(57)【要約】  放射性細菌、特に放射性リステリア−３２Ｐを作製する方法が提供される。組成物及びその使用方法も提供される。
2017533241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の培養物を得ること、前記細菌を生理食塩水ベースの溶液で５〜６０分間にわたり飢餓させること、及び続いて放射性核種を含む培地で５〜２４０分間にわたり前記細菌を成長させて、放射性細菌を作製することを含む、放射性細菌を作製するための方法。
【請求項２】
前記放射性核種を含む培地では、３２Ｐが添加された培地であって、その他の場合にホスフェートを含まない培地で前記細菌が成長される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が弱毒化されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記放射性核種が３２Ｐである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、前記放射性核種を含む培地で５０〜７０分間にわたり成長される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が、前記放射性核種を含む培地で６０分間にわたり成長される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
続いて前記放射性細菌を洗浄し、且つそれを回収することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象の腫瘍を処置するか、又は対象の腫瘍の転移を軽減若しくは防止する方法であって、前記対象の前記腫瘍を処置するか、又は前記対象の前記腫瘍の転移を軽減若しくは防止するのに有効な量の、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって作製される放射性細菌を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記放射性細菌が作製される前記細菌が、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記放射性細菌が作製される前記細菌が、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ビブロ・コレラ（Ｖｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｍｕ  ｂｒｅｖｅ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記放射性細菌が前記対象に全身投与される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記放射性細菌が前記対象の前記腫瘍に局所投与される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記放射性細菌が前記対象の前記腫瘍に注射される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が膵臓腫瘍である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が、卵巣、子宮、頸部、頭部、乳房、前立腺、肝臓、肺、腎臓、ニューロン、グリア、結腸、精巣、若しくは膀胱の腫瘍であるか、又は肝細胞癌である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が手術不可能な腫瘍である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
投与される放射性細菌の量が１〜５００ｍＣｉの放射線量を提供する、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与される放射性細菌の量が１〜５ｍＣｉの放射線量を提供する、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象の腫瘍の処置用である、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象の腫瘍の転移の軽減又は防止用である、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連出願の相互参照
本出願は、参照によりその内容が本明細書に組み入れられる２０１４年１１月４日出願の米国仮特許出願第６２／０７４，７０２号明細書の利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
本出願において、様々な刊行物はカッコ内の番号で示される。これらの参考文献の完全な引用は、本明細書の最後で確認することができる。これらの刊行物の開示、並びに本明細書で言及される全ての文献、特許、及び特許出願公開の開示は、本発明が属する技術分野をより詳細に説明するために、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００３】
膵臓癌と同義語である膵管腺癌は、癌による死亡原因の第４位である。「サイレントキラー」は、原発腫瘍を検出できる前のその転移挙動（３）によって特徴付けられ、この場合、僅か４％の５年生存率となる。現在の癌処置、即ち、外科手術、これに続く放射線及び／又は化学療法は転移に対して効果がない。ゲムシタビン及びエルロニチブは、膵臓癌の処置用のＦＤＡ認証薬であり、進行期の患者で平均生存期間を約６か月のみ改善し（１〜３）、膵臓癌に新たな代替の療法が必要であることを強調している。１つのこのようなアプローチは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を用いる癌療法であり得る。
【０００４】
本研究室は、高度に弱毒化されたリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａａｔ）が、特に転移癌に有用な治療アプローチを提供することを見出した。骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答を強力に抑制し、且つ血管形成を促進し（４〜１０）、これにより転移が起こるため、通常、癌ワクチン療法において大きい問題である。しかしながら、Ｌｉｓｔｅｒｉａａｔに感染すると、ＭＤＳＣは、それらの免疫抑制性によって免疫クリアランスからＬｉｓｔｅｒｉａａｔを保護し（非特許文献１）、Ｌｉｓｔｅｒｉａａｔを腫瘍微小環境に安全に送達し、そこでＬｉｓｔｅｒｉａａｔが腫瘍細胞に感染して、高レベルの活性酸素種（ＲＯＳ）によってこの腫瘍細胞を死滅させる（１１）。また、感染腫瘍細胞がＬｉｓｔｅｒｉａａｔ抗原を提示するため、Ｌｉｓｔｅｒｉａａｔ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）も腫瘍細胞を死滅させる（１１）。重要なことに、免疫抑制がない正常組織では、Ｌｉｓｔｅｒｉａａｔがマクロファージ、ＮＫ細胞、及びＣＴＬによって速やかに除去され（１１、１２）、これにより、このような処置がヒトでの使用でも安全になる。
【０００５】
標的放射性核種療法は、いくつかの種類の癌の処置で成功することが証明され、放射線標識小分子、モノクローナル抗体、ペプチド、及び他の腫瘍標的ビヒクルを利用する（１３）。放射性核種によって放出される放射性粒子は、癌性細胞を物理的に破壊し、このような治療は、多剤耐性機構にさらされない。放射線標識腫瘍特異的抗体（Ａｂ）（放射免疫療法）の形態の標的放射性核種療法を膵臓癌の処置に利用する試みも存在した。しかしながら、膵臓癌の放射免疫療法は、臨床前（１４〜１６）及び切除不能肝臓転移の癌患者（１７）の両方でごく控えめな結果のみを示した。標的ビヒクルの新たな選択が標的放射性核種療法を膵臓癌の処置で成功させるために必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４−０４１７３７９−Ａ１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈａｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
放射線標識抗体を含む細菌での療法が実証されたが（例えば、参照により本明細書に組み入れられる（特許文献１）を参照されたい）、よりシンプルでより効果的且つ経済的な放射性細菌を作製するための方法が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、よりシンプルでより効果的且つ経済的な放射性細菌を作製するための方法を提供することにより、新たな標的癌療法の要望に対応する。
【００１０】
放射性細菌を作製するための方法が提供される。一実施形態では、この方法は、細菌の培養物を得ること、前記細菌を生理食塩水ベースの溶液で５〜６０分間にわたり飢餓させること、及び続いて放射性核種を含む培地で５〜２４０分間にわたり細菌を成長させて、放射性細菌を作製することを含む。
【００１１】
また、対象の腫瘍を処置するか、又は対象の腫瘍の転移を軽減若しくは防止する方法が提供され、この方法は、対象の腫瘍を処置するか、又は対象の腫瘍の転移を軽減若しくは防止するのに有効な量の、本明細書に開示されるいずれかの方法によって作製される放射性細菌を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】３２Ｐのリステリアへの組み込み：リステリア細菌を生理食塩水で３０分間にわたり飢餓させ、続いてホスフェートを含まない培地（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｆｒｅｅ）で１時間にわたり培養し、次いで洗浄し、且つ注射のために生理食塩水中に再懸濁する（１０７／２００μｌ）。再現性のためにｘ軸に示されているようにこの実験を繰り返した。
【図２】リステリア−３２Ｐの生存率：３２Ｐのリステリアへの組み込み後、リステリアの生存率を未処置リステリアと比較した（リステリア−３２Ｐの生存率／未処置リステリアの生存率×１００％）。ｘ軸で示されているようにこの実験を数回繰り返した。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表している。
【図３】図３Ａ−３Ｂ：腫瘍細胞の感染率：４Ｔ１腫瘍細胞のリステリア−３２Ｐ（ＬＭ−Ｐ３２）での感染を未処置リステリア（ＬＭ）と比較した（Ａ）。感染の１時間後の１ウェルのＣＦＵの数。ｘ軸に示されているようにこの実験を数回繰り返した。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表している。感染率はＰａｎｃ−０２細胞でも試験した（Ｂ）。
【図４】放射能カウントの正常組織への組み込み：リステリア−３２Ｐでの処置の最後にマウスを安楽死させ、シンチレーションカウンターを用いて放射能カウントについて組織を分析し、既知の量（μＣｉ）の３２Ｐでの標準曲線を用いてμＣｉを正規化した。３２Ｐのみが骨髄（ＢＭ）細胞に強く組み込まれたが、リステリアに組み込まれた３２Ｐは強く組み込まれなかった。
【図５】Ｐａｎｃ−０２モデルでのリステリア−３２Ｐの有効性の研究：Ｃ５７Ｂ１６マウスに、哺乳動物の脂肪体に入れられた２×１０６Ｐａｎｃ−０２腫瘍細胞を投与し、３日後から、このマウスを３日ごとに２０日目までリステリア−３２Ｐ（１０７ＣＦＵ）で（腹腔内）処置した。全てのマウスを２１日目に安楽死させ、転移の数及び腫瘍の重量について分析した。全ての未処置マウスは、２１日目以内に哺乳動物の脂肪における小さい原発腫瘍、肝臓及び他の臓器における転移、並びに腹膜腔内における腹水が起きた。１群当たりＮ＝５のマウス。２つの実験を表している。５匹のマウスのうちの４匹は癌に罹患しなかった。マンホイットニー、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。転移は特に肝臓に見られる。
【図６】リステリア−３２Ｐは、Ｐａｎｃ−２モデルの肝臓転移をほぼ完全に消失させる。
【図７】リステリアの膵臓腫瘍、転移、及び正常組織への侵入。膵臓腫瘍の６か月齢及び４か月齢のＫＰＣマウス（２匹のマウスのうちの１匹には転移もある）に１０７ＣＦＵのリステリアを注射し、翌日にリステリア細菌のＣＦＵ数について分析した。組織をつや消し対物スライド間で柔らかくし、水中で溶解し、及び寒天にプレーティングする。リステリア細菌は、腫瘍及び転移、並びに膵臓で主に見られた（膵臓組織は、膵臓腫瘍から肉眼的に分離することができなかった）。骨髄では細菌が全く見られなかったことに留意されたい。
【図８】３２Ｐの生体内分布  −  Ｐａｎｃ−０２腫瘍及び転移を有するマウスに１０７のリステリア−３２Ｐを１回注射し、様々な時間間隔（１時間、４時間、２４時間、４８時間、及び９６時間）で原発腫瘍、転移、及び様々な正常組織における放射能カウント数について分析した。図示されているように、３２Ｐは、特に注射の１時間後及び４時間後に転移部及び腫瘍で最も高く、注射の２４時間後、４８時間後、及び９６時間後には３２Ｐのレベルが低下したが、正常細胞と比較すると著しく高いままであった。転移が既に肝臓に広がっていたため、この臓器は例外であった。
【図９】線量制限毒性（ＤＬＴ）の研究  −  様々な線量のリステリア−３２Ｐを、癌が存在しないＣ５７Ｂ１６マウスに注射し、その後、５日間にわたって生存期間を決定した。ここで図示されているように、１０７ＣＦＵは最適な線量であったが、１０８ＣＦＵのマウスは１日目以降に死亡し、これは、リステリアのみで公表されたＬＤ５０＝１０８に一致している。これらの結果は、１回の投与で１μＣｉの放射能を送達する１０７ＣＦＵの線量が非毒性であることを示唆している。これは、たとえ１２回の１０７ＣＦＵのリステリア−３２Ｐが注射されたマウスでも副作用がないことを立証した病理学報告書によっても裏付けられている。
【図１０】定着腫瘍及び転移に対するリステリア−３２Ｐの効果  −  定着腫瘍（０．５〜１ｃｍ）及び転移に対するリステリア−３２Ｐ及び生理食塩水で研究が行われた。簡単に述べると、３回のサイクルの１０７ＣＦＵのリステリア−３２Ｐを連続して４日投与し、続いて各サイクル間に３日の休息期間を設けた（合計１２回の投与）。前の実験とは対照的に、第１の処置は、３日目ではなく１０日目に開始した。ここで図示されているように、リステリア−３２Ｐの処置は、腫瘍及び転移の両方を強力に消失させた。分散分析＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５は有意である。
【図１１】血清中のリステリア−３２Ｐの解離度（dissociation grated）  −  血清中のリステリア−３２Ｐの安定性を、リステリア−３２Ｐを血清と共に３７℃でインキュベートすることによって分析した。０時間後、１時間後、２時間後、及び３時間後にＲＬ細菌を遠心分離機にかけ、及び上清を放射能カウントについて分析した。リステリア−３２Ｐ複合体の解離度（パーセント）を、上清中の遊離放射能をペレット化細菌中の放射能で除した値に１００％を乗じることによって決定した。図示されているデータは２つの実験の平均である。エラーバーはＳＥＭを表している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
癌の処置のために３２Ｐを弱毒化リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に組み込むためのプロトコルの開発：このプロトコルで作製されるリステリア−３２Ｐは、膵臓癌に非常に有効である（リステリア−３２Ｐで処置されたマウスの８０％で癌が消失した）ことが分かった。これは、膵臓癌が処置するのが極端に困難であるために重要である。ここで、最適な組み込みプロトコルが開示され、このプロトコルは、一実施形態では、まずリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を生理食塩水で３０分間にわたり飢餓させ、続いて、３２Ｐが添加されたホスフェートを含まない（phosphate-free）培地で細菌を６０分間にわたり成長させ、続いて洗浄ステップが行われ、したがってリステリア−３２Ｐは注入できる状態である。これは、膵臓（及び他の転移）癌の処置用の放射性リステリアを作製するための極めて単純且つ安価な方法である。
【００１４】
放射性細菌を作製するための方法が提供され、この方法は、細菌の培養物を得ること、前記細菌を生理食塩水ベースの溶液で５〜６０分間にわたり飢餓させること、及び続いて放射性核種を含む培地で５〜２４０分間にわたり細菌を成長させて、放射性細菌を作製することを含む。
【００１５】
一実施形態では、細菌を成長させる放射性核種を含む培地は、３２Ｐが添加された培地であって、他の場合にホスフェートを含まない培地である。
【００１６】
一実施形態では、細菌は弱毒化される。一実施形態では、細菌は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。一実施形態では、放射性細菌が作製される細菌は、任意の適切なグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌、例えば、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）である。
【００１７】
一実施形態では、放射性核種は３２Ｐである。
【００１８】
一実施形態では、細菌は、放射性核種を含む培地で５０〜７０分間にわたり成長される。一実施形態では、細菌は、放射性核種を含む培地で６０分間にわたり成長される。一実施形態では、この方法は、続いて放射性細菌を洗浄し、且つその放射性細菌を回収することを更に含む。
【００１９】
また、対象の腫瘍を処置するか、又は対象の腫瘍の転移を軽減若しくは防止する方法が提供され、この方法は、対象の腫瘍を処置するか、又は対象の腫瘍の転移を軽減若しくは防止するのに有効な量の、本明細書に開示される任意の方法によって作製される放射性細菌を対象に投与することを含む。
【００２０】
一実施形態では、放射性細菌が作製される細菌は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。一実施形態では、放射性細菌が作製される細菌は、任意の適切なグラム陽性又はグラム陰性細菌、例えば、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）である。
【００２１】
一実施形態では、放射性細菌は対象に全身投与される。
【００２２】
一実施形態では、放射性細菌は対象の腫瘍に局所投与される。
【００２３】
一実施形態では、放射性細菌は対象の腫瘍に注射される。
【００２４】
一実施形態では、この腫瘍は膵臓腫瘍である。
【００２５】
一実施形態では、この腫瘍は、卵巣、子宮、頸部、頭部、乳房、前立腺、肝臓、肺、腎臓、ニューロン、グリア、結腸、睾丸、若しくは膀胱の腫瘍であるか、又は肝細胞癌である。
【００２６】
一実施形態では、この腫瘍は手術不可能な腫瘍である。一実施形態では、この腫瘍は末期の腫瘍である。一実施形態では、この腫瘍は定着腫瘍である。一実施形態では、この腫瘍は３期の腫瘍である。一実施形態では、この腫瘍は４期の腫瘍である。一実施形態では、この腫瘍は切除不可能である。
【００２７】
一実施形態では、投与される放射性細菌の量は、１〜５００ｍＣｉの放射線量を提供する。一実施形態では、投与される放射性細菌の量は、１〜５ｍＣｉの放射線量を提供する。
【００２８】
一実施形態では、この方法は、対象の腫瘍を処置するものである。
【００２９】
一実施形態では、この方法は、対象の腫瘍の転移を軽減又は防止するものである。
【００３０】
好ましい一実施形態では、本明細書に記載される本発明の細菌は弱毒化される。弱毒化細菌は、その野生型と比較してその病原性を低減するように処置された細菌である。例えば、細菌は、この細菌のゲノム中の遺伝子のサイレンシングにより、又はこの細菌の遺伝子操作により弱毒化することができる。好ましい一実施形態では、本明細書に記載の本発明の細菌は分離又は精製される。
【００３１】
本発明は、膵臓癌（ほぼ常に転移の形態で検出される）のような、事実上有効な処置のない種類の癌、卵巣癌、腫瘍の位置（頭部及び頸部の癌ではよくある）のために原発腫瘍を除去する外科手術が選択肢とならない癌、手術不可能な肝細胞癌、並びに標準的な処置では再発する又は難治性である転移性疾患（非限定の例として、肺癌及び結腸癌、並びに乳癌が挙げられる）に特に有用である。
【００３２】
特に、膵臓癌を処置するための本明細書に開示される放射性細菌の使用に関して、腹腔内の空洞部への投与は、腹膜腔がＭＤＳＣを含む腹水で満たされているため、最適であると思われる。これらのＭＤＳＣは、リステリア−３２Ｐを腫瘍及び転移部に送達する。膵臓癌は転移によりほぼ死に至る。
【００３３】
本明細書で使用される腫瘍を「処置する」は、疾患の１つ以上の症状、例えば、腫瘍自体、転移自体、腫瘍の血管形成、又は疾患が特徴付けられる他のパラメーターが軽減されるか、改善されるか、防止されるか、寛解の状態に置かれるか、又は寛解の状態に維持されることを意味する。腫瘍を「処置する」はまた、腫瘍の１つ以上の顕著な特徴が処置によって無くなり得るか、軽減され得るか、又は抑制され得ることを意味する。このような顕著な特徴の非限定の例としては、基底膜及び隣接した細胞外マトリックスの制御されないの分解、遊走、分裂、及び内皮細胞の新たな機能性毛細血管への組織化、並びにこのような機能性毛細血管の残存が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される「手術不可能な腫瘍」という用語は、医師によって当技術分野で一般的に使用される用語である。手術不可能な腫瘍は、一般的には、アクセスできない場所（例えば、機械的にアクセス不可能な脳の部分）に位置する腫瘍であるか、又は全てを除去することができない複数の腫瘍から構成された腫瘍である。
【００３５】
本明細書で使用される、腫瘍の転移を軽減又は防止することは、疾患の症状のいずれか、例えば、転移、腫瘍の拡散の程度、転移部の血管形成、又は疾患が特徴付けられる他の因子が軽減されるか、改善されるか、防止されるか、寛解の状態に置かれるか、寛解の状態に維持されるか、又は無くなることを意味する。
【００３６】
本明細書で使用される「放射性核種」は、ある元素のラジオアイソトープを意味する。細菌、例えば、リステリアが含む特定のラジオアイソトープの選択は、処置するべき腫瘍の種類及び体内でのその位置によって決定される。３２Ｐが好ましい。組織及び半減期におけるラジオアイソトープ−放射範囲の選択では、２つの特徴が重要である。好ましい一実施形態では、ラジオアイソトープはβ放射体である。β放射体の例としては、１８８−レニウム（半減期１６．７時間）、９０−イットリウム（半減期２．７日）、３２−リン（半減期１４．３日）、４７−スカンジウム（半減期３．４日）、６７−銅（半減期６２時間）、６４−銅（半減期１３時間）、７７−ヒ素（半減期３８．８時間）、８９−ストロンチウム（半減期５１日）、１０５−ロジウム（半減期３５時間）、１０９−パラジウム（半減期１３時間）、１１１−銀（半減期７．５日）、１３１−ヨウ素（半減期８日）、１７７−ルテチウム（半減期６．７日）、１５３−サマリウム（半減期４６．７時間）、１５９−ガドリニウム（半減期１８．６時間）、１８６−レニウム（半減期３．７日）、１６６−ホルミウム（半減期２６．８時間）、１６６−ジスプロシウム（半減期８１．６時間）、１４０−ランタン（半減期４０．３時間）、１９４−イリジウム（半減期１９時間）、１９８−金（半減期２．７日）、及び１９９−金（半減期３．１日）が挙げられる。好ましい一実施形態では、β放射ラジオアイソトープは、高エネルギーβ放射体１８８−レニウム（Ｅｍａｘ＝２．１２ＭｅＶ）である。１８８Ｒｅは、例えば、処置の進捗及び放射性細菌、例えば放射性リステリアの局在化の成功を評価するための、イメージングに使用することができるγ線を放射するという更なる利点を有する。長寿命アイソトープ、例えば、９０−イットリウム（半減期２．７日）、１７７−ルテチウム（半減期６．７日）、又は１３１−ヨウ素（半減期８日）を使用することもできる。陽電子放射体、例えば、６８−ガリウム（半減期６８分）、１８−フッ素（半減期１１０分）、及び６１−銅（半減期３．４時間）を使用して、膿瘍及び播種性疾患を処置することもできる。加えて、オージェ電子放射体及び／又は転換電子放射体であるラジオアイソトープを使用することができるが、このようなラジオアイソトープは、リステリアによって内部に取り込まれる抗体型に結合する必要がある。オージェ電子放射体の例としては、６７−ガリウム（半減期７８時間）、１１１−インジウム（半減期２．８日）、１２３−ヨウ素（半減期１３時間）、１２５−ヨウ素（半減期６０日）、及び２０１−タリウム（半減期３日）が挙げられる。転換電子放射体の例としては、１１７ｍ−錫（半減期１３．６日）が挙げられる。オージェ電子及び転換電子の両方を放射するラジオアイソトープの例としては、１９５ｍ−水銀（半減期４１．６時間）及び１９５ｍ−プラチナ（半減期４日）が挙げられる。このようなラジオアイソトープは、抗リステリア抗体に結合させてリステリア細菌と共にインキュベートする必要があり、これにより、アイソトープに結合した抗リステリア抗体とリステリア細菌との間の安定した結合が得られる。本発明は、この方法の改善である。
【００３７】
α放射体は、β放射体と比較して短い放射範囲を有し、体内又は血液中に広がっている腫瘍又は癌の処置に好ましいであろう。α放射体の例としては、２１３−ビスマス（半減期４６分）、２２３−ラジウム（半減期１１．３日）、２２４−ラジウム（半減期３．７日）、２２５−ラジウム（半減期１４．８日）、２２５−アクチニウム（半減期１０日）、２１２−鉛（半減期１０．６時間）、２１２−ビスマス（半減期６０分）、２１１−アスタチン（半減期７．２時間）、及び２５５−フェルミウム（半減期２０時間）が挙げられる。好ましい一実施形態では、α放射ラジオアイソトープは、２１３−ビスマスである。２１３Ｂｉは、Ｅ＝５．９ＭｅＶ、組織の経路長が５０〜８０μｍの高ＬＥＴα粒子を放射する。理論的には、細胞は、１つ又は２つのα粒子の衝突によって殺すことができる。２１３Ｂｉは、現在、発生装置（generator）の形態で利用可能であり、このアイソトープの供給源から米国及び外国の臨床施設に輸送することが可能である。
【００３８】
ラジオアイソトープの線量は、腫瘍の局在化、腫瘍の重症度、放射性細菌、例えば、放射性リステリアの投与方法（局所又は全身）、及びラジオアイソトープの崩壊図式によって異なり得る。重要な臓器に対して放射毒性を与えることなく、腫瘍を著しく減少させるか、又は除去することができる線量を計算するために、放射性細菌、例えば放射性リステリア、診断ラジオアイソトープ、又は低活性の治療用ラジオアイソトープを用いた患者の診断スキャンは、核医学で慣習であるように治療前に行うことができる。線量測定計算は、診断スキャンのデータを用いて行うことができる。
【００３９】
放射性細菌、例えば、放射性リステリアの分割線量又は単一線量を使用することができるが、分割線量は、正常な臓器への放射毒性が低いため、腫瘍に対して好ましいであろう。患者の状態及び第１の処置の有効性により、処置は、１回の線量又は数回の続く分割線量から構成することができる。
【００４０】
一実施形態では、対象はヒトであり、放射性細菌、例えば放射性リステリア−３２Ｐによって送達されるラジオアイソトープの線量は、１〜５ｍＣｉである。異なる実施形態では、放射性細菌、例えば放射性リステリアによって送達されるラジオアイソトープの線量は、１〜１００ｍＣｉ、１０１〜２００ｍＣｉ、２０１〜３００ｍＣｉ、３０１〜４００ｍＣｉ、又は４０１〜５００ｍＣｉである。
【００４１】
本明細書で述べられる放射性細菌療法、例えば放射性リステリア療法は、単独で、又はアジュバントと共に、又は別の抗癌剤と組み合わせて、一定期間にわたって対象に投与することができる。一実施形態では、抗癌剤は化学療法薬である。
【００４２】
放射性細菌、例えば放射性リステリアは、抗腫瘍療法のために当技術分野で公知の任意の方式で投与することができる。本明細書に記載の活性化合物の任意の許容され得る投与経路を使用することができる。例えば、経口投与、舌投与、舌下投与、口腔投与、非経口投与、口内投与、クモ膜下投与、脳室内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、又は経鼻投与を、当技術分野で周知の手段によって過度の実験なしで行うことができる。
【００４３】
例えば、静脈注射、筋肉注射、髄腔内注射、又は皮下注射などによる非経口投与では、投与は、放射性細菌、例えば放射性リステリア、又は本発明のこのような放射性リステリアを含む化合物を溶液又は懸濁液に含めることによって達成することができる。このような溶液又は懸濁液としては、滅菌希釈剤、例えば注射用の水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、及び他の媒質（但し、放射性細菌、例えば放射性リステリアの生存に適合性であることが条件である）も挙げることができる。緩衝液、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、又はリン酸緩衝液、及び張性を調整するための作用物質、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースも、放射性細菌、例えば放射性リステリアの生存に適合性である程度まで添加することができる。非限定の例では、非経口製剤をアンプル、使い捨てシリンジ、又は複数回投与バイアル内に封入することができる。
【００４４】
放射性細菌、例えば放射性リステリアは、放射性細菌の生存に適合した薬学的に許容され得る担体に会合させる（associated with）ことができ、これにより、医薬組成物を構成する。この医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体中に放射性細菌を含み得る。別法では、医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体中の放射性細菌から実質的になり得る。更なる別法では、医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体中の放射性細菌からなり得る。薬学的に許容され得る担体は、放射性細菌に適合性でなければならず、対象に対して過度に有害であってはならない。担体の選択は、投与方法によって異なる。
【００４５】
対象は哺乳動物であり得る。異なる実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ウシ、去勢ウシ、雄ウシ、家畜、霊長類、サル、又は好ましくはヒトである。
【００４６】
本明細書に記載の様々な要素の全ての組み合わせは、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈に明確に矛盾しない限り、本発明の範囲内である。
【００４７】
本発明は、以下の実験の詳細からより良く理解されるであろう。しかしながら、当業者であれば、考察した特定の方法及び結果が、以降の特許請求の範囲により完全に記載されるように、本発明の単なる例示であることが容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００４８】
ここで、３２Ｐの弱毒化リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）への組み込みのプロトコルが開示される。本明細書に開示のプロトコルによって３２Ｐが組み込まれる弱毒化リステリアを、ヒト臨床検査で試験した（Ｍａｃｉａｇ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：３９７５−３９８３）。プロトコルの開発は、以下の基準を分析することを含む：３２Ｐのリステリアへの組み込み率、リステリアのみと比較したリステリア−３２Ｐの生存率、リステリアのみと比較したリステリア−３２Ｐの腫瘍細胞への感染率、３２Ｐの正常組織への組み込み、リステリア−３２Ｐの毒性、膵臓モデル（Ｐａｎｃ−０２モデル）におけるリステリア−３２Ｐの有効性、及びＫＰＣモデルにおける膵臓腫瘍へのリステリアの侵入。
【００４９】
３２Ｐのリステリアへの組み込み：３２Ｐのリステリアへの組み込みでは、まず、細菌を生理食塩水で飢餓させ、次いで３２Ｐが添加されたホスフェートを含まない培地で培養した。様々な飢餓時間（３０分、６０分、１２０分）、組み込み時間（３０分、６０分、１２０分）、及び３２Ｐの量（１０μＣｉ、５０μＣｉ、１００μＣｉ、３００μＣｉ）を試験した。生理食塩水での３０分の飢餓時間を使用し、これに続くホスフェートを含まない酵母培地での６０分の培養は、０．５×１０９ＣＦＵのリステリア及び５０μＣｉの３２Ｐの最良の結果をもたらすことが分かった。このプロトコルを用いると、全ての３２Ｐの９３％が高い再現性でリステリアに組み込まれた（図１）。
【００５０】
リステリア−３２Ｐの生存率：３２Ｐのリステリアへの組み込みを行っている間に、３２Ｐがリステリアの生存率に影響を与えたか否かについて実験的に試験した（Ｑｕｉｓｐｅ−Ｔｉｎｔａｙａ  ｅｔ  ａｌ，２０１３ｂ）。このために、未処置リステリア及び３２Ｐが組み込まれたリステリアの連続希釈を寒天プレートで行って、翌日に両方の生きているリステリアのＣＦＵの数を決定した（図２）。
【００５１】
リステリア−３２Ｐの感染率：リステリア−３２Ｐでの腫瘍細胞の感染率を、既に述べられたように（Ｑｕｉｓｐｅ−Ｔｉｎｔａｙａ  ｅｔ  ａｌ，２０１３ｂ）、腫瘍細胞をリステリア又はリステリア−３２Ｐと共に２時間培養し、次いで水中で溶解し、寒天にプレーティングすることによって決定した。翌日に、生きているリステリアのＣＦＵの数を決定した（図３）。
【００５２】
３２Ｐの正常組織への組み込み：単一化合物としてリステリア又は３２Ｐによって膵臓癌のマウスに送達される３２Ｐの生体内分布の両方を処置の最後に分析した。骨髄（ＢＭ）に組み込まれた３２Ｐのレベルが、リステリア−３２Ｐと比較すると、３２Ｐのみで処置された後に著しく高いことが見出された（図４）。これは、安全の観点から重要な結果である。
【００５３】
リステリア−３２Ｐの毒性：リステリア３２Ｐの影響を、リステリア−３２Ｐでの処置の直後及び処置の１か月後に病理学検査によって肝臓、腎臓、骨髄、骨、及び小腸で分析し、生理食塩水でのマウスと比較した。これは、リステリア−３２Ｐでの処置の直後のマウスの一部の炎症細胞で見られたが、これは、未処置のマウスと著しくは異ならず、リステリア−３２Ｐで処置されたときの正常組織での低い組み込みレベルに一致している。また、リステリア−３２Ｐで処置されたマウスのＢＭ細胞性は、生理食塩水のマウスよりも僅かに高かった。しかしながら、処置の１か月後、正常組織ではリステリア−３２Ｐの影響が全く観察されなかった。
【００５４】
膵臓癌のマウスモデルでのリステリア−３２Ｐの有効性：最後に、リステリアの生存率及び機能が３２Ｐによって変更されなかったこと、及び安全面が非常に向上したことを実証した後、リステリア−３２Ｐの有効性を膵臓癌のマウス（Ｐａｎｃ−０２モデル）で決定した。このために、０日目に、マウスにＰａｎｃ−０２腫瘍細胞（哺乳動物の脂肪体）を曝露し、リステリア−１８８Ｒｅで説明されたように、３日ごとに１０７ＣＦＵのリステリア−３２Ｐで（腹腔内）処置した（Ｑｕｉｓｐｅ−Ｔｉｎｔａｙａ  ｅｔ  ａｌ，２０１３ｂ）。マウスの８０％が癌に罹患していないことが分かった（図５）。
【００５５】
膵臓癌は、特に肝臓に転移するため、リステリア−３２ＰによるＰａｎｃ−０２モデルの肝臓での転移の除去の一例（図６）が、転移の処置でのこの方法の有効性も示している。
【００５６】
リステリアのＫＰＣモデルの膵臓腫瘍への侵入：癌患者では、間質障壁は、腫瘍が薬物を取り込むのを防止する（Ｏｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。本明細書では、リステリアがＫＰＣモデルの膵臓腫瘍及び転移部に侵入することが実証されている。ＫＰＣマウスは、１０７ＣＦＵのリステリアを（腹腔内）注射し、翌日にＣＦＵを正常組織、腫瘍、及び転移部から単離した。４Ｔ１及びＰａｎｃ−０２モデルと同様に、リステリア細菌がＫＰＣモデルの転移部及び腫瘍で豊富に見られ、正常細胞では遥かに少ないか、又は全く見られなかった（図７）。
【００５７】
更なる確認の実験が図８〜図１１に示されている。図８では、３２Ｐの体内分布を、Ｐａｎｃ−０２腫瘍及び転移を有するマウスで決定した。このマウスに１０７のリステリア−３２Ｐを１回注射し、様々な時間間隔（１時間、４時間、２４時間、４８時間、及び９６時間）で原発腫瘍、転移部、及び様々な正常組織における放射能カウント数について分析した。図示されているように、３２Ｐは、特に注射の１時間後及び４時間後に転移部及び腫瘍で最も高く、注射の２４時間後、４８時間後、及び９６時間後に３２Ｐのレベルが低下したが、正常細胞と比較すると著しく高いままであった。転移が既に肝臓に広がっていたため、この臓器は例外であった。
【００５８】
線量制限毒性（ＤＬＴ）の研究を行った（図９を参照）。様々な線量のリステリア−３２Ｐを、癌が存在しないＣ５７Ｂ１６マウスに注射し、生存時間をその後５日間にわたって決定した。ここで図示されているように、１０７ＣＦＵは最適な線量であったが、１０８ＣＦＵのマウスは１日目以降に死亡し、これは、リステリアのみで公表されたＬＤ５０＝１０８に一致している。これらの結果は、１回の投与で１μＣｉの放射能を送達する１０７ＣＦＵの線量が非毒性であることを示唆している。これは、たとえ１２回の１０７ＣＦＵのリステリア−３２Ｐが注射されたマウスでも副作用がないことを立証している病理学報告書によっても裏付けられる。
【００５９】
定着腫瘍及び転移に対するリステリア−３２Ｐの効果を、定着腫瘍（０．５〜１ｃｍ）及び転移に対してリステリア−３２Ｐ及び生理食塩水を用いて行った（図１０を参照）。簡単に述べると、３回のサイクルの１０７ＣＦＵのリステリア−３２Ｐを連続して４日投与し、続いて各サイクル間に３日の休息期間を設けた（合計１２回の投与）。前の実験とは対照的に、第１の処置は、３日目ではなく１０日目に開始した。ここで図示されているように、リステリア−３２Ｐの処置は、腫瘍及び転移の両方を強力に消失させた。分散分析＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５は有意である。
【００６０】
血清中のリステリア−３２Ｐの解離度（dissociation grade)を、リステリア−３２Ｐを血清と共に３７℃でインキュベートすることによって分析した。０時間後、１時間後、２時間後、及び３時間後にＲＬ細菌を遠心分離機にかけ、及び上清を放射能カウントについて分析した。リステリア−３２Ｐ複合体の解離度（パーセント）を、上清中の放射能をペレット化細菌中の遊離放射能で除した値に１００％を乗じることによって決定した。図１１に示されているデータは２つの実験の平均である。エラーバーはＳＥＭを表している。
【００６１】
材料及び方法
３２Ｐのリステリアへの組み込みのための例示的なプロトコル
リステリアの飢餓
・弱毒化リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＬＭ）の冷凍の管を−８０℃から取り出し、３７℃の水槽で解凍し（管は１．５ｍｌを含む）：１つの管がＬＭ−Ｐ３２用であり、もう１つの管がＬＭのみ用であるため、２つで行われる。以下のように０．５×１０９細菌／ｍｌにする。
・１０秒間にわたりボルテックスし、１ｍｌを新しい管に移し；
・この１ｍｌを１５０００ｒｐｍで１２０秒間にわたり遠心分離機にかけ；
・上清を廃棄し、細菌を１ｍｌの生理食塩水で洗い流し；
・この１ｍｌを１５０００ｒｐｍで１２０秒間にわたり遠心分離機にかけ；
・上清を廃棄し、ペレットを生理食塩水中に再懸濁し（ペレット中に０．８×１０９の細菌の場合、０．８ｍｌの生理食塩水中に再懸濁し、１０９／ｍｌにする）；次いで、５００μｌの生理食塩水を５００μｌの細菌に添加することによって０．５×１０９の細菌の濃度にし；及び
・生理食塩水中の１ｍｌの細菌（０．５×１０ｅ９）をエッペンドルフから１５ｍｌ管に移し；
・１５ｍｌ管を密封し、細菌を生理食塩水中、シェーカー（２００ｒｐｍ）において３７℃で３０分間にわたり飢餓させる。
【００６２】
３２Ｐのリステリア（ＲＬ）への組み込み
・３０分の飢餓後、１５ｍｌ管をボルテックスし、１ｍｌをエッペンドルフ管に移し、この管を１５０００ｒｐｍで１２０秒間にわたり遠心分離機にかけ；
・上清を廃棄し、１ｍｌのホスフェートを含まない培地（ＥＭＭＰ）にペレットを再懸濁し、これを十分にボルテックスし；
・１ｍｌの細菌溶液をエッペンドルフ管から１５ｍｌ管に再び移し、且つ５μｌの１０ｕＣｉ／ｕｌ３２Ｐを添加し（５０ｕＣｉを０．５×１０ｅ９／１ｍｌのホスフェートを含まない培地に添加する）；及び
・１５ｍｌ管を密封し、３２Ｐの組み込みのためにシェーカー（２００ｒｐｍ）において３７℃で６０分間にわたり細菌をインキュベートする。
【００６３】
上清及び細菌における放射能を測定するための準備
・６０分間のインキュベーション後、０．５×１０ｅ９ＲＬ／１ｍｌの培養物を再びエッペンドルフ管に移し、この管を１５０００ｒｐｍで１２０秒間にわたり遠心分離機にかけ；
・１００μｌの上清を取り出し、非組み込み３２Ｐを測定するためにこれを確保し、残りの上清を廃棄し；
・ペレットを１ｍｌの生理食塩水中に再懸濁し、これを入念にボルテックスし、管を１５０００ｒｐｍで１２０秒間にわたり遠心分離機にかけ；
・上清を廃棄し、ペレットを５００μｌの生理食塩水中に再懸濁する（細菌を１０ｅ９／ｍｌの最終希釈にするため）。これを十分にボルテックスし、ペレットが完全に再懸濁するようにし；及び
・１０ｅ９ＲＬ／１ｍｌの５００μｌのうちの１００μｌを取り出して、これを３２Ｐの取り込みを測定するために確保する（上清と等しくするために放射能カウントを必ず２で除す）。
【００６４】
ＲＬの生存率
１０ｅ４ＣＦＵ／ｍｌに希釈後、別の１００μｌ（１０ｅ９／ｍｌ；１０ｅ５×に希釈）をＬＢ上の細菌にプレーティングするために使用する（１００μｌの１０ｅ４／ｍｌを各ＬＢプレートにプレーティングする）。
【００６５】
ＲＬのマウスへの注射
マウスへの注射のため、５×１０ｅ７ＣＦＵのＬＭ−Ｐ３２／ｍｌ生理食塩水に最終希釈し、２００μｌを各マウスに注射する［１００μｌの０．５×１０９のリステリア−Ｐ３２／ｍｌプラス９００μｌの生理食塩水→２００μｌの腹腔内注射］。必ず二重で行うようにし、ＬＭのみでも同様にする。
【００６６】
ＲＬによる腫瘍細胞の感染率
感染率を試験するために、１０ｅ８ＣＦＵのｐ３２が細菌に組み込まれた１００μｌを、２４ウェルプレートに蒔かれた４Ｔ１細胞（抗生物質を含まない１０％ＦＢＳを含む５００μｌのＤＭＥＭ中、１０ｅ６細胞／ウェル）に添加する。細胞を２時間感染させ、５０μｇ／ｍｌの最終濃度のゲンタマイシンを１時間添加する。１時間後、培地を完全に取り出し、感染細胞を、一切の抗生物質を含まない１ｍｌの温培地で１回洗浄する。最後に、細胞を１ｍｌの水を用いて５分間溶解する。溶解した細胞をピペットで２０回上下させて溶解物を入念に混合し、次いで、この溶解物をエッペンドルフ管に移す。入念にボルテックスし、１００μｌをＬＢプレートにプレーティングする。
【００６７】
培地の組み込み
・ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｆｒｅｅ（ＥＭＭＰ）粉末−カタログ：Ｅ２２０５−２０
・水１リットルにつき２９．３２８ｇを溶解する。ｐＨを５．５に調整する；
・オートクレーブ又はフィルター滅菌（０．２μｍ）；
・室温で保存する。
【００６８】
参考文献（References)
【表１】
2017533241.tif 000003
【表２】
2017533241.tif 000004
【図１】
2017533241.tif 000005
【図２】
2017533241.tif 000006
【図３】
2017533241.tif 000007
【図４】
2017533241.tif 000008
【図５】
2017533241.tif 000009
【図６】
2017533241.tif 000010
【図７】
2017533241.tif 000011
【図８】
2017533241.tif 000012
【図９】
2017533241.tif 000013
【図１０】
2017533241.tif 000014
【図１１】
2017533241.tif 000015
【国際調査報告】
2017533241.tif 000016
2017533241.tif 000017