(57)【要約】ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を用いて標的核酸の検出、プロービング、マッピング、および標的シーケンシングを行う方法が提供される。標的核酸へのガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合を検出する方法であって、ガイドＲＮＡがプローブにハイブリダイズ可能な３′テール配列を含む方法が提供される。標的核酸へのガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合を検出する方法であって、複合体が物理的に検出される方法が提供される。
2017530695.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列をシーケンシングする方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的核酸の鎖にニックを形成するＣａｓ９ニッカーゼであり、前記ニックからプライマー伸長が開始されて相補鎖を鋳型として成長鎖が形成されることにより、前記標的核酸がシーケンシングされる
前記方法。
【請求項２】
前記シーケンシングが、前記成長鎖への個々のヌクレオチドの付加を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチドが、蛍光標識されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔが、それぞれ異なる標識をされており、各塩基付加サイクル中に溶液で供給される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレオチドが可逆的ターミネーターであり、合成による逐次シーケンシングが行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチドが末端リン酸で標識されており、リアルタイムシーケンシングが行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸配列が、線状のひも（linear string）として分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸配列が、実質的に伸展された線状のひもとして分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ニックからのシーケンシングの開始が、標的核酸線状ひも上の複数の部位から開始される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
各核酸上の複数の部位および複数の標的核酸上の複数の部位が並行して分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ゲノムの１または複数の領域がシーケンシングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が、ニック形成後に除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸が、細胞中でｉｎ  ｓｉｔｕで分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸が細胞中でｉｎ  ｓｉｔｕで分析され、前記細胞が分析前に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
分析前にＲＮＡ分子が除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させることであって、
ここで、前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記ガイドＲＮＡは、３′テール核酸配列を含む、前記接触させること；
検出可能なプローブ配列を前記３′テール配列にハイブリダイズさせること；および
前記検出可能なプローブ配列を検出することにより前記標的核酸配列を検出すること
を含む前記方法。
【請求項１７】
前記３′テール配列が、プライマーとして働くことができる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記３′テール配列が、前記ｇＲＮＡの結合位置のすぐ近くの配列に相補的な配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記３′テール配列が、ＤＮＡ  ＰＡＩＮＴのためのドッキング部位またはハンドルを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記標的核酸は線状のひもとして分析される
前記方法。
【請求項２１】
前記線状のひもが、表面上、フローストリーム（flow stream）中、またはマイクロチャネルもしくはナノチャネル中で伸展される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記線状のひもが、一方の末端が表面に付着し、且つ第２の末端が光または磁気ピンセット、物理化学的結合、フローストリーム中でのぶら下がり（dangling）を含む牽引力に付着することにより伸展される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸に沿った１または複数の複合体の結合位置が検出される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
複数の複合体の結合位置により、単一分子マップの構築が可能になる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｇＲＮＡが、反復ＤＮＡを標的とし、１または複数の反復単位の位置が検出される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｇＲＮＡが、ＤＮＡ上の単一コピー配列を標的とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
複数のｇＲＮＡが、単一ゲノム遺伝子座を標的とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
（空欄）
【請求項２９】
複数の単一コピー遺伝子座が、各々の遺伝子座に特異的なｇＲＮＡによって標的化される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
ある遺伝子座への結合が、別の遺伝子座への結合と区別可能である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
複数のｇＲＮＡが、各々の遺伝子座に結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記線状のひもが、クロマチン繊維である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記線状のひもが、染色体内で折り畳まれている、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記線状のひもが、染色体内で折り畳まれており、前記染色体が、中期または有糸分裂期の染色体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記標的核酸は、ナノポアまたはナノギャップを、特性を変化させるように横切るか、または通過し、
前記変化した特性を検出することにより前記複合体の結合を検出することによって前記標的核酸配列を検出する
前記方法。
【請求項３６】
前記核酸に沿った１または複数の複合体の結合位置が、イオン電流、電子トンネル、または光学的検出を含む方法によって検出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ガイド中の認識配列が比較的短く、前記ガイドの残りの部分が、縮重塩基またはユニバーサル塩基を含み、前記標的核酸に沿った多数の結合部位を可能にしている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
複数の複合体の結合位置により、単一分子マップの構築が可能になる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させることを含み、
前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、
前記複合体を検出することにより前記標的核酸配列を検出する
前記方法。
【請求項４０】
前記ガイドＲＮＡが検出可能な標識を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｃａｓ９タンパク質が検出可能な標識を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記複合体が検出可能な標識を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記複合体がナノポアによって検出される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記複合体が電子顕微鏡によって検出される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記複合体が走査型プローブ顕微鏡によって検出される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記複合体がカンチレバーによって検出される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記複合体が水晶発振子マイクロバランスによって検出される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記複合体が電界効果トランジスターによって検出される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記ガイドＲＮＡが、プローブ配列に相補的な３′テール配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記ガイドＲＮＡが、検出可能な標識を含むプローブ配列に相補的な３′テール配列を含み、前記プローブ配列が前記３′テール配列に結合される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ガイドＲＮＡが、複数の検出可能な標識を含むプローブ配列に相補的な３′テール配列を含み、前記プローブ配列が前記３′テール配列に結合される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ガイドＲＮＡが、検出可能な標識を含むプローブ配列に相補的な３′テール配列を含み、前記プローブ配列が前記３′テール配列に結合され、前記プローブ配列が増幅される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ガイドＲＮＡが、プローブまたは検出可能な標識に対する結合対として３′テール配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的核酸が二本鎖ゲノムＤＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的核酸が染色体ＤＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的核酸が、基板上で伸長される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的核酸が、平面状の表面上で伸長される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
前記標的核酸が、ポア内で伸長される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５９】
前記標的核酸が、チャネル内で伸長される、請求項３９に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９、ｃａｓ９ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９である、請求項３９に記載の方法。
【請求項６１】
検出可能な標識が、前記Ｃａｓ９タンパク質に直接または間接的に結合されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項６２】
検出可能な標識が、前記ガイドＲＮＡに直接または間接的に結合されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項６３】
検出可能な標識を、前記複合体に直接または間接的に結合させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記標的核酸の鎖にニックを形成するＣａｓ９ニッカーゼであり、前記ニックから相補鎖を鋳型としてプライマー伸長が開始されることにより前記標的核酸がシーケンシングされる、請求項３９に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記標的核酸の鎖にニックを形成するＣａｓ９ニッカーゼであり、前記ニックから前記相補鎖を鋳型としてプライマー伸長が開始されて検出可能な標識が取り込まれることにより前記標的核酸が検出される、請求項３９に記載の方法。
【請求項６６】
前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質が組み合わせられた後に、前記標的核酸と接触させられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項６７】
前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質が組み合わせられた後に、試料内の前記標的核酸と接触させられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項６８】
前記ガイドＲＮＡが、シード領域配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項６９】
ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの非シード領域に、縮重位置もしくは縮重配列またはユニバーサル塩基を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項７０】
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を各々有する複数のガイドＲＮＡ配列と接触させることを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項７１】
前記標的核酸が溶液試料内にある、請求項３９に記載の方法。
【請求項７２】
前記標的核酸が基板上に存在する、請求項３９に記載の方法。
【請求項７３】
前記標的核酸が基板に結合している、請求項３９に記載の方法。
【請求項７４】
前記標的核酸が細胞内にある、請求項３９に記載の方法。
【請求項７５】
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有し且つ３′プライマー伸長部を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させることであって、
ここで、前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成する、前記接触させること；
前記プライマーを鋳型に沿って伸長させて１または複数の検出可能な標識を伸長産物に取り込ませること；および
前記１または複数の検出可能な標識を検出することにより前記標的核酸配列を検出すること
を含む前記方法。
【請求項７６】
標的核酸配列を検出する方法であって、
前記標的核酸配列を、前記標的核酸配列に相補的な部分を有し且つ３′プライマー伸長部を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させることであって、
ここで、前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的核酸配列に共局在して複合体を形成する、前記接触させること；
前記プライマーをローリングサークル増幅鋳型に沿って伸長させて、複数の検出可能な標識をローリングサークルコンカテマー中に取り込ませること；および
前記複数の検出可能な標識を検出することにより前記標的核酸配列を検出すること
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本願は、２０１４年８月１９日に提出された米国仮特許出願第６２／０３９，３４１号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成した短鎖ガイドＲＮＡに依存して、侵入する外来核酸中に存在する相補的配列を分解する。Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011); およびBhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011) を参照されたい。近年、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロ再構成により、通常はトランスにコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）と融合したｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）が、そのｃｒＲＮＡに一致する標的ＤＮＡ配列をＣａｓ９タンパク質に配列特異的に切断させるのに十分であることが実証された。標的部位に相同なｇＲＮＡの発現により、Ｃａｓ９が動員され、標的ＤＮＡが分解される。H. Deveau et al., Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008) を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの種々の使用が知られている。国際公開第２０１４／０９９７４４号、同第２０１３１７６７７２号、米国特許第８，６９７，３５９号、およびSternberg et al., Nature, Vol. 507, pp. 62-67 (2014) を参照されたい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示の態様は、標的核酸配列を検出する方法であって、標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させるステップを含み、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、複合体を検出することにより標的核酸配列が検出される、方法に関する。ある態様では、方法は、エクスビボ、すなわち、容器内または基板（substrate）上などのインビトロで行われる。ある態様では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質は、調製および単離されて本開示のインビトロの方法において試薬として使用される。本方法の態様は、ＤＮＡなどの、分析的プロービングまたは調製用のプロービング、検出、標識、マッピング、およびシーケンシングなどの核酸のプロービングを含む。例えば、本開示は、ＤＮＡの存在を同定する目的での、例えば単一分子レベルでの、ＤＮＡのプロービング方法；ＤＮＡをアフィニティー精製する目的でのＤＮＡのプロービング方法；ＤＮＡに沿った重要な特異的領域を区切る（mark out）ため、またはシーケンシング開始部位を形成するためのＤＮＡのマッピング方法に関する。
【０００４】
本明細書に記載の方法によれば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質、および二本鎖ＤＮＡ標的配列を含む複合体が形成される。ある態様では、本開示の範囲に含まれるＤＮＡ結合タンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成するタンパク質を含み、ガイドＲＮＡは複合体を二本鎖ＤＮＡ配列へとガイドし、ここで複合体はＤＮＡ配列に結合する。本開示のこの態様は、二本鎖ＤＮＡへのまたは二本鎖ＤＮＡとのＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質の共局在と呼ばれることもある。このようにして、ＤＮＡ結合タンパク質−ガイドＲＮＡ複合体を用いて、特異的標的ＤＮＡ配列で検出可能な複合体を形成させることができ、これにより、標的ＤＮＡ配列の存在が検出される。ある態様では、複合体は、検出可能な標識の存在によって検出され得る。ある態様では、複合体は、直接標識されてもよく、間接的に標識されてもよい。ある態様では、検出可能な標識は、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、または複合体上に存在し得る。
【０００５】
ある態様では、ガイドＲＮＡの共局在因子はＤＮＡ結合タンパク質でなくてもよい。ガイドＲＮＡと標的核酸配列で共局在させるために試薬を用いてもよい。ある態様では、ガイドＲＮＡは、必ずしも本開示のある態様において有効と考えられるＤＮＡ結合タンパク質の存在を必要としなくてもよい。ＤＮＡ結合タンパク質は存在しなくてもよい。例えば、ガイドＲＮＡ自身が標的核酸配列に結合してもよく、ガイドＲＮＡに標識または他の機能的部分が結合していて、標識または他の機能的部分が標的核酸配列またはその近くに局在するようになっていてもよい。
【０００６】
ある態様では、複合体は、検出可能な標識を有さず、複合体の構造を検出することにより検出され得る。蛍光的または他の視覚的または分光学的に検出可能な部分の可視化とは対照的に、複合体の物理的構造がプロービングされる。ある態様では、複合体は、検出可能な標識を有さず、複合体の静電荷などの物理化学的特性を検出することによって検出され得る。そのような方法としては、ナノポア検出法、電子顕微鏡、光学顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、原子間力顕微鏡、カンチレバー検出法、水晶発振子検出法、電界効果トランジスター検出法を用いて複合体を検出することが含まれ、これらの方法は全て当業者に公知である。当業者であれば、本開示に基づいて、複合体の構造を検出可能な他の方法を容易に想像することができる。
【０００７】
ある態様では、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムの文脈における「ガイドＲＮＡ」という用語は、当業者に公知であり、標的核酸に相補的な部分、例えば２０ヌクレオチドの部分を含む。ガイドＲＮＡを設計する方法は当業者に周知である。本明細書に記載の方法は、標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を各々有する複数のガイドＲＮＡ配列と接触させることを含む。本明細書に記載の方法は、複数の標的核酸配列を、対応する標的核酸配列に相補的な部分を各々有する複数の対応するガイドＲＮＡ配列と接触させることを含む。
【０００８】
ある態様では、本開示に係るガイドＲＮＡは、標的核酸に相補的な部分と、プローブ配列もしくは検出可能な標識に相補的であるかもしくは相補的であり得るか、またはその他の方法で結合する３′テール部分または配列とを含む。ある態様では、３′テール部分により特異的機能性が与えられる。３′テール部分は、モジュラーであってよく、同じ機能性または複数の機能性のための複数の配列（element）を有してよい。ある態様では、３′テール部分は、１以上または複数のプローブ配列または検出可能な標識に、相補的であり得るか、またはその他の方法で（例えば、アプタマー機構を介して）結合し得る。各プローブ配列または検出可能な標識は別個の役割を果たし得る（例えば、１つの配列の役割は、ＣＹ３標識オリゴヌクレオチドに結合することであってもよく、第２の配列の役割は、Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチドに結合することであってもよい）。例えば、テール配列は、機能性タンパク質を標的核酸配列に局在させるために用いることができる。例えば、テール配列は、ガイドＲＮＡによって置換される標的二本鎖の部分に結合することができる。
【０００９】
ある態様では、プローブ配列は１つの検出可能な標識を含み、プローブ配列は３′テール配列に結合する。ある態様では、プローブ配列は複数の検出可能な標識を含み、プローブ配列は３′テール配列に結合する。ある態様では、プローブ配列は検出可能な標識を含み、プローブ配列は３′テール配列に結合し、そこでプローブ配列は増幅される。ある態様では、プローブ配列は３′テール配列に結合し、そこでプローブ配列は増幅される。ある態様では、ガイドＲＮＡは、プローブまたは検出可能な標識に対する結合対として、３′テール配列を含む。ある態様では、テール配列は、鋳型配列に結合した場合、プライマーとして働くことができる。その後、テール配列を伸長して、蛍光ヌクレオチドなどの１または複数の検出可能な標識、または１または複数の標識が直接もしくは間接的に結合可能なビオチン標識ヌクレオチドもしくはｄｉｇ標識ヌクレオチドなどの１または複数の結合部分を取り込ませる。ある態様では、ローリングサークル増幅を、テールプライマー配列およびローリングサークル増幅鋳型と共に用いて、複数の検出可能な部分または検出可能な部分が結合可能な結合部分を有するローリングサークルコンカテマー産物を作成することができる。このように、ローリングサークル増幅を用いてシグナル強度を増幅することができる。ローリングサークル増幅法は当業者に公知であり、Drmanac et al., Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays, Science, vol. 327, p. 78-81 (2009)を含む。
【００１０】
ある態様では、標的核酸は二本鎖核酸である。ある態様では、標的核酸は二本鎖ゲノムＤＮＡである。ある態様では、標的核酸は染色体ＤＮＡである。
【００１１】
ある態様では、ガイドＲＮＡはシード領域配列を含む。ある態様では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの非シード領域に、縮重する位置もしくは配列、またはユニバーサル塩基を含む。
【００１２】
ある態様では、標的核酸は、平面基板上またはポアもしくはチャネル上などの基板上で伸長される。すなわち、標的核酸はポアまたはチャネル内で伸長される。
【００１３】
ある態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、当業者に知られるように、野生型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ欠損（nuclease null）Ｃａｓ９である。野生型Ｃａｓ９を単離する方法は当業者に公知である。Ｃａｓ９ニッカーゼの作製方法は当業者に公知である。ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９の作製方法は当業者に公知である。
【００１４】
ある態様では、検出可能な標識が、Ｃａｓ９タンパク質に直接または間接的に結合されている。ある態様では、検出可能な標識が、ガイドＲＮＡに直接または間接的に結合されている。ある態様では、検出可能な標識はガイドＲＮＡの一部である（例えば、ガイドＲＮＡの（例えばインビトロ転写による）作製中に蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる場合。ある態様では、検出可能な標識が複合体に直接または間接的に結合されている。
【００１５】
ある態様によれば、シーケンシング法によって標的核酸の配列を決定する方法が提供される。ある態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、標的核酸の鎖にニックを形成するＣａｓ９ニッカーゼであり、そこで相補鎖を鋳型としてニックからプライマー伸長または鎖伸長が開始されることにより、標的核酸の鎖の一方などの標的核酸がシーケンシングされる。ニッキングエンドヌクレアーゼおよびＤＮＡｓｅ  １の使用などのその他のニッキングアプローチに対する利点は、ガイドＲＮＡの使用によりニックが形成される位置がプログラム可能なことであり、複数の特異的位置を標的とすることができる。コンピューターにより実行される方法およびソフトウェアを用いて、合成のための目的のゲノム部分を同定し、ｇＲＮＡを作製するために必要なＤＮＡ鋳型をオーダーし、ガイドＲＮＡをインビトロ転写し、その後、所望の位置でニックを形成して標的シーケンシングを行うことができる。鋳型に沿ったプライマー伸長によるシーケンシング法は当業者に公知である。プライマーとしてのニックの利用は当業者に公知である。さらに、本開示のこの特徴を用いて、伸長産物中に検出可能な標識を含めることにより、例えば標的核酸から配列情報を得る代わりにまたはそれ加えて、標的核酸を検出することができる。したがって、Ｃａｓ９タンパク質は、標的核酸の鎖にニックを形成するＣａｓ９ニッカーゼであり、相補鎖を鋳型としてニックからプライマー伸長が開始されて検出可能な標識が取り込まれることにより、標的核酸が検出される。この態様では、伸長産物に取り込まれた標識が検出されるので、標識が伸長産物に取り込まれると、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は標的ＤＮＡと共にある必要はない。
【００１６】
ある態様では、単離されたガイドＲＮＡおよび単離されたＣａｓ９タンパク質を好適な条件下で混合した後、インビトロで反応液中または複合体形成媒体中で標的核酸と接触させる。ある態様では、標的核酸は、核酸試料などの試料内にある。核酸試料は複数の核酸を含んでいてもよく、核酸の複合混合物（complex mixture）と呼ばれ得る。ある態様では、標的核酸に特異的なガイドＲＮＡを用いて核酸の複合混合物中の標的核酸を同定する方法が提供される。ある態様では、１以上または複数の標的核酸に特異的なガイドＲＮＡを用いて核酸の複合混合物中の１以上または複数の標的核酸を同定する方法が提供される。この態様では、複数の標的核酸を検出するためのマルチプレックス法が提供される。複数の標的核酸の各々には、対応するガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体が結合することができ、それにより、本明細書に記載されているようにまたは当該技術分野で知られるように、検出またはシーケンシングすることができる。
【００１７】
ある態様では、標的核酸に特異的なガイドＲＮＡを用いて核酸の複合混合物中の標的核酸をアフィニティー精製する方法が提供される。ある態様では、１以上または複数の標的核酸に特異的なガイドＲＮＡを用いて核酸の複合混合物中の１以上または複数の標的核酸をアフィニティー精製する方法が提供される。この態様では、複数の標的核酸をアフィニティー精製するためのマルチプレックス法が提供される。複数の標的核酸の各々に、対応するガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体が結合し得る。これらの態様では、当業者に公知の結合対を用いたアフィニティーシステムを用いることができる。複合混合物中の他の核酸を枯渇させる（deplete）ことにより標的核酸が精製される。複合混合物から標的核酸を枯渇させることにより標的核酸が精製される。枯渇は、枯渇させる標的のアフィニティー捕捉によって起こり得る。あるいは、枯渇は、枯渇させる標的の切断によって起こり得る。場合によっては、より少量の標的を分析するために、複合混合物中に多量に存在する核酸を混合物から枯渇させる必要があり得る。例えば、反復ＤＮＡまたは他の高濃度核酸を試料から枯渇させることが望ましいことがある。
【００１８】
ある態様では、枯渇の標的となる核酸に特異的なガイドＲＮＡを用いて核酸の複合混合物中の標的核酸を枯渇させる方法が提供される。ある態様では、１以上または複数の標的核酸に特異的なガイドＲＮＡを用いて核酸の複合混合物中の１以上または複数の標的核酸のための方法が提供される。この態様では、複数の標的核酸を枯渇させるためのマルチプレックス法が提供される。複数の枯渇させる標的である核酸の各々に、対応するガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質複合体が結合し得る。
【００１９】
ある態様では、標的核酸は溶液試料内にある。ある態様では、標的核酸は基板上に存在する。ある態様では、標的核酸は基板に結合している。ある態様では、標的核酸は細胞内にある。ある態様では、細胞は真核細胞である。ある態様では、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。ある態様では、細胞は哺乳動物細胞である。ある実施形態では、哺乳動物細胞は生細胞であり、Ｃａｓ９または他のＤＮＡ結合タンパク質などのガイドＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質が、エレクトロポレーション、キャリアを介した送達（例えば、リポフェクチン）、マイクロインジェクション、および当業者に公知の他の方法によって送達される。ある実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｃａｓ９または他のＤＮＡ結合タンパク質などの送達されるＤＮＡ結合タンパク質、およびガイドＲＮＡを含む溶液に浸した固定細胞である。同様にして、ｇＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質を用いて標的核酸配列で共局在させる本明細書に記載の方法を中期染色体スプレッドに対して行うことができる。
【００２０】
ある態様では、ガイドＲＮＡは約１０〜約５００ヌクレオチドである。ある態様では、ガイドＲＮＡは約２０〜約１００ヌクレオチドである。ある態様では、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である。ある態様では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは別個の種であり、融合されている。
【００２１】
ある態様では、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。
【００２２】
ある態様では、ＤＮＡ量などによって特徴付けられる２つ以上の異なるポリヌクレオチド種または細胞の混合物を含む試料をプロービングする方法であって、試料中の１または複数のポリヌクレオチド種に相補的な１または複数の配列を選択し、相補的配列を含む１または複数のｇＲＮＡを生成し、１または複数のｇＲＮＡをＣａｓ９と組み合わせ、試料をｇＲＮＡおよびＣａｓ９に晒し、試料中の１または複数のポリヌクレオチド種と結合したｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を検出し；検出に基づいて試料のポリヌクレオチド成分または細胞のアイデンティティーを決定することによる、方法が提供される。ある態様では、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９は、インビトロで生成されるか、インビトロで存在する。ある態様では、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９はインビトロで組み合わせられる。ある態様では、ｇＲＮＡはインビトロで生成されるか、または存在するが、Ｃａｓ９タンパク質はインビボで生成される。別の態様では、試料は、複数の異なるポリヌクレオチド種を含み、例えば１０または１００または１０００または１０，０００の異なるポリヌクレオチド種の複合混合物で存在し得る。
【００２３】
その他の応用例としては、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９を用いることを含む、標的生物のアイデンティティーを評価する方法；ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９を用いることを含む、標的生物の状態を評価する方法；ＤＮＡ分子に結合したＣａｓ９とガイドＲＮＡの複数とを分解（resolve）することを含む、ＤＮＡ分子をマッピングする方法；またはＣａｓ９とガイドＲＮＡの複数の複合体ならびに複数のプローブを用いることを含む、ＤＮＡ分子中のアレル変異体（variant）を分解する方法が含まれる。これらの具体的応用例のそれぞれは、本明細書に記載のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９システムを用いて標的ＤＮＡ部位で複合体を形成させてｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を検出する、ＤＮＡをプロービングする方法に基づく。
【００２４】
ＤＮＡ分子は、染色体または染色体外のものであってよい。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、活性、または不活性、または一部不活性であってよい。Ｃａｓ９は、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ルシフェラーゼなど）および／または１もしくは複数のアフィニティータグと融合していてよい。アフィニティータグは、１または複数の蛍光プローブによって認識され得る。アフィニティータグは、Ｃａｓ９に測定可能な属性（例えば、電荷または形状）を付与する１または複数のタグによって認識され得る。Ｃａｓ９は、１または複数の直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）アミノ酸を含み得る。直交アミノ酸は、プローブ、タグ、リンカーなどの他の分子に対する親和性を付与することができる。
【００２５】
ガイドＲＮＡは、１または複数の蛍光プローブを用いて直接プロービングすることができる。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９に測定可能な属性（例えば、電荷または形状）を付与する１または複数のタグによって直接プロービングすることができる。ガイドＲＮＡは、１または複数の修飾された塩基を含み得る。修飾塩基は、プローブ、タグ、リンカーなどの他の分子に対する親和性を付与することができる。
【００２６】
生物は、原核生物であっても真核生物であってもよく、単細胞であっても多細胞であってもよい。ＤＮＡは生物から抽出される。ＤＮＡは天然形態であってもよく、ＤＮＡは表面上またはデバイス中で伸展（stretch）されていてもよい。ＤＮＡは、チャネルまたはナノポア中を移動することができる。生物は固定されて、インビトロ合成されたＣａｓ９とガイドＲＮＡの複合体に対して透過性にされる。
【００２７】
ある実施形態では、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡは、ＤＮＡの標的化に用いられる前に複合体化される。ガイドＲＮＡは標的ＤＮＡに相補的である。ＤＮＡに結合した複合体は、蛍光シグナルを測定することによって検出される。ＤＮＡに結合した複合体は、ナノポアセンサー中を移動中またはナノポアもしくはナノギャップセンサーの近くでの電流シグナルを測定することによって検出される。
【００２８】
ＤＮＡ上の１または複数の複合体を一度に検出することができる。ＤＮＡ上の任意の２つの複合体の分解能（resolution）は、１ナノメートルまたは５ナノメートルまたは１０ナノメートルと低くてもよく、１０００ミリメートルと大きくてもよい（およびその間の任意の値）。特異的複合体の検出は特異的アレルの存在を示す。ＤＮＡに結合した複合体のパターンを作成して、これを用いてＤＮＡ分子のマップを得ることができる。ＤＮＡに結合した複合体のパターンを作成して、これを用いて生物のアイデンティティーおよび／または状態を知ることができる。ある態様では、ガイドＲＮＡもしくはＣａｓ９またはガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、生細胞または生育不能（すなわち、死んだ）細胞のいずれかに供給され得る。
【００２９】
Ｃａｓ９とガイドＲＮＡの複合体を用いてＤＮＡ分子上に配列特異的開始部位を作る方法が提供される。ポリメラーゼまたはリガーゼを用いて単一分子シーケンシングを行うことができる。開始部位は、ゲノム変異体、反復配列、高度可変領域の近位であってもよい。
【００３０】
Ｃａｓ９とガイドＲＮＡの複合体を用いてＤＮＡ分子をプルダウン、すなわちアフィニティー精製する方法が提供される。プルダウンを可能にするアフィニティータグをＣａｓ９とガイドＲＮＡの複合体に結合させる。アフィニティータグは、複合体がＤＮＡに結合する前または後に複合体に結合させる。１または複数のＣａｓ９とガイドＲＮＡの複合体に結合した１または複数の特異的標的ＤＮＡ分子をプールから抽出することができる。抽出された標的ＤＮＡ分子は、ディープシーケンシングなどのシーケンシングに供することができる。
【００３１】
ある実施形態では、ガイドＲＮＡは、特定の条件下では、Ｃａｓ９（または他のＤＮＡ結合タンパク質）なしで用いられ、特定の種類の配列に対して標的化された場合、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的への安定なまたは一時的な結合を形成するのに十分である。
【００３２】
ある実施形態では、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９共局在複合体は二本鎖切断をもたらすが、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９共局在複合体は標的核酸に結合したままである。そのようなｇＲＮＡ／Ｃａｓ９共局在は、複合体の解体（break up）を開始させるための７Ｍ尿素の添加などの条件を用いて標的核酸から除去されてもよい（その全体を参照により援用するSternberg et al Nature 507:62 (2014)参照）。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとＣａｓ９の複合体が、ＤＮＡなどの標的核酸配列への結合前に形成される。いくつかの実施形態では、複合体は、Ｃａｓ９が最初に標的核酸と相互作用した後に形成され、すなわち、Ｃａｓ９が標的核酸と相互作用し、その後、ガイドＲＮＡとの共局在複合体が形成される。
【００３４】
本発明の特定の実施形態のその他の特徴および利点は、以下の実施形態およびそれらの図面の説明において、および特許請求の範囲から、さらに十分に明らかになるであろう。
【００３５】
本発明の、前述した特徴およびその他の特徴、ならびに利点は、添付の図面と共に、具体的実施形態についての以下の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】標識ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９によってプロービングされた固定マウス細胞の画像を示す図である。
【図２】図１と同様なＣａｓ９プロービングプロトコールに従って、標識オリゴヌクレオチドによってプロービングされた固定マウス細胞の画像を示す図である。
【図３】ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９切断およびゲルシフトアッセイのアガロースゲルを示す図である。
【図４−１】ｇＲＮＡテールをプロービングするための種々の模式図である。
【図４−２】ｇＲＮＡテールをプロービングするための種々の模式図である。
【図４−３】ｇＲＮＡテールをプロービングするための種々の模式図である。
【図５Ａ】ラテラルフローアッセイのダイアグラムを示す図である。
【図５Ｂ】ラテラルフローアッセイのダイアグラムを示す図である。
【図５Ｃ】ラテラルフローアッセイのダイアグラムを示す図である。
【図６Ａ】標識ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９によってプロービングされる伸展ＤＮＡの画像を示す図である。
【図６Ｂ】標識ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９によってプロービングされる伸展ＤＮＡの画像を示す図である。
【図６Ｃ】標識ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９によってプロービングされる伸展ＤＮＡの画像を示す図である。
【図７】ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プロービングを用いてゲノム再編成を同定するためのダイアグラムを示す図である。
【図８】ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９に結合した折り紙バーコードを用いてゲノム領域を同定するためのダイアグラムを示す図である。
【図９】ニック部位からシーケンシングを開始させるためのダイアグラムを示す図である（配列番号：１〜２）。
【図１０】ＣＨＯＰＣＨＯＰを用いた、Ｈｅｒ２を同定するための、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位を同定する出力のダイアグラムを示す図である。
【図１１】オリゴヌクレオチドの集合（ensemble）からｇＲＮＡ鋳型を作製するためのＰＣＲアセンブリー法を示す図である。
【図１２】ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プロービングを用いてゲノム融合を同定するためのダイアグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本開示の実施形態は、ＤＮＡ結合タンパク質およびガイドＲＮＡを使用して標的核酸で共局在または複合体化させた後、複合体に会合または結合した検出可能な部分の検出によって、または複合体自体の物理的プロービングによって標的核酸を検出することに基づく。そのようなＤＮＡ結合タンパク質には、種々の目的のためにＤＮＡに結合させるための当業者に周知のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質（RNA-guided DNA binding protein）が含まれる。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は天然のものであってよい。本開示の範囲に含まれるＤＮＡ結合タンパク質としては、本明細書中でガイドＲＮＡと呼ぶＲＮＡによってガイドされ得るものが含まれる。この態様では、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡで共局在複合体を形成する。ある態様では、ＤＮＡ結合タンパク質はヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質であってよい。この態様では、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質の変更または修飾によって生じ得る。そのようなヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質は当業者に公知であり、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質などのヌクレアーゼ活性を有する天然ＤＮＡ結合タンパク質が含まれる。そのようなＣａｓ９タンパク質およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは当該技術分野で十分に裏付けられている。その全体が参照により援用される、全ての補足情報を含む、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477を、参照されたい。
【００３８】
ヌクレアーゼ活性を有する例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡにニックを形成するか、または二本鎖ＤＮＡを切断するように機能する。そのようなヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を示す１つまたは複数のポリペプチド配列を有するＤＮＡ結合タンパク質から生じ得る。そのような例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、それぞれが二本鎖ＤＮＡの特定の鎖を切断すること、またはニックを形成することに関与する、２つの別個のヌクレアーゼドメインを有していてもよい。当業者に知られているヌクレアーゼ活性を有する例示的なポリペプチド配列としては、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが挙げられる。したがって、例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインの１つまた救数を含む天然タンパク質である。ある態様によれば、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されるように変更または修飾されている。そのような変更または修飾には、ヌクレアーゼ活性またはヌクレアーゼドメインを不活性化するような１または複数のアミノ酸の変更が含まれる。そのような修飾としては、ヌクレアーゼ活性を示す１または複数のポリペプチド配列すなわちヌクレアーゼドメインがＤＮＡ結合タンパク質に存在しないようにするために、ヌクレアーゼ活性を示す１または複数のポリペプチド配列すなわちヌクレアーゼドメインを除去することが含まれる。本開示に基づいて、当業者は、ヌクレアーゼ活性を不活性化するためのその他の修飾を容易に知ることができるであろう。したがって、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を不活性化するように修飾されたポリペプチド配列を含むか、またはヌクレアーゼ活性を不活性化するような、１もしくは複数のポリペプチド配列の除去を含む。ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性は不活性化されているものの、ＤＮＡに結合する能力は保持している。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合に必要な１または複数のポリペプチド配列を含むが、ヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列の１または複数、または全てを欠いていてもよい。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合に必要な１または複数のポリペプチド配列を含むが、不活性化されたヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列の１または複数、または全てを有していてもよい。
【００３９】
ある態様によれば、２つ以上のヌクレアーゼドメインを有するＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つを除いた全てが不活性化されるように修飾または改変されていてもよい。そのような修飾または改変されたＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質が二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを切断するか、またはニックを形成するものである限り、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。ＲＮＡによってＤＮＡまでガイドされる場合、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。したがって、有用なＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９、ならびにそのホモログおよびオルソログであり得る。その全体が参照により援用されるJinek et al., Science 337, 816-821 (2012)を参照されたい。
【００４０】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）では、Ｃａｓ９は、タンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわちＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインが介在するプロセスによって、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端二本鎖切断を形成する。その全体が参照により援用されるJinke et al., Science 337, 816-821 (2012)を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477の補足情報で確認されている以下のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在することが知られている。メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）Ｃ７株；コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）；コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）ＹＳ‐３１４株；コリネバクテリウム・グルタニカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２  Ｋｉｔａｓａｔｏ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  ＡＴＣＣ１３０３２  Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  Ｒ株；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Corynebacterium kroppenstedtii）ＤＳＭ４４３８５株；マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）ＡＴＣＣ１９９７７株；ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ１０１５２株；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ４株；ロドコッカス・ジョスティイ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１株；ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）Ｂ４  ｕｉｄ３６５７３株；アシドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）１１Ｂ株；アルスロバクター・クロロフェノリカス（Arthrobacter chlorophenolicus）Ａ６株；クリベラ・フラビダ（Kribbella flavida）ＤＳＭ１７８３６  ｕｉｄ４３４６５株；サーモモノスポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）ＤＳＭ４３１８３株；ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）Ｂｄ１株；ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＤＪＯ１０Ａ株；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（Slackia heliotrinireducens）ＤＳＭ２０４７６株；パーセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）ＥＸ  Ｈ１株；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）ＮＣＴＣ９４３４株；カプノサイトファガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）ＤＳＭ７２７１株；フラボバクテリウム・サイクロフィルム（Flavobacterium psychrophilum）ＪＩＰ０２  ８６株；アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ８３５株；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ（Roseiflexus castenholzii）ＤＳＭ１３９４１株；ロゼイフレクサス（Roseiflexus）ＲＳ１株；シネコシスティス（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株；エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）Ｐｅｉ１９１株；未培養細菌Ｔｅｒｍｉｔｅ  ｇｒｏｕｐ  １  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ  Ｒｓ  Ｄ１７；フィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）Ｓ８５株；バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７株；リステリア・イノキュア（Listeria innocua）；ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）；ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＧＧ株；ラクトバチルス・��リバリウス（Lactobacillus salivarius）ＵＣＣ１１８株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）Ａ９０９株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ  ＮＥＭ３１６株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ  ２６０３株；ストレプトコッカス・ディスガテクティアエ亜種エクイシミリス（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）ＧＧＳ１２４株；ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi zooepidemicus）ＭＧＣＳ１０５６５株；ストレプトコッカス・ガロリティカス（Streptococcus gallolyticus）ＵＣＮ３４  ｕｉｄ４６０６１株；ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）チャリス（Challis）株ＣＨ１亜株；ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＮ２０２５  ｕｉｄ４６３５３株；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ１  ＧＡＳ株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ５００５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ２０９６株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ９４２９株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０２７０株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ６１８０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ３１５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＳＳＩ‐１株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０７５０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＮＺ１３１株；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophiles）ＣＮＲＺ１０６６株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＤ‐９株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＧ１８３１１株；クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）Ａ３  Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂ  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂａ４  ６５７株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｆ  Ｌａｎｇｅｌａｎｄ株；クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）Ｈ１０株；フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）ＡＴＣＣ２９３２８株；ユウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）ＡＴＣＣ３３６５６株；マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）；マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）１６３Ｋ株；マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）；マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）５３株；ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）ＤＳＭ１２１１２株；ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）ＢＴＡｉ１株；ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）Ｘ１４株；ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＢｉｓＢ１８；ロドシュードモナス・パルストリス  ＢｉｓＢ５株；パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）ＤＳ‐１株；ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）ＤＦＬ１２株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）Ｐａｌ  ５  ＦＡＰＥＲＪ株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス  Ｐａｌ  ５  ＪＧＩ株；アゾスピリルム（Azospirillum）Ｂ５１０  ｕｉｄ４６０８５株；ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）ＡＴＣＣ１１１７０株；ディアフォロバクター（Diaphorobacter）ＴＰＳＹ  ｕｉｄ２９９７５株；フェルミネフォロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）ＥＦ０１‐２株；ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）０５３４４２株；ナイセリア・メニンジティディス  ａｌｐｈａ１４；ナイセリア・メニンジティディス  Ｚ２４９１株；デスルホビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）ＤＳＭ  ２６３８株；キャンピロバクター・ジェジュニ亜種ドイレイ（Campylobacter jejuni doylei）２６９  ９７株；キャンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）８１１１６株；キャンピロバクター・ジェジュニ；キャンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）ＲＭ２１００株；ヘリコバクター・ヘパティカス（H Helicobacter hepaticus）；ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）；トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）ＤＳＭ９１８７株；シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）Ｔ６ｃ株；シューワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）ＡＴＣＣ７００３４５株；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）Ｐａｒｉｓ株；アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）１３０Ｚ株；パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）；フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダ（Francisella tularensis novicida）Ｕ１１２株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ハラークティカ（Francisella tularensis holarctica）；フランシセラ・ツラレンシス  ＦＳＣ  １９８株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ツラレンシス（Francisella tularensis tularensis）；フランシセラ・ツラレンシス  ＷＹ９６‐３４１８株；およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５株。したがって、本開示の態様は、本明細書に記載のようにヌクレアーゼ欠損、またはニッカーゼにした、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質に関する。
【００４１】
Ｃａｓ９タンパク質は、文献中で当業者にＣｓｎ１と呼ばれることもある。ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＣａｓ９タンパク質配列を以下に示す。その全体が参照により援用されるDeltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011)を参照されたい。
【００４２】
【化１】
2017530695.tif 000003
【００４３】
標的核酸としては、本明細書に記載されるような共局在複合体が検出に有用となり得る任意の核酸配列が挙げられる。標的核酸としては遺伝子が挙げられる。標的核酸は、単一細胞から抽出されたＤＮＡ内にあってもよい。標的核酸は、単一染色体から抽出されたＤＮＡであってもよい。本開示の目的のために、二本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡは標的核酸を含んでいてもよく、共局在複合体は、その標的核酸においてまたはその標的核酸に隣接して、またはその標的核酸の近傍で、標的核酸を検出するように、ＤＮＡに結合するか、またはＤＮＡと共局在することができる。そのような標的核酸は、内在性（または天然）の核酸および外来性（または外来）核酸を含んでいてもよい。そのような標的核酸は、核酸の混合物であってもよい。そのような標的核酸は、基板に結合していてもよい。そのような標的核酸は、当業者に公知の方法を用いて伸長または伸展されていてもよい。ＤＮＡを伸展させる方法は、KH Rasmussen, R Marie, JM Lange, WE Svendsen, A Kristensen, and KU Mir, Lab Chip, 2011, 11:1431-44, and A device for extraction, manipulation and stretching of DNA from single human chromosomes; DLV Bauer, R Marie, KH Rasmussen, A Kristensen, KU Mir, 2012 Nucl Acids Res, 2012, 1-7, DNA catenation maintains structure of human metaphase chromosomesに記載されている。
【００４４】
検出可能な標識または部分は当業者に公知である。本明細書において、「検出可能な標識」という用語は、標的核酸の同定に用いることができる標識を指す。検出可能な標識は、当業者に公知の方法を用いてｇＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質に結合させる。あるいは、ｇＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質が結合対の半分を含み、対応する結合対のもう半分が検出可能な標識に結合していてもよい。このように、標識を、結合対の結合により、ｇＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質に間接的に結合させることができる。好適な結合対または結合力は、当業者に公知であり、相補的核酸配列、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ＮＨＳ−エステルなど、チオエーテル結合、静電荷相互作用、ファンデルワールス力など（例えば、Holtke et al.、米国特許第５，３４４，７５７号；同第５，７０２，８８８号；および同第５，３５４，６５７号；Huber et al.、米国特許第５，１９８，５３７号；Miyoshi、米国特許第４，８４９，３３６号；Misiura and Gait、国際公開第９１／１７１６０号参照）を含む。ビオチン、またはその誘導体を、オリゴヌクレオチド標識として（例えば、標的化部分、回収可能部分（retrievable moiety）、および／または検出可能な標識として）用い、その後、（例えば、検出可能に標識された）アビジン／ストレプトアビジン誘導体（例えば、フィコエリトリン結合ストレプトアビジン）または抗ビオチン抗体（例えば、検出可能に標識された抗体）を結合させてよい。ジゴキシゲニンを標識として取り込ませて、その後、検出可能に標識された抗ジゴキシゲニン抗体（例えば、検出可能に標識された抗体、例えば蛍光標識された抗ジゴキシゲニン）を結合させてよい。アミノアリル−ｄＵＴＰ残基をオリゴヌクレオチド中に取り込ませ、その後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体化蛍光色素にカップリングさせてもよい。一般的に、検出可能に標識されたコンジュゲートパートナーを結合させて検出可能にする限りにおいて、コンジュゲート対の任意のメンバーを回収可能部分および／または検出可能な標識に取り込ませてもよい。本明細書において、抗体という用語は、任意のクラスの抗体分子またはその任意の細断片、例えばＦａｂを指す。
【００４５】
検出可能な標識のサイズおよび組成は大きく異なっていてもよい：以下の参照文献は具体的な実施形態に適切なオリゴヌクレオチドタグを選択するためのガイダンスを提供する：Brenner、米国特許第５，６３５，４００号；Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 1665; Shoemaker et al. (1996) Nature Genetics, 14:450；Morris et al.、欧州特許出願公開第０７９９８９７（Ａ１）号；Wallace、米国特許第５，９８１，１７９など。
【００４６】
検出可能な標識を核酸プローブ中に取り込ませる方法は周知である。通常は、例えばＰＣＲによる重合または増幅ステップ、ニックトランスレーション、ランダムプライマー標識、末端トランスフェラーゼテーリング（例えば、１または複数の標識を、プライマー配列の切断後に加えることができる）、およびその他の最中に、検出可能な標識を（例えば、ハプテン結合デオキシリボヌクレオチドまたは蛍光色素結合デオキシリボヌクレオチドとして）核酸プローブなどの核酸に取り込ませる（Ausubel et al., 1997, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York参照）。
【００４７】
本明細書に記載されているように検出可能な部分、標識、またはレポーターを用いて標的核酸を検出することができる。ガイドＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質を、蛍光部分、ハプテン、発色部分などの検出可能な部分の直接または間接的な結合などの種々の方法で標識することができる。標識が結合され得る位置は、本明細書中で、標識付加部位または検出可能部分の付加部分と呼ばれ、標識を結合可能なヌクレオチドを含んでいてもよい。当業者は、核酸またはタンパク質の標識化に関する参照文献を参考にすることができる。検出可能な部分の例としては、種々の放射活性部分、酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、金属粒子、タンパク質−タンパク質結合対、タンパク質−抗体結合対などが含まれる。蛍光部分の例としては、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、シアニン、塩化ダンシル、フィコシアニン、フィコエリトリンなどが含まれるが、これらに限定されない。生物発光マーカーの例としては、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシ（click beetle）など）、ルシフェリン、エクオリンなどが含まれるが、これらに限定されない。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素システムの例としては、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。同定可能なマーカーとしてはさらに、放射活性化合物、例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈが含まれる。同定可能なマーカーは種々の供給元から市販されている。
【００４８】
蛍光標識、およびヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドへの蛍光標識の結合は、Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Ninth Edition (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller and Manak, DNA Probes, 2nd Edition (Stockton Press, New York, 1993); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); およびWetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26:227-259 (1991)）などの多くの総説に記載されている。本発明に応用可能な具体的な方法論が以下の参照文献の例に開示されている：米国特許第４，７５７，１４１号、同第５，１５１，５０７号、および同第５，０９１，５１９号。ある態様では、例えば米国特許第５，１８８，９３４号（４，７−ジクロロフルオレセイン色素）；同第５，３６６，８６０号（スペクトル分解可能なローダミン色素）；同第５，８４７，１６２号（４，７−ジクロロローダミン色素）；同第４，３１８，８４６号（エーテル置換フルオレセイン色素）；同第５，８００，９９６号（エネルギー転移色素（energy transfer dye））；Lee et al.；同第５，０６６，５８０号（キサンチン色素）；同第５，６８８，６４８号（エネルギー転移色素）などに開示されているように、標識された標的配列の標識として１または複数の蛍光色素を用いる。標識は、以下の特許および特許出願に開示されているように、量子ドットを用いて行うこともできる：米国特許第６，３２２，９０１号、同第６，５７６，２９１号、同第６，４２３，５５１号、同第６，２５１，３０３号、同第６，３１９，４２６号、同第６，４２６，５１３号、同第６，４４４，１４３号、同第５，９９０，４７９号、同第６，２０７，３９２号、米国特許出願公開第２００２／００４５０４５号、および同第２００３／００１７２６４号。本明細書において、「蛍光標識」という用語は、１または複数の分子の蛍光吸収および／または放出特性を通じて情報を伝えるシグナル伝達部分を含む。そのような蛍光特性には、蛍光強度、蛍光寿命、発光スペクトル特性、エネルギー転移などが含まれる。
【００４９】
ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列に容易に取り込まれる市販の蛍光ヌクレオチドアナログとしては、これらに限定されるものではないが、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャム・バイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−５−ｄＵＴＰ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（商標）−７−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）Ｒ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）−５−ｄＵＴＰ、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）（商標）４８８−５−ｄＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−１２−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）  ６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）  ６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ４８８−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ５３２−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ５６８−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ５９４−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ５４６−１４−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−５−ＵＴＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（商標）−７−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）  ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）Ｒ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）  ＴＲ−１４−ＵＴＰ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）−５−ＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ４８８−５−ＵＴＰ、ＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ５４６−１４−ＵＴＰ（モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州）などが挙げられる。あるいは、上記フルオロフォアおよび本明細書に記載のものは、例えばホスホロアミダイトまたはＮＨＳケミストリーを用いてオリゴヌクレオチド合成中に添加され得る。他のフルオロフォアを有するヌクレオチドをカスタム合成するためのプロトコールは当該技術分野で公知である（Henegariu et al. (2000) Nature Biotechnol. 18:345参照）。２−アミノプリンは、オリゴヌクレオチド配列の合成中にその中に直接取り込ませることができる蛍光塩基である。ＤＡＰＩ、ＹＯＹＯ−１、臭化エチジウム、シアニン色素（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）などのインターカレーション色素で事前に核酸を染色することもできる。
【００５０】
合成後の結合に利用可能な他のフルオロフォアとしては、これらに限定されるものではないが、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ４０５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ４３０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）  ６４７、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、ダンシル、リサミンローダミンＢ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、ローダミン  ６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州から入手可能）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャム・バイオサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）などが挙げられる。これらに限定されるものではないが、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ａｌｅｘａ色素（６１０、６４７、６８０）、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ色素などのＦＲＥＴタンデムフルオロフォアを用いることもできる。
【００５１】
ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、およびＡＰＣ−Ｃｙ７；さらに、ＰＥ−Ａｌｅｘａ色素（６１０、６４７、６８０）およびＡＰＣ−Ａｌｅｘａ色素などのＦＲＥＴタンデムフルオロフォアを用いることもできる。
【００５２】
金属銀または金粒子を用いて、蛍光標識ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列からのシグナルを増強してもよい（Lakowicz et al. (2003) BioTechniques 34:62）。
【００５３】
ビオチン、またはその誘導体を、ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列上の標識として用いた後に、検出可能に標識されたアビジン／ストレプトアビジン誘導体（例えば、フィコエリトリン結合ストレプトアビジン）、または検出可能に標識された抗ビオチン抗体を結合させてもよい。ビオチン／アビジンはリガンド−リガンド結合対の一例である。抗体／抗原結合対を本明細書に記載の方法と共に用いることもできる。他のリガンド−リガンド結合対またはコンジュゲート結合対も当業者に周知である。ジゴキシゲニンを標識として取り込ませた後、検出可能に標識された抗ジゴキシゲニン抗体（例えば、フルオレセイン化抗ジゴキシゲニン）を結合させてもよい。アミノアリル−ｄＵＴＰまたはアミノヘキシルアクリルアミド−ｄＣＴＰ残基をオリゴヌクレオチド配列に取り込ませた後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体化蛍光色素にカップリングさせてもよい。一般的に、検出可能に標識されたコンジュゲートパートナーを結合させて検出可能になる限りにおいて、コンジュゲート対の任意のメンバーを検出オリゴヌクレオチドに取り込ませることができる。本明細書において、抗体という用語は、任意のクラスの抗体分子またはＦａｂなどのその任意の細断片を指す。
【００５４】
その他の好適な標識には、フルオレセイン（ＦＡＭ、ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ダンシル、ビオチン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）、蛍光アミノ酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）（例えば、Ｐ−ｔｙｒ、Ｐ−ｓｅｒ、Ｐ−ｔｈｒ）などが含まれ得る。ある実施形態では、以下のハプテン／抗体対が検出に用いられ、各抗体は検出可能な標識で誘導体化されている：ビオチン／α−ビオチン、ジゴキシゲニン／α−ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）／α−ＤＮＰ、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）／α−ＦＡＭ。
【００５５】
ある例示的実施形態では、例えば米国特許第５，３４４，７５７号、同第５，７０２，８８８号、同第５，３５４，６５７号、同第５，１９８，５３７号、および同第４，８４９，３３６号、国際公開第９１／１７１６０号などに開示されているように、ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列をハプテンで間接的に標識し、その後、これに捕捉剤（capture agent）を結合させてもよい。多くの異なるハプテン−捕捉剤対が使用可能である。例示的なハプテンとしては、ビオチン、デスビオチンおよびその他の誘導体、ジニトロフェノール、ダンシル、フルオレセイン、ＣＹ５、ジゴキシゲニンなどが含まれるが、これらに限定されない。ビオチンの場合、捕捉剤はアビジン、ストレプトアビジン、または抗体であってもよい。抗体を他のハプテンに対する捕捉剤として用いてもよい（多くの色素−抗体対が市販されている。例えば、モレキュラープローブス社、ユージーン、オレゴン州）。
【００５６】
ある態様では、本明細書に記載の検出可能な部分はスペクトル的に分解可能（spectrally resolvable）である。複数の蛍光標識に関して「スペクトル的に分解可能」とは、標識の蛍光発光バンドが十分に異なり、すなわち、十分に非重複であり、米国特許第４，２３０，５５８号、同第４，８１１，２１８号など、またはWheeless et al., pp21-76, Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1985)に記載のシステムによって例示される、例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシステムを用いた標準的な光検出システムなどにより、それぞれの標識によって生成される蛍光シグナルに基づいて、それぞれの標識が結合する分子タグを区別できることを意味する。ある態様では、フルオレセイン、ローダミンなどの、スペクトル的に分離可能な有機色素とは、発光極大波長（wavelength emission maxima）が少なくとも２０ｎｍ離れていること、その他の態様では少なくとも４０ｎｍ離れていることを意味する。その他の態様では、キレート化されたランタニド化合物、量子ドットなど、スペクトル的に分離可能とは、発光極大波長が少なくとも１０ｎｍ離れていること、その他の態様では少なくとも１５ｎｍ離れていることを意味する。
【００５７】
ある実施形態では、検出可能な部分は、電子顕微鏡と併用した場合、通常の核酸と比べて高い検出性をもたらすことができる。より高い検出性を有する部分は、しばしば、酢酸水銀、白金ジメチルスルホキシド、複数の金属−ビピリジル錯体（例えば、オスミウム−ｂｉｐｙ、ルテニウム−ｂｉｐｙ、白金−ｂｉｐｙ）などの金属および有機金属のグループに属する。これらの部分のいくつかは容易に特異的に核酸を染色することができるが、これらの部分を核酸に結合させるためにリンカーを用いることもできる。合成中にヌクレオチドに付加されるそのようなリンカーとしては、ａｃｒｙｄｉｔｅで修飾された実体（ｅｎｔｉｔｙ）およびチオールで修飾された実体、アミン反応性基、ならびにクリックケミストリーを実施するためのアジド基およびアルキン基が挙げられる。ガンマ−アデノシンチオ三リン酸、ヨードデオキシシチジン三リン酸、およびメタロヌクレオシド（metallonucleoside）一般（Dale et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 70, No. 8, pp. 2238-2242 (1973)参照）などのいくつかの核酸アナログもより検出可能である。修飾ヌクレオチドは合成中に付加される。合成とは、例えばオリゴヌクレオチドの固相合成を指し得る。この場合、核酸アナログであってもよい修飾核酸、または検出可能な部分もしくは結合ケミストリーリンカー（attachment chemistry linker）で修飾された核酸が、固相上で形成中の核酸断片に次々と加えられ、ホスホラミダイトによる合成が最も一般的な方法である。合成は、ポリメラーゼが核酸鋳型の相補鎖を合成している間の、ポリメラーゼにより行われるプロセスを指すこともある。あるＤＮＡポリメラーゼは、核酸アナログ、または検出可能な部分もしくは相補的核酸鋳型への結合ケミストリーリンカーのいずれかで修飾された修飾核酸を用い、取り込ませることができる。
【００５８】
用いられる検出方法は、反応性標識、回収可能な標識、および／または検出可能な標識において使用される具体的な検出可能な標識によって決まる。ある例示的な実施形態では、本明細書に記載のプローブを介して１または複数の反応性標識、回収可能な標識、または検出可能な標識が結合した、細胞周期の種々の時期、例えば、これらに限定されるものではないが、間期、前期前、前期、前中期、中期、後期、終期、および細胞質分裂期の染色体および染色体のサブ染色体領域などの標的核酸が、顕微鏡、分光光度計、チューブルミノメーターまたはプレートルミノメーター、ｘ線フィルム、シンチレーター、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）装置、マイクロフルイディクス装置などを用いて選択および／またはスクリーニングされ得る。
【００５９】
本明細書において、「染色体」という用語は、ＤＮＡ、タンパク質、ＲＮＡ、および他の関連する因子を含む、生細胞中の遺伝を伝える遺伝子の担体（support）を指す。本明細書中では、ヒトゲノムの染色体を同定およびナンバリングするための通常の国際的システムを用いる。個々の染色体のサイズは、マルチ染色体ゲノム内で異なっていてもよく、ゲノム間でも異なっていてもよい。染色体は任意の種から得ることができる。染色体は、成体の対象、若年の対象、乳児の対象、生まれていない対象（例えば、羊水穿刺、絨毛採取などの出生前検査などにより胎児から、または例えば胎児手術中に、胎児から直接）、生物学的試料（例えば、生物学的組織、体液、または細胞（例えば、痰、血液、血液細胞、組織または細針生検試料、尿、脳脊髄液、腹腔液、および胸膜液、またはそれらに由来する細胞）、または細胞培養試料（例えば、初代細胞、不死化細胞、半不死化細胞など）から得ることできる。ある例示的な実施形態では、１または複数の属から１または複数の染色体を得ることができ、そのような属には、ヒト属、ショウジョウバエ属、線虫属、ダニオ属、コイ属、ウマ属、イヌ属、ヒツジ属、タイヘイヨウサケ属（Ocorynchus）、タイセイヨウサケ属、ウシ属、イノシシ属、ヤケイ属、ナス属、コムギ属、イネ属、トウモロコシ属、オオムギ属、バショウ属、カラスムギ属、ポプラ属、アブラナ属、サトウキビ属などが含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
蛍光標識された標的化部分または検出可能な標識を用いる場合、蛍光写真顕微鏡（fluorescence photomicroscopy）を用いて、当該技術分野で公知の通常の方法を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を検出および記録することができる。あるいは、画像処理能を有するデジタル（コンピューターにより実行される）蛍光顕微鏡を用いることもできる。複数色の標識が結合した染色体のＦＩＳＨをイメージングするための２つの周知のシステムに、マルチプレックス−ＦＩＳＨ（Ｍ−ＦＩＳＨ）およびスペクトル核型決定（ＳＫＹ）が含まれる。染色体のペイント方法およびペイントされた染色体の検出方法の総説については、Schrock et al. (1996) Science 273:494; Roberts et al. (1999) Genes Chrom. Cancer 25:241; Fransz et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14584; Bayani et al. (2004) Curr. Protocol. Cell Biol. 22.5.1-22.5.25; Danilova et al. (2008) Chromosoma 117:345；米国特許第６，０６６，４５９号；およびＦＩＳＨ  ＴＡＧ（商標）  ＤＮＡ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  Ｋｉｔの説明書（モレキュラープローブス社）を参照されたい。
【００６１】
ある例示的な実施形態では、改変を加えた（例えば、ソフトウェア、Ｃｈｒｏｍａ  ８４０００フィルターセット、および強化フィルターホイール（enhanced filter wheel））Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドイメージングコーポレイション、サンタクララ、カリフォルニア州）などのコンピューター化されたイメージングシステムを用いて、蛍光標識された染色体の画像が検出および記録される。その他の好適なシステムとして、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡に接続した冷却ＣＣＤカメラ（Ｋｏｄａｋ  ＫＡＦ  １４００  ＣＣＤを備えたＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ社のＮＵ２００シリーズ）を用いたコンピューター化されたイメージングシステムが含まれ、画像はRied et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1388）に記載されているように処理される。その他の好適なイメージングおよび分析システムが前述のSchrock et al.および前述のSpeicher et al.に記載されている。
【００６２】
本明細書に記載の方法によって作製されたプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を、種々の生物学的または臨床的試料に対して、細胞周期の任意（または全て）の段階（例えば、有糸分裂期、減数分裂期、間期、Ｇ０、Ｇ１、Ｓ、および／またはＧ２）にある細胞中で行うことができる。例としては、全ての種類の細胞培養物、動物または植物の組織、末梢血液リンパ球、頬側スミア、無培養原発性腫瘍から調製された擦過標本（touch preparation）、癌細胞、骨髄、生検から得られた細胞または体液（例えば、血液、尿、痰など）中の細胞、羊水由来の細胞、母体血由来の細胞（例えば、胎児細胞）、精巣および卵巣に由来する細胞などが含まれる。試料は、通常、試料または検体の採取源に応じた通常の技術を用いて本発明のアッセイ用に調製される。これらの例は、本明細書に記載の方法および／または組成物に適用可能な試料の種類を限定するものと解釈されるべきではない。
【００６３】
ある例示的な実施形態では、プローブは、それぞれ異なる標識をされた（すなわち、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体のうちの少なくとも２つが異なって標識されている）複数のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を含む。複数色染色体ペインティングの種々のアプローチが当該技術分野で報告されており、本明細書に記載の指針に従って本発明に適用させることができる。そのようなそれぞれ異なる標識（「複数色ＦＩＳＨ」）の例としては、Schrock et al. (1996) Science 273:494およびSpeicher et al. (1996) Nature Genet. 12:368）に記載のものが含まれる。Schrock et al.は、スペクトル的イメージング方法を記載しており、この方法では、落射蛍光フィルターセットおよびコンピューターソフトウェアを用いて、一組の標的染色体セットに同時にハイブリダイズさせた、異なって標識された複数のＤＮＡプローブの検出および識別を行う。Speicher et al.は、「ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｕｌｔｉｆｌｕｏｒ  ＦＩＳＨ」）と名付けられた２７色のＦＩＳＨにおいてヒト染色体（または染色体腕）の各々を標識するための５つの蛍光色素の異なる組合せの使用を記載している。その他の好適な方法を用いることもできる（例えば、Ried et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1388-92参照）。
【００６４】
ある態様では、標的ＤＮＡを一本鎖にする必要なく、天然二本鎖ＤＮＡ上の目的の領域をプロービングしてアクセスするためにＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が用いられる。目的の標的二本鎖核酸配列に特異的なガイドＲＮＡを当業者に公知の方法を用いて設計し、Ｃａｓ９とプレインキュベートした後、標的ＤＮＡを含む試料に加える。その後、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９は標的ＤＮＡに共局在してこれと複合体を形成する。
【００６５】
本開示に基づき、当業者は、標的核酸を含むＤＮＡに共局在するガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を容易に同定または設計することができる。当業者はさらに、ガイドＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質に直接的または間接的のいずれにせよ結合させるための検出可能な部分を同定することができる。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡが挙げられる。
【００６６】
ある態様では、目的の配列に特異的なガイドＲＮＡを設計する。ｇＲＮＡをＣａｓ９とプレインキュベートした後、この組合せを、標的ＤＮＡを含む試料に加えるか、別の方法で標的ＤＮＡに接触させる。ｇＲＮＡまたはＣａｓ９は検出可能な標識を含んでもよく、複合体形成後に検出可能な標識が加えられてもよい。コンポーネントの混合物の全てが溶液で提供されてもよく、あるいは、標的核酸は表面に固定されてもよく、細胞もしくは組織内に存在してもよい。
【００６７】
本開示の態様によれば、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムには（適切な設計で）配列特異的であるという利点があり、標的配列は、ｇＲＮＡ上の１７〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列により「プログラム」される。
【００６８】
Ｃａｓ９システムは、ｇＲＮＡの「シード」領域中に特定の配列が用いられた場合、非常に効率的な結合を示し、これは、ゲノム中におけるこれらの短い配列の頻繁な出現に基づいたゲノムマッピングツールとして用いることができる。
【００６９】
Ｃａｓ９システムはさらに、ｇＲＮＡの非シード領域で縮重位置（および／またはユニバーサル塩基）を用いることにより、マッピングツールとなるように改変することができる。
【００７０】
標識化の特異性を高めるために、目的の遺伝子座の周辺にガイドのクラスターを結合させることができる。
【００７１】
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの直接固相合成（ＩＤＴ社などの業者で利用可能）により、または固相合成されたＤＮＡオリゴのインビトロ転写により作製することができる。
【００７２】
ｇＲＮＡは、アレイ合成されたオリゴ（必要な約１００〜２００ｎｔより大きい長さで利用可能）から容易に合成することができ、増幅することができるので、各ガイドのコストが非常に低くなり、多数のｇＲＮＡの作製が容易に拡張可能になる。例えば、カスタムアレイ社（Ｃｕｓｔｏｍ  Ａｒｒａｙ  Ｉｎｃ．）は、１回の機器のランにより、ｇＲＮＡ作製に適した９０，０００のアレイ合成オリゴを提供することができる。
【００７３】
反応動態（reaction kinetic）は、等温（３７度、あるいは室温）、迅速、１分未満であり、得られる複合体は非常に安定であり、容易にプロービング可能である。
【００７４】
標的ＤＮＡは、溶液中のまたは表面に固定されたバルクＤＮＡ、細胞中のｉｎ  ｓｉｔｕのＤＮＡ、表面に広げられた染色体上のＤＮＡ、および表面上またはナノチャネル中の伸展された単一ＤＮＡ分子であり得る。
【００７５】
他の改変されたヌクレアーゼ、例えばホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、原核生物アルゴノート（ｐＡｇｏ）、またはＢｕｒｒＨ系ヌクレアーゼ（ＢｕｒｒＨ−ｂａｓｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＢｕＤＮ）を、Ｃａｓ９の代わりにまたはＣａｓ９と同時に用いることができる。例えば、ＴｔＡＧＯは、ＲＮＡに対する高い親和性を示し、且つｄｓＤＮＡへの低い親和性を示す。
【００７６】
ある態様では、Ｃａｓ９タンパク質を直接標識することにより（例えば、量子ドットまたは有機色素に結合したアフィニティータグを介して）、ＤＮＡ結合Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡを検出することができる。市販のＣａｓ９タンパク質は既にアフィニティータグを含んでいる（ＰＮＡＢｉｏ社のＣａｓ９はヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）を含み、ニュー・イングランド・バイオラボ社から入手可能なＣａｓ９はヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを含む。ｇＲＮＡの３′末端のテール部分などでｇＲＮＡを標識することにより、テール部分がプロービングされ得、ＤＮＡ結合Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡを検出することができる。例えば、蛍光部分をテールに結合させることができ、異なる色のプローブを結合させてコーディングスキームを作成することができ、プローブを交換してコードのレパートリーを増やすことができる。ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴと組み合わせ、超分解能イメージング（super-resolution imaging）を実現することができる。流体素子（fluidic device）と組み合わせ、ＥＸＣＨＡＮＧＥ−ＰＡＩＮＴを行うことができ、これにより超分解能での多重化（multiplexing）が可能になる。このスキームでは、各サイクルで同じ色（colors）が使用されるが、異なるＤＮＡ  ＰＡＩＮＴイメージャー（imager）配列に色が関連付けられる、試薬交換のサイクルを行うことにより、限定された数のコードを用いて、多数の遺伝子座の超分解能イメージングを行うことができる。例えば、Ｃｙ３Ｂ、Ａｔｔｏ  ６５５を含むたった２種の標識を、各回異なるイメージャー配列とカップリングさせて５回用いることにより、１０種のｇＲＮＡをコーディングすることができる。各サイクルで、ｇＲＮＡのサブセットが標識される。サイクルが完了した後、ｇＲＮＡのアイデンティティーは、色および特定のｇＲＮＡが光を発するサイクル数を決定することにより解読される。
【００７７】
シグナル強度を増強するために、複数のフルオロフォアで標識されたオリゴをｇＲＮＡのテール部分に結合させてもよい。あるいは、テールに結合してパッドロックプローブとして環状化するオリゴを用いることにより、テールの３′末端によってプライミングされるローリングサークル増幅を行うことができる。ハイブリダイゼーション連鎖反応または当業者に公知の他のシグナル増幅方法も用いることができる。
【００７８】
検出方法としては、蛍光検出方法、エレクトロルミネセンス検出方法、化学発光検出方法、生物発光検出方法、および比色検出方法が含まれる。
【００７９】
蛍光、エレクトロルミネセンス、化学発光、生物発光、または比色の部分または複合体の検出を含む方法以外の検出方法を用いることもでき、例として、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ結合ＤＮＡ鎖をナノポアまたはナノギャップまたはナノチャネルを通過させてＣａｓ９−ｓｇＲＮＡの結合位置を決定すること、電子顕微鏡または走査型プローブ顕微鏡を用いて、表面上の伸長された／伸展されたＤＮＡへのＣａｓ９−ｓｇＲＮＡの結合位置を検出すること、カンチレバー、水晶発振子マイクロバランス、電界効果トランジスターなどを用いて標的ＤＮＡへのＣａｓ９−ｓｇＲＮＡの結合を検出することが挙げられる。
【００８０】
ある態様では、標的核酸におけるｇＲＮＡとＣａｓ９の複合体の存在は、当業者に公知のナノポアもしくはナノギャップ検出技術またはナノポアもしくはナノギャップシーケンシング技術を用いて決定される。簡潔に述べると、導電性の媒体中でｇＲＮＡおよびＣａｓ９が結合した標的核酸を電圧差の影響下でナノポアを通過させる。イオン電流の界面依存的変化を用いて、個々のヌクレオチドと核酸に結合したｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体とを区別する。このようにして、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の存在を検出することができる。ある態様では、イオン電流の界面依存的変化により、ナノポアまたはナノギャップ中への標的核酸の進入、およびｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が標的核酸に結合しているかどうか、および１または複数の結合位置が決定される。線状重合体として核酸がナノポアに進入すると、ポア中の重合体の物理的存在がポア中のイオンの流れを乱すため、イオン電流が低下する。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体がＤＮＡ上の特定の位置に結合している場合、その位置がポアに進入すると、イオンの流れはさらに低下し、イオン電流が低下する。この電流の低下はｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が標的核酸に結合していることを示している。そのサイズおよび物理化学的特性に応じて、標的核酸（すなわち、ＤＮＡ重合体）に結合した各種の構造体または複合体は、イオン電流の特徴的変化を生じさせる。異なる位置またはアレルを標的とするｇＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体を別々に標識して、ナノポアの読取りでこれらが区別できるようにすることができる。
【００８１】
「ナノポア」とは、平面状の表面または膜を通る孔または通路などの、ナノメートルスケールの幅を有する孔または通路を意味する。ナノポアは、脂質二重層などの多量体タンパク質環によって形成され得る。ナノポアは、窒化ケイ素、グラフェン、またはそのような非生物学的材料の固体平面状表面中の物理的孔であってもよい。通常、通路の幅は０．２〜２５ｎｍである。本明細書において、ナノポアは、分子の膜通過を可能にする膜貫通構造を含み得る。ナノポアの例としては、α溶血素（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））およびＭｓｐＡ（Mycobacterium smegmatis）が含まれる。ナノポアのその他の例は、ナノポアシーケンシングを記述している技術分野中に見出すことができ、あるいは、β−ＰＦＴ類Ｐａｎｔｏｎ−ＶａｌｅｎｔｉｎｅロイコシジンＳ、アエロリジン、およびクロストリジウムε毒素、α−ＰＦＴ類細胞溶解素Ａ、二成分（binary）ＰＦＴ炭疽毒素などの孔形成毒素、またはニューモリシンもしくはグラミシジンなどのその他のものとして当該技術分野で記述されていることがある。ナノポアは、ナノポアシーケンシング技術の出現と共に技術的および経済的に重要になってきている。ナノポアシーケンシングの方法は、例えば参照により援用される米国特許第５，７９５，７８２号に記載されているように、当該技術分野で公知である。簡潔に述べると、ナノポア検出は、電圧伝導性流体（voltage-conducting fluid）、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＮｉＣｌ、ＬｉＣｌ、または当業者に公知のその他のイオンを形成する無機化合物などのイオン溶液に浸したナノポア穿孔膜を含む。電圧が膜に印加され、ナノポアを通したイオンの伝導により電流が生じる。ナノポアがＤＮＡなどの重合体と相互作用すると、所与の時点でポア中を移行する重合体サブ断片の特徴に応じて、例えばモノマー特異的に、ナノポア中の流れが変わり、その結果、モノマーまたはサブ断片の同定を可能にする電流の変化が生じる。本開示の範囲に含まれるナノポアとしては、当業者に公知の固体非タンパク質ナノポアおよび当業者に公知のＤＮＡ折り紙ナノポアが含まれる。そのようなナノポアは、既知のタンパク質ナノポアより大きなナノポア幅を提供し、二本鎖標的核酸とＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体などのより大きな検出用分子が通過できるが、複合体がナノポアを通過する際のイオン電流の変化を検出するのに十分な感度を有したままである。
【００８２】
「ナノポア分析」とは、重合体とナノポアの相互作用に基づいてｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を含むポリヌクレオチドなどの重合体のコンポーネントを決定する方法を意味する。ナノポア分析は、重合体との相互作用によって開口部のサイズが変化する際に起こる、ナノポアを通るイオンのコンダクタンスの変化を測定することにより実現され得る。
【００８３】
ナノポアに加えて、本開示は、ギャップの幅が約０．２〜約２５ｎｍまたは約２〜約５ｎｍなどの約数ナノメートルである、２つの電極間のギャップとして当該技術分野で知られるナノギャップの使用を想定する。ギャップは、ナノポアの開口部を模倣しており、ＤＮＡが電極間でギャップを通過するか、または超えることを可能にする。本開示の態様はさらにナノチャネルの使用を想定する。ＤＮＡが通過するナノチャネルに隣接して電極が配置される。それに加えて、またはその代わりに、複合体が光学的に標識される場合、ナノチャネル中で伸展されたＤＮＡ重合体に沿って結合した複合体の位置を決定することができる。電場中の分子または部分の移動および電場を通過する構造体を表す電場の歪みの発生に基づく、分子または部分の同定およびシーケンシングの異なる実施形態を当業者は容易に想像できると理解されるべきである。
【００８４】
その他の態様では、Ｃａｓ９ニッカーゼを用いて標的二本鎖核酸にニックを形成することができ、ニックを、ポリメラーゼまたはリガーゼに基づくシーケンシングのための、配列に定義されるプライミング部位として用いることができ、これにより、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ標的部位の周辺の配列情報が明らかになる。ゲノムの多数の選択された部分、例えばエクソーム、ＧＷＡＳシグナルによって同定される領域、心疾患、癌などに関連する特異的遺伝子のシーケンシングを可能にするガイドのライブラリーを設計することができる。プライマー伸長を用いて、蛍光ヌクレオチドの取込み、ライゲーション、または蛍光ヌクレオチドの取込み後のライゲーションなどにより、ニック形成部位を標識することもできる。プライマー伸長が既存の鎖を置換する場合、例えば置換されたフラップへのオリゴのハイブリダイゼーションによりそれを標識することができる。ガイドの一部が縮重配列を含む場合など、複数のニック形成部位がある場合、複数の標識部位をマッピングツールとして用いることができる。プライマー伸長法は当業者に公知である。
【００８５】
本明細書に記載されている方法の具体的な応用例としては、同定または診断またはマッピング方法が挙げられる。図６Ａに示されているようなセントロメア反復などのヒトゲノムの「暗黒物質（dark matter）」へのアクセス。セントロメアＤＮＡ配列は、その高い反復性のため、現在の参照ゲノムから大部分が欠落している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた本明細書に記載されている単一分子をマッピングまたはシーケンシングする方法は、標的化された様式で、超分解能で反復部位をマッピングして、さらにそれらの部位からのシーケンシングを可能にすることにより、参照ゲノムのより完全なアセンブリーを可能にする。そのような方法は個人的なゲノムと共に用いることができる。
【００８６】
本開示に係る方法には、標識クローンを用いて現在行われているよりも高い効率および分解能で染色体スプレッドのＦＩＳＨを行うことも含まれる。標識されたｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、よりきれいなシグナルを得ることを可能にするので、本明細書に記載の例示的方法における効果的なＦＩＳＨプローブである。この方法により、多くの癌および不妊問題に関連する染色体切断点（chromosomal breakpoint）、複雑な転座または再編成のより速くより良い同定が可能になる。
【００８７】
本開示に係る方法はインビトロ診断を可能にする。
【００８８】
本開示に係る方法は、迅速な診断プラットフォームに関連して、細菌またはウイルスにおける多剤耐性をコードする遺伝子のプロービングを可能にし、これに関連して、ｄｓＤＮＡを直接および安定的に標的化するためにＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを用いることができる。
【００８９】
以下の例示的方法も本開示に含まれる。
【００９０】
Ｍｇの存在を含む野生型Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、（ａ）核酸を、ヌクレアーゼ活性を有するか、または保持しているＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む複合体と、複合体が核酸に結合し、核酸を切断するが、核酸から容易に解離しない（すなわち、核酸に結合したままであり、切断された鎖の両方を保持する条件下で）接触させること、および（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、そのような条件は、Ｍｇ２＋などの二価カチオンの存在を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも１つのコンポーネントが標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは天然ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは人工ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９はＣａｓ９の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドＲＮＡのシード領域、すなわちＰＡＭ部位に隣接する４〜７ヌクレオチドだけを含む。
【００９１】
Ｍｇ非存在下での野生型Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、（ａ）核酸を、ヌクレアーゼ活性を有するか、または保持しているＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む複合体と、複合体が核酸に結合し、核酸を切断せず、核酸から容易に解離しない条件下で接触させること、および（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、そのような条件は、Ｍｇ２＋などの二価カチオンの欠如を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも１つのコンポーネントが標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは天然ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは人工ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９はＣａｓ９の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは切断型ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドＲＮＡのシード領域、すなわちＰＡＭ部位に隣接する４〜７ヌクレオチドだけを含む。
【００９２】
欠損／Ｄｅａｄ  Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、（ａ）核酸を、（例えばＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ  ｄＣａｓ９）などの酵素的に不活性な、またはヌクレアーゼ欠損のＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む複合体と、複合体が核酸を切断せず、核酸から容易に解離しない条件下で接触させること、および（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも１つのコンポーネントが標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは天然ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは人工ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９はＣａｓ９の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは切断型ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドＲＮＡのシード領域、すなわちＰＡＭ部位に隣接する４〜７ヌクレオチドだけを含む。
【００９３】
ニッカーゼＣａｓ９
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、（ａ）核酸を、Ｃａｓ９ニッカーゼ（すなわち、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ変異体またはＨ８４０Ａ変異体などのＣａｓ９タンパク質のニック形成変異体）およびガイドＲＮＡを含む複合体と、複合体が核酸から容易に解離しない条件下で接触させること、および（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも１つのコンポーネントが標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは天然ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは人工ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９はＣａｓ９の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは切断型ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドＲＮＡのシード領域、すなわちＰＡＭ部位に隣接する４〜７ヌクレオチドだけを含む。
【００９４】
ＤＮＡ結合タンパク質なしでガイドＲＮＡを用いる方法
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、（ａ）ガイドＲＮＡが核酸から容易に解離しない条件下で核酸をガイドＲＮＡと接触させること、および（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じるガイドＲＮＡ−ＤＮＡ複合体は標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、標識またはタグはテール上にある。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは天然ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは人工ＰＡＭ部位に隣接する配列に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＰＡＭ部位に隣接する配列への結合を必要としない。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは切断型ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのシード領域、すなわちＰＡＭ部位に隣接する４〜７ヌクレオチドだけを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は反復ＤＮＡの領域であり、シグナルは増幅される。いくつかの実施形態では、標的核酸はガイドＲＮＡの添加前に変性される。
【００９５】
ＲＮＡを用いる方法
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、（ａ）ＲＮＡが核酸に結合する条件下で核酸をＲＮＡと接触させること、および（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じるＲＮＡ−ＤＮＡ複合体は標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、標識またはタグはテール上にある。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は反復ＤＮＡの領域であり、シグナルは増幅される。
【００９６】
二本鎖を不安定化／開鎖（open）する試薬およびＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、（ａ）核酸を、二本鎖の不安定化／開鎖試薬およびガイドＲＮＡまたはＲＮＡと、複合体が形成されて核酸に結合して複合体が核酸から容易に解離しない条件下で接触させること、および（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも１つのコンポーネントは標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、標識またはタグはテール上にある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９はＣａｓ９の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは切断型ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドＲＮＡのシード領域、すなわちＰＡＭ部位に隣接する４〜７ヌクレオチドだけを含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子座は反復ＤＮＡの領域であり、シグナルは増幅される。不安定化試薬（一本鎖ＤＮＡ安定化剤を含む）には、ヘリカーゼ、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）、大腸菌の一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、ベタイン、ベタイン／グリシン、ホルムアミド、尿素、ＤＭＳＯなどが含まれる。二本鎖開鎖試薬には、プライモソームタンパク質ＰｒｉＡ、三本鎖形成ｂｉｓ−ＰＮＡ、ガンマＰＮＡなどが含まれる。
【００９７】
インビトロＲＮＡ合成およびプロービング
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を検出、標識、プルダウン、または標的化する方法であって、（ａ）、無細胞系でＲＮＡを合成すること、（ｂ）核酸をＲＮＡおよび他のコンポーネントと接触させることであって、これにより複合体が形成され、前記複合体が核酸から容易に解離しないこと、および（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を分析することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、生じる複合体の少なくとも１つのコンポーネントは標識またはタグ化される。いくつかの実施形態では、標識またはタグはテール上にある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９はＣａｓ９の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは切断型ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドＲＮＡのシード領域、すなわちＰＡＭ部位に隣接する４〜７ヌクレオチドだけを含む。
【００９８】
ニック形成およびシーケンシング
いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）複合体が核酸の一方の鎖中にニックを誘導する条件下で、核酸を、Ｃａｓ９タンパク質のニック形成変異体および特異的位置を標的とするガイドＲＮＡを含む複合体と接触させること、（ｂ）ニックの３′末端をヌクレオチドで伸長させること、（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を検出するステップ、およびＤＮＡがシーケンシングされるようにステップ（ｂ）を繰り返すことを含む、標的シーケンシングに関する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは標識されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは末端リン酸で標識されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは４つ以上のリン酸を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、切断可能な結合を介して塩基で標識されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは可逆的ターミネーターである。いくつかの実施形態では、塩基における標識により可逆的な終止がもたらされる。いくつかの実施形態では、糖の３′または２′位における修飾により可逆的な終止がもたらされる。いくつかの実施形態では、４つのヌクレオチド全てが同時に伸長に利用可能である。いくつかの実施形態では、単一分子検出方法が用いられる。いくつかの実施形態では、単一分子は、線状のひも（linear string）として分析される。いくつかの実施形態では、核酸は細胞中でｉｎ  ｓｉｔｕで分析される。核酸が細胞中でｉｎ  ｓｉｔｕで分析されるいくつかの実施形態では、細胞は分析前に固定される。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｓｉｔｕで分析される核酸はＤＮＡ分子であり、分析前にＲＮＡ分子が除去される。いくつかの実施形態では、試薬を用いて、ニック形成後に核酸から複合体が取り除かれる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９はＣａｓ９の変化バージョンである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは切断型ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、切断型ガイドは、ガイドＲＮＡのシード領域、すなわちＰＡＭ部位に隣接する４〜７ヌクレオチドだけを含む。
【００９９】
ニック形成および捕捉
いくつかの実施形態では、ニックの３′末端が修飾ヌクレオチドで伸長される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドはビオチン修飾されている。いくつかの実施形態では、取り込まれたビオチンを用いて、例えば自身が標識されている（または標識される）ストレプトアビジン／ニュートラアビジンまたは抗ビオチン抗体との相互作用を介して、標的ＤＮＡを標識する。いくつかの実施形態では、取り込まれたビオチンを用いて、例えば、磁気ビーズもしくはアガロースビーズなどのビオチンコーティングされた捕捉材料にまたは表面に自身が結合している（または結合する）ストレプトアビジン／ニュートラアビジンまたは抗ビオチン抗体との相互作用を介して、標的ＤＮＡを捕捉する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによって導かれるニック形成および捕捉を助けるように修飾されている塩基の取込みを用いて、溶液中で行われる反応中で、核酸試料の特異的な１または複数の部分を単離する。この実施形態では、例えば、ニック形成およびビオチン化ｄＵＴＰの取込み後、生成物を、ビーズ上のストレプトアビジンがゲノムのビオチン化部分に結合できる長さの時間（例えば、１時間）、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズと反応させる。その後、磁石を適用し、固相ビーズに結合しているゲノムの標的部分を上清から分離することにより、目的の標的領域を単離する。上清は捨てられる。種々の程度の洗浄ストリンジェンシーおよび上清の除去の後、選択されたゲノムＤＮＡは、当該技術分野で公知の方法により（例えば、９０℃超に加熱することにより）、ビーズから分離される。その後、サイズ選択、ポリッシング（polishing）、バーコード化、テーリング（tailing）、ライブラリー作製、クラスター増幅、ロロニー（rolony）増幅などから選択されるステップを含み得る、当業者に公知の次世代シーケンシングの方法およびデバイスなどにより、捕捉された分子をシーケンシングすることができる。核酸試料の一部またはサブセットを選択または濃縮するための本明細書に記載のニック形成および取込みのアプローチは、伸長により複数のビオチンを取り込むことが可能になって捕捉効率が向上される限り、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９の結合と比べて利点がある。もう１つの利点は、標的が捕捉可能になるまでにｇＲＮＡ／ｃａｓ９結合、ニック形成、および伸長の３つのステップが必要なので、オフターゲットな捕捉が減少することである。この選択方法は、既存のアプローチ（例えば、Ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ）よりクリーンであり、オフターゲット配列がより少ないので、シーケンシングが少なくなる。いくつかの実施形態では、ライゲーション反応などニックの５′末端で、例えばビオチン化オリゴヌクレオチドのライゲーションなどの反応を行う。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ二本鎖のセンスおよびアンチセンス鎖を分離することができる。この態様では、一方の鎖がｇＲＮＡ／Ｃａｓ９結合により、またはビオチン化ヌクレオチドの取込みにより捕捉され、他方は上清から回収される。あるいは、二本鎖の、ｇＲＮＡ結合により置換された鎖は、一本鎖結合タンパク質、ヒドロキシアパタイト、または配列特異的オリゴヌクレオチドへの結合により捕捉することができる。
【０１００】
ニック形成および直接シーケンシング
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡにより導かれるニック形成が、表面に結合した標的核酸、すなわちＤＮＡで行われるか、あるいは、ニック形成が行われた後、ＤＮＡを表面に結合させる。いくつかの実施形態では、その後、ニックの３′末端が用いられてＤＮＡシーケンシングを開始させることができる。ニックの３′末端により、ポリメラーゼに基づくシーケンシング、例えばイルミナ社の合成によるシーケンシング（sequencing by synthesis）が可能になる。ニックの３′末端および５′末端の両方により、例ＳＯＬＩＤ（ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））などのライゲーションに基づくシーケンシング、およびライゲーションによるシーケンシング（コンプリートゲノミックス社（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ））が支持される。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは長さが長いままで保持され、これが表面に結合する前または結合した後にニック形成が行われる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡを表面に結合させ、その長さに沿った配列または特徴を分析できるように伸展させるか、または伸長させる。そのような分析は、光学顕微鏡、電子顕微鏡、Ｘ線顕微鏡、または走査型プローブ顕微鏡を用いて行われ得る。いくつかの実施形態では、分析が光学的方法により行われる場合、表面上に配置されたポリヌクレオチド上でのシーケンシング反応に対して全反射照明（Total Internal Reflection）またはエバネッセント光／導波管イメージングが行われる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、線状化されるが、表面に結合しなくてもよい。いくつかの実施形態では、線状化は、ポリヌクレオチドが一方の末端で結合して流れの中でぶら下がる（dangle）ことによって起こる。いくつかの実施形態では、標的核酸、すなわちＤＮＡは、流体力学的抗力により実質的に線状にされる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ナノスリット、ナノチャネル、またはナノグルーブ中に配置されることによりナノコンファインメント（nano-confinement）によって伸展される。いくつかの実施形態では、線状ＤＮＡは実質的に直鎖状（straight）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって導かれるニックは、長い線状ポリヌクレオチド上の複数の選択された配列位置で行われる、合成によるシーケンシングを導く。この実施形態では、ポリメラーゼ酵素（例えば、９  Ｄｅｇｒｅｅ  Ｎｏｒｔｈもしくはその変異体またはＰｈｉ２９もしくはその変異体）が、合成によるシーケンシングにおいて検出可能なヌクレオチドを取り込むことによりニックからの伸長を行う。この検出は、（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングにおけるように）ｐＨを介したものであり得る。いくつかの実施形態では、検出はヌクレオチド上の蛍光標識を介したものである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、蛍光標識されていることに加え、可逆的ターミネーターとしても働き、それにより、当該技術分野で公知の方法（例えば、イルミナ社またはＬａｓｅｒｇｅｎ社のシーケンシング）により、逐次的な４色シーケンシングを行うことができる。取り込まれるヌクレオチドは、ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ（Ｌａｓｅｒｇｅｎ社）であってもよく、光切断可能な部分はＵ���光により切断される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体形成に続くシーケンシングは、選択的または標的化されたシーケンシングを行うことを目的とする。その他の実施形態では、ｇＲＮＡは縮重位置の少なくとも一部を含み、ゲノム中に分布する複数の開始部位からシーケンシングが開始され、これは特定の遺伝子座に選択的ではない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡが細胞内にあるが、ニック形成が起こる。いくつかの実施形態では、細胞は固定されている。例えば、ニック形成は、ＤＮＡがシーケンシングされる蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕシーケンシング（ＦＩＳＳＥＱ）反応の一部を形成し得る。いくつかの実施形態では、ニック形成を用いて、細胞内のゲノムＤＮＡ中にニックを誘導し、その後、例えばＰｈｉ２９などの標準的な鎖置換ポリメラーゼによる分岐またはローリングサークル増幅により、ニックに隣接した領域の増幅を開始する。その後、増幅産物に対してシーケンシングを行う。あるいは、ＴｒｕｅＳｅｑ（Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏ社／ＳｅｑＬＬ社）などの単一分子シーケンシング法を用いて、ニック形成されたゲノムＤＮＡをニックから直接シーケンシングする。
【０１０１】
結合およびナノポア分析
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の配列または結合部位の位置を検出する方法であって、（ａ）複合体が核酸から容易に解離しない条件下で、核酸をＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む複合体と接触させること；（ｂ）ナノポアまたはナノギャップに核酸を通過させること；および（ｃ）結合位置を分析すること、を含む方法に関する。いくつかの実施形態では、単一分子検出方法が用いられる。いくつかの実施形態では、単一チャネル記録が用いられる。いくつかの実施形態では、単一分子は線状のひもとして分析される。
【０１０２】
オフターゲット結合
いくつかの実施形態では、本発明は、ガイドＲＮＡオフターゲット結合部位を検出する方法であって、（ａ）複合体が核酸から容易に解離しない条件下で、核酸をＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む複合体と接触させること、（ｂ）結合位置を検出すること、（ｃ）標的化された結合位置を決定すること、（ｄ）オフターゲット結合の位置を決定すること、および（ｅ）オフターゲット結合の位置によりオフターゲット結合の配列のアイデンティティーを決定することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、標識を用いて目印を与え、これを参照して標的結合またはオフターゲット結合を決定することができる。いくつかの実施形態では、標識は、核酸上の物理地図を作成する結合試薬を含む。いくつかの実施形態では、結合試薬は、非乱雑ｇＲＮＡ（non-promiscous gRNA）、制限酵素、ニッカーゼ酵素、オリゴヌクレオチドなどの１または複数であってもよい。いくつかの実施形態では、単一分子検出方法を用いる。いくつかの実施形態では、単一分子は線状のひもとして分析される。
【０１０３】
コピー数の検出
いくつかの実施形態では、本発明は、染色体またはゲノムの領域のコピー数を決定する方法であって、（ａ）標的核酸配列を、コピー数を決定する対象の染色体またはゲノム領域に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質ならびに参照染色体および／またはゲノム領域に相補的な部分およびＣａｓ９タンパク質と接触させること、（ｂ）コピー数を決定する対象の染色体／ゲノム領域からのシグナルと参照染色体またはゲノム領域からのシグナルとの比率を得ることを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は異数性の検出に応用される。いくつかの実施形態では、異数性はトリソミー２１である。いくつかの実施形態では、コピー数を決定する対象の遺伝子座はＬＳＩ  ２１ｑ２２．１３−ｑ２２．２である。
【０１０４】
Ｈｅｒ２
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｈｅｒ２増幅の程度を決定する方法であって、（ａ）標的核酸配列を、Ｈｅｒ２遺伝子座に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質ならびに参照遺伝子座に相補的な部分およびＣａｓ９タンパク質と接触させること、および（ｂ）参照遺伝子座と比べたＨｅｒ２遺伝子座からのシグナルの比率を得ることを含む方法に関する。
【０１０５】
遺伝子融合
いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子融合の発生率を決定する方法であって、（ａ）標的核酸配列を、第１のゲノム遺伝子座に相補的な部分を有するガイドＲＮＡプローブ配列およびＣａｓ９タンパク質ならびに第２のゲノム遺伝子座に相補的な部分を有するガイドＲＮＡプローブ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させること、（ｂ）第１および第２の遺伝子座間の共局在イベントを検出することであって、遺伝子融合がゲノム領域間の任意の融合であるステップを含む方法に関する。ある態様では、共局在の結果、プローブは互いに隣接する。
【０１０６】
Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔアッセイ
いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子融合の発生率を決定する方法であって、（ａ）標的核酸配列を、ゲノム遺伝子座（第１の遺伝子座）に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質ならびに隣接ゲノム遺伝子座（第２の遺伝子座）に（参照に準じて）相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させること、および（ｂ）第１および第２の遺伝子座間の共局在イベントが検出されないかを決定することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＬＫなどの未分化リンパ腫キナーゼに適用される（図１２参照）。いくつかの実施形態では、方法はＲＯＳ１に適用される。ＲＯＳ１はインスリン受容体ファミリーの受容体型チロシンキナーゼである。いくつかの実施形態では、アッセイは非小細胞肺癌の診断において適用される。
【０１０７】
ゲノム再編成
いくつかの実施形態では、本発明は、ゲノム領域の再編成を検出する方法であって、（ａ）ゲノムＤＮＡ試料を、ゲノム領域の特異的サブ領域に相補的な部分を各々有する複数のガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させることであって、各サブ領域に対するｇＲＮＡが、他のサブ領域に対するｇＲＮＡからの区別を可能にするコードを含んでいること、および（ｂ）ゲノムＤＮＡをイメージングし、コードを解読し、コードのオーダーを参照と比較することであって、ほぼ目的のゲノム領域の長さにわたってコードが共局在していること、を含む方法に関する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはテールでコードされている。いくつかの実施形態では、コードの解読は、テールのコード化部分を解読分子（decoder molecule）と接触させることにより行われ、そのような解読分子には、ＤＮＡまたはタンパク質プローブが含まれる。いくつかの実施形態では、ゲノム再編成を決定することに加え、特定のゲノムセグメントの異なるアレルも区別される。いくつかの実施形態では、異なるゲノムセグメントに対してと同様に、異なるアレルに対して異なるコードを用いることができる。いくつかの実施形態では、目的の領域は、ゲノムのＢＲＣＡ１および／またはＢＲＣＡ２領域である。いくつかの実施形態では、目的の領域はＭＨＣまたはＨＬＡ領域である。いくつかの実施形態では、目的の領域は、ＭＭＲ遺伝子、ＭＬＨ１−ＰＭＳ２およびＭＳＨ２−ＥＰＣＡＭ−ＭＳＨ６の周辺の領域であり、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）の診断または分析において用いることができる。いくつかの実施形態では、各ゲノムセグメントに対して複数のｇＲＮＡが用いられ、そのような複数のガイドＲＮＡの各々は同じコードで標識されている。
【０１０８】
反復数の計数
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡの鎖が線状のひもとして分析される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは伸展される。いくつかの実施形態では、ナノポア／ナノギャップ分析が行われる。いくつかの実施形態では、ヒト第４染色体および第１０染色体上の３．３ｋｂのＤ４Ｚ４リピート含有遺伝子座上の反復単位の数を計数（enumerate）する方法が用いられる。いくつかの実施形態では、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）の患者を診断または分析するためにＤ４ＺＡ領域の評価を用いる。いくつかの実施形態では、方法は、テロメアサブユニット反復数を計数するために用いられる。いくつかの実施形態では、方法は、セントロメア反復数を計数するために用いられる。いくつかの実施形態では、方法は、メジャーサテライト反復数を計数するために用いられる。いくつかの実施形態では、方法は、マイナーサテライト反復数を計数するために用いられる。
【０１０９】
Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ある態様では、Ｃａｓ９仲介ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うための方法は、目的の染色体領域またはゲノム領域に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と標的核酸配列を接触させるステップを含み、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、目的の染色体領域またはゲノム領域が、フローセル中に配列され、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの試薬および洗浄試薬が、目的の染色体領域またはゲノム領域の上に流される。ある態様では、複合体の位置は、蛍光、化学発光、エレクトロルミネセンス、比色検出などを含む群の方法を用いて検出される。
【０１１０】
アレル特異的検出
いくつかの実施形態では、本発明は、特異的アレルの存在を決定する方法であって、（ａ）標的核酸配列を、検出対象のアレルに相補的なシード部分（ＰＡＭ部位に隣接する最初の４〜７ヌクレオチド）を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させること、および（ｂ）核酸と共局在したｇＲＮＡ／Ｃａｓ９の存在を検出することを含む方法に関する。
【０１１１】
結合アッセイ
ある態様では、特異的配列を検出するための診断方法であって、（ａ）標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させるステップ、（ｂ）表面上の位置で複合体を捕捉するステップ、（ｃ）複合体中にのみ存在し、標的核酸配列上には存在しない標識により、その位置で捕捉された複合体を検出するステップを含む方法が提供される。ある態様では、特異的配列を検出するための診断方法であって、（ａ）標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させるステップ、（ｂ）表面上の位置で複合体を捕捉するステップ、（ｃ）複合体中にのみ存在し、ｃａｓ９／ｇＲＮＡ上に存在しない標識により、その位置で捕捉された複合体を検出するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、アッセイは、ラテラルフローアッセイ、ディップスティックアッセイ、ペーパーマイクロフルイディクスアッセイ（paper microfluidics assay）、ドットブロットアッセイ、マイクロアレイアッセイの一部として行われる。いくつかの実施形態では、アッセイは診断的アッセイである。
【０１１２】
免疫組織化学およびｇＲＮＡ／Ｃａｓ９  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、本発明は、同じ試料上で免疫組織化学（ＩＨＣ）およびｇＲＮＡ／ｃａｓ９仲介ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を組み合わせる方法であって、（ａ）標的クロマチン内の標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させるステップであって、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、標的核酸配列に共局在して複合体を形成するステップ、（ｂ）標的クロマチンをタンパク質結合試薬と接触させるステップ、および（ｃ）ガイドＲＮＡ／ｃａｓ９複合体とタンパク質結合試薬の比較位置を検出するステップを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、タンパク質結合試薬は抗体である。いくつかの実施形態では、タンパク質結合試薬はアプタマーである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体およびタンパク質結合試薬はそれぞれ異なる標識をされている。いくつかの実施形態では、ＩＨＣ試薬およびガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＩＳＨ試薬は一緒に添加される。いくつかの実施形態では、ＩＨＣ試薬およびガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＩＳＨ試薬は連続して、すなわち次々と添加される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９  ＩＳＨは変性ステップを必要としないので、ＩＨＣを実施するためにタンパク質およびクロマチンの構造はインタクトなままである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を用いてクロマチンの特定の部分が単離され、分析方法を用いて、単離されたクロマチン上に存在するタンパク質が検出される。
【０１１３】
ガイドＲＮＡテールのプロービング
いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸配列を検出する方法であって、（ａ）標的核酸配列を、標的核酸配列に相補的な部分を有するガイドＲＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質と接触させるステップであって、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、標的核酸配列に共局在して複合体を形成し、ガイドＲＮＡが、３′テール配列を含み、前記テールが、プローブ配列に相補的であるか、またはプライマーとして作用できるステップ、および（ｂ）複合体を検出することにより標的核酸配列を検出するステップを含む方法に関する。ある態様では、テールは、ｇＲＮＡ結合位置のすぐ近傍の配列に相補的な配列を含む。ある態様では、テールは、二本鎖の置換鎖に相補的な配列を含む。ある態様では、二本鎖の標的鎖の一方がガイドＲＮＡにより隔離され、他方の鎖が他の試薬と結合できるように開鎖される。例示的な試薬としては、一本鎖結合タンパク質、標識されていてもよい相補的オリゴヌクレオチド、または鎖に相補的なテールの一部が含まれ得る。ある態様では、テールは、ＤＮＡ  ＰＡＩＮＴのためのドッキング部位またはハンドルを含む。いくつかの実施形態では、もう一方の鎖とのＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体は安定化される。いくつかの実施形態では、ＲＰＡなどの一本鎖結合タンパク質またはオリゴヌクレオチドもしくはそのアナログ／模倣物が置換鎖に結合することにより、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体が他方の鎖と安定化され得る。いくつかの実施形態では、安定化効果は、天然二本鎖の再ジッピング（re-zipping）による競合の減少によるものである。
【０１１４】
ＰＡＭ特異性が変化したＣａｓ９
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の部位を標識または標的化する方法であって、（ａ）核酸を、ガイドＲＮＡと非標準的ＰＡＭ配列に隣接して結合するように変化させたＣａｓ９タンパク質とを含む標識複合体に、複合体が核酸に結合する条件下で接触させるステップ、および（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を分析するステップを含む方法に関する。ある態様では、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に少なくとも１つの洗浄ステップがあってもよく、ｇＲＮＡの結合を促進するために、補助的な試薬が供給されてもよい。
【０１１５】
一般に、本明細書に記載の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡは、当業者に周知の修飾されたＲＮＡヌクレオチドを含み得る。一般に、本明細書に記載の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡは、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラまたはＲＮＡ／ＰＮＡキメラを含み得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡまたはＲＮＡは無細胞系で作製される。ｇＲＮＡまたはＲＮＡの作製方法は、当業者に周知のインビトロ転写および自動化された化学的ＲＮＡ合成法を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡまたはＣａｓタンパク質または補助的タンパク質は、細胞系で発現され、無細胞系で精製される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡまたはＲＮＡは、無細胞系中でＣａｓタンパク質または補助的タンパク質と複合体を形成する。
【０１１６】
以下の実施例は本開示の代表例として記載されるものである。本開示、図面、および添付の特許請求の範囲を考慮して、これらの実施形態およびその他の同等な実施形態が明らかになるので、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１７】
実施例Ｉ
プロトコール
ｇＲＮＡ合成プロトコール：
ＰＣＲアセンブリーを以下の通り行う。
【０１１８】
以下を含む反応ミックスを調製する。
・１２μＬのＱ５  ＤＮＡ  ポリメラーゼ  ２×マスターミックス（ＮＥＢ社）
・３μＬの１０μＭ  Ｔ７フォワードプライマー
・３μＬの１０μＭ  バーコードリバースプライマー
・３μＬの１０μＭ  Ｓｐ．ｇＲＮＡ．ｓｐｌｉ６０（フォワード）
・３μＬの１０μＭ  ｇＲＮＡ．ｅｎｄ（リバース）
【０１１９】
ＰＣＲデバイスのサイクル条件
１．９８℃、３０秒
２．９８℃、１０秒
３．５２℃、２０秒
４．７２℃、１５秒
５．ステップ２から２９サイクル繰り返す
６．７２℃、２分
７．４℃で維持
【０１２０】
スピンカラム（Ｚｙｍｏ社）でＤＮＡを精製する。通常、約１μｇのｄｓＤＮＡ鋳型が産生される。
【０１２１】
インビトロ転写（ＩＶＴ）を以下の通り行う。
【０１２２】
以下を含む反応ミックスを調製する。
・５．８μｌのＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ水
・２．５μｌ  ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７−Ｆｌａｓｈ  １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（イルミナ社）
・１．８μｌ  １００ｍＭ  ＡＴＰ
・１．８μｌ  １００ｍＭ  ＣＴＰ（＋２μＬ  Ｃｙ３−ｄＵＴＰ）
・１．８μｌ  １００ｍＭ  ＧＴＰ
・１．８μｌ  １００ｍＭ  ＵＴＰ
・２μｌ  １００ｍＭ  ＤＴＴ
・０．５μｌ  ＲｉｂｏＧｕａｒｄ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
・５μｌ  ＤＮＡ鋳型
・２．０μｌ  ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７−Ｆｌａｓｈ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
【０１２３】
修飾ＮＴＰを用いてガイドＲＮＡを合成することもでき、その場合、以下の修飾が行われる。
・１：１モル比の修飾されるＮＴＰと修飾されたＮＴＰを加える（例えば、０．９μｌのＵＴＰと０．９μｌのＵＴＰ−Ｃｙ３）。
【０１２４】
ＰＣＲデバイス中で３７℃にて２〜１６時間インキュベートした後、４℃を維持する。スピンカラム（Ｚｙｍｏ社）を用いてＲＮＡを精製する。典型的には約１００μｇのＲＮＡ（すなわち、バーコードｇＲＮＡ）が産生される。
【０１２５】
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体アセンブリーのプロトコール
参照用のテールに単一のバーコードを有する１μｇのｇＲＮＡは、２５ｐｍｏｌのＲＮＡとする。Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡを通常モル比１：１で混合して、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を形成させる。野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９、およびヌクレアーゼ欠損またはｄｅａｄ  Ｃａｓ９の複合体化にも同じ反応条件を用いることができる。野生型Ｃａｓ９を用いる場合には、ＭｇＣｌを除いてもよく、その目的は切断を防ぐことである。発現用プラスミド、野生型Ｃａｓ９、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９、およびＣａｓ９ニッカーゼはＡｄｄｇｅｎｅ社から入手可能である。プラスミドは、好適な宿主中で発現させることができ、タンパク質は、発現タンパク質中のＨｉｓタグの利用などの当該技術分野で公知の方法により精製することができる。より多くのｇＲＮＡが確実にＣａｓ９と複合体化するように、Ｃａｓ９とｇＲＮＡをより高い比率（例えば、３：１）で用いることもできる。活性複合体は通常、３７℃で１５分間プレインキュベートすることにより形成される。反応バッファーは様々であり得る。例示的なバッファーとしては、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．５；および１×ＰＢＳ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０が挙げられる。活性複合体は、すぐに用いることもでき、４℃で数週間保存することもできる。
【０１２６】
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ：
このアッセイでは、試料は顕微鏡スライド（またはカバースリップスライド）に固定されている。スライドは、コプリンジャー中でインキュベートしてもよく、反応体積をさらに最小限に抑えるためおよびプロセスを自動化するために、フローチャンバーまたはフローセル中でアセンブルしてもよい。反応は以下の順番で行われ、特に断りのない限り、スライドはコプリンジャー中でインキュベートされる（フローチャンバーについて、情報を括弧で示す）。１×ＰＢＳおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０と共に２分間インキュベートする（フローチャンバーの２倍量で洗浄し、各洗浄間に３０秒間インキュベートする）。１×ＰＢＳおよび０．５％トリトンＸ−１００と共に５分間インキュベートする（フローチャンバーの２倍量で洗浄し、各洗浄間に２分間インキュベートする）。０．１Ｎ  ＨＣｌと５分間インキュベートする（フローチャンバーの２倍量で洗浄し、各洗浄間に２分間インキュベートする）。１×ＰＢＳおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０と共に２分間インキュベートする（フローチャンバーの２倍量で洗浄し、各洗浄間に３０秒間インキュベートする）。Ｃａｓ９バッファー中で５分間インキュベートする（フローチャンバーの２倍量で洗浄し、各洗浄間に３０秒間インキュベートする）。この時間を用いて、３７℃のＣａｓ９バッファー中でＣａｓ９−ｇＲＮＡを予め複合体化するか、または冷蔵された複合体を３７℃に温めることができる。通常は、５μＭのｇＲＮＡおよび５μＭのＣａｓ９を、試料当たり２５μＬ容積の中で複合体化させる。２５μＬのＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を含むＣａｓ９バッファーを加え、湿度室で３７℃にて４時間インキュベートする。あるいは、取外し可能なゴム接着剤で密封して３７℃でインキュベートする。３７℃でＣａｓ９バッファー中にて５分間のインキュベーションを２回行うことにより洗浄する（フローチャンバーの４倍量で洗浄し、各洗浄間に３０秒間インキュベートする）。１×ＰＢＳおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０と２分間インキュベートする（フローチャンバーの２倍量で洗浄し、各洗浄間に３０秒間インキュベートする）。場合により、必要であれば、各試料に２０μＬの２×ＳＣＣおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０に１μＭオリゴプローブを加えることによりプロービングし、湿度室で１５分間インキュベートする。あるいは、インキュベーション前に取外し可能なゴム接着剤で密封する。１×ＰＢＳおよび０．５％ｔｗｅｅｎ−２０中で２分間のインキュベートを２回行うことにより洗浄する（フローチャンバーの４倍量で洗浄し、各洗浄間に３０秒間インキュベートする）。１０μＬの褪色防止用顕微鏡封入剤およびＤＡＰＩでマウントし、マニキュア液（例えば、ＡｎｔｉＦａｄｅまたはＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ）で密封する。スライドはすぐにイメージング可能であり、あるいは暗所で一週間保存することもできる。場合によっては、ＨＣｌステップを省くことができる。
【０１２７】
フローセル
両面テープまたはシート（Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社または３Ｍ社の）を用いて、目的の試料を含むカバーグラスまたはスライドと第２のカバーグラスまたはスライドとの間に挟まれた障壁を作ることにより、フローセルを作成することができる。フローセルを作成するためのシステムがＩｂｉｄｉ社から市販されており、用いることができる（ｓｔｉｃｋｙ−Ｓｌｉｄｅ  ＶＩ０．４またはｓｔｉｃｋｙ−Ｓｌｉｄｅ  Ｉ  Ｌｕｅｒ）。ここで、細胞、染色体、またはＤＮＡが堆積されたスライドまたはカバーグラスをフローセルの粘着性部分に付着させて、基板上にフローセルを作成する。入口領域中へと手作業でピペッティングし、出口領域中で毛細管作用により吸い取る（例えば、吸取り紙を使用する）ことにより、試薬をフローセル中へと流す。あるいは、流体を動かすための自動試薬流動交換システムおよびマルチウェイバルブ（multi-way valve）により試薬を流す。これは、シリンジポンプ、圧力駆動流、および吸引を用いて実現することができる。自動システムは、フローセルがローディングされる顕微鏡またはイメージング機器に組み込まれている。
【０１２８】
ＤＮＡの分子的コーミング（ｃｏｍｂｉｎｇ）
例えばゲルプラグ法を用いて細胞から抽出されたオスのゲノムＤＮＡ（プロメガ社またはノバジェン社）またはＤＮＡを、ビニルシラン（７−オクテニルトリクロロシラン）でコーティングされたカバーグラス上にコーミングする。これは、カバーグラス（例えば、２２×２２ｍｍ）を、カバーグラスの大部分をカバーする０．５Ｍ  ＭＥＳバッファー溶液（例えば、２２×２２ｍｍのカバーグラスに対して１〜１．５ｍｌ）中にＤＮＡを含む容器（ｔｒｏｕｇｈ）に浸漬し、ＤＮＡ末端が表面コーティングに結合可能になり（通常は、１分〜１０分）、その後、容器からカバーグラスを引き出すことにより行われる。容器中のＤＮＡの濃度は、所望の密度のコーミングされたＤＮＡが得られるように調整することができる。例えば、０．５ｎｇ／μＬまでの濃度が、個々の伸展されたＤＮＡ分子を分解可能な適切な密度を与え得る。その後、カバーグラスは、一定の速度（例えば、３００μｍ／ｓ）でＤＮＡ溶液から引き出され、カバーグラスを引き出す際の後退メニスカス（ｒｅｃｅｄｉｎｇ  ｍｅｎｉｓｃｕｓ）の力によりＤＮＡを伸展させることができる。必要に応じて、その後、約１０〜２０ジュール／ｃｍ２の紫外線照射エネルギーを用いてカバーグラス上にＤＮＡを架橋結合させる。必要に応じて、前述のようにカバーグラス上にフローセルを形成する。コーミングされたＤＮＡは、コーミングプロセス中またはその後にＹＯＹＯ−１などの１または複数のインターカレーション色素を用いて染色することによって可視化することができる。ＤＮＡ塩基対とＹＯＹＯ−１染色の比率５：１〜１０：１が通常用いられる。
【０１２９】
カバーグラス上の予め伸展されたＤＮＡへのＣａｓ９／ｇＲＮＡ結合
最初に、フローセル作成のためのコーミングされたゲノムＤＮＡが挟まれたカバーグラスを、ＰＢＳ  ｔｗｅｅｎおよびＰＢＳで洗浄することにより水和する。必要に応じて、Ｂｌｏｃｋａｉｄ（ライフテクノロジーズ社）で基板をブロッキングする。必要に応じて、Ｃａｓ９反応バッファーでフローセル全体を洗浄する。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡを３７℃で予め複合体化させ、その後、フローセルに加え、３０分〜１時間インキュベートする。反応バッファーなどのバッファーおよびＰＢＳ  ｔｗｅｅｎ２０およびＰＢＳで全体を洗浄することにより反応を停止させる。
【０１３０】
図６Ａおよび図６Ｂで使用されているガイドＲＮＡは、以下の、テールを有するセントロメア１６のｇＲＮＡである。
【０１３１】
【化２】
2017530695.tif 000004
【０１３２】
テールへの蛍光標識プローブのハイブリダイゼーション
フローセルが水和されたままであるようにし、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡが形成された後、２００μｌのホルムアミド、２０μｌのｓｄｓ、１２０μｌのｂｌｏｃｋａｉｄ、４０μｌの２０×ｓｓｃ、および２０μｌの水のハイブリダイゼーションバッファー中の、テールに対するＤＮＡプローブを加えることにより複合体をイメージングする。
【０１３３】
テールのプロービングに用いた配列は、ＴＡＧＡＴＧＴＡＴＡＡ  ＧＴＧＡＴＧＴＡＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧＧＡである。
【０１３４】
これは４℃で一晩置いてもよい。他のハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーションバッファー組成物も、プローブとテールのハイブリッドの熱安定性に応じて用いることができる。
【０１３５】
標識化は、Ａｔｔｏ  ６４７Ｎ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ａｌｅｘａ  ６４７などの蛍光標識を用いて片方または両方の末端でなされ得る。適切な蛍光標識（例えば、Ａｔｔｏ  ６５５）が用いられた場合、ＳＴＯＲＭ方法により超分解能イメージングを行うことができる。
【０１３６】
テールへのプローブのハイブリダイゼーションおよびイメージング
ハイブリダイゼーションバッファー中のイメージング溶液にＤＮＡ  ＰＡＩＮＴイメージャープローブを加えて、超分解能に必要な確率論的なオンとオフのパターンを得る。テール上の配列に相補的な配列またはテールに結合するプローブ上の配列に相補的な、図６Ａおよび図６Ｂおよび同様な実験で用いた、ＰＡＩＮＴ配列は、／５Ａｌｅｘ６４７Ｎ／ＴＡＧＡＴＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＡＧＧＴ／３ＡｌｅｘＦ６４７Ｎ、または／５ＡＴＴＯ６４７ＮＮ／ＴＡＧＡＴＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡ／３ＡＴＴＯ６４７ＮＮ／であった。
【０１３７】
イメージングは、全反射照明（Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ：ＴＩＲＦ）モードのニコン社のＴｉ−Ｅ倒立顕微鏡上で、６３３ｎｍ、６４０ｎｍ、または６４７ｎｍのレーザー線およびＣｙ３に適したフィルターブロックを用いて達成され、裏面入射型Ａｎｄｏｒ  Ｉｘｏｎ  Ｘ３  ＥＭＣＣＤカメラを用いて取り込まれる。
【０１３８】
超分解能イメージング
以下のイメージャー鎖であるＰ９イメージャー：ＡＣＣＴＴＡＴＴＡ、を用いてＤＮＡ  ＰＡＩＮＴ法を行うことにより、図６Ｂに示されるような超分解能イメージングを行うことができる。これは、Ｐ９ハンドル（ドッキング配列）を含むテールに結合するか、Ｐ９ハンドル、すなわちＴＡＡＴＡＡＧＧＴ、を含むテールに既に結合しているプローブに結合する。ＤＮＡ  ＰＡＩＮＴをイメージングするための好適なバッファーは、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０である。ニコン社のＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを用いて１５〜３０分間動画を撮影することができ、ＬａｂＶＩＥＷで書かれたＤＮＡ  ＰＡＩＮＴのＩｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ画像解析コードを用いて超解像度画像を構築することができる（Jungmann et al Nano Lett., 2010, 10 (11), pp 4756-4761参照。
【０１３９】
溶液中でのゲノムＤＮＡへのＣａｓ９／ｇＲＮＡの結合
（３７℃で１０分間プレインキュベートした）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体アセンブリーを、バッファー溶液の存在下でＤＮＡに加え、３７℃で１時間インキュベートする。必要に応じて、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡが結合したＤＮＡを精製する。その後、ＤＮＡの伸展が望まれる場合、反応液を０．５Ｍ  ＭＥＳ溶液中に希釈し、ｇＲＮＡ／ｃａｓ９複合体で修飾されたＤＮＡをビニルシランカバーグラス表面上にコーミングする。図６Ｃでこのアプローチを用いた。
【０１４０】
複合体化したＤＮＡの精製
用いるガイドＲＮＡのサイズに応じて、複数の異なる精製方法を用いて標的ＤＮＡ／ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を単離することができ、そのような方法としては、分子ふるい、アフィニティー精製（例えば、ストレプトアビジンビーズへのデスチオビオチンまたは切断可能なリンカーの結合の利用）、または透析膜が含まれる。
【０１４１】
Ｃａｓ９ニック形成および標的シーケンシング
Ｃａｓ９−ｇＲＮＡが標的ＤＮＡ上の特異的位置でｄｓＤＮＡ鋳型に結合する。標的ＤＮＡは天然ゲノムの形態であってよく、反応はインビボで行われる。標的ＤＮＡは、細胞中にあってよく、あるいは、生物を表面に固定して、反応をｉｎ  ｓｉｔｕで行う。これらの場合、ゲノムの空間的位置が保存されたままであることが好ましい。さらに、標的ＤＮＡは抽出されてもよく、反応はエクスビボで行われる。抽出された標的ＤＮＡは表面上または流体システム（例えば、ナノチャネル）中に固定化されてもよく、反応はエクスビボで行われる。
【０１４２】
変異体ニッカーゼ（例えば、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ変異のいずれかを有するＣａｓ９）を用いてｇＲＮＡ／Ｃａｓ９仲介ニック形成反応が行われる。図９参照。Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインはＤ１０Ａ変異によって不活性化することができ、ＨＮＨドメインはＨ８４０Ａ変異によって不活性化することができる。
【０１４３】
２つのニック形成機構の一方を用いることができ、１つはｇＲＮＡと塩基対形成するトップ鎖（top strand）、もう１つは置換される鎖であるボトム鎖（bottom strand）での機構である。Ｄ１０Ａ位の変異により、トップ鎖はニック形成されるが、ボトム鎖はニック形成されない。Ｈ８４０Ａ位の変異により、ボトム鎖はニック形成されるが、トップ鎖はニック形成されない。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流でＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼによって切断が起こる。Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）切断はボトム鎖上の相補的位置で起こる。ゲノム中で多数出現する特異的な短い配列を認識するニッキングエンドヌクレアーゼと比べて、ｇＲＮＡは比較的長い認識配列でニック形成し、これはゲノム中で１度しか見出されないこともある。これは、ゲノム中の特異的固有配列の標的化に用いることができる。標的シーケンシングは以下のステップによって行うことができる。Ｄ１０ＡニッカーゼまたはＨ８４０Ａニッカーゼのいずれかを選択するステップ；シーケンシングする領域の近傍のガイドＲＮＡを選択するステップ；ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９反応を行って、選択されたｇＲＮＡおよびＣａｓ９変異体と複合体を形成させるステップ；必要に応じて、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を標的ＤＮＡから除去するステップ；適切なバッファー中へポリメラーゼおよび蛍光標識された可逆的ターミネーターヌクレオチドを加え、取込み、洗浄、および切断のシーケンシングサイクルを行うステップ。これにより標的位置をシーケンシングすることができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、標的ＤＮＡからおよび試料から完全に除去されてもよい。除去試薬は、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、有機化合物（例えば、尿素、塩化グアニジウム／チオシアナート）、アミド（例えば、ホルムアミド）、タンパク質分解酵素（例えば、プロテアーゼ）、物理的性質（例えば、温度）、またはこれらの組合せであってもよい。
【０１４５】
Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）を用いる場合、シーケンシングはＰＡＭ遺伝子座を通って進行し、遺伝子座の下流に進行し、ＰＡＭを含む鎖をシーケンシングする。Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）を用いる場合、シーケンシングはＰＡＭ遺伝子座の上流方向に進行し、ＰＡＭ配列ＮＧＧに相補的な鎖をシーケンシングする。ガイドＲＮＡ配列のシーケンシングを回避するために、Ｄ１０Ａ変異体を選択することができる。目的の領域上に複数のガイドを選択することができる。
【０１４６】
合成による逐次シーケンシングを行う場合、取り込まれた各ヌクレオチドが可逆的ターミネーターを有し、各標的位置での１個のヌクレオチドの取込みの結果が検出され（好ましくは、ＴＩＲＦ照射およびＣＣＤ検出器またはＣＭＯＳ検出器を用いて）、その後、ターミネーターおよび標識が除去され、各標的位置での次の塩基のためのサイクルが繰り返される。
【０１４７】
種々のイルミナ社のＳＢＳキット（例えば、ＳＢＳ  Ｋｉｔ  ２）をシーケンシングに用いることができ、以下の順番で試薬を添加してイメージングする。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ；Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ；Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ；ＩＭＡＧＩＮＧ  ＴＡＲＧＥＴＥＤ  ＬＯＣＩ；Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｃａｎ  Ｍｉｘ；Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ；Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｗａｓｈ  Ｍｉｘ。イルミナ社のキットの詳細はワールドワイドウェブサイトsupport.illumina.com/downloads/hiseq-rapid-sbs-kit-v2-reagent-prep-guide-15058772.htmlからダウンロードすることができる。ヌクレオチド上の４つの色素のうちの２つに５３２ｎｍのレーザー、色素の他方２つに６６０ｎｍのレーザーを用いることによりイメージングを行う。各レーザーにより励起される２つの各色素は、特異的なエミッションフィルターおよび各色素の特徴を決定するように設計されたアルゴリズムを用いることにより区別される。
【０１４８】
Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘなど、複数の異なるイルミナ社シーケンシング機器の１つを用いることができる。イルミナ社のフローセルホルダーならびに入口ポートおよび出口ポートと適合するフローセルフットプリントを用いることができる。あるいは、高開口数対物レンズ、レーザー、ＣＣＤカメラ、フルオロフォア選択的フィルター、およびシリンジポンプに基づく試薬交換システムまたは圧力駆動試薬交換システム、および加熱されたステージを具備した倒立顕微鏡を備えた自作のシステムを用いることができる。この自作のシステムは、イルミナ社が提供する以外の他のヌクレオチド／色素の組合せに適応させることができる。
【０１４９】
シーケンシングがリアルタイム反応（例えば、ＰａｃＢｉｏまたはＳｔａｒｌｉｇｈｔシーケンシング）としてなされる場合、ヌクレオチドが取り込まれると、天然の脱離基である末端リン酸においてヌクレオチドは標識される。このような反応はＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラで連続的にモニタリングされる。
【０１５０】
伸展ＤＮＡ二本鎖上での標的シーケンシング
配列の線的な位置が保存されるように、（例えば、ゲルプラグ中での抽出を行うことにより）ゲノムＤＮＡを細胞から抽出して、長い長さで維持することができる。これは、ゲノム中の配列の構成決定に重要な有用性がある。本明細書に記載のＡＬＫ、ＢＲＣＡ、ＦＳＨＭ、およびＨＥＲ２の例が示すように、ゲノムの構成中の構造の多様性（ＳＶ）が疾患につながり得る。しかし、白血病におけるＢｃｒ−ＡＢＬの転座などの特定のＳＶはＧｌｅｅｖａｃなどの薬物によって標的化することができ、したがって、白血病患者がこの薬物によって標的化可能な転座を有するかどうかを決定することは重要である。
【０１５１】
好ましくは、シーケンシングは、例えば分子コーミングを用いて伸展ＤＮＡ上でなされ、その結果、標的配列のゲノム中の直線状の構成（linear organization）を可視化することができる。標的領域は、目的の位置で結合するように設計されたｇＲＮＡおよびニック形成変異体Ｃａｓ９を用い、ニック形成反応を行い、その後、ニックから伸長させることにより選択され得る。ニック形成反応は、ＤＮＡのコーミングの前に溶液中で行うことができる。あるいは、ニック形成反応は、ＤＮＡがコーミングされた後、コーミングされたＤＮＡ上でフローセルを用いて行うことができる。シーケンシング反応は、最初に取込みバッファーによりＤＮＡを水和およびプレコンディショニングし、その後、フローセル中にシーケンシング試薬を流すことにより進行する。その結果、標的領域の配列だけでなく、ゲノム中におけるその位置も知ることができる。これが重要である場合の例としては、ｇＲＮＡに基づくシーケンシングの標的化が、転座のホットスポットであるゲノム中の配列を対象としているが、これがゲノム中のどこに転座しているかおよびこれがどの配列と融合しているかが未知の場合が挙げられる。
【０１５２】
ｉｎ  ｓｉｔｕ標的シーケンシング
本明細書に記載の方法は、細胞または核内のゲノムの一部の空間的位置を決定し、そのような空間的位置が遺伝子制御およびゲノム機能にどのように影響するかを決定することに関する。特異的ゲノム配列の細胞中での空間的位置は、それらの配列に特異的なｇＲＮＡを用いて標的化することができる。固定された細胞中のゲノムＤＮＡ上でｇＲＮＡ／Ｃａｓ９仲介ニックが形成され、ｉｎ  ｓｉｔｕでゲノムＤＮＡに対して蛍光に基づくシーケンシングが行われる。Lee et al, 2015:（Nat Protoc. 2015, 10(3):442-58）に記載さるように、ガラス底のディッシュ上で細胞を成長させるか、または組織切片を当該技術分野で公知の方法によりマウントする。細胞は固定される（例えば、１０％ホルマリンのＰＢＳ溶液を２５℃で１５分または１００％メタノールを−２０℃で２０分使用）。ＰＢＳおよびトリトンＸ−１００を用いてならびにＰＢＳのみを用いて洗浄を行う。必要に応じて、尿素を加えて、ニック形成されたＤＮＡからｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を除去する。必要に応じて、ＲＮａｓｅを用いてＲＮＡを除去する。
【０１５３】
細胞内のゲノムＤＮＡの単一分子について直接シーケンシングを行うことができる。ポリメラーゼを用いてニック部位でヌクレオチドを取り込ませる。好ましくは、ヌクレオチドは、高い量子収率をもたらすフルオロフォアを用いた蛍光標識、例えばＣｙ３Ｂまたは複数標識ヌクレオチドを有する。当該技術分野で公知の種々のストリンジェンシーの洗浄を用いて、非取込みヌクレオチドからのシグナルを低減する。単一分子イメージング法によりイメージングを行うが、細胞の一部だけが表面と接触するので、ＴＩＲＦイメージングは取込みシグナルのサブフラクションにしかアクセスできない。共焦点顕微鏡またはライトシート顕微鏡を用いて、細胞および組織内の３次元空間上に分布しているシグナルにアクセスすることができる。特にシグナルが深い位置にある場合、多光子または二光子レーザー顕微鏡を用いてシグナルにアクセスする。そのような方法はバックグラウンドシグナルの低減にも有効である。
【０１５４】
ＰＢＳ洗浄後、シーケンシング反応ミックスを加える前に、シーケンシング反応で用いるバッファーを試料のコンディショニングに用いる。使用されるプライマー、イメージング設備、および温度調節が利用可能かどうかに応じて、ＳＯＬＩＤケミストリー、ＣｙｃＬｉｃケミストリー、ＳＢＬケミストリー、または合成によるシーケンシングケミストリー、例えばイルミナ社のシーケンシングまたはＬａｓｅｒｇｅｎ社のシーケンシングのいずれかが、ヌクレオチドの取込みならびに標識およびターミネーターの切断に適用される。各取込みステップの後、画像が撮られる。画像は処理されて、断続的シグナル（punctuate signal）が生成する。各連続サイクルからの画像が記録される。各画像に基づいてベースコール（base call）が作成され、ベースコールがスタックされて各焦点の配列リードが提供される。多くの記録画像で同時に見られた配列をリード構築プロセスに含めるだけで、非特異的シグナルをフィルタリング除去（filter out）することができる。Ｂｏｗｔｉｅ  １．０または他の配列アラインメントアルゴリズムを用いてリードを参照に整列させ、ノイズまたは目的のものではないオフターゲット配列をさらにフィルタリング除去する。シーケンシングリードの別個の焦点を可視化することにより、細胞内の標的配列の空間的局在の情報が得られる。標的位置を標識するだけでなく、シーケンシングは、目的の領域内の配列変異（variant）およびその空間的位置を明らかにする可能性を有する。
【０１５５】
核酸重合体に沿ったｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体のナノポア分析
ＳｉＮ膜を作製し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて直径２０ｎｍのナノポアをドリルする（Janssen, X. J. A.; Jonsson, M. P.; Plesa, C.; Soni, G. V.; Dekker C.; Dekker, N. H. Nanot variant echnology 2012, 23 (47), 475302）。その後、膜をポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の層でペイントして、静電容量を低減し、シグナル・ノイズ比を改善する。膜によって隔てられた上部および底部のリザーバーを含むフローセル中に膜をマウントし、その後、２つのリザーバーに１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８を満たす。核酸重合体は上部リザーバーに加えられ、電圧が上部リザーバー（−ｖｅ）と底部リザーバー（＋ｖｅ）の間に印加され、ポアを通る実質的に線状の電気泳動的に駆動される核酸重合体の輸送が可能になる。電流は、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器およびＤｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａ  ＤＡＱデジタイザーを備えたイオンチャネル記録システムを用いて記録される。記録は、Ｔｒａｎｓａｌｙｚｅｒ  Ｍａｔｌａｂパッケージを用いて分析される（Plesa, C.; Dekker, C. Nanotechnology 2015, 26 (8), 084003参照）。データは、核酸重合体がナノポアに入る際の電流遮断の増大、さらにその後の、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９結合領域がポアの狭いくびれを通過する際の遮断の断続的増大について分析される。
【０１５６】
実施例ＩＩ
Ｈｅｒ２／Ｅｒｂｂ２診断のためのＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の作成
Ｈｅｒ２（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅによるＥｒｂｂ２としても知られる）遺伝子配列が、種々のオンラインリポジトリ、例えばＮＣＢＩワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/gene/2064で入手可能である。
【０１５７】
Ｈｅｒ２配列を分析してｄｓＤＮＡに沿ったＰＡＭモチーフを見出す。好ましいモチーフは５′−ＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧ−３′（配列番号：１２）である。５′ＧＧはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる最適なＲＮＡ合成を提供する。３′ＮＧＧはＣａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列である。間の１７塩基のＮは標的配列のものであり、高い特異性を提供する。方法は遺伝子変異（すなわち、アイソフォーム）間を区別できるので、エクソームが好ましい。
【０１５８】
標的配列を見出すための複数のプログラムがインターネット上で無料利用可能である。図１０は、ＣＨＯＰＣＨＯＰを用いた場合に提供される出力のダイアグラムを示す図である（Tessa G. Montague; Jose M. Cruz; James A. Gagnon; George M. Church; Eivind Valen. (2014). CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42. W401-W407参照）。
【０１５９】
Ｈｅｒ２の標的配列の部分的リストを表１に示す。この表はさらに、ヒトゲノム上の標的の位置、エキソンの番号、ＤＮＡ鎖（すなわち、センス（＋）対アンチセンス（−））、およびゲノム中のどこかにある二次的標的（すなわち、ミスマッチ、ＭＭ）の潜在的数に関する情報を含む。
【０１６０】
【表１】
2017530695.tif 000005
【０１６１】
【表２】
2017530695.tif 000006
【０１６２】
遺伝子の外側の領域も同様に容易に標的化できることに留意されたい。１ｋｂ末端から、３０ｋｂ、数十もしくは数百キロ塩基、または数メガ塩基の全長遺伝子であり得る、エキソンおよびイントロンなどの特異的領域が標的化される。
【０１６３】
配列標的はｇＲＮＡを作製するための鋳型として用いられる。これは、ｇＲＮＡスキャフォールドに各標的配列を加えることを含む。アセンブリーモデルのダイアグラムを以下に示す。このアセンブリーは、ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲを用いてなされる（融解温度（Ｔｍ）が記載されている）。簡潔に述べると、オリゴヌクレオチドを、業者から入手するか、研究室内で合成する。２つのユニバーサルオリゴヌクレオチド、すなわち、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識モチーフの一部をさらに含むフォワードＰＣＲプライマーであるＦｗｄ−Ｔ７−ｇＲＮＡ；およびユニバーサルｇＲＮＡスキャフォールドであるｇＲＮＡ．ｓｐｌｉｔ６０である。さらに、２つの可変オリゴヌクレオチド、すなわち、目的の標的に特異的な配列であるＳｐ．ｇＲＮＡ．ｓｐｌｉｔ６０；およびマルチプレックス鎖検出のためのバーコードハンドルをさらに含むリバースＰＣＲプライマーであるＲｅｖ−Ｂ１−ｇＲＮＡ．１８である。
【０１６４】
この設計は、費用効率の高いｇＲＮＡの合成およびアセンブリーを可能にするが、ホスホラミダイトケミストリーにより合成されるオリゴヌクレオチドの最適な配列精度を実現し、標識された実体がドッキングできるコードである様々な種類のバーコードハンドルを付加することができる。ＤＮＡ鋳型は、オリゴヌクレオチドアレイ合成装置などを用いて種々のスケールで合成することができ、または商業的に入手することができる。鋳型は、ＰＣＲによって増幅および再増幅して鋳型を生成および永続させることができ、これは新規合成より費用対効果が高い。
【０１６５】
図１１に示されている例示的なＰＣＲアセンブリーにかかる時間は１時間未満であり得る。ＰＣＲに続けて、鋳型ＤＮＡにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼミックスを加えることによりインビトロ転写（ＩＶＴ）によってｇＲＮＡが合成される。この場合、より長い反応により、より多くのｇＲＮＡが得られる。使用回数の限定されたＣａｓ９−ｇＲＮＡ迅速作製キットを３０分以内に作製することができる。１６時間の反応進行で大量に作製することができる。ＩＶＴ後、ＤＮＡ鋳型をＤＮａｓｅＩ処理で分解し、市販のカラム精製キットを用いることによりまたは酢酸アンモニウム存在下でのエタノール沈殿により、ＲＮＡを精製する。
【０１６６】
その後、バーコード化されたｇＲＮＡをマグネシウムイオン存在下でＣａｓ９タンパク質と１：１の比率で複合体化させてＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を形成させる。その後、試薬が用いられ得る。バーコードの解読を容易化するためのバーコードに結合する標識オリゴヌクレオチドである検出プローブもこの段階で加えてもよく、これは下流でのより速いハイブリダイゼーション検出法を可能にする。その決定は予想されるシグナル・ノイズ比に基づいてなされる。例えば、低いノイズが予想される場合（例えば、顕微鏡スライドの表面の染色体スプレッド上でのＨｅｒ２の検出）、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ−標識キットを、単に試料に加えて３７℃で反応させればよい。未反応の複合体を洗浄し、試料をイメージングすることができる。あるキットは、遺伝子座をプロービングするのに必要な全てのＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の集合（ensemble）である。あるＣａｓ９−ｇＲＮＡ−標識キットは、全ての予め標識されたＣａｓ９−ｇＲＮＡの集合である。
【０１６７】
マルチプレックス検出のためのＣａｓ９−ｇＲＮＡをコードするための例
１または複数のコードまたはバーコードハンドル（プローブのドッキング部位）がｇＲＮＡに付加され得る。原理は、ＤＮＡ試料に会合したＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体のアイデンティティーを決定することである。これは、ｇＲＮＡハンドルに特異的な検出可能な「デコーダー」プローブをハイブリダイズさせることによりなされる。ｇＲＮＡハンドルは、１または複数のバーコードを含み得、バーコードは種々の方法で配置され得、例えば連続的にまたは互いに部分的に重複してスタッキングされる。後者により、マルチプレックスバーコードの全体的な長さの短縮が可能になり、所与のｇＲＮＡハンドル長での多重化能力（multiplexing capability）を向上させる。
【０１６８】
多重化能力は、バーコードの数に比例し、バーコードの組合せの数、すなわち、ｎＣｒ＝ｒ（ｎ＋ｒ−１）！／ｒ！（ｎ−１）！（式中、ｎはバーコードの数であり、ｒはバーコードが読まれるイベントの数である）に等しい。例えば、２個のバーコードＢ１およびＢ２を用いると、Ｃ＝１およびＰ＝２が得られ、合計３個のコードとなる（Ｂ１Ｂ１、Ｂ１Ｂ２、Ｂ２Ｂ２）。３個のバーコードを用いると、１０個のコードが得られる。たった５個のバーコードで１２６個のコードを作製することができるが、１０個のバーコードにより合計９２３７８個のコードが提供され、これはエクソームの調査に十分である。
【０１６９】
本明細書に記載のコード方法は以下に関する。遺伝子座１個につき１個のコードを割り当てることができ、これにより、単一アッセイにおいて複数の標的を同定することができる。所与の遺伝子座についてアイソフォーム１個につき１個のコードを割り当てることができ、これは多様性（variation）の同定を可能にする。１個の所与の遺伝子座に２個のコードを割り当てることができ、これにより所与の標的にシグナルアイデンティティーの共局在がもたらされ、標的アイデンティティーの信頼度を向上させることができる。これは、バックグラウンドの高い試料の場合に利点となり、その場合、アッセイは同じ遺伝子座で両方のシグナルが検出された場合のみ陽性となる。１個の所与の遺伝子座に対して３個以上のコードを割り当てることができ、これも共局在を可能にするが、同定を改善し且つ分解能を向上させる特徴（signature）を提供する。例えば、２個の遺伝子座を２セットのＣａｓ９−ｇＲＮＡで認識することができ、１番目の遺伝子座はバーコードＢ１Ｂ２およびＢ１Ｂ３でコードされ、２番目の遺伝子座はバーコードＢ１Ｂ３およびＢ１Ｂ４でコードされる。共通するＢ１は、遺伝子座全体にわたる容易に検出可能なシグナルを提供する。より特異的にシグナルの位置にフォーカスすることができ、遺伝子座１に対する残りのバーコードＢ２Ｂ３および遺伝子座２に対するＢ３Ｂ４を検出することができる。
【０１７０】
ヒトゲノム中に２個以上存在しない１２ヌクレオチド長配列のリストから作成した５個のバーコードのリストを表２に示す。
【０１７１】
【表３】
2017530695.tif 000007
【０１７２】
１２塩基のバーコードサイズは、様々な長さおよび融解温度の種々のプローブの設計を可能にするのに十分である。例えば、１０〜１２マーのプローブは、特定のイオン濃度下（例えば、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）でより安定な相互作用が可能であり、一方、依然として変性剤（例えば、５０％ホルムアミド）を用いて除去可能である。８〜９マーのプローブは、Jungmann R, Avendano MS, Woehrstein JB, Dai M, Shih WM, Yin P. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 2014 Mar;11(3):313-8）に記載のＤＮＡ−ＰＡＩＮＴ技術を用いた超分解能イメージングの実施を可能にする。
【０１７３】
バーコード特異的プローブは多くの種類のものであり得、アッセイに適応させることができる。例えば、プローブは、配列に対するオリゴヌクレオチド相補体であり得る。その他の例では、プローブは、パッドロックプローブのような、プローブの１つの領域がバーコードにハイブリダイズし、１または複数の領域が第２のプローブセットのための補助的ハイブリダイゼーションに役立つ、環状ｓｓＤＮＡ鋳型からなっていてもよい。その後、環状プローブはローリングサークル増幅を用いて増幅されてもよく、これによりシグナル強度が高められる。その他の例では、ハイブリダイゼーションプローブは線状であり、二次プローブのための部位を含み、これはさらに二次または三次プローブなどのための部位を含み、多分岐プローブ（hyperbranched probe）の自己アセンブリーを可能にし、これによりシグナル強度が高められる。ここで説明したプローブのほとんどは蛍光標識されるが、その他の例では、それらのプローブを、発色検出を可能にする分子に結合させ、例えば高密度の金ナノ粒子であれば、検出は比色検出であってもよく、さらに、核中の特異的領域への局在が視覚的に確認される。
【０１７４】
位置決めＲＧＢコード（Locational RGB code）の例が図７に示されており、ＢＲＣＡ１再編成を蛍光バーコード化するためのｇＲＮＡを列挙する表３に示されているように、記載された色スキームに従ってガイドＲＮＡテールがバーコード化される。Ｒは赤、Ｇは緑、Ｂは青である。バーコードは、予想される一連の（sequential）色パターンを形成するように分けられている。このスキームでは、各バーコードが色と関連付けられ、すなわち３個のバーコード配列が作成される必要があり、その後、これらは色コードに従って組み合わされる。例えば、ｇＲＮＡコードがＲの場合、バーコードＲのみがｇＲＮＡテールに付加されなければならず、ｇＲＮＡコードがＲＧＢの場合、ｇＲＮＡテールで３個のバーコード全てが組み合わされる必要がある。バーコードは、それらのそれぞれの蛍光プローブの添加により検出され、実際の一連の色パターンが明らかになる。予想されない全てのパターンがゲノム再編成として同定される。
【０１７５】
【表４】
2017530695.tif 000008
【０１７６】
【表５】
2017530695.tif 000009
【０１７７】
【表６】
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【０１７８】
【表７】
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【０１７９】
【表８】
2017530695.tif 000012
【０１８０】
【表９】
2017530695.tif 000013
【０１８１】
【表１０】
2017530695.tif 000014
【０１８２】
【表１１】
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【０１８３】
【表１２】
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【０１８４】
【表１３】
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【０１８５】
【表１４】
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【０１８６】
【表１５】
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【０１８７】
【表１６】
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【０１８８】
【表１７】
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【０１８９】
【表１８】
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【０１９０】
【表１９】
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【０１９１】
【表２０】
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【０１９２】
【表２１】
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【０１９３】
【表２２】
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【０１９４】
【表２３】
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【０１９５】
【表２４】
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【０１９６】
【表２５】
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【０１９７】
【表２６】
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【０１９８】
【表２７】
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【０１９９】
【表２８】
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【０２００】
もう１つの例では、折り紙コード（Origami Code）（Nat Chem. 2012 Oct;4(10):832-9参照）を用いる；図８参照。核酸折り紙法は当業者に公知である。ｇＲＮＡテールを表３に記載の折り紙複数色スキームに従ってバーコード化する。バーコードは予想される一連のｇＲＮＡパターンを形成するように分けられる。このスキームでは、折り紙はｇＲＮＡテールプローブである。各折り紙複数色プローブがｇＲＮＡに特異的な結合部を有し、すなわち、７４１個の折り紙プローブにつき、７４１個のユニークなｇＲＮＡテール配列がある。ある折り紙複数色プローブは蛍光標識の結合位置を３個有し、高分解能または超分解能イメージングにより、スポット１、スポット２、スポット３に物理的に分解することができる。各スポットは、それに関連する種々の色コードを有する。これらのコードの組合せにより、折り紙複数色プローブのアイデンティティーが提供される。
【０２０１】
ｇＲＮＡバーコードは、それらのそれぞれの蛍光標識折り紙複数色プローブの添加によって検出される。実際の一連のｇＲＮＡパターンが明らかになる。予想されない全てのパターンがゲノム再編成として同定される。遺伝子座の領域を分離する位置決めＲＧＢコードの例と比べて、折り紙コードは単一ｇＲＮＡレベルで分離することができ、ゲノム領域または遺伝子座の編成のはるかに高度で詳細な同定を可能にする。
【０２０２】
Ｈｅｒ２アッセイ
全ての浸潤性乳癌にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術を用いたＨｅｒ２状態の決定が推奨される。現在認められている臨床診断法の最近の総説に、種々の臨床アッセイの現在の課題がハイライトされている（参照文献：Franchet C, Filleron T, Cayre A, Mounie E, Penault-Llorca F, Jacquemier J, Macgrogan G, Arnould L, Lacroix-Triki M. Instant-quality fluorescence in-situ hybridization as a new tool for HER2 testing in breast cancer: a comparative study. Histopathology. 2014 Jan;64(2):274-83）。
【０２０３】
利用可能な現行のアッセイに関する複数の課題が報告されている。その１つとして、従来のＦＩＳＨはプロセスが非常に長く、ハイブリダイゼーション用の試料調製（脱パラフィン、前処理、ペプシン消化、変性）に通常１日かかり、１２〜２４時間の非常に長いハイブリダイゼーションが行われ、翌日、ハイブリダイゼーションを徹底的に洗浄し、可視化が行われる。
【０２０４】
本明細書に記載の例示的な態様では、方法は、試料の前処理、ペプシン消化、または変性のいずれも必要としない。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、固定試料中の天然二本鎖ＤＮＡに容易且つ特異的にハイブリダイズすることができる。さらにハイブリダイズしていない複合体は容易に洗い流される。したがって、プロセス全体を１日以内に行うことができる。このタイムラインは、通常ＦＩＳＨアッセイの前に行われるＨｅｒ２免疫組織化学アッセイと同等である。さらに、このコード方法は、ＩＨＣおよびＣａｓ９−ｇＲＮＡ  ＦＩＳＨの両方を同時に進行させることができる。
【０２０５】
アッセイ間の精度および差異も問題として報告されている。しばしば１年続く乳癌処置の高いコストを考慮すると、間違った処置はかなりの社会的および経済的影響を生じる。本明細書に記載のある態様では、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡが、重複性および共局在を提供するようにコードされる。陽性試料は、異常と比較して区別することができる。さらに、本明細書に記載の方法は、試料の再プロービングが可能であり、すなわち、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡは標的ＤＮＡに結合させたまま、プローブを除去することができ、よりストリンジェントな条件下で新たなラウンドのプロービングを行うことができる。
【０２０６】
現行のＦＩＳＨアッセイには数百ドルかかる（参照文献：ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2706184/）。これは一部には、場合によってはインターカレーション蛍光分子を有する大きなベクターに挿入された非常に長いＤＮＡコピー（ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ）であるもしくは高価なペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ（ｐｈａｒｍＤｘ）である、プローブに用いられる材料のため、またはＤＮＡプローブ（ＩＮＦＯＲＭ）を検出するための抗体および二次抗体の使用のためである。本明細書に記載の方法は、コストを、ＦＩＳＨアッセイの前に行われる通常のＨｅｒ２  ＩＣＨ検査（約１００ドル）と同等にする。Ｃａｓ９は、細菌起源のタンパク質であり、安価な細菌系から効率的に発現および精製される。これは市販もされている。オリゴヌクレオチドアレイ合成装置を用いたｇＲＮＡ鋳型の合成は、現在ＤＮＡを合成する最も安価な方法である（０．０００４ドル／塩基、商業価格）。アレイ合成後、ＰＣＲを用いてオリゴヌクレオチドを増幅することができ、これにより、安価に無限に再増幅可能なｇＲＮＡ鋳型のプールが作成される。インビトロ転写が非常に効率的であり、ＤＮＡ分子当たり５００〜１０００ＲＮＡ分子が産生される。
【０２０７】
Ｈｅｒ２アッセイは、１７番染色体の比率として細胞当たりのＨｅｒ２遺伝子座の平均コピー数をレポートする。１７番染色体の最も一般的なレポーターは、セントロメア領域のαサテライト反復を標的化する。これは、比較的よく特徴解析されている領域であり、最大１０００個の単量体反復を含む（Waye JS, Willard HF. Structure, organization, and sequence of alpha satellite DNA from human chromosome 17: evidence for evolution by unequal crossing-over and an ancestral pentamer repeat shared with the human X chromosome. Mol Cell Biol. 1986 Sep;6(9):3156-65参照）。反復は本明細書に記載のＣａｓ９−ｇＲＮＡ法に特によく適している。この場合、わずかな数の異なるｇＲＮＡのみが必要とさる。表４にｇＲＮＡ標的のリストを示す。このリストは、他のＣＥＰ１７プローブの基礎となるよく特徴付けられているＤ１７Ｚ１遺伝子座から抽出した。このリストは、O'Keefe CL, Warburton PE, Matera AGに報告されているような変異体もカバーする。αサテライトＤＮＡ変異体のためのオリゴヌクレオチドプローブは、ＦＩＳＨにより相同染色体を区別することができる。Hum Mol Genet. 1996 Nov;5(11):1793-9)。しかし、本明細書に記載の方法を用いれば、Ｃａｓ９は通常その５′末端近くの１〜２個のミスマッチを許容するので、たった１１個のｇＲＮＡを用いてそれらの反復の大部分を標的化することができる（表５）。
【０２０８】
【表２９】
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【０２０９】
【表３０】
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【０２１０】
【表３１】
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【０２１１】
さらに、本明細書に記載の方法は、アレル変異体のスクリーニングが可能であり、これは個別化医療において必須の情報であり、処置に影響を与え得る。例えば、Ｈｅｒ２変異体Ｉ６５５Ｖが乳癌処置としてのタモキシフェンの効率低下に関わっており、考慮されるべきである（Chang NW, Chen DR, Chen FN, Lin C, Wu CT. HER2 codon 655 G-allele is associated with reductions in plasma high-density lipoprotein levels in breast cancer patients treated with tamoxifen. J Investig Med. 2011 Dec;59(8):1252-7.doi: 10.231/JIM.0b013e3182354923参照）。２つの同定されたｇＲＮＡ標的を変異体の同定に用いることができる（標的１：ＴＣＴＧＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＧＧ（配列番号：１４５）および標的２：ＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧ（配列番号：１４６））。アレル特異的バーコードと共に４個のｇＲＮＡのセット（標的１個につき２個）を用いることにより、標準的なＨｅｒ２アッセイの一部として、イソロイシンアレル（ＡＴＣ）とバリンアレル（ＧＴＣ）を識別する方法が提供される。
【０２１２】
１７番染色体のその他の領域も標的化できると理解される。例えば、Ｔｏｐ２ＡがＨｅｒ２遺伝子座の近くに位置しており、Ｈｅｒ２と一緒に増幅することが観察されており、これも適切な処置の選択に影響し得る。Smith K, Houlbrook S, Greenall M, Carmichael J, Harris AL. Topoisomerase II alpha co-amplification with erbB2 in human primary breast cancer and breast cancer cell lines: relationship to m-AMSA and mitoxantrone sensitivity. Oncogene. 1993 Apr;8(4):933-8参照。
【０２１３】
Ｈｅｒ２／ＣＥＮ１７をスクリーニングするためのＦＩＳＨプロトコールの例を以下に記載する。同じ試料に対して免疫組織化学およびＦＩＳＨアッセイの両方を行う場合、細胞または組織試料を、顕微鏡に適合する支持体（例えば、清浄なボロシリケート顕微鏡スライドまたは顕微鏡カバースリップ）上で１０％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液中で、４℃で１〜１６時間固定する。あるいは、試料は１００％メタノール中で、−２０℃で２０分〜１時間固定することができる（メタノールは、多くのタンパク質を抽出しつつ、試料中のＤＮＡをより効率的に保持する）。パラフィン包埋組織切片を、スライドに固定する前に脱パラフィンすべきであり、これは通常、キシレン中で５分インキュベートした後、エタノールで２回、水で１回洗浄することにより達成される。その後、固定された試料をＰＢＳＴ（ＰＢＳバッファーおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄し、その後、０．５％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳと５分間インキュベートする。その後、試料をＰＢＳＴで洗浄し、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ−標識複合体混合物を、ＰＢＳＴおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中の試料に加え、３７℃で２〜１６時間インキュベートする（すなわち、ミックスは、Ｈｅｒ２およびＣＥＮ１７に対するセットの両方ならびに同定のためのそれらのそれぞれの標識を含む）。インキュベーション後、ＰＢＳＴ中で３７℃にて３回洗浄することにより非結合Ｃａｓ９を除去する。試料は、褪色防止封入剤およびＤＡＰＩ（例えば、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇまたはＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ）を用いてマウントされ、封入される。試料は油浸６３倍対物レンズを用いてイメージングされる。あるいは、試料は、光から保護して４℃に維持した場合、数週間安定である。その後、腫瘍領域中の少なくとも２０個の核をカウントし、その各々について、Ｈｅｒ２およびＣＥＮ１７局在焦点の数を記録する。Ｈｅｒ２とＣＥＮ１７の比率が計算されてもよく、２０１３  ＡＳＣＯ／ＣＡＰガイダンス（Wolff AC, Hammond ME, Hicks DG, Dowsett M, McShane LM, Allison KH, Allred DC, Bartlett JM, Bilous M, Fitzgibbons P, Hanna W, Jenkins RB, Mangu PB, Paik S, Perez EA, Press MF, Spears PA, Vance GH, Viale G, Hayes DF; American Society of Clinical Oncology; College of American Pathologists. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 2013 Nov 1;31(31):3997-4013参照）に定められているような現行の診療に準拠して報告される。
【０２１４】
実施例ＩＩＩ
図１は、マウス胚性線維芽細胞の核のメジャーサテライト領域およびマイナーサテライト領域ならびにテロメア領域のｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｃａｓ９−ｇＲＮＡプロービングに関する。蛍光標識ＵＴＰを用いて、マウスメジャーサテライト反復（Ｃｙ５）、マイナーサテライト反復（Ａｌｅｘａ−４８８）、およびテロメア（Ｃｙ３）を標的化するための３種のｇＲＮＡを合成した（図１の説明：（Ａ）メジャーサテライト、（Ｂ）マイナーサテライト、（Ｃ）テロメア、（Ｄ）ゲノムＤＮＡのＤＡＰＩ染色、および（Ｅ）重ね合わせ写真）。本明細書に記載のプロトコールに従って、ｇＲＮＡをＣａｓ９と複合体化させた後、ＰＦＡ固定試料に加えた。パターンは、これらの標的で予想されるプロービング（Guenatri M, Bailly D, Maison C, Almouzni G. Mouse centric and pericentric satellite repeats form distinct functional heterochromatin. J Cell Biol. 2004 Aug 16;166(4):493-505参照）と一致する。６３倍／１．４０油浸対物レンズならびに各蛍光チャネルに適したＬＥＤ光源およびフィルターを備えたツァイス社のＡｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１で写真を撮影した。図１に関連する説明：Ａ、メジャーサテライト；Ｂ、マイナーサテライト；Ｃ、テロメア；ＤＮＡのＤＡＰＩ染色；Ｅ、重ね合わせ。
【０２１５】
実施例ＩＶ
図２は、図１の対照実験に関する。図１と同様のＣａｓ９プロービングプロトコールを用いて、マウスメジャーサテライト反復（Ｃｙ５）、マイナーサテライト反復（Ａｌｅｘａ−４８８）、およびテロメア（Ｃｙ３）を標的化する一般的に使用されるＦＩＳＨオリゴヌクレオチドを用いた。ＤＮＡのＤＡＰＩ染色（Ｄ）を除いて、他の蛍光シグナルは、図１で取り込まれた写真より拡散しており、顕微鏡上でコンストラクトを強くする必要があった。（図２の説明：（Ａ）メジャーサテライト、（Ｂ）マイナーサテライト、（Ｃ）テロメア、（Ｄ）ゲノムＤＮＡのＤＡＰＩ染色、および（Ｅ）重ね合わせ写真）。変性がないことで、これらのＦＩＳＨオリゴは、その標的へのハイブリダイズが妨げられ、さらに核の外側で凝集した。６３倍／１．４０油浸対物レンズならびに各蛍光チャネルに適したＬＥＤ光源およびフィルターを備えたツァイス社のＡｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１で写真を撮った。図１に関連する説明：Ａ、メジャーサテライト；Ｂ、マイナーサテライト；Ｃ、テロメア；ＤＮＡのＤＡＰＩ染色；Ｅ、重ね合わせ。
【０２１６】
実施例Ｖ
図３は、天然Ｃａｓ９の結合活性および切断が独立しており、マグネシウムイオンの有無に依存することを示す、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡゲルシフトおよび切断アッセイに関する。以下のように調製した反応液：２ｐｍｏｌのヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９（ＮＥＢ社）、２ｐｍｏｌの合成Ｇｒｎａ（位置Ｌ２２１１６のラムダＤＮＡを標的化）、および０．２ｐｍｏｌの２ｋｂ  ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片（ラムダＤＮＡ  Ｌ２１３３３−Ｌ２３３３２由来）を混合し、５Ｍｍ  ＭｇＣｌ２の存在下（レーン１）またはマグネシウム非存在下（レーン２）で、３７℃で１時間インキュベートした。レーン１は、マグネシウム存在下での二次切断産物を示しており、レーン２は、切断産物が存在しないが、複合体がまだ結合していることにより生じる小さな上側へのシフトを示している。レーン３およびレーン４は、Ｃａｓ９タンパク質を反応液から省いたこと以外は、それぞれレーン１および２と同様の条件下で行われた。レーン３および４では切断およびシフトは観察されなかった。
【０２１７】
実施例ＶＩ
図４Ａ〜図４Ｌは、ｇＲＮＡテールバーコードおよびプロービングの例に関する。図４Ａは、Ｃａｓ９タンパク質（１）、および突出テトラループ（tetraloop）（３）とバーコードを有する突出ｇＲＮＡテール（４）とを有する複合体化したｇＲＮＡ（２）を示している。バーコードは、検出可能な部分または標識（６）を有する、ハイブリダイゼーションプローブ（５）により検出される。図４Ｂは、ｇＲＮＡテールが２個以上のバーコードによってコードされ得ることを示す図である。図４Ｂには２個のバーコードが描かれており（４および７）、これらは、検出可能な部分または標識（６）を有するそれらの各ハイブリダイゼーションプローブ（５および８）によって検出することができる。図４Ｃ中、ハイブリダイゼーションプローブは、シグナルを増幅するために、複数の検出可能な部分または標識（９）を有し得る。図４Ｄ中、検出可能な部分は、直接検出可能でなくてもよく（１０）、検出可能な部分への特異的親和性を有する、二次的な検出可能な薬剤（１１）の使用が必要であってもよい。この二次的薬剤は、検出されているシグナルを検出または増幅するための、検出可能な部分または標識（１２）を有する。図４Ｅ〜図４Ｉは、ローリングサークル増幅を介してｇＲＮＡテールをプロービングする方法を示す図である。図４Ｅは、Ｃａｓ９タンパク質（１）、および突出テトラループ（３）とバーコード（４）を有するｇＲＮＡテールとを有する複合体化したｇＲＮＡ（２）を示している。バーコードの検出は、バーコードに対する親和性をプローブの１つの領域に有し、標識プローブがハイブリダイズする標的部位（１４）を別の領域に有する、環状ハイブリダイゼーションプローブ（１３）によりなされる。図４Ｆは、環状プローブ（１３）が、ｇＲＮＡテール（１６）を伸長させるためのローリングサークル増幅ポリメラーゼ（１５）の鋳型としての機能を果たし得ることを示している。図４Ｇは、ローリングサークル増幅により、多様な密接して局在する標識プローブハイブリダイズ標的部位（１８）を有する、局在する増幅されたハイブリダイゼーションプローブ（１７）が形成されることを示している。図４Ｈは、検出可能なプローブ（１９）を添加することによりシグナル増幅ｇＲＮＡテールプローブ（２０）を生じさせることによって、標識プローブハイブリダイズ標的部位を検出可能にできることを示す図である。図４Ｉは、図４Ｈと同様のローリングサークル増幅されたプローブ（２０）を示す図であり、ｇＲＮＡバーコードに環状プローブがハイブリダイズせずに生成および標識（２１）されることにより、ｇＲＮＡ自体の上でのローリングサークル増幅および標識ステップが避けられる。このｇＲＮＡから離れて生成されるプローブは、図４Ａに示されているようなｇＲＮＡテールのバーコード領域（４）に領域（５）を介してハイブリダイズすることができる。図４Ｊ〜図４Ｌは、核酸自己アセンブリーを介してｇＲＮＡテールをプロービングする方法を示す図である。図４Ｊは、核酸プローブのお互いへの連続的な線状アセンブリーを示す図である。バーコードハイブリダイズ領域（５）、アセンブリー領域（２１）、および標識（６）で構成される第１の断片が最初にｇＲＮＡテールバーコード（図４Ａ、４）にハイブリダイズする。２１または２２または２３に部分的に相補的な標識アセンブリー断片（２２および２３）の混合物が加えられ、反応液中に部分的に相補的な断片が存在する限り、これらは自己アセンブルする。ここでは構造の一部だけが描かれている。これは、以前に記載されているハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）と同様である。Dirks RM, Pierce NA. Triggered amplification by hybridization chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Oct 26;101(43):15275-8参照。図４Ｋは、多分岐核酸プローブデンドリマー構造自己アセンブリーを示す図である。バーコードハイブリダイズ領域（５）、アセンブリー領域（２４）、および標識（６）で構成される第１の断片が最初にｇＲＮＡテールバーコード（図４Ａ、４）にハイブリダイズする。２４または２５または２６に部分的に相補的である標識されたアセンブリー断片（２４、２５、および２６）の混合物が加えられ、反応液中に部分的に相補的な断片が存在する限り、これらは多分岐構造へと自己アセンブルする。ここでは構造の一部だけが描かれている。この種の核酸デンドリマーは以前に報告されている。Li Y, Tseng YD, Kwon SY, D'Espaux L, Bunch JS, McEuen PL, Luo D. Controlled assembly of dendrimer-like DNA. Nat Mater. 2004 Jan;3(1):38-42参照。図４Ｌは、シグナルを直線的に増幅するための核酸プローブの分岐部のアセンブリーを示す図である。バーコードハイブリダイズ領域（５）、アセンブリー領域（２７）で構成される第１の断片が最初にｇＲＮＡテールバーコード（図４Ａ、４）にハイブリダイズする。２７または２９または３０に部分的に相補的な標識されたアセンブリー断片（２９および３０）の混合物が加えられ、これらは自己アセンブルすることができる。検出可能なプローブ（２８）が、反応液中に部分的に相補的な断片が存在する限り、アセンブリー断片（２７）および（３０）の一部にハイブリダイズすることができる。ここでは構造の一部だけが描かれている。これは以前に報告されている分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）と同様である。Collins ML, Irvine B, Tyner D, Fine E, Zayati C, Chang C, Horn T, Ahle D, Detmer J, Shen LP, Kolberg J, Bushnell S, Urdea MS, Ho DD. A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below 100 molecules/ml. Nucleic Acids Res. 1997 Aug 1;25(15):2979-84参照。
【０２１８】
検出可能な部分（例えば、６、９、１０、１２）は、蛍光、化学発光もしくは発色、または共鳴などの複数の検出手段を提供できると理解される。ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、５、８、９、１４）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、修飾ＲＮＡなどの種々の核酸コンポーネントで作製され得ると理解される。
【０２１９】
実施例ＶＩＩ
図５Ａは、ラテラルフロー検査システムの表面に結合しているＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体に関する。調べられるＤＮＡの集団がシステム上にローディングされ、ラテラルフローによりこれが検査ゾーンに移動され、そこで標的特異的Ｃａｓ９−ｇＲＮＡが特異的ＤＮＡに結合する。残りのＤＮＡはアッセイの末端まで流れ続け、対照ゾーンで捕捉されるが、標的ＤＮＡは検査ゾーンでＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体に結合したままである。ＤＮＡ検出は、核酸染色によって、またはＤＮＡへの検出可能なプローブのハイブリダイゼーションによって、またはＤＮＡへの検出可能なプローブの共有結合によって、または検出可能な部分を有する特異的オリゴヌクレオチドプライマーもしくはユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー存在下でのＤＮＡの酵素増幅（例えば、等温増幅）によって行うことができる。ラテラルフローアッセイでしばしば使用される検出可能な部分としては、金ナノ粒子または銀ナノ粒子が含まれる。その他の部分、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセインが、二次的な検出剤と組み合わせて一般的に使用される（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、またはフルオレセインに特異的な、金または銀でコーティングされた抗体）。図５Ｂは、疎水性または電荷など、ＤＮＡまたはタンパク質を保持するための異なる特性を有する２つの材料を用いたラテラルフローシステムに関する。例えば、ニトロセルロース膜は、ＤＮＡよりもタンパク質を選択的に保持し、一方、ナイロン膜はタンパク質よりＤＮＡに結合する。検査対象のＤＮＡ集団をローディングすると、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が標的ＤＮＡに結合する。ＤＮＡに結合したＣａｓ９は、検査ゾーンでＤＮＡ保持膜によって保持されるが、非結合Ｃａｓ９は通過して、対照ゾーンでタンパク質保持膜に結合する。ＤＮＡと共にＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を検出するための検出を行う。ｇＲＮＡは本明細書に記載の方法によりプロービングされる。あるいは、Ｃａｓ９タンパク質自体が部分（例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセイン）を有していてもよい。図５Ｃは、調べられるＤＮＡの集団が最初に分子相互作用（例えば、電荷、疎水性、共有結合性相互作用、または親和性相互作用、例えばビオチン−ストレプトアビジン）により検査ゾーンの表面で捕捉される、ラテラルフローシステムに関する。その後、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡを、検査ゾーンで表面に捕捉された標的ＤＮＡに結合させる。残りの未反応Ｃａｓ９−ｇＲＮＡは通過して、対照ゾーンで捕捉される。ＤＮＡと共にＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を検出するための検出を行う。ｇＲＮＡは本明細書に記載の方法でプロービングされる。あるいは、Ｃａｓ９タンパク質自体が部分（例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセイン）を有していてもよい。
【０２２０】
実施例ＶＩＩＩ
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を用いた標的ＤＮＡのプロービング
ガイドＲＮＡをインビトロで設計、調製、発現、および精製した。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドを合成する（ＩＤＴ社またはＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社のチップ）。これらのオリゴはインビトロＲＮＡ合成のためのＴ７転写開始部位、およびプロービングに用いられる３′末端テールを形成するための伸長部を含む。Ｔ７  ＲＮＡ合成を行い、ＲＮＡを精製する。
【０２２１】
ある態様では、伸長された配列またはテールは、ＤＮＡ−ＰＡＩＮＴを用いた超分解能イメージング（２．７ｎｍの分解能を達成することができ、これは８ＤＮＡ塩基であるので、Ｃａｓ９のフットプリント２０ｂｐより小さい）を達成するために、立体障害が最小限になるようにならびに複雑さおよび自由エネルギーが低くなるように設計される。設計されたガイドＲＮＡは、長さが９塩基長で異なる配列のＡ、Ｔ、およびＣ塩基を含む（Ｇは含まない）、２０種の異なるＰＡＩＮＴドッキング部位を有し、ＰＡＩＮＴプローブは相補的配列にフルオロフォアがプラスされたものである。
【０２２２】
イメージング間にプローブを洗い流して新しいプローブをローディングすることにより、フルオロフォア当たり２０種のプローブを達成することができ、すなわち、フルオロフォア１個につき２０種の異なるｇＲＮＡをイメージングすることができる。したがって、４個のフルオロフォアで８０種のｇＲＮＡを識別することができる。
【０２２３】
ガイドＲＮＡ構造の一実施形態は、（５′→３′）ｇＲＮＡ−ＵＵＵＵＵ−ＰＡＩＮＴドックである。このガイドＲＮＡ配列は、通常ＳｐＣａｓ９と共に使用される一本鎖ガイドＲＮＡの最小の長さである。
【０２２４】
高分解能イメージングのために、伸長された配列またはテールは、立体障害が最小になるようにならびに複雑さおよび自由エネルギーが低くなるように設計される。しかし、高分解能イメージングでは、より長いアニーリング領域が使用される。伸長された配列またはテールの構造は、配列特異的オリゴでプロービングできるバーコードとして働くことができるか、またはパッドロックプローブとして働くことができ、続けてローリングサークル増幅を行うことができる。
【０２２５】
ＳｐＣａｓ９を大腸菌中で発現させた。ギブソンの等温アセンブリーを用いて、大腸菌中での発現に適したプラスミド中に、Ｃａｓ９コード遺伝子をアセンブルおよびクローニングする。誘導後、細胞を溶解し、タンパク質を精製する。
【０２２６】
細胞を溶解することにより標的ＤＮＡを得、それ以上調製しなかった。したがって、試料は、染色体起源および染色体外起源（例えば、プラスミド）のＤＮＡの混合物を含む。
【０２２７】
Ｃａｓ９をｇＲＮＡと混合し、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および標的核酸が複合体を形成するのに十分な時間（約１５分）、ＤＮＡ試料に加え、その後、検出プローブを加える。その後、イメージングデータを取得する（数秒〜数分）。
【０２２８】
ナノポア検出では、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が、計画された間隔でｄｓＤＮＡ断片上に結合する。その後、ＤＮＡを、ナノポア（またはナノギャップ電極）の中をまたはその近傍に移行させる。電流の変化を測定する。すなわち、ｄｓＤＮＡは特定の電流で移動するが、ＤＮＡに結合した複合体は電流を一部ブロックし、これを電流スパイクとして記録することができる。経時的なこれらのスパイクイベントを分析することにより、標的ＤＮＡ上のＣａｓ９／ｇＲＮＡの位置を推測し、ガイドＲＮＡ設計に基づく予測位置と比較することができる。
【０２２９】
上記方法を用いて、複数の標的を一度に検出し、ＤＮＡ標的の性質、例えばセントロメアの反復領域、それらの反復に連結した染色体のアイデンティティー、（細菌ゲノムまたはプラスミドに含まれる）薬剤耐性遺伝子の同定、可動配列（例えば、トランスポゾン、薬剤耐性カセット）、疾患関連遺伝子の特異的アレル（例えば、癌遺伝子、自己免疫、神経変性）の同定などに関する情報することができる。
【０２３０】
実施例ＩＸ
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を用いた標的ＤＮＡのプロービング
Michalet et al (Dynamic Molecular Combing, Science 1999)に従い、ヒトゲノムＤＮＡ（ノバジェン社）を０．５Ｍ  ＭＥＳバッファーｐＨ５．５で約０．２ｎｇ／μｌに希釈し、ビニルシランコーティングされた基板（ゲノミックビジョン社、パリ）上での分子コーミングを行った。簡潔に述べると、これは、ラングミュア−ブロジェット（Langmuir-Blodgett）のセットアップと同様に、ビニルシランコーティングされたカバーグラスをＤＮＡ含有溶液中に浸し、その後、固定された速度でこれを引き上げることを含む。これは、「後退メニスカス」の機構により基板上にＤＮＡを伸展させる働きをした。ＤＮＡが溶液から完全に引き上げられた際、これを１０，０００マイクロジュール／平方センチメートルでＵＶ架橋結合した。これにより、表面上で一方向的に整列された大量のＤＮＡが得られた。注意深くＤＮＡ調製した場合、ＹＯＹＯ−１などのＤＮＡ染色を用いてメガベースの長さのＤＮＡを可視化することができる。
【０２３１】
基板上で伸展されたゲノムＤＮＡをバッファーで湿らせた後、（３７度で１０分間のプレインキュベーションにより）予め形成させたｇＲＮＡ／ｃａｓ９（ＮＥＢ社）複合体を基板に加え、１時間反応させた。その後、過剰な複合体を洗い流した。ガイドＲＮＡは、セントロメア配列に相補的な部分を有するように設計し、ガイドの３′末端は、プローブ配列に相補的なテール核酸配列を有するように設計した。任意の所望のゲノム配列に対してガイドＲＮＡを設計できることが当業者には容易に理解されよう。ガイドＲＮＡおよびテール配列、プロモーターおよび終止シグナル配列を含む配列（ＩＤＴ社）をインビトロ転写システムで用いて、鋳型からプローブ配列に相補的なテール配列を有するガイドＲＮＡを合成した。Ｚｙｍｏ社のｃｌｅａｎ／ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて、プローブ配列に相補的なテール配列を有するガイドＲＮＡを精製した。その後、転写されたＲＮＡを、前述したようにＣａｓ９とインキュベートした後、伸展ＤＮＡに加えた。
【０２３２】
その後、スライドをＢＬＯＣＫＡＩＤ（インビトロジェン社）で処理した。その後、ｇＲＮＡ配列上のテールに対する相補性を有する１６ｎｔのＤＮＡプローブを非ストリンジェントな条件下（４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、Ｂｌｏｃｋａｉｄ）で複合体と反応させた。使用したプローブは両末端をＡｔｔｏ  ６５７Ｎ色素で標識した（インビトロジェン社のカスタム合成オーダー）。ハイブリダイゼーション反応を４℃で一晩置いた。その後、スライドを洗浄して過剰な色素を除去し、ＴＩＲＦ顕微鏡でイメージングした。
【０２３３】
ＤＮＡ標的は二本鎖のままであったので、Ａｔｔｏ６４７Ｎのイメージングの前または後で、ＹＯＹＯ−１色素で染色することができた。ガイドＲＮＡ上の標識は赤色レーザーおよび適切なフィルターを用いて検出し、ＤＮＡ染色は青色レーザーおよび適切なフィルターを用いて検出した。イメージングは広視野ＴＩＲＦ顕微鏡によりなされた。
【０２３４】
図６Ａは、表面上で伸長されたまたは予め伸展された二本鎖ヒトゲノムＤＮＡ（線）に結合させた、セントロメア特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）／Ｃａｓ９複合体（点）の結果を示す画像である。図６Ｂは、ヒトセントロメアＤＮＡ（灰色）へのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９（点）の結合の超解像度画像である。
【０２３５】
図６Ａに示されているように、プローブにより、概算でゲノムの約１％を構成するセントロメアＤＮＡが標的化された。複数の視野を調べたところ、図６Ａに示されているように、線に沿った関連するプローブ標識の点がある視野がしばしば見られた。ＤＮＡ染色により、スライドが、線に沿った関連する標識を示さない多くの伸展ＤＮＡ分子を有することが示され、これにより、本明細書に記載の方法により、検出可能なｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を用いて、複数の核酸を含む試料内の特定の標的核酸を同定できることが実証された。
【０２３６】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９バッファーは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含み、２５℃でｐＨ６．５であった。ハイブリダイゼーションバッファーは、２００μｌの「ｎｅａｔ」ホルムアミド、２０μｌの１０％ＳＤＳ、１２０μｌのｂｌｏｃｋａｉｄ、４０μｌの２０×ｓｓｃ、および２０μｌの水を含んでいた。使用したＣａｓ９は、終濃度２５〜３０ｎＭのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＮＥＢ社）であった。使用した標識オリゴ（ＩＤＴ社）濃度は約８００ｎＭであった。
【０２３７】
図６Ｃは、インビトロでのＣａｓ９結合アッセイに関する。全長ラムダＤＮＡ（約４８ｋｂ）を、単独のまたはＣＲＩＳＰＲ−ｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９でプロービングし、ビニルシラン官能化ガラス表面上で伸展させた。その後、Ｃａｓ９をフィコエリトリンコンジュゲート抗体（濃）で標識し、ＤＮＡをＹＯＹＯ−１（薄）で標識した。画像は、ＴＩＲＦモードで１００倍／１．４７油浸対物レンズを用いてライカ社のＤＭ１６００上で取得した。
【０２３８】
実施例Ｘ
図７は、ＢＲＣＡ１遺伝子座に適用された位置決め赤−緑−青（ＲＧＢ）バーコード化システムに関する。ＢＲＣＡ１遺伝子およびＢＲＣＡ２遺伝子内の大きな再編成は、男女両方において乳癌および卵巣癌感受性の重要なマーカーである。再編成は、癌の発症リスクおよび適切な処置についての情報をもたらし得る。［Judkins T, Rosenthal E, Arnell C, Burbidge LA, Geary W, Barrus T, Schoenberger J, Trost J, Wenstrup RJ, Roa BB. Clinical significance of large rearrangements in BRCA1 and BRCA2. Cancer. 2012 Nov 1;118(21):5210-6.; Liede A, Karlan BY, Narod SA. Cancer risks for male carriers of germline mutations in BRCA1 or BRCA2: a review of the literature. J Clin Oncol. 2004 Feb 15;22(4):735-42］。これらの大きな再編成の範囲は非常に広く、これらの再編成の特徴解析には通常、ＰＣＲ増幅ＤＮＡのサンガーシーケンシングが用いられる。本発明者らのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プロービング戦略は、遺伝子座に沿った特異的色パターン（表３、位置決めコード）を用いて、ＢＲＣＡ遺伝子座の全長を高密度（１００ｂｐ当たり約１個のプロービング部位）で標識する。その遺伝子座内の再編成された任意の領域について、色パターンが変化し、これらの大きな再編成を同定することができる。本発明者らのアプローチは、シーケンシングに代わる簡便な選択肢を提供する。本発明者らのアプローチはさらに、急性骨髄性白血病などのその他の癌、Ｂｕｓｈｙ症候群（Bushy syndrome）などの発達障害、および自閉症などの神経発達疾患におけるその他の同様な再編成を検出するために用いられる。本アプローチを適用できる別のカテゴリーの再編成としては、免疫細胞受容体のＶＤＪ組換えが挙げられる。
【０２３９】
実施例ＸＩ
図８は、ｇＲＮＡ／ｃａｓ９複合体に標的化される特異的位置に適用されたＤＮＡ折り紙バーコードに関する。各バーコードは、ｇＲＮＡが標的化する位置に固有である。ＢＲＣＡ１遺伝子およびＢＲＣＡ２遺伝子は、サンガーシーケンシングでのみ検出可能な、より小さな挿入および欠失を含む様々な大きさのゲノム再編成を受け易い。本発明者らのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プロービング戦略は、各ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位に固有のバーコードを用いて、高密度（１００ｂｐ当たり約１個のプロービング部位）で各ＢＲＣＡ遺伝子座の全長を標識する。このバーコードは、以前に報告されているように蛍光折り紙バーコードの形態をとる［Lin C, Jungmann R, Leifer AM, Li C, Levner D, Church GM, Shih WM, Yin P. Submicrometre geometrically encoded fluorescent barcodes self-assembled from DNA. Nat Chem. 2012 Oct;4(10):832-9］。各バーコードを解読することにより（表３、折り紙コード）、各ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９および遺伝子座上のその位置が同定され、これは、遺伝子座内の再編成された領域、欠失、および挿入に関する情報を提供する。このレベルの分解能は、適切な癌の処置を決定する際に医師が考慮に入れることができる。本発明者らのアプローチは、シーケンシングに代わる選択肢を提供する。本発明者らのアプローチは、その他の癌、発達障害、および神経発達疾患における他の同様な再編成の検出にも用いられる。本アプローチを適用できる別のカテゴリーの再編成としては、免疫細胞受容体のＶＤＪ組換えが挙げられる。
【０２４０】
実施例ＸＩＩ
図９Ａ〜図９Ｂは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ニックからのポリメラーゼ伸長に関する。図９Ａは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体によって切断される標的ＤＮＡのトップ鎖（top strand）を示している。図９Ｂは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９のＨ８４０Ａ変異体によって切断される標的ＤＮＡのボトム鎖（bottom strand）を示している。曲がった矢印は、ニックからのプライマー伸長の方向を示している。プライマー伸長を用いて、標的領域を標識するか、または標的領域のシーケンシングを開始することができる。本発明者らのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ニックおよびシーケンシングアプローチは、ゲノム上でシーケンシング開始部位を正確に標的化して配置することができる。簡潔に述べると、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ニッカーゼは、目的の標的位置でＤＮＡ鎖にニックを形成する。その後、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９が、界面活性剤、変性剤、または温度などの複数の方法のいずれかにより外される。その後、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび標識されたｄＮＴＰを加えることにより、ニック部位からＤＮＡを伸長させる。このｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ニック開始法は多数の目的のゲノム領域に適用することができる。反復領域、例えばセントロメアＤＮＡは、多数の短い反復のため、本質的にシーケンシングおよびアラインメントが難しい。ゲノム再編成は、しばしば、より小さな変異を含む。さらに、多くのゲノム再編成は特徴解析が不十分であり、再編成または融合の位置は未知である。
【０２４１】
実施例ＸＩＩＩ
図１０はＰＡＭ部位を見つけるためにＣＨＯＰＣＨＯＰを用いた場合に得られる出力のダイアグラムである。ＣＨＯＣＨＯＰは、所与の遺伝子座上のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的およびオフターゲットを見つけてスコア化するための多くのオンラインツールで使用されるアルゴリズムの１つである［Tessa G. Montague; Jose M. Cruz; James A. Gagnon; George M. Church; Eivind Valen. (2014). CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42. W401-W407］。このダイアグラムはＨｅｒ２エキソン上の標的サーチの図示的出力を表している。小さい三角形は、Ｈｅｒ２エキソン上のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位を表す。標的配列のリストを抽出し、オフターゲットがないまたは少ない標的のみを維持するように整理した後、ｇＲＮＡを設計するために用いることができる。このツールは他の遺伝子座のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的を見つけるために用いられる。イントロンおよびエキソンの両方または遺伝子座の外側の標的を見つけるために他のツールを用いることができる。
【０２４２】
実施例ＸＩＶ
図１１は、ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたガイドＲＮＡのインビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型のアセンブリーに関する。この戦略は、２個のユニバーサルオリゴヌクレオチドである、インビトロ転写のためのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識モチーフの部分をさらに含むフォワードＰＣＲプライマーである、Ｆｗｄ−Ｔ７−ｇＲＮＡ；およびｇＲＮＡスキャフォールドであるｇＲＮＡ．ｓｐｌｉｔ６０に基づく。さらに２種類の特異的オリゴヌクレオチドである、目的の標的に特異的な配列であるＳｐ．ｇＲＮＡ．ｓｐｌｉｔ６０；およびマルチプレックス鎖検出のためのバーコードハンドルをさらに含むリバースＰＣＲプライマーであるＲｅｖ−Ｂ１−ｇＲＮＡ．１８もある。示唆される融解温度（Ｔｍ）も記載されている。この設計は、費用対効果が高く、増幅エラーを最小限に抑え、小スケールまたは大スケールのオリゴヌクレオチドに適している。ＤＮＡ鋳型は、一度増幅すれば、ＰＣＲで再増幅して鋳型を作製および永続化することができ、これは新規合成より費用対効果が高い。ＰＣＲアセンブリーに要する時間は１時間未満である。ＰＣＲ後、鋳型ＤＮＡにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼミックスを加えることによりインビトロ転写（ＩＶＴ）によりｇＲＮＡを合成する。
【０２４３】
実施例ＸＶ
図１２はＡＬＫ転座のＣａｓ９−ｇＲＮＡ標的化の模式図である。この図は、２つの融合領域が知られている場合に、特異的バーコードを有するｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を用いることにより融合の発生率を検出できることを示している。ＡＬＫ遺伝子座は、染色体内および染色体間の両方の再編成および逆位を受け易い。臨床的な結果が有害である７種のそのような再編成が知られている［Solomon B, Varella-Garcia M, Camidge DR. ALK gene rearrangements: a new therapeutic target in a molecularly defined subset of non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2009 Dec;4(12):1450-4］。本発明者らのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９プロービング戦略は、各遺伝子座に関連する色を用いて、特異的座領域を高密度（１００ｂｐ当たり約１個のプロービング部位）で標識する。この戦略は、遺伝子融合および逆位の検出に有用である。２つの標識された遺伝子座が隣接する場合、それらのそれぞれの標識が共局在シグナルとして検出される。再編成の場合、２つのシグナルはもはや共局在せず、かなり離れている。逆位の場合、シグナルは共局在しないが、まだ同じ近傍にある。信頼性を高めるためには、（ＡＬＫ染色体再編成による）遺伝子融合の場合、またはＡＬＫ逆位の場合に、異なる共局在の組合せを提供する第３の遺伝子座を標識する。そのようなＡＬＫ欠損の検出は、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＫ−ＮＰＭ１融合）、肺腺癌（ＡＬＫ−ＥＭＬ４の融合および逆位）、および特定の小児神経芽細胞腫などの複数の癌の同定に重要である。特定のＡＬＫ再編成に対しては治療法が存在する。複数のその他の疾患が遺伝子融合により特徴付けられており、本発明者らのアプローチに適している。遺伝子融合標的のいくつかの例としては、ＡＢＬ１−ＢＣＲ、ＡＭＬ１−ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＡＭＬ１−ＥＴＶ６、ＢＣＬ−２−ＩＧＨ、ＢＣＬ−２−ＭＬＴ、Ｃ−Ｍｙｃ−ＩＧＨ、ＣＯＬ１Ａ１−ＰＤＧＦＢ、ＣｙｃＤ１−ＩＧＨ、ＥＴＶ６−ＴＲＫＣ、ＥＴＶ６−ＪＡＫ、ＦＬＩ１−ＥＷＳ、ＰＡＸ８−ＰＰＡＲＧ、ＰＭＬ−ＮＲ１Ｂ１、ＴＣＲ−ＲＢＴＮ２、ＳＳ１８−ＳＳＸが挙げられる。
【図１】
2017530695.tif 000036
【図２】
2017530695.tif 000037
【図３】
2017530695.tif 000038
【図４−１】
2017530695.tif 000039
【図４−２】
2017530695.tif 000040
【図４−３】
2017530695.tif 000041
【図５Ａ】
2017530695.tif 000042
【図５Ｂ】
2017530695.tif 000043
【図５Ｃ】
2017530695.tif 000044
【図６Ａ】
2017530695.tif 000045
【図６Ｂ】
2017530695.tif 000046
【図６Ｃ】
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【図７】
2017530695.tif 000048
【図８】
2017530695.tif 000049
【図９】
2017530695.tif 000050
【図１０】
2017530695.tif 000051
【図１１】
2017530695.tif 000052
【図１２】
2017530695.tif 000053
【国際調査報告】
2017530695.tif 000054
2017530695.tif 000055
2017530695.tif 000056