(57)【要約】  難治性癌及び／または再発癌の処置に使用するための、抗体分子及び薬剤を含む組成物、ならびに、抗体分子及び薬剤を投与することを含む、難治性癌及び／または再発癌を処置する方法の記載。該抗体分子及び薬剤を含むキットも記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する、抗体分子を、
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤と、組み合わせて含む、組成物であって、
前記組成物が、対象における再発癌及び／または難治性癌の処置に使用するためのものであり、及び前記対象が、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有することを特徴とする、前記組成物。
【請求項２】
（ｉ）標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する、抗体分子を、
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤と、組み合わせて含む、組成物の使用であって、
前記使用が、対象における再発癌及び／または難治性癌の処置に使用するための薬物の製造におけるものであり、及び前記対象が、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有することを特徴とする、組成物の前記使用。
【請求項３】
対象における再発癌及び／または難治性癌を処置する方法であって、
（ｉ）標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する、抗体分子を、
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤と、組み合わせて投与することを含み、
前記対象が、再発癌及び／または難治性癌を有するという基準で選択され、及び前記対象が、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有することを特徴とする、前記方法。
【請求項４】
対象における再発癌及び／または難治性癌の処置に使用するためのキットであって、
（ｉ）標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する、抗体分子、
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤、
（ｉｉｉ）リツキシマブ、リツキシマブバイオシミラー、オファツムマブ、オビヌツズマブ、アレムツズマブ、ガリキシマブ、トシツモマブ、放射活性のあるトシツモマブ、イブリツモマブ、放射活性のあるイブリツモマブ、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３７抗体、Ｂ細胞癌の処置に使用される治療用抗体、からなる群から選択される１つ以上の物質、を含み、
前記使用が、対象における再発癌及び／または難治性癌の処置のためのものであり、及び前記対象が、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有することを特徴とする、前記キット。
【請求項５】
前記再発癌及び／または難治性癌が、抗体治療に抵抗性である、請求項１に記載の組成物、または請求項２に記載の使用、または請求項３に記載の方法、または請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記再発癌及び／または難治性癌が、（ｉ）に定義された前記抗体分子に抵抗性である、請求項１もしくは５に記載の組成物、または請求項２もしくは５に記載の使用、または請求項３もしくは５に記載の方法、または請求項４もしくは５に記載のキット。
【請求項７】
前記薬剤が、前記標的細胞上に存在するＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを防止または低減する、請求項１、５、もしくは６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２、５、もしくは６のいずれか一項に記載の使用、または請求項３、５、もしくは６のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８】
標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する前記抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する抗体分子が、前記標的細胞にＦｃγＲＩＩｂ依存性様式で内部移行することができる、請求項１もしくは５〜７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜７のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜７のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを防止または低減する前記薬剤が、前記標的細胞への前記抗体分子の内部移行をさらに防止または低減する、請求項１、５〜８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２、５〜８のいずれか一項に記載の使用、または請求項３、５〜８のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
前記難治性癌が、前記対象が癌処置を受けて応答していない場合、及び／または、前記対象が癌処置を受けたが前記処置中に前記癌が前記対象において進行した場合に、難治性癌であると見なされる、請求項１もしくは５〜９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜９のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜９のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
前記対象が、前記対象が以前に癌を処置されているが部分寛解以上を達成しない場合に、応答していないと見なされる、請求項１０に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項１２】
前記再発癌が、前記対象が以前に癌を処置されており、以前に前記処置に応答しており、及び後に再発した場合に、再発癌であると見なされる、請求項１もしくは５〜９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜９のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜９のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
前記対象が、
（ｉ）処置後に少なくとも部分寛解を達成し、及び／または前記対象が処置後に少なくとも完全寛解を達成するが、
（ｉｉ）前記癌が前記処置の休止後に前記対象において進行した場合に、前記対象が後に再発したと見なされる、請求項１２に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項１４】
前記対象がその後、前記処置の休止の約１ヶ月超後に再発している、請求項１３に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項１５】
前記対象がその後、前記処置の休止の約１ヶ月超後、または約２ヶ月超後、または約３ヶ月超後、または約４ヶ月超後、または約５ヶ月超後、または約６ヶ月超後、または約７ヶ月超後、または約８ヶ月超後、または約９ヶ月超後、または約１０ヶ月超後、または約１１ヶ月超後、または約１２ヶ月超後、または約２年超後、または約３年超後、または約４年超後、または約５年超後、または約６年超後、または約７年超後、または約８年超後、または約９年超後、または約１０年超後に再発している、請求項１３または１４に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項１６】
前記対象が、再発癌の特徴を少なくとも１回、または少なくとも２回、または少なくとも３回、または少なくとも４回、または少なくとも５回、または少なくとも６回、または少なくとも７回、または少なくとも８回、または少なくとも９回、または少なくとも１０回示す、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項１７】
前記処置が、抗体治療、例えば、請求項１〜９のいずれか一項に記載の（ｉｉ）に定義された前記薬剤の非存在下で投与された、請求項１〜９のいずれか一項に記載の（ｉ）に定義された前記抗体分子である、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項１８】
前記処置が、１つ以上の治療薬を含む、請求項１７に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項１９】
前記標的細胞が、上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂ発現を有する、請求項１もしくは５〜１８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜１８のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜１８のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記標的細胞上の上昇したＦｃγＲＩＩｂ発現が、対照と比較して決定される、請求項１９に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項２１】
前記対照が、非難治性癌及び／または非再発癌を有する対照個体の対照細胞を含む、請求項２０に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項２２】
前記上昇したＦｃγＲＩＩｂ発現が、前記対照と比較したときに前記対象の前記標的細胞において少なくとも２倍高い、請求項２０または２１に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項２３】
前記標的細胞が癌細胞である、請求項１もしくは５〜２２のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜２２のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜２２のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記標的細胞がＢ細胞である、請求項１もしくは５〜２３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜２３のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜２３のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記再発癌、及び／または前記難治性癌、及び／または前記癌細胞、及び／または同じ癌タイプ、及び／または前記癌が、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、小リンパ球性リンパ腫を含む群から選択される、請求項１もしくは５〜２４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜２４のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜２４のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記対象が応答していないこと、及び／または対象における部分寛解、及び／または対象における完全寛解、及び／または癌が対象において進行していることが、
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を含む群から１つ以上を測定することによって決定される、請求項１０〜２５のいずれか一項に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項２７】
前記薬剤が、ポリペプチド、またはアンチカリン、またはペプチド、または抗体、またはキメラ抗体、または一本鎖抗体、またはアプタマー、または設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、またはＦａｂ、もしくはＦ（ａｂ′）２、もしくはＦｖ、もしくはＳｃＦｖ、もしくはｄＡｂ抗体断片、またはＩｇＧ２抗体、またはＩｇＧ４抗体、またはＩｇＧ２及びＩｇＧ４のキメラ分子、またはＮ２９７Ｑ変異を含む抗体変異体、またはＤＡＮＡ変異抗体、または小分子、または天然物、またはアフィボディ、またはペプチド模倣薬、または核酸、またはペプチド核酸分子、または脂質、または炭水化物、または、アンキリン反復タンパク質、もしくはアルマジロ反復タンパク質、もしくはロイシンリッチタンパク質、もしくはテトラリオペプチド反復タンパク質、もしくは設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を含むモジュールフレームワークに基づくタンパク質を含む、請求項１もしくは５〜２６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜２６のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜２６のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
（ｉｉ）に定義された前記薬剤が、ＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合する１つ以上の抗体分子である、請求項１もしくは５〜２７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜２７のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜２７のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
（ｉｉ）に定義された前記薬剤が、エフェクター細胞を動員することができるドメインを含まない１つ以上の抗体分子である、請求項１もしくは５〜２８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜２８のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜２８のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
（ｉｉ）に定義された前記薬剤が、モノクローナル抗体分子、及び／またはポリクローナル抗体分子、及び／または二重特異性抗体分子である１つ以上の抗体分子である、請求項２８に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項３１】
前記薬剤が、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
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を有する可変重鎖（ＶＨ）を含む、請求項１もしくは５〜３０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３０のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３０のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記薬剤が、以下のＣＤＲ：
2017517504.tif 000086
を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項１もしくは５〜３１のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３１のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３１のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記薬剤が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列を有する、請求項１もしくは５〜３２のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３２のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３２のいずれか一項に記載の方法、または請求項４もしくは５〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
前記薬剤が、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、及び配列番号５０からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列を有する、請求項１もしくは５〜３３のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３３のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３３のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記薬剤が、以下のＣＤＲアミノ酸配列：
2017517504.tif 000087
を有する、請求項１もしくは５〜３４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３４のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３４のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜３４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３６】
前記薬剤が、以下のアミノ酸配列：
2017517504.tif 000088
を有する、請求項１もしくは５〜３５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３５のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３５のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
前記薬剤が、ＦｃγＲＩＩｂが前記抗体分子の前記Ｆｃドメインに結合することを防止または低減するために、請求項３１〜３６に定義された前記薬剤と競合することができる薬剤である、請求項１もしくは５〜３０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３０のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３０のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
前記薬剤が、ＦｃγＲＩＩｂシグナル伝達を防止または低減する、請求項１もしくは５〜３７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３７のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３７のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
前記薬剤が、前記標的細胞による前記抗体分子の内部移行を防止または低減する、請求項１もしくは５〜３８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３８のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３８のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
前記細胞表面抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ５２を含む群から選択される、請求項１もしくは５〜３９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜３９のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜３９のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
（ｉ）に定義された前記抗体分子が、ＣＤ２０に特異的に結合する、請求項１もしくは５〜４０のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２もしくは５〜４０のいずれか一項に記載の使用、または請求項３もしくは５〜４０のいずれか一項に記載の方法、または請求項４〜４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
（ｉ）に定義された前記抗体分子が、Ｉ型ＣＤ２０抗体である、請求項４１に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項４３】
（ｉ）に定義された前記抗体分子が、ＩＩ型ＣＤ２０抗体である、請求項４１に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項４４】
前記Ｉ型ＣＤ２０抗体が、リツキシマブ、またはリツキシマブバイオシミラー、またはオファツムマブである、請求項４２に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項４５】
前記ＩＩ型ＣＤ２０抗体が、オビヌツズマブまたはトシツモマブである、請求項４３に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項４６】
（ｉ）に定義された前記抗体分子が、ＣＤ５２抗体である、請求項４０に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項４７】
前記ＣＤ５２抗体がアレムツズマブである、請求項４６に記載の組成物、または使用、または方法、またはキット。
【請求項４８】
前記組成物またはキットが、１つ以上の治療薬を含む、請求項１もしくは５〜４７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項４〜４７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４９】
前記組成物が１つ以上の治療薬をさらに含む、請求項２または５〜４７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
前記対象が、１つ以上の治療薬をさらに投与される、請求項３または５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象が難治性癌もしくは再発癌を有するか、または前記対象が難治性癌及び再発癌を有する、請求項１もしくは５〜４８のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２、５〜４７、もしくは４９のいずれか一項に記載の使用、または請求項１、５〜４７、もしくは５０のいずれか一項に記載の方法、または請求項１もしくは５〜４８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
前記対象が難治性慢性リンパ性白血病もしくは再発慢性リンパ性白血病を有するか、または前記対象が難治性慢性リンパ性白血病及び再発慢性リンパ性白血病を有する、請求項１、５〜４９、もしくは５１のいずれか一項に記載の組成物、または請求項２、５〜４７、４９、もしくは５１のいずれか一項に記載の使用、または請求項１、５〜４７、５０、もしくは５１のいずれか一項に記載の方法、または請求項１、５〜４８、もしくは５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
明細書、及び／または実施例、及び／または添付の図面を参照して、本特許請求の範囲に実質的に記載及び／または特許請求される、組成物、または使用、または方法、またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難治性癌及び／または再発癌の処置に使用するための、抗体分子及び薬剤を含む組成物に関する。本発明は、抗体分子及び薬剤を投与することを含む、難治性癌及び／または再発癌を処置する方法にも関する。該抗体分子及び薬剤を含むキットも記載される。
【０００２】
治療用抗体は、免疫系を働かせることによる新たな作用機構を明らかにし、癌治療を変容させている。例えば、抗体が治療効果を発揮することができる１つの機構は、抗体分子が結合する細胞を標的とする細胞傷害性細胞（例えばマクロファージ）及び酵素（例えば補体）などの天然エフェクター系を動員することによって、癌及び他の不要な細胞の除去を刺激することによるものである。
【０００３】
ＣＤ２０特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）リツキシマブは、癌免疫療法に許可された最初の抗体であり、したがって、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及びマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）を含む、ＣＤ２０を発現するＢ細胞癌を患う患者に広く投与されている（Ｌｉｍ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９５，１３５−１４３（２０１０）にて査読。
【０００４】
抗体療法は効果的であるが、一部の場合では、患者は抗体療法への抵抗性を獲得し、これは処置の無効化及び癌の悪化につながる。他の場合では、癌は癌治療に全く応答しない場合がある。
【０００５】
残念ながら、再発癌及び／または難治性癌の効果的な治療用抗体治療は依然として欠如している。ますます多くの抗体療法が数種類の癌の処置のために開発されていることに伴い、これらの療法に対する癌細胞の抵抗性を理解し、そのような抵抗性を克服する薬を開発する必要が生じている。
【０００６】
例えば、リツキシマブ応答性リンパ腫において、一部の個体は、第１の処置で抵抗性を示すか、またはリツキシマブ含有併用療法に抵抗性であるようになる。リツキシマブに加えて、リンパ腫は、他の抗体療法、例えば、抗体分子であるオファツムマブ（これはＣＤ２０に結合する）またはアレムツズマブ（これはＣＤ５２に結合する）に対する抵抗性も示し得る。
【０００７】
こうした背景の下、本発明者らは、驚くべきことに、抗体と、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤とを含む治療が、再発癌及び／または難治性癌を処置するために使用され得ることを特定した。
【０００８】
これまでに、ＦｃγＲＩＩｂと治療用抗体リツキシマブとの間の相互作用を抑制すると、抗体のリサイクリングを低減させ、慢性リンパ性白血病及びマントル細胞リンパ腫の処置におけるリツキシマブの有効性を向上させることができると示されている（Ｌｉｍ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩｂ  ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｂｌｏｏｄ（２０１１）及び国際公開第２０１２／０２２９８５号）。
【０００９】
さらに、治療用抗体の活性は、部分的にＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）との治療用抗体の相互作用によって左右されることが知られている。具体的には、ＩｇＧの治療活性の大部分を説明するのは、ＦｃγＲの相対的な発現レベル、親和性、及び活性である（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．＆  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ＦｃｇａｍｍａＲｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５０，１０５−１２５（２０１１）、及びＮｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．＆  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ８，３４−４７（２００８）にて査読）。
【００１０】
しかしながら、本発明の発明者らはこの度、驚くべきことに、抗体と、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤とを含む併用療法が、再発癌及び／または難治性癌を処置するために使用され得ることを実証した。したがって、本発明は、再発癌及び／または難治性癌を有する患者のサブグループを治療するための方法及び使用を提供する。
【００１１】
換言すると、本発明の発明者らは、対象における癌が応答しない（すなわち抵抗性のある）抗体を、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤と組み合わせて含む併用療法が、抗体に対する癌の抵抗性を低減及び／または克服することによって再発癌及び／または難治性癌を処置するために使用され得ることを実証した。
【００１２】
第１の態様において、本発明は、
（ｉ）標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する、抗体分子を、
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤と、組み合わせて含む、組成物であって、
該組成物が、対象における再発癌及び／または難治性癌の処置に使用するためのものであり、及び対象が、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有することを特徴とする、組成物を提供する。
【００１３】
第２の態様において、本発明は、
（ｉ）標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する、抗体分子を、
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤と、組み合わせて含む、組成物の使用であって、
該使用が、対象における再発癌及び／または難治性癌の処置に使用するための薬物の製造におけるものであり、及び対象が、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有することを特徴とする、組成物の使用を提供する。
【００１４】
第３の態様において、本発明は、対象における再発癌及び／または難治性癌を処置する方法であって、
（ｉ）標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する、抗体分子を、
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤と、組み合わせて投与することを含み、
対象が、再発癌及び／または難治性癌を有するという基準で選択され、及び対象が、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有することを特徴とする、方法を提供する。
【００１５】
第４の態様において、本発明は、対象における再発癌及び／または難治性癌の処置に使用するためのキットであって、
（ｉ）標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する、抗体分子、
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤、
（ｉｉｉ）リツキシマブ、リツキシマブバイオシミラー、オファツムマブ、オビヌツズマブ、アレムツズマブ、ガリキシマブ、トシツモマブ、放射活性のあるトシツモマブ、イブリツモマブ、放射活性のあるイブリツモマブ、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ３７抗体、Ｂ細胞癌の処置に使用される治療用抗体、からなる群から選択される１つ以上の物質、を含み、
該使用が、対象における再発癌及び／または難治性癌の処置のためのものであり、及び対象が、ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有することを特徴とする、キットを提供する。
【００１６】
本発明の第４の態様のある好ましい実施形態では、１つ以上の物質は、リツキシマブ（もしくはリツキシマブバイオシミラー）及びオファツムマブ、またはリツキシマブ（もしくはリツキシマブバイオシミラー）及びオビヌツズマブを含むか、またはそれらからなる。
【００１７】
本発明の第４の態様のある代替的な好ましい実施形態では、１つ以上の物質は、アレムツズマブ及び抗ＣＤ４０抗体、アレムツズマブ及び抗ＣＤ１９抗体、アレムツズマブ及び抗ＣＤ３７抗体、またはアレムツズマブ及び抗ＣＤ４０抗体及び抗ＣＤ１９抗体及び抗ＣＤ３７抗体を含むか、またはそれらからなる。
【００１８】
本発明の第４の態様のある代替的な好ましい実施形態では、１つ以上の物質は、Ｂ細胞癌を処置するために使用される治療用抗体、例えばガリキシマブなどを含むか、またはそれらからなる。
【００１９】
抗体分子は、免疫学及び分子生物学の当業者に周知である。抗体分子は体液性免疫系の構成要素であり、細菌及びウイルスなどの身体に対する異物を同定及び中和するためにエフェクターＢ細胞によって生成されるタンパク質である。
【００２０】
典型的に、抗体分子は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を有する。抗体分子の重鎖は、１つの可変ドメイン及び３つの定常ドメインを備え、抗体分子の軽鎖は、１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインを備える。可変ドメイン（集合的にＦＶ領域と称される場合がある）は、抗体の標的に結合し、各可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つのループを備え、これらが標的結合を担う。
【００２１】
したがって、ここで「抗体分子」という用語には、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体、または合成抗体、または組み換え生成抗体、または多特異性抗体、または二重特異性抗体、またはヒト抗体、またはヒト化抗体、またはキメラ抗体、またはラクダ化抗体、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、または一本鎖抗体、またはＦａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）断片、またはジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、または細胞内抗体、または抗体重鎖、または抗体軽鎖、または抗体重鎖及び／もしくは軽鎖のホモダイマーまたはヘテロダイマー、または抗原結合性の機能的断片もしくはその誘導体、またはＩｇＧ、またはＩｇＧ１、またはＩｇＧ２、またはＩｇＧ３、またはＩｇＧ４、またはＩｇＡ、またはＩｇＭ、またはＩｇＤ、またはＩｇＥを含む、全てのタイプ及びクラスの抗体分子ならびにそれらの機能的断片が含まれる。
【００２２】
抗体分子は、明確な標的分子に特異的に結合することが知られている。すなわち、抗体分子は、非標的である分子ではなく、その標的に優先的かつ選択的に結合する。
【００２３】
タンパク質結合性の査定方法は、生物化学及び免疫学の当業者には既知である。これらの方法が、標的に対する抗体分子の結合性、及び／またはＦｃ受容体に対する抗体のＦｃドメインの結合性、ならびにこれらの相互作用の相対強度、または特異性、または抑制、または防止、または低減を査定するために使用され得ることは、当業者には理解されるであろう。タンパク質結合性を査定するために使用され得る方法の例は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ページ３３２〜３３６（１９８９）の抗体特異性に関する考察を参照のこと）。
【００２４】
したがって、ここで「特異的に結合する抗体分子」には、標的に特異的に結合するが非標的には結合しないか、または標的よりも弱く（例えばより低い親和性で）非標的に結合する抗体分子が含まれる。
【００２５】
ここではまた、抗体分子が非標的に結合するよりも少なくとも２倍強く、または少なくとも５倍強く、または少なくとも１０倍強く、または少なくとも２０倍強く、または少なくとも５０倍強く、または少なくとも１００倍強く、または少なくとも２００倍強く、または少なくとも５００倍強く、または少なくともよりも約１０００倍強く、標的に特異的に結合するという意味も含まれる。
【００２６】
さらにここでは、抗体分子が少なくとも約１０−１Ｋｄ、または少なくとも約１０−２Ｋｄ、または少なくとも約１０−３Ｋｄ、または少なくとも約１０−４Ｋｄ、または少なくとも約１０−５Ｋｄ、または少なくとも約１０−６Ｋｄ、または少なくとも約１０−７Ｋｄ、または少なくとも約１０−８Ｋｄ、または少なくとも約１０−９Ｋｄ、または少なくとも約１０−１０Ｋｄ、または少なくとも約１０−１１Ｋｄ、または少なくとも約１０−１２Ｋｄ、または少なくとも約１０−１３Ｋｄ、または少なくとも約１０−１４Ｋｄ、または少なくとも約１０−１５ＫｄのＫｄで標的に結合する場合に、抗体分子は標的に特異的に結合するという意味も含まれる。
【００２７】
抗体分子の別の注目すべき部分は、Ｆｃドメイン（ないしは断片結晶化可能ドメイン（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）として知られる）であり、これは抗体分子重鎖の各々の定常ドメインのうちの２つを含む。Ｆｃドメインは、抗体分子とＦｃ受容体との間の相互作用を担う。
【００２８】
Ｆｃ受容体は、しばしば免疫系の細胞の細胞表面上に見出される膜タンパク質である（すなわち、Ｆｃ受容体は、標的細胞膜（ないしはプラズマ膜または細胞質膜として知られる）上に見出される）。Ｆｃ受容体の役割は、Ｆｃドメインを介して抗体に結合し、抗体を細胞に内部移行させることである。免疫系において、これは、抗体媒介性食作用及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害をもたらし得る。
【００２９】
本発明に含まれるＦｃ受容体の一例は、ＦｃγＲＩＩｂ（ないしはＣＤ３２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｂ１、ＣＤ３２Ｂ２、ＦｃＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃＲＩＩＢとして知られる）であり、これは、抗体に対する結合及び抗体のリサイクリングを担う抑制性Ｆｃ受容体である。
【００３０】
したがって、ここで「ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメイン」には、本発明の抗体分子のＦｃドメインがＦｃγＲＩＩｂに結合することができること、そして好ましくはその結合が、その抗体分子が別のタンパク質、もしくはペプチド、もしくはポリペプチド、もしくはＦｃ受容体に結合するよりも少なくとも２倍強い、または少なくとも５倍強い、または少なくとも１０倍強い、または少なくともよりも約２０倍強い、または少なくとも５０倍強い、または少なくとも１００倍強い、または少なくとも２００倍強い、または少なくとも５００倍強い、または少なくとも１０００倍強いことが含まれる。
【００３１】
本発明の薬剤は、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減し、これは、細胞への抗体分子の内部移行を防止または低減する。
【００３２】
本発明の薬剤を構成し得るもの、そして本発明の薬剤がどのように同定され得るかは、分子生物学の当業者には容易に明らかとなるであろう。例えば、本発明の薬剤は、ウェスタンブロッティングによって検出される、細胞内の免疫受容体チロシン系抑制（ＩＴＩＭ）モチーフにおけるチロシン−２９３のリン酸化によって示されるように、ＦｃγＲＩＩｂの刺激またはシグナル伝達を遮断する薬剤についてスクリーニングすることによって同定され得る。例えば、Ｒａｊｉ細胞を、リン酸化ＦｃγＲＩＩｂについて免疫ブロットする前に、抗ＦｃγＲＩＩｂ試験薬剤の存在下または非存在下で、細胞表面抗原に対する抗体分子、例えば抗ＣＤ２０リツキシマブを用いて培養してもよい（国際公開第２０１２／０２２９８５号）。
【００３３】
参照により本明細書に組み込まれるＮｅｕｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５，５９７−６０６は、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤を同定するためにスクリーニングされ得る分子の様々なクラスを記載している。
【００３４】
本発明の薬剤は、小さな有機部分、または小さな無機部分、またはペプチド、またはポリペプチド、またはペプチド模倣薬、または核酸、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはアプタマー、または脂質、または炭水化物、または抗体分子であってもよい。
【００３５】
ここで「ＦｃγＲＩＩｂ結合を防止または低減する薬剤」には、薬剤が抗体分子のＦｃドメインに対するＦｃγＲＩＩｂの結合を完全に遮断するか、または抗体分子のＦｃドメインに対するＦｃγＲＩＩｂの結合を部分的に遮断することが含まれる。
【００３６】
ここで「完全に遮断する」には、ＦｃγＲＩＩｂと抗体分子のＦｃドメインとの間に検出可能な結合がないことが含まれる。ここで「部分的に遮断する」には、薬剤の存在下でのＦｃγＲＩＩｂと抗体分子のＦｃドメインとの間の検出可能な結合が、薬剤の非存在下でのＦｃγＲＩＩｂと抗体分子のＦｃドメインとの間の検出可能な結合よりも低いことが含まれる。
【００３７】
薬剤は、立体障害によって、かつ／または抗体分子に結合することによって、かつ／またはＦｃドメインに結合することによって、かつ／またはＦｃγＲＩＩｂに結合することによって、かつ／または抗体分子に結合し、ＦｃγＲＩＩｂとの接触を遮断することによって、かつ／またはＦｃドメインに結合し、ＦｃγＲＩＩｂとの接触を遮断することによって、かつ／またはＦｃγＲＩＩｂに結合し、Ｆｃドメインとの接触を遮断することによって、ＦｃγＲＩＩｂ結合を防止または低減してもよい。
【００３８】
ここではまた、薬剤の存在下での結合性が、薬剤の非存在下での抗体分子のＦｃドメインに対するＦｃγＲＩＩｂ結合の約９０％未満、または約８０％未満、または約７０％未満、または約約６０％未満、または約５０％未満、または約４０％未満、または約３０％未満、または約２０％未満、または約１０％未満、または約５％未満、または約１％未満である場合に、薬剤が抗体分子のＦｃドメインに対するＦｃγＲＩＩｂ結合を低減するということも含まれる。
【００３９】
ここでは、薬剤の存在下での結合性が、薬剤の非存在下での抗体分子のＦｃドメインに対するＦｃγＲＩＩｂ結合よりも少なくとも２倍弱い、または少なくとも５倍弱い、または少なくとも１０倍弱い、または少なくとも２０倍弱い、または少なくとも５０倍弱い、または少なくとも１００倍弱い、または少なくとも２００倍弱い、または少なくとも５００倍弱い、または少なくとも１０００倍弱い場合に、薬剤が抗体分子のＦｃドメインに対するＦｃγＲＩＩｂ結合を低減するということがさらに含まれる。
【００４０】
ここでは、薬剤の存在下で結合が検出可能でない場合、または結合が検出可能である場合は検出可能な結合が無視できるものである場合に、薬剤が抗体分子のＦｃドメインに対するＦｃγＲＩＩｂ結合を防止するということが含まれる。
【００４１】
本発明に含まれる抗体分子標的の一例は、抗体分子のエピトープ（ないしはこの文脈では細胞表面エピトープとして知られる）となる細胞表面抗原である。細胞表面抗原及びエピトープは、免疫学または細胞生物学の当業者には容易に理解されるであろう用語である。
【００４２】
ここで「細胞表面抗原」には、細胞表面抗原が細胞膜の細胞外側に露出しているが、細胞膜の細胞外側に一過性にのみ露出していてもよいことが含まれる。ここで「一過性に露出する」には、細胞表面抗原が細胞に内部移行されるか、または細胞膜の細胞外側から細胞外空間に放出されてもよいことが含まれる。細胞表面抗原は、プロテアーゼによって媒介され得る開裂によって、細胞膜の細胞外側から放出されてもよい。
【００４３】
ここではまた、細胞表面抗原は細胞膜に接合し得るが、細胞膜と一過性にのみ結合し得ることも含まれる。ここで「一過性に結合する」には、細胞表面抗原が細胞膜の細胞外側から細胞外空間に放出されてもよいことが含まれる。細胞表面抗原は、プロテアーゼによって媒介され得る開裂によって、細胞膜の細胞外側から放出されてもよい。
【００４４】
ここでは、細胞表面抗原が、ペプチド、またはポリペプチド、または炭水化物、またはオリゴ糖鎖、または脂質、及び／またはタンパク質、もしくは糖タンパク質、もしくはリポタンパク質上に存在するエピトープであってもよいことがさらに含まれる。
【００４５】
本発明により処置される疾患は、再発癌及び／または難治性癌である。
【００４６】
再発癌とは、以前に処置されており、その処置の結果として対象が完全または部分的に回復した（すなわち対象は寛解期にあると考えられる）が、処置の休止後に癌が再発または悪化した癌である。別の言い方をすると、再発癌とは、処置が効果的であり対象が完全または部分的に回復した期間の後に、処置に抵抗性であるようになった癌である。
【００４７】
癌が、獲得抵抗性に起因する再発癌、または再発癌及び難治性癌であってもよいことは理解されるであろう。ここで「獲得抵抗性」には、癌、及び／または対象、及び／または標的細胞が、１回目に特定の処置が施される前はその処置に対して抵抗性でなかったが、少なくとも１回目にその処置が施された後またはその間（例えば、処置が施された２回目の後、３回目の後、４回目の後、５回目の後、６回目の後、７回目の後、８回目の後、９回目の後、１０回目の後、１１回目の後、１２回目の後）に抵抗性であるようになったことが含まれる。
【００４８】
本発明の文脈内では、再発癌が抗体で以前に処置されており、かつその抗体に抵抗性であるようになったことが好ましい。本明細書で考察されるように、本発明は、そのような再発癌を有する患者のサブグループを治療するための手段を提供する（すなわち、本発明は、抗体を用いた処置に抵抗性のある再発癌を有する対象を処置するための手段を提供する）。
【００４９】
本発明の文脈内では、再発癌が本明細書に定義される抗体分子で以前に処置されており、かつその抗体分子に抵抗性であるようになったことがさらに好ましい。本明細書で考察されるように、本発明は、そのような再発癌を有する患者のサブグループを治療するための手段を提供する（すなわち、本発明は、本明細書に定義される抗体分子に抵抗性のある再発癌を有する対象を処置するための手段を提供する）。
【００５０】
したがって本発明は、癌が抵抗性であるようになったものと同じ抗体分子を使用して、対象における癌を処置するための手段を提供することが理解されるであろう。
難治性癌とは、処置されているがその処置に応答していない、かつ／または処置されているが処置中に進行している癌である。別の言い方をすると、難治性癌とは、処置に抵抗性のある癌である。
【００５１】
癌が、内因性抵抗性に起因する難治性癌であってもよいことは理解されるであろう。ここで「内因性抵抗性」には、癌、及び／または対象、及び／または標的細胞が、１回目に特定の処置が施されるときからその処置に抵抗性であるという意味が含まれる。
【００５２】
本発明の文脈内では、難治性癌が抗体で以前に処置されているが、その抗体に抵抗性があったことが好ましい。本明細書で考察されるように、本発明は、そのような難治性癌を有する患者のサブグループを治療するための手段を提供する（すなわち、本発明は、抗体を用いた処置に抵抗性のある難治性癌を有する対象を処置するための手段を提供する）。
【００５３】
本発明の文脈内では、難治性癌が本明細書に定義される抗体分子で以前に処置されているが、その抗体分子に抵抗性があったことがさらに好ましい。本明細書で考察されるように、本発明は、そのような難治性癌を有する患者のサブグループを治療するための手段を提供する（すなわち、本発明は、本明細書に定義される抗体分子に抵抗性のある難治性癌を有する対象を処置するための手段を提供する）。
【００５４】
したがって本発明は、癌が抵抗性であるものと同じ抗体分子を使用して、対象における癌を処置するための手段を提供することが理解されるであろう。
【００５５】
再発癌及び／または難治性癌は、医薬分野の当業者によって容易に診断されるものであり、本明細書でさらに考察される。
【００５６】
本発明者らはこの度、予想外なことに、抗体分子と、抗体分子に対するＦｃγＲＩＩＢ結合を遮断する薬剤とを用いた処置が、再発癌及び／または難治性癌を治療するために使用され得ることを示した。付随する実施例において実証されるように、本発明の抗体分子及び薬剤は、難治性慢性リンパ性白血病及び／または再発慢性リンパ性白血病の処置に特に効果的である。
【００５７】
本発明者らは、本発明の抗体分子及び薬剤を用いた処置が機能するのは、ＦｃγＲＩＩＢがこれらの抗体分子を内部移行させることによって、再発癌及び／または難治性癌の処置における治療用抗体分子の有効性を低減させるからであると考える。本発明者らの所見を踏まえて、本発明者らは、このような本発明の抗体分子及び薬剤が、治療用抗体分子によって処置され得、かつ対象の標的細胞がＦｃγＲＩＩＢを発現する、あらゆる再発癌及び／または難治性癌の処置に効果的となると考える。
【００５８】
いくつかのＢ細胞癌が、異なるレベルにおいてではあるが、ＦｃγＲＩＩＢを発現することは理解されている。ＦｃγＲＩＩＢ発現は、慢性リンパ性白血病及びマントル細胞リンパ腫において最も顕著であり、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫では中程度であり、濾胞性リンパ腫において最も顕著でない。しかしながら、一部の場合では、低レベルのＦｃγＲＩＩＢを概して発現する癌（例えば濾胞性リンパ腫）を患う対象は、非常に高いレベルのＦｃγＲＩＩＢ発現を有し得る。異なるタイプのＢ細胞癌（そして特に上述の癌）におけるＦｃγＲＩＩＢの発現レベルは、抗体分子リツキシマブの内部移行の速度と相関する。したがって、ＦｃγＲＩＩＢの発現及び関連する抗体分子の内部移行は、Ｂ細胞癌により共有される共通機構であると考えられている（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。抗体分子のＦｃγＲＩＩＢ依存性初期化は、本明細書に開示されるＦｃγＲＩＩＢに対する抗体によって遮断され得る（実施例、特に図３）。
【００５９】
したがって、本発明の抗体分子及び薬剤は、Ｂ細胞癌、そして特に、再発マントル細胞リンパ腫及び／もしくは難治性マントル細胞リンパ腫、ならびに／または再発濾胞性リンパ腫及び／もしくは難治性濾胞性リンパ腫、ならびに／または再発びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及び／または難治性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の処置に使用され得る。
【００６０】
本発明が再発癌及び／または難治性癌を患う対象を処置するためには、対象はＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞を有する必要がある。ＦｃγＲＩＩｂは細胞表面受容体であり、したがって標的細胞の表面上に存在することは理解されるであろう。ＦｃγＲＩＩｂ、例えば、ＦｃγＲＩＩｂタンパク質及び／またはＦｃγＲＩＩｂ  ｍＲＮＡの存在を査定するために、異なる生物学的マーカーが使用され得ることは、当業者には理解されるであろう。
【００６１】
ＦｃγＲＩＩｂタンパク質を測定するには、例えば、免疫組織化学的検査、ウェスタンブロッティング、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ、フローサイトメトリ、及びＡＴ−１０抗体を使用した検出といった当該分野で既知の方法があることは、当業者であれば理解するであろう。ＦｃγＲＩＩｂ  ｍＲＮＡを測定するには、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ配列決定、定量的ＰＣＲ、及びマイクロアレイハイブリダイゼーションといった当該分野で既知の方法があることは、当業者であれば理解するであろう。
【００６２】
ＦｃγＲＩＩｂの存在を査定するためには、標的細胞内のＦｃγＲＩＩｂ生物学的マーカーのレベルを、ＦｃγＲＩＩｂを発現しない対照細胞内のＦｃγＲＩＩｂ生物学的マーカーのレベルと比較することが必要となり得ることは、当業者であれば理解するであろう。この対照細胞は、ＦｃγＲＩＩｂを発現しない個体からの対照細胞、または個体からのＦｃγＲＩＩｂを発現しない対照細胞、または対象からのＦｃγＲＩＩｂを発現しない対照細胞、またはＦｃγＲＩＩｂを発現しないように遺伝子改変されている細胞であってもよい。
【００６３】
ここで「ＦｃγＲＩＩｂを発現する標的細胞」には、標的細胞がＦｃγＲＩＩｂタンパク質及び／またはＦｃγＲＩＩｂ  ｍＲＮＡを発現することが含まれる。ここではまた、標的細胞は、ＦｃγＲＩＩｂタンパク質及び／またはＦｃγＲＩＩｂ  ｍＲＮＡが対照細胞よりも標的細胞内で２倍超高い、または５倍超高い、または１０倍超高い、または２０倍超高い、または５０倍超高い、または１００倍超高い、または２００倍超高い、または５００倍超高い、または１０００倍超高い場合に、ＦｃγＲＩＩｂを発現するものと定義され得るということも含まれる。
【００６４】
医薬が、例えば医薬が身体に吸収される速度を変更するように異なる添加剤で改質され得、かつ例えば身体への特定の投与経路を可能にするように異なる形態で改質され得ることは、医学の当業者には既知であろう。
【００６５】
したがってここでは、本発明の組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物が、賦形剤、及び／または薬学的に許容可能な担体、及び／または薬学的に許容可能な希釈剤、及び／またはアジュバントと組み合わされ得ることが含まれる。
【００６６】
ここではまた、本発明の組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物が、抗酸化剤、及び／もしくは緩衝液、及び／もしくは静菌薬、及び／もしくは製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る、水性及び／もしくは非水性の滅菌注射溶液、ならびに／または、懸濁化剤及び／もしくは増粘剤を含み得る、水性及び／もしくは非水性の滅菌懸濁液を含む、非経口投与に好適であり得るということも含まれる。本発明の組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物は、単位用量または複数用量の容器、例えば密閉されたアンプル及びバイアルで提示されてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（すなわち凍結乾燥）状態で保管されてもよい。
【００６７】
即時注射溶液及び懸濁液は、以前に説明されている種類の無菌の粉末、及び／または顆粒、及び／または錠剤から調製され得る。
【００６８】
ヒト患者への非経口投与の場合、本発明の組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物の一日薬用量レベルは、通常、単一または分割用量の投与で成人１人当たり１日につき１ｐｇ〜１０ｍｇである。いかなる事象においても、あらゆる個別の患者に対して最も好適な実際の薬用量は医師が決定し、その量は、特定の患者の年齢、体重、及び応答と共に変動する。上記の薬用量は平均的事例の例である。当然ながら、より高いかまたはより低い薬用量範囲がふさわしい個別の事例が存在し得、そのような事例は本発明の範囲内である。典型的には、本発明の組成物及び／または薬物は、本発明の抗体及び／または薬剤をおよそ２ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌまたはおよそ２ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する。ある好ましい実施形態では、本発明の薬物及び／または組成物は、本発明の抗体及び／薬剤を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する。
【００６９】
概して、ヒトにおいては、本発明の組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物の経口または非経口投与が好ましい経路であり、最も簡便である。獣医学的用途では、本発明の組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物は、通常の獣医学診療に従って好適に許容可能な製剤として投与され、特定の動物に最も適切な投薬計画及び投与経路は獣医が決定する。したがって、本発明は、（上記そして以下にさらに記載される）様々な状態を処置するのに効果的な量の本発明の抗体及び／または薬剤を含む薬学的製剤を提供する。好ましくは、本組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物は、静脈内、筋肉内、皮下からなる群から選択される経路による送達に適合される。
【００７０】
本発明は、本発明のポリペプチド結合部分の薬学的に許容可能な酸もしくは塩基付加塩を含む、組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物も含む。本発明において有用な前述の塩基化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩を調製するために使用される酸は、無毒性の酸付加塩、すなわち薬理学的に許容可能なアニオンを含有する塩、とりわけ塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸［すなわち１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３ナフトエート）］塩などを形成するものである。薬学的に許容可能な塩基付加塩も、本発明による薬剤の薬学的に許容可能な塩形態を生成するために使用され得る。本質的に酸性である本薬剤の薬学的に許容可能な塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、そのような化合物と無毒性の塩基塩を形成するものである。そのような無毒性の塩基塩としては、そのような薬理学的に許容可能なカチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えばカリウム及びナトリウム）及びアルカリ土類金属カチオン（例えばカルシウム及びマグネシウム）などから誘導される塩、アンモニウムまたはＮ−メチルグルカミン−（メグルミン）などの水溶性アミン付加塩、ならびに低級アルカノールアンモニウム及び薬学的に許容可能な有機アミンの他の塩基塩が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬剤及び／またはポリペプチド結合部分は、保管のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体内で再構成されてもよい。任意の好適な凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）及び／または再構成技術が用いられ得る。凍結乾燥及び再構成は、様々な度合いの抗体活性損失につながる場合があり（例えば従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性損失が大きい傾向がある）、埋め合わせのために使用レベルを上方に調整する必要があり得ることは、当業者には理解されるであろう。一実施形態では、凍結乾燥された（フリーズドライされた）ポリペプチド結合部分は、再水和されたときにその活性（凍結乾燥前）の約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を失う。
【００７１】
ここでは、対象は哺乳類または非哺乳類であってもよいことが含まれる。好ましくは、哺乳類の対象はヒトであるか、またはウマ、またはウシ、またはヒツジ、またはブタ、またはラクダ、またはイヌ、またはネコなどの非哺乳類である。最も好ましくは、哺乳類の対象はヒトである。
【００７２】
好ましくは、本発明は、再発癌及び／または難治性癌が、抗体治療に抵抗性である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【００７３】
好ましくは、本発明は、再発癌及び／または難治性癌が、（ｉ）に定義された抗体分子に抵抗性である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【００７４】
好ましくは、本発明は、薬剤が、標的細胞上に存在するＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【００７５】
上記に概説されたように、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩＩｂを含む）は、細胞上に存在する膜タンパク質である。タンパク質が細胞上に存在するかどうかを検出するには、例えば、免疫組織化学的検査、及び検出可能な標識でタグ付けされたタンパク質の可視化といった当該分野で既知の方法があることは、当業者であれば理解するであろう。
【００７６】
ここで「標的細胞上に存在するＦｃγＲＩＩｂ」には、ＦｃγＲＩＩｂがＦｃγＲＩＩｂタンパク質であり、かつ／またはＦｃγＲＩＩｂが標的細胞膜上に存在し、かつ／またはＦｃγＲＩＩｂが標的細胞膜内に存在することが含まれる。
【００７７】
好ましくは、本発明は、標的細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体分子であって、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるＦｃドメインを有する抗体分子が、標的細胞にＦｃγＲＩＩｂ依存性様式で内部移行することができる、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【００７８】
上記に概説されたように、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩＩｂを含む）は、細胞への抗体分子の内部移行を媒介し、これは、抗体分子の破壊につながり得る。ＦｃγＲＩＩｂが細胞への抗体分子の内部移行を媒介する様式は、細胞生物学の当業者には既知であろう。
【００７９】
ここで「標的細胞に内部移行する」には、抗体分子が細胞膜から標的細胞へと取り除かれること、及び／または抗体分子が標的細胞内にリサイクルされること、及び／または抗体分子が標的細胞に内部移行し破壊されること、及び／または抗体分子が標的細胞のエンドソーム内に被包されること、及び／または抗体分子が標的細胞に内部移行し、そのためもはや治療上有効ではないこと、及び／または抗体分子が標的細胞によって形質膜陥入されることが含まれる。
【００８０】
抗体分子がいくつかの異なるプロセスで細胞に内部移行し得ることは理解されるであろう。上で考察されたように、本発明の教示は、抗体分子のＦｃドメインがＦｃγＲＩＩｂに結合することによって抗体分子が内部移行し得るということである。しかしながら、抗体分子が飲作用（細胞外分子が細胞内に受動的に取り込まれることができるプロセス）などの別のプロセスによって内部移行し得ることは理解されるであろう。抗体分子が細胞内に取り込まれ得る他のプロセスは、細胞生物学の当業者には既知であろう。
【００８１】
ここで「ＦｃγＲＩＩｂ依存性様式」には、ＦｃγＲＩＩｂ活性を必要とする様式で抗体分子が内部移行することが含まれる。
【００８２】
好ましくは、本発明は、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤が、標的細胞への抗体分子の内部移行をさらに防止または低減する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【００８３】
好ましくは、本発明は、難治性癌が、対象が癌処置を受けて応答していない場合、及び／または、対象が癌処置を受けたが処置中に癌が対象において進行した場合に、難治性癌であると見なされる、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【００８４】
ここで「対象が癌処置を受けている」には、対象が治療薬で以前に処置されているか、または治療薬で現在処置されていることが含まれる。
【００８５】
ここでは、対象が治療薬で以前に処置されている場合、その処置が、約１日、または約２日、または約３日、または約４日、または約５日、または約６日、または約１週間超、または約２週間超、または約３週間超、または約１ヶ月超、または約２ヶ月超、または約３ヶ月超、または約４ヶ月超、または約５ヶ月超、または約６ヶ月超、または約７ヶ月超、または約８ヶ月超、または約９ヶ月超、または約１０ヶ月超、または約１１ヶ月超、または約１年超、または約２年よりも月、または約３年超、または約４年超、または約５年超、または約１０年超以前に行われたということも含まれる。
【００８６】
ここで「治療薬」には、リツキシマブ、リツキシマブバイオシミラー、オファツムマブ、オビヌツズマブ、アレムツズマブ、オクレリズマブ、ガリキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、ＣＤ２０抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ３７抗体、ＣＤ５２抗体、クロラムブシル、シクロホスファミド、多分割シクロホスファミド、フルダラビン、オキサリプラチン、イブルチニブ、ヌクレオシド類似体、アルキル化剤、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、レナリドミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン（アドリアマイシンとしても知られる）、プレドニゾン、イダルビシン、メルファラン、クラドリビン、シタラビン、デキサメタゾン、メトトレキサート、メスナ、ゲムシタビン、テムシロリムス、ミトキサントロン、シスプラチン、サリドマイド、エトポシド、プロカルバジン、フラボピリドール、エンザスタウリン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、アントラサイクリン、イホスファミド、カルボプラチン、メチルプレドニゾロン、及びダカルバジンからなるリストから選択される１つ以上の治療薬；ならびに／または、フルダラビン及びシクロホスファミド（ＦＣ）；シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、及びプレドニゾン（ＣＨＯＰ）；シクロホスファミド、ビンクリスチン、及びプレドニゾン（ＣＯＰ、ＣＶＰとしても知られる）；リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、及びプレドニゾン（Ｒ−ＣＯＰ、Ｒ−ＣＶＰとしても知られる）；イダルビシン及びフルダラビン；メルファラン、クロラムブシル、及びプレドニゾン（ＭＣＰ）；リツキシマブ及びクロラムブシル；リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びプレドニゾン（Ｒ−ＣＨＯＰ）；リツキシマブ、フルダラビン、及びシクロホスファミド（Ｒ−ＦＣ）；メスナ、イホスファミド、ミトキサントロン、及びエトポシド；メスナ、イホスファミド、ミトキサントロン、エトポシド、及びリツキシマブ；レナリドミド及びリツキシマブ；リツキシマブ及びクラドリビン；リツキシマブ、メルファラン、クロラムブシル、及びプレドニゾン（Ｒ−ＭＣＰ）；シタラビン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びプレドニゾン；多分割シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びデキサメタゾン（Ｈｙｐｅｒ−ＣＶＡＤ）；リツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びデキサメタゾン（Ｒ−Ｈｙｐｅｒ−ＣＶＡＤ）；イホスファミド、カルボプラチン及びエトポシド（ＩＣＥ）；イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド、及びリツキシマブ；ゲムシタビン、デキサメタゾン、及びカルボプラチン；ゲムシタビン、デキサメタゾン、カルボプラチン、及びリツキシマブ；ゲムシタビン及びオキサリプラチン；ゲムシタビン、オキサリプラチン、及びリツキシマブ；メトトレキサート及びシタラビン；ボルテゾミブ及びゲムシタビン；リツキシマブ及びボルテゾミブ；フルダラビン、シクロホスファミド、及びミトキサントロン（ＦＣＭ）；リツキシマブ、フルダラビン、シクロホスファミド、及びミトキサントロン（Ｒ−ＦＣＭ、ＦＣＭＲとしても知られる）；リツキシマブ及びフルダラビン；デキサメタゾン及びゲムシタビン；デキサメタゾン、ゲムシタビン、及びシスプラチン；デキサメタゾン、ゲムシタビン、シスプラチン、及びリツキシマブ；デキサメタゾン、フルダラビン、ミトキサントロン、及びデキサメタゾン（ＲＦＮＤ）；サリドマイド及びリツキシマブ；プレドニゾン、エトポシド、プロカルバジン、及びシクロホスファミド（ＰＥＰ−Ｃ）；リツキシマブ、サリドマイド、プレドニゾン、エトポシド、プロカルバジン、及びシクロホスファミド；ベンダムスチン及びリツキシマブ（ＢＲ）；リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド、及びプレドニゾン（Ｒ−ＣＨＯＥＰ、ＥＰＯＣＨ−Ｒとしても知られる）；アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、及びダカルバジン（ＡＢＶＤ）；ブレオマイシン、エトポシド、アドリアマイシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、及びプレドニゾン（ＢＥＡＣＯＰＰ）；シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、及びプレドニゾン（ＣＯＰＰ）；シクロホスファミド、エトポシド、プレドニゾン、及びプロカルバジン（ＣＥＰＰ）；リツキシマブ、シクロホスファミド、エトポシド、プレドニゾン、及びプロカルバジン（ＲＣＥＰＰ）；リツキシマブ、シクロホスファミド、リポソームドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン（ＲＣＤＯＰ）；リツキシマブ、シクロホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン（ＲＣＮＯＰ）；リツキシマブ、シクロホスファミド、エトポシド、ビンクリスチン、及びプレドニゾン；デキサメタゾン、シスプラチン、シタラビン、及びリツキシマブ（ＤＨＡＰ）；エトポシド、メチルプレドニゾロン、シタラビン、シスプラチン、及びリツキシマブ（ＥＳＨＡＰ）；ならびに、クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、及びプレドニゾン（ＣｈｌＶＰＰ）からなるリストから選択される１つ以上の治療薬の組み合わせが含まれる。
【００８７】
上記に概説された治療薬に加えて、癌、及び／または再発癌、及び／または難治性癌を処置するために使用され得る治療薬の他のタイプ及び組み合わせは、医学の当業者であれば理解するであろう（それらの例は、Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  Ｓｕｍｍａｒｙ  ＮＧＣ−９３９２  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１２、Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  Ｓｕｍｍａｒｙ  ＮＧＣ−９２７８  ２０１２、ＭｃＫａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ：１２０４６、Ｈａｌｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ，１１１：５４４６−５４５６、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６９（６）：５０７−５１６、Ｂｙｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６９（１）：３２−４２、及びＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２０１４に見出すことができる）。
【００８８】
ここで「癌処置を受けて応答していない」には、癌処置を受けた後に対象が癌症状の重症度の低減を示さないこと、及び／または対象が癌症状の数の低減を示さないこと、及び／または対象が改善した癌の予後を有しないこと、及び／または対象が癌の診断マーカーの低減を示さないことが含まれる。
【００８９】
ここで「癌が対象において進行した」には、癌処置中に対象が癌症状の重症度の上昇を示すこと、及び／または対象が癌症状の数の増加を示すこと、及び／または対象がより悪い癌の予後を有すること、及び／または対象が癌の診断マーカーの増加を示すことが含まれる。
【００９０】
ここで「示す」には、対象が癌症状及び／もしくは癌診断マーカーを示すこと、ならびに／または癌症状及び／もしくは癌診断マーカーが測定され得、かつ／もしくは査定され得、かつ／もしくは数量化され得ることが含まれる。
【００９１】
癌症状及び癌診断マーカーが何であるか、そして癌症状の重症度の低減もしくは上昇、または癌診断マーカーの低減もしくは増加があるかどうかをどのように測定し、かつ／もしくは査定し、かつ／もしくは数量化するか、ならびに癌の予後を形作るためにこれらの癌症状及び／または癌診断マーカーがどのように使用され得るかは、医学の当業者には容易に明らかとなるであろう。
【００９２】
癌処置はしばしば一連の処置として施される、すなわち、治療薬は、ある期間にわたって投与される。一連の処置の時間の長さはいくつかの要因に依存し、これには、他の理由の中でもとりわけ、投与されている治療薬のタイプ、処置されている癌のタイプ、処置されている癌の重症度、ならびに対象の年齢及び健康が含まれ得る。
【００９３】
ここで「処置中」には、対象が一連の処置を現在受けていること、及び／または治療薬を受けていること、及び／または一連の治療薬を受けていることが含まれる。
【００９４】
好ましくは、本発明は、対象が、対象が以前に癌を処置されているが部分寛解以上を達成しない場合に、応答していないと見なされる、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【００９５】
寛解は、対象における癌の低減の査定に関する、癌医学の分野では周知の用語である。部分寛解も、癌医学の分野では周知の用語であり、これは、対象における癌が、特定の癌症状及び／または癌診断マーカーを使用して測定されたとき、その特定の癌症状及び／または癌診断マーカーの処置前のレベルと比較して５０％低減している寛解の段階に関する。一部の状況では、対象が部分寛解しているものと分類されるには、癌症状及び／または癌診断マーカーのその低減が特定の長さの時間にわたって維持されなければならない。対象が癌の寛解にあるかどうか、そして対象が寛解のどの段階にあるかは、医学の当業者には明らかとなるであろう。
【００９６】
ここで「部分寛解以上を達成しない」には、癌症状または癌診断マーカーが、癌症状の重症度の低減、及び／または癌症状の数の低減、及び／または癌の予後の改善、及び／または癌診断マーカーの低減に基づいて査定され、かつ／もしくは測定され、かつ／もしくは数量化されており、処置前の癌症状または癌診断マーカーと比較して５０％未満低減していることが含まれる。
【００９７】
ここではまた、対象が部分寛解以上を達成しないかどうかの査定及び／または測定及び／または数量化が、処置の休止後の癌症状及び／もしくは癌診断マーカーと、処置が始まる前の癌症状及び／もしくは癌診断マーカー、ならびに／または処置中の癌症状及び／もしくは癌診断マーカーとの比較に基づくことも含まれる。査定及び／または測定及び／または数量化が、対象が部分寛解以上を達成していないと考えられる前に、少なくとも１回、または少なくとも２回、または少なくとも３回、または少なくとも４回、または少なくとも５回、または少なくとも６回、または少なくとも７回、または少なくとも８回、または少なくとも９回、または少なくとも１０回、または少なくとも１５回、または少なくとも２０回行われ得るということも含まれる。
【００９８】
ここでは、処置の休止後の癌症状及び／または癌診断マーカーの低減が、処置が始まる前の癌症状及び／もしくは癌診断マーカー、ならびに／または処置中の癌症状及び／もしくは癌診断マーカーと比較して、約１％未満、または約５％未満、または約１０％未満、または約１５％未満、または約２０％未満、または約２５％未満、または約３０％未満、または約３５％未満、または約４０％未満、または約４５％未満、または約５０％未満である場合に、対象は部分寛解以上を達成しないということがさらに含まれる。
【００９９】
好ましくは、本発明は、再発癌が、対象が以前に癌を処置されており、以前に処置に応答しており、及び後に再発した場合に、再発癌であると見なされる、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１００】
ここで「以前に癌を処置されている」には、対象が治療薬で以前に処置されているが、処置が休止していることが含まれる。したがって、ここでは、治療薬を用いた処置の休止が、少なくとも約１日、または少なくとも約２日、または少なくとも約３日、または少なくとも約４日、または少なくとも約５日、または少なくとも約６日、または約１週間超、または約２週間超、または約３週間超、または約１ヶ月超、または約２ヶ月超、または約３ヶ月超、または約４ヶ月超、または約５ヶ月超、または約６ヶ月超、または約７ヶ月超、または約８ヶ月超、または約９ヶ月超、または約１０ヶ月超、または約１１ヶ月超、または約１年超、または約２年超、または約３年超、または約４年超、または約５年超、または約１０年超以前に起こった場合、対象が以前に癌の治療をされているということが含まれる。
【０１０１】
患者が処置に応答しているかどうかは、医学の当業者には明らかとなるであろう。
【０１０２】
ここで「以前に処置に応答している」には、処置の休止後、癌症状の重症度の査定かつ／もしくは測定かつ／もしくは数量化された低減、及び／または癌症状の数の低減、及び／または癌の予後の改善、及び／または癌診断マーカーの低減があることが含まれる。
【０１０３】
再発は、対象の癌が以前に処置に応答した後に、対象のその癌が悪化することに関する、癌医学の分野では周知の用語である。癌が再発したときは、医学の当業者には明らかとなるであろう。
【０１０４】
ここで「後に再発した」には、対象が以前に処置に応答した後に、対象が癌症状の重症度の上昇を示すこと、及び／または対象が癌症状の数の増加を示すこと、及び／または対象がより悪い癌の予後を有すること、及び／または対象が癌診断マーカーの増加を示すことが含まれる。
【０１０５】
好ましくは、本発明は、対象が、（ｉ）処置後に少なくとも部分寛解を達成し、及び／または対象が処置後に少なくとも完全寛解を達成するが、（ｉｉ）癌が処置の休止後に対象において進行した場合に、対象が後に再発したと見なされる組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１０６】
ここで「処置後の完全寛解」には、処置の休止後に検出可能な癌症状及び／または癌診断マーカーがないことが含まれる。
【０１０７】
ここではまた、一部の場合では、処置後の完全寛解は、癌症状及び／または癌診断マーカーが、処置の休止後の少なくとも約１日、または少なくとも約２日、または少なくとも約３日、または少なくとも約４日、または少なくとも約５日、または少なくとも約６日、または約１週間超、または約２週間超、または約３週間超、または約１ヶ月超、または約２ヶ月超、または約３ヶ月超、または約４ヶ月超、または約５ヶ月超、または約６ヶ月超、または約７ヶ月超、または約８ヶ月超、または約９ヶ月超、または約１０ヶ月超、または約１１ヶ月超、または約１年超、または約２年超、または約３年超、または約４年超、または約５年超、または約１０年超、または約２０年、または約３０年、または約４０年、または約５０年にわたって検出可能でない場合であるということも含まれる。最も具体的には、一部の場合では、処置後の完全寛解は、癌症状及び／または癌診断マーカーが、処置の休止後の約６ヶ月超検出可能でない場合であるということが含まれる。
【０１０８】
好ましくは、本発明は、対象がその後、処置の休止の約１ヶ月超後に再発している、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１０９】
好ましくは、本発明は、対象がその後、処置の休止の約１ヶ月超後、または約２ヶ月超後、または約３ヶ月超後、または約４ヶ月超後、または約５ヶ月超後、または約６ヶ月超後、または約７ヶ月超後、または約８ヶ月超後、または約９ヶ月超後、または約１０ヶ月超後、または約１１ヶ月超後、または約１２ヶ月超後、または約２年超後、または約３年超後、または約４年超後、または約５年超後、または約６年超後、または約７年超後、または約８年超後、または約９年超後、または約１０年超後に再発している、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。最も好ましくは、対象がその後、処置の休止の約６ヶ月超後に再発している。
【０１１０】
好ましくは、本発明は、対象が、再発癌の特徴を少なくとも１回、または少なくとも２回、または少なくとも３回、または少なくとも４回、または少なくとも５回、または少なくとも６回、または少なくとも７回、または少なくとも８回、または少なくとも９回、または少なくとも１０回示す、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１１１】
ここで「再発癌の特徴を示す」には、対象が以前に癌を処置されており、以前に処置に応答しており、及び後に再発したことが含まれる。
【０１１２】
癌が再発し得るのは、対象においてその癌を処置するために以前に使用されていた処置に対して癌が抵抗性を発達させたためであると考えられている。したがって、再発癌を患う対象は、その対象において癌を処置するために以前に使用された治療薬と異なる治療薬を使用して処置されることが多い。したがって、直前に言及された実施形態では、後に対象が再発癌の特徴を示す度に、対象が、対象を以前に処置したことがある治療薬と異なる治療薬で処置されること、及び／または、対象が、対象を以前に処置したことがある治療薬と同じ治療薬で処置されることが含まれる。
【０１１３】
好ましくは、本発明は、処置が、抗体治療、例えば、先の実施形態の（ｉｉ）に定義された薬剤の非存在下で投与された、先の実施形態の（ｉ）に定義された抗体分子である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１１４】
ここで「非存在下で投与された」には、（ｉ）に定義された抗体分子が、（ｉｉ）に定義された薬剤の後及び／または前の期間に投与されたことが含まれる。したがって、ここで「期間」には、（ｉ）に定義された抗体分子が、（ｉｉ）に定義された薬剤の１時間超、または２時間超、または３時間超、または６時間超、または１２時間超、または１８時間超、または２４時間超、または２日超、または３日超、または４日超、または５日超、または６日超、または７日超、または２週間超、または３週間超、または４週間超、または５週間超、または６週間超、または７週間超、または８週間超、または３ヶ月超、または４ヶ月超、または５ヶ月超、または６ヶ月超、または７ヶ月超、または８ヶ月超、または９ヶ月超、または１０ヶ月超、または１１ヶ月超、または１２ヶ月超、または１年超、または２年超、または３年超、または４年超、または５年超、または１０年超、または２０年超前及び／または後に投与されたことが含まれる。
【０１１５】
好ましくは、本発明は、処置が、１つ以上の治療薬を含む、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１１６】
好ましくは、本発明は、標的細胞が、上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂ発現を有する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１１７】
上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂ発現が何であるか、そして発現がどのように測定され得るかは、分子生物学及び細胞生物学の当業者には既知であろう。例えば、上述のＦｃγＲＩＩｂ発現の測定方法に加えて、ＦｃγＲＩＩｂ発現レベルは、腫瘍生検の免疫組織化学的検査によって測定され得る。ＦｃγＲＩＩｂ発現レベルを決定するための複数の技術及び方法論があることは、当業者であれば理解するであろう。
【０１１８】
ここで「標的細胞が上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂ発現を有する」には、以下に記載されるように、標的細胞が上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂタンパク質を含むこと、及び／または標的細胞が対照と比較して上昇したレベルのＦｃγＲＩＩｂ  ｍＲＮＡを含むことが含まれる。
【０１１９】
好ましくは、本発明は、標的細胞上の上昇したＦｃγＲＩＩｂ発現が、対照と比較して決定される、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１２０】
好適な対照は、正常なレベルのＦｃγＲＩＩｂ発現を有するものであろう。正しい対照の選択、及びＦｃγＲＩＩｂ発現の正常なレベルの定義は、対象、対象内の標的細胞型のタイプ、及び癌のタイプなど、いくつかの可変要因に依存し得る。適切な対照及び正常なレベルのＦｃγＲＩＩｂ発現が何であるかは、分子生物学または細胞生物学の当業者には明らかとなるであろう。
【０１２１】
ここで「対照」には、対照が対照細胞であること、及び／または対照がＦｃγＲＩＩｂ発現レベルのデータベースからの情報であることが含まれる。ここではまた、対照細胞が標的細胞と異なる細胞型であること、及び／または標的細胞と同じ細胞型であることも含まれる。ここでは、対照細胞が対照個体からのものであること、ならびにその対照個体が対象及び／または対象以外の個体であり得ることがさらに含まれる。
【０１２２】
好ましくは、本発明は、対照が、非難治性癌及び／または非再発癌を有する対照個体の対照細胞を含む、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１２３】
ここで「非難治性癌及び／または非再発癌を有する対照個体」には、その対照個体が再発癌及び／または難治性癌ではない癌を有することが含まれる。ここではまた、その対照個体が、治療薬で以前に少なくとも１回処置されていることが含まれる。
【０１２４】
好ましくは、本発明は、上昇したＦｃγＲＩＩｂ発現が、対照と比較したときに対象の標的細胞において少なくとも２倍高い、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１２５】
ここではまた、上昇したＦｃγＲＩＩｂ発現が、対照と比較して標的細胞において約１０倍高い、または約２０倍高い、または約３０倍高い、または約４０倍高い、または約５０倍高い、または約６０倍高い、または約７０倍高い、または約８０倍高い、または約９０倍高い、または約１００倍高い、または約２００倍高い、または約３００倍高い、または約４００倍高い、または約５００倍高い、または約６００倍高い、または約７００倍高い、または約８００倍高い、または約９００倍高い、または約１０００倍高いことも含まれる。
【０１２６】
好ましくは、本発明は、標的細胞が癌細胞である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１２７】
癌細胞は、癌の特徴を示す細胞であり、すなわち、癌細胞は１つ以上の癌診断マーカーを示す。標的細胞が癌細胞であるかどうかは、細胞生物学及び腫瘍学の当業者には明らかとなるであろう。
【０１２８】
好ましくは、本発明は、標的細胞がＢ細胞である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１２９】
Ｂ細胞（ないしはＢリンパ球として知られる）は、細胞表面上のＢ細胞受容体の存在によって免疫系の他の細胞から区別される、適応免疫応答の細胞型である。
【０１３０】
ここで「Ｂ細胞」には、プラズマＢ細胞（エフェクターＢ細胞としても知られる）、及び／またはメモリーＢ細胞、及び／またはＢ−１細胞、及び／またはＢ−２細胞、及び／または辺縁帯Ｂ細胞、及び／または濾胞性Ｂ細胞、及び／または制御性Ｂ細胞、及び／またはナイーブＢ細胞が含まれる。
【０１３１】
好ましくは、本発明は、再発癌、及び／または難治性癌、及び／または癌細胞、及び／または同じ癌タイプ、及び／または癌が、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、小リンパ球性リンパ腫を含む群から選択される、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１３２】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、異なるリンパ腫の一群に対する集合名であり、これにはとりわけ、濾胞性細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、リンパ形質細胞性ＮＨＬ（ヴァルデンストレームマクログロブリン血症としても知られる）、小リンパ球性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性混合細胞型リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅｄ  ｍｉｘｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、及びびまん性混合細胞型リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｍｉｘｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）が含まれる。
【０１３３】
上述の癌の各々は周知であり、これらの癌を処置するために使用される治療薬が十分に説明されているように、症状及び癌診断マーカーは十分に説明されている。したがって、症状、癌診断マーカー、ならびに非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、及び小リンパ球性リンパ腫を処置するために使用される治療薬は、医学の当業者には既知であろう。
【０１３４】
好ましくは、本発明は、対象が応答していないこと、及び／または対象における部分寛解、及び／または対象における完全寛解、及び／または癌が対象において進行していることが、
2017517504.tif 000003
を含む群から１つ以上を測定することによって決定される、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１３５】
（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）、（ｘｉｉ）、（ｘｉｉｉ）、及び（ｘｖ）が「癌診断マーカー」に関し、（ｘｉｖ）が「癌症状」に関することは理解されるであろう。
【０１３６】
腫瘍学の分野における数十年の研究及び技術革新によって、癌診断マーカー及び癌症状の測定方法及び査定方法が十分に特徴付けられているように、多数の癌の「癌診断マーカー」及び「癌症状」は十分に特徴付けられている。したがって、腫瘍学の当業者であれば、上記のポイントの各々が特定の癌にどのように関連するかを理解し、特定の癌診断マーカーまたは癌症状の測定もしくは査定に基づいて、対象が処置に応答していないかどうか、または対象が部分寛解にあるかどうか、または対象が完全寛解にあるかどうか、または癌が対象において進行しているかどうかは、当業者には容易に明らかになるであろう（それらの例は、ＭｃＫａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ：１２０４６、Ｈａｌｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ，１１１：５４４６−５４５６、及びＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２０１４に見出すことができる）。
【０１３７】
いくつかの癌診断マーカー（例えば「リンパ球数」、「好中球数」、「血小板数」、「ヘモグロビン数」、「異型細胞の割合」、「骨髄リンパ球の割合」、及び「循環リンパ球の割合」など）の査定は、対象内の細胞及び分子の数量化に依存する。これらの細胞及び分子を数量化するためのアッセイは、当該分野で周知である。
【０１３８】
ここで「腫瘍細胞」には、新生細胞、ならびに／またはＣＤ１９＋、ＣＤ５＋、及びＣＤ２３＋である新生細胞が含まれる。
【０１３９】
いくつかのバイオマーカーは、ある特定のタイプの癌を示し得る。例えば、慢性リンパ性白血病細胞は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２３を同時発現する。しかしながら、ＣＤ２０及びＣＤ７９ｂのレベルは、正常なＢ細胞と比較した場合により低い。
【０１４０】
ここで「リンパ球上のバイオマーカーの存在及び／または非存在」には、「存在」という用語が、対照Ｂ細胞と比較したときに増加した量のバイオマーカー、または検出可能なバイオマーカーを含むこと、そして、非存在が、対照Ｂ細胞と比較したときに低減した量のバイオマーカー、または検出可能なバイオマーカーがないことを含むことが含まれる。ここではまた、対照Ｂ細胞が「対照個体」からのものであり得ることも含まれる。ここでは、リンパ球上のバイオマーカーの存在及び／もしくは非存在が、ＣＤ５、及び／もしくはＣＤ１９、及び／もしくはＣＤ２０、及び／もしくはＣＤ２３、及び／もしくはサイクリンＤ１、及び／もしくはＢＣＬ２、及び／もしくはＦＭＣ６、及び／もしくはＣＤ３、及び／もしくはＣＤ１０及び／もしくはＢＣＬ６、及び／もしくはＣＤ２１、及び／もしくはＣＤ４５、及び／もしくはＫｉ−６７、及び／もしくはＩＲＦ４／ＭＵＭ１、及び／もしくはＭＹＣ、及び／もしくはＣＤ３０、及び／もしくはＣＤ１３８、及び／もしくはＥＢＥＲ−ＩＳＨ、及び／もしくはＡＬＫ、及び／もしくはＨＨＶ８、及び／もしくはκ／λ、及び／もしくはＣＤ７９ｂの存在、ならびに／またはＣＤ２０、及び／もしくはＣＤ７９ｂ、及び／もしくはＣＤ１０、及び／もしくはＣＤ２３、及び／もしくはＢＣＬ６の非存在を含むことがさらに含まれる。
【０１４１】
多数の癌の診断、予後、及び進行の臨床的定義は、進行度分類として知られるある特定の分類に依存する。こうした進行度分類システムは、いくつかの異なる癌診断マーカー及び癌症状を並べて、癌の診断、及び／または予後、及び／または進行の概要を提供するように働く。進行度分類システムを使用して癌の診断、及び／または予後、及び／または進行をどのように査定するか、そしてそのためにどの癌診断マーカー及び癌症状を使用すべきかは、腫瘍学の当業者には既知であろう。
【０１４２】
ここで「癌進行度分類」には、ステージ０、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、及びステージＩＶを含むＲａｉ分類、ならびに／またはステージＡ、ステージＢ、及びステージＣを含むＢｉｎｅｔ分類、ならびに／またはステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、及びステージＩＶを含むＡｎｎ  Ａｒｂｏｕｒ分類が含まれる。
【０１４３】
癌が細胞の形態の異常を引き起こし得ることは既知である。これらの異常は、ある特定の癌において再現性よく発生することが多く、これは、こうした形態変化の検査（ないしは組織学的検査として知られる）が、癌の診断または予後に使用され得ることを意味する。細胞の形態を検査するために試料を可視化するための技術、及び可視化のために試料を調製するための技術、例えば、光学顕微鏡法または共焦点顕微鏡法は、当該分野で周知である。
【０１４４】
ここで「組織学的検査」には、小型の成熟リンパ球の存在、ならびに／または細胞質の縁が狭い小型の成熟リンパ球の存在、認識可能な核小体を欠く密な核を有する小型の成熟リンパ球の存在、ならびに／または細胞質の縁が狭く、かつ認識可能な核小体を欠く密な核を有する小型の成熟リンパ球の存在、ならびに／または異型細胞、及び／もしくは非正円形細胞、及び／もしくは前リンパ球の存在が含まれる。
【０１４５】
癌は、細胞が細胞死または制御不可能な増殖を回避することにつながり得る、細胞のＤＮＡ内の変異の結果であることは周知である。したがって、これらの変異の検査（細胞遺伝学的検査としても知られる）は、癌の診断及び／または予後を査定するための有用な手段となり得る。この一例は、慢性リンパ性白血病の特徴である染色体上の位置１３ｑ１４．１の欠失である。細胞内の変異を検査するための技術、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）は、当該分野で周知である。
【０１４６】
ここで「細胞遺伝学的検査」には、細胞、具体的には染色体内のＤＮＡの検査が含まれる。細胞遺伝学的検査は、難治性癌及び／または再発癌の存在に関連し得るＤＮＡの変化を同定するために使用され得る。そのようなものとしては、染色体１３の長腕における欠失、ならびに／または染色体上の位置１３ｑ１４．１の欠失、ならびに／または染色体１２のトリソミー、ならびに／または染色体１２の長腕における欠失、ならびに／または染色体１１の長腕における欠失、ならびに／または１１ｑの欠失、ならびに／または染色体６の長腕における欠失、ならびに／または６ｑの欠失、ならびに／または染色体１７の短腕における欠失、ならびに／または１７ｐの欠失、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または抗原遺伝子受容体再構成、ならびに／またはＢＣＬ２再構成、ならびに／またはＢＣＬ６再構成、ならびに／またはｔ（１４：１８）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または（３：ｖ）転座、ならびに／または（８：１４）転座、ならびに／または（８：ｖ）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）及び（ｑ１３：ｑ３２）転座を挙げることができる。
【０１４７】
癌を患う対象が、しばしば癌が身体にかける負担の結果として、ある特定の身体的症状を示すことは既知である。これらの症状は同じ癌において再度起こることが多く、そのため、疾患の診断、及び／または予後、及び／または進行の特徴となり得る。どの身体的症状がどの癌に関連するか、そしてこれらの身体系の査定が、疾患の診断、及び／または予後、及び／または進行とどのように相関するかは、医学の当業者であれば理解するであろう。
【０１４８】
ここで「身体的症状」には、肝腫及び／または脾腫が含まれる。
【０１４９】
ここで「対象が応答していないこと」には、処置前と処置の休止後とで比較したとき、ならびに／または処置中と処置の休止後とで比較したとき、ならびに／または処置中の対象において、直前の実施形態のポイント（ｉ）、及び／もしくは（ｉｉ）、及び／もしくは（ｉｉｉ）、及び／もしくは（ｉｖ）、及び／もしくは（ｖ）、及び／もしくは（ｖｉ）、及び／もしくは（ｖｉｉ）、及び／もしくは（ｖｉｉｉ）、及び／もしくは（ｉｘ）、及び／もしくは（ｘ）、及び／もしくは（ｘｉ）、及び／もしくは（ｘｉｉ）、及び／もしくは（ｘｉｉｉ）、及び／もしくは（ｘｉｖ）、及び／もしくは（ｘｖ）の測定ならびに／または査定が未変化であること、あるいは変化が生じた場合にはそれが無視できることが含まれる。
【０１５０】
ここで「対象における部分寛解」には、「リンパ球数」については、処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後にリンパ球数が少なくとも５０％減少すること、そして／あるいは「リンパ節評価」については、処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後に１つ以上のリンパ節の大きさが少なくとも５０％減少すること、かつ／またはさらなる肥大したリンパ節がないこと、そして／あるいは「身体的症状」については、処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後に（脾腫に関連して）脾臓の大きさが少なくとも５０％減少すること、かつ／または処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後に（肝腫に関連して）肝臓の大きさが少なくとも５０％減少すること、そして／あるいは「好中球数」については、１５００細胞／μｌ以下であること、そして／あるいは「血小板数」については、１００，０００血小板／μｌ以下であること、そして／あるいは処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後に好中球数の数が少なくとも５０％減少すること、そして／あるいは「ヘモグロビン数」については、１１ｇ／ｄＬ以下であること、かつ／または処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後にヘモグロビンの量が少なくとも５０％減少することが含まれる。
【０１５１】
ここで「対象における完全寛解」には、「リンパ球数」については、最大でも４０００細胞／μｌの細胞数であること、そして／または「リンパ節評価」については、リンパ節が最大でも直径１．５ｃｍであること、そして／または「身体的症状」については、検出可能な肝腫がないこと、及び／もしくは検出可能な脾腫がないこと、そして／または「好中球数」については、１５００細胞／μｌ以下であること、そして／または「血小板数」については、１００，０００血小板／μｌ以下であること、そして／または「ヘモグロビン数」については、１１ｇ／ｄＬ以下であることが含まれる。
【０１５２】
ここで「癌が対象において進行していること」には、「リンパ球数」については、処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後にリンパ球数の数が少なくとも５０％増加すること、かつ／または少なくとも５０００細胞／μｌ超であること、そして／あるいは「リンパ節評価」については、処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後に少なくとも１．５ｃｍの直径までリンパ節が肥大すること、かつ／またはリンパ節の大きさが少なくとも５０％増加すること、そして／あるいは「身体的症状」については、肝腫の出現があること、かつ／または脾腫の出現があること、かつ／または処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後に（脾腫に関連して）脾臓の大きさが少なくとも５０％増加すること、かつ／または処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後に（肝腫に関連して）肝臓の大きさが少なくとも５０％増加すること、そして／あるいは「ヘモグロビン数」については、ヘモグロビンレベルが２０ｇ／Ｌ超低下すること、かつ／またはヘモグロビンレベルが１００ｇ／Ｌ未満に低下すること、「血小板数」については、処置前及び／もしくは処置中と比較して処置の休止後に好中球数の数が少なくとも５０％減少すること、かつ／または最大でも１００，０００血小板／μｌであることが含まれる。
【０１５３】
好ましくは、本発明は、薬剤が、ポリペプチド、またはアンチカリン、またはペプチド、または抗体、またはキメラ抗体、または単鎖抗体、またはアプタマー、または設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、またはＦａｂ、もしくはＦ（ａｂ′）２、もしくはＦｖ、もしくはＳｃＦｖ、もしくはｄＡｂ抗体断片、またはＩｇＧ２抗体、またはＩｇＧ４抗体、またはＩｇＧ２及びＩｇＧ４のキメラ分子、またはＮ２９７Ｑ変異を含む抗体変異体、またはＤＡＮＡ変異抗体、または小分子、または天然物、またはアフィボディ、またはペプチド模倣薬、または核酸、またはペプチド核酸分子、または脂質、または炭水化物、または、アンキリン反復タンパク質、もしくはアルマジロ反復タンパク質、もしくはロイシンリッチタンパク質、もしくはテトラリオペプチド反復タンパク質、もしくは設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を含むモジュールフレームワークに基づくタンパク質を含む、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１５４】
好ましくは、本発明は、（ｉｉ）に定義された薬剤が、ＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合する１つ以上の抗体分子である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１５５】
好ましくは、本発明は、（ｉｉ）に定義された薬剤が、エフェクター細胞を動員することができるドメインを含まない１つ以上の抗体分子である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１５６】
免疫系は、免疫応答をもたらすこと、助けること、または維持することにおいて各々が異なる役割を有する、いくつかの異なる細胞型を含む。免疫におけるその役割を担うために、免疫系の細胞は、しばしばこの細胞が特定の身体的位置または標的（例えばシグナルを保有する細胞など）に動員されることをもたらす刺激に反応することが多い。免疫系の細胞のクラスの１つはエフェクター細胞であり、その同一性及び役割は、免疫学の当業者には周知であろう。
【０１５７】
ここで「エフェクター細胞」には、エフェクターＴ細胞、及び／またはエフェクターＢ細胞（プラズマ細胞としても知られる）、及び／またはエフェクターメモリーＴ細胞、及び／またはエフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、及び／またはエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる。
【０１５８】
ここで「エフェクター細胞を動員することができるドメイン」には、エフェクター細胞を抗体分子の位置に動員する抗体分子上のエピトープ及び／または抗原が含まれる。ここではまた、エフェクター細胞を動員することができるドメインが、抗体分子のＦｃドメイン、ならびに／または抗体分子のＦｃドメイン上の抗原及び／もしくはエピトープであり得るということも含まれる。
【０１５９】
好ましくは、本発明は、（ｉｉ）に定義された薬剤が、モノクローナル抗体分子、及び／またはポリクローナル抗体分子、及び／または二重特異性抗体分子である１つ以上の抗体分子である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１６０】
上記に概説されたように、異なるタイプ及び形態の抗体が本発明に含まれ、免疫学の当業者には既知であろう。治療目的で使用される抗体が、抗体分子の特性を改質するさらなる構成要素でしばしば修飾されることは周知である。
【０１６１】
したがって、ここでは、本発明の抗体分子（例えば、モノクローナル抗体分子、及び／またはポリクローナル抗体分子、及び／または二重特異性抗体分子）が、検出可能な部分及び／または細胞傷害性部分を含むということが含まれる。
【０１６２】
ここで「検出可能な部分」には、酵素、放射性原子、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分からなる群からの１つ以上が含まれる。検出可能な部分は、インビトロ、及び／またはインビボ、及び／またはエクスビボで抗体分子が可視化されることを可能にする。
【０１６３】
ここで「細胞傷害性部分」には、放射性部分、及び／または酵素（ここで酵素はカスパーゼである）、及び／または毒素（ここで毒素は細菌性毒素または毒液である）が含まれ、細胞傷害性部分は、細胞溶解を誘発することができる。
【０１６４】
ここでは、抗体分子が単離形態及び／もしくは精製形態であり得、かつ／またはＰＥＧ化されていてもよいことがさらに含まれる。
【０１６５】
以下の実施形態において、配列番号は以下のクローンで示される配列を指す。
【０１６６】
上で考察されたように、抗体のＣＤＲは、抗体標的に結合する。本明細書に記載される各ＣＤＲに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｉｎ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，ｐｐ  ｘｖ−ｘｖｉｉによる定義に従う。
【０１６７】
当業者であれば認識しているように、アミノ酸を各ＣＤＲに割り当てるための他の方法も存在する。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（ＩＭＧＴ（Ｒ））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／及びＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）出版のＬｅｆｒａｎｃ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ”Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ”）。
【０１６８】
３つ以下のＣＤＲ領域（一部の場合では、ほんの単一のＣＤＲまたはその一部のみ）を含む分子が、ＣＤＲ（複数可）が誘導される抗体の抗原結合活性を保持することができることは理解されている。例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２３８９−９３には、全ＶＬ鎖（３つのＣＤＲ全てを含む）がその基質に対して高い親和性を有することが記載されている。
【０１６９】
２つのＣＤＲ領域を含む分子は、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ  ＆  Ｓｏｌｌａｚｚｏ  ２００１，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，４：４１７−４３０に記載されている。４１８ページ（右のコラム、３  Ｏｕｒ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）には、フレームワーク領域内に散在するＨ１及びＨ２  ＣＤＲ高頻度可変領域のみを含むミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）が記載されている。このミニボディは、標的に結合することができるものとして記載されている。Ｐｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３６７−９及びＢｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３６：６４９−５９は、Ｖａｕｇｈａｎ  ＆  Ｓｏｌｌａｚｚｏによって参照され、Ｈ１及びＨ２ミニボディならびにその特性をより詳細に記載している。Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：９２１−９では、２つの結合したＣＤＲからなる分子が抗原に結合することができることが実証されている。Ｑｕｉｏｃｈｏ  １９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２９３−４は、「ミニボディ」技術の概要を提供する。Ｌａｄｎｅｒ  ２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：８７５−７は、２つのＣＤＲを含む分子は抗原結合活性を保持することができると述べている。
【０１７０】
単一のＣＤＲ領域を含む分子は、例えば、Ｌａｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＪＢＣ，２７２：３０９３７−４４に記載されており、ここでは、あるＣＤＲから誘導されたある範囲のヘキサペプチドが抗原結合活性を示すことが実証され、完全な単一のＣＤＲの合成ペプチドが強い結合活性を示すと記述されている。Ｍｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＪＢＣ，２７４：３７８９−９６では、ある範囲の１２アミノ酸長のペプチド及び関連するフレームワーク領域が抗原結合活性を有することが示され、ＣＤＲ３様ペプチドが単独で抗原に結合することができると述べられている。Ｈｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８６：１７９１−１８００では、「マイクロ抗体」（単一のＣＤＲを含む分子）が抗原に結合することができると報告されており、抗ＨＩＶ抗体からの環状ペプチドが抗原結合活性及び機能を有すると示されている。Ｎｉｃａｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３：１８８２−９１では、単一のＣＤＲがそのリゾチーム抗原に対する抗原結合活性及び親和性を与えることができると示されている。
【０１７１】
このように、３つ以下のＣＤＲを有する分子は、それらが誘導される抗体の抗原結合特性を保持することができる。
【０１７２】
好ましくは、本発明は、薬剤が、以下のＣＤＲ：
2017517504.tif 000004
を有する可変重鎖（ＶＨ）を含む、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１７３】
好ましくは、本発明は、薬剤が、以下のＣＤＲ：
2017517504.tif 000005
を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１７４】
好ましくは、本発明は、薬剤が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列を有する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１７５】
好ましくは、本発明は、薬剤が、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、及び配列番号５０からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列を有する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１７６】
好ましくは、本発明は、薬剤が、以下のＣＤＲアミノ酸配列：
2017517504.tif 000006
を有する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１７７】
好ましくは、本発明は、薬剤が、以下のアミノ酸配列：
2017517504.tif 000007
を有する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０１７８】
本発明の薬剤はまた、配列番号１ならびに配列番号２の定常領域（ＣＨ）及び（ＣＬ）を含んでもよい。
【０１７９】
さらなる実施形態では、薬剤は、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減するために、本明細書に記載される本発明の薬剤、例えば上記の実施形態に記載されたアミノ酸配列（例えば配列番号１〜１９４）を有する薬剤と競合することができる。
【０１８０】
ここで、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減するために、本明細書に定義される薬剤（例えば抗原分子など）と「競合することができる」とは、試験される薬剤が、本明細書に定義される薬剤がＦｃγＲＩＩｂに結合することを少なくとも部分的に抑制するか、または別様に妨げること、及びＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減することができることを意味する。
【０１８１】
例えば、この薬剤は、本明細書に記載される薬剤の結合性を少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％抑制すること、及び／あるいはＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減する薬剤の能力を少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％抑制することができてもよい。
【０１８２】
競合的結合性は、当業者に周知の方法、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などによって決定され得る。
【０１８３】
ＥＬＩＳＡアッセイは、エピトープ修飾抗体または遮断抗体を評価するために使用され得る。競合する抗体を同定するのに好適なさらなる方法は、参照により本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅに開示されている（例えば、ページ５６７〜５６９、５７４〜５７６、５８３、及び５９０〜６１２（１９８８，ＣＳＨＬ，ＮＹ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２）を参照のこと）。
【０１８４】
本発明の薬剤は、以下の定常領域（ＣＨ及びＣＬ）を含んでもよい。
【０１８５】
ＩｇＧ１−ＣＨ［配列番号１］
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１８６】
ｌ−ＣＬ［配列番号２］
ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【０１８７】
本発明の薬剤は、以下のクローンの１つ以上の配列を有してもよい。
抗体クローン：１Ａ０１
１Ａ０１−ＶＨ［配列番号３］
2017517504.tif 000008
１Ａ０１−ＶＬ［配列番号２７］
2017517504.tif 000009
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＤＹＹＭＮ［配列番号５１］
ＣＤＲＨ２：ＬＩＧＷＤＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号５２］
ＣＤＲＨ３：ＡＹＳＧＹＥＬＤＹ［配列番号５３］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ［配列番号５４］
ＣＤＲＬ２：ＤＮＮＮＲＰＳ［配列番号５５］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＮＡＳＩ［配列番号５６］
【０１８８】
抗体クローン：１Ｂ０７
１Ｂ０７−ＶＨ［配列番号４］
2017517504.tif 000010
１Ｂ０７−ＶＬ［配列番号２８］
2017517504.tif 000011
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＭＨ［配列番号５７］
ＣＤＲＨ２：ＦＴＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ［配列番号５８］
ＣＤＲＨ３：ＥＮＩＤＡＦＤＶ［配列番号５９］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ［配列番号６０］
ＣＤＲＬ２：ＤＮＱＱＲＰＳ［配列番号６１］
ＣＤＲＬ３：ＷＤＤＲＬＦＧＰＶ［配列番号６２］
【０１８９】
抗体クローン：１Ｃ０４
１Ｃ０４−ＶＨ［配列番号５］
2017517504.tif 000012
１Ｃ０４−ＶＬ［配列番号２９］
2017517504.tif 000013
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＡＭＳ［配列番号６３］
ＣＤＲＨ２：ＳＩＳＤＳＧＡＧＲＹＹＡＤＳＶＥＧ［配列番号６４］
ＣＤＲＨ３：ＴＨＤＳＧＥＬＬＤＡＦＤＩ［配列番号６５］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＨＶＬ［配列番号６６］
ＣＤＲＬ２：ＧＮＳＮＲＰＳ［配列番号６７］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ［配列番号６８］
【０１９０】
抗体クローン：１Ｅ０５
１Ｅ０５−ＶＨ［配列番号６］
2017517504.tif 000014
１Ｅ０５−ＶＬ［配列番号３０］
2017517504.tif 000015
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＴＹＡＭＮ［配列番号６９］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＮＹＶＤＳＶＫＧ［配列番号７０］
ＣＤＲＨ３：ＮＦＤＮＳＧＹＡＩＰＤＡＦＤＩ［配列番号７１］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号７２］
ＣＤＲＬ２：ＤＮＮＳＲＰＳ［配列番号７３］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＧＧＰＶ［配列番号７４］
【０１９１】
抗体クローン：２Ａ０９
２Ａ０９−ＶＨ［配列番号７］
2017517504.tif 000016
２Ａ０９−ＶＬ［配列番号３１］
2017517504.tif 000017
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＮＡＷＭＳ［配列番号７５］
ＣＤＲＨ２：ＹＩＳＲＤＡＤＩＴＨＹＰＡＳＶＫＧ［配列番号７６］
ＣＤＲＨ３：ＧＦＤＹＡＧＤＤＡＦＤＩ［配列番号７７］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＡＶＮ［配列番号７８］
ＣＤＲＬ２：ＧＮＳＤＲＰＳ［配列番号７９］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＲＷＶ［配列番号８０］
【０１９２】
抗体クローン：２Ｂ０８
２Ｂ０８−ＶＨ［配列番号８］
2017517504.tif 000018
２Ｂ０８−ＶＬ［配列番号３２］
2017517504.tif 000019
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＤＹＹＭＳ［配列番号８１］
ＣＤＲＨ２：ＬＩＧＨＤＧＮＮＫＹＹＬＤＳＬＥＧ［配列番号８２］
ＣＤＲＨ３：ＡＴＤＳＧＹＤＬＬＹ［配列番号８３］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ［配列番号８４］
ＣＤＲＬ２：ＹＤＤＬＬＰＳ［配列番号８５］
ＣＤＲＬ３：ＴＴＷＤＤＳＬＳＧＶＶ［配列番号８６］
【０１９３】
抗体クローン：２Ｅ０８
２Ｅ０８−ＶＨ［配列番号９］
2017517504.tif 000020
２Ｅ０８−ＶＬ［配列番号３３］
2017517504.tif 000021
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＤＹＹＭＳ［配列番号８７］
ＣＤＲＨ２：ＡＩＧＦＳＤＤＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号８８］
ＣＤＲＨ３：ＧＤＧＳＧＷＳＦ［配列番号８９］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ［配列番号９０］
ＣＤＲＬ２：ＤＮＮＫＲＰＳ［配列番号９１］
ＣＤＲＬ３：ＡＴＷＤＤＳＬＲＧＷＶ［配列番号９２］
【０１９４】
抗体クローン：５Ｃ０４
５Ｃ０４−ＶＨ［配列番号１０］
2017517504.tif 000022
５Ｃ０４−ＶＬ［配列番号３４］
2017517504.tif 000023
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＮＹＧＭＨ［配列番号９３］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号９４］
ＣＤＲＨ３：ＷＲＤＡＦＤＩ［配列番号９５］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号９６］
ＣＤＲＬ２：ＳＤＮＱＲＰＳ［配列番号９７］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＳＷＶ［配列番号９８］
【０１９５】
抗体クローン：５Ｃ０５
５Ｃ０５−ＶＨ［配列番号１１］
2017517504.tif 000024
５Ｃ０５−ＶＬ［配列番号３５］
2017517504.tif 000025
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＴＹＧＭＨ［配列番号９９］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１００］
ＣＤＲＨ３：ＥＮＦＤＡＦＤＶ［配列番号１０１］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１０２］
ＣＤＲＬ２：ＳＮＳＱＲＰＳ［配列番号１０３］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＱＶＶ［配列番号１０４］
【０１９６】
抗体クローン：５Ｄ０７
５Ｄ０７−ＶＨ［配列番号１２］
2017517504.tif 000026
５Ｄ０７−ＶＬ［配列番号３６］
2017517504.tif 000027
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＴＹＧＭＨ［配列番号１０５］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＡＹＤＧＳＫＫＤＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１０６］
ＣＤＲＨ３：ＥＹＲＤＡＦＤＩ［配列番号１０７］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１０８］
ＣＤＲＬ２：ＧＮＳＮＲＰＳ［配列番号１０９］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＶＳＧＷＭ［配列番号１１０］
【０１９７】
抗体クローン：５Ｅ１２
５Ｅ１２−ＶＨ［配列番号１３］
2017517504.tif 000028
５Ｅ１２−ＶＬ［配列番号３７］
2017517504.tif 000029
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＭＨ［配列番号１１１］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＩＮＫＤＹＡＤＳＭＫＧ［配列番号１１２］
ＣＤＲＨ３：ＥＲＫＤＡＦＤＩ［配列番号１１３］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１１４］
ＣＤＲＬ２：ＳＮＮＱＲＰＳ［配列番号１１５］
ＣＤＲＬ３：ＡＴＷＤＤＳＬＮＧＬＶ［配列番号１１６］
【０１９８】
抗体クローン：５Ｇ０８
５Ｇ０８−ＶＨ［配列番号１４］
2017517504.tif 000030
５Ｇ０８−ＶＬ［配列番号３８］
2017517504.tif 000031
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＮＹＧＭＨ［配列番号１１７］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＲＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１１８］
ＣＤＲＨ３：ＤＲＷＮＧＭＤＶ［配列番号１１９］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１２０］
ＣＤＲＬ２：ＡＮＮＱＲＰＳ［配列番号１２１］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＷＶ［配列番号１２２］
【０１９９】
抗体クローン：５Ｈ０６
５Ｈ０６−ＶＨ［配列番号１５］
2017517504.tif 000032
５Ｈ０６−ＶＬ［配列番号３９］
2017517504.tif 000033
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＭＨ［配列番号１２３］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＤＴＡＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１２４］
ＣＤＲＨ３：ＤＨＳＶＩＧＡＦＤＩ［配列番号１２５］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ［配列番号１２６］
ＣＤＲＬ２：ＤＮＮＫＲＰＳ［配列番号１２７］
ＣＤＲＬ３：ＳＳＹＡＧＳＮＮＶＶ［配列番号１２８］
【０２００】
抗体クローン：６Ａ０９
６Ａ０９−ＶＨ［配列番号１６］
2017517504.tif 000034
６Ａ０９−ＶＬ［配列番号４０］
2017517504.tif 000035
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＭＨ［配列番号１２９］
ＣＤＲＨ２：ＶＴＳＹＤＧＮＴＫＹＹＡＮＳＶＫＧ［配列番号１３０］
ＣＤＲＨ３：ＥＤＣＧＧＤＣＦＤＹ［配列番号１３１］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１３２］
ＣＤＲＬ２：ＧＮＳＮＲＰＳ［配列番号１３３］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＮＥＧＶ［配列番号１３４］
【０２０１】
抗体クローン：６Ｂ０１
６Ｂ０１−ＶＨ［配列番号１７］
2017517504.tif 000036
６Ｂ０１−ＶＬ［配列番号４１］
2017517504.tif 000037
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＮＹＧＭＨ［配列番号１３５］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１３６］
ＣＤＲＨ３：ＤＱＬＧＥＡＦＤＩ［配列番号１３７］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１３８］
ＣＤＲＬ２：ＤＮＮＫＲＰＳ［配列番号１３９］
ＣＤＲＬ３：ＡＴＷＤＤＳＬＳＧＰＶ［配列番号１４０］
【０２０２】
抗体クローン：６Ｃ１１
６Ｃ１１−ＶＨ［配列番号１８］
2017517504.tif 000038
６Ｃ１１−ＶＬ［配列番号４２］
2017517504.tif 000039
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＤＹＧＭＳ［配列番号１４１］
ＣＤＲＨ２：ＡＩＳＧＳＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１４２］
ＣＤＲＨ３：ＧＤＩＤＹＦＤＹ［配列番号１４３］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＦＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１４４］
ＣＤＲＬ２：ＥＮＮＫＲＰＳ［配列番号１４５］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶ［配列番号１４６］
【０２０３】
抗体クローン：６Ｃ１２
６Ｃ１２−ＶＨ［配列番号１９］
2017517504.tif 000040
６Ｃ１２−ＶＬ［配列番号４３］
2017517504.tif 000041
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＭＨ［配列番号１４７］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１４８］
ＣＤＲＨ３：ＥＲＲＤＡＦＤＩ［配列番号１４９］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１５０］
ＣＤＲＬ２：ＳＤＮＱＲＰＳ［配列番号１５１］
ＣＤＲＬ３：ＡＴＷＤＳＤＴＰＶ［配列番号１５２］
【０２０４】
抗体クローン：６Ｄ０１
６Ｄ０１−ＶＨ［配列番号２０］
2017517504.tif 000042
６Ｄ０１−ＶＬ［配列番号４４］
2017517504.tif 000043
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＭＨ［配列番号１５３］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１５４］
ＣＤＲＨ３：ＤＨＳＡＡＧＹＦＤＹ［配列番号１５５］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ［配列番号１５６］
ＣＤＲＬ２：ＧＮＳＩＲＰＳ［配列番号１５７］
ＣＤＲＬ３：ＡＳＷＤＤＳＬＳＳＰＶ［配列番号１５８］
【０２０５】
抗体クローン：６Ｇ０３
６Ｇ０３−ＶＨ［配列番号２１］
2017517504.tif 000044
６Ｇ０３−ＶＬ［配列番号４５］
2017517504.tif 000045
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＭＨ［配列番号１５９］
ＣＤＲＨ２：ＧＩＳＷＤＳＡＩＩＤＹＡＧＳＶＫＧ［配列番号１６０］
ＣＤＲＨ３：ＤＥＡＡＡＧＡＦＤＩ［配列番号１６１］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１６２］
ＣＤＲＬ２：ＧＮＴＤＲＰＳ［配列番号１６３］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＰＶＶ［配列番号１６４］
【０２０６】
抗体クローン：６Ｇ０８
６Ｇ０８−ＶＨ［配列番号２２］
2017517504.tif 000046
６Ｇ０８−ＶＬ［配列番号４６］
2017517504.tif 000047
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＩＳ［配列番号１６５］
ＣＤＲＨ２：ＧＩＳＧＳＧＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１６６］
ＣＤＲＨ３：ＳＶＧＡＹＡＮＤＡＦＤＩ［配列番号１６７］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１６８］
ＣＤＲＬ２：ＧＤＴＮＲＰＳ［配列番号１６９］
ＣＤＲＬ３：ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶ［配列番号１７０］
【０２０７】
抗体クローン：６Ｇ１１
６Ｇ１１−ＶＨ［配列番号２３］
2017517504.tif 000048
６Ｇ１１−ＶＬ［配列番号４７］
2017517504.tif 000049
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＭＨ［配列番号１７１］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１７２］
ＣＤＲＨ３：ＥＬＹＤＡＦＤＩ［配列番号１７３］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ［配列番号１７４］
ＣＤＲＬ２：ＡＤＤＨＲＰＳ［配列番号１７５］
ＣＤＲＬ３：ＡＳＷＤＤＳＱＲＡＶＩ［配列番号１７６］
【０２０８】
抗体クローン：６Ｈ０８
６Ｈ０８−ＶＨ［配列番号２４］
2017517504.tif 000050
６Ｈ０８−ＶＬ［配列番号４８］
2017517504.tif 000051
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＮＹＧＭＨ［配列番号１７７］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤ  ＳＶＫＧ［配列番号１７８］
ＣＤＲＨ３：ＥＹＫＤＡＦＤＩ［配列番号１７９］
ＣＤＲＬ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ［配列番号１８０］
ＣＤＲＬ２：ＤＮＮＫＲＰＳ［配列番号１８１］
ＣＤＲＬ３：ＱＡＷＧＴＧＩＲＶ［配列番号１８２］
【０２０９】
抗体クローン：７Ｃ０７
７Ｃ０７−ＶＨ［配列番号２５］
2017517504.tif 000052
７Ｃ０７−ＶＬ［配列番号４９］
2017517504.tif 000053
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＳＹＧＭＨ［配列番号１８３］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ［配列番号１８４］
ＣＤＲＨ３：ＥＦＧＹＩＩＬＤＹ［配列番号１８５］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ［配列番号１８６］
ＣＤＲＬ２：ＲＤＹＥＲＰＳ［配列番号１８７］
ＣＤＲＬ３：ＭＡＷＤＤＳＬＳＧＶＶ［配列番号１８８］
【０２１０】
抗体クローン：４Ｂ０２
４Ｂ０２−ＶＨ［配列番号２６］
2017517504.tif 000054
４Ｂ０２−ＶＬ［配列番号５０］
2017517504.tif 000055
ＣＤＲ領域
ＣＤＲＨ１：ＮＨＧＭＨ［配列番号１８９］
ＣＤＲＨ２：ＶＩＳＹＤＧＴＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ［配列番号１９０］
ＣＤＲＨ３：ＥＴＷＤＡＦＤＶ［配列番号１９１］
ＣＤＲＬ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＮＡＮ［配列番号１９２］
ＣＤＲＬ２：ＤＮＮＫＲＰＳ［配列番号１９３］
ＣＤＲＬ３：ＱＡＷＤＳＳＴＶＶ［配列番号１９４］
【０２１１】
好ましくは、本発明は、薬剤が、ＦｃγＲＩＩｂが抗体分子のＦｃドメインに結合することを防止または低減するために、先の実施形態に定義された薬剤と競合することができる薬剤である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２１２】
好ましくは、本発明は、薬剤が、ＦｃγＲＩＩｂシグナル伝達を防止または低減する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２１３】
Ｆｃ受容体は、細胞シグナル伝達によって細胞挙動を調節することができる。ＦｃγＲＩＩｂシグナル伝達によってどの下流細胞シグナル伝達調節因子が活性化及び／または非活性化されるか、そしてこれらの細胞シグナル伝達調節因子の活性化及び／または非活性化が細胞にどのような作用を及ぼすかは、細胞生物学の当業者には既知であろう。
【０２１４】
ここで「薬剤がＦｃγＲＩＩｂシグナル伝達を防止または低減する」には、ＦｃγＲＩＩｂがＦｃドメインに結合しているときにＦｃγＲＩＩｂシグナル伝達が防止もしくは低減されること、及び／またはＦｃγＲＩＩｂがＦｃドメインに結合していないときにＦｃγＲＩＩｂシグナル伝達が防止もしくは低減されることが含まれる。
【０２１５】
好ましくは、本発明は、薬剤が、標的細胞による抗体分子の内部移行を防止または低減する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２１６】
好ましくは、本発明は、細胞表面抗原が、ＣＤ１９、またはその一部分、ＣＤ２０、またはその一部分、ＣＤ４０、またはその一部分、ＣＤ５２、またはその一部分、Ｔｈｙ−１（すなわちＣＤ９０、表面抗原分類９０（Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ．２００９  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３５（３）：２５８−６５））、またはその一部分、Ｌｙ−６（すなわちリンパ球抗原６（Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ．２００９  Ａｐｒ；３６（４）：６９７−７０３））、またはその一部分、ＣＤ５９（すなわち補体制御タンパク質（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｊａｎ；４４（ｌ−３）：７３−８１））、またはその一部分、Ｆａｓ（すなわちＦＳ７結合細胞表面抗原、ＣＤ９５、ＡＰＯ−１、またはＴＮＦＲＳＦ６（Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２００９；６４７：６４−９３））、またはその一部分、ＥＧＦＲ（すなわち上皮細胞成長因子受容体（ＦＥＢＳ  Ｊ．２０１０  Ｊａｎ；２７７（２）：３０１−８））、またはその一部分、Ｈｅｒ２（すなわちヒト上皮細胞成長因子受容体２（Ｃｌｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．２００８  Ｏｃｔ；８（５）：３９２−４０１））、またはその一部分、ＣＸＣＲ４（すなわちケモカイン受容体４（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００７  Ａｐｒ；１７６８（４）：９５２−６３））、またはその一部分、ＨＬＡ分子（すなわちヒト白血球抗原分子（Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｊｕｎ；３０（３）：２０３））、またはその一部分、ＧＭ１（すなわちガングリオシド、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｓｅｐ；５１（９）：２７３１−８））、またはその一部分、ＣＤ２２（すなわちＣｈｅｓｏｎ（２００８）ＮＥＪＭ  ３５９（６）：６１３−２６）、またはその一部分、ＣＤ２３（Ｃｈｅｓｏｎ，２００８）、またはその一部分、ＣＤ８０（Ｃｈｅｓｏｎ，２００８）、またはその一部分、ＣＤ７４（Ｃｈｅｓｏｎ，２００８）、またはその一部分、ＤＲＤ（Ｃｈｅｓｏｎ，２００８）、またはその一部分からなる群から選択される、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２１７】
好ましくは、本発明は、（ｉ）に定義された抗体分子が、ＣＤ２０に特異的に結合する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２１８】
好ましくは、本発明は、（ｉ）に定義された抗体分子が、Ｉ型ＣＤ２０抗体である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２１９】
好ましくは、本発明は、（ｉ）に定義された抗体分子が、ＩＩ型ＣＤ２０抗体である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２２０】
ＣＤ２０抗体分子には２つのタイプがあり、これらは、異なる分類に分かれるものとして発明者らにより２００３年に初めて定義され（Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍＡｂ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２、及びＣｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００３．ＣＤ２０−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｃａｓｐａｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：５４８０−５４８９）、後にＩ型及びＩＩ型抗体分子として２００４年に定義された（Ｃｒａｇｇ  ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ  ２００４．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３）。初めに、これの根拠は、抗ＣＤ２０  ｍＡｂが、リンパ腫異種移植片を根絶するその能力に基づいて、２つの明確に異なる試薬の種類に分かれることであった（Ｉ型（例えばリツキシマブ及び１Ｆ５）は補体を用い、ＩＩ型（例えばＢｌ）は補体を用いない）。両方の型の抗体分子が生存期間の優れた延長をもたらしたが、ＣＶＦの投与による補体価の消耗は、リツキシマブ及び１Ｆ５の効力をかなり減退させたが、Ｂｌの活性には作用を及ぼさなかった。これらの結果は、異なるＣＤ２０抗体分子が異なるインビボのエフェクター機構を動作させることを明らかに示した。さらに、これらの結果は、リツキシマブ及び１Ｆ５が、ＣＤ２０を標的細胞膜内の脂質ラフトに転座させること（これはＢｌ型抗体分子にはなし得ないことである）の結果として補体を効率的に活性化させることができることを示した過去の研究と完全に一致する（Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍＡｂ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２）。補体に結合し、ＣＤ２０が脂質ラフト内に移動することを誘発する抗体分子の能力と、優れた相関関係がある（Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍＡｂ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２、及びＣｒａｇｇ，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ  ２００４．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３）。したがって、Ｉ型及びＩＩ型の本質は、ＣＤ２０を脂質ラフト内に移動させるそれらの能力によって定義され得る。これは、以下に示されるように決定され得る。���Ｉ型抗体分子がより強力な同型接着及び直接細胞死を誘起することができることとも相関関係があるが、これらを単独で使用して、Ｉ型またはＩＩ型抗体分子を定義することはできない（Ｔｘ−１００ラフトアッセイとは異なる；以下を参照のこと）。
【０２２１】
したがって、様々な抗ＣＤ２０抗体分子は、ＣＤ２０をプラズマ膜内に再分配するそれらの能力、及び様々なエフェクターアッセイにおけるそれらの活性によって、Ｉ型（例えばリツキシマブ１つのオファツムマブ）またはＩＩ型（例えばトシツモマブ（Ｂｌ）、ＧＡ１０１、及び１１Ｂ８）として分類される（Ｗｅｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｖｙ  ２００９．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩｂ  ｉｓ  ｎｏｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５０：７２３−７２７．、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３．ＣＤ２０−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｃａｓｐａｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３：５４８０−５４８９、及びＣｒａｇｇ  ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ２００４．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｒｅａｇｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３）。Ｉ型（例えばリツキシマブ、オファツムマブ）抗ＣＤ２０抗体分子は、ＣＤ２０が大きな界面活性剤抵抗性マイクロドメイン（ラフト）内に再分布することを誘発するが、ＩＩ型（トシツモマブ様）抗ＣＤ２０モノクローナル抗体はそれを誘発しない（Ｂｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ４７（２）：ｐｐｌ０７−ｌ  １４）。
【０２２２】
上で考察されたように、抗ＣＤ２０抗体分子は、それらがＣＤ２０を脂質ラフト内に再分配するかどうかによって、Ｉ型またはＩＩ型と指定され得る。これは、Ｔｘ−１００不溶性アッセイによって、またはショ糖密度勾配分離及びウェスタンブロッティングによって行われる。両方法は、Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ２００３に次のように記載されている。
【０２２３】
１．  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性によるラフト結合抗原の査定
ラフトマイクロドメイン内の抗原の存在の急速な査定として、低温におけるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性に基づくフローサイトメトリ法を用いた。手短に述べると、細胞をＲＰＭＩ／１％  ＢＳＡで洗浄し、２．５×１０６／ｍｌで再懸濁させた。次いで、細胞を、１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ抱合ｍＡｂと共に３７℃で１５分間インキュベートし、冷ＰＢＳ／１％  ＢＳＡ／２０ｍＭアジ化ナトリウムで洗浄し、次いでこの試料を半分に分割した。１つの半割部を氷上に維持して１００％表面抗原レベルの計算を可能にし、他方を氷上で１５分間０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処置して、不溶性ラフト画分内に残存する抗原の割合を決定した。次いで、細胞を、アッセイの残部全体にわたって４℃に維持し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物で１回洗浄し、再懸濁させ、上に詳述したようにフローサイトメトリによって査定した。間接検出法を使用して同様の結果を得た。標的抗原のラフト結合の恒常的レベルを決定するために、細胞をまず、氷上で１５分間０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処置し、ＦＩＴＣ標識ｍＡｂの結合の前にＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物で洗浄した。さらなる架橋によってより多くの抗原がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性画分内に移動し得るかどうかを査定するために、細胞を前述同様にＦＩＴＣ−ｍＡｂと共にインキュベートし、洗浄し、次いで４つに分割した。これらの試料のうちの２つを、ヤギ抗マウスＩｇ  Ｆ（ａｂ’）２断片と共に氷上で１５分間インキュベートした。洗浄後、架橋試料のうちの１つ及び非架橋試料のうちの１つをＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で溶解させ、フローサイトメトリ前に、上に詳述したように洗浄した。
【０２２４】
２．  ショ糖密度勾配分離及びウェスタンブロッティング−脂質ラフト画分の調製及びウェスタンブロッティング
モノクローナルＡｂ（１μｇ／１０６細胞）を３７℃で細胞に添加した。２０分間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、ＭＥＳ緩衝生理食塩水（２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＩｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、５μｇ／ｍｌアプロチニン、５μｇ／ｍｌロイペプチン、ｌＯｍＭ  ＥＤＴＡ）中１．０％の氷冷Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で溶解させた。次いで、ショ糖密度勾配遠心分離によって脂質ラフト画分を調製した。手短に述べると、ライセートを溶解緩衝液中で等体積の８０％ショ糖と混合し、非連続的な５〜３０％のショ糖密度勾配をかけ、次いで２００，０００×ｇで１６時間遠心分離した。画分（０．５ｍｌ）を収集し、ウェスタンブロッティングにより分析した。各画分の１５ｍｌのアリコートを２×ローディングバッファー中で１：１に希釈し、５分間９５℃に加熱し、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離させ、その後ＰＶＤＦ膜上に移し、一次抗体（例えばマウス抗ＣＤ２０、ＣＤ２０を検出するためのクローン７Ｄ１、またはラフト画分を同定するための抗Ｌｙｎウサギポリ血清（ｐｏｌｙｓｅｒａ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国））、続いてＨＲＰ抱合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ）と共にインキュベートした。ＥＣＬ＋ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ）を使用してブロットを可視化した。
【０２２５】
抗ＣＤ２０抗体分子は、ＣＤ２０の大ループ内のＡｘＰモチーフを必要とし得る（オファツムマブ及び他のＧｅｎｍａｂ抗体はそれを必要としない）。しかしながら、（Ｎｉｅｄｅｒｆｅｌｌｎｅｒ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｂｌｏｏｄ  １１８，３５８−３６７）は、ＩＩ型抗体分子が、Ｉ型と比較してわずかに異なるＣＤ２０ループの領域に結合することを示す。
【０２２６】
好ましくは、本発明は、Ｉ型ＣＤ２０抗体が、リツキシマブ、またはリツキシマブバイオシミラー、またはオファツムマブである、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２２７】
好ましくは、本発明は、ＩＩ型ＣＤ２０抗体が、オビヌツズマブまたはトシツモマブである、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２２８】
好ましくは、本発明は、（ｉ）に定義された抗体分子が、ＣＤ５２抗体である、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２２９】
好ましくは、本発明は、ＣＤ５２抗体がアレムツズマブである、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２３０】
好ましくは、本発明は、組成物またはキットが、１つ以上の治療薬を含む、組成物またはキットを提供する。
【０２３１】
好ましくは、本発明は、組成物が１つ以上の治療薬をさらに含む、使用を提供する。
【０２３２】
好ましくは、本発明は、対象が、１つ以上の治療薬をさらに投与される、方法を提供する。
【０２３３】
好ましくは、本発明は、対象が難治性癌もしくは再発癌を有するか、または対象が難治性癌及び再発癌を有する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２３４】
好ましくは、本発明は、対象が難治性慢性リンパ性白血病もしくは再発慢性リンパ性白血病を有するか、または対象が難治性慢性リンパ性白血病及び再発慢性リンパ性白血病を有する、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２３５】
好ましくは、本発明は、明細書、及び／または実施例、及び／または添付の図面を参照して、本特許請求の範囲に実質的に記載及び／または特許請求される、組成物、または使用、または方法、またはキットを提供する。
【０２３６】
明白な先行公開文献に関する本明細書中の列挙または考察は、必ずしもその文献が技術水準の一部であるという承認、または共通の一般知識であるという承認として解釈されるべきではない。
【０２３７】
これより、以下の図を参照して、本発明のある特定の態様を具現する好ましい非限定的な実施例を記載する。
【０２３８】
図１．ｈＦｃγＲＩＩＢとｈＦｃγＲＩＩＡとを区別することができるｍＡｂの作製及び特徴付け。（Ａ）ｓｃＦｖクローンを、ｈＦｃγＲＩＩＢまたは及びｈＦｃγＲＩＩＡへの特異的結合についてスクリーニングした。黄色のドットは、全長ＩｇＧへの変換のために選ばれたｈＦｃγＲＩＩＢに特異的なクローンを表す。（Ｂ）ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの結合性分析。ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂを、ｈＦｃγＲＩＩＢトランスフェクト細胞（赤色の線）またはｈＦｃγＲＩＩＡトランスフェクト細胞（青色の線）への結合性について査定した。同じｍＡｂを、ＩＣ上の存在下でのｈＦｃγＲＩＩＢトランスフェクト細胞への結合性（３ｎＭ、緑色の線）について査定し、このｍＡｂが、ｈＦｃγＲＩＩＢ発現細胞に結合するＩＣと競合（ｃｏｍｐｅｔｅ  ｏｕｔ）することができることが示された。この図は、１つの代表的なｈＦｃγＲＩＩＢクローンからのデータを示す。（Ｃ）フローサイトメトリによって決定されたＰＢＭＣ集団上の作製されたｍＡｂの結合プロファイル。ｈＦｃγＲＩＩＡ特異性ｍＡｂは、単球及び好中球に対する強い結合性を示し、一方で、ｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂは、同様に単球及び好中球に結合し、そのためｈＦｃγＲＩＩＡ及びＢに対しておそらく二重特異性である６Ａ０９を除いて、Ｂ細胞に主に結合した。（Ｄ）Ｂ細胞に対するｍＡｂの用量依存性結合。ｍＡｂは０．１、１、または１０μｇ／ｍｌで添加し、染色の強度はフローサイトメトリによって決定した。（Ｅ）ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの親和性。選択されたｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂ（７Ｃ０７、５Ｃ０４、５Ｃ０５）を、様々な濃度のｈＦｃγＲＩＩＢ融合タンパク質に対するそれらの結合性について、表面プラズモン共鳴法によって査定した（０（赤色）、０．１６（緑色）、０．８（青色）、４（桃色）、２０（青緑色）、及び１００（茶色）ｎＭ）。センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）は、各ｍＡｂに対する典型的な結合応答を示す。ＫＤ値は、１：１結合モデルから計算した（表２参照）。
【０２３９】
図１（２／２）．ｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ（ＡＴ１０）の治療効果、及びｈＦｃγＲＩＩＢとｈＦｃγＲＩＩＡとを区別することができる特異性ｍＡｂの作製。（上）Ｄａｕｄｉ細胞を異種移植（皮下（ｓ．ｃ．））したＳＣＩＤマウス（５／群）を、矢印で示されるように（腹腔内（ｉ．ｐ．））処置した。平均腫瘍重量を±ＳＥＭでプロットし、独立ｔ検定を使用して分析した；ｐ値は、リツキシマブ（Ｒｉｔ）単独対Ｒｉｔ＋ＡＴ１０処置群を比較する（＊＊ｐ≦０．００５）。代表的なデータ（ｎ＝２）。（下）ｈＦｃγＲＩＩＢトランスフェクト細胞（赤色の線）またはｈＦｃγＲＩＩＡトランスフェクト細胞（青色の線）に結合するｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ、及びｈＦｃγＲＩＩＢトランスフェクト細胞（緑色の線）に結合するＩＣのｍＡｂ依存性抑制。図７及び８ならびに表６も参照されたい。
【０２４０】
図２．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂは、標的細胞の表面上でのＦｃγＲＩＩＢとのリツキシマブ（Ｒｉｔ）の結合を遮断することができる。（Ａ）ｈＦｃγＲＩＩＢ  ＩＴＩＭのリン酸化を誘起するｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂの能力。Ｒａｊｉ細胞を、３７℃で３０分間、Ｎ２９７Ｑ  ｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）で処置し、その後溶解させ、免疫ブロッティングによりｈＦｃγＲＩＩＢ（ｐＦｃγＲＩＩＢ）のリン酸化状態を査定した。ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｉｓｏ  ｃｔｒｌ）及びＲｉｔを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。αチューブリンをローディング対照としてプローブした。（Ｂ）Ｒｉｔによって誘発されるｈＦｃγＲＩＩＢ  ＩＴＩＭのリン酸化を遮断するｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂの能力。１０μｇ／ｍｌのＲｉｔを３７℃で３０分間添加する前に、Ｒａｊｉ細胞を１０分間Ｎ２９７Ｑ  ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）で前処置した。処置した細胞を溶解させ、上記のように免疫ブロッティングによってｐＦｃγγＲＩＩＢ及びαチューブリンについて査定した。少なくとも３つの独立した実験の代表的なブロットが示されている。（Ｃ）Ｒｉｔによって誘発される内部移行を遮断するｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂの能力。ベクター対照（ｃｔｒｌ）またはｈＦｃγＲＩＩＢトランスフェクトＲａｍｏｓ細胞を、指示された時間点に対して３７℃で、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの野生型（ＷＴ）またはＮ２９７Ｑ変異体（１０μｇ／ｍｌ）及びＡＦ４８８標識Ｒｉｔ（５μｇ／ｍｌ）で処置した。消光アッセイを使用してＲｉｔの内部移行を決定し、表面ＣＤ２０発現の％として表す。ＡＦ４８８標識トシツモマブはＣＤ２０の結合後に著しく内部移行しないため、これを陰性対照として使用した２２。３つの独立した実験の平均±ＳＤが示されている。（Ｄ）Ｒｉｔ内部移行を遮断するｍＡｂのパネルの能力（Ｃに示される）は、それらの相対階級的親和性と相関した（Ｒ２＝０．７８）。（Ｅ）Ｒｉｔ内部移行を遮断するｍＡｂのパネルの能力（Ｃに示される）は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ濃度測定ソフトウェアによって査定されたとき、ｈＦｃγＲＩＩＢのＲｉｔ誘発性リン酸化を遮断するそれらの能力（Ｂ）と相関した（Ｒ２＝０．７９）。
【０２４１】
図３．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は、インビトロで強力な細胞傷害活性を有し、標的ＣＬＬ細胞の表面上でのｈＦｃγＲＩＩＢとのＲｉｔの結合を遮断することができる。（Ａ）ある範囲の凍結組織上で査定したｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ７Ｃ０７及び６Ｇ１１のＩＨＣ分析。６Ｇ１１は、ヒト脾臓内の細胞に対して非常に特異的な結合性を示し、非リンパ球性細胞への背景染色は事実上存在せず、カニクイザルまたはマウスの脾臓組織の染色はほとんどまたは全くなく、一方で、７Ｃ０７は、予想通りリンパ球への結合性を示しただけでなく、ヒト組織及びカニクイザル組織の両方の内膜への結合性も示した。（Ｂ〜Ｅ）初代患者ＣＬＬ細胞でのＡＤＣＣ（Ｂ）、ＰＣＤ（Ｃ）、及びＡＤＣＰ（Ｄ）を測定するアッセイにおける６Ｇ１１の細胞傷害能力。ＣＬＬ細胞を６Ｇ１１（１０μｇ／ｍｌ）でオプソニン化し、Ｒｉｔ（１０μｇ／ｍｌ）を各アッセイで陽性対照として添加した。各ドットは、１人のＣＬＬ患者からの３通りの試料の平均を表す。（Ｅ）高親和性または低親和性のｈＦｃγＲＩＩＩＡ対立遺伝子変異体（それぞれ１５８Ｆ及びＶ）を保有するエフェクター細胞を使用したＡＤＣＣアッセイ。６Ｇ１１は、両方の場合で、Ｒｉｔと比較してＡＤＣＣを誘発するのにより強力であった。この図は、３つの異なるＣＬＬドナーを使用した３つの独立した実験からの平均±ＳＤを示す。（Ｆ）ＣＬＬ細胞の表面からのＲｉｔ内部移行を損なう６Ｇ１１の能力。６つのＣＬＬ試料を、３７℃で最大６時間、野生型（左パネル）またはＮ２９７Ｑ（右パネル）ｍＡｂ、アイソタイプ対照または６Ｇ１１（１０〜２０μｇ／ｍｌ）及びＡＦ４８８標識Ｒｉｔ（５μｇ／ｍｌ）で処置した。Ｒｉｔの内部移行を上記のように査定し、表面ＣＤ２０発現の％を提示した。（Ｇ）ＣＬＬ細胞の表面に残存する６Ｇ１１の能力。６つのＣＬＬ試料を野生型またはＮ２９７Ｑ  ６Ｇ１１（１０μｇ／ｍｌ）で最大６時間処置し、抗ｈＦ（ａｂ’）２−ＰＥを用いた染色により、ｈＦｃγＲＩＩＢ表面発現を間接的に数量化した。値は、０時点において氷上で行った染色に正規化し、表面ｈＦｃγＲＩＩＢ発現％として表した。データは箱ひげ図として表され、ｐ値は示されるように群を比較する（＊ｐ≦０．０５）。（Ｈ及びＩ）６Ｇ１１を用いたＡＤＣＰの増補。ＣＦＳＥ標識ＣＬＬ細胞を、Ｎ２９７Ｑアイソタイプ対照または６Ｇ１１と組み合わせたＲｉｔで、培養液中で３時間オプソニン化し、洗浄し、５：１比でＭＤＭに添加した。共培養後、−ＣＤ２０６−ＡＰＣ染色を使用してＭＤＭを同定し、結果をフローサイトメトリによって分析した。代表的なドットプロットが（Ｈ）に示され、貪食されたＣＦＳＥ＋ｖｅＣＬＬ細胞を有するＭＤＭの割合として計算された二重陽性事象の％が（Ｉ）に示される。（Ｊ）６Ｇ１１を用いたＡＤＣＣの増補。ＣＬＬ細胞を、Ｎ２９７Ｑアイソタイプ対照または６Ｇ１１と組み合わせたＲｉｔで３時間オプソニン化し、次いでＮＫ細胞と共培養した。各ドットは、１つの初代ＣＬＬ試料からの３通りの平均を表す。データを対応ｔ検定（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、及びＪ）ｔ検定によって分析した；ｐ値は示されるように群を比較する（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．００５、＊＊＊＊ｐ≦��．０００１）。
【０２４２】
図４．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１はインビボで活性であり、Ｂ細胞のＣＤ２０  ｍＡｂ枯渇を増強する。（Ａ及びＢ）インビボでｈＦｃγＲＩＩＢ＋ｖｅ標的細胞を欠失させる６Ｇ１１の能力。それぞれ高レベルまたは低レベルのＣＦＳＥで標識された、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−標的及びｍＦｃγＲＩＩ−／−非標的Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞を、野生型またはγＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに養子移入（静脈内（ｉ．ｖ．））した。２４時間後、指示された野生型またはＮ２９７Ｑ  ６Ｇ１１  ｍＡｂをマウスに受けさせ（静脈内）、１６時間後、循環細胞（Ａ）または脾細胞（Ｂ）を分析して、残存する標的対非標的比を決定した。データを正規化して、１．０の対照（ＮＴ）標的：非標的比が与えられた。各ドットは個別のマウスからの結果を表し、平均比は水平線（±ＳＥＭ）によって示される。データは、少なくとも２つの独立した実験から組み合わされている。（Ｃ〜Ｅ）インビボで標的細胞を欠失させるＲｉｔの能力を増補する６Ｇ１１の能力。（Ｃ）上記のように、それぞれ高レベルまたは低レベルのＣＦＳＥで標識された、ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−標的、及びｍＦｃγＲＩＩ−／−非標的Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６受容マウスに注入（静脈内）した。２４時間後、指示されたｍＡｂを単独または組み合わせでマウスに受けさせ（５〜１０μｇ、静脈内）、１６時間後、脾臓を分析して、上記のように標的対非標的比を決定し正規化した。データは、少なくとも３つの独立した実験から組み合わされている。（Ｄ）上記のように、ＣＦＳＥ＋ｖｅｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−標的、及びｍＦｃγＲＩＩ−／−非標的Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞を、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−Ｃ５７ＢＬ／６受容マウスに注入（静脈内）した。１日目及び２日目に野生型６Ｇ１１（５００μｇ、静脈内／腹腔内）、続いて２日目にＲｉｔ（５〜５０μｇ、静脈内）をマウスに受けさせ、１６時間後、脾臓を分析して、上記のように標的対非標的比を決定し正規化した。データは、少なくとも３つの独立した実験から組み合わされている。（Ｅ）ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｒｉｔもしくは６Ｇ１１（５００μｇ）、または２５０μｇの各ｍＡｂの組み合わせのいずれかを、０日目に静脈内で受けさせ、示されるように、循環Ｂ細胞の数を経時的に査定した。棒グラフは、処置前レベルに正規化された、少なくとも２つの独立した実験からの最大１２マウス／群における循環Ｂ細胞％の平均±ＳＥＭを示す。二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）統計検定を行って、処置群を比較した；ｐ値は、示されるように群を比較する（＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１）。（Ｆ〜Ｇ）インビボで標的細胞を欠失させるＧＡ１０１ｇｌｙの能力を増補する６Ｇ１１の能力。ＣＦＳＥ＋ｖｅｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−標的、及びｍＦｃγＲＩＩ−／−非標的Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞を、野生型受容マウスに注入（静脈内）し、その後１日目にＧＡ１０１ｇｌｙもしくは６Ｇ１１単独または組み合わせで処置し（０．２μｇ、静脈内）、１６時間後、脾臓を分析して、標的対非標的比を決定し、上に詳述したように表した。データは、３つの独立した実験から組み合わされている。（Ｇ）ＣＦＳＥ＋ｖｅｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−標的、及びｍＦｃγＲＩＩ−／−非標的Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞を、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−受容マウスに注入（静脈内）し、その後、１日目及び２日目に野生型アイソタイプ対照または６Ｇ１１のいずれか（５００μｇ、腹腔内）、続いて２日目にＧＡ１０１ｇｌｙ（１μｇ、静脈内）で処置し、１６時間後、脾臓を分析して、標的対非標的比を決定し、上に詳述したように表した。一元配置分散分析統計検定を行って、処置群をＮＴ／アイソタイプ対照またはＣＤ２０  ｍＡｂ／６Ｇ１１単独処置群と比較した（Ａ〜Ｄ及びＦ〜Ｇ）；ｐ値は、示されるように群を比較する（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【０２４３】
図４（２／２）．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１はインビボで活性であり、Ｂ細胞のＣＤ２０  ｍＡｂ枯渇を増強する。ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスに、Ｒｉｔ±野生型もしくはＮ２９７Ｑ  ６Ｇ１１（２０ｍｇ／ｋｇ）、または１０ｍｇ／ｋｇの各ｍＡｂの組み合わせのいずれかを、０日目に受けさせ、循環Ｂ細胞の数を経時的に査定した。（上）処置前及びｍＡｂ注入後２日目を示す循環性Ｂ細胞を分析する代表的なドットプロット。四分部分の右上枠内の数は、処置前レベルと比較したＢ細胞の％を示す。（下）左のグラフは、Ｒｉｔ±野生型６Ｇ１１を有する循環Ｂ細胞の枯渇を示し、右上のグラフは、Ｒｉｔ±野生型またはＮ２９７Ｑ  ６Ｇ１１を有する循環Ｂ細胞の枯渇を示し、右下のグラフは、Ｒｉｔ（ｍ２ａ、４ｍｇ／ｋｇ）±６Ｇ１１（ｍＩｇＧ１、２０ｍｇ／ｋｇ）を有する循環Ｂ細胞の枯渇を示す。処置前レベルに正規化された、処置後の循環Ｂ細胞％の平均＋ＳＤが示されている；最大１２マウス／群が、少なくとも２つの独立した実験から組み合わされている。二元配置分散分析を行った。図１５も参照されたい。
【０２４４】
図５．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は、インビボで患者ＣＬＬ細胞のＲｉｔ枯渇を増強する。（Ａ〜Ｂ）初代患者ＣＬＬ細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに生着し、ヒトにおいて観察されるものと同様の明確な増殖性クラスターを脾臓内に形成する。６〜１０×１０７個の初代患者ＣＬＬ細胞の静脈内接種の前に、マウスに照射した。注入４〜５日後、脾臓を採取し、切片を調製し、（Ａ）ｈＣＤ１９（赤色）もしくはＫｉ６７（緑色）の存在について染色し、免疫蛍光法により査定したか、または（Ｂ）ｈＣＤ２０及びＫｉ６７について染色し、ＩＨＣにより査定した。（Ｃ）ヒトＣＬＬ細胞を注入されたマウスにおける、Ｒｉｔ、６Ｇ１１、またはその組み合わせの抗腫瘍活性。上記のようにＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに初代ヒトＣＬＬ細胞を接種し、接種４〜５日後、１〜１０ｍｇ／ｋｇのｈＣＤ２０  ｍＡｂ、ｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ、または両方のいずれかでマウスを処置した。２〜３日後にマウスに第２の注入を受けさせ、最後の処置の２〜３日後に屠殺し、脾臓内に残存するヒトＣＬＬ細胞の％を列挙し、アイソタイプ対照ｍＡｂでの処置後に存在した割合に正規化した。１０体の異なる患者からのＣＬＬ試料をこのように査定した。各ドットは１匹のマウスを表す。（Ｄ及びＥ）完全レスポンダー、すなわち脾臓内でＣＬＬ細胞が検出されなかったマウス（Ｄ）、及び客観的レスポンダー、すなわちＣＬＬ細胞が≧７５％低減したマウス（Ｅ）の割合を、上記（Ｃ）に提示されたデータから計算した。（Ｆ〜Ｇ）インビボ処置に対する屈折性患者ＣＬＬ細胞の応答。難治性と以前に指定された患者からのＣＬＬ細胞（ｎ＝４、表４参照）を、（Ｃ〜Ｅ）にあるように接種し、処置し、査定した。（Ｆ）ドットが個別のマウスを表す生データを示し、（Ｇ）はＲｉｔ難治性患者における客観的レスポンダーの出現頻度を示す。一元配置分散分析を行って、処置群を比較した；ｐ値は、示されるように群を比較する（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【０２４５】
図５（２／２）．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は、インビボで正常及び悪性の標的細胞の治療的なｍＡｂ枯渇を増強する。（Ａ〜Ｂ）初代患者ＣＬＬ細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脾臓を、免疫蛍光法（Ａ）またはＩＨＣ（Ｂ）によって査定した；対照は一次ｍＡｂなし。（Ｃ）ヒトＣＬＬ細胞を異種移植したマウス（ｎ＝１１患者）を、１〜１０ｍｇ／ｋｇのｈＣＤ２０  ｍＡｂ（Ｒｉｔ）、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ（６Ｇ１１）、または両方で処置し、脾臓内に残存するＣＬＬ細胞の％を列挙し、アイソタイプ対照での処置後の割合に正規化した。（Ｄ）難治性と以前に指定された患者からのＣＬＬ細胞を異種移植したマウス（ｎ＝４）を、（Ｃ）にあるように処置し、査定した。（Ｅ）ＣＦＳＥ＋ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−（標的）、及びｍＦｃγＲＩＩ−／−（非標的）脾細胞を、野生型マウスに注入（静脈内）し、ＧＡ１０１ｇｌｙもしくは６Ｇ１１単独または組み合わせ（０．００８ｍｇ／ｋｇ）で処置し、前述同様に脾臓内の欠失について査定した。データは、２〜３つの独立した実験から組み合わされている。（Ｆ）ＣＦＳＥ＋ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−（標的）、及びｍＦｃγＲＩＩ−／−（非標的）脾細胞を、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−受容マウスに注入し、野生型アイソタイプ対照または６Ｇ１１のいずれか（２０ｍｇ／ｋｇ）、続いてＧＡ１０１ｇｌｙ（０．０４ｍｇ／ｋｇ）で処置し、（Ｅ）にあるように分析した。（Ｇ）ＣＬＬ細胞を移植したマウス（ｎ＝４）を、ＧＡ１０１（０．２ｍｇ／ｋｇ）、６Ｇ１１（１ｍｇ／ｋｇ）、または両方で処置し、（Ｃ）にあるように査定した。（Ｈ）ＣＬＬ細胞を移植したマウス（ｎ＝３）を、アレムツズマブ（Ａｌｅｍ、１ｍｇ／ｋｇ）、６Ｇ１１（１ｍｇ／ｋｇ）、または両方で処置し、（Ｃ）にあるように査定した。（Ｃ〜Ｄ及びＧ〜Ｈ）円グラフは、表１に定義される、ｍＡｂ療法後のＮＲ（黒色）、ＯＲ（青色）、及びＣＲ（緑色）の初代患者ＣＬＬ保有マウスの数を表す。（Ｃ〜Ｈ）各ドットは個別のマウスを表し、平均比は水平線によって表されている。（Ｅ及びＦ）一元配置分散分析を使用して分析されたデータ、ならびに（Ｃ〜Ｄ及びＧ〜Ｈ）並べ替え統計検定。図１６及び１７、ならびに表８及び４も参照されたい。
【０２４６】
図６．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は、前臨床インビボ系及びインビトロ系で耐容され、毒性の結果をもたらさない。（Ａ〜Ｄ）単回投与後の６Ｇ１１のインビボの有効性及び半減期（図１７Ａ）。同齡かつ同性のｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス（６〜７マウス／群）に、指示された濃度の野生型６Ｇ１１  ｍＡｂを注入した（静脈内または腹腔内）。（Ａ）循環性Ｂ細胞の％を、フローサイトメトリによって最大７日目まで経時的に査定した。（Ｂ）７日目にマウスを屠殺し、脾臓内のＢ細胞の数（脾臓リンパ球の％として表される）をフローサイトメトリによって数量化した。７日の期間にわたる（Ｃ）血清６Ｇ１１  ｍＡｂ濃度及び（Ｄ）ＭＡＨＡ力価を、材料及び方法の節に記載されるように、ＭＳＤによって査定した（平均＋ＳＥＭ）。（Ｅ〜Ｆ）複数投与後の６Ｇ１１のインビボの有効性及び半減期。同齡かつ同性のｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇ×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス（６マウス／群）またはｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス（３マウス／群）に、０日目に１０ｍｇ／ｋｇの野生型６Ｇ１１  ｍＡｂを静脈内注入し、続いて３日目、７日目、及び１０日目に同用量を腹腔内注入した。１０日後（２４日目）にマウスを屠殺し、器官を毒性について査定した（図１７Ｃ）。（Ｅ）血液を経時的に試料採取し、循環Ｂ細胞をフローサイトメトリによって数量化した（平均＋ＳＤ）。（Ｆ）６Ｇ１１  ｍＡｂに対するＭＡＨＡ力価を、（Ｄ）にあるように査定した（平均＋ＳＥＭ）。（Ｇ）高密度の前培養ヒトＰＢＭＣを使用したインビトロのサイトカイン応答。ヒトＰＢＭＣを、４８時間にわたるＰＢＳ（ＮＴ）または１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照もしくは６Ｇ１１の野生型もしくはＮ２９７Ｑ変異体の添加の前に、１×１０７／ｍｌで４８時間にわたって前培養した。上清を採取し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＴＮＦ−αの濃度をＭＳＤによって査定した。ＣＤ３  ｍＡｂ（ＯＫＴ３）を、最適濃度及び準最適濃度（それぞれ１及び０．０２μｇ／ｍｌ）で陽性対照として使用した。データは、３体の独立した健康なドナーからのＰＢＭＣを使用した３つの独立した実験の代表である（平均±ＳＥＭ）。
【０２４７】
図６（２／２）．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は良好に耐容され、毒性の結果をもたらさない。ｈＦｃγＲＩＩＢ＋血液Ｂ細胞（左のグラフ）、単球（中央のグラフ）、または好中球（右のグラフ）の枯渇における、Ｒｉｔ±野生型またはＮ２９７Ｑ  ６Ｇ１１の効力を査定するためのインビトロの全血枯渇アッセイ。平均値が示され（水平線）、各ドットは個別のドナーを表す。図１４、１８、及び１９、ならびに表７も参照されたい。
【０２４８】
図７．ｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ（ＡＴ１０）は、インビボのＲｉｔによる悪性Ｂ細胞のクリアランスを増強する。１：１比でＭａｔｒｉｇｅｌ中に混合した（Ａ）５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞または（Ｂ）Ｒａｊｉ細胞を、ＳＣＩＤマウス（最大５マウス／群）の側腹部に注入（皮下）した。その後、腫瘍保有マウスに、Ｘ軸上に示されるように（矢印）７日目から始めて週１回の基準で最大４回、指示されたｍＡｂを注入（腹腔内）した。腫瘍成長を経時的に監視し、以下の等式：［重量＝（長さ×幅２）／２］を使用して推定した。平均腫瘍体積を測定値±ＳＥでプロットした。２つの独立した実験からの代表的なデータが示されている。（Ｃ）２．５×１０６個のＲａｊｉ細胞を、ＳＣＩＤマウス（６マウス／群）に注入（静脈内）した。上記のように、その後、腫瘍保有マウスに、７日目から始めて週１回の基準で最大４回、指示されたｍＡｂを注入（腹腔内）した。マウスを経時的に監視し、末期腫瘍発達の徴候が顕れた直後に屠殺した。データは、独立ｔ検定を使用して分析した；ｐ値は、示されるように群を比較する（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．００５）。
【０２４９】
図８．作製されたクローンは、ｈＦｃγＲＩＩＢに対して非常に特異的である。（Ａ）相同性の高いｈＦｃγＲＩＩｂタンパク質（下）と比較したｈＦｃγＲＩＩＡアミノ酸（ａａ）配列（上）のアライメント。差異は赤色で強調され、ＩｇＧ結合部位が示されている。（Ｂ〜Ｄ）ｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂをＰＢＭＣと共にインキュベートし、次いで、ＣＤ１４＋ｖｅ単球（Ｂ）、ＣＤ１９＋ｖｅＢ細胞（Ｃ）、またはＣＤ３＋ｖｅＴ細胞（Ｄ）に対する結合性について、フローサイトメトリによって査定した。血液中のＣＤ１９＋ｖｅＢ細胞（Ｃ）に対する高度かつ用量依存性の結合が、２Ｂ０８及び２Ｅ０８を除く全てのクローンについて観察され、一方で、ＣＤ１４＋ｖｅ単球（Ｂ）に対する結合にはその逆が当てはまった。クローン６Ａ０９は、単球及びＢ細胞の両方に対する交差反応性を示した。（Ｄ）ｍＡｂのいずれもＣＤ３＋ｖｅＴ細胞を染色しなかった。
【０２５０】
図９．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの野生型及びＮ２９７Ｑ変異体の両方が同じように、標的細胞の表面からのＲｉｔ内部移行を遮断することができる。（Ａ〜Ｂ）それぞれ、単離されたヒト扁桃Ｂ細胞（Ａ）及び初代末梢血単球（Ｂ）上のｈＦｃγＲＩＩＢ  ＩＴＩＭのリン酸化（ｐＦｃγＲＩＩＢ）を誘起する、野生型及び／またはＮ２９７Ｑ（ＮＱ）ｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂ（クローン６Ｇ１１及び６Ｇ０８）の能力。αチューブリン、ＧＡＰＤＨ、及びｈＦｃγＲＩＩＢを、示されるようにローディング対照として使用し、代表的なブロットを示した。（Ｃ）ｈＦｃγＲＩＩＢトランスフェクトＲａｍｏｓ細胞を、指示された時間点に対して３７℃で、選択されたｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ（選択された拮抗薬及び作動薬を表す）の野生型もしくはＮ２９７Ｑ変異体（１０μｇ／ｍｌ）、またはアイソタイプ対照（ｉｓｏ  ｃｔｒｌ）及びＡＦ４８８標識Ｒｉｔ（Ｒｉｔ、５μｇ／ｍｌ）で処置した。消光アッセイを使用してＲｉｔの内部移行を決定し、表面ＣＤ２０発現の割合として表した。ＡＦ４８８標識トシツモマブはＣＤ２０の結合後に著しく内部移行しないため、これを陰性対照として使用した２２。３つの独立した実験の平均＋ＳＤが示されている。
【０２５１】
図１０．インビトロのｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂのＡＤＣＣ活性。（Ａ）ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂで前オプソニン化したＲａｊｉ細胞を、健康なドナーの末梢血から精製したＮＫ細胞と共培養し、ＡＤＤＣ活性を、材料及び方法の節に記載されるように査定した。この図は、４つの独立した実験の平均＋ＳＤを示す。（Ｂ）Ａの結果に基づいて、７つのｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂを、ある範囲の濃度に関するそれらのＡＤＣＣ活性についてさらに試験した。Ｒｉｔ（Ｒｉｔ）を陽性対照として含めた。全てのｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂがＲｉｔよりも好ましく機能することが示され、７Ｃ０７及び６Ｇ１１が、より低い濃度においても最も良好に機能するｍＡｂであった。２つの代表的な実験のうちの１つが示され、データ点は、３通りの試料からの平均＋ＳＤを表す。
【０２５２】
図１１．野生型またはＮ２９７Ｑ  ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂで染色されたヒト組織のＩＨＣ。７Ｃ０７または６Ｇ１１の野生型もしくはＮ２９７Ｑ変異体を、様々な組織から採取した新鮮な凍結切片に添加した。過酸化水素ブロックを用いないＴｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＳＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）増幅を使用して、組織反応性を検出した。（Ａ）ヒト脾臓の７Ｃ０７染色。７Ｃ０７は、類洞及び血管を非特異的に染色することが示された。（Ｂ）６Ｇ１１の野生型またはＮ２９７Ｑ変異体を、ヒト脾臓切片に添加し、上に詳述したように結合性について査定した。両方のフォーマットが、この組織内の小リンパ球細胞を同じように染色することが示された。（Ｃ）６Ｇ１１（１μｇ／ｍｌ）の染色、続いて、切片上に示される、様々なヒト組織の凍結保存された断面上のＴＳＡ検出。反応性は観察されなかった。
【０２５３】
図１２．グリコシル化Ｎ２９７Ｑ  ６Ｇ１１変異体は、内因性Ｆｃ依存性エフェクター活性を欠き、インビトロでＡＤＤＣを誘発することができない。初代ヒトＣＬＬ細胞を、野生型もしくはＮ２９７Ｑバージョンの６Ｇ１１、または野生型ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）でオプソニン化し、次いでＮＫ９２細胞と共培養し、ＡＤＤＣ  活性を、材料及び方法の節に記載されるように査定した。野生型６Ｇ１１とは異なり、Ｎ２９７Ｑ  ６Ｇ１１  ｍＡｂは、アイソタイプ対照オプソニン化標的細胞と比較可能なＡＤＣＣ有効性によって示されるような内因性Ｆｃ媒介性エフェクター機能を有しなかった。各ドットは１体のＣＬＬ患者を示す；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１（対応のあるスチューデントｔ検定によって査定した場合）。
【０２５４】
図１３．ｈＦｃγＲＩＩＢは、初代ヒトＣＬＬ細胞上でＣＤ２０よりもｍＡｂ誘発性内部移行に抵抗性である。６つのＣＬＬ試料を、前述同様の内部移行の査定前に、３７℃で２または６時間、５μｇ／ｍｌのＡＦ４８８標識Ｒｉｔ（灰色の棒）またはＡＦ４８８標識野生型６Ｇ１１（白色の棒）のいずれかで処置した；表面ＣＤ２０またはｈＦｃγＲＩＩＢ発現の％が表されている。（Ｂ）６つのＣＬＬ試料を野生型またはＮ２９７Ｑ  ＡＴ１０（１０μｇ／ｍｌ）で１〜６時間処置し、抗ｈＦ（ａｂ’）２−ＰＥを用いた染色により、ｈＦｃγＲＩＩＢ表面発現を間接的に数量化した。値は、０時点において氷上で行った染色に正規化し、表面ｈＦｃγＲＩＩＢ発現％として表した。データは箱ひげ図として表され、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を行って、処置群を比較した；ｐ値は、示されるように群を比較する（＊ｐ≦０．０５）。
【０２５５】
図１４．ｈＦｃγＲＩＩＢマウスの作製及び特徴付け。（Ａ）全長ｈＦｃγＲＩＩＢ２をＲａｊｉ細胞から増幅し、重複するＰＣＲによって同じ細胞から単離された天然ｈＦｃγＲＩＩＢプロモーターと連結させて、指示されたコンストラクトを作製した。（Ｂ）ｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇの発現を、陽性及び陰性のマウス株におけるＰＣＲ増幅によって査定した。（Ｃ）マウスを作製し、戻し交配し、ＣＤ１９−ＰＥ及びｈＦｃγＲＩＩ（ＡＴ１０）−ＦＩＴＣ  ｍＡｂを用いた染色によって循環血液の表現型を決定し、フローサイトメトリによって査定した。（Ｄ）発現賦活性（ａｃｔｉｖａｔｏｒｙ）及び抑制性のｍＦｃγＲＩＩならびに／またはｈＦｃγＲＩＩＢ受容体を、インハウスで作製した特異的なｍＡｂを使用して、指示されたマウス系統から作製したＢＭＤＭ上で精査した（Ｔｕｔｔら、準備中の論文）。データは、ヒト導入遺伝子の存在下における、賦活性及び抑制性ｍＦｃγＲのプロファイルの代償性変化の欠如を示す。（Ｅ）ｍＦｃγＲＩＩまたはｈＦｃγＲＩＩＢの発現を、それぞれ、指示された野生型またはｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスの脾臓からのＣＤ１９−ｖｅＣＤ１１ｂ＋ｖｅＮＫ１．１−ｖｅＬｙ６Ｇ＋ｖｅ．好中球上で査定した。３つの独立した実験の代表的なドットプロットが示されている。予想通り、ｈＦｃγＲＩＩＢではなくｍＦｃγＲＩＩが好中球上で発現されている。（Ｆ）野生型またはｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス脾臓からの凍結切片を免疫蛍光法によって分析し、ｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇの発現を査定し、指示されたマーカー（それぞれＡＴ１３０−２及びＡＴ１０  ｍＡｂ、赤色）、Ｂ細胞（Ｂ２２０、上のパネル（緑色））及びマクロファージ（Ｆ４／８０、下のパネル（緑色））を使用して、内在性ｍＦｃγＲＩＩ受容体と比較した。
【０２５６】
図１４（４／５）．ｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇマウスの作製及び特徴付け、ならびに６Ｇ１１  ｍＡｂのＰＫ、ＰＤ、ＭＡＢＥＬ、及びＣＲＳ誘発特性の査定。図１４に関連する。（Ｄ）マウス白血球サブセットの免疫表現型を決定するためのゲーティングストラテジー（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。（Ｅ）ｍＦｃγＲＩＩまたはｈＦｃγＲＩＩＢの発現を、それぞれ、指示された野生型またはｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスならびにヒト血液の循環（血液）細胞及び脾臓Ｂ細胞、単球／マクロファージ、及び好中球上で査定した。少なくとも３つの独立した実験の代表的なドットプロットが示されている。
【０２５７】
図１４（５／５）．ｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇマウスの作製及び特徴付け、ならびに６Ｇ１１  ｍＡｂのＰＫ、ＰＤ、ＭＡＢＥＬ、及びＣＲＳ誘発特性の査定。図１４に関連する。（Ｆ）示されるように、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスの循環（血液）及び脾臓の白血球サブセット、ならびに健康なヒト白血球、ならびにＣＬＬ患者及びＢ細胞株上のｈＦｃγＲＩＩＢ発現の査定が示されている。平均±ＳＤが示され、各ドットは単一のドナー／試料を表す。（中央のパネル）野生型またはｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス脾臓からの凍結切片を免疫蛍光法によって分析し、ｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇの発現を査定し、指示されたマーカー（それぞれＡＴ１３０−２及びＡＴ１０  ｍＡｂ、赤色）、Ｂ細胞（Ｂ２２０、上のパネル（緑色））及びマクロファージ（Ｆ４／８０、下のパネル（緑色））を使用して、内在性ｍＦｃγＲＩＩと比較した。（下のパネル）ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス肝臓内のＣＤ３１＋内皮細胞上のｈＦｃγＲＩＩＢ発現の査定。
【０２５８】
図１５．ｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ  ＡＴ１０はインビボで活性であり、Ｂ細胞のＲｉｔ枯渇を増強する。（Ａ）それぞれ高レベルまたは低レベルのＣＦＳＥで標識された、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−標的及びｍＦｃγＲＩＩ−／−非標的Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞を、野生型またはγＫＯ  Ｃ５７ＢＬ／６受容マウスに養子移入（静脈内）した。２４時間後、指示されたｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ  ＡＴ１０の野生型またはＦ（ａｂ）２断片をマウスに受けさせ（静脈内、ｍＩｇＧ１）、１６時間後、脾細胞を分析して、残存する標的対非標的比を決定した。データを正規化して、１．０の対照（ＮＴ）標的：非標的比が与えられた。各ドットは個別のマウスからの結果を表し、平均比は水平線によって示される。データは、少なくとも２つの独立した実験の４〜６マウス／群から組み合わされている。（Ｂ）それぞれ高レベルまたは低レベルのＣＦＳＥで標識された、ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−標的及びｍＦｃγＲＩＩ−／−非標的Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６受容マウスに注入（静脈内）した。２４時間後、指示されたｍＡｂを単独または組み合わせでマウスに受けさせ（１０μｇ、静脈内）、１６時間後、脾臓を分析して、上記のように標的対非標的比を決定した。データは、少なくとも３つの独立した実験から組み合わされている。（Ｃ及びＤ）Ｒｉｔ及びＡＴ１０を単独または組み合わせで使用したＢ細胞の全身枯渇。ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５００μｇのＲｉｔ（Ｒｉｔ、ｈＩｇＧ１）、ＡＴ１０（ｍＩｇＧ１）、または２５０μｇの各ｍＡｂの組み合わせのいずれかを、０日目に受けさせ（静脈内）、循環Ｂ細胞の数をフローサイトメトリによって経時的に査定した。（Ｃ）処置前及びｍＡｂ注入後２日目を示す循環性Ｂ細胞を分析する代表的なフローサイトメトリドットプロット。（Ｄ）棒グラフは、ｍＡｂ注入後の指示された日における循環Ｂ細胞数の平均±ＳＥＭ；処置前の循環血液Ｂ細胞に正規化された、２つの独立した実験からの≧６マウス／群（循環Ｂ細胞％として表される）を示す。一元配置分散分析（Ｂ）及び二元配置分散分析（Ｄ）統計検定を行って、処置群を比較した；ｐ値は、示されるように群を比較する（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、及び＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【０２５９】
図１６．ＣＬＬ細胞は、間質細胞との相互作用によりＲｉｔ依存性枯渇から保護される。
（Ａ）６〜１０×１０７個の初代患者ＣＬＬ細胞を、同時に静脈内及び腹腔内に免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。注入４〜５日後、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇで１回もしくは２回用量のＲｉｔ（Ｒｉｔ）またはアイソタイプ対照で処置した。２日後、マウスを屠殺し、脾臓及び腹膜内に残存するＣＬＬ細胞の数をフローサイトメトリによって査定し、その後、アイソタイプ対照を受けた試料に正規化した。このデータは、腹膜内のＣＬＬ細胞はｍＡｂの単回投薬で効率的に欠失した（破線の棒）が、脾臓からのＲｉｔ誘発性枯渇（塗りつぶされた棒）はＲｉｔの２回投薬後でも不完全であったことを示す。この図は、３〜５マウス／群の平均＋ＳＥＭを示す。データは、ｔ検定によって分析した；ｐ値は、示されるように群を比較する（＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【０２６０】
（Ｂ）ヒトＣＬＬ細胞を異種移植されたマウスにおける、Ｒｉｔ、６Ｇ１１、またはその組み合わせの抗腫瘍活性。マウスを、１〜１０ｍｇ／ｋｇのｈＣＤ２０  ｍＡｂ（Ｒｉｔ）、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ（６Ｇ１１）、または両方のいずれかで処置し、脾臓内に残存するＣＬＬ細胞の％を列挙し、アイソタイプ対照での処置後の割合に正規化した。独立した各実験からの平均値が示され、各患者は色分けされている（ｎ＝１１患者）。
【０２６１】
（Ｃ）難治性と以前に指定された患者からのＣＬＬ細胞（ｎ＝４、表Ｓ４参照）を、（Ｂ）にあるように異種移植し、処置し、査定した。データは、対応のある一元配置分散分析検定を使用して分析した。
【０２６２】
図１７．ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は、インビボでマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞のＲｉｔ枯渇を増強する。（Ａ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、１０×１０６個のＪｅｋｏ−１  ＭＣＬ細胞を接種（皮下）し、腫瘍が４×４ｍｍに達したとき、６Ｇ１１、Ｒｉｔ（Ｒｉｔ）、または両方の組み合わせの組み合わせで処置した。マウスを経時的に監視し、末期腫瘍発達の徴候が顕れた直後に屠殺した。データは、独立ｔ検定を使用して分析した（＊ｐ≦０．０５及び＊＊＊ｐ≦０．００１）。（Ｂ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに照射し、次いで６〜７×１０６個の初代ヒトＭＣＬ細胞を接種した。接種４〜５日後、マウスを、１ｍｇ／ｋｇのＲｉｔ（Ｒｉｔ）、６Ｇ１１、または両方のいずれかで処置した。２〜３日後にマウスに第２の注入を受けさせ、２〜３日後に屠殺し、脾臓内に残存するヒトＭＣＬ細胞の％を列挙した。このデータは、両方のｍＡｂ、特にその組み合わせの、初代ヒトＭＣＬ細胞を欠失させる能力を明らかに示す。一元配置分散分析検定を行って、処置群を比較した；ｐ値は、示されるように群を比較する（＊ｐ≦０．０５、＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【０２６３】
（Ｃ及びＤ）インビボで標的細胞を欠失させるＩＩ型ｈＣＤ２０  ｍＡｂ  ＧＡ１０１ｇｌｙの能力を増補する６Ｇ１１の能力。（Ｃ）ＣＦＳＥ＋ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−（標的）、及びｍＦｃγＲＩＩ−／−（非標的）脾細胞を、野生型マウスに養子移入（静脈内）し、ＧＡ１０１ｇｌｙもしくは６Ｇ１１単独または組み合わせ（０．００８ｍｇ／ｋｇ）で処置し、前述同様に血液を査定した。データは、２〜３つの独立した実験から組み合わされている。（Ｄ）ＣＦＳＥ＋ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−（標的）、及びｍＦｃγＲＩＩ−／−（非標的）脾細胞を、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−受容マウスに養子移入（静脈内）し、アイソタイプ対照または６Ｇ１１のいずれか（２０ｍｇ／ｋｇ）、続いてＧＡ１０１ｇｌｙ（０．０４ｍｇ／ｋｇ）で処置し、前述同様に血液を分析した。各ドットは個別のマウスからの結果を表し、平均比は水平線によって示される。（Ｂ、Ｃ、Ｆ、及びＧ）データは、一元配置分散分析検定を使用して分析した（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、及び＊＊＊＊ｐ≦０．０００１）。
【０２６４】
図１８．インビボの６Ｇ１１のＰＫ、ＰＤ、及びＭＡＢＥＬ特性の査定。（Ａ及びＢ）模式図（Ａ）に起訴されるように、同齡かつ同性のｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス（６〜７マウス／群）に、１〜１００ｍｇ／ｋｇの野生型６Ｇ１１  ｍＡｂを注入（静脈内または腹腔内）し、試料採取した。実験の７日目にマウスを屠殺し、器官を毒性の徴候について査定した。（Ｂ）マウスの体重を、ｍＡｂ注入後最大７日目（１６８時間）まで経時的に査定した（０日目の体重の１００％に正規化し、次いで各群について平均＋ＳＥＭとして表した）。（Ｃ及びＤ）模式図（Ｃ）に示されるように、同齡かつ同性のｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇ×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス（６マウス／群）またはｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス（３マウス／群）に、０日目に１０ｍｇ／ｋｇの野生型６Ｇ１１を注入（静脈内）し、続いて３日目、７日目、及び１０日目に同用量のｍＡｂを腹腔内注入した。実験の２４日目にマウスを屠殺し、器官を毒性の徴候について査定した。（Ｄ）マウスの体重を実験全体にわたって測定し、（Ｂ）に詳述されるように査定した。
【０２６５】
（下のパネル）ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス（４マウス／群、平均＋ＳＤ）における、野生型６Ｇ１１（２０ｍｇ／ｋｇ）による循環単球及び好中球の枯渇の査定。
【０２６６】
図１９．インビトロの全血及び希釈血液（２０％  ｖ／ｖ）サイトカイン放出アッセイ。３人の健康な献血者からの（Ａ）新鮮な血液、または（Ｂ）（血清非含有ＣＴＬ培地内で）５倍に希釈したヘパリン処置血液を、３７℃で２４時間、１０μｇ／ｍｌの指示されたｍＡｂで処置し、その後、後続の分析のために上清を採取した。サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γ）を、ＭＳＤによって数量化した。各ドットは、個別のドナーを示す（ｎ＝３）。
【実施例】
【０２６７】
実施例１：実験データ
概要
治療用抗体は、免疫系を働かせることによる新たな作用機構を明らかにし、癌治療を変容させている。残念ながら、治癒は稀にしか起こらず、患者は内因性または獲得抵抗性のいずれかを示す。ここで、免疫細胞の脱感作及び抗体薬に対する腫瘍細胞の抵抗性に関わる受容体であるヒト（ｈ）ＦｃγＲＩＩＢを標的とし、それを遮断する治療可能性を実証する。ＦｃγＲＩＩＢ遮断抗体は、ＣＤ２０特異性抗体リツキシマブの内部移行を防止し、それにより、インビトロかつインビボで、細胞表面到達性及び免疫エフェクター細胞媒介性の抗腫瘍活性を最大にした。完全に同系のｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇマウスモデルにおいて、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂは、リツキシマブＢ細胞枯渇を増強した。抵抗性易発性間質区画からのヒト慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）腫瘍細胞の枯渇を査定するマウスモデルでは、リツキシマブの同時投与は、再発／難治性患者からのＣＬＬ細胞を用いた実験を含め、客観的応答及び完全応答を向上させた。有力候補であるｈＦｃγＲＩＩＢ特異性抗体、６Ｇ１１は、良好なオンターゲットの免疫反応性、好ましい薬物動態を有し、リツキシマブとの組み合わせにおける相加／相乗活性にインビボで有害作用を及ぼさないことが示された。これらのデータは、Ｂ細胞リンパ増殖性障害の免疫療法のための、このｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂのさらなる臨床開発を支持する。
【０２６８】
導入
一般に生物学的療法、具体的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、拡大を続ける治療薬のクラスである１。これらは癌治療に改革をもたらし、いくつかの悪性腫瘍については従来の化学療法と並ぶ標準治療となっている。１０年以上にわたり、治療用ｍＡｂの活性の大部分は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）とのそれらの相互作用によって左右されることが知られている。具体的には、ＩｇＧの治療活性の大部分を説明するのは、ＦｃγＲの相対的な発現レベル、親和性、及び活性である（２、３にて査読）。抗体薬に対する内因性または獲得抵抗性の根底にある機構についてはそれほど知られていない。ＣＤ４７などの「貪食拒否（ｄｏｎ’ｔ−ｅａｔ−ｍｅ）」シグナルは抗体媒介性エフェクター細胞の抗癌活性を制限することが示されているが４、それらの臨床的重要性の根拠は依然として初期段階にある。ますます多くの抗体療法が数種類の癌の処置のために開発されていることに伴い、これらの療法に対する癌細胞の抵抗性を理解し、それらを克服する薬を開発する必要が生じている。
【０２６９】
前臨床５〜８及び臨床的有効性９〜１１に関して、いくつかの抗癌ｍＡｂは抗体依存性の免疫細胞媒介性抗腫瘍機構の働きに依存するため、これらの共通抗体エフェクター機構に対する抵抗性機構を理解し、防止することが特に必要である。
【０２７０】
ヒト（ｈ）ＣＤ２０特異性ｍＡｂリツキシマブは、癌免疫療法に許可された最初のものであり、したがって、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及びマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）を含む、ＣＤ２０を発現するＢ細胞癌を患う患者に広く投与されている（１２にて査読）。興味深いことに、リツキシマブはＦＬ及びＤＬＢＣＬにおいて有効であり、総合的な生存を向上させるが、ＣＬＬ及びＭＣＬでは中程度の応答しか見られない。さらに、リツキシマブ応答性リンパ腫においてさえも、一部の個体は、第１の処置で抵抗性を示すか、またはリツキシマブ含有併用療法に抵抗性であるようになるため、これは、ｍＡｂ抵抗性機構を研究するための理想的なシステムとなる。
【０２７１】
近年の研究は、抑制性Ｆｃγ受容体ＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ／ＣＤ３２Ｂ）が、標的Ｂ細胞からのリツキシマブ内部移行を促進することを実証した３２、３３。Ｂ細胞上で発現される主要なＩｇＧ結合性免疫受容体として、ＦｃγＲＩＩＢは、Ｂ細胞表面からリツキシマブを「吸い込む」ことにより働き、全てのｍＡｂ依存性免疫細胞の抗癌機構を効果的に弱めるようである（１３、及び準備中の論文）。対照的に、近年許可されたオビヌツズマブ（ＧＡ１０１）などのいわゆるＩＩ型抗ＣＤ２０  ｍＡｂは、それらにＣＤ２０を脂質ラフト内に再分配する能力がないことにおそらく起因して、このプロセスに対してさほど感応性がない（Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＦｃγＲＩＩＢ媒介性リツキシマブ内部移行は、臨床応答と相関し、ＣＬＬ＞ＭＣＬ＞ＦＬ及びＤＬＢＣＬの順に従った３２、３３。Ａｂ抵抗性におけるＦｃγＲＩＩＢの役割と一致して、リツキシマブ免疫化学療法で処置されたＭＣＬ患者の遡及的分析は、ＦｃγＲＩＩＢ陽性腫瘍生検と比較してＦｃγＲＩＩＢ陰性腫瘍生検を有する患者の中でより優れた生存を示した１３。同様に、リツキシマブ単独療法を受ける高レベルのＦｃγＲＩＩＢを有するを発現するＦＬ患者では、乏しい応答が観察された（１４、及び提出された論文）。
【０２７２】
以下の実施例は、リツキシマブ内部移行を遮断することができる、ｈＦｃγＲＩＩＢに対する抗体の開発を記載し、それらのインビトロ及びインビボの治療可能性を精査する。ヒト細胞型特異性かつ組織特異性様式でｈＣＤ２０及びｈＦｃγＲＩＩＢを同時発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作製し、概念実証研究においてＰＫ／ＰＤ及び毒性学的パラメータを査定するために使用した。次いで、単独またはリツキシマブもしくは他のＣＤ２０  ｍＡｂと組み合わせて使用したｈＦｃγＲＩＩｂ  ｍＡｂが抵抗性を防止または克服する際の作用を、これら及び他のユニークなマウスモデル（ここでは、ヒトＣＬＬ細胞（患者の表現型、すなわちリツキシマブ応答性または再発／難治性を維持する）が、ヒト間質細胞を含む関連する抵抗性易発性組織区画においてインビボで研究され得る）において査定した。
【０２７３】
材料及び方法
動物及び細胞
ヒト（ｈ）ＣＤ２０  Ｔｇ、γ鎖−／−、及びマウス（ｍ）ＦｃγＲＩＩＢ−／−マウスは以前に説明されており（Ｂｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、遺伝子型はＰＣＲ及び／またはフローサイトメトリによって確認されている。内務省の指針に従って、現地の施設でマウスを繁殖させ飼養した。動物実験は現地の倫理委員会の承認を得、内務省認可ＰＰＬ３０／１２６９及びＭ９０−１１の下で行った。ヒト（ｈ）ＣＤ２０  Ｔｇ、γ鎖−／−、及びＦｃγＲＩＩＢ−／−マウスは以前に説明されており１５、遺伝子型はＰＣＲ及び／またはフローサイトメトリによって確認されている。１０〜１２週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスが、Ｈａｒｌａｎ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（英国オックスフォードシャー州ブラックソーン）から供給され、現地の動物施設で飼養された。ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入し、次いで現地の動物施設で繁殖させ飼養した。初代腫瘍細胞を用いた異種移植研究（以下を参照のこと）のために、６〜８週齢の雌ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスがＴａｃｏｎｉｃ（デンマーク国ボンホルト（Ｂｏｍｈｏｌｔ））から供給され、現地の施設で飼養された。
【０２７４】
臨床試料
臨床試料の使用のための倫理的許可は、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗｅｓｔ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅからのＳｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ  ＮＨＳ  Ｔｒｕｓｔ、またはＥｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｓｋaｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌによって得た。ヘルシンキ宣言に従って、インフォームドコンセントが提供された。試料は、Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙに認可されたＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＳｏｕｔｈａｍｐｔｏｎのＣａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋから譲渡されたか、またはＳｋaｎｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ルンド）の血液学部門及び腫瘍学部門によって得た。ＣＬＬ及びＭＣＬ試料を、単離されている単一細胞懸濁液として査定し、Ｆｉｃｏｌｌ精製し、後続の分析のために凍結保存するか、または異種移植研究において新鮮な状態で使用した。
【０２７５】
細胞培養
細胞培養を、補充ＲＰＭＩ（２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸塩、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン、ならびに１０％のＦＣＳ［Ｍｙｏｃｌｏｎｅ］を含有するＲＰＭＩ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、スコットランド国ペイズリー）中で行った。マウス脾臓Ｂ細胞を、ＭＡＣＳ  Ｂ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、英国）を使用したネガティブセレクションによって精製し、同じ培地内で培養した。細胞株をＥＣＡＣＣから得、抗生物質非含有の補充ＲＰＭＩ培地内に維持した。正常なヒト末梢Ｂ細胞を、ＭＡＣＳ  Ｂ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、英国）を使用したネガティブセレクションによって精製した。
【０２７６】
単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）及び骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の作製
国立血液サービス、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（英国サウサンプトン）、またはハルムスタッドの病院もしくはＳｋaｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（スウェーデン）内の血液センターのいずれかから得た末梢血から、ヒトＭＤＭを分化した。手短に述べると、接着性ＣＤ１４＋単球を、以前に説明されているように、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、１０％のＦＣＳ、及び２５〜１００ｎｇ／ｍＬの低エンドトキシン組み換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国）、またはインハウスで作製）を含有するＲＰＭＩ内で培養した１６。培地の半分を、採取まで２日毎に新鮮なＭ−ＣＳＦと交換した。冷ＰＢＳと一緒の短いインキュベーション後、培養７〜１０日目にＭＤＭを採取した。
【０２７７】
ＢＭＤＭは、以前に報告されているように、マウスの大腿骨及び脛骨の骨髄から単離した細胞から作製した１７。手短に述べると、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、ならびに１ｍＭのピルビン酸塩、ペニシリン、及びストレプトマイシン（各々１００μｇ／ｍｌで）、ならびに２０％のＬ９２９細胞馴化培地（Ｍ−ＣＳＦを含有する）で富化したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国ペイズリー）中で、骨髄細胞を培養した。細胞は、３７℃、５％  ＣＯ２で使用前に１０〜１４日間培養した。ＣＤ１１ｂ及びＦ４／８０発現について、形態学的検査及び／またはフローサイトメトリによってマクロファージ分化を日常的に確認した。
【０２７８】
抗体及び試薬
ｍＡｂは、典型的に、ハイブリドーマまたは安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−ｋ１細胞の培養上清から生成した。ＩｇＧは、タンパク質Ａ上で精製し、電気泳動（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＥＰシステム、Ｂｅｃｋｍａｎ）によって純度を査定し、凝集がないことをＨＰＬＣによって確認した。Ｆ（ａｂ’）２断片は、以前に説明されているように生成した１８。ｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ  ＡＴ１０は、以前に説明された１９。リツキシマブは、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの腫瘍学薬局から寄贈されたか、またはルンド（スウェーデン）の大学病院薬局から購入した。リン酸化ｈＦｃγＲＩＩＢに対する抗体（クローンＥＰ９２６Ｙ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ、米国）、及びαチューブリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）を、免疫ブロッティングに使用した。ＡＦ６４７標識ＩｇＧ１、抗ＣＤ３−ＰＥ、抗ＣＤ１９−ｐｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５、及び抗ＣＤ５６−ＡＦ４８８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＰＢＭＣを標識した。ＰＢＭＣ免疫表現型決定のために、Ｚｅｎｏｎ標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用してＰＥで標識されたＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂを、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、及び抗ＣＤ５６−ＡＰＣと併せて使用した。
【０２７９】
フローサイトメトリ
蛍光抱合ｍＡｂは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃから購入したか、またはインハウスで作製した。フローサイトメトリは以前に説明されているとおりであり２０、試料はＦＡＣＳｃａｎ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、またはＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ上で査定し、データはＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ＰｒｏまたはＦＡＣＳＤｉｖａ（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０２８０】
ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの作製
ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂは、ｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることにより同定した。ｈＦｃγＲＩＩＢ及びｈＦｃγＲＩＩＡの細胞外ドメインを、それぞれ標的及び非標的として使用するためにｍＩｇＧ３−Ｆｃ（ｈＦｃγＲＩＩＡ／Ｂ−Ｆｃ）に融合させ、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内で生成し、続いてタンパク質Ａ上で精製した。３回の連続選択を行った。事前選択は、選択１の前に行い、また、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ上に乗せた、コーティングされたマウスＩｇＧ３κ及びビオチン化ｈＦｃγＲＩＩＡ−Ｆｃに対して行った。結合ファージをトリプシン消化によって溶出し、標準的手順を使用してプレート上で増幅させた２１。選択１の増幅されたファージを、エッチングしたポリスチレンボール（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）にコーティングされたｈＦｃγＲＩＩＢに対する選択のために使用した。選択２のための事前選択は、コーティングされた余剰のストレプトアビジンに対して行った。選択３は、例えば、異なる濃度のビオチン化ｈＦｃγＲＩＩＢを使用して、限界希釈選択として行った。ｈＦｃγＲＩＩＡを全ての選択において競合相手として使用した。選択３からのファージミドをｓｃＦｖ生成フォーマットに変換し、後続のスクリーニングアッセイに使用し、可溶性または細胞結合抗原への特異的結合ならびに免疫複合体結合の抑制を査定した。ｈＦｃγＲＩＩに対する３つの異なる市販の抗体（ＭＣＡ１０７５ＸＺ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＭＡＢ１３３０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡＦ１３３０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））を、組み換え及び細胞表面結合ＦｃγＲＩＩＢの評価に使用した。フローサイトメトリ及び蛍光マイクロアレイ技術（ＦＭＡＴ）による細胞表面結合ＦｃγＲＩＩＢの評価のために、マウス抗ｈＦｃγＲＩＩ−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）も使用した。全ての実験において、対応するアイソタイプ対照を陰性対照として含めた。細胞結合抗原の評価のために、ＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＣＨＯ−ｋ１細胞に、ＦｃγＲＩＩＡ−ｐＩＲＯまたはＦｃγＲＩＩＢ−ｐＩＲＯのいずれかをｐＩＲＥＳｐｕｒｏと一緒に同時トランスフェクトした。１０μｇ／ｍｌのＰｙｒｏｍｙｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、トランスフェクト細胞の選択のために使用した。限界希釈法によって得た個別のクローンを、次いでｈＦｃγＲＩＩ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び対応するアイソタイプ対照で染色し、続いてフローサイトメトリ及びＦＭＡＴ分析により発現が最も高いクローンを選択し、これらをさらなる実験に使用した。ｓｃＦｖの一次スクリーニングのために、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢをトランスフェクトしたＣＨＯ−ｋ１細胞をＦＭＡＴプレートに播種した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ｓｃＦｖ、続いて脱グリコシルマウス抗ＨＩＳ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び脱グリコシル抗マウスＣｙ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加した。８２００検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して染色細胞を検出した。一次スクリーニングからの陽性クローンを、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢ���ランスフェクト細胞に対する結合性についてもう１回再発現及び再試験した。ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合し、かつＩＣ結合を抑制したＳｃＦｖクローンを、標準的手順を使用してＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３にわたって配列決定して、ユニークなクローンを同定した。大腸菌における１０ｍｌの発現調製物からのリゾシーム（ｌｙｓｏｓｙｍｅ）（Ｓｉｇｍａ）を用いた周辺質調製後、ユニークなクローンをＮｉ−ＮＴＡスピンカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。合計で１７個のユニークなクローンを野生型及びＮ２９７Ｑ  ｈＩｇＧ１変異体に変換した。ＶＨ及びＶＬをＰＣＲ増幅し、それぞれ、抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域を含む発現ベクターに挿入した。その後、懸濁液中での成長に適合されたＨＥＫ  ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にＰＥＩを使用してトランスフェクトし、次いで細胞懸濁液を撹拌しながら３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、供給溶液（ＵｌｔｒａＰｅｐＳｏｙ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ）で希釈し、トランスフェクション６日後に採取した。採取した培養培地を滅菌濾過し、AＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステムに接続されたＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が充填されたカラムに適用した。このカラムをローディングバッファーで洗浄し、低ｐＨ緩衝液で溶出させた。溶出した抗体を滅菌濾過し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜４（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）を使用して、適切な製剤緩衝液に透析した。透析後、この材料を滅菌濾過し、４℃で保管した。次いで、精製されたＩｇＧを、トランスフェクトＣＨＯ−ｋ１細胞ならびにＦｃγＲＩＩＢを天然に発現する細胞株及びＰＢＭＣに対する結合性について査定した。
【０２８１】
免疫複合体（ＩＣ）結合の遮断
ＦＩＴＣに特異的なｈＩｇＧ１をＦＩＴＣ−ＢＳＡ−ビオチンまたはＦＩＴＣ−ＢＳＡとモル比１０：１で混合することによって、ＩＣを形成した。この混合物を、使用前に室温で１時間プレインキュベートした。ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合した大腸菌発現ＳｃＦｖクローンの上清（１０μｌ）を、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢを発現するＣＨＯ−ｋ１細胞に添加し、１時間放置して結合させた。ＩＣを３ｎＭで添加した。Ｓｔｒｅｐ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ＡＦ）−６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）を使用し、続いてフローサイトメトリによって結合したＩＣを検出し、遮断をＡＦ６７４シグナルの損失として数量化した。
【０２８２】
抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
食作用アッセイ（ＡＤＣＰ）を、大部分は以前に詳述されているように行った２３。マクロファージへの成熟化後、これらの細胞を、氷冷ＰＢＳまたはＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）もしくはトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）のいずれかを使用して採取し、９６ウェルプレート内に５×１０４細胞／ウェルで再度播種し、３７℃で２〜４時間または一晩インキュベートした。その後、ＣＬＬ細胞を、３７℃で１５分間、５μＭのカルボキシフルオセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。洗浄後、ＣＬＬ細胞を、１０μｇ／ｍｌのオプソニン化ｍＡｂ（複数可）と共に３０分間インキュベートし、その後、５：１の比でマクロファージ培養物に添加した。１時間後、擦過を使用して細胞を収集し、氷上で１５分間、ＡＰＣ標識ＣＤ２０６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはｈＦｃγＲＩＩＩ  ｍＡｂ（３Ｇ８、インハウス）で染色して、ＭＤＭを区別した。収集されるマクロファージを最低５０００個として、細胞を採取し、フローサイトメトリによって分析した。二重陽性で染色された細胞の割合を、食作用可能性の尺度として決定した。食作用の確認を、共焦点顕微鏡法によって日常的に行った２３。
【０２８３】
ＡＤＣＣアッセイは、健康な献血者の末梢血からＭＡＣＳ単離された初代ＣＤ５６＋ｖｅＮＫ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）、またはＧＦＰと一緒にＣＤ１６−１５８Ｖ対立遺伝子を発現するように安定にトランスフェクトされたＮＫ−９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入）のいずれかを使用して、２つの方法で行った２４。初代ＮＫ細胞エフェクターを使用したアッセイでは、標的細胞を、ＮＫ細胞との混合前に、１〜１０μｇ／ｍｌのｍＡｂと共に３０分間プレインキュベートした。これらの細胞を、２０：１のエフェクター：標的細胞比で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１０％のＦＢＳ（全てＧｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０＋ＧｌｕｔａＡＭＸ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３〜４時間インキュベートした。製造業者の指示に従ってＣｅｌｌａＴＯＸキット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）を使用して溶解を測定し、生じた生物発光をＶｉｃｔｏｒ２Ｖルミノメーターで読み取った。ＮＫ細胞株を使用したとき、ＮＫ細胞を１：１〜５：１余剰の標的と共に４時間インキュベートし、溶解はフローサイトメトリによって決定した。手短に述べると、インキュベーションの終わりで、細胞懸濁液を９ｎＭのＳＹＴＯＸ赤色死細胞染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に２０分間暗所でインキュベートし、次いでこれらの細胞をフローサイトメトリによってアッセイした。
【０２８４】
内部移行の抑制がＡＤＣＰ及びＡＤＣＣにどのように影響するかを精査するために、抗体内部移行の時間を取れるように、ＣＬＬ細胞を、エフェクターとの共培養の前に、リツキシマブ単独または６Ｇ１１のアイソタイプ対照もしくはＮ２９７Ｑ変異した変異体との組み合わせと共に３〜４時間インキュベートした。
【０２８５】
内部移行アッセイ及びＡＦ４８８標識
ｍＡｂを、製造業者の指示（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）に従ってＡＦ４８８で標識した。内部移行を決定するために、以前に詳述されているように消光アッセイを行った２３。手短に述べると、細胞試料（２〜４×１０５細胞／ウェル）を所与の時間にわたってＡＦ４８８標識ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、洗浄し、再懸濁させ、４℃で３０分間、抗ＡＦ４８８消光抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）の存在下または非存在下でインキュベートした。次いで試料をフローサイトメトリによって査定した。結果は表面接触可能ｍＡｂの％として表され、これは内部移行されたｍＡｂの量に反比例する。
【０２８６】
ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングを、以前に説明されているように行った２６。手短に述べると、２．５〜５×１０６個の細胞を処置し、洗浄し、プロテアーゼとホスファターゼ阻害薬とのカクテルを含有するＯｎｙｘ緩衝液中で溶解させた。次いで試料をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離させ、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に直ちに移した。膜を５％の脱脂粉乳でブロッキングし、適切に希釈した一次抗体と共にインキュベートし、洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）と共にインキュベートした。バンドは、増強化学発光（ＥＣＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）を用いたインキュベーション及び感光性フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）への露出によって可視化した。製造業者の指示のとおりにＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、濃度測定を行った。
【０２８７】
インビボの免疫療法
養子移入アッセイ：以前に詳述されているように（Ｂｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ｂ）、約２×１０７脾細胞／ｍｌを、それぞれ５μＭ及び０．５μＭのＣＦＳＥで標的または非標的として染色し、洗浄し、１：１比で混合し、受容マウスに静脈内注入した（約５×１０６細胞／マウス）。次いで、１日目及び／または２日目に、マウスに静脈内及び／または腹腔内注入し、１日後に処分して、フローサイトメトリを使用して血液及び脾臓の白血球を検査した。
【０２８８】
養子移入：養子移入アッセイは、大部分は以前に詳述されているように行った２７。手短に述べると、関連するＣ５７ＢＬ／６マウスからの約２×１０７脾細胞／ｍｌを、室温で１０分間、それぞれ５μＭ及び０．５μＭのＣＦＳＥで標的（Ｔ）または非標的（ＮＴ）として染色し、洗浄し、１：１のＮＴ：Ｔ比で混合し、−１日目に受容マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注入した（約５×１０６脾細胞／マウス）。次いで、０日目に、マウスにｍＡｂを静脈内注入し、１日後に処分して、それらの血液及び脾細胞をＮＴ及びＴ細胞について検査した。一部の養子実験では、次いで受容マウスに、０日目及び１日目にｍＡｂを（静脈内経路及び／または腹腔内経路を介して）注入し、１日後に処分して、それらの血液及び脾細胞をＮＴ及びＴ細胞について検査した。フローサイトメトリを使用して、Ｂ細胞集団を、ＦＳＣ−Ｈ及びＳＳＣ−ＨパラメータならびにＣＤ１９陽性によって同定した。
【０２８９】
Ｂ細胞欠失：全身Ｂ細胞枯渇アッセイでは、異なる遺伝子型のマウスに、単一用量のｈＣＤ２０、ｈＦｃγＲＩＩ、または両方のｍＡｂを静脈内で与え（２５０〜５００μｇ）、次いで血液または器官中に残存するＢ細胞の割合を、前述同様にフローサイトメトリまたは免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によって経時的に査定した２７。
【０２９０】
初代ヒト異種移植モデル：ＣＬＬまたは白血病相におけるＭＣＬ患者から血液試料を収集し、収集の２４時間以内に異種移植研究のために使用した。手短に述べると、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳを使用してＰＢＭＣを単離させ、十分な洗浄後、これらの細胞を、３〜５×１０８細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させた。６〜１０×１０７細胞／マウスに対応する２００μｌの細胞懸濁液を静脈内注入する１〜５時間前に、マウスに１Ｇｙを照射した。細胞注入後４〜５日目に、マウスを、１〜１０ｍｇ／ｋｇのｈＣＤ２０  ｍＡｂ、ｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ、または両方のいずれかで処置した。２〜３日後にマウスに第２の注入を受けさせ、２〜３日後に屠殺した。脾臓を分離し、２つに分割し、１つの半割部をＯＣＴ中に入れ、他方を単一細胞懸濁液にした。その後、赤血球を、細胞表面染色ｍＡｂと共に氷上で３０分間インキュベーションする前に、溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して溶解させた。ヒト細胞を、ｈＣＤ５及びｈＣＤ１９染色（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、ｈＣＤ４５陽性細胞及び白血病細胞として同定及び数量化した。
【０２９１】
インビボの白血球枯渇
ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照または野生型６Ｇ１１のいずれかを注入（静脈内）した後、マウス末梢血白血球の全身枯渇をフローサイトメトリによって経時的に査定した。白血球サブセットレベルを投薬前レベルに正規化し、％として表した。
【０２９２】
インビボＰＤ、ＰＫ、及び免疫原性
６Ｇ１１（ＰＫ）及びＭＡＨＡの血清濃度を、ＥＣＬイムノアッセイを使用して決定した。ビオチン化抗６Ｇ１１ポリクローナルヤギ血清及びＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｓｕｌｆｏ  Ｔａｇ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国）を使用して、マウス血清中の６Ｇ１１  ｍＡｂを検出した。６Ｇ１１について作成された既知の標準曲線との比較によって、血清中のｍＡｂレベルの数量化を行った。６Ｇ１１  ＰＫパラメータ（Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ、ＣＬ（Ｆ）、Ｖｚ（Ｆ）、Ｖｓｓ、及びｔ１／２）を、ソフトウェアアプリケーションＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ｖ．６．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ、米国カリフォルニア州）を使用し、ノンコンパートメントモデルを用いて評価した。Ｃｍａｘ及びＴｍａｘは、血清濃度−時間プロファイルから直接得た。
【０２９３】
定性的及び半定量的ＥＣＬイムノアッセイを使用して、マウス血清中で６Ｇ１１を対象とするＭＡＨＡの存在を検出した。ビオチン及びＳｕｌｆｏ−Ｔａｇ標識６Ｇ１１を含むアッセイ緩衝液中で、試料を希釈した。インキュベーション後、事前ブロッキングされているストレプトアビジンプレートに試料を移した。ＭＳＤに基づく技術を使用してシグナルを査定し、発光シグナルは試料中に存在する抗６Ｇ１１のレベルに比例した。親和性精製したヤギ抗６Ｇ１１血清を、陽性対照試料の調製に用いた。
【０２９４】
インビボの薬物動力（ＰＤ）、薬物動態（ＰＫ）、予想される生物学的効果の最小レベル（ｍｉｎｉｍｕｍ  ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｌｅｖｅｌ）（ＭＡＢＥＬ）、及び免疫原性研究
単一用量ＰＤ、ＰＫ、及びＭＡＢＥＬ：同齡かつ同性のｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスに、１、１０、または１００ｍｇ／ｋｇの単一用量の野生型６Ｇ１１を注入し、静脈内及び腹腔内の投与経路の両方を１０ｍｇ／ｋｇ用量において検査した（図１７Ａ）。一連の血液試料を、注入直後から終了の最大１６８時間前に採取した。苦痛、体重減少、毒性、または病態のあらゆる徴候について、動物を期間全体にわたって検査した。ｈＦｃγＲＩＩＢ＋ｖｅＢ細胞の枯渇（ＰＤ）及び他のパラメータ（例えば、６Ｇ１１  ＰＫ及びマウス抗ヒト抗体［ＭＡＨＡ］）を、次のように精査した。
【０２９５】
反復投与免疫原性：図１７Ｃに示されるように、同齡かつ同性のｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス及びｍＦｃγＲＩＩ−／−対照マウスに、１０日の期間にわたって１０ｍｇ／ｋｇの野生型６Ｇ１１を複数回注射した（最初の静脈内投与、続いて３用量を腹腔内に送達した）。投薬前の血液試料を、フローサイトメトリによって循環性Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ｖｅ及びＢ２２０＋ｖｅ）について分析した。上記のように、動物を期間全体にわたって、かつ１４日後に検査した。６Ｇ１１（ＰＫ）及びＭＡＨＡの血清濃度を次のように決定した。
【０２９６】
６Ｇ１１  ＰＫ分析：ＥＣＬイムノアッセイを使用して、マウス血清中の６Ｇ１１濃度を決定した。ヒツジ抗ｈＩｇＧ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）またはヤギ抗ｈλ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）（リツキシマブの存在下における）を９６ウェルＭＳＤプレート上にコーティングし、次いで０．４５％の魚ゼラチンを使用してブロッキングした。その後、結合していない材料を洗い流しながら、ビオチン化抗６Ｇ１１ポリクローナルヤギ血清及びＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｓｕｌｆｏ  Ｔａｇ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＭＳＤ）の添加によって６Ｇ１１  ｍＡｂを検出した。トリポリアミンを含有するＲｅａｄ緩衝液Ｔ（ＭＳＤ）を添加し、電圧を印加すると、６Ｇ１１に関連したｓＴａｇは化学発光シグナルを生成した。６Ｇ１１について作成された既知の標準曲線との比較によって、血清中のｍＡｂレベルの数量化を行った。
【０２９７】
６Ｇ１１  ＰＫを、ソフトウェアアプリケーションＰｈｏｅｎｉｘ（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ｖ．６．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用し、ノンコンパートメントモデルを用いて評価した。Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ、ＣＬ（Ｆ）、Ｖｚ（Ｆ）、Ｖｓｓ、及びｔ１／２を含むＰＫパラメータ推定値を決定した。Ｃｍａｘ及びＴｍａｘは、血清濃度−時間プロファイルから直接得た（表３）。
【０２９８】
インビトロの全血枯渇アッセイ
新鮮なヘパリン処置したヒト血液をＣＴＬ培地（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ドイツ）内で５倍に希釈し、２０μｇ／ｍｌのＲｉｔ及び／または野生型もしくはＮ２９７Ｑ  ６Ｇ１１のいずれかと共に９６ウェルプレート内に播種したか、あるいは無処置（ＮＴ）で２４時間放置し、その後、細胞を採取し、フローサイトメトリのために抗ヒトＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５／ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ１４−ＡＰＣ、及びＣＤ６６ｂ−ＦＩＴＣ  ｍＡｂで染色して、それぞれ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、及び好中球を同定した。ＣＤ３＋細胞に対する白血球サブセットの比を計算した。
【０２９９】
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【０３００】
免疫原性アッセイ（ＭＡＨＡ）：定性的及び半定量的ＥＣＬイムノアッセイを使用して、マウス血清中で野生型ｈＩｇＧ１  ６Ｇ１１を対象とするＭＡＨＡの存在を検出した。ビオチン及びＳｕｌｆｏ−Ｔａｇ標識６Ｇ１１を含むアッセイ緩衝液中で、試料を希釈した。インキュベーション後、事前ブロッキングされているストレプトアビジンプレートに試料を移した。トリポリアミンを含有するＲｅａｄ緩衝液Ｔ（ＭＳＤ）を添加し、ＭＳＤに基づく技術を使用してシグナルを査定し、発光シグナルは試料中に存在する抗６Ｇ１１のレベルに比例した。親和性精製したヤギ抗６Ｇ１１血清を、陽性対照試料の調製に用いた。
【０３０１】
インビトロのサイトカイン放出アッセイ
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、ノルウェー国オスロ）の密度遠心分離法によって、ＰＢＭＣを精製した。高密度（１．５ｍｌ／ウェル）の２４ウェルプレート内の血清非含有ＣＴＬ培地（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ドイツ）中で４８時間、高密度培養２８（１×１０７／ｍｌ）で細胞をプレインキュベートした。細胞をその後洗浄し、血清非含有ＣＴＬ培地（１×１０６／ｍｌ）内に再懸濁させ、０．０２もしくは１μｇ／ｍｌのＯＫＴ３で事前コーティングされた９６ウェルプレートに播種した（１００μｌ／ウェル）か、または未処置（ＮＴ）で放置した。ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ（クローン６Ｇ１１）またはアイソタイプを適合させた対照ｍＡｂ（ｈＩｇＧ１）の野生型及びＮ２９７Ｑ変異体を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。サイトカイン（ＩＬ−６、−１０、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−α）を、製造業者の指示に従ってＭＳＤ  Ｖ−Ｐｌｅｘアッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、米国ロックビル）によって処置したＰＢＭＣ上清中で数量化した。
【０３０２】
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）
ヒト及び他の動物組織のＩＨＣ染色を次のように行った。様々な供給源から器官を採取し、凍結させ、次いで、６Ｇ１１及び７Ｃ０７クローンでの免疫染色の前に切開した。過酸化水素ブロックを用いないＴｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＳＡ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）増幅を使用して、組織反応性を検出した。いかなる非ｈＦｃγＲＩＩＢ特異性結合をも同定するために、抗原陰性組織を含めた。
【０３０３】
統計分析
インビトロで実験群間の差異を比較するために、両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）ｔ検定分析を行った。インビボで実験群間の生存の差異を査定するために、カプランマイヤー曲線を生成し、ログランク検定によって分析した。２つより多くの群を含むインビボ実験では、二元配置分散分析または一元配置分散分析を使用した。インビボでの客観的応答または完全応答の差異については、カイ二乗検定を使用した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓではバージョン５）を使用して行った。
【０３０４】
ｈＦｃγＲＩＩＢ及びｈＣＤ２０を発現するトランスジェニックマウスの作製
ｈＦｃγＲＩＩＢ２導入遺伝子を、異なるエクソン及びイントロンの接合部を標的とするプライマーを使用した重複ＰＣＲ反応によって、ＲａｊｉゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡから構築した。この発現カセットは、ｈＦｃγＲＩＩＢプロモーター２２エクソン１／２、イントロン２〜３、及びエクソン３〜７（２．４ｋｂ）を含み、ＮｏｔＩ部位及びＸｂａＩ部位を介してｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にまずクローン化され、ベクターのＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ配列に連結された。このコンストラクト（ｐｏｌｙＡ配列を含む）は３５１７ｂｐの長さであり、ＮｏｔＩ部位及びＳｍａＩ部位を介してベクターｐＢＣ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にさらにサブクローニングされた。コンストラクトの機能発現は、ＡＴ１０−ＦＩＴＣを使用したフローサイトメトリによって、一過性にトランスフェクトされたＩＩＡ１．６細胞内で確認した。ベクター配列を欠く精製された発現カセットを、ＦＶＢ／Ｎ接合体の雄性前核内に微量注入した。Ｔｇマウスを、ＰＣＲ（耳先から抽出されたゲノムＤＮＡからのｃＤＮＡ断片のエクソン３〜７の増幅）、またはＡＴ１０−ＦＩＴＣを使用した末梢血のフローサイトメトリのいずれかによってスクリーニングした。得られたＴｇ陽性ファウンダーを、１０超の世代のＣ５７ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃマウスに戻し交配した。対応するマウス受容体を欠くｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇマウスを、マウスＦｃγＲＩＩＢ−／−マウスと交雑させることにより生成した。得られたマウスを、次いでｈＣＤ２０  Ｔｇマウスと交雑させて、ｈＣＤ２０×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩＢ−／−後代を作製した。
【０３０５】
表面プラズモン共鳴法
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００分析機（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）を使用して、他で説明されているようにｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの結合親和性を決定した２５。製造業者の指示に従って標準的なアミンカップリングを使用し、ｍＡｂをＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）上に固定化した。可溶性ｈＦｃγＲＩＩＢ（０．１６〜１００ｎＭ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国）を５分間注入し、解離を１０分間監視した。対照フローセルに対する背景結合を監視し、自動的に減算した。ＫＤ値は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアを使用し、１：１結合モデルから計算した。
【０３０６】
インビボの免疫療法
皮下細胞株異種移植腫瘍モデル：ＳＣＩＤマウス（３〜６マウス／群）に、成長因子を低減させたＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）内の５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞またはＲａｊｉ細胞を、０日目に皮下注入し、その後、週に１回、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に治療用ｍＡｂで処置した。ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに、１０×１０６個のＪｅｋｏ−１細胞を０日目に皮下注入した。腫瘍成長を監視し、腫瘍が４×４ｍｍに達したとき、マウスをランダム化し、週に２回１０ｍｇ／ｋｇの治療用ｍＡｂで処置した。キャリパーを使用して腫瘍成長を経時的に監視し、以下の等式を使用して腫瘍サイズを推定した：
［重量＝（長さ×幅２）／２］
【０３０７】
静脈内細胞株異種移植モデル：ＳＣＩＤマウス（６／群）に、２．５×１０６個のＲａｊｉ細胞（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）を、０日目に静脈内注入し、その後、週に１回で最大４回、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に治療用ｍＡｂで処置した。麻痺のあらゆる徴候についてマウスを検査することによって、腫瘍成長を定期的に監視した。
【０３０８】
インビトロのサイトカイン放出アッセイ
新鮮な血液、または（血清非含有ＣＴＬ培地内で）５倍に希釈したヘパリン処置血液を、９６ウェルプレート（Ｕ底）内で培養し、３７℃で２４時間、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂで処置し、その後、後続の分析のために上清を採取した。サイトカイン（ＩＬ−１β、−２、−４、−６、−１０、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−α）を、製造業者の指示に従ってＭＳＤ  Ｖ−Ｐｌｅｘアッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、米国ロックビル）によって、処置した全血または希釈血液の上清中で数量化した。
【０３０９】
蛍光顕微法
切開のための組織を、ドライアイスの土台上のイソペンタン中に置かれたＯＣＴ培地（ＲＡ  Ｌａｍｂ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ）内で凍結させた。１０μｍの凍結切片をアセトン中で固定し、５％の正常なヤギ血清でブロッキングし、ｈＦｃγＲＩＩ／ＣＤ３２に対するｍＡｂ（クローンＡＴ１０、インハウスで作製）、ｍＦｃγＲＩＩ／ＣＤ３２（クローンＡＴ１３０−２、インハウスで作製２９）Ｂ細胞（ラット抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、英国）、濾胞性樹状細胞（ラット抗マウスＦＤＣ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、英国）、及びマクロファージ（ラット抗マウスＦ４／８０；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国）、続いてＤｙＬｉｇｈｔ５９４抱合ヤギ抗ｈＩｇＧ（Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）、及びＡＦ４８８抱合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）と共にインキュベートした。切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国）内に載置し、Ｐｌａｎ  Ａｃｈｒｏｍａｔ  １０×０．２５対物レンズを使用し、Ｃｅｌｌ  Ｂソフトウェア下で動作するＣＣ１２カラーカメラを備えたＣＫＸ４１倒立顕微鏡反射蛍光システム（全てＯｌｙｍｐｕｓ、英国）を使用して、画像を収集した。ＲＧＢ画像ファイル（ＴＩＦＦ）をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（ＣＳ６）に移し、赤／緑の画像オーバーレイをコントラスト拡張して、グレースケール全体を使用した。
【０３１０】
好中球染色プロトコル
血液試料または脾臓を、同齡かつ同性のＣ５７ＢＬ／６マウス、ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウス、及びｍＦｃγＲＩＩ−／−×ｈＦｃγＲＩＩｂ＋／−マウスから採取した。脾臓を、１００μｍの細胞ストレーナー（ＢＤ）を通過させることによって均質化させ、次いで完全ＲＰＭＩ内で洗浄し、５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、１管当たり２００μｌの細胞懸濁液をフローサイトメトリに使用した。１０μｇ／ｍｌの抗マウスＦｃγＲＩＩ（ＡＴ１３０−２  Ｆ（ａｂ’）２−ＦＩＴＣ）、抗ヒトＦｃγＲＩＩ（ＡＴ１０  Ｆ（ａｂ’）２−ＦＩＴＣ）、または無関係の対照（３Ｇ８  Ｆ（ａｂ’）２−ＦＩＴＣ）（全てインハウスで生成及び標識した）、加えて以下：抗マウスＣＤ１９（１Ｄ３−ＰＥ、インハウス）、抗マウスＮＫ１．１（ＰＫ１３６−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７）、抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、抗マウスＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８−ＰＥ−Ｃｙ７）、抗マウスＬｙ−６−Ｇ（１Ａ８−ＡＰＣ−Ｃｙ７）、抗マウスＬｙ−６Ｃ（ＨＫ１．４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；別段の記載がない限り全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で、試料を染色した。細胞を４℃で３０分間染色し、次いで１ｍｌの赤血球溶解緩衝液を添加し（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国）、細胞を遠心分離し、次いで１回洗浄し、ＦＡＣｓ  Ｃａｎｔｏで分析した。デブリ及びＣＤ１１ｃｈｉｇｈ細胞を除外し、好中球はＣＤ１９−ＣＤ１１ｂ＋ＮＫ１．１−Ｌｙ−６Ｇ＋であった。
【０３１１】
結果
ｈＦｃγＲＩＩＢのＦｃ結合ドメインに特異的なｍＡｂの作製及び特徴付け。
Ｉ型ＣＤ２０  ｍＡｂであるリツキシマブに対する抵抗性は、一部のリンパ腫患者では、部分的には腫瘍からのその内部移行によって説明され得ること、また、標的Ｂ細胞表面上の抑制性ＦｃγＲＩＩＢ／ＣＤ３２Ｂの発現がこのプロセスを促進することが、近年報告されている１３、２３。この仮説と一致して、ＡＴ１０とリツキシマブとのインビボの同時投与は、ｈＣＤ２０及びｈＦｃγＲＩＩＢが腫瘍上で同時発現される２つの異なるリンパ腫異種移植モデルにおいて相加／相乗的な抗腫瘍応答をもたらした（図７）。
【０３１２】
ｈＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインは、重要な賦活性ＦｃγＲであるｈＦｃγＲＩＩＡの細胞外ドメインと約９８％相同性である（図８Ａ）。これら２つの受容体は対立する機能を媒介するため、治療用抗体がｈＦｃγＲＩＩＢに対して高度に特異性であることが非常に重要である。ＡＴ１０は、ｈＦｃγＲＩＩＡとｈＦｃγＲＩＩＢとの両方に同様の親和性で結合するため、この基準を満たさない１９。さらに、これはマウス起源（ＩｇＧ１）であり、その翻訳可能性は限定される。ヒトにおける治療可能性を有するｈＦｃγＲＩＩＢ特異性抗体を作製するために、本発明者ら専有のヒト抗体ファージディスプレイライブラリｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）を使用し３０、ｈＦｃγＲＩＩＢヘの結合に関して、またｈＦｃγＲＩＩＡへの結合に対してパニングして（またはその逆も同様である）、単一特異性試薬を作製した（図１）。結果として生じたｍＡｂを、ＦｃγＲＩＩＢに選択的に結合するそれらの能力（図１Ａ）、及びｈＦｃγＲＩＩＡではなくｈＦｃγＲＩＩＢに対する免疫複合体（ＩＣ）結合を遮断するそれらの能力（図１Ｂ）について査定した。個別のヒトＰＢＭＣサブセット（好中球、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞）、単離したＢ細胞（図１Ｃ及びＤ、図８Ｂ〜Ｄ）、悪性ヒトＢ細胞株、またはＴｇマウス（ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−、データは示されていない）からの脾細胞への結合に関するスクリーニングは、ｈＦｃγＲＩＩＢまたはｈＦｃγＲＩＩＡのいずれかに対する抗体の高い特異性を実証した。これらのｍＡｂのｈＦｃγＲＩＩＢに対する相対的親和性をＥＬＩＳＡによって決定し（表１）、サブセットを表面プラズモン共鳴法によって査定し、ｈＦｃγＲＩＩＢへの結合に関して２×１０−６〜２×１０−８Ｍの範囲内のＫＤが示された（図１Ｅ及び表２）。上記の所見に基づいて、１４個の高度に特異的なｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂを同定し、検証した。各ｍＡｂに関する優秀な特異性は同定されていないが、これらは全てＩＣ結合を遮断し、ＦｃγＲＩＩＡと交差反応せず、ＦｃγＲＩＩＡとＢとで異なる高濃度の残基が発生するＩｇＧ結合溝周囲にこれらが結合することが強く示される（図７及び８）。
【０３１３】
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【０３１４】
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【０３１５】
拮抗性ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂはリツキシマブの内部移行を遮断する
リツキシマブと一緒のｈＦｃγＲＩＩＢ＋ｖｅＢ細胞のインキュベーションは、ｈＦｃγＲＩＩＢを介する抑制性シグナル伝達を誘発し、ｈＦｃγＲＩＩＢ細胞質ＩＴＩＭモチーフのリン酸化に関連する３１〜３３。本発明者らは、この受容体の免疫抑制機能に基づいて、ＣＤ２０内部移行及びｈＦｃγＲＩＩＢ活性化／リン酸化の遮断の両方を防止することができるｍＡｂが、治療学的関心の対象となるであろうと推測した。したがって、１４個のｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂを、非ホジキンリンパ腫Ｒａｊｉ  Ｂ細胞内のＦｃγＲＩＩＢリン酸化を制御するそれらの能力についてスクリーニングした。可変ドメイン依存性様式で抗体媒介性作用を査定するために、定常Ｆｃドメインを介してＦｃγＲに結合することができないＮ２９７Ｑ変異を定常領域内に保有する抗体変異体を設計した（以下を参照のこと）３４。ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂを用いたＲａｊｉ細胞の短期処置（３０分間）は、２つの異なる応答、すなわち、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ＩＴＩＭの高レベルのリン酸化を誘発したｍＡｂ（例えば、クローン５Ｃ０４及び６Ｇ０８）、ならびに、クローン６Ｇ１１及び７Ｃ０７といった、作用をほとんどまたは全く及ぼさなかったｍＡｂをもたらした（図２Ａ）。同様の観察が、初代ＣＬＬ細胞、扁桃、及び単球で見られた（図９Ｂ及び９Ｃ、データは示されていない）。これらのデータは、ｈＦｃγＲＩＩＢを活性化させることなくこの受容体に対する免疫複合体の結合を遮断することができるｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂが、成功裏に作製されたことを実証する。
【０３１６】
次に、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂがｈＦｃγＲＩＩＢとリツキシマブとの間の相互作用を遮断し、かつ結果として生じるリツキシマブの内部移行を防止することができるかどうかを精査した。６Ｇ０８などの一部のｍＡｂは作動性のままであり、受容体のリン酸化を刺激した。対照的に、ここで拮抗性と称される２つのｍＡｂ（６Ｇ１１及び７Ｃ０７）は、ＡＴ１０によく似て、Ｒａｊｉ細胞及び初代ＣＬＬ細胞上にリツキシマブが結合した後に誘発されるＦｃγＲＩＩＢのリン酸化をほぼ完全に防止することができた（図２Ｂ、データは示されていない）３２。フローサイトメトリ消光アッセイ２３を使用して、同じｍＡｂがｈＦｃγＲＩＩＢトランスフェクトＲａｍｏｓ細胞の表面からのリツキシマブの内部移行を効率的に遮断することができたと決定した（図２Ｃ）。注目すべきことに、これらのｍＡｂの存在下における内部移行の欠如は、ＩＩ型ｍＡｂ、トシツモマブ、及びｈＦｃγＲＩＩＢを欠くＲａｍｏｓ細胞で見られるものと同様であった（図２Ｃ）。野生型及びＮ２９７Ｑ変異体の両方がこのアッセイにおいて同等の活性を有し、抗体可変ドメイン（Ｆｖ）依存性作用（図９）が示され、拮抗性作用が野生型ｈＩｇＧ１フォーマット内で保持されたことが実証された。後続の分析は、リツキシマブ内部移行を遮断するｍＡｂパネルの能力が、ｈＦｃγＲＩＩＢに対するそれらの相対的親和性に直接関連することを明らかにし（Ｒ２＝０．７８）（図２Ｄ）、これは、リツキシマブ刺激後のｈＦｃγＲＩＩＢのリン酸化を遮断するそれらの相対階級的能力と相関した（Ｒ２＝０．７９）（図２Ｅ）。このように、高親和性拮抗性ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂは、標的細胞表面からのリツキシマブのｈＦｃγＲＩＩＢ媒介性除去を防止した。
【０３１７】
拮抗性ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂは、Ｆｃ：ＦｃγＲ依存性細胞傷害を誘発し、リツキシマブの内部移行を遮断し、それにより強力なインビトロの抗腫瘍活性を誘起する
一部のｍＡｂの拮抗性作用が、賦活性ＦｃγＲ発現免疫細胞と生産的に結合する野生型ｈＩｇＧ１フォーマット内で保持されたという所見は、これらのｍＡｂが内因性Ｆｃ：ＦｃγＲ依存性抗腫瘍活性を有し得ることを示唆した。したがって、そのような作用について本発明者らのｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂをスクリーニングした。初代ＮＫ細胞と一緒のオプソニン化標的Ｒａｊｉ細胞のインキュベーションは、拮抗性ｍＡｂ  ７Ｃ０７及び６Ｇ１１が、リツキシマブ自体から誘起されるものよりも高い、最も高い細胞傷害活性も有したことを実証した（図１０Ａ及びＢ）。これら２つのクローンが、リツキシマブ内部移行の遮断及びＡＤＣＣの誘起において最も高い親和性、最も強力な活性を有したことを証明したので、次に、ＦｃγＲを発現することが知られるヒト及び動物組織のパネルに対するそれらの結合性を査定した。クローン７Ｃ０７及び６Ｇ１１の両方が、ヒト脾臓及び扁桃内のリンパ球を特異的に染色した（図３Ａ、データは示されていない）。７Ｃ０７と６Ｇ１１のいずれも、カニクイザル、ラット、ウサギ、またはマウスにおけるリンパ球と反応せず、これらのｍＡｂが他の種におけるＦｃγＲＩＩＢと交差反応性でないことが示された（図３Ａ、データは示されていない）。しかしながら、６Ｇ１１ではなくクローン７Ｃ０７は、ヒト及び他の種からの脾臓の類洞及びリンパ節組織を同様に染色し、望まれない交差反応性が示された（図３Ａ及び図１１Ａ）。野生型及びＮ２９７Ｑ  ｍＡｂは同等に染色することが示され（図１１Ｂ）、他のヒト組織上でさらなる予期しない交差反応性は観察されなかった（図１１Ｃ）。この反応性プロファイルに基づいて、クローン６Ｇ１１を本発明者らの有力臨床候補として選択した。
【０３１８】
初代患者ＣＬＬ試料の広範なパネルを使用して、６Ｇ１１の内因性細胞傷害活性をＡＤＣＣ、ＰＣＤ、及びＡＤＣＰアッセイにおいてさらに調査した。リツキシマブで観察されたレベルよりも著しく高いレベルの実質的な活性が、各アッセイにおいて実証された（図３Ｂ〜Ｄ）。さらに、ｈＦｃγＲＩＩＩＡの高親和性変異体または低親和性変異体のいずれか（それぞれ１５８  ＶまたはＦ）を発現するＮＫ細胞エフェクターを用いたアッセイにおいて、６Ｇ１１は、細胞死の誘発においてリツキシマブと比較してより有効であった（図３Ｅ）。
【０３１９】
その後、ＣＬＬ細胞の表面からのリツキシマブの内部移行を防止する６Ｇ１１の能力を検査した。６Ｇ１１（それ自体は内因性Ｆｃ依存性エフェクター活性を欠く；図１２）の野生型及びＮ２９７Ｑ変異体の両方が、リツキシマブの内部移行を著しく防止することができた（図３Ｆ）。興味深いことに、ＣＤ２０とは異なり、また以前に報告されているように１７、野生型またはＮ２９７Ｑ  ｈＩｇＧ１  ｍＡｂのいずれか（６Ｇ１１またはＡＴ１０）によるＣＬＬ細胞の表面上のｈＦｃγＲＩＩＢの結合は、直接的または間接的に査定されたときに、高レベルのｈＦｃγＲＩＩＢ内部移行をもたらさなかった（図３Ｇならびに図１３Ａ及びＢ）。
【０３２０】
６Ｇ１１がリツキシマブの内部移行を防止することによってその細胞傷害活性を増進することもできるかどうかに取り組むために、リツキシマブを含む初代ＣＬＬ細胞と６Ｇ１１のＮ２９７Ｑ変異体とを共インキュベート（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）し、ＭＤＭ  ＡＤＣＰ及びＮＫ細胞ＡＤＣＣを査定した。際立ったことに、Ｎ２９７Ｑ  ６Ｇ１１は、リツキシマブ単独と比較して、リツキシマブオプソニン化ＣＬＬ細胞を貪食するＭＤＭの能力を実質的に促進することが示された（図３Ｈ及びＩ）。活性の同様の上昇が、ＮＫ細胞を用いたＡＤＣＣアッセイで見られた（図３Ｊ）。ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＢを発現せず、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂにより誘起されるあらゆる増補が、リツキシマブ内部移行の抑制に起因する標的細胞に対する作用から生じることを裏付ける。これらのデータは、Ｂ細胞標的の表面上のｈＦｃγＲＩＩＢの遮断が、ｍＡｂ：Ａｇ：ｈＦｃγＲＩＩＢ複合体の内部移行を抑制し、エフェクター細胞による欠失の標的となるそれらの能力を増補することを裏付ける。
【０３２１】
まとめてみると、これらの観察は、６Ｇ１１が、内因性細胞傷害活性と、細胞表面からのその除去の防止によるリツキシマブ活性の増強との二重機構によって抗腫瘍活性を誘起することができることを示唆した。
【０３２２】
６Ｇ１１は、免疫適格性のｈＣＤ２０＋ｖｅｈＦｃγＲＩＩｂ＋ｖｅＴｇマウスにおいて内因性Ｂ細胞枯渇活性を有し、リツキシマブを用いた枯渇を増強する
上で考察されたように、ｈＦｃγＲＩＩＢは、標的Ｂ細胞上（ここでそれは、細胞表面からのリツキシマブの望ましくない除去を媒介する）、及びマクロファージなどの重要な免疫エフェクター細胞上（ここでそれは、抗癌抗体応答を弱めるように機能する）の両方で発現される５〜７、３５。ｈＦｃγＲＩＩＢを全身的に標的とすることが関連性のあるｈＦｃγＲＩＩＢ発現細胞型に及ぼす影響を理解するために、ｈＦｃγＲＩＩＢプロモーターの制御下でｈＦｃγＲＩＩＢ遺伝子を発現するマウスを作製した（図１４Ａ及びＢ）。ＴｇマウスにおけるｈＦｃγＲＩＩＢの発現及び分配は、ｍＦｃγＲＩＩとは異なり、好中球上ではなくＢリンパ球、ＢＭＤＭ、及び単球上で強力に発現される、ヒト組織におけるものに酷似する（図１４Ｃ〜Ｆ、示されていない）。さらに、同等の発現がｍＦｃγＲＩＩ−／−背景内で維持され、内在性マウス抑制性ＦｃγＲからの合併症の非存在下でｈＦｃγＲＩＩＢの作用を研究することが可能であった。重要なことに、６Ｇ１１の拮抗性活性がこれらのマウスにおいて保持された（図１４（５／５）。加えて、内皮細胞上のｈＦｃγＲＩＩＢ発現は、野生型マウスにおける発現よりも低く、ヒトにおける発現により類似した（図１４（５／５）。
【０３２３】
インビボの６Ｇ１１処置の安全性を確認するため、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスのコホートを１、１０、または１００ｍｇ／ｋｇの６Ｇ１１で処置する用量漸増研究を行った（図１８）。処置されたマウスのいずれも、急性作用、苦痛、または体重減少などの有害事象を被らなかった（図１８）。７日目の組織検査は、器官（腎臓、脳、脾臓、肝臓、肺）内のいかなる全毒性も示さなかった。ｈＦｃγＲＩＩＢ＋Ｂ細胞の実質的枯渇が、１０及び１００ｍｇ／ｋｇ群において同等の活性と共に、１ｍｇ／ｋｇ超の用量において血液（図６Ａ）及び脾臓（図６Ｂ）の両方で観察された。６Ｇ１１は、マウスの血清中で容易に検出されるが本質的に免疫原性である完全ヒトｍＡｂであり、そのため、その半減期及びマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）応答の根拠を同時に査定した。１ｍｇ／ｋｇ超の用量において、ＰＫプロファイルに影響する標的媒介性クリアランスが克服され、１０及び１００ｍｇ／ｋｇ群における標的結合の作用はほとんどまたは全くなかった（図６Ｃ）。しかしながら、７日以内に、急速なｍＡｂクリアランスをもたらす著しいＭＡＨＡが観察された（図６Ｄ）。著しいＭＡＨＡの出現前の時間点に基づいて、ｍＡｂ半減期は、１０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量については２〜４日間の領域内であると推定する（図６Ｃ、Ｄ、及び表７）。
【０３２４】
６Ｇ１１が臨床的に送達され得る方法をより良好に模倣するために、反復投薬研究も行い、２４日の期間全体にわたって４回それを投与し（図１８）、前述同様にマウスを検査した。循環Ｂ細胞の枯渇がｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−において観察されたが、複数用量（１０ｍｇ／ｋｇ）の６Ｇ１１を注入したｍＦｃγＲＩＩ−／−対照群では観察されなかった（図６Ｅ）。同様に、マウスは体重減少（図１８）または有害事象を被らず、全毒性の徴候は観察されなかった（データは示されていない）。前述同様に、実質的なＭＡＨＡ応答がｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスにおいて１週間以内に観察され、血清からの６Ｇ１１の急速な枯渇に寄与した（図６Ｆ）。対照的に、ＭＡＨＡはｍＦｃγＲＩＩ−／−対照群では検出されず、異種ｍＡｂ及び表面抗原への共依存がＭＡＨＡ誘発に必要とされることが示された（図６Ｆ）。
【０３２５】
Ｂ細胞以外のｈＦｃγＲＩＩＢ＋細胞が６Ｇ１１処置後に検出され得るかどうかを調査するために、ヒト血液を用いた全血枯渇アッセイ（図６（２／２））及びｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇマウスを用いたインビボ実験（図Ｓ４Ｎ）を行った。単球または好中球ではなくＢ細胞が、Ｎ２９７Ｑ  ６Ｇ１１ではなく野生型６Ｇ１１  ＩｇＧ１によって欠失された。単球及び好中球の枯渇の同様の欠如が、リツキシマブとの組み合わせで見られた（図６（２／２）。次に、高密度培養（Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）によって刺激に感応性にされたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する６Ｇ１１の潜在的影響を査定するための、かつＣＲＳを誘起するものとして以前に強調されたいくつかのｍＡｂ特異性（ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＣＤ５２）の付加後に実質的なレベルのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び／またはＩＬ−８を検出することができる、近年開発されたインビトロのサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）アッセイ（ＣＲＡ）（Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）を使用した。４８時間にわたる野生型またはＮ２９７Ｑ  ６Ｇ１１の適用は、５００倍低い用量のＣＤ３  ｍＡｂを用いた場合とは異なり、実質的なサイトカイン放出をもたらさなかった（図６）。全血または希釈血液ＣＲＡを使用して同様の結果を得た（図１９）。
【０３２６】
集合的に、これらのデータは、有害作用を示さず、治療上関連性のある６Ｇ１１  ｍＡｂに関するＰＫプロファイルを示し、有効性研究を支持した。
【０３２７】
６Ｇ１１は、免疫適格性マウスにおいて内因性活性を有し、リツキシマブを用いた枯渇を増強する
標的ｈＦｃγＲＩＩＢ単独またはリツキシマブとの組み合わせの枯渇可能性を、ｈＩｇＧ１  ６Ｇ１１及びｍＩｇＧ１  ＡＴ１０の両方を使用して査定した。まず、ＣＦＳＥ＋ｖｅｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−脾細胞野生型受容者に注入し、その結果、６Ｇ１１（図４Ａ及びＢ）またはＡＴ１０（図１５Ａ）で処置した短期養子移入アッセイ２３では、移植細胞は、血液循環及び脾臓から効率的に枯渇されたことが観察された。興味深いことに、１μｇと低いｍＡｂの投与は、約５０％のＢ細胞枯渇を誘起するのに十分であった。Ｆ（ａｂ’）２断片及びＮ２９７Ｑ変異体で活性が失われ、またｈＦｃγＲＩＩＢ＋ｖｅ標的が賦活性ＦｃγＲを欠くγ鎖−／−マウスにおいて欠失しなかったため、枯渇は全面的にＦｃ：賦活性ＦｃγＲ相互作用に依存した（図４Ａ及びＢならびに図１５Ａ）。これらのデータは、以前に示されているように、拮抗性ｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂが、免疫エフェクター細胞上の賦活性ＦｃγＲとの相互作用に依存して、標的細胞をインビボで欠失させることができることを裏付ける３６。
【０３２８】
本発明者らの分析をリツキシマブを用いた併用療法に広げるため、交雑によりｈＣＤ２０＋／−１５，３７×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスを作製した。リツキシマブと６Ｇ１１（またはＡＴ１０）との組み合わせは、標的を野生型受容者に移植する短期アッセイにおけるいずれのｍＡｂ単独と比較しても、ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−Ｂ細胞のより高い枯渇をもたらした（それぞれ図４Ｃ及び図１５Ｂ）。同様に、養子移入ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−Ｂ細胞は、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−受容マウス（エフェクター細胞上でもｈＦｃγＲＩＩＢを発現する）においてリツキシマブを６Ｇ１１と組み合わせることによってより著しく枯渇された（図４Ｄ）。
【０３２９】
次に、この組み合わせが循環性Ｂ細胞に及ぼす作用を、ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスモデルにおいて精査した。前述同様に、この組み合わせは、単独療法と比較して著しく高い循環Ｂ細胞の枯渇をもたらし（図４Ｅならびに図１５Ｃ及びＤ）、ｈＦｃγＲＩＩＢが標的及びエフェクター細胞の両方で発現される完全に同系のシステムにおいて、この能力を初めて実証した。リツキシマブと野生型ｈＩｇＧ１  ６Ｇ１１（またはＡＴ１０）とを組み合わせることの作用は、２倍高い用量で単独で適用された個別のｍＡｂについて観察された応答から判断して、相加活性に関して予想されたものよりも高かった（それぞれ図４（２／２）及び１５）。
【０３３０】
６Ｇ１１の内因性（Ｂ細胞枯渇）作用と外因性（リツキシマブ後押し）作用とのどちらがこの活性に関してより重要であったかを査定するために、Ｎ２９７Ｑ  ６Ｇ１１をｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスにおいて使用し、Ｎ２９７Ｑ  ６Ｇ１１単独は欠失において不活性であるが、Ｂ細胞のリツキシマブ欠失を著しく後押しすることを示す（図４（２／２）。同様の結果がｍＩｇＧ１  ６Ｇ１１で見られた。ＡＴ１０（図１５）で予想かつ観察されたように、ｍＩｇＧ１  ６Ｇ１１は、ｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスにおいて乏しい単剤枯渇活性を示したが（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、Ｎ２９７Ｑ  ｈＩｇＧ１  ６Ｇ１１と同様に、マウスＩｇＧ２ａバージョンのリツキシマブを、Ｂ細胞を枯渇させるその能力において著しく後押しした（図１５）。さらに、そのマウスＦｃのために、それはＭＡＨＡによって能動的に清掃されず、併用療法のより長期の査定が容易になる。これらのデータは、リツキシマブのインビボの枯渇活性を増進するためにｈＦｃγＲＩＩＢ機能を拮抗することの長期の有益作用を示す。
【０３３１】
まとめると、これらの研究は、内部移行の防止によるリツキシマブ抗腫瘍活性の増強と連関した内因性抗腫瘍機能を伴う、６Ｇ１１のインビボの二重作用機構を裏付けた。
【０３３２】
６Ｇ１１は、インビボでＢ細胞のＩＩ型ｈＣＤ２０  ｍＡｂ媒介性枯渇を増進する
６Ｇ１１がＩＩ型ｈＣＤ２０  ｍＡｂ（これは、Ｉ型ＣＤ２０  ｍＡｂと同じ程度まで内部移行せず１３、２３、３３、ＣＬＬにおける使用に近年認可された）との組み合わせにおいても効果的であったかどうかを精査するために、養子移入モデルにおける実験を行った。リツキシマブについては、ＧＡ１０１ｇｌｙ（グリコシル化オビヌツズマブ）及び６Ｇ１１単独療法の両方が、脾性及び循環性の標的ＣＦＳＥ＋ｖｅｈＣＤ２０＋／−×ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−Ｂ細胞の中程度の枯渇をもたらしたが、一方で、併用療法は、野生型及びｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−受容マウスにおける脾性及び循環性の標的細胞の両方の枯渇を著しく増進した（図４Ｆ及びＧ、データは示されていない）。これらのデータは、６Ｇ１１が、直接Ｂ細胞を標的とする他のｍＡｂと組み合わせても効果的であることを示唆する。
【０３３３】
６Ｇ１１は、インビボの初代ＣＬＬ細胞のリツキシマブ媒介性枯渇を後押しし、客観的及び完全な抗腫瘍応答を向上させる
リツキシマブは、いくつかのＢ細胞悪性腫瘍の処置を改善するために成功裏に用いられてきたが、ＣＬＬの制御における活性は限定されている。血液中の初期の末梢性枯渇にもかかわらず、二次リンパ組織及びいわゆる増殖中心からの効果的な腫瘍減量はそれほど成功しない。したがって、ＣＬＬ細胞に対する６Ｇ１１の抗腫瘍活性をより良好に査定するために、初代ヒトＣＬＬ細胞が二次リンパ器官（脾臓及び骨髄）に帰巣し、支持性のヒトＴ細胞と並んでクラスター状に増殖し、それによりヒト疾患における状況を綿密に模倣する、動物モデルを開発した（図５Ａ及びＢ）。このモデルにおいて、リツキシマブは腹膜腔内に存在するＣＬＬ細胞を枯渇させるのに効果的であるが、脾臓内に存在する増殖中心内のＣＬＬ細胞を枯渇させるのには完全に効果的ではない（図１６）。
【０３３４】
初代ＣＬＬ細胞を移植したマウスをリツキシマブまたは６Ｇ１１単独のいずれかで処置したとき、アイソタイプ対照ｍＡｂで処置した動物と比較して、腫瘍体積の著しい低減が脾臓内で見られた（図５Ｃ）。リツキシマブと６Ｇ１１との組み合わせでの処置は、さらにより高い枯渇速度をもたらした（図５Ｃ）。さらに、これらのデータを応答速度の基準に従って査定したとき、コンビナトリアル療法後の部分的レスポンダー及び完全レスポンダーの数は、アイソタイプ対照処置マウスまたは単独療法よりも著しく高かった（それぞれ図５Ｄ及び５Ｅ）。
【０３３５】
さらに、併用療法後の客観的レスポンダー（ＯＲ、脾臓内のＣＬＬ細胞の７５％超の低減として定義される）及び完全レスポンダー（ＣＲ、脾臓内のＣＬＬ細胞が０．１％未満として定義される）の数は、アイソタイプ対照処置マウスまたは単独療法よりも著しく高かった（図５及び５（２／２）、ならびに表５）。これらのデータは、インビボの初代ＣＬＬ細胞に対するリツキシマブ／６Ｇ１１併用療法の上昇した有効性を実証する。
【０３３６】
次いで、リツキシマブ、オファツムマブ（ｈＣＤ２０  ｍＡｂ）、及び／またはアレムツズマブ（ｈＣＤ５２  ｍＡｂ）不応性患者から単離したＣＬＬ細胞を移植したマウスを処置する、６Ｇ１１の能力を検査した（表４）。この異種移植マウスは、単独療法としての６Ｇ１１もしくはリツキシマブ、または組み合わせた２つのｍＡｂのいずれかで処置した。予想通り、リツキシマブ単独での処置は非効率的であり（図５及び５（２／２）ならびに表８）、マウスの９５％超がＯＲをもたらせなかった。対照的に、６Ｇ１１単独は、著しいＣＬＬ細胞の枯渇を示したが、ＯＲを向上させなかった（図５及び５（２／２）ならびに表５）。しかしながら、注目すべきことに、リツキシマブと６Ｇ１１との同時投与は、２５％超のＯＲ（表５）と共に強力な枯渇（図５及び５（２／２）、ならびに表８）をもたらした。これらのデータは、６Ｇ１１が、レスポンダー患者におけるリツキシマブの活性を後押しすることに加えて、処置不応性ＣＬＬ細胞に対して活性であり得ることを示唆する。
【０３３７】
リツキシマブ及び６Ｇ１１を用いた併用療法はインビボの難治性ＣＬＬ細胞を克服する
その後、リツキシマブの存在下または非存在下で、リツキシマブ及び／またはアレムツズマブ（ｈＣＤ５２  ｍＡｂ）不応性患者から単離したＣＬＬ細胞を移植したマウスを処置する、６Ｇ１１の能力を検査した（表４）。予想通り、リツキシマブ単独での細胞の枯渇は不十分であったが、これは６Ｇ１１の存在下で著しく向上した（図５Ｆ）。さらに、併用療法を受けたより多くの難治性ＣＬＬ細胞移植マウスが、この組み合わせとの部分的応答を達成した（図５Ｇ）。これらのデータは、６Ｇ１１がリツキシマブ感応性患者群及び不応性患者群の両方でリツキシマブの有効性を後押しすることができるという奨励を提供する。
【０３３８】
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【０３３９】
リツキシマブ及び６Ｇ１１を用いた併用療法は初代ＭＣＬ細胞に対してインビボの活性を有する
他の型の悪性Ｂ細胞を標的とする６Ｇ１１の能力を評価するために、Ｊｅｋｏ  ＭＣＬ細胞または新鮮に単離した初代ＭＣＬ細胞（それぞれ図１７Ａ及びＢ）を移植した免疫不全マウスモデルを使用した。マウスにＪｅｋｏ  ＭＣＬ細胞を移植したとき、６Ｇ１１またはリツキシマブのいずれかを用いた単独療法は長期生存をもたらさなかったが、一方で、この組み合わせは、マウスの約３０％を１００日まで治癒するのに効果的であった。同様に、初代ＣＬＬ細胞と同じく、初代ＭＣＬ細胞は併用療法に好ましく応答した（図１７Ｂ）。
【０３４０】
６Ｇ１１は良好に耐容され、インビボで治療上関連性のある薬物動態を有し、インビトロでサイトカイン急増をもたらさない
次に、６Ｇ１１  ｍＡｂ処置の安全性を確認するため、ｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスのコホートを１、１０、または１００ｍｇ／ｋｇの６Ｇ１１の単回注射で処置する用量漸増研究を行い、静脈内及び腹腔内の投与経路の両方を１０ｍｇ／ｋｇ用量において検査した（図１８Ａ）。処置されたマウスのいずれも、急性作用、苦痛、または体重減少などの有害事象を被らなかった（図１７Ｂ）。７日目の組織検査は、器官（腎臓、脳、脾臓、肝臓、肺）内のいかなる全毒性も示さなかった（データは示されていない）。ｈＦｃγＲＩＩＢ＋ｖｅＢ細胞の枯渇が、１０及び１００ｍｇ／ｋｇ群において同等の活性と共に、１ｍｇ／ｋｇ超の用量において血液（図６Ａ）及び脾臓（図６Ｂ）の両方で観察され、有効性が示された。６Ｇ１１は、マウスの血清中で容易に検出されるが本質的に免疫原性である完全ヒトｍＡｂであり、そのため、その半減期及びマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）応答の根拠を同時に査定した（図６Ｃ及びＤ）。これらのデータは、１ｍｇ／ｋｇ超の用量において、ＰＫプロファイルに影響する標的媒介性クリアランスが克服され、１０及び１００ｍｇ／ｋｇ群に見られる標的結合の作用はほとんどまたは全くなかったことを示す。しかしながら、７日以内に、ｍＡｂの急速なクリアランスをもたらす著しいＭＡＨＡが観察された（１０ｍｇ／ｋｇの静脈内群において４日目から７日目に４桁増加、図６Ｄ）。投与後の著しいＭＡＨＡ出現前の始めの４日に基づいて、抗体の半減期は、１０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量については２〜４日間の領域内であると推定する（図６Ｃ及びＤならびに表３）。
【０３４１】
６Ｇ１１が臨床的に送達され得る方法をより良好に模倣するために、反復投薬研究も行い、１０日の期間にわたってそれを投与し（初期静脈内投与、続いて３用量を腹腔内に送達した；図１７Ｃ）、苦痛、体重減少、毒性、または病態のあらゆる徴候について、動物を期間全体にわたって、また１４日後（ｍＡｂ受容から合計２４日）に検査した。前述同様に、循環Ｂ細胞の枯渇がｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−において観察されたが、複数（１０ｍｇ／ｋｇ）用量の６Ｇ１１を注入したｍＦｃγＲＩＩ−／−対照群では観察されなかった（図６Ｅ）。同様に、マウスは体重減少を被らず（図１７Ｂ）、有害事象を被った様子はなく、全毒性の徴候は観察されなかった（図１７Ｄ、データは示されていない）。前述同様に、実質的なＭＡＨＡ応答がｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスにおいて１週間以内に観察され、血清からの６Ｇ１１の急速な枯渇に寄与した（図６Ｆ）。興味深いことに、ＭＡＨＡはｍＦｃγＲＩＩ−／−対照群では検出されず、表面抗原の存在がＭＡＨＡ誘発に必要とされることが示された（図６Ｆ）。
【０３４２】
最後に、近年開発されたインビトロのサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）アッセイを使用して、高密度培養２８によって刺激に感応性にされたヒトＰＢＭＣに対する６Ｇ１１の潜在的影響を査定した。このアッセイ系は、ＣＲＳを誘起するものとして以前に強調されたいくつかのｍＡｂ特異性（ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＣＤ５２）の付加後に実質的なレベルのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び／またはＩＬ−８を検出することができる（図６Ｆ及び準備中の論文）。このアッセイにおいて４８時間にわたる野生型またはＮ２９７Ｑ  ６Ｇ１１の適用は、５００倍低い用量のＣＤ３  ｍＡｂを用いた場合とは異なり、実質的なサイトカイン放出をもたらさなかった（図６Ｇ）。全血サイトカインアッセイを使用して同様の結果が得られ（図１８）、これらはまとめて、ヒトにおける精査に先立って６Ｇ１１の良好な安全性プロファイルを示す。
【０３４３】
６Ｇ１１は、インビボで臨床的関連性のある他の抗体の治療活性を増進する
近年の観察は、ＦｃγＲＩＩＢ依存性内部移行が、リツキシマブ以外のいくつかの臨床的関連性のある抗体に対する抵抗性の根底にあり得ることを示す（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、（Ｐａｌｌａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。したがって、６Ｇ１１を、近年認可されたｈＣＤ２０  ｍＡｂであるオビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、及び臨床的に十分に検証されているｈＣＤ５２特異性ｍＡｂであるアレムツズマブと組み合わせることを検査した。ｈＣＤ２０に対するオビヌツズマブの特異性により、同系のマウスモデルにおける作用を研究することが可能となった。ＧＡ１０１及び６Ｇ１１単独療法の両方が、脾細胞及び循環Ｂ細胞の中程度の枯渇をもたらしたが、一方で、この組み合わせは、野生型（図５（２／２）及びｈＦｃγＲＩＩＢ＋／−×ｍＦｃγＲＩＩ−／−マウスにおける枯渇を著しく増進した（図６Ｆ及びＳ６Ｇ）。６Ｇ１１をＧＡ１０１と組み合わせると、ＣＬＬ患者異種移植マウスモデルにおける脾臓腫瘍細胞の枯渇が著しく向上した（図５（２／２）ならびに表５及び８）。ｈＣＤ５２に対するアレムツズマブの特異性は同系のｈＣＤ２０モデルにおける研究の妨げとなったが、ＣＬＬマウスモデルにおいて６Ｇ１１とアレムツズマブとを組み合わせると治療活性が著しく向上し、併用処置マウスの９０％超がＣＲを顕した（図５（２／２）ならびに表５及び８）。
【０３４４】
これらのデータは、６Ｇ１１が複数の標的に対するｍＡｂ薬抵抗性を克服し得ることの根拠を提供する。
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【０３４５】
考察
癌細胞は高度に増殖性であり、本質的にゲノム不安定であり、高い変異の傾向を有する。これらの様相は、遺伝学的に異なる処置抵抗性のクローンが出現し、処置の失敗につながる、選択された従来の抗癌薬の下での細胞進化に最適な環境を提供する。この能力は、ＤＮＡ損傷化学療法３８、ならびに明確に異なるシグナル伝達経路を標的とする小分子阻害薬、例えばイマチニブ、エルロチニブ、及びイブルチニブなど３９〜４３に対して発達する抵抗性機構において明らかに明白である。そのような機構は、標的受容体の変異または下流シグナル伝達タンパク質の代償性変化を伴う４４。その他は、薬物排出ポンプの上方制御により達成される多剤抵抗性機構を伴う（４５にて査読）。従来型及び標的小分子阻害薬の失敗は、これらの様態の抵抗性を克服するための手段、そしてまた免疫系を働かせる療法を含む代替的療法の探索につながっている。
【０３４６】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、今日までこの手法のうち最も成功している典型であり、血液疾患におけるＡｂが当該分野を先導している。Ｂ細胞癌は、抗体療法に関して臨床学的に最も研究されているタイプの癌を代表する。１９９７年のリツキシマブの認可以来、また第２世代（オファツムマブ）及び第３世代（オビヌツズマブ）のｈＣＤ２０  ｍＡｂの近年の認可に伴い、これらの薬剤は、Ｂ細胞癌を処置するための医療設備における重要な主力薬となっている。しかしながら、ｍＡｂ免疫療法も内因性抵抗性及び獲得抵抗性の両方に影響されやすいことは明らかである。腫瘍がその生存及び成長を支持するために間質細胞及び骨髄系細胞を破壊することによって腫瘍周囲の微小環境に影響を及ぼすことは、今や十分に証明されている４６。ｍＡｂ療法に関連する抵抗性のうち少なくとも２つの機構は、抑制性ＦｃγＲＩＩＢによって誘起される（４７にて査読）。Ｃｌｙｎｅｓ５によって示されたエフェクター細胞に対する抑制性作用に加えて、リツキシマブ及び他のＩ型ｈＣＤ２０  ｍＡｂが、Ｂ細胞表面上に架橋する双極性抗体によってｈＦｃγＲＩＩＢに結合し、ｍＡｂ：ＣＤ２０：ＦｃγＲＩＩＢ複合体の内部移行をもたらし１３、２３、４８、それによって、重要なＦｃ依存性エフェクター機能を働かせるその能力を限定することが近年示されている（２３、及びＴｉｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．未公開）。ここで、本実施例は、これらの抵抗性機構の両方を遮断することができ、したがって他の治療用ｍＡｂの最大の可能性を引き出し、インビボの抗体療法に対する抵抗性の克服を助けることができる、完全ヒトｈＦｃγＲＩＩｂ  ｍＡｂの作製を記載する。
【０３４７】
際立ったことに、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの同時投与は、リツキシマブ応答患者からのＣＬＬ細胞を移植したマウスの客観的応答及び完全応答を向上させただけではなく、重要なことに、これらはまた、リツキシマブまたはｈＣＤ５２標的ｍＡｂであるアレムツズマブに抵抗性である再発／難治性患者からのＣＬＬ細胞のｍＡｂ処置抵抗性表現型を克服した。
【０３４８】
選択された微小環境内でのｈＣＤ５２  ｍＡｂ療法への抵抗性における腫瘍細胞ＦｃγＲＩＩＢの役割が近年提唱された（Ｐａｌｌａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ｈＦｃγＲＩＩＢは、より感受性の脾臓区画と比較してアレムツズマブ抵抗性骨髄白血病Ｂ細胞内で上方制御されたことが見出され、これらにおけるｈＦｃγＲＩＩＢのｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンは、さもなければ抵抗性の組織におけるｈＣＤ５２  ｍＡｂ療法を改善させた。これらの所見は、本発明者らのＣＬＬモデルでなされた観察と一致する。感受性の腹膜区画内にあるＣＬＬ細胞がｈＣＤ２０  ｍＡｂによって容易に枯渇された一方で、抵抗性微小環境における枯渇は腫瘍ＦｃγＲＩＩＢの遮断を必要とした。抵抗性組織区画内のｍＡｂ活性低下の根底にある高いＦｃγＲＩＩＢ発現と一致して、ＦｃγＲＩＩＢ遮断は、本発明者らのＣＬＬモデルにおけるアレムツズマブ及びＩＩ型ｈＣＤ２０  ｍＡｂも増進した。ＩＩ型ｈＣＤ２０  ｍＡｂが高レベルのＦｃγＲＩＩＢの存在下でのみ効率的に内部移行することは、以前に示されている（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。集合的に、これらの観察は、ＦｃγＲＩＩＢ媒介性抵抗性が、いくつかの異なる臨床的に認可された抗体に関連することを実証し、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂとの組み合わせに関する広範な治療可能性を示す。
【０３４９】
Ｉ型ＣＤ２０  ｍＡｂは、ＩＩ型よりも大幅に高い標的腫瘍細胞に内部移行する傾向を示すことが以前に示されており１３、２３、３３、後者は高レベルのＦｃγＲＩＩＢの存在下でのみ効率的に内部移行した３３。したがって、ＩＩ型ＣＤ２０抗体のＢ細胞枯渇活性はインビボの６Ｇ１１との同時処置（ｃｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によって同様に向上するようであるという、ここでのこの所見は興味深い。Ｈｅｍａｎｎ及び共同研究者は、選択された微小環境内でのｈＣＤ５２  ｍＡｂ療法への抵抗性における腫瘍細胞ＦｃγＲＩＩＢの役割を近年示した４９。ＦｃγＲＩＩＢは、より感受性の脾臓区画と比較してアレムツズマブ抵抗性骨髄内で上方制御されることが見出され、白血病細胞内のＦｃγＲＩＩＢのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンは、さもなければ抵抗性の組織におけるｈＣＤ５２  ｍＡｂ治療効果を改善させた。これらの所見は、本発明者らのＣＬＬモデルでなされた観察と一致する。感受性の脾臓区画内にある孤立性ＣＬＬ細胞がｈＣＤ２０  ｍＡｂ処置によって容易に枯渇された一方で、抵抗性微小環境におけるクラスター化した増殖性ＣＬＬ細胞の枯渇は腫瘍ＦｃγＲＩＩＢの遮断を必要とした。重要なことに、これらの観察（本明細書及び３３）は、ＦｃγＲＩＩＢ媒介性抵抗性が、いくつかの異なる臨床的に認可された抗体及び検証された標的に関連することを実証し、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂとの組み合わせに関する広範な治療可能性を示す。
【０３５０】
抗体療法への抵抗性は、いくつかのタイプの癌において観察される。Ｂ細胞癌の中でも、ＣＬＬ及びＭＣＬは、ＦＬ及びＤＬＢＣＬと比較して、ｈＣＤ２０  ｍＡｂを含む投薬計画ではさほど十分に処置されず、前者における内因性抵抗性機構が示される。さらに、ＦＬ及びＤＬＢＣＬを患う個別の患者は、ｈＣＤ２０  ｍＡｂ療法に対して本質的な抵抗性を示し、抗体含有免疫療法に初めは応答性である全てのＢ細胞癌患者のうちの一部は、抵抗性を発達させ、もはや処置から利益を得ない。以前の観察（３２、１４、及び未公開のデータ）は、ＦｃγＲＩＩＢ媒介性の抗体内部移行が、これらの異なるＢ細胞癌及び個体における抵抗性の根底にある共通機構であり得ることを示す。本明細書において、ＦｃγＲＩＩＢ媒介性の抗体内部移行は異なるＢ細胞癌に共通する治療上関連性のある抵抗性機構であるという観察と一致して、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂとの同時投与が、インビボでＣＬＬ及びＭＣＬ両方の腫瘍細胞に対するリツキシマブの抗腫瘍活性を後押しするという所見を提示する。
【０３５１】
本実施例は、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂが内因性の抗腫瘍活性を有することをさらに実証する。Ｖｅｒｉらは、ｈＦｃγＲＩＩＢ特異性ｍＡｂを以前に開発したが、インビボの癌標的に対するそれらの活性を検査しなかった５０。Ｒａｎｋｉｎらはその後、悪性ヒトＢ細胞上のｈＦｃγＲＩＩＢを標的とすることが単独療法として有効であり得ることを示した。しかしながら、この研究３６は、免疫不全異種移植系を使用し、ここでは、マウス受容体とのＡｂ交差反応性の欠如のために、非常に重要な免疫エフェクター細胞上ではなく、腫瘍上でのみ標的抗原が発現され、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの正味の作用の査定の妨げとなった。現行の研究では、２つの異なるｍＡｂクローン（１つはファージディスプレイからの完全ヒト由来、そして１つは従来のハイブリドーマ技術によるマウス由来）を使用し、標的Ｂ細胞及びエフェクターの両方でｈＦｃγＲＩＩＢが発現される免疫適格性の同系マウスモデルにおいて、拮抗性ｈＦｃγＲＩＩＢ抗体が内因性抗腫瘍活性を有することを実証する。重要なことに、ｈＣＤ２０及びｈＦｃγＲＩＩＢの両方を発現する二重Ｔｇマウスを使用して、両方の標的が、免疫適格性の宿主において、ヒトにおけるものに類似した細胞特異性かつ組織特異性様式で発現されるとき、ｈＦｃγＲＩＩＢ媒介性内部移行のｍＡｂによる遮断が、リツキシマブの治療活性を後押しすることを、本発明者らはさらに実証する。興味深いことに、この設定において拮抗性ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂとＣＤ２０  ｍＡｂ（リツキシマブまたはオビヌツズマブ）とを同時投与することには、特に顕著かつ明らかな相乗作用があった。同様の免疫適格性モデルにおけるｈＦｃγＲＩＩＢの遺伝子欠失後に観察されているのと同様に、増進した活性は、エフェクター細胞内のｈＦｃγＲＩＩＢの免疫抑制機能のｍＡｂによる遮断から生じたと推測しそうになる６、７。それにも関わらず、また、ＦｃγＲＩＩＢ媒介性抑制の解除及びリツキシマブ内部移行の防止（直接標的とするのではなく）が、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂによるリツキシマブ治療活性の後押しの主要な機構であることと一致して、Ｂ細胞欠失は（おそらくアイソタイプの差異に起因して）６Ｇ１１単独と比較してＡＴ１０では効率が低かったが、ＡＴ１０とリツキシマブとの組み合わせは、リツキシマブ活性の増補において同じように効果的であったことを、本発明者らは見出した。なお、ＣＬＬは、より高い用量が必要とされるが、リツキシマブ５１及び他のＩ型抗ＣＤ２０  ｍＡｂ５２、５３で準最適に処置されることが長年理解されている。本発明者らのこれまでのデータ１３と連関して、本発明者らの新たな結果は、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂを用いた併用療法が、抵抗性を防止する方法であり得るだけでなく、おそらく、これらの場合に必要とされるｈＣＤ２０  ｍＡｂの用量を低下させる方法でもあり得ることを示す。
【０３５２】
このように、少なくとも３つの明確に異なる機構が、６Ｇ１１の総合的なインビボ治療活性、内因性細胞傷害性、治療用ｍＡｂの内部移行の防止、及び免疫細胞内のＦｃγＲＩＩＢ抑制性シグナル伝達の中和に寄与し得る。いくつかの観察は、受容体内部移行の遮断及び抑制性シグナル伝達が、薬抵抗性の克服に最も重要であることを示唆する。第１に、拮抗性ｈＦｃγＲＩＩＢ及びｈＣＤ２０  ｍＡｂをマウスに同時投与したとき、ｈＦｃγＲＩＩＢが標的及びエフェクター細胞の両方で発現された、顕著かつ明らかに相乗的な作用があった。第２に、Ｂ細胞欠失がＡＴ１０単独では不十分であった一方で、ＡＴ１０とリツキシマブとの組み合わせはリツキシマブ活性の増補において効果的であったことを、本発明者らは見出した。最も決定的なことに、Ｎ２９７Ｑ  ｈＩｇＧ１  ６Ｇ１１（これは、賦活性ＦｃγＲに結合する能力を欠き、かつ直接的な細胞傷害性能力を有しない）に関する本発明者らのデータは、ＦｃγＲＩＩＢ活性の遮断がこの手法の有効性の背後にある重要な機構であることを裏付ける。これは、ＦｃγＲＩＩＢに対する機能遮断ｍＡｂが、ＦｃγＲＩＩＢの遺伝子欠失後に観察される増進した抗癌ｍＡｂ応答を再現することができるという根拠を提供する（Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。しかしながら、ここで本発明者らは、活性に関する免疫エフェクター細胞と対比した標的上の拮抗性ＦｃγＲＩＩＢ機能の相対的な重要性を直接的に調査していない；これらの研究は、本発明者らの進行中の試みの基礎を形成する。
【０３５３】
なお、ＣＬＬは、より高い用量が必要とされるが、リツキシマブ（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）及びオファツムマブ（Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）で準最適に処置されることが長年理解されている。本発明者らのこれまでのデータと連関して、本発明者らの現行の結果は、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂを用いた併用療法が、抵抗性を防止する方法であり得るだけでなく、おそらく、用量を低下させる方法、またはｈＣＤ２０  ｍＡｂ療法の持続期間を短縮する方法でもあり得ることを示す。
【０３５４】
著しい活性を得ることに加えて、治療用ｍＡｂはまた、耐容可能であり、かつ治療上関連性のある薬物動態（ＰＫ）を有さなければならない。ｈＦｃγＲＩＩＢに対する６Ｇ１１の非常に高い特異性は、その９８％相同性のヒトｈＦｃγＲＩＩＡへの結合の欠如、及び毒性学研究に一般的に使用される動物種との無視できる交差反応性と共に、ヒトと同様のレベルかつ細胞型及び組織でヒトｈＦｃγＲＩＩＢを発現するＴｇマウスにおける安全性パラメータ及びＰＫ／ＰＤを精査することを、本発明者らに促した。これらの研究は、６Ｇ１１が良好に耐容され、動物が苦痛、体重減少、毒性、または病態の徴候を示さなかったことを示した。用量滴定実験は、１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量がインビボでｈＦｃγＲＩＩＢを飽和させるのに十分であり、同等のＢ細胞枯渇をもたらし、受容体の長期遮断または除去を維持することができたことを実証した。対照的に、１ｍｇ／ｋｇの用量は準最適であり、急速に清掃され、脾臓Ｂ細胞を認識可能なほどに欠失させなかった。受容体飽和を超える用量では、６Ｇ１１の終末相半減期は、２〜４日目にマウスにおいて推定された。非ヒト霊長類種との交差反応性の欠如は種間スケーリングを妨げたが、これらの数値は、ヒトにおいて約数週間の半減期を有するｈＩｇＧ１  ｍＡｂに典型的な、治療上関連性のあるＰＫプロファイルを示す。
【０３５５】
興味深いことに、ヒト血液及びｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇマウスのインビボの両方で、６Ｇ１１処置は、Ｂ細胞の特異的欠失をもたらした。両系における単球がｈＦｃγＲＩＩＢを発現するが、それらは実質的に欠失されなかった。現行の根拠は、マクロファージ及び／または単球が、ｍＡｂ療法を担う重要なエフェクター細胞である（Ｂｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、（Ｂｉｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｇｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）ことを示唆し、したがって、本発明者らのデータは、重要なエフェクターがｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂによって欠失されないことを示す。
【０３５６】
本発明者らは、抗マウスＦｃγＲＩＩ特異性ｍＡｂ２５の同等のパネルをこれまでに調査し、それらが、主に宿主の非腫瘍細胞によってインビボでそれらが急速に消費されることに起因して、限定された治療的利益しか有しないことを観察した１７。重要なことに、少なくともインビトロでは、同様の速度の内部移行がヒト標的細胞上で見られ、先の研究と合致する３６。ここで本発明者らは、これらの観察を広げ、初代ヒトＣＬＬ試料でも同じことが見られたこと、そしてマウス発現ｈＦｃγＲＩＩＢ  Ｔｇでは急速かつ大規模なｍＡｂ消費が観察されなかったことを実証した。これらのデータは、マウス及びヒトの抑制性ＦｃγＲＩＩ（Ｂ）が、それらの内部移行の能力に関して異なる特性を有し、抗原シンク（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｎｋ）として機能するという本発明者らの先の仮定を裏付け、６Ｇ１１などのｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂがヒトにおいて効果的に働くことを示唆する。
【０３５７】
集合的に、本実施例は、ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂがｍＡｂ薬に対する腫瘍細胞の内因性抵抗性及び獲得抵抗性を克服し、再発／難治性ＣＬＬ細胞を克服するというインビボの概念実証研究を論証する。本発明者らのデータは、ＦｃγＲＩＩＢ発現Ｂ細胞癌の療法のためのｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの臨床開発を支持する。
【０３５８】
これらのデータは、ＦｃγＲＩＩＢ発現Ｂ細胞癌の療法のためのｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの臨床開発を支持する。さらに、ＣＤ２０  ｍＡｂの他の疾患への普及と類似して、例えば、標的ＰＣが高レベルのＦｃγＲＩＩＢを発現する全身性軽鎖アミロイドーシス（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、及びＢ細胞の活性化がＦｃγＲＩＩＢの闘争性によって低減し得るリウマチ性関節炎（Ｂａｅｒｅｎｗａｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｍａｕｒｉ  ａｎｄ  Ｊｕｒｙ，２０１０）における操作にＦｃγＲＩＩＢ発現標的が適し得る自己免疫といった、他の治療状況におけるそれらの有用性を示唆する根拠が存在する。
【０３５９】
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４０．Ｐａｏ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｏｒ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＧＦＲ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ．ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ２，ｅ７３（２００５）。
４１．Ｙｕｎ，Ｃ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｔ７９０Ｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＥＧＦＲ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ＡＴＰ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０５，２０７０−２０７５（２００８）。
４２．Ｓｈａｈ，Ｎ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｆｅｒ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｍａｔｉｎｉｂ（ＳＴＩ５７１）ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ｂｌａｓｔ  ｃｒｉｓｉｓ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２，１１７−１２５（２００２）。
４３．Ｃｏｒｂｉｎ，Ａ．Ｓ．，Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ，Ｅ．，Ｐａｓｃａｌ，Ｆ．＆  Ｄｒｕｋｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｂｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ＳＴＩ５７１．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７，３２２１４−３２２１９（２００２）。
４４．Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．ＭＥＴ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＥＲＢＢ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ  ３１６，１０３９−１０４３  （２００７）。
４５．Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．，Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ａ．＆  Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｌ．Ｕｎｌｅａｓｈｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＢＨ３  ｍｉｍｅｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ９，３２１−３２６（２００９）。
４６．Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．＆  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １４４，６４６−６７４（２０１１）。
４７．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  Ｏｖｅｒｃｏｍｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｐｕｂｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３）。
４８．Ｖａｕｇｈａｎ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）ｂｅｃｏｍｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍＡｂ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｃｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ  ａｎｄ  ｄｒｉｖｅｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ（２０１３）。
４９．Ｐａｌｌａｓｃｈ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ  １５６，５９０−６０２（２０１４）。
５０．Ｖｅｒｉ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃｇａｍｍａ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆｃｇａｍｍａ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２１，３９２−４０４（２００７）。
５１．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９，２１６５−２１７０（２００１）。
５２．Ｃｏｉｆｆｉｅｒ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ，ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ａ  ｐｈａｓｅ  １−２  ｓｔｕｄｙ．Ｂｌｏｏｄ  １１１，１０９４−１１００（２００８）。
５３．Ｃｏｉｆｆｉｅｒ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０）ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  １０８，２８４２−（２００６）。
５４．Ｓｈａｗｎ  Ｒｏｓｅ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｍｉｓｈａｒｉｎ，Ｈａｒｒｉｓ  Ｐｅｒｌｍａｎ，２０１２，Ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｌｙ６ｃ／Ｌｙ６Ｇ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ａｎａｌｙｓｅ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ａ  ８１（４）：３４３−５０
５５．Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｌｉｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｔ．Ｃ．，Ｖｉｄａｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｗｉｊａｙａｗｅｅｒａ，Ｓ．Ｓ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｖ．，Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｃｏｘ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １１５，５１９１−５２０１。
５６．Ｂｉｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．，Ａｓｃｈｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｃｈｗａｂ，Ｉ．，Ｌｕｘ，Ａ．，Ａｌｂｅｒｔ，Ｈ．，Ｄａｎｚｅｒ，Ｈ．，Ｗｏｉｇｋ，Ｍ．，Ｄｕｄｚｉａｋ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．（２０１１）．Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５，９３２−９４４。
５７．Ｃｏｉｆｆｉｅｒ，Ｂ．，Ｌｅｐｒｅｔｒｅ，Ｓ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｇａｄｅｂｅｒｇ，Ｏ．，Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎ，Ｈ．，ｖａｎ  Ｏｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．，Ｋｌｏｃｚｋｏ，Ｊ．，Ｈｏｌｏｗｉｅｃｋｉ，Ｊ．，Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ，ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：ａ  ｐｈａｓｅ  １−２  ｓｔｕｄｙ．Ｂｌｏｏｄ  １１１，１０９４−１１００。
５８．Ｃｏｉｆｆｉｅｒ，Ｂ．，Ｔｉｌｌｙ，Ｈ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｐｌｅｓｎｅｒ，Ｔ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ，Ｈ．，ｖａｎ  Ｏｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．，Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．，Ｋｌｏｃｚｋｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｈｏｌｏｗｉｅｃｋｉ，Ｊ．，Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０）ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  １０８，２８４２−。
５９．Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．Ｐ．，Ｆｉｌａｔｏｖ，Ａ．Ｖ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．（２００３）．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍＡｂ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０１，１０４５−１０５２。
６０．Ｇｕｌ，Ｎ．，Ｂａｂｅｓ，Ｌ．，Ｓｉｅｇｍｕｎｄ，Ｋ．，Ｋｏｒｔｈｏｕｗｅｒ，Ｒ．，Ｂｏｇｅｌｓ，Ｍ．，Ｂｒａｓｔｅｒ，Ｒ．，Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｔｅｎ  Ｈａｇｅｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｋｕｂｅｓ，Ｐ．，ａｎｄ  ｖａｎ  Ｅｇｍｏｎｄ，Ｍ．（２０１４）．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２４，８１２−８２３．
６１．Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｘｉｕ，Ｙ．，Ｋｏｍｕｒａ，Ｋ．，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．（２００６）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓｏｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ＣＤ２０  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０３，７４３−７５３。
６２．Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｋ．，Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｒｏｇｈａｎｉａｎ，Ａ．，Ｏｌｄｈａｍ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｆ．，Ｆｒｅｎｄｅｕｓ，Ｂ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｋ．Ｓ．，Ｓｔｒｅｆｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩｂ  ｏｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｈｅ  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＴＧＮ１４１２．Ｂｌｏｏｄ  １２５，１０２−１１０。
６３．Ｌｉｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｖａｕｇｈａｎ，Ａ．Ｔ．，Ａｓｈｔｏｎ−Ｋｅｙ，Ｍ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｖ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｏｘ，Ｋ．Ｌ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩｂ  ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｂｌｏｏｄ  １１８，２５３０−２５４０。
６４．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ，Ｈ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ａ．，Ｇｉｌｅｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．，Ｃｏｒｔｅｓ，Ｊ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．（２００１）．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９，２１６５−２１７０。
６５．Ｐａｌｌａｓｃｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｌｅｓｋｏｖ，Ｉ．，Ｂｒａｕｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｖｏｒｈｏｌｔ，Ｄ．，Ｄｒａｋｅ，Ａ．，Ｓｏｔｏ−Ｆｅｌｉｃｉａｎｏ，Ｙ．Ｍ．，Ｂｅｎｔ，Ｅ．Ｈ．，Ｓｃｈｗａｍｂ，Ｊ．，Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｕ，Ｂ．，Ｋｕｔｓｃｈ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ  １５６，５９０−６０２。
６６．Ｒｏｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｂｅｒｒ，Ｓ．，Ａｖｏｔａ，Ｅ．，Ｎａ，Ｓ．Ｙ．，Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｍ．，ｔｅｎ  Ｂｅｒｇｅ，Ｉ．，Ｅｉｎｓｅｌｅ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｕｎｉｇ，Ｔ．（２０１１）．Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ＰＢＭＣｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ＣＤ２８  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  ＴＧＮ１４１２．Ｂｌｏｏｄ  １１８，６７７２−６７８２。
６７．Ｖａｕｇｈａｎ，Ａ．Ｔ．，Ｉｒｉｙａｍａ，Ｃ．，Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｌｉｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｈａｈ，Ｖ．，Ｒｏｇｈａｎｉａｎ，Ａ．，Ｆｒｅｎｄｅｕｓ，Ｂ．，Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．（２０１４）．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）ｂｅｃｏｍｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍＡｂ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｃｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ  ａｎｄ  ｄｒｉｖｅｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ  １２３，６６９−６７７。
【０３６０】
実施例２−例示的な薬学的製剤
本発明の組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物は単独で投与されることが可能であるが、１つ以上の許容可能な担体と一緒に薬学的製剤としてそれを提示することが好ましい。この担体（複数可）は、本発明の組成物、及び／または抗体、及び／または薬剤、及び／または薬物と適合性があり、その受容者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には、この担体は、無菌かつ発熱物質非含有である水または生理食塩水である。
【０３６１】
以下の実施例は、活性成分が本発明の抗体分子及び／または薬剤である、本発明による薬物及び薬学的組成物を例示する。
実施例Ａ：錠剤
2017517504.tif 000067
【０３６２】
湿式造粒法、続いて圧縮によって、前述の成分から錠剤を調製する。
実施例Ｂ：点眼液
2017517504.tif 000068
実施例Ｃ：錠剤製剤
ポビドン溶液を用いた成分の湿式造粒、続いてステアリン酸マグネシウムの添加、及び圧縮によって、以下の製剤Ａ及びＢを調製する。
製剤Ａ
2017517504.tif 000069
製剤Ｂ
2017517504.tif 000070
製剤Ｃ
2017517504.tif 000071
【０３６３】
混加した成分の直接圧縮によって、以下の製剤、Ｄ及びＥを調製する。製剤Ｅ中に使用されるラクトースは、方向圧縮タイプのものである。
製剤Ｄ
2017517504.tif 000072
製剤Ｅ
2017517504.tif 000073
【０３６４】
製剤Ｆ（徐放製剤）
ポビドン溶液を用いた成分（以下）の湿式造粒、続いてステアリン酸マグネシウムの添加、及び圧縮によって、この製剤を調製する。
2017517504.tif 000074
薬物放出は約６〜８時間の期間にわたって起こり、１２時間後に完了した。
実施例Ｄ：カプセル製剤
製剤Ａ
上記の実施例Ｃにおける製剤Ｄの成分を混加し、２部の硬ゼラチンカプセルに充填することによって、カプセル製剤を調製する。製剤Ｂ（以下参照）は、同様の様式で調製される。
製剤Ｂ
2017517504.tif 000075
製剤Ｃ
2017517504.tif 000076
【０３６５】
マクロゴール４０００  ＢＰを溶融させ、この溶融物中に活性成分を分散させ、この溶融物を２部の硬ゼラチンカプセルに充填することによって、カプセルを調製する。
製剤Ｄ
2017517504.tif 000077
【０３６６】
活性成分をレシチン及びラッカセイ油中に分散させ、この分散液を弾性の軟ゼラチンカプセルに充填することによって、カプセルを調製する。
【０３６７】
製剤Ｅ（徐放カプセル）
押出機を使用して成分ａ、ｂ、及びｃを押し出し、続いて押出物の球形化及び乾燥によって、以下の徐放カプセル製剤を調製する。次いで、乾燥したペレットを放出制御膜（ｄ）でコーティングし、２部の硬ゼラチンカプセルに充填する。
2017517504.tif 000078
実施例Ｅ：注射製剤
2017517504.tif 000079
１０ｍｌまで無菌の発熱物質非含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加
活性成分をリン酸緩衝液（３５〜４０℃）の大部分に溶解させ、次いでメスアップし、滅菌マイクロプローブフィルタを通して無菌の１０ｍｌ琥珀色ガラスバイアル（１型）内に濾過し、無菌の栓及びオーバーシールで密閉する。
実施例Ｆ：筋肉内注入
2017517504.tif 000080
【０３６８】
活性成分をグリコフロール中に溶解させる。次いでベンジルアルコールを添加し溶解させ、３ｍｌになるまで水を添加する。次いでこの混合物を滅菌マイクロプローブフィルタで濾過し、無菌の３ｍｌガラスバイアル（１型）内に密閉する。
実施例Ｇ：シロップ懸濁液
2017517504.tif 000081
【０３６９】
安息香酸ナトリウムを精製水の一部に溶解させ、ソルビトール溶液を添加する。活性成分を添加し、分散させる。グリセロール中に、増粘剤（分散性セルロース）を分散させる。２つの分散液を混合し、必要量になるまで精製水でメスアップする。必要に応じて、懸濁液の追加剪断によってさらなる増粘を得る。
実施例Ｈ：坐薬
2017517504.tif 000082
【０３７０】
＊活性成分は、粒子の少なくとも９０％が直径６３μｍ以下である粉末として使用する。
【０３７１】
Ｗｉｔｅｐｓｏｌ  Ｈ１５の１／５を、蒸気ジャケット付きパン内で最大４５℃で溶融させる。活性成分を２００μｍの篩にかけ、滑らかな分散液が得られるまで切削ヘッドを装着したＳｉｌｖｅｒｓｏｎを使用して混合しながら、溶融した基剤に添加する。この混合物を４５℃に維持しながら、残りのＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｈ１５を懸濁液に添加し、撹拌して、均質なミックスを確保する。この懸濁液全体を２５０μｍのステンレス鋼スクリーンに通し、連続的に撹拌しながら、４０℃に冷ます。３８℃〜４０℃の温度で、この混合物２．０２ｇを、好適なプラスチック成形型に充填する。この坐薬を室温に冷ます。
【０３７２】
実施例Ｉ：ペッサリー
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【０３７３】
上記の成分を直接混合し、得られる混合物の直接圧縮によってペッサリーを調製する。
【図面の簡単な説明】
【０３７４】
【図１】ｈＦｃγＲＩＩＢとｈＦｃγＲＩＩＡとを区別することができるｍＡｂの作製及び特徴付け。
【図２】ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂは、標的細胞の表面上でのＦｃγＲＩＩＢとのリツキシマブ（Ｒｉｔ）の結合を遮断することができる。
【図３】ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は、インビトロで強力な細胞傷害活性を有し、標的ＣＬＬ細胞の表面上でのｈＦｃγＲＩＩＢとのＲｉｔの結合を遮断することができる。
【図４】ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１はインビボで活性であり、Ｂ細胞のＣＤ２０  ｍＡｂ枯渇を増強する。
【図５】ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は、インビボで患者ＣＬＬ細胞のＲｉｔ枯渇を増強する。
【図６】ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は、前臨床インビボ系及びインビトロ系で耐容され、毒性の結果をもたらさない。
【図７】ｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ（ＡＴ１０）は、インビボのＲｉｔによる悪性Ｂ細胞のクリアランスを増強する。
【図８】作製されたクローンは、ｈＦｃγＲＩＩＢに対して非常に特異的である。
【図９】ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂの野生型及びＮ２９７Ｑ変異体の両方が同じように、標的細胞の表面からのＲｉｔ内部移行を遮断することができる。
【図１０】インビトロのｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂのＡＤＣＣ活性。
【図１１】野生型またはＮ２９７Ｑ  ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂで染色されたヒト組織のＩＨＣ。
【図１２】グリコシル化Ｎ２９７Ｑ  ６Ｇ１１変異体は、内因性Ｆｃ依存性エフェクター活性を欠き、インビトロでＡＤＤＣを誘発することができない。
【図１３】ｈＦｃγＲＩＩＢは、初代ヒトＣＬＬ細胞上でＣＤ２０よりもｍＡｂ誘発性内部移行に抵抗性である。
【図１４】ｈＦｃγＲＩＩＢマウスの作製及び特徴付け。
【図１５】ｈＦｃγＲＩＩ  ｍＡｂ  ＡＴ１０はインビボで活性であり、Ｂ細胞のＲｉｔ枯渇を増強する。
【図１６】ＣＬＬ細胞は、間質細胞との相互作用によりＲｉｔ依存性枯渇から保護される。
【図１７】ｈＦｃγＲＩＩＢ  ｍＡｂ  ６Ｇ１１は、インビボでマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞のＲｉｔ枯渇を増強する。
【図１８】インビボの６Ｇ１１のＰＫ、ＰＤ、及びＭＡＢＥＬ特性の査定。
【図１９】インビトロの全血及び希釈血液（２０％  ｖ／ｖ）サイトカイン放出アッセイ。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図３ｉ】
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【図３ｊ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１４ｅ】
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【図１４ｆ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017517504.tif 000187
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