(57)【要約】  本発明は、製剤添加剤としてのカルシウムイオンを必要としない新規なアルブミンフリーの組換え第ＶＩＩＩ因子製剤を提供する。製剤中に塩化カルシウムを存在させないことにより、多くの改善点及び利点を有する第ＶＩＩＩ因子製剤が得られる。本発明により、第ＶＩＩＩ因子製剤にカルシウムイオンを存在させないことによって、非晶質相の最大濃縮相ガラス転移温度が上昇し、従って凍結乾燥をより効率的に行うことが可能となる。また、製剤中に遊離カルシウムイオンが存在しないため、金属が仲介する酸化反応が回避され、従ってタンパク質分子が化学的不安定性を生じないため、安定性が改善される。最後に、カルシウムを存在させないことは、第ＶＩＩＩ因子製剤に添加される添加剤の種類を減らすことになるため、配合が一層単純になる。【選択図】図１Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
水で再調製した場合、
ＮａＣｌを約３１０ｍＭ以下と、
ヒスチジン（ｐＨ６．５〜７．５）を約５０ｍＭ以下と、
スクロース又はトレハロースを約２０ｍＭ以下と、
ｒＶＩＩＩ因子を約５０〜２０００ＩＵ／ｍＬと、
を含み、製剤添加剤としてのＣａ２＋等の２価の陽イオンを含まない、アルブミンフリー且つカルシウムフリーの安定なｒＦＶＩＩＩ凍結乾燥調製製剤。
【請求項２】
水で再調製した場合、
ＮａＣｌを約３０８ｍＭと、
ヒスチジン（ｐＨ６．５〜７．０）を約２０ｍＭと、
スクロース又はトレハロースを約９ｍＭと、
ｒＶＩＩＩ因子を約５０〜２０００ＩＵ／ｍＬと、
を含み、製剤添加剤としてのＣａ２＋等の２価の陽イオンを含まない、アルブミンフリー且つカルシウムフリーの安定なｒＦＶＩＩＩ凍結乾燥調製製剤。
【請求項３】
前記ｒＦＶＩＩＩは８，０００〜１５，０００ＩＵ／ｍｇの比活性を有するＢ−ドメイン切断タンパク質である、請求項１又は請求項２に記載の調製製剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製製剤の、血友病を治療するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年４月１日に出願された米国特許出願第６１／９７３，２８０の関連出願であり、米国特許法第１１９条の下でこの出願に基づく優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に医薬製剤に関し、詳細にはアルブミンを使用せず（アルブミンフリー）且つ塩化カルシウム等の２価陽イオンを最終製剤に添加することなく安定化させたｒＦＶＩＩＩ凍結乾燥製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルブミンフリーのｒＦＶＩＩＩ製剤に、安定化及び製剤化のためのマトリックス添加剤として塩化ナトリウム、グリシン、マンニトール、スクロース、トレハロース、ヒスチジン、塩化カルシウム等を添加し市販品は多数ある。第ＶＩＩＩ因子は、重鎖及び軽鎖がカルシウムイオンや銅イオン等の２価陽イオンによる金属イオン架橋を介して結合している大きなヘテロダイマー分子であることから、塩化カルシウムはｒＦＶＩＩＩ製剤に欠かせない構成要素であると考えられている。塩化カルシウムは第ＶＩＩＩ因子の完全性及び安定性を維持するために欠かせないという前提の下、現在使用されている製剤は全て塩化カルシウムを含有している。各種製剤は塩化カルシウムを１．７ｍＭ〜５ｍＭと様々な濃度で含有する。最近になって、カルシウム（Ｃａ２＋）は第ＶＩＩＩ因子が補因子活性を呈するために必要ではあるが、重鎖−軽鎖間の結合親和性には影響しないことが示された。また、第ＶＩＩＩ因子が親和性の異なる２個のＣａ２＋結合部位を有することと、重鎖及び軽鎖が両方共予めＣａ２＋で活性化されている場合にのみ、補因子活性を呈する第ＶＩＩＩ因子が再構成できることとが示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
詳細な説明
目的
本発明の目的は、組換え第ＶＩＩＩ因子の製剤マトリックスに塩化カルシウムを添加しなくても安定な凍結乾燥製剤が得られるか否かを見極めることにあった。２価の陽イオン、特に塩化カルシウムを製剤マトリックス中に必須添加剤として添加することの重要性が多くの文献及び先行技術において示唆されている。本発明者はこの仮説や仮定を検証し、塩化カルシウム含有製剤及び塩化カルシウム非含有製剤中におけるｒＦＶＩＩＩの構造完全性及び安定性を評価することを試みた。タンパク質分子の流体力学的半径及びタンパク質の三次構造を高感度で測定する複数の解析ツールを用いてｒＦＶＩＩＩの特性評価を行った。動的光散乱法を用いてタンパク質の流体力学的半径を測定することにより分子サイズの変化の有無を評価した。添加された塩化カルシウムの存在下又は塩化カルシウムの非存在下におけるタンパク質三次構造の変化の有無は、第ＶＩＩＩ因子分子の芳香族アミノ酸周囲の僅かな環境変化を検出する紫外二次微分分光により分析した。驚くべきことに、塩化カルシウム含有ｒＦＶＩＩＩ製剤及び塩化カルシウム非含有ｒＦＶＩＩＩ製剤の間に有意差は認められなかった。更に驚くべきことに、２〜８℃及び加速温度条件（４０℃）下における安定性プロファイルは塩化カルシウム含有製剤も塩化カルシウム非含有製剤も互いに類似していた。
【０００５】
添加剤として塩化カルシウムを含まないｒＦＶＩＩＩ製剤には幾つかの有益な利点がある。まず第１に、分析が必要となる製剤添加剤が１種減ることにより配合が単純になると共に、カルシウムイオンを析出させる添加剤やカルシウムイオンと強力な錯体を形成する添加剤の選択が制限されなくなる。第２に、製剤をカルシウムフリーとすることにより最大濃縮相ガラス転移温度が上昇し、凍結乾燥時における製品の一次乾燥をより高い棚温で行うことができ、従って、凍結乾燥を簡便に且つより短い時間で行うことが可能になる。第３に、製剤中に遊離カルシウムイオンが存在しないため、金属イオンが加速するタンパク質の酸化（この酸化は、化学的不安定性を生じさせる機構により分子の安定性に影響を及ぼす）が回避されるという利点も有する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
サマリー
本発明のアルブミンフリー且つカルシウムフリーの第ＶＩＩＩ因子製剤は、血友病の治療に適した医薬的に許容される薬剤である凍結乾燥製剤であるため、血友病治療用の医薬品の調製に使用することができる。本発明の凍結乾燥品は、分子の完全性、流体力学的半径、補因子活性及び三次構造に関し安定である。本発明の製剤は、患者に投与する際に簡便に且つ短時間で（３０秒以内に）再調製することができる。本発明の製剤は、塩、アミノ酸及び糖（スクロース、トレハロース等）の混合物を含むものの、従来技術と異なり、製剤添加剤としての塩化カルシウムを含まない。塩化カルシウムが存在しないことによって製剤の非晶質相の最大濃縮相ガラス転移温度が上昇し、従って、凍結乾燥プロセスが効率化される。同時に、製剤中に遊離カルシウムイオンが存在しないことは、カルシウムイオンを析出させる可能性又はカルシウムイオンと強力な錯体を形成する可能性のある添加剤の選択が制限されないため有利である。この種の添加剤としては、例えば、第ＶＩＩＩ因子製剤に使用され得る緩衝剤及び安定剤であるヒスチジン、アルギニン、リシン等のアミノ酸が挙げられる。カルシウムイオンが存在しないことは、金属イオンにより支援されるタンパク質の酸化（この酸化は、化学的不安定性を生じさせる機構によってタンパク質分子の安定性に影響を及ぼす可能性がある）の回避にも有利である。
【０００７】
好ましい製剤は、水で再調製した場合、ＮａＣｌを約３１０ｍＭ以下と、ｐＨを約６．５〜７．５とするヒスチジンを約５０ｍＭ以下と、スクロース又はトレハロースを約２０ｍＭ以下と、組換え第ＶＩＩＩ因子を約５０〜２０００ＩＵ／ｍＬとを含むが、製剤添加剤としてのカルシウム（２＋）イオン等の２価の陽イオンを含まない、アルブミンフリー且つカルシウムフリーの安定なｒＦＶＩＩＩ凍結乾燥調製製剤である。特に好ましい安定なアルブミンフリー且つカルシウムフリーのｒＦＶＩＩＩ凍結乾燥製剤は、ＮａＣｌを３０８ｍＭと、ｐＨを約６．５〜７．５とすることができるヒスチジンを２０ｍＭと、スクロース又はトレハロースを約９ｍＭと、組換えＦＶＩＩＩを約５０〜２０００ＩＵ／ｍＬとを含むが、製剤添加剤としてのＣａ２＋等の２価の陽イオンを含まない。好ましい組換え第ＶＩＩＩ因子は、８０００〜１５０００ＩＵ／ｍｇの比活性を有するＢドメイン切断第ＶＩＩＩ因子である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、製剤Ｆ８−Ｅ（Ａ）及び製剤Ｆ８−Ｆ（Ｂ）の動的光散乱測定により得られたヒストグラムである。製剤Ｆ８−Ｅは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）、スクロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）を含み、ＣａＣｌ２は添加されていない。製剤Ｆ８−Ｆは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）、スクロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）及びＣａＣｌ２（１．７ｍＭ）を含む。このヒストグラムは、分子量（ＭＷ）で規格化したタンパク質の流体力学的半径の分布を示している。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂは、製剤Ｆ８−Ｅ（Ａ）及び製剤Ｆ８−Ｆ（Ｂ）の動的光散乱測定により得られたヒストグラムである。製剤Ｆ８−Ｅは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）、スクロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）を含み、ＣａＣｌ２は添加されていない。製剤Ｆ８−Ｆは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）、スクロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）及びＣａＣｌ２（１．７ｍＭ）を含む。このヒストグラムは、分子量（ＭＷ）で規格化したタンパク質の流体力学的半径の分布を示している。
【図２Ａ】図２Ａ及び図２Ｂは、製剤Ｆ８−Ｇ（Ａ）及び製剤Ｆ８−Ｈ（Ｂ）の動的光散乱測定により得られたヒストグラムである。製剤Ｆ８−Ｅは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）、スクロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）を含み、ＣａＣｌ２は添加されていない。製剤Ｆ８−Ｆは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）、スクロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）及びＣａＣｌ２（１．７ｍＭ）を含む。このヒストグラムは、分子量（ＭＷ）で規格化したタンパク質の流体力学的半径の分布を示している。
【図２Ｂ】図２Ａ及び図２Ｂは、製剤Ｆ８−Ｇ（Ａ）及び製剤Ｆ８−Ｈ（Ｂ）の動的光散乱測定により得られたヒストグラムである。製剤Ｆ８−Ｅは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）、スクロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）を含み、ＣａＣｌ２は添加されていない。製剤Ｆ８−Ｆは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）、スクロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）及びＣａＣｌ２（１．７ｍＭ）を含む。このヒストグラムは、分子量（ＭＷ）で規格化したタンパク質の流体力学的半径の分布を示している。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、製剤Ｆ８−Ｉ及び製剤Ｆ８−Ｊ（Ａ）並びに製剤Ｆ８−Ｋ及び製剤Ｆ８−Ｌ（Ｂ）の動的光散乱測定により得られたヒストグラムである。製剤Ｆ８−Ｉ及び製剤Ｆ８−Ｊは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ）、トレハロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）を含み、ＣａＣｌ２は添加されておらず、ｐＨはそれぞれ６．５及び７．０である。製剤Ｆ８−Ｋ及び製剤Ｆ８−Ｌは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）、トレハロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）及びＣａＣｌ２（１．７ｍＭ）を含み、ｐＨはそれぞれ６．５及び７．０である。このヒストグラムは、ＭＷで規格化したタンパク質の流体力学的半径の分布を示している。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、製剤Ｆ８−Ｉ及び製剤Ｆ８−Ｊ（Ａ）並びに製剤Ｆ８−Ｋ及び製剤Ｆ８−Ｌ（Ｂ）の動的光散乱測定により得られたヒストグラムである。製剤Ｆ８−Ｉ及び製剤Ｆ８−Ｊは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ）、トレハロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）を含み、ＣａＣｌ２は添加されておらず、ｐＨはそれぞれ６．５及び７．０である。製剤Ｆ８−Ｋ及び製剤Ｆ８−Ｌは、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）、トレハロース（９ｍＭ）、ポリソルベート８０（１００ｐｐｍ）及びＣａＣｌ２（１．７ｍＭ）を含み、ｐＨはそれぞれ６．５及び７．０である。このヒストグラムは、ＭＷで規格化したタンパク質の流体力学的半径の分布を示している。
【図４】図４は、ＣａＣｌ２含有製剤及びＣａＣｌ２非含有製剤中におけるｒＦＶＩＩＩの三次構造に関する分析結果を示すものである。Ｆ８−Ｅ（点線）及びＦ８−Ｇ（実線）は塩化カルシウム非含有製剤であり、Ｆ８−Ｆ（破線）及びＦ８−Ｈ（太破線）は塩化カルシウム含有製剤である。配合は図１及び図２に関し上に記載した通りである。ｘ軸は波長を表し、ｙ軸は吸光度の二次微分値を表す。
【図５】図５は、ＣａＣｌ２含有製剤及びＣａＣｌ２非含有製剤中におけるｒＦＶＩＩＩの三次構造に関する分析結果を示すものである。Ｆ８−Ｉ（実線）及びＦ８−Ｋ（破線）は塩化カルシウム非含有製剤であり、Ｆ８−Ｊ（点線）及びＦ８−Ｌ（太破線）は塩化カルシウム含有製剤である。配合は図３に関し上に記載した通りである。ｘ軸は波長を表し、ｙ軸は吸光度の二次微分値を表す。
【図６】図６は、製剤添加剤としてＣａＣｌ２を含有するｒＦＶＩＩＩ製剤及びＣａＣｌ２を含有しないｒＦＶＩＩＩ製剤を加速保存温度（４０℃）で８週間保存した後の安定性プロファイルが互いに類似していることを示すものである。カルシウム含有製剤（破線）には、ＮａＣｌ（１８ｍｇ／ｍＬ）、塩化カルシウム（０．２５ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（３ｍｇ／ｍＬ）及びヒスチジン（２０ｍＭ）が配合されており、ｐＨは６．５である。カルシウム非含有製剤（実線）には、ＮａＣｌ（１８ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（３ｍｇ／ｍＬ）及びヒスチジン（２０ｍＭ）が配合されており、ｐＨは６．５である。ｘ軸は保存期間（週）／保存温度を表し、ｙ軸は初期活性（ｔ＝０）に対するパーセントを表す。
【図７】図７は、製剤添加剤としてＣａＣｌ２を含有するｒＦＶＩＩＩ製剤及びＣａＣｌ２を含有しないｒＦＶＩＩＩ製剤を加速保存温度（４０℃）で保存した後の安定性プロファイルが互いに類似していることを示すものである。カルシウム含有製剤（実線）には、ＮａＣｌ（１８ｍｇ／ｍＬ）、塩化カルシウム（０．２５ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（３ｍｇ／ｍＬ）及びヒスチジン（２０ｍＭ）が配合されており、ｐＨは７．０である。カルシウム非含有製剤（破線）には、ＮａＣｌ（１８ｍｇ／ｍＬ）、スクロース（３ｍｇ／ｍＬ）及びヒスチジン（２０ｍＭ）が配合されており、ｐＨは７．０である。ｘ軸は保存期間（週）／保存温度を表し、ｙ軸は初期活性（ｔ＝０）に対するパーセントを表す。
【図８】図８は、２〜８℃で保存したＣａ２＋フリーのｒＦＶＩＩＩ製剤の安定性を示すものであり、ＦＶＩＩＩ活性が低下しなかったことを示している。白抜きの棒グラフはｐＨ６．５の製剤であり、黒塗りの棒グラフはｐＨ７．０の製剤である。ｘ軸は保存期間（週）／保存温度を表し、ｙ軸は初期活性（ｔ＝０）に対するパーセントを表す。
【図９】図９は、Ｃａ２＋フリーのｒＦＶＩＩＩ製剤及び市販のＣａＣｌ２含有第ＶＩＩＩ因子製剤を加速温度（４０℃）で保存した場合の安定性を比較したものである。白抜きの棒グラフはＣａ２＋フリーＦＶＩＩＩ製剤（ｐＨ６．５）であり、黒塗りの棒グラフはＣａ２＋フリーＦＶＩＩＩ製剤（ｐＨ７．０）である。濃淡のある棒グラフは市販のＣａＣｌ２含有第ＶＩＩＩ因子製剤である。ｘ軸は保存期間（週）／保存温度を表し、ｙ軸は初期活性（ｔ＝０）に対するパーセントを表す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
具体的な実施形態
実施例１
実施例１は、凍結乾燥後の第ＶＩＩＩ因子の活性回復率に関し、ＣａＣｌ２含有製剤及びＣａＣｌ２非含有製剤の間に差が見られなかったことを示している。
【００１０】
【表１】
2017509658.tif 000002
【００１１】
実施例２
実施例２は、ＣａＣｌ２含有製剤中及びＣａＣｌ２非含有製剤中の第ＶＩＩＩ因子の流体力学的半径の間に差が見られなかったことを示している。表２はスクロースを用いて製造した製剤に関する結果をまとめたものである。表３はトレハロースを用いて製造した製剤に関する結果をまとめたものである。図１〜３に代表的なヒストグラムを示す。
【００１２】
【表２】
2017509658.tif 000003
【００１３】
【表３】
2017509658.tif 000004
【００１４】
実施例３
実施例３は、塩化カルシウム含有製剤中及び塩化カルシウム非含有製剤中のｒＦＶＩＩＩの三次構造の間に有意差がないことを示している。ｒＦＶＩＩＩの三次構造は二次微分分光により評価した。３種の芳香族アミノ酸、即ちフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンの周囲の僅かな環境変化をピーク位置及びピーク／トラフ間距離の相対値（比で表す）で定量化した。図４及び図５に、それぞれスクロース及びトレハロースを配合した塩化カルシウム含有ｒＦＶＩＩＩ製剤及び塩化カルシウム非含有ｒＦＶＩＩＩ製剤の２ｄＵＶデータを示す。表４及び表５に２ｄＵＶデータをまとめた。
【００１５】
【表４】
2017509658.tif 000005
【００１６】
【表５】
2017509658.tif 000006
【００１７】
実施例４
実施例４は、添加剤として塩化カルシウムを含有する製剤中又は塩化カルシウム非含有製剤中におけるｒＦＶＩＩＩの安定性プロファイルを示すものである。凍結乾燥した製剤を加速温度（４０℃）で保存することにより評価を行った。
【００１８】
図６及び図７は、それぞれｐＨ６．５及びｐＨ７．０のスクロース含有製剤におけるｒＦＶＩＩＩの安定性プロファイルを示すものである。塩化カルシウム含有製剤中及び塩化カルシウム非含有製剤中のＦＶＩＩＩの活性は、保存期間において互いに似通った形の低下を示す。図８は、カルシウムフリー製剤を２〜８℃で８週間保存した後も第ＶＩＩＩ因子活性の有意な低下が認められなかったことを示している。図９は、塩化カルシウム含有ｒＦＶＩＩＩ製剤及び塩化カルシウム非含有ｒＦＶＩＩＩ製剤の安定性を比較したものである。塩化カルシウム含有製剤は市販の第ＶＩＩＩ因子製剤である。
【００１９】
上の実施例は本発明の例示であり、当業者であれば種々の変形例を想起すると理解されたい。従って、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2017509658.tif 000007
【図１Ｂ】
2017509658.tif 000008
【図２Ａ】
2017509658.tif 000009
【図２Ｂ】
2017509658.tif 000010
【図３Ａ】
2017509658.tif 000011
【図３Ｂ】
2017509658.tif 000012
【図４】
2017509658.tif 000013
【図５】
2017509658.tif 000014
【図６】
2017509658.tif 000015
【図７】
2017509658.tif 000016
【図８】
2017509658.tif 000017
【図９】
2017509658.tif 000018
【国際調査報告】
2017509658.tif 000019