(57)【要約】本明細書では、免疫グロブリン（Ｑｇ）由来の抗原結合ドメインと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）由来の定常ドメインと、を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関連する方法及び組成物を提供する。生殖細胞系にキメラ抗原受容体遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、ＣＡＲ遺伝子座が、再構成されていない免疫グロブリン（Ｉｇ）可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、Ｔ細胞受容体定常領域を含む定常領域遺伝子座と、を含み、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメント由来の再構成されたＩｇ可変領域遺伝子によりコードされるＩｇ可変ドメインと、ＴＣＲ定常領域遺伝子によりコードされるＴＣＲ定常ドメインと、を含むＣＡＲポリペプチドを発現するように、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントがＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される、遺伝子改変非ヒト動物。
2017529841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生殖細胞系にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、前記ＣＡＲ遺伝子座が、
再構成されていない免疫グロブリン（Ｉｇ）可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域を含む定常領域遺伝子座と、を含み、
前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメント由来の再構成されたＩｇ可変領域遺伝子によりコードされるＩｇ可変ドメインと、前記ＴＣＲ定常領域遺伝子によりコードされるＴＣＲ定常ドメインと、を含むＣＡＲポリペプチドを発現するように、前記再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントが前記ＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される、遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２】
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトである、請求項１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子が内在性種起源である、請求項１又は請求項２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項４】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がマウスＴＣＲ定常領域遺伝子又はラットＴＣＲ定常領域遺伝子である、請求項１又は請求項２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項５】
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトＩｇ重鎖（ＩｇＨ）可変領域遺伝子セグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項６】
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）可変領域遺伝子セグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項７】
前記ＩｇＬ可変領域遺伝子セグメントがヒトκ遺伝子セグメントである、請求項６に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項８】
前記ＩｇＬ可変領域遺伝子セグメントがλ遺伝子セグメントである、請求項６に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項９】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がＴＣＲα定常領域遺伝子である、請求項１〜８いずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１０】
前記遺伝子改変非ヒト動物が機能的ＴＣＲα鎖を発現しない、請求項９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１１】
前記ＣＡＲ遺伝子座が内在性ＴＣＲα遺伝子座に位置する、請求項９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１２】
前記再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントが内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１３】
前記ＴＣＲα定常領域遺伝子が内在性ＴＣＲα定常領域遺伝子である、請求項１１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１４】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がＴＣＲβ定常領域遺伝子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１５】
前記遺伝子改変非ヒト動物が機能的ＴＣＲβ鎖を発現しない、請求項１４に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１６】
前記ＣＡＲ遺伝子座が内在性ＴＣＲβ遺伝子座に位置する、請求項１４に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１７】
前記再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントが内在性ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項１６に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１８】
前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子が内在性ＴＣＲβ定常領域遺伝子である、請求項１６に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１９】
生殖細胞系に第１のＣＡＲ遺伝子座と、第２のＣＡＲ遺伝子座と、を含む、遺伝子改変非ヒト動物であって、
前記第１のＣＡＲ遺伝子座が、再構成されていない免疫グロブリン（Ｉｇ）ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む第１の再構成されていない可変領域遺伝子座と、Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲβ）定常領域遺伝子を含む第１の定常領域遺伝子座と、を含み、前記再構成されていないＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントが、前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記再構成されていないＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメント由来の再構成された重鎖可変領域遺伝子によってコードされるＩｇ重鎖可変ドメインと、前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子によってコードされるＴＣＲβ定常ドメインと、を含む第１のＣＡＲポリペプチド鎖を発現するように、前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子に操作可能に結合され、
前記第２のＣＡＲ遺伝子座が、再構成されていないＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントを含む、第２の再構成されていない可変領域遺伝子座と、Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）定常領域遺伝子を含む第２の定常領域遺伝子座と、を含み、前記再構成されていないＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントが、前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記再構成されていないＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメント由来の再構成されたＩｇκ可変領域遺伝子によってコードされるＩｇ  κ可変ドメインと、前記ＴＣＲα定常領域遺伝子によってコードされるＴＣＲα定常ドメインと、を含む第２のＣＡＲポリペプチド鎖を発現するように、前記ＴＣＲα定常領域遺伝子に操作可能に結合され、
前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記第１のＣＡＲポリペプチド鎖と、前記第２のＣＡＲポリペプチド鎖と、を含むＣＡＲを発現する、遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２０】
前記Ｉｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメント、並びに／又は前記Ｉｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントがヒトである、請求項１９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２１】
前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子及び／又は前記ＴＣＲα定常領域遺伝子が内在性種起源である、請求項１９又は２０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２２】
前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子及び／又は前記ＴＣＲα定常領域遺伝子がマウス遺伝子又はラット遺伝子である、請求項１９又は２０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２３】
前記遺伝子改変非ヒト動物が機能的ＴＣＲα鎖及び／又は機能的ＴＣＲβ鎖を発現しない、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２４】
前記第２のＣＡＲ遺伝子座が内在性ＴＣＲα遺伝子座に位置する、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２５】
前記再構成されていないＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントが内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項２４に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２６】
前記ＴＣＲα定常領域遺伝子が内在性ＴＣＲα定常領域遺伝子である、請求項２４又は２５に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２７】
前記第１のＣＡＲ遺伝子座が内在性ＴＣＲβ遺伝子座に位置する、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２８】
前記再構成されていないＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントが内在性ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項２９】
前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子が内在性ＴＣＲβ定常領域遺伝子である、請求項２７又は２８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３０】
前記遺伝子改変非ヒト動物が、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む１種又は２種以上のキメラＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチドを発現する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３１】
前記１種又は２種以上のキメラクラスＩα鎖ポリペプチドが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−ｇ、ＨＬＡ−Ｋ、及びＨＬＡ−Ｌからなる群から選択される、請求項３０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３２】
前記遺伝子改変非ヒト動物がヒトβ−２−ミクログロブリンポリペプチドを発現する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３３】
前記遺伝子改変非ヒト動物が、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む、１種若しくは２種以上のキメラＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチド、並びに／又はヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む、１種若しくは２種以上のキメラＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドを発現する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３４】
前記１種又は２種以上のキメラＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドが、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ、及びＨＬＡ−ＤＲＡからなる群から選択され、並びに／又は前記１種又は２種以上のキメラＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドが、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、及びＨＬＡ−ＤＲＢからなる群から選択される、請求項３３に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３５】
前記遺伝子改変非ヒト動物が、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラＣＤ８  α鎖ポリペプチド、及び／又はヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラＣＤ８  β鎖ポリペプチドを発現する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３６】
前記遺伝子改変非ヒト動物が、ヒトＤ１免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ２免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ３免疫グロブリンドメイン、Ｄ４免疫グロブリンドメイン、及び内在性種起源の細胞質ドメインを含むキメラＣＤ４ポリペプチドを発現する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３７】
前記ＣＡＲが、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３８】
前記ＣＡＲが、前記遺伝子改変非ヒト動物のＴ細胞で発現する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項３９】
前記Ｔ細胞が、前記遺伝子改変非ヒト動物の胸腺内でポジティブ選択及びネガティブ選択を受ける、請求項３８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項４０】
前記遺伝子改変非ヒト動物がげっ歯類である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項４１】
前記げっ歯類がマウスである．請求項４０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項４２】
ＭＨＣ上に提示されるペプチドに対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のＭＨＣ上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
（ｂ）前記ＭＨＣ上に提示される前記ペプチドに対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を、（ａ）の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、を含む、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法に従って作製されたＴ細胞。
【請求項４４】
ＭＨＣ上に提示されるペプチドに対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞ハイブリドーマを作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のＭＨＣ上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
（ｂ）前記ＭＨＣ上に提示される前記ペプチドに対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を、（ａ）の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、
（ｃ）工程（ｂ）のＴ細胞からＴ細胞ハイブリドーマを作製することと、を含む、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法に従って作製されたＴ細胞ハイブリドーマ。
【請求項４６】
ＭＨＣ上に提示されるペプチドに対して特異的なＩｇ可変ドメインをコードする核酸を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載の非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のＭＨＣ上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
（ｂ）前記ＭＨＣ上に提示される前記ペプチドに対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を、（ａ）の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、
（ｃ）前記ＣＡＲのＩｇ可変ドメインをコードする核酸を前記Ｔ細胞から単離することと、を含む、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法に従って作製されたＭＨＣ上に提示されるペプチドに対して特異的なＩｇ可変ドメインをコードする核酸。
【請求項４８】
ＭＨＣ上に提示されるペプチドに対して特異的な抗体を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載の非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のＭＨＣ上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
（ｂ）前記ＭＨＣ上に提示される前記ペプチドに対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を、（ａ）の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、
（ｃ）前記ＣＡＲのＩｇ可変ドメインをコードする核酸を前記Ｔ細胞から単離することと、
（ｄ）前記Ｉｇ可変ドメインをコードする前記核酸を、宿主細胞内のＩｇ定常ドメインと操作可能に結合することと、
（ｅ）前記宿主細胞が、前記Ｉｇ可変ドメイン及び前記Ｉｇ定常ドメインを含む抗体を発現する条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含む、方法。
【請求項４９】
前記Ｉｇ定常ドメインがヒトＩｇ定常ドメインである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４８又は４９の方法に従って作製された、ＭＨＣ上に提示されるペプチドに対して特異的な抗体。
【請求項５１】
ヒトＩｇ可変ドメイン及びヒトＴＣＲ定常ドメインを含むＣＡＲを発現するヒト細胞を作製する方法であって、
（ａ）請求項１〜４１のいずれか一項に記載の非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のＭＨＣ上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
（ｂ）前記ＭＨＣ上に提示される前記ペプチドに対して特異的なＣＡＲを発現する非ヒト動物Ｔ細胞を、（ａ）の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、
（ｃ）前記ＣＡＲのＩｇ可変ドメインをコードする核酸を前記非ヒト動物Ｔ細胞から単離することと、
（ｄ）前記ヒト細胞が前記Ｉｇ可変ドメイン及び前記ヒトＴＣＲ定常ドメインを含むＣＡＲを発現するように、前記Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸を、ヒト細胞内のヒトＴＣＲ定常ドメインをコードする核酸と操作可能に結合することと、を含む、方法。
【請求項５２】
前記ヒト細胞がヒトＴ細胞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ヒトＴ細胞がｅｘ−ｖｉｖｏで単離されたヒトＴ細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法に従って作製された、ヒトＩｇ可変ドメイン及びヒトＴＣＲ定常ドメインを含むＣＡＲを発現するヒト細胞。
【請求項５５】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られる、又は得ることができる、ＣＡＲを発現する細胞。
【請求項５６】
前記細胞がＴ細胞である、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
前記細胞がＴ細胞ハイブリドーマである、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５８】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られる、又は得ることができる、再構成されたＩｇ可変領域遺伝子を含む核酸。
【請求項５９】
前記核酸がＣＡＲをコードする、請求項５８に記載の核酸。
【請求項６０】
請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の細胞から得られる、又は得ることができる、再構成されたＩｇ可変領域遺伝子を含む核酸。
【請求項６１】
前記核酸がＣＡＲをコードする、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６２】
前記再構成されたＩｇ可変領域遺伝子が、ＭＨＣ上に提示されるペプチドに対して特異的なＩｇ可変ドメインをコードする、請求項６０又は６１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６３】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られる、又は得ることができる、ＭＨＣ上に提示されるペプチドに対して特異的なＣＡＲ。
【請求項６４】
請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の細胞から得られる、又は得ることができる、ＭＨＣ上に提示されるペプチドに対して特異的なＣＡＲ。
【請求項６５】
ゲノム中にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子座を含む非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞であって、前記ＣＡＲ遺伝子座が、
再構成されていない免疫グロブリン（Ｉｇ）可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントが前記ＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される、非ヒトＥＳ細胞。
【請求項６６】
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトである、請求項６５に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項６７】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子が内在性種起源である、請求項６５又は６６に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項６８】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がマウス定常領域遺伝子又はラット定常領域遺伝子である、請求項６５又は６６に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項６９】
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトＩｇ重鎖（ＩｇＨ）可変領域遺伝子セグメントである、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７０】
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）可変領域遺伝子セグメントである、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７１】
前記ＩｇＬ可変領域遺伝子セグメントがヒトκ遺伝子セグメントである、請求項７０に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７２】
前記ＩｇＬ可変領域遺伝子セグメントがλ遺伝子セグメントである、請求項７０に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７３】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がＴＣＲα定常領域遺伝子である、請求項６５〜７２のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７４】
前記ＣＡＲ遺伝子座が内在性ＴＣＲα遺伝子座に位置する、請求項７３に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７５】
前記再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントが内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項７４に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７６】
前記ＴＣＲα定常領域遺伝子が内在性ＴＣＲα定常領域遺伝子である、請求項７４又は７５に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７７】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がＴＣＲβ定常領域遺伝子である、請求項６８〜７２のいずれか一項に記載非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７８】
前記ＣＡＲ遺伝子座が内在性ＴＣＲβ遺伝子座に位置する、請求項７７に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項７９】
前記再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントが内在性ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項７８に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８０】
前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子が内在性ＴＣＲβ定常領域遺伝子である、請求項７８又は７９に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８１】
ゲノム中に第１のＣＡＲ遺伝子座と、第２のＣＡＲ遺伝子座と、を含む、非ヒトＥＳ細胞であって、
前記第１のＣＡＲ遺伝子座が、再構成されていない免疫グロブリン（Ｉｇ）ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む第１の再構成されていない可変領域遺伝子座と、Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲβ）定常領域遺伝子を含む第１の定常領域遺伝子座と、を含み、前記再構成されていないＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントが前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子に操作可能に結合され、
前記第２のＣＡＲ遺伝子座が、再構成されていないＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントを含む第２の再構成されていない可変領域遺伝子座と、Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）定常領域遺伝子を含む第２の定常領域遺伝子座と、を含み、前記再構成されていないＩｇＶκ及びＪκ遺伝子セグメントが、前記ＴＣＲα定常領域遺伝子に操作可能に結合される、非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８２】
前記非ヒトＥＳ細胞が、そのゲノム中にヒト細胞外ドメイン及び内在性種起源の細胞質ドメインを含むキメラＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドをコードする１個又は２個以上の核酸配列を含む、請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８３】
前記ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−ｇ、ＨＬＡ−Ｋ、及びＨＬＡ−Ｌからなる群から選択される、請求項８２に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８４】
前記非ヒトＥＳ細胞が、そのゲノム中にヒトβ−２−ミクログロブリンポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項６５〜８３のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８５】
前記非ヒトＥＳ細胞が、そのゲノム中に、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドをコードする１個若しくは２個以上の核酸配列、及び／又はヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドをコードする１個若しくは２個以上の核酸配列を含む、請求項６５〜８４のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８６】
前記キメラＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドが、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ、及びＨＬＡ−ＤＲＡからなる群から選択され、並びに／又は前記ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドが、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、及びＨＬＡ−ＤＲＢからなる群から選択される、請求項８５に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８７】
前記非ヒトＥＳ細胞が、そのゲノム中に、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラＣＤ８  α鎖ポリペプチドをコードする核酸配列、及び／又はヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラＣＤ８  β鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項６５〜８６のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８８】
前記非ヒトＥＳ細胞が、そのゲノム中にヒトＤ１免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ２免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ３免疫グロブリンドメイン、Ｄ４免疫グロブリンドメイン、及び内在性種起源の細胞質ドメインを含むキメラＣＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項６５〜８７のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項８９】
前記非ヒトＥＳ細胞がげっ歯類ＥＳ細胞である、請求項６５〜８８のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項９０】
前記げっ歯類ＥＳ細胞がマウスＥＳ細胞である、請求項８９に記載の非ヒトＥＳ細胞。
【請求項９１】
ＣＡＲを発現する遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、請求項６５〜９０のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞を使用することを含む方法。
【請求項９２】
請求項９１に記載の方法を使用して作製される、又はこの方法から得ることができる、遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項９３】
請求項６５〜９０のいずれか一項に記載の非ヒトＥＳ細胞を含む非ヒト胚。
【請求項９４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子座であって、
再構成されていない免疫グロブリン（Ｉｇ）可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域を含む定常領域遺伝子座と、を含み、
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントが前記ＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される、ＣＡＲ遺伝子座。
【請求項９５】
前記Ｉｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトである、請求項９４に記載のＣＡＲ遺伝子座。
【請求項９６】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がげっ歯類ＴＣＲ定常領域遺伝子である、請求項９４又は請求項９５に記載のＣＡＲ遺伝子座。
【請求項９７】
前記げっ歯類ＴＣＲ定常領域がマウスＴＣＲ定常領域である、請求項９６のいずれか一項に記載のＣＡＲ遺伝子座。
【請求項９８】
再構成されていない免疫グロブリン（Ｉｇ）ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、Ｔ細胞受容体β（ＴＣＲβ）定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含むＣＡＲ遺伝子座であって、前記再構成されていないＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントが前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子に操作可能に結合される、ＣＡＲ遺伝子座。
【請求項９９】
前記Ｉｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントがヒトである、請求項９８に記載のＣＡＲ遺伝子座。
【請求項１００】
前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子がマウスＴＣＲβ定常領域遺伝子である、請求項９８又は９９に記載のＣＡＲ遺伝子座。
【請求項１０１】
再構成されていないＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含むＣＡＲ遺伝子座であって、前記再構成されていないヒトＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントが前記ＴＣＲα定常領域遺伝子に操作可能に結合される、ＣＡＲ遺伝子座。
【請求項１０２】
前記Ｉｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントがヒトである、請求項１０１に記載のＣＡＲ遺伝子座。
【請求項１０３】
前記ＴＣＲα定常領域遺伝子がマウスＴＣＲα定常領域遺伝子である、請求項１０１又は１０２に記載のＣＡＲ遺伝子座。
【請求項１０４】
Ｉｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと、Ｉｇ軽鎖可変ドメイン及びＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むＣＡＲであって、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有するＣＡＲ。
【請求項１０５】
前記Ｉｇ軽鎖可変ドメインがＩｇ  κ可変ドメインである、請求項１０４に記載のＣＡＲ。
【請求項１０６】
前記Ｉｇ軽鎖可変ドメインがＩｇ  λ可変ドメインである、請求項１０４に記載のＣＡＲ。
【請求項１０７】
前記Ｉｇ重鎖可変ドメイン及び前記Ｉｇ軽鎖可変ドメインがヒトＩｇ可変ドメインである、請求項１０４〜１０５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１０８】
Ｉｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲα定常ドメインを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと、Ｉｇ軽鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むＣＡＲであって、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有するＣＡＲ。
【請求項１０９】
前記Ｉｇ軽鎖可変ドメインがＩｇ  κ可変ドメインである、請求項１０８に記載のＣＡＲ。
【請求項１１０】
前記Ｉｇ軽鎖可変ドメインがＩｇ  λ可変ドメインである、請求項１０８に記載のＣＡＲ。
【請求項１１１】
前記Ｉｇ重鎖可変ドメイン及び前記Ｉｇ軽鎖可変ドメインがヒトＩｇ可変ドメインである、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１１２】
請求項１０３〜１１１のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する細胞。
【請求項１１３】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１１２に記載の細胞。
【請求項１１４】
被験者においてペプチド／ＭＨＣ複合体に対する免疫応答を誘発する方法であって、ヒトＩｇ重鎖可変ドメイン及びヒトＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと、ヒトＩｇ軽鎖可変ドメイン及びヒトＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むＣＡＲを発現するヒトＴ細胞を前記被験者に投与することを含み、前記ＣＡＲが前記ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する、方法。
【請求項１１５】
Ｉｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、Ｉｇ軽鎖可変ドメイン及びＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、を含む、核酸組成物であって、ＣＡＲが前記第１のＣＡＲポリペプチドを含み、前記第２のＣＡＲポリペプチドがペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する、核酸組成物。
【請求項１１６】
遺伝子改変を含む、非ヒト動物を作製する方法であって、生殖細胞系にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子座を含むように前記非ヒト動物を遺伝子操作することを含み、前記ＣＡＲ遺伝子座が、
再構成されていない免疫グロブリン（Ｉｇ）可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域を含む定常領域遺伝子座と、を含み、
前記再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメント由来の再構成されたＩｇ可変領域遺伝子によりコードされるＩｇ可変ドメインと、前記ＴＣＲ定常領域遺伝子によりコードされるＴＣＲ定常ドメインと、を含むＣＡＲポリペプチドを発現するように、前記ＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される、方法。
【請求項１１７】
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子が内在性種起源である、請求項１１６又は１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がマウスＴＣＲ定常領域遺伝子又はラットＴＣＲ定常領域遺伝子である、請求項１１６又は請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトＩｇ重鎖（ＩｇＨ）可変領域遺伝子セグメントである、請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントがヒトＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）可変領域遺伝子セグメントである、請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ＩｇＬ可変領域遺伝子セグメントがヒトκ遺伝子セグメントである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ＩｇＬ可変領域遺伝子セグメントがλ遺伝子セグメントである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がＴＣＲα定常領域遺伝子である、請求項１１６〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ＣＡＲ遺伝子座が内在性ＴＣＲα遺伝子座に位置する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントが内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＴＣＲα定常領域遺伝子が内在性ＴＣＲα定常領域遺伝子である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ＴＣＲ定常領域遺伝子がＴＣＲβ定常領域遺伝子である、請求項１１６〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ＣＡＲ遺伝子座が内在性ＴＣＲβ遺伝子座に位置する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントが内在性ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ＴＣＲβ定常領域遺伝子が内在性ＴＣＲβ定常領域遺伝子である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
前記非ヒト動物がげっ歯類である、請求項１１６〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記げっ歯類がマウスである、請求項１３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／１６７，６５０号、２０１４年１２月１９日に出願された同第６２／０９４，６０３号、２０１４年１１月７日に出願されたた同第６２／０７６，８３６号、２０１４年９月１９日に出願された同第６２／０５２，９４７号、及び２０１４年９月１９日に出願された同第６２／０５２，９０１号の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（配列表）
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１５年９月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＲＰＢ−０１０．２５＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは４２，０７４バイトである。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子改変げっ歯類は、多くの抗原に対して特異的な治療用抗体の貴重な供給源であることが判明しているが、一部の抗原は標的にすることが困難であることが判明している。したがって、新型の治療用抗原結合タンパク質、並びにかかる抗原結合タンパク質の生成で有用な方法及び組成物に対する多大な必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関連する方法及び組成物を提供する。例えば、本明細書では、ＣＡＲ及びＣＡＲポリペプチド、ＣＡＲ及びＣＡＲポリペプチドを発現する非ヒト動物、並びにＣＡＲ及びＣＡＲポリペプチドをコードする核酸、並びに、かかるＣＡＲ、ＣＡＲ発現非ヒト動物、及びＣＡＲコード核酸の作製及び使用に有用な組成物及び方法を提供する。
【０００５】
本明細書に記載するように、ＣＡＲは、免疫グロブリン（Ｉｇ）可変ドメイン由来の抗原結合ドメインと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）由来の定常ドメインと、を有する抗原結合タンパク質である。概して、本明細書で提供するＣＡＲは２つのＣＡＲポリペプチド鎖を含み、その一方はＴＣＲα定常ドメインを含み、もう一方はＴＣＲβ定常ドメインを含む。各ポリペプチド鎖は、Ｉｇ可変ドメインを含み、一方のポリペプチド鎖は重鎖Ｉｇ可変ドメインを含み、他方の鎖はＩｇ軽鎖（κ又はλ）可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＣＡＲは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質（例えば、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質又はクラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質）によって提示される、ペプチドに対する結合特異性を有する。
【０００６】
特定の態様において、本明細書では、ＣＡＲポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウス又はラットなどげっ歯類）を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、その生殖細胞系に、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメント（例えば、再構成されていないＶ、Ｄ、及びＪ重鎖遺伝子セグメント、再構成されていないＶ  κ及びＪ  κ軽鎖遺伝子セグメント、又は再構成されていないＶ  λ及びＪ  λ軽鎖遺伝子セグメント）を含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、ＴＣＲ定常領域遺伝子（例えば、ＴＣＲα定常領域遺伝子又はＴＣＲβ定常領域遺伝子）と、を含むＣＡＲ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていない可変領域遺伝子セグメント由来の再構成されたＩｇ可変領域遺伝子によりコードされるＩｇ可変ドメインと、ＴＣＲ定常領域遺伝子によりコードされるＴＣＲ定常ドメインと、を含むＣＡＲポリペプチドを発現するように、ＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントはヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常領域遺伝子は、内在性種起源である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常ドメインは、ヒト又はげっ歯類（例えば、マウス又はラット）である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常領域遺伝子は、マウス又はラットのＴＣＲ定常領域である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列（例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列（例えば、ＴＣＲβ遺伝子間配列又はＴＣＲα遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
【０００７】
いくつかの態様において、本明細書では、ＣＡＲを発現する遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウス又はラットなどげっ歯類）を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、その生殖細胞系に第１のＣＡＲ遺伝子座及び第２のＣＡＲ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲ遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源の（例えば、ラット又はマウス起源の）ＴＣＲβ定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントは、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていないＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ遺伝子セグメント由来の再構成された重鎖可変領域遺伝子によりコードされるＩｇ重鎖可変ドメインと、ＴＣＲβ定常領域遺伝子によりコードされるＴＣＲβ定常ドメインと、を含む第１のＣＡＲポリペプチド鎖を発現するように、ＴＣＲβ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲ遺伝子座は、Ｉｇ重鎖可変領域遺伝子（ユニバーサル重鎖可変領域）を含む再構成された可変領域遺伝子座と、内在性種起源の（例えば、ラット又はマウス起源の）ＴＣＲβ定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、遺伝子改変非ヒト動物は、再構成された重鎖可変領域遺伝子によりコードされるＩｇ重鎖可変ドメインと、ＴＣＲβ定常領域遺伝子によりコードされるＴＣＲβ定常ドメインと、を含む第１のＣＡＲポリペプチド鎖を発現する。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲ遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖκ及びＪκを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源の（例えば、ラット又はマウス起源の）ＴＣＲα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントは、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていないＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメント由来の再構成されたＩｇ  κ可変領域遺伝子によりコードされるＩｇ  κ可変ドメインと、ＴＣＲα定常領域遺伝子によりコードされるＴＣＲα定常ドメインと、を含む第２のＣＡＲポリペプチド鎖を発現するように、ＴＣＲα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲ遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖλ及びＪλを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源の（例えば、ラット又はマウス起源の）ＴＣＲα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖλ及びＪλ遺伝子セグメントは、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていないＩｇ  Ｖλ及びＪλ遺伝子セグメント由来の再構成されたＩｇ  λ可変領域遺伝子によりコードされるＩｇ  λ可変ドメインと、ＴＣＲα定常領域遺伝子によりコードされるＴＣＲα定常ドメインと、を含む第２のＣＡＲポリペプチド鎖を発現するように、ＴＣＲα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲ遺伝子座は、Ｉｇ軽鎖κ又はλ可変領域遺伝子（ユニバーサル軽鎖可変領域）を含む再構成された可変領域遺伝子座と、内在性種起源の（例えば、ラット又はマウス起源の）ＴＣＲα定常領域遺��子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、遺伝子改変非ヒト動物は、再構成された軽鎖可変領域遺伝子によりコードされるＩｇ軽鎖可変ドメインと、ＴＣＲα定常領域遺伝子によりコードされるＴＣＲα定常ドメインと、を含む第２のＣＡＲポリペプチド鎖を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、第１のＣＡＲポリペプチド鎖と、第２のＣＡＲポリペプチド鎖と、を含むＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座の一方又は両方は、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列（例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座の一方又は両方は、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列（例えば、ＴＣＲβ遺伝子間配列又はＴＣＲα遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、ＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、非ヒト動物のＴ細胞（例えば、ＣＤ４及び／又はＣＤ８  Ｔ細胞）で発現する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、遺伝子改変非ヒト動物の胸腺においてポジティブ選択及び／又はネガティブ選択を受ける。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体（すなわち、ＭＨＣタンパク質の溝内で提示されるペプチド）に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質によって提示されるペプチドに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質によって提示されるペプチドに対する結合特異性を有する。
【０００９】
本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物のいくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲ遺伝子座（例えば、内在性ＴＣＲα遺伝子座又は内在性ＴＣＲβ遺伝子座）に位置する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座のＴＣＲ定常領域遺伝子は内在性ＴＣＲ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα遺伝子座及び／又はＴＣＲβ遺伝子座の可変領域の全て又は一部は、遺伝子座の可変領域の全て又は一部で置換されて、ＣＡＲ遺伝子座を作製する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域全体がＩｇ可変領域で置換される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントはＩｇ可変領域遺伝子セグメントで置換される。例えば、いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲβ遺伝子座のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントは、Ｉｇ重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα遺伝子座のＶ及びＪ遺伝子セグメントは、Ｉｇ軽鎖（例えば、κ又はλ）Ｖ及びＪ遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲ遺伝子座の外部に位置する。
【００１０】
本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物のいくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座の可変領域遺伝子座内の内在性ＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントの全てがＩｇ可変領域遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座の可変領域遺伝子座内の実質的に全てのＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントは、Ｉｇ可変領域遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下のＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントが、ＣＡＲ遺伝子座の可変領域遺伝子座内にある、及び／又はＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、機能的ＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントは、ＣＡＲ遺伝子座内のＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合されない。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントは、ＣＡＲ遺伝子座内のＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合されない。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、又は８０個のＩｇ可変領域遺伝子セグメントを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は機能的αβ  ＴＣＲを発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、機能的ＴＣＲα鎖及び／又は機能的ＴＣＲβ鎖を発現しない。いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子座及び／又はＴＣＲβ可変領域遺伝子座は、遺伝子改変非ヒト動物内で不活性化されている。例えば、いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子座及び／又はＴＣＲβ可変領域遺伝子座は、内在性遺伝子座の全て又は一部を削除することにより不活性化される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲα可変領域遺伝子座及び／又はＴＣＲβ可変領域遺伝子座は、ＴＣＲ可変領域遺伝子座とＴＣＲ定常領域遺伝子座との操作可能な結合を分断することによって（例えば、非コード調節要素を削除することによって、ＴＣＲ可変領域遺伝子座若しくはその一部を反転させることによって、及び／又は再構成されていないＩｇ可変領域又はその一部をコードする核酸配列など核酸配列を、ＴＣＲ可変領域遺伝子座の可変領域遺伝子セグメントとＴＣＲ定常領域遺伝子座ＴＣＲ定常領域遺伝子との間に挿入することによって）不活性化される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ＴＣＲδ遺伝子座を含まない。ＴＣＲδは、ＴＣＲα遺伝子座の内側、つまりＴＣＲα  Ｖ遺伝子セグメントとＴＣＲα  Ｊ遺伝子セグメントとの間に位置する。したがって、いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ＴＣＲα遺伝子座において、ＴＣＲα定常領域に操作可能に結合されたＩｇ軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントを含むＩｇ軽鎖の可変領域を含み、ＴＣＲδ遺伝子座は、非ヒト動物が機能的δ／γ  ＴＣＲを発現しないように削除されるか、改変されるかのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲδ遺伝子座は保存され、非ヒト動物機能的δ／γ  ＴＣＲを発現しない。
【００１３】
本明細書で提供する遺伝子改変非ヒト動物のいくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座の再構成されていない可変領域は、１個又は２個以上のトリプシノーゲン（ＴＲＹ）遺伝子（例えば、通常、ＴＲＹ遺伝子及び／又はＴＣＲβ可変領域遺伝子座内に存在する偽遺伝子）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＹ遺伝子は内在性種起源である。いくつかの実施形態では、ＴＲＹ遺伝子はマウスＴＲＹ遺伝子である。いくつかの実施形態では、マウスＴＲＹ遺伝子は、Ｔｒｙ１、Ｔｒｙ２、Ｔｒｙ３、Ｔｒｙ４、Ｔｒｙ５、Ｔｒｙ６、Ｔｒｙ７、Ｔｒｙ８、Ｔｒｙ９、Ｔｒｙ１０、Ｔｒｙ１１、Ｔｒｙ１２、Ｔｒｙ１３、Ｔｒｙ１４、Ｔｒｙ１５、Ｔｒｙ１６、Ｔｒｙ１７、Ｔｒｙ１８、Ｔｒｙ１９、及びＴｒｙ２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１個又は２個以上のＴＲＹ遺伝子は、再構成されていない可変領域のＶセグメントの上流に位置する。いくつかの実施形態では、１個又は２個以上のＴＲＹ遺伝子は、再構成されていない可変領域のＶセグメントの下流（例えば、Ｖセグメントの下流並びにＤセグメント及び／又はＪセグメントの上流）に位置する。いくつかの実施形態では、Ｔｒｙ１〜７は、再構成されていない可変領域のＶセグメントの上流に位置し、Ｔｒｙ  ８〜２０は、再構成されていない可変領域のＶセグメントの下流（例えば、Ｖセグメントの下流並びにＤセグメント及び／又はＪセグメントの上流）に位置する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、１種又は２種以上のヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメイン（ヒトα１、α２、及びα３ドメイン）と、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスＩα鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−ｇ、ＨＬＡ−Ｋ、又はＨＬＡ−Ｌである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−ｇ、ＨＬＡ−Ｋ、及び／又はＨＬＡ−Ｌポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座は、内在性ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座のうちの１個又は２個以上（例えば、全て）は、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチドを発現しない。
【００１５】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化β−２−ミクログロブリンポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化β−２−ミクログロブリンポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化β−２−ミクログロブリンポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化β−２−ミクログロブリン遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化β−２−ミクログロブリン遺伝子座は、内在性β−２−ミクログロブリン遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、内在性β−２−ミクログロブリン遺伝子座は、ヒト化β−２−ミクログロブリン遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のβ−２−ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。
【００１６】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、１種又は２種以上のヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスＩＩ  α鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ、又はＨＬＡ−ＤＲＡである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ、及び／又はＨＬＡ−ＤＲＡポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座は、内在性ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座のうちの１個又は２個以上（例えば、全て）は、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドを発現しない。
【００１７】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、１種又は２種以上のヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスＩＩ  β鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、又はＨＬＡ−ＤＲＢである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、及び／又はＨＬＡ−ＤＲＢポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座は、内在性ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座のうちの１個又は２個以上の（例えば、全て）は、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドを発現しない。
【００１８】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化ＣＤ８  α鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  α鎖遺伝子座は、内在性ＣＤ８  α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性ＣＤ８  α鎖遺伝子座は、ヒト化ＣＤ８  α鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のＣＤ８  α鎖ポリペプチドを発現しない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化ＣＤ８  β鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  β鎖遺伝子座は、内在性ＣＤ８  β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性ＣＤ８  β鎖遺伝子座は、ヒト化ＣＤ８  β鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のＣＤ８  β鎖ポリペプチドを発現しない。
【００２０】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは、少なくとも１個のヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは、少なくともヒトＤ１免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ２免疫グロブリンドメイン、及びヒトＤ３免疫グロブリンドメイン、並びに内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＤ１免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ２免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ３免疫グロブリンドメイン、内在性種起源のＤ４免疫グロブリンドメイン、及び内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化ＣＤ４遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４遺伝子座は、内在性ＣＤ４遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性ＣＤ４遺伝子座は、ヒト化ＣＤ４遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のＣＤ４ポリペプチドを発現しない。
【００２１】
特定の態様において、本明細書では、ＣＡＲを発現するＴ細胞の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体及び／又はペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体）に対する抗原特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のＭＨＣ上で提示されるように、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を、遺伝子改変非ヒト動物から得る工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び／又はそれから得ることができるＴ細胞を提供する。
【００２２】
特定の態様において、本明細書では、ＣＡＲを発現するＴ細胞ハイブリドーマの作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体及び／又はペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体）に対する抗原特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のＭＨＣ上で提示されるように、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得る工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、Ｔ細胞からＴ細胞ハイブリドーマを作製する工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び／又はそれから得ることができるＴ細胞ハイブリドーマを提供する。
【００２３】
特定の態様において、本明細書では、Ｉｇ可変ドメイン（例えば、Ｉｇ重鎖可変ドメイン、Ｉｇ  κ可変ドメイン、及び／又はＩｇ  λ可変ドメイン）をコードする核酸の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｉｇ可変ドメインは、単独で、又は別のＩｇ可変ドメインと組み合わせたときのいずれかにおいて、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体及び／又はペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体）に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のＭＨＣ上で提示されるように、本明細書に記載の非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得る工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＡＲのＩｇ可変ドメインをコードする核酸をＴ細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの可変ドメインのそれぞれをコードする核酸は、Ｔ細胞から単離される。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び／又はそれ得ることができるＩｇ可変ドメインをコードする核酸を提供する。
【００２４】
特定の態様において、本明細書では、抗体又は抗体フラグメントの作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体、及び／又はペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体）に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のＭＨＣ上で提示されるように、本明細書に記載の非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得ることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＡＲの重鎖Ｉｇ可変ドメイン及び／又は軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸をＴ細胞から単離する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む抗体又は抗体フラグメントを発現するように、重鎖Ｉｇ可変ドメイン及び軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする１個又は２個以上のベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞がＩｇ重鎖可変ドメイン及びＩｇ重鎖定常ドメインを含むＩｇ重鎖ポリペプチドを発現するように、重鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、重鎖Ｉｇ定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞がＩｇ軽鎖可変ドメイン及びＩｇ重鎖定常ドメインを含むＩｇ軽鎖ポリペプチドを発現するように、軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、軽鎖Ｉｇ定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞が、重鎖Ｉｇ可変ドメイン及び重鎖Ｉｇ定常ドメインを含む重鎖と、軽鎖Ｉｇ可変ドメイン及び軽鎖Ｉｇ定常ドメインを含む軽鎖と、を有する抗体を発現するように、重鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を重鎖Ｉｇ定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合し、軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を軽鎖Ｉｇ定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞が抗体又は抗体フラグメントを発現する条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇ軽鎖及び／又は重鎖定常ドメインは、ヒトＩｇ定常ドメインである。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び／又はそれから得ることができる抗体又は抗体フラグメントを提供する。
【００２５】
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の抗体又は抗体フラグメント（例えば、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する抗体、及び／又は本明細書に記載の方法に従って生成された抗体）を被験者に投与することを含む、被験者の癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、任意の癌性又は前癌性腫瘍を治療してよい。本明細書に記載の方法及び組成物によって治療され得る癌としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎、肝、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮からの癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、癌は、具体的に以下の組織型、つまり、腫瘍、悪性；癌；癌、未分化；巨細胞癌及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリン産生腫瘍、悪性；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌及び胆管癌；索状腺癌；腺様癌；腺腫様ポリープ内の腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；充実癌；類癌、悪性；細気管支肺胞上皮（branchiolo-alveolar）腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭状及び濾胞状腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；類内膜（endometroid）癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；嚢胞腺癌；膠様腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌（扁平上皮化生を伴う）；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；及び神経芽細胞腫、悪性；セルトリ細胞腫；間質細胞腫、悪性；脂質細胞腫、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑内の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児型横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎生期癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；乏突起神経膠腫（oligodendroglioma）；乏突起神経膠腫（oligodendroblastoma）；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経線維鞘、悪性；果粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特異的非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥胖細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；プラズマ細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥胖細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；並びに有毛状細胞性白血病であり得るが、これらに限定されない。
【００２６】
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の抗体又は抗体フラグメント（例えば、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する抗体、及び／又は本明細書に記載の方法に従って生成された抗体）を被験者に投与することを含む、ウイルス感染、細菌感染、蠕虫感染、又は原虫感染など感染症を患う被験者を治療する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書では、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１、及びＨＳＶ−２などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスの治療法を提供する。いくつかの実施形態では、治療される病原体は、マラリアなど寄生生物である。いくつかの実施形態において、本明細書では、アスペルギルス、Ｂｒｕｇｉａ、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌など細菌性疾患、真菌性疾患、及び他の病原性疾患の治療法を提供する。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、Ｂ群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス（Microplasma  hominis）、軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌；又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど；又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
【００２７】
いくつかの態様において、本明細書では、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、ヒトＴ細胞などヒト細胞）の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体、及び／又はペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体）に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のＭＨＣ上で提示されるように、本明細書に記載の非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＭＨＣ上で提示されるペプチドに対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得ることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＡＲの重鎖Ｉｇ可変ドメイン及び／又は軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸をＴ細胞から単離する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞がＩｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲ定常ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現するように、重鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、ＴＣＲ定常ドメイン（例えば、ＴＣＲβ定常ドメイン又はＴＣＲα定常ドメイン）をコードする核酸配列と細胞（例えば、ヒトＴ細胞などヒト細胞）内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞がＩｇ軽鎖可変ドメイン及びＴＣＲ定常ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現するように、軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、ＴＣＲ定常ドメイン（例えば、ＴＣＲβ定常ドメイン又はＴＣＲα定常ドメイン）をコードする核酸配列と細胞（例えば、ヒトＴ細胞などヒト細胞）内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞が重鎖Ｉｇ可変ドメイン及び第１のＴＣＲ定常ドメインを含む第１のＣＡＲ鎖ポリペプチドと、軽鎖Ｉｇ可変ドメイン及び第２のＴＣＲ定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を有するＣＡＲを発現するように、重鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、第１のＴＣＲ定常ドメイン（例えば、ＴＣＲβ定常ドメイン又はＴＣＲα定常ドメイン）と細胞（例えば、ヒトＴ細胞などヒト細胞）内で操作可能に結合し、軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、第２のＴＣＲ定常ドメイン（例えば、ＴＣＲβ定常ドメイン（第１のＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲα定常ドメインである場合）又はＴＣＲα定常ドメイン（第１のＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲβ定常ドメインである場合））をコードする核酸配列と細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常ドメインはヒトＴＣＲ定常ドメインである。いくつかの実施形態では、細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏヒトＴ細胞などｅｘ  ｖｉｖｏヒト細胞）である。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び／又はそれから得ることができるＣＡＲを発現する細胞を提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ペプチドが非ヒト動物内のＭＨＣ上で提示されるように、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物をペプチドを含む抗原に曝露する任意の方法を使用できる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、非ヒト動物に抗原をコードする核酸配列を含むウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はレンチウイルス）を感染させることによって、抗原に曝露される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチドが非ヒト動物で発現するように、ペプチドをコードする核酸を動物に投与することによって、抗原に曝露される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、単鎖ペプチド／ＭＨＣ複合体をコードする核酸を投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチド／ＭＨＣ複合体を遺伝子改変非ヒト動物に投与することによって、抗原に曝露される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、単鎖ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、単鎖ｅｃｔｏ−ＭＨＣ／β−２−ミクログロブリン／ペプチドタンパク質複合体）を投与される。いくつかの実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、多量体（例えば、四量体）として投与される。いくつかの実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、細胞（例えば、マクロファージ細胞又は樹枝状細胞など抗原提示細胞）の表面に提示される。いくつかの実施形態では、Ｂ７．１、Ｂ７．２、又はＩＣＯＳ−Ｌは、細胞の表面に提示される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−α及び／又はＩＦＮ−β）を発現する。
【００２９】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、任意の方法を使用して、Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸を単離できる。いくつかの実施形態では、核酸を単離する工程は、Ｔ細胞からＴ細胞ハイブリドーマを作製し、Ｔ細胞ハイブリドーマから核酸を単離することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ）を使用して単離される。いくつかの実施形態では、核酸は、Ｔ細胞又はＴ細胞ハイブリドーマのＣＡＲ遺伝子座内で再構成されたＩｇ可変領域遺伝子をシークエンシングし、再構成されたＩｇ可変領域遺伝子を含む核酸配列を合成することにより単離される。
【００３０】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られた、又は得ることができるＣＡＲを発現するＣＡＲを提供する。いくつかの実施形態では、この細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞はＴ細胞ハイブリドーマである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。
【００３１】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物又は細胞から得られた、又は得ることができる再構成されたＩｇ可変領域遺伝子（例えば、重鎖Ｉｇ可変領域遺伝子又は軽鎖重鎖可変領域遺伝子）を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、ＴＣＲ定常領域遺伝子（例えば、ＴＣＲα定常領域遺伝子又はＴＣＲβ定常領域遺伝子）を更に含む。いくつかの実施形態では、核酸はＣＡＲポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有するＩｇ可変ドメインをコードする。
【００３２】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物又は細胞から得られた、又は得ることができるＣＡＲ又はＣＡＲポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ又はＣＡＲポリペプチドは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。
【００３３】
特定の態様において、本明細書では、ゲノム中にＣＡＲ遺伝子座を含む非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞又はラットＥＳ細胞などげっ歯類ＥＳ細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメント（例えば、再構成されていないＶ、Ｄ、及びＪ重鎖遺伝子セグメント、再構成されていないＶ  κ及びＪ  κ軽鎖遺伝子セグメント、又は再構成されていないＶ  λ及びＪ  λ軽鎖遺伝子セグメント）を含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、ＴＣＲ定常領域遺伝子（例えば、ＴＣＲα定常領域遺伝子又はＴＣＲβ定常領域遺伝子）と、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、ＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントはヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常領域遺伝子は、内在性種起源である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列（例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列（例えば、ＴＣＲβ遺伝子間配列又はＴＣＲα遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
【００３４】
特定の態様において、本明細書では、ゲノム中に第１のＣＡＲ遺伝子座及び第２のＣＡＲ遺伝子座を含む、非ヒトＥＳ細胞（例えば、マウスＥＳ細胞又はラットＥＳ細胞などげっ歯類ＥＳ細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲ遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源のＴＣＲβ定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントは、ＴＣＲβ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第１のＣＡＲ遺伝子座は、Ｉｇ重鎖可変領域遺伝子（ユニバーサル重鎖可変領域）を含む再構成された可変領域遺伝子座と、内在性種起源のＴＣＲβ定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲ遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖκ及びＪκを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源のＴＣＲα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントは、ＴＣＲα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲ遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖλ及びＪλを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源のＴＣＲα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖλ及びＪλ遺伝子セグメントは、ＴＣＲα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第２のＣＡＲ遺伝子座は、Ｉｇ軽鎖κ又はλ可変領域遺伝子（ユニバーサル軽鎖可変領域）を含む再構成された可変領域遺伝子座と、内在性種起源のＴＣＲα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座の一方又は両方は、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列（例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座の一方又は両方は、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列（例えば、ＴＣＲβ遺伝子間配列又はＴＣＲα遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
【００３５】
本明細書に記載の非ヒト動物ＥＳ細胞のいくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲ遺伝子座（例えば、内在性ＴＣＲα遺伝子座又は内在性ＴＣＲβ遺伝子座）に位置する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座のＴＣＲ定常領域遺伝子は内在性ＴＣＲ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα遺伝子座及び／又はＴＣＲβ遺伝子座の可変領域の全て又は一部は、遺伝子座の可変領域の全て又は一部で置換されて、ＣＡＲ遺伝子座を作製する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域全体がＩｇ可変領域で置換される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントはＩｇ可変領域遺伝子セグメントで置換される。例えば、いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲβ遺伝子座のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントは、Ｉｇ重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα遺伝子座のＶ及びＪ遺伝子セグメントは、Ｉｇ軽鎖（例えば、κ又はλ）Ｖ及びＪ遺伝子セグメントで置換される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、機能的ＴＣＲ遺伝子座を含まない。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、機能的ＴＣＲα鎖遺伝子座及び／又は機能的ＴＣＲβ鎖遺伝子座を含まない。いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα遺伝子座及び／又はＴＣＲβ遺伝子座は、遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞で（例えば、内在性遺伝子座の全て又は一部を削除することによって）不活性化される。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、機能的ＴＣＲδ遺伝子座を含まない。
【００３７】
本明細書に記載の非ヒト動物ＥＳ細胞のいくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座の再構成されていない可変領域は、１個又は２個以上のトリプシノーゲン（ＴＲＹ）遺伝子（例えば、ＴＲＹ遺伝子及び／又はＴＣＲβ可変領域遺伝子座内に通常存在する偽遺伝子）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＹ遺伝子は内在性種起源である。いくつかの実施形態では、ＴＲＹ遺伝子はマウスＴＲＹ遺伝子である。いくつかの実施形態では、マウスＴＲＹ遺伝子は、Ｔｒｙ１、Ｔｒｙ２、Ｔｒｙ３、Ｔｒｙ４、Ｔｒｙ５、Ｔｒｙ６、Ｔｒｙ７、Ｔｒｙ８、Ｔｒｙ９、Ｔｒｙ１０、Ｔｒｙ１１、Ｔｒｙ１２、Ｔｒｙ１３、Ｔｒｙ１４、Ｔｒｙ１５、Ｔｒｙ１６、Ｔｒｙ１７、Ｔｒｙ１８、Ｔｒｙ１９、及びＴｒｙ２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１個又は２個以上のＴＲＹ遺伝子は、再構成されていない可変領域のＶセグメントの上流に位置する。いくつかの実施形態では、１個又は２個以上のＴＲＹ遺伝子は、再構成されていない可変領域のＶセグメントの下流（例えば、Ｖセグメントの下流並びにＤセグメント及び／又はＪセグメントの上流）に位置する。いくつかの実施形態では、Ｔｒｙ１〜７は、再構成されていない可変領域のＶセグメントの上流に位置し、Ｔｒｙ８〜２０は、再構成されていない可変領域のＶセグメントの下流（例えば、Ｖセグメントの下流並びにＤセグメント及び／又はＪセグメントの上流）に位置する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、そのゲノム中に、ヒト化ＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメイン（ヒトα１、α２、及びα３ドメイン）と、内在性種起源細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスＩα鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−ｇ、ＨＬＡ−Ｋ、又はＨＬＡ−Ｌである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−ｇ、ＨＬＡ−Ｋ、及び／又はＨＬＡ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座は、内在性ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞の内在性ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座のうちの１個又は２個以上（例えば、全て）は、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、機能的内在性ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座（例えば、完全に内在性種起源のＭＨＣクラスＩ  α鎖をコードする遺伝子座）を含まない。
【００３９】
いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ヒト化β−２−ミクログロブリンポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化β−２−ミクログロブリンポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化β−２−ミクログロブリン遺伝子座は、内在性β−２−ミクログロブリン遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、内在性β−２−ミクログロブリン遺伝子座は、ヒト化β−２−ミクログロブリン遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、機能的内在性β−２−ミクログロブリン遺伝子座（例えば、完全に内在性種起源のβ−２−ミクログロブリンポリペプチドをコードする遺伝子座）をそのゲノム中に含まない。
【００４０】
いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスＩＩ  α鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ、又はＨＬＡ−ＤＲＡである。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ヒト化ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ及び／又はＨＬＡ−ＤＲＡポリペプチドをコードする遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座は、内在性ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞の内在性ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座のうちの１個又は２個以上（例えば、全て）は、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒトＥＳ細胞は、機能的内在性ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座（例えば、完全に内在性種起源のＭＨＣクラスＩＩ  α鎖をコードする遺伝子座）をそのゲノム中に含まない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスＩＩ  β鎖ポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、又はＨＬＡ−ＤＲＢである。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ヒト化ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、及び／又はＨＬＡ−ＤＲＢポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座は、内在性ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞の内在性ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座のうちの１個又は２個以上（例えば、全て）は、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、機能的内在性ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座（例えば、完全に内在性種起源のＭＨＣクラスＩＩ  β鎖をコードする遺伝子座）をそのゲノム中に含まない。
【００４２】
いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  α鎖遺伝子座は、内在性ＣＤ８  α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞の内在性ＣＤ８  α鎖遺伝子座は、ヒト化ＣＤ８  α鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、機能的内在性ＣＤ８  α鎖遺伝子座（例えば、完全に内在性種起源のＣＤ８  α鎖をコードする遺伝子座）をそのゲノム中に含まない。
【００４３】
いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  β鎖遺伝子座は、内在性ＣＤ８  β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞の内在性ＣＤ８  β鎖遺伝子座は、ヒト化ＣＤ８  β鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、機能的内在性ＣＤ８  β鎖遺伝子座（例えば、完全に内在性種起源のＣＤ８  β鎖をコードする遺伝子座）をそのゲノム中に含まない。
【００４４】
いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは、少なくともヒトＤ１免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ２免疫グロブリンドメイン、及びヒトＤ３免疫グロブリンドメイン、並びに内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＤ１免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ２免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ３免疫グロブリンドメイン、内在性種起源のＤ４免疫グロブリンドメイン、及び内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４遺伝子座は、内在性ＣＤ４遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞の内在性ＣＤ４遺伝子座は、ヒト化ＣＤ４遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、機能的内在性ＣＤ４鎖遺伝子座（例えば、完全に内在性種起源のＣＤ４鎖をコードする遺伝子座）をそのゲノム中に含まない。
【００４５】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載のＥＳ細胞を使用して生成された、又はそれから得ることができる遺伝子改変非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態では、この遺伝子改変非ヒト動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、この遺伝子改変非ヒト動物は、マウス又はラットである。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の非ヒトＥＳ細胞を含む非ヒト胚を提供する。
【００４６】
特定の態様において、本明細書では、ＣＡＲ及び／又はＣＡＲポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物の作製方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、本明細書に記載の非ヒトＥＳ細胞を使用して非ヒト動物を生成することを含む。特定の実施形態では、非ヒトＥＳ細胞はマウス非ヒトＥＳ細胞である。いくつかの実施形態では、この方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２９４，７５４号に記載されるように、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用することを含む。特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法を使用して生成された、又はそれらの方法から得ることができる遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
【００４７】
特定の態様において、本明細書では、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、げっ歯類ＴＣＲ定常領域遺伝子（例えば、マウスＴＣＲ定常領域遺伝子又はラットＴＣＲ定常領域遺伝子）を含む定常領域遺伝子座と、を含むＣＡＲ遺伝子座を提供し、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、ＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＩｇ重鎖（ＩｇＨ）可変領域遺伝子セグメントである。いくつかの実施形態では、再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）可変領域遺伝子セグメント（例えば、Ｉｇ  κ遺伝子セグメント又はＩｇ  λ遺伝子セグメント）である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常領域遺伝子は、ＴＣＲα定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲα遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメントを置換する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲα定常領域遺伝子は、内在性ＴＣＲα定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常領域遺伝子は、ＴＣＲβ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲβ遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、内在性ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントを置換する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲβ定常領域遺伝子は、内在性ＴＣＲβ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、１個又は２個以上のトリプシノーゲン遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列（例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列（例えば、ＴＣＲβ遺伝子間配列又はＴＣＲα遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
【００４８】
特定の態様において、本明細書では、再構成されていないヒトＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、げっ歯類ＴＣＲβ定常領域遺伝子（例えば、ラットＴＣＲβ定常領域遺伝子又はマウスＴＣＲβ定常領域遺伝子）を含む定常領域遺伝子座と、を含むＣＡＲ遺伝子座を提供し、再構成されていないヒトＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントは、ＴＣＲβ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。特定の実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲβ遺伝子座に位置する。特定の実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ  ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントは、内在性ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントを置換する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲβ定常領域遺伝子は、内在性ＴＣＲβ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、１個又は２個以上のトリプシノーゲン遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列（例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列（例えば、ＴＣＲβ遺伝子間配列又はＴＣＲα遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
【００４９】
特定の態様において、本明細書では、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、げっ歯類ＴＣＲα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含むＣＡＲ遺伝子座を提供し、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントは、ＴＣＲα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲα遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ  Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントは、内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメントを置換する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲα定常領域遺伝子は、内在性ＴＣＲα定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は機能的ＴＣＲδ遺伝子座を含まず、いくつかの実施形態では、ＴＣＲδ遺伝子座は削除される。
【００５０】
特定の態様において、本明細書では、生殖細胞系に本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子座を含むげっ歯類（例えば、ラット又はマウス）を提供する。いくつかの態様において、本明細書では、生殖細胞系に本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子座を含むげっ歯類細胞（例えば、ラット細胞又はマウス細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、この細胞はＥＳ細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子座をコードする核酸（例えば、ベクター）を提供する。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列（例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列（例えば、ＴＣＲβ遺伝子間配列又はＴＣＲα遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
【００５１】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載のＣＡＲを発現する非ヒト動物（例えば、マウス又はラット）の作製方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子座を生殖細胞系に含むように、非ヒト動物を遺伝子的に改変することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子座を含むように、非ヒトＥＳ細胞（例えば、マウスＥＳ細胞又はラットＥＳ細胞）を遺伝子的に改変することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＴＣＲα定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないＩｇ軽鎖遺伝子セグメント（軽鎖Ｖ及びＪセグメント）を含むＣＡＲ遺伝子座を非ヒトＥＳ細胞に導入することと、ＴＣＲβ定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないＩｇ重鎖遺伝子セグメント（重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪセグメント）を含むＣＡＲ遺伝子座を非ヒトＥＳ細胞に導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＴＣＲα定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないＩｇ軽鎖遺伝子セグメント（軽鎖Ｖ及びＪセグメント）を含むように、非ヒト動物ＥＳ細胞のＴＣＲα遺伝子座を改変することと、ＴＣＲβ定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないＩｇ重鎖遺伝子セグメント（重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪセグメント）を含むように、非ヒト動物ＥＳ細胞のＴＣＲβ遺伝子座を改変することと、を含む。
【００５２】
特定の態様において、本明細書では、Ｉｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドと、Ｉｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、このＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、図１を参照）に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体である。いくつかの実施形態では、このＩｇ重鎖可変ドメイン及び／又はＩｇ軽鎖可変ドメインは、ヒトＩｇ可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン（例えば、ラット又はマウス定常ドメイン）である。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。
【００５３】
特定の態様において、本明細書では、Ｉｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲα定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドと、Ｉｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びＴＣＲβ定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、このＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、図２を参照）に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体である。いくつかの実施形態では、このＩｇ重鎖可変ドメイン及び／又はＩｇ軽鎖可変ドメインは、ヒトＩｇ可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン（例えば、ラット又はマウス定常ドメイン）である。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。
【００５４】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞又は非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態では、この細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞又は動物は、ヒト又はげっ歯類（例えば、ラット又はマウス）である。特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の細胞を含む非ヒト動物（例えば、ラット又はマウスなどげっ歯類）を提供する。
【００５５】
いくつかの態様において、本明細書では、被験者内のペプチド／ＭＨＣ複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトＩｇ重鎖可変ドメイン及びヒトＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドと、ヒトＩｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びヒトＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むＣＡＲを発現する細胞（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞などヒトＴ細胞）を被験者に投与することを含み、このＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体である。
【００５６】
いくつかの態様において、本明細書では、被験者（例えば、ヒト被験者）内のペプチド／ＭＨＣ複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトＩｇ重鎖可変ドメイン及びヒトＴＣＲα定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドと、ヒトＩｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びヒトＴＣＲβ定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むＣＡＲを発現する細胞（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞などヒトＴ細胞）を被験者に投与することを含み、このＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体である。
【００５７】
特定の態様において、本明細書では、被験者（例えば、ヒト被験者）内のペプチド／ＭＨＣ複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者からＴ細胞（例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞又はＣＤ８  Ｔ細胞）を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトＩｇ重鎖可変ドメイン及びヒトＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドと、ヒトＩｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びヒトＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むＣＡＲのＴ細胞によって発現を誘導することを含み、このＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者にＴ細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のベクター及び第２のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２のベクターでＴ細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列（nucleic  sequence）を含む第１のベクター及び第２のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２のベクターでＴ細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、内在性ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβのＴ細胞による発現を抑制する工程を含む。
【００５８】
特定の態様において、本明細書では、被験者（例えば、ヒト被験者）内のペプチド／ＭＨＣ複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者からＴ細胞（例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞又はＣＤ８  Ｔ細胞）を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトＩｇ重鎖可変ドメイン及びヒトＴＣＲα定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドと、ヒトＩｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びヒトＴＣＲβ定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むＣＡＲのＴ細胞によって発現を誘導することを含み、このＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者にＴ細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のベクター及び第２のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２のベクターでＴ細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列及び第２のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターでＴ細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、内在性ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβのＴ細胞による発現を抑制する工程を含む。
【００５９】
特定の態様において、本明細書では、Ｉｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、Ｉｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、を含む核酸組成物を提供し、このＣＡＲは第１のＣＡＲポリペプチドを含み、第２のＣＡＲポリペプチドは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。特定の実施形態では、このＩｇ重鎖可変ドメイン及び／又はＩｇ軽鎖可変ドメインは、ヒトＩｇ可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン（例えば、ラット定常ドメイン又はマウス定常ドメイン）である。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、単一の核酸分子上にある。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、別個の核酸分子上にある。
【００６０】
特定の態様において、本明細書では、Ｉｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲα定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、Ｉｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びＴＣＲβ定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、を含む核酸組成物を提供し、このＣＡＲは第１のＣＡＲポリペプチドを含み、第２のＣＡＲポリペプチドは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。特定の実施形態では、このＩｇ重鎖可変ドメイン及び／又はＩｇ軽鎖可変ドメインは、ヒトＩｇ可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン（例えば、ラット定常ドメイン又はマウス定常ドメイン）である。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、単一の核酸分子上にある。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、別個の核酸分子上にある。
【００６１】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の核酸組成物で細胞をトランスフェクトすることを含む、ＣＡＲを発現する細胞の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、この細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は、げっ歯類細胞（例えば、ラット細胞又はマウス細胞）である。いくつかの実施形態では、この細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏＴ細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び／又はそれから得ることができる細胞を提供する。
【００６２】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を被験者に投与することを含む、被験者の疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この疾患又は障害は癌であり、このＣＡＲは、癌抗原を提示したＭＨＣに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この疾患又は障害は感染症であり、このＣＡＲは、病原体抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、又は寄生虫抗原）に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この疾患又は障害は、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患であり、このＣＡＲは自己免疫の自己抗原に特異的であり、調節性Ｔ細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、このＴ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、このＴ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】抗原提示細胞上でペプチド／ＭＨＣ複合体と相互作用する、本明細書に記載の例示的なＣＡＲの概略図を示す。
【図２】抗原提示細胞上でペプチド／ＭＨＣ複合体と相互作用する、本明細書に記載の例示的なＣＡＲの概略図を示す。
【図３】レンチウイルスベクターを使用してヒトＩｇ可変領域をマウスＴＣＲ遺伝子座に結合させるための例示的なスキームを示す。図は、配列番号１５５として「ＳＧＳＧ」を開示する。
【図４】抗原提示に反応した、ＣＡＲ発現細胞によるサイトカイン分泌を示す。
【図５】Ｉｇ  κ可変領域遺伝子セグメントを内在性マウスＴＣＲα遺伝子座に挿入するための大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製するための例示的なスキーム（正確な縮尺ではない）を示す。別途記載のない限り（例えば、選択カセットなど）、マウス配列は、塗りつぶし形態及び単線で示し、ヒト配列は、非塗りつぶし形態及び二重線で示す。クローニングに使用された特定の制限部位を示す。
【図６】Ｉｇ  κ可変領域遺伝子セグメントを内在性マウスＴＣＲα遺伝子座に挿入するための例示的なスキーム（正確な縮尺ではない）を示す。別途記載のない限り、マウス配列は、塗りつぶし形態及び単線で示し、ヒト配列は、非塗りつぶし形態及び二重線で示す。ＴＡＱＭＡＮプローブによるハイブリタイゼーション位置を示す。
【図７】追加のＩｇ  κ可変領域遺伝子セグメントを内在性マウスＴＣＲα遺伝子座に挿入するための例示的なスキーム（正確な縮尺ではない）を示す。別途記載のない限り、マウス配列は、塗りつぶし形態及び単線で示し、ヒト配列は、非塗りつぶし形態及び二重線で示す。ＴＡＱＭＡＮプローブによるハイブリタイゼーション位置を示す。
【図８】追加のＩｇ  κ可変領域遺伝子セグメントを内在性マウスＴＣＲα遺伝子座に挿入するための例示的なスキーム（正確な縮尺ではない）を示す。別途記載のない限り、マウス配列は、塗りつぶし形態及び単線で示し、ヒト配列は、非塗りつぶし形態及び二重線で示す。ＴＡＱＭＡＮプローブによるハイブリタイゼーション位置を示す。
【図９】追加のＩｇ  κ可変領域遺伝子セグメントを内在性マウスＴＣＲα遺伝子座に挿入するための例示的なスキーム（正確な縮尺ではない）を示す。別途記載のない限り、マウス配列は、塗りつぶし形態及び単線で示し、ヒト配列は、非塗りつぶし形態及び二重線で示す。ＴＡＱＭＡＮプローブによるハイブリタイゼーション位置を示す。
【図１０】Ｉｇ重鎖可変領域遺伝子セグメントを内在性マウスＴＣＲβ遺伝子座に挿入するためのＬＴＶＥＣを作成するための例示的なスキーム（正確な縮尺ではない）を示す。別途記載のない限り、マウス配列は、塗りつぶし形態及び単線で示し、ヒト配列は、非塗りつぶし形態及び二重線で示す。
【図１１】Ｉｇ重鎖可変領域遺伝子セグメントを内在性マウスＴＣＲβ遺伝子座に挿入するための例示的なスキーム（正確な縮尺ではない）を示す。別途記載のない限り、マウス配列は、塗りつぶし形態及び単線で示し、ヒト配列は、非塗りつぶし形態及び二重線で示す。
【図１２】Ｉｇ重鎖可変領域遺伝子セグメントを内在性マウスＴＣＲβ遺伝子座に挿入するための例示的なＬＴＶＥＣ（正確な縮尺ではない）を示す。別途記載のない限り、マウス配列は、塗りつぶし形態及び単線で示し、ヒト配列は、非塗りつぶし形態及び二重線で示す。
【図１３】Ｉｇ重鎖可変領域遺伝子セグメントを内在性マウスＴＣＲα遺伝子座に挿入するためのスキームの例示的なスキーム（正確な縮尺ではない）を示す。工程４は、ＴＣＲ  Ｖβ３１遺伝子セグメントを削除する、任意選択的な工程を示す。別途記載のない限り、マウス配列は、塗りつぶし形態及び単線で示し、ヒト配列は、非塗りつぶし形態及び二重線で示す。
【図１４】内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子座が、再構成されていないＩｇ  κ可変領域遺伝子セグメント（４個の機能的Ｖκ及び５個の機能的Ｊκ）で置換されている、トランスジェネリックマウスの胸腺細胞及び膵臓Ｔ細胞内でのＩｇ  κ／ＴＣＲα  ＣＡＲ遺伝子座の再構成中のＶκ及びＪκの使用量を示す。ＩＧＫＶ７−３は偽遺伝子である。
【図１５】内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子座が、再構成されていないＩｇ  κ可変領域遺伝子セグメント（４個の機能的Ｖκ及び５個の機能的Ｊκ）で置換されている、３匹のトランスジェネリックマウスの膵臓Ｔ細胞内でのＩｇ  κ／ＴＣＲα  ＣＡＲ遺伝子座の生産的な再構成対非生産的な再構成を示す。この場合の生産的な再構成（「ｐｒｏｄ」）には、再構成された核酸配列がＶκの配列、続いてＪκの配列、続いてＴＣＲα定常ドメインの配列を操作可能な結合で有するタンパク質に翻訳され得る再構成が挙げられる。非生産的な再構成（「ｎｏｎｐｒｏｄ」）には、再構成されたＶκＪκエキソンが、ＴＣＲα定常ドメインをコードする核酸配列のフレーム外である、又はＴＣＲαドメインをコードする配列のフレーム内であるが、終止コドンを含むためタンパク質に翻訳できない、のいずれかである再構成が挙げられる。
【図１６】内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子座が、再構成されていないＩｇ  κ可変領域遺伝子セグメント（１６個の機能的Ｖκ及び５個の機能的Ｊκ）で置換されている、トランスジェネリックマウスの胸腺細胞及び膵臓Ｔ細胞内でのＩｇ  κ／ＴＣＲα  ＣＡＲ遺伝子座の再構成中のＶκ及びＪκの使用量を示す。
【図１７】内在性ＴＣＲα可変領域遺伝子座が、再構成されていないＩｇ  κ可変領域遺伝子セグメント（１６個の機能的Ｖκ及び５個の機能的Ｊκ）で置換されている、トランスジェネリックマウスの胸腺細胞及び膵臓Ｔ細胞内でのＩｇ  κ／ＴＣＲα  ＣＡＲ遺伝子座の生産的な再構成対非生産的な再構成を示す。この場合の生産的な再構成（「ｐｒｏｄ」）には、再構成された核酸配列がＶκの配列、続いてＪκの配列、続いてＴＣＲα定常ドメインの配列を操作可能な結合で有するタンパク質に翻訳され得る再構成が挙げられる。非生産的な再構成（「ｎｏｎｐｒｏｄ」）には再構成されたＶκＪκエキソンがＴＣＲα定常ドメインをコードする配列のフレーム外である、又はＴＣＲαのフレーム内であるが終止コドンを含むため、タンパク質に翻訳できない、のいずれかである再構成が挙げられる。
【図１８】内在性ＴＣＲβ可変領域遺伝子座が、再構成されていないＩｇＨ可変領域遺伝子セグメント（３個の機能的ＶＨ及び全ての機能的Ｄ及びＪＨ）で置換されている、トランスジェネリックマウスの胸腺細胞及び膵臓Ｔ細胞内でのＩｇＨ／ＴＣＲβＣＡＲ遺伝子座の再構成中のＶＨ及びＪＨの使用量を示す。
【図１９】内在性ＴＣＲβ可変領域遺伝子座が、再構成されていないＩｇＨ可変領域遺伝子セグメント（３個の機能的ＶＨ並びに全ての機能的Ｄ及びＪＨ）で置換されている、トランスジェネリックマウスの胸腺細胞及び膵臓Ｔ細胞内でのＩｇＨ／ＴＣＲβＣＡＲ遺伝子座の生産的な再構成対非生産的な再構成を示す。この場合の生産的な再構成（「ｐｒｏｄ」）には、再構成された核酸配列がＶＨの配列、続いてＤの配列、続いてＪＨの配列、続いてＴＣＲβ定常ドメインの配列を操作可能な結合で有するタンパク質に翻訳され得る再構成が挙げられる。非生産的な再構成（「ｎｏｎｐｒｏｄ」）には再構成されたＶＤＪエキソンがＴＣＲβ定常ドメインをコードする配列のフレーム外である、又はＴＣＲβのフレーム内であるが、終止コドンを含むため、タンパク質に翻訳できない、のいずれかである再構成が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
全般
本明細書では、免疫グロブリン（Ｉｇ）由来の抗原結合ドメインと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）由来の定常ドメインと、を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関連する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、このＣＡＲは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示されるペプチドに対する結合特異性を有する。
【００６５】
抗体は、高い親和性及び特異性で標的抗原に結合するその能力のために、有益な治療剤であることが判明している。既存の抗体治療技術の弱点の１つは、細胞膜全体への抗体の送達に伴う課題のために、細胞内抗原など特定の抗原を標的化することの困難さである。したがって、現在の抗体治療法は、概して、細胞表面タンパク質など細胞外抗原及びサイトカインなど可溶性因子を対象とする。一方、多くの腫瘍抗原及びウイルス抗原など細胞内標的は、標的化することが依然として困難である。
【００６６】
細胞膜全体に抗体を送達するという課題は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質上に提示されるペプチド抗原を認識できる抗体を使用することによって回避できる。全ての有核哺乳類細胞は、内在性細胞タンパク質を処理して、クラスＩＭＨＣタンパク質に積載され、細胞の表面で提示されるペプチドにする。同様に、樹枝状細胞又はマクロファージなどプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、外因性抗原を処理して、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質に積載され、ＡＰＣ細胞表面に提示されるペプチドにする。胸腺でのＴ細胞の発現中に、Ｔ細胞は、ポジティブ選択及びネガティブ選択を受ける。これによって、胸腺から出現するＭＨＣに対して非常に弱いペプチド非依存の親和性を有するＴＣＲを発現する、ごく少数のＴ細胞のみを確保し（ポジティブ選択）、一方では、自己ペプチド／ＭＨＣに対して中〜高度の親和性を有するＴＣＲを発現するＴ細胞はアポトーシスに追いやられる（ネガティブ選択）。抗体は、ＴＣＲとは異なって、通常、ＭＨＣベースのポジティブ選択及びネガティブ選択を受けず、従来の抗体生成技術を使用したペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的な抗体を生成することが困難であることが判明している。
【００６７】
本明細書に記載するように、いくつかの実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的な、抗体など可溶性抗原結合分子は、Ｉｇ可変ドメインと、ＴＣＲ定常ドメインと、を有するＣＡＲを発現するＴ細胞を有するように操作される遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウス）を使用して生成され得る。かかる非ヒト動物は、ＴＣＲα及びＴＣＲβ定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないＩｇ軽鎖及び重鎖可変（Ｖ（Ｄ）Ｊ）遺伝子セグメント由来のＩｇ可変ドメインを有し、抗原（例えば、ペプチド／ＭＨＣ）に遭遇すると、ＣＡＲ遺伝子座においてＶ（Ｄ）Ｊ再構成を受けて、Ｔ細胞でのＣＡＲ発現をもたらす、再構成されたＣＡＲ分子を生成する。かかるＴ細胞はポジティブ及びネガティブ選択を受けるため、発現したＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣに対する抗原特異性を有する。したがって、かかるマウスは、ペプチド／ＭＨＣ複合体を標的化できる抗原結合タンパク質を生成するために使用できる。例えば、これらのマウスは、抗原特異的なＴ細胞が生成されるように、ペプチド／ＭＨＣ抗原で免疫され得る。抗原特異的なＴ細胞で発現したＣＡＲのＩｇ可変ドメインをコードする核酸は、宿主細胞がペプチド／ＭＨＣ特異抗体を発現するように、宿主細胞内でＩｇ定常ドメインをコードする核酸に操作可能に結合され得る。
【００６８】
定義
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語のうちの１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
【００６９】
用語「アミノ酸」は、天然であるか、合成であるかにかかわらず、アミノ官能基及び酸性官能基の両方を含み、天然に発生するアミノ酸のポリマーに含まれることができる、全ての分子を包含することを意図する。例示的なアミノ酸としては、天然に発生するアミノ酸；その類似物、誘導体、及び同族体；変形側鎖を有するアミノ酸類似物；並びに前述のいずれかの全ての立体異性体が挙げられる。
【００７０】
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、インタクトな抗体及びそのフラグメントを結合する抗原の両方を指してよい。インタクトな抗体とは、ジスルフィド結合で相互に結合された、少なくとも２個の重（Ｈ）鎖及び２個の軽（（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変ドメインと、重鎖定常ドメインと、を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインと、軽鎖定常ドメインと、を含む。重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、超可変性のいわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）、より保存されている領域が組み入れられている、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）のドメインへと更に細分化され得る。各重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された、３個のＣＤＲ及び４個のＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００７１】
用語「抗原結合フラグメント」及び抗体の「抗原結合部分」は、本明細書で使用するとき、抗原に結合する能力を保持する抗体の１個又は２個以上のフラグメントを指す。用語、抗体の「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖抗体、単離ＣＤＲＨ３、及びインタクトな抗体の可変ドメインの少なくとも一部を保持する他の抗体フラグメントが挙げられる。これらの抗体フラグメントは、従来の組み換え及び／又は酵素技術を使用して得ることができ、インタクトな抗体と同様の方法で抗原結合をスクリーニングできる。
【００７２】
本明細書で使用するとき、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常ドメインと、を含む抗原結合タンパク質を指す。本明細書で使用するとき、ＴＣＲポリペプチドの「定常ドメイン」は、膜近傍のＴＣＲ定常ドメインを含み、ＴＣＲ膜貫通ドメイン及び／又はＴＣＲ細胞質尾部も含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲβ定常ドメインに結合された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む第１のポリペプチドと、ＴＣＲα定常ドメインに結合された免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（例えば、κ又はλ可変ドメイン）を含む第２のポリペプチドと、を含む、二量体である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲα定常ドメインに結合された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む第１のポリペプチドと、ＴＣＲβ定常ドメインに結合された免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（例えば、κ又はλ可変ドメイン）を含む第２のポリペプチドと、を含む、二量体である。
【００７３】
再構成されていない可変領域及び／又は再構成されていない可変領域遺伝子セグメント「由来の」再構成された可変領域遺伝子に関して使用するとき、語句「由来」は、再構成された可変領域遺伝子の配列を、可変ドメインを発現する遺伝子を形成するように再構成された、一連の再構成されていない可変領域遺伝子セグメントまで遡ることができることを指す（該当する場合、スプライスの相違点及び体細胞変異を説明する）。例えば、体細胞変異した、再構成された可変領域遺伝子は、それでもなお再構成されていない可変領域遺伝子セグメント由来である。内在性遺伝子座がユニバーサル軽鎖又は重鎖遺伝子座で置換されるいくつかの実施形態では、用語「由来」は、配列が体細胞変異したことがあっても配列の起源を前記再構成された遺伝子座まで遡ることができることを示す。
【００７４】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子座」は、一連の関連遺伝子要素（例えば、遺伝子、遺伝子セグメント、調節要素）を含む染色体上の位置を指す。例えば、再構成されていない免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、１個又は２個以上の免疫グロブリン定常領域遺伝子、及びＶ（Ｄ）Ｊ組み換え及び免疫グロブリン発現を指示する関連調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、スイッチ要素など）を含んでよい。同様に、再構成されていないＣＡＲ遺伝子座は、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、ＴＣＲ定常領域遺伝子、及びＶ（Ｄ）Ｊ組み換え及びＣＡＲ発現を指示する関連調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含んでよい。遺伝子座は、内在性又は非内在性であり得る。用語「内在性遺伝子座」は、特定の遺伝子要素が自然に見つけられる、染色体上の位置を指す。例えば、内在性マウスＴＣＲα遺伝子座は、野生型マウス内の、ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメント及び定常領域遺伝子を含むマウス染色体１４上の位置を指し、内在性マウスＴＣＲβ遺伝子座は、野生型マウス内の、ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメント及び定常領域遺伝子を含むマウス染色体６上の位置を示す。
【００７５】
再構成されていない可変領域遺伝子セグメントは、再構成されていない可変領域遺伝子セグメントが、抗原結合タンパク質のポリペプチド鎖として定常領域遺伝子とともに発現される、再構成された可変領域遺伝子を形成するように再構成可能である場合、隣接する定常領域遺伝子に「操作可能に結合」される。例えば、再構成されていない免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ＣＡＲ遺伝子座内でＴＣＲ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。
【００７６】
用語「ポリヌクレチド」及び「核酸」は、同じ意味で使用する。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチド、又はリボヌククレオチド、又はこれらの類似物のいずれであっても、任意の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。ポリヌクレチドは、任意の三次元構造を有してよく、任意の機能を実行してよい。ポリヌクレチドの非限定例としては、遺伝子又は遺伝子フラグメントのコード領域又は非コード領域、連鎖回析から定義された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレチド、分岐ポリヌクレチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。ポリヌクレチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体など修飾ヌクレオチドを含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組織化前後に付与されてよい。ポリヌクレチドは、標識成分との共役によって更に修飾されてよい。本明細書で提供する全ての核酸配列では、Ｕヌクレオチドは、Ｔヌクレオチドと代替できる。
【００７７】
本明細書で使用するとき、「特異的結合」及び「抗原特異性」は、抗原結合分子（例えば、抗体又はＣＡＲ）が所定のペプチド／ＭＨＣ複合体など所定の標的に結合する能力を指す。通常、抗原結合分子は、その所定の標的に約１０−７Ｍ以下のＫＤに相当する親和性で特異的に結合し、所定の標的に、非特異的な、無関係の標的（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するためのその親和性よりも少なくとも１０倍小さい、少なくとも１００倍小さい、又は少なくとも１０００倍小さい、親和性（ＫＤで示される）で結合する。
【００７８】
用語「再構成されていない」は、Ｖ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメント（重又はＴＣＲβ可変領域の場合、Ｄ遺伝子セグメントも同様）は、別個に維持されるものの、結合されてＶ（Ｄ）Ｊレパートリーの単独のＶ、（Ｄ）、Ｊを含む再構成されたＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子（「可変領域遺伝子」）を形成することができる、免疫グロブリン、ＴＣＲ若しくはＣＡＲ可変領域遺伝子座又は可変領域遺伝子セグメントの状態を含む。
【００７９】
キメラ抗原受容体遺伝子座
特定の態様において、本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子座を提供する。かかるＣＡＲ遺伝子座は、概して、可変領域遺伝子座と、定常領域遺伝子座と、を含む。可変領域遺伝子座は再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントを含み、定常領域遺伝子座はＴＣＲ定常領域遺伝子を含み、Ｉｇ可変領域遺伝子セグメントは、定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、可変領域は再構成されていない可変領域であり、したがって、再構成されていないＩｇ可変領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、可変領域は再構成された可変領域であり、したがって、再構成された可変領域遺伝子を含む。特定の実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子セグメントはヒト可変領域遺伝子セグメントであり、ＴＣＲ定常領域遺伝子は非ヒト定常領域遺伝子である。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常領域遺伝子は、ラット定常領域遺伝子又はマウス定常領域遺伝子などげっ歯類定常領域遺伝子である。特定の実施形態では、Ｉｇ可変領域遺伝子セグメントはヒト可変領域遺伝子セグメントであり、ＴＣＲ定常領域遺伝子はヒト定常領域遺伝子である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲ遺伝子座に位置する。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＣＲα定常領域遺伝子を含むＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲα定常領域遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、かかる遺伝子座は、再構成されていないＴＣＲα可変領域の一部又は全てを再構成されていないＩｇ可変領域で置換することにより作製される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲβ定常領域遺伝子を含むＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲβ定常領域遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、かかる遺伝子座は、再構成されていないＴＣＲβ可変領域の一部又は全てを再構成されていないＩｇ可変領域で置換することにより作製される。本明細書では、例示的なＣＡＲ遺伝子座の構築方法を実施例２で提供する。
【００８１】
特定の実施形態では、ＣＡＲ可変領域遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメント含む。ヒト可変領域遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域遺伝子座は、当該技術分野で説明されている。例えば、かかる遺伝子座は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，４２９号、同第５，８１４，３１８号、同第６，１１４，５９８号、同第６，９９８，５１４号、同第８，２３２，４４９号、同第８，５０２，０１８号、及び同第８，６９７，９４０号、並びにそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／００９８４９０号、同第２０１２／０１６７２３７号、同第２０１３／０１４５４８４号、同第２０１３／０３２６６４７号、同第２０１４／０１３２７５号、及び同第２０１４／０９３９０８号に記載されている。
【００８２】
特定の実施形態では、ＣＡＲ可変領域遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、複数個のヒトＶＨセグメントと、１個又は２個以上のヒトＤＨセグメントと、１個又は２個以上のヒトＪＨセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、少なくとも３個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１８個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも３０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも４０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも５０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも６０個のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも７０個のＶＨ遺伝子セグメント、又は少なくとも８０個のＶＨ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ遺伝子セグメントは、ヒトＤＨ遺伝子セグメントの全てを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ可変領域は、ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメント（例えば、Ｖ、Ｄ、及び／又はＪ遺伝子セグメント）を更に含む。一実施形態では、ＣＡＲ可変領域は、遠位ＴＣＲ  Ｖβ遺伝子セグメント、例えば、ＴＣＲ  Ｖβ３１遺伝子セグメントを更に含む。別の実施形態では、遠位ＴＣＲ  Ｖβ遺伝子セグメント、例えば、ＴＣＲ  Ｖβ３１遺伝子セグメントは、機能的に不活性であるか、削除されている。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ遺伝子セグメントは、全てのトＪＨ遺伝子セグメントを含む。Ｉｇ重鎖遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１１：５１４７〜５２及び補足情報で提供される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ重鎖可変領域遺伝子セグメントを含むＣＡＲ可変遺伝子座はまた、ヒトＩｇ重鎖可変領域遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ可変遺伝子座は、非ヒト（例えば、げっ歯類、ラット、マウス）Ｉｇ重鎖可変領域遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ可変遺伝子座は、ヒト又は非ヒト（例えば、げっ歯類、ラット、マウス）ＴＣＲβ可変領域遺伝子間配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座の再構成されていない可変領域は、１個又は２個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個）のトリプシノーゲン（ＴＲＹ）遺伝子（例えば、ＴＲＹ遺伝子及び／又は通常、ＴＣＲβ可変領域遺伝子座に存在する偽遺伝子）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＹ遺伝子はマウスＴＲＹ遺伝子である。いくつかの実施形態では、マウスＴＲＹ遺伝子は、Ｔｒｙ１、Ｔｒｙ２、Ｔｒｙ３、Ｔｒｙ４、Ｔｒｙ５、Ｔｒｙ６、Ｔｒｙ７、Ｔｒｙ８、Ｔｒｙ９、Ｔｒｙ１０、Ｔｒｙ１１、Ｔｒｙ１２、Ｔｒｙ１３、Ｔｒｙ１４、Ｔｒｙ１５、Ｔｒｙ１６、Ｔｒｙ１７、Ｔｒｙ１８、Ｔｒｙ１９、及びＴｒｙ２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１個又は２個以上のＴＲＹ遺伝子は、再構成されていない可変領域のＶＨセグメントの上流に位置する。いくつかの実施形態では、１個又は２個以上のＴＲＹ遺伝子は、再構成されていない可変領域のＶＨセグメントの下流かつＤＨセグメントの上流に位置する。いくつかの実施形態では、Ｔｒｙ１〜７は、再構成されていない可変領域のＶＨセグメントの上流に位置し、Ｔｒｙ８〜２０は、再構成されていない可変領域のＶＨセグメントの下流かつＤＨセグメントの上流に位置する。ヒト及び／又はマウスＴＣＲβ遺伝子座に位置するＴＲＹ遺伝子に関する追加情報は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｌｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：３３７〜３４９（２００１）及びＳｋｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８：３７８〜３８７（２００７）で提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、非ヒト調節要素（例えば、非ヒトプロモーター及び／又はエンハンサー）を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト調節要素は、げっ歯類調節要素（例えば、ラット又はマウスプロモーター又はエンハンサー）である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、ＩｇＭエンハンサー（Ｅμ）を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＭエンハンサーは、非ヒトＥμ（例えば、マウス又はラットＥμなどげっ歯類Ｅμ）である。
【００８４】
特定の実施形態では、ＣＡＲ可変領域遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ  κ可変領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、複数個のヒトＶκセグメントと、１個又は２個以上のヒトＪκセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、４個の機能的Ｖκセグメントと、全てのヒトＪκセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、１６個の機能的Ｖκセグメントと、全てのヒトＪκセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、全てのヒトＶκセグメントと、全てのヒトＪκセグメントと、を含む。Ｉｇ  κ遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１１：５１４７〜５２及び補足情報で提供される。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、全てのヒトＪκセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ可変領域は、ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメント（例えば、Ｖ及び／又はＪ遺伝子セグメント）を更に含む。
【００８５】
特定の実施形態では、ＣＡＲ可変領域遺伝子座は、再構成されていないヒトＩｇ  λ可変領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、複数個のヒトＶλセグメントと、１個又は２個以上のヒトＪλセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、全てのヒトＶλセグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、全てのヒトＪλセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ可変領域は、ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメント（例えば、Ｖ及び／又はＪ遺伝子セグメント）を更に含む。Ｉｇ  λ遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００７３００４号及び同第２００２／００８８０１６号で提供される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトＩｇ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含むＣＡＲ可変遺伝子座はまた、ヒトＩｇ軽鎖可変領域遺伝子間配列（例えば、κ可変領域遺伝子間配列及び／又はλ可変領域遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ可変遺伝子座は、非ヒト（例えば、げっ歯類、ラット、マウス）Ｉｇ軽鎖可変領域遺伝子間配列（例えば、κ可変領域遺伝子間配列及び／又はλ可変領域遺伝子間配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ可変遺伝子座は、ヒト又は非ヒト（例えば、げっ歯類、ラット、マウス）ＴＣＲα可変領域遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、非ヒト調節要素（例えば、非ヒトプロモーター及び／又はエンハンサー）を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト調節要素は、げっ歯類調節要素（例えば、ラット又はマウスプロモーター又はエンハンサー）である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ可変領域遺伝子座は、Ｉｇ重鎖可変領域遺伝子（ユニバーサル重鎖可変領域）を含む再構成された可変領域遺伝子座である。いくつかの実施形態では、再構成されたＩｇ重鎖可変領域遺伝子は、再構成されたヒトＩｇ重鎖可変領域遺伝子である。ユニバーサル重鎖可変領域を使用することにより、少なくとも１個の抗原結合ドメインがペプチド／ＭＨＣ複合体に対する特異性を有する二重特異性抗体の生成が促進される。例示的な再構成されたＩｇ重鎖可変領域は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２４５４６８号で提供される。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ可変領域遺伝子座は、Ｉｇ軽鎖可変領域遺伝子（ユニバーサル軽鎖可変領域）を含む再構成された可変領域遺伝子座である。いくつかの実施形態では、再構成されたＩｇ軽鎖可変領域遺伝子は、再構成されたヒトＩｇ軽鎖可変領域遺伝子である。ユニバーサル軽鎖可変領域を使用することにより、少なくとも１個の抗原結合ドメインがペプチド／ＭＨＣ複合体に対する特異性を有する二重特異性抗体の生成が促進される。例示的な再構成されたＩｇ重鎖可変領域は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０１８５８２１号で提供される。
【００８９】
特定の実施形態では、ＣＡＲ定常領域遺伝子座は、ＴＣＲα又はＴＣＲβ定常領域遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ定常領域遺伝子座は、免疫グロブリン調節配列（例えば、ヒト又は内在性種起源の調節配列）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ定常領域遺伝子座は、ＴＣＲβ  Ｃ２の上流にマウス又はラットＩｇＭエンハンサー（Ｅμ）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常領域遺伝子はまた、Ｉｇ定常領域配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＡＲ定常領域遺伝子座は、Ｉｇ重鎖ＣＨ１ドメインをコードする核酸配列を含むＴＣＲβ定常領域遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ定常領域遺伝子座は、Ｉｇ  λ又はＩｇ  κ定常領域又はその一部をコードする核酸配列を含むＴＣＲα定常領域遺伝子を含む。
【００９０】
ヒト化ＭＨＣ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞は、ヒト化ＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチド（例えば、ヒト化ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−ｇ、ＨＬＡ−Ｋ、及び／又はＨＬＡ−Ｌ）をコードする遺伝子座を発現する、及び／又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメイン（例えば、ヒトα１、α２、及びα３ドメイン）と、内在性種起源細胞質ドメインと、を含む。ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチド、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０１１１６１７号、同第２０１３／０１８５８１９号、及び同第２０１４／０２４５４６７号に記載されている。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞は、ヒト化β−２−ミクログロブリンポリペプチドをコードする遺伝子座を発現する、及び／又はそのゲノム中に含む。ヒト化β−２−ミクログロブリンポリペプチド、ヒト化β−２−ミクログロブリンポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化β−２−ミクログロブリンポリペプチドを発現する非ヒト動物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０１１１６１７号及び同第２０１３／０１８５８１９号に記載されている。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞は、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチド（例えば、ヒト化ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ、及び／又はＨＬＡ−ＤＲＡ）をコードする遺伝子座を発現する、及び／又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチド、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８４７，００５号及び同第９，０４３，９９６号、並びに米国特許出願公開第２０１４／０２４５４６７号に記載されている。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞は、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチド（例えば、ヒト化ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＢ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、及び／又はＨＬＡ−ＤＲＢ）をコードする遺伝子座を発現する、及び／又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチド、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８４７，００５号及び同第９，０４３，９９６号、並びに米国特許出願公開第２０１４／０２４５４６７号に記載されている。
【００９４】
ＣＡＲ遺伝子座、並びにヒト化ＭＨＣ  Ｉ及び／又はＭＨＣ  ＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ  α／ＩＩ  β）遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物は、従来の方法を使用して繁殖させることによって生成され得る。あるいは、１個、又は２個以上の遺伝子操作されている遺伝子座（例えば、ＣＡＲ遺伝子座）を既に含むＥＳ細胞内での相同的組み換え及び前記ＥＳ細胞からの非ヒト動物の生成によって、生成され得る。
【００９５】
ヒト化ＣＤ４及びＣＤ８受容体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞は、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座を発現する、及び／又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチド、ヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化ＣＤ８  α鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２４５４６６号に記載されている。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞は、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座を発現する、及び／又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチド、ヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化ＣＤ８  β鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２４５４６６号に記載されている。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞は、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドをコードする遺伝子座を発現する、及び／又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは、少なくとも１個のヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは、少なくともヒトＤ１免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ２免疫グロブリンドメイン、及びヒトＤ３免疫グロブリンドメイン、並びに内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドは、ヒトＤ１免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ２免疫グロブリンドメイン、ヒトＤ３免疫グロブリンドメイン、内在性種起源のＤ４免疫グロブリンドメイン及び内在性種起源の細胞質ドメインを含む。ヒト化ＣＤ４ポリペプチド、ヒト化ＣＤ４ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化ＣＤ４ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２４５４６６号に記載されている。
【００９８】
ＣＡＲ遺伝子座、並びにヒト化ＣＤ４及び／又はＣＤ８（ＣＤ８α／ＣＤ８β）遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物は、従来の方法を使用して繁殖させることによって生成され得る。あるいは、１個、又は２個以上の遺伝子操作されている遺伝子座（例えば、ＣＡＲ遺伝子座）を既に含むＥＳ細胞内での相同的組み換え及び前記ＥＳ細胞からの非ヒト動物の生成によって、生成され得る。
【００９９】
遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞
特定の態様において、本明細書では、ＣＡＲ及び／又はＣＡＲペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物、並びにかかる非ヒト動物の作製において有用な遺伝子改変非ヒト動物ＥＳ細胞を提供する。
【０１００】
特定の態様において、本明細書では、生殖細胞系及び／又はゲノム中に本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子座を含む、遺伝子改変非ヒト動物及び非ヒト動物ＥＳ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物又はＥＳ細胞は、その生殖細胞系及び／又はゲノム中に２個のＣＡＲ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ある遺伝子座はＴＣＲα定常領域遺伝子を含み、ある遺伝子座はＴＣＲβ定常領域遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ遺伝子座は、内在性ＴＣＲ遺伝子座に位置する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は任意の非ヒト動物であり得る。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は脊椎動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、水牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、赤毛猿）からなる群から選択されてよい。好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞を容易に入手できない非ヒト動物の場合、他の方法を用いて、本明細書に記載の遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製できる。かかる方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞又は誘導多能性細胞）を改変すること、及び核移植を用いて、卵母細胞など好適な細胞に改変ゲノムを移植し、好適な条件下で非ヒト動物内で改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を成熟させて胚を形成することが挙げられる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、例えば、トビネズミ科又はネズミ上科の小型哺乳動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はげっ歯類である。特定の実施形態では、げっ歯類は、マウス、ラット、又はハムスターである。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、ネズミ上科から選択される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、カンガルーハムスター科（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（例えば、真正マウス及びラット、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（例えば、キノボリマウス、イワマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、デバネズミ（mole  rates）、タケネズミ、及びモグラネズミ）から選択される科に属する。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、真正マウス又はラット（ネズミ科）、スナネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。いくつかの実施形態では、マウスはネズミ科に属する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、マウス及びラットから選択される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はマウスである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物はＣ５７ＢＬ系統のマウスである。いくつかの実施形態では、Ｃ５７ＢＬ系統は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は１２９系統のマウスである。いくつかの実施形態では、１２９系統は、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスは、１２９系統とＣ５７ＢＬ系統との混合体である。いくつかの実施形態では、マウスは、１２９系統の混合体、及び／又はＣ５７ＢＬ／６系統の混合体である。いくつかの実施形態では、１２９系統の混合体は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。いくつかの実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ）である。いくつかの実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ系統及び／又は１２９系統）との混合体である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する非ヒト動物は、上記系統のいずれかの混合体に由来するマウスであり得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する非ヒト動物は、ラットである。いくつかの実施形態では、ラットは、ウィスターラツト、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。いくつかの実施形態では、ラット系統は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される群から選択される、２つ又はそれ以上の系統の混合体である。
【０１０５】
特定の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物又はＥＳ細胞は、そのゲノム中、及び／又は生殖細胞系ＣＡＲ遺伝子座中に、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座、ヒト化β−２−ミクログロブリン遺伝子座、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座、ヒト化ＣＤ８  α鎖遺伝子座、ヒト化ＣＤ８  β鎖遺伝子座、及び／又はヒト化ＣＤ４遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座は、内在性ＭＨＣクラスＩ  α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化β−２−ミクログロブリン遺伝子座は、内在性β−２−ミクログロブリン遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座は、内在性ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座は、内在性ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  α鎖遺伝子座は、内在性ＣＤ８  α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ８  β鎖遺伝子座は、内在性ＣＤ８  β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＣＤ４遺伝子座は、内在性ＣＤ４遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、内在性ＭＨＣクラスＩ  α鎖ポリペプチド、内在性β−２−ミクログロブリンポリペプチド、内在性ＭＨＣクラスＩＩ  α鎖ポリペプチド、内在性ＭＨＣクラスＩＩ  β鎖ポリペプチド、内在性ＣＤ８  α鎖ポリペプチド、内在性ＣＤ８  β鎖ポリペプチド、及び／又は内在性ＣＤ４ポリペプチドを発現しない。かかる動物は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０１１１６１７号、同第２０１３／０１８５８１９号、同第２０１４／０２４５４６６号、及び同第２０１４／０２４５４６７号、並びに米国特許第８，８４７，００５号、及び同第９，０４３，９９６号に記載されている。
【０１０６】
特定の態様では、遺伝子改変非ヒト動物は、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、２個のＣＡＲポリペプチドを含むＣＡＲを発現する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、非ヒト動物内の非ヒト動物のＴ細胞（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞）で発現される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、αβ  ＴＣＲを発現しない。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、Ｔ細胞の発現中にポジティブ選択を受ける。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、Ｔ細胞の発現中にネガティブ選択を受ける。
【０１０７】
遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞は、当該技術分野において周知の任意の適切な方法を使用して生成できる。例えば、かかる遺伝子改変非ヒト動物ＥＳ細胞は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号、同第７，１０５，３４８号、及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２〜６５９に記載されている、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）を使用して生成できる。改変はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系などゲノム標的ヌクレアーゼ系を使用して実行できる。いくつかの実施形態では、改変は、それぞれが参照により組み込まれる、米国特許出願第１４／３１４，８６６号、同第１４／５１５，５０３号、同第１４／７４７，４６１号、及び同第１４／７３１，９１４号に記載されているように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して実行する。いくつかの実施形態では、可変領域遺伝子セグメントは、大型標的化ベクターが拡張するＣＡＲ遺伝子座に次々に連続して追加される一連の標的化イベントによって、ＣＡＲ遺伝子座に連続的に追加される。いくつかの実施形態では、多数の大型標的化ベクター（例えば、２個又はそれ以上）は、単一の標的化イベント（例えば、２重標的化イベント）でＣＡＲ遺伝子座に同時に組み込まれる。本明細書では、かかる遺伝子改変非ヒト動物及びＥＳ細胞の例示的な作製方法を実施例２で提供する。
【０１０８】
次いで、本明細書に記載のＥＳ細胞を使用して、当該技術分野において周知の方法によって非ヒト動物を生成できる。例えば、本明細書に記載のマウス非ヒト動物ＥＳ細胞を使用して、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ２５：９１〜９９（２００７）に記載されているようにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって遺伝子改変マウスを生成できる。得られたマウスは、ホモ接合性に繁殖させる（bread）ことができる。
【０１０９】
遺伝子改変非ヒト動物の使用方法
本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、ＣＡＲを発現する動物が有用であり得る任意のプロセスで使用できる。例えば、かかる非ヒト動物は、ＣＡＲの作製、ＣＡＲを発現するＴ細胞の作製、ＣＡＲを発現するＴ細胞ハイブリドーマの作製、再構成されたＩｇ可変領域をコードする核酸の作製、及び抗体又は抗体フラグメントの作製に使用できる。
【０１１０】
本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対するＴ細胞免疫応答を誘発するために、トランスジェネリック非ヒト動物の免疫化を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチドが非ヒト動物内のＭＨＣ上に提示されるように、抗原に曝露される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ペプチドに対するＴ細胞応答が動物内で誘発されるように、ペプチドが非ヒト動物のＭＨＣ上に提示されるようにペプチドを含む抗原に本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を抗原に曝露する任意の方法を使用できる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ペプチドが提示されるＭＨＣは、クラスＩ  ＭＨＣである。いくつかの実施形態では、クラスＩ  ＭＨＣは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、又はＨＬＡ−Ｇである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、８〜１０個のアミノ酸である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ペプチドが提示されるＭＨＣは、クラスＩＩ  ＭＨＣである。いくつかの実施形態では、クラスＩＩ  ＭＨＣは、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、又はＨＬＡ−ＤＲである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、１０〜２５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、１３〜２５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、１５〜１８個のアミノ酸である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、癌関連抗原のエピトープを含む。癌関連抗原の例としては、ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、Ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ−４、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ−ＲＡＦ、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、β−カテニン、ＢＩＮＧ−４、ＣＡ−１２５、ＣＡＬＣＡ、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ−１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤ１、サイクリン−Ａ１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３，上皮性腫瘍抗原（「ＥＴＡ」）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ−１，２，８、ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン−３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ヘプシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ１１ｌＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ｈｓｐ７０−２、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ−ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＫＭＨＮ１（別名ＣＣＤＣ１１０）、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、リンゴ酸酵素、ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ−Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ−ｒａｗ、ＮＡ８８−Ａ、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ−ＲＡＲａｌｐｈａ融合タンパク質、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｕｃｉｎ（「ＰＥＭ」）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、ｓｅｃｅｒｎｉｎ１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＳＹＴ−ＳＳＸ１又は−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、テロメラーゼ、ＴＧＦ−ｂｅｔａＲＩＩ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ−３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、チロシナーゼ、チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ���１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、感染性病原体によって発現した抗原のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫、又は原虫である。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１、及びＨＳＶ−２などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、寄生生物はマラリアである。いくつかの実施形態では、病原体は、アスペルギルス、Ｂｒｕｇｉａ、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌である。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、Ｂ群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌；又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど；又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、炎症性疾患、皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、又は自己免疫疾患における自己反応性Ｔ細胞の標的である、タンパク質のエピトープを含む。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎（ulceous  colitis）、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎（polymyosiis）、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症（achlorhydra  autoimmune）、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血（pernicious  anema）、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群（polyglandular  autosyndromes）、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症（又はクレスト症候群）、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス（systemic  lupus  erythematosis）、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、Ｂ型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。自己反応性Ｔ細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、ｐ２０５、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、及びミエリンが挙げられる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチドをコードする核酸配列を含むウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、又はレンチウイルス）を非ヒト動物に投与することによって、ペプチドに曝露される。ウイルス予防接種方法は、例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，３４９号、同第８，６６３，６２２号、同第８，６９１，５０２号、同第８，３７７，６８８号、並びにＰｒｅｃｏｐｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＥＭ  ２０４：１４０５〜１４１６（２００７）に提供されている。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、非ヒト動物が抗原を処理し、それをＭＨＣ上に提示するように、ウイルスが直接投与される。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、樹枝状細胞など抗原提示細胞）は非ヒト動物に投与される、ウイルスにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで感染する。いくつかの実施形態では、このウイルスは、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、単鎖ペプチド／ＭＨＣ複合体）をコードする。単鎖ペプチド／ＭＨＣ系ワクチンの例は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｒｕｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：６２８０〜６２８９（２００７）、ＥＰ１７７３３８３，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：２１７８〜２１８６（２０１２）、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：４４２３〜４４３０（２０１０）に提供されている。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチドが非ヒト動物で発現するように、ペプチドをコードする核酸を動物に投与することによって、ペプチドに曝露される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、単鎖ペプチド／ＭＨＣ複合体をコードする核酸を投与される。単鎖ペプチド／ＭＨＣ系ワクチンの例は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｒｕｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：６２８０〜６２８９（２００７）、ＥＰ１７７３３８３，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：２１７８〜２１８６（２０１２）、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：４４２３〜４４３０（２０１０）に提供されている。特定の実施形態では、この核酸はＤＮＡベクターである。核酸の送達は、ウイルス媒介遺伝子導入及びリポソーム媒介遺伝子導入など当該技術分野において周知の任意の技術によるものであり得る。対象のポリヌクレチドは、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７７０，２９１号、同第７，００１，６１４号、同第６，７４９，８６３号、同第５，５１２，２９５号、及び同第７，１１２，３３８号に記載されているように、遺伝子送達ビヒクルを形成するリポソームと関連している。いくつかの実施形態では、この核酸はｍＲＮＡベクターである。ｍＲＮＡベクターを生成し、投与する例示的な方法は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２７８，０３６号、並びに米国特許出願公開第２０１３／１５１７３６号及び同第２０１２／１３５８０５号に記載されている。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチド／ＭＨＣ複合体を遺伝子改変非ヒト動物に投与することによって、ペプチドに曝露される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、単鎖ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、単鎖ｅｃｔｏ−ＭＨＣ／β−２−ミクログロブリン／ペプチドタンパク質複合体）を投与される。いくつかの実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、多量体（例えば、二量体、三量体、四量体）として投与される。いくつかの実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体は、細胞の表面に提示される。ペプチド／ＭＨＣ複合体を生成し、投与する例示的な方法は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０４５，７９６号、同第５，８６９，２７０号、及び同第７，１４１，６５６号、並びにＴｒｕｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：６２８０〜６２８９（２００７），ＥＰ１７７３３８３、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ３０：２１７８〜２１８６（２０１２）、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：４４２３〜４４３０（２０１０）、及びＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：４２２〜４２９（１９９６）に提供されている。
【０１２０】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得る工程を含む。特定の実施形態では、当該技術分野において周知の任意の方法を使用して、かかるＴ細胞を得ることができる。例えば、かかるＴ細胞は、動物の脾臓、リンパ節、及び／又は末梢血から得ることができる。かかるＴ細胞は、当該技術分野において使用可能な方法を使用して、結合特異性をスクリーニングできる。例えば、カラム又はビーズ（例えば電磁ビーズ）など固体支持体上に積載されたペプチドＭＨＣ複合体を使用して、特定のペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的なＣＡＲを発現する細胞を精製できるか、標識ペプチド／ＭＨＣを使用して、かかるＴ細胞を染色でき、次いで、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）及び／又は磁性活性化細胞分類（ＭＡＣＳ）を使用してこれを精製できる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｔ細胞からＴ細胞ハイブリドーマを作製する工程を含む。Ｔ細胞ハイブリドーマの作製に有用な方法は当該技術分野において周知であり、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３０：１４１〜１５２（１９８２）、及びＫｒｕｉｓｂｅｅｋ  Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ３（２００１）及びＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３４：１８５〜１９３（２０００）に記載されている。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、ＣＡＲのＩｇ可変ドメインをコードする核酸をＴ細胞から単離する工程を含む。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、任意の方法を使用して、Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸を単離できる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、核酸を単離する工程は、Ｔ細胞からＴ細胞ハイブリドーマを作製し、Ｔ細胞ハイブリドーマから核酸を単離することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸増幅法を使用して単離される。例えば、いくつかの実施形態では、核酸増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、Ｑβレプリカーゼ系増幅、核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）、修復連鎖反応（ＲＣＲ）、ブーメランＤＮＡ増幅（ＢＤＡ）、又はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｔ細胞又はＴ細胞ハイブリドーマのＣＡＲ遺伝子座内で再構成されたＩｇ可変領域遺伝子をシークエンシングし、再構成されたＩｇ可変領域遺伝子を含む核酸配列を合成することにより単離される。例示的な核酸シークエンシング法としては、連鎖停止シークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、合成によるシークエンシング、ピロシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、単分子リアルタイムシークエンシング、４５４シークエンシング、及び／又はＤｉｌｕｔｅ−‘Ｎ’−Ｇｏシークエンシングが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
重鎖及び軽鎖Ｉｇ可変領域セグメントをコードするＤＮＡフラグメントを得ると、これらのＤＮＡフラグメントは標準的な、ＤＮＡ組み換え技術を使用して更に操作して、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換できる。これらの操作では、可変ドメインをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常ドメイン又は可動性リンカーなど別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合される。この文脈で使用するとき、用語「操作可能に結合される」は、２個のＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内にとどまるように、２個のＤＮＡフラグメントが結合されることを意味することを意図する。
【０１２６】
重鎖可変ドメインをコードする、単離されたＤＮＡは、可変ドメインをコードするＤＮＡを重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に結合することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤ定常ドメインであり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常ドメインである。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常ドメインのみをコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に連結され得る。
【０１２７】
軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする、単離されたＤＮＡは、可変ドメインをコードするＤＮＡをκ又はλ定常ドメインなど軽鎖定常ドメインをコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に結合することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。
【０１２８】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、宿主細胞がＩｇ重鎖可変ドメイン及びＩｇ重鎖定常ドメインを含むＩｇ重鎖ポリペプチドを発現するように、重鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、重鎖Ｉｇ定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞がＩｇ軽鎖可変ドメイン及びＩｇ重鎖定常ドメインを含むＩｇ軽鎖ポリペプチドを発現するように、軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、軽鎖Ｉｇ定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞が、重鎖Ｉｇ可変ドメイン及び重鎖Ｉｇ定常ドメインを含む重鎖と、軽鎖Ｉｇ可変ドメイン及び軽鎖Ｉｇ定常ドメインを含む軽鎖と、を有する抗体を発現するように、重鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を重鎖Ｉｇ定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合し、軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を軽鎖Ｉｇ定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。Ｉｇ可変領域は、当該技術分野において周知の標準的な分子生物学的技術を使用して、Ｉｇ定常領域と結合させることができる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドを発現できる任意の宿主細胞を使用できる。いくつかの実施形態では、この細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、又はＶｅｒｏ細胞である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、細胞がＩｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲ定常ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現するように、重鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、ＴＣＲ定常ドメイン（例えば、ＴＣＲβ定常ドメイン又はＴＣＲα定常ドメイン）をコードする核酸配列と細胞（例えば、ヒトＴ細胞などヒト細胞）内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞がＩｇ軽鎖可変ドメイン及びＴＣＲ定常ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現するように、軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列を、ＴＣＲ定常ドメイン（例えば、ＴＣＲβ定常ドメイン又はＴＣＲα定常ドメイン）をコードする核酸配列と細胞（例えば、ヒトＴ細胞などヒト細胞）内で操作可能に結合することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞が重鎖Ｉｇ可変ドメイン及び第１のＴＣＲ定常ドメインを含む第１のＣＡＲ鎖ポリペプチドと、軽鎖Ｉｇ可変ドメイン及び第２のＴＣＲ定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を有するＣＡＲを発現するように、重鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列及び第１のＴＣＲ定常ドメイン（例えば、ＴＣＲβ定常ドメイン又はＴＣＲα定常ドメイン）を、細胞（例えば、ヒトＴ細胞などヒト細胞）内で操作可能に結合し、軽鎖Ｉｇ可変ドメインをコードする核酸配列及び第２のＴＣＲ定常ドメイン（例えば、ＴＣＲβ定常ドメイン（第１のＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲα定常ドメインである場合）又はＴＣＲα定常ドメイン（第１のＴＣＲ定常ドメインがＴＣＲβ定常ドメインである場合））をコードする核酸配列を、細胞内で操作可能に結合することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ定常ドメインはヒトＴＣＲ定常ドメインである。Ｉｇ可変領域は、当該技術分野において周知の標準的な分子生物学的技術を使用して、ＴＣＲ定常領域と結合させることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、被験者から単離されたｅｘ  ｖｉｖｏ細胞（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏヒトＴ細胞などｅｘ  ｖｉｖｏヒト細胞）である。
【０１３０】
抗体
特定の態様において、本明細書では、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体又はペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体）に対する結合特異性を有する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、この抗体は完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に記載の方法（例えば、本明細書に記載するように、ＣＡＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して）に従って得ることができる、及び／又は得られる。
【０１３１】
特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体及び抗体フラグメントは、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、又は１０−９Ｍ以下の解離定数でペプチド／ＭＨＣ複合体を特異的に結合できる。いくつかの実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する抗体の結合親和性（ＫＤで示す）は、無関係のペプチドを提示する同一のＭＨＣタンパク質用ペプチドの抗体の親和性よりも少なくとも１０倍小さい、少なくとも１００倍小さい、又は少なくとも１０００倍小さい。抗体の結合親和性を評価する標準的アッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンプロット、及びＲＩＡである。抗体の結合キネティクス（例えば、結合親和性）はまた、Ｂｉａｃｏｒｅ分析など当該技術分野において周知の標準的な分析によって評価できる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体に対して特異的である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、又はＨＬＡ−Ｇである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、８〜１０個のアミノ酸である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体に対して特異的である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩは、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、又はＨＬＡ−ＤＲである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、１０〜２５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、１３〜２５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、１５〜１８個のアミノ酸である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、癌関連抗原のエピトープを含む。癌関連抗原の例としては、ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、Ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ−４、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ−ＲＡＦ、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、β−カテニン、ＢＩＮＧ−４、ＣＡ−１２５、ＣＡＬＣＡ、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ−１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤ１、サイクリン−Ａ１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３，上皮性腫瘍抗原（「ＥＴＡ」）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ−１，２，８、ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン−３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ヘプシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ１１ｌＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ｈｓｐ７０−２、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ−ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＫＭＨＮ１（別名ＣＣＤＣ１１０）、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、リンゴ酸酵素、ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ−Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ−ｒａｗ、ＮＡ８８−Ａ、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ−ＲＡＲａｌｐｈａ融合タンパク質、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｕｃｉｎ（「ＰＥＭ」）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、ｓｅｃｅｒｎｉｎ１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＳＹＴ−ＳＳＸ１又は−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、テロメラーゼ、ＴＧＦ−ｂｅｔａＲＩＩ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ−３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、チロシナーゼ、チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ���１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、感染性病原体によって発現した抗原のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫、又は原虫である。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１、及びＨＳＶ−２などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、寄生生物はマラリアである。いくつかの実施形態では、病原体は、アスペルギルス、Ｂｒｕｇｉａ、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌である。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、Ｂ群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌；又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど；又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、炎症性疾患、皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、又は自己免疫疾患における自己反応性Ｔ細胞の標的である、タンパク質のエピトープを含む。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症（又はクレスト症候群）、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、Ｂ型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。自己反応性Ｔ細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、ｐ２０５、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、及びミエリンが挙げられる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、ヒト重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、この抗体は、ヒト重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤ定常ドメインを含む。ヒト重鎖定常ドメインの配列は当該技術分野において周知である（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２を参照）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、重鎖定常ドメイン又はその一部を欠いている。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、改変Ｆｃドメイン（例えば、ＦｃとＦｃ受容体との間の相互作用を変化させる突然変異）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、（ＥＵ番号付与体系を使用して）２３５、２３６、２３７、２３９、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２９８、３２６、３２７、３３０、３３２、３５０、３５１、３６６、３９２、３９４、４０５及び／又は４０７位置にある、それらのＦｃドメインに対する改変を含む。いくつかの実施形態では、この改変は、（ＥＵ番号付与体系を使用して）Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｅ、Ｇ２３７Ｆ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｄ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｇ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｄ、Ｅ２６９Ｌ、Ｄ２７０Ｎ、Ｄ２７０Ｅ、Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｄ、Ａ３２７Ｈ、Ａ３２７Ｖ、Ａ３２７Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この抗体は、それらのＦｃドメインに対する多数の改変を含む。いくつかの実施形態では、多数の改変は、Ｄ２７０Ｎ／Ｋ３２６Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ、Ｌ２３５Ａ／Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｅ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３６Ｅ／Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２３９Ｅ、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｅ、Ｇ３２７Ｆ／Ｓ２３９Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｇ２３６Ｅ／Ｄ２７０Ｎ／Ａ３２７Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２３９Ｅ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３７Ｆ／Ａ３２７Ｌ／Ａ３３０Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｓ／Ｈ２６８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ａ３２７Ｌ／Ａ３３０Ｉ、Ｄ２６５Ｅ／Ｓ２６７Ｄ／Ａ３３０Ｓ、Ｓ２６７Ｇ／Ｈ２６８Ｅ／Ｄ２７０Ｅ、Ｈ２６８Ｄ／Ｅ２６９Ｌ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ、Ｈ２６８Ｄ／／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈからなる群から選択される。更なるＦｃ改変及びＦｃ改変の組み合わせは、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６２４，８２１号、同第５，６４８，２６０１号、同第６，５２８，６２４１号、同第６，７３７，０５６１号、同第７，１２２，６３７１号、同第７，１８３，３８７１号、同第７，２９７，７７５１号、同第７，３１７，０９１１号、同第７，３３２，５８１１号、同第７，６３２，４９７，１号、同第７，６６２，９２５１号、同第７，６９５，９３６１号、同第８，０９３，３５９１号、同第８，２１６，８０５１号、同第８，２１８，８０５１号、同第８，３８８，９５５１号、及び同第８，９３７，１５８１号、並びに米国特許出願公開第２００５／００５４８３２号、同第２００６／０２２２６５３号、同第２００６／０２７５２８２号、同第２００６／０２７５２８３号、同第２００７／０１９００６３号、同第２００８／０１５４０２５号、同第２００９／００４２２９１号、同第２０１３／０１０８６２３号、及び同第２０１３／００８９５４１号に提供されている。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、この抗体は二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の２個の抗原結合ドメインは、異なる重鎖可変ドメインを有するが、同一の軽鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、この重鎖のＦｃドメインは、重鎖ヘテロダイマーの形成を促進する改変、及び／又は重鎖ヘテロダイマーの形成を抑制する改変を含む。かかる改変は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、同第７，６４２，２２８号、及び同第８，６７９，７８５号、並びに米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に提供されている。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、ヒト軽鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、この軽鎖可変ドメインはλ軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、この軽鎖可変ドメインはκ軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、この抗体はヒト軽鎖定常ドメインを有する。いくつかの実施形態では、この軽鎖定常ドメインはλ軽鎖定常ドメインである。いくつかの実施形態では、この軽鎖定常ドメインはκ軽鎖定常ドメインである。ヒト軽鎖定常ドメインの配列は当該技術分野において周知である（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２を参照）。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体はインタクトな抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗原結合を保持する抗体フラグメントである。いくつかの実施形態では、この抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖抗体、単離されたＣＤＲＨ３、又はインタクトな抗体の可変ドメインの少なくとも一部を保持する別の抗体フラグメントである。
【０１４２】
キメラ抗原受容体
特定の態様において、本明細書では、ペプチド／ＭＨＣ複合体（例えば、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体又はペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体）に対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に記載の方法（例えば、本明細書に記載するように、ＣＡＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して）に従って得ることができる、及び／又は得られる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、又は１０−９Ｍ未満のＫＤに相当する親和性でペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対するＣＡＲの結合親和性（ＫＤで示す）は、ＭＨＣによって提示されない場合のペプチドのＣＡＲの親和性よりも少なくとも１０倍小さい、少なくとも１００倍小さい、又は少なくとも１０００倍小さい。いくつかの実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対するＣＡＲの結合親和性（ＫＤで示す）は、無関係のペプチドを提示する同一のＭＨＣタンパク質用ペプチドのＣＡＲの親和性よりも少なくとも１０倍小さい、少なくとも１００倍小さい、又は少なくとも１０００倍小さい。ＣＡＲの結合親和性を評価する標準的なアッセイは当該技術分野において周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンプロット、及びＲＩＡである。ＣＡＲの結合キネティクス（例えば、結合親和性）はまた、Ｂｉａｃｏｒｅ分析など当該技術分野において周知の標準的な分析によって評価できる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体に対して特異的である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、又はＨＬＡ−Ｇである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、８〜１０個のアミノ酸である。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体に対して特異的である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩは、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、又はＨＬＡ−ＤＲである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、１０〜２５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、１３〜２５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、１５〜１８個のアミノ酸である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、癌関連抗原のエピトープを含む。癌関連抗原の例としては、ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、Ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ−４、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ−ＲＡＦ、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、β−カテニン、ＢＩＮＧ−４、ＣＡ−１２５、ＣＡＬＣＡ、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ−１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤ１、サイクリン−Ａ１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３，上皮性腫瘍抗原（「ＥＴＡ」）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ−１，２，８、ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン−３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ヘプシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ１１ｌＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ｈｓｐ７０−２、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ−ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＫＭＨＮ１（別名ＣＣＤＣ１１０）、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、リンゴ酸酵素、ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ−Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ−ｒａｗ、ＮＡ８８−Ａ、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ−ＲＡＲａｌｐｈａ融合タンパク質、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｕｃｉｎ（「ＰＥＭ」）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、ｓｅｃｅｒｎｉｎ１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＳＹＴ−ＳＳＸ１又は−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、テロメラーゼ、ＴＧＦ−ｂｅｔａＲＩＩ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ−３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、チロシナーゼ、チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ���１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、感染性病原体によって発現した抗原のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫、又は原虫である。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１、及びＨＳＶ−２などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、寄生生物はマラリアである。いくつかの実施形態では、病原体は、アスペルギルス、Ｂｒｕｇｉａ、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌である。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、Ｂ群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌；又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど；又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、炎症性疾患、皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、又は自己免疫疾患における自己反応性Ｔ細胞の標的である、タンパク質のエピトープを含む。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症（又はクレスト症候群）、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、Ｂ型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。自己反応性Ｔ細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、ｐ２０５、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、及びミエリンが挙げられる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、かかるＣＡＲは、Ｉｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドと、Ｉｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、このＩｇ重鎖可変ドメイン及び／又はＩｇ軽鎖可変ドメインは、ヒトＩｇ可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、非ヒト定常ドメイン（例えば、ラット又はマウス定常ドメイン）である。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。ＣＡＲのＩｇ可変ドメインは、本明細書に記載の方法を使用して、又は当該技術分野において周知の任意の方法を使用して生成できる。例えば、抗ペプチド／ＭＨＣ抗体は、当該技術分野において周知の方法を使用して（例えば、ファージディスプレイ法又はイーストディスプレイ法を使用して）生成でき、次いで、抗体の可変ドメインをコードする核酸配列をＴＣＲ定常ドメイン遺伝子に結合することができる。ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する抗体の例及びかかる抗体の産生方法は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９９２，１７６号、同第７，７１８，７７７号、及び同第８，８１５，５２８号、並びにＳｔｅｗａｒｔ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：５７８４〜８８（２００９）及びＨｕｌｓｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２９７２〜８０（２００５）に提供されている。
【０１５０】
医薬組成物
特定の実施形態では、本明細書では、薬学的に許容可能な担体と共に配合された、本明細書に記載の少なくとも１種の作用物質（例えば、本明細書に記載の抗体及び／又は本明細書に記載のＣＡＲ）を含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【０１５１】
本明細書で提供する医薬組成物は、（１）経口投与、例えば、液剤（水性若しくは非水性溶液、又は懸濁液）、錠剤、例えば、バッカル錠、舌下錠、及び全身吸収を標的とするもの、巨丸剤、散剤、顆粒剤、舌に適用するためのペースト剤；又は、（２）非経口投与、例えば滅菌溶液若しくは懸濁液、又は徐放性製剤としての、例えば、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、又は硬膜外注射剤に適するものなど、固体又は液体形態で投与するために特別に配合されてよい。
【０１５２】
非経口投与に好適な、本明細書で提供する医薬組成物は、１種若しくは２種以上の薬学的に許容可能な無菌等張水溶液若しくは非水溶液、分散液、懸濁液、又はエマルション、あるいは、使用直前に滅菌注射用溶液又は分散液に再溶解され得る、滅菌粉末（糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図する受容者の血液と等張にする溶質、又は懸濁化若しくは増粘剤を含んでよい）と組み合わせた、本明細書に記載の１種又は２種以上の作用物質を含む。
【０１５３】
本明細書で提供する医薬組成物で用いてよい、好適な水性又は非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの好適な混合物、オリーブ油など植物油、オレイン酸エチルなど注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、レシチンなどコーティング材の使用によって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
【０１５４】
特定の実施形態では、組成物は、所望の投与量に適したｗ／ｖをもたらす濃度で本明細書に記載の抗体及び／又はＣＡＲを含む。抗体及び／又はＣＡＲは、組成物中に、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも３００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してよい。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、組成物は、処置する特定の症状に必要な１種又は２種以上の活性化合物（通常、互いに悪影響を及ぼさない補完的活性を有するもの）を含む。かかる追加活性化合物は、意図する目的に効果的な量で、ともに好適に存在する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体及び／又はＣＡＲを、凍結乾燥組成物又は所望の最終濃度の水溶液の形態の、緩衝剤、糖類、塩類、界面活性剤、可溶化剤、ポリオール、希釈剤、結合剤、塩類、親油性溶媒、アミノ酸、キレート剤、防腐剤などが挙げられるがこれらに限定されない、任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤と混合することによって調製される（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１２ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌ．Ｂｒｕｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９９９））。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、投与時に、用いる濃度で受容者に対して無害であり、ヒスチジン、リン酸塩、クエン酸塩、グリシン、酢酸塩、及び他の有機酸など緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなど酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウムなど；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残渣未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどタンパク質；ポリビニルピロリドンなど親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギンヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどアミノ酸；単糖類、二糖類、及びトレハロース、グルコース、マンノース、又はデキストリンなど他の炭水化物；ＥＤＴＡなどキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなど糖類；ナトリウムなど塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質タンパク質複合体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ、ポリソルベート８０、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など非イオン性界面活性剤を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩、グリシン、又は酢酸塩である。糖賦形剤は、トレハロース、スクロース、マンニトール、マルトース、又はラフィノースであってよい。界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート８０、又はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８であってよい。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、又はＣａＣｌ２であってよい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、組成物は、緩衝剤又はｐＨ調整剤を含んで、改善したｐＨ調整をもたらしてよい。かかる組成物は、約３．０〜約９．０、約４．０〜約８．０、約５．０〜約８．０、約５．０〜約７．０、約５．０〜約６．５、約５．５〜約８．０、約５．５〜約７．０、又は約５．５〜約６．５のｐＨを有してよい。更なる実施形態では、かかる組成物は、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、又は約９．０のｐＨを有する。特定の実施形態では、組成物は約６．０のｐＨを有する。当業者は、概して、組成物のｐＨは、組成物中で用いる特定の抗体又はＣＡＲの等電位点と等しいべきではないことを理解するであろう。通常、緩衝剤は、有機又は無機の酸又は塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤としては、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸塩、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸など有機酸塩類；トリス、塩酸トロメタミン、又はリン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、アミノ酸成分はまた、緩衝能において作用できる。緩衝剤として組成物中で用いられ得る、代表的なアミノ酸成分としては、グリシン及びヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩、グリシン、及び酢酸塩から選択される。特定の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。別の特定の実施形態では、緩衝剤はクエン酸塩である。更に別の特定の実施形態では、緩衝剤はグリシンである。緩衝剤の純度は、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％であるべきである。本明細書で使用するとき、用語「純度」は、ヒスチジン及びグリシンに関する文脈において、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ  ｅｄ．，Ｏ’Ｎｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，２００１）に記載され、当該業界において理解されているように、ヒスチジン又はグリシンの化学的純度を指す。
【０１５９】
特定の実施形態では、組成物は、緩衝剤としてヒスチジンを含む。特定の実施形態では、ヒスチジンは、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約２０ｍＭ、少なくとも約３０ｍＭ、少なくとも約４０ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約７５ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、又は少なくとも約２００ｍＭのヒスチジンの濃度で組成物中に存在する。別の実施形態では、組成物は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、又は約２０ｍＭ〜約３０ｍＭのヒスチジンを含む。更なる実施形態では、組成物は、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、又は約２００ｍＭのヒスチジンを含む。特定の実施形態では、組成物は、約１０ｍＭ、約２５ｍＭのヒスチジンを含んでよい、又はヒスチジンを含まなくてよい。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、組成物は炭水化物賦形剤を含む。炭水化物賦形剤は、例えば、増粘剤、安定剤、充填剤、可溶化剤などとして作用できる。炭水化物賦形剤は、概ね約１％〜約９９％の重量％又は体積％で、例えば、約０．１％〜約２０％、約０．１％〜約１５％、約０．１％〜約５％、約１％〜約２０％、約５％〜約１５％、約８％〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約２０％、０．１％〜２０％、５％〜１５％、８％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、約０．１％〜約５％、約５％〜約１０％、又は約１５％〜約２０％で存在する。更に他の特定の実施形態では、炭水化物賦形剤は、１％、又は１．５％、又は２％、又は２．５％、又は３％、又は４％、又は５％、又は１０％、又は１５％、又は２０％で存在する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、組成物は炭水化物賦形剤を含む。組成物で用いるのに好適な炭水化物賦形剤としては、果糖、マルトース、ガラクトース、ブドウ糖、Ｄ−マンノース、ソルボースなど単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど二糖類；ラフィノース、メレジトースマルトデキストリン、デキストラン、澱粉など多糖類；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）などアルジトールが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書で提供する組成物で用いる炭水化物賦形剤は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マンニトール、及びラフィノースから選択される。特定の実施形態では、炭水化物賦形剤はトレハロースである。別の特定の実施形態では、炭水化物賦形剤はマンニトールである。更に別の特定の実施形態では、炭水化物賦形剤はスクロースである。更に別の特定の実施形態では、炭水化物賦形剤はラフィノースである。炭水化物賦形剤の純度は、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％であるべきである。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、組成物はトレハロースを含む。特定の実施形態では、組成物は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約４％、少なくとも約８％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％のトレハロースを含む。別の実施形態では、組成物は、約１％〜約４０％、約１％〜約３０％、約１％〜約２０％、約２％〜約４０％、約２％〜約３０％、約２％〜約２０％、約４％〜約４０％、約４％〜約３０％、又は約４％〜約２０％のトレハロースを含む。更なる実施形態では、組成物は、約１％、約２％、約４％、約６％、約８％、約１５％、約２０％、約３０％、又は約４０％のトレハロースを含む。特定の実施形態では、組成物は、約４％、約６％、又は約１５％のトレハロースを含む。
【０１６３】
特定の実施形態では、組成物は賦形剤を含む。特定の実施形態では、組成物は、糖類、塩類、界面活性剤、アミノ酸、ポリオール、キレート剤、乳化剤、及び防腐剤から選択される、少なくとも１種の賦形剤を含む。特定の実施形態では、組成物は、塩類、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、及びＭｇＣｌ２から選択される塩を含む。特定の実施形態では、組成物はＮａＣｌを含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、組成物は、アミノ酸、例えば、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、又はアミノ酸塩を含む。組成物は、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約２５ｍＭ、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、少なくとも約２００ｍＭ、少なくとも約２５０ｍＭ、少なくとも約３００ｍＭ、少なくとも約３５０ｍＭ、又は少なくとも約４００ｍＭのアミノ酸を含んでよい。別の実施形態では、組成物は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、又は約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭのアミノ酸を含んでよい。更なる実施形態では、組成物は、約１ｍＭ、１．６ｍＭ、２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、又は約４００ｍＭのアミノ酸を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、組成物は界面活性剤を含む。本明細書で使用するとき、用語「界面活性剤」は、両親媒性構造を有する、すなわち、相対する溶解傾向の基、典型的に油溶性炭化水素鎖及び水溶性イオン基からなる有機物質を指す。界面活性剤は、界面活性分子の電荷に応じて、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤に分類できる。界面活性剤は、様々な医薬組成物及び生体物質の調製のために、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、及び分散剤として使用されることが多い。ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又は８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ；オクチルグルコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−ザルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、又はセチル−ベタイン；ラウラミドプロピル（lauroamidopropyl）−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウラミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ココイルメチルナトリウム−、又はメチルオレイルジナトリウム−タウレート；並びにＭＯＮＡＱＵＡ（登録商標）シリーズ（Ｍｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレン及びプロピレングリコールのコポリマー（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）ＰＦ６８など）など薬学的に許容可能な界面活性剤を、任意選択的に組成物に添加して、凝集を抑制することができる。特定の実施形態では、組成物は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、又はポリソルベート８０を含む。ポンプ又はプラスチック容器を使用して組成物を投与する場合、界面活性剤は特に有用である。薬学的に許容可能な界面活性剤の存在は、タンパク質の凝集傾向を緩和する。組成物は、約０．００１％〜約１％、又は約０．００１％〜約０．１％、又は約０．０１％〜約０．１％の範囲の濃度であるポリソルベートを含んでよい。他の特定の実施形態では、組成物は、０．００１％、又は０．００２％、又は０．００３％、又は０．００４％、又は０．００５％、又は０．００６％、又は０．００７％、又は０．００８％、又は０．００９％、又は０．０１％、又は０．０１５％、又は０．０２％の濃度であるポリソルペートを含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、組成物は、他の賦形剤及び／又は、希釈剤、結合剤、安定剤、親油性溶媒、防腐剤、補助剤などを含むが、これらに限定されない添加剤を含む。本明細書で提供する組成物では、薬学的に許容可能な賦形剤及び／又は添加剤が使用されてよい。薬学的に許容可能なキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、又はＥＧＴＡが挙げられるが、これらに限定されない）など一般に使用される賦形剤／添加剤を任意選択的に組成物に添加して、凝集を低下させることができる。ポンプ又はプラスチック容器を使用して組成物を投与する場合、これらの添加剤は特に有用である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、組成物は防腐剤を含む。フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀（phenylmercuric  nitrite）、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、６水和物であるが、これに限定されない）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はこれらの混合物など防腐剤は、任意選択的に、約０．００１％〜約５％、又はその範囲内の任意の範囲若しくは値など任意の好適な濃度で組成物に添加できる。組成物で使用する防腐剤の濃度は、微生物効果をもたらすために十分な濃度である。かかる濃度は、選択した防腐剤によって異なり、当業者によって容易に決定される。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、組成物はヒト血液と等張であり、組成物は、本質的にヒト血液と同一の浸透圧を有する。かかる等張性組成物は、概して、約２５０ｍＯＳｍ〜約３５０ｍＯＳｍの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧型又は氷点降下型浸透圧計を使用して測定できる。組成物の張度は、張性調整剤を使用して調整する。「張性調整剤」は、組成物に添加して、組成物に等張性をもたらすことができる、薬学的に許容可能な不活性物質である。本明細書で提供する組成物に好適な張性調整剤としては、糖類、塩類、及びアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
特定の実施形態では、組成物は、エンドトキシン及び／又は関連発熱物質を実質的に含まない、発熱物質を含まない組成物である。エンドトキシンは、微生物中に閉じ込められ、微生物が分解されたか、死んだときのみに放出される毒素を含む。発熱物質はまた、細菌及び他の微生物の外膜由来の発熱性、熱安定性物質を含む。これらの両物質は、ヒトに投与されると、熱、低血圧、及びショックを引き起こすことができる。潜在的な悪影響のため、エンドトキシンは、低量であっても、静脈内に投与される医薬品溶液から除去する必要がある。Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（「ＦＤＡ」）は、静脈内の医薬品適用について、１時間につき体重１キログラムあたり５エンドトキシン単位（ＥＵ）という上限を定めている（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。対象のタンパク質（例えば、抗体）の場合のように、治療タンパク質が体重１キログラムあたり数百又は数千ミリグラムの量で投与されるとき、微量であっても有害かつ危険なエンドトキシンは除去する必要がある。いくつかの実施形態では、組成物中のエンドトキシン及び発熱物質の濃度は、１０ＥＵ／ｍｇ未満、又は５ＥＵ／ｍｇ未満、又は１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．００１ＥＵ／ｍｇである。
【０１７０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与で使用するとき、本明細書に記載の組成物は無菌であるべきである。組成物は、無菌濾過、放射線など様々な滅菌法で滅菌されてよい。特定の実施形態では、組成物は、事前滅菌済みの０．２２マイクロメートルフィルタを使用して、濾過滅菌されてよい。注入用滅菌組成物は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」，２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）に記載されているように、従来の薬務に従って処方され得る。本明細書に開示されているものを含む対象のタンパク質（例えば、抗体又はＣＡＲ）は、通常、凍結乾燥形態で、又は溶液中で保管される。対象のタンパク質（例えば、抗体又はＣＡＲ）を含む無菌組成物は、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈注射用溶液バッグ、又は、皮下注射用針で突き刺し可能なストッパーなどの組成物の回収を可能にするアダプタを有するバイアルに入れられることが想到される。特定の実施形態では、組成物は、プレフィルドシリンジとして提供される。
【０１７１】
特定の実施形態では、組成物は凍結乾燥製剤である。用語「凍結乾燥」又は「フリーズドライ」は、水分の少なくとも５０％が除去されている、凍結乾燥など乾燥処置を受けている物質の状態を含む。
【０１７２】
選択された投与の経路にかかわらず、好適な水和形態で使用されてよい本明細書で提供する薬剤、及び／又は本明細書で提供する医薬組成物は、当業者に周知の従来の方法によって、薬学的に許容可能な投薬形態に配合される。
【０１７３】
治療法
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の抗体又はＣＡＲ（例えば、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する完全ヒト抗体、又はペプチド／ＭＨＣに対する結合特異性を有する完全ヒトＣＡＲ）を被験者に投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体及び／又はＣＡＲは、本明細書に記載の方法を使用して（例えば、本明細書に記載するように、ＣＡＲ遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して）得られる、又は得ることができる抗体及び／又はＣＡＲである。
【０１７４】
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の医薬組成物（例えば、ペプチド／ＭＨＣに対する結合特異性を有する完全ヒト抗体など本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物）を被験者に投与することを含む、被験者の癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、癌性又は前癌性腫瘍の治療に使用できる。本明細書に記載の方法及び組成物によって治療され得る癌としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎、肝、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮からの癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、癌は、具体的に以下の組織型、つまり、腫瘍、悪性；癌；癌、未分化；巨細胞癌及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリン産生腫瘍、悪性；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌及び胆管癌；索状腺癌；腺様癌；腺腫様ポリープ内の腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；充実癌；類癌、悪性；細気管支肺胞上皮腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭状及び濾胞状腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；嚢胞腺癌；膠様腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌（扁平上皮化生を伴う）；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；及び神経芽細胞腫、悪性；セルトリ細胞腫；間質細胞腫、悪性；脂質細胞腫、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑内の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児型横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎生期癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；乏突起神経膠腫（oligodendroglioma）；乏突起神経膠腫（oligodendroblastoma）；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経線維鞘、悪性；果粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特異的非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥胖細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；プラズマ細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥胖細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；並びに有毛状細胞性白血病であり得るが、これらに限定されない。
【０１７５】
特定の実施形態では、被験者に投与される医薬組成物中の抗体及び／又はＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、癌関連抗原のエピトープ（例えば、治療する癌によって発現されるエピトープ）を含む。癌関連抗原の例としては、ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、Ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ−４、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ−ＲＡＦ、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、β−カテニン、ＢＩＮＧ−４、ＣＡ−１２５、ＣＡＬＣＡ、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ−１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤ１、サイクリン−Ａ１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３，上皮性腫瘍抗原（「ＥＴＡ」）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ−１，２，８、ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン−３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ヘプシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ１１ｌＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ｈｓｐ７０−２、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ−ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＫＭＨＮ１（別名ＣＣＤＣ１１０）、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、リンゴ酸酵素、ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ−Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ−ｒａｗ、ＮＡ８８−Ａ、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ−ＲＡＲａｌｐｈａ融合タンパク質、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｕｃｉｎ（「ＰＥＭ」）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、ｓｅｃｅｒｎｉｎ１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＳＹＴ−ＳＳＸ１又は−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、テロメラーゼ、ＴＧＦ−ｂｅｔａＲＩＩ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ−３���トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、チロシナーゼ、チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ−１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
【０１７６】
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の医薬組成物（例えば、ペプチド／ＭＨＣに対する結合特異性を有する完全ヒト抗体など本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物）を被験者に投与することを含む、ウイルス感染、細菌感染、蠕虫感染、又は原虫感染など感染症を患う被験者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１、及びＨＳＶ−２などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスの治療を含むいくつかの実施形態では、この方法は、マラリアなど寄生生物の治療を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、アスペルギルス、Ｂｒｕｇｉａ、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌など細菌性疾患、真菌性疾患、及び他の病原性疾患の治療法を含む。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、Ｂ群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌；又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど；又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
【０１７７】
特定の実施形態では、被験者に投与される医薬組成物中の抗体及び／又はＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、感染性病原体によって発現される抗原のエピトープ（例えば、治療する感染性病原体によって発現されるエピトープ）を含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の医薬組成物（例えば、ペプチド／ＭＨＣに対する結合特異性を有する完全ヒト抗体など本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物）を被験者に投与することを含む、炎症性疾患、皮皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、又は自己免疫疾患を治療する方法を提供する。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症（又はクレスト症候群）、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、Ｂ型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１７９】
特定の実施形態では、被験者に投与される医薬組成物中の抗体及び／又はＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有し、ペプチドは、治療する疾患における自己反応性Ｔ細胞の標的であるタンパク質のエピトープ（例えば、自己免疫疾患における自己反応性Ｔ細胞によって標的化されるエピトープ）を含む。自己反応性Ｔ細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、ｐ２０５、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、及びミエリンが挙げられる。
【０１８０】
本明細書に記載の医薬組成物は、経口的、経鼻的（例えば、スプレーによって）、経直腸的、膣内、非経口的、大槽内、及び局所的（例えば、粉末、軟膏、又は点滴薬によって、バッカル及び舌下を含む）などの任意の投与経路によって送達されてよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、全体的に（例えば、口腔投与、又は非経口投与によって）送達される。
【０１８１】
本明細書に記載の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に害を及ぼすことなく、特定の患者、組成物、及び投与方法に対して望ましい治療反応を達成するのに有効である活性成分の量を得るように様々であってよい。
【０１８２】
選択する投与レベルは、用いる特定の薬剤の活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄率又は代謝率、治療期間、用いる特定の化合物と併用する他の薬品、化合物、及び／又は物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、健康全般、病歴、並びに医療界で周知の要素など様々な要素に応じて異なるであろう。
【０１８３】
当該技術分野において通常の技術を有する医師又は獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を直ちに判断し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで医薬組成物中で用いられる抗体及び／又はＣＡＲの投与量を処方及び／又は投与し、所望の効果を達成するまで投与量を徐々に増やすことができる。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲ受容体は、Ｔ細胞ベースの治療に使用される。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞は、被験者でＴ細胞ベースの免疫応答を誘発するために被験者に投与される。Ｔ細胞ベースの治療で有用な方法は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５１２〜５１９（２００２）及びＢｉｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４：ｄ３８６〜３９３（１９９９）に記載されている。
【０１８５】
いくつかの態様において、本明細書では、被験者内で免疫応答（例えば、Ｔ細胞ベースの免疫応答）を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトＩｇ重鎖可変ドメイン及びヒトＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドと、ヒトＩｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びヒトＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むＣＡＲを発現する細胞（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞などヒトＴ細胞）を被験者に投与することを含み、このＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、被験者は、その必要のある被験者である。いくつかの実施形態では、被験者は、癌を患う被験者である。かかる実施形態では、ＣＡＲによって認識されるペプチド／ＭＨＣ複合体中のペプチドは、癌抗原のペプチドである。
【０１８７】
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を被験者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、任意の癌性又は前癌性腫瘍を治療してよい。本明細書に記載の方法及び組成物によって治療され得る癌としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎、肝、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮からの癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、癌は、具体的に以下の組織型、つまり、腫瘍、悪性；癌；癌、未分化；巨細胞癌及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリン産生腫瘍、悪性；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌及び胆管癌；索状腺癌；腺様癌；腺腫様ポリープ内の腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；充実癌；類癌、悪性；細気管支肺胞上皮腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭状及び濾胞状腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；嚢胞腺癌；膠様腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌（扁平上皮化生を伴う）；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；及び神経芽細胞腫、悪性；セルトリ細胞腫；間質細胞腫、悪性；脂質細胞腫、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑内の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児型横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎生期癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；乏突起神経膠腫（oligodendroglioma）；乏突起神経膠腫（oligodendroblastoma）；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経線維鞘、悪性；果粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特異的非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥胖細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；プラズマ細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥胖細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；並びに有毛状細胞性白血病であり得るが、これらに限定されない。
【０１８８】
特定の実施形態では、被験者に投与されたＴ細胞によって発現されるＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、癌関連抗原のエピトープ（例えば、治療する癌によって発現されるエピトープ）を含む。癌関連抗原の例としては、ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、Ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ−４、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ−ＲＡＦ、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、β−カテニン、ＢＩＮＧ−４、ＣＡ−１２５、ＣＡＬＣＡ、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ−１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤ１、サイクリン−Ａ１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３，上皮性腫瘍抗原（「ＥＴＡ」）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ−１，２，８、ＧＡＧＥ−３，４，５，６，７、ＧＡＳ７、グリピカン−３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ヘプシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ１１ｌＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ｈｓｐ７０−２、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２、腸カルボキシルエステラーゼ、Ｋ−ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＫＭＨＮ１（別名ＣＣＤＣ１１０）、ＬＡＧＥ−１、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、リンゴ酸酵素、ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ−Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ−ｒａｗ、ＮＡ８８−Ａ、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ−９、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ−ＲＡＲａｌｐｈａ融合タンパク質、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｕｃｉｎ（「ＰＥＭ」）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、ｓｅｃｅｒｎｉｎ１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＳＹＴ−ＳＳＸ１又は−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、テロメラーゼ、ＴＧＦ−ｂｅｔａＲＩＩ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ−３、ト���オースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、チロシナーゼ、チロシナーゼ（「ＴＹＲ」）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ−１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、被験者は、病原体に感染している被験者である。かかる実施形態では、ＣＡＲによって認識されるペプチド／ＭＨＣ複合体中のペプチドは、病原性抗原のペプチドである。
【０１９０】
したがって、特定の実施形態において本明細書では、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を被験者に投与することを含む、ウイルス感染、細菌感染、蠕虫感染、又は原虫感染など感染症を患う被験者を患う被験者を治療する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書では、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１、及びＨＳＶ−２などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスの治療法を提供する。いくつかの実施形態では、治療される病原体は、マラリアなど寄生生物である。いくつかの実施形態において、本明細書では、アスペルギルス、Ｂｒｕｇｉａ、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌など細菌性疾患、真菌性疾患、及び他の病原性疾患の治療法を提供する。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、Ｂ群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス、軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌；又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど；又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
【０１９１】
特定の実施形態では、被験者に投与されるＴ細胞によって発現されるＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、感染性病原体によって発現される抗原のエピトープ（例えば、治療する感染性病原体によって発現されるエピトープ）を含む。
【０１９２】
特定の態様において、本明細書では、被験者（例えば、ヒト被験者）内のペプチド／ＭＨＣ複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者からＴ細胞（例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞又はＣＤ８  Ｔ細胞）を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有するＣＡＲのＴ細胞による発現を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者にＴ細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のベクター及び第２のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２のベクターでＴ細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列及び第２のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターでＴ細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、内在性ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβのＴ細胞による発現を抑制する工程を含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、被験者は、自己免疫疾患を患う被験者である。かかる実施形態では、Ｔ細胞は調節性Ｔ細胞（すなわち、抑制性Ｔ細胞）であり、ＣＡＲによって認識されるペプチド／ＭＨＣ複合体中のペプチドは、被験者が自己免疫応答を受ける自己抗原である。
【０１９４】
いくつかの態様において、本明細書では、被験者内で免疫応答を抑制する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトＩｇ重鎖可変ドメイン及びヒトＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドと、ヒトＩｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びヒトＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドと、を含むＣＡＲを発現する調節性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ−２５＋、及びＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞又はＴｒｅｇ１７  Ｔ細胞）を被験者に投与することを含み、このＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩ  ＭＨＣ複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド／ＭＨＣ複合体は、ペプチド／クラスＩＩ  ＭＨＣ複合体である。
【０１９５】
特定の態様において、本明細書では、被験者（例えば、ヒト被験者）内のペプチド／ＭＨＣ複合体に対する免疫応答を抑制する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、調節性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ−２５＋及びＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞又はＴｒｅｇ１７Ｔ細胞）を被験者から単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有するＣＡＲのＴ細胞による発現を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者にＴ細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のベクター及び第２のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２のベクターでＴ細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列及び第２のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターでＴ細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、内在性ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβのＴ細胞による発現を抑制する工程を含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、被験者は、自己免疫疾患を患う被験者である。かかる実施形態では、Ｔ細胞は調節性Ｔ細胞（すなわち、抑制性Ｔ細胞）であり、ＣＡＲによって認識されるペプチド／ＭＨＣ複合体中のペプチドは、被験者が自己免疫応答を受ける自己抗原である。
【０１９７】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、ぜんそく、炎症性疾患、皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、又は自己免疫疾患など有害免疫応答に関連する疾患又は障害を治療してよい。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症（又はクレスト症候群）、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、Ｂ型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１９８】
特定の実施形態では、被験者に投与されるＴ細胞によって発現されるＣＡＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、治療する疾患における自己反応性Ｔ細胞の標的であるタンパク質のエピトープ（例えば、自己免疫疾患における自己反応性Ｔ細胞によって標的化されるエピトープ）を含む。自己反応性Ｔ細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、ｐ２０５、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、及びミエリンが挙げられる。
【０１９９】
核酸分子
本明細書では、本明細書に記載の抗体、ＣＡＲ、並びに抗体及びＣＡＲの一部をコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、この核酸は、本明細書に記載の抗体又はＣＡＲの可変ドメイン（例えば、重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン）をコードする。この核酸は、例えば、全細胞内に、細胞溶解物内に、又は部分的に純粋若しくは実質的に純粋な形態で存在してよい。
【０２００】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の抗体及び／若しくはＣＡＲポリペプチド、又はこれらの一部をコードする核酸を提供する。この核酸は、例えば、全細胞内に、細胞溶解物内に、又は部分的に純粋若しくは実質的に純粋な形態で存在してよい。本明細書に記載の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して得ることができる。例えば、本明細書に記載の核酸分子は、標準的なＰＣＲ技術を使用してクローニングできる、又は化学的に合成できる。ハイブリドーマによって発現されたＣＡＲ又は抗体をコードする核酸の場合、ハイブリドーマによって作製された抗体又はＣＡＲの各鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。
【０２０１】
特定の態様において、本明細書では、Ｉｇ重鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ定常ドメインを含む第１のＣＡＲポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、Ｉｇ軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｉｇ  κ可変ドメイン又はＩｇ  λ可変ドメイン）及びＴＣＲα定常ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、を含む核酸組成物を提供し、このＣＡＲは第１のＣＡＲポリペプチドを含み、第２のＣＡＲポリペプチドは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。特定の実施形態では、このＩｇ重鎖可変ドメイン及び／又はＩｇ軽鎖可変ドメインは、ヒトＩｇ可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン（例えば、ラット定常ドメイン又はマウス定常ドメイン）である。いくつかの実施形態では、このＴＣＲβ定常ドメイン及び／又はＴＣＲα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、単一の核酸分子上にある。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、別個の核酸分子上にある。
【０２０２】
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の抗体の重鎖をコードする第１の核酸配列と、本明細書に記載の抗体の軽鎖（例えば、Ｉｇ  κ軽鎖又はＩｇ  λ軽鎖）をコードする第２の核酸配列と、を含む核酸組成物を提供し、重鎖及び軽鎖を含む抗体は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合特異性を有する。特定の実施形態では、このＩｇ重鎖可変ドメイン及び／又はＩｇ軽鎖可変ドメインは、ヒトＩｇ可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このＩｇ重鎖定常ドメイン及び／又はＩｇ重鎖定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン（例えば、ラット定常ドメイン又はマウス定常ドメイン）である。いくつかの実施形態では、このＩｇ重鎖定常ドメイン及び／又はＩｇ軽鎖定常ドメインは、ヒトＩｇ定常ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、単一の核酸分子上にある。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、別個の核酸分子上にある。
【０２０３】
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、結合されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターの１種は「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る、環状２本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合され得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞（例えば、細菌起源の複製及びエピソーム哺乳類ベクターを有する細菌ベクター）で自己複製を実行できる。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、したがって、宿主ゲノムとともに複製されることができる。更に、特定のベクターは、遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ぶ。
【０２０４】
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の核酸（例えば、本明細書に記載の抗体若しくはＣＡＲ、又はこれらの一部をコードする核酸）を含む細胞を提供する。この細胞は、例えば、原核、真核、哺乳類、鳥、ネズミ、及び／又はヒトであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、プロモーターなど転写調節要素に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、この細胞は、本明細書に記載の核酸を転写し、したがって、抗体、その抗原結合フラグメント、又は本明細書に記載のポリペプチドを発現する。核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、又は染色体外（extrachromasomal）であり得る。
【０２０５】
本明細書で提供する核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を使用して得ることができる。例えば、本明細書に記載の核酸分子は、標準的なＰＣＲ技術を使用してクローニングできる、又は化学的に合成できる。
【０２０６】
ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントを得ると、標準的なＤＮＡ組み換え技術を使用してこれらのＤＮＡフラグメントを更に操作して、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換できる。これらの操作ではＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域又は可動性リンカーなど別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに操作可能に結合される。この文脈で使用するとき、用語「操作可能に結合される」は、２個のＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内にとどまるように、２個のＤＮＡフラグメントが結合されることを意味することを意図する。
【０２０７】
重鎖可変領域をコードする単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に重鎖可変領域ＤＮＡを操作可能に結合することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に連結され得る。
【０２０８】
軽鎖可変領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＤＮＡをコードする軽鎖可変領域を、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に結合することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κ定常領域又はλ定常領域であり得るが、最も好ましくはκ定常領域である。
【実施例】
【０２０９】
実施例１．キメラ抗原受容体を有するＴ細胞の活性化
ペプチド−ＭＨＣ複合体（ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＭＡＧＥ−１ペプチド、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｊｏｎｅｓｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：５７８４〜８８及びＨｕｌｓｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  Ｔｈｅｉｒ  Ｔａｒｇｅｔ  ｂｙ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｄｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２９７２〜８０を参照）を認識する抗体のＶＨ及びＶＬドメインをコードする配列を、合成的に産生した１．９ｋｂヌクレオチド配列に組み込み、免疫グロブリンＶκ及びＶＨドメイン配列を、それぞれＴＣＲＡ  Ｃ配列及びＴＣＲＢ  Ｃ配列の上流に配置した（図３）。Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｊｏｎｅｓらは、ＨＬＡ−Ａ２と複合体化した、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを認識する抗体複合体（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶＮＹ、配列番号１）について記載し、Ｈｕｌｓｍｅｙｅｒらは、ＨＬＡ−Ａ１と複合体化した、ＭＡＧＥ−１ペプチドを認識する抗体（ＥＡＤＰＴＧＨＳＹ、配列番号２）について記載している。
【０２１０】
抗ＮＹ−ＥＳＯ−１／Ａ２並びに抗ＭＡＧＥ−１／Ａ１  ＶＨ及びＶＬを含む合成配列はまた、Ｖκ及びＶＨの両方の上流にＲＯＲリーダー部位（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５３４，６０４号）を含み、２シストロン発現のためにフューリン切断部位及び自己切断Ｆ２Ａペプチドを有する（参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ＴＣＲ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１５：１４１１−１４２３）。合成ＤＮＡは、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎから得た。陰性対照として、生殖細胞系Ｖκ１−３９Ｊκ５［ＵＬＣ１−３９］又はＶκ３−２０Ｊκ１［ＵＬＣ３−２０］及びＶＨ３−２３ＪＨ４［ＵＨＣ］を、それぞれＴＣＲＡ  Ｃ及びＴＣＲＡ  Ｂの上流でレンチウイルスベクターに組み込んだ（いずれも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／０１９５４５４号（ＵＬＣ１−３９及びＵＬＣ３−２０）及び同第２０１４／０２４５４６８号（ＵＨＣ）を参照）。
【０２１１】
各合成１．９ｋｂのＤＮＡ配列（すなわち、ＭＡＧＥ−１ＣＡＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＣＡＲ、ＵＬＣ１−３９ＵＨＣ、及びＵＬＣ３−２０ＵＨＣ  ＣＡＲをコードする配列）は、ｐＬＶＸ  ＥＦ１ａ  ＩＲＥＳ−ＰＵＲＯレンチウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の多数のクローニング部位に連結させた。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより、構成体をδ  ８．９及びＰＭＤＧとパッケージ化し、ウイルス上清を産生し、続いてこれを使用して、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞由来であるが、ＴＣＲαβヘテロダイマーを産生する能力又は細胞膜でＣＤ３を発現する能力に欠けるＪ．ＲＴ３−Ｔ３．５（Ｔ３）細胞を形質導入した。Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ）細胞は、対照として使用した。形質導入後、ＦＡＣＳソーティングによって、Ｔ３細胞を細胞表面ＣＤ３を発現する能力をスクリーニングし、ＣＡＲが形質導入された全てのＴ３細胞がＣＤ３の発現を呈していたが、これは、ＣＡＲ分子が細胞表面で発現したことを示していた。
【０２１２】
ＮＹ−ＥＳＯ−１のＶＬ及びＶＨ又はＶＬ及びＭＡＧＥ−１のＶＬ及びＶＨのいずれかを含むＣＡＲで形質導入されたＴ３細胞のＴ細胞の活性化は、ヒトＩＬ−２の分泌を検出するＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって判定した（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ａ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：１０９〜１２１、及びＭｉｙａｈｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ＥＬＩＳＰＯＴａｓｓａｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８１：４５〜５４）。ヒトＩＬ−２ＥＬＩＳＰＯＴキットは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た（カタログ番号５５１２８２）。
【０２１３】
具体的には、単独のＴ３細胞、又はＭＡＧＥ−１ＣＡＲ（Ａ１ＭＡＧＥＣＡＲ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＣＡＲ（Ａ１ＮＹＥＳＯＣＡＲ）、又はＵＬＣ１−３９ＵＨＣＣＡＲを発現するＴ３細胞のいずれかを、５×１０５細胞／ウェルの濃度でＥＬＩＳＰＯＴプレートのウェルに加えた。単独の標的Ｋ５６２細胞（ＭＨＣを含まない細胞系）又はヒトＨＬＡ−Ａ１（Ｋ５６２＿Ａ１）若しくはヒトＨＬＡ−Ａ２（Ｋ５６２＿Ａ２）を発現する標的Ｋ５６２細胞を、１×１０５細胞／ウェル（５：１のエフェクター対標的細胞比）の濃度で加えた。適切なペプチド（ＭＡＧＥ−１、ＨＬＡ−Ａ１拘束性、又はＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２拘束性）を、１０μｇ／ｍＬの濃度でウェルに加え、プレートを３７℃で１６〜２０時間インキュベートし、製造業者の指示に従って成長させた。
【０２１４】
Ｔ細胞の活性化は、サイトカインの局在部位で形成される、暗藍色の沈殿物によって検出されたサイトカイン分泌性細胞の数に基づいて評価した。図４に示すように、活性化は、ＨＬＡ−Ａ１（Ｋ５６２＿Ａ１）を発現するエフェクター細胞の存在下で、ＭＡＧＥ−１  ＨＬＡ−Ａ１拘束性ペプチド（ＭＡＧＥ−Ａ１）で処理したＡ１ＭＡＧＥＣＡＲを発現する細胞のみで生じ、ＨＬＡ−Ａ２（Ｋ５６２＿Ａ２）又は野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２ＷＴ）を発現するエフェクターでは生じなかった。更に、Ａ１ＭＡＧＥＣＡＲを発現するＴ３細胞は、無関係のペプチドの存在下で、ＨＬＡ−Ａ１を発現するＫ５６２細胞によって活性化されなかった。同様に、ＩＬ−２分泌物によって明らかなように、ＨＬＡ−Ａ２（Ｋ５６２＿Ａ２）を発現するエフェクターの存在下で、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチド（ＥＳＯ−１）で処理したＡ２ＮＹＥＳＯＣＡＲを発現するＴ３細胞のみが活性化した。ＵＬＣ１−３９ＵＨＣ  ＣＡＲ（陰性対照）を発現するＴ３細胞は、いずれのペプチド−ＭＨＣ複合体によっても活性化しなかった。
【０２１５】
実施例２．キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変マウスの生成
実施例２．１．キメラヒトＩｇκ可変−マウスＴＣＲＡ定常遺伝子座の構築
全てのヒトＪκセグメント及び４個の機能的ヒトＶκセグメントを含む、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）Ｉｇκ大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）（「ＶＩ−１」、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｅｃｉｓｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ６  ｍＢ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ１１１：５１４７〜５２及び補足情報を参照）を細菌相同組み換え（ＢＨＲ）によって改変して、５’マウスκアーム及びｎｅｏ−ｔｋ−ｌｏｘｐカセットを、特異的なＩ−ＣｅｕＩ部位及びＡｓｉＳＩ部位を両側に配置したクロラムフェニコール（ＣＭ）耐性カセットで置換した（図５、工程１．）。工程２では、工程１で生成した構成体をＢＨＲによって更に改変して、３’マウスκアーム及びＳｐｅｃカセットを、特異的なＮｏｔＩ部位及びＰＩ−ＳｃｅＩ部位を領外に配置したｌｏｘｐ−ｎｅｏ−ｌｏｘｐカセットで置換した。続いて（工程３）、１６ｋｂ遠位マウスＴｃｒａアーム及びＦｒｔ−Ｈｙｇ−Ｆｒｔカセットを含むＩ−ＣｅｕＩ−ＡｓｉＳＩ核酸フラグメントを工程２の構成体に連結させて、ＣＭカセットを置換した。最後に（工程４）、２４ｋｂの近位マウスＴｃｒａアーム及びＳｐｅｃカセットを含むＮｏｔＩ−ＰＩ−ＳｃｅＩ核酸フラグメントを、工程３の構成体のＮｏｔＩ部位及びＰＩ−ＳｃｅＩ部位に連結させてｌｏｘｐ−ｎｅｏ−ｌｏｘｐカセットを置換し、最終的なＬＴＶＥＣ（ＭＡＩＤ  ６５４８として示す）を作製した。
【０２１６】
最終的なＬＴＶＥＣは、５’から３’の方向に、（１）ＥＳ細胞内の相同組み換え用１６ｋｂ  ５’マウスＴｃｒａアーム（ゲノム位置１４：５２４１１６２９〜５２４２７７９３、全ての座標はマウスアセンブリＧＲＣｍ３８に基づく）、（２）Ｅ．ｃｏｌｉ又はＥＳ細胞内の選択用Ｆｒｔ−Ｈｙｇ−Ｆｒｔカセット、（３）４個の最近位Ｖκセグメント及び全ての５個のＪκセグメント（Ｊ１〜Ｊ５）を含む１１１ｋｂヒトκ遺伝子座ＤＮＡ、（４）ＥＳ細胞内の相同組み換え用２４ｋｂ  ３’マウスＴＣＲＡアーム（ＴＣＲＡ定常遺伝子（ゲノム位置１４：５４２１８９２０〜５４２４３１１７）を含む）、及び（５）Ｅ．ｃｏｌｉ内の選択用Ｓｐｅｃカセットを含んだ。
【０２１７】
ＬＴＶＥＣ（ＭＡＩＤ６５４８）は以下の接合配列を有する（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である（表１））。
【０２１８】
【表１】
2017529841.tif 000003
【０２１９】
ＭＡＩＤ６５４８を使用して、ＭＡＩＤ１５４０ヘテロＥＳ細胞にエレクトロポレーションし（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１１３，６１６号の図４Ａを参照）、マウスＴＣＲＡ  Ｖ及びＪセグメントの全てを削除し、Ｎｅｏカセットで置換した（図６）。得られた遺伝子座の接合配列は、上記の表１と同一である。Ｈｙｇ耐性ＥＳ細胞は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを使用してスクリーニングして、正しく標的化されたクローンを同定した（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：４３〜４８を参照）（表２；ＬＯＡ＝対立遺伝子の喪失；ＧＯＡ＝対立遺伝子の獲得、認識された領域は図６に示す）。
【０２２０】
【表２】
2017529841.tif 000004
【０２２１】
所望に応じて、初期挿入と重なるヒトＩｇκ配列に連結された、上記の同一の１６ｋｂ  ５’マウスＴｃｒａ相同性アームを有するＬＴＶＥＣを使用して、更なるヒトＶκセグメントをＴＣＲ可変領域遺伝子座に追加できる。
【０２２２】
異なる戦略を使用して、かかるＥＳ細胞を生成できる。図７に要約した１つのアプローチは、二重標的化、つまり２つの異なる大型標的化ベクターのＥＳ細胞への共エレクトロポレーションを含む。このアプローチでは、第１の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  １７１０と表記、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００９６５１２Ａ１号に記載されるように構築されたベクターの制限消化物由来）は、ヒトＶκ１−５及びＶκ１−６遺伝子セグメントの配列を含む３’３０ｋｂ相同性アームと、ヒトＶκ３−７〜Ｖκ３−１５遺伝子セグメントを含む１２０ｋｂ配列と、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含む５’２０ｋｂ領域（「重複領域」）と、を含む。第２の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  ６６００と表記、これもまた、米国特許出願公開第２０１２／００９６５１２Ａ１号に記載のように構築されたベクターに由来）は、３’  ２０ｋｂ重複領域（第１のベクターと同様に、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含む領域）と、ヒトＶκ１−１７〜Ｖκ２−３０遺伝子セグメントを含む１４０ｋｂ配列と、ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｎｅｏ−ＦＲＴ選択カセットと、１５．５ｋｂ  ３’マウスＴＣＲ  Ａ相同性アームと、を含む。図６で生成されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ  ６５４８、全てのヒトＪκセグメント及び４個の機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントのヘテロ接合）を、ヌクレオチド配列ＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡｔｃｔｔａｇＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧ（小文字は切断部位；配列番号：２４）におけるハイグロマイシン遺伝子を標的化する、改変亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸と共に、上記の２個の大型標的化ベクターでエレクトロポレーションし、Ｈｙｇ配列における二重鎖切断を促進した。２個の共エレクトロポレーションした大型標的化ベクターは、相動性組み換えによってＤＮＡ配列に挿入され、Ｈｙｇ選択カセットを含み、これを囲む領域を置換した。得られたＥＳ細胞は、内在性ＴＣＲα遺伝子座において、ヒトＪκ１〜Ｊκ５及びＶκ４−１〜Ｖκ２−３０遺伝子セグメントを含むヒト免疫グロブリン可変領域を含んだ。２個の大型標的化ベクターの組み込みの成功は、上記のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ（Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、上記）を使用して、図７及び以下の表３に示すプローブ及びプライマーを使用して確認した（ＧＯＡ＝対立遺伝子の獲得；ＬＯＡ＝対立遺伝子の喪失；コピー番号＝配列のコピー番号を確認して、トランスジェニック取り込み対標的化取り込みを追跡；ｈＡｒｍ１＝第１の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  １７１０）の３０ｋｂ  ３’相同性アーム；ｈＡｒｍ２＝第１の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  １７１０）及び第２の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  ６６００）の２０ｋｂ重複部、ｍＡｒｍ＝第２の標的化ベクター（ＭＡＩＤ  ６６００）の１５．５ｋｂ  ５’相同性アーム、ＷＴマウス対照−マウスＴＣＲα遺伝子座に存在する配列）。
【０２２３】
【表３】
2017529841.tif 000005
【０２２４】
得られた、ＥＳ細胞内の標的遺伝子座は以下の接合配列を有する（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である（表４））。
【０２２５】
【表４】
2017529841.tif 000006
【０２２６】
免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを更に含むＴＣＲα遺伝子座を生成するための別の戦略は、可変遺伝子セグメントを更に含む大型標的化ベクターでの連続標的化を含む（例えば、図８を参照）。全てのヒトＪκ遺伝子セグメント及び４個の機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントがヘテロ接合のＥＳ細胞（ＭＡＩＤ  ６５４８；図６を参照）を、５’から３’の方向に、１５．５ｋｂ  ５’マウス相同性アーム、Ｆｒｔ−Ｕｂ−Ｎｅｏ−Ｆｒｔ選択カセット、Ｖκ３−７〜Ｖκ３−１５遺伝子セグメントを含む１２０ｋｂフラグメント、並びにＶκ１−５及びＶκ１−６遺伝子セグメント（ＭＡＩＤ  ６５４８配列にも存在）を含む３０ｋｂ  ３’ヒト相同性アームを含む、大型標的化ベクターでエレクトロポレーションする。組み込みの成功は、上記のＴａｑｍａｎアッセイを使用して、上記の表３に記載のプライマー及びプローブ、並びに図８に示すＨｙｇ、ｈＩｇＫ５、ｈＩｇＫ６、ｈＩｇＫ１２、Ｎｅｏ、親１５４０ｍ３、親１５４０ｍ１を使用して確認する。組み込みの成功を確認するためにプライマー及びプローブの追加セット（ｈＩｇＫ１０）も使用する：フォワードプライマー−ＣＧＡＴＴＡＴＧＡＣＴＧＧＴＴＡＧＧＴＡＧＡＡＡＧＧＴＧ（配列番号：７１）；プローブ−ＧＣＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＡＡＴＣＣＡＴ（配列番号：７２）；リバースプライマー−ＧＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＡＡＧＣ（配列番号：７３）。
【０２２７】
得られた、ＥＳ細胞内の標的遺伝子座は以下の接合配列を有する（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である（表５））。
【０２２８】
【表５】
2017529841.tif 000007
【０２２９】
図８に示す単標的化又は図７に示す二重標的化を完了すると、ＥＳ細胞は、追加Ｖκ遺伝子セグメントを含む大型標的化ベクターで連続して標的化されてよいが、これは、機能的ヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメント、例えば、近位Ｖクラスター内の全ての機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントの完全レパートリーを組み込むためである。図８及び７に示す、二重標的化法又は連続的な単標的化法のいずれかの代わりに、三重標的化法を使用して、最大で機能的ヒト免疫グロブリンＶκ遺伝子セグメント、例えば、近位Ｖクラスター中の全ての機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントの完全レパートリーを含むＥＳ細胞を生成できる。図９に示すこのアプローチでは、第１の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  １７１０、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で調整済み、上記を参照）は、ヒトＶκ１−５及びＶκ１−６遺伝子セグメント配列を含む３’  ３０ｋｂ相同性アームと、ヒトＶκ３−７〜Ｖκ３−１５遺伝子セグメント配列を含む１２０ｋｂ配列と、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含む５’  ２０ｋｂ領域（「重複領域」）と、を含む。第２の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  ６６００、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で調整済み、上記を参照）は、３’  ２０ｋｂ重複領域（第１のベクターと同様に、ヒトＶκ１−１６遺伝子セグメントを含む領域）と、ヒトＶκ１−１７〜Ｖκ２−２４遺伝子セグメントを含む８０ｋｂ配列と、ヒトＶκ３−２５〜Ｖκ２−３０遺伝子セグメントを含む５’  ６０ｋｂ領域（「重複領域」）と、を含む。最後に、第３の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  ６６４７、これもまた、参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００９６５１２Ａ１号に記載のように構築されたベクターに由来）は、ヒトＶκ３−２５〜Ｖκ２−３０を含む５’  ６０ｋｂ重複領域と、Ｖκ３−３１〜Ｖκ２−４０を含む９０ｋｂ配列と、ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｎｅｏ−ＦＲＴ選択カセットと、１５．５ｋｂ  ３’マウスＴＣＲ  Ａ相同性アームと、を含む。図６で生成されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ  ６５４８、全てのヒトＪκセグメント及び４個の機能的ヒトＶκ遺伝子セグメントのヘテロ接合）を、ヌクレオチド配列ＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡｔｃｔｔａｇＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧ（小文字は切断部位；配列番号：７６）におけるハイグロマイシン遺伝子を標的化する、改変亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸と共に、上記の３個の大型標的化ベクターでエレクトロポレーションし、Ｈｙｇ配列における二重鎖切断を促進した。３個の共エレクトロポレーションした大型標的化ベクターは、相動性組み換えによってＤＮＡ配列に挿入し、Ｈｙｇ選択カセットを含み、これを囲む領域を置換した。得られたＥＳ細胞は、内在性ＴＣＲα遺伝子座において、ヒトＪκ１〜Ｊκ５及びＶκ４−１〜Ｖκ２−４０遺伝子セグメント（すなわち、近位Ｖκクラスターの全ての機能的ヒトＶκ遺伝子セグメント）を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインを含む。３個の大型標的化ベクターの組み込みの成功は、上記のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ（Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、上記）を使用して、図９及び以下の表６に示すプローブ及びプライマーを使用して確認した（ＧＯＡ��対立遺伝子の獲得；ＬＯＡ＝対立遺伝子の喪失；コピー番号＝配列のコピー番号を確認して、トランスジェニック取り込み対標的化取り込みを追跡；ｈＡｒｍ１＝第１の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  １７１０）の３０ｋｂ  ３’相同性アーム；ｈＡｒｍ２＝第１の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  １７１０）及び第２の大型標的化ベクター（ＭＡＩＤ  ６６００）の２０ｋｂ重複部、ｍＡｒｍ＝第２の標的化ベクター（ＭＡＩＤ  ６６００）の１５．５ｋｂ  ５’相同性アーム、ｈＡｒｍ３＝第２の標的化ベクター（ＭＡＩＤ  ６６００）及び第３の標的化ベクター（ＭＡＩＤ  ６６４７）の６０ｋｂ重複部、ＷＴマウス対照−マウスＴＣＲα遺伝子座に存在する配列）。
【０２３０】
【表６】
2017529841.tif 000008
【０２３１】
得られた、ＥＳ細胞内の標的遺伝子座は以下の接合配列を有する（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である（表７））。
【０２３２】
【表７】
2017529841.tif 000009
【０２３３】
更に他の別の戦略では、図６に示す、遺伝子座への連続的な追加ヒトＩｇＶκ遺伝子セグメントの三重、二重、又は単標的化は、選択（例えば、ハイグロマイシン）カセットの、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ媒介又はＣＲＩＳＰＲ媒介破壊を含む、三重（３個の大型標的化ベクター）、二重（２個の大型標的化ベクター）、又は単（１個の大型標的化ベクター）標的化スキームを使用して達成されてよい。
【０２３４】
上記の標的化ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１〜９９を参照）。キメラヒトＩｇκ  Ｖ−マウスＴｃｒａ  Ｃ遺伝子を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）は、特異的な遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの改変を使用した遺伝子型判定によって同定した。
【０２３５】
実施例２．２．キメラヒトＩｇＨ可変−マウスＴＣＲＢ定常遺伝子座の構築
キメラヒトＩｇＨ可変−マウスＴＣＲＢ定常遺伝子座は、複数の異なる戦略のうちの１つによって構築する。
【０２３６】
戦略１を図１１に示す。この戦略で使用する大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ  Ａ）を得るために、全てのヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ及びＤＨセグメント、並びに１個の近位ＶＨセグメント（「ＶＩ−２」）を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）免疫グロブリン重鎖ＬＴＶＥＣを、図１０に示すように、複数のＢＨＲ及び制限消化／ライゲーション工程で改変して、全てのヒト免疫グロブリンＪＨ及びＤＨセグメントを含む構成体（ＬＴＶＥＣ  Ｂ［ＭＡＩＤ  ６５５５］）を生成した。ＬＴＶＥＣ  Ｂの５’マウスアームはトリプシノーゲン遺伝子（Ｔｒｙ１５〜Ｔｒｙ２０）を含み、一方、３’アームはマウスＴＣＲＢ  Ｃ２及びＶβ３１遺伝子を含んだ。ＬＴＶＥＣ  Ｂはまた、ＣＡＲ遺伝子座における免疫グロブリン重鎖可変領域組み換えを増強するためのマウスＩｇＭエンハンサー（Ｅμ）を含む。
【０２３７】
次の工程では、ＢＨＲ、制限消化／ライゲーション、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介等温ＢＡＣアセンブリ（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１４／７４７，４６１号（２０１５年６月２３日出願））の複数の工程によってＬＴＶＥＣ  Ｂを更に改変して、５’から３’の方向に、（１）Ｅ．ｃｏｌｉ内の選択用Ｅｍ７−Ｈｙｇカセット；（２）トリプシノーゲン遺伝子（Ｔｒｙ２０、ゲノム位置６：４１５０４９０７〜４１５２５４４２）を含む、ＥＳ細胞内の相同組み換え用２０ｋｂ  ５’マウスアーム；（３）Ｅ．ｃｏｌｉ又はＥＳ細胞内の選択用Ｆｒｔ−Ｎｅｏ−ｌｏｘＰ−Ｆｒｔカセット；（４）３個の最近位のＶＨセグメント並びに全てのＤＨ及びＪＨセグメントを含む１４５ｋｂのヒトＩｇＨ遺伝子座；（５）ＩｇＭエンハンサー（Ｅμ）（ゲノム位置１２：１１３４２７１６７〜１１３４２８４６２）（あるいは、この配列は除外される）を含む、１２９６ｂｐのマウスＩｇＨ遺伝子座；並びに（６）Ｔｒｂｃ２定常遺伝子（ゲノム位置６：４１５４３９５７〜４１５８４５５９）を含むＥＳ細胞内の相同組み換え用４０ｋｂ  ３’マウスアーム（図１０を参照）を含む大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ  Ａ）を生成した。
【０２３８】
ＬＴＶＥＣ  Ａは以下の接合配列を有する（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である（表８））。
【０２３９】
【表８】
2017529841.tif 000010
【０２４０】
戦略１では、クローニング工程に従ってＬＴＶＥＣ  Ａを生成し、単一工程でキメラ遺伝子座をＥＳ細胞に導入した。図１１に示すように、ヒトＩｇＨ  Ｖ、Ｄ、及びＪセグメントは、マウス３’トリプシノーゲン（ＴＲＹ）遺伝子（マウスＴＲＹ遺伝子は正確な縮尺ではない；ＴＣＲ  Ｂ遺伝子座は多数のＴＲＹ遺伝子を含む）の下流、並びに、２個のトリプシノーゲン繰り返し体（ＭＡＩＤ  １５４５、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１１３，６１６号の図８Ａを参照）の間の全てのマウスＴＣＲＢ  Ｖセグメントの削除を含むＴＣＲＢ遺伝子座を有するＥＳ細胞内のマウスＴＣＲＢ  Ｃ２の上流に挿入する。したがって、マウスＴＣＲＢ  Ｄ１−Ｊ１−Ｃ１及びＤ２−Ｊ２は、ヒトＶ、Ｄ、及びＪセグメントで置換し、マウスＶセグメントの大部分を削除する。マウスＩｇＭエンハンサー（Ｅμ）はまた、ＴＣＲＢ  Ｃ２の５’に挿入されるが、例えば、エレクトロポレーションに使用される標的化ベクターにおいて、当該技術分野において周知の方法を使用して削除されてもよい。任意選択的に、マウスＴＣＲ  Ｖβ３１遺伝子も削除されてよい。
【０２４１】
ヒトＩｇＨ  ＶＨセグメントを更に挿入するために、ＭＡＩＤ  １５４５内のＨｙｇ遺伝子を不活性化する（これも図１１を参照）。これは、（１）機能的Ｈｙｇタンパク質をこれ以上生成できないように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＨ）を使用して小さい挿入欠失変異をＨｙｇコーディング配列に導入すること（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１４／７３１，９１４号（２０１５年６月５日出願））；又は（２）相同組み換えによってＬｏｘｐ−Ｎｅｏ−Ｌｏｘｐカセットで置換し、続いて、Ｃｒｅでこのカセットを削除すること、によって、標的化の前後いずれかに実行できる。
【０２４２】
得られたＣＡＲ遺伝子座の接合配列は、上記の表８と同一である。Ｎｅｏ耐性ＥＳ細胞はＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイによってスクリーニングし、標的化されたクローンを同定する。１５４５対立遺伝子は上流Ｈｙｇ−Ｌｏｘｐカセットを含むため、ＬＴＶＥＣ  Ａ内のＬｏｘｐ部位によって、１５４５ヘテロＥＳ細胞内で標的化されたＴＣＲＢ対立遺伝子を判定できる。したがって、２つのＬｏｘｐ部位間の表域のＣｒｅを削除することを使用して、野生型Ｔｃｒｂ対立遺伝子に対立するものとして、１５４５対立遺伝子に対して標的化されたクローンを判定する。
【０２４３】
戦略２では、Ｔｃｒｂ遺伝子座の基本構成（５’Ｔｒｙ遺伝子クラスターと３’Ｔｒｙ遺伝子クラスターとの間のＶセグメント、並びに３’Ｔｒｙ遺伝子クラスターとＴｃｒｂ２定常との間のＤ及びＪセグメント）を保存する。具体的には、１４個のヒトＴＣＲＢ  Ｖセグメント並びに全てのヒトＴＣＲＢ  Ｄ及びＪセグメントを含むＥＳ細胞（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１１３，６１６号の図７を参照）は５’から３’の方向に、（１）マウスＴｒｙ遺伝子（マウスＴｒｙ遺伝子は正確な縮尺ではない；ＴＣＲＢ遺伝子座は多数のＴｒｙ遺伝子を含む）を含む５’相同性アーム、（２）ＨＹＧ選択カセット、（３）全てのヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ及びＪセグメント、（４）マウスＥμ遺伝子配列、並びに（５）マウスＴＣＲ  Ｂ定常領域、マウスＥβ遺伝子、及びマウスＴＣＲ  Ｖβ３１遺伝子セグメントを含む３’相同性アーム、を含む大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ  Ｂ、図１２を参照）を使用して、最初にヒトＴＣＲＢ  Ｄ及びＪセグメントを免疫グロブリン重鎖Ｄ及びＪセグメントを置換することにより改変した（図１３の工程１）。
【０２４４】
この改変及び選択カセットの削除に続いて、ＥＳ細胞は、５’から３’の方向に、（１）マウスＴｒｙ遺伝子（Ｔｒｙ７）を含む５’相同性アーム、（２）ＮＥＯ選択カセット、（３）３個のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント、及び（４）マウスＴｒｙ遺伝子（Ｔｒｙ４）を含む３’相同性アームを含む、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ  Ｄ、図１２を参照）によるエレクトロポレーションによって更に改変した（図１３の工程３を参照）。
【０２４５】
得られたＥＳ細胞は、ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメントＶＨ１−３、ＶＨ１−２、及びＶＨ６−１、全てのヒト免疫グロブリン重鎖Ｄ及びＪ遺伝子セグメント、並びにマウス免疫グロブリンＥμエンハンサー、マウスＴＣＲＢ定常領域、マウスＴＣＲ  Ｂエンハンサー、及び遠位３’マウスＴＣＲ  Ｖβ３１遺伝子セグメントを含む。この戦略の各工程において、特定のＬＴＶＥＣの導入の成功は、上記のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを使用して確認した。
【０２４６】
最終的なＥＳ細胞内のＴＣＲ  Ｂ遺伝子座は以下の接合配列を有する（マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Ｆｒｔ配列はイタリック体である）。
【０２４７】
【表９】
2017529841.tif 000011
【０２４８】
上記の戦略２の代わりとして、ＬＴＶＥＣ  Ｂを導入するのではなく、マウスＥμを含まないＬＴＶＥＣ  Ｃ（図１２を参照）を導入した。キメラＴＣＲ  Ｂ  ＣＡＲ遺伝子座を生成する更なる戦略は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許仮出願第６２／０５２，９４７号、同第６２／０７６，８３６号、同第６２／０９４，６０３号、同第６２／１６７，６５０号に記載されている。最後に、図１３に示すように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術など様々な戦略を使用して、遠位３’ＴＣＲ  Ｖβ３１を削除できる。
【０２４９】
残っている任意の選択カセットは、Ｃｒｅ又はＦｌｐｏ酵素を使用して削除してよい（例えば、図１３を参照）。戦略１又は戦略２のいずれかについて所望に応じて、初期挿入と重なるヒトＩｇＨ配列に結合された、上記の５’マウスＴｃｒｂ相同性アームを有するＬＴＶＥＣを使用して、更なるヒトＶＨセグメントをＴＣＲ可変領域遺伝子座に追加する。
【０２５０】
上記の標的化されたＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞段階マウス胚に導入した。キメラヒトＩｇＨ  Ｖ−マウスＴｃｒｂ  Ｃ遺伝子を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）は、特異的な遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの改変を使用した遺伝子型判定によって同定した。
【０２５１】
実施例２．３．キメラ抗原受容体マウスの構築
キメラヒトＩｇκ  Ｖ−マウスＴｃｒａ  Ｃ遺伝子及びキメラヒトＩｇＨ  Ｖ−マウスＴｃｒｂ  Ｃ遺伝子を有するマウスを一緒に育てて、両方のキメラ遺伝子座を含むマウスを生成する。かかる遺伝子座の両方を含むマウスは、これらのＴ細胞表面で、Ｔ細胞受容体定常ドメイン及び免疫グロブリン可変ドメイン（マウスＴ細胞受容体定常ドメイン及びヒト免疫グロブリン可変ドメイン）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。各キメラ遺伝子に関して同型接合体であるように子孫を育てる。
【０２５２】
あるいは、キメラヒトＩｇκ−マウスＴｃｒａ  Ｃ遺伝子又はキメラヒトＩｇＨ  Ｖ−マウスＴｃｒｂ  Ｃ遺伝子のいずれかを含むＥＳ細胞を使用して、他のキメラ遺伝子（それぞれキメラヒトＩｇＨ  Ｖ−マウスＴｃｒｂ  Ｃ遺伝子又はキメラヒトＩｇκ−マウスＴｃｒａ  Ｃ遺伝子）を含む標的化ベクターを導入し、上記のようにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によってこれらのＥＳ細胞から両方のキメラ遺伝子を有するマウスを生成した。
【０２５３】
キメラヒトＩｇκ−マウスＴｃｒａ  Ｃ／キメラヒトＩｇＨ  Ｖ−マウスＴｃｒｂ  Ｃ抗原受容体の発現は、細胞表面で検出する。ある検出方法では、（１）標準的な技術を使用してＴＣＲ定常領域発現（抗ＴＣＲα抗体Ｆ１（３Ａ８）＃ＴＣＲ１１４５、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ；抗ＴＣＲβ抗体Ｆ１（８Ａ３）＃ＴＣＲ１１５１、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ；抗ＴＣＲα−βヘテロダイマー抗体クローンＴ１０Ｂ９．１Ａ−３１、ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ；抗ＴＣＲα−βヘテロダイマー抗体クローンＩＰ２６；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を検出するＦＡＣＳ分析を、（２）同一の抗体を使用してキメラタンパク質のサイズを判定するウエスタンブロット法、及び（３）免疫グロブリン可変セグメント配列にアニールするフォワードプライマー混合物及びＴＣＲ定常領域配列にアニールするプライマーを使用して、キメラ転写物の発現を確認するＲＴ−ＰＣＴと組み合わせる。加えて、抗ＣＤ３及び抗ＴＣＲα−β抗体の混合物を使用して、細胞表面でのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の形成を確認できる。上記のように、次世代シークエンシングを使用してキメラ転写物の発現を確認できる。
【０２５４】
実施例３．Ｉｇκ／ＴＣＲαキメラ抗原受容体遺伝子座を含むマウスのＴ細胞におけるヒトＩｇκ可変領域セグメントの使用
胸腺細胞及び脾細胞は、部分ヒトＩｇκ可変領域（図１４及び１５の４個の機能的Ｖκ及び５個の機能的Ｊκ（図６に示すように生成されたマウスを参照）；図１６及び１７の１６個の機能的Ｖκ及び５個の機能的Ｊκ（図７に示すように生成されたマウスを参照））でＴＣＲα可変領域を置換した、ＣＡＲ遺伝子座をゲノム中に含む３匹のマウスから採取した。Ｔ細胞は、抗ＣＤ９０．２電磁ビーズ及びＭＡＣＳＭＡＣＳ（登録商標）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した電磁細胞ソートによって、全脾細胞からプラスに強化した。全ＲＮＡは、製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製膵臓Ｔ細胞及び胸腺細胞から単離した。
【０２５５】
逆転写を実行して、ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＴＣＲα特異的プライマー（５’−ＴＣＡＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧ−３’；配列番号１４３）を使用して、ＴＣＲα定常領域配列を含むｃＤＮＡを生成した。このプロセス中、ＤＮＡ配列（ＰＩＩＡ：５’−ＣＣＣＡＴＧＴＡＣＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴ−３’；配列番号１４４）を、新たに合成したｃＤＮＡの３’末端に結合させた。ｃＤＮＡは、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって精製した。
【０２５６】
次いで、精製ｃＤＮＡは、ＰＩＩＡ特異的プライマー（５’−ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’；配列番号１４５）及びＴＣＲα特異的プライマー（５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧ−３’；配列番号１４６）を使用して、ＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で分離し、長さ４００〜７００ｂｐのフラグメントを単離し、ゲル注出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。これらのフラグメントは、次のプライマー、つまり５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＸＸＸＸＸＸＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ−３’及び５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＸＸＸＸＸＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’（それぞれ配列番号１４７及び配列番号１４８；「ＸＸＸＸＸＸ」は、シークエンシングの多重化サンプルを可能にする、６ｂｐ指標配列を示す）を使用したＰＣＲによって更に増幅させた。シークエンシングのために、Ｍｉｓｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に積載する前に４００ｂｐ〜６００ｂｐのＰＣＲ産物を単離し、精製し、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したｑＰＣＲによって計量した。
【０２５７】
バイオインフォマティクス分析用に、サンプル指標の完全一致に基づいて得られたイルミナ配列をソートし、質を調整した。次いで、重複するメイトペアを集め、ｉｇｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）のローカルインストールを使用して、再構成されたＩｇκ配列のヒト生殖細胞系Ｖ及びＪセグメントデータベースへのアライメント及び再構成されたＴＣＲα配列のマウス生殖細胞系Ｖ及びＪセグメントデータベースへのアライメントに基づいて注釈を付けた。同一のスコアで複数のベストヒットが検出されると、配列は「曖昧」とマーク付けされ、分析から外される。結果を分析し、ｍｙｓｑｌデータベースに保存するために、一連のｐｅｒｌスクリプトを開発した。
【０２５８】
４個の機能的Ｖκ及び５個の機能的Ｊκを含むマウスでは、図１４に示すように、配列分析によって、ＣＡＲ遺伝子座中のＩｇκ可変ドメインは、ＣＡＲトランスジェネリックマウスのＴ細胞及び胸腺細胞内でＶＪ組み換えを受け、測定値の〜８０％は、脾臓及び胸腺の両方において、異なるＪκ遺伝子セグメントで再構成された、最近位Ｖκ遺伝子セグメント（ＩＧＶＫ４−１）を含むことが明らかになった。図１５に示すように、膵臓Ｔ細胞から増幅させた、再構成されたヒトＩｇκ  ＶＪ配列の大部分は、増殖性であった。
【０２５９】
１６個の機能的Ｖκ及び５個の機能的Ｊκを含むマウスでは、図１６に示すように、配列分析によって、ＣＡＲ遺伝子座中のＩｇ  κ可変ドメインは、ＣＡＲトランスジェネリックマウスの膵臓Ｔ細胞及び胸腺細胞内でＶＪ組み換えを受けたことが明らかになった。これらの再構成は、全ての機能的ヒトＶκ及びＪκセグメントを含み、測定値の〜４０％は、最近位Ｖκ遺伝子セグメント（ＩＧＶＫ４−１）を含んだ。図１７に示すように、膵臓Ｔ細胞及び胸腺から増幅させた、再構成されたヒトＩｇ  κ  ＶＪ配列の〜２／３は、増殖性であった。
【０２６０】
実施例４．ＩｇＨ／ＴＣＲβキメラ抗原受容体遺伝子座を含むマウスのＴ細胞におけるヒトＩｇＨ可変領域セグメントの使用
部分ヒトＩｇＨ可変領域（３個の機能的ヒトＶＨ及び全ての機能的ヒトＤ及びＪＨ遺伝子セグメント、図１３を参照）でＴＣＲβ可変領域を置換した、ＣＡＲ遺伝子座をゲノム中に含む４匹のマウスからの胸腺細胞、及び同一のＣＡＲ（ＩｇＨ＋ＴＣＲＣβ）遺伝子座をゲノム中に含む３匹のマウスからの脾細胞を採取した。Ｔ細胞は、抗ＣＤ９０．２電磁ビーズ及びＭＡＣＳＭＡＣＳ（登録商標）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した電磁細胞ソートによって、全脾細胞からプラスに強化した。全ＲＮＡは、製造業者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製膵臓Ｔ細胞及び胸腺細胞から単離した。
【０２６１】
逆転写を実行して、ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＴＣＲβ特異的プライマー（５’−ＣＧＡＧＧＧＴＡＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣ−３’；配列番号１４９）を使用して、ＴＣＲβ定常領域配列を含むｃＤＮＡを生成した。このプロセス中、ＤＮＡ配列（５’−ＣＣＣＡＴＧＴＡＣＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴ−３’；配列番号１５０）を、新たに合成したｃＤＮＡの３’末端に結合させた。ｃＤＮＡは、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって精製した。
【０２６２】
次いで、精製ｃＤＮＡは、プライマー５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＣ−３’及び５’−ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号：それぞれ１５１及び１５２）を使用して、ＰＣＲによって増幅させた。これらのフラグメントは、次のプライマー、つまり５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＸＸＸＸＸＸＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’及び５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＸＸＸＸＸＸＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−３’（「ＸＸＸＸＸＸ」は、６桁のヌクレオチドバーコード；（配列番号：それぞれ１５３及び１５４））を使用したＰＣＲによって更に増幅させた。シークエンシングのために、Ｍｉｓｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に積載する前に４９０〜７１０塩基対を単離し、精製し、ＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したｑＰＣＲによって計量した。
【０２６３】
バイオインフォマティクス分析用に、得られたイルミナ配列を多重化し、質を調整した。次いで、重複する一対の端部測定値を集め、ｉｇｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）のローカルインストールを使用して、再構成されたＩｇＨ配列のヒト生殖細胞系Ｖ、Ｄ、及びＪセグメントデータベースへのアライメントに基づいて注釈を付けた。同一のスコアで複数のベストヒットが検出されると、配列は「曖昧」とマーク付けされ、分析から外される。結果を分析し、ｍｙｓｑｌデータベースに保存するために、一連のＰＥＲＬスクリプトを開発した。
【０２６４】
３個の機能的ヒトＶＨ並びに全ての機能的ヒトＤ及びＪＨを含むマウスでは、図１８に示すように、配列分析によって、ＣＡＲ遺伝子座中のＩｇＨ可変領域は、ＣＡＲトランスジェネリックマウスの膵臓及び胸腺においてＶＤＪ組み換えを受けたことが明らかになった。ＶＨ及びＪＨセグメントの分析を示す。図１９に示すように、膵臓又は胸腺から増幅させた、再構成されたヒトＩｇＨ  ＶＤＪ配列の大部分は、増殖性であった。
【０２６５】
実施例５：キメラ抗原受容体遺伝子座を含むマウスからの抗原結合タンパク質の生成
実施例２で上述したように遺伝子操作されたキメラ抗原受容体遺伝子座ヒトＩｇκ−マウスＴｃｒａ  Ｃ及びヒトＩｇＨ  Ｖ−マウスＴｃｒｂ  Ｃを含むマウスを繁殖させた後、対象の抗原（例えば、ウイルスペプチド−ＭＨＣ抗原；腫瘍ペプチド−ＭＨＣ抗原；自己免疫ペプチド−ＭＨＣ抗原などＭＨＣで提示される抗原）で選択したマウスを免疫した。抗原投与後に、免疫原の標識化四量体化バージョンでソートすることによって、動物から抗原特異的なＴ細胞を回収した。ソートしたＣＡＲ  Ｔ細胞のＩｇκ及びＩｇＨ可変領域の配列を決定し、ヒトＴＣＲα及びＴＣＲβ定常領域のそれぞれの上流の操作可能な結合でこれらの可変領域配列をクローニングする。レポーターＴ細胞系にキメラ核酸配列を導入する。免疫化に使用するペプチド−ＭＨＣ複合体を発現する標的Ｔ細胞でレポーターＴ細胞系をスクリーニングし、対象の抗原に所望の特性、例えば、親和性、選択性、エピトープなどを有するＣＡＲを選択する。選択したＣＡＲのＩｇκ及びＩｇＨ可変領域の配列を決定し、標的化されたペプチド−ＭＨＣ複合体に対して特異的なヒト抗体を生成するために、ヒトＩｇκ及びＩｇＨ定常領域のそれぞれの上流の操作可能な結合でこれらの可変領域配列をクローニングする。これらの抗体を使用して、破壊するために、対象のペプチド−ＭＨＣを発現する感染細胞又は腫瘍細胞を標的化できる。あるいは、ペプチド−ＭＨＣ標的が誘導性自己免疫に含まれている場合、これらの抗体を使用して、自己免疫Ｔ−細胞の活性化を阻害して、病気の症状を緩和することができる。加えて、本明細書に記載のＣＡＲマウスの免疫化から得たキメラヒトＣＡＲクローンは、例えば、養子Ｔ細胞（adaptive  T  cell）移植用にヒト患者から得たＴ細胞の導入に使用できる。
【０２６６】
参照による組み込み
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が存在する場合、本明細書に記載の定義を含む本願が支配する。
【０２６７】
等価物
当業者は、単に日常的な実験を使用して、本明細書に記載の発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、確認することが可能であろう。かかる等価物は、以下の「特許請求の範囲」によって包含されることが意図される。
【図１】
2017529841.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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