(57)【要約】  本発明は、ａ）高レベルのＯＤＣ活性および細胞内ポリアミン量の増加に一部関係する癌（例えば、大腸癌、神経芽細胞腫）を予防および／または処置するための、ｂ）癌患者の生存、特に高レベルのＯＤＣ活性および細胞内ポリアミン量の増加に一部関係する癌の患者の生存を予測するための、そしてｃ）ＯＤＣ１遺伝子の＋２６３位および／または＋３１６位のアレルヌクレオチド配列またはＳＮＰに基づいて、そのような患者の対応する処置選択肢を選択するための方法およびキットならびに癌処置方法を提供し、各例において、それらは処置選択を導く手段として、＋２６３位および／または＋３１６位のＯＤＣ１遺伝子型の決定を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌腫の予防的または治療的処置のための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）前記ＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型がＴであることを前記結果が示す場合、
（ｉ）前記患者内でオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤と；
（ｉｉ）前記第一の薬剤と組み合わせた時にポリアミン経路を調整して前記患者内で全ポリアミン量を減少させる第二の薬剤と、
を含む医薬療法の有効量を前記患者に投与すること、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップａ）が、少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型をテストすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二の薬剤がまた、前記患者内でスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結果が、前記遺伝子型を含む報告を受け取ることまたは前記結果を明らかにする患者の履歴を入手することにより得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｔであることを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｇであることを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ることおよびＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型がＧであることを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ることおよび前記患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むことを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ることならびに前記患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在および＋３１６位のＧの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むことを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの変化が、表Ａに同定される変化である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの変化が、表２に同定される変化である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記医薬療法が、前記テストの結果を得る前に、前記患者が前記医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に前記第一または第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記医薬療法が、前記テストの結果を得る前に、前記患者が前記医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に前記第一および第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一の薬剤が、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の薬剤が、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンでる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクまたはセレコキシブである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
患者における大腸腺癌の危険因子の処置のための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）前記ＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型がＴであることを前記結果が示す場合、
（ｉ）前記患者内でオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤と；
（ｉｉ）前記第一の薬剤と組み合わせた時にポリアミン経路を調整して前記患者内で全ポリアミン量を減少させる第二の薬剤と、
を含む医薬療法の有効量を前記患者に投与すること、
を含み、
前記患者における新しい異常腺窩巣、新しい腺腫性ポリープまたは異形成を伴う新しい腺腫の形成を予防する、方法。
【請求項２２】
ステップａ）が、少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型をテストすることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第二の薬剤がまた、前記患者内でスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現を増加させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者において新しい異常腺窩巣の形成を予防する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者において新しい腺腫性ポリープの形成を予防する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者において異形成を伴う新しい腺腫の形成を予防する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記結果が、前記遺伝子型を含む報告を受け取ることまたは前記結果を明らかにする患者の履歴を入手することにより得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｔであることを示す、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｇであることを示す、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ることおよびＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型がＧであることを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記医薬療法が、前記テストの結果を得る前に、前記患者が前記医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に前記第一または第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含む、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記医薬療法が、前記テストの結果を得る前に、前記患者が前記医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に前記第一または第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含む、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第一の薬剤が、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である、請求項２１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第二の薬剤が、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンでる、請求項２１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクまたはセレコキシブである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
癌腫の予防的または治療的処置のために患者の適切性を評価する方法であって、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）前記ＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型がＴであることを前記結果が示す場合、医薬療法による処置に適すると前記患者を同定することであって、前記療法が前記患者内でオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤と、前記第一の薬剤と組み合わせた時にポリアミン経路を調整して前記患者内で全ポリアミン量を減少させる第二の薬剤との組み合わされた有効量を含む、同定すること；
を含む、方法。
【請求項４１】
ステップａ）が、少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型をテストすることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第二の薬剤がまた、前記患者内でスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現を増加させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記結果が、前記遺伝子型を含む報告を受け取ることまたは前記結果を明らかにする患者の履歴を入手することにより得られる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｔであることを示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｇであることを示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ることおよびＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型がＧであることを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記医薬療法が、前記テストの結果を得る前に、前記患者が前記医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に前記第一および第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含む、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記医薬療法が、前記テストの結果を得る前に、前記患者が前記医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に前記第一および第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含む、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記第一の薬剤が、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である、請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第二の薬剤が、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンでる、請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクまたはセレコキシブである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
そのリスクのある患者において癌腫の発生または再発を予防するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）前記ＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型がＴであることを前記結果が示す場合α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）と非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンとの組み合わされた有効量を前記患者に投与すること、
を含む、方法。
【請求項５７】
ステップａ）が、少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型をテストすることを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記結果が、前記遺伝子型を含む報告を受け取ることまたは前記結果を明らかにする患者の履歴を入手することにより得られる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｔであることを示す、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｇであることを示す、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ることおよびＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型がＧであることを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
癌腫の発生または再発のリスクのある患者をα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンで処置する方法であって、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンの有効量を前記患者に投与することを含み、前記患者が少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位にＴを有すると同定されている、方法。
【請求項６５】
前記患者のＯＤＣ１アレルの両方の＋２６３位で同定された遺伝子型が、Ｔ／Ｔである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記患者のＯＤＣ１アレルの両方の＋２６３位で同定された遺伝子型が、Ｔ／Ｇである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
患者において癌腫を処置するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）少なくとも１つのアレルのＯＤＣ１遺伝子の＋２６３位の前記患者の遺伝子型がＴであることを前記結果が示す場合α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）と非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンとの組み合わされた有効量を前記患者に投与すること、
を含む、方法。
【請求項６８】
ステップａ）が、少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型をテストすることを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記結果が、前記遺伝子型を含む報告を受け取ることまたは前記結果を明らかにする患者の履歴を入手することにより得られる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｔであることを示す、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｇであることを示す、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ることおよびＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型がＧであることを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である、請求項１７、３６、５２、および５６〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクまたはセレコキシブである、請求項１７、３６、５２、および５６〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクである、請求項１７、３６、５２、および５６〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
ＤＦＭＯおよびスリンダクが、全身投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ＤＦＭＯおよびスリンダクが、異なる経路で投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＤＦＭＯまたは前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、経口、動脈内または静脈内投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＤＦＭＯが、経口投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ＤＦＭＯの有効量が、５００ｍｇ／日である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＤＦＭＯが、静脈内投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
ＤＦＭＯの有効量が、約０．０５〜約５．０ｇ／ｍ２／日である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＤＦＭＯおよび前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、経口投与用に配合される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＤＦＭＯおよび前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、硬または軟カプセルまたは錠剤として配合される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＤＦＭＯおよび前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、１２時間ごとに投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＤＦＭＯおよび前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、２４時間ごとに投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８９】
スリンダクの有効量が、約１０〜約１５００ｍｇ／日である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
スリンダクの有効量が、約１０〜約４００ｍｇ／日である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
スリンダクの有効量が、約１５０ｍｇ／日である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
ＤＦＭＯが、スリンダクの前に投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項９３】
ＤＦＭＯが、スリンダクの後に投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項９４】
ＤＦＭＯが、スリンダクの前および後に投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項９５】
ＤＦＭＯが、スリンダクと同時に投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項９６】
ＤＦＭＯが、少なくとも２回目に投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項９７】
スリンダクが、少なくとも２回目に投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項９８】
前記患者が、固形腫瘍を有し、かつ前記方法が、前記固形腫瘍の摘出をさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９９】
ＤＦＭＯおよびスリンダクが、前記摘出の前に投与される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
ＤＦＭＯおよびスリンダクが、前記摘出の後に投与される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記癌腫が、大腸癌、神経芽細胞腫、乳癌、膵臓癌、脳癌、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌または食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非黒色腫皮膚癌、またはグリオブラストーマである、請求項１〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記癌腫が、大腸癌である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記大腸癌が、ステージＩである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記大腸癌が、ステージＩＩである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記大腸癌が、ステージＩＩＩである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記大腸癌が、ステージＩＶであある、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
患者内で新しい進行した大腸腫瘍の形成を予防する、請求項１〜３９および５６〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
患者内で聴覚毒性またはそのリスクを予防する、請求項１〜３９および５６〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
新しい進行した右側大腸腫瘍の形成を予防する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
新しい進行した左側大腸腫瘍の形成を予防する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記患者が、結腸、直腸または虫垂において１つまたは複数の腺腫性ポリープを有すると同定されている、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記患者が、１つまたは複数の進行した大腸腫瘍を有すると同定されている、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記患者が、１つまたは複数の進行した左側大腸腫瘍を有すると同定されている、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記患者が、１つまたは複数の進行した右側大腸腫瘍を有すると同定されている、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記患者が、家族性腺腫性ポリープと診断されている、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記患者が、リンチ症候群と診断されている、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記患者が、家族性大腸癌Ｘ型と診断されている、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記患者が、アムステルダム基準またはアムステルダム基準ＩＩを満たす、請求項１〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記患者が、１つまたは複数の大腸腺腫の摘出歴を有する、請求項１〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記患者が、上皮内腫瘍または前癌病変と関連するＯＤＣ活動亢進を有する、請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記患者が、上皮内腫瘍または前癌病変および上昇した細胞内ポリアミンレベルを有する、請求項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記患者が、ヒトである、請求項１〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、グラント番号Ｒ０１  ＣＡ１２３０６５およびＰ５０  ＣＡ０９５０６０の下、米国国立衛生研究所によって授与された政府支援によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は一般に、癌の生物学および医学の分野に関する。より詳細には本発明は、癌腫の診断、予防、および処置の方法、ならびにそれらの危険因子に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の記載
癌化学防護研究を臨床実践に移行させる際の大きな障害は、わずかな薬物有効性および利益を上回る毒性であった（Ｐｓａｔｙ  ａｎｄ  Ｐｏｔｔｅｒ，  ２００６；  Ｌｉｐｐｍａｎ，  ２００６）。例えば、大腸腺腫（ＣＲＡ）患者の間で、長期間連日経口投与されるＤ，Ｌ−α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ、エフロルニチン）とスリンダクとのポリアミン阻害性コンビネーションの顕著な有効性が、近年になり実証されたが（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、処置は、軽度の無症候性聴覚毒性（ＭｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）およびにベースライン心血管リスクの高い患者における多数の心血管イベント（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）と関連した。所与の予防的または治療的処置レジメンに関して患者の適切性を同定する遺伝子特性の同定が、大きな利益になるであろう。
【０００４】
例えば、大腸癌および他の癌腫を処置および予防するための有効で低毒性の方法が、依然として求められている。米国国立癌研究所によれば、米国では２００９年に大腸癌の新規症例が１４７，０００例および大腸癌による死亡が５０，０００例あった。現行の処置プロトコル、特に結腸癌およびポリープ用のものは、腫瘍摘出、化学療法、および放射線療法を含む。ヒトＯＤＣ１遺伝子のイントロン１内の一塩基多型（ＳＮＰ）は、ＯＤＣ１転写に影響を及ぼし（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、大腸腺腫（ＣＲＡ）リスクの遺伝子マーカとして研究されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。報告されるマイナーＡアレルの頻度はおよそ２５％であり、種族／民族間の相違にもかかわらず、ＯＤＣ１遺伝子型分布は、各種族内でハーディー・ワインベルグ平衡である（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＯＤＣ１のマイナーＡアレルのホモ接合性を有する個体は、メジャーＧアレルを有する個体に比較して腺腫再発のリスクが低い（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。さらに、ＯＤＣ１のＡアレル（ＧＧ遺伝子型ではなくＡＡまたはＧＡ遺伝子型）および報告されたアスピリン使用は、結腸ポリープ再発の減少（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、および切除不能な腺腫の統計学的に有意な５０％のリスク低下（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）に関連した。このＳＮＰおよび他のＳＮＰで、ＯＤＣ１遺伝子型が腺腫再発、組織ポリアミン応答、毒性プロファイルに異なる様式で影響を及ぼすかどうか、ならびにどのようにそれを用いて予防的および治療的処置の適切性を決定するかは、大きな利点になるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要
したがって本発明によれば、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの少なくとも＋２６３位の遺伝子型を同定することと関連して処置、予防、および／または診断する方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、患者の癌腫の予防的または治療的処置の方法であって、
ａ）患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）患者のＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の遺伝子型がＴであると結果が示す場合、
（ｉ）患者の体内のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤と；
（ｉｉ）第一の薬剤と組み合わせた時に患者の体内のポリアミン経路を調整して全ポリアミン量を減少させる第二の薬剤と、
を含む医薬療法の有効量を患者に投与すること、
を含む、方法が提供される。
【０００７】
幾つかの実施形態において、第二の薬剤は、患者の体内のスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現も増加させ得る。幾つかの実施形態において、結果は、この遺伝子型を含む報告を受け取ること、または結果を明らかにする患者の履歴を入手すること、により得ることができる。幾つかの実施形態において、ステップａ）は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型をテストすることを含み得る。
【０００８】
幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者中のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＴであることを示し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＧであることを示し得る。
【０００９】
幾つかの実施形態において、方法は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の遺伝子型がＧであると結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。
【００１０】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００１１】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、ならびに患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在および＋３１６位のＧの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００１２】
幾つかの実施形態において、医薬療法は、テストの結果を得る前に、患者が医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に、第一または第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、医薬療法は、テストの結果を得る前に、患者が医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に、第一および第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、第一の薬剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）であり得る。幾つかの実施形態において、第二の薬剤は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンであり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、選択的なＣＯＸ−２阻害剤であり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクまたはセレコキシブであり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクであり得る。
【００１３】
別の態様において、患者における大腸腺癌の危険因子の処置の方法であって、
ａ）患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）患者のＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の遺伝子型がＴであると結果が示す場合、
（ｉ）患者の体内のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤と；
（ｉｉ）第一の薬剤と組み合わせた時に患者の体内のポリアミン経路を調整して全ポリアミン量を減少させる第二の薬剤と、
を含む医薬療法の有効量を患者に投与すること、
を含み、
患者の体内での新しい異常腺窩巣、新しい腺腫性ポリープまたは異形成を伴う新しい腺腫の形成を予防する、方法が提供される。
【００１４】
幾つかの実施形態において、第二の薬剤は、患者の体内のスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現も増加させ得る。幾つかの実施形態において、方法は、患者の体内での新しい異常腺窩巣の形成を予防し得る。幾つかの実施形態において、方法は、患者の体内での新しい腺腫性ポリープの形成を予防し得る。幾つかの実施形態において、方法は、患者の体内での異形成を伴う新しい腺腫の形成を予防し得る。幾つかの実施形態において、結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること、または結果を明らかにする患者の履歴を入手すること、により得ることができる。幾つかの実施形態において、ステップａ）は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型をテストすることを含み得る。
【００１５】
幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＴであることを示し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＧであることを示し得る。
【００１６】
幾つかの実施形態において、方法は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の遺伝子型がＧであると結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。
【００１７】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００１８】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、ならびに患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在および＋３１６位のＧの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００１９】
幾つかの実施形態において、医薬療法は、テストの結果を得る前に、患者が医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に、第一または第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、医薬療法は、テストの結果を得る前に、患者が医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に、第一および第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、第一の薬剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）であり得る。幾つかの実施形態において、第二の薬剤は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンであり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、選択的なＣＯＸ−２阻害剤であり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクまたはセレコキシブであり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクであり得る。
【００２０】
別の態様において、癌腫の予防的または治療的処置のために患者の適切性を評価する方法であって、
ａ）患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）患者のＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の遺伝子型がＴであると結果が示す場合、医薬療法による処置に適すると患者を同定することであって、この医薬療法が患者の体内のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤と、第一の薬剤と組み合わせた時に患者の体内のポリアミン経路を調整して全ポリアミン量を減少させる第二の薬剤と、の組み合わされた有効量を含む、患者を同定すること；
を含む、方法が提供される。
【００２１】
幾つかの実施形態において、第二の薬剤は、患者の体内のスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現も増加させ得る。幾つかの実施形態において、結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること、または結果を明らかにする患者の履歴を入手すること、により得ることができる。幾つかの実施形態において、ステップａ）は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型をテストすることを含み得る。
【００２２】
幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＴであることを示し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＧであることを示し得る。
【００２３】
幾つかの実施形態において、方法は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の遺伝子型がＧであると結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。
【００２４】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００２５】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、ならびに患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在および＋３１６位のＧの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００２６】
幾つかの実施形態において、医薬療法は、テストの結果を得る前に、患者が医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に、第一または第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、医薬療法は、テストの結果を得る前に、患者が医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に、第一および第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、第一の薬剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）であり得る。幾つかの実施形態において、第二の薬剤は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンであり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、選択的なＣＯＸ−２阻害剤であり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクまたはセレコキシブであり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクであり得る。
【００２７】
別の態様において、癌腫の発生または再発を、そのリスクのある患者において予防する方法であって、
ａ）患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）患者のＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の遺伝子型がＴであると結果が示す場合α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）と非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンとの組み合わされた有効量を患者に投与すること、
を含む、方法が提供される。
【００２８】
幾つかの実施形態において、第二の薬剤は、患者の体内のスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現も増加させ得る。幾つかの実施形態において、結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること、または結果を明らかにする患者の履歴を入手すること、により得ることができる。幾つかの実施形態において、ステップａ）は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型をテストすることを含み得る。
【００２９】
幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＴであることを示し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＧであることを示し得る。
【００３０】
幾つかの実施形態において、方法は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の遺伝子型がＧであると結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。
【００３１】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むこと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００３２】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、ならびに患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在および＋３１６位のＧの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００３３】
別の態様において、癌腫の発生または再発のリスクのある患者をα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンで処置する方法であって、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンの有効量を患者に投与することを含み、患者が少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位にＴを有すると同定されている、方法が提供される。
【００３４】
幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＴであることを示し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＧであることを示し得る。
【００３５】
別の態様において、患者中の癌腫を処置する方法であって、
ａ）患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）患者の少なくとも１つのアレルのＯＤＣ１遺伝子の＋２６３位の遺伝子型がＴであると結果が示す場合α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）と非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンとの組み合わされた有効量を患者に投与すること、
を含む、方法が提供される。
【００３６】
幾つかの実施形態において、第二の薬剤は、患者の体内のスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現も増加させ得る。幾つかの実施形態において、結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること、または結果を明らかにする患者の履歴を入手すること、により得ることができる。幾つかの実施形態において、ステップａ）は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の遺伝子型をテストすることを含み得る。
【００３７】
幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、テストは、患者中のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＴであることを示し得る。幾つかの実施形態において、結果は、患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある遺伝子型がＴＧであることを示し得る。
【００３８】
幾つかの実施形態において、方法は、患者の少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の遺伝子型がＧであると結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。
【００３９】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、および患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００４０】
幾つかの実施形態において、方法は、患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ること、ならびに患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在および＋３１６位のＧの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むと結果が示す場合に、治療薬の有効量を患者に投与すること、をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表Ａに同定される変化であり得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの変化は、表２に同定される変化であり得る。
【００４１】
幾つかの実施形態において、医薬療法は、テストの結果を得る前に、患者が医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に、第一または第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、医薬療法は、テストの結果を得る前に、患者が医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に、第一および第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、第一の薬剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）であり得る。幾つかの実施形態において、第二の薬剤は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンであり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、選択的なＣＯＸ−２阻害剤であり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクまたはセレコキシブであり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクであり得る。
【００４２】
先の実施形態のいずれかにおける変形例において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、選択的ＣＯＸ−２阻害剤であり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクまたはセレコキシブであり得る。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、スリンダクであり得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯおよびスリンダクは、全身投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯおよびスリンダクは、異なる経路で投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯまたはＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、経口、動脈内または静脈内投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯは、経口投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯの有効量は、５００ｍｇ／日であり得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯは、静脈内投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯの有効量は、約０．０５〜約５．０ｇ／ｍ２／日であり得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯおよびＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、経口投与用に配合され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯおよびＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、硬または軟カプセルまたは錠剤として配合され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯおよびＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、１２時間ごとに投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯおよびＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンは、２４時間ごとに投与され得る。幾つかの実施形態において、スリンダクの有効量は、約１０〜約１５００ｍｇ／日であり得る。幾つかの実施形態において、スリンダクの有効量は、約１０〜約４００ｍｇ／日であり得る。幾つかの実施形態において、スリンダクの有効量は、約１５０ｍｇ／日であり得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯは、スリンダクの前に投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯは、スリンダクの後に投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯは、スリンダクの前および後に投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯは、スリンダクと同時に投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯは、少なくとも２回目に投与され得る。幾つかの実施形態において、スリンダクは、少なくとも２回目に投与され得る。
【００４３】
先の実施形態のいずれかにおける変形例において、患者は、固形腫瘍を有し得、方法は、この固形腫瘍の摘出をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯおよびスリンダクは、摘出の前に投与され得る。幾つかの実施形態において、ＤＦＭＯおよびスリンダクは、摘出の後に投与され得る。
【００４４】
先の実施形態のいずれかにおける変形例において、癌腫は、大腸癌、神経芽細胞腫、乳癌、膵臓癌、脳癌、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌または食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非黒色腫皮膚癌、またはグリオブラストーマであり得る。幾つかの実施形態において、癌腫は、大腸癌であり得る。幾つかの実施形態において、大腸癌は、ステージＩであり得る。幾つかの実施形態において、大腸癌は、ステージＩＩであり得る。幾つかの実施形態において、大腸癌は、ステージＩＩＩであり得る。幾つかの実施形態において、大腸癌は、ステージＩＶであり得る。
【００４５】
先の実施形態のいずれかにおける変形例において、方法は、患者の体内の新しい切除不能な大腸腫瘍の形成を予防し得る。幾つかの実施形態において、方法は、患者の体内の聴覚毒性またはそのリスクを予防し得る。幾つかの実施形態において、方法は、新しい切除不能な右側大腸腫瘍の形成を予防し得る。幾つかの実施形態において、方法は、新しい切除不能な左側大腸腫瘍の形成を予防し得る。
【００４６】
先の実施形態のいずれかにおける変形例において、患者は、結腸、直腸または虫垂において１つまたは複数の腺腫性ポリープを有すると同定されている。幾つかの実施形態において、患者は、１つまたは複数の切除不能な大腸腫瘍を有すると同定されている。幾つかの実施形態において、患者は、１つまたは複数の切除不能な左側大腸腫瘍を有すると同定されている。幾つかの実施形態において、患者は、１つまたは複数の切除不能な右側大腸腫瘍を有すると同定されている。幾つかの実施形態において、患者は、家族性腺腫性ポリープと診断されている。幾つかの実施形態において、患者は、リンチ症候群と診断されている。幾つかの実施形態において、患者は、家族性大腸癌Ｘ型と診断されている。幾つかの実施形態において、患者は、アムステルダム基準またはアムステルダム基準ＩＩに適合し得る。幾つかの実施形態において、患者は、１つまたは複数の大腸腺腫の摘出歴を有し得る。幾つかの実施形態において、患者は、上皮内腫瘍または前癌病変と関連するＯＤＣ活動亢進を有し得る。幾つかの実施形態において、患者は、上皮内腫瘍または前癌病変、および細胞内ポリアミンレベルの上昇を有し得る。
【００４７】
先の実施形態のいずれかにおける変形例において、患者は、ヒトであり得る。
【００４８】
本明細書で用いられる「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味し得る。請求項（複数可）で用いられる「ａ」または「ａｎ」は、言語「含む」と共に用いられる場合には、１つ、または１つを超えることを意味し得る。
【００４９】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物を指すこと、または代替物が互いに排他的であることを明白に示す場合を除き、「および／または」を意味するために用いられるが、本開示は、代替物のみ、および「および／または」を指すという定義を支持する。本明細書で用いられる「別の」は、少なくとも二番目以上を意味し得る。
【００５０】
本出願全体を通して、用語「約」は、ある値が、その値または研究対象の間に存在する変動を測定するために用いられる装置、方法に本質的に備わる誤差変動を含むことを示すために用いられる。
【００５１】
用語「含む」、「有する」および「包含する」は、制限のない連結動詞である。「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、「包含する」および「包含している」などのこれらの動詞の１つまたは複数のうちのいずれかの形態または時制もまた、制限がない。例えば、１つまたは複数のステップを「含む」、「有する」または「包含する」任意の方法は、それらの１つまたは複数のステップのみを有することに限定されず、他の列挙されていないステップにも及ぶ。
【００５２】
本明細書および／または特許請求の範囲で用いられる用語「効果的な」は、所望の、予測された、または意図された結果を完遂するのに十分であることを意味する。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「ＩＣ５０」は、得られる最大応答の５０％である阻害用量を指す。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「患者」または「対象」は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、またはこれらのトランスジェニック種などの生存する哺乳動物の生物体を指す。特定の実施形態において、患者または対象は、霊長類である。ヒト対象の非限定的例は、成人、青少年、幼児および胎児である。
【００５５】
「医薬的に許容される」は、一般に安全で非毒性であり、生物学的にも他の点でも不適切でない医薬組成物を調製するのに有用であることを意味し、ならびに獣医学的使用およびヒトの医薬的使用に許容し得ることを包含する。
【００５６】
「予防」または「予防すること」は、（１）疾患のリスクおよび／もしくは素因を有し得るが疾患のあらゆる病態もしくは症状を経験もしくは提示していない対象もしくは患者中の疾患の開始を阻害すること、ならびに／または（２）疾患のリスクおよび／もしくは素因を有し得るが疾患のあらゆる病態もしくは症状を経験もしくは提示していない対象もしくは患者中の疾患病態もしくは症状の開始を遅延させること、を包含する。
【００５７】
「有効量」、「治療有効量」または「医薬的有効量」は、疾患を処置するために対象または患者に投与された場合に、疾患のためのそのような処置を実行するのに十分である量を意味する。
【００５８】
「処置」または「処置すること」は、（１）疾患の病態もしくは症状を経験もしくは提示している対象もしくは患者において疾患を阻害すること（例えば、病態および／または症状のさらなる発生を停止させること）、（２）疾患の病態もしくは症状を経験もしくは提示している対象もしくは患者において疾患を改善すること（例えば、病態および／または症状を回復させること）、および／または（３）疾患の病態もしくは症状を経験もしくは提示している対象もしくは患者において疾患の任意の測定可能な低減を実行すること、を包含する。
【００５９】
上記定義は、参照により本明細書に組み込まれる参考資料のいずれかにおける任意の矛盾した定義に取って代わる。特定の用語が定義されているという事実は、定義されていない任意の用語が不確定であることを示すと見なされてはならない。むしろ、当業者が本発明の範囲および実務を認識し得るように、用いられる全ての用語が、本発明を明確に説明していると考えられる。
【００６０】
本発明の他の目的、特色および利点は、以下の詳細な説明から明白となろう。しかし、この詳細な説明から、本発明の主旨および範囲内で様々な変更および修正が当業者に明白となると思われるため、その詳細な説明および具体的な実施例が好ましい本発明の実施形態を示していて例示に過ぎないことが、理解されなければならない。
【００６１】
以下の図面は、本発明の一部を形成しており、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に示された具体的実施形態の詳細な説明と共にこれらの図面の１つまたは複数を参照することによってよりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】哺乳動物体内のポリアミン代謝の略図。尿サイクル（四角形）におけるアルギニンの代謝により、オルニチンが産生される。ポリアミン（楕円形）経路の最初の酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ１）は、オルニチンをプトレッシン（ｐｕｔｒｅｓｉｎｅ）に変換する。Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＡＭＤ）によるＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の脱カルボキシル化は、脱カルボキシル化されたＳＡＭ（ｄｃＳＡＭ）を生成し、それが、スペルミジンシンターゼ（ＳＲＭ）およびスペルミンシンターゼ（ＳＭＳ）によって、それぞれスペルミジン次いでスペルミンを形成するためにプロピルアミン部分（図示しない）を供与する。スペルミンからスペルミジンへの逆反応は、スペルミジンオキシダーゼ（ＳＭＯ）によって触媒される。スペルミジンおよびスペルミンは、スペルミジン／スペルミンアセチルアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ１）によってモノアセチル化され、そしてモノまたはジ−アセチル化され、ＳＬＣ３Ａ２トランスポータによって排出され得る。両方のアセチル化ポリアミンは、ポリアミンオキシダーゼ（ＰＡＯ）によってプトレッシンに戻され得る。管腔の細菌からのポリアミンのカベオラエンドサイトーシスおよびＳＬＣ３Ａ２依存性プトレッシンインポータもまた、示されている。薬物ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）は、ＯＤＣ酵素の活性を遮断して、ポリアミンレベルを低下させる。非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）およびアスピリンは、ＳＡＴ１酵素の活性を誘導して、細胞からのアセチル化ポリアミンの排出をさらに増加させる。
【図２Ａ】ＯＤＣ１オリゴヌクレオチドによるＧ四重鎖の形成を実証するＣＤスペクトル。ＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３  Ｔ（Ａ）およびＧ（Ｂ）オリゴヌクレオチド（５μＭ；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１）を、１００ｍＭ  ＫＣｌ（短い破線）またはＮａＣｌ（長い破線）の非存在下（実線）または存在下で、９５℃に加熱して室温まで緩やかに冷却した。スペクトルは全て、２５℃で２００〜３５０ｎｍから読み取った。２６０〜２６５ｎｍでの正のＣＤのピークは、平行型Ｇ四重鎖の存在を示している。
【図２Ｂ】ＯＤＣ１オリゴヌクレオチドによるＧ四重鎖の形成を実証するＣＤスペクトル。ＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３  Ｔ（Ａ）およびＧ（Ｂ）オリゴヌクレオチド（５μＭ；それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１）を、１００ｍＭ  ＫＣｌ（短い破線）またはＮａＣｌ（長い破線）の非存在下（実線）または存在下で、９５℃に加熱して室温まで緩やかに冷却した。スペクトルは全て、２５℃で２００〜３５０ｎｍから読み取った。２６０〜２６５ｎｍでの正のＣＤのピークは、平行型Ｇ四重鎖の存在を示している。
【図３】アイソジェニックなＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３プラスミドおよびＳｐ１転写因子の遺伝子操作を含むトランスフェクション実験。ＨＣＴ１１６細胞を、遺伝的にＳｐ１タンパク質のレベルが改変されたｐＧＬ３−ベーシックプラスミド中の１．６ｋｂプロモータ／イントロン１  ＯＤＣ１遺伝子でトランスフェクトした。テスト条件の全てにおいて、ＯＤＣ１＋２６３  Ｔアレルは、ＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３  Ｇアレルと比較して、より高度のルシフェラーゼ発現と関連した。ルシフェラーゼのわずかな減少が、エンプティーベクター（ｐＮ３エンプティー）に比較して、Ｓｐ１（ｐＮ３−Ｓｐ１）の過剰発現と共に観察された。これに反して、Ｓｐ１  ｓｉＲＮＡを用いるＳｐ１タンパク質発現のノックダウンは、対照スクランブルｓｉＲＮＡに比較して、ＧおよびＴの両方のＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３アレルでのルシフェラーゼ発現を統計学的に有意に増加させた。レニラ・ルシフェラーゼを用いて、トランスフェクション効率の差を標準化した。
【図４】ＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３ＧおよびＴオリゴヌクレオチドにおける分子間および分子内Ｇ四重鎖形態の差示的安定化および転位パターン（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）。ＥＭＳＡ実験を、１００ｍＭ  ＫＣｌまたはＮａＣｌの非存在下（−）または存在下（＋）で、ＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３ＧおよびＴオリゴヌクレオチドを用いて実施した。Ｇオリゴヌクレオチドは、Ｔオリゴヌクレオチドよりも多くの単分子内Ｇ四重鎖を生成した。ＫＣｌおよびＮａＣｌ処置は、Ｇオリゴヌクレオチドでは分子内および分子間Ｇ四重鎖をそれぞれ安定化したが、Ｔオリゴヌクレオチドでは明白な効果が示されなかった。
【図５】１０ｍＭ  ＫＣｌ中でのＮＳＣ１７６３２７の存在下および非存在下での＋２６３  ＴおよびＧアレルを含むＧ四重鎖形成を実証するＣＤスペクトル。ＯＤＣ１＋２６３  ＴおよびＧオリゴヌクレオチド（５μＭ）を、１０ｍＭ  ＫＣｌの非存在下（黒色線）または存在下ならびにＮＳＣ１７６３２７の存在下または非存在下で、９５℃に加熱して室温まで緩やかに冷却した。スペクトルは全て、２５℃で２００〜３５０ｎｍを読み取った。２６０〜２６５ｎｍでの正のＣＤのピークは、平行型Ｇ四重鎖の存在を示し、２９０ｎｍでのピークは、鎖の５’−３’の方向性が異なる反平行型Ｇ四重鎖を示している。
【図６Ａ】ＯＤＣ１配列における分子間および分子内Ｇ四重鎖の差示的安定化。Ｇオリゴヌクレオチド（Ａ）およびＴオリゴヌクレオチド（Ｂ）配列において分子間および分子内Ｇ四重鎖が生じた。オリゴヌクレオチドを増加濃度のＫＣｌまたはＮａＣｌ（２５、５０、７５、１００ｍＭ）の非存在下（０）または存在下でインキュベートした。両方の配列でＮａＣｌは、分子間構造の安定化を増進させたが、ＫＣｌは、それらの形成を減少させた。
【図６Ｂ】ＯＤＣ１配列における分子間および分子内Ｇ四重鎖の差示的安定化。Ｇオリゴヌクレオチド（Ａ）およびＴオリゴヌクレオチド（Ｂ）配列において分子間および分子内Ｇ四重鎖が生じた。オリゴヌクレオチドを増加濃度のＫＣｌまたはＮａＣｌ（２５、５０、７５、１００ｍＭ）の非存在下（０）または存在下でインキュベートした。両方の配列でＮａＣｌは、分子間構造の安定化を増進させたが、ＫＣｌは、それらの形成を減少させた。
【図７Ａ】１００ｍＭ  ＫＣｌを含むＴｒｉｓ酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で異なる二本鎖ＤＮＡ配列のＣＤスペクトルが、２００〜３５０ｎｍで得られた。２６０〜２６５ｎｍの正のＣＤのピークは、Ｇ四重鎖の存在を示し、古典的ＤＮＡ  Ｂ形態が、２８０〜２８５ｎｍのピークによって表されている。二本鎖Ｔ（Ａ）およびＧ（Ｂ）は、古典的ＤＮＡ  Ｂ形態を形成でき、Ｓｐ１タンパク質を伴う、または伴わないＫＣｌの存在下でＧ四重鎖コンフォメーションに切り替わることができる。各スペクトルは、２５℃で得られた３つの平均化されたスキャンに対応し、緩衝液および塩によるシグナルへの寄与が修正されたベースラインである。
【図７Ｂ】１００ｍＭ  ＫＣｌを含むＴｒｉｓ酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で異なる二本鎖ＤＮＡ配列のＣＤスペクトルが、２００〜３５０ｎｍで得られた。２６０〜２６５ｎｍの正のＣＤのピークは、Ｇ四重鎖の存在を示し、古典的ＤＮＡ  Ｂ形態が、２８０〜２８５ｎｍのピークによって表されている。二本鎖Ｔ（Ａ）およびＧ（Ｂ）は、古典的ＤＮＡ  Ｂ形態を形成でき、Ｓｐ１タンパク質を伴う、または伴わないＫＣｌの存在下でＧ四重鎖コンフォメーションに切り替わることができる。各スペクトルは、２５℃で得られた３つの平均化されたスキャンに対応し、緩衝液および塩によるシグナルへの寄与が修正されたベースラインである。
【図８Ａ】１００ｍＭ  ＫＣｌを含むＴｒｉｓ酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で異なる二本鎖ＤＮＡ配列のＣＤスペクトルが、２００〜３５０ｎｍで得られた。２６０〜２６５ｎｍの正のＣＤのピークは、Ｇ四重鎖の存在を示し、古典的ＤＮＡ  Ｂ形態が、２８０〜２８５ｎｍのピークによって表されている。二本鎖Ｔ（Ａ）およびＧ（Ｂ）は、古典的ＤＮＡ  Ｂ形態を形成でき、Ｓｐ１タンパク質を伴う、または伴わないＫＣｌの存在下でＧ四重鎖のコンフォメーションに切り替わることができる。各スペクトルは、２５℃で得られた３つの平均化されたスキャンに対応し、緩衝液および塩によるシグナルのへ寄与が修正されたベースラインである。
【図８Ｂ】１００ｍＭ  ＫＣｌを含むＴｒｉｓ酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で異なる二本鎖ＤＮＡ配列のＣＤスペクトルが、２００〜３５０ｎｍで得られた。２６０〜２６５ｎｍの正のＣＤのピークは、Ｇ四重鎖の存在を示し、古典的ＤＮＡ  Ｂ形態が、２８０〜２８５ｎｍのピークによって表されている。二本鎖Ｔ（Ａ）およびＧ（Ｂ）は、古典的ＤＮＡ  Ｂ形態を形成でき、Ｓｐ１タンパク質を伴う、または伴わないＫＣｌの存在下でＧ四重鎖のコンフォメーションに切り替わることができる。各スペクトルは、２５℃で得られた３つの平均化されたスキャンに対応し、緩衝液および塩によるシグナルのへ寄与が修正されたベースラインである。
【図９】アイソジェニックなＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３プラスミドを用いたトランスフェクション実験。ＨＣＴ１１６細胞を、ｐＧＬ３−ベーシックプラスミド中の１．６ｋｂＯＤＣ１プロモータ／イントロン１構築物でトランスフェクトした。ルシフェラーゼプロモータ活性を、６、１２、および２４時間目に測定した。より高いルシフェラーゼプロモータ活性が、ＯＤＣ１  ＋２６３Ｇアレルと比較して、全ての時点でのＯＤＣ１  ＋２６３  Ｔアレルと関連した。レニラ・ルシフェラーゼを用いて、トランスフェクション効率の差を標準化した。＊Ｐ＜０．０１。
【図１０】ＮＳＣ１７６３２７の存在下でのアイソジェニックなＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰプラスミドを用いたトランスフェクション実験。ＨＣＴ１１６細胞を、ｐＧＬ３−ベーシックプラスミド中の１．６ｋｂＯＤＣ１プロモータ／イントロン１構築物でトランスフェクトした。ルシフェラーゼプロモータ活性を、時間を一致させた各ＤＭＳＯ対照と共に２４時間目に測定した。統計学的に有意なルシフェラーゼ活性低下が、ＯＤＣ１＋２６３でＧまたはＴのいずれかを有するＮＳＣ１７６３２７  Ｇ四重鎖安定化剤で観察された。レニラ・ルシフェラーゼを用いて、トランスフェクション効率の差を標準化した。
【図１１】アイソジェニックなＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰプラスミドおよびＳｐ１転写因子の遺伝子操作を用いたトランスフェクション実験。ＨＣＴ１１６細胞を、遺伝的にＳｐ１タンパク質のレベルが改変されたｐＧＬ３−ベーシックプラスミド中の１．６ｋｂＯＤＣ１プロモータ／イントロン１構築物でトランスフェクトした。テストした条件の全てにおいて、ＯＤＣ１  ＋２６３  Ｔアレルは、ＯＤＣ１  ＋２６３  Ｇアレルに比較して、より大きなルシフェラーゼ活性と関連した。ルシフェラーゼのわずかな減少が、エンプティーベクター（ｐＮ３エンプティー）に比較して、Ｓｐ１（ｐＮ３−Ｓｐ１）の過剰発現と共に観察された。これに反して、Ｓｐ１  ｓｉＲＮＡを用いるＳｐ１タンパク質発現のノックダウンは、対照スクランブルｓｉＲＮＡに比較して、ＧおよびＴの両方のＯＤＣ１  ＋２６３アレルでのルシフェラーゼ発現を統計学的に有意に増加させた。レニラ・ルシフェラーゼを用いて、トランスフェクション効率の差を標準化した。
【図１２】ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰハプロタイプ別の異時性腺腫の有病率。プラセボおよび処置群を示す。
【図１３Ａ】ＯＤＣ１  ＋２６３（Ａ）および＋３１６（Ｂ）ＳＮＰ別の異時性腺腫の割合％、処置応答、およびポリアミンレベル。黒色の棒はプラセボ群を示し、白色の棒はＤＦＭＯ／スリンダク処置群を示す。総ポリアミン（黒色の線）およびプトレッシンプール（灰色の線）もまた、遺伝子型別に示されている。Ｎ＝３０７。
【図１３Ｂ】ＯＤＣ１  ＋２６３（Ａ）および＋３１６（Ｂ）ＳＮＰ別の異時性腺腫の割合％、処置応答、およびポリアミンレベル。黒色の棒はプラセボ群を示し、白色の棒はＤＦＭＯ／スリンダク処置群を示す。総ポリアミン（黒色の線）およびプトレッシンプール（灰色の線）もまた、遺伝子型別に示されている。Ｎ＝３０７。
【図１４】ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６ＳＮＰジプロタイプ別の異時性腺腫の割合％、処置応答、およびポリアミンレベル。黒色の棒はプラセボ群を示し、白色の棒はＤＦＭＯ／スリンダク処置群を示す。総ポリアミン（黒色の線）およびプトレッシンプール（灰色の線）もまた、遺伝子型別に示されている。Ｎ＝２１７。
【図１５Ａ】箱ひげ図によって示される遺伝子型ごとのＯＤＣ１  ＋２６３（Ｂ）および＋３１６（Ａ）ＳＮＰ別のポリアミン測定。逆鎖の配列が報告されていることに注意。
【図１５Ｂ】箱ひげ図によって示される遺伝子型ごとのＯＤＣ１  ＋２６３（Ｂ）および＋３１６（Ａ）ＳＮＰ別のポリアミン測定。逆鎖の配列が報告されていることに注意。
【図１６】箱ひげ図によって示されるジプロタイプ３１６／３１６−２６３／２６３別のポリアミン測定。逆鎖の配列が報告されていることに注意。
【図１７】アイソジェニックなＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰを用いたトランスフェクション。ＨＣＴ１１６細胞を、ｐＧＬ３−ベーシックプラスミド中の１．６ｋｂ  ＯＤＣ１プロモータ／イントロン１構築物でトランスフェクトした。ｃ−ＭＹＣコトランスフェクション（ｐｃＤＮＡ３−ｃ−ＭＹＣ）は、エンプティーベクター（ｐｃＤＮＡ３エンプティー）に比較して、ルシフェラーゼ活性の上昇を示した。レニラ・ルシフェラーゼを用いて、トランスフェクション効率の差を標準化した。
【図１８】ｃＭＹＣ（ｐｃＤＮＡ３−ｃ−ＭＹＣ）、Ｓｐ１全長タンパク質（ｐＮ３−Ｓｐ１）、およびＳｐ１  Ｎ末端変異体（ｐＰａｃ−Ｓｐｌｍｕｔ）の過剰発現を有するｐＧＬ３−ベーシックプラスミド中のアイソジェニックなＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰを用いたトランスフェクション実験。対応するエンプティーベクターでの対照実験を示す。レニラ・ルシフェラーゼを用いて、トランスフェクション効率の差を標準化した。
【図１９Ａ】結腸由来細胞株におけるタンパク質発現、細胞株の遺伝子型、ＣｈＩＰおよびｃｏ−ＩＰ。（Ａ）ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞株遺伝子型判定。ＤＮＡを両方の細胞株から得て、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰの周辺の領域を、ダイレクトＤＮＡシーケンシングにより配列決定した。ＯＤＣ１  ＋３１６Ａアレルにより作製されたＰｓｔＩ制限酵素部位も用いた。（Ｂ）ウェスタンブロット分析によるＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞株におけるタンパク質発現。両方の細胞株の総抽出物を、Ｓｐ１およびｃＭＹＣ転写因子の発現について評価した。アクチンを、ローディング対照として用いた。（Ｃ）クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析によるアレル特異性転写因子結合の証拠資料。ＣｈＩＰアッセイを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キットを用いて、製造業者により推奨された通り実施した。ＰＣＲに用いられたＯＤＣ１プライマーの配列は、５’−ＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴ−３’（１７量体；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および５’−ＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡ−３’（１７量体；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であった。Ｓｐ１およびｃＭＴＣ転写因子タンパク質に対する抗体を用いるクロマチンの免疫沈降の後、可視ＯＤＣ１プロモータ特異性ＰＣＲ産物をＨＴ２９  ＤＮＡから得たが、ＨＣＴ１１６  ＤＮＡからは得られなかった。インプットを陽性対照として用い、正常なＩｇＧを陰性対照として用いた。（Ｄ）共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）分析によるアレル転写因子相互作用の証拠資料。Ｃｏ−ＩＰアッセイを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キットを用いて、製造業者により推奨された通り実施した。ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６核抽出物を、Ｓｐ１およびｃＭＹＣに対する抗体で免疫沈降させた。膜をｃＭＹＣタンパク質についてブロットした。正常なＩｇＧを、免疫沈降アッセイにおいて陰性対照として用いた。
【図１９Ｂ】結腸由来細胞株におけるタンパク質発現、細胞株の遺伝子型、ＣｈＩＰおよびｃｏ−ＩＰ。（Ａ）ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞株遺伝子型判定。ＤＮＡを両方の細胞株から得て、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰの周辺の領域を、ダイレクトＤＮＡシーケンシングにより配列決定した。ＯＤＣ１  ＋３１６Ａアレルにより作製されたＰｓｔＩ制限酵素部位も用いた。（Ｂ）ウェスタンブロット分析によるＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞株におけるタンパク質発現。両方の細胞株の総抽出物を、Ｓｐ１およびｃＭＹＣ転写因子の発現について評価した。アクチンを、ローディング対照として用いた。（Ｃ）クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析によるアレル特異性転写因子結合の証拠資料。ＣｈＩＰアッセイを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キットを用いて、製造業者により推奨された通り実施した。ＰＣＲに用いられたＯＤＣ１プライマーの配列は、５’−ＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴ−３’（１７量体；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および５’−ＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡ−３’（１７量体；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であった。Ｓｐ１およびｃＭＴＣ転写因子タンパク質に対する抗体を用いるクロマチンの免疫沈降の後、可視ＯＤＣ１プロモータ特異性ＰＣＲ産物をＨＴ２９  ＤＮＡから得たが、ＨＣＴ１１６  ＤＮＡからは得られなかった。インプットを陽性対照として用い、正常なＩｇＧを陰性対照として用いた。（Ｄ）共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）分析によるアレル転写因子相互作用の証拠資料。Ｃｏ−ＩＰアッセイを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キットを用いて、製造業者により推奨された通り実施した。ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６核抽出物を、Ｓｐ１およびｃＭＹＣに対する抗体で免疫沈降させた。膜をｃＭＹＣタンパク質についてブロットした。正常なＩｇＧを、免疫沈降アッセイにおいて陰性対照として用いた。
【図１９Ｃ】結腸由来細胞株におけるタンパク質発現、細胞株の遺伝子型、ＣｈＩＰおよびｃｏ−ＩＰ。（Ａ）ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞株遺伝子型判定。ＤＮＡを両方の細胞株から得て、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰの周辺の領域を、ダイレクトＤＮＡシーケンシングにより配列決定した。ＯＤＣ１  ＋３１６Ａアレルにより作製されたＰｓｔＩ制限酵素部位も用いた。（Ｂ）ウェスタンブロット分析によるＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞株におけるタンパク質発現。両方の細胞株の総抽出物を、Ｓｐ１およびｃＭＹＣ転写因子の発現について評価した。アクチンを、ローディング対照として用いた。（Ｃ）クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析によるアレル特異性転写因子結合の証拠資料。ＣｈＩＰアッセイを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キットを用いて、製造業者により推奨された通り実施した。ＰＣＲに用いられたＯＤＣ１プライマーの配列は、５’−ＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴ−３’（１７量体；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および５’−ＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡ−３’（１７量体；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であった。Ｓｐ１およびｃＭＴＣ転写因子タンパク質に対する抗体を用いるクロマチンの免疫沈降の後、可視ＯＤＣ１プロモータ特異性ＰＣＲ産物をＨＴ２９  ＤＮＡから得たが、ＨＣＴ１１６  ＤＮＡからは得られなかった。インプットを陽性対照として用い、正常なＩｇＧを陰性対照として用いた。（Ｄ）共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）分析によるアレル転写因子相互作用の証拠資料。Ｃｏ−ＩＰアッセイを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キットを用いて、製造業者により推奨された通り実施した。ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６核抽出物を、Ｓｐ１およびｃＭＹＣに対する抗体で免疫沈降させた。膜をｃＭＹＣタンパク質についてブロットした。正常なＩｇＧを、免疫沈降アッセイにおいて陰性対照として用いた。
【図１９Ｄ】結腸由来細胞株におけるタンパク質発現、細胞株の遺伝子型、ＣｈＩＰおよびｃｏ−ＩＰ。（Ａ）ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞株遺伝子型判定。ＤＮＡを両方の細胞株から得て、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰの周辺の領域を、ダイレクトＤＮＡシーケンシングにより配列決定した。ＯＤＣ１  ＋３１６Ａアレルにより作製されたＰｓｔＩ制限酵素部位も用いた。（Ｂ）ウェスタンブロット分析によるＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞株におけるタンパク質発現。両方の細胞株の総抽出物を、Ｓｐ１およびｃＭＹＣ転写因子の発現について評価した。アクチンを、ローディング対照として用いた。（Ｃ）クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）分析によるアレル特異性転写因子結合の証拠資料。ＣｈＩＰアッセイを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キットを用いて、製造業者により推奨された通り実施した。ＰＣＲに用いられたＯＤＣ１プライマーの配列は、５’−ＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴ−３’（１７量体；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および５’−ＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡ−３’（１７量体；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であった。Ｓｐ１およびｃＭＴＣ転写因子タンパク質に対する抗体を用いるクロマチンの免疫沈降の後、可視ＯＤＣ１プロモータ特異性ＰＣＲ産物をＨＴ２９  ＤＮＡから得たが、ＨＣＴ１１６  ＤＮＡからは得られなかった。インプットを陽性対照として用い、正常なＩｇＧを陰性対照として用いた。（Ｄ）共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）分析によるアレル転写因子相互作用の証拠資料。Ｃｏ−ＩＰアッセイを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈの市販キットを用いて、製造業者により推奨された通り実施した。ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６核抽出物を、Ｓｐ１およびｃＭＹＣに対する抗体で免疫沈降させた。膜をｃＭＹＣタンパク質についてブロットした。正常なＩｇＧを、免疫沈降アッセイにおいて陰性対照として用いた。
【図２０】ｐＧＬ３−ベーシックプラスミドおよびエンハンサプラスミド中のアイソジェニックなＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰを用いたトランスフェクション実験。Ｓｐ１全長タンパク質（ｐＮ３−Ｓｐ１）およびエンプティーベクター（ｐＮ３−エンプティ）の過剰発現を実施した。加えて、Ｓｐ１  ｓｉＲＮＡを用いるＳｐ１タンパク質発現のノックダウンを実施し、スクランブルｓｉＲＮＡを対照として用いた。レニラ・ルシフェラーゼを用いて、トランスフェクション効率の差を標準化した。
【図２１】アイソジェニックなＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３および＋３１６を用いたトランスフェクション実験。ＨＣＴ１１６細胞を、ｐＧＬ３−ベーシックプラスミド中の１．６ｋｂ  ＯＤＣ１プロモータ／イントロン１構築物でトランスフェクトした。ｃ−ＭＹＣコトランスフェクション（ｐｃＤＮＡ３−ｃ−ＭＹＣ）は、エンプティーベクター（ｐｃＤＮＡ３エンプティー）に比較して、ルシフェラーゼ活性の上昇を示した。レニラ・ルシフェラーゼを用いて、トランスフェクション効率の差を標準化した。
【図２２】ベースラインプトレッシンレベルは、ＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３（ｒｓ２３０２６１６）遺伝子型と関連する。＊Ｐ値は、ノンパラメトリックなクラスカル・ワリス検定（中央値の比較）から計算した。データは、表１０上に示されたデータに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
例示的実施形態の記載
細胞代謝の調節不全は、癌をはじめとする複数の疾患に関連する。ポリアミンは、転写レベル、転写後レベル、および翻訳レベルで遺伝子発現を制御することが示された有機カチオンである。ポリアミン合成の最初の酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性は、正常な発育および腫瘍の発育と関連する。ポリアミンレベルおよびＯＤＣ活性の上昇は、大腸腫瘍のリスク増大に関連する。ＯＤＣ発現は、ＭＹＣおよびＭＡＤファミリーメンバーを含むＥボックスの転写因子によって一部調節される。ＯＤＣ１遺伝子は、癌死亡の三番目の原因である大腸腫瘍のリスクに関連する複数のＳＮＰを含む。ＯＤＣ１イントロン１プロモータ領域中の一塩基多型（ＳＮＰ；転写開始部位の３’側＋３１６番目のヌクレオチドに位置するｒｓ２３０２６１５）は大腸癌発症のリスクにとって機能的および予知的であることが見出された。転写活性化因子ＭＹＣおよび転写抑制因子ＭＡＤの両方が、２つのＥボックスに隣接された、ＳＮＰ  ＋３１６にマイナーＡアレルを含むＯＤＣ１プロモータエレメントに優先的に結合して、アレル特異的発現を生じる。ＯＤＣ１  ＋３１６ＳＮＰはまた、特に非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）ユーザにおいて、異時性大腸腺腫の両リスクに関連し、大腸癌診断後の生存に関して有害であり、ならびに食肉消費およびポリアミン摂取などの他の表現型と関連する。
【００６４】
本明細書に記載された通り、ＯＤＣ１遺伝子における遺伝的変異性の包括的研究を実施した。癌予防臨床試験の参加者に出現した１２ＳＮＰの頻度を測定した。ＯＤＣ１における遺伝的多様性の９０％よりも多くを占めるハプロタイプを同定した。２つのＯＤＣ１イントロン１  ＳＮＰ、ｒｓ２３０２６１６（転写開始部位の３’側の＋２６３番目のヌクレオチドに位置する）およびｒｓ２３０２６１５が、疾患プロセスと関連し、臨床試験参加者の半数よりも多くを占めることが見出された。両方のＳＮＰが、臨床試験参加者における異時性腺腫およびポリアミン経路を標的とする薬物への反応を予測した。ｒｓ２３０２６１６  ＳＮＰは、ＤＮＡ  Ｇ四重鎖構造を機能的に調整し、遺伝子型別のＯＤＣ１律速生成物プトレッシンを予測した。両方のＳＮＰが協同で作用して、Ｇ四重鎖構造およびｒｓ２３０２６１６でのＳｐ１結合部位の両方、ならびにｒｓ２３０２６１５隣接ＭＹＣ結合Ｅボックスを含んでＯＤＣ１転写活性を調整する。両方のＳＮＰを用いるハプロタイプ分析は、癌患者における疾患予後および処置予測の両方のより良好な識別をもたらし得る。
【００６５】
複数の態様において、少なくとも一部が患者のＯＤＣ１プロモータ遺伝子型に基づく、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤とスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストとを含む抗癌剤併用療法の適切性、有効性、毒性、および／または投与量を予測することを含む方法が提供される。
【００６６】
本発明は、新しい異常腺窩巣の形成、新しい腺腫性ポリープの形成または異形成を伴う新しい腺腫の形成など、癌の開始を予防するための、そして／または癌危険因子の発生を予防するための、前癌性兆候を示す個体への治療化合物の送達の送達も含む。この分類の細胞は、少なくとも一部が患者のＯＤＣ１プロモータ遺伝子型に基づく、癌性状態への予想される進行を示すポリープおよび他の前癌病変、前悪性腫瘍、前腫瘍または他の異常な表現型を含む。
【００６７】
Ｉ．本発明の態様
天然由来のポリカチオン性ポリアミン（プトレッシン、スペルミジンおよびスペルミン）は、細胞の発育、発達、および生存において多機能的役割を担う遍在性の低分子量脂肪族アミンである（Ｌａｒｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ１）は、ポリアミン生合成における最初の酵素であり、オルニチンからのプトレッシンの形成を触媒する。ＯＤＣ遺伝子は、ネズミの初期発達における細胞発育に必須である（Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。ＯＤＣ１は、上皮発達をつかさどる主要なカスケードであるＷＮＴシグナル伝達経路によって調節される（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｇｒｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。発癌組織において、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制遺伝子の損失によるＷＮＴ経路の調節不全は、ｃ−ＭＹＣ依存性のプロセスを介してＯＤＣ１の発現を増加させ、つまりポリアミン合成を増加させる（Ｋｉｎｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｒｅｙａ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ，  ２００５；  Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。
【００６８】
ＯＤＣプロモータ／イントロン１領域は、ホルモン、成長因子、腫瘍プロモータおよび転写因子への応答を介して転写制御を可能にする複数の配列を含む（Ｐｅｇｇ，  ２００９）。加えて、ＯＤＣ１は、ｎｃＲＮＡによって調節され得る。ＯＤＣ１の５’隣接領域は、ＬＯＣ１０１９２９７１５と称される長いノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を有し、ＯＤＣ１  イントロン１は、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）であるＳＮＯＲＡ８０Ｂをコードし、それらは両者とも、転写レベルで、そして下流での影響について特徴づけられていない。
【００６９】
ポリアミン代謝は、癌の化学防護および処置のための確証された経路である。細胞株実験、マウスモデル、および臨床試験からのエビデンスにより、この経路が大腸癌予防のターゲットとして確証されている。現在２つの臨床試験が継続中であり、ＦＡＰにおける一方の試験（識別番号：ＮＣＴ０１４８３１４４）および神経芽細胞における他方の試験（識別番号：ＮＣＴ０１５８６２６０）を含む。今日まで、ポリアミンがそれらの腫瘍形成性の影響を誘発するメカニズム、および臨床転帰を説明する分子メカニズムは、ほとんど理解されていない（Ｓｐｏｒｎ  ａｎｄ  Ｈｏｎｇ，  ２００８；  Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｆｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００２）。
【００７０】
ＧがＡに変化したＯＤＣ１のイントロン１内のＳＮＰは、転写開始部位（ＴＳＳ）に対して＋３１６位に位置し、２つのｃ−ＭＹＣ結合Ｅボックスに隣接されている（Ｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。臨床的関連が、特にアスピリンユーザにおいて、異なる試験によるＯＤＣ１  ＋３１６遺伝子型と大腸腺腫（ＣＲＡ）再発リスク減少との間で確定された（Ｗａｌｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。しかし散発性大腸癌では、ＯＤＣ１  ＋３１６  Ａアレルは、生存性の低さに関連する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。ＯＤＣ１  ＋３１６は、機能的であり、ＯＤＣ１の転写レベルに影響を及ぼすことによって大腸癌発症に対して促進作用と阻害作用の両方を有し得る。アレル特異性プロモータレポータルシフェラーゼおよびクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験によって実証された通り（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、Ｅボックス活性化因子（形質転換された上皮でのｃＭＹＣ発現）および抑制因子（正常な上皮でのＭＡＤ１発現）の両方がＯＤＣ１  ＋３１６  Ａアレルに優先的に結合するため、これらの二重の役割は、分子レベルで説明することができる。
【００７１】
本明細書に記載された試験において、ＯＤＣ１内の遺伝的変異性の重要性を、ＳＶ４０エンハンサを欠くアイソジェニックルシフェラーゼレポータ（ｐＧＬ３−ベーシック，  Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検査した。ＯＤＣ１は数多くのＳＮＰを含むため（表Ａ参照）、ＯＤＣ１、ならびにその３’側および５’側隣接領域における遺伝子変異性の意義を理解するための包括的検査を実行した（Ｈｕｐｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  ２００５）。これらの試験では、この疾患プロセスにおける臨床的関連を説明する分子メカニズムを理解することも模索された（Ｈｕｐｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  ２００５）。４９のＯＤＣ１  ＳＮＰの頻度を、ＳＮＰ遺伝子型判定アレイおよびアレル特異的識別法を利用して、ＤＦＭＯ／スリンダク癌予防試験に参加した患者１９６名で確認した（Ｅｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。マイナーアレル頻度がおよそ１０％である１１のＯＤＣ１  ＳＮＰを同定して、参加者の９０％よりも多くを占めるコモンハプロタイプであることを決定した。ＯＤＣ１のイントロン１およびエクソン２（５’ＵＴＲの一部）におけるＳＮＰを、表現型との関連について注意深く検査した。計算によるアプローチで、５’ＵＴＲでのＳＮＰが翻訳レベルでの差異的な調節を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を破壊することが示された。それらのＳＮＰは、本明細書に記載された臨床試料およびＳＮＰデータベースにおける変異性を示さず、そして／またはポリアミンレベルもしくはポリープ発生などの表現型と関連しなかった。Ｇ四重鎖ＤＮＡ二次構造を形成可能なイントロン１におけるＧＣリッチ領域に存在する単一ＳＮＰの転写的な寄与をさらに研究した。
【００７２】
本明細書に記載された試験において、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰを同定、確証して、それがＧ四重鎖構造を調整することを見出した。加えて、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰを、臨床転帰およびＤＦＭＯ／スリンダク処置への応答に関係してＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰに焦点をあてた過去の研究に関連させて試験した。
【００７３】
ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰ（ｒｓ２３０２６１６）は（１）臨床試験の参加者において観察された頻度を大きな２つの群に分割し、（２）ＧＣリッチ領域内に配置して、Ｑｕａｄｐａｒｓｅｒソフトウエアを用いる計算試験によって予測された通りＧ四重鎖（Ｇ４）と呼ばれるＤＮＡ二次構造を形成し（Ｍｅｓｓｅｇｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、（３）ＰＲＯＭＯソフトウエアによって予測された通りコンセンサスＳｐ１／Ｓｐ３転写因子結合配列を破壊し（Ｆａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｒａｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）、そして（４）ＤＦＭＯ／スリンダク試験の参加者においてベースライン時の正常組織における遺伝子型別の統計学的に有意なプトレッシンレベルを予測した。したがってＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰは、臨床パラメータとの遺伝子型の関連を精密化し得る、遺伝子調節の新規な分子メカニズムに関与する可能性がある。
【００７４】
Ｇ四重鎖のＤＮＡ二次構造に影響を及ぼすＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰの能力を、円二色性（ＣＤ）、融解温度、およびＥＭＳＡを利用して試験した。ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰは、この位置にＧまたはＴのいずれかを有するＧ四重鎖構造を形成できた。加えて、Ｇ四重鎖構造の熱安定性から、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＧアレルがＯＤＣ１  ＋２６３  Ｔアレルよりも安定したＧ四重鎖構造を形成することが実証された。アイソジェニックレポータルシフェラーゼプラスミドを構築して、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰの機能的意義をテストした。Ｔアレルは、より多くのルシフェラーゼ発現を駆動し、それはインビトロの熱安定性アッセイと一致している。Ｓｐ１転写因子の影響を、インビトロおよびインビボで試験した。インビトロで、Ｓｐ１は、過去に報告された通り、Ｇ四重鎖構造と二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡとの平衡を調整した（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株を用い、遺伝的アプローチを利用してＳｐ１転写因子の役割を試験した。Ｓｐ１タンパク質を、ｓｉＲＮＡ技術を利用してノックダウンした場合、ＯＤＣ１転写の誘導が両方のＯＤＣ１  ＋２６３アレルで観察された。この転写活性は、より安定したＧ四重鎖構造を形成するＧアレルの存在下ではより高かった。加えて、全長Ｓｐ１タンパク質を、哺乳動物発現ベクター（ｐＮ３）を用いて過剰発現した。Ｓｐ１タンパク質は、ＯＤＣ１発現を有意にダウンレギュレートしなかった。この観察を、Ｇ四重鎖とｄｓＤＮＡとの平衡がＳｐ１タンパク質濃度に依存するというインビトロデータと合わせて考慮すると、Ｓｐ１タンパク質の過剰発現は、より高い濃度のＳｐ１タンパク質に応答しないｄｓＤＮＡの状態でＯＤＣ１プロモータ駆動プラスミドを維持していると結論付けることができる。これに対して、Ｓｐ１発現がノックダウンされた場合に平衡はｄｓＤＮＡよりもＧ四重鎖コンフォメーションに傾くようであった。Ｇ四重鎖コンフォメーションはＯＤＣ１プロモータ駆動プラスミドの発現を誘導するようであり、その場合、Ｇ四重鎖の安定性または他の転写因子とのその関連は、ＯＤＣ１の転写レベルに影響を及ぼし得る。
【００７５】
ジプロタイプは、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３1６  ＳＮＰの両方を用いて構築されたが、それはそれらが、介入する組換えイベントの開始を排除するのに十分接近しているためである。ＯＤＣ１についての選択圧を論ずる限定的ハプロタイプが見出された。ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰが、進化においてＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰよりも後期のイベントである可能性がより高い。ＯＤＣ１における遺伝的変異性の包括的研究を実施し、母集団の９０％より多くを占める限定的ハプロタイプ多様性が見出された。機構的に、参加者の半数を超える２つのハプロタイプが指定された。両方のＯＤＣ１イントロン１  ＳＮＰが、疾患プロセスと関連することが見出され、両方が、ＤＦＭＯ／スリンダク試験の参加者における異時性腺腫および処置への応答を予測した。ＳＮＰ  ｒｓ２３０２６１６のみが、遺伝子型別のＯＤＣ１律速生成物プトレッシンを予測し、このことはＯＤＣ１の転写制御の重要性を強調する。両方のＳＮＰが、Ｇ四重鎖およびＯＤＣ１  ＋２６３でのＳｐ１結合、ならびにＯＤＣ１  ＋３１６隣接ＭＹＣ結合Ｅボックスを含んでＯＤＣ１転写活性を調整した。ｃ−ＭＹＣは、Ｓｐ１のＮ末端ドメインおよびＧ四重鎖形成の安定性を含むメカニズムにおいて、Ｓｐ１と協同で作用してＯＤＣ１の転写を活性化した。したがってＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰは、過去に報告されたＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰと同様に、ＯＤＣ１の調節において機能的であり、それらは一緒に作用してＯＤＣ１転写を調節する可能性がある。
【表１】
2017519770.tif 000003
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【００７６】
ＩＩ．大腸癌
大腸癌は結腸または直腸の組織に形成する癌を指し、それぞれ米国で２０１３年に診断された新たな症例は１０２，４８０例および４０，３４０例と推定される。米国国立癌研究所によれば、米国では２０１３年に約５０，８３０例が、大腸癌で死亡するであろう。大腸癌は、男性では皮膚癌、前立腺癌、および肺癌に続き四番目に多い癌である。女性でも、皮膚癌、乳癌、および肺癌に続き四番目に多い癌である。近年急激に低下した大腸癌罹患率は、前癌性ポリープの検出およびその除去を可能にするスクリーニングが増加したことに主に起因した（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。結腸および直腸は、栄養素、無機質、水などの吸収において基本的役割を担う消化器系の一部である。それらは大腸（ｌａｒｇｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）と呼ばれる（大腸（ｌａｒｇｅ  ｂｏｗｅｌ）とも呼ばれる）長い筋肉の管を形成しており、これが小腸から来る部分的に消化された食物を受け取る。結腸は、大腸の最初の４〜５フィートであり、直腸は、最後の数インチである。結腸は大腸の最も長い部分であり、４つの異なる部分：上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ字結腸に分けられる。上行結腸は、盲腸によって小腸につながり、腹部の右側を上向きに通る。横行結腸は、胃から宙吊りになっていて腹部を横向きに通る。下行結腸は、左腹部を下向きに降下し、直腸の直前で終了するＳ字結腸として知られる臓器の端部の短い曲線まで続く。結腸の機能は、残留植物から水、塩、および一部の栄養素を取り出し、その残りを固形廃棄物または糞便にすることである。糞便は、一時的に貯蔵され、結腸から直腸内へ、そしてその後、肛門を通過して体外へ排出される。
【００７７】
大腸癌は、結腸または直腸内の細胞が異常になり、無制御に分裂して、腫瘍と呼ばれる塊を形成する疾患である。大腸癌の大部分は、腺腫として知られる良性ポリープから発達する腺癌である（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。結腸ポリープは、大腸（結腸または直腸）の上部の内壁に小さな結節を形成する正常な発生物である。結腸内視鏡と呼ばれる処置による腺腫の外科的除去は、前向き観察試験により示された通り、７５％〜９０％低い大腸癌リスクと関連する（Ｗｉｎａｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。結腸内視鏡を受けた患者の研究から、一般的母集団の大腸癌リスクのかなりの部分が大腸腫瘍または大腸腺腫性ポリープを発生する個体に存在することが示唆されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００９）。ほとんどの結腸ポリープは無害であるが、一部は浸潤癌に進行し得る（Ｋｒｏｎｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｆｅｎｇｅｒ，  １９９９；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。初期ステージで見出される結腸ポリープは通常、結腸内視鏡術によって安全にかつ完全に摘出され得る。結腸ポリープには３つのタイプ：過形成性、炎症性および腺腫性または腺腫が存在する。過形成性ポリープは、最も多くが下行結腸および直腸に発生する。より大きな右側の過形成性ポリープは、癌性になり得る。炎症性ポリープは通常、潰瘍性大腸炎から生じ、大きな癌リスクではない。腺腫性ポリープまたは腺腫には３つのタイプ：絨毛、管状および腺管絨毛がある。それらは、茎部によって支持された組織の細長い軸で成長し得るか、または茎部がなくカリフラワー様外観もしくは平腺腫としても知られる無茎であり得る。管状腺腫は、最も一般的であり（７５％）、少なくとも大腸癌内に発生する可能性があり、結腸内の至る所に、多くは茎部に生じ得る。絨毛腺腫は、癌性になる可能性がより高く、多くは無茎であり、直腸領域に位置し、分化が十分でなく、腺腫の約１０％を占める。腺管絨毛腺腫は、腺腫の１５％であり、絨毛成分の度合いが、前悪性腫瘍リスクに相関する。
【００７８】
１９９０年にＦｅａｒｏｎおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎによって提起された結腸腫瘍形成のモデルによれば、大腸癌は、正常な粘膜から小さな腺腫へ、その後大きな腺腫への進行を含み浸潤癌および転移に至る多段階過程として発達する（Ｆｅｎｏｇｌｉｏ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  １９７４；  Ｍｏｒｓｏｎ，  １９７４；  Ｆｅａｒｏｎ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  １９９０）。この広く認識された見解を裏づけて、ベースライン時に腺腫が陰性である対象を平均５．３年間追跡し、癌がなく任意の大腸腺腫（１６．０％）、または切除不能な大腸癌（１．３）の割合が低いことを確認した（Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。これは、平均追跡時間４年での任意の大腸腺腫（４６．７％）、切除不能な大腸腺腫（１１．２％）および浸潤癌（０．６％）の割合を報告した、大腸腺腫の摘出を過去に受けた患者（ポリープ切除後患者）において観察されたリスクと対照的である（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。大きなポリープの予防試験から、再発性ポリープのサイズおよび大腸癌リスクが、試験登録時に測定されたポリープサイズと強く関係することが見出された（Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。リスクは、スクリーニング時により進行した大腸腺腫が検出されれば、そして内視鏡検査時の臨床的および組織的所見の重症度によって、大きく上昇する。反対に、スクリーニング時に大腸腺腫がないことが、非常に低い大腸癌リスクと関連する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００９；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。これらの観察から、分子の多段階過程の改変が本来のポリープ−癌連関に関与することが示唆された。癌のモノクローナル誘導体に関するエビデンス、および初期ポリープ中の腫瘍細胞が登録時の結腸内視鏡で除去されたという理解に基づけば、新しい再発性ポリープのサイズは発癌の確率事象を反映して通常は分布し、最初のポリープサイズとは独立していることが予期される（Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。Ｍａｒｔｉｎｅｚおよび共同研究者により提起された実際のモデルで（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、特定の開始イベント（例えば、化学的発癌物質および遺伝的危険因子）から生じる発癌および化学防護戦略への応答が、遺伝的変異性によって影響を受けることが予測された。このモデルは、結腸癌発症における早期遺伝子改変であるとしてＡＰＣと一致しており、本質的に全てのポリープが変異している（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。続く発癌リスクは、個体の間のＡＰＣまたは他の下流の遺伝的因子の変異性によって影響を受ける（Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【００７９】
５０歳を超える母集団の２０％〜３５％は、生涯のうちに大腸腺腫を呈し、それらの個体の２０〜５０％は、追跡調査の際に大腸腺腫の別の新しい腺腫または異時性の発生物（複数可）に見舞われる  （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００９）。散発性大腸腺腫の２％〜５％のみが、悪性に進行する可能性を有すると推定される。したがって、臨床現場において大腸癌の最も妥当な危険因子の１つは、特に大腸腺腫形成が持続するのであれば、大腸腺腫の発生である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００９）。結腸ポリープの定期的なスクリーニングは、後期ステージで見出されると致命的になることの多い結腸癌の予防を支援する。大腸腺腫の同定、そして大腸腺腫の陽性をスクリーニングする個体における次のサーベランスに結腸内視鏡を使用することで、大規模に内視鏡が使用され、それがコストの増加および数多くの処置による過剰なリスクに寄与した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００９）。ポリープ切除後の患者における経過観察間隔の推奨が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｕ．Ｓ．  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙで確定された（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。経過観察の間隔に関する決定を支援するガイドラインが、三群のリスク層化を作成した：１）３年で経過観察を行う高リスク、２）５〜１０年で経過観察を行う低リスク群、および３）１０年で経過観察を行う平均リスク群。リスク層化ガイドラインは、ベースライン時に除去された大腸腺腫の臨床的および組織的特徴に基づいており、腺腫サイズ、組織学的項目、異形成の度合い、および多重度を含む（Ｗｉｎａｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。総合的に言えば、大腸癌は、結腸内視鏡スクリーニングにより、特に大腸腺腫除去の潜在的予防利益を考慮し、また食事およびライフスタイル因子の修正、ならびに化学防護戦略の利用の両方を考慮すれば、潜在的に予防可能である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００９；  Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ，  ２０１０；  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
【００８０】
Ａ．大腸癌の分子経路
大腸癌が分子的特徴によって分類され得ることが、近年の研究で認識された。これらの分子の特色としては、染色体不安定性（ＣＩＮ）、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、およびＣｐＧアイランドメチレータ表現型（ＣＩＭＰ）として知られる選択遺伝子組の高メチル化が挙げられる。ＣＩＮ腫瘍は、大腸癌のおよそ８０％を占め、遺伝的不安定性が腺腫−癌連関を駆動する。ＭＳＩは、全ての大腸癌の約１５％〜２０％で検出され、ＣＩＭＰが先行する可能性がある。いくつかの結腸癌は、ＭＳＩおよびＣＩＮの両方を欠く（Ｇｅｏｒｇｉａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。集中的なＤＮＡ高メチル化の特異的経路が発見され、ＣＩＭＰ表現型と呼ばれた（Ｔｏｙｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。この知見は、Ｃｈｅｎｇおよび共同研究者によって立証され、そこではＣＩＮとＣＩＭＰとの逆相関が報告されており、それらがほとんど重複しない分子多様性を生成するという２つの異なるメカニズムであることが示唆された（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。最後に、ＭＳＩ例の３％は、リンチ症候群と関連し、それはＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子における生殖細胞変異によって誘発され、ヘテロ接合（ＬＯＨ）イベントまたはメチル化の損失を介する野生型アレルの損失を伴い、それによってＭＳＩとＣＩＮとの明白な重複が説明される。他の１２％は、ＭＬＨ１遺伝子のプロモータの散発性の後天的高メチル化によって誘発され、それはＣＩＭＰ表現型を有する腫瘍に発生する（Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｂｏｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｏｅｌ，  ２０１０）。ＭＳＩは、ＭＭＲ遺伝子の野生型コピーの損失に加え、ＣＩＭＰまたはリンチ症候群のいずれかの結果であると見なすことができる（Ｂｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。Ｉｓｓａおよび共同研究者は、大腸癌発生の新しい見解を示唆した（Ｉｓｓａ，  ２００８）。ＦｅａｒｏｎおよびＶｏｌｇｅｓｔｅｉｎによって提案された大腸癌進行の直線多段階モデル（Ｆｅａｒｏｎ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  １９９０）の代わりに、散発性大腸癌は、（少なくとも）３つの異なる平行モードから起こると思われる。第一および第二の経路は最も均質性であり、前駆体病変（鋸葉状腺腫ｖｓ管状腺腫）、遺伝子学（ＢＲＡＦ対ＡＰＣおよびｐ５３変異、ＭＳＩ対ＣＩＮ）、後成学（ＣＩＭＰ陽性ｖｓ陰性）および転帰（良好ｖｓ普通）において明らかな区別を有する。第三の経路はより不均質であるか、またはおそらく完全には理解されていない。それは、ほとんどが絨毛腺腫から生じ得るが、おそらく鋸歯状腺腫からも生じ得る。それはＣＩＭＰの異なる形態を有し、優勢なＫＲＡＳと時折存在するＢＲＡＦの突然変異を有し、通常はＣＩＮが存在せず、予後不良で化学療法への応答性が明白に低い。第一の経路の有病率は１０％〜２０％と推定され、第二は５０％〜７０％、第三は１０％〜３０％である。
【００８１】
Ｂ．ポリアミンと大腸癌
ポリアミン（プトレッシン、スペルミジン、およびスペルミン）は、転写および転写後レベルで遺伝子発現を制御し、そのことがそれらを癌進行の潜在的機能調節因子と示唆している（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｎｙｄｅｒ，  １９６８）。高レベルのポリアミンと癌との関連は最初、ＲｕｓｓｅｌｌおよびＳｎｙｄｅｒによって１９６０年代後期に報告され（Ｃａｓｅｒｏ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｏｎ，  ２００７）、そこで彼らは、再生されたラット肝臓および複数のヒト癌において高レベルのＯＤＣ１活性を測定した。複数の研究から、大腸癌が高レベルのポリアミンに関連することが実証された（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，  ２００１）。ポリアミンは、核酸、酸性タンパク質、および膜などの負電荷巨大分子に静電的に結合可能な可撓性ポリカチオン性であるため独特である（Ｌａｒｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。複雑な調節が、ポリアミンのデノボ合成、レトロ変換、変性、エフラックス、および取り込みの組み合わされた作用を介して、細胞内ポリアミンプールサイズを制御する。エンドサイトーシスおよび溶質輸送のメカニズムによって胃腸組織に輸送される外来性ポリアミンの主な供給源は、食事および腸内細菌である（Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。ポリアミンは、ポリアミン生合成の最初の酵素である酵素オルチニンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ１）の作用を通して合成され、この酵素はオルニチンからのプトレッシンの形成を触媒する。プトレッシンは次に、Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ１（ＡＭＤ１）およびスペルミジンシンターゼ（ＳＲＭ）の作用を通してスペルミジンに変換される。スペルミジンはその後、ＡＭＤ１およびスペルミンシンターゼ（ＳＭＳ）によってスペルミンに変換される。高級ポリアミンを形成するアミノプロピル基は、デカルボキシル化ＳＡＭ（ｄｃＳＡＭ）を生成する、ＡＭＤ１によるＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のデカルボキシル化から生じる。スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ１）は、１つの末端アセチル基をスペルミジンに付加し、１つまたは２つの末端アセチル基をスペルミンに付加し、これが続いてＳＬＣ３Ａ２トランスポータによるアセチル化ポリアミンの排出を促進する（Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）。スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯ）は、非アセチル化スペルミンをスペルミジンに変換する。アセチルポリアミンオキシダーゼ（ＰＡＯ）は、モノアセチル化スペルミジンを中間体として用いて、アセチル化スペルミジンンおよびスペルミンをプトレッシンに戻すことによりポリアミン恒常性も支援する（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）（図１）。
【００８２】
ポリアミンは、細胞増殖および変異性を含む重要な細胞内プロセスを調節する。遺伝的エビデンスから、ポリアミンが細菌の最適な発育に必要であること（Ｂａｌａｓｕｎｄａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）および酵母における好気的発育に必須であること（Ｌｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）が示されている。ポリアミンの細胞機能として、腸粘膜成熟および細胞遊走も挙げられる（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ２００１；  Ｂａｓｕｒｏｙ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００６）。ポリアミンは、転写、ＲＮＡ安定化、翻訳および翻訳フレームシフト、ならびにタンパク質変性に影響を及ぼすことが示された（Ｃｈｉｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｊａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｐｅｇｇ，  １９８８；  Ｐｅｇｇ，  ２００６；  Ｐｅｇｇ，  ２００９，  Ｓｈａｎｔｚ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎ，  ２００７；  Ｉｇａｒａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋａｓｈｉｗａｇｉ，  ２０００；  Ｍａｔｓｕｆｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【００８３】
ポリアミン代謝は、低用量のジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）／スリンダクを用いた前向き無作為化プラセボ対照二重盲検臨床試験およびＦＡＰに関する継続中の臨床試験（識別番号：ＮＣＴ０１４８３１４４）による、大腸癌の化学防護の確証済みの経路である。その併用処置は、過去に結腸ポリープを有した患者での全ての大腸腺腫の７０％減少、ならびに切除不能および／または複数の大腸腺腫の９０％を超える減少と関連した（Ｅｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。ＯＤＣ酵素の不可逆的自殺阻害剤であるＤＦＭＯは、げっ歯類モデルにおけるＭＴＣ依存的発癌を阻害し、Ａｐｃ／Ｍｉｎマウスにおける腸内ポリアミン量および腫瘍形成を抑制した（Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ，  １９９７）。遺伝的研究から、大腸腫瘍形成の際のＯＤＣ発現および活性の上昇を示した疫学研究が立証される（Ｌｕｋ  ａｎｄ  Ｂａｙｌｉｎ，  １９８４；  Ｐｅｎｄｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。Ｏｄｃ１ノックアウトが受精後３．５日目のネズミ胚において致死であることから、ＯＤＣはネズミの発達に必須の役割を担い、ポリアミンプールの適当な恒常性は原腸胚形成前の細胞生存に必要であると思われる（Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。加えて、腫瘍形成におけるＯＤＣ１の重要性が、マウス皮膚腫瘍の易罹患性を改変するＯｄｃ１のハプロ不全と、皮膚および前立腺の化学防護治験におけるＤＦＭＯ単独使用の両方によって立証された（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｓｉｍａｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｒｏｕｎｂｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＭＹＣＮ誘導性神経芽細胞腫マウスモデルにおいて、Ｏｄｃヘテロ接合性ではなくＤＦＭＯでの処置が、悪性リンパ腫発生を減少させた（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。臨床試験が、神経芽細胞腫のヒト患者で継続中である（識別番号：ＮＣＴ０１５８６２６０）。発癌におけるＯＤＣの原因的役割が、トランスジェニックマウスにおけるインビトロおよびインビボでのトランスフェクションによるＯＤＣ１の過剰発現の際に観察された（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｆｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。細胞内非競合ＯＤＣ１阻害剤アンチザイムは、プロテアソーム変性に関してＯＤＣ１を標的とし、ポリアミンレベルを低下させるため、トランスジェニックマウスにおけるこのアンチザイムの過剰発現が、発癌を低下させることが示された（Ｆｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｂａｂｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【００８４】
アスピリン使用と新たな腺腫形成を減少させるポリアミン経路との関連の根底にあるメカニズムは厳密には知られていないが、ポリアミン異化および排出に及ぼすアスピリンおよび他の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の作用が関与すると思われる。ＮＳＡＩＤはＳＡＴ１酵素を転写的に活性化し、この酵素はスペルミジンおよびスペルミンのアセチル化によって、それらの両方をＳＬＣ３Ａ２依存性アルギニン／プトレッシンアンチポータによる排出のターゲットとする（Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０；  Ｂａｂｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｐａｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。
【００８５】
ポリアミンがそれらの腫瘍形成効果を誘発するメカニズムおよびその臨床転帰を説明する分子メカニズムは、依然としてあまり理解されていない（Ｓｐｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｆｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００２）。
【００８６】
Ｃ．オルニチンデカルボキシラーゼおよび大腸癌
主要な発癌経路は、ＯＤＣ１転写の調節に関与する。ＯＤＣ１は、上皮発達を支配する主要なカスケードの１つであるＷＮＴシグナル伝達経路によって調節される（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｇｒｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制遺伝子は、ＷＮＴカスケードの成分であり、結腸癌の遺伝性形態である家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）の個体の生殖細胞系列において変異または損失している（Ｋｉｎｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ＡＰＣは、ヒト結腸癌のほぼ９０％および黒色腫皮膚癌の３０％でも変異している（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。ＯＤＣ１発現およびポリアミン量は腸組織内で増加し、ＯＤＣ１の特異的阻害剤は、ＦＡＰの動物モデルであるＡｐｃＭｉｎ／＋マウスで腸の発癌を抑制する（Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ＡＰＣ突然変異は、結腸癌発症の初期イベントであり、それゆえ、開始イベントであると見なされる。このモデルにおいて、変異したＡＰＣはアンチザイムおよびＳＡＴ１発現の減少をもたらすため、ＡＰＣが結腸でのポリアミン代謝経路を制御することを示している。発癌組織において、ＡＰＣの損失およびＷＮＴ経路の調節不全が、ｃ−ＭＹＣ発癌遺伝子および他の成長関連遺伝子の発現増加をもたらす（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｋｉｎｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｒｅｙａ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒ，  ２００５；  Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；  Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。ＡＰＣ突然変異は、正常にはプロテアソーム変性をもたらすβ−カテニンのＧＳＫ−３βリン酸化を妨げる。変異したＡＰＣは核内のβ−カテニンの安定化および蓄積をもたらし、ＴＣＦ／ＬＥＦ（Ｔ細胞因子／リンパ系増強因子（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ／ｌｙｍｐｈｏｉｄ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ））転写因子と複合体を形成して特異的な発育関連遺伝子を活性化し、ｃ−ＭＹＣおよびサイクリンＤ１などの遺伝子発現を改変する（Ｒｅｙａ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒ，  ２００５；  Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。ＡＰＣ遺伝子の異なる領域内の生殖細胞および体細胞の突然変異は異なる疾患表現型に関連し、β−カテニン結合部位にホットスポットを有する。コドン１４０３〜１５７８での突然変異は結腸外病変と関連し、コドン７８〜１６７およびコドン１５８１２８４３での突然変異は、低減したＦＡＰで認められる。ＡＰＣ遺伝子の異なる欠失の役割は、遺伝子改変されたマウスモデルで試験されている。Ｃ５７ＢＬ／６Ｍｉｎ（複数の腸腫瘍）マウスが最初に開発されたモデルであり、それはＡＰＣ遺伝子のコドン８５０に終始コドンを有した（Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。次に、各１つが異なる表現型を有する、異なるＡＰＣ欠失を有する他のマウスモデルが報告された（Ｆｏｄｄｅ，  ２００２；  Ｂｏｙｄ  ａｎｄ  Ｆａｒｎｈａｍ，  １９９９）。変異ＡＰＣと組み合わせた、または単独の他の遺伝子の遺伝子改変（ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、ＮＯＳ２、Ｐ５３、ＭＬＨ１、ＭＬＨ２、ＳＭＡＤ４、Ｋ−ＲＡＳなど）もまた、大腸癌に影響を及ぼすことが報告されており、散発性結腸癌のより良好なモデルであり得る（Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【００８７】
ＦｅａｒｏｎおよびＶｏｌｇｅｓｔｅｉｎにより提案された、Ｍａｒｔｉｎｅｚおよび共同研究者による大腸癌形成モデルの修飾から、ＡＰＣシグナル伝達経路の下流で、個体間で化学防護戦略に対する異なった応答を付与する他の遺伝的因子の遺伝的変異性によって、大腸のリスクが影響を受けることが、予測された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｆｅａｒｏｎ  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｎ，  １９９０；  Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。加えて、ＣＩＮ、ＭＳＩ、およびＣＩＭＰは、遺伝的および後成学的変化が正常組織から腫瘍結腸組織への進行において重要である大腸癌の経路である。これらの改変における遺伝的変異性、またはこれらの早期遺伝的および後成学的改変の下流メディエータが、この進行において重要な役割を有する。ＡＰＣ機能の損失は正常細胞の増殖に必要とされるｃ−ＭＹＣ発癌遺伝子の発現増加をもたらし、その異常な発現が無制御な増殖および癌をもたらし得る（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｒｅｙａ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ，  ２００５；  Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ，  ２００３；  Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。ｃ−ＭＹＣは、ＯＤＣ１遺伝子を直接標的とすることが実証された転写因子をコードする（Ｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＯＤＣ１発現は、ｍｉｎマウスモデルの腸組織で増加しており、ＡＰＣがＯＤＣの発現に影響するというエビデンスを裏づける（Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。野生型ＡＰＣの条件付き発現がヒト結腸腫瘍細胞におけるＭＹＣ依存的様式でＯＤＣ発現を抑制することを示した次の研究は、ＯＤＣがＡＰＣ依存的腫瘍形成の修飾物質であるという仮説を支持する（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。加えて、ｃＭＹＣが、正常な腸粘膜への明白な影響を有さずに、増殖の増加およびアポトーシスの抑制を介して腸腫瘍の発生において重要な役割を担うことが、腸および結腸の粘膜においてｃ−ＭＹＣの条件付き欠失を有するｍｉｎマウスモデルを用いた試験で示された（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ，  １９９７）。
【００８８】
ＯＤＣ１は、転写開始部位（ＴＳＳ）に対して−４００〜＋４００ｂｐの領域に３つのｃ−ＭＹＣ結合エレメント（Ｅボックス）を有する。ポリアミンにより誘導された核ｃ−ＭＹＣはＭＡＸと相互作用し、この複合体がＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）に結合して、ＯＤＣ１などの標的遺伝子の転写を活性化し、こうしてポリアミン生合成が促進される（Ｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｗａｌｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｗａｌｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。転写抑制因子ＭＡＤ１／ＭＡＸもまた、これらのエレメントに結合して、増殖細胞においてＯＤＣ１の転写レベルを調節する（Ｐｅｇｇ，  ２００９；  Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＯＤＣ１プロモータ活性は、これらの隣接するＥボックスを含む協同的な相互作用によって影響を受ける（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。ＯＤＣ１発現が癌の発生と関連づけられたため、特異的遺伝的変異性を有する個体は、結腸ポリープ発生の高い素因を示し得る。ＯＤＣ１多型と腺腫再発リスクとの関連が、アリゾナ州ツークソンにあるＡｒｉｚｏｎａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒでの大規模な無作為化二重盲検小麦ふすま線維結腸癌予防試験の参加者において評価された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。一塩基多型（ｒｓ２３０２６１５）が２つのＥボックスの間のヒトＯＤＣ１のイントロン１に存在し、転写開始部位の下流３１６ヌクレオチドに位置するＧ／Ａ変異を有する（Ｗａｌｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。腺腫再発のリスクに及ぼすＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰの実質的で統計学的に有意な影響が、特にアスピリンユーザで見出され、再発したポリープのサイズと大腸癌リスクとの間に強い相関があった（Ｗａｌｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。腺腫再発のリスクは、アスピリン摂取を報告したＡＡホモ接合性個体のほぼ半数で見出された（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。アスピリン／葉酸塩ポリープ予防試験においてＢａｒｒｙおよび共同研究者（Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）は、プラセボまたはアスピリン処置（１日あたり８１または３２５ｍｇ）に無作為に割り付けられた個体におけるＯＤＣ１遺伝子型と大腸癌再発との非統計学的に有意な関連を見出した。この試験から、ＯＤＣ１遺伝子型が腺腫リスクに及ぼすアスピリンの影響を改変することも見出された。アスピリン処置はＧＧ遺伝子型の対象では保護的作用を有さなかったが、それは、少なくとも１つのＡアレルを有する対象では、任意の腺腫リスクの統計学的に有意な低下と関連した。英国大腸腺腫予防においてＨｕｂｎｅｒおよび共同研究者（Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）は、希少なＯＤＣ１  ＋３��６  ＡＡホモ接合体が大腸腺腫再発リスクを低下させ、アスピリンが投与されれば再発リスクがさらに低下することを報告した。同時に、Ｈｕｇｈｅｓおよび共同研究者による近年の試験から、アスピリンまたは疾患ステージのデータのないチェコ共和国の症例対照研究において、ＯＤＣ１  ＋３１６遺伝子型と大腸癌との間に相関がないことが報告された（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。家族性大腸癌のＣａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ＳｔｕｄｙからのステージＩ〜ＩＩＩの大腸癌症の４００例の集団研究により、大腸癌患者の特異的転帰がＯＤＣ１  ＋３１６遺伝子型に依存し、ＯＤＣ１  ＧＡ／ＡＡ遺伝子型を有する個体では大腸癌特有の死亡リスクがより高いことが報告された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。加えて、統計学的に有意な相互作用が、ＯＤＣ１  ＋３１６遺伝子型とＤＦＭＯ／スリンダク処置との間で腺腫再発に関係して見出されたが、任意のポリアミンレベルには関係しなかった。具体的には、Ｇアレルに関してホモ接合性の個体は、ＧＡ／ＡＡ個体よりも、処置後の腺腫再発リスクが低かった（Ｆｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ２００２）。結腸癌細胞株中にトランスフェクトされたＯＤＣ１  ＋３１６ＳＮＰプロモータレポータルシフェラーゼ構築物を用いた実験では、ＡアレルがＧアレルよりも多くのルシフェラーゼを駆動することが示された（Ｗａｌｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。コトランスフェクション実験では、Ａアレルが、Ｇアレルに比較して、ＭＹＣおよびＭＡＤなどのＥボックス転写因子の結合増加を示す（Ｗａｌｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。同じく、有意な異時性腺腫リスクの低下が、食事によるポリアミン摂取群および食肉摂取と、ＤＦＭＯ／スリンダク処置の間で検出された（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；  Ｖａｒｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。それらの試験は、他の臨床試験からの食事によるポリアミン摂取と大腸腺腫性ポリープのリスクとの過去の関連を確証し、大腸腺腫に関する変更可能な食事の危険因子を確認する（Ｃａｍｐｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
【００８９】
ＩＩＩ．ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）
エフロルニチンとしても知られるＤＦＭＯは、以下の化学名：２−（ジフルオロメチル）−ｄｌ−オルニチンを有する。それは、ポリアミン生合成経路の律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の、酵素によって活性化される不可逆的阻害剤である。ポリアミン合成のこの阻害の結果、この化合物は、多くの臓器系での癌形成の予防、癌増殖の阻害、および腫瘍サイズの減少において効果的である。それはまた、他の抗腫瘍薬との相乗作用を有する。
【００９０】
ＤＦＭＯは、マウスにおいてＡＰＣ依存性腸腫瘍形成を減少させる（Ｅｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ヒトにＤＦＭＯを連日経口投与すると、ＯＤＣ酵素活性および複数の上皮組織中のポリアミン量が阻害される（Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ    ａｌ．，２００１；Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。無作為化臨床試験において、ＤＦＭＯが、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）スリンダクとの併用で、プラセボと比較して、結腸腺腫を有する個体における腺腫再発率を顕著に低下させることが報告された（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００９１】
ＤＦＭＯは当初、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｍｅｒｒｅｌｌ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇによって合成された。現在、ＦＤＡによる認可には
ａ）アフリカ睡眠病。高用量全身ＩＶ投与剤形−市販されていない（Ｓａｎｏｆｉ／ＷＨＯ）、および
ｂ）男性型多毛症（アンドロゲン誘導性の過剰な体毛の成長）局所投与剤形、
が含まれる。現在、経口配合剤は認可されていない。
【００９２】
良性前立腺肥大の処置におけるＤＦＭＯおよびその使用は、米国特許第４，４１３，１４１号、および同第４，３３０，５５９号の２つの特許に記載されている。米国特許第４，４１３，１４１号には、ＤＦＭＯがインビトロおよびインビボの両方において、ＯＤＣの強力な阻害剤であることが記載されている。ＤＦＭＯの投与は、プトレッシンおよびスペルミジンが通常は活発に生成される細胞において、これらのポリアミンの濃度を低下させる。加えて、ＤＦＭＯは、標準的な腫瘍モデルで試験した場合に、腫瘍細胞の増殖を緩徐にし得ることが示されている。米国特許第４，３３０，５５９号では、良性前立腺肥大の処置におけるＤＦＭＯおよびＤＦＭＯ誘導体の使用について記載されている。良性前立腺肥大は、急速な細胞増殖を特徴とする多くの疾患状態と同様に、ポリアミン濃度の異常な上昇を伴う。この参考資料に記載された処置は、経口的または非経口的のいずれかにより、患者に投与され得る。
【００９３】
顕著な抗腫瘍効果のあるＤＦＭＯは、潜在的に継続投与される可能性がある。この薬物は、０．４ｇ／ｍ２／日という低用量ではヒトに対して相対的に非毒性であるが、腫瘍においてプトレッシン合成を阻害する。ラット腫瘍モデルでの研究は、ＤＦＭＯの輸液が、末梢の血小板数を抑制することなく、腫瘍プトレッシンレベルを９０％低下させ得ることを実証している。
【００９４】
ＤＦＭＯの使用に伴って観察される副作用には、４ｇ／ｍ２／日の高用量での聴力に及ぼす影響が挙げられるが、この影響はそれが中止されることによって解消する。聴力に及ぼすこれらの影響は、０．４ｇ／ｍ２／日の低用量を最大１年間投与した場合には観察されない（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。加えて、ふらつき／めまいが数例認められるが、薬物を中止することで解消される。主に高「治療」用量のＤＦＭＯ（＞１．０ｇ／ｍ２／日）を用いた研究で、および主として過去に化学療法を受けたことのある癌患者または骨髄損傷を有する患者において、血小板減少症が報告された。ＤＦＭＯ治療と関連する毒性は一般に、その他の型の化学療法ほど重度でないが、限られた臨床試験において、それは用量依存的に血小板減少症を促進することが見出されている。さらに、ラットでの試験は、ＤＦＭＯを１２日間持続輸注すると、対照と比較して、血小板数が有意に低下することを示している。他の研究においても、血小板減少症がＤＦＭＯの継続的ｉ．ｖ．治療による主要な毒性であるという、同様の観察がなされた。これらの知見は、ＤＦＭＯが巨核球の骨髄前駆体のＯＤＣ活性を有意に阻害し得ることを示唆している。ＤＦＭＯは上皮創傷治癒のような、増殖性の修復プロセスを阻害し得る。
【００９５】
第３相臨床試験で、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）とスリンダクまたは適合するプラセボを用いた３６ヶ月間の処置後の腺腫性ポリープ再発を評価した。一時的な難聴がＤＦＭＯ処置の既知の毒性であり、そのため一連の空気伝導聴力を解析するための包括的アプローチが開発された。一般化された推定式で、周波数での反復測定による対象内の相関を把握しつつ空気伝導純音閾値の変動に関して処置群間の平均差を推定した。対象２９０名に基づき、プラセボで処置された対象と比較して、ＤＦＭＯ＋スリンダクで処置された対象間の、ベースライン値、年齢、および周波数で補正した平均差は０．５０ｄＢであった（９５％信頼区間、−０．６４〜１．６３ｄＢ；Ｐ＝０．３９）。通常の会話音域の５００〜３，０００Ｈｚでは、推定される差は０．９９ｄＢ（−０．１７〜２．１４ｄＢ；Ｐ＝０．０９）と検出された。用量強度の情報は、モデルに加えられなかった。試験された全範囲にわたり、連続した２つ以上の周波数でベースラインから少なくとも１５ｄＢの聴力低下となった対象は、ＤＦＭＯ＋スリンダク群では１５１人中１４人（９．３％）、およびプラセボ群で１３９人中４人（２．９％）であった（Ｐ＝０．０２）。処置終了後、少なくとも６ヶ月目に実施された経過観察での空気伝導検査から、処置群間で聴力閾値の修正平均差１．０８ｄＢ（−０．８１〜２．９６ｄＢ；Ｐ＝０．２６）が示された。プラセボ群と比較して、ＤＦＭＯ＋スリンダク群において臨床的に有意な聴力低下となった対象の割合に有意差はなかった。この薬物への暴露による聴覚毒性の推定される寄与危険度は８．４％（９５％信頼区間、−２．０％〜１８．８％；Ｐ＝０．１２）であった。プラセボ処置の患者と比較して、ＤＦＭＯ＋スリンダク処置の患者の平均閾値の差は、＜２ｄＢであった。この試験の結果は、ＭｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８においてより詳細に議論されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９６】
ＩＶ．ＮＳＡＩＤ
ＮＳＡＩＤは、ステロイドでない抗炎症性薬である。抗炎症性作用に加えて、それらは、鎮痛作用、解熱作用、および血小板阻害作用を有する。それらは主として、慢性関節炎状態の処置、ならびに疼痛および炎症と関連する特定の軟部組織障害の処置に用いられる。それらは、アラキドン酸をプロスタグランジンの前駆体である環状エンドペルオキシドに変換するシクロオキシゲナーゼを阻害することにより、プロスタグランジンの合成を遮断することによって作用する。プロスタグランジン合成の阻害が、それらの鎮痛作用、解熱作用、および血小板阻害作用の主な要因であり、その他のメカニズムもそれらの抗炎症性効果に寄与し得る。特定のＮＳＡＩＤはまた、リポキシゲナーゼ酵素またはホスホリパーゼＣを阻害し得、またはＴ−細胞の機能を調整し得る（ＡＭＡ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  Ａｎｎｕａｌ，１８１４−５，１９９４）。
【００９７】
アスピリン、イブプロフェン、ピロキシカム（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、インドメタシン（Ｎａｒｉｓａｗａ，１９８１）、およびスリンダク（Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）を含む非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、ＡＯＭ処置ラットモデルにおいて結腸癌の発症を効果的に阻害する。ＮＳＡＩＤはまた、活性化されたＫｉ−ｒａｓを有する腫瘍の発生を阻害する（Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ，１９９５）。ＮＳＡＩＤは、腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導を介して発癌を阻害すると考えられる（Ｂｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕ，１９９６；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ｂ）。複数の試験は、アポトーシスの誘導を含むＮＳＡＩＤの化学防護特性が、プロスタグランジン合成を阻害するそれらの能力の機能であることを示唆している（ＤｕＢｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕ，１９９６；Ｖａｎｅ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔｉｎｇ，１９９７で再考されている）。しかし試験は、ＮＳＡＩＤが、プロスタグランジン−依存性および−非依存性メカニズムの両方を通して作用し得ることを示す（Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ａ；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｈａｎｉｆ，１９９６）。ＮＳＡＩＤスリンダクの代謝産物であるスリンダクスルホンは、ＣＯＸ阻害活性を欠く、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導し（Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ｂ）、発癌の複数のげっ歯類モデルにおいて腫瘍発生を阻害する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，１９９７ａ）。
【００９８】
ヒト臨床試験において、幾つかのＮＳＡＩＤの効果が検査された。イブプロフェンの第２ａ相試験（１ヶ月）が完了し、３００ｍｇ／日の用量でさえも、扁平粘膜におけるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）レベルの有意な減少が認められた。３００ｍｇ用量のイブプロフェンは非常に低用量であり（治療用量は１２００〜３０００ｍｇ／日以上）、長期の使用においても毒性が認められる可能性が低い。しかし、動物化学防護モデルにおいて、イブプロフェンは、他のＮＳＡＩＤよりも効果が低い。
【００９９】
Ａ．スリンダクおよびその主要な代謝産物である、スリンダクスルホンおよびスリンダクスルフィド
スリンダクは、以下の化学名：（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−（（４（メチルスルフィニル）フェニル）メチレン）１Ｈ−インデン−３−酢酸を有する、非ステロイド系抗炎症性インデン誘導体である（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９９）。インビボにおいてスルフィニル部分は可逆的な還元によりスルフィド代謝産物へと変換され、そして不可逆的な酸化によりスルホン代謝産物（エクシスリンド）へと変換される。全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，２５８，８４５号を参照されたい。スリンダクは、Ｋｉ−ｒａｓの活性化をも阻害し、２つの異なる分子へと代謝され、それらはＣＯＸを阻害する能力において異なるが、両方ともアポトーシスの誘導を介して化学防護効果を発揮し得る。スリンダクスルホンはＣＯＸ阻害活性を欠き、プロスタグランジン合成とは独立した様式でアポトーシスの誘導をおそらく促進する。入手可能なエビデンスは、スルフィド誘導体が生物活性化合物のうちの少なくとも１つであることを示す。これに基づき、スリンダクはプロドラッグと見なされ得る。
【０１００】
スリンダク（クリノリル（登録商標））は、例えば１５０ｍｇおよび２００ｍｇ錠として入手可能である。成人への最も一般的な投与量は１５０〜２００ｍｇを１日２回であり、最大１日用量は４００ｍｇである。経口投与後に、約９０％の薬が吸収される。空腹時の患者においては約２時間で、そして食事と共に投与された場合には３〜４時間でピーク血漿レベルに達する。スリンダクの平均半減期は７．８時間であり、スルフィド代謝産物の平均半減期は１６．４時間である。全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第３，６４７，８５８号および同第３，６５４，３４９号は、スリンダクの調製物を含む。
【０１０１】
スリンダクは、変形性関節症、関節リウマチ、硬直性脊椎炎、急性痛風、および急性肩部痛の徴候および症状の急性および長期間の軽減のために適応される。スリンダク（１日あたり４００ｍｇ）によって発揮される鎮痛効果および抗炎症効果は、アスピリン（１日あたり４ｇ）、イブプロフェン（１日あたり１２００ｍｇ）、インドメタシン（１日あたり１２５ｍｇ）、およびフェニルブタゾン（１日あたり４００〜６００ｍｇ）による効果と同等である。スリンダクの副作用としては、ほぼ２０％の患者における軽度の胃腸作用が挙げられ、腹痛および悪心が主訴である。ＣＮＳの副作用が、最大で１０％の患者において認められ、眠気、頭痛、および神経過敏が主訴であると報告されている。皮膚発疹およびかゆみが、５％の患者に生じる。スリンダクを用いた慢性処置は、出血、潰瘍形成、および穿孔のような重篤な胃腸毒性を引き起こす可能性がある。
【０１０２】
癌、特に大腸ポリープ、の化学防護のためのスリンダクの潜在的使用は、十分に研究されてきた。近年の２つの特許（米国特許第５，８１４，６２５号および同第５，８４３，９２９号）には、ヒトにおける、スリンダクの潜在的な化学防護的使用が詳述されている。両方の特許が、全体として参照により本明細書に組み入れられる。米国特許第５，８１４，６２５号において請求されたスリンダクの用量は、１日あたり１０ｍｇ〜１５００ｍｇの範囲であり、好ましい用量は１日あたり５０ｍｇ〜５００ｍｇである。しかし、より高用量での、化学防護における単一薬剤としてのスリンダクの使用に関わる最も大きな問題は、周知の毒性および不耐性への中程度に高いリスクである。６０歳を超える対象においては副作用の発生率がより高いことから、高齢者は特に脆弱であると思われる。この年齢群が大腸癌を発生する可能性が最も高く、それゆえ化学防護からの利益を最も受けやすいことに留意されたい。
【０１０３】
Ｂ．ＮＳＡＩＤの併用
様々なＮＳＡＩＤの併用もまた、様々な目的のために使用される。２つ以上のＮＳＡＩＤを低用量で使用することにより、高用量の個々のＮＳＡＩＤと関連する副作用または毒性を低減できる。例えば、幾つかの実施形態において、スリンダクをセレコキシブと共に使用できる。幾つかの実施形態において、ＮＳＡＩＤの一方または両方が、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である。単独または併用で用いられ得るＮＳＡＩＤの例としては、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ジクロフェナク、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、およびエトリコキシブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
Ｖ．ＤＦＭＯ／スリンダク併用療法
低用量で併用して投与された化学防護薬の前臨床研究は、付加的な毒性をほとんど伴わずに腺腫を予防する顕著な有効性を示し、腺腫再発予防のリスク対利益比を改善する戦略を示唆する。
【０１０５】
上述の通り、Ｍｉｎ（多重腸新生物）マウスは、ＦＡＰと共通の変異型ＡＰＣ／ａｐｃ遺伝子型を有し、ヒトＦＡＰ患者に関する有用な実験動物モデルとなる（Ｌｉｐｋｉｎ、１９９７）。Ｍｉｎマウスは、生後１２０日目までに、胃腸管全体に１００を超える胃腸腺腫／腺癌を発症する可能性があり、ＧＩ出血、閉塞、および死亡に至る。ＤＦＭＯとスリンダクの併用療法が、これらのマウスにおける腺腫の減少に効果的であることが示された（米国特許第６，２５８，８４５号；Ｇｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ，    ２００４）。
【０１０６】
ＶＩ．多型解析
患者のＯＤＣ１の遺伝子型は、実施例部分に記載される具体的方法を含む、以下に示される方法を用いて決定され得る。これらの方法は、当業者によって適用される分子生物学の原理および技術を用いて、さらに改変および最適化され得る。そのような原理および技術は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）で教示される。一塩基多型（ＳＮＰ）の同定に用いられる一般的な方法を、以下に示す。Ｋｗｏｋ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ（２００３）およびＫｗｏｋ（２００１）による参考資料に、これらの方法のうちの幾つかについての概要が示されており、これらの参考資料は両者とも、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０７】
ＯＤＣ１に関係するＳＮＰは、任意のこれらの方法またはその適切な改良の使用によって特徴づけられ得る。そのような方法としては、部位の直接的もしくは間接的なシーケンシング、部位の各アレルが制限部位を作製もしくは破壊するような制限酵素の使用、アレル特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用、多型の異なるアレルによってコードされるタンパク質に特異的な抗体の使用、または任意のその他の生化学的解釈が挙げられる。
【０１０８】
Ａ．ＤＮＡシーケンシング
多型の特徴づけに一般的に用いられる方法は、多型に隣接する遺伝子座および多型を含む遺伝子座のダイレクトＤＮＡシーケンシングである。そのような解析は、「サンガー法」（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）としても知られる「ジデオキシ介在性連鎖停止法（ｄｉｄｅｏｘｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）」、または「マクサム・ギルバート法」（Ｍａｘａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）としても知られる「化学的分解法」により遂行できる。所望の遺伝子の回収を容易にするために、ポリメラーゼ連鎖反応のような、ゲノム配列特異的増幅技術と組み合わせたシーケンシングを用いることができ（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；欧州特許出願第５０，４２４号；欧州特許出願第８４，７９６号、欧州特許出願第２５８，０１７号、欧州特許出願第２３７，３６２号；欧州特許出願第２０１，１８４号；米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，５８２，７８８号；および同第４，６８３，１９４号）、上記全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０９】
Ｂ．エキソヌクレアーゼ抵抗性
多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するために用いられ得る他の方法では、特殊なエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体が使用される（米国特許第４，６５６，１２７号）。多型部位のすぐ３’側のアレル配列に相補的なプライマーが、調査中のＤＮＡにハイブリダイズされる。ＤＮＡ上の多型部位が存在する特定のエキソヌクレオチド抵抗性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含む場合、その誘導体はポリメラーゼによりハイブリダイズされたプライマーの末端に組み入れられる。そのような組み込みがプライマーをエキソヌクレアーゼによる開裂に対して抵抗性にし、それによってその検出を可能にする。エキソヌクレオチド抵抗性誘導体の同一性が公知であるため、ＤＮＡの多型部位中に存在する特定のヌクレオチドを決定できる。
【０１１０】
Ｃ．マイクロシーケンシング法
ＤＮＡ中の多型部位をアッセイするための、いくつかの他のプライマーが誘導する組み込み手順が、記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｓｏｋｏｌｏｖ，１９９０；Ｓｙｖａｎｅｎ  １９９０；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｐｒｅｚａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｕｇｏｚｚｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｎｙｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。これらの方法は、多型部位での塩基を識別するために、標識されたデオキシヌクレオチドを組み込むことに基づいている。シグナルは組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドの解析中に生じる多型は、解析の長さに比例するシグナルを生じる（Ｓｙｖａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０１１１】
Ｄ．溶液中での伸長
仏国特許第２，６５０，８４０号およびＰＣＴ出願ＷＯ９１／０２０８７号では、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するための、溶液ベースの方法が議論されている。これらの方法によれば、多型部位のすぐ３’側のアレル配列に相補的なプライマーが使用される。その部位のヌクレオチドの同一性は、プライマーが多型部位のヌクレオチドに相補的な場合プライマーの末端に組み込まれる標識されたダイデオキシヌクレオチド誘導体を用いて決定される。
【０１１２】
Ｅ．ジェネティックビット分析または固相伸長（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）
ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１５７１２号では、標識されたターミネーターと多型部位の３’側の配列に相補的なプライマーとの混合物を使用する方法が記載されている。組み込まれる標識ターミネーターは、評価される標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドに相補的であり、したがって同定される。この場合、プライマーまたは標的分子は、固相に固定される。
【０１１３】
Ｆ．オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）
これは、異なる方法論を用いる別の固相法である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。標的ＤＮＡの１本の鎖に隣接する配列にハイブリダイズできる２つのオリゴヌクレオチドが、使用される。これらのオリゴヌクレオチドの一方はビオチン化され、他方は検出可能に標識される。厳密に相補的な配列が標的分子中で見出される場合、オリゴヌクレオチドは、それらの末端が隣接し、ライゲーション基質を生成するようにハイブリダイズする。ライゲーションにより、アビジンを用いる標識オリゴヌクレオチドの回収が可能になる。この方法に基づき、ＰＣＲと組み合わされた、他の核酸検出アッセイもまた記載されている（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。この方法では、ＰＣＲが標的ＤＮＡの指数関数的増幅を達成するために用いられ、その後、標的ＤＮＡがＯＬＡを用いて検出される。
【０１１４】
Ｇ．リガーゼ／ポリメラーゼを介するジェネティックビット分析
米国特許第５，９５２，１７４号には、同じく標的分子に隣接する配列にハイブリダイズできる２本のプライマーを含む方法が記載される。ハイブリダイゼーション産物は、標的が固定される固相担体上に形成される。この方法では、単一ヌクレオチドの間隔でプライマー同士が分離されるように、ハイブリダイゼーションが起こる。ポリメラーゼ、リガーゼ、および少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸混合物の存在下でこのハイブリダイゼーション産物をインキュベートすることで、ハイブリダイズされた隣接するオリゴヌクレオチドの任意の対のライゲーションが可能になる。リガーゼを添加することにより、シグナルの生成に必要な２つのイベント、伸長およびライゲーションが生じる。これは、伸長またはライゲーションのいずれかを単独で用いる方法よりも高い特異性および低い「ノイズ」をもたらし、ポリメラーゼによるアッセイとは異なり、この方法は、固相に結合されるシグナルのための二回目のハイブリダイゼーションおよびライゲーションステップとポリメラーゼステップを組み合わせることにより、ポリメラーゼステップの特異性を高める。
【０１１５】
Ｈ．侵入開裂反応（Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）
侵入開裂反応は、特定の多型について細胞ＤＮＡを評価するために用いられ得る。ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）と呼ばれる技術が、そのような反応を利用している（例えば、参照により組み入れられる、ｄｅ  Ａｒｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。一般に、１）標的部位の上流のオリゴヌクレオチド（「上流オリゴ」）、２）標的部位を覆うプローブオリゴヌクレオチド（「プローブ」）、および３）標的部位を有する一本鎖ＤＮＡ（「標的」）、の３種類の核酸分子がある。上流オリゴおよびプローブは重複しないが連続する配列を含む。プローブは、フルオレセインなどのドナーフルオロフォア、およびＤａｂｃｙｌなどのアクセプター色素を含む。上流オリゴの３’末端にあるヌクレオチドは、プローブ−標的デュプレックスの最初の塩基対と重複する（「侵入する」）。その後、プローブは、フルオロフォア／クエンチャー対の分離を生じる構造−特異的５’ヌクレアーゼにより開裂され、これにより検出され得る蛍光量が増加する。Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照されたい。幾つかの例において、アッセイは固相表面上でまたはアレイ形態で実施される。
【０１１６】
Ｉ．ＳＮＰを検出する他の方法
多型の検出および同定のための複数の他の具体的方法を以下に示すが、これらの方法は、そのまま用いることができ、または本発明のＯＤＣ１の多型の同定と併せて適切な改良を施して用いることができる。複数の他の方法はまた、ワールドワイドウェブのＮＣＢＩのＳＮＰウェブサイト、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰにも記載されており、このサイトは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１７】
特定の実施形態においては、集団における任意の所与の遺伝子座で拡張されたハプロタイプが決定され、これによりどのＳＮＰが余剰であり、どのＳＮＰが関連する試験に必須であるかを厳密に同定できる。関連する研究に必須なＳＮＰは、「ハプロタイプ・タグＳＮＰ（ｈｔＳＮＰ）」と称され、遺伝子または連鎖不均衡な領域のハプロタイプを捕らえるマーカである。方法の例としては、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）およびＫｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｏｎ（２００３）を参照されたい。
【０１１８】
ＶＤＡ−アッセイは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ試薬およびその他の標準的反応条件を用いるロングＰＣＲ法によるゲノムセグメントのＰＣＲによる増幅を利用する。ロング増幅は、約２，０００〜１２，０００ｂｐのＤＮＡサイズを増幅し得る。産物の変異検出アレイ（ｖａｒｉａｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ａｒｒａｙ）（ＶＤＡ）へのハイブリダイゼーションは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒにより実施され、コンピュータ化ソフトウエアで解析され得る。
【０１１９】
チップアッセイと呼ばれる方法は、標準的ＰＣＲまたはロングＰＣＲプロトコルによる、ゲノムセグメントのＰＣＲ増幅を利用する。ハイブリダイゼーション産物は、ＶＤＡにより解析される（参照により本明細書に組み入れられる、Ｈａｌｕｓｈｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９））。ＳＮＰは一般に、ハイブリダイゼーションパターンのコンピュータ解析に基づいて「確実な」または「可能性がある」に分類される。ヌクレオチドシーケンシングなどの別の検出方法との比較により、この方法により「確実な」ＳＮＰが１００％の確率で確認され、「可能性がある」ＳＮＰが、７３％の確率で確認された。
【０１２０】
他の方法は単に、ＰＣＲでの増幅と、続く関連する制限酵素での消化を含む。さらに別の方法は、既知のゲノム領域由来の精製ＰＣＲ産物のシーケンシングを含む。
【０１２１】
さらに別の方法において、個々のエクソンまたは大きなエクソンの重複する断片が、ＰＣＲ増幅される。プライマーは発表された配列またはデータベース配列から設計され、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は公知の条件を利用して実施される。サーマルサイクリングを実施し、得られたＰＣＲ産物を様々な条件下で、例えば１５％の尿素を含み、５％グリセロールを含む、または含まない５または１０％  ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＰＣＲ−一本鎖高次構造多型分析（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）により分析する。電気泳動を、一晩で実施する。移動度のシフトを示すＰＣＲ産物を再度増幅し、シーケンシングして、ヌクレオチド変異を同定する。
【０１２２】
ＶＩＩ．医薬製剤および投与経路
本開示の治療化合物は、様々な方法、例えば、経口または注入（例えば皮下、静脈内、腹腔内など）によって投与され得る。活性化合物は、投与経路に応じて、化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を防御する材料でコーティングされ得る。それらは、疾患部位または創傷部位の持続的潅流／輸注によっても投与され得る。
【０１２３】
治療化合物を非経口投与以外で投与するために、化合物をその不活化から防御する材料でコーティングすること、または材料と同時投与することが必要であり得る。例えば、治療化合物は、適切な担体、例えばリポソームまたは希釈剤の中で患者に投与され得る。医薬的に許容し得る希釈剤としては、生理的食塩水および水溶性緩衝液が挙げられる。リポソームとしては、水中油中水型ＣＧＦエマルジョンおよび従来のリポソームが挙げられる（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。
【０１２４】
治療化合物はまた、非経口的、腹膜内、髄腔内、または大脳内に投与され得る。分散体が、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で、調製され得る。貯蔵および使用の通常条件下では、これらの調製物は、微生物の生育を予防する防腐剤を含有し得る。
【０１２５】
注射可能な使用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散体、および滅菌注射可能な溶液または分散体の即時調製用の滅菌粉末を含む。いずれの場合にも、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的でなければならない。組成物は、製造および保管条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現され得る。多くの場合、組成物中に、例えば糖、塩化ナトリウム、またはマンニトールおよびソルビトールなどの多価アルコールなどの等張剤を含むことが好ましい。組成物に吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含むことによって、注入可能な組成物の長期吸収が実行され得る。
【０１２６】
滅菌注入可能溶液は、必要量の治療化合物を、先に列挙された成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に組み込むこと、そして必要に応じて次にろ過滅菌することにより、調製され得る。一般に分散剤は、治療化合物を、基本的な分散媒体および先に列挙されたものの他の必要な成分を含有する滅菌担体中に組み込むことにより調製される。滅菌注入可能溶液調製用の滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それは有効成分（即ち、治療化合物）と予めろ過滅菌された溶液からの任意のさらなる所望の成分を加えた粉末を生じる。
【０１２７】
治療化合物は、例えば不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に、経口投与され得る。治療化合物およびその他の成分は、硬殻もしくは軟殻ゼラチンカプセル中に封入され、錠剤に打錠され、または対象の食事に直接組み込まれてもよい。経口治療投与の場合、治療化合物は、賦形剤と共に組み込まれ得、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの剤型で使用され得る。当然のことながら、組成物および調製物中の治療化合物の割合％は、様々であり得る。そのような治療上有用な組成物中の治療化合物の量は、適切な投与量が得られるような量である。
【０１２８】
投与を容易にするためおよび投与量を均一にするために、非経口組成物を、単位投与剤形に配合することが、特に有利である。本明細書で用いられる単位投与剤形は、処置される対象への単一投与量として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の治療化合物を含有する。本発明の単位投与剤形についての仕様は、（ａ）治療化合物の特有の性質および実現される特定の治療効果、ならびに（ｂ）患者における選択された疾病の処置のためにそのような治療化合物を配合することにおける、当技術分野に内在する制約、によって左右され、それらに直接依存する。
【０１２９】
治療化合物はまた、皮膚、目、または粘膜に局所投与され得る。あるいは、肺への局所送達が望ましい場合には、治療化合物は、乾燥粉末またはエアロゾル配合剤中で吸入によって投与され得る。
【０１３０】
活性化合物は、患者の疾病と関連する疾病を処置するのに十分な治療有効投与量で投与される。例えば、化合物の有効性は、実施例および図表に示されたモデル系など、ヒトの疾患を処置する際の有効性を予測し得る動物モデル系において評価され得る。
【０１３１】
対象に投与される本開示の化合物、または本開示の化合物を含む組成物の実際の投与量は、年齢、性別、体重、疾病の重篤度、処置される疾患の型、過去または同時の治療的介入、対象の特発性および投与経路など、物理的および生理学的因子により決定され得る。これらの因子は、熟練の技術者により決定され得る。投与を担う施術者が、組成物中の有効成分（複数可）の濃度、および個々の対象に適した用量（複数可）を典型的には決定するであろう。投与量は、任意の合併症のイベントにおいて各医師によって調整され得る。
【０１３２】
典型的には有効量は、１日または数日間で、１日あたり１回または複数回の投与で、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇで変動し得る（当然のことながら、投与様式および先に議論された因子に依存する）。他の適切な用量範囲としては、１日あたり１ｍｇ〜１００００ｍｇ、１日あたり１００ｍｇ〜１００００ｍｇ、１日あたり５００ｍｇ〜１００００ｍｇ、および１日あたり５００ｍｇ〜１０００ｍｇが挙げられる。幾つかの特定の実施形態においては、その量は、１日あたり１０，０００ｍｇ未満であり、１日あたり７５０ｍｇ〜９０００ｍｇの範囲である。
【０１３３】
有効量は、１ｍｇ／ｋｇ／日未満、５００ｍｇ／ｋｇ／日未満、２５０ｍｇ／ｋｇ／日未満、１００ｍｇ／ｋｇ／日未満、５０ｍｇ／ｋｇ／日未満、２５ｍｇ／ｋｇ／日未満または１０ｍｇ／ｋｇ／日未満であり得る。あるいはそれは、１ｍｇ／ｋｇ／日〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内であり得る。例えば、糖尿病患者の処置に関しては、単位投与量は、非処置対象と比較して、血糖値を少なくとも４０％減少させる量であり得る。別の実施形態においては、単位投与量は、血糖レベルを非糖尿病対象の血糖レベルの±１０％まで減少させる量である。
【０１３４】
他の非限定的な例において、用量は、１投与あたり、約１マイクログラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重、約１０マイクログラム／ｋｇ体重、約５０マイクログラム／ｋｇ体重、約１００マイクログラム／ｋｇ体重、約２００マイクログラム／ｋｇ体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ体重、約５００マイクログラム／ｋｇ体重、約１ミリグラム／ｋｇ体重、約５ミリグラム／ｋｇ体重、約１０ミリグラム／ｋｇ体重、約５０ミリグラム／ｋｇ体重、約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約２００ミリグラム／ｋｇ体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ体重、約５００ミリグラム／ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれを超え、およびそれから誘導される任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙された数値から誘導される範囲の非限定的例において、先に記載された数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ体重などの範囲が、投与され得る。
【０１３５】
特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の本開示の化合物を含み得る。他の実施形態においては、本開示の化合物は、単位の重量の約２％〜約７５％の間、または約２５％〜約６０％の間、およびそこから誘導される任意の範囲を含み得る。
【０１３６】
薬剤の単回または反復投与も、企図される。反復投与での送達の場合の所望の時間間隔は、日常的実験のみを利用して、当業者によって決定され得る。一例として、対象は、およそ１２時間間隔で、１日２回投与され得る。幾つかの実施形態において、薬剤は１日１回投与される。
【０１３７】
薬剤（複数可）は、日常的スケジュールで投与され得る。本明細書で用いられる日常的スケジュールは、所定の設定された期間を指す。日常的スケジュールは、スケジュールがあらかじめ決定される限り、長さが同一であるまたは異なる期間を包含し得る。例えば、日常的スケジュールは、１日２回、毎日、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週に１回、月に１回またはこれらの間で設定された任意の日数または週での投与を含み得る。あるいは、所定の日常的スケジュールは、第１週では１日２回、その後数ヶ月にわたっては１日１回、などの投与を含み得る。他の実施形態においては、本発明は、薬剤（複数可）が経口で摂取され得ること、およびその時期が食事摂取に依存する、または依存しないことを条件とする。したがって、例えば、対象が食事を済ませているか、または後に食事するかにかかわらず、毎朝および／または毎晩、薬剤が摂取され得る。
【０１３８】
ＶＩＩＩ．併用療法
効果的な併用療法は、両方の薬剤を含む単一の組成物もしくは薬理学的配合剤によって、または１つの組成物が本発明の化合物を含み、かつもう一方が第二の薬剤（複数可）を含む、同時に投与される２つの別個の組成物もしくは配合剤によって実現され得る。あるいは治療は、数分〜数ヶ月の範囲内の間隔で、他の薬剤での処置の前に、またはその後に行われ得る。
【０１３９】
「Ａ」が第一の薬剤（例えば、ＤＦＭＯ）を表し、そして「Ｂ」が第二の薬剤（例えば、スリンダク）を表すなどの、様々な組み合わせを用いることができ、それらの非限定的な例を以下に記載する：
Ａ／Ｂ／Ａ          Ｂ／Ａ／Ｂ          Ｂ／Ｂ／Ａ          Ａ／Ａ／Ｂ        Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ａ／Ａ          Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ      Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ    Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ      Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ      Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ      Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ      Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ      Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ
Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ      Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ      Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１４０】
ＸＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示された技術が、本発明を実施する上で十分に機能する、本発明者により発見された技術を表し、したがって技術の実践の好ましい様式を構成すると見なされ得ることは、当業者に認識されなければならない。しかし、本開示に照らして、本発明の主旨および範囲を逸脱することなく、開示された具体的実施形態に多くの変更を施すことができ、それでもなお同様のまたは類似の結果を得ることができることを、当業者は理解しなければならない。
【０１４１】
材料と方法
オリゴヌクレオチド。ＤＮＡオリゴマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎから購入した（表１）。全てのオリゴマーを、二重蒸留水に４℃で一晩溶解して、最終濃度をおよそ１００μＭにした。溶媒和されたＤＮＡを、３５００Ｄａ分子量カットオフ膜を用いて二重蒸留水により４℃で一晩透析して、全ての短い断片を除去した。オリゴマーを９５℃に加熱して、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃによるＮａｎｏｄｒｏｐ  １０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、分光光度法で濃度を測定した。ε２６０を、最近傍法で計算した（最終濃度＝（Ａ２６０×１０６）／ε２６０）。
【表２】
2017519770.tif 000007
大文字は、ＯＤＣ  ＋２６３の位置でのＧからＴへの変移を示す。下線のひかれた太字は、Ｇ４の形成に関わり得るグアニン反復である。ＯＤＣ  ＳＮＰ  ＋２６３による１つのグアニン反復の破壊に留意されたい。５８のヌクレオチドの各配列が、３つのヌクレオチドに隣接されている。
【０１４２】
円二色性（ＣＤ）および熱安定性（Ｔｍ）分光法。一本鎖ＤＮＡ試料（５μＭ）を、異なる濃度のＫＣｌまたはＮａＣｌおよび／またはＮＳＣ１７６３２７（Ｃ１４）の存在下または非存在下にて、Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０６）で希釈した。その後、試料を９５℃に加熱して、室温まで緩やかに冷却した。二本鎖条件では、ＤＮＡのＧリッチおよびＣリッチ鎖を、９５℃への加熱によりアニーリングして、鎖をＴＭに急冷し、その温度で５分間保持し、Ｑｕｉａｇｅｎ  ＰＣＲ機器（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  Ｑ  Ｓｅｒｉｅｓソフトウエア）中で１℃／分で室温まで冷却した。試料を、組換えヒトＳｐ１タンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ、パート番号Ｅ６３９Ａ）５３０ｎｇの存在下または非存在下で０または１００ｍＭ  ＫＣｌに分割して、ｄｓＤＮＡアニーリング温度に再度加熱し、その後、再度緩やかに放冷した。ＣＤスペクトルデータを、１ｍｍ光路長の水晶セルを用いるＪａｓｃｏ−８１０分光旋光計で、１秒の応答時間で記録した。各試料を、２００〜３５０ｎｍの範囲内での３回の平均的スキャンにより処理して、結果を緩衝液および塩によるシグナル寄与に関してベースライン補正した。熱融解（ＴＭＳ）を、Ｊａｓｃｏ  ＣＤ機器により２６３ｎｍにて、４℃〜９０℃で測定した（加熱速度２℃／分）。
【０１４３】
ＥＭＳＡ（電気泳動移動度シフトアッセイ）。ＤＮＡオリゴマーを、異なる濃度のＫＣｌまたはＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ酢酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０６）中、室温で１時間インキュベートした。ＤＮＡオリゴマーの二次構造を、９５℃で１０分間加熱し、その後、室温まで冷却して、非変性１２％ポリアクリルアミドゲルにロードした。ＤＮＡの電気泳動を、ＴＢＥ緩衝液中、２１７Ｖで実施した。電気泳動に続いて、ゲルをＧｅｌｓｔａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎで染色して、ＵＶ  Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒで視覚化した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエア（ＮＩＨ、メリーランド州ベセスダ所在）を用いて、バンド密度を半定量し、それらの値を化学種全体に対する割合％に換算した。
【０１４４】
プラスミド。ＯＤＣ１プロモータ／イントロン１レポータ構築物を、過去に発表されたプラスミドから調製した（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。部位特異的突然変異誘発を利用して、ＯＤＣ１  ＋２６３をＧからＴに変換して、ｐＧＬ３  ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マジソン所在）中に再度クローニングした。ＯＤＣ１レポータ構築物は、全てのＥボックスエレメントを含むＯＤＣ１を１．６ｋｂ含んだ。ｃ−ＭＹＣおよびＳｐ１の過剰発現実験では、ＯＤＣ１  ｐＧＬ３−ベーシックプラスミドを、ｐｃＤＮＡ３．０（ベクター対照）またはｐｃＤＮＡ３−ｃ−ＭＹＣ発現ベクター（Ｒｉｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）  （Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１６０１１）のいずれか、およびｐＮ３−エンプティーベクター対照（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２４５４４）  または全長Ｓｐ１  ＦＬ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２４５４３）（Ｓａｐｅｔｓｃｈｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）とコトランスフェクトした。
【０１４５】
トランスフェクション実験。ＨＣＴ１１６細胞を、２４ウェルプレートでトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの２４時間前に０．１×１０６細胞／ウェルで播種した。各ウェルを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．５μＬを製造業者の使用説明書に従って使用して各プラスミド０．２５μｇおよびＲｅｎｉｌｌａ−ＴＫプラスミド０．０２５μｇでトランスフェクトした。Ｒｅｎｉｌｌａ−ＴＫプラスミドをＰｒｏｍｅｇａから購入し、全てのプロモータ−レポータトランスフェクション実験で、トランスフェクション効率対照として用いた。過剰発現実験では、ＯＤＣ１  ｐＧＬ３−ベーシックまたはエンハンサプラスミドを、対応するプラスミド：ｐｃＤＮＡ  ３．０エンプティーベクター、ｐｃＤＮＡ３−ｃ−ＭＹＣ発現ベクター（Ｒｉｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１６０１１）、全長ｐＮ３−Ｓｐ１ＦＬ（Ｓａｐｅｔｓｃｈｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２４５４３）、ｐＮ３−エンプティー対照（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２４５４４）、Ｎ−末端変異体ｐＰａｃ−Ｓｐ１（Ｃｏｕｒｅｙ  ａｎｄ  Ｔｊｉａｎ，  １９８８）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１２０９５）、およびｐＰａｃ０エンプティーベクター（Ｃｏｕｒｅｙ  ａｎｄ  Ｔｊｉａｎ，  １９８８）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１２０９４）とコトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後に、培地を、抗生物質が存在しない新しい通常培地と交換した。２４時間後に、細胞をＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解した。二重ルシフェラーゼ活性を、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ＴＤ−２０／２０ルミノメータを用いて製造業者により記載された通り測定し、相対的ルシフェラーゼ単位として表した。実験は三重測定で実施し、少なくとも２回繰り返して、二標本ｔ検定を利用して統計学的有意性（Ｐ＜０．０５）について解析した（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）。
【０１４６】
ノックダウン実験。サイレンサーで選択されたｓｉＲＮＡを用いて、Ｓｐ１タンパク質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４３９２４２０）を、ｓｉＲＮＡスクランブル陰性対照＃１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４３９０８４３）と共に、製造業者の使用説明書に従ってノックダウンした。
【０１４７】
遺伝子型判定。ＳＮＰ遺伝子型判定を、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ｉＰＬＥＸを用いて過去に記載された通り実施した（Ｇａｂｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰ遺伝子型判定を、パイロシーケンシングを利用するＥｐｉｇｅｎＤｘにより実施した。ハプロタイプを、ＰＨＡＳＥソフトウエア（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、およびＤ’値に結びつけられた信頼度に基づくデフォルトアルゴリズム（Ｇａｂｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）を利用するＨａｐｌｏｖｉｅｗ（Ｂａｒｒｅｔｔ，  ２００９；  Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）を用いて構築した。
【０１４８】
ポリアミン測定。細胞を０．２Ｎ  ＨＣｌＯ４中で均質化した。酸可溶性および酸不溶性画分を用いて、それぞれ細胞内ポリアミンおよびタンパク質量を測定した。ポリアミンを含有する酸可溶性画分を、過去に記載された通り、逆相イオン対ＨＰＬＣを用いて分離した（Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。ポリアミン値は、ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質として表す。
【０１４９】
ウェスタンブロット解析。培養中の９０％コンフルエント細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液に溶解して、タンパク質を１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。タンパク質をＨｙｂｏｎｄ−Ｃ膜に電気転写させた。膜を、Ｂｌｏｔｔｏ  Ａ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝生理食塩溶液中のブロッキンググレードの５％脱脂粉乳）を用いてブロックし、Ｂｌｏｔｔｏ  Ａ中で１：５００に希釈した一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてプローブした。一次抗体を、４℃で一晩または室温で２時間インキュベートし、その後、適切な西洋わさびペルオキシダーゼ・タグ二次抗体（１：２０００  希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて化学発光検出を行い、Ｂｉｏｍａｘ  ＸＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）に露光した。
【０１５０】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）および共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）アッセイ。ＣＨＩＰおよびｃｏ−ＩＰアッセイを、製造業者によって推奨された通りＣｈＩＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔプロトコル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃１７−２９５）を用いて実施した。手短に述べると、細胞を１％ホルムアルデヒドで処置してＤＮＡとタンパク質を架橋させ、ＤＮＡ−タンパク質複合体を２００〜１０００ｂｐの長さへと超音波処理により破壊した。溶解物を、プロテアーゼ阻害剤を含む免疫沈降希釈緩衝液により１０倍に希釈した。Ｓｐ１、ｃ−ＭＹＣに対する抗体および対照ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてクロマチンを沈降させ、さらなる試料は正常なＩｇＧ対照として放置した。試料を回転させながら、４℃で一晩免疫沈降させた。サケ精子ＤＮＡ／プロテインＡアガローススラリー６０μｌを添加して回転させながら４℃で１時間インキュベートし、その後、軽く遠心分離（１０００ｒｐｍで１分間）することにより、免疫複合体を得た。プロテインＡアガロースペレットを、低塩緩衝液、高塩緩衝液、ＬｉＣｌ緩衝液およびＴＥ緩衝液で洗浄した。次に、複合体試料をｃｏ−ＩＰまたはＣｈＩＰ分析用に分割した。ｃｏ−ＩＰ分析では、２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液  ２５μｌを添加して、１０分間沸騰させた。その後、希釈されたインプット試料（１：１０）および対照を含む試料２０μＬを、ウェスタンブロット用に１２．５％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルにロードした。ＣｈＩＰ分析では、溶出緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、１％  ＳＤＳ）２５０μＬを２回添加することにより試料を溶出させて、インプットＤＮＡおよび対照を含む全ての試料を６５℃で４時間加熱することにより、ＤＮＡタンパク質架橋を０．２Ｍ  ＮａＣｌで反転させた。ＤＮＡをｄｄＨ２Ｏ  ３０μＬ中に再懸濁した。ＰＣＲ産物およびそれらのサイズの視覚化では、標準的なＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲに用いられたＯＤＣ１プライマー配列は、５’−ＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）および５’−ＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であった。
【０１５１】
実施例１−オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ１）遺伝子におけるＧ四重鎖構造での遺伝的変異性の機能的結論
ＯＤＣ１プロモータ領域は、ホルモン、成長因子、および腫瘍プロモータ、例えばエンハンサＥボックス、ｃＡＭＰ応答エレメント、ＣＡＡＴおよびＬＳＦモチーフ、ＡＰ−１およびＡＰ−２部位、ＧＣリッチＳｐ１／Ｓｐ３結合部位、ＷＴ１、ならびにＴＡＴＡボックスへの応答における転写制御を可能にする複数の配列を含む（Ｐｅｇｇ，  ２００６）。ＯＤＣ１は、転写開始部位（ＴＳＳ）に対して−４００〜＋４００ｂｐの領域に３つのＭＹＣ結合エレメント（Ｅボックス）を有する。ポリアミン誘導性核ｃ−ＭＹＣはＭＡＸと相互作用し、この複合体はＥボックス配列（ＣＡＣＧＴＧ）に結合して、ＯＤＣ１などの標的遺伝子の転写を活性化し、こうしてポリアミン生合成を促進する（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。転写抑制因子ＭＡＤ１／ＭＡＸもまたこれらのエレメントに結合して、増殖性細胞中のＯＤＣ１の転写レベルを調節する（Ｐｅｇｇ，  ２００６；  Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。
【０１５２】
ポリアミン代謝は大腸癌および皮膚上皮癌発症の予防のための確証済みの経路であり（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）、神経芽細胞腫およびＦＡＰについて臨床試験が継続中であるが、ポリアミンがそれらの腫瘍形成作用を誘発するメカニズムは、ほとんど理解されていない（Ｐａｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。転写開始部位（ＴＳＳ）の３１６ヌクレオチド下流に位置しＧ／Ａ変異を有するヒトＯＤＣ遺伝子中の一塩基多型ｒｓ２３０２６１５は、プロモータ／イントロン１領域中の２つのコンセンサスＥボックスに隣接されており、第三のＥボックスの５ヌクレオチドだけ上流にある（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。臨床的関連が、異なる試験によりＳＮＰ  ＋３１６と大腸腺腫（ＣＲＡ）再発リスクとの間で、特にアスピリンユーザにおいて（Ｐｅｇｇ，  ２００６；  Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、および散発性大腸癌（ＣＲＣ）との間で（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）確定された。
【０１５３】
ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰは、ＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰの５３ヌクレオチド上流にあり、Ｓｐ１結合部位を計算上破壊するＴ／Ｇ塩基転換を有し、潜在的なＧ四重鎖（Ｇ４）形成配列中に位置する。グアニンに富む核酸配列は、３つ以上の連続したグアニンの４つ以上の連続から、Ｇ４と呼ばれるＤＮＡ二次構造を形成し得る。Ｇ４が転写レベルで遺伝子調節に直接関与し得ることが、提案されている。遺伝子のプロモータ領域および第一のイントロン（ＴＳＳから−５００〜＋５００塩基）は、ゲノムの残り部分に比較してＧ４モチーフが著しく豊富である（Ｈｕｐｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  ２００５；  Ｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｍａｉｚｅｌｓ，  ２００８）。ＯＤＣ１イントロン１は、推定Ｇ４形成配列となる１つまたは複数の塩基によって分離される３つの隣接するグアニンの９つの連続を含む（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。Ｇ４の平面コアは、一連のＧカルテット、最も多くは３つのカルテットであり、そのそれぞれは、それらが各縁に沿って２つの水素結合を形成し得るように４回回転対称で配列される、４つのグアニン塩基からなる。これらの構造は、その後、らせん方式で互いに重なり、折り畳みパターン（単分子、二分子または四分子）、ループ長および方向性（平行、逆平行または混合）において極めて多様なＧ４構造を形成し（Ｈｕｐｐｅｒｔ，  ２００８；  Ｂｒｏｏｋｓ，  １９８８）、それらを特異的な薬物ターゲッティングを推定的に受け易くしている（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。Ｇ４は、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｋｉｔ、およびＫＲＡＳ（自己充足性）；ｐ５３（非感受性）；Ｂｃｌ−２（アポトーシスの回避）；ＶＥＧＦ−Ａ（血管新生）；ｈＴＥＲＴ（無制限な複製）；ならびにＰＤＧＦ−Ａ（転移）など（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）、癌に関与する遺伝子の転写を調節する（Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  ２０１１；  Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  ２０００）。これらの二次構造の提案された機能は遺伝子転写を改変することであり、ポリメラーゼ失速により遺伝子転写を抑制するまたは転写を遮断する（抑制因子の動員により）または促進するもしくは刺激するかのいずれかである（Ｂｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。近年になり、Ｇ４形成が、インビボでゲノム全体について検討され、ゲノム中でのそれらの存在が確認された（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。ゲノム全体の分析から、遺伝子転写におけるＧ４  ＤＮＡの調節的役割、およびＧ４形成配列に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）が個体間での遺伝子発現に影響を及ぼすことが明らかとなった（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｂａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。Ｇ４形成プロモータ／イントロンは少数の多形部位を有し、それらは、Ｇ４コア部分を進化的に欠いており、このことがＧ４構造の破壊に最も強い影響を有する（Ｂａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。小分子は、発癌遺伝子の転写抑制を観察すると、Ｇ４構造を安定化でき、腫瘍学における新興の治療ターゲットであり、���−ＭＹＣ（Ｑｉｎ  ａｎｄ  Ｈｕｒｌｅｙ，  ２００８）などの発癌遺伝子の発現を減少させる新規の抗癌戦略であり得る（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。ｃ−ＭＹＣ発癌遺伝子は、ＯＤＣ１の転写を活性化し、大腸癌と戦う包括的戦略として提案された（Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【０１５４】
転写因子（Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、およびＳｐ４）の特異性タンパク質／クルッペル様因子（Ｓｐ／ＫＬＦ）ファミリーは、これらの因子のＤＮＡ結合ドメインを形成している３つの保存されたＣｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーの特定の組み合わせによって一体となっている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。Ｓｐ１およびＳｐ３は哺乳動物細胞内で遍在的に発現され、ＤＮＡ結合ドメイン内の９０％を超える配列相同性を共有するが、Ｓｐ２およびＳｐ４は制限された発現パターンを有する（Ｄａｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。Ｓｐ１およびＳｐ３は同じ同族ＤＮＡエレメント（ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ）に結合するが、それらは特に後期発達段階で著しく異なった機能を有するが、それらの機能は早期発達では余剰である（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。Ｓｐ１はＧ４形成エレメントに結合する重要な転写因子であり（Ｔｏｄｄ  ａｎｄ  Ｎｅｉｄｌｅ，  ２００８；  Ｒａｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）、遺伝子調節の可能なメカニズムを示唆する。Ｓｐ１およびＳｐ３の両者が動員されて、転写開始複合体、ヒストン修飾酵素およびクロマチンリモデリング複合体を含む多数のタンパク質と相互作用でき、このことはＳｐ１およびＳｐ３がクロマチンのリモデリングおよび遺伝子発現の調節において重要な転写因子であることを強く示唆する（Ｄａｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【０１５５】
化学防護の臨床的関連を説明する分子メカニズムを理解するために、大腸癌発症におけるＯＤＣ１中の他のＳＮＰの意義を理解する包括的検査が実施された（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰでの多型は、それらが接近していることによって関係する可能性がある。ＤＦＭＯ／スリンダク癌予防試験に参加した患者１９６名において４９のＳＮＰ頻度が確認され（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、参加者のおよそ１０％のマイナーアレル頻度を有する１１のＳＮＰ、および９０％より多くを占める限定的なコモンハプロタイプが同定された。ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰは、観察された頻度を、臨床試験の参加者の主な２群に分割した。加えて、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰは、ＤＦＭＯ／スリンダク試験の参加者の正常組織におけるベースラインでの遺伝子型によって、統計学的に有意なＯＤＣ律速生成物プトレッシンレベルを予測した。したがってＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰは、ＯＤＣ１関連の臨床転帰およびＯＤＣ１  ＋２６３遺伝子型によるプトレッシンレベルの予測を説明する遺伝子転写調節の新規な分子メカニズムに関与する可能性がある。ここでは、Ｇ４形成およびその安定性におけるＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰの役割、およびＳｐ１転写因子がＯＤＣ１の転写調節にどのような役割を担うかが、検査された。
【０１５６】
ＯＤＣ１イントロン１は、Ｇ四重鎖二次構造を形成する。＋２６３アレルに依存するＯＤＣ１発現における転写の差のための潜在的メカニズムを説明するために、より高次のＤＮＡ構造が検討された。計算的研究から、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰがＧ４形成配列内に位置し、Ｓｐ１転写因子結合部位を破壊することも、それぞれＱｕａｄｐａｒｓｅｒ（Ｈｕｐｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  ２００５）およびＰＲＯＭＯソフトウエア（Ｍｅｓｓｅｇｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｆａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）を用いて予測された。推定Ｇ四重鎖形成およびＳｐ１結合の両方への潜在的影響を検査するために、該当する領域のオリゴヌクレオチドを研究した（表１）。
【０１５７】
スペクトルおよび熱安定性を測定する円二色性（ＣＤ）を用いてＧ四重鎖形成を決定できる（Ｈｕｐｐｅｒｔ，  ２００８；  Ｋｙｐｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＯＤＣ１イントロン内では、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰ（６番目の連続の中の）周辺のグアニジンの９つの連続からなる、非Ｂ−ＤＮＡ構造を推定上形成し得るＧリッチ領域を含む５８のヌクレオチドを研究した（表１）。該当するＳＮＰ位置にＧまたはＴアレルのいずれかを有するオリゴマーは、平行ループを示す２６０〜２６５ｎｍ周辺および反平行ループを示す２９０〜２９５ｎｍ周辺の正のスペクトルピークによって認められる通り、任意の一価カチオンの非存在下であっても、Ｇ四重鎖構造を形成できた（図２Ａ〜Ｂ、黒色線）。Ｇ四重鎖は、テトラッドの中心にある一価カチオンによって、特に分子間および分子内構造ではそれぞれカリウムおよびナトリウムによって安定化される（Ｓｅｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  １９９０）。ＯＤＣ１  ＋２６３  Ｔ配列では、ＭＥが、ＮａＣｌまたはＫＣｌの添加により変化し、それぞれ下流および上流にシフトしたが、ピークパターンは変化しなかった（図２Ａ）。この配列の全体的な熱安定性は、ＯＤＣ１  ＋２６３  Ｇよりも低く、ＴＭが４９℃であり、これはＮａＣｌ（−２℃ΔＴＭ）またはＫＣｌ（＋１℃ΔＴＭ）のいずれかの添加により名目上変化した（表２）。１００ｍＭ  ＫＣｌまたはＮａＣｌの添加は、ＯＤＣ１  ＋２６３  Ｇオリゴヌクレオチドのモル楕円率（ＭＥ）を上昇させた（図２Ｂ）。特にＮａＣｌは、ＭＥのわずかな上昇を伴い平行ピークと反平行ピークをより明確に区別し、ＫＣｌは、ＭＥをより頑強に上昇させて、反平行ピークよりも平行ピークの振幅を著しく増加させた。これらのカチオンそれぞれの添加は、熱安定性の変化とも一致した。任意のカチオンが存在しなければ、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＧオリゴのＴＭは６１℃であった。ＮａＣｌの添加は、−１１℃ΔＴＭを誘導し、ＫＣｌは、＋４℃ΔＴＭをもたらした（表２）。したがって、ＯＤＣ１  ＋２６３の両配列は、Ｇ四重鎖形成に特徴的なシグネチャピークを示し、任意の一価カチオンの非存在下であっても先の生理学的熱安定性を有した。一価カチオンの添加は、Ｔ対Ｇ＋２６３アレルでのＧ四重鎖形成および安定性に対してより顕著な影響を有した。
【表３】
2017519770.tif 000008
【０１５８】
ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰはＧ四重鎖安定性に影響を及ぼす。一本鎖Ｇリッチ配列は、４つの別のＤＮＡ鎖（四分子間）、２つの別のＤＮＡ鎖（二分子間）、または１つのＤＮＡ鎖（単分子内）からの形成を含む、複数のコンフォメーションを採用する能力を有する。単分子内Ｇ４は、生物学的に関連する組成物またはアイソフォームである。ＯＤＣ１イントロン１によって形成されたＧ４が分子内であるか、または分子間であるかを決定するために、ＫＣｌまたはＮａＣｌの非存在下および存在下で異なる配列の電気泳動移動度および熱安定性を、電気泳動移動度アッセイ（ＥＭＳＡ）を用いて分析した。＋２６３  ＧまたはＴオリゴヌクレオチドのいずれかで、一価カチオンの非存在下であっても、そしてＣＤデータと一致して、分子間および分子内の両方のＧ四重鎖形成のエビデンスが存在する（図４および６Ａ〜Ｂ）。特にＴアレルでは、化学種のわずか２％が直線形態で存在し、８１％が分子内構造であり、１７％および１％が、それぞれ二分子間および四分子間形態である。同様にＧアレルでは、直線形態がわずか１％であり、分子内形態が８１％、二分子間および四分子間構造が、それぞれ１９および１％である。
【０１５９】
Ｔアレルでは、ＫＣｌおよびＮａＣｌは、四分子または直線分布を変化させず、むしろ二分子間の種をそれぞれ２５％および４８％に選択的に増加させて、分子内形態の分布を変化させるよう機能する（両者は頻度をそれぞれ６９％および４７％に低下させる）。Ｇアレルでは、ＮａＣｌの添加は類似の結果を生じ、主として二分子間の種で３６％へと増加し、および分子内形態で６１％へと減少する。ＫＣｌによりかなり著しい変化があり、二分子間形態が全てのバンド母集団の６％に減少し（およそ７０％の減少）、同時に分子内形態が９４％に増加する。これらのデータは、上記のＣＤデータ、ならびに分子内構造を支持するＫＣｌの傾向、および分子間形態を促進するＮａＣｌの傾向と一致する。さらにＣＤ、およびＥＭＳＡから得られた差示的な平衡安定性から、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＴアレルよりもＧアレルでのＧ四重鎖構造の高い安定性、およびより生物学的関連のある分子間の種を形成するより高い性向が確認される。
【０１６０】
全結合化合物（ｐａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）ＮＳＣ１７６３２７でのＧ四重鎖形態の安定性。形成された任意の高次ＤＮＡ構造を強く増強するために、全Ｇ四重鎖安定化活性を有する化合物ＮＳＣ１７６３２７を用いて、ＣＤスペクトルおよび熱安定性実験を実施した。これらの実験のそれぞれを、１０ｍＭ  ＫＣｌの存在下で実施して、Ｇ四重鎖形態を平衡化させた。Ｇ四重鎖ピークを示す確定済みのＣＤスペクトルが、５μＭ  ＮＳＣ１７６３２７の非存在下および存在下で観察された（図５）。＋２６３  ＴおよびＧアレルの両方のＧ四重鎖ピークのモル楕円率が、１０ｍＭ  ＫＣｌおよび化合物の存在下で約１／３低下したが、熱安定性はそれぞれ７５℃および６８℃に上昇し、言い換えると名目ΔＴＭがそれぞれ、ＤＭＳＯで一致させた実験よりも＋１４および１１℃増加する（表３）。
【０１６１】
次に、ＮＳＣ１７６３２７の影響、およびＯＤＣ１遺伝子内のＧ四重鎖の推定される安定性を、＋２６３  ＴおよびＧプラスミドを用いてインビボで検査した。ＨＣＴ１１６大腸癌細胞をＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰプラスミドでトランスフェクトして、２４時間ＩＣ５０である２μＭ  ＮＳＣ１７６３２７の存在下で生育させた。ＮＳＣ１７６３２７によるＧ四重鎖構造の安定化は、２４時間でＯＤＣ１ルシフェラーゼレポータ発現の統計学的に有意な（Ｐ＜０．０１）減少をもたらした（図１０）。時間を一致させたＤＭＳＯに標準化されたＮＳＣ１７６３２７の影響は、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＴおよびＧでそれぞれ４７．５％および４３．６％の低下である。その同程度の安定化は、エクスビボでの知見と一致する。ＮＳＣ１７６３２７の使用は細胞生存率の変化なしにホタル・およびレニラ・ルシフェラーゼの読み取りの減少に関連したが、形態学的に明白な変化が観察されたことに言及するのは重要である。
【表４】
2017519770.tif 000009
２６２〜２６４ｎｍでの平行Ｇ四重鎖ピークの安定性を、加熱速度２℃／分（４℃から９０℃へ）にて、応答時間１秒で測定した。全ての配列は、それらの一致させた非薬物処置条件との関連でＮＳＣ１７６３２７薬物安定化を示した。
【０１６２】
ＯＤＣ１  Ｇ四重鎖構造は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）で形成され、Ｓｐ１転写因子がＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰ依存的方式でＧ四重鎖構造を古典的Ｂ形態のＤＮＡにシフトさせた。転写的変化の潜在的メカニズムは、Ｓｐ１転写因子の結合を含むＧ四重鎖形態による可能性がある。Ｇ四重鎖形態に及ぼすＳｐ１タンパク質の影響を、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のＯＤＣ１  ＋２６３でのＴおよびＧアレルを用い、１００ｍＭ  ＫＣｌで誘導される複合型Ｇ四重鎖条件で検査した。ｄｓＤＮＡ配列は両者とも古典的Ｂ形態のＤＮＡ  ＣＤスペクトルを形成し、正のモル楕円率ピークが２８０ｎｍに、負のピークが約２５０ｎｍに存在した（図７Ａ〜Ｂ、実線）。１００ｍＭ  ＫＣｌの存在下では（複合型Ｇ四重鎖）、特有の古典的ｄｓＤＮＡピークが２６０〜２６５ｎｍピークにシフトし、それはＣＤ一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）実験で観察されたような、Ｇ四重鎖構造の形成と一致した（図７Ａ〜Ｂ、破線）。Ｇ四重鎖形成配列におけるＳｐ１転写因子の役割に取り組むために、１００ｍＭ  ＫＣｌの存在下または非存在下でのＣＤ実験で、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＴおよびＧアレル含有ｄｓＤＮＡ配列と共に組換え精製ヒトＳｐ１タンパク質  ５３０または２１５ｎｇを添加した。誘導されたＧ四重鎖中のＳｐ１の付加は、Ｓｐ１の両方の濃度でＧ四重鎖の特徴的ピークを維持した（図７Ａ〜Ｂ、白色および黒色三角形）。＋２６３  Ｔ配列において、両方のピークは複合型Ｇ四重鎖ピークよりも低かった。代わって＋２６３  Ｇ配列では、より高濃度のＳｐ１（５３０ｎｇ）がＧ四重鎖ピークを、１００ｍＭ  ＫＣｌのみを用いた場合よりも大幅に安定化した。ｄｓＤＮＡＯＤＣ１  ＋２６３  ＴまたはＧ含有試料は、Ｓｐ１濃度に応じて異なる程度の安定化を有する。Ｓｐ１タンパク質  ５３０ｎｇを添加した場合、両方のアレルは、ＤＮＡの古典的Ｂ形態およびＧ四重鎖形態を反映するピークを示した（図７Ａ〜Ｂ、黒色の円形）。これに対して、Ｓｐ１タンパク質２１５ｎｇをＯＤＣ１  ＋２６３  Ｔアレルに添加した場合、ｄｓＤＮＡまたはＧ四重鎖構造のいずれかの特徴的ピークを示さなかった。これに対して、＋２６３  Ｇアレルは２６３ｎｍに向かって誘導されたピークを形成し、モル楕円率が２／３低下しても、Ｇ四重鎖形態を示していた。
【０１６３】
Ｇ４形態、安定性の差、およびＳｐ１結合部位の破壊がインビボでＯＣＤ１の転写調節に機能的意義を有するか否かを理解するために、トランスフェクション実験を大腸細胞株で実施した。２つのアイソジェニックＯＤＣ１プロモータ／イントロン１ルシフェラーゼプラスミドを、ＯＣＤ１  ＋２６３でのＧまたはＴのいずれか、およびＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰでのＡアレルを含んで作製した。過去の試験は、ＯＤＣ１  ＋３１６  Ａアレルの臨床的および機能的関係、ならびに表現型とのその関連を示した（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
【０１６４】
Ｓｐ１単独によるＧ四重鎖安定化の影響を、ＨＣＴ１１６細胞でさらに試験した。Ｓｐ１発現をダウンレギュレートする遺伝子操作を利用して、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＧおよびＴアレルプラスミドからのルシフェラーゼ発現の変化を検査した。Ｓｐ１のダウンレキュレーションは、ＯＣＤ１プラスミドでのルシフェラーゼ活性の差をもたらした（図３および１１）。＋２６３  Ｔアレルでは、スクランブルｓｉＲＮＡと比較して非統計学的に有意なルシフェラーゼ増加（Ｐ＞０．００１）が観察された。これに対して、＋２６３  Ｇでは、スクランブルｓｉＲＮＡと比較して統計学的に有意な増加（Ｐ＝０．００１）が観察され、ルシフェラーゼ活性において１１５％増加を示した。ダウンレギュレーションをウェスタンブロットで確認し、Ｓｐ１発現における６０％減少が、２種のランダムスクランブルｓｉＲＮＡまたは非処置細胞との比較で観察された。加えて、全長Ｓｐ１タンパク質を、哺乳動物発現ベクター（ｐＮ３）を用いて過剰発現させた。Ｓｐ１タンパク質は、影響を有さないか、またはＯＤＣ１発現を有意にダウンレギュレートしなかった（図１１）。対照実験において、Ｔアレル駆動性レポータは、確証済みのスクランブルｓｉＲＮＡまたはエンプティー発現ベクターのいずれかでのＧアレル駆動性レポータよりも多くのルシフェラーゼを生成した。Ｇ四重鎖とｄｓＤＮＡとの平衡がＳｐ１タンパク質の濃度に依存的であったインビトロデータと合わせて考慮すると、Ｓｐ１タンパク質の過剰発現はＯＤＣ１プロモータ駆動性プラスミドを、より高濃度のＳｐ１タンパク質に応答しないｄｓＤＮＡ状態で維持した。これに対して、Ｓｐ１発現のノックダウンは、ｄｓＤＮＡよりもＧ四重鎖コンフォメーションを優先した。Ｇ四重鎖コンフォメーションは、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＴまたはＧアレルのＧ四重鎖安定性に応じて、ＯＤＣ１駆動性ルシフェラーゼの発現を抑制すると思われる。
【０１６５】
これらの結果はＯＤＣ１の転写調節におけるＧ四重鎖の役割を示唆する。ＯＤＣ１  ＋２６３でのグアニンまたはチミンと、大腸癌患者における機能的または生物学的転帰との間に相関が存在するならば、患者におけるＯＤＣ１発現を低下させるＯＤＣ１特異性Ｇ四重鎖安定化剤を開発するための好機が存在する。
【０１６６】
実施例２−イントロン１多型は、協同してＯＤＣ１転写プロモータ活性および大腸腺腫のリスクを調整する
ここでは、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰの遺伝的変異性を、機能的に分析する。この位置でのＧからＴへの塩基転換は、Ｇ四重鎖ＤＮＡ二次構造とＳｐ１結合部位の両方の安定性を調整して、ＯＤＣ１の転写を機能的に調整できる（実施例１参照）。このＳＮＰの機能的寄与を、単独でおよび過去に試験されたＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰと共にの両方で試験し、ならびに表現型とのその関連も試験した。両方のＳＮＰは、大腸の化学防護試験の参加者で最も頻繁な、限定的なコモンハプロタイプを決定した。ＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰまたは任意のジプロタイプではなく、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰは、機能性をさらに確証するＤＦＭＯ／スリンダク臨床試験の参加者においてプトレッシンレベルを予測できる。ＯＤＣ１  ＋２６３  ＴＴ遺伝子型は、より高いポリアミンレベルおよびより良好な、ＤＦＭＯ／スリンダク処置への応答に関連する。加えて、両方のＳＮＰが、ｒｓ２３０２６１６でのＳｐ１結合部位とｒｓ２３０２６１５隣接Ｅ−ボックス周辺のｃ−ＭＹＣ結合部位とを含む、Ｓｐ１とｃ−ＭＹＣとのタンパク質−タンパク質相互作用によってＯＤＣ１転写活性を調整するように協同することを示すエビデンスが、示されている。
【０１６７】
ＯＤＣ１のコモンハプロタイプは主としてＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰ（ｒｓ２３０２６１６）によって決定される。ＯＤＣ１遺伝的変異性の包括的研究が、大腸癌化学防護のＤＦＭＯ／スリンダク臨床試験の参加者１９６名で実施された。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＭａｓｓＡＲＲＡＹプラットフォームを利用して、４９のＳＮＰの頻度を確認した。加えて、アレル特異性プローブ識別法を利用して、過去の遺伝子型判定法では不可能であったＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰでの遺伝子型を決定した。存在する高ＧＣ環境（ｈｉｇｈ  ＧＣ  ｃｏｎｔｅｘｔ）が、過去に報告された通り遺伝子型判定の難しさに寄与した（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。１２のＳＮＰが、ほぼ１０％以上のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）で同定された（表４）。ＰＨＡＳＥソフトウエアを用い、ハプロタイプを、臨床的遺伝子型判定データおよびｄｂＳＮＰＣＥＰＨデータベースを利用して構築した（表５）。ＯＤＣ１での同じ限定的なコモンハプロタイプ構造が両方のデータ源を利用して決定され、個体の９０％よりも多くを占める。ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰのみが、ハプロタイプ構成を、ＯＤＣ１イントロン１をさらに分割しない２つのより大きな群に細分できた。具体的には、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰはハプロタイプ構造を、ポリープ形成者の臨床試験の全参加者の２５．５％および３０．１％を占める、そして正常ＣＥＰＨ参照母集団の４０．９％および１３．６％を占める二群に分割した。これらの２つのハプロタイプは、合わせて試験集団の半数よりも多くを占め、よく特徴づけられたＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰでＧアレルを共有する（表５、ハプロタイプＡとＢの比較）。イントロン９での第三のＳＮＰであるｒｓ７５５９９７９は、これらの２つのハプロタイプのより大きな方（ハプロタイプＢ、表５）をＣハプロタイプへとさらに細分し、ＣハプロタイプはＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰ（ｒｓ２３０２６１６）でＧアレルを共有し、治験参加者において１８．４％およびＣＥＰＨデータベースにおいて２２．７％の頻度で生じる（表５、ハプロタイプＢとＣの比較）。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗソフトウエアを用いて構築された連鎖不平衡ブロック構造は全てのＳＮＰを同じブロックへとグループ化し、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰ（ｒｓ２３０２６１６）の例外はＯＤＣ１アレル構造での選択圧が異なる遺伝子座でのアレルの非無作為な関連を維持することを示唆した。
【表５】
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ＳＮＰの遺伝子型判定は、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ｉＰＬＥＸを用いて実施した。ＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３遺伝子型判定は、パイロシーケンシングを用いるＥｐｉｇｅｎＤｘにより実施した。
【表６】
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１番はＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３であり、２番はＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋３１６である。ＤＦＭＯ／スリンダク臨床試験（上）および公的データベースＣＥＰＨ（下）からの「アグレッシブコール」のＳＮＰを、ＰＨＡＳＥおよびＨａｐｌｏｖｉｅｗソフトウエアを用いて調整して、最も一般的なハプロタイプを予測した。＊Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＭａｓｓＡＲＲＡＹプラットフォームでは不可能であり、ＰＣＲ−ピロシーケンシングで再度、遺伝子型判定した。
【０１６８】
異時性腺腫、ＤＦＭＯ／スリンダクでの処置への応答、およびポリアミンレベルに関係するＯＤＣ１ハプロタイプおよびジプロタイプ。臨床試験参加者またはＣＥＰＨ遺伝子型のいずれかを利用したハプロタイプ構成は、＋２６３でのＯＤＣ１中のＴアレルとＯＤＣ１  ＋３１６でのＡアレルとの同時出現を同定できず；結果は、この組み合わせが起こるならば、それは＞０．５％（１を、ＣＥＰＨ＋臨床試験の合計で割る）で存在することを示唆する。ＤＦＭＯ／スリンダク臨床試験参加者におけるＯＤＣ１  ＋３１６遺伝子型の分布は、過去に１３０ＧＧ（５５．８％）、８８ＧＡ（３７．８％）、および１５ＡＡ（６．４％）と報告されている（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。ここで、ＯＤＣ１  ＋２６３遺伝子型の分布は、１２２ＧＧ（５２．１％）、９０ＴＧ（３８．５％）、および２２ＴＴ（９．４％）であった。ＤＦＭＯ／スリンダク臨床試験参加者４６３名からのデータは、ＧＧ（Ｎ＝２１７、４６．９％）、ＴＧ（Ｎ＝１２９、２７．９％）、およびＧＡ（Ｎ＝１１７、２５．２％）のＯＤＣ１  ＳＮＰ  ２６３−３１６ハプロタイプを示した。ＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋３１６に関する優性モデル（ＧＧ対ＧＡ／ＡＡ）を利用して、遺伝子型と、異時性腺腫へのＤＦＭＯ／スリンダク処置との統計学的に有意な相互作用が過去に示された（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。Ｇアレルのホモ接合性の個体は、Ａアレルのホモ接合性またはヘテロ接合性の個体よりも、処置後の腺腫再発の低いリスクを有した（ｐ＜０．０００１；図１３Ｂおよび表７下）。同じ解析をＯＤＣ１  ＳＮＰ  ＋２６３について実施した場合、類似の関連が観察された（図１３Ａおよび表７上）。遺伝子型による層化は、優性モデルを用いる処置について統計学的に有意な利益を示した。
【０１６９】
劣性モデルを用いて、遺伝子型による層化は、＋２６３での２つのＴＴアレルを有する個体において、任意のＴ保有者に比較して、処置の統計学的に有意な利益を示した（Ｐ＝０．０００１）。＋３１６および＋２６３で観察された処置応答の修飾が協同的に作用しているか否かを決定するために、ハプロタイプを＋２６３および＋３１６ならびに処置応答に基づいて評価した。ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６ジプロタイプの分布（２６３：２６３−３１６：３１６）は、５３ＧＧ−ＧＧ（２２．８％）、５６ＴＧ−ＧＧ（２４．１％）、３３ＴＧ−ＧＡ（１４．２％）、５５ＧＧ−ＧＡ（２３．７％）、２０ＴＴ−ＧＧ（８．６％）、および１４ＧＧ−ＡＡ（６．０％）であった。参加者１名のみがジプロタイプＴＧ−ＡＡを有することが見出され、その参加者を解析から除外し、ＴＴ−ＡＡまたはＴＴ−ＧＡを有する参加者は見出されなかった。幾つかのジプロタイプは、ＯＤＣ１  ＋２６３または＋３１６に先祖のアレルを有さないため、それらの頻度はより低いと予測される。加えて、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰの両方についてリスク対利益比のより良好な導出が見出され（図１４および表８）、それはＤＦＭＯ／スリンダクによる化学防護のよりよい決定を可能にする。各ジプロタイプ群の標本サイズが小さかったため、統計学的有意性を結論付けるための十分な統計力はなかった。ジプロタイプそのものの緩やかな効果がプラセボおよび処置群で観察され、それは、異時性腺腫のリスク減少および増加にそれぞれ関連している。各群の利益対リスク比と合わせて考慮すると、処置に関するより良好な決定が、ＤＦＭＯ／スリンダク化学防護の利用でなされ得る。
【０１７０】
次に、ＯＤＣ１  ＋２６３および／または＋３１６での遺伝的変異性が、治験参加者の正常組織生検におけるポリアミンレベルと関連するか否かを評価した。ＯＤＣ１  ＋２６３および／または＋３１６における遺伝的変異性がＯＤＣ１の転写調節において重大な役割を担うならば、定常的な組織ポリアミン量はＯＤＣ１  ＋２６３もしくは＋３１６でのアレル構造に依存し、またはこの２つのＳＮＰの間の比較的強いつながりのエビデンスがあるとすれば、定常的な組織ポリアミン量は両方での配列に依存する。ＯＤＣ１  ＋３１６遺伝子型は、組織プトレッシン濃度またはスペルミジンｖｓスペルミン比のいずれかに統計学的に関連しなかった（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。これに対して、ＯＤＣ１  ＋２６３を評価した場合、ベースライン組織プトレッシンレベルと＋２６３遺伝子型との間に、統計学的に有意な関連が見出された。劣性モデルにおいて、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＴＴ遺伝子型保有者は、ＧＧ／ＧＴの保有者よりも高いポリアミンレベルを有した（Ｐ＜０．０１５）（図１３Ａ〜Ｂ、１５Ａ〜Ｂ、および２２；表９および１０、上）。加えて、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６ジプロタイプおよび組織ポリアミンレベルの協同作用については、ほとんどエビデンスが見出されず、ＴＴ−ＧＧジプロタイプ保有者のみが、コモンジプロタイプＴＧ−ＧＧに比較して非有意に高いベースライン組織プトレッシン量を有した（Ｐ＝０．０８５）（図１４および１６；表９）。これらの結果は、過去に示された＋３１６  ＳＮＰに反して、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰが正常組織におけるプトレッシンプールを測定するのに重要であることを示唆する。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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正常な（腫瘍を含まない）直腸粘膜生検をベースライン時に得て、ポリアミン量を測定した。組織を０．２Ｎ過塩素酸で均質化した。ポリアミンを含有する酸可溶性画分を、逆相イオン対ＨＰＬＣを用いて分離し、酸不溶性タンパク質量に対し標準化した。
＊  平均±ＳＤのノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定から計算されたＰ値（中央値の比較）。
【表１２】
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正常な（腫瘍を含まない）直腸粘膜生検をベースライン時に得て、ポリアミン量を測定した。組織を０．２Ｎ過塩素酸で均質化した。ポリアミンを含有する酸可溶性画分を、逆相イオン対ＨＰＬＣを用いて分離し、酸不溶性タンパク質量に対して標準化した。＊  平均±ＳＤのノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定から計算されたＰ値（中央値の比較）。
【０１７１】
ＯＤＣ１アレル特異性プロモータ活性はＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰの両方の重要性を確証する。ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰはＧ四重鎖構造の安定性を調整でき、アイソジェニックルシフェラーゼレポータプラスミドを用いＯＤＣ１  ＋３１６での報告された機能的Ａアレルを用いる、転写についての機能的帰結に関連する（実施例１参照）。加えて、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰは、ＤＦＭＯ／スリンダク試験において遺伝子型による律速生成物プトレッシンを予測できる。複数の関連性試験は、ＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰを異なる大腸癌転帰および表現型と相関させるが、プトレッシンレベルとは相関させない。ＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰは転写レベルで機能的であることが示されているため、ＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰについて提案された分子メカニズムを再度評価した。両方のＳＮＰはプトレッシンレベルを予測することにおいて異なる能力を有し、それらが連鎖していることは、予測されなかった。ＯＤＣ１におけるイントロン１の＋３１６部位での遺伝的変異性は、ＳＶ４０エンハンサバックグランド（ｐＧＬ３−エンハンサ、Ｐｒｏｍｅｇａ）でＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰ  Ｇアレルを含むアイソジェニックプラスミドを用いて、転写活性を変化させると過去に報告された。これに対して、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰの役割を試験するために本明細書で用いたアイソジェニックプラスミドは、ＳＶ４０エンハンサ不含バックグランド（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ，Ｐｒｏｍｅｇａ）であった。これから、ＳＶ４０エンハンサエレメントがＯＤＣ１駆動性ルシフェラーゼプラスミドに影響を及ぼし得る可能性が生じた。ＨＣＴ１１６（図１７）およびＨＴ２９結腸癌細胞株においてこの仮説をテストするために、ＳＶ４０エンハンサの存在下および非存在下で実験を実施した。ＳＶ４０エンハンサエレメントは、ＯＤＣ１  ＋３１６  Ｇアレルに比較して、ＯＤＣ１  ＋３１６  Ａアレルの統計学的に有意な転写活性化に関与する。加えて、ｐＧＬ３−ベーシックプラスミドＯＤＣ１  ＋３１６  Ｇアレルは、ＯＤＣ１  ＋３１６  Ａアレルよりもわずかに大きくルシフェラーゼ活性を駆動した。ＯＤＣ１  ＋２６３  ＴアレルとＯＤＣ１  ＋３１６  Ａアレルのジプロタイプの存在はこれまで未知であったため、過去の試験の通り、ＯＤＣ１  ＋２６３  Ｇアレルを用いた。
【０１７２】
部位特異的突然変異誘発を利用して、ＳＶ４０エンハンサの非存在下（ｐＧＬ３−ベーシック）でのＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰおよび＋３１６  ＳＮＰの全ての組み合わせを作製した。ＨＣＴ１１６細胞において、公知のＯＤＣ１転写活性化剤であるｃ−ＭＹＣと共に４種の全てのＯＤＣ１駆動性ルシフェラーゼレポータプラスミド（ＯＤＣ１  ＋２６３  および＋３１６  ＳＮＰでそれぞれ、ハプロタイプＴＡ、ＴＧ、ＧＡ、およびＧＧ）を用い、コトランスフェクション実験を実施した（Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）（図２１）。ＴＡプロモータレポータは最も高いルシフェラーゼ活性を駆動し、ＧＧがそれに続き、ＴＧおよびＧＡは他の遺伝的バックグランドよりも低レベルで類似のルシフェラーゼ活性を示した。ｃ−ＭＹＣの添加は、ほとんど同レベルのルシフェラーゼ活性で全てのバージョンのプラスミドの活性化をもたらした。これらの観察は、Ａアレルがより高い転写活性と関連した、ＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰに関して過去に発表された作用機序およびｃ−ＭＹＣの存在下でのコトランスフェクション実験でのＯＤＣ１  ＋３１６  Ａアレル特異性と相反している。
【０１７３】
これらの観察を説明し得る分子メカニズムに取り組むために、ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞株を比較して、異なる遺伝的バックグランドを考慮する複雑な解釈を認識した。過去に報告された通り、両方の細胞株は、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰで都合の良い変異を有する（図１９Ａ）（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。したがって、ＯＤＣ１  ＋２６３  ＳＮＰでのＳｐ１結合部位の破壊は機能的な帰結を有し、他の転写因子との相互作用を仲介して、ＯＤＣ１遺伝子転写を活性化する。Ｓｐ１転写因子がラットｏｄｃ遺伝子を転写促進することが示されているため、過去のエビデンスは、上記の仮説を支持する（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。この可能性に取り組むために、Ｓｐ１およびｃ−ＭＹＣタンパク質発現を、両方の細胞株でテストした（図１９Ｂ）。いずれの細胞株も予測通りこれらの転写因子を発現した。ＣｈＩＰ実験を実施して、Ｓｐ１およびｃ−ＭＹＣの両方の転写因子が、インビボでＯＤＣ１イントロン１に結合するか否かを試験した。２００ｂｐのＯＤＣ１特異性ＰＣＲ産物により示された通り、両タンパク質は、ＨＴ２９細胞株中でＯＤＣ１イントロン１に結合した（図１９Ｃ）。これに対してＨＣＴ１１６細胞は、過去に示された通り、かなり低いＳｐ１およびｃ−ＭＹＣの結合を示した（図１９Ｃ）（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。これらの結果は、ＯＤＣ１  ＋２６３での両方のＧアレルの存在が、ＯＤＣ１  ＋２６３での唯一のＧアレルに比較して、Ｓｐ１タンパク質の結合を増進するという仮説と一致する。ｐＧＬ３−エンハンサバックグランドでのアイソジェニックＯＤＣ１  ＋３１６により過去に実証された通り、ＯＤＣ１  ＋３１６にＡアレルを有することは、ｃ−ＭＹＣタンパク質の結合を増進した。加えて、共免疫沈降実験を実施して、両方の転写因子が同じ複合体の一部であるか否かを決定した。Ｓｐ１は、ＨＴ２９細胞株でｃ−ＭＹＣと相互作用したが、ＨＣＴ１１６細胞株では相互作用しなかった（図１９Ｄ）。したがって、アイソジェニックプラスミドＯＤＣ１  ＋２６３  Ｇアレルおよび両方のＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰアレルを用いてＳＶ４０エンハンサの存在下および非存在下での過去の観察を確証するために、ＨＣＴ１１６細胞株を用いた。
【０１７４】
ＣｈＩＰおよびｃｏ−ＩＰ実験は比較的低いＳｐ１およびｃ−ＭＹＣプロモータ占有およびｃｏ−ＩＰによる相互作用の皆無を示したが、Ｓｐ１タンパク質の過剰発現およびダウンレギュレーションがＯＤＣ１転写を調整し得るかどうかを、さらに試験した。Ｓｐ１タンパク質の過剰発現は、ベーシックプラスミドでのわずかな抑制と関連し、その抑制はＳＶ４０エンハンサの存在下で消失した（図２０）。加えて、Ｓｐ１タンパク質をダウンレギュレートして、過去の観察を確証した。一致して、ＳＶ４０エンハンサの非存在下でのＳｐ１タンパク質のノックダウンによりルシフェラーゼ活性の上昇が観察された（図２０）。ＳＶ４０エンハンサの存在下では、特にＯＤＣ１  ＋３１６でのＡアレルで、Ｓｐ１タンパク質のダウンレギュレーションはルシフェラーゼ活性の上昇と関連した。これにより、ＳＶ４０エンハンサの存在はアイソジェニックプラスミドの翻訳に影響を及ぼし、このＳＶ４０エンハンサの存在がアレル特異性をもたらす、という過去の知見が確認された。
【０１７５】
Ｓｐ１転写因子のＮ末端ドメインはｃ−ＭＹＣと相互作用してＯＤＣ１転写活性化を調節する。Ｓｐ１とｃ−ＭＹＣタンパク質との相互作用を試験するために、トランスフェクションによるＯＤＣ１の転写においてそれらの影響を直接テストした。全長Ｓｐ１タンパク質、およびＮ末端ドメイン中の阻害性ドメインが欠如した変異型を、アイソジェニックベーシックプラスミドの存在下で使用した（図１８）。全長Ｓｐ１の存在下でのｃ−ＭＹＣの過剰発現は、ＯＤＣ１駆動性プラスミドからのルシフェラーゼの発現をダウンレギュレートした。これに対して、ｃ−ＭＹＣの存在下でのＳｐ１のＮ末端変異形態の使用は、ルシフェラーゼ発現のアップレギュレーションに関連した。したがって、Ｓｐ１のＮ末端ドメインとｃ−ＭＹＣとの相互作用が、ＯＤＣ１の異なる転写の結果に関与している可能性がある。アイソジェニックプラスミドでの活性化に関してアレル特異性は観察されなかったとはいえ、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  のＴＧおよびＧＡプラスミドに対するＴＡおよびＧＧプラスミドの優先性が一貫して観察された。
【０１７６】
本明細書で提示されたデータは、特にアスピリンユーザにおいて、ＯＤＣ１  ＋３１６  Ａアレルの予測効果および異時性腺腫に関する異なる臨床試験を通して観察された異なる臨床的関連を説明する。Ｂａｒｒｙら（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）の臨床試験において、試験に登録された母集団の大部分が、ＤＦＭＯ／スリンダク処置の利益を与えるがＧＧアレルを有するほど良好ではない、ＯＤＣ１  ＋２６３でのＴアレルに関するヘテロ接合性であった可能性がある。逆に、他の２つの臨床試験に登録された母集団は、ＯＤＣ１  ＋２６３でのＧＧホモ接合体のより高い提示を含み得る（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【０１７７】
本発明の知見は、癌細胞中の所与の発癌遺伝子が、正常細胞におけるその役割と比較して、所与の経路または「モジュール」においてより必須で推定的に異なる役割を担い得る、という発癌遺伝子依存の着想と一致する（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｊｏｅ，  ２００８）。統計学的に高レベルのプトレッシンがＯＤＣ１  ＋２６３  ＴＴ遺伝子型と関連することが見出され、ポリアミン経路を標的とする処置が用いられた場合に、最良の応答がこの遺伝子型で観察された。要約すると、ＯＤＣ１  ＋２６３および＋３１６  ＳＮＰの両方はＯＤＣ１の転写調節に影響を及ぼし、処置に関連するリスク／利益比のより良い導出を提供し、そして大腸腫瘍が全体的なポリアミン量に依存してポリアミンを標的とする高精度治療に対し応答性である可能性を示す。
＊    ＊    ＊
【０１７８】
本明細書に開示および請求された方法の全てが、本開示を参照して過度の実験を行わずに作成および実行され得る。本発明の組成物および方法を、好ましい実施形態に関連して記載したが、本発明の概念、主旨および範囲を逸脱することなく、変更を本明細書に記載された方法およびステップまたは方法の連続に適用し得ることは、当業者に明白であろう。より具体的には化学的におよび生理学的にいずれも関連する特定の薬剤を、同一または類似の結果を実現する本明細書に記載された薬剤で代用し得ることは、明白であろう。当業者に明白なそのような類似の置換および修正は、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の主旨、範囲および概念に含まれると思われる。
【０１７９】
参考資料
以下の参考資料は、本明細書の記載を捕捉する例示的手順または他の詳細を示す限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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Ｆｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｚｙｍｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６１（１６）：６０７３−６０８１，  ２００１．
Ｆｅｎｏｇｌｉｏ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｔｈｅ  ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ３４（Ｓ３）：８１９−８２３，  １９７４．
Ｆｏｄｄｅ，  Ｔｈｅ  ＡＰＣ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ３８（７）：８６７−８７１，  ２００２．
Ｆｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，  ＡＰＣ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ３４：１０−１８，  ２００２．
Ｇａｂｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｂｌｏｃｋｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９６：２２２５−２２２９，  ２００２．
Ｇａｂｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ｉＰＬＥＸ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２：Ｕｎｉｔ  ２．１２，  ２００９．
Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＶ４０  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ：  ｍｙｔｈ，  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｃａｕｓａｌｉｔｙ？  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２（１２）：９５７−９６４，  ２００２．
Ｇｅｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０  （ＳＶ４０）  ｅａｒｌｙ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｆｆｅｃｔｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｍＲＮＡ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８２（１６）：１１６４８−１１６５７，  ２００７．
Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｌｏｃｕｓ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｓｋｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，  ４４（３）：２１２−２１８，  ２００５．
Ｇｅｏｒｇｉａｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｏｒ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １８（５６）：７９３３−７９４０，  １９９９．
Ｇｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ，  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ｏｌｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ｎｅｗ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  ４：７８１−７９２，  ２００４．
Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｃｏｍｂａｔ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １０５９：９７−１０５，  ２００５．
Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １６３：５８−７１；  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ：２６４−２６６，  ２００３．
Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  ＪＡＭＡ，  ２７８：１２７８−１２８１，  １９９７．
Ｇｊｏｅｒｕｐ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ａｄｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １０６：１−５１，  ２０１０．
Ｇｒｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅ．  Ｃｅｌｌ，  ６６：５８９−６００，  １９９１．
Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｌｌｅｌｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６０：６３１４，  ２０００．
Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｏｄｃ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｍｏｕｓｅ  ｓｋｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６５（４）：１１４６−１１４９，  ２００５．
Ｈａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｕａｎｉｎｅ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｙｓｔ．，  ６：２４３９−２４４７，  ２０１０．
Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：  ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ，  １４４：６４６−６７４，  ２０１１．
Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｅｌｌ，  １００：５７−７０，  ２０００．
Ｈａｎｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ５２：２３７−２４５，  １９９６．
Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｒａｆ／ＥＲＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｎｖｅｒｔ  ｎｏｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２５（１０）：１５４３−１５５３，  ２００６．
Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−ＭＹＣ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＣ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８１：１５０９，  １９９８．
Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｈＭＬＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９５：６８７０−６８７５，  １９９８．
Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ，  Ｔｈｅ  ＭＹＣ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｓ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ３：１６３−１７５，  ２００３．
Ｈｉｃｋｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ．  ＤＮＡ，  ６（３）：１７９−１８７，  １９８７．
Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  Ｇ３１６Ａ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｓ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｓｐｉｒｉｎ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １４（８）：２３０３，  ２００８．
Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  Ｇ３１６Ａ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｉｓｋ．  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ．，  ２０１０．
Ｈｕｐｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３３：２９０８−２９１６，  ２００５．
Ｈｕｐｐｅｒｔ，  Ｈｕｎｔｉｎｇ  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  ９０：１１４０−１１４８，  ２００８．
Ｈｕｐｐｅｒｔ，  Ｆｏｕｒ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｒｅｖ．，  ３７：１３７５−１３８４，  ２００８．
Ｉｇａｒａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋａｓｈｉｗａｇｉ，  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ：  ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２７１：５５９−５６４，  ２０００．
Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃ−Ｍｙｃ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡｐｃＭｉｎ／＋  ｍｏｕｓｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ５（１２）：１６５８−１６６４，  ２００６．
Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ．  Ｎｕｔｒ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ６０（Ｓｕｐｐｌ．  １）：３０−３５，  ２００８．
Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｉｖｅ−ｙｅａｒ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｌｏｎｏｓｃｏｐｙ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３５９（１２）：１２１８−１２２４，  ２００８．
Ｉｓｓａ，  Ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ：  ｉｔ’ｓ  ＣＩＮ  ｏｒ  ＣＩＭＰ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １４（１９）：５９３９−５９４０，  ２００８．
Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｄ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ＡＰＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ２１（１１）：１９３５−１９４０，  ２０００．
Ｊａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７１：８７７−８９４，  ２００４．
Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ａｓ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５２：１７０８−１７１１，  １９９１．
Ｋｉｎｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＡＰ  ｌｏｃｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ５ｑ２１．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５３（５０２０）：６６１−６６５，  １９９１．
Ｋｒｏｎｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｆｅｎｇｅｒ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｍａ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  ８（６）：Ｓ８７，  １９９９．
Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃ−ＭＹＣ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ−ＷＣ  ｄｕｐｌｅｘ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３７：３３２１−３３３１，  ２００９．
Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｓｐ１．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７０：４３４１−４３４８，  １９９５．
Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｂｕｔｌｅｒ，  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｓｐ３  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  Ｓｐ１．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：２０１２−２０１９，  １９９７．
Ｋｕｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｂｙ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｔｉｚｙｍｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｄｅｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｍＲＮＡ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４７７：４９０−４９４，  ２０１１．
Ｋｙｐｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３７：１７１３−１７２５，  ２００９．
Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｒｅ  ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ４：１７９６，  ２０１３．
Ｌａｒｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  ２３（１）：８７−９５，  ２００７．
Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｓ，  ２００８：  ａ  ｊｏｉｎｔ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ｔｈｅ  ＵＳ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  １３４（５）：１５７０−１５９５，  ２００８．
Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅ，  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｐ１  ａｎｄ  Ｓｐ３  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ａｎｎ．  Ａｎａｔ．，  １９２：２７５−２８３，  ２０１０．
Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｐ１  ａｎｄ  Ｓｐ３．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８２：４６０−４７１，  ２００４．
Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｉｖｅ−ｙｅａｒ  ｃｏｌｏｎ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｌｏｎｏｓｃｏｐｙ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  １３３（４）：１０７７−１０８５，  ２００７．
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Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｐｈａ−ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩａ  ｔｒｉａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  ９３（１）：５７−５９，  ２００１．
Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｏｎ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ｍｅｎ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｙｅａｒ−ｌｏｎｇ  ｐｈａｓｅ  ＩＩｂ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，  １７（２）：２９２−２９９，  ２００８．
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Ｓｐｏｒｎ  ａｎｄ  Ｈｏｎｇ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ａｄｅｎｏｍａｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｌｉｎｄａｃ：  Ａｎ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １：９，  ２００８．
Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｅｗ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄａｔａ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ６８：９７８−９８９，  ２００１．
Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ａｎｄ  Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，  Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂａｙｅｓｉａｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｄａｔａ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ７３：１１６２−１１６９，  ２００３．
Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  １９９８−２００１．  Ｃａｎｃｅｒ，  １０７（Ｓｕｐｐｌ．  ５）：１１２８−１１４１，  ２００６．
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Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅａｔ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ，  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．  Ｊ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，  １１：１７，  ２０１２．
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Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ−１  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，  ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｆｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｕｌｉｎｄａｃ，  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｉｎｓｔ．，  １０２：１５１３−１５１６，  ２０１０．
【図１】
2017519770.tif 000021
【図２Ａ】
2017519770.tif 000022
【図２Ｂ】
2017519770.tif 000023
【図３】
2017519770.tif 000024
【図４】
2017519770.tif 000025
【図５】
2017519770.tif 000026
【図６Ａ】
2017519770.tif 000027
【図６Ｂ】
2017519770.tif 000028
【図７Ａ】
2017519770.tif 000029
【図７Ｂ】
2017519770.tif 000030
【図８Ａ】
2017519770.tif 000031
【図８Ｂ】
2017519770.tif 000032
【図９】
2017519770.tif 000033
【図１０】
2017519770.tif 000034
【図１１】
2017519770.tif 000035
【図１２】
2017519770.tif 000036
【図１３Ａ】
2017519770.tif 000037
【図１３Ｂ】
2017519770.tif 000038
【図１４】
2017519770.tif 000039
【図１５Ａ】
2017519770.tif 000040
【図１５Ｂ】
2017519770.tif 000041
【図１６】
2017519770.tif 000042
【図１７】
2017519770.tif 000043
【図１８】
2017519770.tif 000044
【図１９Ａ】
2017519770.tif 000045
【図１９Ｂ】
2017519770.tif 000046
【図１９Ｃ】
2017519770.tif 000047
【図１９Ｄ】
2017519770.tif 000048
【図２０】
2017519770.tif 000049
【図２１】
2017519770.tif 000050
【図２２】
2017519770.tif 000051
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月21日(2017.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017519770000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月7日(2017.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌腫の予防的または治療的処置のための方法において使用するための患者においてオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤であって、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）前記ＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型がＴであることを前記結果が示す場合、
（ｉ）前記患者内でオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤と；
（ｉｉ）前記第一の薬剤と組み合わせた時にポリアミン経路を調整して前記患者内で全ポリアミン量を減少させる第二の薬剤と、
を含む医薬療法の有効量を前記患者に投与すること、
を含む、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２】
前記患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ることおよび前記患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むことを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項１に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項３】
前記患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列を決定するテストから結果を得ることならびに前記患者のＯＤＣ１アレルの少なくとも１つの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３に示された配列に比較して、＋２６３位のＴの存在および＋３１６位のＧの存在に加えて、少なくとも１つの変化を含むことを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項２に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項４】
前記少なくとも１つの変化が、表Ａに同定される変化である、請求項２または３に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項５】
前記少なくとも１つの変化が、表２に同定される変化である、請求項２または３に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項６】
患者における大腸腺癌の危険因子の処置のための方法において使用するための患者においてオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤であって、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ること；および
ｂ）前記ＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型がＴであることを前記結果が示す場合、
（ｉ）前記患者内でオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤と；
（ｉｉ）前記第一の薬剤と組み合わせた時にポリアミン経路を調整して前記患者内で全ポリアミン量を減少させる第二の薬剤と、
を含む医薬療法の有効量を前記患者に投与すること、
を含み、
前記患者における新しい異常腺窩巣、新しい腺腫性ポリープまたは異形成を伴う新しい腺腫の形成を予防する、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項７】
ステップａ）が、少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋２６３位の前記患者の遺伝子型をテストすることを含む、請求項１または６のいずれかに記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項８】
前記第二の薬剤がまた、前記患者内でスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現を増加させる、請求項１または６のいずれかに記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項９】
前記患者において新しい異常腺窩巣の形成を予防する、請求項６に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１０】
前記患者において新しい腺腫性ポリープの形成を予防する、請求項６に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１１】
前記患者において異形成を伴う新しい腺腫の形成を予防する、請求項６に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１２】
前記結果が、前記遺伝子型を含む報告を受け取ることまたは前記結果を明らかにする患者の履歴を入手することにより得られる、請求項１または６のいずれかに記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１３】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の１つのアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項１または６のいずれかに記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１４】
前記テストが、前記患者のＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にあるヌクレオチド塩基を決定する、請求項１または６のいずれかに記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１５】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｔであることを示す、請求項１４に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１６】
前記結果が、ＯＤＣ１遺伝子の両方のアレルの＋２６３位にある前記患者の遺伝子型がＴ／Ｇであることを示す、請求項１４に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１７】
少なくとも１つのＯＤＣ１アレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型を決定するテストから結果を得ることおよびＯＤＣ１遺伝子の少なくとも１つのアレルの＋３１６位の前記患者の遺伝子型がＧであることを前記結果が示す場合に治療薬の有効量を前記患者に投与することをさらに含む、請求項１または６のいずれかに記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１８】
前記医薬療法が、前記テストの結果を得る前に、前記患者が前記医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に前記第一または第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項１９】
前記医薬療法が、前記テストの結果を得る前に、前記患者が前記医薬療法で、しかしより低い投与量で既に処置されていた場合に前記第一または第二の薬剤の投与量を増加させることをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２０】
前記第一の薬剤が、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２１】
前記第二の薬剤が、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含有する非アスピリンでる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２２】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である、請求項２１に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２３】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクまたはセレコキシブである、請求項２１に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２４】
前記ＮＳＡＩＤを含有する非アスピリンが、スリンダクである、請求項２３に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２５】
前記癌腫が、大腸癌、神経芽細胞腫、乳癌、膵臓癌、脳癌、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌または食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非黒色腫皮膚癌、またはグリオブラストーマである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２６】
患者内で新しい進行した大腸腫瘍の形成を予防する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２７】
患者内で聴覚毒性またはそのリスクを予防する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２８】
前記患者が、家族性腺腫性ポリープと診断されている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【請求項２９】
前記患者が、ヒトである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する剤。
【国際調査報告】
2017519770.tif 000052
2017519770.tif 000053
2017519770.tif 000054