(57)【要約】  抗ＣＤ４０Ｌドメイン抗体を用いる腎臓移植拒絶を治療する方法が提供される。抗ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂは血小板凝集を引き起こしにくく、したがって血栓塞栓症を引き起こしにくい。適切な抗ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂ用量および投与レジメンもまた提供される。任意に従来の免疫抑制性の腎臓移植治療と、抗ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂ、ＣＴＬＡ４変異体分子（例えば、ベラタセプト）および／または抗ＣＤ２８を用いる、移植拒絶、特に腎臓移植拒絶のための併用療法が提供される。
2017509649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）を、それを必要とする患者に投与することを含む、腎臓移植拒絶を治療する方法。
【請求項２】
移植拒絶が急性移植拒絶である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
移植拒絶が慢性移植拒絶である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
約２から約３０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量でＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）を投与することを含む、請求項１−３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
約２０から約３０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量でＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）を投与することを含む、請求項１−３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量でＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）を投与することを含む、請求項１−３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
免疫抑制性／免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤と共にＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）が投与される、請求項１−６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫抑制性／免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤が、ＣＴＬＡ４変異体分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＴＬＡ４変異体分子がＬ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇ（ベラタセプト）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇ（ベラタセプト）が約１０ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇ（ベラタセプト）が約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）が治療レジメンの期間の間毎週投与される、請求項１−１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）と共に前記免疫抑制性、免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤が、治療レジメンの期間の間毎週投与される、請求項７−１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
治療レジメンの期間が７０日である、請求項１２または１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）が静脈内に投与される、請求項１−１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫抑制性、免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤が静脈内に投与される、請求項７−１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が腎臓移植拒絶の治療のための従来療法をさらに受ける、請求項１−１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記従来療法が抗ＩＬ−２Ｒ抗体、ソルメドロール、およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）の組み合わせである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫抑制性／免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤が抗ＣＤ２８  ｄＡｂである、請求項１−１８のいずれかの方法。
【請求項２０】
前記抗ＣＤ２８  ｄＡｂが配列番号：２６を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ＣＤ２８  ｄＡｂがＰＥＧ化されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＥＧ化抗ＣＤ２８  ｄＡｂが４０ｋＤ分岐ポリエチレングリコールでＰＥＧ化されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で抗ＣＤ２８  ｄＡｂが投与される、請求項２０−２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
１週間間隔で約３ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で抗ＣＤ２８  ｄＡｂが投与される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂｓを用いる、移植拒絶、特に腎臓移植拒絶を治療する方法が提供される。適切な抗ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂ用量および投与レジメンもまた提供される。さらに、抗ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂおよびＣＴＬＡ４抗体を用いる、移植拒絶、特に腎臓移植拒絶のための併用療法が提供される。
【０００２】
関連出願の参照
本出願は、全ての目的のために、その全体が明細書中に組み込まれる、２０１４年３月１９日に出願された米国仮出願番号第６１／９５５，５８８号の利益を主張する。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、かつその全体が出典明示により明細書中に組み込まれる配列表を含有する。２０１５年３月１９日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、２００８９６＿５２２６０３＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、かつサイズは３０，３２８バイトである。
【背景技術】
【０００４】
背景
移植は、末期の臓器不全のための治療であり、米国において年間２５，０００件以上の固形臓器移植が実施されている。約３０年前のカルシニューリン阻害剤治療の導入以来、急性拒絶に起因する早期の生着不全の発生率は、劇的に減少してきた。しかしながら、長い間、移植片生存は理想より低いままである。免疫および非免疫媒介性慢性移植片損傷は、同種移植片機能の進行性の損失を生じうる。慢性移植片損傷は、ある程度、特定のカルシニューリン阻害剤における、現在の免疫抑制性の治療に関連する非免疫性の副作用に起因されうる。近年では、Ｔ細胞共刺激に関与する、細胞表面タンパク質を伴う経路を含むＴ細胞活性化および機能が関与する多くの経路が解明されている。より特異的にＴ細胞媒介性拒絶を阻害し、かつ現在の免疫抑制性の薬剤に関連する副作用を回避するために、Ｔ細胞活性化が関与する経路に対する新規生物学薬剤が開発されている。
【０００５】
これらの薬剤の中でも、抗ＣＤ４０Ｌ抗体である。免疫および炎症反応におけるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の役割は、それらを、病理学的な免疫−炎症プロセスの治療のための有望な標的とした。特異的なＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の遮断は、うまく霊長類における同種移植拒絶を予防し、かつ動物モデルにおける自己免疫疾患およびアテローム性動脈硬化症を治療する。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７４：１３６５−１３６９（２００２）。
【０００６】
ヒトにおいて、２つの異なる抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローンが、様々な自己免疫疾患の治療のための臨床試験において使用されてきた。Ｍａｒｉｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：９３７−４４（２００８）。モノクローナル抗体は、しかしながら、アテローム血栓性中枢神経系事象、心筋梗塞、肺塞栓症、および深部静脈血栓症などの血栓塞栓性（ＴＥ）合併症の非常に高い発生率を示しうる。例えば、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂクローン  ｈｕ５ｃ８（抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎ）の有用性は、ＴＥ合併症の非常に高い発生率により制限される。これらの抗体により誘導されるＴＥ合併症は、それらのＦｃｇＲＩＩａ受容体を介して隣接血小板を連結でき、それによって、凝集することができ、結果として血栓形成を生じる、血小板上の膜結合ＣＤ４０Ｌまたは血小板から放たれるｓＣＤ４０ＬとｍＡｂのより高次の免疫複合体（ＩＣ）の形成を生じると考えられている。血栓塞栓症の危険性は、全ての進行中の臨床試験を停止するに至った。Ｂｏｕｍｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４８：７１９−７２７（２００３）。
【０００７】
したがって、本発明は、ＣＤ４０Ｌを標的とするが、例えば血栓塞栓症（ＴＥ）を起こさないドメイン抗体を用いる、移植拒絶を治療する方法を提供することにより当技術分野での必要性を満たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
血栓塞栓症（ＴＥ）を引き起こさない、または血栓塞栓症（ＴＥ）の危険性がより低い、移植拒絶、特に腎臓移植拒絶を治療する方法は、いまだ臨床使用のために必要とされている。かかる方法は、血小板凝集を引き起こしにくく、したがって血栓塞栓症を引き起こしにくい抗ＣＤ４０Ｌ抗体アンタゴニストについての用量レジメンおよび投与経路を含むことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
腎臓移植拒絶を治療する方法は、治療有効量のＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）を、それを必要とする患者に投与することを含むことができる。
【００１０】
移植拒絶は、急性移植拒絶または慢性移植拒絶でありうる。
【００１１】
腎臓移植拒絶を治療する方法は、約２から約３０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量でＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）を投与することを含むことができる。腎臓移植拒絶を治療する方法はまた、約２０から約３０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量でＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）を投与することを含むことができる。腎臓移植拒絶を治療する方法は、用量約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重でＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）を投与することを含むことができる。
【００１２】
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）は、免疫抑制性／免疫調節性、および／または抗炎症性の薬剤と投与できる。免疫抑制性、免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤は、ＣＴＬＡ４変異体分子でありうる。ＣＴＬＡ４変異体分子は、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇ（ベラタセプト）でありうる。Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇ（ベラタセプト）は、約１０から約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で投与できる。あるいは、ベラタセプトは、約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で投与できる。
【００１３】
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）は、治療レジメンの期間の間毎週投与できる。ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）と共に免疫抑制性、免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤は、治療レジメンの期間の間毎週投与できる。治療レジメンの期間は約７０日とすることができる。
【００１４】
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）は静脈内に投与できる。免疫抑制性、免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤は静脈内に投与できる。
【００１５】
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）は、単独で、または腎臓移植拒絶の治療のための従来療法と組み合わせて投与できる。ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２との使用のための例示的な従来療法は、抗ＩＬ−２Ｒ抗体、ソルメドロール、およびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）の組み合わせである。従来療法は、その後、患者の進行により示される時間の経過で漸減しうる。
【００１６】
免疫抑制性／免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤は、抗ＣＤ２８  ｄＡｂでありうる。抗ＣＤ２８  ｄＡｂは、配列番号：２６を含むことができ、任意にＰＥＧ化されうる。抗ＣＤ２８  ｄＡｂの一例は、ＢＭＳ−９３１６９９（あるいは１ｈ−２３９−８９１（Ｄ７０Ｃ）Ｐ３０Ｌ−ＰＥＧまたは２３９−８９１−Ｄ７０Ｃ  Ｐ３０Ｌ  ＰＥＧと称される）であり、それはＰＥＧ化抗ＣＤ２８  ｄＡｂである。ＰＥＧ部分は、４０ｋＤａ分岐ポリエチレングリコールでありうる。抗ＣＤ２８  ｄＡｂは、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２と組み合わせて約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量で投与できる。一つの例示的な用量は、約３ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２８  ｄＡｂであり、かつ１週間間隔で投与できる。
【００１７】
本明細書中に記載される方法は、それを治療的に必要とする患者における腎臓移植拒絶を治療するのための医薬品の調製のためのＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）の使用として、代替的に考えることができる。ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）の使用は、上記および以下に記載される方法および組み合わせのいずれかに適用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、アバタセプトＩｇＧ１由来の改変されたＦｃテールに融合されたＶＨ可変ドメイン、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３を含むドメイン抗体をリボンフォーマットで示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、可変ドメインＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３（配列番号：２）を含むＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。Ｆｃ融合タンパク質は、分子量７７，９８４ダルトンの二量体であり、３５４アミノ酸からなるそれぞれのポリペプチド鎖を有する。可変ドメインは、リンカーによりヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃ構築物に融合され、３つのシステイン残基がセリンに置換され、かつ１つのプロリンがセリン残基に置換されている（配列番号：３）。
【図２】図２は、Ｎ末端アミノ酸配列（配列番号：１３５６−１３６１、それぞれ、リンカーに連結された様々なＦｃドメインの上から下まで）を提供する。リンカー領域は、ボックスで示される。
【図３】図３は、様々なＦｃフォーマットのドメイン抗体（それぞれ登場順に配列番号：１３６２−１３６５）の例を示す。リンカー領域はボックスにより示される。
【図４】図４は、２５℃でストレプトアビジンＳＰＲセンサーチップ上に捕捉されたｂｉｏｔ−ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌへの、１２．５−０．３９ｎＭのＢＭＳ−９８６００４（２：１希釈系列）の結合についてのＳＰＲセンサーグラムデータを示す。色付きの線は、二重参照のセンサーグラムデータを示し、かつ黒色の線は、アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）の影響を受ける見かけの０．１１ｎＭのＫｄ値の、１：１ラングミュアのデータへのフィットを示す。
【図５】図５は、２μＭのＢＭＳ−９８６００４への１９μＭのＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌの滴定（黒色）、または２μＭのＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌへの１８μＭのＢＭＳ−９８６００４の滴定（青色）についてのＩＴＣデータを示す。モル比（見かけの化学量論（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ））は、ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ三量体のモル当たり、および二価ＢＭＳ−９８６００４Ｆｃ二量体のモル当たりで定義される。横軸の等価点として得られたモル比の値は、１モル以上のＢＭＳ−９８６００４が、ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ三量体のモル当たりに結合することができるということを示唆する；しかしながら、複合体についての正確な構造モデルをＩＴＣデータ単独から決定することはできない。四角は、結合データの結合熱を示し、かつ実線は、「２セット部位モデル（２  ｓｅｔｓ  ｏｆ  ｓｉｔｅｓ  ｍｏｄｅｌ）」へ最良のフィットを示す。
【図６】図６は、マウスＣＤ４０ＬサロゲートｄＡｂ−Ｆｃのインビボにおける有効性（ＫＬＨ誘導性抗体反応）を示す（２パネル）。
【図７】図７は、マウスｄＡｂ  ＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−Ｆｃおよび抗体ＭＲ−１が、マウスにおけるＴＮＢＳ誘導性大腸炎を阻害することを実証する（４パネル）。
【図８】図８は、ＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−ＦｃおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇが相乗的に作用し、心臓同種移植片の生存を延長することを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、サルにおける１１ｍｇ／ｋｇのＩＶ投薬後のＢＭＳ−９８６００４の血漿濃度対時間プロフィールを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、サルにおける２ｍｇ／ｋｇのＩＶ投薬後のＢＭＳ−９８６００３の血漿濃度対時間プロフィールを実証する。
【図１０】図１０は、ＢＭＳ−９８６００３（サルにおける０．２、２．０および２０ｍｇ／ｋｇでのＳＣ投薬後）および５ｃ８  ＩｇＧ１（サルにおける２０ｍｇ／ｋｇでのＩＶ投薬後）の血漿濃度対時間プロフィールを示す。
【図１１】図１１は、マウスにおける１ｍｇ／ｋｇのＩＶおよびＳＣ投薬、ならびに１０ｍｇ／ｋｇのＳＣ投薬後のＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−ＣＴの血漿濃度対時間プロフィールを示す。
【図１２】図１２は、ＢＭＳ−９８６００３および５ｃ８−ＩｇＧ１の血漿暴露のＰＫ／ＰＤモデリングならびに抗ＫＬＨ抗体反応（ＩｇＧ力価）を実証する（４パネル）。
【図１３】図１３は、ＢＭＳ−９８６００４血漿暴露のＰＫ／ＰＤモデリング（左）および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）上のエキソビボのＲＯ（右）を示す。
【図１４】図１４は、ＩＶ．３がヒト血液における血小板の５ｃ８／ｓＣＤ４０Ｌ  ＩＣ媒介性活性化を遮断することを実証する。
【図１５】図１５は、ヒト血液における血小板活性化へのＦｃバリアントの効果を示す。
【図１６】図１６は、ＦｃｇＲＩＩａ多型について遺伝子型解析されたヒトドナー由来の血液における５ｃ８−ＣＴ／ｓＣＤ４０Ｌとの血小板の活性化を実証する。
【図１７】図１７は、ヒトドナー由来の血液における様々な抗体による血小板活性化を図解する。
【図１８】図１８は、ｈＦｃｇＲＩＩａ発現トランスジェニックマウスにおける、ＢＭＳ−９８６００３を含む様々な抗体による血小板活性化のレベルを示す。
【図１９】図１９は、高用量（静脈内に２０ｍｇ／ｋｇ）のＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置された、腎臓移植されたサルについての血清クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）曲線を示す。
【図２０】図２０は、中間用量（静脈内に１０ｍｇ／ｋｇ）のＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置された、腎臓移植されたサルについての血清クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）曲線を示す。
【図２１】図２１は、低用量（静脈内に２ｍｇ／ｋｇ）のＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置された、腎臓移植されたサルについての血清クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）曲線を示す。
【図２２】図２２は、高用量（静脈内に３０ｍｇ／ｋｇ）のＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置された、腎臓移植されたサルについての血清クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）曲線を示す。
【図２３】図２３は、高用量（静脈内に２０ｍｇ／ｋｇ）のＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置された、腎臓移植されたサルについての血清クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）曲線を示す。
【図２４】図２４は、２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置された、腎臓移植されたサルにおける、免疫活性化に一致する末梢血中の白血球組成物（免疫表現型）および他の末梢血球のマーカー（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を示すフローサイトメトリーダイアグラムを示す。
【図２５】図２５は、図２４のサイトメトリーダイアグラムについてのフローパネルを示す。
【図２６】図２６は、静脈内に２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置された、腎臓移植されたアカゲザルの末梢血中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞組成を示す。
【図２７】図２７は、静脈内に２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置された、腎臓移植されたアカゲザルの末梢血中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋メモリーＴ細胞組成を示す。
【図２８】図２８は、静脈内に２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置された、腎臓移植されたアカゲザルの末梢血中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋メモリーＴ細胞組成を示す。
【図２９】図２９は、静脈内に２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）および２０ｍｇ／ｋｇのベラタセプトで処置された、腎臓移植されたアカゲザルの末梢血中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞組成を示す。
【図３０】図３０は、静脈内に２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）および２０ｍｇ／ｋｇのベラタセプトで処置された、腎臓移植されたアカゲザルの末梢血中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋メモリーＴ細胞組成を示す。
【図３１】図３１は、静脈内に２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）および２０ｍｇ／ｋｇのベラタセプトで処置された、腎臓移植されたアカゲザルの末梢血中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋メモリー細胞組成を示す。
【図３２】図３２は、２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）で処置されたアカゲザルにおけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ウイルス性再活性化割合（コピー／ｍＬ）を実証する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
ヒトＣＤ４０Ｌに特異的に結合する抗体ポリペプチドを用いる腎臓移植拒絶を治療する方法が提供される。当該抗体ポリペプチドは、血小板凝集を引き起こしにくく、したがって血栓塞栓症を引き起こしにくい。
【００２０】
本明細書中で使用される、「特異的な結合」は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される、約１μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する抗体ポリペプチドによる抗原の結合を指す。適切なアッセイ系は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ表面プラズモン共鳴システムおよびＢＩＡｃｏｒｅＴＭ動態評価ソフトウェア（例えば、バージョン２．１）を含む。特異的結合相互作用についての親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）またはＫｄは、約１μＭ以下、約５００ｎＭ以下または約３００ｎＭ以下であってもよい。
【００２１】
「約」という用語は当業者により理解され、それが使用される文脈である程度変化するだろう。一般的に、約は、参照値のプラス／マイナス１０％である値の範囲を包含する。
【００２２】
この詳細な説明に従って、以下の略語および定義を適用する。本明細書中で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示がない限り、複数の参照対象を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「抗体」への参照は、多くのかかる抗体を含み、かつ「用量」への参照は、１つ以上の用量および当業者に知られているその等価なもの、およびその他への参照を含む。
【００２３】
本明細書中で使用される「ＢＭＳ−９８６００４」は、アミノ酸配列、ＡＳＴを有する介在性リンカー配列を介して、ｄＡｂ  ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３のＣ末端に連結されたＩｇＧ１の改変されたＦｃ断片を有する抗体ポリペプチドの２つの分子から構成される、二量体の融合ポリペプチドを指す。ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３  ｄＡｂは、配列番号：２のアミノ酸配列を有する。ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３  ｄＡｂについての例示的なコード配列は、配列番号：２７である。改変されたＦｃ断片は、配列番号：３のアミノ酸配列を有する。図１Ａおよび１Ｂを参照されたい。本明細書で使用されるＢＭＳ−９８６００４についての他の名称は、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２、２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−ロング、および２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−ロングを含む。
【００２４】
ここに記載の範囲の間の、任意のおよび全ての、全体もしくは部分的な整数は、本明細書に含まれると理解される。
【００２５】
１．ＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌ活性
ヒトＣＤ４０Ｌに結合する抗体ポリペプチドが提供される。ＣＤ４０Ｌはまた、ＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＴＮＦ−関連活性化タンパク質（ＴＲＡＰ）、５ｃ８抗原、またはＴ−ＢＡＭとしても知られている。ヒトＣＤ４０Ｌについての関連する構造的な情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ２９９６５に見出すことができる。「ヒトＣＤ４０Ｌ」は、以下のアミノ酸配列： 
【化１】
2017509649.tif 000003
（配列番号：３）を含むＣＤ４０Ｌを指す。
【００２６】
ＣＤ４０Ｌはまた、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ウシ（Ｂｏｓ  ｆｆｉｎｉ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、ヨザル（Ａｏｔｕｓ  ｔｉｖｉｒｇａｔｕｓ）、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、スーティーマンガベイ（Ｃｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ｔｏｒｑｕａｔｕｓ  ａｔｙｓ）、ブタオザル（Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）、およびイノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）において、配列決定されている。
【００２７】
本願の抗体ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合は、ＣＤ４０Ｌ活性と拮抗する。「ＣＤ４０Ｌ活性」は、ＡＰＣ上のＭＨＣ分子によるＴ細胞受容体刺激に関連するＡＰＣの共刺激および活性化、サイトカインの存在下での全ての免疫グロブリンアイソタイプの分泌、Ｂ細胞増殖の刺激、サイトカイン産生、抗体クラススイッチおよび親和性成熟を含むが、これらに限定されない。例えば、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群の患者は、それらのＢ細胞で機能的なＣＤ４０を発現するが、それらの活性化Ｔ細胞はＣＤ４０Ｌタンパク質が欠損しており、結果、そのＢ細胞を活性化することおよび免疫グロブリンアイソタイプスイッチングを誘導することができない。Ａｒｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７２：２９１−３００（１９９３）。
【００２８】
ＣＤ４０Ｌ活性は、他の分子との相互作用により媒介されうる。「ＣＤ４０活性」は、ＣＤ４０Ｌと以下の分子：ＣＤ４０（ＣＤ４０Ｌ受容体）、α５β１インテグリン、およびαＩＩｂβ３との機能的な相互作用を含む。例えば、ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞などの多様なＡＰＣ上に、ならびに間質細胞、血管内皮細胞、および血小板上に発現される、その受容体、ＣＤ４０に結合する。
【００２９】
本明細書中で使用される、「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」、「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅｓ）」および「活性化される（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」という用語は、参照と比べて少なくとも１０％、例えば、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％以上まで、所与の測定可能なＣＤ４０Ｌ活性を増加することを指す。活性が、アンタゴニストの非存在下と比べて少なくとも１０％、例示的な実施形態では、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、１００％まで（つまり、検出可能な活性が無い）減少する場合、ＣＤ４０Ｌ活性は「拮抗される」。例えば、抗体ポリペプチドは、いくつかまたは全てのＣＤ４０Ｌ活性と拮抗してもよい。抗体ポリペプチドは、Ｂ細胞増殖を活性化しなくてもよい。抗体ポリペプチドは、Ｔ細胞または樹状細胞（ＤＣ）によるサイトカイン分泌を活性化しなくてもよく、ここで、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインである。
【００３０】
２．抗体ポリペプチド
抗体ポリペプチドは、可変ドメインを含む。抗体ポリペプチドは、単一の可変ドメインを含有するｄＡｂの形態でありうる。抗体ポリペプチドは、ジスルフィド結合により相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む、完全長抗ＣＤ４０Ｌ免疫グロブリン分子であってもよい。各鎖のアミノ末端部は、約１００−１２０アミノ酸の可変ドメイン（ＶＬまたはＶＨ）を含む。その中に含有される相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原認識を主に担うが、フレームワーク残基はエピトープ結合において役割を果たす。各重鎖のカルボキシ末端の「半分」は、エフェクター機能を主に担う定常領域（Ｆｃ）を定義する。
【００３１】
「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）は、ＣＤ４０Ｌなどの抗原に特異的に、かつ一価で結合することができる単一の可変（ＶＬまたはＶＨ）ドメインを含む。例えば、ｄＡｂはラクダ科ｄＡｂの特徴的なＶＨＨ構造を有してもよい。本明細書中で使用される「ＶＨドメイン」は、ＶＨＨ構造を含むことが意図される。ＶＨドメイン（本明細書で実施形態として示される全ての特徴および特徴の組み合わせを含む）は、ＶＨＨドメイン以外である。ｄＡｂは、溶液中でホモまたはヘテロ二量体を形成してもよい。いかなる特定の理論によっても限定されるものではないが、変異したＦｃ構築物を含有する抗体は、血小板表面上のＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａとしても知られている）に結合せず、かつ血小板を活性化しないので、本明細書で開示されるｄＡｂは、血小板凝集を引き起こさないと考えられる。
【００３２】
本明細書中で使用される「可変ドメイン」という用語は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９１）により定義される免疫グロブリン可変ドメインを指す。可変ドメイン内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび位置決めは、よく知られるＫａｂａｔ番号付与法（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）に従う。
【００３３】
抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する可変ドメインを含む完全長抗ＣＤ４０Ｌ免疫グロブリン分子の部分を含む「断片」であってもよい。それゆえ、用語「抗体ポリペプチド」は、例えば、抗原結合重鎖、軽鎖、重鎖−軽鎖二量体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、およびｄＡｂを含む。用語「抗体ポリペプチド」はそれゆえ、組換え操作および発現により作製されたポリペプチド、ならびにハイブリドーマ細胞クローンによる天然の組換えおよび分泌により産生されたモノクローナル抗体を含む。
【００３４】
当技術分野で知られているように、軽鎖は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）として分類され、特定の定常領域、ＣＬによって特徴付けられる。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＡについて３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）；ＩｇＭおよびＩｇＥについて４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）から構成される。抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）のいずれかから選択される重鎖定常領域を有してもよい。
【００３５】
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のそれぞれは、以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列される３つのＣＤＲおよび４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称され、かつ重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称される。
【００３６】
本明細書中で使用される、「Ｆｃドメイン」という用語はＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  ヒト  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．  （１９９１）により定められる、ＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む定常領域抗体配列を指す。Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ由来であってもよい。Ｆｃドメインは、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域由来であってもよい。例示的な改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは：
【化２】
2017509649.tif 000004
（配列番号：３）である。
【００３７】
配列番号：３はヒトＩｇＧ１  Ｆｃ由来であり、かつ、５、１１および１４位でＣｙｓの代わりにＳｅｒを含み、ならびに２３位はＰｒｏの代わりにＳｅｒを含む。システインからセリンへの点突然変異は、Ｆｃヒンジ中のジスルフィドを除去するために作製した。別の例示的なＦｃ領域は、配列番号：５であり、それはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ由来であり、アミノ酸配列：
【化３】
2017509649.tif 000005
（配列番号：５）を有する。
配列番号：５は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ由来であり、かつＰｒｏを含む１０位の改変を含む。
【００３８】
可変ドメインは、Ｆｃドメインに融合されてもよい。可変ドメインがＦｃドメイに融合される場合、可変ドメイン（ｄＡｂを含む、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれか）のカルボキシル末端は、Ｆｃ  ＣＨ２ドメインのアミノ末端に連結または融合されてもよい。あるいは、可変ドメインのカルボキシル末端は、それ自体がＦｃ  ＣＨ２ドメインに融合される、ＣＨ１ドメインのアミノ末端に連結または融合されてもよい。タンパク質は、全体的または部分的にＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間のヒンジ領域を含んでもよい。
【００３９】
様々なＦｃフォーマットのドメイン抗体の例およびそれらの効力を表４に提供する。図２は、本明細書で提供される、リンカー領域に連結される様々なＦｃドメインのＮ末端配列を提供する。リンカー領域はボックスで示される。表２で使用される、「Ｆｃ」は、ｄＡｂがヒトＩｇＧ１ショートＦｃに融合されることを示す。ＣＴ−Ｌ２、ＣＴロング、およびＣＴとも称される「ＣＴロングＦｃ」は、配列番号：３のアミノ酸配列を有する。ＣＴ−Ｓ１とも称される「ＣＴショート」は、ＣＴロングよりＮ末端が７アミノ酸短い。Ｎ２９７Ｑ−Ｌ４とも称される「Ｎ２９７ＱロングＦｃ」は、ＦｃにおけるＮ結合型糖鎖（Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）を除去するために作製されたＮ２９７Ｑ変異を有する、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。Ｎ２９７Ｑ−Ｓ３とも称される「Ｎ２９７ＱショートＦｃ」は、Ｎ２９７ＱロングＦｃよりＮ末端が７アミノ酸短く、かつＦｃドメインにおけるＮ結合型糖鎖を除去するために作製されたＮ２９７Ｑ点突然変異を有する、ヒトＩｇＧ１である。「ＣＴ−Ｆｃ  ＳＰ５」は、ＣＴロングＦｃであり、ＳＰ５は哺乳類発現宿主からの分泌のために使用されるオクテオネクチン（ｏｃｔｅｏｎｅｃｔｉｎ）シグナルペプチドを指す。開裂部位は「＾」で示される。図３は、さらに様々なＦｃドメインフォーマットの例を提供する。
【００４０】
融合抗体ポリペプチドの抗体ポリペプチドは、「アミノ酸リンカー」または「リンカー」により連結されてもよい。例えば、ｄＡｂは、アミノ酸リンカーのＮ末端に融合されてもよく、Ｆｃドメインは、リンカーのＣ末端に融合されてもよい。アミノ酸リンカーは任意の長さとすることができ、かつ任意のアミノ酸の組み合わせからなることができるが、連結したドメイン間の相互作用を減少するために、リンカー長は比較的短くてもよい（例えば、５以下のアミノ酸）。リンカーのアミノ酸組成は、かさ高い側鎖を有するアミノ酸または二次構造を導入しそうなアミノ酸の数を減少するように調整してもよい。適切なアミノ酸リンカーは、最大３、４、５、６、７、１０、１５、２０、または２５アミノ酸長を含むが、これらに限定されない。代表的なアミノ酸リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号：６）、およびＧＧＧＧＳの２、３、４、または５コピーを含むリンカー（それぞれ配列番号：７−１０）を含む。以下に本開示における使用のための適切なリンカー配列を列挙する。
【化４】
2017509649.tif 000006
【００４１】
第一の可変ドメインは、ヒトＦｃドメインに融合されたＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３（配列番号：２）のアミノ酸配列を含む。図１Ａおよび１Ｂを参照されたい。リンカーは、上記の表におけるリンカーリストのいずれかから選択されうる。例えば、リンカーは、ＡＳ（配列番号：１１）を含むことができ、またはＡＳ（配列番号：１１）でありうる。さらに、抗体ポリペプチドを用いる方法は、可変ドメインを含むことができ、当該可変ドメインのアミノ酸配列は、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３（配列番号：２）、ＡＳＴ（配列番号：１２）を含むリンカー、および配列番号：３から選択されるヒトＦｃドメインを含む。別の開示される方法では、抗体ポリペプチドは、可変ドメインを含み、当該可変ドメインのアミノ酸配列は、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３（配列番号：２）、ＡＳ（配列番号：１１）を含むリンカー、および配列番号：５のアミノ酸配列を含むヒトＦｃドメインを含む。
【００４２】
抗体ポリペプチドに適用する場合、「ヒト」という用語は、抗体ポリペプチドがヒト免疫グロブリンに由来する配列、例えば、フレームワーク領域および／またはＣＨドメインを有することを意味する。配列が：（ａ）ヒト個体から、またはヒト個体由来の細胞もしくは細胞株から単離される；（ｂ）クローニングされたヒト抗体遺伝子配列またはヒト抗体可変ドメイン配列のライブラリーから単離される；または（ｃ）上記ポリペプチドの１つ以上からの変異および選択により多様化される、のいずれかである場合、配列は、ヒト免疫グロブリンをコードする配列「に由来」する。本明細書中で使用される「単離された」化合物は、当該化合物が自然状態で天然に結合している少なくとも１つの成分から除去されていることを意味する。
【００４３】
抗体ポリペプチドは、他の種、例えば、マウス由来の抗体の投与によりしばしば誘発される抗抗体免疫反応をほとんど回避しながら、ヒト患者に投与できる。例えば、マウス抗体は、当該技術分野でよく知られる手順に従って、ヒト可変ドメインＦＲにマウスＣＤＲを移植することにより「ヒト化」することができる。本明細書で開示されるヒト抗体は、しかしながら、マウス抗体配列の遺伝子操作を必要とせずに産生することができる。
【００４４】
可変ドメインは、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と同じアミノ酸配列を有する１つ以上のＦＲを含んでもよい。例えば、ドメイン抗体は、ＶＨ生殖系列遺伝子セグメントＤＰ４７、ＤＰ４５、またはＤＰ３８、Ｖκ生殖系列遺伝子セグメントＤＰＫ９、ＪＨセグメントＪＨ４ｂ、またはＪκセグメントＪκ１を含んでもよい。
【００４５】
ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する能力を保持しながら、抗体ポリペプチド配列に変更を行ってもよい。具体的には、抗体ポリペプチド（例えば、ｄＡｂ）は、ｄＡｂ  ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３のようにＣＤ４０Ｌに特異的に結合する機能を保持する、バリアント可変ドメインを含んでもよい。バリアント可変ドメインは、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合するＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３と競合してもよい。
【００４６】
抗体ポリペプチドは、ＰＥＧ化によりそのインビボ半減期を増加するようにフォーマットされてもよい。ＰＥＧは共有結合されている。あるいは、ＰＥＧはシステインまたはリシン残基で抗体ポリペプチドに連結される。ＰＥＧ連結型抗体ポリペプチドは少なくとも２４ｋＤの流体力学サイズを有しうる。一般的に、総ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤ（２０ｋＤおよび６０ｋＤを含めて）である。一般的に、ＰＥＧ連結型ドメイン抗体は、少なくとも２００ｋＤの流体力学サイズを有する。
【００４７】
ＰＥＧ化は、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド活性エステル、サクシニミジルプロピオン酸、マレイミド、ビニルスルホン、またはチオールを含むが、これらに限定されない、いくつかのＰＥＧ結合部分を用いて達成できる。ＰＥＧポリマー、所定の位置のいずれかで抗体ポリペプチドに連結でき、またはドメイン抗体分子にランダムに連結できる。ＰＥＧ化はまた、ドメイン抗体と結合しているペプチドリンカーによって媒介できる。すなわち、ＰＥＧ部分は、抗体ポリペプチドに融合しているペプチドリンカーに結合でき、ここでリンカーは、ＰＥＧ結合のための部位（例えば、遊離システインまたはリシン）を提供する。例えばＣｈａｐｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，“ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ，”Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（４）：５３１−４５（２００２）で開示されるように、抗体をＰＥＧ化する方法は当技術分野で知られている。
【００４８】
３．医薬組成物および治療方法
本方法は、患者に抗体ポリペプチドを投与することを含む。抗体ポリペプチドは、医薬組成物として処方されてもよい。医薬組成物は、治療有効量の１つ以上の抗体ポリペプチド、および任意に薬学的に許容可能な担体を含む。薬学的に許容可能な担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、ならびにそれらの組み合わせを含む。薬学的に許容可能な担体は、融合タンパク質の保存期間または有効性を高める、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、保存料、またはバッファーなどの補助物質をさらに含むことができる。組成物を、投与後の活性成分の急速、持続、または遅延放出を提供するよう製剤化することができる。適切な医薬組成物およびそれらの製造方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（２００５）を参照されたい。
【００４９】
医薬組成物はさらに、免疫抑制性／免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤を含んでもよい。かかる治療を必要とする患者における、移植拒絶を治療する方法は、治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含んでもよい。移植は、腎臓移植でありうる。ＣＤ４０Ｌ媒介性Ｔ細胞活性化に拮抗することは、移植拒絶の間に発生する望ましくないＴ細胞応答を阻害できる。ＣＤ４０Ｌ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害することは、移植拒絶の進行および／または重症度を和らげることができる。
【００５０】
本明細書中で使用される、「患者」は、動物、例えばヒトを含む哺乳類を意味する。患者は、免疫疾患と診断されてもよい。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、症状、障害、状態、または疾患の、進行または重症度を軽減することを含むプロセスを指す。
【００５１】
医薬組成物は、単独で、または免疫抑制性／免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤との併用療法（つまり、同時に、連続的にまたは同時処方）で投与してもよい。様々な免疫疾患が、免疫疾患を治療するための有用な特異的な補助化合物の使用を必要とすることができ、患者ごとに基づいて決定することができる。
【００５２】
例えば、開示される医薬組成物は、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇ（ベラタセプト）などの細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）変異体分子と、同時に（同時にまたは同時処方される）または連続的に、共投与されてもよい。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８より高いアビディティでＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）に結合し、かつそれは、それらの活性化に続いてＴ細胞上で一過性に発現され、ここでそれはＣＤ２８およびＣＤ８０／８６間の相互作用を遮断する。Ｏｏｓｔｅｒｗｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２９４−３００（１９９９）。これはＴ細胞活性化のための負のフィードバックシグナルを生成する。
【００５３】
Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇを含むＣＴＬＡ４変異体分子は、野生型ＣＴＬＡ４と比較して、ＣＤ８０／８６への結合アビディティが増加している。Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−ＩｇによるＣＤ２８−ＣＤ８０／８６経路の介入は、例えば、非ヒト霊長類移植モデルにおいて、単独でまたは他の免疫抑制性の薬剤と組み合わせて、移植関連疾患を治療することを進めるのに成功してきた。Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ５：  ４４３  （２００５）。米国特許出願第２０１０／０１６６７７４号は、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇの構造、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇの生産方法、およびＣＴＬＡ４分子を含む製剤を記載し；かつ当該出願は本明細書中に出典明示により組み込まれる。米国特許第７，０９４，８７４号および７，４８２，３２７号は、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇの投与（１つ以上の他の薬物との共投与を含む）および用量スケジュールをさらに開示し、かつこれらの特許の開示は、明細書中に出典明示により組み込まれる。
【００５４】
任意の適切な方法または経路を使用して、抗体ポリペプチドまたは医薬組成物を投与できる。投与経路は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内の投与を含む。投与される抗体ポリペプチドの治療有効用量は、例えば、治療される免疫疾患のタイプおよび重症度、併用療法の使用、抗体ポリペプチドまたは医薬組成物の投与経路、ならびに患者の体重を含む、多数の要因に依存する。ドメイン抗体の治療有効量についての非限定的な範囲は、患者の体重に対して約０．１から約３０ｍｇ／ｋｇ、または約２から約３０ｍｇ／ｋｇ、または約２０から約３０ｍｇ／ｋｇである。ドメイン抗体の治療有効量は約２０ｍｇ／ｋｇでありる。ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）の治療有効量は約０．１から約３０ｍｇ／ｋｇ、または約２から約３０ｍｇ／ｋｇ、または約２０から約３０ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇでありうる。治療有効量は静脈内に投与できる。治療有効量は、治療レジメンの期間中、毎週投与できる。治療レジメンの期間は変動しうる。期間は約７０日の長さとすることができる。ドメイン抗体は、ＣＴＬＡ４変異体分子（例えば、ベラタセプト）などの免疫抑制性／免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤と共に（同時に、連続的に、または同時処方）投与できる。免疫抑制性／免疫調節性および／または抗炎症性の薬剤は約２０ｍｇ／ｋｇで投与できる。代表的なモデルは、下記および実施例に記載される。
【００５５】
腎臓移植患者に、それらの治療の経過の間、１つ以上のいくつかの免疫抑制性の薬剤を投与できる。これらは、グルココルチコイドを含むことができる。免疫抑制性の薬剤はまた、イムノフィリン結合剤（例えば、シクロスポリンおよびＩＳＡ（ＴＸ）２４７を含むシクロフィリン結合剤などのカルシニューリン阻害剤；タクロリムスおよび改変放出タクロリムスなどのＦＫＢＰ１２結合剤；ならびにシロリムスおよびエベロリムスなどのラパマイシン標的の阻害剤）などの小分子薬剤、ヌクレオチド合成阻害剤（ミコフェノール酸モフェチル、腸溶コーティングされたミコフェノール酸、およびミゾリビンなどのプリン合成阻害剤（ＩＭＰＤＨ）；レフルノミドおよびＦＫ７７８などのピリミジン合成阻害剤（ＤＨＯＤＨ））、代謝アンタゴニスト（アザチオプリンなど）ならびにスフィンゴシン−１−リン酸−受容体アンタゴニスト（ＦＴＹ７２０など）を含む。免疫抑制性の薬剤はまた、枯渇抗体（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または両方に対する）などのタンパク質薬剤を含むことができ、かつウマもしくはウサギ抗胸腺細胞グロブリン、ムロモナブ−ＣＤ３などのマウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体、ヒト化モノクローナル抗ＣＤ５２抗体（アレムツズマブ）、Ｂ細胞枯渇モノクローナル抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、ならびに静脈内免疫グロブリンを含むことができる。これらの薬剤の総説については、Ｈａｌｌｏｒａｎ，  “Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５１：  ２７１５２７２９  （２００４）を参照されたい。
【００５６】
２ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇの範囲における単剤療法における単独ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）の組み合わせが企図される。あるいは、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）は、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇ（ベラタセプト）などのＣＴＬＡ４変異体分子との併用療法で投与できる。ベラタセプトは約１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの量（または任意の整数のその間の量）で、併用療法で投与できる。
【００５７】
あるいは、抗ＣＤ２８  ＤＡｂと組み合わせて、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２（配列番号：１）は投与できる。好ましい抗ＣＤ２８  ｄＡｂはＢＭＳ−９３１６９９であり、それは、可変ドメインＢＭＳ１ｈ−２３９−８９１（Ｄ７０Ｃ）（配列番号：２６）を含み、かつＰＥＧ化される。ＢＭＳ１ｈ−２３９−８９１（Ｄ７０Ｃ）は、例えば、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒ  ＣＤ２８  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」と題される米国特許第８，１６８，７５９号に記載される。抗ＣＤ２８  ｄＡｂを１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの量で、例えば約３ｍｇ／ｋｇで投与できる。
【００５８】
４．同種移植拒絶インビボモデル
本開示の抗体ポリペプチドのＣＤ４０Ｌに拮抗する能力は、いくつかの利用可能なインビトロまたはインビボモデル系の１つにおいて試験することができる。適切なヒト、動物、および細胞モデル系は下記に記載される。さらなる細胞アッセイ系は、実施例に記載される。
【００５９】
ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路を標的とすることは、特に、多数の公開された非ヒト霊長類における移植研究の有望なデータに照らして、固形臓器移植（ＳＯＴ）の拒絶の予防のため長い間多くの関心が示されている。エキソビボ活性化ＣＤ４＋Ｔリンパ球上の、減少したＣＤ４０Ｌ発現が、優れた腎臓同種移植機能と相関することが実証されている。Ｌｅｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３：  ２７６−２８４  （２００４）。さらに、いくつかの研究は、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂが霊長類における急性同種移植拒絶を予防し、かつ反転させることの両方ができることを実証した。例えば、Ｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：  ８７８９−８７９４  （１９９７）は、腎臓同種移植片が移植されたアカゲザルにおいて、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ５Ｃ８が単独で、またはＣＴＬＡ４−Ｉｇとの組み合わせで、有意に生着率（拒絶−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）を延長したことを報告している。またＣＤ４０Ｌ−特異的ｍＡｂ  ｈｕ５ｃ８は単独で、適切な数の生存可能な膵島を移植したアカゲザルにおける同種膵島移植および長期間のインスリン非依存性を可能にした。Ｋｅｎｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：  ８１３２−８１３７  （１９９９）．Ｐｒｅｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５：  １０３２−１０４１  （２００５）は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）不適合のアカゲザルにおける腎臓移植を実施し、かつＣＤ４０Ｌ特異的ｍＡｂ  ＩＤＥＣ−１３１、および／またはシロリムス、および／または移植前ドナー特異的輸血の組み合わせでレシピエントを処置した。ＩＤＥＣ−１３１は、霊長類における腎臓の同種移植拒絶を予防する際に非常に効果的だった。腎臓同種移植を受けたカニクイザルにおいて、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ  ＡＢＩ７９３での処置は、効果的に移植拒絶を予防した。Ｓｃｈｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７７：  ７１７−７２６  （２００４）。同種移植拒絶を予防することに加え、ＣＤ４０Ｌ特異的ｍＡｂは、霊長類移植モデルにおけるドナー特異的な寛容を誘導した。Ｐｒｅｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５：  １０３２−１０４１  （２００５）；  Ｋｅｎｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：  ８１３２−８１３７  （１９９９）。
【００６０】
肝臓または小腸移植後の急性移植拒絶を受けている小児のヒト患者において、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌの発現と移植拒絶の危険性の間で相関が観察された。Ａｓｈｏｋｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９：  １７９−１９１  （２００９）  ａｎｄ  Ａｓｈｏｋｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １４６：  １６６−１７３  （２００９）。同様に、肝臓または腎臓移植後の同種移植拒絶を受けている成人患者において、組織学的な解析は、ＣＤ４０Ｌ発現と急性または慢性拒絶の間の関連性を実証した。Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ３：  １３６３−１３６８  （２００３）  ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  Ｄｉａｌｌ．  Ｔｒａｎｓｌｐａｎｔ．  １３：  ７１６−７２２  （１９９８）。
【００６１】
いくつかの研究は、移植において、より良い有効性を達成するためにＣＤ４０よりＣＤ４０Ｌを標的とすることを裏付けている。例えば、ＣＤ４０Ｌが選択的に遮断される場合、ＣＤ４０と比較して、移植片生存はより長く、かつより耐久性がある。Ｇｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８３：  １６２５−３５  （２００９）。さらに、最新のデータは、ＣＤ４０Ｌ遮断が、移植片生存を促進するためのＴｒｅｇおよび／またはサプレッサー細胞の誘導を高めうることを示唆する。Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖ．  １２０：  ２４８６−９６  （２０１０）。また、ＣＤ４０ではなくＣＤ４０Ｌの遮断が、特にＢ７経路の遮断と併用された場合、無期限の移植片生存を引き起こす、長続きする免疫寛容の誘導を実証した。Ｋｅｎｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：  ８１３２−８１３７  （１９９９）；  Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４：  １３９１−１３９８  （２００４）；  Ｐｒｅｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５：  １０３２−１０４１  （２００５）；  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：  ５４２−５０  （２００５）。固形臓器移植（ＳＯＴ）に対するベラタセプト（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ−Ｉｇ）との組み合わせのための当然の選択として、本開示のドメイン抗体を提供するので、移植片生存を高める際のＣＤ４０−４０ＬおよびＢ７−ＣＤ２８経路を遮断する相乗作用は、特に重要である。
【００６２】
例示的なアミノ酸配列
抗体ポリペプチドにとって有用な代表的な抗ヒトＣＤ４０Ｌ  ＶＨドメインアミノ酸配列は、米国仮出願第６１／９５５，５８８号において、その表１において開示される。表１のＶＨドメイン配列をコードする代表的な核酸は米国仮出願第６１／９５５，５８８号の表２に記載される。
【００６３】
当技術分野でよく知られるように、複数のコドンは同じアミノ酸をコードすることができる。タンパク質配列をコードする核酸は、したがって、コドン縮重を有する核酸を含む。米国仮出願第６１／９５５，５８８号において開示される抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する。それらは、同時に割り当てられる２０１４年１１月１５日に発行された、「ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＴＨＡＴ  ＡＮＴＡＧＯＮＩＺＥ  ＣＤ４０Ｌ」と題される米国特許第８，８９５，０１０号に詳細に記載される反復初期／一次スクリーニングを用いて作製された。
【実施例】
【００６４】
実施例１
クローンＢＭＳ２ｈ−５７２のためのｄＡｂ選択
抗原濃度の減少（ラウンド１では３００ｎＭ；ラウンド２では３０ｎＭ；ラウンド３では３ｎＭ）を用いて、３ラウンドの選択をＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより提供される、ビオチン化（１．４２モルビオチン／モル三量体）ヒトイソロイシンジッパー−ＣＤ４０Ｌ（ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ）に対して並行して実施した。ナイーブ４Ｇおよび６Ｇ  Ｄｏｍａｎｔｉｓ  ｄＡｂライブラリーからのファージを、選択を開始する前に、以下に示されるプールａ）からｈ）へ組み合わせた：
ａ）  ４Ｇ  ＶＨ  ＣＤＲ３  ７−９アミノ酸の間の長さ。
ｂ）  ４Ｇ  ＶＨ  ＣＤＲ３  １０−１２アミノ酸の間の長さ。
ｃ）  ４Ｇ  ＶＨ  ＣＤＲ３  １３−１５アミノ酸の間の長さ。
ｄ）  ４Ｇ  ＶＫ
ｅ）  ６Ｇ  ＶＨ  ＣＤＲ３  ７−９の間の長さ
ｆ）  ６Ｇ  ＶＨ  ＣＤＲ３  １０−１２の間の長さ
ｇ）  ６Ｇ  ＶＨ  ＣＤＲ３  １３−１５の間の長さ
ｈ）  ６Ｇ  ＶＫ
【００６５】
選択の各ラウンドは、所望の濃度のビオチン化ＣＤ４０Ｌを１０００μｌの２％のＭＰＢＳ（２％（ｗ／ｖ）Ｍａｒｖｅｌ［Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｆｏｏｄｓ，  ＵＫ］を含有するリン酸緩衝生理食塩水）中のファージ（上記に示されるナイーブライブラリープールの１つ、または後続の選択アウトプットファージから）の混合物に加えること、および回転混合により室温で１時間インキュベートすることを伴った。ビオチン化抗原ファージ複合体を次いで１００μｌの再懸濁Ｄｙｎａビーズ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ］（ラウンド１および３）または５０μｌの、ニュートラアビジンと結合されたＭ−２８０トシル−活性化Ｄｙｎａビーズ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ］（ラウンド２）を加えることにより捕捉し、かつ、室温で回転混合により５分インキュベートした。Ｄｙｎａビーズ（登録商標）を次いでＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒマグネティックセパレーター［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ］を用いて回収し、かつ７Ｘ  １ｍｌ  ＰＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレンソルビタン２０モノラウレートを含有するＰＢＳ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＫ］）、続いて１Ｘ  １ｍｌ  ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。洗浄されたＤｙｎａビーズ（登録商標）上に保持された結合ファージを５００μｌのトリプシン−ＰＢＳ（４５０μＬのＰＢＳに５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶解される５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌトリプシン［シグマ−アルドリッチ、ＵＫ］を加えた）とのインキュベーションにより溶出した。ファージを含有する溶液を回収し、かつ２５０μＬを用いて、３０分間３７℃で１．７５ｍＬの対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１（ＯＤ６００が０．４）を感染させた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１ファージ感染培養物は、１分間マイクロ遠心機において１１，６００ｘｇで遠心分離され、得られた細胞ペレットは１ｍＬ  ２Ｘ  ＴＹ（１リットル中１６ｇトリプトン、１０ｇ  酵母抽出物および５ｇ  ＮａＣｌ、１２１℃で１５分間オートクレーブされた）に再懸濁され、１５μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンを添加されたＴＹＥ培地を含有する９ｃｍペトリ皿上にプレーティングされた。プレートを３７℃オーバーナイトでインキュベートし、次いで、１５％グリセロールを添加された２ｍｌの２Ｘ  ＴＹが各プレートに加えられ、細胞がガラススプレッダーで緩められ、十分に混合された。５０マイクロリットルのかき集められた細菌を用いて、１５μｇ／ｍｌ  テトラサイクリンを添加された５０ｍｌの２Ｘ  ＴＹ  に植菌し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃オーバーナイトで生育した。オーバーナイト培養物を１５分間３，３００ｇで遠心分離し、細菌をペレットにした。ファージを沈殿させるために、１０ｍｌ  ＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール８０００，  ２．５Ｍ  ＮａＣｌ）が４０ｍｌの上清に加えられた。ファージ／ＰＥＧ溶液を混合し、１時間氷上で放置し、次いで４℃で３０分間、３，３００ｇでスピンし、上清を捨てた。ペレットを２ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁し、マイクロ遠心機において１０分間���１，６００ｘｇでスピンさせ、残っている細菌破砕物を除去した。得られたファージを含有する上清は、次いで、適切な濃度のビオチン化ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌに対する選択の次のラウンドのために用いられた。
【００６６】
ファージＥＬＩＳＡ：
選択ラウンド２および３に続いてモノクローナルファージＥＬＩＳＡを実行した。洗浄は全て、２５０μｌ  ＰＢＳＴの３回洗浄、続いて２５０μｌ  ＰＢＳの３回洗浄を用いて行った。プレートを、５０μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌ  ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌで、４℃オーバーナイトでコーティングした。プレートを洗浄し、次いで室温で１時間２％  ＭＰＢＳ（改変されたリン酸バッファー）でブロッキングした。プレートを洗浄し、２５μｌ／ウェルのファージ上清を等容積の２％  ＭＰＢＳに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合したファージを、５０μｌ／ウェルの、２％  ＭＰＢＳ中１：５０００で希釈された抗Ｍ１３−ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）コンジュゲート［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＵＫ］で検出し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、５０μｌ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液［ＫＰＬ  Ｉｎｃ，  ＵＳＡ］を用いてＥＬＩＳＡを展開した。比色反応を等容積の１Ｍ  ＨＣｌの添加により停止させ、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで読み取った。特異的ファージは、抗原でコーティングされていないが他の点では同一に処理されたウェルとの比較によって同定された。
【００６７】
ｐＤＯＭ４プラスミドからのｄＡｂ遺伝子の回収：
ラウンド２および３のアウトプット由来のｄＡｂ  Ｖ−遺伝子が、ファージベクターｐＤＯＭ４のＳａｃＩおよびＮｏｔＩ制限酵素消化により回収され、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ二重消化ｐＤＯＭ５発現ベクターへライゲーションされた。
【００６８】
可溶性ｄＡｂ  ＥＬＩＳＡ：
結合するｄＡｂを以下のように同定した。可溶性ｄＡｂ発現ベクターｐＤＯＭ５内にクローニングされたｄＡｂ  Ｖ−遺伝子を含有する９６個の個々のコロニーを、各アウトプットからＯｎＥｘ  オートインダクション培地（Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）（Ｎｏｖａｇｅｎ，  ＵＫ）を含有する２００μＬ  テリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）（ＴＢ）中にピックし、ガス透過性粘着性プラスチックストリップで密封した、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル細胞培養クラスター［Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，  ＵＳＡ］中、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３７℃オーバーナイトでインキュベートした。培養物を遠心分離して細胞をペレットにし、そしてＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌに結合するｄＡｂについて、抗原結合ＥＬＩＳＡによって、上清をアッセイした。ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルイムノプレート［Ｎｕｎｃ，  ＵＳＡ］を、５０μｌ／ウェルの、１μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ中のＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌで、４℃オーバーナイトでコーティングした。洗浄は全て、ファージＥＬＩＳＡについて記載した通りであった。プレートを、２００μｌの１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで、室温で１時間ブロッキングした。ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ｄＡｂ含有培養上清を４℃で１０分間、１，８００ｘｇでの遠心分離によって清澄化させ、次いで、等容積のＰＢＳＴが加えられたＥＬＩＳＡプレート（３０μＬ／ウェル）へ加えられた。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄した。結合したｄＡｂを、５０μｌ／ウェルの、ＰＢＳＴ中１：２０００で希釈された９Ｅ１０［抗ｍｙｃ  ＩｇＧ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＫ］を加えること、および室温で１時間インキュベートすることにより検出した；次いでＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、５０μｌ／ウェルの、ＰＢＳＴ中１：２０００で希釈された抗マウスＦｃ−ＨＲＰ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＫ］を加え、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そして５０μｌ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液［ＫＰＬ  Ｉｎｃ，  ＵＳＡ］を加えることによりＥＬＩＳＡを展開し、色を展開させた。比色反応を等容積の１Ｍ  ＨＣｌの添加により停止させ、ＥＬＩＳＡプレートを４５０ｎｍで読み取った。抗原結合ｄＡｂは、抗原を含有していない対照ウェルとの、ＩＺｈＣＤ４０Ｌからのシグナル強度の比較によって同定された。
【００６９】
実施例２
クローンＢＭＳ２ｈ−５７２−６の同定
ＢＭＳ２ｈ−５７２  ｄＡｂをエラープローン親和性成熟に供し、ＢＭＳ２ｈ−５７２系統を生成した。これは、ｄＡｂ当たり平均で３．６アミノ酸変化が導入されるランダム突然変異誘発を用いて行われた。ファージライブラリー（平均サイズ６ｘ１０８）が、（記載したように）抗原のストレプトアビジン／ニュートラアビジン捕捉を交互に有する、ビオチン化単量体および三量体ヒトＣＤ４０Ｌを用いて選択された。抗原の濃度減少（ラウンド１で１００ｎＭ；ラウンド２で１０ｎＭ；ラウンド３で１ｎＭ）を用いる、３ラウンドの選択が行われた。配列決定を用いて、各選択ラウンド後の多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）を観察した。選択アウトプット（ＢＭＳ２ｈ−５７２についてＣＤ４０Ｌ三量体上で選択されたラウンド２）を、可溶性発現ベクターｐＤＯＭ１３（Ｃ末端タグ無し）内にサブクローニングし（記載したように）、単量体および三量体両方のＣＤ４０Ｌ上で、親クローンと比較して、改良されたオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）についてＢＩＡｃｏｒｅにより、モノクローナル細菌マイクロ培養上清としてスクリーニングした。同定された改良されたバリアントをＤＮＡ配列解析し、ユニークなｄＡｂを発現し、精製し、次いでＢＭＳ２ｈビーズＲＢＡならびに細胞性ＣＤ４０Ｌ駆動アッセイを用いてアッセイした（記載したように）。これらのｄＡｂの活性は、以下の表１に示される。
【００７０】
Ｆｃ融合体としてＢＭＳ２ｈ−５７２−６をフォーマットする
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６  ｄＡｂを、ヒトＩｇＧ１に由来するＦｃテールを含有するｐＤＯＭ３８ベクターにクローニングし、ＤＭＳ０５０２を構築した。ＢＭＳ２ｈ−５７２−６  ｄＡｂをまた、ヒトＩｇＧ４に由来するＦｃテールを含有するｐＤＯＭ３８ベクターにクローニングしＤＭＳ０５０５を構築した。構築物をＨＥＫ２９３細胞にて一過性に発現させ、プロテインＡを用いてタンパク質を精製した。精製したＦｃ融合体を、単量体および三量体ＣＤ４０Ｌへの結合についてＢｉａｃｏｒｅにより、ならびに様々な細胞アッセイにおいて、解析した（記載したように）。
【００７１】
クローンＢＭＳ２ｈ−５７２−６０８、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６１４およびＢＭＳ２ｈ−５７２−６１９の同定
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６  ｄＡｂを、ドープトオリゴ（ｄｏｐｅｄ  ｏｌｉｇｏ）アプローチを用いる親和性成熟に供した。４つのドープトライブラリー：
ライブラリー１−多様化したＣＤＲ１における５残基
ライブラリー２−多様化したＣＤＲ２における６残基
ライブラリー３−多様化したＣＤＲ２における１３残基
ライブラリー４−多様化したＣＤＲ３における７残基
がこのｄＡｂのために構築された。
【００７２】
各ライブラリーにおいて、多様化はｎｎＳコドンを用いて行われ、ここで、ｎは親塩基の大部分（８５％）を保持し、等モル量の残りの３塩基間で残りを分け（５％ずつ）、かつＳはＧまたはＣを表した。ファージライブラリー（平均サイズ８ｘ１０８）が、（記載したように）抗原のストレプトアビジン／ニュートラアビジン捕捉を交互に有する、ビオチン化単量体および三量体ヒトＣＤ４０Ｌを用いて選択された。ライブラリー２および３は、選択プロセス中に一緒にとられた。抗原の濃度減少（ラウンド１で５０ｎＭ；ラウンド２で５ｎＭ；ラウンド３で１ｎＭ、競合物−非ビオチン化ＣＤ４０Ｌ三量体の２００倍過剰）を用いて、３ラウンドの選択が行われた。配列決定を用いて、各選択ラウンド後の多様性を観察した。選択アウトプット（ラウンド２および３）を、可溶性発現ベクターｐＤＯＭ１３（Ｃ末端タグ無し）内にサブクローニングし（記載したように）、単量体および三量体両方のＣＤ４０Ｌ上で、親クローンと比較して、改良されたオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）についてＢＩＡｃｏｒｅにより、モノクローナル細菌マイクロ培養上清としてスクリーニングした。同定された改良されたバリアントをＤＮＡ配列解析し、ユニークなｄＡｂを発現し、精製し、次いでＢＭＳ２ｈビーズＲＢＡならびに細胞性ＣＤ４０Ｌ駆動アッセイを用いてアッセイした（記載したように）。結果として、成熟ｄＡｂ  ＢＭＳ２ｈ−５７２−６０８、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６１４およびＢＭＳ２ｈ−５７２−６１９が同定された。
【００７３】
クローンＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３の構築
配列解析は、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６０８と親のｄＡｂ  ＢＭＳ２ｈ−５７２−６との間の全てのアミノ酸の違いがＣＤＲ１に位置しており、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６１４と親のｄＡｂ  ＢＭＳ２ｈ−５７２−６との間の違いがＣＤＲ３に位置していたことを明らかにした。両方の成熟したｄＡｂは親のｄＡｂ  ＢＭＳ２ｈ−５７２−６とＣＤＲ２を共有した。これは、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６０８のＣＤＲ１およびＢＭＳ２ｈ−５７２−６１４のＣＤＲ３を有する組み合わせ変異（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を作成する機会をもたらした。まず、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６０８のＣＤＲ１領域をＰＣＲ増幅した。次に、ＢＭＳ２ｈ−５７２−６１４のＣＤＲ２＋ＣＤＲ３断片をＰＣＲ増幅した。これに二つの断片のＳＯＥ  ＰＣＲ（スプライスオーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応）アセンブリを続け、組み合わせ変異体（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ）ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３を作成した。アセンブリされたｄＡｂ  ＰＣＲ産物を可溶性発現ベクターｐＤＯＭ１３（Ｃ末端タグ無し）内にクローニングし、配列確認し、発現し、精製し、次いでＢＭＳ２ｈビーズＲＢＡならびに細胞性ＣＤ４０Ｌ駆動アッセイを用いてアッセイした（記載したように）。
【００７４】
Ｆｃ融合体としてＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３をフォーマットする
ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３  ｄＡｂを、ヒトＩｇＧ１に由来するＦｃテールを含有するｐＤＯＭ３８ベクターにクローニングし、ＤＭＳ０５０７を構築した。構築物をＨＥＫ２９３細胞にて一過性に発現させ、プロテインＡを用いてタンパク質を精製した。精製したＦｃ融合体を、単量体および三量体ＣＤ４０Ｌへの結合についてＢｉａｃｏｒｅにより、ならびに様々な細胞アッセイにおいて、解析した（記載したように）。
【００７５】
実施例３
ＣＤ４０Ｌ活性細胞アッセイ
抗ヒトＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂを、ＣＤ４０Ｌ活性に拮抗するそれらの能力について機能的にアッセイした。試験されたＣＤ４０Ｌ活性は、初代単球由来樹状細胞（ＤＣ）のｈＣＤ４０Ｌ駆動活性化によるＢ細胞増殖およびサイトカイン産生であった。特に断りのない限り、全てのアッセイは、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地中で行った。以下に詳細に説明される様々なアッセイの結果を、表１および表２に示す。
【００７６】
可溶性ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ駆動初代ヒトＢ細胞増殖：
１×１０５個のヒト扁桃Ｂ細胞を、９６ウェル丸底プレートにおいて、２００μＬ／ウェルの最終体積で、様々な力価（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）のｄＡｂまたはｍＡｂと共に、０．６μｇ／ｍｌのＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌとインキュベートした。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、続いてチミジン（３Ｈ；０．５μｃｉ／ウェル）を６時間加えた。Ｂ細胞の増殖は、チミジン取り込みに基づいて定量した。全てのアッセイは、特に断りのない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地中で行った。
【００７７】
ＣＨＯ−ｈＣＤ４０Ｌ駆動初代ヒトＢ細胞増殖：
ＣＨＯ細胞をヒトＣＤ４０Ｌでトランスフェクトし、細胞表面上で高レベルのＣＤ４０Ｌを発現する安定細胞株を生成した。ＣＨＯ−ＣＤ４０Ｌ細胞を、ヒトＢ細胞とのインキュベーションの前に１０，０００  Ｒａｄで照射した。１×１０５個のヒト扁桃Ｂ細胞を、９６ウェル丸底プレートにおいて、２００μｌ／ウェルの最終体積で、様々な力価のｄＡｂまたはｍＡｂと共に、１ｘ１０３個のＣＨＯ−ＣＤ４０Ｌ細胞とインキュベートした（１：１００の比率のＣＨＯ−ＣＤ４０Ｌ：ヒトＢ細胞）。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、続いてチミジン（３Ｈ；０．５μｃｉ／ウェル）を６時間加えた。Ｂ細胞の増殖は、チミジン取り込みに基づいて定量した。全てのアッセイは、特に断りのない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地中で行った。
【００７８】
初代Ｔ細胞駆動ヒトＢ細胞増殖：
Ｔ細胞をヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）親和性を介して濃縮した。濃縮されたヒトＴ細胞を、３７℃で６日間、ＰＭ−ＬＣＬ（ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株；１０，０００Ｒａｄで照射した）と５：１の比率（Ｔ：ＬＣＬ）で培養し、同種異系Ｔ細胞の集団を生成した。６日目に、増殖したＴ細胞を単離し、３０００Ｒａｄで照射し、次いで抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＯＫＴ３）でコーティングされた９６ウェル平底プレートにおいて、１：２の比率で、初代ヒト扁桃Ｂ細胞（１ｘ１０５  Ｂ細胞／ウェル）と培養した（５ｘ１０４  Ｔ細胞／ウェル）。様々な力価のｄＡｂ／ｍＡｂを各ウェルに加えた；各ウェルにおける最終容量は２００μｌであった。試験プレートを３日間３７℃でインキュベートした。ヒトＢ細胞増殖を、最後の１８時間、培養物へのチミジン（３Ｈ；０．５μｃｉ／ウェル）の添加を介して決定した。全てのアッセイは、特に断りのない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地中で行った。いくつかの例では、上清を回収し、ＩＬ−６の存在について測定した。
【００７９】
初代ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）のＣＨＯ−ｈＣＤ４０Ｌ駆動活性化：
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）が、ＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球細胞）リセットを介してＴ細胞を枯渇させることにより、単球について濃縮された。単球濃縮ＰＢＭＣを、３７℃で６日間、６ウェルプレートにおいて１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子）および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４と培養した。２および５日目に、培養されたプレートを新鮮な培地（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４有り）で補充した。６日目に、未成熟ＤＣ（樹状細胞）を細胞アッセイに用いた。８ｘ１０４個の未成熟ＤＣを、９６ウェル平底プレートにおいて、様々な力価のｄＡｂ／ｍＡｂと共に、４ｘ１０３個のＣＨＯ−ｈＣＤ４０Ｌ細胞（１０，０００  Ｒａｄで照射した）と培養した。２４時間後、上清を回収し、種々のサイトカイン（ＩＬ−１２、ＴＮＦ、ＩＬ−２３）の存在について試験した。ＤＣ活性化は、サイトカイン産生のレベルにより決定した。全てのアッセイは、特に断りのない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地中で行った。
様々な初代細胞アッセイにおける単量体ｄＡｂ分子の効力
【表１−１】
2017509649.tif 000007
【表１−２】
2017509649.tif 000008
【表１−３】
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様々な初代細胞アッセイにおけるＦｃ−フォーマット分子の効力
【表２−１】
2017509649.tif 000010
【表２−２】
2017509649.tif 000011
【００８０】
実施例４
様々な抗体の結合動態およびＣＤ４０Ｌ親和性
ＢＭＳ−９８６００４は、ｄＡｂ  ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３のＣ末端に連結されたＩｇＧ１の改変されたＦｃ断片から構成される、二量体融合タンパク質である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ＢＭＳ−９８６００４またはＣＤ４０Ｌに結合する一価成分ドメイン抗体ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３の動態および親和性を特徴付けた。ＢＭＳ−９８６００４値は、基準となる抗体５ｃ８−ＩｇＧ１および５ｃ８−ＣＴならびに一価成分５ｃ８  ＦＡＢ断片に関するものと比較された。ＳＰＲ実験は、天然の三量体形態へのＣＤ４０Ｌ分子の特異的アセンブリを容易にする、Ｎ末端イソロイシンジッパーモチーフを含有するｈＣＤ４０Ｌ構築物（ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ）を利用した。同等の結合活性を有するＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌのビオチン化バージョン（ｂｉｏｔ−ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ）もまた、いくつかのＳＰＲ実験のために利用された。
【００８１】
一価ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３ドメイン抗体は、一価５ｃ８  Ｆａｂ断片の５．４  ｎＭの親和性と比較して、７．８ｎＭのＫｄで、ｂｉｏｔ−ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌに結合する、表３。ＢＭＳ−９８６００４は二価であり、かつＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ標的は三価であるため、ＳＰＲ結合データは、ＣＤ４０Ｌ標的がチップ表面上か溶液中かに関わらず、アビディティにより影響される。アビディティの影響を受けた結合親和性を推定するために、ｂｉｏｔ−ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ表面に結合するＢＭＳ−９８６００４についてのＳＰＲデータを１：１ラングミュアモデルに適合させ、これは１ｎＭ未満の解離定数を示唆する、表３。同様の結果が５ｃ８−ＩｇＧ１および５ｃ８−ＣＴについて得られた。
ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて決定されたＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ動態および親和性値
【表３】
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＊値は分析物の二価性に起因してアビディティにより影響される。
【００８２】
図４は、２５℃でストレプトアビジンＳＰＲセンサーチップ上に捕捉されたｂｉｏｔ−ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌへの１２．５−０．３９ｎＭ  ＢＭＳ−９８６００４（２：１希釈系列）の結合に関するＳＰＲセンサーグラムデータを示す。カラーの線は二重参照されたセンサーグラムデータを示し、黒い線は１：１ラングミュアがデータへフィットし、０．１１ｎＭのアビディティの影響を受けた見かけのＫｄ値を有することを示す。
【００８３】
ＣＤ４０ＬへのＢＭＳ−９８６００４結合の親和性および熱力学もまた、１５−３７℃の範囲の温度で、等温滴定熱量計（ＩＴＣ）を用いて溶液中で特徴付けられた。これらのデータは、ＳＰＲデータと一致して、検出の高親和性限界（Ｋｄ＜２ｎＭ）を超える異なる様式のＫｄ値を有する、複数の熱力学的に異なる結合様式（図３）の存在を示唆した（表４）。ＩＴＣによって決定されたＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌに対する一価５ｃ８  ＦＡＢ断片の親和性（３．５ｎＭ）もまた、ＳＰＲによって決定された値と一致した。
ＩＴＣを用いて決定されたＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ親和性
【表４】
2017509649.tif 000013
【００８４】
実施例５
様々な抗体のＦｃ受容体親和性
ＢＭＳ−９８６００４のＦｃドメイン（「ＣＴ−Ｌ２」と称される、配列番号：３）が、ＦｃＲｎに結合する能力を保持するが、Ｆｃγ受容体への結合を破壊するように、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインから設計された。設計された分子が所望のＦｃ受容体結合プロフィールを有することを確認するため、ヒトＦｃＲｎ、およびヒトＦｃγ受容体ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ／ｃ（ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ）、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）に対するＢＭＳ−９８６００４の結合親和性が、ＳＰＲを用いて、５ｃ８−ＩｇＧ１および  ５ｃ８−ＣＴと比較して測定された。これらの実験のため、ＢＭＳ−９８６００４はｂｉｏｔ−ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌセンサ表面上にドメイン抗体ドメインを介して捕捉され、かつ可溶性Ｆｃ受容体タンパク質が露出したＦｃドメインへの結合について試験された。同様に、５ｃ８−ＩｇＧ１および５ｃ８−ＣＴが、可溶性ＦｃＲ結合を有する、ＦＡＢドメインを介してｂｉｏｔ−ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ表面上に捕捉された。
【００８５】
ＢＭＳ−９８６００４は、エンドソーム内での結合のために適切なｐＨであるｐＨ６．０で、６７０ｎＭのＫｄでＦｃＲｎに結合した、表５。しかしながら、天然のｐＨで結合は著しく減少し（Ｋｄ＞５０００ｎＭ）、これらの条件下でのＦｃＲｎからの効果的な放出を示唆する。ＢＭＳ−９８６００４は０．６ｎＭのＫｄでＣＤ６４に結合し、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ／ｃ、ＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂに対して統計的に弱い親和性を有していた（Ｋｄ＞３０００ｎＭ）。５ｃ８−ＩｇＧ１および５ｃ８−ＣＴの両方は、ＢＭＳ−９８６００４と同様のＦｃＲｎ親和性を有していた。５ｃ８−ＣＴ、ＢＭＳ−９８６００４と同一の「ＣＴ」Ｆｃ領域を有する、もまた、ＢＭＳ−９８６００４と同様のＦｃγＲ結合特性を有していたが、一方で、５ｃ８−ＩｇＧ１、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する、は、ＦｃγＲにより強く結合した、表５。
ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて決定されたＦｃ受容体親和性。
【表５】
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＊５ｃ８  ＩｇＧ１へのＣＤ３２ａ結合は二相性であった。Ｋｄは優性結合にさえ適合する定常状態に基づいて、〜１０−７Ｍと推定された。このＫｄはＩｇＧ１へ結合するＣＤ３２ａに関する文献で報告されたＫＤの範囲内である。
【００８６】
実施例６
インビトロ細胞ベースアッセイ
ＢＭＳ−９８６００４の効力を様々な初代免疫細胞アッセイにおいて評価し、異なる細胞タイプにわたる強固な効力を裏付けた。実施例３において上記に詳細に記載されるように、初代ヒトＢ細胞増殖アッセイを、二つの方法で実行した：（１）組換えＣＤ４０Ｌ三量体を用いてＢ細胞増殖を駆動した；かつ（２）膜上にＣＤ４０Ｌを発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＣＤ４０Ｌ）を利用して、Ｂ細胞増殖を誘導した。ＣＨＯ−ＣＤ４０Ｌ細胞の利用は、膜結合ＣＤ４０Ｌからのシグナルが、可溶性ＣＤ４０Ｌ三量体と比べた場合、同等に抑制されたことを裏付けるのに特に重要であった。ＣＨＯ−ＣＤ４０Ｌ細胞を用いて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下での培養ＰＢＭＣ由来単球から分化した初代ヒトＤＣの活性化も駆動した。同様に、Ｔ−Ｂ  ＭＬＲ（混合リンパ球反応）アッセイが、活性化Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌの存在によって駆動されるＢ細胞活性化を測定した。上記された初代アッセイの全てにおいて、ＢＭＳ−９８６００４は基準となる５ｃ８  ｍＡｂと等効力であった：アッセイに応じて、効力は１桁ｎＭからサブｎＭの範囲であった（表６）。
様々な初代細胞アッセイにおけるＢＭＳ−９８６００４の効力
【表６】
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【００８７】
実施例７
全血受容体占有（ＲＯ）の評価
受容体占有法を展開して、カニクイザル全血試料において、続いて、ヒト全血試料におけるＢＭＳ−９８６００４による、ＭＳ−９８６００３によるＣＤ４０Ｌ標的結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）を測定した。ＢＭＳ−９８６００３は、そのアミノ末端での非天然グリシン残基を除いて、ＢＭＳ−９８６００４と同じアミノ酸配列を共有するｄＡｂである。
【００８８】
占有率は、ＢＭＳ−９８６００３／ＢＭＳ−９８６００４とＣＤ４０Ｌへの結合について競合し、ヒトおよびカニクイザルＣＤ４０Ｌに交差反応性である、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂを用いるフローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞上で測定された。結合したｄＡｂの存在下では、抗ＣＤ４０Ｌ検出ｍＡｂは、濃度依存的にＣＤ４０Ｌへの結合から遮断され、標的占有率の尺度を提供する。基礎ＣＤ４０Ｌが、末梢血において休止Ｔ細胞上に低レベルで発現されるので、ＲＯは、刺激されていない血液試料、およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を用いてＴ細胞表面上のＣＤ４０Ｌのアップレギュレーションを誘導した試料の両方において、評価された。結合能曲線を、ＢＭＳ−９８６００３およびＢＭＳ−９８６００４でのエキソビボ全血処理に続いて生成した。得られた平均ＥＣ５０およびＥＣ９０値が表７に示される。
エキソビボ全血受容体占有アッセイにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＢＭＳ−９８６００３およびＢＭＳ−９８６００４の結合能
【表７】
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【００８９】
ＢＭＳ−９８６００３およびＢＭＳ−９８６００４についての全血中の標的結合能は、ヒトおよびカニクイザルの間で密接に相関する。基礎およびＰＨＡ−誘導性ＣＤ４０Ｌに結合した場合、ＢＭＳ−９８６００３およびＢＭＳ−９８６００４についてのＥＣ５０値もまた類似する。加えて、これらの値は、インビトロ細胞ベースアッセイにおいてヒトで得られたものに相当する（表４を参照のこと）。測定されたＥＣ９０値に基づいて、末梢血中の完全な標的飽和は濃度≦１０ｎＭで達成されるはずである。
【００９０】
ＢＭＳ−９８６００３およびＢＭＳ−９８６００４の前臨床ＰＫ／ＰＤプロフィールを支持するために、ＢＭＳ−９８６００３でのカニクイザルＫＬＨ試験（キーホールリンペットヘモシニアンでの免疫）およびＢＭＳ−９８６００４でのＩＶブリッジング試験の両方において、ＲＯが評価された。これらの知見のさらなる詳細は、以下の実施例に見出すことができる。
【００９１】
実施例８
インビボ薬理学
マウス疾患モデルにおけるＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂの有効性を示すために、マウスＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂ、２ｍ１２６−２４を、Ｄ２６５Ａ点突然変異を有するマウスＩｇＧ１  Ｆｃでフォーマットし、Ｆｃエフェクター機能をさらに下げた。このマウスサロゲートｄＡｂ  ２ｍ１２６−２４−Ｆｃは、ＢＭＳ−９８６００４、およびＭＲ−１、ハムスター抗マウスＣＤ４０Ｌ抗体、に匹敵する効力を示す（表８）。
インビトロ効力比較
【表８】
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【００９２】
マウスＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂによるＫＬＨ誘導性抗体応答の阻害
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目に２５０μｇのＫＬＨを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウスに、−１日目と６日目に、示されている用量でＭＲ−１またはＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−Ｆｃを皮下（ｓ．ｃ．）投与した。血液を回収し、ＥＬＩＳＡによって、７日目に抗ＫＬＨ  ＩｇＭ、および１４日目にＩｇＧについて血清を分析した。ＫＬＨでの免疫後１４日目に回収されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの血清をプールし、正の比較（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として用い、かつデータをプールされたＢＡＬＢ／ｃ血清の力価に対する試験血清の力価の比率として表す。図６に示されるように、ＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−Ｆｃは、最大効果が３ｍｇ／ｋｇと示され、ＥＣ５０が０．２６ｍｇ／ｋｇと計算される、ＩｇＧ力価の用量依存的抑制を示した。ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂおよび該抗体の両方が１ｍｇ／ｋｇで試験され、それぞれ、ＩｇＧ応答において７０％対３０％の減少を示した。ｄＡｂおよび該抗体の同様の曝露が１ｍｇ／ｋｇで観察され、ＫＬＨ誘導性ＩｇＧ応答の抑制において、ｄＡｂが、該抗体よりもわずかにより強力であることを示唆した。結論として、ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂは、Ｔ細胞依存性抗体応答の阻害において、抗ＣＤ４０Ｌ抗体と少なくとも同じレベルの効力を実証している。
【００９３】
マウスＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂによるＴＮＢＳ誘導性大腸炎の阻害
雄ＳＪＬ／Ｊマウスに、肛門から４ｃｍ遠位に挿入されたカテーテルを介して、５０％  ＥｔＯＨ中２．５ｍｇトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を、直腸内投与した。マウスは、ＴＮＢＳ注入の４時間前に、示された容量でＭＲ−１またはＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−Ｆｃをｓ．ｃ．で１回、投与された。図７は、ＰＢＳ／ＩｇＧまたは変化する用量レベルのＭＲ−１もしくはｄＡｂで処置されたマウスの群の平均体重の変化および生存パーセントを提示する。アバタセプトが陽性対照として用いられた（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、隔日）。ＴＮＢＳ誘導性大腸炎の典型的なプロフィールは、ＩｇＧ対照群で示された：３−４日目でピークに達する体重の減少；３日目以降で発生する大腸炎関連死；および４日後、回復の兆しを示して生き残ったマウス。ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂまたは該抗体による処置（いずれも２、８および２０ｍｇ／ｋｇで試験された）は、体重減少の用量依存的阻害および生存率の増加を引き起こした；８ｍｇ／ｋｇの両化合物は、２０ｍｇ／ｋｇのアバタセプトのものに匹敵する、ある程度の効力を生じた。結論として、マウスＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂ  ＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−Ｆｃは、急性ＴＮＢＳ誘導性大腸炎モデルにおいて、抗ＣＤ４０Ｌ抗体  ＭＲ−１に匹敵する有効性を実証している。
【００９４】
マウス「心臓の耳への（Ｈｅａｒｔ−ｔｏ−Ｅａｒ）」移植モデルにおけるＣＴＬＡ４  ＩｇおよびマウスＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂ間の相乗効果
新生児（４８−７２時間）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの心臓移植片が、ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳介に作成された皮下ポケット内に移植された。マウスは、移植前の日に開始された最初の投与で、示された用量で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ｉ．ｐ．  ２ｘ／ｗｋ）、ＢＭＳ−２ｍ１２６−２４−Ｆｃ（皮下にｓ．ｃ．  １ｘ／ｗｋ）、または両方の組み合わせで処置された。同種移植片の心電図（ＥＣＧ）デバイスによって毎日評価されるように、拒絶までの時間が、連続した３日間の心収縮の不在によって定義された。予想されたように、全く処置をしない、新生児ＢＡＬＢ／心臓を受け取ったＣ５７ＢＬ／６マウスは、１２日の生存期間中央値（ＭＳＴ）を有し、その直後に移植片を拒絶した。３、２０ｍｇ／ｋｇのｄＡｂまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇでの単独療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は、同種移植片の生存の延長に、ほとんどまたは全く影響を与えなかった（ＭＳＴ：それぞれ、１２、１５および１３日）。しかしながら、２０ｍｇ／ｋｇのｄＡｂおよび２５ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ４−Ｉｇの組み合わせで処置した群では、移植片生存が著しく延長し、３５日のＭＳＴを示した（図８）。このデータは、ヒト腎移植患者においてベラタセプトとＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂを組み合わせるための理論的根拠を提供している。
【００９５】
実施例９
インビボ非臨床薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）
様々なインビボ試験を実施し、非臨床設定における、ＢＭＳ−９８６００４、ＢＭＳ−９８６００３、およびマウスＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂ−Ｆｃサロゲート、ＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−ＣＴのＰＫおよびＰＤを特徴付けた。重要な知見を以下に要約する。
【００９６】
ＢＭＳ−９８６００４  ｄＡｂを測定するためのＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）ベースの生物分析方法を展開し、ＰＫ試験、マウスにおける急性および慢性有効性試験、ならびにカニクイザルを採用する探索的ＰＫ／ＰＤ試験を支持した。全ての場合において、全血が得られ、ＥＤＴＡの存在下で血漿が調製され、次いで試料がＥＬＩＳＡ解析に供された。
【００９７】
血漿濃度のＢＭＳ−９８６００４を、ヒトＣＤ４０Ｌ抗原を利用したＥＬＩＳＡアッセイで測定し、試験試料から分析物を捕捉した。試験試料を４℃で解凍し、十分に混合し、１×ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、および１％  ＢＳＡから構成されるアッセイ希釈液（ＰＴＢ）で１：１００に希釈した。試料のその後の希釈は、希釈剤として１％  正常サル血漿／ＰＴＢを用いて作製した。これは、１％で試料マトリックスを維持しながら、試験分析物がいくつかの希釈（１０２−１０５）でアッセイされることを可能にした。
【００９８】
組換え三量体ヒトＣＤ４０ＬをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （ＰＳＳ），  ＬＶＬから得て、２μｇ／ｍＬの終濃度で９６ウェルプレートに結合させた。試験試料、品質管理（ＱＣ）試料および標準を、ＰＴＢ中に０．２５  μｇ／ｍｌの濃度に希釈したアフィニティー精製ウサギ抗重鎖（Ｖｈ）ドメインフレームワークポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｄｅｎｖｅｒ，  ＰＡ）、続いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギポリクローナル二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）で検出し、基質（ＴＭＢ−テトラメチルベンジジン）を添加し、かつ酵素反応を１Ｍリン酸で停止させた。吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。試験試料中のＢＭＳ−９８６００４の解析は、標準曲線を用いて行った。１％サル血漿中で各実行の日に調製された標準曲線校正器を用いて、生物分析法のダイナミックレンジを定義した。１００％の血漿における得られた標準曲線の範囲は１０−１２００ｎｇ／ｍＬであった。ＢＭＳ−９８６００４のための参照標準は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （ＢＰＰＤ），  ＨＰＷから得た。参照標準物質は製造バッチの代表であり、試験プロトコルで用いた。標準曲線およびＱＣは、アッセイ性能のために許容されると考えられた≦２０％の確度および精度の基準を用いて評価された。試験試料は、キャリブレータに由来する濃度の逆数（１／ｘ）で重み付けた、４−パラメータロジスティックフィット回帰モデルを用いて定量した。
【００９９】
その正常値から計算された濃度の偏差により測定された、ＱＣ試料の性能は、参照物質が２ヶ月超の間、−７０℃で保存された場合、３０−１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、適切な（ｎｅａｔ）サル血漿において安定であったことを示した。
【０１００】
非臨床薬物動態
表９は、非臨床動物種におけるＢＭＳ−９８６００４、ＢＭＳ−９８６００３、およびマウスＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−ＣＴに関するＰＫパラメータを要約する。
２つの非臨床動物種からの単回投与ＰＫパラメータ（平均±ＳＤ）
【表９】
2017509649.tif 000018
【０１０１】
ＢＭＳ−９８６００４およびＢＭＳ−９８６００３は、サルにおいて匹敵するＰＫプロフィールを示した（図９Ａおよび図９Ｂ）。ＩＶ投与後、ＢＭＳ−９８６００４およびＢＭＳ−９８６００３の血漿濃度は、それぞれ、最大５０４および４０８ｈの双指数関数的な（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）低下を示した。その後、両試験に登録したサルの５０％で、加速したクリアランスが確認された。ＢＭＳ−９８６００４処置後３８ｄで回収した血漿試料の免疫原性試験は、全てのサルが抗薬物抗体（ＡＤＡ）を発生していること；より高いＡＤＡのレベルの猿がより速いクリアランスを示したこと、を示唆した。ＢＭＳ−９８６００３でのＩＶ  ＰＫ試験について免疫原性試験は行われなかったが、ＰＫ／ＰＤ試験においてＢＭＳ−９８６００３での皮下投与後のサルにおいて、同様のレベルの免疫原性が観察され、両タンパク質がサルにおいて免疫原性であることを示唆した。ＢＭＳ−９８６００４およびＢＭＳ−９８６００３について１２４および１０６ｈの終末相半減期（Ｔ１／２）は、それゆえ、最大２週間（３３６ｈ）だけ収集された曝露を用いて決定された。ＢＭＳ−９８６００４およびＢＭＳ−９８６００３の分布の定常状態容積（Ｖｓｓ）は、それぞれ、０．０９８および０．０７４Ｌ／ｋｇであった。値は、血漿容量（０．０６Ｌ／ｋｇ）より大きく、細胞外液の容量（０．２Ｌ／ｋｇ）よりも小さく、タンパク質は主に細胞外空間内に存在することを示唆した。ＢＭＳ−９８６００４およびＢＭＳ−９８６００３の全身血漿クリアランス（ＣＬＴｐ）は、それぞれ、０．５９および０．６５ｍＬ／ｈ／ｋｇであった。
【０１０２】
サルにおけるＢＭＳ−９８６００４のＰＫパラメータは、アバタセプト、同様のサイズのタンパク質（７８．５対７８−ｋＤａ  ＢＭＳ−９８６００４、アミノ酸配列に基づき）、同一の改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃフォーマットを有する、のものと比較された。予想されたように、ＢＭＳ−９８６００４のパラメータは、アバタセプトのものとほぼ同一であり（０．６ｍＬ／ｈ／ｋｇのＣＬＴｐ、０．０８７Ｌ／ｋｇのＶｓｓ、５ｄのＴ１／２）、ＢＭＳ−９８６００４およびアバタセプトのヒトＰＫが同様である可能性が高いことを示唆した。
【０１０３】
皮下（ＳＣ）投与後のＢＭＳ−９８６００３の吸収が、サルＰＫ／ＰＤ試験において評価された。キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、Ｔ細胞依存性抗原での免疫の２４時間前に、０（ビヒクル対照）、０．２  、２および２０ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量として、ＢＭＳ−９８６００３をサルに投与した。投薬後、ＢＭＳ−９８６００３はゆっくりと吸収され、６−９６ｈの範囲のＴｍａｘであった（図１０）。ＢＭＳ−９８６００３の曝露は、全ての用量レベルにわたって用量比例（ｄｏｓｅ−ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ）よりも少ないように思われた。１：１０：１００の用量比で、平均ＣｍａｘおよびＡＵＣ０−ｉｎｆ比は、それぞれ、１：１２：８０と１：７：４４であった。参考してＩＶ投与（２ｍｇ／ｋｇ）後の曝露を用いて、ＩＶ投薬後の線形ＰＫを想定すると、ＢＭＳ−９８６００３のＳＣ生物学的利用能は、０．２、２、および２０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ、８８％、７４％、および４４％であった。終末相Ｔ１／２は、投与後２から５週目でほとんどのサルで観察された免疫原性によって混乱した。したがって、Ｔ１／２は、０．２、２および２０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ、８５、６６および１０５ｈであると推定された。
【０１０４】
５ｃ８−ＩｇＧ１、ＰＫ／ＰＤ試験において陽性対照として用いられた抗ヒトＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体、のＰＫが、２０ｍｇ／ｋｇでのＩＶ投与後に評価された（図１１）。同じ投与量でＳＣが与えられたＢＭＳ−９８６００３と比べた場合、５ｃ８−ＩｇＧ１は１０倍高い血漿曝露および４倍長いＴ１／２を示した（表９）。
【０１０５】
マウスサロゲートｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、ＢＭＳ−２Ｍ−１２６−２４−ＣＴ、のＰＫが、単回ＩＶおよびＳＣ投与後にマウスで評価された（表９）。単回ＩＶ（１ｍｇ／ｋｇ）の後、血漿濃度は、１０１ｈの終末相Ｔ１／２を有する単一指数関数的な（ｍｏｎｏ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）低下に従った（図１１）。ＣＬＴｐは１．８５ｍＬ／ｈ／ｋｇであり；また、Ｖｓｓは０．２６Ｌ／ｋｇであり、細胞外分布を示した。１および１０ｍｇ／ｋｇの単回ＳＣ投与後、ＢＭＳ−２ｍ−１２６−２４−ＣＴはゆっくりと吸収され、２４時間のＴｍａｘであった。全身曝露は用量に比例して増加した。１：１０の用量比で、１：１１の割合でＣｍａｘおよびＡＵＣ０−ｉｎｆが増加した。終末相Ｔ１／２は、それぞれ、１および１０ｍｇ／ｋｇで１００および１２０ｈであった。ＳＣおよびＩＶ投与後の用量調整された曝露（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）の比は１よりも大きく、ＳＣ投与後の完全な吸収を示唆した。
【０１０６】
薬物動態／薬力学モデル
ＢＭＳ−９８６００３のＰＤが、ＰＫ／ＰＤ試験において抗ＫＬＨ抗体応答の抑制として測定された。ＢＭＳ−９８６００３は、２０ｍｇ／ｋｇの最高用量で、ＫＬＨに対する抗体応答を７０％抑制した（抑制された％応答＝
【数１】
2017509649.tif 000019
）。抗体応答の限界（１５％）および抑制無しが、２および０．２ｍｇ／ｋｇで発生した。比較すると、５ｃ８−ＩｇＧ１は、同じ用量レベル（２０ｍｇ／ｋｇ）で、ＢＭＳ−９８６００３よりも１０倍高い血漿曝露および４倍長いＴ１／２を示した。その結果、５ｃ８−ＩｇＧ１は９７％、抗ＫＬＨ抗体応答を抑制した。ＢＭＳ−９８６００３および５ｃ８−ＩｇＧ１間のインビボ効力を比較するために、ＰＫ／ＰＤモデリングがＳＡＡＭ  ＩＩ（バージョン１．２．１、シアトル、ＷＡ）を用いて行われた。ＳＣ投与後のＢＭＳ−９８６００３の血漿濃度が、消失（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）が中枢および末梢コンパートメントの両方で発生する、２−コンパートメントモデルを伴う一次吸収速度論を用いて説明された。免疫原性からの合併症および非線形吸収の可能性のため、ＰＫデータは、各投与量で個々に適合させた。
【０１０７】
５ｃ８−ＩｇＧ１について、中枢消失を伴う２−コンパートメントモデルが用いられた。抗ＫＬＨ抗体応答は、ＩｇＧ力価の平均値として表され、６−コンパートメントシグナル伝達モデルを用いてモデル化された。体内のＫＬＨの動態は、１コンパートメントモデルであると仮定された。ＢＭＳ−９８６００３および５ｃ８−ＩｇＧ１によるＩｇＧ産生の阻害は、Ｉｍａｘモデルを用いて説明され、１００％に等しい最大阻害であった。図１２に示されるように、モデル適合曲線は、ＰＫおよびＰＤプロフィールの両方を説明することができた  。ＫＬＨ−誘導性ＩｇＧ産生を抑制するためのＢＭＳ−９８６００３および５ｃ８−ＩｇＧ１の血漿ＩＣ５０は、それぞれ、７４±１４および６０±１８ｎＭであると推定された。これらの結果は、これら２つの分子の効力がインビボで同等であったことを実証した。
【０１０８】
ＢＭＳ−９８６００４のＣＤ４０Ｌ受容体占有率（ＲＯ）がＩＶ  ＰＫ試験で測定された。１１ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上のＢＭＳ−９８６００４のＲＯは、時間および濃度依存的であった。ＰＫ／ＰＤモデリングを実施して、ＲＯ  ＥＣ５０を推定した。血漿濃度は、投与後５０４ｈの時点で導入される、さらなるＡＤＡ媒介性一次消失定数を有する、改変２−コンパートメントモデルを用いてモデル化した；また、ＲＯはＥｍａｘモデルを用いてモデル化した（
【数２】
2017509649.tif 000020
）。図１３に示されるように、適合曲線は曝露およびＲＯの両方を説明することができ、推定ＲＯ  ＥＣ５０は３．４±０．３ｎＭであり、γ（ヒル係数）は３．１±０．１であった。比較すると、ＲＯ  ＥＣ５０は、７４±１４ｎＭの抗ＫＬＨ抗体応答のＩＣ５０よりも〜２２倍低く、かなりの（＞５０％）抗ＫＬＨ抗体抑制を達成するために＞９５％ＲＯが必要であることを示唆した。
【０１０９】
実施例１０
ＴＥ／血栓症の危険性の評価
抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体の投与に関連するＴＥは、ＦｃｇＲＩＩａ、ＩｇＧ  Ｆｃ受容体へのＩＣ結合によって容易にされ、活性化および凝集を引き起こす、抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ−ＣＤ４０Ｌ免疫複合体（ＩＣ）媒介性の血小板の架橋によって媒介されるという仮説が立てられている。ＦｃｇＲＩＩａとＩｇＧのＦｃ部分との相互作用を遮断することは、従って、血小板架橋および血栓症を軽減することが期待される。以下の方法およびアプローチを設計して、ＴＥおよび／または血栓症のリスクを評価した。
【０１１０】
インビトロ血小板活性化アッセイ
いくつかのインビトロアッセイを行って、血小板がＦｃｇＲＩＩａ依存的にＣＤ４０Ｌ  Ｍａｂ／ｓＣＤ４０Ｌ  ＩＣによって活性化されるという仮説を試験した。陽性対照、５ｃ８−ＩｇＧ１を用いて、ＢＭＳ−９８６００３およびＢＭＳ−９８６００４を試験する前にアッセイを検証した。血小板上にｈＦｃｇＲＩＩａ受容体を発現するヒトドナーまたはマウスからの血液を、これらの研究のために用いた。血小板活性化は、よく検証された血小板活性化マーカーＰ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）およびＰＡＣ−１（活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に対する抗体を用いてフローサイトメトリーにより検出した。簡単には、検出抗体および試験試薬が加えられた、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する改変Ｔｙｒｏｄｅｓ−ＨＥＰＥＳ中に血液を１：２５に希釈し、インキュベートし、血小板活性化について分析した。最初の実験は、ｓＣＤ４０Ｌまたは５ｃ８ＩｇＧ１単独では、血小板を活性化しなかったが、５ｃ８：ｓＣＤ４０Ｌが１：１から１：８の異なる比率の免疫複合体が血小板を著しく活性化することを実証した。後続の実験は、５ｃ８−ＩｇＧ１または５ｃ８−ｍＩｇＧ２ａ  ＩＣを、主に１：３のモル比の５ｃ８：ｓＣＤ４０Ｌで、使用した。
【０１１１】
５ｃ８／ｓＣＤ４０Ｌ  ＩＣによる血小板の活性化は、抗ＦｃｇＲＩＩａ抗体によって遮断できる
５ｃ８／ｓＣＤ４０Ｌ  ＩＣによる血小板の活性化が実際にＦｃｇＲＩＩＡ媒介性であるかどうかを試験するために、ＦｃｇＲＩＩａブロッキング抗体ＩＶ．３を用いて研究が行われた。ヒトドナーからの血液を、希釈および上述した検出抗体とのインキュベーションの前に、０．５μｇ／μｌのＦｃｇＲＩＩａブロッキング抗体ＩＶ．３と予備インキュベートした。アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、異なるメカニズムを介する血小板活性化因子が、陽性対照として用いられた。図１４に示されるように、５ｃ８／ｓＣＤ４０  ＩＣによる血小板活性化は、ＩＶ．３により完全に遮断されたが、ＡＤＰによる活性化はブロッキング抗体によって阻害されず、ＩＣによる活性化がＦｃｇＲＩＩａ媒介性であることを示した。
【０１１２】
不活性Ｆｃテールの選択
潜在的な血小板活性化を予防するため、可能な候補分子のための要件は、ＦｃｇＲＩＩａへの結合の非存在であった。ＩｇＧ１（例えば５ｃ８−ＣＴおよびＮ２９７Ｑ）またはＩｇＧ４（例えば、５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ）に由来する様々な変異を含有するいくつかの５ｃ８の構築物が発現され、異なるモル比のｍＡｂに対するｓＣＤ４０Ｌを用いて、血小板を活性化しない、Ｆｃテールがスクリーニングされた。野生型およびほとんど変異した構築物は、５ｃ８−ＣＴおよび５ｃ８−Ｎ２９７Ｑを除いて、血小板を活性化した（図１５）。Ｆｃの非存在（５ｃ８−Ｆａｂ２）はまた、血小板を活性化せず、ＩＣ−血小板活性化がＦｃ媒介性であることをさらに確認した。ＣＴテールを選択し、ｄＡｂ候補のＢＭＳ−９８６００３およびＢＭＳ−９８６００４をフォーマットした。
【０１１３】
血小板活性化におけるＦｃｇＲＩＩａ多型の効果
ＦｃｇＲＩＩａの遺伝子は、コドン１３１で可変であり、Ｈｉｓ−Ａｒｇ（ＣＡＴ／ＣＧＴ）多型をもたらす。白人およびアフリカ系アメリカ人のほぼ等しい分布を有する、およそ１００人の個体における遺伝子型分布は、Ａ／Ａ（Ｈｉｓホモ接合性；１４％）、Ａ／Ｇ（Ｈｉｓ／Ａｒｇヘテロ接合性；６０％）、かつ白人アメリカ人についてＧ／Ｇ（アルギニンホモ接合性；２６％）、ならびにアフリカ系アメリカ人についてＡ／Ａ（３０％）、Ａ／Ｇ（５１％）、およびＧ／Ｇ（１９％）であった。Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｌａｂ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：  ６４０−６４４  （１９９４）。Ｆｃ依存性血小板凝集は、ｍＩｇＧ２またはｍＩｇＧ１  Ｆｃフォーマットにおける抗ＣＤ９で処置された場合、Ｒ１３１個体からの試料において見られたが、Ｈ１３１個体からの血小板は、ｍＩｇＧ２フォーマットとしての抗ＣＤ９でのみ凝集した；これは、ＩｇＧ１  ｍＡｂでのＦｃ依存性凝集が、潜在的に患者集団を、この多型によって以前に報告された、低反応者および高反応者へと分離することを示唆する。Ｔｏｍｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８０：  ２２６１−２２６８  （１９９２）。ＩｇＧ１およびＣＴ  Ｆｃテールでの血小板活性化における任意の潜在的な差異に対処するために、１９人のドナーがｈＦｃｇＲＩＩａ多型について遺伝子型解析され、血小板活性化について試料が試験された。ドナープール多型（ＲＲ；４２％、ＨＨ；２１％、ＨＲ；３７％）は、ＩｇＧ１フォーマットへの血小板活性化における任意の潜在的な差異を評価するのに十分であった。文献報告の代表例は、５ｃ８−ＩｇＧ１／ｓＣＤ４０Ｌ  ＩＣでの血小板の活性化は、全ての遺伝子型解析された個体の間で類似していた。５ｃ８−ＣＴ／ｓＣＤ４０Ｌ  ＩＣでは活性化が全く見られず（図１６）、ＣＴテールでフォーマットされた抗体を用いた患者集団におけるＴＥ増大のリスクが無い、または最小限であることを示唆した。
【０１１４】
ＢＭＳ−９８６００４：ヒト血液ドナーにおける血小板活性化
５ｃ８を用いる上記の実験は、ＢＭＳ−９８６００４（ＢＭＳ２ｈ−５７２−６３３−ＣＴ−Ｌ２とも呼ばれる）のための最高のフォーマットとしてのＣＴテールの選択を示唆した。６人のドナーから得た血液を、５ｃ８−ＩｇＧ１、５ｃ８−ＣＴ、Ｆ（ａｂ）２、およびＢＭＳ−９８６００４で処理した。血小板は、ＢＭＳ−９８６００４を含む、他の構築物のいずれかではなく、５ｃ８−ＩｇＧ１によって活性化され（図１７）、このｄＡｂが、臨床試験において血小板の活性化およびＴＥを引き起こすリスクが無いまたは低いことを示唆した。
【０１１５】
ＢＭＳ−９８６００３：ｈＦｃｇＲＩＩａを発現するマウス由来の血液における血小板活性化
抗ＣＤ４０Ｌ抗体による血小板の活性化が、ＦｃｇＲＩＩａ受容体によって媒介されたことをさらに確認するために、ヒト受容体（Ｒ１３１遺伝子型）を発現するトランスジェニックマウスからの血液を、５ｃ８−ＩｇＧ１、５ｃ８−ＩｇＧ２ａ、ｄＡｂ−ＩｇＧ１、５ｃ８−ＣＴ、およびＢＭＳ−９８６００３（ＢＭＳ−２ｈ５７２−６３３−ＣＴとも呼ばれる）で処置した。血小板は、ｈＦｃｇＲＩＩａを発現するマウス由来の血液において、５ｃ８−ＩｇＧ１、５ｃ８−ＩｇＧ２ａ、およびｄＡｂ−ＩｇＧ１／ｓＣＤ４０Ｌ  ＩＣによって特異的に活性化されたが、野生型の同腹子ではそうでなかった。５ｃ８−ＣＴおよびＢＭＳ−９８６００３は血小板を活性化せず、本明細書に開示される抗体でのＴＥの低リスクをさらに確認した（図１８）。
【０１１６】
実施例１１
免疫抑制レジメン
アカゲザルにおいて移植研究を実施して、非ヒト霊長類腎臓移植モデルにおけるＢＭＳ−９８６００４単独での、およびベラタセプトとの組み合わせでの有効性を評価した。これらの研究について、サルを以下の用量反応群および治療レジメン：
第一相−パート１：ＢＭＳ−９８６００４のみについての用量反応（サルのｎ＝９）
Ａ群（高用量）：ＢＭＳ−９８６００４  ２０ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｎ＝６）
手術後（ＰＯＤ）０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、および７０日の投与（毎週）
屠殺ＰＯＤ７７日
Ｂ群（中間用量）：ＢＭＳ−９８６００４  １０ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｎ＝１）
ＰＯＤ０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、および７０日の投与（毎週）
Ｃ群（低用量）：ＢＭＳ−９８６００４  ｄＡｂ  ２ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｎ＝２）
ＰＯＤ７０日を通じて毎週投与
第一相−パート２：ベラタセプトと併用療法（ｎ＝６）
ＢＭＳ−９８６００４単独で  ２０ｍｇ／ｋｇ静脈内
ＰＯＤ０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、および７０（毎週）に投与した
ＢＭＳ−９８６００４  ２０ｍｇ／ｋｇ静脈内＋ベラタセプト２０ｍｇ／ｋｇ静脈内    
ＰＯＤ０、７、１４、２８、４２、５６、および７０日に投与した
第二相−パート１：ＢＭＳ−９８６００４だけについての用量反応（ｎ＝５）
Ａ群（高用量）：ＢＭＳ−９８６００４  ２０ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｎ＝３）        ＰＯＤ０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、および７０（毎週）に投与した
Ｂ群（より高用量）：ＢＭＳ−９８６００４  ３０ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｎ＝２）
ＰＯＤ０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、および７０（毎週）に投与した
に分けた。
【０１１７】
動物をエンドポイントまで生存について追跡した。以下の例で実証されるように、いくつかのサルは所望のエンドポイントまで生存しなかった。これらの動物は、計画した投薬レジメンを果たせなかった。結果は以下の実施例で考察される。
【０１１８】
実施例１２
移植片機能
アカゲザルにおける移植研究を、ＣＤ４０Ｌ  ｄＡｂ  ＢＭＳ−９８６００４についての適切な投薬を評価するために実施した。生存および任意の拒絶反応の特性へのＢＭＳ−９８６００４の影響の評価を完了して、根底にある機構を理解した。
【０１１９】
実験的評価
血清クレアチニン研究を実施して、ＢＭＳ−９８６００４で処置されたアカゲザルにおける同種移植片機能を経時的に試験した。同種生着不全を、臨床の現場における透析を必要とするのに十分な腎不全の発症として定義し（つまり、ＢＵＮ＞１００ｍｇ／ｄＬ、または上昇性のクレアチニンに関連する高カリウム血症＞７．０）、ＢＵＮおよび血清クレアチニンレベルは腎不全についてのバイオマーカーとして使用した。図１９−２１は、第一相−パート１の高用量（２０ｍｇ／ｋｇ）、中間用量（１０ｍｇ／ｋｇ）、および低用量（２ｍｇ／ｋｇ）のＢＭＳ−９８６００４で処置された、腎臓移植されたアカゲザルについての血清クレアチニンレベルを示す。低用量および中間用量群は、移植後およそ６日後に上昇性のクレアチニンレベルに関連する高カリウム血症＞６．０を示した。高用量群におけるサルは、移植後６０日前に高カリウム血症＞７．０を示さなかった。レシピエント生存時間を記録し、かつアカゲザルを同種生着不全の時に安楽死させた。
【０１２０】
下記の表１０は、第一相−パート１のレシピエント生存データおよび臨床評価を提供する： 
レシピエント生存−低、中間、および高用量
【表１０】
2017509649.tif 000021
【０１２１】
同様の実験を第一相−パート２のさらにより高用量（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置された、腎臓移植されたアカゲザルについて実施した。図２２は、処置されたサルについてのクレアチニン曲線を提供する。下記の表１１は、第一相−パート２のレシピエント生存データおよび臨床評価を提供する： 
表１１  レシピエント生存−用量増大
【表１１−１】
2017509649.tif 000022
さらなる研究で、以下の結果が５匹のレシピエントで観察された。
【表１１−２】
2017509649.tif 000023
【０１２２】
同様の研究を第二相の２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ−９８６００４群または２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ−９８６００４＋２０ｍｇ／ｋｇのベラタセプトで処置した、腎臓移植されたアカゲザルについて実施した。
図２３は、処置したサルについてのクレアチニン曲線を提供する。下記の表１２は、第ＩＩ相−パート１のレシピエント生存データおよび臨床評価を提供する。抗ＣＤ１５４  ｄＡｂの最後の用量は移植後７０日であり、かつベラタセプトの最後の用量は、移植後１６８日である。
レシピエント生存−併用療法
【表１２】
2017509649.tif 000024
【０１２３】
腎臓同種移植片生検
さらに同種移植片機能を評価するために、アカゲザルに移植後３５および７０日に経皮的な腎臓生検を行った。予備的な組織学的解析を腎臓移植における専門的知識を有する獣医学病理学者により実施した。生検は、腎臓の同種移植拒絶を診断するために使用される標準化されたＢａｎｆｆ基準によって特徴付けられる。Ｂａｎｆｆ基準は、下記の表１３−１６に定義される。： 
急性Ｔ細胞媒介性拒絶についての基準
【表１３】
2017509649.tif 000025
単核細胞間質性炎症についての定量的な基準（「ｉスコア」）
【表１４】
2017509649.tif 000026
尿細管炎についての定量的な基準（「ｔスコア」）
【表１５】
2017509649.tif 000027
内膜動脈炎についての定量的な基準（「ｖスコア」）
【表１６】
2017509649.tif 000028
経皮的な腎臓生検の結果は、下記表に含まれる。
経皮的な腎臓生検の組織学的解析
【表１７】
2017509649.tif 000029
【０１２４】
実施例１３
フローサイトメトリーによる細胞の表現型解析
末梢血試料を第ＩＩ相アカゲザルから回収し、かつ細胞表現型の解析を実施して、免疫活性化に一致する、白血球組成物（免疫表現型）および他の細胞のマーカーを評価した。第ＩＩ相−２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ−９８６００４群および２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ−９８６００４＋２０ｍｇ／ｋｇのベラタセプト群についての予備的な平均値群Ｔ細胞サブセットフローサイトメトリーデータは、図２４−３１に示される。
【０１２５】
腎臓同種移植片、脾臓、リンパ節、および骨髄試料も安楽死させた時点で回収した。同種移植片実質組織を組織浸潤性細胞の抽出のために処理し、かつ、フローサイトメトリーおよび遺伝子アレイ発現プロファイリングにより解析した。
【０１２６】
実施例１４
ＢＭＳ−９８６００４およびベラタセプトのレベル
研究を実施して、第一相−パート１の２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２）、１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１）、または２０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）のＢＭＳ−９８６００４およびベラタセプトで処置されたアカゲザルから回収された血漿試料における、抗ＢＭＳ−９８６００４および抗ベラタセプトレベルを決定した。０日目（移植前（ｐｒｅ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ））；移植終了時（移植前注入後２時間）；移植後４、７、１４、２８日、およびその後隔週で、各用量を与える直前に、試料を得た。
【０１２７】
実施例１５
ウイルス負荷アッセイ
ウイルス性再活性化は、患者が免疫抑制状態にある場合に、移植後起こることが示された。２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ−９８６００４で処置したアカゲザルを、以前に記載されるリアルタイムＰＣＲ技術を用いてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ウイルス性再活性化の存在について観察した。処置されたサルのいずれにおいてもサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ウイルス性再活性化の証拠はなかった。（図３２を参照されたい）。このデータは、免疫系は、ＢＭＳ−９８６００４により適切に抑制されていること、およびＣＭＶの再活性化はないことのさらなる裏付けを提供する。
【０１２８】
２０ｍｇ／ｋｇのＢＭＳ−９８６００４で処置されたアカゲザルを、アカゲザル全血液を解析することにより、アカゲザルサイトメガロウイルス（ＲｈＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびリンホクリプトウイルス（ＬＣＶ）の存在について観察した。
【０１２９】
実施例１６
血栓塞栓性の可能性の評価
様々な時点からのアカゲザル血漿試料を、Ｄダイマー、フィブリノーゲン、およびアンチトロンビンレベル、ならびにＰＴ／ａＰＴＴ（プロトロンビン時間／活性化部分トロンボプラスチン時間）について解析した。毎週、全血数（ＣＢＣ）から血小板数を記録した。血小板分布幅もまた記録した。血小板分布幅は、血栓塞栓症の診断のためのマーカーとして使用される指標である。血小板分布幅は、血栓塞栓症に関連する血小板活性化に起因して増加する。
【０１３０】
回収時点は当初、手術手順（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の辺りに集中させ、次いでサルの残りの寿命を通じて定期的な時点で間隔をあけた。血漿試料を、２回の腎摘摘出前の時；腎摘摘出後１および７日；移植後０、１、４、７、１４、２１、２８、日、次いで、安楽死の時を含む、安楽死の時まで２週間毎に回収した。
実施例１７
剖検評価
【０１３１】
アカゲザルが任意の血栓塞栓性合併症様の症状を示すならば、確認のために剖検をアカゲザルで実施する。標準的な肉眼検査が実施される。組織は、腎臓同種移植片、副腎、脳、結腸、十二指腸、心臓、回腸、鼠径リンパ節、縦隔リンパ節、空腸、肝臓、肺、腸間膜リンパ節、膵臓、副甲状腺、皮膚、脾臓、胃、胸腺、および甲状腺組織を含む、サルの全てから回収した。これらの試料を１０％の中性緩衝ホルマリン中に回収した。腎臓同種移植片、心臓、皮膚、肺、脾臓、胸腺、縦隔リンパ節および鼠径リンパ節のさらなる試料を、回収し、保管した。可能な場合、任意の著しく異常な組織面積もまた、対照のサル由来の組織に対応する面積と共に回収した。
【０１３２】
屠殺の際、肉眼的、または組織学的な、血栓塞栓症（ＴＥ）の証拠はなかった。測定された様々なＴ細胞解析は、防御免疫は動物のために維持されたということを証拠付けた。当該治療は、安全かつ効果的であり、従来の抗ＣＤ１５４治療と同様の効力を有することが見出された。
【０１３３】
実施例１８
単剤療法、単剤療法＋従来療法、および併用療法
同ガイドラインに続き、上記に記載される同じ動物を用いて、２０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２８  ｄＡｂを単独で、またはいくつかの併用療法において、投与した。ベラタセプトを、１０ｍｇ／ｋｇの用量で腎臓移植前に投与し、次いで再度、ベラタセプト単独の単剤療法、または従来療法との組み合わせ、もしくは抗ＣＤ２８  ｄＡｂとも組み合わせのいずれかで、移植後４日に１５ｍｇ／ｋｇ、および７、１４、１８、４２、５６、８４、１１２、１４０および１６８日に２０ｍｇ／ｋｇを投与した。従来療法は以下から構成される：
Ａ）０日とその後すぐに投与される抗ＩＬ−２Ｒ；
Ｂ）２０ｍｇ／日のソルメドロールを０日目から開始して２８日目まで、２９日の２ｍｇ／日のソルメドロールを８４日まで減少させ、この時点でソルメドロールは１ｍｇ／日に減少された；および
Ｃ）１５ｍｇのミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を０日目から２８日目までｂ．ｉ．ｄ．（１日につき２回または１日２回）で投与し、次いでその後、１５ｍｇでｑ．ｄ。（１日につき１回または１日１回）で投与した。
結果は、様々な治療剤を投与された動物についての表１８−２０において明らかである。
【表１８】
2017509649.tif 000030
【表１９】
2017509649.tif 000031
【表２０】
2017509649.tif 000032
【０１３４】
抗ＣＤ１５４  ｄＡｂおよび従来療法の併用について、抗ＣＤ１５４  ｄＡｂを、静脈内に３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯＤ０からＰＯＤ７０まで各週で投与し、次いで、抗ＣＤ１５４  ｄＡｂを、従来療法なしで、ＰＯＤ７０からＰＯＤ１４０まで隔週で投与し、次いで抗ＣＤ１５４  ｄＡｂを、静脈内に３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯＤ１４０後、毎月、投与した。
【０１３５】
抗ＣＤ２８  ｄＡｂは本明細書中でＢＭＳ−９３１６９９と呼ばれ、それはともに割り当てられた米国特許第８，１６８，７５９号に記載されるＰＥＧ化抗ＣＤ２８  ｄＡｂである。ＰＥＧ部分は、４０ｋＤａの分岐ポリエチレングリコールである。抗ＣＤ２８  ｄＡｂの配列は、以下である：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＰＩＷＰＦＬＥＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＦＴＳＲＬＲＨＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＣＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＮＶＡＮＰＡＴＦＳＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号：２６）
【０１３６】
本実施形態は上記実施例を参照して詳細に説明してきたが、様々な改変が、これらの実施形態の精神から逸脱することなく行うことができ、当業者に容易に知られているであろうことが理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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