(57)【要約】本発明は、結合相互作用、特にタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための一般的な方法およびキットに関し、特にタンパク質−タンパク質相互作用のラベル化、分析、検出および測定のためのハイスループット方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合剤とターゲットとの間の結合相互作用を決定する方法であって、
ａ）結合剤／ターゲット複合体を形成できるように結合剤ライブラリとターゲットとを接触させること、この際、前記結合剤ライブラリの各メンバーは、特有のヌクレオチド配列に関連している；
ｂ）前記結合剤／ターゲット複合体を分離すること；
ｃ）前記結合剤／ターゲット複合体において結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列を結びつけて連結ヌクレオチド配列を形成すること；
ｄ）前記連結ヌクレオチド配列から前記複合体に存在する前記結合剤を同定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記結合剤ライブラリが抗体ライブラリを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体ライブラリが抗体ディスプレイライブラリ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）または抗体のライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を含み、各抗体が前記特有のヌクレオチド配列でラベル化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ターゲットが特有のヌクレオチド配列に関連する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ターゲットがタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ターゲットがタンパク質ディスプレイライブラリを含み、前記ライブラリの各メンバーが特有のヌクレオチド配列に関連する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質ディスプレイライブラリがｃＤＮＡファージディスプレイライブラリである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質がタンパク質混合物内にある、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質混合物が濃縮タンパク質混合物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質混合物がリンタンパク質、膜タンパク質、および／または天然もしくは人工修飾タンパク質に関して濃縮される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
他の結合体に結合する結合剤が使用の前に前記結合剤ライブラリから除かれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合剤ライブラリが使用前に濃縮される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
分離が位置において平均して一つの非結合ターゲットまたは結合剤ライブラリのメンバーをもたらす、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記位置が固体支持体またはコンパートメントでの位置（ｓｅｔ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンパートメントがエマルジョン滴定、拡散律速または分離コンパートメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記複合体における結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列が前記複合体における結合剤に関連する別のヌクレオチド配列と結合している、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合体における結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列が前記結合剤／ターゲット複合体内のターゲットに関連するヌクレオチド配列と結合している、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体内に存在する前記結合剤および／またはターゲットが前記連結ヌクレオチド配列から同定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）前記結合剤または（ｉｉ）前記複合体内に存在する結合剤およびターゲットが前記結合ヌクレオチド配列をシークエンシングすることにより同定される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合剤／ターゲット複合体が分離後に固定される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
２つ以上の複合体からの結合ヌクレオチド配列が存在する結合剤および／またはターゲットを同定する前に結合される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。（ｉ）前記結合剤または（ｉｉ）前記複合体内に存在する結合剤およびターゲットが前記結合ヌクレオチド配列をシークエンシングすることにより同定される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合剤ライブラリとターゲットとを接触させる工程（ａ）を化合物の存在および／または非存在下で行う、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質がタンパク質混合物内で他のタンパク質と架橋される、請求項５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記分離タンパク質の分離を結合する工程の間維持する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記分離を希釈、特異結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、または前記複合体の物理的および／もしくは化学的特性による分離により行う、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体ファージライブラリの各メンバーに関連する前記特有のヌクレオチド配列が前記抗体のＣＤＲをコードするファージ内のヌクレオチド配列である、請求項３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｃＤＮＡファージライブラリの各メンバーに関連する前記特有のヌクレオチド配列が前記ディスプレイされたタンパク質をコードするファージ内の配列である、請求項７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオチド配列を結びつけることが
ｉ．ＰＣＲプライマーの少なくとも２つのペアを用いて前記結合剤と、または結合剤およびターゲットに関連する前記ヌクレオチド配列を増幅して、少なくとも２セットの単位複製配列を製造すること、この際前記プライマーは、プライマーの第１のセットにより生成された前記単位複製配列がプライマーの第２のセットにより生成された単位複製配列における配列と相補的な配列を含むようにデザインされる；
ｉｉ．前記セットの単位複製配列をアニールすること；
ｉｉｉ．増幅反応を行い、結合ヌクレオチド配列を生成すること、
を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅がエマルジョンＰＣＲ増幅を用いて行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｉ〜ｉｉｉが一斉に行われる、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が反復され、前記ターゲットまたは結合剤の濃度が変化する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ａ）前記結合剤ライブラリの各メンバーが特有のヌクレオチド配列に関連する、結合剤ライブラリ；ならびに
ｂ）前記結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列を結びつけるための少なくとも２対のプライマーのセット；および任意に使用説明書
を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項３３】
タンパク質ディスプレイライブラリをさらに含み、前記ライブラリの各メンバーが特有のヌクレオチド配列に関連する、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して結合相互作用、特にタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための方法およびキットに関し、特にタンパク質−タンパク質相互作用のラベル化、分析、検出および測定のためのハイスループット方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞構造は、その複合体、実際に細胞を作る分子機械によって定義される。細胞生物学は、伝統的に触媒、シグナル伝達分子、または細胞および微生物の構成要素としての個々の作用に基づいてタンパク質を同定する。現在では、我々は、機能モジュール内での「状況（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ）」または「細胞的（ｃｅｌｌｕｌａｒ）」機能を有し、その上タンパク質をタンパク質−タンパク質相互作用のネットワークにおける要素としてみなす、タンパク質の役割を拡大させるポストゲノムの出現に直面している。
【０００３】
複合体タンパク質−タンパク質ネットワークの定性的および定量的特徴およびタンパク質と特異的に相互作用する主要な細胞タイプの同定は、ガン、自己免疫疾患およびその他の病気などの多くのヒト疾患における生理学的プロセスおよびタンパク質−タンパク質相互作用の変化を理解するのに最も重要である。タンパク質−タンパク質ネットワークおよび疾患に関連する差異の同定における詳細な洞察は、特定の薬物の合理的なデザインおよび開発のための新たな方法につながるであろう。細胞または組織におけるタンパク質−タンパク質相互作用のパターンはまた、分子診断のためのツールとして使用できる。
【０００４】
タンパク質は、細胞の生理および機能の多くのメカニズムの基礎を表す複合体相互作用に関与している。これらのタンパク質−タンパク質相互作用は、絶妙な複合体ネットワークを編成する。タンパク質−タンパク質相互作用ネットワークの構造は、スケールフリーであることが予定されており、ほとんどのタンパク質は、１つまたは２つの結合のみを有するが、数十、数千以上の結合を有する比較的少数の「ハブ（ｈｕｂ）」を有する。相互作用ネットワークは、非常に動的であり、例えば外部刺激または発達プロセスへのインタラクトームの急激な変化を可能にする。コアタンパク質の間および２つ以上のモジュールタンパク質の間での相互作用は、ドメイン−ドメイン相互作用によって媒介される可能性が高い。付着タンパク質内および付着タンパク間の相互作用は、このような形では起こりにくい。タンパク質複合体の寄与および生物学的プロセスの調節および実行への相互作用にもかかわらず、十分に理解されている複合体は、構造および機能に関して比較的少数である。
【０００５】
細胞相互作用のための速度定数を実験的に得る試みは、わずかである。これらの定量的パラメータは、細胞プロセスの微分方程式に基づく動力学モデルの開発を可能にするであろう。このようなモデルは、薬物作用の理解に必要であり、多くの複雑な疾患のための新薬の発見を促進するであろう。定量的なマルチスケールモデルの開発は、細胞レベルでの薬物の治療作用および副作用の理論的な理解を提供することができる。
【０００６】
用語「サンプリング（ｓａｍｐｌｉｎｇ）」は、集団のサブセットのみが調査される実験的設計に使用される。代表的なサンプリングは、タンパク質相互作用のデータセットの生成において一般的ではなく、サンプリングはしばしば、生物学的プライオリティーによって導かれる。「カバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）」は、可能性のある相互作用の全セットのどの部分が実際にテストされたのかをまとめたものである。現在の技術に照らせば、「インタラクトーム（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ）」、例えば研究される条件下、細胞で起こる全ての物理的相互作用のセットについての推論を行うことは、有効ではない。
【０００７】
いくつかの方法は、別のタンパク質に結合するタンパク質を選択および検出する物理的方法を含むタンパク質−タンパク質相互作用を研究するために考案されており、例えばタンパク質アフィニティ−クロマトグラフィー、アフィニティブロッティング、免疫沈降（２Ｄゲル電気泳動および質量分析を含む）、架橋；ライブラリに基づく方法：タンパク質プロービング、ファージディスプレイ、ツーハイブリッドシステム、その他のライブラリに基づく方法、および遺伝学的方法：遺伝子外サプレッサー、合成致死効果、過剰産生表現型、野生型タンパク質の過剰産生および突然変異タンパク質の過剰産生；ならびに無連鎖非相補性（ｕｎｌｉｎｋｅｄ  ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）。
【０００８】
これらの方法の多くは、ハイスループットのタンパク質相互作用解析には適していない。最も有望なハイスループット技術は、ペプチド−およびペプチド−ライブラリスクリーニング技術の開発によって利用可能であり、例えば関心のあるタンパク質と相互作用するタンパク質の遺伝子を同定およびクローニングする方法である、酵母ツーハイブリッドストラテジー（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）；大規模な実験がコロニーアレイ形式で行われ、各酵母のコロニーは、自動化された方法において、相互作用を示すレポーター遺伝子活性を得ることができる、定義されたペアの「ベイト（ｂａｉｔ）」および「プレイ（ｐｒｅｙ）」タンパク質を発現する、ツーハイブリッドアレイ（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ａｒｒａｙｓ）；タンパク質のライブラリが「ベイト（ｂａｉｔ）」タンパク質に対してパンニングされるファージディスプレイおよび特に細胞における全ての複合体（「コンプレキソーム（ｃｏｍｐｌｅｘｏｍｅ）」）およびそれらの構成タンパク質を明らかにするためのアフィニティ精製／質量分析（ＡＰ−ＭＳ）；ならびにタンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）。ＴＡＰは、その複合体の様々な形態における出現の頻度に従って、コア、モジュール、または付着タンパク質としての相互作用するタンパク質を明らかにする。
【０００９】
これらの方法はすべて、これらの技術を用いることにより得られた情報の信頼性、完全性および容易さに関連する利点および欠点を有する。理想的な方法は、時間および費用対効果の高い方法でインタラクトームの情報を捕捉して、ランダムサンプリングおよびサンプリングの高い冗長性を実現できる。大きく、複数ユニットのタンパク質複合体であっても、動的で、オリジナルの細胞状況に基づく、ネイティブなタンパク質−タンパク質相互作用に基づく、および包括的で十分に広いカバレッジの定量的な相互作用データを提供する。非特異的な、誤って相互作用するタンパク質などのランダムな変数の影響を抑制する。また、オリジナルのタンパク質−タンパク質相互作用以外の検出原理に関与する任意の結合事象関連変数である、変数の影響を減少させる。
【００１０】
ツーハイブリッドスクリーン、特にアレイに基づく技術は、大規模なインタラクトーム情報生成を可能にする。しかし、それらの二元のペアワイズ検出、オリジナルの状況に基づく動的な情報の欠如、人工結合剤（ハイブリッドタンパク質）および酵母の細胞状況制限原理（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）（例えばオリジナルの宿主と比較してねじれた翻訳後修飾）のため、大きな欠点がある。これらのほとんどすべては、様々な方法により部分的に解決されている。しかし、これら必要な特徴の全てを組み合わせた方法は、考案されていない。
【００１１】
アフィニティに基づく方法、特に検出原理として質量分析を使用する方法は、正確な細胞状況において部分的に、多量の半定量的なインタラクトームデータを生成する。しかし、それらはランダムおよび結合（アフィニティ）に関連する変数により影響される。それらは、偶発的で、非特異的な結合事象を検出する。ランダムに抽出され、高カバレッジで包括的なデータセットを生成するには、かなりの量の時間と費用とが必要であり、これによりインタラクトームの動的な性質を検出する可能性の利益を損なうであろう。これらの問題のいくつかは、特にタンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）を用いて解決されており、偶発的で非特異的な結合事象は、最小限にまで減少しているが、信頼できるタンパク質−タンパク質複合体回収を少し犠牲にしている。
【００１２】
これらの技術は、大規模でタンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）の生成を促進している。インタラクトームに関する先駆的な研究の後、いくつかの大規模な研究がおこなわれ、ペアワイズタンパク質−タンパク質相互作用の高品質データセットいくつかがもたらされた。例えば、フィルター処理した酵母インタラクトーム（ＦＹＩ）は、異なるデータセットの共通部分であり、Ｙ２Ｈデータ、ＡＰ−ＭＳデータ、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測、Ｍｕｎｉｃｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓの物理的相互作用、および文献で報告されたタンパク質複合体を含む。
【００１３】
既存の方法論的アプローチは、タンパク質−タンパク質相互作用およびインタラクトーム研究の必要性を完全に満たしていないので、複合体タンパク質−タンパク質ネットワークの分析および特性解析のための新たな方法が必要とされている。
【００１４】
本発明は、結合相互作用、特に細胞レベルでのタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための方法およびキットを提供する。本方法およびキットは、複合体タンパク質ネットワーク、好ましくは細胞のオリジナル状況における全ての、またはサブセットの相互作用するタンパク質を同時に検出するために使用できる。本方法およびキットは、大きく、複数ユニットのタンパク質複合体であっても、動的で、オリジナルの細胞状況に基づく、ネイティブなタンパク質−タンパク質相互作用に基づく、および包括的で、十分に広いカバレッジの定量的および潜在的に動力学的な相互作用データを提供する。
【００１５】
本発明は、複数の抗体ファージを結合剤として用いて、抗体ディスプレイ技術を使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために使用することができる。本発明はまた、複数のアプタマーを結合剤として用いて、アプタマー技術を使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために使用することができる。複数の結合剤の複雑さは、数種の結合剤から数万または数十万または数百万または数千万、数億の結合剤の間の幅広い範囲で変化しうる。本発明の方法に適した高い複雑さの結合剤から低い複雑さの結合剤を得るために、複雑さの低減方法が考案されている（改良）。
【００１６】
ターゲット分子間のより詳細な相互作用を同定し、モニターすることができる。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用を検出することができる。結合剤／ターゲット複合体内の２以上の結合剤の存在は、２以上のターゲットが複合体内に存在し得ることを示すであろう。これは、２以上のターゲットが互いに相互作用している、または互いに結合している可能性を示す。特定の結合剤の識別可能な部分、例えばタンパク質または核酸配列が知られている場合、ターゲットを同定することができる。この方法は、結合ディスプレイ抗体ファージ、すなわち所定の結合特性、例えば既知のエピトープ配列、または特定の分子に結合することが知られているものの識別可能な核酸配列を結びつけることにより高度にパラレルな（ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ）ＰＣＲ増幅を用いて行うことができる。これは、好ましくはエマルジョンＰＣＲにより行うことができる。これは、好ましくは区画において、低いタンパク質複合体濃度で行うことができる。ターゲット間の相互作用、例えばタンパク質−タンパク質相互作用は、高度にパラレルなＰＣＲ増幅により、好ましくは複雑さの減少した結合検出剤を用いて検出することができる。ターゲット−ターゲット、例えばタンパク質−タンパク質相互作用情報は、結合した識別可能な配列のシークエンシング、好ましくは高度にパラレルなＤＮＡシークエンシングにより、またはその他の配列検出手段により、得られる。投入材料、例えばターゲットの量の変化は、リガンド結合動力学データを収集するために使用できる。さらに、本方法は、化合物がターゲット相互作用に何らかの効果を及ぼすか、およびこの効果がアゴニストまたはアンタゴニストであるかを決定するために化合物の存在または非存在下で行うことができる。
【００１７】
本発明はまた、生物のタンパク質フラグメントをディスプレイして、多数のディスプレイ抗体の結合特性を決定する、タンパク質ディスプレイ技術を使用することができ、各抗体は、ユニークで識別可能な配列情報を有し、各ディスプレイタンパク質フラグメントは、識別可能な配列情報を有する。好ましくはディスプレイタンパク質フラグメントの識別可能な配列情報は、ディスプレイアミノ酸配列をコードする配列である。結合抗体の同一性は、各抗体−タンパク質複合体の識別可能な配列情報から決定することができる。場合により、各抗体−タンパク質複合体内の結合タンパク質フラグメントの同一性は、同定することができる。場合により、結合抗体の同一性および結合タンパク質フラグメントの同一性は、各抗体−タンパク質複合体の結合した識別可能な配列情報から決定することができる。結合、動力学特性はまた、異なる量のターゲット、例えばディスプレイタンパク質またはディスプレイ抗体などのタンパク質および結合剤を用いて決定することができる。
【００１８】
本発明の方法および組成物はまた、このようなタンパク質−タンパク質相互作用をアゴナイズしうるまたはアンタゴナイズしうる化合物を同定するために使用することができる。本発明は、アンタゴニストな（妨害する）またはアゴニストな（促進する）化合物との結合相互作用を検出するための方法およびキットを提供する。本発明は、複合体タンパク質ネットワーク、好ましくは細胞のオリジナルな状況におけるアンタゴニストなおよび／またはアゴニストな化合物の結合相互作用を同時に検出するための方法およびキットを提供する。本方法およびキットは、大きく、複数ユニットのタンパク質複合体であっても、包括的であり、定量的および潜在的には動力学的相互作用データの両方の十分に広いカバレッジを有する、オリジナルな細胞の状況に基づき、ネイティブなタンパク質−タンパク質相互作用に基づくデータを提供する。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、結合剤とターゲットとの間の結合相互作用を決定する方法であって、
ａ）結合剤／ターゲット複合体を形成できるように結合剤ライブラリとターゲットとを接触させること、この際、前記結合剤ライブラリの各メンバーは、特有のヌクレオチド配列に関連している；
ｂ）前記結合剤／ターゲット複合体を分離すること；
ｃ）前記結合剤／ターゲット複合体において結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列を結びつけて連結ヌクレオチド配列を形成すること；
ｄ）前記連結ヌクレオチド配列から前記複合体に存在する前記結合剤を同定すること、
を含む、方法を提供する。
【００２０】
本発明は、複合体結合相互作用、特にタンパク質−タンパク質ネットワークまたはインタラクトームを分析し、特徴づける方法を記載する。本方法は、結合剤および場合によりそれらのターゲット（例えば、タンパク質）の同定に関連した共局在に基づき、好ましくは複数のコンパートメントにおける、結合剤および場合によりそれらのターゲットの共局在に関する情報は、ペアワイズ結合され、ヌクレオチドに翻訳される。結合剤および場合によりそれらのターゲットの同一性はまた、ヌクレオチド配列から決定することができる。この情報は、シークエンシングにより明らかにすることができる。
【００２１】
本発明はまた、ターゲット分子相互作用に対するアンタゴニストな（妨害する）またはアゴニストな（促進する）化合物の効果を分析し、特徴づける方法を記載する。本方法は、化合物の存在下および非存在下で、結合剤およびそれらのターゲット（例えばタンパク質）の同定に基づく。結合剤およびそれらのターゲットの間で形成される複合体の検出および結合剤の同定は、その後ヌクレオチドに翻訳される結合ターゲット特異的な結合剤の特有の識別配列のペアワイズ結合により、好ましくは複数のコンパートメントにおいて、行われる。複合体の量の変化ならびに結合剤および場合により関与するターゲットの同定は、シークエンシングにより明らかにすることができる。
【００２２】
結合剤は、好ましくは抗体、またはアプタマーである。
【００２３】
好ましくは、結合剤は、抗体ディスプレイライブラリ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）または抗体のライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）のメンバーであり、各抗体は前記特有のヌクレオチド配列でラベル化されている。
【００２４】
好ましくは、ターゲットはまた、特有のヌクレオチド配列に関連している。
【００２５】
複合体における結合剤に関連するヌクレオチド配列は、複合体における第２の結合剤に関連する第２のヌクレオチド配列と結合することができる。この方法は、ただ一つのターゲットに結合する複数の結合剤を同定するために使用することができる。例えば、ターゲットがタンパク質の場合、本方法は、タンパク質上の異なるエピトープに結合する抗体を同定することができる。または、ターゲットは、タンパク質複合体であってもよく、本方法は、複合体内の異なるタンパク質に結合する複数の結合剤を同定することができる。例えば、結合剤／ターゲット複合体における１つの結合剤に関連するヌクレオチド配列は、結合剤／ターゲット複合体における第２の結合剤に関連するヌクレオチド配列と結合することができる。結合剤の同一性が（結合配列から）識別されると、ターゲットの成分、ひいては例えば天然に相互作用するターゲットにおけるタンパク質を同定することが可能でありうる。例えば、結合剤が既知の結合特性を有する抗体である場合、抗体によって結合されたタンパク質は、同定することができる。したがって、ターゲット内のタンパク質の同一性を同定することができる。これにより、サンプル内のタンパク質−タンパク質相互作用を検出して同定することができる。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用が同定されると、本方法は、相互作用に対する化合物の効果をモニターするために使用することができる。
【００２６】
あるいは、結合剤／ターゲット複合体における結合剤に関連するヌクレオチド配列は、結合剤／ターゲット複合体内のターゲットに関連するヌクレオチド配列と結合することができる。この方法は、どの結合剤がどのターゲットと相互作用するのかを同定するために使用することができる。例えば、結合剤ライブラリのどのメンバーが既知のターゲットと複合体を形成しうるかを同定するために使用することができる。この情報は、結合剤ライブラリのメンバーを特徴づけるために使用して、結合特性情報を得ることができる。
【００２７】
好ましくは、前記ランダム対の結合核酸生成物の生成は、少なくとも２つのペアのＰＣＲプライマーを利用して、同一または非同一の単位複製配列を増幅することを含む；ＰＣＲプライマーの５’末端は、配列タグを有し、タグプライマーによる増幅は、ランダム対の結合核酸生成物をもたらす。より好ましくは、増幅は、エマルジョンＰＣＲ増幅であり、前記単位複製配列の生成およびランダム対の結合核酸生成物は、パラレルプロセスである。
【００２８】
好ましくは、前記結合増幅生成物の前記シークエンシングは、高度なパラレルシークエンシング方法である。
【００２９】
本発明の方法は、結合剤およびターゲット間の相互作用または２以上のターゲット分子間の相互作用に対する化合物の影響を調べるために使用することができる。結合剤とターゲットとを接触させる工程は、化合物の存在下または非存在下で、行うことができ、結果は、化合物が結合剤およびターゲット間またはターゲット分子間の結合相互作用をもたらすのかどうかを決定するために比較された。この方法は、医学的疾患および状態を治療するために使用することができる潜在的な医薬品を同定するために利用することができる。
【００３０】
本発明はまた、
（ｉ）前記結合剤ライブラリの各メンバーが特有のヌクレオチド配列に関連する結合剤ライブラリ；ならびに
（ｉｉ）前記結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列を結びつけるための少なくとも２つのペアのプライマーのセット；および任意に使用説明書
を含む、本発明の方法を行うためのキットを提供する。
【００３１】
キットは、タンパク質ディスプレイライブラリをさらに含むことができ、前記ライブラリの各メンバーが特有のヌクレオチド配列に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、本発明の方法および組成物を用いてタンパク質−タンパク質相互作用を検出するためのアッセイの一般的原理を示す。所定の結合特性情報を有する抗体ライブラリのファージは、相互作用するタンパク質の結合情報を明らかにするために使用される。結合情報は、ＰＣＲ二量体化（ＰＣＲ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）により複数のコンパートメントにおいて決定される。ファージは、それらの特有のＤＮＡを放出する過程で溶解される。これらの特有の配列は、ユニバーサルプライマーを用いて増幅され、二量体化される。結合情報をコードする二量体化生成物は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により配列決定され、結合タンパク質同定は、その認識された結合ターゲットの同一性含む既知の結合特性を有する特異的なファージの検出に基づいて決定される。
【図２】図２は、結合剤の特性解析のためのアッセイの一般的原理を示す−本発明の方法および組成物を用いて結合剤核酸ラベル同一性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とその認識された結合ターゲットの同一性を含むその結合特性情報とを関連付ける。ｃＤＮＡディスプレイおよび抗体ディスプレイファージは、互いに結合される。結合情報は、ＰＣＲ二量体化により複数のコンパートメントにおいて決定される。ファージは、それらの特有のＤＮＡを放出する過程で溶解される。これらの特有の配列は、ユニバーサルプライマーを用いて増幅され、二量体化される。結合情報をコードする二量体化生成物は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により配列決定され、ｃＤＮＡのタンパク質同一性は、データベースサーチによる配列から決定され、結合剤核酸ラベル同一性に関連する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
理想的な方法は、時間および費用対効果の高い方法でインタラクトームから情報を捕捉して、ランダムサンプリングおよび高い冗長性のサンプリングを可能にする。この方法は、大きく、複数ユニットのタンパク質複合体であっても、定性的な相互作用データの包括的なカバレッジを提供する。このデータは、オリジナルの細胞の状況で得られ、よってネイティブなタンパク質−タンパク質相互作用を測定でき、動的な相互作用を検出するために使用することができる。本方法は、非特異的な、誤って相互作用するタンパク質などの、ランダムな変数の影響を抑制する。また、例えば自己結合または特異的結合などのオリジナルのタンパク質−タンパク質相互作用以外の検出原理に関与する任意の結合事象関連効果である変数の影響を減少させる。
【００３４】
本発明の一実施形態は、図１にまとめられており、アッセイシステムの異なるコンポーネントを以下で詳述する。本発明のさらなる実施形態は、図２にまとめられており、前記システムのさらなるコンポーネントを以下で詳述する。
【００３５】
本発明は、結合剤とターゲットとの間の結合相互作用を決定する方法であって、
ａ）結合剤／ターゲット複合体を形成できるように結合剤ライブラリとターゲットとを接触させること、この際、前記結合剤ライブラリの各メンバーは、特有のヌクレオチド配列に関連している；
ｂ）前記結合剤／ターゲット複合体を分離すること；
ｃ）前記結合剤／ターゲット複合体において結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列を結びつけて連結ヌクレオチド配列を形成すること；
ｄ）前記連結ヌクレオチド配列から前記複合体に存在する前記結合剤を同定すること、
を含む、方法を提供する。
【００３６】
本方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。
【００３７】
結合剤
好ましくは、結合剤は、抗体、アプタマーであり、または人工的なタンパク質の骨組（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）に基づく。または、結合剤は、化合物でありうる。結合剤は、抗体ディスプレイライブラリまたは抗体のライブラリのメンバーであり得、各抗体は、特有のヌクレオチド配列でラベル化される。本方法は、結合剤としてディスプレイ抗体を使用してもよく、結合特性、例えば結合剤（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇｅｎｔ）が結合するターゲットが既知であるもの、および複数のディスプレイ抗体剤に関連する特有のヌクレオチド配列は決定され、結合特性および特有のヌクレオチド配列は、相互に創刊する。したがって、本発明は、結合特性を決定し、それらと複数のディスプレイ抗体剤の識別可能な特有のヌクレオチド配列とを関連付ける方法を提供する。これは、結合特性情報を提供する。
【００３８】
本発明で使用される結合剤は、抗体でありうる。本明細書で使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち天然にまたは部分的もしくは完全に合成的に生産されたであろうとなかろうと、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、天然にまたは完全にもしくは部分的に合成であろうとなかろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のペプチド、および抗体結合ドメインまたはそのホモログである結合ドメインを有する任意のペプチドまたはタンパク質を含む、抗体断片、誘導体、機能的均等物および抗体のホモログ、ヒト化抗体を含む。したがって、別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、またはその等価物が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）およびそれらのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；ならびにダイアボディである。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。
【００３９】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｂ細胞によって生成された免疫グロブリン（抗体）の可変鎖の一部であり、これらの分子は、それらに特異的な抗原に結合する。前記分子の最も可変な部分として、ＣＤＲは、免疫グロブリンによって生成される抗原特異性の多様性にとって極めて重要である。免疫グロブリンの可変ドメインのアミノ酸配列に不連続に配置された３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が存在する。免疫グロブリンは、通常２つの可変領域（２つの異なるポリペプチド鎖である重鎖および軽鎖）から構成されるため、各抗原レセプターに対して６つのＣＤＲが存在し、集団として抗原と接触することができる。
【００４０】
全抗体の断片が抗原に結合する機能を発揮できることが示されている。結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６  （１９８９））；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合したＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを結合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーにより結合している（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８））；二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合により構成された多価または多特異的断片（ＷＯ９４／１３８０４；  Ｐ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））である。
【００４１】
「抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）」は、抗原の一部もしくは全部と特異的に結合するまたは抗原の一部もしくは全部と相補的である領域を含む抗体の一部である。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の部位にのみ結合でき、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、１以上の抗体可変ドメインによりもたらされるであろう。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むことができる。
【００４２】
または、結合剤は、人工的なタンパク質の骨組に基づくことができる。タンパク質の骨組は、関心のあるターゲット分子の結合部位をもたらすように改変された安定した、溶解性の天然タンパク質構造に由来する。人工的なタンパク質の骨組の例は、特に制限されないが、２つのα−へリックスの結合海綿をもたらすブドウ球菌プロテインＡのＺ−ドメインに基づく、アフィボディ（Ｎｙｇｒｅｎ，Ｐ．Ａ．（２００８）．ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７５（１１）：２６６８−７６）；ベータ−バレルフォールドのオープンエンドでの小さなリガンドの結合部位を組み込んだリポカリンに由来する、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（２００８）ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７５（１１）：２６７７−８３）、ナノボディ、およびＤＡＲＰｉｎである。人工的なタンパク質の骨組は、通常抗体と同じ抗原タンパク質に結合するように標的化される。短いペプチドはまた、ターゲットタンパク質に結合するために使用することができる。フィロマー（ｐｈｙｌｏｍｅｒ）は、細菌ゲノムに由来する天然構造ペプチドである。このようなペプチドは、タンパク質構造の折り畳みの多様なアレイを表し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質−タンパク質相互作用を阻害／妨害するために使用することができる（Ｗａｔｔ，Ｐ．Ｍ．（２００６）．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４（２）：１７７−８３）］。
【００４３】
または、結合剤は、アプタマーであってもよい。アプタマーは、形状相補性および非共融化学結合の組み合わせにより高い親和性および特異性でターゲット分子を認識する合成オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である（Ｂｌａｎｋ＆Ｂｌｉｎｄ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００５，９：３３６-３４２）。これらの人工リガンドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に入手が容易であり、単なるイオン（例えばＰｂ２＋，Ｌｉｕ＆Ｌｕ，２００３．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，１２５，６６４２−６６４３）からヌクレオチド、小分子、タンパク質、ウイルスおよび細胞まで生物全体におよぶ多種多様な異なる分子クラスを認識するために開発することができる（Ｍｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３５９−３７３）。高い結合親和性アプタマーは、いろいろあるが、テオフィリン（Ｊｅｎｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，１４２５−１４２９）、Ｌ−アルギニン（Ｇｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，１０２９−１０３６）、モエノマイシン（Ｓｃｈｕｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，９２，２５５７−２５６３）、１７ｂ−エストラジオール（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，２２，２５２５−２５３１）のような低分子量分子のためだけではなく、トロンビン（トロンビン結合アプタマー：５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’）（Ｂａｌｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００４，７６，２３，７０５３−６３）、コレラ毒素またはＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質のようなより大きな分子の検出ために既知のＳＥＬＥＸ法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ＆Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９０．Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２）により選択されている（レビューについては、Ｔｏｍｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｍｏｌｅｃ  Ｅｎｇ．，２４，１９１−２００を参照）。上記アプタマーのいくつかは、マイクロプレートまたはバイオセンサートランスデューサー（ＱＣＭ、ＳＰＲ）の表面でのＥＬＩＳＡ様アッセイにおいて使用されている。アプタマー修飾ＡｕＮＰ比色分析システムはまた、サンドイッチに基づくアッセイでのタンパク質ＰＤＧＦの決定のために開発されている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，７７，５７３５−５７４１）。
【００４４】
結合剤は、例えば細菌ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、バクテリオファージディスプレイ、アプタマー、リボソームディスプレイまたはイーストディスプレイライブラリのようなディスプレイ結合剤ライブラリなどのライブラリの一部であってもよい。好ましくは、前記ディスプレイ結合剤ライブラリは、抗体バクテリオファージディスプレイライブラリである。ライブラリは、十分に大きくすべきであり、そのようにしてライブラリは、ターゲットサンプル内の関心のあるターゲットの少なくとも７５％に結合すると期待される複数の結合メンバーから構成される。より好ましくは、ライブラリは、サンプル内の関心のあるターゲットの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％または９９％に結合するように設計される。例えば、結合剤ライブラリは、サンプル内の期待または所望のタンパク質の９５％以上のカバレッジを有するタンパク質またはペプチド配列に対する複数の結合メンバーを含む。このようなライブラリは、文献に記載されている。ライブラリの各メンバーは、ライブラリの１つのメンバーに特有である、検出可能な、核酸同一性ラベルを有する。好ましくは、特有の核酸同一性ラベルは、結合されている。「結合（ｌｉｎｋｅｄ）」とは、結合プロセスが適切なアッセイ条件下、核酸同一性ラベルの共局在に基づいて、ランダムな多量体核酸生成物を形成する可能性を有することを意味する。好ましくは、多量体生成物は、二量体である。適切なアッセイ条件は、例えば脂質エマルジョン中での熱処理による、好ましくは分離コンパートメントでのバクテリオファージ粒子の解体を含み、特有の配列の特異的なコンセンサス増幅は、結合可能な単位複製配列を生成する。結合可能な単位複製配列、例えば結合ディスプレイ特異的核酸ドメインの連結は、同一性ラベルの共局在情報をコードする、結合同一性ラベルを形成する。好ましくは、特有の配列は、結合ディスプレイ特異的核酸ドメイン、例えば１以上のＣＤＲ領域をコードする配列である。連結反応は、増幅に基づくものでもよく、他の技術を含むものでもよい。増幅に基づく連結は、同一の結合能力を有するが、ポリメラーゼ伸長可能な核酸二本鎖の形成をもたらす相補的５’タグまたは二量体リンカー配列を有する、２以上の増幅プライマー対を利用することができる。前記タグまたは二量体リンカー配列は、１つのプライマー対によって増幅された配列が第２のプライマー対によって増幅された配列とハイブリダイズするであろうことを意味する。これにより、同一性ラベルが連結される。
【００４５】
結合剤ライブラリの各メンバーは、結合剤を同定するために使用できる特有のヌクレオチド配列に関連している。本明細書で使用される「関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」とは、複合体中の結合剤の存在が本方法により生成された結合配列内の核酸配列の存在によって検出できることを意味する。ヌクレオチド配列は、結合剤にラベルとして結合してもよく、結合剤自体、例えばアプタマーの一部であってもよく、結合剤内、例えばファージ内の核酸内に存在してもよい。例えば、ライブラリの各メンバーは、特有のヌクレオチド配列でラベル化される。本明細書で使用される場合、「ラベル化（ｌａｂｅｌｌｅｄ）」とは、ライブラリのメンバーに結合されるヌクレオチド配列を言う。抗体などの結合剤または化合物にヌクレオチドを結合させる方法は、当技術分野で公知である。または、結合剤ライブラリがディスプレイライブライである場合、上述のとおり、特有のヌクレオチド配列は、１以上のＣＤＲ領域またはディスプレイ結合ドメインをコードする配列であり得る。例えば、ディスプレイライブラリは、既知の位置で、ファージにディスプレイされたアミノ酸配列をコードする配列を挿入することによって生成することができる。次に、挿入された配列を増幅するであろうユニバーサルプライマーを使用して、結合配列を同定することができる。または、結合剤がアプタマーである場合、アプタマー自体が特有のヌクレオチド配列であり得る。
【００４６】
ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドであり、ＲＮＡまたはＤＮＡ、一本鎖または二本鎖を含むことができる。結合剤またはターゲットをラベル化するために用いられるヌクレオチドは、通常長さが５〜１５０塩基、例えば長さが１０〜４０または２０〜３０塩基である。核酸を形成するヌクレオチドは、分子の安定性を増加させる、そのバイオアベイラビリティを改善する、またはさらなる活性をそれに付与するために化学的に修飾することができる。例えば、ピリミジン塩基は、６または８位で、プリン塩基は、５位で、ＣＨ３またはＩ、ＢｒもしくはＣｌなどのハロゲンで修飾することができる。修飾またはピリミジン塩基はまた、２ＮＨ３、Ｏ６−ＣＨ３、Ｎ６−ＣＨ３およびＮ２−ＣＨ３を含む。２位の修飾は、糖修飾であり、一般にＮＨ２、ＦまたはＯＣＨ３基を含む。修飾はまた、キャッピング３’および５’修飾を含む。
【００４７】
または、モルホリノヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの修飾ヌクレオチドを使用できる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、それぞれが６員モルホリノ環に結合した４つの遺伝子塩基（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン）の一つを含む、異なるモルホリノサブユニットから構築される。前記サブユニットは、非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間結合により連結され、モルホリノオリゴヌクレオチドを与える。ＬＮＡモノマーは、フラノース環配座が２’−Ｏ位を４’−Ｃ位に連結するメチレンリンカーによって制限されることを特徴とする。ＰＮＡは、ＤＮＡのアナログであり、主鎖が糖ではなく擬ペプチドである。
【００４８】
好ましくは、結合剤は、好ましくは異なる見かけの親和性で、１より多くのターゲットを検出することができる。または、結合剤は、好ましくは異なる見かけの親和性で、異なるエピトープまたは結合部位を用いてただ一つのターゲットを検出することができる。
【００４９】
抗体ファージライブラリのメンバーの結合特性は、あらかじめ決定することができる。例えば、どのエピトープがファージの結合剤（抗体）をコードされ発現されたＣＤＲによって結合されているかを決定することができる。この情報は、ＣＤＲをコードする特有のヌクレオチド配列に関連付けることができる。したがって、ファージにより発現された抗体により結合されたエピトープは、特有のヌクレオチド配列の配列から同定することができる。結合したターゲットに存在するエピトープ配列が分かると、タンパク質または結合したタンパク質の群を同定することができるであろう。
【００５０】
特有のヌクレオチド配列でラベル化されたエピトープまたは特有のヌクレオチド配列でラベル化されたエピトープライブラリを用いて抗体ファージライブラリのメンバーの結合特性を決定することができるであろう。
【００５１】
ターゲット
本明細書で使用される「ターゲット（ｔａｒｇｅｔ）」は、結合剤と複合体を形成する分子または分子の群である。複合体は、通常関心のある生物の通常の生理学的条件下で形成される。
【００５２】
好ましくは、ターゲットは、タンパク質を含む。より好ましくは、ターゲットは、タンパク質サンプルの一部である。タンパク質サンプルは、タンパク質ディスプレイライブラリを含むことができ、好ましくは、前記ライブラリの各メンバーは特有のヌクレオチド配列に関連している。好ましくは、前記タンパク質ディスプレイライブラリは、ｃＤＮＡファージディスプレイライブラリである。場合によっては、ターゲットは、複数のターゲット、例えばタンパク質サンプル内の他のターゲットと架橋結合してもよい。例えば、サンプル内のタンパク質は、サンプル内の１以上の他のタンパク質と架橋結合してもよい。
【００５３】
ターゲットは、既知のターゲットであり得る。ターゲット内で複合体を形成する結合剤は、同定することができ、ターゲットと相互作用する化合物を含む。または、ターゲットは、未知であってもよく、本発明の方法は、ターゲット、互いに相互作用する複数のターゲット分子を同定するために使用される。
【００５４】
ターゲットは、特有のヌクレオチド配列に関連してもよい。「関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」とは、結合剤／ターゲット複合体内のターゲットの存在が本方法により生成された結合配列内の核酸配列の存在によって検出することができることを意味する。ヌクレオチド配列は、ターゲットにラベルとして結合してもよく、ターゲット内、例えばファージ内の核酸に存在してもよい。または、ヌクレオチド配列は、ターゲットに結合することが知られているアプタマーの一部であってもよい。結合剤／ターゲット複合体は、アプタマーと接触させて、アプタマーを含む、特有のヌクレオチド配列の結合を介して存在するターゲットを同定することができる。
【００５５】
本発明のアッセイは、任意のタンパク質サンプルに適用することができる。タンパク質は、特に制限されないが、組織、細胞学的標本、体液、細胞培養物またはその他のタンパク質複合体含有物質を含む、いかなる生物学的標本に由来することができる。体液サンプルは、血液、唾液、尿、脳脊髄液、または血清を含む。または、サンプルは、組み換え発現法により作製することができる。標本からのタンパク質の調製は、この分野で公知の標準的な方法を用いて行うことができる。標本は、抽出の前に化学的に処理することができ、例えば固定化学物質または架橋剤を使用できる（例えば、ＢＳ３−（ビス（スルホスクシンイミジル）スべレート）。タンパク質サンプルは、架橋されていても、架橋されていなくてもよい。または、タンパク質は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写−翻訳系により、または組み換え発現系により製造することができる。実験目的および研究中のタンパク質−タンパク質相互作用のタイプによって、タンパク質は、変性もしくは非変性形態および／または架橋もしくは非架橋形態のいずれかで分析することができる。タンパク質サンプルは、複数の条件で分析して、複数のタンパク質−タンパク質相互作用の定量的な結合特性に関する情報を収集することができる。例えば、結合剤の濃度または量は、解離定数および他の動力学的パラメータを決定するために変化させることができる。
【００５６】
タンパク質混合物をあらかじめ選択することもできる。例えば、タンパク質混合物は、例えば、特定の細胞部位からのタンパク質、同じようなサイズまたは正電荷の特定の細胞型からのタンパク質、同じような結合特性、同じような配列特性、または同じような機能（例えば、酵素）を有するタンパク質など、特定のタンパク質の濃縮物でもよい（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）２０．０．１−２０．０．６  ＣＨＡＰＴＥＲ  ２０  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．）。好ましくは、特定のタンパク質は、リンタンパク質、膜タンパク質または天然の翻訳後に人工的に修飾されたタンパク質を含む。本方法のタンパク質混合物中のタンパク質は、変性もしくは未変性および／または架橋もしくは非架橋でありうる。
【００５７】
タンパク質は、タンパク質ディスプレイライブラリの形態であってもよい。例としては、細菌ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、バクテリオファージディスプレイ、およびリボソームディスプレイならびに酵母ディスプレイライブラリを含む。好ましくは、タンパク質ディスプレイライブラリは、タンパク質バクテリオファージライブラリであり、より好ましくはｃＤＮＡファージディスプレイライブラリである。ライブラリは、サンプルにおいて、本方法により検出されると予想されるタンパク質の少なくとも７０％のカバレッジを有する複数のペプチドまたはタンパク質メンバーからなるように、十分に大きくすべきである。より好ましくは、ライブラリは、サンプルにおけるタンパク質またはペプチドの７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれ以上のカバレッジを提供するのに十分な大きさである。好ましくは、ディスプレイライブラリは、任意の適切な生物学的実体、例えば組織サンプルまたは生物全体のカバレッジ、例えば、任意の適切な生物学的実体の９５％以上のタンパク質カバレッジを提供する。このようなライブラリは、文献に記載されている（Ｄａｎｎｅｒ  Ｓ，Ｂｅｌａｓｃｏ  ＪＧ．Ｔ７  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００１  Ｎｏｖ  ６；９８（２３）：１２９５４−９．Ｅｐｕｂ  ２００１  Ｏｃｔ  ２３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１１６０６７２２；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６０８０６．）。ライブラリの各メンバーは、特有のヌクレオチド配列に関連しており、すなわち各メンバーは特有の検出可能な、核酸同一性ラベルを有する。好ましくは、特有の核酸同一性ラベルは、結合されている。「結合（ｌｉｎｋｅｄ）」とは、結合プロセスが適切なアッセイ条件下、核酸同一性ラベルの共局在に基づいて、ランダムな多量体核酸生成物を形成する可能性を有することを意味する。好ましくは、多量体生成物は、二量体である。適切なアッセイ条件は、例えば脂質エマルジョン中での熱処理による、好ましくは分離コンパートメントでのバクテリオファージ粒子の解体を含み、特有の配列の特異的なコンセンサス増幅は、結合可能な単位複製配列を生成する。結合可能な単位複製配列、例えば結合ディスプレイ特異的核酸ドメインの連結は、同一性ラベルの共局在情報をコードする、結合同一性ラベルを形成する。連結反応は、増幅に基づくものでもよく、他の技術を含むものでもよい。増幅に基づく連結は、同一の結合能力を有するが、ポリメラーゼ伸長可能な核酸二本鎖の形成をもたらす相補的５’タグまたは二量体リンカー配列を有する、２以上の増幅プライマー対を利用することができる。前記タグまたは二量体リンカー配列は、１つのプライマー対によって増幅された配列が第２のプライマー対によって増幅された配列とハイブリダイズするであろうことを意味する。これにより、同一性ラベルが連結される。
【００５８】
同一性ラベル、すなわちタンパク質ライブラリ、抗体ライブラリなどの結合剤ライブラリおよびターゲットライブラリで使用される関連する特有のヌクレオチド配列は、それらの生物学的背景が異なり得るため、増幅および連結プロセスは、２つの異なるプライマー対に基づき、例えば１つのプライマー対は、ｃＤＮＡに基づく同一性ラベルなどのターゲット配列を増幅し、第２のプライマー対は、同一性ラベルとして用いられる結合剤特異的なヌクレオチド配列を増幅する。異なるラベルを結合することにより、結合剤特異的な情報をターゲット情報（例えばディスプレイされたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質）に結合することが可能になる。このプロセスの例を図２に示す。
【００５９】
一つの結合剤、好ましくはディスプレイされた抗体ファージは、特異的なターゲット、例えばディスプレイタンパク質ターゲットおよび対応するタンパク質を認識できる。これは、特異性と呼ばれる。または、複数の結合剤は、特異的なターゲット（例えばディスプレイタンパク質および対応するタンパク質）などの一つのターゲットを認識しうる。これは、冗長性と呼ばれる。同様に、一つの結合剤は、例えばタンパク質コンフォメーションまたはタンパク質配列に起因するターゲットコンフォメーションの類似性に基づいて、タンパク質種のような１より多くのターゲットを認識できる。これは、交差反応性と呼ばれる。さらに、ターゲットタンパク質の結合剤認識は、タンパク質のコンフォメーションまたはそのタンパク質配列に基づく。これは、その反応性として知られる。ディスプレイされた結合剤などの結合剤のタンパク質結合親和性は、シークエンシングデータセットの定量的情報から算出することができる。ディスプレイされた結合剤のメンバーの所定の結合特性は、算出された親和性で特異性と冗長性を有する反応性および交差反応性を含むであろう。
【００６０】
これらの尺度を使用して、検出されたターゲット−ターゲット、例えばタンパク質−タンパク質相互作用を算出することができる。反応性、特異性および冗長性ならびに結合同一性ラベルの同一性および豊富さのインプットに基づく計算により、特異的なターゲット−ターゲット、例えばタンパク質−タンパク質相互作用の洞察が得られる。同様に、これらの尺度を使用して、交差反応性によって誘発される計算の不確実性を減少させることができ、この際ディスプレイされた抗体剤の冗長性および親和性が考慮される。多様な濃度の結合剤および／またはターゲットは、タンパク質−タンパク質相互作用のような複数の相互作用の定量的なパラメータを計算するために使用することができる。したがって好ましくは、本方法は、異なる濃度の結合剤および／またはターゲットを用いて行われる。
【００６１】
検出の定量的性質は、同一性ラベルの非特異的な共局在化または同じ同一性ラベルの自己結合により生成された、バックグラウンドの無情報なシークエンシングリードの決定および計算を可能にする。しかし、自己結合ラベルの検出は、データセットの品質に関する情報を含む。
【００６２】
十分なカバレッジを達成するために、濃縮されたライブラリを使用できる。結合剤ライブラリおよび／またはターゲットライブラリの両方を濃縮できる。タンパク質などのディスプレイされたターゲットは、実験的背景におけるすべての潜在的な結合パートナーをカバーするように濃縮することができる。同様に、ディスプレイされた結合剤は、実験的背景における検出可能なターゲットに向けて濃縮された結合特異性を有するように選択することができる。例えば、ライブラリは関心のある特異的なターゲットに限定してもよい。これは、パンニングに基づく選択によって行うことができ、例えば制御された複雑さを有するターゲットサンプルを固体表面上に固定化し、結合した剤（ｂｏｕｎｄ  ａｇｅｎｔ）の洗浄およびその後の溶出によって結合剤ライブラリの結合した剤を選択する結合剤ライブラリと接触させる。同様に、制御された複雑さを有する結合剤サンプルを固体表面に固定化し、結合した剤の洗浄およびその後の溶出によってターゲットライブラリの結合した剤を選択するターゲットライブラリと接触させる。
【００６３】
好ましくは、濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）は、自己結合したディスプレイされた結合剤の除去、すなわちアッセイ条件下で他の結合剤に結合する結合剤の除去を意味する。より好ましくは、濃縮は、ディスプレイされた結合剤の複雑さの減少を意味するが、実験的背景におけるターゲットの検出のための高いカバレッジを有することを確保する。複雑さを低減するには、ライブラリ内のメンバーの総数を減らすこと、非ターゲットタンパク質に結合するメンバーを除去すること、または関心のあるターゲットに結合するメンバーのみを選択することが挙げられる。
【００６４】
結合剤ライブラリは、関心のある成分を含むタンパク質混合物を得ることにより濃縮することができ、例えば既知のタンパク質−タンパク質相互作用を研究し、それらの相互作用を動的に検証すること、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト化合物の影響を試験することを含む。例えば、関心のあるターゲットを固定化すること、例えば固体表面上のタンパク質複合体は、結合剤ライブラリのメンバーの所望のターゲット、例えばタンパク質への結合を可能にする。関心のあるターゲットに結合した結合剤は、希釈または他の手段によって未結合の結合剤から分離することができる。結合剤ライブラリの結合したメンバーは、本発明の方法において、上記複雑さの低いライブラリとして、溶出して、使用することができる。
【００６５】
分離方法（例えば、マイクロアレイまたはエマルジョンに基づく分離）が一つのコンパートメント内の個々の複合体を生成するために、限られた能力を有し、結合した同定可能な配列を得ることができるため、濃縮した結合剤ライブラリを用いることは、一般的に有利である。濃縮したディスプレイ剤ライブラリの複雑さの減少は、分離に基づく、ランダム対の、連結された増幅産物を得るために実施される必要がある分離の数に対して直接的に翻訳可能である。
【００６６】
結合剤の結合
本発明の方法は、相互作用がオリジナルの状況、すなわち細胞内に存在するのと同じ条件において検出することができるように、好ましくは生理学的条件下で行われる。これは、自然に発生する結合相互作用に関する情報を提供する。
【００６７】
結合剤をターゲットと接触させる工程は、公知の緩衝系、例えばタンパク質−タンパク質相互作用の研究のために既に使用されている緩衝系（例えば、ＴＢＳＴ−バッファー）で通常行われる。親和性に依存して、反応は、室温または４℃で行うことができる。再現性のあるシグナルを得るために、最適な時間、最適な温度およびその他のアッセイ条件は、結合、洗浄および検出工程を含めて決定される。最適な条件は、当業者によって決定することができる。
【００６８】
結合してディスプレイされた抗体剤を有するタンパク質複合体の分離
結合剤／ターゲット複合体は、分離する必要があり、すなわちラベル配列、すなわち関連する特有のヌクレオチド配列を結合する前に、他の複合体から分離される。分離は、当技術分野で公知の方法によって行われる。例えば、分離は、希釈、特異的な結合、または物理的および／もしくは化学的特性による分離によって行うことができる。好ましくは、複合体は、エマルジョン液滴、マイクロキャビティなどのようなコンパートメント、好ましくは拡散律速または分離コンパートメントに分離される。
【００６９】
好ましくは、前記分離は、固体表面結合、希釈もしくは他のものの分離、または拡散律速もしくは分離コンパートメントのいずれか１つ以上を提供することを含む。分離は、コンパートメントにおける結合していない結合剤の数を制限し、好ましくは平均して１である。例えば、コンパートメントにおける結合していない結合剤の平均数は、１である。コンパートメントは、エマルジョン内の個々の液滴、またはマイクロキャビティなどの個々の物理的なチャンバーであってもよい。複合体は、物理的または化学的特性に従って分離することができる。好ましくは、前記希釈は、限界希釈である。
【００７０】
コンパートメント化（例えば、多数の反応の効果的な分離または単離）は、ただ一つの結合していないファージの分離に基づくポアソン分布に基づく；例えば、エマルジョンおよびマイクロアレイは、最もよく知られた最先端の方法である。
【００７１】
さらなる分析の前に、結合剤／ターゲット複合体を十分に分離することにより、結合剤の共局在に基づく、核酸ラベルの対が生成される状況が提供されるであろう。複合体が十分に分離されない場合、異なる複合体のメンバーからの核酸ラベルは、結合され、よって偽情報を提供するであろう。分離は、非特異的で共局在化の核酸同一性ラベルの量を減少させ、特に複合体タンパク質混合物が研究される場合、特異的な結合パートナーの同定を可能にする。例えば、分離は、平均してコンパートメントあたりただ一つの結合していない結合剤をもたらすことができ、結合は、自己結合ヌクレオチド配列のみを提供し、結果的に結合剤ライブラリのメンバー間のランダムな結合の可能性を減少させるであろう。いずれの剤の分布もポアソン分布に基づくので、剤の適切な分離を達成するために必要な尺度は、計算することができる。好ましくは、これは、一つのコンパートメント内にただ一つの複合体をもたらす。好ましくは、エマルジョンが使用され、特異的な核酸ドメインの増幅および結合を利用して、結合同一性ラベルを形成することができる。エマルジョン増幅法は、当業者に公知である（例えば、Ｓｃｈｕｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１１  Ｍａｒｃｈ  １；４１０（１）：１５５−７）。
【００７２】
固定化のための固体表面
結合剤／ターゲット複合体は、分離後に固定化されてもよい。例えば、結合剤／ターゲット複合体は、例えばアレイの一部として、表面上に捕捉することができる。これは、複合体間の分離を維持するのに役立つことができる。好ましくは、複合体の分離は、例えば、結合工程の間維持される。
【００７３】
結合剤／ターゲット複合体は、制限されないが、膜（例えば、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）もしくはニトロセルロース）、プラスチック表面（例えば、ポリスチレン）を含む固体支持表面上に固定化されてもよく、または適切なビーズ（例えば、エポキシ活性化ビーズ）に共有結合させることができる。固体表面への結合またはカップリングは、タンパク質のための標準的な方法によって（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．”Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，およびＬａｎｅ，Ｄ．，ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．，１９８８）、または抗体または他の特異的な結合剤（例えば、ビオチン−アビジン）を含む特異的な結合によって行われる。
【００７４】
固定化は、（ａ）広く認められたタンパク質複合体結合能力を有する固定支持体を得ることを含むことができ、すなわち、固定支持体は、結合剤ライブラリまたはターゲット分子の全てのメンバーに結合することができる。認められたタンパク質複合体の量および固定支持体上の利用可能な結合部位の数は、結合して認識されたタンパク質複合体間の十分な分離を達成するようにバランスをとるべきである。好ましくは、前記固体支持体は、膜、プラスチック表面、またはビーズを含む。より好ましくは、固体支持体は、ビーズであり、分離は、平均して一つの結合剤／ターゲット複合体が一つのビーズに結合して、達成される。より好ましくは、広く認められたタンパク質複合体結合能力は、抗バクテリオファージ抗体によって提供される。好ましくは、分離は、反応チャンバーでの物理的分離またはエマルジョン内の液滴での物理化学的分離を含む。
【００７５】
好ましくは、前記ランダム対の結合核酸生成物は、少なくとも２つの対のＰＣＲプライマー利用して、同一または非同一の単位複製配列を増幅すること含み；この際、前記ＰＣＲプライマーの５’末端は、配列タグを有し、タグをつけたプライマーによる増幅は、ランダム対の結合核酸生成物をもたらす。より好ましくは、増幅は、エマルジョンＰＣＲ増幅であり、前記単位複製配列の生成およびランダム対の連結核酸生成物は、並行プロセスである。好ましくは、前記連結単位複製配列生成物の前記シークエンシングは、高度にパラレルなシークエンシング法である。分離は、結合同一性ラベルの特異的な形成を可能にし、この際分離または拡散律速コンパートメント（例えば、固体表面上、エマルジョン内）において共局在化する分子は、結合剤のみの同一性ラベル配列を特異的に結び付ける傾向を有する。しかし、結合していないが、偶然に共局在化された結合剤の同一性ラベルはまた、結合されてもよい。同様に、複合体内に結合していない結合剤からの同一性ラベルは、結合されてもよい。結合プロセスは、例えば、ただ１つの結合剤はコンパートメント内に存在する、２つの同一性識別ラベルを有する結合同一性ラベルを提供することができる。同様に、ターゲットを認識する１より多くの結合剤の場合、異なる結合同一性ラベルは、同じ結合特異性で製造することができる。結合工程は、存在する結合剤ライブラリの１以上のメンバーの同一性ラベルを結びつける。また、結合工程は、結合剤ライブラリのメンバーの同一性ラベルをターゲットに関連する核酸配列に結びつけることができる。結合プロセスは、例えば、互いにハイブリダイズすることによって、それらの近接度のために互いの核酸相互作用に依存しない。配列は、結合プロセスを用いることによって、例えば、本明細書に記載されているような増幅方法によって、一緒に結合される。ＵＳ７３０６９０４におけるもののような、物理的に近接するライゲーションアッセイによる代わりに、これらの方法の使用は、複数の相互作用を並行して検出することが可能になる。ラベルは、結合されて、検出されるために近接している必要はない。これらは、単純に同じコンパートメント内にあることを必要とする。
【００７６】
ヌクレオチド配列の結合
複合体のメンバーに関連する特有のヌクレオチド配列は、
（ｉ）少なくとも２つのペアのＰＣＲプライマーを用いて、結合剤に関連するヌクレオチド配列、および存在するのであればターゲットに関連する配列を増幅して、少なくとも２セットの単位複製配列を製造すること、この際前記プライマーは、第１のセットの単位複製配列が第２のセットの単位複製配列と相補的である配列を含む；
（ｉｉ）少なくとも２つのセットの単位複製配列をアニールすること；ならびに
（ｉｉｉ）増幅反応を行い、結合ヌクレオチド配列を生成すること、
を含む方法によって結合することができる。
【００７７】
工程ｉ〜ｉｉｉは、順次または同時に行うことができる。
【００７８】
各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む。これらのプライマーの配列は、同定可能な配列の増幅を可能にするように設計される。好ましくは、ユニバーサルプライマーであり、すなわちそれらは、ライブライ内の同定可能な配列の全て、例えば、結合剤ライブラリまたはターゲットライブラリの全てのメンバーに結合する。増幅されるプライマー間の配列は、ライブラリの１メンバーに特有のものであり、同定が可能である。好ましくは、ＰＣＲプライマーの対は、二量体化された結合核酸配列を生成するように設計され、そうでなければ、多量体の結合核酸配列を生成する。これは、二量体または多量体のメンバー単位複製配列を増幅する少なくとも２つのプライマーの５’末端に二量体リンカー配列を有することによって達成される。したがって、これらの単位複製配列は、それらの３’末端に部分的に重複し、ポリメラーゼ伸長可能なハイブリダイゼーション産物を形成することができる（例えば、図２に示す）。
【００７９】
好ましくは、増幅は、結合剤、または結合剤およびターゲットに関連するヌクレオチド配列の適切な分離を有するエマルジョンＰＣＲ増幅である。
【００８０】
１より多くの複合体からの結合ヌクレオチド配列は、存在する結合した結合剤および／またはターゲットを同定する前に、組み合わされてもよい。結合剤および／またはターゲットの同一性は、例えば、結合ヌクレオチド配列をシークエンシングすることによって決定することができる。これは、高度にパラレルなシステムを用いて行われる。結合配列は、全ての結合配列を同定するためにただ一つの反応を行うことができるように組み合わせることができる。例えば、結合ヌクレオチドの全ては、ただ一つの反応で配列を決定することができる。結合配列は、定量的に決定して、結合配列の相対存在量を測定することができる。
【００８１】
連結核酸産物の情報の決定
結合剤の所定の結合特性に基づいて、共局在化情報は、結合同一性ラベルから推測することができる。複数の結合同一性ラベル、すなわちシークエンシングリードのカウントの形態で、結合剤および場合によってターゲットに関連する特有のヌクレオチド配列は、結合剤／ターゲット複合体のメンバーの同一性およびそれらの相対存在量の情報を提供する。他の情報もまた、推測可能であり、この際すべての結合同一性ラベルの情報が考慮される。例としては、制限されないが、結合剤の相対親和性と所定の親和性との比較、異なる結合剤について計算された相対存在量の比較、結合および非結合の、ターゲットまたはタンパク質の比率の決定を含む。
【００８２】
抗体結合剤のＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の多量体ＰＣＲ結合（ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ＰＣＲ  ｌｉｎｋｉｎｇ）に基づいて、すべてのＣＤＲ領域の配列は、ＮＧＳシークエンシングを用いて決定することができる。結合剤の所定の結合特性は、好ましくはただ一つのＣＤＲ領域配列同一性に基づくので、１つの好ましい実施形態において、抗体結合剤の完全な配列情報は、その所定の結合特性に関連づけることができる。
【００８３】
複数のタンパク質−タンパク質相互作用に対する化合物の影響の決定
本発明の方法は、化合物の存在または非存在下で結合剤ライブラリとターゲットとを接触させる工程を含み；前記化合物が結合相互作用に影響を及ぼすかどうかを決定することができる。本方法は、複数の結合相互作用、例えばタンパク質−タンパク質相互作用に対する化合物または他の化学的部分の影響を決定するために使用することができる。好ましくは、本方法は、あるタンパク質−タンパク質または他の検出可能な相互作用を促進または妨害できる化合物または化学的部分検出するために使用され、この際前記化合物または化学的部分は、薬として作用する、またはそのような状況の病理学的結果を排除もしくは抑制する。好ましくは、このような薬は、制限されないが、癌、感染症、自己免疫疾患などを含む異なる疾患を治療するために使用することができる。
【００８４】
本明細書で使用される化合物は、共有結合によって結合された２以上の原子を言う。化学的部分は、化合物の一部であり、官能基を形成する。化合物は、公知の医薬品であってもよい。
【００８５】
本発明の方法は、化合物の存在または非存在下で結合剤ライブラリとターゲットとを接触させる工程を含み；前記化合物が結合相互作用に影響を及ぼすかどうかを決定することができる。
【００８６】
さらなる実施形態において、本発明は、インタラクトームデータを決定する方法を提供する。複数のコンパートメントでは、ディスプレイされた抗体剤などの結合剤がそれらの結合特性に従って共局在化する、すなわち２以上の結合剤は、それらが同じターゲットに結合する、またはターゲット自体が相互作用するもしくは互いに結合するターゲットに結合するとき、１つのコンパートメント内に存在する。それらの同定可能な配列、すなわち特有のヌクレオチド配列は、結合され、結合同一性の形態で共局在化情報を伝える。結合特性情報および共局在化情報に基づいて、タンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質の同一性両方に関する情報は、決定することができる。
【００８７】
本発明はまた、
（ａ）タンパク質混合物を得ること；
（ｂ）結合剤−タンパク質複合体ができるように結合剤ライブラリと前記タンパク質混合物とを接触させること、この際結合剤ライブラリの各メンバーは特有の核酸配列に関連する；
（ｃ）前記結合剤−タンパク質複合体を分離すること；
（ｄ）必要に応じて、前記結合剤−タンパク質複合体を固体表面上に固定すること；
（ｅ）前記結合剤−タンパク質複合体内の前記結合剤の前記特有のヌクレオチド配列を検出し、前記結合剤の前記特有のヌクレオチド配列を結合して、前記分離によってもたらされる共局在化に基づく結合核酸生成物を提供すること；
（ｆ）必要に応じて、前記結合核酸生成物を組み合わせること；ならびに
（ｇ）前記ディスプレイ抗体剤のタンパク質結合特性に対応する前記結合核酸生成物をシークエンシングすること、
を含む、得られた標本におけるタンパク質−タンパク質相互作用を決定するための方法を特徴とする。結合核酸生成物の配列は、前記標本における前記タンパク質混合物中のタンパク質−タンパク質相互作用の存在を推測するために使用される。特有のヌクレオチド配列は、同定される存在する抗体剤、および前記ディスプレイ抗体剤の対応するタンパク質結合特性を与える。
【００８８】
タンパク質−タンパク質相互作用データは、タンパク質−タンパク質相互作用のレベルのバックグラウンド判定（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）およびサブトラクション、見かけの相対親和性の決定、ならびにタンパク質およびタンパク質−タンパク質相互作用の相対量を含む、統計的手段によって検証することができる。
【００８９】
本発明はまた、
（ａ）化合物の存在または非存在下でタンパク質混合物を得ること；
（ｂ）結合剤−タンパク質複合体ができるように、結合剤ライブラリと前記タンパク質混合物とを接触させること、この際結合剤ライブラリの各メンバーは特有の核酸配列に関連する；
（ｃ）前記結合剤−タンパク質複合体を分離すること；
（ｄ）必要に応じて、前記結合剤−タンパク質複合体を固体表面上に固定すること；
（ｅ）前記結合剤−タンパク質複合体内の前記結合剤に関連する前記特有のヌクレオチド配列を検出し、前記結合剤に関連する前記特有のヌクレオチド配列を結合して、前記分離によってもたらされる共局在化に基づくランダム対の結合核酸生成物を提供すること；
（ｆ）必要に応じて、前記結合核酸生成物を組み合わせること；ならびに
（ｈ）化合物の存在または非存在において得られた情報を比較すること；
を含む、標本において存在するタンパク質−タンパク質相互作用に対する化合物の影響を決定するための方法に関する。
【００９０】
結合剤の特有のヌクレオチド配列は、存在する結合剤を同定することを可能にし、よって前記結合剤の所定のタンパク質結合特性は、前記標本における前記タンパク質混合物中のタンパク質−タンパク質相互作用の存在を推測するために使用される。
【００９１】
好ましくは、化合物の影響の決定は、ハイスループット実験設定を用いて決定される。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態において、
（ａ）ディスプレイタンパク質ライブラリを得ること、この際各メンバーは特有のヌクレオチド配列に関連する；
（ｂ）結合剤ライブラリと前記ディスプレイタンパク質ライブラリとを接触させて、結合剤／タンパク質複合体の情報を与えること、この際前記結合剤ライブライの各メンバーは特有のヌクレオチド配列に関連する；
（ｃ）前記結合剤／タンパク質複合体を分離すること；
（ｄ）必要に応じて、前記結合剤／タンパク質複合体を固体表面上に固定すること；
（ｅ）必要に応じて、複合体の分離を維持しながら、結合剤に関連する前記特有のヌクレオチド配列と結合核酸生成物を生成するためのタンパク質とを結合すること；
（ｆ）必要に応じて、前記結合核酸生成物を組み合わせること；
（ｇ）前記結合核酸生成物の配列を決定すること、
を含む、結合剤ライブラリのメンバーのタンパク質結合特性を決定するための方法が提供される。
【００９３】
結合剤ライブラリのメンバーのタンパク質結合特性は、結合核酸生成物の配列内の情報から決定することができる。ディスプレイされた剤ライブラリのメンバーに関連する結合した特有のヌクレオチド配列およびタンパク質の検出はディスプレイタンパク質ライブラリの特有のメンバーに対する認識および結合を示す。配列は、ライブラリのどのメンバーがどのタンパク質に結合するかに関する情報を提供することができる。
【００９４】
複数の前記結合剤のタンパク質結合特性は、計算することができる。前記結合剤ライブラリの全てのメンバーの結合特性情報のすべては、結合情報として、組み合わせることができる。
【００９５】
前記特有のヌクレオチド配列の結合は、結合剤および前記分離によってもたらされる共局在化に基づくランダム対の結合核酸生成物を提供するタンパク質に関連する。
【００９６】
好ましくは、前記結合剤ライブラリおよび／またはターゲット（例えば、タンパク質サンプル）は、複数の測定において様々な濃度で使用され、前記複数のタンパク質−タンパク質相互作用の解離定数を含む定量的な結合情報の計算を可能にする。これらの尺度を計算する方法は、当業者に公知である。
【００９７】
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットに関する。キットは、
ａ）結合剤ライブラリの各メンバーが特有のヌクレオチド配列に関連する、結合剤ライブラリ；ならびに
ｂ）前記結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列を
結合するための少なくとも２対のプライマーのセット；および任意に使用説明書、
を含む。
【００９８】
キットはまた、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための手段を含み、この際試薬および場合によっては材料が以下の工程のいずれか１つ以上を実施するために提供される：分離、固定化、特有のヌクレオチド配列を検出すること、ヌクレオチド配列を結合すること、および／または前記共局在化情報を得るために結合ヌクレオチド配列を検出すること。キットはまた、本発明の方法を実施するためおよび前記キットを利用するための説明書をさらに含むことができる。
【００９９】
本発明のキットは、タンパク質ディスプレイライブラリをさらに含むことができ、この際前記ライブラリの各メンバーは特有のヌクレオチド配列に関連している。
【０１００】
本発明の方法と既存の方法との比較
本発明の方法は、時間および費用対効果の高い方法で、インタラクトームの情報を捕捉するための新規なアプローチであり、ランダムサンプリングとサンプリングの高い冗長性とを可能にする。大きく、複数ユニットのタンパク質複合体であっても、動的で、オリジナルの細胞状況に基づく（例えば、生理学的な）、ネイティブなタンパク質−タンパク質相互作用に基づく、および包括的なカバレッジの定量的な相互作用データを提供する。非特異的な、誤って相互作用するタンパク質などのランダムな変数の影響を抑制する。また、オリジナルのタンパク質−タンパク質相互作用以外の検出原理に関与する任意の結合事象関連変数のような、変数の影響を減少させる。本方法は、ベイトタンパク質だけではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび化合物と相互作用するタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ検出に適している。
【０１０１】
ライゲーション近接アッセイ（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）（ＬＧＡ）のＰＣＲに基づく検出は、ターゲットの相対的な発現を決定するために使用される。タンパク質およびｍＲＮＡ発現プロファイルは、同一ではないので、観察される差異は、生物学的プロセスに関して有意であり得る。アッセイは、所与の実験におけるいくつかのターゲットを検出することができる。しかし、人工的にラベルされた多数の特異的抗体を準備する必要があるので、インタラクトームレベルでは実行不可能である。高度に特異的な抗体がなければ、交差反応性は、特異的および非特異的な相互作用を明確に区別するための近接ライゲーションアッセイの能力を低下させる。非常に多数でのターゲットのパラレルな検出は、コストがかかり、煩雑である。
【０１０２】
ＬＧＡの多重化形式が開発されている。このアッセイにおいて、固体支持体上に固定化された抗体は、タンパク質の複合混合物からの抗原を局所的に濃縮するための捕捉試薬として作用する。洗浄後、一対の近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）プローブが添加される。これに続き、さらなる洗浄および近接したオリゴヌクレオチドのライゲーションが行われる。これは、３つの結合事象の必要性に基づいてより高い特異性を可能にする。これは、ＰＣＲ増幅の使用と組み合わせて、高い特異性および感度、ならびにタンパク質定量化のための広いダイナミックレンジを可能にする。この方法は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）と連携して、タンパク質存在量のパターンをデジタル記録し、３６のタンパク質分析物の同時検出を実証するために使用される。
【０１０３】
ＬＧＡのバリエーションは、微小胞などの複雑なターゲット構造の検出のための極めて感度が高く特異的なアッセイ（４ＰＬＡ）として記載されており、ターゲットは、最初に固定化抗体を介して捕捉され、続いて結合したＤＮＡ鎖を有する４つの他の抗体を用いることによって検出される。増幅可能なレポーターを生成するための５つの抗体による同時結合の要件は、増加した特異性および感度の両方をもたらす。
【０１０４】
近接近を使用する近接ライゲーションに基づくアッセイタイプの全ては、非常に頻繁な立体障害のために、実験検証を必要とする。
【０１０５】
本発明の方法の場合、低い特異性は、問題ではなく、検証情報として使用することさえ可能である。本発明の方法は、共局在化およびコンパートメント化を使用し、増幅された同一性ラベルは、コンパートメントにおいて自由に拡散し、より緩和された立体障害を可能にする。
【０１０６】
デュアルエクスプレッションリコンビナーゼベース（Ｄｕａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｂａｓｅｄ）（ＤＥＲＢ）デスティニーベクターは、２セットのタンパク質を目的のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に挿入するためのリコンビナーゼ認識可能配列、２セットのプロモーターおよび相互作用を検出するためのＯＲＦを有するフレーム内のレポータータグを個別にコードする。生きた細胞（原核または真核）へのベクターの導入は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）によるタンパク質相互作用の検出を可能にする。ＤＥＲＢプラットホームは、リコンビナーゼベースのクローニングおよび原理証明実験および未知の相互作用の同定によって確認された相性の良いアクセプティングベクター（ａｃｃｅｐｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）を導入することにより、現在市販されているシステムに対する優位性を示す。システムは、多数のスクリーニングされた相互作用およびその結果多くの努力とコストとを必要とし、インタラクトームレベルで、人工的な試験条件（融合タンパク質および人工プロモーター）を用いて、ロボットシステムにのみに適合する。
【０１０７】
酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）スクリーン（ｓｃｒｅｅｎ）は、タンパク質−断片相補性アッセイ、またはＰＣＡの特異的な実施であり、タンパク質−タンパク質相互作用の同定は、２つのタンパク質断片に基づき、それぞれが第３のタンパク質（例えば、レポーターとして作用する、ＤＨＦＲ）の不完全な断片に共有結合する。タンパク質間の相互作用により、十分な近接近におけるレポータータンパク質の断片は、それらが活性を測定できる機能的なレポータータンパク質を形成することができる。この原理は、ＧＡＬ４転写因子を用いる酵母ツーハイブリッドスクリーンのように、多くの異なるレポータータンパク質に適用することができる。酵母ツーハイブリッドスクリーンは、酵母の核内の人工的な融合タンパク質間の相互作用を調べる。この方法は、偽陽性率が高く、他の手段によって確認された相互作用を検証する必要がある。この方法は、細胞状況の範囲外であり、自然環境の欠如は、タンパク質の細胞状況特異的な修飾によって制御される相互作用のための、または低い親和性相互作用におけるその使用を制限する。インタラクトームレベルでは、非常に大きなインタラクトームデータセットを構築することができるようにさらなる最適化およびアレイの使用を必要とする。これは、高いコストがかかるが、まだこのアッセイタイプの限界の全てを克服しない。
【０１０８】
デュアルベイトシステムを使用することができ、これは偽陽性を排除するための即時選択によるライブラリスクリーンの正確性を改善する。
【０１０９】
コイルドコイル媒介ヘテロ二量体化機能的相互作用トラップアッセイ（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｒａｐ  ａｓｓａｙ）は、説明されており、コイルドコイルヘテロ二量体化ドメインがモジュラータンパク質結合ドメインに代替されている。これは、機能的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用を検証すること、酵素を特定の基質へ導くこと、および機能的に重要な相互作用パートナーのための融合ライブラリをスクリーニングすることに役立つことができる。
【０１１０】
Ｙ２Ｈスクリーンの既知の限界に応えて、哺乳類細胞ベースのツーハイブリッド（Ｍ２Ｈ）システムが開発された。このＭ２Ｈシステムは、相互作用が目的の各タンパク質ペアとＤＮＡ結合および転写トランス活性化ドメインにそれぞれ融合することによって調べられるという点で酵母ツーハイブリッドのシステムと類似している。哺乳類細胞ベースのツーハイブリッド技術は、酵母ベースのアッセイと比べて多くの利点を有し、既知の問題のいくつかを解決する。酵母は、翻訳後修飾に関与する重要なタンパク質を欠くので、これらのタンパク質に基づく相互作用は、アッセイすることができない。さらに、いくつかの異なる哺乳類細胞状況は、細胞状況特異的なインタラクトームデータを提供することができる。しかし、大規模なデータセットは、困難な産物であり、インタラクトームレベルの相互作用は、非常に多数の哺乳類細胞培養標本を取り扱う必要があるため、得ることができない。
【０１１１】
Ｙ２Ｈスクリーンにおけるタンパク質−タンパク質相互作用の検出の変形は、特定のＰＣＲに基づくシークエンシング法（Ｓｔｉｔｃｈ−ｓｅｑと呼ばれる）を使用することである。これは、ＰＣＲスティッチングであり、同じＰＣＲ単位複製配列の相互作用するタンパク質をコードする１対の配列を配置する。ＰＣＲスティッチングは、２ラウンドのＰＣＲからなる。第１ラウンドでは、ＸおよびＹ（Ｙ２Ｈ  ＤＢ−ＸおよびＡＤ−Ｙベクターに存在する）は、それぞれＤＢ−およびＡＤベクター特異的な上流プライマーで増幅される。テンプレートとしての第１ラウンドからの単位複製配列は、８２ｂｐリンカー配列によって結ばれたＸおよびＹ  ＯＲＦからなる連結されたＰＣＲ産物を産生するために使用された。ＰＣＲ産物は、プールされ、スティッチされたＩＳＴ（ｓＩＳＴ）を生成するために次世代ＤＮＡシークエンシングによって配列決定された。Ｓｔｉｔｃｈ−ｓｅｑは、いくつかのＹ２Ｈプロトコルのボトルネックを解消したが、いまだ重要なステップに関連する問題を解決していない。
【０１１２】
ＰＣＡに対する以下の改善を記載する特許：１）大きなライブラリ（＞１０７サイズ）の分析を容易に可能にし、選択性が容易に「調整」、修正、および／または観察することができるレポーター遺伝子（およびそれらの発現を検出するための方法）、２）複数の相互作用の同時におよび独立した測定のための方法（異なるレポーター遺伝子の発現によって判断される）、ならびに３）ａ）ライブラリｖｓライブラリ実験を行うための効率的で自動化可能な方法およびｂ）原核生物のＰＣＡにおいて実施される任意のスクリーン／セレクションからの要請候補の分析を単純化する方法を提供するファージミドベースのシステムを用いるライブラリの構築。ライブラリｖｓライブラリをスクリーニングするためのこのファージミドに基づく技術の使用は、ライブラリを横断することを含み、例えば、ファージのプレイライブラリを細胞のベイトライブラリに感染させ（各細胞が平均して１のファージによってのみ感染されることを確実にするためにファージに対して過剰の細胞を用いる）およびレポーター遺伝子の活性化された発現を探す。これは、大規模なインタラクトームスキャンに向けた重要な工程であるが、動力学的でも細胞状況に基づくものでもない。
【０１１３】
酵母で行われたライブラリｖｓライブラリ実験では、両方の出発ハプロイド細胞からのＤＮＡを含むディプロイドα細胞の形成が用いられる。したがって、プレイハイブリッドのライブラリを含む細胞は、テストベイトハイブリッドを含むα細胞と交配することができる。これは変換効率の問題を解消するが、理想的なインタラクトームスキャンの他の要件には対応していない。
【０１１４】
疎水性コアに隣接する位置で半ランダム化された、２つのロイシンジッパーライブラリは、酵素マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｍＤＨＦＲ）の２つの設計された断片のいずれか一つに遺伝的に融合され、大腸菌に同時形質変換された。ライブラリポリペプチド間の相互作用は、ｍＤＨＦＲの酵素活性の再構成に必要であり、細菌増殖を可能にした。しかし、このストラテジーは、細菌細胞で達成されうる形質転換効率によって制限される。
【０１１５】
ＧＳＴプルダウンアッセイの９６ウェルフィルタープレートフォーマットへの適応もまた、考案されている。マルチウェルフィルタープレートの使用により、従来のシングルチューブアッセイよりもより少ない試薬とより効率的なサンプル処理を用いてかなり少ない時間でより多くのサンプルをアッセイすることができる。このアッセイタイプは、技術的なボトルネックを引き起こす問題のいくつかを解決した；しかし、このシステムを使用して、要求される非常に大きなデータセットを生成することは不可能である。
【０１１６】
タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）法は、免疫共沈降のより特異的なバージョンとして見なすことができ、タンパク質相互作用のハイスループット同定を可能にする。この方法の正確性は、小規模免疫共沈降実験の制度と比較することができ、相互作用は、正しい細胞状況の中で検出される。しかし、２つの連続した工程のタンパク質精製を必要とするので、一時的なタンパク質−タンパク質相互作用を容易に検出することはできない。ＴＡＰ法は、ＴＡＰタグの融合を研究中のタンパク質のＣ末端に適用する。ＴＡＰタグは、Ｎ末端からカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、次いでタバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）切断部位およびプロテインＡからなる。正確な細胞状況において定量的にタンパク質パートナーの実際の決定を提供することが可能であるが、この方法は、インタラクトームレベルでは、大きな努力を要し、使用される構築物でプロテオーム全体をカバーするために大きなコストがかかるであろう。
【０１１７】
この問題に対応して、非変性の高性能マルチベッドイオン交換クロマトグラフィー、スクロース勾配遠心分離および等電点電気泳動を含む複数の分離技術を用いて可溶性ヒトタンパク質インタラクトームのシステマティックで、非常に広範な生化学的分画を実施するためのタグレス戦略が開発された。この方法は、信頼性の高いデータセットを作成するための検証および統計解析を必要とし、またかなりの量のサンプル材料を必要とし、そのコストは、ランダムサンプリングおよび高い冗長性のサンプリングのためのその使用を制限する。
【０１１８】
タンパク質マイクロアレイは、タンパク質相互作用を同定するおよび特徴づける新たなアプローチを導入し、単独の実験において数千のタンパク質間の新たな相互作用を迅速に同定する能力を提供する。アレイ上の各タンパク質の位置および同一性は、既知であるため、相互作用マップは、タンパク質アレイの反復プロービングから迅速に開発することができる。タンパク質マイクロアレイ実験は、１日以内で実施でき、相互作用は、数千の他のタンパク質のコンテクストで評価されるため、マイクロアレイでの相互作用プロファイリングは、新規のタンパク質相互作用が発見される速度を大きく加速することができる。加えて、タンパク質マイクロアレイのｉｎ  ｖｉｔｒｏの性質は、酵母ツーハイブリッドスクリーニングのような他の方法では不可能であり得る、タンパク質濃度、翻訳後修飾、および補因子の存在などのタンパク質相互作用に影響を及ぼすプロービング条件の制御を可能にする。しかし、従来の一つのプローブで前進するアプローチは、大きなインタラクトームレベルの実験には適していない。
【０１１９】
タンパク質アレイに基づく検出のバージョンが使用され、細胞タンパク質溶解物または合成ペプチド混合物は、固定されたベイトタンパク質／ペプチドを有するタンパク質アレイに適用される。非特異的なタンパク質／ペプチドは、様々なストリンジェントな条件下で洗い流され、ベイトタンパク質／ペプチドと特異的に相互作用するタンパク質だけがチップ上に残る。最後に捕捉された相互作用するタンパク質／ペプチド複合体は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析され、それらの同一性は、それらの予測された典型的な質量によって確認される。非常に有望なアプローチであるが、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによるタンパク質シークエンシングは、いくつかの要因（タンパク質の量、分離、翻訳後修飾）によって制限され、相互作用は、自然な状況を欠いている。
【０１２０】
タンパク混合物はまた、固体支持上に固定化され、適切な結合条件下でラベル化されていない複数のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインと接触することができる。少なくとも１つのラベル化されて選択されたタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン（ラベル化されたタンパク質−タンパク質相互作用ドメインは、ラベル化されていないタンパク質−タンパク質相互作用ドメインとは異なる）の存在下で、ラベル化されたタンパク質−タンパク質相互作用ドメインの結合が測定される。この方法は、相互作用ドメイン特異的であり、その適用を制限する。
【０１２１】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）と組み合わせた無細胞ディスプレイ技術は、インタラクトームデータセットのカバレッジおよび信頼性の両方を向上することができる。完全に無細胞の方法は、ハイスループットおよび大きな検出スペースを提供し、クローンを使用せずに相互作用を試験する。ＮＧＳによって提供される定量的な情報は、偽陽性の数を減少させる。この方法は、ベイトタンパク質だけではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび化合物と相互作用するタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出に適している。この方法は、（細胞および組織から抽出された）ｃＤＮＡライブラリを用いた完全なｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理およびＮＧＳのために選択したｃＤＮＡ配列を得るためのターゲットタンパク質の選択を用いる。この方法を用いた選択は、無細胞条件下で行われ、その後のＮＧＳによるシークエンシングは、いかなる種類の細胞を用いるクローニング工程により制限されない。この方法は、細胞状況の外における一つ前進するアプローチを適用し、インタラクトームレベルでの大きなデータセットを生成する能力を制限する。
【０１２２】
別の無細胞アッセイは、タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトランス−スプライシングを行うことができるペプチド配列である、いわゆるインテインを利用する。インテリンは、タンパク質スプライシングの間にタンパク質前駆体から切除されるタンパク質前駆体における介在するタンパク質配列である。２つのハイブリッド融合構築物が提供され、一つは、第１の検査薬およびＮ−インテリンのＮ末端インテリン断片であり、もう一つは、第２の検査薬およびＣ−インテリンのＣ末端インテリン断片である。さらに、一方または両方の融合構築物は、融合構築物のトランス−スプライシングの際に検出可能な変化を受けるレポーターを有してもよい。スループットおよび細胞状況フリーの特徴の両方が、この方法の重大な欠点である。
【０１２３】
タンパク質−ＤＮＡまたはタンパク質−タンパク質相互作用を研究するために使用される別の方法は、ファージディスプレイの方法である。タンパク質は、ディスプレイされたタンパク質のＤＮＡをコードする繊維状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３）の表面にディスプレイされる。目的のターゲットタンパク質またはＤＮＡ配列は、固体支持上に固定化され、ターゲットに結合する候補のためのファージディスプレイタンパク質のライブラリの親和性を高めるために使用される。この方法は、タンパク質−ＤＮＡおよびタンパク質−タンパク質相互作用の両方を同定し、特徴づけるために使用されている。ファージディスプレイは、タンパク質−タンパク質相互作用データを推測するために複数のサイクルを必要とする濃縮プロセスである。濃縮は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ、相互作用を偏らせ、検出における高い親和性相互作用に有利に働く。特定のタンパク質（特に大きなもの）は、ファージディスプレイによる解析には、あまり適していない。細菌に基づくＯＲＦファージディスプレイの主な欠点は、ファージ表面にディスプレイされたタンパク質が、グリコシル化などの適切な翻訳後修飾を欠いていることである。
【０１２４】
当分野で使用されるファージディスプレイは、上記のとおり、自然の結合事象を再現することに限定される。しかし、ファージディスプレイとして発現される抗体レパートリーは、治療用抗体または診断アッセイ用の検出抗体の薬学的リードを提供する上で、極めて成功している。本発明は、後者の状況においてファージディスプレイ技術を適用し、極めて大きなファージ抗体ライブラリは、ほとんどの同定可能なターゲットをカバーする複数の特異性を含む。
【０１２５】
ファージディスプレイのバリエーションは、相互作用パートナーの選択および同定のための方法に関する。ターゲット分子（リガンド）は、それらが二次元グレード（ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｒａｄｅ）でアドレス可能なタンパク質であり、タンパク質ディスプレイウイルスに接触するように固相担体の表面上に固定される。相互作用パートナーは、固定されたリガンドおよび相互作用パートナー間の結合の位置の検出および決定によって同定される。記載されている好ましい検出方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【０１２６】
化学的架橋は、しばしば相互作用するタンパク質を単離／同定しようとする前に、所定のタンパク質相互作用を「固定（ｆｉｘ）」するために使用される。この用途のための一般的な架橋剤は、非開裂［ＮＨＳ−エステル］架橋剤、［ビス−スルホスクシンイミジルスベレート］（ＢＳ３）；開裂可能なＢＳ３、［ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート］（ＤＴＳＳＰ）、およびＣｈＩＰアッセイにおける相互作用を固定するために一般的である［イミドエステル］架橋剤［ジメチルジチオビスプロピオニミデート］を含む。
【０１２７】
目的のＤＮＡモチーフ配列を含む、表面固定化二本鎖ＤＮＡに結合する、遺伝的にコードされたペプチドのファージディスプレイライブラリを用いて予測された転写調節エレメントに特異的に結合するタンパク質を同定するための技術が開発されている。特定のＤＮＡ−タンパク質相互作用の濃縮後、結合したファージを増幅し、濃縮されたファージからのインサートを配列決定して、ラべリングおよびＤＮＡマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションを用いて相互作用するタンパク質を決定する。
【０１２８】
報告によると、１つ以上の分析物がｃｈｅｍＦＥＴアレイを用いて測定されている。アレイは、抗原への抗体の結合を含む１つ以上の目的の化学プロセスに関する関連情報を提供する様々な化学物質のいずれかを含むことができる。いくつかの態様では、単に分析物の存在を検出することに加えて、１つ以上の分析物のレベルまたは濃度を測定する能力は、１つ以上の化学的プロセスに関連して有用な情報を提供する。
【０１２９】
上記記載から明らかなように、本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出して特徴づけるための、およびタンパク質−タンパク質相互作用を調節することができる化合物を選択するための、強力で、汎用性のあるｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを提供する。このシステムは、優れた利便性で使用することができ、ハイスループットのスクリーニング手順を容易に適合させることができる。
【０１３０】
本明細書で言及されたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関連する当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的および個別に参照により組み込まれると示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために図面および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、特定の変更および改良は、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施できることは、明らかであろう。
【実施例】
【０１３２】
実施例１
液滴デジタルＰＣＲにおけるファージ溶解および検出
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ファージミドベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ，  ２１２２０５）ｆ１由来（（＋）  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ），Ｓａｃ−−＞Ｋｐｎポリリンカー  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ（宿主株）：ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ファージを作製するために使用し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ，  Ｎ０３１５Ｓ）を購入した。ファージを滴定して、感染性ファージの数を決定した。ファージを連続的に１０倍希釈して、コンパートメントあたり１ファージよりも少なくなるように希釈した。希釈物をＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  （ｄｄＰＣＲＴＭ）システムを用いてデジタルＰＣＲを行った。簡単に、５’ＣＴＣＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴ３’（Ｍ１３ＫＯ７特異的フォワード）、５’ＧＡＣＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＴＴＣＡＡ３’（Ｍ１３ＫＯ７特異的リバース）および／または５’ＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣ３’（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）特異的フォワード）、５’ＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴ３’（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）特異的リバース）ならびにプローブ５’ＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴ３’（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）特異的プローブ  ＦＡＭ−ＭＧＢラベル化）、５’ＣＣＧＴＣＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＴＣＣＣ３’（Ｍ１３ＫＯ７特異的プローブ  ＶＩＣ−ＭＧＢラベル化）は、コンパートメント化されたファージを増幅するために使用され、増幅は、２つの異なるチャネルに記録され、液滴の生成、ＰＣＲおよび検出は、製造業者のプロトコルに従った。
【０１３３】
効果的なファージ溶解および１つのファージ検出のポアソン分布のカウントが検出され、１つのファージ検出の感度を示す。
【０１３４】
実施例２
二量体化ＰＣＲ（Ｄｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ＰＣＲ）
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ファージミドベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ，  ２１２２０５）ｆ１由来（（＋）  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ），Ｓａｃ−−＞Ｋｐｎポリリンカー  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ（宿主株）：ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ファージを作製するために使用し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ，  Ｎ０３１５Ｓ）を購入した。ファージは、製造業者の指示に従ってＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ，２１３２６）を用いて２０モル過剰のビオチンでラベルされ、記載したように等電点沈殿を用いて沈殿させた（ＤｏｎｇＤ，Ｓｕｔａｒｉａ  Ｓ，Ｈｗａｎｇｂｏ  ＪＹ，Ｃｈｅｎ  Ｐ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｐｕｒｅｒ  Ｍ１３  ｐｈａｇｅ  ｂｙ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｓｅｐ；９７（１８）：８０２３−９．）。同数の精製されたファージは、混合されて、１０ｅ＋６／ｍｌの濃度のファージを提供し、モル当量でアビジン（Ａ９２７５−１ＭＧ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と組み合わされて、または混合物として使用され、デジタルＰＣＲ（ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  （ｄｄＰＣＲＴＭ）  Ｓｙｓｔｅｍ）に供された。簡単に、５’ＴＡＡＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴ３’（Ｍ１３ＫＯ７特異的フォワード）、５’ＧＡＣＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＴＴＣＡＡ３’（Ｍ１３ＫＯ７特異的リバース）および５’ＧＡＡＧＣＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＧＴＴＡＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣ３’（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）特異的フォワード）、５’ＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴ３’（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）特異的リバース）ならびにプローブ５’ＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴ３’（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）特異的プローブ  ＦＡＭ−ＭＧＢラベル化）、５’ＣＣＧＴＣＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＴＣＣＣ３’（Ｍ１３ＫＯ７特異的プローブＶＩＣ−ＭＧＢラベル化）は、コンパートメント化されたファージを増幅するために使用され、増幅は、２つの異なるチャネルに記録され、液滴の生成、ＰＣＲおよび検出は、製造業者のプロトコルに従った。増加した「結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」カウントは、ビオチン−アビジン結合によるアビジンの存在下で予測された。二量体化ＰＣＲ産物を検出するために、増幅したＤＮＡは、製造業者の推奨に従って抽出され、リアルタイムＰＣＲ装置において、プライマー５’ＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴ３’（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）特異的リバース）、５’ＧＡＣＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＴＴＣＡＡ３’（Ｍ１３ＫＯ７特異的リバース）およびプローブ５’ＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴ３’（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）特異的プローブＦＡＭ−ＭＧＢラベル化）、５’ＣＣＧＴＣＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＴＴＣＣＣ３’（Ｍ１３ＫＯ７特異的プローブＶＩＣ−ＭＧＢラベル化）を用いてＰＣＲに供された。正確に二量体化された産物のみが増幅可能であり、予測される増幅シグナルは、両方のプローブによって生成される。
【０１３５】
実施例３
タンパク質／タンパク質複合体のコンパートメントに基づく同定
（ａ）タンパク質の抽出は、部分的であっても保存されたタンパク質複合体およびタンパク質複合体を部分的に精製する方法（例えば、それらの翻訳後修飾などに従って）を提供する、任意の分離方法を含む、標準的な手段によって達成される。
【０１３６】
（ｂ）抗体ライブラリファージは、タンパク質複合体と結合され、希釈され、非結合ファージの単一ファージレベルの分離を達成するためにコンパートメント化される。コンパートメント化（例えば、多数の反応の効果的な分離）は、ただ一つの非結合ファージの分離に基づくポアソン分布に基づく；例えば、エマルジョンおよびマイクロアレイが最先端の方法である。要件は、ファージおよびタンパク質複合体との最小限の非特異的な共局在化だけである。ヌクレオチド配列は、ファージの効果的な熱溶解を用いて結合され、続いてＰＣＲプロセスを結合する。
【０１３７】
（ｃ）抗体をコードする（ファージライブラリにおける抗体遺伝子の任意のＣＤＲ領域に基づく、好ましくはＣＤＲ３に基づく）、コンパートメントあたりのファージ（結合および非結合）の特異的ＤＮＡ断片は、増幅され（二量体化可能な一般的なプライマーを用いて）、結合される（二量体化ＰＣＲの例は、実施例２および４を参照）。
【０１３８】
（ｄ）生成された二量体化、さらに未精製のＰＣＲ単位複製配列は、好ましくはエマルジョンからのＤＮＡ抽出もしくはマイクロアレイキャビティからの反応物の物理的な除去またはその他の手段を用いて結合される。
【０１３９】
（ｅ）多数のＰＣＲ二量体単位複製配列の結合情報は、好ましくは次世代ＤＮＡシークエンシングにより高度にパラレルで定量的に明らかにされる。
【０１４０】
（ｆ）個々のファージの所定の結合特性情報（実施例５および７参照）および結合ファージの結合情報は、バックグラウンドサブトラクション結合情報（偶然またはランダムまた偶発的な相互作用の除去）に基づく有意な相互作用の決定；場合により既知の解離定数情報によって重みづけされた同じ結合特性情報を有する異なるファージの冗長な結合情報に基づいて相互作用の確認およびろ過；確認され、ろ過された、場合によっては重みづけされた結合情報に基づいて二量体および多量体相互作用の決定；定量的な結合情報に基づいてタンパク質およびタンパク質複合体の相対存在量の測定；同じ結合特性情報を有するいくつかのファージの検出の冗長な測定に基づいて二量体および多量体相互作用の決定の統計的誤差ならびにタンパク質およびタンパク質複合体の相対存在量の決定、計算を含む統計的基礎でインタラクトームを計算するために使用される。
【０１４１】
実施例４
コントロールタンパク質／タンパク質複合体のコンパートメントに基づく同定
抗体をディスプレイするＭ１３ファージは、ファージミド抗体ライブラリ（〜３×１０  ９）（Ｄｕｄｇｅｏｎ  Ｋ，Ｆａｍｍ  Ｋ，Ｃｈｒｉｓｔ  Ｄ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２００８  Ｏｃｔ  ２８．）ＫＭ１３ヘルパーファージ、ＴＧ１Ｔｒ細菌株および抗ベータガラクトシダーゼ＆抗ウシユビキチン抗体ディスプレイファージを含み、Ｓｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（６００１＿ｈＤＡｂ）から購入した。コントロールファージは、ＮＧＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰＧＭ，Ｉｏｎ  ＸｐｒｅｓｓＴＭ  Ｐｌｕｓ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ，４４７１２６９）により配列決定され、それらの結合親和性は、それぞれの抗原に対するＥＬＩＳＡによって確認された。抗体は、ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ  （＃Ｓ１２８０）のモノ−ビオチン化ユビキチン（ｂ−ＵＢＩ）、ベータガラクトシダーゼビオチンラベル化（Ｇ５０２５）（ｂ−ＢＣＡＬ）である。卵白（Ａ９２７５）のアビジンもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからである。
【０１４２】
配列決定の結果に基づいて、一般的なプライマーが設計される：一般的なフォワード−ＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡ；二量体化可能な一般的なリバースプライマー−ＴＧＣＧＣＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣおよびＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＣＧＣＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ。二量体化生成物を検出するために、二量体特異的リアルタイムＰＣＲ反応が設計される：フォワード−ＡＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧ、リバース−ＡＧＧＴＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧおよびプローブ−ＦＡＭ  ＴＣＴＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴ  ＭＧＢ。
【０１４３】
コントロールファージ特異的なプローブもまた、設計される：抗ベータガラクトシダーゼ−ＦＡＭ  ＧＣＴＡＧＧＧＣＴＡＴＧＴＡＴＣＣ  ＭＧＢ；抗ウシユビキチン−ＶＩＣ  ＴＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣ  ＭＧＢ。
【０１４４】
指示書に従って、コントロールファージは、増幅される（抗ベータガラクトシダーゼ  ３．８×１０12／ｍｌ＝６．４８ｎＭ、抗ウシユビキチン  ４．０×１０12／ｍｌ＝６．７ｎＭ））。アビジン（３６ｎＭ）（または省略）、ｂ−ＵＢＩ（７２ｎＭ）およびｂ−ＢＧＡＬ（モノマーについて７２ｎＭ）は、混ぜ合わされ、室温で１時間インキュベートして複合体を形成した。１０倍希釈された複合体は、混合され、１．５ｎＭのコントロールファージと共に一晩インキュベートされた。ファージ結合複合体は、２×１０６倍に希釈され、（ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  （ｄｄＰＣＲＴＭ）  Ｓｙｓｔｅｍ）のプロトコルに従って、エマルジョン滴定は生成され、ＰＣＲ条件を使用して増幅される：プローブ用ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｎｏ  ｄＵＴＰ）（１８６−３０２３）、一般的なフォワードプライマー濃度は、８００ｎＭであり、二量体化可能な一般的リバースプライマー濃度は、５０ｎＭである。いくつかのケースでは、コントロールファージ特異的プローブもまた、２５０ｎＭで添加される。増幅された液滴は、製造業者のプロトコルに従って抽出されたクロロホルムであり、増幅した二量体生成物を回収する。
【０１４５】
二量体は、二量体特異的なリアルタイムＰＣＲによって正確に検出され、それらの正しい二量体化構造を証明する。増加した「結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」は、コントロールの特異的なプローブがエマルジョンＰＣＲ反応に含まれる場合、コントロールファージおよびアビジン／高原複合体結合によりアビジンの存在下で検出され、抗ベータガラクトシダーゼおよび抗ウシユビキチンファージの検出が偶然だけよりもより高い割合で同じ液滴に局在したことを示した。
【０１４６】
実施例５
抗体ファージライブラリの結合特性情報のあらかじめの決定
（ａ）抗体（ファージライブラリ、決定される結合特性情報）およびｃＤＮＡライブラリファージ（それらのｃＤＮＡを構成する、抗体ファージライブラリの結合特性情報に対して決定される）は、混合され、抗体−ｃＤＮＡファージコンプレックスは、希釈され、非結合ファージについて単一ファージレベルの分離を達成するためにコンパートメント化される−詳細は、実施例３（ｂ）参照。
【０１４７】
（ｂ）抗体をコードする（ファージライブラリにおける抗体遺伝子の任意のＣＤＲ領域に基づく、好ましくはＣＤＲ３に基づく）、コンパートメントあたりのファージ（結合および非結合）の特異的ＤＮＡ断片は、増幅され（二量体化可能な一般的なプライマーを用いて）、結合される（二量体化ＰＣＲの例は、実施例２および４を参照）。
【０１４８】
（ｃ）精製された二量体化ＰＣＲ単位複製配列は、好ましくはエマルジョンからのＤＮＡ抽出またはマイクロアレイキャビティからの反応の物理的除去を用いて結合される。
【０１４９】
（ｄ）多数のＰＣＲ二量体単位複製配列の結合情報は、好ましくは次世代ＤＮＡシークエンシングにより高度にパラレルで定量的に明らかにされる。
【０１５０】
（ｅ）結合ファージの結合情報は、バックグラウンドサブトラクション結合情報（偶然またはランダムまた偶発的な相互作用の除去）に基づく有意な相互作用の決定；統計的に有意な相互作用に基づいて有意な抗体−ｃＤＮＡ結合の同定；検出されたｃＤＮＡ断片、推定され検出されたタンパク質を含む各検出された抗体−ファージの結合特性情報の決定；同じ結合特性情報を有するいくつかのファージの検出の冗長な測定に基づいて結合特性情報の統計的誤差の確認、計算を含むｃＤＮＡファージライブラリに対する抗体ファージライブラリの結合特性情報を計算するために使用される。
【０１５１】
実施例６
抗体ファージライブラリの濃縮
（ａ）ｃＤＮＡライブラリファージ（それらのｃＤＮＡを構成し、濃縮された抗体ファージライブラリによって検出される必要がある）は、分離可能な手段（非結合抗体ファージの分離のため）により、好ましくはマイクロビーズ上に固定化される。
【０１５２】
（ｂ）抗体ライブラリファージ（ファージライブラリ、濃縮を意図する）は、結合および非結合ファージの分離を達成するために固定化されたｃＤＮＡ−ファージと混合される。
【０１５３】
（ｃ）非結合抗体ファージは、好ましくは洗浄により除去される。
【０１５４】
（ｄ）結合抗体ファージは、高いタイターの調製物を得るために、溶出され、必要に応じて適切な手段により増幅される。
【０１５５】
（ｅ）場合により、濃縮された抗体ファージの高いタイターの調製物は、次の濃縮に供される。
【０１５６】
（ｆ）場合により、溶出した結合ファージは、実施例５に記載の方法を用いてｃＤＮＡファージライブラリに対して確認される。
【０１５７】
実施例７
濃縮された抗体ファージライブラリの結合特性情報をあらかじめ決定する
抗体をディスプレイするＭ１３ファージは、ファージミド抗体ライブラリ（〜３×１０  ９）（Ｄｕｄｇｅｏｎ  Ｋ，Ｆａｍｍ  Ｋ，Ｃｈｒｉｓｔ  Ｄ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２００８  Ｏｃｔ  ２８．）ＫＭ１３ヘルパーファージ、およびＴＧ１Ｔｒ細菌株を含み、Ｓｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（６００１＿ｈＤＡｂ）から購入した。ライブラリは、増幅され、ＫＭ１３ヘルパーファージに感染され、ファージは、プロトコルに従って採取された（Ｌｅｅ  ＣＭ，Ｉｏｒｎｏ  Ｎ，Ｓｉｅｒｒｏ  Ｆ，Ｃｈｒｉｓｔ  Ｄ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（１１）：３００１−８．）。ＰｈＤ１２ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｅ８１１０Ｓ）および大腸菌ＥＲ２７３８宿主株は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＰｈＤ１２ライブラリは、ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌ上にプラークされ（ｐｌａｑｕｅｄ）、５０プラークは、採取され、混合された（抗原ベイトライブラリ）。抗原ベイトライブラリは、マイクロタイタープレートに吸収され、パニングは、Ｓｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（６００１＿ｈＤＡｂ）ライブラリプロトコルに従って完全なＳｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（６００１＿ｈＤＡｂ）ライブラリを用いて行われた。合計６１２クローンがＬＢ／アンピシリンプレート上に沈着され、これらは増幅され、ＫＭ１３ヘルパーファージに感染させ、採取された（濃縮された抗体ライブラリ）。
【０１５８】
ファージの配列に基づいて、一般的なプライマーが設計された：一般的フォワードＳｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（６００１＿ｈＤＡｂ）ライブラリ特異的−ＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡ；二量体化可能な一般的なリバースプライマーＳｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ（６００１＿ｈＤＡｂ）ライブラリ特異的−ＴＧＣＧＣＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣ−および一般的フォワードＰｈＤ１２ファージディスプレイペプチドライブラリ特異的−ＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴ；二量体化可能な一般的リバースプライマーＰｈＤ１２ファージディスプレイペプチドライブラリ特異的−ＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＣＧＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＴＴＴＧＣＴＡＡＡＣＡＡＣＴ。
【０１５９】
二量体化生成物を検出するために、二量体特異的リアルタイムＰＣＲ反応が設計された：フォワード−ＣＧＧＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＡＧＣＡ、リバース−ＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＣＣＴＣＴＡＣおよびプローブ−ＶＩＣ−ＣＡＴＡＣＡＧＡＴＧＣＧＣＡＴＣＣ−ＭＧＢ。
【０１６０】
１０１２の抗原ベイトライブラリおよび濃縮された抗体ライブラリファージは、混合され、室温で一晩インキュベートされた。ファージ複合体は、２×１０６倍に希釈され、（ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  （ｄｄＰＣＲＴＭ）  Ｓｙｓｔｅｍ）のプロトコルに従って、エマルジョン液滴は生成され、ＰＣＲ条件を使用して増幅される：プローブ用ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｎｏ  ｄＵＴＰ）（１８６−３０２３）、一般的なフォワードプライマー濃度は、８００ｎＭであり、二量体化可能な一般的リバースプライマー濃度は、５０ｎＭである。増幅された液滴は、製造業者のプロトコルに従って抽出されたクロロホルムであり、増幅した二量体生成物を回収する。増幅された二量体生成物は、ＮＧＳ配列決定され、特異的ベイトライブラリおよび濃縮された抗体ライブラリ二量体化生成物は、検出され、抗体ベイトライブラリおよびヘッジされた抗体ライブラリのメンバー間の特異的な配列に基づく相互作用を示す。
【０１６１】
実施例８
抗体ファージライブラリのメンバーの定量的結合情報の決定
（ａ）工程ｂにおける変更と共に、実施例３の方法を適用し、いくつかの定量化された量のタンパク質複合体は、平衡状態で使用され、いくつかのパラレルな決定をもたらす。
【０１６２】
（ｂ）パラレルな決定で得られた定量的情報に基づいて、定量的結合曲線は、多数のタンパク質−ファージ相互作用について構築することができ、解離定数および結合能力情報は、計算することができる。
【０１６３】
実施例９
発明の化学量論
結合化学量論に関して、大腸菌の細胞容積中の１ｎＭのタンパク質は、約１分子／細胞であり、２０００分子／哺乳動物（ＨｅＬａ）細胞であり、シグナル伝達タンパク質の特徴的な濃度（ここでは例として）は、１０ｎＭ〜１マイクロＭの範囲である。さらに、ファージディスプレイ抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１０ｎＭから０．１ｎＭの範囲であり、１０（−３）から１０（−４）のオフレートであるため、およびこれらのファージは、通常選択することができるため、飽和結合化学量論は、ほとんどのタンパク質／エピトープにて予測され、オフレートは、早期の解離なしに複合体をコンパートメント化するのに十分な時間を提供する。
【０１６４】
細菌、酵母および哺乳類の細胞において１立方ミクロン（すなわち１ｆＬ）あたり２〜４×１０６タンパク質であり（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．２０１３  Ｄｅｃ；３５（１２）：１０５０−５．）、５０００個の真核細胞（１００００ｆＬ）に対して、１０１０タンパク質であり、最大ファージ濃度は、約１０１６／ｍｌ→１００００ｆＬ体積：１０１１ファージである。
【０１６５】
１０（＋４〜５）の範囲でのインタラクトームの複雑さ、所望の相互作用／ファージの多重度は、約１０であり、これは、１０５の個々のファージに対応する。さらに、すなわち個々のファージあたり０．１ｎＭ（１０１６／ｍｌ）および１００００ｆＬあたり１０６を超える各タンパク質（全タンパク質の０．０１％）は、１ｎＭより高い濃度を有し、平均０．１〜１ｎＭ  Ｋｄの抗体ファージ（ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ  ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ：３０％）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００８）３７６，１１８２-１２００）は、５０〜５％の飽和をもたらすことができる。これは、２５〜０．２５％の共局在化した飽和に相当する（共局在化した飽和は、異なる特異性を有する２つの結合ファージが同じコンパートメントに局在することを意味する）。
【０１６６】
０．２５％の共局在化レートでのＨｉＳＥＱ  ２５００  ＮＧＳ装置の場合、３億回のリード（１０〜３００Ｇｂ、２５０ｂｐリード）は、７×１０５のヘテロ二量体ＰＣＲ生成物の最小数に相当し、これは、最小バイナリ相互作用シークエンシングカバレッジ：３７５を意味する。
【０１６７】
完全にランダム化された、主要な、高カバレッジの抗体ファージライブラリの複雑さは、個々のファージクローンの１０（＋１３）までであり、管理可能なエマルジョンＰＣＲまたはマイクロアレイコンパートメントの数は、１０５〜１０８の範囲であり（ＮＧＳチップコンパートメントの現在の数）、これらの不均衡数は、抗体ファージライブラリの複雑さを低減することによって融合する必要があり、ターゲットタンパク質（部分的または完全なインタラクトームをターゲットにする）に対する結合能力を有するファージの存在量を増加させる。複雑さを低減するために、特異的な選択プロセスが考案されている−ライブラリ（ｃＤＮＡ）法に対するライブラリ（抗体）選択を用いて完全にランダム化されたライブラリからファージを選択することは、低い複雑さ、親和性が高く、ナイーブな、汎用ファージライブラリをもたらし、さらにプロセスは、選択プロセスの間、抗体−タンパク質結合を検出することによってモニターすることができる、または結合キネティクス情報でさえ、例えば異なる量のインプットタンパク質ディスプレイファージを用いて抽出することができる。
【０１６８】
また、ボトムアップを用いてますます複合体ライブラリの段階的な構築によるライブラリを生成することも可能である（既知の結合特性を有するファージを混合し、バックグラウンドファージを添加すること；特定のタスクに合わせた特定のライブラリ、およびトップダウンアプローチがある（例えば相互作用するファージを選択することによる複雑さの低減による）。
【０１６９】
実施例１０
得られた情報の統計的評価
（ａ）タンパク質複合体の抽出は、標準的な手段により達成され、抗体ライブラリファージは、混合され、形成された複合体は、希釈され、非結合ファージの単一ファージレベルの分離を達成するためにコンパートメント化される。
【０１７０】
（ｂ）抗体をコードする、コンパートメントあたりのファージ（結合および非結合）の特異的なＤＮＡ断片は、増幅され、ＰＣＲ（好ましくは限定された数の増幅サイクルによって）結合される。
【０１７１】
（ｃ）この結合情報は、次世代ＤＮＡシークエンシングにより高いパラレルで、および定量的に明らかにされる。
【０１７２】
（ｄ）個々のファージの所定の結合特性情報および結合ファージの結合情報は、インタラクトームを計算するために用いられる。
【０１７３】
本方法は、タンパク質／タンパク質複合体のコンパートメントに基づく同定に基づき、コンパートメントあたりの単一タンパク質複合体のタンパク質−抗体同一性は、ＤＮＡに翻訳される。すべての結合したＤＮＡ断片の同定は、相互作用を定量的に決定するために使用されるが、誤って同じコンパートメントに捕えられた非結合ファージは、バックグラウンドに寄与するであろう。このバックグラウンドは、ランダムなイベントとして単純な統計的手段により処理することができ、これは特異的なイベントから区別することができる。コンパートメント化の間の結合剤の分布は、ポアソン分布によって左右され、したがって各結合剤の出現は計測され（制限されたコンパートメントに基づくＰＣＲ増幅後のＮＧＳによる結合剤の相対存在量の決定により）、コンパートメント数が分かっている場合には、タンパク質／タンパク質複合体のバックグラウンド検出は、計算することができる。多数のタンパク質複合体結合情報が共局在化によるものであり、直接結合を示すように、多数の特異的な結合事象は、抗体の正確なターゲットタンパク質を同定するために使用できるであろう。各タンパク質／タンパク質複合体について、実際の結合効果により、バックグラウンド検出は、タンパク質／タンパク質複合体の検出の任意の変動として計算され、タンパク質／タンパク質複合体の計算されたバックグラウンド検出を除去することによって単純な減算により計算することができる（または結合剤に結合したタンパク質／タンパク質複合体としてポアソン補正された減算は、結合剤の全体数を変化させる）。反応する抗体およびタンパク質分解物の、平衡状態での様々な結合が用いられる場合、スキャッチャードプロットまたは他の結合キネティックス計算は、抗体タンパク質相互作用のＫｄまたはその他のパラメータを計算するために構築することができる。全てまたはいくつかの相互作用についてのインタラクトーム内部のキネティックスデータはまた、異なる濃度の相互作用するタンパク質（実験条件の変更またはスパイク解析の使用）を用いて計算することができる。
【図１】
2017536846.tif 000002
【図２】
2017536846.tif 000003
【配列表】
2017536846000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年1月4日(2017.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合剤とターゲットとの間の結合相互作用を決定する方法であって、
ａ）結合剤／ターゲット複合体を形成できるように結合剤ライブラリとターゲットとを接触させること、この際、前記結合剤ライブラリの各メンバーは、特有のヌクレオチド配列に関連している；
ｂ）１つのコンパートメントにおいてただ一つの結合剤／ターゲット複合体となるように前記結合剤／ターゲット複合体をコンパートメントに単離すること；
ｃ）前記結合剤／ターゲット複合体において結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列を結びつけて連結ヌクレオチド配列を形成すること、この際単離された複合体の単離が結合工程の間維持される；
ｄ）前記連結ヌクレオチド配列から前記複合体に存在する前記結合剤を同定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記結合剤ライブラリが抗体ライブラリを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体ライブラリが抗体ディスプレイライブラリ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）または抗体のライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を含み、各抗体が前記特有のヌクレオチド配列でラベル化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ターゲットが特有のヌクレオチド配列に関連する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ターゲットがタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ターゲットがタンパク質ディスプレイライブラリを含み、前記ライブラリの各メンバーが特有のヌクレオチド配列に関連する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質ディスプレイライブラリがｃＤＮＡファージディスプレイライブラリである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質がタンパク質混合物内にある、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質混合物が濃縮タンパク質混合物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質混合物がリンタンパク質、膜タンパク質、および／または天然もしくは人工修飾タンパク質に関して濃縮される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
他の結合体に結合する結合剤が使用の前に前記結合剤ライブラリから除かれる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合剤ライブラリが使用前に濃縮される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記コンパートメントが固体支持体上の位置（ｓｅｔ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記コンパートメントがエマルジョン滴定、拡散律速または分離コンパートメントである、請求項１４、１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記複合体における結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列が前記複合体における結合剤に関連する別のヌクレオチド配列と結合している、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記複合体における結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列が前記結合剤／ターゲット複合体内のターゲットに関連するヌクレオチド配列と結合している、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合体内に存在する前記結合剤および／またはターゲットが前記連結ヌクレオチド配列から同定される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）前記結合剤または（ｉｉ）前記複合体内に存在する結合剤およびターゲットが前記結合ヌクレオチド配列をシークエンシングすることにより同定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合剤／ターゲット複合体が分離後に固定される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
２つ以上の複合体からの結合ヌクレオチド配列が存在する結合剤および／またはターゲットを同定する前に結合される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合剤ライブラリとターゲットとを接触させる工程（ａ）を化合物の存在および／または非存在下で行う、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質がタンパク質混合物内で他のタンパク質と架橋される、請求項５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離を希釈、特異結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、または前記複合体の物理的および／もしくは化学的特性による単離により行う、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体ファージライブラリの各メンバーに関連する前記特有のヌクレオチド配列が前記抗体のＣＤＲをコードするファージ内のヌクレオチド配列である、請求項３〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｃＤＮＡファージライブラリの各メンバーに関連する前記特有のヌクレオチド配列が前記ディスプレイされたタンパク質をコードするファージ内の配列である、請求項７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド配列を結びつけることが
ｉ．ＰＣＲプライマーの少なくとも２つのペアを用いて前記結合剤と、または結合剤およびターゲットに関連する前記ヌクレオチド配列を増幅して、少なくとも２セットの単位複製配列を製造すること、この際前記プライマーは、プライマーの第１のセットにより生成された前記単位複製配列がプライマーの第２のセットにより生成された単位複製配列における配列と相補的な配列を含むようにデザインされる；
ｉｉ．前記セットの単位複製配列をアニールすること；
ｉｉｉ．増幅反応を行い、結合ヌクレオチド配列を生成すること、
を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅がエマルジョンＰＣＲ増幅を用いて行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程ｉ〜ｉｉｉが一斉に行われる、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が反復され、前記ターゲットまたは結合剤の濃度が変化する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ａ）前記結合剤ライブラリの各メンバーが所定のタンパク質結合特性を有し、既知の特有のヌクレオチド配列に関連する、結合剤ライブラリ；ならびに
ｂ）前記結合剤に関連する前記ヌクレオチド配列を結びつけるための少なくとも２対のプライマーのセット；および任意に使用説明書
を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項３１】
タンパク質ディスプレイライブラリをさらに含み、前記ライブラリの各メンバーが特有のヌクレオチド配列に関連する、請求項３０に記載のキット。
【国際調査報告】
2017536846.tif 000004
2017536846.tif 000005
2017536846.tif 000006
2017536846.tif 000007
2017536846.tif 000008