(57)【要約】  モグロシド化合物およびモグロシド化合物を含有する組成物の、組み換え的および酵素的生産のための方法が、本発明により提供される。
2017529860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１または２以上を含む組換え宿主であって：
（ａ）スクアレンエポキシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）エポキシドヒドロラーゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するＵＧＴ１５７６ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ４３０ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｈ）配列番号６８に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ１６９７ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｉ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＵＧＴ１１７８９ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｊ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴ９８ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｋ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴＳＫ９８ポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで前記遺伝子の少なくとも１つは組換え遺伝子であり；
宿主は、モグロール前駆体、モグロシド前駆体、および／またはモグロシド化合物を生産することができる、
前記組換え宿主。
【請求項２】
請求項１に記載の組換え宿主であって、
（ａ）スクアレンエポキシダーゼポリペプチドが、配列番号５４に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドが、配列番号４３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）シトクロムＰ４５０ポリペプチドが、配列番号４４に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＣＹＰ５４９１ポリペプチド、および／または配列番号７４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８ポリペプチドを含み；
（ｄ）シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドが、配列番号４６に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＣＰＲ４４９７ポリペプチドを含み；および／または
（ｅ）エポキシドヒドロラーゼポリペプチドが、配列番号３８に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ１ポリペプチド、または配列番号４０に記載のアミノ酸配列に対して６５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ２ポリペプチドを含む、
前記組換え宿主。
【請求項３】
以下の１または２以上を含む組換え宿主であって：
（ａ）ジオキシドスクアレンの変換を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｂ）オキシドスクアレンの変換を触媒してククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｃ）２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｄ）ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｅ）ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；または
（ｆ）１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｇ）１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒してモグロールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；または
（ｈ）モグロシド前駆体のグリコシル化を触媒してモグロシド化合物を生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
ここで前記遺伝子の少なくとも１つが組換え遺伝子である、
前記組換え宿主。
【請求項４】
配列番号５４に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するスクアレンエポキシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、請求項３に記載の組換え宿主。
【請求項５】
組換え宿主が、ラノステロールシンターゼ（ＥＲＧ７）ポリペプチドの発現を低減するように改変されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項６】
ＥＲＧ７ポリペプチドが、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項５に記載の組換え宿主。
【請求項７】
モグロシド前駆体および／またはモグロシド化合物を生産する方法であって、
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主を、培養培地中、請求項１〜６のいずれか一項に開示の遺伝子が発現される条件下で増殖させること；
ここで、モグロシド前駆体および／またはモグロシド化合物は、組換え宿主によって合成され；および、
（ｂ）任意に、モグロシド前駆体および／またはモグロシド化合物を単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
モグロシド前駆体が、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールをエポキシ化して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを合成し、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを加水分解してモグロールを合成することによって合成された、モグロールである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを合成するための１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのエポキシ化が、配列番号７４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８ポリペプチドによって触媒される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
モグロール前駆体をin vitroで生産する方法であって、
（ａ）ジオキシドスクアレンを、ジオキシドスクアレンの変換を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｂ）オキシドスクアレンを、オキシドスクアレンの変換を触媒してククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｃ）２４，２５エポキシククルビタジエノールを、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｄ）ククルビタジエノールを、ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｅ）ククルビタジエノールを、ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｆ）１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
モグロールをin vitroで生産する方法であって、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒してモグロールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること、を含む、前記方法。
【請求項１２】
モグロシド化合物をin vitroで生産する方法であって、モグロシド前駆体を、モグロシド前駆体のグリコシル化を触媒してモグロシド化合物を生産することができる１または２以上の酵素と接触させること、を含む、前記方法。
【請求項１３】
モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシド化合物を単離することをさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項３に記載の組換え宿主または請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、
（ａ）ジオキシドスクアレンの変換を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素が、配列番号４３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するククルビタジエノールシンターゼを含み；
（ｂ）オキシドスクアレンの変換を触媒してククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素が、配列番号４３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するククルビタジエノールシンターゼを含み；
（ｃ）２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＣＹＰ５４９１を含み；
（ｄ）ククルビタジエノールの変換を触媒して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＣＹＰ５４９１を含み；
（ｅ）ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素が、配列番号７４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８を含み；
（ｆ）１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素が、配列番号７４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８を含み；
（ｇ）１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールの変換を触媒してモグロールを生産することができる１または２以上の酵素が、配列番号３８に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ１、または配列番号４０に記載のアミノ酸配列に対して６５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ２を含むポリペプチドを含み；および／または、
（ｈ）モグロシド前駆体のモグロシド化合物への変換を触媒することができる１または２以上の酵素が、配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するＵＧＴ１５７６；配列番号５３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴ９８；配列番号５０に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴＳＫ９８；配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ４３０；配列番号６８に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ１６９７；または配列番号７２に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＵＧＴ１１７８９を含む、
前記方法。
【請求項１５】
モグロシド化合物を生産する方法であって、以下の１または２以上：
（ａ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するＵＧＴ１５７６ポリペプチド；
（ｂ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ４３０ポリペプチド；
（ｃ）配列番号６８に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ１６９７ポリペプチド；
（ｄ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＵＧＴ１１７８９ポリペプチド；
（ｅ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴ９８ポリペプチド；または
（ｆ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴＳＫ９８ポリペプチド；
を発現する組換え宿主を、モグロシド前駆体と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１６】
モグロシド前駆体が、植物由来または合成である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
モグロシド化合物を単離することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
モグロシド化合物が、
（ａ）Ｃ３位でグリコシル化されたモグロール；または
（ｂ）Ｃ２４位でグリコシル化されたモグロール；または
（ｃ）Ｃ３位およびＣ２４位でグリコシル化されたモグロール、
である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主、または請求項７もしくは１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
モグロシド化合物が、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶ、またはシアメノシドの１または２以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主、または請求項７もしくは１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
モグロール前駆体が、スクアレン、ジオキシドスクアレン、オキシドスクアレン、２４，２５エポキシククルビタジエノール、ククルビタジエノール、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール、１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノール、または１１−オキソ−モグロールの１または２以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主、または請求項１０もしくは１３に記載の方法。
【請求項２１】
モグロシド前駆体が、モグロール、グリコシル化モグロール、ジグリコシル化モグロールまたはトリグリコシル化モグロールの１または２以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主、または請求項７〜９、１２もしくは１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
組換え宿主が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である微生物を含む、請求項７、８〜１３もしくは１５〜１７のいずれか一項に記載の方法、または請求項１〜６、１４もしくは１８〜２１のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項２３】
細菌細胞が、Escherichia細菌細胞、Lactobacillus細菌細胞、Lactococcus細菌細胞、Corynebacterium（Cornebacterium）細菌細胞、Acetobacter細菌細胞、Acinetobacter細菌細胞、またはPseudomonas細菌細胞を含む、請求項２２に記載の細菌細胞。
【請求項２４】
酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhous、またはCandida albicans種由来の細胞である、請求項２２に記載の酵母細胞。
【請求項２５】
酵母細胞が、Saccharomyceteである、請求項２４に記載の酵母細胞。
【請求項２６】
酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae種由来の細胞である、請求項２５に記載の酵母細胞。
【請求項２７】
１または２以上の遺伝子が、融合タグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜６または１４のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項２８】
融合タグが、タンパク質またはポリペプチドである、請求項２７に記載の組換え宿主。
【請求項２９】
融合タグが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ）、およびＦＬＡＧタグ、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグである、請求項２８に記載の組換え宿主。
【請求項３０】
１または２以上の遺伝子が、融合タンパク質として発現される、請求項１〜６、１２、または２５〜２７のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項３１】
請求項１〜６、１６、もしくは２７〜２９のいずれか一項に記載の組換え宿主、または請求項７、８〜１３もしくは１３〜１７のいずれか一項に記載の方法によって生産されるモグロシド組成物であって、該組成物が、１または２以上のモグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、およびシアメノシドを含む、前記モグロシド組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の組成物を含む、食品または飲料製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、モグロール前駆体、モグロール、および／またはモグロシドの生合成のための方法および材料に関する。より詳細には、本発明は、ククルビタジエノールシンターゼ、シトクロムＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、および／またはエポキシドヒドロラーゼ酵素を使用して、モグロール前駆体および／またはモグロールを生産する方法に関する。本発明はまた、ウリジン−５’−ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を使用してモグロールをグリコシル化し、種々のモグロシドを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
モグロシドは、Momordica grosvenoriiとしても知られているSiraitia grosvenorii（S. grosvenorii、ラカンカ）の果実から単離されたトリテルペン配糖体のファミリーである。フルーツ抽出物は、天然甘味料として商業的に使用されている。４つの主要化合物であるモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、および１１−オキソモグロシドＶ（図１参照）が、S. grosvenoriiから、果実の甘味の原因として同定されている。モグロシドＶはこれら４種の化合物のうち最も豊富であり、乾燥果実の約０．５７％（ｗ／ｗ）を占め、次いでモグロシドＩＶおよびシアメノシドＩであり、それぞれは４つのグルコース部分を含む。１１−オキソモジロシドＶは、Ｃ１１にヒドロキシルの代わりにケトン基を有する。例えば、Takemoto et al., 1983, Yakugaku Zasshi 103: 1151-4; 1155-66; 1167-73；Kasai et al., 1989, Agric. Biol. Chem. 53:3347-9；Matsumoto Chem. Pharm. Bull., 1990, 38:2030-2；およびPrakash et al., 2011, J. Carbohydrate Chem. 30:16-26を参照。
【０００３】
全てのモグロシドは、同じモグロールトリテルペンコアを共有する。アグリコンモグロールは、異なる数のグルコース部分でグリコシル化され、種々のモグロシド化合物を形成する。モグロシドは、次のようにして合成することができる：共通のトリテルペン前駆体であるオキシドスクアレンからのククルビタジエノールの合成、ククルビタジエノールの酸化によるモグロールの生産、およびモグロールのグリコシル化による様々なモグロシドの生産。Tang et al., BMC Genomics 12: 343 (2011)を参照。Tang et al., 2011, BMC Genomics 12:343には、モグロシド生合成に関与する可能性のある候補として、７種のシトクロムＰ４５０および５種のＵＧＴが記載されている。しかしながらTangらは、モグロシド生合成に関与するシトクロムＰ４５０またはＵＧＴを具体的に同定していない。したがって、任意のS. grosvenorii代謝物に作用することができるシトクロムＰ４５０およびＵＧＴを同定する必要性が、依然として存在する。さらに、モグロシドはS. grosvenoriiから抽出することができるが、商業的用途のための、組換え宿主におけるモグロシドの改善された生産の必要性が、依然として存在する。
【発明の概要】
【０００４】
上記の背景に対し、本発明は、先行技術に対して特定の利点および進歩を提供する。
【０００５】
本発明は、モグロシド化合物の生合成のための方法および材料を提供し、モグロシド生合成に関与する酵素を提供する。
【０００６】
本明細書で開示される発明は特定の利点または機能に限定されないが、本発明は、以下の１または２以上を含む組換え宿主であって：
（ａ）スクアレンエポキシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）エポキシドヒドロラーゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するＵＧＴ１５７６ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ４３０ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｈ）配列番号６８に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ１６９７ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｉ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＵＧＴ１１７８９ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｊ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴ９８ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｋ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴＳＫ９８ポリペプチドをコードする遺伝子；
ここで前記遺伝子の少なくとも１つは組換え遺伝子であり；
宿主は、モグロール前駆体、モグロシド前駆体、および／またはモグロシド化合物を生産することができる、前記組換え宿主を提供する。
【０００７】
本明細書に開示される組換え宿主のいくつかの側面において、
（ａ）スクアレンエポキシダーゼポリペプチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドは、配列番号４３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）シトクロムＰ４５０ポリペプチドは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＣＹＰ５４９１ポリペプチド、および／または配列番号７４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８ポリペプチドを含み；
（ｄ）シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、配列番号４６に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＣＰＲ４４９７ポリペプチドを含み；および／または
（ｅ）エポキシドヒドロラーゼポリペプチドは、配列番号３８に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ１ポリペプチド、または配列番号４０に記載のアミノ酸配列に対して６５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ２ポリペプチドを含む。
【０００８】
本発明はさらに、以下の１または２以上を含む組換え宿主であって：
（ａ）ジオキシドスクアレンの変換を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｂ）オキシドスクアレンの変換を触媒してククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｃ）２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｄ）ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｅ）ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；または
（ｆ）１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
（ｇ）１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒してモグロールを生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；または
（ｈ）モグロシド前駆体のグリコシル化を触媒してモグロシド化合物を生産することができる１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子；
ここで前記遺伝子の少なくとも１つが組換え遺伝子である、前記組換え宿主を提供する。
【０００９】
本明細書に開示される組換え宿主の一側面において、組換え宿主はさらに、配列番号５４に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するスクアレンエポキシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子を含む。
【００１０】
本明細書に開示される組換え宿主の一側面において、組換え宿主は、ラノステロールシンターゼ（ＥＲＧ７）ポリペプチドの発現を低減するように改変されている。
【００１１】
本明細書に開示される組換え宿主の一側面において、ＥＲＧ７ポリペプチドは、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００１２】
本発明はさらに、モグロシド前駆体および／またはモグロシド化合物を生産する方法であって、
（ａ）本明細書に開示される組換え宿主を、培養培地中、本明細書に開示される遺伝子が発現される条件下で増殖させること；
ここで、モグロシド前駆体および／またはモグロシド化合物は、組換え宿主によって合成され；および、
（ｂ）任意に、モグロシド前駆体および／またはモグロシド化合物を単離すること、
を含む、前記方法を提供する。
【００１３】
本明細書に開示される組換え宿主のいくつかの側面において、モグロシド前駆体は、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールをエポキシ化して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを合成し、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを加水分解してモグロールを合成することによって合成された、モグロシドである。
【００１４】
本明細書に開示される組換え宿主のいくつかの側面において、１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを合成するための１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのエポキシ化は、配列番号７４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８ポリペプチドによって触媒される。
【００１５】
本発明はさらに、モグロール前駆体をin vitroで生産する方法であって、
（ａ）ジオキシドスクアレンを、ジオキシドスクアレンの変換を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｂ）オキシドスクアレンを、オキシドスクアレンの変換を触媒してククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｃ）２４，２５エポキシククルビタジエノールを、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｄ）ククルビタジエノールを、ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｅ）ククルビタジエノールを、ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること；または
（ｆ）１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること、を含む、前記方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、モグロールをin vitroで生産する方法であって、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒してモグロールを生産することができる１または２以上の酵素と接触させること、を含む、前記方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、モグロシド化合物をin vitroで生産する方法であって、モグロシド前駆体を、モグロシド前駆体のグリコシル化を触媒してモグロシド化合物を生産することができる１または２以上の酵素と接触させること、を含む、前記方法を提供する。
【００１８】
本明細書に開示される方法の一側面において、方法はさらに、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシド化合物を単離することを含む。
【００１９】
本明細書に開示される組換え宿主および方法の一側面において、
（ａ）ジオキシドスクアレンの変換を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素は、配列番号４３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するククルビタジエノールシンターゼを含み；
（ｂ）オキシドスクアレンの変換を触媒してククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素は、配列番号４３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するククルビタジエノールシンターゼを含み；
（ｃ）２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＣＹＰ５４９１を含み；
（ｄ）ククルビタジエノールの変換を触媒して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＣＹＰ５４９１を含み；
（ｅ）ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素は、配列番号７４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８を含み；
（ｆ）１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのエポキシ化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産することができる１または２以上の酵素は、配列番号７４に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８を含み；
（ｇ）１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールの変換を触媒してモグロールを生産することができる１または２以上の酵素は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ１、または配列番号４０に記載のアミノ酸配列に対して６５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ２を含むポリペプチドを含み；および／または、
（ｈ）モグロシド前駆体のモグロシド化合物への変換を触媒することができる１または２以上の酵素は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するＵＧＴ１５７６；配列番号５３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴ９８；配列番号５０に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴＳＫ９８；配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ４３０；配列番号６８に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ１６９７；または配列番号７２に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＵＧＴ１１７８９を含む。
【００２０】
本発明はさらに、モグロシド化合物を生産する方法であって、以下の１または２以上：
（ａ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するＵＧＴ１５７６ポリペプチド；
（ｂ）配列番号６２に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ４３０ポリペプチド；
（ｃ）配列番号６８に記載のアミノ酸配列に対して４５％以上の同一性を有するＵＧＴ１６９７ポリペプチド；
（ｄ）配列番号７２に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するＵＧＴ１１７８９ポリペプチド；
（ｅ）配列番号５３に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴ９８ポリペプチド；または
（ｆ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するＵＧＴＳＫ９８ポリペプチド；
を発現する組換え宿主を、モグロシド前駆体と接触させることを含む、前記方法を提供する。
【００２１】
本明細書に開示される方法の一側面において、モグロシド前駆体は、植物由来または合成である。
【００２２】
本明細書に開示される方法の一側面において、方法はさらに、モグロシド化合物を単離することを含む。
【００２３】
本明細書に開示される組換え宿主および方法のいくつかの側面において、モグロシド化合物は、
（ａ）Ｃ３位でグリコシル化されたモグロール；または
（ｂ）Ｃ２４位でグリコシル化されたモグロール；または
（ｃ）Ｃ３位およびＣ２４位でグリコシル化されたモグロール
である。
【００２４】
本明細書に開示される組換え宿主および方法のいくつかの側面において、モグロシド化合物は、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＶ、またはシアメノシドの１または２以上である。
【００２５】
本明細書に開示される組換え宿主および方法のいくつかの側面において、モグロール前駆体は、スクアレン、ジオキシドスクアレン、オキシドスクアレン、２４，２５エポキシククルビタジエノール、ククルビタジエノール、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール、１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノール、または１１−オキソ−モグロールの１または２以上である。
【００２６】
本明細書に開示される組換え宿主および方法のいくつかの側面において、モグロシド前駆体は、モグロール、グリコシル化モグロール、ジグリコシル化モグロールまたはトリグリコシル化モグロールの１または２以上である。
【００２７】
本明細書に開示される組換え宿主および方法のいくつかの側面において、組換え宿主は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である微生物を含む。
【００２８】
本明細書に開示される組換え宿主および方法のいくつかの側面において、細菌細胞は、Escherichia細菌細胞、Lactobacillus細菌細胞、Lactococcus細菌細胞、Corynebacterium（Cornebacterium）細菌細胞、Acetobacter細菌細胞、Acinetobacter細菌細胞、またはPseudomonas細菌細胞を含む。
【００２９】
本明細書に開示される組換え宿主および方法のいくつかの側面において、酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhous、またはCandida albicans種由来の細胞である。
【００３０】
本明細書に開示される組換え宿主および方法のいくつかの側面において、酵母細胞は、Saccharomyceteである。
【００３１】
本明細書に開示される組換え宿主および方法のいくつかの側面において、酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae種由来の細胞である。
【００３２】
本明細書に開示される組換え宿主のいくつかの側面において、１または２以上の遺伝子は、融合タグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
【００３３】
本明細書に開示される組換え宿主の一側面において、融合タグは、タンパク質またはポリペプチドである。
【００３４】
本明細書に開示される組換え宿主の一側面において、融合タグは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ）、およびＦＬＡＧタグ、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグである。
【００３５】
本明細書に開示される組換え宿主の一側面において、１または２以上の遺伝子は、融合タンパク質として発現される。
【００３６】
本発明はさらに、本明細書に開示された組換え宿主または方法によって生産されるモグロシド組成物であって、該組成物が、１または２以上のモグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、およびシアメノシドを含む、前記モグロシド組成物を提供する。
【００３７】
本発明はさらに、本明細書に開示されたモグロシド組成物を含む、食品または飲料製品を提供する。
【００３８】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲とともに以下の本発明の詳細な説明から、より完全に理解されるであろう。特許請求の範囲はその記述によって定義され、本明細書に記載された特徴および利点の具体的な議論によってではないことに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明の態様の以下の詳細な説明は、以下の図面と併せて読んだ場合に最もよく理解することでき、この図面においては同様の構造は同様の参照番号で示されている。
【００４０】
【図１】図１は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩおよび１１−オキソモグロシドＶの化学構造を示す。
【００４１】
【図２Ａ】図２Ａは、モグロシドをグルコースから生産するための経路の概略図である。
【００４２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、モグロール前駆体、モグロールおよびモグロシドの生産のための経路を示す。図２Ｂは、クルビタジエノールのオキシドスクアレンからの、ククルビタジエノールシンターゼを用いた生産（ステップＡ）、２４，２５エポキシククルビタジエノールのジオキシドスクアレンからの、ククルビタジエノールシンターゼを用いた生産（ステップＢ）、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのククルビタジエノールからの、シトクロムＰ４５０を用いた生産（ステップＣ）、１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノールの２４，２５エポキシククルビタジエノールからの、シトクロムＰ４５０を用いた生産（ステップＤ）、２４，２５エポキシククルビタジエノールのククルビタジエノールからの、シトクロムＰ４５０を用いた生産（ステップＥ）、１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノールの１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールからの、シトクロムＰ４５０を用いた生産（ステップＦ）、モグロールの１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノールからの、エポキシドヒドロラーゼを用いた生産（ステップＧ）、モグロールの１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールからの、シトクロムＰ４５０およびエポキシドヒドロラーゼを用いた生産（ステップＦおよびＧ）、および、１または２以上のモグロシド化合物の、１または２以上のＵＧＴを用いた生産（ステップＨ）を示す。
【００４３】
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２ＢのステップＡ〜Ｈの反応を触媒することができる代表的な酵素を示す。図２Ｃは、クルビタジエノールのオキシドスクアレンからの、配列番号４３のS. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼを用いた生産（ステップＡ）、２４，２５エポキシククルビタジエノールのジオキシドスクアレンからの、配列番号４３のS. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼを用いた生産（ステップＢ）、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのククルビタジエノールからの、配列番号４４のＣＹＰ５４９１を用いた生産（ステップＣ）、１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノールの２４，２５エポキシククルビタジエノールからの、配列番号４４のＣＹＰ５４９１を用いた生産（ステップＤ）、２４，２５エポキシククルビタジエノールのククルビタジエノールからの、配列番号７４のＣＹＰ１７９８を用いた生産（ステップＥ）、１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノールの１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールからの、配列番号７４のＣＹＰ１７９８を用いた生産（ステップＦ）、モグロールの１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノールからの、配列番号３８のエポキシドヒドロラーゼ１または配列番号４０のエポキシドヒドロラーゼ２を用いた生産（ステップＧ）、モグロールの１１−ヒドロキシククルビタジエノールからの、配列番号７４のＣＹＰ１７９８および配列番号３８のエポキシドヒドロラーゼ１または配列番号４０のエポキシドヒドロラーゼ２を用いた生産（ステップＦおよびＧ）、および、モグロシド化合物の、配列番号４８のＵＧＴ１５７６、配列番号６２のＵＧＴ４３０、配列番号６８のＵＧＴ１６９７、配列番号５３のＵＧＴ９８、および／または配列番号７２のＵＧＴ１１７８９を用いた生産（ステップＨ）を示す。
【００４４】
【図３ＡＢ】図３Ａは、本明細書に開示された、モグロールをククルビタジエノールから生産するための代表的な経路を示す。図３Ｂは、Tang et al., 2011, BMC Genomics 12:343で提案された、モグロールをククルビタジエノールから生産するための経路の概略図である。
【００４５】
【図４】図４は、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶ、およびモグロシドＶの、モグロールからの、ＵＧＴを用いた生合成のための経路の概略図である。図４のＵＴＧａは、例えば、ＵＧＴ１５７６（配列番号４８）またはＵＧＴ１６９７（配列番号６８）であり得る。図４のＵＧＴｂは、例えば、ＵＧＴ４３０（配列番号６２）またはＵＧＴ１６９７（配列番号６８）であり得る。図４のＵＧＴｃは、例えば、ＵＧＴ４３０（配列番号６２）またはＵＧＴ１６９７（配列番号６８）であり得る。図４のＵＧＴｄは、例えば、ＵＧＴ１５７６（配列番号４８）またはＵＧＴ１６９７（配列番号６８）であり得る。図４のＵＧＴｅは、例えば、ＵＧＴ９８（配列番号５３）またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）であり得る。図４のＵＧＴｆは、例えば、ＵＧＴ９８（配列番号５３）またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）であり得る。図４のＵＧＴｇは、例えば、ＵＧＴ９８（配列番号５３）またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）であり得る。
【００４６】
【図５】図５は、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ１およびモグロールの、モグロシドＶからの、酵素的生産を示す概略図である。
【００４７】
【図６】図６は、例８に記載された、S. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２（配列番号３９、配列番号４０）を発現するプラスミドで形質転換された酵母株由来の試料中のテトラヒドロキシスクアレンのプロトン＋Ｎａ＋付加物に対応する、ＬＣ−ＭＳ質量ピーク５０１を示す。
【００４８】
【図７ＡＢ】図７Ａは、ククルビタジエノールシンターゼを発現しない酵母株におけるラノステロール生産を示す、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図７Ｂは、例９に記載された、ククルビタジエノールシンターゼ（配列番号４２、配列番号４３）を発現する酵母株におけるククルビタジエノールおよびラノステロール生産を示す、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。
【００４９】
【図８】図８は、例１０に記載された、酵母におけるＣＹＰ５４９１（配列番号１４、配列番号４４）およびＣＰＲ４４９７（配列番号４５、配列番号４６）の発現をもたらす３つのピークを有するＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す（上のパネル）；下の３つのパネルは、これらの３つのピークの断片化スペクトルを示す。３つのピークの質量（４４３．３８、４４１．３７および４５７．３６）は、それぞれヒドロキシル化ククルビタジエノール、オキソククルビタジエノール、およびヒドロキシ＋オキソククルビタジエノールの、プロトン付加物の重量に対応する。
【００５０】
【図９Ａ−Ｃ】図９Ａおよび９Ｂは、ククルビタジエノールからモグロールおよび１１−オキソ−モグロールへの、S. grosvenoriiＣＹＰ５４９１（配列番号１４、配列番号４４）、S. grosvenoriiＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７３、配列番号７４）、およびS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２（配列番号３９、配列番号４０）を用いた生合成経路を示す。図９Ｃは、オキシドスクアレンからモグロールおよび１１−オキソ−モグロールへの、S. cerevisiaeスクアレンエポキシダーゼＥＲＧ１（配列番号５４）、S. grosvenoriiＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７３、配列番号7４）、S. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼ（配列番号４２、配列番号４３）、S. grosvenoriiＣＹＰ５４９１（配列番号１４、配列番号４４）、およびS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２（配列番号３９、配列番号４０）を用いた、可能性のある生合成経路を示す。例９および例１５を参照。
【００５１】
【図１０ＡＢ】図１０Ａは、参照モグロシドＩＡ１のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図１０Ｂは、例１１に記載された、５０μＭのモグロールを供給した培養物中の、ＵＧＴ１５７６（配列番号４７、配列番号４８）を発現する酵母株の試料のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。
【００５２】
【図１１ＡＢ】図１１Ａは、ＵＧＴ ＳＫ９８とＵＧＴ１５７６を同時発現する酵母株からの試料のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示し、例１１に記載のように、ジグリコシル化モグロール（モグロシドＩＩＡ）の生産を示す。図１１Ｂは、ＵＧＴ９８とＵＧＴ１５７６を同時発現する酵母株からの試料のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示し、例１１に記載のように、ジ−およびトリ−グリコシル化モグロールの生産を示す（中間および下部フレーム）。
【００５３】
【図１２】図１２は、例１１に記載された、本明細書で提供されるモグロールからモグロシドＩＩＩＡ１への生合成経路を示す。
【００５４】
【図１３ＡＢ】図１３Ａは、モグロシドＩＥ１標準の溶出を示す。図１３Ｂは、例１２に記載のように、ＵＧＴ４３０（配列番号６１、配列番号６２）によって生産されるモグロシドＩＥ１を示す。
【００５５】
【図１４ＡＢ】図１４Ａは、モグロシドＩＩＥ１標準、モグロシドＩＩＡ標準、モグロシドＩＥ１標準、およびモグロシドＩＡ１標準の溶出を示す。図１４Ｂは、例１３に記載のように、ＵＧＴ１６９７（配列番号６７、配列番号６８）によって生産されるモグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＡおよびモグロシドＩＩＥ１を示す。
【００５６】
【図１５Ａ−Ｄ】図１５Ａは、参照化合物モグロシドＶ（上パネル）およびモグロシドＩＩＥ（下パネル）の溶出を示す。図１５Ｂは、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ４３０およびＵＧＴ９８を同時発現する酵母細胞における、モグロシドＶ（上パネル）およびモグロシドＩＩＥ（下パネル）の生産を示す。図１５Ｃは、例１４に記載のように、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ４３０、ＵＧＴ９８およびＵＧＴ１１７８９を同時発現する酵母細胞における、モグロシドＶ（上パネル）およびモグロシドＩＩＥ（下パネル）の生産を示す。図１５Ｄは、例１４に記載のように、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ４３０、およびＵＧＴ１１７８９を同時発現する酵母細胞中における、トリグリコシル化モグロシドの生産を示す。
【００５７】
【図１６ＡＢ】図１６Ａは、モグロール標準の溶出を示す。図１６Ｂは、例１５に記載のように、ＣＹＰ５４９１（配列番号１４、配列番号４４）、ＣＰＲ４４９７（配列番号４５、配列番号４６）、ＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７３、配列番号７４）、およびエポキシドヒドロラーゼを発現するククルビタジエノール産生宿主中で生産される、モグロールを示す。
【００５８】
【図１７】図１７は、例１６に記載された、モグロシドＶ産生S. cerevisiae株の粗単離物の代表的なＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。
【００５９】
【図１８Ａ−Ｄ】図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃはそれぞれ、例１６に記載された、モグロシドＶ、モグロシドＩＩＡ２およびモグロシドＩＶＡについてのＮＭＲで解明された構造、１Ｈ ＮＭＲスペクトル、および１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。図１８Ｄは、例１６に記載された、モグロシドＩＥ１についてのＮＭＲで解明された構造、１Ｈ ＮＭＲスペクトルおよび１Ｈ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【発明の詳細な説明】
【００６０】
本発明を詳細に説明する前に、いくつかの用語を定義する。本明細書で使用する場合、単数形の「a」、「an」および「the」は、文脈から他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「核酸」への言及は、１または２以上の核酸を意味する。
【００６１】
用語「好ましくは」、「一般に」、および「典型的に」等は、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するためには、または、特定の特徴が特許請求の範囲に記載された発明の構造または機能にとって決定的で、重大で、または重要であると言及するためには、用いられないことに留意されたい。むしろこれらの用語は、本発明の特定の態様において利用可能かまたは利用不可能な代替のまたは追加の特徴を強調することを、意図しているに過ぎない。
【００６２】
本発明を説明および定義する目的で、用語「実質的に」は、定量的な比較、価値、測定または他の表現に起因する可能性のある不確実性の固有の程度を表すために、本明細書で使用されることに留意されたい。用語「実質的に」はまた、本明細書では、定量的表現が、問題の主題の基本機能に変化をもたらすことなく、記載された基準から異なり得る程度を表すためにも、用いられる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は交換可能に使用することができ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む、核酸を指す。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「および／または」は、複数の構成要素を組み合わせてまたは互いに排他的に記載するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ、および／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、およびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘおよび（ｙまたはｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指すことができる。いくつかの態様において、「および／または」は組換え細胞が含む外因性核酸を指すために使用され、ここでは組換え細胞が、ある群から選択される１または２以上の外因性核酸を含む。いくつかの態様において、「および／または」はモグロシドの生産を指すために使用され、ここでは１または２以上のモグロシドが生産される。いくつかの態様において、「および／または」はモグロシドの生産を指すために使用され、ここでは１または２以上のモグロシドが、以下の１または２以上の次のステップを介して生産される：組換え微生物の培養、組換え微生物における１または２以上のモグロシドの合成、および、１または２以上のモグロシドの単離。
【００６５】
モグロシドおよびモグロシド生産
本明細書で使用される場合、用語「モグロシド」および「モグロシド化合物」は交換可能に用いることができ、１または２以上の位置でグリコシル化されたモグロールを記述する。特に、モグロシド化合物は、１、３、１１、２４、および２５位の１または２以上のグルコース部分でグリコシル化されたモグロールであることができる。モグロールは以下に提供される式Ｉの化合物であり、式中、Ｒ１およびＲ２の両方は−Ｈである。
【００６６】
モグロシドは、次の式Ｉのものであることができる：
【化１】
2017529860.tif 000003
【００６７】
式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、−Ｈ、モノグルコシド、ジグルコシド、トリグルコシドであり、および式中、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは−Ｈではない。特にモグロシドは、表１に記載のモグロシドの１つであることができる。表１において、「Ｇｌｃ」はグルコースを表し、１，６−および１，２−結合が示されている。例えば、モグロシドＶのＲ２基は、１つの１，６−結合と１つの１，２−結合によって連結された３つのグルコース分子を含み、これは「Ｇｌｃ６−Ｇｌｃ２−Ｇｌｃ−」で表される立体配座である。モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、およびシアメノシドの構造については、図１を参照。
【００６８】
【表１】
2017529860.tif 000004
【００６９】
モグロシドは、多くのモグロシド前駆体から生産することができる。いくつかの態様において、モグロシド前駆体は、モグロール、グリコシル化モグロール、ジグリコシル化モグロールまたはトリグリコシル化モグロールである。モグロール前駆体には、スクアレン、ジオキシドスクアレン、オキシドスクアレン、２４，２５エポキシククルビタジエノール、ククルビタジエノール、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール、１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノール、１１−オキソ−モグロールが含まれる。例えば、図２および９を参照。例えば、モグロシドＩＡ１は、モグロシドＩＩＡおよびモグロシドＩＩＩＡ１の生成物の前駆体である。例１２を参照。別の例では、モグロシドＩＩＥは、３つの酵素的グリコシル化によってモグロシドＶに変換される。１つの可能な経路において、２つのグルコース部分はまず、１，６結合を介してモグロシドＩＩＥの２つのグルコース分子に、ＵＧＴ９８（配列番号５３）またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）に限定されないＵＧＴによって結合する。第３のグルコース部分は、ＵＧＴ９８（配列番号５３）またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）に限定されないＵＧＴによって、１，２結合でＣ２４結合グルコース部分に付加される。図４を参照。
【００７０】
ククルビタジエノールからモグロールへの経路は、Tang, et al., 2011, BMC Genomics 12: 343により提案された。前駆体であるククルビタジエノールおよびモグロールは、S. grosvenoriiから単離された。Ukiya, et al., 2002, J. Agric. Food Chem. 50: 6710-5を参照。グリコシド中間体は、１１−ヒドロキシ系および１１−オキソ系の両方に存在し、果実が熟成するにつれてモグロシドＩからモグロシドＶに徐々に変化し、Ｐ４５０酵素がその後のグリコシル化の前に、ククルビタジエノールなどのモグロール前駆体のトリテルペンコアを完全に酸化することを示す。Tangらによって提案されたスキームによれば、３つの独立したシトクロムＰ４５０酵素触媒酸化が、ククルビタジエノールからのモグロール形成をもたらす（図３Ｂ）。しかしながら、提案された一次反応は起こりそうもなく、これは、シトクロムＰ４５０酵素による２つのヒドロキシル化反応の前に、２４−２５二重結合の飽和が必要とされるためである。図３Ａに示すように、１つのシトクロムＰ４５０酵素によるククルビタジエノールのエポキシ化、それに続く自発的または酵素触媒による水和、および第２のＰ４５０酵素触媒酸化により、モグロールの生産がもたらされ得る。例１１に記載された、モグロールまたは１１−オキソ−モグロールの生産のためのさらなる経路を、図９に示す。
【００７１】
いくつかの態様において、１または２以上のモグロール前駆体が生産される。モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドは、以下に記載されるように、in vivoで（すなわち、組換え宿主において）、in vitroで（すなわち、酵素的に）、または全細胞生物変換によって生産することができる。本明細書で使用する場合、用語「検出可能な量」、「検出可能な濃度」、「測定可能な量」および「測定可能な濃度」は、ＡＵＣ、μＭ／ＯＤ６００、ｍｇ／Ｌ、μＭまたはｍＭで測定された、モグロシドおよびモグロシド前駆体のレベルを指す。モグロシド生産（すなわち、全体、上清および／または細胞内のステビオールグリコシドレベル）は、当業者に一般的に利用可能な技術により、例えば限定されないが、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、紫外可視分光法／分光光度法（ＵＶ−Ｖｉｓ）、質量分析法（ＭＳ）および核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）により、検出および／または分析することができる。本明細書で使用する用語「相対存在量」は、ＭＳまたはＬＣ−ＭＳによって測定された特定のイオンの濃度を指すために使用され、最も強いイオンに１００の相対存在スコアが割り当てられ、これがベースピークとして参照される。
【００７２】
モグロシド生産経路
いくつかの態様において、本明細書に記載されるように、モグロール前駆体（例えば、スクアレンまたはオキシドスクアレン）、モグロールまたはモグロシドが生産される。スクアレンは、ファルネシルピロリン酸からスクアレンシンターゼを用いて生産することができ、オキシドスクアレンは、スクアレンからスクアレンエポキシダーゼを用いて生産することができる。スクアレンシンターゼは、EC 2.5.1.21に分類された任意の酵素であることができる。スクアレンの生産は、ＮＡＤＰＨの存在下でのスクアレン合成酵素によるファルネシルピロリン酸の変換を触媒するステップを含むことができる。方法がin vivoで実施される本発明の態様において、組換え宿主はしたがって、スクアレンシンターゼをコードする異種核酸を含むことができる。他の側面において、スクアレンシンターゼは内因性であることができる。
【００７３】
スクアレンシンターゼは、例えば、ウリ科植物であるGynostemma pentaphyllum由来のスクアレンシンターゼ（タンパク質受託番号C4P9M2）であることができる。スクアレンシンターゼはまた、Arabidopsis thaliana（タンパク質受託番号C4P9M3）、Brassica napus、Citrus macrophylla、Euphorbia tirucalli（タンパク質受託番号B9WZW7）、Glycine max、Glycyrrhiza glabra（タンパク質受託番号Q42760、Q42761）、Glycrrhiza uralensis（タンパク質受託番号D6QX40、D6QX41、D6QX42、D6QX43、D6QX44、D6QX39、D6QX47、D6QX39、D6QX55、D6QX38、D6QX53、D6QX37、D6QX35、B5AID5、B5AID4、B5AID3、C7EDD0、C6KE07、C6KE08、C7EDC9）、Lotusjaponicas（タンパク質受託番号Q84LE3）、Medicago truncatula（タンパク質受託番号Q8GSL6）、Pisum sativum、Ricinus communis（タンパク質受託番号B9RHC3）、Prunus mume由来のスクアレンシンターゼ、または上記のスクアレンシンターゼのいずれかと少なくとも７０％の同一性を共有する機能的ホモログを、含むことができる。
【００７４】
オキシドスクアレンは、スクアレンから、スクアレンエポキシダーゼ（スクアレンモノオキシゲナーゼとも呼ばれる）により生産することができる。例えばLeber et al., 1998, Mol Biol Cell. 9(2):375-86を参照。スクアレンエポキシダーゼは、EC 1.4.99.7に分類された任意の酵素であることができる。オキシドスクアレンの生産は、ＮＡＤＰＨの存在下で、スクアレンエポキシダーゼによるスクアレンの変換を触媒するステップを含むことができる。例えば例８を参照。
【００７５】
スクアレンエポキシダーゼはまた、S. cerevisiaeからのＥＲＧ１遺伝子の生成物であることもできる。したがって、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５４のポリペプチドまたはそれと少なくとも４５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログであることができる。いくつかの側面において、ＥＲＧ１は過剰発現される。
【００７６】
スクアレンエポキシダーゼは、例えば、Gynostemma pentaphyllum由来のスクアレンエポキシダーゼ（タンパク質受託番号C4P9M2；配列番号８８）であることができる。スクアレンエポキシダーゼは、Arabidopsis thaliana（タンパク質受託番号Q9SM02（配列番号８９）、O65403（配列番号９０）、O65402（配列番号９１）、O65404（配列番号９２）、O81000（配列番号９３）またはQ9T064（配列番号９４））、Brassica napus（タンパク質受託番号O65727（配列番号９５）、O65726（配列番号９６））、Euphorbia tirucalli（タンパク質受託番号A7VJN1（配列番号９７））、Medicago truncatula（タンパク質受託番号Q8GSM8（配列番号９８）、Q8GSM9（配列番号９９））、Pisum sativumおよびRicinus communis（タンパク質受託番号B9R6V0（配列番号１００）、B9S7W5（配列番号１０１）、B9S6Y2（配列番号１０２）、B9T0Y3（配列番号１０３）、B9S7T0（配列番号１０４）、B9SX91（配列番号１０５））由来のスクアレンエポキシダーゼ、または上記のスクアレンエポキシダーゼのいずれかと少なくとも７０％の同一性を共有する機能的ホモログを、含むことができる。
【００７７】
オキシドスクアレンの変換を触媒してククルビタジエノールを形成することができる１または２以上の酵素は、ククルビタジエノールシンターゼを含む。図２Ｂおよび２ＣのステップＡおよび例９を参照。ククルビタジエノールシンターゼは、例えば、Shibuya, Tetrahedron, 60: 6995-7003 (2004)に記載されているオキシドスクアレンシクラーゼなどの、オキシドスクアレンシクラーゼとして分類されているククルビタジエノールシンターゼであることができる。
【００７８】
Cucurbita pepoからのククルビタジエノールシンターゼのアミノ酸配列は、本明細書に配列番号１として提供される。いくつかの態様において、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号１のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を共有するその機能的ホモログである。いくつかの態様において、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドとしては、限定はされないが、Lotus japonicas（BAE53431）、Populus trichocarpa（XP_002310905）、Actaea racemosa（ADC84219）、Betula platyphylla（BAB83085）、Glycyrrhiza glabra（BAA76902）、Vitis vinifera（XP_002264289）、Centella asiatica（AAS01524）、Panax ginseng（BAA33460）およびBetula platyphylla（BAB83086）からのポリペプチドが挙げられる。ククルビタジエノールシンターゼは、上記のククルビタジエノールシンターゼと少なくとも７０％の同一性を共有する、任意のククルビタジエノールシンターゼであることができる。
【００７９】
例５に記載されるように、モンクフルーツからのククルビタジエノールシンターゼが本明細書中で同定され、ポリペプチドのＣ末端部分の配列が決定された。モンクフルーツポリペプチドのＣ末端部分のアミノ酸配列は、本明細書で配列番号２として提供される。したがって、いくつかの態様において、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００８０】
他の態様において、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号４３のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％の同一性を共有するその機能的ホモログである。
【００８１】
いくつかの態様において、２４，２５エポキシククルビタジエノールは、ジオキシドスクアレンから、オキシドスクアレンの変換を触媒してククルビタジエノールを形成することができる１または２以上の酵素を用いて、生産される。ジオキシドスクアレンの２４，２５エポキシククルビタジエノールへの変換を触媒することができる１または２以上の酵素は、好ましくはククルビタジエノールシンターゼを含む。図２Ｂおよび２ＣのステップＢおよび例９を参照。ククルビタジエノールシンターゼは、例えば、Shibuya, Tetrahedron 60:6995-7003 (2004)に記載のククルビタジエノールシンターゼ、または上に記載のククルビタジエノールシンターゼであることができる。いくつかの態様において、ジオキシドスクアレンの２４，２５エポキシククルビタジエノールへの変換を触媒するククルビタジエノールシンターゼは、配列番号１のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％の同一性を共有するその機能的ホモログである。
【００８２】
いくつかの態様において、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールは、ククルビタジエノールから生産される。いくつかの態様において、シトクロムＰ４５０酵素は、ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを形成する。いくつかの態様において、ＣＹＰ５４９１（配列番号１４、配列番号４４）は、ククルビタジエノールの１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールへの変換を触媒する。図２Ｂおよび図２ＣのステップＣおよび例１０を参照。
【００８３】
例６および例１５に示すように、１または２以上のＣＹＰ５３３、ＣＹＰ９３７、ＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ１９９４、ＣＹＰ２０４８、ＣＹＰ２７４０、ＣＹＰ３４０４、ＣＹＰ３９６８、ＣＹＰ４１１２、ＣＹＰ４１４９、ＣＹＰ４４９１、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ６４７９、ＣＹＰ７６０４、ＣＹＰ８２２４、ＣＹＰ８７２８、ＣＹＰ１００２０、またはＣＹＰ１０２８５（それぞれ配列番号３〜２０によってコードされる）を使用して、モグロールを生産することができる。ｅＹＡＣ技術を使用して、例８に示すように、シトクロムＰ４５０酵素の活性を評価することができる。代替的に、in vitro反応を用いて活性を評価することができる。したがって、本発明の一態様において、少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０の核酸配列によってコードされるポリペプチド、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を共有するその機能的ホモログを含む。
【００８４】
いくつかの態様において、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールは、２４，２５エポキシククルビタジエノールから、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを形成することができる１または２以上の酵素を用いて、生産される。いくつかの態様において、シトクロムＰ４５０酵素は、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを形成する。いくつかの態様において、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを形成することができる酵素は、ＣＹＰ５４９１（配列番号１４、配列番号４４）、または配列番号４４と少なくとも５０％の配列同一性を共有する機能的ホモログである。図２Ｂおよび２ＣのステップＤおよび例９を参照。
【００８５】
いくつかの側面において、２４，２５エポキシククルビタジエノールは、ククルビタジエノールから生産される。いくつかの側面において、シトクロムＰ４５０は、ククルビタジエノールの２４，２５エポキシククルビタジエノールへの変換を触媒する。シトクロムＰ４５０は、配列番号７４のＣＹＰ１７９８であることができる。図２Ｂおよび２ＣのステップＥを参照。いくつかの側面において、１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノールは、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールからが生産される。いくつかの側面において、シトクロムＰ４５０は、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールの変換を触媒して１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産する。シトクロムＰ４５０は、配列番号７４のＣＹＰ１７９８であることができる。図２Ｂおよび２ＣのステップＦを参照。
【００８６】
いくつかの態様において、モグロールは、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールから、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールの変換を触媒してモグロールを形成することができる酵素を用いて、生産される。シトクロムＰ４５０活性およびエポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素は、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのモグロールへの変換を触媒する。図２Ｂおよび図２ＣのステップＦおよびＧを参照。シトクロムＰ４５０活性を有する酵素としては、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０の核酸配列によってコードされるポリペプチド、またはそれらと少なくとも７０％の配列同一性を共有するその機能的ホモログが挙げられる。エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素は、好ましくは、エポキシドおよび水からのグリコールの生産を触媒する。エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素の非限定的な例には、S. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ１およびS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２が含まれる。したがって、エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド、配列番号４０に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド、およびその機能的ホモログを含むことができる。
【００８７】
いくつかの態様において、モグロールは、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールから生産される。１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒してモグロールを形成することができる１または２以上の酵素は、好ましくは、エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素を含む。図２Ｂおよび図２ＣのステップＧを参照。エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素の例には、上記のS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ１およびS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２が含まれる。いくつかの態様において、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒してモグロールを形成することができる酵素は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド、配列番号４０に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド、およびその機能的ホモログを含む。
【００８８】
いくつかの態様において、ＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７３、配列番号７４）は、ククルビタジエノール、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールまたは１１−オキソククルビタジエノールの２４−２５の炭素二重結合のエポキシ化を触媒する。図９Ａおよび９Ｂは、ククルビタジエノールからのモグロールおよび１１−オキソ−モグロールの生産の概略図であり、図９Ｃは、オキシドスクアレンからのモグロールおよび１１−オキソ−モグロールの生産の概略図である。例１５も参照。
【００８９】
モグロールのグリコシル化を触媒することができる１または２以上の酵素は、好ましくは、ウリジン−５’−ジホスホ（ＵＤＰ）依存性グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含む。ＵＧＴはモグロシドの生産を触媒することができ、該モグロシドとしては限定することなく、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、または、シアメノシドを含む。かかるＵＧＴは、例えば、配列番号２１のArabidopsis thalianaＵＧＴ７３Ｃ３、配列番号２３のArabidopsis thalianaＵＧＴ７３Ｃ６、配列番号２５のStevia rebaudianaＵＧＴ８５Ｃ２、配列番号２２のArabidopsis thalianaＵＧＴ７３Ｃ５、配列番号２４のStevia rebaudianaＵＧＴ７３Ｅ１、または上記のＵＧＴと少なくとも７０％同一性を共有する機能的ホモログを含むことができる。ＵＧＴはまた、配列番号５３のＵＧＴ９８、配列番号２７がコードするＵＧＴ１４９５、配列番号２８がコードするＵＧＴ１８１７、配列番号３０がコードするＵＧＴ５９１４、配列番号３１がコードするＵＧＴ８４６８、配列番号３２がコードするＵＧＴ１０３９１、または上記のＵＧＴのいずれかの機能的ホモログを含むことができる。例４および７を参照。
【００９０】
ＵＧＴ７３Ｃ３、ＵＧＴ７３Ｃ６、ＵＧＴ８５Ｃ２、およびＵＧＴ７３Ｅ１は、モグロールまたはモグロシドのＣ２４位でグリコシル化を触媒することができる。したがって、生産されるモグロシドがＣ２４位にグリコシル化を含む本発明の方法において、少なくとも１つのＵＧＴは、配列番号２１のＵＧＴ７３Ｃ３、配列番号２３のＵＧＴ７３Ｃ６、配列番号２５のＵＧＴ８５Ｃ２、配列番号２４のＵＧＴ７３Ｅ１、または上記のＵＧＴと少なくとも７０％の同一性を共有する機能的ホモログであることができる。例４を参照。
【００９１】
ＵＧＴ７３Ｃ５は、モグロールおよびモグロシドのＣ３−ＯＨおよびＣ２４位の両方でグリコシル化を触媒することができる。したがって、生産されるモグロシドがＣ２４位でのグリコシル化および／またはＣ３−ＯＨ位でのグリコシル化を含む本発明の方法において、少なくとも１つのＵＧＴは、配列番号２２のＵＧＴ７３Ｃ５、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を共有する機能的ホモログであることができる。例４を参照。
【００９２】
いくつかの態様において、ＵＧＴは、配列番号４８のＵＧＴ１５７６または配列番号４８のＵＧＴ１５７６と少なくとも６０％の配列同一性を共有するＵＧＴである。いくつかの態様において、ＵＧＴ１５７６は、モグロールＣ２４−ＯＨ ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する。例１１を参照。
【００９３】
いくつかの態様において、ＵＧＴは、配列番号５３のＵＧＴ９８またはそれと少なくとも７０％の配列同一性を共有するその機能的ホモログである。これは特に、生産されるモグロシドが、グルコースのＣ−２４位での１，２−グリコシル化および１，６−グリコシル化を含んでモグロシドＩＩＩＡ１を形成する、本発明の態様の場合である。例１１を参照。いくつかの態様において、ＵＧＴ９８（配列番号５３）を使用して、モグロシドＩＩＥをモグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、および／またはシアメノシドＩに変換することができる。例７参照。
【００９４】
いくつかの態様において、例えば、生産されるモグロシドが、グルコースのＣ−２４位での１，２グリコシル化を含んでモグロシドＩＩＡを形成する態様において、ＵＧＴは、配列番号５０のＵＧＴＳＫ９８、または配列番号５０のＵＧＴＳＫ９８と少なくとも７０％の同一性を共有するＵＧＴである。いくつかの側面において、ＵＧＴ９８は、１，２および１，６グルコース結合を触媒して、モグロシドＩＩＥをモグロシドＶに変換する。例１４を参照。
【００９５】
いくつかの態様において、ＵＧＴは、S. grosvenoriiＵＧＴ４３０（配列番号６１、配列番号６２）である。ＵＧＴ４３０は、ＵＧＴファミリー８５Ａのメンバーであり、３Ｃ位でモグロールおよび特定のモグロシドをグリコシル化する。例１２を参照。
【００９６】
いくつかの態様において、ＵＧＴは、S. grosvenoriiＵＧＴ１６９７（配列番号６７、配列番号６８）である。ＵＧＴ１６９７は、ＵＧＴファミリー８５Ａのメンバーであり、３Ｃ位および２４Ｃ位でモグロールおよび特定のモグロシドをグリコシル化する。例１３を参照。
【００９７】
いくつかの態様において、ＵＧＴは、S. grosvenoriiＵＧＴ１１７８９（配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２）である。ＵＧＴ１１７８９は、モグロシド化合物の２４−Ｏ−グルコースおよび／または３−Ｏ−グルコース上の、１，２および／または１，６グルコース結合を触媒する。いくつかの態様において、ＵＧＴ１１７８９は、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶ、またはシアメノシドをグリコシル化する。いくつかの態様において、ＵＧＴ１１７８９をモグロシドＩＥ１、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶまたはシアメノシドと接触させると、モグロシドＩＩＡ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶＡ、シアメノシド、またはモグロシドＶが生産される。例１４を参照。
【００９８】
モグロシドをin vivoで生産する方法
いくつかの態様において、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドは、モグロシド経路に関与する１または２以上の酵素をコードする１または２以上の核酸分子を発現する宿主によって、in vivoで生産される。例えば、１または２以上の、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子、エポキシドヒドロラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、およびＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する、オキシドスクアレン産生組み換え宿主は、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドをin vivoで生産することができる。例１５および１６を参照。
【００９９】
いくつかの態様において、複数の宿主を用いて、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドを生産する。非限定的な例において、モグロールを生産することができる宿主およびＵＧＴを発現する宿主を用いて、モグロシドを生産することができる。該方法はまた、組換え宿主と非組換え宿主の混合物を使用することもできる。２または３以上の宿主の使用を含む態様において、宿主は、共培養または別々に培養することができる。宿主を別々に培養する場合、中間生成物を回収し、任意に精製または部分精製し、中間生成物を基質として用いて組換え宿主に供給することができる。適切な組換え宿主を以下に記載する。
【０１００】
いくつかの側面において、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドの生産をin vivoで行うことができ、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシド生成物は、以下に記載のように、続く反応をin vitroで行うための基質として使用することができる。WO 2013/076577およびWO 2014/086842を参照。
【０１０１】
いくつかの態様において、宿主はオキシドスクアレンをグルコースから、エルゴステロール経路を介して生産する。例えば、WO 2014/0027118を参照。いくつかの側面において、スクアレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸分子を発現する宿主は、スクアレンを生産することができる。いくつかの態様において、スクアレンシンターゼはＥＲＧ９であり、ＥＲＧ９のアミノ酸配列は配列番号８７に記載されている。いくつかの態様において、スクアレンシンターゼは、宿主に対して内因性である。いくつかの態様において、内因性スクアレンシンターゼおよび／またはスクアレンエポキシダーゼのコピー数の増加、スクアレンシンターゼおよび／またはスクアレンエポキシダーゼをコードする異種核酸分子の発現、または内因性スクアレンシンターゼおよび／またはスクアレンエポキシダーゼの発現の増加は、組換え宿主中で生産されるモグロシドのレベルを改善することができる。
【０１０２】
一態様において、組換え宿主は、宿主中のスクアレンエポキシダーゼの高発現を指向する配列に作動可能に連結されたスクアレンエポキシダーゼをコードする異種核酸を含む。したがって、スクアレンエポキシダーゼは、組換え宿主に対して内因性であり得るが、発現レベルは、スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸の追加のコピーおよび／またはより強力なプロモーターの使用によって、増加させることができる。
【０１０３】
オキシドスクアレンは、ラノステロールの生産のための基質として働く。したがって、いくつかの態様において、オキシドスクアレンのレベルは、ラノステロールシンターゼ活性を低下させることによって増加させることができる。内因性ラノステロールシンターゼを発現する組換え宿主において、これは、ラノステロールシンターゼの、内因性プロモーター指向性の発現を、より低いレベルのラノステロールシンターゼの、弱いプロモーター指向性の発現で置換することにより、達成され得る。酵母において、ＥＲＧ７遺伝子は、ラノステロールシンターゼをコードする。したがって、組換え宿主が酵母である場合、ＥＲＧ７遺伝子プロモーターは、ＥＲＧ７の内因性発現レベルより低い発現レベルを指向する別のプロモーターの代わりに用いることができる。したがって、ラノステロールシンターゼは、その配列が配列番号５５として本明細書に提供されるS. cerevisiaeのＥＲＧ７遺伝子の生成物、またはそれと少なくとも５０％の配列同一性を共有するその機能的ホモログであることができる。例８および１５を参照。
【０１０４】
さらに、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの切断型（ｔＨＭＧ１、配列番号７７、配列番号７８）の発現も、オキシドスクアレンの増強されたレベルを導くことができる。酵母ＨＭＧレダクターゼの有用な切断型（ｔＨＭＧ１）は、Donald et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:3341-4に記載されている。
【０１０５】
ジオキシドスクアレンレベルは、スクアレンエポキシダーゼの高発現によって増強することができる。スクアレンエポキシダーゼは、S. cerevisiaeＥＲＧ１遺伝子の生成物であることができる。したがってスクアレンエポキシダーゼは、配列番号５４のポリペプチド、またはそれと少なくとも４５％の配列同一性を共有するその機能的ホモログであることができる。ジオキシドスクアレンのレベルはまた、ラノステロールシンターゼ活性を低下させることによって増強することもできる。ジオキシドスクアレンレベルはまた、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの切断型（ｔＨＭＧ１、配列番号７７、配列番号７８）の発現によって増強することもできる。例８および１５を参照。
【０１０６】
いくつかの態様において、ククルビタジエノールをヒドロキシル化して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを形成すること、または２４，２５エポキシククルビタジエノールをヒドロキシル化して１１−ヒドロキシ−２４，２５−エポキシククルビタジエノールを形成することは、少なくとも１つのＣＹＰ活性化剤によって支援することができる。組換え宿主は、１または２以上のシトクロムＰ４５０酵素をコードする異種核酸およびＣＹＰ活性化剤をコードする異種核酸を、同時発現することができる。ＣＹＰ活性化剤は、例えば、ＣＰＲ４４９７（配列番号４５、配列番号４６）または配列番号４６と少なくとも５０％の配列同一性を共有する機能的ホモログであり得る。例１０、１５、および１６を参照。
【０１０７】
いくつかの態様において、S. grosvenoriiＣＹＰ５４９１（配列番号１４、配列番号４４）、S. grosvenoriiＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７３、配列番号７４）、S. grosvenoriiＣＰＲ４４９７（配列番号４５、配列番号４６）、およびエポキシドヒドロラーゼを同時発現するククルビタジエノール産生S. cerevisiae株は、モグロールを生産する。いくつかの態様において、エポキシドヒドロラーゼは、エポキシドヒドロラーゼ２（配列番号３９、配列番号４０）である。いくつかの態様において、ククルビタジエノール産生S. cerevisiae株はさらに、ＥＲＧ１（配列番号５４）によってコードされるスクアレンエポキシダーゼを過剰発現し、切断型ＨＭＧレダクターゼ（ｔＨＭＧ１、配列番号７７、配列番号７８）を発現し、S. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼ（配列番号４２、配列番号４３）を発現し、ＴＲＰ１遺伝子が欠失しており、および、内因性ＥＲＧ７遺伝子（配列番号５５）の、破壊されたプロモーターを含む。例１５を参照。
【０１０８】
いくつかの態様において、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドは、１または２以上の、スクアレンエポキシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子、エポキシドヒドロラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および／またはグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む組換え宿主で生産される。いくつかの側面において、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するＵＧＴ１５７６ポリペプチドをコードする遺伝子、配列番号６２に記載のアミノ酸配列と４５％以上の同一性を有するＵＧＴ４３０ポリペプチドをコードする遺伝子、配列番号６８に記載のアミノ酸配列と４５％以上の同一性を有するＵＧＴ１６９７ポリペプチドをコードする遺伝子、配列番号７２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ１１７８９ポリペプチドをコードする遺伝子、および／または配列番号５３に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するＵＧＴ９８ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。例１６を参照。
【０１０９】
いくつかの態様において、モグロシドＶは、以下を含むS. cerevisiae株で生産される：S. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼ（配列番号４２、配列番号４３）、ＣＹＰ５４９１（配列番号８１、配列番号４４）、ＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７４）、ＣＹＰ１７９８−ＩＩ（配列番号８６、配列番号７４）、ＣＰＲ４４９７（配列番号８２、配列番号４６）、エポキシドヒドロラーゼ２（配列番号３９、配列番号４０）、ＵＧＴ１５７６（配列番号８３、配列番号４８）、ＵＧＴ４３０（配列番号８４、配列番号６２）、ＵＧＴ１６９７（配列番号８５、配列番号６８）、ＵＧＴ９８（配列番号５２、配列番号５３）およびＵＧＴ１１７８９（配列番号７１、配列番号７２）。いくつかの態様において、株は、S. cerevisiaeＥＸＧ１遺伝子が欠失したS. cerevisiae２８８ＣのＭａｔα誘導体である。いくつかの態様において、宿主はさらに、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＥ１、およびモグロールを生産する。例１６を参照。
【０１１０】
モグロシドをin vitroで生産する方法
いくつかの態様において、モグロシドは、モグロシド前駆体、モグロール、またはグリコシル化モグロールの、in vitroでのモグロシド経路に関与する１または２以上の酵素との接触によって生産される。例えば、モグロールとＵＧＴポリペプチドとの接触は、in vitroでモグロシドの生産をもたらし得る。いくつかの態様において、モグロール前駆体は、上流のモグロシド前駆体と、in vitroでのモグロシド経路に関与する１または２以上の酵素との接触によって生産される。例えば、ククルビタジエノールとシトクロムＰ４５０ポリペプチドおよびエポキシドヒドロラーゼとの接触は、in vitroでモグロールの生産をもたらし得る。
【０１１１】
いくつかの態様において、モグロール前駆体は、１または２以上の次のステップによって生産される：
ａ．オキシドスクアレンをククルビタジエノールシンターゼと、例えば限定されないが配列番号４３に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するククルビタジエノールシンターゼと接触させて、ククルビタジエノールを生産する（図２Ｂおよび２ＣのステップＡ参照）；または
ｂ．ジオキシドスクアレンをククルビタジエノールシンターゼと、例えば限定されないが配列番号４３に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するククルビタジエノールシンターゼと接触させて、２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産する（図２Ｂおよび図２ＣのステップＢ参照）；または
ｃ．ククルビタジエノールをシトクロムＰ４５０と、例えば限定されないが配列番号４４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＣＹＰ５４９１と接触させて、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを生産する（図２Ｂおよび２ＣのステップＣ参照）；または
ｄ．２４，２５エポキシククルビタジエノールをシトクロムＰ４５０と、例えば限定されないが配列番号４４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＣＹＰ５４９１と接触させて、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシドククルビタジエノールを生産する（図２Ｂおよび２ＣのステップＤ参照）；または
ｅ．ククルビタジエノールをシトクロムＰ４５０と、例えば限定されないが配列番号７４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８と接触させて、２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産する（図２Ｂおよび２ＣのステップＥ参照）；または
ｆ．１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールをシトクロムＰ４５０と、例えば限定されないが配列番号７４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するＣＹＰ１７９８と接触させて、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを生産する（図２Ｂおよび２ＣのステップＦ参照）。
【０１１２】
いくつかの態様において、モグロールは、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールをエポキシドヒドロラーゼと、例えば限定されないが、配列番号３８に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ１、または配列番号４０に記載のアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するエポキシドヒドロラーゼ２と接触させて、in vitroで生産される（図２Ｂおよび２ＣのステップＧ参照）。
【０１１３】
いくつかの態様において、モグロシド（図２Ｂおよび２ＣのステップＨ参照）は、in vitroで以下により生産される：
ａ．モグロールを、ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号２１）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号２３）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２５）、および／またはＵＧＴ１５７６（配列番号４８）と接触させて、モグロシドＩＡ１を生産する；または
ｂ．モグロールを、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号２２）と接触させて、モグロシドＩＥ１および／またはモグロシドＩＡ１を生産する；または
ｃ．モグロールを、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号２４）と接触させて、モグロシド１Ａ１および／またはＣ１１−ＯＨ上でグリコシル化されたモグロシドを生産する；または
ｄ．モグロールを、ＵＧＴ４３０（配列番号６２）と接触させて、モグロシドＩＥ１を生産する；または
ｅ．モグロールを、ＵＧＴ１６９７（配列番号６８）と接触させて、モグロシドＩＩＥ１および／またはモグロシドＩＡ１を生産する；または
ｆ．モグロシドＩＡ１を、ＵＧＴ９８（配列番号５３）、ＵＧＴＳＫ９８（配列番号５０）、および／またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）と接触させて、モグロシドＩＩＡを産生する；または
ｇ．モグロシドＩＡ１を、ＵＧＴ４３０（配列番号６２）と接触させて、モグロシドＩＩＥを生産する；または
ｈ．モグロシドＩＡ１を、ＵＧＴ９８（配列番号５３）および／またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）と接触させて、モグロシドＩＩＩＡ１を生産する；または
ｉ．モグロシドＩＥ１を、ＵＧＴ１５７６（配列番号４８）および／またはＵＧＴ１６９７（配列番号６８）を接触させて、モグロシドＩＩＥを生産する；または
ｊ．モグロシドＩＩＡを、ＵＧＴ９８（配列番号５３）および／またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）と接触させて、モグロシドＩＩＩＡ１を生産する；または
ｋ．モグロシドＩＩＥを、ＵＧＴ９８（配列番号６２）および／またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）と接触させて、モグロシドＩＩＩＡ１、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩＥ、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶＡ、モグロシドＩＶ、シアメノシド、またはモグロシドＶを生産する；または
ｌ．モグロシドＩＩＩＡ１を、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号２２）と接触させて、シアメノシド１を生産する；または
ｍ．シアメノシド１を、ＵＧＴ９８（配列番号５３）および／またはＵＧＴ１１７８９（配列番号７２）と接触させて、モグロシドＶを生産する。
【０１１４】
上記のステップの各々は別々に実施することができる。少なくとも２つのステップが別々に実施される態様において、ステップの生成物は、次のステップを実施する前に精製または部分精製することができる。代替的に、１または２以上のステップを同じ混合物内で同時に実施することができる。
【０１１５】
いくつかの態様において、細胞溶解物は、１または２以上の、スクアレンエポキシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする遺伝子、エポキシドヒドロラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、およびＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主から、調製される。例えば細胞溶解物は、１または２以上のＵＧＴを発現する宿主から調製され、モグロシドをin vitroで生産することができるように、モグロールと接触させて用いることができる。
【０１１６】
モグロシドを全細胞生物変換により生産する方法
いくつかの態様において、モグロール前駆体、モグロール、またはモグロシドは、全細胞生物変換によって生産される。全細胞生物変換が起きるためには、モグロシド経路に関与する１または２以上の酵素を発現する宿主は、細胞中のモグロールまたはモグロシド前駆体を取り込んで改変する；in vivoでの改変に続いて、モグロシドが培地中に排出される。例１１〜１４を参照。
【０１１７】
いくつかの態様において、モグロール前駆体は、オキシドスクアレン、ジオキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２４，２５エポキシククルビタジエノールであり、モグロシド前駆体はモグロールである。全細胞生物変換の非限定的な例において、ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を発現する宿主は、細胞中でモグロールを取り込んでモグロールをグリコシル化することができる；in vivoでのグリコシル化の後、モグロシドが培養培地中に排出される。
【０１１８】
細胞には、細胞増殖中または細胞増殖後に、モグロール前駆体またはモグロシド前駆体を供給することができる。細胞は懸濁状態であっても固定化されていてもよい。細胞は、発酵ブロス中または反応緩衝液中に存在することができる。いくつかの態様において、透過促進剤を用いて、モグロール前駆体またはモグロシド前駆体を細胞に移入する。いくつかの態様において、モグロール前駆体またはモグロシド前駆体は、精製形態で、または組成物もしくは抽出物の一部として提供され得る。
【０１１９】
いくつかの側面において、モグロール前駆体またはモグロシド前駆体は、in vitroで生産される；その後、モグロール前駆体またはモグロシド前駆体は、モグロール前駆体またはモグロシド前駆体の変換を触媒することができる宿主に提供される。
【０１２０】
いくつかの態様において、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１５７６、およびＵＧＴ４３０を発現する組換え宿主は、与えられたモグロールをモグロシドＶに変換する。例１４参照。いくつかの態様において、ＵＧＴ１１７８９を発現する宿主は、モグロシドＩＩＥのトリグリコシルモグロシドへの変換を触媒する。いくつかの態様において、ＵＧＴ１１７８９、ＵＧＴ１５７６、およびＵＧＴ４３０を発現する宿主は、モグロールのトリグリコシル化モグロシドへの変換を触媒する。いくつかの態様において、ＵＧＴ１１７８９、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１５７６、およびＵＧＴ４３０を同時発現する組換え宿主は、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１５７６およびＵＧＴ４３０を発現する組換え宿主よりも効率的に、与えられたモグロールをモグロシドＶに変換する。例１４を参照。
【０１２１】
組換え遺伝子および機能的ホモログ
用語「組換え遺伝子」は、レシピエント宿主に導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指し、ここで同一または類似の遺伝子またはＤＮＡ配列が、かかる宿主中に既に存在し得るかどうかは問わない。この文脈において「導入された」または「増強された」とは、当該技術分野において、人間の手によって導入または増強されることを意味すると知られている。したがって、組換え遺伝子は、別の種由来のＤＮＡ配列であってもよく、または同じ種に由来するか、または同じ種に存在するＤＮＡ配列であってもよいが、組み換え法によって宿主に組み入れられて組換え宿主を形成する。宿主に導入される組換え遺伝子は、形質転換される宿主中に通常存在するＤＮＡ配列と同一であることができ、そしてＤＮＡの１または２以上のさらなるコピーを提供するために導入されて、これによりそのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現を可能にする。好ましい態様において、ＤＮＡは、細胞内で産生された遺伝子のｍＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーである。
【０１２２】
いくつかの態様において、ＵＧＴポリペプチドのコード配列などの、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は、異種配列である。語句「異種配列」および「異種コード配列」は、組換え宿主以外の種に由来する配列を記述するために使用される。いくつかの態様において、組換え宿主はS. cerevisiae細胞であり、異種配列はS. cerevisiae以外の生物に由来する。異種コード配列は、例えば、異種配列を発現する組換え宿主とは異なる原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫または真菌由来であることができる。いくつかの態様において、コード配列は宿主に固有の配列である。
【０１２３】
本発明のいくつかの側面において、スクアレンエポキシダーゼポリペプチド、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ポリペプチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、エポキシドヒドロラーゼポリペプチドおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、融合タンパク質である。いくつかの態様において、スクアレンエポキシダーゼポリペプチド（配列番号５４のスクアレンエポキシダーゼポリペプチドを含むが、これに限定されない）、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチド（配列番号４３のククルビタジエノールシンターゼポリペプチドを含むが、これに限定されない）、シトクロムＰ４５０ポリペプチド（配列番号４４のＣＹＰ５４９１ポリペプチドを含むが、これに限定されない）、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド（配列番号４６のＣＰＲ４４９７ポリペプチドを含むが、これに限定されない）、エポキシドヒドロラーゼポリペプチド（配列番号３８のＥＨ１ポリペプチドまたは配列番号４０のＥＨ２ポリペプチドを含むが、これらに限定されない）、および／またはＵＧＴポリペプチド（配列番号４８のＵＧＴ１５７６、配列番号６２のＵＧＴ４３０、配列番号６８のＵＧＴ１６９７、配列番号７２のＵＧＴ１１７８９、配列番号５３のＵＧＴ９８、または配列番号５０のＵＧＴＳＫ９８を含むが、これらに限定されない）は、融合ポリペプチドである。用語「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、「融合酵素」、「キメラタンパク質」、「キメラポリペプチド」および「キメラ酵素」は、本明細書において互換的に使用することができて、異なるタンパク質をコードする２または３以上の遺伝子の接合（joining）によって操作されるタンパク質を指す。いくつかの態様において、スクアレンエポキシダーゼポリペプチド、ククルビタジエノールシンターゼポリペプチド、シトクロムＰ４５０ポリペプチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチド、エポキシドヒドロラーゼポリペプチド、および／またはグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされたポリペプチドの、その後の操作（例えば、精製または検出を容易にするため）、分泌、または局在化を容易にするために設計された「タグ」をコードするタグ配列含む。ポリペプチドをコードする核酸配列にタグ配列を挿入して、コードされたタグが、ポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに位置するようにすることができる。コードされたタグの非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（ＨＩＳタグ）およびＦｌａｇ（商標）タグ（Kodak, New Haven, CT）を含む。タグの他の例には、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグが含まれる。
【０１２４】
いくつかの態様において、融合タンパク質は、ドメインスワッピングによって改変されたタンパク質である。本明細書で使用する「ドメインスワッピング」という用語は、第１のタンパク質のドメインを第２のタンパク質のドメインで置き換えるプロセスを記述するために、使用される。いくつかの態様において、第１のタンパク質のドメインおよび第２のタンパク質のドメインは、機能的に同一または機能的に類似している。いくつかの態様において、第２のタンパク質のドメインの構造および／または配列は、第１のタンパク質のドメインの構造および／または配列とは異なる。いくつかの態様において、シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドは、ドメインスワッピングによって改変される。例えば、いくつかの側面において、ＣＰＲ４４９７（配列番号４６）のシトクロムＰ４５０ドメインまたはレダクターゼドメインは、ＣＰＲ４４９７（配列番号４６）以外のシトクロムＰ４５０レダクターゼのシトクロムＰ４５０ドメインまたはレダクターゼドメインによって置き換えられる。他の側面において、ＵＧＴポリペプチドは、ドメインスワッピングによって改変される。
【０１２５】
上記のポリペプチドの機能的ホモログもまた、組換え宿主においてステビオールグリコシドを生産する際の使用に適している。機能的ホモログは、参照ポリペプチドと配列類似性を有し、参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能の１または２以上を行うポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであることができ、配列類似性は、収束または発散進化事象に起因し得る。このように機能的ホモログは、文献において、ホモログ、またはオルソログ、またはパラログとして指定されることがある。天然に存在する機能的ホモログの変異体、例えば野生型コード配列の突然変異体によってコードされるポリペプチドは、それ自体が、機能的ホモログであり得る。機能的ホモログは、ポリペプチドのコード配列の部位特異的突然変異誘発を介して、または天然に存在する異なるポリペプチドのコード配列由来のドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピンッグ」）によっても、作製することができる。本明細書に記載の機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を改変する技術は知られており、とりわけ、指向性進化技術、部位特異的変異誘発技術およびランダム変異誘発技術を含み、ポリペプチドの特異的活性を増加させ、基質特異性を変化させ、発現レベルを変化させ、細胞内位置を変化させ、またはポリペプチド−ポリペプチド相互作用を所望の様式で改変することができる。かかる改変されたポリペプチドは、機能的ホモログと考えられる。用語「機能的ホモログ」は、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される場合もある。
【０１２６】
機能的ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列のアライメントの分析により、同定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースに対するクエリーを実行することにより、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのホモログを同定することができる。配列分析は、ＵＧＴアミノ酸配列を参照配列として使用する非重複データベースの、ＢＬＡＳＴ、相互ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ分析を含むことができる。アミノ酸配列は、いくつかの例において、ヌクレオチド配列から推定される。４０％を超える配列同一性を有するデータベース中のポリペプチドは、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドとしての適合性についての、さらなる評価の候補である。アミノ酸配列類似性は、保存的アミノ酸置換、例えば１つの疎水性残基の別の残基への置換、または１つの極性残基の別の残基への置換などを可能にする。所望により、かかる候補の手動検査を実行して、さらに評価する候補の数を絞り込むことができる。手動検査は、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドに存在するドメイン、例えば、保存された機能的ドメインを有すると思われる候補を選択することにより、行うことができる。
【０１２７】
保存領域は、ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの一次アミノ酸配列内の領域であって、反復配列である領域、いくつかの二次構造（例えば、ヘリックスおよびベータシート）を形成する領域、正もしくは負に帯電したドメインを確立する領域、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表す領域を特定することにより、同定が可能である。例えば、様々なタンパク質モチーフおよびドメインのコンセンサス配列を記載するＰｆａｍウェブサイトを、World Wide Webのsanger.ac.uk/Software/Pfam/ and pfam.janelia.org/にて参照のこと。Ｐｆａｍデータベースに含まれる情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997)；およびBateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)に記載されている。保存領域はまた、密接に関連する種からの同一または関連ポリペプチドの配列のアライメントによっても、決定することができる。密接に関連する種は、好ましくは同じ科（family）のものである。いくつかの態様において、２つの異なる種からの配列のアライメントは、かかるホモログを同定するのに適切である。
【０１２８】
典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドは、保存領域を同定するのに有用である。関連ポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。いくつかの態様において、保存領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
【０１２９】
組換え宿主
本明細書の以下に記載の組換え宿主は、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドを生産するための方法において使用することができる。例えば、組換え宿主が微生物である場合、この方法は、組換え微生物を培養培地中、本発明の方法の１または２以上のステップを触媒する１または２以上の酵素、例えばシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＣＹＰ４５０および／またはＵＧＴが発現される条件下で、増殖させることを含むことができる。この文脈において、用語「微生物」および「微生物宿主」および「組換え宿主」は交換可能に使用することができ、細菌を含む微生物、または酵母を含む微生物真菌を指す。微生物は、限定はされないが、真核細胞または不死化細胞であることができる。
【０１３０】
例示的な原核生物種および真核生物種は、以下により詳細に記載される。しかし、他の種も適し得ることが理解されるであろう。例えば、適切な種は、以下を含む属であることができる：Agaricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Escherichia、Fusarium／Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodoturula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、Xanthophyllomycesおよび Yarrowia。かかる属からの例示的な種としては、Lentinus tigrinus、Laetiporus sulphureus、Phanerochaete chrysosporium、Pichia pastoris、Physcomitrella patens、Rhodoturula glutinis 32、Rhodoturula mucilaginosa、Phaffia rhodozyma UBV-AX、Xanthophyllomyces dendrorhous、Fusarium fujikuroi／Gibberella fujikuroi、Candida utilisおよびYarrowia lipolyticaが挙げられる。いくつかの態様において、微生物は、子嚢菌、例えばGibberella fujikuroi、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Aspergillus niger、またはSaccharomyces cerevisiaeであることができる。いくつかの態様において、微生物は、原核生物、例えばEscherichia coli、Rhodobacter sphaeroidesまたはRhodobacter capsulatusであることができる。特定の微生物を使用して、目的の遺伝子を高スループット様式でスクリーニングおよび試験でき、一方で所望の生産性または成長特性を有する他の微生物を、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドの大規模生産に使用できることが、理解されるであろう。
【０１３１】
本発明の特定の態様において、微生物には、限定はされないが、S. cerevisiae、A.niger、A.oryzae、E.coli、L.lactisおよびB.subtilisが含まれる。本発明によって提供される、構築され遺伝子操作された微生物は、とりわけ、ケモスタット、バッチ、流加培養、連続灌流発酵、および連続灌流細胞培養を含む従来の発酵プロセスを用いて、培養することができる。
【０１３２】
細菌細胞を含む例示的な態様には、限定はされないが、Bacillus属、Escherichia属、Lactobacillus属、Lactobacillus属、Corynebaclerium属、Acetobacler属、Acinetobacler属、またはPseudomonas属に属する種の細胞が含まれる。
【０１３３】
微生物は真菌であることができ、より具体的にはAspergillus属に属する糸状菌、例えばA. niger、A. awamori、A. oryzaeまたはA. nidulans；Saccharomyces属に属する酵母、例えばS. cerevisiae、S. kluyveri、S. bayanus、S. exiguus、S. sevazziまたはS. uvarum；Kluyveromyces属に属する酵母、例えばK. laclis、K. marxianus var. marxianus、またはK. thermololerans；カンジダ属に属する酵母、例えばC. ululis、C. lropicalis、C. albicans、C. lipolylicaまたはC. versalilis；Pichia属に属する酵母、例えば、R. slipidis、R. pasloris、またはP. sorbilophila、または他の酵母属、例えばCryplococcus、Debaromyces、Hansenula、Pichia、Yarrowia、Zygosaccharomyces、またはSchizosaccharomycesなどに由来し得る。他の微生物に関しては、適切な糸状菌の非網羅的なリストが提供される：Penicillium、Rhizopus、Fusarium、Fusidium、Gibberella、Mucor、MorlierellaおよびTrichoderma属に属する種。
【０１３４】
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiaeは、合成生物学において広く使用されているシャシー生物であり、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。S. cerevisiaeについての、突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデル、および利用可能なその他の情報のライブラリーがあり、生成物収率を高めるための様々なモジュールの合理的な設計が可能である。組換え微生物の作製方法は周知である。
【０１３５】
本明細書に記載の遺伝子は、酵母において、多数の知られているプロモーターのいずれかを用いて発現させることができる。フェニルプロパノイドを過剰生産する菌株は知られており、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドの生産においてアクセプター分子として使用することができる。
【０１３６】
Aspergillus種
A. oryzae、A. nigerおよびA. sojaeなどのAspergillus種は、食品生産において広く使用されている微生物であり、組換え微生物プラットフォームとしても使用することができる。A. nidulans、A. fumigatus、A. oryzae、A. clavatus、A. flavus、A. niger、およびA. terreusのゲノムについてヌクレオチド配列が利用可能であり、フラックスを増強し、生成物の収率を増加させるための内因性経路の合理的設計および改変を可能としている。Aspergillusの代謝モデルが開発され、トランスクリプトーム研究およびプロテオミクス研究もなされている。A. nigerは、クエン酸およびグルコン酸などの多数の食物成分の工業的生産のために培養され、したがってA. nigerなどの種は一般に、モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドの生産に適している。
【０１３７】
Escherichia coli
合成生物学において広く使用されている別のプラットフォーム生物であるEscherichia coliもまた、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。Saccharomycesと同様に、E. coliについての、突然変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデル、および利用可能なその他の情報のライブラリーがあり、生成物収率を高めるための様々なモジュールの合理的な設計が可能である。Saccharomycesについて上記したものと同様の方法を用いて、組換えE. coli微生物を作製することができる。
【０１３８】
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete種
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete種は、培養物中に大量のジベレリンを生産することが知られているために有用であり得る。したがって、モグロール前駆体、モグロール、またはモグロシドの生産におけるアクセプター分子として使用されるテルペンの前駆体は、内因性遺伝子によってすでに生産されている。したがって、テルペンの生合成のための組換え遺伝子を含むモジュールを、かかる属から、他の化合物または経路遺伝子を導入する必要なく、種に導入することができる。
【０１３９】
Arxula adeninivorans（Blastobotrys adeninivorans）
Arxula adeninivoransは二形性酵母であり（これは出芽酵母としてパン酵母のように４２℃の温度まで増殖し、この閾値を超えると糸状の形態で増殖する）、異常な生化学的特徴を有する。これは広範囲の基質上で増殖することができ、硝酸塩を同化することができる。これは、天然プラスチックを生産できる株の生成に、または環境試料中のエストロゲンに対するバイオセンサーの開発に、成功して適用されている。
【０１４０】
Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolyticaは二形性酵母（Arxula adeninivoransを参照）であり、半子嚢菌類（Hemiascomycetes）に属する。Yarrowia lipolyticaの全ゲノムは知られている。Yarrowia種は好気性であり、非病原性であると考えられる。Yarrowiaは、疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、油）の使用において効率的であり、糖で成長することができる。これは工業用途のための高い可能性を有し、油性微生物である。Yarrowia lipolypticaは、その乾燥細胞重量の約４０％まで脂質含量を蓄積することができ、脂質蓄積および再可動のためのモデル生物である。例えばNicaud, 2012, Yeast 29(10):409-18；Beopoulos et al., 2009, Biochimie 91(6):692-6；Bankar et al., 2009, Appl Microbiol Biotechnol. 84(5):847-65を参照。
【０１４１】
Rhodotorula種
Rhodotorulaは単細胞性着色酵母である。油性赤酵母Rhodotorula glutinisは、粗製グリセロールから脂質およびカロテノイドを生産することが示されている（Saenge et al., 2011, Process Biochemistry 46(1):210-8）。Rhodotorula toruloides株は、改良されたバイオマスおよび脂質生産性のための効率的な流加発酵システムであることが示されている(Li et al., 2007, Enzyme and Microbial Technology 41:312-7)。
【０１４２】
Rhodosporidium toruloides
Rhodosporidium toruloidesは油性酵母であり、脂質生産経路を操作するのに有用である（例えば、Zhu et al., 2013, Nature Commun. 3:1112；Ageitos et al., 2011, Applied Microbiology and Biotechnology 90(4):1219-27を参照）。
【０１４３】
Candida boidinii
Candida boidiniiはメチロトローフ酵母である（メタノール上で増殖することができる）。Hansenula polymorphaおよびPichia pastorisなどの他のメチロトローフ種と同様に、異種タンパク質を生産するための優れたプラットフォームを提供する。分泌された外来タンパク質のマルチグラム範囲の収率が報告されている。計算方法ＩＰＲＯにより、最近、Candida boidiniiキシロースレダクターゼの補因子特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨに実験的に切り替える突然変異が予測された。例えば、Mattanovich et al., 2012, Methods Mol Biol. 824:329-58；Khoury et al., 2009, Protein Sci. 18(10):2125-38を参照。
【０１４４】
Hansenula polymorpha（Pichia angusta）
Hansenula polymorphaはメチロトローフ酵母である（Candida boidinii参照）。これは広範囲の他の基板上でさらに成長することができる；これは耐熱性であり、硝酸塩を同化することができる（Kluyveromyces lactisも参照のこと）。これは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリン、およびＣ型肝炎の処置のためのインターフェロンα−２ａ、さらには様々な技術的酵素の生産に適用されている。例えば、Xu et al., 2014, Virol Sin. 29(6):403-9を参照。
【０１４５】
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces lactisは、ケフィアの生産にしばしば適用される酵母である。これはいくつかの糖類で、最も重要なことには乳と乳清に存在する乳糖で増殖することができる。これは特に、チーズ製造のための、キモシン（通常は子牛の胃に存在する酵素）を生産するために成功して適用されている。生産は４０，０００Ｌ規模の発酵槽で行われる。例えばvan Ooyen et al., 2006, FEMS Yeast Res. 6(3):381-92を参照。
【０１４６】
Pichia pastoris
Pichia pastorisはメチロトローフ酵母である（Candida boidiniiおよびHansenula polymorpha参照）。これは、外来タンパク質を生産するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素はキットとして入手可能であり、タンパク質を生産するために学界において世界中で使用されている。複雑なヒトＮ−グリカン（酵母グリカンは類似しているが、ヒトに見られるものと同一ではない）を生産できるように、株が操作された。例えば、Piirainen et al., 2014, N Biotechnol. 31(6):532-7を参照。
【０１４７】
Physcomitrella種
浮遊培養で増殖させた場合のPhyscomitrellaコケは、酵母または他の真菌培養物と類似の特徴を有する。この属は、他の種類の細胞での生産が困難な、植物の二次代謝産物を生産するために使用することができる。
【０１４８】
当業者には明らかなように、モグロールおよびモグロシドをグリコシル化することができる特定のＵＧＴの選択プロセスの詳細は、選択マーカーの身元（identity）に依存する。すべての場合における選択は、マーカーを含む細胞の増殖を促進または可能にする一方、マーカーを欠く細胞の増殖を阻害または防止する。選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、形質移入された宿主集団は、選択マーカーによってそれへの抵抗性が付与されている抗生物質の存在下で、培養することができる。選択マーカーが宿主の栄養要求性を補う遺伝子である場合、形質移入された宿主集団は、それに対して宿主が栄養要求性であるところの化合物の非存在下で、培養することができる。
【０１４９】
選択後、組換え宿主は、当該分野で知られている任意の適切な方法に従ってクローニングすることができる。例えば、組換え微生物宿主を、選択条件下で固体培地上に播種することができ、その後、さらなる選択、特徴付けまたは使用のために、単一のクローンをさらに選択することができる。このプロセスは、宿主内の発現構築物の安定性を増強するために、１または２回以上繰り返すことができる。モグロシド経路ポリペプチドを生産するために、１または２以上の発現ベクターを含む組換え宿主を培養して、振とう培養フラスコまたは発酵槽などの当技術分野で知られている任意の適切な培養装置で、細胞数を増加させることができる。
【０１５０】
種々の組換え宿主に使用される培養培地は、当技術分野で周知である。組換え細菌細胞を培養するために使用される培養培地は、細菌の身元に依存する。組換え酵母細胞を培養するために使用される培養培地は、酵母の身元に依存する。培養培地は一般に、無機塩および化合物、アミノ酸、炭水化物、ビタミン、および宿主の成長に必要であるか、または宿主の健康もしくは成長またはこの両方を改善するのに必要な、他の化合物を含む。特に、培養培地は、典型的には、全てではないが多くのグリコシルトランスフェラーゼに対する補因子である、マンガン（Ｍｎ２＋）およびマグネシウム（Ｍｇ２＋）イオンを含む。
【０１５１】
本明細書中で使用される場合、用語「流加培養」または「半バッチ培養」は交換可能に使用されて、１または２以上の栄養素（基質）が培養中にバイオリアクターに供給され（補給され）、生成物（単数または複数）がランの最後までバイオリアクターに残っているところの生物技術的プロセスにおける、操作技術を指す。いくつかの態様においては、全ての栄養素がバイオリアクターに供給される。
【０１５２】
いくつかの態様において、組換え宿主を改変して、グルカナーゼ活性を、特にモグロシドの脱グリコシル化をもたらし得るグルカナーゼ活性を、低下することができる。したがって組換え宿主は、例えば、エキソ−１，３−β−グルカナーゼ活性を低下または消滅させるように、改変することができる。組換え宿主が酵母である場合の本発明の態様において、これは、ＥＸＧ１遺伝子（配列番号６３、配列番号６４）および／またはＥＸＧ２遺伝子（配列番号６５、配列番号６６）の欠失により達成することができる；これら遺伝子は両方ともエキソ−１，３−β−グルカナーゼをコードする。
【０１５３】
表２は、本明細書で利用する配列の同定を示す。
表２．本明細書で使用する配列
【表２−１】
2017529860.tif 000005
【表２−２】
2017529860.tif 000006
【表２−３】
2017529860.tif 000007
【表２−４】
2017529860.tif 000008
【表２−５】
2017529860.tif 000009
【０１５４】
本発明を、以下の例においてさらに説明する；これらの例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１５５】
以下の例は、本発明の特定の態様およびその様々な使用を例示するものである。これらは説明目的のみで記載されたものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１５６】
例１：モグロシドＶの精製
モグロシドＶを、市販のモンクフルーツ抽出物（PureLo（登録商標）、Swanson）から精製した。３本のPureLo（登録商標）（２４０ｇ）を水（９００ｍＬ）に溶解し、ＨＰ−２０樹脂（４００ｇの樹脂）カラムにロードした。カラムを水（２．５Ｌ）で洗浄し、水中の２０％メタノールでさらに洗浄した。生成物をメタノールで溶出した。溶媒を蒸発させ高真空での乾燥後に、モグロシドＶ（２．５ｇ）を得た。生成物は約８０％の純度であり、１１−オキソモグロシドＶが主要な不純物であった。
【０１５７】
例２：モグロールのモグロシドＶからの酵素的合成
モグロシドＶ（３００ｍｇ）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、１００ｍＬ）に溶解し、Aspergillus nigerからの粗ペクチナーゼ（２５ｍＬ、Sigma P2736）を添加した。混合物を５０℃で４８時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を真空下で乾燥し、次いで分取ＨＰＬＣで精製した。純粋なモグロール（４０ｍｇ）を得て、その構造をＮＭＲおよび質量分析で確認した。図５参照。
【０１５８】
例３：モグロール３−Ｏ−グルコシド（モグロシドＩＥ１）およびモグロール２４−Ｏ−グルコシド（モグロシドＩＡ１）のモグロシドＶからの酵素的合成
モグロシドＶ（３００ｍｇ）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、１００ｍＬ）に溶解し、Aspergillus nigerからの粗ペクチナーゼ（２５ｍＬ、Sigma P2736）を添加した。混合物を５０℃で６．５時間撹拌し、次いで酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を真空下で乾燥し、分取ＨＰＬＣで精製した。純粋なモグロシドＩＥ１（１１．０ｍｇ）およびモグロシドＩＡ１（８．０ｍｇ）を得た。それらの構造を、ＮＭＲおよび質量分析で確認した。図５参照。
【０１５９】
例４：in vitroでのＵＧＴのスクリーニングおよび反応
ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号２１）、ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号２２）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号２３）、ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号２４）、およびＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２５）は、モグロールをin vitroでグリコシル化することが見出された。反応混合物は、４Ｘトリス緩衝液、モグロール（２５０μＭ）、ＵＤＰ−グルコース（７５０μＭ）および１％のアルカリホスファターゼを含んでいた。５μｌの各部分精製ＵＧＴ酵素または粗酵素抽出液を、反応物に添加し、反応容量を水で５０μｌとした。反応物を３０℃で一晩インキュベートし、滅菌９６ウェルプレート中で行った。次に２５μＬのＤＭＳＯを各反応物に添加し、反応プレートを５分間遠心分離した。４０μＬの試料を各ウェルから採取し、濾過して、ＬＣ−ＭＳ分析に使用した。
【０１６０】
ＵＧＴ７３Ｃ３（配列番号２１）、ＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号２３）およびＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２５）は、モグロシド基質全体をモグロシドＩＡ１に変換することが見出された。ＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号２２）は、モグロシドＩＥ１およびモグロシドＩＡ１の両方を生産した。ＵＧＴ７３Ｅ１（配列番号２４）は、モグロールを、モグロシド１Ａ１（主要生成物）と、モグロシドＩＥ１でもモグロシドＩＡでもないグリコシル化モグロールとに変換した。生成物は、Ｃ１１−ＯＨ上のグリコシル化事象によって生じた；正確な質量はモグロシドＩとして示した。
【０１６１】
例５：モンクフルーツのククルビタジエノールシンターゼ
ＣｉｒＣＳ遺伝子は、モンクフルーツのククルビタジエノールシンターゼをコードする；推定７６４のアミノ酸配列の３３８個をカバーする部分遺伝子配列の同定を、アセンブルされたデータのtBLASTn（翻訳ヌクレオチドデータベース）解析をCucurbita pepo（受託番号BAD34645.1、配列番号１）からのククルビタジエノールシンターゼのクエリーを用いて行うことにより、実施した。ＣｉｒＣＳの一部は、C. pepo遺伝子とタンパク質レベルで９７．５％同一である（配列番号２；配列番号１の残基５１５〜７６４から）。
【０１６２】
例６：モグロールのククルビタジエノールからの形成を触媒するＰ４５０酵素をコードするモンクフルーツ遺伝子
モグロールのクルビタジエノールからの形成を触媒するＰ４５０酵素を同定するために、tBLASTn（翻訳ヌクレオチドデータベース）解析を、S. grosvenoriiトランスクリプトームの再アセンブルされたシーケンシングのリードを用いて行った（Tang, et al., BMC Genomics 12: 343(2011)参照）。１０Ｅ−１０以下のＥ値を用いて、データベースクエリー配列と相同な配列を同定した。
【０１６３】
１８個の完全長またはほぼ完全長の遺伝子が同定された。アセンブルされた遺伝子を、ＣＹＰ５３３、ＣＹＰ９３７、ＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ１９９４、ＣＹＰ２０４８、ＣＹＰ２７４０、ＣＹＰ３４０４、ＣＹＰ３９６８、ＣＹＰ４１１２、ＣＹＰ４１４９、ＣＹＰ４４９１、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ６４７９、ＣＹＰ７６０４、ＣＹＰ８２２４、ＣＹＰ８７２８、ＣＹＰ１００２０およびＣＹＰ１０２８５と命名した（表２、配列番号３〜２０参照）。
【０１６４】
ＣＹＰ５３３（配列番号３）、ＣＹＰ９３７（配列番号４）、ＣＹＰ１７９８（配列番号５）、ＣＹＰ１９９４（配列番号６）、ＣＹＰ２７４０（配列番号８）、ＣＹＰ４１１２（配列番号１１）、ＣＹＰ４１４９（配列番号１２）、ＣＹＰ４４９１（配列番号１３）、ＣＹＰ５４９１（配列番号１４、配列番号４４）、ＣＹＰ７６０４（配列番号１６）、ＣＹＰ８２２４（配列番号１７）、およびＣＹＰ１０２８５（配列番号２０）の完全長合成S. grosvenorii遺伝子配列を、酵母発現ベクターにクローニングした。
【０１６５】
例７：モグロシドＩＩＥのグリコシル化を触媒する酵素をコードするモンクフルーツ遺伝子
モグロシドＩＩＥをモグロシドＶに変換することができるＵＧＴをコードするモンクフルーツ遺伝子配列を同定するために、tBLASTn（翻訳ヌクレオチドデータベース）解析を、S. grosvenoriiトランスクリプトームの再アセンブルされたシーケンシングのリードを用いて行った（Tang, et al., BMC Genomics 12: 343(2011)参照）。同定された遺伝子は、ＵＧＴ９８（配列番号２６）、ＵＧＴ１４９５（配列番号２７）、ＵＧＴ１８１７（配列番号２８）、ＵＧＴ３４９４（配列番号２９）、ＵＧＴ５９１４（配列番号３０）、ＵＧＴ８４６８（配列番号３１）、ＵＧＴ１０３９１（配列番号３２）、ＵＧＴ１１７８９（配列番号３３）、ＵＧＴ１１９９９（配列番号３４）、ＵＧＴ１３６７９（配列番号３５）、およびＵＧＴ１５４２３（配列番号３６）であった。
【０１６６】
これらのうち、ＵＧＴ９８（配列番号２６）、ＵＧＴ１４９５（配列番号２７）、ＵＧＴ１８１７（配列番号２８）、ＵＧＴ５９１４（配列番号３０）、ＵＧＴ８４６８（配列番号３１）、およびＵＧＴ１０３９１（配列番号３２）は、公的に入手可能な配列のリードから作製されたコンティグに基づいて合成された（Tang, et al., BMC Genomics 12: 343(2011)）。遺伝子を、酵母発現ベクターに挿入した。
【０１６７】
例８：モグロール経路前駆体の利用可能性を増強する
酵母におけるオキシドスクアレンおよびジオキシドスクアレンの利用可能性を増加させるために、内因性ＥＲＧ７遺伝子（配列番号５５）のプロモーターを、ノーセオスリシン（Nurseothricin）マーカー（ＮａｔＭＸ）およびＣＵＰ１銅誘導性プロモーターを含むＰＣＲ断片で置き換えた。こうして、酵母株を正常ＳＣ培地で増殖させた場合に、ＥＲＧ７の発現は減少した。ＥＲＧ７はラノステロールシンターゼをコードし、発現の低下は、パン酵母においてオキシドスクアレンおよびジオキシドスクアレンの蓄積をもたらすことが知られている。オキシドスクアレンは、一般にトリテルペノイドの前駆体である。オキシドスクアレンおよびジオキシドスクアレンの利用可能性をさらに増加させるために、ＥＲＧ１（配列番号５４）によってコードされるスクアレンエポキシダーゼが過剰発現され、酵母ＨＭＧレダクターゼの切断型コピー（ｔＨＭＧ１、配列番号７７、配列番号７８）が発現された。
【０１６８】
酵母におけるオキシドスクアレンおよびジオキシドスクアレン生産の成功した増強は、２つの可溶性S. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼのいずれか１つがこの株で発現された場合に、テトラヒドロキシスクアレンの生産によって実証された。S. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ１は配列番号３８に記載され、コドン最適化されたS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ１は配列番号３７に記載されている。S. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２は配列番号４０に記載され、コドン最適化されたS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２は配列番号３９に記載されている。図６は、S. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２を発現するプラスミドで形質転換された酵母株からの試料中のテトラヒドロキシスクアレンのプロトン＋Ｎａ＋付加物に対応する、ＬＣ−ＭＳ質量ピーク５０１を示す。テトラヒドロキシスクアレンは、ジオキシドスクアレンの２，３−および２２，２３−エポキシド結合の加水分解により、生産される。バックグラウンド酵母株では、テトラヒドロキシスクアレンの蓄積は検出されなかった。試料を、５０％ＤＭＳＯ中で培養アリコートを沸騰させ、次いで遠心分離によって細胞材料をペレット化することにより作製した。次いで上清を、ＥＳＩ ＬＣ−ＭＳにより測定した。
【０１６９】
例９：酵母株におけるククルビタジエノールの生産
配列番号４２と配列番号４３に記載のS. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼのコドン最適化遺伝子コピーの、S. cerevisiaeへの組み込みは、ククルビタジエノールの生産をもたらした（図７Ｂ参照）。酵母株を、２％グルコースを含むＳＣ培地中、３０℃で５日間増殖させた。ククルビタジエノールの抽出を、培養試料を５０％エタノール／２０％ＫＯＨ中で５分間煮沸し、続いて等容量のヘキサンで抽出することにより行った。次いで、試料をヘキサンで蒸発させ、乾燥抽出物をメタノールに再懸濁した。
【０１７０】
図７Ａおよび７Ｂは、配列番号４２および配列番号４３に記載のククルビタジエノールシンターゼを発現する酵母の試料の、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図７Ａはラノステロールのピークを示し、図７Ｂはククルビタジエノールとラノステロールのピークを示す。ラノステロールに対応するピークは約８．０５の保持時間を示し、ククルビタジエノールに対応するピークは７．８５の保持時間を有する。ラノステロールとククルビタジエノールの両方は、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおいて４０９．４の質量を示す（プロトン付加物から１個のＨ２Ｏ分子の質量を引いたもの）。
【０１７１】
例１０： S. cerevisiaeにおけるククルビタジエノールのＣＹＰ５４９１による改変
ククルビタジエノール産生酵母株（例９参照）の、S. grosvenoriiＣＹＰ５４９１遺伝子（配列番号１４、配列番号４４）を含むプラスミドおよびS. grosvenoriiＣＰＲ４４９７遺伝子（配列番号４５、配列番号４６）を含むプラスミドによる形質転換により、ＬＣ−ＭＳで３つのピークが見られた（図８参照）。図８の上のフレームは、これら３つのピークを有するＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示し、下の３つのフレームは、これらの３つのピークの断片化スペクトルを示す。３つのピークの質量（４４３．３８、４４１．３７および４５７．３６）はそれぞれ、ヒドロキシル化ククルビタジエノール、オキソククルビタジエノール、およびヒドロキシ＋オキソククルビタジエノールのプロトン付加物の重量に対応する。ヒドロキシル化ククルビタジエノール（プロトン化質量４４３．３８）および酸化ククルビタジエノール（プロトン化質量４４１．３７）はそれぞれ、ＮＭＲにより確認されるように、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールおよび１１−オキソ−ククルビタジエノールであった（図９）。
【０１７２】
例１１：S. grosvenoriiＵＧＴ９８、ＵＧＴＳＫ９８およびＵＧＴ１５７６の発現による、S. cerevisiaeにおけるモグロールのグリコシル化
ＵＧＴ９８、ＵＧＴＳＫ９８およびＵＧＴ１５７６遺伝子は、公的に入手可能な配列のリードから作製されたコンティグに基づいて合成された（Tang, et al., 2011, BMC Genomics 12:343）。ＵＧＴ９８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５１および配列番号５３として示され、一方配列番号５２は、ＵＧＴ９８のコドン最適化バージョンに対応する。ＵＧＴＳＫ９８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４９および配列番号５０として本明細書に記載されており、ＵＧＴ１５７６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４７および配列番号４８として本明細書に示されている。
【０１７３】
エキソ−１，３−βグルカナーゼＥＸＧ１およびＥＸＧ２を欠失した酵母株（生産されたモグロシドの脱グリコシル化を防止するため）に、モグロール（１０〜１００μＭ）を与え、ＵＧＴ１５７６（配列番号４７および配列番号４８）を発現するプラスミドで形質転換し、モグロシドＩＡ１が形成された（図１１Ｂ）。試料の調製を、培養液のアリコートをＤＭＳＯと１：１混合し、続いて５分間煮沸（８０℃）し、遠心分離によってペレット化することにより行った。次いで上清を、ＥＳＩ ＬＣ−ＭＳに供した。図１０Ａは、参照モグロシドＩＡ１のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示し、図１０Ｂは、５０μＭのモグロールを与えた培養物中のＵＧＴ１５７６を発現する酵母試料からのピークを示す。これらのデータは、ＵＧＴ１５７６遺伝子が、モグロールＣ２４−ＯＨ ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するグリコシルトランスフェラーゼをコードすることを示す。
【０１７４】
ＵＧＴ９８（配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３）およびＵＧＴＳＫ９８（配列番号４９、配列番号５０）を、酵母発現プラスミドにクローニングし、その後、エキソ−１，３−βグルカナーゼＥＸＧ１およびＥＸＧ２が欠失した酵母株に形質転換すると、供給されたモグロールの変換は検出されなかった。対照的に、ＵＧＴ９８（配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３）またはＵＧＴＳＫ９８（配列番号４９、配列番号５０）とＵＧＴ１５７６（配列番号４７および配列番号４８）の、モグロールを供給された酵母における同時発現は、モグロシドＩＡ１のさらなるグリコシル化をもたらした。ＵＧＴ１５７６と共に同時発現したＵＧＴＳＫ９８は、ジグリコシル化モグロール（モグロシドＩＩＡ、図１１Ａ）の生産をもたらし、一方、ＵＧＴ９８との同時発現は、ジグリコシル化およびトリグリコシル化モグロールをもたらした（中間および下部フレーム、図１１Ｂ）。ＵＧＴ９８とＵＧＴＳＫ９８の両方によって形成されたジグリコシル化モグロールは、ＬＣ−ＭＳの間、モグロシドＩＩＥおよびモグロシドＩＩＡ１とは異なる保持時間を有した。
【０１７５】
したがって、ＵＧＴ９８とＵＧＴＳＫ９８の両方が、モグロシドＩＡ１のグルコースの１，２−グリコシル化を触媒可能であることが判明した。ＵＧＴ９８は多機能性であり、モグロシドＩＡ１の１，２−グリコシル化を触媒し、モグロシドＩＩＡの生産をもたらし、続いてモグロシドＩＩＡの１，６−グリコシル化によってモグロシドＩＩＩＡ１を形成することが判明した（図１１Ｂ）。ＵＧＴ９８とＵＧＴＳＫ９８は、ＵＤＰ−グルコースグリコシルトランスフェラーゼのＵＧＴ９１ファミリーに属し、このファミリーのメンバーは１，２−および１，６−グリコシルトランスフェラーゼであることが知られている。図１２は、モグロールからモグロシドＩＩＩＡ１へのグリコシル化反応を概略的に要約する。
【０１７６】
例１２：S. grosvenoriiＵＧＴ４３０の発現による、モグロールのS. cerevisiaeにおけるグリコシル化
８５Ａ ＵＧＴファミリーのＵＧＴ４３０（配列番号６１、配列番号６２）を合成ＤＮＡからクローン化して、S. grosvenoriiＵＧＴ４３０と同一の配列を得た。クローン化された遺伝子を、ＥＸＧ１およびＥＸＧ２の欠失した酵母株に形質転換した（生産されたモグロシドの脱グリコシル化を防止するため）。酵母株を、プラスミド維持の選択のためにトリプトファンを除きかつ１０μＭのモグロールを含むＳＣ培地で増殖させた。細胞を、１４０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２日間増殖させた。２日後、３００μＬの培養試料を３００μＬの９６％エタノールと混合し、８０℃で１０分間インキュベートした。次に、試料を遠心分離し、上清をＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１７７】
ＬＣ−ＭＳ分析を、Waters Acquity UPLC BEH（登録商標）のＣ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å孔径）を有するWaters Acquity I-Class UPLC（Waters Corporation、Milford、MA）と、陰イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を有するWaters Xevo TQDトリプル四重極質量分析計を用いて行った。化合物の分離は、２つの移動相Ａ（０．１％ギ酸を含む水）およびＢ（０．１％ギ酸を含むＭｅＣＮ）の勾配を、０．３から２．０分の間２０％から５０％Ｂまで増加させ、２．０１分で１００％Ｂまで増加させ、１００％Ｂを０．６分間保持し、さらに０．６分間再平衡させることにより、実施した。流速は０．６ｍＬ／分であり、カラム温度は５５℃であった。モグロシドＩＥ１（m/z 683.5; [M+FA]-）をＳＩＲ（Single Ion Recording）を用いてモニターし、標準と比較した。
【０１７８】
得られたＬＣ−ＭＳクロマトグラムを図１３に示す。ＭＷ＝６８３．５の化合物に属する１つの大きなピークが、ＵＧＴ４３０によって形成された（図１３Ｂ）。このピークの質量は、モノグリコシル化モグロールのギ酸付加物に相当する。この生成物は、図１３Ａに示すモグロシドＩＥ１参照化合物と同一の保持時間を有する。ＵＧＴ４３０は、モグロールを効率的かつ完全にグリコシル化した；ＵＧＴ４３０を発現する酵母の２日間の増殖期間後に、供給されたモグロールが残存していなかった。したがって、S. grosvenoriiＵＧＴ４３０は、S. grosvenoriiモグロシド生合成経路において、モグロール分子のＣ−３位のヒドロキシ基のグリコシル化を担うＵＧＴである。
【０１７９】
例１３：S. grosvenoriiＵＧＴ１６９７の発現による、モグロールのS. cerevisiaeにおけるグリコシル化
８５Ａ ＵＧＴファミリーのＵＧＴ１６９７（配列番号６７、配列番号６８）を、合成ＤＮＡからクローン化して、S. grosvenoriiＵＧＴ１６９７と同一の配列を得た。クローン化された遺伝子を、ＥＸＧ１およびＥＸＧ２の欠失した酵母株に形質転換した（生産されたモグロシドの脱グリコシル化を防止するため）。酵母株を、プラスミド維持の選択のためにヒスチジンを除きかつ１０μＭのモグロールを含むＳＣ培地で増殖させた。細胞を、１４０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２日間増殖させた。２日後、３００μＬの培養試料を３００μＬの９６％エタノールと混合し、８０℃で１０分間インキュベートした。次に、試料を遠心分離し、上清をＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１８０】
ＬＣ−ＭＳ分析を、Waters Acquity UPLC BEH（登録商標）のＣ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å孔径）を有するWaters Acquity I-Class UPLC（Waters Corporation、Milford、MA）と、陰イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を有するWaters Xevo TQDトリプル四重極質量分析計を用いて行った。化合物の分離は、２つの移動相Ａ（０．１％ギ酸を含む水）およびＢ（０．１％ギ酸を含むＭｅＣＮ）の勾配を、０．３から２．０分の間２０％から５０％Ｂまで増加させ、２．０１分で１００％Ｂまで増加させ、１００％Ｂを０．６分間保持し、さらに０．６分間再平衡させることにより、実施した。流速は０．６ｍＬ／分であり、カラム温度は５５℃であった。モグロシドＩＥ１（m/z 683.5; [M+FA]-）をＳＩＲ（Single Ion Recording）を用いてモニターし、標準と比較した。
【０１８１】
得られたＬＣ−ＭＳクロマトグラムを図１４に示す．ＭＷ＝６８３．５の化合物に属する１つの大きなピークが、ＵＧＴ１６９７によって形成された（図１４Ｂ）。このピークの質量は、モノグリコシル化モグロールのギ酸付加物に相当する。ピークはモグロシドＩＡ１に対応する。図１４Ａを参照のこと。この結果は、S. grosvenoriiＵＧＴ１６９７が、モグロールのヒドロキシ基をＣ−２４位でグリコシル化することを示す。ＵＧＴ１５７６はまた、例１１に示すように、モグロールのＣ−２４グリコシル化も示す。
【０１８２】
さらに、ＵＧＴ１６９７はＣ−３位にも作用する；何故ならば、図１４Ｂに示すように、モグロシドＩＩＥ（Ｃ−２４位に１つ、Ｃ−３位に１つのグルコースを含む）の存在が検出されたからである（保持時間２．２２分）。したがってＵＧＴ１６９７は、モグロール上のＣ−３位およびＣ−２４位でグリコシル化し、これはS. grosvenoriiモグロシド生合成経路の一部である。
【０１８３】
例１４：S. grosvenoriiＵＧＴ１１７８９、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ４３０、およびＵＧＴ１５７６の発現による、モグロールおよびモグロシドのS. cerevisiaeにおけるグリコシル化
ＵＧＴ１１７８９の全長配列（配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２）を合成ＤＮＡからクローニングして、S. grosvenoriiＵＧＴ１１７８９と同一の配列を得た。ＥＸＧ１およびＥＸＧ２を欠失した酵母株を、ＵＧＴ１１７８９（配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２）、ＵＧＴ４３０（配列番号６１、配列番号６２）、ＵＧＴ１５７６（配列番号４７、配列番号４８）およびＵＧＴ９８（配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３）で同時形質転換した。これとは別に、ＥＸＧ１およびＥＸＧ２を欠失した酵母株を、ＵＧＴ４３０（配列番号６１、配列番号６２）、ＵＧＴ１５７６（配列番号４７、配列番号４８）およびＵＧＴ９８（配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３）で同時形質転換した。酵母株は、プラスミド維持の選択のためにヒスチジン、ウラシル、トリプトファンおよびロイシンを除き、かつ１０μＭのモグロールを含むＳＣ培地で増殖させた。細胞を、１４０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２日間増殖させた。２日後、３００μＬの培養試料を３００μＬの９６％エタノールと混合し、８０℃で１０分間インキュベートした。次に、試料を遠心分離し、上清をＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１８４】
ＬＣ−ＭＳ分析を、Waters Acquity UPLC BEH（登録商標）のＣ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å孔径）を有するWaters Acquity I-Class UPLC（Waters Corporation、Milford、MA）と、陰イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を有するWaters Xevo TQDトリプル四重極質量分析計を用いて行った。化合物の分離は、勾配Ｉまたは勾配ＩＩによって達成された。勾配Ｉについて、８０％移動相Ａ（０．１％ギ酸を含む水）および２０％移動相Ｂ（０．１％ギ酸を含むＭｅＣＮ）の初期緩衝液濃度を、０．３〜２．０分の間２０％から４０％Ｂに増加し、２．０１分で１００％Ｂに増加し、１００％Ｂを０．６分間保持し、そしてさらに０．６分間再平衡化した。勾配ＩＩでは、８０％移動相Ａ（０．１％ギ酸を含む水）および２０％移動相Ｂ（０．１％ギ酸を含むＭｅＣＮ）の初期緩衝液濃度を、０．３〜２．０分の間２０％から５０％Ｂまで増加し、２．０１分で１００％Ｂに増加し、１００％Ｂを０．６分間保持し、そしてさらに０．６分間再平衡化した。勾配Ｉおよび勾配ＩＩの両方について、流速は０．６ｍＬ／分であり、カラム温度は５５℃であった。モグロールおよびモグロシドは、ＳＩＲ（Single Ion Recording）を用いてモニターし、植物抽出物からの市販のモグロシド混合物（3W botanical extract: Inc.）と比較した。ＳＩＲトレースは以下の通りであった：モグロール（m/z 521.4; [M+FA-H]-）、モグロール＋１グルコース（m/z 683.5; [M+FA-H]-）、モグロール＋２グルコース（m/z 799.5; [M-H]-）、モグロール＋３グルコース（m/z 961.6; [M-H]-）、モグロール＋４グルコース（m/z 1123.6; [M-H]-）およびモグロール＋５グルコース（m/z 1285.66; [M-H]-）。得られたＬＣ−ＭＳクロマトグラムを図１５に示す。
【０１８５】
図１５Ａは、モグロシド参照標準を示し、モグロシドＶおよびモグロシドＩＩＥに対応するピークを示す。図１５Ｂと図１５Ｃの比較は、ＵＧＴ１１７８９コドン最適化配列Ａ（配列番号７０、配列番号７２）の発現の効果を実証する。図１５Ｂは、モグロールを供給されたS. cerevisiae株におけるS. grosvenoriiＵＧＴ１５７６（配列番号４７、配列番号４８）およびＵＧＴ４３０（配列番号６１、配列番号６２）の同時発現の際に生産されるモグロシドＩＩＥが、多機能性ＵＧＴ９８（配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３）の同時発現により、モグロシドＶに変換されたことを示す。図１５ＢのモグロシドＶピークの強度は、８．６５Ｅ３（ＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおけるピークイオン強度）と測定された。S. grosvenoriiＵＧＴ１５７６（配列番号４７、配列番号４８）、ＵＧＴ４３０（配列番号６１、配列番号６２）、ＵＧＴ９８（配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３）およびＵＧＴ１１７８９（配列番号７０、配列番号７２）のS. cerevisiae株における同時発現は、図１５Ｃに示すように、供給されたモグロールをモグロシドＶにさらに効率的に変換する。図１５ＣのモグロシドＶピークの強度は、２．２２Ｅ５と測定された（ＬＣ−ＭＳクロマトグラムにおけるピークイオン強度）。
【０１８６】
この実験は、同時発現されたS. grosvenoriiＵＧＴ９８（配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３）およびＵＧＴ１１７８９（配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２）が、酵母における効率的なモグロシドＶ生産に必要なグルコース−グルコースの１，２−および１，６−結合の各々を触媒することを示す。モグロシドＩＩＥは、ＵＧＴ１１７８９によってグリコシル化されて、３つのグルコースが結合したモグロシドを形成することができる（図１５Ｄ）。ＵＧＴ１１７８９はＵＧＴ９１ファミリーであり、モグロールコアをグリコシル化することができないので、モグロシドＩＩＥのこのグリコシル化は、１，２結合または１，６結合によるものであり、したがってＵＧＴ１１７８９の生成物はモグロシドＩＩＩまたはモグロシドＩＩＩＡ２である。
【０１８７】
例１５：S. grosvenoriiＣＹＰ１７９８の発現による、モグロールのS. cerevisiaeにおける生産
ＣＹＰ１７９８を合成ＤＮＡからクローニングして、S. grosvenoriiＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７４）と同一の配列を得た。ヌクレオチド配列は、S. cerevisiae（配列番号５）における発現のためにコドン最適化された。オキシドスクアレンの利用可能性を高めるために、内因性ＥＲＧ７遺伝子（配列番号５５）のプロモーターを破壊して、ＴＲＰ１遺伝子が欠失したS. cerevisiae株におけるラノステロールシンターゼ発現を低下させた。S. cerevisiaeにおけるオキシドスクアレンの利用可能性をさらに高めるために、ＥＲＧ１（配列番号５４）によってコードされるスクアレンエポキシダーゼが過剰発現され、切断型ＨＭＧレダクターゼ（ｔＨＭＧ１、配列番号７７、配列番号７８）が発現された。S. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼ（配列番号４２、配列番号４３）をコードするコドン最適化遺伝子およびS. grosvenoriiＣＰＲ４４９７（配列番号４５、配列番号４６）をコードする遺伝子の、S. cerevisiae株のゲノムへの組み込みは、ＥＳＩ ＬＣ−ＭＳで検出可能なククルビタジエノールの生産をもたらした（図７Ｂ）。
【０１８８】
次に、クルビタジエノール産生S. cerevisiae株を、S. grosvenoriiＣＹＰ５４９１（配列番号１４、配列番号４４）、S. grosvenoriiＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７３、配列番号７４）、およびS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２（配列番号３９、配列番号４０）を含有するプラスミドで形質転換し、プラスミド維持のためにウラシル、ロイシン、ヒスチジンおよびトリプトファンを除いたＳＣ培地で増殖させた。細胞は、１４０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で４日間増殖させた。４日後、３００μＬの培養試料を３００μＬの９６％エタノールと混合し、８０℃で１０分間インキュベートした。次に、試料を遠心分離し、上清をＬＣ−ＭＳで分析した。ＬＣ−ＭＳ分析を、Waters Acquity UPLC BEH（登録商標）のＣ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å孔径）を有するWaters Acquity I-Class UPLC（Waters Corporation、Milford、MA）と、陰イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を有するWaters Xevo TQDトリプル四重極質量分析計を用いて行った。化合物の分離は、２つの移動相Ａ（０．１％ギ酸を含む水）およびＢ（０．１％ギ酸を含むＭｅＣＮ）の勾配を、０．３から３．５分の間２０％から４０％Ｂまで増加させ、1.0分以内に１００％Ｂまで増加させ、１００％Ｂを１．０分間保持し、さらに０．６分間再平衡させることにより、実施した。流速は０．６ｍＬ／分であり、カラム温度は５５℃であった。モグロール（m/z 521.4; [M+FA]-）をＳＩＲ（Single Ion Recording）を用いてモニターし、標準と比較した。
【０１８９】
S. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼ（配列番号４２、配列番号４３）、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７４）、ＣＰＲ４４９７（配列番号４５、配列番号４５）、およびエポキシドヒドロラーゼ２（配列番号３９、配列番号４０）の発現は、モグロールの生産をもたらした（図１６）。ククルビタジエノール産生株におけるＣＹＰ５４９１単独の発現を、図８に示す。１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールのピーク（質量４４３）および１１−オキソ−ククルビタジエノールのピーク（質量４４１）が示されている。モグロールは、ＣＹＰ１７９８とエポキシドヒドロラーゼ２の同時発現の際にのみ、効率的に生産された。したがってＣＹＰ１７９８は、ククルビタジエノールおよび／または１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールの２４−２５炭素二重結合のエポキシ化を触媒する。
【０１９０】
例１６：モグロシドＶのS. cerevisiaeにおける生産
モグロシドＶは、ＥＸＧ１（配列番号６３、配列番号６４）ノックアウトであるS. cerevisiaeＳ２８８ＣのＭａｔα誘導体中で生産された。S. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼ（配列番号４２、配列番号４３）、ＣＹＰ５４９１（配列番号８１、配列番号４４）、ＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７４）、ＣＹＰ１７９８−ＩＩ（配列番号８６、配列番号７４）、ＣＰＲ４４９７（配列番号８２、配列番号４６）、エポキシドヒドロラーゼ２（配列番号３９、配列番号４０）、ＵＧＴ１５７６（配列番号８３、配列番号４８）、ＵＧＴ４３０（配列番号８４、配列番号６２）、ＵＧＴ１６９７（配列番号８５、配列番号６８）、ＵＧＴ９８（配列番号５２、配列番号５３）、およびＵＧＴ１１７８９（配列番号７１、配列番号７２）を、増殖選択マーカーが隣接する発現カセット中にて、活発に転写された染色体領域における相同組換えにより、S. cerevisiae株に組み込んだ。コドン最適化S. grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼ（配列番号４２、配列番号４３）、ＣＹＰ１７９８（配列番号５、配列番号７４）、ＣＰＲ４４９７（配列番号８１、配列番号４６）、およびＵＧＴ９８（配列番号５２、配列番号５３）は、Genscriptによって合成した。コドン最適化ＣＹＰ５４９１（配列番号８１、配列番号４４）、ＵＧＴ１５７６（配列番号８３、配列番号４８）、ＵＧＴ４３０（配列番号８４、配列番号６２）およびＵＧＴ１１７８９（配列番号７１、配列番号７２）は、S. cerevisiae gBlocks（登録商標）遺伝子断片（Integrated DNA Technologies）として合成した。コドン最適化ＣＹＰ１７９８−ＩＩ（配列番号８６、配列番号７４）およびＵＧＴ１６９７（配列番号８５、配列番号６８）および天然ＣＰＲ４４９７（配列番号４５、配列番号４６）は、GeneArt（登録商標）Strings（商標）ＤＮＡ断片（Life Technologies）として合成した。コドン最適化エポキシドヒドロラーゼ１（配列番号３７、配列番号３８）およびエポキシドヒドロラーゼ２（配列番号３９、配列番号４０）は、DNA2.0によって合成した。
【０１９１】
S. cerevisiae株を、ＳＣ培地中３０℃で５日間増殖させた。次いで培養液を液体窒素で凍結させ、残渣をほぼ乾燥するまで濃縮した。残渣を５０％（ｖ／ｖ）エタノールに再懸濁し、約３０分間で５５℃に加熱した。その後懸濁液を、４４００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。上清を、０．２２μｍのSterilFlipフィルター（Millipore）を用いてろ過した。図１７は、ろ過後のモグロシドＶ産生株の、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。粗生成物を次に、半分取用Agilent 1200 ＨＰＬＣシステムで分離した。このシステムには、Synergi 4u Hydro RP８０Åカラム（Phenomenex：カラム寸法２５０×２１．２ｍｍ、４ミクロン）が装備された。溶出は、溶出液Ｂ（０．０２％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）および溶出液Ａ（０．０２％トリフルオロ酢酸を含む水）の移動相を使用して、勾配を５％から８％Ｂまで０．０〜２．０分で直線的に増加させ、８％から２５％Ｂまで２．０〜１２．０分で直線的に、２５％から５０％Ｂまで１２．０〜２０．０分で、５０％から１００％Ｂまで２０．０〜３２．０分で増加させ、そして最後に１００％Ｂで洗浄し、再平衡化することにより行った。分離には１５ｍＬ／分の流速を用い、室温で行った。すべての画分をＬＣ−ＭＳで分析し、単一のモグロシド化合物を含む画分をプールし、真空下で乾燥させた。
【０１９２】
合わせた画分を、ＮＭＲ分析に利用した。全てのＮＭＲ実験は、ＤＭＳＯ−ｄ６中２５℃で、１．７ｍｍ極低温ＴＣＩプローブを備えたBruker Avance IIIの６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計１５を用いて実施した。構造の解明は、標準的なホモおよびヘテロ核多重パルスＮＭＲ実験により、すなわち１Ｈ、１Ｈ−ＣＯＳＹ、１Ｈ、１３Ｃ−ＨＳＱＣ、および１Ｈ、１３Ｃ−ＨＭＢＣ実験により、実施した。S. cerevisiae産生株からの精製モグロシドピークは、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＩＡ２、モグロシドＩＶＡ、および主要生成物であるモグロシドＶであることが確認された。図１８Ａは、モグロシドＶについての、ＮＭＲで解明された構造、１Ｈ ＮＭＲスペクトル、および１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。図１８Ｂは、モグロシドＩＩＡ２についての、ＮＭＲで解明された構造、１Ｈ ＮＭＲスペクトル、および１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。図１８Ｃは、モグロシドＩＶＡについての、ＮＭＲで解明された構造、１Ｈ ＮＭＲスペクトル、および１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。図１８Ｄは、モグロシドＩＥ１についての、ＮＭＲで解明された構造、１Ｈ ＮＭＲスペクトル、および１Ｈ化学シフト（ｐｐｍ単位）を示す。
【０１９３】
表３：本明細書に開示される配列（表２も参照のこと）
【表３−１】
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【０１９４】
【表３−２】
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【０１９５】
【表３−３】
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【０１９６】
【表３−４】
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【０１９７】
【表３−５】
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【０１９８】
【表３−６】
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【０１９９】
【表３−７】
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【０２００】
【表３−８】
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【０２０１】
【表３−９】
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【０２０２】
【表３−１０】
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【０２０３】
【表３−１１】
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【０２０４】
【表３−１２】
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【０２０５】
【表３−１３】
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【０２０６】
【表３−１４】
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【０２０７】
【表３−１５】
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【０２０８】
【表３−１６】
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【０２０９】
【表３−１７】
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【０２１０】
【表３−１８】
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【０２１１】
【表３−１９】
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【０２１２】
【表３−２０】
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【０２１３】
【表３−２１】
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【０２１４】
【表３−２２】
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【０２１５】
【表３−２３】
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【０２１６】
【表３−２４】
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【０２１７】
【表３−２５】
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【０２１８】
【表３−２６】
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【０２１９】
【表３−２７】
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【０２２０】
【表３−２８】
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【０２２１】
【表３−２９】
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【０２２２】
【表３−３０】
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【０２２３】
【表３−３１】
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【０２２４】
【表３−３２】
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【０２２５】
【表３−３３】
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【０２２６】
【表３−３４】
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【０２２７】
【表３−３５】
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【０２２８】
【表３−３６】
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【０２２９】
【表３−３７】
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【０２３０】
【表３−３８】
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【０２３１】
【表３−３９】
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【０２３２】
【表３−４０】
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【０２３３】
【表３−４１】
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【０２３４】
【表３−４２】
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【０２３５】
【表３−４３】
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【０２３６】
【表３−４４】
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【０２３７】
【表３−４５】
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【０２３８】
【表３−４６】
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【０２３９】
【表３−４７】
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【０２４０】
【表３−４８】
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【０２４１】
【表３−４９】
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【０２４２】
【表３−５０】
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【０２４３】
【表３−５１】
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【０２４４】
【表３−５２】
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【０２４５】
【表３−５３】
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【０２４６】
【表３−５４】
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【０２４７】
【表３−５５】
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【０２４８】
【表３−５６】
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【０２４９】
【表３−５７】
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【０２５０】
【表３−５８】
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【０２５１】
【表３−５９】
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【０２５２】
【表３−６０】
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【０２５３】
【表３−６１】
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【０２５４】
【表３−６２】
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【０２５５】
【表３−６３】
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【０２５６】
【表３−６４】
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【０２５７】
【表３−６５】
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【０２５８】
【表３−６６】
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【０２５９】
【表３−６７】
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【０２６０】
【表３−６８】
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【０２６１】
【表３−６９】
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【０２６２】
【表３−７０】
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【０２６３】
【表３−７１】
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【０２６４】
【表３−７２】
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【０２６５】
【表３−７３】
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【０２６６】
【表３−７４】
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【０２６７】
【表３−７５】
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【０２６８】
【表３−７６】
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【０２６９】
【表３−７７】
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【０２７０】
【表３−７８】
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【０２７１】
【表３−７９】
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【０２７２】
【表３−８０】
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【０２７３】
【表３−８１】
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【０２７４】
【表３−８２】
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【０２７５】
【表３−８３】
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【０２７６】
【表３−８４】
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【０２７７】
【表３−８５】
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【０２７８】
【表３−８６】
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【０２７９】
【表３−８７】
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【０２８０】
【表３−８８】
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【０２８１】
【表３−８９】
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【０２８２】
【表３−９０】
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【０２８３】
【表３−９１】
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【０２８４】
【表３−９２】
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【０２８５】
【表３−９３】
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【０２８６】
【表３−９４】
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【０２８７】
【表３−９５】
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【０２８８】
【表３−９６】
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【０２８９】
【表３−９７】
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【０２９０】
【表３−９８】
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【０２９１】
【表３−９９】
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【０２９２】
【表３−１００】
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【０２９３】
【表３−１０１】
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【０２９４】
【表３−１０２】
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【０２９５】
【表３−１０３】
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【０２９６】
【表３−１０４】
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【０２９７】
【表３−１０５】
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【０２９８】
【表３−１０６】
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【０２９９】
【表３−１０７】
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【０３００】
【表３−１０８】
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【０３０１】
【表３−１０９】
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【０３０２】
【表３−１１０】
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【０３０３】
【表３−１１１】
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【０３０４】
【表３−１１２】
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【０３０５】
【表３−１１３】
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【０３０６】
【表３−１１４】
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【０３０７】
【表３−１１５】
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【０３０８】
【表３−１１６】
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【０３０９】
【表３−１１７】
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【０３１０】
【表３−１１８】
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【０３１１】
【表３−１１９】
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【０３１２】
【表３−１２０】
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【０３１３】
【表３−１２１】
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【０３１４】
【表３−１２２】
2017529860.tif 000131
【０３１５】
【表３−１２３】
2017529860.tif 000132
【０３１６】
【表３−１２４】
2017529860.tif 000133
【０３１７】
【表３−１２５】
2017529860.tif 000134
【０３１８】
【表３−１２６】
2017529860.tif 000135
【０３１９】
【表３−１２７】
2017529860.tif 000136
【０３２０】
【表３−１２８】
2017529860.tif 000137
【０３２１】
【表３−１２９】
2017529860.tif 000138
【０３２２】
【表３−１３０】
2017529860.tif 000139
【０３２３】
【表３−１３１】
2017529860.tif 000140
【０３２４】
【表３−１３２】
2017529860.tif 000141
【０３２５】
【表３−１３３】
2017529860.tif 000142
【０３２６】
【表３−１３４】
2017529860.tif 000143
【０３２７】
【表３−１３５】
2017529860.tif 000144
【０３２８】
【表３−１３６】
2017529860.tif 000145
【０３２９】
【表３−１３７】
2017529860.tif 000146
【０３３０】
【表３−１３８】
2017529860.tif 000147
【０３３１】
【表３−１３９】
2017529860.tif 000148
【０３３２】
【表３−１４０】
2017529860.tif 000149
【０３３３】
【表３−１４１】
2017529860.tif 000150
【０３３４】
【表３−１４２】
2017529860.tif 000151
【０３３５】
【表３−１４３】
2017529860.tif 000152
【０３３６】
【表３−１４４】
2017529860.tif 000153
【０３３７】
【表３−１４５】
2017529860.tif 000154
【０３３８】
【表３−１４６】
2017529860.tif 000155
【０３３９】
【表３−１４７】
2017529860.tif 000156
【０３４０】
【表３−１４８】
2017529860.tif 000157
【０３４１】
【表３−１４９】
2017529860.tif 000158
【０３４２】
【表３−１５０】
2017529860.tif 000159
【０３４３】
【表３−１５１】
2017529860.tif 000160
【０３４４】
【表３−１５２】
2017529860.tif 000161
【０３４５】
【表３−１５３】
2017529860.tif 000162
【０３４６】
【表３−１５４】
2017529860.tif 000163
【０３４７】
【表３−１５５】
2017529860.tif 000164
【０３４８】
本発明を、その特定の態様を参照して詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく、改変および変形が可能であることは明らかであろう。より具体的には、本発明のいくつかの側面は、本明細書において特に有利であると特定されるが、本発明は必ずしも本発明のこれらの特定の側面に限定されないことが企図される。
【図１】
2017529860.tif 000165
【図２Ａ】
2017529860.tif 000166
【図２Ｂ】
2017529860.tif 000167
【図２Ｃ】
2017529860.tif 000168
【図３ＡＢ】
2017529860.tif 000169
【図４】
2017529860.tif 000170
【図５】
2017529860.tif 000171
【図６】
2017529860.tif 000172
【図７Ａ】
2017529860.tif 000173
【図７Ｂ】
2017529860.tif 000174
【図８】
2017529860.tif 000175
【図９Ａ】
2017529860.tif 000176
【図９Ｂ】
2017529860.tif 000177
【図９Ｃ】
2017529860.tif 000178
【図１０ＡＢ】
2017529860.tif 000179
【図１１ＡＢ】
2017529860.tif 000180
【図１２】
2017529860.tif 000181
【図１３Ａ】
2017529860.tif 000182
【図１３Ｂ】
2017529860.tif 000183
【図１４ＡＢ】
2017529860.tif 000184
【図１５ＡＢ】
2017529860.tif 000185
【図１５ＣＤ】
2017529860.tif 000186
【図１６ＡＢ】
2017529860.tif 000187
【図１７】
2017529860.tif 000188
【図１８Ａ】
2017529860.tif 000189
【図１８Ｂ】
2017529860.tif 000190
【図１８Ｃ】
2017529860.tif 000191
【図１８Ｄ】
2017529860.tif 000192
【配列表】
2017529860000001.app
【国際調査報告】
2017529860.tif 000193
2017529860.tif 000194
2017529860.tif 000195
2017529860.tif 000196
2017529860.tif 000197
2017529860.tif 000198
2017529860.tif 000199
2017529860.tif 000200
2017529860.tif 000201