をカラム外に押し出したが、マイクロビーズベッド「ダンプ」は残った。
【０２３３】
プレハイブリダイゼーション相
１．  ５．３８ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、７５０ｎｇ／μｌサケ精子ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５．４４ｘデンハルト溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１１％ＳＤＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５．４３ｘＳＳＰＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）、１０μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−５’、および１０μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−３’を含有する、ブロッキング緩衝液を調製した。１００μｌをマイクロビーズベッド上にピペッティングした。
【０２３４】
２．  カラムを、ペルチェ系で６５℃に加熱し、そしてその上のヘッドスペースに５０ミリバールで２．５分間加圧して、マイクロビーズベッドを通じて、マイクロリットル／分の速度で、ブロッキング緩衝液を駆動した。この工程は、マイクロビーズおよびカラム内部の他の表面をプレハイブリダイズした（ブロッキングした）。
【０２３５】
３．  カラムの流出物は、下に配置した微量遠心管に滴り落ちた。圧を２．５分間維持し、緩衝液の全体積をカラム外に押し出したが、マイクロビーズベッド「ダンプ」は残った。
【０２３６】
４．  第一のハイブリダイゼーション工程のために、ＤＮＡ試料を装填する次の相のため、リグ温度を６５℃に維持した。
ＤＮＡの変性
１．  ブロッキング緩衝液と同じ構成要素を含有するが、１０倍高い濃度の２つのブロッキングオリゴヌクレオチド（各１００μＭ）を含む、ハイブリダイゼーション緩衝液を調製した。
【０２３７】
２．  ３００ｎｇのあらかじめ調製したアダプター修飾ＤＮＡ試料を乾燥させ、そしてハイブリダイゼーション緩衝液５μｌに添加し、次いで短時間ボルテックスし、そして遠心分離した。
【０２３８】
３．  このＤＮＡ試料を９８℃で５分間変性させ、６５℃に５分間冷却し、そして次いで、４℃で５分間保存した。
ハイブリダイゼーション相
１．  ３００ｎｇのＤＮＡを含有する５μｌの変性ＤＮＡ試料を、マイクロビーズベッド上にピペッティングした。
【０２３９】
２．  リグの温度をなお６５℃にしたまま、ヘッドスペースを５０ミリバールに２．５分間再加圧し、ＤＮＡ試料をマイクロビーズの充填ベッドに通した。
リンスおよび洗浄相
１．  リグの温度を５５℃に減少させた。
【０２４０】
２．  ０．１％ＳＤＳおよび０．１ｘＳＳＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）を含有する洗浄緩衝液を調製した。
３．  ２００μｌのリンス緩衝液（１μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−５’および１μＭ  ＦＢ−ＰｒｅＬｉｇ−ブロック−３’を補充した洗浄緩衝液）をマイクロビーズベッド上にピペッティングした。ヘッドスペースを１００ミリバールに３．５分間再加圧して、マイクロビーズを通じてリンス緩衝液を駆動した。
【０２４１】
４．  ブロッキングオリゴヌクレオチドを補充しない洗浄緩衝液の２００μｌアリコットで、先の工程をさらに５回反復した。
溶出相
５．  リグの温度を２５℃に減少させた。
【０２４２】
６．  １００μｌの１００ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）をマイクロビーズベッド上にピペッティングし、そしてこれらを５分間インキュベーションすることによって、ハイブリダイズしたＤＮＡをマイクロビーズから溶出させた。
【０２４３】
７．  ヘッドスペースに５０ミリバールで５分間再加圧した。溶出物を微量遠心管または９６ウェルプレートブロック中に収集した。
溶出したＤＮＡの中和およびクリーンアップ
８．  １００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ）を溶出したＤＮＡに添加し、ｐＨを中和した。
【０２４４】
１９．  製造者の指示にしたがって、ＤＮＡクリーン＆濃縮装置−５カラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、濃縮したＤＮＡを清浄化した。用いたＤＮＡ結合緩衝液：ＤＮＡ比は７であり、そして溶出体積は、３２μｌのヌクレアーゼ不含水であった。
【０２４５】
捕捉後ＰＣＲ
１．  各ＤＮＡ試料を、以下を含有する５０μｌ「捕捉後」ＰＣＲで増幅した：３０μｌ清浄濃縮ＤＮＡ、１×ＡｃｃｕＢｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、０．１／μｌ  ＡＣＣＵＺＹＭＥ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２００ｎＭ順方向ＰＣＲプライマー（ＦＢ−ＰＣＲ２−５’：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧ  ＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ  ＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴ  ＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣ  ＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴ  ＴＣＣＧＡＴＣ−３’（配列番号９）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、および２００ｎＭ逆方向ＰＣＲプライマー（ＦＢ−ＰＣＲ２−３’−指標１：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡ  ＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ  ＧＡＴＣＧＴＧＡＴＧ  ＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴ  ＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴ  ＧＣＴＣ−３’（配列番号１１））。
【０２４６】
２．  試料を以下のように熱周期処理し：９８℃３分間のホットスタート；２０周期の９８℃３０秒間、６５℃３０秒間、および７２℃１分間；７２℃１０分間の最終伸長工程；そして４℃に冷却した。
【０２４７】
３．  増幅したＤＮＡを、製造者の指示にしたがって、ＤＮＡクリーン＆濃縮装置−５カラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を用いて清浄化した。用いたＤＮＡ結合緩衝液：ＤＮＡ比は５であり、そして溶出体積は、３０μｌのヌクレアーゼ不含水であった。
【０２４８】
４．  Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、清浄な連結ＤＮＡ試料中のＤＮＡ濃度を決定した。
５．  高感度Ｄ１Ｋ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｔａｐｅを用いて、２７０〜３２０ｂｐの間であるはずのピーク断片サイズを決定した。
【０２４９】
ハイブリダイゼーション２
ハイブリダイゼーション１から回収した、増幅し清浄化し、そして濃縮した３００ｎｇのＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーション１の濃縮プロセスを反復した。回収した試料をさらなる周期の捕捉後ＰＣＲに供した。
【０２５０】
濃縮ＤＮＡの配列決定
ハイブリダイゼーション２から回収した、増幅し濃縮した清浄ＤＮＡをプールし、そして製造者の指示にしたがって、ＭｉＳｅｑ卓上配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｒｐ．）および１５０周期ＭｉＳｅｑ試薬キットｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｒｐ．）を用いて配列決定した。
【０２５１】
結果
ヒトゲノムＤＮＡを超音波によって断片化し、末端修復し、そしてＡテール付けした。これらの断片に、アダプター二重鎖を連結し、これを次いで、ＰＣＲによって増幅して、そしてハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁した。次いで、フリットの上部に圧縮されたマイクロビーズベッドを通じて、圧の下で、試料を押し込んだ。Ｐｏｒｅｘフリット（Ｆｒｉｔ  Ｍａｋｅ：Ｐｏｒｅｘ、孔サイズ７〜１２μｍ、厚み−２．０ｍｍ、材料−ＸＳ−８２５９１）を取り込む特注カラムを用いた。特注カラムを、先に用いた使い捨て商業的ＤＮＡクリーンアップカラムと交換した。ヒトゲノム中の５つの遺伝子：ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、およびＴＰ５３に対する８７６オリゴヌクレオチドプローブに、マイクロビーズをコンジュゲート化した。各ハイブリダイゼーションはわずか１５０秒であった。ハイブリダイゼーション後、圧力下で充填ビーズベッドを通じて洗浄緩衝液を押し込むことによって、非ターゲットＤＮＡを洗い流した。水酸化ナトリウムでｐＨを上昇させることによって、なおマイクロビーズにハイブリダイズしているターゲットＤＮＡを放出させた。次いで、放出させたＤＮＡをカラムから収集し、清浄化し、そしてＰＣＲによって増幅した。
【０２５２】
２周期のハイブリダイゼーションを用いた。第一周期のハイブリダイゼーションにおいて、ターゲットＤＮＡはマイクロビーズにハイブリダイズし、そして非ターゲットＤＮＡは洗い流された。ｐＨを上昇させることによってターゲットＤＮＡを放出させ、カラムから収集し、そしてＰＣＲによって増幅した。第二周期のハイブリダイゼーションにおいて、ターゲットＤＮＡはハイブリダイゼーション１からの増幅産物であり、そしてプロトコルは上記と同じ工程にしたがった。
【０２５３】
ＨａｐＭａｐ  ＤＮＡ試料で最初のデータセットを生成した（ｈｔｔｐ：／／ｈａｐｍａｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈａｐｍａｐｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌ）。すべての試料は、試験した５遺伝子パネルに関して、臨床測定基準を満たした（４８試料／ＭｉＳｅｑ実行、深度≧３０で、＞９９％塩基のターゲット被覆）。ハイブリダイゼーション工程を反復すると、ベイト領域の＞１４，０００倍の濃縮が生じ、すなわち実施例３で用いた単回のハイブリダイゼーション工程よりも３倍を超える改善があった。ターゲット領域の濃縮は特異的で、再現可能であり、そして均一であった（ＡＴＭ遺伝子に関する結果を示す図５を参照されたい）。平均ターゲット被覆は、＞６００であった。１００．０％のターゲット塩基が、＞３０ｘ深度で被覆された。データを表２に要約する。
【０２５４】
表２
【０２５５】
【表２】
2017529069.tif 000003
【０２５６】
実施例５：全血ＤＮＡからの遺伝／生殖系列変異体検出
プローブ官能化マイクロビーズの調製
実施例３に記載するものと同じ方式でマイクロビーズを調製した。
【０２５７】
濃縮用のＤＮＡの調製
以下の修飾を伴い、実施例３に記載するものと同じ方式でＤＮＡを調製した：ゲノムＤＮＡを全血から抽出した。
【０２５８】
ＤＮＡの濃縮
実施例４に記載するものと同じ方式でＤＮＡを濃縮した。
結果
ＨａｐＭａｐ  ＤＮＡ試料を用いた実施例４の実験を、臨床ＤＮＡ試料で反復した。ＭｉＳｅｑレーンあたり、４８試料を処理した。この実験由来のデータを表３に要約する。
【０２５９】
実施例４に記載するセットアップを用いて、＞５０％頻度の生殖系列／遺伝変異体を、標準的全血ＤＮＡ試料から単離したＤＮＡ中で検出可能であり、したがって、マイクロビーズに基づくハイブリダイゼーションおよび濃縮が、高品質ゲノムＤＮＡ試料において生殖系列／遺伝性変異体を信頼可能に検出するために十分な配列決定深度を生じることが立証された。
【０２６０】
表３
【０２６１】
【表３】
2017529069.tif 000004
【０２６２】
サンガー配列決定と組み合わせて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｉｇｈｔ癌パネルまたはＦｌｕｉｄｉｇｍ  ＰＣＲパネルを用いて、３遺伝子（ＴＰ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２）のサブセットを試験した、４５人の個体由来の臨床試料で、結果を独立に検証した。４５試料のうち４４が臨床的に必要な測定基準を満たした。１つの試料のみがこれらの測定基準を満たさず、これは、供給されたＤＮＡが低濃度であったためであった。平均ターゲット被覆は、＞３００で、約５０％低かった。倍濃縮は、＞１２，０００で同等であった。データを表４に要約する。
【０２６３】
表４
【０２６４】
【表４】
2017529069.tif 000005
【０２６５】
両データセットの比較は、実施例４の設定が、高品質の血液由来ＤＮＡ試料に適用された場合、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｉｇｈｔ癌パネルまたはＦｌｕｉｄｉｇｍ  ＰＣＲパネルのいずれかで同定され、そしてサンガー配列決定で検証されている変異体の１００％を検出可能であることを示した：総数４５の臨床試料に渡り、４１のユニークな変異体を含む総数４６１／４６１。例えば、ＴＰ５３遺伝子中の９ｂｐ欠失（ｃ．７６２＿７７０ｄｅｌＣＡＴＣＡＣＡＣＴ）などの欠失が、試験した臨床試料中で明らかに同定された。
【０２６６】
実施例６：全血調製物由来のＤＮＡ中の体細胞変異検出
プローブ官能化マイクロビーズの調製
真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）および骨髄線維症（ＭＦ）を含むある範囲の骨髄増殖性新生物に関して、駆動因子突然変異を含有することが知られる２１の重要な遺伝子に対して設計されたプローブを含むパネルを用いて、実施例３に記載するものと同じ方式で、マイクロビーズを調製した。遺伝子内容は、臨床的に関連する突然変異が知られる「ホットスポット」エクソン、ならびに腫瘍抑制因子、遺伝性および高関連研究関連遺伝子のすべてのエクソンをターゲティングする。含まれる遺伝子は、ＡＳＸＬ−１、ＣＢＬ、ＣＡＬＲ、ＣＫＩＴ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＭＰＬ、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＲＵＮＸ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＲＳＦ２、ＴＰ５３、ＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、Ｕ２ＡＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂであり、総ターゲットサイズは、３７．６ｋｂであった。
【０２６７】
濃縮用のＤＮＡの調製
実施例５に記載するものと同じ方式で、ＨａｐＭａｐ  ＤＮＡ試料からＤＮＡを調製した。
【０２６８】
ＤＮＡの濃縮
実施例４に記載するものと同じ方式でＤＮＡを濃縮した。
結果
実施例４に記載するセットアップおよびＤＮＡ試料の供給源としての標準的全血を用いて、上記の２１遺伝子パネルは、任意の遺伝子座の読み取りのわずかな割合でしか観察されない低頻度（＞１％）の体細胞変動を検出可能であった。結果は、このセットアップが、優れた品質のＤＮＡ試料において、低頻度を検出する高ストリンジェントな感度を提供することを立証する。
【０２６９】
濃縮によって、ベイト領域の〜１０，０００倍の濃縮、すなわち生殖系列ＤＮＡ試料を用いた実施例４の濃縮よりわずかに３０％少ない濃縮が生じた。平均ターゲット被覆は、〜１０００×であった（表５を参照されたい）。表６は、１２のＨａｐＭａｐ  ＤＮＡ試料で観察される関心対象の部位に渡る被覆を示す。該データによって、該パネルがＭＰＮ中の関心対象の以下の部位での体細胞突然変異を、信頼性をもって検出可能であることが確証される：ＪＡＫ２（エクソン１２−ＡＡｓ５３６−５４７）、ＪＡＫ２（Ｖ６１７Ｆ）、ＭＰＬ（Ｗ５１５）、ＫＩＴ（Ｄ８１６Ｖ）、およびＴＥＴ２（Ｒ５５０）。
【０２７０】
同じセットアップを用いて、臨床研究試料の分析はさらに、パネルが信頼性をもってＳＮＶだけでなく、最大５２ｂｐの欠失も検出可能であることを示し、こうした情報は特にＣＡＬＲ遺伝子で有益であった。
【０２７１】
表５
【０２７２】
【表５】
2017529069.tif 000006
【０２７３】
表６
【０２７４】
【表６】
2017529069.tif 000007
【０２７５】
実施例７：ＦＦＰＥ組織由来のＤＮＡにおける体細胞変異検出
プローブ官能化マイクロビーズの調製
実施例３に記載するものと同じ方式でマイクロビーズを調製した。
【０２７６】
濃縮用のＤＮＡの調製
以下の修飾を伴い、実施例３に記載するものと同じ方式でＤＮＡを調製した：ゲノムＤＮＡをホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）癌組織から抽出した。
【０２７７】
ＤＮＡの濃縮
実施例４に記載するものと同じ方式でＤＮＡを濃縮した。
結果
５遺伝子パネルおよび実施例４に記載するセットアップを用いて、ＦＦＰＥ組織試料から得たＤＮＡ由来の低頻度（＞１％）の体細胞変異体を検出することもまた可能であった。ＦＦＰＥ試料は、固形癌診断および科学的研究のための生物学的材料の一般的な供給源であるが、重度の分解、損傷およびＤＮＡの分子または生物学的修飾につながる調製および／または固定プロセスの結果として、抽出されるＤＮＡの品質が劣っているため、研究が困難である可能性もある。その結果、ＦＦＰＥ試料はしばしば、少量の使用可能ＤＮＡしか生じない。
【０２７８】
これらの困難にもかかわらず、実施例４に記載するセットアップは、ＦＦＰＥ乳癌組織由来のターゲットＤＮＡの〜６５００倍の濃縮を生じ（表７を参照されたい）、すなわち、高品質ＤＮＡ試料を用いた実施例４の濃縮より５０％低いだけであり、そして全血臨床ＤＮＡ試料を用いた実施例５の濃縮より３５％低いだけであった。ＭｉＳｅｑレーンあたり２４試料で、平均ターゲット被覆は〜３００−５００であった。被覆は、ＭｉＳｅｑレーンあたり１２試料のみで行う場合二倍になることも可能であり、体細胞変異体コーリングにより適切な６００〜１０００ターゲット被覆を生じた。
【０２７９】
表７
【０２８０】
【表７】
2017529069.tif 000008
【０２８１】
実施例８：マイクロビーズベッド形成に適したフリットの同定
実施例３において、カラム内にマイクロビーズを保持するフリットで反対端をブロッキングしてあるカラムに、マイクロビーズ懸濁物を適用することによって、マイクロビーズベッドを調製した。マイクロビーズベッドの形成を補助する圧力の下で、マイクロビーズを適用した。試料ならびにハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液もまた圧の下で適用して、マイクロビーズベッドの最適配置を維持し、そしてマイクロビーズベッドを通じた流速を調節して、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を最適にすることを可能にした。
【０２８２】
多くの商業的に入手可能なＤＮＡまたはＲＮＡ精製カラムは、重力流用に、または高速での遠心分離に耐えるように設計されるかいずれかである。これらのカラムの大部分は、実施例３に記載するセットアップで使用するには適しておらず、これは、これらが十分な時間、試料を保持しない（重力流の場合）か、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を調節することが困難になっているか、または流動させるために高圧が必要であり（例えばスピンカラム）、実施例３で用いる低圧条件下では不適切な低い流速を生じるためである。
【０２８３】
フリット要件
実施例３に記載する微量流体適用に適したフリット材料を同定するため、多様な供給業者からのいくつかの異なる材料を試験した。各材料は、試験に含まれるべき以下の要件を満たしていた：
・湿潤性を補助する親水性
・低ＤＮＡ結合能
・ＤＮＡ／ＲＮＡ精製で使用するのに適切
・ＤＮＡ／ＲＮＡ不含
・＞５μｍサイズ（実施例３で用いたビーズサイズ）のビーズを保持可能な適切な孔サイズ
・９５℃の最大温度に耐性
試験
空のカラムに挿入するための試験材料を調製するため、フリットを形成するためのパンチ（直径：２．５ｍｍ）でシリンダーを切り取った。新規に形成したフリットをピンセットで空のプラスチックカラムに挿入した。次いでカラムをリグ内に垂直に入れた。２つの試験を実行した。第一の試験において、５００μｌの水をカラム内にピペッティングした。水レベルをフェルトペンでマークした。３００秒後、カラムの写真を撮影して水レベルを記録した。３００秒の期間、圧を適用せずに流動が生じなかった場合には、試験した材料は、フリットとして使用するために適していると見なされた。
【０２８４】
第二の試験において、５０ミリバールに設定した真空ポンプをカラムの基部に連結した。５００μｌの水をカラム内にピペッティングし、そして水レベルをカラム中に再びマークした（必要な場合）。さらに５００μｌの水をカラム内にピペッティングし、そして真空ポンプのスイッチを入れ、そしてタイマーを開始した。水レベルが５００μｌマークに到達したらタイマーを止め、そして時間を記録した。試験材料は、５０ミリバール圧で５〜１００μｌ／分の流速を可能にする場合、フリットとして使用するために適していると見なされた。
【０２８５】
結果
ある範囲の１８のフリット材料を試験した。適切性要件を満たす２つのフリットタイプを同定し、そしてこれらは本発明を実施するために特に適していることが見出された。フリット特性を表８に要約する。
【０２８６】
表８
【０２８７】
【表８】
2017529069.tif 000009
【０２８８】
フリットタイプ１は、漏洩を防止するため、小さい孔サイズ（７〜１２μｍ）を持つ親水性ポリエチレンシート製であった。この材料は、９５％エタノールおよび０．１Ｎ  ＮａＯＨに化学的に適合し、そして１２１℃の最大温度に耐えることが可能であり、このためオートクレーブに適している。この材料から調製したフリットは、カラムに組み立てるのが比較的容易であった。フリットタイプ１を使用すると、５０ミリバール圧で優れた流速（３０〜４０μｌ／分）および優れたマイクロビーズベッド特性を生じた。わずかにより大きい孔サイズにもかかわらず、該タイプは、ビーズの優れた保持能を有した。フリットタイプ１を実施例４に記載するセットアップに用いた。
【０２８９】
フリットタイプ２は、ホウケイ酸ガラス製であった。この材料は最高５１５℃の温度に耐えることも可能であり、そして水、酸およびアルカリ、塩、有機物質、塩素および臭素に化学的に適合した。このフリットタイプは、流速、マイクロビーズベッド特性およびビーズ保持能に関しては、フリットタイプ１と類似の特性を示した。この材料から調製したフリットは固形であり、カラム内に組み立てた際、形状を維持し、そしてカラム中に挿入した後、平坦な上部表面を有した。
【０２９０】
本発明が例によってのみ記載されており、そして本発明の範囲および精神内にありながら、修飾を行うことも可能であることが理解されるであろう。
参考文献
【０２９１】
【化１】
2017529069.tif 000010
【図１】
2017529069.tif 000011
【図２】
2017529069.tif 000012
【図３】
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【図４】
2017529069.tif 000014
【図５】
2017529069.tif 000015
【図６Ａ】
2017529069.tif 000016
【図６Ｂ】
2017529069.tif 000017
【図７】
2017529069.tif 000018
【配列表】
2017529069000001.app
【国際調査報告】
2017529069.tif 000019
2017529069.tif 000020
2017529069.tif 000021
2017529069.tif 000022
2017529069.tif 000023