(57)【要約】  本発明は、１つ以上の抗生物質の活性を阻害することができる２つ以上のタンパク質を含むハイブリッドタンパク質分子に関し、それらのタンパク質は、各々、異なる生化学的特性を有し、互いに結合している。そのハイブリッドタンパク性分子は、抗生物質によって引き起こされる重篤な下痢などの抗生物質の腸内副作用、および非経口抗生物質療法に続く院内感染を減少させるために、１つ以上の抗生物質の活性を阻害する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の抗生物質の活性を阻害する２つの酵素を含むハイブリッドタンパク質分子であって、前記酵素の一方はβ−ラクタマーゼであり、前記酵素の他方は、β−ラクタマーゼ、アミノグリコシドを阻害する酵素、フルオロキノロンを阻害する酵素、マクロライドを阻害する酵素、テトラサイクリンを阻害する酵素、またはリンコサミドを阻害する酵素のうちから選択される酵素であり、前記酵素は互いに結合されている、ハイブリッドタンパク質分子。
【請求項２】
互いに連結された２つのβ−ラクタマーゼを備えることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項３】
アミノグリコシドを阻害する前記酵素は、ホスホトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、またはアセチルトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項４】
フルオロキノロンを阻害する前記酵素は、アミノグリコシドＮ−アセチルトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項５】
マクロライドを阻害する前記酵素は、エリスロマイシンエステラーゼまたはエリスロマイシンホスホトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項６】
テトラサイクリンを阻害する前記酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性テトラサイクリンオキシドレダクターゼであることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項７】
リンコサミドを阻害する前記酵素は、リンコマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項８】
前記酵素の少なくとも一方の配列が、配列番号１と４０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項９】
前記酵素の少なくとも一方の配列が、配列番号２と４０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項１０】
前記酵素の少なくとも一方の配列が、配列番号３と４０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項１１】
前記酵素の少なくとも一方の配列が、配列番号４と４０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項１２】
前記酵素の少なくとも一方の配列が、配列番号５と４０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項１３】
前記酵素の少なくとも一方の配列が、配列番号６と４０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項１４】
前記酵素の少なくとも一方の配列が、配列番号７と４０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項１５】
前記酵素が、一本鎖タンパク質に融合されていることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項１６】
前記酵素が、架橋による共有結合により互いに連結されていることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子。
【請求項１７】
腸内細菌叢の変化の予防において使用するための、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子を含む、ヒトまたは獣医学的な使用のための医薬組成物。
【請求項１８】
院内感染の予防において使用するための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
抗生物質の投与に伴う下痢の予防において使用するための、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
経口投与用の剤形であることを特徴とする、請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
１つ以上の胃保護剤を含むことを特徴とする、請求項１７乃至２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
生きた非ヒト組換え生物において、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質分子を製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃腸管細菌叢における抗生物質の作用および耐性細菌株の選択に続く抗生物質の副作用の予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、非常に多くの非経口投与される抗生物質を、活性形態で、非修飾の活性形態で、または活性代謝物として胆汁に排出し得る。これらの抗生物質は回腸に再吸収されることにより門脈を介して肝臓に戻り、最終的には排泄され得る。この循環は腸肝循環と言われる。
【０００３】
消化管において非修飾の活性形態でまたは活性代謝物として排泄される場合、これらの抗生物質は、腸および結腸の正常な微生物叢を形成する細菌集団に対して選択圧を与えることがある。このような微生物の選択は、抗生物質によって誘発される急性下痢の発生、ならびに耐性細菌株の選択および拡散という２つの主な結果をもたらす。
【０００４】
抗生物質によって引き起こされる急性下痢の発症は、一般に、非経口の広域抗生物質で観察される。頻度および重症度は、治療期間、使用される抗生物質の活性スペクトルおよび投薬量を含む様々な要因によって決定される（非特許文献１）。抗生物質によって誘発される急性下痢は、それによって、アモキシシリンによる抗生物質療法を受けている全患者の約５〜１０％、アモキシシリン−クラブラン酸混合では１０〜２５％、ならびに第三世代のセファロスポリン、フルオロキノロン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシンおよびテトラサイクリンでは２〜５％で観察されている（非特許文献２；非特許文献３、非特許文献４；非特許文献５）。
【０００５】
抗生物質によって引き起こされる急性下痢の症例の大部分は良性であるが、すべての症例のうち１０〜２０％において重篤な大腸炎を伴うことがある。ほとんどの場合、この大腸炎は、ほとんどの抗生物質に耐性を持つ胞子形成性のグラム陽性嫌気性細菌であるクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の選択に続いている（非特許文献６；非特許文献７）。この細菌の病原性は、毒素Ａと毒素Ｂとの両方の生成に関連する。これらの毒素は、粘膜固有層における好中球の動員を伴う強烈な炎症反応、および最も重篤な形態では偽膜性大腸炎（結腸直腸粘膜の外観からそのように称される）を誘発する（非特許文献８）。偽膜性大腸炎による死亡率は、特に小児および高齢者において高い。これらの大腸炎は、２０１０年に米国において７２００人以上の死亡原因となった（非特許文献９）。クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）Ａ型、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔｒａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）など他の病原体は、抗生物質によって誘発される様々な重症度の急性下痢の原因となり得る（非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００６】
抗生物質が腸の微生物叢に与える選択圧もまた、環境中の耐性細菌の蔓延に寄与する。これらの微生物によって引き起こされる病院中の感染の大部分は、院内感染としても知られ、集中治療室および手術室中で特に一般的であり深刻である。特に、それらには、カテーテル感染、尿路感染、肺疾患および術後感染が含まれる。それらは、主に、グラム陰性腸内細菌、コアグラーゼ陽性または陰性ブドウ球菌、腸球菌およびカンジダ・アルビカンスによって引き起こされる（非特許文献１２）。
【０００７】
院内感染は重大な死因であり、大きな健康問題である。抗生物質治療の広範な使用に続く耐性細菌の出現は、これらの院内感染の治療を複雑にし、社会に相当なコストを突き付ける。欧州においては、院内感染は、毎年およそ２５，０００人の死亡の直接的原因であり、年間１５億ユーロを超える医療費と生産性の損失が推測される（非特許文献１３）。米国においては、毎年、約１７０万人の院内感染が、直接的または間接的に、約９９，０００人の死亡原因となっている（非特許文献１４）。
【０００８】
抗生物質、特にテトラサイクリンは、家畜および愛玩動物の治療で獣医学において広く使用されている。さらに、これらの抗生物質の使用は、家畜の成長および体重増加を助けるために米国において許可されている。当然ながら、この集中的な使用は、環境中の耐性細菌の拡散に関与する（非特許文献１５；非特許文献１６、非特許文献１７）。
【０００９】
β−ラクタム
β−ラクタムは、グラム陽性およびグラム陰性細菌の細胞壁の必須成分であるペプチドグリカンの形成に関与するトランスペプチダーゼおよびトランスグリコシラーゼを阻害する（非特許文献１８）。それらには、β−ラクタム環、ならびにそれらの薬物動態特性および抗菌スペクトルの有効性を改変する可変側鎖（例えば、第一、第二、第三および第四世代のセファロスポリン）がある（非特許文献１９）。このクラスは、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネムおよびモノバクタムを含む。
【００１０】
β−ラクタム系抗生物質は、最も一般的に処方されている抗菌剤である。それらは、様々なタイプの感染（例えば、耳、呼吸器および胃腸感染）のために臨床的に広く使用されている。いくつかの投与経路が使用され得るが、通常、病院で治療される重度の敗血症に対しては非経口経路が好ましい。それらは、アモキシシリン／クラブラン酸と、非定型肺炎の場合のマクロライドとの組合せなど、重篤な感染のための他のクラスの抗生物質と頻繁に組み合わせられる。
【００１１】
β−ラクタム抗生物質の集中的使用は、細菌耐性の出現を助けてきた。主なメカニズムは、β−ラクタマーゼの獲得であり、これはβ−ラクタムコアを加水分解することができる酵素である。現在まで、配列相同性（基質および阻害剤）に従いファミリーに分類され得る数百または数千もの異なるβ−ラクタマーゼが存在する。これらの酵素は、一般的に、それらの選択的な基質に従って分類される（ペニシリナーゼ、セファロスポリナーゼ、イミペネマーゼなど）。さらに、β−ラクタマーゼは、阻害剤に対して耐性を持つようになる、または最新のβ−ラクタムに対してそれらの作用スペクトルを広げるように進化している（非特許文献１９；非特許文献２０）。これらの阻害剤（クラブラン酸、スルバクタムなど）は、一般的に、β−ラクタムと同時に投与され、細菌性β−ラクタマーゼと不可逆的に結合する。
【００１２】
アンブラー（Ａｍｂｌｅｒ）の分類は、これらのβ−ラクタマーゼ酵素の巨大な多様性を示す。それらは、それらのヌクレオチド配列に従って、４つのファミリー（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）に分類される（非特許文献２１）。グループＡ、ＣおよびＤは触媒性セリンを有し、一方、グループＢは亜鉛依存性メタロ−β−ラクタマーゼを含む。
【００１３】
クラスＡのβ−ラクタマーゼは、ＴＥＭ型酵素（非特許文献２２）、ペニシリン耐性の祖先酵素、およびアミノペニシリン（例えば、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン）を含むいくつかのサブファミリーを含む。ＴＥＭ−３６は、ＩＲ−ＴＥＭであり、すなわち、クラブラン酸耐性のβ−ラクタマーゼである（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）；ＴＥＭ−３６すなわちＩＲＴ−７の識別子はラエイクリニック（Ｌａｈｅｙ  Ｃｌｉｎｉｃ）のサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｈｅｙ．ｏｒｇ／
Ｓｔｕｄｉｅｓ／ｔｅｍｔａｂｌｅ．ａｓｐ）上にある。クラブラン酸は、古典的β−ラクタマーゼ（ＴＥＭ−１）を獲得した細菌に対して抗生物質スペクトルを広げるために、アモキシシリンと共に臨床的に使用される。選択圧の下で、ＴＥＭは、現在よく特徴付けられているいくつかのアミノ酸を突然変異させることによって、阻害剤に対して徐々に耐性を持つようになる（非特許文献２５）。
【００１４】
クラスＡのβ−ラクタマーゼの中で、本発明者らは、セフォタキシマーゼを見出しており、これは、ＴＥＭから進化して第三世代のセファロスポリンにスペクトルを広げた酵素である（非特許文献２６）。例えば、酵素ＣＴＸ−Ｍ１６（タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ識別子：ＡＡＫ３２９６１）は、他のペニシリンと比較した場合、セフォタキシムを選択的に加水分解する（非特許文献２７）。
【００１５】
遺伝子ｂｌａＺによってコードされるＰＣ１酵素（タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ識別子：Ｐ００８０７）は、クラスＡのβ−ラクタマーゼ触媒血清である（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１）。コアグラーゼ陽性の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）およびメチＲバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）によって生成されるこの酵素は、メチシリンのβ−ラクタム環を加水分解する（非特許文献３２）。
【００１６】
アミノグリコシド
アミノグリコシドは、アミノシドとも呼ばれ、グリコシド架橋によって中央のアミノシクリトールコアに連結されたアミノ糖である。この中心コアの構造は、３つのグループ：ストレプトマイシン類（ストレプトマイシン）、デスオキシストレプタミン類（ｄｅｓｏｘｙｓｔｒｅｐｔａｍｉｎｓ）（カナマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン）、およびフォーチミシン類（ダクタマイシン（Ｄａｃｔａｍｉｃｉｎ））を区別するために使用される。
【００１７】
アミノグリコシドの理論上の抗生物質スペクトルは非常に広く、好気性のグラム陰性細菌（桿菌、球菌および球桿菌）、陽性または陰性のコアグラーゼブドウ球菌およびグラム陽性桿菌を含む。さらに、ストレプトマイシンはヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対して活性があり、アミカシンは非定型マイコバクテリア（マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）など）およびノカルディア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）に対して活性がある。アミノグリコシドは、β−ラクタムおよびバンコマイシンの相乗活性を有する。
【００１８】
アミノグリコシドは、消化管にほとんどまたは全く吸収されないので、通常、非経口投与される。それらは、主に、そのままの形態で、主として糸球体濾過によって尿中に排出され（投与された投薬量の８５〜９０％が２４時間以内に排出される）、腸肝循環を伴わずに胆汁中にはより少ない程度で排出される（抗生物質に準じて投与された投薬量の約０．５〜２％）（非特許文献３３）。このアミノグリコシドの胃排出は、耐性細菌の選択をもたらし、クロストリジウム・ディフィシレによる偽膜性大腸炎のわずかに増加したリスクにさらす（非特許文献７）。
【００１９】
アミノグリコシドの殺菌効果は、多数の病原体に対して速やかである。アミノグリコシドは、原核生物の３０Ｓリボソームサブユニットに固定され、細菌翻訳の正確さを変える（非特許文献３４）。ほとんどのアミノグリコシドは、解読部位（Ａ部位）において、３０ＳリボソームサブユニットのＲＮＡ成分である１６ＳリボソームＲＮＡと結合する。
【００２０】
細菌は、同じ細胞内に共存し得る３つの主なメカニズムによって、アミノグリコシドに
対する耐性を発現し得る（非特許文献３５）。第一の染色体メカニズムは、メチル化を介して、そのリボソーム標的である１６ＳリボソームＲＮＡに対するアミノグリコシドの親和性の低下をもたらす（非特許文献３６）。第二のメカニズムは、膜透過性の改変による細胞透過性不全（非特許文献３７）、または活性メカニズムによる細胞の外へのアミノグリコシド流出（非特許文献１）に基づく。最後に、酵素不活性化は、最も頻繁に観察されるメカニズムである。これらの酵素をコードする遺伝子は、プラスミドおよび／またはトランスポゾンによって担持される。それによって、その耐性は移動可能であり、多くの場合、病院で蔓延する。これらの酵素は、様々な化学基を有するアミノグリコシドの不可逆的結合を触媒し、３つのクラスに分類される（非特許文献３８；非特許文献３５）。ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）はＡＴＰまたはＧＴＰのリン酸基の転移反応を触媒し、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＡＮＴ）はアデニル基の転移を可能にして基質としてＡＴＰを使用し、アセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＣ）は基質としてアセチル−ＣｏＡを用いてアセチル基を転移する。各々の酵素クラスは、アミノグリコシドの置換基に従って異なるサブクラスを有する。同じ酵素は、同一の分子部位を有するいくつかのアミノグリコシドを不活性化することができる。
【００２１】
ＡＡＣ（６’）−Ｉｂ−ｃｒ（タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ識別子：ＡＢＣ１７６２７．１）は、腸内細菌によって天然に生成されるＮ−アセチルトランスフェラーゼファミリー由来の酵素である。これは、６’位にある−ＮＨ２基のアセチル化を触媒し、この酵素にサブクラスＡＡＣ（６’）における他の酵素と同一の耐性プロファイルを与える（非特許文献３９）。ＡＡＣ（６’）ファミリーにある他の酵素と同様に、ＡＡＣ（６’）Ｉｂ−ｃｒは、アミカシンと、ゲンタマイシンのＣ１ａおよびＣ２エナンチオマーとを含む広範なアミノグリコシドに対して活性があるが、ゲンタマイシンのＣ１エナンチオマーに対しては非常に低い活性を有する（非特許文献３９）。ＡＡＣ（６’）−Ｉｂ−ｃｒは、おそらくＴｒｐ１０２ＡｒｇおよびＡｓｐ１７９Ｔｙｒ残基の突然変異による酵素ＡＡＣ（６’）−Ｉｂの進化によるものである。これは、フルオロキノロンであるシプロフロキサシンに対する酵素活性の獲得をもたらし、その活性はノルフロキサシンおよびペフロキサシンについて相当低い。
【００２２】
フルオロキノロン
フルオロキノロン（例えば、ノルフロキサシン、オフロキサシン、シプロフロキサシンおよびペフロキサシン）は、化学修飾、特にフッ素原子の付加によって、キノロンに由来する合成殺菌性抗生物質の大きなクラスを形成する。
【００２３】
フルオロキノロンは、抗生物質ごとに異なる広域スペクトルの抗生物質である。フルオロキノロンのスペクトルは、グラム陰性桿菌（サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、エシェリキア属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ））、グラム陽性球菌（陽性および陰性コアグラーゼブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌）、グラム陰性球菌（淋菌、髄膜炎菌）およびグラム陽性桿菌を含む。
【００２４】
フルオロキノロンの組織分布は、脳脊髄液、前立腺、骨および胆汁においてさえも優れている。それにより、フルオロキノロンは、組織感染（髄膜炎、肺炎、骨および関節感染、上部尿路の感染、または前立腺感染など）の場合に広く使用されている。しかしながら、フルオロキノロンの血清レベルは、しばしば低く、ある種の細菌のＭＩＣ（最小発育阻止濃度）よりも低く、細菌耐性の出現に有利である。
【００２５】
フルオロキノロンの排出は、使用される製品に依存する。ペフロキサシンについては、主に肝臓であるが、オフロキサシンおよび他のフルオロキノロンについては、主に腎臓で
ある。それらの胆管および消化器系の排出は、クロストリジウム・ディフィシレによる、特に、とりわけ有毒な菌株ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７による偽膜性大腸炎のリスクの主な原因となる（非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２）。
【００２６】
フルオロキノロンは、ＤＮＡジャイレースと細菌トポイソメラーゼＩＩおよびＩＶとを標的とする。それらは、これらの酵素と細菌ＤＮＡとの間で不可逆的な複合体を形成し、ＤＮＡ複製を阻止し、その細菌の死を引き起こす。
【００２７】
４つのキノロン耐性メカニズムが特徴付けられている（非特許文献４４）：（ｉ）抗生物質の細胞内濃度の低下を引き起こす、流出ポンプの活性の増加（非特許文献４３）、（ｉｉ）ＤＮＡジャイレースまたはトポイソメラーゼＩＶに結合するタンパク質の生成、それらの保護ならびにフルオロキノロンの固定化（非特許文献４４）、（ｉｉｉ）これらの標的に対するフルオロキノロンの親和性の減少による高レベル耐性の原因となるＤＮＡジャイレースまたはトポイソメラーゼＩＶの修飾（非特許文献４４）、（ｉｖ）最後に、シプロフロキサシン、ならびにより少ない程度でノルフロキサシンおよびペフロキサシンの修飾を異化することができるアミノグリコシドＮ−アセチルトランスフェラーゼであるＡＡＣ（６’）Ｉｂ−ｃｒの生成（タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ識別子：ＡＢＣ１７６２７．１）（非特許文献３９）。
【００２８】
頻度が急速に増加するこれらの耐性のメカニズムは、コアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌、β−溶血性連鎖球菌および腸球菌を含む多数の細菌種において同定されている（非特許文献４４）。
【００２９】
マクロライド
マクロライドは、比較的限られた数の典型（例えば、エリスロマイシン、スピラマイシン、ジョサマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、アジスロマイシンおよびテリトロマイシン）を有する天然および半合成の抗生物質の均質なファミリーである。
【００３０】
マクロライドの活性スペクトルは比較的広く、好気性グラム陽性球菌（連鎖球菌、肺炎球菌、腸球菌および黄色ブドウ球菌）および嫌気性グラム陰性球菌と、グラム陰性球菌と、ピロリ菌などのグラム陰性桿菌と、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ・ウレアリチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｌａｍｙｄｉａｅ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ならびにクラミジア・トラコマチス（Ｃｌａｍｙｄｉａｅ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）などの厳密な細胞内複製を伴う様々な細菌とを含む。しかしながら、腸内細菌は、それらの外側細胞膜がマクロライドなどの疎水性分子の通過を妨げるので、マクロライドに対して本質的に耐性を持つ。
【００３１】
マクロライドは、脳脊髄液、脳および尿を除いて、体内に広く分布される。排出は、主に胆汁の排出であり、シトクロムＰ４５０による代謝後である。マクロライドの投与は、クロストリジウム・ディフィシレの選択に続く偽膜性大腸炎のリスク増加と関連している（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【００３２】
マクロライドは、サイトＰで原核生物リボソームの５０Ｓサブユニットと可逆的に結合する阻害剤である。それにより、サイトＰからサイトＡへのペプチジル−ｔＲＮＡ複合体（トランスファーＲＮＡ）の転移および解離を阻止し、それによりペプチド鎖伸長を妨げる（非特許文献４５）。
【００３３】
マクロライドに対する３つの耐性メカニズムが知られている（非特許文献４６；非特許
文献４７）：（ｉ）５０ＳリボソームＲＮＡを形成している細菌の２３ＳリボソームＲＮＡのメチル化または突然変異による標的の変化。この耐性メカニズムは、最も頻繁に遭遇するものであり、マクロライド、リンコサミドおよびストレプトグラミンＢである（非特許文献４８）。（ｉｉ）細胞内濃度の低下をもたらす、抗生物質を細胞外に漏出する細胞ポンプによる生成、（ｉｉｉ）リボソームに対するマクロライドの親和性が大きく低下するような、マクロライドを修飾する酵素（エステラーゼエリスロマイシンおよびホスホトランスフェラーゼエリスロマイシン）による不活性化。このタイプの耐性はまた、移動性遺伝要素によって伝達される。
【００３４】
エリスロマイシンエステラーゼ酵素は、マクロラクトンコアの加水分解によってマクロライドを不活性化する。これらの酵素の大部分は、ｅｒｅＡ（非特許文献４９）およびｅｒｅＢ（非特許文献５０）の２つのサブクラスに属する。酵素ｅｒｅＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ識別子：Ｐ０５７８９．１）は非常に広域なスペクトルを有する（エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシンおよびアジスロマイシン）が、テリトロマイシンは加水分解に耐性を持つ（非特許文献５１）。
【００３５】
テトラサイクリン
サイクリンまたはテトラサイクリンは、テトラサイクリン（例えば、クロロテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン）に由来する殺菌性抗生物質のファミリーである。これらの分子は、４つの縮合環を有するという特徴を有し、したがってその名称を有する。
【００３６】
テトラサイクリンの活性スペクトルは、多数の好気性および嫌気性のグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に及ぶ。テトラサイクリンは、マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｅｓ）トレポネーマ（ｔｒｅｐｏｎｅｍｅ）、およびいくつかの原虫（バベシア・ディバージエンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、タイレリア・パルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ
ｐａｒｖａ））などの非在来型病原菌に対しても活性がある。マイコバクテリア、および腸内細菌科のプロテウス、およびシュードモナスは、天然で耐性を持つ。
【００３７】
大部分のテトラサイクリンは、クロロテトラサイクリンを除いて、活性形態で糸球体濾過によって除去される。また、テトラサイクリンは、腸肝循環を伴う胆汁中に排出される。テトラサイクリンの使用はまた、クロストリジウム・ディフィシレの選択に続く偽膜性大腸炎のリスクの増加と関連している（非特許文献２；非特許文献３、非特許文献４；非特許文献５）。
【００３８】
サイクリンファミリー由来の抗生物質は、リボソーム３０ＳサブユニットのサイトＡのアミノアシル−ｔＲＮＡの固定化を阻害し、それにより翻訳を阻害する（非特許文献５２）。少なくとも３つの耐性のメカニズムが同定されている：（ｉ）テトラサイクリンの細胞内濃度の低下を誘導する、流出タンパク質の発現、（ｉｉ）テトラサイクリンの結合を妨げる、分子標的の酵素修飾、（ｉｉｉ）ＮＡＤＰＨ依存性テトラサイクリンオキシドレダクターゼであるＴｅｔＸ（タンパク質のＧｅｎＢａｎｋ識別子：ＡＡＡ２７４７１．１）（非特許文献５３）による不活性化。この酵素は、すべてのテトラサイクリンに対して細菌耐性を誘導する。
【００３９】
リンコサミド
リンコサミド（リンコマイシンおよびその半合成誘導体クリンダマイシン）は、その化学構造はマクロライドと異なるものの類似の作用様式を有する静菌性抗生物質であり、スペクトグラミン（ｓｐｅｃｔｏｇｒａｍｉｎ）ＢとともにＭＬＳ（マクロライド、リンコ
サミドおよびストレプトグラミン）と呼ばれる単一ファミリーにグループ化されている。
【００４０】
リンコサミドの作用スペクトルは、グラム陽性細菌の大部分（例えば、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ、Ｂ型ブドウ球菌、分類できないブドウ球菌、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ））をカバーするが、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）などのいくつかの例外があり、かつ、非常に多数の嫌気性細菌をカバーするが（例えば、アクチノミセス、バクテロイデス、フソバクテリウム、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ））、クロストリジウム・ディフィシレの注目すべき例外がある。ほとんどのグラム陰性細菌は、ほんのわずかな例外（例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、カンピロバクター、クラミジア、ヘリコバクターおよびレジオネラ）を除いて耐性を持つ。
【００４１】
リンコサミドは、主に、腎臓によって排出され、腸肝循環を伴う胆汁中にはより少ない程度で排出される。胃腸管からのそれらの排出およびそれらの抗菌活性は、クロストリジウム・ディフィシレ選択による高頻度の偽膜性大腸炎の主な原因となる。
【００４２】
マクロライドと同様に、リンコサミドは、サイトＡおよびサイトＰにおいて、５０Ｓリボソームサブユニットと可逆的に結合することによって細菌翻訳を阻害する（非特許文献５４）。リンコサミドを用いて獲得された３つの耐性メカニズムが知られている（非特許文献４６）：（ｉ）５０ＳリボソームＲＮＡを構成している細菌の２３ＳリボソームＲＮＡのメチル化または突然変異による標的の変化。この耐性メカニズムは、最も頻繁に遭遇するものであり、マクロライド、リンコサミドおよびＢストレプトグラミンに共通する（非特許文献４８）、（ｉｉ）細胞内濃度の低下を引き起こす、細胞外へ抗生物質を流出させるポンプの細菌による発現、（ｉｉｉ）リンコサミドの分子標的に対する親和性を減少させるリンコサミドの酵素不活性化。
【００４３】
リンコサミドを不活性化することができる酵素は、ブドウ球菌におけるリンコマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼＩｎｅ（Ａ）またはｌｉｎ（Ａ）、エンテロコッカス・フェシウムにおけるＩｎｕ（Ｂ）またはｌｉｎ（Ｂ）、および嫌気性生物におけるｌｉｎＢ様のファミリーに属する（非特許文献５５；非特許文献５６）。例えば、酵素Ｉｎｕ（Ｂ）（タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬｉｃａｔｉｏｎ：Ｑ９ＷＶＹ４）は、リンコマイシンおよびクリンダマイシンの３位のヒドロキシル基に対するアデニル残基の転移を触媒する（非特許文献５６）。
【００４４】
これらの抗生物質の副作用への対抗
先行技術は、腸において以前に報告された有害反応を低減することを目的とする、抗生物質の阻害剤に精通している。これらの阻害剤は、本質的にβ−ラクタムを標的とし、主に、腸管内におけるそれらの拡散のために経口投与されるβ−ラクタマーゼからなる。
【００４５】
特許文献１は、医療用途、医療処置および医薬製剤に関する。本発明は、非経口的に投与されるβ−ラクタムの作用を標的とすることができ、β−ラクタマーゼなどの酵素を、抗生物質と別にまたは同時に、経口的に投与することにより、消化管における抗生物質の一部の不活性化に起因した有害反応を減少させることができる。これは抗生物質の分解をもたらす。
【００４６】
特許文献２は、β−ラクタムとβ−ラクタマーゼ阻害剤とを組み合わせた抗生物質治療
に伴う腸における副作用を減少させるために、同様の方法で、クラスＡのβ−ラクタマーゼ、より具体的にはＰ１Ａ酵素を使用している。
【００４７】
Ｐ１Ａのβ−ラクタマーゼの有効性は、臨床前および臨床的に評価された。この酵素は、アミノペニシリン（例えば、アモキシシリン）およびウレイドペニシリン（例えば、ピペラシリン）を加水分解するが、β−ラクタム阻害剤に感受性がある。アンピシリンの非経口投与と同時の、イヌにおける経口投与は、用量依存的に、これらの動物の空腸内腔において検出されたアンピシリンの量を減少させた。さらに、Ｐ１Ａのβ−ラクタマーゼの存在は循環中に検出されず、アンピシリンの血清濃度は有意に改変されなかった（非特許文献５７；非特許文献５８）。ピペラシリンの非経口投与を受けたマウスにおけるこの酵素の経口投与は、糞便において、この抗生物質に対する耐性微生物（ＶＲＥ−エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ））の数を非常に有意に減少させた（非特許文献５９；非特許文献６０）。
【００４８】
最後に、Ｐ１Ａのβ−ラクタマーゼの経口投与が、アンピシリンの静脈内投与後に健常者においてアンピシリン耐性の腸内細菌科の分離菌の数を減少させるとともに、他のクラスの抗生物質に耐性を持つ、特にテトラサイクリンに耐性を持つ腸内細菌科の分離菌の数を減少させたことが、臨床試験によって実証された（非特許文献６１）。
【００４９】
β−ラクタマーゼの他のクラスに属する組換えβ−ラクタマーゼ酵素も開発されている。特許文献３は、カルバペネムを受けている患者において腸における副作用を減少させるためのメタロ−β−ラクタマーゼ変異体およびその合成を記載している。
【００５０】
先行技術は、腸におけるこれらの酵素の送達を標的とするための剤形も含む。特許文献４は、エリスロマイシンエステラーゼなどのマクロライドを阻害することができる酵素の、結腸に限定された送達のための経口投与用の多粒子剤形を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００５１】
【特許文献１】欧州特許第０６７１９４２号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第２０８６５７０号明細書
【特許文献３】欧州特許第２０３８４１１号明細書
【特許文献４】仏国特許第２８４３３０３号明細書
【非特許文献】
【００５２】
【非特許文献１】アイルズ（Ａｉｒｅｓ）、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、１９９９年
【非特許文献２】ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、１９９４年
【非特許文献３】バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）、１９９６年
【非特許文献４】ホゲナウアー（Ｈｏｇｅｎａｕｅｒ）、ハンマー（Ｈａｍｍｅｒ）ら、１９９８年
【非特許文献５】ウィストロム（Ｗｉｓｔｒｏｍ）、ノルビー（Ｎｏｒｒｂｙ）ら、２００１年
【非特許文献６】ガーディング（Ｇｅｒｄｉｎｇ）、１９８９年
【非特許文献７】アナンド（Ａｎａｎｄ）、バシェイ（Ｂａｓｈｅｙ）ら、１９９４年
【非特許文献８】ケリー（Ｋｅｌｌｙ）、ポトウラキス（Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ）ら、１９９４年
【非特許文献９】シェリー（Ｓｈｅｒｒｙ）、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、２０１２年
【非特許文献１０】スパークス（Ｓｐａｒｋｓ）、カーマン（Ｃａｒｍａｎ）ら、２００１年
【非特許文献１１】ゴルキューイシツ（Ｇｏｒｋｉｅｗｉｃｚ）、２００９年
【非特許文献１２】リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、２０００年
【非特許文献１３】ＥＣＤＣ／ＥＭＥＡ合同作業部会（Ｊｏｉｎｔ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）、２００９年
【非特許文献１４】クレベンス（Ｋｌｅｖｅｎｓ）、エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、２００７年
【非特許文献１５】米国医学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１９９８年
【非特許文献１６】食品動物における薬物使用に関する委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ａｎｉｍａｌｓ）、１９９９年
【非特許文献１７】ジョージタウン大学食品栄養政策センター（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｐｏｌｉｃｙ）、１９９９年
【非特許文献１８】ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）、２０００年
【非特許文献１９】ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）、２００５年
【非特許文献２０】ドローズ（Ｄｒａｗｚ）およびボノモ（Ｂｏｎｏｍｏ）、２０１０年
【非特許文献２１】アンブラー（Ａｍｂｌｅｒ）、１９８０年
【非特許文献２２】ブッシュ（Ｂｕｓｈ）およびヤコビ（Ｊａｃｏｂｙ）、１９９７年
【非特許文献２３】ゾウ（Ｚｈｏｕ）、ボードン（Ｂｏｒｄｏｎ）ら、１９９４年
【非特許文献２４】ヘンケル（Ｈｅｎｑｕｅｌｌ）、チャナル（Ｃｈａｎａｌ）ら、１９９５年
【非特許文献２５】チャイビ（Ｃｈａｉｂｉ）、シロット（Ｓｉｒｏｔ）ら、１９９９年
【非特許文献２６】サルバーダ（Ｓａｌｖｅｒｄａ）、デ  ヴィッサー（Ｄｅ  Ｖｉｓｓｅｒ）ら、２０１０年
【非特許文献２７】ボンネット（Ｂｏｎｎｅｔ）、デュトーア（Ｄｕｔｏｕｒ）ら、２０１０年
【非特許文献２８】アンブラー（Ａｍｂｌｅｒ）、１９７５年
【非特許文献２９】ノット−ハンジカール（Ｋｎｏｔｔ−Ｈｕｎｚｉｋｅｒ）、ウェーリー（Ｗａｌｅｙ）ら、１９７９年
【非特許文献３０】ケマル（Ｋｅｍａｌ）およびノオウレス（Ｋｎｏｗｌｅｓ）、１９８１年
【非特許文献３１】ハーツバーグ（Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇ）およびモルト（Ｍｏｕｌｔ）、１９８７年
【非特許文献３２】ノビック（Ｎｏｖｉｃｋ）、１９６３年
【非特許文献３３】レロイ（Ｌｅｒｏｙ）、ハンバート（Ｈｕｍｂｅｒｔ）ら、１９７８年
【非特許文献３４】ポエルスガード（Ｐｏｅｈｌｓｇａａｒｄ）およびドートワイト（Ｄｏｕｔｈｗａｉｔｅ）、２００５年
【非特許文献３５】ラミレツ（Ｒａｍｉｒｅｚ）およびトルマスキー（Ｔｏｌｍａｓｋｙ）、２０１０年
【非特許文献３６】ドイ（Ｄｏｉ）およびアラカワ（Ａｒａｋａｗａ）、２００７年
【非特許文献３７】ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）、１９８１年
【非特許文献３８】ショー（Ｓｈａｗ）、ラザー（Ｒａｔｈｅｒ）ら、１９９３年
【非特許文献３９】ロビクセク（Ｒｏｂｉｃｓｅｋ）、ストラヒルヴェビッツ（Ｓｔｒａｈｉｌｅｖｉｔｚ）ら、２００６年
【非特許文献４０】ヴァーダカス（Ｖａｒｄａｋａｓ）、コンスタンテリア（Ｋｏｎｓｔａｎｔｅｌｉａｓ）ら、２０１２年
【非特許文献４１】デスパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、パスプレチ（Ｐａｓｕｐｕｌｅｔｉ）ら、２０１３年
【非特許文献４２】スリミングス（Ｓｌｉｍｉｎｇｓ）およびリレイ（Ｒｉｌｅｙ）、２０１３年
【非特許文献４３】モリタ（Ｍｏｒｉｔａ）、コダマ（Ｋｏｄａｍａ）ら、１９９８年
【非特許文献４４】ロビクセク（Ｒｏｂｉｃｓｅｋ）、ヤコビ（Ｊａｃｏｂｙ）ら、２００６年
【非特許文献４５】テンソン（Ｔｅｎｓｏｎ）、ロフマール（Ｌｏｖｍａｒ）ら、２００３年
【非特許文献４６】ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、ストクリッフェ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）ら、１９９９年
【非特許文献４７】ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、２００８年
【非特許文献４８】ワイズブルム（Ｗｅｉｓｂｌｕｍ）、１９９５年
【非特許文献４９】オウニッシ（Ｏｕｎｉｓｓｉ）およびコールバリン（Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ）、１９８５年
【非特許文献５０】アーサー（Ａｒｔｈｕｒ）、オートシェアー（Ａｕｔｉｓｓｉｅｒ）ら、１９８６年
【非特許文献５１】モラー（Ｍｏｒａｒ）、ペンジェリー（Ｐｅｎｇｅｌｌｙ）ら、２０１２年
【非特許文献５２】チョプラ（Ｃｈｏｐｒａ）およびロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、２００１年
【非特許文献５３】スペール（Ｓｐｅｅｒ）、ベドズキー（Ｂｅｄｚｙｋ）ら、１９９１年
【非特許文献５４】ツー（Ｔｕ）、ブラハ（Ｂｌａｈａ）ら、２００５年
【非特許文献５５】レクレアク（Ｌｅｃｌｅｒｃｑ）、ブリソン−ノエル（Ｂｒｉｓｓｏｎ−Ｎｏｅｌ）ら、１９８７年
【非特許文献５６】ボズドガン（Ｂｏｚｄｏｇａｎ）、ベレゾウガ（Ｂｅｒｒｅｚｏｕｇａ）ら、１９９９年
【非特許文献５７】ハーモイネン（Ｈａｒｍｏｉｎｅｎ）、ヴァーリ（Ｖａａｌｉ）ら、２００３年
【非特許文献５８】ハーモイネン（Ｈａｒｍｏｉｎｅｎ）、メンツラ（Ｍｅｎｔｕｌａ）ら、２００４年
【非特許文献５９】スチーフェル（Ｓｔｉｅｆｅｌ）、パルツ（Ｐｕｌｔｚ）ら、２００３年
【非特許文献６０】メンツラ（Ｍｅｎｔｕｌａ）、ハーモイネン（Ｈａｒｍｏｉｎｅｎ）ら、２００４年
【非特許文献６１】ターカネン（Ｔａｒｋｋａｎｅｎ）、ヘイノネン（Ｈｅｉｎｏｎｅｎ）ら、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５３】
従来技術の解決策は、１種類の抗生物質だけを標的とする酵素である、β−ラクタムを分解するβ−ラクタマーゼ、またはマクロライドを阻害するエリスロマイシンエステラーゼを使用している。
【００５４】
複数の異なる抗生物質が、一般的に、病院の患者に使用され、同じ患者に組み合わされることさえある。単一のクラスの抗生物質の阻害は、耐性細菌株の出現に対して控えめなまたは最低限の影響を及ぼすだけである。
【００５５】
例として、グラム陰性桿菌による重篤な感染は、第三世代のセファロスポリンとアミノグリコシドとの組合せを用いて治療されることが多いが、一方、非定型肺炎は、アモキシシリン−クラブラン酸とマクロライドまたはテトラサイクリンとの組合せを用いて容易に治療される。
【００５６】
先行技術に記載されている抗生物質阻害剤は、単一のクラスの抗生物質に向けられているため、異なるクラスの抗生物質が同時に使用される環境、特に病院における耐性細菌株の出現の予防に有効ではない。
【課題を解決するための手段】
【００５７】
本発明は、その最も広く受け入れられているという意味において、１つ以上の抗生物質の活性を阻害することができる２つ以上のタンパク質を含むハイブリッドタンパク質分子を提供することによって、従来技術の欠点を克服することを提案する。各々のタンパク質は、異なる生化学的性質を有し、該タンパク質は関連している。一実施形態において、１つ以上の抗生物質の活性を阻害することができる上記タンパク質は、共有結合で互いに連結されている。
【００５８】
本発明によるハイブリッドタンパク質分子は、１つ以上の抗生物質の活性を阻害して、抗生物質の腸内副作用、例えば、抗生物質によって引き起こされる急性下痢と、非経口による抗生物質の投与に続く院内感染とを減少させる。
【００５９】
本発明は、従来技術における解決策と比較して、より広い作用スペクトルを有することが理解される。
好ましくは、本発明のハイブリッドタンパク質分子は、経口投与される。本発明によるハイブリッドタンパク質分子は、多数のクラスの抗生物質、特に臨床診療において最も一般的に使用される組合せを阻害することができるタンパク質を含み得る。したがって、単一のハイブリッドタンパク質分子の投与がいくつかの抗生物質を標的とすることができ、それによって処方される製品の数を減少させる。
【００６０】
ハイブリッドタンパク質分子とは、２つ以上のポリペプチド鎖の人工的な組み合わせによって形成されるハイブリッドタンパク質を意味する。
抗生物質活性の阻害とは、考慮される抗生物質の生物学的活性の低下または抑制をもたらす全てのプロセスを意味する。これは、限定されないが、特異的な方法で（例えば、モノクローナル抗体を用いて、もしくはモノクローナル抗体の断片を用いて）もしくは非特異的な方法で（例えば、吸着によって）別の分子に抗生物質が結合すること、化学基の酵素的付加もしくは非酵素的付加によって抗生物質を修飾すること、または抗生物質もしくは非抗生物質メカニズムによって抗生物質を加水分解することを含む。
【００６１】
有利には、タンパク質の少なくとも一方は、１つ以上の抗生物質の活性を阻害することができる酵素である。
別の実施形態において、各々のタンパク質は、１つ以上の抗生物質の活性を選択的に阻害することができる酵素である。
【００６２】
有利には、各タンパク質は、複数の異なる抗生物質の活性を選択的に阻害する。
本発明の別の実施形態において、ハイブリッドタンパク質分子は１つ以上の抗生物質の活性を阻害することができる２つ以上のタンパク質を含み、各々の酵素は異なる生化学的
特性を有し、該酵素は互いに共有結合される。
【００６３】
各々の酵素は、２つの異なる抗生物質を選択的に分解することが理解される。
本発明は、予期せぬことに、上記で定義されたハイブリッドタンパク質分子が、それらを形成するタンパク質のそれぞれの機能的活性を合わせており、高い選択圧を受ける病院環境におけるそれらの作用スペクトルの拡大と有効性の増強とをもたらすことを実証する。
【００６４】
１つ以上の抗生物質を不活性化するいくつかのタイプのタンパク質がハイブリッドタンパク質分子を形成するために使用されてもよく、モノクローナル抗体の断片（例えば、一価もしくは二価のＳｃＦｖ）、加水分解酵素、または他のタイプの修飾を触媒する酵素を含む。
【００６５】
有利には、本発明によるハイブリッドタンパク質分子は、抗生物質、好ましくはβ−ラクタム、アミノグリコシド、フルオロキノロン、マクロライド、テトラサイクリンおよび／またはリンコサミドから選択される抗生物質の活性を阻害することができる１つ以上のタンパク質からなる。好ましくは、ハイブリッドタンパク質分子中の各々のタンパク質は、異なる抗生物質の活性を阻害する。一実施形態において、ハイブリッドタンパク質分子は、同じクラスに属する抗生物質の活性を阻害することができる２つのタンパク質を含む。
【００６６】
有利には、ハイブリッドタンパク質中の構成タンパク質の少なくとも一方の配列は、配列番号１〜配列番号７と４０％以上のタンパク質配列相同性を有する。この配列相同性は、標準的な計算パラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷ２またはＣＬＵＳＴＡＬＯＭＥＧＡソフトウェアの使用により決定される（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ら、１９９４年；ラーキン（Ｌａｒｋｉｎ）、ブラックシールド（Ｂｌａｃｋｓｈｉｅｌｄｓ）ら、２００７年）。好ましくは、この配列相同性は、配列番号１〜配列番号７と５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上である。
【００６７】
ハイブリッドタンパク質分子の構成タンパク質または酵素は、０個、１個またはいくつかのグリコシル化を含んでもよい。
一実施形態において、タンパク質または酵素は、単一のモノカテナリータンパク質へと合わせられる。
【００６８】
好ましい実施形態において、ハイブリッドタンパク質分子は、１つ以上の抗生物質の活性を阻害する２つの酵素を含み、該酵素の１つはβ−ラクタマーゼであり、該酵素の１つは、β−ラクタマーゼ、アミノグリコシドを阻害する酵素、フルオロキノロンを阻害する酵素、マクロライドを阻害する酵素、テトラサイクリンを阻害する酵素、またはリンコサミドを阻害する酵素のうちから選ばれる酵素であり、これらの酵素は互いに結合している。
【００６９】
ハイブリッドタンパク質は以下を含んでもよいことが理解される：
−  互いに結合している２つのβ−ラクタマーゼ酵素；または
−  相互接続された、β−ラクタマーゼのうちから選択される酵素およびアミノグリコシドを阻害する酵素であって、アミノグリコシドを阻害する該酵素はホスホトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、もしくはアセチルトランスフェラーゼである；または
−  相互接続された、β−ラクタマーゼから選択される酵素およびフルオロキノロンを阻害する酵素であって、フルオロキノロンを阻害する該酵素はアミノグリコシドＮ−アセチルトランスフェラーゼである；または
−  相互接続された、β−ラクタマーゼのうちから選択される酵素およびマクロライドを阻害する酵素であって、マクロライドを阻害する該酵素はエリスロマイシンエステラーゼもしくはエリスロマイシンホスホトランスフェラーゼである；または
−  相互接続された、β−ラクタマーゼのうちから選択される酵素およびテトラサイクリンを阻害する酵素であって、テトラサイクリンを阻害する該酵素はＮＡＤＰＨ依存性テトラサイクリンオキシドレダクターゼである；または
−  相互接続された、β−ラクタマーゼのうちから選択される酵素およびリンコサミドを阻害する酵素であって、リンコサミドを阻害する該酵素はリンコマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼである。
【００７０】
本発明者らは、予想外におよび驚くべきことに、標的抗生物質に対するそのハイブリッドタンパク質分子の効力が、単独で摂取された、それを含む酵素と同等であることを見出した。
【００７１】
これらのハイブリッドタンパク質はまた、複数のタンパク質構成成分のそれぞれのリーディングフレームの直接的な融合によって、あるいは１つ以上のアミノ酸からなるアダプターをコードするヌクレオチド配列によって得られた単一のリーディングフレームの翻訳から生じる単一のタンパク質鎖として人工的に得ることができる。不活性であり特異的な生物学的作用を有さないことが知られたこうしたアダプターは、フレキシブル、セミリジッド、またはリジッドであり得る（チェン（Ｃｈｅｎ）、ザロ（Ｚａｒｏ）ら、２０１３年）。
【００７２】
別の実施形態によれば、タンパク質または酵素は、共有結合または架橋によって互いに連結される。
これらのハイブリッドタンパク質はまた、化学薬剤（チェン（Ｃｈｅｎ）、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、２０１３年）、酵素触媒（パグイリガン（Ｐａｇｕｉｒｉｇａｎ）およびビーベ（Ｂｅｅｂｅ）、２００７年）、紫外光への曝露（ファンシー（Ｆａｎｃｙ）およびコダデック（Ｋｏｄａｄｅｋ）、１９９９年）、または共有結合の形成をもたらす任意の他の方法を用いた架橋によって人工的に得ることができる。あるいは、このようなハイブリッドタンパク質は、例えば（ストレプト）アビジン／ビオチン複合体などの高親和性リガンドによって非共有結合的に１つ以上のタンパク質のサブユニットを集合させることにより得ることができる（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）、リン（Ｌｉｎ）ら、２０００年；リン（Ｌｉｎ）、パーゲル（Ｐａｇｅｌ）ら、２００６年；パーゲル（Ｐａｇｅｌ）、リン（Ｌｉｎ）ら、２００６年）。
【００７３】
別の実施形態によれば、本発明は、腸内細菌叢の変化の予防に使用するための本発明によるハイブリッドタンパク質分子を含む、ヒトまたは獣医学的使用のための医薬組成物を提供する。
【００７４】
有利には、本発明は、院内感染の予防に使用するための医薬組成物を提供する。
有利には、本発明は、抗生物質の投与に伴う下痢の予防に使用するための医薬組成物を提供する。
【００７５】
好ましい実施形態によれば、本発明によるハイブリッドタンパク質分子を含む医薬組成物は、経口投与のための剤形である。
本発明は、環境中の耐性細菌の蔓延を予防し、多剤耐性微生物によって引き起こされる院内感染のリスクおよび／または重症度を低下させ、ならびに抗生物質によって引き起こされる下痢の頻度および重症度を減少させるべく、正常な腸内細菌叢の変化を予防するためのハイブリッドタンパク質分子を含む医薬組成物を提供することが理解される。
【００７６】
有利には、その医薬組成物は、小児科を含むヒトにおいて投与するためのものである。本発明による医薬組成物は、１つ以上の抗生物質の投与前に、同時にまたは後に、好ましくは経口で投与され得ることが理解される。
【００７７】
別の実施形態において、医薬組成物は、愛玩動物および抗生物質を受けている家畜による抗生物質に対する細菌耐性の蔓延の予防における獣医学的使用のためのものである。
本発明による医薬組成物はまた、アジュバント、賦形剤、安定化剤、塩、添加剤、結合剤、潤滑剤、コーティング剤、着色剤、香味剤、または当業者に公知である任意の他の慣習的に使用される薬剤などの医薬として許容される任意の物質を含む。
【００７８】
本発明による医薬組成物は、ゲル、シロップ、カプセル、錠剤、懸濁液またはエマルジョンの形態に制限されない、固体または液体の形態であり得る。
１つの変形によれば、医薬組成物は、１つ以上の胃保護剤を含む。
【００７９】
胃保護剤とは、腸、好ましくは十二指腸および空腸におけるハイブリッドタンパク質分子の遅延放出のための胃液に耐性を持つ薬剤を意味する。胃保護剤はまた、コーティング剤、例えば、限定されないが、デスポリメタアクリレート（例えば、オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）（登録商標））、セルロース系ポリマー（セルロースエーテル、例えばデュオドセル（Ｄｕｏｄｃｅｌｌ）（登録商標）、セルロースエステル）、ポリ酢酸ビニルコポリマー（例えば、オパンドライ（Ｏｐａｎｄｒｙ）（登録商標））、または当業者に公知であるコーティングもしくは封入もしくはプロセスのための任意の他の薬剤であってもよい。
【００８０】
別の態様によれば、本発明は、生きた非ヒト組換え生物におけるハイブリッドタンパク質分子を生成するための方法を含む。
生きた組換え生物とは、ハイブリッドタンパク質分子を生成するように遺伝子操作され得る任意の細胞を意味する。
【００８１】
限定するものではないが、遺伝子改変され得る細胞という用語は、任意の原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、バキュロウイルスに感染したまたは感染していない昆虫細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）を意味する。
【００８２】
説明
本発明は、以下の非限定的な実施例の記載に照らして、よりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ＩＲ−ＴＥＭのファミリー（アンバー（Ａｍｂｅｒ）クラスＡ）に属する異なるβ−ラクタマーゼのタンパク質配列アラインメントを示す図。このアライメントは、デフォルト設定を使用してｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２サイトのＣＬＵＳＴＡＬＷ２ソフトウェアを用いて行われた。図１は、いくつかの配列のアラインメントにより、ＩＲ−ＴＥＭ酵素が＞９０％のタンパク質同一性を示すことを示す。これらの酵素は、比較的よく保存されていて、８０〜９９％のタンパク質配列同一性を共有しており、また、十分に特徴付けられている（ボンネット（Ｂｏｎｎｅｔ）、２００４年）。
【図２】ＣＴＸ−Ｍセフォタキシマーゼのファミリー（アンバー（Ａｍｂｅｒ）クラスＡ）に属する異なるβ−ラクタマーゼのタンパク質配列アラインメントを示す図。このアライメントは、ソフトウェアのデフォルト設定を使用してｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２サイトで行われた。
【図３】本ハイブリッドタンパク質を生成するために使用されるＰＣＲ技術の例を提供する図。２つのタンパク質は、最初に、リンカーを構成する共通の配列（それぞれ３’末端および５’末端）を用いて別々に増幅される。次に、２つの断片は、相補的ＤＮＡ配列（リンカーの配列）のレベルにハイブリダイズされ、全体は外部プライマーを用いて再増幅される。
【図４】ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてＴＥＭ−３６（配列番号１）、ＣＴＸＭ−１６（配列番号２）、ＴＥＭ３６−ＧＧＧＧＧＧ−ＣＴＸＭ１６（配列番号８）、ＣＴＸＭ１６−ＧＧＧＧＧＧ−ＴＥＭ３６（配列番号９）およびＴＥＭ３６−Ｇ（ＥＡＡＡＫ）２−ＣＴＸＭ１６（配列番号１０）タンパク質を発現させるために使用されたすべての構築物を記載する図。ベクターｐＪｅｘｐｒｅｓｓ９１５へのクローニングは、必要に応じて、ＣＴＸＭ１６をコードするＤＮＡ配列の内部のＮｏｔＩ部位を保存するために中程度の消化を用いて、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ中で行われた。
【図５】ＴＥＭ−３６（配列番号１）、ＣＴＸＭ−１６（配列番号２）、ＴＥＭ３６−ＧＧＧＧＧＧ−ＣＴＸＭ１６（配列番号８）、ＣＴＸＭ１６−ＧＧＧＧＧＧ−ＴＥＭ３６（配列番号９）およびＴＥＭ３６−Ｇ（ＥＡＡＡＫ）２−ＣＴＸＭ１６（配列番号１０）タンパクをコードするＸｈｏＩ／ＮｏｔＩにクローニングされたＤＮＡ断片であって、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ９１５−ＳＥＱ−ＦおよびｐＪｅｘｐｒｅｓｓ９１５−ＳＥＱ−Ｒプライマー、ならびに以下のプログラム（９５℃で３０秒間−２５サイクル［９５℃で３０秒間−５３℃で４５秒間−７２℃で１分間］−７２℃で５分間−４℃）を用いたＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を示す図。
【図６】ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現および精製によって得られ、ＥｎｄｏＨｆによる脱グリコシル化処理を受けた後の、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のハイブリッドタンパク質ならびにそれらの構成酵素ＴＥＭ−３６（配列番号１）およびＣＴＭＸ−１６（配列番号２）を示す図。
【図７】大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるＴＥＭ−３６（配列番号１）、ＣＴＸＭ−１６（配列番号２）タンパク質およびハイブリッドタンパク質ＴＥＭ３６−ＧＧＧＧＧ−ＣＴＸＭ１６、ＣＴＸＭ−１６−ＧＧＧＧＧ−ＴＥＭ３６を発現するために使用されたすべての構築物を記載する図。ｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクターへのクローニングは、ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより行われた。
【図８】ＴＥＭ−３６（配列番号１）、ＣＴＸＭ−１６（配列番号２）、ＴＥＭ３６−ＧＧＧＧＧ−ＣＴＸＭ１６、ＣＴＸＭ１６−ＧＧＧＧＧ−ＴＥＭ３６をコードするｐＥＴ−２６（＋）のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにクローニングされたＤＮＡ断片であって、Ｔ７−ＦおよびＴ７−Ｒプライマーならびに以下のプログラム（９５℃で３０秒間−２５サイクル［９５℃で３０秒間−５５℃で４５秒間−７２℃で１分間］−７２℃で５分間−４℃）を用いたＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を示す図。
【図９】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現およびペリプラズム画分から精製により得られた、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のハイブリッドタンパク質（ＴＥＭ３６−Ｇ５−ＣＴＸＭ１６およびＣＴＸＭ１６−Ｇ５−ＴＥＭ３６）ならびにそれらの構成酵素ＴＥＭ−３６（配列番号１）およびＣＴＸＭ−１６（配列番号２）を示す図。
【図１０】融合体ＡＡＣ−Ｈ６−ＣＴＸＭ１６（配列番号１８）の構築において得られた、ＡＡＣ−６’−Ｉｂ−ｃｒ（配列番号４）、ＣＴＸＭ−１６（配列番号２）、およびＡＡＣ−Ｈ６−ＣＴＸＭ１６をコードするＤＮＡ断片を示す図。
【図１１】ＡＡＣ−６’−Ｉｂ−ｃｒとハイブリッドタンパク質については大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、およびＣＴＸＭ−１６についてはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現および精製後に得られた、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のハイブリッドタンパク質ＡＡＣ−Ｈ６−ＣＴＸＭ１６ならびにその構成酵素ＡＡＣ−６’−Ｉｂ−ｃｒ（配列番号４）およびＣＴＸＭ−１６（配列番号２）を示す図。
【図１２】融合体ＥｒｅＢ−Ｈ６−ＣＴＸＭ１６（配列番号２０）の構築において得られた、ＥｒｅＢ（配列番号５）、ＴＥＭ３６（配列番号１）およびＥｒｅＢ−Ｈ６−ＴＥＭ３６をコードするＤＮＡ断片を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
配列表の説明
以下のテーブル１は、配列表を要約し、各々の配列番号（テーブル中のＩＤ番号）、配列の種類、その名称、その起源、その発現生物およびそのサイズをマッピングする。
【００８５】
【表１】
2017533260.tif 000002
2017533260.tif 000003
【００８６】
実施例１：フレキシブルリンカーによるＴＥＭ−３６とＣＴＸ−Ｍ１６との融合体からなるハイブリッドタンパク質分子
本発明の第一の実施形態は、フレキシブルポリグリシンリンカー（この実施例においては６つのグリシン残基）を介した、ＩＲ−ＴＥＭ（配列番号１；（非特許文献２５））とセフォタキシマーゼ（配列番号２；（ボンネット（Ｂｏｎｎｅｔ）、デュトーア（Ｄｕｔｏｕｒ）ら、２００１年））との融合体を記載し、セフトリアキソンだけでなく、クラブラン酸の存在下でアモキシシリンさえも加水分解することができるハイブリッドタンパク質（配列番号８）を生じさせることを記載する。
【００８７】
タンパク質ＴＥＭ−３６（配列番号１）およびＣＴＸ−Ｍ１６（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列は、ピキア・パストリスの発現ベクターにおける遺伝子合成により商業的に得られた（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ２０．ｃｏｍ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？ｇｃｌｉｄ＝ＣＰｎＱＩｐ３ｃ９ｒ０ＣＦａｏｅｗｗｏｄｎＲＥＡｌｇ）。発現ベクターに挿入されたＴＥＭ−３６のヌクレオチド配列は、配列番号１１に対応し、発現ベクターに挿入されたＣＴＸ−Ｍ１６のヌクレオチド配列は、配列番号１２に対応する。次に、これらの配列は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ならびにテーブル２に示される部分的に相補的なプライマーおよびタンパク質リンカー構築物（この実施例においてはＧＧＧＧＧＧ）を用いたＰＣＲ（９５℃で３０秒間−２５サイクル［９５℃で３０秒間−ＴＭ℃で４５秒間−７２℃で１分間］−７２℃で５分間−４℃）によって増幅された。ＴＥＭ−３６は、一対のＴＥＭ３６−ＦプライマーおよびＴＥＭ３６−６Ｇ−Ｒプライマーを用いて増幅され、ＴＭは５７℃であった。ＣＴＸＭ１６は、一対の６Ｇ−ＣＴＸＭ１６−ＦプライマーおよびＣＴＸＭ１６−Ｒプライマーを用いて増幅され、ＴＭは５７℃であった。リンカーＧＧＧＧＧＧの構成配列は、テーブル２において太字で示され、下線が付されている。
【００８８】
【表２】
2017533260.tif 000004
【００８９】
それにより得られた２つのＰＣＲ断片は、５５℃のＴＭでハイブリダイズされ、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社）を用いて、プライマーを含まないＰＣＲ（９５℃で３０秒間−５５℃で４５秒間−７２℃で２分１５秒間）の５サイクル中で補完された。ハイブリッドタンパク質をコードする完全な配列は、外側のプライマー（ＴＥＭ３６−Ｆ＋ＣＴＸＭ１６−Ｒ）の添加後に再増幅された。こうしたＰＣＲによる融合体の具体例は、図３に概略的に示されている。
【００９０】
それにより生成されたＴＥＭ３６−ＧＧＧＧＧＧ−ＣＴＸＭ１６融合体は、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ９１５ベクター（発現ピキア・パストリス）中に制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いてクローニングされた（図４）。ハイブリッド構築物の配列は両方向で確認され、記載された融合体に対応する。図５は、プライマーｐＪｅｘｐｒｅｓｓ９１５−ＳＥＱ−ＦおよびｐＪｅｘｐｒｅｓｓ９１５−ＳＥＱ−Ｒを用いて得られたＰＣＲ断片をまとめたものである。
【００９１】
ＴＥＭ−３６、ＣＴＸ−Ｍ１６および融合体ＴＥＭ３６−ＧＧＧＧＧＧ−ＣＴＸＭ１６を発現するベクターｐＪｅｘｐｒｅｓｓ９１５は、塩低減ＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ｐＨ＝７．５）で２５μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎｅ）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））選択圧を維持することによって大腸菌ＤＨ１０Ｂ中で増幅された。ピキア・パストリスを形質転換するために、ＳｗａＩ酵素を用いて線状にされた２μｇのベクターは、１５００Ｖでのショックにより６０μｌのコンピテント細胞にエレクトロポレーションされた。形質転換細胞は、１ｍｌの１Ｍ冷ソルビトールに採取され、１００〜４００μｇ／ｍｌのゼオシンおよびニトロセフィン（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＹＰＤ−寒天培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ
；ペプトン２０ｇ／ｌ；デキストロース２０ｇ／ｌ；寒天１５ｇ／１−リン酸塩１０ｍＭ、ｐＨ＝６．８）上への（２００μｌについての）播種の前に、３０℃で２時間培養された。
【００９２】
ピキア・パストリスにおけるベクターｐＪｅｘｐｒｅｓｓ９１５からの発現は目的のタンパク質の分泌をもたらし、それは培養培地中に見出される。ニトロセフィンを含有するＹＰＤ−寒天プレート上で、分泌されたβ−ラクタマーゼは、コロニーの周囲に発現レベルを表す赤色の加水分解ハロー（λ＝４８６ｎｍ）を誘発する。４８時間のインキュベーション後、各構築物について最良の発現を有する形質転換体は、５ｍｌのＹＰＤおよび１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するステリリン（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）チューブに接種され、４８時間、３０℃で増殖され、２００ｒｐｍで撹拌された。
【００９３】
次に、予備培養物は、抗生物質の選択圧を伴わない新鮮なＹＰＤ培地４００ｍｌ（バッフル付き三角フラスコあたり２００ｍｌ）に、６００ｎｍで０．２の初期光学濃度で接種される。この培養物は、１００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で４８時間放置される。４℃で１５分間、１０，０００×ｇで遠心分離した後、この培養培地（上清）は、ベンズアミジン（最終濃度１ｍＭ）の存在下、４℃で保存される。次に、この培養培地のタンパク質は、１０ｋＤａメンブレン（ヴィヴァフロー（Ｖｉｖａｆｌｏｗ）１０モジュール、ザルトリウス社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））を介したタンジェンシャル濾過により４０ｍｌの容量まで１０倍に濃縮され、次に、１０ｋＤａメンブレン（セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））上で限外濾過により１０ｍｌに濃縮される。その１０ｍｌは、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＴＥＭ−３６およびＣＴＸ−Ｍ１６タンパク質についてはスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）Ｇ７５、融解についてはスーパーデックスＧ２００；２６×６０カラム、ジーイーヘルスケア社（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に注入され、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ＝７．０に１ｍｌ画分で、流速１ｍｌ／分にて溶出された。
【００９４】
ニトロセフィン（ＶＷＲ）に対する最も高い活性と最高純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とを有する画分は合わせられ、約０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮される。試料のタンパク質含量は、ＢＣＡ（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））、２８０ｎｍでの吸光度、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での検証によって測定される。図６は結果を示す。
【００９５】
Ｎ−グリコシル化部位を有するＣＴＸ−Ｍ１６および融合体について、グリコシル化は、製造者の推奨（非変性条件下で３７℃にて一晩）に従って、ＥｎｄｏＨｆ酵素（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いて糖を切断することによって確認される。生成および精製されたタンパク質は、トリプシン消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって確認される。
【００９６】
図６に示されるように、ＴＥＭ−３６タンパク質はグリコシル化されておらず、ＣＴＸ−Ｍ１６タンパク質および異なる融合体とは対照的に、そのサイズは２８ｋＤａの予想されたサイズと適合する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上におけるＣＴＸ−Ｍ１６タンパク質および異なる融合体の見かけの分子量は、より高い（ＣＴＸ−Ｍ１６および融合体のそれぞれについて、４５ｋＤａ対２８ｋＤａおよび＞６６ｋＤａ対５６ｋＤａ）。ＥｎｄｏＨｆを用いた切断は、予想される分子量（ＣＴＸ−Ｍ１６と各融合体について、２８ｋＤａと５６ｋＤａ）のタンパク質を与え、それにより、これらのタンパク質がグリコシル化されていることを確認する。
【００９７】
精製タンパク質は、異なるβ−ラクタム（アモキシシリン（アポロサイエンティフィック（Ａｐｏｌｌｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、オーグメンチン（Ａｕｇｍｅｎｔｉｎ）（登録商標）（グラクソ・スミスクライン社（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））およ
びセフトリアキソン（ロセフィン（Ｒｏｃｅｐｈｉｎｅ）（登録商標）、ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）））について試験された。アッセイは、３７℃、ｐＨ＝７．０で２５ｍｌの反応容積において、ｐＨ−ＳＴＡＴ（チトリノ（Ｔｉｔｒｉｎｏ）２．５、メトローム社（Ｍｅｔｒｏｈｍ））で実施される。基質は、０．３ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ中、４ｇ／ｌで調製される。β−ラクタム核の酵素加水分解は酸を放出し、ｐＨの低下を誘発する。このアッセイの原理は、ｐＨ＝７．０を維持するように、０．１Ｎ水酸化ナトリウムの添加によって酸性化を相殺することである。これらの条件において、１単位は、１分間に添加される１μｍｏｌの水酸化ナトリウムに対応し、すなわち、１分間に加水分解される１μｍｏｌのβ−ラクタムに対応する。下記のテーブル３は、３つの基質に対して各々のタンパク質について測定された比活性を列挙する（平均６回の反復）。
【００９８】
【表３】
2017533260.tif 000005
【００９９】
これらの結果は、ＴＥＭ−３６とＣＴＸ−Ｍ１６との融合体が、β−ラクタマーゼ阻害剤の存在下でさえアミノペニシリンと、第三世代のセファロスポリンとの両方に対して活性を有するハイブリッドタンパク質を生成することを示す。両方の活性が文献（リポール（Ｒｉｐｏｌｌ）、バクエロ（Ｂａｑｕｅｒｏ）ら、２０１１年）においてアンタゴニストとして記載されて以来、これらの２つの基質に対してこのような高い触媒定数を有する天然酵素は知られていない。
【０１００】
実施例２：フレキシブルリンカーによるＣＴＸ−Ｍ１６とＴＥＭ−３６との融合体からなるハイブリッドタンパク質分子
本発明の第二の実施形態は、フレキシブルポリグリシンリンカー（この実施例においては６つのグリシン残基）を介した、セフォタキシマーゼ（配列番号２；（ボンネット（Ｂｏｎｎｅｔ）、デュトーア（Ｄｕｔｏｕｒ）ら、２００１年））とＩＲ−ＴＥＭ（配列番号１；（非特許文献２５））との融合体を記載し、セフトリアキソンだけではなく、クラブラン酸の存在下でさえもアモキシシリンを加水分解することができるハイブリッドタンパク質（配列番号９）を生じさせることを記載する。
【０１０１】
この実施形態は、配列ＣＴＸＭ１６およびＴＥＭ−３６を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーを除き、実施例１に記載されているものと同一である。
ＣＴＸＭ−１６は、一対のプライマーＣＴＸＭ１６−ＦとＣＴＸＭ１６−６Ｇ−Ｒとを用いて増幅され、ＴＭは５８℃であった。ＴＥＭ−３６は、一対のプライマー６Ｇ−ＴＥＭ３６−ＦとＴＥＭ３６−Ｒとを用いて増幅され、ＴＭは５８℃であった。リンカーＧＧＧＧＧＧの構成配列は、テーブル４において太字で示され、下線が付されている。
【０１０２】
【表４】
2017533260.tif 000006
【０１０３】
それにより得られた２つのＰＣＲ断片は、５５℃のＴＭでハイブリダイズされ、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社）を用いて、プライマーを含まないＰＣＲ（９５℃で３０秒間−５５℃で４５秒間−７２℃で２分１５秒間）の５サイクル中に補完された。ハイブリッドタンパク質をコードする完全な配列は、外側のプライマー（ＣＴＸＭ１６−Ｆ＋ＴＥＭ−３６−Ｒ）の添加後に再増幅された。
【０１０４】
ハイブリッドタンパク質ＣＴＸＭ１６−ＧＧＧＧＧＧ−ＴＥＭ３６の発現および精製に使用した条件は、実施例１に記載したものと厳密に同一であった。それにより得られたハイブリッドタンパク質はまた、図６に示されるようにグリコシル化されて、クラブラン酸の存在下で持続するペニシリナーゼ活性とセフォタキシマーゼ活性とを兼ね備える。
【０１０５】
実施例１の場合と同様に、天然のタンパク質は、アモキシシリン／クラブラン酸とセフトリアキソンとの両基質に対して、テーブル５に記載される比活性を示さない。
【０１０６】
【表５】
2017533260.tif 000007
【０１０７】
実施例３：リジッドリンカーによるＴＥＭ−３６とＣＴＸ−Ｍ１６との融合体からなるハイブリッドタンパク質分子
本発明の第三の実施形態は、リジッドタンパク質リンカー（この実施例においてはモチーフＧ（ＥＡＡＡＫ）２）を介した、ＩＲ−ＴＥＭ（配列番号１；（非特許文献２５））とセフォタキシマーゼ（配列番号２；（ボンネット（Ｂｏｎｎｅｔ）、デュトーア（Ｄｕｔｏｕｒ）ら、２００１年））との融合体を記載し、セフトリアキソンだけでなく、クラブラン酸の存在下でさえもアモキシシリンを加水分解することができるハイブリッドタンパク質（配列番号１０）を生じさせることを記載する。
【０１０８】
この実施形態は、配列ＣＴＸＭ１６およびＴＥＭ−３６を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーを除き、実施例１に記載されているものと同一である。ＴＥＭ−３６は、一対のプライマーＴＥＭ３６−ＦとＴＥＭ３６−Ｇ（ＥＡＡＡＫ）２とを用いて増幅され、ＴＭは５８℃であった。ＣＴＸＭ１６は、一対のプライマーＣＴＸＭ１６−Ｇ（ＥＡＡＡＫ）２−ＦとＣＴＸＭ１６−Ｒとを用いて増幅され、ＴＭは５８℃であった。リンカー
Ｇ（ＥＡＡＡＫ）２の構成配列は、テーブル６において太字で示され、下線が付されている。
【０１０９】
【表６】
2017533260.tif 000008
【０１１０】
それにより得られた２つのＰＣＲ断片は、５５℃のＴＭでハイブリダイズされ、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社）を用いて、プライマーを含まないＰＣＲ（９５℃で３０秒間−５５℃で４５秒間−７２℃で２分１５秒間）の５サイクル中で補完された。ハイブリッドタンパク質をコードする完全な配列は、外側のプライマー（ＴＥＭ３６−Ｆ＋ＣＴＸＭ１６−Ｒ）の添加後に再増幅された。
【０１１１】
ハイブリッドタンパク質ＴＥＭ３６−Ｇ（ＥＡＡＡＫ）２−ＴＥＭ３６の発現および精製に使用した条件は、実施例１に記載したものと厳密に同一であった。それにより得られたハイブリッドタンパク質はまたグリコシル化されて（図６）、クラブラン酸の存在下で持続するペニシリナーゼ活性とセフォタキシマーゼ活性とを兼ね備える。
【０１１２】
【表７】
2017533260.tif 000009
【０１１３】
実施例１および２と同様に、天然のタンパク質は、アモキシシリン／クラブラン酸とセフトリアキソンとの両基質に対して、テーブル７に記載される比活性を示さない。
実施例４：フレキシブルリンカーによるＴＥＭ−３６とＣＴＸ−Ｍ１６と（およびその反対）の融合体からなる非グリコシル化ハイブリッドタンパク質分子
ＴＥＭ−３６（配列番号１）およびＣＴＸＭ１６（配列番号２）のコード配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用のペリプラズム発現ベクターにおける遺伝子合成によって商業的に得られた（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ２０．ｃｏｍ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？ｑｃｌｉｄ＝ＣＰｎＱｌｐ３ｃ９ｒ０ＣＦａｏｅｗｗｏｄｎＲＥＡｌｇ）。そのヌクレオチド配列は、開始メチオニンでのＮｄｅＩ制限部位と終止コドン後のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とを有するペリプラズム標的ペプチド（ＭＳＩＱＨＦＲＶＡＬＩＰＦＦＡＡＦＣＬＰＶＦＡ）をコードするリーディングフレームと一致させて得られた。次に、遺伝子断片ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩは、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクター（インビトロジェン社）にサブクローニングされた。
【０１１４】
図３に示されるように、本発明者らは、オーバーラップＰＣＲによって２つのハイブリッドタンパク質分子を作製した。ＴＥＭ−３６およびＣＴＸ−Ｍ１６のヌクレオチド配列は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社）と、リンカータンパク質（この実施例においてはＧＧＧＧＧＧ）を構成する部分的に相補的なプライマーとを用いたＰＣＲ（９５℃で３０秒間−２５サイクル［９５℃で３０秒間−ＴＭ℃で４５秒間−７２℃で１分間］−７２℃で５分間−４℃）によって増幅された。ＴＥＭ−３６は、プライマー対のＴ７−ＦおよびＴＥＭ３６−Ｇ６−Ｒ−ｃｏ、またはプライマー対のＴＥＭ３６−Ｇ６−Ｆ−ｃｏおよびＴ７−Ｒのいずれかを用いて、５５℃のＴＭで増幅された。ＣＴＸＭ１６は、プライマー対のＣＴＸＭ１６−Ｇ６−Ｆ−ｃｏおよびＴ７−Ｒ、またはプライマー対のＣＴＸＭ１６−Ｇ６−Ｒ−ｃｏおよびＴ７−Ｆを用いて、５５℃のＴＭで増幅された。リンカーＧＧＧＧＧＧの構成配列は、テーブル８において太字で示され、下線が付されている。
【０１１５】
【表８】
2017533260.tif 000010
【０１１６】
それにより得られた２つのＰＣＲ断片（ＴＥＭ３６−Ｇ６＋Ｇ６−ＣＴＸＭ１６およびＣＴＸＭ１６−Ｇ６＋Ｇ６−ＴＥＭ３６）は、５５℃のＴＭでハイブリダイズされ、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社）を用いて、プライマーを含まないＰＣＲ（９５℃で３０秒間−５３℃で４５秒間−７２℃で２分１５秒間）の５サイクル中で補完された。ハイブリッドタンパク質をコードする完全な配列は、外側のプライマー（Ｔ７−Ｆ＋Ｔ７−Ｒ）の添加後、５５℃のＴＭで操作して再増幅された。
【０１１７】
それにより生成された融合体ＴＥＭ３６−ＧＧＧＧＧＧ−ＣＴＸＭ１６およびＣＴＸ−Ｍ１６−ＧＧＧＧＧＧ−ＴＥＭ３６は、ｐＥＴ２６ｂ＋ベクター（大腸菌における発現）に、ＮｄｅＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いてクローニングされた（図７）。
【０１１８】
ハイブリッド構築物の配列は、２方向で確認され、その２つのハイブリッドタンパク質分子のリンカーは、実際には５つのグリシンのみからなることが明らかになった。より好ましい核酸再編成は、おそらくＰＣＲハイブリダイゼーションの時点で起こった。図８は、プライマーＴ７−ＦおよびＴ７−Ｒを用いて得られたＰＣＲ断片を要約する。
【０１１９】
ＴＥＭ−３６（配列番号１）、ＣＴＸ−Ｍ１６（配列番号２）、ならびに融合体ＴＥＭ３６−Ｇ５−ＣＴＸＭ１６およびＣＴＸＭ１６−Ｇ５−ＴＥＭ３６を発現するｐＥＴ−２６ｂ（＋）発現ベクターは、ＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ、ｐＨ＝７）で５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（ユーロメデックス（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ））選択圧を維持することによって大腸菌ＤＨ１０Ｂ中で増殖された。この発現ベクターを用いて、発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、熱ショックにより形質転換された。形質転換された細胞は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地（酵母エキス５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ；寒
天１５ｇ／ｌ、ｐＨ＝７）上に播種された。
【０１２０】
大腸菌におけるｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクターからの発現は、目的のタンパク質が機能性を有する細菌のペリプラズム区画内に該タンパク質を向かわせる。実施例４に記載されたように作製された融合体は、２つの相補的な方法：（ｉ）部分的に精製されたタンパク質を生化学的に特徴付けることによって、および（ｉｉ）発現菌株上で、様々のβ−ラクタム（アモキシシリン、オーグメンチン（登録商標）およびロセフィン（登録商標））の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を比較することによって、評価された。
【０１２１】
大腸菌におけるハイブリッドタンパク質分子およびそれらの成分の精製：
形質転換された細菌は、１００ｍｌのＬＢ＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシン中、３７℃にて、飽和するまで２００ｒｐｍで撹拌しながら増殖される。次に、予備培養物は、１ＬのＬＢ培地＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシン中に１／４０で接種される。ＯＤ６００ｎｍが０．６の値に達したとき（約２時間）、タンパク質生成は、０．５ｍＭ最終濃度のＩＰＴＧを添加することによって誘導され、２００ｒｐｍで撹拌しながら１６時間、２０℃で継続する。細胞は、５，０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離され、その沈殿物は、即座に浸透圧緩衝液に採取され、外膜を破壊し、ペリプラズマを回収する。細胞は、ＯＤ６００ｎｍの１２０単位について、１ｍｌの緩衝液（リン酸塩１００ｍＭ、スクロース５００ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、ｐＨ＝７．０）を用いて採取され、ボルテックスホモジナイゼーションをしながら数分間インキュベートされる（（シュレーゲル（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）、ルジャス（Ｒｕｊａｓ）ら、２０１３年）から採用されたプロトコル）。１２，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離した後、ペリプラズムタンパク質を含有する上清は、容量が１０ｍｌを超えなくなるまで、アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）（１５ｍｌ、１０ｋＤａ、ミリポア社）上で濃縮される。タンパク質の全量は、排除クロマトグラフィーカラム（スーパーデックスＧ７５、ジーイーヘルスケア社）に注入され、タンパク質は、１ｍｌ画分あたりリン酸緩衝液（リン酸塩１０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ＝７．０）中に１ｍｌ／分の流速で溶出される。ニトロセフィン（ＶＷＲ）に対する最も高い活性と最高純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とを有する画分は合わせられ、約０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮される。試料のタンパク質含量は、２８０ｎｍでの吸光度とＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での検証とによって測定される。図９は、生化学的に特徴付ける前に得られた、部分的に精製されたタンパク質を示す。
【０１２２】
精製タンパク質の酵素活性は、上記の実施例に記載された異なるβ−ラクタム（アモキシシリン（アポロサイエンティフィック）、オーグメンチン（登録商標）（グラクソ・スミスクライン社）およびセフトリアキソン（ロセフィン（登録商標）、ロシュ社））について測定され、その結果は、以下のテーブル９に集められる。
【０１２３】
【表９】
2017533260.tif 000011
【０１２４】
実施例１〜３と同様に、天然のタンパク質は、アモキシシリンとセフトリアキソンとの両基質に対して、テーブル９に記載される比活性を示さない。
ハイブリッドタンパク質分子を発現する大腸菌株の種々のβ−ラクタムに対する耐性：
形質転換された細菌（ＴＥＭ３６、ＣＴＸＭ１６、または融合体ＴＥＭ３６−Ｇ５−ＣＴＸＭ１６およびＣＴＸＭ１６−Ｇ５−ＴＥＭ３６を発現する）または空の菌株（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）は、５ｍｌのＬＢ＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシンの培地中に、必要に応じて３７℃にて、飽和するまで２００ｒｐｍで撹拌しながら置かれる。次に、予備培養物は、５ｍｌのＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカナマイシン培地中に１／４０で接種され、ＯＤ６００が０．６の値に達したとき（約２時間）、タンパク質の生成は、最終１ｍＭ
ＩＰＴＧを添加することによって誘導され、２００ｒｐｍで撹拌しながら１．５時間、３７℃で継続する。
【０１２５】
細胞は、１０８ｃｆｕ／ｍｌで標準化され、カスケードで１０７、１０６、１０５、１０４ｃｆｕ／ｍｌに希釈され、各懸濁液の５μｌは、濃度増加させた抗生物質（アモキシシリン０、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍｌ；オーグメンチン（登録商標）０、１、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２μｇ／ｍｌ、およびロセフィン（登録商標）０、０．５、１、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ−寒天プレート上に堆積される。
【０１２６】
それらのディッシュは、３７℃で一晩インキュベートされ、その結果は翌日に記録された。ＭＩＣは、最も高い接種菌が増殖しない、抗生物質の最低濃度に対応する。
そのデータは以下のテーブル１０に示されている。
【０１２７】
【表１０】
2017533260.tif 000012
【０１２８】
実施例４に記載されているハイブリッドタンパク質分子を発現する大腸菌細胞は、アミノペニシリン（クラブラン酸などの阻害剤を含むまたは含まない）とセフトリアキソンなどの第三世代のセファロスポリンとに対する多剤耐性表現型を示す。これまでに、このような表現型を有する天然細菌株は文献には記載されていない。
【０１２９】
実施例５：ポリヒスチジンリンカーによる融合体ＣＴＸ−Ｍ１６とＡＡＣ−６’−Ｉｂ−ｃｒとからなるハイブリッドタンパク質分子
ＣＴＸ−Ｍ１６（配列番号２）およびＡＡＣ−６’−Ｉｂ−ｃｒタンパク質（以下、ＡＡＣと称する）（配列番号４）をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、大腸菌用の発現ベクターであるｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４１１（ＫａｎＲ）およびｐＪ４０４（ＡｍｐＲ）において、遺伝子合成により商業的に得られた。ベクターｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４１１に
挿入されたＣＴＸ−Ｍ１６の核酸配列は配列番号１６に対応し、ベクターｐＪ４０４に挿入されたＡＡＣの核酸配列は配列番号１２に対応する。次に、これらの配列は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社）と、テーブル１１に示されているタンパク質リンカー（この実施例ではＨＨＨＨＨＨ）を構成する部分的に相補的なプライマーとを用いたＰＣＲ（９５℃で３０秒間−２５サイクル［９５℃で３０秒間−ＴＭ℃で４５秒間−７２℃で１分間］−７２℃で５分間−４℃）によって増幅された。ＣＴＸ−Ｍ１６は、プライマー対の６Ｈ−ＣＴＸ−ＦおよびＴ７Ｒを用いて増幅され、ＴＭは６２℃であった。ＡＣＣは、プライマー対のＡＡＣ−Ｆ＿ｃｏｌｉおよびＡＡＣ−６Ｈ−Ｒを用いて増幅され、ＴＭは５０℃であった。リンカーＨＨＨＨＨＨの構成配列は、テーブル１１において太字で示され、下線が付されている。
【０１３０】
【表１１】
2017533260.tif 000013
【０１３１】
それにより得られた２つのＰＣＲ断片は、６２℃のＴＭでハイブリダイズされ、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社）を用いて、プライマーを含まないＰＣＲ（９５℃で３０秒間−６２℃で４５秒間−７２℃で２分１５秒間）の５サイクル中で補完された。ハイブリッドタンパク質をコードする完全な配列は、外側のプライマー（ＡＡＣ−Ｆ＿ｃｏｌｉ＋Ｔ７Ｒ）の添加後に再増幅された。ＰＣＲによる融合体のこの実施形態は、図３に概略的に示されている。ＡＡＣ、ＣＴＸＭ１６および融合体ＡＡＣ−６Ｈ−ＣＴＸＭ１６をコードする挿入物は、１％アガロースゲル上にロードされ、それぞれのサイズを示した（図１０）。
【０１３２】
それにより生成された融合体ＡＡＣ−６Ｈ−ＣＴＸＭ１６は、図７に示されている原理に従って、ｐＥＴ２６ｂ＋ベクター（大腸菌発現）に、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いてクローニングされた。
【０１３３】
ハイブリッド構築物の配列は、両方向で確認され、記載された融合体に対応する。
ＡＡＣを発現するｐＪ４０４−ＡＡＣ発現ベクター、および融合体ＡＡＣ−Ｈ６−ＣＴＸＭ１６を発現するｐＥＴ−ＡＡＣ−６Ｈ−ＣＴＸＭ１６は、ＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ、ｐＨ＝７．５）で１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（ユーロメデックス）および５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（ユーロメデックス）の選択圧を維持することによって、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中で形質転換された。大腸菌におけるベクターｐＪ４０４からのＡＡＣおよびＡＡＣ−６Ｈ−ＣＴＸ融合体の発現は、目的のタンパク質の封入体をもたらす。
【０１３４】
各々のタンパク質について、１ＬのＬＢは、飽和した予備培養物から１／４０で播種され、次に、ＯＤ（６００ｎｍ）が約０．４〜０．６になるまで、２００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で増殖される。この培養物は、０．５ｍＭ最終濃度のＩＰＴＧを添加することによって、４時間、３７℃、２００ｒｐｍで誘導される。生産終了時に、細胞は遠心分離され、その沈殿物は、溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ｐＨ＝８．０および０．２５ｍ
ｇ／ｍｌリゾチーム）中に４０ｍｌ／Ｌの培養液で採取され、次に、−８０℃で凍結された。それらの細胞は解凍され、ＭｇＳＯ４（２０ｍＭ）およびＤＮＡｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で４５分間、周囲温度で溶解される。その溶解物は遠心分離（３０分間、１２，０００×ｇで、４℃にて）され、目的のタンパク質（ＡＡＣおよびＡＡＣ−６Ｈ−ＣＴＸＭ１６）の封入体を含有する沈殿物は、緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、８Ｍ尿素、ｐＨ＝８．０）中に採取される。タンパク質は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製され、緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、８Ｍ尿素、ｐＨ＝８．０）の勾配を用いて溶離される。
【０１３５】
目的のタンパク質を含有する画分は混合され、１ｍＭ  ＤＴＴの存在下で１時間、４℃でインキュベートされ、次に、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝８中で３連続の透析により復元される。それらのタンパク質は遠心分離により清澄化され、次に、１０ｋＤａメンブレン（セントリコン、ミリポア社）を通した限外濾過によって、１０ｍｌを超えない容量まで濃縮される。それらのタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（スーパーデックスＧ２００；カラム２６×６０、ジーイーヘルスケア社）に注入され、１ｍｌ／分の流速で、１ｍｌ画分で１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０中に溶出される。
【０１３６】
ニトロセフィン（ＶＷＲ）に対する最も高い活性と最高純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とを有する画分は合わせられ、約０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮される。試料のタンパク質含量は、ＢＣＡ（ピアス社）、２８０ｎｍでの吸光度、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での検証によって測定される。図１１は、得られた精製タンパク質の結果を示す。
【０１３７】
精製タンパク質は、異なる抗生物質：β−ラクタムについてはセフトリアキソン（ロセフィン（登録商標）、ロシュ社）、およびアミノグリコシドについてはカナマイシンについて試験された。セフトリアキソンのアッセイは、３７℃、ｐＨ＝７．０で２５ｍｌの反応容積においてｐＨ−ＳＴＡＴ（チトリノ２．５、メトローム社）で行われた。基質は、０．３ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に、４ｇ／ｌで調製される。β−ラクタム核の酵素加水分解は酸を放出し、ｐＨの低下をもたらす。このアッセイの原理は、ｐＨ＝７．０を維持するように、０．１Ｎ水酸化ナトリウムの添加によって酸性化を相殺することである。これらの条件において、１単位は、１分間に添加される１μｍｏｌの水酸化ナトリウムに対応し、すなわち、１分間に加水分解される１μｍｏｌのβ−ラクタムに対応する。
【０１３８】
アセチルトランスフェラーゼの活性は、アセチル基ドナーとしてのアセチル−ＣｏＡ（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））と、アクセプターとしてのカナマイシンと、酵素反応中に放出されるＣｏＥｎｚｙｍｅＡ還元（−ＳＨ）分子を滴定するためのエルマン（Ｅｌｌｅｍａｎ）試薬（ＤＴＮＢ、シグマアルドリッチ）とを用いた間接的比色アッセイによって測定される［Ｒｅｆ］。その反応は、最終容積２００μｌ中の増加させた量の精製酵素と、濃度が５００μＭのカナマイシン、５００μＭのアセチルＣｏＡおよび２５０μＭのＤＴＮＢとともにマイクロ滴定プレート上で行われる。これらの実験条件において、イオンＴＮＢ２は、４１２ｎｍで吸収し、ε（λ＝４１２ｎｍ）は見かけ１９０００Ｍ−１．ウェル−１（２００μｌで満たされる９６ウェルプレートのウェル）であり、１単位は、３７℃で１分あたりに放出される１ナノモルのＴＮＢ２に対応する。
【０１３９】
以下のテーブル１２は、３つの基質（６回の実験の平均、すなわちｎ＝６）に対する各々のタンパク質について測定された比活性を要約する。
【０１４０】
【表１２】
2017533260.tif 000014
【０１４１】
これらの結果は、ＡＡＣ−６’−Ｉｂ−ｃｒとＣＴＸ−Ｍ１６との融合体が、第三世代のセファロスポリンを加水分解することができ、かつアセチル化によってアミノグリコシドを不活性化することができるハイブリッドタンパク質を生成することを示す。これら２つのクラスにおいて抗生物質を不活性化することができる天然酵素は知られていない。
【０１４２】
実施例６：ポリヒスチジンタグタイプのリンカーによるＥｒｅＢとＴＥＭ３６との融合体からなる非グリコシル化ハイブリッドタンパク質分子
ＴＥＭ−３６（配列番号１）およびＥｒｅＢ（配列番号５）をコードする配列は、大腸菌用の発現ベクターにおける遺伝子合成によって商業的に得られた。次に、遺伝子断片ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩは、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）ベクター（インビトロジェン社）にサブクローニングされた。
【０１４３】
図３に記載されている原理に従って、本発明者らは、オーバーラップＰＣＲによってハイブリッドタンパク質分子ＥｒｅＢ−Ｈ６−ＴＥＭ３６を生成した。ＴＥＭ−３６およびＥｒｅＢのヌクレオチド配列は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社）と、タンパク質リンカー（この実施例においてはヒスチジンタグ６）を構成する部分的に相補的なプライマーとを用いたＰＣＲ（９５℃で３０秒間−２５サイクル［９５℃で３０秒間−ＴＭ℃で４５秒間−７２℃で１分間］−７２℃で５分間−４℃）によって増幅された。ＴＥＭ−３６は、プライマー対のＥｒｅＢ６ＨＴＥＭ３６＿ｃｏｌｉ＿ＦおよびＴ７＿Ｒを用いて、６５℃のＴＭで増幅された。ＥｒｅＢは、プライマー対のＥｒｅＢ＿ｃｏｌｉ＿ＦおよびＥｒｅＢ６ＨＴＥＭ３６＿Ｒを用いて、６５℃のＴＭで増幅された。ＨＨＨＨＨＨリンカーの構成配列は、テーブル１３において太字で示され、下線が付されている。
【０１４４】
【表１３】
2017533260.tif 000015
【０１４５】
それにより得られたＰＣＲ断片は、５５℃のＴＭでハイブリダイズされ、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ、プロメガ社）を用いて、プライマーを含まないＰＣＲ（９５℃で３０秒間−５５℃で４５秒間−７２℃で２分１５秒間）の５サイクル中で補完された。ハイブリッドタンパク質をコードする完全な配列は、外側のプライマー（ＥｒｅＢ＿ｃｏ
ｌｉ＿Ｆ＋Ｔ７−Ｒ）の添加後、５５℃のＴＭで操作して再増幅された。
【０１４６】
それにより生成されたＥｒｅＢ−Ｈ６−ＴＥＭ−３６融合体は、ｐＥＴ２６ｂ＋ベクター（大腸菌において発現）にＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素制限を用いてクローニングされた（図７）。
【０１４７】
ハイブリッド構築物の配列は、両方向で確認された。図１２は、ｐＥＴ−ＴＥＭ３６、ＥｒｅＢおよびＥｒｅＢ−Ｈ６−ＴＥＭ３６シリーズにおいてＴ７−ＦおよびＴ７−Ｒプライマーを用いて得られたＰＣＲ断片を要約する。
【０１４８】
ＴＥＭ−３６（配列番号１）、ＥｒｅＢ（配列番号２）および融合体ＥｒｅＢ−Ｈ６−ＴＥＭ３６を発現するｐＥＴ−２６ｂ（＋）発現ベクターは、ＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ、ｐＨ＝７）で５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（ユーロメデックス）選択圧を維持しながら、大腸菌ＤＨ１０Ｂ中で増殖された。それらの発現ベクターを用いて、発現菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、熱ショックにより形質転換された。形質転換された細胞は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地（酵母エキス５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ；寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ＝７）上に播種された。
【０１４９】
大腸菌における目的のタンパク質（ＴＥＭ３６、ＥｒｅＢおよび融合体ＥｒｅＢ−Ｈ６−ＴＥＭ３６）の機能性は、異なるβ−ラクタム（アモキシシリンおよびオーグメンチン（登録商標））ならびにマクロライド（エリスロマイシン）型の抗生物質に対する発現菌株の耐性を測定することによって評価された。
【０１５０】
形質転換された細菌（ＴＥＭ３６、ＥｒｅＢ、またはＥｒｅＢ−Ｈ６−ＴＥＭ３６を発現する）または空の菌株（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）は、５ｍｌのＬＢ＋５０μｇ／ｍｌのカナマイシンの培地中に、必要に応じて３７℃にて、飽和するまで２００ｒｐｍで撹拌しながら置かれる。次に、予備培養物は、５ｍｌのＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカナマイシン培地中に１／４０で接種され、ＯＤ６００ｎｍが０．６の値に達したとき（約２時間）、タンパク質の生成は、１ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧを添加することによって誘導され、２００ｒｐｍで撹拌しながら１．５時間、３７℃で継続される。
【０１５１】
細胞は、１０８ｃｆｕ／ｍｌで標準化され、カスケードで１０７、１０６、１０５、１０４ｃｆｕ／ｍｌに希釈され、各懸濁液の５μｌは、濃度増加させた抗生物質（アモキシシリン０、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４、２０４８μｇ／ｍｌ；オーグメンチン（登録商標）０、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍｌ、およびエリスロマイシン０、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ−寒天ディッシュ上に堆積される。
【０１５２】
それらのディッシュは、３７℃で一晩インキュベートされ、その結果は翌日に記録される。ＭＩＣは、最も高い接種菌がもはや増殖しない、最低濃度の抗生物質に対応する。
そのデータは以下のテーブル１４に示されている。
【０１５３】
【表１４】
2017533260.tif 000016
【０１５４】
実施例６に記載されているハイブリッドタンパク質分子を発現する大腸菌細胞は、アミノペニシリン（クラブラン酸などの阻害剤を含むまたは含まない）とエリスロマイシンなどのマクロライドとに対する多剤耐性表現型を示す。これまでに、単一のタンパク質の発現に起因するこのような表現型を有する天然細菌株は文献には記載されていない。
【０１５５】
参照文献
【０１５６】
【表１５】
2017533260.tif 000017
2017533260.tif 000018
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2017533260.tif 000021
【０１５７】
配列表
【０１５８】
【表１６】
2017533260.tif 000022
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2017533260.tif 000024
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2017533260.tif 000058
【図１】
2017533260.tif 000059
【図２】
2017533260.tif 000060
【図３】
2017533260.tif 000061
【図４】
2017533260.tif 000062
【図５】
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【図６】
2017533260.tif 000064
【図７】
2017533260.tif 000065
【図８】
2017533260.tif 000066
【図９】
2017533260.tif 000067
【図１０】
2017533260.tif 000068
【図１１】
2017533260.tif 000069
【図１２】
2017533260.tif 000070
【配列表】
2017533260000001.app
【国際調査報告】
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