(57)【要約】  本発明は、ヒト内在性レトロウイルスW型(HERV-W)に属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬として使用するための、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体に関する。また、本発明は、HERV-Wに属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬として使用するための、前記抗体、及びレトロウイルス逆転写酵素阻害薬を含む組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬としての使用のための、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体。
【請求項２】
- ヒト内在性レトロウイルスW型(HERV-W)ファミリーに属するウイルスの複製を完全に若しくは部分的に抑制又は阻害することができる；又は
- ヒト内在性レトロウイルスW型ファミリーに属するウイルスの発現若しくは該ウイルスのエンベロープタンパク質の発現を、完全に若しくは部分的に抑制又は阻害することができる、
請求項１に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項３】
前記ウイルスがヒト内在性レトロウイルスファミリー(HERV-W)のMSRVサブタイプに属する、請求項１又は２に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項４】
前記ウイルスがMSRVである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項５】
HERV-W関連疾患を予防及び/又は治療するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項６】
前記HERV-W関連疾患が、多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される、請求項５に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項７】
前記HERV-W関連疾患が、多発性硬化症(MS)及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)から成る群から選択される、請求項５又は６に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項８】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6に示される6つのCDRの各々を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項９】
- 配列番号7に示される軽鎖可変領域(VL)；及び
- 配列番号8に示される重鎖可変領域(VH)
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項１０】
Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2、ダイアボディ、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体から成る群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項１１】
前記抗体が、モノクローナルヒト化抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項１２】
- 重鎖(HC)が配列番号9に規定するアミノ酸配列を有し、
- 軽鎖(LC)が配列番号10に規定するアミノ酸配列を有する、
請求項１１に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項１３】
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体、その断片又は誘導体；及び
- レトロウイルス逆転写酵素阻害薬；
を含む、ヒト内在性レトロウイルスW型(HERV-W)に属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬としての使用のための組成物。
【請求項１４】
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体、その断片又は誘導体；及び
- レトロウイルス逆転写酵素阻害薬；
を含む、多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される疾患を予防及び/又は治療するための使用のための組成物。
【請求項１５】
前記レトロウイルス逆転写酵素阻害薬がアジドチミジン(AZT)である、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される疾患を治療するための方法において、同時に、別個に、又は逐次的に使用するための組み合わせ製剤としての、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のHERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体、及びレトロウイルス逆転写酵素阻害薬。
【請求項１７】
多発性硬化症(MS)及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)から成る群から選択される疾患を治療するための方法において、同時に、別個に、又は逐次的に使用するための組み合わせ製剤としての、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のHERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体、及びレトロウイルス逆転写酵素阻害薬。
【請求項１８】
配列番号11〜配列番号28から成る群から選択される少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１９】
HERV-W関連疾患に罹患した患者でのヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬としての使用のための、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体であって、前記患者が該患者の生体サンプル中のHERV-Wを検出及び/又は定量する工程i)を含む方法により同定される、抗体、その断片又は誘導体。
【請求項２０】
前記工程i)が、請求項１８に記載のキットを用いて行われる、請求項１９に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【請求項２１】
前記生体サンプルが、
- 血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、唾液、滑液、及び脳脊髄液(CSF)等の体液；並びに
- MS脳プラーク、CIDP神経生検、又は糖尿病膵臓生検等の疾患特異的な組織及び病変
から成る群から選択される、請求項１９又は２０に記載の抗体、その断片又は誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト内在性レトロウイルスを標的とする新規抗レトロウイルス薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト内在性レトロウイルス(HERV)は、複雑かつ異種性のマルチコピーの遺伝子エレメントのファミリーであり、生殖系列細胞内への挿入により特定の種のゲノムに侵入した、祖先のレトロウイルス感染の名残である。全体で、HERVエレメントはヒトゲノムの約8 %を占め、HERVエレメントは転写活性を維持している場合であっても、完全なレトロウイルスゲノムを発現させることはめったになく、そのため完全に機能的なプロウイルスコピーから生じることはほとんど想定されない。
【０００３】
多発性硬化症関連レトロウイルスエレメント(MSRV)は、W型ヒト内在性レトロウイルスファミリー(HERV-W)の一つであり、多発性硬化症に罹患した患者の細胞から最初に単離された。MSRVは、通常は個体のゲノム中で潜在性であるが、特定の一般的なウイルス等の補因子(コファクター)により誘発されると、再活性化されることがあり、HERV-Wファミリーのエンベロープタンパク質をさらに発現させることがある。本願発明者らは、以前、この機構を調査し、これが多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(clinically isolated syndrome)(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病等の様々な疾患の発症及び進行における主要な誘発因子及び増悪因子であることを明らかにした。
【０００４】
HERV由来の全ての構造的レトロウイルス遺伝子、すなわち同一のHERVからのマトリックス、カプシド、及びヌクレオカプシド前駆体ポリタンパク質、をコードするgag遺伝子、並びにプロテアーゼ、逆転写酵素、及びインテグラーゼ前駆体ポリタンパク質を含むレトロウイルス酵素をコードするpol遺伝子、そして並びにエンベロープ前駆体タンパク質をコードするenv遺伝子の発現が可能であるにも関わらず、HERV由来の感染性レトロウイルスコピーはこれまで見出されていない。
【０００５】
さらに、外来性の感染性レトロウイルスとは対照的に、HERVは、ヒト個体の各々の全ての細胞のDNAに存在し、したがって、ヒトのレトロウイルスを治療するために古典的に用いられる治療分子は、ウイルス保有細胞の亜集団中の対応するプロウイルスを取り除くことができない。また、これらの内在性エレメントは、これらへの多数の細胞的及び遺伝子的な制約のために、非レトロウイルス分子機構に自らを制御させており、そのようにして古典的なレトロウイルス経路から抜け出している。これらの様々な機構の中でも、遺伝子のサイレンシング、細胞性プロモーター/エンハンサーによる遺伝子制御、又はHERV配列と細胞性遺伝子との間の遺伝子組換えの関与が知られている。そのような特徴は、古典的な外来性レトロウイルスには予期されず、したがって、現在存在する抗レトロウイルス療法は利用可能でない。
【０００６】
そのような状況において、古典的な外来性レトロウイルスの治療には、病原性HERV発現を完全に制御し、結果として、たとえあったとしても、HERV関連疾患の最適な治療効果を得ることは期待できない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035-1038頁及び1570-1580頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、長い間満たされていないと感じられている、HERVウイルスを標的とする新規な抗レトロウイルス治療ストラテジーの必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、驚くべきことに、HERV-Wファミリー由来の内在性エレメントを標的とする予想外の抗HERV作用が、HERV-W発現を低減し阻害することができることを見出した。したがって、第一の態様において、本発明は、ヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬として使用するための、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体に関する。好ましくは、前記抗体、その断片又は誘導体は、HERV-W関連疾患を予防及び/又は治療するためのものである。より好ましくは、前記抗体は、多発性硬化症(MS)又は慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)を予防及び/又は治療するためのものである。より好ましくは、前記抗体は、重鎖(HC)が配列番号9に規定するアミノ酸配列を有し、軽鎖(LC)が配列番号10に規定するアミノ酸配列を有する、モノクローナルヒト化抗体である。
【００１０】
第二の態様において、本発明は、ヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬として使用するための、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体、及びレトロウイルス逆転写酵素阻害薬を含む、好ましくはそれらから成る、組成物に関する。
【００１１】
第三の態様において、本発明は、HERV-W関連疾患、好ましくは、多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される疾患を治療するための方法において、同時に、別個に、又は逐次的に使用するための組み合わせ製剤としての、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体、及びレトロウイルス逆転写酵素阻害薬に関する。
【００１２】
第四の態様において、本発明は、配列番号11〜28から成る群から選択される少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。
【００１３】
第五の態様において、本発明は、HERV-W関連疾患に罹患した患者において、ヒト内在性レトロウイルス(HERV)、好ましくはHERV-Wファミリー、より好ましくはMSRVに属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬として使用するための、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体であって、前記患者が、該患者の生体サンプル中のHERV-Wを検出及び/又は定量する工程i)を含む方法により同定される、抗体、その断片又は誘導体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1(A)は、種々のqPCR用プライマー対及びプローブにより検出した、組み入れ時のHERV-W env及びpolの転写産物のレベルを示す。(B)は、2 mg/mlコホートに組み入れられた患者(無地の丸)及び6 mg/mlコホートに組み入れられた患者(無地の四角)について、「env」及び「UNO」プライマー及びプローブを並行して用いた、HERV-W env転写産物を示す。(C)は、2 mg/mlコホートに組み入れられた患者(無地の丸)及び6 mg/mlコホートに組み入れられた患者(無地の四角)について、「UNO2」、「syn」、及び「pol」プライマー及びプローブを並行して用いた、HERV-W env転写産物を示す。縦座標は、各患者についての標的RNAの相対発現(GUS Bに対する割合)を表し、横座標は、同一のサンプルに対して用いた種々のqPCRプロトコルを表す。
【図２】図2は、種々のqPCR用プライマー対及びプローブにより検出した、組み入れ時の異なるMSの臨床型間での、HERV-W env及びpolの転写産物のレベルの違いを示す。(A)「env」プロトコル、(B)「UNO」プロトコル、(C)「UNO2」プロトコル、(D)「syn」プロトコル、(E)「pol」プロトコル。縦座標は、各患者についての標的RNAの相対発現(GUS Bに対する割合)を表し、横座標は、異なるMSの臨床型：一次性進行型(PPMS)、再発寛解型(RRMS)、及び二次性進行型(SPMS)を表す。
【図３】図3は、特定のqPCR用プライマー対及びプローブにより検出した、HERV-W env及びpolの転写産物のレベルと組み入れ時のMS患者の臨床パラメータとの相関を示す。(A)「Syn」プロトコルは、シンシチン型HERV-W発現と有病期間との間の負の相関を証明する：ピアソンの相関検定r = -0.96；p = 0.009、(B)「Syn」プロトコルは、シンシチン型HERV-W発現と疾患増悪指数(disease progression index)との間の正の相関を証明する：ピアソンの相関検定r = 0.95；p = 0.014、(C)「pol」プロトコルも、HERV-W型pol遺伝子(プロテアーゼ、逆転写酵素、及びインテグラーゼをコードする)発現と疾患増悪指数との間の正の相関を証明する：ピアソンの相関検定r = 0.95；p = 0.048。縦座標は、年単位での有病期間(A)、又は増悪指数(B及びC)を表す；横座標は、各患者についての標的RNAの相対発現(GUS Bに対する割合)を表す。
【図４】図4は、GNC002の最初の6ヶ月間のHERV-W関連転写産物レベルの変動を表す。データは、2 mg/kgコホート(A)、6 mg/kgコホート(B)、及びGNC002に組み入れられた全ての患者(C)における、各HERV-W関連転写産物についてのGUS Bに対する平均標的RNA相対発現を表す。破線は、組み入れ時の対応する転写産物のレベルを表す。縦座標は、患者の群における各qPCRプロトコルについての標的RNAの平均相対発現(GUS Bに対する割合)を表す。横座標は、患者へのGNbAC1の注射回数を表す。
【図５】図5は、GNC002の最初の6ヶ月間のHER注射回数-W関連転写産物レベルの変動を表す。データは、GNC002に組み入れられた全ての患者における、組み入れ時から6回目の注射の日までのMSの治療に伴う各HERV-W転写産物についてのGUS Bに対する平均標的RNA相対発現を表す。HERV-W env及びpolの転写産物レベルにおける変動を、種々のqPCR用のプライマー対及びプローブを用いて測定した、各患者のデータの箱ひげ図(Whiskers plot)(10〜90パーセンタイル)として図示する。(A)「env」プロトコル、(B)「UNO」プロトコル、(C)「UNO2」プロトコル、(D)「syn」プロトコル、(E)「pol」プロトコル。縦座標は、患者の群における各qPCRプロトコルについての標的RNAの平均相対発現(GUS Bに対する割合)を表す。横座標は、患者へのGNbAC1の注射回数を表すが、血液サンプルはその前に採取した(したがって、「1」は、あらゆる注射の前の状態、「3」は、2回目の注射後4週間の状態、及び「6」は、5回目の注射後4週間の状態に相当する)。
【図６】図6は、特異的抗体を用いてウエスタンブロッティングにより検出した、gag、pol、及びenvにコードされるHERV-Wタンパク質を自然に発現するCH2細胞を示す。HERV-W gag、pol、及びenvにコードされる抗原に対する各特異的抗体を用いて検出したバンドの見かけの分子量を、各抗原の細胞抽出物に対応するレーンの右側に表示する。A、B、及びCの左のレーンは、KDaの推定のために用いた分子量マーカーを表す。(A)HERV-W Gagポリタンパク質及び切断産物、約30KDaの典型的なカプシドタンパク質を含む。(B)HERV-W Polポリタンパク質及び切断産物、約55KDaの典型的な逆転写酵素タンパク質を含む。(C)HERV-Wエンベロープタンパク質、切断産物及び多量体、約45及び35KDaのSU(表面)及びTM(膜貫通)切断ユニットを含む。グリコシル化env産物は、75及び80KDa辺りに検出される単量体バンドの間の糖鎖付加の潜在的バリエーションを伴って検出される。55KDaは、非グリコシル化単量体に対応し、二量体はおよそ100KDaである。160KDa辺りのバンドは、グリコシル化二量体又は非グリコシル化三量体のいずれかである可能性ある。
【図７】図7は、GNbAC1及び/又はAZTによる処理有り又は無しのCH2培養におけるHERV-W polにコードされる逆転写酵素タンパク質を示す。HERV-W polにコードされる抗原に対する特異的抗体を用いて検出したバンドの見かけの分子量を、ウエスタンブロットの右側に表示する。ウエスタンブロットのレーンの番号(1〜6)を、写真の下に表示する。1)GNbAC1及びAZTを用いた組み合わせ処理、2)AZTのみの処理、3)GNbAC1のみの処理、4)模擬処理細胞(処理無し)、5)空のウェル、6)分子量マーカー。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本願明細書において用いられる用語「ヒト内在性レトロウイルス」及び「HERV」は、通常「HERV-W」と称される、W型内在性レトロウイルスファミリーに属するウイルスを含むヒト内在性レトロウイルスを指す。
【００１６】
「HERV-W」は、多発性硬化症の患者から最初に単離されたヒトのレトロウイルスである、「多発性硬化症関連レトロウイルス」、MSRVの最初の発見から、ヒトゲノムにおいて解明された、ヒト内在性レトロウイルスのファミリーである。したがって、試験において「LM7」(記述されているMSからの最初の分離株、「MS-レトロウイルス」、「MSRV」、「シンシチン(Syncytin)」、「HERV-W 7q」、「ERVW-E1」、「ERVW-E2」、「X染色体からのHERV-Wコピー」、又は「HERV-W」に言及する場合、これらは全てHERV-Wエレメントを指す。
【００１７】
本願明細書において用いられる用語「MSRV」は、HERV-Wファミリーの一員である、特定の内在性レトロウイルスを指す。本願発明との関連において、「HERV-W」及び「MSRV」という表現は、どちらもHERV-Wエレメントを指す。特に、「HERV-W Env」及び「MSRV-Env」という表現は、どちらも同一のエンベロープタンパク質を指す。典型的には、最終的なアミノ酸配列のわずかな変動(バリエーション)は、治療用途の特異的抗-Env抗体、特に配列番号9に規定するアミノ酸配列を有する重鎖(HC)と、配列番号10に規定するアミノ酸配列を有する軽鎖(LC)とを有する抗体の結合を妨げない。
【００１８】
本願明細書において用いられる表現「HERV-W関連疾患」は、HERV-Wの発現、好ましくはHERV-Wエンベロープタンパク質の発現に関連する病的状態を指す。典型的には、前記HERV-W関連疾患は、慢性炎症性疾患である。本願明細書において用いられる表現「慢性炎症性疾患」は、持続性又は頻発性の炎症が、先天性免疫により、及び/若しくは組織病変に関与する適応免疫により引き起こされ、並びに/又は炎症誘発性分子の過剰発現により局所的に若しくは全身的に検知される、あらゆる疾患を指す。
【００１９】
好ましくは、前記HERV-W関連疾患は、HERV-W関連疾患、好ましくは、多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される。より好ましくは、前記HERV-W関連疾患は、多発性硬化症(MS)及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)から成る群から選択され、これらはどちらも脱髄疾患である。
【００２０】
本願明細書において用いられる用語「治療する」又は「治療」は、本願明細書で用いられる場合、そのような用語が適用される障害若しくは状態を回復させる、緩和させる、進行を阻害する、若しくは予防すること、又はそのような用語が適用される障害若しくは状態の1つ以上の症状を回復させる、緩和させる、進行を阻害する、若しくは予防することを意味する。
【００２１】
本願明細書において用いられる用語「予防」は、臨床的診断が可能になるような臨床症状、典型的な病変、又は生理学的機能障害を未だ呈していない対象に、疾患又は状態が発生することを防ぐことを指す。
【００２２】
本願明細書において用いられる場合、「抗体」又は「免疫グロブリン」は、同一の意味を有し、本願発明において等しく用いられるものである。用語「抗体」は、本願明細書で用いられる場合、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。そのようなものとして、用語「抗体」は、完全な抗体分子のみならず、抗体断片及び抗体の誘導体をも包含する。
【００２３】
本願明細書において用いられる表現「抗体の断片」は、CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)等の超可変領域を模倣するような抗体の部分を指す。本発明の抗体の断片は、その抗体の結合親和性及び特異性を保持している。そのような断片はその抗体の機能的等価物であり、これらはその抗体と実質的に同一のエピトープに結合する。抗体の断片の例には、重鎖、軽鎖、VL、VH、Fv、Fab、Fab’、F(ab)2、及びF(ab')2が含まれるが、これに限定されない。
【００２４】
本願明細書において用いられる表現「抗体の誘導体」は、天然の配列と異なる少なくとも1つの配列(例えば別の種のリンカー配列…)に融合された、好ましくはその抗体の少なくとも1つのCDR、好ましくはその抗体の少なくとも1つのCDR3を含む、本発明の抗体の断片を指し、この誘導体は、本発明の抗体に匹敵する、HERV-W Envへの結合親和性及び特異性を有する。本発明の誘導体は、その抗体の結合親和性及び特異性を保持している。そのような誘導体はその抗体の機能的等価物であり、これらはその抗体と実質的に同一のエピトープに結合する。抗体の誘導体の例には、scFv、(scFv)2、及びダイアボディが含まれるが、これに限定されない。
【００２５】
天然の抗体では、2本の重鎖(HC)がジスルフィド結合により互いに連結されており、各重鎖は、ジスルフィド結合により軽鎖(LC)と連結されている。軽鎖には、ラムダ(l)とカッパ(k)という2種類がある。重鎖には、抗体分子の機能的活性を決定する5つの主要なクラス(又はアイソタイプ)：IgM、IgD、IgG、IgA、及びIgEがある。各鎖は異なる配列ドメインを含んでいる。
【００２６】
典型的には、軽鎖は2つのドメイン、可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含んでいる。重鎖は、4つのドメイン、可変ドメイン(VH)及び3つの定常ドメイン(CH1、CH2、及びCH3、まとめてCHと称される)を含む。軽鎖の可変領域(VL)及び重鎖の可変領域(VH)の両方が、抗原性エピトープに特異的な結合部位を決定する。軽鎖の定常領域ドメイン(CL)及び重鎖の定常領域ドメイン(CH)は、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、及びFc受容体(FcR)への結合等の重要な生物学的特性を付与する。Fv断片は、免疫グロブリンのFab断片のN末端部分であり、1本の軽鎖及び1本の重鎖の可変部分から成る。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原エピトープとの間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、超可変又は相補性決定領域(CDR)に主として由来する残基で構成される。時には、非超可変又はフレームワーク領域(FR)に由来する残基が、全体のドメイン構造、したがって結合部位に影響を与える。相補性決定領域又はCDRは、全体でネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然のFv領域の結合親和性及び特異性を規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、各々3つのCDRを有し、これらはそれぞれL-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、及びH-CDR1、H-CDR2、H-CDR3と示される。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖の各々のV領域に由来するCDRセットを含む6つのCDRを含む。フレームワーク領域(FR)は、CDR間に差し挟まれたアミノ酸配列を指す。
【００２７】
本願明細書において用いられる用語「キメラ抗体」は、任意の種、好ましくはマウス由来の抗体のVHドメイン及びVLドメインを含み、ヒト抗体のCHドメイン及びCLドメインを含む抗体を指す。
【００２８】
本発明によれば、用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体に由来する可変領域フレームワーク及び定常領域を有するが、任意の種、好ましくはマウス由来の抗体のCDRを保持している抗体を指す。
【００２９】
用語「Fab」は、約50,000の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片を表し、IgGをプロテアーゼであるパパインで処理することにより得られる断片の中で、H鎖のN末端側の約半分及びL鎖全体がジスルフィド結合により一緒に結合しているものである。
【００３０】
本願明細書において用いられる用語「F(ab')2」は、約100,000の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片を指し、IgGをプロテアーゼであるペプシンで処理することにより得られる断片の中で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したFabよりもわずかに大きいものである。
【００３１】
本願明細書において用いられる用語「Fab'」は、約50,000の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片を指し、F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる。
【００３２】
「一本鎖Fv」又は「scFv」という表現は、共有結合したVH::VLヘテロダイマーであるポリペプチドを指し、通常は、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたVH及びVLをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現される。「dsFv」は、ジスルフィド結合により安定化されたVH::VLヘテロダイマーである。二価抗体及び多価抗体の断片は、一価のscFvの会合により自発的に形成することができ、また、一価のscFvをペプチドリンカーによりカップリングすることにより作製することもでき、例えば二価のsc(Fv)2である。
【００３３】
用語「ダイアボディ」は、2つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、断片は、同一のポリペプチド鎖(VH-VL)において軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同一の鎖の2つのドメイン間でペアリングさせるには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは別の鎖の相補ドメインとペアリングして2つの抗原結合部位を作るように強いられる。
【００３４】
本願明細書において用いられる表現「本発明の抗体」は、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する、すなわちそれに特異的に結合する、好ましくは、W型ヒト内在性レトロウイルスファミリー(HERV-W)のHERV-Wエンベロープタンパク質に対する、より好ましくは、MSRVのエンベロープタンパク質に対する、より好ましくは、MSRVのエンベロープタンパク質の細胞外ドメインに対する、抗体を指す。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号1〜6に示される6つのCDRの全てを含む。
【００３５】
本願明細書において用いられる用語「生体サンプル」は、インビトロでの評価の目的で得られる任意の生体サンプルを指す。本発明において、サンプル又は患者サンプルは、任意の体液又は疾患特異的な組織及び病変を含んでもよい。体液の例には、血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、唾液、滑液、及び脳脊髄液(CSF)が含まれる。疾患特異的な組織及び病変には、MS脳プラーク、CIDP神経生検、又は糖尿病膵臓生検を含む。
【００３６】
「抗レトロウイルス薬としての使用のための抗体」
特定の個体が病的状態と関連付けられる場合、特にHERV-Wファミリーの多発性硬化症関連(MSRV)エレメントを発現している場合、その個体において病原性HERV-W発現が生じている。患者におけるHERV-W gagにコードされた抗原のエビデンスがあるにも関わらず、これには、免疫系に又は神経膠細胞に曝露された場合、HERV-Wにコードされるタンパク質の中で唯一の病原性プレーヤーとしてエンベロープタンパク質が関与することが示されてきた。
【００３７】
これまで、治療的ストラテジーは、HERV-W関連ヒト疾患における免疫炎症性及び神経病原性の作用を予防するため及び阻害するために、中和ヒト化抗体を用いてHERV-Wエンベロープタンパク質を標的とすることにあった。結果として、この治療的アプローチは、炎症カスケードの上流及び標的化細胞毒性作用の上流、特に、MS中枢神経系(CNS)における潜在治癒力が損なわれた、病変の原発部位における髄鞘再生の阻害を伴う炎症性脱髄カスケードの上流を対象とするものである。
【００３８】
本発明は、本願明細書において「GNbAC1」と呼ぶ、MSRVのエンベロープタンパク質の細胞外ドメインに選択的に結合するヒト化IgG4抗体を、安全性及び薬物動態について、第I相臨床試験において健康なボランティアで評価した。また、この抗体は、MS患者でも、2つの平行するコホートにおける4週間毎の6mg/Kg又は2mg/kgのGNbAC1抗体の繰り返しの注入を伴って、1年間評価された。本願発明者らは、後者のMS患者での第IIa相試験において、GNbAC1による治療に伴う特異的なHERV-W env及びpolのmRNA発現を試験するために、試験前及び試験中に患者から血液サンプルを得、それについて定量的RT-PCR(qRT-PCR)によりHERV-Wバイオマーカーを治療の6か月後に初めて試験した。
【００３９】
これにより得られた結果により、GNbAC1抗体によるインビボでのHERV-W Envタンパク質中和の完全に予想外かつ未知の効果が明らかになった。
【００４０】
実際に、本願発明者らは、この抗体で治療されたヒト患者が、HERV-Wレトロウイルスゲノム発現自体に対する阻害作用を示すことを見出したが、この作用はGNbAC1により特異的に標的化された、エンベロープタンパク質を発現するenv遺伝子に限定されない。実際、本願発明者らの結果は、env mRNA (HERV-Wエンベロープタンパク質をコードする)及びpol mRNA(逆転写酵素を含むHERV-W酵素をコードする)の両方のレベルが、3カ月及び6カ月の治療の後、同一の患者で治療前に測定されたレベルと比較して、平行かつ漸進的な減少を示したことを紛れもなく示している。
【００４１】
したがって、GNbAC1を用いた6カ月間の治療の後に、HERV-W発現に対する顕著な抗レトロウイルス作用が観察され、env及びpol遺伝子の両方の発現に並行して作用した。レトロウイルスHERV-W RNA発現は、HERV-Wエンベロープタンパク質発現によって制御されることが予想されておらず、全く関連しない抗原タンパク質をコードするpol遺伝子由来のmRNAはなおさらであるので、本願発明者らは、HERV-W Env(又はMSRV-Env)の未知の作用は、MS患者に見られるような疾患関連発現に関して、HERV-W遺伝子制御に正の作用を生み出し、本願発明者らによって行われた第IIa相臨床試験の患者においてGNbAC1により拮抗される(実施例1を参照)と結論付ける。この効果は、免疫系及び神経膠系への既知のHERV-W Env病態生理学作用とは全く関連しない。
【００４２】
結果として、第一の態様において、本発明は、ヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬として使用するための、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体に関する。
【００４３】
本願明細書において用いられる表現「ヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬」は、ヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルスの発現及び/又は複製を阻害することができる抗体、その断片又は誘導体を指す。より具体的には、前記表現は：
- HERVに属する、好ましくはHERV-Wファミリーに属するウイルスの複製を完全に若しくは部分的に抑制又は阻害することができる。典型的には、前記複製の抑制又は阻害が、全体的かつ完全である；又は
- ヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルス、好ましくはヒト内在性レトロウイルスW型(HERV-W)ファミリーに属するウイルスの発現又は該ウイルスのエンベロープタンパク質の発現を、完全に若しくは部分的に、抑制又は阻害することができる、
抗体を指す。
【００４４】
好ましくは、前記ウイルスは、W型ヒト内在性レトロウイルスファミリー(HERV-W)に属する。より好ましくは、前記ウイルスはMSRVである。この特定の実施態様において、本発明の抗体は、MSRVのエンベロープタンパク質に対するものである。
【００４５】
好ましい実施態様において、本発明の抗レトロウイルス薬は、HERVに属するウイルス、好ましくはHERV-Wに属するウイルスenvにコードされる及び/又はpolにコードされるタンパク質の発現を、完全に若しくは部分的に、抑制又は阻害する。
【００４６】
発明者らは、MSRVの特定のエンベロープタンパク質を標的とすることにより、ウイルスの発現が阻害又は抑制されるという驚くべき効果がもたらされることを示した。既述したように、MSRVは、複数の疾患の発症及び進行に関与している。結果として、本発明の抗体は、HERV-W関連疾患、好ましくは、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)の発現に関連する病的状態を治療するための使用に非常に有望である。
【００４７】
好ましくは、前記HERV-W関連疾患は、多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される。
【００４８】
より好ましくは、前記HERV-W関連疾患は、多発性硬化症(MS)及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)から成る群から選択される。
【００４９】
また、一つの実施態様において、本発明は、多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される疾患の予防及び/又は治療のために使用するための薬剤であって、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、又はその断片若しくは誘導体からなる薬剤にも関係する。この特定の実施態様において、抗体はHERV-W発現を防ぐ。
【００５０】
一つの実施態様において、本発明の抗体、断片又は誘導体は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6に示される6つのCDRの各々を含む。
【００５１】
一つの実施態様において、本発明の抗体、断片又は誘導体は：
- 可変ドメインが、CDR-L1について配列番号1、CDR-L2について配列番号2、及びCDR-L3について配列番号3に示す3つのCDRの各々を含む、軽鎖；及び
- 可変ドメインが、CDR-H1について配列番号4、CDR-H2について配列番号5、及びCDR-H3について配列番号6に示す3つのCDRの各々を含む、重鎖
を含む。
【００５２】
上述の相補性決定領域(CDR)は、表1に示される：
【００５３】
【表１】
2017519815.tif 000002
【００５４】
一つの実施態様において、本発明の抗体、断片又は誘導体は：
- 配列番号7に示される軽鎖可変領域(VL)；及び
- 配列番号8に示される重鎖可変領域(VH)
を含む。
【００５５】
上述の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、表2に示される：
【００５６】
【表２】
2017519815.tif 000003
【００５７】
一つの実施態様において、本発明の抗体、断片、又は誘導体は、Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2、ダイアボディ、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体から成る群から選択される。
【００５８】
好ましい実施態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、一価、二価、多価、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性である。別の実施態様において、HERV-W Envに対する抗体は、結合断片又はコンジュゲートである。例えば、本発明の抗体は、増殖阻害剤、細胞傷害剤、又はプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートされてもよい。
【００５９】
また、エフェクター機能に関して、例えば抗体の抗原依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)及び/又は補体依存性細胞傷害(CDC)を強化するように本発明の抗体を改変することも望ましい可能性がある。これは、抗体のFc領域に1種以上のアミノ酸置換を導入することにより達成されてもよい。代わりに、又は追加的に、システイン残基をFc領域に導入し、それによりこの領域において鎖間のジスルフィド結合を形成させてもよい。このようにして作製されたホモ二量体の抗体は、改善された内在化能力並びに/又は増加した補体介在性殺細胞及び/若しくは抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)を有する可能性がある(Caron PC.ら、1992；及びShopes B. 1992)。
【００６０】
本発明の抗体の別の種類のアミノ酸修飾が、抗体の元の糖鎖付加パターンを改変するのに有用である可能性がある。「改変する」とは、抗体中に見出される1種以上の炭水化物部分を欠失させること、及び/又は抗体に存在しない糖鎖付加部位を1つ以上付加することを意味する。抗体の糖鎖付加は、典型的にはN結合型である。「N結合型」は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を指す。アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニンのトリペプチド配列(Xはプロリンを除く任意のアミノ酸)が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付加の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的糖鎖付加部位が生じる。抗体への糖鎖付加部位の付加は、(N結合型糖鎖付加部位については)上述のトリペプチド配列を1つ以上含むようにアミノ酸配列を改変することにより、好都合に行われる。
【００６１】
別の実施態様において、本発明の抗体は、モノクローナルヒト化抗体、より好ましくは、IgG4ヒト化モノクローナル抗体である。
【００６２】
前記ヒト化抗体は、CDRドメインをコードする核酸配列を、ヒト抗体と同一の重鎖定常領域；及びヒト抗体と同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する、動物細胞用の発現ベクターに挿入し、動物細胞に導入することにより発現ベクターを発現させることにより、前記CDRドメインをコードする核酸配列を取得することにより生産されてもよい。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と、抗体軽鎖をコードする遺伝子とが、別個のベクターに存在している種類のものでも、両方の遺伝子が同一のベクターに存在している種類のもの(タンデム型)でもよい。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易性、動物細胞への導入の容易性、及び動物細胞における抗体H鎖とL鎖との発現のバランスの点では、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターがより好ましい。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターの例には、pKANTEX93、pEE18等が含まれる。従来の組換えDNA及び遺伝子トランスフェクション手法に基づくヒト化抗体の製造方法は当該技術分野において公知である。抗体は、例えばCDRグラフト化、ベニアリング(veneering)、又はリサーフェシング(resurfacing)、及び鎖シャフリング(chain shuffling)を含む当該技術分野において公知の様々な手法を用いてヒト化することができる。また、そのような抗体を調製するための一般的な組換えDNA技術も公知である。
【００６３】
したがって、本発明の一つの実施態様は：
- 可変ドメインが、CDR-L1について配列番号1、CDR-L2について配列番号2、及びCDR-L3について配列番号3に示す3つのCDRの各々を含む、軽鎖；並びに
- 可変ドメインが、CDR-H1について配列番号4、CDR-H2について配列番号5、及びCDR-H3について配列番号6に示す3つのCDRの各々を含む、重鎖
を含むモノクローナルヒト化抗体に関する。
【００６４】
特定の実施態様において、前記ヒト化抗体の重鎖(HC)は、配列番号9に規定するアミノ酸配列を有し、前記抗体の軽鎖(LC)は、配列番号10に規定するアミノ酸配列を有する。この特定の抗体は、本願明細書において「GNbAC1」と称される。
【００６５】
上述の重鎖及び軽鎖は表3に示される：
【００６６】
【表３−Ａ】
2017519815.tif 000004
【表３−Ｂ】
2017519815.tif 000005
【００６７】
「抗レトロウイルス薬としての使用のための組成物」
本願発明者らは、新たに明らかになった本発明の抗体の抗レトロウイルス作用についてさらに調査した。この目的のために、本願発明者らは、特異的抗体によりウエスタンブロット解析で検出される、HERV-W gag、pol、及びenvにコードされるタンパク質を発現する細胞培養においてインビトロでその作用を評価した。
【００６８】
本願発明者らは、GNbAC1を用いて治療した患者のpol RNAレベルの減少に加えて、HERV-W逆転写酵素(RT)に相当するpolタンパク質の発現が、GNbAC1の存在下で培養した細胞ではそれほど重要でないようにみえることを確認した。さらに、RTは、発現されたRNAからレトロウイルスDNAの追加的なコピーを生成することにより、レトロウイルス発現を増幅することが知られている。これらの新たに生産されたレトロウイルスDNAコピーは、その後対応するRNAを発現することができ、そのため、pol RNA由来のRT等、この発現の生産物自体による発現コピーを増加させることによりレトロウイルスエレメントの全体的な発現を増幅する。
【００６９】
結果として、発明者らは、GNbAC1とアジドチミジン(AZT)等のレトロウイルス逆転写酵素の阻害剤との両方の組み合わせにより、HERV-W発現、特に本願明細書で実証するようにRT発現において、より優れた阻害作用が生じる可能性があると考えた。
【００７０】
したがって、これについてさらに試験が行われ、非常に驚くべきことに、このHERV-W Envに対する抗体とレトロウイルス逆転写酵素阻害薬との組み合わせは、これらの生殖細胞においてHERV-W RTタンパク質の発現を消失させた。
【００７１】
並行かつ同時の培養において、ウエスタンブロットによる未処理細胞でのHERV-W RTの陽性検出、及びGNbAC1又はAZT単独で処理した細胞でのわずかな又は部分的な低減により、この観察の特異性及び有意性が確認された：同一の条件において、HERV-W Envタンパク質を中和するGNbAC1抗体とAZTとの両方の組み合わせにより、このHERV-W RTタンパク質の検出が消失した。
【００７２】
したがって、第二の態様において、本発明は、ヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬として使用するための、
- 本発明の抗体、断片、又は誘導体；及び
- レトロウイルス逆転写酵素阻害薬
を含む組成物に関する。
【００７３】
好ましくは、前記レトロウイルス逆転写酵素阻害薬は、アジドチミジン、エンテカビル、ラミブジン、アデホビル(アデフォビル)、ソフォスビル、ジダノシン、テノホビル、アバカビル、ラミブジン、スタブジン、エムトリシタビン、ザルシタビン、テルビブジン、及びジダノシンから成る群から選択される。より好ましくは、前記レトロウイルス逆転写酵素阻害薬は、アジドチミジン(AZT)である。既に開示されている全ての技術データが、本願発明に適用可能である。
【００７４】
本発明の組成物は、HERV-W病原性発現への治療介入についての想定外かつ新規な展望を与える。
- GNbAC1等の、HERV-W Envに対する抗体；及び
- AZT等の、逆転写酵素自体及び/又はその活性を標的とする分子
の組み合わせを用いた治療は、HERV-Wに関連する疾患においてHERV-W RT発現を阻害するのに非常に有用であることが判明した。
【００７５】
したがって、本発明はHERV-W関連疾患の予防及び/又は治療のために使用するための、
- 本発明の抗体、断片又は誘導体；及び
- レトロウイルス逆転写酵素阻害薬
を含む組成物にも関係する。
【００７６】
また、本発明は、多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される疾患を予防及び/又は治療するための使用のための、
- 本発明の抗体、断片又は誘導体；及び
- レトロウイルス逆転写酵素阻害薬
を含む組成物に関する。より好ましくは、前記疾患は、多発性硬化症(MS)及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)から成る群から選択される。
【００７７】
以前に開示された全ての技術的データは、本願発明に適用可能である。
【００７８】
第三の態様において、本発明は、HERV-W関連疾患、好ましくは、多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される疾患の治療のための方法において、同時に、別個に、又は逐次的に使用するための組み合わせ製剤としての、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体又はその断片若しくは誘導体及びレトロウイルス逆転写酵素阻害薬、好ましくはアジドチミジンに関する。
【００７９】
以前に開示された全ての技術的データは、本願発明に適用可能である。
【００８０】
「本発明のキット」
罹患した患者におけるこれらのHERV-Wエレメントの発現並びに/又は疾患特異的な組織及び病変におけるこれらの検出により、HERV-W関連疾患又は症候群の一般的なカテゴリーが特定され規定される。また、これは、疾患の進行の経時変化の間及びその治療中のHERV-Wの生物活性を反映する。
【００８１】
したがって、特定の疾患特異性又はHERV-W関連疾患若しくは症候群の患者の臨床的特徴との特定の関連を有する、改善された感度でのHERV-Wの検出は、診断的同一性及び層別性にとって、並びに患者の経過観察及び治療的モニタリングにとって重要な価値を構成する。したがって、プライマー、プローブ、及びPCRプロトコルのパネルから、本願発明者らは、患者においてHERVの発現の存在を検出する及び/又はそのレベルを測定するのに有用であることが明らかになったプライマー及びプローブを選択しキットを開発した。
【００８２】
結果として、第四の態様において、本発明は配列番号11〜28から成る群から選択される少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、好ましくは少なくとも4つ、好ましくは少なくとも5つ、好ましくは少なくとも6つ、好ましくは少なくとも7つ、好ましくは少なくとも8つ、好ましくは少なくとも9つ、好ましくは少なくとも10のオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。
【００８３】
好ましくは、前記キットは少なくとも配列番号17及び/若しくは18、又は配列番号19及び20を含む。
【００８４】
あるいは、前記キットは：
- 配列番号19、20、23、24、及び25；又は
- 配列番号17、18、23、24、及び25；又は
- 配列番号19、20、14、15、16、23、24、及び25；又は
- 配列番号17、18、14、15、16、23、24、及び25を含む。
【００８５】
より好ましくは、本発明のキットは、配列番号11〜28に示される全てのオリゴヌクレオチドを含む。典型的には、前記キットは、PCR、又はより具体的には定量的PCR(qPCR)アッセイを行うために用いることを目的としている。したがって、キットは、好ましくは、RNA又はDNA相対定量のために、及び様々な適応症に対して最も適当な参照細胞遺伝子由来のプライマー及び/又はプローブも含む。
【００８６】
前記キットは、好ましくは：
- 配列番号26、27、及び28；又は
- GUSB遺伝子に特異的な配列；又は
- RNAse P遺伝子に特異的な配列；又は
- qPCRによる相対定量のための参照細胞遺伝子に特異的な配列
をさらに含む。
【００８７】
前記キットは、MSRVを含むが他のHERV-Wサブタイプも含む、W型ヒト内在性レトロウイルスファミリー(HERV-W)に属するウイルスの検出及び/又は定量をモニタリングするのに有用である。より具体的には、本発明のキットは、RTを含む、HERV-W polポリタンパク質をコードする配列として、HERV-W Envをコードする配列を検出及び/又は定量するのに有用である。典型的には、患者のHERV-Wの検出及び/又は定量は：
(i) 好ましくは体液中又は疾患特異的な組織及び病変中に検出される、特異的なHERV-W RNA、DNA、又は抗原の検出及び/又は定量、
(ii) 血液由来の、又は病変若しくは機能不全を伴う器官由来の細胞又は組織中の上昇したDNA又はRNAのコピー数の検出及び/又は定量
を包含する。
【００８８】
結果的に、第五の態様において、本発明は、HERV-W関連疾患に罹患した患者において、HERVに、好ましくはHERV-Wに、より好ましくはMSRVに属するウイルスを標的とする抗レトロウイルス薬として使用するための、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体であって、前記患者が、該患者の生体サンプル中のHERV-Wを検出及び/又は定量する工程i)を含む方法により同定される、抗体、その断片又は誘導体に関する。
【００８９】
これにより、この特定の実施態様において、医師は、HERV-W関連疾患に罹患した患者の適切な医療ケアを適合させ最適化することができる。HERV-Wの発現の存在及び/又はレベルのモニタリングは、経過観察ケア及び臨床的意思決定に非常に適している。実際、医師は、各患者のための最適なストラテジーを有する適切な治療を規定することができる。
【００９０】
典型的には、検出及び/又は定量する工程i)は、当業者に周知の定常的な手法に従って行ってもよい。典型的には、前記工程i)は、患者の生体サンプルをプローブ、プライマー、リガンド、又は抗体等の選択試薬と接触させ、それにより元からサンプル中にある目的の核酸又はタンパク質の存在を検出することを含む。好ましくは、前記HERV-Wの存在を検出する及び/又は定量する工程i)は、本発明のキットを用いて行われる。
【００９１】
以前に開示された全ての技術的データは、本願発明に適用可能である。
【００９２】
「医薬組成物」
本発明のさらなる目的は、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する有効量の抗体を含み、場合によりレトロウイルス逆転写酵素阻害薬を含む医薬組成物に関する。
【００９３】
上述の本発明の任意の治療剤を、医薬的に許容される賦形剤、及び場合により生分解性ポリマー等の持続放出マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成してもよい。
【００９４】
「医薬的に」又は「医薬的に許容される」は、必要に応じて、哺乳類、特にヒトに投与した場合、有害な、アレルギー性の、又は他の不都合な反応を生じさせない、分子の実体及び組成物を指す。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、非毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意の種類の製剤化助剤を指す。
【００９５】
医薬組成物の形態、投与の経路、用量、及びレジメンは、治療されるべき状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重、性別等に必然的に依存する。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、鼻腔内、眼内、静脈内、筋肉内、又は皮下等の投与用に製剤化することができる。
【００９７】
好ましくは、医薬組成物は、注射することができる製剤について医薬的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張性の滅菌された生理食塩水(リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、若しくは塩化マグネシウム等、又はそのような塩の混合物)であってもよく、また乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であって、状況に応じて、滅菌水又は生理食塩水を加えると、注射可能な溶液を構成することが可能になるものでもよい。
【００９８】
投与のために用いられる用量は、様々な変数に応じて、特に用いられる投与方法、関係する病的状態、又はその代わりに所望の治療期間に応じて、適合させることができる。
【００９９】
医薬組成物を調製するために、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する有効量の抗体を、医薬的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散してもよい。
【０１００】
注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、落花生油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、容易に注射針を通過できる程度の流体でなければならない。製造及び貯蔵の条件下において安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用を防ぐように保存されなければならない。
【０１０１】
遊離塩基又は医薬的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水中に調製することができる。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、これらの混合物中、又は油中に調製することもできる。通常の貯蔵及び使用の条件下において、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。
【０１０２】
製剤化されると、溶液は、用量処方(dosage formulation)に適合する方法で、かつ治療的に有効な量で、投与される。製剤は、上述の注射溶液の種類等の様々な投与形態で、容易に投与されるが、薬剤放出カプセル等を用いてもよい。
【０１０３】
好ましくは、本発明のHERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、又はその断片及び誘導体を、緩衝液に製剤化してもよく、その緩衝液中に抗体等を溶解し、貯蔵し、患者に注射する。好ましくは、前記緩衝液は、20mMヒスチジン、5%スクロース、及び0.01%ポリソルベート20を含み、pH 6.0を示す。GNbAC1の静脈投与に用いられる製剤の一例を、実施例3に示す。
【０１０４】
水性溶液中での非経口投与に関しては、例えば、溶液は適切に緩衝化されていてもよく、液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされていてもよい。これらの特定の水性溶液は、静脈、筋肉内、皮下、及び腹腔内の投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして、当業者に周知である。例えば、1用量を、1 mlの等張NaCl溶液中に溶解し、1000 mlの皮下注入液に加えるか、又は提案される注入部位に注射することができる(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035-1038頁及び1570-1580頁を参照)。治療される患者の状態に応じて、投与のある程度の変動が必然的に起こる。いずれの場合も、投与の責任者が、個々の患者の適切な用量を決定する。
【０１０５】
静脈注射又は筋肉内注射等の非経口投与のために製剤化された化合物に加え、他の医薬的に許容される形態には、例えば、経口投与のための錠剤又は他の固体；時間放出カプセル；及び現在用いられている任意の他の形態が含まれる。
【０１０６】
「本発明の治療的方法及びモニタリング方法」
また、本発明は、患者にHERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体を投与することにより、該患者におけるヒト内在性レトロウイルス(HERV)に属するウイルスの発現及び/又は複製を阻害するための方法に関する。
【０１０７】
さらなる実施態様において、本発明は、多発性硬化症(MS)、統合失調症(SZ)、双極性障害(BP)、単極性うつ病又は精神病性うつ病、臨床的孤発症候群(CIS、神経症状を伴う)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、てんかん、乾癬、がん、炎症性膵炎、及び1型糖尿病又は2型糖尿病等の糖尿病から成る群から選択される疾患に罹患した患者に、HERV-Wエンベロープタンパク質(HERV-W Env)に対する抗体、その断片又は誘導体を投与することにより、該疾患を予防する及び/又は該疾患を患う患者を治療するための方法であって、前記抗体が、HERVを標的とする、好ましくはHERV-Wを標的とする、より好ましくはMSRVを標的とする抗レトロウイルス薬として作用する方法に関する。
【０１０８】
また、本発明は、
1) 本発明のキットを用いて、生体サンプル中のヒト内在性レトロウイルス(HERV)ファミリー、好ましくはHERV-W、より好ましくはMSRVに属するウイルスを検出及び/又は定量することにより、患者の予後を予測する工程；及びその後
2) 前記工程1)によりヒト内在性レトロウイルス(HERV)の発現が示された場合は、本発明の方法は、前記患者に本発明の抗体、断片又は誘導体を与える工程3)を含む工程、
を含む、HERV-W関連疾患に罹患した患者を治療する方法にも関する。
【０１０９】
また、本発明は、
a. 本発明の抗体、断片、又は誘導体を用いて患者を治療する工程；そして
b. 前記患者の生体サンプル中のHERV-Wを検出及び/又は定量する工程
を含む、HERV-W関連疾患に罹患した患者の治療への応答をモニタリングするための方法にも関する。
【０１１０】
別の実施態様において、本発明は、HERV-W関連疾患に罹患した患者の生体サンプル中でHERV-Wを検出及び/又は定量する工程を含む、該患者の治療への応答をモニタリングするための方法に関する。好ましくは、前記患者は、本発明の抗体、断片又は誘導体を含む。「抗体を含む患者」という表現は、抗体を用いて治療され、自身の血液、組織、又は器官中に検出可能な量の該抗体を示す、患者を指す。典型的には、前記抗体、断片、又は誘導体は、HERV-Wを検出及び/又は定量する工程の前に、患者に提供又は投与される。
【０１１１】
本発明によれば、HERV-W関連疾患に罹患した患者の治療への応答をモニタリングする場合、生体サンプルは、血液、脳脊髄液、尿等の体液、又はMS脳プラーク、CIDP神経生検、若しくは糖尿病膵臓生検等の疾患特異的な組織及び病変中のサンプルであってもよい。
【０１１２】
典型的には、検出及び/又は定量する工程b.は、当業者に周知の定常的手法に従って行ってもよい。典型的には、前記工程b.は、患者の生体サンプルをプローブ、プライマー、リガンド、又は抗体等の選択試薬と接触させ、それにより元からサンプル中にある目的の核酸又はタンパク質の存在を検出することを含む。好ましくは、HERV-Wの発現の存在を検出する及び/又はそのレベルを測定する工程b.は、本発明のキットを用いて行われる。
【０１１３】
以前に開示された全ての技術的特徴は、本願発明に適用可能である。
【実施例】
【０１１４】
「実施例１：GNbAC1を用いて治療された多発性硬化症の患者におけるヒト内在性レトロウイルスW型mRNA発現の阻害」
GNbAc1は、内在性レトロウイルスエレメントのHERV-Wファミリーの一員であり、そのためHERV-W Envとも呼ばれる、多発性硬化症関連レトロウイルスエンベロープタンパク質(MSRV-Env)に対するIgG4モノクローナル抗体である。GNbAC1は、健康な志願者に対して行われた第I相臨床試験において、有益な安全性プロファイル及び線形の薬物動態を示している。
【０１１５】
本GNC002第IIa相臨床試験は、10人のMS患者において、2及び6 mg/kgのGNbAC1の安全性プロファイル及び薬物動態を評価するために行われた。GNC002は、12ヶ月の長さの試験であり、GNbAC1が月単位で投与される。
【０１１６】
本解析は、GNC002の最初の6ヶ月の間に採取されたサンプルについて行われ、登録された患者の末梢血単核球細胞(PBMC)におけるHERV-W関連転写産物のレベルがリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)により評価された。HERV-W転写産物は、以下の種々のプライマー/プローブセット：MSRV-env、HERV-W-UNO、HERV-W-UNO2により評価された。
【０１１７】
［材料及び方法］
GeneuroによるGNC002実験マニュアル中のプロトコルに従って、サンプルを4 ml CPTバキュテナー管に採取し、処理し、保存し、そして輸送した。
【０１１８】
GNC002試験に関与した2つの求人センターにより、10人のMS患者からの凍結PBMCが提供された。
【０１１９】
【表４】
2017519815.tif 000006
【０１２０】
（ソフトウェア）
- Biorad CFX Manager 2.0：PCRの実行及び解析
- Genex 5：PCRの生データの平滑化
- Graph Pad Prism：描画
- SigmaStat：統計解析
【０１２１】
使用した正規性検定は、コルモゴロフ‐スミルノフ検定である。相関は、データがパラメトリックである場合は、ピアソンの積率解析を用い、データがノンパラメトリックである場合は、スピアマンの順位相関解析を用いて決定した。
【０１２２】
（プロトコル）
簡潔に言えば、第一の工程は、全RNAをPBMCサンプルから抽出することにある。サンプルは、CPTチューブに採取され、ウシ胎児血清中0.5 mlのDMSO 10%中で凍結された、血液から単離されたPBMCであった。解凍後、PBMCサンプルを氷冷PBSで洗浄し、全RNAをQIAamp RNeasy Mini Kitを用いて抽出した。その後、cDNAを、予め抽出された全RNA中に含まれる全てのmRNAを逆転写することにより調製した。これらのcDNAに対して、(複数のプレートを用いる試験全体にわたって値の標準化を可能にする)プレート間のキャリブレーターとして用いる内部標準を加えて定量的PCRを行った。結果を、MS集団における安定的発現レベルを有する参照のハウスキーピング遺伝子であるGUS B RNAの発現に対する割合によって、標的RNA(MSRV/HERV-W)の相対発現として表した。 
【０１２３】
（プライマー及びプローブの配列）
対照のハウスキーピング遺伝子、GUS B用の市販の検出プライマー/プローブセットは、Taqman Gene Expression Assay GusB (Applied biosystem 4448485)である。VIC(登録商標)は、GusBプローブの5’末端で検出される蛍光色素標識である。
【０１２４】
MSRV-envプライマー及びプローブは、シンシチンではなく、MSRV-Envタンパク質をコードする配列を特異的に検出するように設計されている。反対に、シンシチンプライマーは、MSRV-envではなく、シンシチンをコードする配列の特異的増幅を可能にする。FAM(商標)色素標識の蛍光は、MSRV-env及びシンシチンのプローブにおいて測定される。
【０１２５】
UNO2プライマーは、Geneuroにより、MSRV-Envの配列を認識するように設計されており、他の内在性レトロウイルス配列の対応する領域との類似性により、潜在的な免疫抑制機能を有するようになっている；それにも関わらず、この技術用語(「免疫抑制ペプチド/配列」)は、本願明細書において、多くのレトロウイルスにおいて全く免疫抑制的ではない可能性がある、レトロウイルスエンベロープタンパク質中の定義されたドメインを特定するために用いられる。これらのプライマーは、シンシチンをコードする配列ともハイブリダイズすることができる。
【０１２６】
UNOは、Geneuroにより設計され、MSRV-Env及びシンシチンをコードする配列に結合する。UNO及びUNO2プライマーにより増幅される配列に対して設計されたプローブは無いため、SYBRグリーン蛍光により、これらの配列の増幅の定量が可能になる。
【０１２７】
MSRV-polプライマー及びプローブは、Geneuroにより設計され、MSRV逆転写酵素をコードする配列を認識する。MSRV-polプローブハイブリダイゼーションの検出は、FAM(商標)蛍光レポーターを用いて定量される。
【０１２８】
【表５】
2017519815.tif 000007
【０１２９】
CFXサーモサイクラーによって検出されるフルオロフォアは、プローブの5’にある。プローブの無いプライマーセットに関しては、インターカレートするSYBRグリーン色素を用いて検出を行う。
【０１３０】
「結果の解析」
解析におけるバイアスを防ぐサンプルの排除基準は以下のとおりである：
- 抽出及びDNase処理の後、サンプルのRNA濃度が10 ng/μL未満
- 三重のPCRの標準偏差が、1サンプルにつき0.2 Cqより高い
- GUS BのCq(Cycle of Quantification(定量のサイクル))が、分解カットオフより高い、これは、RNAが本試験の期待される品質レベルに達していないことを示す。分解カットオフは、以下のように計算される：平均 + 2 x 全ての個別のGUS B Cq値の標準偏差
【０１３１】
MSRV/HERV-W env遺伝子及びGUS Bに対する全ての個別のCqを、Genex(登録商標)ソフトウェア(MultiD analyses AB、スウェーデン)を用いて、各試験プレートに加えられた各自の内部標準に従って標準化する。
【０１３２】
各サンプル中の各標的RNAの相対発現は、以下のとおり計算される：
GUS Bに対する標的RNA相対発現 = 2(Cq GUS B ‐Cq 標的RNA)
【０１３３】
（抽出収率及びサンプル排除）
抽出後、Nanodrop(登録商標)装置を用いて、各サンプルの全RNA濃度を決定する。全RNA濃度が10 ng/μl未満の全サンプルを排除した。全RNAの定量の前に、最終的に全RNA調製物に残存するコンタミネートしたゲノムDNAを取り除くために、全RNAをDNase処理に供した。このDNase工程の後、各サンプルについてコンタミネートしているゲノムDNAが存在していないことを、逆転写をしないPCRによって管理した(NoRT Ctrl n°1)。この工程中にゲノムDNAが検出される場合、対応するサンプルを2回目のDNase工程及び2回目のRNA定量、並びに2回目のNoRT管理(NoRT Ctrl n°2)に供した。この追加のDNase処理の後にゲノムDNAが依然として調製物に存在する場合、又は全RNAが10 ng/μlを下回った場合、サンプルを最終的に排除した。 
【０１３４】
（Genex(登録商標)による生データの標準化及びサンプルの排除）
複数のPCRマイクロプレートから回収された生データを調和させるために、全ての生データを、Genexソフトウェアを用いて、各マイクロプレートに存在する内部標準に従って標準化した。PCR三重の標準偏差が0.2 Cqを超えたサンプルを、試験から排除した。サンプルの質は、GUS B発現レベルにより反映される。分解カットオフを超えた全てのサンプルを試験から排除した。
【０１３５】
「結果」
（組み入れ時のHERV-W関連転写産物レベル）
試験の最初の時点において、GNbAC1又はプラセボの最初の投与の前に、PBMCを全対象の血液から単離した。したがって、表5及び図1に示す結果は、本試験の組み入れ時点での各患者についての目的のHERV-W関連転写産物の基礎レベルに対応する。
【０１３６】
【表６】
2017519815.tif 000008
【０１３７】
全患者の結果の分布は、「env」及び「syn」qPCRプロトコルについては同質だが、「UNO2」で特異的に標的化されたRNAについて比較的低い相対発現が検出されたにも関わらず、UNO及びUNO2プロトコルでは分布の違いが見られる。
【０１３８】
2 mg/kgのコホートと6 mg/kgのコホートに登録された患者間で、及び試験に関与した両求人センター間で、組み入れ時のHERV-W転写産物レベルの分布に違いは観察されなかった。 
【０１３９】
（組み入れ時のHERV-W env及びpol転写産物レベルの臨床データとの比較）
組み入れ時の臨床パラメータとHERV-W関連転写産物レベルとの相関を、表6に要約した情報に従って評価した。
【０１４０】
【表７】
2017519815.tif 000009
【０１４１】
第一に、これらの結果は、種々のqPCRプロトコルに用いられたプライマー及びプローブが何であっても、また、HERV-W遺伝子が何であっても(env又はpol)、最も高いHERV-W RNAレベルは、PPMS患者において見られ、最も低いレベルは、SPMS患者において見られたという事実を証明した(図2)。これは、2つの異なる形態の進行性MS(PPM及びSPMS)の患者における差異的なHERV-W転写産物発現レベルに関する興味深い新情報を明確に与える。また、これはRRMSにとっても興味深い可能性があるが、本願明細書にはそのような症例はただ1つしか提示されておらず、中程度の相対発現を伴う。
【０１４２】
これにより、MS患者におけるHERV-W転写産物レベルの定量が、診断的価値を有する可能性があり、また、例えば、SPMSとPPMSとの症例の間の鑑別診断を裏付ける目的に用いることができることが示される。また、これは、PPMS、SPMS、及び最終的にはRRMSでも、予後又は治療モニタリングのためのqPCR閾値を層別化するために有用である可能性がある。
【０１４３】
第二に、現在は少数ではあるが、「Syn」及び「pol」プロトコルを用いた場合、HERV-W env及びpolのRNA転写産物レベルと有病期間及び/又は増悪指数との間に統計的に有意な相関が見い出された。異なるプライマー及びプローブを用いる他のプロトコルでは、臨床パラメータとの間に有意な相関が生じず、このことにより、図3に示すように、選択したプロトコルの価値が強調される。
【０１４４】
これにより、シンシチンサブタイプをコードするenv遺伝子(配列番号：14、15、及び16を伴う「Syn」プロトコル)又はpol遺伝子一般(配列番号：23、24、及び25を伴う「pol」プロトコル)のHERV-W転写産物レベルの定量のためのプロトコルの選択も、MSの特定の診断的価値を有する可能性があることが示される。本願明細書において、「syn」及び「pol」qPCRプロトコルを、臨床的層別化、経過観察、及び治療的モニタリングのためのHERV-W関連疾患活性(疾患増悪の進行)のバイオマーカーとして用いることができる。また、これは、「Syn」qPCRを用いて、進行性MSにおける疾患の「有病期間対活性」を層別化するのにも有用である可能性があり、数年間にわたる増悪進展(特にSPMS)を有する患者におけるHERV-W env「シンシチン」の転写産物レベルに応じて適用する治療ストラテジーの違いについての展望がもたらされる。
【０１４５】
（6ヶ月間のHERV-W関連転写産物レベル）
本試験に組み入れられた各患者について、1日目(組み入れ)、2日目、8日目、15日目、及び29日目にPBMCを血液サンプルから単離した。その後、患者は5回の追加の月単位のGNbAC1投与を受け、抗体の各注入の前に、PBMCを血液サンプルから単離した。したがって、以下の結果は、GNC002試験の最初の6ヶ月における各HERV-W関連転写産物の変動を表す。
【０１４６】
2回目のGNbAC1投与は、患者によって、1日目からの異なる時点で起こった。したがって、HERV-W関連転写産物の平均変動を、各GNbAC1の投与の前に採取された血液サンプルのみを用いて評価した。
【０１４７】
2 mg/kgのコホートにおいて、組み入れ時の基底値と比較した場合、6回目のGNbAC1投与において、全てのHERV-W転写産物レベルの減少が観察された(図4)。これは、6 mg/kgコホートで確認された(図4)。全患者(2 mg/kg及び6 mg/kgのコホート)を1つに集めた場合、GNC002試験の期間全体にわたり、HERV-W UNO、UNO2、及びpol qPCRプロトコルにより、減少がより良く実証される(図4)。また、このことは、全患者で1回目、3回目、及び6回目のGNbAC1注射の前に測定された値の統計的分布を用いても表される(図5)。
【０１４８】
非常に予想外なことに、減少はpol mRNAについても記録される。この作用は、HERV-W Envタンパク質に特異的に結合する抗体が、6ヶ月間にわたり月1回、疾患関連HERV-W発現を伴う患者に注射された後に生じさせることが期待されるものではない。したがって、逆転写酵素、プロテアーゼ、及びインテグラーゼ酵素をコードするmRNAに対するこの作用は、GNbAC1等の抗-Env抗体に特有かつ新規なものであるようである。したがって、全体的なHERV-W発現自体に対する作用、及び、polにコードされる生産物を介した、複製レトロウイルス活性に対する作用が実証される。したがって、抗レトロウイルス作用、特にHERV-Wファミリーを標的とする抗-内在性レトロウイルス作用が示される。
【０１４９】
図5において、GNbAC1又はHERV-W発現に干渉する任意の薬剤で治療される患者群の治療的モニタリングのために最も正確なqPCRプロトコル用プライマー及びプローブの選択は、HERV-W envについては「UNO2」、HERV-W酵素をコードするpol遺伝子については「pol」である。それでもなお、他のqPCRプロトコルにより得られた統計を用いた割合の計算も、診断的又は予後的に興味深い可能性がある。
【０１５０】
この試験において、GNC002試験に組み入れられたMS患者のHERV-W関連転写産物レベルを、異なるHERV-W env遺伝子の代表配列を増幅する種々のプライマーのセット及びHERV-W pol配列(逆転写酵素コーディング領域内)を増幅する1つのプライマーのセットを用いて、リアルタイム定量的PCRにより評価した。ここで調査したHERV-W転写産物は、MSRV-env、HERV-W-UNO、HERV-W-UNO2、HERV-W-Syn、及びMSRV-polと命名される。
【０１５１】
結果は、これらのバイオマーカーにより、MSの診断及びHERV-W関連疾患の治療的モニタリングのための、高感度の目的の生体臨床的(bioclinical)データがもたらされることを明確に示す。
【０１５２】
さらに、HERV-W関連転写産物レベルは、PPMS患者の方がSPMS患者よりも高いようであり、このことにより、患者の生体臨床的評価のための、さらには、MS進行型(SPMS及びPPMS)間の鑑別診断の目的ための、種々のプライマーのセットを用いた本発明の定量的PCR試験の価値が裏付けられる。
【０１５３】
2 mg/kg及び6 mg/kgの両方のコホートにおいて、全てのHERV-W関連転写産物レベルがGNC002の最初の6ヶ月間で減少したので、これにより、患者の治療的モニタリングのための、及び治療効果の生体臨床的評価のための、本発明のプライマーのセット及びqPCRプロトコルの生体臨床的価値が裏付けられる。
【０１５４】
また最後に、このことにより、MSに罹患した患者における(GNbAC1等の)抗HERV-W Env抗体治療が、HERV-Wに対する阻害作用を有するという生物学的エビデンスが与えられるが、この作用はenv mRNAレベルについては予想されておらず、pol mRNAについてはさらにより予想されていなかった。これにより、ヒト外来性レトロウイルスではこれまで説明されていなかった、このヒト疾患に関連する内在性レトロウイルスに対する抗-Env抗体治療の有効性が明らかに示される。 
【０１５５】
「実施例2：ヒト内在性レトロウイルスW型pol遺伝子にコードされたタンパク質(逆転写酵素)の阻害は、GNbAC1抗体とAZTとの併用治療により相乗的に強化される」
「A.HERV-W gag、pol、及びenvタンパク質を自然に発現する細胞培養の抗原キャラクタライゼーション」
［材料及び方法］
（HERV-W gag、pol、及びenvタンパク質を自然に発現する細胞培養）
ヒトCH2細胞を、10%ウシ胎児血清(10270106；Invitrogen)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P4333；Sigma)を補ったIMDM培地(12440053；Lifetech)中、37℃、5% CO2で維持した。タンパク質抽出
【０１５６】
（タンパク質抽出）
CH2細胞を、4℃で、cOmplete(登録商標)抗-ホスファターゼインヒビターカクテル(04 693 132001；Roche)及び0.05% LPG(326495-22-1；Avanti Polar)を含む、500μlのRIPA緩衝液(R0278、SIGMA)に再懸濁し、回転台上で26℃、2時間インキュベートし、10000gで20分間、26℃で遠心分離した。上清を回収し、-20℃で保存した。 
【０１５７】
（ウエスタンブロッティング）
タンパク質抽出物を、2X Laemmli buffer (Biorad)で希釈し、5分間、100℃で加熱した後でロードした。タンパク質を7.5%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(TGX、Biorad)により分離した。ゲルを、15分間、120mAで、泳動バッファー(Life Technologies)中で泳動した。タンパク質を0.2μmニトロセルロース膜(Biorad)上にトランスファーした後、膜を0.05% Tween20緩衝液(Sigma)を含む1x PBS (Biomerieux)で2回洗浄し、回転台上でStarting Block (Thermo)を用いて室温で1時間ブロッキングした。一次抗体を、表1に従って、1x PBSで1時間使用した。その後、膜を3回洗浄し、HRP-コンジュゲートヤギ抗-ウサギ(G21234；lifetech、1/1000、1x PBS中)又はマウス(115-035-146；jackson、1/1000、1x PBS中)IgG抗体と共に30分間インキュベートした。目的のタンパク質を、所定のプロトコルに従って、比色反応(Opti 4-CN、Biorad)により検出した。
【０１５８】
標的抗原を有する抗体及び抗体希釈：1) ウサギポリクローナルpAb1(SQ09AK001、Squarix)、MSRV-Env、0.5μg/ml；2) ウサギポリクローナル330110 J77血清(330110 J77、InCellArt)、MSRV-Polポリタンパク質、1/500；マウスモノクローナル38E12(250510, Squarix)；MSRV-Gagポリタンパク質、1μg/ml。
【０１５９】
「結果」
図6からわかるとおり、これらの細胞は、gag、pol、及びenvにコードされるタンパク質に対する特異的抗体により検出される、全てのHERV-W構造タンパク質を発現する。
【０１６０】
注目すべきは、抗-gag抗体が、カプシドP30-様タンパク質バンドの比較的強い検出を含む、HERV-W gagにコードされるポリタンパク質及び種々の切断されたタンパク質を検出することである。抗-Env抗体により検出されるパターンは、HERV-W envにコードされるグリコシル化及び非-グリコシル化単量体、二量体、及び三量体、並びに45及び35KDa付近の切断されたSU又はTMユニットの検出を伴い、より複雑であるように思われる。抗-pol抗体は、主に切断された逆転写酵素を検出するが、ゲルの上部に高分子のバンドが見られ(KDa推定を表示していない)、これらはHERV-W polにコードされる切断されていないポリタンパク質に相当すると思われる。
【０１６１】
「B．ヒト内在性レトロウイルスW型pol遺伝子にコードされたタンパク質(逆転写酵素)は、GNbAC1抗体とAZTとの併用治療に曝露された細胞ではもはや検出されない」
［材料及び方法］
（脊索腫細胞培養）
ヒトCH1及びCH2細胞(1:1)の細胞を、CH2細胞の増殖を最適化するために共培養し、6ウェルプレート(CC7672-7506；CytoOne)に、1.106 細胞/ウェルの密度で、10%ウシ胎児血清(10270106；Invitrogen)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P4333；Sigma)を補ったIMDM培地(12440053；Lifetech)中、37℃、5% CO2で維持した。細胞をi) AZT (1μg/ml、A21-69；Sigma)、ii) GNbAC1 (300μg/ml、T950111-A；Polymun)、iii) AZT + GNbAC1で、又は対応する対照をGNbAC1緩衝液[20mM His、5%スクロース(w/v)、0,01% Tween 20 (w/v)]で、処理した。 
【０１６２】
（タンパク質抽出）
CH1及びCH2細胞を、4℃で、cOmplete(登録商標)抗-ホスファターゼインヒビターカクテル(04 693 132001；Roche)及び0.05% LPG(326495-22-1；Avanti Polar)を含む、200μlのRIPA緩衝液(R0278、SIGMA)に再懸濁し、回転台上で26℃、2時間インキュベートし、10000gで20分間、26℃で遠心分離した。上清を回収し、-20℃で保存した。 
【０１６３】
（ウエスタンブロッティング）
タンパク質抽出物を、2X Laemmli buffer (Biorad)で希釈(2:1)し、5分間、100℃で加熱した後でロードした。タンパク質を7.5%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(TGX、Biorad)により分離した。ゲルを、15分間、120mAで、泳動バッファー(Life Technologies)中で泳動した。タンパク質を0.2μmニトロセルロース膜(Biorad)上にトランスファーした後、膜を0.05% Tween20緩衝液(Sigma)を含む1x PBS (Biomerieux)で2回洗浄し、回転台上でStarting Block (Thermo)を用いて室温で1時間ブロッキングした。一次抗体を、表1に従って、1x PBSで1時間使用した。その後、膜を3回洗浄し、HRP-コンジュゲートヤギ抗-ウサギ(G21234；lifetech、1/400、1x PBS中)又はマウス(115-035-146；jackson、1/1000、1x PBS中)IgG抗体と共に30分間インキュベートした。目的のタンパク質を、所定のプロトコルに従って、比色反応(Opti 4-CN、Biorad)により検出した。抗体：ウサギポリクローナル330110 J77血清(330110 J77、InCellArt)、MSRV-Polポリタンパク質に対して得られたもの、1/500希釈。
【０１６４】
図7に示される、この試験の結果からわかるとおり、GNbAC1とAZTの両方の組合せの存在下で培養した細胞(レーン番号1)は、もはや検出可能なレベルのHERV-W逆転写酵素(RT)を発現していない。AZT単体に曝露された場合(レーン番号2)、抗HERV-W RT抗体により染色された、対応するシグナルの減少により、HERV-W RT発現の明確な低減が示される；それでもなお、これは部分的な効果に留まる。レーン番号3において、GNbAC単体への曝露は、このインビトロ条件で検出されるように、HERV-W polにコードされる逆転写酵素タンパク質に対する影響が小さいようである。並行する陽性対照として、模擬処理としてGNbAC1希釈剤(希釈緩衝液)のみに曝露した細胞のHERV-W RTタンパク質の発現は、レーン番号4のこれらの細胞において発現されたこのRTバンドの正常な存在を示す。
【０１６５】
したがって、この試験において、GNbAC1抗HERV-W Env抗体とアジドチミジン(AZT)の両方の組み合わせのみが、HERV-W gag、pol、及びenv遺伝子を全部発現するこのヒト細胞の培養のHERV-W RT生産を完全に阻害するのに十分な効果を有する一方で、各治療分子単体では、このHERV-W発現に対して部分的又は非常に小さい効果しか有さないことが示される。たとえこれがインビトロ細胞培養条件に関連しているとしても、それでもなお、HERV-W Envタンパク質を中和する抗体と抗-レトロウイルス逆転写酵素薬というこの独自の組み合わせの、HERV-W RT発現の阻害の有効性に対する明らかに増加した重大な相乗効果を実証する。これらの治療分子は、(i)完全に異なる分子及びタンパク質構造を特異的に標的としている、(ii)完全に異なる作用様式を有する(特異的エピトープ標的化によるEnv中和作用及びRT酵素活性の阻害)、及び(iii)一方は抗体であり、他方は小さい化学分子であるだけになおさらHERV-W等の内在性レトロウイルスのRT発現への作用に相乗効果を与えることが予想されていない。
【０１６６】
「実施例3：ヒト個体での静脈注射に適したGNbAC1抗体製剤のための緩衝溶液の処方」
実施例1で言及したとおり、GNbAc1は、多発性硬化症関連レトロウイルスエンベロープタンパク質(MSRV-Env)に対するIgG4モノクローナル抗体であるが、MSRV-Envは内在性レトロウイルスエレメントのHERV-Wファミリーの一員であり、そのためHERV-W Envとも呼ばれる。GNbAC1は、健康な志願者に対して行われた第I相臨床試験において、有益な安全性プロファイル及び線形の薬物動態を示している。GNC002第IIa臨床試験は、10名のMS患者において、2及び6 mg/kgのGNbAC1の安全性プロファイル及び薬物動態を評価するために行われた。GNC002は、12ヶ月の期間にわたる試験であり、GNbAC1が月単位で投与される。
【０１６７】
GNbAC1抗体の静脈(iv)投与の目的のために、抗体が溶解され、貯蔵され、患者に注射される、特に適した緩衝液の製剤は、以下のとおりである：20mMヒスチジン、5%スクロース、0.01%ポリソルベート20、pH 6.0。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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