(57)【要約】  本発明は、標的タンパク質（例えば、細胞受容体）に結合する結合パートナー（例えば、ペプチドリガンド）を同定するための方法を提供する。本方法は、標的タンパク質と候補結合パートナーの共存発現、および細胞膜におけるその近接度に基づく結合パートナーの選択を伴う。【選択図】図１
2017530721.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリペプチドに結合する結合パートナーを同定するための方法であって、（ａ）第１の膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含有する前記標的ポリペプチドを含む第１の融合分子を発現する第１の構築物、および、各々が第２の膜貫通ドメイン（ＴＭ）に結合した候補結合パートナーを含む、第２の融合分子群のコンビナトリアルライブラリーを発現する第２の構築物を生成する工程であって、前記融合分子群のうちの１つが酵素をさらに含み、他方の融合分子が前記酵素の基質配列および人工シグナル伝達経路の活性化因子をさらに含む、工程と、（ｂ）前記第１の構築物および前記第２の構築物を宿主細胞において発現させて細胞集団を生成する工程であって、各々の細胞が細胞膜に共存する前記第１の融合分子および第２の融合分子を有する工程と、（ｃ）前記人工シグナル伝達経路が活性化されている前記細胞集団から細胞を選択する工程と、（ｄ）前記選択された細胞において前記第２の融合分子を同定する工程とを含み；それにより前記標的ポリペプチドの結合パートナーを同定する、方法。
【請求項２】
前記第１の膜貫通ドメイン（ＴＭ）が、前記標的ポリペプチドの天然ドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の膜貫通ドメイン（ＴＭ）が、前記標的ポリペプチドに組換えによって融合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素がそのＮ末端で前記第２の膜貫通ドメインに結合し、前記基質配列がそのＮ末端で前記第１の膜貫通ドメインに結合し、そのＣ末端で前記活性化因子に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素による前記基質配列の切断の結果、前記第２の融合分子から前記活性化因子が放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的ポリペプチドが細胞受容体であり、前記結合パートナーが前記受容体のリガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞受容体が細胞表面受容体であり、前記第２の膜貫通ドメインがＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞受容体がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞受容体がＴｐｏＲまたはＧＬＰ１Ｒである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素がプロテアーゼであり、前記基質配列が前記プロテアーゼの切断部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼがＴＥＶプロテアーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基質配列が、ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４）（ＴＥＶ１）、ＥＮＦＹＦＱＳ（配列番号５）（ＴＥＶ２）、ＥＮＬＹＹＱＳ（配列番号６）（ＴＥＶ３）、またはＥＮＬＦＦＱＳ（配列番号７）（ＴＥＶ４）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記候補結合パートナーがペプチドまたは抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記候補結合パートナーが、リンカー配列を介して前記第２の膜貫通ドメインに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンカー配列が、３、５、６、８、１０、またはそれ以上のＧＧＧＧＳ（配列番号１）のタンデムリピートを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性化因子が転写因子であり、前記人工シグナル伝達経路が、前記転写因子によって認識される転写調節配列の制御下でのレポーター遺伝子の発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーター遺伝子がレンチウイルスベクターを介して前記宿主細胞に導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記レポーター遺伝子が、前記融合分子の発現の前に前記宿主細胞に導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写因子がＧＬＡ４−Ｖ１６であり、前記転写調節配列がＧＡＬ４  ＵＡＳおよび前記アデノウイルス後期プロモーターを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼｌｕｃ２Ｐ遺伝子またはｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞がＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞が前記第１の融合分子を安定して発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の融合分子がレンチウイルスベクターを介して前記宿主細胞で発現する、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、米国特許仮出願第６２／０６６，１０５号（２０１４年１０月２０日出願）に対する優先権の利益を主張する。優先権出願の全開示は、参照によりその全文があらゆる目的のために本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
細胞内コンビナトリアルライブラリーは、細胞の生理機能を撹乱させる新規なアゴニストおよびその他の分子の生成に非常に有望である。しかし、広いダイナミックレンジにわたって定量的である、汎用読み出し機構が必要とされる。例えば、溶液中のアゴニストを同定するための現在の選択方法は、通常、軽蔑的な（ｐｅｊｏｒａｔｉｖｅ）レポーター系と結合している、その細胞内シグナル伝達ドメインを活性化させるように物理的状態を変える受容体と、それらアゴニストの相互作用に依存する。従って、各々のレポーター系は、その性質が細胞の特定の情報および問題の系の分子生物学に依存する別々の構築物を必要とする。そのような選択スキームは、特にシグナル伝達の機構が不明である場合に、結合イベントを伝えることのできる系を導くことができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
結合イベントに基づいてリガンドを選択するための、より動的で普遍的な方法が当技術分野で必要とされている。本発明は、この必要およびその他の当技術分野でまだ対処されていない必要に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、天然の細胞環境において標的ポリペプチドに結合する結合パートナーを同定するための方法を提供する。一部の方法では、標的ポリペプチドは、レンチウイルスベクターを使用する、候補結合パートナーのコンビナトリアルライブラリーによって、細胞で同時発現される。一部の方法では、候補結合パートナーは、標的ポリペプチドと融合しているシグナル伝達分子を切断する酵素を含み、細胞で合成レポーター系へのシグナル伝達を可能にする。
【０００５】
一部の実施形態では、本発明の方法は、（ａ）第１の膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含有する標的ポリペプチドを含む第１の融合分子を発現する第１の構築物と、各々が第２の膜貫通ドメイン（ＴＭ）に結合した候補結合パートナーを含む、第２の融合分子群のコンビナトリアルライブラリーを発現する第２の構築物であって、該融合分子群のうちの１つが酵素をさらに含み、他方の融合分子が酵素の基質配列および人工シグナル伝達経路の活性化因子をさらに含む、第２の構築物とを生成する工程、（ｂ）第１の構築物および第２の構築物を、各々の細胞が細胞膜に共存する第１の融合分子および第２の融合分子を有する、宿主細胞において発現させて細胞集団を生成する工程、（ｃ）人工シグナル伝達経路が活性化されている細胞集団から細胞を選択する工程、ならびに（ｄ）選択された細胞において第２の融合分子を同定する工程を伴う。選択された細胞から同定された第２の融合分子は、分子が標的ポリペプチドの結合パートナーを明らかにすることを可能にする。
【０００６】
これらの方法の一部では、第１の膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、標的ポリペプチドの天然ドメインである。一部の方法では、第１の膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、標的ポリペプチドに組換えによって融合している。一部の方法では、酵素はそのＮ末端で第２の膜貫通ドメインに結合し、基質配列はそのＮ末端で第１の膜貫通ドメインに結合し、そのＣ末端で活性化因子に結合している。一部の方法では、酵素による基質配列の切断の結果、第２の融合分子から活性化因子が放出される。一部の方法では、標的ポリペプチドは細胞受容体であり、結合パートナーは受容体のリガンドである。これらの方法の一部では、細胞受容体は細胞表面受容体であり、第２の膜貫通ドメインはＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインである。これらの方法の一部は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を対象とする。これらの方法の一部は、特にＴｐｏＲまたはＧＬＰ１Ｒを対象とする。
【０００７】
本発明の一部の方法は、プロテアーゼである酵素を用いる。これらの方法の一部では、基質配列はプロテアーゼの切断部位を含む。これらの方法の一部では、用いるプロテアーゼは、ＴＥＶプロテアーゼである。これらの方法の一部では、用いる基質配列は、ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４）（ＴＥＶ１）、ＥＮＦＹＦＱＳ（配列番号５）（ＴＥＶ２）、ＥＮＬＹＹＱＳ（配列番号６）（ＴＥＶ３）、またはＥＮＬＦＦＱＳ（配列番号７）（ＴＥＶ４）を含む。本発明の一部の方法は、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である宿主細胞を用いる。一部の方法では、宿主細胞は、第１の融合分子を安定して発現する。これらの方法の一部では、第２の融合分子は、レンチウイルスベクターを介して前記宿主細胞で発現する。
【０００８】
本発明の一部の方法では、用いる候補結合パートナーはペプチドまたは抗体である。一部の方法では、候補結合パートナーは、リンカー配列を介して第２の膜貫通ドメインに結合している。これらの方法の一部では、リンカー配列は、３、５、６、８、１０、またはそれ以上のＧＧＧＧＳ（配列番号１）のタンデムリピートを含む。
【０００９】
本発明の一部の方法では、活性化因子は転写因子であり、人工シグナル伝達経路は、転写因子によって認識される転写調節配列の制御下でのレポーター遺伝子の発現である。これらの方法の一部では、レポーター遺伝子は、レンチウイルスベクターを介して宿主細胞に導入される。一部の方法では、レポーター遺伝子は、融合分子の発現の前に宿主細胞に導入される。一部の方法では、転写因子はＧＬＡ４−Ｖ１６であり、転写調節配列はＧＡＬ４  ＵＡＳおよびアデノウイルス後期プロモーターを含む。一部の方法では、用いるレポーター遺伝子はルシフェラーゼｌｕｃ２Ｐ遺伝子またはｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子である。
【００１０】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することによって実現されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】受容体−リガンド相互作用をモニターするための近接度に基づく方法の模式図を示す図である。（Ａ）膜タンパク質は特定のシグナル伝達経路に結合していて、その結果、膜タンパク質がひとたび可溶性または膜繋留アゴニストによって刺激されるとレポーター遺伝子の発現が活性化される。（Ｂ）近接度に基づく選択系は、２つの膜繋留タンパク質からなる。第１のタンパク質は、その細胞内側でプロテアーゼＴＥＶに結合している、潜在的膜繋留リガンドからなる大型ライブラリーである。第２に、膜繋留受容体タンパク質は、その細胞内側に付加されたＴＥＶ切断部位および人工転写因子を有する。同じ場所に共存する受容体タンパク質とリガンドの相互作用は、ＴＥＶおよびＴＥＶ認識部位を近づけ、それは触媒作用による転写因子の放出を大いに促進する。放出された転写因子は細胞核に入り、レポーター遺伝子の発現が活性化される。
【図２】トロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）活性化の近接度に基づく同定を示す図である。ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を有する安定した細胞株を、ＵＡＳおよびＴｐｏＲ−ＴＥＶ切断部位転写因子の制御下で確立した。トロンボポエチン（ＴＰＯ）またはＴｐｏＲ結合抗体３Ｄ９もしくは１４Ｆ１２をコードするレンチウイルスを細胞に形質導入した。３、５、６、８、または１０コピーの（ＧＧＧＧＳ）（配列番号１）またはヒトＩｇＧ１  Ｆｃをはじめとする、異なるリンカーをコードする遺伝子を、リガンドとＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインとの間に置いた。ルシフェラーゼ活性を感染後２日目に測定した。ＧＬＰ１Ｒ−ＴＥＶ切断部位−転写因子を有する細胞株を陰性細胞対照として使用した。同じリンカー型および長さをもつ無関係の抗体を有する対照レンチウイルスからの発光シグナルを測定することによって反応を制御した。
【図３Ａ】グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）の近接度に基づく反応。全長ＧＬＰ１Ｒ（１〜４６３）および末端切断型ＧＬＰ１Ｒ（１〜４２６）を、ＴＥＶ切断部位および転写因子とＣ末端で結合させた。ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を有する安定した細胞株を、ＵＡＳおよび異なるＧＬＰ１Ｒ構築物の制御下で確立した。陽性対照としてＧＬＰ１Ｒ天然リガンド、エキセンディン−４をコードするか、または陰性対照として無関係の抗体をコードするレンチウイルスを細胞に形質導入した。ルシフェラーゼ活性を感染後１〜３日目に測定した。感染細胞の発光シグナルを対応する非感染細胞のシグナルで除算して信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）を得た。
【図３Ｂ】ＴＥＶ切断部位を変化させることによる信号対雑音比の増強。様々な効率で切断される４つのＴＥＶ切断部位をＧＬＰ１Ｒ（１−４２６）構築に使用した。異なるＴＥＶ基質配列を含有するＧＬＰ１Ｒ構造を含有する安定した細胞株に、潜在的陽性構築物としてＧＬＰ１Ｒ天然リガンド、エキセンディン−４、またはＶｃ１．１または陰性対照として無関係の抗体をコードするレンチウイルスを形質導入した。ルシフェラーゼ活性を感染後１〜３日目に測定した。感染細胞の発光シグナルを対応する非感染細胞のシグナルで除算した。
【図４】近接度に基づく方法のためのレポーター遺伝子としての蛍光タンパク質。ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子を含有する安定した細胞株を、ＵＡＳおよび異なるＴＥＶ切断部位をもつＧＬＰ１Ｒ構造の制御下で調査した。陽性構築物としてエキセンディン−４または陰性対照として無関係の抗体を含有するレンチウイルスを細胞に形質導入した。蛍光タンパク質の選択的発現が感染後２日目に観察された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｉ．大要
本発明は、標的タンパク質またはポリペプチドの結合パートナーを同定するための方法を提供する。標的タンパク質は、別のポリペプチドまたはペプチド分子、例えば、細胞表面受容体、核内受容体およびその他のリガンド結合タンパク質と結合することのできるどんなタンパク質またはポリペプチドであってもよい。本方法は、標的タンパク質（例えば、細胞受容体）と候補結合パートナー（例えば、候補ポリペプチドリガンド）の共存発現および近接度に基づく選択形式に依拠する。本発明は、本発明者らによる細胞受容体のリガンドを同定するための一般的な系の生成に一部分基づいている。この系は、空間でのリガンドとその受容体が接近することである、近接度効果によって引き起こされる化学速度の促進を利用する。この系は、人工シグナル伝達経路を使用する。したがって、受容体−リガンド系の正確な化学的性質またはそのシグナル伝達の機構に依存しない。この方法は、分子がその自然環境にある場合に、受容体と相互作用する大型ライブラリーからの分子の自己分泌選択（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を可能にする。本明細書において詳述されるように、本発明は、リガンド−受容体結合活性を検出するための、新規で普遍的な方法を提供する。これは、下流のシグナル伝達機構が不明な状況において特に重要である。
【００１３】
近接度効果は、有効モル濃度として現れ、細胞の生物学の多くを調節する。そのような近接度効果は、区画化、足場分子への付着、または酵素活性部位での封鎖によって達成することができる。有効モル濃度は、数百から１０１０モル程度の大きさであり得る。適切な酵素−基質系、最適反応困難度（ｏｐｔｉｍａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ）、および最適化されたリンカー長を選ぶことにより、大部分の膜受容体およびその他の結合タンパク質のレポーター系を構築するために使用することのできる頑強で普遍的な系を本発明によって生成することができる。当技術分野で現在公知の選択方法とは異なり、本発明の近接度に基づくレポーター系は、２つの分子が相互作用するかどうかだけに依存し、天然の経路の特定の下流の必要条件から独立している。代わりに、この系は、近接度効果のために競合する反応と比較するとその化学が支持される普遍的なレポート系に結合している。従って、細胞などの複雑な系の状況において、誘導された有効モル濃度は所定の相互作用を支持する特異性パラメータとなる。
【００１４】
本明細書において詳述されるように、本発明の方法は、候補結合パートナーからなる細胞内コンビナトリアルライブラリーと、候補結合パートナーおよび目的のタンパク質（例えば、標的受容体）が細胞区画（例えば、細胞膜）に共存している発現系を用いる。細胞内コンビナトリアルライブラリーは、目的のタンパク質も発現する細胞において、１．０×１０８もの異なる抗体またはペプチドを発現することができる。この発現系は、相互作用する分子を封鎖し、それらがバルク溶液中で相互作用する場合に達成されうるよりも高い有効モル濃度に達することを可能にする。その上、細胞膜でこの分子相互作用を利用し、その発生を伝えることのできる酵素−基質レポーター系が利用される。酵素−基質系は、細胞区画のどんな分子相互作用にも一般化できる方法で構築される。
【００１５】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分および特許請求の範囲を参照することによって実現されるであろう。
【００１６】
ＩＩ．定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味をもつ。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（Ｅｄ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（Ｅｄ．），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（Ｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｎａｎｄａｎｄ（Ｅｄｓ．），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；およびＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ  ｅｄ．，２０００）。加えて、以下の定義が本発明の実践において読者を助けるために記載される。
【００１７】
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味をもつ。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（３ＰｒｄＰ  ｅｄ．，２００２）；およびＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ＰｔｈＰ  ｅｄ．，２０００）。加えて、以下の定義が本発明の実践において読者を助けるために記載される。
【００１８】
単数形の用語「１つの（ａ、ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに示されている場合を除いて複数の言及を含む。同様に、「または」という語は、文脈上明らかに示されている場合を除いて「および」を含むものとする。
【００１９】
本明細書において、用語ペプチドの「アミノ酸」とは、天然起源のアミノ酸および合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体および天然起源のアミノ酸と似た様式で機能するアミノ酸ミメティクスをさす。天然起源のアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然起源のアミノ酸と同じ基本的化学構造を持つ化合物、すなわち、水素と結合した炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをさす。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を持つが、天然起源のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。
【００２０】
本明細書において、用語「含んでいる」または「含む」は、本発明に不可欠な組成物、方法、およびそのそれぞれの成分に言及する際に使用されるが、指定されていない要素にも、それが不可欠であるか否かにかかわらず適用される。
【００２１】
本明細書において、用語「から本質的になる」とは、所定の実施形態に必要な要素をさす。この用語は、本発明のその実施形態の１もしくは複数の基本的で新規なまたは機能的な特徴に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
【００２２】
用語「からなる」とは、実施形態の説明に列挙されていない要素を含まない、本明細書に記載される組成物、方法、およびそのそれぞれの成分をさす。
【００２３】
用語「接触する」はその通常の意味を有し、２以上の作用物質（例えば、ポリペプチドまたは有機小分子）を組み合わせること、作用物質と細胞を組み合わせること、または２つの異なる細胞集団を組み合わせることをさす。接触はインビトロで行うことができる（例えば試験管または増殖培地において２つのポリペプチドを混合するかまたは抗体集団と細胞集団を混合する）。接触は、細胞でまたはインサイチュでも行うことができる（例えば、２つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの細胞中での同時発現によって細胞中で、あるいは細胞可溶化物中で、細胞内の２つのポリペプチドを接触させる）。
【００２４】
ポリペプチド配列に関して、「保存的に修飾された変異体」とは、保存的アミノ酸置換、つまり同様の電荷をもつ側鎖を有する他のアミノ酸残基に置き換えられたアミノ酸残基を有する変異体をさす。同様の電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において既に定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖をもつアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖をもつアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖をもつアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖をもつアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖をもつアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖をもつアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００２５】
用語「操作された細胞」または「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、その中に組換え発現ベクターが導入された細胞をさす。そのような用語が特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代も言及することを意図することは当然理解される。特定の修飾は、突然変異かまたは環境上の影響のいずれかに起因して後続の生成において起こることがあるので、そのような後代は実際には親細胞と同一でないことがあるが、それでもなお本明細書において用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００２６】
エキセンディン−４は、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体の３９アミノ酸アゴニストである。エキセンディン−４は、アメリカドクトカゲ、ヘロデルマ・ススペクツム（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液中に存在する。エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１よりも著しく長い半減期を有する。
【００２７】
「融合」タンパク質またはポリペプチドとは、少なくとも２つのポリペプチドと、その２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチドに作動可能に連結するための連結配列または結合からなるポリペプチドをさす。融合ポリペプチドに連結された２つのポリペプチドは、一般に２つの独立した供給源に由来する。従って融合ポリペプチドは通常、天然には連結された状態では見出されない２つの連結したポリペプチドを含む。
【００２８】
「異種」とは、２つのポリペプチドを言及して使用される場合に、その２つのポリペプチドが天然には同じ細胞または微生物中では見出されないことを示す。対立遺伝子の変異または天然に存在する変異イベントは、本明細書に定義される異種の生体分子または配列を生じさせない。ベクター構築物の「異種」領域は、大きなポリヌクレオチド分子内の、天然にはその大きな分子に関連して見出されないポリヌクレオチドの同定できるセグメントである。従って、異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、その遺伝子は通常、供給源生物のゲノムにおいて哺乳動物ゲノムのポリヌクレオチドに隣接しないポリヌクレオチドに隣接されることになる。
【００２９】
用語「単離された」とは、ポリペプチドまたはタンパク質がその天然の環境から取り出されることを意味する。しかし、それとともに見出される成分の一部は、「単離された」タンパク質と一緒であり続けることがある。従って、「単離されたポリペプチド」は、それが天然に出現するままの姿ではなく、実質的には１００％未満純粋なタンパク質である。
【００３０】
用語「同一の」または「同一性」パーセントとは、２以上の核酸またはポリペプチド配列の状況において、同じである２以上の配列または下位配列をさす。２つの配列が、比較ウィンドウ、あるいは以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるかまたは手作業によるアライメントおよび外観検査によって測定される、設計された領域にわたる最大一致度について比較し整列させた場合に、指定された百分率の、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（すなわち指定された領域で、または、指定されていない場合は全配列で、６０％同一、随意に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である）場合に、その２つの配列は、「実質的に同一」である。随意に、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００〜５００または１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸）の領域にわたって存在する。
【００３１】
比較のための配列アライメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ，１９７０の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アライメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似性検索の方法によって；これらのアルゴリズム（ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実施によって；あるいは、手作業によるアライメントおよび外観検査によって（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．，２００３）参照）、実施することができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載されている。
【００３２】
上記の配列同一性の百分率の他に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることを示す別の徴候は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが以下で説明する第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、一般に第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることを示す別の徴候は、２つの分子またはそれらの補体が以下で説明するストリンジェントな条件下で互いとハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることを示すさらに別の徴候は、配列を増幅するために同じプライマーを使用することができることである。
【００３３】
「リガンド」は、特定の抗原、受容体または標的分子によって認識される分子である。本発明の実践に用いることのできるリガンドの例としては、それに限定されるものではないが、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン、ホルモン受容体、ポリペプチド、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物（例えばオピエート、ステロイド等）、レクチン、糖、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、およびモノクローナル抗体が挙げられる。
【００３４】
「結合（Ｌｉｎｋａｇｅ）」とは、２つの生体分子（例えば、ポリペプチドまたは２つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を動作可能にまたは機能的に接続する手段をさし、それには、制限されるものではないが、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、および静電結合が含まれる。「融合した」とは、共有結合による結合をさす。「リンカー」または「スペーサー」とは、２つの生体分子を接続する分子または分子の群をさし、２つの分子を最小の立体障害で好ましい立体配置に置くのに役立つ。
【００３５】
用語「動作可能に連結された」とは、これが核酸に言及する場合、機能的関係にあるポリヌクレオチド要素の結合をさす。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合に「動作可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列と動作可能に連結される。動作可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が一般に隣接していることを意味し、２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、隣接していてリーディングフレーム内にあることを意味する。
【００３６】
別に指定のない限り、用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを言及するために本明細書において同義的に使用される。それらは、短いオリゴペプチド（例えば、約２５未満の残基をもつペプチド）と長いポリペプチド分子（例えば、約２５を超えるかまたは３０アミノ酸残基のポリマー）の両方を包含する。一般に、本発明で使用される候補ペプチドまたはポリペプチドリガンドは、約４アミノ酸残基長〜約３５０以上のアミノ酸残基長で構成され得る。一部の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、約６アミノ酸残基長〜約６０アミノ酸残基長で構成される。一部のその他の実施形態では、それらは約８アミノ酸残基長〜約４０アミノ酸残基長で構成され得る。ペプチドまたはポリペプチドには、天然起源のアミノ酸ポリマーおよび非天然起源のアミノ酸ポリマー、ならびに、１またはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマーが含まれ得る。別に指示のない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に修飾された変異体も暗に包含する。
【００３７】
本明細書において、用語「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」とは、ペプチドの機能を生物学的に模倣する基準ペプチドの誘導体化合物をさす。一般に、ペプチド模倣物誘導体は、基準ポリペプチドの生物学的機能の少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％を有する。
【００３８】
用語「動作可能に連結された」とは、２以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係をさす。一般に、それは転写調節配列の転写配列に対する機能的関係をさす。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、適切な宿主細胞またはその他の発現系においてそれがコード配列の転写を刺激するかまたは調節する場合に、コード配列に動作可能に連結されている。通常、転写配列に動作可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に隣接している、すなわちそれらはシス作用性である。しかし、一部の転写調節配列、例えばエンハンサーなどは、それらが転写を増強するコード配列に物理的に隣接しているかまたは非常に近接して位置している必要はない。
【００３９】
別に記述のない限り、用語「受容体」とは、広義には、所定のリガンドに親和性をもつ分子をさす。受容体は、天然起源の分子であっても人工の分子であってもよい。また、それらは、それらの未変化の状態で、または他の種との凝集体として用いることができる。受容体は、直接に、または特定の結合物質を介して結合メンバーと共有的にまたは非共有的に結合することができる。本発明の実践に用いることのできる受容体の典型的な例は、細胞表面シグナル伝達受容体である。
【００４０】
語句「シグナル伝達経路」または「シグナル伝達活性」（例えば、ＧＬＰ−１Ｒ介在性のシグナル伝達）とは、少なくとも１つの生化学反応をさし、より一般的には細胞と刺激化合物または作用物質との相互作用に起因する一連の生化学反応をさす。このように、刺激化合物と細胞との相互作用は、シグナル伝達経路を通して伝達される「シグナル」を生成し、最終的に細胞応答をもたらす。
【００４１】
本明細書において、用語「変異体」とは、基準分子の配列と実質的に同一の配列を含む分子（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）をさす。例えば、基準分子は、本明細書に開示される酵素ポリペプチドまたは融合物であってよい。また、基準分子はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、変異体は基準分子と少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上の配列同一性を共有することができる。一部のその他の実施形態では、変異体は、１またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を有することで基準分子とは異なる。一部のその他の実施形態では、基準分子の変異体は、保存的に修飾された変異体、例えば、変更されたアミノ酸配列を有する（例えば、１または複数の保存的アミノ酸置換をもつ）が、基準分子の生物活性を実質的に保持する変異体である。保存的アミノ酸置換は、当業者に周知である。
【００４２】
用語「ベクター」は、それと結合した別のポリヌクレオチドを輸送する能力のあるポリヌクレオチド分子をさすことを意図する。ベクターの１つの種類は、「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントを連結することのできる環状二本鎖ＤＮＡループをさす。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することのできるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞で自己複製する能力がある（例、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによりそれらは宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）と呼ばれる。
【００４３】
ＩＩＩ．近接度に基づく選択のための発現系
本発明の方法は、発現した標的タンパク質（例えば、細胞受容体）および候補結合パートナーのライブラリー（例えば、候補ポリペプチドリガンド）を細胞区画、例えば細胞膜に固定し共存させる発現系を利用する。候補結合パートナーは、細胞内コンビナトリアルライブラリーを介して発現する。標的タンパク質と結合パートナーの相互作用は、細胞区画（例えば、細胞膜）での分子相互作用の発生を伝える酵素基質系を活性化させる。標的タンパク質および結合パートナーは、各々が融合しているか、または酵素−基質レポーター系の一成分だけを有するように発現する。細胞表面受容体およびペプチドリガンドを例として使用して、系は、リガンドと受容体が相互作用して反応体を近接させる場合にだけ機能する。受容体とそのリガンドの相互作用がそれらを近づけると、タンパク質分解反応によって、宿主細胞において検出可能な応答をもたらし得る活性化因子またはエフェクター分子が放出される。例えば、活性化因子は、核に入り核内のプロモーターと結合してレポーター遺伝子を活性化させるペプチドまたはポリペプチド転写因子であり得る。この発現系および結果として得られる選択形式から得られる多くの利点がある。例えば、この系は、多数の潜在的アゴニストの分子相互作用を、無傷の生細胞の生理学的に適切な環境で決定することを可能にする。その上、この系は、シグナル伝達の機構が不明であるかまたはリガンド自体が不明である受容体のリガンドの検索を可能にする。
【００４４】
候補結合パートナー（例えば、ポリペプチドリガンド）と標的タンパク質（例えば、細胞受容体）が細胞膜で共存発現するために、結合パートナーを膜貫通タンパク質ドメインと融合させ、第１の発現構築物から発現させることができる。標的タンパク質は、第２の発現構築物から融合物として発現する。一部の実施形態では、標的タンパク質は、１または複数の天然の膜貫通ドメイン（ＴＭ）、例えば、細胞外ドメインと細胞表面受容体の天然ＴＭを含む細胞表面受容体である。標的タンパク質が天然のＴＭ（例えば、核内受容体またはその他のリガンド結合タンパク質）を欠く、一部のその他の実施形態では、それは異種の膜貫通タンパク質ドメインとの融合物として発現することができる。一部の実施形態では、融合ポリペプチドの成分を結びつける（例えば、候補リガンド（例えば、抗体またはペプチド）を膜貫通タンパク質ドメインに結び付ける）リンカー配列が、発現構築物において使用される。例えば、これまでに生成された膜繋留毒素の大部分は、２０個の交互のグリシンとアスパラギン残基のストレッチを含む。このリンカー配列は、本発明の発現構築物で使用することができる。膜テザーに先立つそのようなリンカーは、ペプチド毒素がその同族のイオンチャンネルと結合するために必要な回転柔軟性および距離を提供することができる。様々な実施形態では、融合構築物を発現させるために、様々な長さのリンカーを使用し、最適化することができる。
【００４５】
受容体およびペプチドリガンドを用いて選択スキームを例証するため、候補リガンドおよび受容体を、各々が融合するかまたは酵素−基質レポーター系の一成分だけを有するような方法で発現させる。従って、本明細書において例証されるように、リガンド−ＴＭ融合構築物は、酵素（またはその基質）をさらに発現することができ、受容体構築物は、基質配列（または酵素）をさらに発現することができる。様々な実施形態では、基質ペプチド配列は、エフェクターまたは活性化因子配列（例えば、転写因子）にさらに連結される。リガンドと受容体が結合すると、基質配列の酵素が切断されて、エフェクター分子が放出される。次に、放出されたエフェクター分子は、細胞の検出可能なシグナル伝達経路を活性化させることができ、リガンド−受容体結合イベントが起こったことを示す徴候を提供する。
【００４６】
本発明に適した酵素−基質レポーターは、特定の酵素−基質系に限定されない；いくつかの周知の酵素とポリペプチド基質対のいずれかを本発明の実践に用いることができる。本明細書中で例証されるように、酵素−基質系の一例は、ＴＥＶプロテアーゼと酵素の特異的ペプチド切断部位である。ＴＥＶプロテアーゼは周知であり、タバコモザイクウイルス（ＴＥＶ）由来の高度に配列特異的なシステインプロテアーゼである。それはキモトリプシン様プロテアーゼのＰＡクラスのメンバーである。その高い配列特異性のために、それはインビトロおよびインビボで融合タンパク質の制御切断に頻繁に使用される。本発明の実践では、野生型ＴＥＶプロテアーゼ、野生型酵素の任意の変異体（例えば、保存的に修飾された変異体）または酵素断片が使用されてよい。ＴＥＶプロテアーゼおよび変異体を発現する配列およびベクターは当技術分野で常套的に使用されていて、文献または市販の供給業者、例えば、Ｋａｐｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１９：３１２−８，２０００；Ｋａｐｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１４：９９３−１０００，２００１；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．１９：２３７９−８８，２０１０；およびＡｄｄｇｅｎｅ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）で容易に入手可能である。ＴＥＶプロテアーゼの対応する切断部位配列も当技術分野において十分に特徴づけられ、使用されている。ＴＥＶプロテアーゼに適した基質配列の例としては、例えば、ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４）（ＴＥＶ１）、ＥＮＦＹＦＱＳ（配列番号５）（ＴＥＶ２）、ＥＮＬＹＹＱＳ（配列番号６）（ＴＥＶ３）およびＥＮＬＦＦＱＳ（配列番号７）が挙げられる。一部の実施形態では、本発明の構築物で使用されるＴＥＶプロテアーゼ基質配列は、ＥＮＦＹＦＱＳ（配列番号５）（ＴＥＶ２）である。
【００４７】
同様に、当技術分野で周知のどんなレポーター遺伝子も本発明の実践に用いることができる。それは、細胞によるその発現を検出し、かつ／または定量することのできるタンパク質をコードするどんな遺伝子またはポリヌクレオチドでもあり得る。従って、レポーターの発現のレベルの測定値は、レポーター遺伝子の発現を指示するプロモーター要素の活性化のレベルを示す。レポーター遺伝子として有用な遺伝子の例としては、例えば、代謝酵素、抗生物質耐性因子、発光タンパク質、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。そのようなレポーター遺伝子は当技術分野で周知であり、特定の例が、Ｗｏｏｄ（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（１）：５０−５８に記載されている。本発明のいくつかの構築物では、レポーター遺伝子はルシフェラーゼをコードする。一部のその他の実施形態では、レポーター遺伝子はβ−ガラクトシダーゼなどの代謝酵素をコードする。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、宿主細胞において栄養要求突然変異を補完し、選択培地で遺伝子を発現する細胞の増殖を許容する遺伝子であり得る。
【００４８】
本発明の方法を実践するための発現ベクターおよびレポーター細胞の構築は、分子生物学の常套的に行われる方法に従って容易に実行することができる。本発明の必要な工程を実施するためのいくつかの特定のプロトコールも本明細書において例証される。例えば、本明細書において詳述されるように、リガンド−ＴＭ−酵素融合物をコードする発現ベクターは、候補リガンドとＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン（アミノ酸５１４〜５６１）のＮ末端を融合させることによって生成することができ、一方で酵素（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ）は膜貫通ドメインのＣ末端に融合される。回転柔軟性を許容するために、リンカー配列をリガンド配列と膜貫通ドメインの間に挿入することができる。本明細書中で例証されるように、１つのリンカー配列は、１または複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上の）ＧＧＧＧＳ（配列番号１）のタンデムリピートを含む。一部の実施形態では、リンカーは、８、１０またはそれ以上のＧＧＧＧＳ（配列番号１）のタンデムリピートを含む。リガンド−ＴＭ−酵素融合物は、レンチウイルスベクター（例えば、本明細書において例証されるｐＬＶ２ベクター）にクローン化されて、宿主細胞に遺伝子導入するためのウイルス粒子を生成することができる。受容体−基質−エフェクター分子融合物に関して、例となるエフェクター分子は、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６  Ｃ末端活性化ドメインへのＧａｌ４  ＤＮＡ−結合ドメインの融合であり得る。この結果、全ての哺乳動物細胞に直交する人工転写因子（ＧＡＬ４−ＶＰ１６）が得られる。標的受容体（例えば、ＴｐｏＲまたはＧＬＰ１Ｒ）のコード領域は、そのＣ末端で基質配列または酵素（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位）およびＧＡＬ４−ＶＰ１６転写因子の切断部位に融合する。次に、この融合配列は、適切な発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ５ベクター）にクローン化させることができる。
【００４９】
様々な発現ベクターを本発明で使用することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、宿主細胞において候補結合パートナーのコンビナトリアルライブラリーを導入し、発現させるのに適している。レンチウイルスベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方を形質導入するかまたは感染させて、一般に高いウイルス力価を生じることのできるレトロウイルスベクターである。本発明に適したレンチウイルスに基づくベクターの例としては、例えば、本明細書において例証されるｐＬＶ２レンチウイルスベクターが挙げられる。本発明を実行するために用いられ、修飾されてよいその他のレンチウイルスベクターとしては、例えば、ｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｈｙｇ、およびｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏが挙げられる。クローン化された候補リガンド配列を含む様々なレンチウイルスベクターは、候補リガンドライブラリーを発現するための適切な宿主細胞に導入することができる。例えば、ＨＥＫ２９３細胞株、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株、およびＴＦ−１細胞株は全て本発明に適している。当技術分野で周知の多くのその他のパッケージング細胞株（例えば、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞株）も、本発明においてコンビナトリアルライブラリーを発現させるために用いることができる。レンチウイルスに基づくベクターおよび宿主細胞に加えて、その他のレトロウイルスに基づくベクターおよび発現系も本発明の方法の実践に用いることができる。これらには、ＭＭＬＶに基づくベクターｐＱＣＸＩＮ、ｐＱＣＸＩＱおよびｐＱＣＸＩＨ、ならびに適合するプロデューサー細胞株、例えばＨＥＫ２９３に基づくパッケージング細胞株ＧＰ２−２９３、ＥｃｏＰａｃｋ２−２９３およびＡｍｐｈｏＰａｃｋ２９３、ならびにＮＩＨ／３Ｔ３に基づくパッケージング細胞株ＲｅｔｒｏＰａｃｋ  ＰＴ６７などが含まれる。
【００５０】
受容体と結合することのできる候補リガンドを同定するため、宿主細胞は、結合イベントの発生の検出を可能にするエフェクター分子によって活性化させることのできる検出可能なレポーター遺伝子を含むこともできる。例えば、選択されたエフェクター分子がＧＡＬ４−ＶＰ１６転写因子である場合、ＵＡＳ−レポーターレポーター遺伝子ベクターを宿主細胞に導入することができる。本明細書中で例証されるように、レポーター遺伝子ベクターは、ＧＡＬ４−ＶＰ１６転写因子によって認識され、動作可能に連結された配列の発現を活性化する転写制御配列（例えば、ＧＡＬ４  ＵＡＳの数回のリピートおよびアデノウイルス後期プロモーター）を含む。動作可能に連結された配列は、一般に、容易に検出可能なシグナルをコードする。例えば、レポーター遺伝子ベクター中の転写制御配列は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６転写因子の結合に応答して、ルシフェラーゼｌｕｃ２ＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子の転写を推進することができる。本明細書中で例証されるように、レポーター遺伝子を含む安定した宿主細胞または細胞株は、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）にレポーター遺伝子構築物（例えば、ＵＡＳ−レポーター遺伝子ベクター）を遺伝子導入することによって容易に生成することができる。
【００５１】
本発明は、リガンドとＴｐｏＲおよびＧＬＰ−１Ｒ受容体の共存発現および結合の検出を例証した。本明細書に記載される一般的な選択スキームは、どんな細胞受容体のリガンドを同定する際にも広く応用することができる。これらには、一般にそれら自体の膜貫通ドメイン、例えば、ＧＰＣＲおよび酵素結合受容体を含むいずれの細胞表面受容体（例えば、ＧＰＣＲまたは酵素結合受容体）も含まれる。膜貫通ドメインを含む表面受容体に加えて、その他の細胞受容体またはリガンド結合タンパク質も、例えば、細胞質受容体または核内受容体を含むそれらのリガンドまたは結合パートナーを同定するために、本発明の選択系で調べることができる。天然の膜貫通ドメインを欠く受容体またはリガンド結合タンパク質に関して、それらは本発明の選択法で使用する前に組換えによって異種膜貫通ドメイン（例えば、ＰＤＧＦＲ  ＴＭ）に融合させることができる。様々な実施形態では、選択系を用いてリガンドが同定されていない受容体（オーファン受容体）の新規なリガンドまたはモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することができる。既知リガンドを有する受容体に関して、新規なアゴニストまたはアンタゴニストの同定は、リガンドの作用を模倣するか、増強するかまたは阻害するために特に求められることがある。
【００５２】
本発明の一部の実施形態は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を対象とする。ＧＰＣＲは細胞表面受容体タンパク質の最大のファミリーを構成する。ＧＰＣＲには３つの主なファミリー、Ｇｓ−、Ｇｉ−、およびＧｑ−共役受容体がある。活性化によって、異なるＧＰＣＲがいくつかのシグナル伝達経路を刺激する。例えば、Ｇｓ共役受容体はｃＡＭＰ産生を増加させるが、Ｇｉ共役受容体は低下させる。そのため、これらの２つの異なるＧＰＣＲは、ｃＡＭＰ応答要素を活性化するかまたは阻害することができる。一方、Ｇｑ共役受容体は、細胞内カルシウム濃度を増加させ、複数の応答要素を活性化させる。配列相同性および機能的類似性に基づいて、ＧＰＣＲは、クラスＡ（ロドプシン様受容体）、クラスＢ（セクレチン受容体ファミリー）、クラスＣ（代謝型グルタミン酸／フェロモン）、クラスＤ（真菌接合フェロモン受容体）、クラスＥ（環状ＡＭＰ受容体）、およびクラスＦ（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体）に分類されることができる。本発明の一部の実施形態は、酵素結合受容体を対象とする酵素結合受容体は、受容体チロシンキナーゼ；チロシンキナーゼ関連受容体；受容体様チロシンホスファターゼ；受容体セリン／トレオニンキナーゼ；受容体グアニリルシクラーゼ、およびヒスチジンキナーゼ関連受容体を包含する。これらのうち、受容体チロシンキナーゼは、酵素結合受容体の最大の集団となる。これらの分子の大部分は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン、神経成長因子（ＮＧＦ）等のような増殖因子およびホルモンの受容体である。
【００５３】
細胞膜への共存以外に、本発明の方法は、その他の細胞区画に受容体と共存するリガンドを選択するためにも使用することができる。２つのタンパク質が選択的に近づくどんな状況も、それらの相互作用の有効モル濃度を増加させる。従って、例えば、本発明の方法は、レポーター系を再指示することにより、オルガネラ−オルガネラ相互作用をモニターすること、または一般にタンパク質輸送をたどることにも用いることができる。
【００５４】
ＩＶ．細胞膜局在性リガンドライブラリー
本発明は、細胞で発現すると細胞膜に局在することのできるポリペプチドまたは抗体（例えば、一本鎖抗体）のコンビナトリアルライブラリーを提供する。ライブラリーは、各々、少なくとも１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０またはそれ以上の異なるポリペプチドまたは抗体配列を含むことができる。一般に、ライブラリーの各メンバーは、膜貫通ドメインと動作可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｋｅｄ）特定のまたは無作為化されたポリペプチドまたは抗体配列を含む。膜貫通ドメイン、例えば、本明細書中で例証されるＰＤＧＦＲ膜貫通領域は、発現したペプチドを細胞膜に繋留させる。ＰＤＧＦＲ以外に、当技術分野で周知の多くのその他の膜貫通ドメイン、ならびにこれらの既知膜貫通タンパク質ドメインの変異体（例えば、保存的に修飾された変異体）も、本発明のリガンドライブラリーの構築に用いることができる。例えば、Ｒｅｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：１６７９−１６８９，２０００；およびＨｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ａｄｈ．Ｍｉｇｒ．４：３１３−３２４，２０１０を参照されたい。
【００５５】
一部の実施形態では、候補リガンドは、ポリペプチドまたはペプチド配列のコンビナトリアルライブラリーである。どんなポリペプチドまたはペプチド（例えば、無作為化ペプチド）も、本発明の組み合わせライブラリーの構築に用いることができる。それらは少なくとも４、５、６、７、８、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、３００またはそれ以上のアミノ酸残基長を含むことができる。従来の遺伝子工学技術は、一般にポリペプチドのライブラリーの発現に用いられる。本発明の組換えポリペプチドまたはペプチドライブラリーを作製するには、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを適した発現系に挿入する。融合ペプチドの発現には、当技術分野で公知の多数の種類の適切な発現ベクターを用いることができ、それには、例えば、細菌、ウイルス、酵母、真菌、昆虫または哺乳動物発現系を含むベクターが含まれる。本明細書において例証されるように、本発明のペプチドまたはポリペプチドライブラリーを作製するのに好ましい発現系は、レンチウイルスに基づくものである。そのような発現ベクターを入手し使用するための方法は周知である。本発明のコンビナトリアルライブラリーを作製し発現させるために使用されるこれおよびその他の分子生物学技術のガイダンスには、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８：２７７−２９８（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，（Ｔｕａｎ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ），およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、ならびにそれらに引用される参考文献を参照されたい。例示的な実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクターの適切なプロモーター、例えば、本明細書中で例証されるレンチウイルスベクターのＥＦ１ａプロモーターの制御下に置くことができる。
【００５６】
本発明の一部の実施形態では、使用されるリガンドのコンビナトリアルライブラリーは、抗体のライブラリーである。どんな抗体配列も、本発明の組み合わせペプチドライブラリーの構築に用いることができる。一部の実施形態では、一本鎖抗体ライブラリーが一般に使用される。一本鎖抗体ライブラリーは、抗体の重鎖または軽鎖だけまたはその可変領域を含むことができる。しかし、より一般に、一本鎖抗体ライブラリーのメンバーは、１つの隣接するタンパク質内でペプチドスペーサーによって分離された重鎖および軽鎖可変領域の融合物から形成される。例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第８８／０６６３０号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９２／０１０４７号を参照されたい。抗体ライブラリーの多様性は、天然源由来の抗体コード配列、例えば免疫または未免疫Ｂ細胞の非クローン性集団などを得ることから起こり得る。あるいは、またはそれに加えて、多様性は、当技術分野で周知の人工変異誘発によって導入することができる。一部の実施形態では、抗体ライブラリーは、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を発現する。本発明での使用に適した特定のｓｃＦｖライブラリーは、当技術分野で記載されている（例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１２６１２−６、２０１２）。そのような抗体ライブラリーは、当技術分野で周知の様々なベクターで作製し、それらから発現させることができる。好ましくは、本発明で使用される抗体ライブラリーは、レンチウイルスまたはレトロウイルスに基づくベクターによって構築される。真核生物宿主細胞の内部で発現させるためのそのような抗体ライブラリーの構築は、本明細書に例証される技術および当技術分野で周知のその他の方法に従って実施することができる。
【００５７】
当技術分野で周知の多くの技術は、候補リガンドのライブラリーのメンバーの多様性を増やすために容易に用いることができる。これらには、例えば、コンビナトリアル鎖シャッフリング、抗体配列のヒト化、変異の導入、親和性成熟、変異誘発宿主細胞の使用等が含まれる。これらの方法は全て、当業者の裁量で本明細書に記載される方法の実践において用いることができる。例えば、Ａｕｊａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．８：１５５−１６８，１９９７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−８２，１９９１；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−１３，１９９４；Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１−１０７０５，２０００；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１００−１０２，１９９６；Ｆｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７７６１−７７６６，１９９６；Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３−３９１３，１９９２；Ｅｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：１２７−１４３，１９９６；Ｋａｎｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６：５７−８６，２０００；Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９−３６８，１９９６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１００６８−１００７３，２０００；およびＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３，１９９５を参照されたい。
【００５８】
一部の実施形態では、候補リガンドのライブラリーは、１つの候補ポリペプチドまたは出発フレームワークポリペプチド（例えば、細胞受容体の既知のポリペプチドリガンド）に由来する変異体または変異株を含む。例えば、候補ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子は、１またはそれ以上の選択されたコドンで変更されていてよい。変更は、候補ポリペプチドをコードする遺伝子での１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入として定義され、その結果ポリペプチドのアミノ酸配列が変化する。好ましくは、変更は、分子の１またはそれ以上の領域での少なくとも１つのアミノ酸の任意のその他のアミノ酸による置換によるものとなる。変更は、当分野で公知の多様な方法によって生成することができる。これらの方法としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド介在性変異誘発（例えば、Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−５０，１９８７）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ３４：３１５，１９８５）、エラープローンＰＣＲ（例えば、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：６２３０−４，１９８９；およびＫｅｏｈａｖｏｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｉｌｌｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８６：９２５３−７，１９８９参照），ならびにＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−９１，１９９４；およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１０７４７−５１，１９９４）が挙げられる。
【００５９】
一部の実施形態では、候補リガンドは、精製を改善するため、宿主細胞でのペプチドの発現を強化するため、検出を助けるため、ペプチドを安定化させるため等に使用することのできる融合パートナー（例えば別のペプチドまたはその他の部分）とさらに共役させることができる。本発明の候補ペプチドリガンドに適した融合パートナーの例としては、ポリエチレングリコール、ペグ化、またはその他の化学製品が挙げられる。多くの適したペプチドまたはポリペプチド融合パートナーの中には、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ等がある。一部の実施形態では、本発明の候補ペプチドまたはポリペプチドは、検出可能な標識を備えることができる。
【００６０】
一部の実施形態では、候補リガンドは、２０個の標準アミノ酸の１またはそれ以上の天然起源のアミノ酸誘導体、例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチンまたはカルボキシグルタミン酸を含むことができ、さらに、ポリペプチド結合によって結合されていないアミノ酸も含むことができる。同様に、それらは環状ポリペプチドおよびその他の立体構造的に制限された構造であってもよい。ポリペプチドを修飾して類似体および誘導体を生成するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．５，ｐ．３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）；およびＢｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｅｄ．Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｅ．Ｗｏｌｆｆ，Ｃｈ．１５，ｐｐ．６１９−６２０，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９５））。
【００６１】
Ｖ．近接度に基づくアッセイによるリガンドの選択
本発明は、宿主細胞集団の細胞膜に発現し局在することのできる、標的分子（例えば、標的受容体）の１またはそれ以上のリガンドを候補リガンドの大型の細胞内コンビナトリアルライブラリーから同定するための方法を提供する。これらの方法では、ライブラリーからの異なる候補リガンドと標的分子（例えば、表面受容体）が宿主細胞の細胞膜に共存する。標的分子（例えば、受容体）および候補リガンドは各々、酵素の一成分およびその酵素の同族のペプチド基質または認識配列に融合する。共存するリガンドが近くの標的分子（例えば、受容体）と結合すると、基質配列に融合していたエフェクター細胞（例えば、転写因子）は酵素反応の結果として放出される。その後、エフェクター分子は、人為的な細胞応答またはシグナル伝達経路を活性化させるとすぐに検出可能な応答、例えば、蛍光応答、発光応答またはその他のシグナルを導くことができる。
【００６２】
本発明の方法を実践するための宿主細胞は、本明細書に記載される標的分子、候補リガンド、およびレポーター構築物を有し発現させるのに適したいずれの周知の真核細胞または細胞株であってもよい。一部の実施形態では、近接度に基づくリガンド選択のための融合分子を発現させるために哺乳動物宿主細胞が使用される。例えば、それらは、ハイブリドーマ細胞株であってもよいし、下に例証されるように外因性発現ベクターを有する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）であってもよい。これらには、どんな正常な致死の、または異常な不死の動物またはヒト細胞も含まれる。本明細書において例証される細胞株に加えて、本発明の標的分子および候補リガンド構築物を発現する能力のあるいくつかのその他の適した宿主細胞株も当技術分野で公知である。これらには、例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびその他のハイブリドーマ細胞株が含まれる。ポリペプチドを発現させるための哺乳動物組織細胞培養の使用は、一般に、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７に考察されている。哺乳動物宿主細胞の発現ベクターには、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなど、ならびに必要な情報処理部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列などが含まれ得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含む。適したプロモーターは、構成的、細胞種特異的、段階特異的、および／または調節可能または制御可能であってよい。有用なプロモーターとしては、限定されるものではないが、本明細書において例証されるＥＦ１αおよびヒトＵｂＣプロモーター、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えばヒト最初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、ならびに当技術分野で公知のプロモーターとエンハンサーの組合せが挙げられる。
【００６３】
結合活性をモニターするための候補リガンド構築物および標的分子（例えば、受容体）構築物の発現は、分子生物学において常套的に実行される技法および本明細書において例証される方法によって実施することができる。また、標的受容体のリガンドのための候補リガンドのライブラリーからの選択も、当技術分野で周知の標準的な手順または本明細書に記載される特定の実例によって実行することができる。使用するリガンドに関わらず、ポリペプチドまたは抗体リガンドのコンビナトリアルライブラリーをコードする発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のライブラリーを、最初に適切な宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）に導入して、リガンドをコードするウイルスのライブラリーを得ることができる。特定の膜結合標的分子（ＴｐｏＲまたはＧＬＰ−１Ｒなどの受容体）を発現するウイルスとともに該ウイルスを宿主細胞に同時に遺伝子導入すると、リガンド融合物のライブラリーは、発現し、受容体とともに膜に共存するようになる。一部の実施形態では、標的分子を発現するベクターおよびレポーター遺伝子構築物は、最初に宿主細胞に導入されることができる。次に、リガンドを発現するライブラリーを標的分子（例えば、表面受容体）を安定して発現する宿主細胞に導入することができる。
【００６４】
本方法で用いる特定のエフェクター分子およびレポーター遺伝子に応じて、様々な近接度に基づく反応アッセイを使用して、リガンドと標的分子の結合を検出することができる。ＧＡＬ４−ＶＰ１６転写因子およびＧＡＬ４  ＵＡＳ転写応答要素を例として使用して、ＵＡＳ−レポーター遺伝子と標的受容体切断部位転写因子融合物の両方を有する宿主細胞を、候補リガンド−ＴＭ−ＴＥＶプロテアーゼ融合物のライブラリーを有するレンチウイルスによって最初に感染させることができる。次に、細胞を培養した後、レポーター遺伝子活性を測定する。
【００６５】
本発明は、一般にレポーターによってコードされるタンパク質の活性を測定することに基づく、レポーター発現を検出および定量化するための様々な方法を用いることができる。幅広い種類の適切な検出可能なマーカーが当技術分野で公知であり、それには、検出可能なシグナルを与える能力のある蛍光、放射線、酵素またはその他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンなどが含まれる。一部の実施形態では、放射性またはその他の環境上望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼなどを用いることができる。酵素タグの例では、ヒトの眼にまたは分光測定によって目に見える手段を提供するために用いることのできる、比色指標基質が公知である。本明細書中で例証されるように、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼアッセイによってその発現を容易に検出することのできるルシフェラーゼ遺伝子、または蛍光顕微鏡によってその発現を観察することのできるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子であり得る。本発明に適したレポーター遺伝子のその他の例としては、蛍光顕微鏡によって可視化されるかまたは蛍光活性化セルソーターを用いて検出されることのできる、β−ラクタマーゼ、およびＧＦＰまたはその他の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００６６】
レポーター遺伝子が酵素をコードする場合、代謝されて測定可能な産物を生成するその酵素の基質を使用することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼ用基質Ｘ−ｇａｌは、この酵素によって切断されて青色の反応生成物を生成するが、β−ガラクトシダーゼレポーター発現をアッセイするために頻繁に使用される（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．ｅｄ．（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。あるいは、β−ガラクトシダーゼ用基質ｏ−ニトロフィル（ｎｉｔｒｏｐｈｙｌ）−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、これはβ−ガラクトシダーゼによって代謝されて黄色い色の化合物を生成する。酵素の量は、分光測定によって、またはＥＬＩＳＡリーダーを用いて、着色された化合物の光学濃度を測定することによって求められる。吸光度は、４２０ｎｍで読み取られる（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．Ｈ．ｅｄ．（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。その他の慣用されるレポーター遺伝子は、抗生物質耐性因子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（下の実施例に示される通り）、およびクラゲ緑色蛍光タンパク質である（Ｖａｌｄｉｖｉａ  ａｎｄ  Ｆａｌｋｏｗ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５（９）：３６０−３６３；Ｎａｙｌｏｒ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８（５）：７４９−７５７；Ｈｉｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｎｎｏｎ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：１６５−１７４）。その上、多様な代替タンパク質を、検出され定量されるそれらの能力に基づきレポーターとして使用することもできる。そのような遺伝子の発現レベルを測定するためのアッセイは十分に開発され、当業者によって一般に実践される（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２：７０４−７２０；Ｄａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９：１４３−１４８；およびＢｒｏｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９（２）：１６９−１８１）。
【００６７】
［実施例］
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、その範囲を制限しないために提供される。本発明のその他の変形形態は、当技術分野の当業者に直ちに明白であり、添付される特許請求の範囲に包含される。
【００６８】
［実施例１］材料および方法
細胞株。ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５７３）またはＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−３２１６）細胞を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で維持し、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて遺伝子導入した。哺乳動物細胞抗生物質ジェネティシンおよびハイグロマイシンは、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ製であった。ルシフェラーゼアッセイ試薬は、Ｐｒｏｍｅｇａより入手した（Ｅ１５００）。
【００６９】
プラスミド構築リガンド−ＴＭ−ＴＥＶプロテアーゼをコードするレンチウイルスベクター。リガンドを、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン（５１４〜５６１アミノ酸）のＮ末端に融合し、一方、ＴＥＶプロテアーゼを膜貫通ドメインのＣ末端に融合した。異なる数のＧＧＧＧＳ（配列番号１）リンカー配列を、リガンドと膜貫通ドメインの間に付加した。リガンド−膜貫通−ＴＥＶをＵＢＣ（ユビキチンＣ）プロモーターの制御下でレンチウイルスベクターに導入した。
【００７０】
受容体−ＴＥＶ切断部位−ＧＡＬ４−ＶＰ１６転写因子ベクターＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインを単純ヘルペスウイルスＶＰ１６  Ｃ末端活性化ドメインに融合させて、哺乳動物細胞に直交する人工転写因子を生成した。ＴｐｏＲまたはＧＬＰ１Ｒのコード領域は、その後にＴＥＶプロテアーゼ切断部位およびＧＡＬ４−ＶＰ１６転写因子が続き、その発現がＣＭＶプロモーターの制御下であるｐｃＤＮＡ５にクローン化された。ベクターは、安定した細胞株の生成のために、ゲンタマイシン選択カセットを有する。
【００７１】
上流活性化配列レポーター遺伝子ベクター（ＵＡＳ）ＵＡＳレポーター遺伝子ベクターは、９反復のＧＡＬ４  ＵＡＳおよびアデノウイルス後期プロモーターを含む。この配列は、ＧＡＬ４−ＶＰ１６転写因子の結合に応答して、ルシフェラーゼｌｕｃ２ＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子の転写を推進する。ベクターは、安定した細胞株の生成のための、ハイグロマイシン選択カセットを有する。
【００７２】
安定したレポーター細胞株の生成安定した細胞株を、リポフェクタミンを最初に用いてＨＥＫ２９３細胞にＵＡＳ−レポーター遺伝子ベクターを遺伝子導入することによって生成した。遺伝子導入された細胞を、２００ｕｇ／ｍＬハイグロマイシンで選択した。２週間後、選択された細胞を回収し、特異的受容体−ＴＥＶ切断部位−ＧＡＬ４−ＶＰ１６転写因子ベクターで遺伝子導入した。８００ｕｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１００ｕｇ／ｍＬハイグロマイシンで２週間、細胞を選択した。
【００７３】
レンチウイルスのパッケージＨＥＫ２９３Ｔ細胞でレンチウイルスベクターとｐＣＭＶＤ８．９およびｐＶＳＶｇウイルスパッケージングベクターを１：１：１の比で同時遺伝子導入することによってウイルスを作製した。ウイルスを含有する上清を遺伝子導入後４８時間に回収し、０．２２ｕｍメンブレンフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。レンチウイルス調製物の力価を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて求めた。
【００７４】
近接度に基づく反応アッセイＵＡＳ−レポーター遺伝子と受容体−切断部位−転写因子の両方を有する安定した細胞株を、９６ウェルプレートにウェル当たり２００００細胞で播種した。リガンド−ＴＭ−ＴＥＶプロテアーゼを１と等しいＭＯＩで有するレンチウイルスによって細胞を感染させた。細胞を２４〜７２時間培養した後、レポーター遺伝子活性を測定した。ルシフェラーゼ活性はルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することによって求めたが、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現は蛍光顕微鏡によって観察した。
【００７５】
［実施例２］系の構築
本発明者らは、タンパク質分解反応が非効率であるために規定濃度で反応がゆっくりしか進行しない酵素−基質系を構築した。本発明者らは、ＴＥＶプロテアーゼと高度に特異的な切断部位を使用した。プロテアーゼを、リガンド構築物のＰＤＧＦＲ膜貫通（ＴＭ）ドメインのＣ末端に付加した（図１）。切断部位は、受容体の細胞質部分と人工のペプチド転写因子との間に位置した。切断後、転写因子は放出され、レポーター遺伝子の発現を活性化する（図１）。重要なことに、潜在的リガンドおよびその受容体は、両方とも細胞膜に固定されているので、それらの間の相互作用はいずれもそれらが付加されている細胞内反応体の接近を引き起こすことができ、シグナルの生成を促進することができる。
【００７６】
この系では、有効モル濃度パラメータは２つのレベルで作動する。第１に、反応体は細胞膜に閉じ込められて共存しているので、相互作用を助ける封鎖の強力な影響がある。第２に、これらの封鎖された分子が相互作用する場合、それらは酵素と基質成分を一つに集め、それにより系のシグナル伝達成分の有効モル濃度を大きく増加させる。この系は膜での分子相互作用だけを必要とし、相互作用の結果生じる立体構造の変化などの特殊な効果にほとんど依存しないことに注意することが重要である。
【００７７】
［実施例３］構想の検証
本方法を検証するため、本発明者らは、１回膜貫通タンパク質と複数回膜貫通タンパク質の両方を調査した。１回膜貫通受容体に関して、本発明者らは、本発明者らが以前にトロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）に対して産生させたｓｃＦｖ抗体に加えて天然のトロンボポエチン（ＴＰＯ）リガンドも調査した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：７３４−７４１，２０１３）。複数回膜貫通受容体に関して、本発明者らは、ＧＬＰ−１  ＧＰＣＲ受容体によるペプチドの認識を調査した。
【００７８】
ホルモンＴＰＯまたはＴＰＯＲ結合抗体、３Ｄ９または１４Ｆ１２を、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインのＮ末端に融合させることによって細胞表面に提示させた。同様に構築した無関係の抗体を陰性対照として使用した。膜繋留３Ｄ９−ｓｃＦｖタンパク質は、ＴｐｏＲ  ｓｉｅ−ｂｌａレポーター細胞株を活性化することができ、従って陽性対照として使用された。細胞膜に提示された抗体または標準品ＴＰＯは、無関係の抗体対照と比較して転写因子媒介性シグナルを増加させた（図２）。本発明者らはまた、系の受容体成分とペプチドまたは抗体の非特異的相互作用について、対照となる直交実験も実施した。これに関して、本発明者らは、ＧＬＰ１Ｒ−転写因子融合物と、ＴＰＯ活性化抗体またはＴＰＯＲを発現する細胞においてのみ活性であるＴＰＯなどの無関係の活性化因子を有する細胞株を調査した。結果は、抗体またはＴＰＯの提示が、間違った受容体を有する細胞でシグナルを増加させないことを示した。本発明者らは、近接度に基づく反応について、リガンドとＴＭドメインとの間のリンカーの長さの効果も試験した。トロンボポエチンは、３３２ＡＡを有し、ｓｃＦｖは約２５０ＡＡを有する。３〜９のＧＧＧＧＳ（配列番号１）のタンデムリピートによって細胞膜に繋留されたＴＰＯは、同様のシグナルを生じたが、ｓｃＦｖの場合には、距離が長いほど高い活性がもたらされた（図２）。従って、長く柔軟なリンカーほど一般的に有用性が高い可能性がある。
【００７９】
本発明者らは次に、本方法が複数回膜貫通タンパク質に使用することができるかどうかを調査した。以前の調査で、本発明者らは膜に繋留されたエキセンディン−４がグルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）を活性化することができることを見出した。従って、本発明者らはＧＬＰ−１Ｒおよびエキセンディン−４をこの調査の受容体リガンド対として使用した。ＧＬＰ１Ｒは、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体のβ１ファミリーに属する。クラスＢ受容体結合ペプチドリガンドの結合モデルは、ペプチドリガンドのＣ末端部分が最初に受容体のＮ末端エクトドメインと相互作用する２段階機構を想定する。２番目の段階で、リガンドのＮ末端は、膜貫通へリックスおよび受容体の接続ループと相互作用し、それは活性化およびシグナル伝達を引き起こす。
【００８０】
本発明者らは、全長ＧＬＰ１Ｒを転写因子に融合させた。膜に繋留されたエキセンディン−４は、ＴＥＶプロテアーゼとそのＣ末端細胞内ドメインで融合した。同時に発現した受容体とエキセンディン−４の相互作用の結果、シグナル活性が著しく増加し、それは感染後１日目から始まって３日目まで続いた（図３Ａ）。本発明者らは、転写因子が付加されているＧＬＰ１ＲのＣ末端尾部の長さが信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比に影響を及ぼすかどうかも試験した。全長受容体は５９ＡＡの細胞内尾部を持つ。これまでの調査で、Ｃ末端は、ＧＬＰ−１の能力または受容体の発現に影響を及ぼさずに、Ｃ末端のＬｅｕ４２２残基の範囲まで末端を切断することができたことが実証された。この末端切断受容体の細胞内尾部は、２２アミノ酸を有する。本発明者らは、ＧＬＰ１Ｒのアミノ酸１〜４２６を、末端切断受容体に付加された放出可能な転写因子と融合させた。より短い受容体細胞内尾部での構築は、より高いＳ／Ｎ比を生じた。さらなる対照として、本発明者らは同様の長さの非特異的ペプチドリガンドを調査した。ｎＡＣｈＲ（ニコチン性アセチルコリン受容体）／ＧＡＢＡ（代謝型ＧＡＢＡ受容体）の遮断薬であるＶｃ１．１などの非特異的ペプチドは、さらに低いＳ／Ｎを生じた（図３Ｂ）。最後に、ＧＬＰ１Ｒを無関係のＧタンパク質共役型受容体、ＣＸＣＲ４に代えた場合は、応答は見られなかった（図３Ｂ）。
【００８１】
［実施例４］異なるＴＥＶ切断部位の効果
シグナルの強度を維持する一方で雑音を低下させるために、異なる効率でＴＥＶによって切断することのできる４つのＴＥＶ基質配列を試験した。ＴＥＶプロテアーゼは、一般形Ｅ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｑ−Ｇ（配列番号２）またはＥ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｑ−Ｓ（配列番号３）の線状エピトープを認識し、切断はＱとＧの間またはＱとＳの間で起こる。最も効率のよい基質は、本発明者らが上記の実験の全てで使用したＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４）（ＴＥＶ１）であった。
【００８２】
本発明者らは、より低い効率で切断される基質配列が、シグナルの強度を維持したままより低い雑音を生じると仮定した。系統的調査により、多くの異なるアミノ酸が異なる切断効率（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）で異なる位置に収容され得ることが実証された。本発明者らは、４つの異なる配列ＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４）（ＴＥＶ１）、ＥＮＦＹＦＱＳ（配列番号５）（ＴＥＶ２）、ＥＮＬＹＹＱＳ（配列番号６）（ＴＥＶ３）およびＥＮＬＦＦＱＳ（配列番号７）（ＴＥＶ４）のＳ／Ｎ比を比較した。それらのそれぞれのｋｃａｔｓ／Ｋｍは、４．５１±０．６５；０．０２４±０．００１；０．０５６±０．００５；０．３５±０．０４１ｍＭ−１・ｓ−１である。
【００８３】
本発明者らは、近接度に基づくシグナル伝達系においてこれらの配列を用いることの反応速度への影響をモニターした。比較的劣るＴＥＶ２基質が感染後３日目に最大Ｓ／Ｎ比を生じたが、より良好なＴＥＶ１およびＴＥＶ４基質は２日目から非常に高レベルの雑音をもたらした（図３Ｂ）。従って、ＴＥＶ２は、現在、近接度に促進される反応を制御するための最適な切断部位である。
【００８４】
［実施例５］蛍光タンパク質はレポーター遺伝子として使用することができる
機能性抗体またはペプチドの選択に通常使用される近接度に基づく反応には、蛍光活性化セルソーターなどの選択方法と組み合わせる上で、ＧＦＰまたはβラクタマーゼなどのレポーター遺伝子が理想的であり得る。その上、蛍光タンパク質は生細胞での動的細胞アッセイ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙｓ）に有用であり、単一の試料においてシグナル伝達活性の経時的評価を可能にする。図４に示されるように、本発明者らはｔｄＴｏｍａｔｏをレポーター遺伝子として使用し、その発現を顕微鏡で観察した。ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を使用する結果と一致して、膜に繋留されたエキセンディン−４は、高い割合のｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞を誘導したが、無関係のタンパク質（抗体）は、認識できる量の蛍光を生成できなかった。特に、弱められたＴＥＶ２およびＴＥＶ３切断部位は、非常に低いバックグラウンドを示した。
【００８５】
前述の発明は、理解が明確になるように例示および例としていくらか詳細に記載されたが、添付される特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく特定の変化および修正をそれに行ってよいことは、本発明の教示を考慮すると当業者には直ちに明白であろう。
【００８６】
本明細書中で引用される全ての刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許、および特許出願は、あたかも各々が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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