(57)【要約】  細胞表面抗原の分布を改変するための方法を提供する。当該方法において使用するための多価メディトープを包含する組成物、ならびに治療および診断のための方法および使用を包含する、それらを製造、使用、試験、およびスクリーニングする方法も提供する。
2017536091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面抗原の分布を改変するための方法であって、
細胞を、細胞表面抗原に結合し得る複数のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントに接触させるステップと；
複数のメディトープ利用可能抗体の第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第１のメディトープと接触させるステップと；
複数のメディトープ利用可能抗体の第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第２のメディトープと接触させて、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２のメディトープ利用可能抗体と多価メディトープとの架橋が、細胞表面抗原の分布を改変するステップと
を含む方法。
【請求項２】
細胞表面抗原の同時局在化を増加させるための方法であって、
細胞を、細胞表面抗原に結合し得る複数のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントに接触させるステップと；
複数のメディトープ利用可能抗体の第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第１のメディトープと接触させるステップと；
複数のメディトープ利用可能抗体の第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第２のメディトープと接触させて、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２のメディトープ利用可能抗体と多価メディトープとの架橋が、細胞表面抗原または受容体の同時局在化を増加させるステップと
を含む方法。
【請求項３】
メディトープ利用可能抗体の細胞内部移行を増加させるための方法であって、
細胞表面抗原を発現する細胞を、複数のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させ、それによって、前記複数のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントが、細胞表面抗原に結合するステップと；
複数のメディトープ利用可能抗体の第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第１のメディトープと接触させるステップと；
複数のメディトープ利用可能抗体の第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第２のメディトープと接触させて、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２のメディトープ利用可能抗体と多価メディトープとの架橋が、細胞表面抗原に結合する第１および第２のメディトープ利用可能抗体の細胞内部移行を増加させるステップと
を含む方法。
【請求項４】
細胞表面抗原の細胞内部移行を増加させるための方法であって、
第１の細胞表面抗原を、細胞表面抗原に結合する第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップと；
第２の細胞表面抗原を、第２の細胞表面抗原に結合する第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップと；
複数のメディトープ利用可能抗体の第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第１のメディトープと接触させるステップと；
複数のメディトープ利用可能抗体の第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第２のメディトープと接触させ、それによって、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、第１および第２の細胞表面抗原の細胞内部移行を増加させるステップと
を含む方法。
【請求項５】
抗体治療の有効性を増加させる方法であって、
対象に、有効量の、細胞表面抗原に特異的に結合するメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメント、および有効量の多価メディトープを投与するステップと；
第１の細胞表面抗原に結合した第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントに結合した多価メディトープの第１のメディトープ；および第２の細胞表面抗原に結合した第２のメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントに結合した多価メディトープの第２のメディトープの複合体を形成して、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２の抗体の架橋が、抗体治療の有効性を増加させるステップと
を含む方法。
【請求項６】
対象において所望の治療効果を達成するために必要とされる抗体治療の投薬量を減少させる方法であって、
対象に、有効量のメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメント、および有効量の多価メディトープを投与するステップと；
多価メディトープの第１のメディトープを、第１のメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントに接触させるステップと；
多価メディトープの第２のメディトープを、第２のメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントに接触させて、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２の抗体の架橋が、対象において所望の治療効果を達成するために必要とされる抗体治療の投薬量を減少させるステップと
を含む方法。
【請求項７】
第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを架橋させる方法であって、
細胞を、第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップであって、前記第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントが第１のメディトープ結合性部位を含むステップと；
前記第１のメディトープ結合性部位を、多価メディトープと接触させるステップであって、前記多価メディトープが、第２のメディトープに結合する第１のメディトープを含むステップと；
前記多価メディトープを、第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップであって、前記第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントが、第２のメディトープ結合性部位を含むステップと；
前記第１のメディトープ結合性部位を前記第１のメディトープに結合させ、前記第２のメディトープ結合性部位を前記第２のメディトープに結合させ、前記第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを前記細胞に結合させ、かつ前記第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを前記細胞に結合させ、それによって、前記第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび前記第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを架橋させるステップと
を含む方法。
【請求項８】
細胞表面抗原が、受容体媒介性細胞内取り込み作用が可能な受容体である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
多価メディトープが、メディトープに連結した免疫グロブリンＦｃ領域またはその部分を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
多価メディトープのメディトープが、リンカーにカップリングされている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
リンカーが、配列番号１９９、２００、２０１、２０２、２０３、もしくは２０４の配列、またはその変異体を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
多価メディトープが、治療剤または診断剤にカップリングされている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
治療剤が、化学療法剤、治療用抗体、毒素、放射性同位体、酵素、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、色素、金属、金属合金、およびナノ粒子からなる群から選択されるか；または
診断剤が、蛍光物質、発光物質、色素、および放射性同位体からなる群から選択されるイメージング剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１のメディトープ利用可能抗体が、第２のメディトープ利用可能抗体とは異なるエピトープに結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
メディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントが、細胞またはその組織の疾患または状態によって発現される抗原に特異的に結合する、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
疾患または状態が癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
メディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびメディトープを逐次的に投与する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
メディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントの少なくとも１つが、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、ペンテト酸アルツモマブ、アナツモマブ、アナツモマブマフェナトクス、アルシツモマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベクツモマブ、エクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、カプロマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エルツマキソマブ、ファノレソマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、サツモマブ、スレソマブ、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、−ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ブロダルマブ、アンルキンズマブ、バピヌズマブ、ダロツズマブ、デムシズマブ、ガニツマブ、イノツズマブ、マブリリムマブ、モキセツモマブパスドトックス、リロツムマブ、シファリムマブ、タネズマブ、トラロキヌマブ、トレメリムマブ、およびウレルマブからなる群から選択される抗体またはその抗原結合性フラグメントと抗原結合について競合するか、またはそれと同じエピトープに結合するか；または
メディトープ利用可能抗体またはフラグメントが、ＣＡ−１２５、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ５２、ＴＡＧ−７２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−２、インターロイキン−２受容体ａ−鎖（ＣＤ２５）、ＣＤ２２、Ｂ細胞活性化因子、インターロイキン−５受容体（ＣＤ１２５）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＤ３０、ＩＬ−１ベータ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１、ヒトインターロイキン−２受容体、Ｔａｃ、ＲＡＮＫリガンド、Ｃ５または他の補体タンパク質、ＣＤ１１ａ、アルファ−ｖベータ−３インテグリン、ＨＥＲ２、ｎｅｕ、ＣＤ１５、ＣＤ２０、インターフェロンガンマ、ＣＤ３３、ＣＡ−ＩＸ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−５、ＣＤ３イプシロン、ＣＡＭ、アルファ−４−インテグリン、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＲＳＶ抗原、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）のＦ（または融合）タンパク質、ＮＣＡ−９０（顆粒球細胞抗原）、ＩＬ−６、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７、ＣＴＡＡ１６．８８、ベータ−アミロイド、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体のアルファサブユニット、肝細胞成長因子、ＩＦＮ−アルファ、神経成長因子、ＩＬ−１３、ＣＤ３２６、ＣＤ１９、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４７、およびＣＤ１３７からなる群から選択される抗原に特異的に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
多価メディトープが、下式を有するペプチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２（式ＶＩ）
［式中、
Ｘ１は、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、β−アジドアラニン、またはヌルであり；
Ｘ２は、Ｇｌｎまたはヌルであり；
Ｘ３は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、β，β’−ジフェニル−Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ブロモ−Ｌフェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、修飾Ｐｈｅ、水和性カルボニル含有残基、またはボロン酸含有残基であり；
Ｘ４は、ＡｓｐまたはＡｓｎであり；
Ｘ５は、Ｌｅｕ；β，β’−ジフェニル−Ａｌａ；Ｐｈｅ；フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体；水和性カルボニル含有残基；またはボロン酸含有残基であり；
Ｘ６は、ＳｅｒまたはＣｙｓであり；
Ｘ７は、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＣｙｓであり；
Ｘ８は、Ａｒｇ、修飾Ａｒｇ、または水和性カルボニル含有残基もしくはボロン酸含有残基であり；
Ｘ９は、ＡｒｇまたはＡｌａであり；
Ｘ１０は、Ｌｅｕ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ；β，β’−ジフェニル−Ａｌａ；Ｐｈｅ；フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体；水和性カルボニル含有残基；またはボロン酸含有残基であり；
Ｘ１１は、Ｌｙｓであり；
Ｘ１２は、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、７−アミノヘプタン酸、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、プロパルギルグリシン、イソアスパラギン酸、またはヌルである］。
【請求項２０】
多価メディトープが、配列番号１、２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、１８６、１８７、１８８、１８９、もしくは２０７のアミノ酸配列、またはそれに由来する環式ペプチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
第１のリンカーにカップリングされている第１のメディトープおよび第２のメディトープを含み、第１のリンカーが、ＰＡＳ化配列、ソルターゼ配列、Ｓｓｐ  Ｉcインテイン配列、Ｓｓｐ  ＩNインテイン配列、および／またはアルデヒドタグを含む、多価メディトープ。
【請求項２２】
第２のリンカーをさらに含む、請求項２１に記載の多価メディトープ。
【請求項２３】
第１のリンカーが、Ｓｓｐ  Ｉcインテイン配列およびＳｓｐ  ＩNインテイン配列を含む、請求項２１に記載の多価メディトープ。
【請求項２４】
第１のリンカーがＳｓｐ  Ｉcインテイン配列を含み、第２のリンカーがＳｓｐ  ＩNインテイン配列を含む、請求項２２に記載の多価メディトープ。
【請求項２５】
ソルターゼ配列が配列ＬＰＸＴＧ（配列番号２４９）を含み、Ｘが任意のアミノ酸である、請求項２１に記載の多価メディトープ。
【請求項２６】
第１のリンカーおよび／または第２のリンカーが、グリシン残基をさらに含む、請求項２１、２２、または２５に記載の多価メディトープ。
【請求項２７】
アルデヒドタグが、配列番号２４７の配列を含む、請求項２１から２６のいずれかに記載の多価メディトープ。
【請求項２８】
第１および／または第２のリンカーが、リシン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、および／または非天然アミノ酸残基をさらに含む、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の多価メディトープ。
【請求項２９】
第１および／または第２のリンカーが、治療剤または診断剤にコンジュゲートされている、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の多価メディトープ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年１０月２日出願の米国特許仮出願第６２／０５９，１４６号に基づく利益を主張するものである。
【０００２】
配列一覧の参照による組込み
本出願は、電子フォーマットでの配列一覧と共に出願されている。その配列一覧は、２０１５年１０月２日に作成された４５１キロバイトのサイズの７０６１２２０００５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴという名称のファイルとして提供されている。配列一覧の電子フォーマット内の情報は、その全体が参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、いくつかの治療用、診断用、および研究用途で使用されている。治療用および診断用分野には、癌、抗ウイルス治療、自己免疫疾患および炎症性疾患、アレルギー、心臓血管疾患、骨粗鬆症、およびリウマチ学が包含される。
【０００４】
タンパク質工学などの努力によって、有効性および標的化が改善されていて（例えば、二重特異性ｍＡｂ）、限局性、組織浸透、および血液クリアランスが改善されていて（例えば、単鎖Ｆａｂ可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、および他のフラグメント）、かつ（例えば、変異またはグリコシル化によって）修飾されたＦｃ領域を含有するものなど免疫賦活性、安全性、毒性、および／または薬物速度／薬物動態特性が改変されているｍＡｂが作成されている。送達の改善のために小分子の部位特異的コンジュゲーションが可能となるように（例えば、ＴｈｉｏＭＡＢ）、またはその同源エピトープに不可逆的に結合するように（例えば、無限親和性ｍＡｂ）、ｍＡｂは再設計されている。また、生理活性ペプチドおよび他の生物製剤（例えば、ＣｏｖＸ−ｂｏｄｙ）の循環および提示が改善されるように、ｍＡｂは開発されている。様々な薬剤とのコンジュゲーションによって、標的化免疫療法および診断方法が可能になっている。事前標的化療法のために、かつ腫瘍イメージングにおける検出限界を改善するために、ヘテロ多量体ｓｃＦｖおよびアビジンと融合したｓｃＦｖまたはｍＡｂが開発されている。
【０００５】
ｍＡｂは有効であり、小分子による手法を上回る利点を有し得るが、既存の抗体および方法には、様々な限界がある。これらの限界には、オフターゲット相互作用から生じる有害な副作用および／またはとりわけ抗体−薬物コンジュゲートの長時間循環などによる付随的損傷が包含され得る。加えて、一部の抗体は、細胞表面抗原上のエピトープに効果的に結合し得る一方で、それらは、所望か、または意図されている結果を生じさせるために、細胞による内部移行を必要とし得る。コグネイト抗原への単なる結合は、治療応答を誘発するためには不十分なことがある。細胞表面抗原の内部移行比率が上昇することで、抗体または抗体治療の有効性が改善され得るであろう。
【発明の概要】
【０００６】
これらの欠点を考慮して、有効性、相乗作用、特異性、および安全性の改善をもたらすものを包含する改善された抗体および関連化合物、ならびにその方法および使用が必要とされている。そのような必要に対処する、ペプチドおよび他の分子を包含する抗体、化合物、および組成物、ならびに関連方法を本明細書において提供する。
【０００７】
本開示は、抗体の細胞内部移行を増加または促進する方法であって、細胞に、細胞または細胞表面抗原上に存在するエピトープに特異的に結合するメディトープ利用可能抗体および多価メディトープを投与するステップと、それによって、標的細胞の表面上の細胞表面抗原の内部移行を促進するステップとを含む方法を含む。
【０００８】
細胞上の細胞表面抗原のクラスター化を増加または促進する方法であって、細胞に、細胞表面抗原に特異的に結合するメディトープ利用可能抗体および多価メディトープを投与するステップと、それによって、標的細胞の表面上の細胞表面抗原のクラスター化を促進するステップとを含む方法も提供する。一態様では、メディトープ利用可能抗体および多価メディトープの投与後のクラスター化度は、抗体のみと共にインキュベートした後に観察されるクラスター化度と比較して増加するか、または抗体および一価メディトープとのインキュベーションと比較して増加する。
【０００９】
別の実施形態は、細胞上の細胞表面抗原の内部移行を増加または促進する方法であって、細胞に、細胞表面抗原に特異的に結合するメディトープ利用可能抗体および多価メディトープを投与するステップと、それによって、標的細胞の表面上の細胞表面抗原の内部移行を促進するステップとを含む方法を提供する。一態様では、メディトープ利用可能抗体および多価メディトープの投与後の内部移行度は、抗体のみとのインキュベート後の抗原の内部移行度と比較して増加するか、または抗体および一価メディトープとのインキュベーションと比較して増加する。
【００１０】
別の実施形態は、細胞への多価メディトープの送達であって、細胞に、細胞表面抗原に特異的に結合するメディトープ利用可能抗体および多価メディトープを投与することと、それによって、標的細胞の表面上の細胞表面抗原のクラスター化および／または抗原の内部移行を促進することを含む送達を提供する。別の態様では、目的の抗原は、内部移行性または非内部移行性抗原である。別の態様では、メディトープの非存在下での単一特異性二価抗体の結合は、抗原の内部移行をもたらさず、その内部移行度は、代謝回転から、もしくは抗原に特異的な抗体の非存在下で生じるもの以下であるか、または代謝回転もしくは抗原特異的抗体の非存在下で生じるものの２倍超を越えない。
【００１１】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、二価または二重特異性である。別の実施形態はさらに、細胞に、メディトープ利用可能抗体が結合するエピトープとは別個の抗原上のエピトープに結合するか、それと結合について競合しないか、または細胞表面上の異なる抗原の異なるエピトープに特異的に結合する別のメディトープ利用可能抗体を投与することを含む。
【００１２】
一例では、治療方法は、対象に、１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体またはフラグメント、例えば、本明細書において記載されているもののうちの任意のものを投与することを包含する。一例では、この方法は、対象に、１つまたは複数の、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントと、メディトープ、例えば、多価メディトープおよび治療剤または診断剤にカップリングしているメディトープを包含する本明細書において記載されているもののうちの任意のものとを投与することを包含する。一態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントと、１つまたは複数のメディトープとを逐次的に投与する。別の態様では、それらを同時に投与する。
【００１３】
一般に、１つまたは複数のメディトープは、メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合性部位またはその抗原結合性フラグメントに結合するペプチドを含む。一態様では、メディトープ利用可能抗体を、１つまたは複数のメディトープの投与と同時に、その前に、またはその後に投与する。一部の態様では、１つまたは複数のメディトープを、薬物、小分子、化学療法剤、治療用抗体、毒素、放射性同位体、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、色素、蛍光または発光物質、金属、金属合金、増感剤、および有機または無機ナノ粒子からなる群から選択される治療剤などの治療剤にカップリングさせる。
【００１４】
また、提供するメディトープのうちには、２つ以上のメディトープおよび１つまたは複数のリンカーを含むものなどの多価メディトープがあり、例えば、ここで、２つ以上のメディトープの各々は、メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合部位に結合するペプチドである。そのような多価メディトープは、本明細書において記載されているメディトープのうちの任意のものを含んでよい。一態様では、２つ以上のメディトープは、少なくとも３つのメディトープまたは少なくとも４つのメディトープを含む。一態様では、１つまたは複数のリンカーには、ペプチド、小さな化学的スキャフォールド、ビオチン−ストレプトアビジン、有機もしくは無機ナノ粒子、ポリヌクレオチド配列、ペプチド核酸、有機ポリマー、または免疫グロブリンＦｃドメインが包含される。
【００１５】
例示的な多価メディトープは、二価、三価、および四価メディトープ、さらには、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、数１００、１０００、数１０００以上のメディトープを含有する多価メディトープである。一部の態様では、そのような多価メディトープは、メディトープをナノ粒子、ウイルス、および／または例えば、他の半固体支持体などの他の支持体、例えば、ナノチューブ、バッキーボール、ＬＧＡ粒子、および／または手術中イメージングにおいて使用するための量子ドットにカップリングさせることによって達成される。
【００１６】
多価メディトープのうちには、リンカーを介して免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域またはその部分（例えば、下式のＲ4A）に連結しているメディトープを包含する１つまたは複数の鎖を包含する化合物がある。Ｉｇ定常領域またはその部分は、一部の実施形態では、Ｆｃ領域またはその部分、例えば、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメインである。一部の態様では、Ｉｇ定常領域部分はさらに、ＣＨ４ドメインを包含する。Ｉｇは、一部の態様では、ＩｇＧである。一部の態様では、定常領域部分は、ＣＨ２を含有せず、ＣＨ１を含有せず、ＣＨ４を含有せず、かつ／または可変領域または抗原結合性部分を含有しない。そのような化合物およびメディトープは多くの場合に、複数のＩｇ定常領域部分、例えば、Ｆｃ部分の間の相互作用によって、二価または多価、例えば、四価である。一例では、多価メディトープは、下式を有する、１つまたは複数のポリペプチド鎖などの１つまたは複数の鎖を有する：
Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A（式Ｉ）
［式中、Ｒ3Aは、ペプチドメディトープまたは結合性部分などのメディトープまたは中央空洞結合性部分であり、Ｌ3Aは、Ｒ3AおよびＲ4Aを連結するペプチジルリンカーなどのリンカーであり、Ｒ4Aは、Ｉｇ  Ｆｃ領域またはその機能性フラグメントを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖定常領域部分である］。
【００１７】
一部の実施形態では、鎖は下式を有する：
Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A−Ｚ1（式ＩＩ）
［式中、Ｒ3Aは、ペプチドメディトープまたは結合性部分などの第１のメディトープまたは中央空洞結合性部分であり；Ｌ3Aは、ペプチジルリンカーなどの第１のリンカーであり；Ｒ4Aは、Ｉｇ  Ｆｃ領域またはその機能性フラグメントを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖定常領域部分であり；Ｚ1は、水素、０〜５０アミノ酸を含むアミノ酸配列、−Ｌ3B−Ｒ3B、または−Ｌ3B−Ｒ3B−Ｒ5Bであり、Ｌ3Bは、第２のリンカーであり；Ｒ3Bは、第２のメディトープであり；Ｒ5Bは、０〜５０アミノ酸を含むアミノ酸配列である］。
【００１８】
一部の場合には、メディトープは、第１のメディトープであり、リンカーは、第１のリンカーであり、鎖は、下式を含む：
Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A−Ｌ3B−Ｒ3B（式ＩＩＩ）
［式中、Ｌ3Bは、Ｒ4AおよびＲ3Bを連結する第２のリンカーであり；Ｒ3Bは、第２のメディトープまたは中央空洞結合性部分である］。
【００１９】
一部の状況では、化合物、鎖、メディトープまたは中央空洞結合性部分、例えば、ペプチドメディトープは、テールまたはリーダー配列、例えば、１個または複数のグリシンまたはセリン、またはアスパルタート残基を有する配列を包含する。したがって、一部の実施形態では、鎖は、下式を含む：
Ｒ5A−Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A−Ｒ5B（式ＩＶ）、または
Ｒ5A−Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A−Ｌ3B−Ｒ3B−Ｒ5B（式Ｖ）
［式中、Ｒ5AおよびＲ5Aのそれぞれは、ヌルである（存在しない）か、または０〜５０アミノ酸長さ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０を含む配列である］。
【００２０】
一部の実施形態では、化合物は、鎖、例えば、ペプチドメディトープ（Ｒ3AまたはＲ3Bなど）などのメディトープまたは中央空洞結合性部分、およびＩｇ  Ｆｃ領域またはその機能性フラグメントを含む重鎖定常領域部分を有する第１の鎖を含む。鎖のこれらの２つの成分は典型的には、Ｌ3AまたはＬ3Bのリンカーなどのリンカー、典型的にはペプチジルリンカーを介して連結される。一部の態様では、鎖はさらに、１〜５０アミノ酸のアミノ酸配列であり得るテールおよび／またはリーダー配列を包含する。
【００２１】
一部の実施形態では、鎖の様々な成分は、例えば、アミド結合（複数可）によって共有結合される。一部の実施形態では、鎖およびメディトープおよび化合物のリンカー、例えば、Ｌ3A、Ｌ3B、または両方は、２５〜４０アミノ酸長さであるか、または２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸長さ（もしくはその概数）、例えば、３０、３６、３７、または３９アミノ酸長さ（もしくはその概数）である。一部の態様では、リンカー、例えば、Ｌ3A、Ｌ3B、または両方は、約２Å〜約３００Å、例えば、約２Å〜約２００Åの長さであるか；約５０Å〜約１５０Åまたは約５０Å〜約２００Åの長さであるか；または約１００Å〜約１４０Åの長さ、例えば、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００、２５０、または３００Åの長さ（もしくはその概数）である。
【００２２】
一部の実施形態では、リンカーは、配列番号１９９、２００、２０１、２０２、２０３、もしくは２０４の配列、またはその修飾変異体、例えば、残基のいずれか１、２、３、または４個がコンジュゲートされたアミノ酸で置換されていてもよく、かつ／または１個または複数のリシンがアルギニンなどの異なるアミノ酸に変異されているものを包含するか、または有する。一部の場合には、コンジュゲートされたアミノ酸は、リシンについて置換されている（すなわち、リシンの代わりに挿入）。
【００２３】
メディトープ（多価および／または標識されたメディトープを包含する）、メディトープ利用可能抗体、および複合体、ならびに／または例えば、上記の本明細書に記載の他の化合物を含む組成物、例えば、医薬組成物も提供する。一例では、組成物は、複合体、メディトープ、および／またはメディトープ利用可能抗体、ならびに薬学的に許容される担体を包含する。
【００２４】
また、対象に、本明細書において記載されている、例えば、上記のような医薬組成物あるいはメディトープ利用可能抗体、メディトープ、複合体、および／または他の化合物のうちの任意のものを投与することによって実施される方法などの治療方法を提供する。一例では、この方法は、対象に、上記のとおりの抗体またはフラグメントを投与することを包含する。
【００２５】
多価および／または標識されたメディトープを包含するメディトープ、メディトープ利用可能抗体−メディトープ複合体などを送達する方法も提供する。一態様では、そのような方法は、複合体または医薬組成物を投与することを含み得るか、またはメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与することをさらに包含し、投与は、メディトープ利用可能抗体が特異的に結合する細胞表面抗原の凝集および／または内部移行の増加を誘導する。抗原は、腫瘍関連または腫瘍特異的抗原であり得る。抗原は、内部移行性または非内部移行性抗原であり得る。そのような方法は、治療剤または診断剤を、目的の抗原を発現する細胞に送達することを伴い得る。様々な態様で、治療剤または診断剤は、１つまたは複数のメディトープに、メディトープ利用可能抗体に、様々なメディトープのリンカーに、またはそのような薬剤のコンジュゲーションを収容するために適した多価メディトープの他の構造的特徴にカップリングされていてよい。ある種の態様では、投与から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１５時間以内、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、２１、もしくは２８日以内に、多価メディトープは、目的の抗原を発現する細胞のリソソームコンパートメントに送達される。
【００２６】
一部の実施形態では、細胞表面抗原の分布を改変する方法は、細胞を、細胞表面抗原に結合することができる複数のメディトープ利用可能抗体、またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップと、複数のメディトープ利用可能抗体の第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第１のメディトープと接触させるステップと、複数のメディトープ利用可能抗体の第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第２のメディトープと接触させて、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２のメディトープ利用可能抗体と多価メディトープとの架橋が、細胞表面抗原の分布を改変するステップとを包含する。
【００２７】
一部の実施形態では、細胞表面抗原の同時局在化を増加させるための方法は、細胞を、細胞表面抗原に結合することができる複数のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップと、複数のメディトープ利用可能抗体の第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第１のメディトープと接触させるステップと、複数のメディトープ利用可能抗体の第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第２のメディトープと接触させて、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２のメディトープ利用可能抗体と多価メディトープとの架橋が、細胞表面抗原または受容体の同時局在化を増加させるステップとを包含する。
【００２８】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体の細胞内部移行を増加させるための方法は、細胞表面抗原を発現する細胞を、複数のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させ、それによって、前記複数のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを細胞表面抗原に結合させるステップと、複数のメディトープ利用可能抗体の第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第１のメディトープと接触させるステップと、複数のメディトープ利用可能抗体の第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を、多価メディトープからの第２のメディトープと接触させて、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２のメディトープ利用可能抗体と多価メディトープとの架橋が、細胞表面抗原に結合した第１および第２のメディトープ利用可能抗体の細胞内部移行を増加させるステップとを包含する。
【００２９】
一部の実施形態では、細胞表面抗原の細胞内部移行を増加させるための方法は、第１の細胞表面抗原を、細胞表面抗原に結合する第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップと、第２の細胞表面抗原を、第２の細胞表面抗原に結合する第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップと、複数のメディトープ利用可能抗体の第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を多価メディトープからの第１のメディトープと接触させるステップと、複数のメディトープ利用可能抗体の第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位を多価メディトープからの第２のメディトープと接触させ、それによって、第１および第２のメディトープ利用可能抗体を架橋させ、第１および第２の細胞表面抗原の細胞内部移行を増加させるステップとを包含する。
【００３０】
一部の実施形態では、抗体治療の有効性を増加させる方法は、対象に、有効量の、細胞表面抗原に特異的に結合するメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメント、および有効量の多価メディトープを投与するステップと、第１の細胞表面抗原に結合した第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントに結合した多価メディトープの第１のメディトープ、および第２の細胞表面抗原に結合した第２のメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントに結合した多価メディトープの第２のメディトープの複合体を形成して、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２の抗体の架橋が、抗体治療の有効性を増加させるステップとを包含する。
【００３１】
一部の実施形態では、対象において所望の治療効果を達成するために必要とされる抗体治療の投薬量を低減する方法は、対象に、有効量のメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメント、および有効量の多価メディトープを投与するステップと、多価メディトープの第１のメディトープを第１のメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントと接触させるステップと、多価メディトープの第２のメディトープを第２のメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントと接触させて、第１および第２のメディトープ利用可能抗体の架橋を生じさせ、それによって、第１および第２の抗体の架橋が、対象において所望の治療効果を達成するために必要とされる抗体治療の投薬量を低減するステップとを包含する。
【００３２】
一部の実施形態では、第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメント、および第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを架橋する方法は、細胞を第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップであって、前記第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントが第１のメディトープ結合性部位を包含するステップと、前記第１のメディトープ結合性部位を多価メディトープと接触させるステップであって、前記多価メディトープが第２のメディトープに結合する第１のメディトープを包含するステップと、前記多価メディトープを第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップであって、前記第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントが第２のメディトープ結合性部位を包含するステップと、前記第１のメディトープ結合性部位を前記第１のメディトープに結合させ、前記第２のメディトープ結合性部位を前記第２のメディトープに結合させ、前記第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを前記細胞に結合させ、かつ前記第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを前記細胞に結合させ、それによって、前記第１のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメント、および前記第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを架橋するステップとを包含する。
【００３３】
一部の実施形態では、細胞表面抗原は、受容体媒介性細胞内取り込み作用が可能である受容体である。
【００３４】
一部の実施形態では、多価メディトープは、メディトープに連結した免疫グロブリンＦｃ領域またはその部分を包含する。一部の実施形態では、メディトープは、リンカーにカップリングされている。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号１９９、２００、２０１、２０２、２０３、もしくは２０４の配列、またはその変異体を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、多価メディトープは、治療剤または診断剤にカップリングされている。一部の実施形態では、治療剤は、化学療法剤、治療用抗体、毒素、放射性同位体、酵素、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、色素、金属、金属合金、およびナノ粒子からなる群から選択される；または診断剤は、蛍光物質、発光物質、色素、および放射性同位体からなる群から選択されるイメージング剤である。
【００３６】
一部の実施形態では、第１のメディトープ利用可能抗体は、第２のメディトープ利用可能抗体とは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントは、細胞またはその組織の疾患または状態によって発現される抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、疾患または状態は、癌である。
【００３７】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびメディトープを逐次的に投与する。一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントの少なくとも１つは、下記からなる群から選択される抗体またはその抗原結合性フラグメントと抗原結合について競合するか、またはそれらと同じエピトープに結合する：アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、ペンテト酸アルツモマブ、アナツモマブ、アナツモマブマフェナトクス、アルシツモマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベクツモマブ、エクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、カプロマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エルツマキソマブ、ファノレソマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、サツモマブ、スレソマブ、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ブロダルマブ、アンルキンズマブ、バピヌズマブ、ダロツズマブ、デムシズマブ、ガニツマブ、イノツズマブ、マブリリムマブ、モキセツモマブパスドトックス、リロツムマブ、シファリムマブ、タネズマブ、トラロキヌマブ、トレメリムマブ、およびウレルマブ；または以下からなる群から選択される抗原に特異的に結合するメディトープ利用可能抗体またはフラグメント：ＣＡ−１２５、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、ＴＮＦ−α、ＣＤ５２、ＴＡＧ−７２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−２、インターロイキン−２受容体ａ−鎖（ＣＤ２５）、ＣＤ２２、Ｂ細胞活性化因子、インターロイキン−５受容体（ＣＤ１２５）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＤ３０、ＩＬ−１β、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１、ヒトインターロイキン−２受容体、Ｔａｃ、ＲＡＮＫリガンド、Ｃ５または他の補体タンパク質、ＣＤ１１ａ、アルファ−ｖベータ−３インテグリン、ＨＥＲ２、ｎｅｕ、ＣＤ１５、ＣＤ２０、インターフェロンガンマ、ＣＤ３３、ＣＡ−ＩＸ、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ−５、ＣＤ３イプシロン、ＣＡＭ、アルファ−４−インテグリン、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＲＳＶ抗原、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）のＦ（または融合）タンパク質、ＮＣＡ−９０（顆粒球細胞抗原）、ＩＬ−６、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７、ＣＴＡＡ１６．８８、ベータ−アミロイド、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体のアルファサブユニット、肝細胞成長因子、ＩＦＮ−アルファ、神経成長因子、ＩＬ−１３、ＣＤ３２６、ＣＤ１９、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４７、およびＣＤ１３７。
【００３８】
一部の実施形態では、多価メディトープは、下式を有するペプチドを包含する：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２（式ＶＩ）
［式中、
Ｘ１は、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、β−アジドアラニン、またはヌルであり；
Ｘ２は、Ｇｌｎまたはヌルであり；
Ｘ３は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、β，β’−ジフェニル−Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ブロモ−Ｌフェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、修飾Ｐｈｅ、水和性カルボニル含有残基、またはボロン酸含有残基であり；
Ｘ４は、ＡｓｐまたはＡｓｎであり；
Ｘ５は、Ｌｅｕ；β，β’−ジフェニル−Ａｌａ；Ｐｈｅ；フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシンの非天然類似体；水和性カルボニル含有残基；またはボロン酸含有残基であり；
Ｘ６は、ＳｅｒまたはＣｙｓであり；
Ｘ７は、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＣｙｓであり；
Ｘ８は、Ａｒｇ、修飾Ａｒｇ、または水和性カルボニル含有残基もしくはボロン酸含有残基であり；
Ｘ９は、ＡｒｇまたはＡｌａであり；
Ｘ１０は、Ｌｅｕ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ；β，β’−ジフェニル−Ａｌａ；Ｐｈｅ；フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体；水和性カルボニル含有残基；またはボロン酸含有残基であり；
Ｘ１１は、Ｌｙｓであり；
Ｘ１２は、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、７−アミノヘプタン酸、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、プロパルギルグリシン、イソアスパラギン酸、またはヌルである］。
【００３９】
一部の実施形態では、多価メディトープは、配列番号１、２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、１８６、１８７、１８８、１８９、もしくは２０７のアミノ酸配列、またはそれに由来する環式ペプチドを包含する。
【００４０】
一部の実施形態では、多価メディトープは、第１のリンカーにカップリングしている第１のメディトープおよび第２のメディトープを包含し、第１のリンカーは、ＰＡＳ化配列、ソルターゼ配列、Ｓｓｐ  Ｉｃインテイン配列、Ｓｓｐ  ＩＮインテイン配列、および／またはアルデヒドタグを含む。一部の実施形態では、多価メディトープは、第２のリンカーを包含する。
【００４１】
一部の実施形態では、第１のリンカーは、Ｓｓｐ  ＩCインテイン配列およびＳｓｐ  ＩNインテイン配列を包含する。一部の実施形態では、第１のリンカーは、Ｓｓｐ  Ｉcインテイン配列を包含し、第２のリンカーは、Ｓｓｐ  ＩNインテイン配列を包含する。一部の実施形態では、ソルターゼ配列は、配列ＬＰＸＴＧ（配列番号２４９）を包含し、Ｘは、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、第１のリンカーおよび／または第２のリンカーはさらに、グリシン残基を包含する。一部の実施形態では、アルデヒドタグは、配列番号２４７の配列を包含する。一部の実施形態では、第１のおよび／または第２のリンカーはさらに、リシン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸および／または非天然アミノ酸残基を包含する。一部の実施形態では、第１のおよび／または第２のリンカーは、治療剤または診断剤にコンジュゲートされている。
【００４２】
一部の実施形態では、複合体は、細胞および多価メディトープに結合している第１および第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントを包含し、前記第１および第２のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントはそれぞれ、メディトープ結合性部位を包含し、多価メディトープは、第１および第２のメディトープを含み、多価メディトープの第１のメディトープは、第１のメディトープ利用可能抗体のメディトープ結合性部位に結合しており、多価メディトープの第２のメディトープは、第２のメディトープ利用可能抗体のメディトープ結合性部位に結合している。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】腫瘍治療を増強するための一実施形態における作用機序が示されている。例示されている実施形態では、二価抗体は、腫瘍細胞上で過剰発現される抗原上のエピトープ（例えば、ＥｒｂＢ受容体ファミリー）に結合し（左側のパネル）、かつ受容体シグナル伝達をブロックし、細胞内取り込み作用および受容体リサイクリングを改変し、かつ／または免疫応答を誘発する。ＥＧＦＲの別のドメインを認識するマツズマブなどの抗体をセツキシマブと組み合わせて加えることが場合によって、表面受容体のデイジーチェーニングによって、より有効であり得る（右側のパネル１）。多価メディトープ（この特定の実施例では、三価）は治療用ｍＡｂをテザー（ｔｅｔｈｅｒ）／架橋して、その治療可能性を増強することができる（右側）。加えて、多価メディトープ（ここでは、三価バージョンとして示されている）は、治療法と、さらにはイメージングとの両方を増強することができるイメージング剤を担持することができる。
【図２】例示的な二価メディトープが示されている。このメディトープは、ＩｇＧのＦｃ領域に直接融合しているペプチドリンカーのＮ末端に直接融合している。この例では、このＦｃは、発現中に自然にホモ二量体化するので、メディトープ−Ｆｃコンストラクトからの最終生成物は二価である。
【図３】ある種の実施形態で使用してもよい代替のメディトープ−Ｆｃリンカー、多重コイルである。
【図４】ＳＰＲによって決定された、一価（左側のパネル）および四価（右側のパネル）メディトープとセツキシマブとの結合反応速度が示されている。表面プラスモン共鳴トレースの上のパネルは、二価ＩｇＧ上を通過する一価メディトープのイラストを示している。右側のパネルに示されているとおり、アビジンは、ビオチン化メディトープで飽和されて、同じ固定化セツキシマブＩｇＧ上を通過した。多価メディトープのオフレートは、少なくとも１／３６に低減された（２つの実験の間で時間尺度が異なることに注意されたい）。
【図５】ラクタム結合を含有するメディトープについて、一部の実施形態による二量体および三量体メディトープの合成が示されている。配列の説明：（ＧＱＦＤＬＳＴＲＲＬＫＧ）配列番号１７３；（ＧＫＬＲＲＴＳＬＤＦＱＧ）配列番号１７４。
【図６】メディトープ結合パラメーターを最適化するために使用することができ、本明細書において記載されている実施形態によって使用することができる修飾されたＡｒｇ８残基が示されている（Ｒ＝アルキル、置換アルキル、芳香族、またはＮＨＲ’’’であり、ここで、Ｒ’’’＝アルキル、置換アルキル、または芳香族である）。
【図７】一部の実施形態によるメディトープの化学構造が示されている。円は、修飾して、例えばＦａｂに対するメディトープ親和性を向上させることができる位置を示している。囲みは、環化ストラテジーを示している。上段と下段の一番右の囲み内の「クリック」化学およびオレフィン複分解はそれぞれ、メディトープを環化するための追加の経路である。
【図８】セツキシマブのフレームワークループに結合しているメディトープペプチドが示されている。図８Ａ：セツキシマブＦａｂ（軽鎖はＶLおよびＣLによって示されている；重鎖はＶHおよびＣHによって示されている）と環式ＣＱＦＤＬＳＴＲＲＬＫＣ（網掛け部分内に示されており、語「メディトープ」で標識されている）（配列番号１）との複合体は、このメディトープが、セツキシマブのＣＤＲループとは別であるＦａｂフレームワークのインターフェースに結合することを示している。図８Ｂ（上）は、ｃＱＦＤメディトープの棒モデルによる表示を示しており、（下）は、ｃＱＹＮメディトープの棒モデルによる表示を示している。Ｎ末端およびＣ末端システインは、溶媒に曝露されており、高い温度因子を示す。
【図９Ａ】既に仮定されていたとおり、ｃＱＦＤおよびｃＱＹＮメディトープが、セツキシマブのＣＤＲには結合しないことが示されている。図９Ａには、２つの結晶構造が重ねて示されており、一方は、セツキシマブＦａｂおよびその抗原ＥＧＦＲドメインＩＩＩであり、他方は、ｃＱＦＤメディトープおよびセツキシマブＦａｂを示しており、ここで、ｃＱＦＤメディトープは、セツキシマブＦａｂの中央空洞部に結合している。抗原ＥＧＦＲドメインＩＩＩは、メディトープ結合部位からかなり離れた相補性決定領域で結合している。
【図９Ｂ−Ｃ】図９Ｂの左側には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果が、かつ右側には、対応するサイズ排除クロマトグラフィー結果が示されている。個々の成分であるＦａｂ、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ、およびＳＭＴ−ｃＱＦＤメディトープ、さらには、それら３種全ての混合物のサイズ排除実験によって、ヘテロ三量体複合体の形成およびその共溶出が示されている。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、初めに溶出された画分を示しており、このことは、混合物で観察される新たなピーク（「複合体」の薄灰色に網掛けされている一番左のピーク）中に、３つの成分全てが存在することを示している。図９Ｃには、ＦＡＣＳ分析の結果が示されており、これは、ｃＱＦＤメディトープは、セツキシマブの存在下でのみ、ＥＧＦＲ陽性ＭＤ−ＭＢＡ−４６８細胞に結合したことを示している（矢印）。メディトープ単独またはＭ４２５、マウスＥＧＦＲ抗体の存在下でのメディトープは、結合しなかった。
【図９Ｄ】図９Ｄには、セツキシマブｓｃＦｖまたはＦａｂとカップリングしたセンサーチップを使用する表面プラスモン共鳴実験の結果が示されている。実験によって、１００μＭという高濃度のｃＱＦＤメディトープでも、ｓｃＦｖは飽和され得ないことが示されている。セツキシマブＦａｂをカップリングさせたセンサーチップを使用する同じ実験では、完全な飽和が示されている。この実験での解離定数は６６０ｎＭである。対照ＳＰＲ実験（下段のパネル）によって、セツキシマブｓｃＦｖは可溶性ＥＧＦＲドメインＩＩＩフラグメントに容易に結合することが示されており、これは、ＣＤＲループが機能性であったことを示している。
【図１０】ｓｃＦｖ−メディトープのリンカーが示されている。１２〜２０アミノ酸リンカー（典型的には｛ＧＧＧＳ｝3-5）を介して軽鎖可変ドメインを重鎖可変ドメインに（またはその逆で）融合させることによって、ｓｃＦｖを作る。この例では、フレキシブルなリンカー配列の一部を、メディトープ配列に置き換えることができる。
【図１１】セツキシマブ（Ｃ）またはＭ４２５をＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞と共に事前インキュベートした後のＦＡＣＳ分析の結果が示されている。単量体メディトープ（ｃＱＦＤ）３μＭを添加し、ＦＡＣＳ分析に進める前に洗浄するか、または洗浄しないかのいずれかであった。
【図１２】メディトープ利用可能化変異が抗原認識を妨害しなかったことを示す研究結果が示されている。市販のトラスツズマブ（親）、ＮＳ０細胞から生成したトラスツズマブ（ＮＳ０親）、およびｍｅｍＡｂトラスツズマブ（ｍｅｍＡｂ）をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識し、ＳＫＢＲ３細胞（上部のパネル）に施与した。過剰なｍＡｂを洗い流した後に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−メディトープ−Ｆｃ（ＭＦＣ）を施与した。３種のｍＡｂは同じ範囲で細胞に結合したが、ｍｅｍＡｂ標識された細胞のみが、ＭＦＣ結合を増強している。
【図１３】抗体（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８定常状態）の非存在下、トラスツズマブ（メディトープ使用不可能）（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８  １０ｎＭ  Ｔ）の存在下、３分間のｍｅｍＡｂトラスツズマブおよび四価メディトープ（Ｍ４Ｆｃ）の存在下（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８  １０ｎＭ  ｍｅＴｖ２  １０ｎＭ  Ｍ４Ｆｃ  ３分）、および１０分間のｍｅｍＡｂトラスツズマブおよび四価メディトープ（Ｍ４Ｆｃ）の存在下（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８  １０ｎＭ  ｍｅＴｖ２  １０ｎＭ  Ｍ４Ｆｃ  １０分）での、２４時間後のＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞上のＨＥＲ２分布の棒グラフが示されている。
【図１４】ＭＰＬ−ｚＨＥＲ２と抗体との相互作用のＳＰＲセンサグラムが示されている。図１４Ａには、ＭＰＬ−ｚＨＥＲ２と固定化メディトープ利用可能トラスツズマブＩｇＧとの相互作用を示すＳＰＲセンサグラムが示されている。図１４Ｂには、ＭＰＬ−ｚＨＥＲ２と固定化ＨＥＲ２との結合相互作用を示すＳＰＲセンサグラムが示されている。
【図１５】ｚＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬとｍｅｍＡｂトラスツズマブとの相互作用が示されている。図１５Ａには、ｚＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬと固定化ｍｅｍＡｂトラスツズマブとの相互作用を示すＳＰＲセンサグラムが示されている。図１５Ｂには、漸増比のＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬとｍｅｍＡｂトラスツズマブＩｇＧとの相互作用を示す分析用サイズ排除クロマトグラフィートレースが示されている。
【図１６】多価メディトープのゲル濾過クロマトグラムが示されている。図１６Ａには、三価メディトープの代表的なゲル濾過カラムクロマトグラム（ＨｉＬｏａｄ  ｐｒｅｐ７５  ２６／６００ＰＧ）が示されている。図１６Ｂには、二価メディトープの代表的なゲル濾過カラムクロマトグラム（ＨｉＬｏａｄ  ｐｒｅｐ７５  ２６／６００ＰＧ）が示されている。
【図１７】メディトープ利用可能トラスツズマブへの多価メディトープ結合が示されている。図１７Ａには、メディトープ利用可能トラスツズマブへのＢＶＭ画分２６〜２９結合が示されている。図１７Ｂには、ｍｅｍＡｂトラスツズマブへのＴＶＭ精製からのＳＥＣ画分の結合分析が示されている。
【図１８】精製三価メディトープの分析が示されている。図１８Ａには、ＨＰＬＣによる精製三価メディトープの分析が示されている。図１８Ｂには、質量分析による精製三価メディトープの分析が示されている。
【図１９】低濃度（Ａ）、中濃度（Ｂ）、および高濃度（Ｃ）でのメディトープ利用可能抗体への多価メディトープの結合分析が示されている。
【図２０】低濃度（上のパネル）、中濃度（中央のパネル）、および高濃度（下のパネル）のメディトープ利用可能抗体で、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、１：１の多価メディトープ：メディトープ利用可能抗体結合モデルに対するデータフィット品質が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
複数のメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントに結合している複数の多価メディトープを含む複合体を本明細書において提供する。これらの複合体の形成は、複数の抗体またはその抗原結合性フラグメントが結合する細胞表面抗原の分布を改変する。多価メディトープおよびメディトープ利用可能抗体、ならびに標的抗原上のその同源エピトープの相互作用を介しての複合体の形成は、細胞上の細胞表面抗原のクラスター化または同時局在化を増加または促進することができ、このことによって、複合体の内部移行が増加または促進され得る。次に、内部移行の増加を使用して、標的細胞の表面から細胞表面抗原の濃度を除去または減少させることができ、標的細胞へのメディトープ利用可能抗体−メディトープ複合体の内部移行の比率を上昇させることができる。内部移行比率の上昇は、ある種の治療の有効性を上昇させるか、または特定の治療効果を達成するために必要な薬物の量を減少させることができる。細胞表面抗原のクラスター化を増加または促進する方法は、細胞に、細胞表面抗原に特異的に結合する１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体を投与するステップと、１つまたは複数の多価メディトープを投与し、それによって、標的細胞の表面上の細胞表面抗原のクラスター化を促進するステップとを含み得る。特定の実施形態では、多価メディトープは、１つまたは複数の薬剤にコンジュゲートされている。
【００４５】
Ａ．  細胞表面抗原提示を変更するための多価メディトープ
多価メディトープは、標的細胞表面抗原に対するメディトープ利用可能抗体と共に使用され、宿主細胞の表面上でのそれらの分布に変化を生じさせることができる。例えば、腫瘍関連抗原などの細胞表面抗原、ＧＰＣＲなどの受容体、受容体チロシンキナーゼ、ＣＴＬＡ４などの他のシグナル伝達分子、および細胞表面タンパク質上に存在する他のエピトープの提示を、多価メディトープ、およびそれらの抗原上のエピトープを認識するメディトープ利用可能抗体の使用によって操作および／または再構成することができる。受容体およびシグナル伝達分子の再構成は、シグナル伝達経路および細胞応答に対して顕著な効果を有し得る。
【００４６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、この種の再構成は、細胞−細胞接触によって起こり、その際、１個の細胞からのリガンドが他の細胞上の受容体にエンゲージして、多価相互作用を効果的にもたらす。この接触点によって、受容体／リガンドは局在化するか、または相互に近接して、シグナル伝達「シナプス」をもたらす。そのシグナル伝達シナプスは、細胞内で翻訳後修飾を開始し、例えば、アクチンおよび微小管構成を改変し、最終的に、特異的転写イベントをもたらし得る。
【００４７】
多価メディトープの使用を、細胞表面抗原の分布を改変するために、同様の様式で使用することができる。具体的には、１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体を、１つまたは複数の多価メディトープと併せて投与し、細胞表面上の標的抗原に結合させることができる。一実施形態では、多価メディトープは、それらのコグネイト抗原に結合した連結メディトープ利用可能抗体の複合体の形成を可能にする。メディトープ利用可能抗体は、多価メディトープと会合して、表面抗原を相互に引き寄せるか、または架橋させて、細胞表面上のそれらの抗原の提示を効果的に改変する。
【００４８】
この効果を、二価メディトープをメディトープ利用可能抗体と共に使用することによって例示する。この組み合わせは、第１のメディトープ利用可能抗体の１つのＦａｂアームが、第２のメディトープ利用可能抗体の１つのＦａｂアームとエンゲージすることを可能にする。このシナリオでは、メディトープ利用可能抗体に結合した細胞表面抗原および二価メディトープの「線状」配置が予測されるであろう。三価、四価、またはより高い価のメディトープを使用し、追加のメディトープ利用可能抗体に会合した表面由来抗原をクラスター化することが可能である。多価メディトープを、クラスター化のジオメトリーを正確に制御するために調整することができる。例えば、２つの受容体を近接させ、可能性として細胞内シグナル伝達分子のより高い活性につなげることが有利であり得る。この場合、２つ以上のメディトープの間のリンカーは、ＰＥＧリンカー、ペプチドリンカー、またはＤＮＡ、例えば、ＤＮＡオリガミによって約１〜１０Å（例えば）であり得る。別法では、受容体を遠位に保持することが有利であり得る。この場合、特定の受容体を「押し」分けるために、メディトープ間で硬いリンカーを使用することができる。これらの硬いリンカーは、メディトープが、軽鎖および／または重鎖のＮおよび／またはＣ末端に融合している全ＩｇＧなどのタンパク質ドメインであり得るであろう。別法では、各メディトープの距離を直接制御するために、ＤＮＡを使用することができる。さらに、ＤＮＡオリガミの最近の進歩は、各メディトープの位置をしっかりと制御することができる追加の例を提供している。
【００４９】
別の実施形態では、メディトープ利用可能抗体を非内部移行性抗原に対して、かつ第２のメディトープ利用可能抗体をシグナル伝達に関係する抗原に対して使用することが可能である。この場合には、多価メディトープ利用可能抗体を、シグナル伝達受容体を、シグナル伝達において活性な細胞膜の領域から隔離するために使用することができるであろう。代わりに、シグナル伝達事象が活性なままであることを保証することが有利であることがある。柔軟か、または硬く、規定の長さを有する多価メディトープを、その対を調節するために使用することができる。
【００５０】
別の実施形態では、メディトープ利用可能抗体および多価メディトープを、免疫応答のために特異的な細胞をマークするために使用することができる。この場合、多価メディトープを介してのメディトープ利用可能抗体−会合受容体のクラスター化は、Ｔ細胞上のＦｃＲで「高」濃度のＦｃドメインを提供するであろう。複数回の調査によって、Ｆｃドメインは、適切な応答を誘発する限定数の点変異によって、特異的に調節することができることが実証されている。
【００５１】
別の実施形態では、メディトープ利用可能抗体についての多価メディトープの結合親和性を操作することによって、標的抗原上のコグネイトエピトープについて好ましい結合親和性を有するメディトープ利用可能抗体を選択することによって、または寿命を最適化するために両方の特徴を、さらには、メディトープ利用可能抗体−多価メディトープ複合体の標的化の特異性を操作することによって、抗体治療の有効性を改変および改善することができる。具体的には、相互作用の寿命は、キネティックオフレート（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｏｆｆ−ｒａｔｅ）に関連している。一部の事例では、最長の可能寿命が有利であろうことが想像され得る。他の場合では、中等度の寿命（ｔａｕ＝１０ｍｓから１０分）が有利であろう。後者の場合では、腫瘍組織上で過剰発現されるが、ある種の健康な組織でも、より低いレベル（１０、１００、または１０００分の１）ではあるが発現される特異的な受容体（例えば、ＥＧＦＲまたはＨｅｒ２）が存在する。臨床的には、腫瘍には結合し、健康な組織には結合しないことが望まれ得る。中等度の寿命を有するメディトープ利用可能抗体および多価メディトープの組合せの使用が、多価メディトープの選択性を増強する。具体的には、正常な細胞に存在する低濃度の抗原で、メディトープ利用可能抗体は、抗原に結合することができるであろうし、多価メディトープも相互作用することができるであろう。しかしながら、第２のメディトープ利用可能抗体が抗原にエンゲージする可能性は低く、多価メディトープは解離される。病態では、隣接するメディトープ利用可能抗体が抗原にエンゲージする可能性は高く、２つ以上のメディトープ利用可能抗体会合抗原を架橋することが可能である。
【００５２】
他の実施形態では、提供する方法は、細胞の特性を利用し、多価メディトープと会合した薬剤を効率的に放出するために、内部移行およびコンジュゲートされた生物製剤のソーティング経路を改変する。研究によって、内部移行の機構には、細胞膜に局在化される粒子のサイズが重要であることが実証されており（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２００４  Ｊａｎ  １；３７７（Ｐｔ  １）：１５９〜６９；Ｊ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年２月３日；１２：５．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７７−３１５５−１２−５を参照されたい）、会合リガンドのサイズが、内部移行経路をもたらし得ることを示唆している。メディトープ利用可能抗体との多価メディトープの使用は、細胞表面抗原に結合した単一の抗体と比較して、より大きな粒径を有するリガンドの出現をもたらすであろう。
【００５３】
内部移行を促進するか、内部移行比率を改変する代替の手法は、本明細書において提供する特定の実施形態においてのとおり、細胞結合受容体の凝集を促進または制御することによる。本明細書における一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体と連結した多価メディトープを使用して、同時局在化、クラスター化、凝集、内部移行、および／または細胞内輸送もしくはソーティングを行うか、繰り返すか、または増強もしくは改変する。抗体のみの投与と比較して、そのような受容体抗原を認識するメディトープ利用可能抗体および多価メディトープを細胞に投与した後に、そのような表面受容体のクラスター化および／または内部移行に、本明細書において差異が観察される。提供する実施形態のうちには、メディトープ利用可能抗体によって認識される表面抗原の同時局在化およびクラスター化、ならびに／または受容体などの細胞表面抗原などのそのような抗原の内部移行／輸送／ソーティングを促進する多価メディトープがある。内部移行される宿主細胞上の細胞表面タンパク質は、そのリガンドに応答する宿主細胞の能力に影響を及ぼし得るであろうそれらのコグネイトリガンドとの相互作用について、利用可能性が低いであろう。
【００５４】
例えば、治療およびイメージング法における、細胞にメディトープおよび／またはカップリングされた薬剤を送達する際のそのような多価メディトープの方法および使用も提供する。例示的な方法は、多価メディトープにカップリングされた細胞毒素または放射標識された薬剤の送達を行う方法である。標的細胞の表面上に豊富な特異的な抗原を認識する一部の潜在的に有用な抗体は、「不十分に内部移行性」である（Ｍａｔｚｋｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９８８  ２：１１〜１４；Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．１９９５  ２８：１２６〜１４２）。不十分か、または最適以下の内部移行は、標的臓器または組織における細胞内送達および蓄積を減らす（Ｍａｔｚｋｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９８８  ２：１１〜１４；Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．１９９５  ２８：１２６〜１４２）。したがって、これらの「不十分に内部移行性」の抗体は、細胞内標的化のために最適化されない。したがって、抗体標的化および細胞による内部移行を増強する抗体系が必要とされている。一部の実施形態では、当該方法は、細胞表面抗原の内部移行の程度または比率の増加をもたらす。例えば、ＡＤＣなど、細胞に薬剤を送達するために、抗体が使用される状況において、増加したか、またはより急速な内部移行は有利であり得る。抗体を送達する場合に、疾患の進行に関連するか、またはその原因となっている表面受容体または他の表面抗原のダウンレギュレーションを促進することも有利であり得る。これはまた、例えば、細胞表面上の受容体または他の表面抗原の量を減少させることによって、例えば、分解のためにそれを標的化することによって有利であり得る。補助受容体を包含する一部のそのような受容体は、細胞シグナル伝達を行うか、または媒介することができる。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、有害な細胞シグナル伝達経路を減少、妨害、または除去することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、抗原内部移行を１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍，７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍以上増加させることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、細胞表面上に存在する抗原の量を１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１，７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、７５分の１、１００分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、５００分の１以上減少させることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、低い内部移行比率を有する抗体の内部移行を包含する抗体内部移行を１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍，７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍以上増加させることができる。
【００５５】
一部の抗体は、細胞に侵入した後で、治療効果を発揮する。一部の実施形態では、増加したか、またはより急速な内部移行は、抗体の効力または有効性を増加させ得る。したがって、一部の実施形態では、同じ治療効果を達成するために、より少ない投薬量を使用することができる。一部の実施形態では、多価メディトープと結合したメディトープ利用可能抗体の投与は、１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１，７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、７５分の１、１００分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、または５００分の１の薬物を使用して、抗体のみの投与と同じ治療効果を達成することができる。
【００５６】
一部の実施形態では、増加したか、またはより急速な内部移行は、エンドソームへの抗体の増加したか、またはより急速な送達をもたらす。一部の抗体は、タンパク質分解切断部位を含むリンカーを含む。そのリンカーを、イメージング剤または治療剤を包含する薬剤にコンジュゲートすることができ、次いで、これは、内部移行すると抗体によって放出される。一部の実施形態では、リンカー切断は、エンドソームまたはリソソームにおいて起こる。したがって、エンドソームまたはリソソームへの抗体の増加したか、またはより急速な送達は、抗体の効力または有効性を増加させ得る。
【００５７】
一部の状況では、よりゆっくりか、またはそれほど急速ではない内部移行率が望まれ得る。一部の実施形態では、細胞表面抗原の同時局在化またはクラスター化の増加は、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）および／または補体媒介性溶解などの望ましいエフェクター機能を促進し、かつ／または細胞表面受容体抗原を介してのシグナル伝達をエンゲージおよび促進し得る。
【００５８】
メディトープを送達し、かつ／または標的細胞上の細胞表面抗原の同時局在化またはクラスター化を増強または増加させるための方法を提供する。一部の実施形態では、当該方法を、細胞に、細胞表面抗原（複数可）に特異的に結合する１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体、および多価メディトープを投与することによって実施する。一部の実施形態では、抗原の同時局在化、クラスター化、および／または凝集を増強または増加させる。一部の態様では、増加は、メディトープ利用可能抗体および／もしくは多価メディトープを添加する前、またはその非存在下で、またはメディトープを伴わない抗体の存在下で観察されたものと比較して、程度、比率、および／または期間の増加である。一部の実施形態では、当該方法は、細胞表面抗原によるシグナルおよび／または結合した抗体を介して媒介されるエフェクター機能を促進するか、またはその程度を増強する。
【００５９】
メディトープ、それにカップリングされた薬剤を送達するための、かつ／または標的細胞上の細胞表面抗原の内部移行および／または分解を増強または増加するための方法を提供する。一部の実施形態では、当該方法を、細胞に、細胞表面抗原（複数可）に特異的に結合する１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体、および多価メディトープを投与することによって実施する。一部の実施形態では、抗原の内部移行および／または分解を促進、増強、または増加させる。一部の態様では、内部移行の増加は、メディトープ利用可能抗体および／もしくは多価メディトープを添加する前に、またはその非存在下で、またはメディトープを伴わない抗体の存在下で観察されたものと比較して、程度、比率、および／または期間の増加である。一部の実施形態では、メディトープを、ＡＤＣまたは放射性免疫療法（ＲＩＴ）において使用するためなど、化学療法剤、細胞毒素、または放射標識された薬剤などの治療剤または診断剤とカップリングさせる。一部の実施形態では、当該方法は、内部移行または細胞内輸送を改変する。一部の実施形態では、当該方法は、細胞間または細胞内シグナル伝達を改変する。
【００６０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗体によって標的とされる抗原を発現する細胞または組織へと抗体媒介性送達するためのＡＤＣまたはＲＩＴまたは他の方法などにおいて、薬剤の送達を増強するために有用である。一部の実施形態では、当該方法は、それらが癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、腫瘍関連糖タンパク質（ＴＡＧ−７２）、ＫＳ１／４などの非内部移行性抗原の状況において、クラスター化、したがって、抗原、抗原に結合した抗体、および抗体と会合した薬剤の内部移行を促進することにおいて有利である（Ｓｃｈｍｉｔｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００８年１２月；５７（１２）：１８７９〜１８９０；Ｍｙｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９３；５３：３９５６〜３９６３を参照されたい）。
【００６１】
ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）として販売されている抗Ｈｅｒ２  ＡＤＣであるＴＤＭ１の開発の成功にも関わらず、コンジュゲート薬物の僅かな画分（約２％）しか、腫瘍に送達されない。そのような低い送達率の正確な理由は不明だが、これはおそらく、細胞が利用する種々の内部移行経路（例えば、クラスリン媒介性細胞内取り込み作用および／または小胞媒介性細胞内取り込み作用および／またはマクロピノサイトーシス）、さらには、いったん細胞内に取り込まれた物質の経路指定（リサイクリングエンドソーム、または後期エンドソームもしくはリソソーム）に由来する。ジスルフィドリンカーを介して抗体にコンジュゲートしている薬物は、細胞質の還元環境によって放出され得る。別法では、一部は、エンドソームベシクルにおいて活性な特異的なプロテアーゼによって放出され得る（例えば、オーリスタチン）。種々のリンカーを使用する他の研究によって、リソソームは、コンジュゲーション化学とは独立して、薬物の放出において有効な手段であることが示されている。ジスルフィドも、血清中で還元することができ、プロテアーゼは、健康な組織において活性であり得る。一部の実施形態では、提供する方法、抗体、およびメディトープは、疾患を治療するための毒素などの薬剤のより特異的、かつ有効な送達などの改善をもたらす。
【００６２】
腫瘍免疫療法では、多くの抗原は、腫瘍特異的であることとは対照的に、腫瘍に関連しているか、または腫瘍細胞／環境で比較的高いレベルで発現されているに過ぎない。例えば、Ｈｅｒ２およびＥＧＦＲは、Ｈｅｒ２＋乳癌および結腸直腸癌などの腫瘍組織において著しく過剰発現されるが、それらは、健康な組織でも発現され、このことが、オン−ターゲット、オフ−組織毒性（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ）をもたらし得る。他の種類の抗原（腫瘍特異的抗原および胎児腫瘍性抗原、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）など）は、腫瘍組織においてのみ、かつ／または他ではわずかに、または発生のある種の段階でのみ発現される。同じ抗原上で独自のエピトープを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を組み合わせると、様々な抗体エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、補体依存性溶解、シグナル伝達阻害）の増強、細胞死の増強、および癌標的化抗体の場合には、腫瘍増殖阻害の増強を包含する相乗効果が生まれ得る。例えば、Ｄｅｃｈａｎｔ  Ｍら、「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００８年７月１日；６８（１３）：４９９８〜５００３；Ｓｃｈｅｕｅｒ  Ｗら、「Ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００９年１２月１５日；６９（２４）：９３３０〜６；Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ  ＰＭら、「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＣＤ２０  ｂｙ  ａｎｔｉ−Ｂ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｒ  Ｆ（ａｂ’）（２）  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００２年３月；５１（１）：１５〜２４．  Ｅｐｕｂ  ２００１年１２月１８日を参照されたい。この細胞死増強の正確な機構については論争中であるが、研究によって、効果の増強を達成するためには、ｍＡｂは両方とも多価（例えば、全抗体または一価Ｆａｂに対してＦ（ａｂ）’2）であるべきことが示されており、このことは、第２の二価ｍＡｂ（同じ抗原上で独自のエピトープに結合する）が細胞表面抗原をクラスター化し、より有効に作用する、例えば、腫瘍細胞をより有効に死滅させ得ることを示唆している。図１および２を参照されたい。
【００６３】
一部の態様では、例えば、メディトープ利用可能抗体と組み合わせて相乗作用を達成するために、多価メディトープを第２の抗体または二重特異性抗体の代わりに使用する。一部の態様では、同じ抗原上の別のエピトープを認識する第２の抗体の使用と比較して、多価メディトープは利点をもたらす。例えば、多価メディトープの生成は、第２の抗体と比較した場合に、より効率的で、かつ費用効果が高くなり得る。例えば、いくつかの前臨床／治験が２種のモノクローナル抗体の同時投与を調査しているが、そのような治療剤の製造および販売の費用はおそらく、非常に高価となるであろう。一部の態様では、多価メディトープはまた、腫瘍などの疾患部位に対して比較的より容易に標的化される。メディトープ結合性部位（メディトープ結合性部位内で、抗体ＣＤＲとは別）の性質、および選択した任意の抗体をメディトープ利用可能化するための本明細書において提供する幅広く適用可能な方法があれば、多価メディトープはまた、治療的に許容される特徴を有する第２の抗体またはエピトープを同定する必要なしに、広範な治療用抗体に容易に適用可能であるという利点を有する。したがって、一部の態様では、多価メディトープの使用によって、許容される特徴を有する第２のｍＡｂを同定する必要性、およびそれを開発する関連する多大なコストが回避される。
【００６４】
一部の実施形態では、多価メディトープは、二価抗体を上回る利点、および／またはその改善をもたらす。一部の実施形態では、二重特異性抗体のみの使用と比較して、例えば、二重特異性抗体の異なるアームによって結合される２つの抗原、例えば、細胞表面抗原の凝集を増強するために、例えば、親和性、抗体によって誘導されるシグナル伝達、エフェクター機能、および／または内部移行を増強するために、多価メディトープを二重特異性メディトープ利用可能抗体と共に使用する。したがって、一部の態様では、多価メディトープを二重特異性メディトープ利用可能抗体に関連して使用すると、それは、二重特異性抗体のみと比較して、例えば、追加的なクラスター化程度をもたらすことによって、有効性レベルの上昇をもたらす。
【００６５】
一部の実施形態では、それぞれ、同じ細胞の表面上で発現される異なる抗原に特異的に結合する２つのメディトープ利用可能抗体を多価メディトープと一緒に、二価抗体の代わりに使用して、細胞表面上での相互に対する２つの抗原の密度または存在比に関わらず、抗原（例えば、受容体）凝集の増強、および／または特定のレベルの凝集を得る。一部の態様では、そのような実施形態は、抗原の細胞表面クラスター化、および／または同時局在化を増強する。一実施形態では、多価メディトープを、そのようなクラスター化を達成するために、多数の異なる抗原を認識する多数のメディトープ利用可能抗体と一緒に使用する。したがって、一部の実施形態では、クラスター化が、抗体の各アームがその個々の抗原に結合している場所でのみ起こるであろう二重特異性抗体と比較して、そのような実施形態におけるクラスター化は、抗体の１つによって結合される抗原が、別の抗体によって結合される抗原と比較して、かなり高い密度で細胞表面上に存在する場合にも、達成され得る。
【００６６】
同様に、イメージング剤などの様々な薬剤にコンジュゲートした抗体を用いる場合、細胞をクラスター化または同時局在化し、かつ／または表面抗原を内部移行する能力が重要であり得る。例えば、薬剤、例えば、実薬を、標的組織内に、多くの場合に、標的組織の細胞または腫瘍細胞などの標的細胞内に選択的に送達することを目標として、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの薬物−コンジュゲート生物製剤を一般に設計する。生物製剤、例えば、抗体の標的化は一般に、目的の細胞に優先的に結合するように設計される；標的細胞または組織上のみに存在し、かつ／または他の組織上には非常に少量か、またはまれにしか存在しない抗原への選択的結合が特に望まれ得る。特に、罹患細胞、例えば、腫瘍細胞を直接標的化する薬物−コンジュゲート抗体では、薬剤−コンジュゲート抗体が、細胞表面上の標的抗原に結合した後に、標的細胞内に内部移行されることがことが望まれ得るか、または重要である。例えば、Ｔｒａｉｌら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ２０１３、２、１１３〜１２９；Ｐｅｒｅｚら、Ｈ．Ｌ．．Ｐｅｒｅｚら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ（２０１３）を参照されたい。一部の状況では、抗原の内部移行をもたらす抗体は、放射性免疫療法（ＲＩＴ）の状況においても望まれ得る。Ｂｏｕｄｏｕｓｑ  Ｖら、（２０１３）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｍＡｂｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉ−ＣＥＡ  ｍＡｂｓ  ｉｎ  Ａｌｐｈａ−Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  212Ｐｂ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（７）：ｅ６９６１３を参照されたい。一般に、コンジュゲートされた薬剤、例えば、薬物は、標的細胞内で放出され、活性である。一部の状況では、例えば、腫瘍環境に対して特異的な特定の細胞外マトリックス成分および／または抗原を標的化する際には、内部移行が必要ないことがある。Ａｃｋｅｒｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００８年７月；５７（７）：１０１７〜１０２７を参照されたい。
【００６７】
一部の実施形態では、非内部移行性抗原は、メディトープの非存在下での単一特異性二価抗体の結合が、抗原の内部移行をもたらさず、代謝回転から、もしくは抗原に特異的な抗体の非存在下で生じるもの以下であるか、または代謝回転から、もしくは抗原特異的抗体の非存在下で生じるものの２倍超を越えない内部移行度をもたらすものである。一部の実施形態では、単一特異性二価抗体と共にインキュベートした後の抗原は、代謝回転から、または抗原特異的抗体の非存在下で生じるものの３倍、４倍、５倍、６倍，７倍、８倍、または９倍超である比率で内部移行しない。
【００６８】
一部の実施形態では、非内部移行性抗原は、細胞表面抗原のみのための天然結合パートナーまたはリガンドの結合が、抗原の内部移行をもたらさないか、あるいは代謝回転から、もしくは結合パートナーもしくはリガンドの非存在下で生じるもの以下であるか、または代謝回転から、もしくはリガンド／結合パートナーの非存在下で生じるものの２倍超を越えない内部移行度をもたらすものである。一部の実施形態では、抗原の天然リガンドまたは結合パートナーと共に細胞をインキュベートした後の抗原は、代謝回転から、または天然リガンドもしくは結合パートナーの非存在下で生じるものの３倍、４倍、５倍、６倍，７倍、８倍、または９倍超である比率で内部移行しない。一部の実施形態では、抗原は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６時間以上の半減期で、単一特異性二価抗体または天然リガンドまたは結合パートナーの結合の後に内部移行する。
【００６９】
Ｂ．  多価メディトープ
細胞表面抗原の分布を改変する開示の方法と共に使用するための多価メディトープ、さらには、それを含有するベクター、細胞、ライブラリ、および他のシステムを本明細書において提供する。
【００７０】
用語「多価メディトープ」は、本明細書において使用される場合、複数のメディトープ、および１つまたは複数のリンカーまたは連結手段を指す。そのような多価メディトープは、これらだけに限定されないが、本明細書に記載のメディトープを包含する任意のメディトープを含んでよい。一態様では、多価メディトープは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のメディトープを含んでよい。多価メディトープを構成するメディトープは、同じか、または異なる構造または配列を有してよい。
【００７１】
用語「メディトープ」は、本明細書において使用される場合、Ｋａｂａｔナンバリングに従うとその軽鎖の４０位にトレオニン、４１位にアスパラギン、および８５位にアスパルタートを有するか、または本明細書において開示するセツキシマブ、メディトープ利用可能トラスツズマブ、もしくはメディトープ利用可能Ｍ５Ａのメディトープ結合性部位内のものに対応する残基を含有するメディトープ結合性部位を含有するメディトープ利用可能抗体またはその抗原結合性フラグメントのメディトープ結合性部位などの中央空洞に結合するペプチドまたは複数のペプチドを指す。例示的なメディトープには、これらだけに限定されないが、ｃＱＦＤ（配列番号１）およびｃＱＹＮ（配列番号２）ペプチド、ならびにその変異体（「メディトープ変異体」または「変異型メディトープ」）が含まれる。メディトープの特徴と同様の機能的特徴を有する他の分子も、メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合性部位に結合し得る。「メディトープ類似体」と定義されるそのような分子には、これらだけに限定されないが、メディトープと同じメディトープ結合性部位に結合し得る小分子、アプタマー、核酸分子、ぺプチボディおよび任意の他の物質が含まれ得る。一部の実施形態では、メディトープ配列を、本明細書において開示するとおり環化させる（例えば、末端（または末端近くの）システイン残基がジスルフィド結合を形成する）。
【００７２】
用語「リンカー」は、本明細書において使用される場合、複数のメディトープがそれによって連結または接続される手段を指す。一実施形態を例示するために、２つ以上のメディトープを含む多価メディトープの場合には、メディトープは、１つまたは複数のリンカーによって連結される。一態様では、２つのメディトープを含む多価メディトープは、３つのリンカーを使用することによって環化させることができるであろう。
【００７３】
メディトープを連結して多価メディトープを形成するための１つまたは複数のリンカーまたは連結手段は、個々のメディトープを連結および分離するために適した任意の構造であってよい。修飾ペプチドバックボーン、小さな化学的スキャフォールド、ビオチン−ストレプトアビジン、有機もしくは無機ナノ粒子、ポリヌクレオチド配列、ペプチド−核酸、有機ポリマー、または免疫グロブリンＦｃドメインを有する一部の実施形態では、例示的なリンカーは、ペプチドを形成するために使用してよい１つまたは複数のアミノ酸の使用を包含する。連結のための手段は、共有結合および／または非共有結合を含み得る。
【００７４】
１つまたは複数のリンカーは、様々な機能または特性を提供する様々な配列または他の構造的特徴を包含し得る。例えば、１つまたは複数のリンカーは、多価メディトープの誘導体化を可能にする構造的要素を含有し得る。例示的な構造的要素には、プロテアーゼ切断部位の存在または非存在、免疫原性配列、例えば、ＰＡＳ化およびインテイン配列を包含する多価メディトープの環化をもたらすか、または補助する配列、ならびに例えば、治療剤または診断剤とコンジュゲートしている、例えば、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）と適合性のアルデヒドタグ、リシン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸および使用することができる非天然アミノ酸を包含する残基、部位またはタグが包含される。
【００７５】
本来、多くの場合に多価を介して、特異性および親和性が達成される。リンカーを伴う二価リガンドでは、これは、ΔＧ全体＝ΔＧ１＋ΔＧ２−ΔＧリンカーと表すことができる。言い換えると、Ｋ全体＝Ｋ1×Ｋ2／Ｋリンカーである。リンカーが自由エネルギーに寄与していない場合（Ｋリンカー約１）、二価標的のための二価リガンドの見掛けの親和性は、単量体結合定数の積である。したがって、一般に多価を介して、親和性の有意な増大を達成することができる（例えば、ＫD＝１μＭのメディトープでは、「理論」二価メディトープの親和性は１ｐＭである）。そのような大きな増大は一般には稀にしか見られないが（主に、二価／三価／多価受容体の幾何学的形状によって）、相乗作用は観察される。細胞表面で発現される抗原の幾何学的形状は、多価メディトープのリンカーに対して厳密な制約を課し得るが、特異性も保証することができ、この特異性は、標的化送達するためなどの一部の状況においては、例えば、オフターゲット効果のリスクを最小限にすることによって、重要な目標であり得る。
【００７６】
一例では、多価メディトープは、Ｆｃ領域の実質的に全てなど、抗体のＦｃ領域またはその一部を含有する。リガンドを「二量体化する」ためにＦｃ領域を使用することは確立されており、例えば、Ｊａｚａｙｅｒｉ  ＪＡ  ＆  Ｃａｒｒｏｌｌ  ＧＪ．、「Ｆｃ−ｂａｓｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２２（１）：１１〜２６（２００８）に記載されている。一部の例では、二価メディトープを作成するために、メディトープをリンカー、典型的にはペプチドリンカー、例えば、フレキシブルなペプチドリンカーを介してＦｃ領域に（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域のＮ末端に）融合させる。一例では、１７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０アミノ酸長さなど、ＩｇＧのＦａｂの間の距離におおよそ合うように、リンカーの長さを選択する。一部の態様では、このリンカーは、グリシン、セリン、および／またはそれらの組合せを含有する。例示的な「メディトープ−Ｆｃ」融合を配列番号３および４に示す。図２も参照されたい。
【００７７】
一部の態様では、メディトープ−Ｆｃは、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域または定常領域部分に連結しているメディトープであるか、またはそれを含有する。Ｉｇ定常領域は一般に、Ｆｃ領域もしくは定常領域ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）またはその機能性フラグメントを含む。
【００７８】
一部の実施形態では、メディトープ、例えば、多価メディトープは、下式を有する１つまたは複数の鎖（例えば、ポリペプチド鎖）を有する化合物である：
Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A（式Ｉ）
［式中、Ｒ3Aは、ペプチドメディトープなどのメディトープ（例えば、本明細書において提供するメディトープのいずれか）であり、Ｌ3Aは、Ｒ3AおよびＲ4Aを連結するペプチジルリンカーなどのリンカーであり、Ｒ4Aは、Ｉｇ  Ｆｃ領域またはその機能性フラグメントを含む免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖定常領域部分である］。
【００７９】
一部の態様では、メディトープは、第１のメディトープであり、リンカーは、第１のリンカーであり、鎖は、下式を含む：
Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A−Ｌ3B−Ｒ3B（式ＩＩＩ）
［式中、Ｌ3Bは、Ｒ4AおよびＲ3Bを連結するペプチジルリンカーなどの第２のリンカーであり；Ｒ3Bは、第２のメディトープ（例えば、本明細書において提供するメディトープのいずれか）である］。一部の状況では、鎖は、下式を包含する：
Ｒ5A−Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A−Ｒ5B（式ＩＶ）または
Ｒ5A−Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A−Ｌ3B−Ｒ3B−Ｒ5B（式Ｖ）
［式中、Ｒ5AおよびＲ5Aのそれぞれは、テールもしくはリーダー配列、またはヌルであり、例えば、ヌルであるか、または０〜５０アミノ酸長さを含む配列である］。様々な成分が、アミド結合などによって、共有結合されてよい。
【００８０】
一部の場合には、多価メディトープを包含するメディトープ含有化合物、例えば、メディトープ−Ｆｃｓなどの提供する化合物のリンカー、例えば、Ｌ3A、Ｌ3B、またはその両方は、２５〜４０アミノ酸長さ、例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０（（もしくはその概数））以上、例えば、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０アミノ酸長さであり、かつ／または約２Å〜約２００Åの長さ、例えば、約５０Å〜約１５０Åの長さ、約５０Å〜約２００Åの長さ、約５０Å〜約３００Åの長さ、約１００Å〜約１４０Åの長さ、例えば、約１３０Å（（もしくはその概数））など、または１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００Å（（もしくはその概数））の長さである。
【００８１】
一部の態様では、リンカーを、標的である細胞表面上の２個の受容体の間の距離と同じか、またはほぼ同じである長さを有するように設計する。一部の実施形態では、受容体は、同じか、または異なってよい。例えば、２つの受容体は、異なるアミノ酸配列および／または異なるエピトープを含んでよい。一部の状況では、単一抗原上の異なるエピトープを認識する２つのｍＡｂは、相乗的に作用する（Ｋａｍａｔ，Ｖ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７、７２６〜７３３（２００８）を参照されたい）。一部の例では、メディトープ−Ｆｃなどの二価メディトープは、第２のモノクローナル抗体様分子として機能するが、任意のメディトープ利用可能抗体と対になり得る柔軟性を有し、したがって、一部の態様では、第２の治療用モノクローナル抗体を同定および開発するコストを低減する。一部の実施形態では、多価メディトープ変異体（価および／またはリンカーの幾何学的配置を改変することによって作成される）は、特異性および相乗効果をさらに増強する。したがって、一部の例では、リンカーの長さを、ＩｇＧ、例えば、全長ＩｇＧなどの抗体のＣＤＲの間の距離を模倣するか、またはそれに近いように設計する。
【００８２】
一部の態様では、多価メディトープを包含するメディトープ含有化合物、例えば、メディトープ−Ｆｃなど、提供する化合物のリンカー、例えば、Ｌ3A、Ｌ3B、またはその両方は、リソソームコンパートメントに存在するプロテアーゼのための切断部位などのタンパク質分解性切断部位、例えば、ＭＭＰ切断部位、ＡＤＡＭ切断部位、および／またはカテプシン切断部位を含む。
【００８３】
一部の態様では、多価メディトープを包含するメディトープ含有化合物、例えば、メディトープ−Ｆｃなど、提供する化合物のリンカー、例えば、Ｌ3A、Ｌ3B、またはその両方は、非構造化、無秩序、または相対的に非構造化もしくは無秩序リンカーである。一部の態様では、リンカーは、次の特性の１つまたは複数を有する：非構造化立体配座、配座異性柔軟性、増強された水溶性、高度なプロテアーゼ抵抗性、低い免疫原性、哺乳類受容体への低い結合、規定の荷電度、および増加した流体力学的（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）（またはストークス）半径。
【００８４】
一部の実施形態では、リンカーを、抗体／エピトープ相互作用、抗体／抗体相互作用、または抗体／メディトープ相互作用の立体障害を阻止するか、またはそれをもたらすように規則的に、または無作為に設計する。修飾例には、アミノ酸置換、付加、欠失、修飾が含まれる。一部の実施形態では、立体障害は、受容体がクラスター化、シグナル伝達することを、または受容体媒介性細胞内取り込み作用を受けることを阻止し得る。一部の実施形態では、立体障害の阻止によって、受容体はクラスター化し、シグナル伝達し得るか、または受容体媒介性細胞内取り込み作用を受け得る。
【００８５】
一部の態様では、リンカーを、ペプチドバックボーンの大きな配座異性自由度を有するなど、生理学的条件下で変性ペプチド配列のような挙動を有するように設計する。一部の例では、リンカーは本質的に、例えば、生理学的条件で、または水溶液中で、二次構造を欠いている。
【００８６】
所与のポリペプチドにおいて二次および三次構造の存在または非存在を識別するために、様々な方法が当技術分野において樹立されている。特に、二次構造を、分光測光法で、例えば、「遠ＵＶ」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）での円偏光二色性分光法で測定することができる。アルファ−へリックスおよびベータ−シートなどの二次構造要素はそれぞれ、特徴的な形状およびＣＤスペクトルの大きさをもたらす。また、米国特許出願公開第２００３０２２８３０９Ａ１号において記載されているとおりの周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｙ．ら（１９７４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２２２〜４５）およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズム（Ｇａｒｎｉｅｒ  Ｊ、Ｇｉｂｒａｔ  Ｊ  Ｆ、Ｒｏｂｓｏｎ  Ｂ．（１９９６）、ＧＯＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５４０〜５５３）などのある種のコンピュータープログラムまたはアルゴリズムによって、ポリペプチド配列について二次構造を予測することもできる。所与の配列では、多少の二次構造が存在するか、まったく存在しないかを、アルゴリズムによって予測することができ、それは、例えば、アルファ−へリックスまたはベータ−シートを形成する配列の残基の全部および／またはそのパーセンテージ、または無作為なコイル形成（二次構造を欠いている）をもたらすと予測される配列の残基のパーセンテージとして表される。
【００８７】
一実施形態では、リンカーは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定すると、０％〜約５％未満の範囲のアルファ−ヘリックスパーセンテージを有する。別の実施形態では、リンカーは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定すると、０％〜約５％未満の範囲のベータ−シートパーセンテージを有する。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定すると、０％〜約５％未満の範囲のアルファ−ヘリックスパーセンテージおよび０％〜約５％未満の範囲のベータ−シートパーセンテージを有する。一部の実施形態では、リンカーは、約２％未満のアルファ−ヘリックスパーセンテージおよび約２％未満のベータ−シートパーセンテージを有し、ＧＯＲアルゴリズムによって決定すると、ランダムコイル少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％など、ＧＯＲアルゴリズムによって決定すると、高い程度のランダムコイルパーセンテージを有する。例えば、一部の態様では、リンカーは、水溶液中または生理学的溶液中で三次構造を欠いているか、実質的に欠いている。一部の態様では、これは、ＧＯＲアルゴリズムによって決定すると、ランダムコイル形成９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％超、および／またはＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定すると、アルファへリックスおよび／またはベータシート５、４、３、２、もしくは１％未満、または０％、例えば、２％未満を有する。一部の態様では、（ｉ）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタマート（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）残基の合計は、リンカーの総アミノ酸残基の少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０％を構成し；リンカーは、少なくとも１個のプロリンを含有し、少なくとも１個のグルタマートを含有し、少なくとも１個のリシンを含有し、少なくとも１個のセリンを含有し、かつ／または少なくとも１個のグルタミンを含有し；リンカーは、アスパラギン残基（複数可）よりも多いグルタミン残基（複数可）を含有し；リンカーは、トレオニン残基よりも多いセリン残基（複数可）を含有し；リンカーは、トリプトファンを含有せず、チロシンを含有せず、フェニルアラニンを含有せず、システインを含有せず、イソロイシンを含有せず、ロイシンを含有せず、かつ／またはアスパラギンを含有せず；リンカーは、Ｗを含有せず；Ｙを含有せず；かつ／またはＦを含有せず；リンカーは、芳香族残基を含有せず；リンカーは、１個以下のＷ、Ｙ、および／またはＦを含有し、かつ／または１個以下の芳香族残基を含有し；リンカーは、ヒスチジンを含有せず、システインを含有せず、かつ／またはヒスチジンまたはシステインを含有せず；リンカーは、１個以下のヒスチジン、１個以下のヒスチジン、および／または１個以下のヒスチジンまたはシステインを含有し；かつ／またはリンカー中の大部分の残基は、荷電している。一部の態様では、リンカーを、血清プロテアーゼ（複数可）によって切断するための部位などのある種のプロテアーゼ切断部位の存在を回避するように、かつ／または免疫原性を回避するように設計する。
【００８８】
一部の態様では、リンカーを、非反復または相対的に非反復であるように設計する。用語「非反復性」は、ポリペプチドの文脈において本明細書において使用される場合、ペプチドまたはポリペプチド配列において内部相同性がないか、その程度が限られていることを指す。用語「実質的に非反復」は、例えば、その配列において、同一のアミノ酸種類である４個の連続アミノ酸の事例がほとんどないか、もしくはないこと；またはポリペプチドが３以下の平均サブ配列スコアを有すること；またはポリペプチド配列を構成する配列モチーフに、Ｎ末端からＣ末端への順でパターンが存在しないことを意味し得る。用語「反復性」は、ポリペプチドの文脈において本明細書において使用される場合、ペプチドまたはポリペプチド配列における内部相同性の程度を指す。対照的に、「反復性」配列は、短いアミノ酸配列の多数の同一のコピーを含有し得る。ポリペプチドの文脈では、配列は、規程されているか、もしくは変動可能な長さの短い配列の多数のコピー、またはモチーフ自体が非反復配列を有し、全長ポリペプチドを実質的に非反復にするモチーフを含有し得る。
【００８９】
ポリペプチドまたは遺伝子の反復性の程度は、コンピュータープログラムもしくはアルゴリズムによって、または当技術分野で公知の他の手段によって測定することができる。本開示では、本明細書において開示するリンカーなどの特定のポリペプチドの反復性の程度を計算する際に使用するためのアルゴリズムを開示する。一態様では、所定の長さのポリペプチドの反復性を、式１によって示される式に従って、計算することができる（本明細書において下記では、「サブ配列スコア」）：
【数１】
2017536091.tif 000003
［式中：ｍ＝（ポリペプチドのアミノ酸長さ）−（サブ配列のアミノ酸長さ）＋１；
Ｃｏｕｎｔi＝配列i内でのそれぞれ特有のサブ配列の出現の累積数］。特定のペプチド配列のサブ配列スコアを計算するための例は、その開示があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／００１７９９７号において提供されている。
【００９０】
一部の態様では、これは、アミノ酸がセリンまたはグリシンでない限り、同一の３個の連続アミノ酸を含有しないか、または１０、９、８、７、６、５、４、３、または２未満のサブ配列スコアを有するか、またはグリシンおよびセリン以外の少なくとも１個の残基を含有する。一部の態様では、リンカーは、任意の血清プロテアーゼのためか、または血液凝集経路ファミリーのタンパク質、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩａ、ＸＩａ、Ｘａ、ＩＸａ、およびＶＩＩａ因子、トロンビン、血漿カリクレイン、活性化ＰＣ、プロトロンビナーゼ、ｈＫ１、ＰＳＡ／ｈＫ３、ｈＫ１０、ｈＫ１５、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、Ｈａｇｅｍａｎ因子（凝固因子ＸＩＩ）、因子Ｘａ、ＡＤＡＭＴＳ１３、フォンヴィレブランド因子−切断プロテアーゼ（ＶＷＦＣＰ）、プロテアーゼネキシン２、プラスミン、トリプシン、α−キモトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９、エラスターゼ、ＭＡＳＰ−１（マンノース−結合性レクチン−関連セリンプロテアーゼ−１）、ＭＡＳＰ−２、ＭＡＳＰ−３、カテプシンＫ、カテプシンＢ、ストレプトキナーゼ、血漿プロカルボキシぺプチダーゼＢ、トロンビン活性化フィブリン溶解阻害薬（ＴＡＦＩ）、プラスミノーゲン活性化因子ファミリー（組織プラスミノーゲン活性化因子、尿プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）など）、ウロキナーゼ、補体コンバターゼファミリータンパク質、因子Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、因子Ｄ、ならびにＣ４ｂ・２ａ、Ｃ３ｂ・Ｂｂ、およびＣ３ｂ・Ｂｂ・Ｃ３ｂなどのＣ３コンバターゼの１種もしくは複数またはいずれかのための切断部位を含有しない（またはそれによって切断されない）。
【００９１】
提供するリンカーのうちには、配列番号１９９、２００、２０１、２０２、２０３、もしくは２０４として示されるアミノ酸配列、または残基のいずれか１個、２個、３個、もしくは４個が、リジン残基などに代わって、コンジュゲートされたアミノ酸で置換されていてもよいその修飾変異体を有するものがある。
【００９２】
一部の実施形態では、Ｔ細胞エピトープ（複数可）の可能性を最小限にすることなどによって、潜在的な免疫原性を回避するか、または減少させるように、リンカーを設計する。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に提示するための、所与のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの能力は、ペプチドの一次配列を包含するいくつかの因子に依存している。一態様では、本開示のペプチドまたはリンカーは、その配列がＡＰＣにおける抗原プロセシングに対して抵抗性であるので、低い免疫原性度を有する。別の態様では、本開示のペプチドまたはリンカーは、ＭＨＣ受容体に実質的に結合しないか、または免疫応答を誘発するために十分な程度ではＭＨＣ受容体に結合しない配列を有する。本開示は、リンカー、およびリンカーを含むペプチドを提供し、そのリンカーおよびペプチドは、一次配列において実質的に非反復性であり、ＭＨＣ  ＩＩ受容体との結合を減少させるように設計される。他の態様では、本開示のペプチドおよびリンカーは、Ｔ細胞受容体または抗体結合のためのエピトープを形成せず、低い免疫原性度をもたらす。一態様では、免疫原性の回避は、少なくとも部分的に、リンカー配列の配座異性柔軟性の結果；すなわち、アミノ酸残基の選択および順序による二次構造の欠如に寄与し得る。例えば、水溶液中、または生理的条件下でコンパクトに折り畳まれた立体配座に適合する傾向を有する配列は、水溶液中、または生理的条件下でコンパクトに折り畳まれた立体配座に適合する傾向が相対的に低い配列よりも、配座エピトープをもたらす可能性が高い。従来の治療実施および投与を使用しての、本開示のリンカーを含む融合タンパク質の投与は一般に、リンカー配列に対する中和抗体の形成をもたらさないであろう。一態様では、例えば、リンカーがメディトープに連結して融合している場合には、低免疫原性のリンカー配列は、融合パートナーの免疫原性を減少させる。
【００９３】
一実施形態では、リンカーは、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープを含有してもよいし、または実質的に含有しなくてもよい。より低い免疫原性タンパク質を生じさせる目的でのそのようなエピトープの除去は、以前に開示されており；例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ９８／５２９７６、ＷＯ０２／０７９２３２、およびＷＯ００／３３１７を参照されたい。同じ原理、例えば、エピトープの同定を使用して、そのようなエピトープをリンカーに導入することができる。ヒトＴ細胞エピトープのためのアッセイは、記載されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，Ｍ．ら、（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８１：９５〜１０８）。Ｔ細胞エピトープまたは非ヒト配列の作成を伴うか、または伴わずにオリゴマー化することができるペプチド配列が、特に重要である。これは、Ｔ細胞エピトープの存在について、および非ヒトの６〜１５マーおよび、特に、９マー配列の出現について、これらの配列の直接的な繰り返しを試験し、次いで、エピトープ配列を包含するか、または除去もしくは破壊するように、リンカー配列の設計を改変することによって達成される。一部の実施形態では、リンカー配列は、ＭＨＣ受容体に結合すると予測されるリンカーのエピトープの数の制限によって、実質的に非免疫原性である。ＭＨＣ受容体に結合することができるエピトープの数を制限することで、Ｔ細胞活性化の可能性、さらには、Ｔ細胞ヘルパー機能が随伴して低下し、Ｂ細胞活性化またはアップレギュレーションが低下し、抗体産生が低下する。予測されるＴ細胞エピトープの低度は、例えば、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ら、（１９９９）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７：５５５〜６１）などのエピトープ予測アルゴリズムによって決定することができる。Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：５５５）において開示されているとおり、タンパク質内の所与のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、複数の最も共通するヒトＭＨＣ対立遺伝子に対するそのペプチドフレームの結合のＫd（解離定数、親和性）のｌｏｇである。スコアは、少なくとも２０ｌｏｇ超で、約１０から約−１０までの範囲であり（１０ｅ10Ｋd〜１０ｅ-10Ｋdの結合制限に対応する）、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆなどの、ＭＨＣ上でペプチド提示中にアンカー残基として役立つ疎水性アミノ酸を回避することによって減少させることができる。一部の実施形態では、リンカー配列は、約−５、または−６、または−７、または−８、または−９のＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値スコア、または−１０のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの予測Ｔ細胞エピトープを有しない。本明細書において使用される場合、「−９」のスコアは、−５のスコアよりもストリンジェントなＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値である。
【００９４】
９マーペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ［Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ら、（１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７：５５５］によって記載されているとおりに、ポケットポテンシャルを付加することによって計算することができる。この方法によって計算されるＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、およそ−１０〜＋１０の範囲である。しかしながら、Ｐ１位に疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ）（配列番号２４０）を欠いた９マーペプチドは、−１００９〜−９８９の範囲の計算されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを有する。この値は、生物学的に意味がなく、疎水性アミノ酸が、ＨＬＡ結合のためのアンカー残基として役立ち、かつＰ１に疎水性残基を欠いたペプチドは、ＨＬＡに対するバインダーとは判断されないという事実を反映している。
【００９５】
一部の実施形態では、リンカーは、例えば、エピトープ同定プログラムまたアルゴリズムによって予測されるとおり、いくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有すると予測されるか、または予測されない。一実施形態では、本開示のリンカーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のＭＨＣクラスＩＩエピトープを有するか、または有すると予測される。別の実施形態では、本明細書において開示するリンカーは、約２以下、約３以下、約４以下、約５以下、約６以下、約７以下、約８以下、約９以下、約１０以下、約１１以下、約１２以下、約１３以下、約１４以下、約１５以下、約１６以下、約１７以下、約１８以下、約１９以下、約２０以下、約２１以下、約２２以下、約２３以下、約２４以下、約２５以下、約２６以下、約２７以下、約２８以下、約２９以下、または約３０以下のＭＨＣクラスＩＩエピトープを有するか、または有すると予測される。
【００９６】
一部の実施形態では、リンカーは、Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．およびＲａｇｈａｖａ，Ｇ．Ｐ．Ｓ．（２００１）、ＰｒｏＰｒｅｄ：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１７（１２）：１２３６〜３７において記載されているＰｒｏＰｒｅｄツールによって予測されるとおり、いくつかの予測ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有してもよいし、または含有しなくてもよい。ＰｒｏＰｒｅｄは、抗原タンパク質配列においてＭＨＣクラスＩＩ結合領域を予測するためのグラフィカルウェブツールである。一態様では、ＰｒｏＰｒｅｄツールを使用するＭＨＣクラスＩＩエピトープの予測は、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ、Ｔ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９９）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７：  ５５５に由来する定量マトリックスを利用する。
【００９７】
加えて、リンカー配列中の非反復配列および対応するエピトープの欠如は、リンカーに結合するか、またはリンカーによって活性化されるＢ細胞の能力を限定または増強する。反復配列は認識され、少数のＢ細胞とでも多価接触を形成し得、複数のＴ細胞独立受容体の架橋の結果として、Ｂ細胞増殖および抗体産生を刺激し得る。対照的に、リンカーは、その延長配列にわたって多くの異なるＢ細胞と接点を作成し得るが、それぞれ個々のＢ細胞は、配列の反復性の欠如によって、個々のリンカーと１つまたは少数の接点しか作成し得ない。一実施形態では、本開示のリンカーは典型的には、Ｂ細胞の増殖、したがって、免疫応答を刺激するかなり低い傾向を有する。一実施形態では、リンカーに融合したメディトープは、リンカーに融合していない対応するメディトープと比較すると、低い免疫原性を有する。
【００９８】
一実施形態では、非反復リンカーは典型的には、高度な反復性を有するリンカーよりも弱い接点を抗体と共に形成する。抗体は、多価分子であり、例えば、ＩｇＧは、２つの同一な結合性部位を有し、ＩｇＭは、１０の同一な結合性部位を含有する。したがって、反復性配列に対する抗体は、高い結合活性で、そのような反復配列との多価接点を形成することができ、そのことは、そのような反復配列の効力および／または除去に影響を及ぼし得る。対照的に、非反復リンカーに対する抗体はおそらく、一価相互作用のみをもたらし、非反復リンカーを含むペプチドが長期間、循環中に残存し得るように、免疫クリアランスのより低い可能性をもたらす。
【００９９】
例えば、ＭＨＣクラスＩエピトープを予測するためのアルゴリズムを使用して、リンカー配列を、ＭＨＣクラスＩエピトープの候補を同定するために評価することができる。所与のポリペプチドにおいて、潜在的なＭＨＣクラスＩエピトープ、すなわち、ＭＨＣクラスＩ分子上で表示され得るエピトープを同定するために、多くの異なる予測プログラムが利用可能である。いくつかの例示的なアルゴリズムが、その開示があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０５１５５５において記載されている。エピトープ同定プログラムの例は、次の機構および施設のウェブサイトにおいて見出すことができる：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｄｉａ）、Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．およびＲａｇｈａｖａ、Ｇ．Ｐ．Ｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２；１９（８）：１００９〜１４（２００３）において記載されているとおりのＰｒｏＰｒｅｄ−Ｉツール。Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ  Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）５０：２１３〜２１９において記載されているとおりのＳＹＦＰＥＩＴＨＩ。Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ。例えば、Ｋｉｍ  Ｙ、Ｓｉｄｎｅｙ  Ｊ、Ｐｉｎｉｌｌａ  Ｃ、Ｓｅｔｔｅ  Ａ、Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ．、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １０：３９４（２００９）を参照されたい。Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ。例えば、Ｊ．Ｈａｋｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｎｕｓｓｂａｕｍ、Ｈ．Ｓｃｈｉｌｄ、Ｈ．−Ｇ．Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ、Ｃ．Ｋｕｔｔｌｅｒ、Ｈ．−Ｇ．Ｈｏｌｚｈｕｅｔｔｅｒ、Ｐ．−Ｍ．Ｋｌｏｅｔｚｅｌ、Ｓ．Ｈ．Ｅ．Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｈ．−Ｊ．Ｍｏｌｌｅｎｋｏｐｆ（２００３）  ＭＡＰＰＰ  −  ＭＨＣ−Ｉ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２（３）：１５５〜１５８を参照されたい。Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ、Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  Ｃ、Ｌｕｎｄ  Ｏ、Ｋｅｓｍｉｒ  Ｃ．、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５７（１−２）：３３〜４１、２００５において記載されているとおりのＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ、ＮｅｔＣｈｏｐ  Ｓｅｒｖｅｒ。
【０１００】
これらの予測ウェブサイト内で使用されるアルゴリズムは、同じサイトにおいて見出すことができる。以下は、適切な予測アルゴリズムを記載している参照文献の非排他的リストである：Ｐａｒｋｅｒら（１９９４）  Ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｒａｎｋｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＨＬＡ−Ａ２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２、１６３〜１７５；Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ  Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら（１９９９）ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０：２１３〜２１９；Ｒｅｃｈｅら（２００２）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｍｏｔｉｆｓ．  Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６３（９）：７０１〜９；Ｇｒｅｅｎｂａｕｍら（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ２０（２）：７５〜８２。
【０１０１】
一実施形態では、本開示のリンカーは、ＭＨＣ受容体のためのいずれのエピトープも含有しない。一実施形態では、本開示のリンカーは、いずれのＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩエピトープも含有しない。別の実施形態では、本明細書において開示するリンカーは、例えば、エピトープ同定プログラムまたはアルゴリズムによって予測すると、いずれの予測ＭＨＣクラスＩエピトープも含有しない。一実施形態では、本開示のリンカーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のＭＨＣクラスＩエピトープを有するか、または有すると予測される。別の実施形態では、本明細書において開示するリンカーは、約２以下、約３以下、約４以下、約５以下、約６以下、約７以下、約８以下、約９以下、約１０以下、約１１以下、約１２以下、約１３以下、約１４以下、約１５以下、約１６以下、約１７以下、約１８以下、約１９以下、約２０以下、約２１以下、約２２以下、約２３以下、約２４以下、約２５以下、約２６以下、約２７以下、約２８以下、約２９以下、または約３０以下のＭＨＣクラスＩエピトープを有するか、または有すると予測される。
【０１０２】
提供するメディトープおよび化合物の定常領域部分、例えば、Ｒ4Aは一般に、ＩｇＧ分子などのＩｇ分子、またはその機能性部分のＦｃ領域に存在する１つまたは複数の定常領域を包含する。一部の態様における部分は、可変領域ドメインまたはその機能性フラグメントを包含しない。例えば、一部の状況では、定常領域部分は、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３の１つまたは複数を含有する。一部の例では、定常領域部分は、ＣＨ４をさらに包含してよい。一部の場合には、部分は、ＣＨ３のみを包含し、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ４部分を包含しない。例示的な定常領域部分は、２０５および２０６、ならびに例えば、いずれか１個、２個、３個、または４個のアミノ酸が、リシン残基での置換など、コンジュゲートアミノ酸で置換されているその修飾変異体を包含する。
【０１０３】
一部の実施形態では、リンカーは、誘導体化するために、例えば、例えば、スキャフォールドまたはリンカーを介して、診断剤、例えば、イメージング剤または治療剤などの薬剤に多価メディトープをコンジュゲートするために使用することができる反応性官能基を含有する。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、スキャフォールド、リンカー、または薬剤のコンジュゲーションにおいて有用なリシン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ＦＧＥ配列、または非天然アミノ酸を包含する１つまたは複数のコンジュゲーション部位を含む。一部の実施形態では、コンジュゲーション部位の数および場所を、コンジュゲーション部位を付加または除去することによって制御し、それによって、後でコンジュゲートされる薬剤の量または場所を制御することができる。一部の実施形態では、ＰＡＳ化配列、ソルターゼ配列、またはインテイン配列を含むリンカーはさらに、１つまたは複数のコンジュゲーション部位を含む。例えば、一部の実施形態では、多価メディトープは、例えば、リンカー中を包含して、１つまたは複数のＰＡＳ化配列を含む。ＰＡＳ化配列は、規定の、またはランダムな配列中にプロリン、アラニン、およびセリンを含み得る。したがって、ＰＡＳ化配列は、中性および疎水性アミノ酸を含むペプチドを包含し得る。配列番号２３１は、例示的な三価メディトープを開示している。ＰＡＳ化を含む配列は、Ｍｏｒａｔｈら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ、２０１５年５月４日；１２（５）：１４３１〜４２において記載されている。ＰＡＳ化は、薬物送達を改善し、血漿半減期を延長し得る。例えば、ＰＡＳ化は、タンパク質の流体力学的体積を増加させ得て、循環を延長し、かつ／または腎臓濾過前の生体活性を増進させる。
【０１０４】
一部の実施形態では、チオール官能基を、リンカー上の任意の適切な位置に導入することができ、イメージング剤、他のタンパク質およびペプチド、金属キレート剤、ｓｉＲＮＡ、ナノ粒子、細胞傷害性薬物などの診断剤または治療剤を含有するいくつかの外部試薬を使用して選択的に修飾することができる。
【０１０５】
例えば、一部の実施形態では、メディトープ、例えば、多価メディトープは、配列番号５７、５８、５９、６４、２５０、２５１、２５２、もしくは１９２のアミノ酸配列、または残基の任意の１個、２個、３個、または４個がリシンなどのコンジュゲートされるアミノ酸で置換されていてもよいその修飾変異体を有する１つまたは複数の鎖（例えば、ポリペプチド鎖）を有する。一部の実施形態における鎖は、金属イオンに結合する金属キレート剤、小分子、化学療法剤、治療用抗体もしくはその機能性フラグメント、毒素、放射性同位体、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、有機もしくは無機ナノ粒子、ＲＮＡｉ分子、ｓｉＲＮＡ分子、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、色素、蛍光もしくは発光物質、酵素、増感剤、放射性物質、またはキレート剤を含むコンジュゲートされるペプチジル部分である。
【０１０６】
一部の実施形態では、多価メディトープを環状化してよい。環状化多価メディトープは、線状多価メディトープよりも安定であるか、またはより限定された幾何学的配置を有し得る。環状化多価メディトープは、より急速なクリアランスを包含する、線状多価メディトープを上回る異なる機能特性も有し得る。一部の実施形態では、多価メディトープは、多価メディトープの環状化またはメディトープの線状鎖の作成を助け得る１つまたは複数のソルターゼまたは「インテイン」配列を含む。一部の実施形態では、多価メディトープのリンカーは、ソルターゼまたはインテイン配列を含む。インテイン配列は、Ｓｓｐ  ＩcおよびＳｓｐ  ＩN配列を包含し、Ｓｃｏｔｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、１９９９年１１月２３日；９６（２４）：１３６３８〜４３において記載されている。配列番号２３１は、配列番号２３１の１１８および１１９位に「ＧＧ」配列、ならびに２５４〜２５８位に「ＰＥＴＧ」ソルターゼ配列を含むスプリットソルターゼ配列を含む。一部の実施形態では、ソルターゼ配列は、配列ＬＰＸＴＧ（配列番号２４９）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸を含む。ソルターゼ配列は、Ａｎｔｏｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００９年６月５日；２８４（２３）：１６０２８〜３６において記載されている。配列番号２３７〜２３９は、追加の例示的な多価メディトープペプチドを開示している。
【０１０７】
一部の態様では、多価メディトープの鎖は第１の鎖であり、メディトープはさらに、例えば、式Ｒ3A−Ｌ3A−Ｒ4A（式Ｉ）またはＲ3A−Ｌ3A−Ｒ4A−Ｌ3B−Ｒ3B（式ＩＩＩ）を有する、本明細書において上記したとおりの鎖などの第２の鎖を包含する。
【０１０８】
一部の実施形態では、リンカーの組成および／またはＦｃとメディトープとの間の距離を、例えば親和性および特異性を最適化するために体系的に改変する。一実施形態では、各天然または非天然残基を、最適化のために、リンカー内の任意の位置で置換することができる。一部の態様では、リンカーは、２〜１００（またはその概数）残基長さ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００（またはその概数）残基（アミノ酸）長さ、あるいはそれ以上である。一例では、現在および未来のＤＮＡシンセサイザーを使用して、そのようなリンカーを作成し、メディトープとＦｃ領域との間に挿入する。このリンカーをまた、回転半径を制限し、かつＦｃ−メディトープの親和性および特異性を増強するために「硬直化（ｒｉｇｉｄｉｆｉｅｄ）」することもできる。例えば、多重コイルドメインを、メディトープとＦｃとの間に設けることができる（図３）。他の例では、不活性タンパク質ドメイン（例えば、免疫グロブリンフォールド）をリンカーの代わりに用いる。多数の免疫グロブリンフォールドを、メディトープとＦｃドメインとの間に設けることができる。ある種の実施形態では、リンカーの組成は、あり得る抗原性を緩和するために、ヒト由来のものである。
【０１０９】
一部の例では、例えば、選択性および結合親和性の増強のために、提供するメディトープをスキャフォールドにテザーして、多価メディトープを作成する。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原に結合するメディトープ利用可能ｍＡｂにスキャフォールドを設け、それを「デイジーチェーン」して、リガンド拮抗作用を増強し、受容体細胞内取り込み作用を改変し、かつ／またはＡＤＣＣ／ＣＤＣを介する免疫応答を改善するために、多価メディトープスキャフォールドを使用する（図１を参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、２つ以上の抗体またはその機能性フラグメントをテザーするために、メディトープを使用する。そのようなメディトープは、例えば、癌または腫瘍の治療およびイメージングを増強するための多価メディトープの一部であってよい。多価メディトープには、多価メディトープテザリング体を作るために、リンカー（複数可）を介して、例えば長いリンカーおよびビオチンを介してストレプトアビジンにカップリングしている２つ以上のメディトープを包含し得る。
【０１１０】
一実施形態では、多価メディトープテザリング体は、四価メディトープテザリング剤である。一態様では、四量体テザリング体は、表面プラスモン共鳴によって、一価ペプチドと比較して、抗体への結合の増大を有することが示されており、このことは、多価相互作用と一致する。一例では、そのような多価メディトープ（例えば、四価メディトープ）の使用は、抗体単独または一価メディトープ単独の使用と比較して、抗原へのメディトープ利用可能抗体の結合親和性（例えば、セツキシマブの場合には、ＥＧＦＲ陽性細胞に対する結合親和性）の増大をもたらす。そのような結合親和性は、よく知られている方法を使用して、例えば、ＦＡＣＳ分析によって決定することができる。図４を参照されたい。
【０１１１】
一部の実施形態では、リンカー上での受容体の制約に対処するために、未修飾か、または修飾されている、例えば、変異型の、例えば、最適化されているメディトープを、リンカーを最適化することなどによって、多価スキャフォールドにカップリングさせる。一部の態様では、多価メディトープを隣接する抗体、例えば、ＩｇＧに「ラッチ−オン（ｌａｔｃｈ−ｏｎ）」して、「デイジーチェーン」様配列を形成することができ（図１を参照されたい）、これは、例えば腫瘍抗原を標的化している抗体において、腫瘍細胞の抗原密度が高い場合に使用することができる。二価メディトープおよび抗体の分子内会合が可能である一方で、抗体、例えば、ＩｇＧのＣ２対称性が、そのような相互作用について、リンカーに幾何形状的制約を課し得る。したがって、一部の態様では、多価メディトープは三価以上のスキャフォールドに基づき、１個超の抗体が「デイジーチェーン」されるであろうことを保証する。第３のメディトープアームを包含することによって、三価メディトープと抗原結合抗体との当初遭遇の寿命が延長され得る。このことは次いで、その追加のアームが隣接する抗原結合抗体に結合して、複合体全体を安定化させる確率を上昇させ得る。他の実施形態では、メディトープ利用可能抗体および他の標的、例えば他のＢ細胞およびＴ細胞表面タンパク質、例えばＴ細胞受容体および同時刺激分子に同時に結合する多官能化メディトープを構成することができる。一部の実施形態では、異なるメディトープについて特異性を有する複数のメディトープ利用可能抗体（例えば、１つまたは複数の修飾メディトープ利用可能抗体を包含）をそのような異なるメディトープと一緒に、そのような多価実施形態で使用する。
【０１１２】
様々なリンカーおよびスキャフォールドが当技術分野では知られており、これらの実施形態に関連して使用することができる。例示的なスキャフォールド合成スキームを図５に示し、かつ本明細書中の実施例において検討する。一部の態様では、図５に示されているテンプレート４および５の使用によって、二価および三価メディトープの両方の形成がそれぞれ可能となる。一部の実施形態では、例えば、結合または他の特性を改善または改変するために、種々の長さのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／または他のリンカーを使用する。一部の態様では、ＰＥＧ長さは、１０（またはその概数）Ａ〜１０００（またはその概数）Ａまたはその付近である。合成手法は、放射性核種イメージング用のＤＯＴＡを組み込むためにも適している。例えば、ＦＩＴＣ標識二価メディトープ、すなわち化合物１３の合成では、３０ÅのＰＥＧ二官能性アームが組み込まれている（図５）。一部の例におけるＩｇＧ内のＣＤＲ領域間の距離は、約１３０Åである。距離は、例えば、約５０Å〜約１５０Åの長さ；または約５０Å〜約２００Åの長さ、または約１００Åおよび約１４０Åの長さ、例えば、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００Åの長さ（もしくはその概数）などで変動し得る。この手法が最適であることを保証するために、ＰＥＧリンカーの長さを体系的に変えることができる。市販のＰＥＧのエンドツーエンド距離は、９０Åに達し、これは、ＩｇＧ距離を超えるであろう。
【０１１３】
他の実施形態では、例えば、高親和性多価メディトープを作成し、かつ／または相乗作用をもたらすために、他のスキャフォールドおよび／またはリンカーを使用する。例えば、ＤＮＡを、より硬直したスキャフォールドを作るためのメディトープ用のスキャフォールドとして使用することができる。例えば、多価を達成するために、生物および化学由来の種々のスキャフォールドも使用することができる。これには、これらに限定されないが、二価または三価スキャフォールドの構築、四価スキャフォールドとしてストレプトアビジン（欧州特許出願公開第２０６５４０２（Ａ１）号を参照されたい）またはストレパビジン、独自のスキャフォールド（Ｈｕｔｃｈｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  ＪＭＢ４０６：４，５９５（２０１１））、Ｏｒｉｇａｍｉ  ＤＮＡ（Ｇｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４、２４５〜２４８（２００９）を参照されたい）などの使用が包含される。これらに限定されないが、ＤＮＡ（一本鎖、二重鎖、Ｈｏｌｌｉｄａｙジャンクション、アプタマーなど）、ＲＮＡ（一本鎖、ヘアピン、ステムループ、アプタマーなど）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、硬直のためのＤＮＡ／ＰＮＡ二重鎖および三重鎖、有機およびまたは無機ナノ粒子（直接カップリングしているか、またはＰＥＧなどの有機ポリマーを介してカップリングしている）、それ自体と、および／またはＤＮＡもしくはＰＮＡと二重鎖を形成し得る有機ポリマーを包含する分子を使用して、化学的スキャフォールドを作ることもできる。
【０１１４】
多価メディトープのキャラクタリゼーション
例えば、多価スキャフォールドへのコンジュゲーションが、メディトープ−Ｉｇ相互作用に影響を及ぼさないことを保証するために、ＳＰＲおよびＩＴＣを包含するいくつかの知られている方法のうちのいずれかによって、メディトープ利用可能抗体への多価メディトープの結合特性をキャラクタライズすることができる。これらの手法が一般的に、細胞表面上に（腫瘍細胞の表面上などに）存在する抗原に関連していない場合、場合によっては、そのような測定は、多価および相乗効果を決定するその能力において制限を受け得る。したがって、一部の態様では、ＦＡＣＳ分析および／または細胞生存率アッセイを使用して、メディトープ利用可能抗体（例えば、セツキシマブの状況では、ＥＧＦＲを過剰発現する細胞）が認識する抗原を発現する細胞そのものに対する多価メディトープの作用を定量する。一般に、メディトープ利用可能抗体が認識する抗原を発現（例えば、過剰発現）する細胞系をメディトープ利用可能抗体と共に、抗体が、細胞上に発現されている抗原に結合する条件下でインキュベートする。場合によっては、様々な濃度の抗体を使用する。同時にか、またはその後に、細胞を多価メディトープと共に、場合によっては濃度を変えてインキュベートする。適切なインキュベーション時間および洗い出しを実施する。第２の抗体および一価メディトープを、陽性対照および陰性対照としてそれぞれ使用することができる。抗体およびメディトープを、よく知られているフローサイトメトリーまたは顕微鏡によって検出可能な薬剤で標識することもできる。一部の例では、一価メディトープと比較して、多価メディトープの存在下でのシグナルのシフト（ＦＡＣＳの場合）または上昇は、相乗作用または相加作用を示している。他の例では、多価メディトープの相加作用をさらに確認するために、非標識の一価メディトープを競合アッセイで使用して、それが、抗原結合したメディトープ利用可能抗体について、標識された多価メディトープと競合し得るかどうかを決定する。
【０１１５】
他の例では、細胞生存性アッセイを使用して、メディトープ利用可能抗体の細胞死滅効果を増強する多価メディトープの能力を決定する。例えば、目的の抗原を発現する細胞を、メディトープ利用可能抗体および／または多価メディトープの濃度を変えながらインキュベートすることができる。一価メディトープおよび第２抗体を再び、対照として使用することができる。一部の例では、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を使用して、生細胞の数またはパーセンテージを定量する。細胞生存性、増殖、および／または死を測定するための他の手法が当技術分野では知られており、それらを使用することもできる。
【０１１６】
他の例では、そのようなアッセイにおいて活性を実証する多価メディトープについて、ウェスタンブロット分析または他の生化学的手法またはシグナル伝達による手法を行って、細胞表面受容体などの特定の抗原に関連するシグナル伝達の阻害を調査する（例えば、セツキシマブの場合には、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の一部であるＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ＭＡＰのリン酸化状態を追跡する）。そのような研究からのデータを、メディトープ利用可能抗体のみ（すなわち、メディトープなし）、一価メディトープで、かつ／またはチロシンキナーゼまたは他の既知の阻害剤（ＡＧ１４７８など）で処置された細胞からのデータと比較することができる。一部の例では、多価メディトープ濃度を関数として細胞死の上昇が観察されるが、このことは、多価メディトープの相乗的細胞死滅効果を実証している。
【０１１７】
Ｉ．変異型メディトープ
提供するメディトープのうちには、メディトープ１または２（配列番号１または２のメディトープ）と比較して１つまたは複数の修飾、例えば、構造的修飾を有するメディトープ変異体（変異型メディトープとも呼ばれる）があり、かつそれらを生産する方法を提供する。一部の実施形態では、ｃＱＦＤおよびｃＱＹＮメディトープを、メディトープ変異体を設計する際の出発点として使用する。一部の態様では、例えば、未修飾のメディトープ、ｃＱＦＤおよびｃＱＹＮと比較して、セツキシマブおよび本明細書において記載されている他の抗体を包含する１つまたは複数の提供するメディトープ利用可能抗体についての親和性の上昇または改変、ｐＨ依存性の改変、または異なる生理学的条件下での異なる親和性などの改変された特性を有するように、メディトープ変異体を設計する。様々な化学的および生物物理的方法を使用して、メディトープ変異体を設計および生産する。
【０１１８】
メディトープ変異体には、これらに限定されないが、メディトープ、例えば、ｃＱＦＤおよびｃＱＹＮならびに本明細書において記載されている他のものなどに修飾が組み込まれている変異体が包含される。適切な修飾には、これらに限定されないが、ペプチド環化の様式および／または位置に対する修飾、環式ペプチドの１つもしくは複数のアミノ酸成分に対する修飾、または環式ペプチドへの１つもしくは複数のアミノ酸の付加もしくはそれらからのアミノ酸の欠失などの、当技術分野で知られている任意のペプチド修飾が包含されるが、これらに限定されない。特定の例では、ｃＱＦＤを、以下の修飾のうちの１つまたは複数で改変することができる：Ａｒｇ８の修飾、Ｐｈｅ３の修飾、Ｌｅｕ５の修飾、Ｌｅｕ１０の修飾、ペプチド環化の様式の変更、および／または１つもしくは複数の位置での水和可能カルボニル官能基の組み込み、および１つもしくは複数のアミノ酸欠失もしくは付加。ｃＱＹＮの場合には、適切な修飾には、以下のうちの１つまたは複数が包含され得る：Ａｒｇ８の修飾、Ｌｅｕ５の修飾、Ｌｅｕ１０の修飾、ペプチド環化の様式の変更、および／または１つもしくは複数の位置での水和可能カルボニル官能基の組み込み、および１つもしくは複数のアミノ酸欠失もしくは付加。メディトープ内の一定のアミノ酸位置を欠失させるか、または異なる天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸で置き換えることができるか、あるいは、例えば「クリック化学」を使用することによって、メディトープをフラグメントと化学的にコンジュゲートさせることができる。配列番号１のＡｒｇ９がシトルリンに変異しているメディトープは、セツキシマブに結合することが、本明細書では示されている。加えて、アミノおよびカルボキシ末端をさらなるアミノ酸で、メディトープ変異体の環式部分より先まで（すなわち、それに加えて）伸長して、Ｆａｂに追加的に接触させることができる。例えば、プロテインＬをｃＱＦＤメディトープのＣ末端に加えたところ、先行データによって、これは、かなり高い親和性で結合することが示されている。
【０１１９】
一部の実施形態では、メディトープには、表１および２に列挙されているもの、さらには１６アミノ酸長さまでのものなど、追加のアミノ酸を含むそのようなメディトープが包含される。例えば、一部の態様では、メディトープは、第１の残基の前、すなわち、０位にセリンをさらに包含するメディトープ１、２、または１５〜５５のうちの一つである。表１に列挙されているメディトープは、ＣおよびＮ末端を接続するために、ジスルフィド結合を使用するが、ただし、ある種のメディトープが、テールまたはリーダーなどの追加の配列を含有して、結合が２つの末端残基の間にない場合を除く。例示的なテールおよびリーダー配列は、本明細書においてＲ5AおよびＲ5Bとして示されるテールなどの、１〜４０、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、９、８、７、６、５、４、３、または２アミノ酸長さなどの１〜５０アミノ酸長さを有するものである。例示的なテールおよびリーダー配列は、いずれか１つまたは複数のＧ、Ｓ、Ｐ、Ｋ、および／またはＤ残基（複数可）を含有する。例示的なテールおよびリーダーは、ＧＧＧＳＫ、Ｇ、ＧＰＧＧＳＤＰＧ、およびＧＰＧＧＳＤＰＧを包含する。例えば、配列番号３１を有するメディトープは、追加のテールを含有したが、これは、ジスルフィド結合が、２つの末端残基の間にないことを意味した。同様に、表中のある種の他のメディトープ（配列番号１８７〜１９０、２０７）は、テールおよび／またはリーダーを含有し、末端残基以外の残基の間に結合が生じている。表２のペプチドでは、ラクタム架橋、ジスルフィド以外の結合（［３＋２］付加環化など）または結合なしが利用されている（例えば、非環式または線状変異体）。本明細書において記載されている実施形態に従って使用することができる追加のメディトープには、本明細書において定義されるとおりの任意のメディトープ、セツキシマブまたは任意の他の治療用抗体の抗体フレームワーク結合インターフェース（すなわち、Ｆａｂ軽鎖および重鎖の間）に結合するペプチドが包含される。例えば、環式ペプチドｃＱＦＤおよびｃＱＹＮに加えて、一部の実施形態は、ｃＱＦＤおよびｃＱＹＮの１つまたは複数の変異体を包含する。
【０１２０】
【表１】
2017536091.tif 000004
【０１２１】
【表２】
2017536091.tif 000005
【０１２２】
メディトープ変異体は典型的には、５〜１６アミノ酸長さ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６アミノ酸長さ、例えば８〜１３アミノ酸長さ、例えば、９〜１２アミノ酸長さのアミノ酸配列長さを有する。加えて、メディトープは、（例えば、融合タンパク質またはペプチドの一部としての）他の分子、例えば、リンカーまたは薬剤を包含する他のペプチドとコンジュゲートまたは会合していてよい。したがって、この場合、メディトープを含有する化合物は、このパラグラフに記載されている長さを超える追加のアミノ酸残基を含有することがあり、その際、メディトープ部分が、５〜１６アミノ酸を含有し、複合体または化合物が追加のアミノ酸を含有する。例は、本明細書において記載されており、例えば、上記の配列番号３１である。
【０１２３】
一部の実施形態では、変異型メディトープは環式ペプチドである。他の実施形態では、それらは、線状または非環式ペプチドである。
【０１２４】
メディトープは、例えば、下式を有するペプチドまたはそのようなペプチドに由来する環式ペプチドを包含し得る：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２（式ＶＩ）
［例えば、式中：
Ｘ１＝Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、β−アジドアラニン、またはヌル；
Ｘ２＝Ｇｌｎまたはヌル；
Ｘ３＝Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、β−β’−ジフェニル−Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニンもしくは４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、修飾Ｐｈｅ、水和性カルボニル含有残基；またはボロン酸含有残基；
Ｘ４＝ＡｓｐまたはＡｓｎ；
Ｘ５＝Ｌｅｕ；β−β’−ジフェニル−Ａｌａ；Ｐｈｅ；Ｔｒｐ；Ｔｙｒ；フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体；水和性カルボニル含有残基；またはボロン酸含有残基；
Ｘ６＝Ｓｅｒ；
Ｘ７＝ＴｈｒまたはＳｅｒ；
Ｘ８＝Ａｒｇ、Ｓｅｒ、修飾Ａｒｇ、または水和性カルボニルもしくはボロン酸含有残基；
Ｘ９＝Ａｒｇ、Ａｌａ；
Ｘ１０＝Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、β−β’−ジフェニル−Ａｌａ；Ｐｈｅ；Ｔｒｐ；Ｔｙｒ；フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体；水和性カルボニル含有残基；またはボロン酸含有残基；
Ｘ１１＝Ｌｙｓ；および
Ｘ１２＝Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、７−アミノヘプタン酸、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、プロパルギルグリシン、イソアスパラギン酸、またはヌル］。
【０１２５】
一部の態様では、修飾Ａｒｇは、図６に示されている式の構造を有する。一部の態様では、修飾Ｐｈｅは、フェニル環に１個または複数のハロゲンが組み込まれたＰｈｅである。一部の態様では、式ＶＩは、配列番号１または配列番号２ではない。
【０１２６】
一部の実施形態では、メディトープは、式ＶＩＩの構造を有するペプチドまたは薬学的に許容されるその塩である：
【０１２７】
【化１】
2017536091.tif 000006
［式中、
「＊」でマークされている中心は、「Ｒ」または「Ｓ」配置であり；
Ｒ3およびＲ3'はそれぞれ独立に、Ｈか、またはＣ1〜4アルキル、−ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される１、２、または３個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり；
Ｒ5は以下の（Ａ）あるいは（Ｂ）であり：
（Ａ）オキソ、アセタール、ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｈ、および−ＣＯＮＨ2基からなる群から選択される１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいＣ1〜8アルキル；あるいは
（Ｂ）以下のａ）またはｂ）で置換されているＣ1〜4アルキル：
ａ）１個もしくは２個のフェニル基（ここで、各フェニルは、−ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換されていてもよい）；または
ｂ）ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基；
Ｒ6は、−Ｃ1〜4アルキル−ＯＨまたは−Ｃ1〜4アルキル−ＳＨであり；
Ｒ7は、−Ｃ1〜4アルキル−ＯＨまたは−Ｃ1〜4アルキル−ＳＨであり；
ｍは、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｒ8は下記の（ａ）あるいは（ｂ）であり：
（ａ）−ＯＨ、−ＮＲaＲb、−Ｎ（Ｒc）Ｃ（Ｏ）Ｒe、または−Ｎ（Ｒc）Ｃ（＝ＮＲd）Ｒe；（ここで、
ＲaはＨであり；
Ｒbは、Ｈか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、−ＳＨ、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｈ、もしくは−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル基からなる群から選択される１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいＣ1〜8アルキルであり；
Ｒcは、Ｈ、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリールであり；
Ｒdは、Ｈか、またはそれぞれ、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、ハロゲン、オキソ、アセタール、ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｈ、および−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル基からなる群から選択される１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいＣ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル、Ｃ2〜8アルキニル、Ｃ3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり；かつ
Ｒeは、Ｈ；−ＮＨＲd；または−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、オキソ、Ｃ2〜4アセタール、Ｃ2〜4ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、および−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル基からなる群から選択される１個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいＣ1〜12アルキル、Ｃ3〜8シクロアルキル、Ｃ2〜12アルケニル、Ｃ2〜8アルキニル、またはアリール基である）；あるいは
（ｂ）オキソ、アセタール、ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、−ＳＨ、−ＯＨ、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、または−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル基で置換されているＣ1〜12アルキル；
Ｒ9は、Ｃ1〜4アルキルまたは−Ｃ1〜2アルキレン−Ｒxであり；
（ここで、Ｒxは、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ2、または−ＣＨ2ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ2である）；
Ｒ10は下記の（１）あるいは（２）であり：
（１）オキソ、アセタール、ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｈ、および−ＣＯＮＨ2基からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよいＣ1〜8アルキル；あるいは
（２）１もしくは２個のフェニル基、または１個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているＣ1〜4アルキル基（ここで、各フェニルは、−ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される１、２、または３個の置換基で置換されていてもよい）；
ｎは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
Ｘは、その各炭素がオキソ、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒyで置換されていてもよいＣ1〜8アルキレンまたはＣ2〜8アルケニレンであり；
（ここで、前記アルキレンのうちの１個の炭素は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、５員のヘテロアリール環、または−Ｓ−Ｓ−で置き換えられていてもよい）；かつ
Ｒyは、−Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ（ＲZ）Ｃ（Ｏ）−または−ＣＨ（Ｒz）ＣＯ2Ｈである
（ここで、Ｒzは、−Ｈか、または−ＯＨ、−ＳＨ、もしくは−ＮＨ2で置換されていてもよい−Ｃ1〜4アルキルである）］。
【０１２８】
場合によっては、Ｘは、その各炭素が−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒyで置換されていてもよいＣ1〜8アルキレンまたはＣ2〜8アルケニレンであり（ここで、前記アルキレンのうちの１個の炭素は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、５員のヘテロアリール環、または−Ｓ−Ｓ−で置き換えられていてもよい）；Ｒyは、−Ｃ1〜4アルキルまたは−ＣＨ（Ｒz）ＣＯ2Ｈである（ここで、Ｒzは、−Ｈか、または−ＯＨ、−ＳＨ、もしくは−ＮＨ2で置換されていてもよい−Ｃ1〜4アルキルである）；またはその薬学的に許容される塩。
【０１２９】
場合によっては、そのようなメディトープは、配列番号１もしくは２ではないか、またはそのような配列に由来する環式ペプチドではなく、かつ／またはメディトープ１または２ではない。
【０１３０】
式ＶＩＩのメディトープの一部の実施形態では、ｍは、０、１、もしくは２である。他の実施形態では、Ｒ3は、Ｈまたはフェニルであり、Ｒ3'は、フェニル、２−ブロモフェニル、３−ブロモフェニル、または４−ブロモフェニルである。さらなる実施形態では、Ｒ5は、オキソ、−Ｂ（ＯＨ）2、−ＣＯ2Ｈ、もしくは−ＣＯＮＨ2基で、またはブロモもしくはクロロ置換基でそれぞれ置換されていてもよい１個もしくは２個のフェニル基でそれぞれ置換されていてもよいメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルである。さらなる実施形態では、Ｒ8は、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｎ（Ｒc）Ｃ（Ｏ）Ｒe、または−Ｎ（Ｒc）Ｃ（＝ＮＲd）Ｒeである。なおさらなる実施形態では、Ｒcは、Ｈまたはメチルであり、Ｒdは、ＨまたはＣ1〜4アルキルであり、かつＲeは、Ｃ1〜4アルキルまたは−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）である。他の実施形態では、Ｒ9は、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ2、または−ＣＨ2ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ2で置換されていてもよいメチルまたはエチルである。なお他の実施形態では、Ｒ10は、オキソ、−Ｂ（ＯＨ）2、−ＣＯ2Ｈ、または−ＣＯＮＨ2基でそれぞれ置換されていてもよいメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルである。なお他の実施形態では、−Ｘ−ＮＨ−は、−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）6−ＮＨ−、−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）−ＮＨ−、−β−Ａｌａ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）−ＮＨ−、または−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2−トリアジニル−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）−ＮＨ−である。
【０１３１】
一部の実施形態では、メディトープは、式ＶＩＩＩの構造を有するペプチドである：
【０１３２】
【化２】
2017536091.tif 000007
【０１３３】
「＊」でマークされている中心は、「Ｒ」または「Ｓ」配置である。記号
【化３】
2017536091.tif 000008
は、Ｌ1AへのＲ1Aの結合点を示す。
【０１３４】
Ｒ3およびＲ3'はそれぞれ独立に、Ｈか、またはＣ1〜4アルキル、−ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される１、２、または３個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり；
【０１３５】
Ｒ5は、以下の（Ａ）あるいは（Ｂ）である：
（Ａ）オキソ、アセタール、ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｈ、および−ＣＯＮＨ2基からなる群から選択される１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいＣ1〜8アルキル；あるいは
（Ｂ）以下のａ）またはｂ）で置換されているＣ1〜4アルキル基：
ａ）１個もしくは２個のフェニル基（ここで、各フェニルは、−ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換されていてもよい）；または
ｂ）ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基。
【０１３６】
Ｒ6は、−Ｃ1〜4アルキル−ＯＨまたは−Ｃ1〜4アルキル−ＳＨである。Ｒ7は、−Ｃ1〜4アルキル−ＯＨまたは−Ｃ1〜4アルキル−ＳＨである。記号ｍは、０、１、２、３、４、または５である。
【０１３７】
Ｒ8は、−ＯＨ、−ＮＲaＲb、−Ｎ（Ｒc）Ｃ（Ｏ）Ｒe、または−Ｎ（Ｒc）Ｃ（＝ＮＲd）Ｒeである。Ｒaは、Ｈである。Ｒbは、Ｈか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、−ＳＨ、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｈ、もしくは−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル基からなる群から選択される１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいＣ1〜8アルキルである。Ｒcは、Ｈ、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリールである。Ｒdは、Ｈか、または−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、ハロゲン、オキソ、アセタール、ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｈ、および−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル基からなる群から選択され１個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいＣ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル、Ｃ2〜8アルキニル、Ｃ3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基である。Ｒeは、Ｈ；−ＮＨＲd；または−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨ、オキソ、Ｃ2〜4アセタール、Ｃ2〜4ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、および−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル基からなる群から選択される１個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいＣ1〜12アルキル、Ｃ3〜8シクロアルキル、Ｃ2〜12アルケニル、Ｃ2〜8アルキニル、またはアリール基である。別法では、Ｒ8は、オキソ、アセタール、ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、−ＳＨ、−ＯＨ、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、または−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル基で置換されているＣ1〜12アルキルである。
【０１３８】
Ｒ9は、Ｃ1〜4アルキルまたは−Ｃ1〜2アルキレン−Ｒxである。Ｒxは、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ2、または−ＣＨ2ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ2である。
【０１３９】
Ｒ10は、下記の（１）あるいは（２）である：
（１）オキソ、アセタール、ケタール、−Ｂ（ＯＨ）2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｃ1〜4アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｃ1〜4アルキル、−ＣＯ2Ｈ、および−ＣＯＮＨ2基からなる群から選択される１個または複数の置換基で置換されていてもよいＣ1〜8アルキル；あるいは
（２）１もしくは２個のフェニル基、または１個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているＣ1〜4アルキル基（ここで、各フェニルは、−ＯＨ、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される１、２、または３個の置換基で置換されていてもよい）；
【０１４０】
記号ｎは、０または１である。記号ｐは、０または１である。
【０１４１】
Ｘは、下記の（１）〜（３）である：
（１）本明細書において論述するメディトープ環化ストラテジーのいずれかから生じるリンカー；（２）置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、または置換ヘテロアリーレンあるいは（３）その各炭素がオキソ、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ2、−ＮＨＣ（Ｏ）−、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒyで置換されていてもよいＣ1〜8アルキレンまたはＣ2〜8アルケニレン。Ｘ  Ｃ1〜8アルキレンのうちの１個の炭素は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、５員のヘテロアリール環、または−Ｓ−Ｓ−で置き換えられていてもよい。Ｒyは、−Ｃ1〜4アルキルまたは−ＣＨ（Ｒz）Ｃ（Ｏ）−または−ＣＨ（Ｒz）ＣＯ2Ｈである。Ｒzは、−Ｈか、または−ＯＨ、−ＳＨ、もしくは−ＮＨ2で置換されていてもよい−Ｃ1〜4アルキルである。式ＶＩＩには、すべての適切な薬学的に許容される塩が包含される。（１）において、Ｘは、その化学的三価によって、かつＸが上述したとおりのさらなる置換基（例えば、−ＮＨ2およびオキソ）を包含してもよいことによって、置換リンカーと考えられる。一部の実施形態では、Ｘは、下式である：
【０１４２】
【化４】
2017536091.tif 000009
【０１４３】
式ＩＸにおいて、＊＊は、式ＶＩＩＩ中のＸに結合するグルタミンへの結合点を表し、＊＊＊は、式ＶＩＩＩ中のＸおよびリシンに結合する窒素への結合点を表す。記号
【化５】
2017536091.tif 000010
は、分子の残りの部分へのＸの結合点を示す。
【０１４４】
式ＶＩＩＩのメディトープの一部の実施形態では、ｍは、０、１、または２である。他の実施形態では、Ｒ3は、Ｈまたはフェニルであり、Ｒ3'は、フェニル、２−ブロモフェニル、３−ブロモフェニル、または４−ブロモフェニルである。さらなる実施形態では、Ｒ5は、オキソ、−Ｂ（ＯＨ）2、−ＣＯ2Ｈ、もしくは−ＣＯＮＨ2基で、またはブロモもしくはクロロ置換基でそれぞれ置換されていてもよい１もしくは２個のフェニル基でそれぞれ置換されていてもよいメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルである。さらなる実施形態では、Ｒ8は、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｎ（Ｒc）Ｃ（Ｏ）Ｒe、または−Ｎ（Ｒc）Ｃ（＝ＮＲd）Ｒeである。いっそうさらなる実施形態では、Ｒcは、Ｈまたはメチルであり、Ｒdは、ＨまたはＣ1〜4アルキルであり、Ｒeは、Ｃ1〜4アルキル、または−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）である。他の実施形態では、Ｒ9は、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＨ2ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ2、または−ＣＨ2ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ2で置換されていてもよいメチルまたはエチルである。なお他の実施形態では、Ｒ10は、オキソ、−Ｂ（ＯＨ）2、−ＣＯ2Ｈ、または−ＣＯＮＨ2基でそれぞれ置換されていてもよいメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルである。なお他の実施形態では、−Ｘ−ＮＨ−は、−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−（例えば、ジスルフィド架橋を介して結合）、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）6−ＮＨ−、−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）−ＮＨ−、−β−Ａｌａ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）−ＮＨ−、または−Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2−トリアジニル−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）−ＮＨ−である。
【０１４５】
ａ．  修飾
構造データおよび熱力学的データに基づき、本明細書において記載されているメディトープ１および２内のいくつかの位置が、全体結合親和性を増強し、かつ／または本明細書において記載されているとおりの他の特性を改変するために例えば、種々の天然または非天然アミノ酸で修飾するための標的部位として同定されている。そのような修飾には、これらに限定されないが、ヘッドトゥテールの環式ラクタムペプチドを作成するためのｃＱＦＤまたはｃＱＹＮの修飾、Ａｒｇ８の修飾、３位の修飾（例えば、ｃＱＦＤまたはその変異体のＰｈｅ３）、Ｌｅｕ５の修飾、Ｌｅｕ１０の修飾、および／または水和性カルボニル官能基の組み込みが包含される（図７を参照されたい）。本明細書において実証されているとおり、ｃＱＦＤの元のメディトープにおいてＰｈｅ３、Ｌｅｕ５、およびＡｒｇ８をそれぞれアラニンに変異させると、メディトープ利用可能抗体結合インターフェースに対する、生じた化合物の親和性が１０〜１４０分の１に低下する。一部の態様では、変異型メディトープには、配列番号１もしくは２のメディトープまたは表１もしくは２に列挙されている他のメディトープの１、３、５、８、１０、および１２位のうちの１つまたは複数に修飾を有するものが包含される。
【０１４６】
８位
一部の実施形態では、メディトープ変異体は、メディトープ１または２の８位（Ａｒｇ８）に対応する位置に修飾を含有する。未修飾のメディトープ（ｃＱＦＤ；配列番号１）において、Ａｒｇ８は伸長されて、メディトープ利用可能抗体重鎖のＱ１０５の重鎖カルボニルと水素結合を形成している。この残基のすぐ周囲の範囲は、溶媒に曝露されても疎水性である。一部の態様では、このメディトープは、この位置に修飾された残基を含有する（例えば、修飾されたＡｒｇ８）。一部の例では、この修飾された残基は、メディトープ利用可能抗体Ｈ−結合のために有用なＡｒｇ８残基のイミニウム官能基を維持しており、置換または非置換の疎水性アームを導入して、空洞を満たす。リガンドドッキング計算によって裏付けられるとおり、そのような修飾は、エントロピーの上昇によって結合をかなり増大させる。Ｎ−アルキルグアニジニウム基またはアルキル−アミジン官能基を使用することによって、そのような修飾を組み込むことができる。いずれの場合においても、末端Ｎ原子の置換される基は、アルキルまたはアリールであってよく、その場合、そのアルキルまたはアリール基の各位置は、末端位を包含する基内で、追加の官能基で場合によって置換されていてよい。一例では、図６に示されているとおりの構造を有する修飾されたアルギニン（修飾されたＡｒｇ８）は、例えば、配列番号１または２のメディトープのＡｒｇ８について、ＮＨ2上でブチル基で置換されている（図６ではＮＨＲとして示されている）。一部の態様では、変異型メディトープは、８位にｎ−ブチル−アルギニンまたはブチルアミジン修飾を含有する。
【０１４７】
３位
一部の実施形態では、メディトープ変異体は、メディトープ１のＰｈｅ３など、３位に対応する位置に修飾を含有する。メディトープ変異体Ｐｈｅ３Ｔｙｒ  ｃＱＹＮ（配列番号２）のヒドロキシル基は、ｃＱＦＤ（配列番号１）と比較して、Ａｒｇ８側鎖の伸長された立体配座中に改変を有する。本明細書のデータによって、Ｆａｂへの水結合を伴う、好ましい水素結合ネットワークの形成が示唆されている。エンタルピーによって駆動される最適化は、薬物設計における多くの小分子手法で成功することが判明しており、提供するメディトープには、エントロピーの上昇を操作する機会が存在する。一部の実施形態では、メディトープ設計においてエンタルピーおよび／またはエントロピーを上昇させる手法を使用して、様々なメディトープを作成する、例えば、結合を最適化する。
【０１４８】
例えば、メディトープ利用可能抗体に結合すると、Ｐｈｅ３の疎水性フェニル環は、メディトープ利用可能抗体Ｆａｂの側鎖残基のかなり極性の配列に囲まれる。一部の実施形態では、１個または複数のハロゲンをこの残基のフェニル環に導入して、極性側鎖残基とのハロゲン結合相互作用を可能にする。ハロゲン結合は、水素結合と類似しているが、臭素または塩素（または他のハロゲン）などのハロゲンと酸素原子との相互作用を伴う比較的強い非共有結合である。一部の態様では、この位置の残基を、ハロゲン置換基を組み込むように修飾する。一部の態様では、メディトープ利用可能抗体との、例えば、メディトープ利用可能抗体のそれぞれＴｙｒ８７（軽鎖）、Ｇｌｎ３８、および／またはＴｙｒ９１（重鎖）位でのハロゲン結合に適した位置に臭素原子が位置するように、Ｐｈｅ３を、２−ブロモ−、３−ブロモ−、または４−ブロモフェニルアラニンで置き換える。そのようなフェニルアラニン誘導体は市販されており、かつ一部の態様では固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって、環式ペプチドメディトープ変異体に組み込まれる。例示的な変異型メディトープには、２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、または４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニンをメディトープ１のＰｈｅ３に対応する位置に含有するものが包含される。
【０１４９】
他の例では、メディトープに、追加のフェニル基をこの位置で、例えば、Ｐｈｅ３をβ，β’−ジフェニルアラニンに置き換えることによって組み込む。
【０１５０】
５および１０位（例えば、メディトープ１または２のＬｅｕ５、Ｌｅｕ１０）
一部の実施形態では、メディトープ変異体は、メディトープ１または２の５または１０位（Ｌｅｕ５またはＬｅｕ１０）に対応する位置に修飾を含有する。本明細書において示されているとおり、メディトープ１のＬｅｕ５およびＬｅｕ１０の側鎖は、メディトープ利用可能Ｆａｂ、セツキシマブに疎水性に接触している。ある種の実施形態では、異なる天然アミノ酸または非天然アミノ酸をこれらの位置のうちの一方または両方に組み込み、例えばそれによって、伸長され得る表面積量を変えることによって、メディトープの１つまたは複数の特性、例えば、親和性を改変する。一実施形態では、天然アミノ酸（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ）および非天然類似体（例えば、β，β’−ジフェニル−Ｌ−アラニンまたは、分枝アルキル、ナフチルなどの伸長された芳香族、もしくは他の疎水基を包含する側鎖が組み込まれているアミノ酸）を、ＳＰＰＳを介して、一方または両方の位置に体系的に導入する。
【０１５１】
「水和性」官能基
ある種の実施形態では、メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合部位を囲む１個または複数のＦａｂヒドロキシル支持側鎖を、選択的なトラッピングを介して、水和性官能基が組み込まれているメディトープと共有結合を形成することによって利用する。したがって、一部の実施形態では、例えば、高度に選択的であるが、メディトープ利用可能抗体または他の物質との不可逆的な相互作用を生じさせるために、メディトープは、水和性置換基を有する１個または複数の残基を含有する。例えば、メディトープ１のＡｒｇ８は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うとメディトープ利用可能抗体の軽鎖のＳｅｒ４３（３．５Å）および重鎖のＴｙｒ９１（３．８Å）の近傍まで伸長している。メディトープのＡｒｇ８またはＬｅｕ１０の末端に水和性官能基を組み込むことで、セリンまたはチロシンヘミアセタールの選択的な形成が可能になるであろう。そのような共有付加物は本質的に、不可逆的な結合をもたらすであろう。加えて、ボロン酸を含有する残基も、水和性基としてメディトープに取り込むことができる。ボロン酸は、多発性骨髄腫を治療するために使用されるボルテザミブ（ｂｏｒｔｅｚａｍｉｂ）（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））の構造活性において重要な役割を果たす。水和性残基のさらなる代表的な例を図６にも示すが、ここで、Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨＯまたは−ＣＨ2Ｂ（ＯＨ）2である。一部の例では、ＳＰＰＳを使用して、そのような基を含有する残基を組み込むことによって、そのような変異体を調製する。
【０１５２】
抗体のＦａｂ−メディトープ結合部位内で新たなアミノ酸残基を設計する際、および必要な相補性「水和性」官能基をそのメディトープの種々の位置に導入する際に、そのような水和性ストラテジーを適用することができる。システイン残基をＦａｂ領域に導入することによって、類似のストラテジーを適用することができ、このストラテジーでは、この官能基を、メディトープ内に含有される求電子性カルボニル基またはその誘導体などの「水和性」官能基を求核的に攻撃するために、またはＦａｂ領域と、必要なチオール官能基またはチオール同等官能基を含有するメディトープとの間に選択的ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を作るために使用する。このアイデアによる他の実施形態には、α，β−不飽和カルボニル官能基などの、メディトープに含有されるマイケルアクセプタを導入することが包含されるであろう。これらの官能基は、チオールと選択的に反応して、安定な共有炭素−硫黄結合を形成することがよく知られている。
【０１５３】
別の環化ストラテジーおよびジスルフィド架橋の置き換え
ある種の実施形態では、変異型メディトープは、ｃＱＦＤおよびｃＱＹＮ中においてと同様に、ジスルフィド架橋を包含する。２個のシステイン残基の側鎖が反応することによって、ジスルフィド架橋が形成され得る。ある種の実施形態では、メディトープ、例えば、メディトープ１または２中のジスルフィド架橋を、別の結合に置き換えるか、または除去する。したがって、変異型メディトープのうちには、元のメディトープとは別の結合を有するか、またはそれらのジスルフィド架橋を欠いたものがある。
【０１５４】
一部の態様では、アミノ酸鎖内の１個または複数の非天然アミノ酸の間に結合を作る。非天然アミノ酸で作ることができる結合の例には、以下を含む結合が包含される：（ｉ）アルデヒドまたはケトンを含む残基と、アミン基（ここで、そのアミン窒素は、−ＮＨ２またはアルキルオキシ基で置換されている）を含む残基との反応（例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ｍ−アセチルフェニルアラニン、またはｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン残基と、ｐ−（２−アミノ−３−ヒドロキシエチル）−フェニルアラニン残基との反応）によって作られる安定なヒドラゾンまたはオキシムベースの結合、（ｉｉ）フェニルセレニジルアラニン（ｐｈｅｎｙｌｓｅｌｅｎｉｄｙｌａｌａｎｉｎｅ）を組み込むことによる、チオール反応性、（ｉｉｉ）ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニンを組み込むことによる、ベンゾフェノンを含有するＵＶ架橋剤、（ｉｖ）ｐ−イソプロピルチオカルボニル−フェニルアラニンまたはｐ−エチルチオカルボニル−フェニルアラニンを組み込むことによる、アミン反応性、（ｖ）例えば、アジド基を含有する残基と、アルキン基を含有する残基とのＨｕｉｓｇｅｎ付加環化を介しての反応（例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン残基とｐ−アジドフェニルアラニン残基との反応）によって作られる、トリアジン、チアゾール、チアゾリジン、またはオキサゾール結合などの複素環式結合；（ｖ）一方の残基中の酸基と他方の残基中のアミン基との反応によって作られるアミド結合；（ｖｉ）一方の残基中の酸基と、セリンなどの他方の残基中のアルコールとの反応によって作られるエステル結合；（ｖｉｉ）末端オレフィンをそれぞれ含有する２個の残基の反応によって、例えば、オレフィン複分解（例えば、２個のアリルグリシン残基または２個のＮ−アリル置換アミノ酸の反応）によって作られる二重結合、あるいは（ｖｉｉｉ）当技術分野で知られている適切な残基の任意の他の対の反応による結合。総説については、例えば、Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｓ．、「Ｔｈｅ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．  ２００３、９、４７１〜５０１を参照されたい。一実施形態では、メディトープは、反応性基を、ｐ−アセチルフェニルアラニンなどのＦａｂに組み込まれている非天然アミノ酸に向けることもできる。
【０１５５】
例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性に対処し、かつ後続のコンジュゲーション化学作用のために化学選択的制御を可能にするために、メディトープを環化させるための様々な方法を使用することができる。一部の実施形態では、環化ストラテジーは、ヘッドトゥテール（ヘッドテール）ラクタム環化（非環式ペプチドの末端残基の間での環化）および／または他の残基の間でのラクタム結合を包含するラクタム環化ストラテジーである。また、グリシン、β−Ａｌａ、７−アミノヘプタン酸などの残基を、非環式メディトープ環化前駆体に組み込んで、異なるラクタム環サイズおよび結合様式を生じさせることによって、ラクタム形成を行うことができる。「クリック」化学およびオレフィン複分解などの追加の環化ストラテジーも使用することができる（図７、右の囲みを参照されたい）。ペプチドおよびペプチド模倣物質を環化するそのような方法は、当技術分野でよく知られている。
【０１５６】
一部の実施形態では、ラクタム結合を含有するメディトープは、ｉｎ  ｖｉｖｏでより安定であり、例えば、他の結合を有するメディトープと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏでより安定な結合を有する。
【０１５７】
一部の実施形態では、非環式ペプチドの末端残基を反応させて、環式メディトープ、例えば、環式メディトープ変異体を形成する。他の実施形態では、残基３と１１との、および４と１１との間を包含する他の位置が環化に適している。したがって、一部の態様では、メディトープは、例えば１２−アミノ酸ペプチドの残基３と１１との、および／または４と１１との間など、Ｎ末端残基およびＣ末端残基以外の残基の間で形成される結合を含有する。
【０１５８】
一部の実施形態では、メディトープ、例えば、変異型メディトープは、反応性アミン官能基（例えば、Ｌｙｓ１１）を含有し、これは、メディトープ変異体を、例えば、スキャフォールドもしくはリンカーに、または本明細書において記載されているとおりの診断用、例えば、イメージング剤または治療剤などの薬剤に後でコンジュゲートするために使用することができる。例えば、図５は、メディトープ変異体をＦＡＣＳ分析用のフルオレセインとコンジュゲートするための手順を示している；このストラテジーは、ｉｎ  ｖｉｖｏＰＥＴイメージング用のＤＯＴＡを包含する他のイメージング剤および他の薬剤に適用することもできる。
【０１５９】
メディトープのキャラクタリゼーション
一部の実施形態では、例えば、本明細書において実施例で記載されている方法などのＩＴＣ、ＳＰＲ、および／または回折、および／または他の方法によって、変異型メディトープなどのメディトープをキャラクタライズする。一例では、例えば、最も望ましい特性、例えば、１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体に対して最大の親和性、またはｐＨ依存性などの他の望ましい特性を有するメディトープ変異体を引き続き修飾して望ましい特性を向上させるように、メディトープの合成およびそのキャラクタリゼーションを反復して実施する。
【０１６０】
一例では、メディトープのメディトープ利用可能抗体への結合をキャラクタライズするために、そのメディトープを均一性＞９５％まで精製し、質量分析法によって構造的にキャラクタライズする。ペプチドを水中で透析し、その濃度をＵＶ−Ｖｉｓによって測定し、かつ元素分析で較正し、適切な緩衝液中に希釈する（＞１００×）。メディトープ利用可能抗体への結合を、ＩＴＣ、ＳＰＲ、Ｘ線回折、またはそれらの組合せによって厳密にキャラクタライズする。ＩＴＣ測定は、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｎａｎｏＩＴＣで、測定１回当たり僅かペプチド１〜２ｍｇを用いるだけで行うことができる。一例では、ＳＰＲ測定のためには、低密度チップおよび高密度チップをメディトープ利用可能抗体、例えば、Ｆａｂまたは完全ＩｇＧとコンジュゲートさせる。場合によっては、セツキシマブの場合、ＥＧＦＲ（残基１〜６２１）の全細胞外ドメインのうちの可溶性フラグメントなどの抗原を使用して、そのチップを初めにキャラクタライズする。本明細書において報告される研究では、例えば、ＳＰＲおよびＩＴＣによって測定した場合に、ｃＱＦＤメディトープは、完全に無傷のセツキシマブＩｇＧと比較して、同様のエンタルピーおよびエントロピーで、セツキシマブＦａｂフラグメントに結合した。したがって、セツキシマブまたは他のメディトープ利用可能抗体の全ＩｇＧまたはＦａｂフラグメントを使用して、結合測定を実施することができる。一例では、回折のために、セツキシマブＦａｂフラグメントおよび配列番号１のメディトープの共結晶化条件を十分に確立し、回折品質の結晶を典型的には、１〜３日、典型的には１日で得る。全データセットは社内ソース（Ｒｉｇａｋｕ  ００７−ＨＦおよびＲ−Ａｘｉｓ  ＩＶ＋＋）では８〜１２時間で、かつＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅでは１０分間で収集されるので、メディトープ変異体とメディトープ利用可能抗体との相互作用を迅速にキャラクタライズすることができる。
【０１６１】
一部の態様では、ＩＴＣ、ＳＰＲ、およびＸ線回折データは、例えば総合的に、後続の化学的修飾のガイドとなり、かつ最終的にメディトープの親和性を向上させ、かつ／またはメディトープを他に改変するための原子の詳細を提示する。ΔＧ＝−ＲＴ  ｌｎ  Ｋａに基づく計算によって、セツキシマブに対するメディトープのマイクロモルからナノモルまでの親和性の相違は、強い水素結合程度に基づく３００Ｋでの約４ｋＣａｌ／ｍｏｌの自由エネルギーの変化から生じていることが示されている。したがって、タンパク質結合ポケットから、整列していた水分子が失われるか、またはアミノ酸残基鎖が再配向するだけでも十分に、結合は数桁変わり得る。
【０１６２】
一部の例では、メディトープの特性を改変するために、例えば、メディトープ−Ｆａｂ相互作用の親和性を向上させるために、他の手法を使用する。一例では、上記の研究で得られるものなどの構造データを使用して、例えば、相補性メディトープ結合を改善し得るように、例えば追加の水素結合を加える、アミノ酸で非天然アミノ酸を置換する、または疎水性インターフェースを改変する変異誘発によって、Ｆａｂ中の残基を置き換えることができる。一部の例では、蛍光偏光アッセイを使用して、配列番号１などの所与のメディトープに置き換わり得るメディトープ変異体を同定する。他の例では、同じ技術を使用して、メディトープに置き換わり得る小分子を同定し、次いでこれらの小分子をテンプレートとして使用して、メディトープの結合親和性をさらに向上させる。
【０１６３】
一部の例では、メディトープ変異体を、ｐＨ依存性に基づき、例えば、異なるｐＨ条件では異なる親和性を有するように設計する。したがって、ある種の実施形態では、メディトープ利用可能抗体メディトープ相互作用をｐＨに関して微調整する。そのようなメディトープの例を本明細書において記載する。一部の態様では、メディトープ変異体の結合親和性を、緩衝液のｐＨを関数として測定する。例えば、変異型メディトープは、１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体またはフラグメントに対して、リソソームのｐＨレベルでは低いか、または低酸素環境では高い結合親和性を有するメディトープを包含する。例えば、メディトープ利用可能抗体に対して、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ７〜８、例えば、ｐＨ７．３〜７．５）では比較的高い結合親和性を示し、かつその抗体に対して、より酸性のｐＨ、例えば、４〜６．５（またはその概数）のｐＨでは、例えば、エンドソームのｐＨ（例えば、５（またはその概数）〜６．５（またはその概数））またはリソソームのｐＨ（例えば、４．５（またはその概数）〜５（またはその概数））では、比較的低い結合親和性を示す変異型メディトープを提供する。他の例では、メディトープは、腫瘍環境などの低酸素環境では、例えば、血液中などの他の生理学的条件下で観察される親和性と比較して、抗体に対して高い結合親和性を有する。一部の実施形態では、低いｐＨで（例えば、薬物送達のためにリソソームにおいて）特異的に放出するためのメディトープ変異体またはメディトープ「類似体」の修飾；および低酸素環境（例えば、腫瘍間質ｐＨは多くの場合に、正常組織よりも低い）においてより高い親和性で結合するようなメディトープの修飾を提供する。
【０１６４】
別の例では、メディトープは、メディトープ利用可能抗体に対して第１のｐＨでは低いか、または限られた結合親和性を、かつ第２のｐＨでは高い結合親和性を有し得る。一部の実施形態では、第１のｐＨは、非生理学的ｐＨであり得、第２のｐＨは、生理学的ｐＨまたは標的組織もしくは疾患状態のｐＨであり得る。一部の実施形態では、メディトープおよびメディトープ利用可能抗体を、メディトープおよびメディトープ利用可能抗体が製造または貯蔵中に低いか、または限られた架橋を示すように第１のｐＨで、単一の組成物で一緒に製造または貯蔵することができる。したがって、メディトープおよびメディトープ利用可能抗体は、溶液中では相対的に可溶性で、未結合のままであるが、生理学的条件下を包含する第２のｐＨで使用または投与した後に、結合し、クラスターを形成し、かつ同時局在化を増加させ得る。そのようなメディトープ変異体を作成するための方法も提供する。
【０１６５】
一部の実施形態によれば、メディトープ結合部位を利用または最適化して、メディトープ利用可能抗体およびその機能性フラグメントの結合、それらの精製、および／またはそれらを使用するイメージング方法もしくは他の方法を増強することができる。別の実施形態では、メディトープは、メディトープ結合部位のＦａｂ中の１個または複数の操作システイン（例えば、ＴｈｉｏＭＡｂ）に結合する１個または複数のシステイン残基を含有してよい。これによって、このメディトープは、任意の診断用および／または治療用物質、分子、または化合物にコンジュゲートする。例えば、その物質は、マーカーなどの小分子診断用分子であってよい。この「Ｃｙｓメディトープ」は、そのコンジュゲートを抗体に向かわせ、共有結合を介して結合する。別法では、このメディトープをＦａｂに、メディトープ結合部位に組み込まれている１つまたは複数の非天然アミノ酸にコンジュゲートさせることができる。
【０１６６】
ＩＩ．  メディトープ−薬剤コンジュゲート
特定の実施形態では、多価メディトープを、治療有効量の１種または複数の治療剤または診断剤に、例えば、イメージング剤、治療上有効な薬剤または化合物に、または両方にコンジュゲートする。一部の実施形態では、複数のメディトープ、１つまたは複数リンカー、および１つまたは複数の薬剤を含むそのような複合体を提供する。
【０１６７】
本開示は、疾患または状態を治療、予防、診断、またはモニターするための治療剤または診断剤または化合物にコンジュゲートした多価メディトープ、またはその変異体の使用を企図する。一態様では、薬剤への多価メディトープのそのようなコンジュゲーションは、メディトープ利用可能モノクローナル抗体と関連して使用する場合、疾患を治療および検出するためのｍＡｂをベースとした治療法およびイメージング法を著しく改善するであろう高度に多角的なプラットフォーム技術を提供する（図１を参照されたい）。
【０１６８】
薬剤を、当技術分野で公知の任意の手段によってコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、薬剤を、リシン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ホルミルグリシンまたはアルデヒドタグ、非天然アミノ酸などにコンジュゲートする。ホルミルグリシンまたはアルデヒドタグは、反応性アルデヒド基を作成するためにホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によって認識および標的化され得る６−アミノ酸（ＬＣＴＰＳＲ；配列番号２４７）または１３−アミノ酸（ＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ、配列番号２４８）配列を含むことができる。反応性アルデヒド基は、メディトープまたは多価メディトープを薬剤にコンジュゲートすることを含むサブ配列反応において有用であり得る。Ｃａｒｒｉｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３、３２１〜３２２（２００７）を参照されたい。
【０１６９】
診断剤および治療剤には、関連技術においてよく知られているような任意のそのような薬剤が包含される。イメージング剤のうちには、これらに限定されないが、「色素」、「標識」、または「指示薬」と一般に称される様々な有機または無機小分子を包含する蛍光および発光物質がある。例には、フルオレセイン、ローダミン、アクリジン色素、Ａｌｅｘａ色素、およびシアニン色素が包含される。本開示の実施形態に従ってイメージング剤として使用することができる酵素には、これらに限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、またはβ−ラクタマーゼが包含される。そのような酵素を、色素原、蛍光原化合物または、発光原化合物と組み合わせて使用して、検出可能なシグナルを生成することができる。
【０１７０】
本開示の実施形態に従ってイメージング剤として使用することができる放射性物質には、これらに限定されないが、18Ｆ、32Ｐ、33Ｐ、45Ｔｉ、47Ｓｃ、52Ｆｅ、59Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、77Ａｓ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｓｒ、89Ｚｒ、94Ｔｃ、94Ｔｃ、９９ｍＴｃ、99Ｍｏ、105Ｐｄ、105Ｒｈ、111Ａｇ、111Ｉｎ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、142Ｐｒ、143Ｐｒ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、154-1581Ｇｄ、161Ｔｂ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、169Ｅｒ、175Ｌｕ、177Ｌｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、189Ｒｅ、194Ｉｒ、198Ａｕ、199Ａｕ、211Ａｔ、211Ｐｂ、212Ｂｉ、212Ｐｂ、213Ｂｉ、223Ｒａおよび225Ａｃが包含される。本開示の実施形態に従って追加のイメージング剤として使用することができる常磁性イオンには、これらに限定されないが、遷移金属およびランタニド金属（例えば、原子番号２１〜２９、４２、４３、４４、または５７〜７１を有する金属）のイオンが包含される。これらの金属には、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕのイオンが包含される。
【０１７１】
イメージング剤が放射性金属または常磁性イオンである場合、この薬剤を、これらのイオンに結合するための長いテールに結合している１個または複数のキレート基を有する長いテールを有するテールの長い他の試薬と反応させることができる。その長いテールは、金属またはイオンを結合のためにそれに加えることができる懸垂基を有するポリリシン、多糖、または他の誘導体化もしくは誘導体化可能な鎖などのポリマーであってよい。本開示に従って使用することができるキレート基の例には、これらに限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＴＥＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、および同様の基が包含される。免疫反応性の最小限の低下ならびに最小限の凝集および／または内部架橋を伴って、分子への結合の形成を可能にする基によって、キレートは通常、ＰＳＭＡ抗体または機能性抗体フラグメントに連結する。同じキレートを、マンガン、鉄、およびガドリニウムなどの非放射性金属と複合体化させて、本明細書において記載されている抗体および担体と共に使用すると、そのキレートはＭＲＩのために有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡなどの大環状キレートが、様々な金属、ならびにこれらに限定されないが、それぞれガリウム、イットリウム、および銅の放射性核種を包含する放射性金属と共に使用される。ＲＡＩＴのために223Ｒａなどの核種を安定的に結合するために重要な大環状ポリエーテルなどの他の環状キレートも使用することができる。ある種の実施形態では、Ａｌ−18Ｆ複合体などのＰＥＴイメージング剤をＰＥＴ分析において使用するための標的化分子に結合させるために、キレート部分を使用することができる。
【０１７２】
例示的な治療剤には、これらに限定されないが、薬物、化学療法剤、治療用抗体および抗体フラグメント、毒素、放射性同位体、酵素（例えば、腫瘍の部位でプロドラッグを切断して細胞毒性剤にするための酵素）、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、ならびに色素が包含される。治療剤には、キレート剤に結合している金属、金属合金、金属間またはコア−シェルナノ粒子も包含され得、これらは、健康な細胞と比較して、標的化細胞の放射線療法に対する感度を上げるための放射線増感剤として作用する。さらに、治療剤には、ＭＲＩコントラスト剤のための常磁性ナノ粒子（例えば、マグネタイトまたはＦｅ3Ｏ4）が包含され得、これらは、他の種類の療法（例えば、光線力学的療法および温熱療法ならびにイメージング（例えば、蛍光イメージング（ＡｕおよびＣｄＳｅ））と共に使用することができる。
【０１７３】
化学療法剤は多くの場合に、本来、細胞毒性または細胞増殖抑制性であり、それらには、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、ホルモン療法、標的化治療剤、および免疫治療剤が包含され得る。一部の実施形態では、本開示の実施形態に従って治療剤として使用することができる化学療法剤には、これらに限定されないが、１３−シス−レチノイン酸、２−クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、オールトランスレチノイン酸、アルファインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミホスチン、アナグレリド、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、三酸化ヒ素、アムサクリン、アミノカンプトテシン、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、オーリスタチン、ジメチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロイン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミン（ＡＦＰ）、ドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロイン−フェニルアラニン（ＭＭＡＦ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オーロマイシン、アザシチジン、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ベンダムスチン、ベバシズマブ、エタネルセプト、ベキサロテン、ビカルタミド、ビスマス、ボルテゾミブ、ブレオマイシン、ブスルファン、ロイコボリンカルシウム、シトロボラム因子、カペシタビン、カネルチニブ、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コルチゾン、シクロホスファミド、シタラビン、ｃｃ１００６５、ダルベポエチンアルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、デシタビン、デニロイキンジフチトクス、デキサメタゾン、デキサゾン、デクスラゾキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ドセタキセル、ドロスタチン、ドキソルビシン、ドキシフルリジン、エニルウラシル、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、エベロリムス、エキセメスタン、エストラムスチン、臭化エチジウム、エトポシド、フィルグラスチム、フルオキシメステロン、フルベストラント、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヘキサメチルメラミン、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、インターフェロンアルファ、インターロイキン２、インターロイキン１１、イソトレチノイン、イキサベピロン、イダルビシン、メシル酸イマチニブ、イホスファミド、イリノテカン、ラパチニブ、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、リポソームＡｒａ−Ｃ（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ａｒａ−Ｃ）、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、マイタンシノイド（ｍａｙｔｏｎｓｉｎｏｉｄ）、ネララビ���、ニルタミド、オクトレオチド、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、パニツムマブ、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ペントスタチン、プリカマイシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、リシン、リシンＡ鎖、リツキシマブ、ロミプロスチム、ラリトレキセド（ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、サパシタビン、サルグラモスチム、サトラプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ、セムスチン、ストレプトゾシン、タキソール、タモキシフェン、テガフール、テガフール−ウラシル、テムシロリムス、テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トリミトレキサート（ｔｒｉｍｉｔｒｅｘａｔｅ）、アルルビシン（ａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、イットリエウム（ｙｔｔｒｉｅｕｍ）、またはゾレドロン酸が包含される。
【０１７４】
本開示の実施形態に従って治療剤として使用することができる治療抗体およびその機能性フラグメントには、これらに限定されないが、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、およびトラスツズマブ、ならびに本明細書に列挙されている具体的な疾患に関連する他の抗体が包含される。
【０１７５】
本開示の実施形態に従って治療剤として使用することができる毒素には、これらに限定されないが、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素が包含される。
【０１７６】
本開示の実施形態に従って治療剤として使用することができる放射性同位体には、これらに限定されないが、32Ｐ、89Ｓｒ、90Ｙ、99mＴｃ、99Ｍｏ、131Ｉ、153Ｓｍ、177Ｌｕ、186Ｒｅ、213Ｂｉ、223Ｒａ、および225Ａｃが包含される。
【０１７７】
Ｃ．  メディトープ利用可能抗体
メディトープ結合部位を介して１つまたは複数のメディトープに結合し得るメディトープ利用可能抗体およびその抗体結合性フラグメントを提供する。場合によっては、メディトープ利用可能抗体は、配列番号１または２（メディトープ１または２）の環式ペプチドに、かつ／あるいはメディトープ１、２、１６〜１８、２３、２９、３１、３２、３６、３９、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５４、または５５（配列番号１、２、１６〜１８、２３、２９、３１、３２、３６、３９、４２、４３、４５、４６、５１、５２、５４、または５５で示される配列を有するペプチドに基づくメディトープ）などの１種または複数のその変異体、または場合によっては、メディトープ１、２、または１５〜５５かつ／あるいは配列番号１８６〜１９０および２０７のメディトープの任意のものに結合する。提供するメディトープ利用可能抗体のうちには、セツキシマブの親和性と類似の親和性で１つのメディトープまたは複数のメディトープに結合するものがある。例えば、ある種の態様では、１０（もしくはその概数）μＭ以下、５（もしくはその概数）μＭ以下、または２（もしくはその概数）μＭ以下、１（もしくはその概数）μＭ以下、５００、４００、３００、２００、１００（もしくはその概数）ｎＭ以下、あるいはそれ未満、例えば２００（もしくはその概数）ピコモル以下の解離定数で、抗体はメディトープに結合する。場合によっては、本明細書に列挙されているもののうちの任意のものなど解離定数は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、蛍光、蛍光偏光、ＮＭＲ、ＩＲ、熱量滴定；結合平衡除外；円偏光二色性、示差走査熱分析、または他の知られている方法などの特定の技術を使用して測定される解離定数である。例えば、場合によっては、類似体またはメディトープは、ＳＰＲによって測定した場合に、もしくはＩＴＣによって測定した場合に、またはこれらの方法のうちの任意の方法によって測定した場合に、１０（もしくはその概数）μＭ以下、５（もしくはその概数）μＭ以下、または２（もしくはその概数）μＭ以下、１（もしくはその概数）μＭ以下、５００、４００、３００、２００、１００（もしくはその概数）ｎＭ以下、あるいはそれ未満の結合定数を示す。
【０１７８】
一部の例では、メディトープ結合性部位は、モノクローナル抗体セツキシマブの構造的特徴である。したがって、一部の場合には、メディトープ結合性部位は、セツキシマブのメディトープ結合性部位内のものに対応する残基を含有する。Ｘ線結晶解析によって、配列番号１のペプチドは、約７００ｎＭの結合定数で、重鎖および軽鎖の様々な残基によって規定されるセツキシマブＦａｂフラグメントの中央空洞内のメディトープ結合性部位（図８および９Ａを参照されたい）に結合することが明らかになっている。
【０１７９】
ある種の実施形態では、メディトープとセツキシマブ結合部位との独自の相互作用を利用して、追加のメディトープ利用可能抗体を作成する。一部の実施形態では、配列番号１もしくは２のメディトープまたはその変異体などの提供するメディトープのうちの１つまたは複数に結合する能力を与えるように、セツキシマブのＣＤＲとは別である１つまたは複数のＣＤＲを有する抗体などのセツキシマブ以外の抗体（時にはテンプレート抗体と称される）を修飾することによって、メディトープ利用可能抗体を作成する。このテンプレート抗体は、ヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体であってよい。一態様では、修飾には、Ｆａｂフラグメントの中央空洞内、典型的には重鎖および軽鎖可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）ならびに／または定常領域内の残基を、そのテンプレート抗体がメディトープ利用可能となるように置換することが包含される。例えば、テンプレート抗体がヒトまたはヒト化抗体である場合、修飾は一般的に、重鎖および軽鎖可変領域のＦＲ内の残基での置換を包含する。一部の実施形態では、そのような残基を、セツキシマブまたは匹敵するアミノ酸中に存在する対応する残基と置き換える。したがって、ある種の実施形態では、ヒトまたはヒト化抗体のＦＲ内の残基を、対応するマウス残基で置き換え；ある種の実施形態では、それらを、メディトープと相互作用する類似の官能基または部分を有する残基などの他の残基によって置き換える。典型的には、対応するマウス（または他の）残基によって置き換えられる残基は、中央Ｆａｂ空洞内に存在するので、免疫系に曝露されない。したがって、一部の実施形態では、ヒト対象への送達に関して、これらのアミノ酸置換をヒトまたはヒト化抗体に導入することで、修飾されたテンプレート抗体の抗原性は上昇しないか、または実質的に上昇しない。加えて、抗原性予測アルゴリズムをさらに使用して、点突然変異を有するヒト配列が抗原性であるはずがないことをさらに示すことができる。
【０１８０】
一部の実施形態では、置き換えられる１個または複数の残基は、Ｋａｂａｔナンバリング（その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２を参照されたい）に従うと軽鎖フレームワーク残基１０、３９〜４３、４５、８３、８５、１００、および／もしくは１０４および／またはＫａｂａｔナンバリングに従うと重鎖フレームワーク残基番号４０、８９、および１０５から選択される。一般に、別段の指定がない限り、抗体の重鎖または軽鎖中のアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに関する。セツキシマブメディトープ結合部位内の残基などの本明細書において記載されているセツキシマブの残基に対応する他の抗体中の残基も、本開示内に包含される。一部の実施形態では、軽鎖残基９、１０、３９、４０、４１、４２、４３、８３、８５、１００、および／もしくは１０４ならびに／または重鎖残基４０、８９、および／もしくは１０５に対応するテンプレート抗体中の残基を、例えば、セツキシマブ内でそれらの位置に存在するアミノ酸で置き換える。一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（またはＦＲ、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４などの１つまたは複数内）で、テンプレート抗体の軽鎖フレームワーク領域（またはそれぞれ１つまたは複数のＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのようなＦＲ、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、テンプレート抗体の重鎖フレームワーク領域（または個々の１種または複数のＦＲ−Ｈ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、テンプレート抗体のＶＨ領域に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有するか；かつ／またはそのＶＬ領域内で、テンプレート抗体のＶＬ領域に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、テンプレート抗体と比較して、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、すべての内で、完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を含有する。一部の態様では、抗体は、テンプレート抗体と比較して、軽鎖（例えば、ＦＲ−Ｌ）内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾を含有し、かつ／またはテンプレート抗体と比較して、重鎖（例えば、ＦＲ−Ｈ）内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾を含有する。
【０１８１】
一実施形態では、置き換えられる１個または複数の残基は、これらだけに限定されないが、Ｋａｂａｔナンバリングに従うと４０、４１、８３および８５を包含する軽鎖フレームワーク残基である。一実施形態では、軽鎖残基４０は、トレオニンで置き換えられ；軽鎖残基４１は、アスパラギンで置き換えられ、軽鎖残基８３は、イソロイシンまたはバリンで置き換えられ、かつ／または軽鎖残基８５は、アスパラルタートで置き換えられる。一実施形態では、軽鎖残基４０は、トレオニンで置き換えられ；軽鎖残基４１は、アスパラギンで置き換えられ、軽鎖残基８３は、グルタマートで置き換えられ、かつ／または軽鎖残基８５は、アスパルタートで置き換えられる。特定の例では、軽鎖フレームワークＰｒｏ４０は、Ｔｈｒ（Ｐ４０Ｔ）またはＳｅｒ（Ｐ４０Ｓ）で置き換えられ、軽鎖フレームワークＧｌｙ４１は、Ａｓｎ（Ｇ４１Ｎ）で置き換えられ、軽鎖フレームワーク残基Ｐｈｅ８３は、Ｉｌｅ（Ｆ８３Ｉ）またはＶａｌ（Ｆ８３Ｖ）またはグルタマート（Ｆ８３Ｅ）で置き換えられ、軽鎖フレームワーク残基Ｔｈｒ８５は、Ａｓｐ（Ｔ８５Ｄ）またはＡｓｎ（Ｔ８５Ｎ）で置き換えられる。
【０１８２】
したがって、提供するメディトープ利用可能抗体のうちには、１つまたは複数の修飾、典型的にはアミノ酸置換を、セツキシマブまたは他のメディトープ利用可能抗体（メディトープ利用可能トラスツズマブおよびメディトープ利用可能Ｍ５Ａを包含する本明細書において記載されているものなど）のメディトープ結合部位内の位置に対応する残基に有する抗体がある。それらの抗体のうちには、Ｋａｂａｔナンバリングに従うと４０位にトレオニン、セリンまたはアスパルタート、４１位にグリシン以外の残基、および８５位にアスパルタートまたはアスパラギンを有するＶＬ領域を有する抗体、例えば、４０位にトレオニン、４１位にアスパラギン、および８５位にアスパルタートを有するＶＬ領域を備えた抗体がある。一部の実施形態では、この抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うと、４０位にセリンおよび８９位にイソロイシンを備えたＶＨ領域、ならびに／または４０位にセリンまたはプロリンおよび８９位にイソロイシン、チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンを備えたＶＨ領域を有する。一部の実施形態では、ＶＬ領域は、１０位にイソロイシンもしくはロイシンおよび／または８３位にイソロイシンまたは８３位にグルタマートを有する。一部の実施形態では、このＶＬ領域は、９位にバリンまたはイソロイシンおよび／または１００位にグルタミン以外の残基を有する。
【０１８３】
一部の例では、Ｋａｂａｔナンバリングに従うと、そのＶＬ領域は、９位にバリンまたはイソロイシン、１０位にイソロイシンまたはロイシン、３９位にアルギニン、４０位にトレオニン、４１位にアスパラギン、４２位にグリシン、４３位にセリン、８３位にイソロイシンもしくはグルタマート、８５位にアスパルタート、および１００位にアラニンを有し、かつそのＶＨ領域は、４０位にセリンおよび８９位にイソロイシンを有する。一部の例では、そのＶＬ領域は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うと４０位にプロリン、４１位にグリシン、もしくは８５位にトレオニンを含有せず、かつ／またはそのＶＨ領域は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うと４０位にアスパラギンもしくはアラニン、または８９位にバリンを含有しない。一部の例では、そのＶＬ領域は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うと１０位にセリン、４０位にプロリン、４１位にグリシン、８３位にフェニルアラニン、または８５位にトレオニンを含有せず、かつ／あるいはそのＶＨ領域はＫａｂａｔナンバリングに従うと４０位にアスパラギンもしくはアラニンまたは８９位にバリンを含有しない。
【０１８４】
一部の態様では、抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うとＰ８、Ｖ９またはＩ９、Ｉ１０またはＬ１０、Ｑ３８、Ｒ３９、Ｔ４０、Ｎ４１、Ｇ４２、Ｓ４３、Ｐ４４、Ｒ４５、Ｄ８２、Ｉ８３、Ａ８４、Ｄ８５、Ｙ８６、Ｙ８７、Ｇ９９、Ａ１００、Ｇ１０１、Ｔ１０２、Ｋ１０３、Ｌ１０４、Ｅ１０５、Ｒ１４２、Ｓ１６２、Ｖ１６３、Ｔ１６４、Ｅ１６５、Ｑ１６６、Ｄ１６７、Ｓ１６８、およびＹ１７３を有する軽鎖、ならびに／またはＫａｂａｔナンバリングに従うとＱ６、Ｐ９、Ｒ３８、Ｑ３９、Ｓ４０、Ｐ４１、Ｇ４２、Ｋ４３、Ｇ４４、Ｌ４５、Ｓ８４、Ｄ８６、Ｔ８７、Ａ８８、Ｉ８９、Ｙ９０、Ｙ９１、Ｗ１０３、Ｇ１０４、Ｑ１０５、Ｇ１０６、Ｔ１０７、Ｌ１０８、Ｖ１０９、Ｔ１１０、Ｖ１１１、Ｙ１４７、Ｅ１５０、Ｐ１５１、Ｖ１５２、Ｔ１７３、Ｆ１７４、Ｐ１７５、Ａ１７６、Ｖ１７７、Ｙ１８５、Ｓ１８６、およびＬ１８７を有する重鎖を有する。
【０１８５】
一部の態様では、抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うとＰ８、Ｖ９またはＩ９、Ｉ１０またはＬ１０、Ｑ３８、Ｒ３９、Ｔ４０、Ｎ４１、Ｇ４２、Ｓ４３、Ｐ４４、Ｒ４５、Ｄ８２、Ｅ８３、Ａ８４、Ｄ８５、Ｙ８６、Ｙ８７、Ｇ９９、Ａ１００、Ｇ１０１、Ｔ１０２、Ｋ１０３、Ｌ１０４、Ｅ１０５、Ｒ１４２、Ｓ１６２、Ｖ１６３、Ｔ１６４、Ｅ１６５、Ｑ１６６、Ｄ１６７、Ｓ１６８、およびＹ１７３を有する軽鎖、ならびに／またはＫａｂａｔナンバリングに従うとＱ６、Ｐ９、Ｒ３８、Ｑ３９、Ｓ４０、Ｐ４１、Ｇ４２、Ｋ４３、Ｇ４４、Ｌ４５、Ｓ８４、Ｄ８６、Ｔ８７、Ａ８８、Ｉ８９、Ｙ９０、Ｙ９１、Ｗ１０３、Ｇ１０４、Ｑ１０５、Ｇ１０６、Ｔ１０７、Ｌ１０８、Ｖ１０９、Ｔ１１０、Ｖ１１１、Ｙ１４７、Ｅ１５０、Ｐ１５１、Ｖ１５２、Ｔ１７３、Ｆ１７４、Ｐ１７５、Ａ１７６、Ｖ１７７、Ｙ１８５、Ｓ１８６、およびＬ１８７を有する重鎖を有する。
【０１８６】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体を、例えば、セツキシマブにおける対応する位置（Ｋａｂａｔナンバリングに基づく）に似るように、ヒトまたはヒト化抗体、例えば、トラスツズマブなどの抗体の軽鎖において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１の残基を変異させることによって作成する。一部の態様では、そのような抗体は、ヒトまたはヒト化配列と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき軽鎖の９、１０、３９、４０、４１、４２、４３、４５、８３、８５、および１００位に変異残基を含有する。一態様では、メディトープ利用可能抗体の軽鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき、Ｖ９またはＩ９、Ｉ１０またはＬ１０、Ｒ３９、Ｔ４０、Ｎ４１  Ｇ４２、Ｓ４３、Ｒ４５、Ｉ８３またはＥ８３、Ｄ８５、およびＡ１００、例えば：Ｖ９、Ｉ１０、Ｒ３９、Ｔ４０、Ｎ４１、Ｇ４２、Ｓ４３、Ｒ４５、Ｉ８３、Ｄ８５、およびＡ１００を含有する。一部の実施形態では、抗体は、他の点では、ヒトであるか、またはヒト化されている。
【０１８７】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体を、例えば、セツキシマブにおける対応する位置に似るように、ヒトまたはヒト化抗体、例えば、トラスツズマブなどの抗体の重鎖において１または２残基などの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１の残基を変異させることによって作成する。一部の態様では、そのような抗体は、ヒトまたはヒト化配列と比較して、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき、重鎖において４０および８９位に変異残基を含有する。一態様では、重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づきＳ４０およびＩ８９を含有する。一部の実施形態では、抗体は、他の点では、ヒトであるか、またはヒト化されている。
【０１８８】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、例えば、ヒト化またはヒト配列と比較して、１３の変異を含有する。一態様では、メディトープ利用可能抗体は、ヒト化またはヒト配列と比較して、１１の変異を有する軽鎖、および２つの変異を有する重鎖を含有する。一部の態様では、抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき、軽鎖においてＶ９またはＩ９、Ｉ１０またはＬ１０、Ｒ３９、Ｔ４０、Ｎ４１、Ｇ４２、Ｓ４３、Ｒ４５、Ｉ８３、Ｄ８５、およびＡ１００、ならびに重鎖においてＳ４０およびＩ８９を含有する。一部の態様では、抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき、軽鎖においてＶ９またはＩ９、Ｉ１０またはＬ１０、Ｒ３９、Ｔ４０、Ｎ４１、Ｇ４２、Ｓ４３、Ｒ４５、Ｅ８３、Ｄ８５、およびＡ１００、ならびに重鎖においてＳ４０およびＩ８９を含有する。一部の態様では、抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき、軽鎖においてＶ９、Ｉ１０、Ｒ３９、Ｔ４０、Ｎ４１、Ｇ４２、Ｓ４３、Ｒ４５、Ｉ８３、Ｄ８５、およびＡ１００、ならびに重鎖においてＳ４０およびＩ８９を含有する。一部の態様では、抗体は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づき、軽鎖においてＶ９、Ｉ１０、Ｒ３９、Ｔ４０、Ｎ４１  Ｇ４２、Ｓ４３、Ｒ４５、Ｅ８３、Ｄ８５、およびＡ１００、ならびに重鎖においてＳ４０およびＩ８９を含有する。一部の実施形態では、抗体および／またはそのフレームワーク領域は、他の点では、ヒトであるか、またはヒト化されている。
【０１８９】
他の実施形態では、ＣＤＲグラフティングを介して、典型的には、本明細書において記載されているメディトープ利用可能抗体のうちの任意のものなどのメディトープ利用可能抗体の重鎖および／または軽鎖の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、ＣＤＲ１〜３のうちの１つまたは複数）を、それらを既存抗体または新たな抗体のＣＤＲなどの他のＣＤＲと置き換えるように変更することによって、メディトープ利用可能抗体を作成する。ＣＤＲグラフティングは、例えば、マウスなどの非ヒト種において作成される抗体のＣＤＲをヒト抗体フレームワーク上にグラフト化することによる、ヒト化モノクローナル抗体を生産するための標準的な実行法である。米国特許第５，５５８，８６４号および同第８，１３３，９８２号；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ：  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｎ  ｌｏｏｐ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、４：７７３〜７８３（１９９１）を参照されたい。したがって、ある種の実施形態では、目的の既存抗体または新たに生じさせた抗体のＣＤＲをグラフト化することによって、メディトープ利用可能抗体の抗原特異性を改変する。また、提供するメディトープ利用可能抗体のうちには、そのようなＣＤＲグラフト化されたメディトープ利用可能抗体がある。
【０１９０】
一部の実施形態では、本明細書において開示されている抗体（例えば、セツキシマブ、メディトープ利用可能トラスツズマブ、またはメディトープ利用可能Ｍ５Ａ（抗ＣＥＡ）抗体）のうちの１種をテンプレート配列として使用し、かつそれを改変する、例えば、その抗原結合特徴を改変するための１つまたは複数の既知の抗体操作方法を実施して、別の特徴を持つメディトープ利用可能抗体を生成することで、メディトープ利用可能抗体を作成する。抗原結合特性および他の特性を改変するために典型的に使用される既知の抗体操作方法には、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ無作為化、親和性成熟、選択法が包含され、この選択法には、エラープローンＰＣＲ、スパイクＰＣＲ（ｓｐｉｋｅｄ  ＰＣＲ）、特定部位の変異誘発、ファージディスプレイ、および他の選択方法が包含される。また、コンストラクト、ライブラリ、およびＧＰＩに連結している発現系を包含する発現系を、そのような方法を実施するために提供する。したがって、ある種の実施形態では、提供するメディトープ利用可能抗体は、軽鎖および／または重鎖可変領域を、セツキシマブ、メディトープ利用可能トラスツズマブ、またはメディトープ利用可能Ｍ５Ａなどのメディトープ利用可能抗体のフレームワーク領域または領域（ＦＲ）（またはそのような抗体のＦＲ（複数可）に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９（またはその概数）％の同一性を有するＦＲ（複数可））と共に有する。一部の態様では、そのような抗体は、そのメディトープ利用可能抗体のＣＤＲとは別である１つまたは複数のＣＤＲを有する。
【０１９１】
例えば、一部の実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号７１で示される軽鎖配列の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１（ＦＲ−Ｌ１）、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４（あるいは配列番号７１のＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９（またはその概数）％同一であるＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４）ならびに一部の態様では、配列番号７１で示される軽鎖配列のＣＤＲとは別である少なくとも１つのＣＤＲを含むアミノ酸配列を有し；かつ／またはＶＨ領域は、配列番号７２で示される重鎖配列の重鎖ＦＲ１（ＦＲ−Ｈ１）、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４（あるいは配列番号７２のＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９（またはその概数）％同一であるＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４）ならびに一部の態様では、配列番号７２で示される重鎖配列のＣＤＲとは別である少なくとも１つのＣＤＲを有するアミノ酸配列を有する。
【０１９２】
一部の実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号９で示される軽鎖配列の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１（ＦＲ−Ｌ１）、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４（あるいは配列番号９のＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９（またはその概数）％同一であるＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４）ならびに一部の態様では、配列番号９で示される軽鎖配列のＣＤＲとは別である少なくとも１つのＣＤＲを含むアミノ酸配列を有し；かつ／またはＶＨ領域は、配列番号６で示される重鎖配列の重鎖ＦＲ１（ＦＲ−Ｈ１）、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４（あるいは配列番号６のＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９（またはその概数）％同一であるＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４）ならびに一部の態様では、配列番号６で示される重鎖配列のＣＤＲとは別である少なくとも１つのＣＤＲを有するアミノ酸配列を有する。
【０１９３】
一部の実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号６８で示される軽鎖配列の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１（ＦＲ−Ｌ１）、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４（あるいは配列番号６８のＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９（またはその概数）％同一であるＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４）ならびに一部の態様では、配列番号６８で示される軽鎖配列のＣＤＲとは別である少なくとも１つのＣＤＲを含むアミノ酸配列を有し；かつ／またはＶＨ領域は、配列番号７０で示される重鎖配列の重鎖ＦＲ１（ＦＲ−Ｈ１）、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４（あるいは配列番号７０のＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９（またはその概数）％同一であるＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４）ならびに一部の態様では、配列番号７０で示される重鎖配列のＣＤＲとは別である少なくとも１つのＣＤＲを有するアミノ酸配列を有する。
【０１９４】
一部の実施形態では、ＶＬ領域は、配列番号６１で示される軽鎖配列の軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１（ＦＲ−Ｌ１）、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４（あるいは配列番号６１のＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９（またはその概数）％同一であるＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４）ならびに一部の態様では、配列番号６１で示される軽鎖配列のＣＤＲとは別である少なくとも１つのＣＤＲを含むアミノ酸配列を有し；かつ／またはＶＨ領域は、配列番号６３で示される重鎖配列の重鎖ＦＲ１（ＦＲ−Ｈ１）、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４（あるいは配列番号６３のＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９（またはその概数）％同一であるＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４）ならびに一部の態様では、配列番号６３で示される重鎖配列のＣＤＲとは別である少なくとも１つのＣＤＲを有するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、配列番号６、７、９、１０、１２、１４、６１、６３、６８、６９、７０、７１、および／または７２で示されるＣＤＲとは別である１つまたは複数のＣＤＲを有する。
【０１９５】
一部の実施形態では、メディトープは、セツキシマブ以外の抗体であり、ＥＧＦＲに特異的に結合せず、ＥＧＦＲ以外の抗原に結合し、かつ／またはセツキシマブが特異的に結合するＥＧＦＲ上のエピトープに特異的に結合しない。
【０１９６】
一部の例では、メディトープ利用可能抗体を、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、ペンテト酸アルツモマブ、アナツモマブ、アナツモマブマフェナトクス、アルシツモマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベクツモマブ、エクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、カプロマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エルツマキソマブ、ファノレソマブ、Ｆｂｔａ０５、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、サツモマブ、スレソマブ、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｔｒｂｓ０７、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ブロダルマブ、アンルキンズマブ、バピヌズマブ、ダロツズマブ、デムシズマブ、ガニツマブ、イノツズマブ、マブリリムマブ、モキセツモマブパスドトックス、リロツムマブ、シファリムマブ、タネズマブ、トラロキヌマブ、トレメリムマブ、ハイブリドーマ１０Ｂ５によって産生される抗体、Ｂ６Ｈ１２．２、およびウレルマブ、そのフラグメント、そのＣＤＲおよび／または抗原結合領域を有する抗体、および／もしくは結合についてそのような抗体と競合する抗体；ならびに／または配列番号７８〜１２４および／または１２５〜１７０のうちの任意のもので示される配列を有する抗体、そのフラグメント、そのＣＤＲおよび／または抗原結合領域を有する抗体、ならびに／または結合についてそのような抗体と競合する抗体のうちから選択されるテンプレート抗体を基にして作成する。表３に、一定の抗体についてのＣＡＳ（登録商標）登録番号を列挙する。
【０１９７】
【表３】
2017536091.tif 000011
2017536091.tif 000012
【０１９８】
他の例では、テンプレート抗体は、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、ペンテト酸アルツモマブ、アナツモマブ、アナツモマブマフェナトクス、アルシツモマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベクツモマブ、エクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、カプロマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エルツマキソマブ、ファノレソマブ、Ｆｂｔａ０５、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、サツモマブ、スレソマブ、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Ｔｒｂｓ０７、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ハイブリドーマ１０Ｂ５によって産生される抗体、およびブロダルマブまたはチウゼタン（ｔｉｕｚｅｔａｎ）のうちから選択される。一部のそのような例では、１つまたは複数のＣＤＲは、これらのテンプレート抗体に存在するＣＤＲであり、かつ／または抗体は、そのような抗体と同じ抗原もしくはエピトープに特異的に結合し、かつ／またはそれらの抗原への結合について、そのような抗体と競合する。
【０１９９】
したがって、場合によっては、メディトープ利用可能抗体（そのフラグメントを包含）は、ＣＡ−１２５、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、ＴＮＦ−α、ＣＤ５２、ＴＡＧ−７２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−２、インターロイキン−２受容体ａ−鎖（ＣＤ２５）、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＣＤ２３Ａ、ＦｃイプシロンＲＩＩ、ＦｃεＲＩＩ、ＦＣＥ２、ＣＬＥＣ４Ｊ、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＪ、免疫グロブリンＥ結合因子、リンパ球ＩｇＥ受容体、ＢＬＡＳＴ−２、またはＩＧＥＢＦとしても公知）、ＣＤ３７（テトラスパニン−２６、ＴＳＰＡＮ２６、ｔｓｐａｎ−２６、またはＧＰ５２−４０としても公知）、Ｍｕｃｉｎ−１、プロラクチン受容体（ＰＲＬ−Ｒとしても公知）、ＳＤＣ−１（ＣＤ１３８、シンデカンプロテオグリカン１、シンデカン１、またはヘパラン硫酸プロテオグリカン繊維芽細胞成長因子受容体としても公知）、Ｂ細胞活性化因子、インターロイキン−５受容体（ＣＤ１２５）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＣＤ３０、ＩＬ−１β、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１、ヒトインターロイキン−２受容体、Ｔａｃ、ＲＡＮＫリガンド、補体タンパク質、例えば、Ｃ５、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１１ａ、例えば、ヒトＣＤ１１ａ、インテグリン、例えば、αｖβ３インテグリン、ビトロネクチン受容体αｖβ３インテグリン、ＨＥＲ２、ｎｅｕ、ＣＤ３、ＣＤ１５、ＣＤ２０（小ループおよび／または大ループ）、インターフェロンγ、ＣＤ３３、ＣＡ−ＩＸ、ＴＮＦα、ＣＴＬＡ−４、癌胎児性抗原、ＩＬ−５、ＣＤ３ε、ＣＡＭ、α−４−インテグリン、ＩｇＥ、例えば、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＲＳＶ抗原、例えば、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質、ＴＡＧ−７２、ＮＣＡ−９０（顆粒細胞抗原）、ＩＬ−６、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７、ＣＴＡＡ１６．８８、ＩＬ１３、インターロイキン−１β、β−アミロイド、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体のαサブユニット、肝細胞成長因子、ＩＦＮ−α、神経成長因子、ＩＬ−１３、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ３２６、ＣＤ４７、およびＣＤ１３７からなる群から選択される抗原に特異的に結合する。一部の例では、メディトープ利用可能抗原は、癌または他の疾患などの目的の疾患または状態において標的として同定されている他の抗原に結合する。
【０２００】
ＣＤ１９
一実施形態では、テンプレート抗体は、抗ＣＤ１９抗体、例えば、ＭＯＲ２０８などのＣＤ１９のためのヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体、あるいはそのような抗体の重鎖、軽鎖、ＶＨ、またはＶＬを有する抗体、あるいはその機能性フラグメントである。一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、ＣＤ１９に特異的に結合する。ＣＤ１９（または分化−１９のクラスター）は、例えば、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１７１５６９またはＵｎｉＰｒｏｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  Ｐ１５３９１によって同定される。一態様では、ＣＤ１９は、Ｂ芽細胞に進展中の早期認識可能なＢ系列細胞からのＢ細胞の表面に存在するが、血漿細胞への成熟で失われる。ある種の態様では、ＣＤ１９は、抗原受容体依存性刺激のための閾値を低下させる調節分子である。
【０２０１】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、ＭＯＲ２０８（ＸｍＡｂ（登録商標）５５７４）（ＣＤ１９、例えば、未熟、成熟、および悪性Ｂ細胞のＣＤ１９に特異的に結合するモノクローナル抗体）の、それぞれ軽鎖および重鎖アミノ酸配列を示す配列番号２２６および／または配列番号２２７のアミノ酸配列（リーダー配列を含むか、または含まない）を含み、かつ／またはそれぞれＭＯＲ２０８のＶＬおよびＶＨアミノ酸配列を示す配列番号２４５および／または２４６のアミノ酸配列（リーダー配列を含むか、または含まない）を含む。
【０２０２】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号２２６で示される軽鎖配列、またはＭＯＲ２０８の軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号２２７で示される重鎖、またはＭＯＲ２０８の重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２０３】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、リーダー配列を含むか、または含まずに、配列番号２４５として示されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾などの１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、リーダー配列を含むか、または含まずに、配列番号２４６として示されるアミノ酸配列のＶＨ領域のアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾などの１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２０４】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、ＭＯＲ２０８、または配列番号２２６の軽鎖フレームワーク領域（またはそれぞれ１つもしくは複数のＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またその重鎖フレームワーク領域内（または１つもしくは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、ＭＯＲ２０８、または配列番号２２７の重鎖フレームワーク領域（またはそれぞれ１つまたは複数のＦＲ−Ｈ））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；および／またはそのＶＨ領域内で、ＭＯＲ２０８または配列番号２４６のＶＨ領域に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、ＭＯＲ２０８または配列番号２４５のＶＬ領域に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、ＭＯＲ２０８と比較すると（例えば、配列番号２２６または２２７のＣＤＲ（複数可）と比較すると）、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を含有する。
【０２０５】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、ＭＯＲ２０８によって特異的に結合されるＣＤ１９のエピトープに特異的に結合しないが、ＣＤ１９には特異的に結合するか、またはＭＯＲ２０８のＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてＭＯＲ２０８と競合しないが、ＣＤ１９には特異的に結合する。
【０２０６】
ＣＤ２２
一実施形態では、テンプレート抗体は、抗ＣＤ２２抗体、例えば、エプラツズマブ、もしくはモキセツモマブなどのＣＤ２２のためのヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体、あるいはそのような抗体の重鎖、軽鎖、ＶＨ、またはＶＬを有する抗体、あるいはその機能性フラグメントである。一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、ＣＤ２２に特異的に結合する。ＣＤ２２（または分化−２２のクラスター）は、例えば、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１７６２またはＵｎｉＰｒｏｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  Ｐ２０２７３によって同定されるとおりのレクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーに属する分子である。一態様では、ＣＤ２２は、成熟Ｂ細胞の表面上に、かつより少ない規模で一部の未熟Ｂ細胞上に存在する。ある種の態様では、ＣＤ２２は、免疫系の過剰活性化および自己免疫疾患の発生を予防する調節分子である。一実施形態では、ＣＤ２２のためのテンプレート抗体は、配列番号１７５のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質、または配列番号１７６の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質上の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する。
【０２０７】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、エプラツズマブ（ＣＤ２２、例えば、成熟および悪性Ｂ細胞のＣＤ２２に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体）の軽鎖および重鎖アミノ酸配列をそれぞれ示す配列番号１７７および／または配列番号１７８のアミノ酸配列（各配列において、下記ではイタリック体で示されるリーダー配列を含むか、または含まない）を含み、かつ／またはエプラツズマブのＶＬおよびＶＨアミノ酸配列をそれぞれ示す配列番号１７９および／または１８３のアミノ酸配列（各配列において、イタリック体で示されるリーダー配列を含むか、または含まない）を含む。
【０２０８】
エプラツズマブ軽鎖配列（配列番号１７７）：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＬＬＦＷＩＰＡＳＲＧＤＶＱＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＬＡＮＳＹＧＮＴＦＬＳＷＹＬＨＫＰＧＫＡＰＱＬＬＩＹＧＩＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＧＴＨＱＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
【０２０９】
エプラツズマブ重鎖配列（配列番号１７８）：
ＭＤＦＧＦＳＬＶＦＬＡＬＩＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＲＦＴＮＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＮＰＧＮＮＹＡＴＹＲＲＫＦＱＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＹＧＮＹＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。
【０２１０】
エプラツズマブ軽鎖可変（ＶＬ）領域配列（配列番号１７９）：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＬＬＦＷＩＰＡＳＲＧＤＶＱＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＬＡＮＳＹＧＮＴＦＬＳＷＹＬＨＫＰＧＫＡＰＱＬＬＩＹＧＩＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＧＴＨＱＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ。
【０２１１】
エプラツズマブ重鎖可変（ＶＨ）領域配列（配列番号１８３）：
ＭＤＦＧＦＳＬＶＦＬＡＬＩＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＲＦＴＮＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＮＰＧＮＮＹＡＴＹＲＲＫＦＱＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＥＧＹＧＮＹＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
【０２１２】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号１７７もしくは配列番号１７９において示される軽鎖もしくはＶＬ配列、またはエプラツズマブの軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号１７８もしくは１８３で示される重鎖もしくはＶＨ配列、またはエプラツズマブの重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２１３】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、リーダー配列を含むか、または含まずに、配列番号１７９として示されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾などの１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、リーダー配列を含むか、または含まずに、配列番号１８３のアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾などの１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２１４】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、エプラツズマブ、または配列番号１７７もしくは１７９の軽鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、エプラツズマブ、または配列番号１７８もしくは１８３の重鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｈ）に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、エプラツズマブのＶＨ領域に対して（例えば、配列番号１８３のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、エプラツズマブのＶＬ領域に対して（例えば、配列番号１７９のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、エプラツズマブと比較すると（例えば、配列番号１７７もしくは１７９または配列番号１７８もしくは１８３のＣＤＲ（複数可）と比較すると）完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含有する。
【０２１５】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、エプラツズマブによって特異的に結合されるＣＤ２２のエピトープに特異的に結合しないが、ＣＤ２２には特異的に結合するか、またはエプラツズマブのＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてエプラツズマブと競合しないが、ＣＤ２２には特異的に結合する。
【０２１６】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、モキセツモマブ（抗ＣＤ２２マウスモノクローナル抗体）のＶＬおよびＶＨアミノ酸配列をそれぞれ示す配列番号６５および／または配列番号６７のアミノ酸配列（リーダー配列を含むか、または含まない）を含み、かつ／またはモキセツモマブの重鎖アミノ酸配列を示す配列番号６６のアミノ酸配列（適用可能な場合には、イタリック体で示されているリーダー配列を含むか、または含まない）を含む。
【０２１７】
モキセツモマブ軽鎖可変（ＶＬ）領域配列（配列番号６５）：
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＩＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＣＧＴＫＬＥＩＫ。
【０２１８】
モキセツモマブ重鎖配列（配列番号６６）：
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＩＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＣＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＧＧＴＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＨＳＧＹＧＴＨＷＧＶＬＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＫＡＳＧＧＰＥＧＧＳＬＡＡＬＴＡＨＱＡＣＨＬＰＬＥＴＦＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＥＱＣＧＹＰＶＱＲＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷＮＱＶＤＱＶＩＲＮＡＬＡＳＰＧＳＧＧＤＬＧＥＡＩＲＥＱＰＥＱＡＲＬＡＬＴＬＡＡＡＥＳＥＲＦＶＲＱＧＴＧＮＤＥＡＧＡＡＮＧＰＡＤＳＧＤＡＬＬＥＲＮＹＰＴＧＡＥＦＬＧＤＧＧＤＶＳＦＳＴＲＧＴＱＮＷＴＶＥＲＬＬＱＡＨＲＱＬＥＥＲＧＹＶＦＶＧＹＨＧＴＦＬＥＡＡＱＳＩＶＦＧＧＶＲＡＲＳＱＤＬＤＡＩＷＲＧＦＹＩＡＧＤＰＡＬＡＹＧＹＡＱＤＱＥＰＤＡＲＧＲＩＲＮＧＡＬＬＲＶＹＶＰＲＳＳＬＰＧＦＹＲＴＳＬＴＬＡＡＰＥＡＡＧＥＶＥＲＬＩＧＨＰＬＰＬＲＬＤＡＩＴＧＰＥＥＥＧＧＲＬＥＴＩＬＧＷＰＬＡＥＲＴＶＶＩＰＳＡＩＰＴＤＰＲＮＶＧＧＤＬＤＰＳＳＩＰＤＫＥＱＡＩＳＡＬＰＤＹＡＳＱＰＧＫＰＰＲＥＤＬＫ。
【０２１９】
モキセツモマブ重鎖可変（ＶＨ）領域配列（配列番号６７）：
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＩＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＣＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＧＧＴＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＨＳＧＹＧＴＨＷＧＶＬＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ。
【０２２０】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号６５で示されるＶＬ配列、またはモキセツモマブの軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号６６もしくは６７で示される重鎖もしくはＶＨ配列、またはモキセツモマブの重鎖またはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２２１】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、リーダー配列を含むか、もしくは含まない配列番号６５として示されるアミノ酸配列、またはモキセツモマブのＶＬと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、リーダー配列を含むか、もしくは含まない配列番号６７のアミノ酸配列、またはモキセツモマブのＶＨと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２２２】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、モキセツモマブ、または配列番号６５の軽鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、モキセツモマブ、または配列番号６６もしくは６７の重鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｈ）に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、モキセツモマブのＶＨ領域に対して（例えば、配列番号６７のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、モキセツモマブのＶＬ領域に対して（例えば、配列番号６５のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、モキセツモマブと比較すると（例えば、配列番号６５または６６または６７のＣＤＲ（複数可）と比較すると）完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含有する。
【０２２３】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、モキセツモマブによって特異的に結合されるＣＤ２２のエピトープに特異的に結合しないが、ＣＤ２２には特異的に結合するか、またはモキセツモマブのＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてモキセツモマブと競合しないが、ＣＤ２２には特異的に結合する。
【０２２４】
ＣＤ２３
一実施形態では、テンプレート抗体は、抗ＣＤ２３抗体、例えば、ルミリキシマブなど、ＣＤ２３のためのヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体、あるいはそのような抗体の重鎖、軽鎖、ＶＨ、またはＶＬを有する抗体、あるいはその機能性フラグメントである。
【０２２５】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、ＣＤ２３に特異的に結合する。ＣＤ２３は、ＦｃイプシロンＲＩＩ、またはＦｃεＲＩＩとしても公知であり、アレルギーおよび寄生虫に対する耐性に関係する抗体アイソタイプであるＩｇＥのための「低親和性」受容体であり、ＩｇＥレベルの調節において重要である。ＣＤ２３は、例えば、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１９３９４８．２またはＵｎｉＰｒｏｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  Ｐ０６７３４によって同定されているとおりのＣ型レクチンである。ＣＤ２３抗原は、複数の造血細胞種上で発現される４５−ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。一部の態様では、ＣＤ２３は、成熟Ｂ細胞、活性化マクロファージ、好酸球、濾胞性樹状細胞、および血小板上で発現される。ＣＤ２３は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属さない唯一のＦｃＲである。ＣＤ２３の機能には、Ｂ細胞によるＩｇＥ産生のモジュレーション、および胚中心由来Ｂ細胞の生存の促進が包含される。ＣＤ２３の発現は、正常に活性化された濾胞性Ｂ細胞およびＣＬＬ細胞において高度にアップレギュレーションされる。
【０２２６】
一実施形態では、ＣＤ２３のためのテンプレート抗体は、配列番号１７２のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質、または配列番号１８４の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質上の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する。
【０２２７】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、ルミリキシマブのＶＬおよびＶＨアミノ酸配列をそれぞれ示す配列番号１８５および／または配列番号１９０のアミノ酸配列（適用可能な場合には、イタリック体で示されているリーダー配列を含むか、または含まない）を含む。
【０２２８】
ルミリキシマブ軽鎖可変（ＶＬ）領域配列＋リーダー（配列番号１８５）：
2017536091.tif 000013
【０２２９】
ルミリキシマブ重鎖可変（ＶＨ）領域配列＋リーダー（配列番号１９０）：
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＰＬＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＡＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＲＦＴＦＮＮＹＹＭＤＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＶＳＲＩＳＳＳＧＤＰＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＥＮＡＮＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＬＴＴＧＳＤＳＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳ。
【０２３０】
ルミリキシマブ（ＩＤＥＣ−１５２、Ｐ５Ｅ８、ゴミリキシマブ；Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃとしても公知）は、カニクイザル可変領域およびヒト定常領域（ＩｇＧ１−κ）を含有する霊長類化抗ＣＤ２３ｍＡｂである。活性化ヒト末梢血Ｂ細胞によるＩｇＥの産生を阻害するために元々開発されたが；しかしながら、後で、強力な抗ＣＤ２３ｍＡｂとしての評価を得た。前臨床データは、ルミリキシマブが、主に固有のアポトーシス経路（すなわち、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬおよびＸＩＡＰのダウンレギュレーション、Ｂａｘの活性化、ならびにミトコンドリアシトクロムｃの放出を誘導）によって、ＣＬＬ細胞およびＣＤ２３発現Ｂ細胞に対して、その抗腫瘍効果を媒介することを示唆している。異種移植片モデルにおいて、ルミリキシマブをリツキシマブまたはフルダラビンと組み合わせた場合に、相乗的細胞毒性も、ＣＤ２３発現Ｂ細胞系および一次ＣＬＬ細胞について実証されている。４６人の高度に事前治療されたＣＬＬ患者のフェーズＩ治験において、ルミリキシマブは、単一薬剤としては中等度の臨床的活性を示した。客観的完全応答（ＣＲ）または部分応答（ＰＲ）は観察されなかったが、ルミリキシマブは、患者の５２％において肥大リンパ節サイズを減少させ、患者の９１％において末梢血リンパ球数を低下させた。ルミリキシマブの安全性プロファイルは、主な有害事象（ＡＥ）がグレード１／２に限定されることを実証した。ルミリキシマブは、免疫抑制性ではなく、ＭＴＤ（最大許容用量）は達成されなかった。
【０２３１】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号１８５で示されるＶＬ配列、またはルミリキシマブの軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号１９０で示されるＶＨ配列、またはルミリキシマブの重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２３２】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、リーダー配列を含むか、もしくは含まない配列番号１８５として示されるアミノ酸配列、またはルミリキシマブのＶＬと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、リーダー配列を含むか、もしくは含まない配列番号１９０のアミノ酸配列、またはルミリキシマブのＶＨと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２３３】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、ルミリキシマブ、または配列番号１８５の軽鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、ルミリキシマブ、または配列番号１９０の重鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｈ）に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、ルミリキシマブのＶＨ領域に対して（例えば、配列番号１９０のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、ルミリキシマブのＶＬ領域に対して（例えば、配列番号１８５のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、ルミリキシマブと比較すると（例えば、配列番号１８５または１９０のＣＤＲ（複数可）と比較すると）完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含有する。
【０２３４】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、ルミリキシマブによって特異的に結合されるＣＤ２３のエピトープに特異的に結合しないが、ＣＤ２３には特異的に結合するか、またはルミリキシマブのＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてルミリキシマブと競合しないが、ＣＤ２３には特異的に結合する。
【０２３５】
ＣＤ３３
一実施形態では、テンプレート抗体は、抗ＣＤ３３抗体、例えば、ゲムツズマブなどのＣＤ３３のためのヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体、あるいはそのような抗体の重鎖、軽鎖、ＶＨ、またはＶＬを有する抗体、あるいはその機能性フラグメントである。一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、ＣＤ３３に特異的に結合する。ＣＤ３３（または分化−３３のクラスター）は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  Ｐ２０１３８によって同定される。一態様では、ＣＤ３３は、骨髄系細胞の表面上に存在する。
【０２３６】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、ゲムツズマブ（マイロターグ）（ＣＤ３３、例えば、未熟、成熟、および悪性Ｂ細胞のＣＤ３３に特異的に結合するモノクローナル抗体）の、それぞれ軽鎖および重鎖アミノ酸配列を示す配列番号２２４および／または配列番号２２５のアミノ酸配列（リーダー配列を含むか、または含まない）を含み、かつ／またはそれぞれゲムツズマブのＶＬおよびＶＨアミノ酸配列を示す配列番号２４３および／または２４５のアミノ酸配列（リーダー配列を含むか、または含まない）を含む。
【０２３７】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号２２４で示される軽鎖配列、またはゲムツズマブの軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号２２５で示される重鎖、またはゲムツズマブの重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２３８】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、リーダー配列を含むか、または含まない配列番号２４３として示されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、リーダー配列を含むか、または含まない配列番号２４４として示されるアミノ酸配列のＶＨ領域のアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２３９】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、ゲムツズマブ、または配列番号２２４の軽鎖フレームワーク領域（またはそれぞれ１つもしくは複数のＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またその重鎖フレームワーク領域内（または１つもしくは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、ゲムツズマブ、または配列番号２２５の重鎖フレームワーク領域（またはそれぞれ１つまたは複数のＦＲ−Ｈ））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；および／またはそのＶＨ領域内で、ゲムツズマブまたは配列番号２４４のＶＨ領域に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、ゲムツズマブまたは配列番号２４３のＶＬ領域に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、ゲムツズマブと比較すると（例えば、配列番号２２４または２２５のＣＤＲ（複数可）と比較すると）、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を含有する。
【０２４０】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、ゲムツズマブによって特異的に結合されるＣＤ３３のエピトープに特異的に結合しないが、ＣＤ３３には特異的に結合するか、またはゲムツズマブのＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてゲムツズマブと競合しないが、ＣＤ３３には特異的に結合する。
【０２４１】
ＣＤ３７
一実施形態では、テンプレート抗体は、抗ＣＤ３７抗体、例えば、オトレルツズマブ（ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）などのＣＤ３７のためのヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体、あるいはそのような抗体の重鎖、軽鎖、ＶＨ、またはＶＬを有する抗体、あるいはその機能性フラグメントである。
【０２４２】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、ＣＤ３７に特異的に結合する。ＧＰ５２−４０またはＴＳＰＡＮ２６としても公知のＣＤ３７は、テトラスパニンファミリーとしても公知の膜貫通４スーパーファミリーのメンバーである。その開示があらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１１１２９７８は、ＣＤ３７結合分子およびその免疫複合体を開示している。
【０２４３】
一実施形態では、ＣＤ３７のためのテンプレート抗体は、配列番号１９１のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質、または配列番号１９２の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質上の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する。
【０２４４】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、オトレルツズマブのＶＬおよびＶＨアミノ酸配列をそれぞれ示す配列番号１９３および／または配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。
【０２４５】
オトレルツズマブ（ＢｅｔａｌｕｔｉｎまたはＩＭＧＮ５２９としても公知）は、ＮＨＬサブタイプ上のＣＤ２０の発現プロファイルと同様の発現プロファイルを有するＣＤ３７を標的とする。
【０２４６】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号１９３で示されるＶＬ配列、またはオトレルツズマブの軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号１９４で示されるＶＨ配列、またはオトレルツズマブの重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２４７】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、配列番号１９３として示されるアミノ酸配列、またはオトレルツズマブのＶＬと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、配列番号１９４のアミノ酸配列、またはオトレルツズマブのＶＨと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２４８】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、オトレルツズマブ、または配列番号１９３の軽鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、オトレルツズマブ、または配列番号１９４の重鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｈ）に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、オトレルツズマブのＶＨ領域に対して（例えば、配列番号１９４のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、オトレルツズマブのＶＬ領域に対して（例えば、配列番号１９３のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、オトレルツズマブと比較すると（例えば、配列番号１９３または１９４のＣＤＲ（複数可）と比較すると）完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含有する。
【０２４９】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、オトレルツズマブによって特異的に結合されるＣＤ３７のエピトープに特異的に結合しないが、ＣＤ３７には特異的に結合するか、またはオトレルツズマブのＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてオトレルツズマブと競合しないが、ＣＤ３７には特異的に結合する。
【０２５０】
ムチン−１
一実施形態では、テンプレート抗体は、抗ムチン−１抗体、例えば、ｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅ（クリバツズマブテトラキセタンとしても公知）などのムチン−１のためのヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体、あるいはそのような抗体の重鎖、軽鎖、ＶＨ、またはＶＬを有する抗体、あるいはその機能性フラグメントである。
【０２５１】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、ムチン１に特異的に結合する。ムチン−１は、ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）、または多形性上皮ムチン（ＰＥＭ））としても公知であり、例えば、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０１８０２１またはＵｎｉＰｒｏｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  Ｐ１５９４１によって同定されるとおり、ヒトにおいてＭＵＣ１遺伝子によってコードされるムチンである。一実施形態では、ムチン−１のためのテンプレート抗体は、配列番号１９５のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質、または配列番号１９６の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質上の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する。
【０２５２】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、それぞれｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅ（クリバツズマブテトラキセタンとしても公知）のそれぞれＶＬおよびＶＨアミノ酸配列を示す配列番号１９７および／または配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。その開示があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１００４２５６２は、追加のムチン−１抗体を開示している。
【０２５３】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号１９７で示されるＶＬ配列、またはｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅの軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号１９８で示されるＶＨ配列、またはｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅの重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２５４】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、リーダー配列を含むか、もしくは含まない配列番号１９７として示されるアミノ酸配列、またはｈＰＡＭ４−ＣｉｄｅのＶＬと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、リーダー配列を含むか、もしくは含まない配列番号１９８のアミノ酸配列、またはｈＰＡＭ４−ＣｉｄｅのＶＨと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２５５】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、ｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅ、または配列番号１９７の軽鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、ｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅ、または配列番号１９８の重鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｈ）に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、ｈＰＡＭ４−ＣｉｄｅのＶＨ領域に対して（例えば、配列番号１９８のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、ｈＰＡＭ４−ＣｉｄｅのＶＬ領域に対して（例えば、配列番号１９７のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、ｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅと比較すると（例えば、配列番号１９７または１９８のＣＤＲ（複数可）と比較すると）完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含有する。配列番号１９７は、ｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅ軽鎖可変（ＶＬ）領域配列を示し、配列番号１９８は、ｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅ重鎖可変（ＨＬ）領域配列を示す。
【０２５６】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、ｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅによって特異的に結合されるムチン１のエピトープに特異的に結合しないが、ムチン１には特異的に結合するか、またはｈＰＡＭ４−ＣｉｄｅのＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてｈＰＡＭ４−Ｃｉｄｅと競合しないが、ムチン１には特異的に結合する。
【０２５７】
プロラクチン受容体
一実施形態では、テンプレート抗体は、抗プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）抗体、例えば、ＬＦＡ−１０２または００２−Ｈ０８などのプロラクチン受容体のためのヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体、あるいはそのような抗体の重鎖、軽鎖、ＶＨ、またはＶＬを有する抗体、あるいはその機能性フラグメントである。
【０２５８】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、プロラクチン受容体に特異的に結合する。一態様では、プロラクチン受容体は、染色体５ｐ１３−１４上の遺伝子によってコードされ、膜貫通受容体としてプロラクチン分子と相互作用する。プロラクチン受容体は、プロラクチンに結合する細胞外領域、膜貫通領域、および細胞質領域を含有する。
【０２５９】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、ＩｇＧ１カッパサブタイプのヒト化モノクローナル抗体であり、非リガンド競合的手法でＰＲＬＲの推定上の二量化領域に結合し、ＰＲＬ誘発性シグナル伝達を阻害するＬＦＡ−１０２のＶＬおよび／またはＶＨアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。ＬＦＡ−１０２は、その開示があらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１１０１５０７６０号において開示されている。
【０２６０】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、ＬＦＡ−１０２のＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／またはＬＦＡ−１０２のＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２６１】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、ＬＦＡ−１０２のＶＬと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、ＬＦＡ−１０２のＶＨと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２６２】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、ＬＦＡ−１０２の軽鎖フレームワーク領域（またはそれぞれ１つもしくは複数のＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またその重鎖フレームワーク領域内（または１つもしくは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、ＬＦＡ−１０２の重鎖フレームワーク領域（またはそれぞれ１つまたは複数のＦＲ−Ｈ））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；および／またはそのＶＨ領域内で、ＬＦＡ−１０２のＶＨ領域に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、ＬＦＡ−１０２のＶＬ領域に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、ＬＦＡ−１０２と比較すると、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を含有する。
【０２６３】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、ＬＦＡ−１０２によって特異的に結合されるプロラクチン受容体のエピトープに特異的に結合しないが、プロラクチン受容体には特異的に結合するか、またはＬＦＡ−１０２のＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてＬＦＡ−１０２と競合しないが、プロラクチン受容体には特異的に結合する。
【０２６４】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、００２−Ｈ０８のそれぞれＶＬおよびＶＨアミノ酸配列を示す配列番号２０８および／または配列番号２０９のアミノ酸配列を含む。その開示があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２０３１５２７６は、００２−Ｈ０８を包含するプロラクチン受容体抗体を開示する。
【０２６５】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号２０８で示されるＶＬ配列、または００２−Ｈ０８の軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号２０９で示されるＶＨ配列、または００２−Ｈ０８の重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２６６】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、配列番号２０８として示されるアミノ酸配列、または００２−Ｈ０８のＶＬと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、配列番号２０９として示されるアミノ酸配列、または００２−Ｈ０８のＶＨと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２６７】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、００２−Ｈ０８、または配列番号２０８の軽鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、００２−Ｈ０８、または配列番号２０９の重鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｈ）に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、００２−Ｈ０８のＶＨ領域に対して（例えば、配列番号２０９のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、００２−Ｈ０８のＶＬ領域に対して（例えば、配列番号２０８のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、００２−Ｈ０８と比較すると（例えば、配列番号２０８または２０９のＣＤＲ（複数可）と比較すると）完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含有する。
【０２６８】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、００２−Ｈ０８によって特異的に結合されるプロラクチン受容体のエピトープに特異的に結合しないが、プロラクチン受容体には特異的に結合するか、または００２−Ｈ０８のＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合について００２−Ｈ０８と競合しないが、プロラクチン受容体には特異的に結合する。
【０２６９】
ＳＤＣ−１
一実施形態では、テンプレート抗体は、抗ＳＤＣ−１抗体、例えば、インダツキシマブ・ラブタンシンなどのＳＤＣ−１のためのヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体（シンデカン１、またはＣＤ１３８としても公知）、あるいはそのような抗体の重鎖、軽鎖、ＶＨ、もしくはＶＬを有する抗体、あるいはその機能性フラグメントである。
【０２７０】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、ＳＤＣ−１に特異的に結合する。一態様では、ＳＤＣ−１は、膜貫通（Ｉ型）へパラン硫酸プロテオグリカンであり、シンデカンプロテオグリカンファミリーのメンバーである。シンデカンは、細胞結合、細胞シグナル伝達、および細胞骨格構築を媒介し、シンデカン受容体は、ＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質の内部移行に必要である。シンデカン−１タンパク質は、内在性膜タンパク質として機能し、細胞外マトリックスタンパク質のためのその受容体を介して、細胞増殖、細胞遊走、および細胞−マトリックス相互作用に関係する。改変されたシンデカン−１発現は、いくつかの異なる腫瘍種において検出されている。複数の転写変異体がこの遺伝子には存在し得て、今日までに、２種のみの全長特質が記載されている。これらの２種は、この遺伝子の主な変異体を表しており、同じタンパク質をコードする。一実施形態では、ＳＤＣ−１のためのテンプレート抗体は、配列番号２１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質上の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する。
【０２７１】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、インダツキシマブ・ラブタンシンのそれぞれＶＬおよびＶＨアミノ酸配列を示す配列番号２１１および／または配列番号２１２のアミノ酸配列を含む。インダツキシマブ・ラブタンシン（ＢＴ−０６２、ＢＴ０６２、またはＢ−Ｂ４としても公知）は、ＳＤＣ−１抗体である。
【０２７２】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号２１１で示されるＶＬ配列、またはインダツキシマブ・ラブタンシンの軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号２１２で示されるＶＨ配列、またはインダツキシマブ・ラブタンシンの重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２７３】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、配列番号２１１として示されるアミノ酸配列、またはインダツキシマブ・ラブタンシンのＶＬと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、リーダー配列を含むか、もしくは含まない配列番号２１２のアミノ酸配列、またはインダツキシマブ・ラブタンシンのＶＨと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２７４】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、インダツキシマブ・ラブタンシン、または配列番号２１１の軽鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、インダツキシマブ・ラブタンシン、または配列番号２１２の重鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｈ）に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、インダツキシマブ・ラブタンシンのＶＨ領域に対して（例えば、配列番号２１２のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、インダツキシマブ・ラブタンシンのＶＬ領域に対して（例えば、配列番号２１１のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、インダツキシマブ・ラブタンシンと比較すると（例えば、配列番号２１１または２１２のＣＤＲ（複数可）と比較すると）完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含有する。
【０２７５】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、インダツキシマブ・ラブタンシンによって特異的に結合されるＳＤＣ−１のエピトープに特異的に結合しないが、ＳＤＣ−１には特異的に結合するか、またはインダツキシマブ・ラブタンシンのＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてインダツキシマブ・ラブタンシンと競合しないが、ＳＤＣ−１には特異的に結合する。
【０２７６】
ＥＧＦＲ
一実施形態では、テンプレート抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、ＡＢＴ−８０６、ザツキシマブなどのＥＧＦＲのためのヒトもしくはヒト化抗体またはマウス抗体、あるいはそのような抗体の重鎖、軽鎖、ＶＨ、またはＶＬを有する抗体、あるいはその機能性フラグメントである。一部の態様では、抗ＥＧＦＲテンプレート抗体は、セツキシマブではなく、セツキシマブの全部または一部のＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは結合についてセツキシマブと競合しない。
【０２７７】
一実施形態では、ＥＧＦＲのためのテンプレート抗体は、配列番号２１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質、または配列番号２１４の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質上の１つまたは複数のエピトープに特異的に結合する。
【０２７８】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、ＥＧＦＲ抗体であるＡＢＴ−８０６（ｍＡｂ８０６／４１４としても公知）のそれぞれＶＬおよびＶＨアミノ酸配列を示す配列番号２１５および／または配列番号２１６のアミノ酸配列を含み、かつ／またはそれぞれＡＢＴ−８０６の軽鎖および重鎖配列を示す配列番号２１７および配列番号２１８のアミノ酸配列を含む。
【０２７９】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号２１５で示されるＶＬ配列、またはＡＢＴ−８０６の軽鎖もしくはＶＬ配列のＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号２１６で示されるＶＨ配列、またはＡＢＴ−８０６の重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２８０】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、配列番号２１５として示されるアミノ酸配列、またはＡＢＴ−８０６のＶＬと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、配列番号２１６として示されるアミノ酸配列、またはＡＢＴ−８０６のＶＨと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２８１】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、ＡＢＴ−８０６、または配列番号２１５の軽鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、ＡＢＴ−８０６、または配列番号２１６の重鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｈ）に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、ＡＢＴ−８０６のＶＨ領域に対して（例えば、配列番号２１６のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、ＡＢＴ−８０６のＶＬ領域に対して（例えば、配列番号２１５のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、ＡＢＴ−８０６と比較すると（例えば、配列番号２１５または２１６のＣＤＲ（複数可）と比較すると）完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含有する。
【０２８２】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、ＡＢＴ−８０６によって特異的に結合されるＥＧＦＲのエピトープに特異的に結合しないが、ＥＧＦＲには特異的に結合するか、またはＡＢＴ−８０６のＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてＡＢＴ−８０６と競合しないが、ＥＧＦＲには特異的に結合する。
【０２８３】
一部の実施形態では、テンプレート抗体は、ザツキシマブのそれぞれＶＬおよびＶＨアミノ酸配列を示す配列番号２１９および／または配列番号２２０のアミノ酸配列を含み、かつ／またはザツキシマブ、ＥＧＦＲ抗体の軽鎖および重鎖配列を示す配列番号２２１および／または２２２のアミノ酸配列を含む。
【０２８４】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントは、配列番号２１９で示されるＶＬ配列、またはザツキシマブの軽鎖もしくはＶＬのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）、および／または配列番号２２０で示されるＶＨ配列、またはザツキシマブの重鎖もしくはＶＨのＣＤＲ（すなわち、１つまたは複数のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３）を有する。
【０２８５】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体のＶＬ領域は、配列番号２１９として示されるアミノ酸配列、またはザツキシマブのＶＬと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、一般に複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有し、かつ／またはメディトープ利用可能抗体のＶＨ領域は、配列番号２２０のアミノ酸配列、またはザツキシマブのＶＨと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の修飾など、１つまたは複数、例えば、複数の修飾（一般に、フレームワーク領域において）を含有する。
【０２８６】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体は、その軽鎖フレームワーク領域内（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、および／またはＦＲ−Ｌ４内）で、ザツキシマブ、または配列番号２１９の軽鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｌ（複数可））に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはその重鎖フレームワーク領域（または１つまたは複数のそのような領域内、例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、および／またはＦＲ−Ｈ４内）で、ザツキシマブ、または配列番号２２０の重鎖フレームワーク領域（または個々の１つまたは複数ＦＲ−Ｈ）に対して少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＨ領域内で、ザツキシマブのＶＨ領域に対して（例えば、配列番号２２０のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％（もしくはその概数）の同一性を含有し；かつ／またはそのＶＬ領域内で、ザツキシマブのＶＬ領域に対して（例えば、配列番号２２０のアミノ酸配列に対して）少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％（もしくはその概数）の同一性を含有する。一部の実施形態では、抗体は、重鎖および／または軽鎖内のＣＤＲの１つまたは複数、例えば、全部の内で、ザツキシマブと比較すると（例えば、配列番号２１９または２２０のＣＤＲ（複数可）と比較すると）完全または少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含有する。
【０２８７】
一部の態様では、メディトープ利用可能抗体は、ザツキシマブによって特異的に結合されるＥＧＦＲのエピトープに特異的に結合しないが、ＥＧＦＲには特異的に結合するか、またはザツキシマブのＣＤＲを含有せず、かつ／もしくは抗原結合についてザツキシマブと競合しないが、ＥＧＦＲには特異的に結合する。
【０２８８】
メディトープ利用可能抗体は一般的に、一般的にはヒト定常領域または部分的にヒト定常領域である定常領域、典型的には重鎖および軽鎖定常領域をさらに包含する。一部の態様では、重鎖定常領域は、ＣＨ１またはその一部分を包含する。一部の態様では、軽鎖定常領域は、ＣＬまたはその一部分を包含する。一部の実施形態では、その定常領域の部分は、例えば、必要な結合親和性で、抗体がメディトープに結合し得るようにするために十分なものである。一部の態様では、その定常領域は、セツキシマブまたはトラスツズマブの定常領域である。したがって、一部の態様では、重鎖定常領域は、１つまたは複数のヒトＩｇＧ１定常領域であり；一部の態様では、軽鎖定常領域は、κ定常鎖領域である。他の例では、定常領域は、ヒト（または他の生物、例えば、マウスまたはニワトリ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥｓ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＭを包含する他のアイソタイプのものを包含し得、かつκまたはλ定常領域を包含し得る。したがって、提供するメディトープ利用可能抗体のうちには、ヒト、マウス、もしくはニワトリなどの他のＩｇＧ、または他の免疫グロブリン中の残基の変異によって生じるものがある。言い換えると、本明細書において提供するメディトープ利用可能化方法は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＭを包含し、かつこれらに限定されないが、ニワトリ、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、霊長類、およびヤギを包含する、抗体を産生する任意の生物に由来する任意の抗体のために使用することができる。
【０２８９】
例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の第１の定常領域（ＣＨ１）の配列は、セツキシマブのメディトープ結合性領域内ではない残基で異なり、メディトープ利用可能化技術をセツキシマブのＩｇＧ１以外のアイソタイプに適用可能であることが確認される。別の例として、ＩｇＧ１およびＩｇＥ  Ｆａｂドメインの配列および構造的アラインメントは、メディトープ結合性部位に近いＩｇＥ上の残基を示す。
【０２９０】
モノクローナル抗体内のＦａｂ空洞にメディトープ部位をグラフト化するために提供する方法を使用して、メディトープ結合のための独自のハンドルを作り、既に開示した技術と共に、新たに作成する抗体のために使用することができる。ある種の実施形態では、メディトープ結合部位を、既存の抗体および未来のモノクローナル抗体全てに作ることができる。
【０２９１】
また、例えば、親和性、結合活性、ｐＨ依存性を包含するメディトープとの相互作用の態様、さらには、抗体の薬物速度（ＰＫ）および薬物動態（ＰＤ）を包含する他の態様を包含するメディトープ利用可能抗体の様々な特性を改変するように、メディトープ利用可能抗体を修飾する方法も提供する。したがって、提供するメディトープ利用可能抗体のうちには、以下のセクションＦに記載されている任意の１つまたは複数の修飾を有する抗体を包含する、これらの方法に従って、例えば、ファルマコホア結合モデルを作成することによって作成された修飾抗体もある。
【０２９２】
また、メディトープ利用可能抗体を作成するためにテンプレート抗体として使用される抗体のうちには、ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙ（商標）などの修飾抗体およびその部分がある。したがって、提供するメディトープ利用可能抗体のうちには、提供するメディトープのうちの１種または複数に、例えば、本明細書において記載されているとおりの親和性で結合し得るように修飾されたＣｏｖＸ-ｂｏｄｙがある。
【０２９３】
また、本明細書において記載されている抗体のうちの任意のものなどのメディトープ利用可能抗体に結合している１つまたは複数のメディトープを含有する複合体を提供する。
【０２９４】
また、メディトープ利用可能抗体をコードするｃＤＮＡおよびＲＮＡ分子などの核酸、ならびにそれらを含有するベクターおよびライブラリ、さらには、選択および発現方法を包含するそれらを使用するための方法、ならびにそのようなコンストラクトを使用してトランスジェニック動物を発生させるための方法を提供する。
【０２９５】
Ｄ．  使用方法および組成物
多価メディトープを包含するメディトープの方法および使用も提供する。方法のうちには、メディトープ、抗体、および／またはそれにコンジュゲートした薬剤を、メディトープ利用可能抗体によって認識される抗原を発現する細胞および組織に送達する方法がある。
【０２９６】
一部の実施形態では、提供する方法は、腫瘍細胞の特性を利用し、薬剤を効率的に放出するために、コンジュゲートした生物製剤の内部移行およびソーティング経路を改変する。一部の実施形態では、当該方法は、例えば、メディトープ利用可能抗体の投与に関連して、例えば、それと併せて、その前、またはその後に、多価メディトープを投与することによって、抗原および／もしくはメディトープ利用可能抗体の同時局在化、クラスター化、凝集、内部移行、および／もしくは細胞内輸送またはソーティング、ならびに／またはその発生反復または増強または改変を行う。そのような受容体抗原を認識するメディトープ利用可能抗体および多価メディトープを細胞に投与した後の、そのような表面受容体のクラスター化および／または内部移行には、抗体のみの投与と比較して、差異が観察される。提供する実施形態のうちには、メディトープ利用可能抗体（ｍｅｄｉｔｏｐｅ−ｅｎａｂｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（メディトープ利用可能抗体（ｍｅｄｉｔｏｐｅ  ｅｎａｂｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））によって認識される表面抗原の同時局在化およびクラスター化、ならびに／または受容体などの細胞表面抗原などのそのような抗原の内部移行／輸送／ソーティングを促進する多価メディトープを投与することを含む方法がある。
【０２９７】
また、例えば、イメージングおよび治療方法において、メディトープおよび／またはカップリングされた薬剤を細胞に送達する際の多価メディトープの方法および使用を提供する。例示的な方法は、多価メディトープにカップリングされた細胞毒素または放射標識された薬剤の送達を行う方法である。一部の実施形態では、当該方法は、細胞表面抗原の内部移行の程度および／または比率の増加をもたらす。例えば、薬剤を細胞に送達するために抗体を使用するか、または例えば、癌などの疾患の進行に関連するか、またはその原因である表面受容体または他の表面抗原のダウンレギュレーションを、分解のためにそれらを標的とすることによって促進するために抗体を送達するＡＤＣまたは他の使用の状況において、増加したか、またはより急速な内部移行は、有利であり得る。ＡＤＣＣおよび／または補体媒介性溶解などのエフェクター機能を促進するために、かつ／または細胞−表面受容体抗原を介するシグナル伝達をエンゲージおよび促進するために、抗体を送達する状況などの一部の状況では、よりゆっくりとした程度か、またはそれほど急速ではない内部移行が望ましいことがある。
【０２９８】
メディトープを送達し、かつ／または標的細胞上の細胞表面抗原の同時局在化またはクラスター化を増強または増加させるための方法を提供する。一部の実施形態では、当該方法を、細胞に、細胞表面抗原（複数可）に特異的に結合する１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体、および多価メディトープを投与することによって実施する。一部の実施形態では、抗原の同時局在化、クラスター化、および／または凝集を増強または増加させる。一部の態様では、増加は、メディトープ利用可能抗体および／もしくは多価メディトープを添加する前、またはその非存在下で、またはメディトープを伴わない抗体の存在下で観察されたものと比較して、程度、比率、および／または期間の増加である。一部の実施形態では、当該方法は、細胞表面抗原によるシグナルおよび／または結合した抗体を介して媒介されるエフェクター機能を促進するか、またはその程度を増強する。
【０２９９】
メディトープ、それにカップリングされた薬剤を送達するための、かつ／または標的細胞上の細胞表面抗原の内部移行および／または分解を増強または増加するための方法を提供する。一部の実施形態では、当該方法を、細胞に、細胞表面抗原（複数可）に特異的に結合する１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体、および多価メディトープを投与することによって実施する。一部の実施形態では、抗原の内部移行および／または分解を促進、増強、または増加させる。一部の態様では、増加は、メディトープ利用可能抗体および／もしくは多価メディトープを添加する前に、またはその非存在下で、またはメディトープを伴わない抗体の存在下で観察されたものと比較して、程度、比率、および／または期間の増加である。一部の実施形態では、メディトープを、ＡＤＣまたはＲＩＴにおいて使用するためなど、化学療法剤、細胞毒素、または放射標識された薬剤などの治療剤または診断剤とカップリングさせる。一部の実施形態では、当該方法は、内部移行または細胞内輸送を改変する。
【０３００】
一部の態様では、例えば、メディトープ利用可能抗体と組み合わせて相乗作用を達成するために、多価メディトープを第２の抗体または二重特異性抗体の代わりに使用する。一部の態様では、同じ抗原上の別のエピトープを認識する第２の抗体の使用と比較して、多価メディトープは利点をもたらす。例えば、多価メディトープの生成は、第２の抗体と比較した場合に、より効率的で、かつ費用効果が高くなり得る。例えば、いくつかの前臨床／治験が２種のモノクローナル抗体の同時投与を調査しているが、そのような治療剤の製造および販売の費用はおそらく、非常に高価となるであろう。一部の態様では、多価メディトープはまた、腫瘍などの疾患部位に対して比較的より容易に標的化される。メディトープ結合性部位（メディトープ結合性部位内で、抗体ＣＤＲとは別）の性質、および選択した任意の抗体をメディトープ利用可能化するための本明細書において提供する幅広く適用可能な方法があれば、多価メディトープはまた、治療的に許容される特徴を有する第２の抗体またはエピトープを同定する必要なしに、広範な治療用抗体に容易に適用可能であるという利点を有する。したがって、一部の態様では、多価メディトープの使用によって、許容される特徴を有する第２のｍＡｂを同定する必要性、およびそれを開発する関連する多大なコストが回避される。
【０３０１】
一部の実施形態では、多価メディトープは、二価抗体を上回る利点、および／またはその改善をもたらす。一部の実施形態では、二重特異性抗体のみの使用と比較して、例えば、二重特異性抗体の異なるアームによって結合される２つの抗原、例えば、細胞表面抗原の凝集を増強するために、例えば、親和性、抗体によって誘導されるシグナル伝達、エフェクター機能、および／または内部移行を増強するために、多価メディトープを二重特異性メディトープ利用可能抗体と共に使用する。したがって、一部の態様では、多価メディトープを二重特異性メディトープ利用可能抗体に関連して使用すると、それは、二重特異性抗体のみと比較して、例えば、追加的なクラスター化程度をもたらすことによって、有効性レベルの上昇をもたらす。
【０３０２】
一部の実施形態では、それぞれ、同じ細胞の表面上で発現される異なる抗原に特異的に結合する２つのメディトープ利用可能抗体を多価メディトープと一緒に、二価抗体の代わりに使用して、細胞表面上での相互に対する２つの抗原の密度または存在比に関わらず、抗原（例えば、受容体）凝集の増強、および／または特定のレベルの凝集を得る。一部の態様では、そのような実施形態は、抗原の細胞表面クラスター化、および／または同時局在化を増強する。一実施形態では、多価メディトープを、そのようなクラスター化を達成するために、多数の異なる抗原を認識する多数のメディトープ利用可能抗体と一緒に使用する。したがって、一部の実施形態では、クラスター化が、抗体の各アームがその個々の抗原に結合している場所でのみ起こるであろう二重特異性抗体と比較して、そのような実施形態におけるクラスター化は、抗体の１つによって結合される抗原が、別の抗体によって結合される抗原と比較して、かなり高い密度で細胞表面上に存在する場合にも、達成され得る。
【０３０３】
一部の実施形態では、当該方法は、抗体によって標的とされる抗原を発現する細胞または組織への抗体媒介性送達のためのＡＤＣまたはＲＩＴまたは他の方法などにおいて、薬剤の送達を増強する。一部の実施形態では、当該方法は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、腫瘍関連糖タンパク質（ＴＡＧ−７２）、ＫＳ１／４（Ｓｃｈｍｉｔｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｄｅｃ  ２００８；５７（１２）：１８７９〜１８９０；Ｍｙｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９３；５３：３９５６〜３９６３を参照されたい）、およびＣＤ２０などの非内部移行性抗原の状況において、抗原、抗原に結合した抗体、および抗体と会合した薬剤のクラスター化を、したがってそれらの内部移行を促進することにおいて有利である。
【０３０４】
当該方法は、治療用および診断用使用、さらには、抗体精製を包含する他の使用を包含する、メディトープ、例えば、多価メディトープ、およびメディトープ利用可能抗体、ならびにそれらを含有する複合体の投与を伴う方法を包含する。そのような診断および治療方法において使用するための、ペプチジル中央空洞結合性カッパ軽鎖結合性融合タンパク質、メディトープ（変異体および多価メディトープおよびメディトープ融合タンパク質を包含する）を含有する医薬組成物も提供する。
【０３０５】
提供する抗体および結合性化合物（例えば、メディトープ）は、実際的な有用性を有し、一部の実施形態では、利用可能なｍＡｂをベースとする技術に関連する障害を克服することができる。一部の実施形態では、提供する化合物および方法は、例えば、新たな表面を露出し、抗原性であり得る非天然試薬で生じ得る抗原性の問題、ならびに／またはそのような分子の製造における安定性およびスケーラビリティに伴う懸念に対処する（Ｎｅｌｓｏｎ  ＡＬ  （２０１０）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｈｏｐｅ  ａｎｄ  ｈｙｐｅ．  ＭＡｂｓ  ２（１）：７７〜８３）。セツキシマブは、臨床において成功裏に使用されており、安定していて、大規模に生産されている。一部の実施形態では、メディトープ結合性部位に沿って並ぶ残基の特有の組合せは、配列において遠位であり（すなわち、おそらくペプチドＴ細胞エピトープではない）、深い空洞内に位置する（すなわち、おそらく表面露出Ｂ細胞エピトープではない））。したがって、一部の実施形態では、メディトープ結合性部位を含有するｍＡｂは、免疫原性ではない。
【０３０６】
本明細書におけるデータは、二価メディトープ−Ｆｃ化合物とメディトープ利用可能抗体で処理された細胞との安定な相互作用を実証している。提供する化合物および方法は、一部の実施形態では、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＭら（２０１２）  Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ２（５）：５２３〜５４０；Ｐａｇｅｌ  ＪＭ，ら（２００６）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０８（１）：３２８〜３３６において記載されているものなどの、事前標的化イメージングおよび薬物送達方法において有用である。
【０３０７】
一部の実施形態では、化合物および方法は、トラスツズマブ−ペルツズマブの組合せにおいて観察されたとおり（Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊら（２０１２）  Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６（２）：１０９〜１１９）、相乗的腫瘍阻害の誘導において有用である（Ｋａｍａｔ，Ｖ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７、７２６〜７３３（２００８）；Ｋｏｅｆｏｅｄ  Ｋら、（２０１１）  Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  ＭＡｂｓ  ３（６）：５８４〜５９５；Ｓｐａｎｇｌｅｒ  ＪＢら、（２０１０）  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７（３０）：１３２５２〜１３２５７）。一部の例では、メディトープ−Ｆｃなどの二価メディトープは、第２の「ｍＡｂ」様分子として機能するが、任意のメディトープ利用可能抗体と対となり得る柔軟性を有する。一部の態様では、これによって、第２の治療用ｍＡｂを同定および開発するコストが減少する。一部の実施形態では、多価メディトープ変異体（例えば、価および／またはリンカー幾何学的配置を改変することによって作成）は、特異性および相乗効果をさらに増強する。
【０３０８】
一部の実施形態では、メディトープ結合性部位を、利用可能な方法による有効なＡＤＣの開発に典型的に影響を及ぼす異質性およびコンジュゲーション効率の問題を回避する際に有用なコンジュゲーションの特異点として使用する。毒素を有するメディトープは、一部の実施形態では、反応性化学物質をＦａｂ空洞に向かわせることができ、特異性および単位化学量論に有利である。
【０３０９】
一部の態様では、中程度の親和性のメディトープ（例えば、ｃＱＦＤおよびｃＱＹＮメディトープ）は、多価手法を考慮する場合などに有利であり（（Ｍａｍｍｅｎ  Ｍ、Ｃｈｏｉ  Ｓ、＆  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ  Ｇ（１９９８）  Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ  ３７：２７５５））、一部の実施形態では、種々の非天然アミノ酸、環化ストラテジー、および／またはスクリーニング法を使用して、親和性および／または薬物動態／薬力学／毒性を改善する。本明細書において実証するとおり、一部の実施形態では、メディトープの変化に順応するように、メディトープ結合性部位を適合させることが等しく可能である。
【０３１０】
Ｉ．治療用および診断用の使用ならびに医薬組成物
一実施形態では、典型的には、（同時にか、または別々に）１つまたは複数のメディトープ利用可能モノクローナル抗体と組み合わせて投与する場合に、メディトープ、メディトープ変異体、多価メディトープ、ＭＰＬ、多価メディトープテザリング剤、および多価メディトープ変異体テザリング剤の特異性および結合を使用して、疾患または状態を治療、診断（例えば、イメージング）するための治療剤、診断剤（例えば、イメージング剤）、またはそれらの組合せを送達する。
【０３１１】
一例では、下記でさらに記載するとおりの事前標的化療法または事前標的化イメージングのために、メディトープ利用可能モノクローナル抗体を投与し、その後で、メディトープ、メディトープ変異体、多価メディトープテザリング剤、または多価メディトープ変異体テザリング剤を投与することによって、メディトープ、例えば、多価メディトープを使用する。さらに、操作ｓｃＦｖｓまたは化学的にコンジュゲートされたｍＡｂについて実証されているとおり、多価メディトープを使用することによって、選択性を増強し、かつ腫瘍の検出を改善することができるが、これらの非ヒトコンストラクトに固有の起こり得る免疫原性は回避される。
【０３１２】
したがって、本明細書において記載されているプラットフォーム技術は、ｍＡｂ送達分野において大きなインパクトを有し、かつ抗体の使用が適応とされるものなど、癌を包含する様々な疾患および条件を治療および診断するための有用な方法を提供する。例えば、結腸直腸癌、扁平上皮細胞癌腫、頭頚部癌を包含するＥＧＦＲ陽性癌を対象とするメディトープ利用可能抗体は、セツキシマブおよびメディトープの使用から利益を受けるであろう。加えて、そのような抗体のメディトープ利用可能バージョンを作成するために他の治療用抗体を修飾することによって、このプラットフォーム技術を、いくつかの他の癌、疾患、および他の状態を治療および診断するための方法において利用することができる。
【０３１３】
そのような方法でのメディトープの使用は、例えば抗体に結合またはコンジュゲートするための他の手段と比較して、例えば、特異性によって有利である。例えば、ＰｐＬ（プロテインＬ）およびＳｐＡ（プロテインＡ）は、マウス特異的またはキメラ抗体特異的ではない。ＰｐＬは、マウスの約６６％に、かつヒトＩｇＧκ軽鎖の約５０％に結合し、ＳｐＡは、マウスの１２％およびヒト可変重鎖の５０％に結合する（Ｇｒａｉｌｌｅら、２００２）。対照的に、本明細書において実証されているとおり、メディトープとメディトープ利用可能抗体との相互作用は高度に特異的であり、このことによって、オフターゲット作用を包含する有害作用が回避され得、例えば、対象に内因性の免疫グロブリンへの治療用化合物の結合が回避され得る。
【０３１４】
一部の実施形態では、メディトープ利用可能抗体と組み合わせて投与されるメディトープ、抗体−メディトープ複合体、メディトープ利用可能抗体と組み合わせて投与されるメディトープ、またはそれらの組合せを、１つまたは複数のイメージング剤とコンジュゲートすることができる。一態様では、イメージング剤には、これらに限定されないが、蛍光、発光、磁気性タンパク質、または放射性核種タンパク質、ペプチドもしくはその誘導体（例えば、遺伝子操作された変異体）が包含され得る。ｍＲＮＡ成分によって発現され得る蛍光タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、赤色、青色、黄色、シアン、およびサファイア蛍光タンパク質、ならびにリーフコーラル蛍光タンパク質が包含される。ｍＲＮＡ成分によって発現され得る発光タンパク質には、ルシフェラーゼ、エクオリン、およびその誘導体が包含される。多数の蛍光および発光色素およびタンパク質が、当技術分野では知られている（例えば、いずれも、本明細書において全て示されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／００６７５０３号；Ｖａｌｅｕｒ，Ｂ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００２；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ９．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００２；およびＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎウェブサイトで入手可能）を参照されたい）。
【０３１５】
他の態様では、メディトープ利用可能抗体と組み合わせて投与されるメディトープ、抗体−メディトープ複合体、メディトープ利用可能抗体と組み合わせて投与されるメディトープ、またはそれらの組合せを、ナノ粒子、放射性物質（例えば、放射性同位体、放射性核種、放射標識、または放射性トレーサー）、色素、コントラスト剤、蛍光化合物または分子、生物発光化合物または分子、酵素、および増感剤（例えば、常磁性イオン）などの非タンパク質イメージング剤または送達ビヒクルとさらにコンジュゲートさせるか、または別段に会合させることができる。加えて、一部のナノ粒子、例えば量子ドットおよび金属ナノ粒子（下記）は、イメージング剤または治療剤として使用するためにも適し得ることに留意すべきである（例えば、温熱および光線力学的療法を使用して、さらには蛍光およびまたはＭＲＩコントラストを介するイメージング剤）。
【０３１６】
メディトープ−ｍＡｂ技術によって、１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体、治療剤、イメージング剤、またはそれらの組合せにさらにコンジュゲートさせることができる抗体−メディトープ複合体を作成するために使用することができるシステムが可能である。したがって、独自の細胞毒性剤またはイメージング剤にそれぞれコンジュゲートしているメディトープまたは高親和性メディトープ変異体のセットによって、治療に望ましいメディトープコンジュゲートおよびメディトープ利用可能ｍＡｂを同時に投与することができるであろう。メディトープコンジュゲートは、化学的修飾、ペイロードの放出、および一貫しないペイロードコンジュゲーションによる特異性の低下などの欠点を有する現行の抗体−薬物コンジュゲートを上回る改善である。治療用抗体またはその機能性フラグメントの結合親和性を増大するための方法を本明細書では提供する。そのような方法は、対象に、治療有効量の医薬組成物を、任意の適切な投与経路を介して投与することを包含し得る。医薬組成物は、メディトープ利用可能抗体と組み合わせたメディトープまたはメディトープ変異体、メディトープ利用可能抗体と組み合わせた多価メディトープまたはメディトープ変異体テザリング体、メディトープ利用可能治療用抗体またはその機能性フラグメント、薬学的に許容される担体、ならびに任意のそれらの組合せを包含し得る。多価メディトープの結合親和性の増大は、細胞表面に結合しているＩｇＧの多価架橋に帰せられ得る。ＩｇＧの架橋（親マウスＭ４２５抗体を介するか、または抗ＩｇＧ  ＩｇＭを使用）は、シグナル伝達、受容体細胞内取り込み作用および再循環、ならびに細胞死に大きな影響を及ぼす。したがって、多価ペプチドは、治療用モノクローナル抗体と相乗的に作用して、その治療効力を増強させ得る。
【０３１７】
一部の実施形態では、メディトープは単独で、またはテザリング体の一部として、結合部位でＦａｂシステインに結合するシステインまたは他の適切なアルキル化剤を含有して、システイン−システイン相互作用をもたらし得る。別法では、メディトープは、非天然アミノ酸（例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニン）でＦａｂに結合し得る。このＣｙｓメディトープは、任意の物質とコンジュゲートし、そのコンジュゲートをＩｇＧへと向ける。
【０３１８】
治療用抗体によって標的化され得る疾患または状態で、治療を特定の種類の細胞または細胞群に向けるための方法において、抗体−メディトープ複合体を使用することもできる。そのような治療方法は、治療有効量の医薬組成物を、疾患または状態を有する対象に、任意の適切な投与経路を介して投与することを包含し得る。医薬組成物は、メディトープ利用可能抗体と組み合わせたメディトープまたはメディトープ変異体、メディトープ利用可能抗体と組み合わせた多価メディトープまたはメディトープ変異体テザリング体、メディトープ利用可能治療用抗体またはその機能性フラグメントを包含し得る。
【０３１９】
他の実施形態では、腫瘍または他の組織をイメージングするための方法を提供する。そのような方法では、未修飾の治療用抗体を、対応する抗原を過剰発現する腫瘍または他の組織を標的化するために投与することができる。その後、イメージング剤で標識されている多価メディトープテザリング体を、任意の適切な投与経路を介して投与し、標的腫瘍または組織に結合している治療用抗体に結合させる。図１を参照されたい。イメージング剤の例には、これらに限定されないが、放射標識（例えば、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、90Ｙ、99mＴｃ、125Ｉ、131Ｉ、177Ｌｕ、166Ｈｏ、および153Ｓｍ）、金属または磁気性標識（例えば、金、鉄、ガドリニウム）、ビオチン、キレート化剤（例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸（「ＤＯＴＡ」））、または上記の任意の薬剤が包含される。一実施形態では、本明細書において記載されている方法で使用されるイメージング剤は、ＤＯＴＡである。
【０３２０】
上記のイメージングまたは治療方法には、既知の方法を上回るいくつかの利点が存在する。第一には、治療用モノクローナル抗体の二価特性によって、腫瘍に対する選択性が増強される。下記でさらに検討するとおり、この選択性の増強は、ｓｃＦｖｓを使用すると失われ、かつ親和性の増強によっても完全には補償されない。第二には、標識されている多価メディトープテザリング体の質量が、濾過について腎閾値未満であり（６０ｋＤａ未満、約１０ｋＤａの低さであることもある）、身体から容易に濾過によって排出され得る。対照的に、治療用抗体をイメージング剤または他の治療剤で直接標識することは典型的には回避される。それというのも、その抗体が、体内を長期間（数日から数週間）にわたって循環するであろうためである。したがって、腫瘍または他の罹患器官のイメージングは多くの場合に、選択性の低いｓｃＦｖｓを使用して実行されている。
【０３２１】
さらなる実施形態では、メディトープを使用して２つ以上の治療用分子を合わせて、癌、自己免疫疾患、または他の状態を治療するために医薬組成物の一部として、治療有効量で対象に投与することができる医薬化合物を形成することができる。２つ以上の治療用分子には、これらに限定されないが、上記のものなどの腫瘍または疾患特異的受容体を標的化し得る機能性抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2またはＦａｂフラグメント）、ペプチド、または他の小分子が包含され得る。それらの治療用分子は、同じ治療用分子が２つ以上であってもよいし、または別法では、同じ腫瘍または罹患組織を標的化する異なる分子が２つ以上であってもよい。
【０３２２】
一部の実施形態では、医薬化合物または組成物には、ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙ（商標）などの特許権下の抗体またはその一部が包含され得る。一例では、メディトープを、２つ以上の治療用分子を特別に設計されたＣｏｖＸ抗体に結合するためのリンカーとして使用する。一例では、そのようなメディトープに随伴する小分子、ペプチド、またはｓｃＦｖは、ＣｏｖＸ抗体のメディトープ結合部位（例えば、フレームワーク結合インターフェース）によって認識される。これらの成分を合わせると、その結果生じる二価ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙ（商標）は、抗体の長い半減期も保持しながら、小分子、ペプチド、またはｓｃＦｖの生物学的作用を持つ。
【０３２３】
一部の実施形態では、提供するメディトープ、メディトープ利用可能抗体、およびその複合体を、治療用抗体を使用することで治療または標的化することができる任意の癌、疾患、または他の状態を包含する疾患または状態の治療、診断、またはイメージングにおいて使用する。癌は、免疫系を活発に抑制することによって、免疫学的監視を回避する。この免疫抑制に対抗することを目的とする方法の一つは、腫瘍細胞によって独自に発現または過剰発現される抗原のエピトープを使用するワクチン接種を介するものである。例えば、シグナル伝達経路を阻害し、増殖因子を抑制し、かつ／または免疫応答を誘導するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、癌および他の疾患を治療するために成功裏に臨床導入されている。
【０３２４】
したがって、それらの疾患および条件には、任意の癌、さらには治療用ｍＡｂを使用して標的化されるものなどの他の疾患および条件が包含され、これらに限定されないが、白血病およびリンパ腫（例えば、アレムツズマブ、ベクツモマブ、ゲムツズマブ、ＦＢＴＡ０５、イブリツモマブチウゼタン、オファツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、乳癌（例えば、トラスツズマブ、アデカツムマブ、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）のメディトープ利用可能バージョンを使用して、治療またはイメージングすることができる）、前立腺癌（例えば、アデカツムマブ、カプロマブペンデチド、エタラシズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して、治療またはイメージングすることができる）、結腸直腸癌（例えば、ラベツズマブ、パニツムマブ、ペンテト酸アルツムマブ、ボツムマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、胃腸癌（例えば、アルシツムマブ、カツマキソマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、卵巣癌（例えば、アバゴボマブ、カツマキソマブ、エタラシズマブ、イゴボマブ、オレゴボマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、肺癌（例えば、アナツムマブマフェナトックスのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、膵臓癌（例えば、クリバツズマブテトラキセタンのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、腎臓癌（例えば、ギレンツキシマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、黒色腫癌（例えば、エタラシズマブ、イピリムマブ、ＴＲＢＳ０７のメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、膠腫（例えば、ニモツズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、骨転移（例えば、デノスマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、頭頚部癌（例えば、ザルツムマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、心臓血管疾患（例えば、アブシキシマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、自己免疫障害（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、関節リウマチ（例えば、アトリズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、移植拒絶（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３のメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、クローン病（例えば、セルトリズマブ、フォントリズマブ、ナタリズマブ、インフリキシマブ、ビシリズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、ヘモグロビン尿（エクリズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、乾癬（例えば、エファリズマブ、インフリキシマブ、ウステキヌマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、多発性硬化症（例えば、ナタリズマブ、ウステキヌマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、喘息（例えば、ベンラリズマブ、メポリズマブ、オマリズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）（例えば、パリビズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、黄斑変性（例えば、ラニビズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、虫垂炎（例えば、ファノレソマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる）、および抗体で標的化または治療され得る任意の他の状態が包含される。上記で列挙された抗体および関連疾患または障害は単なる例であり、プラットフォームを制限するものではない。
【０３２５】
ある種の実施形態では、メディトープまたはその変異体を１つまたは複数のメディトープ利用可能抗体に治療上有効な化合物と共に結合させることで、疾患または状態を治療、予防、診断、モニタリングし得るように、１つまたは複数のメディトープ、メディトープ変異体、多価メディトープテザリング剤、または多価メディトープ変異体テザリング剤を、１種または複数のイメージング剤、治療有効量の治療上有効な薬剤もしくは化合物、または両方にコンジュゲートさせることができる。メディトープ利用可能ｍＡｂにカップリングする高親和性および／または多価メディトープのそのようなコンジュゲーションは、疾患を治療および検出するためのｍＡｂベースの治療およびイメージング方法をかなり改善する高度に多用途のプラットフォーム技術を提供する（図１を参照されたい）。
【０３２６】
一部の実施形態では、提供する方法および化合物は、抗体工学、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗体−指向酵素プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ）、免疫系エンゲージメント（例えば、Ｆｃ修飾（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ＪＲ  ＆  Ｌａｚａｒ  ＧＡ  （２０１１）  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１７（９）：１２７８〜１２８５）、ケモカイン融合、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｗｏｌｆ  Ｅ、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ  Ｒ、Ｋｕｆｅｒ  Ｐ、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ  Ｂ、＆  Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ  （２００５）  ＢｉＴＥｓ：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｑｕｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １０（１８）：１２３７〜１２４４）および疾患イメージング（例えば、イムノＰＥＴおよび事前標的放射性核種イメージング（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＭら（２０１２）  Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ２（５）：５２３〜５４０；Ｐａｇｅｌ  ＪＭら（２００６）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １０８（１）：３２８〜３３６）において有用である。
【０３２７】
一部の態様では、提供する方法および化合物は、利用可能なそのような方法、例えば、例えば治療およびイメージング用途に有害な望ましくない結果につながり得る遺伝子配列の翻訳後化学修飾または操作を使用する方法において観察される問題を克服する。例えば、利用可能な方法を使用して疾患部位に細胞毒素を指向させるＡＤＣでは、毒素の化学的コンジュゲーション（典型的には、ｍＡｂ上のリシン、還元システイン、または糖を伴う）は、ｍＡｂの特異性および安定性に不利な影響を及ぼし、その生体内分布を改変し得る不均一な混合物を生成し得る。
【０３２８】
別の例として、利用可能な方法を使用して、腫瘍浸透を促進し、かつイメージングを増強するために、ｍＡｂのサイズをＦａｂフラグメント（例えば、一本鎖Ｆａｂ可変ドメイン（ｓｃＦｖ））に低減することは、価を減少させ、したがって、元のｍＡｂと比較して、親和性および組織特異性の両方に影響を及ぼし得る。他の場合には、利用可能な方法で、検出を増強するための事前標的イメージングプロトコルの一部として、スキャフォールドを介して一緒にステッチされた（例えば、「ロック−アンド−ドック」）ストレプトアビジンまたは多数のＦａｂ／ｓｃＦｖとコンジュゲートされたｍＡｂは、免疫原性であり、血清において不安定であり、かつ技術的に困難であり、かつ特に臨床使用に必要な規模では、生産に費用がかかり得る。提供する化合物および方法は、一部の実施形態では、例えば、癌ならびに他の疾患および状態のための代替のｍＡｂプラットフォームならびに改善されたｍＡｂベースの送達系を提供することによって、そのような困難の克服に有用である。
【０３２９】
実施形態および例示的な実施例に関して本発明を記載したが、記載および例示されているとおりの本発明を、本明細書に開示されているとおりの本発明の意図および範囲から逸脱することなく変更することを、当業者であれば認め得るであろう。実施例は、本発明の理解を促進するために示されているものであって、本発明の範囲をいかなる形でも制限することを意図したものでも、そのように解釈されるべきものでもない。実施例は、従来方法の詳細な説明を含まない。そのような方法は、当業者によく知られており、多くの刊行物において記載されている。さらに、上記および下記の実施例において引用されている参照文献は全てその全体が、本明細書に完全に記載されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３３０】
次の文献は、あらゆる目的のためにそれらの全体で参照によって本明細書に組み込まれる：２０１２年２月１０日出願の米国特許出願第６１／５９７，７０８号；２０１１年１０月１０日出願の米国特許出願第１３／２７０，２０７号、現在の米国特許第８，６５８，７７４号；２０１１年１０月１０日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５５６５６号；２０１２年４月１０日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１２／３２９３８号；２０１２年４月１０日出願の米国特許出願第１３／４４３，８０４号、現在の米国特許第８，９６２，８０４号；２０１２年２月１０日出願の米国特許出願第６１／７４９，８３０号、および２０１３年２月１１日出願の米国特許出願第１３／７６４，７６２号。
【０３３１】
Ｅ．  定義
「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原またはエピトープに特異的に結合するか、または免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を指し、これには、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、さらには、これらに限定されないが、フラグメント抗原結合性（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）フラグメントを包含する機能性抗体フラグメントが包含される。用語「抗体」には、細胞内抗体、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、メディトープ利用可能抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ）など、免疫グロブリンの遺伝子操作されているか、または別段に修飾された形態が包含される。別段に述べられていない限り、用語「抗体」には、これらの機能性抗体フラグメントが包含されると理解すべきである。
【０３３２】
用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、当技術分野では、抗原特異性および結合親和性をもたらす抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことが知られている。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）が、かつ各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）が存在する。「フレームワーク領域」および「ＦＲ」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことが当技術分野では知られている。一般に、各重鎖可変領域には４つのＦＲ（ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、およびＦＲ−Ｈ４）が、かつ各軽鎖可変領域には４つのＦＲ（ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、およびＦＲ−Ｌ４）が存在する。
【０３３３】
Ｋａｂａｔら（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）、ＪＭＢ  ２７３、９２７〜９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５（１９９６）、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  Ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２、７３２〜７４５、（「Ｃｏｎｔａｃｔ」ナンバリングスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、「ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００３年１月；２７（１）：５５〜７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）、ならびにＨｏｎｅｇｇｅｒ  ＡおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ、「Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：  ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２００１年６月８日；３０９（３）：６５７〜７０（ＡＨｏナンバリングスキーム）に記載されているものを包含する、いくつかのよく知られているスキームのうちの任意のものを使用することで、所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列の境界を容易に決定することができる。
【０３３４】
所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、同定のために使用されるスキームに応じて変化し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造アラインメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造情報に基づく。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａスキームでのナンバリングは両方とも、最も共通する抗体領域の配列長さに基づき、挿入は、例えば「３０ａ」など、挿入文字によって収められ、欠失が一部の抗体で現れる。これら２つのスキームは、異なる位置に一定の挿入および欠失（「インデル」）を設けるので、ナンバリングに相違が生じる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは複雑な結晶構造の分析に基づき、多くの観点においてＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームと類似している。
【０３３５】
以下の表４に、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＣｏｎｔａｃｔスキームによって個々に同定されたＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、およびＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３の位置を列挙している。ＣＤＲ−Ｈ１では、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームの両方を使用して、残基ナンバリングをリストに挙げる。ＫａｂａｔナンバリングスキームはＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を設けているので、Ｋａｂａｔナンバリング規則を使用してナンバリングした場合のＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じて、Ｈ３２からＨ３４の間で変動することに注意されたい。
【０３３６】
【表４】
2017536091.tif 000014
【０３３７】
したがって、別段の指定がない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域などの「ＣＤＲ」もしくは「相補性決定領域」、または個々に指定されるＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２）は、公知のスキームのうちの任意のものによって規定されるとおりの任意の（または具体的な）相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。同様に、別段の指定がない限り、所与の抗体またはその領域、例えば、その可変領域などの「ＦＲ」もしくは「フレームワーク領域」、または個々に指定されるＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２）は、公知のスキームのうちの任意のものによって定義されるとおりの任意の（または具体的な）フレームワーク領域を包含すると理解されるべきである。一部の例では、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＣｏｎｔａｃｔ方法によって定義されるとおりのＣＤＲなど、特定の１つのＣＤＲ、ＦＲ、または複数のＦＲもしくはＣＤＲを同定するためのスキームが指定されている。他の場合には、ＣＤＲまたはＦＲの特定のアミノ酸配列が示されている。
【０３３８】
用語「メディトープ利用可能」抗体および「メディトープ利用可能抗体」および「メディトープ利用可能抗体」は、メディトープ結合部位を介してメディトープに結合し得る抗体またはその機能性フラグメントを指す。メディトープ利用可能抗体の例には、これに限定されないが、本明細書において記載されているセツキシマブなどが包含される。「メディトープ結合部位」は、結合したメディトープと相互作用するアミノ酸残基を含有するメディトープ利用可能抗体の領域であり、その残基には、重鎖および軽鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が包含される。抗体のＦａｂフラグメントまたはＦａｂ部分に関して、メディトープ結合部位は、Ｆａｂフラグメントまたは部分の中央空洞内に位置している。
【０３３９】
Ｆａｂの三次元構造に関して、「中央空洞」は、重鎖および軽鎖の可変および定常領域の部分によってライニングされているＦａｂの内部空洞を指す。したがって、中央空洞は、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬ領域の残基によってライニングされており、抗原結合部位を包含しない。
【０３４０】
一部の実施形態では、メディトープ結合部位は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うとメディトープ利用可能抗体の軽鎖の残基４０、４１、８３、および８５、ならびに／またはＫａｂａｔナンバリングに従うとメディトープ利用可能抗体の重鎖の残基３９、８９、１０５、および１０８を包含する。
【０３４１】
一部の実施形態では、メディトープ結合部位は、Ｋａｂａｔナンバリングに従うと抗体の軽鎖の残基８、９、１０、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８２、８３、８４、８５、８６、８７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１４２、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、および１７３、ならびに重鎖の残基６、９、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、８４、８６、８７、８８、８９、９０、９１、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１０、１４７、１５０、１５１、１５２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１８５、１８６、および１８７によって形成される空洞内に位置している。
【０３４２】
メディトープ利用可能抗体のＦａｂ部分に関して、メディトープ結合部位は、中央空洞内に残基を包含する。メディトープ結合部位は典型的に、定常領域の残基をさらに包含する。
【０３４３】
「治療剤」は、本明細書で使用される場合、疾患または状態を治療する際に有用な原子、分子、または化合物である。
【０３４４】
「治療有効量」、「治療有効濃度」、または「治療有効用量」は、標的状態の予防もしくは治療、その状態に関連する症状の緩和、所望の生理学的効果の提示、または疾患もしくは状態の治療をもたらす状態のイメージングまたは診断を可能にすることなど、所望の治療効果を対象においてもたらす化合物の量である。正確な治療有効量は、所与の対象における治療の有効性に関して、最も有効な結果をもたらす組成物の量である。この量は、これらに限定されないが、治療用化合物の特徴（活性、薬物速度、薬物動態、および生物学的利用能を包含）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類および段階、全身状態、所与の投薬量および薬物種に対する反応性を包含）、製剤中の薬学的に許容される１種の担体または複数の担体の性質、ならびに投与経路を包含する様々な因子に応じて変化するはずである。臨床分野および薬理学的分野の当業者であれば、日常的な実験を介して、即ち、化合物の投与に対する対象の反応をモニタリングし、それにしたがって投薬量を調節することによって、治療有効量を決定することができる。補足的なガイダンスについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版、Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＵＳＩＰ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２００５を参照されたい。
【０３４５】
「薬学的に許容される担体」は、目的の化合物を身体のある組織、器官、または部分から、身体の別の組織、器官、または部分へと担持または運搬することに従事する薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。例えば、この担体は、液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくはカプセル封入材料、またはそれらの一部の組合せであってよい。担体の各成分は、「薬学的に許容される」必要があり、その際、担体は、製剤の他の成分と相容性でなければならない。また、担体が遭遇し得る身体のいずれの組織、器官、または部分との接触にも適していなければならず、このことは、担体が、毒性、刺激、アレルギー性応答、免疫原性、またはその治療効果を上回る何らかの他の合併症のリスクを持っていてはならないことを意味している。
【０３４６】
「投与経路」は、これらに限定されないが、エアゾール、腸内、経鼻、眼、経口、非経口、直腸、経皮、または膣による経路を包含する当技術分野で知られている任意の投与経路を指し得る。局所用クリーム剤もしくは軟膏剤を使用して、または経皮パッチによって、「経皮」投与を達成することができる。「非経口」は、眼窩内、点滴、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、髄腔内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経皮気管内を包含する、一般的に注入に関連する投与経路を指す。
【０３４７】
「組み合わせて」または「〜と組み合わせて」は、複数の薬剤、治療剤、または治療の文脈において本明細書において使用される場合、対象における同じ疾患または状態を治療する過程において、２種以上の薬剤、薬物、治療レジメン、治療様式、またはそれらの組合せ（例えば、メディトープと組み合わせた抗体またはメディトープ）を任意の順序で施すことを意味する。これには、同時投与（または「共投与」）、第１の薬剤を投与し、その前または後に第２の薬剤を投与すること、さらには、最大で数日間の時間的間隔を空けて順番に投与することが包含される。また、そのような併用治療は、任意の１種または複数の薬剤、薬物、治療レジメン、または治療様式の複数回の施与を包含し得る。さらに、２種以上の薬剤、薬物、治療レジメン、治療様式、またはそれらの組合せの施与は、同じか、または異なる投与経路によるものであってよい。
【０３４８】
「治療用抗体」は、癌、自己免疫疾患、移植拒絶、心臓血管疾患、または本明細書において記載されているものなどの他の疾患もしくは状態を治療するために使用される任意の抗体またはその機能性フラグメントを指し得る。本明細書において記載されている実施形態に従って使用することができる治療用抗体の例には、これらに限定されないが、マウス抗体、マウス化もしくはヒト化キメラ抗体、またはヒト抗体が包含され、それらには、これらに限定されないが、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、ＲｅｏＰｒｏ（アブシキシマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）；Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（ムロモナブ（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３）；Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（バシリキシマブ）、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、Ｃｉｍｚｉａ（セルトリズマブペゴル）、Ｚｅｎａｐａｘ（ダクリズマブ）、Ｓｏｌｉｒｉｓ（エクリズマブ）、Ｒａｐｔｉｖａ（エファリズマブ）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブ・チウキセタン）、Ｔｙｓａｂｒｉ（ナタリズマブ）、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ラニビズマブ）、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）が包含される。
【０３４９】
ある状態を「治療すること」またはその「治療」は、その状態を予防すること、その状態の発症または発生速度を遅らせること、その状態が発生するリスクを低減すること、その状態に関連した症状の発生を予防または遅延させること、その状態に関連する症状を低減または終息させること、その状態の完全または部分的退縮を生じさせること、あるいはこれらの一部の組合せを指し得る。
【０３５０】
本明細書で使用される場合、用語「包含すること」、「含有すること」、および「含むこと」は、そのオープンな非限定的な意味で使用されている。
【０３５１】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって別段に明瞭に示されていない限り、複数指示物も包含する。
【０３５２】
より簡潔な説明を提供するために、本明細書に示されている量的表現のうちの一部は、用語「約」で修飾されていない。用語「約」が明確に使用されているか、使用されていないかに関わらず、本明細書に示されている全ての量は、実際に示されている値を指すことが意図されており、かつ示されているそのような値についての実験条件および／または測定条件による同値および近似値を包含する、当技術分野の通常の技能に基づき合理的に推測されるであろう示されているそのような値の近似値も指すことが意図されていることは理解されるであろう。
【０３５３】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、１〜１２個の炭素原子を有する飽和の直鎖または分枝鎖炭化水素基を指す。代表的なアルキル基には、これらに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、２−メチル−１−プロピル、２−メチル−２−プロピル、２−メチル−１−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−３−ブチル、２，２−ジメチル−１−プロピル、２−メチル−１−ペンチル、３−メチル−１−ペンチル、４−メチル−１−ペンチル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、２，２−ジメチル−１−ブチル、３，３−ジメチル−１−ブチル、２−エチル−１−ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシルなど、およびヘプチル、オクチルなどのより長いアルキル基が包含される。用語「Ｃx〜yアルキル」（ここで、ｘおよびｙは整数である）は、ｘ〜ｙ個の炭素原子を有するアルキルを指す。
【０３５４】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、その中に１つまたは複数の二重結合を有し、かつ２〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖炭化水素基を指す。アルケニル基の実例には、これらに限定されないが、エチレニル、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、２−エチルヘキセニル、２−プロピル−２−ブテニル、４−（２−メチル−３−ブテン）−ペンテニルなどが包含される。用語「Ｃx〜yアルケニル」（ここで、ｘおよびｙは整数である）は、ｘ〜ｙ個の炭素原子を有するアルケニルを指す。
【０３５５】
用語「アルキレニル」または「アルキレン」は、二価のアルキル基を指す。用語「アルケニレン」または「アルケニレン」は、二価のアルケニル基を指す。
【０３５６】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、その中に１つまたは複数の三重結合を有し、かつ２〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖炭化水素基を指す。例示的なアルキニル基には、これらに限定されないが、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、メチルプロピニル、４−メチル−１−ブチニル、４−プロピル−２−ペンチニル、４−ブチル−２−ヘキシニルなどが包含される。
【０３５７】
用語「ヘテロアルキル」は、単独で、または別の用語との組合せで、別段に述べない限り、少なくとも１個の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を包含し、窒素および硫黄原子が酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子が第四級化されていてもよい安定な直鎖もしくは分枝鎖、またはその組み合わせを意味する。ヘテロ原子（複数可）Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位で、またはアルキル基が分子の残りの部分に結合する位置で置き換えられていてよい。例には、これらだけに限定されないが−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3、−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ3、−Ｓｉ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3、−Ｏ−ＣＨ3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、および−ＣＮが含まれる。最高２または３個のヘテロ原子が連続してよく、例えば、−ＣＨ2−ＮＨ−ＯＣＨ3および−ＣＨ2−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ3）3などである。
【０３５８】
同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、単独で、または別の置換基の一部として、別段に述べない限り、限定ではないが、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−および−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−によって例示されるとおりのヘテロアルキルに由来する二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子は、鎖末端の一方または両方を占めてもよい（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。なおさらには、アルキレンおよびヘテロアルキレン架橋基では、架橋基の配列は、架橋基の式が記載されている方向によって示されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）2−の両方を表す。上記のとおり、ヘテロアルキル基は、本明細書において使用される場合、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＯＲ’、−ＳＲ’、および／または−ＳＯ2Ｒ’など、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合する基を包含する。−ＮＲ’Ｒ’’などの具体的なヘテロアルキル基の列挙に続いて「ヘテロアルキル」が言及されている場合、ヘテロアルキルおよび−ＮＲ’Ｒ’’という用語は、重複していないか、または相互に排他的ではないと理解されるであろう。むしろ、具体的なヘテロアルキル基は、明確さを付与するために列挙されている。したがって、用語「ヘテロアルキル」は、本明細書において、−ＮＲ’Ｒ’’などの具体的なヘテロアルキル基を排除すると解釈されるべきではない。
【０３５９】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、単独で、または別の用語の一部として、別段に述べない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式バージョンを意味する。加えて、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は、複素環が分子の残りの部分に結合する位置を占めることができる。シクロアルキルの例には、これらだけに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれる。ヘテロシクロアルキルの例には、これらだけに限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが含まれる。「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」は単独で、または別の置換基の一部として、それぞれシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルに由来する二価ラジカルを意味する。
【０３６０】
用語「アリール」は、別段に述べない限り、一緒に融合しているか（すなわち、縮合環アリール）、または共有結合している単一の環または複数の環（好ましくは、１〜３個の環）であり得るポリ不飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味する。縮合環アリールは、縮合環の少なくとも１個がアリール環である一緒に融合している複数の環を指す。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、またはＳなどの少なくとも１個のヘテロ原子を含有し、窒素および硫黄原子が酸化していてもよく、窒素原子（複数可）が第四級化していてもよいアリール基（または環）を指す。したがって、用語「ヘテロアリール」は、縮合環ヘテロアリール基（すなわち、縮合環の少なくとも１個がヘテロ芳香環である一緒に縮合した複数の環）を包含する。５，６−縮合環ヘテロアリーレンは、一方の環が５員を有し、他方の環が６員を有し、少なくとも１個の環がヘテロアリール環である一緒に縮合している２個の環を指す。同様に、６，６−縮合環ヘテロアリーレンは、一方の環が６員を有し、他方の環が６員を有し、少なくとも１個の環がヘテロアリール環である一緒に縮合している２個の環を指す。また、６，５−縮合環ヘテロアリーレンは、一方の環が６員を有し、他方の環が５員を有し、少なくとも１個の環がヘテロアリール環である一緒に縮合している２個の環を指す。ヘテロアリール基は、炭素またはヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが含まれる。上述のアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれのための置換基は、下記の許容される置換基の群から選択される。「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」は単独で、または別の置換基の一部として、それぞれアリールおよびヘテロアリールに由来する二価ラジカルを意味する。ヘテロアリール基の非限定的例には、ピリジニル、ピリミジニル、チオフェニル、フラニル、インドリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル、チアナフタニル、ピロロピリジニル、インダゾリル、キノリニル、キノキサリニル、ピリドピラジニル、キナゾリノニル、ベンゾイソオキサゾリル、イミダゾピリジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フリルチエニル、ピリジル、ピリミジル、ベンゾチアゾリル、プリニル、ベンゾイミダゾリル、イソキノリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピロリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル、またはキノリルが含まれる。上記の例は、置換または非置換であってよく、上記の各ヘテロアリール例の二価ラジカルは、ヘテロアリーレンの非限定的例である。
【０３６１】
用語「ボロン酸エステル」は、置換基−Ｂ（ＯＲ）2を指す（ここで、各Ｒ基は独立に、Ｃ1〜4アルキルであるか、または２個のＲ基は一緒になって、Ｃ2〜6アルキレンを形成している）。
【０３６２】
用語「アセタール」は、−ＣＨ（ＯＲ）2基を指す（ここで、各Ｒ基は独立に、Ｃ1〜4アルキルであるか、または２個のＲ基は一緒になって、Ｃ2〜6アルキレンを形成している）。例示的なアセタール基には、ジメチルアセタールもしくはジエチルアセタールまたは環式アセタールが包含される。用語「ケタール」は、−Ｃ（ＯＲ）2−基を指す（ここで、各Ｒ基は独立に、Ｃ1〜4アルキルであるか、または２個のＲ基は一緒になって、Ｃ2〜6アルキレンを形成している）。例示的なケタールには、ジメチルケタールもしくはジエチルケタールまたは環式ケタールが包含される。
【０３６３】
用語「ハロ」は、クロロ、フルオロ、ブロモ、またはヨードを表す。一部の実施形態では、ハロは、クロロ、フルオロ、またはブロモである。用語「ハロゲン」は、本明細書で使用される場合、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を指す。用語「オルトエステル」は、−Ｃ（ＯＲ）3基を指す（ここで、各Ｒ基は独立に、Ｃ1〜4アルキルであるか、または２個のＲ基は一緒になって、Ｃ2〜6アルキレンを形成している）。用語「オキソ」は、＝Ｏ基を意味し、炭素原子または硫黄原子に結合していてよい。用語「ホスホン酸エステル」は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）2基を指す（ここで、各Ｒ基は独立に、Ｃ1〜4アルキルであるか、または２個のＲ基は一緒になって、Ｃ2〜6アルキレンを形成している）。
【０３６４】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、３〜１５個の環炭素原子を有する飽和または部分飽和の単環式、縮合多環式、架橋多環式、またはスピロ多環式炭素環を指す。シクロアルキル基の非限定的カテゴリーは、３〜６個の炭素原子を有する飽和または部分飽和の単環式炭素環である。シクロアルキル基の実例には、これらに限定されないが、以下の部分が包含される：
【０３６５】
【化６】
2017536091.tif 000015
【０３６６】
本明細書で使用される場合、用語「５員のヘテロアリール」は、炭素、酸素、窒素、および硫黄から選択される５個の環原子を有する単環式芳香族複素環を指す。５員のヘテロアリール基の例には、これらに限定されないが、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、フラニル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、およびチアジアゾリルが包含される。５員のヘテロアリールの特定の例には、アジドとプロパルギル基との間でのＨｕｉｓｇｅｎ反応などの１，３−付加環化反応によって形成され得るものが包含される。
【０３６７】
本明細書で使用される場合、用語「置換」は、指定の基または部分が、１個または複数の適切な置換基を持っていることを意味している。本明細書で使用される場合、用語「非置換」は、指定の基が置換基を持っていないことを意味している。本明細書で使用される場合、用語「置換されていてもよい」は、指定の基が非置換であるか、または指定の数の置換基によって置換されていることを意味している。構造系を説明するために用語「置換」が使用されている場合、その置換は、その系の上の、価が許容する任意の位置に存在することが意図されている。本明細書で使用される場合、表現「１個または複数の置換基」は、その系の上の、価が許容する任意の位置に存在し得る１個から最大可能な数までの置換を示している。ある種の実施形態では、「１個または複数の置換基」は、１、２、３、４、または５個の置換基を意味する。別の実施形態では、１個または複数の置換基は、１、２、または３置換基を意味する。
【０３６８】
「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」または「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」は、本明細書において使用される場合、下記の（Ａ）および（Ｂ）の部分から選択される基を意味する：
（Ａ）オキソ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＳＯ2Ｃｌ、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＯ4Ｈ、−ＳＯ2ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2、−ＯＮＨ2、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ2、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ2、−ＮＨＳＯ2Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ3、−ＯＣＨＦ2、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに
（Ｂ）下記のｉ．およびｉｉ．から選択される少なくとも１個の置換基で置換されているアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール：
ｉ．
オキソ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＳＯ2Ｃｌ、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＯ4Ｈ、−ＳＯ2ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2、−ＯＮＨ2、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ2、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ2、−ＮＨＳＯ2Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ3、−ＯＣＨＦ2、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、および
ｉｉ．  下記の１．および２．から選択される少なくとも１個の置換基で置換されているアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール：
１．
オキソ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＳＯ2Ｃｌ、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＯ4Ｈ、−ＳＯ2ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2、−ＯＮＨ2、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ2、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ2、−ＮＨＳＯ2Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ3、−ＯＣＨＦ2、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、および
２．
オキソ、ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＳＯ2Ｃｌ、−ＳＯ3Ｈ、−ＳＯ4Ｈ、−ＳＯ2ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2、−ＯＮＨ2、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ2、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ2、−ＮＨＳＯ2Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ3、−ＯＣＨＦ2、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、および非置換ヘテロアリールから選択される少なくとも１個の置換基で置換されているアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール。
【０３６９】
「サイズ限定置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」または「サイズ限定置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」は、本明細書において使用される場合、「置換基」のために上記した置換基のすべてから選択される基を意味し、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ1〜Ｃ20アルキルであり、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換２〜２０員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換３〜８員ヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換アリールは、置換または非置換Ｃ6〜Ｃ10アリールであり、各置換または非置換ヘテロアリールは、置換または非置換５〜１０員ヘテロアリールである。「低級置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」または「低級置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」は、本明細書において使用される場合、「置換基」のために上記した置換基のすべてから選択される基を意味し、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ1〜Ｃ8アルキルであり、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換２〜８員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ3〜Ｃ7シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換３〜７員ヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換アリールは、置換または非置換Ｃ6〜Ｃ10アリールであり、各置換または非置換ヘテロアリールは、置換または非置換５〜９員ヘテロアリールである。
【０３７０】
一部の実施形態では、本明細書における化合物において記載される各置換された基は、少なくとも１個の置換基で置換されている。より具体的には、一部の実施形態では、本明細書における化合物において記載される各置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および／または置換ヘテロアリーレンは、少なくとも１個の置換基で置換されている。他の実施形態では、これらの基の少なくとも１個または全部は、少なくとも１個のサイズ限定置換基で置換されている。他の実施形態では、これらの基の少なくとも１個または全部は、少なくとも１個の低級置換基で置換されている。
【０３７１】
本明細書における他の実施形態では、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ1〜Ｃ20アルキルであってよく、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換２〜２０員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換３〜８員ヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換アリールは、置換または非置換Ｃ6〜Ｃ10アリールであり、かつ／または各置換または非置換ヘテロアリールは、置換または非置換５〜１０員ヘテロアリールである。本明細書における化合物の一部の実施形態では、各置換または非置換アルキレンは、置換または非置換Ｃ1〜Ｃ20アルキレンであり、各置換または非置換ヘテロアルキレンは、置換または非置換２〜２０員ヘテロアルキレンであり、各置換または非置換シクロアルキレンは、置換または非置換Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキレンであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキレンは、置換または非置換３〜８員ヘテロシクロアルキレンであり、各置換または非置換アリーレンは、置換または非置換Ｃ6〜Ｃ10アリーレンであり、かつ／または各置換または非置換ヘテロアリーレンは、置換または非置換５〜１０員ヘテロアリーレンである。
【０３７２】
一部の実施形態では、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ1〜Ｃ8アルキルであり、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換２〜８員ヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ3〜Ｃ7シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換３〜７員ヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換アリールは、置換または非置換Ｃ6〜Ｃ10アリールであり、かつ／または各置換または非置換ヘテロアリールは、置換または非置換５〜９員ヘテロアリールである。一部の実施形態では、各置換または非置換アルキレンは、置換または非置換Ｃ1〜Ｃ8アルキレンであり、各置換または非置換ヘテロアルキレンは、置換または非置換２〜８員ヘテロアルキレンであり、各置換または非置換シクロアルキレンは、置換または非置換Ｃ3〜Ｃ7シクロアルキレンであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキレンは、置換または非置換３〜７員ヘテロシクロアルキレンであり、各置換または非置換アリーレンは、置換または非置換Ｃ6〜Ｃ10アリーレンであり、かつ／または各置換または非置換ヘテロアリーレンは、置換または非置換５〜９員ヘテロアリーレンである。
【０３７３】
本明細書に示されている、価が満たされていない任意の原子は、原子価を満たすために十分な数の水素原子を有すると仮定されている。アルキル、Ｒ3、またはＲ5などの任意の変数記号が、本明細書中で提示されているいずれかの式または説明中に１回より多く出現している場合、各出現におけるその変数記号の定義は、他のどの出現におけるその定義からも独立している。数値範囲は、本明細書で使用される場合、連続する数値全体を包含することが意図されている。例えば、「０から４」または「０〜４」と表されている範囲は、０、１、２、３、および４を包含する。多官能価部分が示されている場合、核への結合点は、線またはハイフンによって示されている。例えば、−ＯＨは、酸素原子が分子の残りの部分へのヒドロキシル基の結合点である部分を指す。
【０３７４】
本明細書において示されている式はいずれも、構造式によって示されている構造を有する化合物、さらには特定の変形または形態を表すことが意図されている。例えば、本明細書のいずれの式の化合物も不斉中心またはキラル中心を有することがあり、したがって種々の立体異性体型で存在し得る。その一般式の化合物の、光学異性体、鏡像異性体、およびジアステレオ異性体を包含する立体異性体およびその混合物は全て、その式の範囲内にあるものとみなす。さらに、ある種の構造は、幾何異性体（すなわち、シスおよびトランス異性体）として、互変異性体として、またはアトロプ異性体として存在し得る。そのような異性体型およびその混合物は全て、本明細書においては、本発明の一部として企図される。したがって、本明細書において示されている式はいずれも、ラセミ化合物、１種もしくは複数の鏡像異性体型、１種もしくは複数のジアステレオ異性体型、１種もしくは複数の互変異性体型、またはアトロプ異性体型、およびその混合物を表すことが意図されている。
【０３７５】
ジアステレオ異性体混合物は、例えば、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶化などによる当業者によく知られている方法によって、その物理的化学的相違に基づき、その個々のジアステレオ異性体に分離することができる。適切な光学的に活性な化合物（例えば、キラルアルコールまたはモッシャー酸塩化物などのキラル補助剤）との反応（またはジアステレオ異性体塩の混合物の形成）によって、鏡像異性体の混合物をジアステレオ異性体混合物に変換し、そのジアステレオ異性体を分離し、かつ個々のジアステレオ異性体を対応する純粋な鏡像異性体に変換（例えば、加水分解または脱塩）することによって、鏡像異性体を分離することができる。鏡像異性体は他にも、キラルＨＰＬＣカラムを使用することによって分離することができる。本発明の化合物のキラル中心は、ＩＵＰＡＣ  １９７４推奨によって定義されるとおり「Ｒ」もしくは「Ｓ」と、またはペプチド文献に合わせて「Ｄ」もしくは「Ｌ」名称によって命名することができる。
【０３７６】
本明細書で使用される場合、下付き文字と共に表示されている構造の一部を囲む囲みは、その囲み内にある構造フラグメントが、下付き文字に従って繰り返されることを示している。例えば、下部構造：
【０３７７】
【化７】
2017536091.tif 000016
［式中、ｘは０、１、または２である］は、そのフラグメントが構造に存在しないか、または−フラグメント−であるか、または−フラグメント−フラグメント−であることを示している。例えば、式ＶＩＩ内では、以下の下部構造：
【０３７８】
【化８】
2017536091.tif 000017
［式中、ｐは０または１である］は、囲み内の−Ｘ−ＮＨ−基が構造に存在しないか（ｐが０である）、または１回存在する（ｐが１である）ことを意味している。
【０３７９】
本発明の化合物は、薬学的に許容される塩を形成することができ、これも、本発明の範囲内のものである。「薬学的に許容される塩」は、非毒性で、生理学的に許容可能で、それを製剤化した医薬組成物と相容性で、かつ他の点でも、対象への処方および／または投与に適している本明細書において記載されている化合物の遊離の酸または塩基の塩を指す。本明細書における化合物に対する言及は、別段に示されていない限り前記化合物の薬学的に許容される塩に対する言及を包含すると理解されたい。
【０３８０】
化合物塩には、無機酸および／または有機酸で形成される酸塩、さらには、無機塩基および／または有機塩基で形成される塩基塩が包含される。加えて、所与の化合物が、これらに限定されないが、ピリジンまたはイミダゾールなどの塩基性部分と、これらに限定されないが、カルボン酸などの酸性部分との両方を含有する場合、当業者は、その化合物が双性イオン（分子内塩）として存在し得ることが分かるであろう；そのような塩は、本明細書で使用されるとおりの用語「塩」の範囲内に包含される。例えば、塩がその中で沈殿するものなどの媒体中か、または水性媒体中で化合物を、当量などの量の適切な酸または塩基と反応させ、続いて凍結乾燥させることによって、本発明の化合物の塩を調製することができる。
【０３８１】
例示的な塩には、これらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩（「メシル酸塩」）、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス（２−ヒドロキシ−３−ナフトアート））が包含される。薬学的に許容される塩は、アセタートイオン、スクシナートイオン、または他の対イオンなどの他の分子の包接を伴うことがある。対イオンは、親化合物上の電荷を安定させる任意の有機または無機部分であってよい。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造中に１個超の荷電原子を有することがある。多数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である例は、多数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に許容される塩は、１個もしくは複数の荷電原子および／または１個もしくは複数の対イオンを有し得る。
【０３８２】
例示的な酸付加塩には、酢酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、リン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩（トシル酸塩としても知られている）などが包含される。
【０３８３】
例示的な塩基性塩には、アンモニウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミンなどの有機塩基（例えば、有機アミン）を有する塩、ならびにアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩などが包含される。塩基性窒素含有基を、低級アルキルハロゲン化物（例えば、塩化、臭化、およびヨウ化メチル、エチル、およびブチル）、ジアルキル硫酸塩（例えば硫酸ジメチル、ジエチルおよびジブチル）、長鎖ハロゲン化物（例えば、塩化、臭化、およびヨウ化デシル、ラウリル、およびステアリル）、アラルキルハロゲン化物（例えば、臭化ベンジルおよびフェネチル）などの薬剤で第四級化することができる。
【０３８４】
医薬化合物から薬学的に有用な塩を形成するために適していると一般に考えられている酸および塩基は、例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌらによって（Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．（編）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ．（２００２）Ｚｕｒｉｃｈ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；Ｓ．Ｂｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６（１）、１〜１９；Ｐ．Ｇｏｕｌｄ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９８６）３３、２０１〜２１７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＴｈｅ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｂｏｏｋ（Ｆｏｏｄ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＭＤ、ＦＤＡから入手可能）において検討されている。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３８５】
本明細書において記載されている化合物はいずれも、そのような化合物の任意の非溶媒和形態または水和物、溶媒和物、もしくは多形およびその混合物も指すことが意図されている（そのような形態が、明確に列挙されていなくても）。「溶媒和物」は、本発明の化合物と１個または複数の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合は、水素結合を包含する、様々な程度のイオン結合および共有結合を伴う。特定の場合には、例えば１個または複数の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子中に組み込まれている場合には、溶媒和物を単離することができる。「溶媒和物」は、溶液相および単離可能な溶媒和物の両方を包含する。適切な溶媒和物には、水、エタノールなどの薬学的に許容される溶媒と共に形成されるものが包含される。一部の実施形態では、溶媒は水であり、溶媒和物は水和物である。
【０３８６】
本明細書に示されている式はいずれも、化合物の標識されていない形態、さらには同位体標識された形態を表すことが意図されている。同位体標識された化合物は、本明細書に示されている式によって示されるが、ただし、１個または複数の原子が、選択された原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられている構造を有する。本発明の化合物に組み込むことができる同位体の例には、それぞれ2Ｈ、3Ｈ、11Ｃ、13Ｃ、14Ｃ、15Ｎ、18Ｏ、17Ｏ、31Ｐ、32Ｐ、35Ｓ、18Ｆ、36Ｃｌ、および125Ｉなどの水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、塩素、およびヨウ素の同位体が包含される。そのような同位体で標識された化合物は、代謝研究（例えば、14Ｃを用いる）、反応速度研究（例えば、2Ｈまたは3Ｈを用いる）、薬物もしくは基質組織分布アッセイを包含する検出もしくはイメージング技術［陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）もしくは単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）など］、または患者の放射性治療において有用である。特に、18Ｆまたは11Ｃ標識された化合物は、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ研究に特に適し得る。さらに、ジュウテリウム（すなわち、2Ｈ）などの比較的重い同位体で置換することで、より高い代謝安定性、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長または投薬必要量の低減から生じる、ある種の治療上の利点を得ることができる。一般的には、下記のスキームまたは実施例および調製において開示されている手順を実施し、その際、容易に利用可能な同位体標識された試薬を同位体標識されていない試薬の代わりに用いることによって、同位体標識された本発明の化合物およびそのプロドラッグを調製することができる。
【実施例１】
【０３８７】
メディトープＦｃ結合
メディトープを、ポリ−グリシン−セリンリンカーを介してＦｃドメインのＮ末端に融合させることによって、メディトープ−Ｆｃコンストラクトを作成した。このメディトープ−Ｆｃコンストラクトのための遺伝子は、ＤＮＡ２．０によってコンストラクトされ（３７残基リンカーを介してヒトＩｇＧガンマ重鎖３（受入番号ＡＡＷ６５９４７）残基２２〜２４１に結合したｃＱＦＤメディトープ）、ｐＡｃＧＰ６７Ａベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングされ、Ｓｆ９細胞において産生された。タンパク質を、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。メディトープ−Ｆｃは、配列番号５７で示されるとおりのアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含した（１位にリーダー（「Ｇ」）を有して下記に示されており、メディトープは太字、リンカーはイタリック体、Ｆｃ部分は通常文字）：
ＧＣＱＦＤＬＳＴＲＲＬＲＣＧＧＳＲＳＧＧＴＳＧＧＧＳＶＰＧＳＧＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＱＡＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号５７）。
【０３８８】
このコンストラクトを使用すると、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、セツキシマブＦａｂ、ＥＧＦＲｄＩＩＩおよびメディトープが複合体を形成することが実証された。メディトープ−Ｆｃコンストラクトを、ＥＧＦＲｄＩＩＩおよびセツキシマブＦａｂの化学量論的複合体に付与すると、Ｆａｂ−ＥＧＦＲｄＩＩＩ複合体よりもかなり早く溶離される新たなピークが観察され、流体力学的質量の増加と一致した。この新たなピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、３つのタンパク質すべての存在を示した。これらの研究によって、メディトープが抗原認識を著しく妨害することはないことがさらに確認された。
【実施例２】
【０３８９】
メディトープ利用可能トラスツズマブの作成
メディトープ結合性部位を、ヒトｍＡｂフレームワーク上にグラフト化して、メディトープ利用可能抗体（ｍｅｄｉｔｏｐｅ−ｅｎａｂｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（メディトープ利用可能抗体（ｍｅｄｉｔｏｐｅ  ｅｎａｂｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））、具体的には、メディトープ利用可能抗体トラスツズマブを作成した。セツキシマブおよびトラスツズマブの配列をアラインさせ、配列同一性をトラスツズマブの原子モデルにマッピングした（１Ｎ８Ｚ、Ｃｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２１、７５６〜７６０（２００３）を参照されたい）。このマッピング、ならびにｃＱＦＤ−セツキシマブおよびトラスツズマブ構造の重ね合わせに基づき、セツキシマブおよびトラスツズマブの間で異なり、その側鎖が、メディトープと直接接触しているか、またはメディトープ結合に間接的に影響を及ぼし得るかのいずれかである１３個の残基を同定した。これらの残基は：軽鎖中にＴｈｒ４０、Ａｓｎ４１、Ａｓｐ８５（上記を参照されたい）、非結合リン酸基を配位させており、かつ一部の例では、軽鎖中のＴｈｒ４０およびＡｓｎ４１を含有するループを安定化させている軽鎖中のＡｒｇ３９、およびＡｒｇ４５、メディトープ中のＬｅｕ１０の側鎖近くの浅い疎水性表面の形成に関係しているＶａｌ９およびＩｌｅ１０、ならびに軽鎖中のＧｌｙ４２、Ｓｅｒ４３、Ｉｌｅ８３およびＡｌａ１００、さらに、重鎖中のＳｅｒ４０およびＩｌｅ８９。
【０３９０】
トラスツズマブ配列における同等の位置を変異させ（Ｋａｂａｔナンバリングに基づき、軽鎖ではＴｈｒ４０、Ａｓｎ４１、Ａｓｐ８５、Ａｒｇ３９、Ａｒｇ４５、Ｉｌｅ９、Ｌｅｕ１０、Ｇｌｙ４２、Ｓｅｒ４３、Ｉｌｅ８３およびＡｌａ１００に、ならびに重鎖ではＳｅｒ４０およびＩｌｅ８９に）、タンパク質を生成および精製した。ＳＰＲを使用すると、ｃＱＦＤメディトープが、セツキシマブと同様の親和性で、グラフト化されたトラスツズマブＦａｂに結合したことが示された（ＫD＝１．２μＭ）。メディトープ利用可能トラスツズマブＦａｂが、市販供給元から単離されたＦａｂと同様の親和性で、可溶性ＨＥＲ２に結合したことも観察され、変異が、抗原結合に対して有害作用を有さないことが確認された。サイズ排除クロマトグラフィーによって、メディトープ利用可能トラスツズマブ、ｓＨＥＲ２、およびメディトープ−Ｆｃが同時溶離したことが実証された。
【０３９１】
点変異がＦａｂの全体構造を著しく混乱させなかったことをさらに確認するために、トラスツズマブメディトープ利用可能抗体のＦａｂを、ｃＱＦＤメディトープを伴って、およびそれを伴わずに結晶化させた。結晶化を補助するために、プロテインＡおよびプロテインＬの存在下で、十分な回折結晶を得た。アポ−メディトープ利用可能抗体トラスツズマブおよびメディトープ含有複合体の構造を、それぞれ１．９５および２．０Åで解析した。プロテインＡおよびプロテインＬに結合した親トラスツズマブＦａｂも結晶化させ、２．０８Å解像度まで解析した。「アポ」−メディトープ利用可能抗体トラスツズマブ上へのアポ−親トラスツズマブＦａｂまたはＨＥＲ２結合親トラスツズマブＦａｂ（２２）のいずれかの重ね合わせは、全体構造におけるマイナーな変化のみを明らかにした（ＲＭＳＤ＝４３３および４３１Ｃα原子でそれぞれ０．２２Åおよび０．５６Å）。「アポ」−およびメディトープ−リガンド結合型メディトープ利用可能抗体トラスツズマブの重ね合わせによって、セツキシマブで観察されたことと同様に、メディトープ占有が、オープンな立体配座における重鎖ループ（残基３９〜４４）を安定化させ、一部で、僅かに高いＲＭＳＤの原因となったことが示された。より重要なことには、「アポ」−およびメディトープ−リガンド結合型メディトープ利用可能抗体における配列マッピングによって同定された残基（Ｔｈｒ４０、Ａｓｎ４１およびＡｓｐ８５）は本質的に、セツキシマブにおけるそれらのカウンターパートと同じ位置にあり、メディトープと共に同様の相互作用を形成した。メディトープの重要な側鎖回転異性体も本質的に、ｃＱＦＤ−セツキシマブ構造においてと同じであった。セツキシマブを伴う場合と同じく、ＣＤＲループの有意な改変は観察されなかった。
【０３９２】
これらのデータは、抗原結合に著しい影響を及ぼすことなく、ヒトＦａｂフレームワーク上へのメディトープ結合性部位のグラフト化の成功を実証している。メディトープ部位のグラフト化の成功は、回折データを介して得られた当初セツキシマブ−メディトープモデルおよび相互作用の特異性をさらに実証している。データによって、結合活性を介してメディトープ結合親和性を増強する実行可能性がさらに確認され、二価メディトープが特異的であり、高い親和性で、ただし、コグネイトメディトープ利用可能抗体の存在下でのみ、抗原を過剰発現している細胞に結合することが示されている。
【実施例３】
【０３９３】
多価、高親和性メディトープ
この実施例では、改善された親和性を有し、例えば、抗体事前標的イメージングおよび／または薬物送達において有用な多価メディトープの作成を記載する。特異性および親和性は、結合活性／多価によって一般に得られる（Ｍａｍｍｅｎ  Ｍ、Ｃｈｏｉ  Ｓ、＆  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ  Ｇ（１９９８）  Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．編、Ｅｎｇ  ３７：２７５５）。
【０３９４】
二価メディトープ−Ｆｃコンストラクトを、上記の実施例１においてのとおりに作製した；この化合物は、細胞−会合セツキシマブまたは細胞−会合トラスツズマブメディトープ利用可能抗体に対して、メディトープと比較すると、増強された見掛けの親和性を有することが実証された。メディトープ−Ｆｃ（ＭＦＣ）は、セツキシマブで事前処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＥＧＦＲ−過剰発現乳癌細胞系）に結合し、大々的な洗浄手順（本質的に二価メディトープの約１０6倍希釈）にも関わらず結合し続けたことが観察された。メディトープ−Ｆｃコンストラクトは、未処理の細胞またはＭ４２５、メディトープ結合性部位を有さないマウス抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂで事前処理された細胞には結合しなかった（Ｋａｍａｔ，Ｖ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７、７２６〜７３３（２００８）；Ｒｏｄｅｃｋ  Ｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７（１４）：３６９２〜３６９６（１９８７））。ＦＩＴＣ標識された単量体ｃＱＦＤメディトープは、セツキシマブ事前処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に結合したが、そのシグナルは、ＦＡＣＳによって測定すると、１回の洗浄後に、バックグラウンドレベルに低下した（約１００倍希釈、その結合親和性と一致）ことも実証された（図１１）。
【０３９５】
メディトープ−Ｆｃとセツキシマブとの安定した特異的相互作用は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の表面上でのその同時局在化によっても明らかに見られた（図１１）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、二価メディトープを作成することによって得られる結合活性は、セツキシマブの存在下でのみ、病的濃度のＥＧＦＲを発現する細胞へのその選択的結合を促進したことが確認された。
【０３９６】
メディトープ−Ｆｃでの研究を、メディトープ利用可能抗体トラスツズマブを使用して実施した。メディトープ利用可能抗体トラスツズマブを、ＨＥＲ２−過剰発現ＳＫＢＲ３乳癌細胞で試験した。ＦＡＣＳおよび蛍光顕微鏡法の両方によると、グラフト化されたトラスツズマブは、親トラスツズマブと同じレベルで細胞に結合した。ＦＡＣＳ分析によって、本発明者らが作成したトラスツズマブメディトープ利用可能抗体および親トラスツズマブが、細胞表面ＨＥＲ２に対して、市販のトラスツズマブと同じ範囲の親和性を有したことが示された（図１２）。セツキシマブでの場合と同じく、顕微鏡法によって、メディトープ−ＦｃがＳＫＢＲ３細胞上のメディトープ利用可能抗体トラスツズマブと同時局在化したことが実証された。同じ特異的結合が反復された。メディトープ利用可能抗体トラスツズマブおよび親対照は、グラフト化された残基で異なるだけであったので、特異性が完全に、メディトープ利用可能化点変異に由来したことが確認された。
【０３９７】
次の多価メディトープ−Ｆｃコンストラクトも作成した。
2017536091.tif 000018
【０３９８】
配列番号２３７〜２３９は、追加の多価メディトープペプチドを開示している。
【０３９９】
上記配列のそれぞれでは、適用可能な場合には、リーダーおよびテール配列は下線付きであり、メディトープ配列は太字であり、リンカー配列はイタリック体であり、Ｆｃ部分は、通常の文字で示されている。
【０４００】
四価メディトープ−Ｆｃは、細胞表面抗原に結合したメディトープ利用可能抗体を介して、高い親和性で結合することが示された。一部の実施形態では、上記四価および二価コンストラクトのそれぞれ、または１種もしくは複数は、細胞表面抗原に結合したメディトープ利用可能抗体を介して、例えば、高い親和性で結合することが示されている。
【実施例４】
【０４０１】
メディトープ利用可能抗体および多価メディトープの投与後の抗原局在化および分布の評価
この実施例では、様々な蛍光標識分子を使用して実施した超解析および共焦点顕微鏡研究を記載する。これらの研究を、メディトープ利用可能抗体（ｍｅｄｉｔｏｐｅ−ｅｎａｂｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（メディトープ利用可能抗体（ｍｅｄｉｔｏｐｅ  ｅｎａｂｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））および多価メディトープの投与後に、内部移行およびクラスター化を包含する抗原局在化および分布を評価するために実施した。抗体および標識メディトープの局在化も、投与後に評価した。
【０４０２】
抗原特異的抗体を単独で、かつ多価メディトープと組み合わせて投与した後のこれらの受容体抗原の分布を観察するために、光活性化可能なＨｅｒ２およびＥＧＦＲコンストラクトを作成した。蛍光プローブを抗体、例えば、メディトープ利用可能抗体、および／または多価メディトープにコンジュゲートして、蛍光を使用しての、それらの局在化の観察を可能にした。超解析および共焦点顕微鏡法を行った。
【０４０３】
Ａ．  材料および方法
メディトープ利用可能抗体によって標的化される細胞表面抗原の可視化を可能にするために、光活性化可能なＨＥＲ２およびＥＧＦＲコンストラクトを作成した。メディトープの局在化を可視化するために、四価メディトープを包含する標識多価メディトープも作成した。
【０４０４】
ｐｅｒｂＢ２−ｐａＧＦＰ（またはＨＥＲ２−ｐａＧＦＰ）部位特異的突然変異誘発
ｐｅｒｂＢ２−ＥＧＦＰ  ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドを、Ａｄｇｅｎｅから購入した（プラスミド＃３９３２１）。このプラスミドを、光活性化可能な（ｐａ）ＧＦＰをコードする領域を作成するようにＥＧＦＰコード領域を変異させる反復部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）のために使用した。様々なプライマー対を、プラスミドのＥＧＦＰコード領域において５アミノ酸を改変する反復ＳＤＭのために使用した。
【０４０５】
ＳＤＭの各ラウンドの後に、得られたＤＮＡを、ＢＰ５アルファコンピテント細胞（ＢＩＯＰＩＯＮＥＥＲ）に形質転換し、ＬＢ／アンピシリン寒天プレート上、３７℃で平板培養した。単一コロニーを選択し、ＬＢ１０ｍＬ中で増幅させて、ＳＤＭのその後のラウンドにおいて使用するためにプラスミドＤＮＡを精製した。ＳＤＭの最終ラウンドの後に、プラスミドを、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ（ＣＯＨ）Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＣｏｒｅにおいてＳａｎｇｅｒ配列決定に掛けた。
【０４０６】
ａｄｄｇｅｎｅコンストラクトによってコードされたタンパク質のアミノ酸配列を、ＨＥＲ２−ｐａＧＦＰベクターによってコードされたものと比較するＣｌｕｓｔａｌアラインメントを行った。次の変異が見出された：Ｌ１３３５Ｆ、Ｔ１３３６Ｓ、Ｖ１４３４Ａ、Ｔ１４７４Ｈ、およびＡ１４７７Ｋ。
【０４０７】
ｐｅｒｂＢ１−ｐａＧＦＰ（またはＥＧＦＲ−ｐａＧＦＰ）の作成
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターにおけるＥＧＦＲ−ＧＦＰは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ  ＩＤ  ３２７５１、Ｕｌｌｒｉｃｈ／Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓｃｈｅｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｘｅｌ  Ｕｌｌｒｉｃｈ、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）から得た。Ｎ１ベクターにおけるＰＡＧＦＰを元々は、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｌｉｐｐｉｎｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚから得たが；これはＡ２０６Ｋ変異を含有した。
【０４０８】
ＥＧＦＲ−ＧＦＰ  ＤＮＡを、コンストラクトをマッピングするプライマーを使用して配列させた。ＧＦＰの代わりにＰＡＧＦＰインサートをクローニングするために、ＡｇｅＩおよびＢｓｒＧＩ切断部位を使用した。簡単には、ベクターおよびインサートプラスミドを、ＡｇｅＩおよびＢｓｒＧＩ制限酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３７℃で３０分間使用して消化した。消化されたプラスミドを、２％アガロースゲル上で可視化した。適切なサイズのバンドを切断し、ベクターおよびインサートＤＮＡを作成するために精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で３０分間使用してライゲートした。ライゲーション反応生成物をコンピテントＢＰ５α細菌細胞に形質転換し、カナマイシン耐性プレート上に播種した。プレートを３７℃で終夜インキュベートした。コロニーを選び、カナマイシン補充されたＬＢブロス中で成長させた。ＤＮＡを抽出し、ＥＧＦＲ−ＰＡＧＦＰコンストラクトを確認するために配列決定に送った。
【０４０９】
四価メディトープ−Ｆｃ（Ｍ４ＦＣ）および蛍光標識Ｍ４ＦＣの生成
配列番号５８のアミノ酸配列を有し、実施例３において記載した四価メディトープ−Ｆｃ（Ｍ４ＦＣ）を生成し、この実施例の研究において使用した。Ｍ４ＦＣを生成するために使用したヌクレオチド配列を、配列番号２２３において提供する。
【０４１０】
このＭＭ４Ｆｃをコードするベクターを生成するために、ＤＮＡをＤＮＡ２．０によって合成した。コンストラクトをＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の分泌型ｐＡｃＧＰ６７Ａベクターにクローニングした。
【０４１１】
バキュロウイルスコンストラクション：
下記の製造者推奨プロトコルに従ってＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＫｉｔからのＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ  Ｂｒｉｇｈｔ  ＤＮＡを使用して、同時遺伝子導入を実施した。２百万のＳｆ９細胞（Ｇｉｂｃｏ）を６０ｍｍ組織培養プレート上に、ＳＦＭ−９００  ＩＩ培地２ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で播種した。細胞がしっかりと結合した後に、ＳＦＭを除去し、遺伝子導入緩衝液Ａ１ｍＬを、定速の過流下で添加した。その間に、ＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄバキュロウイルスＤＮＡ０．５μｇおよびｐＡｃＧＰ６７Ａ−Ｍ４ＦＣベクター２μｇを混合し、５分間放置し、その後、遺伝子導入緩衝液Ｂ１ｍＬをＤＮＡ混合物に混合した。次いで、プレートを定速で揺らしながら、溶液を昆虫細胞に１滴ずつ添加した。プレートを２７℃で４時間インキュベートし、その後、遺伝子導入緩衝液を除去し、ＳＦＭ５ｍＬに交換した。プレートを、湿ったキムワイプを備えた１０ｃｍ組織培養皿内に入れ、すべての細胞が死ぬまで、２７℃でインキュベートした。
【０４１２】
バキュロウイルス増幅：
１５０ｍｍ組織培養プレートへの接種物Ｐ１ウイルス３００μＬを、ＳＦＭ−９００  ＩＩ培地４０ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に２０×１０6のＳｆ９細胞と共に播種した。すべての細胞が７日目までに死滅したことが確認された。死滅しなければ、Ｐ１体積を少なくとも３倍増加させた。ウイルスによって死滅した細胞は、プレートに付着したままであった；過成長から死滅した細胞は剥離した。Ｐ２を同様に増幅させたが、５〜６日目までに細胞が死滅することが確認され；Ｐ３を同様に増幅させたが、４〜５日目までに細胞が死滅することが確認された。こうして得たＰ３は、力価＝２×１０8ｐｆｕ／ｍＬであると推測された。
【０４１３】
発現：
Ｈｉ−Ｆｉｖｅ細胞を、懸濁培養物（２×１０6細胞／ｍＬ）にＭ．Ｏ．Ｉ．＝３（例えば、細胞１００ｍＬにＰ３  ３ｍＬ）で接種した。翌日に成長停止、および４日までに完全な細胞死をもたらしたら、接種を有効と考えた。したがって、Ｐ３のＭ．Ｏ．Ｉを、必要に応じて、最高１０に調節した。Ｍ．Ｏ．Ｉ＝１０を超える必要があれば、Ｐ４増幅を考慮する。
【０４１４】
一部の場合には、感染を促進するために、最終体積にする前に２時間、Ｐ３を、より高い密度の細胞培養物で事前インキュベートした。過剰な細胞デブリの存在によるタンパク質分解を防止するために、３日目に、または＞８０％細胞がトリパンブルーについて陽性であったときに、培養上清を一般に採取した。
【０４１５】
精製：
１０，０００ｇ以上で、少なくとも３０分間、４℃で、細胞デブリを回転させた。上清を、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。一部の場合には、ｐＨを、ｐＨストリップを使用して評価し、酸性過ぎれば、ｐＨを１Ｍトリス、ｐＨ８．０または１０倍ＰＢＳ、ｐＨ７．４で７〜８に調節した；ｐＨは一般に、中性に近かった。
【０４１６】
プロテインＡまたはプロテインＧのいずれかを、精製のために使用した（一般に、８に近いｐＨを有する上清では、プロテインＡを使用した）。カラムに、プロテインＡまたはＧアガロースビーズ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を充填し、５カラム体積の１×ＰＢＳで平衡化させた。濾過上清を、重力流によってカラムに通した。体積が大きい場合には（＞１Ｌ）、カラムを２〜３カラム体積の１倍ＰＢＳで間欠的に洗浄した。カラムを１０カラム体積の１×ＰＢＳで洗浄した。
【０４１７】
０．７カラム体積の０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を適用し、通過させた。タンパク質を２カラム体積の０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶離した。溶離するタンパク質が、即時中和のための０．１溶離体積の１Ｍトリス、ｐＨ９．０、および沈殿を防止するための０．１カラム体積の１０倍ＰＢＳのレザバーに直接滴下することが保障された。Ｏ．Ｄ．を２８０ｎｍで測定して、収量を決定した（典型的な収量は＞３０ｍｇ／Ｌであった）。
【０４１８】
Ｍ４ＦＣおよびＦｃのみ（分解生成物）を識別するために、タンパク質調製物を、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。５μＭセツキシマブＩｇＧを、最終体積８０μＬの６μＭ粗製Ｍ４ＦＣ（１倍ＰＢＳで調節）と混合し、室温で５分間放置し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に施与した。所望の複合体の存在を、約１０ｍＬのその溶離によって確認した。
【０４１９】
ゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィーを精製の最終ラウンドで使用し、続いて、１倍ＰＢＳへの透析によって緩衝液を交換した。Ｍ４ＦＣを約１５０μＭに濃縮した。
【０４２０】
貯蔵：
Ｍ４ＦＣは一般に、４℃で最大１か月間安定していた。長期貯蔵では、タンパク質を少量アリコットでフラッシュ凍結し、−８０℃で貯蔵した。解凍したＭ４ＦＣをリサイズして、凝集物を除去した。
【０４２１】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識：
典型的には、Ｍ４ＦＣタンパク質を、５０μＬ反応物において標識した。タンパク質濃度を２ｍｇ／ｍＬに調節し、０．１体積の１Ｍ炭酸水素ナトリウムと混合した。２０μＬピペットチップのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ粉末／フレークサイズをタンパク質混合物に直接添加し、室温でインキュベートし、３０〜６０分間、添加した色素の量および所望の標識程度に応じて、光を遮断した。蛍光顕微鏡法によると、タンパク質は一般に、３〜５色素で標識された。未反応の色素を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０−Ｆｉｎｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填されたＢｉｏ−Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって分離した。５０％ＰＢＳ平衡化セファデックススラリーを充填し、３〜５分、１，１００ｇ回転で、スイングバケット遠心器内の１５ｍＬチューブホルダー中でビーズを圧縮することによって、カラムをパッキングした。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘカラムの上部に装填し、標識タンパク質を２分、１，１００ｇ回転で溶離液中に収集した。標識タンパク質を、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ遠心濾過フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して新鮮なＰＢＳに緩衝液交換し、０．２２μｍ濾過した。
【０４２２】
ＥＧＦＲ−ＰＡＧＦＰの超解像イメージング
Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ  ＩＩおよび塩基性ピラニア腐食プロトコルを使用して、カバーガラスを清浄にした。ＰＡＬＭ顕微鏡法では、細胞を、フィブロネクチン様改変タンパク質（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の２５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた清浄なカバーガラス上で成長させた。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣから元々は得た）をフェノールレッド非含有ダルベッコ改変イーグル培地、すなわち、２０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００単位／ｍｌのストレプトマイシン、および２．５ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充された栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養した。製造者の指示に従ってＦｕＧＥＮＥ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）遺伝子導入試薬を使用して、ＥＧＦＲ−ＰＡＧＦＰコンストラクト２ｕｇを、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞に一過性に遺伝子導入した。遺伝子導入の約２４時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ＝７．４中、３７℃で迅速に洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドおよび０．２％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、３０分間、室温で、ＰＢＳ中で固定した。ＰＢＳ中のフィルター滅菌された２５ｍＭグリシンで、クエンチを１０分間行い、細胞を最後に、ＰＢＳで３回洗浄した。カバーガラスを、イメージ収集中のドリフトを修正するための基準マーカーとして役立つ１：４０００希釈されたＴｅｔｒａＳｐｅｃｋビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＰＢＳ、５分間インキュベートした。カバーガラスを、ＰＢＳを補充されたＡｔｔｏｆｌｕｏｒセルチャンバー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での調製直後にイメージングした。
【０４２３】
Ｈｅｒ２−ＰＡＧＦＰの超解像イメージング
細胞を清浄なコーティングされたカバーガラス上に播種した。Ｈｅｒ２−ｐａＧＦＰを、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＤＮＡ３ｕｇ、Ｆｕｇｉｎｅ  ＨＤ遺伝子導入試薬、４８時間）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＤＮＡ２ｕｇ、ＪｅｔＰｒｉｍｅ遺伝子導入試薬、２４時間または４８時間）細胞に一過性に遺伝子導入した。細胞を１０ｎＭトラスツズマブと共に１０分間インキュベートし、洗浄し、本明細書において上記したとおりに固定し、イメージングした。ＰＣ−ＰＡＬＭを使用して、Ｈｅｒ２の分布を画定した。
【０４２４】
Ｂ．  メディトープ利用可能抗ＨＥＲ２抗体および多価メディトープの投与後のＨＥＲ２分布の評価
細胞を、定常状態で（抗体添加なし）、またはメディトープ利用可能化されていないトラスツズマブと共に１０分間インキュベートした後に評価した。Ｈｅｒ２の分布は、単一指数分布に従っていると観察され、単一レベルの構成を意味した。定常状態では（抗体添加なし）、遺伝子導入から２４時間目に、１０の異なる細胞からの１４エリアの評価に基づき、遺伝子導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、１クラスター当たり平均５つのＨＥＲ２タンパク質を提示した。密度は、２つの集団が同時存在したことを示し：観察されたエリアの半分は、１クラスター当たり３〜５つのタンパク質を有し、観察されたエリアの他の半分は、１クラスター当たり６〜９つのタンパク質を有した。
【０４２５】
トラスツズマブと共に１０分間インキュベートした後に、Ｈｅｒ２−ｐａＧＦＰ遺伝子導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、１クラスター当たり平均６つのタンパク質を提示した。
【０４２６】
別の研究では、効果を、メディトープ利用可能抗体と組み合わせて多価メディトープと共にインキュベートした後に観察された効果と比較した。ＨＥＲ２−ｐａＧＦＰは、上記のとおりにＭＤＡ−４６８細胞中で発現された。細胞を、配列番号９の重鎖、および８３Ｅを有する配列番号６の配列である軽鎖を有する１０ｎＭメディトープ利用可能トラスツズマブｖ２．０と共に、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を迅速に、事前加温しておいた（３７℃）培地で１回洗浄し、次いで、新鮮な１０ｎＭ四価メディトープ（Ｍ４Ｆｃ）と共に３７℃で、２つの異なる時点（３分および１０分）でインキュベートした。
【０４２７】
８３Ｅメディトープ利用可能抗体トラスツズマブの軽鎖配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＩＬＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２４１）。
８３Ｅメディトープ利用可能抗体トラスツズマブのＶＬ配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＩＬＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＥＡＤＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２４２）。
【０４２８】
図１３において示されているとおり、１０ｎＭ  Ｍ４Ｆｃ（四価メディトープ）と共に３分間インキュベートした細胞は、１０ｎＭ  Ｍ４Ｆｃと共に１０分間インキュベートした細胞での４１±８分子／μｍ2（ｎ＝８、細胞数＝４）と比較して、１９６±４１分子／μｍ2（ｎ＝９、細胞数＝５）で、より高い密度のＨＥＲ２−ｐａＧＦＰを有することが観察された。加えて、１クラスター当たり、より多数のＨＥＲ２タンパク質およびより大きなクラスター半径によって実証されるとおり、Ｍ４Ｆｃとの１０分間のインキュベーションと比較して、３分後には、より多いクラスター化が観察された。抗体の非メディトープ利用可能形態のみとのインキュベーションと比較して、メディトープ利用可能抗体との事前インキュベーション後の四価メディトープＦｃの添加は、３分までに受容体抗原の急速な蓄積およびクラスター化をもたらした。抗体の非メディトープ利用可能形態のみとのインキュベーションと比較して、１０分までに、このインキュベーションは、これらの受容体の急速な内部移行をもたらした。これらのデータは、抗体のみとのインキュベーションと比較して、多価メディトープの添加が、細胞−表面受容体抗原の分布および内部移行に影響を及ぼしたことを実証している。
【０４２９】
Ｃ．  メディトープ利用可能抗体および多価メディトープを投与した後の抗体およびメディトープ−局在化の評価
単独、および多価メディトープを伴うメディトープ利用可能抗体と共にインキュベートした後の細胞内取り込みプロセスに対する効果を共焦点顕微鏡法によって評価した。具体的には、二価メディトープＦｃ（ＭＦＣ）および上記四価メディトープ−Ｆｃ（Ｍ４ＦＣ）の効果を、蛍光顕微鏡法によって評価した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識セツキシマブを、これらのメディトープのそれぞれを伴わずに、またはそれらと組み合わせて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞と共に１５分間、１時間４０分、３時間３５分、および６時間３５分、同時インキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞をホルムアルデヒドによって固定し、適切な場合には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識された抗体を、特異的細胞マーカーについて染色するために施与し、その後、カバーガラスを載せ、サンプルを分析した。メディトープの結合は、メディトープ利用可能抗体（セツキシマブ）の存在に依存しており；単独で施与されたメディトープは、細胞結合をもたらさなかった。
【０４３０】
二価メディトープ−Ｆｃ（ＭＦＣ）は、ほぼ完全に同時インキュベーション期間を通じて、セツキシマブと同時局在化し；イメージによって、これが細胞内取り込みされたことが実証された。同時インキュベーションから４．５時間後に観察されたメディトープおよび抗体の多少の分離に併せて、局在化はより斑点状になった。早期エンドソーム（ＥＥＡ１）、リソソーム（ＬＡＭＰ１およびＬＡＭＰ２）およびゴルジ（ＧＭ１３０）のマーカーの染色によって、通常、細胞の最も濃縮したスポットでのＥＥＡ１およびセツキシマブ／ＭＦＣの非常に僅かな重複を除いて、細胞内取り込み経路の古典的なコンパートメント内には、セツキシマブ／ＭＦＣの同時局在化は存在しなかったことが示された。ＡＰＰＬ１エンドソームは、成長因子受容体輸送およびシグナル伝達に関係し、ＥＥＡ１早期エンドソームとは別個であり、クラスリン由来細胞内取り込みベシクルおよびマクロピノソームのサブセットに共通の早期細胞内取り込み中間体を表す。ＡＰＰＬ１の染色によって、細胞内セツキシマブ／ＭＦＣがＡＰＰＬ１エンドソームの部分ではないことも示された。
【０４３１】
ＭＦＣの存在は、斑点の形成を促進した。セツキシマブのみを伴うインキュベーションは、いくつかの斑点形成をもたらしたが；しかしながら、ドットが、さらにより顕著であった。ドットをカウントするＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェアを使用すると、セツキシマブのみに対して、セツキシマブ＋ＭＦＣと共にインキュベートされた細胞において観察されるドットは、約２倍多かった。ドットはまた、これらの細胞において平均して２倍明るかった（＋ＭＦＣ細胞では２００ルーメン／ピクセル2で７５ドットに対して、セツキシマブのみの細胞では１００ルーメン／ピクセル2で３７ドット）。抗体とＭＦＣとの二価相互作用に依存する斑点の出現も観察された。セツキシマブＦａｂ部分（一価）が代わりに使用された場合（ＭＦＣと共にインキュベート）、４時間の同時インキュベーション後でも、処理細胞は、細胞内斑点を含有せず、ＦａｂおよびＭＦＣと共にインキュベートされた細胞の両方の染色パターンは、ＩｇＧ＋ＭＦＣの早期同時インキュベーション時点によく似ていた。斑点形成はまた、セツキシマブおよびＭ４２５（別の抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ）の両方をＭＤＡ−ＭＢ−４６８に施与した場合に見ることができたが、これは、斑点が受容体架橋から生じることを示している。
【０４３２】
同時インキュベートした場合、四価メディトープ−Ｆｃ（Ｍ４ＦＣ）はまた、セツキシマブとの重複位置を示した。しかしながら、細胞との終夜インキュベーションの後でも観察された二価ＭＦＣとは異なり、Ｍ４ＦＣは、３．５時間超のインキュベーションの後に、かろうじて検出可能となった。さらに、Ｍ４ＦＣの内部移行が、ＭＦＣよりも急速に起こり、早くも２０分で観察された。
【０４３３】
これらの研究は、蛍光コンジュゲートされた四価コンジュゲートされたメディトープの蛍光シグナルの急速な消失を実証し、多価メディトープおよび薬剤のこの組合せが、リソソームに急速に輸送され、タンパク分解されることを示唆した。
【０４３４】
特異的な細胞内取り込み経路を遮断する薬物（クラスリン媒介性細胞内取り込み作用ではＤｙｎａｓｏｒｅ、および微飲作用ではＥＩＰＡなど）を、細胞を処理し、メディトープ利用可能抗体、例えば、セツキシマブ、および多価メディトープ、例えば、メディトープ−Ｆｃの局在化に対する効果を観察するために使用する。
【０４３５】
一例では、クラスリン媒介性細胞内取り込み作用を遮断することができるダイナミン阻害薬の細胞透過性阻害薬であるＤｙｎａｓｏｒｅを使用した。細胞を、５０μＭ  Ｄｙｎａｓｏｒｅで１時間、事前処理し、その後、Ｍ４ＦＣおよびセツキシマブをさらに３時間添加した。この処理の後に、セツキシマブおよびＭ４ＦＣの両方が、核周囲領域に蓄積されるのが観察された。インキュベーション後に、細胞をＭ４２５（別の抗ＥＧＦＲ抗体）で染色して、抗原の位置を評価した。Ｍ４２５染色によって区別されるとおり、ＥＧＦＲの局在化と対照させた場合に、多価メディトープおよびメディトープ利用可能抗体の細胞内残留はより顕著であった。クラスリンコーティングされたベシクルを形成しないと（Ｄｙｎａｓｏｒｅの存在下で）、より少ないセツキシマブが形質膜上に見られた。効果はまた、ＥＧＦＲからのセツキシマブの分離を示し得る。Ｍ４ＦＣの形質膜会合はすでに、セツキシマブよりも弱く、ダイナミン遮断は、より顕著な細胞内存在をもたらした。
【０４３６】
合わせて、これらのデータは、標的細胞に薬物を効果的に放出するために、多価メディトープをイメージング剤、治療剤、および／または細胞傷害剤、例えば、細胞毒素などの薬剤とコンジュゲートすることができることを示している。これらのデータは、多価メディトープをメディトープ利用可能抗体と組み合わせて使用すると、腫瘍特異的なそのような抗原を包含する、ＣＥＡなどの長い寿命を有する受容体抗原、非内部移行性抗原、または低速内部移行性抗原の内部移行を誘導することができることを示している。
【実施例５】
【０４３７】
８３Ｅメディトープ利用可能抗体を使用しての結合研究
様々な技術を使用して、メディトープ利用可能抗体のＶＨ領域における残基８３を改変する効果を試験した。下記で論述するとおり、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングの使用、さらには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ結合研究は、メディトープ利用可能抗体に対する、メディトープ結合親和性を増加させるメディトープ結合性ポケットのこの改変の能力を実証した。
【０４３８】
Ｉ８３Ｅ変異トラスツズマブメディトープ利用可能抗体の結晶構造のグラフ表示を、ＶＬの８３位にイソロイシンを有するメディトープ利用可能抗体トラスツズマブ、バージョン１の上に重ね合わせた。抗体をメディトープ利用可能にするために成されたアミノ酸置換は、標的抗体のバックボーン、または抗体フラグメントの現在の形態を著しく改変することはできなかった。
【０４３９】
モデルは、８３位の残基をイソロイシンからグルタマートに変える効果を例示している。グルタマート側鎖は、メディトープとの静電結合を形成すると考えられる。この相互作用は大部分埋れているので、誘電性は、約４（タンパク質の内部）から８０（平均水誘電性）の範囲と予測される。２つの電荷の間の力は、ｑ１×ｑ２×Ｒ／４×ｐｉ×ｅ×ｒ｜Ｒ｜＾２であり、式中、Ｒは、２つの電荷の間のベクトルであり、ｑは、電荷であり、ｅは、誘電性である。Ａｒｇ９位での誘電性は未知であるが、これはおそらく、８０よりもかなり低い。議論のために、これが４であれば、グルタマートとアルギニンとの間の相互作用は、約２０強い。この関係は、下記で論述するとおり、メディトープ利用可能抗体抗体のＩ８３Ｅバージョンとメディトープとの間の親和性の増加を説明し得る。
【０４４０】
Ｉ８３Ｅ修飾を含有するメディトープ利用可能抗体へのメディトープの結合を、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）およびＩ８３Ｅ修飾を有するメディトープ利用可能抗体ペルツズマブを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合研究において次で試験した。ＳＰＲセンサーグラムは、メディトープＣＱＦＤＬＳＴＲＲＬＫＣ（配列番号１）と固定化ペルツズマブＩ８３Ｅ  ＩｇＧとの結合相互作用を示した。濃度を、約１０ｕｍから１５６ｎＭまで２倍希釈した。データは、実際に、Ｋｄをデータにフィットさせることができないほど高い、高いＫｄを示す。観察された長期のオフレートのために、実験のさらなる最適化が必要とされるであろう。
【０４４１】
次の研究では、Ｉ８３Ｅ修飾を有するメディトープ利用可能抗体ＵＣＨＴ１抗体の結合を、この置換を有さないＵＣＨＴ１抗体と比較した。健康なドナーのＰＢＭＣから濃縮したＴ細胞をＲＰＭＩ完全培地中で終夜培養した。細胞を収集し、１ｕｇの親ＵＣＨＴ１（メディトープ使用不可能）またはメディトープ利用可能ＵＣＨＴ１を細胞に４℃で１５分間添加した。細胞をＰＢＳ＋２％ＢＳＡで洗浄し、次いで、ＡｌｅｘａＦ−６４７標識されたメディトープで４℃で３０分間染色した。細胞を洗浄し、ＤＡＰＩ溶液中に再懸濁させた。サンプルをＣＹＡＮ機器に流し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。細胞を、ＤＡＰＩ-リンパ球でゲーティングした。結果は、２種の異なる細胞種における明らかなシグナルシフトによって実証されるとおり、残基８３をグルタマートに変えることによる抗体におけるメディトープ結合性部位の改変が、抗原結合にマイナスの影響を及ぼさないことを実証している。
【実施例６】
【０４４２】
メディトープ利用可能抗体Ｍ５Ａ抗ＣＥＡ抗体を使用する受容体細胞内取り込み作用
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、結腸直腸癌などの癌のための腫瘍マーカーであり、莫大な量の研究の焦点となっている。この実施例では、８３Ｅ改変を含有するメディトープ利用可能抗体である抗ＣＥＡ抗体（Ｍ５Ａ）を結合親和性のために使用した。
【０４４３】
ヒトＣＥＡ産生結腸腫瘍細胞系であるＬＳ１７４Ｔ細胞を、抗体結合を研究するために使用した。ＬＳ１７４Ｔ細胞をトリプシン処理し、４０μｍフィルターで濾過して、デブリを除去し、次いで、２００ｇで５分間回転させた。細胞培地を除去し、細胞を０．３％ＢＳＡ−ＰＢＳ１ｍｌで洗浄した。約１×１０6細胞を各処理で使用し、洗浄緩衝液１００μｌ中で再懸濁させ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−コンジュゲートしたＭ５Ａ  ｍＡｂを、１００ｎＭの最終濃度まで添加し、室温で約５分間インキュベートした。次いで、各処理を２つに分割し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−Ｍ４ＦＣまたはＭＦＣのいずれかを２５０ｎＭの最終濃度まで添加し、サンプルを約１５分間さらにインキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞を１回洗浄し、死細胞を排除するためにＳＹＴＯＸブルーを補充された緩衝液１ｍｌ中に再懸濁させた。
【０４４４】
細胞を、初めに前方側方散乱光（ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）で、次いで、ＳＹＴＯＸブルーでゲーティングした。
【０４４５】
メディトープの結合は、ＳＰＲによる親和性測定と相関し、バインダーが緊密なほど、メディトープと結合した細胞が多いことを示す。さらに、四価メディトープの比較的高い価が、１３Ｍと１３Ｍ（Ｉ８３Ｅ）との間の親和性の差異をもたらすことが分かり得る。これらの結果は、多価メディトープの使用が、メディトープについて比較的低い親和性を有するメディトープ利用可能抗体抗体の結合特徴を改善し得ることを示している。
【実施例７】
【０４４６】
表面受容体架橋用途のためのヘテロ−二価ＭＰＬ：アフィボディ融合タンパク質
疾患を検出するための目的の他のタンパク質に加えて、これらだけに限定されないが、ＨＥＲ２およびＩＧＦ１Ｒを包含する表面細胞受容体に結合するいくつかの修飾されたブドウ球菌プロテインＡ変異体が存在する。これらは、脱免疫化されていて、組織イメージング用途のために、より大きく、より高価なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびｍＡｂフラグメントの代わりとして開発中である小さなタンパク質である。この技術の非限定的例を、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０年４月３０日；３９８（２）：２３２〜４７；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０年８月２４日；１０７（３４）：１５０３９〜４４；Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０年９月１日；１１（６）：５８１〜９；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１１年４月；２４（４）：３８５〜９６；およびＥｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ．２０１３年２月；４０（３）：４３９〜４９において見出すことができる。
【０４４７】
これらのアフィボディタンパク質のいくつかを用いて、メディトープ利用可能抗体（メディトープ利用可能抗体）を、ｍＡｂのみを使用してもアクセス不可能な幾何学的配置を介して他の表面細胞受容体に連結するために、メディトーププロテインＬ（ＭＰＬ）の融合タンパク質が、細胞表面タンパク質クラスター化を促進するためのツールとして開発されている。次のアフィボディ融合タンパク質が生成された：
−ＭＰＬ−ｚＨＥＲ２（抗ヒト上皮性成長因子受容体アフィボディ）
−ｚＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬ（抗インスリン成長因子受容体アフィボディ）
【０４４８】
Ａ．  材料／方法
ＤＮＡコンストラクト
Ｈｉｓ６−ＳＭＴ−ＭＰＬ−ｚＨＥＲ２コード配列を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから、ｐｅｔ２８ｂ＋修飾ベクターにおいて、配列番号２３２（核酸）および配列番号２３３（アミノ酸）において示されているとおりに配列させた。Ｈｉｓ６−ＳＭＴ３タグを除去するためのＵＬＰ１プロテアーゼ切断ステップの結果として、Ｎ末端Ｓ残基が、最終精製タンパク質上に存在する。
【０４４９】
ｚＩＧＦ１Ｒ-ＭＰＬ
ｚＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬを、ＤＮＡ２．０から、ＰＪ４１１ベクターにおいて無タグコンストラクトとして配列させた。核酸配列は、配列番号２３４において示されており、アミノ酸配列は、配列番号２３５において示されている。
【０４５０】
Ｂ．  タンパク質発現／精製
Ｈｉｓ６−ＳＭＴ３−ＭＰＬ−ｚＨＥＲ２
プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、Ｋａｎ  ＬＢ寒天プレート上に終夜、３７℃で播種した。単一コロニーを選択し、スターター培養物としてＫａｎを含むＬＢ培地５０ｍＬ中で一晩、大規模発現のために成長させた。２Ｌシェーカーフラスコ内でＫａｎを含むＬＢ１Ｌに接種するために、終夜培養物１０ｍＬを使用した。約０．６のＯＤ６００値が達成されるまで、フラスコを３７℃で振盪した。タンパク質発現を１Ｍ  ＩＰＴＧ２００μＬで誘導し、培養を４時間振盪し続けた。次いで、細胞を遠心によって採取し、１倍ＰＢＳ緩衝液  ｐＨ７．４中に再懸濁させた。精製するまで、細胞を−２０℃で凍結させた。
【０４５１】
精製の前に、細胞を室温に解凍し、フレンチプレッシャーセルによって溶解させた。細胞溶解産物を４℃、４５分間、４５，０００ｒｐｍでの遠心によって清澄化した。アフィニティークロマトグラフィー精製の前に、細胞溶解産物を濾過した。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを、洗浄および溶離のためにＰＢＳおよびイミダゾール勾配を使用する当初の精製のために使用した。溶離されたタンパク質を、ＰＢＳに透析しながら、ＵＬＰ１酵素を１０ｍＭ  ＤＴＴと共に用いて４℃で終夜切断した。次いで、終夜透析したタンパク質を逆Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによってさらに精製した。次いで、カラム通過画分および洗浄液を濃縮し、最終精製のために、分取グレードＳ７５ゲル濾過カラムに施与した。最終材料を濃縮し、小さな体積に分取し、凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０４５２】
ｚＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬ
プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、Ｋａｎ  ＬＢ寒天プレート上に終夜、３７℃で播種した。単一コロニーを選択し、スターター培養物としてＫａｎを含むＬＢ培地５０ｍＬ中で一晩、大規模発現のために成長させた。２Ｌシェーカーフラスコ内でＫａｎを含むＬＢ１Ｌに接種するために、終夜培養物１２ｍＬを使用した。約０．６のＯＤ６００値が達成されるまで、フラスコを３７℃で振盪した。タンパク質発現を１Ｍ  ＩＰＴＧ２００μＬで誘導し、培養を４時間振盪し続けた。次いで、細胞を遠心によって採取し、１倍ＰＢＳ緩衝液  ｐＨ７．４中に再懸濁させた。精製するまで、細胞を−２０℃で凍結させた。
【０４５３】
精製の前に、細胞を室温に解凍し、フレンチプレッシャーセルによって溶解させた。硫酸アンモニウムを添加し（３０％ｍ／ｖ）、溶解産物を磁気撹拌棒によって４℃で１時間撹拌した。タンパク質溶液を、３４００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清およびペレットを慎重に分離した。ペレットをＰＢＳ２０ｍＬに再懸濁させ、２．５時間後に１回緩衝液を交換して一晩透析した。透析した材料を濃縮し、最終精製のために、分取グレードＳ７５ゲル濾過カラムに施与した。最終材料を濃縮し、小さな体積に分取し、凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０４５４】
Ｃ．  結合アッセイ：
メディトープ利用可能トラスツズマブ（融合タンパク質のＭＰＬ部分を介して）および、融合タンパク質のｚＨＥＲ２アフィボディ部分を介してのＨＥＲ２の両方とのＭＰＬ−ｚＨＥＲ２結合相互作用を、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によってモニターした。非常に安定な相互作用の長いオフレートによって、結合親和性を計算するために、追加の最適化が必要なことがある。
【０４５５】
ＳＰＲを、泳動緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋を使用して２５℃で実施した。メディトープ利用可能抗体トラスツズマブまたはＨＥＲ２の細胞外部分のいずれかをＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリングを使用する一連のＳ  ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。分析物タンパク質（ＭＰＬ−ｚＨＥＲ２またはｚＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬ）の２倍希釈物を固定化表面上に３０μＬ／分の流速で流した。
【０４５６】
ＳＥＣ結合アッセイを、４℃で、分析用ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラムで、ＰＢＳ緩衝液中で実施した。初めに、種々の比のメディトープ利用可能抗体トラスツズマブＩｇＧおよびｚＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬを、装填する前に、氷上で３０分間事前インキュベートした。ＭＰＬ−ｚＨＥＲ２と固定化メディトープ利用可能トラスツズマブＩｇＧとの相互作用を示すＳＰＲセンサグラムを生成した。ＭＰＬ−ｚＨＥＲ２と固定化ＨＥＲ２の結合相互作用を示すＳＰＲセンサグラムも生成した。
【０４５７】
メディトープ利用可能トラスツズマブとのｚＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬ結合相互作用
ｚＩＧＦ１Ｒ−ＭＰＬと固定化メディトープ利用可能トラスツズマブとの相互作用のＳＰＲセンサグラムは、０．９３ｎＭの計算ＫDをもたらした。
【実施例８】
【０４５８】
メディトープ利用可能抗体／メディトープ−Ｆｃ架橋を使用する抗体内部移行の増加
Ａ．  抗体生成
配列番号２２４を含む軽鎖および配列番号２２５を含む重鎖を有するメディトープ利用可能ゲムツズマブ抗体を、遺伝子導入されたＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で生成した。細胞をＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養した。遺伝子導入の日に、細胞を収集し、３００ｇで５分間、室温で遠心して、１ｍｌ当たり１．１×１０6細胞の最終濃度を得た。
【０４５９】
遺伝子導入のためのＤＮＡを、次のとおりに調製した：内毒素非含有発現プラスミド１μｇを、Ｏｐｔｉｍｅｍ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に添加して、遺伝子導入体積各１ｍｌにつき３３．５μｌの総体積にした。別に、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（商標）１．３３μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、遺伝子導入体積各１ｍｌにつきＯｐｔｉｍｅｍ培地３２．１７μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に室温で添加し、穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡ混合物および２９３Ｆｅｃｔｉｎ（商標）混合物を合わせ、混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートした。
【０４６０】
ＤＮＡ遺伝子導入混合物を、シェーカーフラスコ内のＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に、細胞１ｍｌ当たり遺伝子導入混合物６７μｌの比で添加した。遺伝子導入された細胞を１２５ＲＰＭ、湿度８５％、ＣＯ2８％、および３７℃で４〜６日間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、３０００ｇで１０分間遠心した。上清を遠心された細胞から収集し、０．２２ミクロンフィルターを使用して滅菌した。フロースルーを滅菌２０ｍＭヒスチジン＋５％スクロース緩衝液中、４℃、分光測光法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）によって分析して５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で貯蔵した。インタクトな抗体の生成を、標準的なタンパク質ゲル上での可視化によって確認した。
【０４６１】
Ｂ．  抗体標識
メディトープ利用可能ゲムツズマブ抗体を、製造者の指示に従ってｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ  ＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で標識した。ｐＨｒｏｄｏ（商標）色素は、ｐＨ感受性であり；その蛍光は、ｐＨが低下するにつれて上昇する。したがって、ｐＨｒｏｄｏ（商標）標識された抗体の蛍光の定量化によって、抗体細胞内取り込み作用の比率が示される。簡単には、ｐＨｒｏｄｏ（商標）を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で調製して、色素の２〜５μＭの最終濃度を達成した。抗体２ｍｇをｐＨ９のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍＬに溶かした。次いで、蛍光プローブを５０ｕｌ刻みで４回、抗体溶液にゆっくり添加し、各添加で１５分間、振盪しながら室温でインキュベートした。メディトープ−Ｆｃタンパク質（配列番号２３６）を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識した。
【０４６２】
Ｃ．  蛍光顕微鏡
ヒト前骨髄球性白血病細胞系であるＨＬ−６０細胞を、蛍光顕微鏡のために染色して、ｐＨｒｏｄｏ（商標）標識抗体の受容体媒介性細胞内取り込み作用比率を決定した。細胞を、Ｎｕｎｃ（登録商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩチャンバー化８ウェルカバーガラスポリスチレンチャンバー（０．７ｃｍ2／ウェル）内で染色した。細胞を、１００ｎＭ抗体および１００ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（登録商標）標識メディトープ−Ｆｃか、または１００ｎＭ抗体のみ（対照）のいずれかを使用して３０分間、３７℃で、血清非含有培地中で染色した。ＨＬ−６０細胞の核も、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（２μｇ／ｍＬ最終濃度で２０分間）で染色した。
【０４６３】
適切な時点で、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定する前に、カバーガラスを氷冷ＢＳＡ／ＰＢＳ中で洗浄した。その後、ウェルをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）上に載せた。細胞を共焦点顕微鏡で、ｐＨｒｏｄｏ（商標）標識抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識されたメディトープ−Ｆｃ、およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２標識核のために適切な波長設定を使用してイメージングした。Ｚセクショニングは、内部移行した物質の可視化を可能にし、すべての定量的測定を同じ規定のセクション高さで行った。イメージングされた細胞（ｎ＝９）の各染色内部および外部の総蛍光を、３０分の単一時点でＩｍａｇｅＪ分析を使用して計算した。ゲムツズマブのみでの総染色は、６６０４．５７±４６３．９５と計算された。メディトープ−Ｆｃに結合したゲムツズマブでの総染色は、１１６１１．８３±１１４０．４４と計算され、ＨＬ−６０細胞が、メディトープ−Ｆｃに結合した抗体を、抗体のみのほぼ２倍の比率で内部移行させたことを示している（ｐ＝２．４４Ｅ−０８）。
【実施例９】
【０４６４】
メディトープ利用可能抗体／メディトープ−Ｆｃ架橋を使用しての抗体内部移行の増加
Ａ．  抗体生成
配列番号２２６を含む軽鎖および配列番号２２７を含む重鎖を有するメディトープ利用可能ＭＯＲ２０８抗体を、上記のとおりの遺伝子導入されたＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）において生成した。
【０４６５】
Ｂ．抗体標識
ヒトリンパ芽球、ＣＣＬ−８６（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）に由来するヒトＢリンパ球細胞系であるＲａｊｉ−Ｂ細胞を、蛍光顕微鏡法のために染色して、ｐＨｒｏｄｏ（商標）標識ＣＤ−１９抗体の受容体媒介性細胞内取り込み作用比率を決定した。細胞を、Ｎｕｎｃ（登録商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩチャンバー化８ウェルカバーガラスポリスチレンチャンバー（０．７ｃｍ2／ウェル）内で染色した。細胞を、１００ｎＭ抗体および１００ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（登録商標）標識メディトープ−Ｆｃか、または１００ｎＭ抗体のみ（対照）のいずれかを使用して３０分間、３７℃で、血清非含有培地中で染色した。Ｒａｊｉ−Ｂ細胞の核も、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（２μｇ／ｍＬ最終濃度で２０分間）で染色した。
【０４６６】
細胞を共焦点顕微鏡で、ｐＨｒｏｄｏ（商標）標識された抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識されたメディトープ−Ｆｃ、およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２標識核のために適切な波長設定を使用してイメージングした。Ｚセクショニングは、内部移行した物質の可視化を可能にし、すべての定量的測定を同じ規定のセクション高さで行った。細胞を可視化し、各可視化事象での各時点で定量化した。イメージングされた細胞の各染色内部および外部の総蛍光を、３０分の単一時点でＩｍａｇｅＪ分析を使用して計算した。ＭＯＲ−２０８のみでの総染色は、１７９７．７１±１９４．９７（ｎ＝８）と計算された。メディトープ−Ｆｃに結合したＭＯＲ−２０８での総染色は、４４３０．４３±６３２．５９（ｎ＝８）と計算された。結果は、Ｒａｊｉ−Ｂ細胞が、メディトープ−Ｆｃに結合したＭＯＲ２０８抗体を、抗体のみの比率のほぼ２倍の比率で内部移行させることを実証している（ｐ＝３．９４Ｅ−０３）。
【実施例１０】
【０４６７】
多価メディトープ細胞標識
Ａ．  多価メディトープ生成
二価メディトープ（ＢＶＭ）および三価メディトープ（ＴＶＭ）を、Ｎ末端Ｈｉｓ６−ＳＭＴ３−ＴＶＭタグ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を有するｐＥＴ２８ｂ＋プラスミドにおいてコドン最適化遺伝子から発現させた。ＢＶＭは、配列番号２２８の核酸配列および配列番号２２９のペプチド配列を有した。ＴＶＭは、配列番号２３０の核酸配列および配列番号２３１のペプチド配列を有した。
【０４６８】
タンパク質発現のために、プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換した。テリフィックブロス（ＴＢ）およびカナマイシン（Ｋａｎ）中の終夜培養物を、ＴＢ／Ｋａｎの１Ｌ培養物に接種するために使用し、これは、Ｏ．Ｄ．６００＝０．５〜０．６であり、そこまで成長させた。培養物を５００μＭの最終濃度のＩＰＴＧで誘導し、シェーカー上、１８℃で終夜、または３７℃で４時間成長させた。細胞を、４０００ｒｐｍでの遠心によって４℃で３０分間採取した。培養上清を廃棄し、細胞を３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、精製するまで−２０℃で凍結させた。
【０４６９】
細胞を、ＤＮＡＳＥ１およびＰＭＳＦを用いてフレンチプレッシャーセルによって溶解させた。溶解産物を４５，０００ｒｐｍでの遠心によって４℃で３０〜４５分間清澄化した。タンパク質を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。次いで、Ｈｉｓ６−ＳＭＴタグをＨｉｓ６−ＵＬＰ１によって切断し、続いて、逆ＩＭＡＣによって分離した。逆カラム通過画分および洗浄液を濃縮し、ＨｉＬｏａｄ分取７５  ２６／６００  ＰＧゲル濾過カラム（ＧＥ）に施与した。両方のタンパク質での代表的なクロマトグラムが図１６Ａ（ＴＶＭ）および図１６Ｂ（ＢＶＭ）において示されている。２８０ｎｍ、２３０ｎｍ、および２６０ｎｍでの吸光度測定が示されている。さらなる分析のために、画分２１〜２３をＴＶＭのために選択し、画分２６〜２９をＢＶＭのために選択した。
【０４７０】
選択した画分のＳＰＲ分析は、ＢＶＭおよびＴＶＭがメディトープ利用可能抗体トラスツズマブ抗体に結合したことを示した（それぞれ図１７Ａおよび図１７Ｂ）。ＴＶＭ生成物を、ＨＰＬＣによって確認した（図１８Ａ）。図１８Ａの４．２分での主要なピークは、正確な単量体ＴＶＭ分子量であり、５．３分でのピークは、二量体である。主なピークを含有する画分を、質量分析によって分析した（図１８Ｂ）。
【０４７１】
Ｂ．  顕微鏡法
ＴＶＭを、製造者プロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）に従って、ＮＨＳ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識した（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０、室温で１時間）。実施例２において記載したとおり、標識されたＴＶＭを、ＳＫＢＲ３細胞、ＨＴＢ−３０（商標）ＡＴＣＣ（登録商標）に、メディトープ利用可能抗体トラスツズマブまたは親トラスツズマブと共に添加した。
【０４７２】
メディトープ利用可能抗体トラスツズマブで標識された細胞は、正常な形態を示し、プレートに結合したままであった。対照的に、メディトープ利用可能抗体トラスツズマブおよび三価メディトープで標識された細胞は、丸まった形態を示し、多くの場合に、カバーガラスの表面から分離した。イメージングされ得たメディトープ利用可能抗体トラスツズマブおよび三価メディトープで標識された細胞は、細胞の周囲に沿って、ＴＶＭ−ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７に対応する蛍光を示した。形態のこの変化は、親トラスツズマブおよび三価メディトープでは観察されず、形態の変化および細胞の分離が、多価メディトープとメディトープ利用可能抗体との併用処理によるものであったことを示した。
【実施例１１】
【０４７３】
メディトープ−薬物コンジュゲートの細胞毒性作用の評価
メディトープ利用可能抗体、および細胞毒素にコンジュゲートした多価メディトープと共にインキュベートした後の細胞に対する細胞毒性作用を評価する。二価メディトープＦｃ（ＭＦＣ）および上記の四価メディトープ−Ｆｃ（Ｍ４ＦＣ）をオーリスタチンにコンジュゲートする。
【０４７４】
ＨＬ−６０細胞を、９６ウェル組織培養プレートに１０００細胞／ウェルの密度で播種する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートする。翌日、細胞を次の条件下で３連でインキュベートする：１）非染色対照；２）メディトープ利用可能ゲムツズマブ抗体のみ；３）未標識ＭＦＣを伴うメディトープ利用可能ゲムツズマブ抗体；および４）オーリスタチンにカップリングしたＭＦＣを伴うメディトープ利用可能ゲムツズマブ抗体。細胞を６日間培養する。インキュベート期間の終了時に、Ａｌａｍａｒ  ＢｌｕｅまたはＰｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ１２μｌを各ウェルに添加し、４時間インキュベートする。プレートを、５４０励起および５９０発光波長を用いるＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４プレートリーダーを使用して読み取る。
【０４７５】
次いで、細胞生存パーセンテージを各ウェルにおいて計算し、データを、シグモイド用量応答の非線形フィッティングを使用して分析する。ＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍグラフ作成ソフトウェアを使用して計算し、オーリスタチンにカップリングしたＭＦＣを伴うメディトープ利用可能ゲムツズマブ抗体の細胞毒性作用を、実験において使用した対照と比較した。
【０４７６】
データは、オーリスタチンにカップリングしたＭＦＣを伴うメディトープ利用可能化ゲムツズマブ抗体がＨＬ−６０細胞において細胞毒性を誘導することを示している。したがって、結果は、オーリスタチン細胞毒素にカップリングしたＭＦＣを伴うメディトープ利用可能ゲムツズマブ抗体が細胞傷害薬をＨＬ−６０細胞に選択的に送達し得ることを実証している。
【実施例１２】
【０４７７】
多価メディトープ価の試験
多価メディトープ結合を、様々なリガンド密度に対して試験して、価を決定した。
【０４７８】
メディトープ利用可能トラスツズマブバージョン２（配列番号６の軽鎖および配列番号９の重鎖）をＣＭ５チップ上に、アミンカップリング化学（ＥＤＣ／ＮＨＳ）を使用して様々な密度で固定した。低密度チャネルは約１５０ＲＵであり（図１９Ａ）、中密度チャネルは約７５０ＲＵ（図１９Ｂ）であり、高密度チャネルは約１５００ＲＵであった（図１９Ｃ）。
【０４７９】
三価メディトープ（ＴＶＭ）（配列番号２３１）濃度を５倍希釈列として、ＨＢＳ−ＥＰ＋中で１μＭから２．６ｐＭまで調製した。サンプルを３０μＬ／分、３７℃で、４つのチャネルすべての上に流した。センサグラムは、チャネル１上にあり、２つの「０」濃度緩衝液ブランクを有するブランク固定を二重に参照した（ｄｏｕｂｌｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）。
【０４８０】
対照メディトープペプチドを実験の開始時および終了時に流して、実験中の表面活性の低下を評価した。実験が完了した後に、最も密なリガンド表面で、シグナルの５％未満の低下が観察された。実験のための再生緩衝液は、２〜１０秒の変動時間での１０ｍＭグリシンｐＨ３．０のパルスであり、泳動緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋の３０秒パルスが続いた。
【０４８１】
１：１フィットモデルを用いるＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、データフィットを行った。リガンドの表面密度が上昇するにつれて、１：１結合モデルに対するデータフィット品質は低下し、オフレートは、曲率の欠如によって、十分に決定されなかった。データを表５において示す。
【０４８２】
【表５】
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【０４８３】
データは、メディトープ利用可能抗体の密度が上昇するにつれて、１個よりも多いメディトープ利用可能抗体に結合する個々の多価メディトープの数が増加することを示している。密度が上昇するにつれて、チップ上の個々のメディトープ利用可能抗体間の距離が縮まる。したがって、２個以上の抗体が、単一多価メディトープのリーチ内にあるチャンスが増加し、より多い多価結合が予測される。
【０４８４】
この効果が観察された。データは、リガンド密度が上昇するにつれて、１：１フィットからの偏差の増加を示したが、これは、結合活性を示す（図２０）。低密度表面で計算された解離定数は、３８ｎＭであると予め計算された一価メディトープに匹敵するが、反応速度定数は異なる。３７℃での一価メディトープの半減期は、４．７分であり、最も高密度に固定化された表面上の三価メディトープで計算された半減期は、１４５分であり；＞３０倍の改善である。より高い密度でのデータは、価の増加およびより長期のオフレートを示す。データは、多価メディトープがリガンド密度の増加に対応して多価結合し得ることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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