(57)【要約】本発明は、脂肪族カルボン酸が結合し、改質された誘導体及びこのペプチド誘導体を有効成分として含む機能性化粧品に関するものである。本発明によって合成されたペプチド誘導体は、皮膚細胞に対する透過力が良く、コラーゲン細胞の再生能力に優れるだけでなく、細胞毒性の問題もない。したがって、本発明のペプチド誘導体を使用し、シワの改善及び／または老化防止のための化粧品の有効成分として活用することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシルプロリン若しくはグリシルヒドロキシプロリンであるジペプチドの末端にＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたジペプチド誘導体化合物。
【請求項２】
前記ジペプチド誘導体化合物は、下記の化学式（Ｉ）若しくは化学式（ＩＩ）で表示される、請求項１に記載の化合物。
【化１】
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化学式（Ｉ）において、Ｒ１は水素若しくはヒドロキシ基であり、Ｒ２はカルボキシ基を介して結合されるＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸である。
【化２】
2017505341.tif 000013
化学式（ＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２は化学式（Ｉ）で定義されたものと同一であり、Ｒ３はＣ１〜Ｃ２０のアルキレン、Ｃ３〜Ｃ１０のシクロアルキレン及びＣ６〜Ｃ２０のアリーレンで構成される群から選択される。ＡとＢは、それぞれ独立して‐ＮＨ基若しくは酸素原子である。
【請求項３】
前記脂肪族カルボン酸は、ブタン酸、ペンタン酸、オクタン酸及びデカン酸で構成される群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記脂肪族カルボン酸は、飽和脂肪族カルボン酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記脂肪族カルボン酸は、Ｃ５〜Ｃ８の脂肪族カルボン酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
グリシルプロリン若しくはグリシルヒドロキシプロリンであるジペプチドの末端にＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたジペプチド誘導体化合物を有効成分として含むシワ改善用化粧品の組成物。
【請求項７】
前記ジペプチド誘導体化合物は、下記の化学式（Ｉ）若しくは化学式（ＩＩ）で表示される、請求項６に記載のシワ改善用化粧品の組成物。
【化１】
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化学式（Ｉ）において、Ｒ１は水素若しくはヒドロキシ基であり、Ｒ２はカルボキシ基を介して結合されるＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸である。
【化２】
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化学式（ＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２は化学式（Ｉ）で定義されたものと同一であり、Ｒ３はＣ１〜Ｃ２０のアルキレン、Ｃ３〜Ｃ１０のシクロアルキレン及びＣ６〜Ｃ２０のアリーレンで構成される群から選択される。ＡとＢは、それぞれ独立して‐ＮＨ基若しくは酸素原子である。
【請求項８】
前記脂肪族カルボン酸は、ブタン酸、ペンタン酸、オクタン酸及びデカン酸で構成される群から選択される、請求項６に記載のシワ改善用化粧品の組成物。
【請求項９】
前記脂肪族カルボン酸は、飽和脂肪族カルボン酸である、請求項６に記載のシワ改善用化粧品の組成物。
【請求項１０】
前記脂肪族カルボン酸は、Ｃ５〜Ｃ８の脂肪族カルボン酸である、請求項６に記載のシワ改善用化粧品の組成物。
【請求項１１】
前記ジペプチド誘導体化合物は、皮膚組織においてコラーゲンの生合成を誘導する、請求項６に記載のシワ改善用化粧品の組成物。
【請求項１２】
前記ジペプチド誘導体化合物は、皮膚組織においてプロリダーゼの活性を促進させる、請求項６に記載のシワ改善用化粧品の組成物。
【請求項１３】
前記ジペプチド誘導体化合物は、前記化粧品の組成物中に、０．１〜１０００μＭの濃度で含まれている、請求項６に記載のシワ改善用化粧品の組成物。
【請求項１４】
グリシルプロリン若しくはグリシルヒドロキシプロリンであるジペプチドの末端にＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたジペプチド誘導体化合物を有効成分として含む老化防止用化粧品の組成物。
【請求項１５】
前記ジペプチド誘導体化合物は、下記の化学式（Ｉ）若しくは化学式（ＩＩ）で表示される、請求項１４に記載の老化防止用化粧品の組成物。
【化１】
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化学式（Ｉ）において、Ｒ１は水素若しくはヒドロキシ基であり、Ｒ２はカルボキシ基を介して結合されるＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸である。
【化２】
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化学式（ＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２は化学式（Ｉ）で定義されたものと同一であり、Ｒ３はＣ１〜Ｃ２０のアルキレン、Ｃ３〜Ｃ１０のシクロアルキレン及びＣ６〜Ｃ２０のアリーレンで構成される群から選択される。ＡとＢは、それぞれ独立して‐ＮＨ基若しくは酸素原子である。
【請求項１６】
前記脂肪族カルボン酸は、ブタン酸、ペンタン酸、オクタン酸及びデカン酸で構成される群から選択される、請求項１４に記載の老化防止用化粧品の組成物。
【請求項１７】
前記脂肪族カルボン酸は、飽和脂肪族カルボン酸である、請求項１４に記載の老化防止用化粧品の組成物。
【請求項１８】
前記脂肪族カルボン酸は、Ｃ５〜Ｃ８の脂肪族カルボン酸である、請求項１４に記載の老化防止用化粧品の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチド誘導体に関するものであって、さらに詳細には皮膚への透過度が向上し、細胞毒性のないペプチド誘導体及びこれを有効成分として含む機能性化粧品の組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
有史以前の時代から自分を誇示したり、自然環境などから保護したり、身分や階級を表示したりするための目的で、植物の油、花びら、炭や黄土などの天然成分を用いた化粧品が使われた。過去の化粧品は単に皮膚を清潔にしたり保護したり、美化したりすることが目的であったが、最近は、消費者の欲求に応じる様々な生理的効果を有する機能性化粧品に対する関心が高まっている。
【０００３】
機能性化粧品は、１）皮膚にメラニン色素が沈着することを防止したり、メラニン色素の色を薄くしたりするなどの方法で皮膚の美白を手助けする化粧品、２）皮膚に弾力を与えて皮膚のシワ改善を手助けする化粧品、３）強い日差しを防止したり、紫外線を遮断若しくは散乱させたりするなどの方法で皮膚をきれいにやいたり、紫外線から皮膚を保護したりすることを手助けする化粧品などに区分することができる。
【０００４】
機能性化粧品を開発するためには、皮膚細胞内の信号伝達システム及び関連物質の調節メカニズムのような皮膚生理に対する基本的なメカニズム研究に基づき、新しい作用原理及びメカニズムを究明する研究を行わなければならない。かかる研究を通じて皮膚活性物質を開発し、該当活性物質を効果的に伝達できる適切な剤形を開発しなければならない。
【０００５】
最近、機能性化粧品の研究において、皮膚に対する効能が改善された素材を発掘するための試みが続けられている。これに関し、薬学、皮膚科学及び生命科学など隣接技術で効能が知られた素材を化粧品に導入・適用する方法や、漢方生薬材若しくは天然物から効能物質を抽出した後、生命科学技術を応用して新素材を開発したり、新しい誘導体を合成してその効能を探す方法が活発に行われている。また、機能性化粧品に使用し得る素材を皮膚に適切に伝達する径皮吸収システムに対する研究も持続的に行われている。素材の皮膚伝達システムに関し、リポソーム、ナノカプセルなど微粒子包接体の開発及び選択的径皮吸収のための製材開発など、径皮伝達システム（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ、ＴＤＳ）分野の研究が集中的に行われている。
【０００６】
皮膚は生体の最も外側に形成され、外部の危険な物質から生体を保護するが、様々な外部の刺激によって老化しやすい。皮膚に生じるシワは、自然老化（内因的老化）と光老化（ｐｈｏｔｏ−ａｇｉｎｇ、外因的老化）による皮膚老化が主な原因である。皮膚細胞が老化すると、細胞再生能力の低下によってコラーゲンやエラスチンといった弾力繊維が減少したり、活性酸素によって過酸化脂質が生成されたり、生体構成物質が酸化して変性したりする。すなわち、皮膚組織が老化するにつれて、皮膚組織を構成する繊維質と基質の生合成能力が低下すると、皮膚が薄くなり、皮膚の弾力が低下してシワが形成される。したがって、老化防止若しくはシワ改善のためには、コラーゲンの合成促進、抗酸化作用などの機能が要求される。
【０００７】
シワ改善機能性化粧品の素材として、次のような成分が開発された。１）皮膚ターンオーバー（ｓｋｉｎ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ）を刺激する方法で表皮細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ）の分化及び再生を制御する成分（例えばレチノイド（Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ）、アルファ‐ヒドロキシ酸（αｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ、ＡＨＡｓ）、メバロン酸（Ｍｅｖａｌｏｎｉｃ、ＭＡ））、２）コラーゲンの分解に関与するマトリックスメタロプロテアーゼ‐１（ＭＭＰ‐１）の活性を抑えてコラーゲンの代謝を抑制したり、コラーゲン若しくはヒアルロン酸の合成を促進したりするなどの方法で細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｌｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）を調節する成分（例えばケイ酸（Ｓｉｌｉｃｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｎ‐メチル‐Ｌ‐セリン、イソフラボノイド、芍薬から抽出したペオニフロリン（Ｐａｏｎｉｆｌｏｒｉｎ）、レチノイン‐ｄ‐トコフェロール））、３）過酸化脂質の生成を抑制するなどの方法で活性酸素（ＲＯＳ）を消去（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）する抗酸化剤成分（例えばベンザスタチン（Ｂｅｎｚａｓｔａｔｉｎｓ）、メラノシン（Ｍｅｌａｎｏｃｉｎｓ）、コエンザイム（Ｑ１０）、アスタキサンチン（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ））、４）抗炎症作用成分（例えばグリチルリチン酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体）、５）紫外線によって損傷したＤＮＡを保護したりＤＮＡを修繕したりすることで、紫外線による皮膚損傷を防止する成分（例えばクレアチン（Ｃｒｅａｔｉｎ）、クアンドルブッシュ（Ｃａｎｄｌｅｂｕｓｈ）の抽出物、植物性プランクトンから抽出したフォトリアーゼ（ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ））、６）筋肉運動を低下させる類似ボトックス（Ｂｏｔｏｘ−ｌｉｋｅ）ペプチド類。
【０００８】
ペプチドは、人体内でホルモンとして働いたり、免疫に関与したりするが、皮膚細胞に関連して怪我の治癒、損傷した皮膚に対する皮膚バリア回復（ｓｋｉｎ‐ｂａｒｒｉｅｒ  ｒｅｐａｉｒ）などの機能を行う。薬品や化粧品の活性成分若しくは補助成分として人体に投与されるペプチドは、信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、酵素抑制ペプチド、神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）抑制ペプチド、活性成分の細部内への移動を促進するキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）ペプチドに区分することができる。その中でも、化粧品分野で使用されるペプチドには、皮膚組織内における特定タンパク質の合成を促進若しくは誘導する信号ペプチドが用いられる。
【０００９】
しかし、ペプチドは親水性作用基を有する。したがって、経皮投与される化粧品の成分として使用されるペプチドは皮膚を通過できず、実際にその機能を発揮することができない。また、ペプチドは皮膚に相当量存在する酵素に弱いため、ペプチドが吸収されたとしてもこれらペプチドが分解されて効果を発揮できなくなり得る。さらに、一部のペプチド誘導体成分は細胞毒性を有するものと知られているため、化粧品の活性成分に不適合である。
【００１０】
したがって、機能性化粧品の活性成分として皮膚細胞内部へ効率よく浸透でき、皮膚細胞に吸収されても生体内で分解されず長時間安定して存在できると共に、皮膚毒性のない素材を開発する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、皮膚細胞への透過効率がよく、皮膚再生能力に優れるだけでなく、細胞毒性のないペプチド誘導体化合物を提供しようとすることである。
【００１２】
本発明の他の目的は、このペプチド誘導体化合物を有効成分として含む機能性化粧品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、脂肪族カルボン酸で改質されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド誘導体化合物及びこの誘導体化合物を有効成分として含む機能性化粧品の組成物に関するものである。
【００１４】
本発明の一側面によると、本発明は、グリシルプロリン若しくはグリシルヒドロキシプロリンであるジペプチドの末端にＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されているジペプチド誘導体化合物を提供する。
【００１５】
例示的な実施形態において、前記ジペプチド誘導体化合物は、下記の化学式（Ｉ）若しくは化学式（ＩＩ）で表示できる。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
化学式（Ｉ）において、Ｒ１は水素若しくはヒドロキシ基であり、Ｒ２はカルボキシ基を介して結合されるＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸である。
【００１８】
【化２】
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【００１９】
化学式（ＩＩ）において、Ｒ１及びＲ２は化学式（Ｉ）で定義されたものと同一であり、Ｒ３はＣ１〜Ｃ２０のアルキレン、Ｃ３〜Ｃ１０のシクロアルキレン及びＣ６〜Ｃ２０のアリーレンで構成される群から選択される。ＡとＢは、それぞれ独立して‐ＮＨ基若しくは酸素原子である。
【００２０】
一つの例示的な実施形態において、前記脂肪族カルボン酸は、飽和脂肪酸若しくは不飽和脂肪族カルボン酸であり得る。具体的に前記脂肪族カルボン酸は、ブチル酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸で構成される群から選択される脂肪族モノカルボン酸である。
【００２１】
前記脂肪族カルボン酸は、ブタン酸、ペンタン酸、オクタン酸及びデカン酸で構成される群から選択することができる。例えば、前記脂肪族カルボン酸は、Ｃ５〜Ｃ８の脂肪族カルボン酸であってもよい。
【００２２】
また、本発明の他の側面によると、本発明は、グリシルプロリン若しくはグリシルヒドロキシプロリンであるジペプチドの末端にＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたジペプチド誘導体化合物を有効成分として含むシワ改善用化粧品の組成物を提供する。
【００２３】
本発明の例示的な実施例によると、前記ジペプチド誘導体化合物は、皮膚組織においてコラーゲンの生合成を誘導し／誘導したり、皮膚組織においてプロリダーゼ（Ｐｒｏｌｉｄａｓｅ）の活性を促進させる方法で皮膚老化を防止し、シワの生成を緩和することができる。
【００２４】
一つの例示的な実施形態において、前記ジペプチド誘導体化合物は、前記化粧品の組成物中に、０．１〜１０００μＭ、好ましくは１〜５００μＭ、さらに好ましくは１０〜２００μＭの濃度で含むことができる。
【００２５】
さらに、本発明の他の側面によると、本発明は、グリシルプロリン若しくはグリシルヒドロキシプロリンであるジペプチドの末端にＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたジペプチド誘導体化合物を有効成分として含む老化防止用化粧品の組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、グリシルプロリン若しくはグリシルヒドロキシプロリンジペプチドの末端に親油性脂肪族カルボン酸を導入した誘導体化合物を提案する。本発明によってグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドに脂肪族カルボン酸の導入された誘導体化合物は、皮膚細胞に対する透過性が大きく向上し、皮膚細胞の増殖を誘導した。
【００２７】
この誘導体化合物は、皮膚細胞においてコラーゲンの生合成を促進するだけでなく、コラーゲンの再生性に関与する酵素であるプロリダーゼの活性を増進させるが、細胞毒性を引き起こさない。したがって、本発明によって合成された誘導体化合物は、皮膚老化の防止及び／またはシワ改善用化粧品の有効成分として活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の例示的な一つの実施形態によってＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド誘導体を、真皮繊維芽細胞に投与した後、該当ジペプチド誘導体による繊維芽細胞の増殖効果をＷｓｔ‐１ａｓｓａｙを用いて分析した結果を測定したグラフである。対照群に、脂肪族カルボン酸で置換されていないグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド（ＧＰ）、プロパン酸（Ｃ３）、ラウリン酸（Ｃ１２）及びパルミチン酸（Ｃ１６）で置換されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドを用いた。
【図２】本発明の例示的な実施形態によってＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド誘導体を、ヒトの真皮繊維芽細胞に投与した後、該当ジペプチド誘導体によるコラーゲンの生合成度合いを測定したグラフである。対照群に、カルボン酸で置換されていないグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド（ＧＰ）、プロパン酸（Ｃ３）、ラウリン酸（Ｃ１２）及びパルミチン酸（Ｃ１６）で置換されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドを用いた。
【図３】本発明の他の例示的な実施形態によってＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド誘導体を、繊維芽細胞に投与した後、細胞溶解液でプロリダーゼの活性を測定したグラフである。陰性対照群（ＮＴ）に、カルボン酸で置換されていないグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド（ＧＰ）、プロパン酸（Ｃ３）、ラウリン酸（Ｃ１２）及びパルミチン酸（Ｃ１６）で置換されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドを用いて、陽性対照群に、プロリダーゼの活性を誘導するものとして知られているインシュリン‐類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ‐ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）を用いた。
【図４】本発明の他の例示的な実施形態によってＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド誘導体を、ヘアレスマウスに投与した後、Ｆｒａｎｚ  ｃｅｌｌ試験法を用いて皮膚透過力を測定したグラフである。対照群に、カルボン酸で置換されていないグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド（ＧＰ）、プロパン酸（Ｃ３）、ラウリン酸（Ｃ１２）及びパルミチン酸（Ｃ１６）で置換されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドを用いた。
【図５】本発明の他の例示的な実施例によって製造されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド誘導体を、人体に投与した後、国際臨床試験を行った結果を測定したグラフである。本発明のグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド誘導体は、皮膚におけるシワの面積と長さを大きく減少させた。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
Ａ．脂肪族カルボン酸で改質されたジペプチド誘導体化合物
本発明によって合成される脂肪族カルボン酸で改質されたジペプチド誘導体である化合物は、グリシル（ヒドロキシ）プロリン若しくはグリシルヒドロキシプロリンジペプチドの末端にＣ４〜Ｃ１０、好ましくはＣ５〜Ｃ１０、さらに好ましくはＣ５〜Ｃ８の脂肪族カルボン酸が導入されている。例えば、脂肪族カルボン酸はジペプチドの末端に直接結合されてもよく、適切なリンカー若しくは架橋剤（ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｅｒ）を介して間接的に結合されてもよい。
【００３０】
即ち、本発明の一側面は、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドのＮ‐末端及び／またはＣ‐末端に脂肪族カルボン酸が結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）誘導体に関するものである。本発明によってグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの末端に結合される脂肪族カルボン酸は、ジペプチドの細胞若しくは組織への浸透を促進すると、安定性を向上させることができる。本明細書において「結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」若しくは「結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」とは、ジペプチドと、このジペプチドの末端に導入される脂肪族カルボン酸成分が互いに連結され、近接性が維持できるようにするそれぞれの成分間の相互作用、例えば、共有、イオン或いは疎水性相互作用を意味する。本発明によってグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの末端に結合して生成される誘導体化合物は、その化合物の塩、光学及び／または幾何異性質体、部分異性質体またはこれらの混合物を含む意味に解析されなければならない。例えば、本発明の誘導体化合物は、ジペプチド及び／または脂肪族カルボン酸の可能な光学及び／または幾何異性質体、またはこれら異性質体の混合物の形態であったり、或いは脂肪族カルボン酸の薬学的、食品工学的、化粧品工学的に許容される塩を含んだりすることができ、ガラス形態または両性イオン形態または薬学的に許容される無機若しくは有機塩基若しくは酸が付加された塩の形態を有することができる。
【００３１】
これに関し、脂肪族カルボン酸はリンカー若しくは架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）を介してジペプチドに結合することができるが、これら用語は、本明細書において交換的に用いられ、２つの成分を共に結合／連結して１つ以上の原子を含む鎖及び／または輪を意味する。また、本明細書において「ペプチド」は、「ペプチド類似体」、即ちＬ‐アミノ酸の側鎖若しくはα‐アミノ酸のバックボーンに対して１つ以上置換された類似体を含む。側鎖若しくはバックボーンが改質化されたペプチド類似体の例には、ピロリジン輪がヒドロキシ基で置換されたヒドロキシプロリンや、Ｎ‐メチルグリシン「ペプトイド」が挙げられる。
【００３２】
例示的な１つの実施形態において、本発明のジペプチド誘導体化合物は、ジペプチドのグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドのＮ‐末端に脂肪族カルボン酸がアミド結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を通じて導入された化合物として下記化学式（Ｉ）で表すことができる。
【００３３】
【化１】
2017505341.tif 000005
【００３４】
化学式（Ｉ）において、Ｒ１は水素若しくはヒドロキシ基であり、Ｒ２はカルボキシ基を介して結合されるＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸である。
【００３５】
他の代案的な実施形態において、脂肪族カルボン酸は、リンカー若しくは架橋剤を介してグリシル（ヒドロキシ）プロリンの末端に結合することができる。リンカーとグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの間及び／またはリンカーと脂肪族カルボン酸の間における共有結合を形成するに使用されるリンカーの作用基（反応性基）は、アミン基、ヒドロキシ基、ヒドラジノ基、チオール基、マレイミド基、カルボニル基及びカルボキシル基を有することができる。少なくとも一端にこれら作用基を有するリンカーは、例えばＣ１〜Ｃ２０の直鎖若しくは側鎖型アルキル基であってもよく、Ｏ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子を有するＣ１〜Ｃ２０の直鎖若しくは側鎖型ヘテロアルキル基であってもよく、Ｃ３〜Ｃ１０のシクロアルキル基であってもよく、前述したヘテロ原子を有するＣ３〜Ｃ１０のシクロアルキル基であってもよく、１つ〜３つの輪を有するＣ６〜Ｃ２０のアリール基であってもよく、１つ〜３つの輪を有してＮ、Ｏ、Ｓなどのヘテロ原子を１つ〜４つ含むＣ６〜Ｃ２０のヘテロアリール基であってもよい。
【００３６】
さらに、これら作用基は同一であってもよく（同種作用基）、それぞれ異なる類型の作用基（異種作用基）であってもよい。好ましくは、リンカーの作用基は、アミン基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、マレイミド基から選択することができ、必要によっては選択的にリンカーが、ジペプチドに結合する媒介体であるチオール基を有するアミノ酸残基１つ〜４つの短い配列を含むことができる。
【００３７】
例えば、リンカーは、独立して置換若しくは非置換されたアルキル、置換若しくは非置換されたヘテロアルキル、置換若しくは非置換されたアリール、置換若しくは非置換されたヘテロアリール、アルデヒド、酸、エステル、無水物、スルフィドリル、カルボキシ基から選択される２‐作用性及び多作用性有機ラジカル、例えば、マレイミド誘導体、マレイミドシクロヘキサン誘導体、マレイミドベンゾ酸誘導体、マレイミドカプロン酸誘導体及びスクシンイミド誘導体を含んだり、或いはシアンブロマイド若しくはシアンクロリド、スクシンイミジルエステル若しくはスルホニルハライドなど、或いはこれらの組み合わせから由来できる。
【００３８】
グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドと脂肪族カルボン酸の結合体を形成する際、架橋剤を用いて化学的結合を誘導することができる。ジペプチドのＮ‐末端にアミン基を有するため、架橋剤による結合体の形成が容易である。特に、アミノ基と可逆的若しくは非可逆的連結を形成する架橋剤が好ましい。使用可能な架橋剤には、１，５‐ジフルオロ‐２，４‐ジニトロベンゼン、ｐ，ｐ´‐ジフルオロ‐Ｎ，Ｎ´‐ジニトロジフェニルスルホン、ジメチルアジプイミダート、フェノル‐１，４‐ジスルホニルクロライド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、アゾフェニル‐ｐ‐ジイソシアネート、グルタルアルデヒド（様々な側鎖と反応）、Ｎ‐３‐マレイミドプロパン酸、Ｎ‐６‐マレイミドカプロン酸、Ｎ‐１１‐マレイミドウンデカン酸、４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシ‐６‐アミドカプロン酸、１，４‐ビス‐マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，１１‐ビス‐マレイミドテトラエチレングリコール（ＢＭ［ＰＥＯ］４）、１‐エチル‐３‐［３‐ジメチルアミノプロピル］カボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、ｍ‐マレイミドベンゾイル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ‐ＭＢＳ）、スクシンイミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート（ＳＭＣＣ）及びそのスルホン酸塩（ｓｕｌｆｏ‐ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル‐４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシ（６‐アミドカプロエート）（ＬＣ‐ＳＭＣＣ）、Ｎ‐マレイミドベンゾイル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＭＢＳ）、Ｎ‐スクシンイミジル‐３‐（ｍ‐マレイミド）プロピオン酸エステル若しくはそのスルホン酸塩、スクシンイミジル‐４‐（ｐ‐マレイミドフェニル）ブチル酸エステル（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル６‐［３‐（２‐ピリジルジチオ）‐プロピオナミド］ヘキサノエート（ｓＳＰＤＰ）及びそのスルホン化塩（ｓｕｌｆｏ‐ＳＰＤＰなどが挙げられるが、これに限らない。前記架橋剤のスクシンイミジル基は、アミド結合を形成する１次アミンと反応する。これらの架橋剤のうち、一部は水中溶解度が低いが、親水性基、例えばスルホネート基を架橋剤に添加して水中溶解度を向上させることができる。
【００３９】
例示的な実施形態において、両端にアミン基及び／またはヒドロキシ基を有するリンカーを用いることができる。これらの作用基の間には、例えばＣ１〜Ｃ２０の（ヘテロ）アルキレン基、Ｃ３〜Ｃ１０のシクロアルキレン基、Ｃ６〜Ｃ２０の（ヘテロ）アリーレン基が形成される。例えば、両端にアミン基を有するリンカーを用いる場合、リンカーの一端に形成されたアミン基と脂肪族カルボン酸のカルボキシ基が反応し、アミド結合を形成することができる。リンカーの一端は脂肪族カルボン酸とアミド結合で連結されている一方、リンカーの他端は開放されたアミン基を有する。したがって、開放されたリンカーの他端に位置するアミン基が、グリシル（ヒドロキシ）プロリンのＣ‐末端に位置するカルボキシ基と反応してアミド結合を形成することができる。これにより、リンカーの両端にアミド結合を形成しながら、脂肪族カルボン酸がグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドのＣ‐末端に結合できる。
【００４０】
代案的に、両端にヒドロキシ基を有するポリアルコールをリンカーに用いる場合、リンカーの両端にエステル結合を形成しながら、脂肪族カルボン酸がグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドのＣ‐末端に結合できる。
【００４１】
例示的な実施形態において、本発明のジペプチド誘導体化合物は、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドのＣ‐末端に、リンカーを介して脂肪族カルボン酸が導入された化合物であって、下記化学式（ＩＩ）で表すことができる。
【００４２】
【化２】
2017505341.tif 000006
【００４３】
化学式（ＩＩ）において、Ｒ１は水素若しくはヒドロキシ基であり、Ｒ２はカルボキシ基を介して結合されるＣ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸、Ｒ３はＣ１〜Ｃ２０のアルキレン、Ｃ３〜Ｃ１０のシクロアルキレン及びＣ６〜Ｃ２０のアリーレンで構成される群から選択される。ＡとＢは、それぞれ独立して‐ＮＨ基若しくは酸素原子である。
【００４４】
例示的な実施形態によって、本発明のジペプチド誘導体は、グリシンとプロリンで構成されるジペプチドであるグリシル（ヒドロキシ）プロリン、またはグリシンとヒドロキシプロリンで構成されるジペプチドであるグリシルヒドロキシプロリンの末端に適切な炭素数を有する脂肪族カルボン酸がアミド結合を通じて連結された誘導体である。一つの例示的な実施形態において、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドに結合できる脂肪族カルボン酸は、飽和脂肪酸若しくは不飽和脂肪族カルボン酸であり、直鎖若しくは側鎖の形態を有することができる。例えば、ジペプチドに導入できる脂肪族カルボン酸は、直鎖の形態の飽和脂肪族カルボン酸である。
【００４５】
本発明によってグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの末端に導入・結合できる飽和脂肪族カルボン酸の非制限的な例には、ブタン酸／ブチル酸（ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ／ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ペンタン酸／バレリアン酸（ｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ／ｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘキサン酸／カプロン酸（ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ／ｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタン酸／エナント酸（ｈｅｐｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ／ｅｎａｎｔｈｉｃ  ａｃｉｄ）、オクタン酸／カプリル酸（ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ／ｃａｐｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノナン酸／ペラルゴン酸（ｎｏｎａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ／ｐｅｌａｒｇｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、デカン酸／カプリン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ／ｃａｐｒｉｃ  ａｃｉｄ）のような飽和脂肪族モノカルボン酸と、スクシン酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、グルタル酸（ｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、アジピン酸（ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ）、ピメリン酸（ｐｉｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ）、スベリン酸（ｓｕｂｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、アゼライン酸（ａｚｅｌａｉｃ  ａｃｉｄ）、セバシン酸（ｓｅｂａｃｉｃ  ａｃｉｄ）のような脂肪族ジカルボン酸と、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）、イソクエン酸（ｉｓｏｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）、プロパン‐１，２，３‐トリカルボン酸（ｐｒｏｐａｎｅ‐１，２，３‐ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）のような脂肪族トリカルボン酸が含まれる。
【００４６】
また、本発明によってグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの末端に導入・結合できる不飽和脂肪族カルボン酸の非制限的な例を挙げると、クロトン酸（ｃｒｏｔｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）のようなブテン酸（ｂｕｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ペンテン酸（ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘキセン酸（ｈｅｘｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプテン酸（ｈｅｐｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、オクテン酸（ｏｃｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ノネン酸（ｎｏｎｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、シス‐４‐デセン酸／オブツシル酸（ｃｉｓ‐４‐ｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ｏｂｔｕｓｉｌｉｃ  ａｃｉｄ、１０：１（ｎ‐６））、シス‐９‐デセン酸／カプロレイン酸（ｃｉｓ‐９‐ｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ／ｃａｐｒｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、１０：（ｎ‐１））のようなデセン酸（ｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アコニット酸（ａｃｏｎｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）などの不飽和脂肪族カルボン酸を含むことができる。
【００４７】
例えば、本発明によってグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの末端に導入可能な脂肪族カルボン酸は、Ｃ４~Ｃ１０の飽和脂肪族モノカルボン酸である。例示的に、本発明によってグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの末端に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）できる脂肪族カルボン酸は、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸及びデカン酸で構成される群から選択される脂肪族モノカルボン酸である。好ましくは、Ｃ５〜Ｃ１０、さらに好ましくはＣ５〜Ｃ８の飽和脂肪族モノカルボン酸である。
【００４８】
本発明の例示的な実施形態で確認したところによると、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの末端に導入されたこれら脂肪族カルボン酸の炭素数が４つ未満であると、置換されていないグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドに比べて細胞透過度の向上を期待し難い。したがって、例えば、ギ酸、酢酸及びプロピオン酸（プロパン酸）のように炭素数４つ未満のカルボン酸が導入されたグリシル（ヒドロキシ）プロリン誘導体を、化粧品の有効成分として使用しても、皮膚細胞の内部へ効率良く浸透できない。したがって、炭素数４つ未満のカルボン酸が導入されたジペプチド誘導体化合物は、皮膚細胞の成長率向上、コラーゲンの再生能力改善及びこれに関与するプロリダーゼの活性改善などが期待できないため、シワの改善効果が微弱である。
【００４９】
一方、例えば、パルミチン酸のように炭素数が１０つを越えた脂肪族カルボン酸が導入されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド誘導体は、寧ろ皮膚細胞に毒性を示す。したがって、炭素数が１０つを越えるカルボン酸、例えば炭素数１２つのラウリン酸や炭素数１６つのパルミチン酸が導入されたグリシル（ヒドロキシ）プロリン誘導体は、皮膚細胞におけるコラーゲンの生合成が抑制されて皮膚細胞の老化を引き起こすなど、シワの改善に悪影響を与え得る。特に、本発明の実施例で確認したところによると、驚くことに炭素数１０つを越える脂肪族カルボン酸が導入されたグリシル（ヒドロキシ）プロリン誘導体は、繊維芽細胞の増殖、コラーゲン生合成及びプロリダーゼの活性を阻害するだけでなく、皮膚透過度も阻害する。
【００５０】
特定化合物が皮膚バリアを通過して皮膚内へ吸収される度合いは、様々な因子によるが、その中でも該当化合物の分子量、溶融点及び疎水性／親水性の度合いが作用する。皮膚を構成する組織のうち、最外殻の角質（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ）は、脂質二重層を介して疎水性の高い不溶性タンパク質であるケラチンが積層された構造を成す。ペプチドは、水素結合が可能なアミド結合を有する親水性物質であって、皮膚組織に存在する別の物質と水素結合を形成するなどの理由で、特に皮膚表皮細胞の最外殻を成す角質層において拡散し難い。ペプチドを皮膚に投与した場合、皮膚組織に存在する別の物質と水素結合をするなどの理由で、皮膚組織への浸透が困難である。
【００５１】
したがって、本発明においては、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの末端に親油性作用基として適切な個数の炭素数を有する疎水性の脂肪族カルボン酸を導入して改質された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ペプチド誘導体を合成し、皮膚細胞バリアの透過度を向上させようとした。かかる目的に関し、本発明によってグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの末端に結合する脂肪族カルボン酸は、Ｃ４〜Ｃ１０の直鎖若しくは側鎖の形態の飽和若しくは不飽和脂肪族カルボン酸である。驚くことに、本発明で確認したところ、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドに結合する脂肪族カルボン酸の炭素数が４つ未満であると、グリシル（ヒドロキシ）プロリンに対する細胞透過効果が期待し難く、脂肪族カルボン酸の炭素数が１０つを越えると、細胞毒性によって皮膚細胞の生長及びこれに密接な関連を有するコラーゲン再合成を抑制することが明らかになった。
【００５２】
従来、機能性化粧品の素材に関し、一般的にパルミチン酸のように炭素数１６以上の高級脂肪酸を結合した場合に細胞透過度を向上させることができると知られている。しかしながら、本発明によると、既存のものより少ない炭素を含むカルボン酸をジペプチドに結合させる場合に細胞透過度を向上でき、細胞毒性がないので、皮膚細胞の成長を向上できることが確認された。さらに、本発明によって適切な炭素数のカルボン酸が導入されたジペプチド誘導体を投与すると、皮膚弾力維持に密接な関連のあるコラーゲンを再生するだけでなく、コラーゲンの再生に関与するプロリダーゼの活性を増加させる。
【００５３】
特に、本発明によると、驚くことにパルミチン酸のように炭素数１６以上の高級脂肪酸をジペプチドに結合した誘導体の場合には、皮膚細胞に対して毒性を引き起こして皮膚細胞の成長を抑制するため、シワ改善の効果が期待し難い。このように、本発明のジペプチドにアミド結合される脂肪酸の炭素数は十分な臨界的異議を有し、炭素数１６以上の高級脂肪酸が、寧ろ細胞毒性を引き起こすということは、本発明の属する技術分野において予測できなかった事実である。
【００５４】
例示的な実施形態によって、グリシル（ヒドロキシ）プロリンの末端に脂肪族カルボン酸が導入されたジペプチド誘導体化合物は、公知の方法にしたがって合成できる。例えば、化学式（Ｉ）で表されるジペプチド誘導体を製造するために、まず、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドを合成する。グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドは、再組合発現ベクターを用いる生命工学的方法や化学的合成方法を利用することができる。生命工学的方法として、グリシン（Ｇｌｙ）をコーディングする塩基（ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＴ）と、プロリン（Ｐｒｏ）をコーディングする塩基（ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ）に適切な再組合発現ベクター、例えばヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを有するプラスミドベクターであるｐＥＴベクターに、ＰＣＲ法を活用してジペプチドコーディング塩基をクローニングし、再組合ベクターを製造する。続いて、宿主である大腸菌内でＨｉｓ‐Ｇｌｙ‐Ｐｒｏペプチドの形態に大量発現した後、純水精製する段階を通じて製造することができる。このとき、必要であれば、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドをコーディングする塩基と別途に、異なるアミノ酸若しくはペプチドをコーディングする塩基を同時に挿入して融合タンパク質の形態に発現させることもできる。
【００５５】
化学的合成方法の例は、液相合成法と固体相合成法に区分できるが、ペプチド合成用有機合成機器を利用して固体相ペプチドを合成する方法（Ｓｏｌｉｄ‐ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＳＰＰＳ）を利用することができる（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６３，８５（１４）：２１４９‐２１５４；Ｄｔｓｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．  １０９（４９）：１９０１‐２）。固体相合成のため、適当なレジンにジペプチドのカルボキシ基末端を構成する（ヒドロキシ）プロリンをカップリングし、続いてグリシンと（ヒドロキシ）プロリンをカップリングする方法で合成する。このとき、合成されるアミノ酸であるグリシン及び／または（ヒドロキシ）プロリンのアルファ‐アミノ基、即ちＮ‐末端は、適切な保護基で保護された形態で使用できる。
【００５６】
まず、ジペプチドのカルボキシ基末端を構成する（ヒドロキシ）プロリンを適切なレジンにカップリングし、プロリン結合レジンをスウェリングする。固体相合成のために求められるレジンは、適切なユニット（リンカー）で処理された不溶性であり、多孔性の固形相支持体であるレジンは、ジペプチドのＣ‐末端を構成する（ヒドロキシ）プロリンと結合する。使用できるレジンは、スウェリング及び固さが良子なポリスチレンレジンはもちろん、ポリアミドレジン、ＰＥＧ‐ｈｙｂｒｉｄポリスチレンレジン、ヒドロキシメチルレジン、アミノメチルレジン、クロロメチル化レジン若しくはクロロトリチルレジン（例えば、２‐クロロトリチルクロリドレジン、ＣＴＣレジン）などを用いることができる。これらのレジンに（ヒドロキシ）プロリンをローディングし、これらのレジンに（ヒドロキシ）プロリンがエステル結合してカップリングされる。続いて、固体相合成反応を通じて、（ヒドロキシ）プロリンとグリシンのペプチドカップリング反応が行われる。このとき、グリシンはアルファ‐アミノ酸が保護されたグリシンを用いることができるが、アルファ‐アミノ基を保護するための保護基として、ｔ‐ＢＯＣ（ｔ‐ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、Ｆｍｏｃ（９‐ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ  ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｚ）などを用いることができ、特に弱アルカリの条件下において除去でき、別の装備が要求されないＦｍｏｃを用いることができる。ジペプチドを合成するとき、グリシンのＣ‐末端のカルボニル基を活性化させるためのカップリング試薬を活性剤に使用することができ、カップリング後のＮ‐末端の保護基は適切な脱保護剤を使用することができる。
【００５７】
ペプチドのカップリングにおいてＣ‐末端を活性化するに使用できる活性剤には、Ｎ‐［（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ‐）‐１Ｈ‐１，２，３‐ｔｒｉａｚｏｌｏ［４，５‐ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ‐１‐ｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］‐Ｎ‐ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｎ‐ｏｘｉｄｅ（ＨＡＴＵ）と１‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐７‐ａｚａｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＡｔ）或いはＮ‐［（１Ｈ‐ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ‐１‐ｙｌ）（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］‐Ｎ‐ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｎ‐ｏｘｉｄｅ（ＨＢＴＵ）と１‐ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）にＮ，Ｎ‐ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＥＡ）が一緒に使用でき、Ｎ，Ｎ´‐ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＩＣ）、ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣ）のようにカルボン酸と反応して反応性の大きいＯ‐ａｃｙｌｉｓｏ‐ｕｒｅａを形成するカルボジイミド類のような塩基と、ラセミ化を防止できる添加補助剤として６‐Ｃｈｌｏｒｏ‐１‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐１Ｈ‐ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅのような１‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）や１‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐７‐ａｚａ‐ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＡｔ）などのトリアゾール類を用いることができる。これらのトリアゾール類は、カルボキシ基とカルボジイミド類の反応によって形成されたＯ‐ａｃｙｌｉｓｏ‐ｕｒｅａと反応し、反応性の弱いエステルを形成してラセミ化を防止する。 
【００５８】
ジペプチド合成が終了すると、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む切断溶液によって、脂肪酸誘導体が固体樹脂から分離され、ピペリジンなどを使用してグリシンの保護基（例えばｆｍｏｃ保護基）を除去する脱保護反応を行い、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドの合成を終了する。必要によっては、保護基が除去されたジペプチドを、適切な酸を用いてレジンから分離する工程がまず行われた後に、カルボン酸との結合反応を行うことができる。
【００５９】
続いて、合成されたジペプチドのＮ‐末端に脂肪族カルボン酸を反応させ、アミド結合を形成する。例えば、飽和脂肪酸の末端に存在するカルボキシ基とジペプチドＮ‐末端のアミン基が反応すると、脱水・縮合によってアミド結合された形のカルボン酸ジペプチドの形の誘導体を合成できる。この反応は、例えばジペプチドとレジンがカップリングされた状態で行われるが、これによって高分子ビーズが生成される。例えば、ジペプチドを構成する２つのアミノ酸がカップリングされた後、Ｎ‐末端のアミン基は、希望するアルキル基を希望するアルキル基を有するアシル活性体、例えばａｃｙｌａｎｈｙｄｒｉｄｅと４‐（Ｎ，Ｎ‐ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＭＡＰ）を一緒に反応させて、Ｎ‐末端にアミド結合を形成したり、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）される脂肪族カルボン酸とＮ，Ｎ‐ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＩＣ）、１‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐７‐ａｚａ‐ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＡｔ）若しくは１‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）が一緒に使用されてアミド結合を形成したりすることができる。
【００６０】
このようにレジンとカップリングされたジペプチドに脂肪族カルボン酸が結合する場合には、トリフルオロ酢酸のような酸水溶液を使用し、固体支持体レジンから脂肪酸ジペプチド誘導体を切断・分離する。必要によっては、ジエチルエステルなどを加えて合成されたカルボン酸‐ジペプチドを結晶化し、ろ過・乾燥・ＨＰＬＣなどを利用した分析・精製工程を行って、保管及び販売のための凍結乾燥及び包装などの工程をさらに行うことができる。
【００６１】
一方、コラーゲンは、人体をはじめとする動物における連結組織を構成する主要タンパク質であって、特に、皮膚組織において真皮成分の約９０％を占める繊維状タンパク質である。生体内で様々な生合成過程を通じて合成されるコラーゲンの基本構造単位は、２つの同一のα１鎖と、この鎖に比べて若干異なるα２鎖の３つのサブユニットで構成され、３つの鎖が螺旋構造を成すトロポコラーゲンである。特に、一部のプロリンとセリンは、水酸化反応によってヒドロキシプロリンとヒドロキシセリンに転換されている。かかる特異的なアミノ酸によるサブユニットにおける分子内架橋結合（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ）及びサブユニット間における分子間架橋結合（ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ）を形成している。
【００６２】
このようにコラーゲンは、結合組織の主要構造ブロックであって、皮膚をはじめとする結合組織に高張力強度を提供するだけでなく、変形を克服できる能力を提供する。例えば、コラーゲンは皮膚のハリを維持し、皮膚組織の結合力に関与したり、細胞接着（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）支持などに関与したりする。皮膚の自然老化及び紫外線照射による光老化によって皮膚が薄くなり、その結果、皮膚にシワが形成されることが知られている。さらに、コラーゲンは、骨移植や組織の再生性のための足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、人工皮膚の代替物質のような組織の再構成のための素材や怪我治癒のための物質といった医学的用途に活用されている。特に、生体内に存在する大部分のコラーゲン形態であるタイプＩコラーゲンは、皮膚組織においてエラスチンと共に皮膚に張力と弾力を提供するものであって、紫外線から皮膚を保護し、シワを予防する。
【００６３】
皮膚細胞である繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の構成タンパク質のコラーゲンでは、プロリン（Ｐｒｏ）とヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が繰り返された構造（Ｇｌｙ‐Ｐｒｏ‐Ｘ若しくはＧｌｙ‐Ｘ‐Ｈｙｐ、Ｇｌｙはグリシンであり、Ｘはその他のアミノ酸）を成している。このようにコラーゲンは、プロリンとヒドロキシプロリンが繰り返される構造を有するが、繊維芽細胞は、これらのアミノ酸を生合成しないで、細胞周辺の細胞外基質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）で提供を受ける独特な生理学的な特性を示す。繊維芽細胞において、プロリンとヒドロキシプロリンの供給に関し、プロリダーゼが重要な役割をするが、Ｘａａ‐Ｐｒｏジペプチダーゼと呼ばれるプロリダーゼは、ペプチドのＣ‐末端に位置するプロリン若しくはヒドロキシプロリンを有するジペプチドを加水分解する細胞質内の酵素である。コラーゲンには、プロリン若しくはヒドロキシプロリンのようなイミノ酸（ｉｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）の含量が高いため、プロリダーゼは、コラーゲンの代謝において重要な役割をする。即ち、コラーゲンの分解過程中、最終段階に関与するプロリダーゼによってコラーゲンの主要アミノ酸若しくはイミノ酸であるプロリン若しくはヒドロキシプロリンに分解され、これによって生成されたプロリン若しくはヒドロキシプロリンは、７０〜９０％がリサイクルされ、コラーゲン合成に用いられる。したがって、（ヒドロキシ）プロリンのリサイクルを促進する酵素であるプロリダーゼの活性を促進させると、コラーゲンの生合成が増加し、シワ改善の効果が得られる。
【００６４】
若い皮膚細胞では、ＥＣＭの分解、プロリダーゼの活性など全ての生理的現象が正常に作動する。しかし、皮膚細胞が自然的な原因若しくは紫外線によって老化すると、皮膚細胞が合成するコラーゲンのようなＥＣＭ分子の量が減るだけでなく、プロリダーゼの活性も一緒に低下してコラーゲンの再生率が著しく低下し、これによって皮膚の弾力が減少してシワが発生する。
【００６５】
本発明の例示的な実施例によると、グリシル（ヒドロキシ）プロリンの末端に、脂肪族カルボン酸が導入されたジペプチド誘導体を皮膚に投与すると、皮膚組織を構成する繊維芽細胞の増殖を誘導するだけでなく（図１を参照）、真皮繊維芽細胞におけるコラーゲンの生合成を増進させる（図２を参照）。さらに、本発明によって合成されたジペプチド誘導体は、コラーゲンの再合成に関与するプロリダーゼの活性も向上させ（図３を参照）、特に皮膚バリアを通過し、皮膚細胞に対する浸透効果を向上させる（図４を参照）。また、脂肪族カルボン酸が導入・結合されたジペプチド誘導体を人体に投与した結果、シワ生成が著しく減少し（図５を参照）、シワ改善及び／または老化防止用化粧品の有効成分として活用することができる。
【００６６】
Ｂ．シワ改善用機能性化粧品
本発明は、コラーゲンの再生能力が良好であり、プロリダーゼの活性を促進させるだけでなく、細胞毒性のないジペプチド誘導体を有効成分として含有する皮膚シワ改善用及び／または老化防止用化粧品の組成物に関するものである。化粧品組成物のうち、有効成分であるジペプチド誘導体は、グリシル（ヒドロキシ）プロリンの末端にＣ４‐Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入・結合された化合物である。
【００６７】
例示的に、脂肪族カルボン酸が末端に導入されたグリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチド誘導体化合物は、化粧品の組成物中に、０．００１〜１０００μＭの濃度、好ましくは１〜５００μＭの濃度、さらに好ましくは１０〜２００μＭの濃度に含有することができるが、決して本発明がこれに限定されるものではない。
【００６８】
本発明による組成物は、化粧及び／または皮膚科学的に許容可能な媒質、即ち皮膚、粘膜、頭髪及び頭皮に適合な媒質を含有する。これは、局所適用に適合な全ての投与形態で、特に水性、水性／アルコール性、若しくは油性溶液、または水性、水性／アルコール性、若しくは油性ゲル、または固体若しくは混練無水生成物、水相に油相を分散させて得られたエマルジョン（Ｏ／Ｗ）若しくはその反対（Ｗ／Ｏ）、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球、イオン型（リポソム）及び／若しくは非イオン型の素嚢分散剤の形で提供することができる。これらの化粧品組成物は、当該分野における通常の方法によって製造することができる。また、本発明による化粧品組成物は、泡沫（ｆｏａｍ）の形、若しくは圧縮された推進剤をさらに含むエーロゾル組成物の形で用いることができる。本発明による化粧品の組成物中に含まれ得る様々な成分の量は、当該分野において通常に用いられる量である。
【００６９】
本発明による化粧品組成物を製造するための溶媒として、エタノール、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセレス‐２６、メチルグルセス‐２０、イソセチルミリストレート、イソセチルオクタノエート、オクチルドデシルミリストレート、オクチルドデカノール、イソステアリルイソステアレート、セチルオクタノエート及びネオペンチルグリコールジカプレートのうちから選択された１種以上を用いることができる。かかる溶媒を用いて本発明の化粧品組成物を製造する場合、化合物の種類によって、溶媒の混合比によって溶媒に対する化合物の溶解度が少しずつ相違するが、本発明の属する技術分野における通常の技術者であれば、製品の特性に応じて溶媒の種類及び使用量を適切に選択することができる。
【００７０】
本発明の化粧品組成物は、化粧品に配合可能な１）ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ピリドキシン、ニコチン酸、葉酸、ビタミンＣ及びこれらの塩や誘導体のような水溶性ビタミン、２）ビタミンＡ、カロチン、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＥ（トコペロール）、これらの誘導体（脂肪酸アスコルビンや酢酸αトコペロール）のような脂溶性ビタミン、３）コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ケラチンなどの高分子ペプチド、４）ヒドロキシエチルセルロース、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸若しくはその塩のような高分子多糖、５）セラミド、フィトスフィンゴシンなどのスフィンゴ脂質、及び／または６）褐藻、紅藻、緑藻エキス若しくはこれらから精製されたカラギーナン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム／カリウムなどの海草エキスから構成される群から選択される物質を含むことができる。
【００７１】
本発明の機能性化粧品の組成物には、前記成分と共に必要によって、通常、化粧品に配合される他の成分を配合することができる。添加できる配合成分には、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、抗酸化剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、発泡剤、充填剤、顔料、着色剤、ゲル化剤若しくは濃縮剤、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【００７２】
油脂成分は、１）トリ２‐エチルへキサン酸グリセリル、２‐エチルヘキサン酸セチル、脂肪酸アルコールのようなエステル系油脂、２）スクアレン、流動パラフィン、イソパラフィン、α‐オレフィンオリゴマー、ヴァセリンなどの炭化水素系油脂、３）ポリメチルシリコン、メチルフェニルシリコン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルポリシロキサン、ジメチルシロキサン‐メチルセチルオクシシロキサンの共重合体、アルキル変性シリコン油などのようなシリコン系油脂、４）ペルフルオロポリエーテルのようなフッ素系油脂、及び／または５）アボカド油、オリーブ油、油菜油、ひまし油、ひまわり油、ヤシ油、ホホバ油、卵黄油、牛脂、キャンデリラワックス、液状ラノリンなどのような動物若しくは植物油脂などから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。
【００７３】
保湿剤は、１）セリン、グルタミン、ソルビトール、マンニトール、ピロリドン‐カルボン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリグリセリン、乳酸のような水溶性低分子保湿剤、２）コレステロール、コレステロールエステルのような脂溶性低分子保湿剤、３）カルボキシビニルポリマー、ポリアスパラギン酸塩、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、水溶性キチン、キトサン、デキストランのような水溶性高分子、及び／または４）ポリビニルピロリドン‐エイコセン共重合体、ニトロセルロース、デキストリン脂肪酸エステル、高分子シリコンのような脂溶性高分子などから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。
【００７４】
エモリエント剤（軟化剤）は、長鎖アシルグルタミン酸コレステリルエステル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、１２‐ヒドロキシステアリン酸、ステアリン酸、ロジン酸、ラノリン脂肪酸コレステリルエステルなどから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。
【００７５】
界面活性剤は、１）自己乳化型モノステアリン酸グリセリン、プロピレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ラウリン酸アルカノールアミドなどのような非イオン性界面活性剤と、２）脂肪酸石けん、α‐アシルスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルリン酸塩、Ｎ‐アシルアミノ酸塩、アルキルスルホスクシン酸塩、ペルフルオロアルキルリン酸エステルのような陰イオン性界面活性剤と、３）塩化アルキルトリメチルアンモニウム、臭化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、ステアリン酸エチルアミノエチルアミド、ラノリン誘導体の第４級アンモニウム塩のような陽イオン性界面活性剤、及び／または４）カルボキシベタイン系、アミドベタイン系、スルホベタイン系、アミノカルボン酸塩系、イミダゾリン系誘導体のような両性界面活性剤から少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。これらの界面活性剤は、乳化剤若しくは保湿剤として用いることができる。
【００７６】
有機及び無機顔料は、ケイ酸、無水ケイ酸、タルク、セリサイト、カオリン、クレイ、ベントナイト、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化チタン、酸化アルミニウム、硫酸カルシウム、硫酸バリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化クロム、水酸化クロム、カラミン及びこれらの複合体などの無機顔料と、ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ビニル樹脂、尿素樹脂、フェノール樹脂、フッ素樹脂、ケイ素樹脂、アクリル樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、ポリカーボネート樹脂、セルロース、シルクパウダー、ＣＩピグメントイエローなどの有機顔料、及び前述した無機顔料と有機顔料の複合顔料などから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。
【００７７】
有機粉体は、ステアリン酸カルシウムなどの金属石けんと、セチルリン酸亜鉛ナトリウム、ラウリン酸亜鉛、ラウリン酸カルシウムなどのアルキルリン酸金属塩と、Ｎ‐ラウロイル‐β‐アラニンカルシウム、Ｎ‐ラウロイル‐β‐アラニン亜鉛、Ｎ‐ラウロイルグリシンカルシウムなどのアシルアミノ酸多価金属塩と、Ｎ‐ラウロイル‐タウリンカルシウム、Ｎ‐パルミトイル‐タウリンカルシウムなどのアミドスルホン酸多価金属塩と、Ｎ‐エプシロン‐ラウロイル‐Ｌ‐リジン、Ｎ‐エプシロン‐パルミトイルリジン、Ｎ‐α‐パリトイルオルニチン、Ｎ‐α‐ラウロイルアルギニン、Ｎ‐α‐硬化牛脂脂肪酸アシルアルギニンなどのＮ‐アシル塩基性アミノ酸と、Ｎ‐ラウロイルグリシルグリシンなどのＮ‐アシルポリペプチドと、α‐アミノカプリル酸、α‐アミノラウリン酸などのα‐アミノ脂肪酸と、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ジビニルベンゼン‐スチレンの共重合体、四フッ化エチレンなどから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。
【００７８】
殺菌剤は、ヒノキチオル、トリクロサン、トリクロロヒドロキシジフェニルエーテル、クロルヘキシジングルコン酸塩、フェノキシエタノール、レジョルシン、イソプロピルメチルフェノール、アズレン、サリチル酸、ジンクピリチオン、塩化ベンザルコニウム、感光素３０１号、モノニトログアイアコールナトリウム、ウンデシレン酸などから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。
【００７９】
酸化防止剤は、ブチルヒドロキシアニソール、ガーリック酸プロピル、エリソルビン酸などを含むが、本発明がこれに制限されるものではない。
【００８０】
抗酸化剤は、ビタミン、例えばビタミンＣ及びその誘導体、例えばアスコルビン酸酢酸塩、リン酸塩及びパルミチン酸塩と、ビタミンＡ及びその誘導体と、葉酸及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、例えばトコフェリルアセテートと、フラボン若しくはフラボノイドと、アミノ酸、例えばヒスチヂン、グリシン、チロシン、トリプトファン及びこれらの誘導体と、イミダゾール、例えばシス‐若しくはトランス‐ウロカニン酸及びこれらの誘導体と、ペプチド、例えばＤ，Ｌ‐カルノシン、Ｄ‐カルノシン、Ｌ‐カルノシン及びこれらの誘導体と、カロチノイド及びカロチン、例えばα‐カロチン、β‐カロチンと、リコピンと、尿酸及びその誘導体と、α‐ヒドロキシ酸、例えばクエン酸、乳酸、リンゴ酸と、α‐ヒドロキシ脂肪酸、例えばパルミチン酸、フィチン酸、ラクトフェリンと、スチルベン及びその誘導体と、マンノース及びその誘導体と、リボ酸及びその誘導体、例えばジヒドロリボ酸と、フェルラ酸及びその誘導体と、チオル、例えばグルタチオン、システイン及びシスチンなどから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。ビタミンＡ若しくはビタミンＡ‐パルミテート（レチノール）及びビタミンＥを添加することが特に望ましい。
【００８１】
ｐＨ調整剤は、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸ナトリウム、フマル酸、フマル酸ナトリウム、スクシン酸、スクシン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸一水素ナトリウムなどから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。アルコールは、セチルアルコールなどの高級アルコールを含む。
【００８２】
発泡剤は、例えばジナトリウム‐Ｎ‐カルボキシエトキシエチル‐Ｎ‐（ココイルアミドエチル）アミノアセテート、ナトリウムラウリルエーテルスルフェート、ナトリウムラウロイルサルコシネート、トリエタノールアミンラウリルスルフェート及びナトリウムココイルイセチオネート及びココナッツ脂肪酸の混合物などから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。
【００８３】
充填剤は、特にダウコーニング社でＰｏｌｙｔｒａｐという名前で市販中のエチレングリコールジメタクリレート／ラウリルメタクリレートの共重合体のようなアクリル共重合体などから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。
【００８４】
紫外線吸収剤としては、パラアミノベンゾ酸、パラアミノベンゾ酸エチル、パラアミノベンゾ酸アミル、パラアミノベンゾ酸オクチル、サリチル酸エチレングリコール、サリチル酸フェニル、サリチル酸オクチル、サリチル酸ベンジル、パラメトキシケイ皮酸‐２‐エトキシエチル、パラメトキシケイ皮酸オクチル、ジイソプロピル‐ジイソプロピルケイ皮酸エステル混合物、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、ヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸及びその塩、ジヒドロキシメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシベンゾフェノン、テトラヒドロキシベンゾフェノンなどから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。
【００８５】
顔料及び顔料類似効果を有する粉末は、鉄酸化物、アルミニウムシリケート、例えばオーカー、チタン酸化物、マイカ、カオリン、マンガン含有クレイ、カルシウムカーボネート、フレンチチョーク、マイカ‐チタン酸化物、マイカ‐チタン酸化物‐鉄酸化物、ビスマスオキシクロライド、ナイロンビーズ、セラミックビーズ、粉末状天然有機化合物、例えば粉砕された固体藻類（ａｌｇａｅ）、粉砕された植物部分などから少なくとも１つを含むが、これに制限されるものではない。 
【００８６】
着色剤には、処理若しくは未処理された染料を用いることができる。ゲル化剤若しくは濃縮剤として、天然ゴム（キサンタンガム）、ポリサカライド（ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチルセルロース）、カルボキシビニル重合体（カルボマー）、アクリル共重合体を用いることができる。
【００８７】
特に、その他に添加できる配合成分はこれに限定されるものではなく、また、前記いずれの成分も、本発明の目的及び効果を損傷させない範囲内で配合することが可能であるが、好ましくは０．０１〜５重量％、より好ましくは０．０１〜３重量％の割合で配合することができる。
【００８８】
本発明の化粧品は、溶液、油化物、粘性混合物などの形状を有することができる。本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分として前記化合物の他に化粧品組成物に通常用いられる成分を含むことができ、例えば、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤及び担体を含む。
【００８９】
本発明の化粧品組成物は、皮膚の老化防止効果を有する化粧品、洗顔剤及びシャンプなどに様々に適用することができる。本発明の化粧品組成物は、化粧品業界において通常製造される任意の剤形に製造することができる。例えば、乳液、クリーム、化粧水、パック、ファンデーション、ローション、美容液、毛髪化粧料などが挙げられる。
【００９０】
本発明の化粧品組成物を添加できる製品には、例えば、各種クリーム、ローション、スキンなどのような化粧品類と、シャンプ、リンス、クレンジング、洗顔剤、石けん、トリートメント、美容液などがある。具体的には、本発明の化粧品組成物は、スキンローション、スキンソープナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石けん、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション及びボディクレンザーのような様々な剤型に製造することができる。
【００９１】
本発明の剤形がペースト、クリーム若しくはゲルの場合、担体成分として、動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク若しくは酸化亜鉛などを使用することができる。
【００９２】
本発明の剤形がパウダー若しくはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウム水酸化物、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーを使用することができ、特にスプレーの場合は、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。
【００９３】
本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合には、担体成分として、溶媒、溶媒化剤若しくは乳濁化剤が用いられる。例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエイト、プロピレングリコール、１，３‐ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール若しくはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００９４】
本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノール、若しくはプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトルエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシード、ベントナイト、アガー若しくはトラガントなどを用いることができる。
【００９５】
本発明の剤形が界面活性剤を含有するクレンジングの場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリード、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、リノリン誘導体若しくはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが使用できる。
【００９６】
以下、例示的な実施例を参照し、本発明について説明するが、決して本発明が下記に記述される実施例に記載の内容に限定されるものではない。
【００９７】
実施例１：ブチル酸（Ｃ４）で置換されたグリシルプロリン（Ｂｕｔｙｌ‐ＧＰ）の合成
固体状ジペプチドを合成するために、２‐クロロトリチル樹脂に３当量のプロリンをローディングし、１ｍＭのプロリン結合樹脂に、溶媒としてジメチルフォルムアミド１０ｍｌを加えて常温で３０分スウェリングした。３当量の９‐フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で保護されたグリシン溶液（Ｆｍｏｃ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ）１ｍＭを、樹脂に結合されたプロリンに加えてペプチドカップリング反応を行った。ペプチドカップリング試薬として６‐クロロ‐１‐ヒドロキシ‐１Ｈ‐ベンゾトリアゾル（Ｃｌ‐ＨＯＢｔ）を、塩基にはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を使用し、ペプチドカップリング反応は常温で約３時間行った。ペプチドカップリング反応前後にそれぞれ３回に亘り、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）若しくはジクロロメタン（ＤＣＭ）１０ｍｌを加えて常温で５分間洗浄した。グリシンに結合された保護基を除去するため、濃度２０％のピペリジン溶液を１０ｍｌ加えて常温で約２０分間反応させた。３回に亘ってＤＭＦ１０ｍｌを加え、常温で約５分間洗浄した。合成されたジペプチドに炭素水４つの飽和カルボン酸であるブチル酸を加えて２４時間程放置し、グリシル（ヒドロキシ）プロリンジペプチドのＮ‐末端にオクタン酸のカルボキシ基がアミド結合するようにした。２つのアミノ酸がカップリングされた後、ジペプチドのＮ‐末端のアミン基に、アシル無水物（ａｃｙｌａｎｈｙｄｒｉｄｅ）と４‐（Ｎ，Ｎ‐ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＭＡＰ）を一緒に反応させて、Ｎ‐末端でアミド結合を形成したり、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）される脂肪族カルボン酸とＮ，Ｎ‐ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１‐ヒドロキシ‐７‐アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）或いは１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を一緒に使用し、アミド結合を形成した。ブチル酸の結合によってレジンに生成された高分子ビーズにジクロロメタンを１０ｍｌ加え、常温で約５分間洗浄した。切断溶液として２％濃度のトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＦＡ）を２０ｍｌ加え、常温で３０分間反応させて、高分子ビーズからブチル酸で改質されたジペプチドを分離し、ジクロロメタンを用いて洗浄した。
【００９８】
ジエチルエーテルを１００ｍｌ加えて０〜５℃で１時間程度反応させ、ＴＦＡ水溶液に溶解されたブチル酸グリシルプロリンを低温で沈殿させ、フィルタリングを通じて溶媒を除いた結晶のみを得た。ろ過されたブチル酸グリシルプロリンを常温で約３時間放置し、乾燥させた。乾燥されたｃｒｕｄｅブチル酸グリシルプロリンを高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を利用して４５分間分析した後、８時間の間精製した（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  １０ＡＶＰ  Ｓｙｓｔｅｍ）。カラムにＳＨＩＭＡＤＺＵ  Ｃ１８分析カラムを使用し、展開溶媒としてＡバッファは０．０５％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏを、Ｂバッファは０．０５％のＴＦＡ／アセトニトリルを使用した。アセトニトリルの濃度勾配は、３０分に亘って０〜６０％にし、流量（ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）は１ｍｌ／ｍｉｎ、流入体積（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）は１００μｌ（０．５ｍｇ／ｍｌ）、２３０ｎｍ波長で測定した。ＨＰＬＣ分析を通じて、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １４．８６７ｍｉｎｕｔｅで測定されたピークに対応する精製された（純度９９．３％）ブチル酸グリシルプロリン（Ｂｕｔｙｌ‐ＧＰ、Ｃ４）を質量分析法（Ｋｒａｔｏｓ  ＰＣ  Ａｘｉｍａ  ＣＦＲ  Ｖ２．３．５）で分析した。精製された化合物の分子量（２４３．０Ｄａ）及び構造式（Ｃ１１Ｈ１８Ｎ２Ｏ４）を確認し、意図したジペプチド誘導体が合成されたことを確認した。凍結乾燥機を使用し、精製されたブチル酸グリシルプロリンを−４０℃で２日間凍結乾燥した後、包装容器に包装し、−１５℃の低温で保管して後続実験に使用できるようにした。
【００９９】
実施例２：ペンタン酸（Ｃ５）で置換されたグリシルプロリン（Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ）の合成
グリシルプロリンジペプチドのＮ‐末端に炭素数５つのペンタン酸を結合させたことを除き、実施例１の手順を繰り返した。ＨＰＬＣ分析を通じて、精製されたペンタン酸グリシルプロリン（Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ、Ｃ５）を質量分析法で分析し、精製された化合物の分子量を確認した。凍結乾燥機を使用し、精製されたペンタン酸グリシルプロリンを−４０℃で２日間凍結乾燥した後、包装容器に包装し、−１５℃の低温で保管して後続実験に使用できるようにした。
【０１００】
実施例３：オクタン酸（Ｃ８）で置換されたグリシルプロリン（Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ）の合成
グリシルプロリンジペプチドのＮ‐末端に炭素数８つのオクタン酸を結合させたことを除き、実施例１の手順を繰り返した。ＨＰＬＣ分析を通じて、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ２６．２５０ｍｉｎｕｔｅで測定されたピークに対応する精製された（純度９５．８％）オクタン酸グリシルプロリン（Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ、Ｃ８）を質量分析法で分析し、精製された化合物の分子量（２９９．１Ｄａ）及び構造式（Ｃ１５Ｈ２６Ｎ２Ｏ４）を確認し、意図したジペプチド誘導体が合成されたことを確認した。凍結乾燥機を使用し、精製されたオクタン酸グリシルプロリンを−４０℃で２日間凍結乾燥した後、包装容器に包装し、−１５℃の低温で保管して後続実験に使用できるようにした。合成されたオクタン酸グリシルプロリンに対するＮＭＲ分析結果を下記に示す。
【０１０１】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：ｄ（ｐｐｍ）＝０．８６（ｔ、３Ｈ）１．１５〜１．２４（ｍ、８Ｈ）、１．４８（ｍ、２Ｈ）、１．８３〜１．９１（ｍ、２Ｈ）、２．１２〜２．１５（ｍ、４Ｈ）、３．４０〜３．５９（ｍ、２Ｈ）３．９３〜４．０２（ｍ、２Ｈ）、４．２０〜４．２４（ｍ、１Ｈ）、７．９３〜７．９４（ｍ、１Ｈ）
【０１０２】
実施例４：デカン酸（Ｃ１０）で置換されたグリシルプロリン（Ｄｅｃａｎｏｙｌ‐ＧＰ）の合成
グリシルプロリンジペプチドのＮ‐末端に炭素数１０つのデカン酸を結合させたことを除き、実施例１の手順を繰り返した。ＨＰＬＣ分析を通じて、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １５．１２５ｍｉｎｕｔｅで測定されたピークに対応する精製された（純度９４．５％）デカン酸グリシルプロリン（Ｄｅｃａｎｏｙｌ‐ＧＰ、Ｃ１０）を質量分析法で分析し、精製された化合物の分子量（３２７．３Ｄａ）及び構造式（Ｃ１７Ｈ３０Ｎ２Ｏ４）を確認した。凍結乾燥機を使用し、精製されたデカン酸グリシルプロリンを−４０℃で２日間凍結乾燥した後、包装容器に包装し、−１５℃の低温で保管して後続実験に使用できるようにした。
【０１０３】
比較例１〜４：ジペプチド及びジペプチド誘導体の合成
カルボン酸で置換されていないグリシルプロリンジペプチドと、このジペプチドのＮ‐末端にそれぞれ炭素数３つのプロパン酸、１２つのラウリン酸、１６つのパルミチン酸を結合させたことを除いては、実施例１の手順を繰り返し、置換されていないグリシルプロリン（ＧＰ、Ｃ０；比較例１）、プロパン酸グリシルプロリン（Ｐｒｏｐｙｌ‐ＧＰ、Ｃ３；比較例２）、ラウリン酸グリシルプロリン（Ｌａｕｒｙｌ‐ＧＰ、Ｃ１２；比較例３）、パルミチン酸グリシルプロリン（Ｐａｌｍｉｔｙｌ‐ＧＰ、Ｃ１６；比較例４）を合成した。
【０１０４】
プロパン酸グリシルプロリンに関し、ＨＰＬＣ分析を通じて、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １２．８２５ｍｉｎｕｔｅで測定されたピークに対応する精製された（純度９８．９％）プロパン酸グリシルプロリン（Ｐｒｏｐｙｌ‐ＧＰ、Ｃ３）を質量分析法で分析し、精製された化合物の分子量（２２８．９Ｄａ）及び構造式（Ｃ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ４）を確認した。また、ラウリン酸グリシルプロリンに関し、ＨＰＬＣ分析を通じて、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ２０．７４２ｍｉｎｕｔｅで測定されたピークに対応する精製された（純度９８．２％）ラウリン酸グリシルプロリン（Ｌａｕｒｙｌ‐ＧＰ、Ｃ１２）を質量分析法で分析し、精製された化合物の分子量（３５５．１Ｄａ）及び構造式（Ｃ１９Ｈ３４Ｎ２Ｏ４）を確認した。さらに、パルミチン酸グリシルプロリンに関し、ＨＰＬＣ分析を通じて、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ２０．４４２ｍｉｎｕｔｅで測定されたピークに対応する精製された（純度９７．８％）パルミチン酸グリシルプロリン（Ｐａｌｍｉｔｙｌ‐ＧＰ、Ｃ１６）を質量分析法で分析し、精製された化合物の分子量（４１０．０Ｄａ）及び構造式（Ｃ２３Ｈ４２Ｎ２Ｏ４）を確認した。
【０１０５】
実験例１：細胞増殖誘導効果
実施例１〜４において合成したＢｕｔｙｌ‐ＧＰ、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ、Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ及びＤｅｃａｎｏｙｌ‐ＧＰの細胞増殖誘導効果を確認した。対照群として、脂肪酸が結合されていないＧＰ、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ、Ｌａｕｒｙｌ‐ＧＰ、Ｐａｌｍｉｔｙｌ‐ＧＰを用いた。ヒトの真皮繊維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ｎｅｏｎａｔａｌ）を使用し、細胞増殖能力を確認するため、水溶性テトラゾリウム塩（ｗａｔｅｒ‐ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔ  Ｗｓｔ）‐１分析を利用してｆｏｒｍａｚａｎ発色物質が生成されることをＥＬＩＳＡで測定した。Ｗｓｔ‐１分析によると、代謝的に旺盛な活動をする細胞のミトコンドリア電子伝達系に存在する脱水素酵素であるｓｕｃｃｉｎａｔｅｔｒｚｏｌｕｍ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅが生きている細胞においてのみ有効であるため、発色強度を比較して細胞数を確認することができる。４８‐ウェルプレートの各ウェル（ｗｅｌｌ）に、ヒトの真皮繊維芽細胞を２×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌに置き、３７℃及び５％のＣＯ２条件を有するインキュベータで２４時間の間培養した。培養後、各ウェルの培地を除去し、新しい無血漿培地に取り替えた。再び２４時間の間培養した後、それぞれのウェルに、上記で合成されたジペプチド誘導体と対照群のジペプチド（誘導体）を濃度毎に（１０、５０、１００、２００μＭ）処理し、さらに７２時間培養した。培養が完了した後、３０ｍｌのＷｓｔ‐１溶液（Ｅｚ‐Ｃｙｔｏｘ）をそれぞれのウェルに加えた。さらに２時間培養した後、Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用し、５４０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。測定された各試料の吸光度（ＯＤｓａｍｐｌｅ）と、脱イオン水（ＤＷ）で処理した陰性対照群試料の吸光度（ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ）とを基準に、細胞増殖率を下記の式（Ｉ）によって換算した。
【０１０６】
細胞増殖率（％）＝［ＯＤｓａｍｐｌｅ／ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ］×１００（Ｉ）
【０１０７】
本実施例によって、ジペプチド誘導体の処理による繊維芽細胞の成長促進率を測定したグラフを図１に示し、その結果を表１に示す。本発明によって合成されたＢｕｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ４）、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ５）、Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ８）及びＤｅｃａｎｏｙｌ‐ＧＰ（Ｃ１０）で改質されたジペプチド誘導体を投与すると、細胞成長率が濃度依存的に大きく増加した。一方、脂肪族カルボン酸で改質されていないＧＰの場合、成長促進誘導効果がなく、Ｐｒｏｐｙｌ‐ＧＰ（Ｃ３）の場合は、細胞成長誘導効果が微弱であった。したがって、適切な炭素数を有する脂肪族カルボン酸で改質されたジペプチドの細胞透過力が向上したものと考えられる。Ｌａｕｒｙｌ‐ＧＰ（Ｃ１２）及びＰａｌｍｉｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ１６）は、細胞成長率が寧ろ低下したが、これは、脂肪族カルボン酸が細胞毒性を誘導したためであると推測される。
【０１０８】
【表１】
2017505341.tif 000007
【０１０９】
実験例２：コラーゲンの生合成の誘導
実施例１〜４において合成したＢｕｔｙｌ‐ＧＰ、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ、Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ及びＤｅｃａｎｏｙｌ‐ＧＰのコラーゲン生合成誘導効果を確認した。対照群として、脂肪酸が結合されていないＧＰ、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ、Ｌａｕｒｙｌ‐ＧＰ、Ｐａｌｍｉｔｙｌ‐ＧＰを用いた。ヒトの真皮繊維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ｎｅｏｎａｔａｌ）を使用し、コラーゲン生合成効果のために、主に肌細胞に存在するコラーゲンの基本ユニットであるＰｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、ＭＫ１０１）を使用して測定した。４８‐ウェルプレートの各ウェルに、繊維芽細胞を5×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌに置き、３７℃及び５％のＣＯ２条件を有するインキュベータで２４時間の間培養した。培養後、各ウェルの培地を除去し、新しい無血漿培地に取り替えた。再び２４時間の間培養した後、それぞれのウェルに、上記で合成されたジペプチド誘導体と対照群のジペプチド（誘導体）を濃度毎に（１０、５０、１００、２００μＭ）処理し、培養が完了した後、製造社の指示に従ってＰｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉに対するＥＬＩＳＡを行った。本実施例によってコラーゲン生合成増加効果を測定したグラフを図２に示し、下記の表２にその結果を示す。図２及び表２に示すように、本発明によって合成されたＢｕｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ４）、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ５）、Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ８）及びＤｅｃａｎｏｙｌ‐ＧＰ（Ｃ１０）で改質されたジペプチド誘導体を投与すると、コラーゲンの生合成が大きく増加した。特にＰｅｎｔｙｌ‐ＧＰとＯｃｔｙｌ‐ＧＰでコラーゲンの生合成が大きく誘導された。一方、脂肪族カルボン酸で改質されていないＧＰを投与してもコラーゲン生合成誘導効果はなく、Ｐｒｏｐｙｌ‐ＧＰ（Ｃ３）の場合にも、コラーゲン生合成誘導効果は微弱であった。Ｌａｕｒｙｌ‐ＧＰ（Ｃ１２）及びＰａｌｍｉｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ１６）は、細胞毒性によってコラーゲンの生合成を阻害した。
【０１１０】
図１、図２及び表１、表２の結果より、カルボン酸で置換されていないＧＰの場合、ｐｒｏｌｉｄａｓｅの活性を増加させることが知られているにも関わらず、細胞が透過できず、細胞増殖及びコラーゲンの生合成を誘導できなかったことが分かる。一方、本発明に従い、Ｃ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸を導入することでジペプチド誘導体が細胞膜を透過し、細胞増殖及びコラーゲンの生合成を誘導した。特にＣ５〜Ｃ８の脂肪族カルボン酸で改質されたジペプチド誘導体で、その効果が最も優れた。一方、炭素数４未満の脂肪族カルボン酸は、細胞増殖及びコラーゲンの生合成の誘導に限界があり、炭素数１０を越える脂肪族カルボン酸は、過度の疎水性のため、細胞膜に損傷を与え、細胞毒性を誘発して細胞増殖及びコラーゲンの生合成を阻害するので、ジペプチドを細胞に投与するための脂肪族カルボン酸には適合しないことが分かる。
【０１１１】
【表２】
2017505341.tif 000008
【０１１２】
実験例３：Ｐｒｏｌｉｄａｓｅの活性
肌細胞においてコラーゲンの再合成に関与するプロリダーゼの活性誘導効果を確認するため、プロリダーゼの活性分析を行った。実施例１〜４において合成したＢｕｔｙｌ‐ＧＰ、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ、Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ及びＤｅｃａｎｏｙｌ‐ＧＰのコラーゲン生合成誘導効果を確認した。対照群として、脂肪酸が結合されていないＧＰ、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ、Ｌａｕｒｙｌ‐ＧＰ、Ｐａｌｍｉｔｙｌ‐ＧＰを、陽性対照群としてＩＧＦを用いた。これらをそれぞれ濃度毎に処理し、７２時間培養した。細胞溶解液中のプロリダーゼの活性を測定し、酵素の基質として９４ｍｍｏｌのグリシルプロリンを用いた。図３は、本実施例によって脂肪族カルボン酸で改質されたグリシルプロリンによるプロリダーゼの活性測定結果を示し、その結果を下記の表３に示す。本発明によって合成されたＢｕｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ４）、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ５）、Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ（Ｃ８）及びＤｅｃａｎｏｙｌ‐ＧＰ（Ｃ１０）は、全てプロリダーゼの活性を大きく増加させ、特にＣ５とＣ８でプロリダーゼの活性促進効果が最も優れて、プロリダーゼの活性を増加させるものとして知られているＩＧＦを処理した場合に近接した。
【０１１３】
一方、ＧＰ（Ｃ０）はプロリダーゼの活性を殆ど増加させず、Ｐｒｏｐｙｌ‐ＧＰ（Ｃ３）は、酵素活性増進効果が微弱であった。Ｌａｕｒｙｌ‐ＧＰは、ＧＰに比べても寧ろプロリダーゼ活性誘導度合いが低下し、Ｐａｌｍｉｔｙｌ‐ＧＰは、過度の細胞毒性によってプロリダーゼの活性を大きく抑制した。Ｃ４〜Ｃ１０の炭素を有する脂肪族カルボン酸で改質されたグリシルプロリン誘導体は、細胞透過性に優れて細胞内のプロリダーゼの活性を増加させ、プロリンのリサイクル効率を高め、その結果、真皮繊維芽細胞におけるコラーゲンの生合成率を増加させて細胞増殖を誘導することと考えられる。
【０１１４】
【表３】
2017505341.tif 000009
【０１１５】
実験例４：皮膚透過力の測定
実施例１〜４において合成したＢｕｔｙｌ‐ＧＰ、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ、Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ及びＤｅｃａｎｏｙｌ‐ＧＰに対する皮膚透過力を測定した。対照群として、脂肪酸が結合されていないＧＰ、Ｐｅｎｔｙｌ‐ＧＰ、Ｌａｕｒｙｌ‐ＧＰ、Ｐａｌｍｉｔｙｌ‐ＧＰを用いた。皮膚透過力を確認するため、ヘアレスマウスを用いたＦｒａｚ  ｃｅｌｌ試験法を利用した。これらのジペプチド及びジペプチド誘導体を０．３％の溶液でマウスの皮膚にパッチし、２４時間が経過した後、下層溶液を取ってＨＰＬＣで定量分析を行った。図４は、本実施例によって測定した皮膚透過力の測定結果を示し、その測定結果を下記の表４に示す。図４及び表４に示すように、ＧＰジペプチドの場合、皮膚にパッチした後、２４時間が過ぎても検出量が微弱であったが、ＧＰ脂肪酸誘導体の場合には３０倍以上、皮膚透過度が改善された。特に、Ｃ４〜Ｃ１０の脂肪族カルボン酸が導入されたジペプチド誘導体は、皮膚透過率が大きく向上した。Ｃ１２及びＣ１６で改質されたジペプチドは、毒性を示すだけではなく、細胞透過率もよくなかった。これは、皮膚に損傷を与え、下層部で検出されなかったものと予想される。
【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
実施例５：皮膚のシワ改善効果試験
実施例３において製造されたオクタン酸で改質されたグリシル（ヒドロキシ）プロリン（Ｏｃｔｙｌ‐ＧＰ、Ｃ８）を人体に投与し、時間経過による皮膚のシワ改善効果を評価した。Ｓｐｉｎｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｓｉａ（本社はフランス、支社はタイ王国・バンコク）に依頼し、４４〜６１歳の正常皮膚を持つ女性２０人を対象に行った。オクタン酸グリシル（ヒドロキシ）プロリンを０．００５％（５０ｐｐｍ）ずつ、１日２回投与し、レプリカ分析（Ｒｅｐｌｉｃａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を通じて、初期・４週経過・８週経過の時点で皮膚のシワ改善程度を評価した。図５は、本実施例による臨床試験の結果を示すグラフであり、下記の表５にその結果を示す。本発明によって脂肪酸で改質されたグリシル（ヒドロキシ）プロリン誘導体が、シワを減少させるのに大きい効果があった。
【０１１８】
【表５】
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Number of wrinkles:シワの数
Total wrinkle area（ｍｍ２）:シワの合計面積（ｍｍ２）
Total wrinkle length（ｍｍ）:シワの合計長さ（ｍｍ）
Mean wrinkle length（ｍｍ）:シワの平均長さ（ｍｍ）
【０１１９】
本願は、大韓民国の政府（中小企業庁）の支援で、中小企業技術情報振興院の中小企業融複合技術開発事業（ＳＤ１２３０７３）の支援を受けて行われた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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