(57)【要約】  本発明は、核酸の検出、解析および処理のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブを作製および使用するための組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の核酸標的に対するプローブの作製方法であって：
ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない前記目的の核酸標的の領域を同定すること；
ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない前記領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；および
ｃ）前記プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること
を含む方法。
【請求項２】
前記作製することが増幅、クローニング、合成またはこの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所望でない領域が、リピート配列、非保存配列、保存配列、ＧＣリッチ配列、ＡＴリッチ配列、二次構造およびコード配列からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記所望でない配列がリピート配列である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、前記断片化したプローブ含有核酸に核酸アダプターを結合する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アダプターが増幅プライマーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅プライマーが標識、結合部位または制限部位を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識がフルオロフォア、比色標識、量子ドットまたはビオチンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、前記断片化したプローブ含有核酸を分離する工程、および前記断片化したプローブ含有核酸のサブセットを単離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅がＰＣＲである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記所望でない領域が、コンピュータソフトウェアおよびコンピュータのプロセッサを用いて同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記断片化することが超音波処理によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記断片化することがＤＮＡｓｅ  Ｉ処理によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離することが電気泳動またはクロマトグラフィーによるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記領域またはプローブが１００から６００ｂｐ長または１５０から３００ｂｐ長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記領域またはプローブがおよそ１５０ｂｐ長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記領域またはプローブが、互いに長さが５％以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記領域またはプローブが、互いに長さが３％以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記領域またはプローブが、互いに長さが１％以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記領域またはプローブが、互いに長さが２０％以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記領域またはプローブが少なくとも２００ｂｐ長である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、ｄ）前記プローブのサブセットをさらに増幅させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、ｄ）前記プローブをサイズに基づいて分離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分離することが、クロマトグラフィーまたは電気泳動を用いて行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、前記プローブのサブセットを単離する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記サブセットが、前記分離したプローブのサイズに基づいている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プローブが標識される、請求項１または２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記標識が蛍光標識である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：
ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない前記目的の核酸標的の領域を同定すること；
ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない前記領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；
ｃ）前記プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；
ｄ）前記プローブにアダプターを結合させること；および
ｅ）前記プローブのサブセットをさらに増幅させること
を含む方法。
【請求項３０】
目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：
ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない前記目的の核酸標的の領域を同定すること；
ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない前記領域に対応する複数のプローブ含有核酸を増幅、クローニング、合成またはこの組合せによって作製すること；および
ｃ）前記プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること
を含む方法。
【請求項３１】
目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：
ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない前記目的の核酸標的の領域を同定すること、ここで、前記所望でない核酸が、リピート配列、非保存配列、保存配列、ＧＣリッチ配列、ＡＴリッチ配列、二次構造およびコード配列からなる群より選択される；
ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない前記領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；および
ｃ）前記プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること
を含む方法。
【請求項３２】
目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：
ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない前記目的の核酸標的の領域を同定すること；
ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない前記領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；
ｃ）前記プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；
ｄ）前記プローブをサイズごとに分離すること；および
ｅ）前記プローブのサブセットを単離すること
を含む方法。
【請求項３３】
目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：
ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない前記目的の核酸標的の領域を同定すること；
ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない前記領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；
ｃ）前記プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；
ｄ）前記プローブをサイズごとに分離すること；および
ｅ）前記プローブのサブセットを単離すること、ここで、前記サブセットは８０から３００ｂｐ長の核酸を含む
を含む方法。
【請求項３４】
前記核酸がおよそ１５０ｂｐ長である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：
ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない前記目的の核酸標的の領域を同定すること；
ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない前記領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；
ｃ）前記プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；
ｄ）プローブのサブセットを単離し、プローブセットを作製すること；および
ｅ）前記プローブセットを用いてハイブリダイゼーションアッセイを行うこと
を含む方法。
【請求項３６】
請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法によって作製されるプローブセット。
【請求項３７】
前記プローブがハイブリダイゼーションプローブである、請求項３６に記載のプローブセット。
【請求項３８】
前記プローブが、癌遺伝子の発現または染色体の異数性を検出するものである、請求項３６に記載のプローブセット。
【請求項３９】
前記癌遺伝子が、Ｈｅｒ２、ｐ５３およびから選択される、請求項３８に記載のプローブセット。
【請求項４０】
請求項３６から３９のいずれか一項に記載のプローブを含むキット。
【請求項４１】
さらに、核酸対照、ハイブリダイゼーション試薬または検出試薬のうちの１つ以上を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
標的核酸を請求項３６から３９のいずれか一項に記載のプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーションアッセイを行う方法。
【請求項４３】
前記ハイブリダイゼーションアッセイがＩＳＨアッセイである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法によって作製されたプローブのハイブリダイゼーションアッセイにおける使用。
【請求項４５】
前記ハイブリダイゼーションアッセイがＩＳＨアッセイである、請求項４４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出、解析および処理のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブを作製および使用するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）は、染色体上の特定のＤＮＡ配列の有無を検出し、位置特定するために使用される細胞遺伝学的手法である。ＦＩＳＨでは蛍光プローブが使用され、この蛍光プローブは、染色体上の該プローブが高度の配列相補性を示す部分にのみ結合するものである。蛍光プローブが染色体のどこに結合しているかを見出すためには蛍光顕微鏡検査が使用され得る。ＦＩＳＨは多くの場合、遺伝カウンセリング、医学および種の同定における使用のためのＤＮＡ内の特定の特色を見出すために使用される。また、ＦＩＳＨは、細胞内、循環腫瘍細胞内および組織試料中の特定のＲＮＡ標的（ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）を検出し、位置特定するためにも使用され得る。これとの関連において、細胞内および組織内における遺伝子発現の空間的−時間的パターンを規定するのに有用であり得る。
【０００３】
ヒトゲノムＤＮＡは、ゲノム全体に多コピーで存在するユニーク配列と反復配列の混合物である。一部の用途では、染色体上の目的のユニーク配列のみとアニーリングするハイブリダイゼーションプローブを作製することが望ましい。ユニーク配列のプローブの調製は、生物体のゲノム全体における数多くの類型の反復配列の存在によって煩雑になる（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．１９７５）。ハイブリダイゼーションプローブ内における反復配列の存在は、プローブの一部分が目的の配列外に見られる他の反復配列に結合するため、プローブの特異性を低下させる。したがって、ハイブリダイゼーションプローブの目的の特定配列との結合を確実にするためには、反復配列のないプローブが必要である。
【０００４】
この問題は、非標識ブロッキング核酸の使用を伴って反復配列のハイブリダイゼーションを阻害することによる最近の貢献によって対処されている（米国特許第５，４４７，８４１号および米国特許第６，５９６，４７９号）。ハイブリダイゼーションにおけるブロッキング核酸の使用は高価であり、反復配列のハイブリダイゼーションは完全には抑制されず、ゲノムのハイブリダイゼーションパターンが歪曲され得る（Ｎｅｗｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ：ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｅｆｆｅｃｔ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ  ３３（２２）：ｅｌ９１（２００５））。したがって、ブロッキングＤＮＡの使用を伴わずにリピート配列のハイブリダイゼーションが抑制される方法が、最適なハイブリダイゼーションのために望ましい。
【０００５】
これを達成するための手段の１つは、ハイブリダイゼーション前にハイブリダイゼーションプローブから不要なリピートセグメントを除去することである。高度反復配列の除去を伴う手法は、これまでに報告されている。ヒドロキシアパタイトなどの吸収剤は、抽出されたＤＮＡから高度反復配列を除去するための手段をもたらす。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、ＤＮＡを二本鎖の再会合条件、例えば、温度、塩濃度または他のストリンジェンシーに基づいて分画する。この手順は面倒であり、異なる配列では異なるものになる。また、リピートＤＮＡは、固定化ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによっても除去することができる（Ｂｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｂｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．５７８−５８７（１９８２））。これらの手順ではすべて、反復配列の物理的除去は、ＤＮＡ配列の塩基組成に基づいた内在的多様性を伴う条件の厳密な最適化に依存する。
【０００６】
ハイブリダイゼーションプローブから反復配列を除去するためのいくつかの他の方法が報告されている。方法の１つは架橋剤を使用することを伴うものであり、反復配列のハイブリダイゼーションを直接的に抑制するか、またはＰＣＲ反応におけるリピート配列の増幅を抑制するかのいずれかのために反復配列を架橋させる（米国特許第６，４０６，８５０号）。別の方法では、ＰＣＲ補助型アフィニティクロマトグラフィーを使用してハイブリダイゼーションプローブからリピート部を除去する（米国特許第６，５６９，６２１号）。これらの方法はどちらも、リピート配列を除去するために標識ＤＮＡの使用に依存するものであり、これにより、このような方法は複雑で再現が困難となっている。さらに、どちらの方法も時間がかかり、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または高い標的特異性が必要とされる他のハイブリダイゼーション反応における使用に適した機能性プローブを作製するために多数回のリピート部除去が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，４４７，８４１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５９６，４７９号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４０６，８５０号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５６９，６２１号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．１９７５
【非特許文献２】Ｎｅｗｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ：ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｅｆｆｅｃｔ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．ｖｏｌ  ３３（２２）：ｅｌ９１（２００５）
【非特許文献３】Ｂｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｂｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．５７８−５８７（１９８２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、プローブから反復配列を除去するための方法が所望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、核酸の検出、解析および処理のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブを作製および使用するための組成物および方法に関する。
【００１１】
本技術の実施形態により、目的のものでない配列が除外されるように、および／または目的の配列が含まれるように選択的に作製または合成されるプローブ（例えば、実質的にリピート部が含まれていない核酸プローブ）を作製および使用するための組成物、キットおよびシステムを提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）目的の核酸の少なくとも１００ｂｐ長（例えば、少なくとも１００、２００、少なくとも３００または少なくとも４００）であり、場合により互いの長さの違いが２０％より大きくない（例えば、２０％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、３％以下、１％以下または同一の長さ）の所望でない配列が実質的に含まれていない（例えば、リピート部、非保存配列、保存配列、ＧＣリッチ配列、ＡＴリッチ配列、二次構造またはコード配列が含まれていない）目的の核酸標的の領域を同定すること；およびｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を（例えば、増幅、クローニング、合成またはこの組合せによって）作製することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、さらに、ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製する工程；およびｄ）所望でない配列が実質的に含まれていないプローブ（例えば、例えば所望でないリピート配列がないＩＳＨプローブ）を作製するためにプローブのサブセットをさらに増幅させる工程のうちの１つ以上を含むものである。一部の実施形態では、該方法は、さらに、ｄ）プローブをサイズに基づいて分離する工程を含むものである。一部の実施形態では、分離することが、クロマトグラフィーまたは電気泳動を用いて行われる。一部の実施形態では、該方法は、さらに、プローブのサブセットを単離する工程を含むものである。一部の実施形態では、サブセットは、分離した核酸のサイズに基づいたものである。一部の実施形態では、プローブが核酸アダプターに結合されている。一部の実施形態では、アダプターが増幅プライマーである。一部の実施形態では、増幅プライマーは下流用途のために機能性付与されている（例えば、標識、結合部位または制限部位の付加により）。一部の実施形態では、プローブを分離し、プローブのサブセットを単離する（ａｉｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ）。一部の実施形態では、増幅がＰＣＲである。一部の実施形態では、所望でない配列が実質的に含まれていない領域が、コンピュータソフトウェアおよびコンピュータのプロセッサを用いて同定される。一部の実施形態では、プローブ含有核酸が超音波処理によって断片化される（が、任意のさまざまな他の化学的、物理的または他のアプローチが使用され得る。）。一部の実施形態では、分離することが電気泳動またはクロマトグラフィーによるものである。一部の実施形態では、断片が約１００から５００ｂｐ長であるが、他の長さを使用してもよい。一部の実施形態では、プローブが標識される（例えば、蛍光標識で）。一部の実施形態では、プローブは、所望でない核酸配列が、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％含まれていない。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；ｄ）該プローブにアダプターを結合させること；および場合によりｅ）プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００１３】
さらなる実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；および場合によりｄ）プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００１４】
さらなる実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること、ここで、該所望でない領域は、例えば、少なくとも１００ｂｐ長であるリピート配列、非保存配列、保存配列、ＧＣリッチ配列、ＡＴリッチ配列、二次構造またはコード配列である；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；およびｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；ならびに場合によりｄ）プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００１５】
また他の実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；ｄ）該プローブをサイズごとに分離すること；ｅ）該プローブのサブセットを単離すること；および場合によりｆ）該プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００１６】
さらに他の実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；ｄ）該プローブをサイズごとに分離すること；ｅ）該プローブのサブセットを単離すること、ここで、該サブセットは８０から３００ｂｐ長の核酸を含む（例えば、およそ１５０ｂｐ長）；および場合によりｆ）該プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００１７】
さらなる実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；およびｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；場合によりｄ）プローブセットを作製するためにプローブのサブセットをさらに増幅させること；およびｅ）該プローブセットを用いてハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＩＳＨアッセイ）を行うことを含む方法を提供する。
【００１８】
さらに、本明細書において、前述の方法によって作製された、所望でない配列が含まれていない一組の核酸プローブ（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）プローブ））、および該プローブを含むキットおよびシステムを提供する。本開示は、特定のアッセイまたは標的に限定されない。一部の実施形態では、プローブが、癌遺伝子の発現または染色体の異数性を検出するものである。
【００１９】
さらに、本明細書において、標的核酸を、前述の方法によって作製されたプローブ（例えば、ＩＳＨプローブ）と接触させることを含む、ハイブリダイゼーションアッセイを行う方法を提供する。
【００２０】
また、本明細書において、前述の方法によって作製された任意のプローブ（例えば、ＩＳＨプローブ）のハイブリダイゼーション（例えば、ＩＳＨ）アッセイにおける使用を提供する。
【００２１】
さらなる実施形態は本明細書に記載している。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施形態の例示的な標識プローブの模式図を示す。
【図２】ＨＥＲ２遺伝子座のマップを示す。
【図３】リピート部が含まれていないＨＥＲ遺伝子座由来のプローブの増幅を示す。
【図４】ＨＥＲ２遺伝子座由来の断片化プローブを示す。
【図５】アダプター結合ＨＥＲ２プローブの増幅を示す。
【図６】ＨＥＲ２リピート部が含まれていないプローブを示す。
【図７】本開示の実施形態のプローブを用いたＨＥＲ２遺伝子座のＦＩＳＨハイブリダイゼーションを示す。
【図８−１】ＨＥＲ−２プローブの設計における使用のために選択されたＨＥＲ−２遺伝子の８０ｂｐの部分を示す。
【図８−２】ＨＥＲ−２プローブの設計における使用のために選択されたＨＥＲ−２遺伝子の８０ｂｐの部分を示す。
【図８−３】ＨＥＲ−２プローブの設計における使用のために選択されたＨＥＲ−２遺伝子の８０ｂｐの部分を示す。
【図８−４】ＨＥＲ−２プローブの設計における使用のために選択されたＨＥＲ−２遺伝子の８０ｂｐの部分を示す。
【図８−５】ＨＥＲ−２プローブの設計における使用のために選択されたＨＥＲ−２遺伝子の８０ｂｐの部分を示す。
【図８−６】ＨＥＲ−２プローブの設計における使用のために選択されたＨＥＲ−２遺伝子の８０ｂｐの部分を示す。
【図８−７】ＨＥＲ−２プローブの設計における使用のために選択されたＨＥＲ−２遺伝子の８０ｂｐの部分を示す。
【図９】リピート部が含まれていない例示的なｐ１６プローブのマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本明細書で用いる場合、用語「所望でない核酸が実質的に含まれていない」とは、核酸に、所望でない核酸が実質的に含まれていない（例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％含まれていない）ことをいう。所望でない核酸としては、限定されないが、反復核酸、非保存配列、保存配列、ＧＣリッチ配列、ＡＴリッチ配列、二次構造またはコード配列が挙げられる。
【００２４】
使用する場合、用語「実質的にリピート部が含まれていない核酸配列」または「リピート部が含まれていない核酸」とは、反復核酸配列が実質的に含まれていない（例えば、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％含まれていない）核酸領域をいう。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「試料」は、最も広い意味で用いている。意味の一例において、これは、細胞（例えば、ヒト、細菌、酵母および真菌）、生物体、任意の供給源から得られた被検物または培養物ならびに生物学的試料を包含していることを意図する。生物学的試料は、動物（ヒトを含む。）から得られたものであり得、生物学的材料またはこれに見られる組成物、例えば限定されないが、骨髄、血液、血清、血小板、血漿、間質液、尿、脳脊髄液、核酸、ＤＮＡ、組織、およびこの精製または濾過された形態をいう。しかしながら、かかる例は、本発明に適用可能な試料型を限定するものと解釈されるべきでない。
【００２６】
用語「標識」は、本明細書で用いる場合、検出可能な（好ましくは、定量可能な）効果をもたらすために使用され得、核酸またはタンパク質に結合され得る任意の原子または分子をいう。標識としては、限定されないが、色素；放射性標識、例えば３２Ｐ；結合性部分、例えばビオチン；ハプテン、例えばジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｇｅｎｉｎ）；発光性、リン光性もしくは蛍光性の部分；および蛍光色素の単独または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による発光スペクトルを抑制もしくはシフトさせ得る部分との組合せが挙げられる。標識は、蛍光、放射能、比色、重量測定、Ｘ線回折または吸光、磁気、酵素活性などによって検出可能なシグナルをもたらすものであり得る。標識は、電荷を有する部分（正または負の電荷）であってもよく、または電荷的中性のものであってもよい。標識は、核酸配列またはタンパク質配列を含むもの、または該配列からなるものであってもよい（標識を含む該配列が検出可能である限り）。一部の実施形態では、核酸は、標識なしで直接検出される（例えば、配列の直接的な読み出し）。
【００２７】
本明細書で用いる場合、用語「核酸分子」は、任意の核酸含有分子、例えば限定されないが、ＤＮＡまたはＲＮＡをいう。この用語には、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の任意の塩基アナログ、例えば限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリンを含む配列が包含される。
【００２８】
本明細書で用いる場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対合に関して用いている。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の度合い、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍおよび核酸のＧ：Ｃ比などの要素によって影響される。構造内に相補的核酸の対合を含有している単一の分子は「自己ハイブリダイズ」型となる。
【００２９】
用語「プライマー」は、精製された制限消化物の場合のような天然に存在するものであれ、合成により作製されたものであれ、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（例えば、ヌクレオチドと誘導剤、例えばＤＮＡポリメラーゼの存在下および適切な温度とｐＨ下）に置かれた場合、合成の開始点としての機能を果たし得るオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、増幅の最大効率のために好ましくは一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーをまず、鎖を分離するために処理した後、伸長産物を調製するために使用する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成がプライミングされるのに充分に長いものであるのがよい。プライマーの厳密な長さは、多くの要素、例えば、温度、プライマーの供給源および方法の用途に依存する。例えば、一部の実施形態では、プライマーは、１０から１００個以上のヌクレオチド（例えば、１０から３００、１５から２５０、１５から２００、１５から１５０、１５から１００、１５から９０、２０から８０、２０から７０、２０から６０、２０から５０個のヌクレオチドなど）の範囲である。
【００３０】
一部の実施形態では、プライマーは、目的の核酸にハイブリダイズしないさらなる配列を含むものである。用語「プライマー」には、化学修飾プライマー、蛍光修飾プライマー、機能性プライマー（融合プライマー）、配列特異的プライマー、ランダムプライマー、特異的配列とランダム配列の両方を有するプライマー、ならびにＤＮＡプライマーおよびＲＮＡプライマーが包含される。
【００３１】
用語「増幅させる」または「増幅」は、核酸との関連において、多コピーのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部分の生成をいい、典型的には少量のポリヌクレオチド（例えば、１個のポリヌクレオチド分子という少量）から開始し、このとき、増幅産物またはアンプリコンは一般的に検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅には、さまざまな化学的方法および酵素的方法が包含される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）中における１コピーまたは数コピーの標的または鋳型ＤＮＡ分子からの多コピーのＤＮＡの生成は増幅の形態の一例である。増幅は、出発分子の厳密な複製に限定されない。例えば、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを使用し、試料中の限定的な量のＲＮＡからの多数のｃＤＮＡ分子の生成は増幅の一形態である。さらに、転写過程における単一のＤＮＡ分子からの多数のＲＮＡ分子の生成もまた増幅の一形態である。
【００３２】
本明細書で用いる場合、用語「固相支持体」は、試薬、例えば抗体、抗原および他の試験成分を結合させる任意の固形または静止状態の物質に関して用いている。固相支持体の例としては、顕微鏡スライド、マイクロタイタープレートのウェル、カバースリップ、ビーズ、粒子、細胞培養フラスコ、ならびに多くの他の適切なアイテムが挙げられる。
【００３３】
本発明は、核酸の検出、解析および処理のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブを作製および使用するための組成物および方法に関する。
【００３４】
本技術の実施形態により、所望でない配列が実質的に含まれていないプローブ（例えば、所望でない配列、例えばリピート配列がないＦＩＳＨプローブ）を作製するための組成物および方法であって、プローブから所望でない配列を除去する既存の方法の多工程またはそうでなければ厄介な方法を提供することによる制限が解決される組成物および方法を提供する。
【００３５】
リピート部が含まれていないＩＳＨプローブの作製における使用のための本発明の実施形態の実例を示す。当業者には、本開示の方法が、他の所望でない配列および他のプローブ用途にも適用され得ることが理解されよう。
【００３６】
ＦＩＳＨプローブにおけるリピート配列の存在は、同様のリピート部を含有している他の遺伝子座にバックグラウンドシグナルをもたらす。さらに、これは、ＦＩＳＨプローブの嵩を不必要に増大させ、無駄な物質をもたらす。最後に、リピート配列に関係なく、ＦＩＳＨプローブは典型的には、ｌ００ｋｂ長を超えるＢＡＣ配列から直接生成させたＤＮＡから調製される。本明細書において提供する方法により、目的のゲノム領域に特異的である非リピート配列の選択が可能になり、目的のゲノム領域を含むＢＡＣの利用可能性に伴う潜在的問題が回避され、リピート部が含まれていないプローブを作製する既存の方法の不都合点が解決される（例えば、Ｒｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０８６−１０９４，２００１；Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｋｒｅａｔｅｃｈ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ；Ｓｅａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  １３  Ｎｕｍｂｅｒ  ６  １９８５；Ｄｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．７；Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｏｃｔ；１９（７）：９０１−９；およびＣｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ（１９９７）１００：４７２−４７６を参照のこと）。
【００３７】
本明細書に記載のプローブにより、既存のプローブと比べて以下の利点が得られる：リピート配列による干渉の低減；ヒトＤＮＡブロック剤の必要性が解消される；より速いハイブリダイゼーション時間；より高いハイブリダイゼーション温度（例えば、より容易なプローブ除去およびより一様なハイブリダイゼーション温度）によって、より速いハイブリダイゼーション時間がもたらされる；増幅（例えば、ＰＣＲ）による調製によって、より高速で、安価で、より信頼性のある製造がもたらされる；ならびに、作製したら、鋳型は規模拡大した製造用途における有用性が見出される。
【００３８】
Ｉ．プローブの作製
所望でない配列が実質的に含まれていないプローブの例示的な作製方法を以下に説明する。ＩＳＨ（例えば、ＦＩＳＨ）プローブの作製における使用のための本発明の実施形態の実例を示す。当業者には、本開示の方法が、他の所望でない配列および他のプローブ用途にも適用され得ることが理解されよう。
【００３９】
本技術の実施形態により、目的のものでない配列が除外されるように、および／または目的の配列が含まれるように選択的に作製または合成されるプローブ（例えば、実質的にリピート部が含まれていない核酸プローブ）を作製および使用するための組成物、キットおよびシステムを提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）目的の核酸の少なくとも１００ｂｐ長（例えば、少なくとも１００、２００、少なくとも３００または少なくとも４００）であり、場合により互いの長さの違いが２０％より大きくない（例えば、２０％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、３％以下、１％以下または同一の長さ）の所望でない配列が実質的に含まれていない（例えば、リピート部、非保存配列、保存配列、ＧＣリッチ配列、ＡＴリッチ配列、二次構造またはコード配列が含まれていない）目的の核酸標的の領域を同定すること；およびｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を（例えば、増幅、クローニング、合成またはこの組合せによって）作製することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、さらに、ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製する工程；およびｄ）所望でない配列が実質的に含まれていないプローブ（例えば、例えば所望でないリピート配列がないＩＳＨプローブ）を作製するためにプローブのサブセットをさらに増幅させる工程のうちの１つ以上を含むものである。一部の実施形態では、該方法は、さらに、ｄ）プローブをサイズに基づいて分離する工程を含むものである。一部の実施形態では、分離する工程が、クロマトグラフィーまたは電気泳動を用いて行われる。一部の実施形態では、該方法は、さらに、プローブのサブセットを単離する工程を含むものである。一部の実施形態では、サブセットは、分離した核酸のサイズに基づいたものである。一部の実施形態では、プローブが核酸アダプターに結合されている。一部の実施形態では、アダプターが増幅プライマーである。一部の実施形態では、増幅プライマーは下流用途のために機能性付与されている（例えば、標識、結合部位または制限部位の付加により）。一部の実施形態では、プローブを分離し、プローブのサブセットを単離する。一部の実施形態では、増幅がＰＣＲである。一部の実施形態では、所望でない配列が実質的に含まれていない領域が、コンピュータソフトウェアおよびコンピュータのプロセッサを用いて同定される。一部の実施形態では、プローブ含有核酸が超音波処理によって断片化される（が、任意のさまざまな他の化学的、物理的または他のアプローチが使用され得る。）。一部の実施形態では、分離することが電気泳動またはクロマトグラフィーによるものである。一部の実施形態では、断片が約１００から５００ｂｐ長であるが、他の長さを使用してもよい。一部の実施形態では、プローブが標識される（例えば、蛍光標識で）。一部の実施形態では、プローブは、所望でない核酸配列が、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％含まれていない。
【００４０】
一部の実施形態では、プローブはおよそ５０から１０００ｂｐ長である。例えば、一部の実施形態では、プローブは５０から９００ｂｐ、５０から８００ｂｐ、５０から７００ｂｐ、５０から６００ｂｐ、５０から５００ｂｐ、５０から４５０ｂｐ、５０から４００ｂｐ、５０から３５０ｂｐ、５０から３００ｂｐ、５０から２５０ｂｐ、５０から２００ｂｐ、５０から１５０ｂｐ、５０から１００ｂｐ、８０から９００ｂｐ、８０から８００ｂｐ、８０から７００ｂｐ、８０から６００ｂｐ、８０から５００ｂｐ、８０から４５０ｂｐ、８０から４００ｂｐ、８０から３５０ｂｐ、８０から３００ｂｐ、８０から２５０ｂｐ、８０から２００ｂｐ、８０から１５０ｂｐ、８０から１００ｂｐ、１００から９００ｂｐ、１００から８００ｂｐ、１００から７００ｂｐ、１００から６００ｂｐ、１００から５００ｂｐ、１００から４５０ｂｐ、１００から４００ｂｐ、１００から３５０ｂｐ、１００から３００ｂｐ、１００から２５０ｂｐ、１００から２００ｂｐ、１００から１５０ｂｐ、１５０から９００ｂｐ、１５０から８００ｂｐ、１５０から７００ｂｐ、１５０から６００ｂｐ、１５０から５００ｂｐ、１５０から４５０ｂｐ、１５０から４００ｂｐ、１５０から３５０ｂｐ、１５０から３００ｂｐ、１５０から２５０ｂｐ、１５０から２００ｂｐ、１５０から１５０ｂｐ、または８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０ｂｐである。一部の実施形態では、プローブは、所望でない核酸配列が、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９９％または１００％含まれていない。
【００４１】
一部の実施形態では、本発明により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；ｄ）該プローブにアダプターを結合させること；および場合によりｅ）プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００４２】
さらなる実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；；および場合によりｄ）プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００４３】
さらなる実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること、ここで、該所望でない領域は、例えば、少なくとも１００ｂｐ長であるリピート配列、非保存配列、保存配列、ＧＣリッチ配列、ＡＴリッチ配列、二次構造またはコード配列である；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；およびｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；ならびに場合によりｄ）プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００４４】
また他の実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；ｄ）該プローブをサイズごとに分離すること；ｅ）該プローブのサブセットを単離すること；および場合によりｆ）該プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００４５】
さらに他の実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；ｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；ｄ）該プローブをサイズごとに分離すること；ｅ）該プローブのサブセットを単離すること、ここで、該サブセットは８０から３００ｂｐ長の核酸を含む（例えば、およそ１５０ｂｐ長）；および場合によりｆ）該プローブのサブセットをさらに増幅させることを含む方法を提供する。
【００４６】
さらなる実施形態により、目的の核酸に対するプローブの作製方法であって：ａ）少なくとも１００ｂｐ長である所望でない配列が実質的に含まれていない目的の核酸標的の領域を同定すること；ｂ）所望でない配列が実質的に含まれていない該領域に対応する複数のプローブ含有核酸を作製すること；およびｃ）プローブ含有核酸を断片化し、プローブを作製すること；場合によりｄ）プローブセットを作製するためにプローブのサブセットをさらに増幅させること；およびｅ）該プローブセットを用いてハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＩＳＨアッセイ、例えばＦＩＳＨ）を行うことを含む方法を提供する。
【００４７】
さらに、本明細書において、前述の方法によって作製された所望でない配列が含まれていない一組の核酸プローブ（例えば、ＩＳＨプローブ）ならびに該プローブを含むキットおよびシステムを提供する。
【００４８】
さらに、本明細書において、標的核酸を、前述の方法によって作製されたプローブ（例えば、ＩＳＨプローブ）と接触させることを含む、ハイブリダイゼーションアッセイを行う方法を提供する。
【００４９】
また、本明細書において、前述の方法によって作製された任意のプローブ（例えば、ＩＳＨプローブ）のハイブリダイゼーション（例えば、ＩＳＨ）アッセイにおける使用を提供する。
【００５０】
プローブの例示的な作製方法を以下に詳細に説明する。
【００５１】
Ａ．プローブ
本発明により、一部の実施形態では、プローブライブラリーの作製方法を提供する。一部の実施形態では、プローブはおよそ１００から４００ｂｐ長（例えば、１００から３００ｂｐ長）である。
【００５２】
一部の実施形態では、標的配列の異なる領域に相補的なプローブのライブラリーを作製する。一部の実施形態では、ライブラリー内のすべてのプローブが同様の長さ（例えば、１％、２％、３％、４％もしくは５％、１０％、２０％以内または同一の長さ）である。
【００５３】
プローブは、任意の数の修飾塩基、修飾主鎖、副溝結合部を含むもの、および標識（例えば、以下により詳細に記載するようなもの）を含むものであり得る。かかるアナログの例としては、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【００５４】
Ｂ．所望でない配列の同定
本発明は、特定の型の所望でない配列に限定されない。一部の実施形態では、所望でない配列は、例えば、リピート配列、非保存配列、保存配列、ＧＣリッチ配列、ＡＴリッチ配列、二次構造およびコード配列である。好ましい一部の実施形態では、プローブ結合を最適化するために、リピート部が含まれていない配列を取り出す。
【００５５】
一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡの目的の領域内のリピートが実質的に含まれていないセグメントまたは他の所望でないセグメントをまず同定する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡの目的の領域内のリピート部が含まれていない連続したセグメントを、バイオインフォマティクス法によって同定する。本発明は、特定のバイオインフォマティクス法に限定されない。一部の実施形態では、市販のソフトウェアパッケージ、例えば、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＢｒｏｗｓｅｒのＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ機能（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国立がん研究所）から入手可能）などが使用されるが、他の市販の、または市販でないソフトウェアパッケージも具体的に想定される。
【００５６】
一部の実施形態では、Ｇｅｎｏｍｅ  ＢｒｏｗｓｅｒのＲｅｐｅａｔ−Ｍａｓｋｅｒ機能を使用し、リピート配列が小文字で、非リピートが大文字で提示されることによりリピート部分が非リピート部分と区別され、配列をダウンロードする。配列のリピート部分を除去するため、および長さの順に連続鎖の非リピート配列を提示するために外部ソフトウェアプログラムまたは手作業での配列情報の調査を使用する。短鎖（通常、３００ｂｐ未満）は廃棄し、合わせた配列長さが、意図される使用に許容され得る標識強度を有するプローブを調製するのに充分であるようないくつかの長鎖を同定する。
【００５７】
Ｃ．プローブの作製
所望でない配列の同定後、所望でない配列が実質的に含まれていないプローブを設計する。プローブは、任意の適切な方法を用いて作製され得る。一部の実施形態では、プローブを、後述の方法を用いて増幅させる。
【００５８】
一部の実施形態では、プローブのライブラリーを合成する。一部の実施形態では、合成プローブは、標的配列に相補性の領域と、標的配列に相補的でない標識領域とを含むものである（例えば、図１を参照のこと）。一部の実施形態では、標識含有領域は、プローブライブラリー全体で同一である。一部の実施形態では、分枝または別の非線状の構成である標識含有領域を有するプローブを作製する。
【００５９】
一部の実施形態では、増幅方法またはプローブ作製における使用のためのオリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチド合成のための例示的な方法は本明細書に記載している。所望のオリゴヌクレオチドを得るため、構成ブロックを順に、成長中のオリゴヌクレオチド鎖に、産物の配列に必要とされる順番でカップリングさせる。この過程は、１９７０年代後期以来、完全に自動化されている。鎖合成が終了したら、産物を固相から溶液に放出させ、脱保護し、収集する。産物は多くの場合、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって単離され、所望のオリゴヌクレオチドが高純度で得られる。典型的には、合成オリゴヌクレオチドは、１５から２５塩基長前後の一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
【００６０】
一部の実施形態では、ヌクレオシド間結合の形成の選択性および速度は、ホスファイトトリエステル方法論において構成ブロックとしての機能を果たすヌクレオシド（ヌクレオシドホスホルアミダイト）の３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトホスホルアミダイト）誘導体を使用することにより改善される。所望でない副反応を抑制するため、ヌクレオシド内の他のすべての官能基を、保護基を結合することによって非反応性（保護型）にする。オリゴヌクレオチド鎖合成が終了したら、すべての保護基を除去し、所望のオリゴヌクレオチドを得る。
【００６１】
例示的な保護基およびヌクレオシドホスホルアミダイト構成ブロックとしては、限定されないが、酸不安定性ＤＭＴ（４，４’−ジメトキシトリチル）保護基が挙げられる。それぞれチミジンおよびウリジンの核酸塩基であるチミンおよびウラシルは、環外アミノ基を有しておらず、したがってなんら保護は必要とされない。
【００６２】
グアノシンおよび２’−デオキシグアノシンの核酸塩基は環外アミノ基を有しているが、この塩基性度は、カップリング反応条件下でホスホルアミダイトと反応しない程度に低い。しかしながら、Ｎ２−非保護型５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシグアノシンから誘導したホスホルアミダイトは、オリゴヌクレオチド合成に一般的に使用される溶媒であるアセトニトリルに難溶性である。一方で、同じ化合物のＮ２−保護型はアセトニトリルに良好に溶解し、したがって広く使用されている。核酸塩基アデニンおよびシトシンは、カップリング反応条件下で活性型ホスホルアミダイトと反応性の環外アミノ基を担持している。合成サイクルにおいてさらなる工程または代わりのカップリング剤と溶媒系の使用により、オリゴヌクレオチド鎖合成が、非保護アミノ基を有するｄＡおよびｄＣホスホルアミダイトを用いて行われる。一部の実施形態では、ヌクレオシド内の環外アミノ基が、全長のオリゴヌクレオチド鎖合成にわたって永続的に保護型に維持される。
【００６３】
環外アミノ基の保護は５’−ヒドロキシ基のものと、後者が各合成サイクルの終了時に除去されるため、一般的にオルトゴナルである。実施するのが最も単純で、したがって最も広く認められているのは、環外アミノ基に塩基不安定性保護を担持させるストラテジーである。ほとんどの場合、２つの保護スキームが使用される。
【００６４】
一部の実施形態では、Ｂｚ（ベンゾイル）保護がＡ、ｄＡ、ＣおよびｄＣに対して使用され、一方、ＧおよびｄＧはイソブチリル基で保護される。近頃では、Ａｃ（アセチル）基が多くの場合で、ＣおよびｄＣを保護するために使用される。
【００６５】
２つ目の弱保護スキームでは、ＡおよびｄＡをイソブチリル基またはフェノキシアセチル基（ＰＡＣ）で保護する。ＣおよびｄＣにはアセチル保護を担持させ、ＧおよびｄＧは４−イソプロピルフェノキシアセチル（ｉＰｒ−ＰＡＣ）基またはジメチルホルムアミジノ（ｄｍｆ）基で保護する。弱保護基は標準的な保護基よりも容易に除去される。しかしながら、このような基を担持しているホスホルアミダイトは、溶液中で保存する場合、安定性が低い。
【００６６】
一部の実施形態では、ホスファイト基を塩基不安定性の２−シアノエチル基によって保護する。ホスホルアミダイトが固相支持体結合オリゴヌクレオチドとカップリングし、ホスファイト部分がＰ（Ｖ）種に変換されたら、このリン酸基保護の存在は、さらなるカップリング反応が成功裡に行われるのに必須でなくなる。
【００６７】
非ヌクレオシドホスホルアミダイトは、種々の官能部が合成オリゴヌクレオチドの末端または配列の中央部のヌクレオチド残基間に導入されるように設計されたホスホルアミダイト試薬である。配列内部に導入されるためには、非ヌクレオシド修飾体は少なくとも２つのヒドロキシ基を有するものでなければならず、このうち一方は多くの場合、ＤＭＴ基で保護されるが、他方には反応性のホスホルアミダイト部分を担持させる。
【００６８】
非ヌクレオシドのホスホルアミダイトは、天然のヌクレオシドには利用可能でない所望の基またはより単純な化学設計を用いてより容易に導入され得る所望の基を導入するために使用される。
【００６９】
オリゴヌクレオチド合成は、所望の配列が合成されるまでヌクレオチド残基を成長中の鎖の５’末端に段階的に付加することによって行われる。各付加は合成サイクルと称され、次に示す４つの化学反応からなる。
【００７０】
工程１：脱ブロッキング（脱トリチル化）
ＤＭＴ基を酸溶液で、例えば、不活性溶媒（ジクロロメタンまたはトルエン）中、２％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）または３％のジクロロ酢酸（ＤＣＡ）で除去する。形成されたオレンジ色のＤＭＴカチオンを洗い流す；この工程により、遊離の５’末端ヒドロキシル基を担持している固相支持体結合オリゴヌクレオチド前駆体がもたらされる。脱トリチル化を長時間、または推奨されているものより強い酸溶液を用いて行うと、固相支持体結合オリゴヌクレオチドの脱プリンがもたらされ、したがって、所望の完全長産物の収量が低下する。
【００７１】
次に、ヌクレオシドホスホルアミダイト（または数種類のホスホルアミダイトの混合物）のアセトニトリル溶液を酸性アゾール触媒、１Ｈ−テトラゾール、２−エチルチオテトラゾール、２−ベンジルチオテトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾールまたはいくつかの同様の化合物によって活性化させる。混合は通常、非常に短時間であり、固相支持体の入った反応器に成分を送達しながら、オリゴヌクレオチド合成装置の流体ライン内で行う。次いで、支持体結合物質に対して１．５から２０倍過剰の活性化型ホスホルアミダイトを出発固相支持体（最初のカップリング）または支持体結合オリゴヌクレオチド前駆体（カップリング後）と接触させると、その５’−ヒドロキシ基が、入ってくるヌクレオシドホスホルアミダイトの活性型ホスホルアミダイト部分と反応してホスファイトトリエステル結合が形成される。２’−デオキシヌクレオシドホスホルアミダイトのカップリングは非常に急速であり、小規模で、終了に必要とされるのは約２０秒である。一方で、立体障害性の２’−Ｏ−保護型リボヌクレオシドホスホルアミダイトでは、高収量でカップリングさせるのに長時間が使用される。また、この反応は、特にホスホルアミダイトの希薄溶液が使用される場合、水の存在に対して非常に敏感であり、一般的には無水アセトニトリル中で行われる。一般的に、合成規模が大きいほど、低い過剰度で高い濃度のホスホルアミダイトが使用される。一方で、この活性体の濃度は主に、アセトニトリル中への溶解度によって決定され、合成規模に無関係である。カップリングが終了したら、未結合試薬（あれば）および副産物を洗浄によって除去する。
【００７２】
キャッピング工程は、固相支持体結合物質を無水酢酸と１−メチルイミダゾールまたはあまり多くないが触媒としてＤＭＡＰの混合物で処理することにより行われ、ホスホルアミダイト法では、２つの目的を果たす。
【００７３】
カップリング反応の終了後、少量割合の固相支持体結合５’−ＯＨ基（０．１から１％）が未反応のままであり、内部塩基の欠失を有するオリゴヌクレオチド（一般的に（ｎ−１）ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）と称される。）の形成を抑制するために、さらなる鎖伸長を永続的にブロックする必要がある。未反応の５’−ヒドロキシ基は、大体において、キャッピング混合物によってアセチル化される。
【００７４】
また、１Ｈ−テトラゾールで活性化させたホスホルアミダイトは、少しばかり、グアノシンのＯ６位と反応することが報告されている。Ｉ２／水で酸化されると、この副産物は、場合によってはＯ６−Ｎ７移動によって脱プリンを受ける。かくして形成された脱プリン部位は、塩基性条件下（下記参照）でのオリゴヌクレオチドの最終の脱保護の過程で容易に切断され、２種類の短鎖オリゴヌクレオチドが得られる。したがって、完全長産物の収量が低下する。キャッピング工程がＩ２／水での酸化前に行われる限り、Ｏ６修飾はキャッピング試薬での処理によって速やかに除去される。
【００７５】
オリゴヌクレオチドホスホロチオエート（ＯＰＳ）の合成はＩ２／水での酸化を伴わず、それぞれ、上記の副反応に悩まされない。他方で、キャッピング工程が硫化前に行われた場合、固相支持体に、キャッピング工程後に残った残留無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールが含有される場合があり得る。キャッピング混合物はイオウ転移反応を干渉し、これにより、所望のＰＳトリエステルの代わりにリン酸トリエステルヌクレオシド間結合が広く形成される。したがって、ＯＰＳの合成では、キャッピング工程の前に硫化工程を行うことが賢明である。
【００７６】
新たに形成される三配位ホスファイトトリエステル結合は天然のものでなく、オリゴヌクレオチドの合成条件下での安定性は限定的である。支持体結合物質をヨウ素と水で、弱塩基（ピリジン、ルチジンまたはコリジン）の存在下で処理すると、ホスファイトトリエステルが天然に存在するリン酸ジエステルヌクレオシド間結合の保護型前駆体である四配位リン酸トリエステルに酸化される。酸化は、無水条件下で、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたはより効率的には（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンフルスルホニル）−オキサジリジン（ＣＳＯ）を用いて行われ得る。酸化工程を硫化工程に置き換えるとオリゴヌクレオチドホスホロチオエートが得られる。後者の場合、硫化工程は、キャッピング前に最良に行われる。
【００７７】
固相合成では、合成されているオリゴヌクレオチドは、その３’末端ヒドロキシ基によって固相支持体物質に共有結合され、鎖合成の全過程にわたって結合されたままである。固相支持体はカラム内に含め、この寸法は合成の規模に依存し、０．０５ｍＬから数リットルの間で異なり得る。圧倒的大量数のオリゴヌクレオチドが、４０ｎｍｏｌから１μｍｏｌの範囲の小規模で合成される。近頃では、固相支持体をマルチウェルプレートのウェル（ほとんどの場合、プレートあたり９６または３８４ウェル）内に含めるハイスループットオリゴヌクレオチド合成が、小規模でのオリゴヌクレオチドのパラレル合成に最もよい方法となっている。鎖合成の終了時、オリゴヌクレオチドを固相支持体から放出させ、カラムまたはウェルから溶出させる。
【００７８】
有機固相合成およびペプチド合成とは対照的に、オリゴヌクレオチド合成は、非膨潤性または低膨潤性の固相支持体上で最良に進行する。最も多くの場合で使用される２つの固相物質は、細孔制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ）ガラス（ＣＰＧ）とマクロ多孔質ポリスチレン（ＭＰＰＳ）である。
【００７９】
ＣＰＧは、一般的に細孔径によって規定される。オリゴヌクレオチドケミストリーでは、約５０、８０、１００、１５０および２００量体のオリゴヌクレオチドの調製を可能にするために、それぞれ５００、１０００、１５００、２０００および３０００Åの細孔径が使用される。素のＣＰＧをさらなる加工に適したものにするため、この物質表面を（３−アミノプロピル）トリエトキシシランで処理し、アミノプロピルＣＰＧを得る。アミノプロピルの枝をさらに伸長させ、長鎖アミノアルキル（ＬＣＡＡ）ＣＰＧにしてもよい。次いで、このアミノ基は、オリゴヌクレオチド合成に適したリンカーのアンカリングポイントとして使用される（下記参照）。
【００８０】
オリゴヌクレオチド合成に適したＭＰＰＳは、細孔生成（ｐｏｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）剤の存在下でのジビニルベンゼン（最低６０％）、スチレンおよび４−クロロメチルスチレンの重合によって得られる低膨潤性の高架橋ポリスチレンである。得られたマクロ多孔質クロロメチルＭＰＰＳをアミノメチルＭＰＰＳに変換させる。
【００８１】
この固相支持体物質をオリゴヌクレオチド合成に適したものにするため、非ヌクレオシドリンカーまたはヌクレオシドスクシネートを、アミノプロピルＣＰＧ、ＬＣＡＡ  ＣＰＧまたはアミノメチルＭＰＰＳの反応性アミノ基に共有結合させる。残りの未反応アミノ基を無水酢酸でキャッピングする。典型的には、概念的に異なる３つのグループの固相支持体が使用される。
【００８２】
近頃のより簡便でより広く使用されている方法では、合成を、非ヌクレオシドリンカーが固相支持体物質に結合されたユニバーサル支持体で開始する。３’末端ヌクレオシド残基に応答性のホスホルアミダイトをユニバーサル固相支持体と、オリゴヌクレオチド鎖合成の第１合成サイクルにおいて標準的なプロトコルを用いてカップリングさせる。次いで、鎖合成を終了まで継続した後、固相支持体結合オリゴヌクレオチドを脱保護する。ユニバーサル固相支持体の特徴的な特色は、スキーム６に示すように、オリゴヌクレオチドの放出が、３’末端ヌクレオチド残基の３’−Ｏをユニバーサルリンカーに結合しているＰ−Ｏ結合の加水分解性切断によって行われることである。このアプローチの極めて重要な利点は、合成するオリゴヌクレオチドの配列に関係なく同じ固相支持体が使用されることである。合成されたオリゴヌクレオチドからリンカーおよび３’末端リン酸基を完全に除去するために、固相支持体１およびいくつかの同様の固相支持体には、アンモニアガス、水性水酸化アンモニウム、水性メチルアミンまたはこの混合物が必要とされ、市販されている。固相支持体に無水メタノール中のアンモニア溶液が使用され、これも市販されている。
【００８３】
一般に、３’末端ヌクレオシド残基の３’−ヒドロキシ基は固相支持体に、ほとんどの場合、化合物３の場合のように３’−Ｏ−スクシニルの枝によって結合される。オリゴヌクレオチド鎖合成は、ホスホルアミダイト構成ブロックが、それぞれ３’末端から２番目のヌクレオチド残基とカップリングすることから開始される。ヌクレオシド固相支持体上に合成されたオリゴヌクレオチドの３’末端ヒドロキシ基は、ユニバーサル固相支持体に適用可能なものよりいくぶん穏やかな条件下で脱保護される。しかしながら、ヌクレオシド固相支持体は配列特異的様式で選択されなければならないという事実により、合成過程全体のスループットは低下し、人為的ミスの尤度が高まる。
【００８４】
オリゴヌクレオチドホスホロチオエート（ＯＰＳ）は、リン酸基部分の酸素原子の１つがイオウで置き換えられた修飾オリゴヌクレオチドである。非橋絡位置にイオウを有するホスホロチオエートのみが広く使用されており、市販されている。非橋絡酸素のイオウでの置き換えにより、リンに新たなキラル中心が生じる。ジヌクレオチドの単純な場合、これにより、Ｓｐ−およびＲｐ−ジヌクレオシドモノホスホロチオエートのジアステレオマーペアの形成がもたらされる。（ｎ−１）個のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であるｎ量体のオリゴヌクレオチドでは、ジアステレオマーの数ｍはｍ＝２（ｎ−１）と計算される。核酸の非天然アナログであるため、ＯＰＳは、ホスホジエステル部分の橋絡Ｐ−Ｏ結合を切断することによって核酸を破壊する類型の酵素であるヌクレアーゼによる加水分解に対してかなり大きく安定である。この特性により、広範なヌクレアーゼ曝露が不可避であるインビトロ用途およびインビボ用途におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドとしてのＯＰＳの使用が決定される。同様に、ｓｉＲＮＡの安定性を改善するため、少なくとも１つのホスホロチオエート結合が多くの場合、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の３’末端に導入される。キラル的に純粋なＯＰＳでは、全−Ｓｐジアステレオマーは、その全−Ｒｐアナログよりも酵素分解に対して安定である。しかしながら、キラル的に純粋なＯＰＳの調製は合成上の課題が残っている。ラボラトリープラクティスでは、ＯＰＳのジアステレオマー混合物が一般的に使用される。
【００８５】
ＯＰＳの合成は、天然オリゴヌクレオチドのものと非常に類似している。違いは、酸化工程がイオウ転移反応（硫化）で置き換えられていること、およびキャッピング工程が硫化後に行われることである。効率的なイオウ転移を行い得る報告された多くの試薬のうち、次の３種類のみが市販されている。
【００８６】
３−（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン，ＤＤＴＴ（３）は、迅速な硫化速度論および溶液中での高い安定性をもたらす。Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られている３Ｈ−１，２−ベンゾジチオル−３−オン１，１−ジオキシド（４）は、アセトニトリルにおいてより良好な溶解性および短い反応時間を示す。しかしながら、この試薬は、溶液中での安定性が限定的であり、硫化性ＲＮＡ結合において低効率的である。
【００８７】
Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）はアセトニトリルに可溶性であり、市販されている。しかしながら、ＴＥＴＤでのヌクレオシド間ＤＮＡ結合の硫化反応は１５分間を要する。
【００８８】
過去において、オリゴヌクレオチド合成は、溶液中または固相上で手作業にて行われていた。固相合成は、固相のための容器として、形状が低圧クロマトグラフィーカラムと同様の小型のガラスカラムまたは多孔質フィルターを備えたシリンジを用いて実施されていた。現在、固相オリゴヌクレオチド合成は、コンピュータ制御機器（オリゴヌクレオチド合成装置）を用いて自動で行われ、カラム、マルチウェルプレートおよびアレイ形式でテクニカルに実施される。ハイスループットが必要とされない研究および大規模用途にはカラム形式が最良に適している。マルチウェルプレート形式は、合成オリゴヌクレオチドに対する産業および学究的需要の高まりを満たすために、小規模でのハイスループット合成のために特別に設計されたものである。小規模合成および中規模から大規模合成のためのいくつかのオリゴヌクレオチド合成装置が市販されている。
【００８９】
増幅方法を以下に説明するが、他の方法を使用してもよい。次に、バイオインフォマティクス法を用いて同定されたリピート部が含まれていない最長のセグメント由来の配列の鎖を増幅させるための増幅（例えば、ＰＣＲ）プライマーを設計する。一部の実施形態では、かかるセグメントを、ゲノムの、またはゲノム由来ＢＡＣ  ＤＮＡを増幅鋳型として用いて増幅させる。一部の実施形態では（例えば、長鎖の場合）、多重オーバーラッププライマーセットが使用される。
【００９０】
核酸増幅手法の実例としての非限定的な例としては、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介型増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００９１】
一般に、増幅方法ではＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびｄＮＴＰが使用される。例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されないが、ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびＢｓｍ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが挙げられる。
【００９２】
ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号，これらは各々、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。）は一般的にＰＣＲと称され、変性、プライマーペアと反対鎖とのアニーリングおよびプライマー伸長の多数回サイクルを用いて、標的核酸配列のコピー数を指数関数的に増大させる。ＲＴ−ＰＣＲと称される異型形態では、逆転写酵素（ＲＴ）を用いてｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、次いでｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅させ、多コピーのＤＮＡを生成させる。ＰＣＲの他の種々の変形型については、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５（１９８７）；ならびにＭｕｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ７：２８７（１９８８）（これらは各々、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。
【００９３】
転写媒介型増幅（米国特許第５，４８０，７８４号および同第５，３９９，４９１号，これらは各々、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。）は一般的にＴＭＡと称され、実質的に一定の温度、イオン強度およびｐＨの条件下で多コピーの標的核酸配列が自己触媒的に合成され、このとき、標的配列の多コピーのＲＮＡによってさらなるコピーが自己触媒的に生成する。例えば、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，８２４，５１８号（これらは各々、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。米国特許出願公開第２００６００４６２６５号（参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。）に記載された異型形態では、ＴＭＡに、場合により、ＴＭＡ法の感度と精度を改善するためにブロッキング部分、終結性部分および他の修飾性部分の使用が組み込まれる。
【００９４】
リガーゼ連鎖反応（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２９２（１９９１），参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。）は一般的にＬＣＲと称され、標的核酸の隣接領域とハイブリダイズする２組の相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドが使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＤＮＡリガーゼにより、熱変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルにて共有結合により連結され、検出可能な二本鎖のライゲーションされたオリゴヌクレオチド産物が得られる。
【００９５】
鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３９２−３９６（１９９２）；米国特許第５，２７０，１８４号および同第５，４５５，１６６号，これらは各々、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。）は一般的にＳＤＡと称され、プライマー配列のペアと反対鎖の標的配列とのアニーリング、ｄＮＴＰの存在下でのプライマー伸長のサイクルが使用され、二本鎖のヘミホスホロチオエート含有プライマー伸長産物、ヘミ修飾型制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介性ニッキング、およびニックの３’末端からのポリメラーゼ媒介性プライマー伸長がもたらされ、存在している鎖と置換されて、次の回のプライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖置換のための鎖が生成され、産物の幾何的増幅がもたらされる。好熱ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）では好熱性のエンドヌクレアーゼとポリメラーゼが高温にて本質的に同じ方法で使用される（欧州特許第０６８４３１５号）。
【００９６】
他の増幅方法としては、例えば：核酸配列ベース増幅（米国特許第５，１３０，２３８号，参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。），一般的にＮＡＳＢＡと称される；プローブ分子自体を増幅させるためにＲＮＡレプリカーゼが使用されるもの（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６：１１９７（１９８８），参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。），一般的にＱβレプリカーゼと称される；転写ベース増幅方法（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３（１９８９））；および自己持続的（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４（１９９０），これらは各々、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。）が挙げられる。既知の増幅方法のさらなる論考については、Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．，「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．編），ｐｐ．５１−８７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９３））を参照のこと。
【００９７】
一部の実施形態では、増幅は等温増幅である。一部の実施形態では、増幅方法は、当業者に認知されているような固相増幅、ポロニー増幅、コロニー増幅、エマルジョンＰＣＲ、ビーズＲＣＡ、表面ＲＣＡ、表面ＳＤＡなどである。一部の実施形態では、溶液中または適切なマトリックスにＤＮＡ分子の一端のみによってテザーリングされた遊離ＤＮＡ分子の増幅がもたらされる増幅方法が使用される。一部の実施形態では、両方のＰＣＲプライマーを表面に結合させるブリッジＰＣＲに依存する方法（例えば、ＷＯ２０００／０１８９５７，Ｕ．Ｓ．７，９７２，８２０；７，７９０，４１８号およびＡｄｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）：２８（２０）：Ｅ８７を参照のこと；これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。）が使用される。一部の場合では、本発明の方法により、同一のアンプリコンの空間的クラスタリングが維持されるマルチプレックス増幅を示す「ポリメラーゼコロニー技術」または「ポロニー」がもたらされ得る（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  Ｌｉｐｐｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓのウェブサイト参照）。このようなものとしては、例えば、インサイチュポロニー（Ｍｉｔｒａ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，ｅ３４，１９９９年１２月１５日）、インサイチュローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，２２５，１９９８年７月）、ブリッジＰＣＲ（米国特許第５，６４１，６５８号）、ピコタイターＰＣＲ（Ｌｅａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２４，３７６９，２００３年１１月）およびエマルジョンＰＣＲ（Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １００，８８１７，２００３年７月２２日）が挙げられる。
【００９８】
本発明の実施形態における使用に適した核酸ポリメラーゼの例としては、限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片，Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ）、さまざまな耐熱菌において同定され、クローニングされた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｌｅｒ  Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９９６，４８：３７７−４３５）（例えば、Ｔａｑ，ＶＥＮＴ，Ｐｆｕ，Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ）ならびにその遺伝的修飾誘導体（ＴａｑＧｏｌｄ，ＶＥＮＴｅｘｏ，Ｐｆｕ  ｅｘｏ）が挙げられる。好ましくは、コロニープライマー伸長に使用される核酸ポリメラーゼは、鋳型の不完全または偽の増幅が回避されるのに充分に特異的なプライマーと鋳型のハイブリダイゼーションが起こる温度で安定なものである。
【００９９】
増幅溶液は好ましくは、天然に存在するか、または天然に存在しない、例えば、蛍光基もしくは放射性基で修飾されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを含有するものである。化学的および生物学的方法のための多種多様な合成により修飾された核酸が、検出能および／または核酸の機能的多様性を高めるために開発されている。このような機能性付与／修飾された分子（例えば、ヌクレオチドアナログ）は天然の重合性酵素と充分に適合性であり、最近検討されたような天然の対応物の塩基対合特性および複製特性を維持しているものであり得る（Ｔｈｕｍ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００１，４０（２１）：３９９０−３９９３）。
【０１００】
増幅溶液の他の成分は、選択された核酸ポリメラーゼに従って添加され、これらは本質的に、各ポリメラーゼの活性をサポートするのに有効であると当該技術分野で知られている化合物に相当しているものである。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ベタイン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＭｇＣｌ２などの化合物の濃度は、先行技術において、最適な増幅を有するために重要であることがよく知られており、したがって、作業者は、かかる濃度を本発明の方法のために、本明細書において以下に提示する実施例に基づいて容易に調整することができよう。
【０１０１】
Ｄ．断片化
一部の実施形態では、増幅の前または後に、ＤＮＡを次いで、およそ５０から５０００ｂｐ（例えば、５０から４０００、５０から３０００、５０から２５００、５０から２０００、５０から１５００、５０から１０００、１００から５０００、１００から４０００、１０００から３０００、１００から２５００、１００から２０００、１００から１５００、１００から１０００または１００から５００ｂｐ）の範囲の長さに断片化し（例えば、超音波処理または他の適切な方法、例えばＤＮＡｓｅ  Ｉにより）、得られたリピート部が含まれていないＤＮＡライブラリーを（例えば、ライゲーション、化学反応、伸長反応などにより）アダプターに結合させる。好ましい一部の実施形態では、プローブはおよそ１５０ｂｐ（例えば、５０から９００ｂｐ、５０から８００ｂｐ、５０から７００ｂｐ、５０から６００ｂｐ、５０から５００ｂｐ、５０から４５０ｂｐ、５０から４００ｂｐ、５０から３５０ｂｐ、５０から３００ｂｐ、５０から２５０ｂｐ、５０から２００ｂｐ、５０から１５０ｂｐ、５０から１００ｂｐ、８０から９００ｂｐ、８０から８００ｂｐ、８０から７００ｂｐ、８０から６００ｂｐ、８０から５００ｂｐ、８０から４５０ｂｐ、８０から４００ｂｐ、８０から３５０ｂｐ、８０から３００ｂｐ、８０から２５０ｂｐ、８０から２００ｂｐ、８０から１５０ｂｐ、８０から１００ｂｐ、１００から９００ｂｐ、１００から８００ｂｐ、１００から７００ｂｐ、１００から６００ｂｐ、１００から５００ｂｐ、１００から４５０ｂｐ、１００から４００ｂｐ、１００から３５０ｂｐ、１００から３００ｂｐ、１００から２５０ｂｐ、１００から２００ｂｐ、１００から１５０ｂｐ、１５０から９００ｂｐ、１５０から８００ｂｐ、１５０から７００ｂｐ、１５０から６００ｂｐ、１５０から５００ｂｐ、１５０から４５０ｂｐ、１５０から４００ｂｐ、１５０から３５０ｂｐ、１５０から３００ｂｐ、１５０から２５０ｂｐ、１５０から２００ｂｐ、１５０から１５０ｂｐ、または８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７，９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０ｂｐなど）である。一部の実施形態では、アダプター結合ライブラリーを次いで分画し（例えば、電気泳動、クロマトグラフィーまたは他の分離方法により）、さまざまな断片サイズのすべての選択された配列を含有しているプールを得る。所望の断片サイズに相当する画分（例えば、ゲル切片）を単離する。
【０１０２】
Ｅ．増幅
一部の実施形態では、所望のサイズの画分が鋳型として、調製的増幅条件下で、アダプターに相当する増幅（例えば、ＰＣＲまたは本明細書に記載の別の方法）プライマーとともに使用される。
【０１０３】
選択されたすべてのリピート部が含まれていない配列が、増幅されたライブラリー内に存在する。プローブ（例えば、断片化または任意選択のさらなる増幅後に単離）は次いで、使用のために（例えば、ＦＩＳＨ試薬として）標識される（例えば、蛍光標識、ビオチン、量子ドット標識、または比色検出もしくは銀染色検出のための標識で）。
【０１０４】
一部の実施形態では、プローブのライブラリーが発現ベクター内にクローニングされる（例えば、ベクターあたり１種類より多くのプローブ）。一部の実施形態では、かかる発現ベクターは、ライブラリーの今後の作製（例えば、増幅または発現により）に有用性が見出される。
【０１０５】
ＩＩ．プローブの使用
本明細書に記載のプローブは、さまざまな診断用、研究用、臨床用およびスクリーニング用の用途に有用性が見出される。本記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブは、核酸ハイブリダイゼーションプローブの使用によって行われるあらゆる形態の核酸検出における使用のための広範な有用性を有する。この核酸ハイブリダイゼーションプローブは、溶液中の、または固定化支持体に結合された核酸配列標的の検出に有用性が見出される。本組成物および方法が溶液中の核酸配列標的を検出するために使用され得る用途の例としては、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＰＮＡクランプ媒介性ＰＣＲおよびデジタルＰＣＲが挙げられる。本組成物および方法が、固相支持体に固定化された核酸配列標的を検出するために使用され得る用途の例としては、ノザンブロット、サザンブロット、ドットブロット、スロットブロット、マイクロアレイ、粒子ベースアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイ（ＩＳＨ）、例えば、クロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＲＩＳＨ）、ラピッドＦＩＳＨ、銀インサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）およびＦＩＳＨアッセイなどが挙げられる。かかる用途は数多くの分野、例えば、医学診断、分子医学、法医科学、被検物および生物体の目録作成ならびに微生物病原体の疫学に適している。
【０１０６】
本発明は特定の標的に限定されない。本明細書に記載の組成物および方法は、さまざまな標的核酸（例えば、ヒトまたは哺乳動物のゲノム核酸）、細菌、ウイルスのものなどの検出に有用性が見出される。
【０１０７】
また、プローブを、ａＣＧＨの場合のように、固相表面（例えば、ニトロセルロース）上に固定化される単離核酸として使用してもよい。一部の実施形態では、プローブは、例えばＷＯ９６／１７９５８（これは、参照によりこの全体が、特にアレイＣＧＨの説明について本明細書に組み込まれる。）に記載のような核酸アレイの構成員であり得る。高密度アレイが作製され得る手法はよく知られている（例えば、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７６７−７７３（１９９１）および米国特許第５，１４３，８５４号を参照のこと）、これらはともに、参照によりこの説明が本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
核酸ハイブリダイゼーションプローブの有用性の詳細説明を以下にＦＩＳＨ用途について提示するが、本プローブは他の用途にも有用性が見出される。
【０１０９】
ＦＩＳＨおよび他のインサイチュハイブリダイゼーション方法は、さまざまな試料型に対して行われ得る。例としては、限定されないが、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織）、新鮮組織、凍結組織、細胞（例えば、真核生物または原核生物の細胞）；任意の適切な固定剤を用いて調製されたものが挙げられる。一部の実施形態では、タッチプレップ（ｔｏｕｃｈ  ｐｒｅｐ）またはブラッシング（例えば、Ｓｍｏｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｅｎｄｏｓｃ．２０１２年１月；７５（１）：６５−７３を参照のこと）が使用される。
【０１１０】
タッチプレップ被検物は、スライド上に塗り付けるか押し付け、組織に圧力をかけ、冷温下でエタノール中に固定することによって作製された。具体的な一実施形態では、組織を外科的に抽出し、腫瘍組織には比較的弱い圧力および正常組織には比較的強い圧力をかけることによってガラススライド上に塗り付けた後、約１００％エタノール中に約４℃でおよそ１０分間固定する。別の具体的な実施形態では、本発明の方法によって解析される試料は、最初に液体窒素中で凍結させ、約−８０℃で保存したものである。
【０１１１】
典型的なＩＳＨ用途では、以下のものが典型的な手順である。被検物細胞を収集し、洗浄し、ペレット化する。細胞ペレットは通常、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄する。細胞をＰＢＳ中に懸濁させ、遠心分離によって再収集する。細胞は、例えば、酸アルコール溶液、酸アセトン溶液またはアルデヒド、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド中に固定され得る。例えば、メタノールと氷酢酸をそれぞれ３：１の比で含有している固定剤が固定剤として使用され得る。また、中性緩衝ホルマリン溶液を使用してもよく、およそ１％から１０％の３７から４０％ホルムアルデヒド（リン酸ナトリウム水溶液中）を含むものである。細胞を含むスライドは、大部分の固定剤を除去し、濃縮された細胞をごく一部の溶液中に懸濁された状態にすることによって調製され得る。
【０１１２】
細胞懸濁液をスライドに、細胞がスライド上で重ならないように適用する。細胞密度は光学顕微鏡または位相差顕微鏡によって測定され得る。このようなウェル内の細胞の密度が次いで、位相差顕微鏡を用いて評価される。細大容量の細胞懸濁液を含むウェルが充分な細胞を有していない場合、細胞懸濁液を濃縮して別のウェル内に入れる。
【０１１３】
インサイチュハイブリダイゼーションの前に、細胞内に含有された染色体プローブおよび染色体ＤＮＡを各々、変性させる。変性方法は、いくつかの様式で行われる。例えば、変性は、高ｐＨを有する緩衝溶液を用いて、高温（例えば、約７０℃から約９５℃の温度）を用いて、または有機溶媒、例えばホルムアミド、炭酸エチレンおよびハロゲン化テトラアルキルアンモニウムまたはこの組合せを用いて行われ得る。例えば、染色体ＤＮＡは、７０℃より上の温度（例えば、約７３℃）と７０％ホルムアミドおよび２×ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を含有する変性バッファーの組合せによって変性させることができる。変性条件は典型的には、細胞の形態構造が保存されるように確立する。染色体プローブは熱によって変性させることができる。例えば、プローブは約７３℃まで約５分間加熱され得る。
【０１１４】
変性用化学薬品または変性条件の除去後、プローブを染色体ＤＮＡと、ハイブリダイズ条件下でアニーリングさせる。「ハイブリダイズ条件」とは、プローブと核酸配列標的間のアニーリングを助長する条件である。ハイブリダイゼーション条件は、濃度、塩基組成、複雑度およびプローブの長さならびにインキュベーションの塩濃度、温度および長さに応じて異なる。プローブ濃度が高いほど、ハイブリッドが形成される可能性が大きくなる。例えば、インサイチュハイブリダイゼーションは典型的には、１から２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミドおよび非特異的ハイブリダイゼーションを抑止するためのブロッキングＤＮＡを含有するハイブリダイゼーションバッファー中で行われる。一般に、ハイブリダイゼーション条件としては、上記のように、約２５℃から約５５℃温度と約０．５時間から約９６時間のインキュベーション長さが挙げられる。より詳しくは、ハイブリダイゼーションは約３７℃から約４０℃で約２から約１６時間行われ得る。
【０１１５】
染色体プローブの標的領域外のＤＮＡとの非特異的結合は、一連の洗浄によって除去され得る。各洗浄での温度および塩濃度は所望のストリンジェンシーに依存する。例えば、高ストリンジェンシー条件では、洗浄は、約６５℃から約８０℃で、０．２×ＳＳＣから約２×ＳＳＣおよび約０．１％から約１％の非イオンデタージェント、例えばＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）または他の適切な界面活性剤を用いて行われ得る。ストリンジェンシーは、洗浄の温度を下げることにより、または洗浄液の塩濃度を上げることにより低下させ得る。
【０１１６】
試料を含むスライドは典型的には、２×ＳＳＣ中で３７℃にて１０から３０分間インキュベートされる。次いで、スライドは、０．２ｍｇ／ｍｌのペプシン中で３７℃にて２０分間インキュベートされる。スライドは続いて、ＰＢＳ中で室温にて２分間２回洗浄される。細胞は２．５％中性緩衝ホルマリン中で室温にて５分間固定される。スライドは続いて、ＰＢＳ中で室温にて２分間２回洗浄される。スライドは、７０％、８５％および１００％エタノールの溶液中への室温で１分間の連続接触による脱水に供される。スライドは、その直後に使用されるか、または室温で暗所に保存される。
【０１１７】
ハイブリダイゼーションは、ＨＹＢｒｉｔｅ法または慣用的な方法を用いて行われ得る。ＨＹＢｒｉｔｅ法では、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）のＨＹＢｒｉｔｅＴＭシステムが使用される。
【０１１８】
プローブをその核酸標的に特異的にハイブリダイズさせるための条件は、一般的に、特異的ハイブリッドを生成させるための所与のハイブリダイゼーション手順に使用可能な条件の組合せを含むものであり、この条件は当業者によって容易に決定され得る。かかる条件には典型的には、制御された温度、液相および染色体プローブと標的間の接触が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、多くの要素、例えば、プローブ濃度、標的の長さ、標的およびプローブのＧ−Ｃ含有量、溶媒組成、温度ならびにインキュベーションの持続時間に応じて異なる。少なくとも１回の変性工程がプローブと標的との接触前に行われ得る。または、プローブと核酸標的の両方を、互いに接触した状態にしながら一緒に変性条件に供してもよく、後でプローブを生物学的試料と接触させてもよい。ハイブリダイゼーションは、その後に、例えば、２から４×ＳＳＣとホルムアミドの約５０：５０の容量比の混合物の液相中で、約２５から約５５℃の範囲の温度で、例示として約０．５から約９６時間の範囲の時間、またはより好ましくは、約３２から約４０℃の温度で約２から約１６時間の範囲の時間、プローブ／試料のインキュベーションを伴って行われ得る。特異性を高めるため、ブロッキング剤、例えば、米国特許第５，７５６，６９６号（この内容は参照によりこの全体が、特にブロッキング核酸の使用の説明が本明細書に組み込まれる。）に記載のような非標識ブロッキング核酸の使用が、本発明の方法と併せて用いられ得る。プローブを試料中に存在するその核酸標的と特異的にハイブリダイズさせるための他の条件も容易に使用され得、これは当業者であれば容易にわかるであろう。
【０１１９】
適切なインキュベーション期間が終了したら、染色体プローブの試料ＤＮＡとの非特異的結合が一連の洗浄によって除去され得る。温度および塩濃度は、所望のストリンジェンシーのために適切に選択される。必要とされるストリンジェンシーレベルは、ゲノム配列に対する特異的プローブの配列の複雑度に依存し、既知の遺伝子組成の試料にプローブを体系的にハイブリダイズさせることにより決定され得る。一般に、高ストリンジェンシー洗浄は、約６５から約８０℃の範囲の温度で、約０．２×から約２×ＳＳＣおよび約０．１％から約１％の非イオンデタージェント、例えばＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）を用いて行われ得る。低ストリンジェンシー洗浄が必要とされる場合、洗浄は、低温で高い塩濃度を用いて行われ得る。
【０１２０】
染色体プローブは、検出可能な標識で直接標識され得る。検出可能な標識の例としては、フルオロフォア、例えば、光を吸収した後に蛍光を発する有機分子、ならびに放射性同位体、例えば、３２Ｐおよび３Ｈが挙げられる。フルオロフォアは、ヌクレオチドに共有結合させた後、この標識ヌクレオチドをプローブに、標準的な手法、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングおよびＰＣＲ標識を用いて組み込むことにより直接標識され得る。または、プローブ内のデオキシシチジンヌクレオチドを、リンカーによりアミノ基転移させてもよい。次いで、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｏｒｅ）が、このアミノ基転移デオキシシチジンヌクレオチドに共有結合され得る。例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，４９１，２２４号（これは、参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。有用なプローブ標識手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｙ．−Ｓ．Ｆａｎ編，Ｃｈａｐ．２，「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ」，Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，ｐ．２１−４０，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，著作権２００２（以下、本明細書において「Ｍｏｒｒｉｓｏｎ−２００２」と引用する。）（参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０１２１】
核酸プローブに対するフルオロフォアの結合は当該技術分野でよく知られており、任意の利用可能な手段によって行われ得る。フルオロフォアは、例えば、特定のヌクレオチドに共有結合させ得、この標識ヌクレオチドがプローブに、標準的な手法、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミング、ＰＣＲ標識などを用いて組み込まれ得る。または、フルオロフォアを、プローブのアミノ基転移させたデオキシシチジンヌクレオチドにリンカーを介して共有結合させてもよい。プローブを標識するための方法は、米国特許第５，４９１，２２４号およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（２００２），Ｙ．−Ｓ．Ｆａｎ編，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ」，Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ．２１−４０，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（これらはともに、参照によりプローブの標識の説明が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０１２２】
プローブを標識するために使用され得る例示的なフルオロフォアとしては、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）、ＣＡＳＣＡＤＥ  ｂｌｕｅアセチルアジド（ａｅｃｔｙｌａｚｉｄｅ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）、ＳＰＥＣＴＲＵＭＯＲＡＮＧＥ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，Ｉｌｌ．）およびＳＰＥＣＴＲＵＭＧＯＬＤ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）が挙げられる。
【０１２３】
本明細書に記載の方法に使用され得るフルオロフォアのさらなる例は：７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）；５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミン  ローダミンＢ、５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチル−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート；５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシ−クマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン５−（および−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸；エオシン−５−イソチオシアネート；エリスロシン−５−イソチオシアネート；５−（および−６）−カルボキシローダミン６Ｇ；ならびにＣａｓｃａｄｅｓ  ｂｌｕｅアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）である。
【０１２４】
プローブは、蛍光顕微鏡と各フルオロフォアに適切なフィルターにより、または多種類のフルオロフォアを観察するためのデュアルもしくはトリプルバンドパスフィルターセットを使用することにより観察され得る。例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，７７６，６８８号（これは、参照により本明細書に組み込まれる。）を参照のこと。ハイブリダイズされたプローブを可視化するために任意の適切な顕微鏡イメージング方法、例えば、自動デジタルイメージングシステム（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇから入手可能なものなど）が使用され得る。または、染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを調べるためにフローサイトメトリーなどの手法が使用され得る。
【０１２５】
また、プローブを、例えばビオチンまたはジゴキシゲニンで、当該技術分野でよく知られた手段によって間接的に標識してもよい。しかしながら、次いで、標識プローブを可視化するために二次検出分子またはさらなる加工が使用される。例えば、ビオチンで標識されたプローブは、検出可能なマーカー、例えばフルオロフォアにコンジュゲートさせたアビジンによって検出され得る。さらに、アビジンを酵素マーカー、例えばアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートさせてもよい。かかる酵素マーカーは、その酵素に対する基質を用いた標準的な比色反応にて検出され得る。アルカリホスファターゼの基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムが挙げられる。ジアミノベンゾエートはホースラディッシュペルオキシダーゼの基質として使用され得る。ハイブリダイズされたビオチンまたは他の間接標識プローブの蛍光検出は、市販のチラミド増幅システムの使用によって行われ得る。
【０１２６】
当業者には、フルオロフォアの代わりに標識含有部分として他の薬剤または色素が使用され得ることが認識されよう。プローブに結合させ得る好適な標識としては、限定されないが、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、質量標識、高電子密度粒子、磁気粒子、スピン標識、ルミネッセンスを生じる分子、電気化学的活性分子、酵素、補因子および酵素基質が挙げられる。ルミネッセンス性薬剤としては、例えば、ラジオルミネッセンス性、ケミルミネッセンス性、バイオルミネッセンス性およびリン光性の標識含有部分が挙げられる。または、間接的な手段によって可視化される検出部分を使用してもよい。例えば、プローブはビオチンまたはジゴキシゲニンで、当該技術分野で知られた常套的な方法を用いて標識され得、次いで、検出のためにさらに加工され得る。ビオチン含有プローブの可視化は、その後、検出可能なマーカーにコンジュゲートさせたアビジンに結合させることによって行われ得る。検出可能なマーカーはフルオロフォアであり得、この場合、プローブの可視化および識別は、ＩＳＨに関して上記のようにして行われ得る。
【０１２７】
一部の実施形態では、プローブは、核酸全体に一般的な間隔で配置された標識（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個ごとに１個の標識基）を有するように設計される。
【０１２８】
一部の実施形態では、プローブライブラリーが、異なる検出可能な標識（例えば、異なる色の蛍光シグナル）を有するプローブを含むものである。
【０１２９】
または、標的領域とハイブリダイズされたプローブは、標識部分と、不溶性の着色生成物を生成させる適切な基質との酵素反応によって可視化され得る。セット内のビオチン含有プローブは、その後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせたアビジンと適切な基質とのインキュベーションによって検出され得る。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）がアルカリホスファターゼの基質として使用され、一方、ジアミノベンジジンがＨＲＰの基質として使用される。
【０１３０】
フルオロフォアで標識されたプローブまたはプローブ組成物が使用される実施形態では、検出方法は、蛍光顕微鏡検査、フローサイトメトリー、またはプローブハイブリダイゼーションを調べるための他の手段を伴うものであり得る。任意の適切な顕微鏡イメージング方法が、多種類のフルオロフォアを観察するために本発明の方法と併せて使用され得る。蛍光顕微鏡検査が使用される場合、ハイブリダイズされた試料は、各フルオロフォアの励起に適した光で、適切なフィルター（１つまたは複数）の使用を伴って観察され得る。または、自動デジタルイメージングシステム、例えばＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ、ＢｉｏＶｉｅｗまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇシステムを使用してもよい。
【０１３１】
アレイＣＧＨでは、プローブは標識せず、そうではなく、ＷＯ９６／１７９５８に記載のように、基質上の個別の位置に固定化する。これとの関連において、このプローブが多くの場合、「標的核酸」と称される。試料核酸が典型的には、ハイブリダイゼーション複合体の検出が可能になるように標識される。ハイブリダイゼーションに使用される試料核酸は、ハイブリダイゼーション反応前に検出可能に標識され得る。または、ハイブリダイゼーション産物に結合する検出可能な標識を選択してもよい。２色またはマルチカラーａＣＧＨでは、標的核酸アレイを、異なるように標識された核酸の２つ以上のコレクションと、同時または逐次のいずれかでハイブリダイズさせる。例えば、試料核酸と参照核酸を各々、別々の区別可能な標識で標識する。各標的核酸スポットにおける各シグナルの強度の差が、コピー数の差の表示として検出され得る。任意の適切な検出可能な標識がａＣＧＨに使用され得るが、蛍光標識が典型的には最も簡便である。
【０１３２】
シグナルを可視化する例示的な方法はＷＯ９３／１８１８６（これは参照によりこの説明が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。結果の表示を容易にするため、および蛍光強度の小さな差を検出する感度を改善するため、デジタル画像解析システムを使用してもよい。例示的なシステムはＱＵＩＰＳ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（定量的画像処理システム）の頭文字）であり、これは、自動ステージ、フォーカスコントロールおよびフィルターホイール（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｔｄ．，Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ｎ．Ｙ．）を備えた標準的な蛍光顕微鏡がベースの自動画像解析システムである。フィルターホイールは、顕微鏡の蛍光励起路内に励起波長の選択のために設置される。ダイクロイックブロック内の特別なフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖｔ．）により、画像位置合わせシフトをせずに多種類の色素の励起が可能になる。顕微鏡は２つのカメラポートを有し、このうち一方は、スライド上の関心領域を見出すために使用される高感度高速ビデオ画像表示のため、ならびに集光のためのインテンシファイア付きＣＣＤカメラ（Ｑｕａｎｔｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）を有する。他方のカメラポートは、高い解像度と感度での実際の画像収集のために使用される冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｌｔｄ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚ．による型番２００）を有する。冷却ＣＣＤカメラはＳＵＮ  ４／３３０ワークステーション（ＳＵＮ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）とＶＭＥバスによってインターフェース接続されている。マルチカラー画像の全収集は、画像処理ソフトウェアパッケージＳＣＩＬ−Ｉｍａｇｅ（Ｄｅｌｆｔ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて制御される。
【０１３３】
一部の実施形態では、本開示により、核酸の増幅および／または解析のためのキットおよびシステムを提供する。一部の実施形態では、キットは、コピー数または遺伝子発現の変化の解析および検出に必要、充分または有用な試薬（例えば、プライマー、プローブ、アンカー、固相支持体、試薬、対照、使用説明書など）を含むものである。例えば、一部の実施形態では、キットは、関心領域と対照領域の増幅およびシーケンシングのためのプライマーおよびアンカーを備えたものである。一部の実施形態では、キットは解析ソフトウェア（例えば、シーケンシングデータを解析するための）を含むものである。
【０１３４】
一部の実施形態では、キットは、試薬、プライマー、プローブ、アンカー、固相支持体、バッファーなどを含む１つ以上の容器を含むものである。一部の実施形態では、キットの各構成要素が別々の容器内にパッケージングされている。一部の実施形態では、容器が、一緒に使用されるように同じキットまたはボックス内に梱包および／または同じキットまたはボックスで出荷される。一部の実施形態では、キットの１つ以上の構成要素が別々に出荷および／またはパッケージングされる。
【０１３５】
本アッセイおよびキットは、ポイントオブケアアッセイシステム、例えば、Ａｂｂｏｔｔ社のＰｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学的イムノアッセイシステム用に適合または最適化させることができる。免疫センサーならびにこの製造方法および使い捨て試験デバイスにおける動作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号および米国特許出願公開第２００３０１７０８８１号、同第２００４００１８５７７号、同第２００５００５４０７８号および同第２００６０１６０１６４号（参照により該センサーならびに方法に関する教示が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０１３６】
一部の実施形態では、該システムは、自動化された試料および試薬取扱いデバイス（例えば、ロボティクス）を含むものである。
【実施例】
【０１３７】
［実施例１］
プローブの作製
ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｒｏｗｓｅｒを使用し、ＨＥＲ２遺伝子座の領域内の座標ｈｇ１８＿ｄｎａ  ｒａｎｇｅ  ｃｈｒ１７：３５００４６７８から３５２３０３８０までを有する配列を同定した。この配列をダウンロードし、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒによって同定された領域が小文字でマスクされるようにコード化した。この２２５７０３塩基の配列を、３個より多くの連続した小文字を有する配列をすべて除去し、リピート部が含まれていない配列の鎖をその元の配列の位置に沿って戻すソフトウェアプログラムで処理した（図２）。
【０１３８】
これらの配列は、サイズが非常に小さいものから５６１５塩基の範囲であった。最も長い断片のみを配列ライブラリーの作製に選択する。最小限の長さのカットオフを１２００ｂｐにし、７６９０４ｂｐの配列を含む３５の配列を得た。個々の各配列のＰＣＲ増幅により、アンプリコンの長さに応じていろいろな収量の配列サブドメインが得られることが予測される。したがって、配列を、各々１２００ｂｐの多重にオーバーラップする部分配列に分けた。すべての部分断片を、プライマー位置における差異が含まれるように隣の部分断片と少なくとも１００ｂｐのオーバーラップを含むように設計した。この方法により９５の候補配列が作製された。
【０１３９】
各配列に対して、プライマーペアを、Ｍｉｎ  ８００，Ｏｐｔ  １２００，Ｍａｘ  １２００のアンプリコン；プライマー長さｍｉｎ２２，ｏｐｔ  ２５，ｍａｘ  ３０；Ｔｍ  ｍｉｎ  ６５，ｏｐｔ  ７０，ｍａｘ  ７５を得るためのジェネリックプライマーを探すウェブベースプログラム「ＢａｔｃｈＰｒｉｍｅｒ３」により設計した。プライマー配列をｘｌｓファイルとしてダウンロードし、順に配置するのに適したものになるようにフォーマットを調整するためにスプレッドシートにコピーした。
【０１４０】
プライマーをＩＤＴに、ディープウェルプレート内の各々１２ｎｍｏｌの乾燥型の混合フォワード／リバースプライマーとしてオーダーした。各ウェルに、２４０ｕＬの水（５  Ｐｒｉｍｅ  ２９００１３２）を添加して各々５０ｕＭにした。必要に応じてＰＣＲ用に希釈液を調製した。
【０１４１】
ゲノムＤＮＡのＰＣＲにより、クリーンな１２００量体産物がウェルの約半数でしか得られず、したがって、もっと高い成功率を得るため、所望の遺伝子座を含むＢＡＣ  ＤＮＡの調製物を使用した。該遺伝子座を含む大腸菌内ＢＡＣクローンをＧｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから入手し、培養物を培養し、ＤＮＡを「ミニプレップ」によって単離した。
【０１４２】
ＰＣＲマスターミックス：Ｐｈｉｒｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆ−１２２Ｌ）を含むＰＣＲキットを使用した。これは、４００ｕＬの５×反応バッファー＋４０ｕＬの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）＋４０ｕＬのＰｈｉｒｅポリメラーゼ＋６０ｕＬのＤＭＳＯ＋１２６０ｕＬの水＋０．５ｕｇのＢＡＣ  ＤＮＡ鋳型を含むものであった。
【０１４３】
ＰＣＲ：９６ウェルプレートのウェルに２ｕＬの各プライマーペア５ｕＭ＋１８ｕＬのマスターミックスを添加し；ウェルにキャップし、９８度で３０秒，３０回の（９８度で８秒，７２度で３０秒，７２度で２分）、７２度で１０分、４度にプログラミングしたサーモサイクラーに設置した。終了時、５ｕＬの各反応液を微量のＤＮＡ負荷量の６倍の色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｒ０６１１）を有する２０ｕＬの水中に試料採取し、２０ｕＬをｅＧｅｌ  ９６アガロースゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のウェルに移し、電気泳動を８分間行った。９６個のウェルのうち９４個が予測ＭＷに明白なバンドを示す（図３）。
【０１４４】
収量を最大限にするためのＰＣＲの拡張．電気泳動試料からの残りの５ｕＬを含む各ウェルに、１０ｕＬの同じ５ｕＭプライマー＋１０ｕＬの水＋２５ｕＬのＤｒｅａｍＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  ２ＸｐｃｒＭＭを添加し、チューブにキャップし、１０回の（９５度で３０秒，５５度で３０秒，７２度で２分）７２度で６分にプログラミングしたサーモサイクラーに設置した。終了時、各ウェルに６ｕＬの（３０ｕＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２＋１９２ｕＬの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ＋３７８ｕＬの水＋１００ｕＬのＤｒｅａｍＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  ２ＸｐｃｒＭＭ）を添加し、チューブにキャップし、６回の（９５度で３０秒，５５度で３０秒，７２度で２分）７２度で１０分にプログラミングしたサーモサイクラーに設置した。カラムの内容物を合わせ、ゲノム範囲の異なる遺伝子座である６つのアンプリコン混合物を得、ＤＮＡをイソプロパノールでの沈殿によって単離し、水中に再懸濁させ、５２から７５ｕｇのＤＮＡを含有する１００ｕＬの溶液を得た。
【０１４５】
超音波処理による断片化：ＰＣＲウェル１から４８および４９から９６のおよそ１８０ｕｇのＤＮＡ  １２００量体をチューブ内で水と合わせて４００ｕＬにし、３００ｍＭの酢酸ナトリウムを加えた。チューブ（ｔｕｂ）を超音波装置キャビネット内のビーカー内の氷水に入れ、アウトプットコントロール３、３０％デューティサイクルで１６分間、超音波処理した（超音波装置Ｂｒａｎｓｏｎ  ４５０）。超音波処理による産物をイソプロパノールで沈殿させ、２００ｕＬの６００ｍＭ  ＮａＣｌ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２中）中に再懸濁させた。試料を、ＭｏｎｏＱ  カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、バッファーＡ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２；バッファーＢ＝Ａ＋２．０Ｍ  ＮａＣｌ，０．４ｍＬ／分  ％Ｂ＝４０から５０，３２分間を用いたＨＰＬＣによって分画し、画分を収集した。ブロードピークにおけるＤＮＡ溶出物の中心は約１５分であった。画分を合わせ、各々について７つのプールを得た。エチジウムブロミドで可視化した３％アガロースゲル上での電気泳動は、約８０ｂｐから約４００ｂｐの範囲の画分（標識されたＨ１５、Ｈ１８、Ｈ２１、Ｈ２４、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ３３）を示す（図４）。
【０１４６】
断片化ＤＮＡのアミノ化：プールした画分をイソプロパノール沈殿によって濃縮し、２０ｕＬの水中に再懸濁させ、沸騰水中で１分間加熱することにより変性させた。この２０ｕＬの変性ＤＮＡに、１０００ｕＬの水、６００ｕＬのトリフルオロ酢酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）３４８ｕＬのエチレンジアミンおよび１９０ｍｇのメタ重亜硫酸ナトリウムの１８０ｕＬの混合物を添加し、混合物を６５度で２０分間インキュベートした。次いで、混合物をｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５によって脱塩し、脱塩産物をイソプロパノール沈殿によって濃縮し、水中に再懸濁させた。
【０１４７】
このアミノ化産物をカルボキシテトラメチルローダミンで、そのＮＨＳエステル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃ１１７１）を用いて当該技術分野でよく知られた手段によって標識した。標識産物を残留未結合色素から、１０ｋＤａフィルター（Ｎａｎｏｓｅｐ  １０  Ｏｍｅｇａ，Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いた限外濾過によって単離した後、０．２２ｕフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＦＣ３０ＧＶ００，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に通して濾過した。
【０１４８】
アダプター媒介型ＰＣＲによるプローブの調製
また、所望のサイズの断片を、アダプターをライゲーションし、この産物を、アダプター配列に対応するプライマーを使用するＰＣＲの鋳型として使用することにより修飾した。これにより、所望のサイズの大量数の産物を作製する効率的な手段がもたらされるとともに、さらなる官能基を産物にカップリングさせる手段がもたらされる。この方法は、断片を修飾して５’リン酸化平滑末端を得た後、所望の配列のアダプターをライゲートすることからなる。アダプターは、不要なアダプター配列を除去するか、またはさらなる基のライゲーションに適した付着末端を出現させるかのいずれかのためにｄｓＤＮＡ  ＰＣＲ産物が適切な制限酵素で切断され得るような制限部位を含むように設計され得る。
【０１４９】
断片の末端修復は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｋｉｔ  Ｋ０７７１を使用説明書に従って使用することによるものであり、４ｕｇの各画分Ｈ１８、Ｈ２４、Ｈ３０で開始した。平滑末端化産物を、４ｕｇの超音波処理した分画ＤＮＡのスピンカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ３１０００１）処理を用いて単離し、およそ３．５ｕｇの平滑末端化産物Ｈ１８ｂ、Ｈ２４ｂ、Ｈ３０ｂをそれぞれ７４、６６、７０ｎｇ／ｕＬの濃度で得た。
【０１５０】
アダプターミックスを、各オリゴヌクレオチドＧ６ａ、Ｇ６ｂ、Ｇｃ６ａ、Ｇｃ６ｂ、ＢｓＰＤ、ＢｓＴＢ、ＢｓＰＤｃ、ＢｓＴＢｃを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０および２５０ｍＭ  ＮａＣｌと合わせることにより調製し、混合物を沸騰水中で１分間加熱し、室温まで冷却した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１３７２６，５単位／ｕＬのリガーゼと反応バッファーを含むキット）を使用し、アダプターを平滑末端の各ＤＮＡ画分にライゲートした：１０ｕＬの平滑末端のＤＮＡ画分に５ｕＬのアダプターミックス、２ｕＬの１０×Ｌｉｇａｓｅバッファー、２ｕＬの５０％ＰＥＧ４０００および１ｕＬを添加し、混合物を室温で一晩放置した。アダプター結合産物を、スピンカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ３１０００１）（５０ｕＬの溶出バッファーで溶出）を用いて単離し、標識されたＨ１８Ｔ、Ｈ２４Ｔ、Ｈ３０Ｔはそれぞれ３７、３９、３０ｎｇ／ｕＬの濃度であった。
【０１５１】
アダプター結合ＨＥＲ２画分のＰＣＲは、各々、１ｕＬのアダプター結合鋳型Ｈ１８Ｔ、Ｈ２５Ｔ、Ｈ３０Ｔおよび市販のＰＣＲマスターミックス（ＤｒｅａｍＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｋ１０８１）を使用する２０ｕＬ規模で行った。各反応液には１種類のプライマーＧ６ａまたはＢｓＰＤを５または１０ｕＭで含めた。サイクル条件は２４×（９５度で３０秒，５２度で３０秒，７２度で３０秒）にした。産物を、１ｕＬの１Ｍ水酸化ナトリウムを４ｕＬの産物に添加することによって変性させ、３％アガロース／ＥｔＢｒゲル上で解析した。すべてのプライマーおよびプライマー濃度で、試験ＰＣＲ産物は、鋳型サイズに対応するバンドを示す（図５）。
【０１５２】
図５に示すＰＣＲ産物を、１０ｕＭのＢｓＰＤ２４プライマーを使用する増幅のための鋳型として使用した；１０ｕＬのＢｓＰＤ  １０−１８、ＢｓＰＤ  １０−２４およびＢｓＰＤ  ５−３０を添加し、８００ｕＬの最終１×マスターミックスを得た。これを８×１００ｕＬの分割量に分け、サイクル条件１２×（９５度で３０秒，６０度で３０秒，７２度で２分）で増幅させた。４１．５ｕＬの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と１３ｕＬの１．０Ｍ塩化マグネシウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）のさらなる容量２．１ｕＬの混合物を各ウェルに添加し、混合物をさらなる８×（９５度で３０秒，６０度で３０秒，７２度で４分）に供した。合わせた産物をイソプロパノールで沈殿させ、２００ｕＬずつの水中に再懸濁させ、ポリエチレングリコールでさらに沈殿させ、ＰＣＲ産物をプライマーから分離した。最終ＰＣＲ産物を２００ｕＬの水に溶解させ、標識されたＨ１８Ｂ、Ｈ２４Ｂ、Ｈ３０Ｂの濃度は１１２６、１２７０、１３５７ｎｇ／ｕＬと測定された。
【０１５３】
アダプター部分を減らすためのＰＣＲ産物の制限消化：制限酵素ＢｓｐＤＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ）を使用した。２６０ｕＬの水に４０ｕＬの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファーＢｓｐＤＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ）、１００ｕＬの上記のＰＣＲ産物Ｈ１８Ｂ、Ｈ２４Ｂ、Ｈ３０Ｂ、および１０ｕＬの１０Ｕ／ｕＬのＢｓｐＤＩを添加し、混合物を３７度で１６時間インキュベートした。反応液は標識されたＨ１８Ｒ、Ｈ２４Ｒ、Ｈ３０Ｒであった。１６時間のインキュベーション後、各々の試料を電気泳動のために採取し、消化産物を未消化産物と比較した。ＰＣＲストリップのウェルに８ｕＬの２×ローディングダイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．６ｕＬ（Ｈ１８Ｂ，Ｈ２４Ｂ，Ｈ３０Ｂ）、２．４ｕＬ（Ｈ１８Ｒ，Ｈ２４Ｒ，Ｈ３０Ｒ）＋水を１０ｕＬまで添加した；各混合物を２×５ｕＬずつに分け、すべてに４ｕＬの水を添加した。各々の一方に１ｕＬの１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、９５度で３０秒間加熱して変性させた。５μＬを各々、３％アガロース／ＥｔＢｒゲルのウェルにロードし、電気泳動を行った。ゲルの画像において、「−」および「＋」は、ＮａＯＨなしおよびありに対応する。すべての消化物は、ＢｓｐＤＩによる成功裡の切断が予測されるより小さいサイズの最終断片の存在を示す（おそらくアニーリング断片と残留プライマーによるダブレット）。ＮａＯＨによる変性では、未消化産物と消化産物の両方でサイズのさらなる低減が示される。断片の長時間アニーリングによる高分子量スメアは変性によって消失する。
【０１５４】
産物Ｈ１８Ｂ、Ｈ２４Ｂ、Ｈ３０Ｂ、Ｈ１８Ｒ、Ｈ２４Ｒ、Ｈ３０Ｒを、上記の手順によってイソプロパノールで沈殿させ、２０ｕＬの水中に再懸濁させ、アミノ化に供し、カルボキシテトラメチルローダミンで標識した。
【０１５５】
ＦＩＳＨハイブリダイゼーション条件
標的化プローブを、顕微鏡のガラススライドに結合させたリンパ球のヒト染色体ＤＮＡとハイブリダイズさせた。典型的な実験では、試薬混合物は、７μＬのＬＳＩ／ＷＣＰハイブリダイゼーションバッファー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ））と、２０００ｎｇの超音波処理したヒト胎盤ＤＮＡ、５００ｎｇのＣＯＴ−１  ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））、５０ｎｇのプローブＣＥＰ１７−ＳＧバッファー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ））および１００ｎｇの試験プローブを含有する３μＬの水とからなる。
【０１５６】
顕微鏡スライドを、７０％、８５％および１００％エタノール中への連続浸漬によって脱水し、次いで風乾した。試験溶液（１０μＬ）をスライド上に載せ、２２×２２ｍｍスリップで覆い、覆われた領域全体に溶液を広げた。ラバーセメントを適用して端を封止し、スライドを、温度を制御する機器内に配置した。温度を７０℃まで５分間昇上げて、試料と試薬の両方のＤＮＡを変性させ、次いで１時間、４５℃まで下げ、試薬がその標的とハイブリダイズする時間をもたせた。ハイブリダイゼーション時間の終了後、ラバーセメントとスリップを除去し、スライドを、０．４×ＳＳＣと０．３％  ＮＰ４０の溶液中で７３℃にて２分間、次いで、２×ＳＳＣ，０．１％ＮＰ４０中で室温にて１分間洗浄し、次いで風乾した。
【０１５７】
スライドを、観察のために、１０ｕＬのＤＡＰＩ溶液を標的領域上に載せてスリップで覆うことにより調製した。スライドを、目的のフルオロフォアに適したフィルターを取り付けた蛍光顕微鏡で観察した。
【０１５８】
得られたハイブリダイゼーションパターンの蛍光顕微鏡検査
１０μＬのＤＡＰＩ−ＩＩ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ））をスライド上の標的の位置に載せ、２２×２２ｍｍスリップで覆い、ＤＡＰＩ、フルオレセイン（緑色）およびＴＡＭＲＡ（オレンジ色）のシグナルの同時可視化を可能にするフィルターを取り付けた蛍光顕微鏡下で観察した。写真（図７）は、試験プローブによって染色されたＨＥＲ２遺伝子座（オレンジ色）とＣＥＰ１７−ＳＧによって染色されたセントロメアの位置（緑色）について予測されたものと整合するオレンジ色と緑色のシグナルパターンを示す。中期の染色体では、オレンジ色と緑色のシグナルは、同じ染色体上の隣接する位置に存在しているが、間期の核は、各々で、任意距離で２つの強いシグナルを示す。同様の結果が、同じＨＰＬＣ画分のアダプター媒介型ＰＣＲによって調製したプローブでも見られた。標識前での制限消化によるアダプター末端の除去では、区別不能な性能特性を有するプローブが得られた。
【０１５９】
１２００量体断片に対して使用したプライマー配列：
【０１６０】
【表１】
2017533733.tif 000002
2017533733.tif 000003
2017533733.tif 000004
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2017533733.tif 000008
【０１６１】
アダプター修飾およびアダプター媒介性ＰＣＲに使用した配列
【０１６２】
【表２】
2017533733.tif 000009
【０１６３】
［実施例２］
設計は、モデル標的ｐ５３、ＨＥＲ２およびｐ１６を使用し、比較のための利用可能なＢＡＣプローブを元にして行った。除去のためにフラッグ付加したリピート配列を有する標的に対応するゲノム配列を、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを用いて同定した。ＰＣＲプローブでは、コンピュータ用アプリケーションを使用して配列のリピート部が含まれていない部分を単離し、調製のための標的に対する断片を「キロマー（ｋｉｌｏｍｅｒ）」と同定した。ウェブベースアプリケーション「ＢａｔｃｈＰｒｉｍｅｒ３」を使用し、各キロマー配列をできるだけ多く増幅させるためのプライマー配列を作製し、同定されたプライマー配列は、ＩＤＴにより９６ウェル形式で合成された。オリゴおよびオリゴ−ＰＣＲハイブリッドプローブでは、配列のリピート部が含まれていない部分をさらに加工し、指定のサイズおよびＧＣ含有量の断片を同定した。Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートを、一般的なアダプター配列の付加、合成オーダーを発注するための配列表のソートおよびフォーマット設定などの加工に使用した。
【０１６４】
最終プローブで終結するバルクＤＮＡを、オリゴ合成，オリゴ−ＰＣＲハイブリッドまたは１ステップもしくは２ステップＰＣＲのいずれかによって作製した。１ステップＰＣＲ法は以下のとおりである：ＢＡＣまたはゲノムＤＮＡ鋳型を用いたＰＣＲ後、産物を合わせ、超音波処理によって断片化し、ＢＡＣベースＦＩＳＨプローブに使用したものと同じ方法によって化学標識され得る産物を得る。この様式で作製されたＦＩＳＨプローブは、ＡＭ  ＢＡＣプローブと構造的に同一である。唯一の違いは、ＢＡＣ  ＤＮＡ内に存在するリピート配列とベクター配列がＰＣＲプローブから除かれていることである。２ステップ法は以下のとおりである：超音波処理した産物をアダプターにライゲートし、選択されたすべての標的化配列を含有する１種類の鋳型混合物を作製する。次いで、この鋳型は、アミノ化および標識のためのバルクＤＮＡを作製するために１種類のプライマーセットを使用する単独ＰＣＲ反応に使用され得る。この場合、増幅産物は既に所望のサイズであるため、超音波処理はもはや必要とされない。鋳型は調製されたら無期限に保存され、新たに調製されるたびにサンプル採取される。アダプター配列が産物の５’末端と３’末端に存在する。これらは制限消化によって除去してもよいが、試験により、その存在はＦＩＳＨアッセイの性能を損なわないことが示されている。
【０１６５】
フルオロフォア標識の結合のためのアミン基を、アミノアリルｄＵＴＰをＰＣＲ反応液に含めること、または化学的アミノ化のいずれかによって導入した。化学的アミノ化は、ＡＭプローブとともに使用されるビスルファイト／ＴＦＡ／エチレンジアミン法によって行ったが、少量のテトラメチルエチレンジアミンを、反応混合物の脱塩後、ただしエタノール沈殿の前に添加するという例外を伴って行った。これにより、そうでない場合は標識反応でフルオロフォアに対して競合するであろう残留未結合エチレンジアミンが置き換えられる。
【０１６６】
アミノ化ＤＮＡのフルオロフォアでの標識は、数多くの小規模反応により適するようにした確立された方法の変形法によって行った。この変形法では、アミノ化ＤＮＡを、テトラメチルエチレンジアミンと塩化ナトリウム（２５％ＤＭＳＯ中）の反応バッファーと合わせ、活性フルオロフォアを添加し、混合物を６０℃で２時間インキュベートする。産物をエタノール沈殿によって単離し、７５℃で７２時間のホルムアミド処理標準液に供する。
【０１６７】
ＨＥＲ２  ＰＣＲプローブ：
ＨＥＲ２  ＰＣＲプローブでは、３種類のバリアントを作製した（すべて、リピート部が含まれていない７６ｋｂの配列を使用）。最も単純な「１ステップＰＣＲ」プローブでは、ＰＣＲで作製したＤＮＡを、慣用的なプローブのＢＡＣ  ＤＮＡと同じに処理：超音波処理による断片化後、化学的アミノ化および標識した。「２ステップＰＣＲ」プローブでは、超音波処理断片をアダプターにライゲートし、鋳型を作製した。この鋳型を、アミノ化および標識に使用可能状態のバルクＤＮＡを作製するために１種類のプライマーを用いて増幅させた。第３の形式「アミノアリルｄＵＴＰを伴う２ステップＰＣＲ」では、この同じ鋳型を、アミノアリルｄＵＴＰの存在下でプライマーペアを用いて増幅させ、任意の所望のフルオロフォアでの標識に使用可能状態のアミノ化産物を作製した。
【０１６８】
ＨＥＲ２遺伝子座内のリピート部が含まれていない配列の作製：
ＨＥＲ２  ＰＣＲ形式のための配列を、Ｐ１クローンｐＶＹＳ  １７４  Ｃ、Ｅ、Ｈ、Ｉによって規定される遺伝子座を用いて同定した。これらのクローンは、ｈｇ１８＿ｄｎａ  ｒａｎｇｅ  ｃｈｒ１７：３５００４６７８から３５２３０３８０までの２２６ｋｂを含む。これらの座標をＵＣＳＤ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒに入力し、Ｒｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒ機能を用いて対応する配列を提示し、リピート配列であることがわかっている部分を小文字で得た。大文字の「ユニーク」配列部分をアプリケーションを用いてコピーして大文字のユニーク部分配列を選び出し、各々の位置情報を保持した。これにより、１２００ｂｐより長い（１２３４から５６１５ｂｐまでの）３５個の配列（合計７６９０４ｂｐ）を得た。これらを別のアプリケーションで加工し、すべての配列を、少なくとも３００ｂｐのオーバーラップを有する１２００ｂｐずつの合計９５個の配列に切断した。これらの１２００ｂｐ配列をウェブベースアプリケーション「ＢａｔｃｈＰｒｉｍｅｒ３」に入力し、設定は、少なくとも６５度のＴｍを有するプライマーが得られるように調整し、できるだけ多く（少なくとも８００ｂｐ）の各配列がアンプリコン内に含まれるようにした。同定されたプライマー配列を合成し、９６ウェルプレート形式でのプライマーペアとして配置した。プライマーを水に溶解させて調製し、なお９６ウェルプレート形式のまま、５ｕＭの各プライマーを得た。ＰＣＲは、プライマーペアと同じ形式の９６ウェルプレートにし、Ｐｈｉｒｅポリメラーゼ、Ｐ１クローンｐＶＹＳ  １７４  Ｃ、Ｅ、Ｈ、Ｉの混合物からなる鋳型および０．５ｕＭのプライマーを含むマスターミックスを使用した（注：ゲノムＤＮＡを鋳型として使用してもよいが、遺伝子座特異的クローン、例えばＢＡＣおよびＰＡＣが好ましい。）。産物を９６ウェルｅＧｅｌによって解析した。産物は、９５個のウェルのうち９４個で強い明白なバンドを示す。Ｔａｑポリメラーゼを使用した場合、９５の反応液のうち８７しか産物を示さなかった。
【０１６９】
ＨＥＲ−２のリピート部が含まれていない配列の断片化：
ＰＣＲウェルの内容物を合わせ、１２００量体ＤＮＡをエタノール沈殿およびＰＥＧ沈殿によって単離した。この１２００量体混合物を、他のＡＭプローブ用のＢＡＣ  ＤＮＡの断片化で使用したものと同じ手段によって超音波処理し、超音波処理した産物を、イオン交換カラムを伴うＨＰＬＣによって分画し、約１２０から約４００ｂｐの範囲の狭いサイズ画分を得た。一部の実施形態では、分画工程を省く（ｅｌｍｉｎａｔｅ）。
【０１７０】
１ステップＰＣＲ法によるＨＥＲ−２プローブ：
Ｐｒｏｂｅ  ５／１３−７６Ａを調製するため、１５０ｂｐが中心の画分を標準的な手順によってアミノ化し、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識した。
【０１７１】
２ステップＰＣＲ法によるＨＥＲ−２プローブ：
２ステップ法によりＨＥＲ−２プローブを調製するため、同じ１５０ｂｐのＨＰＬＣ画分の一部分を平滑末端化剤で処理し、アダプターにライゲートした。アダプター結合産物を第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用し、このとき、アダプターに対応する配列を有する１種類だけのプライマーを使用した。１種類のプライマーを用いてアダプター結合鋳型を増幅させることにより、ステム−ループ構造による最も短い断片の増幅が抑制され、長鎖断片を多く含有する産物が得られる。このＰＣＲ産物をアミノ化し、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識し、次いで、７５℃で７２時間のホルムアミド処理に供した。
【０１７２】
アミノアリルｄＵＴＰでのアミノ化によるＨＥＲ−２  ＰＣＲプローブ：
アミノアリルｄＵＴＰでのアミノ化によるＨＥＲ−２  ＰＣＲプローブを調製するため、超音波処理した１２００量体のＨＰＬＣ画分を再結合させ（未分画断片をシミュレーションするため）、平滑末端化剤で処理し、ＢｓｐＱＩ制限部位を含む共通の５’末端を含有するアダプターにライゲートした。アダプター結合産物を第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用し、このとき、アダプター配列に対応する２種類のプライマーを使用し、ｄＴＴＰの半数をアミノアリルｄＵＴＰで置き換えた。このＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＱＩで処理して共通の末端を消化により除去し、ＤＮＡ産物をＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識し、次いで、７５℃で７２時間のホルムアミド処理に供した。
【０１７３】
ＨＥＲ−２オリゴプローブ：
ＨＥＲ−２オリゴプローブの設計は、ＨＥＲ２  ＰＣＲプローブと同じリピート部が含まれていない配列により開始した。アプリケーションを使用し、この配列のオーバーラップしていない８０塩基部分（すべて、およそ５０％のＧＣ含有量（Ｇ＋Ｃ最小＝３９，最大＝４１）を有する。）を選択した。合計４０１のかかる配列が見つかった。これらをウェブアプリケーションＱｕｉｃｋＦｏｌｄに、パラメータＮａ＋＝０．０５Ｍ，Ｍｇ＋＋＝０．００１Ｍ，最大１のフォールディングで入力し、結果をテキストおよびｄｅｌｔａＧとしてコピーした。ＥｘｃｅｌのＦｉｎｄ機能を使用し、除去のための特定の制限部位を含む配列にフラッグ付加した（このような配列が、標的配列による干渉なくアダプターに使用されることを可能にするため）。残りの配列をｄｅｌｔａＧによってソートし、フォールディングする傾向が最も低い２８８個（３つの９６ウェルプレート）をさらなる加工に選択し、ゲノム内位置によってソートした。８０量体配列をペアで共通の２０塩基の連結配列によって接合し、また、異なる共通の２０塩基をそのペアの３’末端に付加し、合計２００塩基の合成をもたらした。２８８個のすべての８０量体（図には１４４個の個々の「フォワード」２００量体を示した。また、標的８０量体と共通の２０量体の相補鎖も計算し、同様にして合成し、１４４個の個々の「リバース」２００量体を得た。これらのアセンブリを、混合すると配列が付着様式で二本鎖を形成し、長鎖のアニーリング産物が得られるように設計した。
【０１７４】
核酸を上記の手順によって化学的にアミノ化し、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識した。標識産物をゲル電気泳動によって精製して切断型合成産物を除去し、完全長産物を合わせて最終プローブを得た。
【０１７５】
さらなるＨＥＲ２オリゴプローブの設計は、ＨＥＲ２  ＰＣＲプローブの場合と同じ配列から開始し、リピート配列をマスキングした。他の望ましくない部分配列：５個以上連続する「Ｇ」または「Ｃ」塩基ならびにＢｓｐＱＩ制限部位「ＧＣＴＣＴＴＣ」および「ＧＡＡＧＡＧＣ」に対応する配列を除去するためのフラッグ付加のためにさらなるマスキングを導入した。残りの配列を加工し、５５から６５％のＧＣを有する６０塩基鎖を同定した。配列の下流４０ｋｂには許容され得る配列がごくわずかしか見つからず、このため、１から１８０ｋｂの範囲のものだけを次の段階に持ち越した。各配列の３’末端に塩基「ＧＧＴＴＧＡＡＧＡＧ」ポリメラーゼを、相補的プライマーを用いて付加した。ウェブベースアプリケーション「Ｚｉｐｆｏｌｄ」を使用し、フォールディングエネルギーを調べた。評価した１０２７個の６０量体のうち、フォールディングする傾向が最も低い９６０個を保持した。これらをフォールディングエネルギーに従って５つの群（各々１９２個の構成員＝２つの９６ウェルプレート）に分け、各群をゲノム配列全体における位置によってソートした。これらのオリゴヌクレオチドを水に溶解させ、フォールディング傾向に従って群をまとめた。各群の試料を、共通の３’末端とＰｈｉｒｅポリメラーゼに対応する配列を含むプライマーとアニーリングさせ、各々を伸長させて平滑末端の二本鎖混合物にした。これをイオン交換ＨＰＬＣによって精製し、切断型オリゴマー産物を除去した。
【０１７６】
ｐ５３  ＰＣＲプローブ：
ＨＥＲ−２プローブと同様にして、ｐ５３  ＰＣＲプローブを、対応するＢＡＣ  ｐ５３プローブ用のＢＡＣの配列を元にして設計した。キロマーをＰＣＲによって作製し、合わせ、超音波処理によって断片化した。１ステップＰＣＲプローブでは、超音波処理断片を単純にアミノ化し、標識した。２ステップＰＣＲ異型形態では、超音波処理断片を平滑末端にし、アダプターにライゲートして鋳型を作製した。アミノ化および標識のためのバルクＤＮＡを作製するため、鋳型を、アダプター配列に対応するプライマーを用いて増幅させた。標識のためのアミンを含有するバルクＤＮＡを同じ鋳型から調製したが、アミノアリルｄＵＴＰを反応混合物中に含めた。さらなる異型形態では、アダプターに含まれた認識部位に特異的な制限酵素でＰＣＲ産物を消化することにより、アダプター配列を除去した。
【０１７７】
ｐ５３遺伝子座内のリピート部が含まれていない配列の作製：
ｐ５３  ＰＣＲ形式のための配列を、ＢＡＣクローンｐＶＹＳ  １７３ｉによって規定される遺伝子座を用いて同定した。このクローンは、ｈｇ１８＿ｄｎａ  ｒａｎｇｅ  ｃｈｒ１７：７４３５１１９から７６０６８２３までの１７２ｋｂからなる。これらの座標をＵＣＳＤ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒに入力し、Ｒｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒ機能を用いて対応する配列を提示し、リピート配列であることがわかっている部分を小文字で得た。以下の表１はプライマー配列を示す。
【０１７８】
【表３】
2017533733.tif 000010
2017533733.tif 000011
2017533733.tif 000012
2017533733.tif 000013
2017533733.tif 000014
2017533733.tif 000015
【０１７９】
大文字の「ユニーク」配列部分を上記のようにしてコピーして大文字のユニーク部分配列を選び出し、各々の位置情報を保持した。これにより、１２００ｂｐより長い配列を１７個だけ（合計３５９３０ｂｐ）得た。これらに長さ８００から１２００の１３個の断片および６５０から８００ｂｐの１０個の断片を付加し、最終合計５５６６１ｂｐを得た。アプリケーション「ＳｅｑＣｈｏｐ３」を第１セットに対して使用して４００塩基オーバーラップを有する１２００量体を作製し、６５個の配列を得た。２００塩基オーバーラップを有する８００量体の第２セット（８００から１２００）では２６個の配列が得られる。９６ウェルプレートを全部うめるため、６５０から８００塩基の領域内のさらに５つの配列を受け入れる。このようにして作製された配列を、少なくとも６５度のＴｍを有するプライマーが得られるように調整し、できるだけ多くの各配列がアンプリコン内に含まれるようにした。プライマーを水に溶解させ、なお９６ウェルプレート形式のまま、５ｕＭの各プライマーを得た。ＰＣＲは、プライマーペアと同じ形式の９６ウェルプレートにし、Ｐｈｉｒｅポリメラーゼ、ＢＡＣクローンｐＶＹＳ  １７３ｉからなる鋳型および０．５ｕＭのプライマーを含むマスターミックスを使用した。ＰＣＲの終了時、さらなるプライマー、ＴａｑポリメラーゼおよびｄＮＴＰを添加し、プレートをさらに８サイクルに供し、産物の収量を高めた。産物を９６ウェルｅＧｅｌによって解析した。産物は、９６個のウェルのうち９１個で強い明白なバンドを示す。ＰＣＲウェルの内容物を合わせ、ＤＮＡをエタノール沈殿およびＰＥＧ沈殿によって単離した。この混合物を、他のプローブ用のＢＡＣ  ＤＮＡの断片化で使用したものと同じ手段によって超音波処理した。
【０１８０】
１ステップＰＣＲ法によるｐ５３プローブ：
１ステップＰＣＲ法によりｐ５３プローブを調製するため、超音波処理した産物をアミノ化し、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識し、次いで、７５℃で７２時間のホルムアミド処理に供した。
【０１８１】
２ステップＰＣＲ法によるｐ５３プローブ：
２ステップＰＣＲ法によりｐ５３プローブを調製するため、超音波処理した産物の一部を、使い捨てシリカベーススピンカラム（ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて、だが、結合バッファーを、１００から３００ｂｐの範囲の画分が単離されるように調整して分画した。この画分の一部を平滑末端化剤で処理し、アダプターにライゲートした。このアダプター結合産物を第２のＰＣＲ反応の鋳型として使用し、このとき、アダプターに対応する配列を有する１種類だけのプライマーを使用した。ＰＣＲ産物をアミノ化し、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識し、７５℃で７２時間のホルムアミド処理に供した。
【０１８２】
アミノアリルｄＵＴＰでのアミノ化によるｐ５３  ＰＣＲプローブ：
このプローブは、ＰＣＲ工程にＰＣＲ混合物に添加されるアミノアリルｄＵＴＰを含めること以外は上記のようにして調製した。ＰＣＲ産物をＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識し、７５℃で７２時間のホルムアミド処理に供した。
【０１８３】
リピート部が含まれていない超音波処理した平滑末端のｐ５３  ＤＮＡの一部を、ＢｓｐＱＩ制限部位を含むアダプターにライゲートした。この産物を鋳型として、アダプターに対応するプライマーペアとともに、アミノアリルｄＵＴＰを含有するＰＣＲ反応液中で使用し、産物をＢｓｐＱＩ制限酵素に曝露してアダプター末端を除去した。消化産物（ｐ５３に特異的な配列のみを含む。）をＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識し、次いで、７℃で７２時間のホルムアミド処理に供した。
【０１８４】
ｐ５３に対するオリゴ−ＰＣＲプローブ
ｐ５３オリゴプローブの配列を上記のようにして同定した；しかしながら、この場合、リピート配列のマスキングに加えて、「Ｇ」および「Ｃ」が５個以上連続する部分配列もすべてマスクした。パラメータを、４５から６０％のＧＣ含有量を有する長さ１４０の部分配列が同定されるように設定した。同定された２８９個の配列をＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴに供すると、ヒトゲノム内の他の遺伝子座とのマッチが見つかった。この後、２８１個のユニーク配列が残った。これらのうち２８０個に共通のフォワード配列とリバース配列（各々、２５塩基であり、制限部位を含む。）を付加し、各々１９０塩基の２８０個の配列を得た。これらの配列を、「ウルトラマー（ｕｌｔｒａｍｅｒ）」として９６ウェルプレート形式での合成のためにＩＤＴに送付した。産物を合わせ、鋳型としてＰＣＲにおいてアダプターに対応するプライマー配列とともに使用した。アダプター末端を制限酵素での消化によって除去し、産物をアミノ化し、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識し、７５℃で７２時間のホルムアミド処理に供した。
【０１８５】
表２はこれらの１９０ｂｐの配列を示す。
【０１８６】
【表４】
2017533733.tif 000016
2017533733.tif 000017
2017533733.tif 000018
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【０１８７】
表３は、プローブ設計の概要および下流／クリーンアップの方法を示す。
【０１８８】
【表５】
2017533733.tif 000030
【０１８９】
試験結果
プローブをまず、雄性リンパ球スライドにおいて試験し、プローブ強度、特異性、バックグラウンドおよびクロスハイブリダイゼーションを、対応するＢＡＣプローブを対照として評価した。
【０１９０】
試験したプローブはすべて、リンパ球スライドでのクロスハイブリダイゼーション試験に合格であった。プローブ設計がリンパ球スライドで合格したら、次いで、これをＦＦＰＥスライドにおいて試験した。プローブはすべて、乳がん組織ＦＦＰＥスライドにおいて試験した。一部のプローブは、乳がんスライドと胃がんスライドの両方において試験した。すべてのＦＦＰＥスライドに対してユニバーサル前処法を使用した。すべての実験で、ＡＭインベントリー（ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）のＨＥＲ２およびｐ５３  ＢＡＣプローブを対照として使用した。ＢＡＣ対照プローブは、一晩ハイブリダイゼーションするとリンパ球スライドおよびＦＦＰＥ組織スライドの両方で合格であったが、１時間のハイブリダイゼーションでは両方のスライド型で不合格であった。
【０１９１】
結果は、ＲＦ  ＰＣＲプローブ設計が、直接合成またはオリゴ−ＰＣＲハイブリッドのいずれかによって設計された合成オリゴの性能よりも勝っていたことを示す。直接合成されたＨＥＲ２オリゴプローブおよびオリゴ−ＰＣＲハイブリッドｐ５３プローブは１時間のＦＦＰＥで不合格であり、一方、オリゴ−ＰＣＲハイブリッドＨＥＲ２プローブはすべての品質評価で不合格であった。このようなデータに基づいて、オリゴプローブ設計をさらなる評価から除外し、一方、最適なプローブ設計の選択のためにＲＦ  ＰＣＲ法を使用した。
【０１９２】
ＲＦ  ＰＣＲ設計は、リンパ球スライドにおいて観察された一部の最適下限の特異性データ点を除いてすべて、品質評価で、１時間および一晩のハイブリダイゼーションでリンパ球スライドおよびＦＦＰＥスライドの両方において合格であった。
【０１９３】
２ステップＰＣＲ設計は、いくつかの下流またはクリーンアップオプション、例えば、超音波処理後のＤＮＡ断片分画、アミノアリル−ｄＵＴＰを用いた第２のＰＣＲ、および第２のＰＣＲ後のアダプター除去を有する。表１に、各プローブ設計でのすべての下流またはクリーンアップ工程を示す。両方のＨＥＲ２  ２ステッププローブについて、分画サイズの違い、アミノアリルｄ−ＵＴＰを用いた第２のＰＣＲの有無、および第２のＰＣＲ後のアダプター除去の有無は、最終プローブの品質に対してプラスの影響を有しなかった。
【０１９４】
３つのｐ５３  ２ステップＰＣＲプローブと同様、アミノアリル−ｄＵＴＰおよびアミノ化（対比）を用いた第２のＰＣＲ、および第２のＰＣＲ後のアダプター除去の有無は、最終プローブの品質に対して影響を及ぼさなかった。
【０１９５】
リピート部が含まれていないＰＣＲ  ＦＩＳＨプローブの設計および調製のための最終手順は以下のとおりである。
１：遺伝子座の所望の座標をＧｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒで同定する。
２：リピート部をＮでマスクした配列をダウンロードする。
３：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇプログラムに配列を入力する。
４：ユニーク配列のキロマーを同定するために処理し、ＢａｔｃｈＰｒｉｍｅｒ３用にフォーマット設定する。
５：ＢａｔｃｈＰｒｉｍｅｒ３（ウェブ）を使用し、各キロマーのためのＦプライマーとＲプライマーを同定する。
６：混合プライマーを９６ウェルプレート形式でオーダーする。
７：プレート内でＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いたＰＣＲ、ｅＧｅｌ−９６によるアッセイ。
８：ＰＣＲ産物を合わせ、超音波処理による断片化。
９：超音波処理したＤＮＡを平滑末端化する。
１０：アダプターをライゲートして鋳型を作製する。
１１：アダプター−プライマーを用いたＰＣＲにより、アミノ化、標識のためのバルクＤＮＡを作製するか
またはアダプター−プライマーとＡＡｄＵＴＰを用いたＰＣＲにより、標識のためのアミノ化ＤＮＡを作製する。
【０１９６】
１３：アミノ化する（必要であれば）。
【０１９７】
１４：標識、ホルムアミド処理。
【０１９８】
［実施例３］
この実施例では、ｐ１６を標的化するリピート部が含まれていないプローブの開発を記載する。ｐ１６プローブのマップを図９に示す。プライマー配列を表４に示す。
【０１９９】
【表６】
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2017533733.tif 000033
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【０２００】
Ｐｈｕｓｉｏｎを用いた１２００量体のＰＣＲ：２μＬの各ｐ１６ＲＦ  ５ｕＭに１８μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  ＭＭを添加し、９８度で３０秒，２５×（９８℃で８秒，６８℃で３０秒，７２度で１分）、７２℃で１０分、４℃にプログラミングしたサーモサイクラーに設置した。ＰＣＲで伸長する：各ウェルに、２μＬの同じ５μＭプライマーおよび２μＬの（８０ｕＬの２ＸｐｃｒＭＭ＋６０μＬのｄＮＴＰ＋２０μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２）を添加し、サーモサイクリングを行った：１０×（９８℃で８秒，６８℃で３０秒，７２℃で２分）。３μＬをｅＧｅｌのウェルに負荷し、電気泳動を８分間行った。ほとんどのウェル（６８／７３）で、予測された（同じ）ＭＷの強い明白なバンドが示された。しかしながら、いくつかは狭い間隔のダブレットを示す。ｐ１６ＲＦ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲのウェルを合わせて総量１２００μＬにし、３×４００μＬでチューブ内に分け、４０μＬの３Ｍ  ＮａＡｃおよび１ｍＬのＥｔＯＨを添加し、チューブを−２０℃で収納した。チューブを１５０００ｒｐｍで４度にて１２分間スピンし、ペレットを４００μＬの７０％ＥｔＯＨ中で洗浄し、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させ、合わせ、２００μＬの水中に再懸濁させ、６５度の炉内に５分間入れ、４０００ｒｐｍで５分間スピンしてポリメラーゼを沈降させた。上清みを新たなチューブに移し、３００μＬのＰＥＧ  ｒｇｔを添加した。１５分後、チューブを１４０００ｒｐｍで５分間スピンし、ペレットを４００μＬの水中に再懸濁させた。電気泳動により、１２００量体ミックスと整合するバンドが示された。
【０２０１】
ｐ１６−１２００量体を超音波処理する：（鋳型としての使用のために２０μＬを保存）３８０ｕＬのｐ１６−１２００量体に４０ｕＬの３Ｍ  ＮａＡｃを添加し、チューブを強度３で３０％デューティサイクル２×１０分間超音波処理し、１ｍＬのＥｔＯＨを添加した。チューブを１５０００ｒｐｍで４℃にて１０分間スピンし、ペレットを４００μＬの７０％ＥｔＯＨ中で洗浄し、乾燥させ、１００μＬの水中に再懸濁させた。次いでチューブを１５０００ｒｐｍで４度にて５分間スピンし、超音波装置プローブの残渣を沈降させた。電気泳動により、およそ５０から４００ｂｐのサイズ範囲が示された。
【０２０２】
分画：１０μＬの超音波処理した１２００量体に４０μＬの水および１０μＬのバッファーを添加し、チューブを混合してスピンカラム１にピペッティングし、１４０００ｒｐｍで１分間スピンし；排出液に１０μＬのバッファーを添加し、混合し、スピンカラム２にピペッティングし、１４０００ｒｐｍで１分間スピンし；排出液に１０μＬのバッファーを添加し、混合し、スピンカラム３にピペッティングし、１４０００ｒｐｍで１分間スピンした。カラムを２×２００μＬの洗浄バッファーで洗浄し、５０μＬの溶出バッファーで溶出させた。電気泳動によりおよそ１００から３００ｂｐのサイズが示された。
【０２０３】
Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｋｉｔを用いてｐ１６ｓｏｎおよびｐ１６ｓ２を平滑末端化する：３μＬの上記のもの（４０μＬの水中）に５μＬの１０×バッファーおよび２．５ｕＬの酵素ミックスを添加し、チューブをボルテックスし、２０℃の浴中に２０分間入れた。Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用説明書に従って使用し、産物を５０μＬのバッファー中に単離した。
【０２０４】
アダプターをｐ１６ｓｏｎＢ、ｐ１６ｓ２Ｂにライゲートする：各々１μＬの１０００μＭ  ＰａｄＢｓＰＤ１、ＣａｄＢｓＰＤ１、ＰａｄＥｃｏＲ１、ＣａｄＥｃｏＲ１、５μＬの１０×リガーゼバッファー、５μＬの５０％ＰＥＧ４０００、５μＬの７／２８（ｐ１６ｓｏｎＢ，ｐ１６ｓ２Ｂ）を各チューブに添加し、チューブをボルテックスし、１μＬのリガーゼを添加した。Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ精製キットを用いて産物を単離した。
【０２０５】
アダプター結合ｐ１６のＰＣＲ：ストリップウェルに（８，８，２，８，２）μＬの水および（各々１μＬの２０μＭ、２、８μＬの２０ｕＭ  ＰａｄＢｓＰＤ１；２，８μＬの２０ｕＭ  ＰａｄＥｃｏＲ１）を添加した。ウェルに１０μＬの５０μＬのＤｒｅａｍＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  ２ＸｐｃｒＭＭ＋２μＬの上記のプローブを添加した。サーモサイクリングを２５×（９５℃で３０秒，５５℃で３０秒，７２℃で３０秒）のプログラムで行った。解析により、ｐ１６ｓｏｎＡ鋳型による産物のバンドはｐ１６ｐ２Ａによるものよりもわずかに太いことが示された。どちらについても、２μＭの１種類のプライマーにより８μＭと同様の収量が得られた；ＰａｄＢｓＰＤ１プライマーとＰａｄＥｃｏＲ１プライマー間に差はなし。ＰａｄＥｃｏＲ１により最良の全体的性能が得られた。
【０２０６】
ＰａｄＥｃｏＲ１単独プライマー５μＭを用いたアダプター結合ｐ１６のＰｒｅｐ  ＰＣＲ．ストリップウェルに１００μＬの（４００μＬの水＋４μＬの１０００μＭ  ＰａｄＥｃｏＲ１＋２μＬの（ｐ１６ｓｏｎＡ，ｐ１６ｓ２Ａ）＋２００μＬのＤｒｅａｍＴａｑ  ２ＸｐｃｒＭＭ）を添加し、キャップし、２５×（９５℃で３０秒，５５℃で３０秒，７２℃で３０秒）にプログラミングしたサーモサイクラーに設置した。次に、さらに３．０μＬの（３０μＬの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ＋１０μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２＋８μＬの１０００μＭ  ＰａｄＥｃｏＲ１）を各ウェルに添加し、サーモサイクリングを１０×（９４℃で３０秒，５５℃で３０秒，７２℃で２分）のプログラムで行った。産物を上記のとおりに沈殿させ、再懸濁させた。
【０２０７】
ｐ１６調製物をアミノ化する：５０μＬの上記のｐ１６ｓｏｎをチューブに移し、ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて容量を２０μＬまでに減少させた。これおよび残留２０μＬの７／２９  ｐ１６ｓｐ，ｐ１６ｓｐ２ｐを沸騰水浴中に１分間入れ、次いで、各々に１８０μＬの（５００μＬの水＋３００μＬのＴＦＡ＋１７４μＬのエチレンジアミン＋９５ｍｇのＮａ２Ｓ２Ｏ３を添加し、６５℃の水浴中に１５分間入れた。次に、溶液を水中で脱塩し、４５０μＬの各ナノ液滴（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を収集した。ＴＭＥＤ／ＮａＣｌを添加し、チューブを６５℃の浴中に５分間入れ、５０μＬの３Ｍ  ＮａＡｃおよび１ｍＬのイソプロパノールを添加した。得られた溶液を沈殿させ、水中に再懸濁させた。
【０２０８】
アミノ化ｐ１６産物をＴＡＭＲＡ、ＣＲ６Ｇで標識する：１μＬの１Ｍ  ＮａＯＨを上記のものに添加し；１分後、２５μＬの（７５μＬのＴＭＥＤ／ＮａＣｌ＋７５μＬのＤＭＳＯ）を添加し、チューブをボルテックスし、２μＬの（１００ｍＭ  ＴＡＭＲＡ，１００ｍＭ  ＣＲ６Ｇ）を添加した。得られた溶液を沈殿させ、水＋１５μＬの２０×ＳＳＣと１０５μＬのホルムアミド中に再懸濁させ、２×ＳＳＣの１５０μＬを得た。得られた溶液を上記のようにして精製した。
【０２０９】
本出願において言及した、および／または以下に列挙する刊行物および特許はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。記載の特色および実施形態の種々の修正、組合せおよび変形が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者に明らかであろう。具体的な実施形態を記載したが、請求項に記載の発明は、かかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことは理解されよう。実際、記載の実施態様および実施形態の関連技術分野の当業者に自明の種々の修正例が以下の特許請求の範囲の範囲に含まれることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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