(57)【要約】哺乳動物、好ましくヒトにおけるフレイルを治療する方法および組成物が提供される。この方法は概して、例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの投与により、γ−カルボキシラーゼおよびオステオカルシンに関与するＯＳＴ−ＰＴＰシグナル伝達経路またはＰＴＰ−１Ｂシグナル伝達経路の調節を含む。この方法は、筋肉疲労または肺障害の少なくとも１つを軽減しながら、同時にまた、代謝障害、男性生殖障害または認知障害の少なくとも１つを軽減することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンおよび薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬組成物を、フレイルを患っている患者に投与することを含む、フレイルを治療する方法。
【請求項２】
（ａ）筋肉疲労または（ｂ）肺障害の少なくとも１つを軽減しながら、同時に（ｃ）代謝障害、（ｄ）男性生殖障害または（ｅ）認知障害の少なくとも１つを軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも（ａ）筋肉疲労、および（ｃ）代謝障害、（ｄ）男性生殖障害または（ｅ）認知障害の少なくとも１つを軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも（ｂ）肺障害、および（ｃ）代謝障害、（ｄ）男性生殖障害または（ｅ）認知障害の少なくとも１つを軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｃ）代謝障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｄ）男性生殖障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｅ）認知障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも（ｂ）肺障害および（ｃ）代謝障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも（ｂ）肺障害および（ｄ）男性生殖障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも（ｂ）肺障害および（ｅ）認知障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｃ）代謝障害、（ｄ）男性生殖障害または（ｅ）認知障害の少なくとも１つを軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｃ）代謝障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｄ）男性生殖障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｅ）認知障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）筋肉疲労、（ｂ）肺障害、（ｃ）代謝障害、（ｄ）男性生殖障害、および（ｅ）認知障害を軽減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が少なくとも５５歳であるヒトである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記オステオカルシンが低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記オステオカルシンがヒトオステオカルシンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記オステオカルシンが完全に非カルボキシル化ヒトオステオカルシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンが、
（ａ）Ｃ末端から最後の１０アミノ酸を欠失している成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
（ｂ）Ｎ末端から最初の１０アミノ酸を欠失している成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸６２〜９０を含む断片、
（ｄ）成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸１〜３６を含む断片、
（ｅ）成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸１３〜２６を含む断片、
（ｆ）成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸１３〜４６を含む断片、および
（ｆ）上記の変異体
からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ヒトにおけるフレイルを治療するための医薬を製造するための低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／０８１，８６１号からの優先権を主張し、その開示はその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の利益の声明
本発明は、国立衛生研究所によって認められた付与番号Ｒ０１  ＡＲ０４５５４８の下で連邦政府の補助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、哺乳動物における加齢に伴う障害を治療するための方法に関する。このような障害としては、代謝障害、男性生殖障害、認知障害、筋肉疲労、および肺障害が挙げられる。
【背景技術】
【０００４】
非常に少数の骨芽細胞特異的タンパク質の１つであるオステオカルシンはホルモンのいくつかの特徴を有する。例えば、それはプレプロ分子（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）として合成され、全身循環において分泌される（非特許文献１、非特許文献２）。それらの精巧な細胞特異的発現のために、オステオカルシン遺伝子は、骨芽細胞特異的転写因子を同定し、骨生理学の分子基礎を定義するために集中的に研究されている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００５】
オステオカルシンは、石灰化した骨マトリクスに伴って見出されている最も豊富にある非コラーゲン性タンパク質であり、それは現在、骨代謝回転の臨床的評価のための生物学的マーカーとして使用されている。オステオカルシンは、その一次構造において３つのγ−カルボキシル化グルタミン酸残基を含有する小さい（４６〜５０アミノ酸残基）骨特異的タンパク質である。オステオカルシン（ギリシャ語で骨に関するオステオ（ｏｓｔｅｏ）；ラテン語で石灰塩に関するカルシ（ｃａｌｃ）、タンパク質に関するイン（ｉｎ））という名称は、Ｃａ２＋に結合するタンパク質の能力および骨におけるその存在度に由来する。オステオカルシンは特有の翻訳後修飾を受け、それによりグルタミン酸残基がカルボキシル化して、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基を形成する。それ故、オステオカルシンの他の名称は骨Ｇｌａタンパク質である（非特許文献１）。
【０００６】
成熟ヒトオステオカルシンは５，８００ｋＤａの予測分子量である４９アミノ酸を含有する（非特許文献５）。オステオカルシンは、主に骨芽細胞および象牙芽細胞（ｏｎｄｏｎｔｏｂｌａｓｔ）によって合成され、骨の非コラーゲン性タンパク質の１５〜２０％を含む。非特許文献５は、成熟オステオカルシンが、グルタミン酸残基の翻訳後ビタミンＫ依存性修飾によって形成される３つのカルボキシグルタミン酸残基を含有することを示した。カルボキシル化Ｇｌａ残基は、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４にある。いくつかのヒトオステオカルシンは２つのみのＧｌａ残基を含有することが示されている（非特許文献６）。
【０００７】
オステオカルシンはホルモンのいくつかの特徴を有する。非特許文献７は、高齢のオステオカルシン欠損マウス由来の石灰化した骨が野生型のものより２倍厚くなったことを実証した。オステオカルシンの不在は、骨吸収を損なわずに骨形成の増加を生じ、石灰化に影響を与えなかったことが示された。ヒトオステオカルシンの多発性免疫反応性形態が循環（非特許文献８）およびまた尿（非特許文献９）中に発見されている。ヒトオステオカルシンの断片は、骨マトリクスの破骨細胞分解の間に、または骨芽細胞による合成後の循環タンパク質の異化分解の結果として産生され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｕｓｃｈｋａら、１９８９、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗ  ６９：９９０−１０４７
【非特許文献２】Ｐｒｉｃｅ、１９８９、Ｃｏｎｎｅｃｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２１：５１−５７（ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ５７−６０）
【非特許文献３】Ｄｕｃｙら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１５０１−１５０４
【非特許文献４】Ｈａｒａｄａ  ＆  Ｒｏｄａｎ、２００３、Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：３４９−３５５
【非特許文献５】Ｐｏｓｅｒら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：８６８５−８６９１
【非特許文献６】Ｐｏｓｅｒ  ＆  Ｐｒｉｃｅ、１９７９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４３１−４３６
【非特許文献７】Ｄｕｃｙら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：４４８−４５２
【非特許文献８】Ｇａｒｎｅｒｏら、１９９４、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９：２５５−２６４
【非特許文献９】Ｔａｙｌｏｒら、１９９０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．７０：４６７−４７２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、加齢に伴うフレイルを治療する方法を提供する。本明細書で使用する場合、「フレイル（ｆｒａｉｌｔｙ）」とは、ヒトが加齢すると頻繁に生じる複合的な障害を指す。フレイルは加齢に伴う以下の障害または状態のうちの少なくとも２つ以上によって特徴付けられる：（ａ）筋肉疲労；（ｂ）ぜんそく、気管支炎または慢性閉塞性肺疾患などの気管支収縮に関与する肺障害；（ｃ）メタボリックシンドローム、耐糖能異常、１型糖尿病、２型糖尿病、アテローム性動脈硬化症または肥満などの代謝障害；（ｄ）男性不妊、精子数の低下、精子運動性障害、精子生存率低下、低いテストステロンレベル、性欲減衰、勃起障害、精巣の発育不足または精巣の過剰なアポトーシスなどの男性生殖障害；（ｅ）加齢に伴う神経変性に起因する認知喪失（不安症、鬱病、記憶喪失または学習困難を含み得る）などの認知障害。
【００１０】
いくつかの実施形態において、フレイルは、（ａ）筋肉疲労または（ｂ）ぜんそく、気管支炎または慢性閉塞性肺疾患などの気管支収縮に関与する肺障害を含む。このような実施形態において、フレイルはまた、（ｃ）メタボリックシンドローム、耐糖能異常、１型糖尿病、２型糖尿病、アテローム性動脈硬化症または肥満などの代謝障害；（ｄ）男性不妊、精子数の低下、精子運動性障害、精子生存率低下、低いテストステロンレベル、性欲減衰、勃起障害、精巣の発育不足または精巣の過剰なアポトーシスなどの男性生殖障害；または（ｅ）加齢に伴う神経変性に起因する認知喪失（不安症、鬱病、記憶喪失または学習困難を含み得る）などの認知障害のうちの１つ以上を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、フレイルは、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）ぜんそく、気管支炎または慢性閉塞性肺疾患などの気管支収縮に関与する肺障害、ならびに任意に（ｃ）メタボリックシンドローム、耐糖能異常、１型糖尿病、２型糖尿病、アテローム性動脈硬化症または肥満などの代謝障害；（ｄ）男性不妊、精子数の低下、精子運動性障害、精子生存率低下、低いテストステロンレベル、性欲減衰、勃起障害、精巣の発育不足または精巣の過剰なアポトーシスなどの男性生殖障害；または（ｅ）加齢に伴う神経変性に起因する認知喪失（不安症、鬱病、記憶喪失または学習困難を含み得る）などの認知障害のうちの１つ以上を含む。
【００１２】
治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物を、フレイルを患っている患者に投与することを含む、フレイルを治療する方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、方法は、上記の（ａ）または（ｂ）の少なくとも１つ、すなわち、筋肉疲労または肺障害の少なくとも１つを軽減しながら、同時に上記の（ｃ）〜（ｅ）の少なくとも１つ、すなわち、代謝障害、男性生殖障害または認知障害を軽減することを含む。
【００１３】
本明細書に開示されるフレイルを治療する方法のいくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｃ）〜（ｅ）の代謝障害、男性生殖障害または認知障害の少なくとも１つを軽減することを含む。本明細書に開示されるフレイルを治療する方法のいくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ｂ）肺障害および（ｃ）〜（ｅ）の代謝障害、男性生殖障害または認知障害の少なくとも１つを軽減することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｃ）代謝障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｄ）男性生殖障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｅ）認知障害を軽減することを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ｂ）肺障害および（ｃ）代謝障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ｂ）肺障害および（ｄ）男性生殖障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ｂ）肺障害および（ｅ）認知障害を軽減することを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｃ）〜（ｅ）の代謝障害、男性生殖障害または認知障害の少なくとも１つを軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｃ）代謝障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｄ）男性生殖障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｅ）認知障害を軽減することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労、（ｂ）肺障害、（ｃ）代謝障害、（ｄ）男性生殖障害、および（ｅ）認知障害を軽減することを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、「フレイル」を患っているヒト患者は、少なくとも５５歳である患者である。いくつかの実施形態において、患者は、少なくとも６０、６５、７０、７５または８０歳である。特定の実施形態において、患者は、５５から８０歳、６０から７５歳、または６５から７０歳のヒトである。特定の実施形態において、患者は、５５から６０歳、６５から７０歳、７０から７５歳、７５から８０歳、８０から８５歳、または８５から９０歳のヒトである。
【００１９】
方法の特定の型において、上記に挙げた実施形態における種々の障害は、オステオカルシンの形態、例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物を患者に投与することによって軽減される。いくつかの実施形態において、オステオカルシンはヒトオステオカルシンである。いくつかの実施形態において、オステオカルシンは完全に非カルボキシル化ヒトオステオカルシンである。
【００２０】
本発明はまた、ＯＳＴ−ＰＴＰシグナル伝達経路またはＰＴＰ−１Ｂシグナル伝達経路を調節する薬剤を含む医薬組成物を、フレイルを患っている患者に投与することを含む、患者におけるフレイルを治療する方法であって、その薬剤は、ＯＳＴ−ＰＴＰホスホリラーゼ発現もしくは活性を減少させるか、またはＰＴＰ−１Ｂホスホリラーゼ発現もしくは活性を減少させるか、γ−カルボキシラーゼ発現もしくは活性を減少させるか、または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させる、方法を提供する。特定の実施形態において、薬剤は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。特定の実施形態において、薬剤は、ヒト低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。
【００２１】
特定の実施形態において、薬剤は、ＯＳＴ−ＰＴＰの発現または活性を阻害するか、ＰＴＰ−１Ｂの発現または活性を阻害するか、γ−カルボキシラーゼの発現または活性を阻害するか、γ−カルボキシラーゼのリン酸化を阻害するか、オステオカルシンのカルボキシル化を阻害するか、またはオステオカルシンを脱カルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）する。特定の実施形態において、薬剤は、小分子、抗体または核酸からなる群から選択される。
【００２２】
薬剤が低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである特定の実施形態において、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４に対応する位置において低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンにおけるグルタミン酸の少なくとも１つは、カルボキシル化されない。特定の実施形態において、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４に対応する位置において低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンにおけるグルタミン酸の３つ全ては、カルボキシル化されない。
【００２３】
特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、調製物中の成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４に対応する位置における全Ｇｌｕ残基の約２０％超がカルボキシル化されていない、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの調製物である。特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンおよび成熟ヒトオステオカルシンが最大配列相同性のために並べられた場合、成熟ヒトオステオカルシンと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を共有する。特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンおよび成熟ヒトオステオカルシンが最大配列相同性のために並べられた場合、成熟ヒトオステオカルシンと約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、または約９８％のアミノ酸配列同一性を共有する。特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、成熟ヒトオステオカルシンと１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸が異なる。
【００２４】
特定の実施形態において、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４に対応する位置における低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのグルタミン酸の少なくとも１つは、カルボキシル化されていない。特定の実施形態において、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４に対応する位置における低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのグルタミン酸の３つ全ては、カルボキシル化されていない。
【００２５】
特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、
（ａ）Ｃ末端から最後の１０アミノ酸を欠失している成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
（ｂ）Ｎ末端から最初の１０アミノ酸を欠失している成熟ヒトオステオカルシンを含む断片、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸６２〜９０を含む断片、
（ｄ）成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸１〜３６を含む断片、
（ｅ）成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸１３〜２６を含む断片、
（ｆ）成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸１３〜４６を含む断片、および
（ｇ）上記の変異体
からなる群から選択されるポリペプチドである。
【００２６】
特定の実施形態において、医薬組成物は、ワルファリン、ビタミンＫ阻害剤、およびそれらの生物学的に活性な断片または変異体からなる群から選択される小分子を含む。特定の実施形態において、小分子はワルファリンである。別の特定の実施形態において、薬剤はオステオカルシンの活性または発現を増加させる小分子である。
【００２７】
特定の実施形態において、医薬組成物は、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼに結合し、これらの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む。好ましくは、抗体または抗体断片はモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、抗体または抗体断片はＯＳＴ−ＰＴＰまたはＰＴＰ−１Ｂの細胞外ドメインに結合する。特定の実施形態において、ＯＳＴ−ＰＴＰはヒトＯＳＴ−ＰＴＰであるか、またはＰＴＰ−１ＢはヒトＰＴＰ−１Ｂである。特定の実施形態において、ＯＳＴ−ＰＴＰは、配列番号１１のマウスＯＳＴ−ＰＴＰまたは配列番号１１と実質的に相同もしくは同一であるアミノ酸配列を有するＯＳＴ−ＰＴＰである。特定の実施形態において、ＯＳＴ−ＰＴＰは、配列番号１１と少なくとも７０％相同または同一であるアミノ酸配列を有するＯＳＴ−ＰＴＰである。特定の実施形態において、ＰＴＰ−１Ｂは、配列番号１７のヒトＰＴＰ−１Ｂまたは配列番号１７と実質的に相同もしくは同一であるアミノ酸配列を有するＰＴＰ−１Ｂである。特定の実施形態において、ＰＴＰ−１Ｂは、配列番号１７と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％相同または同一であるアミノ酸配列を有するＰＴＰ−１Ｂである。
【００２８】
特定の実施形態において、医薬組成物は、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼの発現または活性を阻害する核酸を含む。特定の実施形態において、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。特定の実施形態において、核酸は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびｓｉＲＮＡからなる群から選択される単離された核酸であり、その核酸は、配列番号１０、または配列番号１０と特異的ハイブリダイゼーションを可能にするように配列番号１０と実質的に相同もしくは同一である配列、または配列番号１０と実質的に相同もしくは同一である配列と十分に相補的であり、そのハイブリダイゼーションは骨芽細胞におけるＯＳＴ−ＰＴＰの発現を阻止または低減する。特定の実施形態において、核酸は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される単離された核酸であり、その核酸は、配列番号１６、または配列番号１６と特異的ハイブリダイゼーションを可能にするように配列番号１６と実質的に相同もしくは同一である配列、または配列番号１６と実質的に相同もしくは同一である配列と十分に相補的であり、そのハイブリダイゼーションは骨芽細胞におけるＰＴＰ−１Ｂの発現を阻止または低減する。
【００２９】
特定の実施形態において、医薬組成物は、約０．５ｍｇ〜約５ｇ、約１ｍｇ〜約１ｇ、約５ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、または約２５ｍｇ〜約２００ｍｇの薬剤を含む。特定の実施形態において、医薬組成物は、制御放出調製物に製剤化される薬剤を含む。特定の実施形態において、医薬組成物は、ヒトの身体においてその半減期を延長させるように化学的に修飾される薬剤を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、フレイルを治療するための医薬組成物は、アミノ酸配列
ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＸ１ＰＲＲＸ２ＶＣＸ３ＬＮＰＤＣＤＥＬＡＤＨＩＧＦＱＥＡＹＲＲＦＹＧＰＶ（配列番号１３）
（ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の各々は独立して、アミノ酸またはアミノ酸類似体から選択され、但し、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３が各々グルタミン酸である場合、Ｘ１はカルボキシル化されておらず、またはＸ２の５０パーセント未満がカルボキシル化され、および／またはＸ３の５０パーセント未満がカルボキシル化されている）
を含む低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンポリペプチドを含むか、または前記オステオカルシンポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３以外の１〜７位において配列番号１３と異なるアミノ酸配列を含み、ならびに／または
前記アミノ酸配列は１つ以上のアミド骨格置換基を含んでもよい。
【００３１】
特定の実施形態において、配列番号１３のオステオカルシンポリペプチドは融合タンパク質である。特定の実施形態において、配列番号１３の位置４３におけるアルギニンは、タンパク質分解に対するオステオカルシンポリペプチドの感受性を減少させるアミノ酸またはアミノ酸類似体と置換される。特定の実施形態において、配列番号１３の位置４４におけるアルギニンは、β−ジメチル−アルギニンと置換される。特定の実施形態において、オステオカルシンポリペプチドは、非カルボキシル化ヒトオステオカルシン（１〜４９）のレトロエナンチオマー（ｒｅｔｒｏｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）である。
【００３２】
本発明はまた、ＯＳＴ−ＰＴＰシグナル伝達経路またはＰＴＰ−１Ｂシグナル伝達経路を調節することによって哺乳動物におけるフレイルを治療する方法であって、ＯＳＴ−ＰＴＰホスホリラーゼ活性を減少させるか、またはＰＴＰ−１Ｂホスホリラーゼ活性を減少させるか、γ−カルボキシラーゼ活性を減少させるか、または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを増加させる薬剤を投与することを含み、その薬剤はフレイルを治療する量で投与される、方法を提供する。
【００３３】
本発明は、フレイルを治療するための医薬としての、ＯＳＴ−ＰＴＰホスホリラーゼ活性を減少させるか、ＰＴＰ−１Ｂホスホリラーゼ活性を減少させるか、γ−カルボキシラーゼ活性を減少させるか、および／または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを増加させる薬剤の使用を提供する。
【００３４】
本発明は、ヒトにおけるフレイルを治療するための医薬を製造するための、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンポリペプチド、またはその模倣物の使用を提供する。
【００３５】
本発明はまた、ヒトにおけるフレイルを治療するための医薬を製造するための、ＯＳＴ−ＰＴＰホスホリラーゼ活性を減少させるか、ＰＴＰ−１Ｂホスホリラーゼ活性を減少させるか、γ−カルボキシラーゼ活性を減少させるか、および／または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを増加させる薬剤の使用を提供する。
【００３６】
本明細書に開示される使用の特定の実施形態において、薬剤はγ−カルボキシラーゼのリン酸化を阻害する。特定の実施形態において、薬剤は低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させる。特定の実施形態において、薬剤はカルボキシル化オステオカルシンと比較して低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの割合を増加させる。特定の実施形態において、薬剤はオステオカルシンのカルボキシル化を阻害する。特定の実施形態において、薬剤はオステオカルシンを脱カルボキシル化する。
【００３７】
本明細書に開示される使用の特定の実施形態において、薬剤は低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。したがって、本発明は、ヒトにおけるフレイルの治療に使用するための低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを提供する。
【００３８】
治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物を、筋肉疲労を患っている患者に投与することを含む、筋肉疲労を治療または予防する方法もまた、本明細書に開示される。このような実施形態において、患者はフレイルを患っていてもよく、患っていなくてもよい。
【００３９】
いくつかの実施形態において、筋肉疲労を患っている患者および筋肉疲労のための治療を必要とする患者は、フレイルを患っておらず、少なくとも５５歳のヒトである。いくつかの実施形態において、患者は少なくとも６０、６５、７０、７５または８０歳である。特定の実施形態において、患者は、５５〜８０歳、６０〜７５歳、または６５〜７０歳であるヒトである。特定の実施形態において、患者は、５５〜６０歳、６５〜７０歳、７０〜７５歳、７５〜８０歳、８０〜８５歳、または８５〜９０歳であるヒトである。
【００４０】
治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物を、肺障害を患っている患者に投与することを含む、肺障害を治療または予防する方法もまた、本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、肺障害は、ぜんそく、気管支炎、または慢性閉塞性肺疾患である。このような実施形態において、患者は、フレイルを患っていてもよく、患っていなくてもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、肺障害を患っている患者および肺障害のための治療を必要とする患者は、フレイルを患っておらず、少なくとも５５歳であるヒトである。いくつかの実施形態において、患者は少なくとも６０、６５、７０、７５または８０歳である。特定の実施形態において、患者は、５５〜８０歳、６０〜７５歳、または６０〜７０歳であるヒトである。特定の実施形態において、患者は、５５〜６０歳、６５〜７０歳、７０〜７５歳、７５〜８０歳、８０〜８５歳、または８５〜９０歳であるヒトである。
【００４２】
本発明はまた、ＯＳＴ−ＰＴＰシグナル伝達経路またはＰＴＰ−１Ｂシグナル伝達経路を調節する薬剤を含む医薬組成物を、筋肉疲労を患っている患者に投与することを含む、患者における筋肉疲労を治療または予防する方法であって、その薬剤は、ＯＳＴ−ＰＴＰホスホリラーゼ発現もしくは活性を減少させるか、またはＰＴＰ−１Ｂホスホリラーゼ発現もしくは活性を減少させるか、γ−カルボキシラーゼ発現もしくは活性を減少させるか、または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させる、方法を提供する。特定の実施形態において、薬剤は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。特定の実施形態において、薬剤は、ヒト低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。このような実施形態において、患者は、フレイルを患っていてもよく、患っていなくてもよい。
【００４３】
本発明はまた、ＯＳＴ−ＰＴＰシグナル伝達経路またはＰＴＰ−１Ｂシグナル伝達経路を調節する薬剤を含む医薬組成物を、肺障害を患っている患者に投与することを含む、患者における肺障害を治療または予防する方法であって、その薬剤は、ＯＳＴ−ＰＴＰホスホリラーゼ発現もしくは活性を減少させるか、またはＰＴＰ−１Ｂホスホリラーゼ発現もしくは活性を減少させるか、γ−カルボキシラーゼ発現もしくは活性を減少させるか、または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させる、方法を提供する。特定の実施形態において、薬剤は低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。特定の実施形態において、薬剤は、ヒト低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンである。いくつかの実施形態において、肺障害は、ぜんそく、気管支炎、または慢性閉塞性肺疾患である。このような実施形態において、患者は、フレイルを患っていてもよく、患っていなくてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、オステオカルシン皮下注入が、野生型マウスにおいて血糖を減少させることを示す。示した用量の組換えオステオカルシンまたはＰＢＳを、２８日間、野生型マウスにおいて皮下に注入した。血糖を示した日に測定した。
【図２】図２は、オステオカルシン皮下注入が、野生型マウスにおいて耐糖能を増加させることを示す。グルコースの単回注射を与える前に、示した用量の組換えオステオカルシンまたはＰＢＳを、１４日間、野生型マウスに皮下に注入した。その後、示した時間において血糖を測定した。
【図３】図３は、オステオカルシン皮下注入が、野生型マウスにおいてインスリン感受性を増加させることを示す。インスリンの単回注射を与える前に、示した用量の組換えオステオカルシンまたはＰＢＳを、１８日間、野生型マウスに皮下に注入した。その後、示した時間において血糖を測定した。
【図４】図４は、オステオカルシン皮下注入が、野生型マウスにおいて脂肪質量を減少させることを示す。（Ａ）示した用量の組換えオステオカルシンまたはＰＢＳを、野生型マウスにおいて、２８日間、皮下に注入した。体重を示した日に記録した。（Ｂ）生殖腺脂肪体を２８日後に測定した。
【図５】図５は、オステオカルシン皮下注入が、野生型マウスにおいてＧＴＧ誘導性肥満を軽減することを示す。野生型マウスに金チオグルコース（ＧＴＧ）またはビヒクルを注射して、過食症および肥満を誘導した。２週間後、それらに、２８日までの間、１ｎ／ｈｒの組換えオステオカルシンまたはＰＢＳを注入する浸透圧ポンプを移植した。その後、示した日に体重増加を記録した。
【図６】図６は、ＷＴのメスと交配したオステオカルシン−／−と野生型（ＷＴ）のオスのマウスによって得られた平均の子を産む頻度（Ａ）および産子数（Ｂ）の比較を示す（繁殖は６週から４カ月齢で試験した）。
【図７】図７は、６週、３カ月および６カ月齢におけるオステオカルシン−／−および野生型（＋／＋）の同腹の子のマウスの精巣重量（Ａ）、大きさ（Ａの下側パネル）および精子数（Ｂ）の分析を示す。
【図８】図８は、３カ月齢におけるオステオカルシン−／−およびＷＴの同腹の子の繁殖マウスにおけるテストステロン血清レベルの分析（Ａ）を示す。３カ月齢におけるＥＳＰ−／−およびＷＴの同腹の子の非繁殖マウスのテストステロン血清レベルの分析を示す（Ｂ）。
【図９】図９は、２〜４カ月齢でビヒクル（ｖｅｈ）またはある用量のオステオカルシン（０、３または３０ｎｇ／ｇ）を１日に１回注射したＷＴマウスにおける精巣の重量および大きさ（下側のパネル）（Ａ）、精子数（Ｂ）、アポトーシス（Ｃ）、およびテストステロン血清レベル（Ｄ）の分析を示す。
【図１０Ａ】ライディッヒ細胞によってテストステロン産生を増加させることによってオステオカルシンはメスの妊性に有利に働く。（Ａ−Ｂ）野生型（ＷＴ）またはオステオカルシン−／−骨芽細胞培養物の上清の存在下で培養した精巣外植（Ａ）または初代ライディッヒ細胞（Ｂ）によるテストステロン産生。
【図１０Ｂ】Ａ−Ｂ）野生型（ＷＴ）またはオステオカルシン−／−骨芽細胞培養物の上清の存在下で培養した精巣外植（Ａ）または初代ライディッヒ細胞（Ｂ）によるテストステロン産生。
【図１０Ｃ】（Ｃ−Ｄ）増加させた用量の組換え非カルボキシル化オステオカルシン（０、０．３、１、３、１０、１００ｎｇ／ｍｌの培養培地）による刺激後の精巣外植（Ｃ）または初代ライディッヒ細胞（Ｄ）によるテストステロン産生。
【図１０Ｄ】（Ｃ−Ｄ）増加させた用量の組換え非カルボキシル化オステオカルシン（０、０．３、１、３、１０、１００ｎｇ／ｍｌの培養培地）による刺激後の精巣外植（Ｃ）または初代ライディッヒ細胞（Ｄ）によるテストステロン産生。
【図１０Ｅ】（Ｅ）ビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（３ｎｇ／ｇ体重）注射の１時間、４時間、および８時間後のＷＴマウスにおける循環テストステロンレベル。
【図１０Ｆ】（Ｆ−Ｇ）ＷＴのメスと交配したＷＴ、オステオカルシン−／−、またはＥｓｐ−／−のオスの同腹の子のマウスによって得られた平均産子数（Ｆ）および頻度（Ｇ）の比較（繁殖は６〜１６週齢で試験した）。
【図１０Ｇ】（Ｆ−Ｇ）ＷＴのメスと交配したＷＴ、オステオカルシン−／−、またはＥｓｐ−／−のオスの同腹の子のマウスによって得られた平均産子数（Ｆ）および頻度（Ｇ）の比較（繁殖は６〜１６週齢で試験した）。
【図１０Ｈ】（Ｈ−Ｌ）ＷＴの同腹の子のマウスと比較したオステオカルシン−／−およびＥｓｐ−／−における精巣の大きさ（Ｈ）、精巣の重量（Ｉ）、精巣上体の重量（Ｊ）、精嚢の重量（Ｋ）、および精子数（Ｌ）。
【図１０Ｉ】（Ｈ−Ｌ）ＷＴの同腹の子のマウスと比較したオステオカルシン−／−およびＥｓｐ−／−における精巣の大きさ（Ｈ）、精巣の重量（Ｉ）、精巣上体の重量（Ｊ）、精嚢の重量（Ｋ）、および精子数（Ｌ）。
【図１０Ｊ】（Ｈ−Ｌ）ＷＴの同腹の子のマウスと比較したオステオカルシン−／−およびＥｓｐ−／−における精巣の大きさ（Ｈ）、精巣の重量（Ｉ）、精巣上体の重量（Ｊ）、精嚢の重量（Ｋ）、および精子数（Ｌ）。
【図１０Ｋ】（Ｈ−Ｌ）ＷＴの同腹の子のマウスと比較したオステオカルシン−／−およびＥｓｐ−／−における精巣の大きさ（Ｈ）、精巣の重量（Ｉ）、精巣上体の重量（Ｊ）、精嚢の重量（Ｋ）、および精子数（Ｌ）。
【図１０Ｌ】（Ｈ−Ｌ）ＷＴの同腹の子のマウスと比較したオステオカルシン−／−およびＥｓｐ−／−における精巣の大きさ（Ｈ）、精巣の重量（Ｉ）、精巣上体の重量（Ｊ）、精嚢の重量（Ｋ）、および精子数（Ｌ）。
【図１０Ｍ】（Ｍ）ＷＴの同腹の子のマウスと比較したオステオカルシン−／−およびＥｓｐ−／−における循環ステロイド性ホルモンレベル。分析は繁殖および非繁殖マウスで実施した。エラーバーはＳＥＭを表わす。スチューデントのｔ検定（＊）Ｐ＜０．０５、（＊＊）Ｐ＜０．００１。
【図１１Ａ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ａ−Ｂ）明暗試験（Ｌ／ＤＴ）：明区画に進入するまでの潜在時間（Ｓｅｃ＝秒）、区画間の移行の数、および明区画で過ごした時間を測定した。
【図１１Ｂ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ａ−Ｂ）明暗試験（Ｌ／ＤＴ）：明区画に進入するまでの潜在時間（Ｓｅｃ＝秒）、区画間の移行の数、および明区画で過ごした時間を測定した。
【図１１Ｃ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｃ−Ｄ）高架式十字迷路試験（ＥＰＭＴ）：オープンアーム（ｏｐｅｎ  ａｒｍ）に進入する数およびオープンアームで過ごした時間（Ｓｅｃ＝秒）をスコア付けした。
【図１１Ｄ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｃ−Ｄ）高架式十字迷路試験（ＥＰＭＴ）：オープンアーム（ｏｐｅｎ  ａｒｍ）に進入する数およびオープンアームで過ごした時間（Ｓｅｃ＝秒）をスコア付けした。
【図１１Ｅ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｅ−Ｆ）オープンフィールド試験（ＯＦＴ）：総距離（ｃｍ）、移動した距離の％、および周辺に対して中心で過ごした時間ならびに飼育事象の数を測定した。マウスの各群のビデオトラッキングを右側パネルに表す。
【図１１Ｆ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｅ−Ｆ）オープンフィールド試験（ＯＦＴ）：総距離（ｃｍ）、移動した距離の％、および周辺に対して中心で過ごした時間ならびに飼育事象の数を測定した。マウスの各群のビデオトラッキングを右側パネルに表す。
【図１１Ｇ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｇ−Ｊ）（Ｇ−Ｈ）強制水泳試験の間に動かずに過ごした時間（秒）および（Ｉ−Ｊ）尾懸垂試験の図。両方の試験は鬱病のような挙動を評価する。
【図１１Ｈ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｇ−Ｊ）（Ｇ−Ｈ）強制水泳試験の間に動かずに過ごした時間（秒）および（Ｉ−Ｊ）尾懸垂試験の図。両方の試験は鬱病のような挙動を評価する。
【図１１Ｉ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｇ−Ｊ）（Ｇ−Ｈ）強制水泳試験の間に動かずに過ごした時間（秒）および（Ｉ−Ｊ）尾懸垂試験の図。
【図１１Ｊ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｇ−Ｊ）（Ｇ−Ｈ）強制水泳試験の間に動かずに過ごした時間（秒）および（Ｉ−Ｊ）尾懸垂試験の図。
【図１１Ｋ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｋ−Ｌ）モリス水迷路試験を１０日にわたって実施する。グラフは、マウスの各群について水泳領域の水面下プラットフォームに位置するのに必要な時間（秒）を示す。左側パネルのビデオトラッキングは分析した各群について得た標準の図である。エラーバーはＳＥＭを表わす。スチューデントのＴ検定をバーの上部に表す。
【図１１Ｌ】オステオカルシンは、不安、鬱病、記憶および学習に影響を及ぼす。（Ａ−Ｌ）（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）オステオカルシン−／−（ｎ＝２１）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＪおよびＬ）Ｇｐｒｃ６ａ−／−（ｎ＝１６）およびＷＴ（ｎ＝２１およびｎ＝１５）の同腹の子のマウスの挙動分析。（Ｋ−Ｌ）モリス水迷路試験を１０日にわたって実施する。グラフは、マウスの各群について水泳領域の水面下プラットフォームに位置するのに必要な時間（秒）を示す。左側パネルのビデオトラッキングは分析した各群について得た標準の図である。エラーバーはＳＥＭを表わす。スチューデントのＴ検定をバーの上部に表す。
【図１２Ａ】図１２は、オステオカルシンの投与が不安および鬱病を軽減することを示す。（Ａ−Ｅ）脳室内（ＩＣＶ）注入により組換え非カルボキシル化オステオカルシンを受けている成体のオステオカルシン−／−マウスの挙動分析。（Ａ）明暗試験、（Ｂ）高架式十字迷路試験、（Ｃ）オープンフィールド試験、（Ｄ）強制水泳試験、および（Ｅ）尾懸垂試験を、ビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（１０ｎｇ／時間）を注入したＷＴ（ｎ＝７）およびオステオカルシン−／−のコホートにおいて実施した。３つのバーの各セットにおいて、最も右側のバーはオステオカルシンの投与後の結果を表す。
【図１２Ｂ】図１２は、オステオカルシンの投与が不安および鬱病を軽減することを示す。（Ａ−Ｅ）脳室内（ＩＣＶ）注入により組換え非カルボキシル化オステオカルシンを受けている成体のオステオカルシン−／−マウスの挙動分析。（Ａ）明暗試験、（Ｂ）高架式十字迷路試験、（Ｃ）オープンフィールド試験、（Ｄ）強制水泳試験、および（Ｅ）尾懸垂試験を、ビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（１０ｎｇ／時間）を注入したＷＴ（ｎ＝７）およびオステオカルシン−／−のコホートにおいて実施した。３つのバーの各セットにおいて、最も右側のバーはオステオカルシンの投与後の結果を表す。
【図１２Ｃ】図１２は、オステオカルシンの投与が不安および鬱病を軽減することを示す。（Ａ−Ｅ）脳室内（ＩＣＶ）注入により組換え非カルボキシル化オステオカルシンを受けている成体のオステオカルシン−／−マウスの挙動分析。（Ａ）明暗試験、（Ｂ）高架式十字迷路試験、（Ｃ）オープンフィールド試験、（Ｄ）強制水泳試験、および（Ｅ）尾懸垂試験を、ビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（１０ｎｇ／時間）を注入したＷＴ（ｎ＝７）およびオステオカルシン−／−のコホートにおいて実施した。３つのバーの各セットにおいて、最も右側のバーはオステオカルシンの投与後の結果を表す。
【図１２Ｄ】図１２は、オステオカルシンの投与が不安および鬱病を軽減することを示す。（Ａ−Ｅ）脳室内（ＩＣＶ）注入により組換え非カルボキシル化オステオカルシンを受けている成体のオステオカルシン−／−マウスの挙動分析。（Ａ）明暗試験、（Ｂ）高架式十字迷路試験、（Ｃ）オープンフィールド試験、（Ｄ）強制水泳試験、および（Ｅ）尾懸垂試験を、ビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（１０ｎｇ／時間）を注入したＷＴ（ｎ＝７）およびオステオカルシン−／−のコホートにおいて実施した。３つのバーの各セットにおいて、最も右側のバーはオステオカルシンの投与後の結果を表す。
【図１２Ｅ】図１２は、オステオカルシンの投与が不安および鬱病を軽減することを示す。（Ａ−Ｅ）脳室内（ＩＣＶ）注入により組換え非カルボキシル化オステオカルシンを受けている成体のオステオカルシン−／−マウスの挙動分析。（Ａ）明暗試験、（Ｂ）高架式十字迷路試験、（Ｃ）オープンフィールド試験、（Ｄ）強制水泳試験、および（Ｅ）尾懸垂試験を、ビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（１０ｎｇ／時間）を注入したＷＴ（ｎ＝７）およびオステオカルシン−／−のコホートにおいて実施した。３つのバーの各セットにおいて、最も右側のバーはオステオカルシンの投与後の結果を表す。
【図１３Ａ】図１３は、母体のオステオカルシンが成体子孫における空間学習および記憶を決定することを示す。（Ａ−Ｆ）ＤＬＴ（Ａ）、ＥＰＭＴ（Ｂ）、ＯＦＴ（Ｃ）、ＦＳＴ（Ｄ）、ＴＳＴ（Ｅ）およびＭＷＭＴ（Ｆ）を、ＷＴマウスと比較して、妊娠期間の間にビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（２４０ｎｇ／日）を１日に１回注射したオステオカルシン−／−の母親から生まれた３ヶ月齢のオステオカルシン−／−マウスにおいて実施した。
【図１３Ｂ】（Ａ−Ｆ）ＤＬＴ（Ａ）、ＥＰＭＴ（Ｂ）、ＯＦＴ（Ｃ）、ＦＳＴ（Ｄ）、ＴＳＴ（Ｅ）およびＭＷＭＴ（Ｆ）を、ＷＴマウスと比較して、妊娠期間の間にビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（２４０ｎｇ／日）を１日に１回注射したオステオカルシン−／−の母親から生まれた３ヶ月齢のオステオカルシン−／−マウスにおいて実施した。
【図１３Ｃ】（Ａ−Ｆ）ＤＬＴ（Ａ）、ＥＰＭＴ（Ｂ）、ＯＦＴ（Ｃ）、ＦＳＴ（Ｄ）、ＴＳＴ（Ｅ）およびＭＷＭＴ（Ｆ）を、ＷＴマウスと比較して、妊娠期間の間にビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（２４０ｎｇ／日）を１日に１回注射したオステオカルシン−／−の母親から生まれた３ヶ月齢のオステオカルシン−／−マウスにおいて実施した。
【図１３Ｄ】（Ａ−Ｆ）ＤＬＴ（Ａ）、ＥＰＭＴ（Ｂ）、ＯＦＴ（Ｃ）、ＦＳＴ（Ｄ）、ＴＳＴ（Ｅ）およびＭＷＭＴ（Ｆ）を、ＷＴマウスと比較して、妊娠期間の間にビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（２４０ｎｇ／日）を１日に１回注射したオステオカルシン−／−の母親から生まれた３ヶ月齢のオステオカルシン−／−マウスにおいて実施した。
【図１３Ｅ】（Ａ−Ｆ）ＤＬＴ（Ａ）、ＥＰＭＴ（Ｂ）、ＯＦＴ（Ｃ）、ＦＳＴ（Ｄ）、ＴＳＴ（Ｅ）およびＭＷＭＴ（Ｆ）を、ＷＴマウスと比較して、妊娠期間の間にビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（２４０ｎｇ／日）を１日に１回注射したオステオカルシン−／−の母親から生まれた３ヶ月齢のオステオカルシン−／−マウスにおいて実施した。
【図１３Ｆ】（Ａ−Ｆ）ＤＬＴ（Ａ）、ＥＰＭＴ（Ｂ）、ＯＦＴ（Ｃ）、ＦＳＴ（Ｄ）、ＴＳＴ（Ｅ）およびＭＷＭＴ（Ｆ）を、ＷＴマウスと比較して、妊娠期間の間にビヒクルまたは組換え非カルボキシル化オステオカルシン（２４０ｎｇ／日）を１日に１回注射したオステオカルシン−／−の母親から生まれた３ヶ月齢のオステオカルシン−／−マウスにおいて実施した。
【図１３Ｇ】（Ｇ）ＷＴ母親に由来するＷＴ胚およびオステオカルシンを注射したオステオカルシン−／−の母親に由来するオステオカルシン−／−胚のＥ１８．５海馬冠状断面の脳領域に対する側脳室の表面（％）。
【図１３Ｈ】（Ｈ）ＷＴ母親に由来するＷＴ胚およびオステオカルシン（２４０ｎｇ／日）を注射したオステオカルシン−／−の母親に由来するオステオカルシン−／−胚のＥ１８．５海馬冠状断面のアポトーシス細胞の数（ＴＵＮＥＬアッセイによって染色した）。
【図１３Ｉ】（Ｉ）ＷＴおよびオステオカルシンを注射したオステオカルシン−／−の母親に由来するオステオカルシン−／−胚のクレシルバイオレット、ＮｅｕＮ免疫蛍光、および歯状回領域（ＷＴに対する％）。スケールバー＝０．５ｍｍ。
【図１３Ｊ】図１３は、母体のオステオカルシンが成体子孫における空間学習および記憶を決定することを示す。
【図１３Ｋ】図１３は、母体のオステオカルシンが成体子孫における空間学習および記憶を決定することを示す。
【図１４】図１４は、オステオカルシンが成体の野生型（ＷＴ）マウスにおいて認知機能を改善することを示す。ビヒクル（ＰＢＳ）または組換え非カルボキシル化オステオカルシン（Ｏｃｎ）（３、１０、３０ｎｇ／時間）をＩＣＶ注入した３ヶ月齢のＷＴマウスにおいて実施した明暗（ＤＬＴ）および高架式十字迷路試験（ＥＰＭＴ）からの結果を示す。（Ａ）ＤＬＴは進入するまでの潜在時間、進入の回数、および明区画において過ごした時間を測定した。（Ｂ）ＥＰＭＴはオープンアームへの進入の回数および明区画において過ごした時間を測定した。
【図１５】図１５は、オステオカルシンが高齢の野生型（ＷＴ）マウスにおいて海馬機能を改善することを示す。ビヒクルまたは１０ｎｇ／ｈｒの組換え非カルボキシル化オステオカルシンで１ヶ月間処置した１７ヶ月齢のマウスにおける新規物体認識試験における不変および新規の物体の調査。
【図１６】図１６は、オステオカルシンを欠損している若いマウスにおける低下した筋肉質量および機能を示す。（Ａ）種々の筋肉の種類（ＳＯｌ；ＥＤＬ；ＴＡ；Ｇａｓ＝腓腹筋；Ｑｕａ＝大腿四頭筋）についての３ヶ月齢の野生型（ＷＴ）およびオステオカルシン−／−マウスにおける種々の筋肉についての体重に対する筋肉質量の割合。（Ｂ）３ヶ月齢の野生型（ＷＴ）およびオステオカルシン−／−マウスが走った距離の比較。（Ｃ）３ヶ月齢の野生型（ＷＴ）およびオステオカルシン−／−マウスについての走った時間の比較。
【図１７】図１７は、Ｇｐｒｃ６ａが骨格筋において発現されることを示す。（Ａ）野生型マウス由来の種々の組織におけるＧｐｒｃ６ａ  ｍＲＮＡ。（Ｂ）野生型およびオステオカルシン−／−マウス由来のＧｐｒｃ６ａ  ｍＲＮＡの比較。
【図１８】図１８は、若いオステオカルシン＋／−；Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−マウスにおける減少した筋肉質量および機能を示す。（Ａ）種々の筋肉の種類についての３ヶ月齢のオステオカルシン−／−、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−、およびオステオカルシン＋／−；Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−マウスにおける種々の筋肉についての体重に対する筋肉質量の割合。（Ｂ）３ヶ月齢のオステオカルシン−／−、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−、およびオステオカルシン＋／−；Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−マウスが走った距離および走って過ごした時間の比較。Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−マウスは破壊されたＧｐｒｃ６ａの１つのコピーを有する。
【図１９】図１９は、オステオカルシンがグルコース摂取に有利に働くことを示す。（Ａ）野生型マウスにおける３Ｈ−２−デオキシグルコース摂取に対する増加させた量の非カルボキシル化オステオカルシンの効果。インスリンの効果もまた、比較のために示す。（Ｂ）野生型およびＧｐｒｃ６ａ−／−マウスにおける３Ｈ−２−デオキシグルコース摂取に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果。
【図２０】図２０は、オステオカルシンが解糖に有利に働くことを示す。（ａ）野生型マウスにおける細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の変化に対する増加させた量の非カルボキシル化オステオカルシンの効果。インスリンの効果もまた、比較のために示す。（Ｂ）野生型およびＧｐｒｃ６ａ−／−マウスのＥＣＡＲに対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果。（Ｃ）野生型およびＧｐｒｃ６ａ−／−マウスにおけるＬ−乳酸産生。
【図２１】図２１は、オステオカルシンおよびグルコースの作用の一般的様式を示す。
【図２２】図２２は、オステオカルシンによる解糖の調節はＰＫＡによって媒介されることを示す。（Ａ）オステオカルシンが解糖をどのように正に調節し得るかの概略図。（Ｂ）ＫＴ５７２０（プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害剤）の存在および不在下での細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果。
【図２３】図２３は、オステオカルシンが、Ｓ６Ｋリン酸化およびタンパク質合成を促進することを示す。
【図２４】図２４は、筋肉におけるオステオカルシンについての起こり得る作用機構の概略図を示す。
【図２５Ａ】図２５は、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、運動の間、筋肉機能に必要であることを示す。（Ａ）休息期または運動の単回の実施（４０分、トレッドミルでの３０ｃｍ／ｓの走行）の後のマウスにおいて測定した血清総オステオカルシン（Ｏｃｎ）およびインスリン（Ｉｎｓ）レベル（ｎ＝７／群）。
【図２５Ｂ】（Ｂ）休息期ならびに運動の単回の実施（４０分、トレッドミルでの３０ｃｍ／ｓの走行）の０、１、２および４時間後のマウスにおいて測定した血清非カルボキシル化（ｕｎｃａｒｂ）−Ｏｃｎレベル（ｎ＝７／群）。
【図２５Ｃ】（Ｃ）休息期および運動の単回の実施後のマウスにおける血清ＣＴＸレベル（ｎ＝７／群）。
【図２５Ｄ】（Ｄ）３ヶ月齢のメスのＯｃｎ欠損およびＷＴの同腹の子の持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝８〜１０／群）。
【図２５Ｅ】（Ｅ）３ヶ月齢のＯｃｎ  ｆ／ｆおよびＯｃｎＯｓｂ−／−の同腹の子の持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝３〜５／群）。
【図２５Ｆ】（Ｆ）３ヶ月齢のメスのＧｐｒｃ６ａ欠損およびＷＴの同腹の子の持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝８〜１０／群）。
【図２５Ｇ】（Ｇ）種々の組織におけるＧｐｒｃ６ａ発現。
【図２５Ｈ】（Ｈ）ＥＤＬおよびヒラメ筋におけるＧｐｒｃ６ａ発現（ｎ＝３）。
【図２５Ｉ】（Ｉ）ヒラメ筋におけるＧｐｒｃ６ａ発現のインサイチュハイブリダイゼーション分析。
【図２５Ｊ】（Ｊ）ＷＴおよびＯｃｎ−／−筋肉におけるＧｐｒｃ６ａ発現（ｎ＝６／群）。
【図２５Ｋ】（Ｋ）ビヒクルまたはＯｃｎ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＷＴおよびＧｐｒｃ６ａ−／−筋管におけるｃＡＭＰ蓄積。
【図２５Ｌ】（Ｌ）３ヶ月齢のメスのＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおける持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝８〜１０／群）。
【図２５Ｍ】（Ｍ）３ヶ月齢のメスのＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−マウスの持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝８〜１０／群）。
【図２５Ｎ】（Ｎ）３ヶ月齢のメスのＯｃｎ＋／−；Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−マウスおよび対照の同腹の子の持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝８〜１０／群）。
【図２６Ａ】図２６は、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達がグルコース摂取を促進することを示す。漸進的な速度増加試験の間のメスのＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおける（Ａ）ＶＯ２。
【図２６Ｂ】漸進的な速度増加試験の間のメスのＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおける（Ｂ）ＶＯ２最大。
【図２６Ｃ】漸進的な速度増加試験の間のメスのＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおける（Ｃ）ＲＥＲ。
【図２６Ｄ】（Ｄ−Ｅ）ビヒクルまたはＯｃｎ（パネルＤにおいて示した用量、パネルＥにおいて１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＷＴおよびＧｐｒｃ６ａ−／−筋管における３Ｈ−２−デオキシグルコース（３Ｈ−２−ＤＧ）の摂取。
【図２６Ｅ】（Ｄ−Ｅ）ビヒクルまたはＯｃｎ（パネルＤにおいて示した用量、パネルＥにおいて１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＷＴおよびＧｐｒｃ６ａ−／−筋管における３Ｈ−２−デオキシグルコース（３Ｈ−２−ＤＧ）の摂取。
【図２６Ｆ】（Ｆ）Ｇｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおける運動の単回の実施後の解糖（Ｇｌｙ−白大腿四頭筋）および酸化（Ｏｘ−赤大腿四頭筋）の筋肉における３Ｈ−２−ＤＧの摂取（ｎ＝４／群）。
【図２６Ｇ】（Ｇ）極度の疲労までトレッドミルで走った後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおける血糖値（ｎ＝４／群）。
【図２６Ｈ】（Ｈ）極度の疲労までトレッドミルで走った後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−マウスにおける血糖値（ｎ＝４／群）。
【図２６Ｉ】（Ｉ）運動の単回の実施後、Ｏｃｎ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＷＴ筋管およびＯｃｎ（５００ｎｇ／ｇ）を注射したＷＴマウスの筋肉におけるＡｋｔリン酸化（Ｓｅｒ４７３）のウェスタンブロット解析。
【図２６Ｊ】（Ｊ）運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−筋肉におけるＡｋｔリン酸化（Ｓｅｒ４７３）のウェスタンブロット解析。
【図２６Ｋ】（Ｋ）休息期および運動後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−筋肉におけるグリコーゲン含有量およびグリコーゲン分解。
【図２７Ａ】図２７は、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達がグルコース利用を促進することを示す。（Ａ−Ｃ）休息期および運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるアスパラギン酸塩およびＴＣＡサイクル代謝産物蓄積（ｎ＝６／群）。
【図２７Ｂ】（Ａ−Ｃ）休息期および運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるアスパラギン酸塩およびＴＣＡサイクル代謝産物蓄積（ｎ＝６／群）。
【図２７Ｃ】（Ａ−Ｃ）休息期および運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるアスパラギン酸塩およびＴＣＡサイクル代謝産物蓄積（ｎ＝６／群）。
【図２７Ｄ】（Ｄ）運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスならびに（Ｅ）Ｇｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−マウスの筋肉における１３Ｃで標識したＴＣＡ代謝産物および乳酸塩（ｎ＝３／群）。
【図２７Ｅ】（Ｄ）運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスならびに（Ｅ）Ｇｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−マウスの筋肉における１３Ｃで標識したＴＣＡ代謝産物および乳酸塩（ｎ＝３／群）。
【図２７Ｆ】（Ｆ）２５ｍＭのグルコースを含有するＫＨＲ緩衝液中で培養した筋原線維における酸素消費速度（ＯＣＲ）。
【図２８Ａ】図２８は、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が脂肪酸の摂取および酸化に有利に働くことを示す。（Ａ−Ｂ）休息期および運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉および血漿におけるアシルカルニチンレベル（ｎ＝４〜６／群）。
【図２８Ｂ】（Ａ−Ｂ）休息期および運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉および血漿におけるアシルカルニチンレベル（ｎ＝４〜６／群）。
【図２８Ｃ】（Ｃ）３ｍＭのオレイン酸を含有するＫＨＲ緩衝液中で培養した筋原線維におけるＯＣＲ。
【図２８Ｄ】（Ｄ）運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるＡＴＰ蓄積（ｎ＝６／群）。
【図２８Ｅ】（Ｅ）運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるＨＳＬリン酸化（Ｓｅｒ５６３）のウェスタンブロット解析。
【図２８Ｆ】（Ｆ−Ｇ）ＷＴおよびＧｐｒｃ６ａ−／−筋管またはＯｃｎ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＷＴ筋管におけるＣｄ３６、Ｆａｔｐ１およびＣｐｔ１ｂ発現。
【図２８Ｇ】（Ｆ−Ｇ）ＷＴおよびＧｐｒｃ６ａ−／−筋管またはＯｃｎ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理したＷＴ筋管におけるＣｄ３６、Ｆａｔｐ１およびＣｐｔ１ｂ発現。
【図２８Ｈ】（Ｈ）休息期および運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆ、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−およびＯｃｎ＋／−；Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−マウスの筋肉におけるＦａｔｐ１発現（ｎ＝４〜６／群）。
【図２８Ｉ】（Ｉ）運動後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるＦＡＴＰ１のウェスタンブロット解析。
【図２８Ｊ】（Ｊ）運動の単回の実施後のＣｒｅｂｆ／ｆおよびＣｒｅｂＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるＣｄ３６、Ｆａｔｐ１およびＣｐｔ１ｂ発現。
【図２８Ｋ】（Ｋ）運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるＣＲＥＢリン酸化（Ｓｅｒ１３３）のウェスタンブロット解析。
【図２８Ｌ】（Ｌ）３ヶ月齢のＧｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−；ＣｒｅｂＭｃｋ＋／−、ＣｒｅｂＭｃｋ＋／−および対照マウスの持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝８〜１３／群）。
【図２９Ａ】（Ａ−Ｂ）運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−筋肉におけるＩｌ６およびＩｌ６ｒａ発現。
【図２９Ｂ】（Ａ−Ｂ）運動の単回の実施後のＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−筋肉におけるＩｌ６およびＩｌ６ｒａ発現。
【図２９Ｃ】（Ｃ）運動の単回の実施後の循環ＩＬ−６レベルＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウス。
【図２９Ｄ】（Ｄ）運動の単回の実施後の循環ＩＬ−６レベルＧｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−マウス。
【図２９Ｅ】（Ｅ）野生型およびＩＬ−６−／−マウスにおける総および非カルボキシル化オステオカルシンレベル。
【図２９Ｆ】（Ｆ）ＩＬ６およびＩＬ６Ｒαによる処理後のＯｃｎ、Ｒａｎｋｌ、およびＯｐｇ発現。
【図２９Ｇ】（Ｇ−Ｈ）ＩＬ−６−／−およびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおける運動後のＣＴＸ発現の変化。
【図２９Ｈ】（Ｇ−Ｈ）ＩＬ−６−／−およびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおける運動後のＣＴＸ発現の変化。
【図３０Ａ】（Ａ−Ｂ）２〜９ヶ月齢のメスおよびオスのマウスにおける総およびｕｎｃａｒｂ−Ｏｃｎの循環レベル（ｎ＝５〜７／群）。
【図３０Ｂ】（Ａ−Ｂ）２〜９ヶ月齢のメスおよびオスのマウスにおける総およびｕｎｃａｒｂ−Ｏｃｎの循環レベル（ｎ＝５〜７／群）。
【図３０Ｃ】（Ｃ）種々の年齢のマウスにおけるＰＩＮＰ、骨形成マーカーの循環レベル（ｎ＝５〜７／群）。
【図３０Ｄ】（Ｄ）種々の年齢のマウスの大腿骨におけるオステオカルシン（Ｏｃｎ）発現（ｎ＝４／年齢）。
【図３０Ｅ】（Ｅ）休息期および運動の単回の実施後の３、６および１２ヶ月齢のメスおよびオスのマウスにおける循環ｕｎｃａｒｂ−Ｏｃｎレベル（ｎ＝５〜７／群）。
【図３０Ｆ】（Ｆ）２〜３３歳のメスおよびオスのアカゲザルにおける循環総Ｏｃｎレベル（ｎ＝５〜７／群）。
【図３０Ｇ】（Ｇ）１１〜７８歳の女性および男性における循環総Ｏｃｎレベル（ｎ＝６／群）。
【図３１Ａ】図３１は、オステオカルシン処置が若いおよび老齢のＷＴマウスにおいて筋肉機能を増加させることを示す。（Ａ−Ｂ）Ｏｃｎで処置した３ヶ月齢のＷＴ、Ｇｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−のメスのマウスの持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝６〜１０／群）。
【図３１Ｂ】（Ａ−Ｂ）Ｏｃｎで処置した３ヶ月齢のＷＴ、Ｇｐｒｃ６ａｆ／ｆおよびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−のメスのマウスの持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝６〜１０／群）。
【図３１Ｃ】（Ｃ）Ｏｃｎで処置した１２および１５ヶ月齢のＷＴのメスのマウスの持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝６〜１０／群）。
【図３１Ｄ】（Ｄ）運動の単回の実施後にＯｃｎ（５００ｎｇ／ｇ）を注射したＷＴマウスの筋肉におけるＡｋｔリン酸化（Ｓｅｒ４７３）のウェスタンブロット解析。
【図３１Ｅ】（Ｅ）運動の単回の実施後にＯｃｎ（５００ｎｇ／ｇ）を注射したＷＴマウスの筋肉におけるＡＭＰＫリン酸化（Ｔｈｒ１７９）のウェスタンブロット解析。
【図３１Ｆ】（Ｆ）運動の単回の実施後にＯｃｎ（５００ｎｇ／ｇ）を注射したＷＴマウスの筋肉におけるＨＳＬリン酸化（Ｓｅｒ５６３）のウェスタンブロット解析。
【図３１Ｇ】（Ｇ）走行前にＯｃｎを受けている１５ヶ月齢のＷＴマウスにおける運動の単回の実施後の解糖（Ｇｌｙ−白大腿四頭筋）および酸化（Ｏｘ−赤大腿四頭筋）の筋肉における３Ｈ−２−ＤＧの摂取（ｎ＝５／群）。
【図３１Ｈ】（Ｈ）２８日間、Ｏｃｎを受けている１０ヶ月齢のＷＴマウスの持久力運動の間のパフォーマンス（ｎ＝７／群）。
【図３１Ｉ】（Ｉ）２８日間、Ｏｃｎを受けている１０ヶ月齢のＷＴマウスの腓腹筋におけるＣｄ３６、Ｆａｔｐ１およびＣｐｔ１ｂの発現（ｎ＝７／群）。
【図３１Ｊ】（Ｊ）２８日間、Ｏｃｎを受けているＷＴマウスの筋肉におけるＡｋｔリン酸化（Ｓｅｒ４７３）のウェスタンブロット解析（ｎ＝７／群）。（Ｋ）筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達およびＩＬ−６が運動能力を増加させるのにどのように協働するかを表した概略図。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
フレイルを治療する方法が本明細書に開示される。フレイルを治療するとは、フレイルを有することが知られているか、またはフレイルを有する疑いのある患者におけるフレイルの症状を遅延させ、改善させ、フレイルの程度を最小化させ、フレイルを反転させるために、フレイルの発症後に能動的に介入することを意味する。筋肉疲労、肺障害、代謝障害、男性生殖障害、または認知障害を軽減することとは、筋肉疲労、肺障害、代謝障害、男性生殖障害、または認知障害を有することが知られているか、または有する疑いがある患者における筋肉疲労、肺障害、代謝障害、男性生殖障害、または認知障害の症状を遅延、改善し、それらの程度を最小化し、またはそれらを反転させるために、筋肉疲労、肺障害、代謝障害、男性生殖障害、または認知障害の発症後に能動的に介入することを意味する。
【００４６】
フレイルは、加齢に伴う以下の障害または状態：（ａ）筋肉疲労；（ｂ）肺障害；（ｃ）代謝障害；（ｄ）男性生殖障害；および（ｅ）認知障害のうちの少なくとも２つ以上によって特徴付けられる。
【００４７】
「筋肉疲労」は、時々、サルコペニアと称され、筋肉量および機能の進行性喪失である。それは加齢のほぼ普遍的な特徴であり、多くの場合、骨量減少後に発生する。その細胞および分子レベルの基盤は知られていない。
【００４８】
「肺障害」は、気管支収縮が役割を果たす疾患および状態、例えば、ぜんそく、気管支炎、または慢性閉塞性肺疾患を含む。
【００４９】
「代謝障害」は、メタボリックシンドローム、耐糖能異常、１型糖尿病、２型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および肥満を含む。
【００５０】
「男性生殖障害」は、男性不妊、精子数の低下、精子運動性障害、精子生存率低下、低いテストステロンレベル、性欲減衰、勃起障害、精巣の発育不足、および精巣の過剰なアポトーシスを含む。
【００５１】
「認知障害」は、学習する、記憶する、課題を解決する、情報を処理する、正確に推論する、または情報を思い出す能力の全てまたは部分的のいずれかの一時的または永久的喪失によって特徴付けられる状態を含み、この喪失は通常の加齢プロセスの結果として生じる。いくつかの実施形態において、認知障害は、脳における特定の神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、または筋萎縮性側索硬化症）または血管状態（例えば、脳卒中、虚血）のような加齢に関連する要因の結果である。認知障害が記憶喪失である場合、喪失は短期間または長期間の記憶において生じ得る。認知障害はまた、様々な形態の認知症も含む。
【００５２】
本明細書に開示されるフレイルを治療する方法のいくつかの実施形態において、その方法は、（ａ）筋肉疲労または（ｂ）肺障害のうちの少なくとも１つを軽減しながら、同時に（ｃ）代謝障害、（ｄ）男性生殖障害、または（ｅ）認知障害のうちの少なくとも１つを軽減することを含む。
【００５３】
本明細書に開示されるフレイルを治療する方法のいくつかの実施形態において、その方法は、少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｃ）〜（ｅ）代謝障害、男性生殖障害、または認知障害のうちの少なくとも１つを軽減することを含む。本明細書に開示されるフレイルを軽減する方法のいくつかの実施形態において、その方法は、少なくとも（ｂ）肺障害および（ｃ）〜（ｅ）代謝障害、男性生殖障害、または認知障害のうちの少なくとも１つを軽減することを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｃ）代謝障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｄ）男性生殖障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ａ）筋肉疲労および（ｅ）認知障害を軽減することを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ｂ）肺障害および（ｃ）代謝障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ｂ）肺障害および（ｄ）男性生殖障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも（ｂ）肺障害および（ｅ）認知障害を軽減することを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｃ）〜（ｅ）代謝障害、男性生殖障害、または認知障害のうちの少なくとも１つを軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｃ）代謝障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｄ）男性生殖障害を軽減することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労および（ｂ）肺障害ならびに（ｅ）認知障害を軽減することを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）筋肉疲労、（ｂ）肺障害、（ｃ）代謝障害、（ｄ）男性生殖障害、および（ｅ）認知障害を軽減することを含む。
【００５８】
「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトであるが、イヌもしくはネコなどのペット、またはウマ、ウシ、ブタもしくはヒツジなどの家畜であってもよい。特定の実施形態において、患者は、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、または８０歳のヒトである。特定の実施形態において、患者は、５５から８０歳、６０から７５歳、または６５から７０歳のヒトである。特定の実施形態において、患者は、５５から６０歳、６５から７０歳、７０から７５歳、７５から８０歳、８０から８５歳、または８５から９０歳のヒトである。
【００５９】
フレイルの治療を必要とする患者は、フレイルを有することが知られているか、もしくは有する疑いがあるか、またはフレイルを発症するリスクのある患者を含む。治療を必要とするこのような患者は、例えば、低い低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンレベルを有することが知られている哺乳動物であってもよい。本発明の方法による治療を必要とする患者は、フレイルを治療するために血清低カルボキシル化／非カルボキシル化レベルを増加させる療法を必要とすることが知られている患者を含む。
【００６０】
本発明の方法によるフレイルの治療を必要とする患者は、フレイルを治療すること以外の目的で本明細書に記載される治療剤のみを投与される患者を含まない。したがって、例えば、本発明の方法によるフレイルの治療を必要とする患者は、骨量減少、またはメタボリックシンドローム、耐糖能異常、１型糖尿病、２型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、もしくは肥満などの代謝障害を軽減する目的のためにオステオカルシンのみで治療される患者を含まない。それは、耐糖能の増加、インスリン産生の増加、インスリン感受性の増加、膵臓β細胞増殖の増加、アディポネクチン血清レベルの増加、酸化リン脂質の減少、アテローム斑の退縮、炎症性タンパク質生合成の減少、血漿コレステロールの低下、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）増殖および数の低下、または動脈プラークの厚さの減少を引き起こす目的のためにオステオカルシンのみで治療される患者を含まない。
【００６１】
本発明の方法によるフレイルの治療を必要とする患者はまた、男性生殖障害または認知障害を軽減する目的のためにオステオカルシンのみで治療される患者を含まない。
【００６２】
本発明の方法によるフレイルの治療を必要とする患者はまた、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンではないオステオカルシン、例えば完全にカルボキシル化されたオステオカルシンで治療される患者を含まない。
【００６３】
本明細書におけるデータは、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が運動への適応に有利に働くことを示す。なぜならそれは、グルコースのトリカルボン酸サイクルへの取り込みおよび利用を増加させ、脂肪酸利用を促進するからである。筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達はまた、インターロイキン６である、生物活性オステオカルシンおよび筋原線維で利用される栄養素の生成に有利に働くマイオカインの運動誘発性上方制御の主要な決定因子である。さらに、循環オステオカルシンレベルは中年の前に急に減少し、老齢のマウスにおいて運動の間に増加しない。このことは、外因性オステオカルシンが、若いマウスにおいて運動能力を増加させ、１５ヶ月齢のマウスに３ヶ月齢のマウスの運動能力を与える理由を説明する。したがって、運動の間に筋肉機能を増強するのに必要なオステオカルシン−インターロイキン−６軸が存在し、運動能力の加齢誘発性の減少を反転させるために利用され得る。
【００６４】
本明細書におけるデータは、筋原線維におけるシグナル伝達によって、オステオカルシンが運動への適応に有利に働くことを示す。なぜならそれは、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルへのグルコース取り込みおよび利用ならびにＦＡの利用を促進するからである。筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達はまた、運動の間の循環レベルのインターロイキン−６（ＩＬ−６）である、グルコースおよびＦＡ産生に有利に働くマイオカイン、ならびに生物活性オステオカルシンの産生に有利に働く骨芽細胞におけるシグナルの増加の大部分に関与する。対照的に、循環オステオカルシンレベルは、試験した全ての種において中年前に急に減少し、若いマウスにおけるより老齢のマウスにおける運動の間にある程度まで増加しない。オステオカルシンの機能および経時的なその循環レベルの進化と一致して、外因性オステオカルシンは、若いマウスの運動能力を増加させ、１２〜１５ヶ月齢のマウスに３ヶ月齢の運動能力を与える。これらの結果は、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達とＩＬ−６との間のクロストークの存在を明らかにし、これは、グルコースおよびＦＡを生成するＩＬ−６の能力と一緒に、運動への適応を促進し、若いマウスの運動能力を増加させ、老齢のマウスの運動能力を正常化させるために利用され得る。
【００６５】
筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達は運動への適応に有利に働く
種々の生理学的状況において低カルボキシル化および生物学的に活性なオステオカルシンの循環レベルを測定することにより、長期間の有酸素ベースの運動（３０ｃｍ／ｓにおけるトレッドミルでの４０分の走行、本明細書以下、運動と称する）が、骨吸収の増加、オステオカルシン脱カルボキシル化に関与する骨再形成の装備のために、３ヶ月齢の野生型（ＷＴ）マウスにおいてオステオカルシンレベルを２倍増加させることが明らかになった（Ｆｅｒｒｏｎら、２０１０、Ｃｅｌｌ  １４２：２９２−３０８）。運動の間の骨吸収のこの増加についての分子的説明は、骨への筋肉シグナル伝達の一部として以下に提示される。循環オステオカルシンレベルはまた、運動の実施後、若い女性において増加した。これらの観察を鑑みて、オステオカルシンが運動への適応を調節するか否かを試験した。オスのオステオカルシン（Ｏｃｎ）−／−マウスにおける身体的活動および低い循環テストステロンレベルに対するテストステロンの影響を考慮して（Ｏｕｒｙら、２０１１、Ｃｅｌｌ  １４４：７９６−８０９）、この問題はメスのマウスで対処した。
【００６６】
極度の疲労まで一定の速度にてトレッドミルで強制的に走らせた場合、３、６および９ヶ月齢のＯｃｎ−／−マウスは、ＷＴの同腹の子より３０％少ない時間および距離を走った（図２５Ｄ）。このことは、骨から筋肉へのシグナル伝達の不在によって引き起こされた。なぜなら、運動能力の同じ減少がまた、骨芽細胞においておよび出生後にオステオカルシンのみを欠いているマウスにおいても観察されたからであった（図２５Ｅ）。運動能力のこの減少は２ヶ月齢のＯｃｎ−／−マウスにおいて観察されず、この表現型が発生学的起源ではないことを示している。Ｇｐｒｃ６ａ（Ｏｕｒｙら、２０１１、Ｃｅｌｌ  １４４：７９６−８０９）と呼ばれるオステオカルシン受容体、ＧＰＣＲを欠いている３ヶ月齢のマウスは、Ｏｃｎ−／−マウスのように運動能力の同じ減少を経験した（図２５Ｆ）。
【００６７】
Ｏｃｎ−／−およびＧｐｒｃ６ａ−／−マウスは、運動に関連した任意の表現型の解釈を困難にする代謝および／または行動異常を示す。これらの混乱させる要因を排除し、オステオカルシンが骨格筋におけるシグナル伝達によって運動への適応を促進するかどうかを決定するために、この組織におけるＧｐｒｃ６ａ発現および機能を研究した。ｑＰＣＲ調査により、Ｇｐｒｃ６ａが、大部分の組織およびさらに解糖筋肉（ＥＤＬ）より長時間の労力を必要とする酸化筋肉（ヒラメ筋）より骨格筋において高度に発現されることが示され、同時にインサイチュハイブリダイゼーション解析により、Ｇｐｒｃ６ａが筋原線維において発現されることが実証された（図２５Ｇ〜Ｉ）。Ｇｐｒｃ６ａ発現はＷＴ筋肉よりＯｃｎ−／−において３倍高く、オステオカルシンは、Ｇｐｒｃ６ａ−／−筋管においてｃＡＭＰ産生を増加させなかったが、ＷＴにおいては増加させた（図２５Ｊ〜Ｋ）。これらのデータは、Ｇｐｒｃ６ａが筋原線維においてオステオカルシンシグナルを媒介し得ることを示唆している。この仮説を試験するために、Ｇｐｒｃ６ａのｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を有するマウスを、Ｍｃｋ−ＣｒｅまたはＨｓａ−Ｃｒｅデリータ（ｄｅｌｅｔｅｒ）マウスと交配させた（Ｂｒｕｎｉｎｇら、１９９８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ２：５５９−５６９）。Ｇｐｒｃ６ａ発現は、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−およびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−マウスの骨格筋において５０％以上減少し、耐糖能およびインスリン感受性はこれらの変異マウスにおいて正常であった。
【００６８】
３ヶ月齢で開始して、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−およびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−マウスは、Ｏｃｎ−／−マウスにおいて示したものと同等の重症度の運動能力の減少を経験した（図２５Ｌ−Ｍ）。このことは筋肉の固有特性の破壊に起因しなかった。なぜなら、興奮収縮連関および耐疲労性は、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−および対照マウスから単離した筋肉において同様であったからである。運動能力の同じ減少が、筋原線維におけるオステオカルシンの１つの対立遺伝子およびＧｐｒｃ６ａの１つの対立遺伝子を欠いている化合物変異マウス（Ｏｃｎ＋／−；Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−）において見られ、したがって、オステオカルシンが、筋原線維におけるＧｐｒｃ６ａを介するシグナル伝達によって運動への適応に有利に働くことが実証された（図２５Ｎ）。他方で、複数の証拠により、オステオカルシンが、心臓におけるシグナル伝達によって運動への適応に有利に働かず、Ｇｐｒｃ６ａ発現が骨格筋より心臓において２０倍低く、心機能がＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−およびＯｃｎ−／−マウスにおいて正常であり、心筋細胞においてＧｐｒｃ６ａのみの欠失はマウスの運動能力に直接的に影響を与えないことが示唆された（図２５Ｇ）。
【００６９】
筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達は、運動の間、グルコース取り込みおよび利用を促進する
筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が運動への適応にどのように有利に働くかを決定するために、極度の疲労まで増加させた速度にてトレッドミルで走っているＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−および対照マウスにおける間接的な熱量測定により栄養利用を測定した。このアッセイの条件において、最大酸素摂取量は、分析した全てのＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおいて約２０％減少し、一方でそれらの呼吸商は対照マウスのものと同様であった（図２６Ａ〜Ｃ）。筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、運動の間の有酸素能力を促進することを示唆しているこれらの結果により、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、ミトコンドリア数／呼吸ならびに／または栄養素の摂取および利用に影響を及ぼすかどうかを試験した。
【００７０】
筋肉におけるミトコンドリアの数は、既に不十分な運動能力を有している３ヶ月齢のＯｃｎ−／−マウス、およびＷＴの同腹の子において同じであった。ミトコンドリア発生および運動Ｐｇｃ１αへの筋肉適応の転写決定因子（Ｄａ  Ｃｒｕｚら、２０１２、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌ．１５：７７８−７８６；Ｈａｎｄｓｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、２００８、Ｎａｔｕｒｅ  ４５４：４６３−４６９；Ｒｕａｓら、２０１２、Ｃｅｌｌ  １５１：１３１９−１３３１）ならびにその標的遺伝子の発現は、運動後のＯｃｎ−／−、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−および対照マウスの筋肉において同様であった。ミトコンドリアタンパク質ＣＯＸおよびＳＤＨの活性はＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−および対照筋肉において同じであり、グルコース、ピルビン酸塩、およびアミノ酸の存在下で培養したＷＴとＧｐｒｃ６ａ−／−筋原線維との間でミトコンドリア呼吸において差はなかった。それらのネガティブな性質を考慮して、これらの結果は慎重に解釈する必要がある。しかしながら、それらは、運動への適応に有利に働く筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達の能力が、ミトコンドリア数または呼吸に対する測定可能な効果に続いて起こらないことを示す。このことにより、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、運動の間の栄養素摂取および利用に影響を与えるかどうかを調査した。
【００７１】
運動の開始時にエネルギーを生成するために筋肉により使用される主な栄養素はグルコースであり、オステオカルシンはＷＴにおいて３Ｈ−２−デオキシグルコース（３Ｈ−２ＤＧ）の摂取を増加させたが、Ｇｐｒｃ６ａ−／−筋管においては増加させなかった（図２６Ｄ〜Ｅ）。他の分泌した分子の関与を排除するために、この実験は無血清条件において実施した。インビボでのこれらの結果と一致して、３Ｈ−２ＤＧの摂取は、より強く求められる酸化筋肉において顕著に減少したが、運動後のＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの解糖筋肉においては減少しなかった（図２６Ｆ）。Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるグルコース摂取のこの減少は、血糖値が、運動後、対照マウスよりＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−およびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−において２倍高くなった理由についての説明を与える（図２６Ｇ〜Ｈ）。注目すべきことに、運動後の血糖値のこのような増加は、筋肉においてインスリンシグナル伝達を欠いているマウスにおいて観察されず（Ｗｏｊｔａｓｚｅｗｓｋｉら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１２５７−１２６４）、このことは、オステオカルシンおよびインスリンが筋原線維において異なる機能を与えることを示唆している。
【００７２】
オステオカルシンは、休息期または運動後にてグルコース輸送体Ｇｌｕｔ１およびＧｌｕｔ４の筋肉における発現に影響を及ぼさなかった。むしろ、それは、Ｇｐｒｃ６ａおよびＧｌｕｔ４の両方を発現するＣ２Ｃ１２筋芽細胞の細胞膜へのＧＬＵＴ４の転位を促進した。ＧＬＵＴ４の蓄積の同様の増加が、ＷＴにおける運動後に観察されたが、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおいて観察されなかった（図２６Ｉ）。ＧＰＣＲによるシグナル伝達はＰＩ３Ｋ活性化に有利に働くことができ、細胞膜へのＧＬＵＴ４の転位に有利に働く事象である、Ａｋｔリン酸化を導く（Ｌｏｐｅｚ−Ｉｌａｓａｃａら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：３９４−３９７）。この概念と一致して、Ｇｐｒｃ６Ｍｃｋ−／−マウスの筋肉におけるＡｋｔリン酸化は、運動後、対照マウスの筋肉と比較して減少した。オステオカルシンは、ＷＴマウスの培養した筋管または筋肉においてＡｋｔのリン酸化を誘導し、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、筋芽細胞におけるＧＬＵＴ４転位を誘導するオステオカルシンの能力を無効にした（図２６Ｉ〜Ｊ）。
【００７３】
筋原線維におけるグルコースは、運動の間にグルコースに分解されるグリコーゲンの形態で保存される。休息期と運動後の筋グリコーゲンレベルの差によって規定される、運動により誘発されるグリコーゲン分解は、対照マウスのものと比較してＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−の筋肉において顕著に減少した（図２６Ｋ）。グリコーゲンからグルコースを生成する能力のこの低下は、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおいて観察された減少した運動能力による可能性がある。運動の間、グルコースは、完全に酸化されるトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルに入るアセチル−ＣｏＡを生成するために筋原線維において分解される（酸化的リン酸化）。運動前後の筋肉において実施したメタボロミクス解析により、ＴＣＡサイクルの活性を増加させるのに必要とされるオキサロ酢酸の細胞レベルの信頼できる指標であるアルパラギン酸塩、ならびに運動の間に大部分を増加させる２つのＴＣＡサイクル中間体であるフマル酸塩およびリンゴ酸塩の蓄積が示され（Ｇｉｂａｌａら、１９９８、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｅ２３５−２４２；Ｓａｈｌｉｎら、１９９０、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５９：Ｃ８３４−８４１）、運動後、対照マウスのものよりＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−の筋肉において同じ程度まで上昇しなかった（図２７Ａ〜Ｃ）。これらの観察と一致して、１３Ｃで標識したＴＣＡ中間体および乳酸塩の蓄積は、運動の直前に１３Ｃ−グルコースを注射したＧｐｒｃ６Ｍｃｋ−／−およびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−マウスの筋肉において減少した（図２７Ｄ〜Ｅ）。ＴＣＡサイクルにおけるグルコースの利用が、筋原線維においてオステオカルシンシグナル伝達を欠いているマウスの筋肉において運動の間に減少することを示す、これらの結果は、筋原線維についての唯一の利用可能な基質がグルコースである場合、酸素消費速度（ＯＣＲ）が、ＷＴ筋原線維よりＧｐｒｃ６ａ−／−において顕著に低下するという理由を説明する（図２７Ｆ）。
【００７４】
筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達は、運動の間、ＦＡ利用に有利に働く
持久力運動の間、脂肪分解および脂肪酸（ＦＡ）摂取および骨格筋における酸化の進行性の増加が起こる（Ｈａｗｌｅｙら、２０１４；Ｋｏｖｅｓら、２００５）。したがって、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達もまた、運動の間のＦＡの摂取および／または利用に影響を及ぼすかどうかを、ＦＡ代謝の信頼できる指標である、アシルカルニチンの筋肉および血漿レベルを測定することによって試験した（Ｏｖｅｒｍｙｅｒら、２０１５）。
【００７５】
運動後、対照マウスの筋肉において観察された長鎖および中鎖アシルカルニチンの蓄積は、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉において同じ程度まで起こらなかったことが発見された（図２８Ａ）。代わりに、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの血漿内でアシルカルニチン蓄積の顕著な上昇が起こった（図２８Ｂ）。さらに、運動後、対照マウスの筋肉において顕著に減少した遊離Ｌ−カルニチンのレベルは、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおいては減少しなかった。これらの結果は、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、運動の間、効果的なＦＡ利用に必要とされることを示唆している。これらの結果は、オステオカルシンが、ＷＴの筋管において増加させたように、Ｇｐｒｃ６ａ−／−筋管において１４Ｃ−オレイン酸塩酸化を増加させることができないという理由、およびオレイン酸塩がこれらの筋原線維に対して唯一の利用可能な基質である場合、ＯＣＲがＷＴ筋原線維よりＧｐｒｃ６ａ−／−において顕著に低下したという理由についての説明を与える（図２８Ｃ）。
【００７６】
要するに、運動の前後でＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおいて実施した代謝解析は、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、グルコースおよびＦＡの摂取および利用に有利に働くことを示した。したがって、オステオカルシンは、運動の間の最適な筋肉性能に必要であるＡＴＰを生成するのに必要なはずである。この仮説と一致して、ＡＴＰレベルは、運動後、対照のマウスよりＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉において顕著に低下した（図２８Ｄ）。
【００７７】
オステオカルシンによるＦＡ摂取および利用の調節は、転写後機構を介して部分的に起こる。細胞エネルギーセンサーであるＡＭＰＫは、Ｔｈｒ１７２でのそのリン酸化後、ＣＰＴ１Ｂの活性を増加させることによって、運動の間、ＦＡ利用に有利に働き（Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、２０１４、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５７：１６９３−１７０２）、しかしながら、このリン酸化は、運動後、対照マウスのものよりＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−の筋肉において著しく弱くなった。ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）である酵素は、それがＳｅｒ５６３においてリン酸化されると、筋肉において遊離脂肪酸への筋肉細胞内トリグリセリドの加水分解に有利に働く（ＷａｔｔおよびＳｐｒｉｅｔ、２０１０、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２９９：Ｅ１６２−１６８）。オステオカルシンが、ＷＴマウスの筋肉においてｓｅｒ５６３にてＨＳＬリン酸化を向上させている間、このリン酸化事象は、運動後、対照マウスのものよりＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−の筋肉において弱くなった（図２８Ｅ）。
【００７８】
オステオカルシンはまた、筋肉においてＦＡ摂取および利用を有利に働かせるために転写機構も使用した。細胞への長鎖ＦＡの摂取を容易にするＣｄ３６およびＦａｔｐ１、ならびにミトコンドリア膜を横切るそれらの輸送体を促進するＣｐｔ１ｂの発現（Ｓｔａｈｌら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１２：２６６−２７３）は、Ｇｐｒｃ６ａ−／−筋管において減少し、オステオカルシンは、ＷＴ筋管においてＦａｔｐ１およびＣｐｔ１ｂならびにより少ない程度でＣｄ３６の発現を増加させた（図２８Ｆ〜Ｇ）。このことは、Ｃｄ３６、Ｆａｔｐ１およびＣｐｔ１ｂ発現が、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−またはＯｃｎ＋／−の筋肉において増加せず、運動後、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−マウスでは、対照マウスのものと同じ程度に増加し（図２８Ｈ）、同じことが、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−筋肉におけるＦＡＴＰ１およびＣＰＴ１Ｂ蓄積に当てはまるという理由を説明する。対照筋管よりＣｒｅｂ−／−におけるＦａｔｐ１の発現を低くすると、運動後、対照マウスのものと比較してＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるＣＲＥＢのリン酸化が減少し、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−；ＣｒｅｂＭｃｋ＋／−マウスの運動能力が、Ｏｃｎ−／−およびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの全てのものと同様であるという事実は、ＣＲＥＢが、筋原線維におけるＦＡ摂取および利用のオステオカルシン調節の転写メディエーターであり得ることを示唆している（図２８Ｊ〜Ｌ）。
【００７９】
オステオカルシンとインターロイキン−６との間のクロストークは運動への適応を決定する
運動の間、筋肉におけるＦＡ利用のオステオカルシン調節における転写事象の関与により、オステオカルシンによって調節される遺伝子を求めて、対照およびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるトランスクリプトミック（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ）解析を行い、それは、運動の間の筋肉機能のその調節を調整する。この解析は、運動後、発現がＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−筋肉において最も減少した遺伝子が、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、運動の間に循環レベルが上昇し、エネルギー代謝に対して多重効果を与えるマイオカインをコードするものであることを明らかにした（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｅｂｂｒａｉｏ、２０１２、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：４５７−４６５）。より低い程度ではあるが、同じことが、可溶性ＩＬ−６受容体についても当てはまった。この観察と一致して、筋原線維におけるＩｌ６およびＩｌ６ｒａ発現、ならびに筋肉におけるＩＬ−６含有量は、運動後、対照マウスの筋肉よりＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−およびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−において著しく低下し、オステオカルシンは、ＷＴにおいてＩｌ６の発現を増加させたが、Ｇｐｒｃ６ａ−／−筋管においては増加させなかった（図２９Ｂ〜Ｃ）。さらに、通常、マウスにおける運動によって誘導される循環ＩＬ−６レベルの上昇は、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−およびＧｐｒｃ６ａＨｓａ−／−マウスのそれぞれにおいて６８％および８２％減少した（図２９Ｃ〜Ｄ）。この後者の結果は、筋肉におけるＩｌ６発現の主要な調節因子としてオステオカルシンを同定し、運動後に観察されたＩＬ−６循環レベルの増加の大部分が筋肉由来のＩＬ−６の増加に起因することを示す。
【００８０】
Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおける循環ＩＬ−６レベルの上昇の大幅な減少は、これらの変異マウスに示される脂肪質量の増加を部分的に説明できる。注目すべきことに、運動に影響を与えることが知られている他のマイオカインは、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達の不在による影響を受けなかった。
【００８１】
これらの結果を鑑みて、およびＩＬ−６が骨細胞においてシグナル伝達できるので（Ｌｉら、２００８、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４３：１６５−１７３；Ｔａｍｕｒａら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１９２４−１１９２８）、ＩＬ−６が、骨芽細胞によるオステオカルシンの産生および／または骨吸収によるその活性化を調節するかどうかを試験した。ＩＬ−６での骨芽細胞の処理はオステオカルシンの発現を減少させることが観察され、それによって総（カルボキシル化および非カルボキシル化形態）オステオカルシンの循環レベルがＩｌ６−／−マウスにおいて増加するという理由を説明できる。より重要なことに、ＩＬ−６は、骨芽細胞において、破骨細胞分化に有利に働くサイトカインであるＲａｎｋｌの発現を増加させ、Ｒａｎｋｌについてのおとり（ｄｅｃｏｙ）受容体および骨吸収の阻害剤であるオステオプロテゲリン（Ｏｐｇ）の発現を減少させた（ＫａｒｓｅｎｔｙおよびＷａｇｎｅｒ、２００２、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ２：３８９−４０６；Ｐａｌｍｑｖｉｓｔら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３３５３−３３６２）。この観測は、オステオカルシンの低カルボキシル化形態および活性形態の循環レベルがＩｌ６−／−マウスにおいて減少するという事実と一致する（図２９Ｅ）。筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達によるＩｌ−６発現の調節およびＩＬ−６による骨吸収もまた、骨吸収のバイオマーカーであるＣＴＸの循環レベルが、Ｉｌ６−／−およびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおいて運動後に低くなるという理由を説明できる（図２９Ｇ〜Ｈ）。これらの実験は、運動の間の筋肉機能の増加に必要である、骨におけるオステオカルシン産生と筋肉におけるＩＬ−６合成との間のフィードフォワード調節の存在を明らかにする。この調節ループは、肝臓の糖新生および脂肪分解に有利に働くＩＬ−６の能力と相乗作用するはずである。なぜならＩＬ−６のこれらの２つの他の機能は、運動の間、筋原線維に利用可能な栄養素のプールを増加させるからである。
【００８２】
循環オステオカルシンレベルは中年前に急に減少する
筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達の不在によって引き起こされる運動能力の減少は、運動能力に対する加齢による有害な影響と類似点を有する。オステオカルシン循環レベルの減少が、この有害な加齢の結果が原因であり得るかどうかを決定するために、全生涯を通じて複数の種における循環オステオカルシンレベルを測定した。
【００８３】
オステオカルシンの循環レベルは、血清ＰＩＮＰレベルおよびオステオカルシン発現によって測定すると、骨形成の著しい減少のために、２〜９ヶ月齢のオスおよびメスのマウスにおいて７０％減少したことが観測された（図３０Ａ〜Ｄ）。注目すべきことに、循環オステオカルシンレベルのこの減少は、運動を実施するＷＴマウスの能力が減少するときに起こる。また、循環オステオカルシンレベルは、運動の間増加しないことも観測された。また、循環オステオカルシンレベルは、６および１２ヶ月齢のマウスにおいて、３ヶ月齢のマウスと同様に運動の間に増加しないことも観測された。循環オステオカルシンレベルはまた、若年（２〜３歳）と中年（１３〜１５歳）との間のオスおよびメスのアカゲザルにおいても減少する（図３０Ｆ）。さらに一層際立って、ヒトにおいて循環オステオカルシンレベルは、女性において３０歳前、および男性において５０歳時または前にそれらの最低点に到達する（図３０Ｇ）。このように循環オステオカルシンレベルは、運動能力が減少し始めるときに分析した全ての種において中年前または付近でそれらの底に到達する。
【００８４】
オステオカルシンは若いおよび高齢のＷＴマウスの運動能力を増加できる
オステオカルシンによる運動の間の筋肉機能の調節、生活の間のその循環レベルの急なおよびより速い減少、ならびにそれらのレベルが、運動の間、若いマウスでは上昇するが、高齢のマウスにおいて上昇しないという事実は、外因性オステオカルシンが若いおよび高齢のＷＴマウスの運動能力を増加できるかどうかを調べる根拠となった。
【００８５】
最初に、運動直前の非カルボキシル化マウスオステオカルシン（オステオカルシン）（１００ｎｇ／ｇ体重）の単回の腹腔内注射が、３ヶ月齢のＷＴマウスの運動能力を改善するかどうかを試験した。この注射により、循環インスリンレベルに影響を与えずに循環オステオカルシンレベルが増加した。それはまた、極度の疲労前にトレッドミルでのそれらのマウスの走行の時間および距離を２０％以上増加させた（図３１Ａ）。そのオステオカルシンはＧｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスにおいて筋肉機能を改善せず、オステオカルシンは、筋肉機能に有利に働くように筋原線維においてシグナル伝達する必要があることが実証された（図３１Ｂ）。
【００８６】
オステオカルシンが高齢マウスおいて同じ能力を有するかどうかを決定するために、走行前の低い循環オステオカルシンレベルを有する１２および１５ヶ月齢のマウスに、それらの循環レベルを十分に上昇させるように５００ｎｇ／ｇ体重のオステオカルシンを注射した。オステオカルシンのこの急速な送達は、３ヶ月齢の未処置のマウスと同じ時間および距離を走行する能力を高齢マウスに与えた。このことは、解糖筋肉より最も高いレベルでＧｐｒｃ６ａを発現する酸化筋肉において大きな程度まで発生する、Ａｋｔ、ＡＭＰＫおよびＨＳＬのリン酸化、ならびにグルコース摂取の増加に起因した（図３１Ｃ〜Ｆ）。２８日間のミニポンプによるオステオカルシンの長時間送達（９０ｎｇ／時間）が、最も低い循環オステオカルシンレベルを有する９ヶ月齢のマウスにおいて筋肉機能を増加させるかどうかも試験した。この送達様式は循環オステオカルシンレベルを増加させたが、インスリンのレベルに影響を与えず、それはまた、これらのマウスが極度の疲労前にトレッドミルで走行する時間および距離の顕著な増加を生じた（図３１Ｇ）。運動を実施するこの改善された能力は、脂肪酸輸送体Ｆａｔｐ１の筋肉における発現の増加およびＡｋｔ経路の活性化によって部分的に引き起こされた（図３１Ｈ）。まとめると、これらの結果は、外因性オステオカルシンが３〜１５ヶ月齢のＷＴマウスの運動能力を改善できることを示す。
【００８７】
この研究により、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、グルコースおよびＦＡの取り込みおよび利用に有利に働くので、筋肉機能および運動への適応を増強するのに必要であり、十分であることが明らかになる。運動の間の筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達はまた、Ｉｌ６、栄養素および生物活性オステオカルシンの産生に有利に働くマイオカインの発現を増加させる。この研究は、運動への適応を決定する骨と筋肉との間のクロストーク周囲に集まる調節経路を明らかにする。
【００８８】
オステオカルシンによる運動の間の筋肉機能の調節
オステオカルシンが運動への適応を促進できるかどうか、およびどのように促進できるかを試験した。オステオカルシンまたはその受容体であるＧｐｒｃ６ａが細胞特異的に不活性化した種々の変異マウス株の分析により、Ｇｐｒｃ６ａを介する筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、運動の間の最適な筋肉機能、それにより運動能力を助長するために必要であることが示された。筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達の不在によって引き起こされる筋肉機能の減少は３ヶ月齢前には現れず、オステオカルシンの出産後および骨芽細胞特異的欠失によりに再生され、このオステオカルシンの機能は発生学的起源ではない筋肉に対する骨の影響を明らかにすることを示している。さらなる遺伝学的証拠により、このオステオカルシンの機能が心臓におけるそのシグナル伝達に続発することは除外した。したがって、オステオカルシンは運動の間の筋肉機能およびそれ故、筋原線維におけるＧｐｒｃ６ａによりそのシグナル伝達を介する運動への適応の全身性の調節因子である。
【００８９】
筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達による栄養素利用の調節
この調査は、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が栄養素取り込みおよび利用のいくつかの態様を増強することを示した。最初に、細胞膜へのグルコース輸送体ＧＬＵＴ４の転位に有利に働くことによって、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達は、インスリン非依存性に筋原線維におけるグルコース取り込みを促進する。第２に、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達は、運動の間、骨格筋を収縮するための重要なグルコース源である、グリコーゲンの効果的な動員に必要とされる。第３に、オステオカルシンシグナル伝達は、ＴＣＡサイクルの活性およびそれにより筋収縮に必要なＡＴＰの生成を促進する。第４に、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達はＦＡ輸送体の発現および蓄積を増加させ、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉におけるアシルカルニチンの蓄積によって決定されるようにＦＡ利用を増強する。運動後、Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−マウスの筋肉において観察されたＴＣＡサイクル中間体の欠失、およびこれらの変異筋肉におけるＦＡの減少した利用は全て、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、ミトコンドリアにおけるグルコースおよびＦＡの効率的な酸化ならびに筋肉機能を増加させることによる運動への適応に有利に働くのに必要とされるという見解を支持する。
【００９０】
オステオカルシンとインターロイキン−６との間のクロストークおよび運動への適応
筋原線維における発現がオステオカルシンによって調節され、運動の間に筋肉機能を増加させるオステオカルシンの能力を媒介または妨げ得る遺伝子を探すために調査を行った。この調査は、オステオカルシン標的遺伝子として最先の特徴付けられたマイオカインであるＩＬ−６を特定した。運動の間の筋肉機能にとって重要なことに、ＩＬ−６はまた、白色脂肪組織における脂肪分解および肝臓でのグルコース新生、すなわち筋原線維の栄養素の生成に有利に働く（Ｆａｌｄｔら、２００４、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４５：２６８０−２６８６）。筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達が、運動の間に生じる循環インターロイキン−６レベルの増加の３分の２以上に関与することを示すことによって、本明細書における結果は、長期間の探索後に、運動の間の筋肉におけるＩｌ−６発現の調節因子としてオステオカルシンを特定する。
【００９１】
最終結果が活性オステオカルシンの産生を増加させることである、いくつかの機能を与える骨細胞におけるインターロイキン−６シグナルを発見した。インターロイキン−６はオステオカルシンの発現を阻害するが、それは、Ｒａｎｋｌの発現を刺激することによって破骨細胞分化および骨吸収に有利に働く。この後者の機能は、Ｉｌ６−／−マウスにおいて見られる生物活性オステオカルシンの循環レベルの減少についての説明を提供し、ＩＬ−６およびオステオカルシンが運動への適応に有利に働くように協働することを示唆している。一方で、肝臓におけるグルコース産生および脂肪分解を介するＦＡの生成に有利に働くことによって、ＩＬ−６は筋原線維についての栄養素の利用可能性に有利に働き、他方で、ＩＬ−６は生物活性オステオカルシンの産生を増強し、次いで筋原線維におけるこれらの栄養素の取り込みに有利に働く（ＰｅｄｅｒｓｅｎおよびＦｅｂｂｒａｉｏ、２０１２、２０１２、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：４５７−４６５）。したがって、オステオカルシンとＩＬ−６との間のクロストークは、運動への適応を可能にする多くの全体的な機構のうちの一部である。このことは、骨の代謝機能が、運動への適応に有利に働くように他の器官のものと協力して作用することを示す。
【００９２】
オステオカルシンは運動能力の加齢に関連する減少を反転できる
本明細書における結果は、オステオカルシンが、急速的に送達されるか、または長期的に送達されるかに関わらず、筋原線維におけるオステオカルシンシグナル伝達は、３ヶ月齢のＷＴマウスの運動能力を増加させ、１５ヶ月齢のマウスに３ヶ月齢のマウスの運動能力を与えるのに十分であることを示す。これらの結果は、オステオカルシンシグナル伝達が、加齢に伴い生じる筋肉機能の減少を治療するために利用され得ることを示しているので、生物医学的観点から重要である。
【００９３】
オステオカルシン循環レベルは、運動後に増加し、加齢に伴い減少する。オステオカルシンまたはその受容体であるｇｐｒｃ６ａを欠失しているマウスは、３ヶ月齢において、高齢のマウスにおいて見られる筋肉疲労の表現型を示すことが観察されている。この表現型は、トレッドミルで走行するマウスの能力によって判断されるように、減少した筋肉量および減少した筋肉性能を含む。同じ表現型は筋原線維においてｇｐｒｃ６ａを欠失しているマウスのみにおいて観察される。これらのマウスは、全ての組織においてオステオカルシンを欠いているオステオカルシン−／−マウスにおいて見られる代謝の撹乱を全く有さない。
【００９４】
筋肉において、オステオカルシンは、グルコース取り込み、解糖、脂肪酸酸化、およびタンパク質合成に有利に働くことが示されている。
【００９５】
トレッドミルで走っている間の野生型マウスにおけるオステオカルシンの簡単な注射は、マウスが走る距離を２０％増加させるようである。さらに、１２〜１５ヶ月齢の野生型マウスにオステオカルシンを注射すると、若いマウスのように走る。
【００９６】
上記の観察は、患者への低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの投与は、筋肉疲労に対して有益な効果を与えるはずであることを示す。特に、患者への低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの投与は、加齢に伴う疲労の複合要素の一部である筋肉疲労に対して有益な効果を与えるはずである。
【００９７】
オステオカルシンまたはその受容体ＧＰＲＣ６Ａの不在は、ぜんそくにおいて見られるように気管支収縮を引き起こすが、ぜんそくにおいて見られる局所炎症を引き起こさないことが見出された。オステオカルシン−／−マウスにおけるオステオカルシンの脳室内注入は、それらの気管支収縮を矯正せず、それはオステオカルシンの中心的機能の結果ではないことを示している。
【００９８】
気管支収縮を引き起こす神経伝達物質であるアセチルコリンのレベルは、オステオカルシン−／−およびＧｐｒｃ６ａ−／−マウスの肺において増加するが、脳においては増加しない。ぜんそく様状態がアレルゲンによって誘発されている野生型マウスにおける２週間の噴霧によるオステオカルシンの送達は、アレルゲンによって引き起こされる局所炎症に影響を与えずに、それらの気管支収縮を完全に救済した。
【００９９】
オステオカルシンに対する受容体であるＧＰＲＣ６Ａは、肺において高レベルで発現される。オステオカルシンおよびＧＰＲＣ６Ａノックアウトマウス（それぞれ、オステオカルシン−／−、ｇｐｒｃ６ａ−／−）は、野生型マウスと比較して、増加した気道抵抗、多くの気管支収縮、および減少した気道内径を示した。対照的に、機能ノックアウトマウス（Ｅｓｐ−／−）のオステオカルシン増加は、増加した気道内径を示した。
【０１００】
メタコリンがマウスの肺に投与されると、肺気道は収縮する。オステオカルシン−／−マウスは、野生型マウスと比較して、メタコリンに対して誇張した反応（多くの収縮）を示した。野生型マウスは炎症増加剤で処置し、気管支収縮および炎症の症状を含むぜんそくを発生させた。これらのマウスにオステオカルシンを噴霧により投与すると、炎症症状は依然として観察されたが、気管支収縮は観察されなかった。これらのマウスの脳へ送達されるオステオカルシンは同様の効果を示さなかった。
【０１０１】
（マウスを感作させるために）アルブミンの腹腔内注射を与え、その１週間後、アルブミンをマウスの肺へ噴霧により投与したマウスぜんそくモデルにおいて、アルブミンの噴霧と一緒にオステオカルシンを噴霧により与えると、別様で観察された気管支収縮が防がれた。
【０１０２】
上記の観察は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの患者への投与が、肺障害に対して有益な効果を与えるはずであることを示す。特に、患者への低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの投与は、加齢に伴うフレイル複合要素の一部である肺障害に対して有益な効果を与えるはずである。
【０１０３】
骨における骨芽細胞によって分泌される低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、エネルギー代謝の種々の態様を調節する役割を担っている。例えば、それは、膵臓β細胞集団、インスリン分泌、インスリン感受性、耐糖能、および血清アディポネクチンを増加させ、体重増加および脂肪質量を減少させる。それはまた、アテローム性動脈硬化の病理学的効果を減少させる。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン、ならびにその断片および変異体は、メタボリックシンドローム、１型および２型糖尿病、アテローム性動脈硬化、ならびに肥満を軽減するのに有用である。
【０１０４】
オスの哺乳動物におけるオステオカルシンおよび生殖生物学は生化学的経路に関連しており、その生化学的経路によってオステオカルシンの増加した活性が、テストステロンの合成に関与する酵素の増加した活性を導く。次にこれにより、オスの生殖に対して有益な効果が導かれる。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン、ならびにその断片および変異体は、オスの哺乳動物における生殖に関連する障害を軽減するのに有用である。このような障害としては、男性不妊、精子数の低下、精子運動性障害、精子生存率低下、低いテストステロンレベル、性欲減衰、勃起障害、精巣の発育不足および精巣の過剰なアポトーシスが挙げられる。
【０１０５】
成体のオステオカルシン−／−マウス（オステオカルシン発現を完全に欠いているマウス）の脳への低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの直接投与は、マウスにおいて不安、鬱病、学習、および記憶の欠陥を減少させた。上記の観測を鑑みると、オステオカルシンが、不安、鬱病、学習、および記憶などの認知機能を調節するという結論が下され得る。したがって、本発明の特定の態様は、加齢に伴うフレイル複合要素の一部である認知障害を軽減するための、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン、ならびにその断片および変異体の治療的使用を対象とする。加齢は頻繁に中等度から重度の認識機能障害を伴うことは知られている。加齢はまた、骨量の損失を伴う。骨芽細胞は主要なオステオカルシン源であるので、本明細書に開示された見解は、フレイルを伴う認知障害を軽減するためのオステオカルシンの使用を支持する。特定の実施形態において、認知障害は、加齢の結果として生じる、増加した不安、増加した鬱病、減少した記憶、または減少した学習能力である。
【０１０６】
特定の実施形態において、本発明の方法は、フレイルの治療を必要とする患者を特定する工程を含む。したがって、本発明は、
（ａ）フレイルの治療を必要とする患者を特定する工程と、
（ｂ）治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを患者に投与する工程と
を含み、フレイルが治療される、方法を提供する。
【０１０７】
γ−カルボキシラーゼはオステオカルシンをカルボキシル化し、それによりカルボキシル化されたオステオカルシンを生成する。このことは、γ−カルボキシラーゼの活性を調節することによってオステオカルシンのカルボキシル化の程度を調節する機会を提供する。特に、このことは、オステオカルシンのカルボキシル化の程度を低下させる機会を提供し、それによりフレイルを治療するための低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを提供する。したがって、本発明の特定の態様は、哺乳動物におけるフレイルを治療するためにγ−カルボキシラーゼの活性を阻害する薬剤の治療的使用を対象とする。
【０１０８】
ＯＳＴ−ＰＴＰは、脱リン酸化を介してγ−カルボキシラーゼを活性化する。上記に示したように、γ−カルボキシラーゼの活性化はオステオカルシンのカルボキシル化を導く。このことは、ＯＳＴ−ＰＴＰ（これは後でγ−カルボキシラーゼの活性を調節する）の活性を調節することによってオステオカルシンのカルボキシル化の程度を間接的に調節する機会を提供する。したがって、本発明の特定の態様は、哺乳動物におけるフレイルを治療するためのＯＳＴ−ＰＴＰの活性を阻害する薬剤の治療的使用を対象とする。
【０１０９】
ヒトにおいて、ＰＴＰ−１Ｂは、脱リン酸化を介してγ−カルボキシラーゼを活性化する。上記に示したように、γ−カルボキシラーゼの活性化はオステオカルシンのカルボキシル化を導く。このことは、ヒトにおけるＰＴＰ−１Ｂ（これは後でγ−カルボキシラーゼの活性を調節する）の活性を調節することによってオステオカルシンのカルボキシル化の程度を間接的に調節する機会を提供する。したがって、本発明の特定の態様は、ヒトにおけるフレイルを治療するためのＰＴＰ−１Ｂの活性を阻害する薬剤のヒトにおける治療的使用を対象とする。
【０１１０】
本発明の他の態様は、患者における低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルの検出に基づいた診断方法を対象とし、そのレベルは哺乳動物におけるフレイルに関連する障害を伴う。
【０１１１】
一態様において、患者におけるフレイルを診断する方法は、（ｉ）患者から採取した生物試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルを決定する工程と、（ｉｉ）低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの患者レベルと、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの対照レベルとを比較する工程と、（ｉｉｉ）患者レベルが対照レベルより十分に低い場合、患者がフレイルを有するか、またはフレイルのリスクがあると診断する工程とを含む。次いでさらなる工程は、患者または患者の医療従事者に診断を知らせることであってもよい。
【０１１２】
本発明の他の態様は、低カルボキシル化／非カルボキシル化対カルボキシル化オステオカルシンの減少した比の検出に基づいた診断法を対象とする。このような比は哺乳動物におけるフレイルを伴う可能性がある。一態様において、患者におけるフレイルに関連する障害を診断する方法は、（ｉ）患者から採取した生物試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化対カルボキシル化オステオカルシンの患者の比を決定する工程と、（ｉｉ）低カルボキシル化／非カルボキシル化対カルボキシル化オステオカルシンの患者の比と、低カルボキシル化／非カルボキシル化対カルボキシル化オステオカルシンの対照の比とを比較する工程と、（ｉｉｉ）患者の比が対照の比より有意に低い場合、患者は、フレイルを有するか、またはフレイルのリスクがあると診断される工程とを含む。次いでさらなる工程は、患者または患者の医療従事者に診断を知らせることであってもよい。
【０１１３】
本発明の方法における使用のための医薬組成物
本発明は、ＯＳＴ−ＰＴＰシグナル伝達経路を調節するため、またはＰＴＰ−１Ｂシグナル伝達経路を調節するための薬剤を含む、哺乳動物におけるフレイルを治療するのに使用するための医薬組成物であって、その経路はγ−カルボキシレートおよびオステオカルシンに関する、医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、薬剤は、ＯＳＴ−ＰＴＰホスホリラーゼ活性を阻害し、ＰＴＰ−１Ｂホスホリラーゼ活性を阻害し、γ−カルボキシラーゼ活性を減少させ、および／または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを増加させる。特定の実施形態において、薬剤はオステオカルシンを脱カルボキシル化する。薬剤は、小分子、ポリペプチド、抗体、および核酸からなる群から選択され得る。本発明の医薬組成物は、哺乳動物においてフレイルを治療するのに有効な量の薬剤を提供する。
【０１１４】
特定の実施形態において、本発明の方法に使用するための医薬組成物は、血清低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン血清レベル増加させるように機能し得る。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法において投与され得る治療剤は、低カルボキシル化オステオカルシン、非カルボキシル化オステオカルシン、またはγ−カルボキシラーゼ、ＰＴＰ−１ＢもしくはＯＳＴ−ＰＴＰの発現もしくは活性を減少させる阻害剤（例えば、抗体、小分子、アンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡ）を含む。医薬品はまた、オステオカルシンを脱カルボキシル化する薬剤を含んでもよい。
【０１１６】
治療剤はフレイルを治療するのに十分な量で投与される。
【０１１７】
特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物は別の治療剤と一緒に投与される。いくつかの実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンおよび他の治療剤は、同じ医薬組成物に存在する。他の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンおよび他の治療剤は別個の医薬組成物で投与される。
【０１１８】
他の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは医薬組成物中に存在する唯一の活性医薬成分である。
【０１１９】
治療剤の生物学的に活性な断片または変異体もまた、本発明の範囲内である。「生物学的に活性な」とは、γ−カルボキシラーゼおよびオステオカルシンに関与するＯＳＴ−ＰＴＰシグナル伝達経路またはＰＴＰ−１Ｂシグナル伝達経路を調節できることを意味する。「生物学的に活性な」とは、また、ＯＳＴ−ＰＴＰの発現またはγ−カルボキシラーゼを脱リン酸化するその能力を減少させること、およびγ−カルボキシラーゼの発現またはオステオカルシンをカルボキシル化するその能力を減少させること、またはカルボキシル化されたオステオカルシンを脱カルボキシル化し、それにより増加したレベルの低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを生じることを意味する場合もある。
【０１２０】
「生物学的に活性な」とはまた、ＰＴＰ−１Ｂの発現もしくはγ−カルボキシラーゼを脱リン酸化するその能力を減少させること、およびγ−カルボキシラーゼの発現またはオステオカルシンをカルボキシル化するその能力を減少させること、またはカルボキシル化されたオステオカルシンを脱カルボキシル化し、それにより増加したレベルの低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを生じることを意味する。
【０１２１】
「生物学的に活性な」とはまた、哺乳動物におけるフレイルを治療するための低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの能力を保持するオステオカルシンの断片または変異体を指す。
【０１２２】
低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物
本発明の特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物は、哺乳動物におけるフレイルを治療するのに使用するために提供される。
【０１２３】
「低カルボキシル化オステオカルシン」とは、４９アミノ酸を有する成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列の位置Ｇｌｕ１７、Ｇｌｕ２１およびＧｌｕ２４における、またはオステオカルシンの他の形態におけるＧｌｕ１７、Ｇｌｕ２１およびＧｌｕ２４に対応する位置におけるＧｌｕ残基の１つ以上がカルボキシル化されていない、オステオカルシンを意味する。低カルボキシル化オステオカルシンは、「非カルボキシル化オステオカルシン」、すなわち、位置１７、２１および２４におけるグルタミン酸残基の３つ全てが、カルボキシル化されていないオステオカルシンを含む。オステオカルシンの調製物は、調製物の成熟オステオカルシンにおける位置Ｇｌｕ１７、Ｇｌｕ２１、およびＧｌｕ２４（一緒にまとめて）における全Ｇｌｕ残基（または他の形態における対応するＧｌｕ残基）の約１０％超が、カルボキシル化されていない「低カルボキシル化オステオカルシン」とみなされる。低カルボキシル化オステオカルシンの特定の調製物において、調製物の成熟オステオカルシンにおける位置Ｇｌｕ１７、Ｇｌｕ２１、およびＧｌｕ２４における全Ｇｌｕ残基（または他の形態における対応するＧｌｕ残基）の約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または約９９％超は、カルボキシル化されていない。特定の実施形態において、調製物の成熟オステオカルシンにおける位置Ｇｌｕ１７、Ｇｌｕ２１およびＧｌｕ２４におけるＧｌｕ残基の本質的に全て（または他の形態における対応するＧｌｕ残基）は、カルボキシル化されていない。
【０１２４】
「低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン」は、本明細書において、まとめて低カルボキシル化および非カルボキシル化オステオカルシンを指すために使用される。「非カルボキシル化オステオカルシン」は、本明細書において、調製物の成熟オステオカルシンにおける位置Ｇｌｕ１７、Ｇｌｕ２１およびＧｌｕ２４におけるＧｌｕ残基の全て（または他の形態における対応するＧｌｕ残基）がカルボキシル化されていない、オステオカルシンの調製物を指すために使用される。
【０１２５】
ヒトオステオカルシンｃＤＮＡ（配列番号１）は、５，８００ｋＤａ（Ｐｏｓｅｒら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：８６８５−８６９１）の予測分子量で配列番号２の少なくとも４９アミノ酸（すなわち、位置５２〜１００）によって表される成熟オステオカルシンタンパク質をコードする。配列番号２は、配列番号１によってコードされるヒトオステオカルシンのプレプロ配列（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、成熟ヒトオステオカルシン（配列番号１２）は配列番号２の処理された生成物である。本出願において、成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸位置を参照する。成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸位置は、以下のように配列番号２のアミノ酸位置に対応することは理解される：成熟ヒトオステオカルシンの位置１は配列番号２の位置５２に対応し、成熟ヒトオステオカルシンの位置２は配列番号２の位置５３に対応するなどである。特に、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４は、それぞれ配列番号２の位置６８、７２および７５に対応する。
【０１２６】
２つのアミノ酸配列における位置が対応する場合、それは、それらの間で最大の相同性を提供するように２つのアミノ酸配列が互いに並んでいるときの互いに並んでいる２つの位置を意味する。対応するこの同じ概念はまた、核酸にも当てはまる。
【０１２７】
例えば、２つのアミノ酸配列ＡＧＬＹＳＴＶＬＭＧＲＰＳおよびＧＬＶＳＴＶＬＭＧＮにおいて、第１の配列の位置２〜１１はそれぞれ第２の配列の位置１〜１０に対応する。したがって、第１の配列の位置２は第２の配列の位置１に対応し、第１の配列の位置４は第２の配列の位置３に対応するなどである。たとえ２つの配列における位置が同じアミノ酸によって占められていないとしても、１つの配列における位置は別の配列における位置に対応し得ることは留意すべきである。
【０１２８】
「オステオカルシン」は成熟タンパク質を含み、本明細書に記載される種々のドメイン、および変異体を含む、完全長オステオカルシン（配列番号２）または成熟タンパク質に由来する生物学的に活性な断片をさらに含む。
【０１２９】
本発明の一実施形態において、本発明の方法における使用のための医薬組成物は、哺乳動物の非カルボキシル化オステオカルシンを含む。本発明の特定の実施形態において、本発明の方法における使用のための組成物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトの非カルボキシル化オステオカルシン、またはその部分、および配列番号１の核酸によってコードされるヒトの非カルボキシル化オステオカルシン、またはその部分を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法における使用のための組成物は、本明細書に記載されるヒトオステオカルシン断片の１つ以上を含んでもよい。
【０１３０】
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法における使用のための組成物は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するヒトの非カルボキシル化オステオカルシンを含む。
【０１３１】
特定の実施形態において、本発明は、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４に対応する位置の１つ以上においてカルボキシル化グルタミン酸を含有しないヒトの低カルボキシル化オステオカルシンを含む医薬組成物を提供する。本発明の方法における使用のためのオステオカルシンの特定の形態は、位置１７、２１および２４におけるグルタミン酸残基の少なくとも１つがカルボキシル化されていない、成熟ヒトオステオカルシンである。特定の実施形態において、位置１７におけるグルタミン酸残基はカルボキシル化されていない。好ましくは、位置１７、２１および２４におけるグルタミン酸残基の３つ全ては、カルボキシル化されていない。成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列は配列番号１２に示される。
【０１３２】
オステオカルシンの一次配列は、種の間で高度に保存され、それは、ヒトの身体において１０個の最も豊富なタンパク質のうちの１つであり、その機能は進化の間ずっと保存されていることを示唆している。保存された特徴は、位置１７、２１、および２４において３つのＧｌａ残基ならびにＣｙｓ２３とＣｙｓ２９との間にジスルフィド結合を含む。さらに、ほとんどの種は位置９においてヒドロキシプロリンを含有する。オステオカルシンのＮ末端は分子の他の部分と比較して最も高い配列変異を示す。ヒトおよびマウスオステオカルシンの高度の保存は、健康および疾患状態の両方においてヒトについての動物モデルとのマウスの関連性を明確に示し、本明細書に開示されたマウスモデルに由来する実験データに基づいてヒトにおけるフレイルを治療するためのオステオカルシンの治療的および診断的使用を確証する。
【０１３３】
本発明はまた、オステオカルシンのポリペプチド断片の使用を含む。断片は、オステオカルシンの完全長の天然に存在するアミノ酸配列（例えば、配列番号２）に由来し得る。断片はまた、成熟オステオカルシン（例えば、配列番号１２）に由来し得る。本発明はまた、本明細書に記載されるオステオカルシンの変異体の断片を包含する。断片は、生物学的に活性である任意の長さのアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１３４】
オステオカルシンの特定の断片は、成熟タンパク質のＧｌｕ１７、Ｇｌｕ２１およびＧｌｕ２４を含有する断片を含む。他の特定の断片は、成熟タンパク質のＣ末端から最後の１０アミノ酸を欠失している成熟タンパク質の断片である。他の特定の断片は、成熟タンパク質のＮ末端から最初の１０アミノ酸を欠失している断片である。別の特定の断片は、Ｃ末端から最後の１０アミノ酸およびＮ末端から最初の１０アミノ酸の両方を欠失している成熟タンパク質の断片である。このような断片は配列番号２のアミノ酸６２〜９０を含む。
【０１３５】
本明細書に記載される本発明の医薬組成物についてのオステオカルシンの他の特定の断片は、以下のアミノ酸配列：
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜１９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置２０〜４３
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置２０〜４９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜４３
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜４２
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜４１
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜４０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３８
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３７
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３６
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３４
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３３
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３２
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３１
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜２９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置２〜４９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置２〜４５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置２〜４０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置２〜３５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置２〜３０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置２〜２５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置２〜２０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置４〜４９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置４〜４５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置４〜４０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置４〜３５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置４〜３０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置４〜２５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置４〜２０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜４９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜４５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜４０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜３５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜３０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜２５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜２０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１０〜４９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１０〜４５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１０〜４０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１０〜３５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１０〜３０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１０〜２５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置１０〜２０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置６〜３４
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置６〜３５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置６〜３６
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置６〜３７
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置６〜３８
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜３４
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜３５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜３６
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜３７
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜３８
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜３０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜２５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜２３
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜２１
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜１９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置７〜１７
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜３０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜２５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜２３
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜２１
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜１９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置８〜１７
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置９〜３０
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置９〜２５
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置９〜２３
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置９〜２１
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置９〜１９
−  成熟ヒトオステオカルシンの位置９〜１７
を含むか、それらからなるか、または本質的にそれらからなるポリペプチドを含む。
【０１３６】
１つの特定の断片は、成熟ヒトオステオカルシンの位置１〜３６を含む断片である。別の特定の断片は、成熟ヒトオステオカルシンの位置２０〜４９を含む断片である。他の断片は、成熟ヒトオステオカルシンのＰｒｏ１３からＴｙｒ７６またはＰｒｏ１３からＡｓｎ２６を含有するように設計されてもよい。さらに、成熟ヒトオステオカルシンの位置２３および２９においてシステイン残基を含有し、それらの２つのシステインの間にジスルフィド結合を形成できる断片が有用である。
【０１３７】
断片は、別個（他のアミノ酸またはポリペプチドと融合していない）であってもよく、またはより大きなポリペプチド内にあってもよい。さらに、いくつかの断片が単一のより大きなポリペプチド内に含まれてもよい。一実施形態において、宿主における発現のために設計される断片は、オステオカルシン断片のアミノ末端と融合した異種プレポリペプチド（ｐｒｅ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）およびプロポリペプチド（ｐｒｏ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）領域ならびに／または断片のカルボキシ末端と融合したさらなる領域を有してもよい。
【０１３８】
上記のオステオカルシンの変異体およびオステオカルシン断片もまた、本発明の組成物および方法における使用のために提供される。「変異体」とは、１つ以上のアミノ酸置換、付加、欠失および／または挿入などの、それらのアミノ酸配列において修飾を含有するが、依然として生物学的に活性であるオステオカルシンペプチドを指す。いくつかの場合、変異体の抗原特性および／または免疫特性は、変異体が由来する、対応するペプチドに対して実質的に変化していない。このような修飾は、例えば、Ａｄｅｌｍａｎら、１９８３、ＤＮＡ  ２：１８３によって教示されているオリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発などの標準的な突然変異誘発技術を使用して、または化学合成によって容易に導入されてもよい。変異体および断片は相互排他的な用語ではない。断片はまた、断片が依然として生物学的に活性であるように１つ以上のアミノ酸置換、付加、欠失および／または挿入を含有し得るペプチドを含む。
【０１３９】
本発明の範囲内である１つの特定の種類の変異体は、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４に対応する位置の１つ以上が、グルタミン酸ではないアミノ酸によって占められている、変異体である。いくつかの実施形態において、グルタミン酸ではないアミノ酸はまた、アスパラギン酸ではない。このような変異体は低カルボキシル化オステオカルシンの型である。なぜなら、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４に対応する３つの位置のうちの少なくとも１つが、これらの位置のうちの少なくとも１つがグルタミン酸によって占められていないので、カルボキシル化されたグルタミン酸ではないからである。
【０１４０】
特定の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列：
ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＸ１ＰＲＲＸ２ＶＣＸ３ＬＮＰＤＣＤＥＬＡＤＨＩＧＦＱＥＡＹＲＲＦＹＧＰＶ（配列番号１３）
（ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の各々は独立して、アミノ酸またはアミノ酸類似体から選択され、但し、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３が各々グルタミン酸である場合、Ｘ１はカルボキシル化されておらず、またはＸ２の５０パーセント未満がカルボキシル化され、および／またはＸ３の５０パーセント未満がカルボキシル化されている）
を含むオステオカルシン変異体を提供する。
【０１４１】
特定の実施形態において、オステオカルシン変異体は、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３以外の１〜７位において配列番号１３とは異なるアミノ酸配列を含む。
【０１４２】
他の実施形態において、オステオカルシン変異体は、１つ以上のアミド骨格置換を含むアミノ酸配列を含む。
【０１４３】
完全に機能的な変異体は、典型的に、重要ではない残基または重要ではない領域において唯一の保存された変化または変化を含有する。機能的変異体はまた、機能の変化、または重要な変化を生じない、類似のアミノ酸の置換を含有してもよい。あるいは、このような置換は、ある程度まで機能にプラスまたはマイナスの影響を与えてもよい。このような機能的なオステオカルシン変異体の活性は本明細書に記載されるもののようなアッセイを使用して決定され得る。
【０１４４】
変異体は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンについての有用および新規の特性を提供するように、天然に存在してもよいか、または組換え手段により作製されてもよいか、または化学合成されてもよい。例えば、変異オステオカルシンポリペプチドは、低減された免疫原性、増加した血中半減期、増加した生物学的利用能、および／または増加した有効性を有してもよい。特定の実施形態において、血中半減期は、成熟オステオカルシンの位置１９、２０、４３および４４における天然Ａｒｇ残基の１つ以上を、別のアミノ酸またはアミノ酸類似体、例えば、β−ジメチル−アルギニンで置換することによって増加する。このような置換は、本明細書に記載されるオステオカルシンの天然アミノ酸配列における他の変化と組み合わされてもよい。
【０１４５】
本発明の医薬組成物および方法における使用のために提供されるのは、上記のオステオカルシンの誘導体およびオステオカルシン断片でもある変異体である。誘導体化は、化学化合物を、誘導体と呼ばれる類似の化学構造の生成物に変換する化学において使用される技術である。一般に、化合物の特定の官能基が誘導体化反応に関与し、化合物を、異なる反応性、溶解性、沸点、融点、凝集状態、機能活性、または化学組成の誘導体に変換する。結果として得られる新たな化学特性は、誘導体化化合物の定量または分離のために使用されてもよく、または治療剤として誘導体化化合物を最適化するために使用されてもよい。誘導体化のための周知の技術が、上記のオステオカルシンおよびオステオカルシン断片に適用されてもよい。このように、上記のオステオカルシンの誘導体およびオステオカルシン断片は、それらが天然のアミノ酸と異なるようにいくつかの方法で化学的に修飾されているアミノ酸を含有する。
【０１４６】
オステオカルシン模倣物も提供される。「模倣物」とは、天然または非天然に存在するオステオカルシンポリペプチドの実質的に同じ構造および機能的特性を有する合成化学化合物を指し、例えば、修飾された骨格、側鎖および／または塩基を有するポリペプチド様およびポリヌクレオチド様ポリマーを含む。ペプチド模倣物は、一般に、鋳型ペプチドと類似している特性を有する非ペプチド薬物として製薬業界において使用される。一般に、模倣物は、生物学的または薬理学的活性を有する実例のポリペプチドと構造的に類似している（すなわち同じ形状を有する）が、１つ以上のポリペプチド結合が置き換わっている。模倣物は、アミノ酸の合成、非天然類似体から完全に構成されてもよいか、または部分的に天然のペプチドアミノ酸および部分的に非天然のアミノ酸の類似体のキメラ分子である。模倣物はまた、アミノ酸保存的置換が模倣物の構造および／または活性を実質的に変化させない限り、任意の量の天然のアミノ酸保存的置換を組み込んでいてもよい。
【０１４７】
当業者によるオステオカルシンに適合され得る例として、Ｃｈｏら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３−１３０５は、種々の側鎖で置換されたキラルアミノカーボネートモノマーからなる「非天然バイオポリマー」、このようなポリマーのライブラリーの合成、およびモノクローナル抗体に対する結合親和性についてのスクリーニングを開示している。Ｓｉｍｏｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：９３６７−９３７１は、様々な側鎖を有するＮ−置換グリシン（「ペプトイド」）からなるポリマーを開示している。Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１８５４−１８５７は、Ｄ−アミノ酸で合成されたタンパク質に対してＬ−ペプチドのファージライブラリーをスクリーニングし、次いでＤ−アミノ酸を使用して選択されたＬ−ペプチドを合成することによって特定されるＤ−ペプチドリガンドを開示している。Ｂｒｏｄｙら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：３８１−８は、数百から数千のアプタマーの生成およびスクリーニングを記載している。
【０１４８】
本発明の範囲内の特定の種類のオステオカルシン変異体は、１つ以上の骨格アミドが、異なる化学構造によって置き換えられているか、または１つ以上のアミノ酸がアミノ酸類似体によって置き換えられているオステオカルシン模倣物である。特定の実施形態において、オステオカルシン模倣物は、非カルボキシル化ヒトオステオカルシンのレトロエナンチオマー（ｒｅｔｒｏｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）である。
【０１４９】
オステオカルシンならびにその断片および変異体は、任意に化学合成または組換え法によって生成され、本明細書に記載される修飾されたオステオカルシン分子（すなわち、オステオカルシン断片または変異体）として生成されてもよい。オステオカルシンポリペプチドは、任意の従来の手段（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５）によって生成されてもよい。同時に行われる複数のペプチド合成が、米国特許第４，６３１，２１１号に記載され、また、使用することができる。組換えにより生成される場合、オステオカルシンは、融合タンパク質、例えば、ＧＳＴ−オステオカルシン融合タンパク質として生成されてもよい。
【０１５０】
本発明の方法において使用され得る低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン分子は、別の生物に由来するタンパク質を含む、ヒトオステオカルシンと実質的に相同性のタンパク質、すなわちヒトオステオカルシンのオルソログを含む。１つの特定のオルソログはマウスオステオカルシンである。マウスオステオカルシン遺伝子１  ｃＤＮＡは配列番号３であり、マウスオステオカルシン遺伝子２  ｃＤＮＡは配列番号４であり、マウスオステオカルシン遺伝子１および遺伝子２のアミノ酸配列は配列番号５である。
【０１５１】
本明細書に使用される場合、２つのタンパク質は、それらのアミノ酸配列が少なくとも約７０〜７５％相同である場合、実質的に相同である。典型的に、相同の程度は、少なくとも約８０〜８５％、最も典型的には、少なくとも約９０〜９５％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上である。２つのアミノ酸配列または核酸配列間の「相同性」は、本明細書に開示されるアルゴリズムを使用することによって決定され得る。これらのアルゴリズムはまた、２つのアミノ酸配列または核酸配列間の同一パーセントを決定するために使用され得る。
【０１５２】
本発明の特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、配列番号２のヒトオステオカルシンまたは少なくとも８アミノ酸長である配列番号２の部分と少なくとも８０％の相同性を共有するオステオカルシン分子である。別の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、配列番号２のヒトオステオカルシンまたは少なくとも８アミノ酸長である配列番号２の部分と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性を共有するオステオカルシン分子である。相同配列は実質的に同一であるこれらの配列を含む。特定の実施形態において、相同性または同一性は成熟ヒトオステオカルシンの全長に対してである。
【０１５３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の相同性パーセントまたは同一性パーセントを決定するために、配列は最適な比較目的のために並べられる（例えば、ギャップが最適な整列のために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の１つまたは両方に組み込まれてもよく、非相同配列は比較目的のために無視されてもよい）。好ましくは、比較目的のために並べられる参照配列の長さは、参照配列が比較される配列の長さの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％またはそれ以上である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合、分子はその位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために組み込まれる必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【０１５４】
本発明はまた、より低い程度の同一性を有するが、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンによって実施される同じ機能の１つ以上を実施するように十分な類似性を有するポリペプチドを包含する。保存されたアミノ酸置換を考慮することによって類似性が決定される。そのような置換は、ポリペプチドにおける所与のアミノ酸を同様の特性の別のアミノ酸により置換するものである。保存可能な置換は表現型の上ではサイレントである可能性がある。どのアミノ酸の変化が表現型の上ではサイレントである可能性があるかについての指針は、Ｂｏｗｉｅら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０において見出すことができる。
【０１５５】
保存可能な置換の例は、疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの中で、１つを別のものに置き換えること；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒを交換すること；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕを交換すること；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換；塩基性残基Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＡｒｇの交換；芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒの間の置き換え；極性残基ＧｌｎおよびＡｓｎの交換；ならびに小さな残基Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの交換である。
【０１５６】
２つのオステオカルシンポリペプチド間の配列の比較ならびに同一性パーセントおよび相同性の決定は、数学アルゴリズムを使用して成し遂げられ得る。例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ，ＨＧ、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖａｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照のこと。このような数学アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７に記載されている。
【０１５７】
２つのオステオカルシンアミノ酸配列間の同一性または相同性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３アルゴリズムを使用して決定され得る。
【０１５８】
本発明によれば、実質的に相同性のオステオカルシンはまた、高度にストリンジェントな条件下（例えば、６５℃での０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中でのフィルタ結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、ならびにＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２．１０．３）および機能的に等価の遺伝子産物のコード）；または中程度のストリンジェントな条件などの低いストリンジェントな条件下（例えば、４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９前出）、なおさらに生物学的に活性な低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンをコードする）でヒトオステオカルシン核酸配列とハイブリダイズできる核酸配列によってコードされるポリペプチドであってもよい。
【０１５９】
本発明による実質的に相同性のオステオカルシンはまた、ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃での０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中でのフィルタ結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら、ｅｄｓ．、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２．１０．３）および機能的に等価の遺伝子産物のコード）または中程度のストリンジェントな条件などの低いストリンジェントな条件下（例えば、４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９前出）、なおさらに生物学的に活性な低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンをコードする）でヒトオステオカルシン核酸配列と少なくとも７０〜７５％、典型的には少なくとも約８０〜８５％、最も典型的には少なくとも約９０〜９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列とハイブリダイズできる核酸配列によってコードされるポリペプチドであってもよい。
【０１６０】
ヒトオステオカルシンの生物学的に活性な断片または変異体は、天然のヒトオステオカルシンとは異なる数のアミノ酸を含有してもよいことが理解される。したがって、成熟ヒトオステオカルシンの位置１７、２１および２４に対応するアミノ酸残基の位置番号は、断片または変異体において異なっていてもよい。当業者は、この断片または変異体のアミノ酸配列と、成熟ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列との比較からこのような対応する位置を容易に認識するであろう。
【０１６１】
完全長オステオカルシン、成熟オステオカルシン、またはオステオカルシン断片もしくは変異体が、関連しないタンパク質またはポリペプチドと融合する、融合タンパク質に対応するペプチドもまた、本発明の範囲内であり、本明細書に開示されるオステオカルシンヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づいて設計され得る。このような融合タンパク質は、マーカー機能を与える酵素、蛍光タンパク質、または発光タンパク質との融合を含む。本発明の特定の実施形態において、融合タンパク質は、身体における特定の標的細胞または位置に対してオステオカルシンをターゲティングできるポリペプチドとの融合を含む。例えば、オステオカルシンポリペプチド配列は、前記リガンドに対する受容体を発現する細胞に対して融合タンパク質をターゲティングできるリガンド分子と融合されてもよい。特定の実施形態において、オステオカルシンポリペプチド配列は、哺乳動物の脳内の特定のニューロンに対して融合タンパク質をターゲティングできるリガンドと融合されてもよい。
【０１６２】
オステオカルシンはまた、薬物スクリーニングのため、または組換えタンパク質を作製するのに使用するためのキメラタンパク質の一部として作製されてもよい。それらのキメラタンパク質は、オステオカルシンと実質的に相同性ではないアミノ酸配列を有する異種ペプチドに結合したオステオカルシンペプチド配列を含む。異種ペプチドは、オステオカルシンのＮ末端またはＣ末端に融合されてもよいか、または内部に位置されてもよい。一実施形態において、融合タンパク質はオステオカルシン機能に影響を与えない。例えば、融合タンパク質は、オステオカルシン配列がＧＳＴ配列のＮ末端またはＣ末端に融合されるＧＳＴ融合タンパク質であってもよい。他の種類の融合タンパク質としては、限定されないが、酵素融合タンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼ融合物、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ−４融合物、ポリ−Ｈｉｓ融合物およびＩｇ融合物が挙げられる。このような融合タンパク質、特にポリ−Ｈｉｓ融合物は組換えオステオカルシンの精製を容易にすることができる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列を使用することによって増加され得る。したがって、融合タンパク質は、そのＮ末端において異種シグナル配列を含有してもよい。
【０１６３】
当業者は、オステオカルシンと共に使用するための周知の技術を適応する方法を理解する。例えば、欧州特許第０４６４５３３号は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）の様々な部分を含む融合タンパク質を開示している。Ｆｃ領域は療法および診断に有用であるので、結果として例えば、改善された薬物動態特性（例えば、欧州特許第０２３２２６２号を参照のこと）を生じる。創薬において、例えば、ヒトタンパク質は、アンタゴニストを特定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ領域と融合されている（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．８：５２−５８およびＪｏｈａｎｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１）。したがって、本発明の種々の実施形態はまた、オステオカルシンポリペプチドおよび種々のサブクラスの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＢ）の重鎖または軽鎖の定常領域の種々の部分を含有する可溶性融合タンパク質を利用する。特定の免疫グロブリンは、融合がヒンジ領域において起こる、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部分である。いくつかの使用のために、融合タンパク質をその意図する目的のために使用した後にＦｃ領域を除去することが望まれる。特定の実施形態において、Ｆｃ部分は、さらに組み込まれ、例えば、第Ｘａ因子で切断されてもよい、切断配列によって簡単な方法で除去されてもよい。
【０１６４】
キメラまたは融合タンパク質は標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片は、従来技術に従ってインフレームで一緒にライゲーションされ得る。別の実施形態において、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成器を含む従来技術によって合成されてもよい。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を生成するように、後でアニールされ、再増幅され得る、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して実施されてもよい（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴタンパク質）を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている。オステオカルシンをコードする核酸は、融合部分がインフレームでオステオカルシンと連結するように、このような発現ベクター内にクローニングされ得る。
【０１６５】
１つ以上の機能部位が、異なるアイソフォームに由来するか、または別の種由来の別のオステオカルシン分子に由来する、キメラオステオカルシンタンパク質が産生され得る。部位はまた、哺乳動物ゲノムにおいて発生するが、まだ発見または特徴付けられていないオステオカルシン関連タンパク質に由来してもよい。
【０１６６】
ポリペプチドは、多くの場合、一般に２０種の天然に存在するアミノ酸と称されている２０アミノ酸以外のアミノ酸を含有する。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシングおよび他の翻訳後修飾などの自然プロセスによって、または当該分野において周知の化学修飾技術によって修飾されてもよい。
【０１６７】
したがって、本発明の方法に有用なオステオカルシンポリペプチドはまた、遺伝コードによってコードされたものではない置換された天然に存在しないアミノ酸残基を含有する誘導体を包含し、ここで置換基が含まれるか、成熟ポリペプチドが、ポリペプチド（例えば、ポリエチレングリコール）の半減期を増加させるための化合物などの別の化合物と融合されるか、あるいは追加のアミノ酸が、リーダーもしくは分泌配列またはオステオカルシンポリペプチドもしくはプロ−タンパク質配列を精製するための配列などのオステオカルシンポリペプチドと融合される。
【０１６８】
低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、その安定性、半減期、摂取または有効性を増加させるために医薬品化学における公知の方法に従って修飾されてもよい。公知の修飾としては、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニン化などのトランスファーＲＮＡにより媒介されるアミノ酸のタンパク質への付加、およびユビキチン化が挙げられる。
【０１６９】
本発明の特定の実施形態において、血中半減期を増加させるための手段として、残基Ａｒｇ４３においてタンパク質分解に対する感受性を低減させるために、修飾がオステオカルシンに対してなされてもよい。このような修飾は、例えば、レトロエナンチオアイソマー、Ｄ−アミノ酸、または他のアミノ酸類似体の使用を含む。
【０１７０】
Ｎ末端アミノ基のアシル化は、ヒドロオロト酸などの親水性化合物を使用して、またはメチルイソシアネートもしくはイソプロピルイソシアネートなどの適切なイソシアネートとの反応によって成し遂げられて、Ｎ末端において尿素部分を生じ得る。オステオカルシン誘導体の作用期間を増加させる他の薬剤もまた、Ｎ末端に連結されてもよい。
【０１７１】
還元的アミノ化は、アンモニアがアルデヒドまたはケトンで濃縮されて、後でアミンに還元されるイミンを形成するプロセスである。還元的アミノ化は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンおよびその断片または変異体をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートするための有用な方法である。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンならびにその断片および変異体へのＰＥＧの共有結合は、増加した水溶性、変化した生物学的利用能、薬物動態、免疫原性、および生物活性を有するコンジュゲートを生じ得る。例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら、１９９８、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１４４６−１４４９を参照のこと。
【０１７２】
グリコシル化、脂質結合、硫酸化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化などの、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンならびにその断片および変異体に適用され得るいくつかの特に一般的な修飾は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）などの最も基本的なテキストに記載されている。Ｗｏｌｄ，Ｆ．、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２などの、多くの詳細なレビューがこの研究に利用可能である。
【０１７３】
また周知のように、ポリペプチドは、必ずしも完全に線形ではない。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝していてもよく、それらは、一般に、天然プロセシング事象および天然に発生しないヒトによる操作によってもたらされた事象を含む翻訳後事象の結果として、分枝しているか、または分枝していない環状であってもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳天然プロセスによって、および合成法によって合成されてもよい。このような非線形ポリペプチドを調製するための周知技術は、非線形オステオカルシンポリペプチドを生成するように当業者によって適合され得る。
【０１７４】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンならびにその断片および変異体におけるいずれの場所で発生してもよい。共有結合修飾による、ポリペプチドにおけるアミノ基もしくはカルボキシル基、またはその両方の遮断は、天然に存在するおよび合成ポリペプチドにおいて一般的であり、本発明に使用される低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその断片および変異体に適用され得る。例えば、ほとんどいつもタンパク質分解処理の前に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において作製されるポリペプチドのアミノ末端残基は、Ｎ−ホルミルメチオニンである。このように、アミノ末端残基にＮ−ホルミルメチオニンを有する低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンならびにその断片および変異体の使用は本発明の範囲内である。
【０１７５】
本発明の範囲内である種々のタンパク質修飾の簡単な説明を以下の表に記載する：
【０１７６】
【表１−１】
2017536368.tif 000003
【０１７７】
【表１−２】
2017536368.tif 000004
【０１７８】
【表１−３】
2017536368.tif 000005
【０１７９】
【表１−４】
2017536368.tif 000006
【０１８０】
【表１−５】
2017536368.tif 000007
【０１８１】
【表１−６】
2017536368.tif 000008
【０１８２】
【表１−７】
2017536368.tif 000009
【０１８３】
【表１−８】
2017536368.tif 000010
【０１８４】
本発明はまた、低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどを用いて、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体のカルボン酸官能基をエステル化することによって生成され得る、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体のプロドラッグの使用を包含する。エステルではない低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体のプロドラッグの使用もまた、意図される。例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体の薬学的に許容可能な炭酸塩、チオ炭酸塩、Ｎ−アシル誘導体、Ｎ−アシルオキシアルキル誘導体、第三級アミンの第四級誘導体、Ｎ−マンニッヒ塩基、シッフ塩基、アミノ酸コンジュゲート、リン酸エステル、金属塩およびスルホン酸エステルもまた、意図される。いくつかの実施形態において、プロドラッグは、生物加水分解性部分（例えば、生物加水分解性アミド、生物加水分解性カルバミン酸塩、生物加水分解性炭酸塩、生物加水分解性エステル、生物加水分解性リン酸塩、または生物加水分解性ウレイド類似体）を含有する。本明細書に開示される低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体のプロドラッグを調製するためのガイドラインは、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ａ．Ｅｄ．、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５；Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−ＬａｒｓｅｎおよびＨ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｅｄ．、１９９１、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５、ｐａｇｅｓ  １１３−１９１；ならびにＢｕｎｄｇａａｒｄ，Ｈ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ、１９９２、８、ｐａｇｅｓ  １−３８などの文献に見出すことができる。
【０１８５】
本発明の方法を実施するために、例えば、オステオカルシンをコードするｃＤＮＡ配列を組換えにより発現することによって、オステオカルシンを組換えにより発現することが望まれ得る。ヒトオステオカルシンのｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列は、配列番号１および配列番号２に表される。オステオカルシンヌクレオチド配列は当業者に公知の様々な異なる方法を使用して単離できる。例えば、オステオカルシンを発現することが知られている組織からＲＮＡを使用して構築されたｃＤＮＡライブラリーは、標識されたオステオカルシンプローブを使用してスクリーニングすることができる。あるいは、ゲノムライブラリーは、オステオカルシンをコードする核酸分子を誘導するようにスクリーニングすることができる。さらに、オステオカルシン核酸配列は、既知のオステオカルシンヌクレオチド配列に基づいて設計される２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することによって誘導することができる。反応についての鋳型は、オステオカルシンを発現することが知られている細胞株または組織から調製されるｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡであってもよい。
【０１８６】
オステオカルシンポリペプチドおよびペプチドは化学的に合成できる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）が、オステオカルシンおよび完全オステオカルシン自体に由来する大きなポリペプチドは、有益には、核酸を発現するための当該分野において周知の技術を使用して組換えＤＮＡ技術によって生成できる。このような方法は、オステオカルシンヌクレオチド配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用できる。これらの方法は、例えば、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組換えを含む。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、前出に記載される技術を参照のこと。
【０１８７】
様々な宿主発現ベクター系が、オステオカルシンヌクレオチド配列を発現するために利用され得る。特定の実施形態において、オステオカルシンペプチドまたはポリペプチドが分泌され、培養培地から回収できる。
【０１８８】
オステオカルシンタンパク質の正確な修飾、プロセシングおよび細胞内局在化が発生することを確実にするために適切な発現系が選択され得る。この目的で、細菌宿主細胞がオステオカルシンの発現に有用であり、それ自体の細胞はオステオカルシンをカルボキシル化することはできない。
【０１８９】
単離されたオステオカルシンは、それを天然に発現する細胞、例えば骨芽細胞から精製できるか、またはオステオカルシンを天然に発現するが、オステオカルシンを過剰生産するように組換えにより修飾されている細胞から精製できるか、またはオステオカルシンを天然に発現しないが、オステオカルシンを発現するように組換えにより修飾されている細胞から精製できる。特定の実施形態において、組換え細胞は内因性オステオカルシン遺伝子の発現を活性化するように操作されている。例えば、国際特許公開公報ＷＯ９９／１５６５０およびＷＯ００／４９１６２は、遺伝子発現のランダム活性化（ｒａｎｄｏｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＲＡＧＥ）と呼ばれる内因性遺伝子を発現する方法を記載しており、それは、内因性オステオカルシンの発現を活性化または増加させるために使用され得る。ＲＡＧＥ方法は、下流の内因性遺伝子の発現を活性化させるための調節配列の非相同性組換えに関与する。あるいは、国際特許公開公報ＷＯ９４／１２６５０、ＷＯ９５／３１５６０、およびＷＯ９６／２９４１１、ならびに米国特許第５，７３３，７６１号および米国特許第６，２７０，９８５号は、ターゲティング配列、調節配列、エクソン、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡ構築物の相同組換えに関与する内因性遺伝子の発現を増加させる方法を記載している。相同組換えにより、下流の内因性遺伝子が発現される。上述の特許に記載される内因性遺伝子を発現する方法は、本明細書において参照により明確に組み込まれる。
【０１９０】
治療剤が低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体である本発明の方法の特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体は、約０．５μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約９０ｍｇ／ｋｇ／日、約５μｇ／ｋｇ／日〜約８５ｍｇ／ｋｇ／日、約１０μｇ／ｋｇ／日〜約８０ｍｇ／ｋｇ／日、約２０μｇ／ｋｇ／日〜約７５ｍｇ／ｋｇ／日、約５０μｇ／ｋｇ／日〜約７０ｍｇ／ｋｇ／日、約１５０μｇ／ｋｇ／日〜約６５ｍｇ／ｋｇ／日、約２５０μｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約５００μｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約１５ｍｇ／ｋｇ／日〜約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１６ｍｇ／ｋｇ／日、または約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日の投薬範囲で患者に投与される。
【０１９１】
治療剤が低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体である本発明の方法の特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体は、約０．５μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約８０μｇ／ｋｇ／日、約３μｇ／ｋｇ／日〜約５０μｇ／ｋｇ／日、または約３μｇ／ｋｇ／日〜約３０μｇ／ｋｇ／日の投薬範囲で患者に投与される。
【０１９２】
治療剤が低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体である本発明の方法の特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンまたはその誘導体もしくは変異体は、約０．５ｎｇ／ｋｇ／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ／日、約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約８０ｎｇ／ｋｇ／日、約３ｎｇ／ｋｇ／日〜約５０ｎｇ／ｋｇ／日、または約３ｎｇ／ｋｇ／日〜約３０ｎｇ／ｋｇ／日の投薬範囲で患者に投与される。
【０１９３】
γ−カルボキシラーゼ、ＰＴＰ−１Ｂ、および／またはＯＳＴ−ＰＴＰの阻害剤を含む組成物
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法に有用な医薬組成物は、γ−カルボキシラーゼ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはＯＳＴ−ＰＴＰの発現または活性を低下させる阻害剤を含む。好ましくは、γ−カルボキシラーゼ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはＯＳＴ−ＰＴＰの生物活性は阻害される。阻害剤は、抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル）もしくは抗体の断片、小分子、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸（例えば、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）であってもよい。
【０１９４】
特定の実施形態において、阻害剤は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＯＳＴ−ＰＴＰの活性を低下させる。他の実施形態において、阻害剤は、以前に記載されているように、配列番号１１のアミノ酸配列と実質的に相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を有するＯＳＴ−ＰＴＰの活性を低下させる。
【０１９５】
特定の実施形態において、阻害剤は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するヒトＰＴＰ−１Ｂの活性を低下させる。他の実施形態において、阻害剤は、以前に記載されているように、配列番号１７のアミノ酸配列と実質的に相同または実質的に同一であるアミノ酸配列を有するＰＴＰ−１Ｂの活性を低下させる。
【０１９６】
特定の実施形態において、阻害剤は、配列番号７のアミノ酸配列を有するヒトγ−カルボキシラーゼの活性を低下させる。他の実施形態において、阻害剤は、配列番号７と実質的に相同または同一であるアミノ酸配列を有するγ−カルボキシラーゼの活性を低下させる。
【０１９７】
ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、およびγ−カルボキシラーゼの小分子阻害剤
特定の実施形態において、薬剤は小分子である。「小分子」とは、１００より大きく、約２，５００ダルトン未満、好ましくは５００ダルトン未満の分子量の有機化合物を意味する。このような小分子は、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼの生物活性を阻害する。
【０１９８】
小分子阻害剤は、ビタミンＫの阻害剤として作用する薬剤を含んでもよい。哺乳動物におけるフレイルを治療するために、ワルファリンならびにクマディンおよび他の誘導体を含む、他のビタミンＫ阻害剤が、γ−カルボキシラーゼの阻害から利益を受ける患者に投与されてもよい。本発明の特定の実施形態において、小分子ワルファリンはγ−カルボキシラーゼの活性を阻害するために使用されてもよい。ワルファリン誘導体は、アセノクマロール、フェンプロクモンおよびフェニンジオンによって例示される。ワルファリンおよび他のクマディン誘導体はオステオカルシンのビタミンＫ依存性γ−カルボキシル化を遮断するので、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させる。
【０１９９】
他の阻害剤は、γ−カルボキシラーゼのチオール特異的阻害剤を含む。γ−カルボキシラーゼのＣｙｓおよびＨｉｓ残基はγ−カルボキシラーゼのカルボキシラーゼ機構に関与し、酵素が、チオール特異的阻害剤、例えばＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）および水銀剤、例えばｐ−ヒドロキシ水銀安息香酸（ｐＨＭＢ）によって阻害されることが観察される。これらの阻害剤のさらなる非限定的な例としては、５，５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）、ヨードアセトアミド（ＩＡ）、Ｎ−フェニルマレイミド（ＰｈｅＭ）、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミド（ＰｙｒＭ）、ナフタレン−１，５−ジマレイミド（ＮＤＭ）、Ｎ，Ｎ’−（１，２−フェニレン）ジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ，Ｎ’−１，４−フェニレンジマレイミド（ｐＰＤＭ）、Ｎ，Ｎ’−１，３−フェニレンジマレイミド（ｍＰＤＭ）、１，１−（メチレンジ−４，１−フェニレン）ビスマレイミド（ＢＭ）、４−（Ｎ−マレイミド）フェニルトリメチルアンモニウム（ＭＰＴＭ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−マレイミドプロピオニル）−２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジアミン（ＢＭＰ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、ジエチルピロカルボネート、ｐ−クロロ水銀安息香酸およびチオスルフィン酸が挙げられる。これらの阻害剤はまた、例えば、ＢＳＡまたはアミノデキストランなどとのコンジュゲートまたは誘導体として提供されてもよい。
【０２００】
ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、およびγ−カルボキシラーゼの抗体阻害剤
本発明はまた、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼポリペプチドのエピトープに結合でき、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼの活性を阻害できる、１つの抗体または複数の抗体、ならびにその生物学的に活性な断片または変異体を含む組成物を提供する。
【０２０１】
その活性を減少させるＯＳＴ−ＰＴＰに対する抗体が治療的に使用されてもよい。特定の実施形態において、ＯＳＴ−ＰＴＰに対する抗体はＯＳＴ−ＰＴＰの細胞外ドメインに結合する。
【０２０２】
特定の実施形態において、ＯＳＴ−ＰＴＰに対する抗体は、配列番号１１のマウスＯＳＴ−ＰＴＰまたは配列番号１１と実質的に相同または同一であるアミノ酸配列を有するＯＳＴ−ＰＴＰにおけるエピトープに結合する。他の実施形態において、ＯＳＴ−ＰＴＰに対する抗体は、配列番号１１と少なくとも７０％相同または同一であるアミノ酸配列を有するＯＳＴ−ＰＴＰにおけるエピトープに結合する。
【０２０３】
ヒトＯＳＴ−ＰＴＰは、当該分野において公知の方法によりマウスＯＳＴ−ＰＴＰ（配列番号１０）またはラットＯＳＴ−ＰＴＰ（配列番号１４）のヒトオルソログを単離することによって得られ得る。例えば、ヒト骨芽細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、そのライブラリー由来のｃＤＮＡクローンをマウスプローブとハイブリダイズすることによってヒトＯＳＴ−ＰＴＰ  ｃＤＮＡを同定することができる。マウスプローブはマウスＯＳＴ−ＰＴＰ（配列番号１０）の一部に基づき得る。あるいは、マウス配列に基づいたプライマーを使用してＰＣＲを使用して、ヒトＯＳＴ−ＰＴＰ遺伝子を得ることができる。
【０２０４】
その活性を減少させるヒトＰＴＰ−１Ｂに対する抗体が本発明の方法において治療的に使用され得る。特定の実施形態において、ヒトＰＴＰ−１Ｂに対する抗体はヒトＰＴＰ−１Ｂの細胞外ドメインに結合する。
【０２０５】
特定の実施形態において、ヒトＰＴＰ−１Ｂに対する抗体は、配列番号１７のヒトＰＴＰ−１Ｂにおけるエピトープまたは配列番号１７と実質的に相同もしくは同一であるアミノ酸配列を有するＯＳＴ−ＰＴＰに結合する。他の実施形態において、ヒトＰＴＰ−１Ｂに対する抗体は、配列番号１７と少なくとも７０％相同または同一であるアミノ酸配列を有するヒトＰＴＰ−１Ｂにおけるエピトープに結合する。
【０２０６】
γ−カルボキシラーゼは細胞内タンパク質であるので、それに対する抗体または抗体の断片が、好ましくは、抗体、断片または変異体を、γ−カルボキシラーゼを発現する標的細胞、例えば、骨芽細胞の内部へ送達する技術と組み合わせる場合、治療的に使用される。オステオカルシンに対する抗体または抗体断片もしくは変異体は、同様に、抗体または断片を標的細胞の内部へ送達する技術と共に使用されてもよく、また、診断および薬物スクリーニングアッセイにおいて使用されてもよい。
【０２０７】
特定の実施形態において、本発明は、マウスＯＳＴ−ＰＴＰの位置１３１６またはヒトＯＳＴ−ＰＴＰの対応する位置においてアミノ酸を含む、ＯＳＴ−ＰＴＰにおけるエピトープを認識する抗体、抗体の断片または変異体を提供する。特定の実施形態において、これらの抗体、抗体の断片または変異体は、γ−カルボキシラーゼを活性化するＯＳＴ−ＰＴＰの能力を遮断または阻害する。特定の実施形態において、これらの抗体または断片の使用は、γ−カルボキシラーゼを活性化するその能力の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または実質的に全てを喪失しているＯＳＴ−ＰＴＰを生じる。
【０２０８】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の抗原決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループからなり、典型的に、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。エピトープは、通常、少なくとも５個の連続したアミノ酸を有するが、いくつかのエピトープは、それらを含有するタンパク質のフォールディングによって一緒にもたらされる不連続なアミノ酸によって形成される。
【０２０９】
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「複数の抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖Ｆｖ抗体断片、Ｆａｂ断片、およびＦ（ａｂ’）２断片を含む。ポリクローナル抗体は特定の抗原に対して特異的である抗体分子の異種集団であり、一方でモノクローナル抗体は、抗原内に含まれる特定のエピトープに対する抗体の同種集団である。モノクローナル抗体は本発明において特に有用である。
【０２１０】
目的のポリペプチド（例えば、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼ）に対して特異的結合親和性を有する抗体断片は公知の技術によって生成され得る。そのような抗体断片としては、限定されないが、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂ断片が挙げられる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得る。例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと。一本鎖Ｆｖ抗体断片は、アミノ酸架橋（例えば、１５〜１８アミノ酸）を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を連結することによって形成され、一本鎖ポリペプチドを生じる。一本鎖Ｆｖ抗体断片は、米国特許第４，９４６，７７８号に開示されているものなどの標準的な技術によって産生され得る。
【０２１１】
一旦産生されると、抗体またはその断片は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または放射免疫測定（ＲＩＡ）を含む、標準的な免疫学的検定法によって標的ポリペプチドの認識について試験され得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）におけるＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照のこと。
【０２１２】
本明細書において使用される免疫学的検定、免疫組織化学、ＲＩＡ、ＩＲＭＡは、オステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、γ−カルボキシラーゼ、ビタミンＫ、またはそれらの断片もしくは変異体に特異的に結合する抗体を含む、種々の抗体の生成に基づく。特に試料中のオステオカルシンの量を定量するために抗体および抗体を使用する方法もまた、米国特許第５，６８１，７０７号に記載されている。米国特許第５，６８１，７０７号は、オステオカルシンのＮ末端２０アミノ酸、またはＣ末端１４アミノ酸に結合する抗体を開示している。抗ＯＳＴ−ＰＴＰ抗体は市販されている。
【０２１３】
一実施形態において、その活性を減少させるＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼに対する抗体は、フレイルを有する患者の治療に有用である。
【０２１４】
ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、およびγ−カルボキシラーゼの核酸阻害剤
本発明の他の実施形態は、発現ならびにそれによりオステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、および／またはγ−カルボキシラーゼの生物活性を低下させるか、または阻害するアンチセンス核酸または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を対象とする。オステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、および／またはγ−カルボキシラーゼをコードするｃＤＮＡ配列は本明細書に記載されている。これらの配列に基づいて、発現を停止または低下させるためにオステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、および／またはγ−カルボキシラーゼをコードするそれぞれの遺伝子またはｍＲＮＡと十分にハイブリダイズするアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、当該分野において公知の方法を使用して、容易に設計され、操作され得る。
【０２１５】
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法において使用するためのアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号６のヒトγ−カルボキシラーゼ核酸配列に対して、ストリンジェントな条件下で結合するものを含む。本発明のさらに別の実施形態において、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１０のＯＳＴ−ＰＴＰ核酸配列、または配列番号１０と実質的に相同である配列に対して、ストリンジェントな条件下で結合するものである。
【０２１６】
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法に使用するためのアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１６のヒトＰＴＰ−１Ｂ核酸配列、または配列番号１６と実質的に相同である配列に対して、ストリンジェントな条件下で結合するものを含む。
【０２１７】
アンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、様々な疾患を治療するために哺乳動物において治療的に使用される。例えば、Ａｇｒａｗａｌ  ＆  Ｚｈａｏ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．２：５１９−５２８；Ａｇｒａｗａｌ  ＆  Ｚｈａｏ、１９９７、ＣＩＢＡ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９：６０−７８；およびＺｈａｏら、１９９８、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８：４５１−４５８を参照のこと。それらの全内容は、本明細書に完全に記載されているかのように本明細書に参照により組み込まれる。アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ）、および他の高分子アンチセンス化合物（例えば、天然に存在する核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間結合ならびに同様に機能する天然に存在しない部分から構成されるオリゴヌクレオチド化合物）は、遺伝子またはその転写産物との塩基対であってもよい。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０：２００４−２０１１および米国特許第６，８２８，１５１号は、アンチセンス核酸およびそれらの製剤を作製し、使用する方法を記載しており、それらの全内容は、完全に本明細書に記載されているかのように本明細書に参照により組み込まれる。前述の文献の開示は本発明の方法に使用するために当業者により適合され得る。
【０２１８】
アンチセンス核酸を作製する方法は当該分野において周知である。哺乳動物におけるフレイルを治療するために、細胞または組織を１つ以上のアンチセンス化合物または組成物と接触させることによって、細胞または組織におけるＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ１Ｂ、ならびにγ−カルボキシラーゼ遺伝子およびｍＲＮＡの発現を調節する方法が本発明によってさらに提供される。本明細書に使用される場合、「標的核酸」という用語は、オステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼおよびＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）をコードするＤＮＡを包含する。その標的核酸との核酸オリゴマー化合物の特異的ハイブリダイゼーションは標的核酸の正常な機能を干渉する。標的核酸と特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸のこの機能の調節は、一般に、「アンチセンス」と称される。干渉されるＤＮＡの機能は複製および転写を含む。干渉されるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、およびＲＮＡに関与し得るか、またはＲＮＡによって促進され得る触媒活性などの全ての生体機能を含む。このような標的核酸機能を干渉する全体的な効果は、ＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現の調節である。本発明の文脈において、「調節」とは、オステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰおよび／またはγ−カルボキシラーゼについての遺伝子またはｍＲＮＡの発現の低下または阻害を意味する。ＤＮＡは好ましいアンチセンス核酸である。
【０２１９】
ターゲティングプロセスは、所望の阻害効果が達成されるように生じるアンチセンス相互作用についてのオステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、および／またはγ−カルボキシラーゼをコードする標的ＤＮＡまたはＲＮＡ内の１つの部位または複数の部位の決定を含む。本発明の文脈内で、特定の遺伝子内部位は、オステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼ、好ましくはヒトオステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼについてのｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを包含する領域である。当該分野において公知であるように、翻訳開始コドンは、典型的に、５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」と称される。少数の遺伝子は、インビボで機能することが示されているＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧ、ならびに５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有する。したがって、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、各場合において開始アミノ酸が典型的に真核生物におけるメチオニンであったとしても、多くのコドン配列を包含し得る。真核性遺伝子が２つ以上の代替の開始コドンを有し得ることも当該分野において公知であり、それらの任意の１つが、好ましくは、特定の細胞種類もしくは組織において、または特定のセットの条件下で翻訳開始のために利用され得る。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するためにインビボで使用される１つのコドンまたは複数のコドンを指す。慣例の実験により、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡの最適配列が決定される。
【０２２０】
遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は、３つの配列、すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ、５’ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）のうちの１つを有し得ることも当該分野において公知である。
【０２２１】
「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）において約２５〜約５０の連続するヌクレオチドを包含するこのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を指す。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）において約２５〜約５０の連続するヌクレオチドを包含するこのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を指す。
【０２２２】
当該分野において公知である、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」とは、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指し、また、効果的に標的化され得る領域でもある。他の標的領域は、翻訳開始コドンから５’方向におけるｍＲＮＡの部分を指し、したがって遺伝子上のｍＲＮＡまたは対応するヌクレオチドの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含むことが当該分野において知られている、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および翻訳終止コドンから３’方向におけるｍＲＮＡの部分を指し、したがって遺伝子上のｍＲＮＡまたは対応するヌクレオチドの翻訳終止コドンと３’末端との間にヌクレオチドを含むことが当該分野において知られている、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。
【０２２３】
変異体が翻訳を開始または停止する代替のシグナルの使用により産生され得ること、ならびにｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡが１つより多い開始コドンまたは終止コドンを有し得ることも当該分野において公知である。代替の開始コドンを使用するｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに由来する変異体は、そのｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「代替の開始変異体」として知られている。代替の停止コドンを使用するこれらの転写産物は、そのｐｒｅ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「代替の停止変異体」として知られている。１つの特定の種類の代替の停止変異体は、複数の転写産物が、転写機構によって「ポリＡ停止シグナル」の１つの代替の選択から生じ、それによって特有のポリＡ部位を終了する転写産物を生じる「ポリＡ変異体」である。
【０２２４】
１つ以上の標的部位が同定されると、標的と実質的に相補的である、すなわち、遺伝子発現および転写またはｍＲＮＡ翻訳を阻害する所望の効果を得るように、十分にハイブリダイズし、十分に特異性を有する核酸が選択される。
【０２２５】
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の、ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい、水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成により対をなす相補的核酸塩基である。本明細書に使用される「相補的」とは、２つのヌクレオチド間で正確に対をなす能力を指す。例えば、核酸の特定の位置におけるヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同じ位置においてヌクレオチドと水素結合できる場合、核酸およびＤＮＡまたはＲＮＡはその位置において互いに相補的であるとみなされる。核酸およびＤＮＡまたはＲＮＡは、各分子における対応する位置の十分な数が、互いと水素結合し得るヌクレオチドによって占められる場合、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、安定および特異的な結合が核酸とＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で生じるように、相補性または正確な対合の十分な程度を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことは当該分野において理解される。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に対する化合物の結合が、機能の喪失を生じるように標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨げる場合、および特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合、生理学的条件下、およびインビトロアッセイの場合、アッセイが実施される条件下で非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するように十分な程度の相補性が存在する場合、アンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズ可能である。
【０２２６】
アンチセンス核酸は動物およびヒトにおける疾患状態の治療における治療用部分として利用されている。リボザイムを含むアンチセンス核酸薬物は多数の臨床試験においてヒトに対して安全および効果的に投与されている。このように、核酸は、例えば、オステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、および／またはγ−カルボキシラーゼの発現を調節するために、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療レジメンにおいて有用であるように構成され得る有用な治療用部分であり得ることが確立されている。
【０２２７】
本発明の文脈において核酸は「オリゴヌクレオチド」を含み、これは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間（骨格）結合から構成されるオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、多くの場合、例えば、ヌクレアーゼの存在下で向上した細胞摂取、核酸標的に対する向上した親和性および増加した安定性などの望ましい特定のために天然型より好ましい。
【０２２８】
アンチセンス核酸がアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、限定されないが、オリゴヌクレオチド模倣物を含む、他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは、約８〜約５０核酸塩基（すなわち、約８〜約５０の連結したヌクレオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、約１２〜約３０核酸塩基を含むアンチセンス核酸である。アンチセンス化合物は、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）核酸（オリゴザイム）、および標的核酸とハイブリダイズし、その発現を調節する他の短い触媒ＲＮＡまたは触媒核酸を含む。
【０２２９】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技術によって簡便および慣例的に作製され得る。このような合成のための機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含む、いくつかの供給業者によって販売されている。当該分野において公知であるこのような合成のための任意の他の手段が、さらにまたは代替として利用されてもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの核酸を調製するために同様の技術を使用することは周知である。
【０２３０】
本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療および予防のため、ならびに研究用試薬およびキットとして利用され得る。治療に関して、フレイルを有する疑いのある動物、好ましくはヒトが、本発明によるアンチセンス化合物を投与することによって治療される。本発明の方法に有用な化合物は、有効量のアンチセンス化合物を適切な薬学的に許容可能な希釈剤または担体に加えることによって医薬組成物に製剤化され得る。本発明のアンチセンス化合物および方法はまた、フレイルの進行を遅らせるのにも有用である。
【０２３１】
本発明はまた、哺乳動物におけるフレイルを治療するためのｓｉＲＮＡの使用を包含する。米国特許出願公開第２００４／００２３３９０号（その全内容は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られているプロセスによって多くの生物において配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導できることを教示している。しかしながら、哺乳動物細胞において、３０塩基対またはそれ以上であるｄｓＲＮＡは、タンパク質合成の停止およびさらにアポトーシスによる細胞死を誘発する配列非特異的反応を誘導できる。最近の研究により、ＲＮＡ断片がＲＮＡｉの配列特異的メディエーターであることが示されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８）。これらの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による遺伝子発現の干渉は、現在、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ、植物において、ならびにマウス胚幹細胞、卵母細胞および初期胚において遺伝子をサイレンシングするための天然に存在するストラテジーとして認識されている（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３２：７９−８８；Ｔｉｍｍｏｎｓ  ＆  Ｆｉｒｅ、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：８５４；ＷｉａｎｎｙおよびＺｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ、２０００、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：７０−７５；Ｓｖｏｂｏｄａら、２０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：４１４７−４１５６）。
【０２３２】
哺乳動物細胞培養において、遺伝子発現のｓｉＲＮＡにより媒介される減少は、細胞を合成ＲＮＡ核酸でトランスフェクトすることによって達成されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８）。米国特許出願公開第２００４／００２３３９０号（その全内容は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる）は、目的の遺伝子に対して標的化された低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたｐｏｌ  ＩＩプロモーターを含有する発現カセットを含有するウイルスベクターを使用した例示的な方法を提供する。
【０２３３】
本明細書に使用される場合、ＲＮＡｉはＲＮＡ干渉のプロセスである。典型的なｍＲＮＡはタンパク質の約５，０００コピーを産生する。ＲＮＡｉは、好ましくは、オステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼをコードするｍＲＮＡによって作製されたタンパク質コピーを干渉するか、またはその数を顕著に減少させるプロセスである。例えば、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、干渉される標的ｍＲＮＡのタンパク質コードヌクレオチド配列と相補的になり、一致するように操作される。本発明の特定の実施形態において、細胞内送達後、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と会合し、塩基対合相互作用により標的ｍＲＮＡ（オステオカルシン、γ−カルボキシラーゼ、ＰＴＰ−１ＢまたはＯＳＴ−ＰＴＰをコードするｍＲＮＡなど）に結合し、それを分解する。ＲＩＳＣは、標的化ｍＲＮＡのさらなるコピーを分解できるままである。低分子ヘアピンＲＮＡおよびより長いＲＮＡ分子などのＲＮＡの他の形態が本発明の方法において使用されてもよい。より長い分子は、例えば、アポトーシスを引き起こし、インターフェロン反応を誘導することによって細胞死を引き起こす。細胞死は哺乳動物におけるＲＮＡｉを達成するのに主要なハードルであった。なぜなら、３０ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ転写産物の非特異的分解および宿主細胞の全体的な停止を生じる防御機構を活性化したからである。約２０〜約２９ヌクレオチドを使用して、哺乳動物細胞における遺伝子特異的抑制を媒介するｓｉＲＮＡはこの障害を克服するように見える。これらのｓｉＲＮＡは、遺伝子抑制を引き起こすのに十分に長いが、インターフェロン反応を誘導する長さではない。本発明の特定の実施形態において、抑制するための標的は、オステオカルシンｍＲＮＡ、ＯＳＴ−ＰＴＰ  ｍＲＮＡ、ＰＴＰ−１Ｂ  ｍＲＮＡ、またはγ−カルボキシラーゼｍＲＮＡである。本発明の方法に有用なｓｉＲＮＡ分子は、配列番号１６のヒトＰＴＰ−１Ｂ配列、配列番号６のヒトγ−カルボキシラーゼ配列、または配列番号１０のマウスＯＳＴ−ＰＴＰ配列に対してストリンジェントな条件下で結合するこれらの配列を含む。本発明の方法に有用なｓｉＲＮＡ分子はまた、配列番号１６、配列番号６または配列番号１０に対して、８０％、８５％、９０％、または９５％相同である核酸に対してストリンジェントな条件下で結合するこれらの配列を含む。
【０２３４】
医薬組成物の製剤化および投与
本発明は、対象に投与するために医薬組成物に製剤化される、本明細書に記載されるポリペプチド、核酸、抗体、小分子および他の治療剤の使用を包含する。治療剤（「活性化合物」とも称される）が、対象、例えばヒトへの投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、ポリペプチド、核酸、抗体、小分子および薬学的に許容可能な担体を含む。好ましくは、このような組成物は、ヒトへ投与される場合、非発熱性である。
【０２３５】
本発明の医薬組成物は、γ−カルボキシラーゼおよびオステオカルシンに関与するＯＳＴ−ＰＴＰシグナル伝達経路またはＰＴＰ−１Ｂシグナル伝達経路を調節するのに十分な量で投与される。
【０２３６】
本明細書に使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、医薬投与に適合した、任意および全ての溶媒、結合剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合する限り、このような媒体が本発明の医薬組成物に使用されてもよい。補足的な活性化合物または治療剤もまた、組成物に組み込まれてもよい。本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、鼻腔内、皮下、経口、吸入、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。
【０２３７】
「投与する」という用語は、その広範な意味において使用され、本発明の組成物を対象へ導入する任意の方法を含む。これは、対象へ外因的に導入されているポリヌクレオチドの転写または翻訳によるようにインビボでポリペプチドまたはポリヌクレオチドを産生することを含む。このように、外因性組成物から対象において産生されるポリペプチドまたは核酸は、「投与する」という用語に含まれる。
【０２３８】
非経口、皮内、または皮下への適用のために使用される液剤または懸濁剤は以下の成分を含んでもよい：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与バイアル内に封入され得る。
【０２３９】
注射用の使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（治療剤が水溶性である場合）または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与に関して、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬ(登録商標)（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合、組成物は滅菌しなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで流体的でなければならない。製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合、必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。
【０２４０】
滅菌注射用溶液は、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要な量で活性化合物（例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンタンパク質または抗ＯＳＴ−ＰＴＰ抗体）を組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、活性化合物を、基礎分散媒体および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル内に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて、以前に濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２４１】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されてもよいか、または錠剤に圧縮されてもよい。治療される特定の状態に応じて、哺乳動物におけるフレイルを治療するための本発明の医薬組成物は、全身的または局所的に製剤化され、投与され得る。製剤化および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．）およびＧｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００）に見出すことができる。経口投与に関して、薬剤は、胃で存続するように腸溶性形態で含有され得るか、または公知の方法によってＧＩ管の特定の領域で放出されるようにさらにコーティングもしくは混合されてもよい。経口治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用されてもよい。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のための液体担体を使用して調製されてもよく、液体担体中の化合物は経口により適用され、排出され（ｓｗｉｓｈｅｄ）、吐かれるか、または飲み込まれてもよい。薬学的に適合性の結合剤、および／または補助物質は、組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、または同様の性質の化合物のいずれかを含有してもよい：微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ（登録商標）、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳＴＥＲＯＴＥＳ（登録商標）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味剤などの矯味矯臭剤。
【０２４２】
吸入による投与に関して、化合物は、適切な推進剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含有する、加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達されてもよい。
【０２４３】
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によってでもよい。経粘膜的または経皮的投与に関して、浸透される障壁に適した浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は一般に当該分野において公知であり、例えば、経粘膜投与に関して、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜的投与は鼻腔用スプレーまたは座薬の使用により達成され得る。経皮投与に関して、活性化合物は、一般に当該分野において公知である軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０２４４】
適切な場合、化合物はまた、直腸送達のための座剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の座剤基剤）または停留かん腸の形態で調製され得る。
【０２４５】
一実施形態において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤などの、身体からの急速な排せつに対して化合物を保護する担体で調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用されてもよい。このような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に得ることができる。リポソーム懸濁液（例えば、モノクローナル抗体と共に特定の細胞に対して標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に許容可能な担体として使用されてもよい。それらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２４６】
投与の容易性および投薬量の均一性のために単位投薬形態で経口または非経口組成物を製剤化することが特に有益である。本明細書に使用される「単位投薬形態」とは、治療される対象のために単一の投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位投薬形態についての仕様は、活性化合物の特有の性質および達成される特定の治療効果、ならびに個体を治療するためのこのような活性化合物を配合する分野における固有の制約により決定され、それらに直接依存する。
【０２４７】
以前に示されたように、薬剤は、ポンプによって連続して、または長時間にわたって日中の間に高頻度で投与されてもよい。特定の実施形態において、薬剤は、約０．３〜１００ｎｇ／時間、好ましくは約１〜７５ｎｇ／時間、より好ましくは約５〜５０ｎｇ／時間、さらにより好ましくは約１０〜３０ｎｇ／時間の割合で投与されてもよい。薬剤は、約０．１〜１００μｇ／時間、好ましくは約１〜７５μｇ／時間、より好ましくは約５〜５０μｇ／時間、さらにより好ましくは約１０〜３０μｇ／時間の割合で投与されてもよい。治療のために使用される抗体、タンパク質、またはポリペプチドの有効な投薬量は、特定の治療の過程にわたって増加または減少されてもよいこともまた、理解される。投薬量の変化は、生物試料、好ましくは血液または血清中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルをモニタリングすることの結果であり、それらから明らかになる。
【０２４８】
本発明の実施形態において、薬剤は、所望の用量の薬剤を所望の期間注入するために、浸透圧ポンプを使用して皮下に長期間の自動化薬物送達によって送達され得る。インスリンポンプは、広範に利用可能であり、長期間にわたってインスリンを自動的に送達するために糖尿病患者によって使用される。このようなインスリンポンプは、本発明の方法における使用のための薬剤を送達するように適合され得る。薬剤の送達速度は、個体の要求（例えば、基本速度およびボーラス用量）の変化に適合するように広範囲で容易に調節され得る。新たなポンプは周期的な投薬様式を許容する。すなわち、液体は、連続したフロー様式ではなく、別の用量の少しの固定体積で周期的に送達される。装置についての全体の液体送達速度は、投与期間を制御し、調節することによって制御され、調節される。ポンプは、「Ａｎａｌｙｔｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」という発明の名称の米国特許第６，５６０，４７１号に記載されているシステムのように、連続モニタリング装置および遠隔装置に接続されてもよい。このような構成において、連続血液モニタリング装置を制御するハンドヘルド遠隔装置は、血液モニタリング装置および本発明の方法における使用のために治療剤を送達する流体送達装置の両方と無線で通信でき、それらを制御できる。
【０２４９】
本発明のいくつかの実施形態において、慣例の実験が使用されて、血清低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンレベルに対する治療剤の効果をモニタリングすることによって各患者についての適切な投薬量の値を決定することができる。薬剤は１日に１回または複数回投与されてもよい。血清低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンレベルは、治療前および間にモニターされて、血清低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンレベルを向上させるため、または血清低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンレベルを正常にし、長期間にわたって正常なレベルを維持するために投与するための適切な量の治療剤を決定することができる。特定の実施形態において、患者は、その血清低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンレベルが、治療剤による治療を施す前に正常なレベルより著しく低い（約２５％未満）かどうかを決定するために試験される。投与頻度は、１日当たり単回用量から１日当たり複数回用量まで変化させてもよい。特定の投与経路としては、経口、静脈内および腹腔内が挙げられるが、同様に投与の他の形態が選択されてもよい。
【０２５０】
タンパク質もしくはポリペプチド、小分子、抗体、または核酸の「治療有効量」は、所望の治療効果を達成する量である。例えば、治療剤が哺乳動物におけるフレイルを治療するために投与される場合、治療有効量は、筋肉疲労または肺障害に関連する１つ以上の症状を軽減し、同時に、代謝障害、男性生殖障害、または認知障害に関連する１つ以上の症状を軽減する量である。
【０２５１】
本発明に使用するためのタンパク質またはポリペプチド、小分子または核酸の治療有効量は典型的に変化し、典型的に対象において約１ナノグラム／ミリリットル〜約１０マイクログラム／ミリリットルの血清治療剤レベルを達成するのに十分な量、または対象において約１ナノグラム／ミリリットルから約７マイクログラム／ミリリットルの血清治療剤レベルを達成するのに十分な量であり得る。他の特定の血清治療剤レベルは、約０．１ナノグラム／ミリリットル〜約３マイクログラム／ミリリットル、約０．５ナノグラム／ミリリットル〜約１マイクログラム／ミリリットル、約１ナノグラム／ミリリットル〜約７５０ナノグラム／ミリリットル、約５ナノグラム／ミリリットル〜約５００ナノグラム／ミリリットル、および約５ナノグラム／ミリリットル〜約１００ナノグラム／ミリリットルを含む。
【０２５２】
本発明の方法において患者に投与される本明細書に開示される治療剤の量は、慣例の方法により当業者によって決定することができ、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約７５０ｍｇ／ｋｇ／日、約１０ｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日、約２５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２５０ｍｇ／ｋｇ／日、約５０ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲または他の適切な量であり得る。
【０２５３】
本発明の方法において患者に投与される本明細書に開示される治療剤の量はまた、約１μｇ／ｋｇ／日〜約１，０００μｇ／ｋｇ／日、約５μｇ／ｋｇ／日〜約７５０μｇ／ｋｇ／日、約１０μｇ／ｋｇ／日〜約５００μｇ／ｋｇ／日、約２５μｇ／ｋｇ／日〜約２５０μｇ／ｋｇ／日、または約５０μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。
【０２５４】
本発明の方法において患者に投与される本明細書に開示される治療剤の量はまた、約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約１，０００ｎｇ／ｋｇ／日、約５ｎｇ／ｋｇ／日〜約７５０ｎｇ／ｋｇ／日、約１０ｎｇ／ｋｇ／日〜約５００ｎｇ／ｋｇ／日、約２５ｎｇ／ｋｇ／日〜約２５０ｎｇ／ｋｇ／日、または約５０ｎｇ／ｋｇ／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。
【０２５５】
当業者は、限定されないが、状態の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の障害または疾患を含む特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要とされる投薬量に影響を与え得ることを理解するであろう。
【０２５６】
治療有効量のタンパク質、ポリペプチド、ヌクレオチドまたは抗体による対象の治療は、単一の治療を含んでもよく、または好ましくは一連の治療を含んでもよい。
【０２５７】
特定の実施形態において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンによる対象の治療は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを、患者の血中の全オステオカルシンの約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％にする。
【０２５８】
小分子剤の適切な用量は、当業者である医師、獣医、または研究者の知識の範囲内の多くの要因に依存することは理解される。小分子の用量は、例えば、治療される対象または試料の属性、大きさおよび状態に応じて変化し、さらに、組成物が投与される経路、および医師が小分子に望む効果に応じて変化する。さらに、小分子の適切な用量は、調節される発現または活性に対する小分子の効力に依存することは理解される。これらの小分子の１つ以上が、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼの発現または活性を調節するために哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される場合、比較的少ない用量が最初に処方され、適切な反応が得られるまで、その後用量を増加させてもよい。加えて、任意の特定の対象についての特定の用量レベルは、利用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、および食事、投与時間、投与経路、排せつ速度、他の薬物が患者に投与されているか否か、ならびに調節される発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することは理解される。
【０２５９】
治療に関して、適切な対象は、フレイルを有する疑いがあるか、フレイルを有すると診断されているか、またはフレイルを発症するリスクがある哺乳動物であってもよい。
【０２６０】
本発明の方法に有用な医薬組成物の適切な投与経路は、経口、腸内、非経口、経粘膜的、経皮的、筋肉内、皮下、経皮、直腸、髄内、髄腔内、静脈内、脳室内、心房内、大動脈内、動脈内、または腹腔内投与を含んでもよい。本発明の方法に有用な医薬組成物は、限定されないが、カテーテル、バルーン、埋め込み可能な装置、生分解性インプラント、プロテーゼ、移植片、縫合糸、パッチ、シャント、またはステントなどの医療機器によって対象に投与され得る。１つの特定の実施形態において、治療剤（例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン）は、標的領域への局所投与のためにステント上にコーティングされてもよい。この状況において、例えば、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの持続放出製剤が利用されてもよい。
【０２６１】
本発明の化合物はまた、摂取、分布および／または吸収を補助するために、他の分子、分子構造または化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の製剤と混合、カプセル化、複合体化、またはそうでなければ会合されてもよい。製剤を補助するこのような摂取、分布および／または吸収の処理を教示し、本発明を実施するのに有用な技術について当業者により参考にされ得る代表的な米国特許出願としては、限定されないが、米国特許第５，１０８，９２１号；同第５，３５４，８４４号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４５９，１２７号；同第５，５２１，２９１号；同第５，５４３，１５８号；同第５，５４７，９３２号；同第５，５８３，０２０号；同第５，５９１，７２１号；同第４，４２６，３３０号；同第４，５３４，８９９号；同第５，０１３，５５６号；同第５，１０８，９２１号；同第５，２１３，８０４号；同第５，２２７，１７０号；同第５，２６４，２２１号；同第５，３５６，６３３号；同第５，３９５，６１９号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４１７，９７８号；同第５，４６２，８５４号；同第５，４６９，８５４号；同第５，５１２，２９５号；同第５，５２７，５２８号；同第５，５３４，２５９号；同第５，５４３，１５２号；同第５，５５６，９４８号；同第５，５８０，５７５号；および同第５，５９５，７５６号が挙げられ、それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６２】
低カルボキシル化オステオカルシンが血液脳関門を横切る間、オステオカルシンの特定の誘導体、変異体、または改変形態は、横切らなくてもよい。血液脳関門を横切らないオステオカルシンの形態を利用する本発明の実施形態において、血液脳関門を横切って物質を輸送するために当該分野において公知の方法を利用できる。例えば、米国特許出願公開第２０１３／００３４５９０号または米国特許出願公開第２０１３／００３４５７２号に開示されている方法が使用されてもよい。ヒトインスリンまたはトランスフェリン受容体は、モノクローナル抗体−改変されたオステオカルシン複合体でこれらの受容体をターゲティングすることによって利用され得る（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、２００７、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４：１７３３−１７４４；Ｂｅｄｕｎｅａｕら、２００８、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １２６：４４−４９）。改変されたオステオカルシンを含有する界面活性剤でコーティングされたポリ（ブチルシアノアクリレート）ナノ粒子が使用されてもよい（Ｋｒｅｕｔｅｒら、２００３、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０：４０９−４１６）。あるいは、改変されたオステオカルシンを含有するペグ化ナノ粒子にコンジュゲートしたカチオン性アルブミンなどのカチオン性担体が、改変されたオステオカルシンを脳へ送達するために使用されてもよい（Ｌｕら、２００６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１１８７８−１１８８７）。
【０２６３】
本発明のさらに別の態様において、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、薬学的に許容可能な担体と共に医薬組成物として投与される。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンについての例示的な医薬組成物は、溶液としての注射または注射可能な自己凝固もしくは自己ゲル化鉱物ポリマーハイブリッドとしての注射を含む。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは、リン酸カルシウムの細孔性結晶生体模倣生物活性組成物を使用して投与され得る。米国特許第５，８３０，６８２号、同第６，５１４，５１４号および同第６，５１１，９５８号ならびに米国特許出願公開第２００６／００６３６９９号、同第２００６／００５２３２７号、同第２００３／１９９６１５号、同第２００３／０１５８３０２号、同第２００４／０１５７８６４号、同第２００６／０２９２６７０号、同第２００７／００９９８３１号および同第２００６／０２５７４９２号を参照のこと。それらの全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６４】
治療方法
本発明は、哺乳動物におけるフレイルを治療するためにＯＳＴ−ＰＴＰシグナル伝達経路またはＰＴＰ−１Ｂシグナル伝達経路を調節することにより、哺乳動物における低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを調節する方法を提供する。特に、この方法は、ＯＳＴ−ＰＴＰホスホリラーゼ活性を阻害し、ＰＴＰ−１Ｂホスホリラーゼ活性を阻害し、γ−カルボキシラーゼ活性を低減させ、および／または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを増加させるために使用する。本発明によれば、この方法は、フレイルを治療するのに有効な薬剤の量を提供する。薬剤は、小分子、抗体および核酸からなる群から選択され得る。
【０２６５】
特定の実施形態において、この方法は、フレイルの治療を必要とする患者を識別する工程、次いで本明細書に開示された方法を患者に適用する工程を含む。
【０２６６】
本発明の一実施形態において、治療方法は、治療前の患者の濃度と比較して、患者の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの血中濃度を上昇させるのに十分な治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを、それを必要とする患者に投与することを含む。低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンは血液／脳関門を横切ることができるので、これは、脳の標的領域内に治療有効濃度の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを導くことができる。好ましくは患者はヒトである。別の実施形態において、治療方法は、治療前の患者の割合と比較して、患者の血液中の全オステオカルシンに対する低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの割合を上昇させるのに十分な治療有効量の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを、それを必要とする患者に投与することを含む。
【０２６７】
本発明の別の態様において、フレイルが治療されるような治療有効量で低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるフレイルを治療する方法が提供される。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２６８】
本発明の一実施形態において、フレイルが治療されるように、骨芽細胞におけるＯＳＴ−ＰＴＰ発現もしくは活性を低下させるか、または骨芽細胞におけるＰＴＰ−１Ｂ発現もしくは活性を低下させる治療有効量の薬剤を、このような治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるフレイルを治療する方法が提供される。好ましくは、患者はヒトである。
【０２６９】
本発明は、フレイルが治療されるように骨芽細胞におけるγ−カルボキシラーゼ発現または活性を低下させる治療有効量の薬剤を、このような治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるフレイルを治療する方法（ｉ）であって、骨芽細胞におけるγ−カルボキシラーゼ発現または活性を低下させる治療有効量の薬剤を、このような治療を必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法を対象とする。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本発明の一実施形態において、薬剤は、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および低分子干渉ＲＮＡからなる群から選択される単離された核酸であり、この核酸は、遺伝子またはｍＲＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするγ−カルボキシラーゼをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと十分に相補的であり、そのハイブリダイゼーションは骨芽細胞におけるγ−カルボキシラーゼの発現を阻止または低下させる。本発明の別の実施形態において、核酸は、骨芽細胞による摂取を容易にするためにリン酸基または他のターゲティングリガンドにコンジュゲートされる。
【０２７０】
本明細書に記載される方法において、疾患または障害を「治療すること」または「軽減すること」は、疾患もしくは障害またはその症状を改善するだけでなく、疾患もしくは障害の進行を遅延させること、または疾患もしくは障害の有害効果を改善することも包含すると理解される。
【０２７１】
本発明はまた、哺乳動物におけるフレイルを治療するための遺伝子治療の使用も包含する。これは、オステオカルシンまたはその生物学的に活性な断片もしくは変異体をコードする遺伝子をベクター内に組み込み、フレイルに罹患しているか、またはフレイルを発症するリスクが高い哺乳動物由来の細胞を、当該分野において公知の種々の方法に従って、ベクターでトランスフェクトまたは感染させることによって達成され得る。細胞はエキソビボまたはインビボでの方法によってトランスフェクトまたは感染されてもよい。
【０２７２】
当該分野において公知の遺伝子治療の方法は本発明の方法における使用に適合され得る。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療のための最も有望なベクターの１つであり、本発明の方法において使用され得る。遺伝子導入および遺伝子治療の従来の方法は、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｅｄ．Ｔ．Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９９９；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ｅｄ．Ｐ．Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７；およびＲｅｔｒｏ−ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ｅｄ．Ｃ．Ｐ．Ｈｏｄｇｓｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９９６に記載されている。ＡＡＶはヒト遺伝子治療についての魅力的なベクター系である。なぜなら、それはヒトに対して非病原性であり、それは組み込みの高い発生頻度を有し、それは非細胞分裂細胞に感染することができ、したがってそれを、組織培養物および完全動物の両方において哺乳動物細胞内への遺伝子の送達に有用にする。例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７−１２９を参照のこと。最近の研究により、ＡＡＶが遺伝子送達のための有用なベクターである可能性があることが実証された。ＬａＦａｃｅら、１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６２：４８３−４８６；Ｚｈｏｕら、１９９３、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（ＮＹ）、２１：９２８−９３３；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０６１３−１０６１７；およびＷａｌｓｈら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ  ８４：１４９２−１５００。組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子（Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８：１４８−１５４；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２−３８２８；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ＆  Ｓｍｉｔｈ、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；Ｙｏｄｅｒら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ、８２：ｓｕｐｐｌ．１：３４７  Ａ；Ｚｈｏｕら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９：１８６７−１８７５；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、４：２０７２−２０８１；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３−１９７３）およびヒト疾患に関与する遺伝子（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｌｕｏら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ、８２：ｓｕｐｐｌ．１、３０３Ａ；Ｏｈｉら、１９９０、Ｇｅｎｅ、８９：２７９−２８２；Ｗａｌｓｈら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７２５７−７２６１；Ｗｅｉら、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、���：２６１−２６８）のインビトロおよびインビボ形質導入のために首尾良く使用されている。
【０２７３】
特定の他の実施形態において、目的の遺伝子（例えば、オステオカルシン）は、レトロウイルスベクターを使用して標的細胞に転移され得る。レトロウイルスとは、レトロウイルス科に属するウイルスを指し、腫瘍ウイルス、泡沫状ウイルス（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＆  Ｍｉｌｌｅｒ、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２１７−２２２；Ｗｕら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４４９８−４５０１）、およびレンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１（Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７；Ｐｏｅｓｃｈｌａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１３９５−１１３９９；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｋｕｍａｒら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５８４１−５８４８；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８７１−８７５；Ｋｉｍら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１１−８１６）、および猫免疫不全ウイルス（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４９９１−５０００；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＆  Ｐｏｗｅｒ、１９９９、Ｖｉｒｏｌ．７３：２４９１−２４９８；Ｐｏｅｓｃｈｌａら、１９９８、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３５４−３５７）を含む。これらの刊行物の開示は本発明の方法における使用に適合され得る。多種多様な疾患を治療するためのレトロウイルスベクターを利用する多くの遺伝子治療法は当該分野において周知であり、本発明の方法における使用に適合され得る（例えば、米国特許第４，４０５，７１２号および同第４，６５０，７６４号；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２７５−１２８１；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：９２６−９３２；Ｃｒｙｓｔａｌ、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０、ならびに米国特許第６，８９９，８７１号（それらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。多数のこれらの方法は、現在、ヒト臨床試験に適用されている（Ｍｏｒｇａｎ、１９９３、ＢｉｏＰｈａｒｍ、６：３２−３５；Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５２８−５もまた、参照のこと（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
【０２７４】
本明細書に記載される治療方法の有効性は、この方法が、治療される疾患または障害の症状のいずれかを改善するかどうかを決定することによってモニターされ得る。あるいは、血清低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの濃度（絶対的な意味で、または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシン／全オステオカルシンの割合としてのいずれか）をモニターすることができ、その濃度は治療に応答して増加するはずである。
【０２７５】
診断
本発明は、減少した濃度の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンに基づいて哺乳動物におけるフレイルを診断するための方法および組成物を提供する。本発明の特定の実施形態において、フレイルを有するか、またはフレイルを発症するリスクのある患者を診断するための方法であって、（ｉ）患者から採取した生体試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの患者の濃度と、障害を有さない対象から採取した生体試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの対照の濃度を決定する工程と、（ｉｉ）患者の濃度と対照の濃度を比較する工程と、（ｉｉｉ）患者の濃度が対照の濃度未満である場合、フレイルを有するか、またはフレイルを発症するリスクがあると患者を診断する工程とを含む、方法が提供される。
【０２７６】
「生体試料」は、固体および液体試料を含む。本発明の生体試料は、組織、器官、細胞、タンパク質あるいは細胞、血液または血液、血清、腹水もしくは脳液（例えば、脳脊髄液）などの生体液の膜抽出物を含み得る。好ましくは、生体試料は血液または脳脊髄液である。
【０２７７】
本発明の別の実施形態において、フレイルを有するか、またはフレイルを発症するリスクがある患者を診断するための方法であって、（ｉ）患者から採取した生体試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの患者の濃度を決定する工程と、（ｉｉ）患者の濃度を基準濃度と比較する工程であって、患者の濃度が基準濃度より低い場合、フレイルを有するか、またはフレイルを発症するリスクがあると患者を診断する、工程とを含む、方法が提供される。この方法がヒトで実施される場合、基準濃度は、障害を発症するリスクのないヒトについて正常な範囲であると以前に決定されている低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの濃度であり得る。特定の実施形態において、生体試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。
【０２７８】
ヒトにおける低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの「基準濃度」は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｎｇ／ｍｌ〜７．５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌの値の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを含み得る。ヒトにおける低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの基準濃度はまた、約０．１ｎｇ／ｍｌ、約０．５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ、約７ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌの低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンを含み得る。
【０２７９】
本発明の別の実施形態において、フレイルを有するか、またはフレイルを発症するリスクのある患者を診断するための方法であって、（ｉ）患者から採取した生体試料中の全オステオカルシンに対する低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの割合を決定する工程と、（ｉｉ）その割合と基準の割合とを比較する工程であって、患者の割合が基準の割合より低い場合、フレイルを有するか、またはフレイルを発症するリスクがあると患者を診断する、工程とを含む、方法が提供される。特定の実施形態において、基準の割合は、５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、または３０％〜３５％である。特定の実施形態において、基準の割合は、約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％である。好ましくは、患者はヒトである。特定の実施形態において、生体試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、細胞試料、または組織試料である。
【０２８０】
タンパク質発現、例えば、オステオカルシン発現のレベルを検出するためのアッセイは当業者に周知である。このようなアッセイは、例えば、抗体ベースの免疫学的検定を含む。本明細書に開示される抗体を使用する方法は、特に、オステオカルシン、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼを差次的に発現するフレイルを有する哺乳動物由来の細胞、組織および他の生体試料に適用可能である。この方法は、目的のタンパク質およびその断片または変異体に選択的に結合する抗体を使用する。
【０２８１】
生体試料中のオステオカルシンの量は、ラジオイムノアッセイ、免疫放射定量測定法、および／または酵素免疫測定法などのアッセイによって決定され得る。「ラジオイムノアッセイ」は、抗原の標識された（例えば、放射活性物質で標識された）形態を使用して抗原の濃度を検出し、測定するための技術である。抗原についての放射性標識の例としては、３Ｈ、１４Ｃ、および１２５Ｉが挙げられる。生体試料中の抗原（例えば、オステオカルシン）の濃度は、抗原に対する抗体との結合のために（例えば、放射性活性物質で、蛍光で）標識された抗原と競合する試料中の抗原を有することによって測定され得る。標識された抗原と標識されていない抗原との間の競合的結合を確実にするために、標識された抗原は、抗体の結合部位を飽和するのに十分な濃度で存在する。試料中の抗原の濃度が高くなると、抗体に結合する標的された抗原の濃度は低くなる。
【０２８２】
ラジオイムノアッセイにおいて、抗体に結合した標識された抗原の濃度を決定するために、抗原−抗体複合体は遊離抗原から分離されなければならない。遊離抗原から抗原−抗体複合体を分離するための１つの方法は、抗アイソタイプ抗血清により抗原−抗体複合体を沈殿させることによる。遊離抗原から抗原−抗体複合体を分離するための別の方法は、ホルマリンで殺傷した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により抗原−抗体複合体を沈殿させることによる。遊離抗原から抗原−抗体複合体を分離するためのさらに別の方法は、抗体が、セファロース（登録商標）ビーズ、ポリスチレンウェル、ポリ塩化ビニルウェル、またはマイクロタイターウェルに（例えば共有）結合する、「固相ラジオイムノアッセイ」を実施することによる。抗体に結合した標識された抗原の濃度を、抗原の既知の濃度を有する試料に基づいた標準曲線と比較することによって、生体試料中の抗原の濃度が決定され得る。
【０２８３】
「免疫放射定量測定法」（ＩＲＭＡ）は、抗体試薬が放射活性物質で標識された免疫学的検定である。ＩＲＭＡは、タンパク質、例えば、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）とのコンジュゲーションなどの技術による多価抗原コンジュゲートの産生を必要とする。多価抗原コンジュゲートは、１つの分子当たり少なくとも２つの抗原残基を有さなければならず、抗原残基は、抗原への少なくとも２つの抗体による結合を可能にするように十分に間隔をあけていなければならない。例えば、ＩＲＭＡにおいて、多価抗原コンジュゲートはプラスチック球などの固体表面に結合され得る。非標識「試料」抗原および放射活性物質で標識された抗原に対する抗体が、多価抗原コンジュゲートでコーティングされた球を含有する試験管に加えられる。試料中の抗原は抗原抗体結合部位について多価抗原コンジュゲートと競合する。適切なインキュベーション期間後、未結合の反応物を洗浄により除去し、固相上の放射活性物質の量を測定する。結合した放射性抗体の量は試料中の抗原の濃度に反比例する。
【０２８４】
最も一般的な酵素免疫測定法は、「酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）」である。「酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）」は、標識された（例えば、酵素結合した）抗体の形態を使用して抗原の濃度を検出し、測定するための技術である。「サンドイッチＥＬＩＳＡ」において、抗体（例えば、オステオカルシンに対する）は固相（例えば、マイクロタイタープレート）に結合し、抗原（例えば、オステオカルシン）を含有する生体試料に曝露される。次いで固相を洗浄して未結合の抗原を除去する。標識された（例えば、酵素結合した）抗体は、次いで、（存在する場合）抗体−抗原−抗体サンドイッチを形成する結合抗原に結合する。抗体に結合され得る酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。酵素が結合した抗体は基質と反応して、アッセイされ得る有色の反応生成物を生成する。
【０２８５】
「競合的ＥＬＩＳＡ」において、抗体は抗原（例えば、オステオカルシン）を含有する試料とインキュベートされる。次いで抗原−抗体混合物は、抗原でコーティングされた固相（例えば、マイクロタイタープレート）と接触される。試料中に存在する抗原が多いほど、固相に結合するのに利用可能である遊離抗体は少ない。標識された（例えば、酵素結合された）二次抗体は、次いで、固相に加えられて、固相に結合した一次抗体の量を測定する。
【０２８６】
「免疫組織化学アッセイ」において、組織切片が、アッセイされるタンパク質に特異的である抗体に組織を曝露することによって特異的タンパク質について試験される。次いで抗体は、タンパク質の存在および量を決定するための複数の方法のいずれかによって視覚化される。抗体を視覚化するために使用される方法の例は、例えば、抗体に結合した酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）、または化学的手法（例えば、ＤＡＢ／基質クロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ））によるものである。
【０２８７】
タンパク質発現のレベルを検出することに加えて、本発明の診断アッセイは、ＲＮＡ発現のレベルを検出するように設計された方法を利用できる。ＲＮＡ発現のレベルは、例えば、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲまたはインサイチュハイブリダイゼーションの使用を含む、当業者に周知の方法を使用して決定され得る。
【０２８８】
オステオカルシンのカルボキシル化は、ヒドロキシアパタイトに対する、より大きな親和性を与える。全てのオステオカルシンは、免疫学的検定によって測定され得、続いて、ヒドロキシアパタイトとインキュベートされ、遠心分離される。ヒドロキシアパタイトに吸着されないオステオカルシンを含有する上清は、次いで、同様の免疫学的検定を使用して測定される。この手順の結果は、絶対濃度として、またはカルボキシル化オステオカルシンに対する低カルボキシル化オステオカルシンの割合として表され得る。
【０２８９】
別の手順は、オステオカルシンのＧｌｕ／Ｇｌａ残基の全てまたはいくつかのカルボキシル化状態を区別するモノクローナル抗体を使用する。例えば、ＧｌｕＯＣ４−５（ＴａＫａＲａカタログ番号Ｍ１７１）は、位置２１および２４においてグルタミン酸残基（脱カルボキシル化された）を有するヒトオステオカルシンと反応し、Ｇｌａ型のオステオカルシンとは反応しない。
【０２９０】
オステオカルシン測定法の概説については、Ｌｅｅら、２０００、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：４３２−４４６を参照のこと。
【０２９１】
薬物スクリーニングおよびアッセイ
薬物スクリーニングの細胞ベースおよび非細胞ベースの方法は、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、もしくはγ−カルボキシラーゼの活性もしくは発現を低下させ、ならびに／または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの活性もしくは発現のレベルを増加させる候補薬剤を同定するために提供される。そのような薬剤は哺乳動物におけるフレイルの治療における使用が見出されている。
【０２９２】
非細胞ベースのスクリーニング法は、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、γ−カルボキシラーゼまたはオステオカルシンに結合し、それによってこれらのタンパク質の活性を調節する化合物を同定するために提供される。
【０２９３】
そのような非細胞ベースの方法は、ＯＳＴ−ＰＴＰに結合する薬剤について同定またはアッセイする方法であって、（ｉ）ＯＳＴ−ＰＴＰまたはその断片もしくは変異体を含む混合物を提供する工程、（ｉｉ）混合物を候補薬剤と接触させる工程、（ｉｉｉ）候補薬剤がＯＳＴ−ＰＴＰに結合するかどうかを決定する工程、ここで、薬剤がＯＳＴ−ＰＴＰまたはその断片もしくは変異体に結合する場合、（ｉｖ）薬剤が、γ−カルボキシラーゼを脱リン酸化するＯＳＴ−ＰＴＰの能力を低下させるかどうかを決定する工程、および（ｖ）哺乳動物におけるフレイルを治療する必要のある患者に薬剤を投与する工程を含む、方法を含む。特定の実施形態において、混合物は、ＯＳＴ−ＰＴＰまたはその断片もしくは変異体を含む膜断片を含む。
【０２９４】
スクリーニング法は、ＯＳＴ−ＰＴＰのホスファターゼ１ドメインに結合する薬剤について同定またはアッセイするために提供され、その方法は、（ｉ）ＯＳＴ−ＰＴＰまたはその断片もしくは変異体のホスファターゼ１ドメインを含む混合物を提供する工程、（ｉｉ）混合物を薬剤と接触させる工程、（ｉｉｉ）薬剤がＯＳＴ−ＰＴＰのホスファターゼ１ドメインに結合するかどうかを決定する工程、ここで薬剤がＯＳＴ−ＰＴＰまたはその断片もしくは変異体のホスファターゼ１ドメインに結合する場合、（ｉｖ）薬剤がＯＳＴ−ＰＴＰのホスファターゼ１ドメインを阻害するかどうかを決定する工程、および薬剤がＯＳＴ−ＰＴＰのホスファターゼ１ドメインを阻害する場合、（ｖ）哺乳動物におけるフレイルの治療を必要とする患者に薬剤を投与する工程を含む。
【０２９５】
スクリーニング法は、ＰＴＰ−１Ｂに結合する薬剤について同定またはアッセイするために提供され、その方法は、（ｉ）ＰＴＰ−１Ｂまたはその断片もしくは変異体を含む混合物を提供する工程、（ｉｉ）混合物を候補薬剤と接触させる工程、（ｉｉｉ）候補薬剤がＰＴＰ−１Ｂに結合するかどうかを決定する工程、ここで薬剤がＰＴＰ−１Ｂまたはその断片もしくは変異体に結合する場合、（ｉｖ）薬剤が、γ−カルボキシラーゼを脱リン酸化するＰＴＰ−１Ｂの能力を低下させるかどうかを決定する工程、および（ｖ）哺乳動物におけるフレイルの治療を必要とする患者に薬剤を投与する工程を含む。特定の実施形態において、混合物は、ＰＴＰ−１Ｂまたはその断片もしくは変異体を含む膜断片を含む。
【０２９６】
スクリーニング法は、γ−カルボキシラーゼに結合する薬剤について同定またはアッセイするために提供され、その方法は、（ｉ）γ−カルボキシラーゼまたはその断片もしくは変異体を含む混合物を提供する工程、（ｉｉ）混合物を薬剤と接触させる工程、（ｉｉｉ）薬剤がγ−カルボキシラーゼに結合するかどうかを決定する工程、ここで薬剤がγ−カルボキシラーゼまたはその断片もしくは変異体に結合する場合、（ｉｖ）フレイルの治療を必要とする哺乳動物に薬剤を投与する工程を含む。その方法は、薬剤がγ−カルボキシラーゼ活性を低下させるかどうかを決定する工程をさらに含んでもよい。
【０２９７】
上記のアッセイにおける標的分子への薬剤の結合は、競合的結合アッセイの使用により決定され得る。競合相手は標的分子に結合することが知られている結合部分である。特定の状況下で、結合部分が薬剤と置き換わっているか、または薬剤が結合部分と置き換わっている、薬剤と結合部分との間のような競合的結合が存在していてもよい。
【０２９８】
薬剤または競合相手のいずれかは標識化され得る。薬剤または競合相手のいずれかは最初に、結合を可能にするのに十分な時間、タンパク質に加えられる。インキュベーションは、最適な結合を容易にする任意の温度、典型的に４℃〜４０℃で実施され得る。インキュベーション時間もまた、最適な結合のために選択されてもよいが、高速ハイスループットスクリーニングを容易にするように最適化されてもよい。典型的に、０．１〜１時間が十分である。過剰な薬剤および競合相手は一般に除去されるか、または洗い落とされる。
【０２９９】
このようなアッセイを使用して、競合相手が最初に加えられてもよく、続いて薬剤が加えられてもよい。競合相手の置換は、薬剤が標的分子に結合するので、標的分子に結合でき、標的分子の活性を調節する可能性がある指標である。この実施形態において、構成要素のいずれかは標識化されてもよい。このように、例えば、競合相手が標識化される場合、洗浄溶液中の標識の存在は、薬剤による置換を示す。
【０３００】
別の例において、薬剤が最初に加えられ、インキュベーションおよび洗浄に続いて競合相手が加えられる。競合相手による結合の不在は、薬剤が競合相手より高い親和性で標的分子に結合していることを示し得る。このように、薬剤が標識される場合、競合相手結合の欠如に加えて標的分子上の標識の存在は、薬剤が標的分子に結合できることを示し得る。
【０３０１】
この方法は、標的分子の活性を調節できる薬剤を同定するために異なるスクリーニングを含んでもよい。このような例において、この方法は、第１の試料中の標的分子および競合相手を混合することを含む。第２の試料は、薬剤、標的分子、および競合相手を含む。薬剤の添加は、標的分子の活性の調節を可能にする条件下で実施される。競合相手の結合は両方の試料について決定され、２つの試料間の結合における変化または差は、標的分子に結合でき、その活性を調節する可能性のある薬剤の存在を示す。すなわち、競合相手の結合が第１の試料と比べて第２の試料中で異なる場合、薬剤は標的分子に結合できる。
【０３０２】
陽性対照および陰性対照はアッセイにおいて使用され得る。好ましくは、全ての対照および試験試料は、十分に有意な結果を得るために少なくとも３連で実施される。全ての試料のインキュベーションは標的分子への薬剤の結合についての十分な時間である。インキュベーション後、全ての試料を洗浄して、特異的に結合していない物質を除去し、結合した、一般に標識化した薬剤の量を決定した。例えば、放射性標識が利用される場合、試料はシンチレーションカウンタで計数されて、結合した薬剤の量を決定できる。
【０３０３】
様々な他の試薬がスクリーニングアッセイに含まれてもよい。それらは、最適なタンパク質間結合を容易にし、および/または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用され得る、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗浄剤などのような試薬を含む。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などの別様でアッセイの効率を改善する試薬が使用されてもよい。構成要素の混合物は必要な結合を与える任意の順序で加えられてもよい。
【０３０４】
このように、一例において、この方法は、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼを含む試料および薬剤を混合する工程、ならびにＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼ酵素活性に対する効果を評価する工程を含む。酵素活性、具体的にはＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼ酵素活性とは、酵素に関連する生物活性の１つ以上を意味する。ＯＳＴ−ＰＴＰおよびＰＴＰ−１Ｂに関して、活性は、好ましくはγカルボキシラーゼの脱リン酸化であり、γ−カルボキシラーゼに関して、それはオステオカルシンのカルボキシル化である。スクリーニングアッセイは、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、もしくはγカルボキシラーゼの活性を低下させ、および／または低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させる薬剤を見出すために設計される。
【０３０５】
具体的には、スクリーニング法は、ＯＳＴ−ＰＴＰの活性を低下させる薬剤を同定するために提供され、その方法は、（ａ）ＯＳＴ−ＰＴＰまたはその断片もしくは変異体を含む対照混合物、およびＯＳＴ−ＰＴＰまたはその断片もしくは変異体を含む試験混合物を提供する工程、（ｂ）試験混合物を薬剤と接触させる工程、（ｃ）試験混合物および対照混合物中のＯＳＴ−ＰＴＰの活性のレベルを決定する工程、（ｄ）試験混合物中のＯＳＴ−ＰＴＰ活性のレベルが対照混合物中のＯＳＴ−ＰＴＰ活性のレベルより低い場合、その薬剤をＯＳＴ−ＰＴＰ活性を低下させる薬剤として同定する工程、ならびに（ｅ）フレイルの治療を必要とする哺乳動物に、同定された薬剤を投与する工程を含む。
【０３０６】
スクリーニング法は、ＰＴＢ−１Ｂの活性を低下させる薬剤を同定するために提供され、その方法は、（ａ）ＰＴＰ−１Ｂまたはその断片もしくは変異体を含む対照混合物、およびＰＴＰ−１Ｂまたはその断片もしくは変異体を含む試験混合物を提供する工程、（ｂ）試験混合物を薬剤と接触させる工程、（ｃ）試験混合物および対照混合物中のＰＴＰ−１Ｂの活性のレベルを決定する工程、（ｄ）試験混合物中のＰＴＰ−１Ｂ活性のレベルが対照混合物中のＰＴＰ−１Ｂ活性のレベルより低い場合、その薬剤をＰＴＰ−１Ｂ活性を低下させる薬剤として同定する工程、ならびに（ｅ）フレイルの治療を必要とする哺乳動物に、同定した薬剤を投与する工程を含む。
【０３０７】
スクリーニング法は、γ−カルボキシラーゼ活性を低下させる薬剤を同定するために提供され、その方法は、（ａ）γ−カルボキシラーゼまたはその断片もしくは変異体を含む対照混合物、およびγ−カルボキシラーゼまたはその断片もしくは変異体を含む試験混合物を提供する工程、（ｂ）試験混合物を薬剤と接触させる工程、（ｃ）試験混合物および対照混合物中のγ−カルボキシラーゼの活性のレベルを決定する工程、（ｄ）試験混合物中のγ−カルボキシラーゼ活性のレベルが対照混合物中のγ−カルボキシラーゼのレベルより低い場合、その薬剤を、γ−カルボキシラーゼ活性を低下させる薬剤と同定する工程、ならびに（ｅ）フレイルの治療を必要とする哺乳動物に、同定した薬剤を投与する工程を含む。
【０３０８】
本発明はまた、オステオカルシンを脱カルボキシル化する薬剤を同定するためのスクリーニング法を提供し、その方法は、（ａ）カルボキシル化オステオカルシンを含む対照混合物、およびカルボキシル化オステオカルシンを含む試験混合物を提供する工程、（ｂ）試験混合物に薬剤を添加する工程、（ｃ）試験混合物および対照混合物中のカルボキシル化オステオカルシンのレベルを決定する工程、（ｄ）試験混合物中のカルボキシル化オステオカルシンが対照混合物中のカルボキシル化オステオカルシンのレベルより低い場合、その薬剤を、オステオカルシンを脱カルボキシル化する薬剤と同定する工程、ならびに（ｅ）フレイルの治療を必要とする哺乳動物に、同定された薬剤を投与する工程を含む。
【０３０９】
オステオカルシン遺伝子発現を低下させる薬剤を同定するための細胞ベースの方法が提供され、その方法は、（ａ）細胞中のオステオカルシンの第１の発現レベルを決定する工程、（ｂ）試験薬剤と接触させた後、オステオカルシンの第２の発現レベルを決定する工程、および（ｃ）第１の発現レベルと第２の発現レベルとを比較する工程であって、第１の発現レベルが第２の発現レベルより低い場合、その薬剤を、オステオカルシン遺伝子発現を増加させる薬剤と同定する、工程、ならびに（ｅ）フレイルの治療を必要とする哺乳動物に、同定された薬剤を投与する工程を含む。オステオカルシン遺伝子発現のレベルは、生成したオステオカルシンｍＲＮＡの量または生成したオステオカルシンタンパク質の量を測定することによって決定され得る。特定の実施形態において、細胞は骨芽細胞である。
【０３１０】
γカルボキシラーゼは、γ−カルボキシグルタミン酸残基を形成するためにオステオカルシン内の特定のグルタミン酸残基の翻訳後修飾を触媒する。本明細書に記載されるアッセイの一実施形態において、γカルボキシラーゼ活性またはデカルボキシラーゼ活性のレベルは、オステオカルシンカルボキシル化のレベルを測定することによって決定される。
【０３１１】
本明細書に記載されるスクリーニングまたはアッセイ法に使用される細胞は、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＯＳＴ−ＰＴＰのホスファターゼ１ドメイン、ＰＴＰ−１Ｂ、γ−カルボキシラーゼ、またはオステオカルシンを天然に発現する細胞、およびＯＳＴ−ＰＴＰ、ＯＳＴ−ＰＴＰのホスファターゼ１ドメイン、ＰＴＰ−１Ｂγ−カルボキシラーゼ、またはオステオカルシンを発現（または過剰発現）するように遺伝子操作された細胞を含む。このような細胞は、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＯＳＴ−ＰＴＰのホスファターゼ１ドメイン、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼを過剰発現する形質転換された骨芽細胞を含む。
【０３１２】
哺乳動物におけるフレイルを治療するのに有用な薬剤を同定する方法であって、フレイルを有する哺乳動物を提供する工程、（ｂ）哺乳動物から採取された投与前の生体試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの量を決定する工程、（ｃ）哺乳動物に薬剤を投与する工程、（ｄ）哺乳動物から採取した投与後の生体試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの量を決定する工程、および（ｅ）投与後の生体試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの量が、投与前の生体試料中の低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンの量より高い場合、その薬剤を、哺乳動物におけるフレイルを治療するのに有用であると同定する工程を含む、方法が提供される。
【０３１３】
本明細書に使用される場合、「薬剤」という用語は、任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖、ポリヌクレオチド、脂質などまたはそれらの混合物を含む。薬剤のいくつかは治療的に使用され得る。薬剤は、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、γ−カルボキシラーゼ、オステオカルシン、またはそれらの断片であってもよい。
【０３１４】
一般に、本明細書に記載されるアッセイにおいて、複数のアッセイ混合物は、種々の濃度に対して異なる反応を得るために異なる薬剤濃度で並行して実施される。典型的に、これらの濃度の１つは、陰性対照として役立ち、すなわち、ゼロ濃度であるか、または検出レベル未満である。
【０３１５】
スクリーニングに使用するための薬剤は、多数の化学的クラスを包含するが、典型的に、それは有機分子、好ましくは１００ダルトン超かつ約２，５００ダルトン未満、好ましくは約５００ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物である。薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的に、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくはこれらの官能化学基の少なくとも２つを含む。薬剤は、多くの場合、上記の官能基の１つ以上で置換された環式炭素もしくは複素環式構造および/または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。薬剤はまた、ペプチド、単糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造的類似体または組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。特に好ましい生体分子はペプチドである。
【０３１６】
十分に確認された薬理学的活性を有する高純度の小有機リガンドおよびペプチドのライブラリーは、本明細書におけるアッセイに使用するために多くの供給源から利用可能である。一例は、１，８６６種の薬物様化合物（小さい、中間の疎水性）を含有するＮＣＩの多様なセットである。別のものは、多くの伸長された柔軟な化合物を含む既知の生物活性（４６７種の化合物）についてのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＣＣＢ；Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌによって維持されている）のセットである。ＩＣＣＢライブラリーのいくつかの他の例は、Ｃｈｅｍ  Ｂｒｉｄｇｅ  ＤｉｖｅｒＳｅｔ  Ｅ（１６，３２０種の化合物）；Ｂｉｏｎｅｔ  １（４，８００種の化合物）；ＣＥＲＥＰ（４，８００種の化合物）；Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  １（８，８００種の化合物）；Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ２（７０４種の化合物）；Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ＨｉｔＦｉｎｄｅｒ（１４，３７９種の化合物）；Ｐｅａｋｄａｌｅ  １（２，８１６種の化合物）；Ｐｅａｋｄａｌｅ  ２（３５２種の化合物）；ＣｈｅｍＤｉｖ  Ｃｏｍｂｉｌａｂ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２８，８６４種の化合物）；Ｍｉｘｅｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｌａｔｅ  １（３５２種の化合物）；Ｍｉｘｅｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｌａｔｅ  ２（３２０種の化合物）；Ｍｉｘｅｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｌａｔｅ  ３（２５１種の化合物）；Ｍｉｘｅｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｌａｔｅ  ４（３３１種の化合物）；ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｍｉｃｒｏｆｏｒｍａｔ（５０，０００種の化合物）；Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔｌ（５，０５６種の化合物）である。他のＮＣＩ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓは、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ、バージョン２（１，９００種の化合物）；Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ（８７９種の化合物）；Ｏｐｅｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  １（９０，０００種の化合物）；Ｏｐｅｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２（１０，２４０種の化合物）；Ｋｎｏｗｎ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ：ＮＩＮＤＳ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１，０４０種の化合物）；ＩＣＣＢ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  １（４８９種の化合物）；ＳｐｅｃＰｌｕｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（９６０種の化合物）；ＩＣＣＢ  Ｄｉｓｃｒｅｔｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓである。以下のＩＣＣＢ化合物は、ＩＣＣＢ、Ｈａｒｖａｒｄおよび他の共同研究機関における化学者から個々に収集した：ＩＣＣＢ１（１９０種の化合物）；ＩＣＣＢ２（３５２種の化合物）；ＩＣＣＢ３（３５２種の化合物）；ＩＣＣＢ４（３５２種の化合物）。天然産物抽出物：ＮＣＩ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ（３５２種のウェル）；有機画分−ＮＣＩ  Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ（１，４０８種のウェル）；Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ  １（２００種のウェル）；ＩＣＣＢ−ＩＣＧ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＤＯＳ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ；ＤＤＳ１（ＤＯＳ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｅｔ）（９６００種のウェル）。化合物ライブラリーはまた、ＡｃｔｉＭｏｌ、Ａｌｂａｎｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＴｉｍＴｅｃおよびその他などの商業的供給業者から入手可能である。
【０３１７】
スクリーニングにおいて同定された公知および新規の薬剤は、構造的類似体を生成するためにアシル化、アルキル化、エステル化、またはアミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの直接またはランダム化学修飾にさらに供されてもよい。
【０３１８】
化合物をスクリーニング、設計、または修飾する場合、考慮される他の要因としては、薬剤分野において認識され、分子を概ね薬物様にする特性および構造的特徴に関連するリピンスキーのルールオブファイブ（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｒｕｌｅ−ｏｆ−ｆｉｖｅ）（５個以下の水素結合供与体（ＯＨおよびＮＨ基）；１０個以下の水素結合受容体（特にＮおよびＯ）；５００ｇ／ｍｏｌ以下の分子量；５未満の分配係数ｌｏｇ  Ｐ）、およびヴェバー基準（Ｖｅｂｅｒ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）が挙げられる。
【０３１９】
薬剤はタンパク質であってもよい。本文脈において、「タンパク質」とは、少なくとも２つの共有結合しているアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造から作製され得る。したがって、本明細書に使用される「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸とみなされる。「アミノ酸」はまた、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基を含む。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）立体配置のいずれかであってもよい。好ましい実施形態において、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−立体配置である。天然に存在しない側鎖が使用される場合、例えば、インビボでの分解を防ぐか、または遅らせるために非アミノ酸置換基が使用されてもよい。
【０３２０】
薬剤は、天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質の断片もしくは変異体であってもよい。したがって、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、またはタンパク質性細胞抽出物のランダムもしくは指向性消化物が使用されてもよい。このように、原核生物および真核生物タンパク質のライブラリーは、種々のタンパク質の１つに対するスクリーニングのために作製されてもよい。細菌、真菌、ウイルス、および哺乳動物タンパク質のライブラリーが使用されてもよく、哺乳動物タンパク質が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【０３２１】
薬剤は、約５〜約３０アミノ酸のペプチドであってもよく、約５〜約２０アミノ酸が好ましく、約７〜約１５が特に好ましい。ペプチドは、上記に概説されているように天然に存在するタンパク質、ランダムペプチド、または「バイアスされた（ｂｉａｓｅｄ）」ランダムペプチドの消化物であってもよい。本明細書における「ランダム」または文法的な同義語は、各々の核酸およびペプチドが、それぞれランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸から本質的になることを意味する。一般にこれらのランダムペプチド（または以下に説明されている核酸）は化学的に合成されるので、それらは、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を任意の位置に組み込んでいてもよい。合成プロセスが、配列の長さにわたる可能な組み合わせの全てまたは大部分の形成を可能にするように、ランダム化されたタンパク質または核酸を生成するために設計されてもよく、それによりランダム化された薬剤である生物活性タンパク質性薬剤のライブラリーを形成する。
【０３２２】
ライブラリーは、任意の位置に配列選択性または一定性を有さずに完全にランダム化されてもよい。あるいは、ライブラリーはバイアスされてもよい。すなわち、配列内のいくつかの位置は、一定に保持されるか、または制限された数の可能性から選択される。例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、例えば、ＳＨ３ドメインについてプロリン、リン酸化部位についてセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジンなどを架橋するために、システインの生成に対して、またはプリンなどに対して、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的にバイアスされた（小さいまたは大きい）残基の定義されたクラス内でランダム化される。
【０３２３】
薬剤は、遺伝子発現またはｍＲＮＡ翻訳をそれぞれ遮断するために、目的のタンパク質をコードする遺伝子、またはそのｍＲＮＡに結合する単離された核酸、好ましくはアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、またはｃＤＮＡであってもよい。本明細書における「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的な同義語は、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。このような核酸は一般にリン酸ジエステル結合を含有するが、いくつかの場合、以下に概説されているように、例えば、ホスホラミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９９３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１９２５およびその文献における参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、１９７０、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら、１９７７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら、１９８４、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．  ８０５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；ならびにＰａｕｗｅｌｓら、１９８６、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１）；ホスホロチオエート（Ｍａｇら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、１９８９、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）；Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、ならびにペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら、１９９２、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７を参照のこと）を含む代替の骨格を有し得る核酸類似体が含まれ、これらの文献の全ては参照により組み込まれ、本明細書に記載される方法における使用のための核酸剤を設計する際の指針のために当業者により参考され得る。
【０３２４】
他の類似の核酸としては、陽性骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）（Ｄｅｎｐｃｙら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７）；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号；同第５，６３７，６８４号；同第５，６０２，２４０号；同第５，２１６，１４１号；および同第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、１９９１、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  １３：１５９７；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２および３、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、１９９４、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７）；ならびに米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ  ６および７、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載されているものを含む非リボース骨格が挙げられる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸もまた、本明細書に記載される薬剤として使用され得る核酸の定義の範囲内である。いくつかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ、Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎ．２、１９９７  ｐａｇｅ３５に記載されている。これらの参考文献の全ては参照により本明細書に明確に組み込まれる。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾は、標識などの追加の部分の付加を容易にするため、または生理的環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増加させるために行われてもよい。さらに、天然に存在する酸および類似体の混合物が作製されてもよい。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、ならびに天然に存在する核酸および類似体の混合物が作製されてもよい。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよいか、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む、塩基の任意の組み合わせを含有する。
【０３２５】
一般的にタンパク質について上記のように、核酸剤は、天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「バイアスされた」ランダム核酸であってもよい。例えば、原核生物または真核生物ゲノムの消化物が、タンパク質について上記に概説したように使用されてもよい。
【０３２６】
薬剤はコンビナトリアル化学ライブラリーから得ることができ、それらの多種多様なものが文献において利用可能である。本明細書において、「コンビナトリアル化学ライブラリー」とは、定義されたまたはランダムな方式で、一般に化学合成によって生成された多様な化学化合物の収集を意味する。数百万の化学化合物がコンビナトリアル混合によって合成され得る。
【０３２７】
ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼなどの種々のタンパク質の１つに対する薬剤の結合の測定は多くの手段で行うことができる。好ましい実施形態において、薬剤は標識され、結合は直接測定される。例えば、これは、種々のタンパク質のうちの１つの全部または一部を固体支持体に結合させ、標識化薬剤（例えば、放射性または蛍光標識を含む薬剤）を加え、過剰な試薬を洗い落とし、標識が固体支持体に存在するかどうかを決定することによって行うことができる。利用され得る種々の遮断および洗浄工程は当該分野において公知である。
【０３２８】
本明細書において、「標識化」とは、薬剤が、検出可能なシグナルを提供する標識、例えば放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなど）、蛍光または化学発光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンなど）、酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、抗体、磁性粒子などの粒子、または特異的結合分子などで直接的または間接的に標識されることを意味する。特異的結合分子は、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなどの対を含む。特異的結合メンバーに関して、相補的なメンバーは、通常、上記で概説したように、公知の手順に従って、検出を提供する分子で標識される。標識は検出可能なシグナルを直接的または間接的に提供できる。化合物の１つのみが標識され得る。あるいは、１つより多くの成分が異なる標識で標識されてもよい。
【０３２９】
ノックインおよびノックアウトマウスを含むトランスジェニックマウス、および本明細書に開示される核酸（例えば、Ｅｓｐ、ＰＴＰ−１Ｂ、オステオカルシン、γ−カルボキシラーゼについてのｃＤＮＡ）を過剰発現または過小発現するそれら由来の単離細胞（特に骨芽細胞）は、当該分野において公知の慣例の方法を使用して作製できる。特定の場合、核酸は、核酸遺伝子またはｍＲＮＡを過剰発現する生物を生じるプロモーターおよび調節エレメント（内因性または異種）の制御下でそれらに作動可能に連結される宿主生物のゲノム内へ挿入される。増幅される遺伝子を保有するトランスフェクトベクターに含まれる外因性／異種プロモーターの一例は、α１（Ｉ）コラーゲンである。多くのこのようなプロモーターは当該分野において公知である。
【０３３０】
ヒト骨芽細胞は、オステオカルシン（またはその断片もしくは変異体）を過剰発現するトランスフェクトされたヒト骨芽細胞を生じる既知のプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結されたヒトＥｓｐ、ヒトＰＴＰ−１Ｂ、またはヒトオステオカルシン（またはそれらの断片もしくは変異体）についてのｃＤＮＡを保有するベクターでトランスフェクトされ得る。
【０３３１】
オステオカルシン（またはその断片もしくは変異体）、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼを過剰発現するトランスジェニックマウスおよびマウス細胞、ならびにトランスフェクトされたヒト細胞が本明細書に開示される。オステオカルシン、Ｅｓｐ、およびγ−カルボキシラーゼについての１つまたは両方の対立遺伝子の欠失を有する二重変異体マウス、ならびに二重変異体の種々の組み合わせもまた、本明細書に開示される。
【０３３２】
標的動物または細胞のゲノム内へ挿入するためのタンパク質をコードするｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを保有するベクターもまた、本明細書に開示される。このようなベクターは、任意選択に、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに作動可能に連結されるプロモーターおよび調節エレメントを含む。「作動可能に連結される」とは、プロモーターおよび調節エレメントの制御下でｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現を可能にするようにｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに連結されるプロモーターおよび調節エレメントを意味する。
【０３３３】
ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、および／またはγ−カルボキシラーゼの発現を低下させ、それによって哺乳動物におけるフレイルを治療するのに使用するためのアンチセンスおよび低分子干渉ＲＮＡは、ＯＳＴ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂ、またはγ−カルボキシラーゼをそれぞれコードする遺伝子および／またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするように作製され得る。マウス（ＯＳＴ−ＰＴＰ、Ｐｔｐｒｖ）ｃＤＮＡについての配列は配列番号１０に示される。（ＯＳＴ−ＰＴＰ、Ｐｔｐｒｖ）タンパク質についてのアミノ酸配列は配列番号１１に示される。このｃＤＮＡ、またはこのｃＤＮＡに基づいたアンチセンスおよび低分子干渉ＲＮＡは、ＯＳＴ−ＰＴＰについてのｍＲＮＡとハイブリダイズし、それによってその翻訳を干渉する。ＯＳＴ−ＰＴＰ発現の低下は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させ、それによって哺乳動物における認知に関連する障害に対して治療的効果を与える。ヒトＰＴＰ−１Ｂ  ｃＤＮＡについての配列は配列番号１６に示される。ヒトＰＴＰ−１Ｂタンパク質についてのアミノ酸配列は配列番号１７に示される。このｃＤＮＡ、またはこのｃＤＮＡに基づいたアンチセンスおよび低分子干渉ＲＮＡは、ヒトＰＴＰ−１ＢについてのｍＲＮＡとハイブリダイズし、それによってその翻訳を干渉する。ヒトＰＴＰ−１Ｂ発現の低下は、低カルボキシル化／非カルボキシル化オステオカルシンのレベルを増加させ、それによって哺乳動物におけるフレイルに対して治療的効果を与える。マウスγ−カルボキシラーゼについてのｃＤＮＡは配列番号８によって特定され、そのアミノ酸配列は配列番号９である。このｃＤＮＡ、またはこのｃＤＮＡに基づいたアンチセンスおよび低分子干渉ＲＮＡは、γ−カルボキシラーゼについてのｍＲＮＡとハイブリダイズし、それによってその翻訳を妨げ、これは好ましい実施形態である。ヒトγ−カルボキシラーゼについてのｃＤＮＡは配列番号６によって特定され、アミノ酸配列は配列番号７である。ヒトγ−カルボキシラーゼｃＤＮＡは、ヒトにおけるフレイルを治療するためにγ−カルボキシラーゼ発現を低下させるために治療的に使用され得る。
【０３３４】
本発明は以下の実施例によって本明細書において例示され、それらは限定とみなされるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は参照により明確に本明細書に組み込まれる。当業者は、本発明が多くの異なる形態で実現され得、本明細書に記載される実施形態に限定されるとみなされるべきではないことを理解する。むしろ、これらの実施形態は、本開示が当業者に本発明を完全に伝えるように提供される。本発明の多くの修飾および他の実施形態は、上述の詳細な説明に提示される教示の利点を有する本発明に関する当業者が想起できる。特定の用語が利用されるが、それらは、他に示されない限り、当該分野におけるように使用される。
【実施例】
【０３３５】
実施例１  オステオカルシン欠損マウス
「オステオカルシン欠損マウス」または「オステオカルシン−／−」マウスとは、両方のオステオカルシン対立遺伝子が欠失しているマウスの系統を指す。オステオカルシン−／−マウスの生成は以前に報告されている（Ｄｕｃｙら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：４４８−４５２）。成熟タンパク質をコードするオステオカルシン遺伝子１（ＯＧ１）のエクソン４、および全オステオカルシン遺伝子２（ＯＧ２）配列は欠失しているが、オステオカルシン関連遺伝子（ＯＲＧ）は所定の位置に残ったままであった。正確なターゲティングの結果、全成熟オステオカルシンタンパク質コード配列のｐＧＫＮｅｏ選択カセットによる置換が生じた。
【０３３６】
オステオカルシン−／−マウスは、ＷＴマウスより高い血糖および低いインスリン血清濃度を有した。ＧＳＩＳ、ＧＴＴおよびＩＴＴによって分析されるインスリン分泌および感受性ならびに耐糖能は、エネルギーが消費されたので、オステオカルシン−／−マウスにおいて全て減少した。したがって、インスリン作用に関与する遺伝子の発現は骨格筋および肝臓において減少したが、Ｐｅｐｃｋ発現は増加した。膵島の大きさおよび数、β細胞の質量、膵臓インスリン含有量およびインスリン免疫反応性は、全てオステオカルシン−／−マウスにおいて顕著に減少した。Ｋｉ６７免疫染色によって測定したβ細胞増殖は、Ｐ５の子（ｐｕｐｓ）および３ヶ月齢でオステオカルシン−／−膵臓において２倍減少した。β細胞増殖、インスリン分泌および感受性のこの顕著な減少に伴って、脂肪体の質量、脂肪細胞の数（ＷＴ、９３．２＋／−１０．７×１０３の脂肪細胞／脂肪体（ｎ＝５）；オステオカルシン−／−、１２５．６＋／−１０．６×１０３の脂肪細胞／脂肪体（ｎ＝３））および血清トリグリセリド濃度は増加した。アディポネクチン発現および血清濃度は、特に増加した脂肪体の質量を考慮すると、ＷＴマウスよりオステオカルシン−／−において顕著に減少したが、他のアディポカインの発現は影響を受けなかった。アディポネクチン作用の分子標的の発現はオステオカルシン−／−マウスにおいて減少した。しかしながら、オステオカルシン＋／−マウスはＷＴの同腹の子と区別ができなかった。マウスアディポネクチンについてのｃＤＮＡ配列は配列番号８であり、それはまた、アミノ酸配列番号９によっても特定される。ヒトアディポネクチンについてのｃＤＮＡ配列は配列番号６であり、それはまた、アミノ酸配列番号７によっても特定される。
【０３３７】
実施例２  ＧＴＧ誘導性肥満
ＧＴＧ誘導性肥満について、オスおよびメスの４週齢の野生型（ＷＴ）およびオステオカルシン−／−マウス（ｎ＝１０／群）に０．５ｍｇ／ｋｇのＧＴＧを注射した。
【０３３８】
実施例３  代謝研究
耐糖能試験（ＧＴＴ）に関して、一晩絶食させた後、グルコース（２ｇ／ｋｇ体重（ＢＷ））を腹腔内（ＩＰ）注射し、示した時間において血糖ストリップおよびＡｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ血糖測定器（Ｒｏｃｈｅ）を使用して血糖をモニターした。
【０３３９】
実施例４  組換えオステオカルシン
組換えオステオカルシンは、細菌により産生され、標準的な手順に従ってグルタチオンビーズで精製される。次いでオステオカルシンはトロンビン消化を使用してＧＳＴサブユニットから切断される。トロンビン汚染はアフィニティーカラムを使用して除去した。生成物の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定性的に評価した。
【０３４０】
実施例５  非カルボキシル化オステオカルシンの投与は血糖を減少させる
血糖に対する低カルボキシル化オステオカルシンの効果をモニターするインビボでの実験を行った。野生型マウスに３つの異なる量のマウス組換え低カルボキシル化オステオカルシンまたはプラセボ（ＰＢＳ）を２８日にわたって皮下に注入した（０．３、１および３ｎｇ／時間）。プラセボを注入した対照動物と比較して、低カルボキシル化オステオカルシンの３つ全ての用量は２８日にわたってインビボで血糖を減少させた（図１）。
【０３４１】
実施例６  非カルボキシル化オステオカルシンの投与は耐糖能を増加させる
別のインビボ実験において、耐糖能に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果を調査した。野生型マウスにグルコースの単回注射を与える前に０．３または３ｎｇ／時間の用量の組換え非カルボキシル化オステオカルシンまたはＰＢＳを１４日にわたって皮下に注射した。その後、示した時間において血糖を測定した。その結果は、両方の用量の非カルボキシル化オステオカルシンが、グルコース注射の後、１２０分の時点で対照レベルより耐糖能を増加させることを示す（図２）。
【０３４２】
実施例７  非カルボキシル化オステオカルシンの投与はインスリン感受性を増加させる
インスリン感受性に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果もまた、調べた。野生型マウスにインスリンの単回注射を与える前に１８日にわたって０．３または３ｎｇ／時間の用量の組換えオステオカルシンまたはＰＢＳを皮下に注入した。その後、注射の０〜１２０分後に示した時間において血糖を測定した。その結果は、インスリン感受性が、両方の用量の非カルボキシル化オステオカルシンによって増加することを示す（図３）。
【０３４３】
実施例８  非カルボキシル化オステオカルシンの投与は脂肪質量を増加させる
別のインビボ実験において、体重および脂肪体質量に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果をモニターした（図４）。野生型マウスにＰＢＳまたは非カルボキシル化オステオカルシンを０．３、１または３ｎｇ／時間にて２８日にわたって皮下に注射した。その結果は、体重が、最も効果的である最も高い用量での非カルボキシル化オステオカルシンによってわずかに減少したことを示す（図４）。２８日後に測定した生殖腺脂肪体質量は、３ｎｇ／時間の非カルボキシル化オステオカルシン処置によって約１８％減少した。その他の投薬量は、その期間において脂肪体質量を顕著に減少させなかった。
【０３４４】
実施例９  非カルボキシル化オステオカルシンの投与はＧＴＧ誘導性肥満を減少させる
ＧＴＧ誘導性肥満に対する非カルボキシル化オステオカルシンの効果を調査した（図５）。野生型マウスに、過食症および肥満を誘導するために金チオグルコース（ＧＴＧ）またはビヒクルを注射した。２週間後、それらに、２８日にわたって１ｎｇ／時間の組換え非カルボキシル化オステオカルシンまたはＰＢＳを注入する浸透圧ポンプを皮下に移植した。体重増加は、調べた最初の時点の７日で、両方の用量の非カルボキシル化オステオカルシンで顕著に減少し、２８日の期間全体にわたって対照より低いままであった。２８日目に、体重は非カルボキシル化オステオカルシン処置で約１５％減少した。
【０３４５】
実施例１０  オスのオステオカルシン欠損マウスは生殖能力を減少させる
野生型（ＷＴ）の同腹の子と交配されたオステオカルシンの両方の対立遺伝子が破壊され、非機能的であるオスのマウス（オステオカルシン−／−マウス）は、正常に機能しない生殖能力を示す。オステオカルシン変異体がＣ５７Ｂ１／６Ｊであるか、または１２９ｓｖ／ｅｖ遺伝的背景であるかに関わらず、非常に少ない子を３ヶ月の過程にわたって得た。さらに、その子は、ＷＴのオスのマウスとＷＴのメスのマウスを交配したときに得た子より著しく小さい大きさであった。８匹のオステオカルシン−／−オスマウスを、各々６〜１２週齢の２匹のＷＴメスマウスと一緒に置いたとき、１７匹のみの子を得、同腹の子一匹当たりの産子数は４．２５であった。対照的に、８匹のＷＴオスマウスを、各々同じ期間、２匹のＷＴマウスと一緒に置いたとき、６３匹の子を得、産子数もまた、著しく多かった（同腹の子一匹当たり７．９３匹の子）（図６）。さらに、６ヶ月齢後、ＷＴマウスの場合と異なって、オスのオステオカルシン−／−マウスは全体的に不妊症であったことが観察された。この複製表現型は、オステオカルシン＋／−マウス（単一の破壊されたオステオカルシンの対立遺伝子を有するマウス）において観察されなかった。
【０３４６】
実施例１１  オステオカルシンの不在下での異常精子形成
オスのオステオカルシン欠損マウスにおいて異なる年齢で精巣重量を測定した。６週齢ほどの早さで、オスのオステオカルシン−／−マウスはそれらのＷＴの同腹の子より顕著に小さい精巣を有し、この表現型は経時的に漸進的に悪化した（図７Ａ）。オステオカルシン−／−およびＷＴの同腹の子のオスのマウスの精液中の精子数もまた、測定した。精子数は、６週齢にてオステオカルシン−／−マウスで既に３７％減少しており、この減少は６ヶ月齢にてＷＴマウスの精子数の６０％減少に達したことが見出された（図７Ｂ）。
【０３４７】
実施例１２  Ｇｐｒｃ６ａ−／−マウス
Ｇｐｒｃ６ａ−／−マウスは、Ｏｕｒｙら、２０１１、Ｃｅｌｌ  １４４：７９６−８０９におけるように生成した。
【０３４８】
実施例１３  妊娠マウスへのオステオカルシン送達
妊娠マウスへのオステオカルシン送達のために、送達までに栓が毎日存在するとすぐにＩＰ注射（２４０ｎｇ／日）を実施した（Ｅ０．５〜Ｅ１８．５）。成体のオステオカルシン−／−またはｏｂ／ｏｂマウスにおけるオステオカルシンまたはレプチン注入のために、オステオカルシン（３００ｎｇ／時間）、レプチン（３００ｎｇ／時間）、またはビヒクルを送達するポンプ（Ａｌｚｅｔマイクロ浸透圧ポンプ、モデル１００２）を、３ヶ月齢のマウスの背部において皮下に外科的に取り付けた。オステオカルシン−／−マウスにおける認知機能の出生後救出のために、オステオカルシン（１０ｎｇ／時間）またはビヒクルを、以前に記載されている（Ｄｕｃｙら、２０００、Ｃｅｌｌ  １００：１９７−２０７）ように脳室下帯内（ｉｎｔｒａｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）（ｉｃｖ）に送達した。血清および組織中のレプチンおよびオステオカルシン含有量をＥＬＩＳＡによって決定した。
【０３４９】
実施例１４  組織構造
Ｌｅｉｃａ  ＭＺ８解剖光学顕微鏡下で氷冷ＰＢＳ  １×中で全ての解剖を実施した。脳幹を小脳から単離し、視床下部を採取時に中脳から除去した。単離した脳の全ての部分を液体窒素中で急速凍結し、使用するまで−８０℃に維持した。
【０３５０】
実施例１５  免疫蛍光、クレシルバイオレット染色、およびアポトーシス
完全な成体および胎児の脳の免疫蛍光を、４％ＰＦＡで固定し、クリオマトリクス（ｃｒｙｏｍａｔｒｉｘ）（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に埋め込み、−８０℃で保存した組織の２０μｍの冠状クリオスタットスライスで実施した。切片を室温にて乾燥させ、４％ＰＦＡで固定した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤を透過させた。ロバ血清による室温での遮断後、切片を、４℃にて一晩、抗Ｎｅｕｎ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とインキュベートした。スライドをフルオロゲル（Ｆｌｕｏｒｏｇｅｌ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）でマウントした。
【０３５１】
脳形態を視覚化するためのクレシルバイオレット染色を、酢酸クレシルバイオレット（１ｇ／Ｌ）中の１：１のクロロホルム：エタノールで脱脂した２０μｍの低温切開片を一晩インキュベートすることによって実施した。エタノールおよびキシレンを使用して染色を識別し、組織構造についてのＤＰＸ封入剤（Ｓｉｇｍａ）を使用してマウントした。
【０３５２】
ＷＴおよびオステオカルシン−／−脳におけるアポトーシスを評価するために、製造業者のプロトコルに従ってＡＰＯＰＴＡＧ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２０μｍのクリオスタット切片を処理した。Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ４０００Ｂを使用して画像を得、Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して細胞数および染色の強度を定量した。
【０３５３】
実施例１６  生理学的測定
歩行活動（ｘａｍｂ）および全体活動（ｘｔｏｔ）を含む身体活動を、以前に記載されている（Ｆｅｒｒｏｎら、２０１２、Ｂｏｎｅ  ５０：５６８−５７５）ようにＯｘｙｍａｘシステムに接続した赤外線ビームを使用して測定した。
【０３５４】
実施例１７  尾懸垂試験（ＴＳＴ）
尾懸垂試験を以前に記載されている（Ｍａｙｏｒｇａら、２００１、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２９８：１１０１−１１０７；Ｓｔｅｒｕら、１９８５、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８５：３６７−３７０）ように実施した。マウスを保有施設から試験室まで短い距離移動させ、少なくとも１時間平静な状態でそこに置いておいた。粘着テープ（尾の先端からの距離は２ｃｍであった）を使用してマウスを個々に尾で懸垂させた（床からの距離は３５ｃｍであった）。典型的に、マウスは、一時的に不動性の時間を増加させながら、たびたびいくつかの逃避に向けた挙動を示した。記録したパラメーターは動かないで過ごした秒数である。高度に訓練された観測者によって、マウスの遺伝子型を盲目にして、５分間にわたってマウスをスコア付けした。
【０３５５】
実施例１８  オープンフィールドパラダイム試験（ＯＦＴ）
オープンフィールド試験（Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９−４９３）を使用してマウスの不安および自発運動を測定した。各動物を４３×４３ｃｍのオープンフィールドチャンバに置き、３０分間試験した。ビデオトラッキングによって各試験時間の全体にわたってマウスをモニターし、Ｍａｔｌａｂソフトウェアを使用して分析した。マウスをオープンフィールド領域の中心に個々に置き、自由に探索させた。全体の運動活動を移動した合計距離として定量した。後ろ足で立った回数ならびにオープンフィールドチャンバの周辺に対して中心で過ごした時間および距離（％）を測定することによって不安を定量した。
【０３５６】
実施例１９  高架式十字迷路試験（ＥＰＭＴ）
各マウスに５分間装置を探索させた。オープンアームに進入した数を測定することによって全体の活動を評価した（Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９−４９３）。オープンアームで過ごした時間を比較することによって不安を評価した。
【０３５７】
実施例２０  マウス強制水泳試験（ＦＳＴ）
Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９−４９３に記載されている方法に従って強制水泳試験を実施した。簡潔に述べると、マウスを、１０ｃｍの水位を含み、２３〜２５℃に維持したガラス円筒（高さ：２５ｃｍ、直径：１０ｃｍ）内に個々に落とした。合計６分間、動物を試験した。不動時間の合計を記録した。マウスが頭を水の上に維持するのに必要な動きを除いて逃避するように試みなかったとき、マウスは不動であるとみなした。マウスの遺伝子型を盲目にして観測者によってマウスをスコア付けした。
【０３５８】
実施例２１  明暗試験
静かな暗い部屋で試験を実施した。マウスのホームケージからの少しの寝床を含むケージ内にマウスを個々に収容し、試験前に少なくとも１時間部屋に慣れさせた。未処置のマウスを暗区画の試験チャンバ内に個々に入れた。試験は５分間であり、明区画で過ごした時間および明区画に進入した回数を、マウスの遺伝子型を盲目にして高度に訓練された観測者によって記録した。
【０３５９】
実施例２２  モリス水迷路試験
マウスに適合した訓練プロトコル（Ｄ’Ｈｏｏｇｅら、２００５、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：６５３９−６５４９）を使用してモリス水迷路（ＭＷＭ）設定（Ｍｏｒｒｉｓ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：６８１−６８３）により空間記憶を評価した。迷路は１５０ｃｍの直径を有し、無毒性の白色ペイントで不透明にした水（２３℃）を含んだ。プールは、コンピューター、タブレットおよび壁に貼られた幾何学的図形を有するポスターを含む、遠くに視覚的刺激を有する明るく照らされた部屋に置いた。反復試行（１０日で４回の試行／日）にわたって空間学習を評価した。
【０３６０】
試行の間、小さなプラットフォーム（直径１０ｃｍ）を固定した位置で水面の下に隠した。マウスを迷路の境界で水に入れ、プラットフォームに到達させ、その後、それらをホームケージに戻した。２分以内にプラットフォームに到達しなかったマウスをプラットフォームの方向へ徐々に誘導し、それらのケージへ戻す前に１０秒間そこに置いておいた。このような１日４回の訓練試行（試行間の間隔：５分）を１０連続日で与えた。プールにおける出発点は、各位置が使用されるように４つの固定位置（０°、９０°、１８０°および２７０°）の間で変化させた。プラットフォームを見つけるまでの潜在時間の減少は既に２回目の取得日に存在し、１回目の取得日も報告する。
【０３６１】
実施例２３  オステオカルシンはいくつかの種類の挙動に影響を及ぼす
オステオカルシン−／−マウスは、オステオカルシン−／−、オステオカルシン＋／−、Ｅｓｐ−／−、およびＧｐｒｃ６ａ−／−マウスを挙動試験のバッテリーに供することによって実証されるように広範な認識機能障害を示す。これらの実験における対照として、ＷＴの同腹の子およびＴｐｈ２＋／−マウスは、使用したオステオカルシン−／−マウスにおいて観察されたマウスと同様にセロトニンおよびドーパミン含有量の減少を示した。
【０３６２】
不安様挙動は３つのコンフリクトに基づいた試験によって分析した。最初の明／暗移行試験（ＤＬＴ）は、明るく照らされた領域に対する齧歯動物の生来の嫌悪および光を避けるためのそれらの自発的な探索挙動に基づく（Ｃｒａｗｌｅｙら、１９８５、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｂｅｈａｖｏｒｉａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９：３７−４４；Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９−４９３）。試験機器は、暗く、安全な区画および照射された嫌悪区画からなる。マウスを各々６分間試験し、３つのパラメーターを記録した：（ｉ）明るい区画へ進入するまでの潜在時間、（ｉｉ）明るい区画で過ごした時間、および（ｉｉｉ）区画間の移行の数。オステオカルシン−／−マウスにおいて、明るい区画に進入するまでの潜在時間は増加し、明るい区画で過ごした時間は減少し、この２つは不安に関連する挙動の指標である。また、区画間の移行の回数は減少し、これは不安に関連する挙動の別の指標および運動−探索活動の指標である（図１１Ａ〜Ｂ）。逆に、反対のことがＥｓｐ−／−マウスに当てはまる。オープンスペースに対する齧歯動物の嫌悪を利用する高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験（Ｌｉｒａら、２００３、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５４：９６０−９７１；Ｈｏｌｍｅｓら、２０００、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ７１：５０９−５１６）も使用した。ＥＰＭは２つのオープンアームおよび２つの囲われたアームからなり、各々、床から高さ６０ｃｍのオープンルーフを有する。明るい環境の照射条件下で試験は行う。動物を１つの閉じたアームに対向する中心領域に置き、５分間ＥＰＭを探索させる。アームに進入した合計回数およびオープンアームで過ごした時間は全体の活動の尺度となる。オープンアームで過ごした時間およびオープンアームに進入した時間の割合の減少は不安の増加を示す。このことは、オステオカルシン−／−マウスにおいて正確に見られるが、Ｅｓｐ−／−マウスは、ＷＴの同腹の子より不安様挙動が少なく、探索動員が多くなることが示された（図１１Ｃ〜Ｄ）。最後に、本発明者らは、新規の環境が不安および探索を引き起こすオープンフィールドパラダイム試験（ＯＦＴ）を使用した（Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９−４９３；Ｓａｈａｙら、２０１１、Ｎａｔｕｒｅ  ４７２：４６６−４７０）。動物をオープンフィールドボックスの中心に置き、３０分にわたって通常の明条件下でビデオトラッキングする。オステオカルシン−／−マウスは、ＷＴの同腹の子と比較して動いた距離、中心で過ごした時間、および垂直活動の劇的な減少を示し、これらの全ての特徴は不安増加の指標である（図１１Ｅ〜Ｆ）。
【０３６３】
不安はしばしば鬱病を伴う。これは尾懸垂試験（ＴＳＴ）によって評価し、その試験において、動物を短時間、それらの尾によって懸垂されるという回避できないストレスに供し、それらの動物は不動の姿勢を取ることによってこれに対応する（Ｃｒｙａｎら、２００５、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｅｈａｖｏｒｉａｌ  Ｒｅｖ．２０：５７１−６２５；Ｃｒｏｗｌｅｙら、２００６；Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２９：５７１−５７６；Ｄａｖｉｄら、２００９、Ｎｅｕｒｏｎ  ６２：４７９−４９３）。この試験において、マウスが不動の時間が多くなるほど、それらはより鬱になる。このことは、オステオカルシン−／−マウスにおいて観察された（図１１Ｇ〜Ｈ）。強制水泳試験（ＦＳＴ）において、マウスを２回の試行に供し、その間にそれらを、逃避することができない水を満たしたガラス円筒内で強制的に水泳させる。１回目の試行は１５分間継続する。２４時間後、２回目の試行を６分間継続して実施する。時間が経つと、マウスは逃避する試みを止め、受動的に浮かび、これは鬱様状態の指標である。他の挙動試験と一致して、オステオカルシン−／−マウスはＷＴマウスより４５％多い時間浮遊して過ごした（図１１Ｉ〜Ｊ）。
【０３６４】
記憶および空間学習挙動を評価するために、オステオカルシン−／−およびオステオカルシン＋／−マウスをモリス水迷路（ＭＷＭＴ）試験に供した。この試験は、距離手がかりを学習し、水から逃避するために水面下のプラットフォームに移動するためにオープン水泳領域の周辺付近に進むマウスの能力に依存する。空間学習を反復した試行（１２日間の４回の試行／日）にわたって評価する。オステオカルシン＋／−およびオステオカルシン−／−マウスはそれぞれ、学習の遅延および完全に学習できないことを示した（図１１Ｋ〜Ｌ）。
【０３６５】
脳内の神経伝達物質含有量および遺伝子発現について示されるように、Ｇｐｒｃ６ａ−／−マウスは、全てのこれらの試験においてＷＴの同腹の子と区別できなかった。まとめると、これらの試験は、オステオカルシンが不安および鬱病を軽減し、探索、挙動、記憶および学習を向上させることを示す。
【０３６６】
実施例２４  オステオカルシンの投与は認知障害を回復させる
ニューロンにおいてシグナル伝達するオステオカルシンのこの能力の薬理学的関連性を、ＷＴおよびオステオカルシン−／−マウスにおいて脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏ−ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＩＣＶ）注入（１０ｎｇ／時間）を介して非カルボキシル化オステオカルシンを送達することによって確立した。カニューレの位置を、これらのポンプを介してメチレンブルーを投与することによって検証した。色素で標識した全ての脳室は、オステオカルシンが脳全体にわたって拡散している可能性があることを示す。さらに、注入したオステオカルシン−／−マウスの血液中のオステオカルシンの測定により、全身循環内の中枢に送達されたホルモンの漏出がないことが示された。非カルボキシル化オステオカルシンによるこの一週間の処置はオステオカルシン−／−マウスにおいて示した不安および鬱病の特徴を矯正した（図１２Ａ〜Ｅ）。まとめると、本明細書に記載される結果は、オステオカルシンが脳内に直接作用することによってマウスにおける不安および鬱病を軽減することを示す。
【０３６７】
実施例２５  母性オステオカルシンは成体子孫における空間記憶および学習に有益である
胎児脳発達に対する母性由来のオステオカルシンの影響により、オステオカルシンが子孫の高齢期において認知機能に何らかの影響を及ぼすかどうかの問題を提起した。この問題に対処するために、オステオカルシン−／−またはオステオカルシン＋／−母親由来の３ヶ月齢のオステオカルシン−／−マウスを挙動試験に供した。それらの母親の遺伝子型に関わらず、不安および鬱病様表現型はオステオカルシン−／−マウスにおいて同様に重度であったが、学習および記憶の欠陥は、オステオカルシン＋／−母親由来よりオステオカルシン−／−母親由来のオステオカルシン−／−マウスにおいて顕著に重度であった（図１３Ａ〜Ｆ）。この結果は、母性オステオカルシンが成体子孫における空間学習および記憶の獲得のために必要であることを示した。
【０３６８】
成体子孫における空間学習および記憶を獲得するための母性オステオカルシンの重要性をさらに評価するために、Ｅ０．５からＥ１８．５の妊娠オステオカルシン−／−母親を、１日に１回、オステオカルシン（２４０ｎｇ／日）の注射により処置した。オステオカルシンは送達後にこれらのメスまたはそれらの子供に決して注射しなかった。この妊娠のみの処置はオステオカルシン−／−マウスの不安または鬱病の表現型に対して有益な効果を示さなかったが、学習および記憶のそれらの欠陥の３分の２以上を救出し、このことは、この表現型が大部分、発生学的起源であることを示す（図１３Ａ〜Ｇ）。この観察と一致して、組織学的切片のクレシルバイオレット染色は、妊娠したオステオカルシン−／−母親の注射後、Ｅ１８．５オステオカルシン−／−胚の脳における脳室拡張の救出を示した（図１３Ｈ）。同様に、アポトーシス細胞の数は減少し、ＮｅｕＮ陽性細胞の数は、注射しなかったオステオカルシン−／−母親に由来するオステオカルシン−／−胚と比較して増加した（図１３Ｉ〜Ｊ）。この染色はまた、オステオカルシン−／−母親に由来する成体オステオカルシン−／−における海馬のＣＡ３およびＣＡ４領域の厚さの欠陥の救出を示した（図１３Ｈ）。最後に、ウェスタンブロット分析は、注射しなかったオステオカルシン−／−母親由来のものと比較して、注射したオステオカルシン−／−母親に由来するオステオカルシン−／−Ｅ１８．５胚の海馬におけるカスパーゼ−３切断タンパク質レベルの減少を示した（図１３Ｋ）。
【０３６９】
実施例２６  脳へのオステオカルシンの直接送達は用量依存的に野生型（ＷＴ）成体マウスにおける認知機能を改善する
オステオカルシンが成体マウスにおいて認知機能を改善するのに十分であるかどうかを決定するために、ＷＴの２ヶ月齢マウスにＩＣＶポンプを移植し、１ヶ月間にわたってビヒクル（ＰＢＳ）、または３、１０もしくは３０ｎｇ／時間の組換え非カルボキシル化完全長マウスオステオカルシンを送達した。注入の１ヶ月後、動物を挙動試験に供した。暗明移行（Ｄ／ＬＴ）試験および高架式十字迷路（ＥＰＭＴ）試験におけるそれらの能力に基づいて、３または１０ｎｇ／時間の組換え非カルボキシル化完全長マウスオステオカルシンを受けている動物は不安様挙動の減少を示した。この改善はそれぞれ、Ｄ／ＬＴおよびＥＭＰ試験における明区画およびオープンアームの探索の増加によって証明される（図１４Ａ〜Ｂ）。
【０３７０】
実施例２７  高齢の野生型（ＷＴ）マウスの脳へのオステオカルシンの直接送達は海馬機能を改善する
組換え非カルボキシル化完全長マウスオステオカルシン（１０ｎｇ／時間）を送達するＩＣＶポンプを１６ヶ月齢のＷＴマウスに移植した。１ヶ月の注入期間の後、マウスを新規物体認識試験の改変型に供して、記憶および海馬機能をアッセイした。簡潔に述べると、マウスは、２つの物体を含む新規領域に、露出間で３分の休息間隔を取って、５回の５分間露出を行った。露出１〜４の間、マウスはこれらの２つの物体に慣れ、等しい量の探索を生じた。５回目の露出において、物体の１つを新規物体と置き換えた。ＰＢＳまたは組換え非カルボキシル化完全長マウスオステオカルシンを受けている高齢のマウスの両者は、新規物体と固定物体を区別できた。しかしながら、図１５は、オステオカルシン処置を受けているマウスは、ビヒクル単独で処置したマウスより新規物体を探索する時間は短く、このことは、海馬コンテキストエンコードおよび／または獲得効果の改善された効果を示す（Ｄｅｎｎｙら、２０１２、Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ２２：１１８８−１２０１）。
【０３７１】
実施例２８  オステオカルシン欠損は筋肉疲労を導く
図１６〜２４は、オステオカルシンシグナル伝達の不在が筋肉質量および機能に対して有害な結果をもたらすことを示す。オステオカルシンの両方のコピーを欠いている若いオステオカルシン−／−マウスは、老齢マウスにおける筋肉疲労の表現型を連想させる。これらのマウスは野生型マウスより体重に対する筋肉質量の低い割合を有し（図１６Ａ）、野生型マウスほど遠く（図１６Ｂ）、または長く（図１６Ｃ）走ることができない。
【０３７２】
実施例２９  動物およびヒトの研究
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）を、ＮＩＨ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｏｏｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＭＤにて、１２時間の明／１２時間の暗サイクル、室温７８±２度、湿度６０±２０％で標準的な非ヒト霊長類ケージに個々に収容した。Ｏｃｎ−／−マウスは１２９−Ｓｖ遺伝的背景で維持した。Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ−／−、Ｇｐｒｃ６ａＭｙｈ６−／−、Ｏｃｎ＋／−；Ｇｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−およびＧｐｒｃ６ａＭｃｋ＋／−；ＣｒｅｂＭｃｋ＋／−マウスは１２９−Ｓｖ／Ｃ５７／ＢＬ６混合型遺伝的背景で維持した。対照の同腹の子を全ての実験において使用した。マウス遺伝子型はＰＣＲによって決定した。オステオカルシンコンディショナルアレルおよびＧｐｒｃ６ａコンディショナルアレルの生成は以前に記載されている（Ｏｕｒｙら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５：２２８−２４１；Ｏｕｒｙら、２０１１、Ｃｅｌｌ  １４４：７９６−８０９）。
【０３７３】
運動研究のために、トレッドミル（Ｈａｒｖａｒｄ装置）で走行する試験の前に全てのマウスを３日間（１０分／日）訓練した。試験の日に、マウスを５分間トレッドミルに慣れさせ、続いて１７ｃｍ／ｓの一定の速度で１０分間走らせ、次いで３０ｃｍ／ｓまで徐々に速度を増加させた。次に、１分の間にマウスが電気格子から落ちる回数（＞１５）によって規定される極度の疲労までマウスを走らせた。握力計測器（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ機器）を使用して筋力の測定を実施した。互いに１分の間隔を空けて５回の単回測定の平均として値を表わす。実施した全ての生化学および代謝分析に関して、休息期または４０分の走行（３０ｃｍ／ｓ）の最後に血液／組織を採取し、処理した。
【０３７４】
ヒトの健常ボランティアを使用して、生存期間にわたってオステオカルシンをアッセイした（Ｅｌｅｃｓｙｓ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）。
【０３７５】
実施例３０  エネルギー代謝研究
耐糖能およびインスリン耐性試験を以前に記載されるように実施した（Ｌｅｅら、２００７、Ｃｅｌｌ  １３０：４５６−４６９）。インビボでのグルコース摂取に関して、２−デオキシ−ｄ−［３Ｈ］グルコース（３Ｈ−２−ＤＧ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（１０μＣｉ）のボーラスを耐久走行の前に投与した。筋肉内の３Ｈ−２−ＤＧおよび３Ｈ−２−ＤＧ−６−Ｐ含有量を、液体シンチレーションカウンタによって決定し、筋肉質量に
正規化した。筋管におけるグルコース摂取および脂肪酸酸化アッセイを以前に記載されるように実施した（Ｓｅｂａｓｔｉａｎら、２００７、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２９２：Ｅ６６７−６８６）。ＧＬＵＴ４タンパク質（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｓｃ−１６０６）の細胞外ドメインに対する抗体を使用してフローサイトメトリーによってＧＬＵＴ４転位を決定した。単離した筋原線維における酸素消費速度（ＯＣＲ）の測定を、ＸＦ２４  Ｓｅａｈｏｒｓｅ分析器（登録商標）（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。ミトコンドリア機能を分析するために、筋原線維を連続して３つの化合物（オリゴマイシン１０μｇ／ｍｌ、ＦＣＣＰ２００μｍ、ロテノン０．２μＭ）で処理し、それらの各々の投与後、ＯＣＲを記録した。
【０３７６】
Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｂｒｏｎｘ、ＮＹ）においてメタボリックプロファイリングを行った。凍結して固定した骨格筋からの代謝産物を抽出し、２工程手順で誘導体化し、ＧＣ−ＴＯＦＭＳ分析を実施した（Ｑｉｕら、２０１４、Ｊ．Ａｍ．Ａｓｓｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０：２１３６−２１４６）。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＴＱ）分析を、Ｓｅｒａｓｉｎｇｈｅら、２０１５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５７：５２１−５３６に従って解糖およびＴＣＡサイクル代謝産物の定量のために使用した。Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ  ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱｐ１８０キット（Ｗａｎｇ−Ｓａｔｔｌｅｒら、２０１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：６１５）を使用して、血漿および筋肉の両方についてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＴＱ）によってアミノ酸、生体アミン、アシルカルニチンおよびリン脂質を定量した。イソフルランによる浅麻酔下でＶｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  Ｍｏｄｅｌ  ２１００を使用して心エコー検査を実施した。
【０３７７】
ＡＤＰおよびＡＴＰ分析を、それぞれＳｉｇｍａ（ＭＡＫ０３３）およびＡｂｃａｍ（ａｂ８３３５５）製の市販のキットを使用して製造業者の指示書に従って実施した。
【０３７８】
実施例３１  生化学および分子生物学
血清オステオカルシン、ＰＩＮＰ、ＣＴＸ、およびインスリン値を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。血糖値を、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋグルコメーターを使用して測定した。尿中３−ＭＨを以前に記載されるように測定した（Ａｒａｎｉｂａｒら、２０１１、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１０：８４−９１）。ｃＡＭＰ蓄積の決定を、市販のキット（Ｒ＆Ｄ）を使用して実施した。遺伝子発現のために、１μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｑＰＣＲ分析を、ＳＹＢＥＲグリーンマスターミックス（ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＦＸ−ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して実施した。各遺伝子の相対発現レベルをＨｐｒｔまたはＧａｐｄｈの発現に正規化した。インサイチュハイブリダイゼーションのために、筋肉を液体Ｎ２で冷却したメチルブタン中で凍結させた。クリオスタットを使用して試料を１０μｍに切片化した。以前に記載されるようにＤＩＧ標識化リボプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを実施した（Ｏｕｒｙら、２０１１、Ｃｅｌｌ  １４４：７９６−８０９）。
【０３７９】
実施例３２  筋肉組織形態計測
ミトコンドリア組織形態計測、筋肉酵素組織化学およびヘマトキシリン／エオシン染色を標準的なプロトコルに従って実施した。
【０３８０】
実施例３３  筋芽細胞および筋原線維の培養
７日齢マウス由来の骨格筋筋芽細胞の培養を記載されるように実施した（Ｇｈａｒａｉｂｅｈら、２００８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ３：１５０１−１５０９）。筋芽細胞は、５％ウマ血清を含有する培地中で３〜４日間で筋管に分化した。筋線維を短趾屈筋から単離した。５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて２時間、ＤＭＥＭ２％コラゲナーゼを用いて筋肉を切断した。筋線維を、広口径ピペットを使用して組織から分け、約５０％コンフルエンスでマトリゲルコーティングプレートにプレーティングした。一晩のインキュベーション後、単離した筋原線維を使用した。
【０３８１】
収縮測定を、速収縮筋肉長趾伸筋（ＥＤＬ）および遅筋ヒラメ筋で実施した。両方の筋肉を後肢から切断し、冷却したＫｒｅｂｓ溶液（９５％Ｏ２〜５％ＣＯ２で泡立てた１１９  ＮａＣｌ、４．７  ＫＣｌ、２．５  ＣａＣｌ２、１．２  ＫＨ２ＰＯ４、１．２  ＭｇＳＯ４、２０  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．４）：ｍＭ単位）中に入れた。ナイロン縫合糸を使用して筋肉の腱を力変換器（４００Ａ、Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および調節可能なフックに縛った。連続して泡立てた（Ｏ２９５／ＣＯ２５％）（２８℃にて）Ｋｒｅｂｓ溶液を含有する刺激チャンバ内に筋肉を浸漬した。２つの白金電極（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １２００Ａ−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍ）間の電場を使用して筋肉を収縮させるように刺激した。
【０３８２】
筋長（Ｌｏ）を最初に最大力を生じるように調整した。力−収縮頻度関係を、漸増の刺激頻度（閾値を超えた電流で３５０ｍｓ間、１０〜１２０Ｈｚにて０．５ｍｓパルス）を使用して収縮を誘発することによって決定した。刺激間で、筋肉を約１分間休息させた。筋肉の疲労性を、１０分にわたって１Ｈｚにて反復性刺激（３０Ｈｚ、３０ｍｓの持続時間）に対する力の損失を測定することによって評価した。収縮特性の測定が完了した後、筋肉をＬｏにて測定し、乾燥させて緩衝液を除去し、秤量した。筋肉断面積を、筋肉質量をその長さおよび組織密度（１．０５６ｇ／ｃｍ３）で割ることによって決定した。次いで力発生を筋肉断面積に正規化して、特定の力を決定した。
【０３８３】
実施例３４  統計
全てのデータは平均±標準誤差として提示する。２つの群間の比較のために不対両側スチューデントのｔ検定および２つより多い群を含む実験のためにＡＮＯＶＡ検定を使用して統計的解析を実施した。全ての実験について、＊はＰ≦０．０５を示し、＃はＰ≦０．００５を示す。
【０３８４】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
配列番号１
ヒトオステオカルシンｃＤＮＡ
【０３８５】
【表２】
2017536368.tif 000011
【０３８６】
配列番号２
ヒトオステオカルシンアミノ酸配列
【０３８７】
【表３】
2017536368.tif 000012
【０３８８】
配列番号３
マウスオステオカルシン遺伝子１ｃＤＮＡ
【０３８９】
【表４】
2017536368.tif 000013
【０３９０】
配列番号４
マウスオステオカルシン遺伝子２ｃＤＮＡ
【０３９１】
【表５】
2017536368.tif 000014
【０３９２】
配列番号５
マウスオステオカルシン遺伝子１および２アミノ酸配列
【０３９３】
【表６】
2017536368.tif 000015
【０３９４】
配列番号６
ヒトγ−カルボキシラーゼｃＤＮＡ
【０３９５】
【表７】
2017536368.tif 000016
【０３９６】
配列番号７
ヒトγ−カルボキシラーゼアミノ酸配列
【０３９７】
【表８】
2017536368.tif 000017
【０３９８】
配列番号８
マウスγ−カルボキシラーゼｃＤＮＡ
【０３９９】
【表９】
2017536368.tif 000018
【０４００】
配列番号９
マウスγ−カルボキシラーゼアミノ酸配列
【０４０１】
【表１０】
2017536368.tif 000019
【０４０２】
配列番号１０
マウスＥｓｐ（ＯＳＴ−ＰＴＰ、Ｐｔｐｒｖ）ｃＤＮＡ
【０４０３】
【表１１−１】
2017536368.tif 000020
【０４０４】
【表１１−２】
2017536368.tif 000021
【０４０５】
配列番号１１
マウスＥｓｐ（ＯＳＴ−ＰＴＰ、Ｐｔｐｒｖ）アミノ酸配列
【０４０６】
【表１２】
2017536368.tif 000022
【０４０７】
配列番号１２
成熟ヒトオステオカルシンアミノ酸配列
【０４０８】
【表１３】
2017536368.tif 000023
【０４０９】
配列番号１３
ヒトオステオカルシン変異体アミノ酸配列
【０４１０】
【表１４】
2017536368.tif 000024
【０４１１】
配列番号１４
ラットＥｓｐ（ＯＳＴ−ＰＴＰ、Ｐｔｐｒｖ）ｃＤＮＡ
【表１５−１】
2017536368.tif 000025
【０４１２】
【表１５−２】
2017536368.tif 000026
【０４１３】
配列番号１５
ラットＥｓｐ（ＯＳＴ−ＰＴＰ、Ｐｔｐｒｖ）アミノ酸配列
【０４１４】
【表１６】
2017536368.tif 000027
【０４１５】
配列番号１６
ヒトＰＴＰ−１Ｂ  ｃＤＮＡ
ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＰＴＰＢＸアクセッション番号Ｍ３１７２４
【０４１６】
【表１７】
2017536368.tif 000028
【０４１７】
配列番号１７
ヒトＰＴＰ−１Ｂアミノ酸配列
ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＰＴＰＢＸアクセッション番号Ｍ３１７２４
【０４１８】
【表１８】
2017536368.tif 000029
【０４１９】
【表１９】
2017536368.tif 000030
【図１】
2017536368.tif 000031
【図２】
2017536368.tif 000032
【図３】
2017536368.tif 000033
【図４】
2017536368.tif 000034
【図５】
2017536368.tif 000035
【図６】
2017536368.tif 000036
【図７】
2017536368.tif 000037
【図８】
2017536368.tif 000038
【図９】
2017536368.tif 000039
【図１０Ａ】
2017536368.tif 000040
【図１０Ｂ】
2017536368.tif 000041
【図１０Ｃ】
2017536368.tif 000042
【図１０Ｄ】
2017536368.tif 000043
【図１０Ｅ】
2017536368.tif 000044
【図１０Ｆ】
2017536368.tif 000045
【図１０Ｇ】
2017536368.tif 000046
【図１０Ｈ】
2017536368.tif 000047
【図１０Ｉ】
2017536368.tif 000048
【図１０Ｊ】
2017536368.tif 000049
【図１０Ｋ】
2017536368.tif 000050
【図１０Ｌ】
2017536368.tif 000051
【図１０Ｍ】
2017536368.tif 000052
【図１１Ａ】
2017536368.tif 000053
【図１１Ｂ】
2017536368.tif 000054
【図１１Ｃ】
2017536368.tif 000055
【図１１Ｄ】
2017536368.tif 000056
【図１１Ｅ】
2017536368.tif 000057
【図１１Ｆ】
2017536368.tif 000058
【図１１Ｇ】
2017536368.tif 000059
【図１１Ｈ】
2017536368.tif 000060
【図１１Ｉ】
2017536368.tif 000061
【図１１Ｊ】
2017536368.tif 000062
【図１１Ｋ】
2017536368.tif 000063
【図１１Ｌ】
2017536368.tif 000064
【図１２Ａ】
2017536368.tif 000065
【図１２Ｂ】
2017536368.tif 000066
【図１２Ｃ】
2017536368.tif 000067
【図１２Ｄ】
2017536368.tif 000068
【図１２Ｅ】
2017536368.tif 000069
【図１３Ａ】
2017536368.tif 000070
【図１３Ｂ】
2017536368.tif 000071
【図１３Ｃ】
2017536368.tif 000072
【図１３Ｄ】
2017536368.tif 000073
【図１３Ｅ】
2017536368.tif 000074
【図１３Ｆ】
2017536368.tif 000075
【図１３Ｇ】
2017536368.tif 000076
【図１３Ｈ】
2017536368.tif 000077
【図１３Ｉ】
2017536368.tif 000078
【図１３Ｊ】
2017536368.tif 000079
【図１３Ｋ】
2017536368.tif 000080
【図１４】
2017536368.tif 000081
【図１５】
2017536368.tif 000082
【図１６】
2017536368.tif 000083
【図１７】
2017536368.tif 000084
【図１８】
2017536368.tif 000085
【図１９】
2017536368.tif 000086
【図２０】
2017536368.tif 000087
【図２１】
2017536368.tif 000088
【図２２】
2017536368.tif 000089
【図２３】
2017536368.tif 000090
【図２４】
2017536368.tif 000091
【図２５Ａ】
2017536368.tif 000092
【図２５Ｂ】
2017536368.tif 000093
【図２５Ｃ】
2017536368.tif 000094
【図２５Ｄ】
2017536368.tif 000095
【図２５Ｅ】
2017536368.tif 000096
【図２５Ｆ】
2017536368.tif 000097
【図２５Ｇ】
2017536368.tif 000098
【図２５Ｈ】
2017536368.tif 000099
【図２５Ｉ】
2017536368.tif 000100
【図２５Ｊ】
2017536368.tif 000101
【図２５Ｋ】
2017536368.tif 000102
【図２５Ｌ】
2017536368.tif 000103
【図２５Ｍ】
2017536368.tif 000104
【図２５Ｎ】
2017536368.tif 000105
【図２６Ａ】
2017536368.tif 000106
【図２６Ｂ】
2017536368.tif 000107
【図２６Ｃ】
2017536368.tif 000108
【図２６Ｄ】
2017536368.tif 000109
【図２６Ｅ】
2017536368.tif 000110
【図２６Ｆ】
2017536368.tif 000111
【図２６Ｇ】
2017536368.tif 000112
【図２６Ｈ】
2017536368.tif 000113
【図２６Ｉ】
2017536368.tif 000114
【図２６Ｊ】
2017536368.tif 000115
【図２６Ｋ】
2017536368.tif 000116
【図２７Ａ】
2017536368.tif 000117
【図２７Ｂ】
2017536368.tif 000118
【図２７Ｃ】
2017536368.tif 000119
【図２７Ｄ】
2017536368.tif 000120
【図２７Ｅ】
2017536368.tif 000121
【図２７Ｆ】
2017536368.tif 000122
【図２８Ａ】
2017536368.tif 000123
【図２８Ｂ】
2017536368.tif 000124
【図２８Ｃ】
2017536368.tif 000125
【図２８Ｄ】
2017536368.tif 000126
【図２８Ｅ】
2017536368.tif 000127
【図２８Ｆ】
2017536368.tif 000128
【図２８Ｇ】
2017536368.tif 000129
【図２８Ｈ】
2017536368.tif 000130
【図２８Ｉ】
2017536368.tif 000131
【図２８Ｊ】
2017536368.tif 000132
【図２８Ｋ】
2017536368.tif 000133
【図２８Ｌ】
2017536368.tif 000134
【図２９Ａ】
2017536368.tif 000135
【図２９Ｂ】
2017536368.tif 000136
【図２９Ｃ】
2017536368.tif 000137
【図２９Ｄ】
2017536368.tif 000138
【図２９Ｅ】
2017536368.tif 000139
【図２９Ｆ】
2017536368.tif 000140
【図２９Ｇ】
2017536368.tif 000141
【図２９Ｈ】
2017536368.tif 000142
【図３０Ａ】
2017536368.tif 000143
【図３０Ｂ】
2017536368.tif 000144
【図３０Ｃ】
2017536368.tif 000145
【図３０Ｄ】
2017536368.tif 000146
【図３０Ｅ】
2017536368.tif 000147
【図３０Ｆ】
2017536368.tif 000148
【図３０Ｇ】
2017536368.tif 000149
【図３１Ａ】
2017536368.tif 000150
【図３１Ｂ】
2017536368.tif 000151
【図３１Ｃ】
2017536368.tif 000152
【図３１Ｄ】
2017536368.tif 000153
【図３１Ｅ】
2017536368.tif 000154
【図３１Ｆ】
2017536368.tif 000155
【図３１Ｇ】
2017536368.tif 000156
【図３１Ｈ】
2017536368.tif 000157
【図３１Ｉ】
2017536368.tif 000158
【図３１Ｊ】
2017536368.tif 000159
【国際調査報告】
2017536368.tif 000160