(57)【要約】肥満及び肥満関連状態を治療する方法であって、ＩΚＫε／ＴＢＫ１阻害剤とベータアドレナリン作動薬または交感神経系活性化剤との組合せを投与することを含む方法、ならびに係る組合せを含む医薬組成物がここに提供される。肥満は、マクロファージ浸潤ならびにインスリン作用を減衰させる炎症性サイトカイン及びケモカインの局部的分泌を伴った、肝臓及び脂肪組織における慢性の低程度の炎症状態を発生させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満、インスリン抵抗性、または肝脂肪症に関連した状態を有する被験者を治療する方法であって：前記肥満、インスリン抵抗性、または肝脂肪症に関連する状態または症状を有する被験者に対して：前記状態または症状が減少または除去されるように、（ｉ）ＩΚＫε及び／またはＴＢＫ１阻害剤、ならびに（ｉｉ）ベータアドレナリン作動薬または交感神経系活性化剤を投与することを含む前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記投与することは、前記被験者における体脂肪の減少を引き起こす前記方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記被験者は肥満、糖尿病またはインスリン抵抗性を有し、またはこれを経験するリスクがある前記方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記糖尿病はＩＩ型糖尿病である前記方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記治療は増大したグルコース代謝、体脂肪の減少、体脂肪増大の欠如、増大したインスリン受容体シグナリング、減少したレベルのインスリン受容体リン酸化、肝臓における慢性炎症の減少または予防、脂肪組織における慢性炎症の転生または予防、肝脂肪症の減少または予防、代謝エネルギー消費の促進、循環する遊離脂肪酸の減少、またはコレステロールの減少をもたらす前記方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記被験者は肝臓脂肪症（脂肪肝疾患）を有する前記方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記被験者は脂肪性肝炎を有する前記方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記被験者は過体重または肥満である前記方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記被験者はヒトである前記方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、更に、インスリンシグナル伝達障害、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、肝臓脂肪症、慢性肝炎、及び脂肪組織における慢性炎症からなる群から選択される疾患または状態について前記被験者を試験することを含むステップを具備する前記方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、更に、前記試験に基づく治療の有効性を評価するステップを具備する前記方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、更に、前記評価に基づいて前記治療を調節することを含む前記方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記治療を調節することは、ΙＫΚε／ΤΒΚ１阻害剤の投与量を変化させること、異なるΙＫΚε／ΤΒΚ１阻害剤に切り替えること、ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性剤の量を変化させること、異なるアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤に切り替えること、追加の治療を加えることの１以上を含む前記方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記ΙＫΚε及び／またはΤΒΚ１阻害剤、ならびにベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性剤は、単一の医薬組成物中に一緒に処方される前記方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記ΙＫΚε及び／またはΤΒΚ１阻害剤、ならびにベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性剤は、別々の医薬組成物であり、且つ一緒に投与される前記方法。
【請求項１６】
（ｉ）ΙΚΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤、及び（ｉｉ）ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤を含有する医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の医薬組成物であって、前記ΙＫΚε及び／またはΤΒΚ１阻害剤は小分子を含む前記医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の医薬組成物であって、前記ΙＫΚε及び／またはΤΒΚ１阻害剤は次式Ｉの構造及びそれらの生理学的に許容可能な塩を含む前記医薬組成物：
【化１】
2017507930.tif 000005
ここで、Ｒ１は水素、アルキル、フェニル、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、またはアミノ基であり、これは非置換であってよく、または一つのアルキルで置換されてよい；ｍは０、１または２である；Ｒ２はアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ブタジエニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−）であり、これは何れかの隣接する炭素原子もしくはアミノ基と共にベンゼン環を形成し、これは非置換であってよく、または少なくとも一つのアルキルで置換されてよい。
【請求項１９】
請求項１８に記載の医薬組成物であって、前記ΙＫΚε及び／またはΤΒΚ１阻害剤はアンレキサノクスを含む前記医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１６に記載の医薬組成物であって、前記ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤が小分子を含む前記医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の医薬組成物であって、前記ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤がβ２アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む前記医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の医薬組成物であって、前記小分子がフェンテルミンである前記医薬組成物。
【請求項２３】
（ｉ）ΙΚΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤、及び（ｉｉ）βアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤を具備するキットまたはシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の資金援助に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＤＫ０６０５９１の下での政府の支援によってなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
分野
ここでは肥満及び肥満関連状態を治療する方法であって、ＩＫＫε／ＴＢＫ１阻害剤とベータアドレナリン作動薬または交感神経系活性化因子との組合せを投与することを含む方法、ならびにかかる組合せを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満は、マクロファージ浸潤ならびにインスリン作用を弱める炎症性サイトカイン及びケモカインの局部的分泌を伴った、肝臓及び脂肪組織における軽度の慢性的炎症状態を生じ、インスリン抵抗性及びその後の２型糖尿病の発症をもたらす（Ｗｅｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，２００５；Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，２００６；Ｌｕｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓｈｏｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；これらの全体を本明細書の一部として援用する）。多くの研究は、幾つかの集団に亘って、炎症とインスリン抵抗性との間の強い相関を示している（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ  ２００６；その全体を本明細書の一部として援用する）。更に、炎症経路の遺伝子除去または薬理学的阻害は、肥満をインスリン抵抗性から切り離すことができる（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，２００６；Ｓｈｏｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；それらの全体を本明細書の一部として援用する）。
【０００４】
転写因子ＮＦκＢ及びその炎症プログラムは、肥満した肝臓及び脂肪組織におけるインスリン抵抗性の発症において重要な役割を果たす（Ｙｕａｎら，２００１；Ａｒｋａｎら，２００５；Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら，２００８；Ｃｈｉａｎｇら，２００９；その全体を本明細書の一部として援用する）。ＮＦκＢは、ΙΚΚα、ΙΚΚβ、ΙΚΚε、及びＴＢＫ１の四つのメンバーを有するΙκΒキナーゼ（ＩＫＫ）ファミリーによって活性化される。ΙΚΚα及びΙΚΚβは、足場パートナーのＮＥＭＯと共に作用して、ＮＦκＢを活性化させる（Ｈａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｉｎ，２００６；その全体を本明細書の一部として援用する）。ΙΚΚβの薬理学的阻害または遺伝子除去によって、インスリン抵抗性におけるこのキナーゼの役割が決定されたが（Ｙｕａｎら，２００１；Ａｒｋａｎら、２００５；その全体を本明細書の一部として援用する）、非標準のキナーゼΙΚΚε及びＴＢＫ１の役割は定かではない。
【０００５】
肥満は増大した食物摂取及び減少したエネルギー消費によって引き起こされる複雑な代謝性障害である。肥満はまた、２型糖尿病、心臓病、脳卒中、関節炎、及び特定の癌を発症するリスクを増大させる。このような肥満状態において、アドレナリンのようなカテコールアミンに対する脂肪組織の感度が低下し、この感度低下は更にエネルギー消費を減少させることを示唆するかなりの証拠が存在する。しかし、このプロセスの詳細は十分には理解されていない。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書で提供されるのは、肥満及び肥満関連状態を治療する方法であって、ΙΚΚε／ΤΒΚ１阻害剤とベータアドレナリン作動薬または交感神経系活性化剤との組合せを投与することを含む方法、及び係る組合せを含有する医薬組成物である。
【０００７】
幾つかの実施形態において、本発明は、肥満、インスリン抵抗性、または肝脂肪症に関連した状態を有する被験者を治療する方法であって：前記肥満、インスリン抵抗性、または肝脂肪症に関連する状態を有する被験者に対して：（ｉ）ＩＫΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤、ならびに（ｉｉ）ベータアドレナリン作動薬または交感神経系活性化剤を投与することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、この投与は、被験者における体脂肪の減少を引き起こす。幾つかの実施形態において、被験者は肥満、糖尿病、またはインスリン抵抗性を有するか、またはこれらを経験するリスクにある。幾つかの実施形態において、糖尿病はＩＩ型糖尿病である。幾つかの実施形態において、前記治療は、増大したグルコース代謝、体脂肪の減少、体脂肪増加の欠如、増大したインスリン受容体シグナル伝達、減少したインスリン受容体のリン酸化レベル、肝臓における慢性炎症の低下もしくは予防、または脂肪組織における慢性炎症の減少もしくは予防、肝脂肪症の低下もしくは予防、代謝性エネルギー消費の促進、循環する遊離脂肪酸の減少、またはコレステロールの減少をもたらす。幾つかの実施形態において、前記被験者は、肝脂肪症（脂肪肝疾患）を有している。幾つかの実施形態において、前記被験者は、脂肪性肝炎を有している。幾つかの実施形態において、前記被験者は、過体重または肥満である。幾つかの実施形態において、前記被験者はヒトである。
【０００８】
幾つかの実施形態において、本方法は更に、インスリンシグナル伝達障害、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、肝臓脂肪症、慢性肝炎、及び脂肪組織における慢性炎症からなる群から選択される疾患または状態について前記被験者を試験することを含むステップを具備する。幾つかの実施形態において、本方法は更に、前記検査に基づいて治療の有効性を評価するステップを具備する。幾つかの実施形態では、本方法は更に、前記評価に基づいて治療を調整することを含む。幾つかの実施形態において、前記治療を調整することは、ΙＫΚε／ΤΒΚ１阻害剤の投与量を変化させること、異なるΙＫΚε／ΤΒΚ１阻害剤に切り替えること、ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性剤の量を変化させること、異なるアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤に切り替えること、追加の治療を加えることの１以上を含む。
【０００９】
幾つかの実施形態において、本方法は、単一の医薬組成物中に一緒に処方されたΙＫΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤及びベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性剤を投与することを含む。他の実施形態において、ΙΚΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤、及びベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤は別々の医薬組成物であり、一緒に投与される（例えば１時間以内、２０分以内、１５分以内、５分以内、１分以内、同時等）。
【００１０】
幾つかの実施形態において、本発明は、（ｉ）ΙΚΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤、及び（ｉｉ）ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤を含有する医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態において、ΙΚΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤は小分子を含む。幾つかの実施形態において、ΙΚΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤は、式Ｉの構造及びそれらの生理学的に許容可能な塩を含む。
【化１】
2017507930.tif 000003
【００１１】
ここで、Ｒ１は水素、アルキル、フェニル、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、またはアミノ基であり、これは非置換であってよく、または一つのアルキルで置換されてよい；ｍは０、１または２である；Ｒ２はアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ブタジエニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−）であり、これは何れかの隣接する炭素原子もしくはアミノ基と共にベンゼン環を形成し、これは非置換であってよく、または少なくとも一つのアルキルで置換されてよい。幾つかの実施形態において、ΙΚΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤は、アンレキサノクスを含む。幾つかの実施形態において、ベータアドレナリン作用性アゴニストまたは交感神経系活性化剤は、小分子を含みます。幾つかの実施形態において、ベータアドレナリン作用性アゴニストまたは交感神経系活性化剤は、β２アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む。幾つかの実施形態において、小分子のベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤はフェンテルミンである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＩＫＫε及びＴＢＫ１の過剰発現が、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるβ−アドレナリン作動性／ｃＡＭＰ経路に対する感度を低下させることを示している。（Ａ）１０μΜのＩＳＯ（黒色バー）または１０μΜのＣＬ−３１６２４３（ＣＬ、灰色バー）を伴った、または伴わない４時間の処理の後の、空のベクター、Ｆｌａｇ−ＩＫＫε、またはＦｌａｇ−ＩＫＫεＫ３８Ａを発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＵｃｐｌ発現の増加倍率。（Ｂ）１０μΜのＩＳＯまたは１０μΜのＣＬでの処理された、空のベクター（白色バー）、Ｆｌａｇ−ＩＫＫε（黒色バー）、またはＦｌａｇ−ＩＫＫεＫ３８Ａ（灰色バー）を発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのグリセロール放出。（Ｃ）図１Ｂからの全細胞溶解物の免疫ブロット。結果は三回再現された。Ｄ．Ｅ．は暗露光を表し、Ｌ．Ｅ．は露光を表す。（Ｄ）５０μΜのＦＳＫでの１５分間の処理を伴った、または伴わない空のベクターまたはＦｌａｇ−ΙΚＫεを発現している３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からの全細胞溶解物のイムノブロット。（Ｅ）１０μＭのＩＳＯまたは５０μＭのＦＳＫでの１５分間の処理を伴った、または伴わない空のベクター、Ｆｌａｇ−ＩＫＫε、またはＦｌａｇ−ＩＫＫεＫ３８Ａを発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるｃＡＭＰレベル。
【図２】ＴＮＦαでの長期の治療は、βアドレナリン作動性の刺激に対する脂肪細胞の感度を、ΙΚΚε及びＴＢＫ１の活性に依存した形で減少させることを示している。（Ａ）指定された異なる濃度のＴＮＦαを用いて、または用いずに２４時間処理され、続いて１０μＭのＩＳＯまたは５０μＭのＦＳＫを用いて、または用いずに処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのグリセロール放出。（Ｂ）５０μＭのアンレキサノクス（Ａｍ）の前処理の存在下または不存在下において、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを用いて、または用いずに２４時間処理され、続いて１０μＭのＩＳＯまたは５０μＭのＦＳＫを用いて、または用いずに処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのｃＡＭＰレベル。（Ｃ）１μＭのＣＡＹ１０５７６（ＣＡＹ）の前処理の存在下または不存在下において、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを用いて、または用いずに２４時間処理され、続いて５０μＭのＦＳＫを用いて、または用いずに処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのｃＡＭＰレベル。（Ｄ）図２Ａと同じく異なる濃度のＴＮＦαを用いて、または用いずに２４時間処理され、続いて１０μＭのＩＳＯまたは５０μＭのＦＳＫを用いて、または用いずに処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞由来の全細胞溶解物の免疫ブロット。結果は、複数の実験において再現された。「［］は全ＨＳＬを示す。「ｎ．ｓ．」は非特異的バンドを表す。矢印はＣＧＩ−５８を示す。（Ｅ）増大する濃度（０、１０、５０、および２００μＭ）のアンレキサノクスを用いた３０分の前処理の存在下または不存在下において、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαまたは１００μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）を用いて、または用いずに２４時間処理され、続いて１０μＭのＩＳＯを用いて、または用いないで１５分間処理された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞由来の全細胞溶解物の免疫ブロット
【図３】ΙΚΚε及びＴＢＫ１はＰＤＥ３Ｂの活性化を介してｃＡＭＰレベルを低下させることを示している。（Ａ）５０μＭのＦＳＫ、２５０μＭのＩＢＭＸ、またはその両方を用いて、または用いないで１５分間処理された、空のベクター、Ｆｌａｇ−ΙΚΚε、またはＦｌａｇ−ＴＢＫ１を発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのｃＡＭＰレベル。（Ｂ）１０μＭのザルダベリン（Ｚａｒｄａ）を一緒に用いて、または用いないで、１０μＭのＩＳＯまたは５０μＭのＦＳＫを用いて、または用いないで１５分間処理された、空のベクター、Ｆｌａｇ−ΙΚΚε、またはＦｌａｇ−ＴＢＫ１を発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのｃＡＭＰレベル。（Ｃ）指示された組換えキナーゼと共に、基質としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞または１μｇのＭＢＰ（三重リン塩基性タンパク質）から免疫沈降されたＨＡ−ＰＤＥ３Ｂを用いたインビトロキナーゼ反応の３２Ｐホスホ画像。（Ｄ）抗ＨＡ抗体を用い、続いてＣＩＰを用いまたは用いないで処理した免疫沈降物（上パネル）、およびＦｌａｇ−ＩＫＫε／ＴＢＫ１またはＦｌａｇ−ＩＫＫε／ＴＢＫ１・Ｋ３８Ａと共にＨＡ−ＰＤＥ３Ｂを共発現するＣｏｓ−１細胞由来の全細胞溶解物（下パネル）の免疫ブロット。Ｄ．Ｅ．は暗露光を表し、Ｌ．Ｅ．は明露光を表す。（Ｅ）Ｆｌａｇ−ＴＢＫ１またはＦｌａｇ−ＴＢＫ１・Ｋ３８Ａと共にＨＡ−ＰＤＥ３Ｂを共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＧＳＴ−１４−３−３プルダウンの免疫ブロット。ポンソー染色は、ＧＳＴ−１４−３−３プルダウンに用いられたビーズの量を示している。
【図４】ＩＫＫε及びＴＢＫ１がセリン３１８においてＰＤＥ３Ｂをリン酸化して、１４−３−３βの結合をもたらすことを示している。（Ａ）質量分析実験からの、ＩＫＫεまたはＴＢＫ１（Ｐ部位）によりリン酸化されたＰＤＥ３Ｂ上の部位の要約。（Ｂ）Ｆｌａｇ−ＴＢＫ１と共にＨＡ−ＰＤＥ３ＢまたはＨＡ−ＰＤＥ３Ｂ・Ｓ３１８Ａを共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のＧＳＴ−１４−３−３プルダウンの免疫ブロット。ポンソー染色は、ＧＳＴ−１４−３−３プルダウンに用いられたビーズの量を示している。（Ｃ）ニトロセルロース膜上のＧＳＴ−１４−３−３オーバーレイ（上ブロット）、及びＦｌａｇ−ＴＢＫ１と共にＨＡ−ＰＤＥ３ＢまたはＨＡ−ＰＤＥ３Ｂ・Ｓ３１８Ａを共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の全細胞溶解物の免疫ブロット（下ブロット）。（Ｄ）１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαを用いて、または用いずに１６時間処理され、続いて２５μＭのＦＳＫを用いて、または用いずに１５分間処理された、空のベクター、ＨＡ−ＰＤＥ３ＢまたはＨＡ−ＰＤＥ３Ｂ  Ｓ３１８Ａを発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からのｃＡＭＰレベル。
【図５】ＩＫＫε／ＴＢＫ１阻害剤であるアンレキサノクスは、食餌で誘導された肥満マウスにおいて、白色脂肪組織におけるβアドレナリン作動性アゴニストに刺激された脂肪分解を感作する。（Ａ）アンレキサノクスまたは担体対照で４日間処理されたＮＤ給餌マウスまたはＨＦＤ給餌マウスにおいて、ＣＬ−３１６，２４３注射の１５分後の血清ＦＦＡレベル（左パネル）及びグリセロールレベル（右パネル）の増加倍数。（Ｂ）アンレキサノクスまたは担体を用いた前処理１時間後のエクスビボでの精巣上体（左パネル）および鼠径部（右パネル）ＷＡＴＳからのグリセロール放出。ＣＬ−３１６，２４３治療は時間ゼロで開始された。（Ｃ）ＣＬ−３１６，２４３処理６０分後の、図５（Ｂ）からの鼠径部ＷＡＴ溶解物における免疫ブロット。（Ｄ）アンレキサノクスまたは担体対照で４日間処理されたＨＦＤ給餌マウスにおいて、ＣＬ−３１６２４３（ＣＬ）または生理食塩水対照の注射２０分後の精巣上体ＷＡＴにおけるｃＡＭＰレベル。（Ｅ）アンレキサノクスまたは担体対照で４日間処理されたＨＦＤ給餌マウスにおいて、ＣＬ−３１６２４３（ＣＬ）または生理食塩水対照の注射５分後の精巣上体ＷＡＴにおけるｃＡＭＰレベル。（Ｆ）各処理群のマウスの相対的酸素消費。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
「核因子カッパＢキナーゼサブユニットイプシロンの阻害剤」、「Ｉ−カッパ−Ｂキナーゼイプシロン」、「ＩＫＫε」、及び「ＩＫＫｉ」の用語は、ここではＩＫＢＫＥ遺伝子によりコードされる酵素を指称するために互換的に使用される。
【００１４】
詳細な説明
本明細書では、肥満及び肥満関連状態を治療する方法であって、ΙΚΚε／ΤΒΚ１阻害剤とベータアドレナリン作動薬または交感神経系活性化剤との組合せを投与することを含んでなる方法、及び係る組合せを含有する医薬組成物が提供される。幾つかの実施形態において、本発明は、アンレキサノクスまたは他のＩＫＫｉ／ＴＢＫ１阻害剤とベータ−アドレナリン作動性活性化剤（例えば、ベータ２またはベータ３）との組合せ、または交感神経系を活性化する薬剤（例えば、アンフェタミン、フェンテルミン）との組合せを提供する。
【００１５】
幾つかの実施形態において、本発明は、被験者における体脂肪を減少させ、または体脂肪の増加を予防する方法であって、価体重または肥満した身体組成を経験しまたはそのリスクのある被験者に対して、治療的に有効な用量の（ｉ）ＩΚＫε／ＴＢＫ１阻害剤、ならびに（ｉｉ）（Ａ）ベータアドレナリン作動薬または（Ｂ）交感神経系活性化剤を投与することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記投与は、被験者における体脂肪の減少または増加の防止を引き起こす。幾つかの実施形態において、前記被験者は糖尿病及びインスリン抵抗性のような状態を経験しているか、またはこれらを経験するリスクがある。幾つかの実施形態において、前記医薬組成物を投与することは、増大したグルコース代謝、増大したインスリン受容体シグナル伝達、減少したインスリン受容体のリン酸化レベル、肝臓における慢性炎症の低下もしくは予防、または脂肪組織における慢性炎症の減少もしくは予防、肝脂肪症の低下もしくは予防、代謝性エネルギー消費の促進、循環する遊離脂肪酸の減少、及び／またはコレステロールの減少をもたらす。
【００１６】
幾つかの実施形態において、ＩＫＫｉ阻害剤はＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重阻害剤である。幾つかの実施形態において、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ阻害剤は小分子である。例えば、幾つかの実施形態において、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重阻害剤は、２−アミノ−４−（３’−シアノ−４’−ピロリジン）フェニル−ピリミジン化合物またはその誘導体もしくは類似体である（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１３  Ｏｃｔ  ６．  ｄｏｉ：１０．１００２／ｉｊｃ．２８５０７；その全体を本明細書の一部として援用する）。他の実施形態では、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ二重阻害剤は、Ａ２０、ＴＡＸ１ＢＰ１（Ｐａｒｖａｔｉｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８５，１４９９９−１５００９（２０１０）；その全体を本明細書の一部として援用する）またはその誘導体もしくは類似体である。幾つかの実施形態において、ＴＢＫ１／ＩＫＫｉ阻害剤は、アンレキサノクス、その誘導体もしくは類似体、またはその医薬的に許容可能な塩である。
【００１７】
アンレキサノクス、または２−アミノ−７−イソプロピル−１−アザキサントン−３−カルボン酸；２−アミノ−７−イソプロピル−５−オキソ−５Ｈ−クロメノ［２，３−ｂ］ピリジン−３−カルボン酸が、例えば米国特許番号４，１４３，０４２に記載されており、その全体を本明細書の一部として援用する。幾つかの実施形態において、該化合物は式Ｉ及びその生理学的に許容可能な塩の構造を有している：
【化２】
2017507930.tif 000004
【００１８】
ここで、Ｒ１は水素、アルキル、フェニル、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、またはアミノ基であり、これは非置換であってよく、または一つのアルキルで置換されてよい；ｍは０、１または２である；Ｒ２はアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、ブタジエニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−）であり、これは何れかの隣接する炭素原子もしくはアミノ基と共にベンゼン環を形成し、これは非置換であってよく、または少なくとも一つのアルキルで置換されてよい。上記で述べた式の各々において指定された置換基は、前記アザキサントン環の６位、７位、８位、または９位のうちの任意の一つまたは複数の位置で置換されてよい。
【００１９】
式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２で表されるアルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する直鎖、分岐鎖、または環状のアルキル基であってよい。アルキル基の代表的な例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル等であり得る。
【００２０】
Ｒ１及びＲ２で表されるアルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ等のような、アルキル部分に１〜４個の炭素原子を有するものであることができる。
【００２１】
Ｒ１で表されるモノアルキル置換アミノ基は、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、またはイソプロピルアミノのような、アルキル部分に１〜３個の炭素原子を有するものであり得る。Ｒ２で表されるハロゲンは、塩素、臭素、ヨウ素、またはフッ素であり得る。
【００２２】
Ｒ２で表されるアルキル置換アミノ基は、モノまたはジ−アルキル置換されたものを含み、そのアルキル部分は１〜３個の炭素原子を有するもの、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、またはジプロピルアミノである。
【００２３】
一般式（Ｉ）の化合物は、従来の方法で、これを有機アミン［例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ｄｌ−メチルエフェドリン、１−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−イソプロピルアミノエタノール、イソプロテレノール、デキストロメトルファン、ヘトラザン（ジエチルカルバマジン）、ジエチルアミン、トリエチルアミン等］、アルカリ金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）、またはアンモニアと共に、例えば適切な溶媒中でそれらを一緒に混合及び加熱して反応させることにより、対応する有機アミン塩、アルカリ金属塩、またはアンモニウム塩に変換することができる。
【００２４】
幾つかの実施形態においては、ベータアドレナリン受容体に作用し、ベータブロッカーの反対の効果を有する交感神経刺激剤（例えば、小分子、ペプチド、ＲＮＡ等）が提供される。幾つかの実施形態では、ベータアドレナリン作動性受容体アゴニストが提供される。幾つかの実施形態において、ベータアドレナリン作用性受容体アゴニストは、エピネフリン及びノルエピネフリンシグナル伝達の作用を模倣する。幾つかの実施形態において、βアドレナリン作動性受容体アゴニストはβ１、β２、及びβ３受容体の１以上を活性化する。
【００２５】
幾つかの実施形態において、ドブタミン、イソプロテレノール（β１及びβ２）、キサモテロール、エピネフリン等から選択されるβ１アゴニストが提供される。他の適切なβ１アゴニストが、本発明の範囲内である。
【００２６】
幾つかの実施形態においては、β２アゴニストは、サルブタモール（米国ではアルブテロール）、レボサルブタモール（米国ではレバルブテロール）、フェノテロール、ホルモテロール、イソプロテレノール（β１及びβ２）、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン、クレンブテロール、イソエタリン（ｉｓｏｅｔａｒｉｎｅ）、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、エピネフリン等から選択されるβ２アゴニストが提供される。他の適切なβ２アゴニストが、本発明の範囲内である。
【００２７】
幾つかの実施形態においては、任意の適切なβ３アゴニスト（例えば、ミラベグロン）が本発明の範囲内である。
【００２８】
幾つかの実施形態において、ベータアドレナリン受容体アゴニストは、サルブタモール（アルブテロール、ベンントリン［Ｖｅｎｔｏｌｉｎ］）、レボサルブタモール（レバルブテロール、ゼオペネックス［Ｘｏｐｅｎｅｘ］、テルブタリン（ブリカニル［Ｂｒｉｃａｎｙｌ］）、ピルブテロール（マクスエール［Ｍａｘａｉｒ］）、プロカテロール、クレンブテロール、メタプロテレノール（アルペント［Ａｌｕｐｅｎｔ］）、フェノテロール、メシル酸ビトルテロール、リトドリン、イソプレナリン、サルメテロール（セレベント［Ｓｅｒｅｖｅｎｔ］ディスカス）、ホルモテロール（フォラジル［Ｆｏｒａｄｉｌ］、シムビコート）、バンブテロール、クレンブテロール、インダカテロール、アルブタミン［ａｒｂｕｔａｍｉｎｅ］、ベフノロール、ブロモアセチルアルプレノロールメタン、ブロクサテロール［ｂｒｏｘａｔｅｒｏｌ］、シマテロール、シラゾリン［ｃｉｒａｚｏｌｉｎｅ］、デノパミン、ドペキサミン、エチレフリン、ヘキソプレナリン、ヒゲナミン［ｈｉｇｅｎａｍｉｎｅ］、イソクスプリン、マブテロール、メトキシフェナミン、ニリドリン［ｎｙｌｉｄｒｉｎ］、オキシフェドリン、プレナルテロール、ラクトパミン、レプロテロール、リミテロール、トレトキノール［ｔｒｅｔｏｑｕｉｎｏｌ］、ツロブテロール、ジルパテロール、ジンテロール［ｚｉｎｔｅｒｏｌ］等を含む一覧から選択されるが、これらに限定されない。
【００２９】
幾つかの実施形態では、交感神経系活性化剤が提供されます。このような薬剤は、何れか適切な機構（１以上の神経伝達物質（例えば、ノルエピネフリン、セロトニン及びドーパミンエピネフリン及び／またはアドレナリン）に作用し、その放出を増大させ、またはその再取り込みを阻害すること、アドレナリン作動性受容体アゴニストとして作用すること等）によって、交感神経系を活性ささせることができる。適当な交感神経系活性化剤は、ベンゾジアゼピン（例えば、ジアゼパム（バリウム）、クロナゼパム（クロノピン）、ロラゼパム（アクチバン［Ａｔｉｖａｎ］）、テマゼパム（レストリル［Ｒｅｓｔｏｒｉｌ］）、フルニトラゼパム（ロヒプノール）、トリアゾラム（ハルシオン）、アルプラゾラム（ザナックス））、アンフェタミン（例えば、アンフェタミン（アデラール）、メタンフェタミン（デソキシン）、メチルフェニデート（リタリン）、フェンテルミン、４−メチルアミノレックス、フェンメトラジン（プレルジン［Ｐｒｅｌｕｄｉｎ］）、メトカチノン、フェンフルラミン（ポンジミン［Ｐｏｎｄｉｍｉｎ］、フェンフェン）、デクスフェンフルラミン（レダックス［Ｒｅｄｕｘ］）、プソイドエフェドリン（スゥーダフェッド）、エフェドリン、フェニルプロパノールアミン（旧トリアミニック［Ｔｒｉａｍｉｎｉｃ］）、フェニレフリン（スゥーダフェッドＰＥ）等）、フェンテルミン、トピラメート等から選択することができる。他の適切な交感神経系の活性化剤が、本発明の範囲内である。
【００３０】
幾つかの実施形態において、本発明は、過体重及び肥満の治療または予防における使用を見出す。最も広く受け入れられている肥満の臨床的定義は、ＢＭＩに基づく世界保健機関（ＷＨＯ）の基準である。大人のためのこの規則の下では、グレード１の過体重（一般的かつ単純に太りすぎと呼ばれる）は２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩである。グレード２の過体重（一般的に太りすぎと呼ばれる）は、３０〜３９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩである。グレード３の過体重（一般的に重度または病的な太りすぎと呼ばれる）は、４０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩである。外科的な文献では、多くの場合、特に重度の肥満を認識するために異なる分類を使用する。この設定では、ＢＭＩが４０ｋｇ／ｍ２を超えるＢＭＩは重度の肥満として記述され、４０〜５０ｋｇ／ｍ２のＢＭＩは病的肥満と呼ばれ、５０ｋｇ／ｍ２を超えるＢＭＩは超肥満と称される。子供の肥満の定義には、年齢と性別を適合させた対照被験者について、それぞれ、第８５百分位数よりも大きいＢＭＩ（太りすぎを定義するために一般的に使用される）または第９５百分位数よりも大きいＢＭＩ（一般的に肥満を定義するために使用される）が含まれる。肥満の二次的な原因には、甲状腺機能低下症、クッシング症候群、インスリノーマ、視床下部性肥満症、多嚢胞性卵巣症候群、遺伝性症候群（例えば、プラダー・ウィリー症候群、アルストレーム症候群、バルデ・ビードル症候群、コーエン症候群、ボルジェソン・フォルスマン・レーマン症候群、フレーリッヒ症候群）、成長ホルモン欠損症、経口避妊薬の使用、薬剤誘発性肥満（例えば、フェノチアジン、バルプロ酸ナトリウム、カルバマゼピン、三環系抗うつ薬、リチウム、グルココルチコイド、酢酸メゲストロール、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、インシュリン、アドレナリンアンタゴニスト、セロトニンアンタゴニスト［特にシプロヘプタジン］）、摂食障害（特に過食障害、神経性過食症、夜間摂食障害）、性腺機能低下症、偽性副甲状腺機能低下、及び経管栄養関連の肥満が含まれる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載の医薬の組合せ及び治療は、上記で述べた肥満の二次的要因のうちの１以上の治療における使用を見出す。
【００３１】
幾つかの実施形態において、被験者は、バイオマーカー、代謝産物、身体的な症状、徴候、等を測定することにより、疾患または状態（例えば、肥満及び／または関連障害；これにはインスリン抵抗性、糖尿病、脂肪症、非アルコール性脂肪変性及びアテローム性動脈硬化症を含むが、これらに限定されない）の存在、不存在またはレベルを評価するために試験され、肥満症及び／または関連障害のリスクまたは存在を決定する。該リスクにはインスリン抵抗性、糖尿病、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎、及びアテローム性動脈硬化症が含まれるが、これらに限定されない。その後、被験者はこの試験の結果に基づいて、本明細書に記載の医薬の組合せで治療される。幾つかの実施形態において、患者は、試験され、治療処理され、次いで治療に対する応答をモニターするために再び試験される。幾つかの実施形態では、試験及び治療のサイクルは、試験及び治療のパターン（例えば、試験／治療、試験／治療／試験、試験／治療／試験／治療、試験／治療／試験／治療／試験、試験／治療／治療／試験／治療／治療等）、周期、または各試験と治療相の間の時間間隔に制限なく生じ得る。
【００３２】
一般に、提供される技術に従う組成及び／または医薬の組合せは、そのような化合物の投与に応答する状態を有する哺乳動物、特にヒトに投与するために処方されることが想定される。従って、想定される化合物が、医薬組成物または組合せで投与される場合、製剤は薬学的に許容される担体との混合物の形態であり得ることが想定される。例えば、想定される化合物及び組合せは、医薬的に許容可能な塩として経口投与されることができ、または生理食塩水溶液（例えば、約７．２〜７．５のｐＨに緩衝される）で静脈内に投与することができる。リン酸塩、重炭酸塩、またはクエン酸塩のような従来の緩衝剤を、この目的のために使用することができる。勿論、当業者は特定の投与経路のための多数の製剤を提供するために、本明細書の教示内において製剤を修飾することができる。特に、想定される化合物は水または他の媒体中でより可溶性になるように修飾されてよく、これは例えば、当業者の範囲内であるマイナーな修飾（塩形成、エステル化等）を用いて達成することができる。また、患者における最大の有益な効果について本発明の化合物の薬物動態を管理するために、特定の化合物の投与及び投薬レジメンの経路を変更することも、当業者の技術の範囲内である。
【００３３】
一定の医薬剤形においては、毒性の低下、器官または標的細胞特異性を増加させる等を含む種々の目的のために、意図される化合物のプロドラッグ形態が形成されてよい。種々のプロドラッグ形態の中で、本発明の化合物のアシル化（アセチル化等）された誘導体、ピリジンエステル、及び種々の塩形態が好ましい。当業者は、宿主生物または患者内の標的部位への活性化合物の送達を容易にするために、本発明の化合物をプロドラッグ形態へと容易に変更する方法を認識するであろう。該当する場合、当業者はまた、化合物の意図した効果を最大にするために、宿主生物または患者内の標的部位への本発明の化合物の送達において、プロドラッグ形態の好ましい薬物動態学的パラメータを利用するであろう。同様に、意図された化合物はそれらの生物学的に活性な形態へと代謝され得るものであり、該化合物の全ての代謝産物が本明細書において具体的に意図されることが理解されるべきである。加えて、意図される化合物（及びそれらの組合せ）は、肥満症及び関連疾患を治療するための更に別の薬剤と組合せて投与され得るものであり、該疾患にはインスリン抵抗性、糖尿病、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎、及びアテローム性動脈硬化症が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
被験者への投与に関しては、化合物及び／またはそれらの組合せは、薬学的に有効な量で投与されることが想定される。当業者は、薬学的に有効な量が使用される治療薬、被験者の年齢、状態、及び性別、被験者における疾患の程度に依存して変化することを認識している。一般的に、投与量は過粘稠度症候群、肺水腫、鬱血性心不全のような有害な副作用を引き起こすように大きいものであってはならない。投与量は、所望の治療目標を達成するために、個々の臨床医によって調整することができる。
【００３５】
本明細書で用いる「薬学的に有効な量」の用語により包含される実際の量は、投与経路、治療される被験者のタイプ、及び検討中の特定の被験者の身体的特性に依存するであろう。この量を決定するための要因及びそれらの関係は、医学、獣医学、及び他の関連技術分野における当業者に周知である。この投与の量及び方法は、最適な効果を達成するように調整できるが、体重、食事、及び併用薬のような因子、ならびに当業者が認識する他の因子に依存するであろう。
【００３６】
幾つかの実施形態では、（ｉ）ΙΚΚε／ΤΒΚ１阻害剤及び（ｉｉ）（Ａ）ベータアドレナリン作動性アゴニスト、または（Ｂ）交感神経系活性化剤の両方を含む単一の医薬組成物が提供される。他の実施形態では、別個の医薬組成物が投与され、その一方はＩＫＫε／ΤΒΚ１阻害剤を含んでおり、またもう一方はベータアドレナリン作動薬及び／または交感神経系活性化剤を含んでいる。別個の医薬組成物の投与の用量及びスケジュールは一緒にまたは別々に決定及び／または調節することができる。
【００３７】
用量及び頻度は、実質的に有害な影響を伴わない当該化合物の有効レベルを作成するように選択される。経口または静脈内に投与する場合、該用量は一般に、０．００１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日または用量（例えば、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日もしくは用量、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日もしくは用量、１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日もしくは用量、またはその中の量）の範囲である。
【００３８】
幾つかの実施形態では、単回用量が被験者に投与される。他の実施形態においては、複数回投与が、時間、日、週で隔てられた二以上の時点に亘って投与される。幾つかの実施形態において医薬組成物は、長期に亘って（例えば慢性的に）、例えば月または年（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の月または年）に亘って投与される。そのような実施形態において、医薬組成物は、長期の持続時間に亘って定期的なスケジュールに基づいて（例えば、毎日、毎週など）接種することができる。
【００３９】
薬学的有効量を投与する方法には、非経口、経口、腹腔内、鼻腔内、局所、舌下、直腸、及び膣の形態での投与が含まれるが、これらに限定されない。非経口の投与経路には、例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、及び注入経路が含まれる。幾つかの実施形態では、アンレキサノクス、その誘導体または薬学的に許容される塩は経口投与される。
【００４０】
医薬組成物は、好ましくは、１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に、本技術の１以上の化合物を含有する。薬学的に許容される担体は、例えば、全ての目的で本明細書の一部として明示的に援用するレミングトン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ）の製薬科学、マック出版社（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、１９８５）に記載されたもののように、当技術分野において知られている。
【００４１】
従って、幾つかの実施形態において、当該組成物（一つの薬剤または医薬組成物を含む）は、錠剤、カプセル、徐放性錠剤、徐放性カプセル剤、遅放出性錠剤、遅放出性ペレット、遅放出性カプセル、迅速放出錠性剤、迅速放出性カプセル、迅速放出性ペレット、舌下錠、ゲルカプセル、マイクロカプセル；経皮送達製剤、経皮ゲル、経皮パッチ、滅菌溶液、標的部位への直接の注射として使用するための筋肉内もしくは皮下注射用として調製された、または静脈内投与のための滅菌溶液；直腸内投与のために統制された溶液；胃栄養チューブまたは十二指腸栄養チューブを通して投与するために調製された溶液；直腸投与用の坐剤；溶液またはエリキシルとして調製された経口摂取用の液体；局所クリーム；ゲル；ローション；チンキ；シロップ；エマルジョン；または懸濁液として製剤化される。
【００４２】
幾つかの実施形態において、時間放出製剤は、持続放出、持続作用、延長放出、制御放出、調節放出、または連続放出の機構であり、例えば、当該組成物は、治療剤を迅速に、徐々に、または任意の適切な放出速度で継時的に放出するように製剤化される。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本技術の医薬製剤及び／または処方剤は、粒子で提供される。本明細書で使用される粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子（幾つかの場合にはもっと大きい）を意味し、全体として、または部分的に、本明細書に記載した治療剤からなることができる。粒子は、コーティング（腸溶コーティングを含むが、これに限定されない）に囲まれたコアの中に、当該製剤及び／または配合物を含有してよい。調製物及び／または製剤は、該粒子全体に分散されてよい。調製物及び／または製剤は、該粒子中に吸着されてもよい。該粒子は、ゼロ次放出、一次放出、二次放出、遅延放出、持続放出、即時放出、及びそれらの任意の組合せ等を含む、任意の次数の放出速度であってよい。該粒子は、調製物及び／または製剤に加えて、薬学及び医学の分野で日常的に使用される材料の何れかを含有してよく、これには侵食性、非侵食性、生分解性もしくは非生分解性の材料またはこれらの組合せが含まれる。該粒子は、溶液または半固体状態の製剤を含有するマイクロカプセルであってよい。該粒子は、実質上はいかなる形状であってもよい。
【００４４】
非生分解性及び生分解性ポリマー材料の両方を、調製物及び／または製剤を送達するための粒子の製造に使用することができる。このようなポリマーは、天然または合成のポリマーであってもよい。該ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選択される。特に興味のある生体接着性ポリマーには、マクロ分子（１９９３）２６：５８１−５８７（著者：Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ，Ｃ．Ｐ．Ｐａｔｈａｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌ）に記載された生体内分解性ヒドロゲルが含まれており、その教示を本明細書の一部として援用する。これらには、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、及びポリ（オクタデシルアクリレート）が含まれる。
【００４５】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は緩衝剤を用いて製剤化される。該緩衝剤は、任意の薬学的に許容される緩衝剤であってよい。緩衝系には、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液が挙げられます。緩衝剤の例としては、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム及びリン酸、アスコルビン酸ナトリウム、酒石酸、マレイン酸、グリシン、乳酸ナトリウム、乳酸、アスコルビン酸、イミダゾール、重炭酸ナトリウム及び炭酸、コハク酸ナトリウム及びコハク酸、ヒスチジン、ならびに安息香酸ナトリウム及び安息香酸が含まれる。
【実施例】
【００４６】
実験
肥満は、ＮＦκＢ経路が関与する慢性炎症状態を生成し、非標準ΙκΒキナーゼＩＫＫｉ及びＴＢＫ１の持続的な上昇をもたらす。本発明の実施形態の開発の際に行われた実験は、これらのキナーゼが、白色脂肪組織におけるβアドレナリン受容体シグナル伝達を弱めることを示している。これらキナーゼの特異的阻害剤を用いた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の処理は、ＴＮＦα及びポリ（Ｉ：Ｃ）により減衰されたβアドレナリン作動性シグナリング及び脂肪分解を復元した。逆に、前記キナーゼの過剰発現は、イソプロテレノールまたはフォルスコリンに応答して、Ｕｃｐ１、脂肪分解、ｃＡＭＰレベル、及びホルモン感受性リパーゼのリン酸化の誘導を減少させた。非標準のＩＫＫは、主要な脂肪細胞のホスホジエステラーゼであるＰＤＥ３Ｂをリン酸化及び活性化することにより、カテコールアミン感度を低下させる。薬物アンレキサノクスで肥満マウスを治療することにより、これらキナーゼのインビボ阻害は、肥満誘発性カテコールアミン耐性を逆転させ、β−３アドレナリン作動薬の注射に応答してＰＫＡシグナル伝達を回復させた。これらの研究は、脂肪細胞におけるｃＡＭＰ産生を減少させることによって、ΙΚΚε及びＴＢＫ１が肥満時のエネルギー消費の抑制に寄与することを示している。
【００４７】
実施例１
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、ΙΚΚε及びＴＢＫ１の過剰発現はβアドレナリン／ｃＡＭＰ経路に対する感度を低下させる
【００４８】
脂肪組織の交感神経活性化は、脂肪分解及び脂肪の酸化を刺激することによって、エネルギーバランスの維持に関与している（Ｃｏｐｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｌａｎｇｉｎ，２００６；Ｆｅｓｔｕｃｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；その全体を本明細書中一部として援用する）。白および褐色脂肪組織におけるβアドレナリン作動薬または寒冷暴露の何れかによるβアドレナリン受容体シグナル伝達の活性化は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を介した事象のカスケードを開始し、Ｕｃｐ１転写のアップレギュレーションで最高潮に達し、これは増加したプロトンリーク及びエネルギー消費をもたらす（Ｈｉｍｍｓ−Ｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｙｅｈｕｄａ−Ｓｈｎａｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；その全体を本明細書の一部として援用する）。野生型（ＷＴ）の対照に比較して、ΙΚΚε−欠損マウスは、白色脂肪デポーにおけるＵｃｐ１の増大した発現を伴って、高脂肪食（ＨＦＤ）においてもエネルギー消費の増加を示す（Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体を本明細書の一部として援用する）。ΙΚΚε−欠損マウスにおけるエネルギー消費の増加は、ＨＦＤ給餌マウスでのみ見られ（チェンマイら、２００９；本明細書中でその全体が参考として援用される）、これは肥満の際のＩＫＫεの誘導時に、キナーゼが過剰栄養に対する増大した適応性熱発生を抑制することを示す。この効果は更に、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中でＩＫＫε過剰発現させ、また非選択的βアドレナリン作動性アゴニストであるイソプロテレノール（ＩＳＯ）、またはＰ３アドレナリン作動性アゴニストであるＣＬ−３１６，２４３で処理した後にＵｃｐｌ遺伝子の発現を調べることによって分析された。Ｕｃｐ１遺伝子発現における倍差は、対照サンプルに対する処理されたサンプルでの相対的なＵｃｐ１・ｍＲＮＡレベルを正規化することによって計算された。空ベクターを発現する細胞のＩＳＯまたはＣＬ−３１６，２４３での処理は、それぞれ、Ｕｃｐ１・ｍＲＮＡレベルにおける１．６倍または２倍の増大をもたらした（図１Ａ）。ＷＴ・ＩＫＫεがこれら細胞内で過剰発現されたときには、ＩＳＯまたはＣＬ−３１６，２４３に応答したＵｃｐ１遺伝子発現の誘導が鈍化された。しかし、ΙＫΚεＫ３８Ａのキナーゼ不活性変異体の発現（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；その全体を本明細書の一部として援用する）は、効果が低かったが、それでも適度にＵｃｐ１発現を抑制した。
【００４９】
増加したＵｃｐ１発現に加えて、ΙＫΚεノックアウトマウスはまた増加した脂肪分解及び脂肪の酸化を示し（Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体を本明細書の一部として援用する）、肥満マウスの脂肪組織における減少した脂肪分解は、部分的にはＩＫＫε及びＴＢＫ１の増大した発現をもたらし得ることを示唆している（Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；その全体を本明細書の一部として援用する）。この肥満に依存性した増加は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてＩＫＫεを過剰発現させ、続いてＩＳＯまたはＣＬ−３１６，２４３に応答したグリセロール放出を検定することよって、非標準のＩＫＫにおいてモデル化された。イソプロテレノール及びＣＬ−３１６，２４３の両者は、空ベクター発現細胞における脂肪分解を増加させたが、ＷＴ・ＩＫＫεの過剰発現はイソプロテレノール及びＣＬ−３１６，２４３の脂肪分解効果を４０％減少させ、また基礎グリセロール放出を減少させた（図１Ｂ）。ＩＫＫεの過剰発現による脂肪分解の減少には、ＩＳＯまたはＣＬ−３１６，２４３に応答して、ＨＳＬ及びペリリピンの劇的に減少したリン酸化が伴った（図１Ｃ）。過剰発現によって達成されるタンパク質のレベルはＷＴキナーゼに比較して低かったが、触媒的に不活性なキナーゼの発現は、脂肪分解のシグナル伝達を遮断する上で効果が低かった（図１Ｂ、図１Ｃ、図１）。ＴＢＫ１の過剰発現は、イソプロテレノールまたはアデニリルシクラーゼ活性化剤であるフォルスコリンに応答して、ＨＳＬのリン酸化を減少させた（図１）。フォルスコリンで刺激された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でΙΚΚεが過剰発現されたときに、抗ホスホＰＫＡ基質モチーフ抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出されたのと同じ結果が得られた（図１Ｄ）。
【００５０】
ΙΚΚεの過剰発現はまた、フォルスコリン（図１Ｄ）またはイソプロテレノール（図１）に応答してｐ３８（Ｐ−Ｐ３８）のリン酸化を抑制したのに対して、ＩＫＫεΚ３８Αの過剰発現は効果なしであった（図１）。グリセロール放出はＨＳＬ及びペリリピンリン酸化の変化の結果である可能性が高いが、グリセロール中間体の再エステル化もまた影響を受けているかどうかを我々は検定していないことに留意することが重要である。総合すると、これらのデータは、肥満において観察されるものと同様に、ΙΚΚεまたはＴＢＫ１の過剰発現が脂肪分解のシグナル伝達を抑制できることを示している。キナーゼ不活性変異体の部分的な有効性は、二量体化に起因した内因性のΙΚΚεまたはＴＢＫ１キナーゼの活性化を反映することが想定される（Ｌａｒａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；それらの全体を本明細書中の一部として援用する）。
【００５１】
ＰＫＡシグナリングは、カテコールアミンに応答したＵｃｐ１誘導の原因なので（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；それらの全体を本明細書中の一部として援用する）、本発明の実施形態を開発する際に、ｃＡＭＰレベルを減少させることによる、ΙΚΚε及びＴＢＫ１に誘発された脂肪細胞におけるβアドレナリン感度の減少を調べるために実験が行われた。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるΙΚΚε過剰発現は、イソプロテレノール及びフォルスコリンの両方により産生されるｃＡＭＰレベルの上昇を８０％超減少させたのに対して、ΙΚΚεＫ３８Ａの過剰発現はこれを減少させなかった（図１Ｅ）。以前の研究は、脂肪組織におけるアドレナリン作動性刺激に対する減少した感受性が、低下したβアドレナリン作動性受容体から（Ｒｅｙｎｉｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；その全体を本明細書中の一部として援用する）、またはα２アドレナリン作動性受容体の増大した発現（Ｓｔｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；その全体を本明細書中の一部として援用する）から生じ得ることを示した。
【００５２】
実施例２
ＴＮＦαでの長期治療は、βアドレナリン作動性に刺激に対する脂肪細胞の感受性をΙΚΚε及びＴＢＫ１の活性に依存した形で低下させる。
【００５３】
肥満には、炎症誘発性マクロファージの脂肪組織への浸潤が伴う。これらの細胞は、ＴＮＦαのような炎症性サイトカインを分泌し、これは異化経路を刺激することによってインスリン抵抗性を発生させる（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，２００６；Ｌｕｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｙｅ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ，２０１０；Ｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；それらの全体を本明細書一部として援用する）  。ＴＮＦαは、脂肪細胞において脂肪分解を増加させることが知られているが（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｐｌｏｍｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；それらの全体を本明細書一部として援用する）、エネルギー消費を抑えるように働き得る肥満における抗炎症性応答の証拠ｍ存在する（Ｇｒｅｇｏｒ  ａｎｄ  Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，２０１１；Ｓａｌｔｉｅｌ，２０１２；Ｃａｌａｙ  ａｎｄ  Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，２０１３；Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；それらの全体を本明細書一部として援用する）。本発明の実施形態の開発の際に、細胞培養における肥満脂肪組織の炎症環境をモデル化するためにＴＮＦαを用いて実験が行われ、該サイトカインが、この関係においてβアドレナリン作動性シグナル伝達をも調節するかどうかが決定された。ＴＮＦαでの短期治療は、フォルスコリン処理により産生されたｃＡＭＰの増加を増強したが、この効果は１２時間後には減少した。暴露の２４時間後、ＴＮＦαは、フォルスコリンによって産生される第２メッセンジャーの産生を阻害した（図２）。このように、脂肪細胞における炎症性サイトカインであるＴＮＦαの異化効果は一過性であり、その後は抑制相が続く。
【００５４】
ＴＮＦαを用いた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の２４時間の治療はＩＫＫεの発現を誘導し、またＩＫＫβ及びＮＦκＢ経路の活性に依存した形で、活性部位におけるＴＢＫ１リン酸化を増大させた（Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体を本明細書一部として援用する）。ＴＮＦαでの長期の治療により生じたβアドレナリン感度の抑制が非標準のＩＫＫの活性の増大によるものであるかどうかを決定するために、本発明の実施形態の開発の際に実験が行われた。ＴＮＦαでの長期治療は、β−アドレナリン作動性の刺激に応答してＵｃｐ１遺伝子発現の誘導を抑制した（図２）のに対して、ΙΚΚε・ｍＲＮＡ（Ｉｋｂｋｅ）の発現はアップレギュレートされた。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のＴＮＦαでの２４時間の治療は、イソプロテレノール及びフォルスコリンの両者に応答したグリセロールの放出を、用量依存的に減少させた（図２Ａ）。ＴＮＦαでの処理は、イソプロテレノール及びフォルスコリンで刺激されたｃＡＭＰ産生；選択的であるが構造的に無関係なＩＫＫε及びＴＢＫ１の阻害剤であるアンレキサノクス（図２Ｂ）（Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；その全体を本明細書一部として援用する）またはＣＡＹ１０５７６（図２Ｃ）（Ｂａｍｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；その全体を本明細書一部として援用する）を用いた細胞のプレインキュベーションにより大きく救出される効果を低下させた。ＨＳＬ、ペリリピン、及びＰＫＡ基質モチーフ抗体により認識される他のタンパク質の減少したリン酸化によって明らかにされたように、イソプロテレノールに刺激されたβアドレナリンシグナル伝達はまた、ＴＮＦαに（図２Ｄ）で細胞を処理することにより減少したのに対して、ＩＫＫεの発現は同時にアップレギュレートされ、またＴＢＫ１リン酸化はＴＮＦαでの処理によって増加した。アンレキサノクスでの３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の前処理はまた、抗リン酸化ＰＫＡ基質モチーフ抗体、抗ホスホ−ＨＳＬ、及び抗ホスホペリリピン抗体を用いたウェスタンブロッティングによって決定されたように、イソプロテレノールに刺激されたβアドレナリン作動性シグナル伝達に対するＴＮＦαの阻害効果をブロックした（図２Ｅ）。イソプロテレノールに応答したｐ３８のリン酸化はまた、アンレキサノクスによって用量依存的に且つ劇的に増強された。以前の研究により、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）アゴニストのポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＩＫＫε及びＴＢＫ１の直接の活性化をもたらすことが示された（Ｈｅｍｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；それらの全体を本明細書一部として援用する）。ＴＮＦαと同様に、ポリ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のポリ（Ｉ：Ｃ）での処理は、βアドレナリン刺激に応答したｃＡＭＰ産生、脂肪分解及びリン酸化の刺激を同時に減少させ（図２）、またイソプロテレノール刺激への感受性に対するポリ（Ｉ：Ｃ）の阻害効果は、アンレキサノクスでの前処理によって部分的に修復されたが、ＴＮＦα処理（図２Ｅ）で観察された程度までは復元されなかった（図２Ｅ）。これらの結果は、肥満に関連した炎症がＩＫＫε及びＴＢＫ１の活性化を導き、これがβアドレナリン作動性に対する脂肪細胞の減少した感受性を生じることを示している。
【００５５】
実施例３
ＩＫＫε及びＴＢＫ１は、ＰＤＥ３Ｂの活性化を介してｃＡＭＰレベルを低下させる。
【００５６】
ｃＡＭＰレベルはホスホジエステラーゼによっても調節することができ、これは第二メッセンジャーを切断し、また該プロセスにおいてｃＡＭＰ依存性の信号を減衰させる。ホスホジエステラーゼ３Ｂ（ＰＤＥ３Ｂ）は、脂肪細胞において発現される主要なＰＤＥアイソフォームである（Ｚｍｕｄａ−Ｔｒｚｅｂｉａｔｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；その全体を本明細書一部として援用する）。細胞内及びインビボでのＰＤＥ３Ｂの遺伝子除去または薬理学的阻害により、脂質及びグルコース代謝における酵素の重要な役割が明らかにされた（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｄｅｇｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；それらの全体を本明細書一部として援用する）。脂肪細胞におけるインスリンによるリン酸化及びＰＤＥ３Ｂの活性化は、Ａｋｔによって媒介されると考えられ、またｃＡＭＰ自体は、ＰＤＥ３ＢのＰＫＡ依存的リン酸化及び活性化を促進することにより、自身のレベルの負のフィードバック調節因子として作用する（  Ｄｅｇｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；その全体を本明細書一部として援用する）。
【００５７】
本発明の実施形態の開発の際に行われた実験は、フォルスコリンまたはイソプロテレノールで刺激されたΙＫΚεを過剰発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてｃＡＭＰ産生が損なわれたことを示したので（図１Ｅ）、非正規のＩＫＫが脂肪細胞におけるＰＤＥ３Ｂの増大した活性を介してアドレナリン作動性の刺激を脱感作し得るかどうかを決定するために、追加の実験が行われた。ΙΚΚεまたはＴＢＫ１を発現している３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における、非特異的ホスホジエステラーゼ阻害剤であるＢＭＸでの前処理は、フォルスコリンに応答したｃＡＭＰ産生の十分な刺激を救出した（図３Ａ）。興味深いことに、選択的なＰＤＥ３Ｂ及びＰＤＥ４阻害剤であるザルダベリン（Ｓｃｈｕｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；その全体を本明細書一部として援用する）はまた、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるイソプロテレノール及びフォルスコリンに応答したｃＡＭＰレベルに対するΙΚΚε及びＴＢＫ１過剰発現の阻害効果をブロックし（図３Ｂ）、非標準のＩＫＫの標的としてのＰＤＥ３Ｂの重要な役割を示唆した。
【００５８】
次に、ΙΚΚε及びＴＢＫ１が、ｃＡＭＰレベルを調節するためにＰＤＥ３Ｂを直接リン酸化するかどうかを調べた。組換えのＴＢＫ１、Ａｋｔ及びＰＫＡと、基質としての［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び精製ＰＤＥ３Ｂと共にインビトロでインキュベートした；リン酸化は、オートラジオグラフィーに続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ＴＢＫ１は、ＰＤＥ３Ｂのリン酸化を直接触媒した。以前に報告されたように、リン酸化はまた、Ａｋｔ及びＰＫＡとのインキュベーションによっても生じた（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；それらの全体を本明細書一部として援用する）（図３Ｃ）。ＩＫＫεはまた、インビトロにおいてこのリン酸化を触媒した。ＴＢＫ１、ΙΚΚε及びＰＫＡとのインビトロインキュベーションにより生成されるリン酸化におけるこの増加は、ＰＤＥ３Ｂが１４−３−３結合モチーフを認識する抗体でブロットされたときにも検出された（図３）。精製されたＰＤＥ３Ｂを、同じ量の組換えＴＢＫ１及び標準のＩＫＫベータキナーゼと共にインビトロでインキュベートしたとき、ＰＤＥ３Ｂのリン酸化がかろうじて検出可能であったが、これはＰＤＥ３Ｂが非標準ＩＫＫのより良好な標的であるような特異性レベルを示している（図３）。このリン酸化は、ＡＴＰに関してで、用量依存的であった（図３）。
【００５９】
ΙΚΚεが細胞内でＰＤＥ３Ｂをリン酸化できるかどうかを判断するために、ΙΚΚε及びその不活性な変異体Ｋ３８Ａが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中においてＨＡタグを付されたＰＤＥ３Ｂと共に同時発現させ、続いて抗ＨＡ抗体による免疫沈降（ＩＰ）を行った。細胞内でΙΚΚεを発現させるとＰＤＥ３Ｂの電気泳動移動度シフトが生じたが、ΙΚΚεＫ３８Ａを発現させたときには該シフトは検出されなかった。ＰＤＥ３Ｂのリン酸化は、１４−３−３結合モチーフを認識する抗体を用いたブロッティングにより検出されたのと同様に、ΙΚΚεの発現後にも検出されたが、細胞におけるそのキナーゼ不活性変異体Ｋ３８Ａは検出されなかった。この分子シフトがＰＤＥ３Ｂのリン酸化に依存するかどうかを決定するために、ＨＡ−ＰＤＥ３Ｂを、ΙΚΚε、ＴＢＫ１またはそのキナーゼ不活性変異体と一緒に、ＣＯＳ−１細胞において共発現させ、また免疫沈降物はウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いてまたは用いずに処理された。両方の野生型キナーゼの発現は、ＰＤＥ３Ｂの電気泳動移動度を減少させ、これはホスファターゼでの処理によって逆行することができた（図３Ｄ、レーン３、７をレーン４、８と比較する）。キナーゼ不活性変異体は何れも効果がなかった（図３Ｄ、レーン５、９をレーン６、１０と比較する）。
【００６０】
以前の研究により、ΙΚΚε及びＴＢＫ１は、そのキナーゼドメインに対して近位にあるユビキチン様ドメイン（ＵＬＤ）を含む配列を介して、それらの基質に特異的に結合することが示唆された。このドメインは、ＩΚΚファミリーメンバー間で高度に保存されており、ΙΚΚεとＴＢＫ１間では４９％同一である（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；それらの全体を本明細書一部として援用する）。ＰＤＥ３ＢがΙΚΚε及びＴＢＫ１の真正な基質であることを確認するために、ＧＳＴ−ＵＬＤドメイン融合タンパク質をＴＢＫ１から調製し、この融合タンパク質を３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の溶解物と共にインキュベートした。該融合タンパク質は、内因性ＰＤＥ３Ｂをこれらの溶解物（図３）から特異的に沈殿させた。更に、これら２つのタンパク質の相互作用を調査するために、ＷＴ・ＴＢＫ１及びそのＫ３８Ａ変異体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ付きのＰＤＥ３Ｂと共に共発現させ、また抗ＨＡ抗体を用いて該タンパク質を免疫沈降させた。キナーゼ-不活性ＴＢＫ１は、ＰＤＥ３Ｂと共に優先的に同時免疫沈降したのに対して、ＰＤＥ３ＢのＷＴ・ＴＢＫ１とのｆ互作用はかろうじて検出可能であったに過ぎない（図３）。これらのデータは、ＴＢＫ１及びΙΚΚεはＰＤＥ３Ｂなどの基質と会合し、その後はリン酸化の際に解離することを示している。
【００６１】
１４−３−３βとの相互作用を開始することにおいるＩΚΚε及びＴＢＫ１によるＰＤＥ３Ｂリン酸化の役割を更に試験するために、ＧＳＴ−１４−３−３β融合タンパク質が調製され、これはＰＤＥ３Ｂと共にＴＢＫ１を共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の溶解物と共にインキュベートされた。ＰＤＥ３Ｂは、ＴＢＫ１によるリン酸化の後にＧＳＴ−１４−３−３βによって優先的に解体されたが、その不活性なＫ３８Ａ変異体によっては解体されなかった。これに対して、ＧＳＴビーズ単独では、ＰＤＥ３Ｂまたはそのリン酸化形態の何れをも豊富にしなかった（図３Ｅ）。
【００６２】
実施例４
ΙΚΚε及びＴＢＫ１はセリン３１８においてＰＤＥ３Ｂをリン酸化し、１４−３−３βの結合を生じる。
【００６３】
ΙΚΚε及びＴＢＫ１によるＰＤＥ３Ｂリン酸化の調節的な役割を評価するために、我々は、何れの部位がリン酸化されるかを決定した。ＨＡ−ＰＤＥ３Ｂは、Ｃｏｓ−１細胞内においてΙΚΚε及びＴＢＫ１と共発現され、リン酸化されたＰＤＥ３Ｂは抗ＦＪＡ抗体でＩＰにより濃縮された。次いで、ヒトＰＤＥ３Ｂ上のリン酸化部位がＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析によって決定された。この分析は、セリン２２、２９９、３１８、３８１、４６３、４６７、及び５０３が、両キナーゼによってリン酸化されたことを明らかにした。キナーゼ類の間で相違はなかった（図４Ａ）。興味深いことに、ＰＤＥ３Ｂのリン酸化プロファイルは、既知のＡｋｔまたはＰＫＡプロファイルの何れにも一致しなかった（Ｌｉｎｄｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。しかし、セリン２９９及びセリン３１８におけるリン酸化は、以前に、インスリン及びフォルスコリンの両方に応答した脂肪細胞及び肝細胞におけるマウスＰＤＥ３Ｂ（マウスＰＤＥ３Ｂにおけるセリン２７７及び２９６に相当する残基）について同定された（Ｌｉｎｄｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。幾つかのセリン残基は、刺激に応答してＰＤＥ３Ｂ上でリン酸化されることが知られているが、セリン３１８（ヒト）が最もよく特徴付けされている。この残基は、Ａｋｔ及びＰＫＡの両方のためのコンセンサスリン酸化配列に存在し、また、一旦リン酸化されると、コンセンサス１４−３−３結合モチーフとして働く（Ｌｉｎｄｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。そこで、我々はＰＤＥ３ＢのＳｅｒ３１８Ａｌａ（Ｓ３１８Ａ）変異体を作製し、ＧＳＴ−１４−３−３β融合タンパク質を用いて、またはＧＳＴ−１４−３−３オーバーレイアッセイによって、その相互作用を調べた。興味深いことに、ＴＢＫ１とのインキュベーションにもかかわらず、ＰＤＥ３Ｂのホスホ欠損したＳ３１８Ａ変異体は、ＧＳＴ−１４−３−３Ｐと特異的に相互作用しなかったのに対して、野生型タンパク質は相互作用した（図４Ｂ、Ｃ）。ＧＳＴ破壊アッセイにおいて、ＰＤＥ３Ｂ・Ｓ３１８Ａの分子シフトがウエスタンブロットにより未だ検出され（図４Ｂ）、ＴＢＫ１によるＰＤＥ３Ｂのリン酸化が他の部位において依然として発生したことを示したが、１４−３−３β結合について決定的なものではなかった。
【００６４】
セリン３１８でのＰＤＥ３Ｂのリン酸化の機能的重要性を調べるために、我々は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてＷＴ・ＰＤＥ３Ｂ及びそのＳ３１８Ａ変異体を過剰発現し、ＴＮＦαに対する該細胞の応答を試験した。細胞内でのＷＴ・ＰＤＥ３Ｂの過剰発現は、フォルスコリン刺激されたｃＡＭＰ産生及びＴＮＦαによって生成されるＨＳＬのリン酸化の減衰を低下させたのに対して、ＰＤＥ３Ｂ・Ｓ３１８Ａは無効であった（図４Ｄ、図４−図補充１Ａ，Ｂ）。これらのデータは、ΙＫΚε及びＴＢＫ１は、幾つかの部位においてにＰＤＥ３Ｂをリン酸化することができるが、セリン３１８は、ＰＤＥ３Ｂと１４−３−３βの間の相互作用を促進することによるホスホジエステラーゼ機能の調節において特に重要であることを示唆している。更に重要なことに、この残基は、βアドレナリン作動性刺激に対する脂肪細胞の感度にΙΚΚε及びＴＢＫ１の負の作用を媒介する主要な部位である。
【００６５】
実施例５
ΙΚΚε／ΤΒΚ１阻害剤のアンレキサノクスは、食餌誘導性肥満マウスにおいて白色脂肪組織におけるβアドレナリン作動性アゴニストに刺激された脂肪分解を感作する。
【００６６】
生体内でのエネルギーバランスを維持する上での非標準ＩＫＫの機能的重要性を試験するために、本発明の実施形態の開発に際して、ΙＫΚε及びＴＢＫ１の選択的阻害剤であるアンレキサノクスの投与が、齧歯類における食事誘発性のカテコールアミン抵抗性を逆転させ得るかどうかを調査するために実験が行われた。マウスは高脂肪または通常食を与えられ、強制経口アンレキサノクスで４日間（体重減少が見られている時点以前）それらを処理し、次いでβ３アドレナリン作動性アゴニストＣＬ−３１６，２４３の単回腹腔内（ＩＰ）注射を与えた。ＣＬ−３１６，２４３の注射は、正常給餌（ＮＤ）での担体処理マウス及びアンレキサノクス処理マウスの両方において、血清のＦＡ及びグリセロールのレベルにおいて３倍の増加を刺激した。血清ＦＦＡを増大させるＣＬ−３１６，２４３の効果は、ＨＦＤを給餌された担体処理マウスにおいて顕著に減衰された。しかしながら、アンレキサノクスで処理されたＨＦＤ給餌マウスは、彼らが対照のＨＦＤ給餌マウスと一致した体重であるという事実にもかかわらず、通常食のマウスと同様に応答した（図５Ａ）。血清グリセロールレベルの増加倍数は、ビヒクル処理されたＨＦＤ給餌マウスに比較して、アンレキサノクス処理されたＨＦＤマウスにおいても有意に高かった。加えて、ＨＦＤ上のマウス由来の白色脂肪組織のアンレキサノクスを用いたエクスビボ前処理は、グリセロール放出を高めた（図５Ｂ）。この効果は鼠蹊部脂肪デポーにおいてより顕著であり、ここではアンレキサノクスの前処理が、担体で前処理された組織に比較して、ＨＳＬ、ペリリピン、及びＣＬ−３１６，２４３に応答してＰＫＡ基質モチーフ抗体により認識される他のタンパク質のリン酸化を増大させた（図５Ｃ）。以前に他の阻害剤で報告されたように、アンレキサノクスはまた、フィードバック阻害の軽減によるＳｅｒｌ７２でのＴＢＫ１のリン酸化を同時に増加させた（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００６７】
アンレキサノクスでのＴＢＫ１及びΙＫΚεの阻害が、ｃＡＭＰ産生の刺激を増加させることにより、ｉｎ・ｖｉｖｏでのカテコールアミンに誘導された脂肪分解に対する耐性を逆転するかどうかを調べるために、我々は、ＣＬ−３１６，２４３のＩＰ注射後のＨＦＤ上のマウス由来の副睾丸脂肪組織においてｃＡＭＰレベルを測定した。ｃＡＭＰのレベルは、アンレキサノクスで前処理されたＨＦＤ上のマウスにおいて、ＣＬ−３１６，２４３のＩＰ注射後に増加した（図５Ｄ）。これと一致して、ＨＳＬリン酸化もまた、アンレキサノクスで前処理されたＨＦＤ給仕されたマウスにおいて、ＣＬ−３１６，２４３のＩＰ注射後に増加した（図５Ｅ）。
【００６８】
アンレキサノクスを用いて非標準のＩＫＫをターゲッティングすることにより、肥満脂肪組織におけるカテコールアミン性の阻害が食餌誘導性肥満マウスにおけるエネルギー消費の増加を導くことができるかどうかを調べるために、代謝ケージの中で、ＣＬ−３１６，２４３の単回注射後の担体もしくはアンレキサノクス処理されたＨＦＤ給仕マウスの酸素消費速度を測定した。エネルギー消費を増大させるＣＬ−３１６，２４３の効果は、担体処理されたＨＦＤ給仕マウスに比較して、アンレキサノクス処理されたＨＦＤ給仕マウスにおいてより顕著であった（図５Ｆ）。これらのデータは、選択的阻害剤のアンレキサノクスで非標準ＩＫＫをターゲッティングすることによる肥満脂肪組織におけるカテコールアミン抵抗性が改善されたことを示している。
【図１−１】
2017507930.tif 000006
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月6日(2017.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分（ｉ）：ＩΚＫε及び／またはＴＢＫ１阻害剤、ならびに／或いは
成分（ｉｉ）：ベータアドレナリン作動薬または交感神経系活性化剤、
を含む、肥満、インスリン抵抗性、または肝脂肪症に関連した状態又は症状を有する被験者を治療するための医薬組成物であって、
医薬組成物が成分（ｉ）及び（ｉｉ）のうち、成分（ｉ）のみを含有する場合、医薬組成物は成分（ｉｉ）と一緒に投与されることを特徴とし、
医薬組成物が成分（ｉ）及び（ｉｉ）のうち、成分（ｉｉ）のみを含有する場合、医薬組成物は成分（ｉ）と一緒に投与されることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項２】
前記被験者における体脂肪の減少を引き起こす、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記被験者は肥満、糖尿病またはインスリン抵抗性を有し、またはこれを経験するリスクがある、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記糖尿病はＩＩ型糖尿病である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記治療は増大したグルコース代謝、体脂肪の減少、体脂肪増大の欠如、増大したインスリン受容体シグナリング、減少したレベルのインスリン受容体リン酸化、肝臓における慢性炎症の減少または予防、脂肪組織における慢性炎症の軽減または予防、肝脂肪症の減少または予防、代謝エネルギー消費の促進、循環する遊離脂肪酸の減少、またはコレステロールの減少をもたらす、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記被験者は肝臓脂肪症（脂肪肝疾患）を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記被験者は脂肪性肝炎をも有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記被験者は過体重または肥満である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記被験者はヒトである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記被験者がインスリンシグナル伝達障害、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、肝臓脂肪症、慢性肝炎、及び脂肪組織における慢性炎症からなる群から選択される疾患または状態について試験されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記試験に基づいて治療の有効性が評価されている、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記評価に基づいて前記治療が調節される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記調節が、ΙＫΚε／ΤΒΚ１阻害剤の投与量を変化させること、異なるΙＫΚε／ΤΒΚ１阻害剤に切り替えること、ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性剤の量を変化させること、異なるベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤に切り替えること、または追加の治療を加えることの１以上を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記成分（ｉ）、及び前記成分（ｉｉ）が、単一の医薬組成物中に一緒に処方されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記成分（ｉ）及び前記成分（ｉｉ）が、別々の医薬組成物であり、且つ一緒に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（ｉ）ΙΚΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤、及び（ｉｉ）ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤を含有する医薬組成物。
【請求項１７】
前記ΙＫΚε及び／またはΤΒΚ１阻害剤は小分子を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ΙＫΚε及び／またはΤΒΚ１阻害剤は次式Ｉの構造及びそれらの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項１７に記載の医薬組成物：
【化１】
2017507930.tif 000017
ここで、Ｒ１は水素、アルキル、フェニル、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、またはアミノ基であり、これは非置換であってよく、または一つのアルキルで置換されてよい；ｍは０、１または２である；Ｒ２はアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、またはブタジエニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−）であり、これは何れかの隣接する炭素原子もしくはアミノ基と共にベンゼン環を形成し、これは非置換であってよく、または少なくとも一つのアルキルで置換されてよい。
【請求項１９】
前記ΙＫΚε及び／またはΤΒΚ１阻害剤はアンレキサノクスを含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤が小分子を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ベータアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤がβ２アドレナリン作動性受容体アゴニストを含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記小分子がフェンテルミンである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
（ｉ）ΙΚΚε及び／またはＴＢＫ１阻害剤、及び（ｉｉ）βアドレナリン作動性アゴニストまたは交感神経系活性化剤を具備するキットまたはシステム。
【国際調査報告】
2017507930.tif 000018