(57)【要約】  本出願は、拒絶反応関連症状を改善し、早期分離を低減する方法を提供し、また、改変されたエピトーププロファイルを有する目的化合物を生産する方法を提供する。破壊された遺伝子を有するノックアウトブタ、並びに、それに由来するブタの臓器、組織、および細胞が提供される。
2017536814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの細胞の核ゲノムにおいて、破壊されたα（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比べて減少している、トランスジェニックブタ。
【請求項２】
請求項１に記載のトランスジェニックブタから単離された、ブタの臓器、組織、輸血製剤、または細胞。
【請求項３】
皮膚、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、小腸、血液、およびそれらの構成成分からなる群から選択される、請求項２に記載のブタの臓器、組織、輸血製剤、または細胞。
【請求項４】
該ブタ由来の臓器、組織、輸血製剤、または細胞がヒトに移植される場合に、野生型のブタ由来の臓器、組織、輸血製剤または細胞がヒトに移植される場合と比較して、拒絶反応関連症状が改善される、請求項１に記載のトランスジェニックブタ。
【請求項５】
該ブタ由来の臓器、組織、輸血製剤、または細胞がヒトに移植される場合に、拒絶反応関連症状が細胞性拒絶反応関連症状、体液性拒絶反応関連症状、超急性拒絶反応関連症状、急性体液性異種移植反応拒絶反応関連症状および急性血管性拒絶反応関連症状を含む群から選択される、請求項４に記載のトランスジェニックブタ。
【請求項６】
該ブタ由来の臓器、組織、輸血製剤、または細胞がヒトに移植される場合に、野生型のブタ由来の臓器、組織、輸血製剤または細胞がヒトに移植される場合と比較して、血小板減少症が減少する、請求項４に記載のトランスジェニックブタ。
【請求項７】
該トランスジェニックブタ由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合に、野生型のブタ由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合と比較して、肝臓が血小板取り込みの減少を示す、請求項１に記載のトランスジェニックブタ。
【請求項８】
創傷からの早期分離の低減を示す、請求項１に記載のトランスジェニックブタから得られる皮膚関連物。
【請求項９】
創傷が、ヒトの皮膚の創傷である、請求項８に記載の皮膚関連物。
【請求項１０】
該トランスジェニックブタ由来の腎臓がヒトに移植される場合に、野生型のブタ由来の腎臓がヒトに移植される場合と比較して、拒絶反応関連症状が減少する、請求項４に記載のトランスジェニックブタ。
【請求項１１】
ヒトに異種移植するための移植材料を製造する方法であって、請求項１に記載のトランスジェニックブタを該移植材料の供給源として提供することを含む方法であり、該移植材料は、臓器、組織、輸血製剤および細胞からなる群から選択され、かつ、該移植材料はαＧａｌ抗原のレベルが低減し、Ｎｅｕ５ＧＣ抗原のレベルが低減し、またＳｄａ様抗原のレベルが低減している、方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの細胞の核ゲノムにおいて、破壊されたα（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含むトランスジェニックブタであって、ここで、該α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が、ＧからＡへの置換に隣接した３塩基対の欠失、１塩基対の欠失、１塩基対の挿入、２塩基対の挿入、６塩基対の欠失、１０塩基対の欠失、７塩基対の欠失、５塩基対の欠失に代わる８塩基対の挿入、５塩基対の挿入、１１塩基対の欠失および１８塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され；ここで、該ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が４塩基対の挿入、１塩基対の欠失、２塩基対の欠失、３塩基対の欠失、５塩基対の欠失、８塩基対の欠失、２０塩基対の欠失、１１塩基対の欠失、１２塩基対の欠失、１塩基対の挿入、１塩基対の欠失に代わる２塩基対の挿入、４塩基対の挿入に代わる３塩基対の欠失、６６塩基対の欠失かつ１２塩基対の挿入、および１塩基対の置換を伴う５塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、ここで、該β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が１２塩基対の欠失、５塩基対の欠失、１４塩基対の欠失、１２塩基対の欠失かつ１塩基対の置換、１塩基対の挿入を伴う２７１塩基対の欠失、および１塩基対の挿入を含む破壊の群から選択され、ここで、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しており、該トランスジェニックブタ由来の組織がヒトへ移植される場合に、野生型のブタ由来の組織がヒトへ移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症状が改善される、トランスジェニックブタ。
【請求項１３】
該α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が５塩基対の欠失、７塩基対の欠失、および５塩基対の欠失と７塩基対の欠失の両方を含む群から選択され、該ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が１２塩基対の欠失および３塩基対の欠失に代わる４塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、該β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が１２塩基対の欠失、５塩基対の欠失および１塩基対の挿入を含む破壊の群から選択され、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しており、該トランスジェニックブタ由来の組織がヒトへ移植される場合に、野生型のブタ由来の組織がヒトへ移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症状が改善される、請求項１２に記載のトランスジェニックブタ。
【請求項１４】
α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が１１塩基対の欠失および１８塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が６６塩基対の欠失/１２塩基対の挿入および５塩基対の欠失/１塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が１４塩基対の欠失、１２塩基対の欠失、および２７１塩基対の欠失/１塩基対の挿入を含む破壊の群から選択され、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しており、該トランスジェニックブタ由来の組織がヒトへ移植される場合に、野生型のブタ由来の組織がヒトへ移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症状が改善される、請求項１２に記載のトランスジェニックブタ。
【請求項１５】
ヒト対象がヒト臓器移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト臓器移植が行われるまでの期間を拡大させる方法であって、少なくとも１つの細胞の核ゲノムにおいて破壊されたα（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタ由来の臓器を提供すること、および治療的に有効な方法で該トランスジェニックブタ由来の該臓器を該ヒト対象に取り付けることを含む方法。
【請求項１６】
該トランスジェニックブタ由来の臓器が、ヒト対象に体内に外科的に取り付けられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該トランスジェニックブタ由来の臓器が、ヒト対象に外部に外科的に取り付けられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
該臓器が、直接的または間接的に該対象に取り付けられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト対象がヒト肝臓移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト肝臓移植が行われるまでの期間を拡大させる方法であって、少なくとも１つの細胞の核ゲノムにおいて破壊されたα（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタ由来の肝臓を提供すること、および治療的に有効な方法で該トランスジェニックブタ由来の該肝臓を該ヒト対象に取り付けることを含む方法。
【請求項２０】
ヒトからの皮膚関連物の早期分離を低減する方法であって、破壊されたα（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨ、およびβ４ＧａｌＮＴ２を含み、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタを提供すること、および、該トランスジェニックブタ由来の皮膚関連物を製造することのステップを含む方法。
【請求項２１】
αＧａｌ抗原、Ｓｄａ様抗原およびＮｅｕ５ＧＣ抗原のレベルが低減されたブタの移植材料を、移植を必要とする対象に移植することを含む、ヒト対象における超急性拒絶反応関連症状を改善する方法であって、野生型のブタ由来のブタの移植材料がヒト対象に移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症状が改善される方法。
【請求項２２】
破壊されたα（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨ、およびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタから単離された、改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬。
【請求項２３】
細胞培養培地、細胞培養血清、細胞培養添加物および増殖可能な単離細胞を含む群から選択される、請求項２２に記載の細胞培養試薬。
【請求項２４】
該α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が５塩基対の欠失、７塩基対の欠失、および５塩基対の欠失と７塩基対の欠失の両方を含む群から選択され、該ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が１２塩基対の欠失および３塩基対の欠失に代わる５塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、該β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が１２塩基対の欠失、５塩基対の欠失および１塩基対の挿入を含む破壊の群から選択されるトランスジェニックブタから単離される、請求項２２に記載の細胞培養試薬。
【請求項２５】
該α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が１１塩基対の欠失および１８塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が６６塩基対の欠失/１２塩基対の挿入および５塩基対の欠失/１塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が１４塩基対の欠失、１２塩基対の欠失/１塩基対の置換、および２７１塩基対の欠失/１塩基対の挿入を含む破壊の群から選択されるトランスジェニックブタから単離される、請求項２２に記載の細胞培養試薬。
【請求項２６】
改変されたエピトーププロファイルを有する目的化合物を生産する方法であって、破壊されたα（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨ、およびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタから単離される、改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬を提供するステップと、目的化合物を発現できる単離細胞を該細胞培養試薬と共に培養するステップとを含み、目的化合物上のＮｅｕ５Ｇｃエピトープ、Ｓｄａ様エピトープまたはａｌｐｈａＧａｌエピトープのレベルが、野生型のブタから単離された細胞培養試薬と共に培養された単離細胞から目的化合物が生産された場合の目的化合物上の該エピトープのレベルよりも低い、方法。
【請求項２７】
目的化合物が、糖脂質および糖タンパク質を含む群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
目的化合物が、抗体、増殖因子、サイトカイン、ホルモンおよび凝固因子を含む糖タンパク質の群から選択される糖タンパク質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が５塩基対の欠失、７塩基対の欠失、および５塩基対の欠失と７塩基対の欠失の両方を含む群から選択され、ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が１２塩基対の欠失および、３塩基対の欠失に代わる５塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、該β４ＧａｌＮＴ２遺伝子が１２塩基対の欠失、５塩基対の欠失および１塩基対の挿入を含む破壊の群から選択されるトランスジェニックブタから細胞培養試薬が単離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
該α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が１１塩基対の欠失および１８塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、該ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が６６塩基対の欠失/１２塩基対の挿入および５塩基対の欠失/１塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、該β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が１４塩基対の欠失、１２塩基対の欠失/１塩基対の置換、および２７１塩基対の欠失/１塩基対の挿入を含む破壊の群から選択され、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しているトランスジェニックブタから細胞培養試薬が単離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
αＧａｌ抗原のレベルが低減し、Ｓｄａ様抗原のレベルが低減し、かつ、Ｎｅｕ５Ｇｃ抗原のレベルが低減している、ヒトへの移植のためのブタの移植材料。
【請求項３２】
少なくとも１つの細胞の核ゲノムにおいて破壊されたα（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１、３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しており、ＶＶＬ結合が低減している、トランスジェニックブタ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月２２日に出願された米国仮出願第６２／０６７，１２９号に対して優先権を主張するものであり、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
本明細書と共に提出されたテキスト形式の配列表は、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
連邦により支援された研究または開発についての記述
該当なし。
【０００４】
技術分野
本発明は、異種移植、およびトランスジェニックブタ、ヒトへの移植に好適なトランスジェニックブタの臓器、組織、または細胞、特に、血小板減少症、超急性拒絶反応（ＨＡＲ）、または血小板取り込みを引き起こす傾向が減少したトランスジェニックブタを開発するための遺伝子組換えの分野に広く関するものである。
【背景技術】
【０００５】
ある動物から同種の別の動物への、例えばヒトからヒトへの移植は、腎臓、心臓、肺、肝臓および他の臓器の疾患、並びに重度の熱傷疾患などの皮膚損傷を含む多くの重篤な症状にとって、通例の治療の選択肢であることはよく知られている。しかしながら、臓器移植に関して、現在の、または期待される臨床上の需要を満たすための、移植に利用可能な好適な臓器は十分存在しないことがよく知られている。およそ１０万人の患者が腎臓移植リストに載っており、移植あるいは死に至るまでに平均で５年近く待機リストに載っている状態である。腎不全患者において、透析は、患者が移植を待つことができる時間の長さを増大させる。１８，０００人を超える患者が、ＵＮＯＳ肝臓移植国際待機リストに載っているが、今のところ７，０００未満の移植が米国において毎年実施されている。肝疾患または肝不全患者にとって利用できる、透析に匹敵するシステムは存在しない。
【０００６】
異種移植、すなわち、ある動物由来の臓器、組織、または細胞の、異なる種の別の動物への移植、例えばブタの臓器のヒトレシピエントの移植は、移植に利用可能な臓器の不足を減少させ、世界中で数千人を救う可能性を有している。しかしながら、標準的な、非修飾のブタ組織を用いた、ヒトまたは他の霊長類への異種移植は、移植された組織の重度の拒絶反応を伴う。該拒絶反応は、超急性拒絶反応、急性拒絶反応、慢性拒絶反応であってよく、生着を制限する血小板減少症凝固障害を含んでよく、あるいは急性体液性異種移植反応（ＡＨＸＲ）であってよい。移植された組織に存在するブタ抗体に対するヒト超急性拒絶反応は、非常に強いため、該移植組織はヒトに移植された数分または数時間以内に、ヒトの免疫系により一般的に損傷を受ける。さらに、臓器に応じて異なる拒絶反応メカニズムが優勢となり得る。Demetris et al. 1998 “Antibody-mediated Rejection of Human Orthotopic Liver Allografts.  A study of liver transplantaion across ABO blood group barriers”, Am J. Pathol 132:489-502; Nakamura et al 1993 “Liver allograft rejection in sensitized recipients.  Observations in a Clinically Relevant Small Animal Model” Am J. Pathol. 142:1383-91; Furuya et al 1992. “Preformed Lymphocytotoxic Antibodies: the Effects of Class, Titer and Specificity on Liver v Heart Allografts” Hepatology16:1415-22; Tector et al 2001. “Rejection of Pig Liver Xenografts in Patients with Liver Failure: Implications for Xenotransplantation”, Liver Transpl pp.82-9（これらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。例えば、血小板減少性の凝固障害の初期の進行は、ブタ肝臓の異種移植後の非ヒト霊長類レシピエントの死における主な要因である。しかし、抗体仲介異種移植拒絶反応（ＡＭＸＲ、ＡＭＲ）が妨げられた場合、ブタ腎臓の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）レシピエントは、重大な血小板減少症を発症せず、凝固障害の臨床病態も示さない。例えば、Ekser et al. 2012 “Genetically Engineered Pig to Baboon Liver Xenotransplantation: Histopathology of Xenografts and Native Organs” PLoS ONE  pp e29720; Knosalla et al 2009, “Renal and Cardia Endothelial Heterogeneity Impact Acute Vascular Rejection in Pig to Baboon Xenotransplantaion”, Am J Transplant 1006-16; Shimizu et al 2012. “Pathologic Characteristics of Transplanted Kidney Xenografts”, J. Am. Soc. Nephrology 225-35（これらの全体は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０００７】
移植のための臓器、組織、および細胞の必要性に加えて、輸血のための安全な血液が不足している。濃縮赤血球（ＲＢＣ）を利用した１，１００万回の血液の輸血が、米国で毎年投与されている(National Blood Data Source, 1998)。米国の血液供給は、慢性的に不十分である。２００１年、米国の血液バンクが得る量は最も望ましい量よりも約２５０，０００ユニット少ないと見込まれていた。当局は、通常、定期的な供血者が休暇に出かけ、大学生も主な都心を離れる夏季に、危機的な全国的不足が起こると予測する。国は頑強で競争力のある血液集配システム（blood collection and distribution system）を有しているため、定期的な不足は、たいていは死に至らないが、待機手術を延期する必要があり得、危機的でない必要性は満たされない。通常の提供された血液は約４２日間しか保管できず、また血液を提供するのは適格ドナーのうちの５％未満であるため、吹雪またはハリケーンなどの厳しい気象条件はしばしば、血液の貯えが危険なほど少ない状況をもたらす。
【０００８】
ヒトの血液は希少資源であるのみならず、レシピエントへの潜在的な危険もまた伴う。ウイルスのスクリーニングプロセスがあるにもかかわらず、提供されたヒトの血液は１００％安全ではない(FDA, Annual Summary of Fatalities Reported to the FDA Following Blood Collection and Transfusion, FY2013)。母集団におけるＣ型肝炎およびＨＩＶの発症は、費用がかかり難しい、提供された血液製剤の検査を強いる。ヒトの血液がいずれの感染性微生物も含まないことを確認することは困難かつ費用がかかるために、量の制限がなく、感染性の病原体を含まないであろう赤血球および他の輸血製剤の供給源を開発することが、非常に望ましいであろう。
【０００９】
ブタ細胞は、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧａｌ）、およびシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）を発現し、これらはヒト細胞では見られない。ブタ細胞はまた、β１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ（β４ＧａｌＮＴ２）を発現し；多くのヒトは、β４ＧａｌＮＴ２の一形態を発現していると考えられている(Morton et al (1970) Vox Sang 19:472-482)。αＧａｌ酵素は、糖タンパク質上のガラクトース−α１，３−ガラクトース（αＧａｌ）残基の形成を触媒する。ＣＭＡＨは、シアル酸Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）に変換する。ブタのβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ（β４ＧａｌＮＴ２）は、シアル酸修飾ラクトースアミンへのＮ−アセチルガラクトサミンの末端付加を触媒し、ＣＡＤまたはＣＴ血液型抗原としてもまた知られる、Ｓｄａ、およびＧａｌＮＡｃβ１，４［Ｎｅｕ５Ａｃα２，３］Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌを含むがこれらに限定されないＳｄａ様抗原を産生する(Blanchard et al (1983) JBC 258:7691-7695)。ブタのβ４ＧａｌＮＴ２は、同様にさらなるグリカンの形成を触媒し得る。Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープ、αＧａｌエピトープおよびＳｄａエピトープに対する抗体が、組織の埋め込み（implantation）よりも前からヒトの血液に存在し、埋め込まれた組織の強烈な即時の抗体媒介性拒絶反応に関係する。さらなるβ４ＧａｌＮＴ２（Ｓｄａ様）エピトープに対する抗体がまた、患者の血液中に存在し得、埋め込まれた組織の抗体媒介性拒絶反応の一因となり得る。
【００１０】
α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＣＭＡＨをコードする遺伝子を除去して酵素の発現を妨げること、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＣＭＡＨをコードする遺伝子を修飾して酵素の発現を低減または制限すること、あるいは他の方法で拒絶反応を制限することを含む多くの戦略が、拒絶反応に対処するために採用されてきた。Phelps et alの米国特許第７，７９５，４９３号は、機能性のαＧａｌの発現を欠いているブタの生産の方法を記述している。例えば、Day et alの米国特許第７，５４７，８１６号は、野生型のブタと比較してα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が減少しているノックアウトブタを記述している。Dayのブタは、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの発現が減少し得るが、Ｎｅｕ５Ｇｃ抗原性エピトープは存在したままであり、Dayブタ由来の糖脂質はαＧａｌ抗原性エピトープを有する。残念なことに、ＧＴＫＯブタは異種移植に対するバリアーとしての抗α−Ｇａｌ抗体を低減させ得るが、ヒヒにおけるＧＴＫＯの心臓および腎臓の異種移植を用いた研究は、ＧＴＫＯ臓器がなお免疫原性反応を引き起こし、移植された臓器に対する拒絶反応または損傷をもたらすことを示している。ＧＴＫＯの腎臓が移植され、２つの異なる免疫抑制治療レジメンで治療されたヒヒは、手術後１６日以内に死亡した。Chen et alは、「Ｇａｌ抗原の遺伝学的欠失は、異種移植の生着に大きな利益を与えない」と結論づけた(Chen et al., (2005) Nature Med 11(12):1295-1298）。Koike et alの米国特許第７，５６０，５３８号、およびZhu et alの米国特許第７，１６６，３７８号および８，０３４，３３０号は、遅延型の異種移植拒絶反応および超急性拒絶反応をそれぞれ受ける可能性が低い、移植のためのブタの臓器を作製する方法を記述している。Zhuの特許は、ブタ細胞上のＣＭＡＨ活性またはエピトープの低減について論じている。しかしながら、Basnet et alは、ヒト血清の、ＣＭＡＨ−／−マウス細胞に対する細胞傷害性反応を調べた。Basnet et alは、「抗Ｎｅｕ５ＧｃＡｂ媒介性免疫応答は、異種間の細胞移植において、移植片機能損失に顕著に関係し得るが、臓器移植においては関係しない」と結論付けた(Basnet et al., 2010 Xenotransplantation 17(6):440-448)。Diamond et alの米国特許第６，１６６，２８８号は、異種移植物質の拒絶反応が減少したヒトへの異種移植のための、臓器、組織、または細胞を製造する方法を記述している。米国特許第６，１６６，２８８号は、ブタの臓器、組織、および細胞由来の特定の異種反応性抗原を意図的に除去する酵素をコードするフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックブタについて記述している。米国特許第６，１６６，２８８号は、３つのブタ遺伝子における改変を有するトランスジェニックブタは提供していない。
【００１１】
Schwarz et alの米国特許第６，５７２，８６７号は、霊長類において抗（αＧａｌ（１，３）Ｇａｌ）抗体の血漿レベルを低減するための免疫抑制組成物を提供する。免疫抑制療法は移植分野において知られている。免疫抑制薬レジメンは、患者の免疫応答を弱めるために感染リスクを上昇させ、費用のかかる維持を目的とした医薬を必要とし、他の薬物と相互作用する薬を含み得、体重増加などのさらなる副作用を引き起こし得る。
【００１２】
本分野の進歩は、拒絶反応を低減させる修飾を有する遺伝子組換えブタの開発に、大いに左右される。残念ながら、ホモ接合性トランスジェニックブタの開発は、ゆっくりとしたプロセスであり、胎仔線維芽細胞の相同組み換えの後に体細胞核移植（ＳＣＮＴ）が続き、その後ヘテロ接合性トランスジェニック動物を繁殖させてホモ接合性トランスジェニックブタを産生する伝統的方法を用いる、３年もの長い期間を必要とする。異種移植のための新規のトランスジェニックブタの開発は、多能性幹細胞の欠如により妨げられており、遺伝子操作が行われた細胞として、代わりに胎仔線維芽細胞に頼っている。
【００１３】
従って、ヒト移植レシピエントに対する臓器、組織、血液および細胞の移植材料の供給源として、αＧａｌエピトープ、Ｓｄａ様エピトープおよびＮｅｕ５Ｇｃエピトープが低減されたトリプルノックアウト（αＧａｌ、β４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ）ブタを生産する、改善された、単純で、再現可能な、効率の良い、標準化された方法が、当業界において必要とされている。
【発明の概要】
【００１４】
本開示は、ヒトに移植するために、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現を減少させたブタの臓器、組織、または細胞を作製する方法に広く関する。
【００１５】
少なくとも１つの細胞の核ゲノムにおいて、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含むトランスジェニックブタが提供される。トランスジェニックブタにおけるα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの発現は、野生型のブタにおける発現と比較して減少している。トリプルトランスジェニックブタから得られる臓器、組織、輸血製剤、または細胞が提供される。ブタの臓器、組織、輸血製剤または細胞は、皮膚、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、小腸およびそれらの構成成分からなる群から選択されてよい。ある局面において、トリプルトランスジェニックブタ由来の組織がヒトに移植される場合、野生型のブタ由来の組織がヒトに移植される場合と比較して、拒絶反応関連症状が改善される。ある局面において、拒絶反応関連症状は、細胞性拒絶反応関連症状、体液性拒絶反応関連症状、超急性拒絶反応関連症状、性体液性異種移植反応拒絶反応関連症状、および急性血管性拒絶反応関連症状を含む群から選択される。ある局面において、トリプルトランスジェニックブタ由来の臓器、組織、輸血製剤または細胞がヒトに移植される場合、野生型のブタ由来の臓器、組織、輸血製剤または細胞がヒトに移植される場合と比較して、血小板減少症が減少する。ある局面において、トランスジェニックブタ由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合、野生型のブタ由来の肝臓がヒト血小板に暴露される場合と比較して、ヒト血小板の取り込みの減少を示す。ある局面において、トリプルトランスジェニックブタ由来の腎臓がヒトに移植される場合、野生型のブタ由来の腎臓がヒトに移植される場合と比較して拒絶反応関連症状が減少する。
【００１６】
ある実施形態において、少なくとも１つの核ゲノムにおいて破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少しているトリプルトランスジェニックブタから得られる皮膚関連物が提供される。本出願のある局面において、該皮膚関連物は、創傷からの、特にヒトの皮膚創傷からの早期分離の低減を示す。
【００１７】
ヒトに異種移植するための移植材料の製造方法が提供される。本方法は、移植材料の供給源として本出願のトリプルトランスジェニックブタを提供することを含み、ここでは、移植材料は、臓器、組織、輸血製剤および細胞からなる群から選択され、また、移植材料は低減されたレベルのαＧａｌ抗原、Ｓｄａ様抗原およびＮｅｕ５Ｇｃ抗原を有する。
【００１８】
少なくとも１つの核ゲノムにおいて、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ１，４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含む、トリプルトランスジェニックブタが提供される。ある実施形態において、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊は、ＧからＡへの置換に隣接した３塩基対の欠失、１塩基対の欠失、１塩基対の挿入、２塩基対の挿入、６塩基対の欠失、１０塩基対の欠失、７塩基対の欠失、５塩基対の欠失に代わる８塩基対の挿入、５塩基対の挿入、１１塩基対の欠失、および１８塩基対の欠失が含まれるが、これらに限定されない破壊の群から選択される；ＣＭＡＨ遺伝子の破壊は、４塩基対の挿入、１塩基対の欠失、２塩基対の欠失、３塩基対の欠失、４塩基対の挿入、５塩基対の欠失、８塩基対の欠失、１１塩基対の欠失、１２塩基対の欠失、１塩基対の挿入、１塩基対の欠失に代わる２塩基対の挿入、６６塩基対の欠失に代わる１２塩基対の挿入、３塩基対の欠失に代わる４塩基対の挿入;および５塩基対の欠失／１塩基対の置換が含まれるが、これらに限定されない破壊の群から選択され、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊は、１塩基対の挿入、１２塩基対の欠失／１塩基対の置換、１２塩基対の欠失、１４塩基対の欠失、５塩基対の欠失および２７１塩基対の欠失／１塩基対の挿入が含まれるが、これらに限定されない破壊の群から選択される。ある実施形態において、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊は、５塩基対の欠失および７塩基対の欠失が含まれる破壊の群から選択され、ＣＭＡＨ遺伝子の破壊は、１２塩基対の欠失および３塩基対の欠失／４塩基対の挿入が含まれる破壊の群から選択され、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊は、１塩基対の挿入、１２塩基対の欠失および５塩基対の欠失が含まれる破壊の群から選択される。ある実施形態において、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊は、１１塩基対の欠失および１８塩基対の欠失が含まれる破壊の群から選択され、ＣＭＡＨ遺伝子の破壊は、６６塩基対の欠失/１２塩基対の挿入および５塩基対の欠失／１塩基対の置換が含まれる破壊の群から選択され、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊は、１４塩基対の欠失、１２塩基対の欠失／１塩基対の置換、および２７１塩基対の欠失／１塩基対の挿入が含まれる破壊の群から選択される。機能性α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の、トリプルトランスジェニックブタにおける発現は、野生型のブタと比較して減少している。トリプルトランスジェニックブタ由来の組織がヒトに移植される場合、野生型のブタ由来の組織がヒトに移植される場合と比較して、超急性拒絶反応関連症候群が改善される。
【００１９】
ヒト対象がヒト臓器移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト臓器移植が行われるまでの期間を拡大させる方法が提供される。本方法は、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少しているトリプルトランスジェニックブタ由来の臓器を提供すること、および、治療的に有効な方法でトリプルトランスジェニックブタ由来の臓器をヒト対象に外科的に取り付けることを包含する。ある局面において、臓器はヒト対象に、体内に外科的に取り付けられる。ある局面において、臓器はヒト対象に、外部に外科的に取り付けられる。臓器は、対象に直接的または間接的に、取り付けられてよい。
【００２０】
ヒト対象がヒト肝臓移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト肝臓移植が行われるまでの期間を拡大させる方法が提供される。本方法は、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少しているトリプルトランスジェニックブタ由来の臓器を提供すること、および、治療的に有効な方法でトリプルトランスジェニックブタ由来の肝臓をヒト対象に外科的に取り付けることを包含する。ある局面において、肝臓はヒト対象に、体内に外科的に取り付けられる。ある局面において、肝臓はヒト対象に、外部に外科的に取り付けられる。肝臓は、対象に直接的または間接的に、取り付けられてよい。
【００２１】
ヒト対象がヒト腎臓移植を必要とする対象として同定されてから、ヒト腎臓移植が行われるまでの期間を拡大させる方法が提供される。本方法は、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼの発現が野生型のブタと比較して減少している、トリプルトランスジェニックブタ由来の腎臓を提供すること、および、治療的に有効な方法でトリプルトランスジェニックブタ由来の腎臓をヒト対象に外科的に取り付けることを包含する。ある局面において、腎臓はヒト対象に、体内に外科的に取り付けられる。ある局面において、腎臓はヒト対象に、外部に外科的に取り付けられる。腎臓は、対象に直接的または間接的に、取り付けられてよい。
【００２２】
ヒト対象からの皮膚関連物の早期分離の低減方法が提供される。本方法は、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を提供するステップ、およびトリプルトランスジェニックブタ由来の皮膚関連物を製造するステップを包含する。トリプルトランスジェニックブタにおけるα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現は、野生型のブタと比較して減少している。
【００２３】
患者における超急性拒絶反応関連症状を改善する方法が提供される。本方法は、低減されたレベルのαＧａｌ抗原、Ｓｄａ様抗原、およびＮｅｕ５Ｇｃ抗原を有するブタの移植材料を、対象に移植することを包含する。超急性拒絶反応関連症状は、野生型のブタ由来のブタの移植材料がヒトに移植される場合と比較して、改善される。
【００２４】
改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬が提供される。細胞培養試薬は、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含むトリプルトランスジェニックブタから単離される。トリプルトランスジェニックブタにおけるα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現は、野生型のブタと比較して減少している。細胞培養試薬は、細胞培養培地、細胞培養血清、細胞培養添加物および増殖可能な単離細胞を含む群から選択される。ある局面において、細胞培養試薬は、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が、所定の位置における５塩基対の欠失，７塩基対の欠失または１塩基対の挿入からなる破壊の群から選択され、ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が１２塩基対の欠失、３塩基対の欠失／４塩基対の挿入、７塩基対の欠失および１１塩基対の欠失からなる破壊の群から選択され、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が、所定の位置における１塩基対の挿入、１２塩基対の欠失および５塩基対の欠失から選択される、トリプルトランスジェニックブタから単離される。ある局面において、細胞培養試薬は、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が、１１塩基対の欠失および１８塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が６６塩基対の欠失/１２塩基対の挿入および５塩基対の欠失/１塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が１４塩基対の欠失、１２塩基対の欠失／１塩基対の置換、および２７１塩基対の欠失／１塩基対の挿入を含む破壊の群から選択される、トリプルトランスジェニックブタから単離される。
【００２５】
改変されたエピトーププロファイルを有する目的化合物を生産する方法が提供される。本方法は、改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬を提供するステップ、および、目的化合物を発現可能な単離細胞を、改変されたエピトーププロファイルを示す細胞培養試薬と培養するステップを包含する。改変されたエピトーププロファイルを有する細胞培養試薬は、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含むトリプルトランスジェニックブタから単離される。トリプルトランスジェニックブタにおけるα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現は、野生型のブタと比較して減少している。目的化合物上のＮｅｕ５Ｇｃエピトープ、ａｌｐｈａＧａｌエピトープおよびＳｄａ様エピトープのレベルは、目的化合物が野生型のブタから単離された細胞培養試薬と培養された単離細胞から生産される場合の、目的化合物上のＮｅｕ５Ｇｃエピトープ、ａｌｐｈａＧａｌエピトープおよびＳｄａ様エピトープのレベルよりも低い。ある実施形態において、目的化合物は糖脂質および糖タンパク質を含む群から選択される。いくつかの局面において、目的化合物は、抗体、増殖因子、サイトカイン、ホルモンおよび凝固因子を含む糖タンパク質の群から選択される糖タンパク質である。ある実施形態において、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が、所定の位置における５塩基対の欠失，７塩基対の欠失または１塩基対の挿入からなる破壊の群から選択され、ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が１２塩基対の欠失、３塩基対の欠失／４塩基対の挿入、７塩基対の欠失および１１塩基対の欠失からなる破壊の群から選択され、およびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が、所定の位置における１塩基対の挿入、１２塩基対の欠失および５塩基対の欠失から選択される。ある実施形態において、α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊が、１１塩基対の欠失および１８塩基対の欠失を含む破壊の群から選択され、ＣＭＡＨ遺伝子の破壊が６６塩基対の欠失／１２塩基対の挿入および５塩基対の欠失／１塩基対の置換を含む破壊の群から選択され、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊が、１４塩基対の欠失、１２塩基対の欠失／１塩基対の置換、および２７１塩基対の欠失／１塩基対の挿入を含む破壊の群から選択される。
【００２６】
ヒトに移植するためのブタの移植材料が提供される。ブタの移植材料の脂質およびタンパク質は、低減されたレベルのαＧａｌエピトープを有し、また、該移植材料は、低減されたレベルのＮｅｕ５ＧｃエピトープおよびＳｄａ様エピトープを有する。
【００２７】
少なくとも１つの核ゲノムにおいて、破壊されたα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子を含み、α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現が野生型のブタと比較して減少しており、ＶＶＬ結合が低減しているトランスジェニックブタが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１は、例示的なノックアウトブタにおける配列改変の模式図を図示している（ブタ単離識別子４７−１）。パネルＡは、野生型（ｗｔ）および破壊されたα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＧＧＴＡ−１）ヌクレオチド配列の一部を示している。野生型ＧＧＴＡ−１ヌクレオチド配列（ＷＴ）の一部を、一番上の行に示している。トリプルトランスジェニックブタ由来の改変されたＧＧＴＡ−１ヌクレオチド配列の同じ領域を、下の２つの行に示しており、それぞれが１つのＧＧＴＡ−１対立遺伝子についての改変された配列を提供している。例示的なトリプルトランスジェニックブタ由来の破壊されたＧＧＴＡ−１ヌクレオチド配列は、５塩基対および７塩基対の欠失である。ダッシュ記号は、欠失したヌクレオチド配列が野生型配列において存在するであろうヌクレオチド配列の部分を示す。
【００２９】
【図１Ｂ】パネルＢは、例示的なトリプルトランスジェニックブタについての野生型および破壊されたＣＭＡＨ遺伝子の部分を示している。野生型（ｗｔ）ＣＭＡＨ遺伝子の一部を、一番上の行に示している。同じトリプルトランスジェニックブタ由来の比較可能な領域の両対立遺伝子のヌクレオチド配列を、野生型配列の下に示している。トリプルトランスジェニックブタの破壊されたＣＭＡＨ配列には、１２塩基対の欠失および３塩基対の欠失/４塩基対の挿入が含まれる。ダッシュ記号は、欠失が存在するヌクレオチド配列の領域を示している。
【００３０】
【図１Ｃ】パネルＣは、例示的なトリプルトランスジェニックブタについて、野生型および破壊されたβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子の一部を示している。野生型（ｗｔ）β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の一部を、一番上の行に示している。同じ例示的トリプルトランスジェニックブタ由来の比較可能な領域のヌクレオチド配列を、野生型配列の下に示している。図示したように、トリプルトランスジェニックブタの破壊されたβ４ＧａｌＮＴ２配列には、１塩基対の挿入、１２塩基対の欠失および５塩基対の欠失が含まれる。ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨ配列とは異なり、３つの異なる対立遺伝子が検出された。β４ＧａｌＮＴ２配列は、ブタのゲノムにおいて、２つ以上の別々の遺伝子座に存在する可能性がある。ダッシュ記号は、β４ＧａｌＮＴ２欠失が存在するヌクレオチド配列の領域を示す。
【００３１】
【図２】図２は、ＣＭＡＨ／αＧａｌダブルトランスジェニックブタ（ＣＭＡＨ、上図）またはＣＭＡＨ／αＧａｌ／β４ＧａｌＮＴ２トリプルトランスジェニックブタ（Ｂ４、下図）のいずれか由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から得られたフローサイトメトリーデータのグラフを示している。細胞を、染色しないか（細胞のみ、白曲線）、または、ＦＩＴＣが結合したドリコスビフロラスアグルチニン（Dolichus biflorus agglutinin）で染色するか（ＤＢＡ−ＦＩＴＣ、黒塗りの黒曲線）のいずれかとした。ＤＢＡは、β４ＧａｌＮＴ２により生産された、グリカンまたはＳｄａ様グリカンを有するα−Ｎ−アセチルガラクトサミンに結合する。上図において、野生型β４ＧａｌＮＴ２配列（ＣＭＡＨ）を有するダブルノックアウト（ＣＭＡＨ／αＧａｌ）ブタ由来のＰＢＭＣのプロファイルは、ダブルトランスジェニックＣＭＡＨ／αＧａｌブタ（白曲線）由来の無染色細胞のプロファイルから明らかに移動している。下図において、破壊されたβ４ＧａｌＮＴ２配列（Ｂ４）を有するトリプルトランスジェニックブタ由来の、ＤＢＡとインキュベート後のＰＭＢＣのプロファイルが、トリプルトランスジェニックＣＭＡＨ／αＧａｌ／β４ＧａｌＮＴ２ブタ由来の無染色細胞のプロファイルと大部分が重なっている（重なっている白曲線と黒曲線の領域を灰色で示している）。ＤＢＡ−ＦＩＴＣで処理した細胞のプロファイルにおけるこの限られた変化は、トリプルトランスジェニックブタ由来のＰＢＭＣへのＤＢＡ結合の欠如と、トリプルトランスジェニックブタ由来の細胞上のＳｄａ様抗原の出現の低減を示している。
【００３２】
【図３Ａ】図３は、様々なブタ由来のＰＢＭＣのエピトープ解析結果を示している。パネルＡは、野生型（ＷＴ）およびトリプルトランスジェニック（ＧＧＴＡ１−／−、ＣＭＡＨ−／−、Ｂ４ＧａｌＮＴ２−／−）ブタで行った実験のフローサイトメトリーの結果を示している。細胞数をｙ軸に表している；蛍光をｘ軸に表している。
【００３３】
一番左のグラフは、ネガティブコントロール（白色）と、ＩＢ４レクチンとインキュベートした細胞（暗色）のデータを図示している。ＩＢ４は、ＧＧＴＡ１の遺伝子産物により作製されるアルファガラクトース結合糖質と相互作用する。コントロールの結果（ネガティブ）と、実験の結果（ポジティブ）の重なりを有する曲線は灰色で示している。ＩＢ４とインキュベートした野生型細胞は、無染色の野生型細胞と、明確に離れたピークを示している。ＩＢ４とインキュベートしたトリプルトランスジェニックブタの細胞は、顕著な第二のピークを示さず、このことはαＧａｌ結合糖質の顕著な低減を示している。
【００３４】
中央のグラフは、ネガティブコントロール（白色）と、ＨＤ抗体とインキュベートした細胞（暗色）のデータを図示している。ネガティブコントロールは、無関係なアイソタイプコントロール抗体とした。ＨＤ抗体は、ＣＭＡＨ遺伝子の産物により生産されるＮｅｕ５Ｇｃ糖質と相互作用する。コントロールの結果（ネガティブ）と、実験の結果（ポジティブ）の重なりを有する曲線は灰色で示している。ＨＤ抗体とインキュベートした野生型細胞は、無関係の抗体で処理した野生型の細胞と明確に離れたピークを示している。ＨＤ抗体とインキュベートしたトリプルトランスジェニックブタ由来の細胞は、顕著な第二のピークを示さず、このことはＮｅｕ５Ｇｃエピトープレベルの顕著な低減を示している。
【００３５】
一番右のグラフは、ネガティブコントロール（白色）と、ＤＢＡレクチンとインキュベートした細胞（暗色）のデータを図示している。ＤＢＡレクチンは、β４ＧａｌＮＴ２の遺伝子産物により生産された糖質構造と相互作用する。コントロールの結果（ネガティブ）と、実験の結果（ポジティブ）の重なりを有する曲線は灰色で示している。ＤＢＡと相互作用した野生型細胞は、無染色の野生型細胞と明確に離れたピークを示す。ＤＢＡとインキュベートしたトリプルトランスジェニックブタの細胞は顕著な第二のピークを示さず、このことはβ４ＧａｌＮＴ２の遺伝子産物により産生される糖質の顕著な低減を示している。
【００３６】
【図３Ｂ】パネルＢは、４４名の別々のヒト由来の血清中のヒトＩｇＧ（Ｘ軸）およびＩｇＭ（Ｙ軸）の、様々なブタタイプ由来のＰＢＭＣへの相対的結合を評価するフローサイトメトリー実験から得られた結果の散布図を示している。野生型（ＷＴ）ブタ由来のＰＢＭＣでの結果は、白四角で示しており、シングルトランスジェニックαＧａｌ破壊（ＧＧＴＡ１−／−）ブタ由来の結果は三角で示しており、ダブルトランスジェニックＣＭＡＨ／αＧａｌ破壊（ＧＧＴＡ１−／−およびＣＭＡＨ−／−）ブタ由来の結果は白丸で示しており、トリプルトランスジェニックＣＭＡＨ／αＧａｌ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２破壊（ＧＧＴＡ１−／−およびＣＭＡＨ−／−およびβ４ＧａｌＮＴ２−／−）ブタ由来の結果は黒丸で示している。トリプルトランスジェニックＣＭＡＨ／αＧａｌ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２破壊（ＧＧＴＡ１−／−およびＣＭＡＨ−／−およびβ４ＧａｌＮＴ２−／−）ブタ由来の結果は、低レベルのＩｇＭおよびＩｇＧ結合で、クラスターを形成している；いくつかのデータポイントは、トリプルトランスジェニック細胞への中程度のＩｇＧ結合を示している。
【００３７】
【図４】図４は、アカゲザル、ヒヒ、およびヒト由来の血清中のアカゲザルＩｇＧ（Ｘ軸）およびＩｇＭ（Ｙ軸）の、様々なブタタイプ由来のＰＢＭＣへの相対的結合を評価するフローサイトメトリー実験から得られる結果の散布図を示している。シングルトランスジェニックαＧａｌ破壊（ＧＧＴＡ１−／−）ブタ由来のＰＢＭＣでの結果はｘ軸に示しており、ダブルトランスジェニックＣＭＡＨ／ＧＧＴＡ１−／−破壊（ＧＧＴＡ１−／−およびＣＭＡＨ−／−）ブタ由来の結果は白丸で示しており、トリプルトランスジェニックＣＭＡＨ／ＧＧＴＡ１−／−／Ｂ４ＧａｌＮＴ２破壊（ＧＧＴＡ１−／−およびＣＭＡＨ−／−およびβ４ＧａｌＮＴ２−／−）ブタ由来の結果は黒丸で示している。ＣＭＡＨ／ＧＧＴＡ１−／−およびＣＭＡＨ／ＧＧＴＡ１−／−／β４ＧａｌＮＴ２はｙ軸上である。線より下の結合は、ｘ軸上のブタ細胞への結合が、ｙ軸上のブタ細胞への結合よりも抗原性が高いことを示している。ヒト（上図）、ヒヒ（中央図）、およびアカゲザル（下図）の血清をブタ細胞で試験した。ＩｇＭの結果は左に表している；ＩｇＧの結果は右に表している。
【００３８】
【図５】図５は、赤血球（ＲＢＣ）に結合するＩｇＧ抗体のレベルを示す、一連のフローサイトメトリーの結果を提供する。複数のタイプのＲＢＣを３つのヒト血清に対して評価した。ヒトＡ血清の結果は左の列であり、ヒトＯ血清１の結果は中央の列であり、ヒトＯ血清２の結果は右の列である。Ｂ４Ｇａｌ／ＣＭＡＨ／Ｇａｌトリプルノックアウト(B4G triple KO)ＲＢＣの結果は一番上の行である。ヒトＯ １ ＲＢＣの結果は２行目である。ヒトＯ ２ ＲＢＣの結果は３行目である。ヒトＡ ＲＢＣの結果は４行目である。ブタ野生型ＲＢＣは一番下の行である。野生型ブタＲＢＣをヒトＡおよびヒトＯ血清１で評価した場合、複数の顕著なピークが存在する；野生型ブタＲＢＣをヒトＯ血清２で評価した場合、複数の小さなピークが存在する。ヒトＡ ＲＢＣと、二つのヒトＯ血清の図において、顕著なピークがある。しかしながら、ヒトＡ ＲＢＣおよびヒトＡ血清は、１つの重なるピークのみを示す。予想通り、ヒトＯ ＲＢＣは両方とも、３つ全ての血清に対して試験した場合に、一つの重なるピークのみを示す。Ｂ４Ｇａｌ／ＣＭＡＨ／ＧａｌトリプルノックアウトＲＢＣは、ヒトＯ ＲＢＣと同様に、３つ全ての血清に対して試験した場合、一つの重なるピークのみを示す。
【００３９】
【図６】図６は、様々なブタＲＢＣおよびヒトＲＢＣへのヒト抗体の結合の、フローサイトメトリー比較から得られたデータの概要を提供する。７４名のヒト由来の血清を、ブタＲＢＣおよびヒトＲＢＣとインキュベートした。野生型ブタＲＢＣ（Ｗ）、ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨを欠損している動物（ＣＭＡＨ ＲＢＣ）、またはＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２を欠損している動物（Ｂ４Ｇ ＲＢＣ）およびヒト同種ＲＢＣ（ｈ）のデータを示している。パネルＡは、様々なＲＢＣへのＩｇＧ結合の概要を表している。該データは、ＩｇＧについての、正規化された蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）および標準偏差を示している。ヒトＡ、Ｂ、ＯおよびＡＢ血清を用いた。抗体結合の群間の比較を、反復測定一元配置ＡＮＯＶＡおよびチューキーの多重比較検定を用いて行った。様々なＲＢＣへのヒト抗体結合は、野生型細胞において最大であり、各グリカン産生遺伝子が不活性化されるについて減少した。トリプルノックアウト−ＲＢＣ（Ｂ４Ｇ）は、ヒトアロＲＢＣ（ｈ）で見られる抗体結合レベルに最も近似した。パネルＢは、様々なＲＢＣへのＩｇＭ結合の概要を示す。該データは、ＩｇＭについての、正規化された蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）および標準偏差を示している。野生型＞ダブルノックアウト＞トリプルノックアウト≒ヒトの傾向が、ＩｇＧおよびＩｇＭの両方について見られた。パネルＣでは、フローサイトメトリーを用いて、α−Ｇａｌ、Ｎｅｕ５ＧｃおよびＤＢＡ反応性グリカンの発現における、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子の不活性化の影響を明らかにした。ブタの野生型（Ｗ）赤血球、ＣＭＡＨ／αＧａｌダブルノックアウト（Ｄ）赤血球、ＣＭＡＨ／αＧａｌ／βＧａｌＮＴ２トリプルトランスジェニック赤血球（Ｔ）およびヒトの血液型Ｏ型赤血球の結果を該図に示している。フローサイトメトリーの結果は、各遺伝子の破壊による抗原性構造の損失を示している。パネルＤでは、ｘ軸にhuman O RBCへの抗体結合を調べた場合の、各ヒト血清サンプルのそれぞれのＭＦＩを、ｙ軸にトリプルノックアウトブタＲＢＣ（Ｂ４Ｇ）への抗体結合を調べた場合の各ヒト血清サンプルのそれぞれのＭＦＩを表すように、データをプロットした。グラフ上の対角線を下回るデータポイントは、ヒトの血液型Ｏ型細胞への結合よりも、ブタトリプルノックアウト細胞への結合が少ないことを示している。ヒト血液型Ｏ型血液は、万能供血者と考えられている；輸血されたヒト血液型Ｏ型ＲＢＣは、限られた体液性破壊を起こす。
【００４０】
【図７】図７は、個々の抗体アイソタイプの存在量を測定する定量マススペクトロメトリーを用いた免疫グロブリン解析の結果を提供する。パネル７Ａは、ＲＢＣへのＩｇＧおよびＩｇＭの結合を評価するために用いられる生化学的手法を記載する模式図である。野生型ブタ（Ｗ）、ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ欠損ブタ（Ｄ）、ＧＧＴＡ／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２ブタ（Ｔ）および自家性ヒトＲＢＣ（Ｈ）由来のＲＢＣを評価した。該プロセスの詳細は、本明細書の他の部分に記載している。ＲＢＣから溶出した物質を示す代表的なゲルを、パネルＢに示している。分子量マーカー（Ｍｗ）、未精製の開始血清（Ｓ）および精製ヒトＩｇＧを比較のためにロードした。他のコントロールには、未処理のＲＢＣ（レーン１全サンプル）、酸洗浄したが血清とインキュベートしていないＲＢＣ（レーン２全サンプル）が含まれた。低ｐＨで２分または３分インキュベートすることにより、血清処理ＲＢＣから物質を得た（レーン３および４のそれぞれについて、全サンプル）。１つの矢印は、アルブミンと同様のサイズで移動するタンパク質を指している。自家性ヒトＲＢＣはブタ細胞よりも本タンパク質を放出しなかったが、本結果は他の実験で再現されなかった。２つの矢印はＩｇＧと同様のサイズで移動するタンパク質を強調している（レーン３および４）。ＩｇＧ重鎖のサイズのバンドの強度は、異なるＲＢＣ間で様々であった。２分または３分のいずれかの間低ｐＨで細胞をインキュベートすると、同様のタンパク質レベルを放出した。細胞から放出された抗体量を定量するために、２分溶出サンプル中の免疫グロブリン重鎖のおよそのサイズを包含するゲル切片を回収して、トリプシンとインキュベートし、マススペクトロメトリーで評価した（本明細書の下記参照）。３つの矢印は、ヘモグロビンと同一のサイズで移動するタンパク質を示している。血清フリーサンプル中の上清におけるヘモグロビンの存在は、操作中にＲＢＣ溶解が起こったことを示した。全ＲＢＣについてのレーン１と２との間の差異は、酸洗浄が溶解を促進し、細胞からより多くのヘモグロビンを放出させたことを示唆している。免疫グロブリン軽鎖のわずかに上部に二重で移動した、＊で印を付けた未知のポリペプチドは、血清非存在下でもＲＢＣから放出された。
【００４１】
パネルＣは、同一の血清の別々の分注液とインキュベートした後の、各タイプのＲＢＣから溶出したＩｇＭおよびＩｇＧの、マススペクトロスコピーにより決定された相対的レベルを示している。各血清について、マススペクトロメトリー解析から得られたＡＵＣを、自家性ヒト赤血球へのＩｇＧまたはＩｇＭ全結合に対して得られた値に、全て正規化した。ＩｇＧについて、各アイソタイプのＡＵＣを合計することにより抗体総量を計算した。野生型ブタ赤血球（Ｗ）、トリプルノックアウトブタ赤血球（Ｂ）、および自家性ヒト赤血球（Ａ）からの結果を示している。自家性ヒト赤血球は、試験した血清を得た対象と同じ対象由来である。
【００４２】
【図８】図８は、免疫グロブリン由来ペプチドの、代表的なマススペクトロスコピークロマトグラムを提供する。相対的存在量を、ｙ軸上に表している。分単位の時間（min）を、ｘ軸上に表している。このようなクロマトグラムを用いて、ＡＵＣを算出した。
【００４３】
【図９】図９は、フローサイトメトリー分析のゲーティングおよび運命（fate）を示している。３つのヒト血清を、野生型ブタ（Ｗ）由来ＲＢＣ、自家性ヒトＲＢＣ（Ａ）、およびＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２欠損ブタ（Ｔ）由来ＲＢＣとインキュベートした。ヒト免疫グロブリンの結合を伝える蛍光二次抗体とインキュベートした後、細胞をフローサイトメトリーで解析した。前方散乱（ＦＳＣ、ｘ軸）および側方散乱（ＳＳＣ、ｙ軸）を用いて、ＲＢＣを同定した。黒の楕円は、解析のためのＲＢＣを選択するために用いたゲートを示している。各ゲートの隣に示されたパーセンテージは、該ゲート内に存在する事象の合計の割合を示している。細片の増加およびゲート領域に入っているＲＢＣの低減に見られるように、ヒト血清は野生型ブタＲＢＣを破壊する。野生型ＲＢＣの高抗原性および結果としての細胞破壊は、いくつかの実験において、野生型（Ｗ）サンプルのヒストグラム品質に寄与しているだろう。
【００４４】
【図１０】図１０は、マススペクトロメトリーにより決定された、各ＩｇＧアイソタイプについて得られる曲線下面積（ＡＵＣ）の値を図示している。ＡＵＣをｙ軸上に表している；ＩｇＧアイソタイプおよびＲＢＣタイプをｘ軸上に表している。トリプルノックアウトブタ赤血球（ＴＫＯ）、ヒト自家性赤血球（Human Auto）および野生型ブタ赤血球（ＷＴ）の結果を示している。
【００４５】
【図１１】図１１は、野生型（ＷＴ）またはＧａｌ／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２トリプルノックアウトブタ（Ｂ４Ｇ）から得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から得られたフローサイトメトリーの結果を図示している。２つのブタ単離物（５８−１および５９−２）由来のＰＢＭＣを示している。ＩＢ４にはαＧａｌが結合する；低減したαＧａｌ発現存在下において、ＩＢ４結合は低減する。Ｎｅｕ５Ｇｃは、ＣＭＡＨ遺伝子産物により生産されるエピトープである。ＤＢＡはβ４ＧａｌＮＴ２産物が結合するレクチンである。灰色のヒストグラムは、ネガティブコントロールの結果を表している。ＩＢ４、ＤＢＡおよびＮｅｕ５Ｇｃを有する野生型細胞については、２つのピークが明確に存在する。両方のトリプルノックアウトブタ単離物については、第二のピークが除かれるか、あるいは、移動してネガティブコントロールと重なっており、これは、結合の低減を示している。
【００４６】
【図１２】図１２は、レクチン染色後の、大動脈内皮細胞（ＡＥＣ）または不死化腎臓内皮細胞（ｉＲＥＣ）から得られたフローサイトメトリーの結果を提供している。指定した細胞型を、ＩＢ４、Ｎｅｕ５Ｇｃ、ＤＢＡ、ＰＮＡ、JacalinまたはＶＶＬとインキュベートした。左の列は野生型ＡＥＣ（ＷＴ／ＡＥＣ）から得られた結果を表し、２列目はαＧａｌ破壊ブタ（ＧＡＬ／ＡＥＣ）から得られた結果を表し、中央の列はダブルノックアウトＣＭＡＨ／αＧａｌブタ（ＣＭＡＨ／ＡＥＣ）から得られた結果を表し、４列目はトリプルノックアウトＣＭＡＨ／αＧａｌ／β４ＧａｌＮＴ２ブタ（Ｂ４Ｇ／ＡＥＣ）から得られた結果を表し、５列目は野生型不死化腎臓内皮細胞から得られた結果を表し、６列目はＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２およびＳＬＡ抗原破壊不死化腎臓内皮細胞から得られた結果を表している。灰色のヒストグラムはレクチン無しのネガティブコントロールである。黒の実線はレクチン結合を示している。Ｇａｌ破壊細胞において第二のＩＢ４ピークが無いこと、ＣＭＡＨ破壊細胞において第二のＮｅｕ５Ｇｃピークが無いこと、およびβ４ＧａｌＮＴ２破壊細胞において第二のＤＢＡピークが無いことに注目されたい。第二のＰＮＡおよびJacalinピークは、シングル、ダブルおよびトリプルノックアウトブタ由来の細胞において生じる。トリプルノックアウトＡＥＣおよび、β４ＧａｌＮＴ２／ＳＬＡトリプルノックアウト、Ｓｌａ抗原破壊ｉＲＭＥＣにおいて、第二のＶＶＬピークが大幅に移動している。メカニズムに拘束されるものではないが、該トリプルノックアウト細胞上の抗原の、ＶＶＬレクチン認識の低減は、トリプルノックアウトＣＭＡＨ／αＧａｌ／β４ＧａｌＮＴ２細胞およびブタから得られた驚くべき結果に寄与しているであろう。
【００４７】
【図１３】図１３は、例示的なトリプルトランスジェニックブタにおける、野生型および破壊されたβ４ＧａｌＮＴ２、ＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨ遺伝子の一部を示している。各野生型配列の下線部は、Ｃｒｉｓｐｒ標的領域を示している。該図は、複数のトリプルトランスジェニックブタ（ブタ単離識別子５４−２、５８−１および５９−２）由来の配列破壊を表している。β４ＧａｌＮＴ２の３つのバリエーション、１４ヌクレオチドの欠失、１２ヌクレオチドの欠失／１ヌクレオチドの置換、および、２７１ヌクレオチドの欠失／１ヌクレオチドの挿入が示されている。図示された第三のβ４ＧａｌＮＴ２変異は、２７１ヌクレオチドの欠失／１ヌクレオチドの挿入であり、二重のスラッシュ（／／）が該欠失との境界を定めている。２つのαＧａｌ（ＧＧＴＡ１）のバリエーション、１１ヌクレオチド（ｎｔ）の欠失および１８ヌクレオチド（ｎｔ）の欠失が示されている。２つのＣＭＡＨのバリエーション、６６ヌクレオチドの欠失／１２ヌクレオチドの挿入、および、５ヌクレオチドの欠失／１ヌクレオチドの置換が示されている。
【００４８】
【図１４】図１４は、ヒト臨床交差適合試験において、複数のヒト血清で評価されたトリプルトランスジェニックブタ（αＧａｌ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２／ＣＭＡＨ欠損）由来のトリプルトランスジェニック細胞から得られたデータを示している。上のグラフは、ＰＲＡ＝０の３１のヒト血清からの結果を表している；下のグラフは、ＰＲＡ＞８０の１９のヒト血清からの結果を表している。ＤＴＴ非存在下でのＩｇＭおよびＩｇＧの結果を、黒棒線で示している；ＤＴＴで処理した後のＩｇＧの結果を、白棒線で示している。細胞傷害性スコアを、ｙ軸上に表している。細胞傷害性スコア１は、同種移植の非常に良い候補である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の詳細な説明
本出願は、トランスジェニックブタと、ブタゲノムがコードする所定の産物を発現しない、ヒトに移植するための、ブタの臓器、組織および細胞と、これらを作製および使用する方法を提供する。ある実施形態において、本出願は、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β４ＧａｌＮＴ２およびシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を含み、機能性のα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β４ＧａｌＮＴ２およびシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼのノックアウトブタにおける発現が、野生型のブタと比較して減少している、トリプルトランスジェニックブタを提供する。
【００５０】
Ｉ．一般的用語
本明細書および特許請求の範囲において、「含む（including）」および「含む（comprising）」という用語は制約のない（open-ended）用語であり、「含むが、それらに限定されない」と解釈されるべきである。これらの用語は、より制限された用語である「本質的に〜からなる」および「〜からなる」を包含する。
【００５１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数形の参照を含む。尚、用語「a」（または「an」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に用いられ得る。用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、および「有する（having）」が互換的に用いられ得ることもまた、注意すべきである。
【００５２】
他に規定されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で特に言及される全ての出版物および特許は、本発明と関連して用いられ得る出版物で報告される化学物質、装置、統計解析および方法論を記述することおよび開示することを含む全ての目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される全ての参照は、当業界の技術レベルを指し示すものとして理解されるべきである。本明細書中のいかなるものも、本発明が先発明としてそれらの開示に先行する資格がないと認めるものと解釈されるべきではない。
【００５３】
II.組成物および方法
異種移植における使用に好適なトランスジェニック動物、および、異種移植における使用に好適な哺乳動物を生産する方法が提供される。特に、本出願は、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧａｌ）、β１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ（β４ＧａｌＮＴ２）およびシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）の発現が減少したトリプルトランスジェニックブタの生産について記載する。
【００５４】
本発明の実施形態において、αＧａｌ、β４ＧａｌＮＴ２およびＣＭＡＨ遺伝子の活性がより低く、結果として得られるαＧａｌ、β４ＧａｌＮＴ２およびＣＭＡＨ産物が、細胞表面上のα１、３−ガラクトシルエピトープ、Ｓｄａ様エピトープ、もしくはＮｅｕ５Ｇｃ、糖タンパク質、または糖脂質の野生型レベルをもはや産生しない、ブタ並びに、ブタ由来のブタの臓器、組織および細胞が提供される。別の実施形態において、αＧａｌ、β４ＧａｌＮＴ２およびＣＭＡＨ遺伝子は、該遺伝子の転写が生じないように、不活性化される。いくつかの実施形態において、αＧａｌ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２／ＣＭＡＨトリプルノックアウトブタが作製される。トランスジェニックブタを作製する方法、およびそれに対する挑戦は、Galli et al 2010 Xenotransplantation 17(6) p.397-410において議論されている。本発明の方法および細胞培養物は、本明細書の下記にさらに詳述されている。
【００５５】
用語「トランスジェニック哺乳動物」は、所与の遺伝子が改変、除去、または破壊されたトランスジェニック哺乳動物を指す。該用語は、全ての子孫世代を含むことが意図されていることは、強調されるべきである。従って、子孫が創始動物または子孫動物から体細胞核移植（ＳＣＮＴ）により生み出されたか、伝統的生殖方法により生み出されたかにかかわらず、創始動物並びに、そのＦ１、Ｆ２、Ｆ３などの子孫全てが含まれる。「シングルトランスジェニック」は、１つの遺伝子が改変、除去、または破壊されているトランスジェニック哺乳動物を意味する。「ダブルトランスジェニック」は、２つの遺伝子が改変、除去または破壊されているトランスジェニック哺乳動物を意味する。「トリプルトランスジェニック」は、３つの遺伝子が改変、除去、または破壊されているトランスジェニック哺乳動物を意味する。「クワドループルトランスジェニック」は、４つの遺伝子が改変、除去、または破壊されているトランスジェニック哺乳動物を意味する。
【００５６】
原則として、トランスジェニック動物は、目的の遺伝子配列の一方または両方のコピーが破壊されていてよい。目的の核酸配列の１つのコピーまたは対立遺伝子のみが破壊されている場合、該ノックアウトマウスは「ヘテロ接合性（heterozygous）トランスジェニック動物」と呼ばれる。用語「ヌル」変異は、目的のヌクレオチド配列の２つのコピーが、異なるかたちで破壊されているが、ある遺伝物質が両対立遺伝子から除去されるように破壊が重複している例、および、目的のヌクレオチド配列の両対立遺伝子が、同じ破壊を有する例の両方を包含する。いくつかの実施形態において、目的の３つの遺伝子の破壊は、トランスジェニック動物の少なくとも１つの細胞、少なくとも複数の動物細胞、少なくとも半数の動物細胞、少なくとも多数の動物細胞、少なくとも圧倒的多数の動物細胞、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の動物細胞において生じ得る。
【００５７】
用語「キメラ」、「モザイク」または「キメラ哺乳動物」は、そのゲノム含有細胞のいくつかにおいて、ノックアウトを有するトランスジェニック哺乳動物を指す。キメラは、未変化の遺伝子配列を有する少なくとも１つの細胞、未変化の遺伝子配列を有する少なくとも数個の細胞、または未変化の配列を有する多数の細胞を有する。
【００５８】
用語「ヘテロ接合性」または「ヘテロ接合性哺乳動物」は、そのゲノム含有細胞の全てにおいて、染色体対の一方に破壊を有するトランスジェニック哺乳動物を指す。
【００５９】
用語「ホモ接合性」または「ホモ接合性哺乳動物」は、そのゲノム含有細胞の全てにおいて、染色体対の両方に破壊を有するトランスジェニック哺乳動物を指す。「ホモ接合性改変」は、染色体対の両方における改変を指す。
【００６０】
本出願の「非ヒト哺乳動物」には、げっ歯類、ヒツジ（sheep）、イヌ、ヒツジなどのヒツジ類（ovine)、肉牛および乳牛などのウシ、およびブタ（pig）やイノシシ(hog)などのブタ類（swine)を例とする哺乳動物が含まれる。本出願は典型的な非ヒト動物（ブタ）を提供するが、他の動物も同様に遺伝子組換えされ得る。
【００６１】
「変異」は、子孫に伝達される、動物の遺伝物質における検出可能な変化である。変異はたいてい、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドにおける変化、例えば、ヌクレオチドの付加、挿入、欠失、反転または置換などである。
【００６２】
「ブタ」は、野生ブタ、家畜ブタ、ミニブタ、Sus scrofaブタ、Sus scrofa domesticusブタ、並びに近交系ブタを含むがこれらに限定されない、当業界で知られる任意のブタを意図している。限定されることなく、ブタは、Landrace、Yorkshire、Hampshire、Duroc、Chinese Meishan、Chester White、Berkshire Goettingen、Landrace/York/Chester White、Yucatan、Bama Xiang Zhu、Wuzhishan、Xi Shuang Banna およびPietrain ブタを含む群から選択され得る。ブタの臓器、組織、細胞または輸血製剤は、ブタ由来の、臓器、組織、失活させた動物組織、細胞、または輸血製剤である。
【００６３】
α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧａｌ、ＧＧＴＡ、ＧＧＴ１、ＧＴ、αＧＴ、ＧＧＴＡ１、ＧＧＴＡ−１）遺伝子は、酵素（ＧＴ、αＧａｌ、α１、３ガラクトシルトランスフェラーゼ）をコードする。Ensemble transcript ENSSSCG00000005518には、ブタのＧＧＴＡ１ヌクレオチド配列が含まれる。機能性のα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質上のガラクトース−α１，３−ガラクトース（αＧａｌ、Ｇａｌ、Ｇａｌ、ｇａｌ１，３ｇａｌ、ｇａｌ１−３ｇａｌ）残基の形成を触媒する。ガラクトース−α１，３−ガラクトース（αＧａｌ）残基は、ヒト免疫系により認識される、抗原性エピトープまたは抗原である。トランスジェニック臓器材料からのαＧａｌの除去は、外来物の移植へのヒトの免疫応答を取り除くことはなく、異種移植に対する迅速な免疫応答におけるさらなる抗体の関与を示唆している(Mohiudden et al (2014), Am J. Transplantation 14:488-489 and Mohiudden et al 2014 Xenotransplantation 21:35-45)。機能性のαＧａｌの発現の減少をもたらすαＧａｌ遺伝子の破壊は、ＧからＡへの置換に隣接した３塩基対の欠失、１塩基対の欠失、１塩基対の挿入、２塩基対の挿入、６塩基対の欠失、１０塩基対の欠失、７塩基対の欠失、５塩基対の欠失に代わる８塩基対の挿入、５塩基対の挿入、１１塩基対の欠失、および１８塩基対の欠失を含んでよいが、これらに限定されない（表１参照）。Ｃｒｉｓｐｒ標的配列は、該遺伝子の、開始コドンの近く、エクソン３に存在する。
【００６４】
シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ遺伝子、ＣＭＡＨ）遺伝子は、酵素（ＣＭＡＨ）をコードしている。機能性のＣＭＡＨは、シアル酸Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）の、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）への変換を触媒する。Ｎｅｕ５Ｇｃ残基は、ヒト免疫系により認識される抗原性エピトープまたは抗原である。Ensembl database id Gene: ENSSSCG00000001099には、ブタのＣＭＡＨヌクレオチド配列が含まれ、Ｃｒｉｓｐｒ標的領域はエクソン６の近傍である。機能性のＣＭＡＨの発現の減少をもたらすＣＭＡＨ遺伝子の破壊には、４塩基対の挿入、１塩基対の欠失、２塩基対の欠失、３塩基対の欠失、２０塩基対の欠失、５塩基対の欠失、８塩基対の欠失、１１塩基対の欠失、１２塩基対の欠失、１塩基対の挿入、１塩基対の欠失に代わる２塩基対の挿入、４塩基対の挿入に代わる３塩基対の欠失、６６塩基対の欠失／１２塩基対の挿入、および５塩基対の欠失／１塩基対置換が含まれてよいが、これらに限定されない（表１参照）。
【００６５】
β１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＮＴ２、β４ＧａｌＮＴ２、Ｂ１，４ＧａｌＮＴ２、β１，４ＧａｌＮＴ２）遺伝子は、β１，４Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ２グリコシルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）をコードする。機能性のＢ４ＧａｌＮＴ２は、Ｓｄａ様グリカンを生産する(Dall’Olio et al (2014) Biochemica Biophysica Acta 1840:443-453 and Blanchard et al  (1983) JBC 258:7691-7685)。Ｂ４ＧａｌＮＴ２は、ほとんどのヒトで発現されると考えられている；先の研究は、機能性のＢ４ＧａｌＮＴ２の発現を欠くヒトはたった５％であることを示唆した。ブタ細胞におけるβ４ＧａｌＮＴ２の破壊は、試験したヒトサンプルの５％を超えるサンプルにおいて、交差適合を顕著に減少させる；本結果は予想外だった。Ｓｄａ様グリカンは、Ｓｄａ、および血液型または血液型群決定および、胃腸癌抑制に関連する同様のグリカンを含んでよい。EnsemblデータベースENSSSCG00000030269エントリーには、β４ＧａｌＮＴ２ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列が含まれる。ゲノムのブタのβ４ＧａｌＮＴ２は、およそ４０，０００塩基対にわたって多数のエクソンにおよび、多数の遺伝子座で生じ得る。これらの実験において利用されるＣｒｉｓｐＲ標的領域は、エクソン２で見られ、ＣＴＧＴＡＴＣＧＡＧＧＡＡＣＡＣＧＣＴＴである。機能性のβ４ＧａｌＮＴ２の発現の減少をもたらすβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子の破壊には、１塩基対の挿入、１２塩基対の欠失、５塩基対の欠失、１４塩基対の欠失、１２塩基対の欠失／１塩基対の置換、２７１塩基対の欠失／１塩基対の挿入が含まれてよいが、これらに限定されない。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【００６６】
フレーズ「破壊された遺伝子」は、破壊された遺伝子が、内在性配列のアミノ酸配列と異なる改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするか、内在性アミノ酸配列よりも少ないアミノ酸残基を有するポリペプチドをコードするか、あるいは野生型の目的のヌクレオチド配列はポリペプチドをコードするが破壊された遺伝子はポリペプチドをコードしないかのいずれかである、目的のヌクレオチド配列の挿入、分断（interruption）、または欠失を包含することを意図している。
【００６７】
本明細書は、機能性のαＧａｌ、β４ＧａｌＮＴ２およびＣＭＡＨ遺伝子の発現が低減されたトランスジェニック動物を提供する。動物は、異種移植に好適な任意の哺乳動物であってよい。特定の実施形態において、動物はブタである。「ＭＡＨ／αＧＡＬダブルノックアウト」、「ＭＡＨ／αＧＡＬ ＤＫＯ」、「ＣＭＡＨ／αＧａｌ」、「ＣＭＡＨ／αＧａｌ ＤＫＯ」、「ＣＭＡＨ−／−／ＧＡＬ−／−」、「αＧａｌ／ＣＭＡＨ ＤＫＯｓ」、「αＧＡＬ／ＣＭＡＨ ダブルノックアウト」、「ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ ＤＫＯ」、「ＧＴ１／ＣＭＡＨ ＤＫＯ」、「ＧＧＴＡ１−／−／ＣＭＡＨ−／−」、「ＧＧＴ１−／−／ＣＭＡＨ−／−」、「ＣＭＡＨ／ＧＧＴＡ ＤＫＯ」、「ＧＴ／ＣＭＡＨ−ＫＯ」、「ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ ＫＯ」、「ＤＫＯ（αＧａｌ／ＣＭＡＨ）」、「ＤＫＯ（αＧＡＬ＆ＣＭＡＨ）」、「ＣＭＡＨ−／αＧａｌ−」、「αＧａｌ−／ＣＭＡＨ−」、「ＣＭＡＨ−／αＧＡＬ−」およびその変異体は、機能性のα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼの発現を欠いているトランスジェニック動物、細胞、または組織を指す。トリプルノックアウト産物または豚は、野生型のバックグラウンドまたはＣＭＡＨ／αＧａｌダブルノックアウトバックグラウンドにおいて作製されてよい。「ＣＭＡＨ／αＧＡＬ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２トリプルノックアウト」、「ＣＭＡＨ／αＧＡＬ／β４ＧａｌＮＴ２トリプルノックアウト」、「ＣＭＡＨ／αＧＡＬ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２ ＴＫＯ」、「ＣＭＡＨ／αＧａｌ／β４ＧａｌＮＴ２」、「ＣＭＡＨ／αＧａｌ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２ ＴＫＯ」、「ＭＡＨ−／−／ＧＡＬ−／−／Ｂ４ＧａｌＮＴ２−／−」、「αＧａｌ／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２ ＴＫＯｓ」、「αＧＡＬ／ＣＭＡＨ／β４Ｇａｌトリプルノックアウト」、「ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２ ＴＫＯ」、「ＧＴ１／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２ ＴＫＯ」、「ＧＧＴＡ１−／−／ＣＭＡＨ−／−／β４ＧａｌＮＴ２−／−」、「ＧＧＴ１−／−／ＣＭＡＨ−／−／β４ＧａｌＮＴ２−／−」、「ＣＭＡＨ／ＧＧＴＡ／β４ＧａｌＮＴ２ ＴＫＯ」、「ＧＴ／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２−ＫＯ」、「ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２ ＫＯ」、「ＴＫＯ（αＧａｌ／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２）」、「ＴＫＯ（αＧＡＬ、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２）」、「ＣＭＡＨ−／αＧａｌ−／β４ＧａｌＮＴ２−」、「αＧａｌ−／ＣＭＡＨ−／β４ＧａｌＮＴ２−」、「ＣＭＡＨ−／αＧＡＬ−β４ＧａｌＮＴ２−」およびその変異体は、機能性のα１、３ガラクトシルトランスフェラーゼ、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼおよびβ４ＧａｌＮＴ２の発現を欠いているトランスジェニック動物、細胞、または組織を指す。
【００６８】
トランスジェニックの移植材料。移植材料は、異種移植片として用いられる、動物由来の臓器、組織、輸血製剤および／または細胞を包含する。異種移植片として用いられる移植材料は、αＧａｌ、β４ＧａｌＮＴ２およびＣＭＡＨの発現が減少したトランスジェニック動物から単離されてよい。トランスジェニックブタまたはノックアウトブタ由来のトランスジェニックの移植材料は、出生前の、新生児の、未熟なまたは完全に成熟したトランスジェニック動物から単離され得る。移植材料は、臓器移植を必要とするヒト対象に対する持続性または一時的な臓器置換（organ replacement）として用いられてよい。脳、心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、腺、鼻、口、唇、脾臓、歯肉、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸（smallintestine）、小腸（smallbowel）、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靱帯、腎上体、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎腺、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節およびリンパ管を含むがこれらに限定されない、任意のブタの臓器が用いられ得る。
【００６９】
別の実施形態において、本出願は異種移植に有用な非ヒト組織を提供する。いくつかの実施形態において、非ヒト組織は、αＧａｌ／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２トリプルトランスジェニックブタ由来のブタの組織である。上皮、結合組織、血液、骨、軟骨、筋肉、神経、腺様（adenoid）組織、脂肪組織、疎性結合組織、褐色脂肪組織、海綿骨組織、筋肉、軟骨組織、海綿（cavernous）組織、軟骨様組織、クロム親和性組織、肉様組織、弾性組織、上皮、脂肪組織、線維硝子組織、線維組織、ギャンジー包帯、ゼラチン状組織、肉芽組織、腸管関連リンパ系組織、骨格筋組織、ハラー脈管組織、未分化組織、間質組織、被覆組織、島組織、リンパ組織、リンパ系組織、間葉組織、中腎組織、多房性脂肪組織、胸腺組織、膠様結合組織、骨髄組織、軟組織鼻点、腎発生組織、結節組織、骨様組織、骨組織、造骨組織、骨髄組織、網状組織、根尖周囲組織、細網組織、平滑筋、硬性造血組織および皮下組織、心臓弁、皮膚および腱を含む失活した動物組織および生きたブタの皮膚を含むがこれらに限定されない任意のブタ組織が用いられ得る。
【００７０】
別の実施形態は、αＧａｌ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２およびＣＭＡＨの発現が低減または減少したブタのトリプルトランスジェニック動物由来の細胞または細胞株を提供する。ある実施形態において、これらの細胞または細胞株は、異種移植に用いられ得る。上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、角化細胞、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、リンパ細胞（ＢおよびＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、他の筋肉細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、上皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス膵島細胞、膵臓インスリン分泌細胞、骨細胞、骨前駆細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、大動脈内皮細胞、毛細血管内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クッパ−細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ細胞、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、毛髪細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、免疫記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、プラズマ細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、尿細管周囲細胞、セルトリ細胞、黄体細胞、頸部細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、濾胞細胞、粘液細胞、線毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、ゴブレット細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性細胞、扁平上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨髄、胚性幹細胞、線維芽細胞および胎生線維芽細胞を含むが、これらに限定されない任意のブタの組織または臓器由来の細胞が、用いられ得る。
【００７１】
生育不能な派生物には、酵素的または化学的処理により生細胞を剥離させた組織が含まれ、これらの組織派生物は、移植における使用に先立ち、架橋または他の化学的処理により、さらに処理され得る。好ましい実施形態において、該派生物には、皮膚、骨、尿、膀胱または臓器の粘膜下組織を含む様々な組織由来の細胞外マトリックスが含まれる。さらに、医療機器として、限定されないが心臓弁および他の生育不能な組織を含むように生存組織を剥離された腱、関節、および骨が提供される。ある実施形態において、細胞培養に好適で、かつ、本発明のトランスジェニックブタから単離された、血清または培地が提供される。ブタのトランスジェニック臓器、組織、または細胞の構成成分もまた提供される。構成成分は、架橋およびアルデヒド架橋を含むがこれらに限定されない、当業界で知られる任意の方法によってもまた、修飾されてよい。構成成分は、該構成成分を取得したより大きな臓器または組織に応じて変化してよい。皮膚の構成成分は、剥離皮膚、コラーゲン、上皮細胞、線維芽細胞および真皮を含んでよいが、これらに限定されない。骨の構成成分は、コラーゲンおよび細胞外マトリックスを含んでよいが、これらに限定されない。心臓の構成成分は、弁および弁組織を含んでよいが、これらに限定されない。
【００７２】
「異種移植」は、細胞、組織、または臓器の、異なる種からレシピエント対象への移植、埋め込み、または注入を含む任意の手順を包含する。レシピエントがヒトである異種移植が、特に想定される。従って、異種移植には、血管柄付き異種移植、部分的血管柄付き異種移植、非血管柄付き異種移植、異種ドレッシング材、異種包帯、異種構造および異種輸血が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
実施形態において、破壊されたα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β４ＧａｌＮＴ２およびＣＭＡＨ遺伝子を含むトランスジェニックブタから単離された細胞培養試薬が提供される。細胞培養試薬は、組織培養、インビトロ組織培養、微少流体の組織培養、細胞培養、または単離した細胞もしくは細胞株を成長させるための他の方法に利用される試薬である。細胞培養試薬には、細胞培養培地、細胞培養血清、細胞培養添加物、フィーダー細胞、および増殖可能な単離細胞が含まれるが、これらに限定されない。「増殖可能な単離細胞」は、細胞が少なくとも１つのさらなるクローン細胞に増殖、分裂、または繁殖可能である、他の細胞型または他の細胞から、単離されたまたは部分的に単離細胞を意図している。
【００７４】
培養で増殖される細胞は、抗原性エピトープを合成するか、あるいは、培養細胞により生産される目的化合物に組み込み得る。抗原性エピトープは、ヒト抗体による結合の増加と、目的化合物の活性の減少をもたらし得る。Ghaderi et al 2010 Nature Biotechnology 28(8):863-867を参照されたい（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。αＧａｌ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２またはＮｅｕ５Ｇｃのレベルの低減などの、改変されたエピトーププロファイルを有する細胞培養試薬で産生細胞を増殖させることは、目的化合物上の、αＧａｌ抗原、Ｎｅｕ５Ｇｃ抗原、および／またはＳｄａ様抗原のレベルを低減させ得る。目的化合物は、糖タンパク質および糖脂質を含み得るが、これらに限定されない。目的の糖タンパク質は、抗体、増殖因子、サイトカイン、ホルモンまたは凝固因子を含み得るが、これらに限定されない。目的の糖脂質は、治療薬、抗原、および生物界面活性剤を含み得るが、これらに限定されない。
【００７５】
単語「提供する」は、製造する、調達する、用意する、準備する、供給する、または備え付ける、を包含することを意図している。細胞を提供する方法は対象を提供する方法とは異なり得、臓器を提供する方法はブタを提供する方法とは異なり得、腎臓を提供する方法は肝臓を提供する方法とは異なり得、臓器を提供する方法は輸血に好適な材料を提供する方法と異なり得ることは、認識されている。
【００７６】
移植拒絶反応は、移植された組織、臓器、細胞または物質がレシピエントの体に受け入れられなかった場合に起こる。移植拒絶反応では、レシピエントの免疫系が移植された物質を攻撃する。複数のタイプの移植拒絶反応が存在し、別々にまたは一緒に生じてよい。拒絶反応プロセスには、超急性拒絶反応（ＨＡＲ）、急性体液性異種移植拒絶反応（ＡＨＸＲ）、血小板減少症、急性体液性拒絶反応、超急性血管拒絶反応、抗体媒介性拒絶反応および移植片対宿主病が含まれるが、これらに限定されない。「超急性拒絶反応」は、１つ以上の拒絶反応メカニズムと関連する、移植後最初の２４時間以内に生じる、または始まる移植された物質の拒絶反応を意味する。拒絶反応は、「超急性拒絶反応」、「体液性拒絶反応」、「急性体液性拒絶反応」、「細胞性拒絶反応」および「抗体媒介性拒絶反応」を包含するが、これらに限定されない。急性体液性異種移植反応（ＡＨＸＲ）は、病理学の領域で特徴付けられており、移植後数日以内に生じる急性抗体媒介性拒絶反応、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）の発症、微少血管性血管障害（microvascular angiopathy）、既に形成された非Ｇａｌ ＩｇＭおよびＩｇＧ結合、補体活性化、微小血管血栓症、および移植後最初の数週間内の消費性血小板減少症を含むが、これらに限定されない。血小板減少症は、血小板の量が、通常の範囲の１４０，０００から４４０，０００／μｌを下回る。血小板減少症関連の症状には、内出血、脳内出血、血尿、吐血、歯肉出血、腹部膨満、タール状便、過長月経、鼻出血、斑状出血、点状出血または紫斑が含まれるが、これらに限定されない。ブタ肝臓によるヒト血小板の取り込みが、異種移植レシピエントにおける血小板減少症の発症の一因である。血小板減少症は、異種移植された臓器の再灌流時、または、再灌流の期間の直後に起こりうる。
【００７７】
別の実施形態において、本発明は、ブタの臓器、組織または細胞上のαＧａｌ、β４ＧａｌＮＴ２およびＮｅｕ５Ｇｃの発現が低減しているブタの臓器、組織または細胞を、ヒトに移植することを含む、患者において拒絶反応関連症状を改善する方法であって、１つ以上の拒絶反応関連症状が、野生型のブタ由来の組織がヒトに移植される場合と比較して改善される方法を提供する。「改善する」、「向上させる」、「改良する」、「増強する」および「助ける」は、望ましいものにおいて、前進するまたは進歩することを意図する。拒絶反応関連症状を改善することは、望ましくない症状を減少、軽減、または縮小することを包含し得ることもまた、想定される。拒絶反応関連症状は、別の拒絶反応関連症状が変化すると同時に改善され得ることも、さらに認められている。変化した第二の拒絶反応関連症状は、改善されるか、あるいは増加し得る。変化した第二の拒絶反応関連症状は、あまり望ましくない方法で変化し得る。拒絶反応関連症状には、超急性拒絶反応関連症状および急性体液性異種移植反応関連症状が含まれるが、これらに限定されない。拒絶反応関連症状には、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、微少血管性血管障害、既に形成された非ＧａｌＩｇＭおよびＩｇＧ結合、補体活性化、凝集、線維症、微小血管血栓症、消費性血小板減少症、消費性凝固障害、最重度血小板減少症、難治性凝固障害、移植片間質性出血、斑紋（mottling）、チアノーゼ、浮腫、血栓症、壊死、フィブリン血栓形成、全身性播種性血管内凝固、糸球体毛細血管におけるＩｇＭ沈着、糸球体毛細血管におけるＩｇＧ沈着、クレアチニンレベルの上昇、ＢＵＮレベルの上昇、Ｔ細胞の浸潤、浸潤性好酸球、浸潤性プラズマ細胞、浸潤性好中球、動脈炎、内皮への抗体結合、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、またはＴＩＭ−３の発現の変化、および全身性炎症が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
「超急性拒絶反応関連症状」は、超急性拒絶反応に関連するとして、または超急性拒絶反応により引き起こされるとして、当分野に知られる任意の症状を包含することを意図している。超急性拒絶反応関連症状は、移植された臓器、組織、または細胞のタイプに応じて変化し得ることが認められている。超急性拒絶反応関連症状には、血栓性閉塞、移植片脈管構造の出血、好中球流入、虚血、斑紋、チアノーゼ、浮腫、臓器不全、臓器機能の低下、壊死、糸球体毛細血管血栓症、機能不全、溶血、発熱、凝固、胆汁産生量の減少、無力症、低血圧、乏尿、凝固障害、血清アミノトランスフェラーゼレベルの上昇、アルカリホスファターゼレベルの上昇、黄疸、嗜眠、アシドーシスおよび高ビリルビン血症および血小板減少症が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００７９】
血小板減少症は、血小板の量が、通常の範囲の１４０，０００から４４０，０００／μｌを下回る。血小板減少症関連の症状には、内出血、脳内出血、血尿、吐血、歯肉出血、腹部膨満、タール状便、過長月経、鼻出血、斑状出血、点状出血または紫斑が含まれるが、これらに限定されない。ブタ肝臓によるヒト血小板の取り込みが、異種移植レシピエントにおける血小板減少症の発症の一因である。
【００８０】
血小板（plateletまたはthrombocyte）は、血液凝固、止血、および血液血栓形成に関連する巨核球の除核断片である。ヒト血小板は、血小板アフェレーシス、血小板フェレーシスおよび超遠心分離を含むがこれらに限定されない、様々な方法により、通常通りに単離される。
【００８１】
フレーズ「血小板取り込み」は、血小板の肝臓または肝臓細胞への取り込みを包含することを意図している。メカニズムにより限定されないが、この取り込みは、貪食プロセスにより生じ得る。血小板取り込みは、当業界で知られる任意の血小板取り込みモニタリングアッセイによりモニターされ得る。血小板取り込みモニタリングアッセイには、免疫学的方法、ウエスタンブロット、免疫ブロット、顕微鏡、共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡およびファゴソーム単離が含まれるが、これらに限定されない。適切な血小板取り込みモニタリングアッセイは、用いられる標識のタイプによって決まり得ることが認識されている。血小板取り込みは、吸収された血小板全体のパーセンテージ、吸収されなかった血小板全体のパーセンテージ、吸収されなかった血小板に対する吸収された血小板の比率、少なくとも１つの血小板を吸収している細胞のパーセンテージ、血小板を吸収していない細胞のパーセンテージ、または、細胞当たりの吸収された血小板の数として測定され得る。２以上の細胞型による血小板取り込みが肝臓の血小板取り込み全体に寄与し得ることが、認識されている。動物の肝臓による血小板取り込み全体には、肝臓の類洞内皮細胞による血小板取り込み、クッパー細胞による血小板取り込み、ＬＳＥＣおよびクッパ−細胞による血小板取り込み、およびさらなる細胞型による血小板取り込みが含まれ得る。異なる細胞型による血小板取り込みが肝臓による血小板取り込み全体の同様のまたは異なる部分に寄与し得ることが、認識されている。従って、肝臓による血小板取り込みの改変、阻害、低減、減少、または低下は、１つ以上の肝臓細胞型による血小板取り込みの改変、阻害、低減、減少、または低下を含む。
【００８２】
メカニズムにより限定されないが、血小板取り込みは、ＬＳＥＣおよびクッパ−細胞による貪食により生じ得る。貪食は、分解酵素を含むリソソームの融合によりファゴソームとなる、エンドソームの形成により特徴付けられる。
【００８３】
当業界で知られる、拒絶反応関連症状を評価する、検討する、解析する、測定する、定量する、決定する任意の方法は、請求項に係る組成物および方法と共に用いられ得る。拒絶反応関連症状を解析する方法には、血小板計算を伴うＣＢＣ、凝固研究、肝臓機能検査、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査、標準的診断基準、免疫学的方法、ウエスタンブロット、免疫ブロット、顕微鏡、共焦点顕微鏡、透過型電子顕微鏡、ＩｇＧ結合アッセイ、ＩｇＭ結合アッセイ、発現アッセイ、クレアチニンアッセイおよびファゴソーム単離などの実験的評価が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
遺伝子産物の発現は、遺伝子産物の発現全体が減少した場合、改変されたサイズの遺伝子産物が生産された場合、または遺伝子産物が変化した機能性を示す場合に減少する。従って、遺伝子が野生型の量の産物を発現しているが、該産物が酵素活性変化、サイズ変化、細胞局在パターン変化、受容体−リガンド結合変化、または他の活性変化を有する場合、その遺伝子産物の発現は減少していると考えられる。発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、マイクロアレイ解析、免疫沈降、放射線学的アッセイ、ポリペプチド精製、分光光度分析、アクリルアミドゲルのクーマシー染色、ＥＬＩＳＡ、２次元ゲル電気泳動、インサイツハイブリダイゼーション、化学発光、銀染色、酵素試験、ポンソーＳ染色、多重ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学アッセイ、ラジオイムノアッセイ、比色測定法、免疫放射定量測定法、ポジトロン断層撮影、蛍光測定アッセイ、透過性細胞の蛍光活性化細胞選別染色、放射性免疫吸着試験、リアルタイムＰＣＲ、ハイブリダイゼーションアッセイ、サンドイッチ免疫測定法、フローサイトメトリー、ＳＡＧＥ、差動増幅または電子解析を含むがこれらに限定されない、当業界で知られる任意の方法により解析され得る。発現は、直接的または間接的に解析され得る。間接的発現解析には、酵素により触媒される産物のレベルを解析して、酵素の発現を評価することが含まれ得るが、これに限定されない。例えば、Ausubel et al, eds (2013) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York, N.Y. and Coligan et al (2013) Current Protocols in Protein Science, Wiley-Interscience New York, NYを参照されたい。ブタのＡＳＧＲ１の遺伝子発現アッセイが市販されている(Applied Biosystems商標, Carlsbad CA)。
【００８５】
「〜と比較して」は、何かを同様だが異なるものと比較すること、例えば、トランスジェニックブタによる実験から得られたデータポイントを、野生型ブタによる同様の実験から得られたデータポイントと比較することを包含することを意図している。単語「比較する」は、比較しているものの間の類似点または相違点を見出すために、特徴、質、値、量、または割合を調べることを包含する。比較することは、比較しているものにおける有意差を明らかにし得る。「有意差」は、トランスジェニックブタ由来の物質および野生型ブタ由来の物質についての結果などの、複数の群について得られた結果における統計的に有意な差を意図している。一般的に、統計的有意差は、限定されないが、スチューデントｔ検定、カイ二乗、片側ｔ検定、両側ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、ダネットの事後検定、フィッシャー検定およびｚ検定などの統計的有意差検定により評価される。２つの結果の間の有意差は、ｐ＜０．１、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０４、ｐ＜０．０３、ｐ＜０．０２、ｐ＜０．０１以上を有する結果であり得る。
【００８６】
単語「単離された」は、別のエンティティーまたはグループから物理的に分離されたエンティティーを包含することを意図する。単離細胞は、別の細胞グループから物理的に分離されている。細胞グループの例には、成長中の細胞塊、細胞培養液、細胞株、組織、および動物が含まれるが、これらに限定されない。単語「単離する」は、別のエンティティーまたはグループから物理的にエンティティーを分離することを包含することを意図する。例には、他の細胞からある細胞を物理的に分離すること、細胞の残部から細胞構成成分を物理的に分離すること、および動物から組織または臓器を物理的に分離することが含まれる。単離細胞または細胞構成成分は、他の天然の細胞または細胞構成成分から１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最大１００％で分離される。１つ以上の細胞を、別の細胞グループから単離する方法は、当業界で知られている。例えば、Freshney (ED) Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3rd Ed.) 1994、 Wiley-Liss; Spector et al (Eds)(1998) Cells: a Laboratory Manual (vol.1) Cold Spring Harbor Laboratory Press and Darling et al (1994) Animal Cells: culture and media  John Wiley & Sonsを参照されたい。動物から組織または臓器を単離する方法は当業界で知られており、単離される組織または臓器、および組織または臓器を移植する所望の方法によって変わる。動物またはサンプルから輸血製剤を単離する方法は、当業界で知られており、所望の輸血製剤によって変わる。これらの方法には、遠心分離、透析、溶出、アフェレーシスおよび寒冷沈降反応が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
「皮膚関連物」は、皮膚から単離された物、および皮膚と共に用いることが意図される物を包含する。皮膚または他の組織から単離された皮膚関連物は、皮膚と共に用いられる前に修飾されてよい。皮膚関連物には、交換用ドレッシング材、熱傷被覆、皮膚産物、置換真皮、皮膚線維芽細胞、コラーゲン、コンドロイチン、結合組織、角化細胞、セルフリーの異種真皮、セルフリーのブタ真皮、複合皮膚代替、および表皮並びに一時的創傷被覆が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Matou-Kovd et al (1994) Ann Med Burn Club 7:143を参照されたい（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８８】
皮膚関連物の付着期間は、皮膚関連物のヒト対象への適用と、皮膚関連物のヒト対象からの自然な分離との間の時間である。ヒト対象の皮膚創傷が塞がれている場合、皮膚関連物は自然な分離または機械的分離で除去され得る。しかしながら、皮膚関連物のヒト対象からの自然な分離は、早期に起こり得る。早期の自然な分離は、医師が分離を望む前に起こる。例示を目的とし、限定を目的としないが、早期の自然な分離は、創傷が塞がれる前に起こり得る。早期の自然な分離はまた、「脱落（sloughing）」、「剥落（shedding）」、または「剥離（flaking）」と呼ばれ得る。早期の自然な分離の臨床管理には、皮膚関連物の再適用、ドレッシング材の適用、包帯の適用、抗生物質の投与、および輸液の投与を含み得る。皮膚創傷は、対象の皮膚の成長、および皮膚移植を含むがこれらに限定されない、当業界で知られる任意の方法により塞がれ得る。早期分離の低減には、分離を医師が望む前の皮膚関連物の自然な分離の減少、低下、頻度の低下、減退、量の減少が包含される。早期分離の低減は、野生型のブタから得られる皮膚関連物と比較した、完全な早期分離の事象の減少、部分的な早期分離の事象の減少、および部分的な早期分離における皮膚関連物のより小さな部分の関与に関連し得る。目的の皮膚関連物の適用はまた、付着期間の増加、伸長、改善、延長、または拡張を示し得る。本願の皮膚関連物の使用は、付着期間を増加させ得る。
【００８９】
皮膚創傷には、開放創、熱傷、裂傷、潰瘍、下腿潰瘍、足部潰瘍、メラノーマ除去、癌除去、形成手術、および咬傷を含むがこれらに限定されない、外皮への任意の損傷が包含される。
【００９０】
「外科的に取り付ける」は、当業界で知られる任意の外科的な方法により、連結すること、結合させること、合体させること、取り付けること、固定すること、繋げること、連結すること、または結びつけることを意図している。
【００９１】
ある実施形態において、本出願は、αＧａｌ、ＣＭＡＨおよびβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子の発現が減少した、複数ノックアウトしたブタ動物由来の、輸血に好適な非ヒト物質を提供する。輸血に好適なこれらの物質には、血液、全血、血漿、血清、赤血球、血小板、および白血球細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。これらの物質は、単離、濃縮または精製され得る。輸血に好適な物質を単離、濃縮、または精製する方法は、当業界で知られている。血清学的に、ブタの赤血球（ＲＢＣ）は、ヒトＲＢＣと多くの共通した特徴を有するPond W.G, Houpt K.A, The Biology of the Pig Ithaca: Comstock Pub. Associates, 1978 and Jandl, J. H. Blood: Textbook of Hematology, Boston:Little, Brown, 1996)。他の哺乳動物のように、ブタにおける赤血球生成の主要な部位は骨髄である。ｐＲＢＣは、直径およそ４−８ミクロンの、両凹面の円盤である。ブタ血液のヘマトクリット値は３５−４７％であり、ヘモグロビン濃度は６−１７ｇ／１００ｍｌである。ｐＲＢＣの半減期は、ヒトＲＢＣの６０日と比較して、およそ４０日である。
【００９２】
これまでに１５のブタ式血液型が同定されている。最も重要で、よく研究されているのはＡ−Ｏ（Ｈ）であり、ヒトのＡＢＯ式血液型に密接に関連している。ｐＲＢＣ上のＡおよびＯ抗原は、ヒトのルイス抗原と同様のメカニズムで、循環血漿スフィンゴ糖脂質から受動的に吸着される(Marcus, D.M. & Cass, L.E. (1969) Science 164:553-555)。ｐＲＢＣ表現型の解析は、完全に信頼できるものではない。ブタの表現型解析は、抗Aモノクローナル抗体 (mAb)（血液バンクで用いられる）および抗Ｈレクチン抗体(Ulex europaeus)による、頬側の上皮細胞の免疫組織化学染色によって、達成され得る(Villarroya H et al 1990 Autoimmunity 6:47-60)。血液型Ａを有する糖脂質が、ブタの胃粘膜、上皮細胞および赤血球から単離されている。ｐＲＢＣに由来する特徴がはっきりしたいくつかのタンパク質の中で、ブタのヘモグロビンは、ヒト対応物と８５％の配列同一性を共有し、２．８Åの分解能で同様の三次元構造を示す。たいていの組織細胞とは異なり、ブタのＲＢＣは核を有さず、それゆえ、限定されないが、ブタ内在性レトルトウイルス（ＰＥＲＶ）などのレトロウイルスを抱える可能性は低い。ｐＲＢＣはまた、細胞内オルガネラを欠き、インビボにおいて比較的半減期が短い。
【００９３】
以下の実施例は、例示的な目的のみに提示されたものであり、本発明の範囲を限定することを決して意図していない。実際に、本明細書に示された、および記載されたものに加えて様々な改変が、先の記述および以下の実施例から当業者に明らかになっているであろうし、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るだろう。
【実施例】
【００９４】
実施例１．標的であるＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１およびβ４ＧａｌＮＴ２領域のＤＮＡシーケンシング解析
クローンブタ由来のゲノムＤＮＡを、GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を用いて抽出した。ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１およびβ４ＧａｌＮＴ２ Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９標的領域のＰＣＲ増幅を行った。標的ＣＭＡＨ、ＧＧＴＡ１およびβ４ＧａｌＮＴ２領域の配列決定をするために、プライマーを用いた。
【００９５】
Pwo Master (Roche, Indianapolis IN)を使用し、Pwo SuperYield DNA ポリメラーゼ、 dNTPack (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を使用した。ＧＧＴＡ１のＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９４℃、２分；９４℃、１５秒、５４℃、３０秒、および７２℃、４５秒を１５サイクル；９４℃、１５秒、５４℃、３０秒、７２℃、４５秒、各サイクルさらに５秒を２５サイクル；および７２℃５分の最後の伸長ステップ。ＣＭＡＨに対しては、９４℃、２分；９４℃、１５秒、５６℃、３０秒および７２℃、４５秒を１５サイクル；９４℃、１５秒、５６℃、３０秒、７２℃、４５秒、各サイクルさらに５秒を２５サイクル；および７２℃５分の最後の伸長ステップ。β４ＧＡＬＮＴ２に対しては、９４℃、２分；９４℃、１５秒、６２℃、３０秒、７２℃、４０秒を１５サイクル、９４℃１５秒、６２℃、３０秒、７２℃４０秒、各サイクルさらに５秒を２５サイクル；および７２℃５分の最後の伸長ステップ。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル上で分離し、GenElute Gel Extraction Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で精製した。ＰＣＲ産物を、特定の塩基配列決定用プライマー、ＧＧＴＡ１に対しては5’ CCTTAGTATCCTTCCCAACCCAGAC 3’ (配列番号5)；ＣＭＡＨに対しては5’ CATTTTCTTCGGAGTTGAGGGC 3’ (配列番号6)；β４ＧＡＬＮＴ２に対しては5’ AAAGCCACAGGAGGAGCCAG 3’ (配列番号7)により、サンガー法(DNA Sequencing Core Facility, Indiana University School of Medicine)で配列決定した。変異が検出されると、ＰＣＲ産物をｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターへ挿入し、大腸菌に形質転換した。個々の遺伝子のそれぞれの対立遺伝子における変異をさらに調べるために、個々のクローンを再度配列決定した。
【００９６】
例示的なＤＮＡ配列解析の結果を、図１のパネルＡ−Ｃに要約した。ＤＮＡ配列解析により、少なくとも１匹のブタにおける両対立遺伝子のＧＧＴＡ１およびＣＭＡＨ遺伝子の改変が確認された。配列解析により、ＧＧＴＡ１標的領域における、重複する５つおよび７つの塩基対の欠失が示された（パネルＡ）。同じブタにおいて、配列解析により、一方の対立遺伝子上の１２塩基対の欠失、および、他方の対立遺伝子上の３塩基対の欠失に代わる重複する５塩基対の置換からなるＣＭＡＨ遺伝子の破壊が確認された（パネルＢ）。ＤＮＡ配列解析により、同じブタにおけるβ４ＧａｌＮＴ２遺伝子配列の改変が確認された。β４ＧａｌＮＴ２遺伝子配列データは、３つのバリエーションを示している；３つの変異の存在は、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子が少なくとも２つの遺伝子座で生じることを示唆し得る。β４ＧａｌＮＴ２遺伝子の重複している領域において、１つの対立遺伝子は１塩基対の挿入を示し、１つの対立遺伝子は５塩基対の欠失を示し、１つの対立遺伝子は１２塩基対の欠失／１塩基対の置換を示す。野生型β４ＧａｌＮＴ２配列の根拠は発見されなかった（パネルＣ）。図１３は、さらなるトリプルノックアウトブタ単離物のＤＮＡ配列解析を要約するものである。
【００９７】
実施例２．ノックアウトブタ(トリプルトランスジェニックブタ）の生産
ｇＲＮＡ発現を進めるためのＰＸ３３０プラスミドへのオリゴアニーリングおよびクローニングを、Addgeneプラスミド42230 [http://www.addgene.org/42230 and 20]を用いて行った。標的遺伝子のためのオリゴペアは、ＧＧＴＡ１(NCB1 Accession:XM_005660398.1)、 5’CACCGAGAGAAAATAATGAATGTCAA-3’ フォワード) (配列番号8)、 5’AAATTGACATTCATTATTTTCTC-3’ (リバース) (配列番号9); ＣＭＡＨ (NCBI Accession: NM_001113015.1) 5’-CACCGAGTAAGGTACGTGATCTGT-3’ (フォワード) (配列番号10)、 5’-AAACACAGATCACGTACCTTACTC-3’ (リバース) (配列番号11; β４ＧａｌＮＴ２ (NCBI Accession: NM_001244330.1) 5’-CACCGTGTATCGAGGAACACGCTT-3’ (フォワード) (配列番号12)、 5’-AAACAAGCGTGTTCCTCGATACAC-3’ (リバース) (配列番号13)である。
【００９８】
肝臓由来細胞、３つのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プラスミド全てで同時導入した。４８時間後、α−Ｇａｌヌル細胞を単離するために、処理した細胞をＩＢ４レクチンカラムに通過させた。２，０００，０００個のα−Ｇａｌネガティブ細胞を、さらに０．５％ＢＳＡを伴う５００μｌＨＢＳＳ中の２μｇ／ｍｌのフルオレセイン標識ドリコスビフロラスアグルチニン（ＤＢＡ）−ＦＩＴＣ (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)で染色し、BD FACSARia sorter (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)を用いて、ＤＢＡ−ネガティブ細胞をフロー選別した。ＣＭＡＨ遺伝子機能の指標である、Ｎｅｕ５Ｇｃの存在は、体細胞核移植の前に、解析しなかった。
【００９９】
体細胞核移植（SCNT）は、インビトロの成熟卵母細胞を用いて行った(DeSoto Biosciences Inc., St. Seymour TN and Minitube of America (Mount Horeb WI)。卵丘細胞を０．１％ヒアルロニダーゼ中でのピペッティングにより卵母細胞から除去した。正常な形態および可視極体を有する卵母細胞を選択して、操作培地で培養した（５μｇ／ｍｌビスベンズイミドおよび７．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含む、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を伴うカルシウムフリーＮＣＳＵ−２３で１５分間）。この培養期間に続いて、第一極体および減数第二分裂中期プレートを除去するために、卵母細胞を除核した。トリプルトランスジェニックブタのため、部位標的の、ＩＢ４対抗選択された、ＤＢＡネガティブ肝臓由来細胞（ＬＤＣ）の単一細胞を、各除核された卵母細胞に注入した。部位標的の、ＩＢ４対抗選択された、ＤＢＡネガティブ肝臓由来細胞から作製されたトリプルノックアウトブタ中絶胎児から取得した胎仔線維芽細胞のＳＣＮＴから、いくつかのトリプルトランスジェニックブタを生育させた。電気的融合は、ＢＴＸエレクトロポレーター(Harvard Apparatus, Holliston MA)で誘導した。様々な例において、細胞を注入した除核された卵母細胞（一対）を、２８０ｍＭマンニトール、０．００１ｍＭＣａＣｌ２および０．０５ｍＭＭｇＣｌ２中での１４０Ｖ、５０μｓの、または、２８０ｍＭマンニトール、０．１ｍＭＣａＣｌ２、および０．０５ｍＭＭｇＣｌ２中での１８０Ｖ、５０μｓの２つのＤＣパルスに曝露した。活性化の後、卵母細胞を、０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＮＣＳＵ−２３培地中に置き、３８．５℃、５％ＣＯ２の加湿環境下で、１時間未満培養した。活性化後１時間以内に、卵母細胞をレシピエントブタに移した。レシピエントブタは、発情期の初日に同期化された西洋ブタ（occidental pig）であった。胚移植後２５日目または２６日目に、超音波により妊娠を確認した。 
【０１００】
本研究で用いた動物は全て、Institutional Biosafety Committee (IBC)およびInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)により承認された。
【０１０１】
実施例３．トリプルノックアウトのＩＢ４対抗選択
肝臓由来細胞（ＬＤＣ）を、３セットの標的コンストラクト（αＧａｌ、β４ＧａｌＮＴ２およびＣＭＡＨ）で遺伝子導入した。細胞を、αＧａｌに結合する物質であるＩＢ４で選択した。ＩＢ４対抗選択を生き延びた大きな細胞集団の細胞由来のＤＮＡを得て、標的遺伝子配列を評価した。ＩＢ４対抗選択を生き延びた大きな細胞集団を、妊娠ブタを作製するために、ＳＣＮＴに直接用いた。
【０１０２】
実施例４．標的ベクターの設計
ＣｒｉｓｐＲコンストラクト、ジンクフィンガーコンストラクトおよびＴＡＬＥＮコンストラクトなどの標的ベクターを、好適な部位でブタのＣＭＡＨ(Ensemble transcript ENSSSCT00000001195)の配列を標的とするように設計する。ターゲティングベクターコンストラクトを、好適な部位でＧＧＴＡ１(Ensemble transcript ENSSSCT00000006069)を標的とするように設計する。ターゲティングベクターコンストラクトを、NCBI GeneID:100621328およびEnsemble: ENSSSCG00000030269における好適な部位でβ４ＧａｌＮＴ２を標的とするように設計する。
【０１０３】
Ensemble transcriptに挙げられた配列の一部の逆相補であるプライマー配列を有するＣＭＡＨ Ｃｒｉｓｐｒコンストラクトを作製して、トリプルノックアウトブタの作製に利用した。適切なEnsemble transcriptに挙げられた配列の一部に同一であるプライマー配列を有するＧａｌ Ｃｒｉｓｐｒコンストラクトを作製して、トリプルトランスジェニックブタの作製に利用した。上記に示したNCBI配列NCBI GeneID:100621328の一部に同一であるプライマー配列を有するβ４ＧａｌＮＴ２ Ｃｒｉｓｐｒコンストラクトを作製して、トリプルトランスジェニックブタの作製に利用した。
【０１０４】
実施例５．ヒト血清とトランスジェニックＰＢＭＣとの交差適合
トランスジェニックブタ（たとえばトリプルＧＧＴＡ−１／β４ＧａｌＮＴ２／ＣＭＡＨ）および野生型のブタの全血を、静脈穿刺から、ＡＣＤに回収した。全血をＰＢＳと１：１で混合し、フィコールで分離した。Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)を用いて、全血からブタの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。ＰＢＭＣをフィコール層から除去して、ＰＢＳで数回洗浄し、その後赤血球を除去する必要がある場合に溶解液で洗浄した。ＰＢＭＣを、４，０００，０００cells/mlでＥＸ−ＣＥＬＬ培地に懸濁した(ハイブリドーマ細胞１４６１０ＣのためのＥＸ−Ｃｅｌｌ ６１０ＨＳＦ−血清フリー培地)。
【０１０５】
血清は、４４名の健常なヒトボランティアから取得した。２５％の熱失活血清を調製した。２５μｌの熱失活血清、２５μｌのＥＸ−ＣＥＬＬ培地および５０μｌの懸濁細胞を、９６ウェルのＶ字底プレートの各ウェルに添加した。細胞を４℃で３０分間培養し、その後ＥＸ−ＣＥＬＬ培地で３回洗浄した。細胞を次のように二次抗体で染色した：ＥＸ−ＣＥＬＬ培地中で１：２５０濃度のAlexa Flour 488 ヤギ抗ヒトＩｇＧ 109-546-170、ＥＸ−ＣＥＬＬ培地中で１：２５０濃度のAlexa Flour 488 ヤギ抗ヒトＩｇＭ 709-546-073；１００μｌの二次抗体を添加した。細胞をピペットで懸濁した。細胞をＥＸ−ＣＥＬＬ培地で１回洗浄し、ＥＸ−ＣＥＬＬ培地中または１：１のＥＸ−ＣＥＬＬ培地およびFlow Fixative Solution中（１％緩衝パラホルムアルデヒド）にてピペットで再懸濁した。Alexa flour 488に対するチャネルＦＬ−１ゲーティングで、フローサイトメトリー分析を達成した。この実験の結果は図３、パネルＢに示している。
【０１０６】
実施例６．ＤＢＡレクチンフローサイトメトリー染色
目的のトランスジェニックブタおよび他のブタ由来の全血を、抗凝血性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）中に回収した。全血をＰＢＳと１：１で混合し、フィコールで分離した(Ficoll-Paque PLUS， GE Healthcare 17-1440-03)。カルシウム含有のフローウオッシュバッファーおよび染色バッファーを得た。フローウオッシュバッファーは、微粒子を除去するために０．４５μＭでフィルター濾過した、０．５％ＢＳＡ ＩｇＧフリー、０．１％アジ化ナトリウムを有するＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）であった。ＰＢＭＣを２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、フローウオッシュバッファー中に再懸濁し、均一に懸濁した。氷上で細胞を１５分間ブロックした。細胞を再度、再懸濁した。１００μｌ（２Ｘ１０５細胞）を５ｍｌのフローチューブへ添加した。ＤＢＡ−フルオレセイン（２ｍｇ／ｍｌストック）を得た。ＤＢＡ−フルオレセインレクチンストックを、フローバッファーに１：１０で希釈して、最終濃度０．２μｇ／ｍｌとした。ＤＢＡ−フルオレセインレクチンを、１μｇＤＢＡ：１ｘ１０６細胞（０．２μｇ／２ｘ１０５細胞または１μｌ）の比率で細胞に添加した。ＤＢＡレクチンおよび細胞を室温で３０分間インキュベートした。細胞を、４ｍｌのFlow Wash HBSSで完全に洗浄した。細胞を４００ｘｇで５分間回転させ、洗浄上清を除去した。細胞を２００μｌのFlow Wash HBSSに再懸濁した。さらなる洗浄を行う場合は、同じパラメーターを利用した。必要に応じて、最後の洗浄後に、細胞をおよそ２００μｌのFlow Fixativeに、２ｘ１０５細胞で固定し、解析まで４℃で保管した。フローサイトメトリー分析を、前方および側方錯乱に基づくゲートで行った。細胞蛍光現象は、ＦＬ−１で回収した；１０，０００現象を、散乱ゲートで回収した。各細胞株について、細胞のみおよびＤＢＡ−フルオレセインのデータの両方を回収した。ＩＢ４レクチンは、αＧａｌ遺伝子産物により産生された、αＧａｌ結合糖質と相互作用する。ＨＤ抗体は、ＣＭＡＨ遺伝子産物により産生されたＮｅｕ５Ｇｃ糖質と相互作用する。ＤＢＡレクチンは、β４ＧａｌＮＴ２遺伝子産物により産生された糖質構造と相互作用する。これらの実験から得られた結果は、図３、パネルＡに示している。
【０１０７】
実施例７．ＲＢＣに結合するＩｇＧ抗体
ヒトＡ血清および２つのヒトＯ血清およびＲＢＣを取得した。ブタの野生型およびｊ／ＣＭＡＨ／ＧＡＬトリプルノックアウトＲＢＣを取得した。Ficoll-Paque Plus (GE Health, Uppsala Sweden)を用いて、クエン酸デキストロースチューブ(Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes NJ)に回収された全血から、赤血球を単離した。抗凝血剤非存在下で全血を回収し、遠心分離して凝固物質を除去することにより、新鮮な血清を単離した。密度分離後、ＲＢＣをＰＢＳで３回洗浄して、室温でＰＢＳに１：１０で希釈した。ＲＢＣに結合する抗体を決定するために、ＲＢＣ（２×１０５細胞／ウェル）を、希釈した熱失活ヒト血清と、３０分間４℃でインキュベートし、最終血清濃度は２５％であった。細胞を、アジ化物を含むＰＢＳ中で３回洗浄して、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Alexa Fluor 488またはロバ抗ヒトＩｇＭ Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)で染色した。フローサイトメトリー分析を、Accuri C6フローサイトメーターおよびCFlowソフトウエア (Accuri, Ann Arbor, MI USA)を用いて行った。ＲＢＣゲーティングは、前方散乱および側方散乱に基づいた。ＲＢＣへのＩｇＧ抗体結合の例示的なフローサイトメトリー図を、図５に示している。
【０１０８】
αＧａｌに対しては抗体/レクチン イソレクチン Griffonia simplicifolia GS-IB4 Alexa Fluor 647 (Invitrogen, Grand Island NY, USA)を用いて、Ｎｅｕ５Ｇｃに対してはニワトリ抗Ｎｅｕ５Ｇｃ抗体キット (BioLegend, San Diego CA)を用いて、β４ＧａｌＮＴ２由来糖質に対してはフルオレセインドリコスビフロラスアグルチニン（ＤＢＡ） (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA USA)を用いて、ブタのＲＢＣ細胞表面グリカンの細胞表面解析を行った。これらの一連の実験から得られた図は、図６に示している。［Matt-実験の詳細を確認のこと。］
【０１０９】
実施例８．ＲＢＣストリッピングおよび関連するフローサイトメトリー
密度分離に続いて、ＲＢＣをＰＢＳ中で３回洗浄して、５０％Alsever’s 溶液中に懸濁した。ＲＢＣを、２１，３００×ｇ、二分間でペレットにした。血清容量に対する細胞ペレット容量１：１で、血清をペレット状の細胞に添加した。血清ＲＢＣ混合物を混合し、４℃で２０分間インキュベートした。細胞を、２１，３００×ｇ、二分間でペレットにし、Alsever’s 溶液で１回洗浄した。細胞を、酸性ストリッピングバッファー（ｐＨ２．７５クエン酸／リン酸塩、３００ｍＯｓ／ｋｇ）と混合して結合抗体を除去し、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ９．０(Calbiochem, LaJolla CA)で中和した。低ｐＨ処理の間に溶出した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマススペクトロメトリーで解析した（以下参照）。抗体溶出サンプルに対するフローサイトメトリー分析の適合を、２ｘ１０６ＲＢＣを用いて達成した。０．１％アジ化ナトリウムを含むＥＸ−ＣＥＬＬ ６１０−ＨＳＦ血清フリー培地 (Sigma, St. Louis, MO USA)中に細胞を懸濁し、２５％の熱失活血清の混合液と４℃で３０分間インキュベートした。ＲＢＣを３回洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Alexa Fluor 488またはロバ抗ヒトＩｇＭ Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove PA、 USA) 抗体で染色した。二次抗体を、４℃で３０分間ＲＢＣとインキュベートして洗浄した。フローサイトメトリー分析はBD Accuri C6 フローサイトメーター (Accuri, Ann Arbor, MI, USA)で達成し、ヒストグラムはFlowJo 7.6.5 (FlowJo LLC, Ashland OR, USA)を用いて作製した。代表的な図を図８に示している。ＲＢＣゲーティングは、前方散乱および側方散乱に基づいた。代表的なゲーティングは図１０に示している。
【０１１０】
実施例９．ＲＢＣから溶出するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析
単一のヒト血清を、様々なＲＢＣ（野生型ブタ（Ｗ）、ＣＭＡＨ／ＧＡＬ ＤＫＯ（Ｄ）、ＣＭＡＨ／ＧＡＬ／β４ＧａｌＮＴ２（Ｔ）；および自家性ヒト（Ａ））とインキュベートした。上述のストリッピングの後、１００μｌの溶出液を９００μｌのアセトンに希釈することで、中和された溶出液を沈降させ、−２０℃で３０分間インキュベートした。沈降物を、２０，０００ｘｇ、４℃で１５分間回転させた。上清を廃棄し、ペレットを水に溶解した７０％ｖ／ｖエタノールで洗浄した。沈降物を、再度２０，０００ｘｇ、４℃で１５分間回転させた。再度上清を廃棄し、ペレットをVacufuge Plus (Eppendorf, Hauppauge, NY, USA)にて３７℃で３０分間乾燥させた。その後サンプルを、製造業者の説明書に従い、２−メルカプトエタノール (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO、 USA)を含む１００μｌの２Ｘ Laemmeli Buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)に溶解した。サンプルをその後９５℃で５分間加熱し、室温まで冷却した。各サンプル１５μｌを、２６ウェルの４−２０％ Stain-Free TGX ゲル(Bio-Rad)に添加し、Bio-Rad criterion システムを用いて、２００Ｖで４２分間、変性および還元条件下で電気泳動した。電気泳動後、ゲルを取り除き、１００ミリリットルのG-250 Bio-Safe Coomassie Stain (Bio-Rad)で３０分間染色した。その後、ゲルを水中で脱染し、Li-Cor Classic Imager (LiCor Biosciences, Lincoln, NE USA)上で７００ｎｍのレーザーを用いて画像化した。それぞれのサンプルを、その後マススペクトロメトリーの準備および解析のために、ドライアイスで運んだ。プロセスの概略図を図７のパネルＡに示している；ＲＢＣから溶出した物質の代表的なゲルを、図７のパネルＣに示している。
【０１１１】
実施例１０．ＲＢＣから溶出した免疫グロブリンのマススペクトロメトリー定量
マススペクトロメトリー解析をMSBioworks、LLCにより行った。製造業者の説明書に従い、各サンプル５０μｌの分注液を、ＰＮＧａｓｅ Ｆ(New England Biolabs)で処理した。各サンプルを３０分間アセトン沈殿し、続いてクライアントプロトコルごとに７０％エタノールで、４℃にて洗浄した。結果として得られた沈殿物を乾燥させ、ＤＴＴを伴う４０μｌの１．４×ＬＤＳローディングバッファーに再懸濁した。ＭＯＰＳバッファーシステムにおいて、４−１２％ビストリスＳＤＳＰＡＧＥゲル上に、２０μｌを流した。
【０１１２】
重鎖含有領域（５０ｋＤａ）を切り取り、トリプシン消化を以下のプロトコルでrobot (ProGest, DigiLab)を用いて行った：１）２５ｍＭ重炭酸アンモニウム、その後アセトニトリルで洗浄した。２）１０ｍＭジチオスレイトールにて６０℃で還元した後、５０ｍＭのヨードアセトアミドにて室温でアルキル化した。３）トリプシンにて３７℃で４時間消化した。４）ギ酸でクエンチして、上清をさらに処理することなく直接解析した。
【０１１３】
ゲル消化物を、ThermoFisher Q ExactiveにインターフェイスしたWaters NanoAcquity HPLCシステムで、ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより解析した。ペプチドを、捕捉カラムに添加し、７５μｍの分析カラムを３５０ｎＬ／ｍｉｎで溶出した；両カラムはJupiter Proteo 樹脂 (Phenomenex)で充填されていた。質量分析計は、データ依存モード（data-dependent mode）で操作し、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳはそれぞれ、７０，０００ＦＷＨＭ分解能および１７，５００ＦＷＨＭ分解能でOrbitrapにおいて行った。ＭＳ／ＭＳに対し、最も豊富な１５個のイオンを選択した。曲線下面積（ＡＵＣ）を、それぞれのアイソタイプ特異的ペプチドに対して同定して計算した。ＡＵＣの比較により、サンプル中の各抗体レベルの定量的な評価が可能となる。代表的な図を図９に示している。質量分析により各抗体を同定および定量するために用いられるペプチドの配列を表２に示している。
【表２】
2017536814.tif 000007
【０１１４】
実施例１１．データ処理
データを、Mascotのローカルコピーを用いて、以下のパラメーターで検索した: Enzyme: Tripsin、Database: Swissprot Human (forward and reverse appended with common contaminants)、 Fixed modification: Carbidomethyl (C)、 Variable modifications: Oxidation (M)、 Acetyl (Protein N-term)、 Deamidation (NQ)、 Pyro-Glu (N-term Q)。  Mass values: Monoisotopic Peptide Mass Tolerance: 10 ppm Fragment Mass Tolerance: 0.02 Da Max Missed Cleavages: 2 Mascot DATファイルを、バリデーション、フィルタリングのために、また、サンプルごとに非重複リストを作製するために、Scaffoldソフトウエアに組み込んで解析した。データは１％タンパク質およびペプチドレベル偽発見率でフィルターをかけ、タンパク質あたり少なくとも２つの固有のペプチドを必要とした。ＬＣ／ＭＳの生データを、標的ペプチドの正確なｍ／ｚ値についてチェックし、選択イオンのクロマトグラムをQualBrowser (Thermo)で抽出した；それぞれの場合について、ピークエリアを計算した。
【０１１５】
実施例１２．ＲＢＣへの抗体結合を定量化するためのマススペクトロメトリーおよびフローサイトメトリー技術の比較
蛍光二次抗体の利用、人工的マスキングの可能性、および異なるＩｇＧアイソタイプの報告の困難性は、フローサイトメトリーの結果に影響を与え得る。定量的マススペクトロメトリーは、二次試薬なしの直接ペプチド解析を可能にし得、また、個々のアイソタイプレベルについての情報を与え得る。マススペクトロメトリーおよびフローサイトメトリーは、本方法における様々な固有のバイアスを反映し得る抗体結合の指標を提供する。個々のアイソタイプレベルは、それぞれに、様々な免疫エフェクター機能に寄与し得る。血清およびＲＢＣを３名のヒトから回収した。各血清を、その自家性のＲＢＣ（Ａ）およびブタＲＢＣ（野生型（Ｗ）またはトリプルノックアウト（Ｔ））とインキュベートした。免疫グロブリン結合を、フローサイトメトリーおよびマススペクトロメトリーを用いて評価した。図８のパネルＡおよびＢは、この実験から得られたフローサイトメトリーの図を提供している。マススペクトロメトリー定量は、トリプルノックアウトブタ細胞（Ｔ）が、３つの血清のうち２つで、自家性ＲＢＣ（Ａ）よりも少ないＩｇＧに結合し、３つの血清全てで、より少ないＩｇＭに結合したことを示した。フローサイトメトリーおよび定量マススペクトロメトリーの両方が、トリプルノックアウトブタ由来のＲＢＣへのヒト免疫グロブリンの結合レベルが低いことを示した。ヒトの血液型Ｏ型ＲＢＣの抗原性は、免疫抑制非存在下においても体液性損傷を避ける上で十分低いために、非会はヒトの血液型Ｏ型ＲＢＣに対して行った。
【０１１６】
実施例１３．ＲＢＣに結合する抗体のアイソタイプ解析
異なるＲＢＣへの各アイソタイプの結合を定量化するために、ＡＵＣを用いた。ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨノックアウトＲＢＣ（Ｄ）、ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２ノックアウトＲＢＣ（Ｔ）および自家性ヒトＲＢＣ（Ａ）を用いて評価を行った。血清１のゼロ値は、特定のアイソタイプの標的細胞への結合がないことを示す。血清２、３および４における自家性ヒト細胞へのＩｇＧ４の結合は、１０倍から１６倍の範囲で増加した。ＩｇＧ２は、複数の血清において、ブタ（Ｔ）ＲＢＣと比較してヒト細胞（Ａ）への結合の増加を示す唯一の他のアイソタイプであったが、その増加はＩｇＧ４で見られる増加よりも小さかった（３〜６倍の範囲、血清２、３および４参照）。これらの一連の実験の結果は、図１０に示している。
【０１１７】
実施例１４．様々なブタのレクチン染色
ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ ＤＫＯブタ由来のブタの腎臓を、ヒストリチクム菌（Clostridium histolyticum）由来の、０．０２５％のコラゲナーゼタイプＩＶ(Sigma, St. Louis, MO, USA)と共に流した。一次ＲＭＥＣを単離して、１０％のＤＫＯブタ血清、１００μｇ／ｍｌの内皮細胞特異的増殖因子、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンＢを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。３日間培養後、ｃＤＮＡがSV40の大きな抗原および小さな抗原を発現するレンチウイルスベクター(Applied Biological Materials Inc, Richmond, BC, Canada)を含む、レンチウイルス上清で、２４時間、ブタのＲＭＥＣを感染させた。単一細胞クローンを単離して、１０継代まで増幅した。ｉＲＭＥＣを、１０％のＤＫＯブタ血清、１００μｇ／ｍｌの内皮細胞特異的増殖因子、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地で培養して、１５−４０継代内で特徴づけのために使用した。αＧａｌ／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２／ＳＬＡ抗原破壊ｉＲＥＣを得た。
【０１１８】
ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／Ｂ４ＧＡＬＮＴ２ ＫＯブタの胸部および腹部大動脈分枝由来の初代大動脈内皮細胞を、ヒストリチクム菌由来の０．０２５％コラゲナーゼタイプＩＶ(Sigma, St.Louis, MO, USA) 2で単離した。該ＡＥＣを、ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／Ｂ４ＧＡＬＮＴ２ ＫＯブタ血清、１００ｕｇ／ｍｌ内皮細胞特異的増殖因子、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンＢを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、同様に、ＷＴ／ＧＧＴＡ１ ＫＯ ＡＥＣについては１０％ＦＢＳで、あるいは、ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ ＤＫＯおよびＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／Ｂ４ＧＡＬＮＴ２ ＡＥＣについては５％ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ ＤＫＯブタ血清を添加した培地で培養した。これらの細胞を５継代以内に使用した。ＣＭＡＨ欠損ブタの細胞は、ウシ血清からのＮｅｕ５Ｇｃの取り込みを妨げるため、ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ ＤＫＯブタ血清において生育させた。
【０１１９】
初代ＡＥＣ細胞（２×１０５細胞）を、フルオレセイン標識ドリコスビフロラスアグルチニンレクチン(ＨＢＳＳ中で１：１０００に希釈) (DBA, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)、フルオレセイン標識Artocarpus integrifoliaレクチン (ＨＢＳＳ中で１：１０００に希釈)(AIL, Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Vicia villosa レクチン (ＨＢＳＳ中で１：１０００に希釈)(VVL, Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Arachis hypogaea レクチン (ＨＢＳＳ中で１：１０００に希釈) (PNA, Vector Laboratories)、およびグリフォニアシンプリシフォリア（Griffonia simplicifolia）由来のAlexa Fluor 488標識イソレクチンＩＢ４ (ＨＢＳＳ中で１：１０００に希釈) (Invitrogen, Grand Island, NY, USA ）を用いて染色した。Ｎｅｕ５ＧＣについては、Alexa Fluor標識抗Ｎｅｕ５ＧＣまたは健常ニワトリＩｇＹ (BioLegend)により、０．５ｍｇ／ｍＬストックから１：５０００の最終希釈比率で、細胞を染色した。細胞を３０分間、４℃で染色した。細胞をその後洗浄し、C6フローサイトメーター (BD Biosciences)を用いて解析した。次に、蛍光強度を、レクチンの場合は無染色細胞、あるいは、Ｎｅｕ５ＧＣの場合はアイソタイプコントロールの、いずれかと比較して計算した。代表的な図は図２に示している。
【０１２０】
実施例１５．ＰＢＭＣの表現型解析
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をFicoll-Paque (GE Healthcare、 Uppsala、 Sweden)により単離して数えた。次に、製造業者の説明書によって、Hank’s Balanced Salt Solution （ＨＢＳＳ）に希釈したＮｅｕ５ＧＣブロッキングバッファー (Biolegend、 San Diego、 CA、 USA)にて、２ｘ１０６細胞/ミリリットルの密度で細胞を再懸濁した。細胞を、染色に先立ち、氷上で１５分間インキュベートした。１００マイクロリットル（２ｘ１０５細胞）を、１２ｘ７５ｍｍのポリスチレンフロー染色チューブ(BD Biosciences、 Bedford、 MA、 USA)に添加した。細胞を、１×１０６細胞当たり、下記１マイクログラムの比率で染色した：フルオレセイン標識ドリコスビフロラスアグルチニンレクチン (DBA、 Vector Laboratories、 Burlingame、 CA、 USA)、フルオレセイン標識Artocarpus integrifolia レクチン (AIL、 Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Vicia villosa レクチン (VVL、 Vector Laboratories)、フルオレセイン標識Arachis hypogaea レクチン (PNA、 Vector Laboratories)、およびグリフォニアシンプリシフォリア（Griffonia simplicifolia）由来のAlexa Fluor 488 標識イソレクチン IB4 (Invitrogen、 Grand Island、 NY、 USA )。Ｎｅｕ５ＧＣについては、Alexa Fluor標識抗Ｎｅｕ５ＧＣまたは健常ニワトリＩｇＹ(BioLegend)により、０．５ｍｇ／ｍＬストックから１：５０００の最終希釈比率になるよう、細胞を染色した。細胞を氷上でインキュベートしながら、３０分間染色した。次に、細胞を４ミリリットルのＮｅｕ５ＧＣブロッキングバッファーで洗浄し、４００ｘｇで５分間、ペレット状にした。上清を廃棄し、細胞を２００マイクロリットルのブロッキングバッファーで再懸濁して直ちに解析した。前方散乱および側方散乱ゲーティング法を用いて１０，０００現象を回収することにより、細胞をC6フローサイトメーター (BD Biosciences)を用いて解析した。次に、蛍光強度を、レクチンの場合は無染色細胞、あるいは、Ｎｅｕ５ＧＣの場合はアイソタイプコントロールの、いずれかと比較して計算した。
【０１２１】
実施例１６．臨床交差適合検査
トリプルトランスジェニックブタ由来のＰＢＭＣを、同種移植に利用されるヒト臨床交差適合検査に供した。反応性抗体パネル（ＰＲＡ）が０である３１名のヒト対象（上図）および、ＰＲＡスコアが８０を超える１９名のヒト対象（下図）から、血清を取得した。臨床医は、通常、細胞傷害性スコア１のヒトの臓器を移植する。トランスジェニックブタ由来のフィコール処理したＰＢＭＣを、２×１０６細胞／ｍｌの細胞濃縮物に調整した。いくつかの血清分注液をＤＴＴで処理した。交差適合トレイを２セット準備した。血清およびコントロールを、交差適合トレイに添加した。該細胞調製物を完全に混合し、Hamilton リピーティングディスペンサーにおいてゆっくりと引き上げた。１マイクロリットルの細胞を、照射された表示箱（view box）上の、血清を含む各ウェルに添加した。テスト細胞は、ポジティブコントロールウェルに、最後に添加した。同じ数のトレイを、Sorvall 遠心機の反対側のバケットに設置した。遠心機をオンにし、１０００ｒｐｍに達した後、遠心機をオフにした。トレイを照射された表示箱上で調べて、細胞小滴が血清と混合していることを確認した。トレイを室温で３０分間インキュベートした。すべてのトレイを、Jet Pipetteを用いて、各ウェルに対して１５μｌのＰＢＳで４回洗浄した。細胞を穏やかに洗浄する技術を用いて、２−３分間落ち着かせた。ＰＢＳ、油、および血清を除去した。
【０１２２】
実用的な希釈率のＡＨＧ／Ｃ’ Ｃｌａｓｓ １混合物を調製した。一方のセットのトレイを、５μｌのＡＨＧ／Ｃ’で処理した；他方のセットのトレイを５μｌの希釈していないウサギ補体で処理した（ＡＨＧなしトレイ）。トレイを、場合により４分間６０ｒｐｍで、ローター上に置いた。トレイを、６０分間室温でインキュベートした。細胞を５μｌのフルオロクエンチで染色して、５分間そのままにした。トレイを逆相蛍光顕微鏡に設置した；各ウェルを１６０×の総合倍率を用いて評価した。
【０１２３】
各ウェルの死細胞のパーセンテージを推定した。ＡＯは生細胞のインタクトな細胞膜を通過し、ＤＮＡに入り込み、４９０ｎｍで励起された場合に緑の蛍光（５３５ｎｍ）を発する。エチジウムブロマイドで染色された死細胞は、４９０ｎｍで励起された場合に赤の蛍光（６０５ｎｍ）を発する。各ウェルは、以下に記載のシステムを用いてスコア付けした：
【表３】
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【０１２４】
これらの一連の実験の結果は、図１４に示している。複数の血清が細胞傷害性スコア１を有することに注目されたい。
【０１２５】
実施例１７．エクスビボにおけるトランスジェニック肝臓へのヒト血小板の灌流
トリプルトランスジェニックＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／β４ＧａｌＮＴ２ブタを麻酔して、挿管する。正中線腹部切開を行う。肝臓を除去して、正常体温の条件下で灌流装置に設置する。湿度、温度および気流が灌流装置内で維持される。灌流装置は、流速を変化させることで一定の圧力を維持する。門脈を通る遠心流と、肝動脈を通る拍動流とを用いる。両方の流速を、ブタの生理学的な血圧値にセットする。ベースの灌流溶液は、生理学的栄養およびインスリンを有する酸素化されたリンゲル液である。
【０１２６】
ヒト血小板を、健常なボランティア対象から得るか、単離から６日未満に商業的に購入し、２０−２４℃で保管する。およそ１×１０１１個のヒト血小板を、抗凝血性クエン酸デキストロース含有滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。血小板を、製造業者のプロトコルに従い、ＣＦＳＥで標識してよい。
【０１２７】
ブタ肝臓を、血小板添加に先立ち、２時間灌流する。灌流システムへの添加前と、血小板の添加後の予め決定した時点で、血小板サンプルを得る。灌流前および灌流後のサンプルにおける血小板レベルを評価する。ブタ肝臓の灌流前後の評価を行う。野生型ブタの肝臓を得、同様の条件下で該肝臓を灌流する。
【０１２８】
実施例１８．トランスジェニック異種移植片に対する反応の評価
ブタの肝臓を、トリプルノックアウトブタ（αＧａｌ、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２）から得る。肝臓を、ピギーバック法を用いて、死亡したばかりヒトの死体に外科的に移植する。手術後、生体試料をヒトの死体から得る。拒絶反応関連反応の臨床指標をモニターする。
【０１２９】
実施例１９．トランスジェニック異種移植片に対する反応の評価
ブタの腎臓を、トリプルトランスジェニックブタ（αＧａｌ、ＣＭＡＨ、β４ＧａｌＮＴ２）から得る。既存の、および新規のドナー特異的抗体を管理する化合物を、高度に感作されたヒト対象に投与する。ブタの腎臓を、該対象に外科的に移植する。手術後、ヒトの死体から生体試料を得る。移植片拒絶反応の臨床指標をモニターする。
【０１３０】
実施例２０．共焦点顕微鏡解析
子ブタ（ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、βＧａｌＮＴ2トリプルノックアウト、野生型または目的の他の子ブタ）を安楽死させる。肝臓、心臓および腎臓組織を該ブタから得る。各組織の凍結切片を調製する。マウントした組織を、ＨＢＳＳ中のOdysseyブロッキングバッファー (Li-Cor Biosciences、 Lincoln NE)で１時間ブロックする。該スライドを、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定する。組織をＩＢ４レクチン Alexa Fluor 647 (Invitrogen、 Grand Island NY)で染色して、Ｇａｌエピトープの存在を可視化する。Ｎｅｕ５Ｇｃエピトープを可視化するために、組織をニワトリ抗Ｎｅｕ５Ｇｃ抗体またはコントロール抗体(Sialix、 Vista CA)で１時間染色する。組織を、ＤＢＡで染色してＳｄａ様エピトープ組織の存在を可視化し、ＨＢＳＳで３回洗浄する。ロバ抗ニワトリ Dylight 649 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc、 West Grove PA)二次抗体を、およそ１時間、該組織とインキュベートする。組織を、０．１％ＨＢＳＳ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。核を染色するために、ＤＡＰＩ染色剤(Invitrogen、 Grand Island NY)を、全スライドに１分間添加後、２回の０．１％ＨＢＳＳ洗浄を行う。組織を、ProLong Gold (Invitrogen、 Grand Island NY)にマウントする。共焦点顕微鏡観察を、Olympus FV1000を用いて行う。
【０１３１】
実施例２１．抗体媒介性補体依存性細胞傷害
抗体媒介性補体依存性細胞傷害アッセイは、当業界で知られている。Diaz et al (Diaz et al.、 2004 Transplant Immunology 13(4):313-317)の方法を行う。ヒト血清を、健常なボランティアから得る。２５％の熱失活血清を調製する。熱失活ヒト血清を段階的に希釈して、各濃度１００μｌを、９６ウェルのＶ字底アッセイプレートに入れる。血清を、目的のブタ（ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／４ＧａｌＮＴ２トリプルトランスジェニックまたはその他）から得た１００μｌに分取したＰＢＭＣと混合する。ＰＢＭＣ最終濃度は、５ｘ１０６／ｍｌまたは１ｘ１０６／ｍｌのいずれかである。血清濃度は、５０％、１７％、２％、０．６％、０．２％、および０．０７％と様々である。混合物を、４℃で３０分間インキュベートする。３０分後、プレートを４００ｘｇで４分間遠心分離する。プレートをデカントして、ＨＢＳＳで洗浄する。ウサギ補体（１：１５希釈を１５０μｌ）を各ウェルに添加して、３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＭＣを、アセトン中の１ｍｇ／ｍｌストック溶液から常に用時調製したフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）ストック溶液、および、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で５０μｇ／ｍｌで調製したヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で標識する。補体中で培養後、Accuri C6 フローサイトメーターを用いた解析のために、２５０μｌのＨＢＳＳおよび１０μｌのＦＤＡ／ＰＩを含むチューブにピペットで移す。
【０１３２】
死細胞（ＰＩ＋／ＦＤＡ−）、損傷細胞（ＰＩ＋／ＦＤＡ＋）および生細胞のパーセンテージを決定する。ダブルネガティブな事象（ＰＩ−／ＦＤＡ−）を、計算から除外する。血清に曝されていない細胞における細胞傷害性のパーセンテージを、自然な死滅と考える。細胞傷害性の値を、自然な死滅に関して補正する。
【０１３３】
実施例２２．ブタ肝臓の調達
ブタを、プロポフォールにより、前投与、挿管および麻酔して、仰臥位にする。腹部への正中切開を行う。肝臓への靱帯の付着を取り除く。門脈および肝動脈をカニューレ処置し、２リットルの冷却したヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸溶液(Essential Pharmaceuticals、 LLC)を流す。肝臓をブタから除去し、肝臓灌流回路に設置するまで、氷上にて４℃でヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸溶液に保管する。冷阻血時間は４５分から３時間の範囲で様々である。特定の実験において、ブタの肝臓を屠殺場から得てもよい。屠殺場から得たブタの肝臓に、失血している２分間以内に、ヘパリン（２０００Ｕ／Ｌ）を含むヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタル酸溶液を流す。
【０１３４】
実施例２３．血小板取り込み解析Ｉ
血小板を、蛍光緑色細胞質マーカーである、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）、で標識する。正常体温のブタ肝臓灌流システムを用いる。目的のノックアウトブタまたは野生型ブタ由来のブタ肝臓を、血小板の添加に先立ち２時間灌流する。およそ３，０００億個の血小板（非標識７０％、標識３０％）を、灌流システムに添加する。様々な所定の時点で、生検材料をブタ肝臓から取得する。生検材料を、共焦点顕微鏡により調べる。生検材料を、バイベル・パラーデ小体に特異的な染色剤で処理する。バイベル・パラーデ小体は、血小板および内皮細胞内で生じる。蛍光ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを行う。血小板はヒトまたはヒヒである。あるいは、共焦点顕微鏡観察の前に、生検材料を内皮細胞マーカーおよびリソソームマーカーで標識する。
【０１３５】
実施例２４．血小板取り込み解析II
血小板を、蛍光緑色細胞質マーカーである、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。正常体温のブタ肝臓灌流システムを用いる。目的のノックアウトブタまたは野生型ブタ由来のブタ肝臓を、血小板の添加に先立ち２時間灌流する。生検材料を、透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）により解析する。
【０１３６】
実施例２５．インビトロ血小板取り込み
初代肝臓類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）を、目的のブタ肝臓の類洞から単離する。初代野生型ブタＬＳＥＣは、５日間培養後に食作用能を失う；これらの実験は、３日目および４日目のＬＳＥＣで行う。ヒトまたはヒヒ血小板を、本明細書の他の部分に記載したように、ＣＦＳＥで標識する。単離したＬＳＥＣと、標識した血小板とを、共にインキュベートする。サンプルを共焦点顕微鏡観察により解析する。
【０１３７】
実施例２６．ＮＨＰにおける腎臓異種移植
レシピエント非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を、抗ＣＤ４／抗ＣＤ８（５０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１５４／抗ＣＤ２８ｄＡｂ、ＭＭＦおよびステロイドの単回投与で処置する。いくつかの研究において、タクロリムスを用いる（目標レベル８−１２）。アカゲザル(Macaca mulatta)を、ＮＨＰとして用いる。いくつかの実験において、アカゲザルは３−５歳および６ｋｇ未満であってよい。ノックアウトブタの腎臓（または野生型コントロールの腎臓）を、ＮＨＰレシピエントに移植する。サンプル（血液、尿、および腎臓生検サンプル）を、解析のために規定した時点で回収する。腎臓の機能、血清クレアチニン、異種抗体の存在と量(フローサイトメトリーおよびマルチパラメーターフローサイトメトリー)、サイトカイン分泌、末梢血液、尿および移植片生検材料からの転写プロファイル、異種移植片組織学的検査および抗ブタ抗体の開発（フローベース異種交差適合アッセイ）を続いて行う。ＣＭＡＨの欠失は、ＮＨＰにおける研究にとって有用でない。ＮＨＰ研究に対して、野生型ＣＭＡＨ遺伝子を有するブタを用いる（Ｇａｌ−／β４ＧａｌＮＴ２）。超音波ガイド針生検を、移植後２、５および１０週間目に行う。
【０１３８】
実施例２７．ＮＨＰの獣医による治療
ＮＨＰを個々のケージに入れ、清潔で適切な大きさの居住区を与える；１日２回餌を与え；動物ケア技術者が少なくとも１日２回チェックし、臨床獣医スタッフが１日１回チェックする。動物を採血または他の手順のために麻酔するたびに、身体検査を行う。
【０１３９】
実施例２８．ＮＨＰ静脈切開および組織サンプリング
ＮＨＰの静脈切開および組織サンプリング（例えば：採血、リンパ節生検および骨髄穿刺）を、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）またはテラゾール（４ｍｇ／ｋｇ）麻酔下のいずれかで、飢餓状態の動物に行う。ブプレノルフィン（６時間ごとに０．０１ｍｇ／ｋｇ）を、腎臓移植をうけている動物の術後鎮痛として、必要に応じて担当獣医により決定された場合に、投与する。例えば、ベースラインからの２５％の体重の減少；４日間の完全な食欲不振；主要臓器不全または治療に非応答性の症状、例えば呼吸困難、黄疸、尿毒症、難治性下痢症、自傷または持続性嘔吐、および即時介入（immediate intervention）に非応答性の手術合併症：出血、血管移植／循環不全、感染および創し開などであるが、これらに限定されない「不可逆的な重症疾患」について、動物をモニターする。 
【０１４０】
実施例２９．ブタの胚移植手術、静脈切開および摘出手順
胚移植手術：手術前に、挿管のためにＴＫＸ（テラゾール（５００ｍｇ）＋ケタミン（２５０ｍｇ）およびキシラジン（２５０ｍｇ）；５０ポンド当たり１ｃｃ、筋肉内）により雌ブタに麻酔をし、また、精密気化器を用いて排ガスを排除して、ＥＴチューブを通じた吸入によりイソフルランにより麻酔した。回復期の間、動物を少なくとも１５分に１回モニターし、バイタルサイン（体温、脈拍、呼吸速度および毛細血管の再充満時間）を評価して記録する。訓練された動物ケア技術者または獣医は、該動物を、自発的に胸骨臥位において自立できるまで、モニターする。担当獣医の承認により、動物を通常の居住エリアに返す。術後の鎮痛薬には、８〜１２時間ごとの０．０１−０．０５ｍｇ／ｋｇの筋肉内ブプレノルフィン投与、または、毎日の２−４ｍｇ／ｋｇの皮下投与が含まれる。胚移植のおよそ２６日後に、超音波を行い、雌ブタが食事で注意をそらしている間に、妊娠の成立を確認する。約１０日後に、２回目の超音波を行う。臨床上の困難が生じなければ、出生は自然分娩で生じる。帝王切開は、獣医スタッフが推奨した場合に行う。標準的な帝王切開プロトコルは、胚移植手術で用いられる一般的な麻酔プロトコルと共に用いられる。実験用子ブタを無菌状態にし、臍帯を消毒する。全ての子ブタは、出生後最初の数時間の間に、初乳をもらう。子ブタは、少なくとも７日齢まで、２４時間観察する。子ブタが乳を飲む能力を維持している間、子ブタをその母親から保護するために、出産クレート（Farrowing crate）を用いる。
【０１４１】
全ての静脈切開を、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）またはテラゾール（４ｍｇ／ｋｇ）麻酔下のいずれかで、飢餓状態の動物に行う。臓器摘出、最終外科手技は、挿管のための、必要に応じてペントタール（１０−２０ｍｇ／ｋｇ）を加える麻酔プロトコル（テラゾール（５００ｍｇ）＋ケタミン（２５０ｍｇ）＋キシラジン（２５０ｍｇ）；５０ポンド当たり１ｃｃ；筋肉内）、および、排ガス排除に影響を与える精密気化器を用いた、ＥＴチューブを通じた吸入によるイソフルランを用いる。ブタを生理食塩水で灌流後、心臓および他の組織／臓器を除去する。または、ブタを吸入麻酔薬で麻酔し、バルビツール酸誘導体（１００−１５０ｍｇ／ｋｇ）で処理して、両側の気胸術（bilateral pneumothorax）を行う。
【０１４２】
実施例３０．Ｔ細胞増殖応答に対する免疫抑制剤のＣＦＳＥ ＭＬＲ検討
アカゲザル由来のＰＢＭＣを、ＧＧＴＡ−／β４ＧａｌＮＴ２−ダブルノックアウトブタまたはコントロールブタ由来のブタＰＢＭＣとともにインキュベートする。ＣＦＳＥの希釈液を、Ｔ細胞サブセットにおけるＴ細胞増殖を評価するために用いる。
【０１４３】
実施例３１．腎臓の異種移植における免疫抑制剤の検討
レシピエントマカクは、免疫学的に成熟し（ＣＭＶ＋、ＬＣＶ＋、ＳＶ４０＋、＞４ｋｇ）、ＭＨＣおよび系統が規定されている。免疫抑制の候補（抗ＣＤ１５４ｄＡｂ、クローン５Ｃ８抗ＣＤ１５４）を、アカゲザルに投与する。レシピエントマカクを、移植に先立ち、Ｔ細胞除去（抗ＣＤ４／抗ＣＤ８、単回投与）、ＭＭＦ、ステロイドおよび免疫抑制の候補で処理する。腎臓の機能を、血清クレアチニンを用いて評価する。クレアチニンの増加、および／または、ＢＵＮ＞５．０ｍｇ／ｄｌもしくは１００ｍｇ／ｄｌはそれぞれ、負の結果と考えられる。超音波ガイド針生検材料を、移植後２、５および１０週間目に行う。マルチパラメーターフローサイトメトリー（Ｔ、Ｂおよび他の細胞サブセット）を用いた免疫表現型検査のために、移植前、および移植後毎週、末梢血液サンプルを回収する。サイトカイン分泌並びに転写プロファイルのエクスビボ検討を含む機能性アッセイは、規定した時点の末梢血液、尿および移植片生検材料である。末梢血液サンプルにおける、共刺激および共抑制の受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３であるがこれらに限定されない）の発現を評価してよい。
【０１４４】
本発明は、例示のために本明細書で説明される実施形態に限定されるのでなく、特許請求の範囲の範囲内にある全てを含む。例示的な実施形態を参照して本発明を記述しているが、本明細書で述べられる例示的な実施形態を記載しているいかなる限定または因子も、明示的に特許請求の範囲に挙げられているのでなければ、特許請求の範囲の意味に組み込まれることを意図していないことは、理解されるべきである。同様に、請求項の範囲内に入るために、本明細書に記載される発明の特定された利点または目的の、いずれかまたは全てを満たす必要はないことは、理解されるべきである。なぜなら、本発明は特許請求の範囲により規定されているためであり、また、本発明の固有の、および／または予期しない利点が、たとえ本明細書内で明示的に論じられていなくても、存在し得るためである。
【０１４５】
さらに、本明細書で引用される全ての参考文献は、本明細書で完全に説明されるかのように、その全体が、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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