(57)【要約】  シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する、慢性炎症反応を調節するための薬剤が提供される。シトルリン化テネイシンＣおよび慢性炎症を調節する薬剤を特定する方法も提供される。そのような薬剤の治療用途も提供される。【選択図】  図２５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する、慢性炎症反応を調節するための薬剤。
【請求項２】
薬剤がシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数の物理的性質を変化させることによりシトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
薬剤がシトルリン化テネイシンＣの結合特性を変化させることによりシトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項４】
薬剤がシトルリン化テネイシンＣの抗原性を変化させることによりシトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
薬剤がシトルリン化テネイシンＣのシトルリン化のレベルを変化させることによりシトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
薬剤がシトルリン化テネイシンＣの非シトルリン化テネイシンＣに対する比を変化させることによりシトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
シトルリン化のレベルが一つもしくは複数の特定のドメイン（例えば、ＦＢＧドメイン）において変化する、請求項５に記載の薬剤、または、一つもしくは複数の特定のドメイン（例えば、ＦＢＧドメイン）のシトルリン化の、一つまたは複数の他の特定のドメインに対する比が変化する、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
配列番号７０において番号付けされた５５、２０９、２１４、２１９、２２０、５０、５１、７２、１２０、１６９、１７３および２２２番残基のうちの一つもしくは複数においてシトルリン化が変化する、請求項５に記載の薬剤、または、配列番号７０において番号付けされた５５、２０９、２１４、２１９、２２０、５０、５１、７２、１２０、１６９、１７３および２２２番残基のうちの一つもしくは複数のシトルリン化の、配列番号７０において番号付けされた５５、２０９、２１４、２１９、２２０、５０、５１、７２、１２０、１６９、１７３および２２２番のうちの一つもしくは複数の他の残基に対する比が変化する、請求項６に記載の薬剤。
【請求項９】
シトルリン化テネイシンＣの生物活性を下方制御する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１０】
シトルリン化テネイシンＣの生物活性を上方制御する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１１】
テネイシンＣのシトルリン化の阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１２】
シトルリン化テネイシンＣの結合特性の阻害剤である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１３】
シトルリン化テネイシンＣの競合結合性阻害剤である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１４】
ＴＬＲ４受容体および／またはＦｃγ受容体の拮抗薬である、請求項１〜９または請求項１２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１５】
低分子干渉ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）分子、低分子ヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、シトルリン化テネイシンＣに対する結合親和性を有する化合物、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）およびその抗原結合性フラグメント、小分子阻害化合物、シトルリン化テネイシンＣのドメインまたはその変異体、ポリペプチド並びにタンパク質からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１６】
抗体またはその抗原結合性フラグメントがＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂ、単一可変ドメインおよびドメイン抗体からなる群から選択される、請求項１５に記載の薬剤。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合性フラグメントがヒト化されている、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１８】
抗体またはその抗原結合性フラグメントがＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、シトルリン化テネイシンＣまたはそのドメインに対する特異性を有する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１９】
シトルリン化テネイシンＣのＦＢＧドメインに対する結合親和性を有する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２０】
抗体またはその抗原結合性フラグメントがシトルリン化テネイシン-のＦＢＧドメインに対する特異性を有する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２１】
抗体またはその抗原結合性フラグメントがシトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５５、２０９、２１４、２１９、２２０、５０、５１、７２、１２０、１６９、１７３および２２２番目の残基のうちの一つまたは複数に対する特異性を有する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２２】
シトルリン化テネイシンＣのＦＢＧドメインの生物活性を調節する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２３】
シトルリン化テネイシンＣがＦＢＧドメインにおいてシトルリン化される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２４】
シトルリン化テネイシンＣがＦＢＧドメインのみにおいてシトルリン化される、請求項２２に記載の薬剤。
【請求項２５】
シトルリン化テネイシンＣの特定のシトルリン化残基が配列番号７０において番号付けされた５５、２０９、２１４、２１９、２２０、５０、５１、７２、１２０、１６９、１７３および２２２番目の残基のうちの一つまたは複数を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２６】
シトルリン化テネイシンＣがＦＢＧドメイン以外の一つまたは複数のドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型様リピート）においてシトルリン化される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２７】
シトルリン化テネイシンＣに対する結合特異性を有する自己抗体の生物活性を調節する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２８】
単独で、および／または自己抗体がシトルリン化テネイシンＣとの複合体の一部である場合に、シトルリン化テネイシンに対する結合特異性を有する自己抗体と結合する、請求項２７に記載の薬剤。
【請求項２９】
シトルリン化テネイシンＣの活性を調節する薬剤を特定する方法であって、
（ｉ）  一つまたは複数の候補薬剤を用意し；
（ｉｉ）  一つまたは複数の細胞をシトルリン化テネイシンＣおよび一つまたは複数の候補薬剤と接触させ；
（ｉｉｉ）  一つまたは複数の細胞をシトルリン化テネイシンＣと接触させ、候補薬剤とは接触させず；
（ｉｖ）  対照段階（ｉｉｉ）の細胞と比較して、前記候補薬剤が段階（ｉｉ）の一つまたは複数の細胞に対するシトルリン化テネイシンＣの効果を調節するかどうかを判定すること、
を含む、前記方法。
【請求項３０】
シトルリン化テネイシンＣの活性が上方制御される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
シトルリン化テネイシンＣの活性が下方制御される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
段階（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の細胞がＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を発現する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
一つまたは複数の細胞が炎症性細胞、線維芽細胞、線維芽細胞様細胞（例えば、滑膜細胞としても知られている、ＲＡ滑膜線維芽細胞）、マウス胎仔線維芽細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞からなる群から選択される、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
炎症性細胞がマクロファージ、樹状細胞、単球、リンパ球、単球様細胞およびマクロファージ様細胞からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２９〜３４に記載の方法を実行することにより慢性炎症反応を調節する薬剤を特定する方法。
【請求項３６】
慢性炎症反応が不適切な炎症を特徴とする状態と関連している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
慢性炎症反応が、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性状態、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎および心血管疾患と関連している、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
慢性炎症反応が関節リウマチ（ＲＡ）と関連している、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の方法に従って特定される薬剤。
【請求項４０】
特定された薬剤が慢性炎症反応を調節する、請求項３９に記載の薬剤。
【請求項４１】
慢性炎症反応を下方制御する、請求項４０に記載の薬剤。
【請求項４２】
慢性炎症反応を上方制御する、請求項４０に記載の薬剤。
【請求項４３】
低分子干渉ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）分子、低分子ヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、シトルリン化テネイシンＣに対する結合親和性を有する化合物、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）およびその抗原結合性フラグメント、小分子阻害化合物、シトルリン化テネイシンＣのドメインまたはその変異体、ポリペプチド並びにタンパク質からなる群から選択される、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項４４】
慢性炎症反応が不適切な炎症を特徴とする状態と関連している、請求項１〜２８および請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項４５】
慢性炎症反応が、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性状態、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎および心血管疾患と関連している、請求項１〜２８および請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項４６】
請求項１〜２８および請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の薬剤並びに薬剤的に許容できる担体、賦形剤および／または希釈剤を含む組成物。
【請求項４７】
少なくとも１つの他の薬剤をさらに含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
少なくとも１つの他の薬剤が抗炎症剤、スタチン、生物学的作用物質（生物学的製剤）、免疫抑制剤、サリチル酸塩および／または殺菌剤である、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
抗炎症剤が非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、副腎皮質ステロイド、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）または免疫抑制剤から成る群から選択される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
医薬品として使用するための、請求項１〜２９および３９〜４９に記載の薬剤または組成物。
【請求項５１】
慢性炎症性状態の治療で使用するための、請求項１〜２９および３９〜４９に記載の薬剤または組成物。
【請求項５２】
慢性炎症性状態を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜２９および３９〜４９に記載の薬剤または組成物の用途。
【請求項５３】
対象に請求項１〜２９および３９〜４９に記載の有効量の薬剤または組成物を投与することを含む、慢性炎症性状態を治療する方法。
【請求項５４】
慢性炎症性状態がシトルリン化テネイシンＣを有する対象におけるものである、請求項５０〜５３に記載の薬剤、組成物、用途または方法。
【請求項５５】
慢性炎症性状態がシトルリン化テネイシンＣに対して特異性を有する自己抗体を有する対象におけるものである、請求項５０〜５４に記載の薬剤、組成物、用途または方法。
【請求項５６】
シトルリン化テネイシンＣまたは自己抗体が対象由来の血液、滑液または関節組織のうちの一つまたは複数の試料中に存在する、請求項５４または５５に記載の薬剤、組成物、用途または方法。
【請求項５７】
慢性炎症反応が不適切な炎症を特徴とする状態と関連している、請求項５０〜５６に記載の薬剤、組成物または用途。
【請求項５８】
慢性炎症反応が、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性状態、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎および心血管疾患と関連している、請求項５０〜５７に記載の薬剤、組成物または用途。
【請求項５９】
請求項２９〜３８に記載の方法を実行するためのパーツキットであって、
（ｉ）  一つまたは複数の細胞
（ｉｉ）  一つまたは複数の細胞の対照試料
（ｉｉｉ）  シトルリン化テネイシンＣの試料
（ｉｖ）  それらの使用のための説明書
を含む前記パーツキット。
【請求項６０】
（ｖ）  候補薬剤
を所望により含む、請求項５９に記載のパーツキット。
【請求項６１】
（ｖｉ）  シトルリン化テネイシンＣ活性または慢性炎症に対する候補薬剤の効果を判定する手段
を所望により含む、請求項６０に記載のパーツキット。
【請求項６２】
（ｉ）  請求項１〜２９および３９〜４９に記載の薬剤または組成物
（ｉｉ）  投与手段
（ｉｉｉ）  それらの使用のための説明書
を含むパーツキット。
【請求項６３】
（ｉｖ）  少なくとも１つの他の薬剤
を所望により含む、請求項６２に記載のパーツキット。
【請求項６４】
実施例および図面を参照して本明細書に詳述される薬剤。
【請求項６５】
実施例および図面を参照して本明細書に詳述される方法。
【請求項６６】
実施例および図面を参照して本明細書に詳述される組成物。
【請求項６７】
実施例および図面を参照して本明細書に詳述されるパーツキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシトルリン化テネイシンＣおよび慢性炎症におけるその活性に関する。また、シトルリン化テネイシンＣの修飾薬、およびその生物活性、並びに慢性炎症を上方制御または下方制御する薬剤の特定におけるシトルリン化テネイシンＣの用途が提供される。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、病原体、組織損傷、または刺激物質等の有害刺激に対する組織の複雑な生物学的反応である。保護を目的として、組織は有害刺激を除去し、さらに組織の治癒プロセスを開始する。炎症に関連する異常は、様々なヒト疾患の原因となる大きな非関連障害群（炎症性障害）を含む。炎症現象を伴う疾患の例としては、（限定はされないが）喘息、自己免疫疾患、糸球体腎炎、アレルギー（過敏症）、炎症性腸疾患、再灌流障害、関節リウマチおよび移植拒絶反応が挙げられる。
【０００３】
具体的には、慢性炎症は上記疾患の多くに関連する消耗性の重篤な状態であり、持続的な炎症および／または自己免疫疾患等における免疫応答変化を特徴とする。
【０００４】
関節リウマチ（ＲＡ）は、限定はされないが、慢性炎症性状態の典型例である。ＲＡは、炎症誘発性サイトカインおよびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の持続的な合成によって仲介される、滑膜炎並びに関節軟骨および骨の破壊を特徴としている。ＴＮＦαおよびＩＬ-６等の炎症性サイトカインの合成を抑制する生物学的化合物が、短期のＲＡ治療において成功を収めている。しかし、治療の反復を必要とするために高額な治療方法となってしまい、長期寛解も得られない。さらに、サイトカイン機能の全身抑制には感染リスクの増大等の固有の問題が伴う。このように、治療の進歩にもかかわらず、長期に亘って効果的な、経済的な慢性炎症治療モデルの必要性は未だ満たされていない（Smolen(2006)およびWilliams(2007)）。
【０００５】
疾患の慢性を支える機構は不明瞭なままであり、炎症性で且つ破壊性の介在物質の長期発現を駆動する因子も現在知られていない。
【０００６】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）はＲＡにおける炎症性メディエーターの産生駆動において重要な役割を果たしており、ＴＬＲ機能の遮断は臨床的に非常に有効であり得る（Brentano(2005)およびO’Neill(2002)で概説される）。この受容体ファミリーは免疫系の不可欠の部分を形成する。ＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）および損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の両方を認識することにより、感染および傷害に対する宿主防御を仲介する（Matzinger (2002)）。ＤＡＭＰは組織傷害時に生成される内在性の炎症誘発性分子であり、損傷または壊死した細胞から放出される細胞内分子、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子の断片または傷害時に発現増加されるＥＣＭ分子が含まれる（Bianchi(2007)およびGordon(2002)で概説される）。
【０００７】
活性化後、ＴＬＲは自然免疫反応および適応免疫応答の両方を促進し、例えば、炎症誘発性サイトカインおよびＭＭＰの発現を刺激する（Medzhitov(2002)）。ＴＬＲはＲＡ患者由来の滑膜組織において高レベルで発現されており（Radstake(2004)、Roelofs(2005)、Sacre(2007)、およびSacre(2008)）、ＴＬＲ４に標的欠失または機能喪失型変異を有するマウスは実験的関節炎から保護される（Choe(2003)およびLee(2005)）。さらに、ＴＬＲ４の阻害剤はマウスにおける破壊性関節炎を低減することができ（Abdollahi-Roodsaz(2007)）、推定上のＴＬＲ４阻害剤は、予備的な第１相試験において、中等度〜重度のＲＡを患う、２３人中１５人の患者の症状を改善した（Vanags(2006)）。しかし、どのＴＬＲリガンドが病因に関与しているかは不明である。
【０００８】
組織傷害および創傷の修復に関連するテネイシンＣはＥＣＭ糖タンパク質である。テネイシンＣは、胚形成の間の組織リモデリングの活動期中に特異的に発現され、原腸形成および体節形成の間に最初に観察される。発現は、発生のより後半の段階では、乳腺および肺の分岐形態形成の部位、発達中の骨格、心血管系および上皮間葉転換部位の結合組織に制限される。これらのプロセスが終了した後、および胚形成が完了する前に、発現は下方制御される（Jones(2000)）。
【０００９】
テネイシンＣは通常、正常な成人組織では発現されない。しかし、成人において、急性炎症の間に特異的且つ一過性に発現上昇され、慢性炎症においては持続的に発現される（Chiquet-Ehrismann(2003)で概説される）。テネイシンＣは正常なヒト関節においてほとんど発現されないが、ＲＡ滑膜、炎症および線維症の領域、特に滑膜表層下、浸潤性パンヌスおよび血管周辺においてはレベルが大きく増加しているということが、免疫組織化学的な研究によって示されている（Cutolo(1992)、MacCachren(1992)およびSalter(1993)）。ＲＡ患者由来の滑液（Chevalier(1994)およびHasegawa(2007)）およびＲＡ軟骨（Salter(1993)およびChevalier(1994)）においても、テネイシンＣのレベルは著しく増加している。
【００１０】
テネイシンＣは１５０万Ｄａの巨大な六量体タンパク質である。各々の鎖は、集合ドメイン（ＴＡ）、ＥＧＦ様リピート（ＥＧＦ-Ｌ）、フィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（ＴＮＩＩＩ）およびフィブリノーゲン様球（ＦＢＧ）を含む、様々なドメインを含んでいる（Orend(2005)で概説される）。テネイシンＣおよびそのドメインの配列を図１３に示す。
【００１１】
本発明者らは、テネイシンＣが、関節炎において観察される破壊性関節炎に必要とされ、慢性炎症性状態を特徴付ける炎症反応の延長に関与する内在性ＴＬＲ４リガンドであることを以前に示した。具体的には、テネイシンＣがＴＬＲ４の内在性活性化因子であることが示され、これにより、この分子が破壊性関節炎に必要とされることが明示された（国際公開第２０１０／１０３２８９）。
【００１２】
国際公開第２０１０／１０３２８９では、関節における免疫応答の仲介においてテネイシンＣが果たす役割が、インビボでマウスにテネイシンＣのＦＢＧドメインを関節内注射して関節炎を誘導することにより示された。さらに、ザイモサンによって誘導された急性関節炎は、テネイシンＣ欠損マウスではそれほど長期に亘るものではなかった。野生型マウスおよびテネイシンＣヌルマウスの両方がザイモサンによる急性炎症誘導に同等に応答し、これにより、テネイシンＣは炎症惹起に関与していないと思われる、ということが示された。しかし、テネイシンＣヌルマウスが示した滑膜炎の持続性の低さにより、関節炎の維持における役割が示された。ｍＢＳＡでの免疫化により誘導された関節炎の間、テネイシンＣの標的欠失がマウスを持続型びらん性関節炎から保護したという観察により、関節炎の遷延におけるテネイシンＣの重要性が理解された。
【００１３】
テネイシンＣは関節内の細胞を活性化することが可能であることが示され、テネイシンＣの第一活性ドメインは、この分子のＣ末端にある２２７アミノ酸（２６．９ｋＤａ）の球状ドメインであるフィブリノーゲン様球（ＦＢＧ）に位置付けられた（Siri(1991)）。
【００１４】
ＲＡ患者由来の滑膜培養物にＦＢＧを添加することにより、炎症誘発性サイトカインの自然放出が増強された。また、この添加により、ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路の活性化を介して、初代ヒトマクロファージにおけるＴＮＦ-α、ＩＬ-６およびＩＬ-８の合成、並びにＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＩＬ-６の合成が刺激された。
【００１５】
ＬＰＳの場合と同じように、ＦＢＧによるサイトカイン合成の誘導にはＴＬＲ４発現が必要であることが示されている。しかし、ＬＰＳとは異なり、ＴＬＲ４活性化にはＣＤ１４もＭＤ-２も必要とされないと思われる。ＣＤ１４は他のリガンドによるＴＬＲ４の活性化に不要である。ＴＬＲ４がＭｙＤ８８依存的にリピドＡに反応することは必要ではなく（Jiang(2005)）、フィブロネクチンＥＤＡはＣＤ１４不在化であってもマスト細胞を活性化することができ（Gondokaryono(2007)）、ヒト単球ＴＨＰ-１細胞のヒアルロン酸活性化はＴＬＲ４、ＣＤ４４およびＭＤ-２の複合体を必要とするが、ＣＤ１４を必要とはしない（Taylor(2007)）。
【００１６】
各ＴＬＲ４リガンドによる異なる受容体複合体の形成は、様々な細胞内アダプター／シグナル伝達分子の動員を促進し得る。これが、ＦＢＧおよびＬＰＳで観察された示差的な細胞応答、例えば、ＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＦＢＧによるＩＬ-８誘導の欠如、の原因となり得る。同様に、ＴＬＲ４・ＣＤ４４複合体のヒアルロン酸活性化は、ＬＰＳと異なる、マウス肺胞マクロファージ細胞系におけるあるパターンの遺伝子発現を誘導する（Taylor(2007)）。ＦＢＧがヒトマクロファージにおいてＩＬ-８合成を誘導するということは、細胞型特異的なリガンド認識および／またはシグナル伝達が起こることを示唆している。
【００１７】
テネイシンＣの厳密に制御された発現パターンは、テネイシンＣを慢性炎症治療の魅力的な標的としている。テネイシンＣは健常成人にはほぼ存在していないが、組織傷害時に特異的に発現が誘導される。急性炎症の間、テネイシンＣは一時的に発現される。誘導はしばしば炎症に先立って起こり、炎症が回復するまでにｍＲＮＡもタンパク質も共に組織からなくなる（Chiquet-Ehrismann(2003)で概説される）。
【００１８】
テネイシンＣの持続的発現は慢性炎症と関連していることが現在では示されている。ＲＡの他に、テネイシンＣレベルの上昇は、多発性硬化症（Gutowski(1999)）およびシェーグレン疾患（Amin(2001)）を含む他の自己免疫疾患、並びに非治癒性創傷、並びに糖尿病性潰瘍および静脈性潰瘍（Loots(1998)）において観察される。テネイシンＣの新規合成は口腔粘膜の疾患における炎症の強度とよく相関しており、テネイシンＣの血漿レベルは薬物治療または外科手術の前後における炎症性腸疾患の活性に対する信頼性のある指標である（Chiquet-Ehrismann(2003)で概説される）。
【００１９】
国際公開第２０１０／１０３２８９号は、テネイシンＣの生物活性を調節する、慢性炎症反応を調節するための薬剤、および慢性炎症と関連した状態の治療におけるそれらの用途について記述している。しかしながら、そのような状態に対する新規の改善された治療は今なお求められている。
【発明の概要】
【００２０】
本発明者らは、テネイシンＣがインビトロでシトルリン化可能であり、シトルリン化テネイシンＣが慢性炎症性状態を有する患者に選択的に存在するという驚くべきことを示した。
【００２１】
シトルリン化は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）により仲介されるアルギニン残基のシトルリンへの変換によって起こる。この翻訳後修飾は、生理学的には皮膚および中枢神経系において、並びに病理学的には炎症部位において起こる。この変化はタンパク質の高次構造、イオン性相互作用およびタンパク質切断に対する感受性に著しい影響を与える。また、シトルリン化はエピトープを新たにつくり出し、これにより特異的な抗体の産生がもたらされる。抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）は、これらのシトルリン化タンパク質抗原を特異的に認識する。さらに、シトルリン化によりつくり出されたエピトープは、自然免疫系内のＨＬＡ  ＤＲ、Ｔ細胞受容体および特異的リガンドに対するタンパク質結合も決定し得る（６７）。
【００２２】
ＡＣＰＡはＲＡ患者において発見されており、これはこの疾患を診断する一つの方法である。最近になって、これらの抗体は疾患を活発に促進することが示された。しかし、これらの抗体が認識するタンパク質には十分な記述がない。現在までに、ＲＡ滑液内で同定され、エピトープマッピングされ、それらの抗体の特異性がいくつかの研究室で再現性よく確認された（６７）シトルリン化抗原は、フィブリノーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ビメンチンおよびα-エノラーゼだけである。
【００２３】
本発明者らは以前に、シトルリン化α-エノラーゼをＲＡにおける自己抗原と特定し、診断および病因の両方におけるシトルリン化α-エノラーゼの重要性を示した（６８〜７４）。他のグループからの最新のデータは、ＡＣＰＡおよびそれらの抗原も病因に活発に寄与していることを示唆している。例えば、シトルリン化フィブリノーゲンを含有する免疫複合体は、実験的マウス関節炎を増強し（７５、７６）、ヒト単球におけるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）およびＦｃγ受容体の活性化によってサイトカイン合成を相乗的に促進する（７７、７８）。
【００２４】
フィブリノーゲンがシトルリン化されること、およびこの形態のフィブリノーゲンに対する抗体がＲＡ患者内に存在することは、長く知られていた。Sokolove(2011)（１６）は、シトルリン化された場合のフィブリノーゲンがネイティブなフィブリノーゲンと比較してＴＬＲ４のより良好な活性化因子であったこと、および、シトルリン化フィブリノーゲンが抗体と複合体を形成し、その複合体が相乗的なＴＬＲ-Ｆｃγ受容体シグナル伝達を介して炎症を活性化したことを示している。このように、このタンパク質の修飾はＲＡにおける炎症を悪化させる。
【００２５】
本発明者らは以前に、炎症誘発性糖タンパク質であるテネイシンＣを自然免疫反応および適応免疫応答の内在性活性化因子と特定し、その発現がインビボにおける慢性関節炎に必要であることを示した（７９、８０）。さらに、高レベルのテネイシンＣがＲＡ滑膜（８１）および血清（８２）内に存在した。
【００２６】
しかし、以前は、テネイシンＣがシトルリン化され得るとは考えられておらず、また、そのようなシトルリン化がテネイシンＣの炎症誘発活性を調節し得るということも、シトルリン化テネイシンＣが自己抗原となり得るということも考えられてはいなかった。
【００２７】
本発明者らは、完全長テネイシンＣ、および（限定はされないが）ＦＢＧドメインを含むその個々のドメインがインビトロにおいてシトルリン化によって翻訳後に修飾され得ることを確認した。本発明者らは、シトルリン化ＦＢＧが、初代ヒトマクロファージによるサイトカイン（例えばＴＮＦα）合成の刺激において、ネイティブなＦＢＧよりも良好であることを示している。本発明者らは、ＲＡ患者のみがシトルリン化テネイシンＣを認識する抗体を有しており、健常者対照群は有していないこと、およびＲＡ患者および健常者対照群から得られた血清がネイティブな、すなわちシトルリン化されていないテネイシンＣと反応しないことを発見した。また本発明者らは、ＦＢＧドメインに加えて、テネイシンＣの他のドメインがＲＡ患者においてシトルリン化されていることも示している。
【００２８】
これは、テネイシンＣがシトルリン化され得るという最初の発見であり、このテネイシンＣ修飾がＲＡに関連しているという最初の実証である。本発明者らはまた、シトルリン化がテネイシンＣの炎症性（inflammatory capacity）を増強する働きをし、これにより、このタンパク質がＲＡにおける炎症を駆動する少なくとも３つの新しい主要な機構が与えられることを示している。ＡＣＰＡ含有テネイシンＣ免疫複合体の抗体（例えば、Ｆｃγ受容体シグナル伝達を仲介）成分および抗原（例えば、ＴＬＲシグナル伝達を仲介）成分の両方が炎症誘発性であることを示すものであることから、シトルリン化抗原、すなわちテネイシンＣの炎症誘発効果は重要な意味を持つ発見である。従って、シトルリン化テネイシンＣ単独、シトルリン化テネイシンＣに対する自己抗体単独、またはシトルリン化テネイシンＣ-抗体複合体は疾患において炎症を駆動する可能性がある。
【００２９】
本発明者らは、シトルリン化されたフィブリノーゲン内のアミノ酸が、テネイシンＣのＦＢＧドメインと類似していない領域に位置するという、さらに驚くべきことを発見した。言い換えれば、ＦＢＧ-Ｃにおけるシトルリン化されたアミノ酸およびＡＣＰＡの標的は、フィブリノーゲンにおける領域と類似していない。各タンパク質において同じ配列が修飾されると予想され得ることから、これは驚くべきことである。
【００３０】
このことから、ここで初めて、ＦＢＧドメインを含むテネイシンＣのドメインがＲＡにおいてはシトルリン化されていること、および、シトルリン化テネイシンＣに対する抗体がＲＡ患者に選択的に存在することが示された。
【００３１】
本発明の第一の態様において、シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する、慢性炎症反応を調節するための薬剤が提供される。
【００３２】
シトルリン化テネイシンＣの「生物活性」には、１）ＴＬＲまたは他の受容体を介したシトルリン化テネイシンＣの効果；および／または、２）Ｆｃγ受容体もしくは他の受容体を活性化するシトルリン化テネイシンＣを認識する抗体の効果；および／または、３）例えばＴＬＲおよびＦｃｙもしくは他の受容体を相乗的に活性化し得る、テネイシン-ＡＣＰＡ免疫複合体によるシグナル伝達の効果が含まれる。
【００３３】
好ましい実施形態では、シトルリン化テネイシンＣの生物活性の調節には、１）ＴＬＲ（例えばＴＬＲ４）並びに／または単独およびＴＬＲとの組合せにおいて作用する他の受容体（例えばインテグリン）に対するシトルリン化テネイシンＣの作用の調節；２）シトルリン化テネイシンＣに対するＡＣＰＡの産生およびＦｃｙ受容体のそれらの活性化の調節；並びに、３）ＡＣＰＡ抗体との複合体形成およびその結果起こるＦｃγ／ＴＬＲ受容体複合体または他の受容体複合体を介したシグナル伝達を介したテネイシンＣの作用の調節のうちの１つまたは複数が含まれる。シトルリン化テネイシンＣの生物活性の調節は、これらのうちの２つ以上を含む場合があり、あるいは、いくつかの実施形態では、これら全てを含む場合がある。
【００３４】
「シトルリン化テネイシンＣ」には、シトルリン化という翻訳後のプロセス、すなわち、アルギニン残基のシトルリンへの変換によって、いかなる位置であれ、いかなる程度であれ、修飾を受けたテネイシンＣが含まれることが意図される。「シトルリン化テネイシンＣ」には、シトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数の断片も含まれる。従って、本発明の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数の断片の生物活性を調節し得ることが意図される。「シトルリン化テネイシンＣ」には、例えば、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０、２２２番目の残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る、一つまたは複数の特定の残基においてシトルリン化されたテネイシンＣが含まれ得る。あるいは、テネイシンＣは、例えば、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番目の残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る、一つまたは複数の特定の残基においてシトルリン化され得る。特定のシトルリン化残基は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５１を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５５を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１４を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２０を含み得る。別の実施形態では、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含み得る。あるいは、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２２を含み得る。
【００３５】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣの物理的性質のうちの一つまたは複数を変化させることにより、シトルリン化テネイシンＣの結合特性を変化させることにより、および／または、シトルリン化テネイシンＣの抗原性を変化させることにより、シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節し得る。
【００３６】
シトルリン化テネイシンＣの抗原性を変化させることは、シトルリン化型に対して産生される抗体の数が増加または現象することを意味する。シトルリン化タンパク質の抗原性をより高くし、これらの抗体はＲＡ病変形成の駆動において重要となる。テネイシンＣの抗原性が低下することが好ましい。
【００３７】
シトルリン化テネイシンＣの物理的性質を変化させることは、シトルリン化テネイシンＣの以下の特性のうちの一つまたは複数を変化させることを含む：（ｉ）電荷；（ｉｉ）折り畳みパターン（例えば、より微細繊維性の構造の増強）；および（ｉｉｉ）シトルリン化テネイシンＣの隠れたドメイン、モジュールまたは配列の露出または隠蔽。
【００３８】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣのシトルリン化のレベルを変化させること、またはシトルリン化テネイシンＣの非シトルリン化テネイシンＣに対する比を変化させることによっても、シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節し得る。
【００３９】
テネイシンの全体的なシトルリン化レベルが変化され得る（すなわち、より多くまたはより少ないアルギニン残基が修飾される）。シトルリン化のレベルは、テネイシンＣの全体に渡って、または、一つもしくは複数の特定の断片もしくはドメイン（例えばＦＢＧドメイン）のみに渡って減少され得る。シトルリン化のレベルが減少されることが好ましい。
【００４０】
シトルリン化が変化され得るテネイシンＣの個々のドメインには、集合ドメイン（ＴＡドメイン）、ＥＧＦ-Ｌリピート（ＥＧＦ-Ｌドメイン）、フィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（ＴＮＩＩＩドメイン）およびＦＢＧドメインのうちの一つまたは複数が含まれる。好ましい実施形態では、それは、変化を受けた、フィブロネクチンＩＩＩ型様リピートおよび／またはＦＢＧドメインのシトルリン化である。最も好ましい実施形態では、それは、変化を受けた、ＦＢＧドメインのシトルリン化である。シトルリン化の変化はシトルリン化の減少であることが好ましい。
【００４１】
同様に、テネイシンＣの一つまたは複数の他のドメインに対する、テネイシンＣの一つまたは複数の特定のドメイン（例えばＦＢＧドメイン）のシトルリン化の比が変化され得る。あるいは、テネイシンＣの一つまたは複数の他の残基（例えば、５５、２０９、２１４、２１９、２２０、５０、５１、７２、１２０、１６９、１７３および２２２番目の残基のうちの一つまたは複数）に対する、テネイシンＣの一つまたは複数の特定の残基（例えば、５５、２０９、２１４、２１９、２２０、５０、５１、７２、１２０、１６９、１７３および２２２番目の残基（配列番号７０から決定される残基番号））のうちの一つまたは複数のシトルリン化の比が変化され得る。
【００４２】
シトルリン化のレベルは、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番残基（配列番号７０から決定される残基番号）を含む群のいずれか；もしくはこれらの組合せから選択され得る；または、特定のシトルリン化残基は、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２番残基を含む群のいずれか；もしくはこれらの組合せから選択され得る、テネイシンＣまたはその断片の一つまたは複数の特定のシトルリン化残基を、非シトルリン化形態の残基に変化させることにより減少され得る。
【００４３】
特定のシトルリン化残基は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、およびＣＩＴ２２０のうちの一つまたは複数を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５１を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５５を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１４を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２０を含み得る。別の実施形態では、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含み得る。あるいは、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２２を含み得る。
【００４４】
特定のシトルリン化残基はエピトープであり得るか、またはエピトープ内に存在し得、このようなエピトープ内で検出され得る。例えば、前記エピトープは、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９およびＣＩＴ２２０；またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのシトルリン化残基を含み得る。前記エピトープは、ＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２０およびＣＩＴ２２２；またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのシトルリン化残基を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５０を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５１を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５５を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２０９を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１４を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１９を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２０を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２２を含み得る。
【００４５】
シトルリン化のレベルは、最初の場所でシトルリン化を防止することにより（例えば、ＰＡＤ阻害剤を用いることにより）、通常はテネイシン発現を減少させることにより、ネイティブなテネイシンの発現を増加させることにより、および／または、テネイシンＣのアルギニンヌル変異体を投与することにより、減少され得る。
【００４６】
このような薬剤は、例えば以下の、当該技術分野において周知の方法を用いることで特定され得る：
（ａ）  例えばウェスタンブロッティングもしくは関連のハイブリダイゼーション法による、シトルリン化テネイシンＣの発現レベルに対する試験薬剤の影響の測定；
（ｂ）  例えば抗シトルリン化テネイシンＣ抗体を用いたイムノアッセイによる、シトルリン化テネイシンＣタンパク質のレベルに対する試験薬剤の影響の測定；
（ｃ）  例えば実施例の方法による、機能的マーカー、すなわちシトルリン化テネイシンＣ活性の結果に対する試験薬剤の影響の測定；
（ｄ）  例えばＳＤＳＰＡＧＥ上で泳動してシトルリン化を示す際の、電荷もしくはサイズの変化の利用；並びに／または
（ｅ）  質量分析およびプロテオミクス的手法の使用による、シトルリン化の比の定量化および修飾された特定のアルギニン残基の特定。
【００４７】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣの生物活性を下方制御し得る。
【００４８】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣの生物活性を上方制御し得る。免疫性および炎症性の分子および細胞の上方制御活性の望ましさは、免疫不全および炎症性の患者に対する治療の作製、並びにワクチンの開発と関連している（Harandi(2009)を参照）。
【００４９】
本発明の第一の態様の薬剤はテネイシンＣの転写の阻害剤であり得る。
【００５０】
本発明の第一の態様の薬剤はテネイシンＣの翻訳の阻害剤であり得る。
【００５１】
本発明の第一の態様の薬剤はテネイシンＣのシトルリン化の阻害剤であり得る。シトルリン化の阻害は、例えば、シトルリン化のレベルが減少され得る方法と同様に（例えば、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（PAD）を阻害することにより）、達成され得る。
【００５２】
本発明の第一の態様の薬剤はシトルリン化テネイシンＣの結合特性の阻害剤であり得る。例えば、前記薬剤は、シトルリン化テネイシンＣの高次構造を、シトルリン化テネイシンＣがその受容体に結合できないように変化させ得る。
【００５３】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣの競合結合性阻害剤であり得る。当業者には理解されることであるが、前記薬剤は、直接的に（シトルリン化テネイシンＣ受容体拮抗薬として機能することにより）、または間接的に（中間分子または補助分子と結合することにより）、シトルリン化テネイシンＣ受容体の機能を遮断することによっても、シトルリン化テネイシンＣの生物活性を阻害し得る。
【００５４】
本発明の第一の態様の薬剤は、ＴＬＲ-４受容体および／またはＦｃγ受容体および／またはいずれかの他の受容体、または複合体型の受容体の拮抗薬であり得る。
【００５５】
当業者には理解されることであるが、本発明の薬剤によるシトルリン化テネイシンＣの生物活性の阻害は全体的または部分的であり得る。例えば、前記薬剤は、シトルリン化テネイシンＣの生物活性を、前記薬剤に暴露されていない炎症性細胞上でのシトルリン化テネイシンＣの生物活性と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、最も好ましくは１００％阻害し得る。
【００５６】
本発明の第一の態様の薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）分子、低分子ヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、シトルリン化テネイシンＣに対する結合親和性を有する化合物、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）およびその抗原結合性フラグメント、小分子阻害化合物、ポリペプチド並びにタンパク質からなる群から選択され得る。
【００５７】
本発明の一実施形態では、前記薬剤はｓｉＲＮＡである。ＲＮＡ干渉は二段階のプロセスである。開始段階と称される第一段階では、入力ｄｓＲＮＡが、おそらくはダイサー（ｄｓＲＮＡ（直接的にまたは導入遺伝子またはウイルスを介して導入）をＡＴＰ依存的に処理（切断）する、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮアーゼＩＩＩファミリーの一員）の作用によって、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に消化される。続く切断イベントにより、前記ＲＮＡは、２ヌクレオチドの３’オーバーハングをそれぞれ有する１９〜２１ｂｐ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解される（Hutvagner & Zamore, 2002, Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232; Bernstein, 2001, Nature 409:363-366）。
【００５８】
エフェクター段階（effector step）において、ｓｉＲＮＡ二重鎖はヌクレアーゼ複合体と結合してＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ＲＩＳＣの活性化にはＡＴＰ依存的なｓｉＲＮＡ二重鎖の巻き戻しが必要である。活性ＲＩＳＣは次に、塩基対形成相互作用によって相同転写物を標的とし、ｓｉＲＮＡの３’末端からｍＲＮＡを１２ヌクレオチド断片に切断する（上記Hutvagner & Zamore, 2002; Hammond et al., 2001, Nat. Rev. Gen. 2:110-119 (2001); Sharp, 2001, Genes. Dev. 15:485-90）。切断のメカニズムはまだ解明されていないが、各ＲＩＳＣが単一のｓｉＲＮＡおよびＲＮａｓｅを含有することが研究により示されている（上記Hutvagner & Zamore, 2002）。
【００５９】
ＲＮＡｉの著しい作用強度を考慮して、ＲＮＡｉ経路内の増幅段階が提唱された。増幅は、より多くのｓｉＲＮＡを生成するであろう入力ｄｓＲＮＡのコピーによって、または形成されたｓｉＲＮＡの複製によって起こり得る。あるいは、または加えて、増幅はＲＩＳＣの複数の代謝回転イベントによって達成され得る（上記Hammond et al., 2001；上記Hutvagner & Zamore, 2002）。ＲＮＡｉに関するさらなる情報は以下のレビューで見つけることができる：Tuschl, 2001, Chem. Biochem. 2:239-245, Cullen, 2002, Nat. Immunol. 3:597-599およびBrantl, 2002, Biochem. Biophys Act. 1575:15-25。
【００６０】
本発明との使用に適したＲＮＡｉ分子の合成は、以下の通りに達成され得る。最初に、テネイシンＣのｍＲＮＡ配列が、ＡＡジヌクレオチド配列について、ＡＵＧ開始コドンの下流に向けて走査される。各ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの出現率が、可能性のあるｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。非翻訳領域（ＵＴＲ）は調節タンパク質結合部位により富んでいることから、ｓｉＲＮＡ標的部位はオープンリーディングフレームから選択されることが好ましい。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体がｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を干渉し得る（Tuschl, ChemBiochem. 2:239-245）。しかしながら、非翻訳領域を対象とするｓｉＲＮＡも効果的であり得ることは理解されよう。
【００６１】
第二に、ＢＬＡＳＴ（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）等の配列アラインメントソフトウェアを用いて、標的候補部位が適切なゲノムデータベース（例えばヒト、マウス、ラット等）と比較される。他のコード配列に対し有意な相同性を示す推定標的部位が選別される。
【００６２】
適格な標的配列がｓｉＲＮＡ合成の鋳型として選択される。低いＧ／Ｃ含量を含む配列は、５５％よりも高いＧ／Ｃ含量を有する配列と比較して、遺伝子サイレンシングを仲介するのにより効果的であると判明していることから、好ましい配列である。評価のために、標的遺伝子の長さに沿っていくつかの標的部位が選択されることが好ましい。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価のために、負の対照を併せて使用することが好ましい。負の対照ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対する有意な相同性を欠いていることが望ましい。従って、ｓｉＲＮＡのスクランブルされたヌクレオチド配列を使用することが好ましいが、ただし、この配列はいかなる他の遺伝子に対してもいかなる有意な相同性も示さない。
【００６３】
適切なＳｉＲＮＡ分子は、それらがテネイシンＣの全ヌクレオチド配列またはその一部に対し相補的であり、従ってそれに結合するように、上記のように合成することができる。テネイシンＣのヌクレオチド配列は図１４に見出される。
【００６４】
一実施形態では、前記薬剤は低分子ヘアピンＲＮＡ（ＳｈＲＮＡ）であり得る。
【００６５】
低分子ヘアピン型ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現を停止させるのに用いられ得る、急なヘアピンカーブをつくるＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、細胞に導入されたベクター（典型的にはアデノウイルスまたはレンチウイルス）を用い、Ｕ６プロモーターを利用することで、前記ｓｈＲＮＡが常に発現されることを確実にしている。このベクターは通常娘細胞に受け継がれ、これにより遺伝子サイレンシングの遺伝が可能となる。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は細胞機構によってｓｉＲＮＡに切断され、これが後にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、ｓｉＲＮＡに結合した、ｓｉＲＮＡとマッチするｍＲＮＡに結合して、それを切断する（McIntyre(2006)およびPaddison(2002)）。
【００６６】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣのドメインまたはその異型であり得る。ＦＢＧドメインは、慢性炎症の持続性との関連で、テネイシンＣのその標的との相互作用に主に関与していることが示されている。ＦＢＧドメインは、特に、シトルリン化されることも示されている。従って、好ましいドメインはＦＢＧドメイン（図１３に示される配列）またはその異型である。追加または代替のシトルリン化テネイシンＣのドメインはフィブロネクチンＩＩＩ型様リピートである。シトルリン化テネイシンＣまたはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数の断片は、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０、２２２番目の残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る、一つまたは複数の特定の残基においてシトルリン化され得る。あるいは、シトルリン化テネイシンＣまたはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数の断片は、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番目の残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る、一つまたは複数の特定の残基においてシトルリン化され得る。特定のシトルリン化残基は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５１を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５５を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１４を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２０を含み得る。別の実施形態では、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含み得る。あるいは、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２２を含み得る。
【００６７】
特定のシトルリン化残基はエピトープであり得るか、またはエピトープ内に存在し得、このようなエピトープ内で検出され得る。例えば、前記エピトープは、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９およびＣＩＴ２２０；またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのシトルリン化残基を含み得る。前記エピトープは、ＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２０およびＣＩＴ２２２；またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのシトルリン化残基を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５０を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５１を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５５を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２０９を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１４を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１９を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２０を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２２を含み得る。
【００６８】
別の実施形態では、前記薬剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００６９】
シトルリン化テネイシンＣのレベル／活性を効率的に減少させるのに使用することができるアンチセンス分子の設計には、アンチセンスアプローチに重要な２つの態様についての考慮が必要である。第一の態様は、がん細胞の細胞質内へのオリゴヌクレオチドの送達であり、一方、第二の態様は、細胞内の指定のｍＲＮＡとその翻訳を阻害するように特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【００７０】
先行技術により、オリゴヌクレオチドを種々様々な細胞型に効率的に送達するのに使用することができるいくつかの送達戦略が教授される（例えば、Luft, 1998, J Mol Med 76:75-6; Kronenwett et al., 1998, Blood 91:852-62; Rajur et al., 1997, Bioconjug Chem 8:935-40; Lavigne et al., 1997, Biochem Biophys Res Commun 237:566-71; Aoki et al., 1997, Biochem Biophys Res Commun 231:540-5を参照）。
【００７１】
さらに、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造の交互変化のエネルギー論を説明する熱力学サイクルに基づく、標的ｍＲＮＡに対して最も高い予測結合親和性を有する配列を特定するためのアルゴリズムが利用可能である（例えば、Walton et al., 1999, Biotechnol Bioeng 65:1-9を参照）。
【００７２】
インビトロ系を用いて、特定のオリゴヌクレオチドを設計し、その効率を予測するためのいくつかのアプローチも公知である（例えば、Matveeva et al., 1998, Nature biotechnology 16:1374-1375を参照）。
【００７３】
いくつかの臨床試験（clinical trail）により、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性および活性が示さた。例えば、がんの治療に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が成功している（Holmlund et al., 1999, Curr Opin Mol Ther 1:372-85; Gerwitz, 1999, Curr Opin Mol Ther 1:297-306）。より最近では、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンスを介した抑制により、マウスモデルにおけるヒトがん細胞の胸膜播種性転移が阻害されることが報告された（Uno et al., 2001, Cancer Res 61:7855-60）。
【００７４】
従って、当業者は、テネイシンＣの発現を調節するのに適した、従って、シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節するのに適した、アンチセンスアプローチを容易に設計および実行することができる。
【００７５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは１５〜３５塩基長であることが好都合である。例えば、２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドは上皮増殖因子受容体ｍＲＮＡの発現を阻害することが示されており（Witters et al, Breast Cancer Res Treat 53:41-50 (1999)）、２５ｍｅｒオリゴヌクレオチドは副腎皮質刺激ホルモンの発現を９０％超減少させることが示されている（Frankel et al, J Neurosurg 91:261-7 (1999)）。しかしながら、この範囲外の長さ、例えば１０、１１、１２、１３、もしくは１４塩基、または３６、３７、３８、３９もしくは４０塩基を有するオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい場合もあることは理解されよう。
【００７６】
さらに、オリゴヌクレオチドが細胞内在性ヌクレアーゼにより分解または不活性化を受けることは、当業者に理解されよう。この問題に対処するのに、例えば、自然発生的なホスホジエステル結合が別の結合と置換されている、変化したヌクレオチド間結合を有する改変オリゴヌクレオチドの使用が可能である。例えば、Agrawal et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083は、ホスホルアミダートオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いた、ＨＩＶ-１の組織培養物における阻害の増加を示した。Sarin et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いた、ＨＩＶ-１の阻害の増加を示した。Agrawal et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7790-7794は、ヌクレオチド配列特異的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いて、初期感染細胞培養物および慢性感染細胞培養物の両方におけるＨＩＶ-１複製の阻害を示した。Leither et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、インフルエンザウイルス複製の組織培養物における阻害を報告した。
【００７７】
人工的な結合を有するオリゴヌクレオチドは、インビボにおいて分解に対する耐性を有することが示されている。例えば、Shaw et al (1991) in Nucleic Acids Res. 19, 747-750は、ヌクレアーゼがある特定のキャッピング構造により３’末端においてブロックされる場合に、未改変オリゴヌクレオチドがインビボにおいてヌクレアーゼに対してより耐性となること、および、キャッピングされていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがインビボにおいて分解されないことを報告している。
【００７８】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオシド（oligonucleoside phosphorothioate）を合成するＨ-ホスホネート法についての詳細な記述は、その教示が参照によって本明細書に援用されるAgrawal and Tang (1990) Tetrahedron Letters 31, 7541-7544に提供されている。メチルホスホネートオリゴヌクレオシド、ホスホロジチオエートオリゴヌクレオシド、ホスホルアミダートオリゴヌクレオシド、ホスフェートオリゴヌクレオシドエステル、架橋ホスホルアミダートオリゴヌクレオシドおよび架橋ホスホロチオエートオリゴヌクレオシドの合成は、当該技術分野において公知である。例えば、その教示が参照によって本明細書に援用される、Agrawal and Goodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539; Nielsen et al (1988) Tetrahedron Letters 29, 2911; Jager et al (1988) Biochemistry 27, 7237; Uznanski et al (1987) Tetrahedron Letters 28, 3401; Bannwarth (1988) Helv. Chim. Acta. 71, 1517; Crosstick and Vyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693; Agrawal et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405を参照されたい。合成または生産のための他の方法も可能である。リボ核酸（ＲＮＡ）配列を合成し適用してもよいが、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００７９】
本発明において有用なオリゴヌクレオチドは、内在性核酸分解酵素による分解に抵抗するように設計されるていることが好ましい。インビボにおけるオリゴヌクレオチド分解は、長さが減少したオリゴヌクレオチド分解産物を生成する。このような分解産物は、それらの完全長の対応物と比較して、非特異的なハイブリダイゼーションを起こすことが多く、有効であることが少ない。従って、身体内での分解に対し耐性を有し、標的細胞に到達することができるオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、ネイティブなホスホジエステル結合を一つまたは複数の内部人工ヌクレオチド間結合に置換することにより、例えば、結合内でリン酸を硫黄に置換することにより、インビボにおける分解に対する耐性をより高くすることができる。使用され得る結合の例としては、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、種々のホスホルアミダート、リン酸エステル、架橋ホスホロチオエートおよび架橋ホスホルアミダートが挙げられる。他のヌクレオチド間結合が当該技術分野において周知であるため、このような例は限定的ではなく、例示的なものである。リン酸ジエステルヌクレオチド間結合に取って代わるこれらの結合のうちの一つまたは複数を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において周知であり、例えば、混合されたヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを作製するための合成経路が挙げられる。
【００８０】
オリゴヌクレオチドは、「キャップ形成」によって、または同様の基を５’もしくは３’末端ヌクレオチドに組み入れることによって、内在性酵素による伸張に対して抵抗性にすることができる。キャップ形成のための試薬は、アプライドバイオシステムズ社（カリフォルニア州フォスターシティ）からＡｍｉｎｏ-Ｌｉｎｋ  ＩＩ（商標）として市販されている。キャップ形成のための方法は、例えば、Shaw et al (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750およびAgrawal et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(17), 7595-7599により記述されている。
【００８１】
オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼによる攻撃に対して抵抗性にするさらなる方法は、Tang et al (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735に記載されているように、オリゴヌクレオチドが「自己安定化」することである。自己安定化オリゴヌクレオチドは、それらの３’末端にヘアピンループ構造を有し、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび胎児ウシ血清による分解に対する耐性の増加を示す。オリゴヌクレオチドの自己安定化領域は相補的核酸とのハイブリダイゼーションに干渉せず、マウスにおける薬物動態および安定性試験は、オリゴヌクレオチドの直鎖状対応物に対して、自己安定化オリゴヌクレオチドのインビボ残留性の増加を示した。
【００８２】
前記薬剤がシトルリン化テネイシンＣに対する結合親和性を有する化合物である実施形態では、前記化合物は実質的に可逆的に、または実質的に不可逆的に、シトルリン化テネイシンＣの活性部位に結合し得る。さらなる例では、前記化合物は、リガンドまたは受容体へのシトルリン化テネイシンＣの結合を妨げるように、活性部位ではないシトルリン化テネイシンＣの一部に結合し得る。さらに別の例では、前記化合物は、アロステリック効果によってタンパク質の活性を低減するように、シトルリン化テネイシンＣの一部に結合し得る。このアロステリック効果は、シトルリン化テネイシンＣの活性の自然調節、例えば、「上流活性化配列」によるシトルリン化テネイシンＣの活性化、に関与しているアロステリック効果であり得る。あるいは、前記化合物は、シトルリン化テネイシンＣおよびＡＣＰＡの免疫複合体に結合し得る。
【００８３】
試験化合物とシトルリン化テネイシンＣとの間の相互作用を検出するための方法は当該技術分野において周知である。例えば、イオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法または他の物理的方法および分析法を用いた限外濾過が使用され得る。さらに、蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence Energy Resonance Transfer）（ＦＲＥＴ）法が使用され得、この方法では、２つの蛍光標識された独立体の結合性が、互いにすぐそばにある場合の蛍光標識同士の相互作用を測定することにより測定され得る。
【００８４】
高分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質およびリン脂質）に対するポリペプチドの結合性を検出する別の方法としては、例えばPlant et al., 1995, Analyt Biochem 226(2), 342-348に記載される、表面プラズモン共鳴アッセイが挙げられる。方法では、標識された（例えば放射性標識または蛍光標識を有する）ポリペプチドが利用される。
【００８５】
ポリペプチドに結合することが可能な化合物を特定するさらなる方法は、ポリペプチドが化合物に暴露され、前記ポリペプチドへの前記化合物のあらゆる結合が検出および／または測定される方法である。ポリペプチドに対する化合物の結合の結合定数が決定され得る。ポリペプチドへの化合物の結合を検出および／または測定（定量化）するのに適した方法は当業者に周知であり、例えば、ハイスループット操作（例えばチップを用いた方法）が可能な方法を用いて実行され得る。ＶＬＳＩＰＳ（商標）と呼ばれる新技術により、数十万以上の異なる分子プローブを含有する極小チップの生産が可能となった。これらの生物学的チップまたはアレイは、アレイ内に配列されたプローブを有し、各プローブには特定の位置が指定されている。各位置が例えば１０ミクロンの規模を有する生物学的チップが生産されている。前記チップを用いることで、標的分子がチップ上のプローブのいずれかと相互作用するかどうかを判定することができる。選択された試験条件下でアレイを標的分子に暴露した後、走査装置がアレイ内の各位置を調べ、標的分子がその位置のプローブと相互作用しているかどうかを判定し得る。
【００８６】
シトルリン化テネイシンＣに対して結合親和性を有する化合物を特定する別の方法は酵母ツーハイブリッド法であり、この方法では、本発明のポリペプチドを用いることで、シトルリン化テネイシンＣと結合するタンパク質を「捕捉」することができる。酵母ツーハイブリッド法はFields & Song, Nature 340:245-246 (1989)に記載されている。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態では、前記薬剤はシトルリン化テネイシンＣに対するリガンド結合能を有する化合物である。
【００８８】
例えば、前記薬剤は、シトルリン化テネイシンＣ受容体の可溶性断片（例えば、ＦＰＲＬ１）であり得る。あるいは、前記薬剤は、抗体を模倣した高親和性分子（いわゆる、「アフィボディ（affibody）」）であり得る（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号およびwww.affibody.seを参照）。これらのリガンドは、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する表面タンパク質）のＩｇＧ結合ドメインのうちの１つの足場に基づいた３ヘリックスバンドルから構成される、小さく単純なタンパク質である。この足場は親和性リガンドとして優れた性質を有しており、あらゆる所与の標的タンパク質に高い親和性で結合するように設計することができる。
【００８９】
本発明の第一の態様の薬剤は、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり得る。抗原結合性フラグメントは、Ｆｖフラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（単一型および二重型［すなわち、ｄＡｂ-リンカー-ｄＡｂ］を含むｄＡｂ）からなる群から選択され得る。
【００９０】
抗体またはその抗原結合性フラグメントは、シトルリン化テネイシンＣに特異的に結合する（すなわち、非シトルリン化テネイシンＣに結合しない）ことが好ましい。
【００９１】
抗体はＴＬＲ４を活性化するシトルリン化テネイシンＣのＦＢＧドメインに特異的に結合することが好ましい場合があり、および／または、抗体は、シトルリン化テネイシンＣの別のドメインに結合することが好ましい場合がある。特に、それらのドメインのうちの一つまたは複数がシトルリン化されている場合がある。
【００９２】
全長抗体（whole antibody）ではなく、抗体断片を使用することの利点は、幾重にもある。より小さな断片サイズは、固形組織のより良好な浸透等の薬理学的特性の向上をもたらし得る。さらに、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片等の抗原結合性フラグメントは大腸菌（E. coli）内で発現され、大腸菌から分泌され得ることから、大量の前記断片の容易な生産が可能である。
【００９３】
例えばポリエチレングリコールまたは他の適切な重合体の共有結合によって修飾された、抗体およびその抗原結合性フラグメントの修飾型も、本発明の範囲内に含まれる。
【００９４】
抗体および抗体断片を作製する方法は当該技術分野において周知である。例えば、抗体は、抗体分子のインビボにおける産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Orlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299）、または培養下の細胞株によるモノクローナル抗体分子の産生を採用するいくつかの方法のうちのいずれか１つによって作製され得る。これらの方法には、限定はされないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ）-ハイブリドーマ技術が含まれる（Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120）。
【００９５】
選択された抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、公知の技術、例えば、"Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988)および"    Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)で開示された技術によって、作製され得る。
【００９６】
抗体断片は当該技術分野において周知の方法を用いて得ることができる（例えば、Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照）。例えば、本発明による抗体断片は、抗体のタンパク分解性加水分解、または前記断片をコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物もしくは他のタンパク質発現系）における発現によって作製することができる。あるいは、抗体断片は、常法による全長抗体のペプシン分解またはパパイン分解によって得ることができる。
【００９７】
ヒトにおける治療または診断では、ヒト化抗体の使用が好ましいことは、当業者には理解されよう。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体由来の好ましくは最小部分を有する、遺伝子改変されたキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望の機能性を有するマウス、ウサギのラット（rat of rabbit）等の非ヒト種（ドナー抗体）の相補性決定領域に由来する残基によって置換された抗体が含まれる。ある場合では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入された相補性決定領域またはフレームワークの配列内にも存在しない残基を含んでいてもよい。概して、ヒト化抗体は、相補性決定領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のそれらに対応しており、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが関連ヒトコンセンサス配列のそれらに対応している、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体由来の、Ｆｃ領域等の抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る（例えば、Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596を参照）。
【００９８】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野において周知である。概して、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。しばしば移入残基（imported residue）と称されるこれらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には、移入された可変ドメインから取られる。ヒト化は基本的には、記述（例えば、Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536l；米国特許第４，８１６，５６７号を参照）の通りに、ヒト相補性決定領域を対応するげっ歯類相補性決定領域と置換することにより、実行することができる。従って、このようなヒト化抗体は、実質的にインタクトではないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかの相補性決定領域残基および場合によってはいくつかのフレームワーク残基がげっ歯類抗体内の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体であり得る。
【００９９】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野において公知の種々の技術を用いることで特定することもできる（例えば、Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95を参照）。
【０１００】
適切な抗体が得られた後、前記抗体は、例えばＥＬＩＳＡによって、活性について試験され得る。
【０１０１】
本発明の第一の態様の薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）もしくはＴｏｌｌ様受容体４の補助受容体、すなわちＦｃγ受容体、もしくはテネイシンＣまたはこれらのうちいずれかのそのドメインに対する特異性を有する、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり得る。
【０１０２】
ＴＬＲ４等の一次受容体に対する補助受容体は、リガンドの認識および結合を促進し、受容体結合から生じる生物学的プロセスを開始／維持するために、一次受容体へのシグナル伝達分子の結合を補助する。
【０１０３】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣのＦＢＧドメインに対する結合親和性を有する薬剤であり得る。
【０１０４】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣのＦＢＧドメインに対する特異性を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントであり得る。
【０１０５】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２番残基のうちの一つもしくは複数に対する結合親和性を有する、または、シトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番残基のうちの一つもしくは複数に対する結合親和性を有する、または、シトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５５、２０９、２１４、２１９、および２２０番残基のうちの一つもしくは複数に対する結合親和性を有する、薬剤であり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、５５番残基に対する結合親和性を有する薬剤であり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、２０９番残基に対する結合親和性を有する薬剤であり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、２１４番残基に対する結合親和性を有する薬剤であり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、２１９番残基に対する結合親和性を有する薬剤であり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、２２０番残基に対する結合親和性を有する薬剤であり得る。
【０１０６】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２番残基のうちの一つもしくは複数に対する特異性を有する、または、シトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番残基のうちの一つもしくは複数に対する特異性を有する、または、シトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５５、２０９、２１４、２１９、および２２０番残基のうちの一つもしくは複数に対する特異性を有する、抗体またはその抗原結合性フラグメントであり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、５５番残基に対する特異性を有する薬剤であり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、２０９番残基に対する特異性を有する薬剤であり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、２１４番残基に対する特異性を有する薬剤であり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、２１９番残基に対する特異性を有する薬剤であり得る。本発明の第一の態様の薬剤は、２２０番残基に対する特異性を有する薬剤であり得る。
【０１０７】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣのＦＢＧドメインの生物活性を調節する薬剤であり得る。前記薬剤は、シトルリン化テネイシンＣ他のドメインの生物活性に加えて、ＦＢＧドメインの生物活性を調節し得、あるいは、前記薬剤は、シトルリン化テネイシンＣのＦＢＧドメインのみの生物活性を調節し得る。
【０１０８】
本発明の第一の態様の薬剤は、ＦＢＧドメインにおいてシトルリン化されたシトルリン化テネイシンＣを調節し得る。調節されるシトルリン化テネイシンＣは、従って、テネイシンＣの一つまたは複数の（または全ての）他のドメインに加えて、ＦＢＧドメインにおいて、シトルリン化されている場合がある。シトルリン化テネイシンＣは、ＦＢＧドメインのみにおいてシトルリン化されている場合がある。あるいは、シトルリン化テネイシンＣは、ＦＢＧドメイン以外の一つまたは複数のドメインのみにおいてシトルリン化されている場合がある。言い換えれば、シトルリン化テネイシンＣは、シトルリン化ＦＢＧドメインではなく、テネイシンＣの一つもしくは複数または全ての他のドメインにおいてシトルリン化されている場合がある。シトルリン化され得るテネイシンＣの非ＦＢＧドメインの好ましい例は、フィブロネクチンＩＩＩ型様リピートである。
【０１０９】
本発明の第一の態様の薬剤は、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０、２２２番目の残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る、一つまたは複数の特定の残基においてシトルリン化されたシトルリン化テネイシンＣを調節し得る。あるいは、シトルリン化テネイシンＣまたはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数の断片は、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番目の残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る、一つまたは複数の特定の残基においてシトルリン化され得る。特定のシトルリン化残基は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５１を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５５を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１４を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２０を含み得る。別の実施形態では、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含み得る。あるいは、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２２を含み得る。
【０１１０】
特定のシトルリン化残基はエピトープであり得るか、またはエピトープ内に存在し得、このようなエピトープ内で検出され得る。例えば、前記エピトープは、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９およびＣＩＴ２２０；またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのシトルリン化残基を含み得る。前記エピトープは、ＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２０およびＣＩＴ２２２；またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのシトルリン化残基を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５０を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５１を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５５を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２０９を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１４を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１９を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２０を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２２を含み得る。
【０１１１】
本発明の第一の態様の薬剤は、シトルリン化テネイシンＣに対する結合特異性を有する自己抗体の生物活性を調節し得る。好ましい実施形態では、前記薬剤は、単独で、および／または自己抗体がシトルリン化テネイシンＣとの複合体の一部である場合に、シトルリン化テネイシンに対する結合特異性を有する自己抗体と結合する。
【０１１２】
シトルリン化テネイシンＣに対する結合特異性を有する自己抗体は、シトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２番残基のうちの一つもしくは複数に対する結合特異性を有し得る、または、シトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番残基のうちの一つもしくは複数に対する結合特異性を有し得る、または、シトルリン化テネイシンＣの配列番号７０において番号付けされた５５、２０９、２１４、２１９、および２２０番残基のうちの一つもしくは複数に対する結合特異性を有し得る。
【０１１３】
本発明の第二の態様において、シトルリン化テネイシンＣの活性を調節する薬剤を特定する方法が提供され、前記方法は以下の段階を含む：
（ｉ）  一つまたは複数の候補薬剤を用意すること；
（ｉｉ）  一つまたは複数の細胞をシトルリン化テネイシンＣおよび一つまたは複数の候補薬剤と接触させること；
（ｉｉｉ）  一つまたは複数の細胞をシトルリン化テネイシンＣと接触させ、候補薬剤とは接触させないこと；
（ｉｖ）  対照段階（ｉｉｉ）の細胞と比較して、前記候補薬剤が段階（ｉｉ）の一つまたは複数の細胞に対するシトルリン化テネイシンＣの効果を調節するかどうかを判定すること。
【０１１４】
候補薬剤がシトルリン化テネイシンＣの効果を調節するかどうかを判定する方法は、実施例の方法を用いて実行することができる。
【０１１５】
ＴＬＲ４またはあらゆる他の適切な受容体に結合しているテネイシンＣは、固相結合アッセイ、表面プラズモン共鳴、分析的ゲル濾過＋／-阻害剤によって試験することができる。テネイシンＣ／ＡＣＰＡ複合体の活性は、ＦＢＧ単独と同じ方法、および細胞＋／-阻害剤によるサイトカインの刺激についての試験を用いることで説明することができる。
【０１１６】
本発明の第二の態様の方法は、シトルリン化テネイシンＣの活性の上方制御をもたらし得る。
【０１１７】
本発明の第二の態様の方法は、シトルリン化テネイシンＣの活性の下方制御をもたらし得る。
【０１１８】
本発明の第二の態様の方法は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）および／またはＦｃγ受容体を発現する段階（ｉｉ）および（ｉｉｉ）（上記）の細胞を含み得る。
【０１１９】
本発明の第二の態様の方法は、炎症性細胞、線維芽細胞、線維芽細胞様細胞（例えば、滑膜細胞としても知られている、ＲＡ滑膜線維芽細胞）、マウス胎仔線維芽細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞からなる群から選択される一つまたは複数の細胞を有し得る。
【０１２０】
炎症性細胞は、マクロファージ、樹状細胞、単球、リンパ球、単球様細胞およびマクロファージ様細胞からなる群から選択され得る。
【０１２１】
本発明の第三の態様において、本発明の第二の態様の方法を実行することにより慢性炎症反応を調節する薬剤を特定するための方法が提供される。
【０１２２】
この方法では、慢性炎症は、不適切な炎症を伴うあらゆる状態と関連し得る。このような状態としては、限定はされないが、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性状態、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎および心血管疾患が挙げられる。
【０１２３】
特に（しかし非排他的に）興味深いのは、慢性炎症が関節リウマチ（ＲＡ）と関連している場合である。
【０１２４】
本発明の第四の態様において、本発明の第二および第三の態様の方法に従って特定された薬剤が提供される。このような薬剤は慢性炎症反応を調節し得る。
【０１２５】
第四の態様の薬剤は慢性炎症反応を下方制御し得る。
【０１２６】
第四の態様の薬剤は慢性炎症反応を上方制御し得る。
【０１２７】
第四の態様の薬剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）分子、低分子ヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、テネイシンＣに対する結合親和性を有する化合物、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）およびその抗原結合性フラグメント、小分子阻害化合物、ポリペプチド並びにタンパク質からなる群から選択され得る。
【０１２８】
本発明の第一または第四の態様では、慢性炎症は、不適切な炎症を伴うあらゆる状態と関連し得る。このような状態としては、限定はされないが、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性状態、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎および心血管疾患が挙げられる。
【０１２９】
本発明の第五の態様において、本発明の第一または第四の態様で定義される薬剤、並びに薬剤的に許容できる担体、賦形剤および／または希釈剤を含む、組成物が提供される。
【０１３０】
当業者には理解されることであるが、このような有効量の薬剤またはその製剤は、単回ボーラス投与（すなわち、急性投与）として、または、より好ましくは、長期の一連の投与（すなわち、慢性投与）として、送達され得る。
【０１３１】
本発明の薬剤は、使用されている化合物の有効性／毒性およびそれが使用されている適応症に応じて、種々の濃度で製剤化することができる。製剤は、本発明の薬剤を、０．１μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは１μＭ〜１００μＭ、５μＭ〜５０μＭ、１０μＭ〜５０μＭ、２０μＭ〜４０μＭ、最も好ましくは約３０μＭの濃度で含むことが好ましい。インビトロ適用においては、製剤はより低濃度（例えば０．００２５μＭ〜１μＭ）の本発明の化合物を含み得る。
【０１３２】
当業者には理解されることであるが、本発明の薬剤は、概して、予定された投与経路および標準的薬務に関して選択された適切な医薬品賦形剤  希釈剤または担体と混合して投与されることになる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USAを参照）。
【０１３３】
例えば、本発明の薬剤は、即効型、緩効型または徐放型の適用のために、香味剤または着色剤を含有していてもよい錠剤、カプセル剤、膣坐剤（ovules）、エリキシル剤、水剤または懸濁剤の形態で、経口投与、頬側投与または舌下投与することができる。本発明の薬剤は空洞内（intracavernosal）注射により投与されてもよい。
【０１３４】
このような錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシン等の賦形剤、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、グリコール酸デンプンナトリウム（sodium starch glycollate）、クロスカルメロースナトリウムおよびある種の複合ケイ酸塩等の崩壊剤、並びに、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシ-プロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシア等の造粒結合剤を含んでいてもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよび滑石等の滑沢剤が含まれていてもよい。
【０１３５】
同じような種類の固体組成物をゼラチンカプセル内の充填剤として使用してもよい。これに関して好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁剤および／またはエリキシル剤において、本発明の化合物は、種々の甘味剤もしくは芳香剤、着色剤または色素と、乳化剤および／または懸濁化剤と、並びに、水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン等の希釈剤並びにこれらの組合せと、組み合わされてもよい。
【０１３６】
本発明の薬剤は、非経口的に、例えば、静脈内、関節内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与することもでき、あるいは、本発明の薬剤は点滴法によって投与されてもよい。本発明の薬剤は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに充分な塩またはグルコースを含有していてもよい無菌水溶液の形態で、最も良好に使用される。前記水溶液は、必要であれば、適切に緩衝化（好ましくはｐＨ３〜９に）されるべきである。無菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。
【０１３７】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および製剤を予定受容者の血液と等張にする溶質を含有していてもよい水性および非水性の無菌注射液；並びに懸濁化剤および粘稠化剤を含んでいてもよい水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。製剤は単位投与または多回投与用の容器（例えば、密封されたアンプルおよびバイアル）内で提供されてもよく、使用の直前に無菌液体担体（例えば、注射用蒸留水）の添加のみを必要とする凍結乾燥された状態で貯蔵されてもよい。即席の注射液および懸濁液は、前述のような無菌の散剤、粒剤および錠剤から調製されてもよい。
【０１３８】
ヒト患者に対する経口投与および非経口投与において、本発明の薬剤の一日投与量レベルは、通常、成人１人当たり１〜１０００ｍｇ（すなわち、約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）となり、単一用量または分割用量で投与されることになる。
【０１３９】
本発明の薬剤は、鼻腔内に、または吸入によって投与することもでき、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロ-メタン、ジクロロテトラフルオロ-エタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば、１，１，１，２-テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３  もしくは１，１，１，２，３，３，３-ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素または他の適切な気体を用いて、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーから、ドライパウダー吸入器またはエアロゾルスプレー形（aerosol spray presentation）の形式で送達されることが好都合である。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達する弁を備えることにより、投与単位が決定されてもよい。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、例えば、エタノールおよび噴霧剤の混合物を溶媒として用いる活性化合物の溶液または懸濁液を含有していてもよく、さらに、滑沢剤（例えば、ソルビタントリオレエート）を含有していてもよい。吸入器または吹入れ器で用いるカプセル剤およびカートリッジ剤（例えば、ゼラチン製）は、本発明の化合物およびラクトースまたはデンプン等の適切な粉末基剤の混合粉末を含有するように処方されてもよい。
【０１４０】
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、各々の計量された用量または「ひと吹き」が患者への送達のために少なくとも１ｍｇの本発明の化合物を含有するように、準備されることが好ましい。エアロゾルによる全一日量が、患者によって異なり、単一用量で投与されてもよく、あるいは、より一般的に１日を通じた分割用量で投与されてもよいことは理解されよう。
【０１４１】
また、本発明の薬剤は座薬または膣坐薬の形態で投与することができ、あるいは、ローション剤、水剤、クリーム剤、軟膏剤または散布粉剤の形態で局所適用されてもよい。本発明の化合物はまた、例えば、皮膚用パッチ剤の使用により、経皮投与されてもよい。本発明の化合物はまた、経眼経路で投与されてもよい。
【０１４２】
眼用に、本発明の薬剤は、等張のｐＨ調整した無菌食塩水中の微粉化懸濁剤として、または、好ましくは、所望により塩化ベンザルコニウム（benzylalkonium chloride）等の保存剤と組み合わされた等張のｐＨ調整した無菌食塩水中の水剤として、製剤化することができる。あるいは、本発明の薬剤はワセリン等の軟膏剤中で製剤化されてもよい。
【０１４３】
皮膚への局所適用のために、本発明の薬剤は、例えば、以下のうちの一つまたは複数との混合物中に懸濁または溶解された本活性化合物を含有する適切な軟膏剤として製剤化することができる：ミネラルオイル、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水。あるいは、本発明の薬剤は、例えば、以下のうちの一つまたは複数の混合物中に懸濁または溶解された適切なローション剤またはクリーム剤として製剤化することができる：ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水。
【０１４４】
口内の局所投与に適した製剤としては、風味付けした基剤（通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガント）中に活性成分を含む菓子錠剤；不活性な基材（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）中に活性成分を含むパステル剤；並びに適切な液体担体中に活性成分を含む含嗽剤が挙げられる。
【０１４５】
前記薬剤がポリペプチドである場合、ミクロスフェア等の徐放性薬物送達システムを用いることが好ましい場合がある。これらは特に注射の頻度を減少させるように設計されている。このようなシステムの一例は、注射後に長期に亘ってゆっくりとｒｈＧＨを放出する生分解性ミクロスフェア中に組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を封入している、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔである。あるいは、本発明のポリペプチド剤は、必要な部位に薬剤を直接放出する外科的に埋め込まれた装置によって投与することができる。
【０１４６】
タンパク質およびポリペプチドの投与に、電気穿孔療法（ＥＰＴ）システムも使用することができる。パルス電場を細胞に送達する装置により、薬剤に対する細胞膜の透過性が増加され、その結果、細胞内薬物送達の有意な増強がもたらされる。
【０１４７】
タンパク質およびポリペプチドは電気的取り込み（electroincorporation）（ＥＩ）によって送達することもできる。ＥＩは、皮膚表面上の直径３０ミクロン以下の小粒子がエレクトロポレーションで使用される電気パルスと同一のまたは類似した電気パルスを受けた場合に起こる。ＥＩにおいて、これらの粒子は角質層を通過して皮膚のより深い層に駆り立てられる。前記粒子は、薬剤もしくは遺伝子を搭載する、または薬剤もしくは遺伝子で被覆することができ、あるいは、単純に、薬剤が進入することが可能な細孔を皮膚につくり出す「弾」として作用し得る。
【０１４８】
タンパク質およびポリペプチドの別の送達法は、温度感受性のＲｅＧｅｌ注射液である。ＲｅＧｅｌは、体温以下では注射可能な液体であるが、体温の温度では直ちに、公知の安全な生分解性高分子へとゆっくりと腐食および溶解するゲルレザバー（gel reservoir）を形成する。活性薬剤は、生体高分子が溶解するのに伴い長い時間をかけて送達される。
【０１４９】
タンパク質およびポリペプチドの医薬品は、経口的に送達することもできる。１つのそのような系は、身体におけるビタミンＢ１２を経口摂取するための自然プロセスを利用することで、タンパク質およびポリペプチドを共送達する。ビタミンＢ１２取り込み系に乗ることで、タンパク質またはポリペプチドは腸壁を通過することができる。ビタミンＢ１２類似体と薬剤との複合体が形成され、この複合体は、複合体のビタミンＢ１２部分において内因子（ＩＦ）に対する有意な親和性を、そして複合体の薬剤部分において有意な生理活性を同時に保持する。
【０１５０】
本発明のオリゴヌクレオチド薬剤またはポリヌクレオチド薬剤を投与するための方法はも、当該技術分野において周知である（Dass, 2002, J Pharm Pharmacol. 54(1):3-27;  Dass, 2001, Drug Deliv. 8(4):191-213;  Lebedeva et al., 2000, Eur J Pharm Biopharm. 50(1):101-19;  Pierce et al., 2005, Mini Rev Med Chem. 5(1):41-55;  Lysik & Wu-Pong, 2003, J Pharm Sci. 2003 2(8):1559-73;  Dass, 2004, Biotechnol Appl Biochem. 40(Pt 2):113-22;  Medina, 2004,  Curr Pharm Des. 10(24):2981-9を参照）。
【０１５１】
本発明の第五の態様の組成物は、少なくとも１つの他の薬剤をさらに含み得る。
【０１５２】
そのようなさらなる薬剤は抗炎症剤であり得、例えば、限定はされないが、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、スタチン（例えば、シンバスタチン等のＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤）、生物学的作用物質（生物学的製剤）、ステロイド、免疫抑制剤、サリチル酸および／または殺菌剤が挙げられる。非ステロイド系抗炎症剤としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート）および抗炎症性金薬剤（anti-inflammatory gold agent）（例えば、金チオリンゴ酸ナトリウム、金チオリンゴ酸塩または金塩（例えば、オーラノフィン））が挙げられる。生物学的製剤としては、抗ＴＮＦ剤（例えば、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、抗ＩＬ−１試薬、抗ＩＬ−６試薬、抗Ｂ細胞試薬（レトキシマブ（retoximab））、抗Ｔ細胞試薬（抗ＣＤ４抗体）、抗ＩＬ−１５試薬、抗ＣＬＴＡ４試薬、抗ＲＡＧＥ試薬）、抗体、可溶性受容体、受容体結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、変化もしくは減弱された機能を有する変異タンパク質、ＲＮＡｉ、ポリヌクレオチドアプタマー（aptemer）、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはω３脂肪酸が挙げられる。ステロイド類（副腎皮質ステロイドとしても知られている）としては、コルチゾン、プレドニゾロンまたはデキサメタゾンが挙げられる。免疫抑制剤としては、シクロスポリン（cylcosporin）、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸が挙げられる。サリチル酸系としては、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸コリンおよびサリチル酸マグネシウムが挙げられる。殺菌剤としては、キニーネおよびクロロキンが挙げられる。例えば、前記薬剤はＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、または免疫抑制剤のうちの一つまたは複数と組合せで投与され得る。
【０１５３】
本発明の第六の態様において、医薬として使用するための、本発明の第一、第四および第五の態様で定義された薬剤または組成物が提供される。
【０１５４】
本発明の第七の態様において、慢性炎症性状態の治療で使用するための、本発明の第一、第四および第五の態様で定義された薬剤または組成物が提供される。
【０１５５】
本発明の第八の態様において、慢性炎症性状態を治療するための薬剤の製造における、本発明の第一、第四および第五の態様で定義された薬剤または組成物の用途が提供される。
【０１５６】
本発明の第九の態様において、有効量の本発明の第一、第四および第五の態様で定義された薬剤または組成物を対象に投与することを含む、慢性炎症性状態を治療する方法が提供される。
【０１５７】
好ましい実施形態では、本発明の第六、第七、第八または第九の態様において定義された薬剤、組成物、用途または方法は、シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣに対する特異性を有する自己抗体を有する対象における慢性炎症性状態の治療に関する。
【０１５８】
対象が有するシトルリン化テネイシンＣおよび／または自己抗体は、前記対象に由来する血液、滑液および／または関節組織の試料中に存在し得る。
【０１５９】
シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣに対する特異性を有する自己抗体を「有する」とは、あらゆるシトルリン化テネイシンＣ、および／またはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片、および／またはシトルリン化テネイシンＣに対する特異性を有する自己抗体、並びに／またはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体が前記試料中で検出されることを意味する。
【０１６０】
ネイティブなテネイシンＣとは結合しないシトルリン化テネイシンＣに特異的な抗体を用いて、例えばＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロットによりイムノアッセイすることによって、対象がシトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片を有していることを特定することができる。血清または組織／細胞において、これは、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡであることが好ましく、すなわち、１つのシトルリン化テネイシンＣ（ｃｉｔＴＮＣ）Ａｂが捕捉体として使用され、次に血清／組織可溶化液が適切な希釈液として添加され、次に第二の異なるｃｉｔＴＮＣ抗体が添加されて、検出がなされる。第二の抗体は、あらゆる標準的なＥＬＩＳＡプロトコルと同様に、検出または間接的検出のために標識することができる。２つの異なる適切なｃｉｔＴＮＣ抗体を見つけられない場合、前記方法は、プレート上の血清／組織可溶化液およびこれに直接添加される抗体で構成される直接的ＥＬＩＳＡを利用する。あるいは、非シトルリン化ＴＮＣ抗体を捕捉に用い、シトルリン化ＴＮＣ抗体を検出に用いてもよく、その逆であってもよい。これにより、ネイティブなＴＮＣおよびシトルリン化ＴＮＣの比を決定することも可能となる。
【０１６１】
あるいは、テネイシンＣを免疫沈降した後に、ウェスタンブロッティングまたは質量分析を用いてテネイシンＣがシトルリン化されているかどうかを決定してもよい。
【０１６２】
実施例と同様にＲＡ血清を用いるウェスタンブロッティングによって、対象がシトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体を有していることを特定することができる。
【０１６３】
あるいは、ＴＮＣにおけるシトルリン化さた残基をより明確に定義した後、ペプチドアッセイ（上記のウエスタンブロット、および／または巨大なタンパク質には不可能なＥＬＩＳＡ法）を作成することができる。シトルリン化されたペプチドのみが作製され、対照としては、非シトルリン化ペプチドが作製される。プレートが適用されたペプチドおよびＲＡ血清で被膜され、抗体の検出に使用される（前記方法の詳細についてはLundberg(2008)を参照）。前記アッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２番残基を含む群のいずれかから選択されるシトルリン化残基；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）を含むあらゆるテネイシンＣペプチドを含み得る。前記アッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番残基を含む群のいずれかから選択されるシトルリン化残基；またはこれらの組合せをを含むあらゆるテネイシンＣペプチドを含み得る。一実施形態において、前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。別の実施形態において、前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ５０を含み得る。別の実施形態において、前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ５１を含み得る。別の実施形態において、前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ５５を含み得る。前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ２０９を含み得る。前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ２１４を含み得る。前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ２１９を含み得る。前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ２２０を含み得る。あるいは、前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含み得る。あるいは、前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。あるいは、前記ペプチドはシトルリン化残基ＣＩＴ２２２を含み得る。上記ペプチドの組合せを１つのプール内で使用してもよい。同じ配列の等価な非シトルリン化ペプチドがアッセイ対照として使用され得る。
【０１６４】
ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、例えば抗体認識を補助するために、輪状すなわち環状構造であってもよい。
【０１６５】
ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、ＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ７２、ＣＩＴ１２０、ＣＩＴ１６９、ＣＩＴ１７３、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２０およびＣＩＴ２２２から選択される一つまたは複数のシトルリン化残基；またはこれらの組合せを有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。あるいは、ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ７２、ＣＩＴ１２０、ＣＩＴ１６９、ＣＩＴ１７３、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、およびＣＩＴ２２０から選択される一つまたは複数のシトルリン化残基；またはこれらの組合せを有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ５０を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ５１を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ５５を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ７２を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ１２０を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ１６９を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ１７３を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ２０９を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ２１４を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ２１９を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ２２０を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドまたはその断片は、シトルリン化残基ＣＩＴ２２２を有する配列番号７０の一部の配列を含み得る。互いに対し異なるシトルリン化残基を有する、配列番号７０の２つ以上の異なる断片を使用してもよい。配列番号７０の断片または配列に対する言及には、その異型が含まれ得る。例えば異型は、配列番号７０由来の配列と、さらに追加のアミノ酸残基または修飾を有し得る。
【０１６６】
シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約５〜約２５の連続アミノ酸残基を含み得る。シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約１０〜約２５の連続アミノ酸残基を含み得る。シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約１５〜約２５の連続アミノ酸残基を含み得る。シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約１８〜約２２の連続アミノ酸残基を含み得る。シトルリン化テネイシンＣペプチドまたは配列番号７０の一部の配列は、約８〜約２０の連続アミノ酸残基を含み得る。
【０１６７】
例えば、ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３および配列番号６４を含む群のいずれかから選択されるペプチド配列；またはその異型および／またはその組合せを含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号５５のペプチド配列またはその異型を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号５７のペプチド配列またはその異型を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号５９のペプチド配列またはその異型を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号６１のペプチド配列またはその異型を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号６３のペプチド配列またはその異型を含み得る。ペプチドアッセイで使用されるシトルリン化テネイシンＣペプチドは、配列番号６４のペプチド配列またはその異型を含み得る。
【０１６８】
試料中のシトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つまたは複数の断片の存在、および所望によりレベルは、イムノアッセイ、分光法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、スロットもしくはドットブロットアッセイ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗体マイクロアレイ免疫組織学的染色、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フルオロイムノアッセイ、アビジン−ビオチン系もしくはストレプトアビジン（streptoavidin）−ビオチン系を用いるイムノアッセイ等を含む群のいずれかまたはこれらの組合せの使用を含み得る、あらゆる適切なアッセイにより測定され得る。これらの方法は当業者に周知である。
【０１６９】
本発明の第六、第七、第八または第九の態様において定義された薬剤、組成物、用途または方法は、不適切な炎症を伴うあらゆる状態と関連した慢性炎症性状態の治療に関し得る。このような状態としては、限定はされないが、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性状態、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎および心血管疾患が挙げられる。
【０１７０】
本発明の第十の態様において、本発明の第二の態様の方法を実行するためのパーツキットが提供され、前記パーツキットは以下を含む：
（ｉ）  一つまたは複数の細胞
（ｉｉ）  一つまたは複数の細胞の対照試料
（ｉｉｉ）  シトルリン化テネイシンＣの試料
（ｉｖ）  それらの使用のための説明書。
【０１７１】
本発明の第十の態様のキットは、所望により以下を含み得る：
（ｖ）  候補薬剤。
【０１７２】
本発明の第十の態様のキットは、所望により以下をさらに含み得る：
（ｖｉ）  シトルリン化テネイシンＣ活性または慢性炎症に対する候補薬剤の効果を判定する手段。
【０１７３】
本発明の第十一の態様において、以下を含むパーツキットが提供される：
（ｉ）  本発明の第一、第四または第五の態様で定義された薬剤または組成物
（ｉｉ）  投与手段
（ｉｉｉ）  それらの使用のための説明書。
【０１７４】
本発明の第十一の態様のキットは、所望により以下をさらに含み得る：
（ｉｖ）  少なくとも１つの他の薬剤。
【０１７５】
本発明の第十二の態様において、（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片；並びに／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の有無に基づく、慢性炎症性状態を有する対象に対する適切な治療を決定する方法が提供される。
【０１７６】
一実施形態では、第十二の態様の方法は、
（ｉ）対象に由来する試料を準備する段階；
（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片、並びに／またはシトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の存在について試料を試験する段階
を含み、前記方法では、シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片、並びに／またはシトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の有無によって適切な治療が決定される。
【０１７７】
別の実施形態では、第十二の態様の方法は、シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片、並びに／またはシトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の存在について、対象由来の試料を試験することを含み、シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片、並びに／またはシトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の有無によって適切な治療が決定される。
【０１７８】
好ましい実施形態では、試料は、対象に由来する血液、滑液および／または関節組織の試料である。
【０１７９】
好ましい実施形態では、シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片、並びに／またはシトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の存在によって、対象が本発明の第一、第四および第五の態様で定義された有効量の薬剤または組成物を投与されるべきであることが判定される。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、前記方法は、炎症性疾患を有する対象に対する適切な治療を決定するためのものである。
【０１８１】
一実施形態では、前記方法は、
（ｉ）対象に由来する試料を準備する段階；並びに
（ｉｉ）（ｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片；並びに／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の存在について試料を試験する段階
を含み、シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片；並びに／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の有無によって、適切な治療が示される。
【０１８２】
好ましい実施形態では、シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片；並びに／または（ｉｉ）シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の存在によって、対象が有効量の薬剤または組成物を投与されるべきであるかどうかが判定され、前記薬剤または組成物は、抗ＴＮＦ剤；抗ＩＬ１７療法；Ｔ細胞同時刺激修飾薬（例えば、Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）-アバタセプト）：インターロイキン−６（ＩＬ−６）阻害剤（例えば、Ａｃｔｅｍｒａ（商標）-トシリズマブ）；抗ＣＤ２０抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）-リツキシマブ（rituxumab）；Ｂ細胞活性化因子（例えば、抗ＢＡＦＦ）；ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の阻害剤（例えば、Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ（商標））；脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の阻害剤（例えば、Ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂ（商標））；抗ＴＮＣ抗体またはシトルリン化テネイシンＣドメインに対する抗体、並びにシトルリン化テネイシンＣおよび／または非シトルリン化テネイシンＣの生物活性を調節する薬剤のうちの一つまたは複数であり得る。
【０１８３】
本発明の第十三の態様において、慢性炎症性状態を有する対象に対する適切な治療を決定する方法で使用するための、シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片が提供される。
【０１８４】
本発明の第十四の態様において、慢性炎症性状態を有する対象に対する適切な治療を決定する方法で使用するための、シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体が提供される。
【０１８５】
本発明の第十二、第十三または第十四の態様の好ましい実施形態では、適切な治療は、本発明の第一、第四および第五の態様で定義された有効量の薬剤または組成物の投与である。好ましい実施形態では、シトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片、並びに／またはシトルリン化テネイシンＣおよび／もしくはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の存在によって、施行されるべき適切な治療が決定される。
【０１８６】
本発明の第十二、第十三または第十四の態様で定義された方法、シトルリン化テネイシンＣ、シトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片または自己抗体は、不適切な炎症を伴うあらゆる状態と関連した慢性炎症性状態の適切な治療の決定に関連し得る。このような状態としては、限定はされないが、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性状態、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、非治癒性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン症候群、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（例えば、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythrematosus））、喘息、線維性疾患（例えば、肝硬変）、肺線維症、ＵＶダメージ、乾癬、強直性脊椎炎および心血管疾患が挙げられる。
【０１８７】
本発明の方法、キット、アッセイまたは装置において、シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片の有無またはレベルの検出は、一つまたは複数の特定のシトルリン化残基を含むテネイシンＣまたはその断片の検出を含み得る。特定のシトルリン化残基は、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２番残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る。あるいは、特定のシトルリン化残基は、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番目の残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る。特定のシトルリン化残基は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５１を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５５を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１４を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２０を含み得る。別の実施形態では、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含み得る。あるいは、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。
【０１８８】
特定のシトルリン化残基はエピトープであり得るか、またはエピトープ内に存在し得、このようなエピトープ内で検出され得る。例えば、前記エピトープは、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９およびＣＩＴ２２０；またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのシトルリン化残基を含み得る。前記エピトープは、ＣＩＴ５０、ＣＩＴ５１、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、ＣＩＴ２２０およびＣＩＴ２２２；またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのシトルリン化残基を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５０を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５１を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ５５を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２０９を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１４を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２１９を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２０を含み得る。前記エピトープはシトルリン化残基ＣＩＴ２２２を含み得る。
【０１８９】
本発明の方法、キット、アッセイまたは装置において、シトルリン化テネイシンＣおよび／またはシトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片に対する特異性を有する自己抗体の有無またはレベルの検出は、一つまたは複数の特定のシトルリン化残基を含むエピトープに対し特異的な親和性を有する自己抗体の検出を含み得る。特定のシトルリン化残基は、５０、５１、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、２２０および２２２番残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る。あるいは、特定のシトルリン化残基は、５５、７２、１２０、１６９、１７３、２０９、２１４、２１９、および２２０番目の残基を含む群のいずれか；またはこれらの組合せ（配列番号７０から決定される残基番号）から選択され得る。特定のシトルリン化残基は、ＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９、ＣＩＴ２１４、ＣＩＴ２１９、および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５１を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ５５を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１４を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２０を含み得る。別の実施形態では、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２０９および／またはＣＩＴ２１４を含み得る。あるいは、特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２１９および／またはＣＩＴ２２０を含み得る。特定のシトルリン化残基はＣＩＴ２２２を含み得る。
【０１９０】
本発明の態様を具体化している実施例は、以下の図面を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１−１】テネイシンＣ欠損マウスにおける急性炎症の回復促進。（ａ）ザイモサン注射後の、経時的な、野生型（＋／＋）マウス（白いバー）およびテネイシンＣヌル（−／−）マウス（黒いバー）における足膨張。データは、注射前の足直径と比較した足直径の平均増加＋／−ＳＥＭ（遺伝子型当たりｎ＝２４のマウス）として示されている。＊＊＝ｐ＜０．０１。（ｂ〜ｅ）ヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシン（ｂ、ｄ）並びにサフラニンＯ（ｃ、ｅ）で染色された、ザイモサン注射から４日後の野生型マウス（ｂ、ｃ）およびテネイシンＣヌルマウス（ｄ、ｅ）から得られた、代表的な足首関節切片。囲み部分は、関節滑膜（ｓ）および軟骨プロテオグリカン（ｃｐ）を強調している。拡大率は１０倍である。野生型マウス（白いバー）およびテネイシンＣヌルマウス（黒いバー）から得られた、ザイモサン注射から４日後の膝関節における関節炎（ｆ）および軟骨細胞死（ｇ）の定量化。データは、平均値（＋／−ＳＤ）（遺伝子型当たりｎ＝２４のマウス）として表される。＊＝ｐ＜０．０５。
【図１−２】同上。
【図２】滑膜炎は抗原注射後にテネイシンＣ欠損マウスにおいて誘導される。（ａ〜ｂ、ｇ）偽の注射を行った野生型マウスの膝関節の代表的な切片。（ｃ〜ｆ、ｈ〜ｉ）ｍＢＳＡの関節内注射から２４時間後の、野生型マウス（ｃ、ｄ、ｈ）またはテネイシンＣヌルマウス（ｅ、ｆ、ｉ）の膝関節の代表的な切片。野生型およびテネイシンＣヌルマウスの両方の被膜、半月板および関節隙における炎症性細胞浸潤が、それぞれ、（ｃａｐ）、（Ｍ）および（Ｊ）によって強調されている。（Ｓ）は、骨表面全体に沿ってわずか１〜３細胞厚である、偽の注射を行ったマウスの健常な滑膜を強調しており、（ＳＴ）は、共に有意に肥厚した野生型マウスおよびテネイシンＣヌルマウスの滑膜を強調している。切片は、ヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシン（ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｈ、ｉ）並びにサフラニンＯ（ｂ、ｄ、ｆ）で染色されている。拡大率は、１０倍（ａ〜ｆ）または４０倍（ｇ〜ｉ）である。（遺伝子型当たりｎ＝５のマウス）。
【図３】滑膜炎はテネイシンＣ欠損マウスにおいて急速に鎮静する。ｍＢＳＡの関節内注射から３日後の、野生型マウス（ａ、ｂ、ｆ）またはテネイシンＣヌルマウス（ｃ、ｄ、ｅ）の膝関節の代表的な切片。（ａ、ｃ）線は、テネイシンＣヌルマウスと比較した、野生型マウスにおける被膜の炎症の増加を強調している。（ｂ、ｄ）（ｃｐ）は、テネイシンＣヌルマウスと比較した、野生型マウスにおける軟骨プロテオグリカン損失の増加を強調している。（ｅ、ｆ）有意な滑膜過形成（線）、関節隙における細胞およびフィブリンの沈着（矢印）並びにパンヌス浸潤（矢頭）が、テネイシンＣヌルマウスと比較して、野生型マウスにおいて観察される。切片はヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシン（ａ、ｃ、ｅ、ｆ）並びにサフラニンＯ（ｂ、ｄ）で染色されている。拡大率は１０倍（ａ〜ｄ）または２０倍（ｅ〜ｆ）である。（遺伝子型当たりｎ＝５のマウス）。
【図４−１】テネイシンＣ欠損マウスは抗原誘導性関節炎の間の組織破壊から保護される。（ａ〜ｂ）ヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシン（ａ）並びにサフラニンＯ（ｂ）で染色された、ｍＢＳＡの関節内注射から７日後の野生型マウスの膝関節の代表的な切片。拡大率は１０倍である。（遺伝子型当たりｎ＝２４のマウス）。矢頭は骨びらんの領域を強調している。矢印は関節軟骨内へのパンヌス浸潤を強調している。（ｃ〜ｄ）ヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシン（ｃ）並びにサフラニンＯ（ｄ）で染色された、ｍＢＳＡの関節内注射から７日後のテネイシンＣヌル型マウスの膝関節の代表的な切片。拡大率は１０倍である。（遺伝子型当たりｎ＝２４のマウス）。Ｊは無処置の関節軟骨における関節隙およびＡＣを強調している。（ｅ）野生型マウス（白いバー）およびテネイシンＣヌルマウス（黒いバー）から得られた、ｍＢＳＡ注射から２４時間後、３日後および７日後の膝関節炎の組織学的スコア（histological score）。データは平均値＋／−ＳＤ（遺伝子型当たりｎ＝５（２４時間、３日）または遺伝子型当たりｎ＝２４（７日））を表す。（ｆ）野生型マウス（白いバー）およびテネイシンＣヌルマウス（黒いバー）から得られた膝関節におけるｍＢＳＡ注射後の軟骨細胞死、軟骨表面びらんおよび骨びらんの定量化。軟骨細胞死は２４時間、３日および７日の時点で示され、軟骨表面びらんおよび骨びらんは７日の時点で示される。データは平均値＋／−ＳＤ（遺伝子型当たりｎ＝５（２４時間、３日）または遺伝子型当たりｎ＝２４（７日））を表す。
【図４−２】同上。
【図５−１】テネイシンＣは初代ヒトマクロファージおよびＲＡ滑膜線維芽細胞においてＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８の合成を誘導する。（ａ〜ｂ）初代ヒトマクロファージ（ａ）およびＲＡ滑膜線維芽細胞（ｂ）を、非刺激（添加無し）、またはＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ（ａ）もしくは１０ｎｇ／ｍｌ（ｂ））もしくは組換えテネイシンＣ（１．０μＭ〜１．０ｎＭ）で２４時間刺激した。示されるデータは、３つの代表的な実験のうちの１つから得られた、トリプリケートの値の平均値（＋／−ＳＤ）である。（ｃ）初代ヒトマクロファージを、非刺激（添加無し）、またはＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）もしくは組換えテネイシンＣ（１．０μＭ）で２４時間刺激した。（−）は、細胞を培地のみでプレインキュベートしたことを示す。（Ｐ）細胞を、刺激前に、２５μｇ／ｍｌのポリミキシンＢと一緒に３０分間プレインキュベートした。（Ｈ）細胞を、添加無しの培地、または細胞への添加前に１５分間煮沸されたＬＰＳもしくはテネイシンＣを含有する培地と一緒にインキュベートした。示されるデータは、３つの代表的な実験のうちの１つから得られた、トリプリケートの値の平均値（＋／−ＳＤ）である。
【図５−２】同上。
【図６−１】テネイシンＣのＦＢＧドメインはインビボおよびインビトロにおいてサイトカイン合成の刺激を仲介する。（ａ）初代ヒトマクロファージを、非刺激（添加無し）、またはＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）、組換えテネイシンＣ（ＴＮＣ）もしくは１．０μＭのテネイシンＣドメイン（ＴＡ、ＥＧＦ−Ｌ、ＴＮＩＩＩ１〜５、ＴＮＩＩＩ１〜３、ＴＮＩＩＩ３〜５、ＴＮＩＩＩ５〜７、ＴＮＩＩＩ６〜８およびＦＢＧ）で２４時間刺激した。示されるデータは、３つの代表的な実験のうちの１つから得られた、トリプリケートの値の平均値（＋／−ＳＤ）である。（ｂ）ＲＡ滑膜細胞を、非刺激（添加無し）、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）もしくは組換えＦＢＧ（１．０〜０．０１μＭ）と一緒に２４時間刺激した。示されるデータは、５人の異なる患者から得られた、非刺激細胞と比較したサイトカインレベルの平均％変化（＋／−ＳＥＭ）である。（ｃ〜ｈ）ＰＢＳ（ｃ〜ｅ）または１μｇのＦＢＧ（ｆ〜ｈ）の関節内注射から３日後の、野生型マウスの膝関節の代表的な切片。切片はヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシン（ｃ、ｄ、ｆ、ｇ）またはサフラニンＯ（ｅ、ｈ）で染色されている。拡大率は１０倍（ｃ、ｆ）または２５倍（ｄ、ｅ、ｇ、ｈ）である（遺伝子型当たりｎ＝５のマウス）。（ｉ）ＰＢＳ（黒いバー）または１μｇのＦＢＧ（白いバー）の関節内注射から３日後の、野生型マウスの膝関節における関節炎、骨びらん、軟骨表面びらんおよび軟骨細胞死の定量化。データは平均値＋／−ＳＤ（遺伝子型当たりｎ＝５）を表す。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図７】ＦＢＧ介在性のサイトカイン合成はＭｙＤ８８依存的である。（ａ）ヒトＲＡ滑膜線維芽細胞を、非感染、ＧＦＰのみを発現するアデノウイルス（ＡｄＧＦＰ）に感染、またはドミナントネガティブなＭｙＤ８８を発現するアデノウイルス（ＡｄＭｙＤ８８ｄｎ）に感染させた。細胞を、２４時間、非刺激、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激、またはＦＢＧ（１μＭ）で刺激した。示されるデータは３つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。（ｂ）野生型（＋／＋）マウスまたはＭｙＤ８８欠損（−／−）マウスから単離したマウス胎仔線維芽細胞を、非刺激（−）、またはＰＡＭ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１（５ｎｇ／ｍｌ）およびＦＢＧ（１μＭ）で２４時間刺激した。示されるデータは３つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。
【図８−１】ＦＢＧ介在性のサイトカイン合成はＴＬＲ４依存的であるが、ＣＤ１４もＭＤ−２も必要としない。（ａ）初代ヒトマクロファージを、培地単独、またはＴＬＲ２に対する機能阻害抗体（１０μｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ４に対する機能阻害抗体（２５μｇ／ｍｌ）もしくはアイソタイプ対照抗体（２５μｇ／ｍｌ）を含有する培地と一緒に、刺激前に３０分間プレインキュベートした。細胞を、非刺激、またはＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）、ＦＢＧ（１μＭ）もしくはＰＡＭ３（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。示されるデータは３つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。（ｂ）野生型マウス、ＴＬＲ２欠損マウス（ＴＬＲ２−／−）またはＴＬＲ４欠損マウス（ＴＬＲ４−／−）から単離したマウス胎仔線維芽細胞を、非刺激、またはＰＡＭ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１（５ｎｇ／ｍｌ）およびＦＢＧ（１μＭ）で２４時間刺激した。示されるデータは３つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。（ｃ）野生型マウス、ＴＬＲ２欠損マウス（ＴＬＲ２−／−）またはＴＬＲ４欠損マウス（ＴＬＲ４−／−）から単離した骨髄由来マクロファージを、非刺激、またはＰＡＭ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）もしくはＦＢＧ（１μＭ）で２４時間刺激した。示されるデータは３つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。（ｄ）ヒトマクロファージを、阻害剤無し、１μｇ／ｍｌのｍｓｂＢ  ＬＰＳまたは１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１４抗体と一緒に３０分間プレインキュベートし、その後、ＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）、ＦＢＧ（１μＭ）またはＰＡＭ３（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。示されるデータは３つの独立した実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）である。
【図８−２】同上。
【図９】ザイモサン注射後の経時的な足膨張。注射無しのテネイシンＣヌルマウス（ａ、ｅ）（直径１．６ｍｍ）、ザイモサン注射から２４時間後（ｄ、ｆ）（直径２．５ｍｍ）および４日後（ｂ、ｈ）（直径１．７ｍｍ）のテネイシンＣヌルマウス、並びにザイモサン注射から４日後の野生型マウス（ｃ、ｇ）（直径２．１ｍｍ）の足の代表的な画像。
【図１０】組換えタンパク質の合成。（ａ）集合ドメイン（ＴＡ）、１４および半分のＥＧＦ様リピート（ＥＧＦ−Ｌ）、１７のフィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（ＴＮＩＩＩ）（恒常的に発現される８つ（１〜８）および代わりにスプライシングされ得る９つ）、並びにフィブリノーゲン様球（ＦＢＧ）を含む、様々なドメインを含むテネイシンＣ単量体のドメイン構造。（ｂ）合成された組換えタンパク質によって覆われた領域、対応するアミノ酸残基、並びに各タンパク質の分子量。
【図１１】タンパク質純度の分析。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された、１μｇの各組換えタンパク質を示す、銀染色されたゲル。レーン：１（ＴＡ）、２（ＥＧＦ−Ｌ）、３（ＴＮＩＩＩ１〜５）、４（ＴＮＩＩＩ５〜７）、５（ＴＮＩＩＩ６〜８）、６（ＴＮＩＩＩ１〜３）、７（ＴＮＩＩＩ３〜５）および８（ＦＢＧ）。
【図１２】ＦＢＧ介在性関節炎には、インビボにおいてＴＬＲ４の発現を必要とする。１μｇのＦＢＧの関節内注射から３日後のＴＬＲ２ヌルマウス（ａ）およびＴＬＲ４ヌルマウス（ｂ）の膝関節の代表的な切片。切片はヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシンで染色されている。倍率は１０倍である（遺伝子型当たりｎ＝５のマウス）。（ｃ）１μｇのＦＢＧの関節内注射から３日後のＴＬＲ２ヌルマウス（白いバー）およびＴＬＲ４ヌルマウス（黒いバー）の膝関節における、関節炎、骨びらん、軟骨表面びらんおよび軟骨細胞死の定量化。データは平均値＋／−ＳＤ（遺伝子型当たりｎ＝５）を表す。
【図１３】ヒトテネイシンＣおよびそのドメインのアミノ酸配列
【図１４−１】ヒトテネイシンＣのヌクレオチド配列
【図１４−２】同上。
【図１４−３】同上。
【図１５】特異的なＦＢＧペプチドに応答したＴＮＦ合成。添加無しまたは１００μＭの各ＦＢＧペプチド（Ｐ１、Ｐ３〜Ｐ９）と一緒に２４時間インキュベートされたＲＡ膜培養物によるＴＮＦ合成。
【図１６】種々の濃度の特異的なＦＢＧペプチドに応答したＴＮＦおよびＩＬ８の合成。添加無しまたは２５、１００もしくは２５０μＭのＦＢＧペプチドと一緒に２４時間インキュベートされたＲＡ膜培養物によるＴＮＦおよびＩＬ８の合成。
【図１７】ＬＰＳ、全ＦＢＧドメインまたは特異的なＦＢＧペプチドに応答したＩＬ８合成。添加無し、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、１μＭの全ＦＢＧドメイン（ＦＢＧ）または１もしくは２０μＭのＦＢＧペプチド（Ｐ１、Ｐ３〜Ｐ９）と一緒に２４時間インキュベーションした後の、マクロファージによるＩＬ８合成。
【図１８】ＦＢＧペプチドと一緒にプレインキュベーションした後のＬＰＳおよびＦＢＧに応答したＩＬ８およびＴＮＦの合成。２０μＭのＦＢＧペプチドとのプレインキュベーション有りまたは無しで、添加無し、１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは１μＭ全ＦＢＧドメイン（ＦＢＧ）と一緒に２４時間インキュベーションした後の、マクロファージによるＴＮＦおよびＩＬ８の合成。
【図１９】テネイシンＣ標的化ｓｉＲＮＡに応答したＩＬ８およびＴＮＦの合成。ルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ（対照）、またはテネイシンＣ標的化ｓｉＲＮＡ：オリゴ１（ｓｉ１）、オリゴ２（ｓｉ２）もしくはオリゴ１＋２の組合せ（ｓｉ１＋２）を形質移入されたＲＡ線維芽細胞におけるテネイシンＣのｍＲＮＡレベル。２４時間の１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下または非存在下における、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（対照）またはテネイシンＣ標的化オリゴ１＋２（ｓｉＲＮＡ）の組合せを形質移入されたＲＡ線維芽細胞におけるＩＬ６合成。
【図２０】精製されたフィブリノーゲンおよびＦＢＧはインビトロにおいてシトルリン化することができる。無修飾のままである（レーン２、６）、またはシトルリン化緩衝液、ＰＡＤおよびＣａＣｌとのインキュベーションによりシトルリン化された（レーン３、７）、精製されたフィブリノーゲン（レーン２〜５）およびＦＢＧ（レーン６〜９）を示す、クーマシー染色したゲル。このタンパク質のＭＷ増加の観察によって、フィブリノーゲンのシトルリン化を確認した。しかし、ＦＢＧのサイズ変化はそれほど明白ではなかった。ＣａＣｌ非存在下でＰＡＤと一緒のタンパク質のインキュベーションも、ＰＡＤ非存在下でＣａＣｌと一緒のタンパク質のインキュベーションも、タンパク質サイズに影響を与えなかった（レーン４、５および８、９）。
【図２１】精製された完全長テネイシンＣはインビトロにおいてシトルリン化することができる。無修飾のままである（レーン９）、またはシトルリン化緩衝液、ＰＡＤおよびＣａＣｌとのインキュベーションによりシトルリン化された（レーン６）、精製された完全長テネイシンＣを示す、クーマシー染色したゲル。このタンパク質のＭＷ増加の観察によって、テネイシンＣのシトルリン化を確認した。ＣａＣｌ非存在下でＰＡＤと一緒のテネイシンのインキュベーションも、ＰＡＤ非存在下でＣａＣｌと一緒のテネイシンのインキュベーションも、タンパク質サイズに影響を与えなかった（レーン７、８）。精製されたフィブロネクチンはローディングコントロールとして含まれた（レーン２）。
【図２２】ＦＢＧおよびＴＮＣのシトルリン化のウエスタンブロットによる確認。ＡＭＣ検出キットを用いてプローブされた、ネイティブＴＮＣおよびシトルリン化ＴＮＣ（レーン８、９）並びにネイティブＦＢＧおよびシトルリン化ＦＢＧ（レーン４、５）のウエスタンブロット。ネイティブフィブロネクチンおよびシトルリン化フィブロネクチン（レーン２、３）、ネイティブフィブリノーゲンおよびシトルリン化フィブリノーゲン（レーン６、７）並びにネイティブエノラーゼおよびシトルリン化エノラーゼ（レーン１１、１０）を、シトルリン化されていることが知られている正の対照として含んだ。
【図２３】ＦＢＧはインビトロにおいてＰＡＤによりシトルリン化される。精製された組換えＦＢＧを、インビトロにおいて、異なる濃度（ｍｇタンパク質当たり２、７および２０ユニット）の、シトルリン化緩衝液（１００ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ）中のウサギＰＡＤ２、ヒトＰＡＤ２およびヒトＰＡＤ４と一緒に、３７℃で３時間、８時間および２４時間インキュベートすることにより、シトルリン化した。負の対照として、ＦＢＧ−Ｃを、カルシウムを含まない（−Ｃａ２＋）または酵素を含まない（−ＰＡＤ）シトルリン化緩衝液中でインキュベートした。（Ａ）１μｇの各試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、クマシー・ブルーで染色した。ＰＡＤによりシトルリン化されたＦＢＧは、非シトルリン化ＦＢＧよりもわずかに高い分子量に移動する。（Ｂ）タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、化学修飾ミックス（０．０１２５％ＦｅＣｌ３、２．３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４、１．５２Ｍ  Ｈ３ＰＯ４、０．２５Ｍ酢酸、０．２５％２，３−ブタンジオンモノキシム、０．１２５％アンチピリン）中でインキュベートした。シトルリン化タンパク質を、抗修飾シトルリン特異的抗体を用いて検出した。
【図２４】シトルリン化は、ＦＢＧによって刺激されたサイトカイン産生を増強する。非刺激のままである（ＵＮ）または０．１〜１．０μＭ非シトルリン化ＦＢＧ（ｎＦＢＧ）もしくはシトルリン化ＦＢＧ（ｃＦＢＧ）で刺激された初代ヒトマクロファージにおけるＴＮＦ合成。シトルリン化緩衝液単独（ＣＩＴ）およびＰＡＤを含有する緩衝液（ＣＩＴ＋ＰＡＤ）を対照として含んだ。ＰＡＤ非存在下でシトルリン化緩衝液と一緒に、またはカルシウム非存在下でＰＡＤと一緒にインキュベートされたＦＢＧは、シトルリン化されず、サイトカイン合成の増強を示さなかった（図示せず）。
【図２５】ウエスタンブロットにより、５０人中１０人のＲＡ患者（２０％）および５０人中０人の対照がシトルリン化テネイシンＣと反応した。（Ａ）ネイティブな（ｎＴＮＣ）およびシトルリン化された（ｃＴＮＣ）精製ヒト組換えテネイシンＣのクーマシー染色ゲル（上段パネル）。ＡＭＣキットを用いるウエスタンブロットにより示されたテネイシンＣのシトルリン化（下段パネル）。（Ｂ）ＲＡ患者（ＲＡ）または健常者対照群（ＮＨ）（ｎ＝５０）から得られた血清を用いてプローブされた、ｃＴＮＣの代表的なウエスタンブロット。ｎＴＮＣのブロットにおいて、いかなる血清とも反応性は観察されなかった（図示せず）。
【図２６】ＲＡ患者の一部から得られた血清はｃｉｔＴＮＣとの反応性を示す。１人の陽性患者を示す（レーン４）、７人の異なるＲＡ患者由来の血清でプローブされたｃＴＮＣのウエスタンブロット。
【図２７】ＲＡ患者の一部に由来する血清はｃｉｔＴＮＣとの反応性を示す。１人の陽性患者を示す（レーン４）、８人のさらなるＲＡ患者由来の血清でプローブされたｃＴＮＣのウエスタンブロット。
【図２８】健常者対照群から得られた血清はｃｉｔＴＮＣとの反応性を示さない。陽性患者を示していない、８人の異なる対照由来の血清でプローブされたｃＴＮＣのウエスタンブロット。
【図２９】シトルリン化ＴＮＣ＋シトルリン化ＦＢＧに対するＲＡ血清。７人の異なるＲＡ患者由来の血清でプローブされた、同じウェルで一緒に泳動されたｃＴＮＣ＋ｃＦＢＧのウエスタンブロット。完全長ＴＮＣ（３２０ｋＤ）と反応したがＦＢＧとは反応しなかった患者サブセット（レーン４、５）、またはｃｉｔＦＢＧ（２７ｋｄ）と反応したが完全長ＴＮＣとは反応しなかった患者（レーン６）が観察された。
【図３０】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるシトルリン化部位の定義。（Ａ）ｒＰＡＤ２（丸）、ｈＰＡＤ２（四角）およびｈＰＡＤ４（三角）によりシトルリン化されたアルギニン残基を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。シトルリン化部位は下線を引かれ、非シトルリン化部位は破線を引かれ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に網羅されなかった部位は＊で標識されている。（Ｂ）ＦＢＧドメインの配列。全てのアルギニン残基が示されており、シトルリン残基に変化したアルギニン残基は下線が引かれている。＊で標識されたアルギニンはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析によって網羅されなかった。
【図３１−１】シトルリン化抗体エピトープの特定。（Ａ）アミノ末端およびカルボキシ末端におけるシステイン残基の付加、並びに、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより特定された位置におけるアルギニンのシトルリン残基への交換を伴って、ＦＢＧのアミノ酸配列に相当する配列を有するペプチドを設計した。（Ｂ）関節リウマチを有する患者（ＲＡ；ｎ＝２０）および健常対照群（ｎ＝２０）における、シトルリン化ＦＢＧペプチドおよびアルギニン含有対照ペプチドに対するＩｇＧ反応。対照血清の９５パーセンタイルを陽性の判定に用いた（破線）。マン・ホイットニーＵ検定を用いて、群の間の差異についてｐ値を算出した（ｎ．ｓ．＝有意差無し、＊＝ｐ＜０．０５および＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図３１−２】同上。
【図３１−３】同上。
【図３１−４】同上。
【図３２−１】ＦＢＧのシトルリン化はＨＤＦおよびＲＡＦの細胞接着を減少させる。（Ａ）インテグリンαｖβ３と結合することが特定されている配列が、白色で示される（Yokoyama et al., 2000）。この配列内で、２つのアルギニン（黒色で示される）がシトルリン化されることが特定された。（Ｂ）９６ウェルプレートのウェルを、様々な濃度のＦＢＧ、シトルリン化ＦＢＧ（ｃＦＢＧ）、カルシウムを含まない緩衝液中でインキュベートされたＦＢＧ（ＦＢＧ-Ｃａ２＋）、またはＰＡＤ無しでインキュベートされたＦＢＧ（ＦＢＧ-ＰＡＤ）で被膜した。正の対照としてフィブロネクチン（ＦＮ）（１μｇ／ｍｌ）でウェルを被膜し、負の対照としての役割を果たすＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）で被膜した。プレートを、皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）またはＲＡ患者由来の滑膜線維芽細胞（ＲＡＦ）と一緒に４５分間インキュベートし、クリスタルバイオレット（０．１％）で染色後に付着細胞の吸光度を測定することにより接着を測定した。データは少なくとも４つの独立した実験の平均値＋ｓ．ｅ．ｍ．（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）として示される。
【図３２−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【０１９２】
定義
「炎症」には、組織傷害、感染または局所的な免疫応答によって惹起される、体液、血漿タンパク質、および白血球局所的な蓄積の意味が含まれる。
【０１９３】
「急性炎症」には、傷害、感染または局所的な免疫応答の直後の、炎症の初期段階（開始）および短期的な一過性炎症反応の意味が含まれる。典型的には、急性炎症は急速に回復し、およそ数分から長くても数日しか継続しない。
【０１９４】
「慢性炎症」には、持続的な、および／または回復しない炎症の意味が含まれる。慢性炎症は健常組織の不適切な破壊としばしば関連している。これは、進行性であり、数週間以上に亘って継続し得る。慢性炎症は典型的には、自己免疫性状態を含むがこれに限定はされない、持続性の感染または疾患と関連している。
【０１９５】
「慢性関節炎」には、患部関節の歪み並びにヒト疾患で観察されるような軟骨および骨の破壊の証拠となるＸ線像をもたらす、数週間〜数ヶ月に亘る進行性で絶え間のない持続的な炎症の意味が含まれる（Kelly, Harris, Ruddy and Sledge, Textbook of Rheumatology 4th Edition）。
【０１９６】
実験的マウスモデルでは、慢性関節炎は、鎮静するせずに、比較的短期間に亘ってであっても不適切な組織破壊を引き起こす炎症を特徴とする。慢性関節炎は、組織学的には、滑膜および関節隙における炎症性細胞の遷延的存在、軟骨細胞死、並びに軟骨および骨のびらんを特徴とする（および、それらによって同定することができる）。
【０１９７】
「薬剤（agent）」には、全ての化学成分、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬および小分子化合物が含まれる。
【０１９８】
「シトルリン化」とは、タンパク質内の一つまたは複数のアルギニンアミノ酸の、シトルリンアミノ酸への変換を意味する。
【０１９９】
「シトルリン化テネイシンＣの断片」または「シトルリン化テネイシンＣの一つもしくは複数の断片」とは、シトルリン化テネイシンＣに由来するシトルリン化ペプチドまたはドメインを意味する。シトルリン化テネイシンＣの断片は、シトルリン化ＦＢＧドメイン、シトルリン化ＴＡドメイン、シトルリン化ＥＧＦ−Ｌドメイン、シトルリン化ＴＮＩＩＩドメインまたはシトルリン化テネイシンＣ内に由来するあらゆる他の配列であり得る。シトルリン化テネイシンＣの断片は抗原性であることが好ましい。シトルリン化テネイシンＣの断片は生物学的に活性であることが好ましい。
【０２００】
「断片」とは、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを意味する。
【０２０１】
「異型（variant）」とは、そのヌクレオチド配列が、目的の完全長配列と少なくとも９０％の配列同一性、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有していることを意味する。
【０２０２】
２つのポリヌクレオチド間の配列同一性パーセントは、適切なコンピュータプログラム、例えばウィスコンシン大学Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを用いて決定され得、同一性パーセントが、配列が最適にアラインメントされたポリヌクレオチドについて算出されることは理解されよう。
【０２０３】
あるいは、アラインメントはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いて実行され得る（Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680に記載）。
【０２０４】
使用されるパラメーターは以下の通りであり得る：
ファースト・ペアワイズ・アラインメントのパラメーター：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナル（top diagonal）の数；５。
スコアリング法：ｘパーセント。
【０２０５】
マルチプルアライメントのパラメーター：ギャップ開始ペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。
【０２０６】
スコア行列：ＢＬＯＳＵＭ。
【０２０７】
あるいは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用いて局所的配列アラインメントを決定してもよい。
【０２０８】
「抗体」には、実質的にインタクトな抗体分子、並びにキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（自然発生的なヒト抗体に対して少なくとも１つのアミノ酸が変異している）、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、並びにその抗原結合性フラグメントおよび誘導体が含まれる。
【０２０９】
「自己抗体」とは、対象の自己タンパク質のうちの一つまたは複数を対象とする、対象の免疫系によって産生されたあらゆる抗体を意味する。
【０２１０】
「自己抗原」は、自己抗体の産生を刺激する内在性抗原である。
【０２１１】
「抗原結合性フラグメント」とは、シトルリン化テネイシンＣに結合することが可能な、抗体の機能性フラグメントを意味する。
【０２１２】
用語「対象」とは、ヒトを含む全ての動物を意味する。対象の例としては、ヒト、雌ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、およびブタが挙げられる。用語「患者」とは、治療を必要とする障害を有する対象を意味する。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、「医薬製剤」とは、本発明による治療効果のある製剤を意味する。
【０２１４】
「治療有効量」、または「有効量」、または「治療効果のある」とは、本明細書で使用される場合、所与の状態および投与計画に対して治療効果を与える量を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルと共同して所望の治療効果を生むように算出される、活性物質の所定量である。さらに、活性、機能および宿主応答の臨床的に有意な不足を低減する、最も好ましくは防止するのに充分な量を意味することが意図される。あるいは、治療有効量は、宿主における臨床的に有意な状態の改善を引き起こすのに充分な量である。当業者には理解されることであるが、化合物の量はその比活性に応じて変動し得る。適切な投与量は、必要とされる希釈剤と共同して所望の治療効果を生むように算出される、所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の組成物を製造するための方法および用途では、治療有効量の有効成分が提供される。治療有効量は、医学または獣医学の当業者によって、当該技術分野において周知であるような年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患等の患者の特徴に基づいて決定することができる。
【実施例】
【０２１５】
実施例１：一般的方法
【０２１６】
試薬
ザイモサン、メチル化ＢＳＡおよびフロイント完全アジュバント、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（マウスモノクローナル抗体）、ブラストサイジン、並びにアイソタイプ対照抗体（マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１）は、シグマ・アルドリッチ社（ドーセット、英国）から得た。ヒプノルム（hypnorm）はベータファーマ社（VetaPharma Ltd.）（リーズ、英国）から得た。カブトガニ血球抽出物アッセイ（Limulus amaebocyte lysate assay）は、アソシエーツオブケープコッド社（Associates of Cape Cod）（リバプール、英国）から得た。野生型ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ）は、インビトロジェン社（フローニンゲン、オランダ）から得た。Ｍ−ＣＳＦおよびマウスＩＬ−１βは、ぺプロテック社（PeproTech）（ヌイイシュルセーヌ、フランス）から得た。ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、抗菌性−抗真菌性溶液ＰＳＡおよびβ−メルカプトエタノールは、ＰＡＡラボラトリーズ社（PAA Laboratories）（ヨービル、英国）から得た。ヒトＴＬＲ２およびＴＬＲ４／ＣＤ１４／ＭＤ−２を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞株、ポリミキシンＢ、ｍｓｂＢ  ＬＰＳ並びに機能阻害性ＴＬＲ２（クローン：ＴＬ２．１アイソタイプ：マウスＩｇＧ２ａ）およびＴＬＲ４抗体（クローン：ＨＴＡ１２５アイソタイプ：マウスＩｇＧ２ａ）は、インビボジェン社（Invivogen）（カルネ、英国）から得た。フェノール−クロロホルム精製大腸菌（Escherichia coli）ＬＰＳ（Ｒ型およびＳ型）並びにＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ４（Ｐａｍ３Ｃ）は、アレクシス社（Alexis）（バーミンガム、英国）から得た。マウスＴＮＦ−αおよびＩＬ−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ−ＩＬ−１Ｆ３）は、Ｒ＆Ｄシステムズ社（アビンドン、英国）から得た。機能阻害性抗ＣＤ１４抗体（アイソタイプ：マウスＩｇＧ１）は、アブカム社（ケンブリッジ、英国）から得た。ヒトおよびマウスのＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８に対するＥＬＩＳＡは、ファーミンゲン社（Pharmingen）（オックスフォード、英国）から得た。
【０２１７】
完全長テネイシンＣの精製
サイトカイン産生がＬＰＳおよびＬＰＳ関連分子等の細菌混入によるものではないことを確かめるため、記述（Lange(2007)）の通りに、組換え完全長ヒトテネイシンＣを、ｐＣＥＰ−ｐｕベクター内のＨｉｓタグヒトテネイシンＣを形質移入した哺乳類細胞株ＨＥＫ２９３の条件培地から精製した。テネイシンＣを記述（Lange(2007)）の通りに均質に精製し、製造業者の取扱説明書に従ってカブトガニ血球抽出物アッセイを用いてＬＰＳ混入が無いことを確定させた。
【０２１８】
組換えタンパク質の合成
テネイシンＣの各ドメインに対応するタンパク質を合成し（ＴＡ、ＥＧＦ−Ｌ、種々のＴＮＩＩＩリピートおよびＦＢＧ）、精製した。実施例２を参照されたい。
【０２１９】
組換えタンパク質中のＬＰＳ混入の測定
各組換えタンパク質中のＬＰＳのレベルを確認するために、製造業者の取扱説明書に従ってカブトガニ血球抽出物アッセイを使用した（感度：ｍＧタンパク質当たり約０．７±０．５ｐｇ  ＬＰＳ）。本試験に使用された全ての組換えタンパク質は１０ｐｇ／ｍｌ未満のＬＰＳレベルを有していた。
【０２２０】
アデノウイルスベクターおよびそれらの増殖
野生型ＭｙＤ８８（ＡｄＭｙＤ８８ｗｔ）、ＭｙＤ８８のドミナントネガティブ型（ＡｄＭｙＤ８８ｄｎ）およびＧＦＰ対照（ＡｄＧＦＰ）をコードする組換え型複製欠損アデノウイルスベクターを、実験室内で構築した。これらのウイルスの合成についての記述はAndreakos(2004)にある。本試験で使用された全てのウイルスは、Ｅ１／Ｅ３欠失型であり、Ａｄ５血清型に属している。ウイルスを２９３ヒト胎児由来腎臓細胞内で増殖させ、２つの塩化セシウム勾配による超遠心で精製し、ウイルス力価を以前の記述（Sacre(2007)）の通りにプラークアッセイによって決定した。
【０２２１】
動物
１２９／ｓｖ（腹白毛および野ネズミ色の外見を有する近交系マウス）バックグラウンドの、Saga(1992)に記載されるオリジナル系統由来のホモ接合型テネイシンＣ欠損マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ教授（エジンバラ大学、英国）から提供された。同齢のコンジェニックな近交系野生型１２９／ｓｖマウスは、チャールスリバー社（マーゲート、英国）から得た。全てのテネイシンＣ欠損型１２９／ｓｖマウスおよび野生型１２９／ｓｖマウスは雄であり、実験時には８〜１０週齢であった。
【０２２２】
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（黒毛（black coat）を有する近交系マウス）のホモ接合型ＴＬＲ２およびＴＬＲ４欠損マウスは、Ｂ＆Ｋユニバーサル社（B&K Universal）（ハル、英国）から得られた（Hoshino(1999)およびTakeuchi(1999)）。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのホモ接合型ＭｙＤ８８欠損マウスは、サンガー研究所（Sanger Institute）（ケンブリッジ、英国）から提供された。同齢のコンジェニックな近交系野生型Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスは、チャールスリバー社（マーゲート、英国）から得た。マウス胚性線維芽細胞の単離において、８〜１０週齢の１匹の雌を、８〜１０週齢の２匹の雄と交配させた。骨髄由来マクロファージの単離において、マウスは雌であり、実験時には１０〜１２週齢であった。
【０２２３】
全ての動物は、標準的なげっ歯類固形飼料および水を不断給餌され、１２時間の明暗サイクルを有する空調環境において、おがくずを敷き詰めたケージに収容（＜６マウス／ケージ）された。全ての動物手順は施設内倫理委員会による承認を受けた。
【０２２４】
統計手法
平均値、ＳＤ、ＳＥＭ、および統計検定は、ＧｒａｐｈＰａｄバージョン３（グラフパッド・ソフトウェア社（GraphPad Software Inc.）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて算出した。複数の群平均値を、１元配置分散分析、その後適切な場合にはダネット多重比較検定によって、解析した。２つの群のみを含む実験には対応のないｔ検定を用いた。
【０２２５】
実施例２：組換えタンパク質の合成
テネイシンＣの各ドメインに対応するタンパク質を合成し（ＴＡ、ＥＧＦ−Ｌ、種々のＴＮＩＩＩリピートおよびＦＢＧ）、精製した。合成された組換えタンパク質を図９に示す。
【０２２６】
試薬
Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼはストラタジーン社（アムステルダム、オランダ）から得た。Ｅａｓｙ  ｍｉｘ  ５０  ＰＣＲチューブはモレキュラー・バイオプロダクツ社（Molecular Bioproducts）（ラターワース、英国）から得た。ＲＮｅａｓｙキットおよびＮｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムは、キアゲン社（クローリー、英国）から得た。ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔベクター、ｐＣＥＰ４プラスミドベクター、ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ）および４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲルは、インビトロジェン社（フローニンゲン、オランダ）から得た。ｐＥＴ３２ｂベクターおよびＢＬ２１（ＤＥ３）Ｒｏｓｅｔｔａ細胞は、ノバジェン社（Novagen）（ケント、英国）から得た。ＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム、ＨｉＴｒａｐ  Ｓカラム、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ５００  ＨＲカラムおよびヘパリンセファロースカラムは、アマシャム社（バッキンガムシャー、英国）から得た。
【０２２７】
制限酵素はニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs）（ヒッチン、英国）から得た。ＤＭＥＭ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンは、ＰＡＡラボラトリーズ社（ヨービル、英国）から得た。ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬は、ロシュ・アプライド・サイエンス社（Roche Applied Science）（バーゼル、スイス）から得た。
【０２２８】
抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（マウスモノクローナル抗体）、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−アガロース、ＦＬＡＧペプチドは、シグマ・アルドリッチ社（ドーセット、英国）から得た。ｔｅｔｒａ−ｈｉｓ抗体（マウスモノクローナル抗体）は、キアゲン社（クローリー、英国）から得た。アルカリホスファターゼ結合型ヤギ抗（マウスＩｇＧ）ＩｇＧおよびＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｕｅ（アルカリホスファターゼに対する安定な基質）は、プロメガ社（サウサンプトン、英国）から得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄは、バイオラド社（ヘメルヘンプステッド、英国）から得た。
【０２２９】
プライマー設計
ヒトテネイシンＣ配列（Siri(1991)  受入番号Ｐ２４８２１（スイスプロット））で公開されている配列比較を用いて、ドメイン境界を決定した。各ドメインをクローニングするため、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方が必要コード配列の５’末端配列および３’末端配列に対応する１８〜２１塩基を含有する、ＰＣＲプライマーを設計した。フォワードプライマーは、Ｎｄｅ１制限酵素認識部位、その後にＮ末端Ｈｉｓタグ、その直後にコード配列を含有していた。Ｎｄｅ１部位の最後の３塩基はＡＴＣメチオニン開始コードを形成する。リバースプライマーは、コード配列の直後にＴＴＡ終止コドン、その後にｐＥＴ３２ｂ発現ベクター内への一方向性クローニングを可能にするＢａｍＨ１部位またはＫｐｎ１部位を含んでいた。
【０２３０】
【表１】
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【０２３１】
上記のプライマーは全て５’→３’記載である。Ｆｌａｇ配列は太字、Ｈｉｓタグ（ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ［配列番号１９］）は下線、制限酵素切断部位（ＣＡＴＡＴＧ＝Ｎｄｅ１部位、ＧＧＡＴＣＣ＝ＢａｍＨ１、ＧＧＴＡＣＣ＝Ｋｐｎ１部位）は太字のイタリックである。
【０２３２】
ＰＣＲ
ＰＣＲ増幅を、最終体積２５μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー、１μｇのテンプレート、５μｌのＤＭＳＯ、および１．２５ユニットのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼを用いて行った。これをＥａｓｙ  ｍｉｘ  ５０チューブ中の緩衝液およびｄＮＴＰに添加した。全ての反応に使用されたテンプレートは、ＲＮｅａｓｙキットで単離されたＲＮＡを用いてＵ８７ＭＧヒト神経膠腫細胞から調製されたｃＤＮＡであった。変性温度、アニーリング温度および伸張温度がそれぞれ９５℃、５５〜６５℃（プライマーの融解温度（Ｔｍ）に依存）および７２℃である反応を、４０回回した。
【０２３３】
クローニング
ＰＣＲ産物をｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔベクターにライゲーションし、配列決定して、ＰＣＲによってエラーが導入されていないことを確認した。エラーもサイレント変異も有さないクローンを選択した。次に、プライマーに組み込まれたＮｄｅ１およびＢａｍＨ１制限酵素認識部位を利用して、インサートをｐＥＴ３２ｂにライゲーションした（TN５−７およびTN６−８）。ヒトテネイシンＣは、ＴＡドメイン（４９４位）およびＴＮＩＩＩ２（２５０９位）内に内部ＢａｍＨ１部位を有する。従って、ＦＷプライマー内のＮｄｅ１部位およびｐＣＲＢｌｕｎｔのクローニング部位内のＫｐｎ１部位を利用して、ＴＡおよびTN１−８をクローニングした。ヒトテネイシンＣは内部Ｋｐｎ１部位を含有していない。TN１−５、TN１−３およびTN３−５は、プライマー内のＮｄｅ１部位およびＫｐｎ１部位を用いてクローニングした。ＦＢＧは内部Ｎｄｅ１部位（６４３９位）を含有しているため、Ｎｄｅ１およびＢａｍＨ１消化、続いてＮｄｅ１消化という２段階ライゲーションを用いてクローニングした。（位置は、図１４に示されるテネイシンＣの完全長ヌクレオチド配列内の部位を指す）
【０２３４】
細菌の増殖、誘導および溶解
プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｒｏｓｅｔｔａ細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する３Ｌのルリア−ベルターニ培地中で培養し、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導した。３時間後、細胞を４，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離で回収し、氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回洗浄し、フレンチプレスで溶解させた。含有物を１２，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間の遠心分離で回収した。ＴＡおよびＦＢＧを例外として、タンパク質は全て上清中に位置していた。組換えＴＡおよびＦＢＧタンパク質を、２時間一定の撹拌をしながら室温で、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、および１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールを用いて、含有物から抽出した。
【０２３５】
細菌タンパク質の精製
組換えタンパク質を含有する溶液を、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースカラムにアプライし、２０ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で洗浄した。その後、カラムを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で洗浄し、６０ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を用いてタンパク質を溶出させた。ＴＡおよびＦＢＧについては、それぞれの洗浄緩衝液および溶出緩衝液は６Ｍ塩酸グアニジンを含有した。Ｎｉクロマトグラフィーの後、ＴＡおよびＦＢＧはその後の精製を必要としなかった。ＴＮ１−３およびＴＮ６−８はＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによって、ＴＮ１−５、ＴＮ３−５およびＴＮ５−７はＨｉＴｒａｐ  Ｓカラムを用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによって、ＴＮ１−８はＨｉＴｒａｐ  Ｓカラム、続いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ５００  ＨＲカラムを用いるゲル濾過を用いて、さらに精製した。
【０２３６】
不溶性タンパクの再折りたたみ
ＴＡおよびＦＢＧを、６Ｍ塩酸グアニジンを含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、その後４℃で１６時間撹拌しながら２０ｍＭシスタミンで処理することにより、リフォールディングさせた。次に、この溶液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、および１ｍＭ  ２−ヒドロキシエチルジスルフィドを含有する１５倍量の５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に対して４℃で２４時間２回透析し、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に対して４℃で８時間２回透析し、その後、１２，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心した。還元条件および非還元条件下のＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて、再折りたたみをサイズ変化によって評価した。ＴＡドメイン重合およびヘパリンセファロースカラムへのＦＢＧ結合により、タンパク質活性を確認した。
【０２３７】
哺乳類細胞を用いたＥＧＦ−Ｌドメインの合成
大腸菌発現系を用いてＥＧＦ−Ｌリピート領域を発現および精製する初めての試みは不成功であった。これは、この領域内の合計９１個のシステインに起因する、タンパク質フォールディングを達成する難しさが原因である可能性が最も高い。従って、ＨＥＫ２９３細胞を用いて、ＴＮ−ＣのＥＧＦ様ドメインを発現させた。
【０２３８】
２つのＰＣＲ反応を実行した。第一のＰＣＲ産物は、制限酵素ＫｐｎＩ部位、コザック配列、続いてＴＮ−Ｃシグナル配列から成っていた。第二のＰＣＲ産物は、ＦＬＡＧペプチド、ＥＧＦ様ドメイン配列、続いてヒスチジン標識およびＢａｍＨ１制限酵素配列から成っていた。
【０２３９】
前記２つのＰＣＲ産物をHo(1989)に記載される通りにライゲーションした。ＰＣＲ反応を上記の通りに実行した。コンストラクト全体をＰＣＲ  ｂｌｕｎｔベクターにクローニングし、配列決定した。次に、それをｐＣＥＰ４ベクターにサブクローニングした。前記ＤＮＡをＦｕｇｅｎｅを用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ユニット／ｍｌ）を含有するダルベッコー変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でハイグロマイシン耐性（２００μｇ／ｍｌ）について選択した。安定にトランスフェクトされた細胞からの２リットルの条件培地（細胞が培地中で培養された後に収集）を収集し、プールした。プールされた条件培地（２リットル）を３０００ｒｐｍで遠心して、細胞片を培地から分離した。
【０２４０】
次に、培地を抗ＦＬＡＧカラムにアプライした。物質を素通り画分用に５０ｍｌの画分に集めた。カラムを１０カラム体積の１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）で洗浄し、次に１０カラム体積の６０％イソプロパノールで洗浄して、ＬＰＳの除去を確実にした。次に、カラムを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、最後に、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中の２００μｇ／ｍｌ  ＦＬＡＧペプチドを用いてタンパク質を溶出させた。
【０２４１】
タンパク質純度の分析
各タンパク質を１０００倍量の１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）に対して透析した。タンパク質純度を還元条件下のＳＤＳＰＡＧＥで分析した。このために、１μｇの各精製組換えタンパク質を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ勾配ゲル上で泳動し、次いでゲルを銀染色して、シングルバンドを示した（図１０）。ウェスタンブロッティング分析も行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に電気泳動転写した。この膜をトリス緩衝食塩水中の５％ＢＳＡでブロッキングし、次にＦＬＡＧ  Ｍ２を認識する一次抗体（１：２０００希釈）（ＥＧＦ−Ｌ）またはｔｅｔｒａ−ｈｉｓ抗体（１：２０００）（全ての他のタンパク質）と一緒にインキュベートした。次に、ブロットをアルカリホスファターゼ結合型二次抗体と一緒にインキュベートし、安定な基質であるＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｕｅを用いてタンパク質バンドを可視化した。これにより、ゲルが各抗体によって認識される一本の特異的バンドを予想Ｍｗに示される（図示せず）。
【０２４２】
実施例３：動物モデル
ザイモサン誘導性関節炎
ザイモサン誘導性関節炎（ＺＩＡ）を、Keystone(1977)に記載の通りに、ザイモサン（出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae））の注射によりテネイシンＣ欠損型マウスおよび野生型マウスで誘導した。ザイモサンは、１５ｍｇのザイモサンを１ｍｌの無菌ＰＢＳに溶解することにより調製した。この溶液を２回煮沸し、超音波処理した。滅菌水で１：１０希釈した１５０μｌのヒプノルムの腹腔内注射によってマウスを麻酔した後、ザイモサン（１０μｌ）を右足蹠に注射した（０日目）。
【０２４３】
対照マウスは１０μｌのＰＢＳ単独の注射を受けたか、または注射されなかった。関節炎の肉眼での評価のために、各後肢の厚さをマイクロキャリパー（クロプリン社（Kroeplin）、シュリュヒテルン（Schluchlem）、ドイツ）を用いて毎日測定した。直径はマウス毎に、それぞれの炎症を起こした後肢の平均値として表した。
【０２４４】
実験完了後（４日目）、マウスを安楽死させ、後肢を１０％（ｖ／ｖ）緩衝ホルマリンで固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰し、パラフィンに加工した。
【０２４５】
抗原誘発関節炎
抗原誘発関節炎（ＡＩＡ）を、Brackertz(1977)による以前の記述の通りに、テネイシンＣ欠損型マウスおよび野生型マウスにおいて誘導した。簡潔に説明すると、０日目に、マウスを滅菌水で１：１０希釈した１５０μｌのヒプノルムの腹腔内注射で麻酔した後、２００μｇのメチル化ＢＳＡで免疫した。ｍＢＳＡは０．２ｍｌのフロイント完全アジュバント中で乳化し、尾の付け根に皮内注射した。
【０２４６】
７日目に、関節炎を、無菌３３ゲージマイクロカニューレを用いるｍＢＳＡ（１０μｌの無菌ＰＢＳ中１００μｇ）の右膝関節への関節内注射により誘導した。対照マウスは１０ｌのＰＢＳ単独の注射を受けたか、または注射されなかった。
【０２４７】
１４日目に、マウスを安楽死させ、膝関節を切除し、１０％（体積／体積）緩衝ホルマリンで固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰し、パラフィンに加工した。
【０２４８】
ＦＢＧの注射
野生型マウスを滅菌水で１：１０希釈した１５０μｌのヒプノルムの腹腔内注射で麻酔した後、無菌３３ゲージマイクロカニューレを用いて１０μｌの無菌ＰＢＳ中の１００ｎｇ、１または３μｇのＦＢＧを右膝関節に注射した。対照マウスは１０μｌのＰＢＳ単独の注射を受けたか、または注射されなかった。
【０２４９】
３日目および７日目に、マウスを安楽死させ、膝関節を切除し、１０％（体積／体積）緩衝ホルマリンで固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰し、パラフィンに加工した。
【０２５０】
膝関節の組織学的検査
冠状組織切片（４μｍ）を、関節；８０μｍ全体にわたって７つの深度で切り出し、ヘマトキシリンおよびエオシンまたはサフラニンＯで染色して、関節病態を評価した。病理組織学的な変化を、Van Lent(2006)に記載の以下のパラメーターを用いてスコア化した。
【０２５１】
炎症（滑膜（浸潤物）および関節腔（滲出物）への炎症性細胞の流入）を、０（炎症無し）から３（重度の炎症）までの任意の尺度を用いて段階付けした。軟骨細胞死を、総面積に対する空の間隙を含有する軟骨領域の割合として測定した。軟骨表面びらんを、総軟骨領域に対する軟骨減少（cartilage lost）量として測定した。骨破壊を、全膝関節切片の１０個の異なる領域において測定した。破壊は０（損傷無し）〜３（骨構造の完全喪失）の段階で段階付けした。組織学的分析は、実験群を知らされていない研究者が行った。関節当たり少なくとも５つの断面深度（section depth）で病理組織学的スコアを平均することで、実験群内の各動物の平均スコアを算出した。
【０２５２】
結果
ザイモサン誘導性関節炎はテネイシンＣ欠損マウスにおいて持続しない
足蹠へのザイモサン注射を用いて、マウスにおいて急性滑膜炎を誘導した。野生型マウスは２４時間までに最大の足直径に達する急速な足膨張を示した（２．５６ｍｍ、開始足直径の６２％の増加）。これはさらに２４時間持続した。２日後に足直径は減少したが、足は４日目まで膨張したままであった（２．０８ｍｍ、３２％の増加）（図１ａ）。テネイシンＣ欠損マウスは、注射の２４時間後に野生型マウスと同様の程度の足膨張を示した（２．４１ｍｍ、開始足直径の５７％の増加）。しかし、テネイシンＣヌルマウスにおける膨張は野生型マウスよりも早く鎮静し；足直径は２日目に有意に減少し、４日間までに１．７ｍｍ（１１％のみの増加）に減少した（図１ａ）。注射後４日目まで、野生型マウスの足はまだ明白に膨張しており赤色であったが、一方、テネイシンＣヌルマウスの足は明白には膨張も赤色にもなっておらず、注射されていない足と似ていた（図９）。
【０２５３】
この違いは４日目に組織学的に反映された。野生型マウスの滑膜は有意に炎症を起こしており、細胞浸潤を示し、軟骨プロテオグリカン減少が観察された（図１ｂ、ｃ）。対照的に、テネイシンＣ欠損マウスの滑膜は、滑膜炎も、細胞浸潤物も、軟骨プロテオグリカン減少も示さず（図１ｄ、ｅ）、偽の注射を行ったマウスおよび注射していないマウスの関節に似ていた（図示せず）。関節炎の定量化によって、野生型マウスにおいてもテネイシンＣヌルマウスにおいても滲出物（関節腔内の細胞塊）はわずかであったが、浸潤物（滑膜層内の細胞塊）のレベルがテネイシンＣヌルマウスにおいて有意に減少していたことが明らかになった（図１ｆ）。軟骨または骨のびらんはいずれの遺伝子型のマウスでも起こっていなかったが（図示せず）、低レベルの軟骨細胞死が野生型マウスにおいて起こっており、これはテネイシンＣヌルマウスでは観察されなかった（図１ｇ）。これらのことから、テネイシンＣ発現は急性炎症の維持を促進すると思われる。
【０２５４】
テネイシンＣヌルマウスは抗原誘導性関節炎の間の持続的な炎症および構造損傷から保護される
テネイシンＣがより破壊性の炎症性関節疾患にも寄与しているかどうかを判断するために、びらん性関節炎を、ｍＢＳＡによる免疫化の後の膝関節へのｍＢＳＡの関節内注射により誘導した。このモデルは細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を関与させ、ヒトＲＡに似た病理学的変化を誘導する（Brackertz(1977)）。ｍＢＳＡの注射によって、テネイシンＣヌルマウスおよび野生型マウスの両方において類似の炎症反応が誘導された。細胞浸潤および滑膜肥厚は、偽の注射を行ったマウス（図２ａ、ｂ、ｇ）または注射していないマウス（図示せず）と比較して、両方の遺伝子型のマウスにおいて２４時間目まで明らかである（図２ｃ〜ｆ、ｈ、ｉ）。
【０２５５】
しかしこれは、野生型マウスでは持続しているが、テネイシンＣヌルマウスでは持続していない。注射後３日目までに、野生型マウスは、半月板および被膜の炎症増大、滑膜過形成、関節隙内での細胞およびフィブリンの沈着、パンヌス形成並びに局在的な軟骨プロテオグリカン減少を示す（図３ａ、ｂ、ｆ）。対照的に、３日目までに、テネイシンＣヌルマウスでは、炎症は被膜に限定されており、滑膜炎は鎮静されており、関節隙内に存在するフィブリン／細胞凝集物も、パンヌス形成も、軟骨プロテオグリカン減少も見られない（図３ｃ、ｄ、ｅ）。
【０２５６】
７日目までに、野生型マウスは、持続的な炎症性細胞浸潤および関節隙滲出物、大規模な滑膜炎およびパンヌス形成、並びに関節軟骨および骨びらんの破壊を示した（図４ａ、ｂ）。偽の注射をされた膝および注射が行われなかったマウス由来の膝は健常であり、炎症も関節破壊も示さなかった（図示せず）。テネイシンＣ欠損マウスはまた、軽度の炎症性細胞浸潤のみを示し、関節隙滲出物、滑膜炎、パンヌス形成、関節軟骨または骨びらんの破壊が無い健常な関節を有していた（図４ｃ、ｄ）。偽の注射が行われた、およびまたは、注射が行われていないテネイシンＣ欠損マウス由来の関節も健常であった（図示せず）。
【０２５７】
これらの組織学的なデータは、材料と方法に記載されるような関節疾患のスコア化に反映される。注射から２４時間後に野生型マウスおよびテネイシンＣヌルマウスの両方において観察された、細胞浸潤物および滲出物のレベルは有意に異なっていた。しかし、細胞塊は野生型マウスにおいて経時的に増加し続けたが、この反応はテネイシンＣヌルマウスでは減弱されており、関節内の細胞数は経時的に減少した（図４ｅ）。野生型マウスの軟骨において起こる軟骨細胞死のレベルは経時的に次第に高くなっていったが、テネイシンＣヌルマウスにおいては有意な軟骨細胞死は観察されなかった（図４ｆ）。２４時間目または３日目の野生型マウスにおいて軟骨表面びらんも骨びらんも明らかではなかったが（図示せず）、７日目までに有意な組織破壊が起こった。対照的に、テネイシンＣヌルマウスは２４時間目、３日目（図示せず）または７日目（図４ｆ）に組織破壊を示さなかった。これらのデータは、野生型マウスと異なり、テネイシンＣヌルマウスでは関節炎の開始（滑膜および関節隙への細胞流入）は影響を受けず、一方、疾患は組織破壊および細胞死に進行しないことを示している。これらの結果は、テネイシンＣの発現がこのモデルにおける持続的な滑膜炎および関節破壊に必要であることを示している。
【０２５８】
実施例４：細胞培養
患者検体
ヒト単球は末梢血（ロンドン血液銀行）から単離し、マクロファージは、以前の記述（Foxwell(1998)）の通りに、１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦによる４日間の分化の後の単球から派生させた。
【０２５９】
ＲＡ膜細胞（全ての滑膜細胞型の混合集団を意味する）は、以前の記述（Brennan(1989)）の通りに、関節置換外科手術を受けている患者から得られた滑膜から単離した。ＲＡ滑膜線維芽細胞は、以前の記述（Brennan(1989)）の通りに、ＲＡ膜細胞の混合集団から単離した。本試験は地元のＴｒｕｓｔ倫理委員会（Trust ethics committee）（リバーサイドＮＨＳ調査委員会（Riverside NHS Research Committee））による承認を受け、廃棄組織（関節置換外科手術後の滑膜）は患者から署名済みのインフォームドコンセントを受領した場合のみに受け取り、組織を匿名扱いにして患者のアイデンティティーを保護した。
【０２６０】
単離の直後に、ＲＡ膜細胞およびマクロファージを、刺激前に２４時間、９６ウェル組織培養プレート内で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌ（ユニット／ｍｌ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中で、１×１０５細胞／ウェルで培養した。滑膜線維芽細胞（継代数２または３においてのみ使用）を、刺激前に２４時間、９６ウェル組織培養プレート内で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で、１×１０４細胞／ウェルで培養した。
【０２６１】
マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）および骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）
ＭＥＦは、９つ全てのマウスＴＬＲのｍＲＮＡを高レベルに発現し、ＴＬＲリガンド活性化に対し特異的且つ高度に応答性である。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８の標的欠失を有するマウス由来のＭＥＦは、特異的リガンドに対するそれらのＩＬ−６応答において深刻な欠陥を示す（Kurt-Jones(2004)）。ＭＥＦを、同齢の妊娠した雌の野生型、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびヌルマウスから回収されたｄ１３胎仔から単離した（Todaro(1963)に記載）。線維芽細胞を、刺激前に２４時間、９６ウェル組織培養プレート内で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で、２×１０４細胞／ウェルで培養した。
【０２６２】
ＢＭＤＭを、Butler(1999)に記載の通りに、同齢の雌の野生型マウス、ＴＬＲ２ヌルマウスおよびＴＬＲ４ヌルマウスの大腿骨を吸引し、細胞をＤＭＥＭ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍｌ／Ｌ（ｖ／ｖ）抗抗菌性−抗真菌性溶液ＰＳＡ、５０μＭ  β−メルカプトエタノールおよび１０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ中で７日間培養することにより得た。次に、マクロファージを、刺激前に２４時間、９６ウェル組織培養プレート内で、ＤＭＥＭ、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍｌ／Ｌ（ｖ／ｖ）抗抗菌性−抗真菌性溶液ＰＳＡ、５０μＭ  β−メルカプトエタノール中で、１×１０５細胞／ウェルで培養した。
【０２６３】
ＨＥＫ２９３細胞株
ＴＬＲ２およびＴＬＲ４／ＣＤ１４／ＭＤ−２を発現するＨＥＫ２９３細胞株を、刺激前に２４時間、９６ウェル組織培養プレート内で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍｌブラストサイジンを含有するＤＭＥＭ中で、１×１０４細胞／ウェルで培養した。
【０２６４】
細胞刺激およびサイトカイン合成の評価
細胞を、指示用量のテネイシンＣおよび組換えテネイシンＣ断片（１．０μＭ〜１．０ｎＭ）と一緒に、３７℃で２４時間インキュベートした。また、細胞を、指示がある場合は、ＬＰＳ（ヒトマクロファージに対しては１ｎｇ／ｍｌ、ヒト線維芽細胞、ＲＡ膜細胞およびＨＥＫに対しては１０ｎｇ／ｍｌ、ＭＥＦＳおよびＢＭＤＭに対しては１００ｎｇ／ｍｌ、ＨＥＫＳに対しては１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＡＭ３（ヒトマクロファージ、ヒト線維芽細胞、およびＨＥＫに対しては１０ｎｇ／ｍｌ、ＭＥＦおよびＢＭＤＭに対しては１００ｎｇ／ｍｌ）、マウスＩＬ−１（ＭＥＦＳに対して５ｎｇ／ｍｌ）およびマウスＴＮＦ−α（ＭＥＦＳに対して１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。特に記載のない限り、Ｒ型ＬＰＳをインビトロ試験に使用した。
【０２６５】
アデノウイルス遺伝子導入実験において、ヒトＲＡ滑膜線維芽細胞を、感染効率１００のアデノウイルスベクターと共にインキュベートし、２時間後に洗浄し、完全培地中で２４時間培養し、次いで２４時間刺激し、その後上清を集めた。
【０２６６】
記載がある場合、細胞を、刺激前に３７℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ１４抗体、１０μｇ／ｍｌ  ＩＬ１受容体拮抗薬、１０μｇ／ｍｌ抗ＴＬＲ２抗体、２５μｇ／ｍｌ抗ＴＬＲ４抗体、１０もしくは２５μｇ／ｍｌアイソタイプ対照抗体、２５μｇ／ｍｌポリミキシンＢ、または１μｇ／ｍｌ  ｍｓｂＢ  ＬＰＳと一緒にプレインキュベートした。記載がある場合、組換えテネイシンＣおよびＦＢＧ、並びにＬＰＳを、細胞に添加する前に１５分間煮沸した。
【０２６７】
全ての場合において、ＭＴＴ細胞生存率アッセイ（シグマ社、プール、英国）で試験された際、細胞の生存率は実験期間全体に亘り有意な影響を受けなかった。
【０２６８】
次に、製造業者の取扱説明書に従った酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８の存在について上清を調べた。吸光度を分光光度的ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ラボシステムズ・マルチスキャン・バイオクロミック社（Labsystems Multiscan Biochromic）、ヴァンター、フィンランド）上で読み、Ａｓｃｅｎｔソフトウェアプログラム（サーモ・ラボシステムズ社（Thermo Labsystems）、オールトリンガム、英国）を用いて解析した。
【０２６９】
結果
テネイシンＣは初代ヒトＲＡ滑膜線維芽細胞およびマクロファージにおいてＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８の合成を誘導する
次に、テネイシンＣが自然免疫反応を活性化し得るかどうかを調べた。テネイシンＣを用いて初代ヒトマクロファージおよびＲＡ滑膜線維芽細胞を刺激し、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８の産生を調べた。細菌細胞壁成分ＬＰＳを正の対照として使用した。テネイシンＣは、ＬＰＳと有意に異なる細胞型特異的サイトカインプロファイルを誘導した。テネイシンＣは、ヒトマクロファージにおけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８の産生を用量依存的に刺激した（図５ａ）。しかし、テネイシンＣは滑膜線維芽細胞においてはＩＬ−６合成のみを誘導し、一方ＬＰＳはＩＬ−６およびＩＬ−８の両方を誘導した（図５ｂ）。ＬＰＳもテネイシンＣも、線維芽細胞においてはＴＮＦ−α合成を誘導しなかった（データ未記載）。ヒトマクロファージによるＩＬ−６（図５ｃ）、ＩＬ−８およびＴＮＦ−α、並びに滑膜線維芽細胞によるＩＬ−６（図示せず）のテネイシンＣ刺激は、熱感受性であり、ＬＰＳ阻害剤であるポリミキシンＢの影響を受けなかった。まとめると、これらの結果により、テネイシンＣによるサイトカイン誘導がＬＰＳ混入によるものではないという有力な証拠が提供される。
【０２７０】
フィブリノーゲン様球（ＦＢＧ）は細胞のテネイシンＣ活性化を仲介する。
テネイシンＣは巨大な六量体分子であり、その各ドメインは異なる細胞表面受容体に結合する（Orend(2005)で概説される）。テネイシンＣの作用機序を理解するには、サイトカイン産生の促進にどのドメインが重要であるかを特定することが必要である。前記分子の様々なドメインを含む組換えタンパク質を合成した（図１０）。各ドメインを、大腸菌内で作製し、精製した（図１１）。純粋（neat）なタンパク質をカブトガニ血球抽出物アッセイにかけることにより、１０ｐｇ／ｍｌ未満のＬＰＳを含有することが分かった。テネイシンＣの１つのドメインのみが活性であった。フィブリノーゲン様球（ＦＢＧ）は、完全長テネイシンＣと同程度に、ヒトマクロファージにおけるＴＮＦ−α合成（図６ａ）、ヒトマクロファージにおけるＩＬ−６およびＩＬ−８の合成（図示せず）、並びにＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＩＬ−６（図示せず）を刺激した。完全長テネイシンＣと同様に、ＦＢＧは、ＬＰＳによっては誘導される、ＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＩＬ−８合成を誘導しなかった（データ未記載）。ＦＢＧ誘導性のサイトカイン合成も、熱感受性であり、ポリミキシンＢによる影響を受けなかった（データ未記載）。
【０２７１】
テネイシンＣのＦＢＧドメインはヒトＲＡ滑膜におけるサイトカイン産生およびマウスにおける関節炎を誘導する。
ＦＢＧがＲＡ患者由来の滑膜における炎症性サイトカインの発現を促進し得るかどうかを調べた。ＲＡのこの組織モデル（全ての滑膜細胞型の混合集団を含む）は、自発的に高レベルのＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αを産生する（Brennan(1989)）（図６ｂ）。ＦＢＧはさらに、これら全てのサイトカインの合成を増強した（図６ｂ）。ＦＢＧがインビボにおいて炎症を誘導し得るかどうかを判断するために、野生型マウスにＦＢＧを関節内注射した。関節炎の一過性の用量依存的な刺激が観察された。注射されていないマウスにおいて、またはＰＢＳ（図６ｃ〜ｅ）もしくは１００ｎｇ  ＦＢＧ（データ未記載）を注射されたマウスにおいては、炎症もプロテオグリカン減少も起こらなかった。１μｇのＦＢＧを注射されたマウスにおいて、炎症性細胞浸潤（図６ｆ）、軽度の滑膜炎、パンヌス形成（図６ｇ）およびプロテオグリカン減少（図６ｈ）が観察された。３μｇのＦＢＧを注射されたマウスにおいて同様の反応が見られた（データ未記載）。組織学的な定量化の後、高レベルの細胞浸潤物および滲出物並びに軟骨細胞死が、中程度の量の軟骨表面びらんおよび骨損傷と共に、ＦＢＧを注射されたマウスにおいて観察された（図６ｉ）。
【０２７２】
ＦＢＧ介在性サイトカイン合成はＭｙｄ８８に依存的である
フィブリノーゲン（Smiley(2001)）を含む多くのＤＡＭＰが、ＴＬＲの活性化によって自然免疫反応を刺激することが示されている。従って、ＴＬＲもテネイシンＣ誘導性サイトカイン産生を仲介し得るかどうかを調べた。ミエロイド系分化因子８８（ＭｙＤ８８）は、ＴＬＲ３を除く全てのＴＬＲによるシグナル伝達に必要とされる（O’Neill(2008)）。滑膜線維芽細胞の、ドミナントネガティブＭｙＤ８８を発現するアデノウイルスによる感染は、ＩＬ−６のＦＢＧ誘導を無効にしたが、ＧＦＰ対照ウイルスによる感染は無効にしなかった（図７ａ）。これらのデータはＦＢＧ誘導性炎症が機能的ＭｙＤ８８に依存的であることを示唆している。ＩＬ−１受容体拮抗薬の添加がサイトカインの誘導を阻害しなかった（データ未記載）ことから、このＦＢＧの影響はＩＬ−１介在性ではないように思われた。ＦＢＧ作用がＭｙＤ８８依存的であることを確認するために、ＭｙＤ８８遺伝子に標的欠失を有するマウスから単離された胎仔線維芽細胞において、ＦＢＧがサイトカイン合成を刺激しないことを示した。ＴＬＲ２リガンドであるＰＡＭ３、ＴＬＲ４リガンドであるＬＰＳおよびＩＬ−１は全て、ＭｙＤ８８を介してシグナル伝達する。これらによる刺激はまた、欠損マウス由来のＭＥＦにおいて無効にされた。しかし、ＭｙＤ８８を介してシグナル伝達しないＴＮＦ−αは影響を受けなかった（図７ｂ）。野生型ＭｙＤ８８の再トランスフェクションによって、ＦＢＧ、ＰＡＭ３、ＬＰＳおよびＩＬ−１に対するこれらの細胞の応答性が回復した（データ未記載）。
【０２７３】
ＦＢＧはＴＬＲ４を介してシグナル伝達する
ＴＬＲは内因性リガンドに対して特異性を示し；タンパク質はＴＬＲ２およびＴＬＲ４の一方または両方によって認識される（O’Neill(2008)で概説される）。ＴＬＲ４に対する中和抗体は、ヒトマクロファージにおけるＦＢＧおよびＬＰＳ誘導性のＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αの合成、並びにＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＩＬ−６合成の両方を阻害したが、ＴＬＲ２リガンドであるＰＡＭ３の機能には影響を与えなかった。ＴＬＲ２に対する抗体は、ＰＡＭ３介在性サイトカイン合成を阻害したが、ＬＰＳまたはＦＢＧ誘導性のサイトカイン合成には影響を与えなかった。アイソタイプ一致対照は、あらゆるリガンドによって誘導されるサイトカイン合成（ヒトマクロファージによるＴＮＦ−α合成が図８ａに示される）に影響を与えなかった。ＦＢＧ作用がＴＬＲ４依存的であることを確認するために、ＴＬＲ４遺伝子に標的欠失を有するマウスから単離された胎仔線維芽細胞またはマクロファージにおいて、ＦＢＧがサイトカイン合成を刺激しないことを示した。ＴＬＲ２遺伝子に標的欠失を有するマウスから単離された胎仔線維芽細胞またはマクロファージでは、ＦＢＧ介在性サイトカイン合成は影響を受けなかった。ＴＬＲ２欠損マウスから単離された細胞は、ＰＡＭ３に対して非応答性であったが、ＬＰＳおよびＩＬ−１に対しては応答性であった。ＴＬＲ４欠損マウスから単離された細胞は、ＬＰＳに対して非応答性であったが、ＰＡＭ３およびＩＬ−１に対しては応答性であった（図８ｂ、ｃ）。さらに、ＴＬＲ４の発現はインビボにおけるＦＢＧの関節炎誘発性作用に必要とされ；ＦＢＧは、ＴＬＲ２ヌルマウスにおいて関節炎を誘導可能であったが、ＴＬＲ４ヌルマウスにおいては誘導不可であった（図１２）。
【０２７４】
ＦＢＧおよびＬＰＳの異なる補助受容体要求
ＴＬＲ４を介したＬＰＳシグナル伝達は、可溶性タンパク質ＭＤ−２およびＧＰＩ結合型細胞表面または可溶性ＣＤ１４（Fitzgerald(2004)で概説される）を含む受容体複合体によって仲介される。次に、ＣＤ１４およびＭＤ−２がＴＬＲ４のＦＢＧ活性化に必要であるかどうかを調べた。正の対照として、ここでは、ＭＤ−２およびＣＤ１４の両方を必要とするＳ型グリコシル化ＬＰＳの活性を調べた（Jiang(2005)）。ＬＰＳによって仲介される、ヒトマクロファージによるＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αの合成並びにＲＡ滑膜線維芽細胞によるＩＬ−６合成は、抗ＣＤ１４抗体、およびＭＤ−２へのＬＰＳの結合に競合するｍｓｂＢ変異型大腸菌由来の拮抗性ＬＰＳによって阻害された（Coats(2007)）。逆に、ＴＬＲ２の活性化にこれらの補助受容体を必要としないＰＡＭ３、およびＦＢＧの両方によって仲介されるサイトカイン合成は、抗ＣＤ１４抗体またはｍｓｂＢ変異型ＬＰＳの影響を受けなかった（図８ｄはヒトマクロファージによるＴＮＦ−α合成を示す）。これらのデータは、ＣＤ１４もＭＤ−２もＦＢＧ介在性サイトカイン合成に必要でないことを示唆している。従って、ＬＰＳおよびＦＢＧは共に、ＴＬＲ４の活性化を介してシグナル伝達する一方で、異なる補助受容体要求を有し得る。
【０２７５】
実施例５：ヒト組織におけるテネイシンＣの作用および合成の阻害
本実施例では、ヒトＲＡ滑膜における（１）テネイシンＣの炎症誘発作用の阻止および（２）テネイシンＣ発現の阻害の影響を調べた。
【０２７６】
方法
ペプチド合成
ＦＢＧドメイン全体を含む９つの重複ペプチド（表２）が、バイオジェンズ社（Biogenes）（ドイツ）によって合成された。ペプチドを室温で切断し（切断混合物：９０％トリフルオロ酢酸塩、５％チオアニソール（thioanisol）、３％エタンジチオール、２％アニソール）、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製し、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトル解析により特徴付けした。前記ペプチドの純度は、高速液体クロマトグラフィーで測定した場合、＞８５％であった。
【０２７７】
前記施設ではペプチド７を合成することができなかったが、これは、ペプチド鎖の伸張を妨げる二次構造の形成が原因であると思われる（以前に報告（LaFleur(1997)）。
【０２７８】
【表２】
2017505763.tif 000004
【０２７９】
患者検体および細胞培養
ＲＡ膜細胞（全ての滑膜細胞型の混合集団を意味する）は、関節置換外科手術（Brennan(1989)）を受けている患者から得られた滑膜から単離した。滑膜組織を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ギブコ社）、５ｍｇ／ｍｌ  ＩＶ型コラゲナーゼ（シグマ社）および０  １５ｍｇ／ｍｌ  Ｉ型デオキシリボヌクレアーゼ（シグマ社）を含有するＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社）中で消化し、３７℃で２時間インキュベートした。
【０２８０】
インキュベーション後、組織を、ピペットを用いて、ナイロンメッシュを通過させて無菌ビーカーに移した。次に、細胞を完全培地（１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０）で３回洗浄した。１０％ＦＢＳ、１μＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（バイオ・ホイッタカー社（Bio-Whittaker））中で選択することにより、ＲＡ滑膜線維芽細胞をＲＡ膜細胞の混合集団から単離した。ヒト単球は末梢血（ロンドン血液銀行）から単離し、マクロファージは、１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦによる４日間の分化の後の単球から派生させた。
【０２８１】
本試験は地元のＴｒｕｓｔ倫理委員会（Trust ethics committee）による承認を受け、廃棄組織（関節置換外科手術後の滑膜）は患者から署名済みのインフォームドコンセントを受領した場合のみに受け取り、組織を匿名扱いにして患者のアイデンティティーを保護した。
【０２８２】
細胞刺激およびサイトカイン合成の評価
単離の直後に、ＲＡ膜細胞を、９６ウェル組織培養プレート内で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中で、１×１０５細胞／ウェルで培養した。細胞を、３７℃で２４時間、添加無し、緩衝液対照（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）、または２５μｍ、１００μＭもしくは２５０μＭの各々のＦＢＧにまたがるペプチド（FBG spanning peptide）と共に、インキュベートした。
【０２８３】
滑膜線維芽細胞（継代数２または３においてのみ使用）を、３．５ｃｍディッシュに５×１０４細胞の濃度で播種した。ｓｉＲＮＡを、無血清ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ中で４時間、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社）を用いて、１０ｎＭの最終濃度でトランスフェクトした。ヒトテネイシンＣに対する２つの異なるｓｉＲＮＡを使用した（ｓ７０６９およびｓ２２９４９１）（アプライドバイオシステムズ社）。
【０２８４】
ｓ７０６９のｓｉＲＮＡ配列は、（センス  ５’ＣＧＣＧＡＧＡＡＣＵＵＣＵＡＣＣＡＡＡｔｔ３’［配列番号２９］、アンチセンス  ５’ＵＵＵＧＧＵＡＧＡＡＧＵＵＣＵＣＧＣＧｔｃ３’［配列番号３０］）であり、ｓ２２９４９１のｓｉＲＮＡ配列は、（５’ＧＧＡＡＵＡＵＧＡＡＵＡＡＡＧＡＡＧＡｔｔ３’［配列番号３１］、アンチセンス  ５’ＵＣＵＵＣＵＵＵＡＵＵＣＡＵＡＵＵＣＣｇｇ３’［配列番号３２］）である。非標的指向化対照として、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ダーマコン社（Dharmacon））をトランスフェクトした。
【０２８５】
トランスフェクションの４時間後、培地を１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）を含有する事前に平衡化したダルベッコー変法イーグル培地と交換し、細胞をさらに４８時間および７２時間インキュベートした。次に細胞を、３７℃で２４時間、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで刺激した。テネイシンＣのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを、それぞれＰＣＲおよびウェスタンブロッティングで定量化した。ＱｉａＡｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄミニキット（キアゲン社、ドイツ）を用いて、全ＲＮＡを細胞から抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社）および１８ｍｅｒ  オリゴｄＴ（ユーロフィンズＭＷＧオペロン社（Eurofins MWG Operon））を用いて、ｃＤＮＡを等量の全ＲＮＡから合成した。
【０２８６】
遺伝子発現を、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ  ６０００装置（コーベット・リサーチ社（Corbett Research Ltd））における、ＴａｑＭａｎプライマーセット  ヒトテネイシンＣ（Ｈｓ０１１１５６６３−ｍ１）およびヒトリボソームタンパク質内在性コントロール（ＲＰＬＰＯ）（４３１０８７９Ｅ）（アプライドバイオシステムズ社）を用いる定量的リアルタイムＰＣＲに基づくデルタ−デルタｃｔ法（delta-delta ct method）によって、解析した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよび抗体ＭＡＢ１９０８（ミリポア社）を用いるウェスタンブロッティングにより、テネイシンＣタンパク質を細胞上清および細胞可溶化液中で検出した。
【０２８７】
マクロファージを、刺激前に２４時間、９６ウェル組織培養プレート内で、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中で、１×１０５細胞／ウェルで培養した。細胞を、添加無し、１．０μＭ  ＦＢＧ、１ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳまたは１もしくは２０μＭ  ＦＢＧ  ペプチドと一緒に、３７℃で２４時間インキュベートした。記載がある場合、細胞を２０μＭ  ＦＢＧペプチドと一緒に１５分間プレインキュベートした。
【０２８８】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ（シグマ社、プール、英国）で試験された際、細胞の生存率は実験期間全体に亘り有意な影響を受けなかった。製造業者の取扱説明書（Ｒ＆Ｄシステムズ社）に従った酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８の存在について上清を調べた。吸光度を分光光度的ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ラボシステムズ・マルチスキャン・バイオクロミック社、ヴァンター、フィンランド）上で読み、Ａｓｃｅｎｔソフトウェアプログラム（サーモ・ラボシステムズ社、オールトリンガム、英国）を用いて解析した。
【０２８９】
統計手法
平均値、ＳＤおよびＳＥＭは、ＧｒａｐｈＰａｄ（グラフパッド・ソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて算出した。
【０２９０】
結果
特異的なＦＢＧペプチドによるＲＡ膜培養物におけるサイトカイン合成の遮断
ペプチド阻害のアプローチは、テネイシンＣのＦＢＧドメイン内のαｖβ３インテグリン結合部位の位置を正確に示し、テネイシンＣのこのドメインに応答した細胞接着を阻止することに成功している（Lafleur(1997)およびYokoyama(2000)）。
【０２９１】
ＦＢＧの配列全体にまたがる、約３０アミノ酸の、一連の８つの重複ペプチドを合成した（表２）。ペプチドを、ＲＡ滑膜培養物における自発的なサイトカイン合成を遮断する能力について試験した。ＴＮＦおよびＩＬ８の合成が、ペプチド３および８によって阻害されたが、他のペプチドによっては阻害されなかった（ＴＮＦは図１５に示される）。ペプチド３および８は、サイトカイン合成を用量依存的に阻害し、最高濃度ではそれぞれ９５％阻害および５６％阻害を達成した（図１６）。ペプチド５はＴＮＦ合成に影響を与えなかったが、ＲＡ膜細胞におけるＩＬ８合成を用量依存的に遮断し、最大阻害は８１％であった（図１６）。
【０２９２】
サイトカイン産生の誘導に関与するＦＢＧ内の活性ドメインを位置付けるため、初代ヒトマクロファージを各々のＦＢＧペプチドで刺激した。ペプチド１、５および６は全て、サイトカイン合成を用量依存的に誘導した（図１７）。
【０２９３】
任意のペプチドがヒトマクロファージにおけるＦＢＧ誘導性サイトカイン合成を遮断し得るかどうかを決定するために、細胞を各々のＦＢＧペプチドと一緒にインキュベートし、その後、全ＦＢＧまたはＬＰＳで刺激した。ペプチド５はＦＢＧ介在性サイトカイン合成を特異的に遮断し、一方、ペプチド８はＬＰＳおよびＦＢＧの両方に応答したサイトカイン合成を遮断した（図１８）。
【０２９４】
従って、ペプチド８は、あらゆる刺激によって誘導されるサイトカイン産生を、非特異的に遮断する。このドメインは、細胞接着を仲介するＦＢＧのインテグリン結合ドメインであり、従って、組織培養プレートへの細胞接着を阻止する働きをし得る。ペプチド５はＦＢＧ誘導性サイトカイン合成を特異的に遮断したが、このことは、このドメインの標的化がテネイシンＣ誘導性炎症の防止に有用であり得ることを示唆している。
【０２９５】
テネイシンＣ遺伝子発現のサイレンシングは、ＲＡ滑膜線維芽細胞におけるサイトカイン合成を阻害する
ヒトＲＡ滑膜におけるテネイシンＣ発現の阻害の影響を調べることにより、滑膜線維芽細胞がＲＡにおけるテネイシンＣの主な供給源であることが特定された（図１Ｃ）（Goh2010）。
【０２９６】
ｓｉＲＮＡを介した、これらの細胞におけるテネイシンＣ発現のノックダウンは、９４〜９６％の最大効率を有することが示された（図１９）。テネイシンＣのｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞では、基底レベルのサイトカイン合成およびＬＰＳ誘導性サイトカイン産生の両方が、対照細胞と比較してそれぞれ３８％および４４％阻害された（図１９）。
【０２９７】
これらのデータは、ＲＡ滑膜線維芽細胞におけるテネイシンＣのサイレンシングが炎症誘発性サイトカインの合成を減少させることを明らかにしており、テネイシンＣ発現の消失が、滑膜における炎症を阻害するための実行可能な戦略であることを示唆している。
【０２９８】
本研究により、テネイシンＣ活性の（ペプチドによる）遮断およびテネイシンＣ発現の（ｓｉＲＮＡによる）遮断が、ヒトＲＡ滑膜における炎症性サイトカイン合成を減少させることが確認された。これらのデータは、テネイシンＣ遮断がＲＡおよび他の炎症性疾患の治療において臨床的利点となり得ることを示している。
【０２９９】
実施例６：インビトロにおけるシトルリン化
等量のタンパク質および２×シトルリン化緩衝液（２００ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ）を混合した。ｍｇ基質タンパク質当たり８．７５Ｕのウサギ骨格ＰＡＤ（rabbit skeletal PAD）（製造番号Ｐ１５８４、シグマ社製）を添加し、３７℃で３時間または５０℃で２時間インキュベートした。シトルリン化を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥのクマシー・ブルー染色またはＡＭＣ検出により可視化されたサイズ変化によって確認した。
【０３００】
図２０に示される結果は、精製されたフィブリノーゲンおよびＦＢＧがインビトロにおいてシトルリン化可能であることを示している。
【０３０１】
精製された完全長テネイシンＣのインビトロにおけるシトルリン化は、図２１中の結果により示される。
【０３０２】
実施例７：シトルリン化タンパク質のＡＭＣ（抗修飾シトルリン）検出
シトルリン化を、ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ  （Ｍｏｄｉｆｉｅｄ）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ミリポア社（カタログ：１７−３４７））からのプロトコルを用いて検出した。
【０３０３】
Ａ．  ニトロセルロースブロット調製
１．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセルロースに転写。
ブロットを水で２×５分間洗浄。
２．  ブロットを１０ｍｌのＴＢＳ中０．１％オボアルブミン中で室温で１５分間インキュベーション。
３．  水で２×１０分間洗浄。
【０３０４】
Ｂ．  シトルリン残基の修飾
１．  ３ｍｌの試薬Ａおよび３ｍｌの試薬Ｂを混合。
使用の直前に調製。
２．  遮光性容器内で修飾緩衝液をブロットに添加し、３７℃で５〜７時間インキュベーション。
３．  ブロットを水で４〜５回リンス。
【０３０５】
Ｃ．  修飾シトルリン残基の検出
１．  ブロットを新たに調製したＴＢＳ中３％脱脂粉乳中で３０分間〜１時間ブロッキング。
２．  ブロットを５〜８ｍｌの、ＴＢＳ−ＭＬＫで１：１０００希釈した抗修飾シトルリン抗体と一緒に、４℃で撹拌しながら一晩インキュベーション（室温で２〜３時間のインキュベーションでうまくいくと思われる）。
３．  ブロットを水で３回リンスした後、１５分間１回、その後５分間３回洗浄。
４．  ブロットを５〜８ｍｌの、ＴＢＳ−ＭＬＫで１：５０００希釈したヤギ抗ウサギＨＲＰ結合型ＩｇＧと一緒に、撹拌しながら室温１時間インキュベーション。
５．  ブロットを３段階で洗浄。
６．  ブロットをＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３〜５分間洗浄。
７．  ブロットを水で４〜５回リンス。
８．  検出にＥＣＬ−ｐｌｕｓを使用。
【０３０６】
図２２は、ウエスタンブロットによるＦＢＧおよびテネイシンＣのシトルリン化の確認を示している。
【０３０７】
実施例８：ＦＢＧはインビトロにおいてＰＡＤによりシトルリン化される
図２３は、ＦＢＧがインビトロにおいてＰＡＤによりシトルリン化されることを示している。具体的には、クマシー・ブルー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥ、および抗修飾シトルリン特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにおけるＦＢＧの分子量の増加は、ＦＢＧが用量および時間依存的にｒＰＡＤ２、ｈＰＡＤ２およびｈＰＡＤ４によってシトルリン化されることを示している。
【０３０８】
実施例９：シトルリン化がテネイシンＣの炎症誘発活性を調節することの証明
初代ヒトマクロファージを、上記の通りに単離し、刺激前に２４時間、９６ウェル組織培養プレート内で、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中で、１×１０５細胞／ウェルで培養した。細胞を、添加無し（ＵＮ）、様々な濃度（μＭ）のネイティブなＦＢＧ（ｎＦＢＧ）もしくはｃｉｔ  ＦＢＧ（ｃＦＢＧ）、またはシトルリン化緩衝液単独（ＣＩＴ）もしくはｃｉｔ緩衝液＋ＰＡＤ酵素（ＣＩＴ＋ＰＡＤ）と一緒に、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０３０９】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ（シグマ社、プール、英国）で試験された際、細胞の生存率は実験期間全体に亘り有意な影響を受けなかった。製造業者の取扱説明書（Ｒ＆Ｄシステムズ社）に従った酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により、サイトカインＴＮＦ−αの存在について上清を調べた。吸光度を分光光度的ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ラボシステムズ・マルチスキャン・バイオクロミック社、ヴァンター、フィンランド）上で読み、Ａｓｃｅｎｔソフトウェアプログラム（サーモ・ラボシステムズ社、オールトリンガム、英国）を用いて解析した。
【０３１０】
図２４は、シトルリン化がＦＢＧによって刺激されたサイトカイン産生を増強することを示している。
【０３１１】
実施例１０：ＲＡ患者由来の血清は、健常対照群と異なり、シトルリン化テネイシンＣおよびシトルリン化ＦＢＧと反応する
シトルリン化タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ
３３．３３μｌのシトルリン化反応物（ｃｉｔ−ＴＮＣ単独またはｃｉｔ−ＦＢＧと組み合わせたｃｉｔ−ＴＮＣ）を、１．０ｍｍ  ２Ｄ単一レーンウェルを用いるＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−ｔｒｉｓゲルに添加した。
【０３１２】
ＲＡ血清によるウエスタンブロット検出
電気泳動後、タンパク質をニトロセルロースに転写し、膜をブロッキングした後、切断して条片にした（約０．７ｃｍ幅の最大８枚の条片）。条片を、５％ミルクＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ中で１：１００希釈したＲＡ患者または健常人由来の血清と一緒にインキュベートした。条片をローラー上の１５ｍｌファルコンチューブ内で室温で１時間インキュベートし、その後、チューブ内でＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間３回、１５分間１回洗浄した。次に、条片をマウス抗ヒトＩｇ二次抗体（１：５０００）と一緒に室温で１時間インキュベートし、その後、ディッシュ内でＴＢＳ−ｔｗｅｅｎで５分間３回、１５分間１回洗浄した。最後に、条片をＥＣＬ試薬と一緒にインキュベートし、フィルムに露光した。
【０３１３】
図２５Ａは、ネイティブな精製ヒト組換えテネイシンＣ（ｎＴＮＣ）およびシトルリン化した精製ヒト組換えテネイシンＣ（ｃＴＮＣ）のクーマシー染色したゲル（上段パネル）、並びにＡＭＣ（抗修飾シトルリン）キットを用いるウエスタンブロットによって示されたテネイシンＣのシトルリン化（下段パネル）を示している。
【０３１４】
図２５Ｂは、ＲＡ患者（ＲＡ）または健常者対照群（ＮＨ）（ｎ＝５０）から得られた血清を用いてプローブされた、ｃＴＮＣの代表的なウエスタンブロットを示している。ｎＴＮＣのブロットにおいて、いかなる血清とも反応性は観察されなかった（図示無し）。
【０３１５】
図２６および２７は、ＲＡ患者の一部から得られた血清がｃｉｔＴＮＣに対する反応性を示すことをしめしている（各ゲルのレーン４のＲＡ患者試料を参照）。
【０３１６】
図２８は、健常者対照群から得られた血清がｃｉｔＴＮＣとの反応性を示さないことを示している。
【０３１７】
図２９は、シトルリン化ＴＮＣおよびシトルリン化ＦＢＧに対するＲＡ血清の反応性を示している。ｃＴＮＣ＋ｃＦＢＧのウエスタンブロットでは、同じウェルで一緒に泳動され、７人の異なるＲＡ患者由来の血清でプローブされた。完全長ＴＮＣ（３２０ｋＤ）と反応したがＦＢＧとは反応しなかった患者サブセット（レーン４、５）、またはシトルリン化ＦＢＧ（２７ｋｄ）と反応したが完全長ＴＮＣとは反応しなかった患者（レーン６）が観察された。
【０３１８】
同じレーンで、完全長シトルリン化ＴＮＣと一緒に、およびシトルリン化ＦＢＧと一緒に泳動されたゲルは、一部の患者が完全長ＴＮＣに応答することを示している。ＴＮＣに応答する患者の中で、ほんの一部がＦＢＧにも応答し、従ってそれらは、定義によれば、異なるドメインを認識しなければならない。
【０３１９】
実施例１１：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるシトルリン化の部位の定義
図３０および表３に関連して、シトルリン化アルギニン残基をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで特定した。シトルリン化のために使用された酵素とは無関係で、１７個のアルギニンのうち、５個はシトルリン化されず、３個のアルギニンはこのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析には網羅されず、９個のアルギニン残基はシトルリン残基に変化した。
【０３２０】
【表３−１】
2017505763.tif 000005
【０３２１】
【表３−２】
2017505763.tif 000006
【０３２２】
実施例１２：シトルリン化抗体エピトープの特定
図３１に関連して、シトルリン残基を包含する６つの環式ＦＢＧペプチドに対する、２０のＲＡ血清および２０の対照血清における抗体応答を評価した。
【０３２３】
ここで評価されたペプチドは以下の通りである：
Ｒ５５：ＣＶＦＬＲＲＫＮＧ−Ｒ−ＥＮＦＹＱＮＷＣ［配列番号５４］
ＣＩＴ５５：ＣＶＦＬＲＲＫＮＧ−Ｃｉｔ−ＥＮＦＹＱＮＷＣ［配列番号５５］
Ｒ７２：ＣＡＹＡＡＧＦＧＤ−Ｒ−ＲＥＥＦＷＬＧＬＣ［配列番号５６］
ＣＩＴ７２：ＣＡＹＡＡＧＦＧＤ−Ｃｉｔ−ＲＥＥＦＷＬＧＬＣ［配列番号５７］
Ｒ１２０：ＣＦＳＶＧＤＡＫＴ−Ｒ−ＹＫＬＫＶＥＧＹＣ［配列番号５８］
ＣＩＴ１２０：ＣＦＳＶＧＤＡＫＴ−Ｃｉｔ−ＹＫＬＫＶＥＧＹＣ［配列番号５９］
Ｒ１６９／１７３：ＣＫＧＡＦＷＹ−Ｒ−ＮＣＨ−Ｒ−ＶＮＬＭＧＲＣ［配列番号６０］
ＣＩＴ１６９／１７３：ＣＫＧＡＦＷＹ−Ｃｉｔ−ＮＣＨ−Ｃｉｔ−ＶＮＬＭＧＲＣ［配列番号６１］
Ｒ２０９／２１４／２１９／２２０：ＣＥＭＫＬ−Ｒ−ＰＳＮＦ−Ｒ−ＮＬＥＧ−Ｒ−Ｒ−ＫＲＣ［配列番号６２］
ＣＩＴ２０９／２１４：ＣＥＭＫＬ−Ｃｉｔ−ＰＳＮＦ−Ｃｉｔ−ＮＬＥＧＲＲＫＲＣ［配列番号６３］
ＣＩＴ２１９／２２０：ＣＥＭＫＬＲＰＳＮＦＲＮＬＥＧ−Ｃｉｔ−Ｃｉｔ−ＫＲＣ［配列番号６４］
【０３２４】
ペプチドＣＩＴ５５、ＣＩＴ２０９／２１４およびＣＩＴ２１９／２２０を含有するシトルリンに対する強力な抗体応答が、ＲＡ血清においては検出され、一方、対照血清においては検出されなかった。アルギニンを含有する対照ペプチドに対しては応答は観察されなかった。この小さなコホートから得られたデータは、約３５％のＲＡ患者がＣＩＴ５５エピトープ陽性であり、２０％がＣＩＴ２０９／２１４陽性であり、３０％がＣＩＴ２１９／２２０陽性であるが、一方、健常対照群は誰も、健常群の９５パーセンタイルを用いて定義される、陽性を示さなかったことを示している。同じ計算を用いることで、健常対照の一群と比較してＲＡを診断することができ、これらの群における同様の割合が予想され得る。
【０３２５】
これらのデータは、ｃｉｔＦＢＧ抗体陽性またはｃｉｔＦＢＧ陽性に基づく患者の層別化を可能にする。陽性であった患者は、シトルリン化ＦＢＧの活性を標的とするよう設計されたあらゆる薬剤を用いた治療の候補となるだろう。また、異なるエピトープの存在によって、どのようにしてｃｉｔＦＢＧを標的化するかが知らされる。例えば、ＣＩＴ５５が存在した場合、治療にはＦＢＧの免疫原性活性の遮断を含まれ得るが、インテグリン結合部位がシトルリン化されていた場合、治療にはこのドメインの作用の遮断が含まれ得る。
【０３２６】
実施例１３：ＦＢＧのシトルリン化はＨＤＦおよびＲＡＦの細胞接着を減少させる
図３２に関連して、ＦＢＧは、皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）およびＲＡ関節由来の滑膜線維芽細胞（ＲＡＦ）の接着を促進する。ＦＢＧのシトルリン化はＨＤＦおよびＲＡＦの接着を減少させる。インテグリンαｖβ３と結合することが知られている配列の中の２つのアルギニンがシトルリン化されることから、接着の減少はインテグリンαｖβ３に対するｃＦＢＧの結合減少によるものであり得る。Yokoyamaらにより、ＦＢＧ内のこのペプチド配列が細胞表面のａｖｂ３インテグリンに対する結合を介して細胞接着を仲介することが特定された。ここでは、１）インビトロにおいてシトルリン化がインテグリン結合部位で起こること、２）これによって細胞接着が減少すること、および３）これがＲＡＳＦにおいて起こることが示され、これは、ＲＡ関節において、この部位におけるＦＢＧのシトルリン化がＲＡＳＦの接着を減少させ得ることを意味している。これは、疾患増悪において多くの意味を有し得る。例えば、細胞遊走が促進され得（例えば、健常な関節組織への浸潤およびその分解）、ＲＡＳＦ増殖が促進され得る（それにより滑膜の過形成が永続化される）。
【０３２７】
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【図１−１】
2017505763.tif 000007
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３１−４】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【国際調査報告】
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