(57)【要約】  肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）などの疾患および症状の処置のための組成物および技術が本明細書に記載される。右心室代償の発症を引き起こす異常な血管系に対処しない緩和措置または予防措置と異なり、幹細胞ベースの治療の使用は、ＰＡＨにおける微小血管病変に直接影響を与え、それにより、疾患の経過を回復に向かわせ得る。
2017530977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置の方法であって、
心臓関連疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択すること；ならびに、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む組成物を投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する、方法。
【請求項２】
前記心臓関連疾患および／または症状が、肺高血圧症（ＰＨ）または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＡＨが特発性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＡＨが関連性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が慢性疾患および／または症状を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
単回用量を前記被験体に複数回投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組成物の投与が動脈内注入を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組成物の投与が静脈内注入を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
組成物の投与が注射を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
注射が経皮注射を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
注射が心筋内への注射を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
処置が心室壁厚の減少をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
処置が肺圧または収縮期圧の減少をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
処置の方法であって、
心臓関連疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択すること；ならびに、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞を含む組成物を前記被験体に投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する、方法。
【請求項１５】
前記心臓関連疾患および／または症状が、肺高血圧症（ＰＨ）または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＡＨが特発性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＡＨが関連性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞が心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体が慢性疾患および／または症状を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
単回用量を前記被験体に複数回投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組成物の投与が動脈内注入を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
組成物の投与が静脈内注入を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
組成物の投与が注射を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
注射が経皮注射を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
注射が心筋内への注射を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
処置が心室壁厚の減少をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
処置が肺圧または収縮期圧の減少をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）における心筋球由来細胞（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ）の使用に関する組成物および技術が本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００２】
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、肺全体にわたる肺小細動脈の顕著な狭窄または閉塞を特徴とする進行性致死的症状である。肺の血管系におけるこれらの閉塞は、肺を通して血液を送ろうとする際に、右心室に面した肺血管抵抗の増加をもたらす。研究により、ＰＡＨは、肺小血管内壁におけるプロスタサイクリンおよび酸化窒素の減少に関連することが示されている。これらの因子は、通常、血管を拡張し、血管壁における細胞増殖を防止する。加えて、ＰＡＨは、エンドテリン−１（反対の効果を有する物質）のレベルの増加に関連する。その結果、治療アプローチは、「良い因子」に置換するまたは「悪い因子」を遮断するための薬物（これらの多くは、１９９５年以来開発および使用されている）に依拠している。プロスタサイクリン類似体（酸化窒素およびエンドセリン受容体アンタゴニストの下流効果を増大する薬剤）のいくつかの送達形態が、ＰＡＨを有する患者を処置するために使用されている。これらの処置アプローチは、ＰＡＨに罹患している者の生存、運動耐容能および生活の質の改善をもたらした。しかしながら、それらは全く治癒的ではなく、上記処置にもかかわらずＰＡＨがスムーズに進行し、結果として、患者は右心不全で死亡する可能性がある。事実、明らかな臨床経過にもかかわらず、進行性右心不全代償が起こる。
【０００３】
既存の治療の主な限界は、肺小細動脈における根本的な病理学的変化であって、疾患の根源である病理学的変化を改善することができないことである。これまでに、ＰＡＨを有する患者における右心室機能不全の基礎となる多くの病理学的機構に対処する特定の処置はない。非常に有望な手段は、傷害部位に直接導入される幹細胞の使用であり、このような幹細胞は、肺血管系に直接導入され得るか、または注入によって静脈内に導入され得る。重要なことに、様々な研究により、右心室は、幹細胞の投与後に、血液放出中の抵抗の低下を経験することが観察されている。右心の仕事量が減少するので、肺圧の低下および右心室壁厚の減少は、心機能の改善を示唆する。さらなる幹細胞関連ＰＡＨ研究により、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの心臓幹細胞の注入もまた、肺圧および右心室壁厚を有意に減少させることができることが示されている。少なくとも１つの幹細胞ベースのＰＡＨ治療が臨床に到達している。
【０００４】
ＰＡＨにおけるＣＤＣの作製および治療適用に関する組成物および技術が本明細書に記載され、このような幹細胞は、ＰＡＨなどの疾患および／または症状を予防または改善するだけではなく、損傷微小血管系の再生および修復を介してＰＡＨそれ自体を実際に処置することができる。
【発明の概要】
【０００５】
処置の方法であって、心臓関連疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択すること；ならびに、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む組成物を投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書に記載される。他の実施形態では、心臓関連疾患および／または症状は、肺高血圧症（ＰＨ）または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を含む。他の実施形態では、ＰＡＨは、特発性である。他の実施形態では、ＰＡＨは、関連性である。他の実施形態では、被験体は、慢性疾患および／または症状を有する。他の実施形態では、単回用量を被験体に複数回投与する。他の実施形態では、組成物の投与は、動脈内注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、静脈内注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、注射を含む。他の実施形態では、注射は、経皮注射を含む。他の実施形態では、注射は、心筋内への注射を含む。他の実施形態では、処置は、心室壁厚の減少をもたらす。他の実施形態では、処置は、肺圧または収縮期圧の減少をもたらす。
【０００６】
処置の方法であって、心臓関連疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択すること；ならびに、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞を含む組成物を前記被験体に投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書にさらに記載される。他の実施形態では、心臓関連疾患および／または症状は、肺高血圧症（ＰＨ）または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を含む。他の実施形態では、ＰＡＨは、特発性である。他の実施形態では、ＰＡＨは、関連性である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む。他の実施形態では、被験体は、慢性疾患および／または症状を有する。他の実施形態では、単回用量を被験体に複数回投与する。他の実施形態では、組成物の投与は、動脈内注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、静脈内注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、注射を含む。他の実施形態では、注射は、経皮注射を含む。他の実施形態では、注射は、心筋内への注射を含む。他の実施形態では、処置は、心室壁厚の減少をもたらす。他の実施形態では、処置は、肺圧または収縮期圧の減少をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＰＡＨ動物モデルにおける心筋球由来細胞の治療効果。動物を、対照、モノクロタリン偽注入（すなわち、細胞なし）およびモノクロタリンと心筋球由来細胞（＋ＣＤＣ）に分けた。エコー研究および最終的な血行動態研究により、静脈内注入した２００万個のＣＤＣの単回用量は、ＣＤＣを投与した場合の右心室の収縮期圧の減少によって示されるように、モノクロタリンラットモデルにおけるＰＡＨの進行を顕著に軽減することが示された。モノクロタリンを皮下注射（６０ｍｇ／ｋｇ）し、１４日目にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；偽手術）または２００万個のＣＤＣを含むＰＢＳを静脈内注入した３５日後の健常対照およびＰＡＨを有する動物における右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ、上のパネル）およびフルトンインデックス（右心室／［左心室＋中隔］、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）；下のパネル）。値は、平均±ＳＥＭである。*対照（ＣＴＬ）と有意に異なる。＃ＰＢＳと有意に異なる。
【図２】ＣＤＣエキソソームにおけるマイクロＲＮＡの差次的発現。（Ａ）ＣＤＣ由来エキソソームのマイクロＲＮＡ分析は、親細胞起源に基づいて、エキソソームの差次的カーゴ内容物を実証している。正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）エキソソームと比較した、ＣＤＣエキソソームにおけるマイクロＲＮＡ存在量の倍率変化（ｎ＝４回の独立した実験）。ＣＤＣエキソソームおよびＮＨＤＦエキソソームから、全ＲＮＡ（マイクロＲＮＡを含む）を単離した。マイクロＲＮＡアレイによって、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。（Ｂ）ＣＤＣエキソソームとＮＨＤＦエキソソームとの間の可変マイクロＲＮＡプロファイルを示すベン図。フォントサイズは、各マイクロＲＮＡの差次的発現の規模を反映する。
【図３】ＣＤＣからのエキソソームの単離。（Ａ）エキソソームの単離およびエキソソームの精製のグラフ表示。（Ｂ）１５日間の無血清馴化期間にわたってＣＤＣで実施した細胞生存（カルセイン）および細胞死（エチジウムホモダイマー−１）アッセイ。（Ｃ）無血清馴化前後のＣＤＣの代表的な画像。
【図４】ヒートマップまたはマイクロＲＮＡ  ＰＣＲアレイは、差次的に高発現するマイクロＲＮＡとしてＭｉｒ−１４６ａを同定する。ＰＣＲアレイプレートレイアウト上にオーバーレイしたＣＤＣエキソソームとＮＨＤＦエキソソームとの間の転写産物の差次的存在量の調節倍率のデータを示すヒートマップ。
【図５】３５日目までの対照（ＣＴＬ）およびＰＡＨ群（ＣＤＣおよび偽）における連続的な体重
【図６】モノクロタリンを皮下注射（６０ｍｇ／ｋｇ）し、１４日目にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；偽手術）または２００万個の心臓由来細胞（ＣＤＣ）を含むＰＢＳを静脈内注入した２８日後の健常対照（ＣＴＬ）および肺動脈高血圧症を有する動物における右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）。値は、平均±ＳＥＭである。*ＣＴＬと有意に異なる。ｎ＝動物１０匹／群
【図７】モノクロタリンを皮下注射（６０ｍｇ／ｋｇ）し、１４日目にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；偽手術；ｎ＝９）または２００万個の心臓由来細胞（ＣＤＣ；ｎ＝１０）を含むＰＢＳを静脈内注入した３５日後の健常対照（ＣＴＬ；ｎ＝１０）動物および肺動脈高血圧症を有する動物における右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）。値は、平均±ＳＥＭである。*ＣＴＬと有意に異なる。＃ＰＢＳと有意に異なる。
【図８】ＲＶ肥大のフルトンインデックス。モノクロタリンを皮下注射（６０ｍｇ／ｋｇ）し、１４日目にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；偽手術）または２００万個の心臓由来細胞（ＣＤＣ）を含むＰＢＳを静脈内注入した２８日後の健常対照（ＣＴＬ）動物および肺動脈高血圧症を有する動物におけるフルトンインデックス（右心室／［左心室＋中隔］、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）。値は、平均±ＳＥＭである。*ＣＴＬと有意に異なる。＃ＰＢＳと有意に異なる。注：Ａ：２８日間；Ｂ：３５日間。
【図９】３５日目に測定した三尖弁輪収縮期移動距離（ＴＡＰＳＥ）（ＲＶ収縮機能の指標）。値は、平均±ＳＥＭとして示されている。
【図１０】３つの群の平均血管壁厚。値は、平均±ＳＥＭとして示されている。*ＣＴＬと有意に異なる。＃ＰＢＳと有意に異なる。分析した血管の平均直径は、群間で同様であった。ＣＴＬ：３９．４＋／−１．２μｍ（ＳＤ）；ＰＡＨ＋ＰＢＳ（偽）：４０．１＋／−２．８μｍ；ＰＡＨ＋ＣＤＣ：３９．５＋／−３．７μｍ。
【図１１】３つの各群の個々の肺動脈の断面の（平滑筋アクチンの）免疫組織化学的描写。スケールバーは、２５μｍである
【図１２】ＰＢＳのみを投与した偽ＰＡＨ動物と比較した、ＣＤＣを投与したＰＡＨ動物における腎機能のパラメータの改善を示す棒グラフ。*ＣＴＬと有意に異なる；＃偽ＰＡＨと有意に異なる。尿素窒素について、*および＃はｐ＜０．０１。クレアチニンについて、*および＃はｐ＜０．０５。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、完全に記載されているかのようにその全体が参照により組み込まれる。特に定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２２ndｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，２０１２）；Ｈｏｒｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３rdｅｄ．，ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）；Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７thｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２０１３）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３rdｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８，２０１２）；およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願で使用される用語の多くに関する一般的なガイドを当業者に提供する。抗体の調製方法の参考文献については、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ndｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，２０１３）；Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６  Ｊｕｌ，６（７）：５１１−９；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，米国特許第５，５８５，０８９号（１９９６  Ｄｅｃ）；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｍａｒ  ２４，３３２（６１６２）：３２３−７を参照のこと。
【０００９】
当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法および材料であって、本発明の実施に使用され得る方法および材料を認識する。実際、本発明は、記載されている方法および材料に決して限定されない。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【００１０】
本明細書の説明および以下の特許請求の範囲を通して使用される「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味は、特に文脈上明確な指示がない限り、複数の対象を含む。また、本明細書の説明で使用される「ｉｎ」の意味は、特に文脈上明確な指示がない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。
【００１１】
肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の発症について、右心室（ＲＶ）は、適切な血流を維持するために、順応性肥大（すなわち、ＲＶ壁筋肉肥厚）によってそれに与えられる後負荷の増加に適応する。しかしながら、未知の理由により、不適応の影響が起こり、進行性代償不全および不全によってＲＶ機能が損なわれる。さらに、承認されている１２個のＰＡＨ特異的薬剤を用いた現代の処置であっても、患者は進行性疾患を示し、ＲＶ不全で死亡することが最も多い。したがって、ＰＡＨ特異的薬物療法の明らかな臨床的改善にもかかわらず、進行性ＲＶ機能不全が報告されていることに注意することは興味深い。また、エポプロステニルを持続注入している患者では、多くの場合に長年にわたって、臨床状態の改善と共に、肺における持続的な重度の閉塞性動脈症および叢状病変が報告されている。別の研究により、ＰＡＨを有する患者由来の６８個の肺標本が調査され、それらの結果は、肺血管リモデリングの複数の特徴が、現代のＰＡＨ治療で処置された患者に存在することを示したと結論付けられた。これまでに、ＰＡＨを有する患者におけるＲＶ機能不全の基礎となる多くの病理学的機構に対処する特定の処置はない。現在、処置は良くても、利尿薬、変力治療などを使用した支援的なものである。このため、この分野のリーダーは、不適応状態の基礎となる機構の理解、および進行性ポンプ不全のためのユニークかつ異なる処置に対して取り組むことを強く訴えている。
【００１２】
心筋球は、インビトロで心筋細胞の特定の特性（例えば、「拍動」能力）を示す細胞の自己会合凝集体である。それらは興奮性であり、同期的に収縮する。心臓生検から得る場合、心筋球を形成する細胞は、脱凝集され得る。心筋球由来細胞（ＣＤＣ）は容易に採取され、生検標本から容易に増殖され得る。以前の研究では、本明細書に記載される方法によれば、７０人の患者の６９人が、細胞を産生した標本を有しており、自己細胞性心筋形成術の目標を達成することができた。自己細胞は、遺伝的一致が完全であり、安全性の懸念が同種異系細胞よりも少ないので、移植材料として非常に魅力的である。自己細胞の使用に関する実際的な限界は、組織採取から細胞移植までの遅延により生じる。代替策として、定義された免疫学的特徴を有する患者から、心臓幹細胞（ＣＳＣ）の細胞バンクを作製し得る。これらは、同種異系移植で使用するために、ドナー細胞およびレシピエントの免疫学的抗原の適合を可能にするはずである。
【００１３】
単一の生物検体標本から、わずか２回の継代後に、数百万個のＣＤＣが生成され得る。治療目的で生検を特異的に実施する場合、出発物質の量を１０倍以上に容易にスケールアップして、全体的な細胞収率をさらに改善し得る。本発明者らは以前に、抗原選択を用いずに、ヒト生検由来のＣＤＣを使用した。ＣＤＣは、幹細胞マーカーを示す細胞のかなり大きな集団を含み、インビボで観察された再生能力は、ＣＤＣが多くの常在幹細胞を含むという考えをさらに裏付けている。後の自己移植のための常在幹細胞のエクスビボ増殖について記載されている方法は、心筋再生を相当程度に媒介する複合能力をこれらの細胞集団（常在および増殖）に与え得る。もしそうであるならば、心臓幹細胞治療は、心機能不全の障害の処置に対する本発明者らの基本的なアプローチを大きく変化させ得る。さらなる例は、米国特許出願第１１／６６６，６８５号、米国特許出願第１２／６２２，１４３号および米国特許出願第１２／６２２，１０６号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に見られる。
【００１４】
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）との関連では、細胞ベースの既存の治療は、これらの構造を覆っている内皮細胞（ＥＣ）集団に焦点を当てており、移植によって内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の減少または機能不全をこれらで補うことにより、肺血管系の修復におけるＥＰＣの役割が確認された。相乗的利益を最大化するために、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を過剰発現するように初期増殖ＥＰＣをさらに操作することが開発されている。他の研究は、ＰＡＨにおける間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の使用可能性を模索し始めている。予防的利益は注目に値し得るが、これらの早期陽性指標は、特に、確立された疾患の事例において部分的にのみ有効であるか、または有効ではない。加えて、遺伝子改変細胞の使用、またはヒト被験体に送達された細胞の安全性プロファイルに関する懸念が存続する。
【００１５】
これに関して、様々な幹細胞の有効性が主に、実際には、様々な化学的因子の局所放出によるものであるという証拠は、エキソソームなどの微小小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｃｉｅｌｅｓ）の放出が、細胞分化および生着と比較して、確立された疾患の処置のために、単なる緩和措置または予防措置ではなく、非常に好ましい臨床的な治療機構であり得ることを示唆している。再生による幹細胞の治療効果は、細胞それ自体の送達に代えて、このような幹細胞によって産生されたエキソソームを直接送達することによって有意に増強され得る。この目的のために、ＰＡＨの低酸素齧歯類モデルにおいて、幹細胞由来エキソソームの投与が、ＰＡＨの発症を予防することが報告されている。興味深いこのような結果は、幹細胞ベースの他のアプローチに見られる予防効果と類似するが、有害な細動脈の予防および回復が、幹細胞それ自体の使用よりも優れた利点をエキソソームが提供することを可能にするかという疑問に答えるものではない。
【００１６】
いかなる特定の理論にも縛られないが、本発明者らは、幹細胞の治療効果がエキソソームによって再現され得、おそらくはこのような再生プロセスに不可欠であると考える。事実、エキソソームの集中的な適用は実際に、以下の理由により結果の向上を提供し得る。第１に、送達された幹細胞の保持は、短命であることが示されている。第２に、幹細胞からのエキソソームの局所放出の量は限定的であり、細胞が保持される限りにおいてのみ生じる。第３に、送達されるエキソソームの量は、非常に多量であり得る（すなわち、その内容物が高用量である）。第４に、局所組織環境では、エキソソームは、細胞によって容易に取り込まれ得る。第５に、免疫原性の問題が回避される。最後に、エキソソームの反復投与は実行可能である一方、幹細胞の場合には、それらは微小血管系に影響を与えるので非現実的／潜在的に危険である。
【００１７】
ＰＡＨにおけるＲＶ機能不全を処置するために、ＣＤＣおよびそれらの細胞製品（すなわち、エキソソーム）を使用することに対して、説得力のある理論的根拠がある。ＲＶ機能不全では、いくつかの機構が同定されている。これらは、血管新生障害によるＲＶ筋肉毛細血管の希薄化と、それに続く虚血および「冬眠」状態の誘導とを含む。ミトコンドリア異常と共に、心筋細胞における解糖への代謝シフトも報告されている。異常なＲＶ線維化、酸化的ストレス、炎症および心筋細胞アポトーシスもある。最後に、代償不全ＲＶでは、ＩＧＦ−１（同化成長因子）の顕著な減少、およびマイクロＲＮＡ  １３３ａの減少などのエピジェネティック異常が存在する。
【００１８】
ＣＤＣは、不適応ＲＶ筋肉の病理／病態生理の基礎となる機構の多くに影響を与える可能性があるので、細胞治療が、ＲＶ機能不全を有するＰＡＨ患者に有益であると考えられるいくつかの理由がある。これらは、有意な抗炎症効果を有するＣＤＣであって、酸化ストレスおよびニトロソ化ストレスの両方を軽減するＣＤＣ、抗アポトーシス性および抗線維症性のＣＤＣであって、内因性幹細胞を血管傷害部位に誘引することができ、非常に血管新生性であるＣＤＣを含む。他の状況では、ＣＤＣは、心筋症モデルにおける適用が成功しており、ＣＤＣは、拡張型心筋症を有する患者の冠動脈に注入されており、ＣＤＣは、心筋梗塞後の患者において研究されており、それにより、患者における安全性の実績が実証されている。加えて、ＣＤＣ細胞治療およびエキソソーム治療の開発および使用は、緩和措置または予防措置とは反対に、疾患の経過を回復に向かわせることによって、ＰＡＨにおける微小血管病変に直接影響を与える可能性がある。このような再生アプローチは、異常血管系への対処、および右心室代償の発症の補償の両方における治療上の大きな進歩である。これらは、この破壊的な症状の処置において現在用いられている現在の薬理学的手段によって対処されていない。
【００１９】
これらの利益の実現は、ＣＤＣなどの幹細胞によって分泌されるエキソソームが単独で、それらの親細胞の治療利益を再現することができるか、またはこれらのプロセスにおいて不可欠である可能性があるかについての理解の向上を必要とする。このようなプロセスにおけるエキソソームの役割の確認は、新たな治療アプローチにおけるそれらの適用（細胞の移植または投与が利用不可能である被験体（例えば、後期心疾患）における「無細胞」使用を含む）を可能にする。デバイスベースの薬理学的な介入または手術は、重要な選択肢をこのような被験体に提供し得ない。当技術分野では、細胞それ自体の投与または移植を伴う機構を用いずに幹細胞再生の利益をもたらす手段を同定することに対する大きな必要性が存在する。
【００２０】
処置の方法であって、処置を必要とする被験体を選択すること、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞を含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書に記載される。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である。特定の実施形態では、被験体は、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状の処置を必要とする。他の実施形態では、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状は、肺疾患である。他の実施形態では、肺疾患は、肺高血圧症（ＰＨ）または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である。他の実施形態では、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状は、心疾患である。
【００２１】
他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、体内の様々な体細胞源、例えば線維芽細胞、血液および造血幹細胞（ｈＳＣ）、免疫細胞、骨および骨髄、神経組織などのいずれか１つに由来する多能性幹細胞（ｐＳＣ）、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、ｈＳＣ、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。様々な実施形態では、細胞は、ヒト生検組織由来の幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞である。様々な実施形態では、細胞は幹細胞であり、始原細胞および／または前駆細胞は初代培養物である。様々な実施形態では、細胞は、連続継代が可能な細胞株を構成し得る幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞である。様々な実施形態では、ＣＤＣは、哺乳動物のものである。他の実施形態では、ＣＤＣは、ヒトのものである。特定の実施形態では、エキソソームは、合成のものである。
【００２２】
様々な実施形態では、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞の投与は、損傷組織もしくは機能不全組織における遺伝子発現を変化させ、損傷組織の生存能力を改善し、および／または個体における新たな組織の再生もしくは産生を増強する。他の実施形態では、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞の投与は、細胞治療方法のために臨床関連用量で使用される多くの細胞を含む。例えば、３ｍＬ／３×１０5個ほどのＣＤＣは、冠動脈内投与において治療利益を提供することができることが実証されている。別の例では、投与されるＣＤＣの数は、冠動脈当たり２５００万個の冠動脈内ＣＤＣ（すなわち、合計７５００万個のＣＤＣ）を含む。様々な実施形態では、ＣＤＣの数は、単回用量で１×１０5個、１×１０6個、１×１０7個、１×１０8個、１×１０9個のＣＤＣを含む。特定の場合では、これは、体重に比例し得る（総ＣＤＣ用量で、体重１ｋｇ当たり１００，０００〜１００万個のＣＤＣの範囲）。様々な実施形態では、投与は、反復投与であり得る。様々な実施形態では、急性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。様々な実施形態では、慢性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。
【００２３】
様々な実施形態では、被験体への心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞の投与は、当技術分野で公知の技術のいずれかによって行われる。いくつかの実施形態では、これは、経皮送達、および／または心筋もしくは骨格筋内への注射を含む。他の実施形態では、心筋注入が使用され、例えば冠動脈内カテーテルが使用される。様々な実施形態では、送達は、動脈内または静脈内であり得る。さらなる送達部位としては、任意の１つ以上の心臓区画、例えば動脈部位、静脈部位および／または心室部位が挙げられる。特定の実施形態では、投与は、前記部位または罹患組織および／もしくは機能不全組織と異なる組織または器官部位への送達を含み得る。特定の実施形態では、送達は、吸入または経口投与によるものである。
【００２４】
様々な実施形態では、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞の投与は、損傷組織もしくは機能不全組織における遺伝子発現を変化させ、損傷組織の生存能力を改善し、および／または個体における新たな組織の再生もしくは産生を増強する。様々な実施形態では、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞の投与は、組織における機能的改善をもたらす。特定の実施形態では、損傷組織は、肺組織、動脈組織または毛細血管組織である。複数の実施形態では、損傷組織または機能不全組織は、心臓組織を含む。
【００２５】
例えば、肺組織、動脈組織、毛細血管組織または心臓組織が損傷または機能不全である特定の実施形態では、機能的改善は、（他の機能的改善の中でも）心拍出量、収縮性、心室機能の増加および／または不整脈の減少を含み得る。例えば、これは、右心室収縮期圧の減少を含み得る。他の組織では、神経損傷の処置に応じた認知の増強、肺損傷の処置に応じた血液酸素移動の改善、損傷免疫学的関連組織の処置に応じた免疫機能の改善などの機能の改善も実現され得る。他の実施形態では、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状は、肺組織、動脈組織または毛細血管組織、例えば遠位肺動脈の内膜を含む肺組織である。他の実施形態では、肺疾患は、肺高血圧症（ＰＨ）または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨは、特発性である。他の実施形態では、ＰＡＨは、関連性である。他の実施形態では、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状は、心疾患である。
【００２６】
例えば、骨格筋組織が損傷または機能不全である特定の実施形態では、機能的改善は、収縮力の増加、歩行能力の改善（例えば、６分間の歩行試験結果の増加）、座位から立ち上がる能力の改善、臥位もしくは背臥位から座る能力の改善、または手先の器用さ（マウスのポインティングおよび／またはクリック）の改善を含み得る。
【００２７】
様々な実施形態では、損傷組織または機能不全組織は、急性事象よる修復、再生または機能の改善を必要とする。急性事象としては、限定されないが、外傷、例えば裂傷、挫傷または衝突損傷、ショック、血液または酸素流の喪失、感染、化学曝露または熱曝露、毒曝露または毒物曝露、薬物の過剰使用または過剰曝露などが挙げられる。特定の実施形態では、損傷組織は、肺組織、動脈組織または毛細血管組織、例えば遠位肺動脈の内膜である。他の実施形態では、損傷組織は心臓組織であり、急性事象は心筋梗塞を含む。いくつかの実施形態では、エキソソームの投与は、梗塞を受けている領域における心臓壁厚の増加をもたらす。
【００２８】
他の実施形態では、損傷組織または機能不全組織は、例えば、気腫、虚血性心疾患、高血圧症、弁膜心疾患、結合組織疾患、ＨＩＶ感染症、肝疾患、鎌状赤血球症、拡張型心筋症、住血吸虫症などの感染症、糖尿病などの疾患に続発する症状を含む鬱血性心不全などの慢性疾患に起因する。様々な実施形態では、投与は、反復投与、例えば２回、３回、４回、４回以上の逐次投与であり得る。様々な実施形態では、急性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。様々な実施形態では、慢性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。
【００２９】
他の損傷原因としては、限定されないが、傷害、加齢性変性症、癌および感染症も挙げられる。複数の実施形態では、再生細胞は、修復または再生を必要とするものと同じ組織型に由来する。複数の他の実施形態では、再生細胞は、修復または再生を必要とする組織以外の組織型に由来する。他の実施形態では、肺圧の低下、右心室壁厚の減少、および／または病変サイズの減少はすべて、損傷組織または機能不全組織の処置の指標である。
【００３０】
特定の実施形態では、処置の方法は、胚疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択すること、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞を含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物の投与は、前記被験体を処置する。他の実施形態では、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞。特定の実施形態では、処置の方法は、心臓関連疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択すること、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞を含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物の投与は、前記被験体を処置する。様々な実施形態では、組成物の投与は、組成物の複数回投与量を含む。様々な実施形態では、急性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。様々な実施形態では、慢性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。他の実施形態では、組成物の投与は、心筋注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、冠動脈内カテーテルの使用を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、動脈内注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、静脈内注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、経皮注射および／または心筋もしくは骨格筋内への注射を含む。
【００３１】
処置の方法であって、心臓関連疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択すること；ならびに、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む組成物を投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書にさらに記載される。様々な実施形態では、心臓関連疾患および／または症状は、肺高血圧症（ＰＨ）または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を含む。様々な実施形態では、ＰＡＨは、特発性である。様々な実施形態では、ＰＡＨは、関連性である。様々な実施形態では、組成物の投与は、動脈内注入を含む。様々な実施形態では、組成物の投与は、静脈内注入を含む。様々な実施形態では、組成物の投与は、注射を含む。様々な実施形態では、注射は、経皮注射を含む。様々な実施形態では、注射は、心筋または骨格筋内への注射を含む。様々な実施形態では、組成物の投与は、吸入を含む。
【００３２】
被験体における心機能を改善する方法であって、被験体を選択すること、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞を含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体における心機能を改善する方法が本明細書にさらに記載される。いくつかの実施形態では、これは、右心室収縮期圧の減少を含む。他の実施形態では、動脈狭窄または肺血管抵抗の減少がある。他の実施形態では、心機能の改善は、例えば、ベースライン駆出量の改善によって実証され得る。他の実施形態では、心機能の改善は、生存組織の増加、瘢痕量の減少、壁厚の改善、傷害部位の再生リモデリング、血管新生（ａｎｔｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の増強、心筋形成効果の改善、アポトーシスの減少、および／または炎症促進性サイトカインレベルの減少に関する。他の実施形態では、肺圧の低下、右心室壁厚の減少、および／または病変サイズの減少は、より良好な心機能を示唆する。
【００３３】
特定の実施形態では、心機能を改善する方法は、心臓関連疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択すること、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞を含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物の投与は、前記被験体を処置する。様々な実施形態では、心臓関連疾患および／または症状は、心不全を含む。様々な実施形態では、組成物の投与は、複数回投与量を含む。様々な実施形態では、急性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。様々な実施形態では、慢性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。他の実施形態では、組成物の投与は、経皮注射を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、心筋または骨格筋内への注射を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、心筋注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、冠動脈内カテーテルの使用を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、動脈内送達または静脈内送達を含む。
【００３４】
処置の方法であって、処置を必要とする被験体を選択すること、複数のエキソソームを含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書に記載される。特定の実施形態では、被験体は、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状の処置を必要とする。他の実施形態では、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状は、肺疾患である。他の実施形態では、肺疾患は、肺高血圧症（ＰＨ）または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）である。他の実施形態では、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状は、心疾患である。他の実施形態では、複数のエキソソームは、１つ以上のマイクロＲＮＡを含むエキソソームを含む。
【００３５】
特定の実施形態では、複数のエキソソームは、細胞集団を提供すること、前記細胞集団から複数のエキソソームを単離することを含む方法によって作製される。様々な実施形態では、細胞は、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、体内の様々な体細胞源、例えば線維芽細胞、血液および造血幹細胞（ｈＳＣ）、免疫細胞、骨および骨髄、神経組織などのいずれか１つに由来する多能性幹細胞（ｐＳＣ）、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、ｈＳＣ、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。
【００３６】
様々な実施形態では、複数のエキソソームは、細胞集団の上清から単離される。これは、例えば、継代培養することができる細胞株をさらに含む培養液中の細胞集団によって馴化された培地中に分泌されたエキソソームを含む。特定の実施形態では、細胞は、無血清培地中で培養される。特定の実施形態では、エキソソームが単離される場合、培養液中の細胞は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９０％またはそれ以上のコンフルエンスに増殖される。様々な実施形態では、複数のエキソソームは、直径約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、例えば、直径約１０ｎｍ〜約１５ｎｍ、約１５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２５ｎｍ、約２５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約３５ｎｍ、約３５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ３、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約９５ｎｍ、約９５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１０５ｎｍ、約１０５ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約１１０ｎｍ〜約１１５ｎｍ、約１１５ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約１２０ｎｍ〜約１２５ｎｍ、約１２５ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約１３０ｎｍ〜約１３５ｎｍ、約１３５ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約１４０ｎｍ〜約１４５ｎｍ、約１４５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１５０〜約２００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約２５０ｎｍまたはそれを超える直径の１つ以上のエキソソームを含む。
【００３７】
様々な実施形態では、複数のエキソソームは、バイオマーカーを発現する１つ以上のエキソソームを含む。特定の実施形態では、バイオマーカーは、テトラスパニンである。他の実施形態では、テトラスパニンは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３およびＣＤ３７を含む群から選択される１つ以上である。他の実施形態では、エキソソームは、１つ以上の脂質ラフト関連タンパク質（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質およびフロチリン）、コレステロール、スフィンゴミエリンおよび／またはヘキソシルセラミドを発現する。これは、それらの膜表面において膜結合受容体の細胞外ドメインを発現するエキソソームをさらに含む。
【００３８】
複数の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、細胞および／または細胞によって馴化された培地の遠心分離を含む。複数の実施形態では、超遠心分離が使用される。複数の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、サイズ排除ろ過によるものである。他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、不連続密度勾配、免疫親和性、限外ろ過および／または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、分画超遠心分離は、１０００〜２０００×ｇ、２０００〜３０００×ｇ、３０００〜４０００×ｇ、４０００〜５０００×ｇ、５０００×ｇ〜６０００×ｇ、６０００〜７０００×ｇ、７０００〜８０００×ｇ、８０００〜９０００×ｇ、９０００〜１０，０００×ｇ、１０，０００×ｇまでまたはそれを超える遠心力を使用して、細胞に由来する複数のエキソソームから、より大きなサイズの粒子を分離することを含む。特定の実施形態では、分画超遠心分離は、１０，０００〜２０，０００×ｇ、２０，０００〜３０，０００×ｇ、３０，０００〜４０，０００×ｇ、４０，０００〜５０，０００×ｇ、５０，０００×ｇ〜６０，０００×ｇ、６０，０００〜７０，０００×ｇ、７０，０００〜８０，０００×ｇ、８０，０００〜９０，０００×ｇ、９０，０００〜１００，０００×ｇ、１０，０００×ｇまでまたはそれを超える遠心力を使用して、細胞に由来する複数のエキソソームから、より大きなサイズの粒子を分離することを含む。
【００４０】
他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、ろ過または限外ろ過の使用を含む。特定の実施形態では、異なる孔径を有するサイズ排除膜が使用される。例えば、サイズ排除膜は、０．１〜０．５μＭ、０．５〜１．０μＭ、１〜２．５μＭ、２．５〜５μＭ、５μＭまたはそれを超える孔径を有するフィルタの使用を含み得る。特定の実施形態では、孔径は、約０．２μＭである。特定の実施形態では、ろ過または限外ろ過は、１００〜５００ダルトン（Ｄａ）、５００〜１ｋＤａ、１〜２ｋＤａ、２〜５ｋＤａ、５〜１０ｋＤａ、１０〜２５ｋＤａ、２５〜５０ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、１００〜２５０ｋＤａ、２５０〜５００ｋＤａの範囲、５００ｋＤａまたはそれを超えるサイズ排除を含む。特定の実施形態では、サイズ排除は、約２〜５ｋＤａである。特定の実施形態では、サイズ排除は、約３ｋＤａである。他の実施形態では、ろ過または限外ろ過は、１００〜５００ダルトン（Ｄａ）、５００〜１ｋＤａ、１〜２ｋＤａ、２〜５ｋＤａ、５〜１０ｋＤａ、１０〜２５ｋＤａ、２５〜５０ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、１００〜２５０ｋＤａ、２５０〜５００ｋＤａの範囲、５００ｋＤａまたはそれを超える粒子を単離することができる中空糸膜の使用を含む。特定の実施形態では、サイズ排除は、約２〜５ｋＤａである。特定の実施形態では、サイズ排除は、約３ｋＤａである。他の実施形態では、１００〜５００ダルトン（Ｄａ）、５００〜１ｋＤａ、１〜２ｋＤａ、２〜５ｋＤａ、５〜１０ｋＤａ、１０〜２５ｋＤａ、２５〜５０ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、１００〜２５０ｋＤａ、２５０〜５００ｋＤａの範囲、５００ｋＤａまたはそれを超える粒子を単離することができる分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ゲルろ過。特定の実施形態では、サイズ排除は、約２〜５ｋＤａである。特定の実施形態では、サイズ排除は、約３ｋＤａである。様々な実施形態では、このようなシステムは、可変流体流動システムと組み合わせて使用される。
【００４１】
他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、エキソソーム画分を精製および／または濃縮するための接線流ろ過（ＴＦＦ）システムの使用を含む。他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、エキソソームを均一サイズの粒子に精製するための（ＨＰＬＣ）の使用を含む。様々な実施形態では、使用される密度勾配は、例えば、スクロース密度勾配における遠心分離、または調製における別個のシュガークッションの適用である。
【００４２】
他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、沈殿試薬の使用を含む。例えば、沈殿試薬ＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）を馴化細胞培地に追加して、エキソソーム集団を迅速かつ容易に沈殿させ得る。他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、体積排除ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の使用を含み、これが使用される。別の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、溶出技術であるフローフィールドフロー分画（ＦｌＦＦＦ）の使用を含む。
【００４３】
エキソソームを伴う組成物および技術に関する他の例または実施形態は、国際公開第２０１４／０２８，４９３号（これは、参照により本明細書に全体的に組み込まれる）に示されている。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ＰＡＨの処置のためのＣＤＣ
記載されているように、重要な科学的および医学的問題は、幹細胞が、肺動脈高血圧症などの疾患および／または症状の予防または改善において役立ち得るだけではなく、損傷微小血管系の再生および修復を介してＰＡＨそれ自体を実際に処置することができるかを理解することである。本発明者による予備的研究では、ＰＡＨ発症後のＣＤＣの静脈内注入は、心エコー検査によって示されたように、顕著な利益を与えることができることが示された。このような心筋球由来細胞（ＣＳＣ）は、死亡した組織ドナーの健常心臓から得られた心室中隔の右心室面からの心内膜生検によって得られる。心筋球由来細胞は、以前に記載されているように生成される。Ｍａｋｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）．“Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｒｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ（ＣＡＤＵＣＥＵＳ）：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  １  ｔｒｉａｌ．”Ｌａｎｃｅｔ  ３７９，８９５−９０４（２０１２）（これは、参照により本明細書に全体的に組み込まれる）を参照のこと。
【００４５】
簡潔に言えば、心臓生検を小さな断片に細分化し、コラゲナーゼで短時間消化する。次いで、外植片を、２０ｍｇ／ｍｌフィブロネクチンコーティングディッシュ上で培養した。間質様扁平細胞および相明円形細胞は、組織断片から自発的に成長し、２〜３週間でコンフルエンスに達する。０．２５％トリプシンを使用してこれらの細胞を採取し、２０ｍｇ／ｍｌポリｄ−リシン上で懸濁培養して、自己凝集性心筋球を形成する。心筋球をフィブロネクチンコーティングディッシュに播種し、継代することによって、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を得る。２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．１ｍｌの２−メルカプトエタノールを補充したＩＭＤＭ基本培地を使用して、すべての培養物を５％ＣＯ２、３７℃で維持する。Ｍａｋｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）．“Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｒｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ（ＣＡＤＵＣＥＵＳ）：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  １  ｔｒｉａｌ．”Ｌａｎｃｅｔ  ３７９，８９５−９０４（２０１２）（これは、参照により本明細書に全体的に組み込まれる）を参照のこと。
【００４６】
実施例２
ＰＡＨにおけるＣＤＣの治療効果に関する予備的結果
動物実験では、十分に確立されたモノクロタリン傷害モデルを使用して、動物を、対照、モノクロタリン偽注入（すなわち、細胞なし）、およびモノクロタリンと心筋球由来細胞（＋ＣＤＣ）に分けた。コホート間で、開始体重を制御した。
【００４７】
エコー研究および最終的な血行動態研究により、静脈内注入した２００万個のＣＤＣの単回用量は、ＣＤＣを投与した場合の右心室の収縮期圧の減少によって示されるように、モノクロタリンラットモデルにおけるＰＡＨの進行を顕著に軽減することが示された。例えば、モノクロタリンを皮下注射（６０ｍｇ／ｋｇ）し、１４日目にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；偽手術）または２００万個のＣＤＣを含むＰＢＳを静脈内注入した３５日後の健常対照およびＰＡＨを有する動物における右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ、上のパネル）およびフルトンインデックス（右心室／［左心室＋中隔］、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）；下のパネルｌ）。値は、平均±ＳＥＭである。*対照（ＣＴＬ）と有意に異なる。＃ＰＢＳと有意に異なる。
【００４８】
実施例３
培地の馴化およびエキソソームの精製
４継代のＣＤＣから、エキソソームを採取する。正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（対照として有益な利益を提供しない対照として以前に利用されていた細胞）から、エキソソームを単離することもできる。無血清培地中、１００％コンフルエンスで、ＣＤＣおよびＮＨＤＦを１５日間馴化する。次いで、吸引した培地を３，０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞残屑を除去する。次いで、Ｅｘｏｑｕｉｃｋエキソソーム沈殿溶液を使用して、エキソソームを単離した（図３）。
【００４９】
エキソソームペレットを適切な培地に再懸濁し、アッセイに使用する。保存されているエキソソームマーカーＣＤ６３の発現を、ＥＬＩＳＡを使用して検証する。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して、エキソソームペレットのＲＮＡ含量も定量することができる。エキソソームペレットを２ｍｌのＰＢＳに懸濁することによって、エキソソームＲＮＡ分解を実施する。１つのサンプルに、１００ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加して、５％のｔｒｉｔｏｎ濃度を達成する。０．４ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ処理によって、エキソソームを３７℃で１０分間処理する。０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫによって、サンプルを３７℃で２０分間さらに処理する。マイクロＲＮＡ単離キットを使用して、サンプルからＲＮＡを精製する。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、ＲＮＡレベルを測定する。
【００５０】
実施例４
エキソソームペレットの質量分析
消化のために、フィルタ支援サンプル調製（ＦＡＳＰ）法を使用して、タンパク質を調製した。Ｑｕｂｉｔｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、濃度を測定した。トリプシンを１：４０の酵素対基質比で追加し、３７℃のヒートブロック上で、サンプルを一晩インキュベートした。デバイスを遠心分離し、ろ液を回収した。消化したペプチドを、Ｃ１８  ｓｔｏｐ−ａｎｄ−ｇｏ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＳＴＡＧＥ）チップを使用して脱塩した。強陰イオン交換ＳＴＡＧＥチップクロマトグラフィーによって、ペプチドを分画した。Ｃ１８  ＳＴＡＧＥチップからペプチドを溶出し、乾燥した。液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析を用いて、各画分を分析した。サンプルを内径２ｃｍ  ３  １００ｍｍのトラップカラムにロードした。分析カラムは、プルドチップエミッターを備える内径１３ｃｍ  ３  ７５ｍｍの溶融シリカであった。データ依存的な取得によって、４００〜１，４００ｍ／ｚのフルスキャンで上位１５のイオンからタンデム質量スペクトルを取得するように、質量分析計をプログラミングした。ｍｓｃｏｎｖｅｒｔを使用して、質量分析計のＲＡＷデータファイルをＭＧＦ形式に変換した。Ｘ！Ｈｕｎｔｅｒを使用して、その時点においてＧＰＭで利用可能な最新のスペクトルライブラリーに対して、ＭＧＦファイルをサーチした。また、ネイティブスコアリングアルゴリズムおよびｋ−スコアスコアリングアルゴリズムの両方を使用するＸ！！Ｔａｎｄｅｍを使用して、ＯＭＳＳＡによって、ＭＧＦファイルをサーチした。タンパク質は、Ｘ！！Ｔａｎｄｅｍでは０．０１以下のペプチドＥ値スコア、ＯＭＳＳＡでは０．０１以下、０．００１以下、ならびにＸ！Ｈｕｎｔｅｒサーチでは０．５以上のシータ値、ならびにＸ！！ＴａｎｄｅｍおよびＸ！Ｈｕｎｔｅｒでは０．０００１以下のタンパク質Ｅ値スコアを有する１つ以上のユニークなペプチドを有することが必要であった。１〜２日齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ仔ラットから筋細胞単離新生ラット心筋細胞（ＮＲＣＭ）を単離し、記載されているように単層培養した。
【００５１】
実施例５
ＣＤＣエキソソームは、治療効果を提供すると報告されたマイクロＲＮＡが豊富である
ＣＤＣエキソソームの治療利益の根拠を調査するために、本発明者らは、８８個の最も良く定義されたマイクロＲＮＡのＰＣＲマイクロアレイを使用して、それらのマイクロＲＮＡレパートリーをＮＨＤＦエキソソームのものと比較した。２つの細胞型のマイクロＲＮＡ含量は、劇的に異なっていた。２つの群では、４３個のマイクロＲＮＡが差次的に存在していた；これらの中で、ｍｉＲ−１４６ａは、ＣＤＣエキソソームにおいて最も豊富であった（ＮＨＤＦエキソソームよりも２６２倍多かった；図２Ａ、２Ｂおよび４）。
【００５２】
最近、ＣＤＣ由来のマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１４６ａ）の治療効果は、ＣＤＣエキソソームの治療利益のいくつかを媒介することが示されている。例えば、ｍｉＲ−１４６ａは、心筋梗塞のマウスモデルにおいて、梗塞壁厚の肥厚および生存組織の増加をもたらす。Ｉｂｒａｈｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１４  Ｍａｙ  ８；２（５）：６０６−１９（これは、参照により本明細書に全体的に組み込まれる）。
【００５３】
実施例６
ＰＡＨ治療に使用するためのＣＤＣエキソソーム
ＣＤＣ由来エキソソームがＣＤＣの顕著な利益を模倣するというＩｂｒａｈｉｍらの知見に基づいて、図１で実証されている結果は、ＣＤＣがＰＡＨを緩和するように作用することを裏付けている。拡大すると、ＰＡＨにおけるＣＤＣの有益な利益は、マイクロＲＮＡを含む生物学的カーゴのユニークな環境を含有するＣＤＣ−エキソソームが、ＰＡＨなどの肺関連症状におけるＣＤＣの治療効果を再現するのに役立つであろうことを示している。
【００５４】
実施例７
考察
心筋球由来細胞は、ヒト梗塞心臓の治療的再生を誘導することが示されている。伝統的に不可逆的であると考えられていた傷害の形態では、ＣＤＣは、瘢痕の縮小および新たな機能的心筋の成長をもたらした。同様の効果は、動物モデルにおいて確認されている。本明細書では、本発明者らは、エキソソームがＣＤＣ誘導性治療的再生を再現すること、およびエキソソーム産生の阻害がＣＤＣの利益を損なうことを示す。エキソソームは、パラクリン機構を介して細胞挙動を変化させる能力を有するマイクロＲＮＡを含有する。
【００５５】
ｍｉＲ−１４６ａなどのマイクロＲＮＡは、ＣＤＣエキソソームの効果の媒介において重要な役割を果たすと思われるが、包括的な治療利益を与えるには単独では十分ではない可能性がある。レパートリーにおける他のマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４６ａと同義的なまたはおそらくは相乗的な効果を発揮し得る。例えば、ｍｉＲ−２２（ＣＤＣエキソソームにおいて非常に豊富な別のマイクロＲＮＡ）は、心臓ストレスに対する適応反応に重要であることが示されている。同様に、ｍｉＲ−２４（ＣＤＣエキソソームにおいても確認されている）は、フリン（線維化促進性ＴＧＦ−ｂシグナル伝達経路のメンバー）をターゲティングすることによって、心臓線維化を調節する；ＭＩのモデルにおけるｍｉＲ−２４の過剰発現は、心筋瘢痕形成を減少させた。ＣＤＣエキソソームの利益に関するメディエーターとしてのこれらのマイクロＲＮＡの潜在的な役割は単独で、またはｍｉＲ−１４６ａと組み合わせて研究中である。
【００５６】
実施例７
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）の処置のための治療候補としての心筋球由来細胞の同定
動物実験では、３５日目までの対照（ＣＴＬ）およびＰＡＨ群（ＣＤＣおよび偽）の連続的な体重を測定した（図５）。図６に示されているように、モノクロタリンを皮下注射（６０ｍｇ／ｋｇ）し、１４日目にリン酸緩衝生理食塩水（偽手術）または２００万個の心臓由来細胞（ＣＤＣ）を含むＰＢＳを静脈内注入した２８日後の健常対照（ＣＴＬ）および肺動脈高血圧症を有する動物において、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定した。図７に示されているように、モノクロタリンを皮下注射（６０ｍｇ／ｋｇ）し、１４日目にリン酸緩衝生理食塩水（偽手術）または２００万個の心臓由来細胞（ＣＤＣ；ｎ＝１０）を含むＰＢＳを静脈内注入した３５日後の健常対照（ＣＴＬ；ｎ＝１０）動物および肺動脈高血圧症を有する動物におけるＲＶＳＰのその後の測定。モノクロタリンを皮下注射（６０ｍｇ／ｋｇ）し、１４日目にリン酸緩衝生理食塩水（偽手術）または２００万個の心臓由来細胞（ＣＤＣ）を含むＰＢＳを静脈内注入した２８日後の健常対照（ＣＴＬ）動物および肺動脈高血圧症を有する動物におけるフルトンインデックス測定（右心室／［左心室＋中隔］、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）を、右心室（ＲＶ）肥大の尺度として、２８日および３５日の測定で示す（図８）。３つの群（ＣＴＬ、ＰＡＨ＋ＰＢＳ（偽）、ＰＡＨ＋ＣＤＣ）の平均血管壁厚（これらはすべて、群間で同様の平均血管径を有する）に加えて（図１０）、三尖弁輪収縮期移動距離（ＴＡＰＳＥ）（ＲＶ収縮機能の指標）を３５日目に測定した（図９）。３つの各群の個々の肺動脈の断面の（平滑筋アクチンの）免疫組織化学的描写を示す（図１１）。
【００５７】
実施例８
安全性研究
動脈血液ガス、血液および血漿および生化学的性質の測定を表１〜３に示す。
【００５８】
室内空気（ＲＡ）、全身麻酔下で細胞を注入した２４時間後に、動脈血液ガスを取った。いかなるＣＤＣ用量においても、有意な低酸素血症はなかった。
【表１】
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【表２】
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【００５９】
２８日目および３５日目において、メタボリックプロファイリングを実施した。ＭＣＴ後２８日目におけるＣＴＬ、ＰＡＨ偽およびＰＡＨ  ＣＤＣの代謝プロファイル。ＭＣＴ後２８日目のＣＴＬ、ＰＡＨ偽およびＰＡＨ  ＣＤＣ間において、大きな差異は認められなかった。３５日目における腎機能および肝機能を反映する化学的性質を以下の表に示す。注目すべきことに、ＢＵＮおよびクレアチニンは、ＰＡＨ  ＣＤＣ群では、ＰＡＨ偽動物と比較して有意に低い。ＣＤＣでは、腎機能および肝機能が維持されており、対照値を反映している。表３を参照のこと。
【表３】
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【００６０】
ＰＢＳのみを投与した偽ＰＡＨ動物と比較した、ＣＤＣを投与したＰＡＨ動物における腎機能のパラメータの改善を示す棒グラフを図１２に示す。
【００６１】
本明細書に記載される結果に基づいて、ＣＤＣは、肺高血圧症（ＰＨ）および肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）などの肺および心臓関連症状を処置することができることが実証されている。
【００６２】
上記様々な方法および技術は、本発明を実行するための多くの方法を提供する。当然のことながら、本明細書に記載される任意の特定の実施形態にしたがって、記載されているすべての目的または利点を必ずしも達成することができるわけではないことを理解すべきである。したがって、例えば、当業者であれば、本明細書で教示または示唆され得るような他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書で教示される１つの利点または利点群を達成または最適化するように、前記方法を実施することができると認識する。本明細書では、様々な有利および不利な代替策が言及される。いくつかの好ましい実施形態は、１つの、別のまたは複数の有利な特徴を特に組み入れ、他のものは、１つの、別のまたは複数の不利な特徴を特に除外し、さらに他のものは、１つの、別のまたは複数の有利な特徴を組み入れることによって、本発明の不利な特徴を特に軽減することを理解すべきである。
【００６３】
さらに、当業者であれば、異なる実施形態から様々な特徴の適用可能性を認識する。同様に、当業者であれば、上記様々な要素、特徴および工程ならびにこのような各要素、特徴または工程の他の公知の均等物を融合および適合して、本明細書に記載される原理にしたがって方法を実施し得る。多様な実施形態では、様々な要素、特徴および工程の中で、いくつかのものが特に組み入れられ、他のものが特に除外され得る。
【００６４】
特定の実施形態および実施例との関連で本発明を開示したが、当業者であれば、本発明の実施形態は、具体的に開示されている実施形態を超えて他の代替的な実施形態ならびに／またはその使用および改変および均等物に拡大されることを理解する。
【００６５】
本発明の実施形態では、多くのバリエーションおよび代替要素が開示されている。またさらなるバリエーションおよび代替要素は、当業者に明らかである。これらのバリエーションは、限定されないが、心筋球由来細胞の供給源、心臓生検（外植片由来細胞）にもしくは心臓由来細胞（心筋球）の自己会合クラスタに直接由来する細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）および／または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの代替供給源の使用、このような細胞によって産生されたエキソソーム、このような細胞によって産生されたエキソソームを単離、特性評価または変化する方法、ならびに本発明の教示によって作られる生成物の特定の使用である。本発明の様々な実施形態は、これらのバリエーションまたは要素のいずれかを特に組み入れまたは除外し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を記載および特許請求するために使用される成分の量、濃度、反応条件などの特性を表す数字は、いくつかの場合では、「約」という用語によって修飾されると理解すべきである。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、特定の実施形態が得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告されている有効桁数を考慮して、通常の四捨五入技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広範囲を示す数値範囲およびパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示されている数値は、可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態に示されている数値は、それらの各試験測定結果に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含有し得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態の説明との関連で使用される（特に、以下の特許請求の範囲との関連で使用される）「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の言及は、単数形および複数形の両方を包含すると解釈され得る。本明細書における値域の記載は、この範囲内の個々の各値を個別に参照する簡略な方法となることを意図するに過ぎない。特に本明細書で指示がない限り、個々の各値は、それが個別に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、特に本明細書で指示がない限り、または特に文脈上明確な矛盾がない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書における特定の実施形態に関して提供される任意のおよびすべての実施例または例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く説明するためのものに過ぎず、別様に特許請求されている本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な特許請求の範囲に記載されている任意の要素を示すと解釈されるべきではない。
【００６８】
本明細書に開示される本発明の代替要素または実施形態の分類は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは個別に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素の他のメンバーと任意に組み合わせて参照および特許請求され得る。グループの１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由により、グループに組み入れられ得、またはグループから削除され得る。任意のこのような組入または削除が生じた場合、本明細書は、改変されたグループを含有するとみなされるので、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの記載要件を満たす。
【００６９】
本発明を実行するために本発明者らが把握する最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上記説明を読めば、当業者にとって明らかである。当業者であれば、このようなバリエーションを適切に用いることができ、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外の方法で実施され得ると考えられる。したがって、本発明の多くの実施形態は、準拠法によって許容されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題のすべての改変物および均等物を含む。また、特に本明細書で指示がない限り、または特に文脈上明確な矛盾がない限り、上記要素の任意の組み合わせがそのすべての可能なバリエーションで本発明によって包含される。
【００７０】
さらに、本明細書を通して、多数の言及が特許および刊行物に対してなされている。上記で引用されている参考文献および刊行物はそれぞれ、それらの全体が参照により本明細書に個々に組み込まれる。
【００７１】
最後に、本明細書に開示される本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解すべきである。用いられ得る他の改変は、本発明の範囲内であり得る。したがって、限定ではなく例として、本明細書の教示にしたがって、本発明の代替構成が利用され得る。したがって、本発明の実施形態は、厳密に示され記載されているものに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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