(57)【要約】  本発明は、質量分析を使用して植物由来の複合タンパク質サンプルの定量的多重分析法に関する。幾つかの態様では、本開示は、例えば多重化したトランスジェニックタンパク質の選択的かつ感度のある定量のために、トランスジェニック植物品種の世代を分析することにより、トランスジェニック植物品種を維持する方法に関する。【選択図】図１
2017519206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に基づくサンプル中の、既知のアミノ酸配列を有する１もしくは複数の目的タンパク質を定量するハイスループット法であって：
（ａ）  植物に基づくサンプルからタンパク質を抽出し；
（ｂ）  工程（ａ）で抽出したタンパク質を消化してペプチドを得；
（ｃ）  ペプチドを単一工程で分離し；
（ｄ）  既知のアミノ酸配列を有する目的タンパク質から複数のシグネチャーペプチドを決定し；
（ｅ）  高分解能精密質量分析（ＨＲＡＭ  ＭＳ）を使用して複数のシグネチャーペプチドを測定し；そして
（ｆ）  シグネチャーペプチドの測定値に基づき、既知のアミノ酸配列を有する目的タンパク質を定量する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
ペプチドがカラムクロマトグラフィーにより単一工程で分離される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カラムクロマトグラフィーが、液体カラムクロマトグラフィーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
目的タンパク質に対応するペプチドの質量スペクトルデータが単一工程で得られる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１もしくは複数の目的タンパク質が、２個の目的タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１もしくは複数の目的タンパク質が、４個の目的タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
植物に基づくサンプルが、トランスジェニック植物に由来する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１もしくは複数の目的タンパク質が、トランスジェニック植物中での導入遺伝子発現の予想産物を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
１もしくは複数の目的タンパク質が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（２ｍＥＰＳＰＳ）、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１２（ＡＡＤ−１２）、および／またはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数のシグネチャーペプチドが、配列番号：２〜２５，２７〜４５および４７〜６０からなる群から選択される少なくとも１個の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
複数のシグネチャーペプチドが、配列番号：２〜２５，２７〜４５および４７〜６０からなる群から選択される少なくとも２個の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
複数のシグネチャーペプチドが、配列番号：２〜２５，２７〜４５および４７〜６０からなる群から選択される少なくとも３個の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
複数のシグネチャーペプチドが、（１）配列番号３，１２および２１；（２）配列番号
２８，２９および３４；および／または（３）配列番号４９，５５および５６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
複数のシグネチャーペプチドが、（１）配列番号３，１２および２１；（２）配列番号２８，２９および３４；および／または（３）配列番号４９，５５または５６からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
複数のシグネチャーペプチドを測定することが、対応するピーク高およびピーク面積を計算することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
複数のシグネチャーペプチドを測定することが、高フラグメンテーションモードおよび低フラグメンテーションモードからのデータを比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
植物に基づくサンプル中の、既知のアミノ酸配列を有する１もしくは複数の目的タンパク質を定量するハイスループットシステムであって：
（ａ）  植物に基づくサンプルからタンパク質を抽出するためのハイスループット手段；（ｂ）  ペプチドを単一工程で分離するための分離モジュール；
（ｃ）  既知のアミノ酸配列を有する目的タンパク質から複数のシグネチャーペプチドを選択するための選択モジュール；および
（ｄ）  複数のシグネチャーペプチドを測定するための高分解能精密質量分析（ＨＲＡＭ
ＭＳ）；
を含んでなるシステム。
【請求項１８】
分離モジュールが、カラムクロマトグラフィーを含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
カラムクロマトグラフィーが、液体カラムクロマトグラフィーを含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
高分解能精密質量分析（ＨＲＡＭ  ＭＳ）が、タンデム質量分析計を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２１】
高分解能精密質量分析（ＨＲＡＭ  ＭＳ）が、タンデム質量分析計を含まない、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２２】
植物に基づくサンプルが、トランスジェニック植物に由来する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２３】
１もしくは複数の目的タンパク質が、トランスジェニック植物中での導入遺伝子発現の予想産物を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１もしくは複数の目的タンパク質が、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（２ｍＥＰＳＰＳ）、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１２（ＡＡＤ−１２）、および／またはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２５】
複数のシグネチャーペプチドが、配列番号：２〜２５，２７〜４５および４７〜６０からなる群から選択される少なくとも１個の配列を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２６】
複数のシグネチャーペプチドが、配列番号：２〜２５，２７〜４５および４７〜６０か
らなる群から選択される少なくとも２個の配列を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２７】
複数のシグネチャーペプチドが、配列番号：２〜２５，２７〜４５および４７〜６０からなる群から選択される少なくとも３個の配列を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２８】
複数のシグネチャーペプチドが、（１）配列番号３，１２および２１；（２）配列番号２８，２９および３４；および／または（３）配列番号４９，５５および５６を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２９】
複数のシグネチャーペプチドが、（１）配列番号３，１２および２１；（２）配列番号２８，２９および３４；および／または（３）配列番号４９，５５および５６からなる、請求項１７に記載のシステム
【請求項３０】
請求項１７に記載のシステムを使用することを含んでなる、植物に基づくサンプル中の、既知のアミノ酸配列を有する１もしくは複数の目的タンパク質を定量するハイスループット法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
商業用および工業用の使用にトランスジェニック植物を作出するための組換えＤＮＡ技術の使用の増加で、トランスジェニック植物を分析するハイスループット法の開発が必要となっている。そのような分析法は、形質発見調査（ｔｒａｉｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）、製品開発、種子の生産および商品化、ならびに所望の、または最適な表現型を有するトランスジェニック植物の迅速な開発を支援するために必要とされる。さらにヒトが消費するために提案されるＧＭ植物の安全性評価に関する現行のガイドラインは、親と形質転換した作物との間のＤＮＡおよびタンパク質レベルでの特性決定を要求している。開発される新規な植物品種（ｐｌａｎｔ  ｖａｒｉｅｔｙ）は、とりわけ重層の（ｓｔａｃｋｅｄ）遺伝子および形質を含む増大しつづける複合遺伝子修飾からなる。
【０００２】
当該技術分野で好適なトランスジェニック植物の現在の分析法は、ＤＮＡに基づく技術（例えばＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲ）；レポーター遺伝子の使用；サザンブロッティング；および免疫化学を含む。これらの方法のすべてが様々な欠点に悩まされている。
【０００３】
質量分析法は以前に見出されたものであるが、既存の取り組みには、選択されそして感受性のある定量化が無く、限界が存在する。植物中の導入遺伝子発現の産物の、選択され、そして感受性のある定量化のためのハイスループット法（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｅｔｈｏｄ）の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約
本発明は、質量分析法を使用する、植物に由来する複合タンパク質サンプルの定量的多重分析法に関する。幾つかの態様では、本開示は、例えば多重化されたトランスジェニックタンパク質（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の選択的および感受性のある定量化のために、トランスジェニック植物品種の世代を分析することにより、トランスジェニック植物品種を維持するための方法に関する。
【０００５】
一つの態様では、植物に基づくサンプル中の、既知のアミノ酸配列を有する１もしくは複数の目的タンパク質を定量するハイスループット法を提供する。この方法は：
（ａ）  植物に基づくサンプルからタンパク質を抽出し；
（ｂ）  工程（ａ）で抽出したタンパク質を消化してペプチドを得；
（ｃ）  ペプチドを単一工程で分離し；
（ｄ）  既知のアミノ酸配列を有する目的タンパク質から複数のシグネチャーペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を決定し；
（ｅ）  高分解能精密質量分析（ＨＲＡＭ  ＭＳ）を使用して複数のシグネチャーペプチドを測定し；そして
（ｆ）  シグネチャーペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の測定値に基づき、既知のアミノ酸配列を有する目的タンパク質を定量する、
ことを含んでなる。
【０００６】
一つの態様では、ペプチドがカラムクロマトグラフィーにより単一工程で分離される。さらなる態様では、カラムクロマトグラフィーが液体カラムクロマトグラフィーを含んでなる。別の態様では、目的タンパク質に対応するペプチドに関する質量スペクトルデータが単一工程で得られる。
【０００７】
一つの態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、２個の目的タンパク質を含む。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、３〜２０個の目的タンパク質を含む。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、３〜１０個の目的タンパク質を含む。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、４個の目的タンパク質を含む。
【０００８】
一つの態様では、植物に基づくサンプルが、トランスジェニック植物に由来する。さらなる態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、トランスジェニック植物中で導入遺伝子発現の予想産物を含む。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、５’−エノールピルビル−３’−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を含む。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（２ｍＥＰＳＰＳ）を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：２〜２５からなる群から選択される少なくとも１個の配列を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：２〜２５からなる群から選択される少なくとも２個の配列を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：２〜２５からなる群から選択される少なくとも３個の配列を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号３，１２および２１を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：３，１２および２１からなる。
【０００９】
別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−（ＡＡＤ）を含む。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１２（ＡＡＤ  −１２）を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：２７〜４５からなる群から選択される少なくとも１個の配列を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：２７〜４５からなる群から選択される少なくとも２個の配列を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：２７〜４５からなる群から選択される少なくとも３個の配列を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号２８，２９および３４を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号２８，２９および３４からなる。
【００１０】
別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、ビアラホス耐性（ｂａｒ）遺伝子産物またはホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）酵素を含む。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：４７〜６０からなる群から選択される少なくとも１個の配列を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：４７〜６０からなる群から選択される少なくとも２個の配列を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号：４７〜６０からなる群から選択される少なくとも３個の配列を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号４９，５５および５６を含む。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号４９，５５および５６からなる。
【００１１】
一つの態様では、複数のシグネチャーペプチドを測定することは、対応するピーク高またはピーク面積を計算することを含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドを測定することは、高フラグメンテーションモード（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ）および低フラグメンテーションモードからのデータを比較することを含んでなる。
【００１２】
別の態様では、提供されるのは、植物に基づくサンプル中の、既知のアミノ酸配列を有する１もしくは複数の目的タンパク質を定量するためのハイスループットシステムである。このシステムは：
（ａ）  植物に基づくサンプルからタンパク質を抽出するためのハイスループット手段；（ｂ）  ペプチドを単一工程で分離するための分離モジュール；
（ｃ）  既知のアミノ酸配列を有する目的タンパク質から複数のシグネチャーペプチドを選択するための選択モジュール；および
（ｄ）  複数のシグネチャーペプチドを測定するための高分解能精密質量分析（ＨＲＡＭ
ＭＳ）；
を含んでなる。
【００１３】
一つの態様では、分離モジュールがカラムクロマトグラフィーを含んでなる。別の態様では、カラムクロマトグラフィーが液体カラムクロマトグラフィーを含んでなる。別の態様では、高分解能精密質量分析（ＨＲＡＭ  ＭＳ）が、タンデム質量分析計を含んでなる。別の態様では、高分解能精密質量分析（ＨＲＡＭ  ＭＳ）が、タンデム質量分析計を含まない。
【００１４】
一つの態様では、植物に基づくサンプルがトランスジェニック植物に由来する。さらなる態様では、１もしくは複数の目的タンパク質がトランスジェニック植物中での導入遺伝子発現の予想産物を含んでなる。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質が５’−エノールピルビル−３’−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を含んでなる。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質が５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（２ｍＥＰＳＰＳ）を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号：２〜２５からなる群から選択される少なくとも１個の配列を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号：２〜２５からなる群から選択される少なくとも２個の配列を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号：２〜２５からなる群から選択される少なくとも３個の配列を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号３，１２および２１を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号：３，１２および２１からなる。
【００１５】
別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質がアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−（ＡＡＤ）を含んでなる。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質がアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１２（ＡＡＤ  −１２）を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号：２７〜４５からなる群から選択される少なくとも１個の配列を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号：２７〜４５からなる群から選択される少なくとも２個の配列を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号：２７〜４５からなる群から選択される少なくとも３個の配列を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号２８，２９および３４を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドが配列番号２８，２９および３４からなる。
【００１６】
別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質はビアラホス耐性（ｂａｒ）遺伝子産物またはホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）酵素を含んでなる。別の態様では、１もしくは複数の目的タンパク質は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは配列番号：４７〜６０からなる群から選択される少なくとも１個の配列を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは配列番号：４７〜６０からなる群から選択される少なくとも２個の配列を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは配列番号：４７〜６０からなる群から選択される少なくとも３個の配列を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号４９，５５および５６を含んでなる。別の態様では、複数のシグネチャーペプチドは、配列番号４９，５５および５６からなる。
【００１７】
別の態様では、提供されるのは、植物に基づくサンプル中に、既知のアミノ酸配列を有する１もしくは複数の目的タンパク質を定量するハイスループット法である。この方法は本明細書に提供するシステムを使用することを含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本明細書に開示する方法およびシステムに関する代表的な分析作業の流れを表す。
【図２】標準クロマトグラムである５００ｎｇ／ｍＬの合成ペプチドに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの別の代表的データを示表す：全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン  ３６７．２０８２ｍ／ｚ  −  ＥＩＳＧＴＶＫ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン３６７．１８５０ｍ／ｚ  −  ＤＶＡＳＷＲ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ４８４．７７９８ｍ／ｚ  −  ＶＮＧＩＧＧＬＰＧＧＫ（２＋）（最下段の最初のパネル）。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【図３】トリプシン消化したトランスジェニックダイズサンプルのクロマトグラムに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの代表的データを表す：全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン  ３６７．２０８２ｍ／ｚ  −  ＥＩＳＧＴＶＫ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン３６７．１８５０ｍ／ｚ  −  ＤＶＡＳＷＲ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン４８４．７７９８ｍ／ｚ  −  ＶＮＧＩＧＧＬＰＧＧＫ（２＋）（最下段の最初のパネル）。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【図４】重層のＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳの標準（上パネル）およびトランスジェニック（下パネル）抽出イオンクロマトグラムの代表的データを表し、定量化用のペプチド注釈を含む。抽出ウインドは全てのイオンについて２．０ｐｐｍである。
【図５】標準クロマトグラムである５００ｎｇ／ｍＬの合成ペプチドに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの別の代表的データを表す：全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）：抽出イオン３４６．６８８９ｍ／ｚ  −  ＦＧＡＩＥＲ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）：抽出イオン６２１．８５６３ｍ／ｚ  −  ＩＧＧＧＤＩＶＡＩＳＮＶＫ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ５９８．２８３１ｍ／ｚ  −  ＡＡＹＤＡＬＤＥＡＴＲ（２＋）（最下段の最初のパネル）。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【図６】トリプシン消化トランスジェニックダイズサンプルのクロマトグラムについて、ＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの代表的データを表す：全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン  ３４６．６８８９ｍ／ｚ  −  ＦＧＡＩＥＲ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）：抽出イオン  ６２１．８５６３ｍ／ｚ  −  ＩＧＧＧＤＩＶＡＩＳＮＶＫ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ５９８．２８３１ｍ／ｚ  −  ＡＡＹＤＡＬＤＥＡＴＲ（２＋）（最下段の最初のパネル）。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【図７】重層のＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳの標準（上パネル）およびトランスジェニック（下パネル）抽出イオンクロマトグラムの代表的データを表し、定量化に関するペプチドの注釈を含む。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【図８】標準クロマトグラムである５００ｎｇ／ｍＬの合成ペプチドに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの別の代表的データを表す：全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン９２８．９３６７ｍ／ｚ  −  ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン  ７６１．９３３０ｍ／ｚ  −  ＳＶＶＡＶＩＧＬＰＮＤＰＳＶＲ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ５６５．８０１３ｍ／ｚ  −  ＬＨＥＡＬＧＹＴＡＲ（２＋）（最下段の最初のパネル）。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【図９】トリプシン消化トランスジェニックダイズサンプルのクロマトグラムについて、ＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの代表的データを表す：全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン９２８．９３６７ｍ／ｚ  −  ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン７６１．９３３０ｍ／ｚ  −  ＳＶＶＡＶＩＧＬＰＮＤＰＳＶＲ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ５６５．８０１３ｍ／ｚ  −  ＬＨＥＡＬＧＹＴＡＲ（２＋）（最下段の最初のパネル）。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【図１０】重層のＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳの標準（上パネル）およびトランスジェニック（下パネル）抽出イオンクロマトグラムの代表的データを表し、定量化に関するペプチドの注釈を含む。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、前駆体タンパク質から選択されたシグネチャーペプチドが、特定の器械を用いた多重分析中に感度のある定量を生じることができるという発見に基づく。具体的に一つの態様では、液体クロマトグラフィーを高分解能精密質量分析（ＬＣ−ＨＲＡＭ  ＭＳ）法につなげて、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（２ｍＥＰＳＰＳ）のタンパク質発現レベルを検出した。本明細書に開示する方法およびシステムは、それ自体により、または植物抽出物の定量分析のために多重化アッセイ用の追加タンパク質と組み合わせて、２ｍＥＰＳＰＳを分析することができる。具体的に別の態様では、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１２（ＡＡＤ−１２）のタンパク質発現レベルを検出するために、液体クロマトグラフィーを高分解能精密質量分析（ＬＣ−ＨＲＡＭ  ＭＳ）法につなげた。本明細書に開示する方法およびシステムは、それ自体により、または植物抽出物の定量分析のために多重化アッセイ用の追加タンパク質と組み合わせて、ＡＡＤ−１２を分析することができる。具体的にさらに別の態様では、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）のタンパク質発現レベルを検出するために、液体クロマトグラフィーを高分解能精密質量分析（ＬＣ−ＨＲＡＭ  ＭＳ）法とつなげた。本明細書に開示する方法およびシステムは、それ自体により、または植物抽出物の定量分析のために多重化アッセイ用の追加タンパク質と組み合わせて、ＰＡＴを分析することができる。
【００２０】
多数の除草剤に対する耐性を達成するために、または昆虫抵抗性に対する多数の作用様式を提供するために、同時発現または「重層の」（ｓｔａｃｋｅｄ）トランスジェニックタンパク質の数を増やすことによる多数の目的トランスジェニックタンパク質を選択的に検出することができる感度のある多重アッセイを有することは重要である。現在、トランスジェニックタンパク質発現用の全ての関連技術は、従来の免疫化学技術にかなり依存しており、これはサンプル毎に生成することが要求されるデータ容量を受け入れるという難題を与えている。
【００２１】
定量的実験用の質量分析検出は、一般に選択反応モニタリング（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ＳＲＭ）により達成される。特定の種類の器械を使用して、供給源で形成された目的イオンの初期の質量−選択、これに質量分析計（ＭＳ）の衝突領域内でのこの前駆体（タンパク質）イオンの解離、次いで特異的産物（ペプチド）イオンの質量−選択、および計数が続く。幾つかの態様では、単位時間あたりの計数は、積分可能なピーク面積を提供することができ、これから被検体の量または濃度を決定することができる。幾つかの態様では、ＨＲＡＭが可能な質量分析計で行われる定量化のための高分解能精密質量（ＨＲＡＭ）モニタリングの使用には、限定するわけではないがハイブリッド四重極飛行時間型、四重極−オービトラップ（ｏｒｂｉｔｒａｐ）、イオントラップ−オービトラップ、または四重極−イオン−トラップ−オービトラップ（トリブリッド）質量分析計を含むことができる。特定の種類の器械を使用すればペプチドはフラグメンテーション条件にかけられず、むしろ完全（ｆｕｌｌ）走査または標的走査モード（例えば選択的イオンモニタリングモードまたはＳＩＭ）を使用して完全なペプチドとして測定される。積分可能なピーク面積は、それぞれの具体的な被検体について抽出されたイオンクロマトグラムを作成することにより決定することができ、そして被検体の量または濃度を算出することができる。データの高分解能および精密な質量の性質は、目的の被検体（タンパク質および／またはペプチド）について、高度に特異的かつ感度のあるイオンシグナルを可能にする。
【００２２】
別段の定めがない限り、明細書および請求の範囲を含む本出願で使用する以下の用語は、以下に与える定義を有する。本明細書および添付の請求の範囲で使用するように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別の意味を示さない限り、複数の指示対称を含むことに留意しなければならない。
【００２３】
本明細書で使用するように、用語「生物学的隔離（ｂｉｏｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）」とは、遺伝的に修飾された植物またはそれらの遺伝物質の指定領域への移動を制限することを称する。この用語は物理的、物理化学的、生物学的隔離、ならびに自然な環境または人工的な生育条件で遺伝的に修飾された植物の生存、広がりまたは再生を防ぐ他の形態の隔離を含む。
【００２４】
本明細書で使用するように、用語「複合タンパク質サンプル」は、サンプルを精製されたタンパク質サンプルとは区別するために使用される。複合タンパク質サンプルは、多数のタンパク質を含み、そしてさらに他の混入物を含んでもよい。
【００２５】
本明細書で使用するように、一般用語「質量分析」または「ＭＳ」は任意の適切な質量分析法、装置または器械構成を指し、それらには例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス−支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−飛行時間（ＴＯＦ）  ＭＳ、大気圧（ＡＰ）  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、真空ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、またはそれらの組み合わせを含む。質量分析装置は、１組の磁場および電場を通る分子の飛行経路を測定することにより、（分子の質量−対−電荷比の関数として）分子の分子質量を測定する。質量−対−電荷比は、荷電した粒子の電気力学において広く使用される物理的量である。特定のペプチドの質量−対−電荷比は、当業者により演繹的に計算され得る。異なる質量−対−電荷比を有する二つの粒子は、同じ電場および磁場にかけられた場合に真空中で同じ経路を移動しないことになる。
【００２６】
質量分析器械は、３個のモジュールからなる：イオン源、これはサンプル分子をイオンに分割する；質量分析器、これは電磁場をかけることによりイオンをそれらの質量により分離する；および検出器、これはインジケータの値を測定し、そしてこれにより存在する各イオンの量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を算出するデータを提供する。この技術は定性的および定量的応用を有する。これらには未知の化合物の同定、分子中の元素の同位体組成の
決定、化合物のフラグメンテーションを観察することによる化合物の構造の決定、およびサンプル中の化合物量の定量を含む。
【００２７】
質量分析法および装置の詳細な概説は、引用により編入する以下の文献に見いだすことができる；Ｃａｎ  ａｎｄ  Ａｎｎａｎ（１９９７）質量分析によるペプチドおよびタンパク質分析の概説（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．編集、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，ｐ．１０．２１．１−１０．２１．２７；Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ（１９９５）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １６：１７９１−１８１４；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ（１９９８）質量分析によるタンパク質の同定および特性決定（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．編集、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，ｐ．１０．２２．１−１０．２２．２４；およびＤｏｍｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２（５７７１）：２１２−１７。
【００２８】
本明細書で使用する用語では、２以上の目的タンパク質および／またはペプチドがサンプル中に存在する場合、タンパク質および／またはペプチドは「多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）されている」。
【００２９】
本明細書で使用するように、「植物の形質」（ｐｌａｎｔ  ｔｒａｉｔ）とは植物の任意の単一の特徴または定量可能な測定（ｑｕａｎｔｉｆｉａｂｌｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を指すことができる。
【００３０】
本明細書で使用するように、「ペプチド（１または複数）」とは定めた順序でα−アミノ酸を連結することから形成される短い高分子を指すことができる。またペプチドはポリペプチド、例えばタンパク質のプロテアーゼを用いた消化により生成することもできる。
【００３１】
本明細書で使用するように、「タンパク質（１または複数）」は、直鎖状に配列され、そして隣接するアミノ酸残基のカルボキシルおよびアミノ基の間のペプチド結合により連結されたアミノ酸から作られた有機化合物を指すことができる。タンパク質中のアミノ酸配列は、遺伝子配列により定められ、これは遺伝暗号によりコードされている。一般に遺伝暗号は２０種の標準アミノ酸を特定するが、特定の生物では遺伝暗号はセレノシステインを、そして特定の古細菌−ピロリシンを含むことができる。タンパク質中の残基は、しばしば翻訳後修飾により化学的に修飾されるようになることが観察され、これはタンパク質が細胞内で使用される前に、または制御メカニズムの一部としてのいずれかで起こることができる。またタンパク質残基は、当業者によく知られている技術に従い、設計により修飾されることができる。本明細書で使用するように、用語「タンパク質」は天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、修飾アミノ酸、または上記の任意または全ての組み合わせを含んでなる直鎖を包含する。
【００３２】
本明細書で使用するように、用語「単回注入」とはＭＳまたはＬＣ−ＭＳ装置の操作の最初の工程を指す。タンパク質サンプルが装置に単回注入で導入される場合、全サンプルが一回の工程で導入される。
【００３３】
本明細書で使用するように、「シグネチャーペプチド」という句は特異的タンパク質の識別子（短いペプチド）配列を指す。いかなるタンパク質も平均１０から１００個の間のシグネチャーペプチドを含む可能性がある。一般にシグネチャーペプチドは、少なくとも
１つの以下の基準を有する：質量分析により容易に検出され、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラムから予想可能かつ安定に溶出され、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により濃縮され、良好なイオン化、良好なフラグメンテーション、またはそれらの組み合わせ。質量分析により容易に定量されるペプチドは、通常、少なくとも１個の以下の基準を有する：容易に合成され、高度に精製でき（＞９７％）、２０％アセトニトリル≧に可溶性、低い非特異的結合、酸化抵抗性、合成後修飾抵抗性、および疎水性または疎水性指数≧１０かつ≦４０。疎水性指数は、引用により編入するＫｒｏｋｈｉｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３（２００４）９０８に従い算出することができる。１０未満または４０より大きい疎水性指数を有するペプチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムにより再現性よく分割または溶出され得ないことが知られている。
【００３４】
本明細書で使用するように、「重層の」という用語は植物のゲノムに組み込まれた多数の異種ポリヌクレオチドの存在を指す。
【００３５】
タンデム質量分析：タンデム質量分析では、目的分子から生成した親イオンが質量分析器械でフィルターにかけられ、そして引き続き親イオンがフラグメント化されて１もしくは複数の娘イオンが生じ、これが次いで第二質量分析プロトコールで分析されることができる（検出および／または定量）。幾つかの態様では、タンデム質量分析の使用が排除される。このような態様では、タンデム質量分析法は提供される方法およびシステムでは使用されない。すなわちこれらの態様では、親イオンも娘イオンも生成されない。
【００３６】
本明細書で使用するように、「トランスジェニック植物」という用語は、その植物のゲノムに異種ポリヌクレオチドを含んでなる植物への言及を含む。一般に異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが継代を通して伝わるようにゲノム内に安定に組み込まれている。異種ポリヌクレオチドはゲノムのみに、または組換え発現カセットの一部分として組み込まれることができる。本明細書で「トランスジェニック」は、任意の細胞、細胞系統、カルス、組織、植物部分または植物を含むために使用され、その遺伝型は異種核酸の存在により改変され、その異種核酸には最初にそのように改変されたようなトランスジェニック植物、ならびに初期のトランスジェニック植物の有性交配または無性繁殖により作出されるものを含む。
【００３７】
有用な植物部分を提供する任意の植物を、本発明の実施で処理することができる。例には花、果実、野菜および穀物を提供する植物がある。
【００３８】
本明細書で使用するように、「植物」という句には双子葉植物および単子葉植物を含む。双子葉植物の例にはタバコ、シロイヌナズナ、ダイズ、トマト、パパイヤ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウのつる木、キマメ、エンドウマメ、アブラナ属、ヒヨコマメ、テンサイ、ナタネ、スイカ、メロン、コショウ、ピーナッツ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナスおよびレタスがある。単子葉植物の例にはトウモロコシ、コメ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、エンバク、タマネギ、キビおよびライコムギがある。果実の例には、バナナ、パイナップル、オレンジ、ブドウ、グレープフルーツ、スイカ、メロン、リンゴ、モモ、ナシ、キューイフルーツ、マンゴ、ネクタリン、グァバ、カキ、アボカド、レモン、イチジクおよびベリー類がある。花の例にはカスミソウ、カーネーション、ダリア、ラッパスイセン、ゼラニウム、ガーベラ、ユリ、ラン、ボタン、クイーン  アンズ  レース、バラ、キンギョソウまたは他の切り花または装飾花、鉢植えの花および花の球根がある。
【００３９】
複合サンプルから単一タンパク質を同定するための質量分析法で可能になる特異性は、目的タンパク質を同定するために目的タンパク質の配列のみが必要とされる点が独自である。他の多重化の形式に比べて、質量分析法は、非特異的検出を事実上排除するために、完全長のタンパク質の一次アミノ酸配列を利用してタンパク質の一次アミノ酸配列の独自な識別子型部分を標的とすることができる点で独自である。本発明の幾つかの態様では、目的タンパク質（１もしくは複数）を独自に同定するタンパク質分解フラグメントまたはタンパク質分解フラグメントの組を使用して、複合タンパク質サンプル中の目的タンパク質（１もしくは複数）を検出する。
【００４０】
幾つかの態様では、開示する方法は、目的の各タンパク質を個別に多数回測定し、そして個別の結果を１個のサンプルの結果にまとめることとは対照的に、一回の質量分析により複合タンパク質サンプル中の多数のタンパク質の定量または比率の決定を可能とする。
【００４１】
幾つかの態様では、本開示はトランスジェニック植物技術の開発および使用に有用な方法も提供する。具体的には開示された方法は継代を通してトランスジェニック植物の遺伝型を維持するために使用することができる。また本明細書に開示する方法の幾つかの態様は、例えば異花受粉により隣の植物からの導入遺伝子が混入する危険性がある非トランスジェニック植物のハイスループット分析を提供するために使用することができる。このような態様により、導入遺伝子の生物学的隔離が促進かつ／または達成される。他の態様では、本明細書に開示された方法は、所望する発現特性を現す形質転換体を同定するために、ハイスループット様式で植物の形質転換手順の結果を調査するために使用することができる。
【００４２】
遺伝子導入発現技術を介して植物に導入された任意のタンパク質は、本発明の方法を使用して分析することができる。本発明に従い多重分析に適するタンパク質は、トランスジェニック植物をその非トランスジェニック対よりも優れたものにする出力形質（ｏｕｔｐｕｔ  ｔｒａｉｔ）を付与することができる。付与することができる所望する形質の非限定的な例には、除草剤抵抗性、昆虫に対する抵抗性、病気に対する抵抗性、環境ストレスに対する抵抗性、収量の増強、改良された栄養価、改良された寿命、改変された油含量、改変された油組成、改変された糖含量、改変された澱粉含量、植物系医薬品の生産、工業製品の生産（例えばポリヒドロキシアルカノエート：石油由来プラスチックを代えるために理想的と考えられている高分子ポリエステル）、およびバイオレメディエーションの可能性がある。さらに単一植物種内の１もしくは複数のトランスジェニックタンパク質の発現は、本開示の方法を使用して分析することができる。２以上の遺伝子または所望の形質の、目的の単一種への付加またはモジュレーションは遺伝子重層（ｇｅｎｅ  ｓｔａｃｋｉｎｇ）として知られている。さらに１もしくは複数のトランスジェニックタンパク質の発現は、現在開示している多重化分析で１もしくは複数の内因性植物タンパク質と同時に分析することができる。
【００４３】
特にトランスジェニック植物中で発現される適切なタンパク質は、除草剤に対する耐性を付与するもの、例えばグリホサート除草剤に耐性を付与するための５’−エノールピルビル−３’−ホスホシキミ酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）の遺伝子またはその任意のバリアント、２，４−Ｄ除草剤に対する耐性を付与するためのアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）、グルホシネート除草剤に対する耐性を付与するためのホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）、またはそれらの組み合わせである。
【００４４】
質量−対−電荷比は、四重極分析器を使用して測定することができる。例えば、「四重極」または「四重極イオントラップ」器械では、振動高周波場（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ
ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｆｉｅｌｄ）でのイオンは、電極間に掛けたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅およびｍ／ｚに比例する力を経験する。電位および振幅は、特定
のｍ／ｚを有するイオンだけが四重極の長さを移動するが、他の全てのイオンは反れるように選択することができる。すなわち四重極器械は、器械に注入されたイオンの「質量フィルター」および「質量検出器」として作動することができる。
【００４５】
衝突誘起解離（“ＣＩＤ”）は、さらに検出するための娘イオンを生成するために使用されることが多い。ＣＩＤでは親イオンが、アルゴンのような不活性ガスでの振動を介してエネルギーを獲得し、続いて「単分子分解」と呼ばれる方法によりフラグメント化される。十分なエネルギーが親イオンに預けられるので、イオン中の特定の結合は増大したエネルギーにより破壊され得る。
【００４６】
質量分析計は一般に使用者にイオン走査を提供する：すなわち所定の範囲（例えば１０〜１２００ａｍｕ）にわたる各ｍ／ｚの相対量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を提供する。被検体アッセイの結果、すなわち質量スペクトルは、当該技術分野で知られている多数の方法により元のサンプル中の被検体の量に関連付けることができる。例えばサンプリングおよび分析パラメーターが慎重に制御されると仮定すると、所定のイオンの相対量は、相対量を元の分子の絶対量に変換する表と比べることができる。あるいは分子標準（例えば内部標準および外部標準）をそのサンプルで実験し、そしてそれらの標準から生成したイオンに基づき標準曲線を構築することができる。そのような標準曲線を使用して、所定イオンの相対量を元の分子の絶対量に変換することができる。イオンの存在または量を元の分子の存在または量に関連付ける多くの他の方法は、当業者に周知である。
【００４７】
イオン化法の選択は、測定する被検体、サンプルの種類、検出器の種類、陽対陰モード（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）の選択等に基づき決定することができる。イオンは、限定するわけではないが電子イオン化、化学イオン化、高速原子衝突、電解脱離およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、光子イオン化、エレクトロスプレーイオン化、および誘導結合プラズマを含む様々な方法を使用して生じることができる。エレクトロスプレーイオン化とは、溶液が短い長さの毛細管に沿って通され、その終わりに高い正または負の電位が掛けられる方法である。溶液は管の終わりに近づくと、溶媒蒸気中で大変小さい溶液水滴の噴出物（ｊｅｔ）またはスプレーに揮発（噴霧）される。この液滴のミストは、凝縮を避け、そして溶媒を蒸発させるために加熱される蒸発チャンバーを流れる。液滴が小さくなるほど、電気的な表面荷電密度は、同じ電荷間の自然な反発力がイオンならびに中性分子の放出を引き起こす時まで増加する。
【００４８】
ＬＣの溶出液は、直接的かつ自動的に（すなわち「インライン」で）エレクトロスプレー装置に注入することができる。幾つかの態様では、ＬＣ溶出液に含まれるタンパク質は、最初にエレクトロスプレーにより親イオンにイオン化される。
【００４９】
様々な異なる質量分析器を液体クロマトグラフィー―質量分析の組み合わせ（ＬＣ−ＭＳ）に使用することができる。例となる質量分析計には、限定するわけではないがシングル四重極、トリプル四重極、イオントラップ、ＴＯＦ（飛行時間）、および四重極―飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）がある。
【００５０】
四重極質量分析計は、互いに平行に設定された４個の円形ロッドからなることができる。四重極質量分析計（ＱＭＳ）では、四重極は質量−対−電荷比（ｍ／ｚ）に基づきサンプルイオンをフィルタリングする要因となる器械の構成要素である。イオンはロッドにかけられた振動する電場中で、それらの軌道の安定性に基づき四重極中で分離される。
【００５１】
イオントラップは、真空システムまたは管の領域でイオンを捉える電場または磁場の組み合わせである。イオントラップは質量分析法で使用され、同時にイオンの量子状態が操作される。
【００５２】
飛行時間質量分析（ＴＯＦＭＳ）は、イオンの質量−対−電荷比が時間測定を介して決定される質量分析法の一方法である。イオンは既知の強さの電場で加速される。この加速は同じ電荷を有する他のイオンと同じ動力学的エネルギーを有するイオンを生じる。イオンの速度は質量−対−電荷比に依存する。続いて粒子が既知の距離の検出器に到達するためにかかる時間が測定される。この時間は粒子の質量−対−電荷比に依存することになる（より重い粒子は、より低い速度になる）。この時間および既知の実験パラメーターから、イオンの質量−対−電荷比を見い出すことができる。
【００５３】
幾つかの態様では、提供される方法および／またはシステムにより使用される特定の器械は、高フラグメンテーションモードおよび低フラグメンテーションモード（または別の非フラグメンテーションモード）を備えることができる。そのような異なるモードは高い解像度の質量データを生じるために、交互に走査する高および低エネルギー取得法を含むことができる。幾つかの態様では、高解像質量データは生成物データの組（例えば高フラグメンテーションモード下での生成物イオン（フラグメント化イオン）に由来するデータ）、および前駆体のデータの組（例えば低フラグメンテーションまたは非フラグメンテーションモード下での前駆体イオン（非フラグメント化イオン）に由来するデータ）を含んでなることができる。
【００５４】
幾つかの態様では、提供される方法および／またはシステムは、選択工程で使用することができるフィルタリング装置、フラグメンテーション工程で使用することができるフラグメンテーション装置、および／または取得および／または質量スペクトル作成工程（１もしくは複数）で使用することができる１もしくは複数の質量分析器を含んでなる質量分析計を使用する。
【００５５】
フィルタリング装置および／または質量分析器は四重極を含んでなることができる。選択工程および／または取得工程および／または質量スペクトル作成工程（１もしくは複数）には、解像する四重極の使用が関与する。加えて、または別法で、フィルタリング装置は二次元または三次元イオントラップまたは飛行時間（ＴＯＦ）質量分析器を含んでなることができる。質量分析器（１もしくは複数）は、１もしくは複数の飛行時間質量分析器、および／またはイオンサイクロトロン共鳴質量分析器、および／またはオービトラップ型質量分析器、および／または二次元もしくは三次元イオントラップを含んでなるか、またはさらに含んでなることができる。
【００５６】
質量−対−電荷比（ｍ／ｚ）に基づく選択によるフィルタリングは、イオンをｍ／ｚに基づき選択することができる質量分析器、例えば四重極を使用することにより達成することができ；あるいは広いｍ／ｚ範囲を伝えるために、イオンのｍ／ｚに従いイオンを分離し、次いで目的のイオンをそれらのｍ／ｚ値により選択する。後者の例は時限式イオンセレクタ（ｔｉｍｅｄ  ｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｏｒ）（１もしくは複数）と組み合わせた飛行時間質量分析器となる。提供される方法および／またはシステムは、１もしくは複数の目的タンパク質を、例えば２以上の複数のタンパク質から、クロマトグラフィー技法、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を使用して単離および／または分離することを含んでなることができる。方法はさらに目的タンパク質の溶出時間を測定すること、および／または測定した溶出時間を予想された溶出時間と比較することを含んでなることができる。
【００５７】
加えて、または別法では、目的タンパク質はイオンモビリティセル（ｉｏｎ  ｍｏｂｉ
ｌｉｔｙ  ｃｅｌｌ）を使用して行うことができるイオンモビリティ技術を使用して分離することができる。さらに目的タンパク質はイオンモビリティドリフトの順序または時間により選択することができる。この方法はさらに目的タンパク質のドリフト時間を測定すること、および／または測定したドリフト時間と予想されるドリフト時間を比較することを含んでなる。
【００５８】
幾つかの態様では、提供される方法および／またはシステムはラベルフリーであり、ここで定量化は注入物間およびサンプルをわたるピーク強度、あるいは前駆体もしくは目的の生成物のｍ／ｚ値に関する質量スペクトルピーク下の面積を比較することにより達成することができる。幾つかの態様では、内部標準の正規化を使用して、既知の随伴する分析誤差を説明することができる。定量化、スペクトル計数の別のラベルフリー法は、所定の各ペプチドについて非余剰的（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）または余剰的様式で得たフラグメントのイオンスペクトルの数または走査をまとめることを含む。次いで各タンパク質について、関連するペプチドの質量スペクトルをまとめ、タンパク質あたりの走査数の尺度を提供し、これはその量に比例する。次にサンプル／注入間の比較を行うことができる。
【００５９】
幾つかの態様では、イオン源は：（１）エレクトロスプレーイオン化（“ＥＳＩ”）イオン源；（２）大気圧光イオン化（“ＡＰＰＴ”）イオン源；（３）大気圧化学イオン化（“ＡＰＣＴ”）イオン源；（４）マトリックス支援レーザー脱離イオン化（“ＭＡＬＤＩ”）イオン源；（５）レーザー脱離イオン化（“ＬＤＩ”）イオン源；（６）大気圧イオン化（“ＡＰＩ”）イオン源；（７）シリコンでの脱離イオン化（“ＤＩＯＳ”）イオン源；（８）電子衝突（“ＥＩ”）イオン源；（９）化学イオン化（“ＣＩ”）イオン源；（１０）電界イオン化（“ＦＩ”）イオン源；（１１）電界脱離（“ＦＤ”）イオン源；（１２）誘導結合プラズマ（“ＩＣＰ”）イオン源；（１３）高速原子衝突（“ＦＡＢ”）イオン源；（１４）液体二次イオン質量分析（“ＬＳＩＭＳ”）イオン源；（１５）脱離エレクトロスプレーイオン化（“ＤＥＳＩ”）イオン源；（１６）ニッケル−６３放射性イオン源；（１７）大気圧マトリックス支援レーザー脱離イオン化イオン源；および（１８）サーモスプレーイオン源からなる群から選択される。
【００６０】
幾つかの態様では、提供される方法および／またはシステムは、プロセッサーに手順を実行させて方法を実施するために、コンピューター可読プログラム暗号手段を含んでなるコンピュータープログラム要素を実行するように構成された装置および／または制御システムを含んでなる。
【００６１】
幾つかの態様では、提供される方法および／またはシステムは、植物抽出物の液体クロマトグラフィー分離と組み合わせて、低および高エネルギーの交互走査機能を使用する。目的タンパク質に関する情報リストには、限定するわけではないが前駆体イオンのｍ／ｚ、生成物イオンのｍ／ｚ、保持時間、イオンモビリティドリフト時間およびモビリティの変化の率が提供され得る。ＬＣ分離の過程中、そして標的イオンが質量分析計に溶出すると（そして低エネルギー前駆体イオン、または高エネルギー生成物イオンが検出されるか、または保持時間ウインドが活性化されると）、提供される方法および／またはシステムの質量分析器は、（可変および変更可能な幅の）狭いｍ／ｚ範囲を選択してイオンをガスセルに通すことができる。したがってシグナル対ノイズ比は、目的タンパク質の定量化に有意に強化され得る。
【００６２】
幾つかの態様では、目的の標的タンパク質が質量分析計のイオン源にまさに溶出しようとする時のクロマトグラフィーの保持時間で、提供される方法および／またはシステムの質量分析器は、標的の前駆体イオンに従い（可変および変更可能な幅の）狭いｍ／ｚ範囲を選択することができる。次いでこれらの選択したイオンは、高フラグメンテーションモ
ード（ここでサンプルの前駆体イオンは生成物イオンに実質的にフラグメント化される）と低フラグメンテーションモード（または非フラグメンテーションモード）（ここでサンプルの前駆体イオンは実質的にフラグメント化されない）との間を交互かつ反復して切り替えることによりイオンを脱離することができる器械の段階に移される。一般に高分解能精密質量スペクトルは両モードで取得され、そして実験の終わりに、関連する前駆体および生成物イオンはクロマトグラフィーの溶出時間に合った近さ、および場合により他の物理化学的特性により認識される。目的の標的タンパク質に関連する前駆体イオンまたは生成物イオンのいずれかのシグナル強度を使用して、植物抽出物中のタンパク質の量を決定することができる。
【００６３】
当業者は提供した開示に基づき特定の変形が存在できると理解している。したがって以下の実施例は本発明を説明する目的で与えられ、そして本発明または請求の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【００６４】
実施例
【実施例１】
【００６５】
植物サンプル（例えば穀物、葉、根、まぐさ、花粉）を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と合わせたアッセイバッファーＰＢＳＴで抽出する。配列番号：１は５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（２ｍＥＰＳＰＳ）のタンパク質配列を提供する：
ＭＡＧＡＥＥＩＶＬＱＰＩＫＥＩＳＧＴＶＫＬＰＧＳＫＳＬＳＮＲＩＬＬＬＡＡＬＳＥＧＴＴＶＶＤＮＬＬＮＳＥＤＶＨＹＭＬＧＡＬＲＴＬＧＬＳＶＥＡＤＫＡＡＫＲＡＶＶＶＧＣＧＧＫＦＰＶＥＤＡＫＥＥＶＱＬＦＬＧＮＡＧＩＡＭＲＳＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＡＴＹＶＬＤＧＶＰＲＭＲＥＲＰＩＧＤＬＶＶＧＬＫＱＬＧＡＤＶＤＣＦＬＧＴＤＣＰＰＶＲＶＮＧＩＧＧＬＰＧＧＫＶＫＬＳＧＳＩＳＳＱＹＬＳＡＬＬＭＡＡＰＬＡＬＧＤＶＥＩＥＩＩＤＫＬＩＳＩＰＹＶＥＭＴＬＲＬＭＥＲＦＧＶＫＡＥＨＳＤＳＷＤＲＦＹＩＫＧＧＱＫＹＫＳＰＫＮＡＹＶＥＧＤＡＳＳＡＳＹＦＬＡＧＡＡＩＴＧＧＴＶＴＶＥＧＣＧＴＴＳＬＱＧＤＶＫＦＡＥＶＬＥＭＭＧＡＫＶＴＷＴＥＴＳＶＴＶＴＧＰＰＲＥＰＦＧＲＫＨＬＫＡＩＤＶＮＭＮＫＭＰＤＶＡＭＴＬＡＶＶＡＬＦＡＤＧＰＴＡＩＲＤＶＡＳＷＲＶＫＥＴＥＲＭＶＡＩＲＴＥＬＴＫＬＧＡＳＶＥＥＧＰＤＹＣＩＩＴＰＰＥＫＬＮＶＴＡＩＤＴＹＤＤＨＲＭＡＭＡＦＳＬＡＡＣＡＥＶＰＶＴＩＲＤＰＧＣＴＲＫＴＦＰＤＹＦＤＶＬＳＴＦＶＫＮ．
【００６６】
【表１】
2017519206.tif 000003
【００６７】
抽出したタンパク質は変性させ、そして次にトリプシンプロテアーゼを加え、そして３７℃で１５〜２０時間インキュベーションすることによりタンパク質分解的に消化する。次いで消化反応はギ酸で酸性化し（ｐＨ＝１〜２）、そしてＬＣ−ＭＳを使用して分析する。２ｍＥＰＳＰＳのタンパク質配列をコンピューターを用いて分析し、そして消化して、検出すべき理論上のペプチドフラグメントを作成し、そしてＬＣ−ＭＳにより測定する。トリプシン消化後の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（２ｍＥＰＳＰＳ）の候補シグネチャーペプチドを表１に列挙する。
【００６８】
驚くことに、３個の候補シグネチャーペプチドが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または他の定量化法からの結果と比べた場合に、ＬＣ−ＭＳを使用した定量化で良好な相関を提供する。これら３個のシグネチャーペプチドは、ＥＩＳＧＴＶＫ（配列番号：３），ＤＶＡＳＷＲ（配列番号：２１），およびＶＮＧＩＧＧＬＰＧＧＫ（配列番号：１２）である。これら配列の工業的に合成されたペプチドならびに微生物由来２ｍＥＰＳＰＳタンパク質の両方を、上記と同じ消化工程を介して分析参照標準として使用し、ここで合成ペプチドはタンパク質定量化の分析参照標準として直接、役立てることができる。
【００６９】
標準的なクロマトグラムである５００ｎｇ／ｍＬの合成ペプチドに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの代表的データを図２に示し、ここで全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン  ３６７．２０８２
ｍ／ｚ  −  ＥＩＳＧＴＶＫ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン３６７．１８５０ｍ／ｚ  −  ＤＶＡＳＷＲ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ４８４．７７９８ｍ／ｚ  −  ＶＮＧＩＧＧＬＰＧＧＫ（２＋）（最下段の最初のパネル）間の比較で、各シグネチャーペプチドのシグニチャーピーク（１もしくは複数）を同定することができる。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【００７０】
トリプシン消化したトランスジェニックダイズサンプルのクロマトグラムに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの別の代表的データを図３に示し、ここで全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン  ３６７．２０８２ｍ／ｚ  −  ＥＩＳＧＴＶＫ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン３６７．１８５０ｍ／ｚ  −  ＤＶＡＳＷＲ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ４８４．７７９８ｍ／ｚ  −  ＶＮＧＩＧＧＬＰＧＧＫ（２＋）（最下段の最初のパネル）間の比較も、各シグネチャーペプチドのシグニチャーピーク（１もしくは複数）を同定することができる。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【００７１】
各シグネチャーペプチドについて、シグニチャーピーク（１もしくは複数）のピーク面積を算出することができ、そして重層のＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳ標準（上パネル）およびトランスジェニック（下パネル）抽出イオンクロマトグラムの代表的データを、定量化のためにペプチド注釈と共に図４に示す。抽出ウインドは全てのイオンについて２．０ｐｐｍである。
【実施例２】
【００７２】
植物サンプル（例えば穀物、葉、根、まぐさ、花粉）を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と合わせたアッセイバッファーＰＢＳＴで抽出する。抽出したタンパク質は変性させ、そして次にトリプシンプロテアーゼを加え、そして３７℃で１５〜２０時間インキュベーションすることによりタンパク質分解的に消化する。次いで消化反応はギ酸で酸性化し（ｐＨ＝１〜２）、そしてＬＣ−ＭＳを使用して分析する。配列番号：２６はＡＡＤ−１２のタンパク質配列を提供する：
ＭＡＱＴＴＬＱＩＴＰＴＧＡＴＬＧＡＴＶＴＧＶＨＬＡＴＬＤＤＡＧＦＡＡＬＨＡＡＷＬＱＨＡＬＬＩＦＰＧＱＨＬＳＮＤＱＱＩＴＦＡＫＲＦＧＡＩＥＲＩＧＧＧＤＩＶＡＩＳＮＶＫＡＤＧＴＶＲＱＨＳＰＡＥＷＤＤＭＭＫＶＩＶＧＮＭＡＷＨＡＤＳＴＹＭＰＶＭＡＱＧＡＶＦＳＡＥＶＶＰＡＶＧＧＲＴＣＦＡＤＭＲＡＡＹＤＡＬＤＥＡＴＲＡＬＶＨＱＲＳＡＲＨＳＬＶＹＳＱＳＫＬＧＨＶＱＱＡＧＳＡＹＩＧＹＧＭＤＴＴＡＴＰＬＲＰＬＶＫＶＨＰＥＴＧＲＰＳＬＬＩＧＲＨＡＨＡＩＰＧＭＤＡＡＥＳＥＲＦＬＥＧＬＶＤＷＡＣＱＡＰＲＶＨＡＨＱＷＡＡＧＤＶＶＶＷＤＮＲＣＬＬＨＲＡＥＰＷＤＦＫＬＰＲＶＭＷＨＳＲＬＡＧＲＰＥＴＥＧＡＡＬＶ．
【００７３】
【表２】
2017519206.tif 000004
【００７４】
ＡＡＤ１−１２のタンパク質配列をコンピューターを用いて分析し、そして消化して、検出すべき理論上のペプチドフラグメントを作成し、そしてＬＣ−ＭＳにより測定する。トリプシン消化後のＡＡＤ−１２の候補シグネチャーペプチドを表２に列挙する。
【００７５】
驚くことに、３個の候補シグネチャーペプチドが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または他の定量法からの結果と比べた場合に、ＬＣ−ＭＳを使用した定量化で良好な相関を提供する。これら３個のシグネチャーペプチドは、ＦＧＡＩＥＲ（配列番号：２８）、ＩＧＧＧＤＩＶＡＩＳＮＶＫ（配列番号：２９）、およびＡＡＹＤＡＬＤＥＡＴＲ（配列番号：３４）である。これら配列の工業的に合成されたペプチドならびに微生物由来ＡＡＤ−１２タンパク質を、上記と同じ消化工程を介して分析参照標準として使用し、ここで合成ペプチドはタンパク質定量化の分析参照標準として直接、役立てることができる。
【００７６】
標準的なクロマトグラムである５００ｎｇ／ｍＬの合成ペプチドに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの代表的データを図５に示し、ここで全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン  ３４６．６８８９ｍ／ｚ  −  ＦＧＡＩＥＲ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン６２１．８５６３ｍ／ｚ  −  ＩＧＧＧＤＩＶＡＩＳＮＶＫ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ５９８．２８３１ｍ／ｚ  −  ＡＡＹＤＡＬＤＥＡＴＲ（２＋）（最下段の最初のパネル）間の比較。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【００７７】
トリプシン消化したトランスジェニックダイズサンプルのクロマトグラムに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの別の代表的データを図６に示し、ここで全イオン電流（最上段の
最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン  ３４６．６８８９ｍ／ｚ  −  ＦＧＡＩＥＲ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン６２１．８５６３ｍ／ｚ  −  ＩＧＧＧＤＩＶＡＩＳＮＶＫ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン５９８．２８３１ｍ／ｚ  −  ＡＡＹＤＡＬＤＥＡＴＲ（２＋）（最下段の最初のパネル）間の比較も、各シグネチャーペプチドのシグニチャーピーク（１もしくは複数）を同定することができる。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【００７８】
各シグネチャーペプチドについて、シグニチャーピーク（１もしくは複数）のピーク面積を算出することができ、そして重層のＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳの標準（上パネル）およびトランスジェニック（下パネル）抽出イオンクロマトグラムの代表的データを、定量化のためにペプチド注釈と共に図７に示す。抽出ウインドは全てのイオンについて２．０ｐｐｍである。
【実施例３】
【００７９】
植物サンプル（例えば穀物、葉、根、まぐさ、花粉）を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と合わせたアッセイバッファーＰＢＳＴで抽出する。抽出したタンパク質は変性させ、そして次にトリプシンプロテアーゼを加え、そして３７℃で１５〜２０時間インキュベーションすることによりタンパク質分解的に消化する。次いで消化反応はギ酸で酸性化し（ｐＨ＝１〜２）、そしてＬＣ−ＭＳを使用して分析する。配列番号：４６はホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）のタンパク質配列を提供する：
ＭＳＰＥＲＲＰＶＥＩＲＰＡＴＡＡＤＭＡＡＶＣＤＩＶＮＨＹＩＥＴＳＴＶＮＦＲＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲＬＱＤＲＹＰＷＬＶＡＥＶＥＧＶＶＡＧＩＡＹＡＧＰＷＫＡＲＮＡＹＤＷＴＶＥＳＴＶＹＶＳＨＲＨＱＲＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫＳＭＥＡＱＧＦＫＳＶＶＡＶＩＧＬＰＮＤＰＳＶＲＬＨＥＡＬＧＹＴＡＲＧＴＬＲＡＡＧＹＫＨＧＧＷＨＤＶＧＦＷＱＲＤＦＥＬＰＡＰＰＲＰＶＲＰＶＴＱＩ．
【００８０】
ＰＡＴのタンパク質配列をコンピューターを用いて分析し、そして消化して、検出すべき理論上のペプチドフラグメントを作成し、そしてＬＣ−ＭＳにより測定する。トリプシン消化後のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）の候補シグネチャーペプチドを表３に列挙する。
【００８１】
【表３】
2017519206.tif 000005
【００８２】
驚くことに、３個の候補シグネチャーペプチドが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または他の定量法からの結果と比べた場合に、ＬＣ−ＭＳを使用した定量化で良好な相関を提供する。これら３個のシグネチャーペプチドは、ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（配列番号：４９）、ＳＶＶＡＶＩＧＬＰＮＤＰＳＶＲ（配列番号：５５）、およびＬＨＥＡＬＧＹＴＡＲ（配列番号：５６）である。これら配列の工業的に合成されたペプチドならびに微生物由来ＰＡＴタンパク質の両方を、上記と同じ消化工程を介して分析参照標準として使用し、ここで合成ペプチドはタンパク質定量化の分析参照標準として直接、役立てることができる。
【００８３】
標準的なクロマトグラム５００ｎｇ／ｍＬの合成ペプチドに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの代表的データを図８に示し、ここで全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン  ９２８．９３６７ｍ／ｚ
−  ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン  ７６１．９３３０ｍ／ｚ  −  ＳＶＶＡＶＩＧＬＰＮＤＰＳＶＲ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ５６５．８０１３ｍ／ｚ  −  ＬＨＥＡＬＧＹＴＡＲ（２＋）（最下段の最初のパネル）間の比較で、各シグネチャーペプチドのシグニチャーピーク（１もしくは複数）を同定することができる。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【００８４】
トリプシン消化したトランスジェニックダイズサンプルのクロマトグラムに関するＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳからの別の代表的データを図９に示し、ここで全イオン電流（最上段の最初のパネル）；合わせた抽出イオン（最上段から二番目のパネル）；抽出イオン  ９２８．９３６７ｍ／ｚ  −  ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（２＋）（最上段から三番目のパネルまたは中段パネル）；抽出イオン  ７６１．９３３０ｍ／ｚ  −  ＳＶＶＡＶＩＧＬＰＮＤＰＳＶＲ（２＋）（最下段から二番目のパネル）；および抽出イオン  ５６５．８０１３ｍ／ｚ  −  ＬＨＥＡＬＧＹＴＡＲ（２＋）（最下段の最初のパネル）間の比較も、各シグネチャーペプチドのシグニチャーピーク（１もしくは複数）を同定することができる。全てのイオンについて抽出ウインドは２．０ｐｐｍである。
【００８５】
各シグネチャーペプチドについて、シグニチャーピーク（１もしくは複数）のピーク面積を算出することができ、そして重層のＨＲＡＭ  ＬＣ−ＭＳの標準（上パネル）およびトランスジェニック（下パネル）抽出イオンクロマトグラムの代表的データを、定量化のためにペプチド注釈と共に図１０に示す。抽出ウインドは全てのイオンについて２．０ｐｐｍである。
【図１】
2017519206.tif 000006
【図２】
2017519206.tif 000007
【図３】
2017519206.tif 000008
【図４】
2017519206.tif 000009
【図５】
2017519206.tif 000010
【図６】
2017519206.tif 000011
【図７】
2017519206.tif 000012
【図８】
2017519206.tif 000013
【図９】
2017519206.tif 000014
【図１０】
2017519206.tif 000015
【配列表】
2017519206000001.app
【国際調査報告】
2017519206.tif 000016
2017519206.tif 000017
2017519206.tif 000018
2017519206.tif 000019
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