(57)【要約】  本発明は、ＣＤ３及び疾患関連抗原に結合する新規のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を記載する。これらのヘテロ二量体免疫グロブリンは、発現中にヘテロ二量体形成を促進するように操作されており、プロテインＡ特異的な精製法を用いて高度に精製することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ３に結合し、かつ配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、及び配列番号１０４を含む群から選択される重鎖可変ドメインと、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号４０１、及び配列番号４０２を含む群から選択される軽鎖可変ドメインを少なくとも含む、エピトープ結合タンパク質又はその断片。
【請求項２】
配列番号１０１と配列番号１０５、配列番号１０４と配列番号１０６、配列番号１０４と配列番号４０１、配列番号１０４と配列番号４０２を含む群から選択される、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの対を含む、請求項１に記載のエピトープ結合タンパク質又はその断片。
【請求項３】
配列番号３５９と配列番号３９９、配列番号３５９と配列番号４００を含む群から選択される、重鎖と軽鎖との対を含む、請求項１に記載のエピトープ結合タンパク質又はその断片。
【請求項４】
前記抗原結合タンパク質又は断片がヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片である、請求項１、２又は３のいずれか一項に記載のエピトープ結合タンパク質又はその断片。
【請求項５】
前記ヘテロ二量体免疫グロブリン又は断片が第二のエピトープに結合する、請求項４に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片。
【請求項６】
第一のポリペプチドのエピトープ結合領域がＦＡＢであり、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域がｓｃＦｖであるか、又は第一のポリペプチドのエピトープ結合領域がｓｃＦｖであり、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域がＦＡＢである、請求項４又は５に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片。
【請求項７】
ｓｃＦｖがヒトＣＤ３に結合し、配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６の群から選択される配列を含む、請求項６に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片。
【請求項８】
前記ｓｃＦｖが配列番号６０及び６１によりコードされる重及び軽可変領域を含むｓｃＦｖ−ＦｃとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも２倍の発現の改善を有する、請求項６又は７に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片。
【請求項９】
ＦＡＢアームを含む二重特異性抗体において発現される場合の前記ｓｃＦｖが、ＦＡＢアームを含む二重特異性抗体において発現される場合の、配列番号６０及び６１によりコードされる重及び軽可変領域を含むｓｃＦｖとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも２倍の発現の改善を有する、請求項６から８のいずれか一項に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片。
【請求項１０】
前記エピトープ結合タンパク質若しくはその断片又はヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはその断片が、配列番号６０及び６１によりコードされる重及び軽可変領域を含むエピトープ結合タンパク質若しくはその断片又はヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはその断片と比較して、より高い熱安定性を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のエピトープ結合タンパク質若しくはその断片又はヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ３抗原の成分及び疾患関連抗原の両方を標的とするヘテロ二量体免疫グロブリン及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞リダイレクトキリング(T cell redirected killing)は、多くの治療分野において望ましい作用機序である。様々な二重特異性抗体フォーマットがＴ細胞リダイレクトを媒介することが、前臨床及び臨床研究の両方において、示されている(May C et al., (2012) Biochem Pharmacol, 84(9): 1105-12; Frankel SR & Baeuerle PA, (2013) Curr Opin Chem Biol, 17(3): 385-92)。すべてのＴ細胞再標的化二重特異性抗体又はその断片は、少なくとも二の抗原結合部位を有するように操作されており、この場合、一方の部位が標的細胞上の表面抗原に結合し、他方の部位はＴ細胞表面抗原に結合する。Ｔ細胞表面抗原の中でも、ＴＣＲタンパク質複合体に由来するヒトＣＤ３イプシロンサブユニットは、主にＴ細胞キリングをリダイレクトすることを目的とするものである。
【０００３】
多くの二重特異性抗体フォーマットがＴ細胞キリングをリダイレクトするのに用いられているが、これらには、主にタンデム型のｓｃＦｖ断片及びダイアボディベースのフォーマットが含まれ、Ｆｃベースの二重特異性抗体フォーマットについてはごく数例しか報告されていない(Moore PA et al., (2011) Blood, 117(17): 4542-51; 上掲May C et al., (2012); 上掲Frankel SR & Baeuerle PA, (2013))。ヒトＦｃ領域を包含する二重特異性フォーマットは、比較的長い循環半減期を有し、その結果、有効性の向上及び／又は比較的低頻度の投与計画を実現し得る。考え得るＦｃベースの二重特異性フォーマットの中でも、Ｔ細胞キリングをリダイレクトする一の好ましいフォーマットとして、いわゆる重鎖ヘテロ二量体フォーマットがある。本フォーマットは、Ｔ細胞表面においてヒトＣＤ３分子の複数のコピーが凝集するのを可能にせず、それによりＴ細胞の不活性化をすべて阻止するので、特に興味深い(Klein C et al., (2012) MAbs, 4(6): (653-63）。
【０００４】
重鎖ヘテロ二量体を操作するための最初に記載された方法は、「ノブ・イントゥー・ホール」法として知られている(ＰＣＴ公開番号：国際公開第１９９６２７０１１号; Merchant AM et al., (1998) Nat Biotechnol, 16(7): (677-81）。昨今、半免疫グロブリン(half-immunoglobulin)の還元及びインビトロでの再シャッフリングにより二の抗体を一の二重特異性抗体に結合する、ＦＡＢアーム交換法(FAB-arm exchange method)として知られている化学的方法が報告されている(ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９３５３号(Schuurman Jら)及び国際公開第２０１３０６０８６７号(Gramer Mら); Labrijn AF et al., (2013) Proc Natl Acad Sci USA, 110(13): (5145-50)。
【０００５】
両方法及びそれらの派生法も、現在のところ、哺乳動物細胞宿主においてＦｃベースの二重特異性抗体フォーマットを生成するには不適当である。哺乳動物細胞宿主において「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖ヘテロ二量体を発現する場合、ホモ二量体の存在により、二重特異性抗体の回収率が損なわれる(Jackman J et al., (2010) J Biol Chem, 285(27): 20850-9; 上掲のKlein Cら)。ＦＡＢアーム交換法及びその派生法も、同じ欠点を有する他、二の「単一特異性」抗体を最初に別々に生成させなければならないというさらなる問題を有する。
【０００６】
ＣＤ３サブユニットの関与を介してＴ細胞キリングをリダイレクトする二重特異性抗体を開発する際には、ＣＤ３サブユニットに特異的なホモ二量体が最終製剤に存在しないことが必須である。ＣＤ３イプシロンサブユニットを標的とする場合、痕跡量の抗ヒトＣＤ３イプシロン抗体種（ヒトＣＤ３イプシロン抗原に対して単一特異性及び二価）が、一過性のＴ細胞活性化と、Ｔ細胞アポトーシスに至る前のサイトカイン放出とを引き起こし、それにより制御された特異的Ｔ細胞の活性化(controlled and specific T cell activation)という最終目的を阻害する可能性がある。効率的にＴ細胞キリングをリダイレクトする、安定かつ安全なＦｃベースの二重特異性抗体の製造では、純度及び収量に関する製薬産業にとっての課題がなお残る。
したがって、分泌された二重特異性抗体生成物が組換え哺乳動物宿主細胞株由来の細胞培養上清から容易に単離されるような、抗ヒトＣＤ３ホモ二量体を含まない抗ヒトＣＤ３ベースの重鎖ヘテロ二量体を効率的に製造する技術に対するニーズが、依然として存在する。
【０００７】
試薬に対する特異的な(differential)親和性に基づき、ホモ二量体から重鎖ヘテロ二量体を精製する技術は、すでに記載されている。既知のディファレンシャルアフィニティー精製法(differential affinity purification technique）に関する第一の例は、二の異なる動物種由来の二の異なる重鎖であって、そのうちの一が親和性試薬のプロテインＡに結合しない重鎖の使用を伴った(Lindhofer H et al., (1995) J Immunol, 155(1): (219-225)。また、同じ著者らは、二の異なるヒト免疫グロブリンアイソタイプ（ＩＧＨＧ１及びＩＧＨＧ３）に由来する二の異なる重鎖であって、そのうちの一が親和性試薬のプロテインＡに結合しない重鎖の使用についても記載した(IGHG3; Lindhofer Hら,米国特許第６５５１５９２号参照)。さらに最近では、この技術のバリエーションがDavis Sらによって報告されたが（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０１５１７９２号）、これはJendeberg (1997）により記載された二のアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ(Jendeberg L. et al. (1997) J Immunol Methods, 201(1): 25-34)を利用して、ヘテロ二量体重鎖のうちの一において試薬プロテインＡに対する親和性を排除したものである。
【０００８】
本発明の好ましい既知のディファレンシャルプロテインＡアフィニティー精製法は、三種すべて（すなわち目的の二のホモ二量体種とヘテロ二量体）のプロテインＡ結合部位の総数が少なくとも部位一つ分異なり、また二のホモ二量体種のうちの一がプロテインＡ結合部位を有さず、したがってプロテインＡに結合しないという技術に該当する（図１に示す通り）。
【０００９】
薬物安定性は、医薬品開発を成功させる上で重要な側面であり、またＶＨ３ベースの免疫グロブリン又はその断片は、バイオ薬産業にとって非常に重要である。ＶＨ３サブクラスに基づく治療用抗体は広範に開発されてきたが、それは、このようなフレームワークはプロテインＡに結合し、免疫グロブリンへのフォーマット化前の抗体断片の試験が容易になるためである。例えば、抗体発見のために用いられる多くの合成抗体ファージディスプレイライブラリーは、ＶＨ３サブクラスに基づいている。さらに、ＶＨ３ベースの抗体は、他の既知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも良好な発現及び安定性のためにしばしば選択される。
【００１０】
ＶＨ３ドメインは、より強い親和性を持つ二の部位を有するＦｃ領域と比較して、それよりも弱い親和性を有するプロテインＡ結合部位を一箇所のみ有するにすぎないが(Roben PW et al., (1995) J Immunol, 154(12): 6437-45）、既知のディファレンシャルプロテインＡアフィニティー精製法に干渉するのに十分な親和性がある。Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合しないように操作され、ＶＨ３ベースの抗原結合部位を一つ含む重鎖のヘテロ二量体の精製を扱う場合、プロテインＡ結合は、ＶＨ３ドメインを介して復元される。図１に好ましい技術を記載したが、前記のものはもはや有用ではない（図２Ａ）。この事例では、ＶＨ３ベースの抗原結合部位におけるプロテインＡ結合を取り除くことで簡単な解決策が提供され、所望のヘテロ二量体の初期構の造を維持することを可能になる（図２Ｂ）。あるいは、重鎖ヘテロ二量体は、Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合する重鎖上にＶＨ３ベースの抗原結合部位が位置するように再操作することができる（図２Ｃ；ＶＨ３ドメインは、Ｆｃ単量体と比較して、プロテインＡに対してより弱い親和性を有し、したがって目的のヘテロ二量体は、他のホモ二量体種とは異なるｐＨ値、一般的にはｐＨ４でなおも溶出する一方、プロテインＡに結合するホモ二量体種は、この場合二のさらなるプロテインＡ結合部位を包含し、ｐＨ値≦３で溶出することに留意されたい）。
【００１１】
より重要なことには、両方の重鎖がＶＨ３ベースの抗原結合部位を包含するような重鎖のヘテロ二量体の精製を扱う場合、上記の再配置法は、部分的にしか有用ではない（図２Ｄ及び図１５Ｂ）。プロテインＡに基づく特異的な精製は、ＶＨ３ベースの抗原結合部位の少なくとも一（図２Ｅ）又は両方（図２Ｆ）におけるプロテインＡ結合が排除される場合にのみ可能である。
【００１２】
したがって、本可変ドメインサブクラスを包含する重鎖のヘテロ二量体の製造を行う場合、ＶＨ３ドメイン内のプロテインＡ結合を取り除く必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、疾患関連抗原を認識してこれに結合することができる第二の結合アームを含む新規な抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
【００１４】
本発明の文脈では、疾患関連抗原とは、発がんマーカー又は他の何らかの代謝若しくは免疫学的機能不全のマーカー等の病的状態に関連する任意の抗原又はエピトープを意味する。その上、疾患マーカーは、病原性ウイルス又は細菌などの感染性疾患にも関連する。
【００１５】
本発明に従えば、抗ヒトＣＤ３結合アームの標的結合部分は、ＳＰ３４の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは特に、ＣＤ３結合特性を維持しながら配列番号６０及び６１によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖ−Ｆｃと比較して、より良好な発現プロファイルを有する。
【００１６】
特に、ｓｃＦｖ−Ｆｃとして発現される場合、それは、配列番号６０及び６１によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖ−ＦｃとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも２倍の発現の改善を有する。好ましくは、改善されたＳＰ３４  ｓｃＦｖは、配列番号６０及び６１によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも６倍の発現の改善を有し、最も好ましくは配列番号６０及び６１によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、１２倍の発現の改善を有する。
【００１７】
本発明の別の態様に従えば、ＢＥＡＴフォーマットの、ＦＡＢアームを含む二重特異性抗体中のｓｃＦｖとして発現される場合、それは、配列番号６０及び６１によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも２倍の発現の改善を有する。好ましくは、ＢＥＡＴ二重特異性抗体の成分としての改善されたＳＰ３４  ｓｃＦｖは、ＢＥＡＴ二重特異性抗体の成分としての配列番号６０及び６１によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも５倍の発現の改善を有する。
【００１８】
本発明に従えば、抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体の二の結合アームは各々、免疫グロブリン定常領域を含み、第一のアーム又はポリペプチドはプロテインＡに結合し、第二のアーム又はポリペプチドはプロテインＡに結合しない。
【００１９】
本発明によれば、第一のポリペプチドのプロテインＡへの結合及び第二のポリペプチドのプロテインＡへの結合の欠如は、第二のポリペプチドがプロテインＡへのいくらかの残存結合を有さなくてもよいことを意味するものではなく、第二のポリペプチドが第一のアームへの結合と比較してプロテインＡへの結合が不十分であることを示す。
【００２０】
本発明によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の第一及び第二のポリペプチドは、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成に有利なタンパク質−タンパク質界面(interface)を有する修飾ＣＨ３領域を有する操作された免疫グロブリン定常領域を含む。好ましい実施態様において、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供するが、その第一及び第二のポリペプチドはタンパク質−タンパク質界面を有する修飾ＣＨ３ドメインを持つ、操作された免疫グロブリン定常領域を含み、この場合第一のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、第二のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含む。
【００２１】
好ましくはこの場合、第二のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、８４．４位にアミノ酸置換を含み、さらに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置に少なくとも一のさらなる置換を含む。
【００２２】
さらなる実施態様において、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供するが、その第一及び第二のポリペプチドはタンパク質−タンパク質界面を有する修飾ＣＨ３ドメインを持つ、操作された免疫グロブリン定常領域を含み、この場合第一のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は８８位並びに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、第二のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は８５．１位及び／又は８６位並びに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含む。
【００２３】
本発明のさらなる態様によれば、第一のポリペプチドのエピトープ結合領域はＣＤ３タンパク質複合体に結合し、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域は疾患関連抗原に結合するか、又は第一のポリペプチドのエピトープ結合領域が疾患関連抗原に結合し、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域はＣＤ３タンパク質複合体に結合し；かつＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号２００のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、並びに配列番号２０３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２０４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み；又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号３５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、並びに配列番号３５５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００２４】
これらの新規の抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体の使用は、様々なヒトのがん並びに自己免疫及び炎症性疾患の治療を含むがこれらに限定されない。正常な細胞及び組織の中からがん細胞を特異的に破壊することは、腫瘍学における主要な目的に相当する。腫瘍関連細胞表面抗原に対して安全にＴ細胞キリングをリダイレクトすることができる治療法は、臨床効果の改善をもたらし得る。腫瘍学における臨床上満たされていないニーズの既知の分野には、乳がん、転移性乳がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されない。
疾患を引き起こすＴ細胞の排除は、乾癬、多発性硬化症、及び糖尿病などの自己免疫及び炎症性疾患の治療において、Ｔ細胞分化を阻害するよりも有益であり得る。
【００２５】
疾病関連抗原の好ましいセットは、遺伝子産物ＣＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＲＴＨ２、ＰＤＬ１、ＢＬＵＴ１、ＰｉｒＢ、ＣＤ３３、ＴＲＯＰ２、ＣＤ１０５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＮＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ１２３、ＡＤＡＭ１７、ＭＣＳＰ、ＰＳＣＡ、ＦＯＬＲ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＩｇＥ、インテグリンａ４ｂ１、ＣＣＲ５、ルイスＹ、ＦＡＰ、ＭＵＣ−１、Ｗｕｅ−１、ＭＳＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｐ糖タンパク質、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＣＤ３０、ＣＤ４０  ＣＴＬＡ４、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、メソセリン、ＯＸ４０、ＣＡ１２５、ＣＡＩＸ、ＣＤ６６ｅ、ｃＭｅｔ、ＥｐｈＡ２、ＨＧＦ／ＳＦ、ＭＵＣ１、ホスファチジルセリン、ＴＡＧ−７２、ＴＰＢＧ、Ｂ−カテニン、ｂｒｃ−ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、カスパーゼ−８、ＣＤＫ４、サイクリン−Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、Ｆｒａ−１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧｌｏｂｏＨ、グリカン−３、ＧＭ３、ｇｐ１００、ＨＬＡ／Ｂ−ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ−ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ−Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＭＡＧＥ６、ＭＡＧＥ１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＬ−ＩＡＰ、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ−ＢＲ１、ＮＹ−ＢＲ６２、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＥＳＯ１、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、Ｓｔｅａｐ−１、Ｓｔｅａｐ−２、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−Ｂ、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｎ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ウロプラキン−３に由来する。
【００２６】
疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域が
ｉ）  配列番号２０６-２１１；
ｉｉ）  配列番号２１２-２１７；
ｉｉｉ）  配列番号２１８-２２３；
ｉｖ）  配列番号２２４-２２９；
ｖ）  配列番号２３０-２３５；
ｖｉ）  配列番号２３６-２４１；
ｖｉｉ）  配列番号２４２-２４７；
ｖｉｉｉ）  配列番号２４８-２５３；
ｉｘ）  配列番号２５４-２５９；
ｘ）  配列番号２６０-２６５；
ｘｉ）  配列番号２６６-２７１；及び
ｘｉｉ）  配列番号２７２-２７７
からなる群よりそれぞれ選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、本発明によるヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片。
【００２７】
本発明のさらなる態様に従えば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の第二のポリペプチドの定常領域は、ＩｇＧ３  ＣＨ３領域を含む。
【００２８】
本発明のさらなる態様に従えば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の第二のポリペプチドの定常領域は、ＩｇＧからのもの以外のＣＨ３領域を含み、非ＩｇＧ３  Ｃｈ３領域は、プロテインＡ結合を減少／消失させるように少なくとも一の置換を含む。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の第二のポリペプチドのエピトープ結合領域は、プロテインＡ結合を減少させる少なくとも一の修飾を含むＶＨ３領域を含む。
【００３０】
本発明者らは、ＶＨ３ベースの抗原結合部位が一工程のプロテインＡクロマトグラフィーで容易に生成されかつ高純度で精製され得ることを示した。これらの抗体は、製造の容易さに加えて、現在の治療法よりも高い有効性を示し得る。
【００３１】
本発明はまた、組換え哺乳動物宿主細胞株由来の少なくとも一のＶＨ３ベースの抗原結合部位を有する抗ヒトＣＤ３二重特異性重鎖ヘテロ二量体を製造するための方法であって、二重特異性抗体生成物が一工程のプロテインＡクロマトグラフィー後に高純度で容易に単離される方法を提供する。
【００３２】
特に、修飾ＶＨ３領域は、５７、６５、８１、８２ａ、及び１９／５７／５９（Ｋａｂａｔ番号付け）の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、さらにより好ましくは、修飾ＶＨ３領域は５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、８１Ｅ、８２ａＳ、及び１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片は、重鎖可変フレームワーク領域がＩ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ／Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付け）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、軽鎖可変フレームワーク領域がＭ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｔ５１Ａ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付け）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含むか；又は重鎖可変フレームワーク領域がアミノ酸置換Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含み、軽鎖可変フレームワーク領域がアミノ酸置換Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含む。
【００３４】
さらなる実施態様では、ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラスの産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。好ましくは、重鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＶ３−２３の産物であるか又はそれに由来する。より好ましくは、重鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の産物であるか又はそれに由来する。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１８又は配列番号６０のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
【００３５】
好ましい実施態様では、ＣＤ３タンパク質複合体に結合する、第一のポリペプチドのエピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス若しくはヒトＶＫ３サブクラスの産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む。好ましくは、軽鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＶＫ１−３９又はＶＫ３−２０の産物であるか又はそれに由来する。より好ましくは、軽鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）又はＩＧＫＶ３−２０＊０１（配列番号２４）の産物であるか又はそれに由来する。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１９又は配列番号６１のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
【００３６】
好ましい実施態様では、ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、Ｉ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ／Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付け）からなる群より選択される逆突然変異を有するヒト化重鎖可変ドメインと、Ｍ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付け）からなる群より選択される逆突然変異を有するヒト化軽鎖可変ドメインとを含む。さらに好ましくは、ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、逆突然変異Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔ（Ｋａｂａｔ番号付け）を有するヒト化重鎖可変ドメインと、逆突然変異Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付け）を有するヒト化軽鎖可変ドメインとを含む。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片のＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、
配列番号１０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか；又は
配列番号１０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか；又は
配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか；又は
配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか；又は
配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３８】
ＣＤ３タンパク質複合体は、いくつかのサブユニット、例えばデルタ、イプシロン、及びガンマを含む。好ましい実施態様において、ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、ＣＤ３イプシロンサブユニットに結合する。
【００３９】
本明細書に記載のエピトープ結合領域は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の、一又は複数のエピトープへの特異的結合を可能にする結合部位を共に形成する一又は複数の重鎖可変ドメイン及び一又は複数の相補的軽鎖可変ドメインを含む。本発明の一実施態様において、第一のポリペプチドのエピトープ結合領域はＦＡＢを含み、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域はｓｃＦｖを含む。あるいは、第一のポリペプチドのエピトープ結合領域はｓｃＦｖが含み、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域がＦＡＢを含む。
【００４０】
一実施態様において、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＨＥＲ２に結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域と、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域とを含む。
【００４１】
好ましい実施態様では、疾患関連抗原ＨＥＲ２に結合するエピトープ結合領域は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。さらに好ましい実施態様では、ＨＥＲ２に結合するエピトープ結合領域は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ断片を形成するＧ４Ｓリンカーによって連結された重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。好ましくは、ｓｃＦｖ断片の可変ドメインは、プロテインＡへの結合を取り除くための修飾を含み、この場合アミノ酸置換が６５Ｓ（Ｋａｂａｔ番号付け）に存在し、かつｓｃＦｖ断片が配列番号１０９のアミノ酸配列を含むか、又はアミノ酸置換が８２ａＳ（Ｋａｂａｔ番号付け）に存在し、かつｓｃＦｖ断片が配列番号１１１のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
特に、前記のハーセプチン結合アームは、配列番号２０によってコードされる重鎖可変領域と、配列番号２１によってコードされる軽鎖可変領域とを含む。
【００４３】
別の実施態様において、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＣＤ３８に結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１１２又は１１４又は１２２のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域をさらに含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１１３又は１１５又は１２３のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
【００４４】
特に、ＣＤ３８結合ポリペプチドは、配列番号１１６／１１７、１２９／１３０、１３３／１３４、及び１３５／１３６によってコードされる可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとの対を含む。
【００４５】
一実施態様において、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＯＸ４０に結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域をさらに含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
【００４６】
最も好ましくは、ヒト化重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むプロテインＡへの結合を取り除くための修飾を含む。
【００４７】
特に、ＯＸ４０結合ポリペプチドは、配列番号１４１／１４２、２７８／２８０、及び２７９／２８１によってコードされる可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとの対を含む。
【００４８】
一実施態様において、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＣＤ１９に結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域、最も好ましくは配列番号２９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変フレームワーク領域を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域、最も好ましくは配列番号２９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変フレームワーク領域をさらに含む。好ましい実施態様では、重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むプロテインＡへの結合を取り除くための修飾を含む。
【００４９】
特に、ＣＤ１９結合ポリペプチドは、配列番号２９６／２９７によってコードされる可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとの対を含む。
【００５０】
一実施態様において、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＣＤ２０に結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域をさらに含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
【００５１】
最も好ましくは、ヒト化重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むプロテインＡへの結合を取り除くための修飾を含む。
【００５２】
特に、ＣＤ２０結合ポリペプチドは、配列番号１４３／１４４、２８２／２８４、２８３／２８５によってコードされる可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとの対を含む。
【００５３】
一実施態様において、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＥＧＦＲに結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域をさらに含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
【００５４】
最も好ましくは、ヒト化重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むプロテインＡへの結合を取り除くための修飾を含む。
【００５５】
特に、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、配列番号１４５／１４６、２８６／２８８、２８７／２８９、２９０／２９１、２９２／２９４によってコードされる可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとの対を含む。
【００５６】
一実施態様において、疾患関連抗原に結合するエピトープ結合領域は、ＩｇＥに結合する。エピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号２９８のアミノ酸配列を含む、対応するヒト化抗体、又は配列番号３０４のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）の産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域をさらに含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号２９９のアミノ酸配列を含む、対応するヒト化抗体、又は配列番号３０５のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
【００５７】
最も好ましくは、重鎖可変ドメインは、置換Ｇ６５Ｓ又は置換Ｎ８２ａＳ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むプロテインＡへの結合を取り除くための修飾を含む。
【００５８】
特に、ＩｇＥ結合ポリペプチドは、配列番号２９８／２９９、３００／３０２、３０１／３０３、３０４／３０５、３０６／３０８、３０７／３０９によってコードされる可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとの対を含む。
【００５９】
抗ＣＤ３抗体は、直接的及び間接的機序の両方によって毒性を誘発することが判明している。間接的機序は、免疫細胞を発現するＦｃ受容体と相互作用し、かつ一過性のＴ細胞活性化及びサイトカイン放出をもたらすＣＤ３抗体のＦｃ領域によって媒介される。したがって、本明細書に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の安全性を向上させるために、第一及び／又は第二のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、エフェクター免疫細胞及び／又は補体Ｃ１ｑｂに対する結合が低下しているか又は全く結合していない。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、下部ヒンジ領域におけるＦｃ受容体結合を排除するように操作される。より好ましくは、第一及び／又は第二のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）の置換（単数又は複数）を含む。最も好ましくは、第一及び／又は第二のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）の置換を含む。
【００６０】
別の態様では、本発明の開示はまた、エピトープ結合領域がＣＤ３タンパク質複合体のＣＤ３イプシロンサブユニットに結合し、配列番号６０のアミノ酸配列の重鎖可変ドメイン及び配列番号６１のアミノ酸配列の軽鎖可変ドメインを含むＳＰ３４キメラのＦＡＢ熱安定性よりも優れたＦＡＢ熱安定性を有する（表１のように示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定した場合）ＦＡＢを含む、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を記載している。この熱安定性の増大は、これらの改善されたＳＰ３４結合アームが、治療剤として、またその安定性／保管／貯蔵寿命の点でより優れた性能を意味する、インビボ及びインビトロでの安定性を高めたことを意味する。
【００６１】
本発明のさらなる態様に従えば、ＳＰ３４の可変重及び軽ドメイン配列である配列番号６０及び６１を含むｓｃＦｖの発現を改善するための方法であって、以下の工程：
ａ）  配列番号６０及び６１によりコードされる重又は軽可変ドメイン内の残基の少なくとも一を修飾すること；
ｂ）  工程ａ）からの修飾構築物の発現を発現させること；
ｃ）  修飾構築物の発現レベルを、配列番号６０及び配列番号６１又は配列番号６２及び配列番号６３又は配列番号６４及び配列番号６９によりコードされる重／軽可変ドメインを含むｓｃＦｖと比較すること；
ｄ）  前記修飾構築物が配列番号６０及び配列番号６１又は配列番号６２及び配列番号６３又は配列番号６４及び配列番号６９によりコードされる重／軽可変ドメインを含むｓｃＦｖよりも多く発現される場合、それを選択すること
を含む方法が提供される。
【００６２】
本発明に従えば、重可変ドメインは、少なくとも１００ｅの位置にて修飾される。
【００６３】
特に残基１００ｅは、疎水性側鎖を有するアミノ酸と、特にフェニルアラニン又はチロシン残基と置換される。
【００６４】
本発明に従えば、軽可変ドメインは、２９、３０、９１、９５位のうちの少なくとも一にて修飾される。
【００６５】
本発明に従えば、残基は、ランダムに突然変異される。
【００６６】
本発明に従えば、残基は、すべての標準的なアミノ酸及び／又は非標準的なアミノ酸若しくはそのサブセットについて部位特異的突然変異誘発によって突然変異される。
【００６７】
本発明の好ましい態様に従えば、残基は、部位特異的突然変異誘発によって、可変重及び軽ドメインの他の特徴的なバージョンにおいて同じ位置に存在する他の残基に変異される。
【００６８】
特に、残基２９はアラニン、グルタミン酸又はセリン残基を置換し；残基３０はアラニン又はアスパラギン酸残基を置換し；残基９１はフェニルアラニン残基を置換し、かつ残基９５はグリシン又はスレオニン残基を置換する。
【００６９】
さらなる態様において、本発明は、一のエピトープ結合領域がＣＤ３タンパク質複合体のＣＤ３イプシロンサブユニットに結合し、疾患関連抗原に結合する他のエピトープ結合領域がＨＥＲ２に結合する、本明細書に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供する。そのようなヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片のリダイレクトＴ細胞キリングに対する力価は、実施例に記載の通り、フローサイトメトリー法（ＲＤＬ−ＦＡＣＳ）又は比色に基づく方法（ＲＤＬ−ＭＴＳ）を用い、ＪＩＭＴ−１、ＢＴ−４７４、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１等のＨＥＲ２を発現する細胞株でのインビトロアッセイにおいて測定することができる。
【００７０】
好ましい実施態様では、本発明は、以下のものに結合するヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供する：
ｉ）  第一のポリペプチドが配列番号３５９を含む群から選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号３９９又は４００のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３イプシロンに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号１６７のアミノ酸配列を有し、ＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２；
ｉｉ）  第一のポリペプチドが配列番号３５９を含む群から選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号３９９又は４００のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３イプシロンに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号１６７のアミノ酸配列を有し、ＨＥＲ２に結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２；
ｉｉｉ）  第一のポリペプチドが配列番号３５９を含む群から選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号３９９又は４００のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３イプシロンに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号１６２のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３８に結合する、ＣＤ３８タンパク質複合体及びＣＤ３イプシロン；
ｉｖ）  第一のポリペプチドが配列番号１７０のアミノ酸配列を有し、配列番号１３８のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８；
ｖ）  第一のポリペプチドが配列番号１７６のアミノ酸配列を有し、配列番号１１９のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８；
ｖｉ）  第一のポリペプチドが配列番号１７８のアミノ酸配列を有し、配列番号１２８のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８；
ｖｉｉ）  第一のポリペプチドが配列番号３５９を含む群から選択されるアミノ酸配列を有し、配列番号３９９又は４００のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＯＸ４０に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号１６２のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＯＸ４０；
ｖｉｉｉ）  第一のポリペプチドが配列番号１７４のアミノ酸配列を有し、配列番号１７５のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＥＧＦＲに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ；
ｉｘ）  第一のポリペプチドが配列番号１８０のアミノ酸配列を有し、配列番号１８１のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ２０に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ２０。
【００７１】
さらなる実施態様では、本発明は、以下のものに結合するヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供する：
第一のポリペプチドが配列番号３１０のアミノ酸配列を有し、配列番号３のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＨＥＲ２に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＨＥＲ２；
第一のポリペプチドが配列番号３１２又は４０４のアミノ酸配列を有し、配列番号１３２のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８；
第一のポリペプチドが配列番号３１３のアミノ酸配列を有し、配列番号１３８のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８；
第一のポリペプチドが配列番号３１４のアミノ酸配列を有し、配列番号３１５のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＯＸ４０に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＯＸ４０；
第一のポリペプチドが配列番号３１６のアミノ酸配列を有し、配列番号３１７のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＯＸ４０に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＯＸ４０；
第一のポリペプチドが配列番号３１８のアミノ酸配列を有し、配列番号３１９のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ２０に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ２０；
第一のポリペプチドが配列番号３２０のアミノ酸配列を有し、配列番号３２１のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ２０に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ２０；
第一のポリペプチドが配列番号３２２のアミノ酸配列を有し、配列番号３２３のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＥＧＦＲに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ；
第一のポリペプチドが配列番号３２４のアミノ酸配列を有し、配列番号３２５のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＥＧＦＲに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ；
第一のポリペプチドが配列番号３２６のアミノ酸配列を有し、配列番号３２７のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＥＧＦＲに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ；
第一のポリペプチドが配列番号３２８のアミノ酸配列を有し、配列番号３２９のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＥＧＦＲに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ；
第一のポリペプチドが配列番号３３０のアミノ酸配列を有し、配列番号３３１のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ１９に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ１９；
第一のポリペプチドが配列番号３３２のアミノ酸配列を有し、配列番号３３３のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＩｇＥに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ；
第一のポリペプチドが配列番号３３４のアミノ酸配列を有し、配列番号３３５のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＩｇＥに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ；
第一のポリペプチドが配列番号３３６のアミノ酸配列を有し、配列番号３３７のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＩｇＥに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ；
第一のポリペプチドが配列番号３３８のアミノ酸配列を有し、配列番号３３９のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＩｇＥに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ；
第一のポリペプチドが配列番号３４０のアミノ酸配列を有し、配列番号１７３のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＯＸ４０に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＯＸ４０；
第一のポリペプチドが配列番号３４１のアミノ酸配列を有し、配列番号１８１のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ２０に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ２０；
第一のポリペプチドが配列番号３４２のアミノ酸配列を有し、配列番号１７５のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＥＧＦＲに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ；
第一のポリペプチドが配列番号３４３のアミノ酸配列を有し、配列番号３４４のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＥＧＦＲに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＥＧＦＲ；
第一のポリペプチドが配列番号３４５のアミノ酸配列を有し、配列番号３４６のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＩｇＥに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ；
第一のポリペプチドが配列番号３４７のアミノ酸配列を有し、配列番号３４８のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＩｇＥに結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号３６１、配列番号３１１、配列番号３９４、及び配列番号３９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＩｇＥ。
【００７２】
本発明のさらなる態様に従えば、前記ＣＤ３結合ポリペプチドが配列番号１０１／１０５、１０３／１０６、１０４／１０６、１０４／４０１、１０４／４０２の群から選択される重及び軽鎖の可変領域の少なくとも一若しくはその組み合わせを含むヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片。
【００７３】
二重特異性抗体生成について上で議論したように、分泌された二重特異性抗体生成物が組換え哺乳動物宿主細胞株由来の細胞培養上清から容易に単離されるような、抗ヒトＣＤ３ホモ二量体を含まない抗ヒトＣＤ３ベースの重鎖ヘテロ二量体を効率的に製造する必要がある。この趣旨で、プロテインＡに基づく特異的な精製法を用いて、ＶＨ３の可変ドメインサブクラスを包含するヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を単離することができ、この場合少なくとも一方の、好ましくは両方のＶＨ３ベースのエピトープ結合領域が取り除かれる。したがって、別の態様において本発明は、以下の工程：
ｉａ）  第一のポリペプチドの重鎖をコードするＤＮＡベクター及び第二のポリペプチドの重鎖をコードするＤＮＡベクターを調製する工程であって、一方若しくは両方のＤＮＡベクター又は第三のＤＮＡベクターが共通の軽鎖又は第一若しくは第二のポリペプチドの重鎖と共に組み立てられる軽鎖を任意選択的にコードする工程；又は
ｉｂ）  第一及び第二のポリペプチドの重鎖をコードする一のＤＮＡベクターを調製する工程であって、ＤＮＡベクターが共通の軽鎖又は第一若しくは第二のポリペプチドの重鎖と共に組み立てる軽鎖を任意選択的にコードし；かつ
前記ＤＮＡベクターが哺乳動物宿主細胞において一過性の又は安定的な発現に適している工程；
ｉｉ）  哺乳動物宿主細胞株において、（ｉ）のＤＮＡベクターをトランスフェクト又はコトランスフェクトする工程；
ｉｉｉ）  トランスフェクトされた細胞株又はそれから安定的に選択されたクローンを培養し、細胞培養上清を回収する工程；
ｉｖ）  プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂上で細胞培養上清を接触させる工程；
ｖ）  目的のヘテロ二量体免疫グロブリンを溶出して回収する工程
を含む、本明細書に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片のインビトロでの製造方法を提供する。
【００７４】
好ましくは、工程（ｖ）の精製物質中に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片は、少なくとも９５％純粋である。より好ましくは、工程（ｖ）の精製物質中に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片は、少なくとも９６％純粋である。さらにより好ましくは、工程（ｖ）の精製物質中に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片は、少なくとも９７％である。精製物質中に見出されるヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の純度は、キャピラリー電気泳動によって測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】プロテインＡを用いた好ましいディファレンシャルアフィニティー精製法の模式図である。重鎖のいずれもＶＨ３に基づく抗原結合部位を含まない。凡例：［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味し、［（Ａ−）］は非機能的なのプロテインＡ結合部位を意味する。溶出のｐＨを示す。
【図２Ａ−Ｆ】ディファレンシャルプロテインＡクロマトグラフィーを用いて一又は複数のＶＨ３ドメインを包含する重鎖のヘテロ二量体を精製する場合に直面する問題を例示する模式図。ヘテロ二量体の少なくとも一のＶＨ３ドメイン内のプロテインＡ結合部位の変異に基づいた解決策の例を示す。図２Ａ：重鎖のヘテロ二量体が、Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合しない重鎖内のＶＨ３ドメインを包含する場合に直面する問題。図２Ｂ：図２Ａに示した精製の問題に対する解決策として、Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合しないヘテロ二量体の重鎖がプロテインＡ結合部位を取り除くために突然変異されているＶＨ３ドメインを包含する。図２Ｃ：図２Ａで示した問題に対する代替的な解決策として、ヘテロ二量体が一のＶＨ３ドメインのみを包含し、かつＦｃ領域においてプロテインＡに結合する重鎖上にＶＨ３ドメインが位置するように操作される（解決策としてのＶＨ３ドメイン再配置法）。図２Ｄ：ヘテロ二量体の両方の重鎖がＶＨ３ドメインを包含する場合に直面する問題。図２Ｅ：図２Ｄに示した精製の問題に対する解決策として、Ｆｃ領域においてプロテインＡに結合しないヘテロ二量体の重鎖がプロテインＡ結合部位を取り除くために突然変異されているＶＨ３ドメインを包含する。図２Ｆ：図２Ｄで示した問題に対する代替的な解決策として、各ＶＨ３ドメインがそのプロテインＡ結合部位を取り除かれている。四角で囲んだ種類は、特異的なプロテインＡクロマトグラフィープロセス中に共溶出する種類を示す。ｐＨ値Ａ及びＢは、約１のｐＨ単位分だけ異なり、プロテインＡに結合する種の効率的な分離が可能である。一般的には、ｐＨ  Ａ及びｐＨ  ＢのｐＨ値は、それぞれ４及び３である。全図の凡例：［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味し、［（Ａ−）］は非機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。
【図３】Ｆｃ  １３３のプロテインＡ勾配モードクロマトグラフィーのトレース（ＨｉＴｒａｐＴＭ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度対移動相の総量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨと移動相に存在する溶出バッファー（Ｂ）の百分率のプロットをそれぞれ破線及び一点鎖線で示す。
【図４Ａ−Ｃ】プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィーのトレース。２８０ｎｍでの吸光度対移動相の総量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨと移動相に存在する溶出バッファー（Ｂ）の百分率のプロットをそれぞれ破線及び一点鎖線で示す。図４Ａ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ  １３３（ＨｉＴｒａｐＴＭ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡカラム）。図４Ｂ：抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  １３３（ＨｉＴｒａｐＴＭ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡカラム）。図４Ｃ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（ＨｉＴｒａｐＴＭ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡカラム及びＨｉＴｒａｐＴＭ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭプロテインＡカラム）。
【図５】７の既知のヒトＶＨフレームワークサブクラスの各々についての代表的なアミノ酸配列。配列は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って整列させた。プロテインＡのドメインＤと相互作用するヒトＶＨ３−２３フレームワークサブクラスの位置を太字で示す。
【図６Ａ−Ｉ】プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィーのトレース（ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度対移動相の総量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨと移動相に存在する溶出バッファー（Ｂ）の百分率のプロットをそれぞれ破線及び一点鎖線で示す。図６Ａ：抗ＨＥＲ２抗体。図６Ｂ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ５７Ａ。図６Ｃ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ５７Ｅ。図６Ｄ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｇ６５Ｓ。図６Ｅ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｒ６６Ｑ。図６Ｆ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｔ６８Ｖ。図６Ｇ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｑ８１Ｅ。図６Ｈ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｎ８２ａＳ。図６Ｉ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ  Ｒ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａ。
【図７】ＨＥＲ２抗原に対する選択した抗ＨＥＲ２  ＦＡＢバリアントの平衡解離定数（ＫＤ）。
【図８Ａ−Ｄ】プロテインＡ勾配モードクロマトグラフィーのトレース（ＨｉＴｒａｐＴＭ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡカラム）。２８０ｎｍでの吸光度対移動相の総量のプロットを実線で示す。移動相のｐＨと移動相に存在する溶出バッファー（Ｂ）の百分率のプロットをそれぞれ破線及び一点鎖線で示す。図８Ａ：抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ  １３３。図８Ｂ：抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ  １３３。図８Ｃ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ  １３３。図８Ｄ：抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ  １３３。
【図９Ａ−Ｆ】これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＯＫＴ３ヒト化に関するものである。図９Ａ−Ｃ：ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされたヒト化候補の概要。キメラＯＫＴ３抗体と比較したＨＰＢ−ＡＬＬ染色：（−）は結合なし、（＋）はより弱い結合、（＋＋）は中程度の結合、（＋＋＋）は同程度の結合を示す。図９Ｄ：候補から選択された抗体のＤＳＣプロファイル。図９Ｅ：ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体としてフォーマットされたヒト化候補の概要。キメラＯＫＴ３抗体と比較したＨＰＢ−ＡＬＬ染色：（−）は結合なし、（＋）はより弱い結合、（＋＋）は中程度の結合、（＋＋＋）は同程度の結合を示す。図９Ｆ：選択されたｓｃＦｖ−Ｆｃ候補のＤＳＣプロファイル。
【図１０Ａ−Ｂ】これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＳＰ３４ヒト化に関するものである。図１０Ａ：ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされたヒト化候補の概要。図１０Ｂ：ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ）としてフォーマットされたヒト化候補の概要。ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン１−２６Ｆｃ融合タンパク質についてキメラＳＰ３４抗体と比較したＳＰＲデータ：（−）は結合なし、（＋）はより弱い結合、（＋＋）は中程度の結合、（＋＋＋）は強いが同程度ではない結合、（＋＋＋＋）は同程度の結合を示す。
【図１１Ａ−Ｊ】これらの図はすべて、抗ヒトＣＤ３８抗体に関するものである。図１１Ａ：キメラＨＢ−７抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのキメラＨＢ−７抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、１２５、３１、７．８、３．９、１．９、１、及び０．５ｎＭでヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。図１１Ｂ：ヒト化ＨＢ−７ベストフィット(best-fit)抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。図１１Ｃ：ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。図１１Ｄ：ヒト化９Ｇ７ベストフレームワーク(best-framework)抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７ｂベストフレームワーク抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。図１１Ｅ：ヒト７６７抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのヒト７６７抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、及び１５．６ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。親和性は、次の式：Ｒｅｑ＝ＫＡ＊Ｃ＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ＊Ｃ＊ｎ＋１）に従って平衡応答（Ｒｅｑ）対分析物濃度（Ｃ）のプロットから得られた。５０％飽和時の濃度はＫＤである。すべてのＳＰＲデータは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。図１１Ｆ：キメラＨＢ−７及びヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体のＤＳＣプロファイル。図１１Ｇ：キメラ９Ｇ７及びヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体のＤＳＣプロファイル。図１１Ｈ：ヒト化９Ｇ７ベストフレームワーク抗体のＤＳＣプロファイル。図１１Ｉ：ヒト化クローン７６７抗体のＤＳＣプロファイル。図１１Ｊ：９Ｇ７ヒト化抗体の要約表。
【図１２Ａ−Ｃ】代替フォーマットのＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体の模式図。図１２Ａ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１（フォーマットＡ）及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２（フォーマットＢ）抗体。図１２Ｂ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３（フォーマットＣ）及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）（フォーマットＤ））抗体。図１２Ｃ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ１）（フォーマットＥ）抗体。凡例：［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は非機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。
【図１３】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のプロテインＡ精製プロファイル（２８０ｎｍでの吸光度結果）。カラム：１ｍｌ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ。流速：１ｍｌ／分。ランニングバッファー：０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６）。溶出バッファーＮｏ１：２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４）（２０ｍｌ）。溶出バッファーＮｏ２：０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３）（２０ｍｌ）。中和：１Ｍ  トリス（ｐＨ８）の１／１０容量。
【図１４】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体調製物のキャピラリー電気泳動プロファイル。
【図１５Ａ】Ｎ８２ａＳ置換ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図１５Ｂ】Ｎ８２ａＳ非置換ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体バリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。凡例：［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味し、［（Ａ−）］は非機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。溶出のｐＨを示す。
【図１６Ａ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体とヒトＣＤ３イプシロン抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップを、ヒトＣＤ３ガンマ−イプシロン−Ｆｃ融合タンパク質の７４００ＲＵと共有結合させた。１０μｌ／分の流速、５０００、２５００、１２５０、６２５、３１２．５、及び１５６．２５ｎＭで、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体をＨＢＳ−Ｐに注入した。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。親和性は、次の式：Ｒｅｑ＝ＫＡ＊Ｃ＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ＊Ｃ＊ｎ＋１）に従って平衡応答（Ｒｅｑ）対分析物濃度（Ｃ）のプロットから得られた。５０％飽和時の濃度はＫＤである。
【図１６Ｂ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体とヒトＨＥＲ２抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、１５０ＲＵのＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、１０００、３３３、１１１、３７、１２、４．１、１．４、０．５、及び０．１５ｎＭで、ＨＥＲ２−ｈｉｓをＨＢＳ−Ｐに注入した。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。
【図１６Ｃ】それぞれプロフィールＡ及びＢに示される、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体のＤＳＣプロファイル。
【図１７Ａ−Ｇ】ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＭＴＳ法エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。４８時間インキュベーションした３ドナーの平均。抗体濃度をｎＭで示す。図１７Ａ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＢＴ−４７４。図１７Ｂ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＪＩＭＴ−１。図１７Ｃ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体、標的細胞：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１。図１７Ｄ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体、標的細胞：ＮＣＩ−Ｎ８７。図１７Ｅ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体、標的細胞：ＨＴ−１０８０。図１７Ｆ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ１）抗体、標的細胞：ＮＣＩ−Ｎ８７。図１７Ｇ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ１）抗体、標的細胞：ＨＴ−１０８０。
【図１８Ａ−Ｃ】ヒトＰＢＭＣを補充したＪＩＭＴ−１異種移植片。図１８Ａ：ヒトＰＢＭＣは、腫瘍増殖に干渉しない。図１８Ｂ−Ｃ：ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１治療マウス及び非治療マウスの腫瘍体積（ｍｍ３）、４人のヒトＰＢＭＣドナー、マウス４匹のコホート。
【図１９】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（フォーマットＡ）及びＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（フォーマットＢ）抗体の模式図。［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は非機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。
【図２０Ａ】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグ付きタンパク質）をＨＢＳ−Ｐに注入した。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。
【図２０Ｂ】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体ＤＳＣプロファイル。
【図２１】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：精製ヒトＴ細胞。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。４８時間インキュベーションした２ドナーの平均。標的細胞：ＲＰＭＩ  ８２２６。抗体濃度をｎＭで示す。
【図２２】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。４８時間インキュベーションした３ドナーの平均。標的細胞：Ｄａｕｄｉ。抗体濃度をｎＭで示す。
【図２３】ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体の模式図。凡例：［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は非機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。
【図２４】ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＭＴＳ法エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。２０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。４８時間インキュベーションした３ドナーの平均。標的細胞：安定な組換えＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞。抗体濃度をｎＭで示す。
【図２５】ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体の模式図。凡例：［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は非機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。
【図２６】ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＭＴＳ法エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。４８時間インキュベーションした４ドナーの平均。標的細胞：ＨＴ−２９細胞。抗体濃度をｎＭで示す。
【図２７】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）（フォーマットＡ）とＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）（フォーマットＢ）抗体の模式図。［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。
【図２８】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。２４時間インキュベーションした３ドナーの平均。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度をｎＭで示す。
【図２９】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体とヒトＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップを、ヒトＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質の５００ＲＵと共有結合させた。３０μｌ／分の流速、５０、２５、１２．５、６．２、３．１、０．８、及び０．４ｎＭで、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体をＨＢＳ−Ｐに注入した。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。
【図３０】ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。２４時間インキュベーションした３ドナーの平均。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度をｎＭで示す。
【図３１】ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体の模式図。［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。
【図３２】ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。２４時間インキュベーションした３ドナーの平均。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度をｎＭで示す。
【図３３】ＳＰ３４キメラ及びＳｐ３４  Ｈ１Ｌ２１について、ＩｇＧ１からｓｃＦｖ−Ｆｃへの再フォーマット後の相対的発現レベルを示す。ここで劇的な発現の喪失が観察された。
【図３４】Ｔ２７、Ｇ２７ａ、Ｖ２７ｃ、Ｔ２８、Ｔ２９、Ｓ３０、Ｎ３１、Ｙ３２、Ｎ５２、Ｋ５３、Ｒ５４、Ｐ５６、Ｌ９０、Ｙ９２、Ｓ９３、Ｎ９４、及びＬ９５の位置でのアラニンスキャンによるＳＰ３４  Ｈ１Ｌ２１  ＳｃＦｖ−Ｆｃの発現レベルに対する効果を示す。
【図３５】図３５ａは、ＳＰ３４  Ｈ３Ｌ２３  ＳｃＦｖ−Ｆｃの２９位でのランダム突然変異の発現レベルに対する効果を示す；ｂは、ＳＰ３４  Ｈ３Ｌ２３  ＳｃＦｖ−Ｆｃの３０位でのランダム突然変異の発現レベルに対する効果を示す；ｃは、ＳＰ３４  Ｈ５Ｌ２３  ＳｃＦｖ−Ｆｃの９５位でのランダム突然変異の発現レベルに対する効果を示す。
【図３６】複数のヒト化ＳＰ３４についての正規化された発現レベルを示す。
【図３７】複数のＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体のＲＤＬアッセイにおける性能を示す。ここでＣＤ３結合アームは、ｓｃＦｖ（配列番号４０３）として再フォーマットされた元のマウスＳＰ３４、又は重／軽鎖組み合わせＨ１／Ｌ２１（配列番号３６１）、Ｈ５／Ｌ３２（配列番号３１１）、Ｈ５／Ｌ６５（配列番号３９４）、及びＨ５／Ｌ６７（配列番号３９６）を含む修飾ヒト化ＳＰ３４のｓｃＦｖを含む、
【図３８】ラージ細胞集団に対するＣＤ３−リツキシマブＢＥＡＴ二重特異性の効果を示す。
【図３９】ＭＣＦ−７、ＨＣＴ１１６、及びＡ５４９細胞集団におけるアービタックスのＲＤＬアッセイにおける効果を示す。
【図４０】ＭＣＦ−７、ＨＣＴ１１６、及びＡ５４９細胞集団におけるＣＤ３−アービタックスＢＥＡＴ二重特異性のＲＤＬアッセイにおける効果を示す。
【図４１】ＥＧＦＲ  ＰｈａｒｍＤｘ免疫組織化学キット（英国ケンブリッジのＤａｋｏ）を用いて決定された細胞株のＥＧＦＲ状態を示す。
【図４２】ＭＣＦ−７、ＨＣＴ１１６、及びＡ５４９細胞集団におけるベクティビックスのＲＤＬアッセイにおける効果を示す。
【図４３】ＭＣＦ−７、ＨＣＴ１１６、及びＡ５４９細胞集団におけるＣＤ３−ベクティビックスＢＥＡＴ二重特異性抗体のＲＤＬアッセイにおける効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本発明は、一般に、ＣＤ３タンパク質複合体及び疾患関連抗原に結合する新規のヘテロ二量体免疫グロブリンに関する。さらに、これらのヘテロ二量体免疫グロブリンは、プロテインＡへの結合を低減又は排除しているため、アフィニティークロマトグラフィーを用いて非常に高い純度まで精製することができる。
【００７７】
本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形を含み、その逆も同じである。本明細書で用いる用語は、特定の実施態様を説明するためのものであり、限定することを目的としていないことを理解すべきである。
【００７８】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸がペプチド結合を介して結合されて、脱水合成によって一緒に連結されたアミノ酸の鎖を形成するアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリペプチド及びタンパク質は、化学合成又は組換え発現によって合成することができ、最小アミノ酸長に限定されない。
【００７９】
本発明によれば、ポリペプチド群は、タンパク質が単一のポリペプチド鎖からなる限り、「タンパク質」を含む。ポリペプチドは、例えば二量体、三量体、及びより高次のオリゴマー、すなわち一より多いポリペプチド分子からなる多量体をさらに形成することができる。そのような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一でも異なっていてもよい。したがって、そのような多量体の対応する高次構造は、ホモ又はヘテロ二量体、ホモ又はヘテロ三量体などと呼ばれる。ヘテロ多量体の例は、天然に存在する形態の、二の同一軽ポリペプチド鎖と二の同一重ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」はまた、天然に修飾されたポリペプチド／タンパク質を指し、この場合修飾は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等の翻訳後修飾によりなされる。そのような修飾は、当該技術分野でよく知られている。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、天然配列に対して欠失、付加、及び置換等の修飾（本質的に保存的であり得る）を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるなど計画的であってもよく、又はタンパク質を生成する宿主の突然変異若しくはＰＣＲ増幅に起因するエラーによるものなど、偶発的であってもよい。
【００８０】
本明細書で使用する用語「ＣＤ３複合体」は、ＣＤ３（分化クラスター３）Ｔ細胞共受容体として知られているタンパク質複合体を指す(Wucherpfennig KW et al., (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(4): a005140)。ＣＤ３タンパク質複合体は、４の異なる鎖からなる。哺乳動物では、該複合体は、ＣＤ３ｙ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び二のＣＤ３ｅ鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子及びｚ鎖と会合して、Ｔリンパ球に活性化シグナルを生成する(van der Merwe PA & Dushek O (2011) Nat Rev Immunol, 11(1): (47-55)。ＴＣＲ、ｚ鎖、及びＣＤ３分子は、共にＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３ｙ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ｅ鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの、関連性の高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内テールは、ＴＣＲのシグナル伝達能力に不可欠な免疫受容活性化チロシンモチーフ又は略してＩＴＡＭとして知られている単一の保存モチーフを含有する。ＣＤ３はＴ細胞活性化に必要であるため、ＣＤ３を標的とする薬物（通常はモノクローナル抗体）が免疫抑制療法として研究されてきており、今なお継続されている。
【００８１】
本明細書で使用される用語「疾患関連抗原」は、疾患過程に関与する分子を指す。疾患関連抗原の例は、炎症、がん、及び自己免疫疾患など、広範囲の治療領域に見出される。腫瘍学では、疾患関連抗原は、患者集団内のがん、例えば前立腺がんにおけるＥｐＣＡＭ抗原のスクリーニング及び／又はモニタリング及び／又は治療標的化のために広く使用され得る分子である。腫瘍抗原は、腫瘍細胞によって直接的に生成されるか、又は腫瘍の存在への反応として非腫瘍細胞によりに生成され得、好ましい腫瘍抗原は細胞表面分子である。ＴＮＦ−ａ及びＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインを含むがこれらに限定されない炎症性疾患関連抗原が知られている。自己免疫疾患関連抗原もまた知られており、その例には、全身性紅斑性狼瘡における二本鎖ＤＮＡ及びアルツハイマー病におけるアミロイドベータペプチドに対する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書でいう用語「免疫グロブリン」は、用語「抗体」と互換的に使用することができる。免疫グロブリンは、完全長抗体及び任意の抗原結合断片又はその一本鎖を含む。免疫グロブリンは、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。免疫グロブリン、特に天然抗体は、４のポリペプチド鎖から構成されるＹ字型ユニットの一又は複数のコピーとして存在する糖タンパク質である。各「Ｙ」字型は、重（Ｈ）鎖の二の同一コピーと軽（Ｌ）鎖の二の同一コピーとを含有し、それらの相対分子量によって命名される。各軽鎖は重鎖と対をなし、各重鎖はもう一つの重鎖と対をなす。共有結合鎖間ジスルフィド結合及び非共有結合相互作用は、これらの鎖をつなぎ合わせる。免疫グロブリン、特に天然抗体は、抗原結合部位の二のコピーである可変領域を含有する。タンパク質分解酵素であるパパイン(Papain)は、「Ｙ」字型を三の別個の分子、二のいわゆる「Ｆａｂ」又は「ＦＡＢ」断片（Ｆａｂ＝抗原結合断片(fragment antigen binding)）及び一のいわゆる「Ｆｃ」断片又は「Ｆｃ領域」（Ｆｃ＝結晶化可能な断片）に分割する。Ｆａｂ断片は、軽鎖全体及び重鎖の一部からなる。重鎖は、一の可変領域（ＶＨ）及び３又は４の定常領域（抗体クラス又はアイソタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を含有する。ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間の領域はヒンジ領域と呼ばれ、Ｙ字型抗体分子の二のＦａｂアーム間の可動性を付与し、一定の距離で隔てられた二の抗原決定基にうまく結合するように、二のアームが開閉できるようにする。本明細書でいう「ヒンジ領域」は、長さが６−６２アミノ酸の配列領域であり、二の重鎖を架橋するシステイン残基を包含するＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧにのみ存在する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの重鎖は、４の領域、すなわち一の可変領域（ＶＨ）及び三の定常領域（ＣＨ１−３）を各々有する。ＩｇＥ及びＩｇＭは、重鎖上に一の可変領域及び４の定常領域（ＣＨ１−４）を有する。免疫グロブリンの定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び補体系古典経路の第一の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への結合を媒介し得る。各軽鎖は、通常、一の共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結される。各軽鎖は、一の可変領域（ＶＬ）及び一の軽鎖定常領域を含有する。軽鎖定常領域は、本明細書でＩＧＫＣと称されるカッパ軽鎖定常領域であるか、又は本明細書でＩＧＬＣと称されるラムダ軽鎖定常領域である。ＩＧＫＣは、本明細書ではＣｋ又はＣＫと等しく使用され、同じ意味を有する。ＩＧＬＣは、本明細書ではＣλ又はＣＬと等しく使用され、同じ意味を有する。本明細書で使用する用語「ＩＧＬＣ領域」は、すべてのラムダ軽鎖定常領域、例えばＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７からなる群より選択されるすべてのラムダ軽鎖定常領域を指す。ＶＨ及びＶＬ領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ）という領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）という超可変領域にさらに細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３のＣＤＲ及び４のＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。重及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用するエピトープ結合領域を含有する。
操作された免疫グロブリンは、ｓｃＦｖ、ＦＡＢ又はｄＡｂ断片などの異なるエピトープ結合領域フォーマットを包含し得る。これらの断片は、通常、ＩｇＧ  Ｆｃ領域との遺伝的融合によって抗体様構造に組み立てられる。操作された免疫グロブリンは、ヘテロ二量体化増強技術の使用の有無にかかわらず、ホモ又はヘテロ二量体として構築することができ、単一又は二重特異性結合特性を有し得る。
【００８３】
本明細書で使用される用語「完全長抗体」は、可変及び定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を含む。例えば、ヒト及びマウスを含むほとんどの哺乳動物において、ＩｇＧクラスの完全長抗体は四量体であり、二の免疫グロブリン鎖の二の同一の対からなり、各対は一の軽鎖と一の重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリン領域ＶＬと軽鎖定常領域を含み、各重鎖は免疫グロブリン領域ＶＨ、抗体クラス又はアイソタイプに応じてＣＨ１（Ｃｇ１）、ＣＨ２（Ｃｇ２）、ＣＨ３（Ｃｇ３）、ＣＨ４（Ｃｇ４）を含む。いくつかの哺乳動物、例えばラクダ及びラマでは、ＩｇＧ抗体は、二の重鎖のみからなり、各重鎖はＦｃ領域に結合した可変領域を含む。
【００８４】
抗体は、定常領域によって遺伝子学的に決定された、アイソタイプとも呼ばれるクラスに分類される。ヒト定常軽鎖は、カッパ（ＣＫ）及びラムダ（Ｃｋ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（ｍ）、デルタ（ｄ）、ガンマ（ｇ）、アルファ（ａ）又はイプシロン（ｅ）に分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。したがって、本明細書において使用される「アイソタイプ」は、定常領域の化学及び抗原特性により定義される免疫グロブリンのクラス及び／又はサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩＧＨＧ１（ＩｇＧ１）、ＩＧＨＧ２（ＩｇＧ２）、ＩＧＨＧ３（ＩｇＧ３）、ＩＧＨＧ４（ＩｇＧ４）、ＩＧＨＡ１（ＩｇＡ１）、ＩＧＨＡ２（ＩｇＡ２）、ＩＧＨＭ（ＩｇＭ）、ＩＧＨＤ（ＩｇＤ）、及びＩＧＨＥ（ＩｇＥ）である。いわゆるヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、配列決定されているが改変されたスイッチ領域のためにタンパク質をコードしないさらなるヒト免疫グロブリン重定常領域遺伝子である(Bensmana M et al., (1988) Nucleic Acids Res, 16(7): 3108)。改変されたスイッチ領域を有するにも関わらず、ヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、すべての重鎖定常領域（ＣＨ１−ＣＨ３）及びヒンジについてオープンリーディングフレームを有する。その重定常領域についてのすべてのオープンリーディングフレームは、予測される構造的特徴を有するすべてのヒト免疫グロブリン定常領域と良好に整列するタンパク質領域をコードする。このさらなる偽ガンマアイソタイプは、本明細書においてＩｇＧＰ又はＩＧＨＧＰという。ヒト免疫グロブリン重定常領域イプシロンＰ１及びＰ２偽遺伝子（ＩＧＨＥＰ１及びＩＧＨＥＰ２）などの他の偽免疫グロブリン遺伝子が、報告されている。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に用いられる。ヒトにおいてこのクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスにおいてこのクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、及びＩｇＧ３を含む。
【００８５】
本明細書で使用される用語「免疫グロブリン断片」には、（ｉ）例えばＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３領域を含む領域、（ｉｉ）Ｆａｂ′及びＦａｂ′−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ又はＣＫ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１領域からなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一の可変領域からなるｄＡｂ断片(Ward ES et al., (1989) Nature, 341(6242): 544-6)、（ｉｖ）二の連結されたＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖ）ＶＨ領域及びＶＬ領域がペプチドリンカーにより連結されており、二の領域が会合して抗原結合部位を形成するのを可能にしている単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）(Bird RE et al., (1988) Science, 242(4877): 423-6; Huston JS et al., (1988) Proc Natl Acad Sci U S A, 85(16): 5879-83)、（ｖｉ）遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性断片である「ダイアボディ」又は「トリアボディ」(Holliger P et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A, 90(14): 6444-8; Tomlinson I & Holliger P, (2000) Methods Enzymol, 326:461-79)、（ｖｉｉ）Ｆｃ領域と融合したｓｃＦｖ、ダイアボディ又は領域抗体、及び（ｖｉｉｉ）同じか又は異なる抗体と融合したｓｃＦｖが含まれる。
【００８６】
用語「可変領域」は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する領域又はドメインを指す。天然抗体では、抗原結合部位は、特異性を規定する二の可変領域、すなわち一方は重鎖に位置するものであり（本明細書では重鎖可変領域（ＶＨ）という）、他方は軽鎖に位置するもの（本明細書では軽鎖可変領域（ＶＬ）という）からなる。ヒトにおいて、重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、及びＶＨ７の７のサブグループ又はサブクラスに分けることができる。場合によっては、特異性は、ラクダ科に見られる重鎖抗体由来の単一ドメイン抗体のように、二の領域のうちの一にのみ排他的に存在し得る。Ｖ領域は、通常約１１０アミノ酸長であり、７−１７アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極端に可変的な短領域によって隔てられた１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ又は「非ＣＤＲ領域」）と呼ばれるアミノ酸配列の比較的不変のストレッチからなる。天然の重及び軽鎖の可変ドメインは、主にベータシート立体配置を採る４のＦＲを含み、三の超可変領域により連結され、この超可変領域はループを形成する。各鎖において超可変領域は、ＦＲによって緊密に結合され、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（上掲のKabat EAら参照）。本明細書において使用される用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与する。すべての可変領域について、番号付けは、Ｋａｂａｔによる(上掲のKabat EAら）。
【００８７】
複数のＣＤＲの定義が使用されているが、これらは本明細書に包含される。Ｋａｂａｔの定義は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている(上掲のKabat EAら)。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を参照する(Chothia & Lesk J. (1987) Mol Biol, 196: 901-917)。ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている(Martin ACR et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272; Martin ACR et al., (1991) Methods Enzymol, 203: 121-153; Pedersen JT et al., (1992) Immunomethods, 1: 126-136; Rees AR et al., (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172)。接触定義は、最近導入されたものであり(MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol, 262: 732-745)、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋから入手できる利用可能な複合体構造の分析に基づく。ＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）（http://www.imgt.org）によるＣＤＲの定義は、すべての種のすべての免疫グロブリン及びＴ細胞受容体Ｖ領域についてのＩＭＧＴ番号付けに基づいている（ＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）； Lefranc MP et al., (1999) Nucleic Acids Res, 27(1): 209-12; Ruiz M et al., (2000) Nucleic Acids Res, 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res, 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res, 31(1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev Comp Immunol, 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64）。本発明でいうすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）は、好ましくは次のように定義される（上掲のKabat EAらによる番号付け）：ＬＣＤＲ１：２４−３４、ＬＣＤＲ２：５０−５６、ＬＣＤＲ３：８９−９８、ＨＣＤＲ１：２６−３５、ＨＣＤＲ２：５０−６５、ＨＣＤＲ３：９５−１０２。
【００８８】
可変ドメインの「非ＣＤＲ領域」は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られている。本明細書で使用するＶＬ領域の「非ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列：１−２３（ＦＲ１）、３５−４９（ＦＲ２）、５７−８８（ＦＲ３）、及び９９−１０７（ＦＲ４）を含む。本明細書で使用するＶＨ領域の「非ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列：１−２５（ＦＲ１）、３６−４９（ＦＲ２）、６６−９４（ＦＲ３）、及び１０３−１１３（ＦＲ４）を含む。
【００８９】
本発明のＣＤＲは、上記の定義に基づき、次の可変ドメイン残基：ＬＣＤＲ１：２４−３６、ＬＣＤＲ２：４６−５６、ＬＣＤＲ３：８９−９７、ＨＣＤＲ１：２６−３５、ＨＣＤＲ２：４７−６５、ＨＣＤＲ３：９３−１０２を有する「拡張ＣＤＲ」を含み得る。これらの拡張ＣＤＲは、上掲のKabatらにより同様に番号付けされる。本明細書で使用するＶＬ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列：１−２３（ＦＲ１）、３７−４５（ＦＲ２）、５７−８８（ＦＲ３）、及び９８−およそ１０７（ＦＲ４）を含む。本明細書で使用するＶＨ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列：１−２５（ＦＲ１）、３７−４６（ＦＲ２）、６６−９２（ＦＲ３）、及び１０３−およそ１１３（ＦＲ４）を含む。
【００９０】
本明細書で使用する用語「Ｆａｂ」若しくは「ＦＡＢ」又は「Ｆａｂ領域」若しくは「ＦＡＢ領域」には、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及び軽鎖定常免疫グロブリン領域を含むポリペプチドが含まれる。Ｆａｂは、この領域単独を指すか、又は完全長抗体若しくは抗体断片におけるこの領域を指す。
【００９１】
用語「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」は、本明細書で用いる場合、抗体重鎖の定常領域を含むポリペプチドを含むが、第一の定常領域免疫グロブリン領域は除く。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の二の定常領域免疫グロブリン領域、又はＩｇＥ及びＩｇＭの最後の三の定常領域免疫グロブリン領域、及びこれらの領域に対してＮ末端側の可撓性ヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃは、免疫グロブリン領域Ｃガンマ２及びＣガンマ３（Ｃｙ２及びＣｙ３）並びにＣガンマ１（Ｃｙｌ）とＣガンマ２（Ｃｙ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、そのカルボキシル末端に対する残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むように通常定義され、この場合の番号付けはＥＵインデックスによる。Ｆｃは、この領域単独を指すか、又はＦｃポリペプチド（例えば抗体）におけるこの領域を指す。
【００９２】
本明細書で用いる用語「免疫グロブリン定常領域」は、ヒト又は動物種由来の免疫グロブリン又は抗体重鎖定常領域を指し、またすべてのアイソタイプを包含する。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒト由来であり、限定されないが、ＩＧＨＧ１  ＣＨ１、ＩＧＨＧ２  ＣＨ１、ＩＧＨＧ３  ＣＨ１、ＩＧＨＧ４  ＣＨ１、ＩＧＨＡ１  ＣＨ１、ＩＧＨＡ２  ＣＨ１、ＩＧＨＥ  ＣＨ１、ＩＧＨＥＰ１  ＣＨ１、ＩＧＨＭ  ＣＨ１、ＩＧＨＤ  ＣＨ１、ＩＧＨＧＰ  ＣＨ１、ＩＧＨＧ１  ＣＨ２、ＩＧＨＧ２  ＣＨ２、ＩＧＨＧ３  ＣＨ２、ＩＧＨＧ４  ＣＨ２、ＩＧＨＡ１  ＣＨ２、ＩＧＨＡ２  ＣＨ２、ＩＧＨＥ  ＣＨ２、ＩＧＨＥＰ１  ＣＨ２、ＩＧＨＭ  ＣＨ２、ＩＧＨＤ  ＣＨ２、ＩＧＨＧＰ  ＣＨ２、ＩＧＨＧ１  ＣＨ３、ＩＧＨＧ２  ＣＨ３、ＩＧＨＧ３  ＣＨ３、ＩＧＨＧ４  ＣＨ３、ＩＧＨＡ１  ＣＨ３、ＩＧＨＡ２  ＣＨ３、ＩＧＨＥ  ＣＨ３、ＩＧＨＥＰ１  ＣＨ３、ＩＧＨＭ  ＣＨ３、ＩＧＨＤ  ＣＨ３、ＩＧＨＧＰ  ＣＨ３、ＩＧＨＥ  ＣＨ４、及びＩＧＨＭ  ＣＨ４からなる群より選択される。好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトのＩＧＨＥ  ＣＨ２、ＩＧＨＭ  ＣＨ２、ＩＧＨＧ１  ＣＨ３、ＩＧＨＧ２  ＣＨ３、ＩＧＨＧ３  ＣＨ３、ＩＧＨＧ４  ＣＨ３、ＩＧＨＡ１  ＣＨ３、ＩＧＨＡ２  ＣＨ３、ＩＧＨＥ  ＣＨ３、ＩＧＨＭ  ＣＨ３、ＩＧＨＤ  ＣＨ３、及びＩＧＨＧＰ  ＣＨ３からなる群より選択される。より好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトのＩＧＨＧ１  ＣＨ３、ＩＧＨＧ２  ＣＨ３、ＩＧＨＧ３  ＣＨ３、ＩＧＨＧ４  ＣＨ３、ＩＧＨＡ１  ＣＨ３、ＩＧＨＡ２  ＣＨ３、ＩＧＨＥ  ＣＨ３、ＩＧＨＭ  ＣＨ３、ＩＧＨＤ  ＣＨ３、及びＩＧＨＧＰ  ＣＨ３からなる群より選択される。
【００９３】
用語「エピトープ結合領域」は、一又は複数のエピトープへの免疫グロブリン分子の特異的結合を可能にする最低限のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその断片を含む。天然抗体は、抗原結合部位又はパラトープとしても知られている、二のエピトープ結合領域を有する。天然抗体中のエピトープ結合領域は、ＶＨ及び／又はＶＬドメインのＣＤＲ領域内に限られ、そこでアミノ酸媒介性のエピトープ結合が見出される。天然抗体の他に、合成ＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン又はそれらの断片及びそれらの組み合わせを操作して、エピトープ結合領域を提供することができる(Holt LJ et al., (2003) Trends Biotechnol, 21(11): 484-490; Polonelli Let al., (2008) PLoS ONE, 3(6): e2371)。非免疫グロブリンに基づくエピトープ結合領域の例は、エピトープ結合領域を操作するための「スカフォールド」として用いられる合成タンパク質ドメイン(Binz HKet al., (2005) Nat Biotechnol, 23(10): 1257-1268)又はペプチド模倣体(Murali R & Greene MI (2012) Pharmaceuticals, 5(2): 209-235)に見出すことができる。好ましくは、用語「エピトープ結合領域」は、一又は複数のエピトープへの免疫グロブリン分子の特異的結合を可能にする結合部位を共に形成する、一又は複数の重鎖可変ドメインと一又は複数の相補的な軽鎖可変ドメインとの組み合わせを含む。本発明に示されるエピトープ結合領域の例は、ｓｃＦｖ及びＦＡＢを含む。
【００９４】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、動物において、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性又は免疫原性活性を有するポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子の断片を含む。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するポリペプチド又はタンパク質の断片である。免疫原性活性を有するエピトープは、当業者にとって周知の任意の方法、例えばイムノアッセイにより決定されるような、抗体又はポリペプチドが特異的に結合するポリペプチド又はタンパク質の断片である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。好ましくは、本明細書で用いる用語「エピトープ」は、少なくとも約３から５個、好ましくは約５から１０個又は１５個であって約１０００個以下（又はその間の任意の整数）のアミノ酸のポリペプチド配列を指し、それだけで又はより長い配列の一部として、かかる配列に応答して生成された抗体に結合する配列を定義する。断片の長さについて上限臨界値は存在せず、ほぼ完全長のタンパク質配列、又は一若しくは複数のエピトープを含む融合タンパク質さえも含み得る。主題発明における使用のためのエピトープは、由来元の親タンパク質の部分配列と完全に一致する配列を有するポリペプチドに限定されない。したがって、用語「エピトープ」は、天然配列と同一の配列の他、天然配列に対する修飾、例えば欠失、付加、及び置換（一般的に天然では保存的）を包含する。タンパク質抗原のエピトープは、その構造及びエピトープ結合部位との相互作用に基づき、立体構造エピトープ(conformational epitope)と直線状エピトープ(linear epitope)の二のカテゴリーに分けられる(Goldsby R et al., (2003) “Antigens (Chapter 3)” Immunology (Fifth edition ed.), New York: W. H. Freeman and Company. pp. 57-75, ISBN 0-7167-4947-5)。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続なセクションから構成される。このエピトープは、抗原の３Ｄ表面特性及び形状又は三次構造に基づき、パラトープと相互作用する。ほとんどのエピトープは、立体構造エピトープである。対照的に、直線状エピトープは、その一次構造に基づき、パラトープと相互作用する。直線状エピトープは、抗原由来の連続的なアミノ酸配列により形成される。
【００９５】
本明細書で用いる用語「ヘテロ二量体免疫グロブリン」又は「ヘテロ二量体断片」又は「ヘテロ二量体」又は「重鎖のヘテロ二量体」は、第一及び第二の領域のような少なくとも第一及び第二のポリペプチドを含む免疫グロブリン分子又はその部分を含み、この場合第二のポリペプチドは第一のポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、二のポリペプチド鎖を含み、第一の鎖は第二の鎖と少なくとも一の非同一領域を有し、両方の鎖はそれらの非同一領域を介して会合、すなわち相互作用する。より好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、少なくとも二の異なるリガンド、抗原又は結合部位に対して結合特異性を有する、すなわち二重特異性である。本明細書で用いるヘテロ二量体免疫グロブリンは、限定されないが、完全長二重特異性抗体、二重特異性Ｆａｂ、二重特異性Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ領域と融合した二重特異性ｓｃＦｖ、Ｆｃ領域と融合したダイアボディ、及びＦｃ領域と融合したドメイン抗体を含む。
【００９６】
本明細書で用いる用語「ホモ二量体免疫グロブリン」又は「ホモ二量体断片」又は「ホモ二量体」又は「重鎖のホモ二量体」は、第一及び第二の領域のような少なくとも第一及び第二のポリペプチドを含む免疫グロブリン分子又はその部分を含み、この場合第二のポリペプチドは第一のポリペプチドとアミノ酸配列が同一である。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリンは、二のポリペプチド鎖を含み、第一の鎖は第二の鎖と少なくとも一の同一領域を有し、両方の鎖はそれらの同一領域を介して会合、すなわち相互作用する。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリン断片は、少なくとも二の領域を含み、第一の領域は、第二の領域と同一であり、また両方の領域は、そのタンパク質−タンパク質界面を介して会合、すなわち相互作用する。
【００９７】
本発明に含まれるすべての免疫グロブリン定常領域に関して、番号付けは、ＩＭＧＴ（登録商標）（上掲のＩＭＧＴ（登録商標））に従って行うことができる。
【００９８】
ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、及びＩＧＨＧ４からなる群より選択されるすべてのヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常領域に関して、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」(Edelman GM et al., (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85)に従って行うことができる。ＩＧＨＧ１のヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３定常領域の完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（上掲のＩＭＧＴ（登録商標））に見出すことができる。
【００９９】
ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＫＣ）に関して、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」（上掲のEdelman GMら）に従って行うことができる。ヒトＣＫ領域の完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（上掲のＩＭＧＴ（登録商標））に見出すことができる。
【０１００】
ヒトラムダ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７）に関して、番号付けは、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」（上掲のKabat EAら）に従って行うことができる。ヒトＩＧＬＣ領域の完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（上掲のＩＭＧＴ（登録商標））に見出すことができる。
【０１０１】
本明細書でいうヒトＩＧＨＧ１免疫グロブリン重鎖定常領域は、次の領域境界を有する：ＣＨ１領域（ＥＵ番号付け：１１８−２１５）、ヒンジｙ１領域（ＥＵ番号付け：２１６−２３０）、ＣＨ２領域（ＥＵ番号付け：２３１−３４０）、及びＣＨ３領域（ＥＵ番号付け：３４１−４４７）。本明細書でいうヒトＣＫ領域は、残基１０８から２１４（ＥＵ番号付け）に及ぶ。本明細書でいうヒトＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７領域は、残基１０８−２１５（Ｋａｂａｔ番号付け）に及ぶ。
【０１０２】
本明細書で用いる用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含む。好ましくは、天然アミノ酸が含まれる。
【０１０３】
本明細書における用語「修飾」又は「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含む。本明細書で用いる用語「置換」又は「アミノ酸置換」又は「アミノ酸残基置換」は、アミノ酸配列内の第一のアミノ酸残基の第二のアミノ酸残基での置換を指し、この場合、第一のアミノ酸残基は第二のアミノ酸残基とは異なる（すなわち置換アミノ酸残基は置換されたアミノ酸とは異なる）。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、９４位のアルギニンがリジンで置換されているバリアントポリペプチドを意味する。例えば、９４Ｋは、９４位のリジンでの置換を表す。本明細書の場合、多重置換は、スラッシュ又は読点により通常区別される。例えば、「Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖ」又は「Ｒ９４Ｋ、Ｌ７８Ｖ」は、置換Ｒ９４ＫとＬ７８Ｖとを含む二重バリアントを指す。本明細書で用いる「アミノ酸挿入」又は「挿入」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入−９４は、９４位における挿入を表す。本明細書で用いる「アミノ酸欠失」又は「欠失」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４位におけるアルギニンの欠失を表す。
【０１０４】
特定の実施態様において、プロテインＡへの結合が「減少する」、「低下する」又はその「低下」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、標準的な技術の既知の方法（例えば本明細書に記載の方法）により検出される修飾免疫グロブリン又はその断片のプロテインＡへの結合が全体として少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％、最大１００％（排除）減少することを意味する。ある特定の実施態様において、これらの用語は、代わりに１０倍（すなわち１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１０００倍（すなわち３ｌｏｇ）、１００００倍（すなわち４ｌｏｇ）又は１０００００倍（すなわち５ｌｏｇ）の全体的な減少を意味し得る。
【０１０５】
プロテインＡへの結合を「排除する」、「取り除く」、その「排除」又は「除去」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、標準的な技術の既知の方法（例えば本明細書に記載の方法）により検出される修飾免疫グロブリン又はその断片のプロテインＡへの結合が全体として１００％減少することを意味する。
【０１０６】
同様に、アフィニティー試薬への結合が「減少する」、「低下する」又はその「低下」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、標準的な技術の既知の方法（例えば本明細書に記載の方法）により検出される修飾免疫グロブリン又はその断片のアフィニティー試薬への結合が全体として少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％、最大１００％（排除）減少することを意味する。ある特定の実施態様において、これらの用語は、代わりに１０倍（すなわち１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１０００倍（すなわち３ｌｏｇ）、１００００倍（すなわち４ｌｏｇ）又は１０００００倍（すなわち５ｌｏｇ）の全体的な減少を意味し得る。
【０１０７】
アフィニティー試薬への結合を「排除する」、「取り除く」、その「排除」又は「除去」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、標準的な技術の既知の方法（例えば本明細書に記載の方法）により検出される修飾免疫グロブリン又はその断片のアフィニティー試薬への結合が全体として１００％減少することを意味する。
【０１０８】
「二重特異性抗体」は、少なくとも二の異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、二重特異性抗体は、親抗体と比較して、ＶＨ領域内に一又は複数のアミノ酸修飾を有する二重特異性抗体である。特定の実施態様において、二重特異性抗体は、ヒト又はヒト化抗体であり得る。二重特異性抗体はまた、標的抗原を発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化させるためにも用いられ得る。このような抗体は、標的抗原結合アームと、細胞傷害性剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−ａ、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性同位体ハプテン等）に結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野で知られている。従来、二重特異性抗体の組換え製造は、二対の免疫グロブリン重鎖−軽鎖の共発現に基づき、この場合二の重鎖は異なる特異性を有する(Milstein and Cuello, (1983) Nature, 305: 537-40)。免疫グロブリン重及び軽鎖がランダムな取り合わせゆえに、そのハイブリドーマ（クアドローマ）は、異なる抗体分子の混合物を生成する可能性があり、そのうちの一のみが正しい二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー工程により通常行われる正しい分子の精製は面倒であり、生成物収率は低い。類似の手順が、国際公開第９３／０８８２９号及びTrauneckerらの(1991) EMBO J, 10: 3655-9に開示されている。異なるアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変領域（抗体−抗原結合部位）が免疫グロブリン定常領域配列と融合している。融合は例えば、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とである。特定の実施態様において、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、少なくとも一の融合体中に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体及び（所望の場合には）免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、異なる発現ベクターに挿入され、適する宿主生物内にコトランスフェクトされる。こうすれば、構築で用いられる三のポリペプチド鎖の比が等しくなく、そのような比が最適な収率を実現するような実施態様においては、三のポリペプチド断片の相互の割合を調整する際に柔軟性が得られる。しかし、少なくとも二のポリペプチド鎖が等しい比率で発現することで収率が高くなるとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、二又は三すべてのポリペプチド鎖のコード配列を一の発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１０９】
二重特異性抗体は、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方はアビジンに、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対する免疫系細胞を標的とするために（米国特許第４６７６９８０号）、またＨＩＶ感染症の治療用に（国際公開第１９９１／００３６０号、国際公開第１９９２／００３７３号、及びＥＰ第０３０８９号）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は、いくつかの架橋法と共に当該技術分野において周知である（米国特許第４６７６９８０号を参照）。二価より多い抗体も企図されている。例えば、三重特異性抗体を調製することできる（Tutt A et al. (1991) J. Immunol. 147: 60-9を参照)。
【０１１０】
いくつかの実施態様では、本開示は、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはその断片、又はＣＤ３と、腫瘍抗原、サイトカイン、血管増殖因子、及びリンパ脈管新生増殖因子(lympho−angiogenic growth factor)の群内より選択される疾患関連抗原とに結合する二重特異性完全長抗体を提供する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはその断片又は二重特異性抗体は、ＣＤ３と、ＣＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＲＴＨ２、ＰＤＬ１、ＢＬＵＴ１、ＰｉｒＢ、ＣＤ３３、ＴＲＯＰ２、ＣＤ１０５、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＮＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ１２３、ＡＤＡＭ１７、ＭＣＳＰ、ＰＳＣＡ、ＦＯＬＲ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＩｇＥ、インテグリンａ４ｂ１、ＣＣＲ５、ルイスＹ、ＦＡＰ、ＭＵＣ−１、Ｗｕｅ−１、ＭＳＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｐ−糖タンパク質、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、メソセリン、ＯＸ４０、ＣＡ１２５、ＣＡＩＸ、ＣＤ６６ｅ、ｃＭｅｔ、ＥｐｈＡ２、ＨＧＦ／ＳＦ、ＭＵＣ１、ホスファチジルセリン、ＴＡＧ−７２、ＰＢＧ、Ｂ−カテニン、ｂｒｃ−ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、カスパーゼ−８、ＣＤＫ４、Ｃｙｃｌｉｎ−Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、Ｆｒａ−１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン−３、ＧＭ３、ｇｐ１００、ＨＬＡ／Ｂ−ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ−ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ−Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＭＡＧＥ６、ＭＡＧＥ１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＬ−ＩＡＰ、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ−ＢＲ１、ＮＹ−ＢＲ６２、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＥＳＯ１、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３  ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ−１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、Ｓｔｅａｐ−１、Ｓｔｅａｐ−２、サバイビン、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−B、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｎ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ウロプラキン−３、ＰＳＭＡ．からなる群より選択される疾患関連抗原とに結合する。好ましくは、二重特異性ヘテロ二量体免疫グロブリン若しくはその断片又は二重特異性抗体は、ＣＤ３とＨＥＲ２、又はＣＤ３とＣＤ３８、又はＣＤ３とＯＸ４０、又はＣＤ３とＣＤ１９、又はＣＤ３とＣＤ２０、又はＣＤ３とＥｒｂｉｔｕｘ、又はＣＤ３とＶｅｃｔｉｂｉｘとに結合する。
【０１１１】
プロテインＡ：プロテインＡは、いくつかの系統の黄色ブドウ球菌により産生される細胞壁成分であり、単一のポリペプチド鎖から構成される。プロテインＡ遺伝子産物は、病原体の細胞壁と縦列に並んで連結した５の相同的リピート（homologous repeat）から構成される。５のドメインは、長さ約５８のアミノ酸であり、ＥＤＡＢＣで表され、各々は免疫グロブリン結合活性を示す（Tashiro M & Montelione GT (1995) Curr. Opin. Struct. Biol., 5(4): 471-481）。５の相同的免疫グロブリン結合ドメインは、３ヘリックス束状に折り畳まれている。各ドメインは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質、とりわけＩｇＧに結合することができる（Hober S et al., (2007) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 848(1): 40-47）。プロテインＡは、Ｆｃ領域内でほとんどの免疫グロブリンの重鎖に結合するだけでなく、ヒトＶＨ３ファミリーの場合にはＦａｂ領域内でも結合する（Jansson B et al, (1998) FEMS Immunol. Med. Microbiol., 20(1): 69-78）。プロテインＡは、ヒト、マウス、ウサギ、及びモルモットを含む様々な種に由来するＩｇＧに結合するが、ヒトＩｇＧ３には結合しない（上掲のHober Sら(2007)）。ヒトＩｇＧ３がプロテインＡに結合できないのは、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域内のＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ置換により説明可能である（ＥＵ番号付け、Jendeberg et al., (1997) J. Immunol. Methods, 201(1): 25-34）。プロテインＡは、ＩｇＧの他に、ＩｇＭ及びＩｇＡとも相互作用する。
【０１１２】
ヒトＶＨサブクラスの中でも、ＶＨ３は、プロテインＡに結合する唯一のサブクラスであり(Graille M et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10): 5399-5404)、プロテインＡの５のドメインはすべて、この可変ドメインサブクラスに結合することが知られている(Jansson B et al, (1998) FEMS Immunol. Med. Microbiol., 20(1): 69-78.)。ＶＨ３ベースの免疫グロブリン又はその断片は、バイオテクノロジー産業にとって多大な重要性を有する。ＶＨ３ベースの分子がプロテインＡに結合する能力は該分子の機能的な事前スクリーニングをし易くするので、ＶＨ３ベースの分子は幅広く開発されており、したがって抗体探索のために用いられる多くの合成若しくはドナーベースのファージディスプレイライブラリー又はトランスジェニック動物技術は、ＶＨ３サブクラスに基づく。さらに、ＶＨ３ベースの分子は、他の既知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも良好な発現及び安定性のためにしばしば選択される。
【０１１３】
そのように高い親和性で抗体に結合するプロテインＡの能力は、バイオ医薬品においてそれを工業的規模で使用する強い動機付けとなる。バイオ医薬品における抗体の製造のために使用されるプロテインＡは、大腸菌内での組換えにより通常製造され、天然のプロテインＡと実質的に同様に機能する（Liu HFet al., (2010) MAbs, 2(5): 480-499）。
最も一般的には、組換えプロテインＡは、抗体精製用の固定相クロマトグラフィー樹脂に結合される。最適な結合はｐＨ８．２で生ずるが、中性又は生理学的状態（ｐＨ７．０−７．６）においても結合は良好である。溶出は、酸性ｐＨ（グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５−３．０）に対してｐＨを変化させることにより通常達成される。この溶出法は、タンパク質構造に永久的な影響を及ぼすことなく、ほとんどのタンパク質−タンパク質及び抗体−抗原結合相互作用を効率的に解離させる。それにもかかわらず、一部の抗体及びタンパク質は、低ｐＨにより損傷を受けることもあり、低ｐＨ条件に置かれる時間を最低限に抑えるために、回収直後に１／１０容量のアルカリ性バッファー、例えば１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加することにより中和するのが最善である。
【０１１４】
様々なプロテインＡクロマトグラフィー樹脂が市販されている。このような媒体間の主な差異は、支持マトリックスのタイプ、プロテインＡのリガンド修飾、ポアサイズ、及び粒子サイズである。このような因子の差異は、吸着剤の圧縮性、化学的及び物理的ロバスト性、拡散抵抗、及び結合能力の差異の原因となる（上掲のHober Sら(2007))。プロテインＡクロマトグラフィー樹脂の例は、実施例で用いられている、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡ樹脂及びＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭプロテインＡ樹脂を含む（但しこれらに限定されない）。
【０１１５】
用語「クロマトグラフィー」は、タンパク質液体クロマトグラフィーを指し、タンパク質の混合物を分析又は精製するのに多くの場合用いられる液体クロマトグラフィーの形態の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を含む。その他の形態のクロマトグラフィーと同様に、分離は、混合物の異なる成分が二の物質、多孔性の固体（固定相）とそれを通過する移動流体（移動相）に対して異なる親和性を有するので、可能である。ＦＰＬＣでは、移動相は、水溶液又は「バッファー」である。バッファーの流速は、自然流下で操作可能であるか、又は一定速度に通常保たれる容量型ポンプにより制御可能であり、一方バッファーの組成は、二以上の外部リザーバーから異なる割合で液体を出すことにより変えることができる。固定相は、ビーズから、通常は架橋アガロースから構成される樹脂であり、円筒形のガラス又はプラスチック製のカラムに充填される。ＦＰＬＣ樹脂は、用途に応じて、幅広い範囲のビーズサイズ及び表面リガンドが利用可能である。
【０１１６】
「アフィニティークロマトグラフィー」のプロセスは、固定相に架橋していて、かつ特定の分子又は分子のクラスに対して結合親和性を有するリガンドであるアフィニティー試薬の使用を伴う。リガンドは、タンパク質リガンドのような生体分子か又は合成分子であり得る。いずれの種類のリガンドも、良好な特異性を有する傾向がある。製造において最も一般的に用いられるタンパク質リガンドは、アフィニティー試薬のプロテインＡである。アフィニティークロマトグラフィーでは、溶液（例えば目的のタンパク質を含有する粗製細胞上清）をカラム上に充填すると、標的タンパク質は通常吸着される一方で、汚染物質（その他のタンパク質、脂質、炭水化物、ＤＮＡ、色素等）はカラムを通過することができる。吸着剤自体はクロマトグラフィーカラムに通常充填されるが、吸着段階は、バッチ結合モードで撹拌したスラリーとして吸着剤を用いることにより実施可能である。吸着後の次の段階は洗浄段階であり、この段階では、残留汚染物質を除去するために吸着剤を洗浄する。次いで、結合したタンパク質を半純粋又は純粋な形態で溶出する。溶出は、タンパク質が固定リガンドともはや相互作用できず、遊離するように、バッファー又は塩組成を変更することにより通常達成される。いくつかの例では、目的のタンパク質はアフィニティー樹脂に結合しないこともあり得、アフィニティークロマトグラフィーは望ましくない汚染物質を結合させることに向けられる。そのため、非結合画分を回収して目的のタンパク質を単離する。アフィニティークロマトグラフィーは、固定床又は流動床内でも実施可能である。
【０１１７】
用語「勾配モードクロマトグラフィー」は、「溶出」バッファー（バッファーＢ）の割合が漸進的又は段階的に０％から１００％増加するクロマトグラフィー法を指す。
【０１１８】
用語「捕捉溶出モード（capture−elution mode）クロマトグラフィー」又は「捕捉溶出精製モード」又は「捕捉溶出精製」は、「溶出」バッファー（バッファーＢ）の割合が漸進的又は段階的に０％から１００％増加するのではなく、捕捉後に１００％でそのまま適用され、任意選択的にランニングバッファー（バッファーＡ）による洗浄工程を伴うクロマトグラフィー法を指す。
【０１１９】
ＣＤ３を標的とするヘテロ二量体免疫グロブリンの開発
本発明は、上記のような重及び軽鎖ＣＤＲを含み、かつヒト遺伝子ＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２２）の産物であるか又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域をさらに含むＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体ＯＫＴ３の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。好ましくは、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。一般的に、７以下、好ましくは６以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、なお一層好ましくは２以下、最も好ましくは１以下のアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施態様において、本開示は、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供するが、この場合重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は３４、４８、４９、５８、６９、７１、及び７３からなる群より選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置はＫａｂａｔ番号付けに基づいて示される。好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、Ｉ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ、Ｒ５８Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋからなる群より選択される。重鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、３４、４９、及び７１からなる群より選択されるアミノ酸位置にある。重鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔからなる群より選択される。
【０１２０】
さらなる態様において、ＣＤ３タンパク質複合体に結合する第一のポリペプチドのエピトープ結合領域は、ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号２３）及びＩＧＫＶ３−２０＊０１（配列番号２４）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるか又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体ＯＫＴ３の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。好ましくは、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。一般的に、８以下、好ましくは７以下、好ましくは６以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、なお一層好ましくは２以下、最も好ましくは１以下のアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施態様において、本開示は、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供するが、この場合軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は４、３３、３４、４６、４７、６６、７１、及び９６からなる群より選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む。好ましくは、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、Ｍ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆからなる群より選択される。軽鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、４、４６、及び４７からなる群より選択されるアミノ酸位置にある。軽鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙ．からなる群より選択される。いくつかの実施態様において、ＣＤ３タンパク質複合体と結合する第一のポリペプチドのエピトープ結合領域は、上記のような重鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾、及び上記のような軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾を含み得る。
【０１２１】
本開示はまた、配列番号２７から３８、６４−６８、及び３５９からなる群より選択され、好ましくは配列番号３５９からなる選択される重鎖配列を含むＣＤ３タンパク質複合体に結合する抗体又はその断片も提供する。本開示はまた、配列番号３９から４７、６９から９０、３６０、３９９、及び４００からなる、好ましくは配列番号３６０からなる群より選択される軽鎖配列を含むＣＤ３タンパク質複合体に結合する抗体又はその断片も提供する。
【０１２２】
このような重及び軽鎖可変領域配列の各々がＣＤ３タンパク質複合体に結合可能であることを踏まえれば、重及び軽鎖可変領域配列を「混合してマッチさせ」て、本発明の抗ＣＤ３結合分子を作り出すことができる。かかる「混合してマッチさせ」た抗体のＣＤ３結合は、例えば実施例に記載のような結合アッセイを用いて試験可能である。
【０１２３】
ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を促進する免疫グロブリン定常領域の操作
ヘテロ二量体免疫グロブリンを製造する方法は、当該技術分野において知られており、最も単純な方法の一つは、単一細胞内での二の異なる免疫グロブリン鎖の発現を利用することである（国際公開第９５／３３８４４号、Lindhofer H & Thierfelder S）。操作を用いないこの単純な方法は、目的のヘテロ二量体よりもホモ二量体種が形成されることにより制限される（Kufer P et al., (2004) Trends Biotechnol., 22(5): 238-244）。重鎖のヘテロ二量化を強化する補完的な技術（Merchant AM et al., (1998) Nat. Biotechnol., 16(7): 677-681）を用いると、より多くのヘテロ二量体の製造が実現し得るが、なおも相当量の望ましくないホモ二量体の製造を引き起こす(Jackman J et al., (2010) J Biol Chem., 285(27):20850-9, Klein C et al., (2012) MAbs, 4(6):653-63)。それゆえ本発明は、ＢＥＡＴ（登録商標）法に記載されている方法を利用するが（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２／１３１５５５号）、同方法は先行技術の方法よりも優れたヘテロ二量体化を示すバイオミミクリーという独自の概念に基づく。ＢＥＡＴ法は、天然ホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメイン対間の界面交換に基づき、Ｆｃベースの二重特異性抗体の構成要素として利用可能な新規のヘテロ二量体を作り出す。
【０１２４】
一態様において、本発明は、第一及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供するが、その第一及び第二のポリペプチドはタンパク質−タンパク質界面を有する修飾ＣＨ３ドメインを持つ操作された免疫グロブリン定常領域を含み、この場合第一のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、この場合第二のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は８４．４位に、並びに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含む。
【０１２５】
さらなる実施態様において、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供するが、その第一及び第二のポリペプチドはタンパク質−タンパク質界面を有する修飾ＣＨ３ドメインを持つ、操作された免疫グロブリン定常領域を含み、この場合第一のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は８８位に、並びに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、この場合第二のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は８５．１位及び／又は８６位に、並びに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域の８８位で置換されるアミノ酸残基は、第二の操作された免疫グロブリン定常領域の８５．１位及び／又は８６位で置換されるアミノ酸残基と相互作用しており、ここで各群メンバーのアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
【０１２６】
好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で８８位において置換されるアミノ酸残基は、８８Ｗ及びその保存的なアミノ酸置換であり、ここでアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。より好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で８８位において置換されるアミノ酸残基は、８８Ｗであり、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ａ、２０Ｖ、２０Ｔ、２０Ａ、２０Ｎ、２０Ｑ、２０Ｅ、２０Ｓ、２０Ｋ、２０Ｗ、２２Ａ、２２Ｇ、２２Ｔ、２２Ｌ、２２Ｉ、２２Ｖ、２６Ｒ、２６Ｑ、２６Ｔ、２６Ｋ、２６Ｖ、２６Ｓ、２６Ｎ、２６Ｅ、７９Ｙ、８５．１Ｔ、８５．１Ｍ、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｒ、８５．１Ｈ、８５．１Ｋ、８５．１Ｆ、８５．１Ｃ、８５．１Ｎ、８５．１Ｗ、８６Ｓ、８６Ｉ、８６Ｔ、８６Ｈ、８６Ｑ、８６Ｖ、８６Ｗ、８６Ｙ、８６Ｆ、及び９０Ｎからなる群より選択され、ここでアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
【０１２７】
好ましくは、第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で８５位及び８６位において置換されるアミノ酸残基は、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｃ、及び８６Ｓ並びにそれらの保存的なアミノ酸置換からなる群より選択される（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）。より好ましくは、第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｃ、及び８６Ｓからなる群より選択され、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ｅ、５Ａ、７Ｆ、２０Ｔ、２２Ｖ、２６Ｔ、８１Ｄ、８４Ｌ、８４．２Ｅ、８８Ｒ、及び９０Ｒ並びにそれらの保存的なアミノ酸置換からなる群より選択される（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）。
【０１２８】
好ましい実施態様において、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、８８位において置換されるアミノ酸残基は、８８Ｗであり、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ａ、２０Ｋ、２２Ｖ、２６Ｔ、７９Ｙ、８５．１Ｓ、８６Ｖ、及び９０Ｎであり、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、８５．１位及び８６位において置換されるアミノ酸残基は、８５．１Ａ、８５．１Ｓ又は８５．１Ａ、及び８６Ｓであり、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ｅ、５Ａ、７Ｆ、２０Ｔ、２２Ｖ、２６Ｔ、８１Ｄ、８４Ｌ、８４．２Ｅ、８４．４Ｑ、８８Ｒ、及び９０Ｒである（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）。
【０１２９】
代替的実施態様において、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供するが、その第一及び第二のポリペプチドはタンパク質−タンパク質界面を有する修飾ＣＨ３ドメインを持つ、操作された免疫グロブリン定常領域を含み、この場合第一のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は２０位に、並びに３、５、７、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、この場合第二のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は２６位に、並びに３、２２、２７、７９、８１、８４、８５．１、８６、及び８８からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域内の２０位で置換されるアミノ酸残基は、第二の操作された免疫グロブリン定常領域内の２６位で置換されるアミノ酸残基と相互作用しており、
ここで各群メンバーのアミノ酸位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
【０１３０】
好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２０位及び２２位にアミノ酸残基を含み、また任意選択的に３、５、７、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置にさらなるアミノ酸残基を含み、この場合第二の操作された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２６位に、並びに３、５、７、２０、２２、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択されるさらなる位置にアミノ酸残基を含み、ここで各群メンバーのアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２０位及び２２位にアミノ酸残基を含み、また任意選択的に３、５、７、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置にさらなるアミノ酸残基を含み、この場合第二の操作された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２６位及び８６位に、並びに任意選択的に３、５、７、２０、２２、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択されるさらなる位置にアミノ酸残基を含み、ここで各群メンバーのアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
【０１３１】
より好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で２０位において置換されるアミノ酸残基は、２０Ｖ、２０Ｔ、２０Ａ、２０Ｎ、２０Ｑ、２０Ｋ、２０Ｓ、２０Ｗ、及び２０Ｅからなる群より選択され、この場合第一の操作されたグロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ａ、２２Ａ、２２Ｇ、２２Ｌ、２２Ｉ、２２Ｖ、２２Ｔ、２６Ｋ、２６Ｒ、２６Ｑ、２６Ｔ、２６Ｖ、２６Ｓ、２６Ｎ、２６Ｅ、７９Ｙ、８５．１Ｗ、８５．１Ｆ、８５．１Ｔ、８５．１Ｍ、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｒ、８５．１Ｈ、８５．１Ｋ、８５．１Ｃ、８５．１Ｎ、８６Ｗ、８６Ｙ、８６Ｓ、８６Ｉ、８６Ｈ、８６Ｑ、８６Ｖ、８６Ｔ、８６Ｆ、８８Ｑ、８８Ｌ、８８Ｖ、８８Ｒ、８８Ｅ、８８Ｔ、８８Ｉ、８８Ｙ、８８Ｋ、８８Ｗ、及び９０Ｎからなる群より選択され、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で２６位において置換されるアミノ酸残基は、２６Ｔ及び２６Ｅ並びにそれらの保存的アミノ酸置換からなる群より選択され、ここでアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
【０１３２】
最も好ましい実施態様において、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、２０位において置換されるアミノ酸残基は、２０Ｋであり、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ａ、２２Ｖ、２６Ｔ、７９Ｙ、８５．１Ｓ、８６Ｖ、８８Ｗ、及び９０Ｎであり、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、２６位において置換されるアミノ酸残基は、２６Ｔであり、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ｅ、５Ａ、７Ｆ、２０Ｔ、２２Ｖ、８１Ｄ、８４Ｌ、８４．２Ｅ、８４．４Ｑ、８５．１Ｃ／Ｓ／Ａ、８６Ｓ、８８Ｒ、及び９０Ｒである（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）。
【０１３３】
ＣＤ３及び疾患関連抗原を標的とするヘテロ二量体免疫グロブリンの開発
第一の工程（実施例１）として、プロテインＡとの結合を低減又は除去する置換を、ＦＡＢ又はｓｃＦｖ断片に基づくホモ二量体免疫グロブリン中でアッセイした。プロテインＡとの結合を低減又は無くすための置換を有する、重鎖内のＶＨ３サブクラスの可変重鎖ドメインの存在がプロテインＡに基づくあらゆるディファレンシャルアフィニティー法を妨害することが、見出された。このような大きな妨害に対する解決策は、プロテインＡに基づくディファレンシャルアフィニティー法のために、ＶＨ３サブクラスと結合するプロテインＡを低減又は除去するフレームワーク置換の形で見出された。
【０１３４】
第二の工程（実施例２．１）では、マウス抗ＣＤ３抗体のＣＤＲをＩＧＶＨ３−２３及びＩＧＶＫ１又はＩＧＶＫ３ヒト生殖細胞系列フレームワーク上にグラフトすることにより、ヒトＣＤ３（イプシロンサブユニット）を標的とするヒト化抗体を生成した。最良のヒト化バリアントは、そのＶＨドメインに存在するプロテインＡ結合部位がＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いて除去されていた。このようなバリアントを、ＦＡＢ又はｓｃＦｖ断片トとしてフォーマット化した。
【０１３５】
第三の工程では、疾患関連抗原を標的とする抗体の抗原結合部位を生成した。マウス抗体のＣＤＲは、ヒト生殖細胞系列フレームワークＩＧＶＨ３−２３及びＩＧＶＫ１上にグラフト可能であった（実施例２．３、２．４、及び２．６−２．１０）。あるいは、ファージディスプレイライブラリーから単離された抗体のＣＤＲは、ＶＨ３可変ドメインサブクラスに基づき得るか、又はヒト生殖細胞系列フレームワークＩＧＶＨ３−２３及びＩＧＶＫ１上にグラフトされ得た（実施例２．５及び２．６）。エピトープ結合領域のＶＨドメイン内にあるプロテインＡ結合部位を、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いて除去した。
【０１３６】
第四の工程では、ＢＥＡＴ（登録商標）法（国際公開第２０１２／１３１５５５号に記載の通り）に基づきヘテロ二量体抗体を製造し、実施例２．１  ２  ２の抗ＣＤ３抗体と実施例２．２−２．１０に記載の疾患関連抗原のエピトープ結合領域とを、ｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマット又はその逆（実施例３．１）で使用した。ホモ二量体種とヘテロ二量体種との間のプロテインＡ結合部位の数の相違をプロテインＡクロマトグラフィーによるヘテロ二量体種の単離に利用することが可能であるため、本発明の二重特異性抗体を操作して、プロテインＡ結合部位を有せず、ゆえにプロテインＡ樹脂に結合しない二のホモ二量体種のうちの一を得た。さらに、ＢＥＡＴ抗体の安全性プロファイルを改善するために、二の置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）をＦｃ領域の下部ヒンジ領域内へ操作することによって、Ｆｃ受容体結合を低減又は除去した。
【実施例】
【０１３７】
材料及び方法
哺乳動物細胞の一過性発現のための発現ベクターの構築
異なるポリペプチド鎖を一部又は全部コードするｃＤＮＡをＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって最初に遺伝子合成し、これを標準的な分子生物学技法を用いて修飾した。ＰＣＲ産物を、適切なＤＮＡ制限酵素で消化し、精製し、同じＤＮＡ制限酵素で予め消化しておいたウシホルモンポリアデニル化物(bovine hormone poly-adenylation)（ポリ（Ａ））とＣＭＶプロモーターとを有する修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（スイス、ツークのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）にライゲートした。すべてのポリペプチド鎖を、この発現ベクターに独立にライゲートした。この場合、分泌は、マウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドによって引き起こされた。
【０１３８】
組換えタンパク質の発現
抗体、ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、ＢＥＡＴ抗体、及び抗原は、別途明示しない限り、以下に記載のように発現した。一過性発現の場合、操作された各鎖と等量のベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；スイス、ブーフスのＳｉｇｍａ）を用いて、懸濁適合ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（英国、テディントンのＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）にコトランスフェクトした。一般的に、１ｍｌ当たり細胞０．８−１．２百万個の密度で懸濁状態の細胞１００ｍｌを、ＤＮＡ−ＰＥＩ混合物と共にトランスフェクトする。操作された各鎖の遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入すると、該細胞を４から５日間さらに培養することにより免疫グロブリン構築物が生成されて、培地（０．１％プルロニック酸、４ｍＭ  グルタミン、及び０．２５μｇ／ｍｌジェネテシンを補充した、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ２９３、ＨＥＫ２９３−無血清培地（Ｓｉｇｍａ））中への分泌が可能となる。分泌された免疫グロブリンを含有する無細胞培養上清を、遠心分離とその後の滅菌濾過により調製し、さらなる分析で用いた。
【０１３９】
ディファレンシャルプロテインＡ  アフィニティークロマトグラフィー（実施例１）
Ｆｃ  １３３断片及びホモ二量体ｓｃＦｖ−Ｆｃ免疫グロブリンの精製
捕捉溶出モード(capture-elution mode)クロマトグラフィー
精製前に、上清を０．１容量（Ｖ）の１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で条件付けした。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（スイス、グラットブルックのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ；カタログ番号１７−０６１８−０１）を、条件付けした上清に添加した。混合物を、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、結合したタンパク質を、１０ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、４カラム容量（ＣＶ）の０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３．０）で溶出し、０．１Ｖの１Ｍ  トリス−ＨＣ（ｐＨ８．０）で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％アクリルアミド、スイス、バーセルのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）により非還元条件下で分析した。
【０１４０】
勾配モードクロマトグラフィー
生成後、Ｆｃ  １３３断片を含有する細胞培養上清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（上記）を用いて、捕捉溶出モードクロマトグラフィーで最初に精製した。次に、捕捉溶出モードクロマトグラフィーから得られた溶出物質を、１ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡカラム（プロテインＡ結合部位突然変異体）に充填した。カラムを０．２Ｍ  リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ８．０）中で事前に平衡化し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒＴＭクロマトグラフィーシステム（カラム及び装置はいずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ製；カラムカタログ番号：１１−００３４−９３）で、流速１ｍｌ／分で稼働させた。様々な量の二のバッファー（ランニングバッファー（Ａ）：０．２Ｍ  リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ８．０）及び溶出バッファー（Ｂ）：０．０４Ｍ  リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ３．０））を組み合わせたｐＨ直線勾配で溶出を実施した。直線勾配を、Ｂ０％からＢ１００％まで５カラム容量（ＣＶ）で実施した。溶出分画を０．１Ｖの１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％アクリルアミド、スイス、バーセルのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）により非還元条件下で分析した。
【０１４１】
ホモ二量体ＦＡＢ−Ｆｃ免疫グロブリン及びＦＡＢ断片の精製
生成後、細胞培養上清を、０．１Ｖの１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で条件付けした。プロテインＬ樹脂（米国、ピスカタウェイのＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）を条件付けした上清に添加し、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、結合したタンパク質を１０ＣＶのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、４ＣＶの０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３．０）で溶出し、最後に０．１Ｖの１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。プロテインＡ結合を評価するために、プロテインＬ精製後のＦＡＢを、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭカラム（スイス、グラットブルックのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）に、ｐＨ８．０（クエン酸／Ｎａ２ＨＰＯ４バッファー）にて注入した。様々な量の二のバッファー（ランニングバッファー（Ａ）：０．２Ｍ  リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ８．０）及び溶出バッファー（Ｂ）：０．０４Ｍ  リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ３．０））を組み合わせたｐＨ直線勾配で溶出を実施した。直線勾配を、Ｂ０％からＢ１００％まで５ＣＶで実施した。溶出分画を０．１Ｖの１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。上清、通過画分、及び溶出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％アクリルアミド、スイス、バーセルのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）により非還元条件下で分析した。
【０１４２】
Ｆｃ及びＶＨ３ドメインにおけるプロテインＡに対する結合を除去されたＶＨ３ベースのホモ二量体ＦＡＢ−Ｆｃ及びｓｃＦｖ−Ｆｃ免疫グロブリンの精製並びに試験
精製スキームには、上記手順に従い、捕捉溶出モードクロマトグラフィーと、その後の勾配モードクロマトグラフィーが含まれた。
【０１４３】
ディファレンシャルプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（実施例１及び３）
生成後、０．２Ｍ  リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で事前に平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡカラム上に無細胞上清を充填し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒＴＭクロマトグラフィーシステム（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ製；カラムカタログ番号：１１−００３４−９３）で、流速１ｍｌ／分で稼働させた。ランニングバッファーは、０．２Ｍ  リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ６）であった。目的のヘテロ二量体の溶出を、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４）を用いて実施する一方、ホモ二量体種を０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。
溶出後、２８０ｎｍでのＯＤ読み取りを行い、目的のヘテロ二量体を含有する画分をプールし、０．１容量の１Ｍ  トリス（ｐＨ８．０）（Ｓｉｇｍａ）で中和した。
上清、通過画分、及び溶出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−１２％アクリルアミド、スイス、バーセルのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）により非還元条件下で分析した。
【０１４４】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
熱量測定法を用い、抗体の熱安定性を比較した。熱量測定を、ＶＰ−ＤＳＣ示差走査式マイクロカロリメーター(differential scanning microcalorimeter)（スイス、グラットブルックのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）で実施した。細胞容積は０．１２８ｍｌであり、加熱速度は１℃／分であった。また、過剰圧力は６４ｐ．ｓ．ｉに保った。タンパク質断片はすべて、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１−０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いた。各タンパク質のモル熱容量を、同一のバッファーを含有するがタンパク質が省略された重複試料との比較により見積もった。部分的なモル熱容量及び融解曲線を、標準手順を用いて分析した。サーモグラムは、ベースライン補正し、濃度を正規化した後、Ｏｒｉｇｉｎ  ｖ７．０ソフトウェア内の非二状態モデル（Non-Two State model）を用いてさらに分析した。
【０１４５】
ヒトＩｇＧサブクラスについて予測される融解プロファイルは、既知であり(Garber E & Demarest SJ (2007) Biochem Biophys Res Commun, 355(3): 751-7）、またすべてのプロファイルは、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＦＡＢドメインの独立したアンフォールディングに対応する三のアンフォールディング転移(unfolding transition)を含有することが示されている。４のヒトＩｇＧサブクラスのうち、ＩＧＨＧ１は、最も安定なＣＨ３ドメインを有し（〜８５ｏＣ）、一方、その他のサブクラスのＣＨ３ドメインは、いずれも７０℃未満で融解するかは不明であるが、それほど安定ではない。同様に、すべてのサブクラスは、ＣＨ２ドメインについて〜７０ｏＣの融解温度を有することが知られている。
【０１４６】
キャピラリーゲル電気泳動による精製評価（実施例３．２）
非還元試料調製
４０μｇの脱塩したタンパク質試料を、５ｍＭのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を含有するＳＤＳ試料バッファー（スイス、ニヨンのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓ．Ａ．；ＩｇＧ  Ｐｕｒｉｔｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号：Ａ１０６６３）中で緩衝した。１０ｋＤａの内部標準をこの試料に添加した。試料混合物を、７０℃で１０分間加熱した。
【０１４７】
キャピラリーゲル電気泳動
試料調製後、２２０ｎｍに設定したフォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）が取り付けられたＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ  ＰＡ  ８００（スイス、ニヨンのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓ．Ａ．）で、試料を測定した。ＩＤ５０μｍ×３０．２ｃｍ（検出器までの有効長さ２０．２ｃｍ）のベア溶融シリカキャピラリー(bare-fused silica capillary)を分離メディウムとして用いた。試料注入及び分離を、ＳＤＳ−分子量ゲルバッファー中にて、逆極性で、それぞれ５及び１５ｋＶの定電圧で実施した。２Ｈｚの速度でデータを記録し、電流は分離の間中、安定であった。キャピラリー及び試料を２５℃にサーモスタット制御した。
【０１４８】
ＳＰＲによる親和性測定（実施例１）
プロテイＡに対する結合を除去されたＦＡＢ断片のＳＰＲ試験
ＩＧＨＧ１  Ｆｃ断片と融合したヒトＨＥＲ２細胞外領域をコードするｃＤＮＡを、上記の重及び軽発現ベクターと同様の発現ベクターにクローニングし、ＰＥＩ法（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号参照）を用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトした。上清を、０．１Ｖの１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で条件付けし、実施例１に記載したように抗原をプロテインＡ捕捉−溶出クロマトグラフィーにより精製した。ＳＰＲ実験のために、モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体センサーチップを用いた。これは、Ｆｃと融合した組換えＨＥＲ２抗原を正しい向きで捕捉することを可能にした（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ、カタログ番号ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）。測定は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ２０００装置（スイス、グラットブルックのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）で記録した。異なる希釈の抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５７、０．７８、０．３９ｎＭ）をセンサーチップ上に４分間注入した。各測定について、７分間の解離の後に、３Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液を１分間、３０μｌ／分にて再生のために注入した。データ（センサグラム：ｆｃ２−ｆｃ１）を、１：１ラングミュアを用いてフィットさせた。各測定の開始時に、捕捉されたＨＥＲ２−Ｆｃの実験変動を考慮して、すべてのフィッティングにおいてＲｍａｘ値をローカルに設定した。測定は２連で実施し、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ２及び残差の値をともに用いて、実験データと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
【０１４９】
ＳＰＲによる親和性測定（実施例２＆３）
ＳＰＲ分析を用いて、異なる抗体（マウス及びヒト化抗体）の結合反応速度に関する結合及び解離速度定数を測定した。抗体の結合反応速度は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００装置（スイス、グラットブルックのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）で室温で測定し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１、ＢＩＡｃｏｒｅ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）を用いて分析した。
測定は、市販のアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、カタログ番号：ＢＲ−１０００−５０）を使用して、目的のリガンドと個々に結合したＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、カタログ番号：ＢＲ−１０００−１４）で実施した。プロテインＧリガンドは、Ｐｉｅｒｃｅ（スイス、ローザンヌのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓ．Ａ、カタログ番号：２１１９３）からのものであった。
【０１５０】
示されている通り、データ（センサーグラム：ＦＣ２−ＦＣ１）は、物質移動の有無にかかわらず１：１ラングミュアモデルを用いてフィットさせた。捕捉実験では、各測定の開始時に、実験変動を考慮して、すべてのフィッティングにおいてＲｍａｘ値をローカルに設定した。解離時間は、少なくとも３５０秒であった。測定は３連で実施し、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ２及び残差の値をともに用いて、実験データと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
【０１５１】
ＦＡＣＳによるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の親和性測定
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（ドイツ、ブラウンシュワイクのＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ４８３）を、ＦＡＣＳ染色用のＣＤ３陽性細胞株として用いた。ＨＰＢ−ＡＬＬを、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で維持した。キメラＯＫＴ３抗体及びヒト化バリアントの１００μｌ希釈系列を、氷上で４５分間（ＦＡＣＳバッファとしてで参照）、１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳバッファーという）を補充したＰＢＳ中の４×１０５ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞とともにインキュベートした。無関係のヒトＩｇＧ１をアイソタイプコントロールとして、またキメラＯＫＴ３抗体をポジティブコントロールとして使用した。洗浄後、細胞を氷上で４５分間、抗ヒトＦｃ−ＰＥ（オーストリア、ウィーンのＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の１／２００希釈物とともにインキュベートした。次いで、細胞を再び洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。各試料の相対平均蛍光発光を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ
（スイス、アルシュヴィルのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。結果を、キメラＯＫＴ３抗体と比較したＨＢＰ−ＡＬＬの相対的染色として、図１に要約する。
【０１５２】
インビトロアッセイ用の細胞株
ヒトＨＥＲ２陽性細胞株
ＨＥＲ２抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０１０８１２７号に記載されている。本明細書で使用されるＨＥＲ２陽性ヒト細胞株は以下の通りであった。
ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＨＴＢ−２０）
培養条件：１５０ｃｍ２の組織培養フラスコ（スイス、トラザーディンゲンのＴＰＰ；カタログ番号：９０１５０）に、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：１０３７８−０１６）、１％ピルビン酸ナトリウム溶液（オーストリア、パッシングのＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号：Ｓ１１−００３）、１％ＭＥＭ  非必須アミノ酸（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：Ｍ１１−００ｄｓｍｚ３）、及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：３５０５０−０３８）を補充したＲＰＭＩ培地。細胞は、１週間に２回継代した。
ＪＩＭＴ−１（ドイツ、ブラウンシュワイクのＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ５８９）
培養条件：１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：１０３７８−０１６）、１％ピルビン酸ナトリウム溶液（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：Ｓ１１−００３）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：Ｍ１１−００３）、及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：３５０５０−０３８）を補充したダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ（１Ｘ））＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：３１９６６−０１２）。細胞は、１週間に２−３回継代した。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＨＴＢ−２６）。
培養条件：ＪＩＭＴ−１と同じ培養条件。
ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−１２１）。
培養条件：ＨＴ１０８０細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：１０３７８−０１６）、及び１％グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：２５０３０−０２４）を補充したＥＭＥＭ培地で培養する。週３回、細胞を分散培養する（６分の１希釈）。
ＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−５８２２）。
培養条件：ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：１０３７８−０１６）、１％ピルビン酸ナトリウム溶液（オーストリア、パッシングのＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号：Ｓ１１−００３）、１％ＭＥＭ  非必須アミノ酸（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：Ｍ１１−００ｄｓｍｚ３）、及び１％グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：２５０３０−０２４）を含んだＲＰＭＩ  １６４０培地で培養する。週２回、細胞を分散させた（３分の１希釈）。
【０１５３】
ヒトＣＤ３８陽性細胞株
ＣＤ３８抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００５１０３０８３号、国際公開第２００８０４７２４２号、国際公開第２０１１１５４４５３号、及び国際公開第２０１２０９２６１２号に記載されている。本明細書で使用されるＣＤ３８陽性ヒト細胞株は以下の通りであった。
安定な組換えＣＨＯ［ＣＤ３８］細胞
Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツのベルリン、カタログ番号：ＩＲＡＵ３７Ｄ１１、４３０９０８６）で注文したヒトＣＤ３８をコードする遺伝子。ヒトＣＤ３８は、コザック配列、開始コドン、それに続いてシグナルペプチド（マウスのＶリーダー）を５’末端に、ＮｈｅＩ制限部位３’末端に付加したプライマーを用いて増幅させた。アンプリコンを、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、自社で開発したｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）由来のベクターであるｐＴ１の発現カセットにクローニングした。ｐＴ１の発現カセットは、多シストロン性ｍＲＮＡ上の二のＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）を用い、目的の遺伝子の発現をＧＦＰ及びＰＡＣ（ピューロマイシン耐性のための遺伝子）の発現と結び付ける。プラスミドのミディプレップを調製した。また、クローンＣＤ３８のオープンリーディングフレームをＤＮＡ配列決定により確認した。懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）を、５０ｍＬバイオリアクター式（ＴｕｂｅＳｐｉｎ５０バイオリアクター、スイス、トラザーディンゲンのＴＰＰ）中でポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、フランス、イルキーチュのＰｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてトランスフェクトした。この目的のために、指数増殖細胞をＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：３１９８５−０４７）に播種した。これらの細胞にＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体を添加した。エキソサイトーシスのために振とう（２００  ＲＰＭ）下３７℃でＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体とともに５時間インキュベートした後、４ｍＭ  Ｇｌｎを補充した１容量の培地ＰｏｗｅｒＣＨＯ２（スイス、ベットラッハのＬｏｎｚａ、販売店ＲＵＷＡＧ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：ＢＥ１２−７７１Ｑ）を細胞懸濁液に添加した。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２及び８０％湿度の振とうプラットフォーム上でインキュベートした。トランスフェクションの１日後、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ８８３３−２５ｍｇ）を含有する選択培地中に異なる濃度で、細胞を９６ウェルプレートに播種した。静状態で約１４日間の選択後、ＴｕｂｅＳｐｉｎ  ５０バイオリアクターを用いて、４６個の高ＧＦＰ発現細胞プールを懸濁培養物として増やした。懸濁液にうまく適合したら、細胞のＣＤ３８についての分析をＦＡＣＳにより行った。均一なＣＤ３８染色プロフィールを有する安定なＣＨＯ［ＣＤ３８］クローンを選択し、ここで使用した。
その他のＣＤ３８陽性細胞株は以下を含む。
ＮＣＩ−Ｈ９２９（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−９０６８）。
Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−１４３２）。
Ｕ２６６（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＴＩＢ−１９６）
ＲＰＭＩ  ８２２６（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−１５５）。
培養条件：１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）、及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地
Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−８６）
Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−２１３）
【０１５４】
ヒトＯＸ４０陽性細胞株
ＯＸ４０抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号に記載されている。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＨＢＰ−ＡＬＬは、ヒトＯＸ４０陽性細胞株の例である。
ここでは、安定な組換えＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞を使用した。ヒトＯＸ４０をコードする合成ｃＤＮＡを有する組換えＣＨＯ細胞株を、上記の安定な組換えＣＨＯ［ＣＤ３８］細胞株のプロトコールと同様のプロトコールを用いて操作した。
【０１５５】
ヒトＣＤ２０陽性細胞株
ＣＤ２０抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１００９５０３１号に記載されている。ＣＤ２０＋がん細胞の例は、Ｄａｕｄｉがん細胞株（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−２１３）であり、これらのＢリンパ芽球がん細胞は、２０％ＦＢＳ並びに１％Ｐ／Ｓ；１％Ｌ−Ｇｌｕｔ；１％Ｎａ−Ｐｙｒ、及び１％ＮＥＡＡを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で培養する。該細胞を、５％ＣＯ２を補給して３７℃で培養する。
【０１５６】
ヒトＥＧＦＲ陽性細胞株
ＥＧＦＲ抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０１０８１２７号に記載されている。ＥＧＦＲ＋がん細胞の例は、ＨＴ−２９がん細胞株（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＨＴＢ−３８）であり、これらの結腸直腸がん細胞は、１０％ＦＢＳ並びに１％Ｐ／Ｓ；１％Ｌ−Ｇｌｕｔ；１％Ｎａ−Ｐｙｒ、及び１％ＮＥＡＡを補充したマッツコイ５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ）で培養する。該細胞を、５％ＣＯ２を補給して３７℃で培養する。
【０１５７】
ヒトＣＤ１９陽性細胞株
ＣＤ１９抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０９５０３１号に記載されている。Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号ＣＲＬ−１４３２）及びＲａｊｉ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号ＣＣＬ−８６）は、ヒトＣＤ２０陽性細胞株の例である。
【０１５８】
ヒト膜ＩｇＥ陽性細胞株
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０３３７３６号の７１頁には、インターロイキン−４（ＩＬ−４）及び抗ＣＤ４０抗体を添加することによって、ヒトＰＢＭＣをＩｇＥ産生Ｂ細胞にクラススイッチするための方法が記載されている。
【０１５９】
組換え標的抗原
ヒトＣＤ３ガンマ−イプシロン−Ｆｃ融合タンパク質
２６残基ペプチドリンカー（配列：ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＳ；配列番号１８６）によりヒトＣＤ３イプシロン細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０７７６６、残基２２−１１８（配列番号１８５））と融合した、ヒトＣＤ３ガンマ細胞外領域をコードするｃＤＮＡ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０９６９３  残基２３−１０３（配列番号１８４）；UniProt Consortium(2013) Nucleic Acids Res., 41（データべース特集号(Database issue）):D43-7； http://www.uniprot.org/）を、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）により最初に合成した。この合成遺伝子を、標準的なオーバーラップＰＣＲ法を用いてヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分と融合させ、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ｃＤＮＡテンプレートもＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧから入手した。得られたｃＤＮＡを上記修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにクローニングした。
【０１６０】
ＣＤ３ガンマ−イプシロン−Ｆｃタンパク質（配列番号１８７）の一過性発現のために、組換えベクターを上記のようにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて懸濁液適合ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）にトランスフェクトした。次いで、組換えＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ培地（スイス、グラットブルックのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）を用いて、ＣＤ３ガンマ−イプシロン−Ｆｃ構築物を無細胞上清から精製し、さらなる分析に使用した。
【０１６１】
ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン  １−２６＿Ｆｃ融合タンパク質
ヒトＣＤ３イプシロンペプチド１−２６をコードするｃＤＮＡ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０７７６６、アミノ酸２３−４８、配列番号１８８）及びカニクイザルＣＤ３イプシロンペプチド１−２６（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９５ＬＩ５、アミノ酸２２−４７、配列番号１８９）をコードするｃＤＮＡを、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン細胞外領域それぞれについて、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧから入手した合成ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。続いて、増幅された産物を、標準的なオーバーラップＰＣＲ法を用いてヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分と融合させた。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ｃＤＮＡテンプレートは、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧから入手した。得られたｃＤＮＡを上記修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにクローニングした。
【０１６２】
ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン構築物（それぞれ、配列番号１９０及び１９１）の一過性発現のために、組換えベクターを上記のようにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて懸濁液適合ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）にトランスフェクトした。次いで、組換えＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ培地（スイス、グラットブルックのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）を用いて、ＣＤ３イプシロン融合構築物を無細胞上清から精製し、さらなる分析に使用した。これらの二の融合タンパク質は、本明細書において、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質と称される。
【０１６３】
ヒトＨＥＲ２細胞外領域
ＨＥＲ２可溶性細胞外領域の調製は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号に記載されている。ポリヒスチジンタグと融合したヒトＨＥＲ２可溶性細胞外領域（本明細書ではＨＥＲ２−ｈｉｓと称する）又はヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域と融合したヒトＨＥＲ２可溶性細胞外領域（（本明細書ではＨＥＲ２−Ｆｃと称する）を調製した。
【０１６４】
ヒト及びカニクイザルＣＤ３８細胞外領域
ヒトＣＤ３８のｃＤＮＡをＳｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツのＥｒｗｉｎ−Ｎｅｇｅｌｅｉｎ−Ｈａｕｓ、カタログ番号：ＩＲＡＵ３７Ｄ１１、４３０９０８６）から得、その細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ２８９０７  残基４３−３００）をＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｇ）由来の自社製発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターは、コザック配列及び開始コドン、それに続いて、多重クローニング部位の５’末端に対するマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチド及び３’末端に対する６−Ｈｉｓ−タグを包含した。６−Ｈｉｓ−タグと融合したヒトＣＤ３８の可溶性細胞外領域（配列番号１９２）は、次のように発現させ、精製した：ＨＥＫ細胞、０．１％プルロニック酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）、発現ベクター、及びポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、フランス、イルキーチュのＰｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を含有する１容量のＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｅ１５−０３９）を３７℃、５％ＣＯ２及び８０％湿度の振とうフラスコ中でインキュベートした。６ｍＭのグルタミンを補充した１容量のＥｘＣｅｌｌ２９３培地を４時間後に混合物に添加し、さらに５日間インキュベーションを続けた。ポストプロダクション、無細胞上清を遠心分離により調製し、０．２μｍフィルターを用いて濾過し、１Ｍ  トリス（ｐＨ８．７）を用いてｐＨを７．４（４℃）に調整した。Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｅｘｃｅｌｌビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：１７−３７１２−０３）を溶液に添加し、撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。自然流下による精製（gravity-flow purification）のために、その溶液をＥｃｏｎｏ−Ｃｏｌｕｍｎ（スイス、ライナハのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、カタログ番号：７３７−４２５２）に充填した。ビーズをＰＢＳ（２×）、２０ｍＭ  イミダゾールで洗浄し、タンパク質をＰＢＳ、５００ｍＭ  イミダゾール中で溶出させた。溶出画分をプールし、４℃で２回の透析工程によりバッファーをＰＢＳと交換した。精製したヒトＣＤ３８細胞外領域を、０．２２μｍシリンジフィルターを用いて濾過した。
上記の方法を用いて、６−Ｈｉｓ−ｔａｇ（配列番号１９３）と融合したカニクイザルＣＤ３８抗原の可溶性細胞外領域をクローニングし、発現させ、精製した。
【０１６５】
ヒトＯＸ４０細胞外領域
ヒトＯＸ４０の可溶性細胞外領域を調製する方法は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号に記載されている。
【０１６６】
ヒトＥＧＦＲ細胞外領域
ＥＧＦＲ可溶性細胞外領域抗原調製の例は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号に記載されている。
【０１６７】
インビトロＴ細胞リダイレクトキリングアッセイ（redirection killing assay）
末梢血単核細胞の調製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を製造するために、ヒト白血球含有血液フィルターをスイス、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓの血液採集センター(Blood Collection Centre)（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ  ｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｅ，ｒｕｅ  Ｓｏｐｈｉｅ−Ｍａｉｒｅｔ  ２９，ＣＨ−２３００）から集めた。１０Ｕ／ｍｌのリケミン（liquemin）（スイス、ルツェルンのＤｒｏｓｓａｐｈａｒｍ  ＡＧ）を含有する６０ｍｌのＰＢＳとともにバックフラッシングすることにより、細胞をフィルターから除去した。次いで、５０ｍＬのＢｌｏｏｄ−Ｓｅｐ−Ｆｉｌｔｅｒ  Ｔｕｂｅ（スイス、バーゼルのＢｒｕｎｓｃｈｗｉｇ）を用い、製造者の指示通りにＰＢＭＣを精製した。室温で８００ｇで２０分間、管を遠心分離し（ブレーキなし）、細胞を界面から回収した。ＦＢＳ又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含まないロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ、オーストリア、パッシングのＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）培地で細胞を３回洗浄した。ＲＤＬ培地（１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ）中に１０ｅ６細胞／ｍＬでＰＢＭＣを再懸濁させ、アッセイ前に５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で一晩培養した。
【０１６８】
Ｔ細胞調製
Ｔ細胞精製は、ｐａｎ−Ｔ細胞単離キットＩＩ（ドイツ、ベルギッヒグラヂバッハのＭｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、カタログ番号１３０−０９１−１５６）を使用し、製造業者の指示通りにＰＢＭＣ単離後すぐに行った。精製後、Ｔ細胞をＲＤＬ培地中に１０ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁させ、アッセイ前に５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で一晩培養した。
【０１６９】
アッセイ読み取り
かなり類似した結果の二の異なる読み取りを使用して、リダイレクトキリングを定量化した。
フローサイトメトリー法は、本明細書ではＲＤＬ−ＦＡＣＳ法と称され、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ  Ｂら((2005) Cancer Res, 65: 2882-2889), Moore PA et al. ((2011) Blood, 117(17): 4542-51)及びFriedrich M et al. ((2012) Mol Cancer Ther, 11: 2664-2673)に記載されるように蛍光サイトメトリーに基づく。標的細胞を回収し、計数し、１回洗浄し、ＰＢＳ＋１μＭのカルボキシフルオレセイン  スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｓｉｇｍａ）に５×１０ｅ６細胞／ｍｌで再懸濁させた。細胞を、５分毎に穏やかに攪拌しながら３７℃で１５分間インキュベートした。ＣＦＳＥ負荷細胞をＲＤＬ培地で３回洗浄し、ＲＤＬ培地に２×１０ｅ５細胞／ｍＬで再懸濁させた。ＰＢＭＣを回収し、計数し、２×１０ｅ６細胞／ｍＬ  ＲＤＬ培地に再懸濁させた。抗体の段階希釈液（３×溶液）をＲＤＬ培地中で調製した。標的細胞（５０μＬ／ウェル）、Ｔ細胞（５０μＬ／ウェル）、及び３×抗体溶液（５０μｌ／ウェル）を平底９６ウェルプレート（スイス、トラザーディンゲンのＴＰＰ）に分配した。エフェクター：標的比は、１０：１であった。プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３００ｇで３分間遠心分離し、プレートをフリックすることにより上清を捨てた。プレートを２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、再び遠心分離し、ＰＢＳは捨てた。予め加温したＡｃｃｕｔａｓｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）を添加し、プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。１００μｌのＲＤＬ培地の添加後に上下にピペッティングすることにより、剥離、接着細胞を再懸濁させた。溶液をＵ底９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に移した。Ｕ底プレートを３００ｇで３分間遠心分離し、上清を捨て、１／４０希釈で７−ＡＡＤ（スイス、アルシュヴィルのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＡＧ）を補充した冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１０％バーゼン液）２００μｌに細胞を再懸濁させた。プレートは、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（スイス、ツークのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＧ）ですぐに得られた。各ウェルについて、Ｆｌｏｗｊｏ（登録商標）ソフトウェア（ドイツ、ベルギッヒグラヂバッハのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を用いてＣＦＳＥ陽性７ＡＤＤ陰性集団をゲーティングすることにより、生存標的細胞の絶対数を決定した。標的細胞のみをベースラインとしてインキュベートした条件を用いて、各試料の特異的細胞傷害性のパーセンテージを決定した。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（米国、カリフォルニア州ラホヤのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた非線形変動傾き回帰法（nonlinear variable slope regression method）を用いて決定した。特定のリダイレクト溶解（ＲＤＬ）のパーセンテージは、試験抗体が添加された状態に対する抗体のない状態の特異的細胞傷害性のパーセンテージを差し引くことによって計算した。
ＲＤＬ−ＭＴＳ法と本明細書で称される細胞生存率法は、Ｂｕｈｌｅｒ  Ｐら((2008) Cancer Immunol Immunother, 57: 43-52)、Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦら((2013) Proc Natl Acad Sci USA, 110(13): 5145-50)、及びＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１４３５２４号に記載されているような、細胞生存率を評価するための比色法に基づく。標的細胞を回収し、計数し、１回洗浄し、ＲＤＬ培地に２×１０ｅ５細胞／ｍｌで再懸濁させた。ＰＢＭＣを回収し、計数し、２×１０ｅ６細胞／ｍＬ  ＲＤＬ培地に再懸濁させた。抗体の段階希釈液（３×溶液）をＲＤＬ培地中で調製した。標的細胞（５０μＬ／ウェル）、Ｔ細胞（５０μＬ／ウェル）、及び３×抗体溶液（５０μｌ／ウェル）を平底９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に分配した。エフェクター：標的比は、１０：１であった。プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を捨て、プレートを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄してＰＢＭＣを除去し、次いで１００μｌのＲＤＬ培地を各ウェルに添加した。読み取りは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）キット（ドイツ、ジューベンドルフのＰｒｏｍｅｇａ  ＡＧ）を用い、製造者の指示に従って行った。簡潔には、１０−２０μｌのＭＴＳ試薬を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内で２−６時間インキュベートした。次いで、４９０ｎｍの吸光度をＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  プレートリーダー（スイス、ルツェルンのＢｉｏＴｅｋ  ＡＧ）で読み取った。式：特異的殺傷率＝１００×［（ＳＤ−Ｓｐ）／（ＳＤ−ＭＤ）］を用いて特異的殺傷率を算出した。ＳＤは、標的細胞を単独でインキュベートした自然死状態で測定した吸光度である。Ｓｐは、各試験条件（標的細胞＋ＰＢＭＣ＋抗体）で測定された吸光度である。ＭＤは、標的細胞を３回の凍結及び融解サイクルにより溶解させた最大死状態で測定した吸光度である。特定のリダイレクト溶解（ＲＤＬ）のパーセンテージは、試験抗体が添加された状態に対する抗体のない状態の特異的細胞傷性パーセンテージを差し引くことによって計算した。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた非線形変動傾き回帰法を用いて決定した。
【０１７０】
異種移植モデル
ＪＩＭＴ−１異種移植片
細胞株及び試薬
乳がんＪＩＭＴ−１細胞株をＤＳＭＺ（カタログ番号：ＡＣＣ５８９）から入手した。１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（英国、ロンドンのＡＭＩＭＥＤ、カタログ番号：Ｚ１０８３４Ｐ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：１０３７８−０１６）、１％ピルビン酸ナトリウム溶液（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：Ｓ１１−００３）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号：Ｍ１１−００３）、及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：３５０５０−０３８）を補充したＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：３１９６６−０２１）含有ＤＭＥＭ（１Ｘ）に細胞を維持した。ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：Ａ１１１０５−０１）を用い、週に２回に細胞を分散させた。
スイス、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓの血液採集センター(Blood Collection Centre)（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ  ｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｅ，ｒｕｅ  Ｓｏｐｈｉｅ−Ｍａｉｒｅｔ  ２９，ＣＨ−２３００）からのヒト白血球含有血液フィルターより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を回収した。１０Ｕ／ｍＬのリケミン(liquemin)（スイス、ルツェルンのＤｒｏｓｓａｐｈａｒｍ  ＡＧ）を含有する６０ｍｌのＰＢＳとともにバックフラッシングすることにより、細胞をフィルターから除去した。次いで、５０ｍｌのＢｌｏｏｄ−Ｓｅｐ−Ｆｉｌｔｅｒ  Ｔｕｂｅ（スイス、バーゼルのＢｒｕｎｓｃｈｗｉｇ）を用い、製造者の指示に従ってＰＢＭＣを単離し、管を８００ｇで室温で２０分間遠心分離し（ブレーキなし）、細胞を界面から回収した。細胞は、ＦＢＳ（ＲＰＭＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、カタログ番号：２１８７５−０９１）なしのロズウェルパーク記念研究所培地で３回洗浄した。ＰＢＭＣを１０％ＦＢＳ（ＡＭＩＭＥＤ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ）を補充したＲＰＭＩ培地に１０ｅ６細胞／ｍｌで再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。標的細胞を回収し、計数し、１回洗浄し、ＰＢＳに５×１０ｅ６細胞／ｍｌで再懸濁させた。
【０１７１】
マウス及び実験条件
インビボ実験は、５週齢の免疫不全
ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）雌マウスであって、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞欠損によって特徴付けられたマウス（フランス、サン＝ベルトヴァンのＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ）で実施した。前記マウスは、標準的なげっ歯類マイクロアイソレーターケージ内で、無菌かつ標準化された環境条件（２０±１℃の室温、５０〜１０％の相対湿度、１２時間の明暗リズム）で維持した。放射線照射食物、寝床、及び０．２２μｍの濾過飲料水をマウスに与えた。すべての実験は、管轄州当局（スイス、ヌーシャテル州）から許可を得て、スイスの動物保護法(Swiss Animal Protection Law)に従って行った。動物保護法に従い、腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えると、マウスを安楽死させなければならなかった。対応する治療群対ビヒクルコントロール群の平均腫瘍体積の統計分析を、ＡＮＯＶＡ一方向分析及びボンフェローニのパラメトリック検定によって行った。
移植前に、すべてのマウスの右脇腹を、ＶＥＥＴクリーム（スイス、ワリゼレンのＲｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ  ＡＧ）を使って脱毛した。移植日及びその後週に１回、マウスの写真撮影及び体重測定を行った。各動物について、５×１０ｅ６ヒトＰＢＭＣを、最終容積０．２ｍｌのＰＢＳ中５×１０ｅ６のＪＩＭＴ−１乳がん細胞と混合した。４の異なるＰＢＭＣドナーを含めた。ＰＢＭＣ／ＪＩＭＴ−１混合物を各ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右脇腹に皮下注射した。ヒトＰＢＭＣを全く含まない最終容量０．２ｍｌのＰＢＳ中５×１０ｅ６のＪＩＭＴ−１乳癌細胞を有するコントロール群を含めた。１０匹のＪＩＭＴ−１／ＰＢＭＣ移植動物（１ＰＢＭＣドナーにつき１群）の各群について、移植の３時間後、５匹の動物にＨＥＲ２／ＣＤ３−１二重特異性抗体を０．０５ｍｇ／ｋｇで静脈内治療した（容量１００μｌを使用）。治療は、２週間の間、週に３回、２日に１回繰り返された。腫瘍を、週に２回、ノギスを用い二つの垂直寸法で測定し、腫瘍体積を次式：腫瘍体積＝［（幅２×長さ）／２］に従って計算した。
【０１７２】
実施例１：  ＶＨ３サブクラスにおけるプロテインＡへの結合を低減又は除去する変異の決定
免疫グロブリン定常領域におけるプロテインＡ結合を除去する方法は、既知である(Lindhofer H. et al., (1995) J Immunol, 155(1): 219-225; US6,551,592; Jendeberg L. et al., (1997) J Immunol Methods, 201(1): 25-34; ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０１５１７９２号)。完全長ホモ二量体免疫グロブリンにおけるプロテインＡ除去法の使用を評価するために、混合ＩＧＨＧ１−ＩＧＨＧ３  Ｆｃフォーマットに基づく抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリン及び対応するＦｃ  １３３コントロール断片を調製した。抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンは、天然抗体と同様にフォーマットされ、Ｆｃ  １３３断片と融合した抗ＨＥＲ２特異性を有するＦＡＢ断片からなる（天然のヒトＩＧＨＧ３アイソタイプ由来のＦｃ配列であって、ヒンジ配列が天然のヒトＩＧＨＧ１アイソタイプ由来のヒンジ配列全体に置換されており、Ｆｃ  １３３は配列番号１と略記されている。ここで、名称にある数字は、ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３の順で各ドメインの免疫グロブリンガンマアイソタイプサブクラスに対応し；対応する全長抗ＨＥＲ２免疫グロブリンは、本明細書で抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ１３３と称され；重鎖は配列番号２を有し、軽鎖は配列番号３を有する）。トランスフェクション後、材料及び方法のセクションに記載したプロトコールに従い、勾配クロマトグラフィーにより、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ  １３３ホモ二量体及びＦｃ  １３３断片のプロテインＡ結合についてアッセイした。図３及び図４Ａに示すように、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ−Ｆｃ  １３３ホモ二量体が結合することができる一方で、Ｆｃ  １３３断片は、市販のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）に結合しなかった。
【０１７３】
ＦＡＢ定常ドメインの関与を評価するために、上記の抗ＨＥＲ２ホモ二量体を抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子として再フォーマットしたが、ここでｓｃＦｖユニットは１５アミノ酸リンカーにより融合された親免疫グロブリン可変ドメインからなる（本明細書では、抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  １３３と略記される；配列番号４の重鎖）。したがって、得られた抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ１３３ホモ二量体は、親抗ＨＥＲ２ＦＡＢ−Ｆｃ  １３３ホモ二量体免疫グロブリンと同一であったが、ＣＨ１及びＣＫ定常ドメインを欠いていた。図４Ｂに示すように、ｓｃＦｖ−Ｆｃ  １３３ホモ二量体は、親抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンで観察されるように、プロテインＡ結合を示した。この発見は、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ断片の可変ドメインがホモ二量体免疫グロブリンのＦｃ部分におけるプロテインＡ結合を除去する方法の有効性を妨げる原因となったという結論に至った。さらに重要なことに、ホモ二量体免疫グロブリンの可変ドメイン内でのプロテインＡ結合が、プロテインＡ特異的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）精製法に基づくヘテロ二量体免疫グロブリンの調製を妨げると結論付けられた。
【０１７４】
プロテインＡの５すべてのドメインは、ＶＨ３可変ドメインサブクラス(Jansson B et al., (1998) FEMS Immunol. Med. Microbiol., 20(1): 69-78)由来の可変重鎖ドメインに結合することが知られている。この特徴は、プロテインＡがＶＨ３ベースのＦＡＢ及びＦｃ断片の両方に結合することから、抗体分子全体のパパイン消化後のＶＨ３ベースのＦＡＢ断片の調製を妨げることが知られている特徴である。ホモ二量体抗ＨＥＲ２免疫グロブリン又はそのｓｃＦｖ−Ｆｃバージョンに見出される重鎖可変ドメインは、ＶＨ３−２３サブクラスに属し、これらのホモ二量体分子がその操作されたＦｃ領域内にプロテインＡ結合部位を有さないにもかかわらず、プロテインＡに結合する理由を説明する。
【０１７５】
ＶＨ３ベースの免疫グロブリン又はその断片は、バイオテクノロジー産業にとって多大な重要性を有する。ＶＨ３ベースの分子がプロテインＡに結合する能力は該分子の機能的な事前スクリーニングをし易くするので、ＶＨ３ベースの分子は幅広く開発されており、したがって抗体探索のために用いられる多くの合成又はドナーベースのファージディスプレイライブラリー若しくは遺伝子組換え動物技術は、ＶＨ３ドメインサブクラスに基づく。さらに、ＶＨ３ベースの分子は、他の既知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも良好な発現及び安定性のためにしばしば選択される。ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片に結合しないプロテインＡの組換えバージョンは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭという商品名でＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって開発され、商品化されている。
【０１７６】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ樹脂は、本明細書において、上記の二のホモ二量体抗ＨＥＲ２免疫グロブリンのプロテインＡ結合評価のために使用されたことから、少なくとも一のＶＨ３可変領域を有するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製には適していない（プロテインＡ特異的な精製法を使用する場合）と結論付けられた。なぜなら、Ｆｃ領域にプロテインＡ結合を有しないホモ二量体種はＶＨ３ドメインを介して依然としてプロテインＡに結合するであろうからである。
【０１７７】
ＶＨ３に基づくホモ二量体免疫グロブリン又はその断片からのプロテインＡ結合を除去又は低減させる置換を調べるために、ＶＨ３に基づくＦＡＢバリアントをプロテインＡ結合についてアッセイする必要がある。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ樹脂タイプはＶＨ３ドメインサブクラス結合を欠くことが知られているが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭとして知られるもう一つの市販のプロテインＡ樹脂は、ＶＨ３ドメインサブクラスに結合する（同じくＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから）。これを選択し、ＶＨ３ベースのＦＡＢバリアントのプロテインＡ結合について分析した。
【０１７８】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ樹脂の使用の有効性は、ＶＨ３−２３可変ドメインサブクラスのものであることが知られている前述の親抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリンに由来する組換え抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ断片（本明細書では抗ＨＥＲ２  ＦＡＢと略記される；配列番号５を有する重鎖及び配列番号３を有する軽鎖）を調製することにより、及び前記断片をＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭカラムでアッセイすることにより検証された（ＦＡＢ断片については、ＶＫサブクラスＩに基づく軽鎖を有し、プロテインＬクロマトグラフィーを使用して捕獲−溶出モードで最初に精製し、次にＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭカラムでプロテインＡ勾配クロマトグラフィーを実施した。いずれのカラムのプロトコールも、材料及び方法のセクションに記載したプロトコールに従った）。図４Ｃに示すように、ＶＨ３ベースの抗ＨＥＲ２  ＦＡＢは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭカラムにのみ結合し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ樹脂がＶＨ３ベースのＦＡＢ断片への結合を欠いていることを裏付けた。これは、少なくとも単量体ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片に関する限りであり、その上、プロテインＡへの結合を有しない操作されたＦｃ領域を有するＶＨ３ベースのホモ二量体免疫グロブリンに関して先に観察された結果と対照をなす。逆に、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭカラムへの強い結合を示し、これは、プロテインＡ結合を有しないか又は低減させたＶＨ３ベースのＦＡＢバリアントをアッセイする可能性を提供した。
【０１７９】
ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片におけるプロテインＡ結合を除去するために、ＶＨ３ドメイン内の重要なプロテインＡ結合残基を、プロテインＡのＤドメインと複合体を形成するヒトＦＡＢ断片の結晶構造から同定した（ＰＤＢコード：１ＤＥＥ；www.pdb.org；Graille M et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97(10): 5399-5404）。この分析は、実施された置換の性質がヒト起源のプロテインＡ結合ＶＨサブクラスと非プロテインＡ結合ＶＨサブクラス間の配列比較に基づく、合理的設計の開始点として用いられた。図５は、各ヒト重鎖可変ドメインサブクラスについての一の代表的なフレームワークのアライメントを示す。アミノ酸の１５、１７、１９、５７、５９、６４、６５、６６、６８、７０、８１、８２ａ、及び８２ｂの位置（Ｋａｂａｔ番号付け）は、１ＤＥＥ構造のＶＨ３ベースのＦＡＢ断片とプロテインＡのＤドメイン間のタンパク質−タンパク質相互作用界面の一部として同定された。ヒトＶＨサブクラスの中で、ＶＨ３は、プロテインＡに結合する唯一のサブクラスであり、他のサブクラスの同等のアミノ酸配列位置にある残基は、プロテインＡ結合を除去又は低減させ、免疫原性を潜在的に低下させるという観点から置換の供給源として選択された。なぜなら、これらの置換は非プロテインＡ結合ヒトＶＨサブクラスに見られるのと同じアミノ酸位置で、一の残基が別の天然残基に置き換えられたためである。
【０１８０】
突然変異は、標準的なＰＣＲに基づく突然変異誘発法により、前述の抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ断片の配列に導入し、それに続く置換は、Ｇ６５Ｓ（配列番号６の重鎖及び配列番号３の軽鎖）、Ｒ６６Ｑ（配列番号７の重鎖及び配列番号３の軽鎖）、Ｔ６８Ｖ（配列番号８の重鎖及び配列番号３の軽鎖）、Ｑ８１Ｅ（配列番号９の重鎖及び配列番号３の軽鎖）、Ｎ８２ａＳ（配列番号１０の重鎖及び配列番号３の軽鎖）、及びＲ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａの組み合わせ（配列番号１１の重鎖及び配列番号３の軽鎖）で行った。
【０１８１】
さらに、Ｔ５７Ａ置換（配列番号１２の重鎖及び配列番号３の軽鎖）及びＴ５７Ｅ置換（配列番号１３の重鎖及び配列番号３の軽鎖）を行った。Ｔ５７Ａは、国際公開第２０１００７５５４８号においてプロテインＡ結合を除去することが以前に示されており、Ｔ５７Ｅは、ＶＨ３−プロテインＡ相互作用を破壊し得る荷電残基を導入するように設計された。ＶＫサブファミリーＩに基づく軽鎖を有するＦＡＢ突然変異体を、プロテインＬクロマトグラフィーを用いる捕捉−溶出モードで最初に精製し、材料及び方法のセクションに記載したように勾配モードで操作したＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭカラムを用いてプロテインＡ結合についてさらにアッセイした。図６は、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｅ、Ｇ６５Ｓ、Ｑ８１Ｅ、Ｎ８２ａＳ、及びＲ１９Ｇ／Ｔ５７Ａ／Ｙ５９Ａの組み合わせのみが、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔＴＭ樹脂への抗ＨＥＲ２  ＦＡＢの結合を除去又は低減させたことを示す。これらの変異は非プロテインＡ結合ＶＨサブクラスにおいて見出される配列同等残基を置換し、それにより免疫原性を潜在的に低下させるため、置換Ｇ６５Ｓ、Ｑ８１Ｅ、及びＮ８２ａＳは、ＶＨ３ベースのＦＡＢ断片においてプロテインＡ結合を除去する場合に好ましい。
【０１８２】
抗体親和性及び特異性は、ＣＤＲ領域に本質的に限定されるが、いくつかのヒト化抗体の場合に示されるように、フレームワーク置換は抗体特性に影響を与え得る。上記の置換がＶＨ３由来抗体の特異性及び／又は親和性に影響を及ぼし得るかどうかを評価するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって二の好ましいＦＡＢ突然変異体のＨＥＲ２抗原結合をアッセイした。組換えＨＥＲ２抗原を用いたＳＰＲ測定は、材料及び方法のセクションに記載したように行った。両方の好ましい変異体は、置換が特異性又は親和性に関して影響を及ぼさなかったことを実証する元のＦＡＢ分子（図７）と比較した場合、ＨＥＲ２抗原と同一の結合を示した。したがって、これらの置換は、抗原結合の有意な欠失なしに、ＶＨ３由来の抗体分子におけるプロテインＡ結合を操作するために広く使用することができると予想される。
【０１８３】
これらの好ましい二の置換を、先に記載した抗ＨＥＲ２ホモ二量体免疫グロブリン及び抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子に導入し、バリアントのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭ樹脂への結合をアッセイした。次のバリアントを調製した：抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ  １３３（配列番号１４を有する重鎖）、抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ  １３３（配列番号１５を有する重鎖）、抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｇ６５Ｓ）−Ｆｃ  １３３（配列番号１６を有する重鎖及び配列番号３を有する軽鎖）、及び抗ＨＥＲ２  ＦＡＢ（Ｎ８２ａＳ）−Ｆｃ  １３３（配列番号１７を有する重鎖及び配列番号３を有する軽鎖）。
【０１８４】
図８は、４すべての突然変異体のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭクロマトグラフィーのプロファイルを示す。ここに示したすべてのバリアントは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅＴＭカラムにほとんど結合しなくなり、先に同定された置換によるプロテインＡ結合の除去が成功したことを示す。さらに重要なことに、プロテインＡ特異的な精製法と組み合わせると、ＶＨ３ベースのＦＡＢのプロテインＡに対する親和性が除去又は低減される置換により、少なくとも一のＶＨ３可変ドメインが存在するヘテロ二量体免疫グロブリンの調製が可能になると結論付けられた。
【０１８５】
実施例２：  ヒトＣＤ３抗原、腫瘍関連抗原、及び炎症性細胞表面抗原を標的とする抗原結合部位
ヒトＣＤ３抗原に対する抗原結合部位
ヒトＣＤ３イプシロンサブユニットは、二重特異性の関与を介してＴ細胞リダイレクトキリングを引き起こすように選択された。
【０１８６】
２．１Ａ  マウスＯＫＴ３抗体のヒト化バリアント
本明細書で使用される抗ヒトＣＤ３イプシロン抗原結合部位は、マウスＯＫＴ３抗体（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇにより市販され、その後販売中止されたＭｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３、商品名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３；それぞれ配列番号１８及び１９を有するマウス可変重鎖及び軽鎖ドメイン）。ＯＫＴ３マウス可変ドメインをヒト化し、ｓｃＦｖ及びＦＡＢ断片トとしてフォーマットした。
【０１８７】
ヒト化は、ＦＡＢ及びｓｃＦｖフォーマットの両方に適した非常に安定なヒト化バリアントを製造するためにＪｕｎｇ  Ｓ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ(1997, Protein Eng, 10(8): 959-66）によって記載された方法に従った。この方法は、ハーセプチン（登録商標）抗体（ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２、ｈｕＭＡＢ４Ｄ５−８、トラスツズマブ又は商品名ハーセプチン（登録商標）；米国特許公開第５８２１３３７号；それぞれ配列番号２０及び２１を有する可変重鎖及び軽鎖ドメイン）に見出され、固定フレームワーク上へのヒト化プロセスのワークフローに従う(Almagro JC & Fransson J (2008), Front Biosci, 13: 1619-33)。ハーセプチン（登録商標）抗体はもともと生殖系列フレームワークＶＨ３及びＶＫ１の非常に安定したヒトのファミリーに由来するので、これらの二のファミリーに由来する生殖系列フレームワークは、固定フレームワークの供給源として同等に使用することができる。あるいは、ヒトＶＫ３生殖系列軽鎖フレームワークファミリーは、ＶＫ１の代わりに使用することができる。なぜなら、それも良好な安定性を有するからである(Ewert S et al., (2003) J Mol Biol, 325: (531-553)。マウス抗体に加えて、安定性を改善するために、この固定フレームワーク法を用いてヒト抗体を操作することができる。好ましいのは、それぞれ配列番号２２、２３、及び２４（ＩＭＧＴ（登録商標）（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム(Lefranc MP et al. (1999) Nucleic Acids Res, 27(1): 209-12; Ruiz M et al. (2000) Nucleic Acids Res, 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res, 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res, 31(1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev Comp Immunol, 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64; http://www.imgt.org)に基づく）を有するヒト生殖系列フレームワーク  ＩＧＨＶ３−２３＊０４、ＩＧＫＶ１−３９＊０１、及びＩＧＫＶ３−２０＊０１の使用である。
【０１８８】
この目的のために、ハーセプチン（登録商標）抗体の可変ドメイン内のＣＤＲをマウスＯＫＴ３抗体由来のＣＤＲでそれぞれ置換し、マウスＯＫＴ３抗体のキメラに対してベンチマークした第一のヒト化抗体を構築した（可変重鎖及び軽鎖は配列番号２５及び２６を有し、本明細書ではキメラＯＫＴ３抗体と称する）。
【０１８９】
プロトタイプ抗体（配列番号２７及び３９を有する可変重鎖及び軽鎖、ＶＨ／ＶＬと略記される）は、一過性発現試験で産生レベルが増加し、示差走査熱量測定によって測定されたＦＡＢ安定性が増加したが、ヒトＣＤ３イプシロン陽性Ｔ細胞腫瘍株であるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合はなかった（ＦＡＣＳ実験での蛍光強度中央値による評価、材料及び方法のセクションを参照）（図９Ａ）。
【０１９０】
可変ドメインの第一のプロトタイプ対の３Ｄモデルに基づいて、次の逆突然変異（ＣＤＲ移植ハーセプチン（登録商標）プロトタイプからマウスＯＫＴ３配列へ）：可変重鎖ドメインのＩ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ、Ｒ５８Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋ、並びに可変軽鎖ドメインのＭ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付け）のサブセットを選択し、試験した。Ｒ５８Ｎ置換は、ＣＤＲ移植ハーセプチン（登録商標）プロトタイプからマウスＯＫＴ３への変異に対応する一方、Ｒ５８Ｙ置換は、ＣＤＲ移植ハーセプチン（登録商標）プロトタイプからヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４生殖系列置換に対応することに留意されたい。置換の組み合わせに関する操作の方法は、ＣＤＲ領域への推定上の影響及び／又は可変ドメインのパッキング及び／又は免疫原性の観点から種々な置換の相補性に基づいたものであった。
【０１９１】
第一の手法では、すべての候補をヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットした。最良のバリアントは、発現レベル、ＦＡＢ断片の熱安定性、及びＦＡＣＳによるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合能に従って選択された。最良のヒト化バリアントは、そのＶＨドメイン内に存在するプロテインＡ結合部位がＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換を用いて除去されていた。この操作工程は、抗ＣＤ３ホモ二量体を含まない安全なＴ細胞再標的化ＢＥＡＴ抗体をさらに産生するために必要であった。
【０１９２】
ＶＨの逆変異：Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔ、並びにＶＬの逆変異：Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、ＩｇＧ４、Ｆ７１Ｙ、及びＩｇＡ２は、親和性を取り戻した。可変ドメインの最良の組み合わせは、親細胞結合の大部分を保持している（図９Ａ−Ｃ）ことから、ＶＨ８／ＶＬ４、ＶＨ８／ＶＬ８、ＶＨ１１／ＶＬ４、及びＶＨ１１／ＶＬ８であった。さらに、ＶＨ８／ＶＬ８（それぞれ配列番号４８及び５１を有する可変ドメイン）及びＶＨ１１／ＶＬ８（それぞれ配列番号４９及び５１を有する可変ドメイン）の組み合わせは、ＦＡＢ安定性を向上させた（それぞれ＋２．８℃及び＋１．６℃、図９Ｄ）。
【０１９３】
最後に、最良のヒト化バリアントもｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体として再フォーマットし、一過性発現させた。バリアントは、このフォーマットでの一過性トランスフェクションにおける相対親和性、安定性、発現レベルの観点からランク付けされた（図９Ｅ）。ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体フォーマットでの可変ドメインの最良の組み合わせは、ＶＨ８−ＶＬ４（配列番号５８を有するｓｃＦｖ断片）及びＶＨ８−ＶＬ８（配列番号５９を有するｓｃＦｖ断片）であり、抗体フォーマットで確認された組み合わせに類似していた。両方のｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合フォーマットで良好な熱安定性を有した（図９Ｆ）。
【０１９４】
２．１Ｂ  マウスＳＰ３４抗体のヒト化バリアント
マウス抗体ＳＰ３４は、１９８５年に最初に記述された(Pessano S et al., (1985) EMBO J, 4(2):337-44)。それは、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞からの変性タンパク質抽出物で免疫したマウスから得られたハイブリドーマによって産生され、該抗体はヒト特異性及びカニクイザルに対する交差反応性を有する。ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロンサブユニット上のＳＰ３４エピトープが知られている（それぞれ配列番号１９５及び１９６）。
【０１９５】
上記の実施例に記載された方法及びワークフローに従って、配列番号６０を有するＶＨドメインと、配列番号６１を有するＶＬドメインとを有するマウスＳＰ３４抗体のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ３生殖細胞系フレームワークへのＣＤＲ移植を介して操作した。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインは、ＢＥＡＴ抗体フォーマットにおけるその用途に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いてプロテインＡに対する結合をさらに除去することができる。
【０１９６】
この目的のために、生殖系列ＶＨ３重鎖ドメイン及び生殖系列ＶＫ３軽鎖ドメインを有するヒト抗体の可変ドメイン内のＣＤＲをそれぞれマウスＳＰ３４抗体由来のＣＤＲで置換した第一のヒト化抗体を構築した。得られたヒト化抗体は、さらなる親和性の改善のための開始点として使用され、ＳＰ３４抗体のキメラ（それぞれ配列番号６２及び６３を有する重鎖及び軽鎖、本明細書ではキメラＳＰ３４抗体と称される）に対してベンチマークされた。
【０１９７】
プロトタイプの抗体（配列番号６４及び６９を有する可変重鎖及び軽鎖、ＶＨ１／ＶＬ１と略記される）は、ヒトＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質に対する低結合性を有した（ＳＰＲによる評価、材料及び方法のセクション並びに図１０Ａ参照）。
【０１９８】
可変ドメインの第一のプロトタイプ対の３Ｄモデルに基づいて、ＣＤＲ移植ヒト生殖系列ＶＨ３／ＶＫ３プロトタイプとマウスＳＰ３４配列（ヒト対マウスまたはマウス対ヒト）間の逆突然変異か、合理的に設計されたアミノ酸変化のいずれかに対応する置換のサブセットが選択された。次の変更を行い、様々な組み合わせで試験した：可変重鎖ドメインにおけるＷ１００ｅＦ及びＷ１００ｅＹ、並びに可変軽鎖におけるＡ２Ｉ、Ｓ２５Ａ、Ｔ２７Ａ、Ｇ２７ａＡ、Ｖ２７ｃＡ、Ｔ２８Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｎ３１Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｅ３８Ｑ、Ｆ４４Ｐ、Ｇ４６Ｌ、Ｔ５１Ａ、Ｎ５２Ａ、Ｋ５３Ａ、Ｒ５４Ａ、Ｐ５６Ａ、Ｌ６６Ｇ、Ｄ６９Ｔ、Ｆ８７Ｙ、Ｑ８９Ａ、Ｗ９１Ｆ、Ｙ９２Ａ、Ｓ９３Ａ、Ｎ９４Ａ、及びＱ１００Ｇ（Ｋａｂａｔ番号付け；図１０Ａ参照）。置換の組み合わせに関する操作の方法は、ＣＤＲ領域への推定上の影響及び／又は可変ドメインのパッキング及び／又は免疫原性及び／又は哺乳動物細胞における一過性発現への影響の観点から種々な置換の相補性に基づいたものであった。
【０１９９】
第一の手法では、すべての候補は、ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされ、さらにｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質フォーマット（図１０Ｂ）で、ＶＨドメイン内に存在するプロテインＡ結合部位がＧ６５Ｓにより除去されたいくつかのバリアントを用いて試験された。最良のヒト化候補は、発現レベル並びにＳＰＲによるヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質への結合能に従って選択された。
【０２００】
意外なことに、ｓｃＦｖとして再フォーマットした場合、ＳＰ３４キメラ及びＨ１Ｌ２１は、ＩｇＧ１フォーマットと比較して、発現の劇的な消失をもたらす（図３３）。しかし、ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現は、ＶＨにおける置換Ｗ１００ｅＹとＶＬにおける置換Ｗ９１Ｆとの組み合わせによって増強された（図１０Ｂ）。
【０２０１】
したがって、ＣＤ３ベースの二重特異性抗体の製造可能性をさらに改善するために、ヒト化ＳＰ３４  ｓｃＦｖをさらに操作した。ＳＰ３４  ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現に影響を及ぼす重要な位置を同定するために、アラニンスキャンをＶＬ２１  ＣＤＲにおいて実施した。Ｔ２７Ａ、Ｇ２７ａＡ、Ｖ２７ｃＡ、Ｔ２８Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｎ３１Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｎ５２Ａ、Ｋ５３Ａ、Ｒ５４Ａ、Ｐ５６Ａ、Ｌ９０Ａ、Ｙ９２Ａ、Ｓ９３Ａ、Ｎ９４Ａ、及びＬ９５Ａの変更がなされた。興味深いことに、２９、３０（ＶＨ１／ＶＬ２６  配列番号３５１）及び９５（ＶＨ１／ＶＬ３４  配列番号３６３）位における置換のみがｓｃＦｖ−Ｆｃ発現を有意に増加させ（図３４）、さらにこれらの変異体は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロンに対する完全な結合を保持する唯一のものであった。
【０２０２】
これらの結果に基づいて、軽鎖の２９、３０、及び９５位においてより多くの置換を試験した。
【０２０３】
２９位及び３０位はすべての異なる可変軽鎖ファミリーにおいて超可変性を示すため、これらの二つの位置を、部位特異的ＰＣＲによってランダムに突然変異させた。製造したすべての突然変異体から、置換Ｔ２９Ａ、Ｔ２９Ｅ、Ｔ２９Ｓ、Ｓ３０Ａ、及びＳ３０Ｄのみが、ヒトＣＤ３イプシロンへの結合を維持しながら、図３５ａ及び３５ｂの一過性発現レベルを有意に改善した。
【０２０４】
別の手法で、当該技術分野において標準構造残基として知られているＬ９５を、可変ラムダファミリーのこのまさに同じ位置で最も頻繁に見出される残基で置換した。Ｌ９５Ａ、Ｌ９５Ｇ、Ｌ９５Ｔ、Ｌ９５Ｓ、Ｌ９５Ｄ、及びＬ９５Ｎの変更がなされた。意外なことに、Ｌ９５Ｇ及びＬ９５Ｔのみが、標的への結合を維持しながら発現を有意に改善した（図３５ｃ）。
【０２０５】
この研究から、いくつかのヒト化ＳＰ３４ベースのＢＥＡＴを設計し、発現及びＣＤ３イプシロンへの結合について試験した。これらすべての構築物の中で、Ｈ５Ｌ６５（配列番号３９４）及びＨ５Ｌ６７（配列番号３９６）ｓｃＦｖを含有する二重特異性抗体が、Ｈ５Ｌ３２  ｓｃＦｖベースのＢＥＡＴコントロールと比較して２倍の発現増加を示した（図３６）。
【０２０６】
Ｈ５Ｌ６５及びＨ５Ｌ６７を、ＩｇＧ１かｓｃＦｖ−ＦｃのいずれかとしてＤＳＣによってさらに特徴付け、Ｈ５Ｌ３２、Ｈ１Ｌ２１、及びＳＰ３４キメラと比較した。Ｈ５Ｌ６５は、ＩｇＧ１と同じくらい優れた熱安定性を示したが、興味深いことにｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの他のヒト化バリアントと比較して５から２℃の増加を示した。（表１）したがって、改善された抗体のインビボ安定性は、インビトロでもそうであるため、増加する。
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【０２０７】
抗原結合及び組換え発現に関して、重鎖及び軽鎖可変ドメインの好ましい組み合わせは次の通りであった：軽鎖ドメインＶＬ２１（配列番号１０５）、ＶＬ３２（配列番号１０６）、ＶＬ６５（配列番号４０１）、及びＶＬ６７（配列番号４０２）と対のＶＨ１（配列番号１０１）又はＶＨ２（配列番号１０２）又はＶＨ３（配列番号１０３）又はＶＨ５（配列番号１０４）。
【０２０８】
２．２  ＨＥＲ２
Ｔ細胞をリダイレクトしてＨＥＲ２陽性がん細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、様々な種類のヒト乳がんを治療するのに有用である。抗ＨＥＲ２抗体は、記載されており（Blumenthal GM et al., (2013) Clin Cancer Res, 19(18): 4911-6）、現在臨床で使用されているものもあれば、現在ヒトでの臨床検査中であるものもある（Tsang RY & Finn RS (2012) Br J Cancer, 106(1): 6-13）。
【０２０９】
本明細書で使用する抗ＨＥＲ２抗原結合部位は、ＦＡＢ断片（配列番号５を有する重鎖と配列番号３を有する軽鎖とを有するＦＡＢ断片）又はｓｃＦｖ断片（配列番号１０７）としてフォーマットした組換えヒト化抗ＨＥＲ２抗体ハーセプチン（登録商標）（セクション１．１を参照）に由来するものであった。いくつかのフォーマットでは、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５（ＶＨ３ドメインサブクラス）のＶＨドメインに存在するプロテインＡ結合を、Ｇ６５Ｓ置換（配列番号１０８を有する重鎖と配列番号３を有する軽鎖とを有するＦＡＢ断片又は配列番号１０９を有するｓｃＦｖ断片）又はＮ８２ａＳ置換（配列番号１１０を有する重鎖と配列番号３を有する軽鎖とを有するＦＡＢ断片又は配列番号１１１を有するｓｃＦｖ断片）を用いて除去した。
【０２１０】
２．３  ＣＤ３８
ＣＤ３８は、造血細胞及び固形組織に通常見られるＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ３８は、様々な悪性血液病においても発現する。Ｔ細胞をリダイレクトしてＣＤ３８陽性がん細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、多発性骨髄腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性／骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、ＮＫ細胞白血病、及び形質細胞白血病を含む様々な悪性血液病を治療するのに有用であろう。いくつかの抗ＣＤ３８抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００６０９９８７５号）。最もよく特徴がわかっている抗ヒトＣＤ３８抗体の中には、ＯＫＴ−１０及びＨＢ−７マウスハイブリドーマがある(Hoshino S et al., (1997) J Immunol, 158(2): 741-7)。
【０２１１】
第一の手法では、抗ヒトＣＤ３８抗原結合部位は、マウスハイブリドーマＯＫＴ１０（それぞれ配列番号１１２及び１１３の可変重鎖及び軽鎖）又はＨＢ−７（それぞれ配列番号１１４及び１１５の可変重鎖及び軽鎖）及びＦＡＢ又はｓｃＦｖ断片としてさらにフォーマット化することができるそれらのヒト化バージョンに由来し得る。実施例２．１に記載の方法及びワークフローに従って、ＨＢ−７ハイブリドーマのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークにＣＤＲ移植することによって操作される。
【０２１２】
第二の手法では、Ａｌｍａｇｒｏ  ＪＣ  ＆  Ｆｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ(Front Biosci, (2008) 13: 1619-33）によって記載されたいわゆるベストフィットヒト化法に従って、ＨＢ−７ハイブリドーマのベストフィットヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、それぞれヒトＩＧＨＶ４−５９＊０３及びＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１生殖細胞系フレームワーク（上掲のＩＭＧＴ（登録商標）に基づく）上へのＣＤＲ移植を介して操作した。異なる程度の逆突然変異を有するヒト化ＶＨ及びＶＬバリアントをインシリコで調べ、ヒト化ＶＨ及びＶＬの好ましい選択の一をヒトＩｇＧ１フォーマットとして一過性発現させ、本明細書ではヒト化ＨＢ−７ベストフィットＶＨ（配列番号１１６）及びＶＬ（配列番号１１７）ドメインと呼ぶ。次のマウス逆突然変異を導入した：（ＶＨ）Ｓ３５Ｈ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ４８Ｌ、Ｖ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｔ７３Ｎ、Ｆ７８Ｖ、Ｙ９１Ｆ、及び（ＶＬ）：Ｍ４Ｌ、Ｌ４８Ｉ、Ｙ４９Ｓ、Ｔ６９Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付け）。
【０２１３】
ヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体（配列番号１１８を有する重鎖及び配列番号１１９を有する軽鎖）は、ＦＡＣＳによってＣＨＯ［ＣＤ３８］組換え細胞を染色した（データは示さず）。ヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体は、ＳＰＲによりアッセイした場合、キメラＨＢ−７抗体（配列番号２０を有する重鎖及び配列番号１２１を有する軽鎖）と同様のＣＤ３８細胞外領域に対する結合親和性を有した（それぞれ３．６及び２．５ｎＭのＫＤ；；図１１Ａ（キメラ）及び図１１Ｂ（ヒト化））。意外なことに、ヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体は、熱量測定プロファイルから判断した場合、ＦＡＢ断片安定性においてキメラＨＢ−７抗体と比較して有意な増強（＋１４．６℃）をしめした（７６．４℃（キメラ）対９１．０℃（ヒト化）、図１１Ｆ）。
【０２１４】
第三の手法では、ヒトＣＤ３８細胞外ドメイン及びヒトＣＤ３８＋細胞で免疫したマウスを用いて、ヒトＣＤ３８に対する新規ハイブリドーマ候補を生成した。ハイブリドーマを生成する方法は既知であり、本明細書で使用する方法は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号に開示の方法と同様であった。９Ｇ７マウス抗体候補は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８（それぞれ配列番号１２２及び１２３を有する可変重鎖及び軽鎖）に対して高い親和性を有した。上掲の実施例に記載の方法に従って、このマウス抗体を最初にヒト化した。ベストフィット法を使用して、生殖系列ＶＨフレームワークＩＧＨＶ２−５＊０９及びＶＫフレームワークＩＩＧＫＶ１−３３＊０１（上掲のＩＭＧＴ（登録商標）に基づく）をヒト化プロセスの開始点として選択した。ＣＤＲ移植後、第一の抗体プロトタイプ（ヒトＩｇＧ１アイソタイプとしてフォーマット、配列番号１２４を有する重鎖及び配列番号１２５を有する軽鎖）は、ＳＰＲにより判断した場合、マウスの親抗体よりわずかに３分の１だけ低い、ヒトＣＤ３８への強力な結合を示した（配列番号１２６を有する重鎖と配列番号１２７を有する軽鎖とを有するキメラ９Ｇ７抗体；キメラ９Ｇ７抗体（データは示していない）及び第一のヒト化プロトタイプ（データは示していない）に対してそれぞれ０．３ｎＭ及び１ｎＭのＫＤ）。親和性は、抗体の可変軽鎖にＦ３６Ｙ逆突然変異（Ｋａｂａｔ番号付け）を導入すると、２倍改善した（得られた抗体は、本明細書では配列番号１２４を有する重鎖と配列番号１２８を有する軽鎖とを有するヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体という；ヒトＣＤ３８に対して０．５ｎＭのＫＤ、図１１Ｃ）。また、ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体は、キメラ９Ｇ７抗体と比較して、カニクイザルＣＤ３８抗原に対する高い親和性（３．２ｎＭのＫＤ、データは示していない）及び高いＦＡＢ熱安定性（ＤＳＣスキャンからのＦＡＢ  Ｔｍ）を示した（ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体及びキメラ９Ｇ７抗体について、それぞれ９４ｏＣ  ｖｓ．  ８２．２ｏＣ；図１１Ｇ参照）。ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体は、配列番号１２９を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１３０を有する軽鎖可変ドメインとを有する。
【０２１５】
加えて、９Ｇ７マウス抗体は、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークへのＣＤＲ移植を介したベストフレームワーク手法（best-framework approach）に従ってヒト化された。異なる程度の逆突然変異を有するヒト化ＶＨ及びＶＬバリアントをインシリコで調べ、ヒト化ＶＨ及びＶＬの組み合わせの一の好ましい選択をヒトＩｇＧ１抗体として一過性発現させ（得られた抗体は、本明細書では、配列番号１３１を有する重鎖と配列番号１３２を有する軽鎖とを有するヒト化９Ｇ７ベストフレームワーク抗体と呼ぶ）。次のマウス逆突然変異を導入した：（ＶＨ）Ａ２４Ｆ、Ｖ３７Ｉ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ａ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｎ７３Ｔ、Ｌ７８Ｖ、及びＫ９４Ｒ、並びに（ＶＬ）Ｆ３６Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付け）。この抗体は、ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体と類似の親和定数を有するヒトＣＤ３８及びカニクイザルＣＤ３８に対する強い結合を示した（ヒト及びカニクイザルＣＤ３８に対して、それぞれ０．４及び１ｎＭのＫＤ；図１１Ｄ）。ＦＡＢ熱安定性（ＤＳＣスキャンからのＦＡＢ  Ｔｍ）もまた、９Ｇ７ベストフィットＦ３６Ｙヒト化バリアントと非常に類似していた（８９．２℃、図１１Ｈ参照）。図１１Ｊは、上記の様々なヒト化９Ｇ７抗体を要約している。ヒト化９Ｇ７ベストフレームワーク抗体は、配列番号１３３を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１３４を有する軽鎖可変ドメインとを有する。
【０２１６】
第四の手法では、抗体ファージライブラリーをスクリーニングして、ヒトＣＤ３８に対するさらなるｓｃＦｖ断片を生成した。ライブラリーは、天然ヒトＶ遺伝子に基づく多様性を有した。このドナー由来の抗体ファージディスプレイライブラリーは、７０％が自己免疫疾患（脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、脊椎関節症、関節リウマチ、及び強皮症）を有する４８名のヒトドナー由来の血液リンパ球から増幅されたｃＤＮＡを使用した。ライブラリー構築は、Schofieldら（2007, Genome Biol., 8(11): R254）によって記載されたプロトコール従い、合計２．５３×１０ｅ１０クローンの多様性を有した。ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３８を認識するＳｃＦｖ断片を、このドナー由来のファージディスプレイライブラリーから以下のように単離した。組換えに由来するヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３８抗原についての一連の選択サイクルの繰り返しにより、ＳｃＦｖ断片を単離した（材料及び方法のセクションを参照のこと）。抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法は、既知である(Viti F et al., (2000) Methods Enzymol, 326: 480-505)。簡潔には、ライブラリーとのインキュベーションの後、予めプラスチックイムノチューブにコーティング（２０μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に一晩）又はストレプトアビジンビーズ上に捕捉しておいた固定化抗原（ビオチン標識形態の抗原を使用する場合、選択プロセスを通して５０ｎＭの濃度で捕捉した抗原）に結合したファージを回収し、結合しなかったファージを洗い流した。Marksら(Marks JD et al., (1991) J Mol Biol, 222(3): 581-97)によって記載されているように、結合したファージをレスキューし、選択プロセスを３回繰り返した。２回目及び３回目のパニングから１０００以上のクローンを発現させ、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８抗原に対するＥＬＩＳＡによって分析した。陽性クローンをＤＮＡ配列決定に付し、固有のクローンのいくつかを、ヒトＣＤ３８を発現する細胞株に結合する能力についてさらに分析した。ストレプトアビジンビーズ上に固定されたヒトＣＤ３８抗原のビオチン標識バージョンに対する１回目のパニング及びストレプトアビジンビーズ上に固定されたニクイザルのＣＤ３８抗原ビオチン標識バージョンに対する２回目のパニングに続いて、配列番号１３５の可変重鎖配列と配列番号１３６を有する可変軽鎖とを有する一の好ましいｓｃＦｖ断片（クローン番号７６７）を、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８の両方に結合する能力のために選択した。ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットした場合、クローン７６７は、ヒトＣＤ３８に対しては約３００ｎＭ（図１１Ｅ）、カニクイザルＣＤ３８に対しては約１．２μＭ（データは示していない）のＫＤを有した（クローン７６７  ＩｇＧ１抗体は、本明細書では、配列番号１３７を有する重鎖と配列番号１３８を有する軽鎖とを有するヒト７６７抗体と称する）。ＦＡＢ熱安定性（ＤＳＣスキャンからのＦＡＢ  Ｔｍ）は、７０．２℃であった（図１１Ｉ）。クローン７６７  ＶＨドメインは、ＶＨ３ドメインサブクラスに属する。
【０２１７】
２．４  ＯＸ４０
ＣＤ３及びＯＸ４０を標的とする二重特異性抗体は、活性化Ｔリンパ球の標的化及び枯渇を可能にする。この組み合わせにおいて、ＣＤ３及びＯＸ４０分子の両方を発現する活性化Ｔリンパ球は、迅速な細胞消失をもたらす相互殺傷プロセスに関与する。二重特異性抗体によるヒトＣＤ３とＯＸ４０の同時関与は、短期間で病原性Ｔ細胞を効果的に排除することができる。ＯＸ４０は、受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであり、ラットからの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される５０ｋＤａの糖タンパク質として１９８７年に最初に同定された(Paterson DJ et al., (1987) Mol. Immunol. 24: 1281-90)。ＣＤ２８とは異なり、ＯＸ４０は、ナイーブＴ細胞上に恒常的には発現しないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与の後に誘導される。ＯＸ４０は、活性化後２４時間から７２時間後に発現する二次共刺激分子である。そのリガンドであるＯＸ４０Ｌもまた、休止中の抗原提示細胞上では発現しないが、抗原提示細胞の活性化後に発現する。
【０２１８】
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号に開示されているマウス抗ヒトＯＸ４０抗体（それぞれ配列番号１３９及び１４０を有する重鎖及び軽鎖ドメイン）を、抗ヒトＯＸ４０抗原結合部位の供給源として使用することができる。ベストフィットヒト化法に基づく本抗体のヒト化バージョンもまた、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号に開示されており（それぞれ配列番号１４１及び１４２を有する重鎖及び軽鎖ドメイン）、いずれの抗体もＢＥＡＴフォーマットに再フォーマット用に修正可能である。
【０２１９】
実施例２．１に記載の方法及びワークフローに従って、抗ヒトＯＸ４０ハイブリドーマのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークにＣＤＲ移植することによって操作される。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインは、ＢＥＡＴ抗体フォーマットにおけるその用途に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いてプロテインＡに対する結合をさらに除去される。逆突然変異の程度が異なる二のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインのみを調べた。親抗体可変ドメインと第一のプロトタイプ抗体と類似しているＣＤＲ移植ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから、逆突然変異を同定した。その手法は実施例２．１に記載している。これらのＣＤＲ移植可変ドメインは、逆突然変異を有しておらず、本明細書では最小移植(mingraft)と呼ばれる。次いで、これらの配列を、以前のアラインメントから同定されたすべての逆突然変異を含むようにさらに修飾し、本明細書で最大移植(maxgraft)と呼ばれる、修飾された可変ドメイン配列を得た。得られた配列を以下に要約する。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化された抗ＯＸ４０  ＶＨ；ヒト化抗ＯＸ４０／最小移植ＶＨ（配列番号２７８）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化された抗ＯＸ４０  ＶＨ；ヒト化抗ＯＸ４０／最大移植ＶＨ（配列番号２７９）と略記される。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化された抗ＯＸ４０  ＶＬ；ヒト化抗ＯＸ４０／最小移植ＶＬ（配列番号２８０）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化された抗ＯＸ４０  ＶＬ；ヒト化抗ＯＸ４０／最大移植ＶＬ（配列番号２８１）と略記される。
【０２２０】
２．５  ＣＤ２０
Ｔ細胞をリダイレクトしてＣＤ２０発現Ｂ細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、様々な種類のヒトリンパ腫がんを治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトＣＤ２０抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている。最もよく特徴がわかっている抗ヒトＣＤ２０抗体の中には、キメラリツキシマブ抗体及びそのヒト化バリアントがある（キメラリツキシマブ抗体、商品名リツキサン（登録商標）、ＰＣＴ公開番号：国際公開第１９９４０１１０２６号；配列番号１４３のマウスＶＨドメイン及び配列番号１４４のＶＬドメイン）。
【０２２１】
実施例２．１に記載の方法及びワークフローに従って、リツキシマブキメラ抗体のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークにＣＤＲ移植することによって操作される。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインは、ＢＥＡＴ抗体フォーマットにおけるその用途に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いてプロテインＡに対する結合をさらに除去される。逆突然変異の異なる程度の点で異なる二のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを調べた。親抗体可変ドメインと第一のプロトタイプ抗体と類似しているＣＤＲ移植ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから、逆突然変異を同定した。その手法は実施例２．１に記載している。これらのＣＤＲ移植可変ドメインは、逆突然変異を有しておらず、本明細書では最小移植と呼ばれる。次いで、これらの配列を、以前のアラインメントから同定されたすべての逆突然変異を含むようにさらに修飾し、本明細書で最大移植と呼ばれる、修飾された可変ドメイン配列を得た。得られた配列を以下に要約する。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたリツキシマブ  ＶＨ；ヒト化リツキシマブ／最小移植ＶＨ（配列番号２８２）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたリツキシマブ  ＶＨ；ヒト化リツキシマブ／最大移植ＶＨ（配列番号２８３）と略記される。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたリツキシマブ  ＶＬ；ヒト化リツキシマブ／最小移植ＶＬ（配列番号２８４）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたリツキシマブ  ＶＬ；ヒト化リツキシマブ／最大移植ＶＬ（配列番号２８５）と略記される。
【０２２２】
２．６  ＥＧＦＲ
Ｔ細胞をリダイレクトしてＥＧＦＲ陽性がん細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、様々な種類のヒトのがん、好ましくはヒト膵臓がん及びヒト結腸がんを治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトＥＧＦＲ抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている。最もよく特徴がわかっている抗ヒトＥＧＦＲ抗体の中には、キメラセツキシマブ抗体及びそのヒト化バリアントがある（キメラセツキシマブ抗体、商品名アービタックス（登録商標）、Ｃ２２５、ＩＭＣ−Ｃ２２５；ＰＣＴ公開番号：国際公開第１９９６４０２１０号；配列番号１４５のマウスＶＨドメイン及び配列番号１４６のマウスＶＬドメイン）。
【０２２３】
実施例２．１に記載の方法及びワークフローに従って、アービタックス（登録商標）キメラ抗体のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークにＣＤＲ移植することによって操作される。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインは、ＢＥＡＴ抗体フォーマットにおけるその用途に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いてプロテインＡに対する結合をさらに除去される。逆突然変異の異なる程度の点で異なる二のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを調べた。親抗体可変ドメインと第一のプロトタイプ抗体と類似しているＣＤＲ移植ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから、逆突然変異を同定した。その手法は実施例２．１に記載している。これらのＣＤＲ移植可変ドメインは、逆突然変異を有しておらず、本明細書では最小移植と呼ばれる。次いで、これらの配列を、以前のアラインメントから同定されたすべての逆突然変異を含むようにさらに修飾し、本明細書で最大移植と呼ばれる、修飾された可変ドメイン配列を得た。得られた配列を以下に要約する。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたアービタックス  ＶＨ；ヒト化アービタックス／最小移植ＶＨ（配列番号２８６）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたアービタックス  ＶＨ；ヒト化アービタックス／最大移植ＶＨ（配列番号２８７）と略記される。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたアービタックス  ＶＬ；ヒト化アービタックス／最小移植ＶＬ（配列番号２８８）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたアービタックス  ＶＬ；ヒト化アービタックス／最大移植ＶＬ（配列番号２８９）と略記される。
【０２２４】
別のよく特徴がわかっている抗ヒトＥＧＦＲ抗体は、ヒトパニツムマブ抗体及びそのヒト化バリアントである（ヒトパニツムマブ抗体、商品名ベクティビックス（登録商標）；ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３８９９７号；配列番号２９０を有するマウスＶＨドメイン及び配列番号２９１を有するマウスＶＬドメイン）。
【０２２５】
実施例２．１に記載の方法及びワークフローに従って、ベクティビックス（登録商標）キメラ抗体のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークにＣＤＲ移植することによって操作される。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインは、ＢＥＡＴ抗体フォーマットにおけるその用途に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いてプロテインＡに対する結合をさらに除去される。逆突然変異の異なる程度の点で異なる二のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを調べた。親抗体可変ドメインと第一のプロトタイプ抗体と類似しているＣＤＲ移植ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから、逆突然変異を同定した。その手法は実施例２．１に記載している。これらのＣＤＲ移植可変ドメインは、逆突然変異を有しておらず、本明細書では最小移植と呼ばれる。次いで、これらの配列を、以前のアラインメントから同定されたすべての逆突然変異を含むようにさらに修飾し、本明細書で最大移植と呼ばれる、修飾された可変ドメイン配列を得た。得られた配列を以下に要約する。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたベクティビックス  ＶＨ；ヒト化ベクティビックス／最小移植ＶＨ（配列番号２９２）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたベクティビックス  ＶＨ；ヒト化ベクティビックス／最大移植ＶＨ（配列番号２９３）と略記される。
逆突然変異を有しないヒト化及び安定化されたベクティビックス  ＶＬ；ヒト化ベクティビックス／最小移植ＶＬ（配列番号２９４）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有するヒト化及び安定化されたベクティビックス  ＶＬ；ヒト化ベクティビックス／最大移植ＶＬ（配列番号２９５）と略記される。
【０２２６】
２．７  ＣＤ１９
Ｔ細胞をリダイレクトしてＣＤ１９発現Ｂ細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、様々な種類のヒトの血液及び骨髄のがんを治療するのに有用であろう。ヒトＣＤ１９分子は、ヒトＢ細胞の表面に発現する構造的に異なる細胞表面受容体であり、限定されないが、プレＢ細胞、発生初期のＢ細胞（すなわち未成熟Ｂ細胞）、形質細胞及び悪性Ｂ細胞への最終分化を経た成熟Ｂ細胞を含む。ＣＤ１９は、大部分はプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、好発急性リンパ球性白血病及びいくつかのヌル急性リンパ芽球性白血病により発現される(Nadler LM et al. (1983) J Immunol, 131: 244-250; Anderson KC et al., (1984) Blood, 63: 1424-1433; Loken MR et al. (1987) Blood, 70: 1316-1324; Uckun FM et al. (1988) Blood, 71: 13-29; Scheuermann RH & Racila E (1995) Leuk Lymphoma, 18: 385-397)。血漿細胞上でのＣＤ１９の発現は、それが多発性骨髄腫、形質細胞腫、ワルデンシュトレーム腫瘍等の分化したＢ細胞腫瘍上で発現され得ることをさらに示唆する(Grossbard ML et al. (1998) Br J Haematol, 102: 509-15; Treon SP et al. (2003) Semin Oncol, 30: 248-52)。
【０２２７】
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０９５０３１号に記載のヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体は、ＶＨ３−２３及びＶＫ１可変ドメインフレームワークを利用し、実施例２．１に記載のように二重特異性抗体を製造するために使用することができる。配列番号２９６を有するＶＨドメインと、配列番号２９７を有するＶＬドメインとを有するヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体を使用し、ＢＥＡＴ抗体フォーマットにおけるその用途に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いてプロテインＡに対する結合をさらに除去する。
【０２２８】
２．８  ＩｇＥ
Ｔ細胞をリダイレクトして膜結合ＩｇＥ陽性Ｂ細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、喘息又は線維症などの様々な炎症性疾患を治療するのに有用であり得る。いくつかの抗ヒトＩｇＥ抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている。最もよく特徴がわかっている抗ヒトＩｇＥ抗体の中には、オマリズマブ抗体（商品名ソレア（登録商標）、ＵＳＰＴＯ公開番号：ＵＳ６７６１８８９、ＵＳ６３２９５０９、及びＵＳ２００８０００３２１８Ａ１；Presta LG et al., (1993) J lmmunol, 151: 2623-2632；配列番号２９８を有するヒト化ＶＨドメイン及び配列番号２９９を有するＶＬドメイン）及びその変異体バリアントがある。
【０２２９】
実施例２．１に記載の方法及びワークフローに従って、オマリズマブ抗体のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークにＣＤＲ移植することによって操作される。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインは、ＢＥＡＴ抗体フォーマットにおけるその用途に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いてプロテインＡに対する結合をさらに除去される。逆突然変異の異なる程度の点で異なる二の安定化されたＶＨ及びＶＬドメインを調べた。親抗体可変ドメインと第一のプロトタイプ抗体と類似しているＣＤＲ移植ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから、逆突然変異を同定した。その手法は実施例２．１に記載している。これらのＣＤＲ移植可変ドメインは、逆突然変異を有しておらず、本明細書では最小移植と呼ばれる。次いで、これらの配列を、以前のアラインメントから同定されたすべての逆突然変異を含むようにさらに修飾し、本明細書で最大移植と呼ばれる、修飾された可変ドメイン配列を得た。得られた配列を以下に要約する。
逆突然変異を有しない、安定化されたオマリズマブ  ＶＨ；安定化されたオマリズマブ／最大移植ＶＨ（配列番号３００）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有する、安定化されたオマリズマブ  ＶＨ；安定化されたオマリズマブ／最小移植ＶＨ（配列番号３０１）と略記される。
逆突然変異を有しない、安定化されたオマリズマブ  ＶＬ；安定化されたオマリズマブ／最大移植ＶＬ（配列番号３０２）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有する、安定化されたオマリズマブ  ＶＬ；安定化されたオマリズマブ／最小移植ＶＬ（配列番号３０３）と略記される。
【０２３０】
抗ヒトＩｇＥ抗体の別の例は、マウス抗体Ｂｓｗ１７である（Vogel M et al., (2004) J Mol Biol, 341(2): 477-89；配列番号３０４を有するマウスＶＨドメイン及び配列番号３０５を有するマウスＶＬドメイン）。
【０２３１】
実施例２．１に記載の方法及びワークフローに従って、ヒト化Ｂｓｗ１７抗体のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークにＣＤＲ移植することによって操作される。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインは、ＢＥＡＴ抗体フォーマットにおけるその用途に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いてプロテインＡに対する結合をさらに除去される。逆突然変異の異なる程度の点で異なる二の安定化されたＶＨ及びＶＬドメインを調べた。親抗体可変ドメインと第一のプロトタイプ抗体と類似しているＣＤＲ移植ＶＨ３及びＶＫ１との間の配列アラインメントから、逆突然変異を同定した。その手法は実施例２．１に記載している。これらのＣＤＲ移植可変ドメインは、逆突然変異を有しておらず、本明細書では最小移植と呼ばれる。次いで、これらの配列を、以前のアラインメントから同定されたすべての逆突然変異を含むようにさらに修飾し、本明細書で最大移植と呼ばれる、修飾された可変ドメイン配列を得た。得られた配列を以下に要約する。
逆突然変異を有しない、安定化されたＢｓｗ１７  ＶＨ；安定化されたＢｓｗ１７／最大移植ＶＨ（配列番号３０６）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有する、安定化されたＢｓｗ１７  ＶＨ；安定化されたＢｓｗ１７／最小移植ＶＨ（配列番号３０７）と略記される。
逆突然変異を有しない、安定化されたＢｓｗ１７  ＶＬ；安定化されたＢｓｗ１７／最大移植ＶＬ（配列番号３０８）と略記される。
あらゆる可能な逆突然変異を有する、安定化されたＢｓｗ１７  ＶＬ；安定化されたＢｓｗ１７／最小移植ＶＬ（配列番号３０９）と略記される。
【０２３２】
実施例３：  Ｔ細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリンの製造
３．１  ＢＥＡＴ（登録商標）法及び内蔵精製システム
ＢＥＡＴ抗体は、「ノブ・イントゥー・ホール」技術と比較して、優れたヘテロダイマー化を示すバイオミミクリーのユニークな概念に基づく重鎖ヘテロ二量体である（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号）。ＢＥＡＴプラットフォームは、天然ホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメイン対間の３Ｄ同等位置における接触アミノ酸の交換に基づき、Ｆｃベースの二重特異性抗体の構成要素として利用可能な新規のヘテロ二量体を作り出す。この技術は、任意のタイプの抗原結合スカフォールドを用いた、Ｆｃベースの二重特異性抗体の設計を可能にする。ｓｃＦｖ−ＦＡＢフォーマットは、本明細書において、両方の抗原結合部位のための共通の軽鎖を開発する必要なしに、Ｆｃベースの二重特異性抗体を設計するために使用される。
【０２３３】
ＢＥＡＴ抗体は重鎖ヘテロ二量体であるため、二の異なる重鎖を区別することが必要である。これらは、本明細書ではＢＴＡ及びＢＴＢ鎖と呼ばれる。本明細書で使用されるＢＴＡ及びＢＴＢ鎖は、抗原結合部位、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ由来のＣＨ２ドメイン、及びヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ由来の修飾ＣＨ３ドメインを包含する。ＢＴＡ及びＢＴＢ  ＣＨ３ドメインのいくつかは、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号に記載されているドメインの同一又は修飾バリアントであった。ＢＴＡ及びＢＴＢ  ＣＨ３ドメインは、配列番号１４７、１４８、１４９、１５３、１５４、及び１５５（ＢＴＡ）、並びに配列番号１５０、１５１、１５２、１５６、１５７、及び１５８（ＢＴＢ）からなる群より選択された。好ましいＢＴＡ−ＢＴＢ  ＣＨ３ドメインのペアリングは、配列番号１４７と配列番号１５０、配列番号１４８と配列番号１５０、配列番号１４９と配列番号１５１、配列番号１４７と配列番号１５２、及び配列番号１４８と配列番号１５２からなる群より選択される。最も好ましいＢＴＡ−ＢＴＢ  ＣＨ３ドメインのペアリングは、配列番号１４７と配列番号１５６、配列番号１４８と配列番号１５６、配列番号１５４と配列番号１５０、及び配列番号１５４と配列番号１５２からなる群より選択される。
【０２３４】
上記のように、プロテインＡへの非対称結合を有するＢＥＡＴ重鎖ヘテロ二量体は、プロテインＡへの結合を有しない免疫グロブリンアイソタイプ由来の親ドメインを用いて作出することができる（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１３１５５５号）。ホモ二量体種とヘテロ二量体種との間のプロテインＡ結合部位の数の違いは、プロテインＡクロマトグラフィーによってこれらの分子種を分解するのに特に有用である。プロテインＡクロマトグラフィーによる種の分離を妨害する残留結合を避けるために、ヒト重鎖可変ドメインのＶＨ３サブクラス内に天然に見出される任意の二次プロテインＡ結合部位を除去することが必要である。抗原結合部位がＶＨ３ファミリーに由来する場合、そのプロテインＡ結合部位の除去は、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を介して達成することができる。
【０２３５】
ＶＨ３起源の一の抗原結合部位及び非ＶＨ３由来の一の抗原結合部位とを使用して、本発明に包含される二重特異性抗体を調製する場合、ＶＨ３起源の抗原結合部位は、Ｆｃ領域内でプロテインＡに結合する重鎖上に位置する必要がある。あるいは、ＶＨ３由来の抗原結合部位は、Ｎ８２ａＳ置換又はＧ６５Ｓ置換又はそれらと同等の置換で置換されて、プロテインＡ結合を除去することができる。ＶＨ３起源の一対の抗原結合部位を使用して本発明の二重特異性抗体を調製する場合、唯一の可能性は、ＶＨ３ベースノ抗原結合部位の少なくとも一において上記のアミノ酸置換を介してプロテインＡ結合を除去することである。好ましくは、本発明の二重特異性抗体は、プロテインＡ結合部位なしで、二のホモ二量体のうちの一を作出するように操作される。より好ましくは、本発明の二重特異性抗体は、プロテインＡ結合部位なしで一のホモ二量体を作出するように操作され、他方のホモ二量体は、目的のヘテロ二量体に対して、そのプロテインＡ結合部位の数（少なくとも一のプロテインＡ結合部位、好ましくは二のプロテインＡ結合部位）に実質的な差異を有する。
【０２３６】
単一特異性抗ヒトＣＤ３イプシロン抗体によって誘発される毒性の機序は、詳細に調べられている。直接的機序は、抗体の親和性、エピトープ、及び結合価に関連しているが、毒性の間接的機序も記述されている。このような毒性の間接的機序は、免疫細胞を発現するＦｃ受容体と相互作用し、かつ一過性のＴ細胞活性化及びサイトカイン放出をもたらす抗ヒトＣＤ３抗体のＦｃ領域によって媒介される。安全性を向上させる目的で、ヒトＣＤ３イプシロンを標的とするＢＥＡＴ抗体は、その下部ヒンジ領域におけるＦｃ受容体に対する結合を除去された。Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け；Strohl WR et al., (2009) Curr Opin Biotechnol, 20(6): 685-91）を使用して、Ｆｃ受容体結合を除去又は低減させた。これは、ＬＡＬＡ置換と通常呼ばれる。
【０２３７】
プロテインＡに対する結合を除去された少なくとも一のＶＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ抗体の例
ＨＥＲ２／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＨＥＲ２及び抗ＣＤ３イプシロンアームは、ＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖ断片からなるｓｃＦｖ−Ｆｃ型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢ断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、また適切な場合にはＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を使用して、残留プロテインＡ結合を除去した。ヒトＨＥＲ２抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマットした。
【０２３８】
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＨＥＲ２アームについてそれぞれ実施例及び２．２に記載の抗原結合部位の組合せを用いて、第一のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、Ｎ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を有する可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号４７）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１５９）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＮ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６０）から構成された。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体という（図１２Ａ  フォーマットＡ）。
【０２３９】
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＨＥＲ２アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組合せを用いて、第二のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６１）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６２）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＮ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体という（図１２Ａ  フォーマットＢ）。
【０２４０】
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＨＥＲ２アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組合せを用いて、第三のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、Ｇ６５Ｓ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を有する可変重鎖ドメイン、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号４７）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６３）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６４）から構成された。ＰＣＴ公開番号：国際公開第１９９４０２９３５０号に記載されている通りにＫａｂａｔ位重鎖４４（Ｇ４４Ｃ）と軽鎖１００（Ｑ１００Ｃ）の重鎖及び軽鎖ドメインとの間の操作されたジスルフィド結合を用い、二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分をさらに安定化させた。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３抗体という（図１２Ｂ  フォーマットＣ）。
【０２４１】
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＨＥＲ２アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組合せを用いて、第四のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１６６）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６５）から構成された。この重鎖及び軽会合体（heavy chain and light assembly）は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９５６５号に記載されているような抗ヒトＣＤ３イプシロン抗体（ＳＰ３４）のヒト化バージョンを包含した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６７）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＮ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体という（図１２Ｂ  フォーマットＤ）。
【０２４２】
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＨＥＲ２アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組合せを用いて、第五のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、可変重鎖ドメイン、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号８９）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６８）から構成された。この二重特異性抗体のアームは、実施例２．１に記載のヒト化ＳＰ３４  ＶＨ１／ＶＬ２１抗体の可変ドメインを包含した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６７）から構成された。このアームは、上記のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗ＨＥＲ２アームにあたる（図１２ＢのフォーマットＤ参照）。その重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＮ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ１）抗体という（図１２Ｃ  フォーマットＥ）。
【０２４３】
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ１）抗体を一過性発現させ、精製し、ＨＥＲ２及びＣＤ３イプシロン抗原に対するそれらの親和性、それらの安定性、及びＴ細胞キリングをリダイレクトするそれらの能力をインビトロで試験した。一過性発現の収量は、すべてのＢＥＡＴ抗体について５−１５ｍｇ／ｌの範囲の培養上清であった。重要なことに、すべての二重特異性抗体は、一工程のプロテインＡクロマトグラフィー後のその調製中に、非常に低レベルのホモ二量体汚染物質を示した。
これらすべてのＢＥＡＴ抗体はＶＨ３ドメインを包含する両アームで設計されているため、少なくとも一のＶＨ３ドメインにおけるプロテインＡ結合の除去だけで、好ましい特異的な精製法の一を用いて目的のヘテロ二量体を容易に精製することができた（図２Ｅ参照）。ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体の特異的なプロテインＡ精製結果の一例を図１３に示し、図１４には、精製ヘテロ二量体のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す。わずかな含有量のヘテロ二量体汚染物質しか、このプロファイルからは確認することができない。ＦＡＢ部分を有するようにフォーマットされた重鎖のホモ二量体は、プロテインＡに結合しないため、見出されない。ｓｃＦｖ断片を有するようにフォーマットされた重鎖のホモ二量体は、わずかな割合（２．５％）で見出され、一工程のプロテインＡクロマトグラフィー後にヘテロ二量体含量が９７％という結果をもたらした。ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）、及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ１）抗体を、一工程のプロテインＡクロマトグラフィー後に、同レベルの均一性及び純度に精製した。ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−３抗体は、プロテインＡクロマトグラフィー後に、カチオン交換クロマトグラフィーにより除去された、ある割合のジスルフィド結合ヘテロ二量体凝集体（２７％）を示した。
【０２４４】
ＶＨ３ベースの重鎖ヘテロ二量体内でのプロテインＡ結合の除去がプロテインＡクロマトグラフィー後の純度に大いに影響することをさらに実証するために、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体を前記のＮ８２ａＳ置換なしに操作した。図１５Ａ及び１５Ｂは、それぞれＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及びその非Ｎ８２ａＳ置換バージョンについての、プロテインＡクロマトグラフィー溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ｐＨ４では、非Ｎ８２ａＳ置換バージョンの溶出画分は、ＦＡＢアームを有するようにフォーマットされた重鎖のホモ二量体に対応するさらなるバンドを示す（図１５Ｂ）。一方、Ｎ８２ａＳ置換ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３バージョンはそうではなく（図１５Ａ）、ＦＡＢアームを有するようにフォーマットされた重鎖はそのＦｃ領域（ヒトＩｇＧ３アイソタイプに基づくＦｃ領域）においてプロテインＡに結合しないことから、このホモ二量体種で見出されるＶＨ３ベースの可変ドメインがプロテインＡ結合に関与するとしか推論できない。この結果は、ＶＨ３ベースの重鎖ヘテロ二量体内でプロテインＡ結合を除去することの有用性を明らかに示している。
【０２４５】
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体はいずれも、ヒトＨＥＲ２抗原及びヒトＣＤ３イプシロン抗原について同様のＫＤ値を有した。ＫＤ値は、ヒトＨＥＲ２抗原については０．５０−２ｎＭの範囲であり、ヒトＣＤ３イプシロン抗原については１−２μＭの範囲であった（ヒトＣＤ３ガンマ−イプシロン−Ｆｃコンストラクトを用いてＳＰＲによって測定）（材料及び方法のセクションを参照；図１６Ａ及び１６Ｂ）。二の二重特異性抗体についてのＤＳＣプロファイルは類似しており、いずれの場合も、ヒトＨＥＲ２又はヒトＣＤ３イプシロンに関与するｓｃＦｖ部分は、６８℃の範囲のＴｍを有する良好な熱安定性プロファイルを保持していた。両抗体のＦＡＢ部分は、８２−８３℃の範囲のＴｍを有した（図１６Ｃ）。
【０２４６】
ヒト化ハーセプチンＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＨＥＲ２抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＨＥＲ２に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＨＥＲ２アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｙ１領域、ｙ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｙ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３）と組み立てられた、ｙ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１０）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
【０２４７】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２４８】
インビトロＴ細胞キリングアッセイ
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体の作用機序は、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞表面上のＣＤ３抗原と標的細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原とを架橋することにより、標的細胞関して細胞傷害性Ｔ細胞キリングを目的とすることに基づく。
【０２４９】
フローサイトメトリーに基づく方法（本明細書ではＲＤＬ−ＦＡＣＳ法という）又は比色法に基づく方法（本明細書ではＲＤＬ−ＭＴＳ法という）を用いて、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及びＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２抗体のリダイレクトＴ細胞キリングに対する力価を測定した。
ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）耐性乳癌細胞株である高発現ＨＥＲ２細胞株ＪＩＭＴ−１、高発現ＨＥＲ２細胞株ＢＴ−４７４、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）感受性乳癌細胞株、及び低ＨＥＲ２発現乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１又は−２抗体又はコントロール抗体の連続希釈液及びヒトＰＢＭＣの存在下で、４８時間の間に個々に培養した。
これらのアッセイにおいて、献血由来のヒトＰＢＭＣを細胞傷害性Ｔリンパ球の供給源として使用した。すべてのアッセイにおいて、１０：１のエフェクター対標的細胞比を使用した。陰性コントロールは、抗体処理のない試料（標的細胞及びヒトＰＢＭＣのみ）の形態で提供された。インキュベーション時間後にＲＤＬ−ＦＡＣＳ又はＲＤＬ−ＭＴＳ法を用い、細胞傷害性を測定した（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、コントロール抗体が特異的なＴ細胞媒介細胞傷害性を誘発しなかったことを示した。対照的に、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体は、非常に効力のある、用量依存性の腫瘍標的細胞死を誘導した。最大殺傷は、１００％に近かった。どちらの読み取り方法も近い結果をもたらした。ドナー間の変動性が、これらの方法の間でＥＣ５０が約１０倍異なることの主な原因となった。測定したＥＣ５０は、標的細胞株によるＨＥＲ２抗原発現のレベルと相関した。
【０２５０】
ＢＴ−４７４細胞は、最もＨＥＲ２抗原を発現し、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体両方のＥＣ５０は、サブピコモルからピコモルの範囲（それぞれ０．６及び２ｐＭ、図１７Ａ）であった。ＪＩＭＴ−１細胞は、その細胞表面上のＨＥＲ２抗原をマスクしており（Nagy P et al. (2005), Cancer Res, 65(2): 473-482）、その結果として高いＨＥＲ２発現を有するにもかかわらず低いハーセプチン（登録商標）結合を示す。意外なことに、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２の両抗体は、ＲＤＬ−ＭＴＳ法によって測定した場合、ＪＩＭＴ−１細胞に対してピコモル範囲のＥＣ５０を有した（それぞれ２１及び１６ｐＭ；図１７Ｂ）。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体は、１．４ｐＭのＥＣ５０を有した。低ＨＥＲ２発現乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、両抗体がサブナノモルのＥＣ５０を示し（両方とも０．２ｎＭに近い値；図１７Ｃ）、前記の二の細胞株より感受性が低かった。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体は、０．０８ｎＭ．のＥＣ５０を有した。まとめると、これらの結果は、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１及び−２抗体が種々のＨＥＲ２発現乳がん細胞株に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて非常に強力であったことを示す。
【０２５１】
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９５６５号に記載されているような抗ヒトＣＤ３イプシロン抗体（ＳＰ３４）のヒト化バージョンを包含した。このＢＥＡＴ抗体フォーマットの、ＨＥＲ２＋細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力をインビトロで調べた。二の異なるＨＥＲ２＋細胞株、すなわち高ＨＥＲ２発現細胞株（ＮＣＩ−Ｎ８７）及び低ＨＥＲ２発現細胞株（ＨＴ−１０８０）をキリングアッセイにおいて使用した（材料及び方法のセクションを参照）。図１７Ｄ−Ｅは、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＮＣＩ−Ｎ８７及びＨＴ−１０８０細胞のＴ細胞リダイレクトキリングをそれぞれ示す。このアッセイでは、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比を、また４８時間のインキュベーション後にＲＤＬ−ＭＴＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体が、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞及びＨＴ−１０８０細胞をそれぞれ標的とする場合に、０．３５及び２９ｐＭのＥＣ５０を有するＨＥＲ２＋細胞株に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて非常に強力であったことを示す。
【０２５２】
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ１）抗体は、実施例２．１に記載の抗ヒトＣＤ３イプシロン抗体（ＳＰ３４−カッパ１）ＶＨ１／ＶＬ２１のヒト化バージョンを包含した。このＢＥＡＴ抗体フォーマットの、ＨＥＲ２＋細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力をインビトロで調べた。二の異なるＨＥＲ２＋細胞株、すなわち高ＨＥＲ２発現細胞株（ＮＣＩ−Ｎ８７）及び低ＨＥＲ２発現細胞株（ＨＴ−１０８０）をキリングアッセイにおいて使用した（材料及び方法のセクションを参照）。図１７Ｆ−Ｇは、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ１）抗体によるＮＣＩ−Ｎ８７及びＨＴ−１０８０細胞のＴ細胞リダイレクトキリングをそれぞれ示す。このアッセイでは、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比を、また４８時間のインキュベーション後にＲＤＬ−ＭＴＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ１）抗体が、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞及びＨＴ−１０８０細胞をそれぞれ標的とする場合に、０．４６及び３３８ｐＭのＥＣ５０を有するＨＥＲ２＋細胞株に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて非常に強力であったことを示す。
【０２５３】
インビボ有効性試験
ＪＩＭＴ−１異種移植片
ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体のインビボ有効性を、ＪＩＭＴ−１／ＰＢＭＣ異種移植モデルを用いて調べた。献血由来のヒトＰＢＭＣを細胞傷害性Ｔリンパ球の供給源として使用した。ハーセプチン（登録商標）耐性乳癌ＪＩＭＴ−１細胞を非刺激ヒトＰＢＭＣ（４の異なるドナー）と１：１の比で混合し、その後免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに皮下注射した。移植後、動物をＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体で２週間、週３回静脈内治療した。抗体治療は、移植の３時間後に開始し、その後２日目、４日目、７日目、９日目、及び１１日目に続けた。
【０２５４】
ＰＢＭＣなしの腫瘍増殖を評価するため、ヒトＰＢＭＣの非存在下で５×１０ｅ６のＪＩＭＴ−１細胞を５つ中１つのコホートに皮下接種し、一方残りのコホートには健康なドナーからの５×１０ｅ６の非刺激ヒトＰＢＭＣと５×１０ｅ６のＪＩＭＴ−１細胞との混合物を皮下接種した。
【０２５５】
ヒトＰＢＭＣは、抗体の非存在下で、腫瘍増殖に対して負の効果を示さなかった（図１８Ａ）。ヒトエフェクター細胞の存在下でＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体による治療は、ほとんどの動物において腫瘍増殖の完全な抑制を誘導した（１８／２０腫瘍、図１８Ｂ−Ｃ）。治療の最終日の１８日後、腫瘍の１１％（２／１８）のみが再び増殖し始めた。これらのデータは、ＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−１抗体の強力な抗腫瘍効果を非常に明確に示している。
【０２５６】
ＣＤ３８／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＣＤ３８及び抗ＣＤ３イプシロンアームは、ＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖ断片からなるｓｃＦｖ−Ｆｃ型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢ断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、また適切な場合にはＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を使用して、残留プロテインＡ結合を除去した。ヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマットした。
【０２５７】
ヒト化ＨＢ７ベストフィットＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の第一の例を次のようにフォーマットした：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．３に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１１９）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６９）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６２）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＮ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。このアームは、上記のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２  抗ＣＤ３イプシロンアームにあたる（図１２ＡのフォーマットＢ参照）。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体という（図１９  フォーマットＡ）。
【０２５８】
ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体を一過性発現させ、精製し、ＣＤ３８及びＣＤ３イプシロン抗原に対するその親和性、その安定性、及びＴ細胞キリングをリダイレクトするその能力についてインビトロで試験した。ヒトＣＤ３８抗原のＫＤ値は、３．２ｎＭであった（ＳＰＲにより測定；図２０Ａ）。二重特異性抗体のＤＳＣプロファイルは、ｓｃＦｖ部分について約６８℃のＴｍを有する良好な熱安定性プロフィールを示した。ＦＡＢ部分のＴｍは、約９１℃であった（図２０Ｂ）。
【０２５９】
ＣＤ３８発現細胞株（材料及び方法のセクションを参照のこと）を使用し、実施例３．２．１に記載のものと同様のアッセイにおいてリダイレクトＴ細胞キリングを評価した。図２１は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体を用いた、ＲＰＭＩ  ８２２６骨髄腫細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。本アッセイでは、エフェクター細胞として精製Ｔ細胞を、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で用いたことに留意されたい。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体は、２．２ｐＭのＥＣ５０を有した（２ドナーの平均、インキュベーション４８時間）。
【０２６０】
ヒトクローン７６７  ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の第二の例は、次のようにフォーマットされた：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．３に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１３８）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７０）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７１）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体という（図１９  フォーマットＢ）。
【０２６１】
ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体を一過性発現させ、精製し、ＣＤ３８及びＣＤ３イプシロン抗原に対するその親和性、その安定性、及びＴ細胞キリングをリダイレクトするその能力についてインビトロで試験した。ＣＤ３８発現細胞株（材料及び方法のセクションを参照のこと）を使用し、実施例３．２．１に記載のものと同様のアッセイにおいてリダイレクトＴ細胞キリングを評価した。図２２は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体を用いた、Ｄａｕｄｉ細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。本アッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で用いたことに留意されたい。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体は、２４４ｐＭのＥＣ５０を有した（３ドナーの平均、インキュベーション２４時間）。
【０２６２】
ヒト化９Ｇ７ベストフレームワークＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．３に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１３２）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１２又は４０４）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフレームワーク／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２６３】
ヒトクローン７６７  ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８抗に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．３に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１３８）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１３）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２６４】
ＯＸ４０／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＯＸ４０及び抗ＣＤ３イプシロンアームは、ＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖ断片からなるｓｃＦｖ−Ｆｃ型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢ断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、また適切な場合にはＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を使用して、残留プロテインＡ結合を除去した。ヒトＯＸ４０抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマットした。
【０２６５】
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＯＸ４０アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．４に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体の例を操作した。ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号に開示されているヒト化抗ＯＸ４０抗体の可変ドメイン（それぞれ、配列番号１４１及び１４２を有する可変重鎖及び軽鎖ドメイン）を使用したヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＯＸ４０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１７３）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７２）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１６２）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＮ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。このアームは、上記のＢＥＡＴ  ＨＥＲ２／ＣＤ３−２  抗ＣＤ３イプシロンアームにあたる（図１２ＡのフォーマットＢ参照）。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体という（図２３）。
【０２６６】
このＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体の、ＯＸ４０＋細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力をインビトロで調べた。安定な組換えＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞株をキリングアッセイに用いた。図２４は、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体による、安定な組換えＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。このアッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、２０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で使用し、また４８時間のインキュベーション後にＲＤＬ−ＭＴＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３抗体が、０．５ｎＭのＥＣ５０（３ドナーの平均）をゆする、安定な組換えＣＨＯ［ＯＸ４０］細胞に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて、非常に強力であったことを示す。
【０２６７】
ヒト化抗ＯＸ４０／最大移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＯＸ４０抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＯＸ４０に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．４に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＯＸ４０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３１５）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１４）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書では、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０最大移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２６８】
ヒト化抗ＯＸ４０／最小移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＯＸ４０抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＯＸ４０に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．４に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＯＸ４０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３１７）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１６）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＯＸ４０最小移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２６９】
ＣＤ２０／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
マウスリツキシマブ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を次のようにフォーマットした：
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ２０アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．５に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３を操作した。
【０２７０】
ヒト化リツキシマブ／最大移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ２０に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．５に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ２０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３１９）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１８）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ２０最大移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２７１】
ヒト化リツキシマブ／最小移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ２０に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．５に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ２０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｙ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３２１）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２０）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ２０最小移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２７２】
ＥＧＦＲ／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＥＧＦＲ及び抗ＣＤ３イプシロンアームは、ＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖ断片からなるｓｃＦｖ−Ｆｃ型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢ断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、また適切な場合にはＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を使用して、残留プロテインＡ結合を除去した。ヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマットした。
【０２７３】
ヒトＥＧＦＲ及びヒトＣＤ３イプシロン抗原の両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＥＧＦＲアームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．６に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を操作する。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１７５）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含する、マウスアービタックス抗体可変ドメイン（それぞれ配列番号１４５及び１４６を有するマウス可変重及び軽鎖ドメイン）に基づくＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７４）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７１）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。このアームは、上記のＢＥＡＴ  ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗ＣＤ３イプシロンアームにあたる（図１９のフォーマットＢ参照）。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体という（図２５）。
【０２７４】
ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体を一過性発現させ、精製し、ヒトＥＧＦＲ＋細胞株に対してＴ細胞キリングをリダイレクトするその能力についてインビトロで試験した。ＨＴ−２９細胞株をキリングアッセイに用いた。図２６は、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体による、ＨＴ−２９細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。このアッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で使用し、また４８時間のインキュベーション後にＲＤＬ−ＭＴＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３抗体が、７０．６ｐＭのＥＣ５０（４ドナーの平均）を有するＨＴ−２９細胞に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて、非常に強力であったことを示す。
【０２７５】
ヒト化アービタックス／最大移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を次のようにフォーマットする：
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＥＧＦＲに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．６に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３２３）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２２）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＥＧＦＲｃｅｔｕｘ−最大移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２７６】
ヒト化アービタックス／最小移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を次のようにフォーマットする：
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＥＧＦＲに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．６に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３２５）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２４）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロン部分は、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＥＧＦＲｃｅｔｕｘ−最小移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２７７】
ヒト化ベクティビックス／最大移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＥＧＦＲに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．６に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３２７）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２６）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
【０２７８】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＥＧＦＲｐａｎｉ−最大移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２７９】
ヒト化ベクティビックス／最小移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＥＧＦＲに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．６に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３２９）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３２８）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＥＧＦＲｐａｎｉ−最小移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２８０】
ＣＤ１９／ＣＤ３  ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３重鎖は、第一のＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖ断片からなるｓｃＦｖ−Ｆｃ型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似の第一のＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢ断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、また適切な場合にはＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を使用して、残留プロテインＡ結合を除去した。国際公開第２０１００９５０３１号に記載の抗ＣＤ１９ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ１９抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマットする：
【０２８１】
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ１９に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．７に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ１９／ＣＤ３の例を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ１９アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｙ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３３１）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３０）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｙ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ１９／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２８２】
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０９５０３１号に記載のＣＤ１９発現細胞株を使用し、実施例３．２．１に記載のものと同様のアッセイにおいてリダイレクトＴ細胞キリングを評価した。
【０２８３】
ＩｇＥ／ＣＤ３  ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＩｇＥ及び抗ＣＤ３重鎖は、第一のＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖ断片からなるｓｃＦｖ−Ｆｃ型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似の第一のＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢ断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、また適切な場合にはＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を使用して、残留プロテインＡ結合を除去した。
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＩｇＥに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．８に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ  ＩｇＥ／ＣＤ３を操作する。
ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１０／０３３７３６号に記載の、細胞表面でＩｇＥを発現する細胞株を使用し、実施例３．２．１に記載のものと同様のアッセイにおいてリダイレクトＴ細胞キリングを評価した。
【０２８４】
安定化されたオマリズマブ／最大移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を次のようにフォーマットする：
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３３３）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３２）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＩｇＥｏｍａｌｉ−最大移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２８５】
安定化されたオマリズマブ／最小移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を以下のようにフォーマットする：
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３３５）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ    ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３４）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＩｇＥｏｍａｌｉ−最小移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２８６】
安定化されたＢｓｗ１７／最大移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を以下のようにフォーマットする：
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３３７）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３６）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＩｇＥｂｓｗ１７−最大移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２８７】
安定化されたＢｓｗ１７／最小移植ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例を以下のようにフォーマットする：
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３３９）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３３８）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＩｇＥ  ｂｓｗ１７−最小移植／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２８８】
一のＶＨ３ドメインのみを包含するＢＥＡＴ抗体の例
ＣＤ３８／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
ヒト化ＨＢ７／ベストフィット  ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例は、次のようにフォーマットされた：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．３に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１１９）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７６）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、プロテインＡへの結合を有しなかった。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７７）から構成された。この重鎖及び軽会合体は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９５６５号に記載されているような抗ヒトＣＤ３イプシロン抗体（ＳＰ３４）のヒト化バージョンを包含した。このＢＥＡＴ抗体フォーマットは、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体という（図２７  フォーマットＡ）。
【０２８９】
このＢＥＡＴ  ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体の、ＣＤ３８＋細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力をインビトロで調べた。ＣＤ３８＋Ｂリンパ芽球細胞株Ｄａｕｄｉをキリングアッセイに用いた。図２８は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体による、Ｄａｕｄｉ細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。このアッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で使用し、また２４時間のインキュベーション後にＲＤＬ−ＦＡＣＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体が、１．８ｐＭのＥＣ５０（３ドナーの平均）を有するＤａｕｄｉ  ＣＤ３８＋細胞株に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて非常に強力であったことを示す。
【０２９０】
ヒト化９Ｇ７ベストフィット  ＶＨ及びＶＬ配列（それぞれ、配列番号１２９及び１３０）を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の第二の例は、次のようにフォーマットされた：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．３に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８／ＣＤ３を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１２８）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７８）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、プロテインＡへの結合を有しなかった。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７９）から構成された。この二重特異性抗体のアームは、実施例２．１に記載のヒト化ＳＰ３４  ＶＨ５／ＶＬ３２抗体の可変ドメインを包含した。このＢＥＡＴ抗体フォーマットは、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という（図２７  フォーマットＢ）。ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／  ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体は、ヒトＣＤ３  １−２６＿Ｆｃ融合タンパク質に対して１８ｎＭのＫＤ値を有した（図２９）。
【０２９１】
このＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体の、ＣＤ３８＋細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力をインビトロで調べた。ＣＤ３８＋Ｂリンパ芽球細胞株Ｄａｕｄｉをキリングアッセイに用いた。図３０は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体による、Ｄａｕｄｉ細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。このアッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で使用し、また２４時間のインキュベーション後にＲＤＬ−ＦＡＣＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体が、２ｐＭのＥＣ５０（３ドナーの平均）を有するＤａｕｄｉ  ＣＤ３８＋細胞株に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて非常に強力であったことを示す。
【０２９２】
ＯＸ４０／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
抗ＯＸ４０抗体ＶＨ及びＶＬ配列（国際公開第２０１３００８１７１号に記載）を用いてヒトＯＸ４０抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマットする：
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＯＸ４０に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．４に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＯＸ４０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１７３）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４０）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインＡへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＯＸ４０／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２９３】
上記のヒトＯＸ４０発現細胞株を使用し、実施例３．２．４に記載のものと同様のアッセイにおいてリダイレクトＴ細胞キリングを評価した。
【０２９４】
ＣＤ２０／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
マウスリツキシマブ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を次のようにフォーマットした：
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ２０アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．５に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３を操作した。
【０２９５】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ２０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１８１）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含する、マウスリツキシマブ抗体可変ドメイン（それぞれ配列番号１４３及び１４４を有するマウス可変重及び軽鎖ドメイン）に基づくＢＥＡＴ重鎖（配列番号１８０）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、プロテインＡへの結合を有しなかった。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７７）から構成された。このアームは、上記のＢＥＡＴ  ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗ＣＤ３イプシロンアームにあたる（図２７のフォーマットＡ参照）。このｓｃＦｖ断片は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９５６５号（それぞれ、配列番号１８２及び１８３を有するＶＨ及びＶＬドメイン）に記載されているような抗ヒトＣＤ３イプシロンＳＰ３４抗体のヒト化バージョンを包含した。このＢＥＡＴ抗体フォーマットは、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体という（図３１）。
【０２９６】
ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体を一過性発現させ、精製し、ヒトＣＤ２０＋細胞株に対してＴ細胞キリングをリダイレクトするその能力についてインビトロで試験した。ＣＤ３８＋Ｂリンパ芽球細胞株Ｄａｕｄｉをキリングアッセイに用いた。図３２は、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体による、Ｄａｕｄｉ細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。このアッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で使用し、また２４時間のインキュベーション後にＲＤＬ−ＦＡＣＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、ＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体が、２５ｐＭのＥＣ５０（３ドナーの平均）を有するＤａｕｄｉ細胞に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて非常に強力であったことを示す。
【０２９７】
キメラリツキシマブ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ２０抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ２０に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．５に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ２０アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１８１）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４１）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインＡへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＣＤ２０／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０２９８】
ＥＧＦＲ／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
マウスアービタックス抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＥＧＦＲに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．６に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１７５）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４２）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインＡへの結合を有しない。
【０２９９】
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＥＧＦＲｃｅｔｕｘ／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０３００】
ヒトベクティビックス抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＥＧＦＲ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＥＧＦＲに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．６に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＥＧＦＲアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３４４）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４３）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインＡへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＥＧＦＲｐａｎｉ／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０３０１】
ＩｇＥ／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体の例
ヒト化オマリズマブ抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＩｇＥに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．８に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＥＧＦＲ／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３４６）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４５）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインＡへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＩｇＥｏｍａｌｉ／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０３０２】
マウスＢｓｗ１７抗体ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＩｇＥ抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＩｇＥに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．８に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ  ＩｇＥ／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＩｇＥアームは、可変重鎖領域、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３  ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号３４８）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３４７）から構成される。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有するため、プロテインＡへの結合を有しない。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１  ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１  ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ  ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号３１１）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ  ＩｇＥｂｓｗ１７／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
【０３０３】
記載の膜ＩｇＥ発現細胞株を使用し、上記のものと同様のアッセイにおいてリダイレクトＴ細胞キリングを評価した。
【０３０４】
ｓｃＦｖフォーマットでの改良型ＳＰ３４の機能的同等性
−  二重特異性ＣＤ３８×ＣＤ３抗体
種々のＳＰ３４  ｓｃＦｖを、その発現を改善するように行った修飾が機能的特性、すなわちＣＤ３の結合にも影響を与えたかどうかを決定するために、ＣＤ３８×ＣＤ３二重特異性に関して試験した。ＦＡＢとして存在するＣＤ３８結合アームは、配列番号１３３によってコードされる重鎖可変領域と、配列番号１３４によってコードされる軽鎖可変領域とを含む。ＣＤ３結合アームは、ｓｃＦｖ（配列番号４０３）として再フォーマットされた元のマウスＳＰ３４、又は重／軽鎖組み合わせＨ１／Ｌ２１（配列番号３６１）、Ｈ５／Ｌ３２（配列番号３１１）、Ｈ５／Ｌ６５（配列番号３９４）、及びＨ５／Ｌ６７（配列番号３９６）を含む修飾ヒト化ＳＰ３４  ｓｃＦｖを含む。
【０３０５】
異なるバージョンのＳＰ３４を使用するＣＤ３／ＣＤ３８  ＢＥＡＴのそれぞれを一過性発現させ、精製した。Ｔ細胞キリングをリダイレクトする能力を比較するために、それらをインビトロで試験した。Ｒａｊｉ  ＣＤ３８発現細胞株（材料及び方法のセクションを参照）を用いて、リダイレクトＴ細胞キリングを評価した。本アッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で用いた。
【０３０６】
ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、すべてのＢＥＡＴは、６から１０ｐＭの間（２ドナーの平均、インキュベーション２４時間、図３７）に相当するＥＣ５０を示した。
【０３０７】
−  二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３抗体
Ｈ５／Ｌ６５の重鎖／軽鎖組み合わせ（配列番号３９４）を含むＳＰ３４  ｓｃＦｖの特性も、ＣＤ２０  ＦＡＢ結合アーム、リツキシマブ、それぞれ配列番号２８２及び２８３を有するＶＨ及びＶＬドメインと共に試験した。
【０３０８】
ＣＤ３／ＣＤ２０  ＢＥＡＴを一過性発現させ、精製し、次いでインビトロで試験して、Ｔ細胞キリングをリダイレクトする能力を比較した。Ｒａｊｉ  ＣＤ２０発現細胞株（材料及び方法のセクションを参照）を用いて、リダイレクトＴ細胞キリングを評価した。本アッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、５対１のエフェクター細胞対標的細胞比で用い、２４時間インキュベートした。
【０３０９】
ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、すべてのＢＥＡＴは、Ｈ１／Ｌ２１（配列番号３６１）を含むＣＤ３×ＣＤ２０  ＢＥＡＴと同等の、３７．５６ｐＭ（４ドナーの平均、インキュベーション２４時間、図３８）のＥＣ５０を示した。上記参照。
【０３１０】
−  二重特異性ＥＧＦＲ×ＣＤ３抗体
○  アービタックス／ＣＤ３
ＫＲＡＳ突然変異を有する患者は、モノクローナル抗体セツキシマブ（商品名アービタックス）(Karapetis C et al., N Engl J Med 359: 1757 (2008））による治療からの恩恵を何も示さない。
【０３１１】
改良型ＳＰ３４  ｓｃＦｖの特性をさらに評価するため、また高ＥＧＦＲ発現細胞株を殺傷し、ＫＲＡＳ耐性を取り除くことが可能であることを実証するために、二重特異性アービタックス（重鎖配列番号１７４及び軽鎖配列番号１７５）−ｈＳＰ３４（配列番号３９４）ＢＥＡＴを構築し、ＫＲＡＳ突然変異がん細胞株Ａ５４９（肺）及びＨＣＴ１１６（結腸直腸がん）でインビトロのリダイレクトＴ細胞溶解アッセイを実施した。加えて、アービタックス−ｈＳＰ３４が、低ＥＧＦＲ発現細胞ではなく、ＥＧＦＲの高及び中発現レベルを示す細胞のみを殺傷することを実証するために、低ＥＧＦＲ発現細胞株ＭＣＦ−７も本アッセイに含めた。ＥＧＦＲ  ＰｈａｒｍＤｘ免疫組織化学キット（表２）を用いて、細胞株のＥＧＦＲ状態を決定した。
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【０３１２】
ＩｖＩｇを各ウェルに２．５ｍｇ／ｍＬで添加し、アービタックスエフェクター機能をブロックし、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害であるアービタックスの作用機序をより上手く模倣した。図３９に示すように。アービタックスは、どの細胞株にも影響を及ぼさない（いずれのＥＣ５０も評価することは不可能）。
【０３１３】
逆に、図４０に示すように、アービタックス／ｈＳＰ３４  ＢＥＡＴは、それぞれ６６．９７ｐＭ及び４３．３ｐＭのＥＣ５０を有するＫＲＡＳ突然変異Ａ５４９及びＨＣＴ１１６腫瘍細胞を効果的に殺傷することができる一方、より低いＥＧＦＲ発現のＭＣＦ−７細胞は、効率的に死滅しない。
【０３１４】
○  ベクティビックス
改良型ＳＰ３４  ｓｃＦｖの特性をさらに評価するため、また高ＥＧＦＲ発現細胞株を殺傷し、ＳｃＦｖとしてのＦＡＢ−ｈＳＰ３４  ＢＥＡＴ（配列番号３９４）のような二重特異性ベクティビックス（ＶＬ  配列番号２９１及びＶＨ  配列番号２９０）でＫＲＡＳ耐性機序を取り除くことが可能であることを実証するために、高ＥＧＦＲ発現肺がん細胞株ＨＣＣ８２７（肺）の他、ＫＲＡＳ突然変異肺がん細胞株Ａ５４９並びに結腸直腸がんＫＲＡＳ陽性細胞株ＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０で、インビトロのリダイレクトＴ細胞溶解アッセイを実施した。
【０３１５】
ベクティビックス／ｈＳＰ３４  ＢＥＡＴが、低ＥＧＦＲ発現細胞ではなく、ＥＧＦＲの高及び中発現レベルを示す細胞のみを殺傷することを実証するために、低ＥＧＦＲ発現細胞株ＭＣＦ−７もキリングアッセイに含めた。該細胞株のＥＧＦＲ状態（図４１）は、ＥＧＦＲ  ＰｈａｒｍＤｘ免疫組織化学キット（英国、ケンブリッジのＤａｋｏ）を用いて決定した。
【０３１６】
図４２に示すように、ベクティビックスは、評価した細胞株のいずれにも影響を及ぼさない（２ドナーの平均、エフェクター：標的細胞比２０対１）、読み取り：ＭＴＳで４８時間後）。
ベクティビックス／ｈＳＰ３４  ＢＥＡＴの場合、エフェクター：標的細胞比１０：１を使用し、データを４ドナーの平均として提示する。
【０３１７】
図４３に示すように、ベクティビックス／ｈＳＰ３４  ＢＥＡＴは、それぞれ０．１５５７、０．６１２７、０．３４０６、及び６．９８６ｐＭのＥＣ５０を有する高ＥＧＦＲ発現細胞株ＨＣＣ８２７並びにＫＲＡＳ突然変異Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、及びＳＷ４８０腫瘍細胞を効果的に殺傷することができる一方、より低いＥＧＦＲ発現のＭＣＦ−７細胞は、効率的に死滅しない（ＥＣ５０＝６２７．４ｐＭ）。
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【０３１８】
表３において、４ドナーの平均ＥＣ５０を決定し、治療ウインドウを算出した（ＥＣ５０（Ｘ）／ＥＣ５０（ＨＣＣ８２７）ベクティビックス−ＣＤ３）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
2017536412.tif 000052
【図１４】
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【図１５Ａ】
2017536412.tif 000054
【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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