(57)【要約】  本発明は、ヒトインターロイキン１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片を提供し、該抗体または抗原結合断片は、ヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン３に対して阻害可能である。本発明はさらに、白血病及びメラノーマなどの癌の処置ならびに／または診断における、かかる抗体または抗原結合断片の使用を提供する。【選択図】図７（Ｃ）
2017530692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）のドメイン３に対する結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
インタクトな抗体を含むかまたはそれから成る、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）２断片）、及びドメイン抗体（例えば単一ＶＨ可変ドメインまたはＶＬ可変ドメイン）から成る群から選択される抗原結合断片を含むかまたはそれから成る、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体または抗原結合断片が、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対する参照抗体「ＣＡＮ０１」の結合を阻害することができ、
前記参照抗体「ＣＡＮ０１」が、配列番号１のアミノ酸配列から成る重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域とを含むインタクトなＩｇＧである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体または抗原結合断片が、以下の特性：
ａ）２ｎＭ以上のヒトＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）、
ｂ）カニクイザル由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性、
ｃ）１つ以上の癌細胞株においてＡＤＣＣを誘発する能力、及び／または
ｄ）１つ以上の癌細胞株に結合すると内部移行する能力、
のうちの１つ以上を示す、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体または抗原結合断片が、以下の特性：
ａ）２ｎＭ以上のヒトＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）、
ｂ）カニクイザル由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性、
ｃ）１つ以上の癌細胞株においてＡＤＣＣを誘発する能力、及び
ｄ）１つ以上の癌細胞株に結合すると内部移行する能力、
の全てを示す、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体または抗原結合断片が、抗体ＣＡＮ０１が結合することができるＩＬ１ＲＡＰ上のエピトープと少なくとも部分的に重複するＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメイン上のエピトープに結合することができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記エピトープが、ＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸２３５〜３６７に／その内部に位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
以下のＣＤＲ：
ａ）
【化１】
2017530692.tif 000036
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化２】
2017530692.tif 000037
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化３】
2017530692.tif 000038
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号３、４、及び５の前記ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
以下のＣＤＲ：
ａ）
【化４】
2017530692.tif 000039
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化５】
2017530692.tif 000040
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化６】
2017530692.tif 000041
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
配列番号６、７、及び５の前記ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
配列番号８〜１０：
【化７】
2017530692.tif 000042
のいずれか１つのアミノ酸配列、もしくはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれから成る重鎖可変領域を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号８〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成る重鎖可変領域を含む、請求項１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
以下のＣＤＲ：
ａ）
【化８】
2017530692.tif 000043
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化９】
2017530692.tif 000044
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化１０】
2017530692.tif 000045
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
配列番号１１、１２、及び１３の前記ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
配列番号１４〜１８：
【化１１】
2017530692.tif 000046
のいずれか１つのアミノ酸配列、もしくはそれらと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれから成る軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
配列番号１４〜１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成る軽鎖可変領域を含む、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、請求項１３または１８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
配列番号８〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成る重鎖可変領域と、配列番号１４〜１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成る軽鎖可変領域と、を含む、請求項１４または１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｈ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｊ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｋ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｌ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｍ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｎ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、または
ｏ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
を含む、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
前記抗体または抗原結合断片が、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対する参照抗体「ＣＡＮ０３」の結合を阻害することができ、
前記参照抗体「ＣＡＮ０３」が、配列番号１９のアミノ酸配列から成る重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域とを含むインタクトなＩｇＧである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２５】
前記抗体または抗原結合断片が、以下の特性：
ａ）５００ｐＭ以上のヒトＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）、
ｂ）カニクイザル由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性、
ｃ）ＩＬ−１シグナル伝達に対する阻害作用、
ｄ）１つ以上の癌細胞株においてＡＤＣＣを誘発する能力、及び／または
ｅ）１つ以上の癌細胞株に結合すると内部移行する能力、
のうちの１つ以上を示す、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２６】
前記抗体または抗原結合断片が、以下の特性：
ａ）５００ｐＭ以上のヒトＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）、
ｂ）カニクイザル由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性、
ｃ）ＩＬ−１シグナル伝達に対する阻害作用、
ｄ）１つ以上の癌細胞株（例えばＣＭＬ、ＡＭＬ、及び／またはメラノーマ細胞株など）においてＡＤＣＣを誘発する能力、及び
ｅ）１つ以上の癌細胞株（例えばＣＭＬ、ＡＭＬ、及び／またはメラノーマ細胞株）に結合すると内部移行する能力、
の全てを示す、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２７】
前記抗体または抗原結合断片が、抗体ＣＡＮ０３が結合することができるＩＬ１ＲＡＰ上のエピトープと少なくとも部分的に重複するＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメイン上のエピトープに結合することができる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２８】
前記エピトープが、ＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸２３５〜３６７に／その内部に位置する、請求項２７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２９】
以下のＣＤＲ：
ａ）
【化１２】
2017530692.tif 000047
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化１３】
2017530692.tif 000048
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化１４】
2017530692.tif 000049
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖可変領域を含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３０】
配列番号２１、２２、及び２３の前記ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３１】
以下のＣＤＲ：
ａ）
【化１５】
2017530692.tif 000050
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化１６】
2017530692.tif 000051
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化１７】
2017530692.tif 000052
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖可変領域を含む、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
配列番号２４、２５、及び２３の前記ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項３１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３３】
配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３４】
ヒト化重鎖可変領域を含む、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３５】
以下のＣＤＲ：
ａ）
【化１８】
2017530692.tif 000053
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化１９】
2017530692.tif 000054
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化２０】
2017530692.tif 000055
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３６】
配列番号２６、２７、及び２８の前記ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項３５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３７】
配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項３６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３８】
ヒト化軽鎖可変領域を含む、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３９】
前記抗体または抗原結合断片が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞のＡＤＣＣを誘発することができる、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４０】
前記抗体または抗原結合断片が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞のＡＤＣＣを誘発することができない、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４１】
前記抗体または抗原結合断片が、ＩＬ−１シグナル伝達、及び／またはＩＬ−３３シグナル伝達、及び／またはＩＬ−３６シグナル伝達を阻害することができる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４２】
前記抗体または抗原結合断片が、ＩＬ−１シグナル伝達を阻害することができず、ＩＬ−３３シグナル伝達を阻害することができず、かつ／またはＩＬ−３６シグナル伝達を阻害することができない、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４３】
重鎖定常領域、またはその一部を含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４４】
前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から成る群から選択される免疫グロブリンサブタイプのものである、請求項４３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４５】
前記重鎖定常領域が、免疫グロブリンサブタイプＩｇＧ１のものである、請求項４４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４６】
前記重鎖定常領域が、配列番号３０のアミノ酸配列を含むかまたはそれから成る、請求項４５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４７】
軽鎖定常領域、またはその一部を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４８】
前記軽鎖定常領域が、κまたはλ軽鎖のものである、請求項４７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４９】
前記軽鎖定常領域がκ軽鎖のものである、請求項４８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５０】
前記軽鎖定常領域が、配列番号２９のアミノ酸配列を含むかまたはそれから成る、請求項４９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５１】
Ｆｃ領域を含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５２】
前記Ｆｃ領域が非自然発生的である、請求項５１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５３】
前記Ｆｃ領域が、表１に特定される変異のうちの１つ以上を含む、請求項５２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５４】
前記Ｆｃ領域内のフコース残基が欠如しているかまたは少ない、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５５】
薬剤のインビボ半減期を延長させるための部分をさらに含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５６】
前記インビボ半減期を延長させるための前記部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、糖修飾基、脂肪酸、及びデキストランから成る群から選択される、請求項５５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５７】
前記抗体またはその抗原結合断片がＰＥＧ化されている、請求項５６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５８】
細胞傷害性部分をさらに含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５９】
前記細胞傷害性部分が、放射性同位体を含むかまたはそれから成る、請求項５８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６０】
前記放射性同位体が、β放射体、オージェ放射体、変換電子放射体、α放射体、及び低光子エネルギー放射体から成る群から選択される、請求項５９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６１】
前記放射性同位体が、前記薬剤近傍で高用量吸収を生ずる局所吸収エネルギーの放出パターンを有する、請求項５９または６０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６２】
前記放射性同位体が、９０Ｙ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ／１８６Ｒｅ、１６６Ｈｏ、７６Ａｓ／７７Ａｓ、１５３Ｓｍなどの長距離β放射体、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、１６１Ｔｂなどの中距離β放射体、４５Ｃａ、３５Ｓ、もしくは１４Ｃなどの低エネルギーβ放射体、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、９９Ｔｃｍ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、２０１Ｔｌなどの変換またはオージェ放射体、ならびに２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ａｃ、及び２２１Ａｔなどのα放射体から成る群から選択される、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６３】
前記放射性同位体が１７７Ｌｕである、請求項６２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６４】
前記細胞傷害性部分が、細胞傷害性薬物を含むかまたはそれから成る、請求項５８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６５】
前記細胞傷害性薬物が、細胞分裂阻害薬、抗アンドロゲン薬、コルチゾン及びその誘導体、ホスホネート、テストステロン−５−α還元酵素阻害薬、ホウ素付加体（ａｄｄｅｎｄ）、サイトカイン、タプシガルジン及びその代謝物、毒素（例えばサポリンまたはカリチアマイシンなど）、化学療法剤（例えば代謝拮抗薬など）、または腫瘍性疾患の処置に有用な任意の他の細胞傷害性薬物から成る群から選択される、請求項６４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６６】
前記細胞傷害性薬物が、光子活性化療法、中性子活性化療法、中性子誘発性オージェ電子療法、シンクロトロン照射療法、または低エネルギーＸ線光子活性化療法などの活性化療法における使用に好適である、請求項６５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６７】
抗体ポリペプチドが、検出可能部分をさらに含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６８】
前記検出可能部分が、放射性同位体を含むかまたはそれから成る、請求項６７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６９】
前記放射性同位体が、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、１２３Ｉ、及び２０１Ｔｌから成る群から選択される、請求項６８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７０】
前記放射性同位体が８９Ｚｒである、請求項６９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７１】
前記抗体ポリペプチドが、一対の検出可能かつ細胞傷害性の放射性核種、例えば８６Ｙ／９０Ｙまたは１２４Ｉ／２１１Ａｔなどを含む、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７２】
前記放射性同位体が、検出可能部分として、かつまた細胞傷害性部分としても、マルチモーダル様式で同時に作用することができる、請求項７１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７３】
前記検出可能部分が、常磁性同位体を含むかまたはそれから成る、請求項７２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７４】
前記常磁性同位体が、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅから成る群から選択される、請求項７３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７５】
前記検出可能部分が、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学造影、または超音波造影などの造影技術によって検出可能である、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７６】
前記細胞傷害性部分及び／または検出可能部分が、連結部分を介して前記抗体またはその抗原結合断片に間接的に結合している、請求項５８〜７５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７７】
前記連結部分がキレーターである、請求項７６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７８】
前記キレーターが、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミンペンタアセティックアビッド（ａｖｉｄ）（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロドセダン（ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｃｅｄａｎ）−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体から成る群から選択される、請求項７７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７９】
請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片またはその成分ポリペプチド鎖をコードする単離核酸分子。
【請求項８０】
前記分子がｃＤＮＡ分子である、請求項７９に記載の核酸分子。
【請求項８１】
抗体重鎖またはその可変領域をコードする、請求項７９または８０に記載の核酸分子。
【請求項８２】
抗体軽鎖またはその可変領域をコードする、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８３】
請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項８４】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項８３に記載のベクター。
【請求項８５】
請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項８３もしくは８４に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項８６】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項８５に記載の宿主細胞。
【請求項８７】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項８６に記載の宿主細胞。
【請求項８８】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項８７に記載の宿主細胞。
【請求項８９】
請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を生成するための方法であって、請求項８６〜８８のいずれか一項に定義された宿主細胞を、そのコードされた抗体または抗原結合断片の発現を許容する条件下で培養することを含む、方法。
【請求項９０】
有効量の請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項９１】
非経口送達に適した、請求項９０に記載の薬学的組成物。
【請求項９２】
静脈内送達に適した、請求項９１に記載の薬学的組成物。
【請求項９３】
医薬中に使用するための、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９４】
対象における腫瘍性疾患に関連する病的細胞またはその幹細胞もしくは前駆細胞の細胞死の誘発ならびに／または成長及び／もしくは増殖の阻害に使用するための、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、前記細胞がＩＬ１ＲＡＰを発現する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９５】
対象における腫瘍性疾患の処置に使用するための、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、前記腫瘍性疾患が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９６】
前記腫瘍性疾患が、腫瘍性血液疾患である、請求項９５に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９７】
前記腫瘍性血液疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から成る群から選択される、請求項９６に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９８】
前記腫瘍性血液疾患がＣＭＬである、請求項９７に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９９】
前記腫瘍性血液疾患がＭＰＤである、請求項９７に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１００】
前記腫瘍性血液疾患がＭＤＳである、請求項９７に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０１】
前記腫瘍性血液疾患がＡＬＬである、請求項９７に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０２】
前記腫瘍性血液疾患がＡＭＬである、請求項９７に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０３】
前記腫瘍性疾患が、前記対象の体内での固形腫瘍の形成に関連する、請求項９５に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０４】
前記固形腫瘍が、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫から成る群から選択される、請求項１０３に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０５】
前記固形腫瘍がメラノーマである、請求項１０４に記載の腫瘍性疾患の処置に使用するための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０６】
対象における腫瘍性疾患の処置または診断のための薬物の調製における、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用であって、前記腫瘍性疾患が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する、使用。
【請求項１０７】
前記腫瘍性疾患が、腫瘍性血液疾患である、請求項１０６に記載の使用。
【請求項１０８】
前記腫瘍性血液疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から成る群から選択される、請求項１０７に記載の使用。
【請求項１０９】
前記腫瘍性血液疾患がＣＭＬである、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１０】
前記腫瘍性血液疾患がＭＰＤである、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１１】
前記腫瘍性血液疾患がＭＤＳである、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１２】
前記腫瘍性血液疾患がＡＬＬである、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１３】
前記腫瘍性血液疾患がＡＭＬである、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１４】
前記腫瘍性疾患が、前記対象の体内での固形腫瘍の形成に関連する、請求項１０６に記載の使用。
【請求項１１５】
前記固形腫瘍が、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫から成る群から選択される、請求項１１４に記載の使用。
【請求項１１６】
前記固形腫瘍がメラノーマである、請求項１１５に記載の使用。
【請求項１１７】
対象における腫瘍性疾患の処置または診断のための方法であって、前記対象に、有効量の請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含み、前記腫瘍性疾患が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する、方法。
【請求項１１８】
前記腫瘍性疾患が、腫瘍性血液疾患である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記腫瘍性血液疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から成る群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記腫瘍性血液疾患がＣＭＬである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記腫瘍性血液疾患がＭＰＤである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２２】
前記腫瘍性血液疾患がＭＤＳである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２３】
前記腫瘍性血液疾患がＡＬＬである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２４】
前記腫瘍性血液疾患がＡＭＬである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２５】
前記腫瘍性疾患が、前記対象の体内での固形腫瘍の形成に関連する、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２６】
前記固形腫瘍が、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫から成る群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記固形腫瘍がメラノーマである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
ＩＬ−１シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある疾患または状態の処置に使用するための、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２９】
ＩＬ−１シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある前記疾患または状態が、リウマチ性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＳＯＪＩＡ）を含むあらゆる種類の若年性関節炎、骨関節炎、家族性感冒自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、マックル−ウェルズ病、新生児期発症多臓器性炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡（ＰＡＰＡ）症候群、成人発症スチル病、高ＩｇＤ症候群、２型真性糖尿病、マクロファージ活性化症候群、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スウィート病、ループス関節炎、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アテローム性動脈硬化、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、Ｉ型真性糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクターピロリ感染胃炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、Ｃ型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、ナイセリアまたは肺炎球菌性髄膜炎、結核、Ｂｅｃｈｅｔ症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、喘息、Ｉ型糖尿病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患（例えば、代謝症候群、心肥大、うっ血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、脂肪肝疾患、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、慢性腎不全、卒中、及び高尿酸血症）、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー／アトピー性皮膚炎、ならびに痛風から成る群から選択される、請求項１２８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３０】
ＩＬ−１シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある疾患または状態の処置のための薬物の調製における、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項１３１】
ＩＬ−１シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある前記疾患または状態が、リウマチ性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＳＯＪＩＡ）を含むあらゆる種類の若年性関節炎、骨関節炎、家族性感冒自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、マックル−ウェルズ病、新生児期発症多臓器性炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡（ＰＡＰＡ）症候群、成人発症スチル病、高ＩｇＤ症候群、２型真性糖尿病、マクロファージ活性化症候群、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スウィート病、ループス関節炎、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アテローム性動脈硬化、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、Ｉ型真性糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクターピロリ感染胃炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、Ｃ型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、ナイセリアまたは肺炎球菌性髄膜炎、結核、Ｂｅｃｈｅｔ症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、喘息、Ｉ型糖尿病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患（例えば、代謝症候群、心肥大、うっ血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、脂肪肝疾患、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、慢性腎不全、卒中、及び高尿酸血症）、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー／アトピー性皮膚炎、ならびに痛風から成る群から選択される、請求項１３０に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項１３２】
対象におけるＩＬ−１シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある疾患または状態の処置のための方法であって、前記対象に、有効量の請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項１３３】
ＩＬ−１シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある前記疾患または状態が、リウマチ性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＳＯＪＩＡ）を含むあらゆる種類の若年性関節炎、骨関節炎、家族性感冒自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、マックル−ウェルズ病、新生児期発症多臓器性炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡（ＰＡＰＡ）症候群、成人発症スチル病、高ＩｇＤ症候群、２型真性糖尿病、マクロファージ活性化症候群、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スウィート病、ループス関節炎、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アテローム性動脈硬化、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、Ｉ型真性糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクターピロリ感染胃炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、Ｃ型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、ナイセリアまたは肺炎球菌性髄膜炎、結核、Ｂｅｃｈｅｔ症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、喘息、Ｉ型糖尿病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患（例えば、代謝症候群、心肥大、うっ血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、脂肪肝疾患、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、慢性腎不全、卒中、及び高尿酸血症）、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー／アトピー性皮膚炎、ならびに痛風から成る群から選択される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
対象における癌細胞の検出のためのインビトロ法であって、
（ａ）試験される対象からの細胞試料（例えば、白血球幹／前駆細胞または生検組織）を提供すること、
（ｂ）任意選択により、前記試料中に存在する前記細胞を抽出及び／または精製すること、
（ｃ）請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を、前記試料中に存在する細胞と接触させること、
（ｄ）前記抗体またはその抗原結合断片が前記細胞に結合するかどうかを判定すること、を含み、
前記細胞に対する前記抗体またはその抗原結合断片の前記結合が、対象の前記組織内の癌細胞の存在を示す、インビトロ法。
【請求項１３５】
請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を用いた処置から利益を得るであろう癌患者を識別するためのインビトロ法であって、
（ａ）試験される患者からの癌細胞試料（例えば、白血球幹／前駆細胞または生検組織）を提供すること、
（ｂ）任意選択により、前記試料中に存在する前記細胞を抽出及び／または精製すること、
（ｃ）請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を、前記試料中に存在する細胞と接触させること、
（ｄ）前記抗体またはその抗原結合断片が前記細胞に結合するかどうかを判定すること、を含み、
前記癌細胞に対する前記抗体またはその抗原結合断片の前記結合が、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を用いた処置から利益を得るであろう患者を示す、インビトロ法。
【請求項１３６】
癌患者を処置するための方法であって、請求項１３４または１３５に記載の方法を使用して癌を患っていると識別された対象に、前記癌の処置において有効な治療薬を投与することを含む、方法。
【請求項１３７】
前記治療薬が、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片である、請求項１３６に記載の癌患者を処置するための方法。
【請求項１３８】
（ａ）請求項１３４に記載の方法を使用して、閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰを発現する癌細胞の存在に関して、試験される対象からの細胞試料（例えば白血球幹／前駆細胞または生検組織）を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で試験された細胞試料が、閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰ発現を伴う癌細胞を含有する対象を、処置のために選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された前記対象に、前記癌の処置において有効な治療薬を投与するステップと、を含む、請求項１３６または１３７に記載の癌患者を処置するための方法。
【請求項１３９】
（ａ）対象からの細胞試料（例えば、白血球幹／前駆細胞または生検組織）を得るステップと、
（ｂ）請求項１３４に記載の方法を使用して、閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰを発現する癌細胞の存在について前記細胞を試験するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で試験された細胞試料が、閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰ発現を伴う癌細胞を含有する対象を、処置のために選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で選択された前記対象に、前記癌の処置において有効な治療薬を投与するステップと、を含む、請求項１３８に記載の癌患者を処置するための方法。
【請求項１４０】
請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を用いた処置から利益を得るであろう癌患者を識別するためのインビトロ診断法であって、
（ｃ）試験される対象からの細胞試料（例えば、白血球幹／前駆細胞または生検組織）を、ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドまたはＩＬ１ＲＡＰポリヌクレオチド転写物に特異的に結合することができる分子プローブとインビトロで接触させるステップであって、前記プローブが、光子を放出することができる部分に共有結合している、ステップと、
（ｄ）前記部分から放出された光子を検出し、前記試料の画像を形成するステップと、を含み、
前記部分からの光子の局所的放出が、前記対象が、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を用いた処置から利益を得るであろう癌患者であることを示す、インビトロ診断法。
【請求項１４１】
明細書を参照して実質的に本書に記載される、抗体もしくはその抗原結合断片、またはその使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１バイオマーカー（特にＩＬ１ＲＡＰ）に関連し、かつ／またはＩＬ−１シグナル伝達の阻害に応答性のある、疾患及び状態の処置ならびに診断のための抗体系薬剤に関する。具体的には、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄増殖性障害、及び骨髄異形成症候群など）、及び固形腫瘍形成に関連する癌（例えば、メラノーマ、肺癌、及び乳癌）を含むがこれらに限定されない癌の処置ならびに診断のための抗体系薬剤が提供される。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン１生物学
インターロイキン１（ＩＬ−１）は、感染及び炎症に応答して単核食細胞を含む様々な細胞型により産生され得る、強力な炎症促進性サイトカインである。ＩＬ−１ファミリーは、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βを含む７つの作動薬、ならびにＩＬ−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１Ｒａ）を含む３つの自然発生的受容体拮抗薬から成る（非特許文献１）。２つのＩＬ−１受容体であるＩＬ−１Ｒ  Ｉ型及びＩＬ−１Ｒ  ＩＩ型が同定されている。両方の受容体が、３形態全てのＩＬ−１ファミリー分子と相互作用することができる。ＩＬ−１ＲＩは、ＩＬ−１誘発性細胞活性化の媒介を担う。しかしながら、ＩＬ−１／ＩＬ−１ＲＩ複合体は、それ自体ではシグナルを送ることができず、第２の受容体鎖であるＩＬ−１Ｒアクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）との会合に依存する（非特許文献１）。ＩＬ−１ＲＩとは対照的に、ＩＬ−１ＲＩＩは、ＩＬ−１への結合の際に細胞活性化を誘発せず、したがってＩＬ−１ＲＩＩは制御性デコイ受容体として機能し、ＩＬ−１ＲＩに結合するために利用可能なＩＬ−１の純減につながる。
【０００３】
ＩＬ１シグナル伝達に加えて、ＩＬ１ＲＡＰは、ＳＴ２／ＩＬ１ＲＡＰ複合体を介するＩＬ−３３の作用の媒介、及びＩＬ１Ｒｒｐ２／ＩＬ１ＲＡＰ複合体を介するＩＬ３６の作用の媒介のために非常に重要である（非特許文献２）。
【０００４】
ＩＬ−１は、局所感染または炎症の部位において誘発され、様々な生理的及び細胞的事象の制御に関与する、強力な炎症促進性サイトカインである（非特許文献３及び非特許文献４に要約されている）。これは、白血球及び内皮細胞を含むいくつかの細胞型を活性化させることができる。ＩＬ−１は、接着分子、サイトカイン、ケモカイン、ならびにプロスタグランジンＥ２及び一酸化窒素（ＮＯ）などの他の炎症メディエーターの産生及び発現を促進することによって、免疫応答を誘発し増幅させる。結果として、局所的炎症が増幅され持続する。加えて、炎症メディエーターのＩＬ−１誘発性産生は、発熱、頭痛、低血圧、及び体重減少をもたらす。さらに、ＩＬ−１は造血成長因子であり、骨髄移植中の患者における白血球及び血小板の最下点を低減させることが示されている。ＩＬ−１はまた、血管内皮増殖因子の産生を誘発することによって血管新生を促進し、それによってリウマチ性の関節におけるパンヌス形成及び血液供給を促すことが示されている。最後に、ＩＬ−１は、リウマチ性疾患において骨及び軟骨の分解を促進することが示されている。
【０００５】
疾患におけるＩＬ−１の役割
ＩＬ−１は、以下を含む痛風から癌にまで及ぶ広範な疾患及び状態に関係する（概説については、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献５及び非特許文献６を参照されたい）：
・関節疾患、骨疾患、及び筋肉疾患、例えばリウマチ性関節炎及び骨関節炎など、
・家族性地中海熱などの遺伝性全身性自己炎症性疾患、
・全身性若年性特発性関節炎及び成人発症スチル病などの全身性自己炎症性疾患、
・痛風及び２型糖尿病などの一般的な炎症性疾患、
・心筋梗塞などの急性発症虚血性疾患、及び
・癌。
【０００６】
ＩＬ−１活性を遮断するためのいくつかの療法が認可され開発中である。ＩＬ−１の標的化は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方の活性を遮断する自然発生的ＩＬ−１受容体拮抗薬（ＩＬ−Ｒａ）の組換え型であるアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ、Ａｍｇｅｎ）の導入で１９９３年に始まり、それ以来この治療薬は、多数の疾患（上記参照）におけるＩＬ−１の役割を実証するために使用されてきた。アナキンラは現在、その良好な安全記録、短い半減期、及び複数の投与経路のために、ＩＬ−１治療薬の分野の中心となっている。ＩＬ−１を抗体または可溶性受容体で中和することも有効であると証明されており、現在、可溶性デコイ受容体であるリロナセプト（Ａｒｃａｌｙｓｔ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）及び抗ＩＬ−１β中和モノクローナル抗体であるカナキヌマブ（Ｉｌａｒｉｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が、ある特定の稀な遺伝子状態、かかるクリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）のために認可されている。ＩＬ−１α中和、ＩＬ−１β及びキメラＩＬ−１Ｒａを標的にする治療ワクチンを含む他の治療的手法は、早期臨床治験段階である。加えて、カスパーゼ１阻害薬などのＩＬ−１産生の経口活性小分子阻害薬が開発されており、試験されている。
【０００７】
インターロイキン３３（ＩＬ−３３）は、ＩＬ−１ファミリーの核膜結合サイトカインである。ＩＬ−３３は、受容体ＩＬ−３３Ｒ（ＳＴ２）を介してシグナルを送り、アレルギー、喘息、感染、炎症、及び癌の成長促進において重要な役割を果たす（非特許文献７及び非特許文献８を参照されたい）。ＩＬ１ＲＡＰは、ＩＬ−３３によるシグナルを伝えるための、ＩＬ−３３Ｒ（ＳＴ２）受容体複合体の非常に重要な部分である（非特許文献９を参照されたい）。
【０００８】
腫瘍性疾患のバイオマーカーとしてのＩＬ１ＲＡＰ
腫瘍バイオマーカーは内在性タンパク質または代謝物であり、その量または変態は、腫瘍の状態、進行の特徴、及び療法への応答を示す。それらは腫瘍組織または体液中に存在し、転写因子、細胞表面受容体、及び分泌タンパク質を含む広範な分子を包含する。有効な腫瘍マーカーは、早期の癌の診断を容易にすることにより、また処置を個別化することにより、癌死亡率を低減させる潜在性を有するため、大きな需要がある。ここ１０年間で、発癌及び腫瘍進行の理解の向上により、多数の潜在的な腫瘍マーカーが明らかになってきた。組織マイクロアレイ、抗体アレイ、及び質量分析などの現在技術の適用に伴い、さらに多くが近い将来に発見されると予想されている。
【０００９】
インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）などの血液腫瘍性疾患に関連する細胞表面バイオマーカーとして以前に同定されている（例えば、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｎｔａｒｇｉａ  ＡＢ、Ｊａｒａｓらへの特許文献１、非特許文献１０、非特許文献１１、及び非特許文献１２を参照されたい）。より近年、メラノーマなどの固形腫瘍の診断及び治療上のバイオマーカーとしてのＩＬ１ＲＡＰの有用性も明らかになっている（開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｎｔａｒｇｉａ  ＡＢへの特許文献２を参照されたい）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ  ２０１１／０２１０１４（２０１０年）
【特許文献２】ＷＯ  ２０１２／０９８４０７
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，ＣＡ，Ｂｌｏｏｄ  １９９６，８７（６）：２０９５−１４７
【非特許文献２】Ｇａｒｌａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３  Ｄｅｃ  １２；３９（６）：１００３−１８
【非特許文献３】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ，ＣＨＥＳＴ，２０００，１１８：５０３−５０８
【非特許文献４】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，ＣＡ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２００２，２０（５  Ｓｕｐｐｌ  ２７）：Ｓ１−１３
【非特許文献５】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１：６３３−６５２
【非特許文献６】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，２０１４，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０（ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ４３−Ｓ５８
【非特許文献７】Ｃａｙｒｏｌ  ＆  Ｇｉｒａｒｄ（２０１４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３１−７
【非特許文献８】Ｍａｙｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＰＮＡＳ  １１２（１９）：Ｅ２４８７−２４９６
【非特許文献９】Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９（４）：２５５１−２５５５
【非特許文献１０】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７（３７）：１６２８０−５
【非特許文献１１】Ａｓｋｍｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｌｏｏｄ．１２１（１８）：３７０９−１３
【非特許文献１２】Ｂａｒｒｅｙｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｌｏｏｄ  １２０（６）：１２９０−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、向上した特性を有する新しい抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を開発した。この向上した特性は、本抗体を、ＩＬ１ＲＡＰバイオマーカーに関連し、かつ／またはＩＬ−１シグナル伝達、ＩＬ−３３シグナル伝達、及び／もしくはＩＬ−３６シグナル伝達の阻害に応答性のある、疾患及び状態の診断ならびに処置に好適なものとする。
【００１３】
したがって、第１の態様において、本発明は、インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質（「ＩＬ１ＲＡＰ」）のドメイン３に対する結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片（「抗体ポリペプチド」）を提供する。
【００１４】
ここで「インターロイキン１受容体アクセサリータパク質」、「ＩＬ１ＲＡＰ」、及び「ＩＬ１−ＲＡＰ」には、ヒトＩＬ１ＲＡＰタンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ８４０５９、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２１７３．１、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＰＨ３−１に記載されるものが具体的には含まれる（開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４（２４），１２８２９−１２８３２も参照されたい）。ＩＬ１ＲＡＰは、科学文献ではＩＬ１Ｒ３、Ｃ３ｏｒｆ１３、ＦＬＪ３７７８８、ＩＬ−１ＲＡｃＰ、及びＥＧ３５５６としても知られている。
【００１５】
ここでＩＬ１ＲＡＰの「ドメイン３」には、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの受入番号Ｑ９ＮＰＨ３に使用されている付番法によるＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸２３５〜３６９によって定義される構造的領域が含まれる（開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：９０５−９１２も参照されたい）。例えば、本抗体または抗原結合断片が結合するエピトープは、ＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸２３５〜２３９内、２４０〜２４９内、２５０〜２５９内、２６０〜２６９内、２７０〜２７９内、２８０〜２８９内、２９０〜２９９内、３００〜３０９内、３１０〜３１９内、３２０〜３２９内、３３０〜２２９内、２４０〜３４９内、３５０〜３５９、またはアミノ酸３６０〜３６９の間に位置し得る。
【００１６】
したがって、本発明の抗体ポリペプチドは、ＩＬ１ＲＡＰに対する特異性を有する。ここで「特異性」とは、抗体ポリペプチドが、インビボで、すなわちヒトの体内にＩＬ１ＲＡＰが存在する生理的条件下で、ＩＬ１ＲＡＰに結合する能力があることを意味する。抗体ポリペプチドは、インビボでいかなる他のタンパク質にも結合しないことが好ましい。かかる結合特異性は、ＩＬ１ＲＡＰを発現するトランスフェクト細胞を使用して、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫沈降法、ウェスタンブロット、及びフローサイトメトリーなどの当該技術分野で周知の方法によって判定することができる。有利なことに、本抗体ポリペプチドは、ＩＬ１ＲＡＰに選択的に結合することができる、すなわち、いかなる他のタンパク質に対するよりも少なくとも１０倍強力にＩＬ１ＲＡＰに結合する。
【００１７】
ここで「抗体またはその抗原結合断片」には、実質的にインタクトな抗体分子、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体、単離ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／または軽鎖のホモダイマーならびにヘテロダイマー、ならびに抗原結合断片及びその誘導体が含まれる。好適な抗原結合断片及び誘導体には、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）２断片）、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨ及びＶＬドメイン）、及びドメイン抗体（ｄＡｂ、単一及び二重形式［すなわちｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）が含まれる。全抗体ではなく抗体断片を使用することの潜在的な利点は複数ある。より小さなサイズの断片は、固形組織の良好な浸透などの薬理学的特性の向上をもたらし得る。さらに、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｄＡｂ抗体断片などの抗原結合断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現され、そこから分泌され得るため、大量の該断片の容易な生成が可能になる。
【００１８】
したがって、一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、インタクトな抗体（例えばＩｇＧ１抗体など）を含むかまたはそれから成る。
【００１９】
代替的な実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドは、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）２断片）、及びドメイン抗体（例えば単一ＶＨ可変ドメインまたはＶＬ可変ドメイン）から成る群から選択される抗原結合断片を含むかまたはそれから成る。
【００２０】
「抗体またはその抗原結合断片」という表現は、抗体模倣物（例えば、高度の安定性を有するが、ある特定の位置において変異性が導入されることを許す非抗体足場構造体）を包含することも意図する。生化学の当業者であれば、Ｇｅｂａｕｅｒ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ，２００９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３（３）：２４５−２５５（その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）に考察されているような多くの分子に精通しているであろう。例示的な抗体模倣物としては、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）（トリネクチンとも呼ばれる；Ｎｙｇｒｅｎ，２００８，ＦＥＢＳ  Ｊ，２７５，２６６８−２６７６）、ＣＴＬＤ（テトラネクチンとも呼ばれる；Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６），２７−３０）、アドネクチン（モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）とも呼ばれる；Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５２（２００７），９５−１０９）、アンチカリン（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ（２００５），１０，２３−３３）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリン；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４），２２，５７５−５８２）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５），２３，１５５６−１５６１）、ミクロボディ（ＦＥＢＳ  Ｊ，（２００７），２７４，８６−９５）、ペプチドアプタマー（Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５），５，７８３−７９７）、Ｋｕｎｉｔｚドメイン（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２００６）３１８，８０３−８０９）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５），２３，５１４−５２２）、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）（Ａｖａｃｔａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウェザービー、英国）が挙げられる。
【００２１】
キメラＴ細胞（Ｔ−ｃｅｌｌ）受容体（キメラＴ細胞（Ｔ  ｃｅｌｌ）受容体、キメラ免疫受容体、及びキメラ抗原受容体、すなわちＣＡＲとしても知られる）も、本発明の範囲内に含まれる（開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ５（３）：２１１−２６を参照されたい）。これらは、免疫エフェクター細胞上に任意特異性を移す（ｇｒａｆｔ）改変受容体である。典型的に、ＣＡＲは、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移すために使用され、それらのコード配列の移行は、レトロウイルスベクターによって促進される。かかる分子の最も一般的な形態は、ＣＤ３−ζ膜貫通ドメイン及びエンドドメインに融合したモノクローナル抗体から誘導された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む融合物である。Ｔ細胞がこの融合分子を発現するとき、それらは、移行されたモノクローナル抗体特異性を発現する標的細胞を認識し殺滅する。
【００２２】
当業者であれば、本発明が、現在存在するか将来存在するかを問わず、例えば、ポリエチレングリコールまたは別の好適なポリマーの共有結合によって修飾されている、修飾型の抗体及びその抗原結合断片も包含することをさらに理解するであろう（以下参照）。
【００２３】
抗体及び抗体断片を作製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、抗体は、抗体分子のインビボ産生の誘発、免疫グロブリンライブラリのスクリーニング（Ｏｒｌａｎｄｉ．ｅｔ  ａｌ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９、これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）、または培養下の細胞株によるモノクローナル抗体分子の作製を用いるいくつかの方法のうち任意のものによって作製され得る。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術を含むが、これらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５．Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５０４９７、Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０、これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２４】
モノクローナル抗体の生成のための好適な方法は、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）、及び“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２年、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）にも開示されている。
【００２５】
同様に、抗体断片は、当該技術分野で周知の方法を使用して得ることができる（例えば、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，１９８８，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。例えば、本発明による抗体断片は、抗体のタンパク分解性加水分解によって、または大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）内での断片をコードするＤＮＡの発現によって調製され得る。代替的に、抗体断片は、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって取得されてもよい。
【００２６】
一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１：
【化１】
2017530692.tif 000003
のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
（ｂ）配列番号２：
【化２】
2017530692.tif 000004
のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、「ＣＡＮ０１」と表記されるマウス由来抗体の可変領域を参照することにより定義される。
【００２７】
本明細書において使用される「アミノ酸」という用語は、標準的な２０種の遺伝子的にコードされたアミノ酸及びそれらの対応する「Ｄ」型の立体異性体（天然の「Ｌ」型と比較して）、ωアミノ酸他の自然発生的アミノ酸、非従来型アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、ならびに化学的に誘導体化されたアミノ酸（以下参照）を含む。
【００２８】
「アラニン」すなわち「Ａｌａ」または「Ａ」など、あるアミノ酸が具体的に列挙されている場合、その用語は、別段の明示的な記載がない限り、Ｌ−アラニン及びＤ−アラニンの両方を指す。所望の機能的特性が本ポリペプチドによって保持される限り、他の非従来型アミノ酸も、本発明のポリペプチドに好適な成分であり得る。示されるペプチドについては、コードされたアミノ酸残基それぞれ（該当する場合）は、従来のアミノ酸の慣用名に対応する一文字表記によって表わされる。
【００２９】
一実施形態において、本明細書に定義される抗体ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含むかまたはそれから成る。
【００３０】
上記の可変領域を含む任意のインタクトＩｇＧ抗体が、ＣＡＮ０１のＩＬ１ＲＡＰへの結合を競合的に阻害する本発明の抗体ポリペプチドを同定するための参照抗体として使用され得ることは、当業者には理解されるであろう。
【００３１】
したがって、一実施形態において、競合的結合性を判定するための参照として使用されるＣＡＮ０１抗体は、
（ａ）マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ定常領域に移植された配列番号１の可変ドメインを含む重鎖、及び
（ｂ）マウスκ定常領域に移植された配列番号２の可変ドメインを含む軽鎖、
を含む、インタクトＩｇＧ抗体である。
【００３２】
代替的に、参照抗体は、
（ａ）ヒトＩｇＧ１定常領域に移植された配列番号１（例えば、ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、米国）によってコードされた配列番号３０など）の可変ドメインを含む重鎖、及び
（ｂ）ヒトκ定常領域に移植された配列番号２（例えば、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、米国）によってコードされた配列番号２９など）の可変ドメインを含む軽鎖、
を含む、キメラ型インタクトＩｇＧ抗体であってもよい。
【００３３】
所与の被験抗体が抗原に対する参照抗体の結合を阻害することができるかどうかを判定するための好適な方法は、当該技術分野において周知である。例えば、被験抗体が細胞表面抗原に対するＣＡＮ０１参照抗体の結合を阻害することができるかどうかを試験するには、その抗原を発現する細胞を被験抗体と共に２０分間プレインキュベートし、その後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって検出することができるフルオロフォアに共役した参照ＣＡＮ０１抗体と共にインキュベートしてもよい。被験抗体とのプレインキュベーションがフローサイトメトリーにおける参照ＣＡＮ０１抗体の検出を低減させる場合、その被験抗体は、細胞表面抗原に対する参照抗体の結合を阻害する。
【００３４】
かかる競合的結合の阻害は、ＩＬ１ＲＡＰを固定化したＢＩＡｃｏｒｅチップを使用し、試験される抗体ポリペプチドを含む及び含まない参照抗体（例えば「ＣＡＮ０１」など）と共にインキュベートすることでも判定され得る。代替的に、ペアワイズマッピング手法を使用してもよく、この手法では、参照抗体をＢＩＡｃｏｒｅチップの表面に固定化し、ＩＬ１ＲＡＰ抗原を固定化された抗体に結合させ、次いで第２の抗体を同時ＩＬ１ＲＡＰ結合能力について試験する（開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、‘ＢＩＡｃｏｒｅ  Ａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ’，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２９−０１９４−００  ＡＡ  ０５／２０１２を参照されたい）。
【００３５】
さらなる代替形態において、競合的結合の阻害は、フローサイトメトリーを使用して判定されてもよい。例えば、被験抗体が細胞表面抗原に対する参照抗体の結合を阻害することができるかどうかを試験するには、その抗原を発現する細胞を被験抗体と共に２０分間プレインキュベートし、その後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって検出することができるフルオロフォアに共役した参照抗体と共にインキュベートしてもよい。被験抗体とのプレインキュベーションがフローサイトメトリーにおける参照抗体の検出を低減させる場合、その被験抗体は、細胞表面抗原に対する参照抗体の結合を阻害する。試験される抗体がＩＬ１ＲＡＰに対して高い親和性を示す場合、短縮したプレインキュベーション期間を使用してもよい（またはさらにはプレインキュベーションを全く行わなくてもよい）。
【００３６】
さらなる代替形態において、競合的結合の阻害は、ＥＬＩＳＡを使用して判定されてもよい（例えば実施例Ｎに記載される）。
【００３７】
典型的に競合的結合は、被験抗体が、参照抗体（この場合はＣＡＮ０１）が結合する抗原上のエピトープに、または少なくともその非常に近くに結合するために生じる。しかしながら、競合的結合は立体障害によって生じ得、したがって、被験抗体は、参照抗体が結合するものとは異なるエピトープに結合し得るが、それでも抗原に対する参照抗体の結合を妨げるのに十分なサイズまたは構成のものであり得ることは、当業者には理解されるであろう。
【００３８】
本発明の抗体及び抗原結合断片は、抗体を癌の診断薬及び治療薬として特に好適なものにする特性を示すことを基準とした、多数の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体の大規模なスクリーニングの後に同定された。
【００３９】
したがって、一実施形態において、本抗体または抗原結合断片は、以下の特性：
（ａ）２ｎＭ以上のヒトＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）、すなわちＫＤ≦２ｎＭ（例えば、実施例ＡにおいてＢｉａｃｏｒｅ方法論を使用して判定されるようなもの）、
（ｂ）カニクイザル由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性（例えば、実施例Ｄにおいて判定されるようなもの）、
（ｃ）ＩＬ−１シグナル伝達に対する阻害作用（例えば、実施例Ｅ、Ｌ、及びＭにおいて判定されるようなもの）、
（ｄ）１つ以上の癌細胞株（例えば、ＣＭＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬ、及び／もしくはメラノーマ細胞株、ならびに／または以下に特定される他の癌タイプのうちの１つ以上の細胞株モデル）において抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する能力（例えば、実施例Ｆ及びＧにおいて判定されるようなもの）、及び／または
（ｅ）１つ以上の癌細胞株（例えば、ＣＭＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬ、及び／もしくはメラノーマ細胞株、ならびに／または以下に特定される他の癌タイプのうちの１つ以上の細胞株モデル）に結合すると内部移行する能力（例えば、実施例Ｈにおいて判定されるようなもの）、
のうちの１つ以上を示す。
【００４０】
有利なことには、本抗体または抗原結合断片は、上記の特性の全てを示す。
【００４１】
一実施形態において、本抗体または抗原結合断片は、（例えば、以下の実施例Ｌ及びＭにおいて判定されるように）ＩＬ−３３シグナル伝達及び／またはＩＬ−３６シグナル伝達に対する阻害作用をさらに示す。
【００４２】
任意選択により、本抗体または抗原結合断片は、（例えば、実施例Ｅ、Ｌ、及びＭにおいて判定されるように）ＩＬ−１シグナル伝達、ＩＬ−３３シグナル伝達、及びＩＬ−３６シグナル伝達のうちの１つ以上に対する阻害作用を示さない。例えば、本抗体は、ＩＬ−１シグナル伝達またはＩＬ−３３シグナル伝達に対するいかなる認識可能な阻害作用も欠如しているＣＡＮ０１であってよい（以下の実施例Ｌ及びＭを参照されたい）。
【００４３】
代替的な実施形態では、本抗体または抗原結合断片は、上記の特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｅ）のうちの１つ以上を示すが、ＡＤＣＣを誘発することはできない。
【００４４】
一実施形態において、本抗体または抗原結合断片は、参照抗体ＣＡＮ０１が結合することができるＩＬ１ＲＡＰ上のエピトープと少なくとも部分的に重複するＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメイン上のエピトープに結合することができる。したがって、本抗体または抗原結合断片は、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン３、すなわちアミノ酸２３５〜３６７に／その内部に位置するエピトープに結合可能であってもよい（上記参照）。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ：
ａ）
【化３】
2017530692.tif 000005
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化４】
2017530692.tif 000006
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化５】
2017530692.tif 000007
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖可変領域を含む。
【００４６】
このように、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３、４、及び５のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含んでもよい。
【００４７】
例えば、本抗体またはその抗原結合断片は、ＣＡＮ０１参照抗体の対応する領域のアミノ酸配列、すなわち配列番号１を有する重鎖可変領域を含んでもよい。
【００４８】
しかしながら、ＣＤＲ配列における低レベルの変異（典型的には１つまたは２つだけのアミノ酸）が、ＩＬ１ＲＡＰに対する抗体または抗原結合断片の特異性の損失を伴わずに耐容され得ることは理解されるであろう。
【００４９】
同一性パーセントは、例えば、Ｅｘｐａｓｙ機関サイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）において、グローバルアライメントオプション、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、開始ギャップペナルティ−１４、伸長ギャップペナルティ−４をパラメータとして使用して、ＬＡＬＩＧＮプログラム（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）によって判定することができる。代替的に、２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、好適なコンピュータプログラム、例えばウィスコンシン大学Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して判定されてもよく、同一性パーセントは、配列が最適に整列されているポリペプチドに関して計算されることは理解されるであろう。
【００５０】
アライメントは、代替的に、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０に記載されている）を使用して実行されてもよい。使用されるパラメータは次の通りである：
−高速ペアワイズアライメントパラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング法：ｘパーセント。
−マルチプルアライメントパラメータ：ギャップ開始ペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。
−スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００５１】
代替的に、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用して局所配列アライメントを判定してもよい。
【００５２】
さらに好ましい実施形態では、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ：
ａ）
【化６】
2017530692.tif 000008
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化７】
2017530692.tif 000009
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化８】
2017530692.tif 000010
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖可変領域を含む。
【００５３】
例えば、本抗体ポリペプチドは、配列番号６、７、及び５のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含んでもよい。
【００５４】
上記のように、ＣＡＮ０１参照抗体はマウス抗体である。しかしながら、この抗体の構成要素である重鎖及び軽鎖は、例えば、それらの低い免疫原性のために、ヒトにおける使用のためにより好適な抗体ポリペプチドを生成するためにヒト化されていてもよい。例えば、配列番号３、４、及び５のＣＤＲ（または配列番号６、７、及び５のＣＤＲ）は、ヒト可変領域フレームワーク内に移植されてもよい。
【００５５】
ヒトの療法または診断には、ヒト抗体またはヒト化抗体が使用されるのが好ましいことは、当業者には理解されるであろう。ヒト化型の非ヒト（例えばマウス）抗体は、好ましくは最低限の非ヒト抗体由来部分を有する、遺伝子改変されたキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望の機能性を有するマウス、ウサギのラットなどの非ヒト種（ドナー抗体）の相補性決定領域からの残基によって置換されている抗体が含まれる。いくつかの事例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入された相補性決定領域またはフレームワーク配列にも見出されない残基を含む場合もある。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、相補性決定領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが、関連性のあるヒトコンセンサス配列のものに対応する。ヒト化抗体はまた、最適には、典型的にはヒト抗体由来の、Ｆｃ領域などの抗体定常領域の少なくとも一部分を含む（例えば、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６．Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９、Ｐｒｅｓｔａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照されたい）。
【００５６】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野において周知である。概して、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基（しばしば移入残基（ｉｍｐｏｒｔｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）と称される）は、典型的には、移入された可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的には、ヒトの相補性決定領域を対応するげっ歯類の相補性決定領域で置換することによって、説明されているように行われ得る（例えば、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８．Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６ｌ、米国第４，８１６，５６７号を参照されたい）。したがって、かかるヒト化抗体は、実質的にインタクト未満のヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの相補性決定領域残基、そして場合によりいくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体内の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体であり得る。
【００５７】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含む当該技術分野で既知の様々な技術を使用して同定することができる（例えば、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐｐ．７７、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５を参照されたい）。
【００５８】
このように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化されていてもよく、例えば、以下の配列番号８〜１０：
【化９】
2017530692.tif 000011
のいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列のうちの１つを有する、重鎖可変領域を含んでもよい。
【００５９】
例えば、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んでもよい。
【００６０】
関連した好ましい実施形態では、本抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ：
ａ）
【化１０】
2017530692.tif 000012
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化１１】
2017530692.tif 000013
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしく
は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化１２】
2017530692.tif 000014
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む軽鎖可変領域を含む。
【００６１】
このように、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１、１２、及び１３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００６２】
例えば、本抗体またはその抗原結合断片は、マウスＣＡＮ０１参照抗体の対応する領域のアミノ酸配列、すなわち配列番号２を有する軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００６３】
上記に詳述された重鎖可変領域の場合のように、本発明の抗体ポリペプチドの軽鎖可変領域が、ヒトにおける使用により好適な薬剤を生成するためにヒト化されてもよいことは理解されるであろう。例えば、配列番号１１、１２、及び１３のＣＤＲは、ヒト可変領域フレームワーク内に移植されてもよい。
【００６４】
このように、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４〜１８：
【化１３】
2017530692.tif 000015
のいずれか１つのアミノ酸配列、もしくはそれらと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれから成る軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００６５】
例えば、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４〜１８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００６６】
一実施形態において、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成るマウス重鎖可変領域と、配列番号２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成るマウス軽鎖可変領域と、を含む。
【００６７】
代替的に、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成るヒト化重鎖可変領域と、配列番号１４〜１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成るヒト化軽鎖可変領域と、を含んでもよい。
【００６８】
例えば、本抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｇ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｈ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
ｊ）配列番号９のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、または
ｋ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むかもしくはそれから成る軽鎖可変領域、
を含んでもよい。
【００６９】
代替的な実施形態では、本発明の抗体ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１９：
【化１４】
2017530692.tif 000016
のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
（ｂ）配列番号２０：
【化１５】
2017530692.tif 000017
のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、「ＣＡＮ０３」と表記されるマウス由来抗体の可変領域を参照することにより定義される。
【００７０】
上記の可変領域を含む任意のインタクトＩｇＧ抗体が、ＣＡＮ０３のＩＬ１ＲＡＰへの結合を競合的に阻害する本発明の抗体ポリペプチドを同定するための参照抗体として使用され得ることは、当業者には理解されるであろう（参照抗体としてのＣＡＮ０１の使用に関して上記の通り）。
【００７１】
したがって、一実施形態において、競合的結合性を判定するための参照として使用されるＣＡＮ０３抗体は、
（ａ）マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ定常領域に移植された配列番号１９の可変ドメインを含む重鎖、及び
（ｂ）マウスκ定常領域に移植された配列番号２０の可変ドメインを含む軽鎖、
を含む、インタクトＩｇＧ抗体である。
【００７２】
代替的に、参照抗体は、
（ａ）ヒトＩｇＧ１定常領域に移植された配列番号１９（例えば、ｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、米国）によってコードされた配列番号３０など）の可変ドメインを含む重鎖、及び
（ｂ）ヒトκ定常領域に移植された配列番号２０（例えば、ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、米国）によってコードされた配列番号２９など）の可変ドメインを含む軽鎖、
を含む、キメラ型インタクトＩｇＧ抗体であってもよい。
【００７３】
所与の被験抗体が抗原に対する参照抗体の結合を阻害することができるかどうかを判定するための好適な方法は、当該技術分野において周知である（上記参照）。
【００７４】
一実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対するＣＡＮ０３の結合を競合的に阻害する本抗体または抗原結合断片は、以下の特性：
（ａ）５００ｐＭ以上のヒトＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）、すなわちＫＤ≦５００ｐＭ（例えば、実施例ＡにおいてＢｉａｃｏｒｅ方法論を使用して判定されるようなもの）、
（ｂ）カニクイザル由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性（例えば、実施例Ｄにおいて判定されるようなもの）、
（ｃ）ＩＬ−１シグナル伝達に対する阻害作用（例えば、実施例Ｅにおいて判定されるようなもの）、
（ｄ）１つ以上の癌細胞株（例えば、ＣＭＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬ、及び／もしくはメラノーマ細胞株、ならびに／または以下に特定される他の癌タイプのうちの１つ以上の細胞株モデル）において抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する能力（例えば、実施例Ｆ及びＧにおいて判定されるようなもの）、及び／または
（ｅ）１つ以上の癌細胞株（例えば、ＣＭＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬ、及び／もしくはメラノーマ細胞株、ならびに／または以下に特定される他の癌タイプのうちの１つ以上の細胞株モデル）に結合すると内部移行する能力（例えば、実施例Ｈにおいて判定されるようなもの）、
のうちの１つ以上を示す。
【００７５】
有利なことには、本抗体または抗原結合断片は、上記の特性の全てを示す。
【００７６】
一実施形態において、本抗体または抗原結合断片は、（例えば、以下の実施例Ｌ及びＭにおいて判定されるように）ＩＬ−３３シグナル伝達及び／またはＩＬ−３６シグナル伝達に対する阻害作用をさらに示す。
【００７７】
一実施形態において、本抗体または抗原結合断片は、参照抗体ＣＡＮ０３が結合することができるＩＬ１ＲＡＰ上のエピトープと少なくとも部分的に重複するＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメイン上のエピトープに結合することができる。したがって、本抗体または抗原結合断片は、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン３、すなわちアミノ酸２３５〜３６７に／その内部に位置するエピトープに結合可能であってもよい（上記参照）。
【００７８】
好ましい実施形態では、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ：
ａ）
【化１６】
2017530692.tif 000018
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化１７】
2017530692.tif 000019
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化１８】
2017530692.tif 000020
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖可変領域を含む。
【００７９】
このように、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２１、２２、及び２３のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含んでもよい。
【００８０】
例えば、本抗体またはその抗原結合断片は、ＣＡＮ０１参照抗体の対応する領域のアミノ酸配列、すなわち配列番号１９を有する重鎖可変領域を含んでもよい。
【００８１】
しかしながら、ＣＤＲ配列における低レベルの変異（典型的には１つまたは２つだけのアミノ酸）が、ＩＬ１ＲＡＰに対する抗体または抗原結合断片の特異性の損失を伴わずに耐容され得ることは理解されるであろう。
【００８２】
さらに好ましい実施形態では、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ：
ａ）
【化１９】
2017530692.tif 000021
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化２０】
2017530692.tif 000022
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化２１】
2017530692.tif 000023
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む重鎖可変領域を含む。
【００８３】
例えば、本抗体ポリペプチドは、配列番号２４、２５、及び２３のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含んでもよい。
【００８４】
上記のように、ＣＡＮ０３参照抗体はマウス抗体である。しかしながら、この抗体の構成要素である重鎖及び軽鎖は、例えば、それらの低い免疫原性のために、ヒトにおける使用のためにより好適な抗体ポリペプチドを生成するためにヒト化されていてもよい。例えば、配列番号２１、２２、及び２３のＣＤＲ（または配列番号２４、２５、及び２３のＣＤＲ）は、ヒト可変領域フレームワーク内に移植されてもよい。
【００８５】
関連した好ましい実施形態では、本抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲ：
ａ）
【化２２】
2017530692.tif 000024
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）
【化２３】
2017530692.tif 000025
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｃ）
【化２４】
2017530692.tif 000026
またはそれと少なくとも６０％の配列同一性、例えば少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む軽鎖可変領域を含む。
【００８６】
このように、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６、２７、及び２８のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００８７】
例えば、本抗体またはその抗原結合断片は、マウスＣＡＮ０１参照抗体の対応する領域のアミノ酸配列、すなわち配列番号２０を有する軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００８８】
上記に詳述された重鎖可変領域の場合のように、本発明の抗体ポリペプチドの軽鎖可変領域が、ヒトにおける使用により好適な薬剤を生成するためにヒト化されてもよいことは理解されるであろう。例えば、配列番号２６、２７、及び２８のＣＤＲは、ヒト可変領域フレームワーク内に移植されてもよい。
【００８９】
一実施形態において、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成るマウス重鎖可変領域と、配列番号２０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成るマウス軽鎖可変領域と、を含む。
【００９０】
代替的に、本抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２１〜２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成るヒト化重鎖可変領域と、配列番号２６〜２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれから成るヒト化軽鎖可変領域と、を含んでもよい。
【００９１】
上記に定義された本発明の抗体または抗原結合断片が、重鎖定常領域、またはその一部をさらに含んでもよいことは、当業者には理解されるであろう。
【００９２】
一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４重鎖など）のＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３領域を含む。したがって、本抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ１重鎖からの定常領域の一部または全てを含んでもよい。例えば、本抗体ポリペプチドは、上記に定義された重鎖及び軽鎖可変領域のいずれかとそれぞれ組み合わせられたＣＨ１及びＣＬ定常領域を含む、Ｆａｂ断片であってもよい。
【００９３】
同様に、上記に定義された本発明の抗体または抗原結合断片は、軽鎖定常領域、またはその一部をさらに含んでもよい。例えば、本抗体ポリペプチドは、κまたはλ軽鎖からのＣＬ領域を含んでもよい。
【００９４】
例えば、本抗体ポリペプチドは、以下の定常領域を含んでもよい。
（ａ）Ｉｇ  κ鎖Ｃ領域（ホモサピエンス）（ＵｎｉｔＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１８３４）
【化２５】
2017530692.tif 000027
（ｂ）Ｉｇ  γ１鎖Ｃ領域（ホモサピエンス）（ＵｎｉｔＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１８５７）
【化２６】
2017530692.tif 000028
【００９５】
代替的な実施形態では、上記の定常領域の自然発生変異体が用いられてもよい（例えば、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ＆  Ｌｅｆｒａｎｃ，２００９，ＭＡｂｓ  １（４）：３３２−８を参照されたい）。例えば、軽鎖定常領域は、Ｗ４０Ｒ及び／もしくはＶ８３Ｌ変異を有する配列番号２９を含むかまたはそれから成ってもよく、かつ／あるいは、重鎖定常領域は、Ｋ９７Ｒ、Ｄ２３９Ｅ、及び／もしくはＬ２４１Ｍ変異を有するか、またはＣ末端リジン／Ｋを有しない配列番号３０を含むかまたはそれから成ってもよい（ここで、アミノ酸変異の位置は、配列番号２９及び３０における付番法とは異なるＥｕ付番方式を使用して定義されている；開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６３：７８−８５を参照されたい）。
【００９６】
したがって、本発明の例示的な抗体ポリペプチドは、以下を含む。
ＣＡＮ０１及びそのヒト化型：
（ａ）配列番号１（またはそのヒト化型、例えば配列番号８、９、または１０など）の可変領域を配列番号３０の定常領域と一緒に含む重鎖、及び
（ｂ）配列番号２（またはそのヒト化型、例えば配列番号１４、１５、１６、１７、または１８など）の可変領域を配列番号２９の定常領域と一緒に含む軽鎖。
ＣＡＮ０３及びそのヒト化型：
（ａ）配列番号１９（またはそのヒト化型）の可変領域を配列番号３０の定常領域と一緒に含む重鎖、及び
（ｂ）配列番号２０（またはそのヒト化型）の可変領域を配列番号２９の定常領域と一緒に含む軽鎖。
【００９７】
関連した実施形態では、本抗体ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２及びＣＨ３領域）を含んでもよい。Ｆｃ部分が、ＩｇＧ抗体からのものでも、または異なる種類の抗体（例えばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ）からのものでもよいことは、当業者には理解されるであろう。一実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体からのものである。
【００９８】
Ｆｃ領域は、自然発生的（例えば、内因的に産生される抗体の一部）であってもよく、または人工的（例えば、自然発生的Ｆｃ領域に対する１つ以上の点変異、及び／またはＣＨ２ドメイン内の炭水化物部分への修飾を含む）であってもよい。
【００９９】
当該技術分野で十分に立証されているように、抗体のＦｃ領域は、その血清半減期、ならびに補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）などのエフェクター機能を媒介する。
【０１００】
治療用モノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域を改変すると、それらに必要とされる薬理活性により良好に適している分子の作製が可能になる（Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（６）：６８５−９１、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０１】
（ａ）半減期延長のための改変されたＦｃ領域
治療用抗体の効力を向上させるための手法の１つは、その血清残留性を上昇させ、それによって循環レベルの上昇、投与頻度の低下、及び用量の低減を可能にすることである。
【０１０２】
ＩｇＧの半減期は、新生児型受容体ＦｃＲｎに対するそのｐＨ依存性結合に依存する。内皮細胞の表面上で発現されるＦｃＲｎは、ｐＨ依存性様式でＩｇＧに結合し、それを分解から保護する。
【０１０３】
ｐＨ６．０でＦｃＲｎに選択的に結合するがｐＨ７．４では選択的に結合しない一部の抗体は、様々な動物モデルにおいてより長い半減期を示す。
【０１０４】
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３−８、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）などの、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン間の界面に位置するいくつかの変異は、インビボでＦｃＲｎに対する結合親和性を上昇させ、ＩｇＧ１の半減期を延長させることが示されている。
【０１０５】
（ｂ）エフェクター機能改質のための改変されたＦｃ領域
治療用抗体またはＦｃ融合タンパク質の用途に応じて、エフェクター機能（例えばＡＤＣＣなど）の低減または増大のいずれかが所望される場合がある。
【０１０６】
細胞表面分子、特に免疫細胞上のものを標的にする抗体では、ある特定の臨床的徴候に対してエフェクター機能の抑止が必要とされる場合がある。
【０１０７】
逆に、腫瘍学用途を目的とする（例えば、白血病及び固形腫瘍の処置などにおける；以下参照）抗体では、エフェクター機能の増大が治療活性を向上させる場合がある。
【０１０８】
４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、及び第１の成分の補体（Ｃ１ｑ）に異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクター機能をもたらす（Ｂｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６−２５、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０９】
ＦｃγＲまたはＣ１ｑに対するＩｇＧの結合性は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン内に位置する残基に依存する。ＣＨ２ドメインの２つの領域がＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合に非常に重要であり、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４に一意的な配列を有する。２３３位〜２３６位におけるＩｇＧ２残基、ならびに３２７位、３３０位、及び３３１位におけるＩｇＧ４残基のヒトＩｇＧ１への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低減させることが示された（Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４、これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、Ｋ３２２を含む異なる位置におけるアラニン置換が、補体活性化を著しく低減させたことを実証した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ２ドメイン内の変異は、ＦｃγＲＩ、及びＣ１ｑに対する結合性を低減させることが示された（Ｓｔｅｕｒｅｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５−７４、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１０】
多数の変異がヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン内で作られ、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに対するそれらの効果がインビトロで試験されている（上記の参考文献を参照されたい）。注目すべきことに、３３３位におけるアラニン置換は、ＡＤＣＣとＣＤＣとの両方を増大させることが報告された（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、上記；Ｓｔｅｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、上記）。Ｌａｚａｒらは、ＡＤＣＣの増進をもたらす、ＦｃγＲＩＩＩａに対してより高い親和性、及びＦｃγＲＩＩｂに対してより低い親和性を有する、三重変異株（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）を説明した（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＰＮＡＳ  １０３（１１）：４００５−４０１０、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。同じ変異が、増大したＡＤＣＣを有する抗体の作製に使用された（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６：３００９−３０１８、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、マクロファージによる標的細胞の増進した食作用を媒介する、向上したＦｃγＲＩＩＩａ親和性及びＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比を有するわずかに異なる三重変異株（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ）を研究した（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７−２７、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１１】
エフェクター機能の欠如に起因して、ＩｇＧ４抗体は、細胞枯渇を伴わない受容体遮断（すなわちＩＬ−１シグナル伝達の阻害）のための好ましいＩｇＧサブクラスとなる。ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂアーム交換と呼ばれる動的プロセスにおいて半分子を交換することができる。この現象はまた、インビボで治療用抗体と内在性ＩｇＧ４との間に起こり得る。
【０１１２】
Ｓ２２８Ｐ変異はこの組換えプロセスを防止し、不確実性が低い治療用ＩｇＧ４抗体の設計を可能にすることが示されている（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７−７１、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１３】
改変されたＦｃ領域の例を以下の表１に示す。
【表１】
2017530692.tif 000029
【表２】
2017530692.tif 000030
【０１１４】
さらなる実施形態では、Ｆｃ領域のエフェクター機能は、その中のＣＨ２ドメイン内にある炭水化物部分の修飾によって変更され得る。
【０１１５】
例えば、Ｆｃ領域内のフコース残基が欠如しているかまたは少ない治療用抗体は、ヒトにおける増進したＡＤＣＣ活性を示し得ることが知られている（例えば、Ｐｅｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ  １１２（６）：２３９０−９、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ＆  Ｓａｔｏｈ，２００９，ＭＡｂｓ  １（３）：２３０−２６、Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ９；５８を参照されたい（これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。低フコース抗体ポリペプチドは、キンフネンシン（ｋｉｎｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）などのマンノシダーゼの阻害薬を含有する培地内で培養された細胞内での発現によって産生され得る（以下の実施例Ｉを参照されたい）。
【０１１６】
抗体の糖修飾を低フコース形式に変更するための他の方法としては、ラムノースを代謝することができない細胞内で細菌酵素ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロース還元酵素を使用すること（例えば、ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ  ＡＧ（ベルリン、ドイツ）のＧｌｙｍａｘＸ（登録商標）技術の使用）が挙げられる。
【０１１７】
低フコース抗体を作製するための別の方法は、抗体産生細胞内のα−（１，６）−フコシル基転移酵素の阻害または枯渇（例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｌｔｄ（バーゼル、スイス）のＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ技術の使用）によるものである。
【０１１８】
上記のように、本発明の抗体ポリペプチドは、Ｆｃ媒介性エフェクター機能に加えて、またはその不在下でのいずれにおいても、ＩＬ−１シグナル伝達に阻害作用を及ぼすことができる（実施例Ｅ、Ｌ、及びＭを参照されたい）。
【０１１９】
一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、ＩＬ−３３及び／またはＩＬ−３６を含むがこれらに限定されないＩＬ−１スーパーファミリー内の１つ以上の追加の（または代替的な）サイトカインに対して、阻害作用を及ぼすことができる。
【０１２０】
インターロイキン３３（ＩＬ−３３）は、ヘルパーＴ細胞、マスト細胞、好酸球、及び好塩基球に、２型サイトカインを産生させる。このサイトカインは、以前にＮＦ−ＨＥＶ、すなわち「高内皮細静脈（ＨＥＶ）内の核因子（ＮＦ）」と命名されており、これは、それがそうした特殊な細胞内で最初に同定されたためである。ＩＬ−３３は、受容体ＳＴ２（ＩＬ１ＲＬ１としても知られる）及びＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）と相互作用することによってその生物学的効果を媒介し、極性化したＴｈ２細胞からの２型サイトカイン（例えばＩＬ−５及びＩＬ−１３）の産生を推進するＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路内の細胞内分子を活性化させる。インビボのＩＬ−３３による２型サイトカインの誘発は、ＩＬ−３３の投与後に粘膜器官内で観察される重度の病理学的変化を誘発すると考えられている。
【０１２１】
インターロイキン３６（ＩＬ−３６）は、ＩＬ−３６受容体を介してナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に主に作用するサイトカインである。これは、ＮＦ−κＢ及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼを活性化させて、皮膚病変に関与することが知られている。Ｔ細胞の増殖及びＩＬ−２の放出を活性化させることも分かっている。
【０１２２】
本発明の抗体ポリペプチドが、ＩＬ−１、ＩＬ−３３、及び／またはＩＬ−３６シグナル伝達を全体的もしくは部分的に阻害し得ることは、当業者には理解されるであろう。例えば、シグナル伝達は、本発明のポリペプチドの非存在下のシグナル伝達と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、またはそれ以上阻害され得る。
【０１２３】
本発明のポリペプチドによるＩＬ−１、ＩＬ−３３、及び／またはＩＬ−３６シグナル伝達の阻害の程度は、当該技術分野で周知の方法を使用して判定され得る。
【０１２４】
例えば、ＩＬ−１シグナル伝達の阻害は、以下の実施例Ｅ、Ｌ、及びＭに記載されるように測定され得る。
【０１２５】
同様に、ＩＬ−３３シグナル伝達の阻害は、実施例Ｅ、Ｌ、及びＭに記載されるように測定され得る。
【０１２６】
ＩＬ−３６シグナル伝達の阻害は、当該技術分野で既知の方法によって測定され得る。例えば、滑膜線維芽細胞のＩＬ−３６刺激は、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰキナーゼの活性化につながる。代替的に、ＩＬ−３６−α、ＩＬ−３６−β、及びＩＬ−３６−γは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激に応答して、Ｔ細胞の増殖を増加させる（開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｌｏｏｄ  １２０（１７）：３４７８−８７を参照されたい）。
【０１２７】
一実施形態において、本抗体またはその抗原結合断片は、本抗体または抗原結合断片のインビボ半減期を延長させるための部分、例えば、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、糖修飾基、脂肪酸、及びデキストランなどをさらに含んでもよい。このようなさらなる部分は、当該技術分野で周知の方法を使用して、結合部分に共役されるか、または別様に組み合わせられてもよい。
【０１２８】
本発明の抗体ポリペプチドが、修飾または誘導体化されている１つ以上のアミノ酸を含むかまたはそれから成ってもよいことは、当業者には理解されるであろう。
【０１２９】
１つ以上のアミノ酸の化学的誘導体は、官能性側基との反応によって得ることができる。このような誘導体化された分子としては、例えば、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成するように、遊離アミノ基が誘導体化されている分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチル及びエチルエステル、または他の種類のエステル、ならびにヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。化学的誘導体としては、２０種の標準的なアミノ酸の自然発生的アミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、プロリンは４−ヒドロキシプロリンで置換され得、リジンは５−ヒドロキシリジンで置換され得、ヒスチジンは３−メチルヒスチジンで置換され得、セリンはホモセリンで置換され得、リジンはオルニチンで置換され得る。誘導体は、必要な活性が維持される限り、１つ以上の付加または欠失を含むペプチドも含む。他に含まれる修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンを用いるもの）、及び同様の末端修飾である。
【０１３０】
さらに、ペプチド模倣性化合物も有用であり得ることは、当業者には理解されるであろう。「ペプチド模倣薬」という用語は、治療薬としての特定のペプチドの高次構造及び望ましい特徴を模倣する化合物を指す。
【０１３１】
例えば、該ポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結されている分子だけでなく、ペプチド結合が反転している分子も含む。そのようなレトロ−インベルソのペプチド模倣薬は、当該技術分野で既知の方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載されているものなどを使用して作製され得る。この手法は、側鎖の配向ではなく主鎖に関わる変化を含む偽ペプチドの作製を伴う。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロ−インバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかに抵抗性である。代替的に、該ポリペプチドは、アミノ酸残基の１つ以上が従来のアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ２ＮＨ）−結合によって結合されているペプチド模倣性化合物であってもよい。
【０１３２】
さらなる代替形態において、アミノ酸残基の炭素原子間の空間を保持する適切なリンカー部分が使用されることを条件として、ペプチド結合が完全に省略されてもよい；リンカー部分が、ペプチド結合と実質的に同じ電荷分布、及び実質的に同じ平面性を有することが有利となる場合がある。
【０１３３】
該ポリペプチドが、エキソタンパク質分解（ｅｘｏ−ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）消化に対する感受性の低減に役立つように、そのＮまたはＣ末端において簡便に遮断されてよいことも理解されるであろう。
【０１３４】
様々な非コードアミノ酸または修飾アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸なども、哺乳類ペプチドを修飾するために使用されてきた。加えて、推定される生理活性の高次構造は、環化などの共有結合的修飾によって、またはラクタムもしくは他の種類の架橋の組み込みによって安定化され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：２６３６、及びＴｈｕｒｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１１：１６６を参照されたい）。
【０１３５】
本発明の抗体ポリペプチドは、それらの意図される使用、例えば、診断薬（例えば、インビボ造影剤）または治療薬としての使用を容易にするように、官能性部分で増補されてもよい。このように、一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、直接的または間接的に、治療的部分に結合されている。
【０１３６】
一実施形態において、治療的（例えば細胞傷害性）部分をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【０１３７】
任意の好適な治療的部分が使用され得る。好適な治療的部分の１つは、癌細胞（または関連する幹細胞もしくは前駆細胞）の成長の低減もしくは阻害、または具体的にはその殺滅が可能なものである。例えば、治療薬は、細胞傷害性部分であってもよい。細胞傷害性部分は、１つ以上の放射性同位体を含むかまたはそれから成ってもよい。例えば、１つ以上の放射性同位体は、それぞれ独立して、β放射体、オージェ放射体、変換電子放射体、α放射体、及び低光子エネルギー放射体から成る群から選択され得る。１つ以上の放射性同位体が、それぞれ独立して、薬剤近傍で高い吸収用量を生ずる局所吸収エネルギーの放出パターンを有することが所望される場合がある。例示的な放射性同位体としては、９０Ｙ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ／１８８Ｒｅ、１６６Ｈｏ、７６Ａｓ／７７Ａｓ、８９Ｓｒ、１５３Ｓｍなどの長距離β放射体、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、１６１Ｔｂ、１０５Ｒｈなどの中距離β放射体、４５Ｃａもしくは３５Ｓなどの低エネルギーβ放射体、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、９９Ｔｃｍ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、２０１Ｔｌなどの変換またはオージェ放射体、ならびに２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ａｃ、２２５Ａｃ、２１２Ｐｂ、２５５Ｆｍ、２２３Ｒａ、１４９Ｔｂ、及び２２１Ａｔなどのα放射体を挙げることができる。他の放射性核種も利用可能であり、療法に使用することが可能である。
【０１３８】
好ましい一実施形態では、本抗体ポリペプチドは、放射性同位体１７７Ｌｕに結合される（または別様にそれで標識される）。
【０１３９】
代替的に、治療的部分は、１つ以上の治療薬（例えば細胞傷害性薬物など）、例えば、細胞分裂阻害薬、抗アンドロゲン薬、コルチゾン及びその誘導体、ホスホネート、テストステロン−５−α還元酵素阻害薬、ホウ素付加体（ａｄｄｅｎｄ）、サイトカイン、タプシガルジン及びその代謝物、毒素（例えばサポリンまたはカリチアマイシンなど）、化学療法剤（例えば代謝拮抗薬など）、または癌の処置に有用な任意の他の治療薬もしくは細胞傷害性薬物を含むかまたはそれから成ってもよい。
【０１４０】
例示的な治療薬／細胞傷害性薬物は、例えば、以下を含み得る：
・細胞分裂阻害薬、具体的には、シクロホサミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓａｍｉｄｅ）、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、ロムスチン、タキサン、リン酸エストラムスチン、及び他のナイトロジェンマスタード、抗生物質（ドキソルビシン、カリチアマイシン、及びエスペラミシンを含む）、ビンカアルカロイド、アザリジン（ａｚａｒｉｄｉｎｅ）、白金含有化合物、エンドスタチン、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、酵素、置換尿素、メチル−ヒドラジン誘導体、ダウノルビシン、両親媒性アミンを含むがこれらに限定されない、用量制限副作用を有するもの、
・フルタミド及びビカルタミド（ｂｉｋａｌｕｔａｍｉｄｅ）などの抗アンドロゲン薬、ならびにそれらの代謝物、
・コルチゾン及びその誘導体、
・ジホホネート（ｄｉｐｈｏｐｈｏｎａｔｅ）及びブホスホネート（ｂｕｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）などのホスホネート、
・テストステロン−５−α還元酵素阻害薬、
・ホウ素付加体、
・サイトカイン、
・タプシガルジン及びその代謝物。
・細菌性毒素またはそれらの改変変異体。
・免疫調節剤
【０１４１】
代替的に、細胞傷害性部分は、光子活性化療法、中性子活性化療法、中性子誘発性オージェ電子療法、シンクロトロン照射療法、または低エネルギーＸ線光子活性化療法などの活性化療法における使用に好適な１つ以上の部分を含むかまたはそれから成ってもよい。
【０１４２】
例えば、本発明の抗体ポリペプチドを用いる場合、外部のＸ線照射からの局所エネルギー付与が、前投与されたＺ腫瘍標的性の高い薬剤との相互作用によって癌組織内で増進される、いわゆる光活性化放射線療法（ＰＡＴ）を主に重視して、放射線療法の前進のためにシンクロトロン放射（または低エネルギーＸ線）を使用する潜在性がある。
【０１４３】
ＰＡＴ治療法は、シンクロトロン源からの単色Ｘ線、例えば、グルノーブル所在の欧州シンクロトロン放射光研究所（ＥＳＲＦ）におけるＩＤ１７医用ビームラインによって提供されるもの、及び新しいスウェーデンのシンクロトロン設備であるＭａｘ−ＩＶなどの他の設備によって将来利用可能になると予想されるものなどを用いる。
【０１４４】
ルンドに予定されている欧州核破砕中性子源（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐａｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）（ＥＳＳ）において実施予定の「誘発性オージェ電子腫瘍療法」に関する研究は、さらなる潜在的な治療法を提供する。反応器で生成された熱中性子及び準熱中性子は、前臨床実験のため、ならびに高い局所吸収エネルギーをもたらす誘起α粒子及び反跳核（７Ｌ）を用いた脳腫瘍の処置の両方のために、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）に長年使用されている。同様の手法の１つは、中性子、及び中性子の断面積が大きい安定核で標識された好適な腫瘍標的分子を使用することである。抗体またはペプチドは、例えば、安定なガドリニウム（１５７Ｇｄ）で標識され得、Ｇｄ核によって捕捉される中性子の標的分子として作用する（いわゆるガドリニウム中性子捕捉療法（ＧｄＮＣＴ））。モンテカルロ技術により、腫瘍及び周囲組織内の用量分布が、γ光子、中性子、核反跳、ならびに固有Ｘ線、内部変換、及びガドリニウムまたは他の潜在的な元素からのオージェ電子によるものとして計算される。
【０１４５】
任意選択により、本発明の抗体ポリペプチドは、検出可能部分をさらに含んでもよい。例えば、検出可能部分は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、１２３Ｉ、及び２０１Ｔｌから成る群から選択される放射性同位体などの放射性同位体を含むかまたはそれから成ってもよい。任意選択により、この薬剤は、一対の検出可能かつ細胞傷害性の放射性核種、例えば８６Ｙ／９０Ｙまたは１２４Ｉ／２１１Ａｔなどを含んでもよい。代替的に、本抗体ポリペプチドは、いわゆる「多様式治療診断薬（Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｔｈｅｒａｇｎｏｓｔｉｃｓ）」を提供するように、検出可能部分として、かつまた細胞傷害性部分としても、マルチモーダル様式で同時に作用することができる放射性同位体を含んでもよい。したがって、結合部分は、マルチイメージング（例えば、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学造影、または超音波造影）の能力と、放射性核種または化学療法剤などの細胞傷害性薬物を使用した治療能力とを併せ持つナノ粒子に結合されてもよい。
【０１４６】
代替的に、検出可能部分は、常磁性同位体が１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅから成る群から選択されるような常磁性同位体を含むかまたはそれから成ってもよい。
【０１４７】
本抗体ポリペプチドが検出可能部分を含む場合、その検出可能部分は、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学造影、または超音波造影などの造影技術によって検出可能であり得る。
【０１４８】
治療的部分及び／または検出可能部分（例えば、放射性同位体、細胞傷害性部分など）は、抗体もしくはその断片に、直接的または間接的に結合していてもよい。好適なリンカーは当該技術分野で既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノール性リンカー（Ｎ−スクシミジル（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ）−ベンゾエートの誘導体；ドデカボラート）、大環状化合物と非環式キレーターとの両方のキレート化部分、例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミンペンタアセティックアビッド（ａｖｉｄ）（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロドセダン（ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｃｅｄａｎ）−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１］−ペンタデカ−１（１５），１１，１３−トリエン−４−（Ｓ）−（４−イソチオシアナート−ベンジル）−３，６，９−三酢酸（ＰＣＴＡ）の誘導体、５−Ｓ−（４−アミノベンジル）−１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−４，７，１０−トリス（酢酸）（ＤＯ３Ａ）の誘導体、ならびに他のキレート化部分を含む。
【０１４９】
好ましいリンカーの１つは、ＤＴＰＡ、例えば１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用されるものである。さらに好ましいリンカーは、デフェロキサミン、ＤＦＯ、例えば８９Ｚｒ−ＤＦＯ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用されるものである。
【０１５０】
上記に考察したように、本発明の抗体ポリペプチドの生成のための方法は、当該技術分野において周知である。
【０１５１】
簡便には、本抗体ポリペプチドは、組換えポリペプチドであるか、またはそれを含む。かかる組換えポリペプチドの生成に好適な方法は当該技術分野において周知であり、例えば、原核生物または真核生物の宿主細胞における発現などである（例えば、文献内の関連性のある開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０１５２】
本発明の抗体ポリペプチドは、ウサギ網状赤血球ライセートまたはコムギ胚芽ライセート（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）などの市販のインビトロ翻訳系を使用して生成することもできる。好ましくは、翻訳系は、ウサギ網状赤血球ライセートである。簡便には、翻訳系は、ＴＮＴ転写−翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）のように、転写系に結合され得る。この系は、翻訳と同じ反応でコードＤＮＡポリヌクレオチドから好適なｍＲＮＡ転写物を生成する利点を有する。
【０１５３】
代替的に、本発明の抗体ポリペプチドが、例えば周知の液相または固相合成技術（例えばｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ固相ペプチド合成など）を使用して、人工的に合成されてもよいことは、当業者には理解されるであろう。
【０１５４】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の抗体もしくは抗原結合断片またはその成分ポリペプチド鎖をコードする、単離核酸分子を提供する。ここで「核酸分子」には、一本鎖でも二本鎖でもよい、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡまたは相補ＤＮＡ）及びｍＲＮＡ分子が含まれる。ここで「単離」とは、核酸分子が細胞内に位置しないか、または別様に提供されていないことを意味する。
【０１５５】
一実施形態において、核酸分子はｃＤＮＡ分子である。
【０１５６】
核酸分子が、特定の宿主細胞内での本抗体ポリペプチドの発現のために、例えばヒト細胞内での発現のためにコドン最適化されていてもよいことは、当業者には理解されるであろう（例えば、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｇｏｖ，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．６（６）：６５０−６５９を参照されたい）。
【０１５７】
本発明の範囲内には、以下も含まれる。
（ａ）本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様による核酸分子を含むベクター（例えば発現ベクターなど）を提供し、
（ｂ）本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様による核酸分子、または本発明の第３の態様によるベクターを含む、宿主細胞（例えば哺乳類細胞など、例えばヒト細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞、例えばＣＨＯＫ１ＳＶ細胞）を提供し、
（ｃ）本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様による抗体ポリペプチドを作製する方法であって、本発明の第４の態様による宿主細胞の集団を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養することと、そこからポリペプチドを単離することと、を含む、方法を提供する。
【０１５８】
本発明の第６の態様は、薬学的有効量の本発明の第１の態様に記載の抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される希釈剤、担体、アジュバント、または賦形剤とを含む、薬学的組成物を提供する。
【０１５９】
ＥＤＴＡ、クエン酸、ＥＧＴＡ、またはグルタチオンなどのキレート剤を含む追加の化合物が本薬学的組成物中に含まれてもよいことは、当業者には理解されるであろう。
【０１６０】
本薬学的組成物は、十分に貯蔵安定性であり、ヒト及び動物への投与に好適である、当該技術分野で既知の様式で調製されてよい。例えば、本薬学的組成物は、例えば、フリーズドライ、噴霧乾燥、噴霧冷却によって、または超臨界粒子形成からの粒子形成の使用によって、凍結乾燥されてもよい。
【０１６１】
ここで「薬学的に許容される」とは、本発明の抗体ポリペプチドのＩＬ１ＲＡＰ結合活性の有効性を低下させない無毒性材料を意味する。そのような薬学的に許容される緩衝液、担体、または賦形剤は、当該技術分野において周知である（開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）、及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照されたい）。
【０１６２】
「緩衝液」という用語は、ｐＨを安定化させる目的で酸−塩基混合物を含有する水溶液を意味するよう意図される。緩衝液の例は、Ｔｒｉｚｍａ、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、ヘペス、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、ホスフェート、カーボネート、アセテート、シトレート、グリコレート、ラクテート、ボラート、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、タートレート、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジレート、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、及びＴＥＳである。
【０１６３】
「希釈剤」という用語は、薬学的調製物中に抗体ポリペプチドを希釈することを目的とした水溶液または非水溶液を意味するよう意図される。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油（例えば、ベニバナ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油、またはゴマ油など）のうちの１つ以上であり得る。
【０１６４】
「アジュバント」という用語は、本発明の抗体ポリペプチドの生物学的効果を上昇させるために製剤に添加される任意の化合物を意味するよう意図される。アジュバントは、異なるアニオン、例えば、限定されないが、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸、亜硫酸、水酸化物、リン酸、炭酸、乳酸、グリコール酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、及び異なるアシル組成を有する酢酸との亜鉛塩、銅塩、または銀塩のうちの１つ以上であり得る。アジュバントはまた、カチオン性ポリマー、例えばカチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、カチオン性合成ポリマー、例えばポリ（ビニルイミダゾール）、ならびにカチオン性ポリペプチド、例えばポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、及びこれらのアミノ酸を含有するペプチドであってもよい。
【０１６５】
賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質、及びミネラルのうちの１つ以上であり得る。炭水化物の例としては、例えば凍結乾燥を促進するために組成物に添加される、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、及びシクロデキストリンが挙げられる。ポリマーの例は、全て異なる分子量のデンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラゲナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解の程度が異なるポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、ならびにポリビニルピロリドンであり、これらは、例えば粘度制御のため、生体接着の達成のため、または化学分解及びタンパク質分解からの脂質の保護のために、組成物に添加される。脂質の例は、全て異なるアシル鎖長及び飽和度の脂肪酸、リン脂質、モノ、ジ、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、ならびに糖脂質、卵レシチン、大豆レシチン、水素添加卵レシチン及び大豆レシチンであり、これらは、ポリマーと同様の理由で組成物に添加される。ミネラルの例は、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、及び酸化チタンであり、これらは、液体蓄積の低減または有利な色素特性などの利益を得るために組成物に添加される。
【０１６６】
本発明の抗体ポリペプチドは、その送達に好適であるように、当該技術分野で既知のいかなる種類の薬学的組成物へと製剤化されてもよい。
【０１６７】
一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、抗体ポリペプチドが、他の薬学的に許容される担体に加えて、凝集形態でミセル、不溶性単層、及び液晶として存在する脂質などの両親媒性薬剤と組み合わせられている、リポソームの形態であってもよい。リポソーム製剤に好適な脂質としては、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるが、これらに限定されない。好適な脂質としては、血流循環時間を延長させるために極性頭部においてポリ（エチレングリコール）によって修飾された上記の脂質も挙げられる。かかるリポソーム製剤の調製は、例えば米国第４，２３５，８７１号で確認することができ、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
本発明の薬学的組成物はまた、生分解性微粒子の形態であってもよい。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）、またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びポリ酸無水物などの脂肪族ポリエステルは、微粒子の生成において生分解性ポリマーとして広く使用されている。かかる微粒子の調製は、米国第５，８５１，４５１号及び欧州第０  ２１３  ３０３号で確認することができ、それらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
さらなる実施形態では、本発明の薬学的組成物はポリマーゲルの形態で提供され、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラゲナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解の程度が異なるポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、ならびにポリビニルピロリドンなどのポリマーが、薬剤を含有する溶液の増粘のために使用される。ポリマーはまた、ゼラチンまたはコラーゲンを含んでもよい。
【０１７０】
代替的に、抗体ポリペプチドは、食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、もしくは油（例えば、ベニバナ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油、またはゴマ油など）、トラガントガム、及び／または様々な緩衝液中に単に溶解していてもよい。
【０１７１】
本発明の薬学的組成物が、活性抗体ポリペプチドの作用の増強のためのイオン及び規定のｐＨを含み得ることは理解されるであろう。さらに、本組成物は、滅菌などの従来の薬学的作業に供せられてもよく、かつ／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、充填剤などの従来のアジュバントを含有してもよい。
【０１７２】
本発明による薬学的組成物は、当業者に既知の任意の好適な経路を介して投与され得る。したがって、可能性のある投与経路としては、非経口（静脈内、皮下、及び筋肉内）、局所、眼、経鼻、肺、口腔、経口、非経口、膣内、及び直腸内が挙げられる。インプラントからの投与も可能である。
【０１７３】
好ましい一実施形態では、本薬学的組成物は、非経口的に、例えば、静脈内に、脳室内に、関節内に、動脈内に、腹腔内に、髄腔内に、心室内に、胸骨内に（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌｌｙ）、頭蓋内に、筋肉内に、もしくは皮下に投与されるか、または、輸注技術によって投与されてもよい。これらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態で簡便に使用される。水溶液は、必要に応じて（好ましくは３〜９のｐＨに）好適に緩衝されるべきである。無菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学技術によって容易に達成される。
【０１７４】
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、及び製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る、水性及び非水性の滅菌注射溶液、ならびに、懸濁化剤及び増粘剤を含み得る、水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。この製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば密閉されたアンプル及びバイアルで提示されてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管されてもよい。即時注射溶液及び懸濁液は、以前に説明されている種類の無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。
【０１７５】
このように、本発明の薬学的組成物は、非経口投与、例えば静脈内投与に特に好適である。
【０１７６】
代替的に、本薬学的組成物は、鼻腔内に、または吸引によって（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロ−メタン、ジクロロテトラフルオロ−エタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ３もしくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、または他の好適なガスなどの好適な噴射剤の使用と共に、加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示形態で）投与されてもよい。加圧エアロゾルの場合、薬用量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定されてもよい。加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーは、例えば、エタノールと溶媒としての噴射剤との混合物を使用する活性ポリペプチドの溶液または懸濁液を含有してもよく、これは、滑沢剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含有してもよい。吸引器または吸入器内で使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本発明の化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースとの粉末ミックスを含有するように製剤化されてもよい。
【０１７７】
本薬学的組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与される。本明細書において使用される「治療有効量」、または「有効量」、または「治療上有効な」は、所与の状態及び投与計画に対する治療効果を提供する量を指す。これは、必要とされる添加剤及び希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルに関連して所望の治療効果をもたらすように計算された、活性材料の所定の量である。さらに、宿主の活性、機能、及び応答の臨床的に有意な欠損を低減させ、最も好ましくは防止するのに十分な量を意味することが意図される。代替的に、治療有効量は、宿主の臨床的に有意な状態を改善させるのに十分である。当業者には理解されるように、化合物の量はその比活性に応じて変動し得る。好適な薬用量は、必要とされる希釈剤に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性組成物を含有し得る。本発明の化合物の製造のための方法及び用途において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当該技術分野で周知であるように、年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて、通常の技能を有する医療または獣医学従事者によって決定され得る。薬学的に有効な用量の投与は、個別の用量単位あるいはいくつかのより少ない用量単位の形態の単回投与、及び特定の間隔における細分された用量の複数回投与の両方によって実行されてもよい。代替的に、この用量は、長期間にわたる連続輸注として提供されてもよい。
【０１７８】
本発明の抗体ポリペプチドの診断用途との関連において、本明細書において使用される「薬学的有効量」、または「有効量」、または「診断上有効な」は、診断のための、例えばインビボ造影目的の、検出可能なシグナルを提供する量を指す。
【０１７９】
抗体ポリペプチドは、使用されているポリペプチドの効力／毒性に応じて様々な濃度で製剤化され得る。例えば、本製剤は、０．１μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは１μＭ〜５００μＭ、５００μＭ〜１ｍＭ、３００μＭ〜７００μＭ、１μＭ〜１００μＭ、１００μＭ〜２００μＭ、２００μＭ〜３００μＭ、３００μＭ〜４００μＭ、４００μＭ〜５００μＭ、５００μＭ〜６００μＭ、６００μＭ〜７００μＭ、８００μＭ〜９００μＭ、または９００μＭ〜１ｍＭの濃度で活性抗体ポリペプチドを含み得る。典型的には、本製剤は、３００μＭ〜７００μＭの濃度で活性抗体ポリペプチドを含む。
【０１８０】
典型的には、ヒト患者における（治療的部分を含むかまたは含まない）抗体ポリペプチドの治療用量は、投与１回当たり（７０ｋｇの体重に基づいて）１００μｇ〜７００ｍｇの範囲内である。例えば、最大治療用量は、投与１回当たり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、または１〜５ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜２ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。かかる用量が、腫瘍学者／医師によって決定される異なる間隔で投与されてもよいことは理解されるであろう。例えば、用量は、１日１回、週２回、週１回、２週間に１回、または月１回投与されてもよい。
【０１８１】
本発明の薬学的組成物が、単独で、または、癌の処置に使用される他の治療薬、例えば代謝拮抗薬、アルキル化剤、アントラサイクリン系薬剤及び他の細胞傷害性抗生物質、ビンカアルキロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋｙｌｏｉｄ）、エトポシド、白金化合物、タキサン、トポイソメラーゼＩ阻害薬、他の細胞分裂阻害薬、抗増殖性免疫抑制剤、副腎皮質ステロイド、性ホルモン及びホルモン拮抗薬、ならびに他の治療用抗体（例えばトラスツズマブ）などと組み合わせて投与されてもよいことは、当業者には理解されるであろう。
【０１８２】
本発明の第７の態様は、医薬中に使用するための、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１８３】
関連した本発明の第８の態様は、対象における腫瘍性疾患に関連する病的細胞またはその幹細胞もしくは前駆細胞の細胞死の誘発ならびに／または成長及び／もしくは増殖の阻害に使用するための、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで該細胞は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する。
【０１８４】
さらに関連した本発明の第９の態様は、対象における腫瘍性疾患の処置及び／または診断に使用するための、本発明の第１の態様による抗体または抗原結合断片を提供し、ここで該腫瘍性疾患は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する。
【０１８５】
ここで「処置」には、患者の治療的処置及び予防的処置の両方が含まれる。「予防的」という用語は、本明細書に記載される場合、患者もしくは対象における腫瘍性疾患の見込み、または癌細胞の蔓延、播種、もしくは転移を防止ないしは低減する、薬剤またはその製剤の使用を包含するように用いられる。「予防的」という用語はまた、本明細書に記載される場合、以前に腫瘍性疾患を処置されている患者における腫瘍性疾患の再発を防止する、薬剤またはその製剤の使用も包含する。
【０１８６】
ここで「診断」には、インビボ（すなわち患者の体内）か、またはエクスビボ（すなわち患者の身体から除去された組織または細胞試料内）かを問わず、癌性細胞の検出が含まれる。
【０１８７】
ここで「ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する腫瘍性疾患」には、直接的または間接的にその疾患の原因となる病的細胞が、細胞表面上でＩＬ１ＲＡＰを発現するような疾患が含まれる。ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞が、それ自体癌細胞、例えば腫瘍細胞であってもよいことは理解されるであろう。加えて、かかる細胞には、直接的または間接的に個体における腫瘍性疾患の発症の原因となる、病的幹細胞（すなわち、癌幹細胞またはＣＳＣ）及び前駆細胞が含まれる。ＣＳＣの例は、Ｖｉｓｖａｄｅｒ  ＆  Ｌｉｎｄｅｍａｎ，２００８，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：７５５−７６８に開示されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８８】
代替的に、または加えて、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞は、腫瘍性疾患に間接的に関連してもよく、例えば、新生細胞の生存に必要とされる細胞プロセスを媒介してもよい。本発明の抗体薬剤は、この事象において、腫瘍（血管新生）の血液供給に必須の細胞、腫瘍間質、または悪性細胞（例えば抑制性マクロファージまたはＴ細胞）に対して向けられる有益な免疫応答を阻害する細胞を標的にしてもよい。
【０１８９】
ＩＬ１ＲＡＰを発現する標的細胞の殺滅が治療上望ましいかどうかに応じて、ＡＤＣＣを誘発することができる、本発明の第１の態様による抗体または抗原結合断片が使用されてもよい。例えば、標的細胞ＩＬ１ＲＡＰが癌細胞（例えばＣＭＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬ、メラノーマ、肺癌細胞など）である場合、そのような細胞を排除するために、抗体または抗原結合断片にＡＤＣＣを誘発する能力があることが有利となる場合がある。しかしながら、治療的利益が、例えば、腫瘍近傍の血管新生の低減につながるＩＬ−１（またはＩＬ−３３）シグナル伝達の阻害によるＡＤＣＣ活性を欠く抗体または抗原結合断片を使用することでも達成され得ることは理解されるであろう。
【０１９０】
一実施形態において、腫瘍性疾患は、腫瘍性血液疾患である。
【０１９１】
例えば、本抗体またはその抗原結合断片は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から成る群から選択される腫瘍性疾患の処置ならびに／または診断に使用するためのものであり得る。
【０１９２】
さらなる実施形態では、本抗体またはその抗原結合断片は、対象の体内での固形腫瘍の形成に関連する腫瘍性疾患の処置及び／または診断に使用するためのものである。
【０１９３】
したがって、本抗体またはその抗原結合断片は、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫から成る群から選択される腫瘍性疾患の処置に使用するためのものであってもよい。
【０１９４】
本発明の治療的及び予防的態様に関連して、腫瘍性疾患に関連する細胞の表面上に存在するＩＬ１ＲＡＰに対する抗体ポリペプチドの結合が、ＩＬ１ＲＡＰの生物活性の調節（すなわち上昇または低下）をもたらし得ることは、当業者には理解されるであろう。しかしながら、そのような調節作用は必須ではない；例えば、本発明の抗体ポリペプチドは、単純に、固形腫瘍に関連する細胞の表面上でＩＬ１ＲＡＰに結合することによって治療的及び予防的作用を誘起し得、これは次に（例えばＡＤＣＣによって、かつ／または細胞傷害性／放射性部分の薬剤内に存在することによって）免疫系に細胞死を誘発させ得る。
【０１９５】
ここで「ＩＬ１ＲＡＰの生物活性」には、腫瘍性疾患に関連する細胞上のＩＬ１ＲＡＰが関与する、いかなる相互作用またはシグナル伝達事象も含まれる。例えば、一実施形態では、本抗体ポリペプチドは、ＩＬ１ＲＡＰ（例えばＩＬ１Ｒ１、ＳＴ２、Ｃ−ＫＩＴ、及び／またはＩＬ１ＲＬ２など）に対する１つ以上の共受容体の結合を遮断することができる。
【０１９６】
本発明の抗体ポリペプチドによるＩＬ１ＲＡＰの生物活性のかかる阻害は、全体的でも部分的でもよい。例えば、該薬剤は、ＩＬ１ＲＡＰの生物活性を、本抗体ポリペプチドに曝露されたことのない腫瘍性疾患に関連する細胞内のＩＬ１ＲＡＰの生物活性と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、最も好ましくは１００％阻害し得る。好ましい実施形態では、本抗体ポリペプチドは、ＩＬ１ＲＡＰの生物活性を、本抗体ポリペプチドに曝露されたことのない腫瘍性疾患に関連する細胞内のＩＬ１ＲＡＰの生物活性と比較して、５０％以上阻害することができる。
【０１９７】
同様に、腫瘍性疾患に関連する細胞の成長及び／または増殖の阻害が全体的でも部分的でもよいことは理解されるであろう。例えば、本抗体ポリペプチドは、腫瘍性疾患に関連する細胞の成長及び／または増殖を、本抗体ポリペプチドに曝露されたことのない腫瘍性疾患に関連する細胞の成長及び／または増殖と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、最も好ましくは１００％阻害し得る。
【０１９８】
本発明の第１０の態様は、対象における腫瘍性疾患の処置のための薬物の調製における、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片の使用を提供し、ここで該腫瘍性疾患は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する。
【０１９９】
関連した態様では、本発明は、対象における腫瘍性疾患の診断及び／または予後のための薬剤の調製における、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片の使用を提供し、ここで該腫瘍性疾患は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する。したがって、腫瘍性疾患に関連する（ＩＬ１ＲＡＰを発現する）細胞を検出する際に使用するための診断薬及び／または予後剤が提供される。本発明は、対象における腫瘍性疾患の診断及び／または予後のためのキットの調製における、本発明の第１の態様によるＩＬ１ＲＡＰ特異性抗体またはその抗原結合断片の使用をさらに提供する。
【０２００】
一実施形態において、腫瘍性疾患は、腫瘍性血液疾患である。
【０２０１】
例えば、本抗体またはその抗原結合断片は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から成る群から選択される腫瘍性疾患の処置ならびに／または診断に使用するためのものであり得る。
【０２０２】
さらなる実施形態では、本抗体またはその抗原結合断片は、対象の体内での固形腫瘍の形成に関連する腫瘍性疾患の処置及び／または診断に使用するためのものである。
【０２０３】
したがって、本抗体またはその抗原結合断片は、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫から成る群から選択される腫瘍性疾患の処置ならびに／または診断に使用するためのものであってもよい。
【０２０４】
本発明の第１１の態様は、対象における腫瘍性疾患の処置または診断のための方法であって、該対象に、有効量の本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含む方法を提供し、ここで該腫瘍性疾患は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する。
【０２０５】
一実施形態において、腫瘍性疾患は、腫瘍性血液疾患である。
【０２０６】
例えば、本方法は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から成る群から選択される腫瘍性疾患の処置ならびに／または診断に使用するためのものであり得る。
【０２０７】
さらなる実施形態では、本方法は、対象の体内での固形腫瘍の形成に関連する腫瘍性疾患の処置及び／または診断に使用するためのものである。
【０２０８】
したがって、本方法は、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、膀胱癌、脳／ＣＮＳ癌、子宮頸癌、食道癌、胃癌、頭／頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、及び肉腫から成る群から選択される腫瘍性疾患の処置に使用するためのものであってもよい。
【０２０９】
さらなる実施形態では、本発明の抗体ポリペプチド及び製剤は、ＩＬ−１（またはＩＬ−３３）シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある疾患もしくは状態を患うかまたは患うリスクのある患者もしくは対象を処置するために使用されてもよい。
【０２１０】
したがって、本発明の第１２の態様は、ＩＬ−１（またはＩＬ＿３３）シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある疾患または状態の処置に使用するための、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２１１】
かかる状態または病態は、当該技術分野において周知であり（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１：６３３−６５２、及びＤｉｎａｒｅｌｌｏ，２０１４，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０（ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ４３−Ｓ５８を参照されたい）、以下を含むがこれらに限定されない。
リウマチ性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＳＯＪＩＡ）を含むあらゆる種類の若年性関節炎、骨関節炎、家族性感冒自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）、マックル−ウェルズ病、新生児期発症多臓器性炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・ざ瘡（ＰＡＰＡ）症候群、成人発症スチル病、高ＩｇＤ症候群、２型真性糖尿病、マクロファージ活性化症候群、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スウィート病、ループス関節炎、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アテローム性動脈硬化、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、Ｉ型真性糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクターピロリ感染胃炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、Ｃ型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、ナイセリアまたは肺炎球菌性髄膜炎、結核、Ｂｅｃｈｅｔ症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、喘息、Ｉ型糖尿病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患（例えば、代謝症候群、心肥大、うっ血性心不全、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、脂肪肝疾患、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、慢性腎不全、卒中、及び高尿酸血症）、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー／アトピー性皮膚炎、ならびに痛風。
【０２１２】
ＩＬ−１シグナル伝達の遮断は、心筋梗塞の処置に有益とも考えられている。大規模な臨床治験により、心筋梗塞後の（カナキヌマブを使用した）ＩＬ１Ｂ抗体遮断の効力の確認が現在追求されている（ＣＡＮＴＯＳトレイル；Ｒｉｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６２（４）：５９７−６０５を参照されたい）。
【０２１３】
そのような効能については、治療的利益が、例えば、免疫細胞に関連するＩＬ−１（またはＩＬ−３３）シグナル伝達の阻害によるＡＤＣＣ活性を欠く抗体または抗原結合断片を使用することでも達成され得ることは理解されるであろう。
【０２１４】
本発明の第１３の態様は、ＩＬ−１（及び／またはＩＬ−３３及び／またはＩＬ−３６）シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある疾患または状態の処置のための薬物の調製における、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
【０２１５】
本発明の第１４の態様は、対象におけるＩＬ−１（及び／またはＩＬ−３３及び／またはＩＬ−３６）シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に感受性のある疾患または状態の処置のための方法であって、該対象に、有効量の本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含む、方法を提供する。
【０２１６】
本発明の第１５の態様は、対象におけるＩＬ−１（及び／またはＩＬ−３３及び／またはＩＬ−３６）シグナル伝達の阻害薬を用いた処置に対して感受性のある疾患または状態のＡＤＣＣ媒介性処置または増補のための方法であって、該対象に、ＡＤＣＣを誘発することができる本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を有効量で投与するステップを含む、方法を提供する。
【０２１７】
本発明の第１６の態様は、対象における癌細胞の検出のためのインビトロ法を提供し、本方法は、
（ａ）試験される対象からの細胞試料（例えば、白血球幹／前駆細胞または生検組織）を提供すること、
（ｂ）任意選択により、該試料中に存在する該細胞を抽出及び／または精製すること、
（ｃ）本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を、該試料中に存在する細胞と接触させること、
（ｄ）本抗体ポリペプチドが該細胞に結合するかどうかを判定すること、を含み、
該細胞に対する本抗体ポリペプチドの結合は、対象の組織内の癌細胞の存在を示す。
【０２１８】
本発明の第１７の態様は、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を用いた処置から利益を得るであろう癌患者を識別するためのインビトロ法を提供し、本方法は、
（ａ）試験される患者からの癌細胞試料（例えば、白血球幹／前駆細胞または生検組織）を提供すること、
（ｂ）任意選択により、該試料中に存在する該細胞を抽出及び／または精製すること、
（ｃ）本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を、該試料中に存在する細胞と接触させること、
（ｄ）本抗体ポリペプチドが該細胞に結合するかどうかを判定すること、を含み、
癌細胞に対する本抗体ポリペプチドの結合は、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を用いた処置から利益を得るであろう患者を示す。
【０２１９】
当業者であれば、かかるアッセイを行う多くの方法が存在することを理解するであろう。例えば、イムノアッセイは、均一系か、またはより好ましくは不均一系かの、いずれでもよい。このアッセイはまた、競合的形式か、またはより好ましくは非競合的形式かの、いずれで行われてもよい。
【０２２０】
一実施形態において、患者からの血液試料（白血病）または生検（固形腫瘍）でのＩＬ１ＲＡＰ発現は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学的検査を使用して測定され、閾値を超える発現は、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片を用いた処置から利益を得るであろう患者を示す。
【０２２１】
上記のインビトロ法の好ましい実施形態では、ステップ（ｄ）は、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡによって行われる。しかしながら、インビトロの抗体−抗原相互作用の検出に好適な任意のアッセイが使用されてよい。
【０２２２】
本発明の第１８の態様は、癌患者を処置するための方法を提供し、本方法は、本発明の第１６または第１７の態様による方法を使用して癌を患っていると識別された対象に、該癌の処置において有効な治療薬を投与することを含む。一実施形態において、例示的な治療薬は、本発明の第１の態様による抗体ポリペプチドである。
【０２２３】
一実施形態において、本方法は、
（ａ）本発明の第１６または第１７の態様による方法を使用して、閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰを発現する癌細胞の存在に関して、試験される対象からの細胞試料（例えば白血球幹／前駆細胞または生検組織）を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で試験された細胞試料が、閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰ発現を伴う癌細胞を含有する対象を、処置のために選択するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で選択された対象に、該癌の処置において有効な治療薬、例えば本発明の第１の態様による抗体ポリペプチドを投与するステップと、を含む。
【０２２４】
ＩＬ１ＲＡＰを発現する癌細胞が、以下のいずれかに特異的に結合することができるプローブを使用して識別され得ることは、当業者には理解されるであろう：
（ａ）ＩＬ１ＲＡＰポリペプチド（例えば、本発明による抗体またはその抗原結合断片）、または
（ｂ）ＩＬ１ＲＡＰポリヌクレオチド転写物／ｍＲＮＡ（例えば、ＩＬ１ＲＡＰポリヌクレオチド転写物／ｍＲＮＡのある領域に対する配列で相補的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）。
【０２２５】
そのような試験を行うための方法は、当該技術分野において周知である。
【０２２６】
関連した実施形態では、本方法は、
（ａ）対象からの細胞試料（例えば、白血球幹／前駆細胞または生検組織）を得るステップと、
（ｂ）本発明の第１６または第１７による方法を使用して、閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰを発現する癌細胞の存在について該細胞を試験するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で試験された細胞試料が、閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰ発現を伴う癌細胞を含有する対象を、処置のために選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で選択された対象に、該癌の処置において有効な治療薬、例えば本発明の第１の態様による抗体ポリペプチドを投与するステップと、を含む。
【０２２７】
任意選択により、上記の実施形態のステップ（ａ）及び（ｂ）は、閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰ発現を伴う癌細胞の数が低減しているかどうかを判定するために、第１の処置期間後（例えば、１か月後）に繰り返されてもよい。不十分な低減が観察される場合（例えば、低減が観察されない場合）、後続の処置期間では、該癌の処置において有効な治療薬の用量が増加される。閾値基準を超えるＩＬ１ＲＡＰ発現を伴う癌細胞が検出されない場合、処置は終結されてもよい。
【０２２８】
本発明の第１９の態様は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いた処置から利益を得るであろう癌患者を識別するためのインビトロ診断法を提供し、本方法は、
（ａ）試験される対象からの細胞試料（例えば、白血球幹／前駆細胞または生検組織）を、ＩＬ１ＲＡＰポリペプチドまたはＩＬ１ＲＡＰポリヌクレオチド転写物に特異的に結合することができる分子プローブとインビトロで接触させるステップであって、該プローブが、光子を放出することができる部分に共有結合している、ステップと、
（ｂ）該部分から放出された光子を検出し、該試料の画像を形成するステップと、を含み、
該部分からの光子の局所的放出は、該対象が、本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いた処置から利益を得るであろう癌患者であることを示す。
【０２２９】
本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータに関する優先度及び選択肢は、文脈に別段の記載がない限り、本発明の他の態様、特徴、及びパラメータの全てに関する、ありとあらゆる優先度ならびに選択肢との組み合わせで開示されているものと見なされるべきである。例えば、一実施形態において、本発明は、ＡＭＬの処置に使用するための、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、インタクトＩｇＧ１抗体を提供する。
【０２３０】
本明細書における明白な先行公開文献の列記または考察は、必ずしもその文献が技術水準の一部であるという承認、または共通の一般知識であるという承認として解釈されるべきではない。
【０２３１】
特許請求の範囲及び／または本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて用いられる場合の「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語の使用は、「１つの（ｏｎｅ）」を意味する場合もあるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。
【０２３２】
本発明のこれら及び他の実施形態は、上記の説明及び添付の図面と併せて考慮された場合により良好に認識及び理解されるであろう。しかしながら、上記の説明は、本発明の様々な実施形態及びその多数の具体的詳細を示しているが、限定ではなく例示として提示されるものであることを理解されたい。本発明の趣旨から逸脱することなく、多くの置換、変形、追加、及び／または再編が本発明の範囲内で行われてよく、本発明は、そのような置換形態、変形形態、追加形態、及び／または再編形態を全て含む。
【０２３３】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに論証するために含まれるものである。本発明は、これらの図面のうちの１つ以上を、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細説明と組み合わせて参照することによって、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１】間接ＥＬＩＳＡにおける例示的な抗体ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３のヒトＩＬ−１ＲＡＰに対する結合。
【図２】ヒトＣＭＬ細胞に対する例示的な本発明の抗体（ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３）の結合。このグラフは、０．１μｇ／ｍＬの濃度にてＩＬ１ＲＡＰ標的モノクローナル抗体で染色したＫＵ８１２細胞に関するＭＦＩ値を示す。
【図３】ＩＬ−１ｂシグナル伝達を遮断する例示的な抗体ＣＡＮ０３の能力。
【図４（Ａ）】インビトロＡＤＣＣアッセイは、例示的な抗体ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３が、ＣＭＬ細胞の特異的細胞殺滅を誘発することを示す。（Ａ）ＫＵ８１２、ＬＡＭＡ８４、及びＢＶ１７３細胞は、１０μｇ／ｍＬのＣＡＮ０１の添加によって特異的に殺滅された。（Ｂ）例示的な抗体ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３によって媒介される細胞殺滅は、ＢＶ１７３標的細胞に示されるように用量依存性である。（Ｃ）２人のＣＭＬ急性転化患者からの初代細胞の細胞殺滅が、１μｇ／ｍＬのＣＡＮ０１によって誘発された。（Ｄ）Ｔ３１５Ｉ変異を保有する第３のＣＭＬ急性転化患者からの細胞は、ＣＡＮ０１によって媒介されるＡＤＣＣ作用に感応性であった。各実験は、異なるドナーからのＮＫ細胞を用いて少なくとも２回行われ、提示されるデータは、それぞれからの１つの代表的な実験を示す。
【図４（Ｂ）】図４（Ａ）の続き。
【図４（Ｃ）】図４（Ｂ）の続き。
【図４（Ｄ）】図４（Ｃ）の続き。
【図５】例示的な抗体ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３が、メラノーマ細胞（ＳＫＭＥＬ５細胞株）の特異的細胞殺滅の誘発において効率的であることを示す、インビトロＡＤＣＣアッセイ。１μｇ／ｍＬにおいて既に、ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３は、高特異性の標的細胞殺滅を示す。この実験は、異なるドナーからのＮＫ細胞を用いて少なくとも２回行われ、提示されるデータは、１つの代表的な実験を示す。
【図６（Ａ）】（Ａ）氷上で２時間、もしくは３７℃で２時間、ＣＡＮ０１−ＡＦ４８８共役抗体と共にインキュベートしたＬＡＭＡ細胞、または、３７℃で１６時間ＣＡＮ０１−ＡＦ４８８共役抗体と共にインキュベートしたＬＡＭＡ細胞を示す共焦点像（１枚の光学切片、厚さ約０．９μｍ）。過半数の細胞の細胞膜に結合する明確に定義された抗体を、氷上で２時間のインキュベーション後に観察することができる（「Ｉｃｅ  ２ｈ」）。膜結合に加えて、３７℃でＣＡＮ０１−ＡＦ４８８共役抗体と共に２時間インキュベートした後、抗体は細胞に進入し始めており（内部移行）、ここではサイトゾル内にも局在化している。３７℃で１６時間のインキュベーションの後、細胞膜結合は依然として存在しており、抗体内部移行により、過半数の細胞内でのＣＡＮ０１−ＡＦ４８８抗体の蓄積が生じている。スケールバー（右の画像）は、全画像で２０μｍを表す。（Ｂ）氷上で２時間、もしくは３７℃で２時間、ＣＡＮ０３−ＡＦ４８８共役抗体と共にインキュベートしたＬＡＭＡ細胞、または、３７℃で１６時間ＣＡＮ０３−ＡＦ４８８共役抗体と共にインキュベートしたＬＡＭＡ細胞を示す共焦点像（１枚の光学切片、厚さ約０．９μｍ）。過半数の細胞の細胞膜に結合する明確に定義された抗体を、氷上で２時間のインキュベーション後に観察することができる（「Ｉｃｅ  ２ｈ」）。膜結合に加えて、３７℃でＣＡＮ０３−ＡＦ４８８共役抗体と共に２時間インキュベートした後、抗体は細胞に進入し始めており（内部移行）、ここではサイトゾル内にも局在化している。３７℃で１６時間のインキュベーションの後、細胞膜結合は依然として存在しており、抗体内部移行により、過半数の細胞内でのＣＡＮ０３−ＡＦ４８８抗体の蓄積が生じている。スケールバー（右の画像）は、全画像で２０μｍを表す。（Ｃ）ＣＡＮ０３特異的結合及び内部移行のための対照：共焦点像（１枚の光学切片、厚さ約０．９μｍ）は、氷上もしくは３７℃で２時間、または３７℃で１６時間、ＡＦ４８８共役アイソタイプ対照抗体と共にインキュベートしたＬＡＭＡ細胞を示す。アイソタイプ対照抗体は、これらの条件のいずれにおいても特異的結合を示さなかった。細胞残屑及び壊死細胞へのわずかな結合が認められた。スケールバー（右の画像）は、全画像で２０μｍを表す。
【図６（Ｂ）】図６（Ａ）の続き。
【図６（Ｃ）】図６（Ｂ）の続き。
【図７（Ａ）】ＣＡＮ０１での処置は、白血病負荷を著しく低減させる。（Ａ）末梢血中の白血病細胞の出現頻度は、移植後３６日目において、アイソタイプ対照と比較して例示的な抗体ＣＡＮ０１で処置されたマウスにおいてより低かった（０．１０％対０．６９％、ｐ＜０．００４３）。（Ｂ）血小板（ＰＬＴ）数は、ＣＡＮ０１よりもアイソタイプで低かった（ｐ＝０．０１５）。（Ｃ）６２日目において、末梢血中の白血病細胞の平均出現頻度は、アイソタイプ処置マウスで４６．５％であったが、ＣＡＮ０１では３．８％のみであった。（Ｄ）屠殺時、脾臓内の白血病細胞の出現頻度は、ＣＡＮ０１では低減していた（１７．２％対４９．７％、ｐ＝０．００５２）。（Ｅ）骨髄内の白血病細胞の出現頻度は、アイソタイプ対照と比較してＣＡＮ０１で処置されたマウスにおいてより低かった（５．０％対５９．５％、ｐ＝０．０００１）。
【図７（Ｂ）】図７（Ａ）の続き。
【図７（Ｃ）】図７（Ｂ）の続き。
【図７（Ｄ）】図７（Ｃ）の続き。
【図７（Ｅ）】図７（Ｄ）の続き。
【図８（Ａ）】ＣＡＮ０１での処置は、生存期間を延長させ、白血病負荷を低減させる。（Ａ）アイソタイプ処置マウスの生存期間中央値は３７日であり、ＣＡＮ０１で処置されたマウスに関しては５８日間であった（ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）屠殺時、骨髄内の白血病細胞の出現頻度は、ＣＡＮ０１では低減していた（２９．２％対５５．９％、ｐ＝０．０２０）。（Ｃ）白血病細胞の平均出現頻度は、アイソタイプ対照と比較してＣＡＮ０１で処置されたマウスにおいてより低かった（３１．７％対４３．１％）。（Ｄ）ＣＡＮ０１で処置されたマウスは、アイソタイプ対照を与えられたマウスよりも著しく小さな脾臓を有した（６０ｍｇ対９７ｍｇ、ｐ＝０．０３２））
【図８（Ｂ）】図８（Ａ）の続き。
【図８（Ｃ）】図８（Ｂ）の続き。
【図８（Ｄ）】図８（Ｃ）の続き。
【図９】ＣＡＮ０１での処置は、初代ヒトＡＭＬ細胞を移植されたマウスにおける白血病負荷を著しく低減させる。骨髄内の白血病細胞の平均出現頻度は、ＣＡＮ０１で処置されたマウスにおいて０．００１％であり、対照抗体を与えられたマウスにおいて０．１２６％であった。
【図１０（Ａ）】（Ａ）ヒトＩＬ−１α、（Ｂ）ヒトＩＬ−１β、及び（Ｃ）ヒトＩＬ−３３で刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ  １β細胞に対するＣＡＮ０１、ＣＡＮ０３、及びアイソタイプ対照の効果。２つの実験を２連の試料を用いて行い、３つの個別のデータ点として平均値を加えた個別の値として表した。
【図１０（Ｂ）】図１０（Ａ）の続き。
【図１０（Ｃ）】図１０（Ｂ）の続き。
【図１１（Ａ）】（Ａ）マウスＩＬ−１α、（Ｂ）マウスＩＬ−１β、及び（Ｃ）マウスＩＬ−３３、１β細胞で刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ  １β細胞に対するＣＡＮ０１、ＣＡＮ０３、及びアイソタイプ対照の効果。２つの実験を２連の試料を用いて行い、３つの個別のデータ点として平均値を加えた個別の値として表した。
【図１１（Ｂ）】図１１（Ａ）の続き。
【図１１（Ｃ）】図１１（Ｂ）の続き。
【実施例】
【０２３５】
Ａ．ＩＬ１ＲＡＰタンパク質に対する本発明の例示的な抗体の結合親和性
（ｉ）Ｂｉａｃｏｒｅ研究−マウス起源の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体
材料＆方法
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、ウプサラ、スウェーデン）の捕捉キットの技術マニュアル及び標準的な操作原理に従って、ヤギ抗マウスＩｇＧをＣＭ５チップ上に固定化した。
【０２３６】
結合性分析サイクルは３つのステップから成った：（ｉ）固定化された抗マウス抗体によるチップ表面上のリガンドの捕捉、（ｉｉ）補足されたリガンドに対するアナライトの結合、及び（ｉｉｉ）結合したアナライトの解離。
【０２３７】
製造業者の推奨条件を使用して、捕捉分子表面を各結合サイクル後に再生させた。
【０２３８】
全ての結合サイクルは２５℃で行った。
【０２３９】
５サイクルのスタートアップ後、サイクルの開始時に、各抗体（１００ｎＭ）を３０μｌ／分の流速で１２０秒間注入し、次いで、このアナライト（１００ｎＭ）を３０μｌ／分の流速で１２０秒間注入し、続いて解離相を３００秒間監視した。
【０２４０】
本発明の２つの例示的な抗体（ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３）を試験した。
【０２４１】
結果＆結論
結果を以下の表２に示す。
【表３】
2017530692.tif 000031
【０２４２】
（ｉｉ）ＥＬＩＳＡ研究−マウス起源の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体
材料＆方法
間接ＥＬＩＳＡアッセイを行った。全ての試料を２連で分析した。Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６  Ｍｉｃｒｏ  Ｗｅｌｌ（商標）プレートを、０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に希釈した１００ｎｇの組換えｈＩＬ１ＲＡＰ  ２１−３６７（１００μｌ／ウェル）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．０１ＭのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、続いて、１５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）を使用したブロッキングステップを行った。撹拌しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした後、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液を用いてこれらのプレートを再度洗浄した。３倍段階希釈（１０００ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌの範囲）でＥＬＩＳＡブロッキング溶液中に試料を希釈し、次いで、ＥＬＩＳＡプレート（１００μｌ／ウェル）に移した。プレートを撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートし、次いでＥＬＩＳＡ洗浄溶液で洗浄した。アルカリホソハターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｏｈａｔａｓｅ）（ＤＡＫＯ、１：１０００）に共役した１００μｌ／ウェルのウサギ抗マウスＩｇＧを添加し、撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートした。これらのプレートを洗浄し、続いて基質（４−ニトロフェニルホスファタイズ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｓｅ）二ナトリウム塩六水和物、ＳＩＧＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ）（１００μｌ／ウェル）を加えた。その後、これらのプレートを撹拌しながらＲＴでインキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を３０分間連続して測定した。０分における吸光度をバックグラウンドシグナルと見なした。
【０２４３】
結果＆結論
結果は図１に示される。
【０２４４】
本発明の例示的な抗体であるＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３の両方が、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対する高い結合シグナルを保有することが分かった。
【０２４５】
Ｂ．ＩＬ１ＲＡＰ発現細胞に対する本発明の例示的な抗体の結合のフローサイトメトリー研究
材料＆方法
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株ＫＵ８１２細胞を、ＩＬ１ＲＡＰに対して作られた抗体または関連性のあるアイソタイプ対照で染色した。検出には、二次抗ｍＩｇ−ＡＰＣを使用した。
【０２４６】
本発明の２つの例示的な抗体（ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３）を、５つの比較用（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（ＣＡＮ０２、ＣＡＮ０５、ＣＡＮ０７、ＣＡＮ０８、及びＣＡＮ０９）と併せて試験した。アイソタイプ陰性対照抗体も含まれていた。
【０２４７】
結果＆結論
ＩＬ１ＲＡＰ発現ＫＵ８１２白血病細胞の染色は、アイソタイプ対照及びＩＬ１ＲＡＰを標的とする他の比較用抗体と比較して高いＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を明らかにする（図２）。
【０２４８】
Ｃ．本発明の例示的な抗体のエピトープ／ドメインマッピング
材料＆方法
異なる抗体クローンがＩＬ１ＲＡＰ上に結合する場所を理解するために、タンパク質の構造分析を行い、受容体の細胞外部分が、３つの明確に異なるドメイン（以降ドメイン１、２、及び３（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）と称す）に分割され得ることが明らかとなった（開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：９０５−９１２を参照されたい）。異なる抗体クローンに関するドメイン結合パターンを判定するために、一連の受容体コンストラクトを作製し、これらに対する結合性をＥＬＩＳＡアッセイで試験した。
【０２４９】
間接ＥＬＩＳＡアッセイを行った。全ての試料を２連で分析した。Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６  Ｍｉｃｒｏ  Ｗｅｌｌ（商標）プレートを、０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に希釈した１００ｎｇのＲｅｃ  ｈＩＬ１ＲＡＰドメイン１２３（ａａ２１−３６７）（陽性対照）、Ｒｅｃ  ｈＩＬ１ＲＡＰドメイン１２（ａａ２１−２３４）、ドメイン１（ａａ２１−１３４）、またはＲｅｃ  ｈＩＬ１ＲＡＰドメイン３（ａａ２３５−３６７）（１００μｌ／ウェル）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．０１ＭのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、続いて、１５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）を使用したブロッキングステップを行った。撹拌しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションした後、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液を用いてこれらのプレートを再度洗浄した。ＣＡＮ０１、ＣＡＮ０３、ＣＡＮ０５、ＣＡＮ０７、ＣＡＮ０８、及びＫＭＴ−１（陽性対照）を、３倍段階希釈（１０００ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌの範囲）でＥＬＩＳＡブロッキング溶液中に希釈し、次いでＥＬＩＳＡプレート（１００μｌ／ウェル）に移した。プレートを撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートし、次いでＥＬＩＳＡ洗浄溶液で洗浄した。アルカリホスファターゼ（ＤＡＫＯ、１：１０００）に共役した１００μｌ／ウェルのウサギ抗マウスＩｇＧを添加し、撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートした。これらのプレートを洗浄し、続いて基質（４−ニトロフェニルホスファタイズ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｓｅ）二ナトリウム塩六水和物、ＳＩＧＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ）（１００μｌ／ウェル）を加えた。その後、これらのプレートを撹拌しながらＲＴでインキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を３０分間連続して測定した。０分における吸光度をバックグラウンドシグナルと見なした。
【０２５０】
本発明の２つの抗体（ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３）を、５つの比較用抗ＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体（ＣＡＮ０２、ＣＡＮ０５、ＣＡＮ０７、ＣＡＮ０８、ならびに陽性対照としてのポリクローナル抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（ＫＭＴ−１））と併せて試験した。
【０２５１】
結果＆結論
本発明の例示的な抗体であるＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３は、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン３内に結合することが分かった。
【０２５２】
このドメインマッピングデータは、以下の表３に要約が確認できる。
【表４】
2017530692.tif 000032
【０２５３】
Ｄ．本発明の例示的な抗体の特異性／交差反応性
材料＆方法
良好なリード候補抗体の重要な特徴の１つは、それが、関連性のある毒性学的種における相同タンパク質と、等しいかまたはほぼ等しい作用強度で交差反応することである。一般的な規制ガイドラインによると、１匹のげっ歯動物及び１匹の非げっ歯動物に対する結合が好ましいシナリオであるが、抗体ではこれはめったにないことであり、むしろ、多くの研究室が、霊長類以外の関連性のある毒性学的な種の同定に苦労している。
【０２５４】
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（ｒｈｅｓｕｓ）またはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）のような非ヒト霊長類におけるＩＬ１ＲＡＰタンパク質はヒトＩＬ１ＲＡＰタンパク質と９９％の相同性を共有するため、本研究では、これらの種に対する交差反応性が予想された。
【０２５５】
いくつかの潜在的なリード抗体を選択し、ＥＬＩＳＡアッセイで組換えカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＩＬ１ＲＡＰ（ａａ２１−３６７）への結合性を試験した。
【０２５６】
本発明の２つの抗体（ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３）を、６つの比較用抗ＩＬ１ＲＡＰモノクローナル抗体（ＣＡＮ０２、ＣＡＮ０７、ＣＡＮ０８、ＣＡＮ０９、Ｒ＆ＤによるＭａｂ６７６、及びポリクローナル抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体（ＫＭＴ−１）と併せて試験した。
【０２５７】
結果＆結論
驚くべきことに、試験した比較用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体のいくつかはカニクイザルＩＬ１ＲＡＰと交差反応しないことが見出された（それらの中でも、Ｒ＆Ｄによる市販の参照抗体ｍＡｂ６７６、表４）。
【表５】
2017530692.tif 000033
【０２５８】
Ｅ．本発明の例示的な抗体によるＩＬ−１シグナル伝達の阻害
（ｉ）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞株における効果
材料＆方法
ＩＬ１ＲＡＰはＩＬ−１受容体複合体の機能的部分であるため、ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体は、ＩＬ−１シグナル伝達も阻害し得る。いくつかの腫瘍細胞型はＩＬ−１を成長因子として用いることが示されているため、これは、抗腫瘍効果を媒介するための重要な追加の機構であり得る。
【０２５９】
潜在的なリード候補抗体がＩＬ−１シグナル伝達を遮断する能力を試験するために、ＩＬ−１依存性レポーター遺伝子アッセイを設けた。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、比色アッセイにより数量化することができるアルカリホスファターゼの放出によってＩＬ−１シグナル伝達に応答する。リード候補の阻害能力を試験するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞を５０  ０００細胞／ウェルで蒔き、ＩＬ−１βでの刺激の３０分前に、被験抗体と共にインキュベートした。次いで、これらの細胞を、放出されるアルカリホスファターゼの量を測定する前に、３７℃で一晩（ｏ／ｎ）インキュベートした。また、追加の刺激の非存在下で、高濃度の抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）の存在下で細胞をインキュベートすることによって、抗体の潜在的な作動性効果を試験した。このように、あらゆるＩＬ−１Ｒ作動性効果がアルカリホスファターゼの放出として記録される。
【０２６０】
本発明の抗体の１つ（ＣＡＮ０３）を、アイソタイプ陰性対照抗体と併せて試験した。
【０２６１】
結果＆結論
図３に示されるように、例示的な抗体ＣＡＮ０３は、ＩＬ−１シグナル伝達の顕著な阻害を誘発した。試験した候補は作動性効果を示さなかった。
【０２６２】
Ｆ．慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株における本発明の例示的な抗体のＡＤＣＣ作用
材料＆方法
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株ＫＵ８１２、ＬＡＭＡ８４、及びＢＶ１７３、または急性転化中のＣＭＬを患う３人の患者からの初代細胞を、インビトロ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて標的細胞として使用した。手短に述べると、標的細胞を、製造業者の指示に従ってＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で標識し、ウェル１つ当たり細胞５，０００〜１０，０００個の密度で９６ウェルプレート内に播種した。その後、本発明の例示的抗体であるＣＡＮ０１、またはアイソタイプ対照抗体を異なる濃度でウェルに加え、１００，０００個のＮＫエフェクター細胞を各ウェルに加える前に３０分間インキュベートした。ＮＫ細胞の陰性細胞単離キットを製造業者の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ）に従って使用することによって、インフォームドコンセント後の健常な志願者からＮＫ細胞を抽出した。非特異性ヒトＩｇＧ１抗体をアイソタイプ陰性対照として実験に使用した（Ｅｕｒｅｋａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州エメリービル）。ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯフローサイトメーター（ＢＤ）を使用した７−ＡＡＤ陽性細胞の検出によって、細胞死の程度を査定した。各実験は、異なるドナーからのＮＫ細胞を用いて少なくとも２回行った。
【０２６３】
結果＆結論
インビトロＡＤＣＣアッセイは、本発明の例示的な抗体であるＣＡＮ０１が、アイソタイプ対照よりも高い程度までＣＭＬ細胞株ＫＵ８１２、ＬＡＭＡ８４、及びＢＶ１７３を殺滅するようＮＫ細胞に指示することを示す（図４Ａ）。ＢＶ１７３標的細胞を使用したＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３の用量滴定は、細胞殺滅に対する効果が用量依存的であり、濃度上昇に伴って細胞殺滅の程度が高まることを示す（図４Ｂ）。急性転化まで進行した慢性骨髄性白血病は、チロシンキナーゼ阻害薬を用いた処置に対して一過性の効果しか示さず、したがって処置上の重大な問題を課す。２人の個別のＣＭＬ急性転化患者からの初代細胞を用いたＡＤＣＣアッセイは、これらの細胞が、ＣＡＮ０１及びＮＫ細胞によって誘発された細胞傷害性に対して感応性であったことを示す（図４Ｃ）。加えて、いくつかのチロシンキナーゼ阻害薬への抵抗性を生じさせるＴ３１５Ｉ変異を宿した第３のＣＭＬ急性転化患者からの初代細胞は、同様の感応性を示す（図４Ｄ）。まとめると、これらの実験は、ＣＡＮ０１が、ＣＭＬ細胞株ならびに初代急性転化ＣＭＬ細胞の特異的細胞殺滅をＮＫ細胞に指示する能力を有すること、ならびに、ＣＡＮ０１により誘発される細胞傷害効果が用量依存的であることを示す。
【０２６４】
Ｇ．メラノーマ細胞株における本発明の例示的な抗体のＡＤＣＣ作用
材料＆方法
悪性メラノーマ細胞株ＳＫＭＥＬ−５を、インビトロ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイでの標的として使用した。手短に述べると、標的細胞を、製造業者の指示に従ってＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で標識し、ウェル１つ当たり細胞５，０００〜１０，０００個の密度で９６ウェルプレート内に播種した。その後、被験抗体またはアイソタイプ対照抗体異なる濃度でウェルに加え、１００，０００個のＮＫエフェクター細胞を各ウェルに加える前に３０分間インキュベートした。ＮＫ細胞の陰性細胞単離キットを製造業者の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ベルギッシュグラートバッハ、ドイツ）に従って使用することによって、インフォームドコンセント後の健常な志願者からＮＫ細胞を抽出した。非特異性ヒトＩｇＧ１抗体を対照として実験に使用した（Ｅｕｒｅｋａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州エメリービル）。ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯフローサイトメーター（ＢＤ）を使用したＰＫＨ２６陽性細胞内の７−ＡＡＤ陽性の検出によって、細胞死の程度を査定した。各実験は、異なるドナーからのＮＫ細胞を用いて少なくとも２回行った。
【０２６５】
結果＆結論
インビトロＡＤＣＣアッセイは、ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３が、対応するアイソタイプ対照よりも大幅に高い程度のＳＫＭＥＬ−５細胞株の殺滅をＮＫ細胞に指示することを示した（図５）。
【０２６６】
Ｈ．本発明の例示的な抗体の内部移行
材料＆方法
細胞及び培養条件：急性転化中の慢性骨髄性白血病を患う患者から確立された細胞株であるＬＡＭＡ−８４細胞を、ＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から取得し、供給業者の推奨に従って培養した。手短に述べると、１０％のＦＢＳ、１％のグルタミン、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０内で、５％  ＣＯ２、３７℃において細胞を培養した。細胞培養物を、２〜３日毎に０．５×１０６細胞／ｍｌの密度に分割した。細胞は、ＤＳＭＺから受領した後、最大１２継代まで使用した。
【０２６７】
浮遊細胞株ＬＡＭＡ−８４からの細胞を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗浄し、５％のヒトＡＢ＋血清（Ｓｉｇｍａ製）を補充したＰＢＳ−ＢＳＡ中に再懸濁させ、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）標識ＩＬ−１ＲＡＰ選択性抗体ＣＡＮ０１、ＣＡＮ０３、または同アイソタイプの対照抗体を、１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。細胞を氷上または３７℃に２時間または１６時間置いた（インキュベートした）。
【０２６８】
共焦点顕微鏡法（ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ  Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡）を用いた画像分析では、細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で２回洗浄し、手短にスピンダウンし、続いて（ＰＢＳ中）３％のパラホルムアルデヒド固定液中に２０分間（４℃で）再懸濁させた。細胞をスピンダウンし、０．００１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ−ＴＸ）及び核マーカー（ＤＡＰＩ）を含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、ＲＴで５分間インキュベートさせた。短時間の遠心分離の後、細胞をＰＢＳ−ＴＸ中に再懸濁させ、ガラス底の顕微鏡のウェル内に置いた。次いで、細胞を１時間接着させた。細胞の共焦点走査によって画像データを収集し、（核マーカーによって示される）細胞の中心を通る薄い光学切片内のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８蛍光の高解像度画像がもたらされた。細胞膜に結合する抗体及び／または内部移行した抗体のさらなる分析を、ソフトウェア画像分析（Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎ２０１０）によって行った。
【０２６９】
結果＆結論
細胞膜に結合するＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３と、細胞に進入する（「内部移行する」）その能力との構造的関係が、共焦点レーザー走査型顕微鏡法の手段によって記録された高解像度造影データで、またこのデータの画像分析によって実証された。
【０２７０】
画像データ表現は図６に示される。
【０２７１】
Ｉ．本発明の例示的な抗体のインビボの治療効力
材料＆方法
未馴化ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ＭＬＬ／ＡＦ９融合物及び活性化ＮＲＡＳ遺伝子の発現を指示するｃＤＮＡのレトロウイルス組み込みによるヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞の形質転換によって以前に作製された、致死量のＭＡ９Ｒａｓ細胞を移植した。白血病マウスを、ＩＬ１ＲＡＰを標的にする例示的なＣＡＮ０１抗体、または対応するアイソタイプ対照抗体で処置した。これらの抗体を、実験全体にわたって週に２回の腹腔内注入により投与し、第１の処置は移植後３日目に与えた。１０００μｇのボーラスとして与えられた第１回目を除いて、抗体の各用量は５００μｇであった。脊柱後彎、毛並みの乱れ、及び可動性の低下によって判断される、または固形腫瘍に起因する重度の疾患の徴候が現れたら、マウスを屠殺した。
【０２７２】
結果＆結論
免疫不全マウスにヒト白血病細胞を移植し、ＩＬ１ＲＡＰを標的にするモノクローナル抗体であるＣＡＮ０１で処置した。末梢血中の白血病細胞の出現頻度は、移植後３５日目に著しく低減しており、血小板数は、アイソタイプ対照抗体と比較してＣＡＮ０１を与えられたマウスにおいて正常なままであり、より機能的な造血が示された（図７Ａ〜Ｂ）。移植後６２日目に、アイソタイプ処置マウスは、末梢血中の白血病細胞の高い出現頻度を有した（図７Ｃ）。ＣＡＮ０１処置は、脾臓及び骨髄内の白血病細胞の著しい低減をもたらした（図７Ｄ〜Ｅ）。本発明者らは、抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫療法が、ＭＡ９Ｒａｓ異種移植モデルにおいて、末梢血、骨髄、及び脾臓内のヒト白血病を低減させると結論した。これらの結果は、ＡＭＬの新しい有望な治療方針としての抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫療法を支持する。
【０２７３】
Ｊ．本発明の例示的な抗体のインビボの治療効力
材料＆方法
未馴化ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子を宿すＢＶ１７３  ＣＭＬ細胞を移植した。白血病マウスを、ＩＬ１ＲＡＰを標的にする例示的なＣＡＮ０１抗体、または対応するアイソタイプ対照抗体で処置した。これらの抗体を、週に２回、最大１３用量の腹腔内注入により投与し、第１の処置は移植後２日目、最後の処置は４５日目に与えた。１０００μｇのボーラスとして与えられた第１回目を除いて、抗体の各用量は５００μｇであった。脊柱後彎、体重減少、及び可動性の低下によって判断される重度の疾患の徴候が現れたら、マウスを屠殺した。
【０２７４】
結果＆結論
免疫不全マウスにヒトＣＭＬ細胞を移植し、ＩＬ１ＲＡＰを標的にするモノクローナル抗体であるＣＡＮ０１で処置した。アイソタイプ対照を与えられたマウスは、３７日の生存期間中央値（３３〜３８日の範囲）を有したが、ＣＡＮ０１で処置されたマウスは、最後の処置が４５日目に施されたのにもかかわらず、著しく長く生存した（中央値５１日）（図８Ａ）。２匹のＣＡＮ０１処置マウスは、移植後１０１日目の屠殺時に未だ生きており、見かけ上健常であった。ＣＡＮ０１処置は、骨髄内の白血病細胞の著しい低減をもたらした（図８Ｂ）。脾臓では、ＣＡＮ０１で白血病の出現頻度が低減する傾向があった（図８Ｃ）。ＣＡＮ０１で処置されたマウスは、アイソタイプ処置マウスよりも著しく小さな脾臓を有した（図９Ｄ）。本発明者らは、抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫療法がＢＶ１７３異種移植モデルにおいて生存期間を延長させ、ヒト白血病を低減させると結論した。これらの結果は、ＣＭＬの新しい有望な治療方針としての抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫療法を支持する。
【０２７５】
Ｋ．本発明の例示的な抗体のインビボの治療効力
材料＆方法
単核細胞を、診断時にＡＭＬ患者から採取された骨髄吸引液から単離した。これらの細胞を、未馴化ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの静脈内注入によって移植した。移植３日後から始めて、マウスを、抗ＩＬ１ＲＡＰ  ＣＡＮ０１または対応するｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体で処置した。これらの抗体を、実験全体にわたって週に２回の腹腔内注入により投与した。５００μｇのボーラスとして与えられた第１回目を除いて、抗体の各用量は１００μｇであった。マウスを移植２８日後に屠殺し、フローサイトメトリーでＣＤ４５及びＣＤ３３の発現によって検出されるヒト白血病細胞の出現頻度について骨髄を分析した。
【０２７６】
結果＆結論
免疫不全マウスに初代ヒトＡＭＬ細胞を移植し、ＩＬ１ＲＡＰを標的にするモノクローナル抗体であるＣＡＮ０１で処置した。移植２８日後の屠殺時において、骨髄内の白血病細胞の出現頻度は、アイソタイプ対照と比較してＣＡＮ０１では著しく低減していた（０．００１％対０．１２６％、ｐ＜０．０００１；図９）。本発明者らは、抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫療法が、初代ヒトＡＭＬ細胞を移植されたマウスの骨髄内の白血病を低減させると結論した。これらの結果は、ＡＭＬの新しい有望な治療方針としての抗ＩＬ１ＲＡＰ免疫療法を後押しする。
【０２７７】
Ｌ．ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞内のヒトＩＬ−１α媒介性、ＩＬ−１β媒介性、及びＩＬ−３３媒介性シグナル伝達のインビトロＩＬ１ＲＡＰ依存性遮断。抗体ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３の作用強度。
本発明の２つの例示的な抗体（ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３）が、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞を使用したレポーター遺伝子アッセイにおいてＩＬ−１α及びβ依存性シグナル伝達を阻害することができるかどうかを判定するために、以下の実験を行った。
【０２７８】
材料
抗体の調製
本発明の例示的な抗体（ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３）、ならびにアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ２ａ）は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ  ＡＢ（ルンド、スウェーデン）により提供された。
【０２７９】
全ての抗体を、試験のためにＰＢＳ中に希釈した。レポーター遺伝子アッセイの標準溶液、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１βを、最終的なアッセイ濃度における２０倍のＰＢＳ中で作製した。最終的なアッセイ体積は２００μｌ（１０μｌの抗体または希釈剤（ＰＢＳ）＋１８０μｌの細胞＋１０μｌのリガンドを含有する）であった。抗体の最終的なアッセイ濃度は次の通りであった；１００から０．０１ｎＭ（３倍の希釈ステップにおける段階希釈による）。
【０２８０】
ヒトリガンド（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−３３）の調製
ヒトリガンド、ＩＬ−１α。ＩＬ−１β及びＩＬ−３３を、１０μｇ／ｍＬのストック濃度までＰＢＳ中に希釈した。１０μｇ／ｍＬのストック濃度のリガンドを、使用まで−８０℃でアリコート中に保管した。このレポーター遺伝子アッセイでは、０．３ｎｇ／ｍＬの最終濃度（試験前の実験で判定されたこのアッセイにおける最大作用の７０〜８０％をもたらした濃度）でリガンドを使用した。
【０２８１】
最終的なアッセイ濃度へのリガンドの希釈
・リガンドのストック１０μｇ／ｍＬを、１：１００（２μｌ＋１９８μｌの選択培地、以下参照）＝１００ｎｇ／ｍＬに希釈した。
・１００ｎｇ／ｍＬを、１：１６．６７（１５０μｌ＋２３５０．５μｌの選択培地、以下参照）＝６ｎｇ／ｍＬに希釈した。
・６ｎｇ／ｍＬを、アッセイで１：２０；１０μｌのＬＰＳ  ６ｎｇ／ｍＬ＋１９０μｌの細胞及び化合物／ウェルに希釈して、０．３ｎｇ／ｍＬの最終濃度を得た。
【０２８２】
細胞株
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞のＩＬ１ＲＬ１との安定トランスフェクションにより作製されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞を、ＩＬ−３３／ＩＬ−１βセンサー細胞として使用した（カタログ番号ｈｋｂ−ＩＬ−３３、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、米国）。
【０２８３】
方法
研究設計
ＣＡＮ０１、ＣＡＮ０３、及びアイソタイプ対照のストック溶液を、ＰＢＳ中で調製した。レポーター遺伝子アッセイの標準溶液、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１βを、最終的なアッセイ濃度における２０倍のＰＢＳ中で作製した。最終的なアッセイ体積は２００μｌ（１０μｌの抗体または希釈剤（ＰＢＳ）＋１８０μｌの細胞＋１０μｌのリガンドを含有する）であった。抗体の最終的なアッセイ濃度は次の通りであった；１００から０．０１ｎＭ（３倍の希釈ステップにおける段階希釈による）。対照ウェル（刺激／非刺激細胞）において、抗体を１０μｌのＰＢＳと交換した。
【０２８４】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞の培養及び刺激
ＩＬ１ＲＡＰはＩＬ−１受容体複合体の機能的部分であるため、ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体は、ＩＬ−１シグナル伝達を阻害する潜在性を有する。腫瘍細胞は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−３３などのＩＬ１ＲＡＰ依存性リガンドを成長因子として使用することが報告されているため、このシグナルの遮断は、（別々に、またはＡＤＣＣ作用との組み合わせのいずれかで）抗腫瘍効果を媒介するための重要な機構を提供し得る。抗体がＩＬ−１シグナル伝達を遮断する能力を試験するために、ＩＬ−１依存性レポーター遺伝子アッセイを設けた。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、比色アッセイにより数量化することができるアルカリホスファターゼの放出によってＩＬ−１シグナル伝達に応答する。リード候補の阻害能力を試験するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞を５０  ０００細胞／ウェルで蒔き、各リガンドについて０．３ｎｇ／ｍｌの最終濃度におけるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−３３での刺激の４５分前に、被験抗体と共にインキュベートした。抗体の最終的なアッセイ濃度は１００ｎＭから０．０１ｎＭであった。対照ウェルにおいて、抗体をＰＢＳと交換した。これらの細胞を、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（アルカリホスファターゼの検出及び数量化のための培地）により放出されるアルカリホスファターゼの量を測定する前に、３７℃で一晩（ｏ／ｎ）インキュベートした。
【０２８５】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞を解凍し、ＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ（ＨＩ）及びＰＥＳＴ、ならびにＮｏｒｍｏｃｉｎ中で２継代にわたり培養した。２継代後、これらの細胞を、実験前ならびに実験中に少なくとも１継代にわたって上記の培地に添加された選択抗生物質（Ｚｅｏｃｉｎ、ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ、及びブラストサイジン）と共に培養した。ＨｙｇｒｏＧｏｌｄは、細胞株へのＩＬ−１β特異性を維持するために必要とされ、ブラストサイジン及びＺｅｏｃｉｎは、それぞれＩＬ１ＲＬ１及びＳＥＡＰをコードするプラスミドを維持するために必要とされる。これらの実験は、７０％コンフルエンスの細胞で行った。これらの細胞を、２〜３回／週、またはそれらが８０〜９０％コンフルエンスに達したときに分割した。
【０２８６】
リガンドを、３０ｎｇ／ｍｌ〜０．００１ｎｇ／ｍｌの用量範囲内で滴定した。ＩＬ−１シグナル伝達に影響する（アルカリホスファターゼ放出を刺激するか、またはその量を抑制する）抗体能力を試験するための良好なアッセイを作製するためには、用量−応答曲線の線形勾配上に強力なシグナルをもたらした濃度が好ましい。この系では、各リガンドについて０．３ｎｇ／ｍｌの濃度を選択した。２つの個別の実験を、抗体の個別の希釈系列を用いて行った。また、リガンドは各実験のために別々に希釈し、異なる継代からの細胞を使用した。
【０２８７】
結果の評価
次の方程式１を使用して生データを阻害％に変換した。
阻害％＝（１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ））×１００
式中、
Ａ＝添加されるＰＢＳ中に溶解している化合物とのリガンド活性
Ｂ＝陰性対照、リガンドなし、ＰＢＳ（ビヒクル）のみ
Ｃ＝陽性対照、ＰＢＳ（ビヒクル）を含むリガンド、
ＩＣ５０は、最大応答の５０％の阻害をもたらす濃度を表す。
ＥＣ５０は、曲線の上部及び底部に関する計算値に対して５０％の阻害を表す阻害をもたらす濃度を表す。
【０２８８】
結果＆結論
アルカリホスファターゼを放出するように３つの異なるリガンド（ｈＩＬ−１α、ｈＩＬ−１β、及びｈＩＬ−３３）で刺激されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−β細胞のレポーター遺伝子試験系における２つの被験抗体（ＣＡＮ０３及びＣＡＮ０１）の作用を解明するために、実験を設けた。比較対象及び参照として、アイソタイプ対照を使用した。２つの個別の継代から調製された細胞を使用した。全ての実験は、２連の培養物を用いて行った。
【０２８９】
第１の実験では、関連性のある試験系を作製するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−β細胞に対する３つの異なるリガンドの効果を評価した。リガンドを３０ｎｇ／ｍｌから０．００１ｎｇ／ｍｌまで滴定し、この試験系の全てのリガンドに対して適切な濃度として０．３ｎｇ／ｍｌを選択した。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞を、２つの異なる継代から調製した。０．３ｎｇ／ｍｌのリガンドの存在下で１６時間にわたって細胞を刺激し、放出されたアルカリホスファターゼの量を測定するために、その上清を採取し査定した。
【０２９０】
図１０に示されるように、ＣＡＮ０３は、２つの実験における全てのリガンドで、アルカリホスファターゼの放出を阻害することによるＩＬ１ＲＡＰシグナル伝達の阻害効果を示した。ＣＡＮ０３は、ＩＬ−１α媒介性及びＩＬ−１β媒介性シグナル伝達を完全に阻害することができる。ＩＬ−３３誘発性シグナル伝達はＣＡＮ０３によって遮断されるは少なくとも９５％までである。対照的に、ＣＡＮ  ０１及びアイソタイプ対照は、いかなる阻害効果も示さなかった。
【０２９１】
以下の表５は、試験した抗体候補全ての作用強度を要約する。
【表６】
2017530692.tif 000034
【０２９２】
Ｍ．ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞におけるマウスＩＬ−１α媒介性、ＩＬ−１β媒介性、及びＩＬ−３３媒介性シグナル伝達のインビトロＩＬ１ＲＡＰ依存性遮断。抗体ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３の作用強度。
以下の実験は、（ｉ）マウスリガンドがヒト受容体複合体を介してシグナル伝達を刺激することができることを確認するため、及び（ｉｉ）２つの例示的な抗体（ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３）がそのようなシグナルを阻害することができたかどうかを判定するために行った。
【０２９３】
材料
抗体の調製
本発明の例示的な抗体（ＣＡＮ０１及びＣＡＮ０３）、ならびに２つのアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ２ａ及びｈＩｇＧ１／κ）は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ  ＡＢ（ルンド、スウェーデン）により提供された。
【０２９４】
全ての抗体を、試験のためにＰＢＳ中に希釈した。レポーター遺伝子アッセイの標準溶液、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１βを、最終的なアッセイ濃度における２０倍のＰＢＳ中で作製した。最終的なアッセイ体積は２００μｌ（１０μｌの抗体または希釈剤（ＰＢＳ）＋１８０μｌの細胞＋１０μｌのリガンドを含有する）であった。抗体の最終的なアッセイ濃度は次の通りであった；１００から０．０１ｎＭ（３倍の希釈ステップにおける段階希釈による）。
【０２９５】
ヒトリガンド（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−３３）の調製
マウスリガンド、ＩＬ−１α。ＩＬ−１β及びＩＬ−３３を、１０μｇ／ｍＬのストック濃度までＰＢＳ中に希釈した。１０μｇ／ｍＬのストック濃度のリガンドを、使用まで−８０℃でアリコート中に保管した。このレポーター遺伝子アッセイでは、ｍＩＬ−１αについては１０ｎｇ／ｍＬ、ｍＩＬ−１βについては１００ｎｇ／ｍＬ、そしてｍＩＬ−３３については２ｎｇ／ｍＬの最終濃度でリガンドを使用した；これらの濃度は、試験前の実験で判定されたこのアッセイにおける最大作用の７０〜８０％をもたらした。
【０２９６】
最終的なアッセイ濃度へのリガンドの希釈
（ａ）ｍＩＬ−１α、１０ｎｇ／ｍＬ
・リガンドのストック１０μｇ／ｍＬを、１：５０（２０μｌ＋９８０μｌの選択培地、以下参照）＝２００ｎｇ／ｍＬに希釈した
・２００ｎｇ／ｍＬを、アッセイで１：２０；１０μｌのＬＰＳ  ２００ｎｇ／ｍＬ＋１９０μｌの細胞及び化合物／ウェルに希釈して、１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度を得た
（ｂ）ｍＩＬ−１β、１００ｎｇ／ｍＬ
・リガンドのストック１０μｇ／ｍＬを、１：５（２００μｌ＋８００μｌの選択培地、以下参照）＝２０００ｎｇ／ｍＬに希釈した
・２０００ｎｇ／ｍＬを、アッセイで１：２０；１０μｌのＬＰＳ  ２０００ｎｇ／ｍＬ＋１９０μｌの細胞及び化合物／ウェルに希釈して、１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度を得た
（ｃ）ｍＩＬ−３３、２ｎｇ／ｍＬ
・リガンドのストック１０μｇ／ｍＬを、１：２５０（１０μｌ＋２４９０μｌの選択培地、以下参照）＝４０ｎｇ／ｍＬに希釈した
・４０ｎｇ／ｍＬを、アッセイで１：２０；１０μｌのＬＰＳ  ２００ｎｇ／ｍＬ＋１９０μｌの細胞及び化合物／ウェルに希釈して、２ｎｇ／ｍＬの最終濃度を得た
【０２９７】
細胞株
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞のＩＬ１ＲＬ１との安定トランスフェクションにより作製されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞を、ＩＬ−３３／ＩＬ−１βセンサー細胞として使用した（カタログ番号ｈｋｂ−ＩＬ−３３、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、米国）。
【０２９８】
方法
研究設計
ＣＡＮ０１、ＣＡＮ０３、及び２つのアイソタイプ対照のストック溶液を、ＰＢＳ中で調製した。レポーター遺伝子アッセイの標準溶液、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１βを、最終的なアッセイ濃度における２０倍のＰＢＳ中で作製した。最終的なアッセイ体積は２００μｌ（１０μｌの抗体または希釈剤（ＰＢＳ）＋１８０μｌの細胞＋１０μｌのリガンドを含有する）であった。抗体の最終的なアッセイ濃度は次の通りであった；１００から０．０１ｎＭ（３倍の希釈ステップにおける段階希釈による）。対照ウェル（刺激／非刺激細胞）において、抗体を１０μｌのＰＢＳと交換した。
【０２９９】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞の培養及び刺激
ＩＬ１ＲＡＰはＩＬ−１受容体複合体の機能的部分であるため、ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体は、ＩＬ−１シグナル伝達を阻害する潜在性を有する。腫瘍細胞は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−３３などのＩＬ１ＲＡＰ依存性リガンドを成長因子として使用することが報告されているため、このシグナルの遮断は、（別々に、またはＡＤＣＣ作用との組み合わせのいずれかで）抗腫瘍効果を媒介するための重要な機構を提供し得る。抗体がＩＬ−１シグナル伝達を遮断する能力を試験するために、ＩＬ−１依存性レポーター遺伝子アッセイを設けた。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、比色アッセイにより数量化することができるアルカリホスファターゼの放出によってＩＬ−１シグナル伝達に応答する。リード候補の阻害能力を試験するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞を５０  ０００細胞／ウェルで蒔き、最適な刺激をもたらす最終濃度におけるマウスＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−３３での刺激の４５分前に、被験抗体と共にインキュベートした。抗体の最終的なアッセイ濃度は１００ｎＭから０．０１ｎＭであった。対照ウェルにおいて、抗体をＰＢＳと交換した。これらの細胞を、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（アルカリホスファターゼの検出及び数量化のための培地）により放出されるアルカリホスファターゼの量を測定する前に、３７℃で一晩（ｏ／ｎ）インキュベートした。
【０３００】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞を解凍し、ＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ（ＨＩ）及びＰＥＳＴ、ならびにＮｏｒｍｏｃｉｎ中で２継代にわたり培養した。２継代後、これらの細胞を、実験前ならびに実験中に少なくとも１継代にわたって上記の培地に添加された選択抗生物質（Ｚｅｏｃｉｎ、ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ、及びブラストサイジン）と共に培養した。ＨｙｇｒｏＧｏｌｄは、細胞株へのＩＬ−１β特異性を維持するために必要とされ、ブラストサイジン及びＺｅｏｃｉｎは、それぞれＩＬ１ＲＬ１及びＳＥＡＰをコードするプラスミドを維持するために必要とされる。これらの実験は、７０％コンフルエンスの細胞で行った。これらの細胞を、２〜３回／週、またはそれらが８０〜９０％コンフルエンスに達したときに分割した。
【０３０１】
リガンドを、３００ｎｇ／ｍｌ〜０．０１ｎｇ／ｍｌの用量範囲内で滴定した。ＩＬ−１シグナル伝達に影響する（アルカリホスファターゼ放出を刺激するか、またはその量を抑制する）抗体能力を試験するための良好なアッセイを作製するためには、用量−応答曲線の線形勾配上に強力なシグナルをもたらした濃度が好ましい。この系では、ｍＩＬ−１αについては１０ｎｇ／ｍＬ、ｍＩＬ−１βについては１００ｎｇ／ｍＬ、そしてｍＩＬ−３３については２ｎｇ／ｍＬの濃度を選択した。
【０３０２】
結果の評価
次の方程式１を使用して生データを阻害％に変換した。
阻害％＝（１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ））×１００
式中、
Ａ＝添加されるＰＢＳ中に溶解している化合物とのリガンド活性
Ｂ＝陰性対照、リガンドなし、ＰＢＳ（ビヒクル）のみ
Ｃ＝陽性対照、ＰＢＳ（ビヒクル）を含むリガンド、
ＩＣ５０は、最大応答の５０％の阻害をもたらす濃度を表す。
ＥＣ５０は、曲線の上部及び底部に関する計算値に対して５０％の阻害を表す阻害をもたらす濃度を表す。
【０３０３】
結果＆結論
ヒト受容体に対するマウスリガンドのＩＬ１ＲＡＰシグナル伝達の交差反応性を解明するために、実験を設けた。
【０３０４】
第１の組の実験では、３つのマウスリガンドであるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−３３を、ＨＥＫ  Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１βを刺激するそれらの能力について試験した。３つ全てのマウスリガンドが、それらのヒト均等物と比較すると効果は著しく低かったものの、アルカリホスファターゼの放出を刺激することができた。
【０３０５】
この第１の実験では、関連性のある試験系を作製するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−β細胞に対する３つの異なるリガンドの効果も評価した。リガンドを１００ｎｇ／ｍｌから０．００１ｎｇ／ｍｌまで滴定し、ｍＩＬ−１αについては１０ｎｇ／ｍＬ、ｍＩＬ−１βについては１００ｎｇ／ｍＬ、そしてｍＩＬ−３３については２ｎｇ／ｍＬを選択した。効力の低下はＩＬ−１βで最大（約３００倍）、そしてＩＬ−３３で最少（約８倍）であった。
【０３０６】
その後、マウスリガンドにより誘発されるシグナルを阻害する被験抗体の効果を試験した（図１１参照）。比較及び参照として、２つのアイソタイプ対照抗体を使用した（ヒトＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａ）。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＩＬ−３３／ＩＬ−１β細胞を調製した。リガンドの存在下で１６時間にわたって細胞を刺激し、放出されたアルカリホスファターゼの量を測定するために、その上清を採取し査定した。２つの個別の継代から調製された細胞を使用した。全ての実験は、２連の培養物を用いて実施した。
【０３０７】
ＣＡＮ０３は、アルカリホスファターゼの放出によって判定した場合、３つ全てのマウスリガンドによって媒介されるＩＬ１ＲＡＰ依存性シグナル伝達を阻害した。ＣＡＮ０１は、ＩＬ１ＲＡＰ依存性シグナル伝達に対して限定された阻害効果しか有しなかった。アイソタイプ対照のいずれも、いかなる阻害効果も示さなかった。リガンドＩＬ−１β及びＩＬ−３３についての曲線の上部に安定水準がなかったため、ＣＡＮ０１についてはＩＣ５０及びＥＣ５０値を計算することができなかった。
【０３０８】
以下の表６は、試験した抗体候補全ての作用強度を要約する。
【表７】
2017530692.tif 000035
【０３０９】
実施例Ｎ−ＥＬＩＳＡによる競合的結合性の分析
プロトコル
・全ての試料は２連で分析すべきである。
・Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６  Ｍｉｃｒｏ  Ｗｅｌｌ（商標）プレートを、０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に希釈した１００μｌ／ウェルの組換えｈＩＬ１ＲＡＰ  ２１−３６７（１μｇ／ｍｌ）でコーティングする。
・このプレートを４℃で一晩インキュベートする。
・このプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．０１ＭのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）で洗浄する。
・１５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）を添加する。
・このプレートを撹拌しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートする。
・このプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄する。
・試験項目の試料（例えばｍＡｂ１、ｍＡｂ２）をウェルに加える（１００μｌ／ウェル、１０μｇ／ｍｌ）。
・このプレートをＲＴで１時間インキュベートする。
・このプレートをＥＬＩＳＡ洗浄溶液で洗浄する。
・ＣＡＮ０１またはＣＡＮ０３などの参照抗体（１００μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ）の溶液を全てのウェルに加える。
・このプレートをＲＴで１時間インキュベートする。
・このプレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄する。
・アルカリホスファターゼに共役したアルカリウサギ抗マウスＩｇＧに共役した１００μｌ／ウェルの好適な二次抗体を加える（試験項目がヒト抗体である場合、好適な二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（アルカリホスファターゼ抗体、ＳＩＧＭＡ、Ａ１４１８）である）
・このプレートを撹拌しながらＲＴで１時間インキュベートする。
・このプレートを洗浄緩衝液で洗浄する。
・ウェル毎に１００μｌのｐＮＰＰ基質を加える。
（４−ニトロフェニルホスファターゼ二ナトリウム塩六水和物、ＳＩＧＭＡ、１ｍｇ／ｍｌ）。
・このプレートを撹拌しながらＲＴでインキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を３０分間連続して測定する。０分における吸光度がバックグラウンドシグナルと見なされるべきである。
【図１】
2017530692.tif 000056
【図２】
2017530692.tif 000057
【図３】
2017530692.tif 000058
【図４（Ａ）】
2017530692.tif 000059
【図４（Ｂ）】
2017530692.tif 000060
【図４（Ｃ）】
2017530692.tif 000061
【図４（Ｄ）】
2017530692.tif 000062
【図５】
2017530692.tif 000063
【図６（Ａ）】
2017530692.tif 000064
【図６（Ｂ）】
2017530692.tif 000065
【図６（Ｃ）】
2017530692.tif 000066
【図７（Ａ）】
2017530692.tif 000067
【図７（Ｂ）】
2017530692.tif 000068
【図７（Ｃ）】
2017530692.tif 000069
【図７（Ｄ）】
2017530692.tif 000070
【図７（Ｅ）】
2017530692.tif 000071
【図８（Ａ）】
2017530692.tif 000072
【図８（Ｂ）】
2017530692.tif 000073
【図８（Ｃ）】
2017530692.tif 000074
【図８（Ｄ）】
2017530692.tif 000075
【図９】
2017530692.tif 000076
【図１０（Ａ）】
2017530692.tif 000077
【図１０（Ｂ）】
2017530692.tif 000078
【図１０（Ｃ）】
2017530692.tif 000079
【図１１（Ａ）】
2017530692.tif 000080
【図１１（Ｂ）】
2017530692.tif 000081
【図１１（Ｃ）】
2017530692.tif 000082
【配列表】
2017530692000001.app
【国際調査報告】
2017530692.tif 000083
2017530692.tif 000084
2017530692.tif 000085
2017530692.tif 000086
2017530692.tif 000087