(57)【要約】  本発明は、特にＸ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）を治療するための、特異的ｍＴＯＲ阻害剤の薬剤としての新規使用に関する。本発明はまた、Ｘ−ＡＬＤの治療および／または予防に潜在的に有用な化合物を同定するための方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるＸ−副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療および／または予防に用いられる、特異的ｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項２】
前記特異的ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシン誘導体である、請求項１に記載の用途のための特異的ｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項３】
ラパマイシン誘導体がテムシロリムスである、請求項２に記載の用途のための特異的ｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項４】
Ｘ−ＡＬＤが、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）および小児副腎白質ジストロフィー（ｃＡＬＤ）から選択される、請求項１または２に記載の用途のための特異的ｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項５】
特異的ｍＴＯＲ阻害剤と、ｍＴＯＲ非依存性のオートファジー誘発剤、抗酸化剤、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ミトコンドリア転移細孔開口の阻害剤、抗炎症剤、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、サーチュイン１アゴニストおよび抗高脂血症薬からなる群から選択される化合物とを含む組成物。
【請求項６】
前記特異的ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシン誘導体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ラパマイシン誘導体がテムシロリムスである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｍＴＯＲ非依存性のオートファジー誘発剤が、トレハロース、ラニチジン、スペルミジン、レスベラトロール、ベラパミル、ロペラミド、アミオダロン、トリフロペラジン、ミノキシジル、２’５’−ジデオキシアデノシン、タモキシフェン、フマル酸ジメチル、チアゾリジンジオン、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、ベキサロテン、フルスピリレン、トリフロペラジン、ペニトレムＡ、ピモジド、プロプラノロール、ビタミンＥ、α−リポ酸、Ｎ−アセチルシステイン、リチウムおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
医薬として用いられる、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
被験体におけるＸ−副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療および／または予防に用いられる、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｘ−ＡＬＤが、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）および小児副腎白質ジストロフィー（ｃＡＬＤ）から選択される、請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれか一項に記載の組成物と、薬剤的に許容される賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１３】
Ｘ−ＡＬＤの治療および／または予防に潜在的に有用な化合物を同定するための方法であって、
ａ）Ｘ−ＡＬＤ細胞と候補化合物を接触させること、および
ｂ）前記候補化合物の存在下で
（ｉ）ｍＴＯＲの活性レベル、および
（ｉｉ）オートファゴソームマーカーの発現レベル
からなる群から選択されるマーカーを分析することを含んでなり、
ここで前記候補化合物が、ｍＴＯＲの活性を阻害する、および／またはオートファゴソームマーカーの発現を変化させる場合に、前記候補化合物はＸ−ＡＬＤの治療および／または予防に有用であるとする、方法。
【請求項１４】
Ｘ−ＡＬＤが、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）および小児副腎白質ジストロフィー（ｃＡＬＤ）から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｍＴＯＲ活性が、リン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋのレベルを測定することによって決定される、および／または、オートファゴソームマーカーが、ＬＣ３−ＩＩ、ｐ６２、またはそれらの組み合わせである、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にＸ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）を治療するための、特異的ｍＴＯＲ阻害剤の薬剤としての新規用途に関する。本発明はまた、Ｘ−ＡＬＤの治療および／または予防に潜在的に有用な化合物を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）は、ペルオキシソーム輸送体ＡＢＤＣ１の機能喪失による超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）の蓄積によって特徴付けられる、代謝性神経疾患である。Ｘ−ＡＬＤは、単一遺伝子によって遺伝する最もよく知られた脱髄疾患であり、男性の最小発生率は１：１７，０００である。臨床的に、Ｘ−ＡＬＤは、脳、副腎、末梢神経系に起こる進行性の損傷、および最終的な死によって特徴付けられる。
【０００３】
Ｘ−ＡＬＤは、脊髄の軸索障害を伴う成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、脳の脱髄を伴う大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）、および重篤な大脳の脱髄によって特徴付けられる小児期の変異形の、３つの主な表現型を呈する。脳組織内でのＶＬＣＦＡのレベルが減少しないため、Ｘ−ＡＬＤの治療には幾つかの食事性治療、例えば、リセリルトリオレアート、トリオレイン酸グリセロールとエルカ酸トリグリセリドとの混合物であるロレンツォ油と、超長鎖飽和脂肪酸の少ない食事との組み合わせが用いられているが、成功例は限られている。
【０００４】
同種間の骨髄移植によるＸ−ＡＬＤの治療は、移植が疾病の発症前に行われた場合には成功する。しかしながら前記治療は、ＨＬＡが適合したドナーが得られたときのみに実行可能であり、死亡のリスクも高いため、幾つかの制限を有する。
【０００５】
別の治療戦略は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害物質である４−フェニル酪酸およびバルプロ酸の使用に基づいたものである（スペイン特許第２３０３４４１−Ｂ１号）。
【０００６】
Ｎ−アセチルシステインとアルファリポ酸の組み合わせの使用が、Ｘ−ＡＬＤを治療するための抗酸化剤療法として開示されている。前記治療は、過剰なＶＬＣＡによる酸化的損傷を是正するために有効である。そうは言っても、Ｘ−ＡＬＤにおける酸化ストレスの悪化は疾病が進行する間の細胞損傷に付随するのだが、そのことがＸ−ＡＬＤの発生自体の原因となるわけではない（スペイン特許第２３７７３８１−Ｂ１号）。
【０００７】
上記に鑑みて、前記病理を引き起こす分子標的に向けられた、Ｘ−ＡＬＤを治療するための新規な治療法が求められている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、第１の態様によれば、被験体におけるＸ−副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療および／または予防に用いられる、特異的ｍＴＯＲ阻害剤に関する。
【０００９】
第２の態様によれば、本発明は、特異的ｍＴＯＲ阻害剤と、ｍＴＯＲ非依存性のオートファジー誘発剤、抗酸化剤、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ミトコンドリア転移細孔開口の阻害剤、抗炎症剤、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、サーチュイン１アゴニストおよび抗高脂血症薬からなる群から選択される化合物とを含んでなる組成物に関する。
【００１０】
第３の態様によれば、本発明は、医薬として用いられる、本発明の第２の態様で定義された組成物に関する。
【００１１】
第４の態様によれば、本発明は、被験体におけるＸ−副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療および／または予防に用いられる、本発明の第２の態様で定義された組成物に関する。
【００１２】
第５の態様によれば、本発明は、本発明の第３の態様で定義された組成物と、薬剤的に許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１３】
第６の態様によれば、本発明は、Ｘ−ＡＬＤの治療および／または予防に潜在的に有用な化合物を同定するための方法に関し、該方法は、
ａ）Ｘ−ＡＬＤ細胞と候補化合物を接触させること、および
ｂ）前記候補化合物の存在下で
（ｉ）ｍＴＯＲの活性レベル、および
（ｉｉ）オートファゴソームマーカーの発現レベル
からなる群から選択されるマーカーを分析することを含んでなり、
ここで前記候補化合物が、ｍＴＯＲの活性を阻害する、および／またはオートファゴソームマーカーの発現を変化させる場合に、前記候補化合物はＸ−ＡＬＤの治療および／または予防に有用であるとすることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】対照個体（Ｃｔｒｌ）と、ｃＣＡＬＤ（Ａ）ならびにｃＡＭＮ（Ｂ）患者における非発症（ＮＡ）および発症（Ａ）脳領域と、３および１２か月齢の野生型（ＷＴ）ならびにＡｂｃｄ１−／−マウス（Ｃ）の脊髄における、ｐ６２およびＬＣ３−ＩＩのレベルの免疫ブロット分析。ＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩのバンドの位置をＬＣ３ウェスタンブロットの左側に示し、負荷対照としてγ−チューブリン（γｔｕｂ）を用いた。ヒストグラムは、γｔｕｂのレベルを参照したＬＣ３−ＩＩのバンドの定量化、およびそれぞれの対照に比較したｐ６２のレベルを示す。すべてのＸ−ＡＬＤモデルにおいて、ＬＣ３−ＩＩタンパク質のレベルは減少していたが、ｐ６２のレベルは増大していた。データは、４〜５回（ＡおよびＢ）および６回（Ｃ）の独立した実験の平均±ＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図１Ｂ】図１Ａ参照。
【図１Ｃ】図１Ａ参照。
【図２】２０か月齢のＷＴおよびＡｂｃｄ１−／−Ａｂｃｄ２−／−マウスの脊髄から得たサンプル中のリソソーム数の測定。１μｍ２組織あたりのリソソームの数を、１遺伝子型あたり３匹の別々のマウスの平均±ＳＤによって示し、これをＷＴの値に比較して表した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３Ａ】（Ａ）タンパク質分解が高いか（Ｈ）または低い（Ｌ）条件下でインキュベートした、対照（Ｃｔｒｌ）および患者（ＡＬＤ）の線維芽細胞から抽出したＬＣ３およびｐ６２の代表的なウェスタンブロット。（Ｂ）ＬＣ３のレベルを、同条件下であるが、リソソーム阻害剤であるバフィロマイシンＡ１の存在下においても調べた。ＬＣ３ウェスタンブロットにおいて、ＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩのバンドの位置を左側に示し、負荷対照としてγ−チューブリン（γｔｕｂ）を用いた。ヒストグラムは、γｔｕｂのレベルを参照したＬＣ３−ＩＩのバンドの定量化（ＡおよびＢ）および高タンパク質分解条件下でのＣｔｒｌに比較したｐ６２のレベルを示す（Ａ）。すべてのデータは、４回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｃ）対照（Ｃｔｒｌ）および患者（ＡＬＤ）の線維芽細胞にＥＧＦＰ−ＬＣ３をトランスフェクトしてから４８時間後に、高タンパク質分解培地中で２時間３７℃インキュベートした後の、代表的な蛍光イメージを定量化した図である。ヒストグラムは、トランスフェクトした細胞１個あたりの蛍光ドット数を、３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す（トランスフェクトされた細胞を、１実験あたり、少なくとも５０個計数した）。ＡＬＤ線維芽細胞では、蛍光ドットの数が減少していた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３ＢＣ】図３Ａ参照。
【図４】（Ａ）３および１２か月齢のＷＴならびにＡｂｃｄ１−／−マウスの脊髄における、ＢＥＣＬＩＮ−１ならびに総ｐ７０Ｓ６Ｋおよびそのリン酸化型（Ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ）の代表的なウェスタンブロット。負荷対照としてγ−チューブリン（γｔｕｂ）を用いた。（Ｂ）ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化についても、対照個体（Ｃｔｒｌ）および患者（ＡＬＤ）から得られた線維芽細胞において調べた。高（Ｈ）および低（Ｌ）タンパク質分解培地中で細胞をインキュベートした。ヒストグラムは、ＢＥＣＬＩＮ−１のレベル（Ａ）およびＰ−ｐ７０ｓ６Ｋ／ｐ７０Ｓ６Ｋの比（ＡおよびＢ）を示す。データを３か月齢のＷＴマウス（Ａ）およびＣｔｒｌ線維芽細胞（Ｂ）に比較して表し、６回（Ａ）または４回（Ｂ）の独立した実験の平均±ＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５】（Ａ）ビヒクル（ｖｅｈ．）処置（陰性対照）またはＶＬＣＦＡ処置（Ｃ２６：０、５０μＭ  ２４時間）した対照（Ｃｔｒｌ）および患者（ＡＬＤ）の線維芽細胞を、高タンパク質分解培地中で［３Ｈ］バリンによって標識した後、長寿命タンパク質の総分解およびリソソーム分解を測定した。結果を、１．５時間の間に分解した標識タンパク質のパーセンテージとして表し、４回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｂ）ＶＬＣＦＡによって処置したか（＋）またはしていない（−、ｖｅｈ．処置）ＣｔｒｌならびにＡＬＤ線維芽細胞における、ＬＣ３およびｐ６２の代表的なウェスタンブロット。ＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩのバンドの位置をＬＣ３ウェスタンブロットの左側に示し、負荷対照としてγ−チューブリン（γｔｕｂ）を用いた。ヒストグラムは、γｔｕｂのレベルを参照したＬＣ３−ＩＩの定量化、およびＣｔｒｌ線維芽細胞におけるγｔｕｂのレベルに比較したｐ６２のレベルを示す。データは、４回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図６】（Ａ）特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって示すように、ＷＴマウス、および抗酸化剤混合物（Ａｏｘ、ビタミンＥ、α−リポ酸およびＮ−アセチルシステイン）によって４か月間処置したかまたは処置していないＡｂｃｄ１−／−マウスでは、Ａｂｃｄ１−／−マウス脊髄におけるＬＣ３−ＩＩのレベルが増大し、ｐ６２の蓄積が部分的に阻止される。ＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩのバンドの位置をＬＣ３ウェスタンブロットの左側に示し、負荷対照としてγ−チューブリン（γｔｕｂ）を用いた。（Ｂ）ｍＴＯＲの活性に対する、Ａに示した抗酸化剤処置（Ａｏｘ）の効果を、１２か月齢のＡｂｃｄ１−／−マウスの脊髄においても調べた。特異的な抗体を用いた、ＷＴマウス、および抗酸化剤によって処置したかまたは処置していないＡｂｃｄ１−／−マウスにおける総ｐ７０Ｓ６Ｋおよびそのリン酸化型（Ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ）のレベルの代表的なウェスタンブロット。ＡおよびＢにおいて、ヒストグラムは、γｔｕｂのレベルを参照したＬＣ３−ＩＩの定量化、ならびにＷＴ（Ａ）およびＰ−ｐ７０ｓ６Ｋ／ｐ７０Ｓ６Ｋの比（Ｂ）に比較したｐ６２のレベルを示す。データは、６回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図７ＡＢ】（Ａ）〜（Ｃ）：特異的な抗体を用いた代表的なウェスタンブロット分析。テムシロリムス（Ｔｅｍｓ）によって処置された（＋）かまたはされていない（−、ビヒクル、ｖｅｈ．）、１４か月齢のＷＴマウスおよびＡｂｃｄ１−／−マウスの脊髄における、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化（Ａ）、ＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２のレベル（Ｂ）、ならびに抗ＤＮＰ抗体を用いて検出した酸化型のタンパク質（Ｃ）。負荷対照として、総ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ａ）およびγ−チューブリン（γｔｕｂ）（ＢおよびＣ）を用い、ＬＣ３−ＩおよびＬＣ３−ＩＩのバンドの位置を（Ｂ）のＬＣ３ウェスタンブロットの左側に示した。ヒストグラムは、ＷＴ（Ａ）に比較したＰ−ｐ７０ｓ６Ｋ／ｐ７０Ｓ６Ｋの比、γｔｕｂのレベルを参照したＬＣ３−ＩＩの定量化、ＷＴ（Ｂ）に比較したｐ６２のレベル、およびＷＴ（Ｃ）に比較した酸化型タンパク質（Ｏｘタンパク質）の比を示す。すべてのデータは、６回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｄ）：上記のように処置したＷＴマウスおよびＡｂｃｄ１−／−マウスの脊髄のＡＴＰレベルの測定。データはＷＴに比較して表し、６回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。（Ｅ）および（Ｆ）：ＡＴＰの存在下または非存在下（それぞれ＋ＡＴＰおよび−ＡＴＰ）で測定したキモトリプシン様（ＣＴＬ）プロテアソームの活性（Ｅ）、および表示する２０Ｓおよびｉ−２０Ｓサブユニットに対する特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ（Ｆ）を、上記のように未処置の（ｖｅｈ．）、またはテムシロリムス（Ｔｅｍｓ）によって処置した野生型マウス（ＷＴ）およびＡｂｃｄ１−／−マウスの脊髄ライセートにおいて決定した。データはＷＴに比較して表し、１遺伝子型あたり４匹の別々のマウスの平均±ＳＤを示す。Ａ〜Ｆにおいて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．０１。
【図７ＣＤ】図７ＡＢ参照。
【図７ＥＦ】図７ＡＢ参照。
【図８】ＷＴ、Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−およびＡｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−  ＋Ｔｅｍｓマウスの軸索の腫脹におけるシナプトフィジンおよびＡＰＰ蓄積の定量化。データは１遺伝子型および条件あたり５〜６匹のマウスの平均±ＳＤを示す。＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図９】２０か月齢の、ビヒクル処置した（ｖｅｈ．）ＷＴもしくはＡｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−マウスまたはテムシロリムス処置した（＋Ｔｅｍｓ）Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−マウスに対して、トレッドミル実験（Ａ）およびバークロス試験（Ｂ）を行った。＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者らは、意外なことに、オートファジーの機能障害を引き起こすｍＴＯＲの異常なシグナル伝達がＸ−ＡＬＤの病因の機構的な構成要素であり、マウスＸ−ＡＬＤモデルにおけるＸ−ＡＬＤの症状は、ｍＴＯＲ阻害剤の投与によって是正可能であることを見出した。
【００１６】
特異的ｍＴＯＲ阻害剤の医学的用途
第１の態様によれば、本発明は、被験体におけるＸ−副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）の治療および／または予防に用いられる、特異的ｍＴＯＲ阻害剤に関する。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「ｍＴＯＲ」は、ＦＫ５０６結合タンパク質または１２−ラパマイシン関連タンパク質１としても知られる、哺乳類におけるラパマイシンの標的を指す。ｍＴＯＲは、細胞の生長、細胞の増殖、細胞の運動性、細胞の生存、タンパク質の合成および転写を調節するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。ヒトｍＴＯＲは、ｍＴＯＲ遺伝子（２０１４年５月２５日時点でのＮＣＢＩデータベースの受託番号ＮＭ＿００４９５８）によってコードされる。ｍＴＯＲは、構造的および機能的に異なる２つの複合体、ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）およびｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）のコア触媒成分として機能する。好ましい実施形態によれば、本発明の用語「ｍＴＯＲ」は、ｍＴＯＲＣ１複合体中に組み込まれるｍＴＯＲタンパク質を意味する。ｍＴＯＲＣ１複合体は、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲの調節性−関連タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲ）すなわちＲａｐｔｏｒ、哺乳類致死性ＳＥＣ１３タンパク質８（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌｅｔｈａｌ  ｗｉｔｈ  ＳＥＣ１３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８：ＭＬＳＴ８）、ＰＲＡＳ４０タンパク質およびＤＥＰＴＯＲタンパク質から構成される。増殖因子のシグナル伝達阻害剤または栄養素の除去によってｍＴＯＲ活性が抑制されると、オートファジーが誘導される。これとは反対に、ｍＴＯＲのポジティブ調節によってオートファジーは阻害される。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「特異的ｍＴＯＲ阻害剤」は、その標的（例えばｍＴＯＲ）に対する高い特異性を有する化合物を指す。特定の阻害剤の特異性は、特定の阻害剤の対象となる標的の、別の標的に対するＩＣ５０値の比として定義される。例えば、特異的ｍＴＯＲ阻害剤の、ｍＴＯＲに対するＩＣ５０値は、その他の標的に対するＩＣ５０値よりも低い。例えば、ｍＴＯＲに対するＩＣ５０値は、同じ阻害剤のその他の標的に対するＩＣ５０値よりも、少なくとも１０倍低い。別の例では、ｍＴＯＲに対するＩＣ５０値は、１００倍低いか、またはその他の例では１０００倍低い。さらに別の例では、ｍＴＯＲに対するＩＣ５０値は、同じ阻害剤のその他の標的に対するＩＣ５０値よりも１０，０００倍低い。
【００１９】
本発明の特異的ｍＴＯＲ阻害剤には、ｍＴＯＲ遺伝子の発現を阻止する化合物、ｍＴＯＲのｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを減少させる化合物、およびｍＴＯＲの活性を阻害する化合物が含まれる。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「ｍＴＯＲの活性」は、ホルモン、増殖因子および栄養素に応答したタンパク質合成、細胞の運動性、生存、オートファジーおよび代謝のような、幾つかの細胞の工程に関わる、ｍＴＯＲによって調節される細胞の伝達シグナルを指す。好ましい実施形態によれば、特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲによるオートファジーの抑制を阻害する、つまりオートファジーを活性化させる、化合物もしくはリガンド、またはその薬剤的に許容される塩を指す。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「薬剤的に許容される塩」は、特定の化合物の遊離酸および塩基の生物学的有効性を保持し、生物学的にも、または他の点でも、望ましくないものではない塩を指す。薬剤的に許容される塩には、本明細書に記載する化合物とミネラルまたは有機酸との反応によって調製された塩が含まれ、このような塩としては、酢酸塩、アクリル酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、亜硫酸水素塩、臭化物、酪酸塩、ブチン−ｌ，４−ジオエート（ｂｕｔｙｎ−ｌ，４−ｄｉｏａｔｅ）、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩（ｃａｍｐｈｏｒｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、カプロン酸塩、カプリル酸塩、クロロ安息香酸塩、塩化物、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、デカン酸塩、ジグルコン酸塩、リン酸二水素、ジニトロ安息香酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシン−ｌ，６−ジオエート、ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシ酪酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ヨウ化物、イソ酪酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、マンデル酸塩、メタリン酸塩、メタンスルホン酸塩、メトキシ安息香酸塩、安息香酸メチル、リン酸一水素、１−ナフタレンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ピロ硫酸塩、ピロリン酸塩、プロピオル酸塩、フタル酸塩、フェニル酢酸塩、フェニル酪酸、プロパンスルホン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩およびキシレンスルホン酸塩が挙げられる。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「オートファジー」は、不必要な、または機能不全である細胞成分、例えば細胞内タンパク質、タンパク質凝集体、細胞小器官、細胞膜、細胞小器官膜およびその他の細胞成分の、リソソームの作用を介した、細胞による分解に関わる、細胞の異化機構を指す。オートファジー機構は、（ｉ）細胞の標的領域周辺の膜形成、これによって内容を残りの細胞質から分離する、（ｉｉ）得られた小胞と、リソソームまたはエンドソームとの融合、およびそれに続く小胞の内容の分解を含んでよい。オートファジーとの用語はまた、それによって飢餓状態の細胞が栄養素を必要性の低い工程からさらに重要な工程へ再配分する機構のうちの１つを指してもよい。
【００２３】
一つの実施形態によれば、特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲのタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを減少させる化合物である。
【００２４】
特定の実施形態によれば、ｍＴＯＲ特異的な阻害剤は、ｍＴＯＲ特異的な阻害性抗体である。本明細書で用いられる用語「阻害性抗体」は、ｍＴＯＲへ特異的に結合して、ｍＴＯＲの生物学的活性を少なくとも部分的に阻害できる抗体に関する。抗体を得るための方法は、当業者に公知である。これらの方法に用いられる抗体は、例えば、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清またはモノクローナル抗体、抗体断片、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディおよびヒト化抗体であってよい。
【００２５】
特定の実施形態によれば、本発明に従って用いられる特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲまたはｍＴＯＲの機能に必要ないずれかの遺伝子の発現をノックダウンできる、ｍＴＯＲ特異的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。本発明との関連では、ｍＴＯＲ特異的なＲＮＡｉは、アデノウイルスのような安定化ウイルスベクターシステムに含まれてよい。
【００２６】
特定の実施形態によれば、本発明に従って用いられる特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
【００２７】
特定の実施形態によれば、本発明に従って用いられる特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ特異的なマイクロＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒できる酵素ＲＮＡ分子である。マイクロＲＮＡの作用機構には、標的ＲＮＡに相補的なマイクロＲＮＡ分子の配列特異的なハイブリダイゼーションと、それに続くヌクレオチド鎖の切断現象が含まれる。マイクロＲＮＡ分子の組成には、好ましくは標的ｍＲＮＡに相補的な１つ以上の配列、ｍＲＮＡの切断に関与する既知の触媒配列または機能的に等価な配列が含まれる。
【００２８】
特定の実施形態によれば、本発明に従って用いられる特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ核酸の転写および／または翻訳を阻害する、ｍＴＯＲ特異的なアンチセンス核酸である。本発明のｍＴＯＲ阻害性アンチセンス核酸には、開示するようなヒトｍＴＯＲアンチセンス化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
特定の実施形態によれば、本発明に従って用いられる特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ特異的なＤＮＡ酵素である。ＤＮＡ酵素には、アンチセンスおよびマイクロＲＮＡ技術の両方の機構的特色が幾つか組み入れられている。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによく似て、特定の標的核酸配列を認識するが、マイクロＲＮＡにもよく似て、標的核酸を触媒的および特異的に切断するように設計される。
【００３０】
タンパク質または核酸の発現は、そのレベルが、参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち存在しない）減少した際に、低下したとみなされる。
【００３１】
参照値は、特異的な疾病を患っていない被験体であってよい、対照被験体におけるｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを指す。したがって本発明との関連では、参照値は、Ｘ−ＡＬＤを患っていない被験体である対照被験体におけるｍＴＯＲのタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを指す。参照値はまた、対照被験体におけるｍＴＯＲの発現レベル（すなわちｍＲＮＡまたはタンパク質のレベル）も含む。
【００３２】
ｍＴＯＲ特異的な阻害剤が、ｍＴＯＲ  ｍＲＮＡのレベルを減少させられるか否かを決定するために適した方法としては、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡプロテクション分析、ノーザンブロット、ＲＮＡドットブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、マイクロアレイ技術のような、ｍＲＮＡの発現レベルを決定するための標準的なアッセイ、タグベースの方法、例えばＬｏｎｇＳＡＧＥおよびＳｕｐｅｒＳＡＧＥのような変異形を含む遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、マイクロアレイ、Ｆｌｏｗ−ＦＩＳＨ、ｑＦｉＳＨおよび二重融合ＦＩＳＨ（Ｄ−ＦＩＳＨ）のような変異形を含む蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
阻害剤が、ｍＴＯＲタンパク質のレベルを減少させることによって作用するか否かを決定するために適した方法としては、従来の方法、例えば、ｍＴＯＲ遺伝子によってコードされるタンパク質への特異的な結合能をもつ抗体（または抗原決定基を含むその断片）を用いた定量化、およびそれに続く、得られた抗体−抗原複合体の定量化が挙げられる。非標識抗体（一次抗体）および標識抗体（二次抗体）を用いる、本発明で用いてもよい様々な公知のアッセイがあり、このような技術としては、ウェスタンブロットまたはウェスタントランスファー、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＲＩＡ（放射性免疫測定法）、競合ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学および免疫組織化学技術、特異的な抗体を含むバイオチップまたはタンパク質マイクロアレイに基づいた技術、またはディップ・スティックのような形式のコロイド沈殿に基づいたアッセイが挙げられる。対象タンパク質のレベルを検出し、定量するための他の方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、リガンド結合アッセイなどの技術が挙げられる。
【００３４】
別の実施形態によれば、特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ活性を阻害することによって作用する。本発明において用いられる特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ活性を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％特異的に阻害してよく、すべての範囲は５％ないし１００％である。阻害剤が、ｍＴＯＲ活性を減少させることによって作用するか否かを決定するために適した方法としては、ｍＴＯＲによってリン酸化されるいずれかの基質、例えばｐ７０Ｓ６Ｋ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１およびＵＬＫ１タンパク質のリン酸化レベルの決定によって行われるような、ｍＴＯＲ活性レベルの決定を可能にするいずれかの方法が挙げられる。酵素活性を決定するためのアッセイは当業者に公知であり、初速度分析法、進行曲線アッセイ（ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｃｕｒｖｅ  ａｓｓａｙ）、一過性動態アッセイ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｓｓａｙ）および減衰アッセイ（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。酵素活性の連続的アッセイとしては、分光光度アッセイ、蛍光定量アッセイ、熱量測定アッセイ、化学発光アッセイ、光散乱アッセイおよびマイクロスケールの熱拡散アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。酵素活性の非連続アッセイとしては、放射測定アッセイおよびクロマトグラフィーアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、酵素活性に影響を与え得る因子が、塩濃度、温度、ｐＨおよび基質濃度を含むことを理解する。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「ＥＩＦ４ＥＢＰ１」は、２０１４年６月１１日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｑ１３５４１によって示される、真核生物の翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質を指す。ＥＩＦ４ＢＰ１は、ｅＩＦ４Ｆ複合体へのｅＩＦ４Ｅの集合を阻止することによって、ｅＩＦ４Ｅ活性を調節する。ＥＩＦ４ＥＢＰ１のリン酸化型は、ｍＴＯＲＣ１複合体との関連でｍＴＯＲによって調節され、翻訳を活性化する。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「Ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ」または「リン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋ」は、２０１４年５月１４日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｐ２３４３３によって示される、７０ｋＤａセリン／スレオニンタンパク質Ｓ６キナーゼのリン酸化型を指す。これは、ＰＩ３キナーゼ経路のＰＰＩ３およびホスホイノシチド依存性キナーゼ１の下流で作用する。この標的基質はＳ６リボソームタンパク質である。Ｓ６のリン酸化によって、リボソームでのタンパク質合成が誘導される。ｐ７０Ｓ６ＫはｍＴＯＲによってリン酸化され、これによって該タンパク質の活性化型であるＰ−ｐ７０Ｓ６Ｋが誘導され、増殖因子および栄養素に応答したｍＴＯＲシグナル伝達の下流で作用して、細胞増殖および細胞周期進行を促進する。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「ＵＬＫ１」は、２０１４年７月９日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｏ７５３８５によって示される、真核生物のセリン／スレオニンキナーゼを指す。これはホスファチジルイノシトール３キナーゼＰＩＫ３Ｃ３の上流で作用し、ファゴフォアの形成を調節する。前記タンパク質は、ｍＴＯＲによってリン酸化される。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ｍＴＯＲの生物学的活性に対する阻害能の決定は、ｐ７０Ｓ６キナーゼまたはその他のｍＴＯＲ基質のリン酸化型（Ｐ−ｐ７０Ｓ６、Ｐ−ＥＩＦ４ＥＢＰ１、Ｐ−ＵＬＫ１）の発現レベルの測定に基づいたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって検出できる。当該技術分野では、タンパク質のリン酸化型を決定できる複数のアッセイが知られている。前記方法としては、特異的なキナーゼ（すなわちｍＴＯＲ）、該キナーゼの基質（すなわちｐ７０Ｓ６）およびＡＴＰの存在下でのリン酸化基質（例えばリン酸化ｐ７０Ｓ６）の測定に基づいた、キナーゼ活性アッセイが挙げられる。一般にリン酸化基質の検出は、比色、放射性または蛍光検出を含む幾つかのレポーターシステムによって行われる。リン酸化タンパク質を検出できるその他のアッセイとしては、タンパク質のレベルを決定するために適した方法、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫組織化学およびマススペクトロメトリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
あるいは、リン酸化タンパク質の測定は、対象リンタンパク質を特異的に認識するリン特異的な抗体の使用によって行うことができる。この技術を用いる際には、リンタンパク質のレベルを、前記タンパク質の総レベルに対して標準化することが推奨される。例えば、Ｐ−ｐ７０Ｓ６タンパク質のレベルを測定することによってｍＴＯＲの活性を決定する際、ｐ７０Ｓ６タンパク質のレベルを決定することによって、結果は標準化される。
【００４０】
ｍＴＯＲの活性は、ｍＴＯＲによってリン酸化される基質（ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＥＩＦ４ＥＢＰ１またはＵＬＫ１）のレベルが、参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち検出されない）減少した際に、低下したとみなされる。
【００４１】
あるいは、ｍＴＯＲの生物学的活性に対する阻害能の決定は、オートファジーのような、ｍＴＯＲによって調節される細胞工程に関するマーカーの発現レベルの測定に基づいたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって検出できる。
【００４２】
したがって本発明の好ましい実施形態によれば、特異的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲ活性を減少させられるか否かを決定するために適した方法は、少なくとも１つのオートファゴソームマーカーの発現レベルを決定することを含む。本明細書で用いられる用語「オートファゴソームマーカー」または「オートファジックマーカー」は、オートファジーにおいて差次的に発現する、タンパク質またはそれらをコードする遺伝子を指す。本発明の第１の態様に従って、ｍＴＯＲの活性を決定するために有用なオートファゴソームマーカーの具体例としては、ＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態によれば、前記オートファジーマーカーの発現レベルは、基本的なオートファジック条件下で決定される。本明細書で用いられる表現「基本的なオートファジック条件」は、サイトゾル成分の恒常的な代謝回転に関わる細胞機構の一部として、恒常的なオートファジーが低レベルで起こる条件を指す。そのため、基本的なオートファジック条件は細胞の生長を可能にする。別の好ましい実施形態によれば、前記オートファジックマーカーの発現レベルは、オートファジーを刺激する条件下で決定される。本明細書で用いられる表現「オートファジーを刺激する条件」は、オートファジーによって細胞の分解が誘導される条件を指す。オートファジーを刺激する条件には、栄養不足、ホルモン治療およびストレスが含まれる。オートファジーの最も典型的な誘因は栄養不足である。多くのタイプの細胞において、ホルモンおよび増殖因子の欠乏もまた、オートファジー誘導の一因になると考えられる。典型的には、細胞培養においてオートファジーを誘導する条件は、栄養素または血清が欠乏した培地中で細胞を生長させることを含む。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「ＬＣ３−ＩＩ」は、２０１４年５月１４日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｑ９Ｈ４９２によって示される、オートファジー関連タンパク質ＬＣ３または微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂを指す。これはオートファゴソームの液胞形成に関連している。ＬＣ３−ＩＩは、ＬＣ３−Ｉタンパク質の脂質化によって得られる。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「ｐ６２」は、２０１４年５月１４日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｑ１３５０１によって示され、セクエストソーム１としても知られる６２ｋＤａ  ユビキチン結合タンパク質ｐ６２の、Ｌｃｋ  ＳＨ２ドメインに対するホスホチロシン非依存性リガンドを指す。これは、ポリユビキチン含有体の形成およびオートファジック分解の両方に必要とされる。
【００４５】
ｍＴＯＲの活性は、１つ以上のオートファゴソームマーカー（例えばｐ６２）のレベルが、参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち検出されない）減少した際に、低下したとみなされる。加えて、ｍＴＯＲの活性は、１つ以上のオートファゴソームマーカー（例えばＬＣ３−ＩＩ）のレベルが、参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％増大した際に、低下したとみなされる。
【００４６】
具体的には、本発明の特異的ｍＴＯＲ阻害剤の阻害能の決定は、本特許出願の実施例６に示すように、ｍＴＯＲの特異的阻害剤によって処理した細胞におけるオートファジックな流れの活性化を決定することによって実行できる。ｍＴＯＲ特異的な阻害剤によって治療しているＸ−ＡＬＤ患者から得た細胞では、Ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋおよびｐ６２タンパク質のレベルが、前記阻害剤による治療を行っていないＸ−ＡＬＤ患者から得た細胞において決定した前記タンパク質のレベルと比較して、減少していた。さらに、Ｘ−ＡＬＤ患者から得た細胞におけるＬＣ３−ＩＩタンパク質のレベルは、治療されていない前記患者から得た細胞における前記マーカーのレベルに比較して、増大していた。
【００４７】
当業者は、前記オートファゴソームマーカーの発現レベルが、そのｍＲＮＡのレベルまたはタンパク質のレベルを決定することによって、決定できることを理解する。ｍＲＮＡのレベルまたはタンパク質のレベルを決定するために適した方法については、上に詳述した。好ましい実施形態によれば、前記マーカーの発現レベルは、それらのタンパク質レベルを決定することによって、決定される。特異的なマーカーのタンパク質レベルを決定するために適した方法については、既に詳述した。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、前記オートファゴソームマーカーのタンパク質レベルは、ウェスタンブロットによって決定される。
【００４８】
酸化ストレス機構は、Ｘ−ＡＬＤを進行させる一因となる。Ｘ−ＡＬＤ患者の脊髄における酸化ストレスの徴候には、タンパク質に対する酸化的、糖酸化的および脂質酸化的損傷、ならびに酵素による抗酸化防御の変化が含まれる。本発明者らは、特異的ｍＴＯＲ阻害剤により治療されているＸ−ＡＬＤ患者から得た細胞において、酸化型タンパク質のレベルが減少していることを示した。したがって、本発明の好ましい実施形態によれば、特異的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲ活性を減少させられるか否かの決定は、少なくとも１つの酸化的損傷マーカーの発現レベルを決定することをさらに含む。「酸化的損傷マーカー」との用語は、酸化ストレス過程の間に差次的に発現する、タンパク質またはそれをコードする遺伝子のような、いずれかのマーカーを指す。本明細書で用いられる用語「酸化ストレス過程」は、活性酸素種による全身症状と、生体系が反応性の中間体を容易に解毒するかまたは結果としての損傷を修復する能力との間の不均衡を指す。本発明のこの態様に従ってｍＴＯＲの活性を決定するために用いることのできる酸化マーカーの具体例としては、酸化型タンパク質の発現レベル、免疫プロテアソームサブユニットβｌｉ／ＬＭＰ２およびβ５ｉ／ＬＭＰ７の発現レベル、プロテアソームのキモトリプシン様活性およびＡＴＰのレベルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「酸化型タンパク質」は、活性酸素種によって直接、または酸化ストレスの二次産物との反応によって間接的に誘導された、タンパク質の共有結合性の修飾を指す。生体試料中にみられる、タンパク質酸化による最も一般的な産物は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＴｈｒのカルボニル誘導体のタンパク質である。これらの誘導体は化学的に安定であり、活性酸素種のほとんどのタイプに対する酸化ストレスのマーカーとして役立つ。酸化型タンパク質を決定するために適した方法は、ジスルフィド、硫黄ラジカル、グルタチオン付加、メチオニンスルホキシド基、カルボニル基などのような、化学的修飾の検出に基づいたものである。前記方法としては、β−メルカプトエタノールを含まないＳＤＳゲル電気泳動、電子スピン共鳴分光法による検出、質量分析法、臭化シアンによる切断とそれに続くアミノ酸分析、ジニトロフェニルヒドラジン共役アッセイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「βｌｉ／ＬＭＰ２」または「免疫プロテアソームサブユニットＬＭＰ２」は、２０１４年５月１４日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｐ２８０６５によって示されるタンパク質を指す。本明細書で用いられる用語「β５ｉ／ＬＭＰ７」または「免疫プロテアソームサブユニットＬＭＰ７」は、２０１４年５月１４日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｐ２８０６２によって示されるタンパク質を指す。βｌｉ／ＬＭＰ２および／またはβ５ｉ／ＬＭＰ７の発現レベルは、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定できる、当該技術分野において公知の、いずれかの適した方法によって決定できる。
【００５１】
本明細書で用いられる用語「プロテアソームのキモトリプシン様活性」は、プロテアソームのサブユニットβ５によって調節される、プロテアソームのタンパク質分解活性を指す。プロテアソームのキモトリプシン様活性を決定するための方法は当業者に公知であり、これには比色、発光および蛍光アッセイが含まれる。具体的には、プロテアソームのキモトリプシン様活性の決定は、プロテアソーム抽出物と、キモトリプシン様プロテアーゼに特異的な基質、例えばＡＭＣのような蛍光タグによって好ましく修飾されたＳｕｃ−ＬＬＶＹ基質とをインキュベートすることによって分析できる。次に、蛍光リーダーを用いて遊離のＡＭＣ蛍光を測定することにより、タンパク質分解活性を決定する。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「ＡＴＰ」または「アデノシン三リン酸」は、細胞内で補酵素として用いられるアデノシンヌクレオシド三リン酸を指す。ＡＴＰは、細胞内における代謝のための化学エネルギーを輸送する。ＡＴＰのレベルを決定するための方法は当業者に公知であり、これには比色、発光および蛍光アッセイが含まれる。ＡＴＰのレベルを決定するために有用な市販のキットとしては、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから入手可能なＡＴＰｌｉｔｅ  １  ｓｔｅｐが挙げられるが、これは添加したルシフェラーゼおよびＤ−ルシフェリンとＡＴＰとの反応によって起こる光の発生に基づくものである。
【００５３】
ｍＴＯＲの活性は、１つ以上の酸化的損傷のマーカー（例えば酸化型タンパク質、βｌｉ／ＬＭＰ２またはＡＴＰ）のレベルが、参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち検出されない）減少した際に、低下したとみなされる。
【００５４】
本出願の実施例７に、酸化的損傷マーカーのレベルに対する、特異的ｍＴＯＲ阻害剤について示す。特異的ｍＴＯＲ阻害剤によって治療しているＸ−ＡＬＤ患者から得た細胞の酸化型タンパク質のレベルは、前記治療を行っていないＸ−ＡＬＤ患者から得た細胞よりも低い。前記治療はまた、Ｘ−ＡＬＤ患者から得た細胞において、酸化ストレスに付随する生体エネルギー不全を阻止してＡＴＰのレベルを正常化すると共に、プロテアソームのキモトリプシン様活性の誘導を阻止して、免疫プロテアソームサブユニットβｌｉ／ＬＭＰ２およびβ５ｉ／ＬＭＰ７を安定させる。
【００５５】
本発明者らはまた、Ｘ−ＡＬＤの発生に付随する軸索変性が、特異的ｍＴＯＲ阻害剤を用いた治療によって予防できることも示した。したがって、本発明の別の好ましい実施形態によれば、特異的ｍＴＯＲ阻害剤がｍＴＯＲ活性を減少させられるか否かを決定するために適した方法は、少なくとも１つの軸索損傷マーカーの発現レベルを決定することをさらに含む。本明細書で用いられる用語「軸索損傷マーカー」は、軸索損傷において差次的に発現する、タンパク質またはそれらをコードする遺伝子を指す。本明細書で用いられる用語「軸索損傷」は、脱髄性の過程を暗示する、軸索の傷害を指す。使用可能な軸索損傷の具体的なマーカーとしては、Ｉｂａ−１、ＧＦＡＰ、シナプトフィジン、ＡＰＰおよび８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で用いられる用語「Ｉｂａ−１」または「ＡＩＦ−１」は、２０１４年５月１４日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｐ５５００８によって示される、イオン化カルシウム結合アダプター分子１またはアログラフト炎症因子１を指す。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「ＧＦＡＰ」は、２０１４年５月１４日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｐ１４１３６によって示される、グリア線維性酸性タンパク質を指す。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「シナプトフィジン」または「主要シナプス小胞タンパク質ｐ３８」は、２０１４年５月１４日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｐ０８２４７によって示されるタンパク質を指す。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「ＡＰＰ」または「アミロイドベータＡ４タンパク質」は、２０１４年５月１４日時点でのＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｐ０５０６７によって示されるタンパク質を指す。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「８−オキソ−７、８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン」または「８−ｏｘｏｄＧ」は、酸化型のプリンヌクレオシドを指す。前記マーカーは、ＤＮＡの病変部を示すものである。
【００６１】
ｍＴＯＲの活性は、１つ以上の軸索損傷のマーカー（例えばＩｂａ−１、ＧＦＡＰ、シナプトフィジン、ＡＰＰまたは８−オキソ−７、８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン）のレベルが、参照値に対して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（すなわち検出されない）減少した際に、低下したとみなされる。
【００６２】
特定の実施形態によれば、前記特異的ｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシン誘導体である。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「ラパマイシン誘導体」は、化学的に修飾されたラパマイシンを指す。ラパマイシンは、ストレプトマイセスヒグロスコピクスに（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）よって産生された、マクロライド系トリエン抗生物質である。前記ラパマイシン誘導体化合物としては、テムシロリムス、デフォロリムス、（リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３およびＭＫ−８６６９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＡＺＤ８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、ＩＮＫ−１２８、ＸＬ３８８、Ｐ２２８１、Ｐ５２９、ＧＳＫ２１２６４５８、ＫＵ−００６３７９４、ＷＡＹ−００１、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−６８７、Ｗｙｅｔｈ−ＢＭＣＬ−２０００９１００７５−９ｂ、Ｗｙｅｔｈ−ＢＭＣＬ−２００９１００９６−２７、ＫＵ−ＢＭＣＬ−２００９０８０６９−５、ＫＵ−ＢＭＣＬ−２００９０８０６９−Ｉ、ＰＩ−１０３、ＷＹＥ−３５４、トリン１、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、ＰＰ４８７、ＰＰ１２１およびＸＬ７６５ラパマイシン、１６−Ｏ置換ラパマイシン、４０−Ｏ置換ラパマイシン、ラパマイシンのモノおよびジエステル誘導体、ラパマイシンの２７−オキシム、ラパマイシンの４２−オキソ類似体、二環式ラパマイシン、ラパマイシン二量体、ラパマイシンのシリルエーテルならびにラパマイシンアリールスルホン酸塩およびスルファミン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
さらなる特定の好ましい実施形態によれば、前記特異的ｍＴＯＲ阻害剤はテムシロリムスである。
【００６５】
本明細書で用いられる用語「テムシロリムス」は、ラパマイシンの４２位のヒドロキシルエステルを指す。テムシロリムスの化学名は（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘキサデカヒドロ−９，２７−ジヒドロキシ−３−［（１Ｒ）−２−［１Ｓ、３Ｒ、４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメト３Ｈ−ピリド［２，１−］［１、４］オキサアザクロヘントリアコンチン−１１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペントン４’−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸塩］；またはラパマイシン、４３−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノエート］である。この化合物は、腎癌の治療に広く用いられている。テムシロリムスとの用語は、そのプロドラッグ、誘導体または類似体も包含する。テムシロリムスの化学構造は、以下の式によって表される。
【化１】
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【００６６】
テムシロリムスは、限定はされないが、米国特許第８５，３６２，７１８  Ｂ１号または米国特許第８２５８２９９  Ｂ２号に記載されている方法を含む、当該技術分野において公知の方法を当業者が用いることによって得ることのできる化合物である。テムシロリムスはまた、Ｐｆｉｚｅｒから市販されている（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「被験体」は、哺乳類に分類されるすべての動物を指し、家畜、霊長類およびヒト、例えば人間、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、被験体はいずれかの年齢または人種の、男性または女性のヒトである。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「副腎白質ジストロフィー、Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィーまたはＸ−ＡＬＤ」は、脳、副腎、末梢神経系に起こる進行性の損傷、および最終的には死を導く、まれな遺伝性の白質ジストロフィーを指す。特定の実施形態によれば、副腎白質ジストロフィーは、脊髄における軸索障害を伴う成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、脳の脱髄を伴う大脳の副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）および重篤な大脳の脱髄によって特徴付けられる小児期の変異形（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態によれば、副腎白質ジストロフィーは、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）（すなわち脊髄における軸索障害を伴う成人副腎脊髄ニューロパチー）である。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）」は、Ｘ−ＡＬＤの変異形である、脊髄における軸索障害を伴う成人副腎脊髄ニューロパチーを指す。前記疾病は、徐々に起こる、進行性の脚の脱力および硬直、筋動作を協調させる能力の喪失、体重減少、過剰な筋緊張、歩行困難、視覚異常、言葉の明瞭な発音の困難、行動の変化、副腎不全、けいれん、性的機能不全／インポテンス、膀胱機能障害、軽度の末梢神経障害および悪心を含む、幾つかの症状によって特徴付けられる。
【００７０】
本明細書で用いられる用語「治療」は、本明細書に記載するように、臨床症状への感受性を終結、予防、寛解、および／または減少させることを目的とした、いずれかのタイプの治療法を含む。好ましい実施形態によれば、治療との用語は予防的治療（すなわち本明細書で定義する臨床症状、疾患または状態への感受性を減少させるための治療法）に関する。このように、本明細書で用いられる用語「治療」、「治療する」などは、ヒトを含む哺乳類における病理学的状態または疾患のいずれかの治療をカバーする、望ましい薬理的および／または生理的効果を指す。該効果は、疾患もしくはその症状を完全または部分的に予防する点で予防的であってよく、および／または、疾患および／または疾患に起因する有害作用を部分的または完全に治癒させる点で治療的であってよい。すなわち「治療」には、（１）被験体における疾患の発生または再発を予防すること、（２）例えば疾患の発生を抑止するように、疾患を妨げること、（３）例えば、失われ、欠損したか、もしくは欠陥のある機能を回復させるかまたは修復することによって、または非効率的な過程を刺激することによって疾患またはその症状を後退させることで、ホストがもはや疾患またはその症状を患うことのないように、疾患もしくは少なくともそれに付随する症状を停止または終結させること、または（４）疾患もしくはそれに付随する症状を、軽減、緩和、または寛解することが含まれ、ここで、寛解する、とは、少なくとも炎症、疼痛、および／または免疫不全のようなパラメータの規模を縮小させることを指す、広い意味で用いられる。
【００７１】
当業者が認識するように、Ｘ−ＡＬＤの治療法における特異的ｍＴＯＲ阻害剤の有効性は、症状の改善によって示される。
【００７２】
あるいは、本発明は、Ｘ−ＡＬＤを予防および／または治療する薬剤を製造するための、特異的ｍＴＯＲ阻害剤の用途に関する。
【００７３】
「特異的ｍＴＯＲ阻害剤」との用語については、これまでに記載されており、その詳細は参考によって本明細書に取り込まれる。一実施形態によれば、前記特異的ｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシン誘導体である。さらに特定の実施形態によれば、前記特異的ｍＴＯＲ阻害剤はテムシロリムスである。
【００７４】
「Ｘ−ＡＬＤ」との用語については、これまでに記載されており、その詳細は参考によって本明細書に取り込まれる。特定の実施形態によれば、前記Ｘ−ＡＬＤは、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）および副腎白質ジストロフィーの小児期の変異形（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される。さらに特定の実施形態によれば、Ｘ−ＡＬＤは成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）である。
【００７５】
本発明による組成物
別の態様によれば、本発明は、特異的ｍＴＯＲ阻害剤と、オートファジー誘発剤、抗酸化剤、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ミトコンドリア転移細孔開口の阻害剤、抗炎症剤、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、サーチュイン１アゴニストおよび抗高脂血症薬からなる群から選択される化合物とを含んでなる組成物に関する。
【００７６】
「特異的ｍＴＯＲ阻害剤」との用語は、本発明の第１の態様との関連において定義されており、この定義は本発明の第２の態様にも同等に適用される。特定の実施形態によれば、前記特異的ｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシン誘導体である。さらに特定の実施形態によれば、前記ラパマイシン誘導体はテムシロリムスである。「ラパマイシン誘導体」および「テムシロリムス」との用語については既に定義した。
【００７７】
本発明の組成物中に含まれる特異的ｍＴＯＲ阻害剤、好ましくはテムシロリムスの量は、広範囲に変動し得る。しかしながら特定の実施形態によれば、特異的ｍＴＯＲ阻害剤、好ましくはテムシロリムスの重量パーセンテージは、本発明の総組成物に対して、少なくとも０．１０％、０．５０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％である。
【００７８】
本発明の組成物中の阻害剤と、該組成物の少なくとも第２の成分との重量比は、広範囲に変動し得る。しかしながら一般にこの比は、本発明の組成物を投与される被験体の治療条件、年齢、性別、体重などのような因子を考慮して選択される。好ましくは、本発明の特異的ｍＴＯＲ阻害剤、好ましくはテムシロリムスと、本発明の第２の成分、すなわちオートファジー誘発剤、抗酸化剤、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ミトコンドリア転移細孔開口の阻害剤、抗炎症剤、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、サーチュイン１アゴニストおよび抗高脂血症薬からなる群から選択される化合物との前記重量比は、有益な効果、特に、各成分の用量が少なくても同じ効果が得られることで、本発明の組成物を投与される被験体における副作用が減少するように、本発明の組成物の、その各成分に比較した治療効果の増大がもたらされる重量比である。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「ｍＴＯＲ非依存性のオートファジー誘発剤」または「ｍＴＯＲ非依存性のオートファジー賦活剤」は、オートファジーを誘導するｍＴＯＲ経路とは異なるいずれかの経路によって、細胞内のオートファジーを増大させるかまたは刺激することができる、いずれかの薬剤を指す。幾つかの実施形態によれば、オートファジー誘発剤は、オートファゴソームの形成を増大させられる。
【００８０】
特定の実施形態によれば、前記ｍＴＯＲ非依存性のオートファジー誘発剤は、トレハロース、ラニチジン、スペルミジン、レスベラトロール、ベラパミル、ロペラミド、アミオダロン、トリフロペラジン、ミノキシジル、２’５’−ジデオキシアデノシン、タモキシフェン、フマル酸ジメチル、チアゾリジンジオン、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、ベキサロテン、フルスピリレン、トリフロペラジン、ペニトレムＡ、ピモジド、プロプラノロール、ビタミンＥ、α−リポ酸、Ｎ−アセチルシステイン、リチウムおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００８１】
本明細書で用いられる用語「抗酸化剤」は、例えば、活性酸素種の形成を阻止するか、または活性酸素種がいずれかの損傷をもたらす前にそれらを除去する、活性酸素種のレベルを減少させる物質を指す。抗酸化剤の例としては、アルファリポ酸およびＮ−アセチルシステインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書で用いられる用語「ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでミトコンドリア内に選択的に濃縮される、これらの抗酸化剤を指す。ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤の例としては、ミトキノン（ＭｉｔｒｏＱ）および［２−（３，４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）エチル］トリフェニルホスホニウムブロミド（ＭｉｔｏＶｉｔＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
本明細書で用いられる用語「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤」は、ヒストン脱アセチル化酵素の機能に干渉する物質を指す。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の例としては、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、バルプロ酸、ベリノスタット、モセチノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、エンチノスタット、ＳＢ９３９、レスミノスタット、ギビノスタット、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ２００７４５、ＡＣＹ−１２１５、スルホラファンおよびケベトリン（ｋｅｖｅｔｒｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
本明細書で用いられる用語「ミトコンドリア転移細孔開口の阻害剤」は、内膜チャネルの開口によって引き起こされる、ミトコンドリア内膜の透過性の非特異的な増大を遮断する物質を指す。ミトコンドリア転移細孔開口の阻害剤の例としては、シクロスポリンＡおよびその誘導体、ＮＩＭ８１１、ジフェニルボリン酸２−アミノエチルならびにボンクレキン酸が挙げられるが、これらに限定されない
【００８５】
本明細書で用いられる用語「抗炎症剤」は、炎症を減少させる物質を指す。抗炎症剤の例としては、サリチル酸塩、例えばアセチルサリチル酸、ジフルニサルおよびサルサラート；プロピオン酸誘導体、例えばイブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン；酢酸誘導体、例えばインドメタシン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン；エノール酸誘導体、例えばピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカムおよびイソキシカム；フェナム酸誘導体、例えばメフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸およびトルフェナム酸；選択的ＣＯＸ−２阻害剤、例えばセレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブおよびフィロコキシブ；スルホンアニリド類、例えばニメスリド；およびその他の化合物、例えばリコフェロンが挙げられるが、これらに限定されない
【００８６】
本明細書で用いられる用語「ＰＰＡＲアゴニスト」は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体を刺激する物質を指す。ＰＰＡＲアゴニストの例としては、ＧＷ−９６６２、チアゾリジンジオン類、例えばロシグリタゾン；フィブラート類、例えばベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、ジェムフィブロジルおよびフェノフィブラート；ならびにグリタザール類、例えばムラグリタザール、テサグリタザールおよびアレグリタザールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書で用いられる用語「ＲＸＲアゴニスト」は、レチノイドＸ受容体を刺激する物質を指す。ＲＸＲアゴニストの例としては、ＣＤ３２５４、ドコサヘキサエン酸、フルオロベキサロテン、ベキサロテン、レチノイン酸およびＳＲ１１２３７が挙げられるが、これらに限定されない
【００８８】
本明細書で用いられる用語「サーチュイン１アゴニスト」は、サーチュイン１酵素を刺激する物質を指す。サーチュイン１アゴニストの例としては、レスベラトロールおよびＳＲＴ−１７２０が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
本明細書で用いられる用語「抗高脂血症剤」は、血中の脂質や低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を低下させ、および／または高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を増加させる、ＰＰＡＲアゴニストおよびフィブラート類以外の物質を指す。抗高脂血症剤の例としては、スタチン類、例えばアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチン；ナイアシン；胆汁酸捕捉剤、例えばコレスチラミン、コレセベラムおよびコレスチポール；その他の化合物、例えばフィトステロール類、エゼチミブ、オルリスタットおよびナイアシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
別の態様によれば、本発明は、医薬として用いられる本発明の組成物に関する。あるいは本発明は、薬剤の製造のための、本発明の組成物の用途に関する。
【００９１】
さらなる態様によれば、本発明は、被験体のＸ−ＡＬＤの予防および／または治療における用途のための本発明の組成物に関する。
【００９２】
さらに別の態様によれば、本発明は、被験体の必要に応じたＸ−ＡＬＤの予防および／または治療のための方法に関し、該方法は、治療上有効な量の本発明の組成物を、前記被験体に投与することを含む。
【００９３】
「Ｘ−ＡＬＤ」との用語については、これまでに記載されており、その詳細は参考によって本明細書に取り込まれる。特定の実施形態によれば、Ｘ−ＡＬＤは、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）および副腎白質ジストロフィーの小児期の変異形（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される。さらに特定の実施形態によれば、Ｘ−ＡＬＤは成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）である。
【００９４】
医薬組成物
本発明の第２の態様で定義された特異的ｍＴＯＲ阻害剤を含む組成物の医学的用途のために、それらの組成物は医薬組成物中に見出されてよい。
【００９５】
したがって別の態様によれば、本発明は、特異的ｍＴＯＲ阻害剤と、ｍＴＯＲ非依存性のオートファジー誘発剤、抗酸化剤、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ミトコンドリア転移細孔開口の阻害剤、抗炎症剤、ＰＰＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、サーチュイン１アゴニストおよび抗高脂血症薬からなる群から選択される化合物と、薬剤的に許容される賦形剤または担体とを含んでなる組成物の治療上有効な量を含む医薬組成物に関する。「ｍＴＯＲ非依存性のオートファジー誘発剤」、「抗酸化剤」、「ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤」、「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤」、「ミトコンドリア転移細孔開口の阻害剤」、「抗炎症剤」、「ＰＰＡＲアゴニスト」、「ＲＸＲアゴニスト」、「サーチュイン１アゴニスト」および「抗高脂血症薬」との用語、およびそれらの詳細についてはこれまでに記載されており、それらはここでも参照される。
【００９６】
本明細書で用いられる用語「医薬組成物」は、本発明の特異的ｍＴＯＲ阻害剤および少なくとも１つの薬剤的に許容される賦形剤または担体を含む組成物の、治療上有効な量を含む組成物を指す。
【００９７】
本明細書で用いられる用語「治療上有効な量」は、本発明の薬剤に関連して、または本発明の医薬組成物を構成する薬剤、賦形剤および／または担体に関連して、望ましい効果を提供するため、すなわち疾病に由来する１つ以上の症状の明らかな予防、治癒、遅延、重症度の低下または寛解を達成するための、前記薬剤、賦形剤および／または担体の十分な量に関し、これは一般に、特に薬剤自体の特性および達成されるべき治療効果によって決定される。これはまた、治療される被験体、前記被験体の疾病の重症度、選択した剤形などに依存する。この理由から、本発明で言及される用量は、当業者に対する指針としてのみ考慮されるべきであり、当業者はこの用量を、前述の変量に応じて調整しなければならない。一実施形態によれば、有効量は、治療される疾病の１つ以上の症状を寛解させる。
【００９８】
本発明の医薬組成物の化合物の組み合わせは、単離剤形の、もしくはさらなる有効薬剤と組み合わせた、プロドラッグ、塩、溶媒和物またはクラスレートとして見出されてよい。
【００９９】
「薬剤的に許容される賦形剤」または「薬剤的に許容される担体」との用語は、無毒の固体、半固体、または液体の注入剤、希釈剤、カプセル用材料、または従来のいずれかの製剤補助剤を指す。薬剤的に許容される担体は、レシピエントに対して用いられる投与量および濃度においては本質的に無毒であり、製剤のその他の成分に適合性である。適切な担体としては、水、デキストロース、グリセロール、生理食塩水、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。担体には、製剤の有効性を増強する、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または補助剤のような追加の薬剤を含有させることができる。補助剤は、無菌の液体、例えば水、およびピーナッツ油、大豆油、ミネラルオイル、胡麻油などのような、石油、動物、野菜、または合成に由来するものを含む油からなる群から選択されてよい。水または生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液が、特に注射用溶液のために、ビヒクルとして好ましく用いられる。適切な医薬品用ビヒクルについては、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」２２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１２に記載されている。
【０１００】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の医薬組成物の化合物は、人間およびその他の哺乳類への送達投与に適応させた医薬組成物としての標準的な手順に従って処方される。典型的には、静脈内または脳室内に投与するための医薬組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。
【０１０１】
必要に応じて、本発明の医薬組成物には、可溶化剤、および注射部位のいずれかの疼痛を寛解させるための局所麻酔薬も含まれる。一般に成分は、別々に、または単位剤形中に混合されて、例えば、有効薬剤の量が表示されている、アンプルまたは小袋のような気密密閉されたコンテナー内の、凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。医薬組成物が点滴投与される場合には、無菌の、医薬品グレードの水または生理食塩水を含む点滴瓶を用いて投薬することができる。医薬組成物が注射投与される場合には、投与前に成分が混合され得るように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供できる。
【０１０２】
静脈内投与以外の場合には、医薬組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、ゲル、ポリマー、または徐放性製剤であってよい。医薬組成物は、当該技術分野において公知であるように、伝統的な結合剤および担体と共に処方できる。製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカライド（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、標準的な担体、医薬品の製造における機能性が十分に確立されている不活性の担体が含まれてよい。リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、ナノ粒子、ナノカプセルなどへの被包を含む、様々な送達系が知られており、本発明の治療剤の投与に用いることができる。
【０１０３】
さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明の医薬組成物を含む治療剤は、中性または塩の形態として処方できる。薬剤的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離アミノ基によって形成されたもの、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、またはプロカインなどに由来する遊離カルボキシル基によって形成されたものが含まれる。
【０１０４】
本発明に用いられる好ましい賦形剤としては、糖類、デンプン、セルロース、ゴムおよびタンパク質が挙げられる。特定の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、固体医薬剤形（例えば錠剤、カプセル、コートされた錠剤、顆粒、坐薬、再構成して液体の形態にできる無菌の結晶性または非晶質の固体など）、液体剤形（例えば溶液、懸濁液、エマルション、エリキシル剤、ローション、軟膏など）または半固体剤形（ゲル、ポマード、クリームなど）として処方される。薬剤的に許容される担体の例は先行技術において知られており、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルションのようなエマルション、異なるタイプの保湿剤、無菌溶液などが挙げられる。
【０１０５】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、選択された投与経路、例えば全身、経口、非経口または局所に適しているとみなされる投与に対する、いずれかの医薬品の形態であってよく、そのために、所望の投与方法の処方に必要な薬剤的に許容される賦形剤が含まれる。
【０１０６】
本発明の化合物の有効量は広範囲に変動し得るが、一般には、応用の特定の条件、曝露される時間およびその他の事柄に依存して変動する。
【０１０７】
経口投与のための固体剤形としては、従来のカプセル、徐放性カプセル、従来の錠剤、徐放性錠剤、咀嚼錠、舌下錠、発泡錠、丸剤、懸濁液、散剤、顆粒およびゲルが挙げられ得る。これらの固体剤形において、有効化合物は、少なくとも１つの不活性な賦形剤、例えばスクロース、ラクトースまたはデンプンと共に混合できる。このような剤形はまた、通常の実行時に、不活性な希釈剤以外のさらなる物質、例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤も含んでよい。カプセル、錠剤、発泡錠および丸剤の場合、剤形は緩衝剤もまた含んでよい。錠剤および丸剤は、腸溶コーティングを用いて調製できる。
【０１０８】
経口投与のための液体剤形としては、この技術で通常用いられる、薬剤的に許容される不活性な希釈剤、例えば水を含む、エマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられ得る。これらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤のような補助剤、ならびに甘味料、香味料および香料もまた含んでよい。
【０１０９】
注射用の調製品、例えば無菌、注射用の水性または油性の懸濁液が、適切な分散剤、湿潤剤および／または懸濁剤を用いて、公知の技術に従って処方されてよい。許容されるビヒクルおよび溶媒のうち、使用可能なものは、水、リンゲル液および生理食塩水である。無菌油もまた、溶媒または懸濁用液として従来から用いられている。
【０１１０】
局所投与のために、本発明の医薬組成物は、クリーム、ゲル、ローション、液体、ポマード、スプレー溶液、分散剤、固形バー、エマルション、マイクロエマルションなどとして処方可能であり、これらは、適切な賦形剤、例えば乳化剤、界面活性剤、増粘剤、着色料およびそれらの２つ以上の組み合わせを用いる従来の方法に従って処方されてよい。
【０１１１】
加えて、本発明の医薬組成物は、経皮パッチまたはイオン導入装置の形態において投与されてもよい。一実施形態によれば、本発明の化合物は、経皮パッチ、例えば徐放性経皮パッチの形態において投与される。適切な経皮パッチは、例えば、米国特許第５２６２１６５号、米国特許第５９４８４３３号、米国特許第６０１０７１５号および米国特許第６０７１５３１号に、さらに詳細に記載されている。
【０１１２】
本発明の医薬組成物は、従来の賦形剤、すなわち、有効化合物と反応してダメージを与えることのない、非経口投与に適した、薬剤的に許容される担体をさらに含むことができる。適切な、薬剤的に許容されるビヒクルとしては、例えば、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、脂肪酸エステル、石油、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１１３】
幾つかの薬物送達系が知られており、本発明の化合物または組成物を投与するために用いることができる。これらは例えば、リポソーム、マイクロバブル、エマルション、微粒子、マイクロカプセル、ナノ粒子、ナノカプセルなどへの被包が挙げられる。必要とされる投与量は、単一の単位として、または徐放性の形態によって投与できる。
【０１１４】
持続可能な放出形態およびそれらの調製に適切な材料と方法は、当該技術分野において公知である。本発明の一実施形態によれば、本発明の医薬組成物の経口的に投与可能な形態は、少なくとも１つのコーティングまたはマトリックスをさらに含む、徐放性の形態である。コーティングまたは徐放性マトリックスとしては、天然ポリマー、半合成または合成の非水溶性で改変された、ワックス、脂質、脂肪アルコール、脂肪酸、天然半合成または合成の可塑剤、またはそれらのうち２つ以上の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
腸溶コーティングは、当業者に公知の従来の方法を用いて塗布されてよい。
【０１１６】
本発明によるスクリーニング法
別の態様によれば、本発明は、Ｘ−ＡＬＤの治療および／または予防に潜在的に有用な化合物を同定するための方法であって、以下「本発明の方法」と称される方法に関し、該方法は、
ａ）Ｘ−ＡＬＤ細胞と候補化合物を接触させること、および
ｂ）前記候補化合物の存在下で
（ｉ）ｍＴＯＲの活性レベル、および
（ｉｉ）オートファゴソームマーカーの発現レベル
からなる群から選択されるマーカーを分析することを含んでなり、
ここで前記候補化合物が、ｍＴＯＲの活性を阻害する、および／またはオートファゴソームマーカーの発現を変化させる場合に、前記候補化合物はＸ−ＡＬＤの治療および／または予防に有用であるものとすることを特徴とする。
【０１１７】
「ｍＴＯＲ」、「治療」、「予防」および「Ｘ−ＡＬＤ」との用語は、本発明の第１の態様との関連において既に定義されており、これらの定義は、本発明のスクリーニング法との関連においても同様に適用される。
【０１１８】
本発明の方法によれば、第１工程は、Ｘ−ＡＬＤ細胞と候補化合物を接触させることを含む。
【０１１９】
本明細書で用いられる表現「Ｘ−ＡＬＤ細胞」は、ｍＴＯＲが過剰発現して、ｍＴＯＲ経路の活性化が増大している、Ｘ−ＡＬＤ患者に由来する単一の細胞または１個もしくは複数の細胞（培養細胞として）、または器官型培養のような３Ｄ（三次元）構造を形成する一部、のいずれかを指す。
【０１２０】
本明細書で用いられる用語「ｍＴＯＲ経路の活性化増大」は、ｍＴＯＲの活性および／または発現が参照のレベルに比較して増大している細胞を指し、ここで前記参照のレベルとは、ｍＴＯＲ経路の活性化を示さないか、またはｍＴＯＲ経路を活性化できる薬剤によって刺激されていない細胞における発現および／または活性である。本明細書で用いられる用語「ｍＴＯＲ経路」は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路としても知られ、余分な細胞シグナル伝達分子が、細胞表面または細胞内部に位置する特異的受容体を活性化させる際に起こる、細胞におけるタンパク質（ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴおよびｍＴＯＲ）の連鎖を指す。
【０１２１】
本発明のスクリーニング法において、Ｘ−ＡＬＤ細胞のｍＴＯＲの発現レベルまたは活性レベルは、参照の発現レベルまたは参照の活性レベルに対して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％またはそれを超えて増大している。ｍＴＯＲの発現レベルまたはｍＴＯＲ活性を決定するための方法は、本発明の第１の態様との関連において既に定義されており、これらはここでも参照される。
【０１２２】
特定の実施形態によれば、本発明のスクリーニング法の細胞は、ｍＴＯＲを過剰発現するようにトランスフェクションされたか、または遺伝的に改変されたものである。別の特定の実施形態によれば、本発明のスクリーニング法の細胞は、Ｘ−ＡＬＤ患者から得られる。
【０１２３】
ポリヌクレオチドが、いずれかの適切な人工的操作によって細胞内に移入されたか、または細胞が、最初に該ポリヌクレオチドを受け継いだ改変細胞の子孫である場合、その細胞は「遺伝的に改変された」、「トランスフェクトされた」、または「遺伝的に形質変換された」と言われる。ポリヌクレオチド、すなわちｍＴＯＲ配列を含むポリヌクレオチドは、しばしば対象タンパク質（すなわちｍＴＯＲ）をコードする転写可能な配列を含み、この配列によって、細胞は該タンパク質を高レベルで発現できる。遺伝的変化は、改変細胞の子孫が同じ変化を有する場合、「遺伝可能」であると言われる。「形質変換された細胞」は、その細胞に（またはその先祖もしくは祖先に）、例えば組換えＤＮＡ技術またはウイルスによって、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子が導入された細胞を意味する。「核酸」または「核酸分子」は、一重もしくは二重鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、他に制限がない限り、これは、天然ヌクレオチドと同様に機能できる、天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含できる。本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」の用語は互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。
【０１２４】
本発明の方法に用いることのできる細胞の例としては、脳、脊髄、骨髄、皮膚、血液などの多様な組織から得た初代培養；線維芽細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球および幹細胞などの初代培養から得た不死化細胞；人工多能性幹細胞などの初代細胞から得た改変細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態によれば、使用される細胞は線維芽細胞、さらに好ましくはヒト線維芽細胞である。さらになお好ましい実施形態によれば、本発明の方法において使用される細胞は、Ｘ−ＡＬＤ患者から得たヒト線維芽細胞である。
【０１２５】
細胞培養は、前記培養における細胞の生存を許容する条件にて維持される。前記条件としては特に、適切な湿度、温度、ガス濃度、栄養素（培地）などが挙げられる。前記条件を達成するために、当業者に公知の特別なインキュベーターを使用できる。培養条件は、特定の培養それぞれに対して定義され得る。
【０１２６】
具体的には、Ｘ−ＡＬＤ患者から得た初代ヒト線維芽細胞は、１０％  ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ  ストレプトマイシンを加えたダルベッコ変法イーグル培地中で、３７℃、５％ＣＯ２にて培養される。
【０１２７】
「Ｘ−ＡＬＤ細胞と候補化合物を接触させる」との表現は、単数または複数の細胞を、評価される候補化合物と接触させるいずれかの方法を指し、細胞外で前記化合物と接触させるいずれかの可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法、または前記化合物を細胞に導入するいずれかの方法が含まれる。したがって、候補化合物が低分子量の分子である場合には、前記分子を培地に添加することで十分である。候補化合物が高分子量の分子（例えば、核酸またはタンパク質のような生体高分子）である場合には、この分子が細胞内部にアクセスできるような手段の提供が必要となる。候補分子が核酸である場合には、ＤＮＡコンストラクトの導入について既に記載されたように、従来のトランスフェクション手段が使用できる。候補化合物がタンパク質である場合には、細胞はタンパク質と直接接触させられるか、またはタンパク質をコードする核酸と、その転写／翻訳を可能にするエレメントとの組み合わせを細胞内へいったん入れることで接触させられる。この目的のため、組み合わせを細胞内へ入れることが可能な、前述のいずれかの方法を用いることができる。あるいは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質由来のＴａｔペプチド、キイロショウジョウバエ由来のアンテナペディアホメオドメインタンパク質の第３ヘリックス、または単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、およびアルギニンオリゴマーのような、細胞内部へのタンパク質の移行を促進できるペプチドによって修飾された、対象タンパク質の変異形と、細胞とを接触させることが可能である。
【０１２８】
分析される化合物は、好ましくは単離されておらず、天然源由来の複合混合物の一部を形成するか、または化合物ライブラリーの一部を形成する。本発明の方法に従って分析できる化合物ライブラリーの例としては、ペプチド、および、Ｄ−アミノ酸または非ペプチド結合を含むペプチドを含む、ペプチド類似体の両方を含むペプチドライブラリー、ホスホロチオエート型非リン酸ジエステル結合を有する核酸またはペプチド核酸を含む核酸ライブラリー、抗体、炭水化物、低分子量化合物、好ましくは有機分子、ペプチド模倣物のライブラリーなどが挙げられるが、これらに限定されない。低分子量有機化合物のライブラリーを用いる場合、該ライブラリーは、細胞内部へさらに容易にアクセス可能な化合物を含むように、予め選択可能である。このように、化合物は、大きさ、親油性、親水性、水素結合の形成能のような特定のパラメータに基づいて選択できる。
【０１２９】
分析される化合物は、代わりに、天然源から得た抽出物の一部を形成できる。天然源は、土壌、空気中、海洋生物などからの抽出物を含むが、これらに限定されない、いずれかの環境から得られる動物、植物源であってよい。
【０１３０】
試験化合物のインキュベーションは、異なる濃度およびインキュベーション時間によって行われる。陰性および陽性対照の使用が、強く推奨される。
【０１３１】
本発明のスクリーニング法の第２工程は、前記候補化合物の存在下でｍＴＯＲの活性を分析することを含んでなり、ここでマーカーは、
（ｉ）ｍＴＯＲの活性レベル、および
（ｉｉ）オートファゴソームマーカーの発現レベル
からなる群から選択される。
【０１３２】
したがって特定の実施形態によれば、本発明の方法の第２工程は、ｍＴＯＲの活性レベルを決定することによって、前記候補化合物の存在下でｍＴＯＲの活性を分析することを含んでなる。したがって本発明の方法のこの実施形態によれば、Ｘ−ＡＬＤの治療および／または予防に潜在的に有用な化合物を同定するための方法の第２工程は、ｍＴＯＲによってリン酸化されるいずれかの基質、例えばＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＵＬＫ１またはリン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋタンパク質の発現レベルを決定することを含む。「ＥＩＦ４ＥＢＰ１」、「ＵＬＫ１」および「リン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋ」との用語、ならびに前記マーカーを決定するために適切な方法については、最初に本発明との関連において定義されており、これらの定義は、本発明のこの態様にも同等に適用される。
【０１３３】
本発明の方法によれば、前記候補化合物がｍＴＯＲの活性を阻害する場合、その候補化合物は、Ｘ−ＡＬＤの治療および／または予防に有用である。
【０１３４】
本発明の特定かつ好ましい実施形態によれば、ｍＴＯＲの活性は、Ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋのレベルを決定することによって決定される。好ましい実施形態によれば、リン酸化ｐ７０Ｓ６Ｋのレベルは、ウェスタンブロットによって決定される。
【０１３５】
一般に、細胞を候補化合物によって処理した後、分析された前記細胞におけるＰ−ｐ７０Ｓ６Ｋのレベルが処置前よりも低い場合に、該化合物はＸ−ＡＬＤの治療に有用な可能性があるとみなされる。
【０１３６】
別の特定の実施形態によれば、本発明の方法の第２工程は、細胞が線維芽細胞の場合には、少なくとも１つのオートファゴソームマーカーの発現レベルを決定することを含む。「オートファゴソームマーカー」または「オートファジックマーカー」との用語は、本発明の第１の実施形態との関連において既に説明されている。
【０１３７】
本明細書で用いられる用語「発現を変化させる」は、化合物が、オートファゴソームマーカーの発現を、陰性対照、例えば前記化合物によって処理されていない細胞に対し、１倍を超えて、１．５倍を超えて、２倍を超えて、または２．５倍を超えて誘導することを意味する。前記の用語はまた、前記化合物が、オートファゴソームマーカーの発現を、陰性対照、例えば前記化合物によって処理されていない細胞に対し、１倍を超えて、１．５倍を超えて、２倍を超えて、または２．５倍を超えて減少させることも意味する。
【０１３８】
上で説明したように、本発明の特異的ｍＴＯＲ阻害剤はオートファジーを誘導する。特定の実施形態によれば、本発明の方法は、ＬＣ３−ＩＩ、ｐ６２またはそれらの組み合わせから選択されたオートファゴソームマーカーの発現レベルを決定することによって、ｍＴＯＲの活性を決定することを含む。「ＬＣ３−ＩＩ」および「ｐ６２」との用語、ならびに前記マーカーを決定するために適した方法については、最初に本発明との関連において定義されており、これらの定義は、本発明のこの態様にも同等に適用される。
【０１３９】
一般に、化合物が、ＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２のレベルを、前記化合物によって処理されていない細胞において測定された前記レベルに対して変化させる場合に、該化合物はＸ−ＡＬＤの治療に有用な可能性があるとみなされる。したがって、細胞を候補化合物によって処理した後、分析された前記細胞におけるｐ６２のレベルが処置前よりも低い場合、および／または、細胞を候補化合物によって処理した後、分析された前記細胞におけるＬＣ３−ＩＩのレベルが処置前よりも高い場合に、該化合物はＸ−ＡＬＤの治療に有用な可能性があるとみなすことができる。
【０１４０】
必要に応じて、本発明のスクリーニング法は、酸化マーカー、例えば酸化型タンパク質、プロテアソームのキモトリプシン様活性、免疫プロテアソームサブユニットβｌｉ／ＬＭＰ２およびβ５ｉ／ＬＭＰ７の発現レベルならびにＡＴＰのレベルを決定することを、さらに含む。上で説明したように、特異的ｍＴＯＲ阻害剤は、酸化型タンパク質の蓄積を阻止して細胞のエネルギーレベルを回復させる。したがって本発明の方法によれば、化合物が、ｍＴＯＲの活性を阻害することおよび／またはオートファゴソームマーカーの発現を変化させることに加え、細胞を候補化合物によって処理した後、分析された前記細胞における酸化型タンパク質のレベル、プロテアソームのキモトリプシン様活性ならびに／または免疫プロテアソームサブユニットβ１ｉ／ＬＭＰ２およびβ５ｉ／ＬＭＰ７の発現レベルが処置前よりも低い場合、および／または、細胞を候補化合物によって処理した後、分析された前記細胞におけるＡＴＰのレベルが処置前よりも高い場合に、該化合物はＸ−ＡＬＤの治療に有用な可能性があるとみなされる。「酸化マーカー」、「酸化型タンパク」、「プロテアソームのキモトリプシン様活性」、「免疫プロテアソームサブユニットβｌｉ／ＬＭＰ２」、「免疫プロテアソームサブユニットβ５ｉ／ＬＭＰ７」、「ＡＴＰ」との用語、およびそれらを決定するための方法については、本発明の第１の方法との関連において既に詳述した。
【０１４１】
特異的ｍＴＯＲ阻害剤を用いたｍＴＯＲ活性の阻害によって、軸索変性が阻止される。したがって必要に応じ、本発明のスクリーニング法によって脳に由来する細胞のタイプを分析する場合には、前記方法の第２工程は、Ｉｂａ−１、ＧＦＡＰ、シナプトフィジン、ＡＰＰ、８−ｏｘｏｄＧまたはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの軸索損傷マーカーの発現レベルを決定することをさらに含む。本方法によれば、候補化合物がｍＴＯＲの活性を阻害し、かつ細胞を候補化合物によって処理した後、分析された前記細胞におけるＩｂａ−１、ＧＦＡＰ、シナプトフィジン、および／またはＡＰＰのレベルが処置前よりも低い場合に、該化合物はＸ−ＡＬＤの治療に有用な可能性があるとみなされる。８−ｏｘｄＧのレベル決定については、候補化合物がｍＴＯＲの活性を阻害し、かつ細胞を候補化合物によって処理した後、分析された前記細胞における８−ｏｘｏｄＧのレベルが処置前よりも低い場合に、該化合物はＸ−ＡＬＤの治療に有用な可能性があるとみなされる。
【０１４２】
本発明の特定の実施形態によれば、Ｘ−ＡＬＤは、成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、大脳副腎脊髄ニューロパチー（ｃＡＭＮ）および副腎白質ジストロフィーの小児期の変異形（ｃＡＬＤ）からなる群から選択される。さらに特定の実施形態によれば、Ｘ−ＡＬＤは成人副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）である。
【０１４３】
以下の実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は単に例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１４４】
材料および方法
抗体および試薬
以下の抗体をウェスタンブロットに使用した：ガンマチューブリンおよびＤＮＰ（２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン）（Ｓｉｇｍａ）；ＬＣ３（Ｎａｎｏｔｏｏｌｓ）、抗リンｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）、ｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；アミロイド前駆体タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）；ｐ６２および８−ｏｘｏｄＧ（Ａｂｃａｍ）、ＧＦＡＰ、シナプトフィジン、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ウサギおよび抗マウスＩｇＧ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。蛍光ペプチド：Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｓｕｃ−ＬＬＶＴ−ＡＭＣ）および７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手した。ヘキサコサン酸（Ｃ２６：０）およびバフィロマイシンＡ１はＳｉｇｍａから購入した。
【０１４５】
ヒト脳サンプル
大脳副腎脊髄ニューロパチーの患者および同年齢の健常男性対照被験体に由来する脳組織は、ボルチモアにあるメリーランド大学の、発達障害に対する脳および組織バンク（Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）から得た。すべての患者または患者の法定代理人から書面でのインフォームドコンセントを取得し、現地の倫理委員会はすべての試験を承認した。
【０１４６】
マウスおよび行動試験
本試験に用いたすべての方法は、米国国立衛生研究所から出版された、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）（ＮＩＨ刊行物Ｎｏ．８５−２３、１９９６年改訂）ならびにＩＤＩＢＥＬＬおよびカタルーニャ自治政府の倫理委員会に従った。Ａｂｃｄ１欠損マウスの作出と遺伝子型同定については、既に記載した。実験に用いたマウスは、純系のＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドであった。Ａｂｃｄ１欠損マウスおよび野生型マウスを、対照群と処置群に分けた。テムシロリムス（ＬＣ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、腹腔内注射によって、１週間に３回、２０ｍｇ／ｋｇの用量にて３か月間投与し、各月の処置の間には、３週間の休止期間を交互に設定した。対照マウスには、緩衝液のみを含むプラセボを同頻度で注射した。トレッドミル試験を、既述に正確に従って行った（Ｌｏｐｅｚ−Ｅｒａｕｓｋｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０，８４−９２）。ベルトから落ちる潜在時間（秒単位でのショック時間）および受けたショックの回数を記録した。バークロス試験を、既に記載されたように行った（Ｌｏｐｅｚ−Ｅｒａｕｓｋｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０，８４−９２）。プラセボおよび薬物によって処置されたそれぞれの同腹マウスについて、トレッドミルにおける試験を同時に行い、試験時は、処置の状態に関連した同定を行わなかった。
【０１４７】
細胞の培養および処理
皮膚生検により調製された線維芽細胞を、関連する人物または彼らの代理人からのインフォームドコンセントを含む、サンプリングのための施設の指針に従って集めた。初代ヒト線維芽細胞を、ＤＭＥＭ（１０％  ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ  ストレプトマイシンを含む）中で、３７℃の加湿された５％  ＣＯ２／９５％空気中で培養した。他に記載のない限り、実験は８０％コンフルエントの細胞を用いて行った。欠乏条件（高タンパク質分解培地、Ｈ）のため、細胞を洗浄後に完全増殖培地（上記参照、低タンパク質分解培地、Ｌ）から、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含むクレブス−ヘンゼライト培地（１１８．４ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７５ｍＭ  ＫＣｌ、１．１９ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．５４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２．４４ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２８．６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  グルコース）、ｐＨ７．４（高タンパク質分解培地、Ｈ）へ移し、３７℃にて４時間以下インキュベートした。
【０１４８】
培養細胞におけるオートファジーの分析
パルスチェイス実験のため、ヒト対照およびＸ−ＡＬＤ患者の線維芽細胞を、１μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］バリン（Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｇｍｂｈ）を添加した新鮮な完全培地中で４８時間インキュベートした後、１０ｍＭ  Ｌ−バリンを含む新鮮な完全培地中で２４時間追跡を行い、短命なタンパク質を分解させた。次に、すべての培養を、１０ｍＭ  バリンおよび表示する添加物を含む、クレブス−ヘンゼライト培地、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中で、表示する時間インキュベートした。タンパク質分解の分析は、様々な添加物の効果が最大であることを確実にするため１時間後に行い、二次的効果の可能性を避けるため３時間のみ行った。タンパク質分解は、１．５時間の２回の間隔において、標識細胞から培地中に放出されたトリクロロ酢酸可溶性の放射活性の正味放出量を測定することによって算出し、タンパク質分解のパーセンテージとして表した。総タンパク質分解に対するリソソームによる分解の寄与を、２０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と１００μＭ  ロイペプチン（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）とを用いて、既に記載されたように算出した（Ｆｕｅｒｔｅｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７５，７５−８６）。
【０１４９】
４時間後に、４００ｎＭ  バフィロマイシンＡ１の存在下で、γ−チューブリンのレベルに対する内在性ＬＣ３−ＩＩのレベルを、特異的な抗体を用いて測定することによって、オートファジックな流れを評価した。オートファジーはまた、既に記載されるように、ヒト線維芽細胞にｐＥＧＦＰ−ＬＣ３をトランスフェクトして、４８時間後に、トランスフェクトした細胞あたりの蛍光ドットの数を蛍光顕微鏡を用いて計数することによっても評価した。
【０１５０】
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ分析
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従って用いて、均質化した脊髄から全ＲＮＡを分離した。実験には、ＲＮＡインテグリティナンバー（ＲＩＮ）が８を超え、２８Ｓ／１８Ｓの比が１よりも高いＲＮＡサンプルを用いた。次に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびランダムプライマーを用い、各ＲＮＡサンプルに対してファーストストランドｃＤＮＡを合成した。候補プロテアソーム遺伝子の発現を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＲＱ−ＰＣＲによって分析した。
【０１５１】
ｔｕｂｂ５ＲＮＡを内在性の対照とした「デルタ−デルタＣｔ」（ΔΔＣｔ）法を用いて、相対的な定量を行った。転写物の定量化は、各サンプルに対して二重に行った。
【０１５２】
免疫組織化学
２０か月齢のマウス（野生型、Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−およびテムシロリムスによって処置したＡｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−）から脊髄を採取し、４％パラホルムアルデヒドを用いて灌流した後、記載されるように免疫組織化学のために調製を行い、インキュベートした（Ｌｏｐｅｚ−Ｅｒａｕｓｋｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ，２０１１．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０，８４−９２）。
【０１５３】
電子顕微鏡
マウス脊髄のＬ１〜Ｌ２部分を、リン酸緩衝液（１００ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中の３％  グルタルアルデヒド／４％  ＰＦＡ中で、４℃にて２４時間固定した。ビブラトーム切片（厚さ５０〜１００μｍ）を１％  四酸化オスミウム中で後固定した後、２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニル水溶液中に１時間浮遊させた。蒸留水を用いて洗浄を３回行い、３０、５０、７０、９０および１００％の段階的なアセトン系列を通して脱水した後、標準的な手順によってＤｕｒｃｕｐａｎ  ＡＣＭ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に包埋した。対象領域を選択するため、最初にダイアモンドナイフを用いて半薄切片（１．５μｍ）を作製し、１％トルイジンブルーによって染色した。次に超薄切片を切り出し、クエン酸鉛によって染色した後、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ−１０電子顕微鏡を用いて６０ｋＶにて観察した。４匹の異なるマウスから無作為に撮影した３０を超える電子顕微鏡写真（最終倍率は×７，０００）を用いて、１遺伝子型あたりのリソソームを計数した。
【０１５４】
電気泳動およびウェスタンブロット
安楽死させたマウスから組織を取り出し、液体窒素を用いて急速冷凍した。凍結組織およびヒト線維芽細胞サンプルをＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ）中で、モーター駆動性のグラインダー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて均質化した後、超音波処理装置ＵＰ５０Ｈ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ−Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、２分間４℃にて超音波処理を行った。サンプルを、ポリアクリルアミド（１０％アクリルアミド）ゲル電気泳動に、６０分間１２０ｍＶにて供した。分離されたタンパク質をニトロセルロース膜上に転写して、タンパク質をＥＣＬウェスタンブロット分析システムによって検出した後、ＣＬ−ＸＰｏｓｕｒｅフィルム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露した。ＧＳ８００デンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、オートグラフを走査し、定量した。
【０１５５】
その他の手順
ＡＴＰのレベルは、既に記載されたように測定した（Ｇａｌｉｎｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ  ２０１１，Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  １５，２０９５−２１０７）。プロテアソーム活性アッセイのため、組織を、氷冷した緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．２５Ｍ  スクロース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２ｍＭ  ＡＴＰ）中でテフロン（登録商標）−ガラスホモジナイザーを用いて均質化した後、１２，０００×ｇにて１０分間遠心分離した。Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを基質として用い、プロテアソームのキモトリプシン様活性を、記載されたように行った（Ｌａｕｎａｙ  Ｎ，ｅｔ  ｅｌ，２０１３  Ｂｒａｉｎ  １３６，８９１−９０４）。同量の抽出物を、基質（１００μＭ）と共に１００μｌのプロテアソーム活性アッセイ緩衝液（０．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ジチオスレイトール、および５ｍＭ  ＡＴＰを含むかまたは含まない）中で、３０分間３７℃にてインキュベートした。０．９ｍｌの冷エタノールを加えて、反応を停止させた。蛍光マルチプレートＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ  ＦＬリーダー（ＢＭＧ）を、励起および発光波長それぞれ３８０および４６０ｎｍにて用いて、遊離のＡＭＣ蛍光を定量した。アッセイの特異性を確実にするため、ラクタシスチン（５μＭ、２時間）を用いた。すべての反応は二重に行い、読み取りはフルオロフォアの標準溶液を用いて較正した。
【０１５６】
統計解析
２つの群を比較する際には、常にスチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を評価した。複数の群を解析する際には、ＡＮＯＶＡおよびチューキーの事後検定を用いて統計的有意性を決定した。データは平均±ＳＤとして表した。ｐ＜０．０５を有意であるとみなした（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【０１５７】
実施例１：Ｘ−ＡＬＤ患者およびＸ−ＡＬＤマウスモデルでは、オートファジーが損なわれている
大脳型のＸ−ＡＬＤ、ｃＣＡＬＤおよびＡＭＮの患者における、オートファジーの２つの分子指標の発現について調べた。マクロオートファジーが活性化される間、サイトゾルのタンパク質であるＬＣ３−Ｉは脂質化によってＬＣ３−ＩＩに変換され、オートファゴソームを形成する限界膜の両側へ特異的に結合する。ＬＣ３−ＩＩは他の細胞小器官には結合せず、リソソーム内でオートファジー依存的に分解される。ｃＣＡＬＤならびにｃＡＭＮ患者のサンプル由来の脳の非発症領域および発症領域、および対照サンプルにおけるＬＣ３−ＩＩのレベルを評価すると（図１ＡおよびＢ）、患者の脳の非発症領域および発症領域の両方で、ＬＣ３−ＩＩのレベルは一貫して低かった。リソソーム阻害剤の非存在下で、ＬＣ３−ＩＩのレベルはオートファゴソームの形成率およびオートリソソームへの変換率の両方に依存することから、この低下は、オートファジーの機能障害またはオートファゴソーム−エンドソーム／リソソーム融合の増大のいずれかを示している可能性がある。したがって、オートファジーによって分解され得るアグリソーム形成に関わるタンパク質である、多機能タンパク質ｐ６２（ＳＱＳＴＭ１とも呼ばれる）のレベルもまた測定した。ｐ６２の発現レベルはｃＣＡＬＤおよびｃＡＭＮ患者両方の非患部で上昇しており、発症部位ではさらに顕著であった（図１ＡおよびＢ）。これらの結果はすべて、Ｘ−ＡＬＤ患者ではオートファジーが損なわれていることを支持するものである。
【０１５８】
Ｘ−ＡＬＤマウスモデルの、疾病の異なる段階において、両方のオートファジーマーカーを分析した。Ｘ−ＡＬＤのマウスモデルは、ＡＢＣＤ１遺伝子（Ａｂｃｄ１欠損）の古典的ノックアウトであり、脊髄における遅発性の軸索障害を示すが、明らかな炎症性の特色または脱髄を示さないことから、ヒトの成人が発症する副腎脊髄ニューロパチーに類似している。Ａｂｃｄ１欠損マウスは、２０〜２２か月齢で明らかな運動障害および神経病理的表現型を示すが、酸化的損傷が現れるのは非常に早く、３か月齢あたりである。１２か月齢のＡｂｃｄ１欠損マウスの脊髄ではオートファジーの障害が見出され、このことは野生型マウスに比較したＬＣ３−ＩＩのレベルの低下とｐ６２のレベルの上昇によって証明された（図１Ｃ）。これらの違いは、３か月齢のＡｂｃｄ１欠損マウスでは、野生型に比較して有意ではなかった（図１Ｃ）。
【０１５９】
ダブルノックアウト（Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−）マウスは、１６か月齢で明らかな神経病理的表現型を示し、Ａｂｃｄ１欠損マウスの真の代用として用いられる（Ｌｏｐｅｚ−Ｅｒａｕｓｋｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０，８４−９２）。Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−マウスの脊髄では、はっきりとしたリソソームの減少（約５０％）がみられ（図２）、この結果は、オートファジーの低下が観察されたことと一致している。
【０１６０】
実施例２：Ｘ−ＡＬＤ患者の線維芽細胞では、オートファジーが損なわれている
Ｘ−ＡＬＤ線維芽細胞におけるオートファジーを評価するため、既に記載されたように、細胞を培養した（Ｆｕｅｒｔｅｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７５，７５−８６）。培養は、十分な記載が為されている欠乏応答を介してオートファジーを刺激するための、血清およびアミノ酸を含まない培地（クレブス−ヘンゼライト培地）（Ｈ：高タンパク質分解）、または基本的なオートファジーを評価するための完全培地（Ｌ：低タンパク質分解）中で行った。結果は、Ｘ−ＡＬＤ患者由来の線維芽細胞では、対照に比較してｐ６２のレベルが上昇し、ＬＣ３−ＩＩのレベルは低下していることを示しており、特に後者は高タンパク質分解（Ｈ）培地において観察される（図３Ａ）。図３Ａおよび図１でも観察されたＬＣ３−ＩＩのレベルの変動は、タンパク質の合成または分解による可能性があり、ＬＣ３−ＩＩの分解を遮断するためにヒト線維芽細胞をリソソーム阻害剤のバフィロマイシンＡ１によって処理した。これらの条件下で、ＬＣ３−ＩＩのレベルは、細胞内のオートファゴソームの数と相関した。バフィロマイシンＡ１の存在下で、Ｘ−ＡＬＤ患者由来の線維芽細胞のＬＣ３−ＩＩのレベルは、完全（Ｌ）および欠乏（Ｈ）培地の両方で、対照線維芽細胞に比較して、再び低かった（図３Ｂ）。オートファゴソームの低下は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３を一過性に発現させたＸ−ＡＬＤ線維芽細胞における蛍光点の数が減少していることによって（対照線維芽細胞に比較して約５０％）確認された（図３Ｃ）。
【０１６１】
したがって、全体的にこれらの結果は、Ｘ−ＡＬＤ患者由来の線維芽細胞のオートファジックな流れに機能障害があることを支持している。
【０１６２】
実施例３：Ａｂｃｄ１−／−マウスではｍＴＯＲ活性が増大している
Ｘ−ＡＬＤが進行する間の、オートファジー機能障害の機構について調べた。クラスＩＩＩ  ＰＩ３キナーゼ複合体にはＢＥＣＬＩＮ−１が含まれ、プレオートファゴソーム構造の生成を制御している。ＢＥＣＬＩＮ−１の発現低下は、オートファジック液胞形成の減少に付随することが示されてきたことから、Ｘ−ＡＬＤマウスモデルにおけるＢＥＣＬＩＮ−１のレベルを最初に分析した。３または１２か月齢のＡｂｃｄ１−／−マウスの脊髄と野生型マウスとの比較に有意差はみられなかった（図４Ａ）。ｍＴＯＲの活性化状態、マクロオートファジーの主要な負の制御因子についても調べた。このキナーゼは、栄養素が豊富な条件下でオートファジーを阻害する。十分に確立されたｍＴＯＲ基質であるｐ７０Ｓ６Ｋの分析により、１２か月齢のＡｂｃｄ１−／−マウスの脊髄における該タンパク質のリン酸化は、対照マウスに比較して増大していたが、３か月齢ではそうではなかったことが示されたことは（図４Ａ）、図１Ｃに示した結果とよく一致している。同様に、Ｘ−ＡＬＤ線維芽細胞におけるｐ７０Ｓ６Ｋリン酸化の分析では、基本条件下（低タンパク質分解培地、Ｌ）で、対照線維芽細胞に比較した有意な増大が示された（図４Ｂ）。予想したように、欠乏条件下（高タンパク質分解培地、Ｈ）で、線維芽細胞にｍＴＯＲの活性は検出されなかった。
【０１６３】
したがって、ｍＴＯＲはオートファジーを阻害することから、これらの結果はＸ−ＡＬＤにおいて観察されるオートファジーの欠陥がｍＴＯＲ依存性であることを強く示唆している。
【０１６４】
実施例４：ＶＬＣＦＡは、ヒト線維芽細胞におけるオートファジーを損なう
Ｘ−ＡＬＤでは、ＶＬＣＦＡが蓄積される。対照およびＸ−ＡＬＤ患者から分離した線維芽細胞への、過剰なヘキサコサン酸添加の効果について調べた。
【０１６５】
最初に、パルスチェイス実験において、欠乏条件下での長寿命タンパク質の分解を分析することにより、細胞内タンパク質の分解を分析して、過剰なＶＬＣＦＡの添加によって対照およびＸ−ＡＬＤ線維芽細胞に変化が見られたか否かを決定した。既に記載された手順により（Ｆｕｅｒｔｅｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７５，７５−８６）、総タンパク質分解と、それとは別にリソソームのタンパク質分解も推定した。図５Ａに示すように、Ｘ−ＡＬＤ線維芽細胞では、対照線維芽細胞に比較して、長寿命タンパク質の総分解が減少した（約３５％）。
【０１６６】
同様に、このような高タンパク質分解条件下では主にマクロオートファジーに相当する（Ｆｕｅｒｔｅｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７５，７５−８６）リソソームの分解は、Ｘ−ＡＬＤ線維芽細胞の基本レベルに対して顕著に低下した（約５０％）。これらの結果により、上でその他の手順を用いて検出された、Ｘ−ＡＬＤにおけるオートファジーの機能障害が確認された。過剰なＶＬＣＦＡの添加により、対照線維芽細胞における総分解およびリソソームでの分解は、それぞれ約１５％および４０％阻害されたが、Ｘ−ＡＬＤ線維芽細胞において有意な阻害は観察されなかった（図５Ａ）。
【０１６７】
次に、ＶＬＣＦＡによって処置したかまたはしていない、対照およびＸ−ＡＬＤ線維芽細胞から得た細胞抽出物におけるＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２のレベルを、免疫ブロット分析によって決定した。対照線維芽細胞において、過剰なＶＬＣＦＡは明らかにＬＣ３−ＩＩのレベルを低下させ、かつｐ６２のレベルを上昇させたが、既にＬＣ３−ＩＩとｐ６２のレベルが変化したＸ−ＡＬＤ線維芽細胞にＶＬＣＦＡを過剰に添加しても、有意差は観察されなかった（図５Ｂ）。
【０１６８】
これらの結果はパルスチェイス実験と一致していることから、Ｘ−ＡＬＤにみられるＶＬＣＦＡの増加は、疾病に観察されるオートファジーの機能障害に寄与していることが示唆される。
【０１６９】
実施例５：抗酸化剤による処置は、Ａｂｃｄ１−／−マウスにおけるオートファジーを部分的に回復させる
Ａｂｃｄ１欠損マウスは、約１５か月齢から運動障害および神経病理的徴候を呈するが、酸化的損傷が現れるのは非常に早く、約３か月齢である（Ｆｏｕｒｃａｄｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １７，１７６２−１７７３）。ビタミンＥ、α−リポ酸およびＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の組み合わせは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性酸素種（ＲＯＳ）産生を効率的に減少させ、Ｘ−ＡＬＤマウスにおける脊髄のタンパク質およびＤＮＡの酸化的損傷を逆転させ、軸索変性および運動障害を抑止する（Ｌｏｐｅｚ−Ｅｒａｕｓｋｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０，８４−９２）。
【０１７０】
この抗酸化剤カクテルを用いて、マウスを４か月にわたって処置することにより、Ａｂｃｄ１−／−マウスの脊髄におけるＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２のレベルは、それぞれ有意に上昇および低下した（図６Ａ）。これにより、抗酸化剤は、Ａｂｃｄ１−／−マウスにおけるオートファジーの低下調節を、少なくとも部分的に阻止することが示される。また、ｍＴＯＲ活性に対する抗酸化剤処置の効果についても調べた。図６Ｂに示すように、１２か月齢のＡｂｃｄ１−／−マウスに観察されたｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化の増大（図４Ａも参照）は、抗酸化剤処置によってわずかに減少したが、効果は有意ではなかった。このことは、Ｘ−ＡＬＤにおいて、オートファジーはｍＴＯＲ非依存性の機構によって誘導され得ることを強調しており、一般的なオートファジー活性化因子（ｍＴＯＲ阻害剤を含む）は、副腎白質ジストロフィーの治療に有用なツールである可能性を示唆している。
【０１７１】
実施例６：テムシロリムスは、Ａｂｃｄ１−／−マウスにおけるオートファジーを促進する
ｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンは公知のオートファジー誘発剤であることから、本発明者らは、Ｘ−ＡＬＤの病因に対するその治療効果の可能性をｉｎ  ｖｉｖｏにて試験した。ラパマイシンは難水溶性で、水溶液中での安定性に乏しいため、ラパマイシンエステルであるテムシロリムスを用いた。
【０１７２】
１０か月齢のＡｂｃｄ１欠損マウスを、既に記載されたような腹腔内注射により、テムシロリムスまたはビヒクル（対照）を投与することによって処置した。マウスの身体応答をチェックするための用量試験を最初に行った。３か月間にわたってテムシロリムスを継続投与することにより、重篤な体重減少が誘導された（データ未提示）。したがって副作用を阻止するために、他の処置条件、すなわち、３か月間のテムシロリムスの腹腔内注射の各月の処置の間に、３週間の休止期間を交互に設定することを試した。このような条件下で、マウスには、有意な体重減少を伴わない、より良い自発運動動作が観察されたことから、この処置がさらに適していることが示される。
【０１７３】
Ｘ−ＡＬＤにおけるテムシロリムスの効果を評価するため、最初に、処置マウスの脊髄におけるｍＴＯＲ経路の阻害を確認した。予想されたように、テムシロリムスによって処置したマウスではｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化が低下していたが、総ｐ７０Ｓ６Ｋに対する免疫活性は変化していなかった（図７Ａ）。
【０１７４】
ＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２のレベルをウェスタンブロットを用いて測定することによってオートファジーも評価した。ｍＴＯＲの阻害から予想されたように、Ａｂｃｄ１−／−マウスの脊髄において、テムシロリムスはＬＣ３−ＩＩおよびｐ６２をそれぞれ上昇および低下調節することが示された（図７Ｂ）。
【０１７５】
実施例７：テムシロリムスは、Ａｂｃｄ１−／−マウスにおける酸化型タンパク質の蓄積、エネルギー不全およびプロテアソームの変化を阻止する
酸化ストレスはＸ−ＡＬＤの進行に寄与する。Ｘ−ＡＬＤマウスモデルの脊髄およびＸ−ＡＬＤ患者の線維芽細胞には、タンパク質に対する直接の酸化的、糖酸化的および脂質酸化的損傷、ならびに酵素による抗酸化防御の変化による、酸化的損傷の徴候が見られる（Ｆｏｕｒｃａｄｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ，２００８．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １７，１７６２−１７７３）。
【０１７６】
加えて、酸化的損傷はＡＴＰレベルに対して特異的に影響を及ぼし、ＡＴＰレベルはＡｂｃｄ１欠損マウス、およびＸ−ＡＬＤ患者の線維芽細胞において有意に減少していることから、ＶＬＣＦＡによって引き起こされた酸化ストレスは、エネルギー代謝の機能障害をもたらすことが暗示される（Ｇａｌｉｎｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ａｎｔｉｏｘｉｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ  １５，２０９５−２１０７）。ここで、テムシロリムスによる処置は、Ａｂｃｄ１−／−マウスの脊髄における酸化型タンパク質のレベルを大幅に減少させ（図７Ｃ）、かつ生体エネルギー不全を阻止してＡＴＰのレベルを正常化したことが示される（図７Ｄ）。
【０１７７】
最後に、Ｘ−ＡＬＤ発病の間には、酸化ストレスに応答して、ユビキチン−プロテアソーム系および免疫プロテアソーム誘導の機能不全が起こる（Ｌａｕｎａｙ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｒａｉｎ  １３６，８９１−９０４）。ここで、テムシロリムスによる処置が、キモトリプシン様プロテアソーム活性を正常化させ（図７Ｅ）、免疫プロテアソームサブユニットβ１ｉ／ＬＭＰ２およびβ５ｉ／ＬＭＰ７の誘導を阻害する（図７Ｆ）ことが観察された。
【０１７８】
実施例８：テムシロリムスは、Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−マウスにおける軸索変性を阻止する
Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−マウスは、（ｉ）運動神経細胞における酸化的なＤＮＡ損傷のマーカーである、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン（８−ｏｘｏｄＧ）による標識化の増大；（ｉｉ）Ｉｂａ−１およびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）染色それぞれによって明らかになる、小膠細胞症および星状細胞増多症；（ｉｉｉ）軸索腫脹におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびシナプトフィジンの蓄積によって示される軸索損傷；および（ｉｖ）スダンブラック染色によって証明される、散乱したミエリン片によって特徴付けられる、神経病理的表現型を有する｛Ｌｏｐｅｚ−Ｅｒａｕｓｋｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０，８４−９２｝。
【０１７９】
図８に示すように、Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−の処置によって、軸索損傷のマーカー（シナプトフィジンおよびＡＰＰ）の蓄積およびＤＮＡの酸化は減少し、反応性の星状膠細胞および反応性の小膠細胞の数は対照のレベルよりも減少した（データ未提示）。同様に、テムシロリムスによって、ＸＡＬＤマウス由来の脊髄における運動神経細胞の健康が改善された。
【０１８０】
実施例９：テムシロリムスは、Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−マウスにおける自発運動の欠陥の進行を停止させる
Ａｂｃｄ１−／−／Ａｂｃｄ２−／−マウスにおける自発運動の欠陥を、テムシロリムスによる処置後に、トレッドミル試験およびバークロス試験を行って評価した。トレッドミル試験では、ダブルノックアウトマウスが、野生型マウスに比較して、自発運動障害を反映するショック時間の長さとショック数との間の比の増加を示した。興味深いことに、テムシロリムスによる処置は、この比を正常化した（図９Ａ）。
【０１８１】
バークロス実験では、ダブルノックアウト変異体はしばしばバランスを維持できず、またバーから滑り落ちる傾向が非常に強く、バーの反対側の台に達するまでの潜伏時間も長かった（Ｌｏｐｅｚ−Ｅｒａｕｓｋｉｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７０，８４−９２）。テムシロリムスによる処置後、滑り落ちの回数と、バーを渡るために必要な時間とは正常化した（図９Ｂ）。
【０１８２】
全体的に、これらのデータは、テムシロリムスによる処置が、Ｘ−ＡＬＤマウスにおける自発運動の欠陥の進行を停止させることを示している。
【図１Ａ】
2017529397.tif 000003
【図１Ｂ】
2017529397.tif 000004
【図１Ｃ】
2017529397.tif 000005
【図２】
2017529397.tif 000006
【図３Ａ】
2017529397.tif 000007
【図３ＢＣ】
2017529397.tif 000008
【図４】
2017529397.tif 000009
【図５】
2017529397.tif 000010
【図６】
2017529397.tif 000011
【図７ＡＢ】
2017529397.tif 000012
【図７ＣＤ】
2017529397.tif 000013
【図７ＥＦ】
2017529397.tif 000014
【図８】
2017529397.tif 000015
【図９】
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【国際調査報告】
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