(57)【要約】  ＲＮＡウイルス汚染に関してパンクレリパーゼをスクリーニングする方法は、パンクレリパーゼから遊離ウイルスＲＮＡを除去するステップと、パンクレリパーゼ中の任意のウイルスを変性させて、カプシドに包まれたＲＮＡをパンクレリパーゼ環境中に遊離させるステップと、この遊離したＲＮＡを検出するステップとを含む。遊離ウイルスＲＮＡの除去は、ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼでパンクレリパーゼを処理するステップ、又はＲＮＡなどの核酸は溶液中に残しておきながらタンパク質画分を沈殿させる塩でパンクレリパーゼのタンパク質画分を沈殿させるステップを含み得る。遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼもまた提供される。
2017519490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パンクレリパーゼから実質的に全ての遊離核酸を除去する方法であって、前記パンクレリパーゼ中の実質的に全ての遊離核酸の分解を触媒するのに有効なリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼの量及び時間でパンクレリパーゼを処理するステップを含む方法。
【請求項２】
前記リボヌクレアーゼがリボヌクレアーゼＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がウイルスＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスＲＮＡが肝炎ウイルスＲＮＡを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記肝炎ウイルスＲＮＡがＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記パンクレリパーゼ中に存在するプロテアーゼ酵素の生物学的活性を阻害するのに有効な量及び時間でプロテアーゼ阻害薬を用いて前記パンクレリパーゼを処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記パンクレリパーゼ中の遊離ＲＮＡの存在に関してスクリーニングするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼであって、請求項１に記載の方法によって作製されるパンクレリパーゼ。
【請求項９】
遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼであって、請求項２に記載の方法によって作製されるパンクレリパーゼ。
【請求項１０】
遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼであって、請求項６に記載の方法によって作製されるパンクレリパーゼ。
【請求項１１】
パンクレリパーゼの試料中のＥ型肝炎ウイルス汚染を検出する方法であって、（ａ）パンクレリパーゼ中の実質的に全ての遊離核酸の分解を触媒するのに有効なリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼの量及び時間で前記パンクレリパーゼを処理して、遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼを形成するステップと、（ｂ）前記試料中の前記リボヌクレアーゼのＲＮＡ分解活性を阻害するステップと、（ｃ）Ｅ型肝炎ウイルスのカプシドを変性させる能力を有する薬剤をカプシドの変性に有効な量及び時間で用いて前記遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼの試料を処理して、元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを含むパンクレリパーゼを作製するステップと、（ｄ）前記元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを増幅するステップと、（ｅ）前記増幅された元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出するステップとを含む方法。
【請求項１２】
任意選択で、前記元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを抽出するステップと、前記抽出されたＲＮＡを増幅するステップとを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記パンクレリパーゼ中に存在するプロテアーゼ酵素の生物学的活性を阻害するのに有効な量及び時間でプロテアーゼ阻害薬を用いて前記パンクレリパーゼを処理するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記リボヌクレアーゼがリボヌクレアーゼＡを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
パンクレリパーゼのハイスループットスクリーニングに適合される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｅ型肝炎ウイルス汚染に関してパンクレリパーゼの試料をスクリーニングする方法であって、（ａ）パンクレリパーゼのタンパク質画分を沈殿させる能力を有する塩をタンパク質画分の沈殿に有効な量で用いて前記パンクレリパーゼを処理するステップであって、それにより遊離ＲＮＡを実質的に欠く沈殿パンクレリパーゼタンパク質画分を作製するステップと、（ｂ）任意選択で、前記タンパク質画分を洗浄するステップと、（ｃ）Ｅ型肝炎ウイルスのカプシドを変性させる能力を有する薬剤をカプシドの変性に有効な量及び時間で用いて前記タンパク質画分を処理するステップであって、それにより元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを含む沈殿パンクレリパーゼタンパク質画分を作製するステップと、（ｄ）前記元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを増幅するステップと、（ｅ）前記増幅された元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出するステップとを含む方法。
【請求項１７】
任意選択で、前記元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを抽出するステップと、前記抽出されたＲＮＡを増幅するステップとを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩が硫酸アンモニウムを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
パンクレリパーゼのハイスループットスクリーニングに適合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチを入手するステップと、（ｂ）（ｉ）前記パンクレリパーゼ抽出物の試料中、又は前記バッチ中の前記パンクレリパーゼ抽出物の１つ以上からの１つ以上の試料中の遊離ＲＮＡ及びカプシドに包まれたＲＮＡの量を検出又は計測するステップ、（ｉｉ）遊離ＲＮＡ及びカプシドに包まれたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡの存在に関して前記パンクレリパーゼ抽出物又は前記パンクレリパーゼ抽出物のバッチをバリデートするステップ、（ｉｉｉ）前記パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチを１つ以上の剤形に配合するステップとによって、パンクレリパーゼ又はパンクレリパーゼのバッチを作製する方法。
【請求項２１】
前記パンクレリパーゼ抽出物の試料中、又は前記バッチ中の前記パンクレリパーゼ抽出物の１つ以上からの１つ以上の試料中の遊離ＲＮＡ及びカプシドに包まれたＲＮＡの量を検出又は計測するステップが、（ａ）前記パンクレリパーゼ中の実質的に全ての遊離核酸の分解を触媒するのに有効なリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼの量及び時間で前記パンクレリパーゼ又は前記パンクレリパーゼのバッチを処理するステップであって、それにより遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼを作製するステップと、（ｂ）前記リボヌクレアーゼのＲＮＡ分解活性を阻害するステップと、（ｃ）Ｅ型肝炎ウイルスのカプシドを変性させる能力を有する薬剤をカプシドの変性に有効な量及び時間で用いて前記遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼを処理するステップであって、それにより元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを含むパンクレリパーゼを作製するステップと、（ｄ）前記元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを増幅するステップと、（ｅ）前記増幅された元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡ及び遊離ＲＮＡを検出又は計測するステップとを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リボヌクレアーゼがリボヌクレアーゼＡを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
パンクレリパーゼのハイスループットスクリーニングに適合される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
遊離ＲＮＡを実質的に欠くパンクレリパーゼと、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む固形剤形。
【請求項２５】
粗パンクレリパーゼ抽出物中に存在する遊離ＲＮＡと比較して少なくとも５０％少ない遊離ＲＮＡをさらに含む、請求項２４に記載の固形剤形。
【請求項２６】
粗パンクレリパーゼ抽出物中に存在する遊離ＲＮＡと比較して少なくとも９０％少ない遊離ＲＮＡをさらに含む、請求項２４に記載の固形剤形。
【請求項２７】
前記剤形が、散剤、錠剤、ミニ錠剤、マイクロ錠剤、非コーティング剤形、コーティング剤形、コーティング剤形と非コーティング剤形との混合物、ミクロスフェア、小粒、カプレット、ジェルキャップ、カプセル、又はメディカルフードである、請求項２４に記載の固形剤形。
【請求項２８】
遊離ＲＮＡを実質的に欠くパンクレリパーゼを含む前記医薬組成物又は前記剤形の有効量を投与して、それを必要としている患者における消化酵素欠損に関連する病態又は障害を治療又は予防する方法。
【請求項２９】
前記患者が嚢胞性線維症に罹患している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者が膵外分泌機能不全に罹患している、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互関連出願
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１４年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／０１４，３３７号の利益を主張するものであり、その開示は本明細書においてあらゆる目的から全体として参照により援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して医薬品品質保証の分野に関する。より詳細には、本発明は、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）などのＲＮＡウイルスの存在に関する膵臓抽出物のスクリーニングにおいて偽陽性結果を大幅に低減するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生物学的薬物は、その固有の複雑なプロファイルに起因して、製造上及び規制上幾つかの特有の難題を伴う。生物学的薬物は高度な構造的複雑性及び不均一性を有し、生物系で作製されるか、又は生物系に由来する試薬が補足され、結果的に、特に品質及び安全性の観点から分析上特有の難題を伴う複雑な純度／不純物プロファイルを有する。
【０００４】
生物学的薬物の安全性の確保は重要である。汚染は、ウイルスなどの病原微生物の存在を含め、かかる薬物を投与されるある種の患者において重病又はさらには死亡さえも引き起こし得る。実際、かかる薬物の規制当局の承認は、一部には、薬物中の病原微生物を排除すること、又は少なくともそのレベルを許容レベルまで低減することに依存する。生物学的薬物から微生物を除去した後、微生物の除去を確認するため薬物はスクリーニングされる。
【０００５】
検出に先立ち増殖させることのできる細菌などの細胞性微生物とは対照的に、ほとんどのウイルス粒子はそれぞれの試料において直接検出する必要がある。概して、ウイルスの存在は、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡのＰＣＲに基づく増幅及び検出を用いて検出される。従って、ウイルス汚染のスクリーニング及び検出に利用可能な高感度の検出方法を有することが重要である。現行の検出方法は、高感度であるものの、それでもなお偽陰性結果及び偽陽性結果の両方を生じるという欠点を抱えている。偽陰性結果は、患者が汚染された薬物の投与を受けることになり得る点で問題であり、偽陽性結果は、良好な薬物バッチが破棄され、又はさらなる高価な処理に供されることになり得る点で問題である。
【０００６】
パンクレリパーゼは生物学的薬物である。この薬物は、ブタ由来の膵アミラーゼ、膵リパーゼ、及び膵プロテアーゼを含む消化酵素の混合物である。パンクレリパーゼは、膵機能不全患者がその食物をより良く消化できるようにするため使用される。パンクレリパーゼはブタの膵臓から調製され、アミラーゼ、リパーゼ、及びプロテアーゼに加え、各種の他の酵素、塩、核酸及び炭水化物を含む。パンクレリパーゼは高度な酵素活性を有し（この特異的な特性のために調製されている）、この点で他の生物学的マトリックス及び生物学的薬物とは異なる。生物学的供給源から調製されるため、パンクレリパーゼ最終製剤の前駆物質はウイルスなどのヒト病原体を含有することもあり、これは除去しなければならない。
【０００７】
パンクレリパーゼを形成するための膵腺からの消化酵素の抽出に用いられる方法によると、ウイルスエンベロープ又はカプシドの破壊によってウイルス数及びウイルス感染価が減少する。一部のウイルスはこの処理ステップを生き残ることができるが、しかしかかるウイルスの感染価は低下し得る。かかるウイルスの例としては、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）が挙げられる。
【０００８】
パンクレリパーゼがＨＥＶ不含であることを確かめるため、試料はＨＥＶ  ＲＮＡのＰＣＲに基づく増幅及び検出に供される。パンクレリパーゼにウイルスが存在すること、従ってウイルス汚染があることの推定は、そのウイルスに特異的な塩基配列の検出によって行われる。ウイルスＲＮＡはパンクレリパーゼ生産過程のアーチファクトとして遊離形態（いかなるウイルスカプシドもない）で存在することもあり、又は汚染ウイルスとしてカプシドに包まれた若しくはインタクトな形で存在することもある。前者は概して懸念の根拠にはならないが、後者はウイルス汚染を意味する。しかしながら、残念ながら現行の増幅及び検出方法では、遊離ウイルスＲＮＡとカプシドに包まれた又はインタクトなウイルスＲＮＡとが区別されない。パンクレリパーゼは、例えば試験下の試料の生物学的構成物質又は分析の実施に用いられる成分に酵素が反応し／それを変換するなどして、その酵素が分析の妨げとなるため、生物学的構成物質の分析を行うことが極めて困難な製剤である。従って、検出方法及び分析技法をパンクレリパーゼ試料での使用に合わせて特別に調整する必要がある。
【０００９】
カプシドに包まれたＲＮＡを検出し得るためには、まずそれをエンベロープ又はカプシドから遊離させなければならない。ウイルス核酸は、タンパク質ウイルスカプシドを破壊する溶解緩衝液で組織又は他の試料を処理することによって遊離する。次に核酸は精製され、ＰＣＲを用いて増幅され、フルオロフォア（fluorphore）を含有する一本鎖核酸プローブによって目的のウイルスに特異的な配列が検出される。
【００１０】
遊離ウイルス核酸とカプシドに包まれたインタクトなウイルス核酸とを区別できないことにより、試料中のウイルスの存在に関して偽陽性結果が生じ得る。パンクレリパーゼの調製では、抽出過程でカプシドに包まれたウイルスＲＮＡの遊離が生じ得る。溶解緩衝液によってカプシドに包まれたＲＮＡが一般環境中に遊離すると、それを遊離ＲＮＡと区別できなくなる。ある場合には、遊離ＲＮＡは元の核酸鎖の短い断片を成し得る。
【００１１】
現行のＨＥＶ  ＲＮＡ検出方法はパンクレリパーゼにおける遊離形態のＲＮＡ又はその断片とカプシドに包まれたＲＮＡとを区別しないため、改良された検出方法、特に、遊離形態のＲＮＡとカプシドに包まれたＲＮＡとを有効に区別することができ、それによって偽陽性検査結果を低減する検出方法が必要である。
【００１２】
Schielke et al., Virology Journal 2011, 8:487による発表において、この研究者らは、雄ブタ肝ホモジネート中のＨＥＶの存在を判定した。この方法論では、ＲＮＡ増幅前にホモジネートにリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を添加することにより、ウイルスカプシドによって保護されていない全てのＲＮＡが分解された。この研究者らは、ＲＮアーゼによってホモジネートから遊離ＲＮＡがパージされ、続く分析では（カプシドの溶解によってカプシドに包まれたＲＮＡを遊離させた後）全ＨＥＶビリオンのＲＮＡのみが検出されたことを観察した。この発表に記載される方法は、肝ホモジネートに特有である。当業者であれば、膵臓中の酵素、特に膵プロテアーゼがヌクレアーゼを容易に分解し、従って肝臓抽出物に使用されるＲＮアーゼが必ずしも膵臓抽出物で機能するとは限らないことは容易に理解するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、当該技術分野では、膵臓の生物学的試料において偽陽性結果が生じることを回避するため遊離核酸とカプシドに包まれた核酸とを区別可能な検出方法が必要とされている。また、当該技術分野では、膵臓の生物学的試料中のインタクトなウイルスを検出するため遊離核酸を含まない試料の製剤も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
パンクレリパーゼから実質的に全ての遊離核酸を除去する方法は、パンクレリパーゼ中の実質的に全ての遊離核酸の分解を触媒するのに有効なヌクレアーゼの量及び時間でパンクレリパーゼを処理するステップを含む。ヌクレアーゼは好ましくはリボヌクレアーゼであり、より好ましくはリボヌクレアーゼＡを含む。ヌクレアーゼは好ましくはデオキシリボヌクレアーゼであり、より好ましくは同時に使用されるリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼである。一部の実施形態では、リボヌクレアーゼはリボヌクレアーゼＡを含む。遊離核酸はＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよく、好ましくはウイルスＤＮＡ又はＲＮＡを含み、より好ましくはウイルスＲＮＡを含む。遊離ウイルスＲＮＡは肝炎ウイルスＲＮＡを含み得る。遊離肝炎ウイルスＲＮＡは遊離Ｅ型肝炎ウイルスＲＮＡを含み得る。任意選択で、本方法は、パンクレリパーゼ中に存在するプロテアーゼ酵素のリボヌクレアーゼ分解活性を含めたタンパク質分解活性を阻害するのに有効な量のプロテアーゼ阻害薬でパンクレリパーゼを処理するステップを含み得る。遊離ＲＮＡを含めた遊離核酸を欠くパンクレリパーゼが提供される。遊離ＲＮＡを欠き、且つ遊離Ｅ型肝炎ウイルスＲＮＡを含むパンクレリパーゼが提供される。
【００１５】
パンクレリパーゼの試料をＥ型肝炎ウイルス汚染に関してスクリーニングする方法は、パンクレリパーゼ中の遊離ＲＮＡを含めた実質的に全ての遊離核酸の分解を触媒するのに有効な量のリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼでパンクレリパーゼを処理するステップであって、それにより遊離ＲＮＡを含めた遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼを作製するステップと、リボヌクレアーゼのＲＮＡ分解活性を阻害するステップと、Ｅ型肝炎ウイルスのカプシドを変性させる能力を有する薬剤をカプシドの変性に有効な量で用いて遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼを処理するステップであって、それにより元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを含むパンクレリパーゼを作製するステップと、任意選択で、元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを抽出するステップと、元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを増幅するステップと、増幅された元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出するステップとを含む。本方法は、パンクレリパーゼ中に存在するプロテアーゼ酵素の生物学的活性を阻害するのに有効な量のプロテアーゼ阻害薬でパンクレリパーゼを処理するステップをさらに含み得る。リボヌクレアーゼはリボヌクレアーゼＡを含み得る。本方法はパンクレリパーゼのハイスループットスクリーニング能力を有し得る。遊離ＲＮＡの分解は、Ｅ型肝炎ウイルスの存在に関連する塩基配列をそれ以上検出できなくなる程度までＲＮＡを分解することを含み得る。
【００１６】
パンクレリパーゼの試料をＥ型肝炎ウイルス汚染に関してスクリーニングする方法は、パンクレリパーゼのタンパク質画分を沈殿させる能力を有する種類及び濃度の塩を溶液中に核酸を残しておきながらタンパク質画分を沈殿させるのに有効な量で用いてパンクレリパーゼを処理するステップであって、それにより遊離ＲＮＡを実質的に欠く沈殿パンクレリパーゼタンパク質画分を作製するステップと、Ｅ型肝炎ウイルスのカプシドを変性させる能力を有する薬剤をカプシドの変性に有効な量で用いてタンパク質画分を処理するステップであって、それにより元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを含む沈殿パンクレリパーゼタンパク質画分を作製するステップと、任意選択で、元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを抽出するステップと、元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを増幅するステップと、増幅された元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出するステップとを含む。本方法は、任意選択で、沈殿タンパク質画分を１回又は２回以上洗浄するステップを含み得る。本方法は、任意選択で、タンパク質画分を１回又は２回以上洗浄し、再懸濁し及び再沈殿させるステップを含み得る。塩は硫酸アンモニウムを含み得る。本方法はパンクレリパーゼのハイスループットスクリーニング能力を有し得る。
【００１７】
パンクレリパーゼ又はパンクレリパーゼのバッチを作製する方法は、パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチを入手するステップと、パンクレリパーゼ抽出物の試料中、又はバッチ中のパンクレリパーゼ抽出物の１つ以上からの１つ以上の試料中の遊離ＲＮＡ及びカプシドに包まれたＲＮＡの量を検出又は計測するステップと、遊離ＲＮＡ及びカプシドに包まれたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡの存在に関してパンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチをバリデートするステップと、パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチを１つ以上の剤形に配合するステップとを含む。ＲＮＡの検出又は計測方法は、パンクレリパーゼ中の実質的に全ての遊離核酸の分解を触媒するのに有効なリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼの量及び時間でパンクレリパーゼ又はパンクレリパーゼのバッチを処理するステップであって、それにより遊離ＲＮＡを含めた遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼを作製するステップと、リボヌクレアーゼのＲＮＡ分解活性を阻害するステップと、Ｅ型肝炎ウイルスのカプシドを変性させる能力を有する薬剤をカプシドの変性に有効な量及び時間で用いて遊離核酸を実質的に欠くパンクレリパーゼを処理するステップであって、それにより元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを含むパンクレリパーゼを作製するステップと、元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを増幅するステップと、増幅された元はカプシドに包まれていたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡを検出するステップとを含む。
【００１８】
本発明の固形剤形は、遊離ＲＮＡを実質的に欠くパンクレリパーゼと１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。この固形剤形は、粗パンクレリパーゼ抽出物中に存在する遊離ＲＮＡと比較したとき含まれる遊離ＲＮＡが少なくとも５０％少なく、散剤、錠剤、ミニ錠剤、マイクロ錠剤、非コーティング剤形、コーティング剤形、コーティング剤形と非コーティング剤形との混合物、ミクロスフェア、小粒、カプレット、ジェルキャップ、カプセル、又はメディカルフードであり得る。
【００１９】
遊離ＲＮＡを実質的に欠くパンクレリパーゼを含む医薬組成物又は剤形の有効量を投与して、それを必要としている患者における消化酵素欠損に関連する病態又は障害を治療又は予防する方法。患者における消化酵素欠損に関連する病態又は障害を治療又は予防する本方法は、それを必要としている患者にパンクレリパーゼ抽出物を含む医薬組成物又は剤形を投与するステップを含む。本方法は、パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチを入手するステップと、パンクレリパーゼ抽出物の試料中、又はバッチ中のパンクレリパーゼ抽出物の１つ以上からの１つ以上の試料中の遊離ＲＮＡ及びカプシドに包まれたＲＮＡの量を検出又は計測するステップと、遊離ＲＮＡ及びカプシドに包まれたＥ型肝炎ウイルスＲＮＡの存在に関してパンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチをバリデートするステップと；パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチを１つ以上の剤形に配合するステップと、有効量の膵酵素製剤を患者に投与するステップとを含み、ここでパンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチにおけるウイルス感染負荷は閾値未満である。患者は、嚢胞性線維症、膵外分泌機能不全、慢性膵炎又は任意の他の膵臓関連疾患若しくは疾患状態に罹患していてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】パンクレリパーゼの硫酸アンモニウム分画の正規化スペクトルを示す。
【図２】本発明のRNase Alertアッセイに関する補正値のヒストグラムプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本明細書全体を通じて、特許、公開出願、技術論文及び学術論文を含めた様々な刊行物が引用される。引用される刊行物は各々、全体として、及びあらゆる目的から、参照によって本明細書に援用される。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて、本発明の態様に関係する様々な用語が使用される。かかる用語には、特に指示されない限り、当該技術分野におけるその通常の意味を与えるものとする。他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と整合するように解釈されるものとする。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、単数形「a」、「an」、及び「the」には、特に明示的に述べられない限り複数の指示対象が含まれる。
【００２４】
用語「患者」は、ヒト又は他の動物を指す。
【００２５】
一般的な略称は、以下のとおりの計測単位、技法、特性又は化合物に対応する：「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」又は「ｈｒ」は時間を意味し、「ｌ」又は「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」又は「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、及び「ｍｍｏｌｅ」はミリモルを意味する。
【００２６】
用語「ＵＳＰ単位」は、ビタミン又は薬物の力価、即ちビタミン又は薬物の予想される生物学的効果を測るために使用される単位を指す。この単位が適用される各物質について、米国食品医薬品局（U.S. Food and Drug Administration）が１ＵＳＰ単位の用量に関連する生物学的効果を定めている。ひいてはこの標準単位によって物質の他の分量を表すことができる。ほとんどの場合、ＵＳＰ単位は国際単位（ＩＵ）に等しい。
【００２７】
用語「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を指し、用語「ＲＴ−ＰＣＲ」は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を指す。
【００２８】
用語ＤＮＡの「増幅」は、本明細書で使用されるとき、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＮＡ配列の混合物中の特定のＤＮＡ配列の濃度を増加させることを意味する。ＰＣＲの説明については、Saiki et al, Science 1988, 239:487（この開示は本明細書に援用される）を参照のこと。
【００２９】
用語「治療有効量」は、概して、状態、障害又は病態を治療するため患者（ヒトなど）に投与されるとき、かかる治療を達成するのに十分な化合物又は組成物の量を指す。「治療有効量」は、化合物又は組成物、疾患及びその重症度、並びに治療される動物の年齢、体重、健康状態及び反応性に応じて異なり得る。
【００３０】
用語「パンクレリパーゼ」又は「パンクレリパーゼ酵素」又は「パンクレアチン」は、アミラーゼ、リパーゼ、及びプロテアーゼ酵素を含めた数種の酵素の混合物、又は膵臓起源のそれらの混合物を意味する。パンクレリパーゼは、例えばNordmark Arzneimittel GmbH、Scientific Protein Laboratories LLC、又はSigma Aldrichから市販されており、ブタ、ウシ又は他の哺乳類供給源に由来する同様の抽出物を使用し得る。
【００３１】
パンクレリパーゼは、アミラーゼ、リパーゼ、及びプロテアーゼ酵素の混合物を含む。パンクレリパーゼは当該技術分野において、パンクレアチン、膵臓抽出物又は膵臓抽出物のバッチとしても知られる。パンクレリパーゼに存在し得る他の活性酵素としては、以下が挙げられる：（ｉ）活性プロテアーゼ、例えば限定はされないが、トリプシン、Ｅ．Ｃ．（酵素委員会番号）限定なしに、３．４．２１．４；キモトリプシン、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．４．２１．１；キモトリプシンＢ、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．４．２１．１；膵ペプチダーゼＥ、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．４．２１．３６及び３．４．２１．３７；カルボキシペプチダーゼＡ、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．４．１７．１；及びカルボキシペプチダーゼＢ、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．４．１７．２；エラスターゼ、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．４．２１．３６；カリクレイン、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．４．２１．３５  （ｉｉ）活性リパーゼ、例えば限定はされないが、グリセロールエステルヒドロラーゼ（リパーゼ）、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３；ホスホリパーゼＡ２、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．１．１．４；及びステロールエステルヒドロラーゼ、限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．１．１．１３；（ｉｉｉ）ヌクレアーゼ、例えば限定はされないが、リボヌクレアーゼ（限定なしに、Ｅ．Ｃ．２．７．７．１６）及びデオキシリボヌクレアーゼ（限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．１．４．５）；及び（ｉｖ）活性アミラーゼ、例えば、ａ−アミラーゼ（限定なしに、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）。
【００３２】
用語「消化酵素」は、本明細書で使用されるとき、食物が生物によって摂取又は吸収され得るように食物の成分を分解する消化管内の酵素を意味する。消化酵素の非限定的な例としては、パンクレリパーゼ（パンクレアチンとも称される）、リパーゼ、コリパーゼ、トリプシン、キモトリプシン、キモトリプシンＢ、膵ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、グリセロールエステルヒドロラーゼ、ホスホリパーゼ、ステロールエステルヒドロラーゼ、エラスターゼ、キニノゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ａ−アミラーゼ、パパイン、キモパパイン、グルテナーゼ、ブロメライン、フィシン、β−アミラーゼ、セルラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、イソマルターゼ、及びこれらの混合物が挙げられる。これらの酵素は、膵臓又は膵液からの抽出によって得られるか、或いは膵臓以外の供給源、例えば、微生物、細菌、カビ、真菌、植物若しくは他の動物組織、又は遺伝子修飾された微生物、真菌若しくは植物から人工的に作製され、又は得られ得る。
【００３３】
用語「リパーゼ」は、脂質からグリセロール及び単純脂肪酸への加水分解を触媒する酵素を意味する。本発明に好適なリパーゼの例としては、限定はされないが、動物リパーゼ（例えば、ブタリパーゼ）、細菌リパーゼ（例えば、シュードモナス属（Pseudomonas）リパーゼ及び／又はバークホルデリア属（Burkholderia）リパーゼ）、真菌リパーゼ、植物リパーゼ、組換えリパーゼ（例えば、培養下の微生物、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫又は哺乳類宿主細胞のいずれか一つから選択される好適な宿主細胞によって組換えＤＮＡ技術で作製されるか、又は天然に存在する配列と相同な又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む組換えリパーゼ、天然に存在するリパーゼコード核酸と相同な又は実質的に同一の核酸によってコードされるリパーゼ等）、合成リパーゼ、化学修飾されたリパーゼ、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３４】
用語「アミラーゼ」は、デンプンを分解するグリコシドヒドロラーゼ酵素、例えば、ａ−アミラーゼ、β−アミラーゼ、γ−アミラーゼ、酸性ａ−グルコシダーゼ、プチアリンなどの唾液アミラーゼ等を指す。本発明での使用に好適なアミラーゼとしては、限定はされないが、動物アミラーゼ、細菌アミラーゼ、真菌アミラーゼ（例えば、アスペルギルス属（Aspergillus）アミラーゼ、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）アミラーゼ）、植物アミラーゼ、組換えアミラーゼ（例えば、培養下の微生物、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫又は哺乳類宿主細胞のいずれか一つから選択される好適な宿主細胞によって組換えＤＮＡ技術で作製されるか、又は天然に存在する配列と相同な又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む組換えアミラーゼ、天然に存在するアミラーゼコード核酸と相同な又は実質的に同一の核酸によってコードされるアミラーゼ等）、化学修飾されたアミラーゼ、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３５】
用語「プロテアーゼ」は、概して、タンパク質のアミノ酸間のペプチド結合を切断する酵素（例えば、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、又はタンパク質分解酵素）を指す。プロテアーゼは、例えば、アスパラギン酸ペプチダーゼ、システイン（チオール）ペプチダーゼ、メタロペプチダーゼ、セリンペプチダーゼ、スレオニンペプチダーゼ、アルカリ又はセミアルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ及び未知の触媒機構のペプチダーゼなど、概してその触媒タイプによって同定される。本発明での使用に好適なプロテアーゼの非限定的な例としては、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、プラスメプシン）、メタロプロテアーゼ及びグルタミン酸プロテアーゼが挙げられる。加えて、本発明での使用に好適なプロテアーゼとしては、限定はされないが、動物プロテアーゼ、微生物プロテアーゼ、細菌プロテアーゼ、真菌プロテアーゼ（例えば、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）プロテアーゼ）、植物プロテアーゼ、組換えプロテアーゼ（例えば、培養下の細菌、酵母、真菌、植物、昆虫又は哺乳類宿主細胞のいずれか一つから選択される好適な宿主細胞によって組換えＤＮＡ技術で作製されるか、又は天然に存在する配列と相同な又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む組換えプロテアーゼ、天然に存在するプロテアーゼコード核酸と相同な又は実質的に同一の核酸によってコードされるプロテアーゼ等）、化学修飾されたプロテアーゼ、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３６】
パンクレリパーゼは動物供給源、例えば、雄ブタ、ヒツジ及びウシに由来し得る。コリパーゼもまたパンクレリパーゼに含まれ得る。用語「酵素」には、既に活性化した形態が含まれるのみならず、哺乳類の腸液で活性型に変換されることが可能なチモーゲン前駆体もまた含まれる。遊離ＲＮＡは、細胞によるか、ウイルスによるか、又は細胞構造、細胞小器官構造、タンパク質構造、又はその他の、通常かかるポリリボヌクレオチド若しくはウイルス遺伝物質を被包し、封入し、若しくはエンベロープで包む構造によって被包されておらず、封入されておらず、又はエンベロープで包まれていない任意の鎖長のポリリボヌクレオチドを（その断片を含め）含む。遊離ＲＮＡには、無細胞ＲＮＡ及びウイルスフリーＲＮＡ、例えばウイルスカプシドフリーＲＮＡが含まれる。遊離ＲＮＡはまた、ネイキッドＲＮＡとも称され得る。限定ではなく、例として、液体パンクレリパーゼ組成物中の遊離ＲＮＡは、パンクレリパーゼの構成物質中に浮遊する細胞起源又はウイルス起源のポリリボヌクレオチドを含む。遊離ＲＮＡは、例えばカプシドの封じ込めによってリボヌクレアーゼから遮蔽されているウイルスカプシド封入ＲＮＡとは対照的に、リボヌクレアーゼの生物学的活性による分解から保護されていない。ウイルスカプシド封入ＲＮＡはまた、カプシドに包まれたＲＮＡ又はインタクトなウイルスＲＮＡ又はインタクトなＲＮＡとも称され得る。
【００３７】
本発明は、膵臓抽出物のＲＮＡウイルス汚染を検出するためのスクリーニングアッセイに関する。これらのアッセイは、膵臓抽出物中の遊離ウイルスＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ断片又は粗膵臓抽出物をＡＰＩ又は薬物形態に精製及び処理することによって生じる他のＲＮＡ）と、カプシドに包まれたウイルスＲＮＡとを区別し得る点で、現在の技術水準に優る感度の向上を有する。前者のタイプのＲＮＡは、抽出物中で増幅及び検出される場合、抽出物がいかなる汚染ウイルスも含まなかったとしても、ウイルス汚染の偽陽性結果をもたらす。後者のタイプのＲＮＡ（カプシドに包まれたもの）は真のウイルス汚染に相当し、従って遊離ＲＮＡを除外してカプシドに包まれたＲＮＡを同定することが好ましい。
【００３８】
本発明の一部の態様において、本スクリーニングアッセイは、遊離核酸をリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ）で分解することを含む。任意の他の変性剤又は化学的阻害薬又は化学剤、例えばＤＴＴ、βメルカプトエタノールもまた本発明において使用することができ、本発明の範囲内にあると見なされる。例えば、変性剤、例えば限定はされないが、ＤＴＴ、核酸を切断する酵素又はエキソソームもまた使用し得る。リボヌクレアーゼは、膵酵素、特にプロテアーゼ、及び膵臓抽出物中に存在する他の材料に対し、これらの酵素及び材料がヌクレアーゼのＲＮＡ分解活性を阻害し得るか、又はさらにはリボヌクレアーゼを破壊し得る点で高い感受性を有する。膵プロテアーゼはリボヌクレアーゼの分解を容易に触媒すると考えられ、その場合、リボヌクレアーゼが膵臓抽出物中のＲＮＡを分解する見込みはない。この点で、本発明においてリボヌクレアーゼが膵臓抽出物中に存在する遊離ＲＮＡの分解に成功することは意外であり、予想外である。
【００３９】
本発明の一部の態様において、本スクリーニングアッセイは、ＲＮＡウイルス汚染に関して膵臓抽出物をスクリーニングする方法を含む。好ましい実施形態において、本方法は、概して、膵臓抽出物中に存在する実質的に全ての遊離核酸又はその断片の分解を有効に触媒するのに十分な量のリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼ、例えばＲＮアーゼ及びＤＮアーゼで膵臓抽出物を処理するステップを含む。リボヌクレアーゼＡは、本方法において使用し得るリボヌクレアーゼの非限定的な例である。この処理は、分解反応を完了させるのに十分な時間にわたり行われ得る。この処理は、分解反応を完了させるのに十分な時間にわたりリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼを同時に使用して行われ得る。一部の実施形態では、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼは結果的に（consequently）又は順々に、任意の順序で使用されてもよく、かかる実施形態は本発明の範囲内にあると見なされる。
【００４０】
上述のとおり、膵臓抽出物中に存在する、カプシドに包まれたインタクトなウイルスのカプシドが壊れて生じるＲＮＡ又はその断片は、真の汚染であるカプシドに包まれたインタクトなウイルスＲＮＡと共に抽出された場合、ウイルス汚染の偽陽性結果をもたらし得る。この偽陽性結果を防ぐため、本発明の好ましい実施形態では、試料調製の始めにリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ）を加えて、膵臓抽出物中に存在する全ての核酸断片を消化させ得る。分解反応が完了すると、膵臓抽出物は遊離ＲＮＡを含めた遊離核酸を実質的に欠く。遊離ＲＮＡは、好ましくは膵臓抽出物中に存在する任意の遊離ウイルスＲＮＡ又はその断片を含む。
【００４１】
分解反応の完了後、本方法は、例えば、リボヌクレアーゼのＲＮＡ分解活性を阻害するのに有効な量のリボヌクレアーゼ阻害薬で膵臓抽出物を処理することによるか、又はリボヌクレアーゼを変性させるには十分ながら、抽出物中に存在する任意のインタクトなウイルスカプシドは変性させない温度に膵臓抽出物を加熱することによって、リボヌクレアーゼのＲＮＡ分解活性を阻害するステップをさらに含む。
【００４２】
本発明の一部の実施形態では、本方法は、任意選択で、遠心によって細胞残屑又はタンパク質画分を沈殿させることによる、膵臓抽出物中に存在する細胞残屑の除去を含み得る。遠心は、分解反応後に約１８００〜１５，０００ｇ、約４℃〜約２５℃で少なくとも約５分間〜約３０分間実施し得る。膵臓抽出物溶液の沈殿後、遊離ＲＮＡを含めて核酸は液体上清中に残り、しかし沈殿したタンパク質中には存在しない。上清溶液はさらに分析されてもよく、一方ペレットは、偽陰性結果の原因となり得る沈殿したウイルスＲＮＡの存在に関してさらに分析される。
【００４３】
本発明の一部の実施形態では、本方法は、任意選択で、サイズが小さい、例えば限定なしに約１０００ｋＤａ未満の分子及び核酸を除去するため試料をろ過することを含み得る。当業者であれば、使用し得るフィルタの種類及びサイズは容易に分かるであろう。例えば、限定なしに、２００，０００〜４００，０００ＭＷＣＯのフィルタがこのろ過に用いられ得る。概して、ろ過される溶液は、フィルタの上部に小さいタンパク質及びポリペプチドが凝集することを回避するため、例えば約１：２５の比、好ましくは１：１０の比で十分に希釈され、出発容積と比較される。ろ過溶液に小さい分子及び核酸が含まれないことを確実にするため、フィルタは少なくとも１回洗浄して、フィルタの上部溶液から不要な分子を除去し得る。
【００４４】
リボヌクレアーゼの阻害後、本方法は、例えば、カプシドを変性させる能力を有する薬剤でカプシドに包まれたウイルスＲＮＡを膵臓抽出物中に遊離させるのに必要な十分な時間にわたり抽出物を処理することによって膵臓抽出物中に存在する任意のＲＮＡウイルスのカプシドを変性させるステップをさらに含む。変性剤には、ウイルスカプシドを溶解させる薬剤が含まれ得る。本発明においては任意の変性剤又は分解剤を使用し得る。例えば、変性剤又は分解剤、例えば限定はされないが、化学剤、酵素、溶媒、塩を使用することができ、これらは本発明の範囲内にあると見なされる。
【００４５】
遊離したウイルスＲＮＡは、次に膵臓抽出物から抽出し、検出し得る。次に、遊離したウイルスＲＮＡである抽出されたＲＮＡを例えば適切なＰＣＲ技法を用いて増幅し、次に増幅されたＲＮＡを検出し得る。検出は定量的又は定性的であってもよく、当該技術分野における好適な任意の技法に従い得る。例えば、最も代表性のある試料の標的濃度及び精度における反応の直線性の評価を用いて定量的計測を達成し得る。ウイルスカプシドの変性により、好ましくはカプシドに包まれたＲＮＡが膵臓抽出物中に遊離し、膵臓抽出物が汚染ＲＮＡウイルスを含有するかどうかを確立するため最終的に検出されるのは、この遊離した、元はカプシドに包まれていたＲＮＡである。
【００４６】
本発明の一部の態様において、本スクリーニングアッセイは、ＲＮＡウイルス汚染に関して膵臓抽出物をスクリーニングする方法及び膵臓抽出物中に存在するウイルス汚染の存在を検出する方法を含む。好ましい実施形態において、本方法は、ＲＮＡウイルス汚染に関して膵臓抽出物をスクリーニングするステップ及び膵臓抽出物中に存在するカプシドに包まれたウイルスＲＮＡ汚染の存在を検出するステップを含む。
【００４７】
抽出物中に存在する膵酵素は、膵プロテアーゼを含め、リボヌクレアーゼ酵素を阻害し又は分解し得る。従って、本方法は、例えば抽出物中に存在するプロテアーゼ酵素の生物学的活性を阻害するのに有効な量のプロテアーゼ阻害薬で抽出物を処理することによって、膵臓抽出物中のプロテアーゼ酵素を阻害するステップを含み得る。
【００４８】
一部の態様において、このスクリーニング方法は、抽出物中のタンパク質を沈殿させるが核酸は共沈殿させない薬剤で膵臓抽出物のタンパク質画分を沈殿させるステップを含む。タンパク質カプシドを含むウイルスは、抽出物中の他のタンパク質と共に沈殿すると考えられる。膵臓抽出物溶液の沈殿で、遊離ＲＮＡを含めた核酸は液体上清中に残り、しかし沈殿したタンパク質中には存在しない。この薬剤は溶媒又は塩を含み得る。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。沈殿物が核酸を含まないことを確実にするため、沈殿物は少なくとも１回洗浄し得る。
【００４９】
次に核酸不含沈殿物を液体形態に再構成し、以下のとおりのさらなる処理に供し得る。抽出物の核酸不含タンパク質画分の再構成後、本方法は、例えばカプシドを変性させる能力を有する薬剤で抽出物を処理することによって、膵臓抽出物中に存在する任意のＲＮＡウイルスのカプシドを変性させるステップを含む。変性剤には、ウイルスカプシドを溶解させる薬剤が含まれ得る。カプシドの変性は、カプシドを変性させてカプシドに包まれたウイルスＲＮＡを膵臓抽出物中に遊離させるのに十分な時間にわたって行われる。遊離したウイルスＲＮＡは、当該技術分野において公知の方法を利用して再構成タンパク質画分から抽出し得る。次に遊離したウイルスＲＮＡを例えば適切なＰＣＲ技法を用いて増幅し、次に増幅されたＲＮＡを検出し得る。検出は定量的又は定性的であってもよく、当該技術分野における好適な任意の技法に従い得る。ウイルスカプシドの変性により、好ましくはカプシドに包まれたＲＮＡが再構成タンパク質画分中に遊離し、膵臓抽出物が汚染ＲＮＡウイルスを含有するかどうかを確立するため最終的に検出されるのは、この遊離した、元はカプシドに包まれていたＲＮＡである。
【００５０】
膵臓抽出物は膵アミラーゼを含み得る。膵臓抽出物は膵リパーゼを含み得る。膵臓抽出物は膵プロテアーゼ酵素を含み得る。膵臓抽出物は、アミラーゼ、リパーゼ、及びプロテアーゼ酵素の任意の組み合わせを含み得る。極めて好ましい実施形態において、膵臓抽出物はパンクレリパーゼを含む。本方法のいずれかの実施において、膵臓抽出物は、水、ＲＮアーゼフリー水又は好適な緩衝液若しくは生理食塩水溶液を含み得る。
【００５１】
本発明の方法は、任意のＲＮＡウイルス、好ましくはヒトにとって病原性のＲＮＡウイルスを検出し得る。パンクレリパーゼに見出され得る他のウイルスとしては、ＥＭＣＶ（ブタ脳心筋炎ウイルス、ＭＥＶとしても知られる）、ブタ肝炎ウイルス（ＨＥＶ（ブタＥ型肝炎ウイルス）を含む）、ＳＶＤＶ（ブタ水胞病ウイルス、ＰＥＶ９としても知られる）、水疱性発疹ウイルス、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ  Ｉ（ブタサーコウイルス１型））及びＰＣＶ２（ブタサーコウイルス２型）を含む）、ブタロタウイルス（Ｒｏｔａ  Ａ）、レオウイルス（Ｒｅｏ３として知られるレオウイルス３型を含む）、口蹄疫ウイルス、ブタテッショウウイルス１型（ＰＴＶ  １、ＰＥＶ  １としても知られる）、ブタアデノウイルス、及びブタ呼吸器コロナウイルスが挙げられる。エンベロープウイルス、例えば、仮性狂犬病ウイルス、ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）、ＩＦＡ（インフルエンザＡ型）、狂犬病ウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタコレラウイルス、ウエストナイルウイルス、スイポックスウイルス、ハンタウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ブタリンパ向性ヘルペスウイルス、ブタ内在性レトロウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、パラミクソウイルス、及び脳脊髄炎ウイルスもまたパンクレリパーゼに見出され得る。２００８年１２月に開催されたＦＤＡ抗ウイルス薬諮問委員会会議（FDA Antiviral Drugs Advisory Committee Meeting）（ワールドワイドウェブfda.gov/ohrms/dockets/ac/cder08.html#AntiviralDrugsで利用可能）を参照のこと。パンクレリパーゼはまた、潜在的に、新興ウイルス、例えばエンベロープに包まれた又はエンベロープを有しない新興外来病原体（例えばエボラウイルス）又は突然変異ウイルスも含有し得る。パンクレリパーゼに見出され得る他のウイルスとしては、仮性狂犬病ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ピコルナウイルス科（picornaviridae）（ブタピコルナウイルス科（porcine picornaviridae）を含む）、レオウイルス科（reoviridae）（ブタレオウイルス科（porcine reoviridae）を含む）、アストロウイルス科（astroviridae）（ブタアストロウイルス科（porcine astroviridae）を含む）、アデノウイルス科（adenoviridae）（ブタアデノウイルス科（porcine adenoviridae）を含む）及びヘペウイルス科（hepeviridae）（ブタヘペウイルス科（porcine hepeviridae）を含む）が挙げられる。極めて好ましい実施形態において、ＲＮＡウイルスは、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、及び／又はＥ型肝炎を含む肝炎ウイルスを含む。Ｅ型肝炎が最も好ましい。
【００５２】
本スクリーニング方法は、膵臓抽出物のロースループット、又はミディアムスループットスクリーニングに用いられ得る。本スクリーニング方法はまた、膵臓抽出物のハイスループットスクリーニングにも用いられ得る。
【００５３】
一般に、ウイルスＲＮＡ調製物は多量のキャリアＲＮＡを有し、定量化されたＲＮＡのどの部分がキャリアＲＮＡ又はウイルスＲＮＡに由来するのかを区別することは困難であるため、ＲＮＡは分光光度法によっては定量化できない。一次及び二次標準に対するＲＮＡの定量化に、ＰＣＲ技法がより信頼性が高いことが分かっている。
【００５４】
本発明においては、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びネステッドＰＣＲの両方にワンステップＲＴ−ＰＣＲを組み込み得る。ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応は、Erker et al. 1999（本明細書に援用される）に記載されるとおり、カプシドに包まれたウイルスのＯＲＦ  ２領域を標的化する変性プライマーを使用して実施し得る。例えば、ＯＲＦ２センスは「ＧＡＣＡＧＡＡＴＴＲＡＴＴＴＣＧＴＣＧＧＣＴＧＧ」であってもよく、及びＯＲＦ２アンチセンスは「ＣＴＴＧＴＴＣＲＴＧＹＴＧＧＴＴＲＴＣＡＴＡＡＴＣ」であってもよい。試料反応と同時に、２５００ＩＵ／ｍｌの一次又は二次標準を含有する陽性対照反応、及びＨ２０を含有する陰性対照をセットアップし得る。ＰＣＲ反応は、例えば、限定なしに、４５℃で４５分、９４℃で２分、４０サイクルの９４℃で３０秒、６０℃で１分、６８℃で２分、サイクル終了、６８℃で７分の延長及び次に４℃で保持などのＰＣＲサイクル条件を用いて行い得る。
【００５５】
次にＰＣＲ反応からのアンプリコンを標的化する変性プライマーを使用してネステッドＰＣＲ反応を行い得る。陽性対照反応及び陰性対照反応は、ＲＴ−ＰＣＲの陽性及び陰性対照反応から得られたＰＣＲ産物を使用してタンデムにセットアップし得る。ＰＣＲ反応は、例えば、限定なしに、９４℃で１分、３５サイクルの９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒、及びサイクル終了、続いて延長及び保持サイクルなどのＰＣＲサイクル条件を用いて行い得る。完了したＰＣＲ反応から得られる産物をアガロースゲルで電気泳動し、試料の塩基対サイズ及び塩基対長さを分析し得る。
【００５６】
定量的リアルタイムＰＣＲ分析もまた実施し得る。当業者であれば、ｑＰＣＲ標準化手順は容易に分かるであろう。ＰＣＲには陰性及び陽性対照を組み入れ、例えば約５００，０００ＵＩ／ｍｌ〜約２５ＵＩ／ｍｌの範囲の濃度のウイルスから得られるＲＮＡを使用して標準検量線を得る。
【００５７】
膵臓抽出物から遊離核酸を除去すると、遊離ＲＮＡを含めた遊離核酸を実質的に欠く膵臓抽出物が生じる。本明細書に説明及び例示するＲＮＡ分解及びＲＮＡを排除するタンパク質沈殿によれば、得られる膵臓抽出物は、現行の方法論に従い調製される膵臓抽出物と比べて含まれる遊離核酸が少ない。膵臓抽出物から遊離ＲＮＡを除去すると、遊離ＲＮＡを実質的に欠く膵臓抽出物が生じる。本明細書に説明及び例示するＲＮＡ分解及びＲＮＡを排除するタンパク質沈殿によれば、得られる膵臓抽出物は、現行の方法論に従い調製される膵臓抽出物と比べて含まれる遊離ＲＮＡが少ない。現行の技術水準に従い調製される膵臓抽出物は微量の遊離ＲＮＡを含有し、これは膵臓抽出物を得た組織に存在し得るか、又は粗抽出物から有効な薬物形態の膵臓抽出物を作製する処理及び精製ステップのアーチファクトとして存在し得るものである。かかる処理及び精製ステップは、抽出物中に存在するＲＮＡウイルスを溶解させ又は他の形で変性させるため、ＲＮＡのウイルス供給源は最終的に除去されるにしても、ＲＮＡ又はＲＮＡ断片が抽出物中に遊離し得る。本明細書に記載される方法により作製される膵臓抽出物は、これらの方法なしに作製される抽出物又は粗膵臓抽出物と比べ、本発明により作製される膵臓抽出物の方がより精製されて、痕跡量未満の遊離ＲＮＡを有するか又は遊離ＲＮＡを有しない点で純度がより高い。
【００５８】
本発明の一部の実施形態では、膵臓抽出物は遊離核酸を実質的に欠く。一部の実施形態では、膵臓抽出物は、膵臓抽出物中に存在する遊離ＲＮＡの少なくとも約１００％、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、又は５０％を欠く。好ましい実施形態において、膵臓抽出物は、膵臓抽出物中に存在する遊離ＲＮＡの約１００％を欠く。他の実施形態では、膵臓抽出物は、膵臓抽出物中に存在する遊離ＲＮＡの約９９％を欠く。さらに他の実施形態において、膵臓抽出物は、膵臓抽出物中に存在する遊離ＲＮＡの約９８％を欠く。さらに他の実施形態において、膵臓抽出物は、膵臓抽出物中に存在する遊離ＲＮＡの約９０％を欠く。さらに他の実施形態において、膵臓抽出物は、粗膵臓抽出物中に存在する遊離ＲＮＡと比較したとき、膵臓抽出物中に存在する遊離ＲＮＡの約９５％超を欠く。
【００５９】
本発明の他の実施形態において、本スクリーニング方法は、膵臓抽出物中に存在するカプシドに包まれたウイルスＲＮＡの少なくとも約１００％、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、８％、５％、４％、３％、２％、又は１％を検出するステップを含む。好ましい実施形態において、本スクリーニング方法は、膵臓抽出物中に存在するカプシドに包まれたウイルスＲＮＡの約１００％を検出するステップを含む。他の実施形態では、本スクリーニング方法は、膵臓抽出物中に存在するカプシドに包まれたウイルスＲＮＡの約９８％を検出するステップを含む。他の実施形態では、本スクリーニング方法は、膵臓抽出物中に存在するカプシドに包まれたウイルスＲＮＡの約９５％を検出するステップを含む。他の実施形態では、本スクリーニング方法は、膵臓抽出物中に存在するカプシドに包まれたウイルスＲＮＡの約９０％を検出するステップを含む。他の実施形態では、本スクリーニング方法は、膵臓抽出物中に存在するカプシドに包まれたウイルスＲＮＡの約５％を検出するステップを含む。他の実施形態では、本スクリーニング方法は、膵臓抽出物中に存在するカプシドに包まれたウイルスＲＮＡの約２％を検出するステップを含む。
【００６０】
本発明の一部の態様において、本スクリーニング方法は、膵臓抽出物中に存在する約５０，０００ＩＵ／ｍｌ〜約１０，０００ＩＵ／ｍｌのカプシドに包まれたウイルスＲＮＡを検出するステップを含む。一実施形態において、カプシドに包まれたウイルスＲＮＡを含めたウイルス汚染の除去後にウイルス感染価が低下した１つ以上の膵酵素を含むパンクレリパーゼは、本明細書に記載される方法を用いて処理されていない、且つ本明細書に説明及び例示されるｑＰＣＲの標準曲線によって計測したときのパンクレリパーゼ抽出物のウイルス感染価より少なくとも約１ｌｏｇ低い、少なくとも約２ｌｏｇ低い、又は少なくとも約３ｌｏｇ低いウイルス感染価を有し得る。
【００６１】
本発明においては、遊離ＲＮＡを実質的に欠く膵臓抽出物が特徴とされる。本明細書に説明及び例示されるとおりの本発明は、遊離ＲＮＡの約１００％を検出する。かかる膵臓抽出物は膵アミラーゼを含み得る。かかる膵臓抽出物は膵リパーゼを含み得る。かかる膵臓抽出物は膵プロテアーゼ酵素を含み得る。かかる膵臓抽出物は、アミラーゼ、リパーゼ、及びプロテアーゼ酵素の任意の組み合わせを含み得る。極めて好ましい態様において、かかる膵臓抽出物はパンクレリパーゼを含む。
【００６２】
本発明は、遊離ＲＮＡを含めた実質的に全ての遊離核酸を膵臓抽出物から除去する方法及びカプシドに包まれたウイルスＲＮＡを検出する方法を特徴とする。一般に、これらの方法は、抽出物中の遊離ＲＮＡを含めた実質的に全ての遊離核酸の分解を触媒するのに有効な量のリボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼで膵臓抽出物を処理するステップ、及び膵臓抽出物中に存在するカプシドに包まれたウイルスＲＮＡを検出するステップを含む。リボヌクレアーゼはリボヌクレアーゼＡを含み得る。遊離ＲＮＡは遊離ウイルスＲＮＡを含み得る。遊離ＲＮＡは遊離肝炎ウイルスＲＮＡを含み得る。好ましい実施形態において、遊離ＲＮＡは遊離Ｅ型肝炎ウイルスＲＮＡを含む。かかる方法により作製される膵臓抽出物もまた提供される。かかる方法により作製されるパンクレリパーゼもまた提供される。
【００６３】
本発明の一態様では、本発明において作製されるパンクレリパーゼは、例えば意図される投与経路及び標準薬務の点で選択される好適な医薬賦形剤、希釈剤及び／又は担体と混合して、医薬組成物となるよう配合又は形成され得る。本発明の一実施形態において、組成物及び剤形は少なくとも１つの消化酵素を含む。一実施形態において、本発明の組成物は、ヒトにおける使用に好都合な任意の方法による投与用に製剤化することができる。パンクレリパーゼは経口剤形として投与することができる。経口剤形には、散剤、錠剤、ミニ錠剤、マイクロ錠剤、非コーティング剤形、コーティング剤形、ミクロスフェア、小粒、カプレット、ジェルキャップ、カプセル、及びメディカルフードが含まれる。例えば、錠剤は、当該技術分野において公知の圧縮技法によって作製することができる。典型的には、パンクレリパーゼは、酸によって媒介されるリパーゼ不活性化を回避し且つ酵素の胃排出を確実にするため、腸溶性コーティングされたミニミクロスフェアの形態で経口投与される。一部の実施形態では、パンクレリパーゼは腸溶性コーティングされた及びコーティングされていないミニミクロスフェアの形態で経口投与され得る。一部の他の実施形態において、パンクレリパーゼは栄養素と並行して又はそれと一緒に経口投与され得る。
【００６４】
好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定はされないが、希釈剤、結合剤、滑沢剤、滑剤、崩壊剤、及び着色剤が挙げられる。剤形には、保存剤、安定剤、色素及び香味剤などの他の構成成分が含まれてもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類が挙げられる。抗酸化剤及び懸濁剤もまた含まれ得る。治療用途の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、及び担体は製薬の技術分野において公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins (A.R. Gennaro edit. 2005)に記載されている。
【００６５】
剤形又は剤形のバッチ（各剤形がパンクレリパーゼを含む）は、本明細書に記載される方法によって評価又はバリデートすることができる。本発明の一実施形態において、剤形のバッチ、そのバッチは、バッチから選択される１つ以上の剤形に存在する感染性ウイルス又はウイルスＲＮＡ又はその断片の量を検出又は計測することによって評価又はバリデートすることができる。さらに別の態様において、本発明は、前述の検出及びスクリーニング方法のいずれかによってパンクレリパーゼを作製する方法に関する。
【００６６】
本発明のさらに別の態様は、（ａ）パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチを入手するステップと、（ｂ）（ｉ）パンクレリパーゼ抽出物の試料中、又はバッチ中のパンクレリパーゼ抽出物の１つ以上からの１つ以上の試料中の遊離ＲＮＡ及びカプシドに包まれたＲＮＡの量を前述の検出方法によって検出又は計測するステップ、又は（ｉｉ）パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチを前述のスクリーニング及び検出方法によってバリデートするステップとにより、パンクレリパーゼ又はパンクレリパーゼのバッチを作製する方法である。本方法は、（ｉｉｉ）パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチを１つ以上の剤形に配合するステップをさらに含み得る。
【００６７】
一態様において、パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチは、計測されたウイルス含有量が閾値レベル未満である場合にバリデートされる。パンクレリパーゼ抽出物又はパンクレリパーゼ抽出物のバッチが閾値レベルを上回るウイルス含有量を有する場合、その１つ又は複数のパンクレリパーゼ抽出物をさらに処理してそのウイルス含有量を低下させ、再びバリデーションプロセスに供することができる。
【００６８】
本発明のさらに別の態様は、（ａ）剤形又は剤形のバッチを入手するステップであって、各剤形がパンクレリパーゼ抽出物を含有するステップと、（ｂ）（ｉ）剤形における、又はバッチ中の剤形の１つ以上におけるカプシドに包まれたＲＮＡを含む感染性ウイルスの量を前述の検出方法によって検出又は計測するステップ、又は（ｉｉ）剤形又は剤形のバッチを前述のバリデーション方法によってバリデートするステップとにより、剤形又は剤形のバッチを作製する方法である。
【００６９】
本発明の一態様は、患者における消化酵素欠損に関連する病態又は障害を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、本発明の方法によって作製されるパンクレリパーゼ抽出物を含む医薬組成物又は剤形を、それを必要としている患者（例えばヒトなどの哺乳動物）に投与するステップを含む。一実施形態において、本発明は、消化酵素欠損に関連する障害又は病態を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、本発明の方法によって作製されるパンクレリパーゼ抽出物を含む組成物又は剤形を、それを必要としている患者に投与するステップを含み、ここで組成物又は剤形は、消化酵素に加えて、少なくとも１つのプロトンポンプ阻害薬、又は１つの制酸薬、又は胃腸（ＧＩ）ｐＨを上昇させる他の薬物を含む。一実施形態において、本発明は、消化酵素欠損に関連する障害又は病態を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、本発明の方法によって作製されるパンクレリパーゼ抽出物を含む組成物又は剤形を、少なくとも１つのプロトンポンプ阻害薬、１つの制酸薬、又はＧＩ  ｐＨを上昇させる他の薬物を含む剤形と併用して投与するステップを含む。
【００７０】
本発明の方法によって作製されるパンクレリパーゼ抽出物を含む組成物又は剤形で治療し得る障害又は病態には、患者が消化酵素を有しないか若しくは低レベルの消化酵素を有する病態、又は患者が消化酵素の補充を必要とする病態が含まれる。例えば、かかる病態には、膵外分泌機能不全、嚢胞性線維症、慢性膵炎、他の膵疾患（例えば、遺伝性、外傷後及び同種移植片膵炎、ヘモクロマトーシス、シュバックマン症候群、脂肪腫症、又は副甲状腺機能亢進症）、癌又は癌治療の副作用、手術（例えば、胃腸バイパス術、ホイップル手技、膵全摘術等）の副作用又は膵酵素が腸に到達できない他の病態、撹拌不良（例えば、ビルロートＩＩ胃切除術、他の種類の胃バイパス術、ガストリノーマ等）、メトホルミン又は膵臓が障害され得るＨＩＶ及び糖尿病などの自己免疫疾患の症状の治療に使用される薬物による治療などの薬物治療の副作用、閉塞（例えば、膵石症及び胆管結石症、膵臓及び十二指腸新生物、管の狭窄）、吸収不良であって、セリアック病、食物アレルギー及び加齢に関連するものが含まれ得る。
【００７１】
本発明のさらに別の態様は、本発明の方法によって作製されるパンクレリパーゼ抽出物をそれを必要としている患者に投与するステップにより、部分的又は完全な膵外分泌機能不全を有する患者を管理又は治療する方法である。本方法は、（ｉ）膵酵素製剤を入手するステップと、（ｉｉ）膵酵素製剤中の感染性ウイルスの量を前述の検出又はスクリーニング方法によって検出又は計測するステップと、（ｉｉｉ）膵酵素製剤の感染負荷が閾値レベル未満であるとき、有効量の膵酵素製剤を患者に投与するステップとをさらに含み得る。膵機能不全は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、アルコール摂取又は他の原因による慢性膵炎、手術（ウィルズング管注入を伴う又は伴わない膵頭十二指腸切除術又はホイップル手技、膵全摘術）、閉塞（膵石症及び胆管結石症、膵臓及び十二指腸新生物、管の狭窄）、他の膵疾患（例えば、遺伝性、外傷後及び同種移植片膵炎、ヘモクロマトーシス、シュバックマン症候群、脂肪腫症、及び副甲状腺機能亢進症）、及び撹拌不良（ビルロートＩＩ胃切除術、他の種類の胃バイパス術、ガストリノーマ）によって引き起こされ得る。
【００７２】
以下の例は、本発明をさらに詳細に説明するため提供される。それらの例は、本発明を限定するのでなく、例示することが意図される。
【実施例】
【００７３】
実験
実施例１
遊離ウイルスＲＮＡのＲＮアーゼ除去及びカプシドに包まれたウイルスＲＮＡのｑＰＣＲによる定量化を用いたパンクレリパーゼ中のＨＥＶ汚染の検出
一連の実験において、ＲＮアーゼＡによる処理を用いたパンクレリパーゼからの遊離ウイルスＲＮＡの除去を判定し得る。これらの実験ではまた、プロテアーゼ阻害薬、ＲＮアーゼ阻害薬、及びウイルス変性緩衝液がＲＮアーゼＡ処理に及ぼす効果も判定し得る。異種ＲＮアーゼＡは、膵プロテアーゼ及びＲＮアーゼＡを不活性化することが知られる他の膵酵素が同時に存在するにも関わらず、パンクレリパーゼ中の遊離ウイルスＲＮＡの破壊を触媒すると考えられる。
【００７４】
パンクレリパーゼは、ＲＮアーゼフリー水中又は変性緩衝液、例えばチオシアン酸グアニジウム又はプロテイナーゼＫ中のいずれかに１０％（ｗ／ｖ）溶液として調製し得る。次に、特定の実験群を７０００単位／ｍｌのＲＮアーゼＡで処理し、特定のサブ群をプロテアーゼ阻害薬又はＲＮアーゼ阻害薬のいずれかでさらに処理し得る。各実験群は３７℃で１時間インキュベートし、続いて市販の定量プロテアーゼアッセイキット及び定量ＲＮアーゼアッセイキットを使用してプロテアーゼ活性又はＲＮアーゼ活性を判定し得る。
【００７５】
酵素活性試験に続き、各実験群をネイキッド（カプシドに包まれていない）ＨＥＶ（ＷＨＯ標準）又はインタクトな（カプシドに包まれた）ＨＥＶ（ＷＨＯ標準）のいずれかでスパイクし、約３７℃で約１時間インキュベートし得る。表１．インキュベーション条件は、プロテアーゼ活性が最小となり且つＲＮアーゼ活性が最大となるように微調整し、以下の表１に提供する。
【００７６】
【表１】
2017519490.tif 000003
【００７７】
ＨＥＶとのインキュベーション後、ウイルスアッセイキットを使用して各試料をウイルスの変性に供し得る。続いて、試料の残留ＲＮアーゼ活性を判定し（定量ＲＮアーゼアッセイキット）、続いて各試料からＲＮＡを抽出し得る。抽出した試料をＲＮアーゼ阻害薬で処理し、阻害薬の存在下で約３０分間インキュベートした後、残留ＲＮアーゼ活性をさらに評価し得る（定量ＲＮアーゼアッセイキット）。次に全ての試料を増幅し、ＲＮＡ量をｑＰＣＲによって定量化し得る。予想される結果を以下の表２に提供する。
【００７８】
この実験群と並行して、上記に概説した基本プロトコルに従い３つの陽性対照試料を評価し得る。２つの陽性対照はＲＮアーゼ処理を受け、１つの陽性対照はＲＮアーゼ処理を受けない。３つの対照全てをプロテアーゼ阻害薬で処理し得る。１つの陽性対照はネイキッドＨＥＶ及びインタクトＨＥＶ（ＷＨＯ標準）の両方でスパイクし（対照１）、１つ陽性対照はネイキッドＨＥＶのみでスパイクし（対照２）、及び１つの陽性対照はインタクトＨＥＶのみでスパイクし得る（対照３）。予想される結果を以下の表２に提供する。
【００７９】
【表２】
2017519490.tif 000004
【００８０】
【表３】
2017519490.tif 000005
【００８１】
実施例２
タンパク質画分の沈殿及びカプシドに包まれたウイルスＲＮＡのｑＰＣＲによる定量化を用いたパンクレリパーゼ中のＨＥＶ汚染の検出
ＲＮアーゼ処理の代替手法として、遊離ＲＮＡを含めた核酸が溶液中に残り、且つタンパク質沈殿物中には残らないような方法で溶媒又は塩を使用して、溶液からパンクレリパーゼのタンパク質画分を沈殿させてもよい。予備実験では、硫酸アンモニウムを使用して遊離核酸を含むパンクレリパーゼのタンパク質画分を、液体画分中に残るパンクレリパーゼから沈殿させ得ることが観察された。この予備実験は図１に示す。図１において、溶解したパンクレリパーゼにおける優勢なピークは、核酸に関連する波長である２６０ｎｍであり、再懸濁した沈殿タンパク質画分（より少ない廃棄上清）は溶液中のタンパク質に関連する波長である２７７ｎｍのピークを示す。
【００８２】
再構成した沈殿画分中にインタクトなウイルスがあり、この画分をウイルスカプシドを変性させる薬剤で処理し、それによってウイルスＲＮＡを溶液中に遊離させ得る。次に遊離したウイルスＲＮＡを増幅し、増幅されたＲＮＡをＨＥＶ  ＲＮＡ配列特異的プローブで検出し得る。
【００８３】
実施例３
スパイク用のカプシドに包まれたＨＥＶウイルスＲＮＡの定量化
一連の実験において、カプシドに包まれたＨＥＶ感染ヒト血清の定量的特性を判定し得る。これらの実験ではまた、実施例４に示すとおりのスパイク及び較正用のウイルスＲＮＡの量も判定し得る。これらの実験は、概して、ｑＰＣＲ測定用に市販されているCeeram Live技術ＨＥＶ  ｑＰＣＲキット（http://www.ceeramtools.com/kit-hepatitis-e-virus-kit.html）（Ceeramキットと称される）を使用する。当業者であれば、Ceeramキットの使い方は容易に分かるであろう。以下の実験ではCeeramキットを使用するが、定量化の方法はCeeramキットに限定されない。ウイルスＲＮＡの定量化に当業者が利用し得る任意の他の技術が、本発明の主題の範囲内にあると見なされる。
【００８４】
ヒト血清は２５０，０００ＩＵ／ｍｌ溶液に希釈する。８０μｌの希釈ヒト血清を７００μｌのＤＮアーゼ及びＲＮアーゼ溶液に加えて２５，６４１ＩＵ／ｍｌのヒト血清溶液にすることにより、６つの別個の実験（実験１〜６）を行う。全ての遊離ＲＮＡを消化し、且つインタクトなウイルスからのカプシドに包まれたウイルスＲＮＡを抽出して、パンクレリパーゼ試料をスパイクするための正確な量のインタクトなウイルスＲＮＡを実現することが決定的に重要である。遊離ＲＮＡの分解に必要なＲＮアーゼ及びＤＮアーゼの量を使用し得る。例えば、約０．５Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼ及び５０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼを使用して遊離ＲＮＡを消化し得る。溶液は約３０秒間ボルテックスし、ヌクレアーゼ阻害及びＲＮＡ抽出後にCeeramキットを使用してウイルスＲＮＡを定量化する。ウイルスＲＮＡの定量化はＷＨＯ  ＨＥＶ標準６３２９／１０（これは本明細書に援用され、http://whqlibdoc.who.int/hq/2011/WHO_BS_2011.2175_eng.pdfで利用可能である）に対して判定する。
【００８５】
膵臓抽出物中のカプシドに包まれたウイルスＲＮＡの存在を検出するためのパンクレアチン試料のスパイクには、インタクトなウイルスＲＮＡの量を考慮し得る。表３ａ及び表３ｂは、ヒト血清試料中のインタクトなＨＥＶウイルスを定量化するためＷＨＯ標準を使用して作成される標準曲線を示し、以下に提供する。ヒト血清中のインタクトなＨＥＶウイルスの定量化が示され、以下の表４に提供される。
【００８６】
【表４】
2017519490.tif 000006
【００８７】
【表５】
2017519490.tif 000007
【００８８】
【表６】
2017519490.tif 000008
【００８９】
これらの結果は、約１６，３７５．５ＩＵ／ｍｌのＨＥＶインタクトウイルス濃度で６３．８６％のＨＥＶインタクトウイルスの回収率が達成されたことを示している。さらなる試験を実施し、試料抽出、ｐＨ干渉、インキュベーションステップ干渉、ＤＴＴ干渉などの、消化手順においてインタクトなＨＥＶウイルスの回収率に影響を及ぼし得る決定的なパラメータを判定した。
【００９０】
スパイク用のＨＥＶ遊離ＲＮＡの定量化
２５０，０００ＩＵ／ｍｌ  ＨＥＶ感染ヒト血清溶液に希釈したＨＥＶ感染ヒト血清の１６０μｌアリコートを使用して、一連の６つのＲＮＡ単離を行う。各アリコートは約４０，０００ＩＵ／ｍｌヒト血清溶液に等しい。ＲＮＡ抽出キットを使用してＲＮＡ抽出を実施し、遊離ＨＥＶ  ＲＮＡを得る。当業者であれば、市販のＲＮＡ抽出キットを使用したＲＮＡの抽出方法は容易に分かるであろう。ＲＮＡ抽出から得られた最終溶出容積のアリコートをＨＥＶ  ＷＨＯ標準曲線に対してアッセイする。定量化した遊離ＲＮＡの量を用いて、パンクレリパーゼ溶液にスパイクする遊離ＲＮＡの正確な量を計算する。ヒト血清試料中の抽出遊離ＲＮＡを定量化するためＷＨＯ標準を使用して作成される標準曲線を、以下の表５に提供する。スパイク実験用に調製される遊離ＨＥＶ  ＲＮＡの定量化を、以下の表６に提供する。
【００９１】
【表７】
2017519490.tif 000009
【００９２】
【表８】
2017519490.tif 000010
【００９３】
プール試料の平均濃度を標準濃度として使用して、以下の実施例４に記載するとおりの対照を伴う消化実験における遊離ＨＥＶ  ＲＮＡのスパイク用の希釈液を調製する。プール試料の遊離ＨＥＶ  ＲＮＡの濃度は約３１６１６７ＩＵ／ｍｌであり、ＣＶは７．１％である。
【００９４】
実施例４
スパイクしたパンクレリパーゼ試料の対照を伴う消化
遊離ＨＥＶ又はインタクトＨＥＶでスパイクしたパンクレリパーゼ含有試料（処理パンクレアチン）に関して、遠心ステップを伴い及び伴わず、デュプリケートで実験を実施した。同じプロトコルを用いて、遊離ＨＥＶ又はインタクトＨＥＶでスパイクした処理陽性対照試料（パンクレリパーゼなし）を調製する。
【００９５】
処理陽性対照１はネイキッド（遊離）ＨＥＶ  ＲＮＡでスパイクし、処理陽性対照２はインタクトな（カプシドに包まれた）ＨＥＶでスパイクする。実施例３に記載され且つ本明細書に例示されるとおり、５０μｇ  ＤＮアーゼ／ｍｌ及び０．５Ｕ  ＲＮアーゼ／ｍｌを含有する０．４ｍｌのＲＮアーゼフリー水を４６μｌの２５０，０００ＩＵ／ｍｌネイキッドＲＮＡ（これは３１６，１６７ＩＵ／ｍｌに等しい）に加えることにより、処理陽性対照１（遊離ＨＥＶ  ＲＮＡでスパイクしたＲＮアーゼフリー水）を調製する。これにより、０．４４６ｍｌのスパイクした懸濁液中２５，７８５ＩＵ／ｍｌ遊離ＨＥＶ  ＲＮＡの名目濃度を有する溶液が生じる。この溶液をＲＮアーゼ及びＤＮアーゼによって室温で約１時間消化させ、この溶液に１Ｍの濃度の９μｌ  ＤＴＴ（１，４−ジチオスレイトール）を加えてＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ活性を阻害する。この溶液をさらに３７℃で約１時間インキュベートする。０．４５５ｍｌの最終試料容積中におけるスパイクしたネイキッドＨＥＶ  ＲＮＡの名目濃度は約２５，２７５ＩＵ／ｍｌである。遠心ステップを伴う及び伴わない試料アリコートを抜き取り、−８０℃で一晩保存した後、さらに分析する。ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ阻害後、ＲＮＡ抽出を実施し、ＲＮＡを抽出してｑＰＣＲにより定量化する。
【００９６】
処理陽性対照２（カプシドに包まれたＨＥＶ  ＲＮＡでスパイクしたＲＮアーゼフリー水）はインタクトな（カプシドに包まれた）ＨＥＶ  ＲＮＡでスパイクし、実施例３に記載され且つ本明細書に例示されるとおり、５０μｇ  ＤＮアーゼ／ｍｌ及び０．５Ｕ  ＲＮアーゼ／ｍｌを含有する０．４ｍｌのＲＮアーゼフリー水を４６μｌの２５０，０００ＩＵ／ｍｌＥ型肝炎ウイルス感染ヒト血清（２５０，０００ＩＵ／ｍｌに等しい）に加えることによって調製する。これにより、０．４４６ｍｌのスパイクした懸濁液中２５，７８５ＩＵ／ｍｌのインタクトな（カプシドに包まれた）ＨＥＶ  ＲＮＡ溶液が生じる。この溶液をＲＮアーゼ及びＤＮアーゼによって室温で約１時間消化させ、この溶液に１Ｍの濃度の９μｌ  ＤＴＴを加えてＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ分解反応を阻害する。この溶液をさらに３７℃で１時間インキュベートする。０．４５５ｍｌの最終試料容積中におけるスパイクしたネイキッドＨＥＶ  ＲＮＡの名目濃度は約２５，２７５ＩＵ／ｍｌである。遠心ステップを伴う及び伴わない試料アリコートを抜き取り、−８０℃で一晩保存した後、さらに分析する。ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ阻害後、ＲＮＡ抽出を実施し、ＲＮＡを抽出してｑＰＣＲにより定量化する。
【００９７】
０．１ｇパンクレリパーゼ／ｍｌの濃度を有する処理パンクレアチン１（遊離ＨＥＶ  ＲＮＡでスパイクしたパンクレリパーゼ懸濁液）の、５０μｇ  ＤＮアーゼ／ｍｌ及び０．５Ｕ  ＲＮアーゼ／ｍｌを含有する０．４ｍｌの試料容積を、４６μｌの２５０，０００ＩＵ／ｍｌ  Ｅ型肝炎ネイキッドＲＮＡでスパイクして、０．４４６ｍｌのスパイクしたパンクレリパーゼ懸濁液中２５，７８５ＩＵ／ｍｌの溶液を得る。この溶液をＲＮアーゼ及びＤＮアーゼによって室温で約１時間消化させ、この溶液に１Ｍの濃度の９μｌ  ＤＴＴを加えてＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ分解反応を阻害する。この溶液を３７℃で１時間インキュベートする。０．４５５ｍｌの最終試料容積中におけるスパイクしたネイキッドＨＥＶ  ＲＮＡの名目濃度は約２５，２７５ＩＵ／ｍｌである。遠心ステップを伴う及び伴わない試料アリコートを抜き取り、−８０℃で一晩保存した後、さらに分析する。ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ阻害後、ＲＮＡ抽出を実施し、ＲＮＡを抽出してｑＰＣＲにより定量化する。
【００９８】
０．１ｇパンクレリパーゼ／ｍｌの濃度の処理パンクレアチン２（カプシドに包まれたＨＥＶ  ＲＮＡでスパイクしたパンクレリパーゼ懸濁液）の、５０μｇ  ＤＮアーゼ／ｍｌ及び０．５Ｕ  ＲＮアーゼ／ｍｌを含有する０．４ｍｌの試料容積を、４６μｌの２５０，０００１Ｕ／ｍｌ  Ｅ型肝炎インタクトウイルス感染ヒト血清でスパイクして、０．４４６ｍｌのスパイクしたパンクレリパーゼ懸濁液中２５，７８５ＩＵ／ｍｌの溶液を得る。この溶液をＲＮアーゼ及びＤＮアーゼによって室温で約１時間消化させ、この溶液に１Ｍの濃度の９μｌ  ＤＴＴを加えてＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ分解反応を阻害する。この溶液を３７℃で１時間インキュベートする。０．４５５ｍｌの最終試料容積中のスパイクしたインタクトなＨＥＶ  ＲＮＡの名目濃度は約２５，２７５ＩＵ／ｍｌである。遠心ステップを伴う及び伴わない試料アリコートを抜き取り、−８０℃で一晩保存した後、さらに分析する。ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ阻害後、ＲＮＡ抽出を実施し、ＲＮＡを抽出してｑＰＣＲにより定量化する。この実験を２日目に繰り返し、結果を分析する。
【００９９】
図２は、RNase alertアッセイの補正値のヒストグラムプロットを示す。RNase alertアッセイを行ってヌクレアーゼ阻害ステップにおける完全失活を決定した後、ウイルスカプシドの溶解及び元はカプシドに包まれていたＲＮＡの抽出／ｑＰＣＲ解析を行う。当業者であれば、RNase alertアッセイ（https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/AM1964で市販されている）の実施方法は容易に分かるであろう。１日目及び２日目に実施する実験の較正用のＷＨＯ標準曲線を、それぞれ表７及び表８に提供する。
【０１００】
【表９】
2017519490.tif 000011
【０１０１】
【表１０】
2017519490.tif 000012
【０１０２】
１日目及び２日目について標準曲線を作成する。１日目に０．９８９のＲ２値及び８７．２４％の効率が得られ、２日目に０．９９８のＲ２値及び効率１０４．９％が得られた。
【０１０３】
１日目及び２日目の両方の標準曲線とも、データの判定に適切であると考えられる。ネイキッド（遊離）ＨＥＶ  ＲＮＡでスパイクした処理陽性対照１はＣｔ読み取りを示さず、消化／分解反応後の試料中にＨＥＶ核酸が存在しないことが示された。これにより、実験対照によっては残留ネイキッド（遊離）ＲＮＡ核酸が除去され、抽出プロセスの後に持ち越されないことが確認された。
【０１０４】
インタクトなＨＥＶでスパイクした処理陽性対照２は、スパイクに使用した２５０，０００ＩＵ／ｍｌストック溶液に基づく名目スパイク濃度に対して１００％より高い回収率をもたらした。スパイク濃度実測値（スパイクに使用したストック溶液の４３２，４８８ＩＵ／ｍｌの力価を有する）に対する回収率値は、試験した４つの試料中３つについて約１００％である。処理陽性試料における遊離ＨＥＶ  ＲＮＡ及びインタクトなＨＥＶ  ＲＮＡの定量化を表９に提供する。
【０１０５】
処理パンクレアチン１（ネイキッドＲＮＡでスパイクしたパンクレリパーゼ懸濁液）は、実験１日目及び２日目の両方で投入材料の完全消化を実証した。これは、アッセイにおいてＣｔ読み取りがないことによって確認される。処理陽性対照２との比較において、処理パンクレアチン２中のインタクトなＨＥＶの回収率は、遠心を伴う場合も、又は伴わない場合も、パンクレリパーゼの存在下でより低い。遠心がないとき、パンクレリパーゼ中のさらなる構成成分の存在によってインタクトなウイルスの分解がもたらされ得るため、より高濃度のインタクトなＨＥＶが観察され、ウイルス回収率は恐らくは懸濁液中のウイルスの凝集に起因して低下する。
【０１０６】
処理パンクレアチン（パンクレリパーゼ懸濁液）試料に関する対照を伴う消化の１日目及び２日目に得られた結果を、以下の表１０に提供する。
【０１０７】
【表１１】
2017519490.tif 000013
【０１０８】
【表１２】
2017519490.tif 000014
【０１０９】
実施例５
カプシドに包まれたＨＥＶ  ＲＮＡ及び遊離ＨＥＶ  ＲＮＡ試料の対照を伴う消化及びろ過
ろ過を伴い及び伴わず、カプシドに包まれたＨＥＶ  ＲＮＡ及び遊離ＨＥＶ  ＲＮＡ試料の対照を伴う消化を行う。分子フィルタを使用して、ＲＮＡ抽出を妨げ得る３００ｋＤａより小さい細胞夾雑物を除去する。５０μｇ  ＤＮアーゼ／ｍｌ及び０．５Ｕ  ＲＮアーゼ／ｍｌを含有する０．７ｍｌのＲＮアーゼフリー水を８０μｌの２５０，０００ＩＵ／ｍｌインタクトＨＥＶ又はネイキッドＨＥＶでスパイクすることによって試料を調製する。この溶液をＲＮアーゼ及びＤＮアーゼによって室温で約１時間消化させ、この溶液に１Ｍの濃度の１５．６μｌ  ＤＴＴを加えてＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ分解反応を阻害する。この溶液をさらに３７℃で約１時間インキュベートする。次に試料の５００μｌをＨ２Ｏ＋Tween 20  ０．０５％で１：１０希釈し、１０，０００×ｇで１０分間遠心する。３００ｋＤａ分子フィルタの上部にこの上清を加え、フィルタの上部に１ｍｌが得られるまで室温、１８００×ｇで遠心する。４ｍｌのＨ２Ｏ＋Tween 20  ０．０５％を上部溶液に加え、フィルタを１８０°回転させた後、上部に０．５ｍｌの試料が存在するまで遠心を繰り返す。この試料からウイルスＲＮＡを抽出して定量化する。１４０μｌの非ろ過試料を対照として使用する。
【０１１０】
ろ過した試料及び非ろ過対照の結果を表１１に報告する。インタクトなウイルスでスパイクした試料においては、ろ過した試料について回収率が極めて低く、一方、非ろ過対照は実測投入値と比較して１００％及び名目濃度に対して約２００％の回収率を示した。ろ過ステップは、高いＨＥＶ  ＲＮＡ損失を伴い、このプロトコルにとって有害であるように思われる。ネイキッドＲＮＡスパイクに関しては、ろ過ステップを伴う／伴わない試料中に抽出及び定量化後に検出されたウイルスＲＮＡは無視し得る程度であった。
【０１１１】
【表１３】
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【０１１２】
本明細書に記載される方法は、試料中に存在する多量のネイキッド（遊離）ウイルスＲＮＡの消化において有効である。本明細書に説明及び例示される方法は、ＡＰＩ製造又は薬物生産後のＨＥＶの検出に有効である。本明細書に記載される方法は、試料中の汚染ＲＮＡ断片の存在によって生じる偽陽性発生率を低下させる。抽出後にＲＮアーゼ活性がないことによって、パンクレリパーゼ中に存在するインタクトな（カプシドに包まれた）ＨＥＶウイルスＲＮＡを検出するための実質的に全ての分解核酸の除去が示された。
【０１１３】
本発明は、上記に説明及び例示される実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲内で変形例及び改良例が可能である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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