(57)【要約】本発明は、哺乳動物の精子細胞のＸ−染色体に特異的な蛋白質に選択的に結合する精製抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントに関する。精子細胞タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＮｏ．９〜１６に記述されているアミノ酸配列を有する。本発明抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１６に記述されている一つかそれ以上の天然、あるいは合成の抗原ペプチド配列によってホストを免疫化することによって誘導することができる。本発明の抗体は、Ｘ−染色体を有する精製細胞集団を同定するさいに使用でき、また哺乳動物における性比をスキューイングする方法にも使用することができる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１６からなる群から選択される配列、またはこれに対して少なくとも８５％の相同性を示す配列を有する哺乳動物のＸ−染色体を有する精子細胞タンパク質に選択的に結合することを特徴とする精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７〜２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列、あるいはこの配列に対して相補的な配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤＮｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７〜２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の相同性を示すヌクレオチド配列、あるいはこの配列に対して相補的な配列を有する遺伝子によって前記の哺乳動物のＸ−染色体を有する精子細胞タンパク質をコード化する請求項１に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体かポリクローナル抗体、あるいはこれらの抗原−結合フラグメントである請求項１に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１６からなる群から選択される配列、またはこれに対して少なくとも８５％の相同性を示す抗原配列からなる群から選択される天然または合成抗原アミノ酸配列を有する抗原ペプチド組成物によってホストを免疫化することによって前記の抗体またはこれの抗原−結合フラグメントを誘導する請求項３に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のうちの一つかそれ以上からなる群から選択されるペプチドを有する抗原ペプチド組成物によって前記ホストを免疫化することによって前記の抗体またはこれの抗原−結合フラグメントを誘導する請求項３に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒト、雄牛、ウマ科の動物、羊、シカ科の動物、ラクダ科の動物、および豚からなる群から選択される請求項１に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記哺乳動物がＢｏｓ  ＴａｕｒｕｓおよびＢｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓのいずれか一つ、あるいはこれらの交配種である請求項６に記載の精製抗体、またはこれの抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１６からなる群から選択される配列、またはこれに対して少なくとも８５％の相同性を示す配列を有する天然の、あるいは合成した、哺乳動物のＸ−染色体を有する精子細胞タンパク質に対して選択的に結合する抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントに哺乳動物の精子の正味の、あるいは希釈サンプルを接触させ、そして
結合した抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントを直接または間接検出するＸ−染色体を有することを特徴とする哺乳動物の精子細胞の集団を同定する方法。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７〜２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列、あるいはこの配列に対して相補的な配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤＮｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７〜２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の相同性を示すヌクレオチド配列、あるいはこの配列に対して相補的な配列を有する遺伝子によって前記の哺乳動物のＸ−染色体を有する精子細胞タンパク質をコード化する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体かポリクローナル抗体、あるいはこれらの抗原−結合フラグメントである抗体に前記サンプルを接触させる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１６からなる群から選択される配列、またはこれに対して少なくとも８５％の相同性を示す抗原配列からなる群から選択される天然または合成抗原アミノ酸配列を有する抗原ペプチド組成物によってホストを免疫化することによって誘導した抗体またはこれの抗原結合フラグメントに前記サンプルを接触させる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のうちの一つかそれ以上からなる群から選択される天然または合成ペプチドを有する抗原ペプチド組成物によって前記ホストを免疫化することによって誘導する抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントに前記サンプルを接触させる請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト、雄牛、ウマ科の動物、羊、シカ科の動物、ラクダ科の動物、および豚からなる群から選択される哺乳動物から前記サンプル得る請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がＢｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ（ウシ）およびＢｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ（コブウシ）のいずれか一つ、あるいはこれらの交配種である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｘ−染色体を有する精子細胞およびＹ−染色体を有する精子細胞を有する精子細胞の集団を有する哺乳動物の精液のサンプルを得てから、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１６からなる群から選択される配列、またはこれに対して少なくとも８５％の相同性を示す配列を有する天然の、あるいは合成した、哺乳動物のＸ−染色体を有する精子細胞タンパク質に対して選択的に結合する抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントに前記精液のサンプルおよび／または前記の精子細胞の集団を接触させて、前記抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントを有する精子の一部を含むことを特徴とする精子細胞の混合集団を生成する性比のスキューイング方法。
【請求項１６】
前記の哺乳動物のＸ−染色体を有する精子細胞タンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７〜２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列、あるいはこの配列に対して相補的な配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤＮｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７〜２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％の相同性を示すヌクレオチド配列、あるいはこの配列に対して相補的な配列を有する遺伝子によって前記の哺乳動物のＸ−染色体を有する精子細胞タンパク質をコード化した天然の、あるいは合成したペプチドである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプル、またはこれから単離した精子細胞の前記集団をモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である抗体、あるいはこれの抗原結合フラグメントに接触させる請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９〜１６からなる群から選択される配列、またはこれに対して少なくとも８５％の相同性を示す抗原配列からなる群から選択される天然または合成抗原アミノ酸配列を有する抗原ペプチド組成物によってホストを免疫化することによって誘導した抗体またはこれの抗原結合フラグメントに前記サンプルを接触させる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３からなる群から選択される配列、またはこれに対して少なくとも８５％の相同性を示す抗原配列からなる群から選択される天然または合成ペプチドを有する抗原ペプチド組成物によって前記ホストを免疫化することによって誘導した抗体またはこれの抗原結合フラグメントに前記サンプルを接触させる請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、前記の精子細胞の混合集団の一部を使用して卵母細胞に受精する請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、前記抗体、またはこれに結合した抗原結合フラグメントを有する精子細胞を、前記受精ステップの前に、前記混合集団の他の精子細胞から分離して、精子細胞のＸ−染色体に富む集団およびＹ−染色体に富む集団を生成する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記分離を、蛍光活性化細胞選別法、磁気細胞選別法、抗体被覆管への接着法、抗体被覆プレートへの接着法、抗体被覆ビーズへの接着法、およびこれらを組み合わせた方法のうちの一つかそれ以上の方法によって行う請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒト、雄牛、ウマ科の動物、羊、シカ科の動物、ラクダ科の動物、および豚からなる群から選択される哺乳動物から前記精液サンプル得る請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物がＢｏｓ  ＴａｕｒｕｓおよびＢｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓのいずれか一つ、あるいはこれらの交配種である請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１４年２月１９日に出願され、性比スキューイング用抗体およびこの抗体の使用方法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｓｋｅｗｉｎｇ  Ｓｅｘ  Ｒａｔｉｏ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ）を発明の名称とする米国仮特許出願第６１/９４２，０２０号および２０１４年１０月２０日に出願され、性比スキューイング用抗体およびこの抗体の使用方法を発明の名称とする米国仮特許出願第６２/０６５，７９７号の優先権を主張する出願で、各開示全体を本明細書に援用するものとする。
【０００２】
本発明は哺乳類動物における性比をスキューイング（ｓｋｅｗｉｎｇ）して（ゆがめて）、子孫の好ましい性別（ジェンダー）を選択することに関する。特に、本発明は哺乳類動物の精子の特定の集団を選択および/または変更して、次に哺乳類動物の性比をスキューイングする方法に関する。本発明方法は、Ｘ−染色体の存在を示す精子細胞マーカーに特異的な抗体、および上記のスキューイングおよび選択に使用することを対象として特異的な抗体を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
ＸＹ性別判定システムは、ほとんどの哺乳類動物にみられる性別判定システムである。このシステムでは、ある哺乳類動物の性は、この動物の性を塩基配列によって指定（コード化）する一対の性染色体（生殖体部）によって判定する。同形配偶子性であるメスの場合、２つのＸ染色体を示す。同形配偶子性であるオスの場合、Ｘ染色体とＹ染色体を示す。動物の育成の場合、育成者の目的に応じて、性比をメスかオスのいずれかにスキューイングすることが望ましいことが多い。例えば、乳牛を育成する場合、農業経営者の収入源即ち産乳するのは、種のうちのメスである。泌乳牛群に代わる代替動物を得るために人工授精を利用する酪農業者の場合、メスの子孫を残しがちな精子を利用して、代替牛として若い雄牛の信頼性のある供給源を確保し、従って持続的な収入源を確保することを好む。無論、牛群をオス化したい傾向には営利的理由がある。例えば、肉牛の場合、主要な収入源（肉）を与えるのは雄牛である。このように、精子の性別に影響を与えることによって性比に影響を与える方法が望まれている。
【０００４】
性比に影響を与える、潜在的に非侵襲的な方法が数多く知られている。すべての鳥類や哺乳動物の場合のように、性染色体が子孫の性別を主に決定する種の場合、非侵襲的な性比操作の潜在的な可能性はそれほど自明なことではない。記録のある歴史の開始以来、ヒトや動物における子孫の性別を予め選択することは常に興味の対象であった。精子ＤＮＡのフローサイトメトリー分析については、精液のサンプルにおけるＸ−染色体を有する精子とＹ−染色体を有する精子との割合を評価するきわめて有用な分析であることが知られている。また、ある点で、Ｘ−染色体を有する精子およびＹ−染色体を有する精子のフローサイトメトリー選別法は、精液の性比をスキューイングする唯一の実験室手法であることが知られている（Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９２）。
【０００５】
出生前の性別を調節するために行われた最初の真剣な研究の一つは、Ｊ．Ｌ．Ｌｕｓｈによって報告された研究である（１９２５）。Ｌｕｓｈ博士の研究の基礎は、ウサギにおけるＸ−染色体を有する精子とＹ−染色体を有する精子との間にあると考えられる密度差であった。遠心分離によって分離した精子を用いて行った受精からの子孫には、性比の変化は認められなかった。それ以来、Ｘ−染色体を有する精子とＹ−染色体を有する精子とを分離する広範囲に及ぶ方法を記載した、数えきれないほどの報告が発表されている。これら方法の大部分は、“物理的分離方法”（“ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”ｍｅｔｈｏｄｓ）と呼ぶことができる。いずれの方法も、精子の重量、密度、大きさ、運動性や表面電荷の実際の、あるいは観察された相違に依拠するものであった（Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９２）。
【０００６】
子孫の性別を予め決定するために行われた精子のフローサイトメトリーに基づく他の研究は、生体外受精、胚移植、試験管内（ｉｎｔｒａｔｕｂａｌ）受精やイントラサイトプラスミック（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）精子注入に使用する、Ｘ−染色体を有する精子をＹ−染色体を有する精子から分離する、有効性が確認されている方法に結びついた（Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９５）。現在、哺乳動物の精子の性別を判定する営利的に有効な唯一の方法では、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を使用して、ＤＮＡ−結合蛍光体ヘキスト３３３４２（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）によって精子のＤＮＡ含有量を測定し、次に精子を次の３集団：１）蓋然的なＸ集団、２）蓋然的なＹ集団、および３）ＤＮＡが測定されない集団に選別する。この方法によって年間数百万の性別を判定した精子の受精量を実現している。性別判定精度は通常９０％を超えるが、この、一度に一つの精子の性別を判定する方法には大きな制限が付随する。即ち、コスト、選別率、精子への物理的な損傷であり、いずれもが受精率の低下に関係があるが、子孫における異常は認められない。
【０００７】
研究上示唆されている領域には、精子の損傷をどのように判定するか、そして受精過程および胚発生過程のどの時期において無受精が発生するのかがある。選別前方法、および選別後方法はほぼ一時間毎にバッチ方式で行うが、一部を変更して、連続的に行うことも可能である。数百万の精子を並行的に性別判定する数多くの遺伝子的方法、物理的方法および免疫的方法が提案されているが、いずれも精度、反復再現性、精子への損傷や他の問題があるため、現時点では営利化に向いていない。なお、これら方法の改善に関する報告数は増加の一途をたどっているが、これらの一つかそれ以上が最終的に有効であることが証明されることが必然的に求められている。これら方法を発展させるために、定期的に、好ましくは営利的な実験室条件で実行できる迅速かつ低コストの手順を使用することによって、性別判定精度を監視することが決定的に重要である。
【０００８】
最近の証拠によれば、栄養要因、遺伝子要因、生理学的要因、および免疫学的要因によって哺乳動物の性比を操作できることが判明している。精子の性別を判定する方法がいくつか知られているが、いずれも低い精度、不妊の原因となる精子への損傷、低い反復再現性、適当な規模拡大方法の欠如などの問題がある。受精あたりの精子数を加増することによっては代償することができないと考えられる未知の作用機序によって畜牛やその他の考えられる種における受精能力が１０％程度犠牲になっている（Ｓｅｉｄｅｌ、２０１２）。このように、哺乳動物の精子を性別判別する改良方法が依然として求められている。
る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＵＳＰ５，６４１，８７０
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｕｒｒｙ、Ｒ．Ｗ．（２０１１）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５９：６−１２
【非特許文献２】Ｌ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｈｏｎ  （１９９２）、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．７０：８−１８
【非特許文献３】Ｌ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｈｏｎ  （１９９５）、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ．７（４）：８９３−９０３
【非特許文献４】Ｊ．Ｌ．Ｌｕｓｈ（１９２５）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｒｅｓ．３０：８９３
【非特許文献５】Ｐｅｒｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６：４８２−９０
【非特許文献６】Ｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １２１：５４１−６
【非特許文献７】Ｇ．Ｅ．Ｓｅｉｄｅｌ（２０１２）、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．５８（５）：５０５−９
【非特許文献８】Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１）：１０５７−１０６２（１９９５）
【発明の概要】
【００１１】
以上の従来技術の問題からみて、本発明は哺乳動物のＸ−染色体を有する精子細胞を同定する方法、およびＹ−染色体を有する精子細胞を有する精子細胞の混合集団からこのような精子細胞を分離して、Ｘ−染色体分に富む精子細胞集団および／またはＹ−染色体分に富む精子細胞集団を生成する方法を提供するものである。本発明方法は有効性が高く、反復再現性があり、ロバストな上に、営利企業に適用できるように規模を拡大できる方法である。
【００１２】
本発明の一つの態様は、Ｘ−染色体を有する精子細胞に対して特異性を示す哺乳動物の精子細胞タンパク質に選択的に結合する抗体、あるいはこれの抗原フラグメントに関する。上記抗体、あるいはこの抗原−結合フラグメントとしては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、あるいはこれらの抗原−結合フラグメントであればよい。一つの実施態様では、哺乳動物の精子細胞タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に記述されている配列を有する。タンパク質は、遺伝子マッピングによって哺乳動物のＸ−染色体にコード化することができ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５のヌクレオチド配列、あるいはこの配列に対して相補的な配列、あるいはＳＥＱ  ＩＤＮｏ．５対して少なくとも８５％の相同性を示すヌクレオチド配列、あるいはこの配列に対して相補的な配列を有する。哺乳動物の精子細胞タンパク質（以下ＧＸ１と表記する）は、ＮＣＢＩ受け入れＮｏ．ＸＰ_００１２４９５４４．１．に記述されている配列を有すればよい。
【００１３】
上記抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４として記述される天然または合成抗原アミノ酸配列、あるいはこれに対して少なくとも８５％の相同性を示す抗原配列を有する抗原ペプチド組成物によってホストを免疫化することによって誘導することができる。いくつかの実施態様の場合、上記抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のうちの一つかそれ以上からなる群から選択される抗原ペプチド組成物によって上記ホストを免疫化することによって誘導することができる。
【００１４】
本発明の別な態様は、精子細胞の混合集団中のＸ−染色体を有する精子細胞を同定する方法に関する。いくつかの同定の方法の実施態様の場合、上記の抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントを正味の、あるいは希釈された精液に添加する。この場合には、標識抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントを直接、あるいは間接に検出する。
【００１５】
本発明の別な態様は、哺乳動物における性比を、雄を主とする子孫集団、あるいは雌を主とする子孫集団にスキューイング（ｓｋｅｗｉｎｇ）する方法に関する。この方法のいくつかの実施態様の場合、上記の抗体がＸ−染色体を有する精子細胞に結合する条件下で上記の抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントを哺乳動物の精液の正味の、あるいは希釈されたサンプルに添加する。次に、少なくとも一部が結合抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントを有する精液、あるいはこれから単離された精子細胞を使用して卵母細胞を生体中で、あるいは生体外で受精させて、得られた子孫集団の性をスキューイングする。
【００１６】
別な実施態様では、上記スキューイング方法において、抗体、あるいは抗原−結合フラグメントに結合した精子細胞から未結合の精子細胞を分離して、Ｘ−染色体を有する精製細胞分に富む精子細胞集団およびＹ−染色体を有する精子細胞分に富む精子細胞集団を生成する。適当な選別方法を使用することができ、制限するものではないが、例示すると、蛍光活性細胞選別法、磁気細胞選別法などがある。次に、Ｘ−染色体を有する精製細胞分に富む精子細胞集団、あるいはＹ−染色体を有する精子細胞分に富む精子細胞集団を使用して、卵母細胞を生体中で、あるいは生体外で受精させて、得られた子孫集団の性をスキューイングする。
【００１７】
本発明は、Ｘ−染色体を有する精子細胞の同定するために有効な方法、Ｘ−染色体を有する精子細胞とＹ−染色体を有する精子細胞とを分離するために有効な方法、および上記のように処理した精子細胞での受精から得られた子孫の性比をスキューイングするために有効な方法を提供するものである。本発明方法は、実質的に非侵襲性であり、再現可能であるので有利であり、また後で行う営利的な人工授精方法に好適な実行可能なＸ−染色体スキューイング精子細胞集団を提供するものである。
【００１８】
本明細書に添付し、本明細書の一部を構成する添付図面は、本発明のいくつかの態様を示すもので、明細書における説明とともに、本発明のいくつかの原理を説明するものである。以下各図について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】精子細胞集団を含有する混合染色体、精子細胞集団を含有する純粋なＹ−染色体含有精子細胞、および純粋なＸ−染色体か含有精子細胞集団からのＧＸ１ｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析結果（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ）を示す図である。
【図１Ｂ】図１ＡのｃＤＮＡの毛管ゲル分析結果（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｇｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ）を示す図である。
【図２Ａ】免疫化処置８週間後に得られたウサギの精子に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のペプチドに対する本発明抗体が存在していることを示す図である（比較対照は、免疫前のウサギの精子である）。
【図２Ｂ】免疫化処置８週間後に得られたウサギの精子に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のペプチドに対する本発明抗体が存在していることを示す図である（比較対照は、免疫前のウサギの精子である）。
【図２Ｃ】免疫化処置８週間後に得られたウサギの精子に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のペプチドに対する本発明抗体が存在していることを示す図である（比較対照は、免疫前のウサギの精子である）。
【図３Ａ】免疫前のウサギの精子における本発明ＧＸ−１タンパク質に対する抗体の特異性を示すウェスタンブロット分析結果を示す図である。
【図３Ｂ】免疫化処置８週間後に得られたウサギの精子における本発明ＧＸ−１タンパク質に対する抗体の特異性を示すウェスタンブロット分析結果を示す図である。
【図３Ｃ】ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のペプチドで図３Ｂの抗体を予め吸収しておくと、ＧＸ−１タンパク質の検出が必要ないことを証明するウェスタンブロット分析結果を示す図である。
【図４Ａ】図３ＢのＧＸ−１に対する抗体に対してネガティブと決定された精子細胞の蛍光顕微鏡写真である（スケールバー＝２５μ）。
【図４Ｂ】図３ＢのＧＸ−１に対する抗体に対してポジティブと決定された精子細胞の蛍光顕微鏡写真である（スケールバー＝２５μ）。
【図５】図３ＢのＧＸ−１に対する抗体を使用してインキュベーションし、かつ図４Ｂの抗体に対してポジティブな健全な精子を選択した後、Ｘ−染色体精子細胞に対してスキューイングしたウシ精子細胞の性比を示すグラフである。
【図６】タンパク質横縞パターンを可視化するために対比染色剤で染色したＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲルによって得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ＧＸ１全長タンパク質の純度の評価結果を示すグラフである。
【図７】Ｅ．ｃｏｌｉ発現ＧＸ１タンパク質およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４の加水分解から誘導されたペプチドのコンピュータ・マッチング分析結果を示す図である。
【図８】Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＧＸ１−Ｅタンパク質）から発現し、かつ精製した全長ＧＸ１タンパク質で免疫化したウサギから８週間で得た抗精子における抗体の存在を示すグラフである（比較対照は免疫前精子である）。
【図９】免疫前精子（ブロットＡ）および雄牛の精子溶解物上の精製抗−ＧＸ１−Ｅタンパク質抗体（ブロットＢ）のウェスタンブロット分析によって行った雄牛の精子溶解物中における単一種のタンパク質の抗−ＧＸ１−Ｅタンパク質抗体の特異性を示す図である。
【図１０】体外翻訳を使用して発現させたＧＸ１全長タンパク質の評価結果を示す図である（ＧＸ１−Ｍ；矢印はＧＸ１−Ｍタンパク質の位置を示す）。
【図１１】体外発現ＧＸ１タンパク質（ＧＸ１−Ｍ）およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４の加水分解から誘導したペプチドのコンピュータ・マッチング分析結果を示す図である。
【００２０】
以下、本発明の実施態様を詳細に説明する。なお、本発明の実施例は、添付図面に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示に含まれる、あるいは本開示において言及する公知技術文献、遺伝子配列、受け入れ番号および参考配列は、本明細書の一部を構成し、本明細書に全体を援用するものである。なお、本明細書に示しかつ記載する実施態様は、本発明を実施するために最善のモードの一つを説明するものである。本発明の他の異なる実施態様でも実施可能であり、細部については、本発明から逸脱しなくても、各種の自明な態様で変更することが可能である。従って、本明細書における添付図面および説明は例示であり、限定を意図するものではない。以下、本発明の方法および組成物の各種実施態様を以下の実施例によって説明する。
【実施例】
【００２２】
実施例１：Ｘ精子の新規なバイオマーカーの同定
レーザーキャプチャーマイクロダイセクション (LCM)を使用して、選別していない雄牛精子からＹ精子を単離し、精子バイオマーカーを確認した。つまり、多数のＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓ種およびＢｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ種からのＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）製凍結解凍精子を固定し、脱凝縮し、顕微鏡のガラススライドに貼着した。ウシのＹ染色体用のＳｔａｒ＊ＦＩＳＨ（著作物）ペイント系（Ｃａｍｂｉｏ  Ｌｔｄ．；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（ＵＫ））を使用するインサイチュー ハイブリダイゼーション（in situ hybridization）を製造者の使用説明書に従って精子スライドに行った。染色体プローブ上の蛍光ラベル（Ｃｙ３）によって、精子の性染色体顔料を視覚的に分類できた。ＬＣＭ装備顕微鏡を使用して、目的に染色体含量の個々の精子細胞をスライドから取り出し、膜に“捕捉”した。（純粋なＹ染色体および混合染色体を含有する）捕捉された精子細胞の各集団から単離したトータルＲＮＡを次にマイクロアレイ解析によって比較し、Ｘ染色体精子に対して特異的な新規バイオマーカーを確認した。
【００２３】
６組のトータルＲＮＡサンプル（６つのＹ染色体含有サンプル対６つの混合染色体含有サンプル）のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ウシゲノムアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）に対する結合を比較した後、特徴づけされていないタンパク質ＬＯＣ７８１１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）の発現は、混合染色体含有の捕捉された精子から誘導されたＲＮＡのみに認められ、純粋なＹ染色体を含有する捕捉された精子から誘導されたＲＮＡには認められなかったことを確認した。さらに国立生物工学情報センター（ National Center for Biotechnology Information、NCBI）による遺伝子マッピングは、ＧＸ１のＤＮＡがウシのＸ染色体であること突き止めた（アメリカ国立医学図書館（ United States National Library of Medicine (NLM)、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４；遺伝子ＩＤ７８１１９１）。
【００２４】
マイクロアレイ分析結果（即ち、ＧＸ１バイオマーカーの発現がＸ−染色体精子に対して特異的であるかどうか）を確認するために、ウシＹ−染色体またはＸ−染色体（Ｃａｍｂｉｏ）のいずれかについてＳｔａｒ＊ＦＩＳＨ（著作物）ペイント系を使用して調べた新たに用意したスライドから別な精子細胞を得、得られた精子細胞の３集団（１）混合染色体含有集団、（２）純粋なＹ−染色体含有集団および（３）純粋なＸ−染色体含有集団からトータルＲＮＡを単離した。トータルＲＮＡをｃＤＮＡに転換してから、ＧＸ１に対して特異的な鋳型（プライマー）を使用して定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行った（表１）。
【００２５】
外因性制御で規格化した後、ｑＰＣＲ結果（図１Ａ）は、ＧＸ１の検出された発現は混合染色体含有サンプルと純粋なＸ染色体含有サンプルとの間で等しく、また純粋なＹ染色体含有サンプルと非ｃＤＮＡテンプレートコントロール（ＮＴＣ）との間で等しかった。このように、ｑＰＣＲ分析に基づくと、ＧＸ１の発現はＸ−染色体含有精子集団（即ち、純粋なＸ−染色体含有集団または混合染色体含有集団）から誘導されたｃＤＮＡにのみ認められ、純粋なＹ−染色体精子から誘導されたｃＤＮＡには認められなかった（図１Ａ参照）。なお、サンプルが閾値と交差する場合（図１Ａ点線）、サンプルの閾値サイクルが決まり、比較からサイクル数が小さくなるに従って、発現レベルが高くなる。毛管ゲル分析を使用してＰＣＲ結果を確認した（図１Ｂ）。ＧＸ１の増幅ＤＮＡは混合染色体含有サンプルと純粋なＸ染色体含有サンプルのみに認められた。
表１：ｑＰＣＲに使用したプライマーの配列
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【００２６】
実施例２：抗−ＧＸ１ペプチド抗体の生成
次に、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｅｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）製のＧＸ１の複数のペプチド抗原に対してウサギにポリクローナル抗精子を生成した。具体的には、ＧＸ１のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）からＧＸ１タンパク質のアミノ酸配列を誘導し、抗原位置について分析した。ＰＥＧ−ポリスチレン樹脂を使用して、連続流条件下でＦＭＯＣ化学を使用して、ＧＸ１タンパク質（表２）内の３種類の異なる抗原位置から誘導される３種類の免疫グレードペプチドを合成した。合成終了時に、樹脂からペプチドを切断し、保護を外してから、低温ジエチルエーテルを使用して沈殿処理した。沈殿物を低温ジエチルエーテルで三回洗浄し、溶解し、凍結乾燥した。
【００２７】
ペプチドの純度および質量について、それぞれ分析スケールの逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムおよびマトリックス支援レーザー脱イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって評価した。分析的/調製的ＨＰＬＣのために、バイナリーポンプ輸送システム、オートサンプラー、カラム状サーモスタット、一波長（ＵＶ）検出器または多波長検出器（ＤＡＤ）を備えたベックマン・システム低温液体クロマトグラフィーシステムを使用して分析および精製を行った。使用したクロマトグラフィー法については、２０℃で５μｍ、１５０×４．６ｍｍカラムまたは１５０×２．１ｍｍカラム（ＰｈｅｎｏｍｅｎｘまたはＡｇｉｌｅｎｔ）を使用し、検出波長λ＝２１０ｎｍ、２２０ｎｍまたは２８０ｎｍを使用する標準条件で行った。移動相Ａは超純水中０．１％ＴＦＡであり、移動相Ｂは正味アセトニトリルであった。線形勾配プログラムを使用する流量１．０ｍＬ/分または０．２ｍＬ/分で分離を行った。
【００２８】
Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ生体分光ワークステーションを使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。このワークステーションは遅延抽出能および線形能力を有し、３３７−ｎｍ窒素レーザーおよび２−ｍフライトチューブを設けた。２５ｋＶの加速電圧を使用するポジティブイオンモードでマススペクトルを求めた。ほぼ１μリットルのペプチドまたはタンパク質サンプルを１μリットルのマトリックス（１ｍリットルの蒸留水中シナピン酸および０．１％４-ヒドロキシ−α−シアノ桂皮酸１０ｍｇ）と混合し、０．３μリットルのこの混合物をサンプルプレートに貼着した。
【００２９】
品質の確認後、各合成ペプチドを個々にキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質に抱合し、結合してカクテル混合物にした。完全フロイントアジュバント（Freund's Complete Adjuvant, FCA）中でペプチドカクテルを乳化し、２週間おきにニュージーランド産白ウサギに注射し、合計で５回の同時免疫を行い、ＧＸ１抗精子生成を誘導した。一次免疫（前免疫）の前（ウィーク０）、４回目のブースター注射（ウィーク８）の前、４回目のブースター注射２週間後（ウィーク１０）、および試験終了時（ウィーク１４）に血清を回収した。ウィーク０およびウィーク８に回収した血清を各抗原ペプチドについて酵素 結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）滴定法によって分析し、抗血清の特異性を確認した。
【００３０】
ＥＬＩＳＡタイター法の場合、まず、コーティング緩衝液中のペプチド溶液（ＰＢＳ）を室温においてマイクロタイタープレートウェルにコーティングしてから、ＰＢＳにおいて３７℃で１時間１％ＢＳＡを用いてブロッキングした。サンプル、即ち血清中の抗体および精製抗体を繰り返しローディングし、室温で２時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液中の２次ＨＲＰ抱合化ＩｇＧｓ（１：２０，０００）を添加し（１時間、室温）、色素原基質（ＡＢＴＳ）を３０分添加することによって反応を可視化した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４０５ｎｍでの吸光度を測定した。各ステップ後に、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有）でプレートを４回洗浄した。定量化基準として、対照抗体の段階希釈によって標準曲線を決定した。
【００３１】
ＥＬＩＳＡ結果から、試験したすべての希釈液について、免疫前血清が三種類のペプチド抗原に対して反応性を示す抗体を欠いていることが判明した（即ち、４０５ｎｍにおける吸光度の値が０．１未満）。試験したすべての希釈液について、ウィーク８の血清は、抗体のペプチド抗原でコーティングされたウェルへの結合によって示されるように、三種類のペプチド抗原に対して反応性を示す抗体を含有していた（即ち、４０５ｎｍにおける吸光度の値が０．１以上、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃを参照）。
【００３２】
ペプチド複合化樹脂カラムを使用して、免疫親和性クロマトグラフィーによってＧＸ１抗血清からのペプチド抗原に対して特異的な抗体を精製し、かつ濃縮し、抗−ＧＸ１ペプチド抗体を生成した。実験室到着時に、抗体のそれぞれ単独のタンパク質に対する特異性について、免疫前血清、抗−ＧＸ１ペプチド抗体、および雄牛の精子溶解物に予め吸着した抗−ＧＸ１ペプチド抗体の反応性を比較するウェスタンブロット分析によって決定を行った。
【００３３】
つまり、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上で精子溶解物を分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。結果を図３に示す。図中、Ｍはタンパク質スタンダード、およびＳは精子溶解物である。図示のように、免疫前精で精子溶解物を免疫ブロッティングした場合には、タンパク質バンドは検出できなかったが（図３Ａ）、抗−ＧＸ１ペプチド抗体で精査した場合は、雄牛の精子溶解物に単独のタンパク質バンドを検出できた（図３Ｂの矢印を参照）。ウェスタンブロット法で精査する前に、ペプチド抗原で抗−ＧＸ１ペプチド抗体を前吸着した場合には、精子溶解物におけるタンパク質バンドを検出は必要なかった（図３Ｃ）。
表２：ウサギを免疫してＧＸ１抗精子を生成した合成ペプチドの配列
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【００３４】
実施例３：雄牛の精液を使用する抗−ＧＸ１ペプチド抗体のインキュベーション
以下の試験では、市販の展開/冷却（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｃｏｏｌｅｄ）精液を使用した。つまり、精液を雄牛（複数のＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓ種、Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ種、具体的にはＡｎｇｕｓ、Ｃｒｏｓｓ、Ｒｅｄ  Ｂｒａｎｇｕｓを試験した）から回収し、ＢＩＯＸ細胞展開剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ、ＩＭＶ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｐｌｅ  Ｇｒｏｖｅ  ＭＮ）と混合し、４〜５℃で３時間平衡してから、アイスパックを使用して一夜輸送した。実験室到着時に、ＨＥＰＥＳ−ＰＶＡ緩衝液（２５〜３０℃に加温した１１４ｍＭＮａＣｌ、３．２ｍＭＫＣＬ、０．３ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ乳酸、２ｍＭＣａＣｌ２、０．５ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭＮａＨＣＯ３、０．２ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１％ＰＶＡ）で洗浄した。１：１０００希釈比のＬｉｖｅ/Ｄｅａｄ（登録商標） Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）死細胞染料を含有するＨＥＰＥＳ−ＰＶＡに精子ペレットを再懸濁してから、３５℃で１０分間インキュベーションした。ＨＥＰＥＳ−ＰＶＡで精子を一回洗浄して、過剰の染料を除去してから、１０×１０６細胞/ｍＬＨＥＰＥＳ−ＰＶＡの最終濃度に再懸濁した。
【００３５】
１ｍリットルの精子懸濁液を底が丸いＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄ管に移してから、×４００ｇ、４℃で５分間遠心分離処理し、上澄みを除去し、精子ペレットを穏やかに渦巻き処理した（なお、これらの条件は以降の遠心分離処理でも使用した）。以降のステップ全体を通して、精子および緩衝液は４℃に維持した。遠心分離後、１ｍＬのブロッキング緩衝液[３％規定ヤギ精子（ＮＧＳ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ)およびＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理的食塩水中２ｍＭのＥＤＴＡ（ＤＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｒｏｇｉｅｓ）]に懸濁した。穏やかに撹拌しながら、３０分間精子を懸濁してから、遠心分離した。得られた精子ペレットを抗−ＧＸ１ペプチド抗体を（０〜２０μｇ/ｍＬ）含有する１ｍＬのブロッキング緩衝液に懸濁し、穏やかに撹拌しながら１．５時間インキュベーションした。次に、洗浄緩衝液（１ｍＬ；０．５％ＮＧＳ、２ｍＭＥＤＴＡ、ＤＰＢＳ）を各試験管に加えてから、遠心分離した。精子を洗浄してから、１．５μｇの抗−ウサギＩｇＧ−シアニン染料抱合体（Ｃｙ２；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を含有する０．５ｍＬの洗浄緩衝液に懸濁した。
【００３６】
穏やかに撹拌しながら、精子を２０分間インキュベーションしてから、洗浄緩衝液を使用して２度洗浄し、１％パラホルムアルデヒド（１５分間；１６％パラホルムアルデヒドから新たに調製したパラホルムアルデヒド；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）で固定した。固定細胞を遠心分離し、洗浄し、遠心分離し、最後に０．１％ＰＶＡでＤＰＢＳに懸濁した。ＧＸ１タンパク質表面染色に対してポジティブな膜健全精子（Ｃｙ２に対してポジティブで、Ｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ（登録商標）Ｆａｒ  Ｒｅｄに対してネガティブな細胞）の百分率について、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して求めた。さらに、分析を行うまで、サンプルを４℃で保存し、光から保護した。  
【００３７】
実施例４：抗−ＧＸ１ペプチド抗体結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）にポジティブな雄牛精子の単離
５０ｍＷの４８８ｎｍレーザーおよび１００ｍＷの６４０ｎｍレーザーを備えたＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩスペシャルオーダーシステム（２−レーザー６−色４Ｂ−２Ｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用してウシの精子を分離した。このシステムは、保存剤を含有しないＢｉｏＳｕｒｅ（登録商標）シース流体（ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｕｉｄ）（ＢｉｏＳｕｒｅ；Ｇｒａｓｓ  Ｖａｌｌｅｙ、ＣＡ）を使用して７０ｐｓｉのシース圧力において１．０中性デイフィルター（ｄａｙ  ｆｉｌｔｅｒ）および７０μｍのノズル先端を使用して構成した。検出器は、順方向散乱域、散乱高さ、散乱幅（ＦＳＣ−Ａ；−Ｈ；−Ｗ）、一重項識別用側方散乱域、散乱高さ、散乱幅（ＳＣＣ−Ａ；−Ｈ；−Ｗ）、５３０/３０ｎｍフィルター組および上述したようにＣｙ２（ＧＸ１タンパク質に対してポジティブな細胞）で標識化した細胞を検出する５０５ｎｍロングパスミラーを有する４８８ｎｍレーザー（ＦＩＴＣ−Ａ）、および６７０/３０ｎｍフィルターおよびＬｉｖｅ/Ｄｅａｄ（登録商標）ＦａｒＲｅｄ染料の有無を判別する７５０ｎｍロングパスフィルターを有する６４０ｎｍレーザー（ＡＰＣ−Ａ）を有していた。すべてのサンプルを４℃で処理し、シース流体中の１２×７５ｍｍＢＳＡ被覆管に回収した。各サンプルの一部をＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ６．１．３で分析してから選別を行うか、選別を行った後に分析し、ＧＸ１タンパク質に対してポジティブな膜健全精子の百分率を求めた。
【００３８】
抗−ＧＸ１ペプチド抗体結合の有無の選別、即ち抗−ＧＸ１ペプチド抗体結合の有無について精製すべき混合細胞集団の選別に関しては、蛍光顕微鏡検査を使用して確認した（図４Ａ、図４Ｂを参照。スケールバー＝２５μ）。細胞を抗−ＧＸ１抗体に曝すとともに、上述したように、抗−ウサギＩｇＧ−シアニン染料抱合体（Ｃｙ２；緑色）に曝して、抗−ＧＸ１ペプチド抗体との結合に対してポジティブな細胞を検出し、ＤＡＰＩ（青色）で対比着色した。図示のように、抗−ＧＸ１ペプチド抗体との結合に対してネガティブな精子細胞の集団を与えるように選別した膜−健全細胞はＣｙ２では標識化せず（図４Ａ）、一方抗−ＧＸ１ペプチド抗体との結合に対してポジティブな精子細胞の集団を与えるように選別した膜−健全細胞はＣｙ２で標識化した（図４Ａ）。
【００３９】
実施例５：抗−ＧＸ１ペプチド抗体結合に対してポジティブな雄牛の精子の性比
使い捨て式サイトファンネル（ｃｙｔｏｆｕｎｎｅｌ）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を一つ備えたサイトセントラフュージ（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、設定操作条件１０００ｒｐｍ/５分）を使用する汚れのない未被覆サイトスピンガラススライド上で各選別サンプル（上記の実施例４を参照）を回転した。サイトファンネルクリップから取り外した直後に、Ｒｅｎｓなど（２００１）の方法を一部変更した脱凝縮法によって各スライドを処理した。具体的には、溶液Ａ（１０ｍＭトリス、１５４ｍＭＮａＣｌ）を精子スポットに置き、等容積の溶液Ｂ（溶液Ａ中５０ｍＭＤＴＴで新たに調製した）を液滴に加えた。室温で２．５分後、等容積の一部変更した溶液Ｃ（１％ＳＤＳ、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム）を液滴に加えた。スライドを１０秒間インキュベーションしてから、前冷却した１００％ＥｔＯＨ（−２０℃）に移した。次に、−２０℃で１５分間スライドをインキュベーションしてから、室温で乾燥した。続いて、再水和、浸透化および脱水を以下のようにして行った。ＤＰＢＳ中５分間（２回）、Ｈ２Ｏ中で新たに調製した２００ｍＨＣｌ中において１５分間、２Ｘ  ＳＳＣ中において５分間、７０％ＥｔＯＨ中において２分間、９０％ＥｔＯＨ中において２分間、１００％ＥｔＯＨ中において２分間、そして室温における乾燥。ウシのＹ染色体用プローブ混合物をスライド処理と同時に調製した。即ち５μＭのペプチド核酸プローブ[Ｃｙ３−ＯＯ−ＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＴＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８；５０％脱イオンホルムアミド、１０％硫酸デキシタン（ｄｅｘｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、２Ｘ  ＳＳＣ中においてＰｅｒｒｅｔなど（１９９０）の方法で誘導した配列]を７５℃で１０分間インキュベーションし、３７℃において使用するまで保持した。
【００４０】
乾燥したスライドを前加温したオムニスライドサーマルサイクラー（Ｏｍｎｉｓｌｉｄｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｌｅｒ）（３７℃）に置き、ガラスカバースリップを用いて、調製したプローブを精子スポットに付着した。エッジはゴムセメントで封止した。スライドを７５℃で２分間置いてから３７℃において最低で１８時間インキュベーションした。ハイブリダイゼーションインキュベーション後に、カバースリップの位置を乱さずにゴムセメントを丁寧に取り外した。次に、０．１％Ｔｗｅｅｎを含有したＤＰＢＳにスライドを挿入し、２分間撹拌し、穏やかにカバースリップを取り外した。ＤＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中において４５℃で１５分間インキュベーションし、さらに２Ｘ  ＳＳＣ−０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０中において５分間インキュベーションすることによって過剰のプローブをスライドから洗浄した。ＤＡＰＩとともにＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（登録商標）取り付けメディア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、各スライド上の精子スポットにガラスカバースリップを取り付けた。特質を制御するための評価では、未選別の精子だけでなくＸ−選別精子およびＹ−選別精子（Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｉｒｅｓ  Ｉｎｃ、Ｐｌａｉｎ  Ｃｉｔｙ、ＯＨ）から調製したスライドを使用した。処理について何も知らされていない二人の評価者に、Ｙ染色体の有無について（精子頭部内のＣｙ３点頭スポットの有無について）評価してもらい、各サンプル中のＹ―精子およびＸ−精子の百分率を求めた。
【００４１】
抗−ＧＸ１ペプチド抗体結合に対してポジティブな膜健全精子を選別した結果、一定の抗−ＧＸ１ペプチド抗体の一定の濃度をもつＸ−精子に対してスキューイングが認められた。雄牛の精子でインキュベーションした抗−ＧＸ１ペプチド抗体の濃度が高くなると、Ｘ−染色体精子の比率が抗−ＧＸ１ペプチド抗体との結合に対してポジティブなるよう選択された集団内で高くなった。即ち、雄牛の精子でインキュベーションした抗−ＧＸ１ペプチド抗体の濃度を高くすると、結果としてＸ−染色体精子の比率が抗−ＧＸ１ペプチド抗体との結合に対してポジティブなるように選択された集団内で高くなった（図５）。
【００４２】
実施例６：抗−ＧＸ１ペプチド抗体の雄牛精子、雄馬の精子、ヒト精子、雄羊の精子、イノシシ精子および雄鹿の精子との結合
抗−ＧＸ１ペプチド抗体の各種の精子に結合する能力について、雄牛および雄馬だけでなく、ヒト、雄羊、イノシシおよび雄鹿（シカ科）の精子から新たに回収した精液に基づいて評価した。まず、これら種から回収した精液をＤＰＢＳで２度洗浄して、エキステンダーおよび／または精液を除去した。精液ペレットをＤＰＢＳに再懸濁し、未被覆のガラス顕微鏡スライドにスポッティングした。スライドを室温で１０分間乾燥してから、−２０℃のメタノール（１００％ＡＣＳ級；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）中に固定した。−２０℃で１０分間スライドをインキュベーションしてから、ドラフトチャンバー内で最低１０分間完全乾燥した。
【００４３】
疎水性のインク（ＧｎｏｍｅＰｅｎ；ＦｒｏｇｇａＢｉｏ  Ｉｎｃ、Ｔｒｏｎｔｏ、ＯＮ、カナダ）を使用して、精子スポット位置周囲の領域を取り囲んだ。Ｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ（登録商標） Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞染料の１：５００希釈液を含有するＤＰＢＳ中で精子細胞を再水和してから、光から保護した調湿室において室温で３０分間インキュベーションした（なお、特に断わらない限り、以降のすべてのインキュベーションにこれら条件を適用した）。ガーゼを使用してスライドから再水和液体を除去し、ＤＰＢＳ中１０％ＮＧＳで置換し、非特異的な結合サイトをブロックした。室温で１時間スライドをインキュベーションした。
【００４４】
ブロッキング溶液をスライドからガーゼで除去してから、０．５μｇ/ｍＬまたは５μｇ/ｍＬの抗−ＧＸ１ペプチド抗体（一次抗体としても知られている）を含有する３％ＮＧＳ−ＤＰＢＳを、３種類のペプチド抗原（抗体/ペプチド抗原比１：１０、表２を参照）を使用して、あるいは使用せずに吸収後にスライド上に置いた。一次抗体とペプチド抗原の混合物を含有するスライドは吸収対照（Ｂｕｒｒｙ、Ｒ．Ｗ．（２０１１）に依拠した命名法）として機能する。さらに対照として、２枚のスライドを３％ＮＧＳ−ＤＰＢＳで覆った。即ち、一次抗体は使用しなかった。すべてのスライドを４℃で一夜インキュベーションした。
【００４５】
スライドから液体をガーゼで取り除いた後、室温でＤＰＢＳを使用して精子スポットを３回洗浄し、１回の洗浄につき５分間インキュベーションを行った。次に、抗−ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３抱合体（２次抗体；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：１０００希釈液を含有する３％ＮＧＳ−ＤＰＢＳを各精子スポットに置いた。次に、室温で１５分間スライドをインキュベーションした。対照スライドのうち、２次抗体でインキュベーションしたスライドは、Ｃｙ３抱合体の非特異的な結合を識別する２次対照として働く。２次抗体を排除した３％ＮＧＳ−ＤＰＢＳを使用して、残りの対照スライドをインキュベーションした。これは、内生的な蛍光を決するための表示規制（ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）である。
【００４６】
スライドから液体をガーゼで取り除いた後、室温でＤＰＢＳを使用して精子スポットを３回洗浄し、１回の洗浄につき５分間インキュベーションを行った。ＤＡＰＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（登録商標）取り付けメディアを使用して各スライド上の精子スポットにガラスカバースリップを取り付けた。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｅ倒立研究顕微鏡（４０＆６０ｘ対物レンズ）および落射蛍光顕微鏡（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えたＡｒｃｈｕｒｕｓ（登録商標）ＬＣＭシステムを使用してスライドを評価した。抗−ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３抱合体の、おそらくは抗−ＧＸ１ペプチド抗体の特異的結合を介して生じた精子への取り付け状態を可視化することによって、固定された染色精子をＧＸ１タンパク質の存在について評価した。励起波長５１０〜５６０ｎｍで、発光波長が＞５９０ｎｍの蛍光フィルターを利用して、抗−ＧＸ１ペプチド抗体に対する特異的な染色を評価した。対比染色を使用して、精子に生じた結合位置を突き止めた。即ち、励起波長３２５〜３７５ｎｍで、発光波長が＞４２０ｎｍの蛍光フィルターを利用して、Ｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ（登録商標） Ｆｉｘａｂｌｅ  ＶｉｏｌｅｔおよびＤＡＰＩを可視化した。
【００４７】
抗−ＧＸ１抗体が結合した精子の場合、ウシの上頭部領域に局在化していた。ヒトの精子の場合、抗−ＧＸ１抗体は尾に対応していた。抗−ＧＸ１抗体が結合していた馬、羊およびシカの精子の場合、尾部に局在化が認めら、幾つかの精子は下頭部領域に一部の局在化が認められた。イノシシの精子の場合、抗−ＧＸ１の結合は一部の精子の下頭部領域に認められた。抗−ＧＸ１ペプチド抗体ラベリングサンプルを調べるために使用したのと同じ暴露条件で対照スライドを評価した。すべての動物種（ウシ、ヒト、ウマ、ヒツジ、シカ、ブタ）について、抗−ＧＸ１ペプチド抗体との結合はすべての対照スライド上の精子にはなかった：吸収、２次および標識化（ラベリング）。抗−ＧＸ１抗体はすべての精子細胞に結合していなかった。即ち、Ｘ−染色体精子細胞に対する特異性を支持するものである。
【００４８】
実施例７：Ｅ．Ｃｏｌｉ（大腸菌）を使用するＧＸ１タンパク質の合成および精製
牛の精巣ＲＮＡから誘導したｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によってＧＸ１ｍＲＮＡのクローンを生成した。ほぼ３４９ｂｐサイズのアンプリコンをＴＡクローニングベクトル（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に配位子結合した。一旦シーケンシングによって確認した後、ＧＸ１ｃＤＮＡ含有プラスミドをＰＣＲ処理して、ｃＤＮＡフラグメントを生成した。このフラグメントは、制限酵素開裂サイトが側面に位置するＧＸ１に対するタンパク質コーディング領域のヌクレオチド配列からなり、次に大腸菌タンパク質発現ベクトルに配位子結合を発現する。具体的には、フォワードプライマーについては、ＧＸ１コーディング域の開始コドンの直前にＮｄｅＩ開裂サイトが加わるように設計し、一方リバースプライマーについては、ＧＸ１コーディング域の停止コドンをグリシンアミノ酸、インテイン−キチン結合ドメインタグおよびＳｐｅＩ開裂サイトに対する配列で置換するように設計した（表３）。ＰＣＲの生成物を適切な制限酵素で加水分解してから、加水分解ｐＴＸＢ１ベクターに配位子結合し[Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ（ＮＥＢ）、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ]、そして大腸菌ＪＭ１０９細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。形質転換体からプラスミドを単離してから、制限加水分解によってＧＸ１  ｃＤＮＡ挿入の存在についてスクリーニングを行った。ポジティブクローンを順に配列して、Ｃ−末端ラベリングのインテインタグに対して正しい向きにあることを確認してから、（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する）大腸菌Ｔ７発現細胞に転換した。
【００４９】
2017507137.tif 000005
【００５０】
インテインラベリングＧＸ１タンパク質を発現するために、ＬＢ培地にＴ７発現細胞形質転換体を接種し、０．４〜０．６ＯＤ６００の密度まで細胞を培養してから、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して、細胞を誘導した。接種２〜４時間後、ＩＰＴＧ−誘導培養物から細胞を回収し、溶解し、そしてキチン樹脂カラムに担持した。インテイン−キチン結合ドメインタグの結合によってＧＸ１融合タンパク質をキチン樹脂に固定した。カラムを洗浄して、非ＧＸ１融合蛋白質の非特異的結合を除去した。ジチオトレイトール含有緩衝液を添加することによってインテイン開裂を誘導し、これによってカラムからＧＸ１タンパク質を解放した。
【００５１】
溶離後、大腸菌発現ＧＸ１タンパク質（以下省略してＧＸ１−Ｅと呼ぶ）をＰＢＳで透析し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心分離装置（１０ＫＭＷＣＯ；ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して濃縮し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６を参照；Ｍ＝タンパク質スタンダード、Ｐ＝透析/濃縮タンパク質）によって確認した。染色ゲル上にタンパク質の単一バンドのみが観察できる。ＧＸ１−Ｅタンパク質を所定の会社に送り、タンパク質を確認してもらった。会社到着時、ＧＸ１−Ｅタンパク質をトリプシンで加水分解し、得られたペプチドをＬＣ/ＭＳ/ＭＳ（ＭＳ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ  ＬＬＣ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）によって分析した。コンピュータ分析では、ペプチド配列はＧＸ１タンパク質配列に一致し、カバーリッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）は８６％であった（図７を参照；９８/１１４のアミノ酸がマッチし、明るいグレー域はペプチドマッチング位置を示し、そしてダークグレー域は変性アミノ酸を示す）。
【００５２】
実施例８：大腸菌発現ＧＸ１タンパク質からの抗−ＧＸ１タンパク質抗体の生成
実施例７の記載に従って調製したＧＸ１−Ｅタンパク質に対してウサギ中にポリクローナル抗血清を生成した。具体的には、ＧＸ１−Ｅタンパク質を完全フロイントアジュバントに乳化し、完全フロイントアジュバント中でＧＸ１−Ｅタンパク質を乳化し、２週間おきにニュージーランド産白ウサギに注射し、合計で５回の同時免疫を行い、ＧＸ１−Ｅ抗精子生成を誘導した。一次免疫（前免疫）の前（ウィーク０）、４回目のブースター注射（ウィーク８）の前、４回目のブースター注射２週間後（ウィーク１０）、７回目のブースター注射の前（ウィーク１４）、７回目のブースター注射１週間後（ウィーク１５）、および試験終了時（ウィーク１７）に血清を回収した。
【００５３】
ウィーク０およびウィーク８に血清を回収し、ＥＬＩＳＡタイター評価によって分析し、抗血清のＧＸ１−Ｅタンパク質に対する特異性を確認した。ＥＬＩＳＡの結果から、免疫前血清はＧＸ１−Ｅタンパク質に対する反応性を欠き、一方ウィーク８で回収した血清はＧＸ１−Ｅタンパク質に対して高濃度の抗体（即ち、高力価）を含有していたことがわかった。図８に示すように、免疫前血清の場合、試験したすべての希釈液について、ＧＸ１−Ｅタンパク質に対して反応性を示す抗体を欠き（４０５ｎｍにおける吸光度値が０．１未満）、一方ウィーク８の血清の場合、試験したすべての希釈液について、ＧＸ１−Ｅタンパク質に対して反応性を示す抗体を含有していた（４０５ｎｍにおける吸光度値が０．１以上）。
【００５４】
タンパク質抱合樹脂カラムを使用して、ウィーク１０の抗血清（免疫親和性クロマトグラフィー）からの抗体を精製し、かつ濃縮して、精製抗−ＧＸ１−Ｅタンパク質抗体を生成した。実験室到着時に、単一のタンパク質の特異性をウェスタンブロット分析によって決定し、雄牛の精子溶解物上で免疫前血清（図９、ブロットＡ）および精製抗−ＧＸ１−Ｅタンパク質（図９、ブロットＢ）の反応性と比較した。免疫前血清で精子溶解物を免疫ブロッティングした場合、タンパク質バンドはいずれも検出されず、一方抗−ＧＸ１−Ｅタンパク質抗体を使用して分析した場合、雄牛の精子溶解物および対照ＧＸ１−Ｅタンパク質に単一のタンパク質バンドを検出できた（図９、レーン１＝タンパク質スタンダード、レーン２＝雄牛の精子溶解物、レーン３＝ブランク、レーン４＝精製ＧＸ１−Ｅタンパク質）。
【００５５】
実施例９：哺乳動物の性体外タンパク質発現システムを使用するＧＸ１タンパク質の合成および精製
ＧＸ１ｍＲＮＡのクローン（実施例７）をＰＣＲし、ｃＤＮＡフラグメントを生成した。このフラグメントは制限酵素裂開サイトの側面に位置するＧＸ１に対するタンパク質コーティング域のヌクレオチド配列からなり、これらが次に配位子結合してタンパク質発現ベクターになる。具体的には、フォワードプライマーについて、ＧＸ１コーティング域の開始コドンの直前にＮｄｅＩ裂開サイトを加えるように設計し、一方リバースプライマーについては、ＧＸ１コーディング域の停止コドンの直後にＸｈｏＩを加えるように設計した（表４）。
【００５６】
2017507137.tif 000006
【００５７】
ＰＣＲ生成物を適正な制限酵素で加水分解してから、配位子結合して、加水分解ｐＴ７ＣＦＥ１−ＮＨＩＳ−ＧＳＴ−ＣＨＡベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を生成するとともに、形質転換して大腸菌ＪＭ１０９細胞（ＮＥＢ）を生成した。形質転換体からプラスミドを単離し、次に制限加水分解によってＧＸ１ｃＤＮＡ挿入の存在についてスクリーニングした。ポジティブクローンの配列を決定して、ＧＸ１ｃＤＮＡが、Ｎ−末端ラベリングのためのヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識に対して適切な配向にあることを確認した。ポジティブクローンからの精製プラスミドを１ステップヒト用高収率生体外翻訳キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に使用し、使用説明書に従って、Ｈｉｓ−ＧＳＴ標識ＧＸ１タンパク質を合成した。ｘＴｒａｃｔｏｒ（登録商標）緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）に希釈した生体外翻訳反応物をＨｉｓ  ＴＡＬＯＮ自然落下式カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に担持した。希釈反応物がカラムを横断して流れるため、ヘキサヒスチジン標識の結合によってコバルト樹脂にＨｉｓ−ＧＳＴ  ＧＸ１融合タンパク質を固定できた。カラムを洗浄して、非−ＧＸ１タンパク質の非特異的な結合を取り外した。離散的な容量のイミダゾール含有緩衝液の添加を通じてカラムからＧＸ１タンパク質を脱離した。
【００５８】
溶離容量毎にＨｉｓ−ＧＳＴ  ＧＸ１融合タンパク質の純度を（ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上の）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価（図１０）し、タンパク質スタンダート（レーン１）と生体外翻訳反応（レーン２）を比較してから、コバルト樹脂に結合、離散的な容量のイミダゾール含有緩衝液を使用して固定タンパク質の溶離（レーン３〜１０）を行った。生体外発現ＧＸ１タンパク質（以下にＧＸ１−Ｍと省略する）のみを含有していると考えられる溶離液を合わせて、ＰＢＳで透析してから、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心分離装置（１０Ｋ  ＭＷＣＯ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、次にこのタンパク質がどんなタンパク質であるかを確認してもらうために一般の会社に送った。会社到着時、ＧＸ１−Ｍタンパク質をトリプシンで加水分解し、得られたペプチドをＬＣ/ＭＳ/ＭＳ（ＭＳ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ  ＬＬＣ）によって分析した。コンピュータ分析では、ペプチド配列はＧＸ１タンパク質配列に一致し、カバーリッジは８７％であった（図１１；９９/１１４アミノ酸、淡いグレー域はペプチドマッチングの位置を示す、そしてダークグレー域は、変性アミノ酸の位置を示す）。
【００５９】
実施例１０：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４の変異型の確認
変異型については、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に記述された配列から一つかそれ以上のアミノ酸残基分逸脱していると決定されたアミノ酸配列からなることが確認された。なお、生成した変異型タンパク質の抗原特性への影響は最小であった。各変異形タンパク質は、本明細書でＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、３として記述したペプチド域を一つかそれ以上含有していた。変異型の場合、ＢＬＡＳＴＮＰソフトウェア（ＮＣＢＩ）によって少なくとも７９％、８５％、９０％または９５％がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に記述されたアミノ酸配列と一致していた。Ｘ−染色体を有する哺乳動物の精子細胞蛋白質は、ＳＥＱ  ＩＤＮｏ．９〜１６に記述されているアミノ酸配列からなり、そしてＸ−染色体を有する哺乳動物の精子細胞タンパク質の変異型のタンパク質の場合、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７〜２４に記述されているヌクレオチド配列によって遺伝子情報を指定（コード化）することが可能である。
【００６０】
上記に要約したコンピュータ分析から、評価に使用した変異型タンパク質配列は、ＧＸ１に対して高い配列相同を示し、抗−ＧＸ１ペプチド抗体（実施例２）だけでなく、全長タンパク質に対する抗体（実施例８、１１；以降を参照）によって特異的に結合したものと考えられる。また、コンピュータ分析によって一部の変異型のＧＸ１タンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）に対する以下の相同が得られた。即ち、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９（遺伝子ＩＤ：７８１２６７）＝９８％、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０（遺伝子ＩＤ＝１００３３６６１０）＝９２％、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１（遺伝子ＩＤ＝７８１０７２）＝９１％、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２（遺伝子ＩＤ：１００２９９３３３）＝９０％、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３（遺伝子ＩＤ＝１０２３２７６９０）＝８１％、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４（遺伝子ＩＤ＝１０２３２８６３２）＝７９％、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５（遺伝子ＩＤ：１００３３７１９８）＝８５％、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６（遺伝子ＩＤ＝１００３３７１９８アイソフォーム）＝８２％。
【００６１】
実施例１１：生体外発現ＧＸ１タンパク質からの抗−ＧＸ１タンパク質抗体の生成
ＧＸ１−Ｅタンパク質に対してウサギ中にＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃによってポリクローナル抗血清を生成した。具体的には、完全フロイントアジュバント中でＧＸ１−Ｍタンパク質を乳化し、２週間おきにニュージーランド産白ウサギに注射し、合計で５回の同時免疫を行い、ＧＸ１−Ｍ抗精子生成を誘導した。一次免疫（前免疫）の前（ウィーク０）、４回目のブースター注射（ウィーク８）の前、４回目のブースター注射２週間後（ウィーク１０）、および試験終了時（ウィーク１４）に血清を回収した。ウィーク０およびウィーク８に血清を回収し、ＥＬＩＳＡタイター評価によって分析し、抗血清の特異性を確認した。タンパク質抱合樹脂カラムを使用して、ＧＸ１−Ｍ抗血清（免疫親和性クロマトグラフィー）からの抗体を精製し、かつ濃縮して、精製抗−ＧＸ１−Ｍタンパク質抗体を生成した。実験室到着時に、単一のタンパク質に対する特異性をウェスタンブロット分析によって決定し、雄牛の精子溶解物上で免疫前血清および抗−ＧＸ１−Ｍタンパク質抗体および予め吸収処理した抗−ＧＸ１−Ｍタンパク質抗体の反応性を比較した。
【００６２】
実施例１２：精子分離後の子孫における性比のスキューイング
実施例２、８および／または１１の抗体または抗原−結合フラグメントを検出可能な物質で標識化する。なお、標識は限定するものではなく、蛍光標識、放射性標識、酵素標識、タンパク質標識などを使用することができる。抗体または抗原−結合フラグメントは、制限するものではないが、管、ビーズおよび／またはプレートなどの固形支持体に抱合化することができる。次に、抗体がＸ−染色体を有する精子細胞に結合する条件下で、標識化および／または抱合化抗体または抗原−結合フラグメントを哺乳動物の精液および／または精子の正味の、あるいは希釈したサンプルに添加する。次に、抗体に結合した精子細胞を未結合の精子細胞から分離する。任意の適当な分離法を使用することができるが、例示すると、蛍光活性化細胞選別法、磁気細胞選別法、抗体被覆管への接着法、抗体被覆プレートへの接着法、抗体被覆ビーズへの接着法、他の固形マトリックスへの接着法がある。分離した精子細胞を直接使用して、生体外で雌に精液を注入するか、卵母細胞に受精させるか、公知な方法を使用して処理、凍結して、後日の生体外精液注入および／または受精に備える。
【００６３】
実施例１３：精子を分離して行う子孫性比のスキューイング
抗体/抗原結合フラグメントがＸ−染色体を有する精子細胞に結合し、抗体結合精子細胞が卵母細胞に受精することを防止する物理的なバリヤを与える条件下で、実施例２、８および/または１１で説明したように誘導した抗体または抗原−結合フラグメントを哺乳動物の精液および／または精子の正味の、あるいは希釈したサンプルに添加する。次に、一部が抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントが結合し、そして一部がこのような結合抗体/抗原−結合フラグメントを有しない精子細胞の混合物を含有する精液を直ちに使用して、雌に注入するか、あるいは卵母細胞に生体外で受精させるか、あるいは公知方法を使用して処理および／または凍結して、後日の注入および／または受精に備える。この方法では、未結合精子、即ちＹ−染色体を有する精子分に富む集団は卵母細胞に受精でき、得られた子孫集団を雄にスキューイングでき、一方結合精子、即ちＸ−染色体を有する精子分に富む集団は抑制を受ける。
【００６４】
実施例１４：精子を分離せずに行う子孫性比のスキューイング
実施例２、８および／または１１と同様に誘導した抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントを公知方法によって阻害性物質に抱合する。この阻害性物質としては、限定するわけではないが、化学剤、薬剤および／または細胞毒を例示することができる。次に、抗体/抗原−結合フラグメントがＸ−染色体を有する精子細胞に結合する条件下で、哺乳動物の精液および／または精子の正味の、あるいは希釈したサンプルに添加する。阻害性物質が結合しているため、抗体/抗原−結合フラグメント−結合精子細胞が卵母細胞に受精することはない。次に、一部が抗体、あるいはこれの抗原−結合フラグメントが結合、抱合し、そして一部がこのような結合抗体/抗原−結合フラグメントを有しない精子細胞の混合物を含有する精液を直ちに使用して、雌に注入するか、あるいは卵母細胞に生体外で受精させるか、あるいは公知方法を使用して処理および／または凍結して、後日の注入および／または受精に備える。この方法では、未結合精子、即ちＹ−染色体を有する精子分に富む集団は卵母細胞に受精でき、得られた子孫集団を雄にスキューイングでき、一方結合精子、即ちＸ−染色体を有する精子分に富む集団は抑制を受ける。
【００６５】
本発明は、従来技術の課題の解決に有効な、Ｘ−染色体を有する精子細胞の同定方法、Ｘ−染色体を有する精子細胞とＹ−染色体を有する精子細胞とを分離する方法、および／または混合Ｘ−/Ｙ−染色体を有する精子細胞の性比をＸ−染色体を有する精子細胞、あるいはＹ−染色体を有する精子細胞のいずれかに有利にスキューイングする方法を提供するものである。本発明方法は、実質的に非侵襲性であり、再現可能であるので有利であり、また後で行う営利的な人工授精方法に好適な実行可能なＸ−染色体スキューイング精子細胞集団を提供するものである。
【００６６】
次に、本明細書に記載の方法には、例えば人工授精目的で性比をスキューイングされ、雄・雌を調整された精子細胞を提供する多量の精液を分離したり、あるいは、卵母細胞の受精を防ぐＸ染色体の精子細胞を含む、本発明の抗体の結合又はその抗原結合性フラグメットによるＸ染色体及びＹ染色体の精子細胞の混合集団を含む精液又精子細胞のサンプルを提供したりといった、商業規模のスケールアップが明らかに認められる。
【００６７】
本発明の以上の説明に使用した用語は当業者にとって自明な用語と考えられるが、本発明の要旨の理解を容易にするために、以下定義を示しておく。
【００６８】
特許請求の範囲を含む本明細書では、単数表現、複数表現、上記などの表現、一つかそれ以上という表現はいずれも長く存続している特許法の国際協定に従うものである。例えば、細胞という場合、複数の細胞を含むものとする。
【００６９】
特に断らない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載した成分の数量や反応条件などの特性などについては、いずれも“約、ほぼ”を付して理解すべきである。従って、逆のことが指示されていない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載した数値パラメーターは近似値であり、本発明要旨によって実現することを目的としている特性に応じてこれら近似値は異なってくる。
【００７０】
また、“約”は、数値や、あるいは組成物の量、容量、（例えば２つかそれ以上のヌクレオチド配列やアミノ酸配列を比較する場合などの）配列同一性、質量、重量、温度、時間、容量、濃度、百分率などに言及がある場合、一部の実施態様では具体的に記載した数値から±２０％の変動、一部の実施態様では±１０％の変動、一部の実施態様では±５％の変動、一部の実施態様では±１％の変動、一部の実施態様では±０．１％の変動を包含することを意味し、いずれの変動も本発明を実施するさいに適切であり、また本明細書に開示した組成物を利用するさいにも適切なものである。
【００７１】
また、本明細書で使用する“有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”、“含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”と同義な“からなる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）”、あるいは“特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）”は包摂的な表現、あるいは非限定的な表現であり、付随的な、あるいは記載されていない要素または方法ステップを排除する表現ではない。表現“有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”は、記載された要素が本質的であることを意味する特許請求の範囲に従来から使用されてきた表現ではあるが、他の要素を追加することが可能であり、いずれも特許請求の範囲内にある構成である。
【００７２】
同様に、表現“からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）”も、特許請求の範囲に具体的に記載されている任意の要素、ステップを排除するものではない。また、表現“からなる”が、明細書の前文直後ではなく、特許請求の範囲に出てきた場合、これは特許請求の範囲に記載されている要素のみを限定することを意味するが、他の要素を全体として特許請求の範囲から排除するものではない。
【００７３】
同様に、表現“本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）”も、特許請求の範囲を具体的に記載されている任意の材料またはステップに限定するだけでなく、特許請求の範囲に記載されている要旨の基本的かつ新規な特徴に重要な影響を与えないものにも限定するものである。以上の表現“有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”、“からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）”および“本質的にからなる”について、これら表現のうち一つが使用されている場合、本明細書に開示し、かつ特許請求の範囲に記載した要旨は、他の２つの表現のいずれかを包含するものである。
【００７４】
同様に、表現“および／または”が実在物のリストの文脈内で使用されている場合、これは実在物が単独存在するか、あるいは組み合わせで存在していることを指す。例えば、“Ａ、Ｓ、Ｃ、および／またはＯ”という表現は、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｏが個々に存在することが意味するだけでなく、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｏのうち任意のものを、またこれらのすべての組み合わせや部分的組み合わせを意味する。
【００７５】
本明細書で使用する用語“抗体”（Ａｂ）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体および抗体フラグメントが生物学的活性を示す限り、これらを包含するものである。本明細書で使用する用語“ポリクローナル抗体”は、異種抗体の集団から得られた抗体、即ち生体内の異なるＢ細胞系譜が分泌した抗体を指し、また本明細書で使用する“モノクローナル抗体は、実質的に同一性の抗体の集団、即ち集団を構成する個々の抗体が、自然に発生する可能性がある突然変異の場合を除いて同一である集団を指す。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原サイトを指向する抗体である。
【００７６】
本明細書で使用する用語“抗体”（Ａｂ）は、抗体フラグメントを包含するものでもある。“抗体フラグメント”は健全な抗体の一部である、好ましくは健全な抗体の抗原結合域、あるいは抗原変化域である。抗体フラグメントを、制限するわけではないが例示すると、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２；およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；線形抗体（ＵＳＰ５，６４１，８７０；実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１）：１０５７−１０６２（１９９５）を参照）；単一鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成した多特異性抗体がある。
【００７７】
本明細書で使用する用語“性比（ｓｅｘ  ｒａｔｉｏ）”は、哺乳動物集団における雄の雌に対する比を指す用語である。この用語には、ある特定の集団における性比を予測することも含めることができる。
【００７８】
本明細書で使用する用語“精液（ｓｅｍｅｎ）”は、哺乳動物における流体細胞および精子細胞を指す用語である。この用語には、正味の、および希釈された精液も含まれる。
【００７９】
例示および記述を目的として、好適な実施態様を説明してきたが、発明を徹底的に説明するものではなく、また発明を開示された正確な形態に制限するものでもない。以上開示してきた教示に照らせば、自明な一部変更や変形が可能である。選択した実施態様については、開示してきた要旨の原理およびその応用の最善の説明を与えることによって、当業者が各種の実施態様で、かつ特定の用途に合うように変更して実施できるように記載した。このような変更や変形はいずれも、本発明を公正な範囲、法的な範囲、および正当な範囲に従って解釈した場合に特許請求の範囲によって決定される本発明の範囲に包摂されるものである。
【図１Ａ】
2017507137.tif 000007
【図１Ｂ】
2017507137.tif 000008
【図２Ａ】
2017507137.tif 000009
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2017507137.tif 000013
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2017507137.tif 000015
【図４Ｂ】
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【図５】
2017507137.tif 000017
【図６】
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【図７】
2017507137.tif 000019
【図８】
2017507137.tif 000020
【図９】
2017507137.tif 000021
【図１０】
2017507137.tif 000022
【図１１】
2017507137.tif 000023
【配列表】
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【国際調査報告】
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