(57)【要約】  本発明の方法は、ドナー試料から得られる幹細胞産生を拡大するかまたは増加させる方法に関する。該方法には好ましくは、最小限に操作された組織から多数回の収集周期を用いて細胞を収集して、得られる幹細胞の数を増加させる工程が含まれる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外植片組織由来の初代由来幹細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大する方法であって、外植片組織を培養培地中で少なくとも２回の収集周期に渡って培養する工程を含む、ここで収集周期が、半集密（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）幹細胞培養を得るために十分な期間、培養培地中で組織を維持し、そして最終幹細胞集団のために半集密幹細胞を採取する工程を含み、そして外植片組織が各収集周期前に最小限にしか操作されない、前記方法。
【請求項２】
外植片組織から、初代由来幹細胞の拡大された集団を得るｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ.  外植片組織を洗浄し、そして最小限に操作し；
ｂ.  培養培地を含む第一の培養表面において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで外植片組織を培養して、初代由来幹細胞の培養を樹立し；
ｃ.  培養培地から初代由来幹細胞を採取し；そして
ｄ.  培養培地を含む第二の培養表面に、外植片組織をトランスファーし；
ｅ.  工程ｂ.、ｃ.、およびｄ.を外植片組織で少なくとも１回反復し、それによって外植片組織由来の初代由来幹細胞の拡大された集団を得る；
工程を含む、前記方法。
【請求項３】
増殖培地上で初代由来幹細胞を継代し、そして増殖培地から幹細胞を採取する工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
少なくとも１回の収集周期に渡って、培養培地中で組織を培養する工程が、５％未満の血清を含有する培養培地中で最初に組織を培養し、そして次いで１５％血清を含有する培養培地中で組織を培養する工程を含む、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項５】
５％未満の血清を含有する培養培地中で組織を培養する期間が３日間である、請求項４の方法。
【請求項６】
１５％の血清を含有する培養培地中で組織を培養する期間が７日間である、請求項５の方法。
【請求項７】
培養培地および増殖培地がＤＭＥＭである、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項８】
培養培地がＤＭＥＭ−Ｆ１２である、請求項７の方法。
【請求項９】
増殖培地がＤＭＥＭ−低グルコースである、請求項７の方法。
【請求項１０】
増殖培地に非必須アミノ酸が補充されない、請求項９の方法。
【請求項１１】
外植細胞および／または継代細胞が安定核型を有する、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
請求項１または請求項２の方法から得られる幹細胞を含む、幹細胞の療法組成物。
【請求項１３】
最初の３回の収集周期から得た外植細胞を含む、請求項１２の療法組成物。
【請求項１４】
最初の６５回の収集周期から得た外植細胞を含む、請求項１２の療法組成物。
【請求項１５】
最初の１００回の収集周期から得た外植細胞を含む、請求項１２の療法組成物。
【請求項１６】
少なくとも第１継代（Ｐ１）から得た継代細胞をさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか一項の療法組成物。
【請求項１７】
Ｐ１〜Ｐ３から得た継代細胞を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項の療法組成物。
【請求項１８】
Ｐ１〜Ｐ５０から得た継代細胞を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項の療法組成物。
【請求項１９】
組成物を融解した後、幹細胞マーカーの発現を改変することなく、凍結状態で保存可能である、請求項１２〜１６のいずれか一項の療法組成物。
【請求項２０】
幹細胞が神経冠または末梢神経系起源のものである、請求項１〜１１のいずれか一項の方法または請求項１２〜１９のいずれか一項の療法組成物。
【請求項２１】
組織が歯髄である、請求項１〜１１のいずれか一項の方法または請求項１２〜１９のいずれか一項の療法組成物。
【請求項２２】
幹細胞が成体または出生後幹細胞、非胚性幹細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項の方法または請求項１２〜１９のいずれか一項の療法組成物。
【請求項２３】
組織が分娩後組織である、請求項１〜１１のいずれか一項の方法または請求項１２〜１９のいずれか一項の療法組成物。
【請求項２４】
分娩後組織が：臍帯および胎盤からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか一項の方法または請求項１２〜１９のいずれか一項の療法組成物。
【請求項２５】
初代由来および継代幹細胞を混合して、単一外植片組織由来の初代由来および継代幹細胞のバッチを形成する、請求項３の方法。
【請求項２６】
工程ｅを少なくとも３０回反復する、請求項２の方法。
【請求項２７】
外植片組織が、各収集周期前に、酵素的または化学的に処理されず、あるいは解剖されない、先行する請求項のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
幹細胞は、療法適用、医学研究、薬学的試験等のための細胞の魅力的な供給源である。不運なことに、同種移植片としての細胞の使用には問題がある。幹細胞を多量に拡大することは、細胞療法のための必要条件であるが、成体ＭＳＣの増殖能は制限されている。骨髄（ＢＭ）単離由来のＭＳＣに用いる主な方法は、プラスチック培養プレート中に全骨髄を置き、そして４時間後、非接着細胞を洗い流した際のプラスチックへの接着能であることが、技術水準で一般的に知られる。このプロトコルにはまた、低粘度および低浸透圧の高密度溶液（例えばＦｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ）中でＢＭを密度遠心分離して、ＭＳＣを含有するＢＭの単核分画を得る工程が含まれることも可能である。さらに、フラスコ内に骨小片を入れ、そして骨外植片から細胞を増殖させることによって、骨のような固形組織由来のＭＳＣを単離することも可能である。あるいは、コラゲナーゼ消化プロセスを用いることもまた可能である。しかし、細胞に造血幹細胞のような他のタイプの細胞が混入していると、不均一集団が生じる可能性があり、ＭＳＣ試料の純度が損なわれる。この問題を克服するため、２つの類似の技術、磁気ビーズソーティングおよび蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が開発されてきている。そうでなければ、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）はＭＳＣを単離する方法である。ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大は、ＭＳＣ単離後の次の必須の工程であり、これは、療法的に有意な細胞数の産生を目指す、ＭＳＣの遊離ｅｘ  ｖｉｖｏ自動修復を可能にし、これは、ドナー依存性（年齢、性別、外傷の存在、および全身性疾患の存在）または方法依存性などのいくつかの要因に応じる。
【０００２】
ＭＳＣは迅速に増殖するため、比較的短時間で非常に拡大可能であるが、長期間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養、すなわち酵素処理を用いたフラスコ間の細胞継代の多数周期を伴わずに療法的に適切な数のＭＳＣの産生を可能にする方法は、技術水準において存在しない。こうした条件下でのＭＳＣ拡大は、ＭＳＣの最大分化能を次第に減少させることが示されてきている。長期間の継代培養は、細胞の機能を損ない、増殖抑止およびアポトーシスと関連する細胞老化を生じる。他方で、長期間の培養が、腫瘍形成能を獲得する自発的な形質転換を生じうることを示唆するデータがある。さらに、ＭＳＣの特定の特性は、培養中に失われる。ＭＳＣの心臓保護効果は、この継代数未満のものに比較して、５および１０を超えた継代数の細胞で減少する。これは、血管内皮増殖因子放出能の減少によって説明可能である（Ｃｒｉｓｏｓｔｏｍｏら、２００６；Ｄｉｇｉｒｏｌａｍｏら、１９９９；Ｍｕｒａｇｌｉａら、２０００；Ｒｕｂｉｏら、２００５；Ｓｔｅｎｄｅｒｕｐら、２００３）。したがって、技術水準にあるすべての方法は、拡大した細胞の収量および品質の間で折り合いを付けなければならず、これは細胞療法におけるその使用を制限した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃｒｉｓｏｓｔｏｍｏら、２００６
【非特許文献２】Ｄｉｇｉｒｏｌａｍｏら、１９９９
【非特許文献３】Ｍｕｒａｇｌｉａら、２０００
【非特許文献４】Ｒｕｂｉｏら、２００５
【非特許文献５】Ｓｔｅｎｄｅｒｕｐら、２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明に記載する方法および細胞組成物は、前述の限界、例えば多数回の細胞継代、細胞老化、分化減少および増殖因子産生減少、限定された数の凍結保存細胞を克服する。対照的に、本発明者らは、細胞継代減少、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞操作減少、そして平行して、分化能および増殖因子産生増加、安定な核型、現実的に制限のない数の凍結保存細胞を提唱した。
【０００５】
引用するすべての刊行物、特許、および特許公報は、全目的のため、その全体が本明細書に援用される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、外植片組織から単離された幹細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで得てそして／または拡大する方法に関する。該方法は、好ましくは、少なくとも１回の収集周期に渡って、培養培地中で組織を培養する工程を含む。収集周期は、一般的に、半集密（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）幹細胞培養を得るために十分な期間、培養培地中で組織を維持して細胞を外植し、そして最終幹細胞集団のためにこれらの細胞を採取する工程を含む。組織は、好ましくは、各収集周期前に最小限にしか操作されない。
【０００７】
特定の態様において、本発明は、外植片組織から、初代由来幹細胞の拡大された集団を得るｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ.  外植片組織を洗浄し、そして最小限に操作し；
ｂ.  培養培地を含む第一の培養表面において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで外植片組織を培養して、初代由来幹細胞の培養を樹立し；
ｃ.  培養培地から初代由来幹細胞を採取し；そして
ｄ.  培養培地を含む第二の培養表面に、外植片組織をトランスファーし；
ｅ.  工程ｂ.、ｃ.、およびｄ.を外植片組織で少なくとも１回反復し、それによって外植片組織由来の初代由来幹細胞の拡大された集団を得る
工程を含む、前記方法に関する。
【０００８】
これらの方法は、好ましくは、外植片組織を洗浄し、そして最小限に操作する工程を含む。好ましくは、外植片組織は、各収集周期前に、酵素的または化学的に処理されず、あるいは解剖されない。外植片組織から初代由来幹細胞の拡大集団を得る方法は、好ましくは、増殖培地上で初代由来幹細胞を継代し、そして増殖培地から幹細胞を採取する工程もまた含む。継代は、各収集周期後に複数回、または最後に行うことも可能である。
【０００９】
方法は、拡大した細胞を継代し、そして増殖培地中で継代細胞を培養する工程をさらに含むことも可能である。いくつかの側面において、少なくとも１回の収集周期に渡って、培養培地中で組織を培養する工程は、５％未満の血清を含有する培養培地中で最初に組織を培養し、そして次いで１５％血清を含有する培養培地中で組織を培養する工程を含む。５％未満の血清を含有する培養培地中で組織を培養する期間は３日間である。１５％の血清を含有する培養培地中で組織を培養する期間は７日間である。いくつかの実行において、培養培地および増殖培地はＤＭＥＭであり、例えば、培養培地はＤＭＥＭ−Ｆ１２であり、そして／または増殖培地はＤＭＥＭ−低グルコースである。いくつかの側面において、増殖培地には非必須アミノ酸が補充されない。いくつかの態様において、外植細胞および／または継代細胞は安定核型を有する。
【００１０】
本発明はまた、少なくとも最初の収集周期から得た外植細胞を含む、幹細胞の療法組成物にも関する。いくつかの態様において、組成物は、最初の３回の収集周期、最初の６５回の収集周期、または最初の１００回の収集周期から得た外植細胞を含む。いくつかの側面において、組成物は、少なくとも第１継代（Ｐ１）から、Ｐ１〜Ｐ３から、またはＰ１〜Ｐ５０から得た継代細胞を含む。いくつかの実行において、組成物を融解した後、幹細胞マーカーの発現を改変することなく、該組成物を凍結状態で保存可能である。
【００１１】
本発明の方法および組成物のいくつかの態様において、幹細胞は神経冠または末梢神経系起源のものである。いくつかの側面において、幹細胞は成体または出生後幹細胞、非胚性幹細胞である。いくつかの態様において、組織は歯髄または分娩後組織、例えば臍帯または胎盤である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、臍帯（ＵＣ）からの幹細胞単離の模式図を示す。パネルＡはＵＣの５ｃｍ片の単離を示す。パネルＢはＵＣ組織の洗浄を示し；パネルＣは小片に切り分けられたＵＣ組織を示す。パネルＤは、基本培地中に機械的にトランスファーされ、そしてプラスチック培養プレート中で培養されているＵＣ組織の小片を示す。パネルＥは、培養表面に対するＣＤ１０５陽性幹細胞の接着を示す。パネルＦは、間葉系幹細胞の培養を示す。
【図２】図２は、産業規模で幹細胞を培養する方法を示す。
【図３】図３は、バイオテクノロジー、医学、薬学、美容術、栄養等における、幹細胞単離および機械的トランスファーの非酵素的方法の使用を示す。
【図４】図４は、異なるドナーの断片の単離、および同じフラスコにおけるこれらの断片の共培養を示す。異なるＨＬＡマッチ、部分的マッチ、および／またはアンマッチドナーから得た断片は、これらが免疫反応のいかなるシグナルも提示しない限り、ＭＳＣ産生のため、同じフラスコ中で培養されることも可能である。
【図５】図５は、「１回」幹細胞単離のための組織供給源凍結保存の慣用法（ａ）および本出願の組織供給源凍結保存（ｂ）を示す。
【図６】図６は、正常ＭＳＣおよびＥＰまたはｉＰＳ細胞の間の原理的な相違を示す。
【図７】図７は、２つのタイプの増殖培地におけるｈＩＤＰＳＣの増殖を示す。
【図８】図８は、ＭｔｂおよびＭ．ボビス（Ｍ．  ｂｏｖｉｓ）株に感染したＣ５７Ｂｌ／６マウスの肺細胞によるサイトカイン産生に対する、ＩＤＰＳＣ腹腔内接種の影響を示す。
【図９】図９は、蛍光顕微鏡を通して視覚化された角膜移植用のＩＤＰＳＣにおける角膜縁幹細胞マーカーの免疫染色を示す。スケールバーは、５０μｍの距離を示す。パネルＡは、ＩＤＰＳＣにおけるｐ６３の核局在を示す。パネルＢは、パネルＡとＤＡＰＩ核染色の合併図である。パネルＣは、インテグリンβ１の膜局在を示す。パネルＤは、中間径フィラメント、ビメンチンの検出を示す。パネルＥは、細胞膜タンパク質であるコネキシン４３の検出を示す。パネルＦは、形質膜タンパク質であるＡＢＣＧ２の検出を示す。パネルＧは、Ｋ３／１２の弱い陽性免疫染色を示す。パネルＨは、陰性対照を示す。
【図１０】図１０は、ＩＤＰＳＣにおける角膜縁幹細胞マーカー（ＡＢＣＧ２、コネキシン４３、およびＫ１２）の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。レーン１は１００ｂｐラダーである。レーン２はヒト角膜組織試料である。レーン３はヒト角膜縁組織試料である。レーン４はＩＤＰＳＣ試料である。
【図１１】図１１は、歯髄中の幹細胞ニッチを示す。パネルＡは、歯が歯冠部分および歯根部分で構成されることを示す。パネルＢは、歯髄の血管周辺ニッチ（ａ）および神経叢（ｂ）の位置を示す。パネルＣは、血管周辺ニッチ（ａ）および神経叢（ｂ）におけるネスチンの免疫染色を示す。パネルＤは、象牙芽細胞下（ｓｕｂｏｄｏｎｔｏｂｌａｓｔｉｃ）ニッチ（ｃ）ならびに細胞不含および細胞リッチゾーン（ｄ）の位置を示す。パネルＥおよびＦは、それぞれ、象牙芽細胞下ニッチ（ｃ）ならびに細胞不含および細胞リッチゾーン（ｄ）におけるネスチンの免疫染色を示す。
【図１２】図１２は、臍帯における神経幹細胞の推定上のニッチを示す。パネルＡは、羊膜下（ｓｕｂａｍｎｉｏｔｉｃ）上皮におけるニューロフィラメント（ＮＦ）の発現を示す。パネルＢは、静脈における低アフィニティ神経増殖因子（ｐ７５またはＣＤ２７１）の発現を示す。パネルＣは、推定上の神経幹細胞ニッチから単離された幹細胞のベータＩＩＩチューブリンの陽性免疫染色を示す。パネルＤは、推定上の神経幹細胞ニッチから単離された幹細胞のＧＦＡＰの陽性免疫染色を示す。
【図１３】図１３は、臍帯組織中の異なる幹細胞ニッチにおける、Ｏｃｔ３／４、ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２などの転写因子の発現を示す。白い矢印はこれらの転写因子を発現している細胞を示し、一方、黒い矢印は、これらの転写因子の発現を欠く細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
米国特許出願公報第２００４／０１３６９６７号は、臍帯マトリックスから幹細胞を得るための方法であって、臍帯の外植片から細胞を単離するか、あるいは細胞を酵素的に、例えばコラゲナーゼまたはトリプシンで遊離させる工程を含む、前記方法を開示する。次いで、組織切片を別のガラススライドで覆い、そして完全培地中で培養する。したがって、先行技術は、外植片培養の反復可能な使用を解説しない。
【００１４】
先行技術の幹細胞集団をスケールアップする方法とは異なり、本発明は、多数回の収集周期を用いて、培養幹細胞の集団を増加させる。やはり先行技術の方法とは異なり、起源の組織は解剖されず、反復収集周期のために機械的にスライスされるかまたは粉砕される。組織は最小限に操作されるべきである。収集周期は、新鮮な培養表面に組織をトランスファーして、例えば幹細胞の新規外植片培養を樹立する周期を指す。本発明において、収集周期（幹細胞ソーシングのための組織トランスファー）を複数周期、例えば１〜１００トランスファーに渡って反復することも可能である。多数回の収集周期は、ユニークな特徴を持つ幹細胞の大規模供給を提供する、多数の初代培養を樹立する。言い換えると、本発明は、同じ組織の反復収集周期を通じて、最小限に操作された組織供給源から収集される幹細胞の反復初代培養によって、大規模に幹細胞をロバストに培養する方法を提供する。予期せぬことに、収集周期の反復は、各周期中で得られる接着細胞数の増加を生じる。そして驚くべきことに、外植片培養を反復することによって、抗生物質／抗真菌剤および補充物を含有する培養増殖培地に曝露された、最小限に操作された組織片を非酵素的に収集することを通じて、本発明者らは、第０継代（Ｐ０）状態を複数回開始可能であり、これによって、反復収集周期を通じて十分な数の幹細胞を提供しながら、低継代での核型安定により、安全性の見込みが改善されることを見出した。
【００１５】
組織を最小限に操作する方法は、非療法適用、主に診断目的に関して、先行技術に部分的に知られていた。特に、これらの目的には、毒性、発癌性、療法物質、生物学的剤または感受性試験の影響を評価するための、器官（例えば角膜）および組織外植片の培養が含まれる。近年、本発明者らは、歯髄幹細胞単離のためのこの技術の利用を開示した。このアプローチの主な目的は、培養組織構築を維持することであり、例えばその構造および機能に関して、実質および間質を保存することである。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養中の器官は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの器官機能と類似している。さらに、本発明者らはまた、診断スクリーニング法に関して従来技術において以前用いられた、器官片からの細胞単離のために外植片を培養するアプローチも利用した；単離した組織を、単離し、無菌条件下で最小限に処理し、小片に刻み、そして培養培地を含有する細胞培養プレート中に置いた。
【００１６】
外植片培養は、細胞が周囲の細胞外マトリックス中に置かれ、ニッチから外部環境へのｉｎ  ｖｉｖｏ幹細胞／前駆細胞の遊走をより正確に模倣する培養であり、そして前駆細胞は組織から遊走し、そして培養プレート表面に接着する。これらは環境および幹細胞ニッチを保持するため、どちらのアプローチも類似性を有する。幹細胞拡大のためにこの方法を利用すると、培養中の組織が低酸素に供されるため、有益である。しかし、培養培地は、最小限に操作された組織の外植片細胞および生存段階で維持されるはずの組織内の細胞を補助するために十分な栄養供給を提供する。この利点は、先行技術の解説に比較して予期せぬものであり、そして幹細胞を未分化状態に維持する際に大きな利点を提供する。したがって、小さい器官である歯髄、および外植片の機械的トランスファーは、単離後、その始原特性を不変のまま維持するために、幹細胞を連続して単離する戦略である。歯髄は、緩い結合組織であり、そしてこの器官は重量が多様でありうる。より軽いＤＰは、接着および細胞伸長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）なしに流動する傾向がある。基質への歯髄組織の接着を加速させるため、無菌カバースリップを用いて、より低酸素条件を提供することも可能である。カバースリップの使用は、多数回収集周期中、組織幹細胞ニッチ内で低酸素症を誘導する別の例である。
【００１７】
１つの態様において、本発明は、最小限操作された組織から初代由来および継代幹細胞の拡大集団までの少なくとも１つの収集周期を通じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大する方法に関する。各収集周期中、外植片細胞の数は、古典的な酵素的に得られる幹細胞拡大で単離された細胞の数を少なくとも倍増する。収集周期の数は、少なくとも３周期（Ｈ１〜Ｈ３）、少なくとも６５周期（Ｈ１〜Ｈ６５）、または最大１００収集周期（Ｈ１〜Ｈ１００）であることも可能である。各収集周期は、最小限に操作された組織断片（例えば非酵素的または非化学的処理、解剖されない）を、抗生物質を補充した培養培地中で維持して、半集密幹細胞培養を得るために十分な期間、細胞を外植し、そして最終幹細胞集団のためにこれらの細胞を採取する工程を含む。培養細胞のこの世代は収集周期の初代継代（Ｐ０）である。
【００１８】
該方法は、最小限に操作した組織を洗浄し、そして組織を少なくとも１回の収集に渡って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持し、したがって、幹細胞、例えば多様なタイプの間葉系多分化能および多能性幹細胞を培養表面またはビーズに付着させる工程を含む。収集周期由来の各外植片培養はＰ０であり、そしてその後の継代またはバイオリアクター系のための供給源を提供する。外植片培養を最大５０継代まで継代することも可能である。細胞は酵素的にまたは非酵素的に継代可能である。反復収集周期中、組織および細胞を、増殖因子および／または抗菌溶液を含有するＤＭＥＭ補充増殖培地中で維持することも可能である。いくつかの側面において、本発明の方法を用いて組織片を通じて得られる幹細胞の総数は、古典的な酵素的に得られた幹細胞拡大を通じて得られうる幹細胞の数の少なくとも三倍である。いくつかの実行において、本発明の方法を通じて得られる幹細胞の総数は、古典的な酵素的に得られた幹細胞拡大を通じて得られる幹細胞の数よりも、少なくとも３倍〜少なくとも６５倍高い。したがって、本発明は、同じ組織供給源を用いた古典的方法と比較して、単一のまたは混合ドナーの組織／体液供給源から得られる幹細胞数を増加させる方法に関する。
【００１９】
外植片培養を樹立する前に、組織を凍結保存してもよい。培養し、そして続いて継代した外植片由来の接着細胞もまた、凍結保存可能である。凍結後の細胞生存度は、５０〜９０％より高く、これによって、これらの細胞は、産業および療法適用に適したものになる。該方法のいくつかの側面において、療法組成物は、記載する方法にしたがって多数回の収集周期中に得られる凍結融解間葉系幹細胞を混合するバッチから得られる。研究および臨床適用のための細胞のバッチは、異なる収集周期由来のＰ０細胞を含む組成物であることも可能である。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本発明の方法にしたがって単離されたバッチを、ヒトまたは動物の治療が必要な部位に注射しそして／または移植する工程を含む、細胞療法に関する。細胞のバッチは、異なる収集周期および継代の直接凍結ストックから得られた混合細胞であってもよい。また、細胞のバッチを、ヒトまたは動物に投与する前に、凍結ストックから培養することも可能である。いくつかの実行において、細胞のバッチを、放出される適切な因子および／または試験される適切なバイオマーカーなどの、ターゲットとする療法に必要な機能的パラメータに関して試験する。本発明の方法にしたがって単離される最終幹細胞集団は、間葉系マーカーを発現する。最終幹細胞集団はまた、多能性マーカー、神経外胚葉マーカー、および／または周皮細胞マーカーも発現することも可能である。いくつかの態様において、最終幹細胞集団は、好ましくは、間葉系およびいくつかの多能性マーカー、特に神経外胚葉、上皮マーカー、および／または周皮細胞マーカーを発現する。いくつかの態様において、幹細胞は、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ発現、例えばＨＬＡ  ＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）発現を欠く。神経適用のため、好ましくはＣＮＳ因子、マーカー、例えばベータ・チューブリン、ＳＯＸ２；またはＳＯＸ１０；あるいは神経増殖因子およびペプチド、例えばＧＤＮＦ、ＮＧＦ、およびＢＤＮＦを試験する。細胞のバッチは、試験した分化能を有することも可能である。いくつかの側面において、本発明はまた、ｐＨが酸性ではなくそして細胞に対して毒性ではない、細胞療法用の緩衝療法組成物にも向けられる。
【００２１】
本発明の態様はまた、最小限に操作された細胞から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大された培養中で、初代幹細胞を得る方法であって、組織を、化学薬品または酵素によって完全に分解するまで処理せずまた解剖しない、前記方法にも関する。これらの方法は：抗菌溶液を含有する補充増殖培地中で維持された細胞培養チャンバー中の前記組織から、接着幹細胞を連続して、周期的に、または断続的に収集し；そして最初の収集反復工程由来の培養細胞を継代する工程を含む。好ましい態様において、収集工程を反復し、そして各収集工程に関して、少なくとも１回、２回または３回、継代工程を反復する。多数回の収集周期後、培養中で生じる幹細胞を混合し、そして適切なバイオマーカーの品質管理によって、機能性に関して試験することも可能である。療法使用前に、これらの細胞を凍結することも可能である。
【００２２】
表１は、本発明の方法から、そして先行技術の方法から得られる細胞数を比較する。
表１．異なる供給源から得られる成体間葉系幹細胞の比較：
【００２３】
【表１】
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【００２４】
１つの態様において、本発明の方法は、組織から過剰な血液を洗浄し、そして抗生物質および緩衝溶液で、採取組織を消毒する工程を含む。また、組織を機械的に組織断片に分離し、ここで組織は顕微鏡を用いずに目で見える片に切断される。例えば、組織断片は１ｍｍより大きいはずである。組織断片を補充培養培地に曝露する。好ましい態様において、補充培養培地は、ＤＭＥＭ、より好ましくはＤＭＥＭ  Ｆ１２に基づく。数回の培養後、接着細胞が半集密に達したら、組織断片を別の収集周期のため、新規プレートにトランスファーする。
【００２５】
いくつかの態様において、各収集周期（Ｐ０）後の幹細胞を多数継代で培養して、培養中の幹細胞数を拡大する。正常核型を維持しながら、幹細胞を３回、１５回、または５０回継代することも可能である。いくつかの態様において、各反復周期において、幹細胞を、何人かのドナーから、または先行する反復周期と同じドナー由来の何回かの試料採取（例えば同じドナー由来の乳歯歯髄、外科処置を通じた異なる組織試料採取）から、混合された組織片より得る。供給源組織は、新鮮であっても、または細胞バンクや凍結保存後に融解されて得られてもよい。
【００２６】
外植片収集に続いて、未分化または分化細胞の酵素的分割／継代を、当該技術分野に知られる古典的な細胞培養条件において、またはバイオリアクター条件下で、無菌プラスチックフラスコ、ガラスウェア、無菌バッグ、マイクロキャリー（ｍｉｃｒｏ−ｃａｒｒｉｅｓ）、マイクロファイバーリアクターなどにおいて、実行することも可能である。
【００２７】
１つの態様において、幹細胞の拡大法を機械的トランスファー、栄養素枯渇、および低酸素条件によって加速することも可能である。いくつかの実行において、方法は以下の工程を含む：
（ｉ）出生後、若年または成体間葉系細胞および前駆体幹細胞を、最小限に操作された組織（好ましくは神経外胚葉起源幹細胞ニッチの細胞および周皮細胞を含有する組織、あるいは／ならびに上皮供給源、すなわち歯科組織、出産後組織、例えば胎盤、羊膜、臍帯；毛包、および外胚葉下（ｕｎｄｅｒ−ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）供給源等から単離されたもの）から得る工程：
（ｉｉ）ここで、前記組織は、生存性に関して本質的に試験され、抗菌、抗真菌条件で維持され、実質的に血液を含まないよう清浄化され、機械的に小片に分割される（好ましくは、補充培地に曝露するため、約０．５〜５ｍｍ）。
【００２８】
（ｉｉｉ）最小限に操作された組織からの前記幹細胞コロニー形成を、非酵素的／機械的方法の下で実行する。
（ｉｖ）前記コロニー形成は、本質的に機械的操作および培地曝露およびプラスチックウェア、ビーズまたは接着表面への細胞接着によって誘導され、前記コロニー開始は、低酸素／５％またはそれ未満の低血清培地の飢餓ストレス条件下でほぼ第３日またはそれ以後、あるいは正常培養増殖条件下でそれ以後に、開始される。
【００２９】
（ｖ）反復多数回収集は、低い継代数の多数の細胞の使用を提供し、ここで各収集は、新規初代培養を開始し、最初の収集後、ストレスを受けて、組織サイズは減少し、そして次の収集から細胞を収集する期間は、最初の初代収集培養よりも約２倍迅速になる。
【００３０】
（ｖｉ）多数の幹細胞ニッチに由来する、こうした最小限に操作された組織から得た前記細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件を模倣して、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで、同じマーカーを発現する。
【００３１】
（ｖｉｉ）前記コロニー形成のための条件を、化学的ストレス、例えば低酸素、機械的ストレス、例えばカバースリップ下の圧；または／および補充物飢餓、好ましくは血清５％およびそれ未満によって誘導可能な、ストレス−低酸素条件下で、実質的に少なくとも２倍、誘導し、そして加速することも可能である（以下の実施例ＭＳ２を参照されたい）。
【００３２】
（ｖｉｉｉ）多数回反復収集由来の幹細胞の初代収集からのコロニー形成単位を酵素的または非酵素的に継代した後、細胞増殖に適した条件に曝露し、ここで好ましい例において、血清補充は約１５％であり、または増殖因子およびさらなる補充を行う。当該技術分野において、低酸素／ストレス条件を加速することが周知である、低グルコースＤＭＥＭを用いた場合、前記増殖を有意に加速することも可能である（以下の実施例ＭＳ３を参照されたい）。
【００３３】
細胞療法のための移植を、緩衝薬学的組成物、ヒドロゲル、移植足場内で、さらなる活性添加剤、あるいは相乗的薬学的または生物学的成分等を伴いまたは伴わずに、実行することも可能である。
【００３４】
多様な細胞療法適用のために、得た細胞を、全身または／および局所投与経路を通じて、単回、しかし好ましくは多発性硬化症様治療のイヌ治療において以下の実施例に示すように、反復投与様式で細胞を投与することによって、用いることも可能であり、後者の場合、最適な結果は、症状を改善するため、２〜３、好ましくは＞２、３または４回の細胞の反復注射を通じて得られる。より好ましいアプローチにおいて、細胞療法によってプロセスの逆転が調節可能である時点である、疾患の比較的初期の段階で、細胞を投与すべきである。
【００３５】
上に列挙する利点は、顧客の多数の利益に変換されるであろう：
・よく定義され、そして特徴付けられた幹細胞のロバストでそして再現可能な産業規模の産生が可能になると予期される。
【００３６】
・将来のバイオリアクター拡大のため、初期継代由来の高品質の出発材料が得られる。
・Ｃｅｌｌａｖｉｔａ細胞のユニークなタンパク質発現パターンによって、容易でそして標準化された特徴付けが可能になる。
【００３７】
幹細胞単離および断片の機械的トランスファーの非酵素的方法のありうる適用を図３に提示する。細胞または単離断片を、生理活性分子の単離のため、凍結乾燥し、沈殿させ、抽出し、そして精製するかまたはさらにプロセシングすることも可能である。これらの分子を、美容（若返り）外部および内部使用のための「カクテル」または療法クリームを生成するために、新規の未知の物質の配列決定および合成のためのテンプレートとして用いることも可能である。他方で、ＭＳＣを、幹細胞療法として、多様な疾患、傷害および外傷の治療において用いることも可能である。これらの細胞はさらに、癌治療における多様な療法または自殺分子を送達するためのビヒクルとして働きうる。また、これらの細胞を、遺伝子および組織操作、支持体（または足場）を伴うまたは伴わない器官のプリンティング（ｐｒｉｎｔｉｎｇ）において、そして多数の疾患において、他のタイプの細胞および／または幹細胞と組み合わせて用いることも可能である。
【００３８】
しかし、本発明者らは、単離幹細胞の最終集団が、幹細胞ニッチにしたがって、幹細胞特性に影響を及ぼしうる、表２に示すような類似であるがまた限定的な特性を同時に提示しうることを見出した。
【００３９】
表２．  ＵＣおよびＤＰ組織中の異なる幹細胞ニッチ
【００４０】
【表２】
2017529068.tif 000004
【００４１】
表２は、２つの組織の例を提示するが、本開示はこれらの組織に限定されず、そして以下の任意のタイプの組織を含むことも可能である：
ａ.  胚性外胚葉および神経冠由来（舌下および顎下組織、唾液腺および涙腺、歯乳頭、歯堤、ヘルトヴィッヒの上皮鞘、歯小嚢、歯根膜、皮膚、痣等）；
ｂ.  胚外中胚葉由来（卵黄嚢および羊膜、臍帯、胎盤および胎膜）；ならびに
ｃ.  胚性中胚葉由来（脂肪組織および骨髄）。
【００４２】
すべてのこれらの細胞は、断片供給源として働き、これを図１および２にしたがってプロセシングし、そして図３および４にしたがって用いることも可能である。
ａ、ｂ、ｃに記載する、しかしこれらの例に限定されない、異なる組織供給源から得られる各幹細胞タイプを、多様な目的のため、そして多様な適応症のため、細胞療法および再生医学で用いることも可能である。同時に、これらの幹細胞が異なる胚性起源である場合、療法治療において、増進されたまたは相補的なまたは相補的な効果を提供するため、これらを組み合わせて用いることも可能である。例示される組織供給源には：臍帯、歯／歯周組織、下顎組織、粘膜組織、胃腸組織、胎盤、羊水または羊膜嚢、神経組織（例えば神経およびグリア細胞含有組織）、神経冠由来組織または末梢神経系起源、筋肉、骨、皮膚（真皮、上皮、角化細胞含有、またはメラニン形成細胞含有組織、包皮、形成外科または生検由来皮膚）、脂質／脂肪組織、血液および他の体液、乳腺組織、内皮組織、精巣組織、卵巣、心臓組織、肝臓、骨組織、肺組織、唾液腺組織、膵臓組織、心臓および脾臓が含まれる。
【００４３】
幹細胞単離および機械的トランスファーの非酵素的方法はまた、最小限の変動を伴って他の組織、例えば臍帯（図１）に関して拡大可能である。例えば、臍帯（ＵＣ）から５ｃｍ片を単離し（図１Ａ）、過剰な血液を除去するために生理食塩水溶液のような無菌溶液で洗浄する（図１Ｂ）。ＵＣ組織の最初の片を培養するためにさらにより小さい組織断片に切断し（パネルＣ）、そして基本培地内に機械的にトランスファーする（図１Ｄ）。基本培地は、幹細胞の各タイプに特異的なものであることも可能であり、そしてその特定の配合は組織起源に応じる。ＣＤ１０５に関して陽性である幹細胞は、培養表面上に接着するために、組織から遊走する（図１Ｅ）。図１Ｆでは、小さいＵＣ組織断片に由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養が観察可能である。
【００４４】
この方法は、図２に示すように、産業規模培養に容易に変換可能である。多数の断片をＵＣから単離し、そしてＭＳＣ産生のため、多様な培養フラスコに入れる。酵素処理を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大後、これらの細胞を細胞療法において、そして他の目的のために使用可能である。ＵＣ断片の数回の機械的トランスファーは、非常に多量のＭＳＣを提供可能であり、これを生理活性分子の産生に用いることも可能である。
【００４５】
本発明の別の態様は、この方法にしたがって単離された幹細胞を伴う患者治療措置に関する。措置は、患者の免疫および炎症状態を防御的に調節するため、幹細胞の全身投与で始まる。患者において、サイトカインおよび免疫グロブリンおよび他の免疫調節因子を（例えば血液試験で）測定することによって、抗炎症免疫調節効果が確認されたら、次いで、再生細胞療法のため、幹細胞の局所移植を適用することも可能である。
【００４６】
機能アッセイには、感染のリスクを有しうる疾患、例えば院内感染、創傷治癒、例えば糖尿病性潰瘍、手術創傷などのための、相乗作用因子、例えば抗炎症、抗菌および再生因子の特徴付けが含まれることも可能である。
【００４７】
好ましい態様において、細胞療法治療を用いるＣｅｌｌａｖｉｔａ技術は、患者が受けている他の許容されうる医学的および支援的治療とともに補助的に行われるべきであるが、細胞の免疫調節および再生潜在能力を阻害しないように、補助薬剤療法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用性を試験しなければならない。例えば、抗生物質、ステロイド、抗増殖および免疫抑制剤は毒性であるか、細胞活性を阻害する可能性があり、したがって、関連する療法措置に対して措置を調整すべきである。
【００４８】
本開示、その側面および実行は、本明細書に開示する特定の材料タイプ、構成要素、方法、または他の例に限定されない。当該技術分野に知られる多くのさらなる材料タイプ、構成要素、方法、および処置が、本開示からの特定の実行での使用のために意図される。したがって、例えば、特定の実行を開示するが、こうした実行および実行構成要素は、意図する操作と一致する、こうした系および実行構成要素に関して当該技術分野に知られるような、いかなる構成要素、モデル、タイプ、材料、細胞、バージョン、量等を含むことも可能である。
【００４９】
単語「例示的」、「例」またはその変形は、本明細書において、実施例、例、または例示として働くよう意図される。「例示」として、または「例」として、本明細書に記載するいかなる側面または設計も、必ずしも、他の側面または設計よりも好ましいかまたは好都合であるとは見なされないものとする。さらに、実施例は、明確にし、そして理解される目的でのみ提供され、そしていかなる点でも、開示する主題または本開示の関連部分を限定するかまたは制限することを意味しない。多様な範囲のさらなるまたは別の多数の例が提示されうるが、簡潔にする目的のために省略されていることが認識されるものとする。
【００５０】
本開示には、多くの異なる型の態様が含まれるが、本開示は、開示する方法および系の原理の例示として見なされるものとし、そして開示する概念の広い側面を、例示する態様に限定することは意図されないことを理解しつつ、図に示され、そして本明細書において、詳細に特定の態様に記載されるであろう。
【実施例】
【００５１】
実施例１：歯髄の生存度
Ｍａｈｅｒ  Ａｌ−Ａｔａｒｉ  Ａｂｏｕ−Ａｓｉら（２０１１）は、５〜７歳の間の年齢である患者は歯髄ではなく歯胚と呼ばれるものを有し、これは異なる部分：エナメル質、歯髄、歯肉、セメント質、骨、血管および神経を含む将来の歯を形成するであろう未分化細胞の凝集物であるため、Ｋｅｒｋｉｓら、２００６の公表にしたがって歯髄（ＤＰ）から抽出された多能性細胞の起源が、歯髄ではない可能性があると主張した。しかし、Ｃｏｒｄｅｉｒｏら（２００８）は、ヒト剥落乳歯由来の幹細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＰ様組織を生成することを発見した。著者らは、ヒトの歯のスライス内で調製した生体分解性足場中に植え付けたＳＨＥＤを、免疫不全マウス内に移植した。著者らは、これらの細胞によって形成された組織が、生理学的ＤＰのものに非常によく似た構築および細胞性を示すことを観察した。透過型電子顕微鏡を用いた超構造分析およびデンチン・シアロタンパク質に関する免疫組織化学によって、ＳＨＥＤがｉｎ  ｖｉｖｏで象牙芽細胞様細胞に分化したことが示唆された。特に、ＳＨＥＤはまた、ＬａｃＺを安定形質導入されたＳＨＥＤで操作された組織中の血液含有管の壁の裏打ちをする細胞のβ−ガラクトシダーゼ染色によって立証されるように、内皮様細胞にも分化した。この研究によって、剥落乳歯が、ＤＰ組織操作のための幹細胞の多様な供給源を構成することが示唆される。
【００５２】
本発明者らは、抽出時点での歯髄の色に基づいて、細胞培養前に生存歯髄をスクリーニングした。剥落歯は、細胞生存度の指標として、赤い色の歯髄を有するはずである。赤色は、歯髄が除去時点まで血流を受け取っていたことを示す。歯髄が灰色であれば、歯髄への血流は損なわれていた可能性が高い。したがって、幹細胞は壊死している可能性が高く、そしてもはや回収できるように生存していない（Ａｒｏｒａら、２００９）。
【００５３】
歯髄抽出および培養の例は、倫理委員会（欧州ではヘルシンキ、米国ではＩＢＲ）に承認されたインフォームドコンセントを受理した後、健康な被験体由来の新鮮に抽出された乳歯から行い、５０％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン）および５０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有する無菌溶液中で反復して洗浄し、新鮮に抽出された歯髄を再び洗浄し、そして３〜２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬペニシリン、１００単位／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＰ組織維持培地中で歯髄の生存度試験を行った。最小限に操作された歯髄からコロニー形成が始まり、そして細胞がプラスチック細胞培養表面に付着したら、続く収集周期を反復し、そしてまたは継代を通じて細胞を拡大し、そしてまたは組織もしくは細胞を凍結保存する前に、安全性試験（無菌試験およびマイコプラズマ試験）を行う。
【００５４】
歯髄抽出および培養を以下のように行う：
・健康な被験体由来の新鮮に抽出された乳歯を、５０％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン）および５０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有する無菌溶液中で、反復して洗浄する。
【００５５】
・無菌針の補助で歯からＤＰを除去する。新鮮に抽出した歯髄を、３％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含有する溶液中で洗浄する。歯髄の生存度試験を、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００単位／ｍＬペニシリン、１００単位／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および２ｍＭ非必須アミノ酸を補充したＤＰ組織維持培地中で行う。
【００５６】
・歯髄がプラスチック細胞培養表面に付着したら、コロニー形成は５日から２週間観察されるであろう。
・実行する安全性試験は無菌試験およびマイコプラズマ試験である。
【００５７】
実施例２：歯髄外植片由来の幹細胞
歯科起源由来幹細胞の最近の概説（Ｄｅｅｐａ  Ｐｏｎｎａｉｙａｎ  ２０１４）に詳述される歯科組織の異なる例は、歯科組織由来の幹細胞、例えば歯髄幹細胞、歯根膜幹細胞、ヒト剥落乳歯由来の幹細胞、歯小嚢前駆細胞、歯乳頭由来幹細胞、口腔骨膜幹細胞および最近の歯肉結合組織由来幹細胞のバイオマーカーの異なる特性を記載する。顕著なことに、マーカーの大部分は異なる歯科幹細胞間で類似であるが、ＮｏｔｃｈおよびＣＤ２９マーカーの発現は、多様な歯科供給源由来の幹細胞間で異なる。本発明者らが開示する方法によって得られる細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのマーカー発現は同じである。
【００５８】
実施例３：初期継代での反復収集由来のヒトＩＤＰＳＣの奇形腫形成
奇形腫形成は、細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の多能性を決定する際の必須ツールである。Ｇｒｏｐｐら（２０１２）によって最近公表されたプロトコルと類似の、細胞の奇形腫形成能を評価するための一貫したプロトコルを、本発明者らの研究では用いた。本発明者らの方法は、マウスＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞の１０６細胞（Ｇｒｏｐｐらは１０５細胞を用いた）を、免疫不全マウス内に、Ｍａｔｒｉｇｅｌと同時に皮下移植した際に、非常に再現性が高く、そして効率的であることが示された。１００％の例で、本発明者らは、多数の動物で奇形腫形成を観察し、そしてさらに、最長移植後６ヶ月の追跡試験でも観察した。本発明者らは、他の成体間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、例えば乳歯歯髄、臍帯、脂肪組織等由来のものの生体安全性分析のため、この方法を用いた。本明細書に記載する実験系に加えて、やはり部分的に多能性マーカーを発現する、骨髄、肝臓、卵黄嚢、尿膜および羊水由来のイヌ胎児ＭＳＣを用いて、この方法を検証した。
【００５９】
奇形腫アッセイのための方法：
腫瘍発展を４ヶ月間（〜１６週間）監視した。多能性細胞に関しては、奇形腫の組織学的基準は、３つの胚葉すべてに由来する組織の発展であった。この分析を病理学者によって行った。生体／間葉系幹細胞に関しては、細胞注射部位での正常組織完全性に対するいかなるタイプまたはいかなる変化も考慮した。
【００６０】
結果
実験系：
ａ.マウス胚性幹細胞
ｂ.マウス３Ｔ３線維芽細胞
ｃ.永続性マウス細胞株Ｂａｌｂｃ  ３Ｔ３細胞株、クローンＡ３１
ｄ.ヒトｉＰＳ−ＩＤＰＳＣ
ｅ.ヒトＥＳ細胞
ｆ.ヒトＩＤＰＳＣ
本発明者らは、本発明者らが樹立した異なるマウスＥＳ細胞株の多能性を特徴付けるとともに、第２５継代以降のＥＳ細胞の多能性を確認するため、そしてマウスＥＳ細胞株から得られるサブクローンの特徴付けのため、多様な研究において前述の方法を用いた（Ｓｕｋｏｙａｎら、２００２；Ｃａｒｔａら、２００６；Ｋｅｒｋｉｓら、２００７；Ｌａｖａｇｎｏｌｌｉら、２００７；Ｈａｙｓｈｉら、２０１０）。さらに、この方法を用いて、本発明者らのグループのより最近の刊行物（Ｂｅｌｔｒａｏ−Ｂｒａｇａら、２０１１）において、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＣＳＣ）由来のｉＰＳ細胞の多能性を特徴付けた。この刊行物において、ヒトＩＤＰＳＣをｉＰＳ−ＩＤＰＳＣの対照として用いた。本発明者らは、ｉＰＳ−ＩＤＰＳＣが、三胚葉すべてから生じる組織とともに奇形腫を形成する一方、ＩＤＰＳＣはいかなるタイプの奇形腫またはいかなる他のタイプの新生物も産生不能である事を示した。
【００６１】
実験系
ａ.初期（ｎ＝１０）および後期継代（ｎ＝１０）のＩＤＰＳＣの３つの異なる初代培養
ｂ.ヒト初代線維芽細胞
本発明者らは、胚性幹細胞マーカー、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、およびＴＲＡ−１−８１ならびにいくつかの間葉系幹細胞マーカーを、少なくとも最初の２５継代の間に発現する一方、正常核型および幹細胞拡大の特徴的な速度を維持するＩＤＰＳＣ集団の単離を以前報告した。さらに、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、化学的に定義された培養条件下で、平滑筋および骨格筋、ニューロン、軟骨、ならびに骨への均質な分化を経るように誘導可能である。ＩＤＰＳＣは、小さいサイズ、および細胞質中の少数の細胞内小器官を有するが、これらは典型的な間葉系／線維芽細胞様形態を提示する、未刺激（ｎａｉｖｅ）多能性細胞とは異なる（Ｌｉｚｉｅｒら、２０１２）。ＩＤＰＳＣは、上皮性であるＥＳおよびｉＰＳ細胞とは対照的に間葉系である（図５）。ＭＳＣ細胞およびＥＳ細胞（またはｉＰＳ細胞）の間の主な相違は、ＭＳＣが遊走性であり、可塑性であり、そして係留性であることである。ＭＳＣ細胞は細胞外マトリックスを合成し、そして細胞間結合を含まない細胞である。
【００６２】
腫瘍形成は、前述のＥＳおよびｉＰＳ細胞では関連するが、正常ＭＳＣでは関連しない。ＩＤＰＳＣは、多能性マーカーを発現する多様な数の幹細胞（細胞の１〜２５％）を含むＭＳＣ集団によって構成される（Ｋｅｒｋｉｓら、２００６；Ｌｉｚｉｅｒら、２０１２）。このプロトコルは、ＩＤＰＳＣ集団のために、特にＩＤＰＳＣの２０％が多能性マーカーを発現することに基づいて計算された、用いる細胞数に関して、適応された。１０６細胞を試験するのではなく、ＩＤＰＳＣの奇形原性を５ｘ１０６で評価した。ＩＤＰＳＣ  ＤＮＡの存在が研究したすべての器官内に見られたが、腫瘍形成またはいかなる形態変化も観察されなかった（Ｌｉｚｉｅｒら）。
【００６３】
実施例４：主な幹細胞マーカーの発現パターンは、歯髄（ＤＰ）の凍結保存によって影響を受けない
臍帯、羊膜嚢、胎盤および若年性幹細胞由来の新生細胞は未成熟であるため、これらは、成体対応物（骨髄および脂肪組織）と比較した際、より高い増殖能およびより高い拡大速度を示す。したがって、臍帯、羊膜嚢、胎盤および歯髄由来の細胞を、同種療法として将来使用するために凍結保存することも可能である（組織断片および／または細胞の凍結保存を、まずフリーザー（約−８０℃）で、そして続いて液体窒素（約−１９６℃）で行った）。
【００６４】
本発明者らは、外植片の凍結保存および融解の前および後に採取した細胞が、同じパターンの因子発現を維持することを見出した。本発明者らは、凍結保存前および後の歯髄および臍帯由来の反復収集長期培養下で、最小限に操作された外植片から得られた細胞が、間葉系マーカー（すなわちＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０）を発現するが、造血系マーカー（すなわちＣＤ３４、ＣＤ４５）を発現せず、そして少なくとも１つの組織適合性マーカー、ＨＬＡ−ＤＲを発現せず、そして核型安定性を維持し、多能性を維持する（誘導因子、例えばレチノイン酸、ＢＭＰ−ＴＮＦ、ＮＧＦ等とともに培養すると、神経系を含む異なる細胞系譜に分化する）ことを示した。
【００６５】
例えば、乳歯から除去した歯髄を凍結保存し、そしてその後、ＩＤＰＳＣを単離するために融解した。ＩＤＰＳＣを収集０／継代３（Ｈ０Ｐ３）まで培養し、そしてＦＡＣＳ分析によって、新鮮なＤＰから得た同じ継代由来のｈＩＤＰＳＣに比較した。どちらの細胞の発現パターンも類似であることが見出された（表３）。どちらの種類のＩＤＰＳＣも間葉系マーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０）発現に関して陽性であり、そして造血系マーカーＣＤ４５および組織適合性マーカーＨＬＡ−ＤＲの発現に関して陰性であった。
【００６６】
表３．  ｈＩＤＰＳＣの表現型特性に対する歯髄凍結保存の影響
【００６７】
【表３】
2017529068.tif 000005
【００６８】
実施例５：ｈＩＤＰＳＣの増殖速度に対する増殖培地の影響
ｈＩＤＰＳＣを培養するための最適な増殖条件を評価するため、同数の細胞を植え付け、そして２タイプの増殖培地中で５日間培養した（表４）。細胞増殖速度は、タイプ２の増殖培地でより高い（２倍）ことが見出され（図７）、したがって、ＤＭＥＭ−低グルコースで構成され、そして１５％ＦＢＳを補充した増殖培地が、細胞培養により適している。
【００６９】
表４．  用いた多様な培地の組成
【００７０】
【表４】
2017529068.tif 000006
【００７１】
実施例５：歯髄（ＤＰ）からの細胞出芽の開始
ＤＰの２つの等しい断片を組織培養中で維持した。断片の１つを１５％ＦＢＳ存在下で培養し、そしてもう一方を血清欠乏ストレス条件（４．８％ＦＢＳ）下で培養した。ＤＰからの細胞出芽の開始は、４．８％ＦＢＳ存在下では３日、そして１５％ＦＢＳ存在下では７日であった。したがって、血清欠乏は、歯髄トランスファーに必要な時間を減少させうる。したがって、歯髄からの細胞出芽の開始は、血清欠乏培地の存在下でより迅速であった。
【００７２】
実施例７：後期集団（ＬＰ）ｈＩＤＰＳＣのパラクリン効果には、抗炎症、免疫調節、および抗菌特性が含まれる。
ＭＳＣはパラクリン機構を通じて補助し、そして抗炎症および免疫調節機構を通じて再生環境を調節する。
【００７３】
悪性度が異なる結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ））およびマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｔｕｍ  ｂｏｖｉｓ）株に静脈内感染したＣ５７Ｂｌ／６マウスの肺細胞によるサイトカイン産生に対する、ＩＤＰＳＣ腹腔内接種の影響。ＢＩＯＰＬＥＸ試験データに示されるように、ＩＤＰＳＣ接種は、感染肺細胞によるサイトカインの産生を減少させた（図８）。炎症促進性（ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１ｂ、ＭＩＰ−２、ＩＬ−１７）および抗炎症性（ＩＬ−１０）サイトカインの強い減少が、非常に悪性であるＭｔｂ株に感染した肺で観察された。ＩＦＮ−ｇおよびＫＣ産生の減少はより顕著ではなかった。ＩＬ−４産生の誘導は、ＩＤＰＳＣを接種されたマウスでのみ観察された。
【００７４】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、カケキシン、またはカケクチン、および以前、腫瘍壊死因子アルファまたはＴＮＦαとして知られた）は、全身炎症に関与するアディポカインである。ＴＮＦの主な役割は、免疫細胞の制御である。ＴＮＦは内因性発熱物質であり、発熱、アポトーシス性細胞死、悪液質、炎症を誘導可能であり、そして腫瘍発生およびウイルス複製を阻害可能であり、そしてＩＬ１およびＩＬ６産生細胞を通じて敗血症に反応可能である。ＴＮＦ産生の制御不全は、アルツハイマー病を含む多様なヒト疾患に関連づけられてきている。
【００７５】
インターフェロンガンマ（ＩＦＮγまたはＩＦＮ−ｇ）は、インターフェロンのＩＩ型クラスの唯一のメンバーである二量体化可溶性サイトカインであり、ウイルスおよび細胞内細菌感染に対する自然免疫および獲得免疫に、そして腫瘍調節に非常に重要な免疫インターフェロンサイトカインとして知られる。ＩＦＮγはマクロファージの重要な活性化因子である。異常なＩＦＮγ発現は、いくつかの炎症性および自己免疫疾患に関連する。免疫系におけるＩＦＮγの重要性は、部分的に、ＩＦＮγがウイルス複製を直接阻害する能力から、そして最も重要なことに、ＩＦＮγの免疫刺激および免疫調節効果から生じる。
【００７６】
インターロイキン１７は、多様な組織においてケモカイン産生を増加させて、ＩＦＮγ同様、炎症部位に単球および好中球を補充することにより、遅延型反応の強力な仲介因子として作用するサイトカインである。インターロイキン１７は、細胞外病原体による免疫系への侵入に反応する、炎症促進性サイトカインであり、そして病原体の細胞マトリックスの破壊を誘導する。
【００７７】
インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）はまたカタボリンとしても知られ、炎症反応の重要な仲介因子であるサイトカインタンパク質である。該タンパク質は、細胞増殖、分化、およびアポトーシスを含む多様な細胞活性に関与する。ＩＬ−１７の最も顕著な役割は、炎症促進性反応を誘導し、そして仲介する際の関与である。ＩＬ−１７は、一般的に、アレルギー反応に関連する。
【００７８】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）はまたヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られる抗炎症サイトカインである。ＩＬ−１０は、免疫制御および炎症における多面的影響を持つサイトカインである。
【００７９】
ケモカインリガンド２（ＣＸＣＬ２）はまたマクロファージ炎症性タンパク質２（ＭＩＰ−２）とも呼ばれ、好中球性炎症反応を仲介する際に主要な役割を果たし、そして敗血症発展の仲介因子である。ＫＣおよびマクロファージ−炎症性タンパク質−２（ＭＩＰ−２）は、外科手術後、皮膚において特徴的な時間的発現パターンを示す、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフを持つケモカインである。ＫＣおよびＭＩＰ−２は、好中球化学誘引物質である。どちらのケモカインも、広範囲の急性および慢性炎症セッティングで発現されることが知られており、そして後に続く炎症反応の性質および度合いの非常に重要な決定要因であると考えられる。
【００８０】
実施例８：最小限に操作された組織の多数回収集（ＬＰ）によって得られるｈＩＤＰＳＣのロバストな免疫調節能
ＩＤＰＳＣは、単球由来樹状細胞と共培養した際、免疫調節作用を示す。共培養は、Ｌｉｎ  Ｔ増殖の能力減少（５０％およびそれより高い）を生じ、そしてＬｉｎ  Ｔ  ＣＤ４−／ＦｏｘＰ３＋／ＩＬ１０＋およびＬｉｎＴ  ＣＤ４−／ＦｏｘＰ３＋／ＩＦＮ−γ＋細胞の比率の有意な増加に向かうＬｉｎＴ分化を誘導した。ＩＤＰＳＣにおけるＨＬＡ−ＤＲ発現の影響は観察されなかった。
【００８１】
本発明者らは、反復して収集される（Ｃｅｌｌａｖｉｔａ法）最小限に操作された組織から得られる幹細胞が、大部分の多能性マーカーを発現するが、これらの幹細胞のマウスへの注射は奇形腫を形成しないことを立証した。
【００８２】
表５．  多様な哺乳動物種間のｈＩＤＰＳＣ処理の比較、新鮮な培養由来細胞、ならびに凍結保存歯髄および細胞に由来する細胞を用いたモデル。
【００８３】
【表５】
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【００８４】
実施例９：歯髄における新規神経叢および象牙芽細胞下幹細胞ニッチの発見
初期神経マーカー、ネスチンに関する免疫染色によって、神経叢、血管周辺ニッチ、および象牙芽細胞下ニッチの間の発現相違が示された。神経叢中の細胞は、ネスチン陽性であり（図１１Ｃ、ｂ）、一方、血管周囲ニッチ中の細胞はネスチン陰性であった（図１１Ｃ、ａ）。象牙芽細胞下ニッチ中の細胞もまたネスチン陽性であった（図１１Ｄ、ｃおよび１１Ｅ、ｃ）が、細胞不含および細胞リッチゾーンのニッチは、ネスチン陰性であった（図１１Ｄ、ｄおよび１１Ｆ、ｄ）。
【００８５】
実施例１０：臍帯中の推定上の幹細胞ニッチの発見
ニューロフィラメント（ＮＦ）および低アフィニティ神経増殖因子受容体（ｐ７５またはＣＤ２７１）を検出することによって、臍帯中の推定上の幹細胞ニッチを検出した。ＮＦは、ニューロンで見られる１０ｎｍフィラメントまたは中間径フィラメントである。ＣＤ２７１は、ニューロトロフィンの２つの受容体タイプの１つであり、ニューロトロフィンは神経細胞を生存させ、そして分化させるよう刺激するタンパク質増殖因子のファミリーである。ＮＦおよびＣＤ２７１はどちらも、臍帯組織中で見られた。ＮＦ発現は、主に、羊膜下上皮ゾーンであり（図１２Ａ）、一方、ＣＤ２７１発現は、主に、静脈および動脈中であった（図１２Ｂ）。これらのニッチから単離される幹細胞は、神経分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで経て、ベータ−ＩＩＩチューブリンおよびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現することが可能であった（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。
【００８６】
実施例１１：臍帯における多能性幹細胞または未成熟前駆体ニッチの発見
転写因子、例えばＯｃｔ３／４、ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２の発現を検出した。Ｏｃｔ３／４タンパク質発現は、ＷＪ、静脈（ＶＥ）、動脈（ＡＲ）の細胞において、そして羊膜上皮（ＡＥＰ）の基底層（ＢＬ）に位置する細胞において、核局在とともに適切に検出された（図１３）。多能性幹細胞と同様、核においてこれらの３つのマーカーすべてを発現する少量の細胞が検出された。したがって、本発明者らは、臍帯のＶＥまたはＡＲから、そしてＡＥＰから、少数の「本物」の多能性幹細胞の単離を予測可能である。これらの細胞はまた、他の関連組織、例えば胎盤および胚外中胚葉由来の組織でも見られうる。
【００８７】
実施例１２：安全性アッセイ−数回の機械的トランスファー後の幹細胞ニッチｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
人体の特定の解剖学的部位に位置する幹細胞があることはよく知られており、これらは幹細胞ニッチ（ＳＣＮ）と呼ばれる。各組織はそれ自体のＳＣＮを持ち、これは周囲の微小環境から受け取るシグナルに反応して、幹細胞の運命に関する決定を行う。しかし、天然ニッチ内の幹細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ生物学的特性に関しては、そしてＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中にこれらの特性がどのように変化しうるかに関しては、ほとんど知られていない。例えば、細胞は、いくつかのタンパク質発現を停止するか、または新規タンパク質発現を開始する可能性もある。この問題は、臨床研究において、広範囲に及ぶ暗示を有する可能性もあり、そして再生医学における幹細胞の成功および／または失敗を説明する可能性もあるため、非常に重要である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した細胞は、組織構築、ならびに組織背景に基づく機能（細胞間相互作用、特定の因子の分泌等）のすべてを欠く。これが、細胞株が組織特異的機能を失い、そしてＳＣＮにおける細胞とはまったく異なる分子表現型を獲得しうる理由である。ＳＣＮ内の幹細胞マーカーの発現パターンの研究は、幹細胞安全性の評価に、特にヒトにおけるその使用に関して非常に重要である。
【００８８】
表６において、本発明者らは、単離後の細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ組織試料に関する免疫組織化学アッセイ、および数回の機械的トランスファーを用いた培養した細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料に関するフローサイトメトリーによって得たデータを要約する。表６は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞、特に歯髄によって発現されるマーカーの大部分が、機械的トランスファー後に得られる単離細胞において、マーカーの欠如を示さなかったことを示す。臍帯組織の機械的トランスファー後に得られた細胞は、ｃ−ｋｉｔおよびビメンチンを発現する細胞頻度にわずかな相違を示した。これらの結果は歯髄および臍帯組織から単離された幹細胞由来であるが、こうした安全性アッセイは、他の供給源由来の幹細胞で、さらには液体相にある細胞に関しても、使用可能である。
【００８９】
表６．  歯髄および臍帯組織由来の幹細胞におけるｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの主な幹細胞マーカーの発現パターン。＋＋＋は多数の細胞を示し、＋＋は中程度の数の細胞を示し、そして＋は少数の細胞を示す。
【００９０】
【表６】
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【００９１】
別に定義しない限り、本明細書のすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の一般の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似であるかまたは同等であるいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用可能であるが、好ましい方法および材料を本明細書に記載する。引用するすべての刊行物、特許、および特許公報の全体が、すべての目的のため、本明細書に援用される。
【００９２】
本明細書で論じる刊行物は、もっぱら、本出願の出願日前の開示に関して提供される。本明細書のいずれも、本発明が、先行発明によるこうした公開に先行する権利を与えられないという承認とは見なされないものとする。
【００９３】
開示する発明は、特定の方法論、プロトコルおよび材料に限定されないものとし、これは、これらが多様でありうるためであることが理解される。また、本明細書で用いる用語法は、特定の態様を記載する目的のためのみのものであり、そして本発明の範囲を限定するとは意図されず、本発明は、付随する請求項によってのみ限定されるであろう。
【００９４】
当業者は、本明細書に記載する本発明の特定の態様の多くの同等物を認識するか、またはルーチンの実験以上のものを用いずに、確認可能であろう。こうした同等物は、以下の請求項によって含まれると意図される。
【００９５】
参考文献
【００９６】
【化１−１】
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【００９７】
【化１−２】
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【００９８】
【化１−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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