(57)【要約】  変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片は、1つ以上の変異を含み、ここで該変異体TSHRは、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する。この1つ以上の変異は、好ましくは、TSHRの細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)内、又はTSHRの残基22〜260(TSHR260)内であるか、或いは、膜貫通ドメイン(TMD)内であってよい。本発明の変異体TSHR又はその断片は、好ましくは、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる。本発明の変異体TSHR又はその断片は、所定の温度でのその半減期により決定される場合、同等の野生型TSHR又は断片よりも、より大きい熱安定性を有し、且つ活性を保持しつつ精製されることができる。本発明の変異体TSHR又はその断片は、また、活性を保持しつつ脱グリコシル化されることもできる。本発明の変異体TSHR又はその断片を利用する方法、キット及び使用も、提供される。【選択図】図9
2017520246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つ以上の変異を含む、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片であって、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する、前記変異体TSHR又はその断片。
【請求項２】
前記1つ以上の変異が、TSHRの細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)内にある、請求項1記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３】
前記1つ以上の変異が、TSHRの残基22〜260(TSHR260)内にある、請求項1又は2記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４】
前記TSHR又はその断片が、哺乳動物種に由来する、請求項1〜3のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５】
前記TSHR又はその断片が、ヒトTSHR由来であるか、又はこれから誘導される、請求項4記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６】
前記TSHR又はその断片が、サル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ又はウマのTSHR(配列番号:47-56)由来であるか、又はこれらから誘導される、請求項4記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項７】
TSHR自己抗体に結合する、請求項1〜6のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項８】
前記TSHR自己抗体が、M22、K1-70又はK1-18である、請求項7記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項９】
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも1.5倍以上大きい、請求項1〜8のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１０】
前記変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも2倍以上大きい、請求項9記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１１】
前記変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも3倍以上大きい、請求項9又は10記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１２】
前記変異体が、単一点変異を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１３】
前記変異体が、二重点変異を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１４】
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも3.5倍以上大きい、請求項13記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１５】
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも5倍以上大きい、請求項13又は14記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１６】
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも7倍以上大きい、請求項13、14又は15記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１７】
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも3倍以上大きい、請求項13〜16のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１８】
前記変異体が、三重点変異を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１９】
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも9倍以上大きい、請求項18記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２０】
前記変異体が、四重点変異を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２１】
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも20倍以上大きい、請求項20記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２２】
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも12倍以上大きい、請求項20記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２３】
前記変異体が、五重点変異を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２４】
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも40倍以上大きい、請求項23記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２５】
前記変異体が、六重点変異を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２６】
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも800倍以上大きいか、又は四重点変異I253R＋D143P＋R112P＋D151E(配列番号:27、18、16、19(DNA)及び配列番号:45、36、34、37(タンパク質))を含むTSHR260変異体の半減期よりも1.2倍以上大きい、請求項25記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２７】
前記変異体の60℃でのその半減期により決定される熱安定性が、四重点変異I253R＋D143P＋R112P＋D151E(配列番号:27、18、16、19(DNA)及び配列番号:45、36、34、37(タンパク質))を含むTSHR260変異体の半減期よりも3倍以上大きい、請求項25記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項２８】
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型完全長TSHRの半減期よりも3倍以上大きい、完全長TSHR変異体である、請求項1〜11のいずれか一項記載の変異体TSHR。
【請求項２９】
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも5倍以上大きい、請求項28記載の変異体TSHR。
【請求項３０】
前記変異体が、TSHRの残基22〜260(TSHR260)内に、3つ以上の点変異を含む、請求項28又は29記載の変異体TSHR。
【請求項３１】
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、請求項1〜27のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３２】
前記変異体が、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(配列番号:11-25、27及び28(DNA)、配列番号:29-43、45及び46(タンパク質))のいずれかからの単一点変異を含む、請求項1〜12又は28〜29又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３３】
前記変異体が、2つの点変異を含み、その一方がI253Rであり、その二番目が、請求項32記載の様々な変異である、請求項1〜11又は13〜17又は28〜29又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３４】
前記変異体が、3つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、その二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、並びにその三番目がP28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D151E、S166T、P168Y、V169R及びN170W(配列番号:11-17、19-25及び28(DNA)、配列番号:29-35、37-43及び46(タンパク質))のひとつである、請求項1〜11又は18〜19又は28〜31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３５】
前記変異体が、4つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、その二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、並びにその三番目がR112P(配列番号:16及び34)であり、並びにその四番目が、L59F、H63C、D151E、S166T、V169R及びN170W(配列番号:12、14、19、20、23及び24(DNA)、配列番号:30、32、37、38、41及び42(タンパク質))のひとつである、請求項1〜11又は20〜22又は28〜31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３６】
前記変異体が、5つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、その二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、その三番目がR112P(配列番号:16及び34)であり、その四番目がD151E(配列番号:19及び37)又はH63C(配列番号:14及び32)であり、並びにその五番目が、L59F、H63C、D151E、S166T及びV169R(配列番号:12、14、19、20、23(DNA)、配列番号:30、32、37、38、41(タンパク質))のひとつである、請求項1〜11又は23〜24又は28〜31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３７】
前記変異体が、6つの変異を含み、そのひとつがI253Rであり、その二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、その三番目がR112P(配列番号:16及び34)であり、その四番目がD151E(配列番号:19及び37)であり、その五番目がH63C(配列番号:14及び32)であり、並びにその六番目がS166T(配列番号:20及び38)又はV169R(配列番号:23及び41)のいずれかである、請求項1〜11又は25〜31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３８】
前記変異体が、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(配列番号:11-25、27及び28(DNA)、配列番号:29-43、45及び46(タンパク質))のいずれかから選択された1、2、3、4、5又は6の単一点変異を含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項３９】
前記変異体が、TSHR260からなり、且つ同等の野生型が、野生型TSHR260からなる、請求項31〜37のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４０】
前記変異体が、下記の変異のセットの一つ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)：を含む、請求項1〜8又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４１】
前記変異体へのモノクローナルTSHR抗体又はTSHの結合が、同じモノクローナルTSHR抗体の同等の野生型TSHR又は断片への結合と比べた場合に、影響されないか、又は実質的に影響されない、請求項1〜40のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４２】
前記変異体が、検出可能な標識を含む、請求項1〜41のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４３】
前記標識が、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から選択される、請求項42記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４４】
前記標識が、アルカリホスファターゼ(AP)標識又はビオチン標識を含む、請求項42又は43記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４５】
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、請求項41、42、43又は44記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４６】
前記変異体が、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む、請求項45記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４７】
前記変異体が、請求項32〜40のいずれか一項以上に記載の1つ以上の変異を含む、請求項46記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４８】
前記変異体が、2つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも5倍以上大きい、請求項45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項４９】
前記変異体が、4つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の60℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも50倍以上大きい、請求項45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５０】
前記変異体が、6つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の65℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも100倍以上大きいか又は150倍以上大きい、請求項45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５１】
前記熱安定性が、図12bに示された安定性アッセイにより測定される、請求項1〜50のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５２】
膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ以上の変異を含む変異体TSHR又はその断片であって、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する、前記変異体TSHR又はその断片。
【請求項５３】
前記変異体TSHR又はその断片が、完全長TSHRであるか、又は完全長TSHRに比べて、該変異体中に存在するアミノ酸の数により測定される時、完全長TSHRの長さの少なくとも70％以上、少なくとも80％以上、若しくは少なくとも90％以上を含む、請求項52記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５４】
前記変異体が、膜貫通ドメイン内ではない1つ以上の追加的変異を更に含み、この1つ以上の追加的変異が、請求項2〜51のいずれか一項以上に記載されている、請求項52又は53記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５５】
前記追加的変異が、膜貫通ドメイン内ではない、少なくとも2つ以上の追加的変異を含み、この2つ以上の追加的変異が、請求項2〜51のいずれか一項以上に記載されている、請求項54記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５６】
前記追加的変異が、六重点変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (TSHR-JMG55)(配列番号:14、16、18、19、23及び27(DNA)、配列番号:32、34、36、37、41及び45(タンパク質))を含む、請求項55記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５７】
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の1つ以上の変異が、膜貫通ドメイン内ではない該追加的変異のみを含む、同等の変異体TSHR又はその断片に対して、増大した熱安定性を提供する、請求項54、55又は56記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５８】
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、膜貫通ドメイン内ではない該追加的変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも1.2倍以上大きいか、又は1.3倍以上大きい、請求項54〜57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項５９】
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、六重変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (TSHR-JMG55)(配列番号:14、16、18、19、23及び27(DNA)、配列番号:32、34、36、37、41及び45(タンパク質))を含むTSHR変異体の半減期よりも、1.2倍以上大きいか、又は1.3倍以上大きい、請求項54〜57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６０】
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、2倍以上大きい、請求項58又は59記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６１】
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、3倍以上大きいか、又は5倍以上大きい、請求項58又は59記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６２】
前記熱安定性が、図14dに示された安定性アッセイCにより測定される、請求項58〜61のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６３】
前記熱安定性が、図14b及び図14cにおいてそれぞれ示された、安定性アッセイA又は安定性アッセイBのいずれかにより測定される、請求項58〜61のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６４】
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定性アッセイCにより測定された33℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択された単一点変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.1倍以上大きい、請求項54〜57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６５】
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞれ示された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された55℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択された単一点変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.5倍以上大きい、請求項54〜57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６６】
前記TMD内の2つの点変異の少なくとも一方が、T477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択される、請求項64又は65記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６７】
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に3つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定性アッセイCにより測定された40℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内に、その第一の変異がV595I(配列番号:80及び100)であり、且つその第二の変異がY678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番号:79及び99)から選択される二重点変異を含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.2倍以上大きいか、又は2倍以上大きいか、又は3倍以上大きい、請求項54〜57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６８】
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に3つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞれ示された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された55℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内に、その第一の変異がV595I(配列番号:80及び100)であり、且つその第二の変異がY678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番号:79及び99)から選択される二重点変異を含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.2倍以上大きい、請求項54〜57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項６９】
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A (配列番号:69-88(DNA)、配列番号:89-108(タンパク質))のいずれかから選択される単一点変異を含む、請求項52〜57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項７０】
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、2つの点変異を含み、その一つがT477I(配列番号:77及び97)又はV595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)であり、並びにその二番目が、請求項69記載の様々な変異である、請求項52〜57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項７１】
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、3つの点変異を含み、その一つがV595L(配列番号:80及び100)であり、並びにその二番目が、Y678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番号:79及び99))であり、並びにその三番目が、請求項69記載の様々な変異である、請求項52〜57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項７２】
1つ以上の変異を含む変異体TSHR又はその断片の精製方法であって、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有し、該方法が：
i) 変異体又はその断片を含む組成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製する工程；
ii) 精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む、前記方法。
【請求項７３】
前記組成物が、培養物上清を含む、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
前記変異体TSHR又はその断片が、請求項2〜71のいずれか一項記載のものである、請求項72又は73記載の方法。
【請求項７５】
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)：を含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
前記カラムクロマトグラフィーが、陽イオン交換又は陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項72〜75のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
前記工程i)の前又は後のいずれかに、該変異体又はその断片を含む組成物を、アフィニティクロマトグラフィーにより精製する工程を更に含む、請求項72〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
前記アフィニティクロマトグラフィーが、抗体アフィニティクロマトグラフィー及び／又は金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを含む、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
前記方法が：
i) 該変異体又はその断片を含む組成物を、陽イオン交換又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する工程；
ii) 該変異体又はその断片を、抗体アフィニティクロマトグラフィーにより更に精製する工程；
iii) 任意に、該変異体又はその断片を、金属イオンアフィニティクロマトグラフィーにより更に精製する工程；
iv) 精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む、請求項72〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
前記工程(ii)の抗体が、TSHR細胞外ドメイン内の立体配座エピトープに結合するモノクローナル抗体である、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
前記工程(iii)が、ニッケル-アフィニティクロマトグラフィーを含む、請求項79又は80記載の方法。
【請求項８２】
前記アフィニティクロマトグラフィーが、抗体アフィニティクロマトグラフィーであり、且つ任意にpH5.0±0.2の溶出緩衝液による溶出が先行する、pH4.5±0.2の溶出緩衝液による溶出を含む、請求項77〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つH63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)の変異のセットを含む、請求項72〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
請求項72〜83のいずれか一項記載の方法により得られた、請求項2〜71のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項８５】
請求項72〜83のいずれか一項記載の方法により入手可能な、請求項2〜71のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項８６】
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)：を含む、請求項84又は85記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項８７】
前記変異体が、請求項42〜46のいずれか一項記載の検出可能な標識を含む、請求項84、85又は86記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項８８】
前記精製された変異体のTSHR活性アッセイにおける活性が、同じTSHR活性アッセイにおいて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性よりもより大きいことを特徴とする、請求項1〜71のいずれか一項又は請求項84〜87のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項８９】
前記精製された変異体のTSHR活性アッセイにおける活性が、同じTSHR活性アッセイにおいて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性と比べ、500倍以上大きいことを特徴とする、請求項1〜71のいずれか一項又は請求項84〜87のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９０】
前記活性が、1000倍以上大きい、請求項89記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９１】
前記活性が、5000倍以上大きい、請求項89又は90記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９２】
前記活性が、タンパク質1mgあたりの活性として表現された比活性である、請求項88〜91のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９３】
前記TSHR活性アッセイが、該変異体のTSHR自己抗体へ結合する能力を測定する、請求項88〜92のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９４】
前記TSHR自己抗体が、M22、K1-70又はK1-18である、請求項93記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９５】
前記TSHR活性アッセイが、ELISAプレートに直接又は間接に結合された試験されるべき変異体を含む、請求項88〜94のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９６】
前記TSHR活性アッセイが、図12a又は図13cに示されたアッセイを含む、請求項88〜95のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９７】
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ請求項86に示された変異のセットの一つを含む、請求項88〜96のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９８】
前記変異体が、H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)の変異のセットを含む、請求項88〜97のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
【請求項９９】
前記変異体又はその断片が、脱グリコシル化されている、請求項1〜71又は請求項84〜98のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１００】
前記変異体が、少なくともひとつの二重点変異を含む、請求項99記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１０１】
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)：を含む、請求項99又は100記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１０２】
TSHRに対する被検自己抗体を検出するための診断方法であって、該方法が、被検自己抗体の試料を、請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片と接触させることを含む、前記診断方法。
【請求項１０３】
前記被検自己抗体の試料が、かかる被検自己抗体を含むと考えられる対象から単離された、請求項102記載の診断方法。
【請求項１０４】
前記試料が、ヒト又は動物の患者の血清を含む、請求項102又は103記載の診断方法。
【請求項１０５】
前記方法が：
a) 対象由来の体液試料を提供する工程；
b) TSHR又はその断片の第一の給源の1種以上を提供する工程；
c) TSHRの第二の給源の1種以上を提供する工程であって、ここで第二の給源は、請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である工程；
d) 該TSHRの第一及び第二の給源を、同時に又は連続して該体液試料と接触させ、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する工程；
e) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、固定手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源が、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続き固形支持体に固定される工程；
f) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、直接又は間接に検出可能な標識手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源に、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続きかかる直接又は間接標識手段を提供する工程；並びに
g) 該体液試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(e)に従い工程(d)において形成された複合体の存在を検出する工程：を含む、請求項102、103又は104記載の診断方法。
【請求項１０６】
前記工程(b)において提供されたTSHRの該第一の給源が、TSH受容体の1以上のエピトープ、又はTSH受容体の1以上のエピトープを含むポリペプチドを含む、完全長TSHRである、請求項105記載の診断方法。
【請求項１０７】
前記工程(b)において提供されたTSHRの該第一の給源が、請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である、請求項105記載の診断方法。
【請求項１０８】
前記TSHRの第一の給源又はTSHRの第二の給源のいずれか、又は両方の変異体TSHR又はその断片が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、請求項102〜106のいずれか一項記載の診断方法。
【請求項１０９】
前記標識手段が、請求項42〜46のいずれか一項記載の検出可能な標識を含む、請求項105〜108のいずれか一項記載の診断方法。
【請求項１１０】
前記変異体が、標識手段により、直接標識される、請求項109記載の診断方法。
【請求項１１１】
前記標識手段が、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む、請求項109又は110記載の診断方法。
【請求項１１２】
前記TSHRの第一の給源が固形支持体へ固定される固定手段が、モノクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体又はそれらの断片を含む、請求項105〜111のいずれか一項記載の診断方法。
【請求項１１３】
前記TSHRに対する被検自己抗体を検出するためのキットであって、該キットが：
a) TSHR又はその断片の1種以上の第一の給源；
b) TSHRの1種以上の第二の給源であって、ここで該第二の給源が、請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片であるもの；
c) 該TSHRの第一及び第二の給源を、TSHRに対する被検自己抗体を含むと考えられる試料と、同時に又は連続して接触させる手段であって、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する手段；
d) (c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源を、(c)の前に、又は同時に、又は引き続き、固形支持体へ固定するための固定手段；
e) 該複合体の形成の前に、又は同時に、又は引き続き標識された(c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源を、直接又は間接に標識するための検出可能な標識手段；並びに
f) 該試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、(c)において形成された複合体の存在を検出する手段：を含む、前記キット。
【請求項１１４】
請求項106〜112のいずれか一項以上に記載の特徴のいずれかひとつ以上を含む、請求項113記載のキット。
【請求項１１５】
前記(a)において提供された該TSHRの第一の給源が、請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である、請求項113又は請求項114記載のキット。
【請求項１１６】
請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片がそれに直接又は間接に結合された固形支持体。
【請求項１１７】
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、請求項116記載の固形支持体。
【請求項１１８】
前記変異体が、下記の変異のセットの一つ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)：を含む、請求項116又は117記載の固形支持体。
【請求項１１９】
前記変異体が、該支持体に直接結合される、請求項116〜118のいずれか一項記載の固形支持体。
【請求項１２０】
前記支持体が、1個以上のウェルを含むELISAプレートである、請求項116〜119のいずれか一項記載の固形支持体。
【請求項１２１】
請求項116〜120のいずれか一項記載の固形支持体を含む、キット。
【請求項１２２】
前記TSHRに対するモノクローナル自己抗体若しくはそれらの断片、TSHRに対する組換え抗体又は患者のTRAbを検出するための、請求項116〜120のいずれか一項記載の固形支持体、又は、請求項121記載のキットの使用。
【請求項１２３】
医薬品中での使用のための、請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１２４】
前記TSHRモノクローナル自己抗体又は患者TRAbの検出において使用するための、請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１２５】
循環している患者TRAbを吸収させるために治療的有効量で使用するための、請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
【請求項１２６】
小型分子薬物の新規スカフォールドを同定するための小型-分子断片スクリーニングのための、請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片の使用。
【請求項１２７】
請求項1〜71又は84〜101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片へ結合されている固相カラムを通して対象の血液の試料を通過させ、且つ該変異体TSHR又はその断片上に該血液中の循環TRAbを吸収させることを含む、対象におけるTSH受容体に対する免疫応答に関連した自己免疫疾患を治療するインビトロ方法。
【請求項１２８】
下記の点変異の1以上：T56V、L58Y、N106P、P136I、D137P、Q145E、I160F、N163W、S172C、R247Y、E357K、D358K、Q391N、L400Y、N403A、I411V、Y414F,L415P、T425I、Q437H、K513L、V543I、C548R、Y549F、S596L、K608D、H615V、S619A、Y626L及びY626A：を含む、変異体卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)又はその断片。
【請求項１２９】
下記の点変異の1以上：P33E、L56F、V61Y、K109P、P139I、D140P、I164F、P165Y、N167W、S176C、I249R、E354K、D355K、R388N、L397Y、N400A、M408V、Y411F、L412P、T422I、Q434H、K510L、V540I、C545R、Y546F、A593L、K605D、Y612V、S616A、Y623L又はY623A：を含む、変異体黄体化ホルモン受容体(LHR)又はその断片。
【請求項１３０】
それぞれ、ヒトFSHR又はLHRである、請求項128記載の変異体卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)又はその断片、若しくは、請求項129記載の変異体黄体化ホルモン受容体(LHR)又はその断片。
【請求項１３１】
a. 図6(配列番号:29-46)又は図30(配列番号:89-108)に示された変異体TSHR又はその断片のアミノ酸配列をコードしている、図5(配列番号:11-28)又は図29(配列番号:69-88)に示された、ヌクレオチド配列；
b. コードの縮重のために、コドン配列において(a)の任意の配列とは異なるヌクレオチド配列；
c. (a)の任意の配列の対立遺伝子変動を含むヌクレオチド配列；
d. (a-c)の任意の配列の断片を含むヌクレオチド配列；
e. ヌクレオチド塩基の変異、欠失又は置換のために、(a)の配列と異なり、且つ変異体TSHR又はその断片のアミノ酸配列をコードしている、ヌクレオチド配列：を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３２】
請求項131記載のポリヌクレオチドを保有し、且つ宿主生物のゲノムへこのポリヌクレオチドを導入することが可能である、生物学的機能性ベクターシステム。
【請求項１３３】
請求項131記載のポリヌクレオチドで形質転換される宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、糖タンパク質ホルモン受容体に関し、排他的ではないが特に甲状腺刺激ホルモン(TSH)受容体(TSHR)に関する。本発明は、かかる受容体の、特にTSHRの調製品の熱安定性を向上する、変異、特に単一点変異に関する。更に、本発明は、かかる調製品の安定性をなお更に向上するために、一緒に組み合わせられた単一点変異に関する。本発明はまた、自己免疫、特にTSHR自己免疫に関連した疾患を診断、経過観察及び予測するために、TSHR自己抗体(TRAb)などの自己抗体の存在を検出するための、TSHR調製品を含む、熱安定性の糖タンパク質ホルモン受容体の調製品を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
（TSH受容体）
TSHRは、G-タンパク質共役受容体(GPCR)ファミリーの一員であり、且つ以下の3つのドメインからなる：細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)、ヒンジ領域、及び細胞内C-末端を伴う膜貫通ドメイン(TMD)(Nunez Miguel Rらの文献、(2004) Thyroid, 14: 991-1011)。TSHR260は、残基22-260からなり、且つLRDのほとんどを包含している、TSHRのサブドメインである(Sanders Jらの文献、(2007) Thyroid 17:395-410)。TSHR260は、完全長TSHRと同様にTRAbへの結合を示す(Rees Smith Bらの文献、(2009) Hormone and Metabolic Research, 41: 448-455、及びWO 2010/073012)。
【０００３】
甲状腺において、TSHRは、甲状腺濾胞上皮細胞の基底膜上に存在する。TSHのTSHRへの結合は、G-タンパク質のTSHRへの結合に関与しているTSHRシグナル伝達カスケードの活性化を開始し、その後サイクリックAMP経路の刺激、並びに甲状腺ホルモン(サイロキシン；T4及びトリヨードサイロニン；T3)の合成が続く(Sanders Jらの文献、(1997) 「バリエレの臨床内分泌代謝(Balliere's Clinical Endocrinology and Metabolism)」、TF Davies編集、11: 451-479；Balliere Tindall刊, London、及びLatif Rらの文献、(2009) Endocrinology and Metabolism Clinics of North America, 38: 319-341)。
【０００４】
（自己免疫甲状腺疾患）
自己免疫甲状腺疾患は、有病率が100,000名あたり600〜1000名の最も一般的な自己免疫状態の一つである(Jacobson DLらの文献、(1997) Clinical Immunology and Immunopathology, 84: 223-243、及びCooper GSらの文献、(2009) Journal of Autoimmunity, 33: 197-207)。自己免疫システムにより標的化される主要な甲状腺自己抗原は、甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)、サイログロブリン(Tg)及びTSHRである。TPO自己抗体(TPOAb)及びサイログロブリン自己抗体(TgAb)は、橋本甲状腺炎、グレーヴス病及び分娩後甲状腺炎(PPT)を含む、様々な形のAITDの甲状腺自己免疫の血清学的マーカーである(Rees Smith Bらの文献、(2007) Thyroid, 17: 923-938)。TRAbは、TSHR自己免疫の、特にグレーヴス病のマーカーである。更にTRAbは、グレーヴス病の病理に関わっている。TRAbの2つの主要な型が存在する：刺激型及び遮断型(Rees Smith Bらの文献、(2007) 前掲、及びRees Smith Bらの文献、(2009) 前掲)。
【０００５】
甲状腺刺激性自己抗体は、TSHRに結合し、TSHの作用を模倣し、これにより甲状腺を刺激し、高レベルのT4及びT3を産生し；これらの自己抗体はまた、刺激活性又はTSH作動活性を伴うTRAbとしても説明されている(Rees Smith Bらの文献、(2007) 前掲)。甲状腺機能のフィードバック制御メカニズムは、甲状腺刺激性自己抗体の存在下で、最早有効ではなく、且つ患者は、血清中の過剰な甲状腺ホルモン及びそれらの代謝の帰結により特徴付けられる、活動が亢進した甲状腺の臨床症状を呈する。この状態は、グレーヴス病として知られている。刺激活性を伴うTRAbはまた、眼窩後組織中のTSHRとも相互作用することができ、且つグレーヴス病の眼徴候の発達に寄与する(Seethalakshimi, I及びBahn Rの文献、(2012) Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 26:281-289、並びにRees Smith B、Sanders J及びFurmaniak Jの文献、(2008) Biomarkers Med, 2: 567-576)。強力な甲状腺刺激因子として作用するヒトモノクローナル自己抗体(hMAb TSHR1；M22とも称される)は、EP 1565493B1において詳述されている。WO 2008/025991A1において説明されたように、TSHR260に結合したM22 Fabの複合体の構造は、分解能2.55ÅでのX-線結晶解析により解明されている。TSHR260-M22複合体の構造の解析は、互いの相互作用に関与した受容体と刺激性自己抗体残基に関する詳細な情報を提供する。
【０００６】
強力な甲状腺刺激活性を伴う更なるヒトモノクローナル自己抗体(K1-18)は、WO 2010/073012に説明されている。
【０００７】
遮断型TRAbは、刺激性自己抗体よりも、AITD患者においてより少ない頻度で出現する。遮断型自己抗体は、TSHRへ結合し、TSHが受容体へ結合することを防止するが、TSHR活性を刺激する能力は有さない。結果的に、甲状腺ホルモン(T4及びT3)の形成及び分泌は、大きく低下され、且つこの型のTRAbを伴う患者は、活動の低下した甲状腺の臨床症状(甲状腺機能低下症)を呈する。遮断型自己抗体は、遮断活性又はTSH拮抗活性を伴うTRAbとして知られている(Rees Smith Bらの文献、(1988) Endocrine Reviews, 9: 106-121、及びRees Smith Bらの文献、(2007) 前掲)。TSH拮抗活性を伴うTSHRに対するヒト自己抗体(5C9)は、WO 2008/099185A1において詳細に説明されており、且つ強力なTSHR遮断活性を伴う更なるヒトモノクローナル自己抗体(K1-70)は、WO 2010/073012において説明されている。TSHR260との複合体中のK1-70 Fabの構造は、Sanders Pらの文献((2011) Journal of Molecular Endocrinology, 46: 81-99)に説明されたように、X-線結晶解析により解明されている。TSHR260-K1-70構造は、分子レベルでTSHRとTSHR遮断性自己抗体の間の結合配置を示している。TSHR260-M22とTSHR260-K1-70の構造の比較は、TSHRとの刺激性及び遮断性自己抗体の相互作用における類似性及び差異に関する独自の洞察を提供する(Nunez Miguel Rらの文献、(2012) Journal of Molecular Endocrinology, 49: 137-151)。M22と強力な相互作用を形成するがK1-70とは形成しない重要なアミノ酸残基として出現するTSHR-R255は、様々なヒト及び動物TSHR抗体の刺激活性並びに患者血清中の刺激性抗体に関して報告されたR255の重要性と一致する(Sanders Jらの文献、(2006) Thyroid, 16: 1195-1206、及びWO 2006/016121)。
【０００８】
（TSHR抗体の検出方法）
刺激活性又は遮断活性を持つ患者TRAbは、互いに及びTSH結合部位と重なるTSHR LRD上の領域に結合することは、当該技術分野において良く実証されている。しかし、様々な血清中に存在する自己抗体と接触するTSHR残基には、微妙な差異が存在する(Rees Smith Bらの文献、(2007) 前掲)。ヒトモノクローナル自己抗体M22及びK1-70は、AITD患者におけるTRAbの代表であることも、実証されている(Sanders Jらの文献、(2007) 前掲、Rees Smith Bらの文献、(2009) 前掲、Evans Mらの文献、(2010) Clinical Endocrinology, 73: 404-412、Nunez Miguelらの文献、(2012) 前掲)。TSH及びTRAbとのTSHR相互作用の原理は、患者TSHR自己抗体を検出するために、様々なアッセイにおいて利用されている。
【０００９】
TRAbの測定は、グレーヴス病及び他の甲状腺障害の診断及び管理において重要である。現在4種類のアッセイが、TRAbの測定に使用されている：
a) TSH受容体の調製品へのTSH又はヒトモノクローナルTRAbの結合を阻害する患者血清TRAbの能力を測定する、競合結合アッセイ；
b) 培養物中のTSH受容体を発現している細胞を刺激するTRAbの能力を測定する、バイオアッセイ；
c) TRAbと標識されたTSH受容体調製品との免疫沈降；並びに
d) 二価TRAbが、1本のアームでELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに結合し、且つ他方のアームで液相TSHR260-アルカリホスファターゼ融合タンパク質(TSHR260-AP)へ結合し、架橋を形成する、架橋型アッセイ。
【００１０】
かかるアッセイを使用するTSH受容体自己抗体の測定は、下記の参考文献に説明されている：
Sanders Jらの文献、(1997) 前掲、
Sanders Jらの文献、(1999) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84: 3797-3802、
Rees Smith Bらの文献、(2004) Thyroid, 14: 830-835、
Rees Smith Bらの文献、 (2009) 前掲。
【００１１】
（TSHR安定性を向上する戦略）
本発明者らは、TSHR及びTSHR260などのタンパク質は、安定性が悪く、且つ精製時に変性されることを理解している。従って、より熱安定したタンパク質、例えば、より熱安定したTSHR260及び完全長TSHRは、以下を含む多くの適用を有するであろう：
a) 高度に精製されたTSHR260及び完全長TSHRの使用可能な(enabling)生成、
b) TRAbを検出するために改善されたアッセイの設計、
c) 抗体の安定化を伴わずに、高度に精製されたTSHR260の使用可能な結晶化、
d) 新規へ薬物スカフォールドを同定するための、リガンド-フリーTSHR260の結晶を、断片ライブラリーへ入れ(soak into)、引き続きX-線結晶解析することによる、薬物の設計、
e) TSHR260の外側の完全長TSHRの領域の増大した熱安定性を得るための戦略の設計。
【００１２】
天然のタンパク質は、それらの本来の環境において機能するのに十分に安定しているが、産業用途に必要な条件の範囲下では最適には熱安定性でないことが多い。タンパク質操作法、特に変異誘発は、可溶性タンパク質及び膜タンパク質の両方の熱安定性を向上するために、使用されている。変異誘発によりタンパク質の熱安定性を向上する先行する戦略には、以下の2種のアプローチの一方が関与している：タンパク質に対する熱安定化作用に関して、(i)少数の理論的に設計された変異を試験すること、又は(ii)無作為に又は体系的にのいずれかで生成された多数の変異を試験すること(Dodevski I及びPluckthun Aの文献、(2011) Journal of Molecular Biology, 408: 519-655；Serrano-Vega MJらの文献、(2008) Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 105: 877-882)。
【００１３】
本発明は、最も熱安定性を向上する可能性のある変異を確定する本発明者らの研究(表1)に従い、特にTSHRへ、及び特別にはTSHR260へ導入された変異を説明している：
・β-シートにおいて、アミノ酸残基の位置及び環境は、二次構造の決定に重要な極性及び非極性残基の周期性を伴うβ-シートの形成及び安定性において、重要な役割を果たす(Xiong Hらの文献、(1995) Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 92: 6349-6353)。β-鎖の好ましい残基周期性は、「0＋0−0＋0」であり、ここで「0」は、Ile又はThrなどの非極性残基であり、「+」は陽性残基、好ましくはArgであり、並びに「-」は陰性残基、好ましくはAspである。
・ロイシンリッチドメイン(LRD)は、ロイシンリッチ反復(LRR)モチーフの一般的なコンセンサス配列LxxLxLxxNxLxxLpxxoFxxLxxを有し、ここで「L」はLeu、Ile、Val又はPheであり、「N」はAsn、Thr、Ser又はCysであり、「o」は非極性であり、並びに「x」は非保存残基である(Matsushima Nらの文献、(2010) BMC Microbiology, 10: 235-245)。残基は、このモチーフに合わせるために、変異することができる。
・タンパク質を安定化又は脱安定化する傾向があるアミノ酸を、コンピュータによるか、中等温度好性生物及び好熱性生物における相同タンパク質の配列の比較若しくはそれらのプロテオームのアミノ酸組成の比較によるか、又は実験的に、変異体の熱力学特性の測定によるかのいずれかにより確定する。異なる残基は、それらがタンパク質の表面又はコア上のいずれにあるかによって(Yokota Kらの文献、(2006) Science and Technology of Advanced Materials, 7: 255-262)、又は二次構造要素におけるそれらの位置によって(Xiong H, らの文献、(1995) 前掲；Vogt Gらの文献、(1997) Journal of Molecular Biology, 269: 631-643；Minor DL及びKim PSの文献、(1994) Nature 367: 660-663、並びにMinor DL及びKim PSの文献、(1994) Nature, 371: 264)、異なる安定化作用を有する。安定化残基は、表面上のGlu、Lys、Arg及びTyr残基、並びにコア内のAlaを含み；他方で、Gln、Met、Cys及びSer及びAsnは、脱安定化する傾向がある(Cambillau C及びClaverie J-Mの文献、(2000) Journal of Biological Chemistry, 275: 32383-32386；Kim CA及びBerg JMの文献、(1993) Nature, 362:267-270；Kumar Sらの文献、(2000) Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 17 Suppl 1: 79-85；Minor D及びKim PSの文献、1994a+b 前掲；Montanucci Lらの文献、(2008) Bioinformatics, 24: i190-i195；Pack SP及びYoo YJの文献、(2004) Journal of Biotechnology, 111: 269-277；Smith CKらの文献、(1994) Biochemistry 33: 5510-5517；Szilagy A及びZavodsky Pの文献(2000) Structure, 8: 493-504；Vogt Gらの文献、(1997) 前掲；Yokota Kらの文献、(2006) 前掲)。
・好熱性生物は、中等温度好性生物よりも、より多い帯電された残基、及びより少ない極性非帯電残基を有する傾向がある(Cambillau C及びClaverie J-Mの文献、(2000) 前掲)。イオン対の数及び配置は、タンパク質の熱安定性の向上において大きな役割を果たす(Vetriani CDLらの文献、(1998) Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 95: 12300-12305；Kumar Sらの文献、(2000) 前掲；Montanucciらの文献、(2008) 前掲；Szilagy A及びZavodsky Pの文献、(2000) 前掲)。これは恐らく、好熱性タンパク質における高頻度のGlu及びLysを説明している。
・異なる生物のタンパク質相同体のコンセンサス配列への残基の変異は、可能性のある熱安定化変異を確定するために、使用することができる。これを使用し、5℃〜36℃の見かけの融解温度(Tm)の上昇を伴う、免疫グロブリンドメイン、GroELミニシャペロン、p53及びフィターゼを含む、広範なタンパク質のより熱安定性変異体を作出することができる(Lehmann M及びWyss Mの文献、(2001) Current Opinion in Biotechnology, 12: 371-375において検証)。
・好適な骨格ねじれ角を持つ残基は、タンパク質の剛性、従って安定性を向上するためにProへ、又は左巻きらせん形構造の残基の拘束されたねじれ角を減少するためにGlyへのいずれかに変異することができる(Vielle C及びZiekus GJの文献、(2001) Microbiology and Molecular Biology Reviews, 65:1-43)。
・コンピュータモデリングを、タンパク質の熱安定性に対する変異の作用を予測するために使用することができるが、得られた結果は定まらない。
【００１４】
特に本発明に記載されたTSHR260などの、TSHR及びその断片の熱安定性を向上するための新規戦略は、熱安定性アッセイと組合せた、残基毎に理論的アプローチ(先に列挙した)の組合せにより決定された別のアミノ酸に変異された、ポリペプチドTSHR260(アミノ酸残基M22-L260)の理論的-系統的変異誘発(rational-scanning mutagenesis)を使用した。記載された新規戦略は、4つの工程に関与している：(i) 変異体を得るための、PCRによる部位特異的変異誘発、(ii) CHO-K1細胞の一過性トランスフェクションによる、TSHR260変異体の発現、(iii) タンパク質の発現及び熱安定性の評価、(iv) 工程(iii)において確定された最も安定した変異体の熱安定性曲線の分析。
【００１５】
最も熱安定している単一変異を組合せ、更にもっとTSHR260の熱安定性を増大する、TSHR260の二重、三重、四重、五重及び六重変異体を作製した。
【００１６】
TSHR260の熱安定性を増大する単一変異及び組合せ変異は、更に完全長TSHRの熱安定性を増大することもわかった。
【００１７】
同様に、熱安定化する変異は、TSHRの膜貫通ドメイン(TMD)において確定された。最も安定した六重TSHR260変異体由来の6つの変異は、熱安定化するTMD変異と組合せて、完全長TSHRとして発現された。これらの完全長TSHR変異体の熱安定性は、熱安定性曲線の分析を使用し試験し、且つTMDの最も熱安定化する変異を組合せ、完全長TSHRの熱安定性を更に増大した。
【００１８】
向上した熱安定性を伴う完全長TSHR変異体及びその断片は、患者血清中のTSHR自己抗体を検出するアッセイにおいて使用することができ、且つ活性型で精製することができる。
【００１９】
（関連した先行する特許出願）
EP 1565493B1に記載された発明は、強力な刺激活性及びTSHRとのその相互作用を伴うヒトモノクローナル自己抗体(M22又はhMAb TSHR1)の特性に関する詳細を提供する。M22 FabとTSHR LRDの間の相互作用は、WO 2008/025991A1に記載されたように、これら2つの分子間の複合体のX線回折分析(分解能2.55Å)から分子レベルで解析される。
【００２０】
WO 2006/016121A1は、スクリーニングされる患者からの体液試料中の患者血清刺激型TSHR自己抗体、患者血清遮断型TSHR自己抗体及びTSHの、差別的スクリーニング及び確定において使用することができる、少なくとも1つの点変異を含む、変異されたTSHR調製品を開示している。
【００２１】
TSHR遮断活性を伴うマウスMAb(9D33)の作製及び特徴決定は、WO 2004/050708A2に記載されている。9D33は、TSHRへ、高い親和性(2×1010L/mol)で結合し、且つ刺激活性又は遮断活性を伴う、TSH、hMAb TSHR1(M22)及び患者血清TRAbの効果的拮抗物質である。
【００２２】
WO 2008/099185A1は、患者血清中のTSH及び刺激性TRAbの効果的拮抗物質である、TSHRに対するヒトMAb(5C9)の単離及び特徴決定を開示している。5C9は、TSHR構成的活性を阻害することが予想外にわかり、これは甲状腺刺激ホルモン又はM22の非存在下で試験システムにおいてTSHRによりサイクリックAMPを生成すると言われている。更に、5C9は、TSHR活性化変異に関連した、TSHR基本活性(すなわち、TSHの非存在下での活性)の増加を阻害することがわかった。
【００２３】
WO 2010/073012は、患者の末梢血リンパ球からの、強力な刺激活性を伴う更なるヒトモノクローナル自己抗体(K1-18)、及び強力なTSHR拮抗物質であるヒトモノクローナル自己抗体(K1-70)の単離及び特徴決定を開示している。K1-18及びK1-70は、患者の血清中に認められる、各々刺激活性及び遮断活性を伴うTRAbの特徴を有する。この発明は、反対の活性(刺激及び遮断)を伴うTRAbが、単独の患者の血清中に同時に存在することができることの最初の証拠を提供する。更にWO 2010/073012に記載された発明は、二価抗体が、1本のアームでELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに結合し、且つ他方のアームで液相TSHR260-アルカリホスファターゼへ結合し、架橋を形成する、架橋原理を基にTRAbを測定する、新規アッセイを説明している。
【発明の概要】
【００２４】
（発明の概要）
本発明は、排他的ではなく全般的にTSHRに関し、且つ排他的ではないが特に残基22-260の間のTSHR配列(TSHR260)に関する(図3及び4；配列番号:3及び4)。本発明の更なる態様は、残基毎に理論的アプローチの組合せにより決定された別のアミノ酸に変異される、特に新規の理論的-系統的変異誘発アプローチを使用し、アミノ酸変異を設計するための、特にTSHR260におけるアミノ酸変異に関する。更に本発明は、数多くの変異体を作製し且つ試験するためのハイスループット法に関する。本発明の一態様は、排他的ではないが特に、野生型TSHR260(TSHR260-WT)に対するより大きい熱安定性により特徴付けられた単一アミノ酸変異を含むTSHR260を作製することに関する。
【００２５】
別の本発明の態様は、二重変異を含むTSHR260を作出するための、2つの単一アミノ酸変異の組合せの設計、作製及び試験に関する。本発明の一態様は、排他的ではないが特に、単一変異を含むTSHR260及びTSHR260-WTに対するより大きい熱安定性により特徴付けられる、二重変異を含むTSHR260に関する。
【００２６】
本発明の別の態様は、排他的ではないが特に、単一アミノ酸変異の三重、四重、五重及び六重の組合せを含むTSHR260の設計、作製及び試験に関する。本発明のこれらの態様は、排他的ではないが特に、より少ない数の変異を含むTSHR260及びTSHR260-WTに対する増大した熱安定性により特徴付けられる、変異されたTSHR260の作製に関する。
【００２７】
一態様において、本発明は、まだ未発見のTSHR配列において安定化変異を確定するのに成功するアプローチが、理論的アプローチ又はコンピュータによるモデリングにより選択された少数の残基のみを有することを説明する。
【００２８】
一態様において、本発明は、TSHR260の重要な生物活性に関する。この生物活性は、TSHR自己抗体、特にTSHR刺激性ヒトモノクローナル自己抗体M22へ結合する能力に関する。本発明は、TSHR260のM22へ結合する能力を介して測定されたTSHR260の熱安定性を増大する、特異的且つ新規の単一、二重、三重、四重、五重及び六重の変異を説明する。これらの本発明の態様は、増大した熱安定性を有し且つM22及び他のTSHR自己抗体に結合する能力を保持する、新規の変異されたTSHR260調製品に関する。
【００２９】
本発明の別の態様において、TSHR260の熱安定性を増大した新規の単一及び組合せ変異は、驚くべきことに、完全長TSHR(図1及び2；配列番号:1及び2)の熱安定性も増大することがわかった。完全長TSHRの中の変異は、TSHRの熱安定性は増大するが、その生物活性(すなわち、TSHRを刺激するリガンドの能力)又はそのTRAbに結合する能力には影響を及ぼさなかった。
【００３０】
本発明の更なる態様は、TSHR自己抗体を検出する改善された方法の設計及び開発に関する。本発明の一態様において、排他的ではないが特に、水溶液において安定なTSHR260調製品が、アッセイキットフォーマットにおいて、体液中に存在するTSHR自己抗体に結合するために利用される。本発明の別の態様において、安定化変異を含む完全長TSHRの安定した調製品が、アッセイキットフォーマットにおいて体液中に存在するTSHR自己抗体に結合するために利用される。更なる態様において、安定した完全長TSHRは、TSH又はTSHR刺激性抗体への結合に反応するTSHR生体活性を検出する改善された手段を提供する。この生体活性は、安定したTSHRを発現している細胞株におけるサイクリックAMP生成を刺激することができるが、これに限定されない。
【００３１】
TSHRの安定した調製品の更なる適用は、AITD患者の体液中に存在するTSHR自己抗体を中和する新たな機会に関する。これらの適用は、インビトロ又はインビボにおいて、体液を、例えば、安定したTSHR260調製品と、例として安定した完全長TSHR調製品と接触させることであるが、これらに限定されるものではない。加えて、TSHR260よりもより少ないアミノ酸を含むTSHR調製品は、TSHR260と完全長TSHRの中間の配列を含むTSHR調製品と同じ変異により、安定化され得る。ヒトTSHRの調製品が通常好ましいが、他の種のTSHR調製品は、同じ方式で安定化され得る。本発明のなお更なる態様は、他の類似のタンパク質の、特に他の糖タンパク質ホルモン受容体(FSHR及びLHR(図11；それぞれ、配列番号:57及び58)の安定性を向上する新規機会を開く。
【００３２】
（発明の説明）
本発明の一態様に従い、1つ以上の変異を含む、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片が提供され、ここで該変異体TSHRは、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する。この変異は、好ましくは点変異である。以下において、使用される用語「変異体」は、完全長TSHR及び任意のその断片、例えば断片TSHR260(図3及び4；配列番号:3及び4)の両方を指す。熱安定性が更に以下において、考察され、且つ定義される。
【００３３】
好適には、TSHR断片は、抗原断片であるものであり、特にTSHR自己抗体に、特にTSHR刺激性ヒトモノクローナル自己抗体M22に、結合する能力を保持するものである。好適な断片は、TSHR260、並びにより小さい長さの配列及びTSHR260と完全長TSHRの間の中間の長さのものを含む。TSHR418(残基22〜418)は、このような断片の別の例である。
【００３４】
本発明の一態様において、変異体TSHR又はその断片は、完全長TSHRであるか、又は完全長TSHRと比べ変異体中に存在するアミノ酸の数により測定された場合、完全長TSHRの長さの少なくとも70％以上、少なくとも80％以上、若しくは少なくとも90％以上を含む。
【００３５】
好ましくは、1つ以上の変異は、TSHR又はその断片の細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)内にある。より好ましくは、1つ以上の変異は、TSHR又はその断片の残基22〜260(TSHR260)内にある。
【００３６】
好ましい態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、哺乳動物種に由来し、特にその一つは、ヒトTSHR(配列番号:1及び2)由来であるか、又はこれから誘導される。しかし、任意の他の好適な種が使用されてよく、且つ他のそのような種は、サル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ又はウマのTSHR(各々、配列番号:47-56)を含む。
【００３７】
好ましくは、本発明の変異体TSHR又はその断片は、TSHR自己抗体、特にTSHR自己抗体M22、K1-70又はK1-18に結合する。
【００３８】
一態様において、本発明は、変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性(本明細書において更に規定する)が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも1.5倍以上大きい、変異体TSHR又はその断片を提供する。好ましくは、変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性は、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも、1.7、又は2、又は3、又は3.5、又は5倍以上大きい。上記の形態は、排他的ではないが特に、ただ一つの単一点変異を含む変異体に適用する。
【００３９】
変異体TSHR又はその断片(TSHR260など)の半減期は、同等の野生型TSHR又はその断片の半減期と比べ、試験温度で、TSHRに対する抗体又は自己抗体に結合する能力を保持する変異体TSHR又はその断片(又は同等の野生型タンパク質)の量を決定する結合アッセイにおいて、好適に測定される。
【００４０】
本発明の変異体TSHR又はその断片は、任意の数の単一点変異を含むことができるが、本発明者らは、1〜6つの単一点変異を使用することを選んだ。本発明の好ましい態様において、変異体は、以下の変異のいずれか一つから選択された、1、2、3、4、5又は6つの点変異を含む：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(図5及び6；それぞれ、配列番号:11-25、27-43、45及び46)。しかし望ましいならば、上記のものとは異なる点変異を選択することができ、且つ本発明の一態様は、決定されるべき任意の特定の点変異、又は点変異の組合せの熱安定性を使用可能にする結合アッセイの提供であることは、理解されるであろう。本発明の一態様において、変異体は、ただ一つの単一点変異を含む。
【００４１】
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、二重点変異(すなわち、2つの単一点変異のみ)を含む。好ましくは、かかる二重点変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性は、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも、3.5、又は5、又は7、又は9倍以上大きい。或いは、かかる二重点変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性は、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも、3、又は5、又は6、又は8、又は10倍以上大きい。
【００４２】
更なる態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、三重点変異(すなわち、3つの単一点変異のみ)を含む。好ましくは、かかる三重点変異の50℃での半減期により決定される熱安定性は、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体(配列番号:45)の半減期よりも、9、又は12、又は15倍以上大きい。より熱安定性の変異(3つ以上の単一点変異を含むことが多い)と野生型TSHR260(これについては比較的高い温度での半減期の意味のある測定が難しい)の間で比較可能とするために、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体を、野生型TSHR260(TSHR260-WT)と比較することができる。TSHR260-I253Rは、42℃での熱安定性をTSHR260-WTよりも3.0±0.4倍向上し、すなわちTSHR260の42℃での半減期を53±6分間だけ増加した(例えば、表3及び表7のデータ参照)。これはまた、50℃での熱安定性を、TSHR260-WTよりも2.85±0.13倍向上した。
【００４３】
更なる態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、四重点変異(すなわち4つの単一点変異のみ)を含む。好ましくは、かかる四重点変異体の50℃での半減期により決定される熱安定性は、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも、20、又は30、又は50倍以上大きい。或いは、かかる四重点変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性は、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも、12、又は20、又は30倍以上大きい。
【００４４】
更なる態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、五重点変異(すなわち5つの単一点変異のみ)を含む。好ましくは、かかる五重点変異体の55℃での半減期により決定される熱安定性は、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも、40、又は70、又は100倍以上大きい。
【００４５】
更なる態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、六重点変異を含む。好ましくは、かかる六重点変異体の55℃での半減期により決定される熱安定性は、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも、500、又は750、又は900倍以上大きい。或いは、かかる六重点変異体の60℃でのその半減期により決定される熱安定性は、四重点変異I253R＋D143P＋R112P＋D151Eを含むTSHR260変異体(本明細書ではJMG45と称され(各々、配列番号:45、36、34、37)、これは、TSHR260-WTのそれの174倍の60℃での予測される熱安定性を有する)の半減期よりも、3倍以上大きいか、又は55℃で四重点変異I253R＋D143P＋R112P＋D151Eを含むTSHR260変異体の半減期よりも、1.2倍以上大きい。完全長TSHR変異体が、本発明の任意の態様において、望ましいならば使用される。ヒト、マウス又はブタの完全長TSHR変異体が、特に好ましく、且つ良好な熱安定性を有することが示されている。更なる態様において、本発明の変異体TSHRは、完全長TSHR変異体であり、ここでこの変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性は、同等の野生型完全長TSHRの半減期よりも、3、又は5倍以上大きい。
【００４６】
好ましい態様において、完全長TSHR変異体は、TSHRの残基22〜260(TSHR260)内に、3つ以上の点変異を含む。
【００４７】
本発明の特に好ましい態様において、変異体TSHR又はその断片は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる。この文脈において本質的になるとは、好適にはTSHR260と少なくとも80％の配列同一性が、好ましくは90％の配列同一性が、より好ましくは95％の配列同一性が存在することを意味する。
【００４８】
一態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、好ましくは以下のいずれかの単一点変異を含む：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y。当業者に理解されるように、「P28E」とは、TSHRの配列位置28でのアミノ酸プロリン(P)がグルタミン酸(E)への変異、などを意味する。
【００４９】
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、2つの点変異を含み、その一つはI253R(配列番号:45)であり、その二番目は、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、又はR255Yである。
【００５０】
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、3つの点変異を含み、その一つはI253R(配列番号:45)であり、その二番目はD143P(配列番号:36)であり、その三番目はP28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D151E、S166T、P168Y、V169R及びN170Wのひとつである。
【００５１】
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、4つの点変異を含み、その一つはI253Rであり、その二番目はD143Pであり、並びにその三番目はR112P(配列番号:34)であり、並びにその四番目は、L59F、H63C、D151E、S166T、V169R及びN170Wのひとつである。
【００５２】
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、5つの点変異を含み、その一つはI253Rであり、その二番目はD143Pであり、その三番目はR112Pであり、その四番目はD151E(配列番号:37)又はH63C(配列番号:32)であり、並びにその五番目は、L59F、(H63C又はD151E)、S166T及びV169R(それぞれ、配列番号:30、32、37、38及び41)のひとつである。
【００５３】
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、6つの変異を含み、そのひとつはI253Rであり、その二番目はD143Pであり、その三番目はR112Pであり、その四番目はD151Eであり、その五番目はH63Cであり、並びにその六番目は、S166T又はV169Rのいずれかである。
【００５４】
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Yのいずれかから選択された1、2、3、4、5又は6つの点変異を含むことができる。
【００５５】
一つの好ましい態様において、変異体TSHR又はその断片は、TSHR260からなり、且つ同等の野生型は、野生型TSHR260からなる。
【００５６】
本発明の変異体の特に好ましい特徴は、モノクローナルTSHR抗体、特に自己抗体の、該変異体への結合が、同じモノクローナルTSHR抗体又は自己抗体の同等の野生型TSHR又は断片への結合と比べた場合に、影響されない、又は実質的に影響されないことである。
【００５７】
本発明はまた、医薬品における使用のための本発明の変異体TSHR又はその断片を提供する。本発明の変異体の数多くの医学的及び治療上の使用が、存在する。例えば、本発明は、TSHRモノクローナル自己抗体及び患者TRAbの検出における使用のための、本発明の変異体TSHR又はその断片を提供する。同じく、循環患者TRAbを吸収するために治療的有効量で使用するための、本発明の変異体TSHR又はその断片を提供する。
【００５８】
本発明はまた、小型分子薬物のための新規スカフォールドを同定するために小型-分子断片スクリーニングするための、本発明の変異体TSHR又はその断片の使用も提供する。
【００５９】
本発明はまた、対象におけるTSH受容体への免疫応答に関連した自己免疫疾患を治療するインビトロ方法も提供し、この方法は、対象の血液の試料を、本発明の変異体TSHR又はその断片がそれに結合している固相カラムを通過させること、及び該血液中の循環TRAbを、該変異体TSHR又はその断片上に吸収させることを含む。
【００６０】
本発明はまた、変異体が検出可能な標識を含む、本発明の変異体TSHR又はその断片を提供する。この標識は、例えば、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から選択され得る。かかる標識は、例えば、好適な構築体を使用する遺伝子融合(以下に更に説明)を介して又は化学標識によるなど、任意の好適な様式により追加され得る。当業者は、必要な関連技術、及び好適な標識の独自性を熟知しているであろう。
【００６１】
好ましい態様において、この標識は、アルカリホスファターゼ(AP)標識又はビオチン標識を含む。最も好ましくは、アルカリホスファターゼ標識が利用される。
【００６２】
好ましい態様において、標識された変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる。特定の好ましい変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260とアルカリホスファターゼ(AP)標識からなるものであり、本明細書においてTSHR260-AP-Xと称され、ここで「X」は、変異体中の1以上のアミノ酸変異を指す。
【００６３】
標識された変異体又はその断片は、本明細書記載のアミノ酸点変異の1以上を含み得る。当業者に理解されるように、変異は、標識の前又は後のいずれかで、野生型TSHR又はその断片へ導入することができる。
【００６４】
本発明はまた、膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ以上の変異を含む変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片も提供し、ここで該変異体TSHRは、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する。
【００６５】
好ましくは、変異体TSHR又はその断片は、完全長TSHRであるか、又は完全長TSHRに比べた該変異体中に存在するアミノ酸の数により測定される時、完全長TSHRの長さの少なくとも70％以上、又は少なくとも80％以上、又は少なくとも90％以上含む。
【００６６】
好ましい態様において、1以上のTMD変異を伴う変異体TSHR又は断片は、膜貫通ドメイン内ではない、1つ以上の追加的変異を更に含み、この1つ以上の追加的変異は、本明細書記載の本発明に従う。この1つ以上の追加的変異は、例えば、本明細書記載の本発明の態様に従い、TSHR260サブドメイン内であってよい。好ましくは、この追加的変異は、膜貫通ドメイン内ではない、少なくとも2つ以上の追加的変異を含む。好ましくは、かかる変異はTSHR260サブドメイン内にある。
【００６７】
一態様において、該追加的変異は、六重点変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (TSHR-JMG55)(それぞれ、配列番号:32、34、36、37、41及び45)を含む。
【００６８】
好ましくは、本発明は、膜貫通ドメイン(TMD)内の1つ以上の変異が、膜貫通ドメインではない該追加的変異のみを含む同等の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片に対して、増大した熱安定性を提供する、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片を提供する。従ってここで「同等な」変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)は、話題の変異体と同一であり、結果的に膜貫通ドメイン内の追加的変異のいずれかを欠く以外は同じ変異を含む。類似の文脈で本明細書を通じて使用される用語「同等な」とは、変更すべき所は変更して、同じ意味を有する。
【００６９】
一態様において、本発明は、変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、膜貫通ドメイン内ではない該追加的変異のみを含む同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.2倍以上大きい、又は1.3倍以上大きい、膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ以上の変異を含む変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片を提供する。
【００７０】
別の態様において、本発明は、変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、六重変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (TSHR-JMG55)を含むTSHR変異体の半減期よりも、1.2倍以上大きい、又は1.3倍以上大きい、膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ以上の変異を含む変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片を提供する。
【００７１】
好ましくは、前記態様において、この変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性は、2倍以上大きいか、又は3倍以上大きいか、又は5倍以上大きい。
【００７２】
熱安定性は、一般に以下に規定されるが、例えば、図14b、c及びdにそれぞれ示した安定性アッセイA、B、又はCにより測定されてよい。
【００７３】
好ましくは、本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片は、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定性アッセイCにより測定された該変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性は、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I(配列番号:97)、V595I(配列番号:100)又はI648L(配列番号:103)から選択された単一点変異のみを含む同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.1倍以上大きい。
【００７４】
別の好ましい態様において、本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片は、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞれ示された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された該変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性は、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I、V595I又はI648Lから選択された単一点変異のみを含む同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.5倍以上大きい。
【００７５】
好ましくは、本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片は、TMD内の該2つの点変異の少なくとも一つが、T477I、V595I、及びI648Lから選択される。
【００７６】
好ましくは、膜貫通ドメイン(TMD)内に変異を有する本発明の変異体TSHR又はその断片は、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A(それぞれ、配列番号:89-108)のいずれかから選択される単一点変異を含む。これらの変異の2つ以上はまた、組合せられてもよい。
【００７７】
好ましくは、膜貫通ドメイン(TMD)内に変異を有する本発明の変異体TSHR又はその断片は、2つの点変異を含み、その一つはT477I又はV595I又はI648Lであり、並びにその二番目は、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678Aから選択される異なる変異である。
【００７８】
別の態様において、本発明はまた、1つ以上の変異を含む変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片を精製する方法であって、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有し、該方法が：
i)変異体又はその断片を含む組成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製する工程；
ii)精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む方法を、提供する。
【００７９】
この組成物は、精製されるべき変異体タンパク質を含む任意の適した組成物又は配合物であってよい。例えばこれは、水溶液を含んでよい。これは培養物上清−例えば、変異体タンパク質を生成するために使用された細胞培養物由来の上清を含んでよい。
【００８０】
精製されるべき変異体TSHR又はその断片は、例えば、本明細書記載の本発明の変異体TSHR又はその断片のタンパク質のいずれか一つであってよい。好ましくは、変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ好ましくは下記の変異のセットのひとつも含み得る：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)。
【００８１】
好ましくは、このカラムクロマトグラフィーは、陽イオン交換又は陰イオン交換クロマトグラフィーなどの、イオン交換クロマトグラフィーを含む。標準のクロマトグラフィー装置及びプロセスを、使用することができ、且つこのようなものは、当業者には明らかであろう。驚くべきことに、本発明者らは、本発明の及び本明細書記載の変異体タンパク質は、それらの野生型同等物とは異なり、実際に、それらの増大した熱安定性のために、前記方法で精製され得ることを発見した。このことは、本発明の態様を形成する。
【００８２】
好ましくは、本発明の精製方法は更に、工程i)の前又は後のいずれかに、該変異体又はその断片を含む組成物を、アフィニティクロマトグラフィーにより精製する工程を含む。任意の好適なアフィニティクロマトグラフィーを使用してよいが、好ましい態様において、アフィニティクロマトグラフィーは、抗体アフィニティクロマトグラフィー及び／又は金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを含む。一方又は両方を使用してよい。
【００８３】
特に好ましい態様において、前記の本発明の精製方法は：
i)該変異体又はその断片を含む組成物を、陽イオン交換又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する工程；
ii)該変異体又はその断片を、抗体アフィニティクロマトグラフィーにより更に精製する工程；
iii)任意に、該変異体又はその断片を、金属イオンアフィニティクロマトグラフィーにより更に精製する工程；
iv)精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む。
【００８４】
好ましくは、工程(ii)の抗体は、TSHR細胞外ドメイン内の立体配座エピトープに結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。任意の好適な抗体を使用することができる。14C4は、一つの好ましいマウスモノクローナル抗体である。
【００８５】
好ましい態様において、前記工程(iii)は、ニッケル-アフィニティクロマトグラフィーの使用を含むが、他の好適な金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラムを使用してもよい。
【００８６】
別の好ましい態様において、本発明の精製方法は、アフィニティクロマトグラフィーが、抗体アフィニティクロマトグラフィーであり、且つ同じく任意にpH5.0±0.2での溶出緩衝液による溶出が先行する、pH4.5±0.2での溶出緩衝液による溶出を含む。
【００８７】
好ましくは、本発明の精製方法において、変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる。好ましくは、該変異体は、下記の変異のセットを含む：
H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R。
【００８８】
本発明の更なる態様において、変異体TSHR又はその断片の精製は、該変異体又はその断片に結合された抗体、又は該変異体又はその断片との複合体中の抗体を必要とはしない。本発明は、機能性の活性タンパク質が、それに結合又は複合された抗体による精製時に、変異体又はその断片を安定化させる必要がなく、精製を介して生成され得るよう、安定性が増大した変異体を提供する。
【００８９】
本発明の一態様において、排他的ではないが特に、水溶液中で安定しているTSHR260調製品、特にTSHR260-JMG55調製品が、TSHR260結合ELISAにおいて高い活性を伴う調製品を得るために精製される(図12aに示した)。
【００９０】
本発明の変異体TSHRタンパク質の増大した熱安定性は、例えば、本明細書記載の精製方法による、それらの精製を可能にする。かかる活性タンパク質の精製は、これまでは実現できなかった。従って本発明は、これまで実現不可能な純度及び活性レベルで、TSHR260タンパク質を含む、TSHRタンパク質を、提供する。これらは新規生成物である。本明細書において使用される「精製された」変異体TSHR又はその断片は、少なくとも1つの精製工程に供されている変異体TSHR又はその断片をいうことが意図されている。1又は複数の精製工程は、タンパク質を精製するための任意の好適な精製であってよく、且つこのようなものは、当業者には明らかであろう。例えば、本明細書に記載及び請求された精製工程を使用することができるが、他の好適な精製が排除されるものではなく、望ましいならば使用することができる。
【００９１】
本発明の別の態様に従い、本明細書記載の本発明の精製方法により得られた、本明細書記載の本発明の精製された変異体TSHR又はその断片が提供される。変異体TSHR又はその断片はまた、本発明の精製方法により入手可能である。他の精製方法を使用し、本発明者らの精製された変異体を生成することは、可能である。
【００９２】
従って関連する態様において、本発明はまた、TSHR活性アッセイにおいて該精製された変異体の活性が、同じTSHR活性アッセイにおいて測定した培養物上清由来の未精製の変異体の活性よりも大きいことを特徴とする、本明細書記載の本発明の精製された変異体TSHR又はその断片も提供する。この上清は、該変異体タンパク質の発現及び分泌に使用された好適な細胞培養物(例えば本明細書記載のような)由来であることが好ましいであろう。TSHR活性アッセイは、同じ条件を使用する正確に同じアッセイ(すなわち、同一アッセイ)が、未精製及び精製の両方の試料について使用されるならば、試験される変異体の活性の測定をもたらすことが可能である、いずれか好適なアッセイであってよい。当業者には明らかであるように、数多くの好適なアッセイの例が、本明細書においてもたらされる。特に適したアッセイは、図12a、12d、及び13cに示されたものである。
【００９３】
TSHR活性アッセイにおける活性は、例えば試料容積あたりの活性の量−例えば単位/mlなど、いずれか好適な様式で、表現することができる。好適には、この活性は、タンパク質量あたりの活性単位−例えば単位/mgとして測定される変異体の比活性である。
【００９４】
好ましい態様において、本発明は、TSHR活性アッセイにおける該精製された変異体の活性が、同じTSHR活性アッセイにおいて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性と比べ、500倍以上大きいことを特徴とする、本明細書記載の本発明の精製された変異体TSHR又はその断片を提供する。この活性は、同じTSHR活性アッセイにおいて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性と比べ、実際により高くてよく、例えばこの活性は、1000倍以上大きい、又は5000倍以上大きくてよい。好ましくは、この活性は、単位/mgタンパク質の比活性として表現又は測定される。
【００９５】
好ましくは、未精製の変異体の活性は、上清の何らかの希釈又は濃縮を伴わずに、培養物から直接収集された培養物上清から測定されるが、望ましいならば−希釈又は濃縮が、単位/mgタンパク質の比活性に換算して表現される場合に測定された活性に影響を及ぼさないのであれば、これを行うことができることは、理解されるであろう。
【００９６】
好ましくは、TSHR活性アッセイは、該変異体が、TSHR抗体又は自己抗体に結合する能力を測定する。いずれか好適な抗体又は自己抗体を使用することができ、且つ好適なTSHR自己抗体は、M22、K1-70又はK1-18を含む(本明細書記載のような)。
【００９７】
好ましくは、TSHR活性アッセイは、ELISAプレートに直接又は間接に結合された試験されるべき変異体を含む。好ましくは、試験されるべき変異体は、ELISAプレート上に間接的に結合又はコーティングされる。例えば、これは、TSHRに結合するが、TSHRそれ自身の通常の結合は妨害しない抗体を使用し、実現され得る。好ましくは、この抗体は、TSHR細胞外ドメイン内の立体配座エピトープに結合する、モノクローナル抗体である。いずれか好適な抗体を使用してよい。14C4は、一つの好ましいマウスモノクローナル抗体であるが、理解されるように、他のものを使用してよい。
【００９８】
好ましい態様において、TSHR活性アッセイは、図12a又は図13cに示されたアッセイを含む。その活性が試験されるべき変異体がELISAプレートに直接結合されることが可能である場合には、図12dに示された型のアッセイが使用されてよい。好ましくは、本発明の精製された変異体TSHR又はその断片は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつを含む：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)。
【００９９】
特に好ましい態様において、本発明は、変異体が、以下の変異のセットを含む、本明細書記載の本発明の精製された変異体TSHR又はその断片を、提供する：H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)。
【０１００】
本発明の精製された変異体TSHR又はその断片は、本明細書記載の検出可能な標識も含んでよい。
【０１０１】
同じく、変異体又はその断片が、脱グリコシル化され、且つ例えばTSHR活性アッセイにおいて測定されるような活性を保持している、本明細書記載の本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片も提供される。かかるアッセイの例は、本明細書において、且つ同じく精製された変異体の活性に関して上記に説明されている。いずれか好適なTSHR活性アッセイが、使用されてよい。例えば、図12a又は図13cに示されたアッセイは、活性を測定するために使用されてよい。この活性は、脱グリコシル化されない変異体又はその断片の活性の、少なくとも70％以上、少なくとも80％以上、又は少なくとも90％以上であることが好ましい。一部の場合において、この活性は、ほとんど減少されないか、又は脱グリコシルされない変異体又はその断片の活性と同じ、若しくは本質的に同じであることができる。
【０１０２】
原則として、脱グリコシル化は、本明細書に記載及び請求された変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片のいずれかひとつに適用されることができるが、本発明者らは、この変異体が少なくとも二重点変異を含むことを好む。特定のレベルの安定性が必要とされ、且つ本明細書記載の種類の試験は、各場合において脱グリコシル化後に、変異体タンパク質の活性を決定することができるであろう。本発明者らは、十分な活性を保持しつつ、脱グリコシル化されることが可能である、少なくともひとつの二重点変異、又は一部の場合においては少なくともひとつの三重点変異を有する変異体を予測する。理解されるように、脱グリコシル化は、糖残基をタンパク質から除去し、より容易に結晶化できるようにする。いずれか好適な脱グリコシル化プロセスを使用することができ、且つ好適な技術の一つは、以下に詳述されている。
【０１０３】
本発明の脱グリコシル化された変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつを含み：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)：
しかし前述のように、脱グリコシル化は、原則として本明細書に記載及び請求された変異体のいずれか一つに適用され得る。
【０１０４】
本明細書記載の本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片と、被検自己抗体の試料を接触させることを含む、TSHRに対する被検自己抗体を検出するための、診断方法を含む方法も、提供される。TSHR260変異体、特にアルカリホスファターゼで標識されたものの使用は、特に好ましい。点変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (JMG55)を含むTSHR260は、特に好ましい。
【０１０５】
被検抗体は、いずれか好適な給源から由来することができる。好ましくは、被検自己抗体の試料は、かかる被検自己抗体を含むと考えられる対象から単離される。試料は、ヒトを含む任意の種−例えば、ヒト患者血清に由来することができる。好適には、試料は、ヒト又は動物の患者の血清を含む。
【０１０６】
本発明はまた、TSHRに対する被検自己抗体を検出するための、診断方法を含む、方法を提供し、この方法は：
a) 対象由来の試料、例えば体液試料を提供する工程；
b) TSHR又はその断片の第一の給源の1種以上を提供する工程；
c) TSHRの第二の給源の1種以上を提供する工程であって、ここで第二の給源は、本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片である工程；
d) 該TSHRの第一及び第二の給源を、同時に又は連続して該試料、例えば体液試料と接触させ、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する工程；
e) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、固定手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源が、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続き固形支持体に固定される工程；
f) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、直接又は間接に検出可能な標識手段を提供し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源に、工程(d)の前に、又は同時に、又は引き続きかかる直接又は間接標識手段を提供する工程；並びに
g) 該体液試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(e)に従い工程(d)において形成された複合体の存在を検出する工程：を含む。
【０１０７】
TSHRの第一の給源は、完全長TSHR、又はTSHR260を含む断片を含む、TSHRのいずれか好適な形(野生型又は変異型)であることができるが、好ましくは(b)において提供されるTSHRの第一の給源は、TSH受容体の1以上のエピトープ又はTSH受容体の1以上のエピトープを含むポリペプチドを含む完全長TSHRである。望ましいならば、(b)において提供されるTSHRの第一の給源は、本明細書記載の本発明の変異体TSHR又はその断片である。従って本発明の方法のTSHRの第一及び第二の両方の給源は、望ましいならば、本明細書に記載及び請求される本発明の変異体TSHR又はその断片であってよい。
【０１０８】
好ましい態様において、変異体TSHR又はその断片は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になるが、原則として本明細書記載の変異体TSHR又はその断片のいずれかであることができる。
【０１０９】
標識手段は、TSHRの第二の給源を標識するいずれか好適な手段を含むことができ、且つ好適な手段並びにそれらの適用及び使用の方法は、当業者に公知であろう。この標識は、例えば、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から選択され得る。かかる標識は、例えば、好適な構築体を使用する遺伝子融合(以下に更に説明)を介して又は化学標識によるなど、任意の好適な様式により追加され得る。当業者は、必要な関連技術、及び好適な標識の独自性を熟知しているであろう。
【０１１０】
好ましい態様において、標識は、アルカリホスファターゼ(AP)標識又はビオチン標識を含む。最も好ましくは、アルカリホスファターゼ標識が利用される。
【０１１１】
好ましい態様において、標識された変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる。特定の好ましい変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260及びアルカリホスファターゼ(AP)標識からなるものであり、TSHR260-AP-Xと称され、ここで「X」は、変異体中の1以上のアミノ酸変異を指す。
【０１１２】
好ましくは、標識手段は、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む。
【０１１３】
好ましくは、変異体は、標識手段により直接標識され−例えば、TSHR260は、アルカリホスファターゼ(AP)標識又はビオチンにより直接化学的に標識される。
【０１１４】
好ましい態様において、それにより該TSHRの第一の給源が固形支持体へ固定される固定手段は、モノクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体又はそれらの断片を含む。例としては、抗体4E31(本明細書に記載の)であるが、いずれか好適な抗体を使用してよい。
【０１１５】
固形支持体は、いずれか好適な支持体であってよいが、好ましくはプレート、例えば、ELISAプレート、又はELISAプレートウェルである。
【０１１６】
本発明はまた、TSHRに対する被検自己抗体を検出するキットも提供し、該キットは：
a) TSHR又はその断片の1種以上の第一の給源；
b) TSHRの1種以上の第二の給源であって、ここで該第二の給源が、本明細書記載の本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片であるもの；
c)該TSHRの第一及び第二の給源を、TSHRに対する被検自己抗体を含むと考えられる試料と、同時に又は連続して接触させる手段であり、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する手段；
d)工程(c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源を、工程(c)の前に、又は同時に、又は引き続き固形支持体へ固定するための固定手段；
e) 該複合体の形成の前に、又は同時に、又は引き続き標識された工程(c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源を、直接又は間接に標識するための検出可能な標識手段；並びに
f) 該試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(c)において形成された複合体の存在を検出する手段：を含む。
【０１１７】
このキットは、例えば、対応する方法に関連する先に記載した特徴のいずれか1つ以上を含むことができる。
【０１１８】
特に望ましいならば、(a)に提供されるTSHRの第一の給源は、本明細書記載の本発明の変異体TSHR又はその断片である。従って本発明のキット中のTSHRの第一及び第二の両方の給源は、望ましいならば、本明細書に記載及び請求された本発明の変異体TSHR又はその断片であることができる。本発明はまた、本明細書記載の本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片がそれらに直接又は間接に結合されている固形支持体を提供する。
【０１１９】
好ましくは、本発明の固形支持体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片がそれらに結合されている。
【０１２０】
好ましい態様において、本発明の固形支持体は、以下の変異のセットの一つを含む、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片がそれらに結合されている：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)。
【０１２１】
従って、本発明は、特に、TSHRモノクローナル自己抗体及び患者血清TRAbを検出するための、ELISAプレートウェル上に直接コートされたTSHR260の安定して精製された変異体、特にTSHR260-JMG55の使用を提供する。かかる変異体は、望ましいならば、アルカリホスファターゼ(AP)標識などの、検出可能な標識を含んでよい。
【０１２２】
好適には、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片は、該固形支持体へ直接結合される。
【０１２３】
好ましい態様において、支持体は、1個以上のウェルを含むELISAプレートである。
【０１２４】
本発明はまた、本発明の固形支持体を含むキットも提供する。
【０１２５】
本発明はまた、TSHRモノクローナル自己抗体又は患者TRAbを検出するための、本発明の固形支持体又は固形支持体を含む本発明のキットの使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
（図面の説明）
本発明のTSHR分子及び方法は、ここで、単なる例証として、添付図面、図1〜30を参照し、説明する：
【図１】図1は、ヒト(野生型)TSHRのDNA配列(配列番号:1)を示す。
【図２】図2は、ヒト(野生型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:2)を示す。
【図３】図3は、ヒト(野生型)TSHR260断片のDNA配列(配列番号:3)を示す。
【図４】図4は、ヒト(野生型)TSHR260断片のアミノ酸配列(配列番号:4)を示す。
【図５】図5は、熱安定化するTSHR単一変異のDNA配列(配列番号:11-28)を示す。
【図６】図6は、熱安定化するTSHR単一変異のアミノ酸配列(配列番号:29-46)を示す。
【図７】図7は、(a)42℃、(b)50℃、(c)50℃、(d)55℃及び(e)60℃で加熱した、TSHR260変異体に関する、TSHR260熱安定性アッセイの結果の5つの代表的例を示す。
【図８】図8は、50℃で、14C4 Fab2プレート上で加熱した、完全長TSHR変異体の熱安定性を示す。
【図９】図9は、略画形式でTSHR260ドメインを図示し、且つスティック立体構造で最も熱安定化する変異の未変性の残基の位置を示す。
【図１０】図10は、ヒト、ミドリザル、アカゲザル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ、ウマのTSHRアミノ酸配列(それぞれ、配列番号:2、47-56)のアラインメントを示す。
【図１１】図11は、ヒトTSHRアミノ酸配列とヒトFSHR及びヒトLHR(それぞれ、配列番号:2、57及び58)のアラインメントを示す。
【図１２】図12は、以下のTSHR260に関与するアッセイの概略図を示す：(a)TSHR260-結合アッセイ；(b)TSHR260熱安定性アッセイ；(c)TSHR260へのM22-POD結合の阻害；及び、(d)TSHR260-JMG55コートされたELISAプレートウェルアッセイ。
【図１３】図13は、以下のTSHR260-APに関与するアッセイの概略図を示す：(a)TSHR260-AP架橋ELISA；(b)TSHR260-AP熱安定性アッセイ；及び(c)TSHR260-AP架橋阻害ELISA。
【図１４】図14は、以下のTSHRに関与するアッセイの概略図を示す：(a)TSHR-結合アッセイ；(b)TSHR安定性アッセイA；(c)TSHR安定性アッセイB；(d)TSHR安定性アッセイC；及び(e)TSHRへのM22-POD結合の阻害。
【図１５】図15は、TSHR260-APのDNA配列(配列番号:59)を示す。
【図１６】図16は、TSHR260-APのアミノ酸配列(配列番号:60)を示す。
【図１７】図17は、ブタ(野生型)TSHRのDNA配列(配列番号:61)を示す。
【図１８】図18は、ブタ(野生型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:62)を示す。
【図１９】図19は、マウス(野生型)TSHRのDNA配列(配列番号:63)を示す。
【図２０】図20は、マウス(野生型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:64)を示す。
【図２１】図21は、ブタ(変異型)TSHRのDNA配列(配列番号:65)を示す。
【図２２】図22は、ブタ(変異型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:66)を示す。
【図２３】図23は、マウス(変異型)TSHRのDNA配列(配列番号:67)を示す。
【図２４】図24は、マウス(変異型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:68)を示す。
【図２５】図25は、(a)TSHR260(野生型)、(b)14C4 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(c)25E1 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(d)2H11 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(e)23H4 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(f)36F11 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(g)9B7 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、並びに(h)ストリームラインDEAE又はストリームラインHSTのいずれかのマトリクス上のTSHR260-JMG55の、精製に関する装加プール及び溶出プールの、図13(c)に例示された架橋阻害ELISAアッセイにより測定された活性を示す。
【図２６】図26は、ストリームラインHST精製されたTSHR260-JMG55の14C4-アフィニティクロマトグラフィー後の、溶出画分中のTSHR260-JMG55活性の分布を示す。
【図２７】図27は、3ラウンドのカラム精製(ストリームラインHST、14C4-アフィニティ及びニッケル-アフィニティクロマトグラフィー)後の、精製されたTSHR260-JMG55-5.0(低比活性)及び精製されたTSHR260-JMG55-4.5(高比活性)の、染色した12％非還元SDS-PAGEゲルを示す。レーン1：分子量マーカー；レーン2：TSHR260(野生型)培養物上清対照；レーン3：昆虫細胞培養培地対照；レーン4：精製されたTSHR260-JMG55-5.0(2.4μg)；及びレーン5：精製されたTSHR260-JMG55-4.5(3.0μg)。
【図２８】図28は、エンドグリコシダーゼF3を異なる濃度で使用する、精製されたTSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化を示す(染色した12％非還元SDS-PAGEゲル)。(A)レーン1：分子量マーカー；レーン2：昆虫細胞培養培地陰性対照；レーン3：ニッケル-アフィニティ精製されたTSHR260-JMG55-4.5(未処置)；レーン4-6：それぞれ、24時間、72時間及び120時間インキュベーションした後の、40mU エンドグリコシダーゼF3/mgのTSHR260-JMG55-4.5；レーン7-9：それぞれ、24時間、72時間及び120時間インキュベーションした後の、0mU エンドグリコシダーゼF3/mgのTSHR260-JMG55-4.5。(B)レーン1：分子量マーカー；レーン2：昆虫細胞培養培地陰性対照；レーン3：ニッケル-アフィニティ精製したTSHR260-JMG55-4.5(未処置)；レーン4-6：それぞれ、24時間、72時間及び120時間インキュベーション後の、60mU エンドグリコシダーゼF3/mgのTSHR260-JMG55-4.5；レーン7-9：それぞれ、24時間、72時間及び120時間インキュベーションした後の、80mUエンドグリコシダーゼF3/mgのTSHR260-JMG55-4.5。
【図２９】図29は、TSHR-JMG55のTMD内で作製された熱安定化する単一アミノ酸変異のDNA配列(配列番号:69-88)を示す。
【図３０】図30は、TSHR-JMG55のTMD内で作製された熱安定化する単一アミノ酸変異のアミノ酸配列(配列番号:89-108)を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
（方法）
（TSHR260変異のコンピュータモデリング）
コンピュータモデリングは、Discovery studios v3.5 (Accelrys Software社、Accelrys Ltd, Cambridge, CB4 0WN, UK)により、Calculate Mutation Energy Stabilityプロトコールを使用し、行った。TSHR260-M22 Fab複合体の結晶構造(PDBコード：3G04；RCSBタンパク質データバンクからwww.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3go4で入手可能)を、全ての変異に関する初期モデルとして使用し、M22のTSHR260への結合を妨害しない変異が選択されたことを確実にした。TSHR260構造の各残基を、その他の19の可能なアミノ酸の各々に変異し、この変異エネルギーデータを収集し比較した。
【０１２８】
コンピュータモデリングデータは、どの標的残基が各位置で最も安定化される可能性があるかを推定するために、安定化変異の他の予測と組合せて使用した。これらの他の予測は、数多くの要因を基にした：
1.  Pro又はGlyアミノ酸に関して好ましい立体構造を予測する残基のねじれ角、
2.  他の生物及び他の糖タンパク質からのTSHRコンセンサス配列、
3.  LRR及び／又はβ-シートにおける残基の位置、
4.  タンパク質の表面又はコア中の残基の位置。
【０１２９】
（プライマーデザイン）
プライマーを、点変異をTSHR260へ導入するために、PrimerXウェブサイト(www.bioinformatics.org/primerx/index.htm)を使用し、設計した。このタンパク質-ベースのプライマーデザインの選択肢を、QuikChange SDMプロトコールを使用し、且つそれらのオーバーハングが2〜10残基であるプライマー対を選択して、使用した。プライマーは、融解温度73℃〜84℃(理想的には76℃より高い)を有し、長さ27〜49塩基対であり、且つGC含量33％〜70％(理想的には40％より大きい)を有した。プライマーは、Sigma Genosys社(Haverhill, CB9 8QP, UK)から、10μM水溶液中で、96-ウェルフォーマット中に注文した。
【０１３０】
（変異誘発、プラスミドDNA調製及び精製）
TSHR260-6His鋳型構築体(ヒトTSHRのコーディングアミノ酸1-260；野生型TSHR 260のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の各々については、図3(配列番号:3)及び4(配列番号:4)を参照)を、鋳型として完全長ヒトTSHR(Oda Yらの文献、(1998) Journal of Molecular Endocrinology, 20: 233-244)を使用し、6個のHisタグをC末端へ追加し、先に増幅した。TSHRの残基1-260は、完全長TSHRから、BamHI制限部位をヒトTSHRアミノ酸1-260のN末端に、及び1個のアミノ酸リンカー(Asn)、6個のHisタグ、停止コドン及びXbaI制限部位をC末端に追加する2種のプライマー
【化１】
2017520246.tif 000003
により増幅した。このPCR産物を、BamHI及びXbaI制限部位を使用し、pcDNA3.1+へクローニングした。
【０１３１】
TSHR260配列における変異(図5；配列番号:11-28及び図6；配列番号:29-46)は、QuikChange II方式(Agilent Technologies UK社, Stockport, SK8 3GR)によるポリメラーゼ連鎖-反応(PCR)を使用する部位特異的変異誘発により、作製した。変異誘発は、KODホットスタートポリメラーゼキット(Novagen from VWR International社, Lutterworth, LE17 4XN, UK)を使用し、96-ウェルプレートフォーマットで行った。鋳型としてTSHR260-6Hisか、又は好適なベクターpcDNA3.1+中のTSHR260変異体を使用し、50μLのPCR反応物を、各反応物の最終濃度が下記であるように、設定した：1×KOD緩衝液、0.2mM dNTP、1.5mM MgSO4、0.02U/μL KODホットスタートポリメラーゼ、9％v/v DMSO(Sigma Aldrich社, Poole, BH12 4QH)、0.2ng/μL鋳型DNA、0.3μMフォワードプライマー及び0.3μMリバースプライマー。下記のPCRプログラムを試行した：94℃で2分間の変性；94℃で15秒間の変性、68℃で1分間のアニーリング、68℃で8分間の伸長を18サイクル；引き続き、68℃で7分間の伸長の最終工程。この鋳型を、2μL DpnI (Fisher Scientific社, Loughborough, LE11 5RG)による、37℃で少なくとも3時間のインキュベーションにより、消化した。
【０１３２】
PCR反応物1μLを、1.5mLマイクロチューブ又は96-ウェル細胞培養クラスター丸底プレート(Nunc社, Roskilde, デンマーク)の中で、30μL XL1ブルーコンピテント細胞へ添加し、氷上で30分間インキュベーションした。細胞を、42℃で90秒間ヒートショックさせ、氷へ移し、ルリアブロス(LB)培地200μLを添加した。細胞を、37℃で1時間インキュベーションし、その後アンピシリン(100μg/mL)を含有するLB寒天プレート上に塗沫した。30回を超える形質転換が同時に実行された時点で、アンピシリン(100μg/mL)を含有するLB寒天を、48区画を備えたQ-トレープレート(Molecular Dimensions社, Newmarket, CB8 7SQ, UK)へ注ぎ、使用した。プレートを、37℃で一晩インキュベーションし、コロニーを成長させた。
【０１３３】
各形質転換から2つのコロニーを採取し、且つ15mL Falconチューブ又は24-ウェルディープ-ウェルブロック(Promega UK社, Southampton, SO16 7NS, UK)中で、100μg/mLアンピシリンを含むLB培地7mL中で、37℃で一晩成長させた。プラスミドDNAを、Qiagen PlasmidPlus 96 Miniprep Kit (Qiagen社, Manchester, M15 6SH, UK)又はWizard PlusMiniprep DNA精製システム(Promega社)を使用し、一晩培養物の細胞ペレットから抽出し、所望の変異の存在を確認するために、変異したTSHR260 cDNAを、Source Bioscience社(Cambridge, CB4 0WU, UK)により配列決定した。変異体TSHR260-6Hisを含む大腸菌株のストックを、一晩培養物のアリコートへ、グリセロール(最終濃度14％)の添加後、-70℃で維持した。
【０１３４】
（PCRを使用する特異的アミノ酸変異の完全長ヒトTSHR配列への導入）
標準クローニング手順に従い、TSHR完全長ヌクレオチド配列(Oda Yらの文献、(1998) 前掲)を、pcDNA5.1/FRTベクター(Invitrogen社)へ、BamHI及びXhoI制限部位を用いてクローニングした。完全長配列内の変異を、変異誘発を96ウェルプレートフォーマットの代わりに0.2mL PCRチューブ内で行う以外は、TSHR260変異に関して先に記載したQuikChange II方式によるPCRを使用する部位特異的変異誘発により、作製した。PCR反応物を、形質転換し、増大し、これらの変異を、TSHR260 PCR産物に関して前述のように配列決定することにより検証した。完全長野生型TSHRのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列について、各々、図1(配列番号:1)及び図2(配列番号:2)参照。
【０１３５】
（Freestyle Max試薬を使用するTSHR260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション）
トランスフェクションの1日前に、1.5×105個CHO-K1細胞/ウェルを、24-ウェル細胞培養プレート(Nunc社)へプレーティングした。トランスフェクトされるべき各ウェルに関して、pcDNA3.1+(0.2μg/μL)中の5μL TSHR260-6His変異体を、20μL Optipro SFM(Life Technologies社, Paisley, PA4 9RF, UK)と混合した。Optipro SFM 22.5μL中に希釈したFreestyle Max試薬(Life Technologies社)2.5μLを、各DNA/Optipro SFM混合物へ添加し、室温で10〜20分間インキュベーションした。DNA/Freestyle Max混合物40μLを、24-ウェルプレート中のCHO-K1細胞に添加し、37℃で40〜48時間インキュベーションした。その後培地へと分泌された発現されたTSHRタンパク質を、13000rpmで2分間の遠心分離により収集し、細胞デブリを除去し、上清を-70℃で保存した。
【０１３６】
TSHR260-WT標準は、pcDNA3.1+中のTSHR260-6Hisによる90％コンフルエンスCHO-K1細胞を含む80cm2フラスコのトランスフェクションにより作製した。pcDNA3.1+(1μg/μL)中の20μL TSHR260-6Hisを、Optipro SFM(Life Technologies社)480μLに添加した。Optipro SFM 450μL中に希釈したFreestyle Max試薬(Life Technologies社)50μLを、DNA/Optipro SFM混合物へ添加し、室温で10〜20分間インキュベーションした。DNA/Freestyle Max混合物1mLを、CHO-K1細胞の80cm2フラスコへ添加し、37℃で40〜48時間インキュベーションした。その後培地へと分泌された発現されたTSHR260-6Hisタンパク質を、3000rpmで30分間の遠心分離により収集し、細胞デブリを除去し、上清を-70℃で保存した。これは、100U/mLと規定された。TSHR260-結合アッセイ(下記参照)において検出したように、更にTSHR260-WT標準試料を、最初のTSHR260-WT標準と同じ濃度に希釈した。
【０１３７】
（Flp-Inシステムを使用する完全長TSHR構築体のCHO細胞へのトランスフェクション）
Flp-In-CHO細胞(Invitrogen社, Paisley, PA4 9RF, UK；O'Gorman, S.、Fox, D. T.及びWahl, G. M.の文献、(1991) Science, 251: 1351-1355)のコンフルエンスフラスコを使用し、抗生物質を含まない、DMEM(Invitrogen社)、10％ウシ胎仔血清(FCS)(Invitrogen社)、1×L-グルタミン(Invitrogen社)及び1×非必須アミノ酸(NEAA)(Invitrogen社)の入った24ウェルプレートのウェルに1×105〜1.5×105個細胞/ウェルで播種した。細胞を、37℃、5％CO2及び湿度＞95％で一晩インキュベーションした。
【０１３８】
pcDNA5.1/FRT TSHR DNA(前記)及びpOG44 DNA(Invitrogen社)を希釈し、滅菌水中に、各々、0.01μg/mL及び0.1μg/mLの溶液を生じた。pOG44 DNA及びTSHR DNAを、(1)9μLのpOG44、10μLのTSHR DNA及び31μLのオプチメムI(Invitrogen社)；(2)8μLのpOG44、20μLのTSHR DNA及び22μLのオプチメムI；(3)9.5μLのpOG44、5μLのTSHR DNA及び35.5μLのオプチメムI：の3つの異なる濃度で混合し：、且つ室温で5分間インキュベーションした。オプチメムI中に1：25希釈したリポフェクタミン(Invitrogen社)50μLを、各チューブ(前記1-3)に添加し、且つ室温で20分間インキュベーションした。その後各インキュベーション混合物を、95％コンフルエンスのFlp-In-CHO細胞の1ウェル(24ウェルプレート中)に添加し、前述の条件下で一晩インキュベーションした。その後培養培地を除去し、DMEM、10％FCS、1×L-グルタミン、1×NEAA及び1×ペニシリン(100u/mL)/ストレプトマイシン(100μg/mL)(Invitrogen社)に交換し、続けて一晩インキュベーションした。その後細胞を、1×トリプシン/EDTA溶液(Invitrogen社)を用い、ウェルから剥離させ、4つの新規ウェルへ分け、600μg/mLヒグロマイシン(Invitrogen社)を添加した前述の培地において成長させた。
【０１３９】
pOG44プラスミドDNA及びpcDNA5.1/FRT TSHRの両方でトランスフェクションされた細胞は、TSHRをFlp-In-CHO細胞ゲノムへ挿入し、ヒグロマイシン耐性をこの細胞へ付与することが可能であり、そのためヒグロマイシン選択培地において成長することができる。Invitrogen社からのFlp-Inシステムを、本発明者らの構築体中のTSHRが、pOG44により、Flp-In-CHO細胞のFRT部位に挿入されるように設計する。Flp-In-CHO細胞は、1細胞につき1つのFlp-In部位を含み、そのためTSHR DNAは、各実験においてゲノム内で同じ場所に挿入され、且つこれは1細胞につき1コピーとして存在するであろう。このシステムは、最適発現レベルを伴う細胞に関する細胞コロニースクリーニング(その後の安定した細胞株を見つけるための細胞クローニング)は不要であるという利点を有する。結果的に、ヒグロマイシン選択培地中で成長する変異されたTSHRを発現している細胞は、迅速に増大され、且つ様々なアッセイにおいて使用できる。
【０１４０】
（TSHR260結合アッセイにおいて使用される抗体）
（14C4）
TSHR260-結合アッセイにおいて使用される14C4 TSHRマウスモノクローナル抗体は、cDNA免疫化により調製した。簡単には、6〜8週齢のNMRI(非近交系)マウスに、10μMカルディオトキシン100μLを、筋肉内注射し、その5日後完全長TSHR cDNA (pRC/CMVhTSHR；Odaらの文献、(1998) 前掲)100μgにより、筋肉内免疫化した。TSHR DNA免疫化は、3週間間隔で、合計5回注射を繰り返した(Hasanらの文献、(1999) J. Immunol. Methods, 229:1-22)。TSHRに結合する125I-標識したTSHの阻害により、マウス出血液(bleeds)を、TSHR抗体の存在下について試験した(RSR社, Cardiff, UKにより製造されたアッセイ)。モノクローナル抗体を、血清中最高TSHR抗体力価を持つマウス由来の脾臓細胞を用いて作製した。単離した脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞系(X63_Ag8.653；ECACC, Porton Down, UK)と比1：2で混合し、先に説明された方法(de St Groth, S. F.及びScheidegger, D.の文献、(1980) Journal of immunological methods, 35, 1-21)に従い、10％DMSO及び50％PEG(Sigma Aldrich社, Poole, UK)を用いて融合した。細胞を、DMEM(ハイブリッドを選択するためにHATを含有する20％ウシ胎仔血清を補充した)中で培養し、48-ウェルプレートにプレーティングした。14C4を得るために、細胞培養物由来の上清を、125I-TSH標識されたTSHR複合体の免疫沈降により、TSHR抗体に関してスクリーニングした。これらのアッセイにおいて、完全長TSHRは、125I-TSHを用いて標識し、125I-TSH-TSHR複合体を形成する。125I-TSH-TSHR複合体は、TSHと同時にTSHRへの結合が可能である抗体により結合される。次にこの複合体を、標準PEG沈降技術を用い、沈殿させることができ、ペレット中の放射能を測定する。陽性ウェル由来の細胞を、限界希釈により2回再クローニングし、必要なモノクローナル抗体を発現しているクローンを得る。14C4 IgGは、TSHRの凸面上の立体配座エピトープに結合し、同時にTSH又は患者TRAbのTSHRの凹面への結合を可能にする。14C4は、RSR社(Cardiff, UK)から入手可能である(www.rsrltd.com)。
【０１４１】
（M22タンパク質データバンク(PDB)寄託番号3G04）
(www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3go4)
M22(hMAb TSHR1)は、グレーヴス病患者由来の末梢血リンパ球から得られた、ヒト甲状腺刺激モノクローナル自己抗体である(Sandersらの文献、(2003) Lancet 362: 126-128)。簡単に述べると、リンパ球を、甲状腺機能亢進症で高レベルのTSHR自己抗体(グレーヴス病が原因)を有する19歳男性の末梢血20mLから単離した。これらのリンパ球を、エプスタイン・バー・ウイルスにより感染させ、標準技術(Hayakawa Nらの文献、(2002) Autoimmunity, 35: 343-55)を使用し、マウス/ヒトハイブリッド細胞株(K6H6/B5；ECACC, Porton Down, UK)と融合させた。これらの細胞を、48-ウェルプレートにプレーティングし、上清を、TSHRコートされたチューブに結合する125I-TSHの阻害によりスクリーニングした(アッセイ RSR社, Cardiff, UK)。次に陽性ウェルを、高濃度のTSHR自己抗体M22を産生する単独コロニーが単離されるまで、限界希釈により再クローニングした。M22(hMAb TSHR1)は、甲状腺刺激抗体に関するWHO第2回国際標準NIBSCコード：08/204として、当該技術分野において周知である(Burns Cらの文献、(2010)、甲状腺刺激抗体に関する提唱された第2回国際標準のWHO国際協同研究、生物学的標準化に関する専門家会議、Geneva、2010年10月18〜22日、WHO/BS/10.214、下記で入手可能：www.who.int/biologicals/expert_committee/BS_2142_Thyroid_Stimulating_Autoantibody.pdf)。M22(hMAb TSHR1)は、RSR社(Cardiff, UK(前掲))から購入可能である。
【０１４２】
（熱安定性）
本発明の文脈において、熱安定性は、一般に言われるように、変異体TSHR又はその断片(TSHR260変異体など)が、指定された時間、所定の温度に曝された後で、その正常な生物活性を保持する能力である。好適には、温度曝露後に残存する活性変異体タンパク質の割合により決定することができる。活性変異体タンパク質の量の一つの好適な測定は、結合アッセイにおいて、抗体又は自己抗体をTSHRへ結合する能力を保持する変異体タンパク質の割合である。従って所定の温度への曝露後に残存する活性変異体タンパク質の量は、時間の関数として測定することができ、且つその温度での熱安定性曲線−例えば図7に示したもの−が得られる。従って変異体タンパク質の半減期−すなわち、活性タンパク質の量がその最初の値の50％まで低下する(すなわち、50％は失活又は変性される)のに要する時間−が、誘導され得る。変異体タンパク質の半減期は、タンパク質の熱安定性の簡便な定量的測定をもたらし、且つこれは、熱安定性が増大又は減少したかを評価するために、同等の変異されないTSHR又はその断片(すなわち、野生型TSHR又はその断片、例えば野生型TSHR260など)の半減期と比較することができる。
【０１４３】
好適な結合アッセイは、例えば、試験される変異体TSHR又はその断片に結合されたプレート、及びTSHRに対する標識された抗体又は自己抗体、並びにそのような本発明のアッセイフォームの一部を含むことができる。試験される変異体は、抗体の変異体タンパク質への結合を妨害しない様式で、プレートへ好適に結合される。変異体は、例えばいずれか好適な抗体を使用しプレートへ結合されてよく、且つそのような抗体のひとつは前述の14C4である。当業者には明らかであるように、結合された標識された抗体の量を用い、活性変異体タンパク質の量を示すことができる。好ましくは、M22(前述のような)など、TSHRに対する標識されたモノクローナル自己抗体を使用し、アッセイされる変異体タンパク質へ結合する。かかるアッセイの原理は、例えば、図12a及び12b、図13a及び13b、並びに図14a、b、c及びdに示されている。先の図面に示されたアッセイの具体的詳細は変動するが、各場合における変異体タンパク質の熱安定性は、TSHRに対する抗体又は自己抗体(M22など)に結合する能力を保持しているタンパク質の量を測定することにより、変異体タンパク質と野生型を比較することにより誘導することができる。
【０１４４】
本発明において、用語「熱安定性」及び「熱安定な」(及び「増大した熱安定性」などの関連用語全て)は、試験温度でのTSHRに対する抗体又は自己抗体に結合する能力を保持している変異体TSHR又はその断片(又は同等の野生型タンパク質)の量を決定する結合アッセイにおいて、同じ条件下で測定した、同等の野生型TSHR又はその断片の半減期と比較した、変異体TSHR又はその断片(TSHR260など)の半減期に関する定量的意味であることは理解されるべきである。好ましくは、この変異体の結合能の試験に使用される自己抗体は、M22、K1-70又はK1-18である。
【０１４５】
前述のように変異体TSHR又はその断片の半減期を決定することができるいずれか好適な結合アッセイを、使用することができる。本発明の目的のために、本発明者らは、この種の特異的結合アッセイを利用し、且つこれらは以下に完全に説明されている。これらの結合アッセイは、原則として、任意の変異体TSHR又は断片(完全長、TSHR260、又はTSHR260よりも長いか短い配列長のいずれか)の熱安定性を決定するために利用することができる。
【０１４６】
TSHR260変異体などのTSHRの断片に関して、本発明者らは、下記の熱安定性プロトコール及びTSHR260-結合アッセイを利用し、熱安定性を決定した。本発明は、主にTSHR260変異体に関して説明されているが、熱安定性プロトコール及び結合アッセイは、同じ様式で配列長が変動する他のTSHR断片に使用することができることは理解されるであろう。
【０１４７】
完全長TSHR及び完全長変異体に関して、本発明者らは、以下の「14C4-Fab2 ELISAプレート上にコートされた完全長TSHR及び変異体の熱安定性」及び「完全長TSHR変異体の熱安定性」において説明されたものに類似の、しかし改変された結合アッセイを利用した。このアッセイにおいて、大きな差異は、完全長試料は、試験温度まで加熱する前に、プレートに結合されることである。
【０１４８】
（TSHR260-結合アッセイ）
Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の1μg/mL 14C4 Fab2 (Jeffreys Jらの文献、(2002) Thyroid, 12: 1051-1061、及びSanders Jらの文献、(2007) 前掲)の150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、次に4℃で一晩インキュベーションした。ウェルは、洗浄緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス pH7.8；1％v/v トリトンX-100)により3回洗浄し、且つ被験試料(一過性トランスフェクションされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR260-6His)150μLを、各ウェルに適用し、室温で1時間インキュベーションし、TSHR260を14C4-Fab2へ結合させた。次にウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、1g/L BSA、50mg/L正常マウスIgG)及び健常血液ドナー血清プール(NPS)75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で、1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後、これらのウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、M22 Fab-ペルオキシダーゼコンジュゲート(M22-POD、RSR社, Cardiff, CF23 8HE, UK)の100μLを各ウェルに添加した。振盪せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。50μLの0.5M H2SO4の添加により、反応を停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で450nmで測定した(図12a)。
【０１４９】
（結合及び安定性スクリーン）
一過性トランスフェクションされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR260-6His試料を、CHO-K1培地((-)DMEM、10％FBS、2×グルタチオン、1×ペニシリン／ストレプトマイシン、1×NEAA)中に、1/4希釈した。各試料に関して、100μLアリコートを、42℃で30分間加熱し、その間二番目の同一試料を氷上に維持した。次に試料を、TAT緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、1g/L BSA、0.2g/Lアジ化ナトリウム)中に1/5希釈し、150μLアリコートを、前述のように実行したTSHR260-結合アッセイに2つ組で適用した(図12a)。検出されたTSHRタンパク質の量(前記TSHR260結合アッセイ参照)を、i)TSHR260-WT標準の割合、及びii)加熱後に残存する活性TSHRタンパク質の画分として表現した。これを、加熱後に残存するTSHR260-WT標準の画分と比較し、TSHR260-WT標準安定性の割合として変異体安定性を生じた。検出された活性TSHRタンパク質の量が、正確に決定されるにはあまりにも高いか低い場合は、この結合アッセイを、TSHR260変異体の異なる希釈で繰り返した。
【０１５０】
（TSHR260変異体の熱安定性）
CHO-K1細胞において一過性に発現され且つ前述のように上清から収集されたTSHR260変異体を、CHO-K1培地中に25％TSHR260-WT標準(前記参照)まで希釈した。100μLアリコートを、37℃で0〜30日間、又は42℃、50℃、55℃、若しくは60℃で0〜3時間加熱した。次に試料を、TAT緩衝液(試料87.5μL＋TAT緩衝液350μL)中に1/5で希釈し、150μLアリコートを、2つ組で前述のTSHR260-結合アッセイ(図12b)に適用した。アッセイデータを、時間に対してプロットし、指数関数曲線にフィットさせ、且つ変異体の半減期(t1/2)を計算し、TSHR260-WT、TSHR260-I253R又はTSHR260-JMG45と比較した(表5に規定)。
【０１５１】
（発現されたTSHRの総量(活性＋不活性)を決定するドットブロットアッセイ）
TSHR260変異体の発現レベルを、Bio-Dotマイクロ濾過装置(Bio-Rad Laboratories社, Hemel Hempstead, HP2 7DX, UK)を使用する、ドットブロットアッセイにより決定した。前述のトランスフェクトされた細胞培養物から収集したTSHR260-6His調製品の50μLアリコートを、Bio-Dot装置に適用し、重力流により、ニトロセルロースメンブレンを通した。続いて、これらの試料を、重力流により、リン酸緩衝食塩水(PBS、8g/L NaCl、1.15g/Lリン酸水素二ナトリウム、0.2g/Lリン酸二水素カリウム、0.2g/L塩化カリウム、pH7.4)50μLと共に流した。次にメンブレン上の試料を、洗浄緩衝液(PBS中0.5％(v/v)Tween)400μLにより洗浄し、真空を適用し、メンブレンを通して洗浄緩衝液を吸引した。次にメンブレンを、Bio-Dot装置から取り外し、PBS中の0.1mg/Lポリ酢酸ビニルとのインキュベーションにより、穏やかに振盪しながら、1分間ブロックした。このメンブレンを、洗浄緩衝液で洗浄し(3×3分間、室温、振盪しながら)、抗体緩衝液(PBS中180g/L D-グルコース、10％(v/v)ウシ胎仔血清、10％(v/v)〜87％グリセロール、0.5％(v/v)Tween)中に希釈した一次抗体であるTSHRモノクローナル抗体18C5-IgG(0.01mg/mL)又は8E2-IgG(0.02mg/mL)(Jeffreys Jらの文献、(2002) 前掲)と共に、室温で振盪しながら1時間インキュベーションした。再度メンブレンを、洗浄緩衝液で洗浄し(3×3分間、室温、振盪しながら)、その後PBS中の二次抗体であるヤギ抗-マウスHRP(0.04μg/mL, Sigma社)と共に室温で振盪しながら1時間インキュベーションした。再度洗浄緩衝液でメンブレンを洗浄した後(3×3分間、室温、振盪しながら)、メンブレンを、化学発光基質であるSuper Signal West Pico Stable Peroxide(ThermoScientific社)及びSuper Signal West Pico Luminal Enhancer (ThermoScientific社)と共にインキュベーションした。
【０１５２】
18C5-IgG及び8E2-IgGは、TSHR260の線状エピトープに結合し、そのためそれらの結合は、TSHRタンパク質のアンフォールディングにより影響を受けない。18C5-IgGは、TSHR残基246-260により形成された線状エピトープを認識するが、8E2-IgGは、TSHR260のN-末端の残基36-42上の線状エピトープに結合する。これら2つの抗体を組合せて使用すると、変異誘発後のTSHRタンパク質フォールディングにおける可能性のある変化に関わりなく、ブロット上のTSHR260の検出(すなわち、活性＋不活性TSHRの検出)が可能である。
【０１５３】
（14C4-Fab2 ELISAプレート上にコートされた完全長TSHR及び変異体の熱安定性）
完全長野生型TSHR及び変異型TSHR(JMG37、JMG45及びJMG52)の「オン-プレート」安定性を試験するために、96-ウェルMaxisorp ELISAプレート(Nunc社)を、以下のようにコートした。14C4 Fab2を、コーティング緩衝液中に1μg/mLまで希釈し、96-ウェルELISAプレートの各ウェルへ、150μLアリコートとした。これを、室温で3時間インキュベーションし、引き続き4℃で一晩インキュベーションした。ELISAプレートウェルを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、未結合の抗体を除去した。野生型及び変異型TSHR試料を、-80℃から取り出し、室温で解凍し、氷上に配置した(0℃)。次にTSHR試料を、TAT緩衝液中に希釈した。各希釈物150μLを、4個のELISAプレートウェルへピペッティングし、4℃で一晩インキュベーションした。プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、14C4 Fab2に結合していないTSHRを除去した。TAT緩衝液を、各ウェルに添加し(150μL)、次に接着プレートカバーを適用して、ウェルを密封した。次に各プレートを、42℃又は50℃に設定したインキュベーター内に配置した。96-ウェルプレートの1ストリップ(8ウェル)を、各プレートから、5、10、15、20、30、45、60、90、120及び180分後に取り外し、スペアELISAプレートラックに挿入し、これを次に氷上に維持した。180分間の時間経過が完了した後、受容体希釈緩衝液を、ELISAウェルから吸引した。
【０１５４】
次にアッセイ緩衝液(75μL)を、各ウェルに添加し、引き続き健常血液ドナー血清プール(75μL)を添加し、室温(20〜25℃)で、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながら、1時間インキュベーションした。ウェル内容物を廃棄し、1回洗浄緩衝液で洗浄し、M22-POD(RSR社)の100μLを、各ウェルに添加した。室温で振盪せずに25分間インキュベーションした後、プレートウェルを、洗浄緩衝液で2回、次に水で1回洗浄した。その後テトラメチルベンジジン100μLを、各ウェルに添加し、25分間インキュベーションした。この反応を、50μlの0.5M H2SO4で停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で450nmで測定した(安定性アッセイA、図14b)。
【０１５５】
（TSHR260及び完全長TSHR変異体に結合するM22-POD、K1-18-POD及びK1-70-POD）
Maxisorp ELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の1μg/mL 14C4 Fab2の150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。TSHR260変異体を、CHO-K1培地中に希釈し、次にTAT緩衝液中に1/5希釈した。或いは、完全長TSHR変異体を、TAT緩衝液中に希釈した。ウェルを洗浄し、TSHR260又は完全長TSHR被験試料150μLを、各ウェルに適用し、且つ室温で1時間インキュベーションし、TSHR260又は完全長TSHRを14C4-Fab2へ結合させた。次にこれらのウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL及び健常血液ドナー血清75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、100μLのM22-POD(RSR社)、K1-18ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-18-POD；RSR社)又はK1-70ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-70-POD；RSR社)の濃度範囲10μg/mL〜1ng/mLと共に、インキュベーションした。振盪せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、テトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。この反応を、0.5M H2SO4の50μLの添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で、450nmで読み取った。非特異的結合に関して、CHO-K1培地を、TAT緩衝液中に希釈し、TSHR260変異体又は完全長TSHR変異体に関するように、陰性対照として、ウェルに適用し、変動する濃度のM22-POD、K1-18 POD又はK1-170 PODとのインキュベーションを含む、同じ様式で処理した。GraphPad Prism(GraphPad Software社, La Jolla, CA, USA)を使用し、M22-POD、K1-18-POD及びK1-70-PODに関する結合曲線をプロットし、マッチした濃度のM22-POD、K1-18 POD又はK1-70 PODとインキュベーションしたTSHR260又はTSHR試料のOD450から、陰性CHO-K1対照のOD450を減算することにより、非特異的結合について補正した。非線形回帰(1-部位特異的結合飽和曲線)を使用し、平衡結合定数(Kd)を計算し、これは、受容体(完全長TSHR又はTSHR260変異体)の半分がリガンドに結合されるリガンド(M22-POD、K1-18-POD又はK1-70-POD)の濃度である。Kdは、1/Kaに等しく、ここでKaは親和定数である(図12a及び図14a)。
【０１５６】
（TSHR260-結合アッセイにおけるTSHR260変異体へのM22-POD結合のM22 IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG及びTRAb陽性患者血清での阻害）
ELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の1μg/mL 14C4 Fab2の150μLアリコートでコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。TSHR260-WT、TSHR-JMG37、TSHR-JMG45、TSHR-JMG52及びTSHR-JMG55を、培地中に希釈し、引き続きTAT緩衝液中に1/5希釈した。ウェルを洗浄し、完全長TSHR被験試料150μLを、各ウェルに適用し、室温で1時間インキュベーションし、TSHR260を14C4-Fab2へ結合させた。次にこれらのウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL及びTRAb陽性患者血清又はNPS中に希釈したM22 IgG、K1-18 IgG若しくはK1-70 IgG (1000ng/mL〜0.1ng/mL)の75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、89.5ng/mL M22-POD(RSR社) 100μLを各ウェルに添加した。振盪せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。この反応を、0.5M H2SO4の50μLの添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で、450nmで読み取った(図12c)。
【０１５７】
（完全長TSHR変異体へのM22-POD結合のM22 IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG及びTRAb陽性患者血清での阻害）
ELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の1μg/mL 14C4 Fab2の150μLアリコートでコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。完全長TSHR-WT、TSHR-JMG37、TSHR-JMG45及びTSHR-JMG52を、TAT緩衝液中に希釈した。ウェルを洗浄し、完全長TSHR被験試料150μLを、各ウェルに適用し、4℃で一晩インキュベーションし、完全長TSHR変異体を14C4-Fab2へ結合させた。次にこれらのウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL及びTRAb陽性患者血清又はNPS中に希釈したM22 IgG、K1-18 IgG若しくはK1-70 IgG(1000ng/mL〜0.1ng/mL)の75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、89.5ng/mL M22-POD(RSR社) 100μLを各ウェルに添加した。振盪せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。この反応を、0.5M H2SO4の50μLの添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で、450nmで読み取った(図14e)。
【０１５８】
（TSHR刺激の分析）
Flp-Inシステムを使用する変異されたTSHR構築体のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へのトランスフェクションは、WO2006/016121Aに記載されている。
【０１５９】
TSH、モノクローナルTRAb(M22及びK1-18)及び患者血清が、ヒトTSHRによりトランスフェクトされたCHO細胞におけるサイクリックAMPの生成を刺激する能力を、WO2004/050708A2に記載されたように試験した。TSHR変異体を発現しているCHO細胞を、96-ウェルプレートに、2〜3×105個細胞/ウェルでプレーティングし、100％コンフルエンスとなるまで48時間成長させた。被験試料(TSH、M22-Fab、K1-18 IgG又は患者血清)を添加し(サイクリックAMPアッセイ緩衝液、すなわち、1g/Lグルコース、20mM HEPES、222mMショ糖、15g/Lウシ血清アルブミン及び0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチンを含有するNaCl非含有ハンクス緩衝塩溶液(pH7.4)中に希釈した100μL)、且つ37℃で1時間インキュベーションした。被験溶液の除去後、細胞を、200μL溶解緩衝液(0.37％HCl、1％(v/v)トリトンX-100)と、室温で振盪しながら30分間インキュベーションすることにより溶解し、溶解液中のサイクリックAMP濃度を、Enzo Life Sciences社からのダイレクトサイクリックAMP Elisaキットを用いてアッセイした。結果は、細胞溶解液(200μL)中のサイクリックAMPのpmol/mLとして表した。これらの実験は、野生型TSHRを発現しているCHO細胞を使用し実行された類似実験と比較した。各アッセイは、少なくとも2回実行した。GraphPad Prismを使用し、非線形回帰を用い、TSH、M22及びK1-18のデータに対し、用量-反応曲線をフィットさせた。これは、各作用物質(TSH又はモノクローナルTRAb)のEC50、すなわち、最大とベースラインのサイクリックAMP濃度の間の半分の反応を生じる作用物質の濃度を計算することが可能であった。
【０１６０】
（ヒトTSHRタンパク質配列の他の生物のTSHRタンパク質配列、並びにヒトFSHR配列及びヒトLHR配列に対するアラインメント）
ミドリザル、アカゲザル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ及びウマ由来のTSHRのタンパク質配列(図10；配列番号:47-56)並びにヒトFSHR(図11；配列番号:57)及びヒトLHR(図 11；配列番号:58)由来のタンパク質配列を、Uniprotデータベースから入手し、DNAStar MegAlign(v. 9.1, DNAStar社, Madison, WI, USA)を用い、ヒトTSHRのタンパク質配列(図2；配列番号:2)と並置した。
【０１６１】
（TSHR260-アルカリホスファターゼ(TSHR260-AP)構築体の作製）
本発明の標識された変異体の一例(アルカリホスファターゼ標識を含むTSHR260)を、以下に説明しているが、望ましいならば、異なる標識及び異なる長さの変異体TSHR(完全長TSHRを含む)を使用することができることは理解されるであろう。他の標識は、例えば、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から選択されてよく、このようなものは当該技術分野において公知である。かかる標識は、いずれか適切な様式、例えば、好適な構築体を使用する遺伝子融合を介して(更に以下に記載)又は化学標識により、追加することができる。当業者は、特定の標識に必要な関連技術を熟知しているであろう。いずれか好適なビオチン化プロセスに関与するビオチン標識を、使用してよい。
【０１６２】
TSHR260-アルカリホスファターゼ(phosphate)(AP)構築体の作製に使用される方法は、WO2010/073012A2に記載されており、その引用は更なる詳細を示すことができる。
【０１６３】
TSHR260構築体(ヒトTSHRのコーディングアミノ酸1-260；アミノ酸1-21はリーダー配列である)(各々、野生型TSHR260のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列について図3及び4；配列番号:3及び4)を、完全長ヒトTSHRを鋳型として用いて増幅し(Oda Y,らの文献、1998. Journal of Molecular Endocrinology, 20: 233-244)、クローニングベクターpSEAP2-basic(Clontech社)を鋳型として使用し、分泌型アルカリホスファターゼのコーディング配列(17アミノ酸のアルカリホスファターゼリーダー配列を除く)に連結した。2つのPCR反応を実行し、第一のものは、N-末端にEcoRI制限部位、及び1つのアミノ酸リンカー(アスパラギン)及びC-末端に分泌型アルカリホスファターゼの最初の8アミノ酸(17アミノ酸リーダー配列を除く)を追加する、特異的プライマー
【化２】
2017520246.tif 000004
(Sigma Genosys社)により、増幅された完全長TSHRを使用した。第二のPCRは、分泌型アルカリホスファターゼのN-末端にTSHRのアミノ酸254-260及び1アミノ酸リンカー(アスパラギン)、並びに6ヒスチジンタグ、停止コドン、及び分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子のC-末端にXhoI制限部位を追加する、プライマー
【化３】
2017520246.tif 000005
により増幅された、クローニングベクターpSEAP2-basicを使用し、実行した。これらのPCR反応は、94℃で1分間、40℃で1分間、72℃で1分間を30サイクル、その後72℃で7分間で行った。PCR産物を、1％アガロースゲル上を泳動させ、DNAを、製造業者の指示に従いGeneclean IIキット(Anachem社, Luton)を用いて抽出した。その後精製されたPCR産物1及び2を使用し、全TSHR260-アルカリホスファターゼ遺伝子を構築するために、第三のPCRを設定した。このPCR 3反応は、PCR 1産物200ng及びPCR 2産物200ngを含み、PCR 3は、94℃で1.5分間、65℃で1.5分間及び72℃で1.5分間で7サイクル実行した。その後温度を、再度94℃まで2分間上昇させ、プライマー1及びプライマー4を添加し、その後94℃で1分間、52℃で1分間及び72℃で2分間を30サイクル行った。PCR 3産物は、EcoRI及びXhoI制限部位を用い、pFastBac1へクローニングし、且つ変異の存在を、サンガー-クールソン法(Sanger Fらの文献、1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74: 5463-5467)による配列決定を用い証明した。組換えDNAは、WO2008/025991A1に記載のように、Bac-to-Bacバキュロウイルス発現系(Invitrogen社, UK)を用いて作製し、Sf-9細胞へトランスフェクトし、組換えバキュロウイルスストックを入手し且つ増幅した。TSHR260-APは、WO2008/025991A1に記載のように昆虫細胞において発現した。
【０１６４】
（安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製）
特異的変異をTSHR260-AP構築体のTSHR配列(図15及び16；配列番号:59及び60)へ導入するために使用した方法は、TSHR260変異に関して先に説明したものである。TSHR変異(図5及び6；配列番号:14、16、18、19、20、23、27、32、34、36、37、38、41及び45)は、TSHR260-AP構築体へ逐次導入し、以下に詳述した8種の異なる構築体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR-AP-JMG57及びTSHR260-AP-JMG58)を生じた。アミノ酸残基の番号付けは、そのアミノ酸が未変性の野生型TSHR配列において認められる位置を指す：
TSHR260-AP-I253R＝TSHR260-AP＋I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
TSHR260-AP-JMG22＝TSHR260-AP＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
TSHR260-AP-JMG37＝TSHR260-AP＋R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
TSHR260-AP-JMG45＝TSHR260-AP＋R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及び45)
TSHR260-AP-JMG52＝TSHR260-AP＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
TSHR260-AP-JMG55＝TSHR260-AP＋H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
TSHR260-AP-JMG57＝TSHR260-AP＋H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
TSHR260-AP-JMG58＝TSHR260-AP＋H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)。
【０１６５】
（TSHR260-AP架橋ELISAにおいて使用される抗体）
（4E31）
4E31抗体は、TSHRのC-末端の残基603-764(C-TSHR)に対するマウスモノクローナル抗体であり、これは完全長TSHRをELISAプレートウェル上に固定するために使用することができる(EP 1021721B1、Boltonらの文献、(1999) 前掲)。マウスの免疫化のために、C-TSHRを、標準プロトコールを使用し、グルタチオンS-転移酵素(GST)との融合タンパク質として、大腸菌において発現させた(Oda Yらの文献、(1998) 前掲)。最後の162アミノ酸をコードしているcDNAの3’末端(1809-2295 bp)は、pGEX2Tベクター(Pharmacia Biotech社, St. Albans ALI 3AW UK)において、GST融合タンパク質とインフレームでクローニングした。pGEX-2T/C-TSHRプラスミドで形質転換した大腸菌(UT580株)を一晩培養したものを、2×YTG培地(16g/Lトリプトン、10g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、20g/L グルコース、pH7.0)へ1/5希釈し、30℃で3時間インキュベーションした。その後、C-TSHR/GST融合タンパク質発現を誘導するために、イソプロピル-3-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を、最終濃度1mMとなるよう添加し、引き続き更に3時間インキュベーションした。この細菌ペレットを、1％(v/v)トリトンX-100を含有するPBS(8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na2HPO4、0.24g/L KH2PO4、pH7.4)中に再浮遊させ、氷上で1分間3回音波処理した。封入体をペレット化し、4M尿素で洗浄し、8M尿素中で可溶化させ、還元条件下の9％ポリアクリルアミドゲル(SDS-ポリアクリルアミド電気泳動、SDS-PAGE)上で分離した。C-TSHR/GST融合タンパク質(MW 44kDa)を、0.1M NaHCO3及び0.1％ SDS(pH7.8)中のポリアクリルアミドゲル切片から電気溶出させ、50mMトリス-HCl(pH8.0)に対し透析し、-70℃でアリコートで保存した。
【０１６６】
4E31抗体は、電気溶出したC-TSHR/GST融合タンパク質による免疫化により調製した。簡単には、BALB Cマウスを、TSHR抗体の力価が高くなるまで、50μg C-TSHR/GST/1匹マウス/1回注射で、免疫化した。このマウス出血液を、インビトロ転写/翻訳システムにおいて生成された35S-標識されたTSHRを基にした、免疫沈降アッセイを用いて試験した(Prenticeらの文献、(1997) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84:1288-1292)。標準技術を用い、マウス脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞系(X63_Ag8.653；ECACC, Porton Down, UK)と融合させ、クローニングし、モノクローナル抗体を分泌する安定したハイブリドーマを作製した(Odaらの文献、(1998) 前掲)。4E31は、RSR社(Cardiff, UK (前掲))から購入可能である。
【０１６７】
（K1-70）
K1-70は、甲状腺機能低下症患者の末梢血リンパ球から入手された、TSHRに対する遮断型ヒトモノクローナル自己抗体である(Evansらの文献、(2010) Clinical Endocrinology, 73: 404-412；EP2367850)。簡単には、リンパ球を、54歳の甲状腺機能低下症で高レベルのTSHR抗体を持つ患者の末梢血20mLから単離した。リンパ球を、エプスタイン・バー・ウイルスにより感染させ、標準技術を使用し、マウス/ヒトハイブリッド細胞株(K6H6/B5；ECACC, Porton Down, UK)と融合させた(Hayakawa Nらの文献、(2002) 前掲)。これらの細胞を、48-ウェルプレート上にプレーティングし、TSHRコートされたチューブに結合する125I-TSHの阻害を基にしたアッセイを使用し、上清をスクリーニングした(アッセイキットはRSR社(Cardiff, UK)から入手可能)。次に陽性ウェルを、高濃度のTSHR自己抗体K1-70を生成する単独コロニーが単離されるまで、限界希釈により再クローニングした。K1-70は、RSR社(Cardiff, UK (前掲))から購入可能である。
【０１６８】
（M22）
詳細は先の「TSHR260結合アッセイにおいて使用した抗体」に記載。
【０１６９】
（TSHR260-APを基にした架橋ELISA）
架橋ELISAを、先に記した方法を基に使用した(図13a、Rees Smith, Bらの文献、(2009) 前掲、WO2010/073012A2)。このELISAは、二価TSHR抗体の、ELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに対する1つの抗原結合部位に、及び液相中のTSHR260-APへの他の抗原結合部位に、結合する能力、すなわち、架橋を形成する能力を基にしている。CHO細胞において発現された完全長界面活性剤-可溶化された受容体の形のTSHRを、前述のC-末端抗体4E31を介して、ELISAプレートウェル上にコートした(Bolton, Jらの文献、(1999) 前掲)。このアッセイにおいて、出発緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス(pH7.8)；1g/L BSA；50mg/L正常マウスIgG；1％トリトンX-100(pH7.8))75μL及び被験試料(健常血液ドナー血清のプール中に希釈した又はアッセイ緩衝液[50mM NaCl、20mM トリス(pH7.8)、1％トリトンX-100、1g/L BSA]中に希釈した患者血清又はモノクローナル抗体)75μLを、完全長界面活性剤-可溶化されたTSHRによりコートされたELISAプレートウェルに添加し、室温で2時間、振盪しながら(500rpm)インキュベーションした。次に、ウェルの内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1％トリトンX-100)で3回洗浄し、引き続きTSHR260-AP(0.2g/L MgCl2-6H2O及び2g/L BSAを含有する洗浄緩衝液中に希釈した)100μLを添加した。室温で1時間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした後、ウェルを空にし、洗浄し(3回)、且つp-ニトロフェニルリン酸(pNpp)基質(Europa Bioproducts社, Ely, Cambridge UK)100μLを添加し、このプレートを暗所で45分間インキュベーションした。その後、停止溶液(1M NaOH)100μLを添加し、吸光度を、ELISAプレートリーダーにおいて405nmで読み取った。結果を、OD405nm吸光度値として表し、各試料中のTRAbの濃度を、ヒトモノクローナルTSHR自己抗体K1-70により作製された標準曲線を使用し、計算した。
【０１７０】
（TSHR260-AP変異体の熱安定性）
前述のように昆虫細胞において発現され且つ上清から収集されたTSHR260-AP変異体(配列番号に関して「安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製」参照)を、0.2g/L MgCl2-6H2O及び2g/L BSAを含有する洗浄緩衝液中に希釈し、TSHR260-AP架橋ELISAにおいて好適な吸光度を生じた(図13b)。150μLアリコートを、50℃、60℃、又は65℃で、0〜3時間加熱した。試料100μLを、2つ組で、前述のTSHR260-AP架橋ELISAに適用した(図13b)。アッセイデータを、時間に対してプロットし、指数関数曲線にフィットさせ、変異体の半減期(t1/2)を計算し、TSHR260-AP WT(図15及び16；配列番号:59及び60)、TSHR260-AP-JMG22又はTSHR260-AP-JMG45(「安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製」において先に規定)と比較した。
【０１７１】
（TSHR260架橋阻害ELISA）
前述のTSHR260架橋ELISAは、複合されないTSHR260及びTSHR260-Mab複合体を検出する阻害ELISAを形成するために改変することができる(図13c)。このアッセイにおいて、出発緩衝液(TRAb ELISAについて記載；Bolton J,らの文献、(1999) 前掲)75μL及び1μg/mL M22 IgG又は1μg/mL K1-70 IgGの75μLを、完全長界面活性剤-可溶化TSHRでコートされたELISAプレートウェルへ添加し、且つ室温で30分間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした。次にウェルの内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1％トリトンX-100)で洗浄し、引き続き被験試料(すなわち、非標識化TSHR260又はTSHR260-Mab複合体)を1ウェルにつき100μL添加した。室温で1時間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした後、ウェルの内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、TSHR260-AP(0.2g/L MgCl2-6H2O及び2g/L BSAを含有する洗浄緩衝液中に希釈した)100μLを添加した。室温で30分間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした後、ウェルを空にし、洗浄し(3回)、且つp-ニトロフェニルリン酸(pNpp)基質(Europa Bioproducts Ltd, Ely, Cambridge UK) 100μLを添加し、このプレートを45分間インキュベーションした。その後、停止溶液(1M NaOH)50μLを添加し、吸光度を、ELISAプレートリーダーにおいて405nmで読み取った。未標識のTSHR260を含む被験試料による標識されたTSHR260結合(すなわち、TSHR260-AP)の阻害は、以下のように表現した：100×(1−緩衝液のみの405nmの吸光度に対する被験試料の405nm吸光度の比)。
【０１７２】
最初の出発材料と、陰イオン又は陽イオン交換のいずれかのクロマトグラフィー上で精製した後の溶出したTSHR260のプールの、異なる容積でのTSHR260活性の比較を容易にするために、各被験試料の活性は、希釈していない溶出物質に対する希釈係数として表した。
【０１７３】
（ヒトTSHRの凸面に対するモノクローナル抗体の作製）
TSHR260の部分精製において使用したTSHRの凸面に対する2H11、25E1、23H4、9B7及び36F11 TSHRマウスモノクローナル抗体を、cDNA免疫化により調製した。簡単には、6〜8週齢のOF1(非近交系)マウスに、10μMカルディオトキシン100μlを、筋肉内注射し、その5日後完全長TSHR cDNA (pRC/CMVhTSHR；Odaらの文献、(1998) 前掲)100μgにより、筋肉内免疫化した。TSHR DNA免疫化は、3週間間隔で、合計5回注射を繰り返した(Hasanらの文献、(1999) J. Immunol. Methods, 229:1-22)。TSHRに結合するビオチン-標識した14C4 IgGの阻害により、マウス出血液を、TSHRの凸面に対する抗体の存在について試験した(RSR社, Cardiff, UKにより製造されたアッセイ)。モノクローナル抗体を、血清中に最高TSHR抗体力価を持つマウス由来の脾臓細胞を用いて作製した。単離した脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞系(Sp2/O-Ag14))と、標準手順(de St Groth, S. F.及びScheidegger, D.の文献、(1980) Journal of Immunological Methods, 35, 1-21)を用い、融合した。細胞を、DMEM(ハイブリッドを選択するためにHATを含有する15％ウシ胎仔血清を補充した)中で培養し、96-ウェルプレートにプレーティングした。TSHRの凸面に対する抗体を得るために、細胞培養物由来の上清を、ELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに結合するビオチン標識された14C4 IgGの阻害により、スクリーニングした。完全長TSHRが4E31(TSHRのC末端に対する抗体)を使用しELISAプレートウェルに結合されるこれらのアッセイにおいて、培養物上清中のTSHR抗体は、固定されたTSHRへ結合し、且つTSHRの凸面に対する抗体(すなわち、14C4結合部位と重複している)を含むウェルは、ビオチン標識化された14C4のTSHRへの結合を阻害する。陽性ウェル由来の細胞を、限界希釈により2回再クローニングし、必要なモノクローナル抗体を発現しているクローンを得る。
【０１７４】
（TSHR260及びTSHR260-JMG55の調製）
High-Five(商標)昆虫細胞(Invitrogen社からのBTI-TN-5B1-4)を、Insect Xpress培地(Lonza社)において維持した。2L又は0.2Lの振盪-フラスコに、細胞密度およそ1.00×106個細胞/mLで播種し、27℃で一晩(その時点以降、温度は23℃に低下した)110rpmでインキュベーションした。細胞を、バキュロウイルスストックにより、Bac-to-Bacシステム(Invitrogen社)を用いて、感染多重度(MOI)0.012pfu/mLで感染させた。TSHR260(図4；配列番号:4)又はTSHR260-JMG55のいずれかを含む培養物上清を、感染後120時間で、500gで10分間の4℃での遠心分離により収集した。上清200mLにつき完全プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics社, Lewes, UK)1錠を添加し、その後精製まで-70℃で貯蔵した。
【０１７５】
（異なるモノクローナル抗体の存在下でのTSHR260の調製）
High-Five(商標)昆虫細胞を、およそ96時間後に、TSHRモノクローナル抗体(14C4、2H11、25E1、36F11、9B7又は23H4 IgG)の2mg/Lを培養培地に添加した以外は、TSHR260について前述したように培養し、且つ感染させた。TSHR260-TSHR Mab複合体を含む培養物上清を、感染後120時間で、500gで10分間の4℃での遠心分離により収集した。上清200mLにつき完全プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics社, Lewes, UK)1錠を添加し、その後個々の複合体のPIによって決まる陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかによる精製まで、-70℃で貯蔵した。
【０１７６】
（TSHR260の精製）
TSHR260を含む培養物上清(100mL)を、HPLC等級の水により1：1希釈し、2Mトリスを用い、pH9.0に調節し、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製のために、ストリームラインDEAEマトリクス15mLの上に装加した。このカラムを、10mMトリス-HCl(pH9.0)、50mM NaClにより洗浄し、引き続き500mM NaCl及び10mMトリス-HCl(pH9.0)により溶出した。溶出した物質を、50mM NaCl、10mMトリス-HCl(pH8.0)に対して透析した。溶出画分中のTSHR260の存在は、アミノ酸246-260内のTSHRエピトープと反応性であるマウスモノクローナル抗体(TSHR MAb 18C5、Jeffreys Jらの文献、2002) 前掲)(10μg/mL)を使用する、ウェスタンブロット分析、及びTSHR260架橋阻害ELISAにおいて測定した活性(図13c)により確認した。
【０１７７】
（14C4、2H11、25E1、23H4、36F11又は9B7 TSHRモノクローナル抗体の存在下でのTSHR260の精製）
TSHR260-14C4-IgG複合体を含有する培養物上清(200mL)を、未複合のTSHR260に関して前述したように、HPLC等級の水により1：1希釈し、2Mトリスを用い、pH9.0に調節し、ストリームラインDEAEマトリクス15mLの上に装加し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【０１７８】
TSHR260-2H11-IgG、TSHR260-25E1-IgG、TSHR260-23H4-IgG、TSHR260-36F11-IgG又はTSHR260-9B7-IgG複合体を含有する培養物上清(600mL)を、500mM NaH2PO4によりpH6.3に調節し、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製のために、ストリームラインダイレクトHSTマトリクス10mL上に装加した。このカラムを、50mM NaH2PO4(pH6.0)、50mM NaClにより洗浄し、引き続き50mM NaH2PO4(pH7.0)、50mM NaClにより洗浄し、次に50mM NaH2PO4(pH8.0)、50mM NaClに溶出した。溶出画分中のTSHR260の存在は、アミノ酸246-260内のTSHRエピトープと反応性であるマウスモノクローナル抗体18C5(TSHR-MAb 18C5、Jeffreys Jらの文献、(2002) 前掲) (10μg/mL)を使用する、ウェスタンブロット分析、及びTSHR260架橋阻害ELISAにおいて測定した活性(図13c)により確認した。
【０１７９】
（TSHR260-JMG55の精製）
下記のものと同等な精製を、本発明の他の変異体に使用することができる。TSHR260-JMG55は、以下を使用するカラムクロマトグラフィーの3ラウンドにより精製した：a)ストリームラインダイレクトHSTマトリクス上の陽イオン交換クロマトグラフィー；b)セファロースに結合した14C4上のモノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィー；及び、c)ニッケル-アフィニティクロマトグラフィー。TSHR260-JMG55を含有する培養物上清(12L)を、500mMリン酸ナトリウム(NaH2PO4)により、pH6.0に調節した。ツイーン80を最終濃度0.015％v/vまで添加し、培養物上清を、ストリームライン25拡張床クロマトグラフィーシステム(GE Healthcare社)中のストリームラインダイレクトHSTマトリクス75mL上に装加した。2つの更なる12Lのバッチを、個別の実験において同じ様式で処理した。
【０１８０】
このカラムを、0.015％v/vツイーン80を含有する50mM NaH2PO4(pH6.0)、50mM NaClで洗浄し、引き続き0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH7.0)で洗浄し、次に0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)により溶出した。溶出画分中のTSHR260-JMG55の存在は、アミノ酸36-42内のTSHRエピトープと反応するマウスモノクローナル抗体8E2(TSHR-MAb 8E2、Jeffreys J らの文献、(2002) 前掲)(10μg/mL)を使用するウェスタンブロット分析、及びTSHR260-結合アッセイにおいて測定された活性により確認した(図12a)。試料はまた、TSHR260及びTSHR260-IgG複合体のストリームライン精製と比較するために、TSHR260架橋阻害ELISAにおいて分析した(図13c)。
【０１８１】
TSHR260-JMG55は、CNBr-活性化セファロース4B(Sigma社)に結合された、TSHR細胞外ドメインのアミノ酸22-261内の立体配座エピトープに結合するマウスモノクローナル抗体14C4を使用する、アフィニティクロマトグラフィーにより更に精製した(Jeffreys Jらの文献、(2002) 前掲)。特に、3つのストリームラインカラム溶出物からプールされたTSHR260-JMG55を、7mLの14C4-アフィニティカラム上に装加し、0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)により洗浄した。14C4-アフィニティカラムは、pH5.0の溶出緩衝液(100mM NaCl、100mMクエン酸塩、0.015％v/vツイーン80)、引き続きpH4.5の溶出緩衝液により、連続溶出した。溶出画分を、等量の中和緩衝液(0.5mMトリス-HCl(pH8.0)、0.015％v/vツイーン80)に収集し、引き続き0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)へ透析した。pH5.0で溶出された画分(TSHR260-JMG55-5.0)及びpH4.5で溶出された画分(TSHR260-JMG55-4.5)を個別にプールし、透析した。これらの溶出画分中のTSHR260-JMG55の存在は、マウスモノクローナル抗体8E2(10μg/mL)を使用するウェスタンブロット分析、及びTSHR260-結合アッセイを使用し測定された活性により確認した(図12a)。
【０１８２】
透析されたTSHR260-JMG55-4.5は、ニッケル-アフィニティクロマトグラフィーを用い、更に精製した。TSHR260-JMG55は、最終濃度10mMイミダゾール(pH8.0)に調節し、Akta 10プラットフォーム(GE Healthcare社)を使用するNiNTA-HiTrap 1mL固定化金属アフィニティカラム(IMAC)HPカラム(GE Healthcare社)上に装加し、洗浄緩衝液(100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)、0.015％v/vツイーン80)中の10mMイミダゾール(pH8.0)により洗浄し、洗浄緩衝液中の150mMイミダゾール(pH8.0)により溶出した。溶出したTSHR260-JMG55-4.5をプールし、0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)へ透析し、-70℃で貯蔵した。溶出画分中のTSHR260-JMG55の存在は、マウスモノクローナル抗体8E2(10μg/mL)を使用するウェスタンブロット分析、及びTSHR260-結合アッセイにおいて測定された活性により確認した(図12a)。精製されたTSHR260-JMG55-4.5の濃度は、1吸光度単位は、TSHR260-JMG55の1.43mg/mLと等しいこと(この吸光係数は、DNASTAR Protean V.9.1.0を用いて得られる)を基に、280nmの吸光度から計算した。この濃度は、SimplyBlue SafeStain(Invitrogen社)により染色した、12％非還元SDS-PAGEゲル上を泳動した物質のImage Labソフトウェア(Bio-Rad社)を使用するデンシトメーター分析により確認した。
【０１８３】
透析されたTSHR260-JMG55-5.0も、IMACニッケル-アフィニティクロマトグラフィーを用い、更に精製した。TSHR260-JMG55-5.0は、Akta 10プラットフォーム(GE Healthcare社)を使用するNiNTA-HiTrapカラム(GE Healthcare社)上に装加し、洗浄緩衝液により洗浄し、次に洗浄緩衝液中の150mMイミダゾール(pH8.0)により溶出した。溶出したTSHR260 JMG55-5.0は、次に0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)へ透析した。溶出画分中のTSHR260-JMG55の存在は、マウスモノクローナル抗体8E2(10μg/mL)を使用するウェスタンブロット分析、及びTSHR260-結合アッセイにおいて分析された活性により確認した(図12a)。精製されたTSHR260-JMG55-5.0の濃度は、1吸光度単位は、TSHR260-JMG55の1.43mg/mLと等しいこと(この吸光係数は、DNASTAR Protean V.9.1.0を用いて得られる)を基に、280nmの吸光度から計算した。この濃度は、SimplyBlue SafeStain(Invitrogen社)により染色した、12％非還元SDS-PAGEゲル上を泳動した物質のImage Labソフトウェア(Bio-Rad社)を使用するデンシトメーター分析により確認した。
【０１８４】
（TSHR260-JMG55-4.5コートされたELISAプレートウェルアッセイ）
Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液(5μg/mL BSAを含有する15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の精製したJMG55-TSHR260-4.5の4μg/mL又は0.4μg/mLの150μLアリコートでコートし、4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス(pH7.8)；1％v/v トリトンX-100)で3回洗浄し、引き続き250μLのポスト-コート緩衝液(154mM NaCl、58mMショ糖、3g/L BSA、0.2g/Lアジ化ナトリウム)により1時間インキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、アッセイ緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1％v/v トリトンX-100、1g/L BSA) 75μL及び健常血液ドナー血清プール(NPS) 75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながらインキュベーションした。その後、ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、濃度範囲(0.25〜7.5μg/mL)の100μLのM22 Fab-ペルオキシダーゼコンジュゲート(M22-POD, RSR社, Cardiff, CF23 8HE, UK)、K1-70 IgG-ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-70-POD)又はK1-18 IgG-ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-18-POD)のいずれかを、各ウェルに添加した。室温で振盪せずに25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に室温で25分間、振盪せずにインキュベーションした。反応を、50μLの0.5M H2SO4の添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で450nmで読み取った(図12d)。
【０１８５】
（TSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化）
脱グリコシル化は、本発明の他の変異体へ、下記のように適用することができる。脱グリコシル化反応は、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)中で、エンドグリコシダーゼF3(Endo F3, Sigma社)及び5μgのTSHR260-JMG55-4.5の0mU/mg、40mU/mg、60mU/mg及び80mU/mg(Endo F3:TSHR260-JMG55-4.5 比)を用いて、20℃で、24時間、72時間及び120時間行った。これらの反応は、12％非還元SDS-PAGE上で、SimplyBlue SafeStain (Invitrogen社)染色及びTSHRマウスモノクローナル抗体8E2を使用するウェスタンブロットにより、分析した。TSHR260-JMG55-4.5の分子量の何らかの変化を、Mark12分子量マーカー(Invitrogen社)を用いて決定した。TSHR260-JMG55-4.5の活性は、脱グリコシル化後、TSHR260-結合アッセイにより決定した(図12a)。
【０１８６】
（PCRを使用する完全長マウス及びブタTSHR配列への特異的アミノ酸変異の導入）
ブタTSHR完全長ヌクレオチド配列(図17；配列番号:61)を、ブタの甲状腺cDNAライブラリー(EP 1021721B1)からクローニングした。簡単には、総RNAを、酸フェノールグアニジン法(P Chomczynski、N Sacchiの文献；グアニジウムチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出によるRNA単離の単工程法(Single step method of RNA isolation by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)；Analytical Biochemistry, 1987；162: 156-159)を用い、ブタ甲状腺組織2.5gから調製した。mRNAを、DynalビーズmRNA精製キット(Dynal Biotec社；Wirral, CH62 3QL, UK)を用いて調製した。このmRNAを使用し、ZapExpress cDNA GigapackクローニングキットIII(Stratagene社, Cambridge CB4 4DF UK)を使ってcDNAライブラリーを作製した。4種の変性オリゴヌクレオチドを、公知のTSHR配列(マウス、ラット、ヒト、イヌ及びウシ)に作製し、ブタTSHRの2つの断片を、PCRを使用し増幅した。これらを配列決定し、それらのTSHR cDNAとの相同性を検証し、且つ完全長ブタTSHRクローンのcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用した。3種の完全長クローンを入手し、完全に配列決定した。標準クローニング手順を使用し、ブタTSHR cDNAのコーディング配列を、pcDNA5.1/FRTベクター(Invitrogen社)のBamHI及びNotI制限部位へクローニングした。アミノ酸配列は、図18(配列番号:62)参照。
【０１８７】
マウスTSHR完全長ヌクレオチド配列(図19；配列番号:63)を、5'末端のBamHI制限部位及び3'末端のNotI制限部位を持つように合成し(Geneart, Life Technologies社, Paisley, UK)、且つ標準クローニング手順を使用し、pcDNA5.1/FRTベクター(Invitrogen社)へクローニングした。アミノ酸配列は、図20(配列番号:64)参照。
【０１８８】
完全長マウス及びブタのTSHR配列中の変異は、ヒトTSHR260について先に説明したQuikChange II方式によるPCRを使用する、部位特異的変異誘発により、作製した。変異型ブタTSHRのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列については、各々図21及び22(配列番号:65及び66)を、並びに変異型マウスTSHRのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列については、各々図23及び24(配列番号:67及び68)を参照されたい。ブタ及びマウスTSHRにおけるJMG55と同等のアミノ酸変異については、表54を参照されたい。
【０１８９】
完全長TSHR構築体のFlp-In CHO細胞への安定したトランスフェクションは、「Flp-Inシステムを使用する完全長TSHR構築体のCHO細胞へのトランスフェクション」において先に詳細に説明したように、実行した。
【０１９０】
（完全長マウス及びブタTSHR(野生型及び変異体)の熱安定性）
完全長マウス及びブタTSHRの野生型及び変異体の熱安定性を、「完全長TSHR変異体の熱安定性」において以下に説明した(図14c)ような、55℃で加熱された4E31-コートされたプレートに結合されたTSHRが関与している、安定性アッセイBにおいて試験した(図14c)。
【０１９１】
（TSH及びM22による刺激に対する反応におけるマウス及びブタの野生型及び変異型TSHRの分析）
Flp-Inシステムを使用する、野生型及び変異型TSHR構築体のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へのトランスフェクションは、WO2006/016121Aに説明されている。
【０１９２】
TSH及び甲状腺刺激モノクローナル抗体M22の、野生型及び変異型マウス及びブタTSHRを発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMPの生成を刺激するの能力を、ヒトTSHRに関する「TSHR刺激の分析」において先に説明したように試験した。
【０１９３】
（界面活性剤可溶化された完全長野生型及び変異型TSHRの調製）
完全長野生型又は変異型TSHR(ヒト、ブタ又はマウス)を発現しているCHO細胞を、コンフルエンスまで成長させ、175cm2細胞培養フラスコから剥離し、且つこの細胞ペレットを、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を含有する50mM NaCl、10mMトリス-HCl(pH7.5)により洗浄し、その後同じ緩衝液中でホモジナイズした。12000gで30分間4℃での遠心分離後、細胞膜を、1％トリトンX-100の添加以外はホモジナイゼーションに使用したものと同じ緩衝液(およそ4×108個細胞について緩衝液4mL)中で可溶化した。可溶化された受容体調製品を、90000gで2時間、4℃で遠心分離し、上清を-70℃で貯蔵した。
【０１９４】
（完全長野生型及び変異型TSHRへのTSH結合の分析）
Maxisorpアッセイチューブ(Nunc社)を、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の10μg/mL 4E31-Fab2の200μLアリコートによりコートし、37℃で90分間、その後4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを、アッセイ緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス-HCl(pH7.8)、1％トリトン-X-100)により3回洗浄した。完全長TSHR調製品を、アッセイ緩衝液中に希釈し、200μLアリコートを、4E31-コートされたチューブ内で、4℃で一晩インキュベーションした。ウェルは、アッセイ緩衝液で3回洗浄した。アッセイ緩衝液中の非標識TSH 50μL、125I-標識されたTSH(アッセイ緩衝液中30,000cpm)50μL及び出発緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス-HCl(pH7.8)、1％トリトンX-100、1g/L BSA、50mg/L正常マウスIgG)50μLを、コートされたチューブに適用し、室温で2時間、穏やかに振盪しながらインキュベーションし、アッセイ緩衝液1mLで2回洗浄し、ガンマカウンターにおいてカウントした。結合TSH、対、結合／未結合TSHの濃度を、プロットし(G Scatchardの文献、(1949)、Annals of the New York Academy of Sciences, 51: 660-672)、会合定数を誘導した。
【０１９５】
（TSHR-JMG55のTMDにおける熱安定化変異）
更にTSHRのLRDにおいて確定された熱安定化変異に対し、TSHR-JMG55のTMDの配列を試験し、更なる熱安定化変異が、TSHRのこのドメインで確定できるかどうかを決定した。以下の3つの原理を使用し、TSHRのTMD内の可能性のある熱安定化変異を予測した：i) 他の生物のTSHR相同体のコンセンサス配列を使用し、可能性のある熱安定化変異を確定した；ii) TSHRのより低い基本cAMPシグナル伝達活性を生じる変異(SSFAデータベースから検索(www.ssfa-gphr.de)；Kreuchwig Aらの文献、(2013) Mol Endocrinol. 8: 1357-63)を、これらは、GPCRに関して、活性立体構造よりもより熱安定性であるTSHRの不活性立体構造を安定化し得るので、試験した；並びに、iii) 他のGPCR、すなわち、β1-アドレナリン受容体(β1AR、Serrano-Vegaらの文献、(2008) PNAS, 105: 877-82；Miller JL及びTate CGの文献、(2011) J. Mol. Bio. 413: 628-38)、A2Aアデノシン受容体(A2AR；Dore ASらの文献、(2011) Structure, 19: 1283-93)、NTS1ニューロテンシン受容体(NTS1R；Egloff Pらの文献、(2014) PNAS, 111: E655-62；Shibata Yらの文献、(2009) J. Mol. Bio. 390: 262-277)、及びコルチコトロピン-放出因子受容体-1(CRF1R；Hollenstein Kらの文献、(2013) Nature, 499: 438-443)において熱安定化するとして確定された変異を、TSHRへ移入した。合計で56種の可能性のある熱安定化変異が、確定され：10種のTSHRコンセンサス変異、19種のTSHR不活性化変異、26種のGPCR熱安定化変異、及び1種の変異Y601A、これは、TSHRにおいて不活性化し且つβ1-アドレナリン受容体において熱安定化するの両方である(表59)。
【０１９６】
標準クローニング手順に従い、TSHR-JMG55完全長ヌクレオチド配列を、BamHI及びXhoI制限部位を使用し、pcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen社)へクローニングした。完全長TSHR-JMG55配列中の変異を、TSHR260変異について先に説明したQuikChange II方式のPCRを使用し、部位特異的変異誘発により作製した。このPCR反応は、形質転換し、増大し、且つこれらの変異は、TSHR260 PCR産物に関して先に説明したように配列決定することにより検証した。大量のプラスミドDNAを、アンピシリン(100μg/mL)を含むLB培地における、50mL培養物の成長により、得た。プラスミドDNAは、Qiagen Plasmid Plus Midi Kit(Qiagen社, Manchester, M15 6SH, UK)を用い、一晩培養した細胞ペレットから抽出した。
【０１９７】
（Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション）
トランスフェクションの前日に、2.2×105個CHO-K1細胞/ウェルを、90mm細胞培養皿(Nunc社)へ播種した。トランスフェクトされるべき各90mm皿について、pcDNA3.1(+)中のTSHR-JMG55変異体30μgを、Optipro SFM (Life Technologies社, Paisley, PA4 9RF, UK)600μLと混合した。Optipro SFM 540μL中に希釈したFreestyle Max試薬(Life Technologies社)60μLを、各DNA/Optipro SFM混合物へ添加し、室温で10〜20分間インキュベーションした。1200μL DNA/Freestyle Max混合物を、90mm皿中のCHO-K1細胞へ添加し、37℃で40〜48時間インキュベーションした。細胞単層を4mL PBSですすぐことにより、TSHR-TMD変異体を発現しているCHO-K1細胞を収集し、次にスクレーピングによりこれらの細胞を1mL PBS中に収集し、細胞を移した。これらの細胞を、1.5mLバイアル中で、13000rpmで1分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを-70℃で貯蔵した。必要ならば、各細胞ペレットを、可溶化緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、完全プロテアーゼ阻害剤(Roche社))1mL中に懸濁することにより可溶化し、且つ氷上で少なくとも30分間インキュベーションした。その後この物質は、直ちに使用するか、又は-70℃で貯蔵した。
【０１９８】
TSHR-JMG55標準は、pcDNA3.1+中のTSHR-JMG55により、90％コンフルエンスのCHO-K1細胞を含む80cm2フラスコでトランスフェクトすることにより作製した。各80cm2フラスコについて、pcDNA3.1中のTSHR-JMG55の40μgを、Optipro SFM(Life Technologies社)800μLと混合し、次にOptipro SFM 720μL中に希釈したFreestyle Max試薬(Life Technologies社)80μLを、DNA/Optipro SFM混合物に添加し、室温で10〜20分間インキュベーションした。DNA/Freestyle Max混合物1.6mLを、CHO-K1細胞の各80cm2フラスコへ添加し、37℃で40〜48時間インキュベーションした。細胞単層をPBS 10mLですすぐことにより、TSHR-JMG55標準を発現しているCHO-K1細胞を各80cm2フラスコから収集し、次にスクレーピングによりこれらの細胞をPBS 2mL中に収集し、細胞を移した。全てのフラスコからの細胞をプールし、1.5mLバイアル中1mLアリコートで、アリコート化した。細胞を、13000rpmで1分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを-70℃で貯蔵した。必要ならば、各細胞ペレットを、可溶化緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、完全プロテアーゼ阻害剤(Roche社))500μL中に懸濁することにより可溶化し、且つ氷上で少なくとも30分間インキュベーションした。その後この物質は、直ちに使用するか、又は-70℃で貯蔵した。TSHR-JMG55標準は希釈し、これが14C4-コートされたELISAプレートウェルによるTSHR-結合アッセイ(下記「TSHR-結合アッセイ」に記載、図14a)において、「Freestyle Max試薬を使用するTSHR260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」において規定したような、14C4-コートされたELISAプレートウェルによるTSHR260-結合アッセイ(図12a)でもたらされるTSHR260-WT標準と同じ活性をもたらすようにした。これは14C4-活性100U/mLを有するものとして規定した。同様に、4E31-コートされたELISAプレートウェルへのTSHR結合アッセイ(図14a)においてアッセイした同じ試料を使用し、4E31-活性100U/mLと規定した。更に各々、14C4-及び4E31-コートされたELISAプレートウェルによるTSHR-結合アッセイにおいて検出した時に、TSHR-JMG55標準試料を、第一のTSHR-JMG55標準と同じ濃度になるよう希釈した。
【０１９９】
（TSHR-結合アッセイに使用した抗体）
(4E31)
「TSHR260-AP架橋ELISAにおいて使用した抗体」において先に詳述した。
(14C4)
「TSHR260結合アッセイにおいて使用した抗体」において先に詳述した。
(M22)
「TSHR260結合アッセイにおいて使用した抗体」において先に詳述した。
【０２００】
（TSHR-結合アッセイ）
Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の1μg/mL 14C4-Fab2(Jeffreys Jらの文献、(2002) 前掲、及びSanders Jらの文献、(2007) 前掲)又は1μg/mL 4E31-Fab2(EP 1021721B1、Boltonらの文献、(1999) 前掲)の150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、次に4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス(pH7.8)；1％v/vトリトンX-100)で3回洗浄し、且つTAT緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、1g/L BSA、0.2g/Lアジ化ナトリウム)中に希釈した被験試料(一過性トランスフェクトされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR)150μLを、各ウェルに適用し、室温で1時間又は4℃で一晩インキュベーションし、TSHRを、14C4-Fab2又は4E31-Fab2コートされたプレートへ結合させた。
【０２０１】
次にこれらのウェルを、洗浄し、アッセイ緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、1g/L BSA、50mg/L正常マウスIgG)75μL及び健常血液ドナー血清プール(NPS)75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながらインキュベーションした。その後ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、M22 Fab-ペルオキシダーゼコンジュゲート(M22-POD, RSR社, Cardiff, CF23 8HE, UK)100μLを各ウェルに添加した。室温で振盪せずに25分間インキュベーションした後、プレートウェルを、再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、室温で振盪せずに25分間更にインキュベーションした。反応を、0.5M H2SO4 50μLの添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で450nmで読み取った(図14a)。
【０２０２】
各変異体に関して、14C4-コートされたプレート及び4E31-コートされたプレートの両方に結合したアッセイにおけるそれらの活性を測定し、「Freestyle Max試薬を使用するTSHR260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」及び「Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」において規定されたような、TSHR260-結合アッセイにおいて14C4-コートされたプレートに結合されたTSHR260-WT標準(100U/mL)と同じ活性を持つように希釈された14C4-コートされたプレートに結合されたTSHR-JMG55標準と比較した。
【０２０３】
（完全長TSHR変異体の熱安定性）
TSHR変異体の熱安定性を、以下の3つの異なる様式で測定した：A) 14C4-コートされたELISAプレートウェルに結合されたTSHR変異体の加熱(図14b)；B) 4E31-コートされたELISAプレートウェルに結合されたTSHR変異体の加熱(図14c)；及び、C) 溶液中のTSHR変異体の加熱、その後アッセイのためのそれらの4E31-コートされたELISAプレートウェルへの結合(図14d)。
【０２０４】
熱安定性アッセイA及びB：Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の14C4-Fab2(熱安定性アッセイA)1μg/mL又は4E31-Fab2(熱安定性アッセイB)1μg/mLの150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、TAT緩衝液に希釈された被験試料(一過性トランスフェクトされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR)150μLを、各ウェルに適用し、4℃で一晩インキュベーションし、TSHRを14C4-又は4E31-コートされたELISAプレートウェルに結合させた。プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、14C4-Fab2又は4E31-Fab2に結合していないあらゆるTSHRを除去した。TAT緩衝液を、各ウェルに添加し(150μL)、その後接着プレートカバーを適用し、ウェルを密封した。その後各プレートを、45℃又は55℃に設定した水浴中に配置した。最大180分の期間の後、96-ウェルプレートの1ストリップ(8ウェル)を、各プレートから取り外し、スペアELISAプレートラックに挿入し、その後これを氷上で維持した。180分の時間経過が完了した後、この受容体希釈緩衝液を、ELISAプレートウェルから吸引し、前述のTSHR-結合アッセイ(図14a)を継続した。アッセイデータを、時間に対してプロットし、指数関数曲線にフィットさせ、変異体の半減期(t1/2)を計算し、TSHR-JMG55又は別のTSHR変異体と比較した。
【０２０５】
熱安定性アッセイC：Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の4E31-Fab2 1μg/mLの150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。CHO-K1細胞において一過性に発現されたTSHR変異体を、可溶化緩衝液中に希釈した。100μLアリコートを、33℃又は40℃で0〜2時間加熱した。その後試料を、TAT緩衝液(試料83.3μL＋TAT緩衝液250μL)中に1/4希釈し、150μLアリコートを、2つ組で、4E31-コートされたELISAプレートウェルに適用し、これを洗浄緩衝液で3回洗浄し、TSHR-結合アッセイ(図14a)を前述のように実行した。アッセイデータを、時間に対してプロットし、二相指数関数的減衰式にフィットさせた。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の割合を、計算し、且つTSHR-JMG55又は他のTSHR変異体と比較し、10、30及び120分での生存比を生じた。
【０２０６】
（結果）
（単一変異）
本発明者らの実験において、TSHR260の239の単一変異体を調製し、発現させた。特にそのアミノ酸のMet22からLeu260までの各残基を変異させたものは、各位置で最も熱安定であると推定した(表1)。これらの変異体を、TSHR260-結合アッセイにおいて結合及び安定性について、スクリーニングした(図12a、b、表2)。このスクリーンで確定された64種の最良候補の42℃での半減期を決定し、且つ野生型TSHR260(TSHR260-WT、平均t1/2＝30.7±1.1分)と比較し、変異体とTSHR260-WTの間の半減期の差(Δt1/2)、及び変異体半減期とTSHR260-WT半減期の間の安定性比を生じた(表3)。これらの熱安定性曲線は、42℃でのタンパク質の半減期の17分間の増加をもたらし、TSHR260-WTの熱安定性が少なくとも60％有意に向上された、17種の変異を確定した(P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y)(図5及び6；配列番号:11-25、27-43、45及び46)(表3)。最良の単一変異体I253R(配列番号:45)は、42℃での熱安定性をTSHR260-WTよりも3.0±0.4倍向上し、すなわち、42℃でのTSHR260の半減期を、53±6分だけ増大した(図7a)。これはまた、50℃での熱安定性をTSHR260-WTよりも2.85±0.13倍向上した。
【０２０７】
驚くべきことに、最良の熱安定化作用を有した17種の変異は、TSHR260構造全体に分布しているが(図9)、ほとんどは、凸面上、又はLRDの凸面と凹面の端部にあった。7種は凸面上にあり(P142I、D143P、S166T、I167F、P168Y、V169R、及びN170W)、6種はLRDの端部にあり(T62V、H63C、L64Y、R112P、T179C、R255Y)；3種のみが、凹面上にあり(L59F、D151E及びI253R)、並びにP28Eは、結晶構造においては認められない。Leu59及びIle253は、凹側にあるが、結晶構造においてM22-Fabとは相互作用しない(PDBコード3G04；Sanders Jらの文献、(2007) 前掲)。これらの熱安定化変異体の、Asp151は、M22-Fabと直接相互作用し、結晶構造において示された塩橋を形成する、唯一の残基である。結果的に、Asp151は、塩橋相互作用を維持するように、別の陰性アミノ酸Gluへ変異される。
【０２０８】
（ドットブロット結果(発現されたTSHRの総量、すなわち、活性＋不活性TSHRを決定するため)）
TSHR260-結合アッセイにおいて検出されたTSHR260の量は、異なる変異体について変動し(TSHR260-WTの0％〜1000％)、従って発現された各変異体の総量は、ドットブロットアッセイを使用し測定した。ドットブロットアッセイの結果は、表4に示している。ドットブロットアッセイにより測定された発現レベルは、TSHR260-WTに対して規定し、且つ同じくTSHR260-WTに対して規定したTSHR260-結合アッセイの結果と比較した。TSHR260-結合アッセイの結果とドットブロットの結果の間の比は、(TSHR260-結合÷ドットブロット)で計算し、ドットブロットアッセイにおいて検出されたTSHR260の総量と、TSHR260-結合アッセイにおいて検出された活性TSHR260の量の間に大きい解離が存在する場合を決定した。
【０２０９】
（二重変異体）
TSHR260の二重変異体は、表5に示したように、変異P142I(配列番号:35)及びI253R(配列番号:45)を、最良の安定化変異に加えることにより作製し；変異体JMG1−JMG15及びJMG31は、P142Iを伴う二重変異体である。変異体JMG15−JMG29は、I253Rを伴う二重変異体である。P142Iは大きい熱安定化の影響を有し、TSHR260の熱安定性を5倍向上するが、これは非常に低レベルで発現された。この低い発現レベルはまた、P142Iを含む二重変異体の場合にも認められた。従って、更なる変異誘発及び熱安定性アッセイは、I253R変異体にのみ継続した。
【０２１０】
P142I同様、単一変異体T62V、L64Y、P142I、I167F、P168Y、N170W及びT179Cは、低い発現レベルを有し(表4)、このことは、これらの変異を含む二重及び三重変異体においても認められた。実際問題として、これらは、更なる変異体組合せには、使用しなかった。
【０２１１】
二重変異の安定性は、42℃(表6)及び50℃(表7)の両方で測定した。試験した二重変異は全て、TSHR260-WT及び単一変異体TSHR260-I253Rに比べ熱安定性を向上した。最も熱安定性の二重変異体は、JMG22(I253R＋D143P)(各々、配列番号:45及び36)であり、これは、TSHR260-WTの熱安定性を42℃で9.3±0.5倍及び50℃で15.1±0.7倍向上し、各々、半減期261±45分及び23.8±0.7分をもたらした(図7a、b)。
【０２１２】
（三重変異体）
変異体JMG30−JMG42は、変異D143P(配列番号:36)を最も安定化している二重変異に加えた、TSHR260の三重変異体である(表5)。2種の三重変異体I167F＋D143P＋I253R及びT179C＋D143P＋I253Rは、それらの各二重変異体JMG25(I167F＋I253R)及びJMG29(T179C＋I253R)は発現レベルが悪かったので、作製しなかった。
【０２１３】
熱安定性曲線を、50℃で三重変異体について確立し、I253Rの50℃での熱安定性と比較した(表8)。最も熱安定性の三重変異体は、JMG37(I253R＋D143P＋R112P)(各々、配列番号:45、36及び34)であり、これは、50℃での半減期69±3分を有し、且つTSHR260-I253Rよりも16.6±0.5倍大きい熱安定性であった(図7b、c)。
【０２１４】
（四重変異体）
変異体JMG43−JMG48は、変異R112P(配列番号:34)を最も安定化している三重変異体に加えた、TSHR260の四重変異体である(表5)。熱安定性曲線を、50℃及び55℃で四重変異体について決定し、これらの温度でのI253Rの熱安定性と比較した(表8及び表9)。最も熱安定性の四重変異体は、JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E)(各々、配列番号:45、36、34及び37)であり、これは、50℃での半減期226±31分を有し、且つTSHR260-I253Rよりも58±6倍大きい熱安定性であった(図7c)。55℃で、これは半減期27±3分を有し、且つTSHR260-I253Rよりも54±7倍大きい熱安定性であった(図7d)。60℃で、これは、半減期2.40±0.16分を有した。
【０２１５】
（五重変異体）
変異体JMG49−JMG52は、D151E(配列番号:37)を四重変異体に加えた、TSHR260の五重変異体である(表5)。最も熱安定性の五重変異体は、JMG52(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R)(各々、配列番号:45、36、34、37及び41)であった(表9及び表10)。これは、55℃での半減期66±12分を有し、且つTSHR260-I253Rよりも125.1±0.6倍大きい熱安定性であった(図7d)。60℃で、これは半減期7.1±0.6分を有し、且つTSHR260-JMG45よりも3.0±0.2倍大きい熱安定性であった(図7e)。
【０２１６】
（六重変異体）
六重変異は、五重変異体JMG50にS166T(配列番号:38)又はV169R(配列番号:41)変異を加えることにより作製し、JMG54(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋H63C＋S166T)(各々、配列番号:45、36、34、37、32及び38)及びJMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋H63C＋V169R)(各々、配列番号:45、36、34、37、32及び41)を生じた(表5及び表10)。これらは、55℃で正確に測定するにはあまりにも熱安定性であり、そのため熱安定性は60℃で測定した(図7e)。JMG54は、60℃で半減期9.6±1.5分を有し、TSHR260-JMG45よりも4.0 ±0.4倍大きい熱安定性であった。JMG55は、60℃で半減期13±3分を有し、TSHR260-JMG45よりも5.2±0.9倍大きい熱安定性であった。JMG55は、TSHR260-JMG45よりも5.2倍大きい熱安定性であり、これはTSHR260-I253Rよりも56倍より大きい熱安定性であり、これは次にTSHR260-WTよりも3.1倍より大きい熱安定性であった。他の熱安定性比の比較は、要素の安定性比を、積算し、全体の熱安定性比を得ることができることを示唆している(表12)。従って、JMG55は、TSHR260-WTよりもおよそ900倍大きい熱安定性である。
【０２１７】
（37℃での熱安定性）
最も安定した単一、二重、三重、四重、五重及び六重TSHR260変異体(I253R、JMG22(I253R＋D143P)、JMG37(I253R＋D143P＋R112P)、JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E)、JMG52(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R)及びJMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R＋H63C))の熱安定性を、TSHR260-WTに対し37℃で測定した。これらの変異体の半減期を、37℃での熱安定性曲線から計算し、且つ表11に示している。表11はまた、TSHR260-WTと比較した各変異体の安定性比も示している。これらは、他の温度で観察された安定性比(表12)と一致する。
【０２１８】
（温度範囲で最も熱安定な変異体の熱安定性の比較）
TSHR260-WTと比較した変異体の安定性比は、異なる温度で、すなわち、42℃及び50℃で、大きくは変化しない。50℃以上では、TSHR260-WTは安定ではなく、これは参照調製品として使用することはできない。従って、より好適な変異体を、代わりに選択した。次に参照としてのこのより安定した変異体で得られた安定性比を、TSHR260-WTと比べ安定した参照変異体の安定性比で積算した(表12)。例えば、JMG37は、55℃で、TSHR260-WTよりも3.1倍より熱安定性であるI253Rよりも12.0±0.9倍より熱安定性である。従って、JMG37は、55℃でTSHR260-WTよりも12.0×3.1＝37±3倍より熱安定性であると計算され、これは37℃でのTSHR260-WTに対する測定された熱安定性比(34±5倍)に良く対応している。
【０２１９】
（14C4プレート上にコートされた完全長TSHR及び変異体の熱安定性）
14C4-Fab2でコートされたELISAプレートに結合された完全長TSHR-WT(配列番号:2)、TSHR-JMG37(配列番号:45、36、34)、TSHR-JMG45(配列番号:45、36、34、37)、TSHR-JMG52(配列番号:45、36、34、37、41)及びTSHR-JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)の熱安定性を、プレートを42℃又は50℃で加熱することにより、決定した。予想外に、完全長TSHR変異体であるTSHR-JMG37、TSHR-JMG45、TSHR-JMG52及びTSHR-JMG55は、TSHR-WTよりもかなりより熱安定性であった(表13、表14)。50℃で、TSHR-WTは半減期33分を有し、TSHR-JMG37は半減期110分を有し、且つTSHR-WTよりも3.4倍熱安定性であり、TSHR-JMG45は半減期173分を有し、且つTSHR-WTよりも5.3倍熱安定性であり、TSHR-JMG52は半減期175分を有し、且つTSHR-WTよりも5.4倍熱安定性であり、並びにTSHR-JMG55は半減期226分を有し、TSHR-WTよりも6.9倍熱安定性である(図8)。
【０２２０】
（TSHR260及び完全長TSHR変異体に結合するM22-POD, K1-18-POD及びK1-70-POD）
TSHR260変異体及び完全長TSHRに結合するM22-POD、K1-18 POD及びK1-70 PODを、TSHR260変異体又は完全長TSHR変異体によりコートされたELISAプレートに結合するTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲート(すなわち、M22-POD、K1-18 POD又はK1-70 POD)の濃度を変動し、並びに基質テトラメチルベンジジンと一緒にインキュベーションすることによるTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲートの結合を検出することにより、試験した。受容体(TSHR又はTSHR260変異体)の半分がリガンドに結合されるリガンド(TRAb-ペルオキシダーゼ)の濃度である結合定数(Kd)を、TSHR260-WT又は適切なら完全長TSHR-WTの結合定数に対して決定した。試験した変異は、M22-POD、K1-18-POD又はK1-70-PODのいずれかへの完全長TSHR又はTSHR260の結合に影響を及ぼさなかった(表15から表21)。
【０２２１】
（TSHR260変異体及び完全長TSHR変異体へ結合するM22-PODのK1-18 IgG及びK1-70 IgG阻害）
M22-PODとのインキュベーション前に、受容体(TSHR260変異体及び完全長TSHR変異体)を、M22と同じ部位で結合する変動する濃度のK1-18 IgG及びK1-70 IgGとインキュベーションすることは、M22-POD結合の阻害を測定し、且つこれは受容体−抗体相互作用が、熱安定化変異により影響を受けたかどうかを示す。K1-18 IgG及びK1-70 IgGは、M22-PODのTSHR260変異体及び完全長TSHR変異体への結合を、各々、TSHR260-WT及び完全長TSHR-WTへの結合と同じ程度、阻害する。これらの結果は、これらの変異は、モノクローナルTSHR抗体のTSHR260又は完全長TSHRへの結合には影響を及ぼさないことを指摘している(表22から表25)。
【０２２２】
（TRAb陽性患者血清によるTSHR260及び完全長TSHR変異体へのM22-POD結合の阻害）
TSHR260及び完全長TSHRの熱安定化された変異体が、患者血清中のTRAbを検出するアッセイにおける使用に適しているかどうかを決定するために、患者血清が、M22-PODのTSHR260-WT、TSHR260-JMG52、TSHR260-JMG55、完全長TSHR-WT、TSHR-JMG45及びTSHR-JMG52への結合を阻害する能力を、測定した(図12c、図14e)。患者血清は、M22-PODのTSHR260-JMG52及びTSHR260-JMG55への結合を、TSHR260-WTへの結合と同様に阻害した(表27、表29)。更に、患者血清は、M22-PODの完全長TSHR-JMG45及び完全長TSHR-JMG52への結合を、完全長TSHR-WTへの結合と同様に阻害した(表28、表29)。従って、熱安定性TSHR260又は完全長TSHR変異体は、患者血清中のTRAbを検出するアッセイにおける使用に適している。
【０２２３】
（TSHR刺激の分析）
TSH、M22 Fab及びK1-18 IgGによる完全長TSHR及び完全長TSHR変異体(FlpIn CHO細胞において発現される)の刺激を、異なる濃度範囲のTSH、M22-Fab又はK1-18 IgGを使用し生成されたサイクリックAMPの量を測定することにより、決定した。各アッセイにおいて、TSHR変異体の刺激を、同じアッセイにおいて検出されたTSHR-WTの刺激と比較した。EC50、すなわち最大刺激反応の50％を生じる作用物質(TSH、M22-Fab、又はK1-18 IgG)の濃度を、各変異体について計算し、TSHR-WTと比較した(表30から表39)。驚くべきことに、これらの変異は、TSH、M22又はK1-18による刺激に反応したサイクリックAMP生成に対する、顕著な作用を有さなかったが、四重変異体TSHR-JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E)、五重変異体TSHR-JMG52(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R)及び六重変異体TSHR-JMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R＋H63C)について、TSHR-WTと比べ、M22のEC50において小さい増加が存在した(表38)。
【０２２４】
TRAb陽性患者血清による完全長TSHR-WT、TSHR-JMG45及びTSHR-JMG52の刺激も、測定し、これを健常血液ドナー血清の作用と比較した。患者血清による変異された完全長TSHRの刺激は、TSHR-WTの刺激と非常に似ていた(表40及び表41)。
【０２２５】
（熱安定化ヒトTSHR変異の他の種からのTSHR及び他の糖タンパク質ホルモン受容体への移入可能性）
異なる哺乳動物種から現在入手可能なTSHR配列の間には、高い配列相同性(86〜97.5％配列同一性)が存在する。このことは、ヒトTSHR(hTSHR)において確定された熱安定化変異のほとんどは、これらの相同体において熱安定化することを示唆している。表42は、熱安定性を向上するためにヒトTSHRにおいて変異されたアミノ酸のほとんどは、種を超えて保存されることを示している。Pro28、Leu59、Thr62、Leu64、Arg112、Pro142、Asp143、Asp151、Ser166、Pro168、Asn170、Thr179及びIle253は、全ての種を超えて保存されている(表42)。熱安定化変異H63Cの場合、63位は、Hisではなく、イヌTSHRにおいてはGlnであり、且つアカゲザル及びミドリザルの両方においてはArgである。これらの残基は、His及びCysの両方と極めて異なるので、Cysへの変異が、依然熱安定化するかどうかを予測することは困難である。マウス、ラット及びヒツジの熱安定化変異I167Fに関して、167位は、IleではなくValである。Ile及びValは両方共類似した脂肪族アミノ酸であるので、恐らくPheへの変異は依然、熱安定化するであろう。熱安定化変異V169Rの場合、169位は、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、ヒツジ及びウマのTSHR配列においてはAlaであり、これはヒトにおいて存在する脂肪族Valに類似しており、従って、Argへの変異も、これらのTSHRにおいて熱安定化するであろうと予想される。対照的に、マウス及びラットにおいて、残基169はGluであり、これはArgのように帯電された残基であり、従ってArgへの変異は、ヒトTSHRにおけるような、劇的な安定化作用を有さないだろう。熱安定化変異R255Yに関して、マウス及びラットは、255位に、他のTSHR配列に存在するArgではなく、Lysを有し、これらは両方共正帯電したアミノ酸である。従ってTyrへの変異は依然、255位で熱安定化することができるだろう。
【０２２６】
hTSHR(配列番号:2)と他の糖タンパク質hFSHR(配列番号:57)(50％配列同一性)及びhLHR(配列番号:58)(53.3％配列同一性)の間には、比較的低い配列同一性が存在する。しかし、配列アラインメント(図11)は、hTSHR中の熱安定化するように変異された残基の多くは、hFSHR及びhLHRにおいて同じ又は類似の残基に対応していることを、指摘している。従って、多くの熱安定化変異が、恐らく移入可能であろう(表43)。FSHRにおいて、T56V、L58Y、N106P、P136I、D137P、Q145E、I160F、N163W、S172C及びR247Yは、熱安定化されるであろうと予想される。LHRにおいて、対応する変異P33E、L56F、V61Y、K109P、P139I、D140P、I164F、P165Y、N167W、S176C及びI249Rは、熱安定化されると予想される。
【０２２７】
（TSHR260-変異体の更なる熱安定化）
更に2種の熱安定性五重TSHR260変異体を作製し、熱安定性について試験し：TSHR260-JMG57(I253R＋D143P＋R112P＋V169R＋H63C)(各々、配列番号:45、36、34、41及び32)及びTSHR260-JMG58(I253R＋D143P＋R112P＋S166T＋H63C)(各々、配列番号:45、36、34、38及び32)は、それぞれ、55℃での半減期40±2分及び31.4±0.4分を有し、四重変異体TSHR260-JMG45よりも熱安定性は1.64±0.07倍及び1.28±0.05倍である。TSHR260-JMG57及びTSHR260-JMG58はまた、M22-POD結合アッセイの阻害において、患者血清を検出する能力を維持している(図12c、表44)。
【０２２８】
（架橋ELISAにおいてアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260変異体へ結合するM22 IgG、K1-70 IgG及びK1-18 IgG）
本アッセイ(図13a)は、固定された完全長野生型TSHRとアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260変異体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR260-AP-JMG57及びTSHR260-AP-JMG58)の間に架橋を形成する、ヒトモノクローナル刺激型TSHR自己抗体(M22 IgG及びK1-18 IgG)並びにヒトモノクローナル遮断型TSHR自己抗体(K1-70 IgG)の二価の特性に頼っている(配列番号については「安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製」参照)。健常血液ドナー血清のプール中に希釈した場合、M22 IgG、K1-70 IgG及びK1-18 IgGは全て、類似した用量依存的様式でTSHR260-AP変異体及び野生型TSHR260-APに結合した(表45a-c；e-g)。更に、アッセイ緩衝液に希釈した場合、M22 IgG、K1-70 IgG及びK1-18 IgGは全て、類似した用量依存的様式でTSHR260-AP変異体及び野生型TSHR260-APへ結合した(表46a-c；e-g)。健常血液ドナー血清又はアッセイ緩衝液中に希釈したGADに対する陰性対照ヒトモノクローナル自己抗体(5B3 IgG)を、結合について試験した(表45d及び表46d)。5B3 IgG(陰性対照抗体)と野生型TSHR260-AP又はTSHR260-AP変異体のいずれかの間に、結合は認められなかった(健常血液ドナー血清中に希釈したものについては吸光度値0.0016-0.033、及びアッセイ緩衝液中に希釈したものについては0.001-0.034)。これらの実験は、刺激活性又は遮断活性のいずれかを持つヒトモノクローナルTSHR自己抗体のアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260変異体へ結合する能力を明らかにしている。
【０２２９】
（架橋ELISAにおいてアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260変異体へ結合するTRAb陽性及びTRAb陰性血清）
12種のTRAb陽性患者血清(G1-G12)及び11種のTRAb陰性患者血清(N1-N11)を、二価で結合し、且つ固定された完全長TSHRとアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260 (TSHR260-AP)変異体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR260-AP-JMG57及びTSHR260-AP-JMG58)の間に架橋を形成するそれらの能力について試験した(図13a)。TRAb陽性及びTRAb陰性血清の結合は、野生型及び変異体TSHR260-APの両方について類似していた(表47a)。各患者血清についてのTRAb濃度を計算するためのK1-70 IgG標準曲線の使用は、変異体TSHR260-AP構築体について計算したTRAb濃度は、野生型TSHR260-APアッセイの平均に匹敵することを示した(表47b)。野生型TSHR260-APで決定された平均TRAb濃度に比べた、各TSHR260-AP変異体で得られたアッセイ結果についてピアソン相関を行い、良好なr-値を生じ(表47c)、これは患者血清TRAbは、野生型TSHR260-AP及びTSHR260-AP変異体へ同様の様式で結合することを明らかにしている。
【０２３０】
（TSHR260-AP変異体の熱安定性）
TSHR260-AP変異体の半減期(t1/2)を、2つ組測定を用い、各TSHR260-AP構築体について、各温度で、時間経過データ(0時間−3時間)を指数関数曲線にフィットすることにより計算した(図13b)。試験した各構築体の、各温度での半減期を、表48に示している。各TSHR260-AP変異体に関する半減期を、TSHR260-AP-JMG45(65℃)、TSHR260-AP-JMG22(60℃)又はTSHR260-AP-WT(50℃)の半減期と比較した。これから、予測された安定性比を計算し、TSHR260-AP-WTと比較した各TSHR260-AP変異体の全般的安定性を示すことができる。TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG45及びTSHR260-AP-JMG55は、TSHR260-AP-WTよりも、各々、およそ11倍、66倍及び165倍大きい半減期を有した。TSHR260-AP-WTとTSHR260-AP変異体の間の安定性の増大は、アルカリホスファターゼ融合タンパク質を伴わないTSHR260と比べ減少されたが、TSHR260-AP構築体の熱安定性は、アルカリホスファターゼを伴わない同等の構築体よりも大きかった。50℃でのTSHR260-AP-WTの半減期は、野生型TSHR260(アルカリホスファターゼを伴わず)の半減期よりも2.9倍大きかった。同様に、60℃でTSHR260-AP-JMG45及びTSHR260-AP-JMG55は、アルカリホスファターゼを伴わない同等のTSHR260構築体よりも、各々、3.2倍及び1.5倍大きい半減期を有した。
【０２３１】
（野生型TSHR260の精製）
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する精製の後、溶出した野生型TSHR260プールは、TSHR260架橋阻害ELISAにおいて、陰イオン交換カラム上に装加された最初の物質よりも、およそ1/80の活性を含んだ(図25a)。これらの結果は、野生型TSHR260は、精製の間、本質的に不安定であり、陰イオン交換クロマトグラフィー精製のわずか1ラウンドの後、1/80までの活性の喪失を伴うことを確認している。
【０２３２】
（TSHRモノクローナル抗体(14C4、2H11、25E1、 23H4、36F11又は9B7)との複合体中の野生型TSHR260の精製）
先に本発明者らは、TSHR260(野生型)は、ヒトモノクローナル甲状腺刺激性自己抗体M22との複合体において、安定化され、精製され及び結晶化され得ることを示した(WO 2008/025991A1)。M22は、TSHR260断片へ高親和性(5×1010L/mol)で結合するが、容易に解離せず、且つTSHR260断片への患者血清自己抗体の結合を阻害する(EP 1565493B1、Nakatakeらの文献、(2006) Thyroid, 16: 1077-1084)。従って、TSHR260-M22の複合体の形成及び精製は、患者自己抗体のTSHRへの結合を検出するアッセイシステムにおいて使用するため又は他の目的のための複合されないTSHR260の精製方法としては、使用することができない。
【０２３３】
イオン交換クロマトグラフィーによる14C4 IgG、25E1 IgG、2H11 IgG、36F11 IgG又は9B7 IgG(TSHRとの結合についてM22と競合しないTSHRの凸面に対するTSHRモノクローナル抗体)との複合体中の野生型TSHR260の精製は、TSHR260-AP架橋阻害ELISAにおける分析後、装加物質と比べ、溶出した物質において類似の活性(1/2未満への減少)を示した(図13c、各々、図25b、c、d、f及びg)。しかし23H4 IgG(TSHRの凸面に対する更なるモノクローナル抗体)は、TSHR260架橋阻害ELISAにおいて測定された、カラム上に装加された最初の物質のおよそ1/15の少ない活性を含み、陽イオン交換クロマトグラフィー後の溶出された物質により、野生型TSHR260を安定化する効果が少なかった(図25e)。これらの実験は、異なるTSHRマウスモノクローナル抗体(14C4、2H11、25E1若しくは23H4、36F11 IgG又は9B7 IgG；これらは患者血清自己抗体の結合部位から離れたTSHRの凸面に結合する)との複合体中の野生型TSHR260の精製は、イオン交換クロマトグラフィーの1ラウンドの間に、野生型TSHR260を安定化することができたことを示している。
【０２３４】
（TSHR260-JMG55の精製）
TSHR260-JMG55を含有する昆虫細胞培養物上清36Lの陽イオン交換クロマトグラフィーによる最初の精製は、TSHR260結合アッセイにおいて測定した30U/mgから15,872U/mgへの、TSHR260-JMG55の比活性の529倍の増加を示した(図12a、表49)。TSHR260-JMG55の単位は、「Freestyle Max試薬を使用するTSHR260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」において説明したように、TSHR260標準に対して規定される。
【０２３５】
TSHR260架橋阻害ELISAにおける最初の装加物質及びストリームラインカラムから溶出されたプールの分析(図13c)は、装加物質と比べ溶出されたプールにおける類似した活性(総活性のおよそ1/3〜1/4への減少)を示した(図25h)。
【０２３６】
TSHR MAb 14C4アフィニティカラムを使用するTSHR260-JMG55の更なる精製は、2つの異なる型のTSHR260-JMG55の精製を生じた(図26)。pH5.0での14C4-アフィニティカラムでの溶出は、低い比活性12,041U/mgを有する、精製されたTSHR260-JMG55-5.0をもたらしたのに対し、pH4.5での溶出は、高い比活性11,443,46U/mgを有する、精製されたTSHR260-JMG55-4.5をもたらした(表49)。ニッケルアフィニティクロマトグラフィーを使用する高活性のTSHR260-JMG55-4.5の最終精製は、精製されたタンパク質の比活性を6,414,000U/mgまで増大し、最初の培養物上清と比べ全般的精製レベル213,708をもたらした(表49及び表50a)。対照的に、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーを使用する低活性のTSHR260-JMG55-5.0の最終精製は、精製されたタンパク質の比活性20,361U/mgをもたらし、最初の培養物上清と比べ全般的精製レベル679をもたらした(表49及び表50b)。
【０２３７】
これら2つの型の精製されたTSHR260-JMG55は、12％非還元SDS PAGE上でおよそ34kDaでの1本のバンドとして泳動した(図27)。最後の精製の後、高比活性(6,414,000U/mg)のTSHR260-JMG55-4.5の0.665mg及び低比活性(20,361U/mg)のTSHR260-JMG55-5.0の0.927mgを得た。
【０２３８】
K1-18-POD、K1-70-POD及びM22-PODは、精製されたJMG55-TSHR260-4.5コートされたELISAプレートウェルに、用量依存的様式で結合した(表51)。
【０２３９】
（TSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化）
Endo F3非含有の脱グリコシル化緩衝液中の精製されたTSHR260-JMG55-4.5の1、3及び5日間の20℃でのインキュベーションは、分子量が減少しないことを示した(図28A)。対照的に、40mU/mg、60mU/mg又は80mU/mgのEndo F3によるTSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化は、各々、120時間、72時間及び24時間での分子量のおよそ2kDaの最大減少を生じた(図28A及び28B)。20℃で120時間インキュベーションした後の脱グリコシルされたTSHR260-JMG55-4.5の活性の分析は、TSHR260-結合アッセイにおいて決定し(図12a)、且つ-70℃で貯蔵した未処置の精製TSHR260-JMG55-4.5物質の活性と比較した(表52)。TSHR260-JMG55-4.5の無酵素(0mU/mg)、酵素40mU/mg、60mU/mg又は80mU/mgとのインキュベーションは、それぞれ、未処置の精製TSHR260-JMG55-4.5物質の活性の、111％、100％、104％及び104％を生じた。
【０２４０】
精製したTSHR260-JMG55-4.5タンパク質は、その活性を保持し、且つ3ラウンドのカラムクロマトグラフィー(ストリームラインHST、14C4アフィニティ及びニッケルアフィニティクロマトグラフィー)の後安定化し、且つEndo F3による脱グリコシル化により、およそ2kDaの糖残基が除去された。
【０２４１】
野生型TSHR260とは対照的に、TSHR260-JMG55変異型TSHRは、TSHRモノクローナル抗体を添加することなく、3ラウンドのカラムクロマトグラフィー(ストリームラインHST、14C4アフィニティクロマトグラフィー、その後のニッケルアフィニティクロマトグラフィー)により、巧く精製することができ、安定した複合体を形成する。活性TSHR260-JMG55の2つの異なる型を、培養物上清から精製し、これは比活性6,414,000U/mgを有する高比活性型(TSHR260-JMG55-4.5)及び比活性20,361U/mg(315倍低い)を有する低比活性型であった。脱グリコシルされ精製されたTSHR260-JMG55-4.5は、TSHR260-結合アッセイにおいて活性があるという知見は、更にこの変異型TSHR断片の増大した安定性を確認した。
【０２４２】
（熱安定性ヒトTSHR変異のマウス及びブタTSHRへの移入可能性）
最も熱安定性の高いヒトTSHR変異体であるJMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R＋H63C)の同等の変異を、マウスTSHR(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋E169R＋H63C)(図23；ヌクレオチド配列は配列番号:67及び図24；アミノ酸配列は配列番号:68)及びブタTSHR(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋A169R＋H63C)(図21；ヌクレオチド配列は配列番号:65及び図22；アミノ酸配列は配列番号:66)へ移入した(表54)。6つの変異型残基中の5つは、ヒト、マウス及びブタのTSHRで同一であった。残基169のみ、種間で異なり：ヒトTSHRにおいてこれはバリンであり、マウスTSHRにおいてこれはグルタミン酸であり、且つブタTSHRにおいてこれはアラニンである。マウス及びブタの両方のTSHR残基169は、ヒトTSHR-JMG55におけるようにアルギニンへ変異された。完全長変異体マウスTSHR及びブタTSHRを、熱安定性125I-TSHとの結合親和性及びCHO細胞へトランスフェクトされた場合の刺激に対する反応性に関して、それぞれの完全長野生型TSHRと比較した。
【０２４３】
（完全長野生型並びに変異型マウス、ブタ及びヒトTSHRの熱安定性）
完全長野生型及び変異型マウス、ブタ及びヒトTSHRの熱安定性を、安定性アッセイBにおいて45℃で測定した(図14c)。安定性アッセイBは、TSHR変異体の4E31-コートされたプレートへの一晩の結合、その後のプレートの水浴中45℃での最大3時間の加熱に関与している。加熱後に残存する活性TSHRの割合は、TSHR-結合アッセイにおいて測定する(図14a、表55)。
【０２４４】
これらの変異は、マウスTSHRの熱安定性を6.3倍増大した(半減期2.15分から13.6分へ)。ブタTSHRの熱安定性において、同様の増大が存在した(半減期3.6分から12.1分へは、熱安定性の3.34倍の向上をもたらす)。変異型ヒトTSHR(TSHR-JMG55、半減期184分)は、野生型ヒトTSHR(半減期4.8分)よりも、熱安定性が39倍より大きかった。このことは、ヒトTSHRにおいて認められる熱安定化変異は、他の種からTSHRへ移入可能であり、且つそれらの熱安定性を向上するが、この熱安定性の向上は、ヒトTSHR-JMG55について観察される熱安定性の向上ほど大きくないことを示している。
【０２４５】
（CHO細胞において発現されたマウス及びブタの野生型及び変異型TSHRの刺激）
完全長野生型マウス及びブタTSHR並びに完全長マウス及びブタTSHR-JMG55同等変異体の、TSH及びM22 Fabによる刺激(表54)(Flp-In CHO細胞において発現された)を、2種のTSHR作用物質(TSH又はM22-Fab)の異なる濃度範囲で生成されたサイクリックAMPの量を測定することにより、評価した。各アッセイにおいて、TSHR変異体の刺激は、TSHR-WTの刺激と比較した(同じアッセイにおいて測定)。EC50、すなわち最大刺激反応の50％を生じる作用物質の濃度を、各変異体について算出し、且つTSHR-WTと比較した(表56及び表57)。完全長ヒトTSHR-WT及び完全長ヒトTSHR-JMG55変異と同様に、JMG55の同等な変異は、同等のマウス又はブタTSHR-WTと比べ、TSH又はM22による刺激に反応したサイクリックAMP生成に対する顕著な作用を有さなかった。
【０２４６】
（125I-TSHの野生型及び変異型の可溶化完全長ヒト、マウス及びブタTSHRへの結合親和性）
ヒト、マウス及びブタの野生型TSHR(CHO細胞において発現され且つ界面活性剤可溶化された)への125I-TSH結合は、各々、類似した親和定数1.80×109L/mol、1.58×109L/mol及び1.99×109L/molを生じた(表58)。界面活性剤可溶化された完全長変異型ヒト(JMG55)、マウス及びブタTSHR(JMG55同等物；表54)への125I-TSH結合も、同じく野生型TSHRに比し類似した親和定数(各々、0.98×109L/mol、0.87×109L/mol及び1.25×109L/mol)を示した。このことは、TSHの完全長TSHRへの結合は、異なるTSHR種においてJMG55同等なTSHR変異により影響されないことを示している。
【０２４７】
（TSHR-JMG55の膜貫通ドメイン(TMD)への単一変異の熱安定化作用）
合計で56種のTSHRの膜貫通ドメイン内の可能性のある熱安定化変異を確定した：10種のTSHRコンセンサス変異、19種のTSHR不活性化変異、26種のGPCR熱安定化変異、並びに1種のTSHRにおいて不活性化し且つβ1-アドレナリン受容体において熱安定化するの両方である変異(Y601A)(表59)。これらの単一変異を、既にLRDに位置した6つの熱安定化変異(I253R、D143P、R112P、D151E、H63C及びV169R) (配列番号:45、36、34、37、32及び41)を含む、完全長TSHR-JMG55に加えた。
【０２４８】
これらの変異体は、14C4-コートされたプレート又は4E31-コートされたプレートへ結合される場合に、アッセイにおいて活性の異なる相対レベルを示した(図14a)。このことは、これらの変異の一部は、TSHRのこれらの抗体への結合に影響を及ぼすことを示唆している。この理由で、アッセイの両方の型における変異体の活性を試験し、且つこれらの試料を、適宜希釈し、各アッセイにおいて、類似のOD450測定値を生じた(2.0〜2.5のOD450)。D460A及びS505Aは、それらの熱安定性を決定するのに十分な高い活性を有さなかった。14C4熱安定性アッセイ(A)における低活性のために、C600Rの熱安定性は、4E31熱安定性アッセイにおいてのみ決定することができた(B及びC)。
【０２４９】
14C4-Fab2又は4E31-Fab2でコートされたELISAプレートに結合された完全長TSHR-JMG55及び変異体の熱安定性は、3つの異なる様式で測定した。安定性アッセイAは、4℃で一晩のインキュベーション、及びその後のウェルの水浴中55℃で最大2時間の加熱による、TSHR変異体の14C4-コートされたELISAプレートウェルへの結合に関与している(図14b)。同様に、安定性アッセイBは、4℃で一晩のインキュベーション、及びその後のウェルの水浴中55℃で最大2時間の加熱による、TSHR変異体の4E31-コートされたELISAプレートウェルへの結合に関与している(図14c)。対照的に、安定性アッセイCは、溶液中TSHR変異体の33℃で最大2時間の加熱、それに続く4E31-コートされたELISAプレートウェルへの結合に関与している(図14d)。全ての場合において、加熱後残存する活性TSHRの割合は、TSHR-結合アッセイにおいて測定される(図14a)。
【０２５０】
TSHR260野生型及びTSHR260変異体は、TSHRの小型の球形のドメインである。この比較的単純な場合において、経時的熱によるタンパク質の不活性化は、一相指数関数的減衰曲線と正確にフィットし、それから半減期(t1/2)が算出される。しかし、完全長TSHRは、多ドメインタンパク質であり、従ってタンパク質のフォールディング状態とアンフォールディング状態の間に、遷移状態が存在する。結果的に、タンパク質が溶液中で加熱される安定性アッセイCにおいて(図14d)、TSHRのアンフォールディングは、二相減衰、すなわち、タンパク質の減衰が一方は速く他方は遅い2つの減衰プロセスの和であるものとしてより良くモデル化され、アンフォールディングプロセスを説明する2つのパラメータ「半減期(遅)」及び「半減期(速)」、並びに減衰プロセスのパーセントが速い減衰プロセスにより説明される第三のパラメータ「パーセントファスト(PercentFast)」を生じる。3つのパラメータを直接比較することは、より一層複雑であり、従ってこれらの比較は、10、30及び120分間の加熱後に残存する活性TSHRの割合について成される。或いは、TSHRがその活性の50％を失う時点を決定することにより、見かけの半減期が概算される。安定性アッセイA及びBの場合(図14a及び図14b)、TSHRドメインの一方は、抗体14C4又は4E31により、プレートに係留される。このことは、一相指数関数的減衰により密接に似ている熱-不活性化プロセスにつながり、こうしてこれらのアッセイにおけるTSHR変異体の半減期を決定及び比較することができる。全てのアッセイに関して、TSHR-JMG55の熱安定性は、同じ実験で測定され、且つ各TSHR変異体の半減期比を決定するために使用される。
【０２５１】
驚くべきことに、試験した変異のほとんどは、少なくとも1種の安定性アッセイにおいて熱安定性であった(半減期比≧1.3)。アッセイした54種の変異のうちわずかに2種C599S及びI622Aが、3種全ての熱安定性アッセイにおいて中立又は不安定化していた(表60)。TSHR-JMG55の20種のうち、最も熱安定な変異は、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L及びY678Aである(図29、30、配列番号:69-88(DNA)及び89-108(タンパク質))。これらは、TSHR-JMG55の安定性を、安定性アッセイAにおいて最大4.5倍、安定性アッセイBにおいて最大1.6倍、及び安定性アッセイCにおいて最大15倍まで増大した。
【０２５２】
（TSHR-JMG55のTMDにおける二重変異の熱安定性）
3種の単一TSHR-JMG55 TMD変異体T477I、V595I及びI648L(図30；各々、配列番号:97、100及び103)は、3つの熱安定性アッセイ全てにおいて熱安定性をかなり増大したので、これらを更なる変異誘発のために選択した。これらの3種の変異は、互いに及び他の最も熱安定化する単一変異(n＝17)と組合せて、TSHR-JMG55の二重変異体を形成した(表61並びに図29及び30；各々、配列番号:69-88及び配列番号:89-108)。変異体JMG59からJMG73は、T477Iと組合せ、変異体JMG74からJMG92は、V595Iと組合せ、及びJMG93からJMG111は、I648Lと組合せる。JMG66とJMG82は同一であり(JMG55＋T477I＋V595I)、JMG68とJMG101は同一であり(JMG55＋T477I＋I648L)、並びにJMG87とJMG104は同一である(JMG55＋V595I＋I648L)。構築体JMG85(JMG55＋V595I＋C600R)は、変異V595I及びC600Rは非常に近く且つ恐らく互いに干渉するので、作製しなかった。
【０２５３】
これらの二重変異体JMG59からJMG111は全て、熱安定性アッセイCフォーマットにおいてアッセイし(図14d)、且つ同じアッセイにおける単一変異体T477I、V595I又はI648Lの熱安定性と比較した(表62)。15種のT477I二重変異体(JMG59からJMG73)のうちの5種は、T477Iに対し熱安定化された(半減期比≧1.1として規定)。18種のV595I二重変異体(JMG74からJMG92)のうちの12種は、V595Iに対し熱安定化され、且つ19種のI648L二重変異体(JMG93からJMG111)のうちの12種は、I648Lに対し熱安定化された(JMG111は、熱安定性アッセイにおいて試験されるのに十分に活性ではなかった)。JMG87[JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋I648L(配列番号:103)]、JMG90[JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋S671A(配列番号:106)]及びJMG91[JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋Y678L(配列番号:107)]は、熱安定性アッセイCにおいて最も熱安定化しているV595I変異体であった。
【０２５４】
V595I二重変異体(JMG74からJMG92)は最も熱安定化し、且つ14C4及び4E31アッセイにおける活性の差異がT477I二重変異体について認められたものと同じように大きいものを有さないので、JMG74からJMG92変異体は、安定性アッセイA及びBにおいて更に分析した(図14b、c；表63)。これらの変異体は全て、V595Iに対するこれらの熱安定性アッセイのうちの少なくとも1種において、熱安定化された。安定性アッセイAにおける半減期は、TSHR-JMG55-V595Iに関する55℃で27分から、JMG82(JMG55＋V595I＋T477I)[JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋T477I(配列番号:97)]に関する59分まで増大した。安定性アッセイBにおいて最も熱安定化した変異体は、JMG84(JMG55＋V595I＋K565L)[JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋K565L(配列番号:99)]であり、55℃での半減期38分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iの半減期18分を2.4倍向上した。しかし、JMG91(JMG55＋V595I＋Y678L)及びJMG84(JMG55＋V595I＋K565L)は、3種の熱安定性アッセイの全てにおいて、最良の熱安定性を持つオールラウンドの変異体として選択された。安定性アッセイAにおいて、JMG91は、55℃での半減期48分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを1.8倍向上し、安定性アッセイBにおいて、これは55℃での半減期30分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを1.7倍向上し、並びに安定性アッセイCにおいて、これは33℃での半減期108分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを2.1倍向上した。これは、33℃での、10分、30分及び120分後の、各々、生存率80％、64％及び49％と同等であり、これは安定性を、各々、1.3、1.1及び1.3倍増大する。安定性アッセイAにおいて、JMG84は、55℃での半減期44分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを1.6倍向上し、安定性アッセイBにおいて、これは55℃での半減期38分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを2.4倍向上し、並びに安定性アッセイCにおいて、これは33℃での半減期102分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを1.6倍向上する。これは、33℃での、10分、30分及び120分後の、各々、生存率72％、60％及び48％と同等であり、これは安定性を、各々、1.1、1.1及び1.4倍増大する。
【０２５５】
（TSHR-JMG55のTMDにおける三重変異の熱安定性）
TSHR-JMG91及びTSHR-JMG84は、二重TSHR変異体熱安定性アッセイにおいて熱安定化された15種の単一変異と組み合わせた(表61)。安定性アッセイCにおけるこれらの変異体の増大した熱安定性のために、可溶化されたTSHR変異体を、先に使用した33℃の代わりに、40℃で加熱した。三重変異体の一部は、安定性アッセイA及びBにおいて、二重変異体TSHR-JMG91(JMG55＋V595I＋Y678L)又はTSHR-JMG84(JMG55＋V595I＋K565L)に対し熱安定化されるのに対し、TSHR-JMG84上に構築された完全長TSHR-JMG55の三重TMD変異体(JMG127からJMG142)のみ、熱安定性アッセイCにおいて40℃で熱安定化される(表64)。TSHR-JMG55の三重変異体の全般的に最大の熱安定化は、TSHR-JMG131(JMG55＋V595I＋K565L＋N455A)[JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋K565L(配列番号:99)＋N455A (配列番号:93)]である。安定性アッセイAにおいて、TSHR-JMG131は、55℃での半減期60分を有し、これはTSHR-JMG84の半減期38±4分を1.5倍向上した。55℃での安定性アッセイBにおいて、TSHR-JMG131は、半減期32分を有し、これはTSHR-JMG84の半減期23±7分を1.1倍向上した。40℃での安定性アッセイCにおいて、TSHR-JMG131は、47分の半減期を有し、これは、40℃で半減期14±3分を有するTSHR-JMG84よりも熱安定性が3.5倍上回る。
【０２５６】
（TSHR TMD変異体に結合するM22-POD、K1-70-POD及びK1-18-POD）
完全長TSHR変異体、TSHR-JMG55、TSHR-JMG55-V595I、TSHR-JMG84(JMG55＋V595I＋K565L)及びTSHR-JMG91(JMG55＋V595I＋Y678L)に結合するM22-POD、K1-18-POD及びK1-70-PODを、TSHR変異体でコートされたELISAプレートに結合するTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲート(すなわち、M22-POD、K1-18 POD又はK1-70 POD)の濃度を変動し、且つ基質テトラメチルベンジジンとのインキュベーションによりTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲートの結合を検出することにより、試験した(図14a)。結合定数(Kd)、すなわち、受容体の半分がリガンドに結合するリガンド(TRAb-ペルオキシダーゼ)の濃度を、決定した(表65)。試験した変異は、TSHR-JMG55と比べ、TSHR変異体のM22-POD、K1-18-POD又はK1-70-PODのいずれかへの結合に影響を及ぼさなかった(表65から表67)。
【０２５７】
（M22 IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG又はTRAb陽性患者血清による完全長TSHR-JMG55変異体へのM22-POD結合の阻害）
完全長TSHR-JMG55変異体TSHR-JMG55、TSHR-JMG55-V595I、TSHR-JMG84(JMG55＋V595I＋K565L)及びTSHR-JMG91(JMG55＋V595I＋Y678L)へのM22-POD結合の阻害を、TSHR変異体をM22 IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG又はTRAb陽性患者血清とインキュベーションし、その後M22-PODとインキュベーションすることにより、決定した(図14e)。M22 IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG及びTRAb陽性患者血清は、M22-PODの完全長TSHR変異体への結合を、TSHR-JMG55と同じ程度に、阻害する。これらの結果は、これらの変異は、モノクローナルTSHR抗体の完全長TSHRへの結合に影響を及ぼさないことを示している(表68から表70)。同様に、TRAb陽性患者血清は、TSHR-JMG55と類似した、TSHR-JMG55変異体へのM22-POD結合の阻害を示す(表71)。従って、これらの完全長TSHR変異体は、患者血清中のTRAbを検出するためのアッセイにおける使用に適している。
【０２５８】
（TMD領域の熱安定化ヒトTSHR変異の他の種由来のTSHR及び他の糖タンパク質ホルモン受容体への移入可能性）
表72は、熱安定性を向上するためにヒトTSHRにおいて変異されたTMD内に位置したアミノ酸のほとんどは、ヒト、マウス及びブタのTSHRを超えて保存されていることを示している。Glu409、Asp410、His443、Leu452、Asn455、Met463、Tyr466、Leu467、Thr477、Gln489、Lys565、Cys600、Tyr601、Lys660、Tyr667、Ser671及びTyr678は、全ての種を超えて保存されている。残基595は、ヒト及びマウスにおいてはValであるが、しかしブタにおいてはThrである。ブタTSHRにおけるThr595のIleへの変異は恐らく、熱安定化されるであろう。残基648は、ヒトにおいてはIleであるが、マウス及びブタにおいてはLeuである。従って、マウス及びブタのTSHRは、既にhTSHRにおけるI648L熱安定化変異の標的残基を有する。別の脂肪族残基であるValへの変異は、熱安定性を変更し得る。
【０２５９】
ヒトTSHR(配列番号:2)、FSHR(配列番号:57)及びLHR(配列番号:58)の配列アラインメント(図11)は、hTSHR中の多くの熱安定化するよう変異された残基は、hFSHR及びhLHRにおける同じ又は類似の残基に対応していることを指摘している。結果的に、TSHRのTMDに位置した熱安定化変異のほとんどは、FSHR及びLHRの同等の残基に移入された場合に、恐らく、熱安定化される(表73)。唯一の差異は以下である：FSHRにおいてはGln391であり、LHRにおいてはArg388である、His443；FSHRにおいてはIle411である、Met463；FSHRにおいてはSer596であり、LHRにおいてはAla593である、Ile648；並びに、FSHRにおいてはHis615であり、LHRにおいてはTyr612である、Tyr667。これらの同等の変異の一部は、依然熱安定化され得る。
【０２６０】
（まとめと結論）
本発明は、理論的-系統的変異誘発を基に、TSHRなどの、糖タンパク質ホルモン受容体タンパク質の熱安定性を向上する新規アプローチを示す。ここで、わずかな安定化する変異を理論的に設計するアプローチは、TSHR配列中の熱安定化位置を確定するために、タンパク質内の各残基をアラニンへ変異する系統的変異誘発アプローチの力と組合せられる。理論的-系統的変異誘発アプローチにおいて、TSHRタンパク質における各位置に関して、最も可能性のある安定化変異(コンピュータ法又は理論的方法の組合せにより、本発明者らにより予測された)が、作製され、且つ熱安定化特性について試験される。本発明において、ハイスループット法は、最も熱安定化する変異を確定するために、多くの変異体を作製し且つスクリーニングすることを可能にする。これは、その他の点で可能性のあるものよりも、TSHR配列中のより熱安定化する変異の確定を可能にした。本発明に記載の方法は、他のタンパク質の熱安定性を向上するために適用することもできる。本発明の方法は、特に、TSHR260の熱安定性を最大900倍向上する、より熱安定性のTSHR260変異体を作製するためにうまく組合せられるTSHR260の17種の大いに熱安定化する変異(P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y)の確定が可能である(図5及び6；配列番号:11-25、27-43、45及び46)。これらの変異体は依然、TSHR260-WTと類似の方式で、TSHRを刺激するヒト自己抗体M22に結合する。最も安定化した単一(TSHR260-I253R)(配列番号:45)、二重(TSHR260-JMG22：I253R(配列番号:45)＋D143P(配列番号:36))、三重(TSHR260-JMG37：I253R(配列番号:45)＋D143P(配列番号:36)＋R112P(配列番号:34))、四重(TSHR260-JMG45：I253R(配列番号:45)＋D143P(配列番号:36)＋R112P(配列番号:34)＋D151E(配列番号:37))、五重(TSHR260-JMG52：I253R(配列番号:45)＋D143P(配列番号:36)＋R112P(配列番号:34)＋D151E(配列番号:37)＋V169R(配列番号:41))、並びに六重(TSHR260-JMG55：I253R(配列番号:45)＋D143P(配列番号:36)＋R112P(配列番号:34)＋D151E(配列番号:37)＋V169R(配列番号:41)＋H63C(配列番号:32))のTSHR260変異体の熱安定性は、各々、TSHR260の熱安定性を、およそ3.1、13、42、174、450、700及び900倍向上する。更に、完全長TSHRの場合、三重(TSHR-JMG37：I253R＋D143P＋R112P)、四重(TSHR-JMG45：I253R＋D143P＋R112P＋D151E)、五重(TSHR-JMG52：I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R)、並びに六重(TSHR260-JMG55：I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R＋H63C)のTSHR変異体は、完全長野生型TSHRに対する熱安定性を向上する。
【０２６１】
これらの変異は、モノクローナルTSHR抗体(M22、K1-18及びK1-70)のTSHR260又は完全長TSHRへの結合に影響を及ぼさない。更に、TRAb陽性患者血清は、M22-PODのTSHR260変異体及び完全長TSHR変異体への結合を、各々、野生型TSHR260及び完全長TSHRと同じ程度に阻害する。また更に、M22-Fab、K1-18 IgG及びTSHは、野生型TSHRについて認められるのと同様の様式で、Flp-In CHO細胞において発現された完全長TSHR変異体におけるサイクリックAMPの生成を刺激する。
【０２６２】
TSHR調製品の、特にTSHR260の熱安定性の増大は、TSHR260のフォールディング状態を維持するために、それに結合した抗体を必要とせずにその活性を保持しつつ、変異体の、特にTSHR260の最も熱安定性の高い変異体の、TSHR260-JMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R＋H63C；各々、配列番号:45、36、34、37、41及び32)の、均質までの精製を可能にする。これは、立体構造上活性のあるTSHR260がそれに結合した抗体を伴わずに精製された最初の時である。エンドグリコシダーゼF3を使用し精製された物質が脱グリコシル化された後、TSHR260-JMG55は依然活性があった。精製された及び脱グリコシル化されたの両方のTSHR260-JMG55物質は、患者血清中のTSHR自己抗体を検出するための改善されたアッセイにおいて、使用することができる。
【０２６３】
これらの熱安定化変異はまた、例えば、アッセイにおいて使用するためにTSHR260に結合された検出可能な標識アルカリホスファターゼからなる、融合タンパク質TSHR260-APへ、移入可能であった。熱安定化TSHR260-AP変異体、TSHR260-AP-JMG22(I253R＋D143P；配列番号:45及び36)、TSHR260-AP-JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E；配列番号:45、36、34及び37)並びにTSHR260-AP-JMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R＋H63C；配列番号:45、36、34、37、41及び42)は、TSHR260-APの熱安定性を、各々、およそ11、66、又は165倍向上する。これらのTSHR260-AP変異体は依然、野生型TSHR260-APと同程度にTRAb抗体(M22、K1-18、K1-70及びTRAb陽性患者血清)に結合することができる。これらの構築体は、患者血清中のTSHR自己抗体を検出するためのTSHR260-AP架橋ELISAにおける使用に有益である。他の検出可能な標識もまた、使用することができ、且つこれは、TSHR260及び完全長TSHRについて確定された熱安定化変異はまた、これらの標識された構築体の熱安定性も増大させ、従って広範な適用におけるそれらの使用が可能であることを予想させる。
【０２６４】
本発明において開示された熱安定化変異の多くは、驚くべきものであり、且つコンピュータモデリング又は構造試験の単独によっては、予測されなかった。
【０２６５】
本発明の一部として説明された実験は、モデリングソフトウェアを使用することの限定された有用性を強調している。コンピュータにより予測された変異体の熱安定性は、主に2つの状況において使用された。第一に、理論的変異誘発についての2種以上の選択肢が存在する場合、Discovery Studiosを使用し、どの変異が特定位置において恐らく最も熱安定性であるかを予測した。第二に、単独残基について明確な理論的変異が存在しない場合、Discovery Studiosソフトウェアを使用し、最も熱安定性の変異、又は全ての変異が脱安定化された場合、最も少なく脱安定化される変異を予測した。このソフトウェアは、その他の点では試験され得ない多くの熱安定化変異(例えば、H63C、S84F、P142I、D143P、P168Y、N170W及びR255Y)の確定において、一部使用される。しかし一部の残基に関して、いずれか他のアミノ酸への変異誘発は、脱安定化されると予測された。これらの場合において、多くの脱安定化変異からの最も少ない脱安定化の予測が、選択された。驚くべきことに、これらの一部は、最も安定化する変異(例えば、T62V、L64Y、P142I及びI167F)の一部であることがわかった。実際には脱安定化された安定化されるべきと予測された変異の多くの例も存在し、これはコンピュータモデリングの限界及び実験的研究の必要要件を説明しており、このことは、ここで本発明において開示された方法を使用することにより可能になる。
【０２６６】
本発明のもっとも成功する戦略の一つは、プロリン残基のその構造への除去及び導入である。全体で23種の中5種のプロリンへの又はプロリンからの変異(22％)(すなわち、P28E、R112P、P142I、D143P及びP168Y)は、かなりTSHR260を安定化するが、しかし非常に低レベルで又は完全に発現されない23種中8種の変異体(35％)の構造に対し非常に破壊的でもあり得る。それに五員環を持つプロリンは、-63°±15°に拘束された骨格二面角φ、並びに非常に拘束されたプロリン残基の前の残基のねじれ角を伴う、非常に剛性の構造を有する。このタンパク質骨格の減少した可動性は、これに最低の配座エントロピーをもたらし、その結果その幾何構造(geometry)が好ましい場合、アミノ酸のプロリンとの交換は、より熱安定性のTSHRを生じる。しかし、その幾何構造が好ましくない場合、プロリン残基は、ねじれ角を制限することにより、その構造へひずみを導入することができる。そのようなプロリン残基の他のより可動性のあるアミノ酸との置換は、ひずみを解放し、より熱安定性の残基を作製する。
【０２６７】
第二の本発明の成功した戦略は、表面残基の帯電残基への変異である。P28E、D151E、V169R及びI253Rは全て、タンパク質の表面への帯電残基の導入又は変更に関与している。特に、V169R及びI253Rは、hFSHRにおける脂肪族表面残基の類似残基への変異に関与しており、両方の場合において類似残基はArgである。
【０２６８】
完全長TSHRの更なる安定化変異は、TSHRの膜貫通ドメイン(TMD)において確定された。TSHRのTMD領域において確定された20種の最も熱安定化の大きい変異は、以下である：E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L及びY678A(図29及び30；配列番号:69-88(DNA)及び配列番号:89-108(タンパク質))。これらは、TSHR-JMG55の安定性を、安定性アッセイAにおいて最大4.5倍、安定性アッセイBにおいて最大1.6倍、及び安定性アッセイCにおいて最大15倍増大する。これらは組合せられて、完全長TSHRの熱安定性を更に増大するTMD内に位置した変異を伴う、二重変異体(例えば、TSHR-JMG91(JGM55(配列番号:45、36、34、37、32及び41)＋V595I(配列番号:100)＋Y678L(配列番号:107))及びTSHR-JGM84(JGM55(配列番号:45、36、34、37、32及び41)＋V595I(配列番号:100)＋K565L(配列番号:99)))並びに三重変異体(例えば、TSHR-JMG131(JMG55(配列番号:45、36、34、37、32及び41)＋V595I(配列番号:100)＋K565L(配列番号:99)＋N455A(配列番号:93)))を形成する。
【０２６９】
本発明の差し迫った重要な結果は、熱安定性TSHR調製品の最初の生成である。これは、完全長TSHR及びより短い配列からなる他のTSHR調製品の安定性に、変異の作用を適用する新たな機会を開いている。かかるTSHR調製品は、より高い温度で試行され得る改善された手動の及び自動のアッセイシステム(患者TRAbの検出のための)の作製に有用であろう。更に、熱安定性TSHR調製品は、精製されることができ、且つかかる純粋な調製品の利用可能性は、TSHRの構造の研究及び新規療法の開発との関わりにおいて重要であろう。
【実施例】
【０２７０】
(表）
(表1)  TSHR260における単一アミノ酸変異
【表１】
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【０２７１】
特定の変異を実行する理由は、以下である：ねじれ角−TSHR260結晶構造の骨格のねじれ角の試験により決定された、Pro又はGlyへの変異に関して正しい骨格構造を伴う残基の変異；コンセンサス−様々な種を超えたTSHR、又は3種の糖タンパク質ホルモン受容体のいずれかの、コンセンサス配列への変異。同じく、甲状腺機能低下症を引き起こすことが報告されている1種の天然のTSHR変種P27T；β-シート−交互の極性、非極性の周期性が維持されるようなβ-鎖残基の変異誘発、コア残基はIleへ変異され、表面残基は、Thr、Asp又はArgへ変異される；LRR−ロイシンリッチ反復モチーフLxxLxLxxNxLxxLpxxoFxxLxxの一般的コンセンサス配列と一致するための変異であり、ここで「L」はLeu、Ile、Val又はPheであり、「N」は、Asn、Thr、Ser又はCysであり、「o」は、非極性残基であり、且つ「x」は、非保存の残基である(Matsushima、Miyashita、Mikami及びKurokiの文献、2010)；表面−Glu(又は既にGluである場合はAsp)へ変異された表面残基、帯電した残基の性質は、ArgのLysへの、及びLysのArgへの変異により維持される；コア−コア残基の変異、Ile及びAlaのValへの、GlyのGlnへの、他の残基のAlaへの変異；DS−Discovery Studiosソフトウェアを使う、分子モデリングにより安定化されると予測された変異。
【０２７２】
(表2)  M22-ペルオキシダーゼのTSHR260への結合を基にしたアッセイ(TSHR260-結合アッセイ)において評価されるTSHR260の安定性に対する単一変異の作用
【表２】
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【０２７３】
CHO-K1細胞において発現された各TSHR260変異について、TSHR260アッセイ(図12a)におけるM22-結合は、42℃で30分間の加熱後に残存する活性タンパク質の割合により決定される、TSHR260-WT及び安定性の割合として表され(図12b)、TSHR260-WT安定性の割合(％WT)として表される。安定性が増大する変異の安定性スクリーンの結果は、太字で示す。これらの変異は、変異体の半減期を決定する熱安定性アッセイにおいて試験した(図12b)。
M22は、TSHRに対するヒトモノクローナル自己抗体である。
【０２７４】
(表3)  TSHR260-結合アッセイにおいて決定された42℃でのTSHR260変異体の半減期
【表３】
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【０２７５】
各変異体の半減期は、アリコートを42℃で加熱し、2時間の期間について間隔をあけてアッセイすることにより決定した(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-WTの熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-WTの半減期に対する、半減期の差(Δt1/2)及び半減期比を決定した。太字は、最も熱安定化する変異体であり、これらは二重変異体を作製するために使用した。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも2回繰り返した実験に関する平均±平均の標準誤差(SEM)として表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でアッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
【０２７６】
(表4)  ドットブロットアッセイにより測定した、TSHR260-WTに対するTSHR260変異体の発現レベル(TSHR変異体の総量、すなわち、活性＋不活性)の分析、並びにTSHR260-WTに対するTSHR260-結合アッセイにおけるそれらの活性。
【表４】
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nd＝決定されず
【０２７７】
ドットブロット及びTSHR260-結合アッセイ(図12a)の結果は、各々、TSHR260-WTに対して表した(％WT)。変異体は、以下のように、TSHR260-結合アッセイとドットブロットアッセイ(総TSHR変異体タンパク質)の間の比により分類した：(a)TSHR260-結合データとドットブロット発現データの間にほとんど又は全く差がない；(b)TSHR260-結合は、ドットブロット発現よりもかなり大きい(TSHR260-結合／ドットブロット＞2.5)；又は、(c)ドットブロット発現は、TSHR260-結合よりもかなり大きい(TSHR260-結合／ドットブロット＜0.4)。TSHR260-結合アッセイの結果とドットブロットの結果が両方共低い場合(20％WT未満)、これらは分類しなかった。安定性比は、変異体の半減期を基にしたが、これが測定されなかった場合は、変異体が42℃で30分間加熱された場合の安定性スクリーンデータ(TSHR260-WTの割合として(％WT))を列挙した(*)。
【０２７８】
(表5)  二重、三重、四重、五重及び六重TSHR260変異体を作製するための単一TSHR260変異の組合せ
【表５】
2017520246.tif 000020
2017520246.tif 000021
【０２７９】
完全長TSHR中の対応する変異は、TSHR-JMGxとして規定し、ここでxは、TSHR260における各変異の番号である。
【０２８０】
(表6)  42℃で測定したTSHR260二重変異体の熱安定性
【表６】
2017520246.tif 000022
【０２８１】
JMG1、JMG3、JMG5、JMG6、JMG8、JMG10、JMG11、JMG12、JMG13、JMG14、JMG18、JMG25、JMG29及びJMG31は、TSHR260-結合アッセイにおいて低すぎる結合を示したので、熱安定性の決定は不可能であった。JMG21の熱安定性は、42℃では測定しなかった。JMG30は、42℃でのみ試験した三重変異体である。
【０２８２】
各変異体の半減期は、アリコートを42℃で加熱し、3時間かけて間隔をあけてアッセイすることにより、決定する(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-WT及びTSHR260-I253Rの熱安定性を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-WT及びTSHR260-I253Rの半減期と比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期比を決定した。TSHR260-結合アッセイにおいて結合の良好なレベルを持つ最も熱安定化している変異体は、太字で示す。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でアッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
【０２８３】
(表7)  50℃で測定したTSHR260二重変異体の熱安定性
【表７】
2017520246.tif 000023
【０２８４】
JMG1、JMG3、JMG5、JMG6、JMG7、JMG8、JMG10、JMG11、JMG12、JMG13、JMG14、JMG15、JMG18、JMG25、JMG29及びJMG31は、TSHR260-結合アッセイにおいて低すぎる結合を示したので、熱安定性の決定は不可能であった。JMG21の熱安定性は、TSHR260-I253Rのみ同じ実験で決定し、TSHR260-WTは決定しなかった。
【０２８５】
各変異体の半減期は、アリコートを50℃で加熱し、2時間かけて間隔をあけてアッセイすることにより、決定した(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-WT及びTSHR260-I253Rの熱安定性を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-WT及びTSHR260-I253Rの半減期と比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期比を決定した。TSHR260-結合アッセイにおいて結合の良好なレベルを持つ最も熱安定化している変異体は、太字で示す。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でアッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
【０２８６】
(表8)  50℃で測定した三重及び四重TSHR260変異体の熱安定性
【表８】
2017520246.tif 000024
【０２８７】
基本の変異体は、それを三重変異体及び四重変異体が基にした、各々、二重変異体JMG22(I253R＋D143P；表5)又は三重変異体JMG37(I253R＋D143P＋R112P；表5)をいう。JMG34、JMG36、JMG40、JMG42及びJMG48は、TSHR260-結合アッセイにおいて低すぎる結合(TSHR260-WTの＜16％)を示したので、熱安定性の決定は不可能であった。
【０２８８】
各変異体の半減期は、アリコートを50℃で加熱し、3時間かけて間隔をあけてアッセイすることにより、決定した(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-I253Rの熱安定性を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-I253Rの半減期と比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期安定性比を決定した。最も熱安定化している変異体は、太字で示す。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でアッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
【０２８９】
(表9)  55℃で測定した四重、五重及び六重TSHR260変異体の熱安定性
【表９】
2017520246.tif 000025
【０２９０】
基本の変異体は、生じる四重、五重及び六重変異体が基にした、各々、三重変異体JMG37(I253R＋D143P＋R112P；表5)、四重変異体(I253R＋D143P＋R112P＋D151E；表5)又は五重変異体JMG50(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋H62C；表5)をいう。JMG48は、TSHR260-結合アッセイにおいて検出可能な結合を有さなかったので、熱安定性の決定は不可能であった。六重変異体JMG54及びJMG55は、55℃で正確に半減期を決定するにはあまりにも安定していた。
【０２９１】
各変異体の半減期は、アリコートを55℃で加熱し、2時間かけて間隔をあけてアッセイすることにより、決定する(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-I253R及びTSHR260-JMG37の熱安定性を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-I253Rの半減期と比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期安定性比を決定した。最も熱安定化している変異体は、太字で示す。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でアッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
【０２９２】
(表10)  60℃で測定した五重及び六重TSHR260変異体の熱安定性
【表１０】
2017520246.tif 000026
【０２９３】
基本の変異体は、生じる四重、五重及び六重変異体が基にした、各々、三重変異体JMG37(I253R＋D143P＋R112P；表5)、四重変異体JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E；表5)又は五重変異体JMG50(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋H62C；表5)をいう。
【０２９４】
各変異体の半減期は、アリコートを60℃で加熱し、2時間かけて間隔をあけてアッセイすることにより、決定する(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-JMG45の熱安定性を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-JMG45の半減期と比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期安定性比を決定した。最も熱安定化している変異体は、太字で示す。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。
【０２９５】
(表11)  37℃で測定したTSHR260-WT、TSHR260-I253R、JMG22、JMF37、JMG45、JMG52、JMG54及びJMG55の熱安定性曲線
【表１１】
2017520246.tif 000027
【０２９６】
各変異体の半減期は、アリコートを37℃で加熱し、37日間かけて間隔をあけてアッセイすることにより、決定する(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。同じ実験において測定したTSHR260-WTの半減期と比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期安定性比を示している。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でアッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
【０２９７】
【表１２】
2017520246.tif 000028
【０２９８】
(表13)  14C4プレート上の42℃での完全長TSHR変異体の熱安定性
【表１３】
2017520246.tif 000029
【０２９９】
結果は、450nmでの吸光度、及び非加熱試料の450nmでの吸光度の割合の両方で表す。1回の実験における4つ組の測定の平均±SD。
【０３００】
(表14)  14C4プレート上の50℃での完全長TSHR変異体の熱安定性
【表１４】
2017520246.tif 000030
【０３０１】
結果は、450nmでの吸光度、及び非加熱試料の450nmでの吸光度の割合の両方で表す。1回の実験における4つ組の測定の平均±SD。各変異体に関する50℃での半減期及び完全長TSHR-WTに対する安定性比を、列挙する。
【０３０２】
【表１５】
2017520246.tif 000031
【０３０３】
【表１６】
2017520246.tif 000032
【０３０４】
【表１７】
2017520246.tif 000033
【０３０５】
(表18)  完全長TSHR変異体へのM22-POD結合
【表１８】
2017520246.tif 000034
【０３０６】
結果は、各変異体について、非特異的結合を減算した、450nmでの吸光度、及び最大OD450測定値の割合(％最大値)を、1回の実験における2つ組での測定に関する、平均±SDとして表している。Kdは、GraphPad Prismによる、データの飽和結合曲線へのフィットにより決定した。
【０３０７】
(表19)  完全長TSHR変異体へのK1-18-POD結合
【表１９】
2017520246.tif 000035
【０３０８】
結果は、各変異体について、非特異的結合を減算した、450nmでの吸光度、及び最大OD450測定値の割合(％最大値)を、1回の実験における2つ組での測定に関する、平均±SDとして表している。Kdは、GraphPad Prismによる、データの飽和結合曲線へのフィットにより決定した。
【０３０９】
(表20)  完全長TSHR変異体へのK1-70-POD結合
【表２０】
2017520246.tif 000036
【０３１０】
結果は、各変異体について、非特異的結合を減算した、450nmでの吸光度、及び最大OD450測定値の割合(％最大値)を、1回の実験における2つ組での測定に関する、平均±SDとして表している。Kdは、GraphPad Prismによる、データの飽和結合曲線へのフィットにより決定した。
【０３１１】
(表21)  M22-POD、K1-18 POD及びK1-70 PODの結合に対する変異の作用のまとめ(TSHR60-WT又は完全長TSHR-WTに対して)
【表２１】
2017520246.tif 000037
n.d.＝測定されず
【０３１２】
【表２２】
2017520246.tif 000038
【０３１３】
【表２３】
2017520246.tif 000039
【０３１４】
(表24)  完全長TSHR変異体へのM22-POD結合のK1-18 IgGによる阻害
【表２４】
2017520246.tif 000040
【０３１５】
結果は、450nmでの吸光度、及びM22-POD結合の阻害率を、1回の実験における2つ組での測定に関する、±SDとして表している。
【０３１６】
(表25)  完全長TSHR変異体へのM22-POD結合のK1-70 IgG による阻害
【表２５】
2017520246.tif 000041
【０３１７】
結果は、450nmでの吸光度、及びM22-POD結合の阻害率を、1回の実験における2つ組での測定に関する、±SDとして表している。
【０３１８】
(表26)  TSHR260又は完全長TSHR-WTへのM22-POD結合のK1-18 IgG及びK1-70 IgG阻害に対する変異の作用のまとめ(TSHR60-WT又は完全長TSHR-WTに対して)
【表２６】
2017520246.tif 000042
【０３１９】
(表27)  患者血清によるTSHR260変異体へのM22-POD結合の阻害
【表２７】
2017520246.tif 000043
【０３２０】
結果は、1回の実験における2つ組測定に関する、450nmでの吸光度±SD及びM22-POD阻害率として、表している。
【０３２１】
(表28)  患者血清による完全長TSHR変異体へのM22-POD結合の阻害
【表２８】
2017520246.tif 000044
【０３２２】
結果は、1回の実験における2つ組測定に関する、450nmでの吸光度±SD及びM22-POD結合の阻害率として、表している。
【０３２３】
(表29)  TSHR260又は完全長TSHR-WTへのM22-POD結合の正常血清及びTRAb陽性患者血清の阻害に対する変異の作用のまとめ(TSHR60-WT又は完全長TSHR-WTに対して)
【表２９】
2017520246.tif 000045
【０３２４】
(表30)  野生型TSHR及びTSHR-JMG37(I253R+D143P+D151E)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(M22)及びTSHヒトモノクローナル抗体の作用
【表３０】
2017520246.tif 000046
【０３２５】
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(M22)＝1.62ng/mL、EC50(TSH)＝1.02ng/mL。TSHR-JMG37に関して：EC50(M22)＝0.94ng/mL、EC50(TSH)＝0.39ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して: EC50(M22)＝2.13ng/mL、EC50(TSH)＝0.77ng/mL。TSHR-JMG37に関して：EC50(M22)＝3.10ng/mL、EC50(TSH)＝0.86ng/mL。
【０３２６】
(表31)  野生型TSHR及びTSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(M22)及びTSHヒトモノクローナル抗体の作用
【表３１】
2017520246.tif 000047
【０３２７】
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(M22)＝1.52ng/mL、EC50(TSH)＝0.82ng/mL。TSHR-JMG45に関して：EC50(M22)＝5.37ng/mL、EC50(TSH)＝0.84ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して:EC50(M22)＝1.97ng/mL、EC50(TSH)＝0.64ng/mL。TSHR-JMG45に関して：EC50(M22)＝4.03ng/mL、EC50(TSH)＝0.63ng/mL。
【０３２８】
(表32)  野生型TSHR及びTSHR-JMG52 (I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(M22)及びTSHヒトモノクローナル抗体の作用
【表３２】
2017520246.tif 000048
【０３２９】
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(M22)＝1.92ng/mL、EC50(TSH)＝0.42ng/mL。TSHR-JMG52に関して：EC50(M22)＝3.72ng/mL、EC50(TSH)＝0.43ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して: EC50(M22)＝1.40ng/mL、EC50(TSH)＝0.67ng/mL。TSHR-JMG52に関して：EC50(M22)＝3.27ng/mL、EC50(TSH)＝0.99ng/mL。
【０３３０】
(表33)  野生型TSHR及びTSHR-JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(M22)及びTSHヒトモノクローナル抗体の作用
【表３３】
2017520246.tif 000049
【０３３１】
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(M22)＝1.53ng/mL、EC50(TSH)＝1.11ng/mL。TSHR-JMG52に関して：EC50(M22)＝2.87ng/mL、EC50(TSH)＝0.934ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して:EC50(M22)＝1.30ng/mL、EC50(TSH)＝0.445ng/mL。TSHR-JMG52に関して：EC50(M22)＝3.90ng/mL、EC50(TSH)＝0.609ng/mL。
【０３３２】
(表34)  野生型TSHR及びTSHR-JMG37 (I253R+D143P+D151E)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(K1-18)及びTSHヒトモノクローナル抗体の作用
【表３４】
2017520246.tif 000050
【０３３３】
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。試料は、サイクリックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝13.3ng/mL、EC50(TSH)＝0.64ng/mL。TSHR-JMG37に関して：EC50(K1-18)＝11.3ng/mL、EC50(TSH)＝0.53ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)＝12.8ng/mL、EC50(TSH)＝0.71ng/mL。TSHR-JMG37に関して：EC50(K1-18)＝11.1ng/mL、EC50(TSH)＝0.58ng/mL。
【０３３４】
(表35)  野生型TSHR及びTSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR (K1-18)及びTSHヒトモノクローナル抗体の作用
【表３５】
2017520246.tif 000051
【０３３５】
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝12.9ng/mL、EC50(TSH)＝0.57ng/mL。TSHR-JMG45に関して：EC50(K1-18)＝22.5ng/mL、EC50(TSH)＝0.63ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)＝17.8ng/mL、EC50(TSH)＝0.82ng/mL。TSHR-JMG45に関して：EC50(K1-18)＝16.0ng/mL、EC50(TSH)＝0.77ng/mL。
【０３３６】
(表36)  野生型TSHR及びTSHR-JMG52 (I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR (K1-18)及びTSHヒトモノクローナル抗体の作用
【表３６】
2017520246.tif 000052
【０３３７】
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝17.9ng/mL、EC50(TSH)＝0.69ng/mL。TSHR-JMG52に関して：EC50(K1-18)＝14.9ng/mL、EC50(TSH)＝0.51ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝14.3ng/mL、EC50(TSH)＝1.00ng/mL。TSHR-JMG52に関して：EC50(K1-18)＝19.7ng/mL、EC50(TSH)＝0.99ng/mL。
【０３３８】
(表37)  野生型TSHR及びTSHR-JMG55 (I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR (K1-18)及びTSHヒトモノクローナル抗体の作用
【表３７】
2017520246.tif 000053
【０３３９】
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝11.1ng/mL、EC50(TSH)＝0.50ng/mL。TSHR-JMG55に関して：EC50(K1-18)＝14.3ng/mL、EC50(TSH)＝0.48ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝12.0ng/mL、EC50(TSH)＝0.62ng/mL。TSHR-JMG55に関して：EC50(K1-18)＝28.2ng/mL、EC50(TSH)＝0.81ng/mL。
【０３４０】
(表38)  TSH、M22-Fab及びK1-18 IgGによる変異型完全長TSHRを発現しているCHO細胞の刺激に対する変異の作用(TSHR-WTに対して)のまとめ
【表３８】
2017520246.tif 000054
【０３４１】
(表39a)  変異型完全長TSHRを発現しているCHO細胞のM22-Fab及びTSH刺激のEC50に対する変異の作用(TSHR-WTに対して)のまとめ
【表３９】
2017520246.tif 000055
【０３４２】
EC50は、最大シグナル伝達反応の半分を生じるのに必要なリガンドの濃度である。LogEC50は、2〜10回の独立した実験からの平均±SDとして示している。
【０３４３】
(表39b)  変異型完全長TSHRを発現しているCHO細胞のK1-18 IgG及びTSH刺激のEC50に対する変異の作用(TSHR-WTに対して)のまとめ
【表４０】
2017520246.tif 000056
【０３４４】
EC50は、最大シグナル伝達反応の半分を生じるのに必要なリガンドの濃度である。LogEC50は、2〜10回の独立した実験からの平均±SDとして示している。
【０３４５】
(表40)  野生型TSHR及びTSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMPレベル。サイクリックAMP生成の刺激に対する正常血清及び患者血清の作用。
【表４１】
2017520246.tif 000057
【０３４６】
結果は、NPSによる基本刺激に対する比として表し、且つ3回の測定の平均±SDである。
【０３４７】
(表41)  野生型TSHR及びTSHR-JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)を発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMPレベル。サイクリックAMP生成の刺激に対する正常血清及び患者血清の作用。
【表４２】
2017520246.tif 000058
【０３４８】
結果は、NPSによる基本刺激に対する比として表し、且つ3回の測定の平均±SDである。
【０３４９】
(表42)  ヒトTSHRの熱安定化アミノ酸残基の、他の哺乳動物TSHR配列における同等のTSHRアミノ酸残基と比較した分析
【表４３】
2017520246.tif 000059
【０３５０】
熱安定化するよう変異された残基のほとんどは、異なる種由来のTSHRを超えて、良く保存されている。ヒトTSHRとは異なる残基には、ハイライトを付けている。相同体間の配列変化のほとんどは、類似の特性を持つアミノ酸、例えば塩基性、酸性、脂肪族又は芳香族アミノ酸へである。結果的に、本発明者らがヒトTSHR260及びヒト完全長TSHRにおいて認めた熱安定化変異は、同じく表42に示した他の哺乳動物種において熱安定性である可能性がある。*:最も熱安定性のTSHR260変異体JMG55を含む、6種の最も熱安定化変異を、示している。
【０３５１】
(表43)  ヒトTSHRの熱安定化アミノ酸残基の、ヒトFSHR及びヒトLHRにおける同等のTSHRアミノ酸残基と比較した分析
【表４４】
2017520246.tif 000060
【０３５２】
hTSHR(配列番号:2)と同一である、hFSHR(配列番号:57)及びhLHR(配列番号:58)における残基は、太字で示す。これらに加え、受容体間で異なる残基の多くは、類似の特性を持つアミノ酸、例えば塩基性、酸性、脂肪族又は芳香族アミノ酸に制限されている。これらの残基には、ハイライトを付け、hTSHRからの類似の熱安定化変異の移入が、hFSHR及び／又はhLHRにおいて熱安定化される可能性がある残基を示している。*:最も熱安定性のTSHR260変異体JMG55を含む、6種の最も熱安定化変異を、示している。
【０３５３】
(表44)  患者血清によるTSHR260変異体へのM22-POD結合の阻害
【表４５】
2017520246.tif 000061
【０３５４】
結果は、450nmでの吸光度(平均±SD；n=2)及びM22-POD結合の阻害率として示している。
【０３５５】
【表４６】
2017520246.tif 000062
【０３５６】
【表４７】
2017520246.tif 000063
【０３５７】
【表４８】
2017520246.tif 000064
【０３５８】
【表４９】
2017520246.tif 000065
【０３５９】
【表５０】
2017520246.tif 000066
【０３６０】
【表５１】
2017520246.tif 000067
【０３６１】
【表５２】
2017520246.tif 000068
【０３６２】
【表５３】
2017520246.tif 000069
【０３６３】
【表５４】
2017520246.tif 000070
2017520246.tif 000071
【０３６４】
【表５５】
2017520246.tif 000072
【０３６５】
【表５６】
2017520246.tif 000073
【０３６６】
【表５７】
2017520246.tif 000074
【０３６７】
(表49)  2つの異なる型のTSHR260-JMG55の精製及び比活性のまとめ
【表５８】
2017520246.tif 000075
【０３６８】
TSHR260活性は、TSHR260-結合アッセイ(図12a)における試料の活性である。比活性は、試料のタンパク質濃度(mg/mL)で除算した、TSHR260-結合アッセイにおける試料の活性(U/mL)であり、タンパク質1mgの活性をもたらす。精製レベルは、出発物質(ストリームライン装加)の比活性により除算した、各工程での精製された物質の比活性である。
【０３６９】
【表５９】
2017520246.tif 000076
【０３７０】
(表51)  TSHRモノクローナル自己抗体(K1-70、K1-18及びM22)の精製TSHR260-JMG55-4.5でコートされたELISAプレートウェルへの結合
【表６０】
2017520246.tif 000077
【０３７１】
(表52)  エンドグリコシダーゼF3による脱グリコシル化後のTSHR260結合アッセイにおけるTSHR260-JMG55-4.5活性の分析
【表６１】
2017520246.tif 000078
【０３７２】
TSHR260活性は、「TSHR260-結合アッセイ」及び「Freestyle Max試薬を使用するTSHR260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」で規定された、TSHR260標準と比較した、TSHR260-結合アッセイにおける試料の活性である(図12a)。
【０３７３】
(表53)  ニッケル-アフィニティ精製後のTSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化
【表６２】
2017520246.tif 000079
【０３７４】
(表54)  マウス及びブタTSHRにおけるhTSHR-JMG55変異の同等残基
【表６３】
2017520246.tif 000080
【０３７５】
hTSHR-JMG55の熱安定化変異された残基のほとんどは、マウス及びブタ由来のTSHRで、良く保存されている。169位の残基のみが、種を超えて異なる。残基169は、ヒトにおいてバリン、マウスにおいてグルタミン酸、及びブタにおいてアラニンである。
【０３７６】
(表55)  完全長野生型及び変異型マウス、ブタ及びヒトTSHRの45℃での熱安定性
【表６４】
2017520246.tif 000081
【０３７７】
各構築体の半減期は、TSHR調製品の4E31-コートされたプレートへの結合、その後のこのプレートの最大3時間の水浴中45℃での加熱による、安定性アッセイBにおいて測定した。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR-結合アッセイ(図14c)により決定した。結果は、時間に対してプロットし、二相指数関数的減衰曲線にフィットさせた。半減期は、TSHRがその活性の半分を喪失する時間である。示された結果は、平均±SD、n＝2である。
【０３７８】
(表56)  野生型又は変異型のいずれかのマウスTSHRを発現しているCHO細胞におけるcAMP生成の刺激に対する様々な濃度のM22 IgG及びTSHの作用
【表６５】
2017520246.tif 000082
【０３７９】
示された結果は、3つ組の測定の平均±SDである。試料は、サイクリックAMPアッセイ緩衝液中に希釈した。mTSHR-WTに関して：EC50(M22)＝13.09ng/ml；EC50(TSH)＝0.81ng/ml。mTSHR-変異型に関して：EC50(M22)＝20.36ng/ml；EC50(TSH)＝1.41ng/ml。変異型mTSHRは、ヒトTSHR変異体JMG55を基にした。マウスTSHRにおける変異したアミノ酸は、ヒトTSHR-JMG55構築体において変異したアミノ酸に類似しており、且つH63C；R112P；D143P；D151E；E169R(hTSHR V169Rに類似)及びI253Rを含んでいた。
【０３８０】
(表57)  野生型又は変異型のいずれかのブタTSHRを発現しているCHO細胞におけるcAMP生成の刺激に対する様々な濃度のM22 IgG及びTSHRの作用
【表６６】
2017520246.tif 000083
【０３８１】
示された結果は、3つ組の測定の平均±SDである。試料は、サイクリックAMPアッセイ緩衝液中に希釈した。pTSHR-WTに関して：EC50(M22)＝6.23ng/ml；EC50(TSH)＝0.79ng/ml。mTSHR-変異型に関して；EC50(M22)＝6.53ng/ml；EC50(TSH)＝1.04ng/ml。変異型pTSHRは、ヒトTSHR変異体JMG55を基にした。ブタTSHRにおける変異したアミノ酸は、ヒトTSHR-JMG55構築体において変異したアミノ酸に類似しており、且つH63C；R112P；D143P；D151E；A169R(hTSHR V169Rに類似)及びI253Rを含んでいた。
【０３８２】
(表58)  異なる種(ヒト、マウス及びブタ)由来の完全長野生型及び変異型TSHRへのTSH結合に関する会合定数
【表６７】
2017520246.tif 000084
【０３８３】
2つ組で測定した1回の実験から算出した会合定数。
【０３８４】
(表59)  TSHR-JMG55のTMDで作製された単一アミノ酸変異
【表６８】
2017520246.tif 000085
【０３８５】
(表60)  TMDに単一変異を有するTSHR-JMG55変異体の安定性
【表６９】
2017520246.tif 000086
2017520246.tif 000087
【０３８６】
またこれらのTSHR変異体は全て、6つの変異JMG55：I253R、D143P、R112P、D151E、H63C及びV169Rを含む。
a:14C4活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、14C4-コートされたELISAプレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。安定性アッセイAにおける使用に関して、試料は、14C4活性10U/mLまで希釈した。U/mlの定義に関しては、「Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」の項を参照されたい。
b:4E31活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、4E31-コートされたELISAプレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。安定性アッセイBにおける使用に関して、試料は、4E31活性10U/mLまで希釈し、且つ安定性アッセイCにおける使用に関しては、試料は、最終濃度12.5U/mlまで希釈した。U/mlの定義に関しては、「Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」を参照されたい。
c:安定性アッセイA及びBにおいて、各変異体の半減期は、14C4-プレート(安定性アッセイA、図14b)又は4E31-コートされたELISAプレートウェル(安定性アッセイB、図14c)のTSHR変異体によるコーティングにより決定される。結合したTSHRを伴うプレートのストリップは、55℃で最大2時間加熱した。活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットし、且つ指数関数的減衰曲線にフィットさせた。各実験において、TSHR-JMG55の熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR-JMG55変異体の半減期と比較した半減期比を決定した。
d:安定性アッセイC(図14d)において、各TSHR-JMG55変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中、33℃で最大2時間加熱した。活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットし、且つ二相指数関数的減衰曲線にフィットさせた。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR-JMG55変異体の割合を、算出し、且つTSHR-JMG55と比較した。見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失する時点である。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG55の見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
太字は、二重変異体の作製に使用した、20種の最も熱安定化している変異体である。実験は、2つ組でアッセイされた各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。「n.d.」＝決定されず(determined)。
【０３８７】
(表61)  二重、三重及びTSHR-JMG55変異体を作製するためのTSHR-JMG55 TMDにおける単一変異の組合せ
【表７０】
2017520246.tif 000088
2017520246.tif 000089
【０３８８】
列挙した全てのTSHR変異体は、6つの変異JMG55：I253R、D143P、R112P、D151E、H63C及びV169Rを含む。
JMG66は、JMG82と同一であり、JMG68は、JMG101と同一であり、及びJMG87は、JMG104と同一である。変異V595I及びC600Rは、非常に近く且つ恐らく互いに干渉することが見込まれるので、JMG85構築体は作製されなかった。
【０３８９】
(表62)  TMDに二重変異を有するTSHR-JMG55変異体の熱安定性：安定性アッセイC
【表７１】
2017520246.tif 000090
2017520246.tif 000091
【０３９０】
表61で規定したTSHR変異体。
a:14C4活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、14C4-コートされたELISAプレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。U/mlの定義に関しては、「Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」を参照されたい。
b:4E31活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、4E31-コートされたELISAプレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。安定性アッセイCにおける使用に関しては、試料は、最終濃度12.5U/mlまで希釈した。U/mlの定義に関しては、「Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」を参照されたい。
c:安定性アッセイCにおいて、各TSHR変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中、33℃で最大2時間加熱した。残存する活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした(図14d)。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の割合を、算出し、且つJMG59からJMG73についてTSHR-JMG55-T477Iと、JMG74からJMG92の場合はTSHR-JMG55-V595Iと、又はJMG93からJMG111についてはTSHR-JMG55-I648Lと比較した。加えて、見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失する時点である。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG55-T477I、TSHR-JMG55-V595I又はTSHR-JMG55-I648Lの見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
実験は、(2つ組でアッセイされた)各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。「n.d.」＝決定されず。
【０３９１】
(表63)  TSHR-JMG55のTMDに二重変異を有する変異体(JMG74からJMG92)の熱安定性：安定性アッセイA、B及びC
【表７２】
2017520246.tif 000092
【０３９２】
表61で規定したTSHR変異体。
a:安定性アッセイA及びBにおいて、各変異体の半減期は、最初に、14C4-コートされたELISAプレートウェルへの(安定性アッセイA、図14b)又は4E31-コートされたELISAプレートウェル(安定性アッセイB、図14c)への変異体の結合により測定した。結合した変異体TSHRを伴うプレートウェルのストリップは、55℃で最大2時間加熱した。残存する活性変異体TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR-JMG55-V595Iの熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR-JMG55-V595Iの半減期と比較した各変異体に関する半減期比を決定した。
b:安定性アッセイC(図14d)において、TSHR変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中、33℃で最大2時間加熱した。活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の割合を、算出し、且つTSHR-JMG55-V595Iと比較した。見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失する時点である。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG55-V595Iの見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
全体で最も熱安定化変異体であるJMG91及びJMG84は、太字で示し、且つこれらを、三重変異体作製の基本として使用した。実験は、(2つ組でアッセイされた)各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。「n.d.」＝決定されず。
【０３９３】
(表64)  TSHR-JMG55のTMDに三重変異を有する変異体(JMG112からJMG142)の熱安定性：安定性アッセイA、B及びC
【表７３】
2017520246.tif 000093
【０３９４】
表61で規定したTSHR変異体。
a:安定性アッセイA(図14b)及びB(図14c)において、各変異体の半減期は、最初に、14C4-コートされたELISAプレートウェルへの(安定性アッセイA)又は4E31-コートされたELISAプレートウェル(安定性アッセイB)への変異体の結合により測定した。結合した変異体TSHRを伴うプレートウェルのストリップは、55℃で最大2時間加熱した。残存する活性変異体TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR-JMG91又はTSHR-JMG84の熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR-JMG91又はTSHR-JMG84の半減期と比較した各変異体に関する半減期比を決定した。
c:安定性アッセイC(図14d)において、TSHR変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中、40℃で最大2時間加熱した。残存する活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットし、二相指数関数的減衰曲線にフットさせた。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の割合を、算出し、且つTSHR-JMG91又はTSHR-JMG84と比較した(JMG112からJMG126はTSHR-JMG91と比較し、且つJMG127からJMG142はTSHR-JMG84と比較した)。同じく見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失する時点と決定した。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG91又はTSHR-JMG84の見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
実験は、(2つ組でアッセイされた)各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。「n.d.」＝決定されず。
【０３９５】
【表７４】
2017520246.tif 000094
【０３９６】
【表７５】
2017520246.tif 000095
【０３９７】
【表７６】
2017520246.tif 000096
【０３９８】
【表７７】
2017520246.tif 000097
【０３９９】
【表７８】
2017520246.tif 000098
【０４００】
【表７９】
2017520246.tif 000099
【０４０１】
【表８０】
2017520246.tif 000100
【０４０２】
(表72)  マウス及びブタTSHRにおけるhTSHR-JMG55変異の同等残基
【表８１】
2017520246.tif 000101
【０４０３】
hTSHR-JMG55の熱安定化変異された残基のほとんどは、マウス及びブタ由来のTSHRで良く保存されている。595位及び648位の残基のみが、種を超えて異なる。残基595は、ヒト及びマウスにおいてはバリンであるが、ブタにおいてはトレオニンである。残基648は、ヒトにおいてはイソロイシンであるが、マウス及びブタにおいてはロイシンである。
【０４０４】
(表73)  ヒトFSHR及びヒトLHRの同等なアミノ酸残基と比較したヒトTSHRのTMDの熱安定化アミノ酸残基の分析
【表８２】
2017520246.tif 000102
【０４０５】
hTSHR(配列番号:2)と同一である、hFSHR(配列番号:57)及びhLHR(配列番号:58)の残基は、太字で示している。これらに加え、これらの受容体間の多くの残基の差異は、類似の特性を持つアミノ酸、例えば、塩基性、酸性、脂肪族又は芳香族アミノ酸に限定される。hTSHRからhFSHR及びhLHRへの類似の熱安定化変異の移入は、これらの受容体の熱安定性を向上する可能性がある。
【図１】
2017520246.tif 000103
【図２】
2017520246.tif 000104
【図３】
2017520246.tif 000105
【図４】
2017520246.tif 000106
【図５】
2017520246.tif 000107
【図６】
2017520246.tif 000108
【図７ａ−ｂ】
2017520246.tif 000109
【図７ｃ−ｄ】
2017520246.tif 000110
【図７ｅ】
2017520246.tif 000111
【図８】
2017520246.tif 000112
【図９】
2017520246.tif 000113
【図１０−０１】
2017520246.tif 000114
【図１０−０２】
2017520246.tif 000115
【図１０−０３】
2017520246.tif 000116
【図１１−０１】
2017520246.tif 000117
【図１１−０２】
2017520246.tif 000118
【図１２ａ−ｂ】
2017520246.tif 000119
【図１２ｃ−ｄ】
2017520246.tif 000120
【図１３ａ−ｂ】
2017520246.tif 000121
【図１３ｃ】
2017520246.tif 000122
【図１４ａ−ｂ】
2017520246.tif 000123
【図１４ｃ−ｄ】
2017520246.tif 000124
【図１４ｅ】
2017520246.tif 000125
【図１５】
2017520246.tif 000126
【図１６】
2017520246.tif 000127
【図１７】
2017520246.tif 000128
【図１８】
2017520246.tif 000129
【図１９】
2017520246.tif 000130
【図２０】
2017520246.tif 000131
【図２１】
2017520246.tif 000132
【図２２】
2017520246.tif 000133
【図２３】
2017520246.tif 000134
【図２４】
2017520246.tif 000135
【図２５ａ】
2017520246.tif 000136
【図２５ｂ】
2017520246.tif 000137
【図２５ｃ】
2017520246.tif 000138
【図２５ｄ】
2017520246.tif 000139
【図２５ｅ】
2017520246.tif 000140
【図２５ｆ】
2017520246.tif 000141
【図２５ｇ】
2017520246.tif 000142
【図２５ｈ】
2017520246.tif 000143
【図２６】
2017520246.tif 000144
【図２７】
2017520246.tif 000145
【図２８Ａ】
2017520246.tif 000146
【図２８Ｂ】
2017520246.tif 000147
【図２９】
2017520246.tif 000148
【図３０】
2017520246.tif 000149
【配列表】
2017520246000001.app
【国際調査報告】
2017520246.tif 000150
2017520246.tif 000151
2017520246.tif 000152
2017520246.tif 000153
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