(57)【要約】  本発明は、ＦＭＤＶワクチンまたは組成物を包含する。ワクチンまたは組成物は、ＦＭＤＶ抗原を含有するワクチンまたは組成物であってよい。本発明は、ＦＭＤＶに対して動物、具体的にはヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）を防御するために使用され得るＦＭＤＶ抗原、エピトープまたは免疫原をコードおよび発現する組換えベクターも包含する。
2017530124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）抗原またはＦＭＤＶ抗原を発現する組換えウイルスベクターを含む組成物またはワクチン。
【請求項２】
ＦＭＤＶ抗原がＦＭＤＶ  ＶＬＰまたは空カプシドを形成する、請求項１に記載の組成物またはワクチン。
【請求項３】
ＦＭＤＶ抗原が昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターによって発現される、請求項１または２に記載の組成物またはワクチン。
【請求項４】
ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項１に記載の組成物またはワクチン。
【請求項５】
ＦＭＤＶ抗原が野生型Ｐ１ポリペプチドである、請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
【請求項６】
ＦＭＤＶ抗原が修飾Ｐ１ポリペプチドである、請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
【請求項７】
ＦＭＤＶ抗原が、配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列を有するポリペプチドを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
【請求項８】
ＦＭＤＶ抗原が、配列番号３、７、９、１１、１４、１５、１７または２０に記載の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされている、請求項１から７のいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
【請求項９】
ＦＭＤＶ抗原が、ＶＬＰまたは空カプシドの熱および酸安定性の増強を提供する天然に存在しないジスルフィド架橋を形成する、請求項１から８のいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
【請求項１０】
修飾Ｐ１ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０または１６のアミノ酸１７９に対応する位置にシステイン置換を含む、請求項１または４に記載の組成物またはワクチン。
【請求項１１】
薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルをさらに含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
【請求項１２】
配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列を有するＦＭＤＶ抗原をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが配列番号３、７、９、１１、１４、１５、１７または２０に記載の配列を有する、請求項１２に記載のプラスミド。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１２または１３に記載のプラスミド。
【請求項１５】
ＦＭＤＶ空カプシドまたはＦＭＤＶ  ＶＬＰを発現する安定に形質転換された昆虫細胞。
【請求項１６】
１つまたは複数のＦＭＤＶ抗原をコードし、発現する１つまたは複数の異種性ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクター。
【請求項１７】
アデノウイルスである、請求項１６に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１８】
ＦＭＤＶ抗原が、配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列を有するポリペプチドを含む、請求項１６または１７に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１９】
ＦＭＤＶ抗原が、配列番号３、７、９、１１、１４、１５、１７または２０に記載の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされている、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項２０】
昆虫細胞において発現された実質的に精製されたＦＭＤＶ空カプシドまたはＦＭＤＶ  ＶＬＰであって、配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列を有するポリペプチドを含むＦＭＤＶ空カプシドまたはＦＭＤＶ  ＶＬＰ。
【請求項２１】
ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０または１６のアミノ酸１７９に対応する位置にシステイン置換を含む修飾ＦＭＤＶ  Ｐ１である、請求項２０に記載のＦＭＤＶ空カプシドまたはＶＬＰ。
【請求項２２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１６から１９に記載のウイルスベクター、または請求項２０から２１のいずれか１項に記載のＦＭＤＶ空カプシドもしくはＶＬＰの少なくとも１回の投与を含む、ＦＭＤＶ感染に感受性である動物にワクチン接種するまたは動物においてＦＭＤＶに対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項２３】
初回−追加免疫投与レジメンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
初回−追加免疫レジメンが、ＦＭＤＶから動物を防御するためおよび／または感染動物において疾患進行を予防するために、請求項１に記載の組成物の初回投与、およびＦＭＤＶ抗原をｉｎ  ｖｉｖｏで発現するためのポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを含む組成物の追加免疫投与を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
初回−追加免疫レジメンが、ＦＭＤＶから動物を防御するためおよび／または感染動物において疾患進行を予防するために、ＦＭＤＶ抗原をｉｎ  ｖｉｖｏで発現するためのポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを含む組成物の初回投与、および請求項１に記載の組成物の追加免疫投与を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
同じまたは異なるＦＭＤＶ組成物またはワクチンの１回または複数回の投与を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＭＤＶ組成物またはワクチンが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現されたＦＭＤＶ  ＶＬＰまたは空カプシドおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＦＭＤＶ抗原を発現するウイルスベクターを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
母体由来抗体陽性（ＭＤＡ陽性）動物をＦＭＤＶ感染に対して防御する、請求項２２から２７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／０５４，０７３号に対する優先権を主張する。
本発明は、動物において口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）感染と闘うための組成物に関する。本発明は、ＦＭＤＶ抗原を含む医薬組成物、ＦＭＤＶに対するワクチン接種の方法ならびにそのような方法および組成物による使用のためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫（ＦＭＤ）は、家畜を冒す最も病原性および伝染性が高い疾患の１つである。この疾患は、世界の多数の国、特にアフリカ、アジアおよび南アメリカにおける風土病である。加えて、集団発生（ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｏｕｔｂｒｅａｋ）が周期的に発生する場合がある。国におけるこの疾患の存在は、生産性の喪失、感染した群れでの体重および乳汁産生の喪失ならびにこれらの国々に課される輸出禁止から生じる非常に重い経済的帰結になる場合がある。この疾患に対して取られる方策は、国もしくは地域レベルで予防手段として、または集団発生が生じた場合は定期的に、のいずれかで輸入制限の厳格な適用、衛生管理および隔離、病動物の屠殺ならびに不活化ワクチンを使用するワクチン接種プログラムからなる。
ＦＭＤはその短い潜伏期間、その高い伝染性の性質、口および足での潰瘍の形成ならびに時に若年の動物の死によって特徴付けられる。ＦＭＤは、多数の動物種、具体的にはウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ブタ（ｐｉｇ）、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）およびヤギ（ｇｏａｔ）を冒す。この疾患の原因となる病原体は、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のアフトウイルス（Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）属に属するリボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスである（Cooper et al., Intervirology, 1978, 10, 165-180）。現在、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の少なくとも７種の型が公知である：ヨーロッパ型（Ａ、ＯおよびＣ）、アフリカ型（ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３）ならびにアジア型（アジア１）。多数の亜型もまた識別されている（Kleid et al. Science (1981), 214, 1125-1129）。
【０００３】
ＦＭＤＶは、プラスの極性を有する、約８５００ヌクレオチドからなる１本鎖ＲＮＡ分子を含有する、直径約２５ｎｍの裸の正二十面体ウイルスである。このＲＮＡ分子は、とりわけタンパク質Ｐ１またはＰ８８としても公知のカプシド前駆体を含有する単一のポリタンパク質をコードする単一の翻訳領域（ＯＲＦ）を含む。タンパク質Ｐ１は、そのアミノ末端でミリスチル化されている。成熟化工程の際にタンパク質Ｐ１は、プロテアーゼ３ＣによってＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３（またはそれぞれ１ＡＢ、１Ｄおよび１Ｃ；Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261）として公知の３個のタンパク質に切断される。ビリオンにおいて次にタンパク質ＶＰ０は２個のタンパク質ＶＰ４およびＶＰ２（またはそれぞれ１Ａおよび１Ｂ）に切断される。タンパク質ＶＰ０のＶＰ４およびＶＰ２への転換についてならびに、成熟ビリオンの形成についての機序は知られていない。タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は約２６，０００Ｄａの分子量を有する一方で、タンパク質ＶＰ４は約８，０００Ｄａと、より小さい。
【０００４】
カプシドタンパク質の単純な組合せは、プロモーターまたは、ＦＭＤＶカプシドの基本構成物である５Ｓ分子を形成する。次いでこのプロモーターは、１２Ｓ分子を形成するように五量体に複合体化される。ビリオンは、１２個の１２Ｓ五量体の集合によるゲノムＲＮＡ分子のキャプシド形成から生じ、次いで１４６Ｓ粒子を構成する。ウイルスカプシドは、その内部にＲＮＡ分子の存在がなくても形成され得る（本明細書以下で「空カプシド」）。空カプシドは、粒子７０Ｓとも称される。空カプシドの形成は、ウイルス複製の際に天然に生じる場合があり、または化学的処置によって人工的に産生され得る。
【０００５】
いくつかの研究が天然空カプシドについて行われた。具体的には、Ｒｏｗｌａｎｄｓら（Rowlands et al., J. Gen. Virol., 1975, 26, 227-238）は、Ａ１０口蹄疫のビリオンが主に４種のタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含むことを示した。比較により、天然空カプシド（組換えによって得られたのではなくＡ１０口蹄疫ウイルスの培養物から精製された）は、未切断タンパク質ＶＰ０を本質的に含有しており；Ａ−Ｐａｎｄｏ口蹄疫ウイルスでの同一の結果はＲｗｅｙｅｍａｍｕによって記載されている（Rweyemamu et al., Archives of Virology, 1979, 59, 69-79）。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡの存在下での透析後および遠心分離後に得られた人工空カプシドは、タンパク質ＶＰ４を含有していない。これらの人工カプシドはＲｏｗｌａｎｄｓらによるとわずかに免疫原性であり、天然空カプシドはそれらを安定化させるためのホルムアルデヒドでの処置後にだけ免疫原性であり、一方モルモットにおいて天然空カプシドによって誘導された抗体応答は、筆者らによって記されたとおりやはり変化しやすい。さらにＲｏｗｌａｎｄｓらおよびＲｗｅｙｅｍａｍｕらは、天然空カプシドを安定化するための必要性について一致していない。Ｒｗｅｙｅｍａｍｕらに関して、ホルムアルデヒドでの処置の非存在は、天然空カプシドの抗原性のレベルに不利にならない。免疫原性は、モルモットにおける中和抗体の誘導によってだけ検査される。
【０００６】
昆虫細胞中の組換えバキュロウイルスの手段によるカプシドタンパク質の前駆体Ｐ１をコードする遺伝子の発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプロテアーゼ３Ｃと関連するＰ１をコードする遺伝子の発現と比較される（Grubman et al., Vaccine, 1993, 11, 825-829、Lewis et al., J. Virol., 1991, 65, 6572-6580）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＰ１および３Ｃの共発現は、空カプシド７０Ｓの集合を生じる。これら２種の構築物の発現産生物は、モルモットおよびブタ（ｐｉｇ）において中和抗体を産生する。Ｐ１／バキュロウイルス構築物で得られる力価は低い。これらの同じ発現産生物は、ブタ（ｐｉｇ）において部分的な防御を誘導する。しかし疾患に対して防御されているいくつかのブタ（ｐｉｇ）は、チャレンジウイルスの複製に対して防御されない。しかし大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系は、タンパク質をミリスチル化せず、プロテアーゼ３Ｃはこの細胞に有毒である。Ｌｅｗｉｓらは、ウイルスを作り出すことおよび動物において最大の防御を得るために必要なカプシドの構造に関する基本的な疑問は解決されてないと結論した。さらにＧｒｕｂｍａｎらは、ワクチンを製剤する前に空カプシドを安定化することが必要であろうと述べており、この点について彼らは、ウイルス培養物から抽出によって得られる空カプシドに関連する問題について一致している（上記を参照されたい）。
【０００７】
いくつかまたはすべてのタンパク質Ｐ１を含有する融合タンパク質は、ウイルスベクター、すなわちヘルペスウイルスまたはワクチニアウイルスの使用によっても得られる。ＣＡ−Ａ−２，０４７，５８５は、ウシヘルペスウイルスの糖タンパク質ｇｐＩＩＩに融合された、口蹄疫ウイルスのペプチド配列を含有している融合タンパク質（Ｐ１のアミノ酸１４１から１５８がＰ１のアミノ酸２００から２１３に結合されている）を産生するために使用されたウシヘルペスウイルスを具体的に記載している。ウイルスベクターは、安定化ＦＭＤＶ空カプシドを発現するためにも使用されている（ＵＳ７，５３１，１８２）。近年、植物はＦＭＤＶ抗原の産生のための供給源として調査されている（ＵＳ２０１１／０２３６４１６）。
【０００８】
多数の仮説、研究方法および提案が、ＦＭＤに対する有効なワクチンを設計する試みにおいて開発されてきた。現在、市販されている唯一のワクチンは、不活性化ウイルスを含有している。ヨーロッパにおけるＦＭＤの大流行がワクチン製造における欠陥に関連していることから既存のＦＭＤＶワクチンに安全性の懸念が存在する（King, A.M.Q. et al., 1981, Nature 293: 479-480）。不活化ワクチンは、長期免疫を付与せず、そのため毎年、または集団発生事象ではさらに頻繁な追加免疫注射を必要とする。加えて、不完全な不活性化および／または不活化ワクチンの産生の際のウイルスの漏れに関連する危険性がある（King、A.M.Q.、前記箇所）。当技術分野における目標は、有効で安全なワクチンを作製するために、感染性ＦＭＤＶゲノムを欠失しているコンホメーション的に正確な免疫原を構築することである。
母体由来抗体（ＭＤＡ）がＦＭＤに対するワクチン接種への仔ウシ（２歳未満のウシ（ｃａｔｔｌｅ））の応答を阻害できることが報告されている（Graves, 1963, Journal of Immunology 91:251-256、Brun et al., 1977, Developments in Biological Standardisation, 25:117-122）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
動物（まれであるがヒトを含む）のＦＭＤＶへの感染感受性を考慮すると、ＦＭＤＶ感染を予防し、動物を防御するための方法は必要不可欠である。したがって、ＦＭＤＶに対するさらに有効で安定なワクチンに対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
抗原性ＦＭＤＶポリペプチドならびにその断片および変種を含む組成物またはワクチン、ならびにＦＭＤＶポリペプチドならびにその断片および変種を発現する組換えウイルスベクターを含む組成物またはワクチンが提供される。ＦＭＤＶ抗原ならびにその断片および変種は、免疫原性および防御的特性を保有する。ＦＭＤＶ抗原は、昆虫細胞においてバキュロウイルス発現ベクターによって産生され得る。ＦＭＤＶ抗原は、ＦＭＤＶ空カプシドまたはＦＭＤＶ  ＶＬＰ（ウイルス様粒子）の安定性を増強するために修飾されてよい。組換えウイルスベクターは、ＦＭＤＶ抗原を発現しているアデノウイルスベクターであってよい。
抗原性ポリペプチドならびにその断片および変種または組換えウイルスベクターは、ワクチンおよび／または医薬組成物に製剤化されてよい。そのようなワクチンまたは組成物は、動物にワクチン接種されるために使用されてよく、同種および異種ＦＭＤＶ株に対する防御を提供する。
【００１１】
ＦＭＤＶ感染に対する通常飼育の動物および母体由来抗体陽性（ＭＤＡ陽性）動物における防御の増強のための方法が提供される。少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその断片もしくは変種および使用のための説明書を含むキットも提供される。
例示の方法によって示され、記載の具体的な実施形態だけに本発明を限定することを意図しない次の詳細な記載は、添付の図面と合わせて参照すると、最も良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＤＮＡおよびタンパク質配列を要約する表である。
【図２】発現されるＦＭＤＶポリタンパク質および３Ｃによるプロセスを示す図である。
【図３】ｐＭＥＢ０９７のプラスミドマップを示す図である。
【図４】ＭａｃＭＥＢ０９７の電子顕微鏡検査の結果を示す図である。
【図５】Ａ２４株のＦＭＤＶカプシドタンパク質のウエスタンブロット結果を示す図である。
【図６】ＢａｃＭＥＢ０９９の電子顕微鏡検査および特異的ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図７Ａ−１】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ａ−２】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ａ−３】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ａ−４】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ｂ−１】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ｂ−２】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ｃ−１】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ｃ−２】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ｃ−３】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ｃ−４】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ｃ−５】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ｄ−１】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図７Ｄ−２】タンパク質配列の配列アライメントを示す図ある。
【図８】ＦＭＤＶ  ＶＬＰを示す図である。
【図９】平均ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ中和抗体力価の展開を示すグラフである。
【図１０】ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ中和抗体力価を示す表である。
【図１１Ａ】平均ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ中和抗体力価の展開を示すグラフである。
【図１１Ｂ】平均ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ中和抗体力価の展開を示すグラフである。
【図１２Ａ】チャレンジ後の平均直腸温の展開を示す図である。
【図１２Ｂ】チャレンジ後の平均直腸温の展開を示す図である。
【図１２Ｃ】チャレンジ後の平均直腸温の展開を示す図である。
【図１３】熱または酸の存在または非存在におけるコバレントケージ（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃａｇｅ）変異を有するまたは有さないＡ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ  ＶＬＰのＥＭ分析を示す図である。
【図１４】加熱後のＡ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ血清型についての、コバレントケージ変異を有するまたは有さないＶＬＰのＥＬＩＳＡ分析を示すグラフである。
【図１５】５℃に保存したコバレントケージ変異を有するまたは有さないＡ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ  ＶＬＰのＥＬＩＳＡ分析を経時的に示すグラフである。
【図１６】Ｏ１  ＭａｎｉｓａコバレントケージＶＬＰが熱に耐性であることを示すＥＬＩＳＡ結果およびＥＭ写真を示す図である。
【図１７】酸（上）および熱（下）におけるＯ１  ＭａｎｉｓａコバレントケージＶＬＰ安定性を示すＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図１８Ａ】ワクチン接種および分析スキームを示す図である。
【図１８Ｂ】ＦＭＤ  Ａｓｉａ１  ＳｈａｍｉｒおよびＦＭＤ  Ａ２２  Ｉｒａｑに対する中和抗体力価の展開を示すグラフである。
【図１９Ａ】液性応答（メモリーＢ細胞検出）スキームを示す図である。
【図１９Ｂ】Ａｓｉａ  ＳｈａｍｉｒコバレントケージおよびＩｒａｑ  Ａ２２コバレントケージＶＬＰ血清学データを示す図である。
【図２０】ＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチン接種動物の２７日目のＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す図である。
【図２１】ＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチン接種動物の４３日目のＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す図である（Ｂメモリー細胞を測定する）。
【図２２】ＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチン接種動物の２７日目の特異的γインターフェロン（ＩＦＮγ）分泌細胞アッセイを示す図である。
【図２３】４２日目の群によるＦＭＤＶ  ＳＶＮ  ｌｏｇ１０力価を示す図である。
【図２４】研究の経過にわたる（０日目〜４２日目）平均ＦＭＤＶ  ＶＮ  ｌｏｇ１０力価を示すグラフである。
【図２５】プラスミドｐＡＤ３０２７マップを示す図である。
【図２６】ｖＡＤ３０２７のウエスタンブロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＦＭＤＶポリペプチド、抗原ならびにその断片および変種を含む組成物、ならびに動物において免疫原性応答を誘発するＦＭＤＶ抗原を発現する組換えウイルスベクターを含む組成物が提供される。抗原性ポリペプチドまたはその断片もしくは変種は、昆虫細胞においてバキュロウイルス発現ベクターによって産生される。組換えウイルスベクターは、ＦＭＤＶ抗原を発現するアデノウイルスベクターであってよい。抗原性ポリペプチドまたは断片もしくは変種あるいは抗原を発現する組換えウイルスベクターは、ワクチンまたは医薬組成物に製剤化されてよく、動物において防御応答を誘発または刺激するために使用されてよい。一実施形態ではポリペプチド抗原は、ＦＭＤＶ  Ｐ１、ＶＰ２もしくは３Ｃポリペプチドまたはその活性断片もしくは変種である。ＦＭＤＶ抗原は、ＦＭＤＶ空カプシドまたはＦＭＤＶ  ＶＬＰ（ウイルス様粒子）の安定性を増強するために修飾されてよい。
【００１４】
本発明の抗原性ポリペプチドが全長ポリペプチドまたはその活性断片もしくは変種であってよいことが認識される。「活性断片」または「活性変種」によって、断片または変種がポリペプチドの抗原性の性質を保持していることが意図される。それにより本発明は、動物において免疫原性応答を誘発する任意のＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を包含する。ＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原は、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）などの動物において応答を誘発する、誘導するまたは刺激するこれだけに限らないがタンパク質、ペプチドまたはその断片もしくは変種などの任意のＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原であってよい。
【００１５】
具体的なＦＭＤＶ抗原性ポリペプチドは、Ｐ１、ＶＰ２および３Ｃを含む。ＦＭＤＶは、直径約２５ｎｍ、約８５００ヌクレオチドからなる１本鎖ＲＮＡ分子を含有し、陽極性を有する、エンベロープを有さない正二十面体ウイルスである。このＲＮＡ分子は、とりわけタンパク質Ｐ１またはＰ８８としても公知のカプシド前駆体を含有する単一のポリタンパク質をコードする単一の翻訳領域（ＯＲＦ）を含む。タンパク質Ｐ１は、そのアミノ末端でミリスチル化されている。成熟化工程中に、タンパク質Ｐ１は、プロテアーゼ３ＣによってＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３（またはそれぞれ１ＡＢ、１Ｄおよび１Ｃ；Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261）として公知の３個のタンパク質に切断される。ビリオンにおいて次にタンパク質ＶＰ０は２個のタンパク質ＶＰ４およびＶＰ２（またはそれぞれ１Ａおよび１Ｂ）に切断される。タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は約２６，０００Ｄａの分子量を有する一方で、タンパク質ＶＰ４は約８，０００Ｄａで小さい。ＦＭＤＶ配列は、その文書がその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ７，５２７，９６０およびＵＳ７，５３１，１８２にも記載されている。
【００１６】
カプシドタンパク質の単純な組合せは、プロモーターまたは、ＦＭＤＶカプシドの基本構成物である５Ｓ分子を形成する。次いでこのプロモーターは、１２Ｓ分子を形成するように五量体に複合体化される。ビリオンは、１２個の１２Ｓ五量体の集合によるゲノムＲＮＡ分子のキャプシド形成から生じ、それにより１４６Ｓ粒子を構成する。ウイルスカプシドは、その内部にＲＮＡ分子の存在を含まなくても形成され得る（本明細書以下で「空カプシド」）。空カプシドは、粒子７０Ｓとも称される。空カプシドの形成は、ウイルス複製の際に天然に生じる場合があり、または化学的処置によって人工的に産生され得る。
【００１７】
本発明は、有効量の組換えＦＭＤＶ抗原またはＦＭＤＶ抗原を発現する組換えウイルスベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含んでよい、ウシ、ヒツジ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）ワクチンまたは組成物に関する。
いくつかの実施形態ではワクチンは、米国特許第７３７１３９５号に記載の水中油（Ｏ／Ｗ）乳剤などのアジュバントをさらに含む。
さらに他の実施形態ではアジュバントはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ、水酸化アルミニウム、サポニンおよびＣｐＧまたはこれらの組合せを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、動物における応答は防御免疫応答である。
「動物」によって哺乳動物、鳥類などが意図される。動物または宿主は、哺乳動物およびヒトを含む。動物は、ウマ（例えばウマ（ｈｏｒｓｅ））、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）（例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）（例えばライオン、トラ、イエネコ、野生のネコ、他の大きなネコならびにチーターおよびオオヤマネコを含む他のネコ（ｆｅｌｉｎｅ））、ヒツジ（例えばヒツジ（ｓｈｅｅｐ））、ウシ（例えばウシ（ｃａｔｔｌｅ）、雌ウシ）、ブタ（ｓｗｉｎｅ）（例えばブタ（ｐｉｇ））、ヤギ（例えばヤギ（ｇｏａｔ））、鳥類（例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリ）、霊長類（例えば原猿類、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿）ならびに魚類からなる群から選択されてよい。用語「動物」は、胚性および胎生段階を含む発達のすべての段階における個々の動物も含む。
他に説明する場合を除いて、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。単数形語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示す場合を除いて複数の参照物を含む。同様に語「または（ｏｒ）」は、文脈が明らかに他を示す場合を除いて「および（ａｎｄ）」を含むことが意図される。
【００１９】
本開示、具体的には特許請求の範囲および／または段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が、米国特許法に記された意味を有し得ることは記載され；例えばそれらは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味でき；「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は米国特許法に帰する意味を有し、例えばそれらは、明確に引用されていない要素を許容するが、先行技術において見出されるまたは本発明の基本的なまたは新規の特徴に影響を与える要素を排除する。
【００２０】
本発明の抗原性ポリペプチドは、ＦＭＤＶに対して防御できる。すなわちそれらは、動物において免疫応答を刺激できる。「抗原」または「免疫原」によって、宿主動物において特異的免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、生物全体、死滅された、弱毒化または生きている；生物のサブユニットもしくは部分；免疫原性特性を有する挿入物を含有する組換えベクター；宿主動物への提示において免疫応答を誘導できるＤＮＡの小片もしくは断片；ポリペプチド、エピトープ、ハプテンまたはこれらの任意の組合せを含んでよい。代替的に免疫原または抗原は、毒素または抗毒素を含んでよい。
【００２１】
本明細書において使用される用語「免疫原性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド」は、宿主に投与されると、タンパク質に対して方向付けられた液性および／または細胞型の免疫応答を惹起できるという意味で免疫学的に活性であるポリペプチドを含む。好ましくはタンパク質断片は、全タンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有する。それにより本発明によるタンパク質断片は、少なくとも１つのエピトープまたは抗原性決定基を含む、またはから本質的になる、またはからなる。本明細書において使用される「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質の全長配列、その類似物またはその免疫原性断片を含む。「免疫原性断片」によって、１つまたは複数のエピトープを含み、それにより上に記載の免疫学的応答を惹起するタンパク質の断片が意味される。そのような断片は、当技術分野において周知の任意の数のエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996)を参照されたい。例えば直線状エピトープは、例えば固体支持体上で多数のペプチドを同時に合成し、ペプチドはタンパク質分子の一部に対応し、ペプチドが支持体に結合されたままでペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。そのような技術は、当技術分野において公知であり、例えば米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al., 1984, PNAS USA, 81(13): 3998-400、Geysen et al., 1985, PNAS USA, 82(1): 178-82に記載されている。同様にコンホメーションエピトープは、例えばＸ−線結晶解析および２次元核磁気共鳴などにより、アミノ酸の空間的コンホメーションを決定することによって容易に同定される。例えば、上記Epitope Mapping Protocolsを参照されたい。タイレリア・パルバ（Ｔ．ｐａｒｖａ）のタンパク質に特に適用可能な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２６０５に十分に記載されている。
【００２２】
考察のとおり本発明は、抗原性ポリペプチドの活性断片および変種を包含する。それにより用語「免疫原性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド」は、ポリペプチドが本明細書に定義の免疫学的応答を産生するように機能する限り、配列への欠失、付加および置換をさらに検討する。用語「保存的変動」は、生物学的に類似の別の残基によるアミノ酸残基の置き換え、またはコードされるアミノ酸残基が変化しないもしくは生物学的に類似の別の残基であるような核酸配列中のヌクレオチドの置き換えを記す。この観点から特に好ましい置換は、一般に性質において保存的すなわち、アミノ酸のファミリー内で生じる置換であろう。例えばアミノ酸は、一般に４個のファミリーに分けられる：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸、（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、ならびに（４）無電荷極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として分類される。保存的変動の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの１個の疎水性残基の別の疎水性残基への置換、または１個の極性残基の別の極性残基への置換、アルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸へのもしくはグルタミンのアスパラギンへの置換など；または生物学的活性に大きな効果を有さないであろう構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似の保存的置き換えを含む。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響しない少数のアミノ酸置換を保有するタンパク質は、したがって参照ポリペプチドの定義内である。これらの修飾によって産生されたすべてのポリペプチドは、本明細書に含まれる。用語「保存的変動」は、置換ポリペプチドに対して生じた抗体も未置換ポリペプチドと免疫反応する限り、未置換親アミノ酸に代わる置換アミノ酸の使用も含む。
【００２３】
用語「エピトープ」は、特異的Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原またはハプテン上の部位を指す。用語は、「抗原決定基」または「抗原性決定部位」と互換的にも使用される。同じエピトープを認識する抗体は、１個の抗体が別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力を示す簡単なイムノアッセイにおいて同定され得る。
【００２４】
組成物またはワクチンへの「免疫学的応答」は、目的の組成物またはワクチンへの宿主の細胞性および／または抗体介在免疫応答の発生である。通常「免疫学的応答」は、これだけに限らないが次の効果の１つまたは複数を含む：目的の組成物またはワクチンに含まれる１つまたは複数の抗原に特異的に方向付けられた抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生。好ましくは宿主は、新たな感染に対する抵抗を増強されるようなおよび／または疾患の臨床的重症度が低減するような治療的または防御的免疫学的応答のいずれかを示すであろう。そのような防御は、感染した宿主によって通常示される症状の低減または欠如、より早い回復期間および／または感染した宿主のウイルス力価の低下のいずれかによって実証される。
【００２５】
合成抗原も定義に含まれる、例えばポリエピトープ、隣接エピトープおよび他の組換えまたは合成由来抗原。例えばBergmann et al., 1993、Bergmann et al., 1996、Suhrbier, 1997、Gardner et al., 1998を参照されたい。本発明の目的のための免疫原性断片は、分子の少なくとも約３アミノ酸、少なくとも約５アミノ酸、少なくとも約１０〜１５アミノ酸または約１５〜２５アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸を通常含むであろう。断片の長さに決定的な上限は無く、タンパク質配列、またはさらにタンパク質の少なくとも１つのエピトープを含む融合タンパク質のほとんど全長を含んでよい。
【００２６】
したがって、エピトープを発現しているポリヌクレオチドの最小構造は、ＦＭＤＶポリペプチドのエピトープまたは抗原性決定基をコードするヌクレオチドを含む、またはから本質的になる、またはからなる。ＦＭＤＶポリペプチドの断片をコードしているポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードしている配列の最少１５ヌクレオチド、約３０〜４５ヌクレオチド、約４５〜７５または少なくとも５７、８７もしくは１５０連続もしくは近接ヌクレオチドを含んでよい、またはから本質的になってよい、またはなってよい。
【００２７】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖状もしくは分枝状、１本鎖もしくは２本鎖またはこれらのハイブリッドであるＲＮＡまたはＤＮＡを指す。用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。以下はポリヌクレオチドの非限定的例である：遺伝子もしくは遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似物、ウラシル（ｕｒａｃｙｌ）などの修飾ヌクレオチド、他の糖ならびにフルオロリボースおよびチオレートなどの連結基ならびにヌクレオチド枝を含んでよい。ヌクレオチドの配列は、標識構成成分とのコンジュゲーションなどによって重合後にさらに修飾されてよい。この定義に含まれる他の種類の修飾は、キャップ、天然に存在する１つまたは複数のヌクレオチドの類似物での置換、およびポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識構成成分、他のポリヌクレオチドもしくは固体支持体に結合させるための手段の導入である。ポリヌクレオチドは、化学合成によって得ることができ、または微生物由来であってもよい。
【００２８】
用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するポリヌクレオチドの任意のセグメントを指して幅広く使用される。したがって遺伝子は、ゲノム配列中に存在するようなイントロンおよびエクソン、またはｃＤＮＡ中に存在するようなコード配列だけならびに／またはそれらの発現のために必要な制御配列を含む。例えば遺伝子は、ｍＲＮＡもしくは機能性ＲＮＡを発現する、または特異的タンパク質をコードする核酸断片も指し、制御配列を含む。
本発明は、ＦＭＤＶ抗原、エピトープまたは免疫原をコードするポリヌクレオチドへの相補鎖をさらに含む。相補鎖は、ポリマー性で任意の長さであってよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび類似物を任意の組合せで含有してよい。
【００２９】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「ポリペプチド断片」は、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指して本明細書において互換的に用いられる。ポリマーは、直鎖状または分枝状であってよく、修飾アミノ酸またはアミノ酸類似物を含んでよく、アミノ酸以外の化学成分によって中断されてよい。用語は、天然にまたは介入；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化または標識もしくは生理活性構成成分でのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾によって、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
「単離された」生物学的構成成分（核酸またはタンパク質またはオルガネラなど）は、構成成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的構成成分、例えば他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質およびオルガネラから実質的に分離されたまたは精製された構成成分を指す。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。用語は、組換え技術および化学合成によって調製された核酸およびタンパク質も包含する。
【００３０】
本明細書において使用される用語「精製された」は、完全な純度を必要とせず；むしろ相対的な用語が意図される。したがって例えば精製されたポリペプチド調製物は、ポリペプチドがその天然環境においてあるよりもさらに濃縮されているものである。すなわちポリペプチドは細胞構成成分から分離されている。「実質的に精製された」によって、ポリペプチドは細胞性構成成分または材料の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％以上が除去されているいくつかの実施形態を表すことが意図される。同様にポリペプチドは、部分的に精製されてよい。「部分的に精製された」によって、細胞性構成成分または材料の６０％未満が除去されていることが意図される。同様のことがポリヌクレオチドに適用される。本明細書に開示のポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の手段によって精製されてよい。
【００３１】
上に記載のとおり抗原性ポリペプチドまたはその断片もしくは変種は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで昆虫細胞中のバキュロウイルス発現ベクターによってまたはｉｎ  ｖｉｖｏでウイルスベクターによって産生されるＦＭＤＶ抗原性ポリペプチドである。開示のポリヌクレオチドの断片および変種ならびにそれによりコードされるポリペプチドも、本発明により包含される。「断片」によって、ポリヌクレオチドの一部またはそれによってコードされる抗原性アミノ酸配列の一部が意図される。ポリヌクレオチドの断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持しており、それにより本明細書他所に記載の免疫原性活性を有するタンパク質断片をコードしてよい。ポリペプチド配列の断片は、動物において防御免疫応答を誘導する能力を保持している。
【００３２】
「変種」は、実質的に類似配列を意味することが意図される。ポリヌクレオチドについて変種は、天然ポリヌクレオチド内の１つもしくは複数の部位での１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失および／もしくは付加ならびに／または天然ポリヌクレオチド中の１つもしくは複数の部位での１つもしくは複数のヌクレオチドの置換を含む。本明細書において使用される「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ天然に存在するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。本発明の具体的なポリヌクレオチド（すなわち参照ポリヌクレオチド）の変種は、変種ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列同一性百分率の比較によっても評価され得る。「変種」タンパク質は、天然タンパク質内の１つまたは複数の部位での１つもしくは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加ならびに／または天然タンパク質中の１つまたは複数の部位での１つまたは複数のアミノ酸での置換による天然タンパク質由来のタンパク質を意味すると意図される。本発明により包含される変種タンパク質は生物学的に活性である、すなわちそれらは免疫応答を惹起する能力を有する。
【００３３】
一態様では本発明は、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）ＦＭＤＶ単離物由来のＦＭＤＶポリペプチドを提供する。別の態様では本発明は、配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列を有するポリペプチドおよびその変種または断片を提供する。
別の態様では本発明は、ＦＭＤＶ空カプシドまたはＦＭＤＶ  ＶＬＰ（ウイルス様粒子）の温度および／または酸安定性を改善することに関する。空カプシドの温度および／または酸安定性は、ジスルフィド架橋の形成によって有利に確実にされる。
【００３４】
具体的にはこの改善は、カプシドの構造タンパク質、タンパク質ＶＰ２（Ｐ１由来）のポリペプチド配列内、例えばアミノ酸配列、配列番号２、４、６、８、１０または１６（ＦＭＤＶ  Ａ２４株、ＦＭＤＶ  Ｏ１  ｍａｎｉｓａ株、ＦＭＤＶ  Ｉｒａｑ株またはＦＭＤＶ  Ａｓｉａ株のＰ１）の１７９位で、元の配列のアミノ酸をシステインで置き換えることによって得られる。原則としてこのアミノ酸の位置は、他の口蹄疫ウイルス由来のＶＰ２タンパク質において同一である（特に例に記載の株と同様に）。このアミノ酸を含有する領域は、アルファヘリックスに対応する。変異導入されるアミノ酸を同定または確認するために、この領域のアミノ酸配列は、異なるＦＭＤＶ間の構造において配列が十分に保存されている事実を考慮して、配列番号２、４、６、８、１０または１６の配列で対応する領域（例えば約１０またはわずかに多い程度−−例えば１０から２０のアミノ酸）とアライメントされる。変異導入されるアミノ酸は、ＦＭＤＶ  Ｐ１（配列番号２、４、６、８、１０または１６）の１７９位に位置している。慣習により開始コドンに対応するメチオニン（天然配列には存在せず、したがって付加される）が１と番号付けられる。
さらに、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）由来のＦＭＤＶポリペプチドのホモログは、本発明の範囲内であることが意図される。本明細書において使用される用語「ホモログ」は、オルソログ、類似物およびパラログを含む。用語「類似物」は、同じまたは類似の機能を有するが、無関係の生物において別々に進化した２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。用語「オルソログ」は、異なる種由来だが種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。通常オルソログは、同じまたは類似の機能を有するポリペプチドをコードする。用語「パラログ」は、ゲノム内の重複によって関連する２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。パラログは、通常異なる機能を有するが、これらの機能は関連している場合がある。野生型ＦＭＤＶポリペプチドの類似物、オルソログおよびパラログは、翻訳後修飾によって、アミノ酸配列差異によってまたは両方によって野生型ＦＭＤＶポリペプチドから異なっていてよい。具体的には本発明のホモログは、一般に、野生型ＦＭＤＶポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の全体または一部と少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％または９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を表し、類似の機能を表すであろう。変種は、対立遺伝子の変種を含む。用語「対立遺伝子の変種」は、タンパク質のアミノ酸配列において変化をもたらし、天然集団内に存在する多型（例えばウイルス種または変種（ｖａｒｉｅｔｙ））を含有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。そのような天然対立遺伝子の変動は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおいて典型的には１〜５％の相違を生じる場合がある。対立遺伝子の変種は、多数の異なる種における目的の核酸配列の配列決定によって同定でき、これはこれらの種における同じ遺伝子の遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを使用することによって容易に実行され得る。天然対立遺伝子の変動の結果であり、目的の遺伝子の機能活性を変更しない、任意のおよびすべてのそのような核酸変動ならびに生じるアミノ酸多型または変動は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００３５】
本明細書において使用される用語「誘導体」または「変種」は、１つまたは複数の保存的アミノ酸変動または他の少数の修飾を、（１）野生型ポリペプチドと比較した場合に対応するポリペプチドが実質的に等価の機能を有する、または（２）ポリペプチドに対して生じた抗体が野生型ポリペプチドに免疫活性である、ように有するポリペプチドまたは、ポリペプチドをコードしている核酸を指す。これらの変種または誘導体は、未修飾対応物ポリペプチドと比較して実質的に等価な活性を有するペプチドを生じ得る、ＦＭＤＶポリペプチド一次アミノ酸配列の少数の修飾を有するポリペプチドを含む。そのような修飾は、部位特異的変異導入による修飾のように意図的であっても、または自然発生であってもよい。用語「変種」は、配列への欠失、付加および置換を、ポリペプチドが本明細書に定義の免疫学的応答を産生するよう機能する限り検討する。
【００３６】
用語「保存的変動」は、生物学的に類似の別の残基によるアミノ酸残基の置き換え、またはコードされるアミノ酸残基が変化しないもしくは生物学的に類似の別の残基であるような核酸配列中のヌクレオチドの置き換えを記す。この観点から特に好ましい置換は、上に記載のとおり一般に性質において保存的であろう。
【００３７】
本開示のポリヌクレオチドは、遺伝コード、例えば具体的な宿主のために最適化されたコドン使用の結果として縮重である配列を含む。本明細書において使用される「最適化」は、所与の種におけるその発現を増加するように遺伝的に操作されているポリヌクレオチドを指す。ＦＭＤＶポリペプチドをコードするために最適化されたポリヌクレオチドを提供するために、ＦＭＤＶタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列は、１）具体的な種において高度に発現される遺伝子によって好ましいコドンを含む、２）前記種において実質的に見出されるヌクレオチド塩基組成物中のＡ＋ＴもしくはＧ＋Ｃ含有量を含む、３）前記種の開始配列を形成する、または４）ＲＮＡの不安定化、不適切なポリアデニル化、分解および終結を生じるまたは二次構造ヘアピンもしくはＲＮＡスプライス部位を形成する配列を排除するように、修飾されてよい。前記種におけるＦＭＤＶタンパク質の発現の増加は、真核生物および原核生物または具体的な種におけるコドン使用の分布頻度を利用することによって達成され得る。用語「好ましいコドン使用の頻度」は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用において具体的な宿主細胞によって示される優先度を指す。２０種の天然アミノ酸があり、その大部分は１種より多いコドンによって特定される。したがってすべての縮重ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列によってコードされるＦＭＤＶポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しない限り本開示に含まれる。
【００３８】
２個のアミノ酸配列の間の配列同一性は、標準的パラメーターを使用するＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ペアワイズブラスト（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｂｌａｓｔ）およびｂｌｏｓｕｍ６２マトリクスによって確立され得る（例えば「Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）サーバーにおいて入手可能なＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴＸアルゴリズム、およびＡｌｔｓｃｈｕｌらを参照されたい；それにより本文書は用語「ｂｌａｓｔ」によってアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用することを述べる）。
【００３９】
配列に関して「同一性」は、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸を有する位置の数を２種の配列の短い方のヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割ったものを指す場合があり、２種の配列のアライメントはＷｉｌｂｕｒ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎアルゴリズムにより決定されてよい。２種のアミノ酸配列の配列同一性もしくは配列類似性または２種のヌクレオチド配列間の配列同一性は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１６００  Ｆａｒａｄａｙ  Ａｖｅ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定されてよい。ＲＮＡ配列が類似しているまたはＤＮＡ配列とある程度の配列同一性もしくは相同性を有すると称される場合、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等価であると考えられる。それにより、ＲＮＡ配列は本発明の範囲内であり、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）がＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等価であると考えられることによってＤＮＡ配列に由来してよい。
【００４０】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実施されてよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加する条件は周知である。例えば“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”、second edition (Sambrook et al., 1989)を参照されたい。
本発明は、ベクター分子または発現ベクターに含有され、プロモーターエレメントにおよび任意選択でエンハンサーに作動可能に連結されたＦＭＤＶポリヌクレオチドをさらに包含する。
【００４１】
「ベクター」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで標的細胞に送達される異種性ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡもしくはＲＮＡプラスミドまたはウイルスを指す。異種性ポリヌクレオチドは、予防または治療の目的のための目的の配列を含んでよく、任意選択で発現カセットの形態であってよい。本明細書において使用されるベクターは、最終的な標的細胞または対象において複製できる必要はない。用語は、クローニングベクターおよびウイルスベクターを含む。
用語「組換え」は、天然に存在しないまたは天然に見出されない配置で別のポリヌクレオチドに連結されている半合成または合成由来ポリヌクレオチドを意味する。
「異種性」は、それが比較される他の実体とは遺伝的に異なる実体由来であることを意味する。例えばポリヌクレオチドは、遺伝子工学技術によって異なる供給源由来のプラスミドまたはベクター中に置き換えられる場合があり、異種性ポリヌクレオチドである。その天然コード配列から除去され、天然配列以外のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種性プロモーターである。
本発明は、有効量の組換えＦＭＤＶ抗原および薬学的または獣医学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを含み得る、ヒツジ、ウシ、ヤギおよびブタ（ｓｗｉｎｅ）ワクチンまたは医薬もしくは免疫学的組成物に関する。
本明細書に記載の主題は、高度に免疫原性であり動物を同種および異種ＦＭＤＶ株からのチャレンジに対して防御するバキュロウイルス／昆虫細胞発現系において調製されたＦＭＤＶ抗原に関連する組成物および方法にある程度方向付けられている。
【００４２】
組成物
本発明は、有効量の組換えＦＭＤＶ抗原および薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含み得るＦＭＤＶワクチンまたは組成物に関する。一実施形態では組換えＦＭＤＶ抗原は、昆虫細胞においてバキュロウイルス発現ベクターによって発現される。別の実施形態では、ＦＭＤＶワクチンまたは組成物は、ＦＭＤＶ抗原を発現する組換えウイルスベクターを含む。
本発明の一実施形態は、ＦＭＤＶ空カプシドを含むワクチンまたは組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、ＦＭＤＶ空カプシドを発現するウイルスベクターを含むワクチンまたは組成物に関する。ＦＭＤＶ空カプシドは、領域Ｐ１、２Ａ／２Ｂ’／３Ｂ’および３ＣのｃＤＮＡの発現によって得られる。ＦＭＤＶ空カプシドまたはＦＭＤＶ  ＶＬＰ（ウイルス様粒子）は、熱および／または酸（低ＰＨ）安定性が増強されるように修飾されてよい。
【００４３】
本発明は、口蹄疫に対するワクチン、具体的にはそれらの熱および／または酸（低ＰＨ）安定性を改善することに関する。これらのワクチンを調製するための処理、これらのワクチンを産生するための抗原の使用およびこれらを使用するワクチン接種方法にも関する。
本発明は、ウイルスの天然配列と比較して修飾されているヌクレオチド配列、具体的にはｃＤＮＡおよびアミノ酸配列にも関する。本発明は、修飾ヌクレオチド配列の発現産生物ならびにこれらの修飾を組み入れるＦＭＤＶ抗原およびウイルスにも関する。
本発明は、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）などの動物において免疫原性応答を誘発する任意のＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を包含する。ＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原は、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）などの動物において応答を誘発、誘導するまたは刺激するこれだけに限らないがタンパク質、ペプチドまたはその断片などの任意のＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原であってよい。
【００４４】
ＦＭＤＶ免疫学的組成物またはワクチンが組換え免疫学的組成物またはワクチンである一実施形態では、組成物またはワクチンは組換えベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される賦形剤、担体、アジュバントまたはビヒクルを含み；組換えベクターはＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原をコードするポリヌクレオチドを含み得るバキュロウイルス発現ベクターである。ＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ５、ＮＳ１、ＶＰ７、ＮＳ２、ＶＰ６、ＮＳ３、ＮＳ３ａ、Ｐ１、ＶＰ０、３Ｃまたはこれらの任意の断片であってよい。
【００４５】
別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原は、Ｐ１、ＶＰ０、ＶＰ３、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ４、２Ａ、２Ｂまたは３Ｃである。
一実施形態では１つまたは複数のＦＭＤＶ抗原（複数可）をコードしている核酸分子は、ＦＭＤＶ  Ｐ１領域をコードしているｃＤＮＡおよびＦＭＤＶのＦＭＤＶ  ３ＣプロテアーゼをコードしているｃＤＮＡである。
一実施形態ではＦＭＤＶ抗原は、Ｐ１−３Ｃポリペプチドであってよい。別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原はＰ１のみまたはＰ１−２Ａ／２Ｂ１であってよい。さらに別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原は、ＶＰ０−ＶＰ３であってよい。別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原はＶＰ４−ＶＰ２であってよい。さらに別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原は、３Ｃであってよい、または昆虫細胞における発現のために最適化された５’ＵＴＲを有する３Ｃであってよい。一実施形態ではＰ１−２Ａ／２Ｂ１および３Ｃポリペプチドの両方は、単一の構築物を使用して昆虫細胞において発現されてよく、発現は１つまたは複数のプロモーター配列によって制御されてよい。別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原は修飾Ｐ１またはＶＰ２である。
【００４６】
別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原は、ＦＭＤＶ  Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、Ｏ１  ＢＦＳまたはＣａｍｐｏｓ、Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ、Ａｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ、Ａ  Ｉｒａｎ’９６、Ａ２２  Ｉｒａｑ、ＳＡＴ２  Ｓａｕｄｉ  Ａｒａｂｉａ由来であってよい。
本発明は、有効量の組換えＦＭＤＶ抗原またはＦＭＤＶ抗原を発現する組換えウイルスベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含み得るＦＭＤＶワクチンに関する。
別の実施形態では、薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルは、油中水乳剤であってよい。さらに別の実施形態では、油中水乳剤は、水中油乳剤であってよい。
【００４７】
本発明は、ベクター分子または発現ベクターに含有され、プロモーターエレメントに、および任意選択でエンハンサーに作動可能に連結されたＦＭＤＶポリヌクレオチドをさらに包含する。
一態様では本発明は、ＦＭＤＶポリペプチド、具体的には配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列を有するヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）ポリペプチドおよびその変種または断片を提供する。
別の態様では本発明は、本発明の抗原性ポリペプチド、具体的には配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列を有するポリペプチドに対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
【００４８】
さらに別の態様では本発明は、周知の分子生物学技術を使用して当業者によって容易に調製され得る上で同定したＦＭＤＶポリペプチド（配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６）の断片および変種を提供する。
変種は、配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載のアミノ酸配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する相同性ポリペプチドである。
ＦＭＤＶポリペプチドの免疫原性断片は、配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３もしくは１６に記載の配列を有するＦＭＤＶポリペプチドまたはその変種の少なくとも８個、１０個、１５個または２０個の連続するアミノ酸、少なくとも２１個のアミノ酸、少なくとも２３個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸または少なくとも３０個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＦＭＤＶポリペプチドの断片は、全長ＦＭＤＶポリペプチドにおいて見出される具体的な抗原性エピトープを含む。
【００４９】
別の態様では本発明は、配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどのＦＭＤＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の態様では本発明は、配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３もしくは１６に記載の配列を有するポリペプチドに対し少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するポリペプチド、またはこれらのポリペプチドのうち１つの少なくとも８個もしくは少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む保存的変種、対立遺伝子変種、ホモログもしくは免疫原性断片、またはこれらのポリペプチドの組合せをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では本発明は、配列番号３、７、９、１１、１４、１５、１７、１８、１９もしくは２０に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその変種を提供する。さらに別の態様では本発明は、配列番号３、７、９、１１、１４、１５、１７、１８、１９もしくは２０に記載の配列を有するポリヌクレオチドの１つまたはその変種に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドは、同じ転写単位内の追加的コード配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、転写終結因子、ポリアデニル化部位などの調節エレメント、同じまたは異なるプロモーターの調節下の追加的転写単位、宿主細胞のクローニング、発現、相同組換えおよび形質転換を可能にする配列、ならびに本発明の実施形態を提供するために望ましい場合がある任意の構築物など、追加的配列を含んでよい。
【００５１】
ＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原の発現のためのエレメントは、発明のベクター中に有利に存在する。最小限のやり方ではこれは、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドンおよびプロモーター、ならびに任意選択でプラスミドおよびある種のウイルスベクター等のある種のベクター、例えばポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化配列も含む、から本質的になる、またはからなる。ポリヌクレオチドがポリタンパク質断片、例えばＦＭＤＶペプチドをコードする場合、有利にはベクター中でＡＴＧは読み枠の５’に位置付けられ、終止コドンは３’に位置付けられる。エンハンサー配列、イントロンおよびタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列などの安定化配列などの発現を調節するための他のエレメントは、存在してよい。
【００５２】
本発明は、発現ベクターなどのベクターを含む調製物、例えば治療組成物にも関する。調製物は、１つまたは複数のベクター、例えば１つまたは複数のＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を含むおよび発現するｉｎ  ｖｉｖｏ発現ベクターなどの発現ベクターを含んでよい。一実施形態ではベクターは、ＦＭＤＶ抗原、エピトープまたは免疫原をコードする（および有利に発現する）ポリヌクレオチドを薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクル中に含む、から本質的になる、またはからなるポリヌクレオチドを含有し、発現する。したがって本発明の実施形態により、調製物中の他の１つまたは複数のベクターは、ＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープもしくは免疫原またはその断片の１つまたは複数の他のタンパク質をコードし、好適な条件下でベクターが発現するポリヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる。
【００５３】
別の実施形態によると、調製物中の１つまたは複数のベクターは、ＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原の１つまたは複数のタンパク質またはその断片（複数可）をコードするポリヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなり、１つまたは複数のベクターはポリヌクレオチド（複数可）を発現する。別の実施形態では、調製物は、ＦＭＤＶポリペプチド、抗原、融合タンパク質またはそのエピトープをコードし、発現する、有利にはｉｎ  ｖｉｖｏで、ポリヌクレオチドを含む１つ、２つ以上のベクターを含む。本発明は、さまざまなＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原、例えばこれだけに限らないが、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）などのさまざまな動物種由来のＦＭＤＶポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原をコードするおよび発現するポリヌクレオチドを含むベクターの混合物にも方向付けられる。
本発明のさらなる実施形態によると、発現ベクターは、プラスミドベクターまたはＤＮＡプラスミドベクター、具体的にはｉｎ  ｖｉｖｏ発現ベクターである。具体的、非限定的例ではｐＶＲ１０２０または１０１２プラスミド（ＶＩＣＡＬ  Ｉｎｃ．；Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, Hum Gene Ther, 7(10): 1205-17；例えば、米国特許第５，８４６，９４６号および第６，４５１，７６９号を参照されたい）は、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして利用され得る。ｐＶＲ１０２０プラスミドは、ｐＶＲ１０１２由来であり、ヒトｔＰＡシグナル配列を含有する。一実施形態ではヒトｔＰＡシグナルは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＨＵＭＴＰＡ１４の下のアミノ酸Ｍ（１）からアミノ酸Ｓ（２３）までを含む。別の具体的非限定的な例では、ポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして利用されるプラスミドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ２８０７０の下のアミノ酸Ｍ（２４）からアミノ酸Ａ（４８）までのウマＩＧＦ１のシグナルペプチド配列を含有してよい。実行において参考にされ得るおよび用いられ得るＤＮＡプラスミドについての追加的情報は、例えば米国特許第６，８５２，７０５号、第６，８１８，６２８号、第６，５８６，４１２号、第６，５７６，２４３号、第６，５５８，６７４号、第６，４６４，９８４号、第６，４５１，７７０号、第６，３７６，４７３号および第６，２２１，３６２号において見出される。
【００５４】
用語プラスミドは、本発明によるポリヌクレオチドおよび、所望の宿主もしくは標的の１つまたは複数の細胞におけるそのｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために必要なエレメントを含む任意のＤＮＡ転写単位を網羅し；これに関して、スーパーコイルまたは非スーパーコイル、環状プラスミドおよび直鎖状形態が本発明の範囲内であると意図されることが記載される。
【００５５】
各プラスミドは、プロモーターに作動可能に連結されたまたはプロモーターの調節下のまたはプロモーターに依存性の、任意選択で異種性ペプチド配列、変種、類似物または断片に融合された、ＦＭＤＶ抗原、エピトープまたは免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、含有する、またはから本質的になる。一般に、真核細胞において機能性の強力なプロモーターを用いることは有利である。強力なプロモーターは、これだけに限らないが、ヒトもしくはネズミ由来の最初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）または任意選択でラットもしくはモルモットなど別の由来を有するスーパープロモーター（Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995.）であってよい。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、エンハンサー部分と関連する場合もしない場合もある実際のプロモーター部分を含んでよい。ＥＰ−Ａ−２６０１４８、ＥＰ−Ａ−３２３５９７、米国特許第５，１６８，０６２号、第５，３８５，８３９号および第４，９６８，６１５号ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ８７／０３９０５号を参照することができる。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、有利にはヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart et al., 1985, Cell, 41(2): 521-30）またはネズミＣＭＶ−ＩＥである。
【００５６】
さらに一般的な用語ではプロモーターは、ウイルス性、植物または細胞由来のいずれかである。本発明の実施において有用に用いられ得るＣＭＶ−ＩＥ以外の強力なウイルス性プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの初期／後期プロモーターまたはラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターである。本発明の実施において有用に用いられ得る強力な細胞性プロモーターは、例えばデスミンプロモーター（Kwissa et al., 2000, Vaccine, 18(22): 2337-44）またはアクチンプロモーター（Miyazaki et al., 1989, Gene, 79(2): 269-77）などの細胞骨格の遺伝子のプロモーターである。
【００５７】
プラスミドは、他の発現調節エレメントを含んでよい。安定化配列（複数可）、例えばイントロン配列（複数可）、例えばトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼイントロン（Callis et al. Genes & Dev.1(10):1183-1200, Dec. 1987）、ｈＣＭＶ−ＩＥの第１イントロン（ＰＣＴ出願第ＷＯ１９８９／０１０３６号）、ウサギβグロビン遺伝子のイントロンＩＩ（van Ooyen et al., 1979, Science, 206(4416): 337-44）を組み込むことが特に有利である。別の実施形態では、プラスミドは、３’ＵＴＲを含んでよい。３’ＵＴＲは、これだけに限らないが、アグロバクテリウム（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）３’ＵＴＲであってよい（Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721）。
【００５８】
プラスミドおよびポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル（ポリＡ）に関して使用は、さらにウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子のポリ（Ａ）シグナル（Ｕ．Ｓ．５，１２２，４５８を参照されたい）、またはウサギβグロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナルまたはＳＶ４０ウイルスのポリ（Ａ）シグナルで行われてよい。
「宿主細胞」は、遺伝的に変更されたまたは組換えプラスミドもしくはベクターなどの外来性ポリヌクレオチドの投与によって遺伝的に変更され得る原核または真核細胞を記す。遺伝的に変更された細胞に関する場合、用語は元の変更された細胞およびその後代の両方を指す。
一実施形態では組換えＦＭＤＶ抗原は、昆虫細胞において発現される。
【００５９】
使用方法
一実施形態では、本明細書に開示の主題は、有効量の組換えＦＭＤＶ抗原またはＦＭＤＶ抗原を発現する組換えウイルスベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含んでよい有効量のワクチンをヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）に、投与することを含む、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）にワクチン接種する方法に方向付けられている。
本発明の一実施形態では方法は、本発明による乳剤と製剤化されたワクチン組成物の単回投与を含む。例えば、一実施形態では免疫学的またはワクチン組成物は、ポリペプチドおよびＶＬＰ（ウイルス様粒子）もしくは空カプシドを含むバキュロウイルス発現ＦＭＤＶ抗原、またはＦＭＤＶ抗原を発現している組換えウイルスベクターを含む。電子顕微鏡検査は、バキュロウイルス発現ベクターで形質転換された昆虫細胞がＦＭＤＶ  ＶＬＰまたはＦＭＤＶ空カプシドを産生することを示し、それにより本発明による免疫学的またはワクチン組成物はＦＭＤＶ  ＶＬＰもしくはＦＭＤＶ空カプシドを含むものを包含する。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、方法は、２種の異種性ワクチン組成物の単回投与を含む。異種性ワクチンまたは組成物は、ＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチンまたはＦＭＤＶウイルスベクターワクチンなどのさまざまな種類のワクチンであってよい。異種性ワクチンは、Ａ２４、Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、ＡｓｉａまたはＩｒａｑ株などのさまざまなＦＭＤＶ血清型のカプシドを発現する同じ種類のワクチンであってもよい。
一実施形態では、本明細書で開示の主題は、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターによって産生されたＦＭＤＶ抗原またはＦＭＤＶ抗原を発現している組換えウイルスベクターをヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）に投与することを含む、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）にワクチン接種する方法に方向付けられている。
【００６１】
一実施形態では、本明細書に開示の主題は、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターによって産生されたＦＭＤＶ抗原またはＦＭＤＶ抗原を発現している組換えウイルスベクターを含むワクチンをヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）に投与することを含む免疫応答を誘発する方法に方向付けられている。
一実施形態では、本明細書で開示の主題は、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターによって産生されたＦＭＤＶ抗原またはＦＭＤＶ抗原を発現している組換えウイルスベクターを単離すること、および任意選択で薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルと組み合わせることを含む、ワクチンまたは組成物を調製する方法に方向付けられている。
同種および異種両方のＦＭＤＶ株は、ワクチンの有効性を検査するためのチャレンジのために使用される。投与は、皮下または筋肉内であってよい。投与は無針であってよい（例えばＰｉｇｊｅｔまたはＢｉｏｊｅｃｔ）。
【００６２】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つの共通ポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を使用する少なくとも１回の初回投与および少なくとも１回の追加免疫投与からなる初回−追加免疫レジメンは、用いられてよい。初回投与において使用される免疫学的組成物またはワクチンは、追加免疫として使用されるものと性質が異なっている。しかし、同じ組成物が初回投与および追加免疫として使用されてよいことが記される。この投与プロトコールは、「初回−追加免疫」と称される。
【００６３】
本発明による初回−追加免疫は、抗原性ポリペプチドまたはその断片もしくは変種をコードするＦＭＤＶコード配列またはその断片を発現するために使用される組換えウイルスベクターを含んでよい。具体的にはウイルスベクターは、抗原性ポリペプチドをコードするＦＭＤＶ遺伝子またはその断片を発現できる。本明細書で検討されるウイルスベクターは、これだけに限らないが、ポックスウイルス［例えばワクチニアウイルスもしくは弱毒化ワクチニアウイルス、アビポックスウイルスもしくは弱毒化アビポックスウイルス（例えばカナリアポックス、鶏痘、ハトポックス（ｄｏｖｅｐｏｘ）、ハトポックス（ｐｉｇｅｏｎｐｏｘ）、ウズラポックス（ｑｕａｉｌｐｏｘ）、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ；例えばＵＳ５，５０５，９４１、ＵＳ５，４９４，８０７０を参照されたい）、アライグマポックス（ｒａｃｃｏｏｎｐｏｘ）ウイルス、ブタ（ｓｗｉｎｅ）ポックスウイルスなど］、アデノウイルス（例えばヒトアデノウイルス、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）アデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えばイヌ（ｃａｎｉｎｅ）ヘルペスウイルス、シチメンチョウのヘルペスウイルス、マレック病ウイルス、感染性咽頭気管支炎ウイルス、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）ヘルペスウイルス、咽頭気管支炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ウシヘルペスウイルス、ブタ（ｓｗｉｎｅ）ヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、レトロウイルスなどを含む。別の実施形態では、アビポックス発現ベクターは、ＡＬＶＡＣなどのカナリアポックスベクターであってよい。さらに別の実施形態では、アビポックス発現ベクターは、ＴＲＯＶＡＣなどの鶏痘ベクターであってよい。発現される本発明のＦＭＤＶ抗原は、とりわけ具体的なポックスウイルスプロモーター、例えばエントモポックスウイルス・アムサクタ・モオレイ（ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ  Ａｍｓａｃｔａ  ｍｏｏｒｅｉ）４２Ｋプロモーター（Barcena, Lorenzo et al., 2000, J Gen Virol., 81(4): 1073-85）、ワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ（Cochran et al., 1985, J Virol, 54(1): 30-7）、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., 1992, J Virol, 66(6): 3424-34）、ワクシニアプロモーターＨＡ（Shida, 1986, Virology, 150(2): 451-62）、雌ウシポックス（ｃｏｗｐｏｘ）プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., 1988, J Gen Virol, 69 (1): 35-47）、ワクシニアプロモーターＨ６（Taylor et al., 1988, Vaccine, 6(6): 504-8; Guo et al., 1989, J Virol, 63(10): 4189-98; Perkus et al., 1989, J Virol, 63(9): 3829-36）の調節下に挿入される。
【００６４】
別の実施形態では、アビポックス発現ベクターは、ＡＬＶＡＣなどのカナリアポックスベクターであってよい。ＦＭＤＶ抗原、エピトープまたは免疫原は、ＦＭＤＶ  Ｐ１−３Ｃであってよい。ＦＭＤＶウイルスベクターは、ｖＣＰ２１８６、ｖＣＰ２１８１もしくはｖＣＰ２１７６などのカナリアポックスウイルスまたはｖＦＰ２２１５（ＵＳ７，５２７，９６０を参照されたい）などの鶏痘ウイルスであってよい。さらに別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原、エピトープまたは免疫原は、ウキクサにおいて産生されてよい（ＵＳ２０１１／０２３６４１６）。
【００６５】
本発明の初回−追加免疫プロトコールの別の態様では、本発明のＦＭＤＶ抗原を含む組成物は、投与され、ＦＭＤＶ抗原を含有しｉｎ  ｖｉｖｏで発現する組換えウイルスベクターを含むワクチンもしくは組成物、またはＦＭＤＶ抗原を含む不活性化ウイルスワクチンもしくは組成物、またはＦＭＤＶ抗原を含有するもしくは発現するＤＮＡプラスミドワクチンもしくは組成物の投与が続く。同様に初回−追加免疫プロトコールは、ＦＭＤＶ抗原を含有しｉｎ  ｖｉｖｏで発現する組換えウイルスベクターを含むワクチンもしくは組成物、またはＦＭＤＶ抗原を含む不活性化ウイルスワクチンもしくは組成物、またはＦＭＤＶ抗原を含有するもしくは発現するＤＮＡプラスミドワクチンもしくは組成物の投与を含んでよく、本発明のＦＭＤＶ抗原を含む組成物の投与が続く。初回および２回目投与の両方は、本発明のＦＭＤＶ抗原を含む組成物を含んでよいことがさらに記述される。
【００６６】
初回−追加免疫プロトコールは、少なくとも１つの共通ポリペプチドおよび／またはその変種もしくは断片を使用する少なくとも１回の初回投与および少なくとも１回の追加免疫投与を含む。初回投与において使用されるワクチンは、後の追加免疫ワクチンとして使用されるものとは性質が異なっていてよい。初回投与は、１回または複数回の投与を含んでよい。同様に追加免疫投与は、１回または複数回の投与を含んでよい。
【００６７】
哺乳動物である標的種のための組成物の用量容積、例えばヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）組成物の、ウイルスベクターに基づく、例えば非ポックスウイルスウイルスベクターに基づく組成物の用量容積は、一般に約０．１から約５．０ｍｌの間、約０．１から約３．０ｍｌの間および約０．５ｍｌから約２．５ｍｌの間である。
【００６８】
ワクチンの有効性は、ＦＭＤＶの病原性株、有利にはＦＭＤＶ  Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、Ｏ１  ＢＦＳまたはＣａｍｐｏｓ、Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ、Ａｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ、Ａ  Ｉｒａｎ’９６、Ａ２２  Ｉｒａｑ、ＳＡＴ２  Ｓａｕｄｉ  Ａｒａｂｉａ株でヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）などの動物をチャレンジすることによって最後の免疫処置の約２から４週間後に検査されてよい。
【００６９】
さらに他の株は、ＦＭＤＶ株Ａ１０−６１、Ａ５、Ａ１２、Ａ２４／Ｃｒｕｚｅｉｒｏ、Ｃ３／Ｉｎｄａｉａｌ、Ｏ１、Ｃ１−Ｓａｎｔａ  Ｐａｕ、Ｃ１−Ｃ５、Ａ２２／５５０／Ａｚｅｒｂａｉｊａｎ／６５、ＳＡＴ１−ＳＡＴ３、Ａ、Ａ／ＴＮＣ／７１／９４、Ａ／ＩＮＤ／２／６８、Ａ／ＩＮＤ／３／７７、Ａ／ＩＮＤ／５／６８、Ａ／ＩＮＤ／７／８２、Ａ／ＩＮＤ／１６／８２、Ａ／ＩＮＤ／１７／７７、Ａ／ＩＮＤ／１７／８２、Ａ／ＩＮＤ／１９／７６、Ａ／ＩＮＤ／２０／８２、Ａ／ＩＮＤ／２２／８２、Ａ／ＩＮＤ／２５／８１、Ａ／ＩＮＤ／２６／８２、Ａ／ＩＮＤ／５４／７９、Ａ／ＩＮＤ／５７／７９、Ａ／ＩＮＤ／７３／７９、Ａ／ＩＮＤ／８５／７９、Ａ／ＩＮＤ／８６／７９、Ａ／ＡＰＡ／２５／８４、Ａ／ＡＰＮ／４１／８４、Ａ／ＡＰＳ／４４／０５、Ａ／ＡＰＳ／５０／０５、Ａ／ＡＰＳ／５５／０５、Ａ／ＡＰＳ／６６／０５、Ａ／ＡＰＳ／６８／０５、Ａ／ＢＩＭ／４６／９５、Ａ／ＧＵＭ／３３／８４、Ａ／ＯＲＳ／６６／８４、Ａ／ＯＲＳ／７５／８８、Ａ／ＴＮＡｎ／６０／９４７／Ａｓｉａ／１、Ａ／ＩＲＮ／０５、Ａｓｉａ／ＩＲＮ／０５、Ｏ／ＨＫ／２００１、Ｏ／ＵＫＧ／３９５２／２００１、Ｏ／ＵＫＧ／４１４１／２００１、Ａｓｉａ１／ＨＮＫ／ＣＨＡ／０５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ１４９０１０、本明細書に参照により組み込まれる）、ＡｓｉａＩ／ＸＪ（Li, ZhiYong et al. Chin Sci Bull, 2007）、ＨＫ／７０（Chin Sci Bull, 2006, 51(17): 2072−2078）、Ｏ／ＵＫＧ／７０３９／２００１、Ｏ／ＵＫＧ／９１６１／２００１、Ｏ／ＵＫＧ／７２９９／２００１、Ｏ／ＵＫＧ／４０１４／２００１、Ｏ／ＵＫＧ／４９９８／２００１、Ｏ／ＵＫＧ／９４４３／２００１、Ｏ／ＵＫＧ／５４７０／２００１、Ｏ／ＵＫＧ／５６８１／２００１、Ｏ／ＥＳ／２００１、ＨＫＮ／２００２、Ｏ５Ｉｎｄｉａ、Ｏ／ＢＫＦ／２／９２、Ｋ／３７／８４／Ａ、ＫＥＮ／１／７６／Ａ、ＧＡＭ／５１／９８／Ａ、Ａ１０／Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｏ／ＫＥＮ／１／９１、Ｏ／ＩＮＤ４９／９７、Ｏ／ＩＮＤ６５／９８、Ｏ／ＩＮＤ６４／９８、Ｏ／ＩＮＤ４８／９８、Ｏ／ＩＮＤ４７／９８、Ｏ／ＩＮＤ８２／９７、Ｏ／ＩＮＤ８１／９９、Ｏ／ＩＮＤ８１／９８、Ｏ／ＩＮＤ７９／９７、Ｏ／ＩＮＤ７８／９７、Ｏ／ＩＮＤ７５／９７、Ｏ／ＩＮＤ７４／９７、Ｏ／ＩＮＤ７０／９７、Ｏ／ＩＮＤ６６／９８、Ｏ／ＩＮＤ６３／９７、Ｏ／ＩＮＤ６１／９７、Ｏ／ＩＮＤ５７／９８、Ｏ／ＩＮＤ５６／９８、Ｏ／ＩＮＤ５５／９８、Ｏ／ＩＮＤ５４／９８、Ｏ／ＩＮＤ４６９／９８、Ｏ／ＩＮＤ４６５／９７、Ｏ／ＩＮＤ４６４／９７、Ｏ／ＩＮＤ４２４／９７、Ｏ／ＩＮＤ４２３／９７、Ｏ／ＩＮＤ４２０／９７、Ｏ／ＩＮＤ４１４／９７、Ｏ／ＩＮＤ４１１／９７、Ｏ／ＩＮＤ４１０／９７、Ｏ／ＩＮＤ４０９／９７、Ｏ／ＩＮＤ４０７／９７、Ｏ／ＩＮＤ３９９／９７、Ｏ／ＩＮＤ３９／９７、Ｏ／ＩＮＤ３９１／９７、Ｏ／ＩＮＤ３８／９７、Ｏ／ＩＮＤ３８４／９７、Ｏ／ＩＮＤ３８０／９７、Ｏ／ＩＮＤ３７／９７、Ｏ／ＩＮＤ３５２／９７、Ｏ／ＩＮＤ３３／９７、Ｏ／ＩＮＤ３１／９７、Ｏ／ＩＮＤ２９６／９７、Ｏ／ＩＮＤ２３／９９、Ｏ／ＩＮＤ４６３／９７、Ｏ／ＩＮＤ４���１／９７、Ｏ／ＩＮＤ４２７／９８、Ｏ／ＩＮＤ２８／９７、Ｏ／ＩＮＤ２８７／９９、Ｏ／ＩＮＤ２８５／９９、Ｏ／ＩＮＤ２８２／９９、Ｏ／ＩＮＤ２８１／９７、Ｏ／ＩＮＤ２７／９７、Ｏ／ＩＮＤ２７８／９７、Ｏ／ＩＮＤ２５６／９９、Ｏ／ＩＮＤ２４９／９９、Ｏ／ＩＮＤ２１０／９９、Ｏ／ＩＮＤ２０８／９９、Ｏ／ＩＮＤ２０７／９９、Ｏ／ＩＮＤ２０５／９９、Ｏ／ＩＮＤ１８５／９９、Ｏ／ＩＮＤ１７５／９９、Ｏ／ＩＮＤ１７０／９７、Ｏ／ＩＮＤ１６４／９９、Ｏ／ＩＮＤ１６０／９９、Ｏ／ＩＮＤ１５３／９９、Ｏ／ＩＮＤ１４８／９９、Ｏ／ＩＮＤ１４６／９９、Ｏ／ＳＫＲ／２０００、Ａ２２／Ｉｎｄｉａ／１７／７７を含んでよい。
【００７０】
これらのＦＭＤＶ株のさらなる詳細は、European Bioinformatics Information(EMBL-EBI)ウエブページに見出すことができ、関連するすべてのヌクレオチド配列は参照により本明細書に組み込まれる。本発明者らは、すべてのＦＭＤＶ株、本明細書に列挙したものおよびまだ同定されていないものの両方が本開示の教示により、例えば有効なワクチン組成物を産生するために発現され得ることを検討する。同種および異種株の両方がワクチンの有効性を検査するためのチャレンジのために使用される。動物は、皮内、皮下、スプレー、鼻腔内、眼内、気管内および／または経口でチャレンジされてよい。
【００７１】
初回−追加免疫投与は、１から６週間離して、例えば約３週間離して有利に実行されてよい。一実施形態によると、半年に１回の追加免疫または年１回の追加免疫も、有利にはウイルスベクターに基づくワクチンを使用して、想定される。動物は、１回目の投与時に有利には少なくとも６から８週齢である。
初回−追加免疫プロトコールにおいて使用される本発明の組換え抗原性ポリペプチドを含む組成物は、薬学的または獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤に含有される。本発明の手順は、ヒツジ、ウシ、ヤギもしくはブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）ＦＭＤＶから動物を防御するおよび／または感染動物における疾患の進行を予防する。
【００７２】
本明細書の開示が例示の方法によって提供され、本発明がそれに限定されないことは当業者によって理解されるべきである。本明細書の開示および当技術分野の知識から、当業者は投与の回数、投与経路、および各注射プロトコールのために使用される用量をいかなる過度の実験も伴わずに決定できる。
【００７３】
本発明は、本発明により作製された有効量の治療組成物の動物への少なくとも１回の投与を検討する。動物は、オス、メス、妊娠中のメスおよび新生仔であってよい。この投与は、これだけに限らないが、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）もしくは皮下（ＳＣ）注射または鼻腔内を介するまたは経口投与を含む種々の経路を介してよい。本発明による治療組成物は、無針装置（例えばＰｉｇｊｅｔ、Ｄｅｒｍｏｊｅｔ、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ、Ａｖｉｊｅｔ（Ｍｅｒｉａｌ、ＧＡ、ＵＳＡ）、ＶｅｔｊｅｔまたはＶｉｔａｊｅｔ装置（Ｂｉｏｊｅｃｔ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）など）によっても投与されてもよい。プラスミド組成物を投与するための別の手法は、電気穿孔法を使用する（例えばTollefsen et al., 2002、Tollefsen et al., 2003、Babiuk et al., 2002、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／０１１５８号を参照されたい）。別の実施形態では、治療組成物は、遺伝子銃または金微粒子銃（ｇｏｌｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によって動物に送達される。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、標的細胞におけるＦＭＤＶ抗原またはエピトープの送達および発現のための治療有効量の製剤の投与を提供する。治療有効量の決定は、当業者に日常的な実験である。一実施形態では製剤は、ＦＭＤＶ抗原またはエピトープを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、ビヒクルまたは賦形剤を含む。別の実施形態では、薬学的または獣医学的に許容される担体、ビヒクルまたは賦形剤は、宿主動物へのポリヌクレオチドのトランスフェクションもしくは他の移行手段を促進するおよび／または宿主におけるベクターもしくはタンパク質の保持を改善する。
一実施形態では、本明細書に開示の主題は、感染した動物とワクチン接種動物との間の識別（ＤＩＶＡ）のための検出方法を提供する。
【００７５】
本発明のワクチンまたは組成物の使用が、動物におけるＦＭＤＶ感染の検出を可能にすることが本明細書において開示される。本発明のワクチンまたは組成物の使用が、感染した動物とワクチン接種動物との間の識別（ＤＩＶＡ）による動物における感染の検出を可能にすることが本明細書において開示される。方法は、ＦＭＤＶ非構造タンパク質を使用する動物におけるＦＭＤＶの感染の診断について本明細書において開示される（例えばＦＭＤＶ  ３ＡＢＣまたは３Ｄ−特異的ＥＬＩＳＡ）。
【００７６】
製造品
一実施形態では、本明細書に開示の主題は、組換えＦＭＤＶ免疫学的組成物もしくはワクチン、または不活性化ＦＭＤＶ免疫学的組成物もしくはワクチン、組換えＦＭＤＶウイルス性組成物もしくはワクチンのいずれか１つおよび方法を実施するための説明書を含んでよい免疫応答を誘発または誘導する方法を実施するためのキットに方向付けられている。
本発明の別の実施形態は、本発明のＦＭＤＶ抗原を含む組成物またはワクチンおよび組換えＦＭＤＶウイルス性免疫学的組成物もしくはワクチンおよび、動物において免疫応答を誘発するための有効量での送達の方法を実施するための説明書を含む、動物においてＦＭＤＶに対する免疫学的または防御的応答を誘導する方法を実施するためのキットである。
本発明の別の実施形態は、本発明のＦＭＤＶ抗原を含む組成物またはワクチンおよび不活性化ＦＭＤＶ免疫学的組成物もしくはワクチンおよび、動物において免疫応答を誘発するための有効量での送達の方法を実施するための説明書を含む、動物においてＦＭＤＶに対する免疫学的または防御的応答を誘導する方法を実施するためのキットである。
【００７７】
本発明のさらに別の態様は、上に記載の本発明による初回−追加免疫ワクチン接種のためのキットに関する。キットは、少なくとも２個のバイアルを含んでよい：本発明による初回ワクチン接種のためのワクチンまたは組成物を含有する第１のバイアルおよび本発明による追加免疫ワクチン接種のためのワクチンまたは組成物を含有する第２のバイアル。キットは、追加的初回ワクチン接種または追加的追加免疫ワクチン接種のための追加的な第１のまたは第２のバイアルを有利には含有してよい。
続く実施形態は、本発明により包含される。一実施形態では、ＦＭＤＶ抗原またはその断片もしくは変種および薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含む組成物が開示される。別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原を発現する組換えウイルスベクターおよび薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルを含む組成物が開示される。別の実施形態では、ＦＭＤＶ抗原またはその断片もしくは変種がヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）ＦＭＤＶ抗原の少なくとも１５個のアミノ酸を含む免疫原性断片を含む、上に記載の組成物が開示される。一実施形態では、ＦＭＤＶ抗原またはその断片もしくは変種が部分的に精製されている上記組成物が開示される。一実施形態では、ＦＭＤＶ抗原またはその断片もしくは変種が実質的に精製されている上記組成物が開示される。
【００７８】
一実施形態では、ＦＭＤＶ抗原またはその断片もしくは変種がヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）ＦＭＤＶポリペプチドである、上記組成物が開示される。一実施形態では、ＦＭＤＶポリペプチドがＰ１−３Ｃポリペプチド、Ｐ１ポリペプチド、ＶＰ０ポリペプチド、ＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ３ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチド、ＶＰ４ポリペプチド、２Ａポリペプチド、２Ｂ１ポリペプチドまたは３Ｃポリペプチドである、上記組成物が開示される。一実施形態では、ＦＭＤＶ抗原またはその断片もしくは変種が配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３または１６に記載の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、上記組成物が開示される。一実施形態では、ＦＭＤＶ抗原が配列番号３、７、９、１１、１４、１５、１７、１８、１９または２０に記載の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている、上記組成物が開示される。一実施形態では、薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルが油中水乳剤または水中油乳剤である、上記組成物が開示される。別の実施形態では、上記組成物を動物に投与することを含む、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）ＦＭＤＶに感染感受性である動物にワクチン接種する方法が開示される。一実施形態では、初回−追加免疫レジメンを含む、ヒツジ、ウシ、ヤギまたはブタ（ｓｗｉｎｅ）ＦＭＤＶに感染感受性である動物にワクチン接種する方法が開示される。一実施形態では：配列番号１、２、４、５、６、８、１０、１２、１３、または１６に記載の配列を有するポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、昆虫細胞において発現された実質的に精製された抗原性ポリペプチドが開示される。いずれの実施形態でも動物は、好ましくはヒツジ、ウシ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）またはヤギである。一実施形態では、動物においてＦＭＤＶ感染を診断する方法が開示される。さらに別の実施形態では、少なくとも２個のバイアルを含む初回−追加免疫ワクチン接種のためのキットであって、第１のバイアルがＦＭＤＶ抗原またはその断片もしくは変種を含む組成物を含有し、第２のバイアルがＦＭＤＶ抗原を含有するまたは発現する組換えウイルスベクターを含有する、キットが開示される。
【００７９】
薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたはアジュバントまたは賦形剤は、当業者に周知である。例えば薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、０．９％ＮａＣｌ溶液（例えば生理食塩水）またはリン酸緩衝液であってよい。本発明の方法のために使用され得る他の薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、これだけに限らないが、ポリ−（Ｌ−グルタミン酸）またはポリビニルピロリドンを含む。薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたはアジュバントまたは賦形剤は、ベクター（またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発明のベクターから発現されるタンパク質）の投与を促進する任意の化合物または化合物の組合せであってよく；有利には、担体、ビヒクルまたは賦形剤はベクター（またはタンパク質）のトランスフェクションを促進および／または保持を改善できる。用量および用量容積は、本明細書において一般的記載で考察され、当技術分野の知識と合わせて読まれる本開示から、過度の実験を伴わずに当業者によっても決定され得る。
【００８０】
プラスミドのために有利で排他的でなく好適である四級アンモニウム塩を含有する陽イオン性脂質は、有利には下の式を有するものである。
【化１】
2017530124.tif 000003
式中、Ｒ１は炭素原子１２個から１８個を有する飽和または不飽和直鎖脂肪族ラジカルであり、Ｒ２は炭素原子２個または３個を含有する別の脂肪族ラジカルであり、Ｘはアミンまたはヒドロキシル基、例えばＤＭＲＩＥである。別の実施形態では、陽イオン性脂質は、中性脂質、例えばＤＯＰＥと会合され得る。
【００８１】
これらの陽イオン性脂質の内、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ｂｉｓ（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアンモニウム；ＷＯ９６／３４１０９）が優先され、有利にはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成するように中性脂質、有利にはＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；Behr, 1994）と会合される。
有利には、アジュバントを含むプラスミド混合物は、即座に、有利には調製物の投与と同時にまたは調製物の投与の直前に形成される；例えば投与の直前またはこれに先立って、プラスミドアジュバント混合物は形成され、有利には混合物が複合体を形成するために投与の前に十分な時間、例えば投与に先立つおよそ３０分間などの投与に先立つ約１０から約６０分間が与えられるようにされる。
【００８２】
ＤＯＰＥが存在する場合、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥモル比は有利には約９５：約５から約５：約９５、より有利には約１：約１、例えば１：１である。
ＤＭＲＩＥまたはＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥアジュバント：プラスミド質量比は、約１０：約１から約１：約５、および約１：約１から約１：約２、例えば１：１から１：２などの約５０：約１から約１：約１０の間であってよい。
【００８３】
別の実施形態では、薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、アジュバントまたはビヒクルは、油中水乳剤であってよい。好適な油中水乳剤の例は、４℃で安定および流動性であり：抗原含有水性相６から５０ｖ／ｖ％、好ましくは１２から２５ｖ／ｖ％、非代謝可能油（例えばパラフィン油などのミネラル油）および／または代謝可能油（例えば植物油または脂肪酸、ポリオールまたはアルコールエステル）を全体または部分的に含有する油相５０から９４ｖ／ｖ％、界面活性剤０．２から２０ｐ／ｖ％、好ましくは３から８ｐ／ｖ％を含有し、後者は全体または部分的または混合物でいずれかのポリグリセロールエステルである、油ベース油中水ワクチン乳剤を含み、前記ポリグリセロールエステルは、好ましくはポリグリセロール（ポリ）リシノレートまたはポリオキシエチレンリシン油または他の水素化ポリオキシエチレンリシン油である。油中水乳剤において使用され得る界面活性剤の例は、エトキシル化ソルビタンエステル（例えばポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（ＴＷＥＥＮ  ８０（登録商標））、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＣＴから入手可能）ソルビタンエステル（例えばソルビタンモノオレート（ＳＰＡＮ  ８０（登録商標））、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）を含む。加えて、油中水乳剤に関して、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９１９，０８４号、例えばその例８も参照されたい。いくつかの実施形態では、抗原含有水性相は、１つまたは複数の緩衝剤を含む生理食塩水を含む。好適な緩衝溶液の例は、リン酸緩衝生理食塩水である。有利な実施形態では、油中水乳剤は、水／油／水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）三重乳剤（米国特許第６，３５８，５００号）であってよい。他の好適な乳剤の例は、米国特許第７，３７１，３９５号に記載されている。
【００８４】
本発明による免疫学的組成物およびワクチンは、１つまたは複数のアジュバントを含むまたは本質的になってよい。本発明の実施における使用のための好適なアジュバントは、（１）アクリルもしくはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸およびアルケニル誘導体ポリマー、（２）１つもしくは複数の非メチル化ＣｐＧユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列などの免疫刺激配列（ＩＳＳ）（Klinman et al., 1996, PNAS USA, 93(7): 2879-83; WO98/16247）、（３）M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, 6: 147, 183によって発表された“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”の１４７頁に記載のＳＰＴ乳剤、および同書１８３頁に記載の乳剤ＭＦ５９などの水中油乳剤、（４）四級アンモニウム塩、例えばＤＤＡを含有する陽イオン脂質、（５）サイトカイン、（６）水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム、（７）サポニンまたは（８）本出願に参照により引用されるおよび組み込まれるいずれかの文献に考察される他のアジュバント、または（９）その任意の組合せもしくは混合物である。
【００８５】
ウイルスベクターに特に好適である水中油乳剤（３）は：軽質流動パラフィン油（ヨーロッパ薬局方型）、スクアレンなどのイソプレノイド油、スクアレン、アルケンのオリゴマー化から生じる油、例えばイソブテンまたはデセン、植物油などの直鎖アルキル基を有する酸のエステルまたはアルコール、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ（カプリル酸／カプリン酸）、グリセロールトリ（カプリル酸／カプリン酸）およびプロピレングリコールジオレエート、または分枝状のエステル、脂肪アルコールまたは酸、特にイソステアリン酸エステルに基づいてよい。
【００８６】
油は、乳剤を形成するために乳化剤と組み合わせて使用される。乳化剤は、一方においてはソルビタン、マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ）（例えばアンヒドロマンニトールオレート（ａｎｈｙｄｒｏｍａｎｎｉｔｏｌ  ｏｌｅａｔｅ））、グリセロール、ポリグリセロールまたはプロピレングリコールおよび他方においてはオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸のエステルなどの非イオン性界面活性剤であってよく：前記エステルは任意選択でエトキシル化される、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ、例えばＬ１２１などのポリオキシプロピレンポリオキシエチレン共重合体ブロックである。
【００８７】
（１）型アジュバントポリマーの内、架橋アクリルまたはメタクリル酸のポリマー、特に糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されたものが優先される。これらの化合物は、カルボマーの名称で公知である（Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996）。当業者は、米国特許第２，９０９，４６２号も参照できる、少なくとも３個のヒドロキシル基、好ましくは８個以下のそのような基を有するポリヒドロキシ化合物によって架橋されたそのようなアクリルポリマーを提供し、少なくとも３個のヒドロキシル基の水素原子は少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和、脂肪族ラジカルによって置き換えられている。好ましいラジカルは、２個から４個の炭素原子を含有するもの、例えばビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルはメチルなどの他の置換基も含有してよい。名称Ｃａｒｂｏｐｏｌ（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）で販売されている製品は、特に好適である。それらは、アリルサッカロースによってまたはアリルペンタエリスリトールによって架橋されている。その内、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐが参照される。
【００８８】
無水マレイン酸アルケニル誘導体共重合体に関して、直鎖または架橋されたエチレン無水マレイン酸共重合体であり、例えばジビニルエーテルによって架橋されている、ＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）が優先される。J. Fields et al., 1960も参照される。
構造に関して、アクリルまたはメタクリル酸ポリマーおよびＥＭＡは、好ましくは次の式：
【化２】
2017530124.tif 000004
を有する基本単位によって形成される。
式中：
−  Ｒ１およびＲ２は、同じまたは異なっていてよく、ＨまたはＣＨ３を表す
−  ｘ＝０または１、好ましくはｘ＝１
−  ｘ＋ｙ＝２でｙ＝１または２。
ＥＭＡについて、ｘ＝０およびｙ＝２ならびにカルボマーについてｘ＝ｙ＝１。
【００８９】
これらのポリマーは水または生理的食塩水（２０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）に可溶性であり、ｐＨは、発現ベクター（複数可）が組み込まれ得るアジュバント溶液を提供するように７．３から７．４に、例えばソーダ（ＮａＯＨ）によって調整することができる。最終免疫学的またはワクチン組成物中のポリマー濃度は、約０．０１から約１．５％ｗ／ｖ、約０．０５から約１％ｗ／ｖおよび約０．１から約０．４％ｗ／ｖの範囲であってよい。
【００９０】
１つまたは複数のサイトカイン（５）は、免疫学的もしくはワクチン組成物中でタンパク質形態であってよい、または宿主において１つもしくは複数の免疫原またはそのエピトープ（複数可）と共発現されてよい。１つもしくは複数の免疫原またはそのエピトープ（複数可）を発現しているのと同じベクターによって、あるいは別のベクターによってのいずれかでの１つまたは複数のサイトカインの共発現が優先される。
本発明は、そのような組合せ組成物を；例えば活性構成成分を、有利にはアジュバント、担体、サイトカインおよび／または希釈剤と合わせて、混合することによって、調製することを包含する。
【００９１】
本発明において使用され得るサイトカインは、これだけに限らないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、ポリイノシンおよびポリシチジン酸、シチジンリン酸グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）ならびにトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）を含む。サイトカインが本発明の免疫学的またはワクチン組成物と同時投与および／または連続投与されてよいことは理解される。それにより、例えば本発明のワクチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏで好適なサイトカイン、例えばワクチン接種されるまたは免疫学的が誘発される宿主に合致するサイトカイン（例えばウシに投与される調製物のためのウシサイトカイン）を発現する外来性核酸分子も含有してよい。
【００９２】
具体的な実施形態では、アジュバントは、ＴＳ６、ＴＳ７、ＴＳ８およびＴＳ９乳剤（ＵＳ７，３７１，３９５）；ＬＲ３およびＬＲ４（ＵＳ７，６９１，３６８）；ＴＳＡＰ（ＵＳ２０１１０１２９４９４）；ＴＲＩＧＥＮ（商標）（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｌａｂｓ）；合成ｄｓＲＮＡ（例えばポリ−ＩＣ、ポリ−ＩＣＬＣ［ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標）］）；ならびにＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）アジュバント（Ｗ／Ｏ、Ｗ／Ｏ／Ｗ、Ｏ／Ｗ、ＩＭＳおよびゲル；すべてＳＥＰＰＩＣによって製造）を含んでよい。
【００９３】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現ポリペプチドに基づく免疫学的組成物および／またはワクチンの場合、用量はＦＭＤＶ抗原、エピトープまたは免疫原の約１μｇから約２０００μｇ、約５０μｇから約１０００μｇおよび約１００μｇから約５００μｇを含んでよい。用量は、約１０2から約１０20、約１０3から約１０18、約１０4から約１０16、約１０5から約１０12ＶＬＰを含んでよい。ＦＭＤＶ抗原を発現しているウイルスベクターに基づく免疫学的組成物および／またはワクチンの場合、用量は、約１０3ＴＣＩＤ50から約１０15ＴＣＩＤ50（５０％組織培養感染用量）、約１０3ＴＣＩＤ50から約１０14ＴＣＩＤ50、約１０3ＴＣＩＤ50から約１０13ＴＣＩＤ50、約１０3ＴＣＩＤ50から約１０12ＴＣＩＤ50を含んでよい。用量容積は、約０．１から約１０ｍｌの間、有利には約０．２から約５ｍｌの間であってよい。
本発明は、ここに次の非限定的例の方法によりさらに記載される。
【実施例】
【００９４】
ＤＮＡ挿入物、プラスミドおよび組換えウイルスまたはバキュロウイルスベクターの構築は、J. Sambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989）によって記載された標準的分子生物学技術を使用して実行した。
【００９５】
（例１）
バキュロウイルス／昆虫細胞系でのＦＭＤＶ抗原の構築および発現
血清型Ａ  ＦＭＤＶの陽性株ＲＮＡゲノムは、２個の非コード領域に隣接された単一のＯＲＦ（１６６２アミノ酸）からなる。ＯＲＦは、３個の部分を有する。第１の部分は成熟および切断後に４個のカプシド構成成分（ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１）の発現を導くポリタンパク質Ｐ１−２Ａである。第２の部分は２個のタンパク質（２Ｂおよび２Ｃ）を含有し、ＲＮＡ合成および細胞膜小胞増殖に関与するＰ２である。第１の部分は、４個のタンパク質（３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）を含有するＰ３である。３Ｃは、ポリタンパク質の切断に関与する主なものである。３Ｄは別のプロテアーゼであり、３Ａ／３Ｂは膜足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）、病態形成、ＲＮＡ合成およびキャプシド形成に関与する。Ｐ１−２Ａおよび３Ｃは、ＦＭＤＶカプシド粒子またはＦＭＤＶ  ＶＬＰを構成するすべてのタンパク質の発現および切断のために必要である（図２を参照されたい）。潜在的機能性ドメインを下の表１に示す。
【００９６】
【表１】
2017530124.tif 000005
【００９７】
（例１．１）
ジスルフィド架橋の作製（＋最適化翻訳開始コンテクスト（ｃｏｎｔｅｘｔ））および対応する組換えバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ０９７の生成のためにＶＰ２（Ｈ９３Ｃ）中に変異を有するＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ株のポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドｐＭＥＢ０９７の構築
プラスミドｐＭＥＢ０９７の生成
ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ株のポリタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドを含有するプラスミドｐＭＥＢ０９６をプラスミドｐＭＥＢ０９７を生成するために変異導入した。プラスミドｐＭＥＢ０９７は、ＶＰ２（Ｈ９３Ｃ）またはＰ１（Ｈ１７９Ｃ）に変異を含有する修飾ポリタンパク質（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を含有している。修飾ポリタンパク質（配列番号２）は、ヒスチジンのシステインによる置換をＶＰ２の９３位またはＰ１の１７９位に含有している。
【００９８】
組換えバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ０９７の生成
プラスミドｐＭＥＢ０９７（図３を参照されたい）を、相同組換えによってポリヘドリンプロモーターの調節下で、ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ株のＦＭＤＶ  Ｐ１／２Ａ／２Ｂ’３Ｂ’／３Ｃ遺伝子（ＶＰ２の９３位にシステインを有する）をコードする組換えバキュロウイルスを生成するために使用した。ＡＴＣＣ由来のスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）９昆虫細胞をプラスミドｐＭＥＢ０９７およびＢｓｕ３６Ｉトリプルカット（ｔｒｉｐｌｅ−ｃｕｔ）直鎖化ＡｃＮＰＶ  ＤＮＡで、製造者のプロトコール（Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って同時トランスフェクトした。同時トランスフェクション上清からの組換えバキュロウイルスを２回プラーク精製した。クローン５個を２８℃、２５ｃｍ2単層フラスコ規模で増幅した（継代１）。クローン５個をＳｆ９昆虫細胞で増幅し、組換えクローンをＦＭＤＶ  Ａ２４血清型に特異的であるモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。クローン２は、良好なレベルの発現を示した。このクローンを２８℃、５０ｍＬ規模で三角フラスコ（懸濁物）、１０５ｒｐｍでさらに増幅した（継代２）。２００ｍＬ規模での第３継代（継代３）をタンパク質発現のために使用するウイルス保存物を得るために実施した。次いでこのウイルス保存物をプラークアッセイによって滴定した。ウイルス保存物の獲得は、２％ＦＣＳを補充したＳＦ９００ＩＩＩ培地を使用して実施した。滴定後、組換えバキュロウイルス保存物（継代３）を無血清培地でのタンパク質産生のために使用した。
【００９９】
バキュロウイルスＢａｃＭＥＢ０９７の発現分析
昆虫細胞（Ｓｆ９−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を生成されたバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ０９７によって、およびＢａｃＭＥＢ０８４（変異を含まない参照として）によって感染効率（ＭＯＩ）１ｐｆｕ／ｍｌで感染させた。昆虫細胞を１０５ｒｐｍでＦＣＳを含まないＳｆ９００ＩＩ培地中、４日間、２８℃で増殖させた。上清をおよそ４倍に濃縮し：Ａ＝無処置、Ｂ＝１時間、５６℃、Ｃ＝ＨＣｌをｐＨ５未満になるまで添加、のとおり処置した。
【０１００】
カプシドタンパク質のＶＬＰへの正しい集合を電子顕微鏡検査によって評価した（図４、カラム「Ａ」を参照されたい）。２５〜３０ｎｍの粒子は、３１ｎｍの一定の大きさの丸から正二十面体の非常に均一な形態を示し、染色剤の浸透によって特徴付けられ、それによりＦＭＤＶ様と解釈された。粒子の数は１ｍｌあたり約１０8個と推定された。
さらに、ＶＬＰの安定性は、１時間、５６℃での処置（カラム「Ｂ」）および培地の酸性化（カラム「Ｃ」）後に見られたとおり、ＢａｃＭＥＢ０９７中の変異によってもたらされたジスルフィド架橋の形成で明らかに増加した。
【０１０１】
ＦＭＤＶタンパク質の同一性をＦＭＤＶ  Ａ２４血清型に特異的であるモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによる上清の分析によって確認した（図５を参照されたい）。
結論として、トランスファープラスミドｐＭＥＢ０９７で生成されたバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ０９７は、Ｓｆ９昆虫細胞におけるＦＭＤＶカプシド発現およびプロセシングを誘導する。これらのＦＭＤＶ発現カプシドは、ＦＭＤＶ様ビリオンの特徴的形態を有するＶＬＰに自己集合した。ジスルフィド架橋の形成に関与する変異は、ＢａｃＭＥＢ０８４（ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ株のポリタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドを含有するプラスミドｐＭＥＢ０９６を含有している）によって得られたＶＬＰと比較して、ＶＬＰの安定性を増加させた（熱処置または酸性化後）。
【０１０２】
（例１．２）
ジスルフィド架橋の作製（＋最適化翻訳開始コンテクスト）およびＦＭＤＶカプシドタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ０９９の生成のために、ＶＰ２（Ｓ９３Ｃ）に変異を有するＦＭＤＶ  Ｏ１  ｍａｎｉｓａ株のポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドｐＭＥＢ０９９の構築
ＦＭＤＶ  Ｏ１  ｍａｎｉｓａ株のポリタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドを含有するプラスミドｐＭＥＢ０９５をプラスミドｐＭＥＢ０９９を生成するように変異導入した。プラスミドｐＭＥＢ０９９は、ＶＰ２（Ｓ９３Ｃ）またはＰ１（Ｓ１７９Ｃ）に変異を含有している修飾ポリタンパク質（配列番号６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７）を含有している。修飾ポリタンパク質（配列番号６）は、ＶＰ２の９３位またはＰ１の１７９位にセリンのシステインによる置換を含有する。
【０１０３】
組換えバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ０９９の生成および発現をＢａｃＭＥＢ０９７について例１．１において記載の手順により実行した。昆虫細胞（Ｓｆ９−Ｉｎｖ）にバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ０９９を０．５ｐｆｕ／ｍｌの感染効率（ＭＯＩ）で感染させた。昆虫細胞を１０５ｒｐｍでＦＣＳを含まないＳｆ９００ＩＩ培地中で４日間、２８℃で増殖させた。タンパク質産生を、濃縮および１時間、５６℃での加熱を伴うまたは伴わない、上清の処置後（コバレントケージ変異の効果を見るために）に行った。処置した上清を電子顕微鏡検査によっておよび特異的ＥＬＩＳＡによって直接分析した（図６参照されたい）。
【０１０４】
結果（図６Ａおよび６Ｂ）は、ＥＬＩＳＡ方法で顕著な力価が得られたことを示している。このＥＬＩＳＡは、ＶＬＰに特異的であり、ＢａｃＭＥＢ０９９による感染後のＶＬＰの存在を示唆している。
カプシドタンパク質のＶＬＰへの正しい集合を電子顕微鏡検査によって評価した（図６Ｂ）。２５〜３０ｎｍの粒子は、３１ｎｍの一定の大きさの丸から正二十面体の非常に均一な形態を示し、染色剤の浸透によって特徴付けられ、それによりＦＭＤＶ様と解釈された。粒子の数は１ｍｌあたり約１０8個と推定された。
結論として、トランスファープラスミドｐＭＥＢ０９９で生成されたバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ０９９は、Ｓｆ９昆虫細胞におけるＦＭＤＶカプシド発現およびプロセシングを誘導した。これらのＦＭＤＶ発現カプシドは、ＦＭＤＶ様ビリオンの特徴的形態を有するＶＬＰに自己集合した。
（例１．３）
ジスルフィド架橋の作製（＋最適化翻訳開始コンテクスト）およびＦＭＤＶカプシドタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスの生成のために、ＦＭＤＶ  Ｉｒａｑ株のポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドｐＭＥＢ１０６および、ＶＰ２に変異を有するＦＭＤＶ  Ａｓｉａ株のポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドｐＭＥＢ１０４の構築
ＦＭＤＶ  Ｉｒａｑ株のＰ１（１７９位のＣ）に変異を含有する修飾ポリタンパク質（配列番号８）をコードしているポリヌクレオチド（配列番号９）およびＦＭＤＶ  Ａｓｉａ株のＰ１（１７９位のＣ）に変異を含有している修飾ポリタンパク質（配列番号１０）をコードしているポリヌクレオチド（配列番号１１）を含有するプラスミドを例１．１に概説の手順により構築した。
【０１０５】
ＦＭＤＶ  Ｉｒａｑ株の修飾ポリタンパク質（配列番号８）およびＦＭＤＶ  Ａｓｉａ株のポリタンパク質（配列番号１０）を発現している組換えバキュロウイルスの生成および発現をＢａｃＭＥＢ０９７について例１．１に記載の手順により実行した。
トランスファープラスミドｐＭＥＢ１０６で生成されたバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ１０６は、Ｓｆ９昆虫細胞でのＦＭＤＶカプシド発現およびプロセシングを誘導した。トランスファープラスミドｐＭＥＢ１０４で生成されたバキュロウイルスＢａｃＭＥＢ１０４は、Ｓｆ９昆虫細胞でのＦＭＤＶカプシド発現およびプロセシングを誘導した。これらのＦＭＤＶ発現カプシドは、ＦＭＤＶ様ビリオンの特徴的形態を有するＶＬＰに自己集合した。
【０１０６】
（例２）
バキュロウイルス発現「ケージ」ＦＭＤＶ  ＶＬＰの安定性
大規模（１５０Ｌ）にＦＭＤＶ  ＶＬＰを産生する能力を実証した。１５０Ｌバッチ、製造規模で増殖させた場合、バキュロウイルス発現コバレントケージおよび野生型Ａ２４  ＦＭＤＶ−ＶＬＰの十分な力価が得られた（ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ50７．１４／ｍＬ）（ＣＣＩＤ：細胞培養感染用量）。驚くべきことに、試料加熱後でさえ多量の安定ＦＭＤ  ＶＬＰが存在した（加熱２．１４ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ50／ｍｌに対して、非加熱２．１９ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ50／ｍｌ）（図８を参照されたい）。さらに図８に示すとおり、ＥＭ計数は、４Ｌおよび１５０Ｌバッチの両方から優れた数のＶＬＰを明らかにした。
【０１０７】
（例３）
バキュロウイルス、ウキクサおよびカナリアポックス発現ＦＭＤＶでのウシ（ｃａｔｔｌｅ）のワクチン接種、および続く病原性チャレンジ
この研究の目的は、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）において、ＴＳ６アジュバント中に製剤化された３種の実験用ＦＭＤ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ抗原のＦＭＤ病原性チャレンジに対する有効性を検査することであった。
【０１０８】
アオウキクサ属（ウキクサ、ＵＳ２０１１／０２３６４１６を参照されたい）、バキュロウイルスまたはｖＣＰ（カナリアポックスウイルス）発現抗原のいずれかを含有するワクチンをＤ０にウシに投与した（表２．１）。ワクチン防御は、関連ヨーロッパ薬局方研究書によりＤ２１に実施された病原性ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏチャレンジに続くウシの臨床モニタリングを通じて評価した（表２．２）。対照におけるＦＭＤ病変がチャレンジを検証した。バキュロウイルスワクチン接種群の動物２頭は、完全防御を示して病変から完全に防御された一方、他の３頭は部分防御を表す病変の非常に限定された拡張を表した。Ｇ２およびＧ３の動物は、病変の強度は変化していたがすべて病変を表した。中和力価データを図９および図１０に示す。ワクチン接種３週間後（Ｄ２１）、明らかな抗体陽転がＧ２のすべての仔ウシにおいて観察された。Ｇ１およびＧ３では、わずかな抗体陽転が観察された、またはされなかった。対照はその日に陰性であった。すべての仔ウシは、チャレンジ（Ｄ２５またはＤ２８）後に強く抗体陽転した。抗体応答率は、Ｄ２５よりもＤ２８でおよび対照よりもＧ２のワクチン接種動物でさらに強く表れた。この観察は、Ｇ２でのワクチン接種の初回刺激効果を示唆している。結果は、バキュロウイルスＦＭＤＶ  Ａ２４（野生型Ａ２４）ワクチン群が他の２群と比較した場合に、最も高いＳＮ力価を提供し、病原性ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏチャレンジに対する防御を提供したことを示している。
【０１０９】
【表２】
2017530124.tif 000006
【０１１０】
【表３】
2017530124.tif 000007
【０１１１】
（例４）
ＦＭＤＶチャレンジ研究におけるさまざまな実験用ＦＭＤ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏワクチン（バキュロウイルス発現野生型ＦＭＤＶ）のウシ（ｃａｔｔｌｅ）における防御の評価
研究の目標は、ＴＳ６／サポニンアジュバント中に製剤した３個の実験用ＦＭＤ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ抗原のＦＭＤ病原性チャレンジに対する有効性を、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）において検査することであった。バキュロウイルス（ＢａｃＭＥＢ０８４、ろ過または非ろ過）またはカナリアポックスウイルスのいずれかで発現されたＦＭＤ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ抗原を含有するワクチンをＤ０にウシに投与した。ワクチン防御をＤ２１に実施した病原性ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏチャレンジに対して（関連ヨーロッパ薬局方研究書により）評価した。
【０１１２】
【表４】
2017530124.tif 000008
【０１１３】
【表５】
2017530124.tif 000009
【０１１４】
２個のバキュロウイルスワクチンは、全量および１／４のワクチン用量で１００％の動物において防御を実証した。ろ過バキュロウイルスワクチンは、１／１６ワクチン用量でさえ６０％の動物において防御的であった。カナリアポックスウイルスワクチンは、全用量で８０％の動物において防御を実証した。図１１Ａ、１１Ｂおよび図１２Ｃは、経時的ＦＭＤＶ  Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ抗体力価を示すグラフおよび表を示している。結果は、ワクチン接種後３週間（Ｄ２１）に、明らかな抗体陽転がすべてのワクチン接種した仔ウシにおいて観察されたことを示す。バキュロワクチン接種群において用量／効果関係があった（Ｇ１−Ｇ２−Ｇ３およびＧ５−Ｇ６）。対照は両日で陰性であった。すべてのワクチン接種した仔ウシはチャレンジ後に強く抗体陽転した（Ｄ２５およびＤ２８）。抗体応答率は、Ｄ２５よりもＤ２８においてさらに強く表れた。対照における抗体陽転はいくらか弱かった。図１２Ａおよび１２Ｂは、経時的な体温の展開を表している。結果は、対照だけが顕著な体温上昇を表したことを示している。ワクチンは直腸温を上昇させなかった。
【０１１５】
これらのデータを使用して、ＰＤ５０をロジスティック回帰分析およびＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を使用して算出した。ロジスティック回帰分析法は、ワクチンＡの強度＞１６ＰＤ50を概算した。Ｋａｒｂｅｒ法は、ワクチンＡの強度＞２６ＰＤ50を概算した。概算間に差異があった一方で、両方の方法は、ワクチンＡの高度に顕著で実質的な有効性を示唆している。臨床結果を考慮すると、ワクチンＢについての同様の概算もワクチンＢの優れた有効性を示唆した。
【０１１６】
（例５）
バキュロウイルスを使用する実験用ＦＭＤＶ製剤の仔ブタにおける免疫原性
この研究の目的は、バキュロウイルスにおいて発現され、ＴＳ６またはＴＳ６＋サポニン中に製剤化された４種のＦＭＤＶ抗原の免疫原性を評価することであった。ワクチンを次の割合で調製した（表４．１）。
【０１１７】
【表６】
2017530124.tif 000010
【０１１８】
研究された抗原は、血清型（Ａ２４  ＣｒｕｚｅｉｒｏもしくはＯ１−Ｍａｎｉｓａ）、産生方法（昆虫細胞もしくはカイコ）または挿入物（標準もしくはコバレントケージ）によって異なっていた。用語「コバレントケージ」は、システイン残基の置換によって達成されるＦＭＤＶ  Ｐ１ペプチド中の天然に存在しないジスルフィド結合の確立を指す。評価は、２１日の間隔で２回筋肉内にワクチン接種された若年の仔ブタにおいて実施した。仔ブタを各ワクチン接種に続いて全身反応についてモニターし、ＦＭＤＶ−Ａ２４またはＦＭＤＶ−Ｏ１Ｍ中和抗体力価についてＤ１、Ｄ２０およびＤ４２にモニターした。
【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
Ｏ１−Ｍａｎｉｓａバキュロウイルス発現抗原は、Ｇ５のいずれの動物においても抗体陽転を誘発しなかった。これらのデータは、「コバレントケージ」変異を含有するバキュロウイルス産生ＦＭＤＶサブユニットが、免疫原性であることを初めて実証した（下の表５を参照されたい）。さらに本明細書のデータは、「ケージド（ｃａｇｅｄ）」ＦＭＤＶサブユニットが、未修飾野生型ＦＭＤＶと比較した場合に顕著にさらに増殖性、有効および安定であったことを強く示した。さらにカイコに基づくワクチンは、検査した他のワクチンよりも顕著に多い抗原を含有しているとは考えられなかった。
【０１２１】
【表８】
2017530124.tif 000012
結論として、表５における結果によって示されるとおり、すべてのＳＦ９細胞培養、バキュロウイルス発現Ａ２４  ＶＬＰ（群Ｇ１、Ｇ２およびＧ３）は、顕著な「追加免疫」効果をもたらした（すなわち２回目投与は抗体陽転動物の数を顕著に増加させた）。対照的にカイコ培養Ａ２４  ＶＬＰは、初期および持続性血清学的応答を明らかな追加免疫効果を誘発することなく誘発すると考えられる。
【０１２２】
（例６）
バキュロウイルス発現Ａ２４  ＦＭＤＶ  ＶＬＰの酸および熱安定性
Ａ２４  ＦＭＤＶ  ＶＬＰを酸および熱処置に供し、それらの安定性をＥＭ（図１３）およびＥＬＩＳＡ分析（図１４）を使用して評価した。図に示すとおり、コバレントケージＶＬＰは、低ｐＨおよび熱の両方に顕著に耐性であったが野生型ＶＬＰはそうではなかった。さらに、図１５および表６に示すとおりコバレントケージＶＬＰは、５℃で保存した場合にそれらの野生型対応物と比較して経時的に顕著により安定であった。
【０１２３】
【表９】
2017530124.tif 000013
【０１２４】
結論として、「コバレントケージ変異」を有するＡ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ血清型からのＶＬＰの安定化は、加熱または酸性化処置への耐性に関して高度に有効であった。コバレントケージは、１８カ月保存後のＶＬＰを安定化させた。いくつかのＦＭＤＶ血清型は、Ａ２４  Ｃｒｕｚｅｉｒｏ、Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ（図１６、ＥＭおよび図１７、ＥＬＩＳＡ）、Ａｓｉａ１  ＳｈａｍｉｒおよびＡ２２  Ｉｒａｑを含んで、コバレントケージ変異の導入によって効果的に安定化されたことが示された。図１７は、安定化ＶＬＰ（コバレントケージ、ＢａｃＭＥＢ０９９）に加熱の影響が無いことを示す一方で標準ＦＭＤＶ  Ｏ１−Ｍａｎｉｓａ活性成分について加熱後にシグナルが検出されず、標準ＦＭＤＶ  Ｏ１  Ｍａｎｉｓａについては加熱後に集合したＶＬＰが無いことを示している。
【０１２５】
（例７）
バキュロウイルスＦＭＤ  Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ（修飾、コバレントケージ）で製剤化されたワクチンの通常飼育の仔ブタでの免疫原性
研究の目的は、ＴＳ６中に製剤化された２種のバキュロウイルスＦＭＤ  Ｏ１−Ｍａｎｉｓａ抗原および１種のアデノウイルスベクターＦＭＤＶ  Ｏ１−Ｍａｎｉｓａの通常飼育のブタ（ｐｉｇ）における安全性および有効性を評価することであった。各製剤を３週間離した２回注射で投与した（Ｄ０−Ｄ２１）。ブタ（ｐｉｇ）はＤ０に１１〜１２週齢であり、ワクチンの２ｍＬ筋肉内感染を受けた。安全性を局所および全身反応のモニタリングを通じて評価した。有効性を血清学的（血清中和力価）モニタリング（Ｄ−１、Ｄ２０、Ｄ４３）および細胞免疫（ＣＭＩ）アッセイ（Ｄ２７、Ｄ４３）を通じて評価した。
【０１２６】
【表１０】
2017530124.tif 000014
【０１２７】
血液試料を細胞免疫（ＣＭＩ）アッセイのためにＤ２７およびＤ４３に回収した。試料を再刺激後にγインターフェロン（ＩＦＮγ）分泌細胞定量、形質細胞定量またはメモリーＢ細胞定量のいずれかについてアッセイした（表７．２を参照されたい）。すべての定量はＥＬＩＳｐｏｔによって実施した。
【０１２８】
【表１１】
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【０１２９】
結果は、バキュロウイルス発現野生型ＦＭＤＶ  Ｏ１  Ｍ（例５を参照されたい）とは異なり、バキュロウイルス発現修飾（コバレントケージ）ＦＭＤＶ  Ｏ１  Ｍは、仔ブタにおいて抗体陽転を誘発したことを驚くべきことに示した。下の表７．３に示すとおり、１回目のワクチン接種（Ｄ０）接種後、抗体陽転が２個のバキュロウイルス群（Ｇ１およびＧ２）においてＤ２０に観察された。２回目のワクチン接種後、追加免疫効果が両群（Ｇ１およびＧ２）において観察された。
【０１３０】
【表１２】
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図２０に示すとおり、特異的ＩｇＧ分泌形質細胞をバキュロウイルス発現ＦＭＤＶ−ＶＬＰ（修飾、コバレントケージ）／ＴＳ６ワクチン接種群（Ｇ１およびＧ２）の両方において検出した。特異的ＩｇＧ分泌形質細胞は、Ｇ４においてよりもＧ１およびＧ２において顕著に高かった。特異的ＩｇＧ分泌形質細胞はＧ３において検出されなかった。
【０１３１】
図２１は、多数の特異的ＩｇＧ分泌メモリーＢ細胞が群Ｇ１およびＧ２のすべてのワクチン接種ブタ（ｐｉｇ）において検出され、より少ない（ｗｅａｋ  ｐｏｒｔｉｏｎ）特異的ＩｇＧ分泌メモリーＢ細胞がＧ３において検出され、Ｇ４では特異的ＩｇＧ分泌メモリーＢ細胞は検出されなかったことを示している。
図２２は、特異的ＩＦＮγ分泌細胞がＧ１およびＧ２＞Ｇ４＞Ｇ３の順ですべてのワクチン接種群において検出されたことを示している。Ｇ１とＧ２との間に差異はない。特異的ＩＦＮγ分泌細胞は、Ｇ３においてよりもＧ１およびＧ２において顕著に高かった。
バキュロウイルス発現ＦＭＤＶ−ＶＬＰ（修飾、コバレントケージ）／ＴＳ６ワクチン接種群（Ｇ１およびＧ２）の両方における特異的ＩＦＮγ分泌細胞、特異的ＩｇＧ分泌形質細胞および特異的ＩｇＧ分泌メモリーＢ細胞の高いレベルは、ＦＭＤＶ感染に対する良好なレベルの防御を示している。
【０１３２】
（例８）
Ａｓｉａ  Ｓｈａｍｉｒ  ＢａｃＭＥＢ１０２（野生型）およびＢａｃＭＥＢ１０４（コバレントケージ）
【表１３】
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【０１３３】
結果は、ＢａｃＭＥＢ１０４コバレントケージについて多量の安定ＦＭＤ  ＶＬＰが加熱後に存在し、ＶＬＰが少なくとも１５カ月間まで安定であった一方でＢａｃＭＥＢ１０２（ＷＴ）が加熱後にいかなる検出可能なＶＬＰも形成しなかったことを示した。
（例９）
Ｉｒａｑ  ２２  ＢａｃＭＥＢ１０６（コバレントケージ）安定性
【表１４】
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コバレントケージＩｒａｑ２２  ＶＬＰと比較して野生型Ｉｒａｑ２２  ＶＬＰは０日目の加熱後に安定でなかった。
【０１３４】
（例１０）
ブタ（ｐｉｇ）におけるＡｓｉａ  ＳｈａｍｉｒコバレントケージおよびＩｒａｑ  Ａ２２コバレントケージ血清学研究
研究の目的は、バキュロウイルスにおいて産生されたＦＭＤ  Ａｓｉａ１  ＳｈａｍｉｒおよびＦＭＤ  Ａ２２  Ｉｒａｑ  ＶＬＰ抗原の通常飼育のブタ（ｐｉｇ）における免疫原性を評価することであった。Ａｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ抗原の２バッチおよびＡ２２  Ｉｒａｑ抗原の２バッチをＴＳ６製剤において検査した。各製剤を３週間離した２回注射でブタ（ｐｉｇ）に投与した（Ｄ０−Ｄ２１）。ブタ（ｐｉｇ）はＤ０に８〜９週齢であった。免疫原性を血清学的モニタリング（Ｄ−１、Ｄ２０、Ｄ４２）および細胞免疫（ＣＭＩ）アッセイ（Ｄ２６、Ｄ４１）を通じて評価した。
【０１３５】
【表１５】
2017530124.tif 000019
【０１３６】
図１８に示すとおり、両方の株由来のコバレントケージＶＬＰは、強力な、血清型特異的、血清学的応答を誘発した。
ＶＬＰ  Ａｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ（Ｇ１およびＧ３）でワクチン接種したすべてのブタ（ｐｉｇ）は、１．２０Ｌｏｇ１０  ＰＤ５０近くの平均力価で１回目のワクチン接種に明らかに抗体応答した。さらに２回目のワクチン接種後にほとんどのブタ（ｐｉｇ）が１．８Ｌｏｇ１０  ＰＤ５０の力価を超えて明らかな追加免疫効果があった。対照（Ｇ５）およびほとんどのＡ２２  Ｉｒａｑワクチン接種ブタ（ｐｉｇ）（Ｇ２およびＧ４）は、追加免疫ワクチン接種後でさえＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒに対していかなる抗体応答率も示さなかった。
【０１３７】
ＶＬＰ  Ａ２２  Ｉｒａｑでワクチン接種したすべてのブタ（ｐｉｇ）（Ｇ２およびＧ４）は、１．１５Ｌｏｇ１０  ＰＤ５０近くの平均力価で１回目のワクチン接種に抗体応答した。さらに２回目のワクチン接種後にほとんどのブタ（ｐｉｇ）が２．０Ｌｏｇ１０  ＰＤ５０の力価を超えて強い追加免疫効果があった。対照（Ｇ５）およびほとんどのＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒワクチン接種ブタ（ｐｉｇ）（Ｇ１およびＧ３）は、追加免疫ワクチン接種後でさえＡ２２  Ｉｒａｑに対していかなる抗体応答率も示さなかった。
【０１３８】
驚くべきことに、図１９に示すとおり交差反応性が観察された。結果は、特異的ＩＦＮγ応答（細胞性応答）がＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ  ＦＭＤＶペプチドプールが使用された場合に両方のＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ  ＶＬＰ群において検出され、特異的ＩＦＮγ応答（細胞性応答）がＡ２２  Ｉｒａｑ  ＦＭＤＶペプチドプールが使用された場合に両方のＡ２２  Ｉｒａｑ  ＶＬＰ群において検出されたことを示した。Ａｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ  ＶＬＰ群は、Ａ２２  Ｉｒａｑ  ＦＭＤＶペプチドプールが使用された場合に交差免疫原性を示した。特異的形質細胞（液性応答）は、両方のＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉａｒ  ＶＬＰ群および両方のＡ２２  Ｉｒａｑ  ＶＬＰ群において、それぞれＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ不活性化ＡＩコーティング、およびＡ２２  Ｉｒａｑ不活性化ＡＩコーティングで検出された。Ａｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ  ＶＬＰ群において交差免疫原性（形質細胞）がＡ２２  Ｉｒａｑ不活性化ＡＩコーティングで観察された。特異的メモリーＢ細胞（液性応答）が両方のＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉａｒ  ＶＬＰ群および両方のＡ２２  Ｉｒａｑ  ＶＬＰ群において、それぞれＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ  ＡＩコーティングおよびＡ２２  Ｉｒａｑ  ＡＩコーティングで検出された。Ａｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ  ＶＬＰ群において良好な交差免疫原性（Ｂ細胞）がＡ２２  Ｉｒａｑ  ＡＩコーティングで観察された。Ａ２２  Ｉｒａｑ  ＶＬＰ群においていくらかの交差免疫原性（Ｂ細胞）がＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ  ＡＩコーティングでも観察された。あわせて結果は、ＶＬＰが異種性チャレンジに対する防御のために十分な免疫応答を誘発できたことを示している。
【０１３９】
結論として、ＴＳ６でアジュバント化された４種のＦＭＤＶ血清型ＶＬＰ抗原（Ａ２４、Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、Ａｓｉａ１  ＳｈａｍｉｒおよびＡ２２  Ｉｒａｑ）は、強く、血清型特異的な液性および細胞性応答、中和抗体応答、一貫した割合の特異的ＩＦＮγ応答、メモリーＢ細胞（２種の血清型間に交差反応性を有する）の存在を誘導し、同種および異種ＦＭＤＶ感染に対する良好なレベルの防御を示している。
【０１４０】
（例１１）
ヒトアデノウイルス５ベクター組換えＦＭＤＶの構築
この研究の目的は、コドン最適化ＦＭＤＶ構造タンパク質および血清型Ａ２４  ＣｒｕｚｅｉｒｏについてのＣ１４２Ｔ部位変異を有する非最適化３Ｃ  プロテアーゼを発現しているアデノウイルス組換え体を生成することである。ＦＭＤＶ抗原は、ＦＭＤＶカプシド前駆体（ＶＰ１、ＶＰ２（Ｈ９３Ｃ部位変異を有する、コバレントケージ）、ＶＰ３、ＶＰ４、２Ａおよび全２Ｂコドン最適化）ならびに非最適化部分的３ＢならびにＣ１４２Ｔ部位変異を有する全長３Ｃプロテアーゼ（配列番号１６）を含有する。
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ  Ｂａｔｃｈ  ＃８１８２７１０１）を含むＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１０９５）中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。これらの細胞を組換えアデノウイルスｖＡＤ３０２７をレスキューし、ウイルス保存物を作るために使用した。
【０１４１】
発現プラスミドｐＡＤ３０２７（図２５を参照されたい）は、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡテールに連結されたコドン最適化ポリヌクレオチド（ＦＭＤＶカプシドタンパク質配列番号１６をコードしている配列番号１７）を含有する。ポリヌクレオチドは合成イントロンを含む。
発現クローンをＧａｔｅｗａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するデスティネーション（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクターでのエントリー（entry）ベクターのＬＲ組換えによって生成した。組換えアデノウイルスｖＡＤ３０２７をトランスフェクション試薬でのＨＥＫ２９３細胞中の直鎖化発現クローンのトランスフェクションによって生成した。レスキュー後、各ウイルスを凍結融解周期および遠心分離による細胞デブリの清澄化によって回収した。継代のために、各ウイルスをＨＥＫ２９３細胞の単層に接種し、感染およそ３〜４日後、ウイルスを凍結融解周期および遠心分離による清澄化によって回収した。５回継代を−８０℃で保存するウイルス保存物を作るために実行した。
【０１４２】
組換えクローンの配列分析は、ＣＭＶプロモーターの開始からＳＶ４０テールの末端までの配列が正確であったことを確認した（配列番号２０）。免疫蛍光検査は、ｖＡＤ３０２７のすべての検討したプラークがＦＭＤＶカプシドタンパク質を発現することを示した。ＶＰ２タンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロットは、ｖＡＤ３０２７によって発現されたＶＰ２（完全にプロセスされた約２５ｋＤＡ）、ＶＰ０（部分的にプロセスされた導入遺伝子約３７ｋＤａ）またはＰ１（プロセスされていない導入遺伝子約８０ｋＤａ）のいずれかとしてのＶＰ２の直線状エピトープを検出した（図２６を参照されたい）。
【０１４３】
Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、ＡｓｉａおよびＩｒａｑ株についてのコドン最適化ＦＭＤＶ修飾（コバレントケージ）カプシドタンパク質を発現するアデノウイルス組換え体は、上に記載の手順により構築した。
【０１４４】
（例１２）
ブタ（ｐｉｇ）におけるワクチン接種後の種々の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ワクチン候補の血清学評価
（例１２．１）
ＦＭＤＶ  Ａ２４ワクチンの血清学評価
研究の目的は、ブタ（ｐｉｇ）でのワクチン接種後のさまざまなアジュバントと併せた（または併せない）、ヒトアデノウイルス５−ベクターＦＭＤＶワクチンおよびバキュロウイルス発現ＦＭＤ  Ａ２４組換えＶＬＰ（コバレントケージ）ワクチンを含む種々のＦＭＤＶ  Ａ２４ワクチン製剤の免疫原性を評価することである。
通常飼育で飼育された仔ブタ６０頭（およそ１カ月齢）をブタ（ｐｉｇ）４〜７頭をそれぞれ含む９個の処置群の１個にそれぞれ無作為化した。得られた群構成を下の表１１に示す。
【０１４５】
【表１６】
2017530124.tif 000020
【０１４６】
群９（対照）を除いて各仔ブタを２１日ごとに２回、検査ワクチン２ｍｌでワクチン接種した。すべての注射は、筋肉内経路（ＩＭ）を介して頸部、耳後方、代替的に右および左側に施した。
すべての仔ブタから血液試料を０日目（ワクチン接種前）、７、１５、２１日目（ワクチン接種前）、２８、３５および４２日目に回収した。４２日目にすべての仔ブタからの血清試料を血清ウイルス中和（ＳＶＮ）によってＦＭＤＶ抗体について検査した。ｖＡＤ３０２７構築物でワクチン接種されたものおよび対照（群６〜９）からの試料をすべての回収日にＳＶＮアッセイに供した。
【０１４７】
群１〜９からのすべての仔ブタは、研究開始前にＦＭＤＶ抗体について陰性と検査された。対照のすべての仔ブタは、研究を通じてＦＭＤＶ抗体について陰性であった。
ＦＭＤＶ  ＳＶＮ結果を図２３に示す。結果は、ＦＭＤ  Ａ２４組換えＶＬＰワクチンおよびヒトアデノウイルス５ベクターＦＭＤＶワクチンの両方が動物において免疫応答を誘導したことを実証した。１０3.9ＶＬＰの低用量でＦＭＤ  Ａ２４組換えＶＬＰワクチンは、動物において良好な免疫応答を誘導した。ヒトアデノウイルス５ベクターＦＭＤＶワクチンでワクチン接種した動物（群６〜７）は、低用量ＦＭＤ  Ａ２４組換えＶＬＰワクチンでワクチン接種したものよりもより高い抗体応答を二用量ワクチン接種レジメン後に有した。驚くべきことに、ウイルスベクターＦＭＤＶワクチンおよびＢａｃＡ２４  ＶＬＰワクチンでの異種性初回−追加免疫レジメンは、同じワクチンでの初回−追加免疫よりも強い免疫応答を実証した。
【０１４８】
図２４は、研究経過にわたる（０日目〜４２日目）群６〜９でのＦＭＤＶ抗体力価を示している。１５日目までに（１回目のワクチン接種後２週間）、群８からのすべてのｖＡＤ３０２７ワクチン接種は、ＦＭＤＶに対して抗体陽転した。群６〜７のものは、仔ブタの２９〜５７％の間が抗体陽転した。加えて、群あたりの平均抗体力価は、群６〜７におけるものと比較して群８（ウイルスベクターＦＭＤＶワクチンおよびＢａｃＡ２４  ＶＬＰワクチンでの異種性初回−追加免疫レジメン）において高かった。
【０１４９】
アデノウイルス（ＳＶＮ）への抗体応答を４２日目に回収した試料についてすべての群由来のすべての動物において決定した。結果は、Ｌｏｇ10で報告し、値≦０．６Ｌｏｇ10値を血清抗体について陰性とした。
結果は、すべての対照およびＢａｃＡ２４ＶＬＰ製剤ワクチンでワクチン接種した仔ブタが４２日目のＳＮ抗体力価（≦０．６Ｌｏｇ10）でアデノウイルスに対して陰性であったことを示した。群６および７におけるｖＡＤ３０２７でワクチン接種したすべての動物は、１．８から３．０の間の力価範囲で抗体陽転した一方で、群８では仔ブタの５０％が抗体陽転した。全体として群６の動物は、アデノウイルスに対するさらに高い抗体応答を有した。
【０１５０】
（例１２．２）
ＦＭＤＶ  Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、ＡｓｉａおよびＩｒａｑワクチンの血清学評価
この研究の目的は、ブタ（ｐｉｇ）でのワクチン接種後のさまざまなアジュバントと併せた（または併せない）、ヒトアデノウイルス５−ベクターＦＭＤＶワクチンならびにバキュロウイルス発現ＦＭＤ  Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、ＡｓｉａおよびＩｒａｑ組換えＶＬＰ（コバレントケージ）ワクチンを含む種々のＦＭＤＶ  Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、ＡｓｉａおよびＩｒａｑワクチン製剤の免疫原性を評価することである。
研究設計は例１２．１に記載のとおりである。ワクチン接種動物からの血液試料を例１２．１に記載のとおり種々の段階で採取し、血清学的に検査した。結果は、本発明の組成物またはワクチンが、免疫原性であり、動物に防御を提供することを示している。
【０１５１】
（例１４）
通常飼育のブタ（ｓｗｉｎｅ）およびウシ（ｃａｔｔｌｅ）ならびにＭＤＡ陽性ブタ（ｓｗｉｎｅ）およびウシ（ｃａｔｔｌｅ）におけるワクチン接種後の種々の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ワクチン候補の血清学評価および有効性
本研究の目的は、免疫応答を増加させるために通常飼育のブタ（ｓｗｉｎｅ）またはウシ（ｃａｔｔｌｅ）において、ならびにＭＤＡを克服し、免疫応答を増加させるためにＭＤＡ陽性ブタ（ｐｉｇ）およびウシ（ｃａｔｔｌｅ）において、２種の異種性ワクチンの初回−追加免疫投与（２回投与）または２種の異種性ワクチンの同時投与（１回投与）を評価することである。異種性ワクチンは、同じＦＭＤＶ血清型由来のカプシドを発現するＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチンまたはＦＭＤＶウイルスベクターワクチンなどの異なる型のワクチンであってよい。異種性ワクチンは、Ａ２４、Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、ＡｓｉａまたはＩｒａｑ株などの異なるＦＭＤＶ血清型のカプシドを発現する同じ型のワクチンであってもよい。異種性ワクチンは、Ａ２４、Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、ＡｓｉａまたはＩｒａｑ株などの異なるＦＭＤＶ血清型のカプシドを発現している異なる型のワクチンであってもよい。異種性ワクチンは、Ａ２４、Ｏ１  Ｍａｎｉｓａ、ＡｓｉａまたはＩｒａｑ株などの異なるＦＭＤＶ血清型のカプシドを発現する異なる型のワクチンすなわちＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチンまたはＦＭＤＶウイルスベクターワクチンであってもよい。
【０１５２】
一群では、通常飼育のブタ（ｐｉｇ）またはウシ（ｃａｔｔｌｅ）を、３〜５週間の間の間隔でＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチンに続いて組換えウイルス性ＦＭＤＶワクチンによって２回ワクチン接種するまたは、組換えウイルス性ＦＭＤＶワクチンで初回およびＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチンで追加免疫する。別の群では通常飼育のブタ（ｐｉｇ）またはウシ（ｃａｔｔｌｅ）をＦＭＤＶ  ＶＬＰおよび組換えウイルス性ＦＭＤＶワクチンの両方で同時に一度ワクチン接種する。
【０１５３】
一群では、ＭＤＡ陽性であるブタ（ｐｉｇ）またはウシ（ｃａｔｔｌｅ）を３〜５週間の間の間隔でＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチンに続いて組換えウイルス性ＦＭＤＶワクチンによって２回ワクチン接種するまたは、組換えウイルス性ＦＭＤＶワクチンで初回およびＦＭＤＶ  ＶＬＰワクチンで追加免疫する。別の群ではＭＤＡ陽性であるブタ（ｐｉｇ）またはウシ（ｃａｔｔｌｅ）をＦＭＤＶ  ＶＬＰおよび組換えウイルス性ＦＭＤＶワクチンの両方で同時に一度ワクチン接種する。
動物は、ワクチン接種後に同種または異種ＦＭＤＶ株でチャレンジされる。
組成物またはワクチンによって誘導された防御有効性を通常飼育の動物またはＭＤＶ陽性動物においてワクチン接種チャレンジによってＦＭＤＶ病原体に対して評価する。防御効果を臨床観察ならびに／または組織および血液での特異的病原体のウイルスロードによって評価する。ワクチン接種動物から血液試料を種々の段階で採取し、血清学的に検査する。結果は本発明の組成物またはワクチンが、免疫原性であり、通常飼育の動物およびＭＤＶ陽性動物において防御を提供することを示している。
【０１５４】
このように、本発明の好ましい実施形態を詳細に記載してきたが、上の例によって規定された本発明が、その多数の明らかな変更が本発明の精神または範囲から逸脱することなく可能であることから上の記述に記載された具体的な詳細に限定されないことは理解されるべきである。
【０１５５】
本明細書で引用または参照したすべての文書（「本明細書で引用の文書」）および本明細書で引用した文献において引用または参照したすべての文書は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文書において述べる任意の産生物についてのいかなる製造者の説明書、説明、製品仕様書および製品シートと合わせて参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いられてよい。
【図１】
2017530124.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−１】
2017530124.tif 000027
【図７Ａ−２】
2017530124.tif 000028
【図７Ａ−３】
2017530124.tif 000029
【図７Ａ−４】
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【図７Ｂ−１】
2017530124.tif 000031
【図７Ｂ−２】
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【図７Ｃ−１】
2017530124.tif 000033
【図７Ｃ−２】
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【図７Ｃ−３】
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【図７Ｃ−４】
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【図７Ｃ−５】
2017530124.tif 000037
【図７Ｄ−１】
2017530124.tif 000038
【図７Ｄ−２】
2017530124.tif 000039
【図８】
2017530124.tif 000040
【図９】
2017530124.tif 000041
【図１０】
2017530124.tif 000042
【図１１Ａ】
2017530124.tif 000043
【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
2017530124.tif 000048
【図１４】
2017530124.tif 000049
【図１５】
2017530124.tif 000050
【図１６】
2017530124.tif 000051
【図１７】
2017530124.tif 000052
【図１８Ａ】
2017530124.tif 000053
【図１８Ｂ】
2017530124.tif 000054
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
2017530124.tif 000058
【図２２】
2017530124.tif 000059
【図２３】
2017530124.tif 000060
【図２４】
2017530124.tif 000061
【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017530124.tif 000065
2017530124.tif 000066
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