(57)【要約】  亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）の、生体適合性のある送達に関する、製剤およびその使用の方法が提供される。いくつかの態様において、ＺｎＰＰは、経口送達のために製剤される。製剤は、ＺｎＰＰの微粒子を含み得、ここでＺｎＰＰ活性剤は、酸性条件に対する増加した安定性および中性ｐＨでの改善された可溶性を提供する薬学的に許容し得る安定剤と混合され、または該安定剤でコーティングされている。
2017505325.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＺｎＰＰと薬学的に許容し得る安定剤とを含む微粒子であって、ＺｎＰＰの濃度が、微粒子の約５重量％以上である、前記微粒子。
【請求項２】
微粒子中のＺｎＰＰの濃度が、微粒子の約５重量％から約５０重量％までである、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３】
微粒子が、ＺｎＰＰ単独と比較して酸性条件における増加した安定性を有する、請求項１または２に記載の微粒子。
【請求項４】
微粒子が、ＺｎＰＰ単独よりも少なくとも１０％、酸性条件に対してより安定である、請求項３に記載の微粒子。
【請求項５】
微粒子が、ＺｎＰＰ単独よりも２倍、酸性条件に対してより安定である、請求項３に記載の微粒子。
【請求項６】
微粒子が、ＺｎＰＰ単独と比較して中性ｐＨでの向上した可溶性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項７】
微粒子が、ＺｎＰＰ単独よりも少なくとも１０％、中性ｐＨでより可溶性である、請求項６に記載の微粒子。
【請求項８】
微粒子が、ＺｎＰＰ単独よりも少なくとも２倍、中性ｐＨでより可溶性である、請求項６に記載の微粒子。
【請求項９】
微粒子が、ＺｎＰＰと薬学的に許容し得る安定剤とから本質的になる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１０】
微粒子が、約１０ｎｍから約１０μｍまでの直径を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１１】
微粒子が、約１００ｎｍから約５μｍまでの直径を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１２】
安定剤が、アルギン酸塩、キトサン、レシチン、ポロキサマー、トリメタリン酸ナトリウム、カチオン性脂質、タンパク質、油、ポリビニルピロリドン、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１３】
安定剤が、カチオン性脂質、またはカチオン性脂質の混合物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１４】
カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＥＤＭＰＣ、ＤＣＣｈｏｌ、ＤＯＧＳ、ＭＢＯＰ、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１３に記載の微粒子。
【請求項１５】
ＺｎＰＰの濃度が、微粒子の約１０重量％から約２５重量％までであり、および安定剤が、ＤＳＰＣとＤＰＰＣとの混合物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１６】
ＤＳＰＣのＤＰＰＣに対する重量比が約１：１である、請求項１５に記載の微粒子。
【請求項１７】
安定剤が、（ｉ）レシチン、（ｉｉ）ポロキサマーおよび（ｉｉｉ）アルギン酸塩、トリメタリン酸ナトリウムまたはキトサン、を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項１８】
ＺｎＰＰの濃度が、微粒子の約５重量％から約２５重量％までである、請求項１７に記載の微粒子。
【請求項１９】
レシチンの濃度が、微粒子の約１０重量％から約４０重量％までであり、およびポロキサマーの濃度が、微粒子の約１０重量％から約４０重量％までである、請求項１７または１８に記載の微粒子。
【請求項２０】
安定剤が、油をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項２１】
安定剤が、トリメタリン酸ナトリウムを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項２２】
トリメタリン酸ナトリウムの濃度が、微粒子の約３重量％から約６重量％までである、請求項２１に記載の微粒子。
【請求項２３】
安定剤が、アルギン酸塩を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項２４】
アルギン酸塩の濃度が、微粒子の約３重量％から約６重量％までである、請求項２２に記載の微粒子。
【請求項２５】
安定剤が、キトサンを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の微粒子。
【請求項２６】
キトサンの濃度が、微粒子の約３重量％から約６重量％までである、請求項２５に記載の微粒子。
【請求項２７】
複数の、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の微粒子、および任意に、薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項２８】
経口投与のための単位用量の、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
複数の微粒子が、薬学的に許容し得る担体中に懸濁されている、請求項２７または２８に記載の組成物。
【請求項３０】
それを必要とする対象において誘導型ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）の活性を阻害する方法であって、有効量の請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の組成物を、該対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３１】
投与が、経口である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
対象が、高ビリルビン血症を有するヒト乳幼児である、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
それによって誘導型ＨＯ−１の活性が、対照対象における誘導型ＨＯ−１の活性と比較して阻害され、または、誘導型ＨＯ−１の活性が、微粒子の投与前における誘導型ＨＯ−１の活性と比較して阻害される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年２月３日に出願された米国仮出願第６１／９３５，２００に対する優先権の利益を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所から与えられた契約ＴＷ００８７８１に基づく政府支援によってなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
メタロポルフィリンは、ヘムの構造的類似体であり、それらの、新生児高ビリルビン血症および他の状態の管理における使用可能性は、３０年以上の間、多くの研究の対象とされてきた。ビリルビンレベルを制御することにこのクラスの化合物を使用するための薬理学的基礎は、ビリルビン産生経路における律速酵素であるヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）の競合的阻害を介したビリルビン産生の標的化された遮断である。現在進行中の研究は、過度の新生児高ビリルビン血症の処置のための治療域および標的化された介入を明らかにすることにより、安全かつ効果的なメタロポルフィリンを同定することを追求し続けている。
【０００４】
ＨＯ酵素は、構成型（ＨＯ−２）および誘導型（ＨＯ−１）のアイソフォームとして存在する。ヘムオキシゲナーゼは、ＮＡＤＰＨおよび酸素を利用し、ヘム部分を崩壊させてビリベルジン、一酸化炭素（ＣＯ）および鉄を遊離させる代謝酵素である。夫々ビリベルジン還元酵素の基質および産物である、ビリベルジン（ＢＶ）およびビリルビンは、強力な抗酸化物質である。細胞恒常性におけるＨＯ−１の機能は、細胞ストレスの基本的な「センサー」として、および、組織損傷を制限または防止するための直接的な寄与物質として作用すること、ストレスに対する細胞順応におけるＨＯ活性の産物の関与、という特徴を含む。ＨＯ−１経路の薬理学的操作およびその産物は、酸化ストレスおよび炎症に特徴づけられる様々な状態に対する防御を与えるために、使用することができる。
【０００５】
亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）は、ヘム生合成の最中に微量形成される正常な代謝産物である。ヘムの生合成経路中の最終反応は、プロトポルフィリンによる鉄のキレート化である。鉄不足または鉄利用障害の期間中、亜鉛は、フェロキラターゼのための代替の金属基質になり、増加したＺｎＰＰ形成をもたらす。この金属置換が、増加したＺｎＰＰを循環赤血球中に出現させる、鉄の枯渇に対する最初の生化学反応の一つであることを、証拠が示唆している。この亜鉛による鉄の置換は主に骨髄内で起こるため、赤血球中のＺｎＰＰ／ヘム比は、骨髄中の鉄状態を反映する。加えて、ＺｎＰＰは、ヘム分解経路におけるビリルビンおよびＣＯを産生する律速酵素であるＨＯの競合阻害を介して、ヘム異化を調節し得る。臨床的に、ＺｎＰＰの定量は、鉄栄養および代謝を評価するための高感度かつ特異的なツールとして有益である。診断的判断は、小児科、産科および血液バンクを含む様々な臨床現場に適用可能である。
【０００６】
ＺｎＰＰは、新生児黄疸および他の状態の処置のためのいくつかの望ましい特性を有する：それは極めて強力であり、それは血液脳関門（ＢＢＢ）を通過せず、それは光活性化に対して比較的不活性であり、ゆえにin vivoで光感作／光毒性効果を有さず、およびそれはＨＯによって分解されない。しかしながら、該化合物の送達は困難であった。本発明は、この問題に対処する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、有効用量の亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）の、生体適合性のある送達に関する、製剤およびその使用方法を提供する。いくつかの態様において、ＺｎＰＰは、経口送達のために製剤される。これらの製剤は、ＺｎＰＰ活性剤が薬学的に許容し得る賦形剤でコーティングされた、ＺｎＰＰの微粒子を提供する。いくつかの態様において、ＺｎＰＰを含むコーティングされた微粒子と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、治療組成物が提供される。治療組成物は、限定しないが、新生児および乳幼児への投与、例えば、液体としての投与、胃管を介しての投与等を含む、経口投与のために製剤され得る。
【０００８】
本明細書に記載される微粒子は、ＺｎＰＰ活性剤と薬学的に許容し得る安定剤とを含み、例えば、ここで活性剤が総微粒子重量の少なくとも約５％であり得、および好ましくは、総微粒子重量の約５０％以下であり得る。安定剤は、低ｐＨ、例えば胃内に存在する酸性条件での不安定性から、活性剤を保護することができる。安定剤はまた、中性ｐＨにおいて活性剤の可溶性を増加させることもでき、例えば腸内に存在する中性条件における吸収を増加させることができる。
【０００９】
微粒子は、所望の用量の活性剤を適正体積の製剤で送達するのに十分に濃縮された製剤を提供するために、薬学的に許容し得る担体中に懸濁され得る。担体は、水性賦形剤を含めた薬学的に許容し得る賦形剤を含む。かかる組成物は、単位用量製剤、例えば、患者への投与のための微粒子ＺｎＰＰの用量を含むもので、提供することができる。単位用量はまた、典型的には、賦形剤、例えば向上した安定性および可溶性を提供する賦形剤をも、さらに含む。ある態様において、活性剤の有効用量は、患者へ提供されたとき、それが構成型ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−２）を阻害するよりもより大きな程度で、好ましくは、実質的に構成型ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−２）を阻害することなく、誘導型ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）を阻害するのに効果的な用量である。ある態様において、有効用量は、本明細書に記載される組成物または方法での処置の非存在下の対照と比較して、乳幼児または新生児におけるビリルビンの分解の増加を刺激する。
【００１０】
本明細書に記載される製剤および組成物での処置の方法もまた提供される。いくつかの態様において、有効用量の本明細書に記載されたＺｎＰＰの微粒子製剤をそれを必要とする個体へ投与するステップを含む、高ビリルビン血症をＺｎＰＰで処置するための方法が提供される。
【００１１】
特に、開示される態様は、乳幼児における高ビリルビン血症またはその症状を処置する方法を含む。いくつかの態様において、乳幼児は、約３５週から約４３週までの在胎齢の乳幼児である。他の態様において、乳幼児は、３０日齢以下である。いくつかの態様において、乳幼児は、約２，５００ｇの最低出生体重を有する。いくつかの態様において、乳幼児は、約１，７００ｇから約４，０００ｇまでの出生体重を有する。いくつかの態様において、乳幼児は、少なくとも１つのリスク要因、例えば、溶血性疾患、ＡＢＯ式血液型不適合、抗ＣのＲｈ不適合、抗ｃのＲｈ不適合、抗ＤのＲｈ不適合、抗ＥのＲｈ不適合、抗ｅのＲｈ不適合、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損、またはこれらの任意の組み合わせ、を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＺｎＰＰ製剤は、出生後約６時間以内、出生後約１２時間以内、出生後約２４時間以内および出生後約４８時間以内から選択される時間に投与される。いくつかの態様において、ＺｎＰＰ製剤は、経口投与される。
【００１２】
いくつかの態様は、ＺｎＰＰ製剤の投与後の処置後総ビリルビンレベルを決定することをさらに含む。いくつかの態様において、処置後総ビリルビンレベルは、治療量のＺｎＰＰ製剤を乳幼児に投与してから２４時間後、ベースラインの総ビリルビン（ＴＢ）レベルを少なくとも５％下回る。いくつかの態様において、処置後ＴＢレベルは、治療量のＺｎＰＰ製剤を乳幼児に投与してから４８時間後、ベースラインのＴＢレベルを少なくとも１０％下回る。いくつかの態様において、処置後ＴＢレベルは、治療量のＺｎＰＰ製剤を乳幼児に投与してから７２時間後、ベースラインのＴＢレベルを少なくとも２０％下回る。いくつかの態様において、処置後ＴＢレベルは、治療量のＺｎＰＰ製剤を乳幼児に投与してから４８時間後に、ベースラインのＴＢレベルの３ｍｇ／ｄＬ上よりも小さい。
【００１３】
本明細書に記載される製剤はまた、有効用量のＺｎＰＰの送達が望ましい他の方法における使用をも見出す。いくつかの態様において、がんを処置する方法が提供される。ＨＯ−１は、腫瘍促進活性（pro-tumoral activities）に関与することが示された。ＨＯを阻害することにより、本明細書に記載される製剤は、抗腫瘍活性を、単独でまたは化学療法もしくは放射線療法との組み合わせで、例えば癌などの固形腫瘍の処置等において、発揮することができる。
【００１４】
他の方法は、限定しないが、ＨＯの選択的な阻害が望まれる種々の状態における、加齢性黄斑変性症の処置、感染症の処置等を含む。本明細書に記載される組成物はまた、ＮＭＲイメージングのための造影剤としての使用をも見出す。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ヘム分解経路の概略表示を提供する。ビリルビン産生の減少は、ヘム分解経路における律速酵素であるヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）の阻害を介して、標的とすることができる。ヘムは、ＨＯにより分解されて等モル量の一酸化炭素（ＣＯ）およびビリベルジンを産生し、これは次に直ちにビリベルジン還元酵素によって分解されてビリルビンを生成する。
【００１６】
【図２】図２は、光毒性の研究のための実験設定を示す３つのパネル（（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ））を含む。３日齢の仔動物（パネル（Ａ）中で拡大）は、ビヒクルまたは３．７５〜３０μｍｏｌ／ｋｇ体重（ＢＷ）の範囲にわたる用量のＭｐをＩＰで与えられ、次に、BiliBlanket II Meter（パネル（Ｃ）中に図示されるとおり）による測定で３５．０±１．０μＷ／ｃｍ２／ｎｍの放射照度を発する２本の白色管および１本の青色管からなる蛍光灯（パネル（Ｂ）に示されるとおり）に、３時間さらされた。
【００１７】
【図３】図３は、ＺｎＢＧの安全性および効力を纏めたデータを図示する。光にさらされた３日齢の仔動物への３．７５μｍｏｌ  ＺｎＢＧ／ｋｇ  ＢＷの投与は、１００％の生存（白いバー）によって示されるように、光毒性が全くないこと、および、７５％までＨＯ活性を阻害したこと（黒いバー）を示した。
【００１８】
【図４】図４は、種々の亜鉛製剤との接触の後のＨＯ活性のin vitro阻害を示す。３０μＭでのＺｎＰＰ製剤は、３日齢の仔マウスから採取された肝臓、脾臓および脳の超音波破砕物（sonicates）を使用して、in vitro ＨＯ阻害強度について評価された。
【００１９】
【図５】図５は、ＺｎＰＰ製剤の胃内注入を示す２つのパネルを含む。３０μｍｏｌ／ｋｇ  ＢＷの投与量でのＺｎＰＰ製剤は、３日齢の仔マウスに直接胃内（ＩＧ）注入を介して投与された。図５は、以下の製剤の投与の３時間後の胃内容を示す４つのパネルもまた含む：水性ＺｎＰＰリン酸塩（ＺｎＰＰ−ＰＯ４）、ＺｎＰＰ−キトサン（ＺｎＰＰ−ＡおよびＺｎＰＰ−Ｂ）、ＺｎＰＰ  EUDRAGIT（Ｒ）（ＺｎＰＰ−Ｐｏｌｙ）、およびＺｎＰＰリン脂質（ＺｎＰＰ  Ｌｉｐｉｄ）。
【００２０】
【図６】図６（Ａ）は、ＨＯ活性のin vivo阻害を図示する。製剤またはＶＥＨは、３日齢の新生ＦＶＢ仔マウスの体内にＩＧ注入された。投与の３時間後、肝臓、脾臓および脳が採取され、ＨＯ活性がガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により測定された。阻害は、対照値の％で表示された。
【００２１】
【図７】図７は、スプレードライ粒子についてのＳＥＭ画像を示す２つのパネル（（Ａ）および（Ｂ））を図示し、（Ａ）７５％  ｗ／ｗのEUDRAGIT（Ｒ）、および（Ｂ）３８％のEUDRAGIT（Ｒ）である。しわ状の形態は、効率的な薬物封入を確保する、粒子形成の最中の早期のポリマー析出を表す。
【００２２】
【図８】図８は、２つのパネル（（Ａ）および（Ｂ））を図示する。パネル（Ａ）は、リン酸ナトリウムで緩衝された溶液中のＺｎＰＰ−ＰＯ４を投与された仔動物の胃の内容を示し、プロトポルフィリンが、胃内で沈殿した。パネル（Ｂ）は、ＺｎＰＰのスプレードライ微粒子を投与された仔動物の胃の内容を示し、スプレードライ微粒子は、沈殿しない。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の方法が解説される前に、本発明は、解説される特定の方法に限定されないことが理解されるべきであり、したがって、勿論、変化し得る。本発明の範囲は、添付のクレームによってのみ限定されるので、本明細書中で使用される専門用語は、特定の態様を解説する目的のためだけであって、限定することを意図するものでないこともまた、理解されるべきである。
【００２４】
値の範囲が提供されている場合、文脈が明確に他を指示しない限りその下限の単位の十分の一までの、その範囲の上限と下限との間の各介在値、および、その記載された範囲中のあらゆる他の記載された値または介在値が、本発明に包含されることが理解されるべきである。これらの小範囲の上限および下限は、記載された範囲中のあらゆる具体的に除外された境界に従い、独立して、本発明に包含される小範囲に含まれ得る。
【００２５】
他に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または均等のあらゆる方法および材料がまた、本発明の実践または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料がこれから解説される。本明細書で言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物がそれに関して引用された方法および／または材料を開示および解説する。
【００２６】
本明細書中および添付のクレーム中において、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に他を指示しない限り複数の指示対象を含むことに、留意しなければならない。よって、例えば、「微小球（a microsphere）」への参照は、かかる微小球の複数を含み、および、「ステント（the stent）」への参照は、１以上のステントおよび当技術分野における当業者に知られたそれらの均等物への参照を含む、など。
【００２７】
用語「処置すること」および「処置」などは、本明細書中において、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般的に意味することに使用される。効果は、疾患、症状またはその状態を防止するかまたは部分的に防止するという面では予防的であり得、および／または、状態、症状または当該状態に起因する副作用の部分的もしくは完全な治癒という面では治療的であり得る。本明細書中で使用される用語「処置」は、特に、微粒子形態のＺｎＰＰ活性剤を含む組成物の適用に及び、経口投与を含む。用語「予防」は、本明細書中において、疾患または状態の防止または部分的な防止のために取られる１または複数の対策を指すことに使用される。
【００２８】
用語「防止する」は当技術分野で認識されており、および、状態に関連して使用されるときについては当技術分野においてよく理解されており、および、組成物を受けない対象と比較して、対象における状態が生じる可能性を減少させるかまたは発症を遅延させる組成物の投与を含む。よって、高ビリルビン血症の防止は、例えば、組成物を受けている対象が高ビリルビン血症を経験する可能性を、組成物を受けない対象と比較して減少させること、および／または、高ビリルビン血症の発症を、平均で、処置された集団対未処置の対照の集団において、例えば、統計的および／または臨床的に顕著な程度で、遅延させること、を含む。
【００２９】
用語「対象」は、哺乳動物、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、げっ歯動物、ウサギ、リス、クマ、ならびに、チンパンジー、ゴリラおよびヒトなどの霊長類、を含む。
【００３０】
生理的黄疸は、移行期間（生後１週間）中によく見られ、正期産児の６０％〜７０％において観察される。当該状態は、胎盤によるビリルビンクリアランスの突然の停止、および、肝臓のビリルビンの取り込み、細胞内輸送およびグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１Ａ１）抱合活性の一過性の欠損によってもたらされる。主要な寄与因子は、新生児における、成人と比較して２倍〜３倍増加したビリルビン産生速度である。ヘム分解過程は、等モル量のＣＯおよびビリルビンを産生する。同種免疫性溶血性疾患（例えばＲｈ（Rhesus）およびＡＢＯ不適合）または他の溶血性状態（例えばＧ６ＰＤ欠損）を有する新生児は、典型的に、増加したＴＢレベルに関連して上昇したビリルビン産生速度を有する。歴史的に、溶血性疾患という文脈における増加したＴＢ濃度は、神経毒性および脳障害（核黄疸）と関連づけられており、交換輸血などの積極的でかつ比較的リスクの高い介入を促してきた。
【００３１】
低いＩＱスコア（成人期における）のリスクは、深刻な非溶血性黄疸を有する正期産男児において、顕著に、より大きくなり得る。また、一見健康な正期産および近正期産（near-term）の母乳哺育児、または、未特定の溶血性異常を有するそれらにおける、核黄疸の報告された症例の数の増加もあった。そのうえ、最近の無作為化対照試験の結果は、積極的な光線療法は神経発達障害（ＮＤＩ）の発生率を顕著に減少させたが、超低出生体重（ＥＬＢＷ）児（体重５０１〜７５０ｇ）の間での死亡率の増加に相殺され得ることを示唆しており、ビリルビン産生を調節し、それによってこの高リスク群における危険なほど高いビリルビンレベルが生じる可能性を減少させる、薬理学的なアプローチを含む予防法の必要性をさらに強調している。
【００３２】
現在の承認されたおよび一般に使用されている高ビリルビン血症のための処置は、光線療法および交換輸血を含む。光線療法は、新生児を４３０〜４９０ｎｍの範囲にある光（青色光）で照射することを伴う。光は、ビリルビンをルミルビン（lumirubin）およびフォトビリルビンに転換し、これらは、乳幼児によってより簡単に排出される、より毒性の少ない水溶性の光異性体（photoisomers）であり、それによってビリルビンレベルの減少をもたらすことができる。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「薬学的に許容し得る」は、レシピエントのヒトまたは動物の生理機能を、レシピエントの生存率が損なわれる程度までは害することのない化合物または化合物の組み合わせを指す。好ましくは、投与される化合物または化合物の組み合わせは、せいぜい、レシピエントのヒトまたは動物の健康に一時的な不利な影響を誘発するだけである。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「担体」は、治療組成物を所望の経路により（例えば経口投与により）投与させることを可能にする、剤のあらゆる薬学的に許容し得る賦形剤、希釈剤およびその他の分散剤を指す。本明細書中で使用される「担体」は、したがって、レシピエントのヒトまたは動物にとって薬学的におよび生理学的に許容し得る、当技術分野における当業者に知られたかかる賦形剤および化合物を含む。
【００３５】
本明細書に記載される製剤は、安定化された上記のＺｎＰＰの微粒子を含み、ここで微粒子は、コーティングされていないＺｎＰＰと比較して、酸性条件における増加した安定性、および／または中性ｐＨでの向上した可溶性を有する。酸性条件、例えば、ｐＨ４．５以下、４．３以下、４以下、３．５以下では、ＺｎＰＰは沈殿し、および非活性成分へ分解される。いくつかの態様において、微粒子は、酸性条件に対して少なくとも１０％より安定、少なくとも２０％より安定、少なくとも３０％より安定、少なくとも４０％より安定、少なくとも５０％より安定、少なくとも７５％より安定であり、および、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍以上、より安定であり得る。安定性は、in vitroの実験条件中において沈殿および分解を観察することによって、実験的に決定できる。
【００３６】
安定化された本発明の微粒子製剤はまた、中性ｐＨで、例えば、５．５よりも大きく８．５よりも小さいｐＨ（約６．０よりも大きいｐＨ、約６．５よりも大きいｐＨ、約７．０よりも大きいｐＨ、および約８．５よりも小さいｐＨ、約８．０よりも小さいｐＨを含む）で、ＺｎＰＰの向上した吸収を与える。いくつかの態様において、微粒子は、中性ｐＨにおいて、少なくとも１０％より可溶性であり、少なくとも２０％より可溶性であり、少なくとも３０％より可溶性であり、少なくとも４０％より可溶性であり、少なくとも５０％より可溶性であり、または少なくとも７５％より可溶性であり、および、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍以上、より可溶性であり得る。可溶性は、慣用的な方法によって、実験的に決定できる。
【００３７】
微粒子は、活性剤と安定剤とを含むか、または活性剤と安定剤とから本質的になることができる。いくつかの態様において、微粒子中の活性剤の濃度は、総重量の約５％まで、約１０％まで、約１５％まで、約２０％まで、約２５％まで、約３０％まで、約３５％まで、約４０％まで、約４５％まで、約５０％まで、などであり、および、約５重量％から約５０重量％まで、約１０重量％から約４０重量％まで、約１５重量％から約３５重量％まで、約２０重量％から約３０重量％までであり得、好ましくは約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、約２５重量％、約２６重量％、約２７重量％、約２８重量％、約２９重量％または約３０重量％であり得る。
【００３８】
微粒子の重量の残余は、典型的には安定剤によって提供され、すなわち、総重量の約９５％まで、約９０％まで、約８５％まで、約８０％まで、約７５％まで、約７０％まで、約６５％まで、約６０％まで、約５５％まで、約５０％まで、約４５％まで、約４０％までである。いくつかの態様において、微粒子中の安定剤の濃度は、好ましくは約９５重量％、約９４重量％、約９３重量％、約９２重量％、約９１重量％、約９０重量％、約８９重量％、約８８重量％、約８７重量％、約８６重量％、約８５重量％、約８４重量％、約８３重量％、約８２重量％、約８１重量％、約８０重量％、約７９重量％、約７８重量％、約７７重量％、約７６重量％、約７５重量％、約７４重量％、約７３重量％、約７２重量％、約７１重量％または約７０重量％である。安定剤は、酸性条件における増加した安定性を与え、中性ｐＨ条件での増加した可溶性を可能にする。
【００３９】
微粒子は、薬物送達の最適化のために適した、制御されたサイズを有し得る。通常、粒子は、約１０ｎｍまでの直径、約５０ｎｍまでの直径、約１００ｎｍまでの直径、約２５０ｎｍまでの直径、約５００ｎｍまでの直径、約１μｍまでの直径、約２．５μｍまでの直径、約５μｍまでの直径、および、約１０μｍ以下の直径を有する。いくつかの態様において、微粒子のサイズは、直径約１００ｎｍから直径約５μｍまで、例えば、約１００から約５００ｎｍまで、約５００ｎｍから約１μｍまで、などである。複数の微粒子は、定義された平均サイズの範囲を、任意に有し、それは実質的に均一であり得、ここでばらつきは、直径の１００％以下、５０％以下、または１０％以下であり得る。微粒子の直径は、例えば、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して測定することができる。
【００４０】
微粒子は様々な方法により形成することができ、いくつかの態様においては本明細書中で例証された方法を含む。対象となる方法は、限定しないが、制御されたカチオン誘起マイクロエマルジョン（controlled cation-indued micro-emulsion）、およびスプレードライを含む。高分子微粒子作製方法は、高分子電解質複合体形成、ダブルエマルジョン／溶媒蒸発技法、エマルジョン重合技法などを伴うことができる。スプレードライは、水相または他の流体相中に溶解または懸濁された薬物の噴流を使用するプロセスであり、それは高圧ノズルを介して押し出され、細かい霧を産生する。しばしば、増量剤もまた、流体に加えられる。霧の水分または他の液体分は蒸発し、細かい粉末を残す。エアー噴霧スプレードライ（air nebulization spray drying）と呼ばれる、スプレードライの変形は、２つのくさび形ノズルを使用し、それを通して圧縮空気が通過し、および溶液が高速で通過する。くさび形ノズルは、流体加速区間として作用し、そこで４つの流れが高速で衝突し、衝撃波を生じさせ、細かい液滴を生成する。液滴は次に、熱風によって固体の粉末へと乾燥されながらカラム中へと下降してから、回収される。
【００４１】
対象となる安定剤は、限定しないが、アルギン酸塩、キトサン、リン酸のコリンエステルに結合したステアリン酸、パルミチン酸およびオレイン酸のジグリセリドの天然に生じる混合物であるレシチン、トリメタリン酸ナトリウム、ポロキサマー（すなわち、２つのポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の親水性鎖に両側を挟まれたポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖から構成される非イオン性のトリブロック共重合体、種々のサイズ、例えばポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７等を含む）、カチオン性脂質、特にリン脂質、油、例えばココナッツ油等、を含む。キトサンは、ランダムに分布したβ−（１，４）Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成される直鎖状多糖類である。他の対象となる安定剤は、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等）などのタンパク質、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（Ｎ−ビニルピロリドンの水溶性分枝状ポリマー）を含む。本明細書に記載される組成物および方法において有用なＰＶＰは、約１０Ｋまたはそれよりも高い分子量、例えば、約２０Ｋ〜５０Ｋの分子量を有し得る。
【００４２】
用語「カチオン性脂質」は、生理的ｐＨで正に帯電した分子、特に、構成的に正に帯電した分子、例えば第四級アンモニウム塩部分を含むものを、包含することを意図している。本発明の方法に使用するカチオン性脂質は、典型的には、親水性の極性頭部基と親油性の脂肪族鎖とで構成される。例えば、Farhood et al. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1111:239-246、Vigneron et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93:9682-9686を参照。
【００４３】
対象となるカチオン性脂質は、例えば、イミダゾリニウム誘導体（ＷＯ９５／１４３８０）、グアニジン誘導体（ＷＯ９５／１４３８１）、ホスファチジルコリン誘導体（ＷＯ９５／３５３０１）およびピペラジン誘導体（ＷＯ９５／１４６５１）を含む。本発明に使用され得るカチオン性脂質の例は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、ＤＯＴＩＭ（ＢＯＤＡＩとも呼ばれる）（Solodin et al., (1995) Biochem. 34: 13537-13544）、ＤＤＡＢ（Rose et al., (1991) BioTechniques 10(4):520-525）、ＤＯＴＭＡ（米国特許第５，５５０，２８９号）、ＤＯＴＡＰ（Eibl and Wooley (1979) Biophys. Chem. 10:261-271）、ＤＭＲＩＥ（Felgner et al., (1994) J. Biol. Chem. 269(4): 2550-2561）、ＥＤＭＰＣ（Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabamaから市販されている）、ＤＣＣｈｏｌ（Gau and Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-285）、ＤＯＧＳ（Behr et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6982-6986）、ＭＢＯＰ（ＭｅＢＯＰとも呼ばれる）（ＷＯ９５／１４６５１）、および、ＷＯ９７／００２４１に記載されているものを含む。
【００４４】
いくつかの態様において、ＺｎＰＰは、微粒子製剤中で１または複数種のカチオン性脂質で安定化されている。対象となる脂質は、上に挙げられた任意のものを含み、これは例えば、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＥＤＭＰＣ、ＤＣＣｈｏｌ、ＤＯＧＳ、ＭＢＯＰ等を含み、これらは単独で使用されるかまたは異なる脂質のカクテル、例えば、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０等の比率での２種の脂質、として使用され得る。脂質は、微粒子の約９０重量％まで、微粒子の約８５重量％まで、微粒子の約８０重量％まで、微粒子の約７５重量％まで、微粒子の約７０重量％まで、微粒子の約６５重量％まで、または微粒子の約５０重量％まで、を含むことができ、ここで残余は、活性剤であることができ、または、例えば、官能基としてメタクリル酸を有するアニオンポリマーの水性分散体であるEUDRAGIT（Ｒ）Ｌ  ３０  Ｄ−５５と製剤重量の約３５％から約７５％までの濃度で組み合わせられることができる。しかしながら、いくつかの態様において、微粒子は、EUDRAGIT（Ｒ）フリーである。いくつかの態様において、微粒子は、ＺｎＰＰを約１０重量％〜約２５重量％含み、残余は、上記の比率でのＤＳＰＣとＤＰＰＣとの混合物である。
【００４５】
いくつかの態様において、ＺｎＰＰは、レシチン、ポロキサマー、中性油担体、例えばココナッツ油、ならびに、アルギン酸塩、トリメタリン酸ナトリウムおよびキトサンのうちの１以上、を含む混合物により、微粒子製剤中で安定化されている。いくつかの態様において、微粒子は、約５重量％〜約２５重量％のＺｎＰＰ、約１０重量％〜約２０重量％のＺｎＰＰを含む。いくつかの態様において、レシチンは、微粒子の約１０重量％から約４０重量％以下まで、約２０重量％から約３０重量％以下までの濃度で存在する。いくつかのかかる態様において、ポロキサマーは、微粒子の約１０重量％から約４０重量％以下まで、約１５重量％から約２５重量％以下までの濃度で存在する。製剤の残余は、中性油担体および安定剤を含むか、中性油担体および安定剤から本質的になるか、または、中性油担体および安定剤からなる。
【００４６】
いくつかのかかる態様において、安定剤は、アルギン酸塩であり、これは微粒子の約３重量％〜約６重量％、約４重量％〜約５重量％で存在し、また微粒子の約４．５重量％であり得る。
【００４７】
いくつかのかかる態様において、安定剤は、キトサンであり、これは微粒子の約３重量％〜約６重量％、約４重量％〜約５重量％で存在し、また微粒子の約４．５重量％〜５重量％であり得る。
【００４８】
いくつかのかかる態様において、安定剤は、トリメタリン酸ナトリウムであり、これは微粒子の約３重量％〜約６重量％、約４重量％〜約５重量％で存在し、また微粒子の約４．５重量％〜５重量％であり得る。
【００４９】
好ましい医薬組成物は、経口送達のために製剤されている。いくつかの態様において、本発明の微粒子は、例えば、単位用量で、例えば投与直前の再構成のための乾燥粉末などで提供される。医薬組成物は、所望の製剤に応じて、薬学的に許容し得る非毒性の担体または希釈剤を含むことができ、これらは動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を製剤することに一般に使用されるビヒクルとして定義されている。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンガー液、デキストロース溶液およびハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、または、非毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤、賦形剤などを、含むことができる。組成物はまた、ｐＨ調整および緩衝化剤、毒性調整剤、湿潤剤および界面活性剤などの、生理的条件に近づけるための追加の物質をも含むことができる。
【００５０】
他の態様において、経口送達製剤は、薄型フィルム(thin film)として提供され、例えば、そこでは微粒子の乾燥粉末製剤がフィルム形成ポリマーを含有する溶媒中に分散され、それは薄型フィルムにキャストされ、例えば単位用量としてパッケージされ得る。
【００５１】
他の経口製剤は、限定しないが、当技術分野で知られ、本発明の微粒子に適した、錠剤、ロゼンジ、カプセル、スプリンクル、サシェ、スティックパック等を含む。
【００５２】
上記に基づいて、当技術分野における当業者には、単一の患者を処置するために複数の異なる処置および投与手段を使用することができるということが、理解される。
【００５３】
１日あたりの合計用量は、好ましくは、少なくとも１日あたり１回投与されるが、１日当たり２回以上の用量に分割されてもよい。患者の一部は、数日または数週の期間にわたる、患者へのより高い用量またはより頻繁な投与での「負荷（loading）」の期間と、その後に続く減少用量または維持用量から利益を受けることがあり得る。
【００５４】
エアロゾル化送達デバイスに関連して使用することができる製剤に関する具体的な情報は、Remington's Pharmaceutical Sciences, A. R. Gennaro editor (latest edition) Mack Publishing Companyの中に記載されている。薬物送達方法の簡単な総説については、Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照。
【００５５】
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。活性成分の毒性および治療効力は、細胞培養物および／または実験動物における標準的な薬学的手順に従って決定することができ、これは例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対して治療的に有効な用量）を決定することを含む。毒性と治療的効果との間の用量比率は治療指数であり、それは比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表示され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【００５６】
細胞培養および／または動物研究から得られたデータは、ヒトに対する投与量の範囲を定めることに使用することができる。活性成分の投与量は、典型的には、低い毒性を伴うＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、この範囲内で、採用される剤形と利用される投与経路とに応じて変化し得る。
【００５７】
医薬組成物を製剤するために使用される構成成分は、好ましくは、高純度であり、および、有害な可能性のある夾雑物を実質的に含まない（例えば、少なくとも食品（National Food）（ＮＦ）グレード、一般的には少なくとも分析グレード、および、より典型的には少なくとも医薬品グレード）。そのうえ、in vivoでの使用を意図した組成物は、通常無菌である。所与の化合物が使用前に合成されなければならない場合、得られる生成物は、典型的には、合成または精製プロセスの最中に存在し得るいかなる毒性の可能性のある物質も、特に、いかなるエンドトキシンも、実質的に含まない。非経口投与のための組成物もまた無菌であり、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で製造される。
【００５８】
本発明の組成物は、任意の医学的に適切な手順を使用して投与され得る。特定の患者へ与えられるべき治療組成物の有効量は、種々の要因に依存し、そのうちのいくつかの要因は、患者間で異なる。有能な臨床医は、治療剤の有効量を決定することができる。組成物は、１回よりも多い一連の投与によって対象へ投与することができる。
【００５９】
用量レベルが、具体的な化合物、症状の重症度、および対象の副作用への感受性に応じて変化し得ることを、当業者は容易に理解する。薬物のいくつかは、他よりも強力である。所与の剤の好ましい投与量は、当技術分野における当業者によって、様々な手段により容易に決定可能である。好ましい手段は、所与の化合物の生理学的強度を測定することである。
【００６０】
キットおよびパッケージ
いくつかの態様において、本発明の方法における使用のための製剤が提供される。かかる製剤は、安定化されたＺｎＰＰの微粒子等を含み得、これらは、凍結乾燥された無菌粉末としてのパッケージ、安定な懸濁物、例えば、担体中の微粒子の懸濁物のパッケージ、使用前の混合に適した微粒子と担体との別々のパッケージ、などを含む臨床使用に適したパッケージで提供され得る。パッケージは、高ビリルビン血症を患っている患者の機能の改善のための医薬の製造において、微粒子形態のＺｎＰＰ活性剤の有効用量を提供する、単回単位用量であり得る。
【００６１】
処置方法
本明細書に記載される方法は、ＨＯ酵素を阻害するのに有効な用量での本明細書に記載されるＺｎＰＰ含有微粒子を含む医薬組成物の投与、好ましくは経口投与を含む。経口投与は、「初回通過効果」を利用することにより、標的化された送達を可能にし、肝臓および脾臓への局在化をもたらす。ＺｎＰＰはまた、経口送達の後で全身的にもなり得る。有効用量は、個体の年齢、処置される状態などに応じて変化し得る。
【００６２】
態様は、乳幼児における高ビリルビン血症またはその症状を処置する方法を含む。いくつかの態様において、乳幼児は、約３５週から約４３週までの在胎齢の乳幼児である。他の態様において、乳幼児は、３０日齢以下である。いくつかの態様において、乳幼児は、約２，５００ｇの最低ＢＷを有する。いくつかの態様において、乳幼児は、約１，７００ｇから約４，０００ｇまでのＢＷを有する。いくつかの態様において、乳幼児は、少なくとも１つのリスク要因、例えば、溶血性疾患、ＡＢＯ式血液型不適合、抗ＣのＲｈ不適合、抗ｃのＲｈ不適合、抗ＤのＲｈ不適合、抗ＥのＲｈ不適合、抗ｅのＲｈ不適合、Ｇ６ＰＤ欠損、またはこれらの組み合わせ、を有する。いくつかの態様において、ＺｎＰＰ製剤の治療量を投与することは、出生後約６時間以内、出生後約１２時間以内、出生後約２４時間以内および出生後約４８時間以内から選択される時間に行われる。いくつかの態様において、ＺｎＰＰ製剤は、経口投与される。
【００６３】
メタロポルフィリンは、投与後約６〜１２時間後に効果を有し始めるようである。本明細書に開示されるとおりにＺｎＰＰを投与することは、光線療法または交換輸血の発生率または必要性を低下させることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示されるとおりにＺｎＰＰを投与することは、光線療法の継続期間を減少させ得る。いくつかの態様において、本明細書に開示されるとおりにＺｎＰＰを投与することは、光線療法の光強度を減少させ得る。いくつかの態様において、本明細書に開示されるとおりにＺｎＰＰを投与することは、光線療法の必要性を取り除く。
【００６４】
高ビリルビン血症を処置するための剤としての治療的使用において、ＺｎＰＰは、約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇのＺｎＰＰ／ｋｇ  ＢＷ（ＩＭ）の初期用量で投与され得る。ある態様において、メタロポルフィリンでの処置は、１回の単回投与処置である。いくつかの態様において、ＺｎＰＰは、約０．５ｍｇ／ｋｇから約６ｍｇ／ｋｇまでのＺｎＰＰ／ｋｇ  ＢＷ（ＩＭ）の投与量で投与される。いくつかの態様において、ＺｎＰＰは、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇおよび約４．５ｍｇ／ｋｇを含む、約０．５ｍｇ／ｋｇから約４ｍｇ／ｋｇまで、約０．５ｍｇ／ｋｇから約２ｍｇ／ｋｇまで、約０．７５ｍｇ／ｋｇから約１．５ｍｇ／ｋｇまで、約１．５ｍｇ／ｋｇから約４．５ｍｇ／ｋｇまで、または約３．０ｍｇ／ｋｇから約４．５ｍｇ／ｋｇまでの投与量で投与される。しかしながら、投与量は、患者の要求、処置される状態の重症度および採用される化合物に応じて変化し得る。特定の状況のための適当な投与量の決定は、当技術分野における技術の範囲内である。例えば、処置は、化合物の最適用量よりも少ない、より小さい投与量で開始され得る。その後、投与量は、その状況下における最適効果に達するまで、少量ずつ増加され得る。
【００６５】
いくつかの態様は、適格性決定およびスクリーニング評価をさらに含む。いくつかの態様において、適格性決定およびスクリーニング評価は、これに限定されないが、経皮ビリルビン（ＴｃＢ）モニタリング、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）（自動聴性脳幹反応［Ａ−ＡＢＲ］または聴覚脳幹誘発電位［ＢＡＥＰ］としても知られる）を含む聴覚検査、１２リードＥＣＧ、母体および対象の人口統計学的データの検討、対象の病歴の検討、選択要因および除外要因の検討、対象の併用薬の検討、バイタルサインの評価、体重、身長、頭囲および眼を含む身体検査、皮膚科検査、アミエル−チゾン神経学的検査、以下の分析のための血液採取：臨床化学、血液学（血液塗抹標本を含む）、薬物動態学、およびこれらの組み合わせを含む。
【００６６】
いくつかの態様は、処置前、処置中、処置後またはそれらの組み合わせの、対象の継続的評価（continued evaluation）をさらに含む。いくつかの態様において、継続的評価は、これに限定されないが、ＴｃＢのモニタリング、ＡＢＲ（Ａ−ＡＢＲまたはＢＡＥＰとしても知られる）を含む聴覚検査、３つの１２リードＥＣＧ、母体および対象の人口統計学的データの検討、対象の病歴の検討、選択要因および除外要因の検討、対象の併用薬の検討、バイタルサインの評価、体重、身長、頭囲および眼を含む身体検査、皮膚科検査、アミエル−チゾン神経学的検査、以下の分析のための血液採取：臨床化学、血液学（血液塗抹標本を含む）、薬物動態学、およびこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、バイタルサインは、体温（腋窩）、血圧（年齢およびサイズに適切な設備を用いて測定）、脈拍数、呼吸数、およびこれらの組み合わせを、測定することを含む。
【００６７】
本明細書に記載される製剤はまた、有効用量のＺｎＰＰの送達が望ましい他の方法における使用をも見出す。いくつかの態様において、がんを処置する方法が提供される。ＨＯ−１は、腫瘍促進活性に関与することが示された。ＨＯを阻害することにより、本明細書に記載される製剤中のＺｎＰＰは、抗腫瘍活性を、単独でまたは化学療法もしくは放射線療法との組み合わせで、例えば癌などの固形腫瘍の処置等において、提供することができる。
【００６８】
他の方法は、限定しないが、ＨＯの選択的な阻害が望まれる種々の状態における、加齢性黄斑変性症の処置、感染症の処置等を含む。本明細書に記載される組成物はまた、ＮＭＲイメージングのための造影剤としての使用をも見出す。
【００６９】
本発明は、その特定の好ましい態様に関してかなり詳細に記載されたが、他のバージョンも可能である。したがって、添付のクレームの主旨および範囲は、この明細書内に含まれている説明および好ましいバージョンに限定されるべきものではない。
【００７０】
例１
メタロポルフィリンで処置された新生マウスへの光の影響
新生児高ビリルビン血症は、ビリルビンの産生とその除去との間の不均衡から起こる。超低出生体重（ＥＬＢＷ）児についての積極的光線療法対従来型光線療法の研究は、神経発達障害（ＮＤＩ）の発生率単独は、積極的光線療法によって顕著に減少したものの、この減少が、≦５０１〜７５０ｇの乳幼児の間での死亡率の増加に相殺されたことを示した。加えて、光（青色光を含む）の光酸化効果が、動物において示されている。そのうえ、ＥＬＢＷ児のより低いヘモグロビンレベルでは、循環中のヘモグロビンによって吸収される光がより少ないため、彼らをより高い光毒性リスクにさらし得ることが示唆されている。メタロポルフィリン（Ｍｐ）は、高ビリルビン血症を処置するのに有望な薬物であるが、それらのほとんどは、光感作性であり、その後に光毒性となる可能性がある。亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）は、十分な強度を有する有望なＭｐであるが、それは不溶性が悪く、経口的に吸収されない。我々は、生物学的利用能を改善し、胃通過を向上させる、種々のＦＤＡ承認済みの生分解性ポリマーおよびリン脂質を使用したＺｎＰＰの微粒子製剤を設計し開発した。我々は、３日齢マウスへの３０μｍｏｌ／ｋｇのＺｎＰＰ微粒子の胃内投与が、光毒性の兆候を示すことなく、リン酸緩衝液中の３０μｍｏｌのＺｎＰＰ／ｋｇと比較して２倍の強度の増加をもたらしたことを見出した。我々は、高分子微粒子送達システム（マイクロまたはナノ粒子）を使用することは、光感作効果なしにＨＯ阻害強度を保持しつつ、安定性を改善し、およびＺｎＰＰの腸管吸収を向上させることができ、ゆえに新生児高ビリルビン血症を処置するのに有用である、と結論付けた。
【００７１】
具体的な生物学的プロセスにおけるヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）の機能を研究し、治療化合物としてのメタロポルフィリン（Ｍｐ）の投与を介して酵素活性を調節することを目標に、成体および新生動物モデルにおけるヘムの代謝回転を評価した。どの化合物が最も効果的であると思われるかを予測することを我々に可能にする、Ｍｐの特定の化学構造的特徴は発見されていなかった。望ましい薬物特性は、低いＩＣ５０、光感作活性の欠如、経口吸収性、血液脳関門を通過しないこと、短時間作用型であること、ＨＯ−１  ｍＲＮＡ、ＨＯ−１タンパク質、またはＨＯ−１活性を実質的に上方制御しないこと、および、分解し、その後に封鎖された金属イオンを放出しないことを含む。
【００７２】
メタロポルフィリンで処置された新生仔マウスへの光曝露の影響。我々は、新生児黄疸の防止への使用に有望な２つのＭｐ、クロムメソポルフィリン（ＣｒＭＰ）および亜鉛ビスグリコールポルフィリン（ＺｎＢＧ）の、可能性のある光感作効果を実証した。我々がこれらの２つの化合物を選んだのは、両方とも経口吸収され、望ましい用量範囲内で比較的強力であり最小限の光反応性を有し、ＨＯ−１転写の上方制御が最小限であるためである。この研究において、我々は、３日齢の仔マウスに対してＣｒＭＰまたはＺｎＢＧを、３．７５〜３０μｍｏｌ／ｋｇ  ＢＷの範囲にわたる用量で、腹腔内（ＩＰ）投与した。仔動物は、暗所に保たれたか（対照）、または、２本の白色管（Ｆ２０Ｔ１２ｃＷ）および１本の青色管（ＴＬ２０Ｗ／５２）で構成される蛍光灯に３時間さらされた（図２）。ＣｒＭＰで処置された仔動物において、我々は、用量依存性の死亡率を見出し、暗所に保たれたものと光にさらされたものについてのＬＤ５０（５０％致死用量）は、夫々、２１．５μｍｏｌ／ｋｇと２３．０μｍｏｌ／ｋｇであった。
【００７３】
両群の間に、生存率の顕著な差はなかった。ＣｒＭＰと対照的に、３０μｍｏｌ／ｋｇのＺｎＢＧを与えられて暗所に保たれた仔動物は、何ら化学毒性を示さなかった。しかしながら、光への曝露の後、我々は、ＬＤ５０が１９．５μｍｏｌ／ｋｇであったこと、仔動物が顕著な体重減少、肝臓の抗酸化能力の低下、および、クレアチンキナーゼ（ＣＫ−ＭＢ）およびアスパラギン酸アミノトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルの増加を示したことを見出した。加えて、光曝露の６日後、ＺｎＢＧで処置された仔動物は、＞７．５μｍｏｌ／ｋｇ  ＢＷの用量で、大きな組織学的皮膚変化を生じた。興味深いことに、３０μｍｏｌのＺｎＰＰ／ｋｇ  ＢＷで処置されて青色発光ダイオード（ＬＥＤ）の光にさらされた仔動物では、致死性は観察されなかった。まとめると、我々は、ＣｒＭＰは化学毒性を有するが、光毒性を有しないことを示した。ＺｎＢＧは、化学毒性を有しないが、光源に依存する光毒性を有するようであった。最も重要なことに、低用量のＺｎＢＧ（＜３．７５μｍｏｌ／ｋｇ  ＢＷ）は、光感作効果なしに、最大限のＨＯ阻害強度を保持した（図３）。
【００７４】
亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）を使用することの判断。我々は、ポジティブな特性とネガティブな特性とのバランスがとれた別の好都合な化合物である、天然に生じるＺｎＰＰに研究の焦点を当てた。これは、十分な強度（酵素活性を５０％阻害する用量（すなわち、ＩＣ５０）、脾臓および脳：ラットおよびマウスにおいて、夫々およそ６．０μＭおよび３．０μＭ）を有し、測れる程度に血液脳関門を通過することがなく、光化学的に活性でなく、細胞培養物または新生仔マウスにおけるＨＯ−１の上方制御が最小限であり、迅速に作用を発現し、短時間作用型であり、および、ＨＯによって分解されない、Ｍｐである。また、この化合物は、主にＨＯ−１に影響を及ぼすが、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）または可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の基礎活性に何ら顕著な程度の影響を及ぼさない低用量で、投与することができる。
【００７５】
しかしながら、ＺｎＰＰは、溶液中に維持することが困難であり、経口吸収されず、非経口投与を要した。熱損傷させた赤血球で新生仔アカゲザルを処置した溶血性黄疸のモデルにおいて、我々は、４０μｍｏｌ／ｋｇ  ＢＷの用量でＺｎＰＰを皮下（ＳＣ）に与えることが、効果的に、一酸化炭素ヘモグロビンおよび総ビリルビンレベルをベースラインのレベルまで、２４時間以内に減少させたことを見出した。ＨＯ阻害は、腎臓または脳に影響を及ぼすことなく、肝臓および脾臓を標的とした。
【００７６】
ゆえに、この化合物は、新生児黄疸の処置における使用のために、極めて有望である。それ自体では経口投与後に効果的でないものの、高分子微粒子送達システムを使用する製剤は、経口生物学的利用能を与え、および胃通過を向上させる。我々は、Ｍｐをリポソーム中に組み込むことが、脾臓への送達を顕著に増加させ得、ゆえにそれらの効力を向上させたことを、以前に示した。経口送達の必要性が重要であるのは、高ビリルビン血症で再入院している後期早産および正期産の乳幼児など、全ての乳幼児が薬物の非経口投与のための静脈内（ＩＶ）アクセスを有するわけではないためである。そのうえ、経口投与は、標的臓器である肝臓および脾臓への「初回通過効果」を利用することにより、ＨＯ阻害剤の標的化された送達をもたらし、一方、ＩＶ投与は、全身への分布をもたらす。ゆえに、我々は、肝臓および脾臓へのＭｐの標的化された送達をもたらすために、経口生物学的利用能および胃通過を増加させる薬物送達システムを使用する製剤を、設計し開発した。かかる高分子微粒子送達システム（マイクロまたはナノ粒子）は、薬物安定性を改善し、ヒト新生児における使用のための胃通過を向上させる。
【００７７】
このアプローチを使用して、我々は、ＺｎＰＰの経口生物学的利用能および有効性を改善することに成功した複数の製剤を評価した。高分子微粒子送達システム（マイクロまたはナノ粒子）の使用は、分解に対する安定性を改善することおよび腸管吸収を向上させることを両方とも可能にする送達のアプローチを提供する。我々の研究において、ＺｎＰＰ／脂質微粒子を、制御されたカチオン誘起マイクロエマルジョン、またはスプレードライによって調製した。特に、ＤＰＳＳ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）およびＤＰＳＣ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロホスホコリン）は、未熟児において界面活性剤としての使用についてＦＤＡに承認された生分解性リン脂質である。
【００７８】
亜鉛製剤。我々は、その安定性を改善し、およびその腸管吸収を向上させるために、高分子微粒子送達システム（マイクロまたはナノ粒子）を使用する５つの異なるＺｎＰＰの製剤を設計した。ＺｎＰＰを、胃の酸性環境（我々は、それがＺｎＰＰを非活性にすることを見出した）から保護するためだけでなく、小腸への移行の最中にＺｎＰＰの放出をｐＨ＞５．５において最大化させるためにも、腸溶性コーティングされた微粒子を設計した。メタクリル共重合体（EUDRAGIT（Ｒ）Ｌ１００−５５、ｐＨ＜５．５において不溶性）を、ＤＰＰＣおよび／またはＤＳＰＣと組み合わせて使用したか、または、リン脂質のみを使用した。これらのリン脂質は、ＦＤＡ承認済みの賦形剤であり、かつ、内因性のリン脂質であり、高濃度での新生未熟児における使用について以前に承認された人工肺表面活性剤の主構成物質として使用されている。微粒子は、エマルジョンまたはスプレードライ技法によって形成される。
【００７９】
調製および試験したＺｎＰＰ製剤を、表１に示す。エマルジョンを使用して製造した製剤は、凍結保存し、凍結乾燥させることによって、最終的なキトサンベースの微粒子を得た（ＺｎＰＰ−ＡおよびＺｎＰＰ−Ｂ）。スプレードライを使用して製造した製剤は、乾燥粉末として凍結保存した。アルギン酸塩およびキトサンは、成人への使用についてＦＤＡに承認された生分解性ポリマーであるが、それらは未熟児における使用については承認されていない。ヒトへの使用について承認されたエマルジョンのさらなる検討は、我々をアクリルビーズ（例えば、EUDRAGIT（Ｒ））を使用したＺｎＰＰ−Ｐｏｌｙの合成へと導いた。加えて、ＦＤＡ承認済みのリン脂質であるＤＰＰＣおよびＤＳＰＣで構成されるＺｎＰＰ  Ｌｉｐｉｄ調製物を作出した。
【表１】
2017505325.tif 000003
【００８０】
ＺｎＰＰ製剤の評価。我々は、ＺｎＰＰ調製物（ＺｎＰＰ−Ａ、ＺｎＰＰ−ＢおよびＺｎＰＰ−Ｐｏｌｙ）のin vitro  ＨＯ阻害強度を、０．４ＭのＮａ３ＰＯ４、標準生理食塩水、および蒸留水中に調製したリン酸ナトリウム水溶液（ＺｎＰＰ−ＰＯ４）に対して、３日齢の仔マウスから採取された肝臓、脾臓および脳の超音波破砕物において試験した。我々は、ＺｎＰＰ−Ｐｏｌｙが肝臓ＨＯ活性の阻害に関して最も強力であり、ＺｎＰＰ−ＰＯ４溶液がそれに続くことを見出した（図４）。キトサン／アルギン酸塩ベースの製剤は、最も少ない強度を有した。全ての製剤は、脾臓および脳組織において類似した強度を有した。これらの有望な知見およびＺｎＰＰ−Ｌｉｐｉｄの設計に基づき、次に我々は、これらのＺｎＰＰ製剤のin vivo  ＨＯ阻害強度をＺｎＰＰ−ＰＯ４溶液と比較して評価した。３日齢マウスに、ビヒクル（ＶＥＨ）、または５つのＺｎＰＰ製剤のうちの１つの３０μｍｏｌ／ｋｇ  ＢＷ、またはＶＥＨ単独を、直接胃内（ＩＧ）注入によって与えた（図５）。３時間後、仔動物を犠牲にし、肝臓、脾臓および脳をＨＯ阻害強度の測定のために採取した。ＨＯ活性を、ｐｍｏｌ  ＣＯ／ｈ／ｍｇ生体重（ＦＷ）として算出し、および次に対照値の平均±ＳＤ％として表示した。
【００８１】
毒性を評価するため、仔動物を同様に処置し、および次に直ちに、光毒性について試験するために蛍光管（２本の白色／１本の青色ＴＬ５２）下に３時間置き、または、化学毒性について試験するために暗所に保った。次に、仔動物の全体的な生存率を、１週間までモニタリングした。ＺｎＰＰ−ＰＯ４がin vitroでは最も強力（８０％）であることが見出されたにもかかわらず（図４）、おそらく、その胃通過の悪さに起因して（図５）、その強度はＩＧ投与後には顕著に低下した（図６Ａ）。予想したとおり、それは光毒性または化学毒性を示さなかった（図６Ｂ）。
【００８２】
ＺｎＰＰのキトサン／アルギン酸塩ベースの調製物は、in vivoで強力であったが、キトサン／アルギン酸塩は未熟児における使用についてＦＤＡ承認済みではないため、これらの製剤については毒性についてさらなる評価を行わなかった。ＺｎＰＰ−Ｐｏｌｙは、肝臓および脾臓において最も強力であったが（図６Ａ）、それは光毒性を有し、光曝露の４８時間後に９０％の死亡率をもたらしており（図６Ｂ）、これは、Ｐｏｌｙ−Ｏｎｌｙで処置された仔動物の死亡率が光および暗所への曝露の後に夫々１００％および７０％であったように、ポリマー自体に起因した可能性がある。重要なことに、我々は、ＺｎＰＰ−Ｌｉｐｉｄ製剤もまた強力であったが、光または化学毒性を示さなかったことを観察した。ＺｎＰＰ−Ｌｉｐｉｄ製剤は、ＩＧ投与後に肝臓ＨＯ活性を阻害するのに有効であり、かつ、毒性を有さなかったため、我々は、ＺｎＰＰ−Ｌｉｐｉｄ製剤が新生児黄疸の処置に使用するのに最も高い可能性を有する、と結論付けた。
【００８３】
これらのデータは、天然に生じるＺｎＰＰが強力であり、および、迅速な作用を有し、長期的な阻害効果がなく、移行期間中の新生児の処置における使用を意図した抗高ビリルビン血症薬に極めて有用であることを示す。ＺｎＰＰを経口で生物学的利用可能としつつ、これらの効力および安全特性を維持するように設計することは、溶血またはビリルビン産生増加の他の原因を有する標的とする新生児におけるビリルビンレベルの制御のためにそれを使用することへの信頼を、小児科医に与える。
【００８４】
例２
製剤
ＺｎＰＰの１つの不利な点は、それが経口で生物学的利用可能でないこと、および非経口的に投与される必要があることである。ＺｎＰＰの低い経口生物学的利用能は、その低い可溶性、および、胃の中で見出されるような低ｐＨ環境における化学的不安定性、および、腸管におけるその溶解およびその後の吸収を制限する、中性ｐＨでの低い水溶解度による結果である。ＺｎＰＰは、低ｐＨの水溶液中で反応して、ＨＯ阻害には非活性であるプロトポルフィリンＩＸ遊離酸を生成する。
【００８５】
分子を胃の中で見出される酸性環境との相互作用から保護すること、および、その中性ｐＨにおける水溶解度を増加させて上部小腸での吸収を促進することの両方によって、ＺｎＰＰの経口生物学的利用能および有効性を改善する製剤が必要とされる。製剤は、理想的には、最終的な医薬剤形の貯蔵寿命および製造性の両方を改善するため、粉末状の固体状態である。
【００８６】
微粒子を、スプレードライにより形成する（これは、最終剤形のＧＭＰ製造のために要求されるＧＭＰ環境下でのスケールアップへの簡単な道筋を確保する）。
スプレードライ粉末調製物；製剤成分：
ＺｎＰＰ；２０％ｗ／ｗ
ＤＰＰＣ；５％ｗ／ｗ
EUDRAGIT（Ｒ）Ｌ１００−５５；７５％ｗ／ｗ
【００８７】
スプレードライのための１％の固体（ｗ／ｖ）原料溶液の調製：ＺｎＰＰを、ソニケーションによって、１Ｍ水酸化アンモニウム（総溶媒体積の１２．５％を構成する）中に溶解させる。ＤＰＰＣを、エタノール（総溶媒体積の１２．５％）中に溶解させて加える。EUDRAGIT（Ｒ）Ｌ１００−５５を、エタノール（残りの７５％の溶媒体積）中に溶解させて加える。
【００８８】
Buechi-290のスプレードライ条件：
入口温度：７０℃
出口温度：５０℃
アスピレータ：７５％
窒素：３０ｍｍゲージ高
ポンプ：８％
【００８９】
プロセスの最中は、供給溶液容器およびスプレードライヤー室を光から保護する。乾燥粉末は、光から保護して凍結保存する。
【００９０】
この製剤についての観察結果を、図７Ａに示す：２０％のＺｎＰＰ含有量は、ＬＣＭＳにより確認した。０．１ＮのＨＣｌ媒体中では、限られたＺｎＰＰの放出が明らかであり、酸にさらされた粒子のｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中での洗浄および再懸濁は、ＨＰＬＣ／ＭＳにより測定されたＺｎＰＰの大量の放出をもたらした。７５％ｗ／ｗのEUDRAGIT（Ｒ）を含有するスプレードライ粒子についてのＳＥＭ画像。しわ状の形態は、効率的な薬物封入を確保する、粒子形成の最中の早期のポリマー析出を表す。
【００９１】
例３
より高いＺｎＰＰ含量のスプレードライ粉末の調製
より低いEUDRAGIT（Ｒ）含有量でのＺｎＰＰ製剤；製剤成分：
ＺｎＰＰ；２０％ｗ／ｗ
ＤＰＰＣ；４２％ｗ／ｗ
EUDRAGIT（Ｒ）Ｌ１００−５５；３８％ｗ／ｗ
【００９２】
スプレードライのための１％の固体（ｗ／ｖ）原料溶液の調製：ＺｎＰＰを、ソニケーションによって、１Ｍ水酸化アンモニウム（総溶媒体積の１２．５％を構成する）中に溶解させる。ＤＰＰＣを、エタノール（総溶媒体積の５０％）中に溶解させて加える。EUDRAGIT（Ｒ）Ｌ１００−５５を、エタノール（残りの３７．５％の溶媒体積）中に溶解させて加える。スプレードライ条件：上記と同様。
【００９３】
この製剤についての観察結果を、図７Ｂに示す：２０％のＺｎＰＰ含有量は、ＬＣＭＳにより確認した。０．１ＮのＨＣｌ媒体中で、いくらかのＺｎＰＰの放出が明らかであるものの、酸にさらされた粒子のｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中での洗浄および再懸濁は、ＨＰＬＣ／ＭＳにより測定されたＺｎＰＰの大量の放出をもたらした。ＳＥＭ画像は、これらの３８％ｗ／ｗのEUDRAGIT（Ｒ）での粒子について、その前に試験した製剤（７５％ｗ／ｗのEUDRAGIT（Ｒ））と比較して類似した形態を示す。しわ状の形態は、効率的な薬物封入を確保する、粒子形成の最中の早期のポリマー析出を表す。
【００９４】
例４
栄養チューブを介して乳幼児へ経口送達するのに適切な希釈剤で再構成するための粉末を含むバイアルまたはシリンジ
ＺｎＰＰの所望の用量が、少量のスプレードライ粉末中に、あるいは、より最終ＺｎＰＰ含有量に依存性が少なく、および、標的の対象（例えば、新生仔マウスまたはラット、サル、または乳幼児患者へ栄養チューブを介して）に応じて、含有され得る。スプレードライ粉末は、通常、サイズが小さく、粒状粉末よりも凝集する傾向がある。増量剤を使用してスプレードライ粉末を混合し、バイアルに充填することを容易にすることができ、当該粉末は次に、試験対象（新生仔マウスまたはラット、サル等）への、または乳幼児患者へ栄養チューブを介しての投与の前に適切な希釈剤で再懸濁される。これは、下記のとおりに達成することができる。
【００９５】
ＺｎＰＰ−ＤＰＰＣ−EUDRAGIT（Ｒ）のスプレードライ粉末を、増量剤としてのＤ−グルコースと混合して、標的とする量のスプレードライ粉末（ＺｎＰＰ含有量と要求される用量とに基づいて算出される）を、Ｄ−グルコースの適切な量（１０％〜９０％ｗ／ｗの量の範囲にわたる）とともに含有する均一な混合物を得、粉末の混合物を、次にガラスまたはプラスチックのバイアルまたはシリンジに、手作業でまたは充填機を使用して充填することができる。
【００９６】
投与の前に、次に、０．２５％（ｗ／ｖ）のｐＨ４．７のクエン酸緩衝液を含有する適切な量の希釈剤を、要求される用量を含有する標的とする量の粉末へ添加することによって、懸濁液を形成する。希釈剤のｐＨは、ポリマー微粒子の溶解を最小限ではあるが、ＺｎＰＰの化学分解を起こすほど低くはしないための鍵である。懸濁液を撹拌し、投与のための準備ができた状態とする。
【００９７】
図８Ａ、リン酸ナトリウム溶液で投与されたＺｎＰＰ−ＰＯ４は、プロトポルフィリンの沈殿を示している。図８Ｂ。ＺｎＰＰのスプレードライ微粒子の投与の３時間後。３匹の処置された３日齢の仔マウスのうちの２匹で、沈殿が完全に阻害されている。
【００９８】
例５
ＺｎＰＰ経口薄型フィルム剤形
ＺｎＰＰのスプレードライ粉末製剤を、フィルム形成ポリマーを含有する有機溶媒の溶液中に分散することができる。懸濁されたスプレードライ粉末を含有するポリマー溶液を、次に薄型フィルムにキャストし、これを次に適切なサイズの部分に切り、部分の各々は、１回の用量を含有する。薄型フィルムは、何ら追加の液体を必要とすることなく、乳幼児の患者の口内で瞬時に溶解することが予想される。
【００９９】
例６
ＺｎＰＰ速溶錠
ＺｎＰＰのスプレードライされた粉末製剤を、０．２５％（ｗ／ｖ）のｐＨ４．７のクエン酸緩衝液を含有する希釈剤中に懸濁することができ、これにマンニトールを適切な量で添加することができる。懸濁液を、次に、錠剤のサイズの型に移し、これを次に液体窒素の流れの中で凍結させる。凍結した懸濁液を、次に凍結乾燥させ、得られた錠剤を含む型を、保護被膜で密封することができる。凍結乾燥された錠剤は、何ら追加の液体を必要とすることなく、乳幼児の患者の口内で瞬時に溶解することが予想される。
【０１００】
例７
ＺｎＰＰ／キトサン微粒子の調製
製成分（ｗ／ｗ）：ココナッツ油（４０％）、レシチン（３０％）、ＺｎＰＰ（５％）、ポロキサマー１８８（２０％）およびキトサン（ＭＷ−１５０００）（５％）
【０１０１】
調製手順：ココナッツ油（４０ｍｇ）とレシチン（３０ｍｇ）とを、室温（ＲＴ）で撹拌することによって、１０ｍＬのエタノール中に溶解させた。この溶液に、ＺｎＰＰ（５ｍｇ）を添加し、撹拌しながら４０℃まで加熱し、透明な溶液を得た。別途、ポロキサマー１８８（２０ｍｇ）を、８ｍＬの蒸留水中に溶解させ、次に室温で撹拌しながら上記のエタノール溶液に添加した。キトサン１５Ｋ（５ｍｇ）を、１ｍＬの０．０１Ｎ塩酸水溶液中に溶解させ、次に室温で撹拌しながら上記の混合溶液に添加した。溶媒を、この均一溶液から、真空下でロータリーエバポレーターを使用して除去した。残渣を、１０ｍＬの水で、２０分間のソニケーションにより再構成した。溶液を凍結し、凍結乾燥することによって、最終的なＺｎ−ＰＰ／キトサン微粒子を得た。
【０１０２】
例８
ＺｎＰＰ／アルギン酸塩微粒子の調製
製剤成分（ｗ／ｗ）：ココナッツ油（３５％）、レシチン（２０％）、ＺｎＰＰ（２０％）、ポロキサマー１８８（２０％）およびアルギン酸ナトリウム（４．５％）、塩化カルシウム(０．５％)
【０１０３】
調製手順：ココナッツ油（３５ｍｇ）とレシチン（２０ｍｇ）とを、室温で撹拌することによって、１０ｍＬのエタノール中に溶解させた。この溶液に、ＺｎＰＰ（２０ｍｇ）を添加し、撹拌しながら４０℃まで加熱し、透明な溶液を得た。別途、ポロキサマー１８８（２０ｍｇ）とアルギン酸ナトリウム（４．５ｍｇ）とを、８ｍＬの蒸留水中に溶解させ、次に室温で撹拌しながら上記のエタノール溶液に添加した。塩化カルシウム(０．５ｍｇ）を、１ｍＬの水中に溶解させ、次に室温で撹拌しながら上記の混合溶液に添加した。溶媒を、この均一溶液から、真空下でロータリーエバポレーターを使用して除去した。残渣を、１０ｍＬの水で、２０分間のソニケーションにより再構成した。溶液を凍結し、凍結乾燥することによって、最終的なＺｎＰＰ／アルギン酸塩微粒子を得た。
【０１０４】
例９
ＺｎＰＰ／トリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）微粒子の調製
製剤成分（ｗ／ｗ）：ココナッツ油（３５％）、レシチン（２０％）、ＺｎＰＰ（２０％）、ポロキサマー１８８（２０％）およびトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）（５％）
【０１０５】
調製手順：ココナッツ油（３５ｍｇ）とレシチン（２０ｍｇ）とを、室温で撹拌することによって、１０ｍＬのエタノール中に溶解させた。この溶液に、ＺｎＰＰ（２０ｍｇ）を添加し、撹拌しながら４０℃まで加熱し、透明な溶液を得た。別途、ポロキサマー１８８（２０ｍｇ）とＳＴＭＰ（５ｍｇ）とを、８ｍＬの蒸留水中に溶解させ、次に室温で撹拌しながら上記のエタノール溶液に添加した。溶媒を、この均一溶液から、真空下でロータリーエバポレーターを使用して除去した。残渣を、１０ｍＬの水で、２０分間のソニケーションにより再構成した。溶液を凍結し、凍結乾燥することによって、最終的なＺｎＰＰ／ＳＴＭＰ微粒子を得た。
【０１０６】
例１０
ＺｎＰＰ微粒子製剤の調製
製剤成分（ｗ／ｗ）：ＤＳＰＣ（４５％）、ＤＰＰＣ（４５％）、ＺｎＰＰ（１０％）。
【０１０７】
調製手順：ＺｎＰＰ（１０ｍｇ）を、ソニケーションによって、１０ｍＬの１Ｍ水酸化アンモニウム溶液中に溶解させた。４５ｍＬのエタノール中に溶解させたＤＰＰＣ（４５ｍｇ）を加え、よく混合した。Buchi-290ミニスプレードライヤーを使用して、溶液混合物をスプレードライした。設定パラメーターは、入口温度５５℃、出口温度５０℃、アスピレータ７５％、溶液供給ポンプ８％、および、窒素流３０ｍｍとした。プロセスの最中は、供給溶液容器およびスプレードライヤー室を光から保護する。乾燥粉末を、光から保護して凍結保存する。
【０１０８】
例１１
亜鉛プロトポルフィリンの微粒子製剤を使用した、ヘム負荷後の新生仔マウスにおけるヘムオキシゲナーゼ活性のin vivo阻害
ヘム分解における律速酵素であるヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）は、ビリルビンを産生する。溶血は、ビリルビン産生の増加をもたらし新生児高ビリルビン血症を引き起こす可能性があるため、ＨＯの阻害、例えばメタロポルフィリン（Ｍｐ）による阻害は、理想的な戦略であり得る。亜鉛プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）が有望なＭｐであるのは、これが天然に生じるものであり、強力であり、光毒性を有さず、および、最小限のＨＯ−１上方制御を有するためであるが、それは経口吸収されないため、その使用は限られていた。
【０１０９】
我々は、例１０に記載されるとおり、ＺｎＰＰの脂質ベース製剤（ＺＬ）を設計し、それが新生仔マウスモデルにおける経口投与後に、肝臓ＨＯ活性の阻害に効果的で安全であることを示した。我々は、溶血を有する乳幼児のモデルに類似したモデルであるヘム負荷後の新生仔マウスにおけるＺＬの効力および安全性を調査するため、これらの研究をさらに広げる。ＺＬを、例１０に記載されるとおりに調製し、指示された濃度でＰＢＳ中に再懸濁させた。
【０１１０】
３日齢ＦＶＳ仔動物に、３０μｍｏｌ／ｋｇのヘム（Ｈ）またはビヒクル（Ｖ）をＳＱ注入により与えた。ヘム処置の２４時間後、マウスにＶ（Ｈ−Ｖ）またはＺＬ（１．８〜６０μｍｏｌ／ｋｇ、Ｈ−ＺＬ１．８〜Ｈ−ＺＬ６０）を、胃内注入によって与えた。３時間後、仔動物を犠牲にし、ガスクロマトグラフィーによるＨＯ活性の測定のために、肝臓および脳を採取した。肝臓のＨＯ−１のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによって夫々決定することにより、ＨＯ活性の上方制御を評価した。データを、対照に対する％として表示した。
【０１１１】
ヘム負荷の後（Ｈ−Ｖ）、肝臓のＨＯ活性は、予想したとおり、顕著に１．６倍増加した（表２）。ＨＯ活性のこのヘム誘導性の増加は、ＺＬでの処置後に用量依存的に阻害され、ＨＯ活性は、３０μｍｏｌ／ｋｇの用量で、対照のレベルまで戻った。３０μｍｏｌのＺＬ／ｋの投与の後では、脳のＨＯ活性の顕著な阻害も、肝臓のＨＯ−１のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの顕著な変化も、見られなかった。
【０１１２】
３０μｍｏｌ／ｋｇの用量のＺＬは、ヘム負荷後の肝臓のＨＯ活性を効果的に阻害する。加えて、それは血液脳関門を通過しないようであり、ＨＯ−１のｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを誘起させないようである。我々は、ＺＬが、効果的で安全であり、ゆえに、溶血に起因する新生児高ビリルビン血症の処置における使用のための魅力的な化合物である、と結論付ける。
【表２】
2017505325.tif 000004
【０１１３】
均等物
当技術分野における当業者は、本明細書に記載された具体的な態様および方法に対して数多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確認することができる。かかる均等物は、本発明の範囲に包含されることが意図されている。
【０１１４】
本明細書で引用された全ての特許、特許出願、および文献参照は、本明細書に明示的に参照により組み込まれる。
【図１】
2017505325.tif 000005
【図２】
2017505325.tif 000006
【図３】
2017505325.tif 000007
【図４】
2017505325.tif 000008
【図５】
2017505325.tif 000009
【図６】
2017505325.tif 000010
【図７】
2017505325.tif 000011
【図８】
2017505325.tif 000012
【国際調査報告】
2017505325.tif 000013
2017505325.tif 000014