(57)【要約】本開示は、なかでも、ストレス誘発性傷害、特に低酸素を、診断する及び処置するための方法及び組成物を提供する。本発明は、代謝産物である、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸、及びその代謝を制御するある特定の酵素及び基質が、ストレス誘発性細胞メカニズムを媒介するという新規発見に、部分的に、基づく。いくつかの実施形態では、提供される方法及び組成物は、低酸素誘発性傷害を伴う疾患を診断する及び処置するために使用される。いくつかの実施形態では、提供される方法及び組成物は、インビボまたはインビトロで細胞多能性または分化を調節するために使用される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において組織低酸素を診断する方法であって、
（１）前記対象からの試料中のＬ−２−ヒドロキシグルタル酸（（Ｓ）−２−ヒドロキシグルタル酸または「Ｌ−２ＨＧ」））のレベルを測定し；
（２）前記測定レベルと正常酸素状態に相関する基準レベルとを比較するステップを含み、組織低酸素は、前記測定レベルが前記基準レベルから有意差を示すときに診断される、前記方法。
【請求項２】
対象において低酸素誘発性傷害を診断する方法であって：
（１）前記対象からの試料中のＬ−２ＨＧのレベルを測定し；
（２）前記測定レベルと正常酸素状態に相関する基準レベルとを比較するステップを含み、低酸素誘発性傷害は、前記測定レベルが前記基準レベルから有意差を示すときに診断される、前記方法。
【請求項３】
（１）前記対象からの試料中の少なくとも２つのバイオマーカーを測定し、ここで前記少なくとも２つのバイオマーカーの１つはＬ−２ＨＧであり；及び
（２）前記測定レベルと低酸素または正常酸素状態を表す基準レベルとを比較するステップをさらに含み、組織低酸素または低酸素誘発性傷害は、前記測定レベルが前記基準レベルから有意差を示すときに診断される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
低酸素誘発性傷害の処置において有用な薬剤を同定するまたは特徴づける方法であって、前記方法が：
（１）薬剤を対象となる細胞、組織または生体と接触させ；
（２）前記薬剤が存在するときの前記組織中のＬ−２ＨＧのレベルを、それが不在のとき、または前記組織または生体中のＬ−２ＨＧレベルに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定し；
（３）前記薬剤が存在するときの前記測定されたＬ−２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより高い場合、Ｌ−２ＨＧを増加させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものと類似する場合、またはＬ−２ＨＧを増加させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものを超す場合に、低酸素誘発性傷害の前記処置において前記薬剤が有用であると決定するステップを含む、前記方法。
【請求項５】
前記傷害が、敗血症性ショック、虚血性脳卒中、心筋梗塞、貧血症、肺疾患、気道閉塞、急性呼吸窮迫症候群、肺炎、気胸症、肺気腫、先天性心臓欠陥、アテローム性動脈硬化症、血栓症、肺塞栓症、肺水腫、喘息、膿胞性線維症、癌、または外科的処置中であるかまたはこれを含む、低酸素に関連する疾患、障害または病態を含む、請求項２または４に記載の方法。
【請求項６】
対象において組織低酸素またはその根本的原因を処置する方法であって、前記方法が、そのＬ−２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象と比較して少なくとも２倍である対象に、低酸素治療を施すことを含む、前記方法。
【請求項７】
Ｌ−２ＨＧの前記レベルが、正常酸素状態の対象と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍に上昇している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記低酸素治療が、酸素補充療法、赤血球濃厚液の輸血、カフェイン、ビタミン療法、機械的換気、陽圧療法、身体運動、または外科的介入を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記低酸素が慢性である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療が、慢性低酸素または慢性低酸素の根本的原因に向けられている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
慢性低酸素の前記根本的原因が、慢性閉塞性肺障害、気道閉塞、急性呼吸窮迫症候群、肺炎、気胸症、肺気腫、先天性心臓欠陥、アテローム性動脈硬化症、血栓症、肺塞栓症、肺水腫、喘息、及び膿胞性線維症を含む群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｌ−２ＨＧの前記測定が、組織試料から得られる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織試料が、心臓の組織、動脈、脳、腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、血液、尿、血清、リンパ及び脳脊髄液を含む群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｌ−２ＨＧの前記測定が、血液試料から取得される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記血液試料が、静脈血試料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
虚血性組織傷害を処置する方法であって、虚血性組織傷害を有する対象に、Ｌ−２ＨＧのレベルを調節する治療を施すことを含む、前記方法。
【請求項１８】
前記治療が、前記対象におけるＬ−２ＨＧの前記レベルを増加させる、請求項６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療が、前記対象におけるＬ−２ＨＧの前記レベルを低減させる、請求項６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療が、前記組織への送達を達成する経路を介した前記対象へのＬ−２ＨＧを含む組成物の投与を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療が、前記組織への送達を達成する経路を介した前記対象へのＬＤＨＡの阻害剤の投与を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療が、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、またはＭＤＨ２のレベルまたは活性を調節する薬剤の投与を含む、請求項６または１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤の前記投与が、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、またはＭＤＨ２のレベルまたは活性を増加させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤の前記投与が、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、またはＭＤＨ２のレベルまたは活性を低減させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記処置が、これらに限定されないが、α−ケトグルタル酸、α−ケトグルタル酸の細胞透過性変異体（例えば、α−ケトグルタル酸ジメチル）、グルタミン、またはグルタミン酸塩を含む組成物を投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記処置が、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼレベルまたは活性を阻害することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記処置が、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼレベルまたは活性を促進することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
対象において組織低酸素を促進する方法であって、前記方法が、そのＬ−２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象と比較して最大で５０％である対象に治療を施すことを含む、前記方法。
【請求項２９】
Ｌ−２ＨＧの前記レベルが、正常酸素状態の基準対象と比較して、最大で４０％、最大で３０％、最大で２０％、最大で１０％、または最大で５％である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
幹細胞または前駆細胞である細胞の多能性または自己複製を維持するまたは促進する方法であって、前記細胞中のＬ−２ＨＧのレベルを調節することを含む、前記方法。
【請求項３１】
Ｌ−２ＨＧのレベルを調節することが、前記細胞をＬ−２ＨＧと接触させることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｌ−２ＨＧのレベルを調節することが、前記細胞中のＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼレベルまたは活性を阻害することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
癌に罹患している対象において癌を処置する方法であって、１つまたは複数の用量のＬＤＨＡの阻害剤、または１つまたは複数の用量のＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの刺激剤の投与を含む治療レジメンを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記対象が、野生型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１または２（ＩＤＨ１／２）を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
腫瘍血管新生を阻害する方法であって、腫瘍を、治療有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターと接触させることを含む、前記方法。
【請求項３６】
細胞分化を促進させる方法であって、幹細胞または前駆細胞である細胞を、有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターと接触させることを含む、前記方法。
【請求項３７】
前記細胞が癌幹細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
癌の処置において有用な薬剤を同定するまたは特徴づける方法であって、前記方法が：
（１）薬剤を、癌細胞を含む系と接触させ；
（２）前記薬剤が存在するときの前記系中のＬ−２ＨＧのレベルを、それが不在のとき、または前記組織または生体中のＬ−２ＨＧレベルに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定し；
（３）前記薬剤が存在するときの前記測定されたＬ−２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより低い場合、Ｌ−２ＨＧを低減させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものと類似する場合、またはＬ−２ＨＧを増加させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものより低い場合に、癌の処置において前記薬剤が有用であると決定するステップを含む、前記方法。
【請求項３９】
前記系が腫瘍であるかまたは腫瘍を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
敗血症性ショックの症状を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターを投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
心筋梗塞の症状を有するまたは心筋梗塞のリスクがある対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターを投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
虚血性脳卒中の症状を有するまたは虚血性脳卒中のリスクがある対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量のＬＤＨＡの阻害剤またはＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターを投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
ＬＤＨＡ活性の阻害において有用である薬剤を同定するまたは特徴づける方法であって、前記方法が：
（１）薬剤を、ＬＤＨＡを発現する細胞を含有する試料またはＬＤＨＡを含有する無細胞溶液と接触させ；
（２）前記薬剤が存在するときの前記試料中のＬ−２ＨＧのレベルを、それが不在のとき、または前記試料中のＬ−２ＨＧに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定し；
（３）前記薬剤が存在するときの前記測定されたＬ−２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより低い場合、Ｌ−２ＨＧを低減させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものと類似する場合、またはＬ−２ＨＧを増加させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものより低い場合に、ＬＤＨＡ活性の阻害において前記薬剤が有用であると決定するステップを含む、前記方法。
【請求項４４】
Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の促進において有用である薬剤を同定するまたは特徴づける方法であって、前記方法が：
（１）薬剤を、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを発現する細胞を含有する試料またはＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを含有する無細胞溶液と接触させ；
（２）前記薬剤が存在するときの前記試料中のＬ−２ＨＧのレベルを、それが不在のとき、または前記試料中のＬ−２ＨＧに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定し；
（３）前記薬剤が存在するときの前記測定されたＬ−２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより高い場合、Ｌ−２ＨＧを増加させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものに類似する場合、またはＬ−２ＨＧを低減させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものより高い場合に、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の促進において前記薬剤が有用であると決定するステップを含む、前記方法。
【請求項４５】
細胞におけるヒストンのメチル化を促進する方法であって、前記細胞を、Ｌ−２ＨＧ、ＬＤＨＡのアクチベーター、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、またはそれらの組み合わせと接触させることを含む、前記方法。
【請求項４６】
細胞におけるヒストンのメチル化を阻害する方法であって、前記細胞を、ＬＤＨＡの阻害剤、またはＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターと接触させることを含む、前記方法。
【請求項４７】
前記ヒストンのメチル化が、ヒストン３リジン９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）を含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
組織における低酸素の異質性について試験する方法であって、
（１）前記組織の１つの領域内のＬ−２ＨＧのレベルを測定し；
（２）Ｌ−２ＨＧの前記測定レベルを、前記組織の少なくとも１つの異なる領域と比較するステップを含み、前記測定レベルがステップ（１）にて前記領域から測定された前記レベルから有意差を示すときに組織低酸素の異質性が診断される、前記方法。
【請求項４９】
組織における低酸素の異質性について試験する方法であって、
（１）前記組織の１つの領域内のＨ３Ｋ９ｍｅ３のレベルを測定し；
（２）Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の前記測定レベルを、前記組織の少なくとも１つの異なる領域と比較するステップを含み、前記測定レベルがステップ（１）にて前記領域から測定された前記レベルから有意差を示すときに組織低酸素の異質性が診断される、前記方法。
【請求項５０】
前記組織が、腫瘍由来である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
腫瘍が、膠芽腫を有する対象由来である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
組織中の低酸素をイメージングする方法であって、Ｌ−２ＨＧと反応する薬剤を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５３】
低酸素の前記イメージングが、対象で実行される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記薬剤が、Ｌ−２ＨＧに特異的に結合する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬剤が、臨床イメージング法によるその視覚化を可能にする部分を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
Ｌ−２ＨＧの前記レベルが、ガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析または酵素アッセイによって測定される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
Ｌ−２ＨＧの前記レベルの測定が、質量分析の使用を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記測定が、ガスクロマトグラフィー質量分析の使用を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
２−ヒドロキシグルタル酸をキラル誘導化試薬と反応させるステップをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記基準レベルが、正常酸素状態の個体対象に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記正常酸素状態の個体対象が前記対象である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記基準レベルが、正常酸素状態の対象の集団に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記基準レベルが、急性的に低酸素の対象に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記基準レベルが、急性的に低酸素の対象の集団に由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記試料において測定された前記１つまたは複数のバイオマーカーの前記レベルと前記基準レベルとの間の前記差が、前記対象における慢性低酸素の重症度と相関する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、任意の及び全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／９７２，０９１号の利益及びそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
政府支援
合衆国法典第３５巻第２０２条（ｃ）（６）に従い、本明細書に記載または特許請求する１つまたは複数の発明に関し、出願人は、本発明が、アメリカ国立衛生研究所による補助金交付番号Ｒ０１  ＣＡ１６８８０２−０２の下に政府支援を伴って作成されたことを述べる。米国政府は、本発明にある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ストレス、例えば、低酸素、感染、飢餓、温度、毒性等は、細胞の代謝に著しい影響を及ぼし、主要な疾患に寄与する。例えば、大半の細胞は、生存及びそれらの機能を実行するために酸素を必要とし、低酸素は細胞の代謝経路に影響を及ぼし、しばしば低酸素誘発性傷害を引き起こす。ストレスに対する細胞応答の研究における新たな発展は、ストレス誘発性傷害を必然的に含む障害へに対するより良好な処置に導くだろう。ストレスに関連する疾患を処置するための組成物またはシステムの開発を目的とした多くの努力がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、Ｌ−２ＨＧが組織低酸素において重要な役割を担うという認識を包含する。本開示は、他の出願のなかでも、Ｌ−２ＨＧを、組織低酸素を診断するためのバイオマーカーとして使用することができることを実証する。いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、対象から採取された試料から細胞のＬ−２ＨＧを測定することにより、組織低酸素を診断するためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象からのＬ−２ＨＧのレベルを、正常酸素状態の対照対象からのものと比較することができることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象からのＬ−２ＨＧのレベルを、急性低酸素または慢性低酸素を有する患者からのものと比較することができることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、これらの異なる試料からのＬ−２ＨＧの比較が、対象における低酸素を診断するために使用され得ることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、試料の低酸素状態は、Ｌ−２ＨＧレベルを測定することにより確認され得ることを記載する。
【０００５】
あるいはまたは加えて、本開示は、患者において低酸素誘発性傷害を診断することを記載する。症候性または亜症候性（ｓｕｂ−ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ）でない低酸素誘発性傷害は、臨床的に診断することがしばしば難しい。本開示に従って試料からＬ−２ＨＧレベルを測定することは、対象における低酸素誘発性傷害についての指標を与え得る。いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、対象から採取した試料からの細胞のＬ−２ＨＧを測定することにより組織低酸素を診断するためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、血液試料または生検試料であり得る。いくつかの実施形態では、本開示は、対象からのＬ−２ＨＧのレベルを、正常酸素状態の対照対象からのものと比較することができることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象からのＬ−２ＨＧのレベルを、急性低酸素または慢性低酸素を有する患者からのものと比較することができることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、これらの異なる試料からのＬ−２ＨＧの比較が、対象における低酸素誘発性傷害を診断するために使用され得ることを記載する。
【０００６】
本開示は、Ｌ−２ＨＧが、低酸素または低酸素誘発性傷害を診断するための単一の代謝産物として使用され得ることを記載する。あるいはまたは加えて、本開示は、それによりＬ−２ＨＧを、診断のためにより広範なセットのバイオマーカーに統合することができる方法を代替的にまたは追加的に記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、診断においてバイオマーカーセットの一部としてＬ−２ＨＧを使用する方法を記載する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、対象からの試料中の少なくとも２つのバイオマーカーを測定する方法を記載し、ここで少なくとも２つのバイオマーカーのうちの１つはＬ−２ＨＧである。
【０００７】
本開示は、Ｌ−２ＨＧが、低酸素に関連する診断及び治療のための新規及び信頼できる因子であることを記載する。あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝を制御するある特定の酵素、例えば、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、及びＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼが、Ｌ−２ＨＧを制御するメカニズムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、これらの酵素の調節は、予測可能な様式でＬ−２ＨＧのレベルに影響を与え得ることを実証する。いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素に関連する診断及び治療のためにこれらの酵素を調節するためのシステムを記載する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の酸素レベルの測定に従い、低酸素の診断を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素が他の方法を介して診断することができることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、慢性低酸素におけるＬ−２ＨＧの使用を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、急性低酸素におけるＬ−２ＨＧの使用を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、慢性または急性のいずれかの、低酸素の根本的原因により引き起こされた低酸素におけるＬ−２ＨＧの使用を記載する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明に従って、本明細書に記載するような１つまたは複数の低酸素マーカーが、例えば、低酸素または低酸素に関連する疾患、障害、もしくは病態を、診断するまたは処置する文脈において、検出または測定される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、低酸素に関連する疾患、障害または病態は、例えば、敗血症性ショック、虚血性脳卒中、心筋梗塞、貧血症、肺疾患、気道閉塞、急性呼吸窮迫症候群、肺炎、気胸症、肺気腫、先天性心臓欠陥、アテローム性動脈硬化症、血栓症、肺塞栓症、肺水腫、喘息、膿胞性線維症、癌、ならびに外科的処置中であるか、これを含む。
【００１１】
本開示は、低酸素または低酸素誘発性傷害の処置において有用である薬剤を同定するまたは特徴づけるためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ある特定の新規パラメータが低酸素において重要な役割を担う可能性があることを記載する。例えば、いくつかの実施形態では、このパラメータは、Ｌ−２ＨＧのレベルまたは動態であるかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパラメータは、α−ケトグルタル酸のレベルまたは動態であるかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパラメータは、ＬＤＨＡのレベルまたは活性であるかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパラメータは、ＬＤＨＡのレベルまたは活性であるかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパラメータは、ＭＤＨ１のレベルまたは活性であるかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパラメータは、ＭＤＨ２のレベルまたは活性であるかまたはこれからなる。いくつかの実施形態では、このパラメータは、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのレベルまたは活性であるかまたはこれからなる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧを使用することにより低酸素または低酸素誘発性傷害の処置において有用である薬剤を同定するまたは特徴づけるためのシステムを記載する。例えば、細胞、組織または生体中のＬ−２ＨＧのレベルは、薬剤が不在のときまたは組織もしくは生体中のＬ−２ＨＧレベルへの影響が知られている基準薬が存在するときと比較して、薬剤が存在するときに測定することができる。いくつかの実施形態では、薬剤が存在するときに測定されたＬ−２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより高い場合、Ｌ−２ＨＧを増加させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものと類似する場合、Ｌ−２ＨＧを増加させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものを超える場合に、薬剤は、低酸素誘発性傷害の処置において有用であると同定されるまたは特徴づけられる。
【００１３】
本開示は、例えば低酸素または低酸素誘発性傷害を診断することまたは処置することを伴う、Ｌ−２ＨＧレベルに対して比較することができるパラメータを記載する。一例をあげると、いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象のものと比較して上昇している対象へ低酸素治療を施すことによる低酸素の処置を記載する。いくつかの実施形態では、Ｌ−２ＨＧのレベルの上昇は、正常酸素状態の対象について観察されるものと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍であるか、またはさらに高い。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、患者集団を（例えば、低酸素治療での処置に対するそれらの候補性に関して）層別化するため、または１つまたは複数の対象に施したときの特定の治療の有効性をモニターするまたは調節するための技術を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、低酸素治療は、例えば、酸素補充療法、赤血球濃厚液の輸血、カフェイン、ビタミン療法、機械的換気、陽圧療法、身体運動、または外科的介入であってよいかまたはこれを含んでよい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するような低酸素マーカーは、患者試料中で測定される。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、心臓、動脈、脳、腫瘍、またはそれらの組み合わせからの組織試料であってよいかまたはこれを含んでよい。いくつかの実施形態では、試料は、血液、尿、血清、リンパまたは脳脊髄液であってよいかまたはこれを含んでよい。いくつかの実施形態では、試料は、静脈血試料であってよいかまたはこれを含んでよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素または低酸素誘発性傷害を処置するための新規システムを記載する。いくつかの実施形態では、傷害は、低酸素に関連する疾患、障害もしくは病態を有する患者からの症状であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、傷害は、虚血性組織傷害であるかまたはこれを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、組織中のまたは系統的にＬ−２ＨＧレベルを調節する治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＬ−２ＨＧのレベルを増加させる治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＬ−２ＨＧのレベルを低減させる治療を記載する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝を調節する薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、組織への送達を達成する経路を介した対象への組成物の投与を含む治療を記載する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧであるかまたはこれを含む薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧのアンタゴニストであるかまたはこれを含む薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本開示は、限定されないが、α−ケトグルタル酸、α−ケトグルタル酸の細胞透過性変異体（例えば、α−ケトグルタル酸ジメチル）、グルタミン、またはグルタミン酸塩を含む組成物を投与することを含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、α−ケトグルタル酸のアンタゴニストであるかまたはこれを含む薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、及びＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される１つまたは複数の分子の発現または活性に影響を及ぼす薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、組織への送達を達成する経路を介した対象へのＬＤＨＡの阻害剤の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターの投与を含む治療を記載する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素病態を適用することを必然的に含む用途を記載する。例えば、低酸素は、幹細胞または前駆細胞の多能性を維持するなどのいくつかの状況では望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素の恩恵を受けることができる対象において組織低酸素を促進するためのシステムを記載する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧレベルが正常酸素状態の対象と比較して低い対象において組織低酸素を促進するためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象と比較して、最大で５０％である対象において組織低酸素を促進するためのシステムを記載する。いくつかの他の実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象と比較して、最大で４０％、最大で３０％、最大で２０％、最大で１０％、または最大で５％である対象において組織低酸素を促進するためのシステムを記載する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞、組織または生体の多能性または自己複製を維持するまたは促進するための組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、これらの組成物またはシステムは、インビボで使用するためのものである。いくつかの実施形態では、これらの組成物及びシステムは、インビトロで使用するためのものである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞の多能性または自己複製を維持するまたは促進するための組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞または前駆細胞である。いくつかの実施形態では、これらの組成物またはシステムは、細胞中のＬ−２ＨＧのレベルを調節することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞をＬ−２ＨＧと接触させることを含む、Ｌ−２ＨＧのレベルを調節するための組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性または発現を阻害するための組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ活性または発現を促進するための組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＭＤＨ１またはＭＤＨ２活性または発現を促進するための組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧを細胞に送達するための方法を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞中のα−ケトグルタル酸を枯渇させるための方法を記載する。いくつかの実施形態では、細胞または組織の多能性または自己複製を維持するまたは促進するために使用することができる方法は、細胞培養または組織培養に適用される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧの枯渇が細胞分化を促進することを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、幹細胞分化を促進するためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、これらのシステムは、幹細胞または前駆細胞を有効量のＬＤＨＡの阻害剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、これらのシステムは、幹細胞または前駆細胞を有効量のＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、癌幹細胞である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝におけるＬＤＨＡの重要性を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ活性の阻害に有用な薬剤を同定するまたは特徴づけるための方法を記載する。いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤を、ＬＤＨＡを発現する細胞を含有する試料またはＬＤＨＡを含有する無細胞溶液と接触させること、その後薬剤が存在するときの試料中のＬ−２ＨＧのレベルを、それが不在のとき、または試料中のＬ−２ＨＧに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定すること、及び薬剤が存在するときの測定されたＬ−２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより低い場合、Ｌ−２ＨＧを低減させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものと類似する場合、またはＬ−２ＨＧを増加させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものより低い場合に、ＬＤＨＡ活性の阻害において薬剤が有用であると決定することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝におけるＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの重要性を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の促進に有用な薬剤を同定するまたは特徴づけるための方法を記載する。いくつかの実施形態では、本方法は、薬剤を、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを発現する細胞を含有する試料またはＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼを含有する無細胞溶液と接触させること、薬剤が存在するときの試料中のＬ−２ＨＧのレベルを、それが不在のときまたは試料中のＬ−２ＨＧに及ぼすその効果が知られている基準薬が存在するときと比較して測定すること、及び薬剤が存在するときの測定されたＬ−２ＨＧレベルが、それが不在のときのものより高い場合、Ｌ−２ＨＧを増加させると知られている基準薬が存在するときに測定されたものに類似する場合、またはＬ−２ＨＧを低減させないと知られている基準薬が存在するときに測定されたものより高い場合に、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の促進において薬剤が有用であると決定することを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝が、細胞のエピジェネティックな変化に密接につながっているという新規知見を記載する。例えば、本開示は、Ｌ−２ＨＧ蓄積がヒストンのメチル化を促進することを記載する。いくつかの実施形態では、ヒストンのメチル化は、ヒストン３リジン９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を、Ｌ−２ＨＧを含む組成物、ＬＤＨＡのアクチベーター、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、またはそれらの組み合わせと接触させることを含む、細胞中でヒストンのメチル化を促進するためのシステムを記載する。一方で、いくつかの他の実施形態では、本開示は、細胞を、α−ＫＧを含む組成物、ＬＤＨＡの阻害剤、またはＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターと接触させることを含む、細胞中でヒストンのメチル化を阻害するためのシステムを記載する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧを、癌表現型を区別するために使用することができるという新規知見を代替的にまたは追加的に記載する。例えば、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝が、ＩＤＨ１／２変異を伴わない腫瘍の高く相関する領域であるＨ３Ｋ９ｍｅ３染色に影響を与えることを実証する。いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍異質性を同定するためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、これらのシステムは、以下のパラメータ、すなわちＬ−２ＨＧレベル、α−ケトグルタル酸、ＬＤＨＡの発現または活性、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの発現または活性、またはＨ３Ｋ９ｍｅ３の少なくとも１つを測定することを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍は膠芽腫を有する患者からのものである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧを、低酸素をイメージングするために使用することができるという新規知見を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧと反応する薬剤を含む組成物を試料または対象に投与するためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｌ−２ＨＧに特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、イメージング技術によるその視覚化を可能にする別の部分とコンジュゲートする。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧを正確に検出することができる組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧとＲ−２ＨＧを区別できる組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析または酵素アッセイを含む組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、２ＨＧをキラル誘導化試薬と接触させることにより２−ヒドロキシグルタル酸を処理するための組成物またはシステムを記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】低酸素に応答したＬ−２−ヒドロキシグルタル酸（Ｌ−２ＨＧ）の産生を示すＧＣ−ＭＳヒストグラム及びウェスタンブロット画像を示す。（Ａ）のパネルは、異なる細胞型での２ＨＧレベルを示す棒グラフである。指定の細胞を、２１％または０．５％酸素（Ｏ２）中で２４〜４８時間培養した。総細胞内２ＨＧをガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって測定し、入力を統制するために総タンパク質に対して正規化した。２１％Ｏ２における各細胞型の２ＨＧレベルを、倍率変化を示すために任意に１と設定した。グラフは、３重の試料の平均＋／−標準偏差を示す。（Ｂ及びＣ）のパネルは、ウェスタンブロット及び異なるタンパク質の発現を示すこれらのブロットの定量化である。ＳＦ１８８細胞を、非標的ｓｈＲＮＡ（対照）、Ｄ２ＨＧＤＨ（Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５）を標的とするｓｈＲＮＡ、またはＬ２ＨＧＤＨ（Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４）を標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスに安定定期に感染させた。細胞を２１％または０．５％Ｏ２中で４８時間培養し、２ＨＧを（Ａ）のように測定した。ウェスタンブロットは、ＨＩＦ１α、Ｄ２ＨＧＤＨ、Ｌ２ＨＧＤＨ、及びＳ６タンパク質（負荷対照）の発現を示す。（Ｄ）のパネルは、時間の関数としてイオンの濃縮を示すＧＣ−ＭＳヒストグラムである。低酸素のＳＦ１８８細胞からの代謝産物を、４つの画分に分け、次いで、Ｄ−２ＨＧ、Ｌ−２ＨＧ、Ｄ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧの混合物の基準標準物質でスパイクするか、またはスパイクしないままにした。キラル誘導体化を行って、ＧＣ−ＭＳによる２ＨＧエナンチオマーの分離を可能にした。この図の各パネルでは、３つ以上の独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。図６も参照されたい。
【図２】低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧがグルタミン由来のα−ケトグルタル酸を起源とすることを示すＧＣ−ＭＳヒストグラムの定量化結果を示す。（Ａ及びＢ）のパネルは、指定の時間で１３Ｃにより標識された細胞内２ＨＧの割合を示す線図である。同位体追跡を、［Ｕ−１３Ｃ］グルコースまたは［Ｕ−１３Ｃ］グルタミンのいずれかを含有する培地内で培養されたＳＦ１８８細胞において行った。同様の標識パターンが、ＲＣＣ４及びＣＳ−１細胞で観察された（データは示さず）。（Ｃ）のパネルは、正規化２ＨＧを示す棒グラフである。ＳＦ１８８細胞を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）または５ｍＭのジメチル−α−ＫＧの存在下、２１％または０．５％Ｏ２中で４８時間培養した。総細胞内２ＨＧをＧＣ−ＭＳにより評価した。グラフは、３重の試料の平均＋／−標準偏差を示す。３つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。（Ｄ及びＥ）のパネルは、異なる条件における２ＨＧイオンを示すＧＣ−ＭＳヒストグラムである。ＳＦ１８８細胞を、（Ｃ）のように培養し、次いで代謝産物のキラル誘導体化を行って、ＧＣ−ＭＳによる２ＨＧエナンチオマーの分離を可能にした。（Ｄ）のパネルは、同じ目盛りで２ＨＧについてＧＣ−ＭＳヒストグラムのオーバーレイを示す。（Ｅ）のパネルは、異なる目盛りで２ＨＧについて個別のＧＣ−ＭＳヒストグラムを示す。（Ｄ）及び（Ｅ）についてのグラフの線のスタイルは、（Ｃ）に示すものと同じである。（図１Ｄ）のように、Ｌ−２ＨＧ（左）は、Ｄ−２ＨＧ（右）よりも短い保持時間で溶出する。５つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。
【図３】低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧがＬＤＨＡによる無差別な基質使用を介して生じることを示すウェスタンブロット画像を示す。（Ａ、Ｂ、Ｃ）のパネルは、ｓｉＲＮＡ実験後に示された様々なタンパク質のウェスタンブロット画像及び定量化である。ＳＦ１８８細胞を、（Ａ）ＩＤＨ１（ＩＤＨ１−ａ、−ｂ）またはＩＤＨ２（ＩＤＨ２−ａ、−ｂ）、（Ｂ）ＭＤＨ１（ＭＤＨ１−ａ、−ｂ）またはＭＤＨ２（ＭＤＨ２−ａ、−ｂ）、または（Ｃ）ＬＤＨＡ（ＬＤＨＡ−ａ、−ｂ、−ｃ、−ｄ）を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を２１％または０．５％Ｏ２にさらに２４〜４８時間移し、その後、細胞内２ＨＧを測定した。ウェスタンブロットは、標的ノックダウン有効性を確かにし、ＨＩＦ１αの低酸素誘発性発現を示す。Ｓ６タンパク質またはα−チューブリンのいずれかの発現を、負荷対照として示す。各パネルについて、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。図７も参照されたい。パネル（Ｄ）は、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの酵素源をまとめる概略図である。
【図４】ＬＤＨＡの活性部位が、Ｌ−２ＨＧへの還元を受け入れられる幾何学におけるα−ＫＧの結合を立体的に受け入れることができることを示す構造モデルレンダリングを示す。（Ａ及びＣ）のパネルは、ＮＡＤＨを有するＬＤＨＡの活性部位にドッキングしたピルベート及びα−ＫＧのポーズの構造モデルである。（Ｂ及びＤ）のパネルは、ＮＡＤ＋を有するＬＤＨＡの活性部位にドッキングしたＬ−乳酸塩及びＬ−２ＨＧのポーズの構造モデルである。影付きの雲状部分は、基質結合性ポケット内で予測される空の空間を表す。予測される水素結合を青色で示す。線として示す残基は、Ａｒｇ１６８（パネルの右上角の細い灰色の線）、Ｔｈｒ２４７（パネルの左上角の太い灰色の線）、Ｈｉｓ１９２（底部中央の細い灰色の線）、Ａｒｇ１０５（背景中央の淡灰色の線）、Ａｓｎ１３７（上部中央の細い灰色の線）、及びＧｌｎ９９（淡灰色と黒色の間の上部中央の太い灰色の線）である。ドッキングは、ＰＤＢアクセッションコード１Ｉ１０（Ｒｅａｄら、２００１）を使用した。四角は、対応するα−ヒドロキシル酸のＬ−（Ｓ）−エナンチオマーを産生するように還元反応を拘束する、ＮＡＤＨのヒドリド基に関連して、各基質のカルボン酸頭部基及び隣接するカルボニル基の空間的立体配置を強調する。
【図５】Ｌ−２ＨＧが、低酸素に応答してヒストン３リジン９のトリメチル化を増強させることを示す免疫組織化学染色及びウェスタンブロット画像を示す。（Ａ）のパネルは、指定のタンパク質について染色されたヒト膠芽腫検体の免疫組織化学画像である。ＨＩＦ１α発現及びＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルを、生検において捉えた低酸素性領域を有する（ｎ＝２６）または有さない（ｎ＝２１）ヒト膠芽腫検体における免疫組織化学により評価した。パネル（Ｂ）は、ＨＩＦ１αを発現しない（−）または発現する（＋）生検内でのＨ３Ｋ９ｍｅ３染色強度（画素単位）の定量化を示す。値は、平均＋／−標準偏差を表し；＊ｐ＝０．０１は、対応のない両側スチューデントのｔ検定により決定した。（Ｃ、Ｄ及びＥ）のパネルは、指定の条件下のＨ３Ｋ９ｍｅ３のウェスタンブロット画像及び定量化結果である。空のレンチウイルスベクター（ベクター）またはＬ２ＨＧＤＨをコードするレンチウイルスベクターに安定的に感染したＳＦ１８８膠芽腫細胞を、４８時間２１％または０．５％Ｏ２内で培養し、その後ヒストン抽出を行い、ウェスタンブロットによりＨ３Ｋ９ｍｅ３を評価した。（Ｄ）非標的ｓｈＲＮＡ（対照）またはＬ２ＨＧＤＨ（Ｌ１、Ｌ３）を標的とするｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスに安定的に感染したＳＦ１８８膠芽腫細胞を、２１％または０．５％Ｏ２内で培養し、その後ヒストン抽出を行い、ウェスタンブロットによりＨ３Ｋ９ｍｅ３を評価した。（Ｅ）のパネルでは、バルクヒストンを、α−ＫＧ（１ｍＭ）との反応混合物中で精製したヒトＫＤＭ４Ｃと、ならびに指定濃度のＬ−２ＨＧまたはＤ−２ＨＧとインキュベートした。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を、総Ｈ３を負荷対照として使用して、ウェスタンブロットにより評価した。（Ｃ）、（Ｄ）、及び（Ｅ）のパネルは、３つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。
【図６】低酸素に応答したＬ−２ＨＧの選択的産生を示すＧＣ−ＭＳヒストグラムを示す。パネル（Ａ）は、Ｒ（−）−２−ブタノール及び酢酸無水物での連続的な誘導体化後のＬ−２−ヒドロキシグルタル酸を示す概略図である（詳細については実験手法を参照されたい）。（Ｂ及びＣ）のパネルは、ＧＣ−ＭＳからのヒストグラムである。正常酸素状態（２１％Ｏ２）または低酸素（０．５％Ｏ２）で培養された（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または（Ｃ）ＳＶ４０−不死化ＭＥＦからの代謝産物を、（Ａ）のようにキラル誘導体化に供して、ＧＣ−ＭＳによる２ＨＧエナンチオマーの分離を可能にした。図１Ｄに実証するように、Ｌ−２ＨＧ（左）は、Ｄ−２ＨＧ（右）よりも短い保持時間で溶出する。２つ以上の独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。
【図７】低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの酵素源を示すウェスタンブロット画像を示す。上のパネルは、そのパネルの左側に指定された条件下のタンパク質のウェスタンブロット画像であり、下のパネルは、そのウェスタンブロットの定量化である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、（Ａ）ＩＤＨ１（ＩＤＨ１−ａ、−ｂ）またはＩＤＨ２（ＩＤＨ２−ａ、−ｂ）、（Ｂ）ＬＤＨＡ（ＬＤＨＡ−ａ、−ｂ、−ｃ、−ｄ）、または（Ｃ）ＬＤＨＡ（ＬＤＨＡ−ｂ、−ｄ）及びＭＤＨ２（ＭＤＨ２−ａ、−ｂ）の両方を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を２１％または０．５％Ｏ２へとさらに２４〜４８時間移し、その後細胞内２ＨＧを測定した。ウェスタンブロットは、負荷対照としてＳ６タンパク質またはα−チューブリンのいずれかの発現で標的ノックダウン有効性を確かにする。各パネルについて、２つ以上の独立した実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本出願では、文脈から別様に明確でない限り、（ｉ）「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されてよく；（ｉｉ）「または」という用語は、「または」を意味すると理解されてよく；（ｉｉｉ）「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それら単独かまたは１つまたは複数の追加の構成要素またはステップと一緒に提示される、個条書きされた構成要素またはステップを包含すると理解されてよく；（ｉｖ）「約」及び「おおよそ」という用語は、当業者に理解されるであろう標準的な変動を許可すると理解されてよく；（ｖ）範囲が提供される場合、端点を含む。
【００３６】
活性化剤：本明細書で用いるとき、「活性化剤」という用語、またはアクチベーターは、薬剤無し（または異なるレベルでの薬剤）で観察されるものと比較して、その存在またはレベルが標的のレベルまたは活性の上昇と相関する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、活性化剤は、その存在またはレベルが、特定の（例えば、既知の活性化剤、例えば陽性対照、の存在下などの適切な基準条件下で観察される）基準レベルまたは活性と同等またはそれらより大きい標的レベルまたは活性と相関するものである。
【００３７】
投与：本明細書で用いるとき、「投与」という用語は、対象または系への組成物の投与を指す。動物対象（例えば、ヒト）への投与は、任意の適切な経路によるものであってよい。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、（気管支注入によるものを含む）気管支、口腔、経腸、皮間（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、経粘膜、経鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（気管内注入を含む）、経皮、膣及び硝子体であってよい。
【００３８】
薬剤：「薬剤」という用語は、本明細書で用いるとき、例えば、ポリペプチド、核酸、多糖類、脂質、小分子、金属、またはそれらの組み合わせを含む任意の化学クラスの化合物または実体を指してよい。いくつかの実施形態では、薬剤は、自然に見いだされるまたは自然から獲得されるという点で自然産物であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、ヒトの手の作用を通して設計され、操作され、もしくは産生されるかまたは自然に見いだされるものではない点で人工である１つまたは複数の実体であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、単離されたまたは純粋な形態において活用されてよく、いくつかの実施形態では、薬剤は、粗形態で活用されてよい。いくつかの実施形態では、潜在的な薬剤は、コレクションまたはライブラリーとして提供され、例えばそれらは、それらの中の活性剤を同定または特徴づけるためにスクリーニングされてよい。本発明に従って活用されてよい薬剤のいくつかの特定の実施形態には、小分子、抗体、抗体断片、アプタマー、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、ペプチド、ペプチド模倣物等が含まれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリマーであるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリマーではないかまたは実質的にいずれのポリマーも含まない。いくつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも１つのポリマー部分を含有する。いくつかの実施形態では、薬剤は、任意のポリマー部分を欠くか実質的に含まない。
【００３９】
動物：本明細書で用いるとき、「動物」という用語は、動物界の任意の成員を指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達段階の非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、またはクローンであってよい。
【００４０】
アンタゴニスト：本明細書で用いるとき、「アンタゴニスト」という用語または阻害剤は、ｉ）別の薬剤の効果を阻害する、低減するもしくは低下させる；またはｉｉ）１つまたは複数の生物学的事象を阻害する、低減する、低下させる、もしくは遅らせる薬剤を指す。アンタゴニストは、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、金属、または関連する阻害活性を示す任意の他の実体を含む、任意の化学クラスの薬剤であってよいかまたはこれらを含んでよい。アンタゴニストは、直接（その場合その影響をその標的に直接及ぼす）または間接（その場合その標的に結合する以外で；例えば、標的のレベルまたは活性が変化するように、例えば、標的の制御因子と相互作用することによって、その影響を及ぼす）であってよい。
【００４１】
おおよそ：本明細書で用いるとき、「おおよそ」及び「約」という用語は、それぞれ、関連する文脈に適切であると当業者により理解されるであろう通常の統計学的変動を包含すると意図される。ある特定の実施形態では、「おおよそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈からそうでないと明確でない限り（例えば、かかる数字があり得る値の１００％を超す場合）、それぞれ、記した値のいずれかの方向（より多いまたはより少ない）において２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に入る値の範囲を指す。
【００４２】
と関連する：本用語が本明細書で用いられるとき、一方の存在、レベルまたは形態が他方のものと相関する場合に、２つの事象または実体はお互いに「関連する」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベルまたは形態が、疾患、障害、または病態の（例えば、関連する集団にわたる）発生率または感受性と相関する場合に、特定の疾患、障害、または病態と関連するとみなされる。いくつかの実施形態では、２つ以上の実体は、物理的にお互いに近接し、近接したままであるようにそれらが直接的または間接的に相互作用する場合、お互いに物理的に「関連」する。いくつかの実施形態では、お互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、お互いに共有結合する；いくつかの実施形態では、お互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、お互いに共有結合しないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、及びこれらの組み合わせにより、非共有結合的に関連する。
【００４３】
生物学的に活性：本明細書で用いるとき、「生物学的に活性」という語句は、生物系内（例えば、細胞内（例えば、培養物内、組織内、生体内に、単離された）、細胞培養物内、組織内、生体内、等）における活性を有する物質を指す。例えば、生体に投与されたとき、その生体上に生物学的効果を有する物質が、生物学的に活性であるとみなされる。しばしば生物学的に活性な物質の一部または断片のみが、活性を提示するために要求される（例えば、必要及び十分である）ことが当業者により理解されるだろう；そのような環境では、その部分または断片は「生物学的に活性な」部分または断片であるとみなされる。
【００４４】
併用療法：本明細書で用いるとき、「併用療法」という用語は、対象が、２つ以上の治療レジメン（例えば、２つ以上の治療剤）に同時に曝露される状況を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤は、同時に投与されてよい；いくつかの実施形態では、かかる薬剤は、順次投与されてよい；いくつかの実施形態では、かかる薬剤は、重複する投与レジメンにおいて投与される。
【００４５】
同等：「同等」という用語は、本明細書で用いるとき、お互いに同一ではないがその間での比較を可能にし、結論を観察された差異または類似性に基づいて合理的に引き出し得るのに十分に類似する２つ以上の薬剤、実体、状況、条件のセット等を指す。いくつかの実施形態では、条件、環境、個体または集団の同等のセットは、複数の実質的に同一の特性及び１つまたは少数の異なる特性によって特徴づけられる。当業者は、２つ以上のかかる薬剤、実体、状況、条件のセット等が同等であるとみなされるには、任意の所与の環境においてどの程度の同一性が必要とされるかを、文脈において、理解するだろう。例えば、当業者は、異なる環境、個体、または集団のセットでまたはその下で、それらにより得られた結果または観察された現象における差異が、変動したそれらの特性における変動性により引き起こされるまたはそれを示すという、合理的な結論を保証するのに十分な数及びタイプの実質的に同一の特性により特徴づけられるとき、環境、個体、または集団のセットがお互いに同等であると理解するだろう。
【００４６】
に対応する：本明細書で用いるとき、「に対応する」という用語は、しばしば、適切な基準薬において存在するものと（例えば、３次元空間でまたは別の要素または部分に対して）位置を共有する対象となる薬剤の構造要素または部分を示すのに使用される。例えば、いくつかの実施形態では、本用語は、ポリペプチド内のアミノ酸残基または核酸内のヌクレオチド残基などのポリマー内の残基の位置／同一性を指すために使用される。当業者は、簡潔さを目的として、そのようなポリマー内の残基が基準に関連するポリマーに基づく規範的な番号付けシステムを使用してしばしば示される、ゆえに、基準ポリマー内の１９０位の残基に「に対応する」第一のポリマー内の残基は、例えば、必ずしも実際に第一ポリマーの１９０番目の残基である必要はなく、基準ポリマーの１９０番目の位置で見いだされた残基に対応するということを理解するだろう；当業者は、ポリマー配列比較用に特異的に設計された１つまたは複数の市販のアルゴリズムの使用を通すことを含む、「対応する」アミノ酸を同定する方法を容易に理解する。
【００４７】
誘導体：本明細書で用いるとき、「誘導体」という用語は、基準物質の構造類似体を指す。つまり、「誘導体」は、基準物質との著しい構造類似性を示す、例えばコアまたはコンセンサス構造を共有するが、同時にある特定の別々の方法で異なる物質である。いくつかの実施形態では、誘導体は、化学的操作により基準物質から生成されることができる物質である。いくつかの実施形態では、誘導体は、基準物質を生成するものと実質的に類似する（例えば、複数のステップを共有する）合成プロセスの遂行を通して生成されることができる物質である。
【００４８】
設計された：本明細書で用いるとき、「設計された」という用語は、（ｉ）その構造が人の手により選択されるまたはされた；（ｉｉ）人の手を要するプロセスにより産生された；または（ｉｉｉ）自然物質または他の既知の薬剤と異なる薬剤を指す。
【００４９】
決定する：本明細書に記載の多くの方法が「決定する」ステップを含む。当業者は、本明細書を読むと、そのような「決定すること」が、例えば、本明細書に明確に言及される特定の技術を含む、当業者に利用可能な任意の様々な技術を活用することができるまたはこれらの使用を通して達成されることができることを理解するだろう。いくつかの実施形態では、決定することは、身体的試料の操作を必然的に含む。いくつかの実施形態では、決定することは、データまたは情報の考慮または操作、例えば、関連分析を実施するのに適合したコンピュータまたは他の処理装置を活用することを必然的に含む。いくつかの実施形態では、決定することは、供給源から関連情報や材料を受け取ることを必然的に含む。いくつかの実施形態では、決定することは、試料または実体の１つまたは複数の特性を同等の基準と比較することを必然的に含む。
【００５０】
診断情報：本明細書で用いるとき、「診断情報」または「診断において使用するための情報」は、患者が疾患、障害もしくは病態を有するかどうかの決定、または表現型カテゴリー、もしくは疾患、障害もしくは病態の予後に関して有意性を有する、または疾患、障害もしくは病態の処置（一般的な処置または任意の特定の処置のいずれか）への可能性の高い応答、任意のカテゴリーへの疾患、障害もしくは病態の分類において有用である情報である。同様に、「診断」は、対象が疾患、障害もしくは病態（癌など）を有するまたは発症する可能性が高いかどうか、対象において顕在化した疾患、障害もしくは病態の状態、ステージ付けまたは特徴、腫瘍の特性または分類に関連する情報、予後に関する情報または適切な処置を選択するのに有用である情報を含むが、これに限定されない、任意の種類の診断情報を提供することを指す。処置の選択は、特定の治療（例えば、化学療法）剤、または他の処置法、例えば、外科手術、放射線等の選択、治療を控えるか送達するかに関する選択、投与レジメン（例えば、１つまたは複数の用量の特定の治療剤または治療剤の組み合わせの頻度またはレベル）に関連する選択、等を含んでよい。
【００５１】
分化：「分化」という用語は、特殊化されていない（「未拘束の（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」）または比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞または筋細胞などの特殊化された細胞の特性を獲得するプロセスである。分化細胞または分化を誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化された状況を呈している細胞である。分化のプロセスに適用した際の「拘束された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」という用語は、通常の環境下で特定の細胞型または細胞型の小集合に分化し続けるだろう分化経路の点に進行しており、かつ、通常の環境下では、異なる細胞型に分化するまたはより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞の系統内で比較的特殊化されて（または拘束されて）いない位置に戻るプロセスを指す。本明細書で用いるとき、細胞の系統は、細胞の遺伝、つまりその細胞がどの細胞から由来したか、またどの細胞を生じさせることができるかを規定する。細胞の系統は、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、対象とする系統への未拘束の細胞の分化を評価するために使用することができる。
【００５２】
投与レジメン：（または「治療レジメン」）は、本明細書で用いるとき、典型的には期間を空けて、対象に個別に投与される単位用量（典型的には、１つより多い）のセットである。いくつかの実施形態では、所与の治療剤は、推奨される投与レジメンを有し、これには１つまたは複数の用量が必然的に含まれ得る。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、そのそれぞれがお互いに同じ長さの期間で離れている複数の用量を含む；いくつかの実施形態では、投与レジメンは、複数の用量及び個別の用量を離す少なくとも２つの異なる期間を含む。いくつかの実施形態では、治療剤は、所定の期間にわたって連続的に（例えば、注入により）投与される。いくつかの実施形態では、治療剤は１日１回（ＱＤ）または１日２回（ＢＩＤ）投与される。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、そのそれぞれがお互いに同じ長さの期間で離れている複数の用量を含む；いくつかの実施形態では、投与レジメンは、複数の用量及び個別の用量を離す少なくとも２つの異なる期間を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメン内の全ての用量は、同じ単位用量の量のものである。いくつかの実施形態では、投与レジメン内の異なる用量は、異なる量のものである。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、第一用量の量の第一用量、その後第一用量の量とは異なる第二用量の量の１つまたは複数の追加の用量を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、第一用量の量の第一用量、その後、第一用量の量と同じ第二用量の量の１つまたは複数の追加の用量を含む。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、適切な母集団全体に投与されたとき、所望のまたは有益な転帰と相関する（つまり、治療的投与レジメンである）。
【００５３】
低酸素：「低酸素」または「低酸素病態」という用語は、本明細書で用いるとき、哺乳類の１つまたは複数の組織における酸素が生理学的なレベルを下回る、例えば、最適レベル未満である状態または病態を指す。いくつかの実施形態では、低酸素は、ストレス、例えば、有酸素運動、体重圧、麻酔、外科手術、貧血症、急性呼吸窮迫症候群、慢性疾病、慢性疲労症候群、外傷、火傷、皮膚潰瘍、癌に起因する悪液質及び他の異化状態等から生じ得る。いくつかの実施形態では、低酸素は、血管の狭窄または遮断に起因する血流の減少のためにその組織が酸素欠乏である「虚血」または「虚血性病態」であるかまたはこれを含む。虚血または虚血性病態は、冠動脈疾患、アルコール性心筋症を含む心筋症、血管形成術、ステント留置、バイパス手術または心臓修復手術（「開心術」）などの心臓手術、臓器移植、組織への長期重圧（褥瘡または床ずれ）、移植された臓器または組織に損傷を引き起こし得る虚血再灌流傷害、等により引き起こされるものを含む。本開示により提供される技術は、例えば、低酸素に起因する１つまたは複数の症状を、その根本的原因にかかわらず、診断する及び／または処置するのに有効であることができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の処置は、たとえそれらが根本的病態（例えば、数例をあげると、ウイルス性または細菌性感染、細菌または他の毒素への暴露、低い赤血球数、加齢、癌、運動の継続）の１つまたは複数の態様を処置しないとしても、例えば、低酸素症に罹患している対象のエネルギーレベル、強さ及び／または健康状態を増加させ得る。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素病態」という用語は、血液中の酸素含有率が低い病態を指す。特定の実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、おおよそ８０ｍｍ  Ｈｇ未満の動脈ＰＯ２値及びおおよそ３０ｍｍ  Ｈｇ未満の静脈ＰＯ２値により定義されてよい。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、おおよそ６０ｍｍ  Ｈｇ未満の動脈ＰＯ２値により定義されてよい。ある特定の実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、おおよそ５０ｍｍ  Ｈｇ未満の動脈ＰＯ２値により定義されてよい。特定の実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、おおよそ５０〜２０ｍｍ  Ｈｇ間の動脈ＰＯ２値により定義されてよい。あるいはまたは加えて、「低酸素」または「低酸素の」病態は、動脈血液または組織から酸素が存在しないまたはほとんど完全に存在しないとして定義される無酸素症と区別されてよい。いくつかの実施形態では、低酸素の型及び重症度は、２ＨＧの絶対的または相対的定量化または定性化により定義されてよい。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、約１０ｍｍ  Ｈｇ未満の組織内ＰＯ２レベルにより定義されてよい。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、約５ｍｍ  Ｈｇ未満の組織内ＰＯ２レベルにより定義されてよい。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、約１０ｍｍ  Ｈｇ未満の腫瘍内ＰＯ２レベルにおより定義されてよい。いくつかの実施形態では、「低酸素」または「低酸素の」病態は、約５ｍｍ  Ｈｇ未満の腫瘍内ＰＯ２レベルにより定義されてよい。「低酸素」または「低酸素の」病態は、慢性または急性であってよい。「慢性低酸素」は、本明細書で用いるとき、２ＨＧ産生において測定可能な増加をもたらす持続的低酸素病態を指してよい。つまり、慢性低酸素は、２ＨＧがベースラインレベルを超えて蓄積することを可能にするのに十分な期間の低酸素病態として定義されてよい。いくつかの実施形態では、慢性低酸素は、３０分を超える、１時間を超える、２時間を超える、３時間を超える、４時間を超える、５時間を超える、１０時間を超える、１２時間を超える、２４時間を超える、１日を超える、または一週間またはそれ以上の期間の低酸素病態である。いくつかの実施形態では、慢性低酸素は、血液毛細血管と低酸素性領域との間の組織または腫瘍細胞による酸素の消費及び枯渇により引き起こされる。慢性低酸素の持続的病態とは対照的に、急性低酸素は一過的である。いくつかの実施形態では、急性低酸素は、組織または腫瘍において血管または微小血管の一時的な停止があるときに生じる。いくつかの実施形態では、急性低酸素は、赤血球細胞レベルにおける増減の結果として生じる。
【００５４】
低酸素に関連する疾患：「低酸素に関連する疾患、障害または病態」という用語は、低酸素を伴う（例えば、その発生率または重症度が、低酸素の１つまたは複数の態様と相関する及び／またはそれを特徴とする）疾患、障害または病態である。いくつかの特定の実施形態では、低酸素に関連する疾患、障害または病態は、例えば、敗血症性ショック、虚血性脳卒中、心筋梗塞、貧血症、肺疾患、気道閉塞、急性呼吸窮迫症候群、肺炎、気胸症、肺気腫、先天性心臓欠陥、アテローム性動脈硬化症、血栓症、肺塞栓症、肺水腫、喘息、膿胞性線維症、癌、ある特定の外科的処置であってよいかまたはこれを含んでよい。いくつかの実施形態では、低酸素に関連する疾患、障害または病態は、ストレス、例えば、有酸素運動、体重圧、麻酔、外科手術、貧血症、急性呼吸窮迫症候群、慢性疾病、慢性疲労症候群、外傷、火傷、皮膚潰瘍、癌に起因する悪液質及び他の異化状態等と関連する。いくつかの実施形態では、低酸素に関連する疾患、障害または病態は、血管の狭窄または遮断に起因する血流の減少のためにその組織が酸素欠乏である「虚血」または「虚血性病態」であるかまたはこれを含む。虚血または虚血性病態は、冠動脈疾患、アルコール性心筋症を含む心筋症、血管形成術、ステント留置、バイパス手術または心臓修復手術（「開心術」）などの心臓手術、臓器移植、組織への長期重圧（褥瘡または床ずれ）、移植された臓器または組織に損傷を引き起こし得る虚血再灌流傷害、等により引き起こされるものを含む。
【００５５】
マーカー：マーカーは、本明細書で用いるとき、その存在またはレベルが特定の状態または事象の特徴である実体または部分を指す。いくつかの実施形態では、特定のマーカーの存在またはレベルは、疾患、障害、または病態の存在またはステージの特徴であり得る。一例をあげると、いくつかの実施形態では、本用語は、代謝産物、例えば、特定の低酸素誘発性傷害等の特徴である、Ｌ−２ＨＧを指す。別の例をあげると、いくつかの実施形態では、本用語は、遺伝子発現産物、例えば、特定の低酸素誘発性傷害の特徴である、ＬＤＨＡを指す。いくつかの実施形態では、マーカーは、特定の腫瘍、腫瘍サブクラス、腫瘍のステージ、等と関連し得る。あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、特定のマーカーの存在またはレベルは、例えば、腫瘍の特定のクラス、例えば、膠芽腫の特徴であり得る特定のシグナル伝達経路の活性（または活性レベル）と相関する。マーカーの存在または不在の統計学的有意性は、特定のマーカーに依存して変動し得る。いくつかの実施形態では、マーカーの検出は、腫瘍が特定のサブクラスのものである高い可能性をそれが反映するという点で非常に特異的である。そのような特異性は、感受性と引き換えになり得る（つまり、腫瘍がマーカーを発現すると予期され得る腫瘍であったとしても陰性の結果が起こる可能性がある）。逆に、感受性の程度が高いマーカーは、感度が低いものよりもあまり特異的ではない可能性がある。本発明に従って、有用なマーカーは、１００％の精度で特定のサブクラスの腫瘍を区別する必要はない。
【００５６】
質量分析：質量分析は、気相イオンの質量対電荷比に変換することができるパラメータを測定する気相イオン分光計を用いた方法を指す。質量分析計は、一般に、イオン源及び質量分析器を含む。質量分析計の例は、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、静電場分析器型及びこれらの複合型である。
【００５７】
代謝産物：本明細書で用いるとき、「代謝産物」は、食事及び栄養素の消化、尿及び糞を通した老廃物の排出、呼吸、血液循環、及び体温調節などのエネルギーを生成するまたは使用する体内での物理的または化学的プロセス中に産生されるまたは使用される任意の物質を指す。「代謝前駆体」という用語は、それから代謝産物が作られる化合物を指す。「代謝産生物」という用語は、代謝経路の一部である任意の物質を指す（例えば、代謝物、代謝前駆体）。
【００５８】
調節物質：「調節物質」という用語は、対象となる活性が観察される系内のその存在またはレベルが、調節物質が不在のときにそれ以外は同等の条件下で観察されるものと比較して、その活性のレベルまたは特性における変化と相関する実体を指すために使用される。いくつかの実施形態では、調節物質は、アクチベーターであり、調節物質が不在のときにそれ以外は同等の条件下で観察されるものと比較して、その活性がその存在において増加する。いくつかの実施形態では、調節物質は、アンタゴニストまたは阻害剤であり、調節物質が不在のときのそれ以外は同等の条件と比較して、その活性がその存在において低下する。いくつかの実施形態では、調節物質は、その活性が対象となるものである標的実体と直接相互作用する。いくつかの実施形態では、調節物質は、その活性が対象となるものである標的実体と間接的に（つまり、標的実体と相互作用する中間剤と直接的に）に相互作用する。いくつかの実施形態では、調節物質は、対象となる標的実体のレベルに影響を与える；あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、調節物質は、標的実体のレベルに影響を与えることなく対象となる標的実体の活性に影響を与える。いくつかの実施形態では、調節物質は、対象となる標的実体のレベル及び活性の両方に影響を与え、ゆえに活性において観察される差異は、レベルにおいて観察される差異により完全に説明されないかまたはそれに比例しない。
【００５９】
正常酸素状態の：本明細書で用いるとき、「正常酸素状態の」という用語は、慢性的にまたは急性的に低酸素ではない血清または組織ＰＯ２レベルを指す。本用語が「個体」または「対象」を修飾するように使用されるときは、本用語は、慢性または急性低酸素を有さない個体または個体の群を指す。例えば、特定の実施形態では、正常酸素状態の個体は、おおよそ８０〜１００ｍｍ  Ｈｇ間の動脈ＰＯ２またはおおよそ３０〜５０ｍｍ  Ｈｇ間の静脈ＰＯ２を有する。「正常酸素状態」または「正常酸素状態の」は、インビボまたはインビトロでおおよそ２１％の大気酸素分圧により代替的にまたは追加的に定義されてよい。いくつかの実施形態では、正常酸素状態のレベルは、慢性または急性低酸素を有さない個体の集団全体にわたってまたはその中で提示されるレベルを考慮することで確立される。例えば、いくつかの実施形態では、正常酸素状態のレベルは、そのような集団全体にわたるまたはその中でのレベルの平均、中央値、または平均値を表し、典型的に統計学的有意性を示す。いくつかの実施形態では、「正常酸素状態の」病態は、約１０ｍｍ  Ｈｇを超える組織内ＰＯ２レベルにより定義されてよい。いくつかの実施形態では、
【００６０】
栄養素：本明細書で用いるとき、「栄養素」という用語は：細胞、組織または生体の健康に寄与するアミノ酸及びペプチド、ビタミン、ヌクレオチド、脂肪酸、炭水化物、ミネラル及び他の物質または材料を指す。
【００６１】
医薬組成物：本明細書で用いるとき、「医薬組成物」という用語は、１つまたは複数の薬学的に許容され得る担体と一緒に製剤化された活性剤を指す。いくつかの実施形態では、活性剤は、適切な母集団に投与されたときに、所定の治療効果を達成する統計学的に有意な可能性を示す治療レジメンにおける投与に適切な単位用量の量で存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、以下、すなわち経口投与、例えば、水薬（水系または非水系液剤または懸濁剤）、錠剤、例えば、口腔、舌下、及び全身吸収を標的とするもの、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペースト；非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射によって、例えば、滅菌液剤または懸濁剤、または徐放性製剤として；局所適用、例えば、皮膚、肺、または口腔に適用するクリーム、軟膏、または制御放出性パッチまたは噴霧剤として；膣内にまたは直腸内に、例えば、ペッサリー、クリーム、または泡として；舌下；点眼；経皮；または経鼻、肺、及び他の粘膜表面に適するものを含む固体または液体形態での投与のために特別に製剤化され得る。
【００６２】
薬学的に許容され得る：「薬学的に許容され得る」という用語は、本明細書で用いるとき、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わず、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、ヒトまたは動物の組織との接触における使用に好適である薬剤を指す。
【００６３】
薬学的に許容され得る担体：本明細書で用いるとき、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、対象化合物をある臓器、または身体の部分から、別の臓器または身体の部分へと運ぶことまたは輸送することに関与する、薬学的に許容され得る材料、組成物またはビヒクル、例えば、材料を封入した液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒を指す。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容され得る担体として機能することができる材料のいくつかの例には、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；ポリエステル、ポリカーボネートまたはポリ無水物；及び医薬製剤に採用される他の非毒性適合物質が挙げられる。
【００６４】
予防：「予防」という用語は、本明細書で用いるとき、発症の遅延、または特定の疾患、障害もしくは病態の１つまたは複数の症状の頻度もしくは重症度の低下を指す。いくつかの実施形態では、予防は、疾患、障害または病態の１つまたは複数の症状の発症、頻度、または強度において統計学的に有意な低減が、疾患、障害、または病態に感受性である集団において観察される場合に、薬剤が特定の疾患、障害または病態を「予防する」とみなされるように集団に基づいて評価される。
【００６５】
前駆細胞：本明細書で用いるとき、「前駆細胞」という用語は、より大きな発生能を有する細胞、つまり、分化により生じることができる細胞と比較してより初期である（例えば、発生経路または進行に沿ってより初期段階である）細胞の表現型を指す。しばしば、前駆細胞は、有意または非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、細胞が発生し分化する発生経路及び環境に依存して、より低い発生能を有する、つまり、分化した細胞型の複数の別個の細胞、または単一の分化した細胞型を生じさせることができる。
【００６６】
基準：「基準」という用語は、それに対して対象となる薬剤、個体、集団、試料、配列または値が比較される、標準または対照の薬剤、個体、集団、試料、配列または値を記載するために本明細書でしばしば使用される。いくつかの実施形態では、基準の薬剤、個体、集団、試料、配列または値は、対象となる薬剤、個体、集団、試料、配列または値の試験または決定と実質的に同時に試験または決定される。いくつかの実施形態では、基準の薬剤、個体、集団、試料、配列または値は、歴史的な基準であり、任意選択的に有形的表現媒体において具体化される。典型的には、当業者によって理解され得るように、基準の薬剤、個体、集団、試料、配列または値は、対象となる薬剤、個体、集団、試料、配列または値の決定または特徴づけに活用されるものと同等の条件下で決定されるまたは特徴づけられる。
【００６７】
応答：本明細書で用いるとき、処置に対する応答は、処置の結果として起こるまたは処置に相関する対象の病態における任意の有益な変化を指してよい。そのような変化は、病態の安定化（例えば、処置がなければ起こるだろう悪化の予防）、病態の症状の寛解、または病態の治癒への見込みにおける改善等を含んでよい。それは、対象の応答または腫瘍の応答を指してよい。腫瘍または対象応答は、臨床的な判定基準及び客観的な判定基準を含む、広範な判定基準に従って測定されてよい。応答を評価するための技術には、臨床検査、ポジトロン放射断層法、胸部Ｘ線ＣＴスキャン、ＭＲＩ、超音波検査、内視鏡検査、腹腔鏡検査、対象から得られた試料における腫瘍マーカーの存在またはレベル、細胞学的検査、ＧＣ−ＭＳ、または組織学的検査が含まれるがこれらに限定されない。厳密な応答判定基準は、腫瘍または患者の群を比較するときは、比較される群は、応答率を決定するために同じまたは同等の判定基準に基づいて評価されるということを条件として、任意の適切な様式で選択されることができる。当業者は、適切な判定基準を選択することができるだろう。
【００６８】
リスク：文脈から理解され得るように、疾患、障害または病態の「リスク」は、特定の個体が疾患、障害、または病態を発症し得る可能性の度合いである。いくつかの実施形態では、リスクは、割合（％）として表現される。いくつかの実施形態では、リクスは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１００％までである。いくつかの実施形態では、リスクは、基準試料または基準試料の群に関連するリスクに対するリスクとして表現される。いくつかの実施形態では、基準試料または基準試料の群は、疾患、障害、または病態の既知のリスクを有する。いくつかの実施形態では、基準試料または基準試料の群は、特定の個体と同等の個体からのものである。いくつかの実施形態では、相対的リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である。
【００６９】
試料：本明細書で用いるとき、「試料」という用語は、典型的に、本明細書に記載のように、対象となる供給源から得られたまたはそれに由来する生体試料を指す。いくつかの実施形態では、対象となる供給源は、動物またはヒトなどの生体を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、生物学的組織または液体であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、骨髄；血液；血液細胞；腹水；組織または細針生検試料；細胞を含有する体液；浮動性（ｆｒｅｅ  ｆｌｏａｔｉｎｇ）核酸；喀痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹水；胸水；糞便；リンパ；婦人科学的流体；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻スワブ；洗浄液または洗浄物、例えば腺管洗浄物または気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄物；吸引物；擦過物；骨髄検体；組織生検検体；外科的検体；糞便、他の体液、分泌物または排出物；またはそれらに由来する細胞等であってよいかまたはこれを含んでよい。いくつかの実施形態では、生体試料は、個体から得られた細胞であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、得られた細胞は、試料を得た個体から得られた細胞であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、試料は、対象となる供給源から任意の適切な手段によって直接的に得られた「一次試料」である。例えば、いくつかの実施形態では、一次生体試料は、生検（例えば、細針吸引または組織生検）、外科手術、体液（例えば、血液、リンパ、糞便等）の収集等からなる群から選択される方法によって得られる。いくつかの実施形態では、文脈から明らかであり得る通り、「試料」という用語は、一次試料の処理によって（例えば、一次試料の１つまたは複数の構成成分を除去することによって、または一次試料に１つまたは複数の薬剤を添加することによって）得られる調製物を指す。例えば、半透過膜を使用して濾過する。このような「処理された試料」は、試料から抽出された、または一次試料を、ｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、ある特定の構成成分の単離または精製などの技術に供することによって得られた、例えば核酸またはタンパク質を含んでよい。
【００７０】
小分子：本明細書で用いるとき、「小分子」という用語は、低分子量の有機化合物または無機化合物を意味する。一般に、「小分子」は、サイズが約５キロダルトン（ｋＤ）未満の分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、約４ｋＤ、３ｋＤ、約２ｋＤ、または約１ｋＤ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約８００ダルトン（Ｄ）、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄ、または約１００Ｄ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満、または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリマーではない。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリマー部分を含まない。いくつかの実施形態では、小分子は、タンパク質またはポリペプチドではない（例えば、オリゴペプチドまたはペプチドではない）。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリヌクレオチドではない（例えば、オリゴヌクレオチドではない）。いくつかの実施形態では、小分子は、多糖類ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、多糖類を含まない（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質等ではない）。いくつかの実施形態では、小分子は、脂質ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、調節剤である。いくつかの実施形態では、小分子は、生物学的に活性である。いくつかの実施形態では、小分子は、検出可能である（例えば、少なくとも１つの検出可能な部分を含む）。いくつかの実施形態では、小分子は、治療的である。
【００７１】
特異的：「特異的」という用語は、活性を有する薬剤または実体を参照して本明細書で用いるとき、当業者には、その薬剤または実体が、潜在的に可能な標的または状態の間の違いを識別することを意味すると理解される。例えば、薬剤は、競合する代替標的の存在下でその標的に優先的に結合する場合、その標的に「特異的に」結合するとされる。いくつかの実施形態では、薬剤または実体は、その標的に結合する条件下では、競合する代替標的に検出可能に結合しない。いくつかの実施形態では、薬剤または実体は、競合する代替標的（複数可）と比較して、その標的に対してより高いオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、より低いオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、増加した親和性、低減した解離性、または増加した安定性を伴って結合する。
【００７２】
ストレス誘発性障害：「ストレス誘発性障害」という用語は、生体がその恒常性を乱す環境に置かれたときに生じるものを含む。疾病、疾患、生命を脅かす事象、飢餓、疲労、低酸素等の事象は、全て生体に対するストレス因子であると理解される。いくつかの実施形態では、ストレス誘発性障害は、低酸素により引き起こされる。
【００７３】
幹細胞：「幹細胞」という用語は、自己複製し、分化して後代細胞を産生するという両方の、単一細胞のレベルでのそれらの能力により定義される未分化細胞を含むがこれに限定されない。後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が挙げられる。例えば、「幹細胞」は、（１）全能性幹細胞；（２）多能性幹細胞；（３）複能性幹細胞；（４）小能性幹細胞；及び（５）単能性幹細胞を含んでよい。
【００７４】
対象：「対象」は、哺乳類（例えば、いくつかの実施形態では、出生前のヒト形態を含むヒト）を意味する。いくつかの実施形態では、対象は、関連性のある疾患、障害または病態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または病態に感受性である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または病態の１つまたは複数の症状または特徴を呈している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または病態のいずれの症状または特徴も呈さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害もしくは病態に対する感受性、または疾患、障害もしくは病態のリスクに特徴的な１つまたは複数の特徴を有するものである。対象は、患者であることができ、それは、疾患の診断または処置を提供する医師の診察を受けるヒトを指す。いくつかの実施形態では、対象は、治療を施される個体である。
【００７５】
実質的に：本明細書で用いるとき、「実質的に」という用語は、対象となる特徴または特性の全てまたはほぼ全ての程度または度合いを呈する質的な状態を指す。生物学的分野の当業者は、生物学的現象及び化学的現象が、完全であるかもしくは完全に至るまで進行する、または絶対的な結果を達成するまたは回避することは、仮にあるとしてもめったにないことを理解するだろう。ゆえに、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的現象及び化学的現象に固有の、完全性の潜在的な欠如を捉えるために使用される。
【００７６】
感受性である：疾患、障害または病態（例えば、インフルエンザ）に「感受性である」個体は、その疾患、障害または病態を発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、疾患、障害または病態に感受性である個体は、その疾患、障害または病態のいずれの症状も呈さない。いくつかの実施形態では、疾患、障害または病態に感受性である個体は、その疾患、障害または病態を有していると診断されていない。いくつかの実施形態では、疾患、障害または病態に感受性である個体は、その疾患、障害または病態の発症に関連する条件に曝露されている個体である。いくつかの実施形態では、疾患、障害または病態を発症するリスクは、集団に基づくリスクである（例えば、疾患、障害または病態に罹患している個体の家族）。
【００７７】
症状が低下する：本発明に従い、特定の疾患、障害または病態の１つまたは複数の症状が大きさ（例えば強度、重症度等）または頻度において低下するとき、「症状が低下する」。明確にする目的で、特定の症状の発症の遅延は、その症状の頻度が低下する１つの形態とみなされる。比較的小さい腫瘍を有する多くの癌患者は、症状がない。本発明は、症状が排除される場合だけに限定されることを意図しない。本発明は、具体的には、１つまたは複数の症状が、完全には排除されなくても低下する（及び対象の病態が、それによって「改善される」）ように処置を企図する。
【００７８】
治療剤：本明細書で用いるとき、「治療剤」という表現は、一般に、生体に投与されると所望の薬理学的効果を引き出す任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、薬剤は、適切な集団全体に統計学的に有意な効果があることを実証する場合に、治療剤であるとみなされる。いくつかの実施形態では、適切な集団は、モデル生体の集団であってよい。いくつかの実施形態では、適切な集団は、例えば、ある特定の年齢群、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態等の様々な判定基準によって定義され得る。いくつかの実施形態では、治療剤は、疾患、障害または病態の１つまたは複数の症状または特徴を、軽減する、寛解させる、和らげる、阻害する、防止する、その発症を遅延させる、その重症度を低下させる、またはその発生率を低下させるために使用できる物質である。いくつかの実施形態では、「治療剤」は、ヒトに投与するために販売され得る前に、政府機関によって承認されているかまたは承認される必要がある薬剤である。いくつかの実施形態では、「治療剤」は、ヒトに投与するために医学的処方箋が必要とされる薬剤である。
【００７９】
治療有効量：本明細書で用いるとき、それが投与されるものにとって所望の効果を産生する量を意味する。いくつかの実施形態では、本用語は、治療投与レジメンに従って、疾患、障害、または病態に罹患しているまたは感受性である集団に投与されたときに、該疾患、障害、または病態を処置するのに十分な量を指す。いくつかの実施形態では、治療有効量は、疾患、障害、または病態の１つまたは複数の症状の、発生率または重症度を低下させる、またはその発症を遅らせるものである。当業者は、「治療有効量」という用語が、特定の個体において処置の成功が実際に達成されることを要しないことを理解するだろう。むしろ、治療有効量は、そのような処置を必要とする患者に投与されたとき、有意な数の対象において特定の所望の薬理学的な応答を提供する量であってよい。いくつかの実施形態では、治療有効量への言及は、１つまたは複数の特定の組織（例えば、疾患、障害または病態に冒された組織）または液体（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿、等）において測定される量への言及であってよい。当業者は、いくつかの実施形態では、治療有効量の特定の薬剤または治療が、製剤化されてよいかまたは単回用量で投与されてよいことを理解するだろう。いくつかの実施形態では、治療的に有効な薬剤は、例えば、投与レジメンの一部として、製剤化されてよいかまたは複数の用量で投与されてよい。
【００８０】
処置：本明細書で用いるとき、「処置」（「処置する」または「処置すること」）という用語は、特定の疾患、障害または病態（例えば、癌）の１つまたは複数の症状、特性または原因を、部分的または完全に軽減する、寛解させる、和らげる、阻害する、その発症を遅延させる、その重症度を低下させる、またはその発生率を低下させる物質（例えば、抗受容体チロシンキナーゼ抗体または受容体型チロシンキナーゼアンタゴニスト）の任意の投与を指す。このような処置は、関連性のある疾患、障害もしくは病態の徴候を呈さない対象、または疾患、障害もしくは病態の初期徴候だけを呈する対象のものであってよい。あるいはまたは加えて、このような処置は、関連性のある疾患、障害または病態の、１つまたは複数の確立された徴候を呈する対象のものであってよい。いくつかの実施形態では、処置は、関連性のある疾患、障害または病態に罹患していると診断された対象のものであってよい。いくつかの実施形態では、処置は、関連性のある疾患、障害または病態が発症するリスクの増加に統計的に相関している、１つまたは複数の感受性要因を有することが公知の対象のものであってよい。
【００８１】
単位用量：「単位用量」という表現は、本明細書で用いるとき、医薬組成物の単回用量としてまたは物理的に別個の単位で投与される量を指す。多くの実施形態では、単位用量は、所定量の活性剤を含有する。いくつかの実施形態では、単位用量は、薬剤の単回用量全体を含有する。いくつかの実施形態では、１つより多いの単位用量が、全ての単回用量を達成するために投与される。いくつかの実施形態では、意図した効果を達成するために、複数の単位用量の投与が必要とされるか、または必要であると予測される。単位用量は、例えば、所定量の１つまたは複数の治療剤を含有する液体（例えば、許容され得る担体）の体積、固体形態の所定量の１つまたは複数の治療剤、所定量の１つまたは複数の治療剤を含有する徐放製剤または薬物送達デバイス等であってよい。単位用量は、治療剤（複数可）の代わりにまたはそれに加えて、様々な構成成分のいずれかを含む製剤内に存在してよいことが理解されるだろう。例えば、許容され得る担体（例えば、薬学的に許容され得る担体）、希釈剤、安定剤、緩衝液、保存剤等が、下記のように、含まれてよい。多くの実施形態では、特定の治療剤の適切な１日の総投与量は、一部または複数の単位用量を含んでよく、例えば担当医によって健全な医学的判断の範囲内で決定されてよいことを、当業者は理解するだろう。いくつかの実施形態では、任意の特定の対象または生体のための特定の有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；採用される特定の活性化合物の活性；採用される特定の組成物；対象の年齢、体重、全身健康状態、性別及び食事；採用される特定の活性化合物の投与時間及び排出速度；処置期間；採用される特定の化合物（複数可）と組み合わせてまたは同時に使用される薬物または追加の治療、及び医療分野で周知の類似の因子を含む、様々な因子に依存してよい。
【００８２】
ある特定の実施形態の詳細説明
本発明は、なかでも、低酸素と関連する病態を診断または処置するための組成物またはシステムを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞多能性または分化を調節するための組成物またはシステムも記載する。
【００８３】
本発明の様々な態様は、以下の項において詳細に記載される。項の使用は、本発明の限定を意図しない。各項は、本発明の任意の態様に適用されることができる。この出願では、「または」の使用は、別段の指定がない限り、「または」を意味する。
【００８４】
低酸素及びストレス誘発性代謝
ストレス、例えば、低酸素、感染、飢餓、温度、毒性等は、細胞の代謝に著しく影響を与え、主要な疾患に寄与する。下記の実施例に示すように、本発明の実施形態は、ストレス誘発性代謝の試験を包含する。いくつかの実施形態では、ストレスは、低酸素により引き起こされる。
【００８５】
低酸素は、様々な疾患プロセスに関与し、未処置のままにされた場合、著しい組織損傷の原因となる。酸素の、定常的な不断の供給が生命を維持させるために不可欠である。低酸素は、血液または組織中の酸素含有率が低い状態であり、酸素供給と需要の不均衡から生じる。低酸素のいくつかの異なるサブタイプが知られている。例えば、貧血性低酸素は、機能的ヘモグロビンの濃度の低減または赤血球細胞の数の減少による。低酸素性低酸素は、肺内での酸素化の欠損メカニズムから生じ、これは低圧の酸素、肺機能の異常、気道閉塞、または心臓における右から左短絡により引き起こされ得る。酸素親和性低酸素は、酸素を還元するヘモグロビンの能力の低下による。組織または細胞の低酸素は、冠動脈血流の中断または動脈血酸素分圧（ＰＯ２）における低下により引き起こされる。
【００８６】
生命を維持するための酸素の必要性を考慮すると、生体は、多様なメカニズムを進化させて、酸素利用可能度の急性及び慢性の両方の低減；つまり、急性及び慢性低酸素に対応してきた。多細胞生体、特に哺乳類にとって、これらのメカニズムは、赤血球生成、血管新生及び細胞の活性を最小許容可能レベルで維持するように設計された適応性の代謝変化を含む。急性低酸素は、脳卒中、敗血症性ショック、心筋梗塞、及び外科的処置中などの状況において生じる。一方で、慢性低酸素は、貧血症、うっ血性心不全、肺疾患、先天性心疾患、ならびに癌と関連する。
【００８７】
しかしながら、低酸素に関連する疾患の上記リストが低酸素に関与するすべての病態の完全なリストではないことが理解されたい。当業者は、本開示の組成物またはシステムが、上記リストにないものを含む任意の低酸素に関連する疾患、障害または病態に適用されることができることを知っている。
【００８８】
低酸素条件下でのＬ−２ＨＧ代謝
栄養素及び代謝中間体が、細胞の成長及び増殖を促進することに加えて生理学的攪乱（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）に対する細胞の応答に影響を与えることができることが知られている（Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎら、２００９；Ｗａｒｄ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１２）。本開示は、なかでも、Ｌ−２ＨＧ誘発を、低酸素により強いられたストレスに対する新規の細胞の代謝的応答として同定する。
【００８９】
本開示は、２ＨＧの以前の知識を大幅に拡張し、Ｌ−２ＨＧを細胞の代謝のある特定の機能を制御する新規代謝産物として実証する。栄養素及び代謝産物は、基礎的な細胞のプロセスに影響を与える（Ｋａｅｌｉｎ及びＭｃＫｎｉｇｈｔ，２０１３；Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎら、２００９）。α−ＫＧ及び２ＨＧ間の関係は、一つのそのような例として提案されている。例えば、α−ＫＧは、ヒストン及びＤＮＡのジメチル化、ＨＩＦ１α安定性の制御、及びコラーゲンの成熟化などの多様な機能に関与するおおよそ７０種の異なる酵素に対する必須基質として機能する（Ｌｏｓｍａｎ及びＫａｅｌｉｎ，２０１３）。これらの酵素的プロセスをα−ＫＧ利用能につなげることにより、細胞の代謝的適応は、系統分化及び環境的ストレス要因への適応などの重要な細胞の「決断」に密接につながることができる。「癌代謝物」Ｄ−２ＨＧによるα−ＫＧに依存する酵素活性の阻害は、それによりＩＤＨ１／２における発癌性変異が正常な細胞の生理機能を崩壊させる主なメカニズムを表すと思われる（Ｋａｅｌｉｎ及びＭｃＫｎｉｇｈｔ，２０１３；Ｌｏｓｍａｎ及びＫａｅｌｉｎ，２０１３；Ｗａｒｄ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１２）。
【００９０】
２−ヒドロキシグルタル酸（２ＨＧ）は、Ｄ−またはＬ−立体異性体のいずれでも存在することができるキラル分子である。Ｌ−２ＨＧと比べて、Ｄ−２ＨＧは、集中的な研究の対象となっている。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１または２（ＩＤＨ１／２）における変異は、「癌代謝物」Ｄ−２−ヒドロキシグルタル酸（Ｄ−２ＨＧ、（Ｒ）−２−ヒドロキシグルタル酸としても知られる）の産生をもたらす。Ｄ−２ＨＧは、Ｊｕｍｏｎｊｉファミリーヒストンリジン脱メチル化酵素を含む、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）に依存する酵素の競合阻害剤として機能することにより悪性細胞の分化を妨害する。
【００９１】
ＩＤＨ１／２変異による悪性病変の分子病態におけるＤ−２ＨＧの役割の解明に焦点をあてた集中的な研究努力とは対照的に、正常な細胞生理学におけるＤ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧの制御された産生及び排除の潜在的な役割は、あまり注目されていない（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら、２０１２）。癌関連ＩＤＨ１／２変異は、Ｄ−２ＨＧを排他的に産生するが、生化学研究は、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸（Ｌ−２ＨＧ、（Ｒ）−２−ヒドロキシグルタル酸）が、α−ＫＧに依存する酵素のより強力な阻害剤として機能することを実証している。しかしながら、Ｌ−２ＨＧの生物学的源または活性は未知のままである。両方の２−ヒドロキシグルタル酸エナンチオマーの潜在的な生理学的役割は、Ｄ２ＨＧＤＨ（Ｄ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ）及びＬ２ＨＧＤＨ（Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ）として知られる進化的に保存されている「老廃物処理」酵素の存在により示され、それらの唯一の機能は、それぞれＤ−２ＨＧまたはＬ−２ＨＧをα−ケトグルタル酸に変換することである。
【００９２】
本開示は、なかでも、Ｌ−２ＨＧ誘発を、低酸素により強いられた環境的ストレスに対する新規の細胞の代謝応答として同定する。例えば、本発明者らは、低酸素におけるＬ−２ＨＧの産生は、ＩＤＨ１／２とは独立して起こり、代わりに主にＬＤＨＡによるα−ＫＧの無差別酵素的還元を介して生じることを発見した。
【００９３】
本開示は、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２の機能喪失は、複数のタイプの細胞において低酸素条件ではＬ−２ＨＧの産生を損なわないことを実証する。ゆえに、ＩＤＨ１／２酵素は、基質結合の際の立体的拘束のために、α−ＫＧをＬ−２−ヒドロキシグルタル酸に還元させることができない可能性が高い。本発明者らは、その主な触媒活性が、α−ＫＧ及びＬ−２ＨＧに対する構造的類似性を伴ったα−ケト酸基質のＬ−ヒドロキシル酸への還元を必然的に含む代謝酵素の要件を試験した。
【００９４】
しかしながら、本開示は、際立って、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）が、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの産生に必要とされる主要な酵素であることを実証する。本開示は、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧへのＭＤＨ１及びＭＤＨ２からの部分的な寄与を同定する。これらの所見は、ＬＤＨＡ及びＭＤＨ２の組み合わせ除去が、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧのほぼ全ての抑止も結果もたらしたときに確認された。本開示は、例えば、遺伝子操作（例えば、機能喪失）及び構造生物学を含む、複数連の証拠からＬ−２ＨＧ代謝におけるＬＤＨＡの役割を実証する。例えば、本発明者らは、ＬＤＨＡの活性部位が、Ｌ−２ＨＧへのα−ＫＧの還元に対応することができることを発見した。まとめると、本開示からのこれらの知見は、低酸素性細胞が、細胞基質のＭＤＨ１及びミトコンドリアのＭＤＨ２からの少しの寄与を伴って、ＬＤＨＡによる乱雑な基質使用を介して細胞質でグルタミン由来のα−ＫＧの還元からＬ−２ＨＧを産生することができることを示唆する。
【００９５】
低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、利用できる酸素が制限されたときに、それにより細胞がα−ＫＧに依存するプロセス（例えば、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の脱メチル化）を抑圧し得る分子メカニズムを表す。本発明者らは、Ｌ−２ＨＧが、低酸素適応のα−ＫＧ依存性逆転を抑制できることを発見した。ゆえに、本開示は、なかでも、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧが、それを通して細胞が低酸素適応に反作用し得るα−ＫＧに依存するプロセスの抑圧を維持することができる手段を表すことを実証する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧの低酸素誘発性蓄積がグルタミン依存性であることを実証し、これは、低酸素におけるグルタミン依存性Ｌ−２ＨＧ産生と持続的なＨＩＦ１α誘発との間の連結を示す。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本開示は、環境的ストレス、具体的には低酸素が、Ｌ−２ＨＧを制御する細胞のメカニズムを引き起こすことを記載する。それゆえ、本開示は、それにより低酸素がＬ−２ＨＧ代謝に影響を与える分子メカニズムを解明した。
【００９７】
低酸素及び低酸素誘発性傷害の診断
本発明は、なかでも、低酸素または低酸素誘発性傷害について診断する新規システムを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素に関連する疾患、障害または病態を診断するためのシステムを記載する。通常条件下の哺乳類細胞及び体液中でめったに痕跡量で見いだされない代謝産物である、Ｌ−２ＨＧが、不十分な酸素供給の条件下で再現性よく有意に上昇し、低酸素または低酸素誘発性傷害のバイオマーカーとして十分に機能することが、本発明に従って決定されている。
【００９８】
Ｌ−２ＨＧが、ＬＤＨＡの作用を通してクエン酸回路中間体α−ケトグルタル酸の非カルボキシル化還元から生じることが、本発明に従って決定された。本開示は、ＭＤＨ１またはＭＤＨ２もこのプロセスに寄与することを実証する。通常条件下では、Ｌ−２ＨＧを産生するこの反応の程度は最小であり、産生されるＬ−２ＨＧは、Ｌ−２ＨＧを酸化させてα−ケトグルタル酸へと戻すように機能する、Ｌ−２ＨＧデヒドロゲナーゼの酵素活性のために実質的に蓄積しない。しかしながら、本明細書に開示するように、低酸素条件後は、α−ケトグルタル酸の正常な酸化的代謝がヒト細胞中で抑制され、α−ケトグルタル酸は、Ｌ−２ＨＧの蓄積をもたらす還元的代謝を優先的に受ける。
【００９９】
Ｌ−２ＨＧ上昇は、低酸素と共に生じ、細胞レベルでの代謝における変化を反映する。血清総２ＨＧ（両Ｌ−及びＤ−２ＨＧ）が上昇する低酸素とは独立した既知の状況は、生殖細胞系列遺伝子変異を必然的に含む稀な代謝の先天異常、またはＩＤＨ１／２遺伝子内の特定の体細胞変異を伴う骨髄性血液悪性腫瘍に限られる。これらの患者は、心肺疾患または組織低酸素を呈する数に対して稀であり、それらの症状は特有であり重複しない。それゆえ、慢性低酸素のＬ−２ＨＧを試験することに伴う偽陽性のリクスは低い傾向にある。
【０１００】
実施例の項において論ずるように、Ｌ−２ＨＧは、低酸素のバイオマーカーであり、低酸素の診断に使用することができると発見されている。Ｌ−２ＨＧレベルは、当業者に公知の任意の方法で検出されてよい。様々な検出方法の非限定的な例を下記に論ずる。本発明は、ガスクロマトグラフィー質量分析（「ＧＣ−ＭＳ」）、液体クロマトグラフィー質量分析（「ＬＣ−ＭＳ」）、酵素アッセイ及び免疫系の方法などの方法が、Ｌ−２ＨＧレベルの測定に使用されてよいという具体的な見識を提供する。本発明は、キラル誘導体化が、Ｄ−２ＨＧとＬ−２ＨＧを区別するために使用されることができるということを提供する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素及び低酸素誘発性傷害を診断するための方法を記載する。ある特定の実施形態では、血液または組織中のＬ−２ＨＧのレベルを測定することは、組織低酸素に感受性の及び特異的なバイオマーカーとして機能し得、低酸素に関連する疾患、障害または病態の診断またはモニタリングについて潜在的な臨床的な関連を伴う。
【０１０２】
本発明は、なかでも、低酸素が、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、またはＬ−２ＨＧデヒドロゲナーゼを含むがこれに限定されない、ある特定のＬ−２ＨＧ関連酵素の発現または活性により診断されることができることを提供する。これらの酵素が測定される実施形態では、追加のマーカーが当業者に公知の任意の方法によって測定されてよい；例えば、イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット法）、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット法）、ＲＴ−ＰＣＲ、及び質量分析）。例えば、特定の実施形態では、Ｌ−２ＨＧレベルは、ＧＣ−ＭＳによりアッセイされ、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、またはＬ−２ＨＧデヒドロゲナーゼの、核酸またはイムノアッセイをベースとする測定と組み合わせて評価または相関されてよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象からのＬ−２ＨＧのレベルは、正常酸素状態対照対象からのものと比較することができることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象からのＬ−２ＨＧのレベルは、急性低酸素または慢性低酸素と診断された患者からのものと比較することができることを記載する。
【０１０４】
本開示は、患者における低酸素誘発性傷害を診断するためのシステムを代替的にまたは追加的に記載する。症候性または亜症候性でない低酸素誘発性傷害は、臨床的に診断することがしばしば難しい。しかしながら、試料からＬ−２ＨＧレベルを測定することは、対象における低酸素誘発性傷害についての指標を与え得る。
【０１０５】
本開示は、低酸素または低酸素誘発性傷害を診断することまたは処置することを伴う、それに対してＬ−２ＨＧレベルを比較することができるパラメータを記載する。一例をあげると、いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧレベルが正常酸素状態の基準対象のものと比較して上昇している対象への低酸素治療を施すことによる低酸素の処置を記載する。いくつかの実施形態では、Ｌ−２ＨＧのレベルの上昇は、正常酸素状態の対象について観察されるものと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍であるか、またはさらに高い
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧが、低酸素または低酸素誘発性傷害を診断するために単独で使用され得ることを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、診断においてバイオマーカーセットの一部としてＬ−２ＨＧを使用する方法を記載する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、対象からの試料中の少なくとも２つのバイオマーカーを測定する方法を記載し、ここで少なくとも２つのバイオマーカーのうちの１つはＬ−２ＨＧである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するような低酸素マーカーは、患者試料中で測定される。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、心臓、動脈、脳、腫瘍、またはそれらの組み合わせからの組織試料であってよいかまたはこれを含んでよい。いくつかの実施形態では、試料は、血液、尿、血清、リンパまたは脳脊髄液であってよいかまたはこれを含んでよい。いくつかの実施形態では、試料は、静脈血試料であってよいかまたはこれを含んでよい。
【０１０８】
当業者は、低酸素性状態が、低酸素性傷害を有する組織、例えば、腫瘍、及び隣接するまたは近接する組織の両方において見出され得ることを理解するだろう。例えば、慢性低酸素は、血液毛細血管及び低酸素性領域間の腫瘍細胞による酸素の消費及び枯渇により引き起こされ得る。ゆえに、組織または対象が低酸素であるかどうかを決定するためのＬ−２ＨＧレベルの測定のための試料は、腫瘍そのものかまたは近接する組織から得てよい。
【０１０９】
くつかの実施形態では、本開示は、患者集団を（例えば、低酸素治療での処置に対するそれらの候補性に関して）層別化するため、または１つまたは複数の対象に施したときの特定の治療の有効性をモニターするまたは調節するための技術を提供する
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療的介入の臨床的評価のためのバイオマーカーとしてのＬ−２ＨＧの使用を記載する。例えば、血液からのＬ−２ＨＧのクリアランスは、低酸素に関連する疾患、障害または病態に対する治療的介入の妥当性を評価するためのバイオマーカーとして使用することができる。適切な処置の特定もしくは選択、患者が処置に陽性反応を有するかどうかの決定、または処置の最適化は、これらの方法で得られた情報を使用して導くことができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、対照において、治療の有効性を評価する、治療に対する応答性をモニタリングする、疾患経過の予後、疾患進行の測定のための方法を提供する。例えば、１つまたは複数の時点の対象から得た生体試料について決定された好適なバイオマーカー（例えば、Ｌ−２ＨＧ、またはＬＤＨＡの発現／活性）のレベルは、１つまたは複数の他の時点の対象からのレベルと比較される。
【０１１２】
Ｌ−２ＨＧの調節
本明細書で提供する方法及び組成物が、様々な低酸素に関連する疾患、障害または病態のいずれかを処置するために使用されてよいことが企図される。Ｌ−２ＨＧが、コラーゲン成熟化に関与する酵素の強力な阻害剤であると示されている（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２）ため、Ｌ−２ＨＧの低酸素性誘発は、虚血性組織傷害後の組織修復及び新血管形成に関与し得る。例えば、本開示は、Ｌ−２ＨＧ産生の治療的操作、例えば、ＬＤＨＡ活性（低酸素性Ｌ−２ＨＧの主な源）の調節、Ｌ−２ＨＧの外因性補充等が、心筋梗塞または虚血性脳卒中などの病態において利益となり得ることを記載する。
【０１１３】
治療的使用は、単独で、またはかかる低酸素に関連する疾患、障害もしくは病態の処置に使用されると知られている他の処置と組み合わせて、Ｌ−２ＨＧ代謝を調節する薬剤の投与を含む。例えば、いくつかの実施形態では、癌を有する患者については、治療的使用は、単独で、または化学療法等の癌療法と組み合わせて、Ｌ−２ＨＧ代謝を調節する薬剤の投与を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素または低酸素誘発性傷害を処置するための新規組成物またはシステムを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、低酸素に関連する疾患、障害または病態を処置するための組成物またはシステムを記載する。当業者は、本開示により記載される組成物またはシステムが、任意の低酸素に関連する疾患、障害または病態を処置するために使用されることができることを知るであろう。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本開示は、組織中のまたは系統的にＬ−２ＨＧレベルを調節する治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＬ−２ＨＧのレベルを増加させる治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＬ−２ＨＧのレベルを低減させる治療を記載する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝を調節する薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、組織への送達を達成する経路を介した対象への組成物の投与を含む治療を記載する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧであるかまたはそれを含む薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧのアンタゴニストであるかまたはそれを含む薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、限定されないが、α−ケトグルタル酸、α−ケトグルタル酸の細胞透過性変異体（例えば、α−ケトグルタル酸ジメチル）、グルタミン、またはグルタミン酸塩を含む組成物を投与することを含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、α−ケトグルタル酸のアンタゴニストであるかまたはそれを含む薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝を調節するための標的剤を記載する。原則として、そのレベル、形態、または活性がＬ−２ＨＧ代謝の特性と相関するまたはそれを調節する（例えば、阻害するまたは増強する）任意の薬剤は、少なくとも本明細書に記載のある特定の実施形態については、Ｌ−２ＨＧ標的剤であることができる。いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、及びＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される１つまたは複数の分子の発現または活性に影響を与える薬剤を含む組成物の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、それへのＬＤＨＡの阻害剤の投与を含む治療を記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターの投与を含む治療を記載する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ−２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、小分子であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ−２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、ポリペプチドであるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ−２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、核酸であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ−２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、グリカンであるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ−２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、脂質であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ−２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、（例えば、Ｌ−２ＨＧ代謝機構の構成成分に結合する）抗体薬であるかまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようにＬ−２ＨＧ代謝を標的とする薬剤は、（例えば、Ｌ−２ＨＧ代謝機構の構成成分、またはそれをコードするまたは補助する遺伝子または遺伝子産物に結合する）核酸剤（例えば、アンチセンス、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ剤）であるかまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、標的剤は、検出可能部分であるか、それと関連する。いくつかの実施形態では、標的剤は、治療部分と結合している。
【０１２１】
一般に、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝を標的とすることによりある特定の低酸素誘発性傷害を処置することの望ましさ及び有効性を実証する。当業者は、そのような標的を実現するために任意の様々なアプローチが活用されてよいことを理解するだろう。
【０１２２】
本発明のシステムの様々な実施形態に従って、Ｌ−２ＨＧまたはＬ−２ＨＧ代謝を調節する酵素を標的とする薬剤は、単独で、または組成物もしくは医薬品の構成成分として、本明細書に記載のように対象に投与されることができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する薬剤は、生理学的に許容され得る担体または賦形剤と製剤化されて医薬組成物を調製することができる。いくつかの実施形態では、そのような医薬組成物中で活用される担体、または組成物そのものは、無菌であることができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、投与の特定の様式用に製剤化される。組成物を製剤化するためのシステムは、当該分野で公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編集）（１９８９）を参照されたい）。
【０１２４】
組成物または医薬品は、必要に応じて、タンパク質（特に、アルブミン）、ナノ粒子、微小粒子、リポソーム、及びミセルのうちの１つまたは複数を、例えば担体として、特に脂肪酸または脂質の送達用に、含有することができる。
【０１２５】
本明細書に記載の組成物は、任意の適切な経路で投与されてよい。いくつかの実施形態では、組成物は皮下投与される。本明細書で用いるとき、「皮下組織」という用語は、皮膚の直下にある疎性、不規則性結合組織の層として定義される。例えば、皮下投与は、大腿部、腹部、臀部、肩甲部を含むがこれらに限定されない、領域内に組成物を注射することにより実施されてよい。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は経口投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、心臓または筋肉（例えば、筋肉内）、腫瘍（腫瘍内）、神経系（例えば、脳への直接注射；脳室内；髄腔内）などの標的組織への直接投与により投与される。あるいはまたは加えて、組成物は、吸入、非経口、皮内、経皮、または経粘膜（例えば、経口または経鼻）により投与されることができる。必要に応じて、１つより多い経路を同時に使用することができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量または特定の所望の転帰と相関する投与レジメンに従って投与される。
【０１２７】
本開示に従って投与される特定の用量または量は、例えば、所望の転帰の特性もしくは程度、投与の特定の経路もしくは時期、または１つまたは複数の特徴（例えば、体重、年齢、病歴、遺伝的特徴、ライフスタイルパラメータ、またはそれらの組み合わせ）に依存して変動してよい。そのような用量または量は、当業者により決定することができる。いくつかの実施形態では、適切な用量または量は、標準的な臨床技術に従って決定される。あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、適切な用量または量は、望ましいまたは最適な投与量範囲または投与するべき量の特定を助けるために、１つまたは複数のインビトロまたはインビボアッセイの使用を通して決定される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する組成物は、医薬製剤として提供される。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、発生率または特定の終末点、例えば、腫瘍、心筋梗塞等の発生率またはリスクの低下の達成と相関する投与レジメンに従って投与するための単位用量の量であるかまたはこれを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、Ｌ−２ＨＧ代謝機構のある特定の構成成分は、例えば、そのような構成成分と直接相互作用する薬剤、またはそうでなければそのレベルまたは活性を調節する、薬剤の使用を通して、標的とされる（例えば、ＬＤＨＡ）。様々な実施形態では、本明細書に記載のようにＬ−２ＨＧ代謝を標的とする治療法は、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間の期間にわたって、または治療的エンドポイントが観察されるまで、例えば、腫瘍縮小が観察されるで、または心機能が改善するまで、施される。
【０１３０】
Ｌ−２ＨＧ調節剤の同定及び／または特徴づけ
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｌ−２ＨＧ薬剤またはプロトコルを同定するまたは特徴づけるための方法及びシステムを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法及びシステムは、１つまたは複数の候補Ｌ−２ＨＧ調節剤またはプロトコルを、細胞、組織または生体に投与すること、及びＬ−２ＨＧ応答についてアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、細胞または組織は、インビトロである。いくつかの実施形態では、細胞または組織は、インビボである。いくつかの実施形態では、候補Ｌ−２ＨＧ調節剤またはプロトコルは、細胞を含まない系に適用される。いくつかの実施形態では、候補Ｌ−２ＨＧ調節剤またはプロトコルは、ハイスループットスクリーニング系の成分として適用される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法及びシステムは、Ｌ−２ＨＧ増強剤を選択する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法及びシステムは、Ｌ−２ＨＧ阻害剤を選択する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法及びシステムは、１つまたは複数の候補Ｌ−２ＨＧ調節剤またはプロトコルを、細胞、組織または生体に投与すること、及びＬ−２ＨＧ代謝の下流効果についてアッセイすることを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ−２ＨＧ代謝の下流効果は、ヒストン３リジン９のトリメチル化である。いくつかの実施形態では、Ｌ−２ＨＧ代謝の下流効果は、ヒストン３リジン２７のトリメチル化である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、候補Ｌ−２ＨＧを増強する薬剤またはプロトコルは、細胞、組織または生体への投与が、測定されたパラメータ、例えば、Ｌ−２ＨＧにおいて、薬剤（複数可）またはプロトコル（複数可）に曝露されなかった同様の細胞、組織または生体と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の増加をもたらす場合に、Ｌ−２ＨＧを増強する薬剤またはプロトコルであるとみなされる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、候補Ｌ−２ＨＧを阻害する薬剤またはプロトコルは、細胞、組織または生体への投与が、測定されたパラメータ、例えば、Ｌ−２ＨＧにおいて、薬剤（複数可）またはプロトコル（複数可）に曝露されなかった同様の細胞、組織または生体と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の低下をもたらす場合に、Ｌ−２ＨＧを阻害する薬剤またはプロトコルであるとみなされる。
【０１３５】
Ｌ−２ＨＧ代謝に従って癌表現型を診断する
本明細書で提供する方法及び組成物が、組織における低酸素を検出またはイメージングするために使用されてよいことが企図される。いくつかの実施形態では、組織は、腫瘍である。いくつかの実施形態では、低酸素は、Ｌ−２ＨＧ、Ｌ−２ＨＧ代謝を制御するある特定の酵素、またはＬ−２ＨＧにより影響されたある特定の下流のエピジェネティックな変化、またはそれらの組み合わせにより検出またはイメージングされる。いくつかの実施形態では、低酸素は、Ｌ−２ＨＧにより検出またはイメージングされる。いくつかの実施形態では、低酸素は、ＬＤＨＡにより検出またはイメージングされる。いくつかの実施形態では、低酸素は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３により検出またはイメージングされる。いくつかの実施形態では、低酸素は、少なくとも１つの追加の方法により検出またはイメージングされる。いくつかの実施形態では、この追加の方法は、遺伝子の変異である。
【０１３６】
本開示は、Ｌ−２ＨＧが、癌の細胞生物学において重要な役割を担うエピジェネティックなシグナル伝達を直接調節することを実証する。生化学的に、Ｄ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧの双方は、Ｊｕｍｏｎｊｉファミリーヒストンリジン脱メチル化酵素ＫＤＭ４Ｃを阻害し、それは、トリメチル化ヒストン３リジン９（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）の異常蓄積及び正常な細胞の分化の機能障害をもたらすと報告されている（Ｃｈｅｎら、２０１３；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｋａｔｓら、２０１４；Ｌｕら、２０１２；Ｒｏｈｌｅら、２０１３；Ｓａｓａｋｉら、２０１２）。例えば、膠芽腫では、ＩＤＨ１／２変異は、腫瘍全体にわたるＨ３Ｋ９ｍｅ３の拡散的増加を伴うが、一方でＨ３Ｋ９ｍｅ３は、ＩＤＨ１／２変異を伴わない腫瘍において領域による変動を示す（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ａ）。これらのデータは、ＩＤＨ１／２野生型膠芽腫におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３染色の変動性は、低酸素の領域と相関する可能性があることを示す。
【０１３７】
本開示では、本発明者らは、ＨＩＦ１α発現とＨ３Ｋ９ｍｅ３との間の相関関係を、ＩＤＨ１／２について野生型であるヒト膠芽腫試料を用いた免疫組織化学により試験し、ＨＩＦ１α発現及びＨ３Ｋ９ｍｅ３が、高く統計学的に相関することを見出した。これらの観察結果は、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧが、ヒト膠芽腫の血管性に易感染性の領域において観察されたＨ３Ｋ９ｍｅ３の増強を媒介し得ることを示す。本発明者らは、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧが抑止されたとき、低酸素誘発性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３において実質的な低下があったことを発見した。逆に、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの結果としての増加を伴う、Ｌ２ＨＧＤＨの除去は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の増加をもたらした。本発明者らは、たとえ比較的強くなくても、同様のパターンをＨ３Ｋ２７ｍｅ３で観察した。それゆえ、本開示は、Ｌ−２ＨＧが、エピジェネティックな修飾の形成（例えば、Ｈ３Ｋ９、及びＨ３Ｋ２７のトリメチル化）を促進することを確立した。
【０１３８】
本開示は、膠芽腫を有する患者からの生検を使用することによって、本発明者らは、Ｌ−２ＧＨの低酸素性誘発が、この腫瘍型におけるエピジェネティックな異質性の発達に寄与することを発見したことを記載する。低酸素の影響下にある腫瘍細胞は、かかる条件を伴わない腫瘍細胞と比較して異なる表現型を発達させるだろう。ゆえに、Ｌ−２ＨＧのレベル、Ｌ−２ＨＧを制御する他の因子のレベルまたは活性は、癌表現型を区別するための指標として使用することができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧ代謝が、ＩＤＨ１／２変異を伴わない腫瘍の高く相関する領域である、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３染色に影響を与えることを実証する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ、α−ケトグルタル酸、またはＨ３Ｋ９ｍｅ３の発現または活性を使用して腫瘍表現型を区別するまたは腫瘍異質性を同定するためのシステムを記載する。いくつかの実施形態では、腫瘍は膠芽腫を有する患者からのものである。
【０１４０】
癌は、様々な既知の技術のいずれかを使用して本明細書に記載のような変異を検出するためにスクリーニングされてよい。いくつかの実施形態では、その特定の変異または発現は、核酸レベルで（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて）検出される。いくつかの実施形態では、かかる変異、またはその発現は、タンパク質レベル（例えば、癌細胞からのポリペプチドを含む試料において、その試料はポリペプチド複合体、または細胞、組織もしくは臓器を含むがそれに限定されない他の高次構造であってよいかまたはこれを含んでよい）で検出される。
【０１４１】
いくつかの特定の実施形態では、検出は、核酸配列決定を必然的に含む。いくつかの実施形態では、検出は、全エクソーム配列決定を必然的に含む。いくつかの実施形態では、検出は、イムノアッセイを必然的に含む。いくつかの実施形態では、検出は、アマイクロアレイ（ａｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）の使用を必然的に含む。いくつかの実施形態では、検出は、超並列（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ）エクソーム配列決定配列決定を必然的に含む。いくつかの実施形態では、変異は、ゲノム配列決定により検出され得る。いくつかの実施形態では、検出は、ＲＮＡ配列決定を必然的に含む。いくつかの実施形態では、検出は、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定を必然的に含む。いくつかの実施形態では、検出は、質量分析を必然的に含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、検出は、次世代配列決定（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を必然的に含む。いくつかの実施形態では、検出は、ゲノム配列決定、ゲノム再配列決定、標的配列決定パネル、トランスクリプトームプロファイリング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）、ＤＮＡ−タンパク質相互作用（ＣｈＩＰ−配列決定）、及び／またはエピゲノム特徴づけを必然的に含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、検出は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン転写（Ｔｒａｎｆｅｒ）、イムノアッセイ、質量分析、マイクロアレイ分析等の技術を使用することを必然的に含む。
【０１４４】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般に、この発明が属する分野の当業者に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様またはそれに相当する方法及び材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。
【０１４５】
細胞多能性及び自己複製を調節するシステム及びプロトコル
本開示は、なかでも、Ｌ−２ＨＧの低酸素誘発性レベルは、増強された抑圧的なヒストンのメチル化をもたらすことを実証する。ＩＤＨ１／２変異によるＤ−２ＨＧの発癌性産生が分化に対する癌促進遮断をもたらす一方で、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、幹／前駆細胞分化の生理学的制御因子として機能し得る。低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、少なくとも一部には、様々な幹細胞集団の自己複製を維持するための低酸素性ニッチ及びＬＤＨＡ両方の重要性について説明し得る。具体的には、本開示は、低酸素性ニッチ内に存在する正常な幹細胞は、分化に必要とされる遺伝子のサイレンシングを維持するのに十分なＬ−２ＨＧを産生し得、ゆえに前駆／幹細胞運命を維持し得ることを記載する。
【０１４６】
Ｌ−２ＨＧを標的として、幹細胞及び前駆細胞の多能性及び自己複製を維持する。
Ｌ−２ＨＧの低酸素性誘発は、胚肝細胞、造血幹細胞、または臓器幹細胞を含む、正常な幹細胞の多能性及び自己複製を維持することに関与し得る。ゆえに、Ｌ−２ＨＧのＬＤＨＡ媒介性産生またはＬ−２ＨＧの外因性補充を高めるための戦略は、組織操作または他の幹細胞をベースとする治療にとって有益であり得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞、組織または生体の多能性または自己複製を維持するまたは促進するために使用することができるシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、これらのシステムまたはプロトコルは、幹細胞または前駆細胞の自己複製を維持するまたは促進するための使用することができる。いくつかの実施形態では、これらのシステムまたはプロトコルは、細胞中のＬ−２ＨＧのレベルを調節することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧのレベルを調節するためのシステムまたはプロトコルであって、細胞をＬ−２ＨＧと接触させることを含む、前記システムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性または発現を阻害するためのシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＬＤＨＡ活性または発現を促進するためのシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＭＤＨ１またはＭＤＨ２活性または発現を促進するためのシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧを細胞に送達するためのシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞中のα−ケトグルタル酸を枯渇させるためのシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、細胞または組織の多能性または自己複製を維持するまたは促進するために使用することができるシステムまたはプロトコルは、細胞培養または組織培養に適用される。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、幹細胞及び前駆細胞の多能性及び自己複製を促進する薬剤を含む組成物を投与することにより、幹細胞及び前駆細胞の多能性及び自己複製を対象においてインビボで維持するためのシステムまたはプロトコルを記載する。
【０１４９】
Ｌ−２ＨＧを標的として、幹細胞及び前駆細胞の分化を促進する。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌ−２ＨＧの蓄積が、細胞の多能性をもたらすことを記載する。一方で、他のメカニズムを通したＬ−２ＨＧの枯渇またはＬ−２ＨＧの阻害は、細胞分化を促進する。いくつかの実施形態では、本開示は、幹細胞の分化を促進するためのシステムまたはプロトコルを記載する。いくつかの実施形態では、これらのシステムまたはプロトコルは、幹細胞または前駆細胞を、有効量のＬＤＨＡの阻害剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、これらのシステムまたはプロトコルは、幹細胞または前駆細胞を有効量のＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼのアクチベーターと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、癌幹細胞である。
【０１５０】
本発明の、多能性及び／もしくは自己複製する特徴を維持するためのシステムもしくはプロトコル、または細胞分化を促進するためのシステムもしくはプロトコルは、任意の幹細胞または前駆細胞に好適である。例示的な例として、任意の多能性ヒトＥＳＣまたはそれぞれの細胞株は、それぞれの方法において使用してよい。そのような細胞の集団を誘導するための方法は、当該分野で十分に確立されている（参照。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、［１９９８］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１１４５−１１４７またはＣｏｗａｎ，ＣＡ．ら、［２００４］ＪＶ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，１３５３−１３５６）。本方法が、前駆細胞について使用されることを意図する場合、任意の前駆細胞が本発明のこの方法において使用されてよい。好適な前駆細胞の例には、神経前駆細胞、内皮前駆細胞、赤血球前駆細胞、心臓前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、網膜前駆細胞、または造血前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されない。前駆細胞を獲得する方法は、当該分野で周知である。２つの例示的な例として、巨核球前駆細胞を獲得する方法は、米国特許出願２００５／０１７６１４２に開示されており、マウス肝臓前駆細胞株を獲得する方法は、Ｌｉら、（（２００５）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−０１０８）により記載されている。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、選択されたＬ−２ＨＧを制御する遺伝子（例えば、ＬＤＨＡ、ＭＤＨ１／２、またはＬ−２ＨＧデヒドロゲナーゼ）、またはその機能的断片は、本発明の方法の実施に十分な量で内因的に発現される。他の実施形態では、Ｌ−２ＨＧを制御する遺伝子、またはその機能的断片は、所望の転写因子をコードする遺伝子を含む１つまたは複数の組換えベクターを用いて細胞に導入されてよい。
【０１５２】
他の実施形態では、本開示は、本明細書に前述のように、それぞれの細胞を、Ｌ−２ＨＧ代謝を調節する薬剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、Ｌ−２ＨＧである。いくつかの実施形態では、薬剤は、α−ＫＧである。
【０１５３】
本発明は、以下の実施例を参照することにより完全に理解されるだろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【０１５４】
本開示における全ての文献の引用は、参考文献により組み込まれる。
【実施例】
【０１５５】
以下の実施例は、例示のために提供され、いずれにしても本発明の範囲を制限しない。
【０１５６】
実施例１：低酸素性細胞内でのＬ−２−ヒドロキシグルタル酸（Ｈｙｄｒｏｘｇｌｕｔａｒａｔｅ）の蓄積
背景：
特定の代謝産物が細胞応答性に与えることができる潜在的な影響は、様々なヒト癌におけるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１及び２（ＩＤＨ１／２）の再発性体細胞変異の同定により例証された（Ａｍａｒｙら、２０１１；Ｂｏｒｇｅｒら、２０１２；Ｃａｉｒｎｓら、２０１２；Ｌｅｙら、２００８；Ｐａｒｓｏｎｓら、２００８；Ｐａｔｅｌら、２０１２；Ｙａｎら、２００９）。ＩＤＨ１／２は、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）へのイソクエン酸の酸化的脱炭酸を通常触媒する、ＮＡＤＰ＋依存性酵素である（Ｗａｒｄ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１２）。
【０１５７】
ＩＤＨ１／２における癌に関連する変異は、野生型酵素活性の喪失を、Ｄ−２−ヒドロキシグルタル酸（Ｄ−２ＨＧ）へのα−ＫＧの変換を可能にする活性の機能獲得を伴ってもたらす。（Ｄａｎｇら、２００９；Ｇｒｏｓｓら、２０１０；Ｗａｒｄら、２０１０）。Ｄ−２ＨＧは、Ｊｕｍｏｎｊｉヒストンリジン脱メチル化酵素を含む、多くのα−ＫＧ依存性酵素を阻害するその能力を介して「癌代謝物」として機能すると提案されている。（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｆｉｇｕｅｒｏａら、２０１０；Ｌｕら、２０１２；Ｘｕら、２０１１）。具体的には、エピジェネティックな修飾酵素のＤ−２ＨＧ媒介性阻害は、誘発性増殖因子／サイトカインに応答して正常な分化に必要とされる遺伝子の発現を弱める抑圧的なクロマチン構造を促進する（Ｃｈｅｎら、２０１３；Ｆｉｇｕｅｒｏａら、２０１０；Ｋａｔｓら、２０１４；Ｌｏｓｍａｎら、２０１３；Ｓａｓａｋｉら、２０１２）。実際、ＩＤＨ１／２変異体酵素の小分子阻害剤は、Ｄ−２ＨＧ産生を遮断し、抑圧的なクロマチンマークを逆転し、増殖因子／サイトカイン誘発性細胞の分化を回復させることができる（Ｒｏｈｌｅら、２０１３；Ｗａｎｇら、２０１３）。
【０１５８】
留意されたいことには、２ＨＧは、Ｄ−（Ｒ）−またはＬ−（Ｓ）−エナンチオマーのコンフォメーションのいずれでも存在することができるキラル分子である（Ｌｉｎｓｔｅｒら、２０１３）。ＩＤＨ１／２変異体がＤ−２ＨＧを排他的に産生するが、生化学的証拠は、Ｌ−２ＨＧはエピジェネティックな修飾因子を含む多くのα−ＫＧ依存性酵素を強力に阻害することができることを示す（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、２０１２；Ｘｕら、２０１１）。
【０１５９】
ＩＤＨ１／２変異を伴わない正常な細胞は、いまだあまり理解されていない代謝経路を介してＤ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧの両方を少量産生する（Ｌｉｎｓｔｅｒら、２０１３）。進化的に保存されたＤ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−２−ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ２ＨＧＤＨ及びＬ２ＨＧＤＨ）は、α−ＫＧに戻るそれらの変換を触媒することにより、それぞれＤ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧの蓄積を予防する（Ａｃｈｏｕｒｉら、２００４；Ｒｚｅｍら、２００４）。Ｄ２ＨＧＤＨまたはＬ２ＨＧＤＨの同型接合性の生殖細胞系列の機能喪失変異は、Ｄ−２ＨＧまたはＬ−２ＨＧの全身的上昇を特徴とする障害である、２ＨＧ酸性尿をもたらす（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら、２０１２；Ｒｚｅｍら、２００４；Ｓｔｒｕｙｓら、２００５）。２ＨＧ酸性尿を有する患者は、早期死亡をもたらす重大な発生異常を患う（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら、２０１２）。Ｌ２ＨＧＤＨの遺伝性変異から生じるＬ−２ＨＧの全身性上昇は、脳腫瘍と関連している（Ｈａｌｉｌｏｇｌｕら、２００８；Ｍｏｒｏｎｉら、２００４）。同様に、腎臓癌における再発性Ｌ２ＨＧＤＨ喪失の最近の特定は、代替的にまたは追加的に、調節解除されたＬ−２ＨＧの潜在的な発癌性役割を支持する（Ｓｈｉｍら、２０１４）。
【０１６０】
２ＨＧ酸性尿は、生理学的Ｄ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧレベルが、２ＨＧ媒介性病理を予防するためにＤ２ＨＧＤＨ及びＬ２ＨＧＤＨにより密接に制御されなければならないことを実証する（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら、２０１２）。これらの知見は、Ｄ−２ＨＧまたはＬ−２ＨＧの生理学的産生の制御が、特定の細胞機能を調節し得る可能性を高くした。
【０１６１】
前述の所見は、２ＨＧ、特に、低酸素の条件下などのストレス誘発性代謝における研究下にあるＬ−２ＨＧの役割への継続した必要性の証拠を提供する。
【０１６２】
材料及び方法：
細胞培養：接着細胞株ＳＦ１８８、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、及びＳＶ４０−不死化ＭＥＦは、高グルコースＤＭＥＭ中で維持され、一方で、造血細胞株３２Ｄ及びＦＬ５．１２は、ＲＭＰＩ中、１０％ＦＢＳ、グルコース２５ｍＭ、グルタミン４ｍＭ、ペニシリン１００単位／ｍｌ、及びストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍｌで維持され、培養密度に達するまで２〜３日毎に分裂した。低酸素実験については、細胞を、０．５％酸素の低酸素室（Ｃｏｙ）内で、２４〜４８時間培養してから、回収した。ｓｉＲＮＡ実験については、ＳＦ１８８またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を製造業者により説明されるように、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）血清低減培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合したｓｉＲＮＡでリバーストランスフェクトした。Ｌ２ＨＧＤＨ  ｃＤＮＡを、標準的な方法により、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−Ｐｕｒｏベクター（ｐＣＤＨ）（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）へとクローニングした。ｓｈＲＮＡ（ＰＬＫＯ．１）、空ベクター（ｐＣＤＨ）、またはＬ２ＨＧＤＨ（ｐＣＤＨ）の安定的な発現を伴うＳＦ１８８細胞株を生成するために、ヘルパーウイルス及びプラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの上清を、７２時間後に回収し、濾過し、ＳＦ１８８親細胞に一晩適用した。ピューロマイシン耐性細胞を連続培養ピューロマイシン１μｇ／ｍｌから選択した。
【０１６３】
ｓｈＲＮＡ実験：以下のＰＬＫＯ．１ベクター中のＴＲＣバージョン１のｓｈＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を使用した：ｓｈＬ２ＨＧＤＨ−１（Ｌ１）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿０２４８８４．１−１１１３ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＡＴＣＣＡＴＡＡＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号１）；ｓｈＬ２ＨＧＤＨ−２（Ｌ２）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿０２４８８４．１−１３７０ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＣＧＣＡＴＴＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＣＡＣＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号２）；ｓｈＬ２ＨＧＤＨ−３（Ｌ３）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿０２４８８４．１−１２１７ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＧＣＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号３）；ｓｈＬ２ＧＨＤＨ−４（Ｌ４）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿０２４８８４．１−６７４ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号４）；ｓｈＤ２ＨＧＤＨ−２（Ｄ２）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿１５２７８３．２−６３０ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＧＣＧＴＧＴＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＣＡＣＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号５）；ｓｈＤ２ＨＧＤＨ−３（Ｄ３）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿１５２７８３．２−１２７０ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＴＣＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号６）；ｓｈＤ２ＨＧＤＨ−４（Ｄ４）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿１５２７８３．２−３１９ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＧＣＣＧＴＴＣＴＣＣＡＣＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＴＴＴＴＴＧ（配列番号７）；ｓｈＤ２ＨＧＤＨ−５（Ｄ５）＝クローンＩＤ：ＮＭ＿１５２７８３．２−１０６６ｓ１ｃ１、配列：ＣＣＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＧＡＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧ（配列番号８）。
【０１６４】
代謝産物抽出及びＧＣ−ＭＳ解析：代謝産物を、２マイクロモル重化水素化２−ヒドロキシグルタル酸（Ｄ−２−ヒドロキシグルタル−２，３，３，４，４−ｄ５酸；重化水素化−Ｄ−２ＨＧ）を内部標準として補充した１ｍＬの氷冷８０％メタノールで抽出した。−８０°Ｃで一晩インキュベートした後、ライセートを回収し、超音波処理し、次いで２１，０００ｇで、２０分間４℃で遠心分離して、タンパク質を除去した。抽出物をエバポレーター（Ｇｅｎｅｖａｃ  ＥＺ−２  Ｅｌｉｔｅ）内で乾燥させ、３０℃で９０分間、５０マイクロリットルのメトキシアミン塩酸塩４０ｍｇ／ｍＬを含むピリジン内でインキュベートすることにより再懸濁した。代謝産物を、８０マイクロリットルのＭＳＴＦＡ＋１％ＴＣＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び７０マイクロリットルの酢酸エチル（Ｓｉｇｍａ）の添加により代替的にまたは追加的に誘導体化し、３７℃で３０分間インキュベートした。試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ５９７５Ｃ質量選択検出器に結合したＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０Ａ  ＧＣを使用して解析した。ＧＣは、１ｍＬ／分の一定のヘリウムガス流でスプリットレスモードにて操作した。１マイクロリットルの誘導体化代謝産物を、ＨＰ−５ＭＳカラムに注入し、ＧＣオーブン温度を６０℃から２９０℃に２５分間にわたり上昇させた。対象の化合物を表すピークを抽出し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して積分し、次いで、内部標準（重化水素化−Ｄ−２ＨＧ）ピーク面積及びタンパク質含有率の両方に正規化した。代謝産物レベルの定量化に使用するイオンは、２ＨＧ  ｍ／ｚ  ２４７及び重化水素化−２ＨＧ  ｍ／ｚ  ２５２であった。ピークを手動で検査し、各代謝産物について既知のスペクトルに対して検証した。
【０１６５】
キラル誘導体化：いくつかの実験では、細胞を、内部標準を伴わない８０％メタノール中で回収した。メタノールから抽出された代謝産物をエバポレーター（Ｇｅｎｅｖａｃ  ＥＺ−２  Ｅｌｉｔｅ）内で乾燥させ、水中に再懸濁し、ＡＧ  １−Ｘ８アニオン交換カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を実行し、３Ｎ  ＨＣｌで溶出し、４つの画分に分割し、Ｄ−（Ｒ）−２ＨＧまたはＬ−（Ｓ）−２ＨＧ標準物質（Ｓｉｇｍａ）でスパイクするかまたはスパイクしないままにし、エバポレーター内で乾燥させ、Ｒ（−）−２−ブタノール（Ｓｉｇｍａ）、次いで、酢酸無水物（Ｓｉｇｍａ）で９５℃に加熱しながら順次誘導体化し、窒素流下で乾燥させ、酢酸エチルに再懸濁し、上記のようにＧＣ−ＭＳにより解析した。２ＨＧは、ｍ／ｚ  １７３と同定した。この方法によるキラル誘導体化は、Ｌ−２ＨＧがＤ−２ＨＧよりも短い保持時間で溶出されることで、ガスクロマトグラフィーによるＬ−２ＨＧ及びＤ−２ＨＧエナンチオマーの分離を可能にする。
【０１６６】
結果：
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１または２（ＩＤＨ１／２）における体細胞変異は、「癌代謝物」Ｄ−２−ヒドロキシグルタル酸（Ｄ−２ＨＧ）の産生を介して癌の病理形成に寄与する。上昇したＤ−２ＨＧは、Ｊｕｍｏｎｊｉファミリーヒストンリジン脱メチル化酵素を含む、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）依存性酵素の競合阻害剤として機能することにより悪性細胞の分化を遮断することができる。２ＨＧは、Ｄ−エナンチオマーまたはＬ−エナンチオマーのいずれでも存在することができるキラル分子である。癌に関連するＩＤＨ１／２変異は、Ｄ−２ＨＧを排他的に産生するが、生化学的研究は、Ｌ−２ＨＧが代替的にまたは追加的に、α−ＫＧに依存する酵素の強力な阻害剤として機能することを実証している。
【０１６７】
以前の報告は、いくつかの細胞型が、酸素制限条件下で増加した総２ＨＧレベルを呈することを示した（Ａｌｂｅｒｓら、１９９８；Ｗｉｓｅら、２０１１）。実際、本発明者らは、哺乳類細胞は低酸素に応答して２ＨＧを蓄積するという一般化できる現象を同定した（図１Ａ）。本発明者らは、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を使用して正常酸素状態（２１％酸素）対低酸素（０．５％酸素）で培養されたＩＤＨ１／２野生型細胞株における細胞内２ＨＧを測定した。全ての事例で、本発明者らは、細胞の種類に応じて５〜２５倍の範囲の、低酸素における２ＨＧの実質的な増加を観察した（図１Ａ）。重要なことは、ＧＣ−ＭＳにより代謝産物を測定するための標準的な方法は、エナンチオマーの種を区別せず、ゆえに、これらのアッセイにおいて測定された総２ＨＧにはＤ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧの両方が含まれる。
【０１６８】
本発明者らは、次に細胞内２ＨＧレベルに及ぼすＤ２ＨＧＤＨまたはＬ２ＨＧＤＨを操作することの効果を調査した。Ｄ２ＨＧＤＨまたはＬ２ＨＧＤＨを標的とするｓｈＲＮＡを、代謝経路を研究するために広く使用されているＳＦ１８８膠芽腫細胞株に安定的に感染させた（ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓら、２００７；Ｗｉｓｅら、２００８；Ｗｉｓｅら、２０１１）。酸素の利用可能度にかかわらず、Ｄ２ＨＧＤＨの除去は、細胞内２ＨＧにほとんど効果を有さなかった（図１Ｂ）。しかしながら、Ｌ２ＨＧＤＨの除去は、低酸素における２ＨＧの蓄積を大幅に増加させた。これは、Ｌ−２ＨＧが酸素制限に応答して蓄積する２ＨＧの主要な形態を表すことを示す（図１Ｃ）。同様の結果が、Ｄ２ＨＧＤＨまたはＬ２ＨＧＤＨを標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して得られた。
【０１６９】
低酸素において２ＨＧのどちらのエナンチオマーが蓄積するのか直接決定するために、本発明者らは、代謝産物が、Ｒ（−）−２−ブタノール、その後酢酸無水物との連続的な反応を受けるキラル誘導体化手法を活用した（図６Ａ）。それにより、ＧＣ−ＭＳによりＤ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧを区別することを可能にした（Ｗａｒｄら、２０１２；Ｗａｒｄら、２０１０）。キラル誘導体化の前に、低酸素性ＳＦ１８８細胞からの代謝産物抽出物を、未操作のままにするか、または基準として、市販されている標準物質のＤ−２ＨＧ、Ｌ−２ＨＧもしくはＤ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧの混合物でスパイクした。この技術は、Ｌ−２ＨＧが、低酸素性細胞中に存在する２ＨＧの主要なエナンチオマー型であることを実証した（図１Ｄ）。キラル誘導体化は、Ｌ−２ＨＧが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び不死化マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）中で低酸素に応答して選択的に産生されたことを、代替的または追加的に実証した（図６Ｂ及び６Ｃ）。
【０１７０】
実施例２：低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、グルタミン由来のα−ＫＧから生じる
材料及び方法：
細胞培養及びＧＣ−ＭＳ手法は実施例１に記載する。同位体追跡試験では、培地を指示された時間で交換し、その後、１２Ｃ−グルコース（Ｓｉｇｍａ）及び１２Ｃ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）または各代謝産物の１３Ｃバージョンである、［Ｕ−１３Ｃ］グルコースまたは［Ｕ−１３Ｃ］グルタミン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ）を補充したグルコース及びグルタミンを含まないＤＭＥＭ培地を使用して回収した。試料を、内部標準を伴わない８０％メタノール中で回収した。１３Ｃの濃縮を、２ＨＧイオン、ｍ／ｚ  ３４９−３６２の存在量を定量化することにより評価した。自然同位体の存在量の収集を、ＩｓｏＣｏｒソフトウェアを使用することにより実施した（Ｍｉｌｌａｒｄら、２０１２）。
【０１７１】
結果
グルコース及びグルタミンは、増殖する細胞が取り込み、代謝する２つの主要な栄養素を表す（Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎら、２００９）。本発明者らは、低酸素におけるＬ−２ＨＧの産生に活用される炭素主鎖の源を同定するために、［Ｕ−１３Ｃ］グルコースまたは［Ｕ−１３Ｃ］グルタミンのいずれかを補充されたＳＦ１８８細胞において代謝フラックス解析を行った（図２Ａ及び２Ｂ）。正常酸素状態では、比較的少ない総２ＨＧ（図１Ａ）が主にグルタミンから誘導され、グルコースからの寄与は少しであった（図２Ａ及び２Ｂ）。対照的に、より多い低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧ（図１Ａ及び１Ｄ）はグルタミンから排他的に誘導された（図２Ａ及び２Ｂ）。
【０１７２】
グルタミンの細胞代謝がα−ケトグルタル酸を生成する（Ｗｉｓｅ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１０）ので、本発明者らは、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧが、グルタミン由来のα−ＫＧの酵素的還元から生じ得ると理由づけた。本発明者らは、α−ＫＧの細胞透過性形態を細胞に補充することの効果を試験した。正常酸素状態におけるＳＦ１８８細胞への細胞透過性ジメチル−α−ＫＧの添加により、細胞内２ＨＧは中程度に増加し、一方で低酸素では、２ＨＧがほぼ１００倍増加した（図２Ｃ）。これは、キラル誘導体化によりＬ−２ＨＧであると確認された（図２Ｄ及び２Ｅ）。Ｌ−２ＨＧ酸性尿を有する患者からの細胞の以前の試験（Ｓｔｒｕｙｓら、２００７）と一致して、これらの知見は、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧが、グルタミン由来のα−ＫＧの酵素的還元から生じることを示す。
【０１７３】
考察：
栄養素及び代謝産物は、根本的な細胞のプロセスに影響を与える（Ｋａｅｌｉｎ及びＭｃＫｎｉｇｈｔ，２０１３；Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎら、２００９）。例えば、α−ＫＧは、ヒストン及びＤＮＡの脱メチル化、ＨＩＦ１α安定性の調節、及びコラーゲンの成熟化などの多様な機能に関与するおおよそ７０の異なる酵素の必須基質として機能する（Ｌｏｓｍａｎ及びＫａｅｌｉｎ，２０１３）。これらの酵素的プロセスをα−ＫＧ利用能につなげることにより、細胞の代謝的健全性は、系統分化及び環境的ストレス要因への適応などの重要な細胞の「決断」に密接につながることができる。「癌代謝物」Ｄ−２ＨＧによるα−ＫＧに依存する酵素活性の阻害は、それによりＩＤＨ１／２における発癌性変異が正常な細胞の生理機能を攪乱させる主なメカニズムを表すと思われる（Ｋａｅｌｉｎ及びＭｃＫｎｉｇｈｔ，２０１３；Ｌｏｓｍａｎ及びＫａｅｌｉｎ，２０１３；Ｗａｒｄ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，２０１２）。同様に、Ｌ２ＨＧＤＨまたはＤ２ＨＧＤＨのいずれかの両親対立遺伝子における機能喪失変異をもって産まれた子供は、それぞれＬ−２ＨＧ及びＤ−２ＨＧを蓄積し、これは重度の発育障害をもたらす（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら、２；Ｒｚｅｍら、２００４；Ｓｔｒｕｙｓら、２００５）。
【０１７４】
実施例３：低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、ＬＤＨＡによる無差別な基質使用から生じる
材料及び方法：
細胞培養及びＧＣ−ＭＳ手法を実施例１に記載する。
【０１７５】
ウェスタンブロット法：細胞ライセートを、１×ＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）中で抽出し、超音波処理し、１４，０００ｇで４℃にて遠心分離し、上清を収集した。ヒストン酸抽出については、細胞を、低張性溶解バッファー（Ａｍｒｅｓｃｏ）に１時間溶解した。Ｈ２ＳＯ４を、０．２Ｎに一晩４℃で回転させながら加え、上清を遠心分離後に回収した。ヒストンを、３３％ＴＣＡ中に沈殿させ、アセトンで洗浄し、脱イオン化した水中に再懸濁した。清澄化した細胞ライセートまたはヒストン調製物を、総タンパク質濃度に正規化した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に転写し、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）にて調製された５％ミルク中で遮断し、一次抗体を用いて一晩４℃でインキュベートし、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＡ９３１Ｖ及びＮＡ９３４Ｖ）を用いて、その翌日に１時間インキュベートした。ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を適用した後、ＳＲＸ−１０１Ａ（Ｋｏｎｉｃａ  Ｍｉｎｏｌｔａ）を使用してイメージングを行った。インビトロでのヒストン脱メチル化酵素アッセイについては、バルク仔ウシ胸腺ヒストン（Ｓｉｇｍａ）を、トリス−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、プロテアーゼ阻害剤、α−ＫＧ  １ｍＭ、ＦｅＳＯ４  １００マイクロモル、及びアスコルビン酸  ２マイクロモルを含有する反応混合物中でＧＳＴタグ付きＫＤＭ４Ｃ（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とインキュベートした。反応混合物を、３７℃で４時間、様々な濃度のＬ−２ＨＧまたはＤ−２ＨＧ（Ｓｉｇｍａ）の存在下または不在下でインキュベートした。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３レベルを、総ヒストンＨ３を負荷対照として使用して、ウェスタンブロットにより解析した。使用された一次抗体は：抗Ｌ２ＨＧＤＨ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，１５７０７−１−ＡＰ）、抗Ｄ２ＨＧＤＨ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，１３８９５−１−ＡＰ）、抗ＬＤＨＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２０１２）、抗ＩＤＨ１（抗ＩＤＨ２（Ａｂｃａｍ，ａｂ５５２７１）、抗ＭＤＨ１（Ａｂｃａｍ，ａｂ５５５２８）、抗ＭＤＨ２（Ａｂｃａｍ，ａｂ９６１９３）、抗チューブリン（Ｓｉｇｍａ，Ｔ９０２６）、抗Ｓ６リボソームタンパク質（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２３１７）、抗ＨＩＦ１α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，６１０９５９）、抗Ｈ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４４９９）、及び抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，３９７６５）を含んだ。
【０１７６】
ｓｉＲＮＡ実験：以下のｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した：ｓｉＩＤＨ１−ａ＝Ｊ−００８２９４−１０、標的配列：ＧＣＡＵＡＡＵＧＵＵＧＧＣＧＵＣＡＡＡ（配列番号９）；ｓｉＩＤＨ１−ｂ＝Ｊ−００８２９４−１１、標的配列：ＧＣＵＵＧＵＧＡＧＵＧＧＡＵＧＧＧＵＡ（配列番号１０）；ｓｉＩＤＨ２−ａ＝Ｊ−００４０１３−０９、標的配列：ＧＣＡＡＧＡＡＣＵＡＵＧＡＣＧＧＡＧＡ（配列番号１１）；ｓｉＩＤＨ２−ｂ＝Ｊ−００４０１３−１２、標的配列：ＧＣＧＣＣＡＣＵＡＵＧＣＣＧＡＣＡＡＡ（配列番号１２）；ｓｉＭＤＨ１−ａ＝Ｊ−００９２６４−１０、標的配列：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＵＧＵＣＡＣＧＡＣＵ（配列番号１３）；ｓｉＭＤＨ１−ｂ＝Ｊ−００９２６４−１２、標的配列：ＡＧＧＵＵＡＵＵＧＵＵＧＵＧＧＧＵＡＡ（配列番号１４）；ｓｉＭＤＨ２−ａ＝Ｊ−００８４３９−１０、標的配列：ＧＡＵＣＵＧＡＧＣＣＡＣＡＵＣＧＡＧＡ（配列番号１５）；ｓｉＭＤＨ２−ｂ＝Ｊ−００８４３９−１２、標的配列：ＣＧＣＣＵＧＡＣＣＣＵＣＵＡＵＧＡＵＡ（配列番号１６）；ｓｉＬＤＨＡ−ａ＝Ｊ−００８２０１−０５、標的配列：ＧＧＡＧＡＡＡＧＣＣＧＵＣＵＵＡＡＵＵ（配列番号１７）；ｓｉＬＤＨＡ−ｂ＝Ｊ−００８２０１−０６、標的配列：ＧＧＣＡＡＡＧＡＣＵＡＵＡＡＵＧＵＡＡ（配列番号１８）；ｓｉＬＤＨＡ−ｃ＝Ｊ−００８２０１−０７、標的配列：ＵＡＡＧＧＧＵＣＵＵＵＡＣＧＧＡＡＵＡ（配列番号１９）；ｓｉＬＤＨＡ−ｄ＝Ｊ−００８２０１−０８、標的配列：ＡＡＡＧＵＣＵＵＣＵＧＡＵＧＵＣＡＵＡ（配列番号２０）
【０１７７】
結果：
低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの酵素源（複数可）を決定するために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡにより候補代謝酵素を除去した（図３）。ＩＤＨ１またはＩＤＨ２のノックダウンは、低酸素性ＳＦ１８８細胞におけるＬ−２ＨＧの産生を損なわなかった（図３Ａ）。同様に、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、またはＩＤＨ１及びＩＤＨ２を両方一緒に、ｓｉＲＮＡを媒介する除去に供したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、低酸素に応答するＬ−２ＨＧの産生に対してこれらの酵素への依存性を呈さなかった（図７Ａ）。これらの所見は、天然に生じるイソクエン酸のα−ヒドロキシル基（２ＨＧのα−ヒドロキシル基に類似する）が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される酵素反応の立体化学のために、Ｄ−（Ｒ）−エナンチオマーの立体構造内に常に存在するという事実と一致する（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら、１９６２；Ｓｐｒｅｃｈｅｒら、１９６４）。ゆえに、ＩＤＨ１／２酵素は、基質結合の際の立体的拘束に起因して、α−ＫＧをＬ−２−ヒドロキシグルタル酸に還元することができない可能性が高い。
【０１７８】
代謝酵素は、「無差別の」触媒活性（Ｌｉｎｓｔｅｒら、２０１３）を呈することができ、以前の細胞分画試験は、細胞基質のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１）及びミトコンドリアのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２）を、Ｌ−２ＨＧの潜在的な酵素源として関連づけた（Ｒｚｅｍら、２００７）。本発明者らは、その主な触媒活性が、α−ケト酸基質のＬ−ヒドロキシル酸への還元に関与し、それぞれα−ＫＧ及びＬ−２ＨＧに対する構造類似性を有する、代謝酵素の要件を試験した（図３Ｄ）。ＳＦ１８８細胞では、本発明者らは、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧに対するＭＤＨ１及びＭＤＨ２から部分的な寄与を特定した（図３Ｂ）。しかしながら、際立って、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）が、ＳＦ１８８細胞における低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧに必要とされる主要な酵素として特定された（図３Ｃ）。これらの所見は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において確認され、そこではＬＤＨＡ及びＭＤＨ２の組み合わせ除去もまた、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧのほぼ全ての抑止をもたらした（図Ｓ７Ｂ及びＳ７Ｃ）。まとめると、これらの知見は、低酸素性細胞は、ＬＤＨＡによる無差別の基質使用を介して細胞質においてグルタミン由来のα−ＫＧの還元からＬ−２ＨＧを産生することができ、それより少ない細胞基質のＭＤＨ１及びミトコンドリアのＭＤＨ２からの寄与を伴う、ということを示す（図３Ｄ）。
【０１７９】
低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの抑止は、ＨＩＦ１αタンパク質レベルに大きな影響を与えなかった（図３Ｂ及び３Ｃ）。以前の報告は、Ｌ−２ＨＧが、プロテアソーム分解のためにＨＩＦ１αをマークするα−ＫＧ依存性プロリルヒドロキシラーゼのＥＧＬＮファミリーの、Ｌ−２ＨＧ媒介性阻害を介して、正常酸素状態においてＨＩＦ１αを安定化させることができることを実証した（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、２０１２；Ｌｏｓｍａｎら、２０１３）。これらの所見と一致して、本発明者らは、（結果として低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの増強を伴う）Ｌ２ＨＧＤＨの除去に供された低酸素性細胞中のＨＩＦ１αタンパク質レベルにおいて軽微な増加を認めた（図１Ｃ）。しかしながら、低下した酸素利用可能度（０．５％）が、Ｌ−２ＨＧにおける上昇がたとえ無くとも、ＥＧＬＮプロリルヒドロキシラーゼの活性を弱めるのに十分であるように思われる（図３Ｃ）。
【０１８０】
考察：
ＩＤＨ１／２変異による悪性病変の分子病態におけるＤ−２ＨＧの役割の解明に焦点を当てた集中的な研究努力とは対照に、正常な細胞生理学におけるＤ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧの制御された産生及び除去の潜在的な役割は、あまり注目されていない（Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋら、２０１２）。本明細書に提示する知見は、低酸素により強いられた環境的ストレスに応答した新規の細胞の代謝応答としてＬ−２ＨＧ誘発を同定する。酸素制限条件下では、細胞は、ＴＣＡ回路中間体ならびにＮＡＤＨの形態の細胞基質の及びミトコンドリアの還元等価物を蓄積し（Ｂｅｎｓａａｄ及びＨａｒｒｉｓ，２０１４；Ｍｅｔａｌｌｏら、２０１２；Ｓｅｍｅｎｚａ，２０１３；Ｗｉｓｅら、２０１１；Ｚｈｄａｎｏｖら、２０１４）、それは、α−ＫＧの酵素的還元を支持して本明細書に記載のＬ−２ＨＧを産生するだろう。低酸素におけるＬ−２ＨＧの産生は、ＩＤＨ１／２とは独立して生じ、代わりに主にＬＤＨＡによるα−ＫＧの無差別な酵素的還元を介して生じる。低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、それにより細胞が、制限された酸素利用可能度に直面したときに、α−ＫＧに依存するプロセス（例えば、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の脱メチル化）を抑圧し得る分子メカニズムを表す。あるいはまたは加えて、Ｌ−２ＨＧは、低酸素適応のα−ＫＧ依存性逆転を抑制することができる。α−ＫＧは、ＨＩＦ１αクリアランスを開始し、ヒストンのメチル化によりサイレンシングされた遺伝子の発現を回復させることが求められる（Ｋａｅｌｉｎ及びＲａｔｃｌｉｆｆｅ，２００８；Ｋｏｏｉｓｔｒａ及びＨｅｌｉｎ，２０１２；Ｏｚｅｒ及びＢｒｕｉｃｋ，２００７；Ｔａｕｓｅｎｄｓｃｈｏｎら、２０１１）。ゆえに、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、それを通して低酸素適応に反作用し得るα−ＫＧに依存するプロセスの抑圧を細胞が維持できる手段を表す。
【０１８１】
代替的な（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）または無差別な基質使用は、乳酸脱水素酵素を含む多くの代謝酵素の十分に記載された特性である（Ｌｉｎｓｔｅｒら、２０１３；Ｍｅｉｓｔｅｒ，１９５０；Ｓｃｈａｔｚ及びＳｅｇａｌ，１９６９）。低酸素においてＬ−２ＨＧへのα−ＫＧの還元を触媒するＬＤＨＡの能力は、有意義な生物学的効果を媒介し得る代替的な基質使用の例を表す。ＬＤＨＡによるＬ−２ＨＧの産生は、簡素なメカニズムを表し、ここでは単一の酵素が、嫌気的解糖の媒介因子及び細胞の代謝状態についての情報を核に伝達する代謝シグナル伝達経路の発動因子の両方として機能する。ＬＤＨＡ発現は、低酸素においてＨＩＦ１αにより上方制御され（Ｈｕら、２００３）、その後のＬ−２ＨＧへのαＫＧのＬＤＨＡ依存性変換は、低酸素適応を持続するために正のフィードバックループを提供し得る。Ｚｈｄａｎｏｖら、（２０１４）は、近年、持続的な核ＨＩＦ１αの蓄積は、低酸素適応中に進行しているグルタミン代謝に依存することを実証した。これと一致して、本発明者らは、Ｌ−２ＨＧの低酸素誘発性蓄積もグルタミン依存性であることを発見した。これらの知見は、低酸素におけるグルタミン依存性Ｌ−２ＨＧ産生と持続的なＨＩＦ１α誘発との間のつながりを示す。
【０１８２】
低酸素におけるＬ−２ＨＧの選択的蓄積は、２ＨＧのエナンチオマー種を区別することの重要性を強調する（Ｔｅｒｕｎｕｍａら、２０１４）。Ｌ−２ＨＧは、ＨＩＦ１α分解を開始し低酸素適応を終了させるその能力を抑制する、ＥＧＬＮプロリルヒドロキシラーゼの競合阻害剤として機能すると示されている。対照的に、Ｄ−２ＨＧは、ＨＩＦ１αの水酸化及び分解を促進し、ゆえに低酸素適応を妨害する、ＥＧＬＮプロリルヒドロキシラーゼに対する基質として作用することができる（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、２０１２；Ｌｏｓｍａｎら、２０１３）。まとめると、本結果は、Ｄ−２ＨＧと共有されない特性である、ＨＩＦ１α軸を強化し、低酸素への細胞の適応を維持することにおける低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの支援的役割を、支持する。
【０１８３】
実施例４：ＬＤＨＡの活性部位は、Ｌ−２ＨＧへのα−ＫＧの還元に対応することができる
材料及び方法：
細胞培養及びＧＣ−ＭＳ手法を実施例１に記載する。
【０１８４】
推定ＬＤＨＡ基質の分子ドッキング：推定基質及び産物分子のドッキングをＭａｅｓｔｒｏ  ２０１４−３のＧｌｉｄｅを使用して行った（Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００４；Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００６；Ｈａｌｇｒｅｎら、２００４；Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，２０１４）。結晶水及びリガンドを、ＮＡＤＨを除いて除去した後にリガンドをＰＤＢ構造１Ｉ１０の鎖Ａ内へとドッキングした（Ｒｅａｄら、２００１）。欠落している側鎖及びループを、Ｐｒｉｍｅを使用して自動的に再構築した（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００２；Ｊａｃｏｂｓｏｎら、２００４）。ＰＲＯＰＫＡを、７のｐＨに適合するプロトン状態を配置するために使用した（Ｏｌｓｓｏｎら、２０１１；Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄら、２０１１）。ＮＡＤＨまたはＮＡＤ＋の結合次数は、ＰＲＯＰＫＡによる割り当てのミスを避けるために手動で確認した。ＯＰＬＳ２００５を使用して制限最小化を行った（Ｂａｎｋｓら、２００５）。結合部位定義を満たすための最小原子要件を確認するために架空の原子を加えた後、オキサメートを基準リガンドとして使用して結合部位を定義した。ヒドロキシル及びチオール基を、グリッド生成中に回転させた。ピルベート及びα−ケトグルタル酸を、結晶ＮＡＤＨの存在下でドッキングした。乳酸塩及びＬ−２−ヒドロキシグルタル酸を、結合次数を変えることにより結晶ＮＡＤＨからモデル化されたＮＡＤ＋の存在下でドッキングした。リガンドのカルボン酸部分を完全に脱プロトン化した。ドッキングを、柔軟なリガンドを用いてＥｘｔｒａ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｇｌｉｄｅを使用して行った（Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００４；Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００６；Ｈａｌｇｒｅｎら、２００４）。ドッキングポーズは、ドッキング後に最小化した。結果得られたコンフォメーションは、１オングストロームのＲＭＳＤカットオフ内でクラスタリングした。これは、それぞれのドッキングされたリガンドについて単一の代表的なポーズをもたらした。全てのステップは、別段の注記がない限り、既定パラメータを使用した。ポーズ及び予測された水素結合は、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，バージョン１．７．０．０  Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を用いて可視化された。
【０１８５】
結果：
ＬＤＨＡが、どのようにしてＬ−２ＨＧへのα−ＫＧの還元を触媒し得るかをよりよく理解するために、本発明者らは、ＬＤＨＡの活性部位への推定基質の分子ドッキングを行った。結果得られたドッキングポーズは、ピルベートが、カルボン酸頭部基及び隣接するカルボニル基への水素結合により空間的に配位されたことを実証した。（図４Ａ）。ＮＡＤＨからのヒドリド基によるピルベートのカルボニル炭素の求核攻撃は、還元反応が乳酸塩のＬ−（Ｓ）−エナンチオマーを排他的に産生するように空間的に制限される（図４Ｂ）。同様に、α−ケトグルタル酸の分子ドッキングは、カルボン酸頭部基及び隣接するカルボニル基への同一の水素結合を介してピルベートへの類似した空間配位を有利に採択し得ることを示した（図４Ｃ）。重要なことに、ＬＤＨＡの基質結合性ポケット内に、好ましくない立体相互作用を伴わずに、α−ケトグルタル酸のより長い尾に対応するために利用可能なかなりの立体的空間があった（図４Ｃ）。Ｌ−乳酸塩へのピルベートの還元に類似して、α−ＫＧのカルボニル炭素の求核攻撃は、Ｌ−２−ヒドロキシグルタル酸が還元反応の独占的な最終産物となり得るように空間的に制限された（図４Ｄ）。まとめると、これらの知見は、代替的にまたは追加的に、ＬＤＨＡを低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの主要な酵素源と同定する遺伝的データを支持する（図３Ｃ、Ｓ７Ｂ、Ｓ７Ｃ）。
【０１８６】
実施例５：Ｌ−２ＨＧは、低酸素に応答してエピジェネティックな変化を媒介する
材料及び方法：
ヒト膠芽腫検体：ヒト膠芽腫生検検体は、治験審査委員会からの承認後にペンシルベニア大学から得た。全ての事例は、分析の前に非特定化し、以前に十分に特徴づけされた組織マイクロアレイ（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ａ）に含有した。
【０１８７】
免疫組織化学的分析：免疫組織化学試験及び定量化を、以前に記載されたように実施した（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ｂ）。要するに、免疫染色をＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴプロセッサ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。組織切片を、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ中の１０％正常ヤギ血清にて３０分間ブロックした。切片を、１０マイクログラム／ｍｌのマウスモノクローナル抗ＨＩＦ１α（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，ＡＬＸ−２１０−０６９）と、または０．１マイクログラム／ｍｌのウサギポリクローナル抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ８８９８）と５時間インキュベートした。次いで、組織切片をビオチン標識されたヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ，ＰＫ６１０２及びＰＫ６１０１）と１：２００希釈で６０分間インキュベートした。ブロッカーＤ、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の使用説明書に従って使用した。
【０１８８】
自動スコアリングのために、スライドをＰａｎｎｏｒａｍｉｃ  Ｆｌａｓｈ  ２５０スキャナー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して走査し、Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ  ｖｉｅｗｅｒソフトウェアプログラム（３Ｄ  Ｈｉｓｔｅｃｈ，マサチューセッツ州ウォルサム）を通して見た。実験計画を知らされていない個体は、ＪＰＥＧ画像を１０倍の倍率でとらえた。各ＪＰＥＧでの免疫染色の定量化は、前述の方法（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ｂ）に従って、Ｍａｔｌａｂの画像処理ツールボックスを用いる自動解析プログラムを使用して実行した。アルゴリズムは、ＲＧＢの色区別を伴うカラーセグメンテーション、Ｋ平均法及び大津の閾値を用いる背景前景分離を使用した。抽出された画素の数に、各コアのそれらの平均強度（画素単位で表される）を乗じて、スコアに到達した。所与の事例及びマーカーについての最終スコアは、所与のマーカーについて（各事例の）２つのコアのスコアを平均化することにより算出された。
【０１８９】
結果：
生化学的に、Ｄ−２ＨＧ及びＬ−２ＨＧは両方とも、Ｊｕｍｏｎｊｉファミリーヒストンリジン脱メチル化酵素ＫＤＭ４Ｃを阻害すると報告されており、それはトリメチル化ヒストン３リジン９（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）の異常蓄積及び正常な細胞の分化の機能障害を結果もたらす（Ｃｈｅｎら、２０１３；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｋａｔｓら、２０１４；Ｌｕら、２０１２；Ｒｏｈｌｅら、２０１３；Ｓａｓａｋｉら、２０１２）。膠芽腫では、ＩＤＨ１／２変異は、腫瘍全体にわたるＨ３Ｋ９ｍｅ３の拡散的増加を伴うが、一方でＨ３Ｋ９ｍｅ３は、ＩＤＨ１／２変異を伴わない腫瘍において領域による変動を示す（Ｖｅｎｎｅｔｉら、２０１３ａ）。
【０１９０】
上記の結果は、ＩＤＨ１／２野生型膠芽腫におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３染色の変動性は、低酸素の領域と相関する可能性があることを示す。この考えを試験するために、本発明者らは、ＩＤＨ１／２について野生型である４７ヒト膠芽腫試料を使用して免疫組織化学によりＨＩＦ１α発現とＨ３Ｋ９ｍｅ３との間の相関関係を決定した（図５Ａ）。ＨＩＦ１α発現及びＨ３Ｋ９ｍｅ３は、これらの試料において高く統計学的に相関した（ｐ＝０．０１）（図５Ｂ）。
【０１９１】
これらの所見は、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧが、ヒト膠芽腫の血管性に易感染性の領域において観察されるＨ３Ｋ９ｍｅ３の増強を媒介し得ることを示す。この仮説を試験するために、ヒト膠芽腫細胞株ＳＦ１８８を、Ｌ２ＨＧＤＨを発現するレンチウイルスまたは空レンチウイルスベクターに安定的に感染させた。空ベクターに感染したＳＦ１８８膠芽腫細胞は、低酸素に応答してＨ３Ｋ９ｍｅ３の増加した全体レベルを呈し（図５Ｃ）、これは原発性膠芽腫検体からの知見と一致した（図５Ａ及び５Ｂ）。しかしながら、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧがＬ２ＨＧＤＨの過剰発現により抑止されたとき、低酸素誘発性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３において大幅な低下があった（図５Ｃ）。逆に、Ｌ２ＨＧＤＨの除去（結果として低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧの増加を伴う）は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の増加をもたらした（図５Ｄ）。同様のパターンが、比較的強くないが、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３で観察された（データは示さず）。
【０１９２】
本発明者らは、インビトロでヒストン脱メチル化アッセイを行って、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に与える効果が、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧによるＫＤＭ４Ｃの直接阻害を通して媒介され得るかどうか決定した。ヒストン基質への精製したＫＤＭ４Ｃの添加は、用量依存的様式で、Ｌ−２ＨＧによる阻害に感受性であるＨ３Ｋ９ｍｅ３の脱メチル化をもたらした（図５Ｄ）。これらの所見は、Ｌ−２ＨＧ及びＤ−２ＨＧによるＫＤＭ４Ｃのほぼ同等の阻害を実証する以前の報告と一致する（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｌｕら、２０１２）。ゆえに、Ｌ−２ＨＧの誘発は、低酸素に応答してＨ３Ｋ９ｍｅ３を増強すると思われる。
【０１９３】
考察：
ＨＩＦ１αのＥＧＬＮ依存性プロリンヒドロキシル化を制御するそれらの異なる役割とは対照的に、Ｌ−２ＨＧ及びＤ−２ＨＧは両方とも、ヒストン脱メチル化酵素の阻害剤として機能する（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、２０１１；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、２０１２；Ｌｕら、２０１２；Ｘｕら、２０１１）。Ｄ−２ＨＧの発癌性レベルのように、Ｌ−２ＨＧの低酸素誘発性性レベルは、増強された抑圧的なヒストンメチル化をもたらす。ＩＤＨ１／２変異によるＤ−２ＨＧの発癌性産生が分化に対する癌促進遮断をもたらす一方で、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、幹／前駆細胞分化の生理学的制御因子として機能し得る。低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、少なくとも一部には、様々な幹細胞集団の自己複製を維持するための低酸素性ニッチ及びＬＤＨＡ両方の重要性について説明し得る（Ｎｏｍｂｅｌａ−Ａｒｒｉｅｔａら、２０１３；Ｓｉｍｏｎ及びＫｅｉｔｈ，２００８；Ｓｐｅｎｃｅｒら、２０１４；Ｓｕｄａら、２０１１；Ｗａｎｇら、２０１４；Ｘｉｅら、２０１４）。具体的には、低酸素性ニッチに存在する正常幹細胞は、分化に必要とされる遺伝子のサイレンシングを維持するのに十分なＬ−２ＨＧを産生し得、ゆえに前駆／幹細胞運命を維持する。これと一致して、Ｓｈｉｍら（２０１４）は、癌進行プロセス中のＬ２ＧＨＤＨの喪失が、低酸素に応答して本明細書で観察されるものと類似した、Ｌ−２ＨＧの蓄積及び抑圧的なヒストンのメチル化における変化をもたらすと近年示している。最後に、膠芽腫を有する患者からの生検を試験する我々の結果は、Ｌ−２ＧＨの低酸素性誘発が、この腫瘍型におけるエピジェネティックな異質性の発達に寄与する可能性があることを示す。これらの結果が他の腫瘍型に当てはまるかどうかは、将来の臨床検査の対象とするところであるだろう。
【０１９４】
本実施例は、それによりＩＤＨ１／２野生型細胞が低酸素中にα−ＫＧの酵素的還元を介してＬ−２ＨＧを選択的に産生する新規代謝経路の本明細書に含まれる記載を支持する。低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧは、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２のいずれにも依存せず、代わりに、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１及び２（ＭＤＨ１／２）からの追加的な寄与を伴う乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）による無差別の基質使用を介して生じる。ＬＤＨＡの活性部位の構造モデルは、α−ＫＧのＬＤＨＡ媒介性還元がどのようにＬ−２ＨＧを生じさせるかについて指示する基質結合に対する空間的拘束を実証する。さらには、本開示は、Ｌ−２ＨＧが、低酸素に応答して生じるヒストン３リジン９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）を増強することを示す。ゆえに、本開示は、低酸素誘発性Ｌ−２ＨＧが、核内のエピジェネティックなマークの調節を介して細胞の代謝状態についての情報を運ぶ代謝シグナル伝達中間体を表すことを実証する。
参考文献
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ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍａｎｃｕｓｏ，Ａ．，Ｄａｉｋｈｉｎ，Ｅ．，Ｎｉｓｓｉｍ，Ｉ．，Ｙｕｄｋｏｆｆ，Ｍ．，Ｗｅｈｒｌｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２００７）．Ｂｅｙｏｎｄ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｅｎｇａｇｅ  ｉｎ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｔｈａｔ  ｅｘｃｅｅｄｓ  ｔｈｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０４，１９３４５−１９３５０．
Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｍ．Ｅ．，Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ，Ｏ．，Ｌｕ，Ｃ．，Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｔｅｌ，Ｊ．，Ｓｈｉｈ，Ａ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｂｈａｇｗａｔ，Ｎ．，Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ，Ａ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ＩＤＨ１  ａｎｄ  ＩＤＨ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ａ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ｄｉｓｒｕｐｔ  ＴＥＴ２  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １８，５５３−５６７．
Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂａｎｋｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｂ．，Ｈａｌｇｒｅｎ，Ｔ．Ａ．，Ｋｌｉｃｉｃ，Ｊ．Ｊ．，Ｍａｉｎｚ，Ｄ．Ｔ．，Ｒｅｐａｓｋｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｋｎｏｌｌ，Ｅ．Ｈ．，Ｓｈｅｌｌｅｙ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｇｌｉｄｅ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｏｒｉｎｇ．１．Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，１７３９−１７４９．
Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｂ．，Ｒｅｐａｓｋｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｆｒｙｅ，Ｌ．Ｌ．，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｊ．Ｒ．，Ｈａｌｇｒｅｎ，Ｔ．Ａ．，Ｓａｎｓｃｈａｇｒｉｎ，Ｐ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｍａｉｎｚ，Ｄ．Ｔ．（２００６）．Ｅｘｔｒａ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｇｌｉｄｅ：ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４９，６１７７−６１９６．
Ｇｒｏｓｓ，Ｓ．，Ｃａｉｒｎｓ，Ｒ．Ａ．，Ｍｉｎｄｅｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｄｒｉｇｇｅｒｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｊａｎｇ，Ｈ．Ｇ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｊｉｎ，Ｓ．，Ｓｃｈｅｎｋｅｉｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｓｕ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １  ａｎｄ  ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０７，３３９−３４４．
Ｈａｌｇｒｅｎ，Ｔ．Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｂ．，Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂｅａｒｄ，Ｈ．Ｓ．，Ｆｒｙｅ，Ｌ．Ｌ．，Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｗ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，Ｊ．Ｌ．（２００４）．Ｇｌｉｄｅ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｏｒｉｎｇ．２．Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，１７５０−１７５９．
Ｈａｌｉｌｏｇｌｕ，Ｇ．，Ｊｏｂａｒｄ，Ｆ．，Ｏｇｕｚ，Ｋ．Ｋ．，Ａｎｌａｒ，Ｂ．，Ａｋａｌａｎ，Ｎ．，Ｃｏｓｋｕｎ，Ｔ．，Ｓａｓｓ，Ｊ．Ｏ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｏｐｃｕ，Ｍ．（２００８）．Ｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌ２ＨＧＤＨ  ｇｅｎｅ：ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ．Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ３９，１１９−１２２．
Ｈｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｙ．，Ｃｈｏｄｏｓｈ，Ｌ．Ａ．，Ｋｅｉｔｈ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．（２００３）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １ａｌｐｈａ（ＨＩＦ−１ａｌｐｈａ）ａｎｄ  ＨＩＦ−２ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３，９３６１−９３７４．
Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．，ａｎｄ  Ｈｏｎｉｇ，Ｂ．（２００２）．Ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３２０，５９７−６０８．
Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｐｉｎｃｕｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｒａｐｐ，Ｃ．Ｓ．，Ｄａｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｈｏｎｉｇ，Ｂ．，Ｓｈａｗ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２００４）．Ａ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏｏｐ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５５，３５１−３６７．
Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｊｒ．，ａｎｄ  ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．（２０１３）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｎ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ  １５３，５６−６９．
Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｊｒ．，ａｎｄ  Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，Ｐ．Ｊ．（２００８）．Ｏｘｙｇｅｎ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｂｙ  ｍｅｔａｚｏａｎｓ：ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＦ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ３０，３９３−４０２．
Ｋａｔｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｒｅｓｃｈｋｅ，Ｍ．，Ｔａｕｌｌｉ，Ｒ．，Ｐｏｚｄｎｙａｋｏｖａ，Ｏ．，Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．，Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｐ．，Ｓｔｒａｌｅｙ，Ｋ．，Ｋａｒｎｉｋ，Ｒ．，Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．，Ｓｍａｌｌ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ＩＤＨ２  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １４，３２９−３４１．
Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｓ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｃ．Ｇ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｇ．，Ｌｕ，Ｇ．，Ｒａｍｋｉｓｓｏｏｎ，Ｓ．，Ｌｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｊｏｅｎｓｕｕ，Ｐ．，Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｕ．，Ｇｒｏｓｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ（Ｒ）−ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ  ｏｆ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ＥＧＬＮ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８３，４８４−４８８．
Ｋｏｏｉｓｔｒａ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｅｌｉｎ，Ｋ．（２０１２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３，２９７−３１１．
Ｋｒａｎｅｎｄｉｊｋ，Ｍ．，Ｓｔｒｕｙｓ，Ｅ．Ａ．，Ｓａｌｏｍｏｎｓ，Ｇ．Ｓ．，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｎａａｐ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓ，Ｃ．（２０１２）．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ．
Ｌｅｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｍａｒｄｉｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｄｉｎｇ，Ｌ．，Ｆｕｌｔｏｎ，Ｂ．，ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｋ．，Ｄｏｏｌｉｎｇ，Ｄ．，Ｄｕｎｆｏｒｄ−Ｓｈｏｒｅ，Ｂ．Ｈ．，ＭｃＧｒａｔｈ，Ｓ．，Ｈｉｃｋｅｎｂｏｔｈａｍ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｎｏｒｍａｌ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５６，６６−７２．
Ｌｉｎｓｔｅｒ，Ｃ．Ｌ．，Ｖａｎ  Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．（２０１３）．Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｒ  ｐｒｅ−ｅｍｐｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，７２−８０．
Ｌｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｊｒ．（２０１３）．Ｗｈａｔ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｍａｋｅｓ：ｍｕｔａｎｔ  ＩＤＨ，（Ｒ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２７，８３６−８５２．
Ｌｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｌｏｏｐｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｓ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｋ．，ＭｃＭａｈｏｎ，Ｃ．，Ｃｏｗｌｅｙ，Ｇ．Ｓ．，Ｒｏｏｔ，Ｄ．Ｅ．，Ｅｂｅｒｔ，Ｂ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｊｒ．（２０１３）．（Ｒ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｒｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，１６２１−１６２５．
Ｌｕ，Ｃ．，Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｋａｐｏｏｒ，Ｇ．Ｓ．，Ｒｏｈｌｅ，Ｄ．，Ｔｕｒｃａｎ，Ｓ．，Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ，Ｏ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｒ．，Ｋｈａｎｉｎ，Ｒ．，Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｍ．Ｅ．，Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．ＩＤＨ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａ  ｂｌｏｃｋ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８３，４７４−４７８．
Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ａ．（１９５０）．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ｇａｍｍａ−ｄｉｋｅｔｏ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏ  ａｃｉｄｓ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｌａｃｔｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８４，１１７−１２９．
Ｍｅｔａｌｌｏ，Ｃ．Ｍ．，Ｇａｍｅｉｒｏ，Ｐ．Ａ．，Ｂｅｌｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｍａｔｔａｉｎｉ，Ｋ．Ｒ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｈｉｌｌｅｒ，Ｋ．，Ｊｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ｍ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｚ．Ｒ．，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｂｙ  ＩＤＨ１  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ｈｙｐｏｘｉａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８１，３８０−３８４．
Ｍｉｌｌａｒｄ，Ｐ．，Ｌｅｔｉｓｓｅ，Ｆ．，Ｓｏｋｏｌ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｐｏｒｔａｉｓ，Ｊ．Ｃ．（２０１２）．ＩｓｏＣｏｒ：ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ  ＭＳ  ｄａｔａ  ｉｎ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２８，１２９４−１２９６．
Ｍｏｒｏｎｉ，Ｉ．，Ｂｕｇｉａｎｉ，Ｍ．，Ｄ’Ｉｎｃｅｒｔｉ，Ｌ．，Ｍａｃｃａｇｎａｎｏ，Ｃ．，Ｒｉｍｏｌｄｉ，Ｍ．，Ｂｉｓｓｏｌａ，Ｌ．，Ｐｏｌｌｏ，Ｂ．，Ｆｉｎｏｃｃｈｉａｒｏ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｕｚｉｅｌ，Ｇ．（２００４）．Ｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒｓ：ａ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ？  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６２，１８８２−１８８４．
Ｎｏｍｂｅｌａ−Ａｒｒｉｅｔａ，Ｃ．，Ｐｉｖａｒｎｉｋ，Ｇ．，Ｗｉｎｋｅｌ，Ｂ．，Ｃａｎｔｙ，Ｋ．Ｊ．，Ｈａｒｌｅｙ，Ｂ．，Ｍａｈｏｎｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｙ．，Ｌｕ，Ｊ．，Ｐｒｏｔｏｐｏｐｏｖ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｅ．（２０１３）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，５３３−５４３．
Ｏｌｓｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．Ｍ．，Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｃ．Ｒ．，Ｒｏｓｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．（２０１１）．ＰＲＯＰＫＡ３：Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｐＫ（ａ）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｔｈｅｏｒｙ  Ｃｏｍｐｕｔ  ７，５２５−５３７．
Ｏｚｅｒ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂｒｕｉｃｋ，Ｒ．Ｋ．（２００７）．Ｎｏｎ−ｈｅｍｅ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ：ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｊｅｌｌｙ  ｒｏｌｌｅｄ  ｉｎｔｏ  ｏｎｅ？  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，１４４−１５３．
Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｌｉｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｅａｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ，Ｐ．，Ｍａｎｋｏｏ，Ｐ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｈ．，Ｓｉｕ，Ｉ．Ｍ．，Ｇａｌｌｉａ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，１８０７−１８１２．
Ｐａｔｅｌ，Ｊ．Ｐ．，Ｇｏｎｅｎ，Ｍ．，Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｍ．Ｅ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｈ．，Ｓｕｎ，Ｚ．，Ｒａｃｅｖｓｋｉｓ，Ｊ．，Ｖａｎ  Ｖｌｉｅｒｂｅｒｇｈｅ，Ｐ．，Ｄｏｌｇａｌｅｖ，Ｉ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．，Ａｍｉｎｏｖａ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６６，１０７９−１０８９．
Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，Ｖａｎｄｅｒｈｅｌｍ，Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｍｉｎｋｉｎ，Ｊ．Ａ．（１９６２）．Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  Ｉｓｏｃｉｔｒｉｃ  Ａｃｉｄ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８４，３０９−＆．
Ｒｅａｄ，Ｊ．Ａ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｖ．Ｊ．，Ｅｓｚｅｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｅｓｓｉｏｎｓ，Ｒ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｒａｄｙ，Ｒ．Ｌ．（２００１）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｌｔｅｒｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｍ−  ａｎｄ  Ｈ−ｉｓｏｚｙｍｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４３，１７５−１８５．
Ｒｏｈｌｅ，Ｄ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｉ−Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｐａｌａｓｋａｓ，Ｎ．，Ｔｕｒｃａｎ，Ｓ．，Ｇｒｏｍｍｅｓ，Ｃ．，Ｃａｍｐｏｓ，Ｃ．，Ｔｓｏｉ，Ｊ．，Ｃｌａｒｋ，Ｏ．，Ｏｌｄｒｉｎｉ，Ｂ．，Ｋｏｍｉｓｏｐｏｕｌｏｕ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ＩＤＨ１  ｄｅｌａｙｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，６２６−６３０．
Ｒｚｅｍ，Ｒ．，Ｖｅｉｇａ−ｄａ−Ｃｕｎｈａ，Ｍ．，Ｎｏｅｌ，Ｇ．，Ｇｏｆｆｅｔｔｅ，Ｓ．，Ｎａｓｓｏｇｎｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｔａｂａｒｋｉ，Ｂ．，Ｓｃｈｏｌｌｅｒ，Ｃ．，Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｔ．，Ｖｉｋｋｕｌａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ，Ｅ．（２００４）．Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ＦＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｓ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  Ｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０１，１６８４９−１６８５４．
Ｒｚｅｍ，Ｒ．，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｍ．Ｆ．，Ｖａｎ  Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｖｅｉｇａ−ｄａ−Ｃｕｎｈａ，Ｍ．（２００７）．Ｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ，ａ  ｄｅｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐａｉｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３０，６８１−６８９．
Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｋｎｏｂｂｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｌｉｎｄ，Ｅ．Ｆ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．，Ｂｒｕｓｔｌｅ，Ａ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｉ．Ｓ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｒ．，Ｗａｋｅｈａｍ，Ａ．，Ｈａｉｇｈｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｓ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８８，６５６−６５９．
Ｓｃｈａｔｚ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｅｇａｌ，Ｈ．Ｌ．（１９６９）．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｂｙ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｌａｃｔｉｃ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ｘ  ｏｆ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４４，４３９３−４３９７．
Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ（２０１４）．Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１４−３：Ｍａｅｓｔｒｏ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．９，Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．
Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．（２０１３）．ＨＩＦ−１  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２３，３６６４−３６７１．
Ｓｈｉｍ，Ｅ．Ｈ．，Ｌｉｖｉ，Ｃ．Ｂ．，Ｒａｋｈｅｊａ，Ｄ．，Ｔａｎ，Ｊ．，Ｂｅｎｓｏｎ，Ｄ．，Ｐａｒｅｋｈ，Ｖ．，Ｋｈｏ，Ｅ．Ｙ．，Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｐ．，Ｋｉｒｋｍａｎ，Ｒ．，Ｖｅｌｕ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ｌ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ：Ａｎ  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ４，１２９０−１２９８．
Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｋｅｉｔｈ，Ｂ．（２００８）．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，２８５−２９６．
Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｃ．Ｒ．，Ｏｌｓｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．Ｍ．，Ｒｏｓｔｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．（２０１１）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＫ（ａ）Ｖａｌｕｅｓ．Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｔｈｅｏｒｙ  Ｃｏｍｐｕｔ  ７，２２８４−２２９５．
Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｆ．，Ｒｏｕｓｓａｋｉｓ，Ｅ．，Ｋｌｅｉｎ，Ａ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｒｕｎｎｅｌｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｚａｈｅｒ，Ｗ．，Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｊ．，Ａｌｔ，Ｃ．，Ｔｕｒｃｏｔｔｅ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｃａｌ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０８，２６９−２７３．
Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．（１９６４）．Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  Ｌｙａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３９，４２６８−４２７１．
Ｓｔｒｕｙｓ，Ｅ．Ａ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓ，Ｃ．（２００７）．Ｎｏｖｅｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ：ｍａｓｓ  ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｆ  Ｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３０，６９０−６９３．
Ｓｔｒｕｙｓ，Ｅ．Ａ．，Ｓａｌｏｍｏｎｓ，Ｇ．Ｓ．，Ａｃｈｏｕｒｉ，Ｙ．，Ｖａｎ  Ｓｃｈａｆｔｉｎｇｅｎ，Ｅ．，Ｇｒｏｓｓｏ，Ｓ．，Ｃｒａｉｇｅｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，Ｎ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓ，Ｃ．（２００５）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅ  Ｄ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７６，３５８−３６０．
Ｓｕｄａ，Ｔ．，Ｔａｋｕｂｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．（２０１１）．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｎｉｃｈｅ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ９，２９８−３１０．
Ｔａｕｓｅｎｄｓｃｈｏｎ，Ｍ．，Ｄｅｈｎｅ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｂｒｕｎｅ，Ｂ．（２０１１）．Ｈｙｐｏｘｉａ  ｃａｕｓｅｓ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ  Ｊｕｍｏｎｊｉ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５３，２５６−２６２．
Ｔｅｒｕｎｕｍａ，Ａ．，Ｐｕｔｌｕｒｉ，Ｎ．，Ｍｉｓｈｒａ，Ｐ．，Ｍａｔｈｅ，Ｅ．Ａ．，Ｄｏｒｓｅｙ，Ｔ．Ｈ．，Ｙｉ，Ｍ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｔ．Ａ．，Ｉｓｓａｑ，Ｈ．Ｊ．，Ｚｈｏｕ，Ｍ．，Ｋｉｌｌｉａｎ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ＭＹＣ−ｄｒｉｖｅｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２４，３９８−４１２．
Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２００９）．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｗａｒｂｕｒｇ  ｅｆｆｅｃｔ：ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，１０２９−１０３３．
Ｖｅｎｎｅｔｉ，Ｓ．，Ｆｅｌｉｃｅｌｌａ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｏｙｎｅ，Ｔ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｏｒｏｖｅｔｓ，Ｄ．，Ｈｕｓｅ，Ｊ．Ｔ．，Ｋｏｆｌｅｒ，Ｊ．，Ｌｕ，Ｃ．，Ｔｉｈａｎ，Ｔ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３ａ）．Ｈｉｓｔｏｎｅ  ３  ｌｙｓｉｎｅ  ９  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ７２，２９８−３０６．
Ｖｅｎｎｅｔｉ，Ｓ．，Ｇａｒｉｍｅｌｌａ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｄ．，Ｈｕｓｅ，Ｊ．Ｔ．，Ｈｅｇｕｙ，Ａ．，Ｓａｎｔｉ，Ｍ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｊｕｄｋｉｎｓ，Ａ．Ｒ．（２０１３ｂ）．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ３  ｌｙｓｉｎｅ  ２７  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  Ｚｅｓｔ  ２（ＥＺＨ２）ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｇｌｉａｌ  ａｎｄ  ｇｌｉｏｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｓｈｏｗｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３  ｉｎ  Ｈ３Ｆ３Ａ  Ｋ２７Ｍ  ｍｕｔａｎｔ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２３，５５８−５６４．
Ｗａｎｇ，Ｆ．，Ｔｒａｖｉｎｓ，Ｊ．，ＤｅＬａＢａｒｒｅ，Ｂ．，Ｐｅｎａｒｄ−Ｌａｃｒｏｎｉｑｕｅ，Ｖ．，Ｓｃｈａｌｍ，Ｓ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｅ．，Ｓｔｒａｌｅｙ，Ｋ．，Ｋｅｒｎｙｔｓｋｙ，Ａ．，Ｌｉｕ，Ｗ．，Ｇｌｉｓｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ＩＤＨ２  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，６２２−６２６．
Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｈ．，Ｉｓｒａｅｌｓｅｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｄ．，Ｙｕ，Ｖ．Ｗ．，Ｊｅａｎｓｏｎ，Ｎ．Ｔ．，Ｃｌｉｓｈ，Ｃ．Ｂ．，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｃａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｔ．（２０１４）．Ｃｅｌｌ−ｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  １５８，１３０９−１３２３．
Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｒｏｓｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｕ，Ｃ．，Ｗｅｉｇｅｒｔ，Ｏ．，Ａｂｅｌ−Ｗａｈａｂ，Ｏ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｒ．Ｌ．，Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｈａｒｐ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２０１２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ＩＤＨ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ｒ（−）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３１，２４９１−２４９８．
Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｔｅｌ，Ｊ．，Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｒ．，Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ，Ｏ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｂ．Ｄ．，Ｃｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ａ．，Ｃｒｏｓｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｆａｎｔｉｎ，Ｖ．Ｒ．，Ｈｅｄｖａｔ，Ｃ．Ｖ．，Ｐｅｒｌ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＩＤＨ１  ａｎｄ  ＩＤＨ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｓ  ａ  ｎｅｏｍｏｒｐｈｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｔｏ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １７，２２５−２３４．
Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２０１２）．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｈａｌｌｍａｒｋ  ｅｖｅｎ  ｗａｒｂｕｒｇ  ｄｉｄ  ｎｏｔ  ａｎｔｉｃｉｐａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２１，２９７−３０８．
Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｒ．，ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍａｎｃｕｓｏ，Ａ．，Ｓａｙｅｄ，Ｎ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｙ．，Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｈ．Ｋ．，Ｎｉｓｓｉｍ，Ｉ．，Ｄａｉｋｈｉｎ，Ｅ．，Ｙｕｄｋｏｆｆ，Ｍ．，ＭｃＭａｈｏｎ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｍｙｃ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｈａｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｌｕｔａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０５，１８７８２−１８７８７．
Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２０１０）．Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎ：ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３５，４２７−４３３．
Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｗａｒｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｈａｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｃｒｏｓｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｒｕｂｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｃｈｄｅｖａ，Ｕ．Ｍ．，Ｐｌａｔｔ，Ｊ．Ｍ．，ＤｅＭａｔｔｅｏ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．（２０１１）．Ｈｙｐｏｘｉａ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｔｏ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｔｏ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，１９６１１−１９６１６．
Ｘｉｅ，Ｈ．，Ｈａｎａｉ，Ｊ．，Ｒｅｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｋａｔｓ，Ｌ．，Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．，Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｐ．，Ｓｉｇｎｏｒｅｔｔｉ，Ｓ．，Ｂｉｌｌｉａｒｄ，Ｊ．，Ｄｕｆｆｙ，Ｋ．Ｊ．，Ｇｒａｎｔ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−−ａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １９，７９５−８０９．
Ｘｕ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｐ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｉｔｏ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．，Ｘｉａｏ，Ｍ．Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｌ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｏｎｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｉｓ  ａ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９，１７−３０．
Ｙａｎ，Ｈ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｊｉｎ，Ｇ．，ＭｃＬｅｎｄｏｎ，Ｒ．，Ｒａｓｈｅｅｄ，Ｂ．Ａ．，Ｙｕａｎ，Ｗ．，Ｋｏｓ，Ｉ．，Ｂａｔｉｎｉｃ−Ｈａｂｅｒｌｅ，Ｉ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｒｉｇｇｉｎｓ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．ＩＤＨ１  ａｎｄ  ＩＤＨ２  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａｓ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６０，７６５−７７３．
Ｚｈｄａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．，Ｗａｔｅｒｓ，Ａ．Ｈ．，Ｇｏｌｕｂｅｖａ，Ａ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｐａｐｋｏｖｓｋｙ，Ｄ．Ｂ．（２０１４）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｔａｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｘｙｇｅｎ  ｉｎ  ＨＩＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．
【図１】
2017520774.tif 000003
【図２】
2017520774.tif 000004
【図３】
2017520774.tif 000005
【図４】
2017520774.tif 000006
【図５】
2017520774.tif 000007
【図６】
2017520774.tif 000008
【図７】
2017520774.tif 000009
【国際調査報告】
2017520774.tif 000010
2017520774.tif 000011
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