(57)【要約】  （ａ）若年ドナー由来のそれら（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して老齢ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ａ−ｉＰＳＣ）は、ゲノム不安定性の増加、アポトーシスの異常、グルコース代謝の異常、および鈍化したＤＮＡ損傷応答を示すこと；ならびに（ｂ）Ａ−ｉＰＳＣと関連すること、および結果としてＤＮＡ損傷応答およびアポトーシスを阻害することが判明した過剰なグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性の阻害は、これらの異常を実質的に救済し、Ａ−ｉＰＳＣの発がん性を低下させるという発見が開示される。例えば４つのＹａｍａｎａｋａのｉＰＳＣ再プログラミング因子の補助としての発現などによる、多能性因子ＺＳＣＡＮ１０（Ａ−ｉＰＳＣでの活性が低く、グルタチオン関連の上流で作用することが示されている）の補充は、Ａ−ｉＰＳＣにおいて、ＧＬＵＴ３の増強およびグルタチオン／Ｈ２Ｏ２のホメオスタシスの正常化を通じてゲノム安定性、ＤＮＡ損傷応答およびアポトーシスの大幅な回復をもたらし；ＧＬＵＴ３（グルタチオンの上流に作用し、Ａ−ｉＰＳＣにおいても活性の低い多能性幹細胞特異的グルコース輸送体）は、同様の効果を有し、特にＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの送達によるグルタチオン／Ｈ２Ｏ２の阻害が臨床的に有用であり、改善された特性および低下した発がん性のＡ−ｉＰＳＣをもたらすことを示す。【選択図】図１Ｇ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、ゲノム安定性およびグルコース代謝の少なくとも１つを改善するための方法であって、前記Ａ−ｉＰＳＣの再プログラミングの補助として、（ｉ）多能性因子ＺＳＣＡＮ１０；（ｉｉ）多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーターＧＬＵＴ３；および（ｉｉｉ）エキソソームサブユニットの少なくとも１つをＡ−ｉＰＳＣに補充して、前記ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、グルコース代謝およびゲノム安定性の少なくとも１つを実質的にＹ−ｉＰＳＣのレベルに近似するレベルに回復させることを含む、方法。
【請求項２】
ＧＰＸ２の過剰発現が、以下の：
Ａ−ｉＰＳＣを多能性因子ＺＳＣＡＮ１０で補充すること；および／または
Ａ−ｉＰＳＣに多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーター３であるＧＬＵＴ３を補充すること；および
Ａ−ｉＰＳＣをエキソソームサブユニットで補充すること
の少なくとも１つによって阻害され、
前記補充は再プログラミング多能性因子を補助するものであり、かつ前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＤＮＡ損傷応答、アポトーシスおよびゲノム安定性の１つまたはそれ以上において完全なまたは部分的な救出を達成するのに有効な量である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣが維持されている培地にＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットを添加することによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記補充が、前記細胞において、ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの発現を増加させることによって実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットのレベルを胚性幹細胞（ＥＳＣ）のそれらのレベルの約５０％またはそれ以上に回復させるのに十分である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をＥＳＣの約８０％〜約１２０％の範囲内に低下させるのに十分である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのゲノム安定性をほぼＹ−ｉＰＳＣのゲノム安定性にまで回復させるのに十分である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ゲノム安定性が、異数性クローンの発生によって測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのアポトーシス率をほぼＹ−ｉＰＳＣのアポトーシス率に回復させるのに十分である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記アポトーシス率が、ＤＮＡ損傷剤に応答するＤＮＡ断片化アッセイによって測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答をほぼＹ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答に回復させるのに十分である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ損傷応答が、ＤＮＡ損傷剤に応答するＡＴＭまたはＨ２ＡＸのリン酸化によって測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をほぼＹ−ｉＰＳＣの酸化能に低下させるのに十分である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２レベルをおおよそＹ−ｉＰＳＣレベルまで低下させるのに十分である、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞におけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの発現が、前記細胞を、前記ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの核酸を含むベクターでトランスフェクトすることによって増加する、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＺＳＣＡＮ１０をコードする核酸を含むベクターの発現が一過性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させる方法であって、前記細胞がゲノム不安定性、アポトーシスの異常、ＤＮＡ損傷応答の異常およびグルコース代謝における異常の１つまたはそれ以上を有し、かつ胚性幹細胞または若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して、過剰のグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、前記方法が、
前記ｉＰＳＣにおけるグルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）の過剰発現を直接的および／または間接的に阻害することにより、前記におけるグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を阻害して前記ｉＰＳＣにおけるホメオスタシスを部分的にまたは完全に回復させることを含む、方法。
【請求項１８】
老齢ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ａ−ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させる方法であって、前記Ａ−ｉＰＳＣが、若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して過剰のグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、前記方法が
前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）の過剰発現を直接的および／または間接的に阻害することにより前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を阻害して前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオン／Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスを部分的または完全に回復させることを含む、方法。
【請求項１９】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させる方法であって、
前記細胞がゲノム不安定性、アポトーシスの異常、ＤＮＡ損傷応答の異常およびグルコース代謝の異常の１つまたはそれ以上を有し、かつ胚性幹細胞または若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して過剰なグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、
前記方法が、（ｉ）多能性因子ＺＳＣＡＮ１０；（ｉｉ）多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーターＧＬＵＴ３；および（ｉｉｉ）エキソソームサブユニットの少なくとも１つをＡ−ｉＰＳＣに補充することを含み、それぞれが再プログラミングの補助としてのものであり、前記ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、グルコース代謝およびゲノム安定性の少なくとも１つを実質的にＹ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣのレベルに実質的に同一のレベルに回復させる、方法。
【請求項２０】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣが維持されている培地にＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットを添加することによって行われる、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記補充が、前記細胞において、ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３の発現を増加させることによって実施される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットのレベルを胚性幹細胞（ＥＳＣ）のそれらのレベルの約５０％またはそれ以上に回復させるのに十分である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をＥＳＣの約８０％〜約１２０％の範囲内に低下させるのに十分である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのゲノム安定性をほぼＹ−ｉＰＳＣのゲノム安定性にまで回復させるのに十分である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２５】
ゲノム安定性が、異数性クローンの発生によって測定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのアポトーシス率をほぼＹ−ｉＰＳＣのアポトーシス率に回復させるのに十分である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記アポトーシス率が、ＤＮＡ損傷剤に応答するＤＮＡ断片化アッセイによって測定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答をほぼＹ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答に回復させるのに十分である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記再プログラミング因子がＹａｍａｎａｋａ因子であるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣである、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
前記再プログラミング多能性因子が、Ｙａｍａｎａｋａのそれらの群より選択され、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣの１つまたはそれ以上が以下のように置換されている、請求項２に記載の方法。
【請求項３１】
因子（ＬＩＮ２８＋Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｐａｘ５ｓｈＲＮＡ、Ｃ／ＥＢＰａ、ｐ５３．ｓｉＲＮＡ、ＵＴＦ１、ＤＮＭＴｓｈＲＮＡ、Ｗｎｔ３ａ、ＳＶ４０ＬＴ（Ｔ）、ｈＴＥＲＴ）または化合物（ＢＩＸ−０１２９４、ＢａｙＫ８６４４、ＲＧ１０８、ＡＺＡ、デキサメタゾン、ＶＰＡ、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＰＤ０２５９０１＋ＣＨＩＲ９９０２１（２ｉ）、Ａ−８３−０１）。
【請求項３２】
前記再プログラミング多能性因子が、Ｙａｍａｎａｋａのそれらの群より選択され、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣの１つまたはそれ以上が以下の：ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８がＫｌｆ４およびＭＹＣと置換される；ｅｓｒｂがＫｌｆ４と置換される；ＳＶ４０  ＬＴ（Ｔ）がＫｌｆ４、ＭＹＣ、ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇと置換される；ＢＩＸ−０１２９４がＳＯＸ２およびＯＣＴ４と置換される；ＶＰＡがＫｌｆ４およびＭＹＣと置換される、のように置換されている、請求項２に記載の方法。
【請求項３３】
前記補充が、エキソソームサブユニットによって行われ、エキソソームサブユニットが、以下のＥＸＯＳＣ１、ＥＸＯＳＣ２、ＥＸＯＳＣ３、ＥＸＯＳＣ４、ＥＸＯＳＣ５、ＥＸＯＳＣ６、ＥＸＯＳＣ７、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＯＳＣ９、ＥＸＯＳＣ１０およびｈＤｉｓ３の１つまたはそれ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記補充が、Ａ−ｉＰＳＣへのＤＮＡ遺伝子送達によって、またはＲＮＡ送達によって、またはタンパク質の送達によって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
老齢ドナーの体細胞由来のｉＰＳＣであって、前記ｉＰＳＣが、健康な若年ドナー由来のｉＰＳＣまたは胚性幹細胞に匹敵するレベルでＺＳＣＡＮ１０を発現するよう操作されている、ｉＰＳＣ。
【請求項３６】
体細胞由来のｉＰＳＣであって、前記ｉＰＳＣが、Ｙ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣの対照と比較して（ｉ）減少したＺＳＣＡＮ１０発現レベル、（ｉｉ）（例えば、減少したＤＮＡ損傷応答、減少したアポトーシス応答、ゲノム不安定性および減少したグルコース代謝によって測定されるような）増加した発がん性、（ｉｉｉ）低下したＧＬＵＴ３発現レベル、（ｉｖ）低下したエキソソームサブユニットレベル、および（ｖ）増加したＧＰＸ２発現レベルまたは増加したＧＳＳ発現レベル、の１つまたはそれ以上を元々示し、
前記ｉＰＳＣにＺＳＣＡＮ１０が補充されて前記対照に見られるようなレベルに匹敵するレベルにまで、前記１つまたはそれ以上の減少または増加したレベルが回復している、ｉＰＳＣ。
【請求項３７】
体細胞由来のｉＰＳＣであって、前記ｉＰＳＣが、ＺＳＣＡＮ１０の補充の非存在下において、ＺＳＣＡＮ１０発現が欠乏しており、ＺＳＣＡＮ１０をまったく発現しないか、または健康な若年ドナーまたは胚由来のｉＰＳＣの対照よりも実質的に低いレベルのＺＳＣＡＮ１０を発現し、前記ｉＰＳＣが、健康な若年ドナーまたは胚由来のｉＰＳＣのレベルに匹敵するレベルのＺＳＣＡＮ１０を発現するように操作されている、ｉＰＳＣ。
【請求項３８】
（ｉ）幹細胞再プログラミング因子および（ｉｉ）ＺＳＣＡＮ１０をコードする核酸を含むベクターまたはベクターのセット。
【請求項３９】
前記ＺＳＣＡＮ１０の核酸を含むベクターが、再プログラミング因子の核酸を含む単数のベクターまたは複数のベクターとは別のベクターである、請求項３８に記載のベクターのセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、以下の、３つの米国仮特許出願、２０１４年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６２／０６０，５３２号、ならびに２０１５年２月２６日に出願された、米国仮特許出願第６２／１２１，４６０および米国仮特許出願第６２／１２１／４６３号に対する優先権を主張する。各出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府に支援された研究または開発
本開示に記載される研究は、部分的に、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の５Ｒ００ＨＬ０９３２１２−０４、ならびにＰ３０  ＣＡ００８７４８およびＲ０１  ５Ｒ０１ＡＧ０４３５３１−０２からのグラントによって資金提供された。米国政府は、本開示について一定の権利を有する可能性がある。
【０００３】
配列表
本願は、「７７０４−００２１−ＰＣＴ＿ＳＴ２５［３］＿．ｔｘｔ」と題し、１３３．７ｋｂのサイズを持つ、アスキー形式のテキストファイルとして電子形式の配列表を含む。このテキストファイルの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
発明の背景
本開示の技術分野
本開示は、誘導多能性幹細胞の改善に関し、より詳細には、発がん性の低下および／または改善されたアポトーシス応答、および／または改善されたＤＮＡ損傷応答および／または改善されたゲノム安定性を有する誘導多能性幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００５】
関連技術の説明
例えば、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ１を用いた体細胞の直接的な再プログラミング（Ｙａｍａｎａｋａプロトコールとしても知られている）は、胚性幹細胞と酷似する誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をもたらす（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６、２００６）。ｉＰＳＣを作出するための他のプロトコールもまた知られ、例えばＧｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：２３１−２４２（２０１１年４月１日）に記載される。ＥＳ細胞と同様に、ｉＰＳＣは奇形腫、すなわち３つの胚性胚葉全てに由来する組織を有する分化した腫瘍を形成し、マウス胚盤胞に注入されるとすべての組織に寄与する。
【０００６】
いくつかの障害に対する患者特異的ｉＰＳＣの誘導が報告されている（Ｐａｒｔら、Ｃｅｌｌ  １３４：８７７−８６、２００８年；Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：１２１８−２１、２００８年）。ｉＰＳＣの開発は、患者由来のｉＰＳＣおよび指向性の分化方法を用いる疾患モデル研究の機会を提供する。ｉＰＳＣの大きな恩恵を受けることができるその他の分野には、医薬品開発と薬物スクリーニングがある。最後に、ｉＰＳＣが多能性においてＥＳＣに似ているが、ＥＳＣに基づく治療法に関連する組織非適合性の問題を回避することを考慮すると、ｉＰＳＣは、患者自身の体細胞を用いて組織適合性の移植可能組織を作製するという大きな可能性を秘めている。
【０００７】
全米臓器配分ネットワーク（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｈａｒｉｎｇ：ＵＮＯＳ）によると、現在、約１２万人のアメリカ人が臓器移植を受けるのを待っているが、２０１３年の１月から１０月には２４，０００回の移植しか行われていない。ＵＮＯＳは、少数のドナーからの免疫的に適合する臓器を待つ間に１８人の患者が毎日死亡すると推定している。
【０００８】
ｉＰＳＣはさまざまな方法において有用である。第１に、研究ツールとして、それらは遺伝子機能を組織形成へと結びつけるような他では不可能である実験を可能にする。第２に、ｉＰＣＳは、異なる組織および臓器のヒト細胞へと分化できるため、それらは、スクリーニングおよび毒性試験の両方を含む創薬および開発に対する新しい方法を提供する。しかしながら、ｉＰＣＳのもっとも重要な用途は、高齢者集団に関連する制限を含まない、生着、欠損または無機能の臓器および組織の置換、ならびに退行性疾患の治療のための臓器および組織の作製である。
【０００９】
ｉＰＳＣは大きなチャンスを提供するが、臨床現場での応用に関連する多くの未踏の問題や障害が未だ存在する。例えば、異なる組織は、再プログラミングに対する変動しやすい感受性を示す（Ｍａｈｅｒａｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：３４０−３４５、２００８年；Ａｏｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：６９９−７０２、２００９年）。さらに、最近の研究は、ｉＰＳＣが、使用されたドナー組織の組織型に依存する、残存するエピジェネティックな特徴を有すること（Ｋｉｍら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９（１２）：１１１７−１１１９、２０１１年）、および老齢ドナーからのｉＰＳＣ（Ａ−  ｉＰＳＣ）は、加齢に特異的なエピジェネティックな記憶を保持していること（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６７（７３１３）：２８５−２９０、２０１０年）を示してきた。さらに、Ｙａｍａｎａｋａおよび他の者が、若年ドナー組織を用いたｉＰＳＣ（Ｙ−ｉＰＳＣ）を作製するために必要な４個のｉＰＳＣ再プログラミング因子を同定する一方で、同一の４個の因子が老齢ドナー組織由来のｉＰＳＣ（Ａ−ｉＰＳＣ）を再プログラミングするのに十分であるかどうかは不明である。
【００１０】
Ｐｒｉｇｉｏｎｅ，Ａ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１；６（１１）：ｅ２７３５２、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２７３５２はまた、実験においてはアポトーシスに対する抵抗性を見出さなかったが、ヒト由来の老齢のｉＰＳＣにおける核型異常の存在を報告した。これらの研究者らは、細胞死（アポトーシス）そのものとは対照的であるアポトーシス過程にある細胞の指標である微小核形成を測定した。また、すでに死亡した細胞の検出をしない乳酸デヒドロゲナーゼを標準化のために使用した。最後に、ＤＮＡ損傷と測定との間の時間間隔が長すぎる可能性がある。それにもかかわらず、これらの著者はまた、老齢の体細胞のゲノム安定性を保存する再プログラミングプロトコールを開発することの重要性も強調した。
【００１１】
老齢患者は、組織再生ならびに異種移植および自家移植の両方におけるｉＰＳＣの臨床応用の恩恵を受ける可能性が高く、そしてｉＰＳＣは、黄斑変性症およびパーキンソン病のような多くの加齢関連退行性疾患の臨床試験において既に研究されているため、分化および移植の際の品質および結果としてのその機能を改善するために、Ａ−ｉＰＳＣを包括的に評価すること、およびこれらの細胞における加齢の負の影響を逆転させる方法を決定することに重要な必要性が存在する。
【００１２】
ｉＰＳＣの認識されている欠点の１つは、潜在的な発がん性であった。これは、それらを作製するためにがん遺伝子を使用すること、および場合によるとウイルスに基づくベクターの組み込みの使用に起因すると様々に推定されている。結果として、がん遺伝子の使用または組み込みを回避し、ウイルスベクターの使用を回避する努力がなされてきた。例えば、ＭＹＣを伴わない再プログラミングのためのＮａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００８年１月、２６（１）：１０１−６を参照されたい。他の研究者らはｉＰＳＣを作製するためにセンダイウイルスのような非組換え型ウイルスに目を向けている。Ｃｈｅｎ  ＩＰら（２０１３）の、頭蓋骨幹端異形成を有する患者の末梢血からの非組換え型センダイウイルスベクターによる誘導多能性幹細胞再プログラミング、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ．２０１３年１２月；１５（６）：５０３−１３、さらに、Ｌｉｅｕ  ＰＴら（２０１３）の、非組換え型センダイウイルスであるＣｙｔｏＴｕｎｅを用いる誘導多能性幹細胞の作製、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０１３年；９９７：４５−５６（血球または線維芽細胞由来）。さらに他の者は、ＲＮＡに基づく（ベクター不使用）の方法を使用し、この目的のためのツール（Ｂ１８Ｒタンパク質など）は、市販されている。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｃｅｎｔｅｒ／ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ／ｉｎｄｕｃｅｄ−ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌｓ．ｈｔｍ＃ｂｅｎｅｆｉｔｓ％２０ｏｆ％２０ｒｎａ、またはＷａｒｒｅｎ，Ｌ．らの、メッセンジャーＲＮＡによるヒト誘導多能性幹細胞のフィーダー不使用の誘導、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ、２：＃６５７（２０１２年９月１４日）を参照されたい。さらに他の者はタンパク質を用いた。Ｋｉｍ，Ｄ．らの、再プログラミングタンパク質の直接送達によるヒト誘導多能性幹細胞の作製、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２００９年６月５日；４（６）：４７２−６。しかしながら、これらの方法は、低い再プログラミング効率に悩まされる一方で、発がん性が持続する可能性がある。さらに、従前の再プログラミングの試みは、発がん性を考慮する際に、ドナー細胞の年齢を考慮しなかった。また、再プログラミングプロトコールを補助するものとして追加の因子を使用するという提案もまったくなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様において、本開示は、Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、ゲノム安定性およびグルコース代謝の少なくとも１つを改善する方法を提供し、この方法は、前記Ａ−ｉＰＳＣの再プログラミングの補助として、（ｉ）多能性因子ＺＳＣＡＮ１０；（ｉｉ）多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーターＧＬＵＴ３；および（ｉｉｉ）エキソソームサブユニットの少なくとも１つをＡ−ｉＰＳＣに補充して前記ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、グルコース代謝およびゲノム安定性の少なくとも１つを実質的にＹ−ｉＰＳＣのレベルに近似するレベルに回復させることを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＧＳＳまたはＧＰＸ２の過剰発現は、以下の：Ａ−ｉＰＳＣに多能性因子ＺＳＣＡＮ１０を補充すること；および／またはＡ−ｉＰＳＣに多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーター３、ＧＬＵＴ３を補充すること；ならびにＡ−ｉＰＳＣにエキソソームサブユニットを補充することの少なくとも１つによって阻害され、当該補充が再プログラミング多能性因子を補助するものであり、かつ前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＤＮＡ損傷応答、アポトーシス、およびゲノム安定性の１つまたはそれ以上における全部または部分的な救済を達成するのに有効な量である。
【００１５】
別の態様において、本開示は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させる方法を提供し、前記細胞はゲノム不安定性、アポトーシスの異常、ＤＮＡ損傷応答の異常およびグルコース代謝の異常の１つまたはそれ以上を有し、かつ胚性幹細胞または若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して、過剰なグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、前記方法は、前記ｉＰＳＣにおけるグルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）の過剰発現を直接的および／または間接的に阻害することによって前記ｉＰＳＣにおけるグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を阻害して、前記ｉＰＳＣにおいて部分的または完全にホメオスタシスを回復することを含む。
【００１６】
さらに別の態様において、本開示は、老齢ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ａ−ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させる方法を提供し、前記Ａ−ｉＰＳＣは、若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して、過剰なグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、前記方法は、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）の過剰発現を直接的および／または間接的に阻害することによって前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を阻害して、前記Ａ−ｉＰＳＣにおいて部分的または完全にグルタチオン／Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスを回復することを含む。
【００１７】
さらに別の態様において、本開示は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させる方法を提供し、前記細胞がゲノム不安定性、アポトーシスの異常、ＤＮＡ損傷応答の異常およびグルコース代謝の異常のうちの１つまたはそれ以上を有し、かつ胚性幹細胞または若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して、過剰なグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、前記方法が、（ｉ）多能性因子ＺＳＣＡＮ１０；（ｉｉ）多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーターＧＬＵＴ３；および（ｉｉｉ）エキソソームサブユニットの少なくとも１つをＡ−ｉＰＳＣに補充することを含み、それぞれが再プログラミングの補助としてのものであり、前記ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、グルコース代謝およびゲノム安定性の少なくとも１つを実質的にＹ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣのレベルに実質的に同じレベルに回復させる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、補充は、前記Ａ−ｉＰＳＣが維持されている培地にＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットを添加することによって実施される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、補充は、前記細胞においてＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの発現を増加させることによって実施される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、補充は、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットのレベルを、胚性幹細胞（ＥＳＣ）のそれぞれのレベルの約５０％またはそれ以上に回復させるのに十分である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、補給は、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をＥＳＣの約８０％〜約１２０％の範囲内に低下させるのに十分である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記補充は、前記Ａ−ｉＰＳＣのゲノム安定性をＹ−ｉＰＳＣのゲノム安定性とほぼ同じに回復させるのに十分である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ゲノム安定性は、異数性クローンの発生によって測定される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、アポトーシス率は、ＤＮＡ損傷剤に応答するＤＮＡ断片化アッセイによって測定される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ損傷応答は、ＤＮＡ損傷剤に応答するＡＴＭまたはＨ２ＡＸのリン酸化によって測定される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、補充は、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をＹ−ｉＰＳＣの酸化能とほぼ同じに低下させるのに十分である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、補充は、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳまたはＧＰＸ２のレベルをＹ−ｉＰＳＣのそれらのレベルとほぼ同じに低下させるのに十分である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、前記細胞におけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの発現は、前記細胞を前記ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの核酸を含むベクターによってトランスフェクトすることによって増加する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＺＳＣＡＮ１０をコードする核酸を含む前記ベクターの発現は一過性である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、再プログラミング因子は、Ｙａｍａｎａｋａ因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、再プログラミング多能性因子は、Ｙａｍａｎａｋａ因子の群より選択され、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣの１つまたはそれ以上が以下の：因子（ＬＩＮ２８＋Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｐａｘ５ｓｈＲＮＡ、Ｃ／ＥＢＰａ、ｐ５３．ｓｉＲＮＡ、ＵＴＦ１、ＤＮＭＴｓｈＲＮＡ、Ｗｎｔ３ａ、ＳＶ４０ＬＴ（Ｔ）、ｈＴＥＲＴ）または化合物（ＢＩＸ−０１２９４、ＢａｙＫ８６４４、ＲＧ１０８、ＡＺＡ、デキサメタゾン、ＶＰＡ、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＰＤ０２５９０１＋ＣＨＩＲ９９０２１（２ｉ）、Ａ−８３−０１）のように置換されている。
【００３２】
いくつかの実施形態において、再プログラミング多能性因子は、Ｙａｍａｎａｋａ因子の群より選択され、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣの１つまたはそれ以上が以下の：ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８がＫｌｆ４およびＭＹＣと置換される；ｅｓｒｂがＫｌｆ４と置換される；ＳＶ４０  ＬＴ（Ｔ）がＫｌｆ４、ＭＹＣ、ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇと置換される；ＢＩＸ−０１２９４がＳＯＸ２およびＯＣＴ４と置換される；ＶＰＡがＫｌｆ４およびＭＹＣと置換される、のように置換されている。
【００３３】
いくつかの実施形態において、補充はエキソソームサブユニットによって行われ、エキソソームサブユニットは、以下のＥＸＯＳＣ１、ＥＸＯＳＣ２、ＥＸＯＳＣ３、ＥＸＯＳＣ４、ＥＸＯＳＣ５、ＥＸＯＳＣ６、ＥＸＯＳＣ７、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＯＳＣ９、ＥＸＯＳＣ１０およびｈＤｉｓ３の１つまたはそれ以上である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、補充は、Ａ−ｉＰＳＣへのＤＮＡ遺伝子導入、またはＲＮＡ送達、またはタンパク質の送達による。
【００３５】
別の態様において、本開示は、健康な若年ドナー由来のｉＰＳＣに匹敵するレベルでＺＳＣＡＮ１０を発現するように操作された、老齢ドナーの体細胞に由来するｉＰＳＣを提供する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、（ｉ）幹細胞再プログラミング因子および（ｉｉ）ＺＳＣＡＮ１０をコードする核酸を含む１つまたはそれ以上のベクターを含む。
【００３７】
したがって、本明細書に記載された研究の結果として、既存のプロトコールを用いる再プログラミングがＺＳＣＡＮ１０、ＧＬＵＴ３またはエキソソームサブユニットにおいて不十分である場合、ＺＳＣＡＮ１０は、独占的にというわけではないが特に老齢ドナーの体細胞由来の誘導多能性幹細胞を作製するための再プログラミングプロトコールにおける、主要な共調節因子として明らかになってきた。
【００３８】
したがって、別の態様において、本開示は体細胞由来のｉＰＳＣを提供し、当該ｉＰＳＣはＺＳＣＡＮ１０補充の非存在下でＺＳＣＡＮ１０発現を欠損し、ＺＳＣＡＮ１０を全く発現しないか、または対照の健康な若年ドナー由来のｉＰＳＣより実質的に低いレベルのＺＳＣＡＮ１０を発現し、当該ｉＰＳＣは、健康な若年ドナー由来のｉＰＳＣのレベルに匹敵するＺＳＣＡＮ１０レベルを発現するように操作されている。
【００３９】
関連する態様において、本開示は、体細胞由来のｉＰＳＣを対象とし、前記ｉＰＳＣは、Ｙ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣの対照と比較して、（ｉ）減少したＺＳＣＡＮ１０発現レベル、（ｉｉ）増加した発がん性（例えば、減少したＤＮＡ損傷応答、減少したアポトーシス応答、ゲノム不安定性および減少したグルコース代謝によって測定される）、（ｉｉｉ）減少したＧＬＵＴ３発現レベル、（ｉｖ）減少したエキソソームサブユニットレベル、および（ｖ）増加したＧＰＸ２または増加したＧＳＳの発現レベル、の１つまたはそれ以上を元々示し、当該ｉＰＳＣは、ＺＳＣＡＮ１０が補充されて、前記１つまたはそれ以上の減少または増加したレベルを、前記対照において見られるようなレベルに実質的に近いレベルに回復させられている。
【００４０】
別の態様において、本開示は、（ｉ）再プログラミング多能性因子、および（ｉｉ）ＺＳＣＡＮ１０をコードする核酸を含むベクターまたはベクターのセットを対象とする。より詳細な実施形態において、本開示は、請求項３８によるベクターのセットに関し、ＺＳＣＡＮ１０核酸を含むベクターは、再プログラミング因子核酸を含む単数のベクターまたは複数のベクターとは別のベクターである。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本開示は、ｉＰＳＣの品質を評価する方法であって、ＺＳＣＡＮ１０、ＧＬＵＴ３、エキソソームサブユニット（コアエキソソームサブユニットなど）、ＧＰＸ２およびＧＳＳの群より選択される１つまたはそれ以上のタンパク質の発現レベルを測定または試験することを含み、かつ測定または試験された発現レベルを、同じタンパク質のＹ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣにおける対照の発現レベルと比較し、測定または試験された発現レベルが対照の発現レベルと実質的に同様であるかどうかに基づいて前記品質を決定することを含む方法を対象とする。より具体的な実施形態において、評価される品質は、発がん性またはグルタチオン／過酸化水素ホメオスタシスの１つまたはそれ以上である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】ＥＳＣ（図１Ａ）、Ｙ−ｉＰＳＣ（図１Ｂ）、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０（図１Ｃ）およびＡ−ｉＰＳＣ（図１Ｄおよび図１Ｅ）の染色体図を示す。図１Ｆは、Ａ−ｉＰＳＣの複数の独立したクローンにおける倍数性のより高い頻度、およびＺＳＣＡＮ１０発現による倍数性異常の救済を示す棒グラフである。ＤＮＡ含量は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、次いで複数の独立したクローンのフローサイトメトリー解析によって推定した。解析されたクローンの数は各群に示されている。統計的有意性はカイ２乗検定によって決定した。図１Ｇは、各Ａ−ｉＰＳＣクローンにおける細胞遺伝学的解析によって観察された染色体構造異常の数、およびＺＳＣＡＮ１０発現による救済のドットプロットである。エラーバーは、群ごとに解析された４個の独立したクローンの平均の標準誤差を示す。解析した分裂中期の総数を各群に示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図１Ｂ】ＥＳＣ（図１Ａ）、Ｙ−ｉＰＳＣ（図１Ｂ）、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０（図１Ｃ）およびＡ−ｉＰＳＣ（図１Ｄおよび図１Ｅ）の染色体図を示す。図１Ｆは、Ａ−ｉＰＳＣの複数の独立したクローンにおける倍数性のより高い頻度、およびＺＳＣＡＮ１０発現による倍数性異常の救済を示す棒グラフである。ＤＮＡ含量は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、次いで複数の独立したクローンのフローサイトメトリー解析によって推定した。解析されたクローンの数は各群に示されている。統計的有意性はカイ２乗検定によって決定した。図１Ｇは、各Ａ−ｉＰＳＣクローンにおける細胞遺伝学的解析によって観察された染色体構造異常の数、およびＺＳＣＡＮ１０発現による救済のドットプロットである。エラーバーは、群ごとに解析された４個の独立したクローンの平均の標準誤差を示す。解析した分裂中期の総数を各群に示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図１Ｃ】ＥＳＣ（図１Ａ）、Ｙ−ｉＰＳＣ（図１Ｂ）、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０（図１Ｃ）およびＡ−ｉＰＳＣ（図１Ｄおよび図１Ｅ）の染色体図を示す。図１Ｆは、Ａ−ｉＰＳＣの複数の独立したクローンにおける倍数性のより高い頻度、およびＺＳＣＡＮ１０発現による倍数性異常の救済を示す棒グラフである。ＤＮＡ含量は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、次いで複数の独立したクローンのフローサイトメトリー解析によって推定した。解析されたクローンの数は各群に示されている。統計的有意性はカイ２乗検定によって決定した。図１Ｇは、各Ａ−ｉＰＳＣクローンにおける細胞遺伝学的解析によって観察された染色体構造異常の数、およびＺＳＣＡＮ１０発現による救済のドットプロットである。エラーバーは、群ごとに解析された４個の独立したクローンの平均の標準誤差を示す。解析した分裂中期の総数を各群に示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図１Ｄ】ＥＳＣ（図１Ａ）、Ｙ−ｉＰＳＣ（図１Ｂ）、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０（図１Ｃ）およびＡ−ｉＰＳＣ（図１Ｄおよび図１Ｅ）の染色体図を示す。図１Ｆは、Ａ−ｉＰＳＣの複数の独立したクローンにおける倍数性のより高い頻度、およびＺＳＣＡＮ１０発現による倍数性異常の救済を示す棒グラフである。ＤＮＡ含量は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、次いで複数の独立したクローンのフローサイトメトリー解析によって推定した。解析されたクローンの数は各群に示されている。統計的有意性はカイ２乗検定によって決定した。図１Ｇは、各Ａ−ｉＰＳＣクローンにおける細胞遺伝学的解析によって観察された染色体構造異常の数、およびＺＳＣＡＮ１０発現による救済のドットプロットである。エラーバーは、群ごとに解析された４個の独立したクローンの平均の標準誤差を示す。解析した分裂中期の総数を各群に示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図１Ｅ】ＥＳＣ（図１Ａ）、Ｙ−ｉＰＳＣ（図１Ｂ）、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０（図１Ｃ）およびＡ−ｉＰＳＣ（図１Ｄおよび図１Ｅ）の染色体図を示す。図１Ｆは、Ａ−ｉＰＳＣの複数の独立したクローンにおける倍数性のより高い頻度、およびＺＳＣＡＮ１０発現による倍数性異常の救済を示す棒グラフである。ＤＮＡ含量は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、次いで複数の独立したクローンのフローサイトメトリー解析によって推定した。解析されたクローンの数は各群に示されている。統計的有意性はカイ２乗検定によって決定した。図１Ｇは、各Ａ−ｉＰＳＣクローンにおける細胞遺伝学的解析によって観察された染色体構造異常の数、およびＺＳＣＡＮ１０発現による救済のドットプロットである。エラーバーは、群ごとに解析された４個の独立したクローンの平均の標準誤差を示す。解析した分裂中期の総数を各群に示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図１Ｆ】ＥＳＣ（図１Ａ）、Ｙ−ｉＰＳＣ（図１Ｂ）、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０（図１Ｃ）およびＡ−ｉＰＳＣ（図１Ｄおよび図１Ｅ）の染色体図を示す。図１Ｆは、Ａ−ｉＰＳＣの複数の独立したクローンにおける倍数性のより高い頻度、およびＺＳＣＡＮ１０発現による倍数性異常の救済を示す棒グラフである。ＤＮＡ含量は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、次いで複数の独立したクローンのフローサイトメトリー解析によって推定した。解析されたクローンの数は各群に示されている。統計的有意性はカイ２乗検定によって決定した。図１Ｇは、各Ａ−ｉＰＳＣクローンにおける細胞遺伝学的解析によって観察された染色体構造異常の数、およびＺＳＣＡＮ１０発現による救済のドットプロットである。エラーバーは、群ごとに解析された４個の独立したクローンの平均の標準誤差を示す。解析した分裂中期の総数を各群に示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図１Ｇ】ＥＳＣ（図１Ａ）、Ｙ−ｉＰＳＣ（図１Ｂ）、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０（図１Ｃ）およびＡ−ｉＰＳＣ（図１Ｄおよび図１Ｅ）の染色体図を示す。図１Ｆは、Ａ−ｉＰＳＣの複数の独立したクローンにおける倍数性のより高い頻度、およびＺＳＣＡＮ１０発現による倍数性異常の救済を示す棒グラフである。ＤＮＡ含量は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、次いで複数の独立したクローンのフローサイトメトリー解析によって推定した。解析されたクローンの数は各群に示されている。統計的有意性はカイ２乗検定によって決定した。図１Ｇは、各Ａ−ｉＰＳＣクローンにおける細胞遺伝学的解析によって観察された染色体構造異常の数、およびＺＳＣＡＮ１０発現による救済のドットプロットである。エラーバーは、群ごとに解析された４個の独立したクローンの平均の標準誤差を示す。解析した分裂中期の総数を各群に示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図２】ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣおよびＺＳＣＡＮ１０発現による回復（Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０）におけるフレオマイシン処理（３０μｇ／ｍｌ、２時間）後のＤＮＡ断片化アッセイによる低アポトーシス応答の画像定量を示すドットプロットである。エラーバーは、技術的および生物学的な反復の平均の標準誤差を示す。生物学的反復の正確な数を各群の下に示す。
【図３】ＺＳＣＡＮ１０を同定するために使用された方法の概略図である。最初に、多能性ネットワーク解析から得られた５９個のコア多能性遺伝子を、ｐ５３、ＳＩＲＴ１、ＰＬＫ１、およびｐ５３の上流の遺伝子（ＡＴＭ、ＰＡＲＰ、およびＤＮＡＰＫ）などのＤＮＡ損傷応答と関連することが知られている遺伝子に対してフィルタリングした。次いで、遺伝子リストをＡ−ｉＰＳＣ対Ｙ−ｉＰＳＣ／ＥＳＣの差異的発現に基づいてフィルタリングし、候補を単一遺伝子ＺＳＣＡＮ１０にまで絞り込んだ。
【図４】Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０発現の乏しい活性化およびＺＳＣＡＮ１０の一過性発現による完全な再活性化を示す棒グラフである。内在性ＺＳＣＡＮ１０のｍＲＮＡレベルは、ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、およびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０におけるＱ−ＰＣＲによって決定した。内在性ＺＳＣＡＮ１０レベルをβ−アクチンに対して標準化した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図５Ａ】ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較した、Ａ−ｉＰＳＣにおける突然変異誘発頻度の増加を示す棒グラフである。突然変異の頻度は、６−チオグアニン媒介ネガティブ選択の存在下でのＨＰＲＴプロモーター活性の不活性化によって推定され、Ｑ−ＰＣＲによって確認された。Ａ−ｉＰＳＣで観察されたより高い突然変異頻度は、ＺＳＣＡＮ発現後に正常レベルに減少した。エラーバーは、３回の反復の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図５Ｂ】奇形腫のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を示し、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏの発がん性がより高いことを示す。奇形腫解析は、Ｒａｇ２／γｃ免疫不全マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の後肢上の皮下組織に１０６個の未分化細胞を注入し、注射後３ヶ月間奇形腫の形成をモニターして行った。収集した腫瘍を１０％ホルマリン溶液中で固定し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ／Ｅ）染色のために処理した。ＥＳＣ（図５Ｂ）およびＹ−ｉＰＳＣ（図５Ｃ）は、嚢胞構造に発展し、癌腫の徴候のない様々な組織型を含む良性奇形腫を形成する。対照的に、個々のＡ−ｉＰＳＣクローンの４８％（ｎ＝２８）（図５Ｄ）は悪性癌腫および良性奇形腫組織の混合物を生じ、Ａ−ｉＰＳＣクローンの５２％（ｎ＝３０）（図５Ｅ）は奇形がんのみを含んでいた。
【図５Ｃ】奇形腫のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を示し、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏの発がん性がより高いことを示す。奇形腫解析は、Ｒａｇ２／γｃ免疫不全マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の後肢上の皮下組織に１０６個の未分化細胞を注入し、注射後３ヶ月間奇形腫の形成をモニターして行った。収集した腫瘍を１０％ホルマリン溶液中で固定し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ／Ｅ）染色のために処理した。ＥＳＣ（図５Ｂ）およびＹ−ｉＰＳＣ（図５Ｃ）は、嚢胞構造に発展し、癌腫の徴候のない様々な組織型を含む良性奇形腫を形成する。対照的に、個々のＡ−ｉＰＳＣクローンの４８％（ｎ＝２８）（図５Ｄ）は悪性癌腫および良性奇形腫組織の混合物を生じ、Ａ−ｉＰＳＣクローンの５２％（ｎ＝３０）（図５Ｅ）は奇形がんのみを含んでいた。
【図５Ｄ】奇形腫のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を示し、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏの発がん性がより高いことを示す。奇形腫解析は、Ｒａｇ２／γｃ免疫不全マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の後肢上の皮下組織に１０６個の未分化細胞を注入し、注射後３ヶ月間奇形腫の形成をモニターして行った。収集した腫瘍を１０％ホルマリン溶液中で固定し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ／Ｅ）染色のために処理した。ＥＳＣ（図５Ｂ）およびＹ−ｉＰＳＣ（図５Ｃ）は、嚢胞構造に発展し、癌腫の徴候のない様々な組織型を含む良性奇形腫を形成する。対照的に、個々のＡ−ｉＰＳＣクローンの４８％（ｎ＝２８）（図５Ｄ）は悪性癌腫および良性奇形腫組織の混合物を生じ、Ａ−ｉＰＳＣクローンの５２％（ｎ＝３０）（図５Ｅ）は奇形がんのみを含んでいた。
【図５Ｅ】奇形腫のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を示し、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏの発がん性がより高いことを示す。奇形腫解析は、Ｒａｇ２／γｃ免疫不全マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の後肢上の皮下組織に１０６個の未分化細胞を注入し、注射後３ヶ月間奇形腫の形成をモニターして行った。収集した腫瘍を１０％ホルマリン溶液中で固定し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ／Ｅ）染色のために処理した。ＥＳＣ（図５Ｂ）およびＹ−ｉＰＳＣ（図５Ｃ）は、嚢胞構造に発展し、癌腫の徴候のない様々な組織型を含む良性奇形腫を形成する。対照的に、個々のＡ−ｉＰＳＣクローンの４８％（ｎ＝２８）（図５Ｄ）は悪性癌腫および良性奇形腫組織の混合物を生じ、Ａ−ｉＰＳＣクローンの５２％（ｎ＝３０）（図５Ｅ）は奇形がんのみを含んでいた。
【図６Ａ】Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣと比較したＡ−ｉＰＳＣにおける異常なＤＮＡ損傷応答、ならびにＺＳＣＡＮ１０の一過性発現後の永久的な回復を示すイムノブロットである。フレオマイシン処理（２時間、３０μｇ／ｍｌ）後のＡ−ｉＰＳＣにおける減少したＡＴＭリン酸化、およびＺＳＣＡＮ１０発現時のＡＴＭ活性化の回復が観察された。
【図６Ｂ】フレオマイシン処理（２時間、３０μｇ／ｍｌ）後の３個の独立したクローンにおける、Ａ−ｉＰＳＣにおける異常なｐ５３ＤＮＡ損傷応答およびＺＳＣＡＮ１０の一過性発現による回復を示す。赤い線は、両方のイムノブロットに内部標準としてロードされた同じＥＳＣサンプルを示す。
【図６Ｃ】フレオマイシン処理（２時間、３０μｇ／ｍｌ）後のＡ−ｉＰＳＣにおける低Ｈ２ＡＸリン酸化およびＺＳＣＡＮ１０発現によるＨ２ＡＸシグナルの回復を示す。
【図６Ｄ】ＡＴＭ−／−Ｈ２ＡＸ−／−ＥＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＺＳＣＡＮ１０に対するｓｈＲＮＡが導入されたＹ−ｉＰＳＣ（Ｙ−ｉＰＳＣ−ｓｈＺＳＣＡＮ１０）におけるＡＴＭおよびＨ２ＡＸタンパク質のリン酸化されたレベル、およびｐ５３のレベルを示すイムノブロットのスキャン画像である。ベータアクチンをローディングの標準として使用した。
【図６Ｅ】線維芽細胞、ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣ−ｓｈＺＳＣＡＮ１０におけるｍＲＮＡのＺＳＣＡＮ１０レベルの棒グラフである。
【図６Ｆ】放射線処理後のＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０におけるリン酸化−ＡＴＭ、ｐＨ２ＡＸおよびｐ５３レベルを示すイムノブロットのスキャン画像である。
【図６Ｇ】Ｈ２Ｏ２で処理した後の、ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０におけるｐＡＴＭおよびβ−アクチンの免疫ブロットのスキャン画像である。
【図７Ａ】ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較した、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮプロモーターのより高いＤＮＡメチル化を示す散布図である。図７Ａは、Ａ−ｉＰＳＣにおける比較的高いＤＮＡメチル化を示す、ＺＳＣＡＮ１０プロモーターのパイロシーケンシングデータのプロットである。ＺＳＣＡＮ１０の一過性発現は、ＺＳＣＡＮプロモーターのＤＮＡメチル化を低下させた（Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０）。エラーバーは、群ごとに解析された４個の独立したクローンの平均の標準誤差を示す。統計的有意性は、ｔ検定によって決定した。
【図７Ｂ】ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較した、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮプロモーターのより高いＤＮＡメチル化を示す散布図である。図７Ｂは、繊維芽細胞、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣにおいてβ−アクチンで標準化されたＤＮＭＴ３ｂのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図８Ａ】Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの過剰な酸化能およびＺＳＣＡＮ１０による回復を示す棒グラフである。ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、およびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０における総グルタチオンレベル（最大酸化能）を決定するために、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の定量化を用いた。各条件からの３回の反復について平均±標準偏差をプロットする。
【図８Ｂ】ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０およびＡ−ｉＰＳＣにおけるＨ２Ｏ２除去活性を示す棒グラフであり、活性酸素種ＲＯＳ活性として表される。細胞活性酸素種アッセイキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１３８５１）を使用して、５０μＭで３時間のＴＢＨＰ（ｔｅｒｔ−ブチル過酸化水素；安定な化学形態のＨ２Ｏ２）による処理後のＨ２Ｏ２除去活性を測定した。各条件からの４回の反復について平均±標準偏差をプロットする。
【図９Ａ】ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０、Ａ−ｉＰＳＣ−ＧＬＵＴ３およびＡ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２のｍＲＮＡレベル（Ｑ−ＰＣＲによって決定される）を示す棒グラフである。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
【図９Ｂ】ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ−ＧＰＸ２、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０、およびＡ−ｉＰＳＣ−ｓｈＲＮＡ−ＧＰＸ２におけるグルタチオンの酸化能の棒グラフである。還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の定量を測定し、総グルタチオンレベル（最大酸化能）を決定した。各条件からの３回の反復について平均±標準偏差をプロットする。グルタチオン解析は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｋ２６４−１００）を用いて行った。
【図９Ｃ】５０μＭで３時間ＴＢＨＰ（ｔｅｒｔ−ブチル過酸化水素；安定した化学形態のＨ２Ｏ２）で処理後のＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ−ＧＰＸ２、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０およびＡ−ｉＰＳＣ−ｓｈＲＮＡ−ＧＰＸ２におけるＨ２Ｏ２除去活性を示す棒グラフである。各条件からの４回の反復について平均±標準偏差をプロットする。
【図９Ｄ】フレオマイシン処理（２時間、３０μｇ／ｍｌ）の終了後１５時間における、ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ−ＧＰＸ２、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０およびＡ−ｉＰＳＣ−ｓｈＲＮＡにおけるＴＵＮＥＬ陽性アポトーシス細胞（ＴＭＲ−ｄＵＴＯ）を示す棒グラフである。
【図９Ｅ】ＧＰＸ２のｓｈＲＮＡを用いたＡ−ｉＰＳＣの３個の独立したクローンおよび対照（フレオマイシン処理ありおよび処理なしの、ＡＴＭおよびＨ２ＡＸノックダウンのＥＳＣならびにＹ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣ）におけるフレオマイシン処理後のＤＮＡ損傷応答（ｐ−ＡＴＭ、ｐＨ２ＡＸおよびｐ５３）の回復を示すｐＡＴＭ／ｐＨ２ＡＸ／ｐ５３のイムノブロットである。
【図１０Ａ】体細胞（若年および老齢ドナー由来の線維芽細胞試料）、ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０におけるＧＬＵＴ３のｍＲＮＡのリアルタイムｑＰＣＲを示す棒グラフである。
【図１０Ｂ】ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０、およびＡ−ｉＰＳＣ−ＧＬＵＴ３における細胞内グルコース取り込み速度を示す棒グラフである。グルコース取り込み率は、グルコース取り込み解析キット（ｃａｔ＃Ｋ６０６−１００、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって測定した。
【図１０Ｃ】Ａ−ｎｔＥＳＣ（核移植法を用いて作製したＥＳ細胞）、ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０およびＡ−ｉＰＳＣ−ＧＬＵＴ３によるグルタミンの酸化的リン酸化の活性化の棒グラフである。グルタミンを最終濃度４ｍＭで添加した後、酸素消費速度を測定した。
【図１０Ｄ】対照（ＥＳＣ、ならびにＥＳＣにおけるＡＴＭノックダウン、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣ）と比較して増加したＧＬＵＴ３発現を有するＡ−ｉＰＳＣの３個の独立したクローンにおけるフレオマイシン処理後のＤＮＡ損傷応答の回復を示すＡＴＭの免疫ブロットである。
【図１０Ｅ】ＧＬＵＴ３プロモーターへのＺＳＣＡＮ１０結合のクロマチンＩＰ解析を示すグラフである。ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、またはＡ−ｉＰＳＣをＩｇｇ対照またはＺＳＣＡＮ１０抗体とともにインキュベートし、次いでＧＬＵＴ３プロモーターに特異的なプライマーを用いてｑＰＣＲを実施した。
【図１０Ｆ】ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、ＧＬＵＴ３に対するｓｈＲＮＡを発現するＹ−ｉＰＳＣ（Ｙ−ｉＰＳＣ−ｓｈＧＬＵＴ３）およびＧＬＵＴ３に対するｓｈ−ＲＮＡを発現するＡ−ｉＰＳＣ（Ａ−ｉＰＳＣ−ｓｈＧＬＵＴ３）におけるＲＯＳレベルの棒グラフである。
【図１０Ｇ】グルタチオンレベルは、ＧＬＵＴ３の過剰発現時に、Ａ−ｉＰＳＣにおいて正常（ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣにおいて観察されたものと同様に）に減少した（図１０Ｇ）。
【図１１Ａ】Ｋｉｍ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年９月１６日、４６７（７３１３）：２８５−９０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３４２、誘導多能性幹細胞におけるエピジェネティック記憶、に開示されるようなランダムリサンプリングによってＡＲＥ配列を有する１４個の遺伝子を見つける統計的確率を示すヒストグラムである。
【図１１Ｂ】ＦＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０（ＺＳＣＡＮ１０を補充したＡ−ｉＰＳＣ）、およびＡ−ｉＰＳＣにおけるエキソソームサブユニットＥＸＯＳＣ１、ＥＸＯＳＣ２およびＥＸＯＳＣ５の相対的ｍＲＮＡレベル（β−アクチンに対して標準化した）を示す一連の棒グラフである。ヒストグラムは、任意の転写物がＵＵＡＵＵＵＡ（Ａ／Ｕ）（Ａ／Ｕ）ＡＲＥ配列を有する可能性が７であるので、ランダムな機会のみに基づいてサンプル中において１４を見つけるという確率は非常に低い（ｐ＝０．０１２２４）ことを示す。
【図１２Ａ】ＥＳＣ、ＥＳＣｓｈＥＸＯＳＣ２、ＥＳＣｓｈＥＸＯＳＣ８、ＥＳＣｓｈＥＸＯＳＣ２および８、ならびにＡ−ｉＰＳＣにおける相対的なＧＰＸ２のｍＲＮＡ発現（β−アクチンに対して標準化）の棒グラフである。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
【図１２Ｂ】ＥＳＣ、ＥＳＣｓｈＥＸＯＳＣ２、ＥＳＣｓｈＥＸＯＳＣ８、およびＥＳＣｓｈＥＸＯＳＣ２＆８のフレオマイシン処理後のＤＮＡ断片化アッセイによるアポトーシス応答の定量である。エラーバーは、技術的および生物学的な反復の平均の標準誤差を示す。
【図１３Ａ】異なる個体における再プログラミングの概略図である。
【図１３Ｂ】ｐＡＴＭおよびβアクチンのタンパク質のレベルを示すイムノブロットのスキャン画像である。ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣは異なる個体から作製し（Ａ−ｉＰＳＣ  ＡＧ８−７６歳、Ａ−ｉＰＳＣ  ＡＧ４−７１歳、Ａ−ｉＰＳＣＢ、およびＡ−ｉＰＳＣＳ）、フレオマイシンで処理した。
【図１３Ｃ】ＡＧ４個体から作製されたＡ−ｉＰＳＣの染色体図である。
【図１３Ｄ】ｐ５３−／−のｉＰＳＣ（陰性対照）、Ｂ６１２９マウスの遺伝的バックグランドから作製されたＡ−ｉＰＳＣ、およびＢ６ＣＢＡマウスの遺伝的バックグランドから作製されたＡ−ｉＰＳＣにおける、フレオマイシンで処理されたイムノブロットのスキャン画像である。ｐ５３およびβ−アクチンのレベルが示されている。
【図１３Ｅ】ヒトＡ−ｉＰＳＣの６個の異なるクローン（図１３Ｅ）、ヒトＡ−ｉＰＳＣアウトライアーの１個のクローン（図１３Ｆ）、Ｙ−ｉＰＳＣの５個の異なるクローン（図１３Ｇ）、およびＺＳＣＡＮ１０を過剰発現するＡ−ｉＰＳＣの６個のクローン（図１３Ｈ）におけるｐＡＴＭおよびβ−アクチンのタンパク質のレベルを示すイムノブロットのスキャン画像を示す。
【図１３Ｆ】ヒトＡ−ｉＰＳＣの６個の異なるクローン（図１３Ｅ）、ヒトＡ−ｉＰＳＣアウトライアーの１個のクローン（図１３Ｆ）、Ｙ−ｉＰＳＣの５個の異なるクローン（図１３Ｇ）、およびＺＳＣＡＮ１０を過剰発現するＡ−ｉＰＳＣの６個のクローン（図１３Ｈ）におけるｐＡＴＭおよびβ−アクチンのタンパク質のレベルを示すイムノブロットのスキャン画像を示す。
【図１３Ｇ】ヒトＡ−ｉＰＳＣの６個の異なるクローン（図１３Ｅ）、ヒトＡ−ｉＰＳＣアウトライアーの１個のクローン（図１３Ｆ）、Ｙ−ｉＰＳＣの５個の異なるクローン（図１３Ｇ）、およびＺＳＣＡＮ１０を過剰発現するＡ−ｉＰＳＣの６個のクローン（図１３Ｈ）におけるｐＡＴＭおよびβ−アクチンのタンパク質のレベルを示すイムノブロットのスキャン画像を示す。
【図１３Ｈ】ヒトＡ−ｉＰＳＣの６個の異なるクローン（図１３Ｅ）、ヒトＡ−ｉＰＳＣアウトライアーの１個のクローン（図１３Ｆ）、Ｙ−ｉＰＳＣの５個の異なるクローン（図１３Ｇ）、およびＺＳＣＡＮ１０を過剰発現するＡ−ｉＰＳＣの６個のクローン（図１３Ｈ）におけるｐＡＴＭおよびβ−アクチンのタンパク質のレベルを示すイムノブロットのスキャン画像を示す。
【図１３Ｉ】ヒトＥＳＣ、ＤＮＡ損傷応答を示さないヒトＡ−ｉＰＳＣ、および正常なＤＮＡ損傷応答を示すＡ−ｉＰＳＣにおける、β−アクチンに対して標準化されたＺＳＣＡＮ１０の相対的ｍＲＮＡレベルの棒グラフである。
【図１４Ａ】グルタチオン合成酵素（ＧＳＳ）プロモーターに結合するＺＳＣＡＮ１０を示す概略図である。
【図１４Ｂ】Ｙ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳプロモーターへのＺＳＣＡＮ１０結合のＣｈＩＰ−定量的ＰＣＲ解析の棒グラフである。値は、投入量と比較した濃縮パーセントで示される。
【図１４Ｃ】ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０およびＡ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳのｍＲＮＡレベル（Ｑ−ＰＣＲによって決定）を示す棒グラフである。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
【図１４Ｄ】ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣＧＳＳ、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０およびＡ−ｉＰＳＣｓｈＧＳＳのフレオマイシン処理後のＤＮＡ断片化アッセイ（画像定量によって取得）によるアポトーシス応答の定量である。エラーバーは、技術的および生物学的な反復の平均の標準誤差を示す。
【図１４Ｅ】ＧＳＳのｓｈＲＮＡ発現を有するＡ−ｉＰＳＣの３個の独立したクローン（図１４Ｅ）、またはＧＳＳのレンチウイルス発現後のＹ−ｉＰＳＣの３個の独立したクローン（図１４Ｆ）におけるフレオマイシン処置後のＤＮＡ損傷応答（ｐ−ＡＴＭ）の回復を示すリン酸化−ＡＴＭのイムノブロットである。β−アクチンレベルはローディング標準として使用される。
【図１４Ｆ】ＧＳＳのｓｈＲＮＡ発現を有するＡ−ｉＰＳＣの３個の独立したクローン（図１４Ｅ）、またはＧＳＳのレンチウイルス発現後のＹ−ｉＰＳＣの３個の独立したクローン（図１４Ｆ）におけるフレオマイシン処置後のＤＮＡ損傷応答（ｐ−ＡＴＭ）の回復を示すリン酸化−ＡＴＭのイムノブロットである。β−アクチンレベルはローディング標準として使用される。
【図１４Ｇ】ヒトＥＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ（ＤＮＡ損傷応答なし）およびＡ−ｉＰＳＣ（正常ＤＮＡ損傷応答あり）におけるβ−アクチンに対して標準化されたＧＳＳのｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図１５Ａ】線維芽細胞（Ａ−ＳＣ、Ｙ−ＳＣ）、ｉＰＳ細胞（Ａ−ｉＰＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０）およびＥＳ細胞（ＥＳＣ）の全遺伝子発現プロファイルを使用する主成分解析（ＰＣＡ）からのデータのプロットである。
【図１５Ｂ】全遺伝子発現プロファイルの教師なしクラスタリング解析のヒートマップである。ヒートマップは、ピアソンの相関係数によって測定されるペアワイズ遺伝子発現類似性を示す。
【図１５Ｃ】線維芽細胞（Ａ−ＳＣ、Ｙ−ＳＣ）、ｉＰＳ細胞（Ａ−ｉＰＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０）およびＥＳ細胞（ＥＳＣ）におけるＥＳ細胞特異的遺伝子の相対発現レベルのマイクロアレイヒートマップである。ＥＳ細胞特異的遺伝子は、成人および若年の線維芽細胞における平均発現よりもＥＳ細胞において３倍またはそれ以上の発現レベルを有することが明らかにされた。ヒートマップはＥＳ細胞に対する相対的発現倍数差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
詳細な説明
定義
本明細書で使用されるとき、以下の用語は、文脈から明らかにそうでないことを示さない限り、下記の意味を有するものとする。
【００４４】
「ＤＮＡ損傷応答」という用語は、外界からの刺激または代謝の際の誤りによるそのＤＮＡに対する損傷を示す刺激の結果として（運動、分泌、酵素産生、遺伝子発現などの点で）細胞の状態または活性の変化をもたらす任意のプロセスを指す。
【００４５】
「アポトーシス応答」という用語は、例えばＤＮＡ損傷に応答して、細胞のアポトーシスをもたらすプロセスを指す。より低いアポトーシス率またはアポトーシスに対する細胞の不全（集約的にアポトーシス応答の低下と呼ばれる）は、制御されない細胞増殖およびより具体的には悪性腫瘍に関連する。
【００４６】
「倍数性」という用語は、通常二倍性の細胞または生物が２組超の染色体を示す状態を指し、「異数性」という用語は、任意の倍数性（正常な２組の染色体より多いかまたは少ない）を意味する。
【００４７】
「染色体構造異常」という用語は、染色体の正常な構造の変化を指す。染色体構造異常は、重複、欠失、転座、逆位および挿入を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
「ゲノム不安定性」（また「ゲノム不安定性」または「遺伝的不安定性」）という用語は、構造的染色体変化（欠失、増幅および転座）、数値染色体異数性、または細胞系統のゲノム内のＤＮＡ配列上の変異の増加を指す。
【００４９】
「発がん性」という用語は、宿主への移植後の細胞が宿主において悪性腫瘍を発生させる可能性を意味する。この用語は、例えば、誘導多能性幹細胞、および動物またはヒトへの分化および移植の際に悪性腫瘍を発生させる傾向に適用される。ゲノム不安定性、ＤＮＡ損傷応答の異常、アポトーシス応答の低下およびグルコース代謝の低下などの表現型形質は、ｉＰＳＣが老齢のドナー由来であるか否かにかかわらず発がん性の上昇を示す。
【００５０】
因子または他の活性分子の「有効量」という用語は、特定の結果をもたらすのに有効な量を意味する。例えば、ＺＳＣＡＮ１０またはＧＬＵＴ３またはエキソソームサブユニットの補充（またはＧＰＸ２またはＧＳＳ阻害）の場合、有効量は、アポトーシス応答および／またはＤＮＡ損傷応答および／またはグルコース代謝異常の実質的な回復をもたらすか、またはゲノム安定性を維持する量である。
【００５１】
「再プログラミング因子」という用語は、転写因子、すなわち、単独でまたは他の再プログラミング因子と組み合わせて、分化した体細胞を再プログラムして細胞を多能性状態にする能力を有するタンパク質を指す。
【００５２】
「転写多能性ネットワーク」という用語は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）における多能性の転写制御に関与する転写因子のネットワークを指す。本発明者らは、ＺＳＣＡＮ１０が「転写多能性ネットワーク」の一部であり、Ｙ−ＩＰＳＣまたはＥＳＣと比較してＺＳＣＡＮ１０が欠損している幹細胞において補充されるべきであることを示した。
【００５３】
「突然変異誘発能」という用語は、ＤＮＡ配列の調節部分、タンパク質コード部分または他の部分に変異を誘導し、突然変異の頻度を正常（バックグラウンド）レベルを上回るよう増加させる物質の潜在能力または能力を指す。
【００５４】
ｉＰＳＣに関連して使用される「若年」という用語は、マウスの場合５日齢までの、ヒトの場合１６歳までの若年ドナー由来のｉＰＳＣを意味し、そしてより一般的には、例えば完全に成熟した成体段階に入ることを開始するための活性成長段階を遅らせることのような、「若年」の特徴を示すドナーに由来するｉＰＳＣを意味する。
【００５５】
ｉＰＳＣと関連して使用される「古い」という用語は、年齢関連の退行性疾患または状態を示すようになる、マウスの場合１．４年齢超の、ヒトの場合５０歳超の老齢ドナー由来のｉＰＳＣを意味する。
【００５６】
Ａ−ｉＰＳＣのグルコース代謝またはＤＮＡ損傷応答、またはアポトーシス応答、またはゲノム安定性の修復、保存回復または救済の文脈において使用される「実質的」という用語は、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣのものとほぼ同じまたは完全に同じ状態を達成することを意味する。例えば、ＺＳＣＡＮ１０補充を伴うＡ−ｉＰＳＣが、Ｙ−ｉＰＳＣとほぼ同一の倍数性および構造的染色体異常を有している図１Ｆ〜１Ｇを参照されたい。図２、５ａおよび６もまた参照されたい。さらに、胚性幹細胞のそれぞれのレベルの約５０％またはそれ以上のＡ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットのレベルは、実質的に回復したと考えられる。最後に、Ａ−ｉＰＳＣ中のグルタチオンの酸化能が、ＥＳＣまたはＹ−ｉＰＳＣのそれの約８０％〜約１２０％の範囲内になるように（例えば、ＺＳＣＡＮ１０の補充によって、またはＧＳＳまたはＧＰＸ２の阻害によって）低下する場合、実質的に復元されたものと考えられる。
【００５７】
「エキソソーム」という用語は、様々なタイプのＲＮＡ（リボ核酸）分子を分解することができる多タンパク質エキソソーム複合体（またはしばしば単にエキソソームと呼ばれるＰＭ／Ｓｃｌ複合体）を指す。エキソソームの基質は、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、および多くの種の小型ＲＮＡを含む。エキソソームは、表３に列挙される９個のコアサブユニットおよび２個のエキソヌクレアーゼ補因子を含む。
【００５８】
「エキソソームサブユニット」という用語は、９個のコアサブユニットおよび２個の補因子：ＥＸＯＳ１、ＥＸＯＳ２、ＥＸＯＳ３、ＥＸＯＳ４、ＥＸＯＳ５、ＥＸＯＳ６、ＥＸＯＳ７、ＥＸＯＳ８、ＥＸＯＳ９、ＥＸＯＳ１０、およびＤＩＳ３を含むエキソソームの１１個の構成要素（表３に列挙）を指す。
【００５９】
文脈によって他に要求されない限り、単数形は複数形を含むものとする。例えば、単数の「エキソソームサブユニット」は、１つまたはそれ以上のエキソソームサブユニットを意味する。
【００６０】
本開示の概要
本開示は、以下の発見に基づく。
１．  若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して、より高い発がん性を有し、増加したゲノム不安定性、アポトーシスの異常および鈍いＤＮＡ損傷応答を示すことが示された、老齢ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ａ−ｉＰＳＣ）。
【００６１】
２．  Ａ−ｉＰＳＣはまた、過剰のグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性（グルタチオン／Ｈ２Ｏ２）を示すことが示され、これは結果としてＤＮＡ損傷応答およびアポトーシスを阻害する。
【００６２】
３．  この経路の阻害は、これらの異常を実質的に救済し、結果としてＡ−ｉＰＳＣの発がん性を低下させる。
【００６３】
４．  Ａ−ｉＰＳＣは、Ａ−ｉＰＳＣにおいて不十分に活性化された多能性因子ＺＳＣＡＮ１０が欠損していることが示されている。ＺＳＣＡＮ１０は、グルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２スカベンジャータンパク質であるＧＰＸ２を阻害するように作用する。ＺＳＣＡＮ１０発現は、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ３の誘導と強い相関を示し、ＺＳＣＡＮ１０発現が増加するとＧＬＵＴ３内在性発現が増加する。ＺＳＣＡＮ１０は、そのプロモーターに結合することによってＧＬＵＴ３を直接調節する。
【００６４】
５．  例えば、再プログラミングの補助としてのＡ−ｉＰＳＣにおける発現（一過性の発現でさえも）によるようなＺＳＣＡＮ１０の補充は、Ａ−ｉＰＳＣにおいてゲノム安定性、ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答およびグルコース代謝の実質的または完全な回復をもたらし、それらをＹ−ｉＰＳＣのそれらと同様にすることがさらに見出された。これは、グルタチオン／Ｈ２Ｏ２のホメオスタシスを正常化することによって達成されることが示されている。重要なのは、これらのＹ−ｉＰＳＣ属性の十分なまたはむしろ完全な回復は、ＺＳＣＡＮ１０を、ＥＳＣにおいて存在するレベルに正確にまたはＹ−ｉＰＳＣにおいて存在するレベルに正確に補充する必要がないことが示された。さらに、ＺＳＣＡＮ１０はＡ−ｉＰＳＣで発現されないため、この発見は誘導プロトコールを超越すると予想される。換言すれば、ＺＳＣＡＮ１０補充は、この因子の欠乏の場合に使用されるべき任意の幹細胞誘導プロトコールに追加することができる。ＺＳＣＡＮ１０をコードする核酸を含むベクターは、他の再プログラミング因子のための核酸を含むベクターのセットに追加することができる。代替的に、再プログラミング因子およびＺＳＣＡＮ１０のための核酸を含む単一のベクターが、例えば、これをしない場合にＺＳＣＡＮ１０が欠損したｉＰＳＣを産生するであろう細胞の再プログラミングの場合に利用することができる。
【００６５】
６．  ＧＬＵＴ３（多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーター）もまた、Ａ−ｉＰＳＣにおいて十分に活性化されない。Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＬＵＴ３の不十分な活性化は、十分な細胞内グルコースの不足に起因してグルコース代謝における酸化的リン酸化から解糖への多能性幹細胞特異的移行を阻害する。したがって、Ａ−ｉＰＳＣはエネルギー効率の良い酸化的リン酸化を使用して（図１０）、より少ないグルコースで十分なエネルギー源を生成する。しかしながら、酸化的リン酸化はより高いＨ２Ｏ２を生成し、結果的にＧＰＸ２／グルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を増加させる（図８）。過剰なＧＰＸ２／グルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性は、Ｈ２Ｏ２およびＡＴＭ媒介性ＤＮＡ損傷応答を阻止する（図６）。ＧＬＵＴ３の直接的または間接的な補充、例えばＡ−ｉＰＳＣにおける発現増加または培地への添加またはＧＬＵＴ３におけるＺＳＣＡＮ１０媒介性増加は、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＤＮＡ損傷応答およびアポトーシス（図１０Ｄ）ならびにグルコース代謝も正常化する点で同様の効果を有する。
【００６６】
７．  これらの結果は、特にＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３の送達を通じたグルタチオン／Ｈ２Ｏ２の阻害は、臨床的に有用であり、結果として低下した発がん性を有するＡ−ｉＰＳＣをもたらすことを示す。したがって、本発明の結果は、ＺＳＣＡＮ１０の補充（任意の上方調節を含むがこれに限定されない）、およびＡ−ｉＰＳＣにおける過剰なグルタチオン／Ｈ２Ｏ２活性（またはその効果）の阻害に寄与するＧＳＳまたはＧＰＸ２のような任意の因子の延長調節により、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、グルコース代謝およびゲノム安定性（完全性）を実質的に回復させ、結果として発がん性を低下させることにおいて、臨床的に有用であることを示す。そのような因子の１つまたはそれ以上の評価は、ｉＰＳＣの品質を確認することにおいて有用である。
【００６７】
８．  過剰なグルタチオン／Ｈ２Ｏ２活性を低下させる介入は、好ましくは、老齢ドナー由来の体細胞をｉＰＳＣに再プログラミングすることと同時に実施される。したがって、ＺＳＣＡＮ１０は、Ｙａｍａｎａｋａ因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ−ＭＹＣの使用を介するか、または背景セクションにおいて説明されるおよび／または引用されるような任意の他の誘導プロトコールを介する再プログラミングと同時またはその直後に、体細胞へと導入できる。ＺＳＣＡＮ１０の補充は、再プログラミングの間またはその直後に、ならびに分化を誘導する前のいずれの場合においても実施することができる。ＧＬＵＴ３発現の増加は、ＺＳＣＡＮ１０と同時に導入することができる。代替的に、ＧＳＳおよび／またはＧＰＸ２は、それらの発現を抑制することによって、または有効量の対応するタンパク質の阻害物質を導入することによって阻害することができる。
【００６８】
本発明者らは、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣにおける遺伝子の発現を比較することにより、Ａ−ｉＰＳＣに関連する遺伝子を発見した。差異的に発現した遺伝子はごくわずかであり、ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答およびゲノム安定性によって評価されるような発がん性に影響を及ぼすものはさらに少なかった。重要な遺伝子に到達するために、本発明者らは最初に、上述するＫｉｍ，Ｋ．ら、２０１０年（本明細書の他の箇所で議論されているように、代替的なｉＰＳＣ誘導プロトコールを代わりに使用することができる）に記載されるような標準的なＹａｍａｎａｋａのｉＰＳＣ再プログラミング方法を用いてＹ−ｉＰＳＣ（Ｅ１５．５胚から５日齢の新生仔由来のマウス皮膚線維芽細胞を使用）およびＡ−ｉＰＳＣ（１．４年齢のドナー由来のマウス皮膚線維芽細胞を使用）を作製した。形態に基づいて多数のクローンが選択され、そしてそれぞれの型の少なくとも１２クローンの群が選択された。各Ｙ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣクローンを一連の多能性試験にかけ、例えば奇形腫解析における３つの胚葉への多系統寄与および多能性遺伝子発現解析（ＡＰ／ＯＣＴ４／ＳＳＥＡ１／ＮＡＮＯＧ）などのような、至適基準としてのＥＳＣと比較した（データは示さず）。各クローンにおける４つの再プログラミング因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ）の抑制を、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により確認した（データは示していない）。ＤＮＡ倍数性を複数のｉＰＳＣクローンで試験し、正常倍数性を有するＹ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣクローンを同定した（データは示さず）。しかしながら、Ｙ−ｉＰＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣにおいて、倍数性のより高い頻度が観察された（図１Ｆ）。Ａ−ｉＰＳＣはまた、Ｙ−ｉＰＳＣよりも多くの染色体構造異常を示した（図１Ｇ）。
【００６９】
発明者らは、Ａ−ｉＰＳＣのゲノム安定性の不良は、集団からの重度の損傷細胞を排除する直接的なアポトーシスであるｉＰＳＣにおけるようなアポトーシス応答の乏しい誘導に起因すると仮定した。彼らは、フレオマイシン（通常、アポトーシスのようなＤＮＡ損傷応答を動員するＤＮＡ損傷を誘発する薬物）で処理した後、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣの対照の両方が十分なレベルのアポトーシスを示したことを見出した。対照的に、Ａ−ｉＰＳＣは、フレオマイシンに対する不十分なアポトーシス応答を示した。次いで、彼らは、Ａ−ｉＰＳＣにおいてアポトーシス応答を補正し、結果としてゲノム安定性を改善するための方法を開発しようとした。彼らは、ＥＳＣまたはＹ−ｉＰＳＣのゲノム安定性を有するｉＰＳＣを得るためには、さらなる多能性因子が必要であると推論した。多数の以前に同定された多能性ネットワーク遺伝子のスクリーニングにより、ＥＳＣで特異的に発現する（かつ体細胞では発現しない）転写因子であり、かつＳＯＸ２、ＯＣＴ４、およびＮＡＮＯＧを含む転写多能性調節ネットワークの一部を形成する、ＺＳＣＡＮ１０が得られた。ＺＳＣＡＮ１０はまた、ＡＴＭ、ＰＬＫ１およびＪＮＫ２などのＤＮＡ損傷応答遺伝子のプロモーターに結合する。
【００７０】
本発明者らはさらに、ＺＳＣＡＮ１０プロモーターがＹ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣにおいて低メチル化／活性化され、Ａ−ｉＰＳＣにおいて過剰メチル化／不活性化されることを見出した。多能性誘導プロトコールに添加すると、Ａ−ｉＰＳＣの再プログラミング中に一過的に発現された場合、ＺＳＣＡＮ１０は、内在性ＺＳＣＡＮ１０プロモーターの低メチル化／活性化をＹ−ｉＰＳＣに見られるものに近いレベルに導いた。上記のＺＳＣＡＮ１０補充を有するＡ−ｉＰＳＣは、染色体倍数性および構造における異常を、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣに匹敵するレベルまで低下させた。ＺＳＣＡＮ１０はまた、Ａ−ｉＰＳＣの突然変異誘発性をＹ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣに匹敵するレベルまで低下させる。また、ＺＳＣＡＮ１０は、Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷剤に対する応答性（ＡＴＭリン酸化、Ｈ２ＡＸリン酸化およびｐ５３発現）を回復させ、ＺＳＣＡＮ１０がＡ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答を回復させて、Ｙ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答に近づけることを確認した。
【００７１】
また、これらの発明者らは、Ａ−ｉＰＳＣにおいてグルタチオンの酸化能が上昇するメカニズムを調べ、マウスにおいてＡ−ｉＰＳＣ中のグルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）の発現上昇によってこのことが誘導されるが、Ｙ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣ中ではそうならないことを見出した。Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２発現の減少は、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣに匹敵するレベルまでグルタチオン／Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスを回復させた。逆に、Ｙ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２の過剰発現は、グルタチオン／Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスの不均衡を誘導した。しかしながら、ヒトにおいて、Ａ−ｉＰＣＳにおけるグルタチオンの酸化能の上昇は、グルタチオン合成酵素（ＧＳＳ）のレベルの上昇によって引き起こされる。ＧＳＳの下方調節は、グルタチオン／Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスの回復をもたらす。
【００７２】
発がん性
加齢と発がん性は強く相関することが知られている。例えば、Ｓｔｏｌｌ  ＥＡ、Ｈｏｒｎｅｒ  ＰＪ、Ｒｏｓｔｏｍｉｌｙ  ＲＣの発がん性に対する年齢の影響：腫瘍開始細胞および脳微小環境、Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ、２０１３年；１２（５）：７３３−４１を参照されたい。ＰＭＩＤ：２３７１１２３９。さらに、ＤＮＡ過剰メチル化、異常なアポトーシス機構（アポトーシスがより少ない頻度で起こる）およびＤＮＡ損傷応答の鈍化などの事象によって発がん性が一般に増加することも知られている。Ｌｉｕ，Ｊ．Ｃ．の高いミトコンドリアのプライミングは、ｈＥＳＣをＤＮＡ損傷誘発アポトーシスに感受性にする。Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  １３、４８３−４９１、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１３．０７．０１８（２０１３年）。さらに、過剰なグルタチオンおよび／または過剰なグルタチオン活性は、膵臓がんおよび結腸直腸がんなどの特定のがんに相関する。さらに、マウスにおけるＡ−ｉＰＳＣ中のＧＰＸ２の過剰発現およびヒトにおけるＧＳＳの過剰発現によって、過剰なグルタチオン活性が誘発されることを本発明者らは見出した。したがって、そのような表現型異常の１つまたはそれ以上は、発がん性を評価するために本開示において使用されており、この目的ならびにより一般的には本開示の方法におけるｉＰＣＳの品質を評価するために使用することができる。さらに、これらの表現型異常の改善は発がん性を低下させると考えられている。Ｄｏｎｎｅｒｓｔａｇ，Ｂ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、１９９６年１２月２０日；１１０（１−２）：６３−７０。
【００７３】
ＤＮＡ損傷応答およびアポトーシスの両方が、腫瘍形成において重要な役割を果たす。ＡＴＭ、Ｈ２ＡＸ、およびｐ５３のような特定のＤＮＡ損傷応答タンパク質はアポトーシスへとＤＮＡ損傷経路を結びつける。したがって、アポトーシスはＤＮＡ損傷に対する二次的な応答である。しかしながら、プログラム細胞死を誘因することなしに、ＤＮＡ損傷応答の誘導が起こり得る。例えば、ＤＮＡ損傷による腫瘍抑制因子ｐ５３の活性化は、細胞周期停止またはアポトーシスのいずれかを誘導し、この結果は高度に文脈依存的である。したがって、Ｈ２ＡＸ、ＡＴＭ、およびｐ５３などのＤＮＡ損傷応答および／またはアポトーシスを媒介するタンパク質のいずれかの活性化における異常は、Ａ−ｉＰＳＣの異常を示し得、そしてそのような幹細胞の品質を評価するために使用され得る。
【００７４】
ＺＳＣＡＮ１０は、ＥＳ細胞の多能性を維持するために必要とされる胚性幹（ＥＳ）細胞特異的転写因子である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃａｒｄｄｉｓｐ．ｐｌ？ｇｅｎｅ＝ＺＳＣＡＮ１０を参照されたい（最後に２０１５年２月２４日に訪問）。それおよびそれをコードする核酸（例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列：ＮＣ＿００００１６．１０を参照されたい）が公に利用可能である。ヒト、マウスおよびラットのＺＳＣＡＮ１０のｃＤＮＡは、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｍａｍｍａｌｉａｎ−ｃｄｎａ／ｍｇｃ−ｃｄｎａｓ／？ｔｅｒｍ＝ＺＳＣＡＮ１０＆ｓｏｕｒｃｅＩｄ＝ＥＧ／８４８９１＆ｐｒｏｄｕｃｔＩｄ＝４１６ＣＢ００３−５０２２−４２６３−Ｂ１Ｃ６−２９３６２５Ｂ７０ＣＥ１）（最後に２０１５年２月２４日に訪問）。ヒトのｃＤＮＡは、例えば、Ｔｅｍｐｅ  ＡｒｉｚｏｎａのＤＮＡＳＵ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからプラスミドｐＥＮＴＲ２２３．１としても入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｄｎａｓｕ．ｏｒｇ／ＤＮＡＳＵ／ＧｅｔＣｌｏｎｅＤｅｔａｉｌ．ｄｏ？ｃｌｏｎｅｉｄ＝２９５１３４；最後に２０１５年２月２４日に訪問）。当該ヒトのｃＤＮＡのＺＳＣＡＮ１０の挿入部分は配列番号１を有する。
【００７５】
本開示の方法は、ｉＰＳＣの改善された再プログラミングを達成するためにｉＰＳＣをＺＳＣＡＮ１０に曝露することに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、老齢ドナーから作製されたｉＰＳＣ細胞に関する（Ａ−ｉＰＳＣ）。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ細胞は、倍数性または増加した染色体構造異常によって反映されるゲノム不安定性によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ細胞は、不完全なＤＮＡ損傷応答を示す。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ細胞は、アポトーシスの誘導の異常を示す。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ細胞はグルコース代謝の異常を示す。これらの異常（ゲノム不安定性、不完全なＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答の低下およびグルコース代謝低下）の１つまたはそれ以上を示すｉＰＳＣを、ＺＳＣＡＮ１０のレベルを増加させることにより、Ｙ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣのレベルに匹敵するレベルまで改善することができる（本明細書の他の箇所に開示されているように、ＺＳＣＡＮ１０のレベルは、表現型異常が適切に回復する限り、必ずしもＹ−ｉＰＳＣのレベルに到達する必要はない）。このプロセスは、ＺＳＣＡＮ１０をコードするｍＲＮＡのｉＰＳＣ由来の体細胞への導入、次いで機能的ＺＳＣＡＮタンパク質への翻訳によって達成することができる。ＺＳＣＡＮ１０のレベルを増加させるためのさらなる方法には、ＺＳＣＡＮ１０発現がＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質のレベルにおいて、一過性または長期間の様式のいずれかで達成されるような、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス、ＤＮＡプラスミドのような多数のベクターによるトランスフェクションが含まれるが、これらには限定されない。さらに、ＺＳＣＡＮ１０タンパク質レベルは、細胞を、増加したＺＳＣＡＮ１０タンパク質レベル（一過性または長期間の様式で発現する）に導く薬剤と接触させることによって、または細胞を組換えＺＳＣＡＮ１０タンパク質と直接接触させることによって増加させることができる。本明細書に開示されるように、本発明は、実質的に、（ａ）ゲノム不安定性を回復する、（ｂ）不完全なＤＮＡ損傷応答を改善する、または（ｃ）ヒトまたは動物（例えばマウス）のｉＰＳＣにおけるアポトーシス応答を回復するのに十分な用量において、ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０のレベルの増加を提供する。
【００７６】
再プログラミングの補助として使用される場合、ＺＳＣＡＮ１０補充は、再プログラミング因子をコードする核酸を有する１つまたはそれ以上のベクターに添加することができ、またはそのようなベクターのセットにおいて別個のベクター（必要な場合にのみ使用するような）に含めることができる。再プログラミングに有用なベクターは市販されている。これらのいずれも、ＺＳＣＡＮ１０をコードする核酸（および、この技術分野における当業者が理解するようなその発現に有用な任意の他の要素）を含むように改変することができる。
【００７７】
ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、グルコース代謝およびゲノム安定性のうちの１つまたはそれ以上を実質的に回復させるのに有効な量のＺＳＣＡＮ１０補充は、Ｙ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０レベルと比較した、特定のＡ−ｉＰＳＣ（そのような介入なく再プログラミングされる）によって示されるＺＳＣＡＮ１０の欠損に相関する量であるべきである。これに関して、図４は、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の発現の、ＥＳＣレベルの約５０％のレベル（およびＹ−ｉＰＳＣレベルの約６０％）のレベルである、未処理細胞の約５倍のレベルまで増加が、評価された表現型応答を回復させるのに有効であったことを示しているので有益である。一般的に、適切なＺＳＣＡＮ１０のより意味のある比較は、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣのレベルに近いかまたは同等である（ただし、異常からの回復には同等のレベルは必要ない）。ＥＳＣのＺＳＣＡＮ１０レベルの約４０％から約９０または９５％まで、またはＹ−ｉＰＳＣのＺＳＣＡＮ１０レベルの約５０％から１００％までのレベルに達するＺＳＣＡＮ１０の補充は有効な範囲である。いくつかの実施形態では、評価された表現型パラメーター（ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、ゲノム安定性またはグルコース代謝）を実質的に回復させるのに十分な補充は、たとえより高いレベルが可能であったとしても、十分であり、実際にＹ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣにおいても見られる。
【００７８】
十分な量の内在性のＺＳＣＡＮ１０が発現されるがＺＳＣＡＮ１０が有効でない場合、補充量は適宜上方調節され、そのような場合にはＹ−ｉＰＳＣの量の１００％を超える量に到達することができる。
【００７９】
本明細書において補充されることが提案されるＺＳＣＡＮ１０または任意の他の因子の補充方法には、培地への添加、またはこれらの因子の発現を促進する送達ベクターまたは他の任意の系によるトランスフェクション、または細胞をこれらの因子へと曝露する任意の事象が含まれる。ベクターを用いない送達の方法については、例えば、Ｚｈｏｕ  Ｈら（２００９年）の、組換えタンパク質を用いた誘導多能性幹細胞の作製、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：３８１−３８４を参照されたい。任意のタイプのＤＮＡ遺伝子導入（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、Ｔａｌｅｎ、ＣｒｉｓｐＲなど）を使用して補充を達成することができる。代替的に、ＲＮＡ送達またはタンパク質の形態での細胞への送達もまた使用され得る。これらの技術は当該技術分野において周知である。送達のときは、再プログラミング因子を加える前、その間、またはその後に、ならびに分化および移植の前にすることができる。したがって、ＺＳＣＡＮ１０を補充するための試薬を含む細胞を再プログラミングするための試薬（ベクターまたはベクターなし）の組み合わせは、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣのものと同様の高品質および表現型形質の誘導多能性幹細胞を作製するために想定される。これらは市販されているか、またはＺＳＣＡＮ１０の核酸およびアミノ酸配列の両方が既知であることを前提として容易に構築することができる。例えば、Ｙａｍａｎａｋａ再プログラミング多能性因子を細胞に導入するために使用することができるベクターおよびウイルス粒子は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＢＣ、Ｃａｎａｄａ；  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ；およびＡｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡのような供給源より入手することができる。
【００８０】
本実施例は、ＺＳＣＡＮ１０の一過性発現を提供するが、本発明の方法は、ＺＳＣＡＮ１０発現が誘導性であるかどうかに限定されない。特定のプロトコールによって誘導されるＡ−ｉＰＳＣ中のＺＳＣＡＮ１０の補充に限定されるものでもない。実際、ｉＰＳＣ誘導のための多くの既知のプロトコールがあり、それらのうちのいずれか１つを本方法と共に使用することができる。Ｓｉｎｇｈ，ＶＫら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｎ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．  ３（２）：１−１８、２０１５年２月；Ｙｕ，Ｊ．、Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．、Ｓｍｕｇａ−Ｏｔｔｏ，Ｋ．、Ａｎｔｏｓｉｅｗｉｃｚ−Ｂｏｕｒｇｅｔ，Ｊ．、Ｆｒａｎｅ，Ｊ．Ｌ．、Ｔｉａｎ，Ｓ．ら（２００７年）の、ヒト体細胞由来の誘導多能性幹細胞株、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８、１９１７−１９２０、ｄｏｉ：１０．１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１５１５２６；Ｄｉｍｏｓ，Ｊ．Ｔ．、Ｒｏｄｏｌｆａ，Ｋ．Ｔ．、Ｎｉａｋａｎ，Ｋ．Ｋ．、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ，Ｌ．Ｍ．、Ｍｉｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｗ．ら、（２００８年）の、ＡＬＳ患者から誘導された誘導多能性幹細胞は運動ニューロンに分化することができる、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１、１２１８−１２２１、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１５８７９９；Ｈａｎｎａ，Ｊ．、Ｍａｒｋｏｕｌａｋｉ，Ｓ．、Ｓｃｈｏｒｄｅｒｅｔ，Ｐ．、Ｃａｒｅｙ，Ｂ．Ｗ．、Ｂｅａｒｄ，Ｃ．、Ｗｅｒｎｉｇ，Ｍ．ら（２００８年）の、末梢分化成熟Ｂリンパ球の多能性への直接的な再プログラミング、Ｃｅｌｌ  １３３、２５０−２６４、ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｊ．ｃｅｌｌ２００８．０３．０２８；Ｈｕａｎｇｆｕ，Ｄ．、Ｍａｃｈｔ，Ｒ．、Ｇｕｏ，Ｗ．、Ｅｉｊｋｅｌｅｎｂｏｏｍ，Ａ．、Ｓｎｉｔｏｗ，Ｍ．、Ｃｈｅｎ，Ａ．Ｅ．ら（２００８年ａ）の、定義された因子による多能性幹細胞の誘導は、小分子化合物によって大きく改善される、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６、７９５−１７９７、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１４１８；Ｍａｌｉ，Ｐ．、Ｙｅ，Ｚ．、Ｈｏｍｍｏｎｄ，Ｈ．Ｈ．、Ｙｕ，Ｘ．、Ｌｉｎ，Ｊ．、Ｃｈｅｎ，Ｇ．ら（２００８年）の、ヒト成人および胎児の線維芽細胞由来の誘導多能性幹細胞の作製の効率およびペースの改善、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６、１９９８−２００５、ｄｏｉ：１０．１１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００８−０３４６；Ｍａｒｓｏｎ，Ａ．、Ｆｏｒｅｍａｎ，Ｒ．、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｂ．、Ｂｉｌｏｄｅａｕ，Ｓ．、Ｋａｈｎ，Ｍ．、Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ら（２００８）の、Ｗｎｔシグナル伝達は、体細胞の多能性への再プログラミングを促進する、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３、１３２−１３５、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２００８．０６．０１９；Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．、Ｈａｎｎａ，Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｋｕ，Ｍ．、Ｗｅｒｎｉｇ，Ｍ．、Ｓｃｈｏｒｄｅｒｅｔ，Ｐ．ら（２００８年）の、統合的ゲノム解析による直接再プログラミングの解明、Ｎａｔｕｒｅ  ４５４、４９−５５、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７０５６；Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｈ．、Ｚｈａｏ，Ｒ．、Ｗｅｓｔ，Ｊ．Ａ．、Ｙａｂｕｃｈｉ，Ａ．、Ｈｕｏ，Ｈ．、Ｉｎｃｅ，Ｔ．Ａ．��（２００８年ａ）の、定義された因子によるヒト体細胞の多能性への再プログラミング、Ｎａｔｕｒｅ  ４５１、１４１−１４６、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６５３４；Ｓｈｉ，Ｙ．、Ｄｅｓｐｏｎｔｓ，Ｃ．、Ｄｏ，Ｊ．Ｔ．、Ｈａｈｍ，Ｈ．Ｓ．、Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．、およびＤｉｎｇ，Ｓ．（２００８年ａ）の、小分子化合物を伴うＯｃｔ４とＫｌｆ４によるマウス胚線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３、５６８−５７４、ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｊ．ｓｔｅｍ．２００８．１０．００４；Ｓｈｉ，Ｙ．、Ｄｏ，Ｊ．Ｔ．、Ｄｅｓｐｏｎｔｓ，Ｃ．、Ｈａｈｍ，Ｈ．Ｓ．、Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｈ．Ｒ．、およびＤｉｎｇ，Ｓ．（２００８年ｂ）の、誘導多能性幹細胞の作製のための化学的および遺伝的アプローチを組み合わせ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２、５２５−５２８、ｄｏｉ：１０．１０１６ｊ．ｓｔｅｍ．２００８．０５．０１１を参照されたい。
【００８１】
ＺＳＣＡＮ１０発現を増加させるためのベクター
適切なベクターは、ウイルス遺伝子送達ベクター（偽型であってもよい、例えばＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＦＩＣおよびＥＩＡＶ由来のもののようなレンチウイルスに基づいたベクター、ＡＡＶに基づいたベクターなど）、プラスミドなどが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載される実験において、ＺＳＣＡＮ１０およびＧＬＵＴ３の送達は、ＯＣＴ４遺伝子を含む市販のレンチウイルスベクター（Ｐｌａｓｍｉｄ  １９７７８：ＡｄｄｇｅｎｅのＦＵ−ｔｅｔ−ｏ−ｈＯｃｔ４）を用い、それを切り出してＺＳＣＡＮ１０またはＧＬＵＴ３と置き換えて作製した。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１９７７８／（最後に２０１５年２月２５日に訪問）を参照されたい。
【００８２】
用いることができる追加のベクターの例は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能なＳＴＥＭＣＣＡのような切除可能なベクターを含む。しかしながら、ＺＳＣＡＮ１０補充は、特定の発現ベクターに限定されず、多能性幹細胞の誘導に適した任意の方法（ベクターを使用するか否かに関わらず）を、ＺＳＣＡＮ１０を補充するために容易に適合させることができる。本開示に従って、幹細胞に挿入されるＧＬＵＴ３、ＧＰＸ２、および任意の他のヌクレオチドについても同様である。
【００８３】
ベクター不使用の方法もまた、本明細書に例示されるような既知のプロトコールに従い、適合させて使用することができる。
【００８４】
ｉＰＳＣの由来
原則として、いずれの体細胞もｉＰＳＣに再プログラミングすることができる。基本的なＹａｍａｎａｋａプロトコール（Ｔａｋａｈａｓｊｉ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ、２００６年８月２５日；１２６（４）：６６３−７６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ、２００７年１１月３０日；１３１（５）：８６１−７２）は、例えば、背景技術のセクションで引用した参考文献に記載されているようなそのような改変を用いてｉＰＳＣ誘導の代替プロトコールとして使用され得る。さらに、当技術分野で公知の再プログラミングのための他のプロトコールがある。例えば、国際公開第２０１３１７７２２８号「組込み／導入遺伝子を含まない幹細胞の作製」を参照されたい。
【００８５】
再プログラミングのために最も頻繁に使用される細胞は、必要に応じて胚性、新生児、若年および成人の線維芽細胞などの線維芽細胞を含む。
【００８６】
上述のＫｉｍ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年、および上述のＫｉｍ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１１年、によると、ｉＰＳＣの特性には、再プログラミングの前に体細胞が選択された組織に応じたある組織特異性があることに留意されたい。本開示は、ゲノム安定性および／またはアポトーシス応答および／またはＤＮＡ損傷応答における異常、を示すＡ−ｉＰＳＣ（およびより広義には任意のｉＰＳＣ）、ならびにグルタチオン／Ｈ２Ｏ２経路の調節異常に関連する発がん性の増加、そしてより具体的には、ＺＳＣＡＮ１０および／またはグルコース代謝における異常に関連した実施形態、例えばＧＬＵＴ３の不十分な内在性発現に関連するようなものに関する。したがって、ｉＰＳＣがそのような異常を示すかどうかが分からないとき、例えば実施例１の手順に従って試験を実施すべきである。ＺＳＣＡＮ１０異常の判定が必要であれば、例えば実施例２のＺＳＣＡＮ１０レベルを評価する手順に従うことができる。ＧＬＵＴ３レベルを評価する必要がある場合、例えばＧＬＵＴ３の発現レベルを評価するための実施例８の手順を使用することができる。
【００８７】
ＧＬＵＴ３
グルコースの細胞取り込みは、ＧＬＵＴ３（ＳＬＣ２Ａ３としても知られている）が主要なアイソフォームの１つである、グルコーストランスポータータンパク質のファミリーによって媒介される促進された拡散によって生じる。ニューロンおよびいくつかの造血細胞型を除いて、ＧＬＵＴ３は一般に成体組織では発現しない。しかしながら、ＧＬＵＴ３の発現は、様々ながんの型において検出されている。異なるがんの型におけるＧＬＵＴ３の発現が観察されているが、その機能的役割は未知のままである。
【００８８】
脳腫瘍始原細胞（しばしば脳がん幹細胞とも呼ばれる）の場合、ＧＬＵＴ３の発現は、誘導された多能性と相関し、複数の腫瘍型における不良な生存率を予測することが見出されている（Ｆｌａｖａｈａｎ，ＷＡ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６：１３７３−１３８２（２０１３年）。
【００８９】
本発明者らは、正常な染色体数および／または構造、ＤＮＡ損傷応答またはアポトーシスの誘導を特徴とする細胞と比較して、染色体数および／または構造、ＤＮＡ損傷応答の誘導、またはアポトーシスにおける異常を示すｉＰＳＣ細胞のＧＬＵＴ３レベルが有意に低いことを発見した。ある例において、ＧＬＵＴ３のより低いレベルまたは非検出可能レベルを発現する細胞はＡ−ｉＰＳＣ細胞である。実施例８に示すように、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＬＵＴ３の発現の増加は、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０発現の効果と同様に、ＤＮＡ損傷応答の実質的な回復をもたらした（図１０Ｄ）。さらに、本開示に提示されたデータは、ＺＳＣＡＮ１０がＧＬＵＴ３の誘導をもたらすことを示し、ＺＳＣＡＮ１０およびＧＬＵＴ３がｉＰＳＣにおいて相互連結されていることを示唆している。ＣｈＩＰ−ｓｅｑおよび免疫沈降解析により、ＺＳＣＡＮ１０がＧＬＵＴ３プロモーターに結合し、ＺＣＡＮ１０によるＧＬＵＴ３の直接調節を示すことが明らかになった。以下の物質は市販されており、下記に例示されるようなウェブサイト（すべて最後に２０１５年２月２５日に訪問）を使用してオンラインで調達することができる。
【００９０】
ヒト、マウスおよびラットのＧＬＵＴ３をコードするｃＤＮＡ配列は、ここに見出すことができる（配列番号２）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／６５１５（Ｋａｙａｎｏ  Ｔ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３（３０）：１５２４５−１５２４８（１９８８年））。
【００９１】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／２０５２７（Ｎａｇａｍａｔｓｕ  Ｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２６７（１）：４６７−７２（１９９２年））。
【００９２】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／２５５５１（Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ＳＮ．、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５６（１４）：１１９３−７（１９９５年））。
【００９３】
ヒトＧＬＵＴ３を含むプラスミドはＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａから市販されており、ここに見出すことができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｅａｒｃｈ／ｄｅｔａｉｌ．ｐｈｐ？ｐｒｔ＝１＆ｃｉｄ＝＆ｋｅｙ＝Ｃ０２００（２０１４年１０月６日１２：３０ｐｍに訪問）。
【００９４】
さらに、組換えＧＬＵＴ３タンパク質は、ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍから市販されており、ここに見出すことができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｄａｔａｓｈｅｅｔ．ｐｈｐ？ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ｉｄ＝１２１４５８２（最後に２０１５年２月２５日に訪問）。
【００９５】
ｉＰＳＣ、またはより具体的にはＡ−ｉＰＳＣにおけるグルコース代謝、ゲノム安定性、ＤＮＡ損傷および／またはアポトーシスの異常の１つまたはそれ以上を実質的に回復させるのに有効な量のＧＬＵＴ３補充は、上述の異常を示さないｉＰＳＣ細胞におけるＧＬＵＴ３レベルに相関する量でなければならない。代替的に、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＬＵＴ３補充は、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣで検出されるＧＬＵＴ３の量に相関し得る。ＧＬＵＴ３の低下したレベルに起因してｉＰＳＣで観察される異常を回復させるのに有効な補充量は、ＺＳＣＡＮ１０について決定された範囲と定性的に同様の範囲にあると予想される。ＧＬＵＴ３の補充方法は多様であり、ＺＳＣＡＮ１０の補充について記載されたプロトコールはＧＬＵＴ３の補充に適用される。
【００９６】
ＧＬＵＴ３の補充は、ＧＬＵＴ３をコードするｍＲＮＡをｉＰＳＣ由来体細胞に導入し、次いで機能的ＧＬＵＴ３タンパク質に翻訳することによって達成することができる。ＧＬＵＴ３のレベルを増加させるためのさらなる方法には、ＧＬＵＴ３発現が、一過性または長期的な様式のいずれかにおいてＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質レベルにおいて達成されるような、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス、ＤＮＡプラスミドのような多数のベクターによるトランスフェクションが含まれるが、これらには限定されない。
【００９７】
代替的に、ＧＬＵＴ３のタンパク質レベルは、細胞を、増加したＧＬＵＴ３タンパク質レベル（一過性または長期間の様式）に導く薬剤と接触させることによって増加させることができる。実施例８に示すように、ＺＳＣＡＮ１０の発現は、ＧＬＵＴ３のレベルの上昇をもたらす。したがって、ＺＳＣＡＮ１０の細胞レベルを増加させると、ＧＬＵＴ３の上方調節が生じることが予想される。さらに、ＧＬＵＴ３レベルは、細胞を組換えＧＬＵＴ３タンパク質と接触させることによって増加させることができる。本明細書に開示されるように、本方法は、本発明は、実質的に、または完全に、ａ）ゲノム不安定性を回復する、（ｂ）不完全なＤＮＡ損傷応答を改善する、または（ｃ）ヒトまたは動物（例えばマウス）のｉＰＳＣにおけるアポトーシス応答を回復する、または（ｄ）グルコース代謝をＥＳＣまたはＹ−ｉＰＳＣと同様のレベルにまで回復するのに十分な用量において、ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０のレベルの増加を提供する。
【００９８】
ＧＰＸ２
グルタチオンペルオキシダーゼは、還元型グルタチオンを用いてＨ２Ｏ２の還元を触媒する。ＧＰＸ２は、消化管の上皮におけるグルタチオン依存性過酸化水素低下活性の大部分を担う２つのアイソザイムの１つをコードするグルタチオンペルオキシダーゼファミリーのメンバーである。公開された文献は、幹細胞が低ＲＯＳレベルのレドックスニッチに存在し、レドックスホメオスタシスのバランスが複雑なネットワークによって幹細胞の自己再生を支配することを示唆している。本明細書に記載の研究では、Ａ−ｉＰＳＣがＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較してグルタチオンの酸化能が上昇して混乱したグルタチオン−Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスを示すことが見出された（図８Ａ）。
【００９９】
従前の、腸におけるＧＰＸ２発現の解析は、腸の幹細胞コンパートメントにおけるＧＰＸ２の役割を示唆したが、ＥＳＣまたはｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２の役割はこれまで記載されていない。実施例７に示すように、マウスＡ−ｉＰＳＣにおいて、過剰なグルタチオン活性が、遺伝毒性傷害（異常グルタチオン−過酸化水素ホメオスタシス）によって生成された過酸化水素を除去し、そして正常なアポトーシスおよびＤＮＡ損傷応答を阻止する。結果として、損傷した細胞は排除されない。増強されたグルタチオン活性は、ＧＰＸ２の過剰な上昇に起因する。図９Ｂおよび９Ｃに示すように、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２のノックダウンは、グルタチオン−Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスの正常化をもたらした。さらに、ＧＰＸ２の下方調節は、マウスＡ−ｉＰＳＣにおけるＤＮＡ損傷およびアポトーシスにおける異常を回復させた（図９Ｅおよび９Ｄ）。機構的には、本発明者らはＡ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の過剰発現はＧＰＸ２のｍＲＮＡの減少をもたらしたので、マウスにおけるＧＰＸ２発現はＡ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０によって調節されることを発見した。
【０１００】
高レベルのＧＰＸ２が実際にＡ−ｉＰＳＣの異常な再プログラミングの原因であるというさらなる証拠として、本発明者らはマウスＹ−ｉＰＳＣにおいてＧＰＸ２を過剰発現した。Ｙ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２の高レベルは、Ｙ−ｉＰＳＣの挙動をＡ−ｉＰＳＣの挙動にシフトさせた。Ｙ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２の過剰発現は、アポトーシスを減少させ、ＤＮＡ損傷応答を低下させ、グルコース代謝を低下させ、グルタチオン−Ｈ２Ｏ２ホメオスタシス（増加した酸化代謝）の不均衡を誘発した。
【０１０１】
したがって、本開示の１つの態様において、異常な染色体数および／または構造、ＤＮＡ損傷の誘導、またはアポトーシスを示す細胞におけるＧＰＸ２レベルの低下は、上述の異常から実質的にＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣのそれらにまでの実質的な回復をもたらし得る。一態様において、ｉＰＳＣ細胞はＡ−ｉＰＳＣであってもよい。Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２レベルの減少は、ＥＳＣまたはＹ−ｉＰＳＣに酷似するように、ｉＰＳＣ内の分子および表現型の変化を引き起こす可能性がある。Ａ−ｉＰＳＣ、またはより一般的にはｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２のレベルと、健康な若年ドナーからのＹ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣのそれらとの近似または相違も、ｉＰＳＣの品質を評価するためのサロゲートマーカーとして使用することができる。
【０１０２】
ＧＰＸ２のレベルの減少は、多数の方法によって達成することができる。例えば、ＧＰＸ２のタンパク質レベルを直接的または間接的に低下させることが知られている小分子阻害剤を使用することができる。さらに、様々なＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）技術を使用して、ＲＮＡレベルでＧＰＸ２を阻害することができる。したがって、ＧＰＸ２のタンパク質、ＲＮＡ、またはＤＮＡレベルの低下を導く任意の薬剤を用いて、Ａ−ｉＰＳＣにおいて観察される染色体安定性、ＤＮＡ損傷および／またはアポトーシスの異常、またはこれらの異常の１つまたはそれ以上によって特徴付けられる任意のｉＰＳＣにおける異常を回復させることができる。ヒトＧＰＸ２のＯＲＦのｃＤＮＡは、例えばＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ．ｃｏｍ）から市販されている。マウスＧＰＸ２のＯＲＦのｃＤＮＡはまた、例えばＯｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｃｄｎａから市販されている。
【０１０３】
ＤＮＡメチル化
生物体内の体細胞は同じゲノム配列を共有するが、クロマチン修飾ならびにＤＮＡメチル化に起因して遺伝子発現パターンが大きく異なる可能性がある。再プログラミング因子の過剰発現による体細胞の多能性幹細胞への変換は、エピジェネティックなリモデリングを伴う。しかしながら、最近の研究は、逆転の過程が常に完全に完了しているわけではないことを明らかにしている。例えば、マウスはｉＰＳＣから首尾よく作製されたが、すべての多能性幹細胞由来のマウスがエピジェネティクス的に安定というわけではなく、不安定性はマウスの過体重および突然死症候群と関連している。さらに、ｉＰＳＣは、使用されるドナー組織の組織型に依存した残存するエピジェネティックな特徴を含む（Ｋｉｍら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９（１２）：１１１７−１１１９、２０１１年）。最後に、老齢ドナー由来のｉＰＳＣ（Ａ−ｉＰＳＣ）は、加齢に特異的なエピジェネティックな記憶を保持することが示されている（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６７（７３１３）：２８５−２９０、２０１０年）。
【０１０４】
正常細胞において、ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現の正確な調節および安定した遺伝子抑制を保証する。ＤＮＡメチル化はヒストン修飾に関連しており、これらの修飾間の相互作用は、クロマチン構造を変化させることによるゲノムの機能にとって重要である。メチル基の共有結合的付加は、一般に、ＣｐＧアイランドとして知られる大きなクラスターに濃縮されたＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンにおいて生じる。異常なＤＮＡメチル化の状況はがんの特徴である。プロモーター領域内の過剰メチル化（不活性化）の結果として、特定の腫瘍抑制遺伝子の不活性化が起こることが確立され、数多くの研究が様々なタイプのがんにおけるＤＮＡメチル化によって抑制された広範囲の遺伝子を示している。さらに、ゲノム不安定性を誘発し得る低メチル化（活性化）も、細胞形質転換に寄与する。
【０１０５】
本開示において、ＺＳＣＡＮ１０プロモーターは、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣにおいて活性化され、Ａ−ｉＰＳＣにおいて不活性である。この修飾はＺＳＣＡＮ１０のレベルを低下させたが、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の一過性発現で回復し、これは、Ｙ−ｉＰＳＣで検出されたものと同様のレベルにまで内在性ＺＳＣＡＮ１０プロモーターの低メチル化（活性化）を導いた（図７）。さらに、マウスＥＳＣと比較したマウスＹ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣのＤＮＡメチル化解析は、Ａ−ｉＰＳＣがＹ−ｉＰＳＣよりも多数のメチル化可変領域（ＤＭＲ）を含むことを示した。さらに、過剰メチル化ＤＭＲの数は、マウスＡ−ｉＰＳＣにおいてはＹ−ｉＰＳＣにおけるものよりも多い。さらに、ドナーの遺伝的バックグランドに応じて、ヒトＡ−ｉＰＳＣは、マウスＡ−ｉＰＳＣにおいて観察されるものと同様の、より多いＤＮＡメチル化を示す。さらに最近の研究は、ヒト細胞における不十分なＤＮＡ脱メチル化が、非効率的な再プログラミングに関連することを明らかにし（Ｂａｇｃｉ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：２６５−２６９（２０１３年））、さらにマウスとヒトの細胞の間のＤＮＡメチル化の同等のパターンを確立した。したがって、一態様では、本開示は、過剰メチル化ＤＭＲの数またはｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０のメチル化状態のような明確なエピジェネティックな差異が特定のｉＰＳＣの特性のマーカーまたは指標として役立ち得るような方法を提供する。別の態様では、本開示は、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＤＮＡメチル化パターンを、Ｙ−ｉＰＳＣで観察されるものと同様となるように、実質的にまたは完全に回復させる方法を提供する。
【０１０６】
ＥＳＣ／Ｙ−ｉＰＳＣ／Ａ−ｉＰＳＣ／ＺＳＣＡＮ１０／Ａ−ｉＰＳＣのマイクロアレイ解析を行って、Ａ−ｉＰＳＣの遺伝子の差異的発現を検出することによって、Ａ−ｉＰＳＣの発がん性に影響を及ぼす遺伝子を同定した。ＧＰＸ２およびＧＬＵＴ３の両方がこのように同定された。
【０１０７】
ＺＳＣＡＮがエキソソームを制御し、結果としてＧＰＸ２を制御する
本開示において、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ解析は、ＺＳＣＡＮ１０がエキソソーム複合体のサブユニットに結合し、上方調節することを明らかにした。Ａ−ｉＰＳＣは、ＦＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較して、エキソソームサブユニットのより低いｍＲＮＡレベルを示した（図１１Ａ）。さらに、ＺＣＡＮ１０の過剰発現は、エキソソームサブユニットｍＲＮＡの回復をもたらし、ＺＳＣＡＮ１０とエキソソームとの直接的相互作用を実証した。
【０１０８】
マルチサブユニットエキソソーム複合体は、ほぼ全てのクラスのＲＮＡのプロセシング、品質管理および分解に関与する真核細胞の主要なリボヌクレアーゼである（Ｓｃｈｍｉｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．（１０）：５０１−１０、（２００８年））。従前の研究は、エキソソームとＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）との間の相互作用が、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡのターンオーバーの効率を調節する上で重要な役割を果たすことを実証した。ＧＰＸ２遺伝子は、高度に保存されたＡＲＥ配列（Ｓｉｎｇｈら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３５（６）：６３９−５０（２００６年））を含有し、ＺＳＣＡＮ１０→エキソソーム→ＧＰＸ２軸をＧＰＸ２調節の潜在的機序にする。この仮説を検証するために、異なるエキソソームサブユニットをＥＳＣでノックダウンし、ＧＰＸ２のｍＲＮＡのレベルを決定した（図１２Ａ）。ＥＸＯＳＣ２またはＥＸＯＳＣ８のノックダウンは、より低いアポトーシス応答を伴うＥＳＣにおけるＧＰＸ２発現の劇的な増加をもたらした（図１２Ｂ）。したがって、これらの知見は、ＺＳＣＡＮ１０が、種々のサブユニットを含むエキソソーム複合体を含むメカニズムを介してＧＰＸ２を調節することを示している。結果的に、エキソソームサブユニットによってマウスのＡ−ｉＰＳＣを補充すると、ｉＰＳＣの老化に伴う表現型異常および発がん性の改善につながるであろう。
【０１０９】
老齢ヒトドナー由来のｉＰＳ細胞は、異なる再プログラミング効率および表現型異常を示す
老齢のヒトドナーから作製されたＡ−ｉＰＳＣ細胞は、低い再プログラミング効率に関して老化動物から作製されたＡ−ｉＰＳＣにおいて観察された知見を確認する（図１３Ａ）。興味深いことに、同様の年齢の２人の異なるドナー間で、再プログラミング効率の有意差が観察され、これもＤＮＡ損傷応答に反映された（図１３Ｂ）。ドナーから作製され、ＤＮＡ損傷応答に重大な異常を示すＡ−ｉＰＳＣは、構造的染色体異常をも示した（図１３Ｃ）。これらの結果は、個体の遺伝的バックグランドが、Ａ−ｉＰＳＣの再プログラミング効率およびＤＮＡ損傷応答において重要な役割を果たすことを示唆している。この異常は、本明細書に記載されるように補充によって救済することができると予想される。
【０１１０】
様々な遺伝的バックグランドの複数の実験室マウス系統が利用可能である。遺伝的バックグランドがＡ−ｉＰＳＣにとって決定的に重要であるという仮説を検証するために、Ａ−ｉＰＳＣを別個のマウス系統、Ｂ６１２９およびＢ６ＣＢＡから作製した。図１３Ｄに示すように、Ｂ６１２９バックグラウンドマウス由来のＡ−ｉＰＳＣは正常なＤＮＡ損傷応答（ｐ５３の活性化によって示される）を示し、Ｂ６ＣＢＡバックグラウンドマウス由来のＡ−ｉＰＳＣは鈍化したＤＮＡ損傷応答を示した。まとめると、これらの所見は、Ａ−ｉＰＳＣに関連する再プログラミング効率、染色体安定性、ならびにＤＮＡ損傷応答のすべてが、それらが由来する個体または動物の遺伝的バックグランドならびにエピジェネティックな因子および老化に大きく依存することを示している。
【０１１１】
ＧＳＳ
グルタチオン（ＧＳＨ）の新規合成は、γ−グルタミルシステイン合成酵素（γ−ＧＣＳ）およびグルタチオン合成酵素（ＧＳＳ）の２つの酵素によって触媒される。ＧＳＨ合成の律速段階は、グルタミン酸のγ−カルボキシル部分とシステインのアミノ部分との間のアミド結合の形成である。ＧＳＨが合成される速度は、酵素（ＧＣＳ）の活性およびシステインの利用可能性の両方に基づく。ＧＳＳは、グリシンの添加によるγ−ＧｌｕＣｙｓジペプチドのＧＳＨへの変換を触媒することによってＧＳＨ合成を完了する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ、４（１０）：１３９９−４４０（２０１２年））。
【０１１２】
ＧＳＨ合成に関与する酵素は、転写前および転写後の両方の複数のメカニズムによって制御される。ＥＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０結合部位をゲノムワイドにマッピングすることに焦点を当てた従前の研究は、ＧＳＳを含む〜３５００の標的遺伝子を同定した（Ｙｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８４（４５）：３１３２７−３１３３５（２００９年））。本開示において、本発明者らは、ヒトにおいて、ＺＳＣＡＮ１０がＧＳＳプロモーターに直接結合することを示した（実施例１２、図１４Ｂ）。さらに、彼らは、ＧＳＳのｍＲＮＡのレベルが、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣにおいて有意に上方調節されること、およびＡ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の過剰発現の際にこの上方調節が減少することを示した（実施例１２、図１４Ｃ）。
【０１１３】
本明細書中に開示されるさらなる実験は、ＧＳＳが実際にヒトにおけるＡ−ｉＰＳＣの発がん性を調節することに関与しているというさらなる証拠を提供する。実施例１３および図１４Ｄ〜Ｆに記載されるように、ＧＳＳは、アポトーシスならびにＤＮＡ損傷応答の調節の両方において役割を有する。ｓｈＲＮＡを用いたＡ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳの下方調節は、アポトーシス応答の増加（実施例１３、図１４Ｄ）ならびにＤＮＡ損傷応答の救済（実施例１３、図１４Ｅ〜１４Ｆ）をもたらした。対照的に、Ｙ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳの過剰発現は、対照Ｙ−ｉＰＳＣ細胞（図１４Ｄ）と比較してより低いアポトーシス応答、およびＤＮＡ損傷応答の喪失（図１４Ｅおよび１４Ｆ）を引き起こした。
【０１１４】
したがって、本開示の１つの態様において、異常な染色体数および／または構造、ＤＮＡ損傷の誘導、またはアポトーシスを示す細胞におけるＧＳＳレベルの低下は、これらの表現型形質における前述の異常の実質的な回復および実質的にＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣのそれらへの回復をもたらし得る。一態様において、ｉＰＳＣ細胞はＡ−ｉＰＳＣであってもよい。Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳレベルの減少は、ｉＰＳＣ内の分子および表現型の変化を、ＥＳＣまたはＹ−ｉＰＳＣに酷似するようになし得る。
【０１１５】
ＧＳＳレベルの低下は、多数の方法によって達成することができる。例えば、様々なＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）技術を用いて、ＲＮＡレベルでＧＳＳを阻害することができる。したがって、ＧＳＳのタンパク質、ＲＮＡ、またはＤＮＡレベルの低下を導く任意の薬剤を用いて、Ａ−ｉＰＳＣにおいて観察される染色体安定性、ＤＮＡ損傷および／またはアポトーシスの異常、またはこれらの異常の１つまたはそれ以上によって特徴付けられる任意のｉＰＳＣにおける異常を回復させることができる。ヒトおよびマウスの両方のＧＳＳのＯＲＦのｃＤＮＡは、例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｃｄｎａ）から市販されている。ＤＮＡレベルでＧＳＳを標的とするために、クラスター化した規則的な配置の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓゲノム編集ツールを使用することができる（ＳａｎｄｅｒおよびＪｏｕｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２、３４７−３５５（２０１４年））。さらに、ＧＳＳレベルまたは活性は、ＧＳＳのタンパク質レベルおよび／または活性を直接的または間接的に低下させることが知られている阻害剤を用いて低下させることができる。例えば、ブチオニンスルホキシミン（ＤｒｅｗおよびＭｉｎｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３（１９）：２９８９−９４（１９８４年））、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（Ｖａｎｏｎｉ  ＭＡおよびＣｕｒｔｉ  Ｂ、ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ．６０（５）：２８７−３００（２００８年））、およびアザセリン（Ｈｅｎｓｌｅｙら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２３（９）：３６７８−８４（２０１３年））がＧＳＳを阻害することが示されている。したがって、本開示の１つの実施形態において、ブチオニンスルホキシミン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン（Ｖａｎｏｎｉ  ＭＡおよびＣｕｒｔｉ  Ｂ、ＩＵＢＭＢ）および／またはアザセリン、またはＧＳＳの活性および／またはレベルを低下させることが示されている任意の阻害剤を用いて、ＧＳＳレベルが低下するか、またはＧＳＳ活性が阻害される。各インヒビターを個別に使用することに加えて、ＧＳＳ活性および／またはレベルの低下は、２つまたはそれ以上の既知の阻害剤の組み合わせによって達成できる。ＧＳＳの阻害においては、阻害が完全ではないことが重要である。いくらかの量のグルタチオンが細胞にとって重要である。
【０１１６】
代替的に、本発明者らは、ＧＳＳが、ＧＳＳのプロモーターへの結合を介してＺＳＣＡＮ１０によって直接的に調節されることを示したので、本明細書に記載されるように、ＧＳＳの上方調節を抑制するためにＺＳＣＡＮ１０が上方調節され得る。本明細書に記載の研究を通して、ＺＳＣＡＮ１０は、ｉＰＳＣ、特に老齢のドナー由来のｉＰＳＣを産生する体細胞再プログラミングの重要な共調節因子として浮上している。
【０１１７】
ＧＳＳはまた、Ａ−ｉＰＳＣ、より一般的にはｉＰＳＣにおけるＧＳＳのレベルを測定し、それらをＹ−ｉＰＳＣまたは健康なドナー由来のＥＳＣのレベルと比較することによってｉＰＳＣ、特にＡ−ｉＰＳＣの、発がん性、グルタチオン／Ｈ２Ｏ２ホメオスタシス、およびより一般的な品質を評価するためのサロゲートマーカーとしても使用できる。ＧＳＳのレベルが低い、すなわちＹ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣのレベルに匹敵する場合、幹細胞は低い発がん性を有し、安定したグルタチオンホメオスタシスを有し、そして一般的に良好な品質である。
【０１１８】
実験手順
細胞培養
ＥＳＣおよびｉＰＳＣを、１０％ＦＢＳおよび１，０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ（登録商標）白血病阻害因子［ＬＩＦ］、１００万単位／１ｍＬ）を含むＥＳＣ培地で培養した。ＥＳＣの作製のために、以前に報告された確立された方法が使用された（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：２８５−２９０、２０１０年）。体細胞のｉＰＳＣ再プログラミングのために、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびＭＹＣを発現するレトロウイルスが導入された。誘導性再プログラミング因子を含む体細胞については、培地に２μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ドキシサイクリンハイクレート）を補充した。ＤＮＡおよびＲＮＡ単離のために、ＥＳＣまたはｉＰＳＣをトリプシン処理し、新しい組織培養皿に３０分間再播種してフィーダー細胞を除去し、次いで核酸を非接着性細胞懸濁液から抽出した。
【０１１９】
マウスＹ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０、Ａ−ｉＰＳＣ−ｓｈＧＰＸ２、Ａ−ｉＰＳＣ−ｓｈＧＳＳ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＧＬＵＴ、ＥＳＣ−ｓｈＥＸＯＳＣ２、ＥＳＣ−ｓｈＥＸＯＳＣ８、ＥＳＣ  ｓｈＥＸＯＳＣ２および８、ヒトＹ−ｉＰＳＣ、およびヒトＡ−ｉＰＳＣの作製
１０６個の皮膚繊維芽細胞を、Ｂ６ＣＢＡＦ１マウスの、Ｅ１５．５胚性皮膚、５日齢の尾の先端の皮膚、および１．４年齢の尾の先端の皮膚から採取し、ｐＭＸ−ｍＯＣＴ４、ｐＭＸ−ｍＳＯＸ２、ｐＭＸ−ｍＫＬＦ４，２、およびｐＥＹＫ−ｍＭＹＣ３から作製されたレトロウイルスを、各ウイルス上清０．５ｍｌ（ウェル当たり合計２ｍｌ）で６ウェルディッシュにおいて感染させ、室温で９０分間２５００ｒｐｍで回転させた（ＢｅｎｃｈＴｏｐ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ａｌｌｅｇｒａ−６Ｒ）。Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０の作製については、手順は同一であったが、４つの再プログラミング因子に加えて、ＺＳＣＡＮ１０を過剰発現させるためにドキシサイクリン誘導性系を加えた。このシステムは、ｐｌｅｎｔｉＲＺ−ＺＳＣＡＮ１０およびｐｌｅｎｔｉ−ＲＴＴＡベクターから作製された２つのレンチウイルスからなった（Ｋｉｍら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：１１１７−１１１９、２０１１年）。ベクターは、市販のベクターの挿入物をＺＳＣＡＮ１０（または本明細書に記載のＧＬＵＴ３または他の挿入物）で置換することによって作製した。再プログラミング因子に感染した全ての細胞および追加のＺＳＣＡＮ１０、ｓｈＧＰＸ２、ｓｈＧＳＳおよびＧＬＵＴ３を有する細胞を、１０ｃｍ組織培養皿中の２０％ＦＢＳおよび１，０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦを含むＥＳＣ培地において、放射線照射したＣＦ−１マウス胚性フィーダー細胞上に播種した。２日目に培地を交換し、ＺＳＣＡＮ１０過剰発現については３日目にドキシサイクリン添加を開始した。浮遊細胞を培地の遠心分離によって回収し、培地交換中に培養に戻した。４日目に、培養細胞をトリプシン処理し、ＥＳＣ維持培地中で、ゼラチン（０．１％）および放射線照射したマウス胚線維芽細胞で予めコートした４枚の１０ｃｍ培養皿上に再播種した。ＥＳＣ様コロニーが観察されるまで培地を毎日交換した。再プログラミングされたコロニーを、奇形腫アッセイ形成、アルカリホスファターゼ染色、ＳＳＥＡ−１およびＮＡＮＯＧ染色、およびＯＣＴ４発現レベルによって多能性について試験した。
【０１２０】
Ａ−ｉＰＳＣ−ｓｈＧＰＸ２の作製のために、Ａ−ｉＰＳＣを、再プログラミング後に、ＧＰＸ２のためのｓｈＲＮＡウイルスベクターのセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの６ＧＩＰＺレンチウイルスｓｈＲＮＡベクター：ＲＭＭ４５３２−ＥＧ１４７７６）を用いて感染させた。ピューロマイシンを用いてクローンを選択し、Ｑ−ＰＣＲにより下方調節のレベルを測定した。Ａ−ｉＰＳＣ−ｓｈＧＳＳの作製のために、Ａ−ｉＰＳＣを、再プログラミング後に、ＧＳＳのためのｓｈＲＮＡウイルスベクターのセット（ＧＥ  ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ、ＲＭＭ４５３２−ＥＧ１４８５４）で感染させた。
【０１２１】
Ａ−ｉＰＳＣ−ｓｈＺＳＣＡＮ１０の作製のために、マウスＡ−ｉＰＳＣを、再プログラミング後に、ＮＭ＿００１０３３４２５．３を標的とするように設計された一連のｓｈＲＮＡレンチウイルスベクターで感染させた。ＺＳＣＡＮ１０セットのｓｈＲＮＡのセットは、Ａｂｍｇｏｏｄ．ｃｏｍから市販されている（最後に２０１５年１０月６日に訪問）。
【０１２２】
Ｙ−ｉＰＳＣ−ＧＰＸ２の作製のために、マウスＹ−ｉＰＳＣを、再プログラミング後に、ＧＰＸ２のｃＤＮＡを有するレンチウイルス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｓｍｉｄ．ｍｅｄ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＰＬＡＳＭＩＤ／Ｈｏｍｅ．ｊｓｐ））に感染させた。感染したクローンをＱ−ＰＣＲによりＧＰＸ２発現レベルについて評価した。Ｙ−ｉＰＳＣ−ＧＳＳの作製のために、マウスＹ−ｉＰＳＣを、再プログラミング後に、ＧＳＳのｃＤＮＡを有するレンチウイルス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｓｍｉｄ．ｍｅｄ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＰＬＡＳＭＩＤ／）に感染させた。感染したクローンを赤色蛍光マーカーについて選別し、ＧＳＳ発現レベルをＱ−ＰＣＲによって確認した。
【０１２３】
ヒトＡ−ｉＰＳＣの作製のために、８４歳、７６歳および８１歳の対象からの１０５個の皮膚線維芽細胞に、ｈＯＣＴ４、ｈＳＯＸ２、ｈＫＬＦ４およびｈＭＹＣをコードするテトラシストロン性ＳＦＧ−ＳＶ２Ａベクターから作製したレトロウイルスに、各ウイルス上清０．５ｍｌを含む６ウェルディッシュ（ウェル当たり合計２ｍｌ）で感染させ、室温で９０分間２５００ｒｐｍで回転させた（ＢｅｎｃｈＴｏｐ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ａｌｌｅｇｒａ−６Ｒ）。
【０１２４】
ＥＳＣ−ｓｈＥＸＯＳＣ２、ＥＳＣ−ｓｈＥＸＯＳＣ８およびＥＳＣ  ｓｈＥＸＯＳＣ２および８の作製のために、ＥＳＣに、ＥＸＯＳＣ２および／またはＥＸＯＳＣ８に対するｓｈＲＮＡウイルスのセット（ＧＥ  ＤＨＡＲＭＡＣＯＮからのＥＸＯＳＣ２のための２ＧＩＰＺレンチウイルスｓｈＲＮＡベクター：ＲＭＭ４４３１−２００３７０６２９、ＲＭＭ４４３１−２００３３２７３３およびＧＥ  ＤＡＲＭＡＣＯＮからのＥＸＯＳＣ８のための３ＧＩＰＺレンチウイルスｓｈＲＮＡベクター：ＲＭＭ４５３２−ＥＧ６９６３９）を感染させた。ピューロマイシン処理によりクローンを選択した。
【０１２５】
レトロウイルスの作製
２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭを含む１５０ｍｍディッシュあたり５×１０６細胞で一晩播種した。レトロウイルスは、以前に記載されているように、ｐＭＸ−ｍＯＣＴ４、ｐＭＸ−ｍＳＯＸ２、ｐＭＸ−ｍＫＬＦ４およびｐＥＹＫ−ｍＭＹＣコンストラクトを使用して作製された（Ｋｏｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ１４２，２００；ＴａｋａｈａｓｈｉらＣｅｌｌ  １２６：６６３−６７６、２００６年）。以前に記載されているように標準的なリン酸カルシウム法で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの１８時間後に培地を新鮮なＤＭＥＭで２回交換した。トランスフェクションから約４８時間後、レンチウイルスを含む培地を回収し、次いで遠心分離により細胞残屑を除去した。上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、次いでレトロウイルスを、４５Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中、４℃、９０分間、３３，０００ｒｐｍで超遠心分離してペレット化した。レトロウイルス粒子をＥＳＣ培地に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０１２６】
レンチウイルスの生産
２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭを含む１５０ｍｍディッシュあたり５×１０６細胞で一晩播種した。以前に記載されたように、リン酸カルシウム細胞トランスフェクションを使用して、細胞をｐｌｅｎｔｉＲＺ−ＺＳＣＡＮ１０およびｐｌｅｎｔｉ−ＲＴＴＡでトランスフェクトした（Ｋｉｍら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：１１１７−１１１９、２０１１）。ＺＳＣＡＮ１０のｃＤＮＡは、ｐＥＮＴＲ２２３．１の背景を持つクローンＭｍＣＤ００２９５０５２であった。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）システムを用いて、ｍＺＳＣＡＮ１０のｃＤＮＡをｐｌｅｎｔｉＲＺベクターに、ＧＰＸ２のｃＤＮＡをｐｌｅｎｔｉ−ｐｕｒｏベクターにサブクローニングした。ｈｔｔｐｓ：／／ｔｏｏｌｓ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｇａｔｅｗａｙｍａｎ．ｐｄｆを参照されたい。トランスフェクションの４８時間後、レンチウイルスを含む培地を回収し、遠心分離により細胞残屑を除去した。上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、次いでレンチウイルスを４５Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で、４℃、９０分間、３３，０００ｒｐｍで超遠心分離してペレット化した。レンチウイルス粒子をＤＭＥＭ培地に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０１２７】
ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、およびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０細胞について奇形腫解析を行った。結果は、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０細胞の悪性腫瘍の発生率が、挿入物なしのＡ−ｉＰＳＣと比較して減少することを明らかにした。Ａ−ｉＰＳＣ−ＧＬＵＴ３の奇形腫解析は類似の方法で行われ、結果は質的に同じであると予想される。
【０１２８】
定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）解析
遺伝子（ＺＳＣＡＮ１０、ＯＣＴ４、ＧＰＸ２、ＧＬＵＴ３、およびβ−アクチン）の発現レベルを、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＱ−ＰＣＲにより定量した。総ＲＮＡ（１μｇ）を、２０μｌの容量でＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素システム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて逆転写し、次いで得られたｃＤＮＡを２００μｌの全容量に希釈した。この合成したｃＤＮＡ溶液の１０μｌを解析に使用した。多能性遺伝子に関して、各反応は、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２５μｌの容量で実施した。条件は以下のようにプログラムした：９５℃で１０分間の初期変性、次いで９５℃で３０秒、５５℃で１分、および７２℃で１分の４０サイクル；次いで９５℃で１分、５５℃で３０秒、および９５℃で３０秒。すべてのサンプルを２回反復し、ＰＣＲ反応は、各ＰＣＲサイクル中に合成されたシグナルの量を検出することができるＭｘ３００５Ｐリーダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。ＭｘＰｒｏプログラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてｍＲＮＡの相対量を決定した。ＰＣＲ産物の量を、β−アクチンの発現レベルのパーセンテージに標準化した。ＯＣＴ４、ＺＳＣＡＮ１０、ＧＰＸ２およびβ−アクチンのＰＣＲ産物も、１．２％アガロースゲル上でエチジウムブロマイドで染色した後に評価した。ｃＤＮＡを増幅するために使用したプライマーは以下の通りであった：ＯＣＴ４−Ｆｏｒ  ５’−ＧＧＣＴＣＴＣＣＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＡ−３’およびＯＣＴ４−Ｒｅｖ  ５’−ＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧ−３’、ＺＳＣＡＮ１０−Ｆｏｒ  ５’−ＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＧＣＧＴＴＡＧ−３’およびＺＳＣＡＮ１０−Ｒｅｖ  ５’−ＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＧＴＴ−３’、ＧＰＸ２−Ｆｏｒ  ５’−ＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣ−３’およびＧＰＸ２−Ｒｅｖ  ５’−ＡＧＧＡＴＧＣＴＣＧＴＴＣＴＧＣＣＣＡ−３’、β−ＡＣＴＩＮ−Ｆｏｒ  ５’−ＴＣＧＴＧＧＧＴＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＡ−３’およびβ−ＡＣＴＩＮ−Ｒｅｖ  ５’−ＧＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴ−３’およびＨＰＲＴ−Ｆｏｒ  ５’−ＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＧＣ−３’およびＨＰＲＴ−Ｒｅｖ  ５’−ＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＧＡＣＴＣＧＴ−３’、ＥＸＯＳＣ２−Ｆｏｒ  ＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡおよびＥＸＯＳＣ２−Ｒｅｖ  ＣＣＡＡＣＣＣＡＣＣＡＴＴＡＣＣＴＣＣＣ、ＥＸＯＳＣ１−Ｆｏｒ  ＡＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＡＧおよびＥＸＯＳＣ１−Ｒｅｖ  ＣＣＣＡＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＡＴＴＧＧＧＴ、ＥＸＯＳＣ５−Ｆｏｒ  ＣＣＧＡＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＡＡＴＣＡＣＴおよびＥＸＯＳＣ５−Ｒｅｖ  ＣＴＡＣＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧ。導入遺伝子抑制（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびＭＹＣ）は、ウイルスベクターの５’領域および構造遺伝子の５’末端に及ぶ以下のプライマーを用いて確認した。非感染線維芽細胞を陰性対照として用い、Ｙａｍａｎａｋａ因子でトランスフェクトした３日目の線維芽細胞を陽性対照として用いた。ｐＭＸベクターおよび導入遺伝子に隣接した導入遺伝子を検出するためのプライマー配列は以下のものである：ｐＭＸ−Ｓ１８１１−Ｆｏｒ  ５’−ＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＣ−３’およびＯＣＴ４−Ｒｅｖ  ５’−ＣＡＧＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣ−３’、ＫＬＦ４  Ｒｅｖ  ５’−ＧＡＣＡＡＣＧＧＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣ−３’、ＳＯＸ２  Ｒｅｖ  ５’−ＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＴ−３’およびＭＹＣ  Ｒｅｖ  ５’−ＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧ−３’。ＧＬＵＴ３のためのプライマーは、ｍＧｌｕｔ３−ｘｂａ−Ｆ  ａｔｔｔｃｔａｇａＡＴＧＧＧＧＡＣＡＡＣＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣおよびｍＧｌｕｔ３−ｘｂａ−Ｒ  ａｔｇｇａｔｃｃＴＣＡＧＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣであった。
【０１２９】
薬物治療および放射線照射
フレオマイシン（Ｓｉｇｍａ）を３０μｇ／ｍｌで２時間添加した。他に指示がない限り、細胞を、フレオマイシン処理の３０分後に解析のために処理した。ＥＳＣ培地で３０分間の回復後、細胞を収集し、次いで以下の実験のために処理した。長期間のＤＮＡ損傷応答の検出のために、細胞をフレオマイシン処理後に回復させるために６時間与え、次いでＨ２ＡＸ免疫染色のために処理した。ＤＮＡ断片化アッセイにおいて、細胞を回復させるため１５時間与えた。突然変異誘発の可能性を調べるために、細胞を３０μｇ／ｍｌのフレオマイシンで２時間処理し、各処理後に１回継代培養した。このプロセスを３回繰り返した後、細胞を６ＴＧ選択のために処理した。細胞を１０Ｇｙで放射線照射し、２時間回復させ、次いでイムノブロット解析のために溶解物を収集した。
【０１３０】
奇形腫解析
ｉＰＳＣをトリプシンコラゲナーゼ処理によって収集し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｍｉｘ（ＤＭＥＭ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ：コラーゲンを２：１：１の比率）に再懸濁し、１０６個の未分化細胞をＲａｇ２／γＣ免疫不全マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の後肢の上の皮下組織に注入した。奇形腫の形成を注射後３ヶ月間観察した。収集した腫瘍を１０％ホルマリン溶液中で固定し、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ施設およびＨｉｓｔｏｗｉｚ、Ｉｎｃ．でヘマトキシリン・エオジン（Ｈ／Ｅ）染色のために処理した。Ｈ／Ｅ染色プロトコールはｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ／ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ／ｄｙｅｓ−ａｎｄ−ｓｔａｉｎｓ／ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ−ｈｅ−ｓｔａｉｎｉｎｇ／およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｓｈ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ＿Ｆｏｒ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＿ａｎｄ＿Ｅｏｓｉｎ＿Ｓｔａｉｎｉｎｇ．ｐｄｆにて供給されている。
【０１３１】
イムノブロット解析
２時間のフレオマイシン処理（３０μｇ／ｍｌ）の３０分後に、処理細胞および未処理細胞（１×１０５細胞）を回収した。タンパク質を採取するために、１００〜２００ｍＬのＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．２５％Ｎａ−デオキシコレート、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤カクテル、およびホスファターゼ阻害剤カクテル）を浮遊細胞ペレットおよび残りの接着細胞に添加した。試料を氷上でインキュベートし（１０分間）、次いで遠心分離した（１４，０００ｇ、１０分間、４℃）。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。試料をＲＩＰＡバッファ（３０００μｇ／ｍｌ）で同じ濃度に調整し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファ（Ｂｉｏｒａｄ）およびβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）と混合し、次いで９５℃で５分間加熱し、４〜１５％ミニプロティアンＴＧＸ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）上にロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のサンプルを湿式電気転写法（０．２Ｍグリシン、２５ｍＭトリス、および２０％メタノール）を用いて１００Ｖで１時間０．２ｍｍＰＶＤＦ膜に転写した。この膜をＰＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡ（４℃で１時間）でブロックし、次いで、ブロッキング溶液（Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝食塩水［１：１０００］、ＰＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡ）中の一次抗体、抗Ｈ２ＡＸ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５−６３６）（１：１０００）、抗ｐ５３（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐ５３−ＣＭ５Ｐ）（１：１０００）、抗リン酸化−ＡＴＭ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＭＡ１−２０２０）または抗βアクチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃４９６７）（１：５０００）によって４℃一晩インキュベートした。一次抗体インキュベーション後、ペルオキシダーゼで標識した二次抗体を添加する前に、膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。二次抗体（１：１０，０００）はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより入手した。
【０１３２】
バイサルファイトパイロシーケンシング解析
５００ｎｇのゲノムＤＮＡを、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて取扱説明書に従ってバイサルファイト処理した。バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを、ＺＳＣＡＮ１０特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＺＳＣＡＮ１０プロモーターの関心の位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムアセンブリ：Ｃｈｒ１７：２３５９９９５８−２３６００６４７のＧＲＣｍ３８（ＧＣＡ０００００１６３５．４）に基づく。アッセイ（ＰＣＲおよびパイロシーケンシング）は、２３６００６００（ＣｐＧ３）、２３６００６４５（ＣｐＧ２）、および２３６００６４７（ＣｐＧ１）の転写開始部位のすぐ上流の３つのＣｐＧ部位をカバーする。パイロシーケンシングは、Ｅｐｉｇｅｎｄｘ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって設計され実行された。
【０１３３】
細胞遺伝学的解析
細胞遺伝学的解析は、分裂中期染色体調製、Ｇバンド核型分析およびＰＩ染色によるフローサイトメトリー解析によって実施された。分裂中期染色体調製およびＧバンド核型分析は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって実施した。ＰＩ染色のために、細胞を採取し、次いでＰＢＳ中で洗浄し、次いで４℃で３０分間、冷７０％エタノール（凝集を最小限に抑えるようにボルテックスしながらペレットに滴下して加えた）中で固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、リボヌクレアーゼで処理し、次いでＰＩ（ヨウ化プロピジウム染色溶液：３．８ｍＭクエン酸ナトリウム、ＰＢＳ中４０μｇ／ｍｌＰＩ［Ｓｉｇｍａ、Ｐ４１７０］）で染色した。
【０１３４】
免疫組織化学染色
細胞を室温で２０分間、３．７％ホルムアルデヒド中で固定し、次いでＰＢＳで洗浄した。次いで、サンプルをＰＢＳ中０．１  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２０分間透過処理し、次いでＰＢＳ−Ｔ中３％ＢＳＡで１時間ブロックし、次いで一次抗体を室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。抗Ｈ２ＡＸはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（０５−６３６）から購入し、フィコエリトリン結合の抗ＳＳＥＡ−１はＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ＦＡＢ２１５５Ｐ）から購入し、抗ＮＡＮＯＧはＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａ３００−３９７Ａ）から購入した。一次抗体を１：５００希釈で使用した。Ａｌｅｘａ  ５６８結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ａ−２１１２４）およびＡｌｅｘａ  ６３３結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ−２１０７２）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓより入手した。二次抗体を１：１０００希釈で使用した。核を４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）で染色した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色は、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて取扱説明書に従って行った。ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚ１顕微鏡検査システム（Ｚｅｉｓｓ）を用いて蛍光画像を得た。
【０１３５】
ＤＮＡ断片化解析
ＤＮＡ断片化は、ＤＮＡ鎖切断の可視化のためのｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を用い、酵素反応において修飾されたヌクレオチド（例えば、ビオチン−ｄＵＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ）によって遊離の３’−ＯＨ末端を標識することによって測定された。ｉＰＳＣ細胞（１×１０５細胞）を２時間、フレオマイシン（３０μｇ／ｍｌ）で処理した。サンプルを対照として回収し、またはフレオマイシン処理の１５時間後に解析のために処理した。さらに、アポトーシスの陽性対照としてＤＮＡ鎖切断を誘導するために、細胞をＤＮＡａｓｅ  Ｉ組換え体（Ｒｏｃｈｅ）（１０分、３Ｕ／ｍｌ、１５℃〜２５℃）で処理した。浮遊細胞および付着細胞を含有する培地を遠心分離（１０００ｇ、５分）し、回収した。細胞をフローサイトメトリー解析のために処理した。
【０１３６】
Ｈ２Ｏ２活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイ
Ｈ２Ｏ２除去活性を細胞活性酸素種アッセイキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１３８５１）を用いて測定した。ＥＳＣ／ｉＰＳＣを２０μＭのＤＣＦＤＡ（２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート；細胞内のヒドロキシル、ペルオキシルおよび他のＲＯＳ活性を測定する蛍光発生色素）で標識し、次いで５０μＭのＴＢＨＰ（ｔｅｒｔ−ブチル過酸化水素；安定した化学形態のＨ２Ｏ２）とともに３時間培養した。次いで、細胞を蛍光プレートリーダーで解析した。各条件からの４回の反復について平均±標準偏差をプロットする。
【０１３７】
ＴＢＨＰ処理
細胞を、ＰＢＳ中３５０μＭのＴＢＨＰ溶液（Ｌｕｐｅｒｏｘ（登録商標）ＴＢＨ７０Ｘ、Ｈ２Ｏ中７０重量％のｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液、４５８１３９）で３０分間処理した。イムノブロット解析のために溶解物を回収した。対照未処理細胞株をＥＳＣ培地またはＰＢＳ中で培養し、ＴＢＨＰ処理を含まない両方の培地でＤＮＡ損傷応答を誘導しなかった（データ示さず）。
【０１３８】
ＨＰＲＴアッセイ
ＨＰＲＴアッセイは以前に公表されたプロトコール（Ｔｓｕｄａら、ＡＡＴＥＸ  １１（２）、１１８−１２８、２００５年）に従って実施した。ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０を３回のフレオマイシン処理で培養した後、１０６個のＥＳＣおよびｉＰＳＣを、フィーダー細胞（ＣＦ−１  ＭＥＦ）を含む１０ｃｍ組織培養皿上に播種し、陰性選択のために５μｇ／ｍｌの６−ＴＧ（２−アミノ−６−メルカプトプリン；Ｓｉｇｍａ）を添加した。突然変異の頻度は、ＨＰＲＴプロモーター活性の不活性化によって推定した。個々のコロニーを１２日目に計数／ピックアップし、コロニー数を、Ｑ−ＰＣＲ解析によって各群のＨＰＲＴを発現しなかったコロニーの割合に対して標準化した。
【０１３９】
グルタチオン検出アッセイ
フィーダーを含まない細胞を、ＭＥＦ条件付けしたＥＳＣ培地中のＭａｔｒｉｇｅｌコーティングされた組織培養プレート上で培養した。３日目に、細胞をＰＢＳで洗浄し、掻き取り、次いで遠心によりペレット化した。次のステップは、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ２６４−１００、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて取扱説明書に従って実施した。簡潔には、細胞ペレットを氷冷グルタチオンアッセイバッファー中でホモジナイズし、過塩素酸中で保存し、遠心した。上清を水酸化カリウムで中和した。遠心後、上清を還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を検出するために使用したか、または総グルタチオンを、測定前に酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）をＧＳＨに還元することによって測定した。ＧＳＳＧ濃度を特異的に測定するために、還元剤を適用する前に既存のＧＳＨをクエンチした。ＧＳＨと反応して蛍光を発するＯＰＡ（ｏ−フタルアルデヒド）プローブを試料に添加し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＶａｒｉｏｓｃａｎ  ＦｌａｓｈでＥｘ／Ｅｍ＝３４０ｎｍ／４２０ｎｍでシグナルを得た。グルタチオンの酸化能は、総グルタチオン（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）の量によって決定された。
【０１４０】
実施例
実施例１
老齢マウス由来のｉＰＳ細胞は、より高いゲノム不安定性およびより低いアポトーシス活性を示す
Ｙａｍａｎａｋａら（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１２６，６６３−６７６，２００６年）は、若年ドナー組織を用いてｉＰＳＣを作製するための４つのエピジェネティックな再プログラミング因子を同定したが、同じ４つの因子が老齢ドナー組織のｉＰＳＣ再プログラミングに十分であるか否かについていっさい検証しなかった。
【０１４１】
ここで、ｉＰＳＣ細胞は、Ｅ１５．５胚から５日齢の新生仔（Ｙ−ｉＰＳＣ）由来のマウス皮膚線維芽細胞を用いて、または１．４年齢のドナー由来のマウス皮膚線維芽細胞（Ａ−ｉＰＳＣ）を用いて、標準のＹａｍａｎａｋａのｉＰＳＣ再プログラミングプロトコールに従って作製された。
【０１４２】
各細胞型の１２個のクローンを形態に基づいて無作為に採取し、至適基準としてのＥＣＳと比較して多能性を解析した。奇形腫解析における３つの胚葉への多系統寄与および多能性遺伝子発現解析（ＡＰ／ＯＣＴ４／ＳＳＥＡ１／ＮＡＮＯＧ）は、若年および老齢のドナーから単離されたマウス皮膚線維芽細胞の成功した再プログラミングを示した。各クローンにおける４つの再プログラミング因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ）の抑制を、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって確認した。最初に、ＤＮＡ倍数性を複数のｉＰＳＣクローンで試験したところ、正常な倍数性を有するＹ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣクローンの両方が観察された（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｄ）が、Ｙ−ｉＰＳＣと比較した倍数性のより高い頻度が、Ａ−ｉＰＳＣにおいて観察された（図１Ｂ、１Ｅおよび１Ｆ）。さらに、Ａ−ｉＰＳＣは、Ｙ−ｉＰＳＣよりも多くの染色体構造異常を示した（図１Ｇ）。
【０１４３】
多能性幹細胞は、体細胞およびがん細胞の標準的なＤＮＡ損傷応答とは異なる独特なＤＮＡ損傷応答を有することが知られている。多能性幹細胞におけるゲノム安定性の維持は、集団からの重度損傷細胞を排除するためにアポトーシスを直接誘導することによって達成される（Ｌｉｕ，Ｊ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４、２６８−２７４、２０１４年；Ｌｉｕ，Ｊ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１３、４８３−４９１、２０１３年）。したがって、Ａ−ｉＰＳＣで観察される不完全な遺伝的安定性は、アポトーシスの異常に起因すると考えられた。この仮説を検証するために、ＤＮＡ損傷に応答するアポトーシスの活性化を全ての独立したクローンにおいて評価した。
【０１４４】
ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣのｉｎ  ｓｉｔｕ細胞死アッセイを、ＤＮＡ損傷誘発剤であるフレオマイシンによる処理（２時間、３０μｇ／ｍｌ）の終了後１５時間に行った。Ａ−ｉＰＳＣは、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較して、より少ない細胞死に対する細胞染色を示す。酵素反応の非存在下において色素で処理したＹ−ｉＰＳＣ群を陰性対照として使用した。核はＤＡＰＩで染色された。図２に示すように、Ａ−ｉＰＳＣのフレオマイシン処理後のＤＮＡ断片化アッセイにおいてより低いアポトーシス応答が観察される一方で、ＥＳＣとＹ−ｉＰＳＣは同じ条件下で同等のＤＮＡ断片化を示した。まとめると、ここに示されたデータは、Ａ−ｉＰＳＣが、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較して、より高いゲノム不安定性およびより低いアポトーシス活性によって特徴付けられることを示唆する。
【０１４５】
実施例２
ＺＳＣＡＮ１０は、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較して、Ａ−ｉＰＳＣにおいて不十分に活性化される多能性因子である
ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣにおいて不十分に活性化され、かつＡ−ｉＰＳＣにおいて観察される異常のもっとも原因であるようなＥＳＣ特異的多能性因子を同定するために、既知の５９個の多能性因子のネットワークから開始する戦略が開発された。Ｋｉｍら（Ｋｉｍ，Ｊ．、Ｃｅｌｌ  １３２、１０４９−１０６１）は、多能性ネットワーク解析に由来する５９個のコア多能性遺伝子を以前に報告した（図３）。最初に、これらの５９個のコア遺伝子を、ｐ５３、ＳＩＲＴ１、ＰＬＫ１、およびｐ５３の上流の遺伝子（ＡＴＭ、ＰＡＲＰ、およびＤＮＡＰＫ）などのＤＮＡ損傷応答と関連することが知られている遺伝子に対してフィルタリングされた。そこから、遺伝子リストを、Ａ−ｉＰＳＣ対Ｙ−ｉＰＳおよびＡ−ｉＰＳＣ対ＥＳＣの差異的発現に基づいてさらにフィルタリングし、候補を単一の遺伝子ＺＳＣＡＮ１０に絞り込んだ。ＺＳＣＡＮ１０は、ＥＳＣで特異的に発現する既知のジンクフィンガー転写因子であり、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＺＳＣＡＮ４との転写調節ネットワークの統合部分である。
【０１４６】
再プログラミングにおけるＺＳＣＡＮの役割をさらに評価するために、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によってＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣでＺＳＣＡＮのレベルを決定した。予想通り、ＺＳＣＡＮ１０のｍＲＮＡレベルはＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣにおいて有意に低かった（図４）。したがって、ＺＳＣＡＮ１０の発現は、体細胞で低く、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣではより高いが、Ａ−ｉＰＳＣでは制限されていると結論付けられた。
【０１４７】
ここに示されたデータは、ＺＳＣＡＮ１０がＡ−ｉＰＳＣ細胞で観察されたゲノム不安定性の原因となる潜在的因子であることを示唆している。
【０１４８】
実施例３
ＺＳＣＡＮ１０発現は、Ａ−ｉＰＳＣにおける遺伝的安定性およびアポトーシスを回復する
再プログラミングにおけるＺＳＣＡＮ１０の機能を調べるために、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性レンチウイルス発現ベクター内の４つのＹａｍａｎａｋａ因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびＭＹＣ）およびＺＳＣＡＮ１０を用いて老齢のドナーの線維芽細胞からｉＰＳＣを作製した。Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０細胞を、２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを補充した培地中で２日間増殖させた。ドキシサイクリンの回収後、再プログラミングされたコロニーを奇形腫アッセイ形成、アルカリホスファターゼ染色、ＳＳＥＡ−１およびＮＡＮＯＧ染色、およびＯＣＴ４発現レベルにより多能性について試験し、Ａ−ｉＰＳ−ＺＳＣＡＮ１０が成功的に再プログラミングされたことを確認した。次いで、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０を、低レベルのＺＳＣＡＮ１０を含むＡ−ｉＰＳＣで観察されたゲノム安定性およびアポトーシスの異常を救助する能力について試験した。
【０１４９】
ドキシサイリン（ｄｏｘｙｃｙｌｉｎｅ）系を用いる、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の一過性発現は、内在性ＺＳＣＡＮ１０発現をＹ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣにおけるレベルと同様のレベルに永久的に増加させた（図４）。さらに、Ａ−ｉＰＳＣにおける再プログラミング中のＺＳＣＡＮ１０の一過性発現は、異常な染色体倍数性および構造的異常をＹ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣに匹敵するレベルに低下させた（図１Ｃ、１Ｆおよび１Ｇ）。Ａ−ｉＰＳＣにおけるアポトーシスに対するＺＳＣＡＮ１０の効果を試験するために、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０をＤＮＡ損傷誘導剤であるフレオマイシンで処理（２時間、３０μｇ／ｍｌ）し、ＤＮＡ断片化アッセイによりアポトーシス応答を評価した。Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０発現は、ＤＮＡ損傷誘発後のアポトーシスの誘導における異常を回復させた（図２）。
【０１５０】
これらの結果は、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ発現が、老齢ドナーから作製されたｉＰＳ細胞において検出されたゲノム安定性およびアポトーシスの異常を救済することを示す。
【０１５１】
実施例４
Ａ−ｉＰＳＣは、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較してより高い突然変異誘発能を示し、これはＺＳＣＡＮ１０発現によって回復する
実施例３で考察したように、再プログラミング中のＡ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の一過性発現は、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣに匹敵するレベルまでゲノム安定性およびアポトーシスを回復させた。ＺＳＣＡＮ１０発現がＡ−ｉＰＳＣにおけるゲノム安定性およびアポトーシスを回復するメカニズムを定義するために、最低３つの独立したクローン（ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０およびＡ−ｉＰＳＣの各々）の包括的な分子解析が実施された。Ａ−ｉＰＳＣはアポトーシスの誘導に異常を示したので、Ａ−ｉＰＳＣは損傷細胞を排除することができず、Ｙ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣよりも多くのゲノム突然変異を蓄積するであろうという仮説が立てられた。
【０１５２】
ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、およびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０における突然変異誘発能は、ＨＰＲＴプロモーター活性の突然変異誘発破壊を用いて決定した（Ｔｓｕｄａら、ＡＡＴＥＸ  １１（２）、１１８−１２８、２００５年）。哺乳動物細胞のＸ染色体上に位置するヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子は、哺乳類細胞株の遺伝子変異を調べるためのモデル遺伝子として広く使用されている。ＨＰＲＴ法は、ＨＰＲＴ遺伝子および／または／タンパク質の機能性を破壊する突然変異を検出し、突然変異の検出は、毒性類似体である６−チオグアニン（６−ＴＧ）を用いた選択によって達成される。ＨＰＲＴ遺伝子の様々なタイプの突然変異は、それらのＤＮＡに組み込まれた致死６−ＴＧに対する細胞耐性をもたらす。したがって、ＨＰＲＴ突然変異を有する細胞のみが６−ＴＧ含有培地中で増殖できる。適切な遺伝子機能の除去をもたらす突然変異がＨＰＲＴ突然変異体を産生するので、この方法は広範囲の突然変異誘発物質を検出する。
【０１５３】
３回のフレオマイシン処理（各２時間、３０μｇ／ｍｌ）の後、６−ＴＧ（５μｇ／ｍｌ）含有培地中で、ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣを培養した。突然変異の頻度は、ＨＰＲＴプロモーター活性の不活性化によって推定した。個々のコロニーを１２日目に計数／ピックアップし、Ｑ−ＰＣＲ解析によって各群のＨＰＲＴを発現しなかったコロニーの割合に対してコロニー数を標準化した。
【０１５４】
Ａ−ｉＰＳＣはＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較して有意に高い突然変異率を示した（図５Ａ）。ＺＳＣＡＮ１０がＡ−ｉＰＳＣのゲノム安定性およびアポトーシスの異常を回復できるという知見と一致して、ＺＳＣＡＮ１０の一過性発現は、これらの細胞における突然変異誘発能を低下した（図５Ａ）。
【０１５５】
ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、およびＡ−ｉＰＳＣの突然変異誘発能をｉｎ  ｖｉｖｏでさらに試験した。奇形腫形成は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分化能力を決定する確立されたアッセイであり、ヒトＥＳおよびｉＰＳ細胞株を評価するための重要な方法であると考えられる。奇形腫解析は、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣが良性奇形腫を形成するが、Ａ−ｉＰＳＣクローンのかなりの割合（４８％）が悪性癌腫と良性奇形腫の混合物を形成することを明らかにした（図５Ｂ〜５Ｅ）。
【０１５６】
まとめると、これらの結果は、Ａ−ｉＰＳＣがＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣよりもｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方でより高い突然変異誘発能を示すことを示す。
【０１５７】
実施例５
ＺＳＣＡＮ１０は、Ａ−ｉＰＳＣにおける鈍化したＤＮＡ損傷応答を、ＡＴＭ、ｐ５３、およびＨ２ＡＸを介して補正する
老化プロセスは、ＤＮＡ損傷応答の慢性的な活性化を介して徐々にＤＮＡ修復機序を変化させる。Ａ−ｉＰＳＣにおけるＤＮＡ損傷応答およびこのプロセスにおけるＺＳＣＡＮ１０の役割をより詳細に評価するために、既知のＤＮＡ損傷エフェクタータンパク質の活性化を評価した。
【０１５８】
ＤＮＡ損傷に対する細胞応答は、アポトーシスにつながる一連の事象を伴う。初期の事象の１つは、ＤＮＡ二本鎖切断の修復において中心的な役割を果たすセリン／スレオニンキナーゼである毛細血管拡張性運動失調症変異（ＡＴＭ）のリン酸化である。ＡＴＭはＤＮＡ損傷チェックポイントの活性化を開始するいくつかの重要なタンパク質をさらにリン酸化し、細胞周期の停止とアポトーシスを引き起こす。ＡＴＭ活性化は、腫瘍抑制因子ｐ５３およびヒストン２ＡＸ（Ｈ２ＡＸ）のリン酸化をもたらす。ＺＳＣＡＮ１０の影響を受けた事象をよりよく理解することを目的として、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＡＴＭ、Ｈ２ＡＸ、およびｐ５３のリン酸化を、ＤＮＡ損傷の誘導後に調べた。
【０１５９】
ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、およびＡ−ｉＰＳＣを３０μｇ／ｍｌのＤＮＡ損傷誘導剤であるフレオマイシンで２時間処理した。イムノブロット解析により、ＡＴＭ、Ｈ２ＡＸ、およびｐ５３のタンパク質レベルを決定した。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示すように、Ａ−ｉＰＳＣは、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較して、低レベルの、または検出不可能なレベルの、フレオマイシン処理後のリン酸化されたＡＴＭ、ｐ５３およびＨ２ＡＸを示す。Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の発現が、ＤＮＡ損傷経路タンパク質のリン酸化をＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣで検出されたレベルに匹敵するレベルに回復させるので（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）、これらの異常は部分的にＺＳＣＡＮ１０によって媒介される。ＤＮＡ損傷応答の異常が普遍的であり、フレオマイシンに依存しないことを確認するために、同じ実験デザインを用いて実験を行ったが、ＤＮＡ損傷誘発剤を変更した。フレオマイシンで観察されたデータと同様に、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣは、放射線照射および過酸化水素Ｈ２Ｏ２処理後のＡＴＭ／Ｈ２ＡＸ／ｐ５３レベルの増加を示すが、Ａ−ｉＰＳＣは、示さない。放射線照射実験のために、細胞に１０Ｇｙを照射し、２時間回復させ、次いでイムノブロット解析のために溶解物を収集した。放射線照射およびＨ２Ｏ２の両方は、ＤＮＡ損傷応答の既知の誘導物質である。重要なことに、ＺＳＣＡＮ１０の一過性発現によって、Ａ−ｉＰＳＣにおける放射線照射およびＨ２Ｏ２に対するＡＴＭ／Ｈ２ＡＸ／ｐ５３応答が回復した（図６Ｆおよび６Ｇ）。
【０１６０】
過剰発現実験に加えて、本発明者らは、Ｙ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＡＣＮ１０を標的とし、ｓｈＲＮＡを用いてＺＳＣＡＮ１０レベルを減少させた（図６Ｄおよび６Ｅ）。ＤＮＡ損傷反応の調節におけるＺＳＣＡＮ１０の役割のサポートをさらに提供するものとして、ＺＳＣＡＮ１０発現が減少したＹ−ｉＰＳＣは、正常なＺＳＣＡＮ１０レベルを有するものと比較してより低いアポトーシス応答を示した（図６Ｄ）。
【０１６１】
まとめると、これらの結果は、Ａ−ｉＰＳＣにおける異常なＤＮＡ損傷応答が、ＺＳＣＡＮ１０の一過性発現で回復されることを示す。
【０１６２】
実施例６
内在性ＺＳＣＡＮ１０は、Ａ−ｉＰＳＣにおいて過剰メチル化され、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣにおいて低メチル化される
体細胞における多能性の誘導は、とりわけＤＮＡメチル化パターンの変化を伴うエピジェネティックなプロセスと考えられている。ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣで起こる変化およびＺＳＣＡＮ１０の役割をさらに解明する目的で、ＤＮＡメチル化解析を行った。ＺＳＣＡＮ１０プロモーター領域のバイサルファイトパイロシーケンシング解析は、ＺＳＣＡＮ１０プロモーターがＹ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣにおいて低メチル化／活性化され、Ａ−ｉＰＳＣにおいて過剰メチル化／不活性化されることを示した（図７）。一過性ＺＳＣＡＮ１０発現がＡ−ｉＰＳＣのメチル化パターンを回復できるかどうかを試験するために、Ｄｏｘ誘導性発現系を用いて作製したＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０細胞を解析した。Ａ−ｉＰＳＣにおける他の異常を回復させるＺＳＣＡＮ１０の能力と同様に、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の一過性発現は、Ｙ−ｉＰＳＣに近いレベルまでの内在性ＺＳＣＡＮ１０プロモーターの低メチル化／活性化を導いた。
【０１６３】
マウスＥＳＣ対老齢および若年マウス線維芽細胞（Ｙ−ＳＣおよびＡ−ＳＣ−ここで「ＳＣ」は「体細胞」を表す）ならびにＹ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣのマイクロアレイ解析は、ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ３ベータ（ＤＮＭＴ３ｂ）遺伝子（（Ｋｉｍら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６６（４）：５９６−６１２（２００９年））に概説された遺伝子）の異なる調節を明らかにした。ＤＮＭＴ３ｂとは対照的に、ＤＮＭＴ３ａのレベルは、様々な細胞型間で類似していた。この知見は、ＤＮＭＴ３ｂのｍＲＮＡレベルが線維芽細胞において最も低く、ＥＳＣにおいて最も高いというｑ−ＰＣＲ（図７Ｂ）によってさらに裏付けられた。ＤＮＡメチル化におけるＤＮＭＴ３ｂの役割を考慮し、本発明者らは、ＤＮＭＴ３ｂの不十分な活性化がＡ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮプロモーターの異なるメチル化の原因であり得ると仮定する。さらに、ＤＮＭＴ３ｂはＡ−ｉＰＳＣ細胞で過剰発現され、ＺＳＣＡＮ１０過剰発現と同じ結果を達成することができる。したがって、Ａ−ｉＰＳ細胞へのＤＮＭＴ３ｂの外因性導入は、減少したＺＳＣＡＮ１０発現に関連する、これらの細胞または任意の幹細胞／ｉＰＳ細胞の発がん性を低下する可能性がある。
【０１６４】
実施例７
Ａ−ｉＰＳＣにおけるＨ２Ｏ２／グルタチオンホメオスタシスの不均衡、およびＡ−ｉＰＳＣにおける過剰に活性化されたＧＰＸ２の減少を介するＺＳＣＡＮ１０による回復
実施例５に記載されているように、Ａ−ｉＰＳＣの異常ＤＮＡ損傷応答およびＺＳＣＡＮ１０によるその修復もまた、放射線照射およびＨ２Ｏ２のような様々なＤＮＡ損傷剤への応答により確認された。ＤＮＡ損傷剤はＨ２Ｏ２を誘発し、ゲノム損傷を引き起こすことができる。Ｈ２Ｏ２に対する正常な細胞応答は、（１）Ｈ２Ｏ２がグルタチオンによって除去されてゲノム安定性を維持し得ること、および（２）Ｈ２Ｏ２自体がＡＴＭのようなＤＮＡ損傷応答経路を活性化するシグナル伝達分子として働くこと、の２つの異なる機構を含む。より低いグルタチオンおよびより高いＨ２Ｏ２活性を伴うグルタチオン−Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスの不均衡は、ゲノム損傷を誘発してＤＮＡ損傷応答を誘発する。逆に、Ｈ２Ｏ２の除去を促進し、Ｈ２Ｏ２活性を低下させる、より高いグルタチオン活性は、ＤＮＡ損傷応答を鈍らせ、損傷した細胞は消失せず、ゲノム不安定性をもたらす。したがって、グルタチオン−Ｈ２Ｏ２調節のホメオスタシスは、全体のゲノム安定性を維持する上で重要な役割を果たす。
【０１６５】
グルタチオン−Ｈ２Ｏ２の状態を決定するために、グルタチオンの酸化能ならびにＨ２Ｏ２除去活性（最大酸化能）を様々なｉＰＳＣ株で評価した。グルタチオンの細胞内還元型および酸化型の比率（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）は、細胞レドックス状態、酸化ストレスの程度および細胞の抗酸化能の指標としてしばしば用いられる。グルタチオン解析は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｋ２６４−１００）を用いて行った。図８Ａに示すように、Ａ−ｉＰＳＣは過度の酸化能を示し、これはＺＳＣＡＮ１０の一過性発現によってＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣのレベルへと正常化された。Ｈ２Ｏ２除去活性を、活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１３８５１）を用いて測定した。Ａ−ｉＰＳＣは、ＴＢＨＰ（ｔｅｒｔ−ブチル過酸化水素；安定な化学形態のＨ２Ｏ２、３時間）の処理に対する減少した応答を伴う、強いＨ２Ｏ２除去活性を示す（図８Ｂ）。ＺＳＣＡＮ１０発現時、上昇したグルタチオン活性は、Ｙ−ｉＰＳＣ／ＥＳＣに見られるものと同等のレベルにまで低下した（図８Ａおよび８Ｂ）。
【０１６６】
Ａ−ｉＰＳＣにおいてＨ２Ｏ２を除去するグルタチオンの酸化能が、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣと比較して上昇する機構をさらに評価した。異なる細胞株間の比較遺伝子発現解析により、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０と比較してＡ−ｉＰＳＣにおいて上方調節または下方調節された候補遺伝子、ならびにＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０、ＥＳＣ、およびＹ−ｉＰＳＣにおいて同様のレベルで発現された候補遺伝子の同定がもたらされた。グルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）遺伝子はＡ−ｉＰＳＣにおいて過剰発現され、その発現はＺＳＣＡＮ１０発現によって正常化された（図９Ａ）。
【０１６７】
ＧＰＸ２は、グルタチオン媒介性除去活性を調節するＨ２Ｏ２スカベンジャータンパク質である。ＧＰＸ２の過剰レベルがＡ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオン−Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスの不均衡の原因であるかどうかを検証するために、Ａ−ｉＰＳＣにおいてＧＰＸ２がｓｈＲＮＡを用いて阻害された。Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２のノックダウンは、グルタチオン−Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスを正常化し（図９Ｂおよび９Ｃ）、アポトーシスを増加させ（図９Ｄ）、ＤＮＡ損傷応答を回復させた（図９Ｅ）。
【０１６８】
実施例８
ＧＬＵＴ３遺伝子発現は、Ｙ−ｉＰＳＣでは有意に増加しているが、Ａ−ｉＰＳＣでは増加していない
細胞の再プログラミング中に生じる生物学的プロセスのより深い理解を得るために、革新的なアプローチが、老齢の体細胞の再プログラミングに重要なさらなる因子を明らかにするために取られた。フレオマイシン処理（３０μｇ／ｍｌ、２時間）の存在下または非存在下でのＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、およびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０の比較ゲノム解析により、多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ３の同定をもたらした。図１０Ａは、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣと比較して、Ａ−ｉＰＳＣにおける不十分な活性化ＧＬＵＴ３を示す。
【０１６９】
グルコース代謝は、様々な組織の微小環境内で細胞のホメオスタシスを維持するために不可欠である。ほとんどの体細胞は、酸素の存在下で酸化的リン酸化を介して各グルコース分子から３６のＡＴＰを生成し、対照的に、ＥＳＣは解糖を用いて酸素の非在下で各グルコースから２個のＡＴＰを生成する。ｉＰＳＣの再プログラミング中、グルコース代謝は、体細胞特異的酸化的リン酸化からＥＳＣ特異的解糖に移行する。ＥＳＣ特異的解糖は、同じ量のＡＴＰを生成するために酸化的リン酸化よりも１８倍多いグルコースを消費するが、解糖の利点は、ゲノム変異を引き起こし得るＨ２Ｏ２をより少なく生産しながらＡＴＰを生成することである。
【０１７０】
マウスＡ−ｉＰＳＣの状況におけるグルコース代謝におけるＧＬＵＴ３の役割を調べるために、マウスＥＳおよびｉＰＳ細胞株で細胞内グルコース取り込みを観察した。Ａ−ｉＰＳＣは、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣよりも１８倍少ないグルコースを取り込み（図１０Ｂ）、酸化的リン酸化によって測定される、より高い酸素消費速度を有する（図１０Ｃ）。これらの結果は、Ａ−ｉＰＳＣがＥＳＣ特異的解糖系に切り替えるのではなく、体細胞特異的酸化的リン酸化を介してＡＴＰを生成し続けることを示唆している。
【０１７１】
体細胞からｉＰＳＣへの移行中、ＧＬＵＴ３遺伝子発現は、Ｙ−ｉＰＳＣでは有意に増加するが、Ａ−ｉＰＳＣではそうならない（図１０Ａ）。興味深いことに、ＧＬＵＴ３発現は、ＺＳＣＡＮ１０によって誘導され（図１０Ａ）、ＺＳＣＡＮ１０およびＧＬＵＴ３活性の消失がＡ−ｉＰＳＣにおいて機構的に関連することを示唆している。実際、ＧＬＵＴ３の発現の増加は、ＺＳＣＡＮ１０の発現の増加が示すようなＤＮＡ損傷応答の回復も示し（図１０Ｄ）、機構的な関連の仮説を裏付けている。ＧＬＵＴ３を標的とするＺＳＣＡＮ１０の能力を検証するために、本発明者らは、ＺＳＣＡＮ１０がＧＬＵＴ３のプロモーターに結合する能力を、クロマチンＩＰ解析を用いて試験した。図１０Ｅに示すように、ＺＳＣＡＮ１０は、ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣにおいてＧＬＵＴ３プロモーターに結合する。
【０１７２】
ＧＬＵＴ３発現がＺＳＣＡＮ１０によって誘導されること、および酸化的リン酸化がＤＮＡ損傷応答を誘発することが知られているＨ２Ｏ２の産生を誘導していることを考えると、Ａ−ｉＰＳＣにおけるこの応答の減少は発がん性の増加に寄与する可能性がある。実際、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＬＵＴ３の過剰発現が正常なＲＯＳレベルを回復する一方で、Ｙ−ｉＰＳＣにおけるＧＬＵＴ３の下方調節は、ＲＯＳレベルを低下した（図１０Ｆ）。さらに、グルタチオンレベルは、ＧＬＵＴ３の過剰発現時に、Ａ−ｉＰＳＣにおいて正常（ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣにおいて観察されたものと同様に）に減少した（図１０Ｇ）。
【０１７３】
まとめると、本明細書に示されたデータは、低いＺＳＣＡＮ１０発現の結果として（または独立して）、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＬＵＴ３の不十分な活性化が、酸化的リン酸化の過剰活性化およびＨ２Ｏ２産生の増加をもたらし、これがグルタチオンを誘導するモデルを示唆する。
【０１７４】
机上の実施例１
予備解析の一部として、本発明者らは、様々なタイプのｉＰＳＣ（Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０）とＥＳＣとの間の主な相違点を決定しようとした。ＥＳＣ対Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、およびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０のマイクロアレイ解析は、示差的に発現される遺伝子のセットを明らかにした。
【０１７５】
表１は、特定の群の中で差異的に調節される遺伝子の数を示す。平均Ｚスコア解析を用いて、差異的発現の倍数変化に基づいてグループ分けした遺伝子が決定された。表中のスコアが高いほど、ＥＳＣとの発現の差が顕著であることを意味する。
【０１７６】
表１に要約したデータは、Ｙ−ｉＰＳＣとＥＳＣとの間で差異的に発現する遺伝子の数よりも少ない数の遺伝子がＥＳＣと比較したＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０において差異的に発現することを示す。これらの結果は、少なくとも遺伝子全体の発現レベルで、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０はＡ−ｉＰＳＣと比較して、ＥＳＣとより多くの類似点を共有しているだけでなく、Ｙ−ｉＰＳＣと比較しても、ＥＳＣとより多くの類似点を共有することを示唆している。この観察がコア多能性ネットワーク遺伝子の解析にも反映されていることを確認するために、異なるｉＰＳＣ株およびＥＳＣ間のコア多能性ネットワーク遺伝子の発現を行った。表２に示すように、表１で観察されたのと同様に、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１とＥＳＣの間で差異的に発現する遺伝子の数は、Ｙ−ｉＰＳＣとＥＳＣとの間で差異的に発現される遺伝子の数より少なかった。まとめると、このデータは独自の特徴を示唆している
【０１７７】
今後の実験では、遺伝子発現に関して、ＺＳＣＡＮ１０を補充したＡ−ｉＰＳＣがＹ−ｉＰＳＣよりＥＳＣに近い理由についてのさらなる検討が含まれる。これは、老齢の体細胞およびＡ−ｉＰＳＣに負の影響を与えるエピジェネティックな変化（例えばＡ−ｉＰＳＣのブロック分化、Ａ−ＩＰＳＣに由来する細胞の移植時の発がん性の促進）のより深いレベルの解析の一部となるだろう。例えば、Ａ−ｉＰＳＣの不十分な組織分化能を回復するＺＳＣＡＮ１０の能力が評価される。ＺＳＣＡＮ１０補充後、Ａ−ｉＰＳＣは未処理Ａ−ｉＰＳＣと比較して実質的に改善された組織分化を示すことが予想される。したがって、組織分化能は、ＺＳＣＡＮ１０補充によって改善される（そして、ＺＳＣＡＮ１０レベルを測定するか、または本明細書に記載の別のサロゲートマーカーのレベルを測定し、そのレベルをＹ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣの対照のレベルと比較することによって評価できる）Ａ−ｉＰＳＣの品質の別の側面である。
【０１７８】
【表１】
2017536132.tif 000003
【０１７９】
【表２】
2017536132.tif 000004
【０１８０】
さらに、ＥＳＣとＹ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、またはＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０との間で最も顕著に差異的に発現する遺伝子のＤＮＡメチル化状態を評価する。この解析の目的の１つは、既に観察されたＤＮＡメチル化の差異（ＺＳＣＡＮ１０補充の非存在下でのＥＳＣとＡ−ｉＰＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣとの比較）が、表１および表２に概要を示した遺伝子発現パターンと同じパターンに従うかどうかを検証することである。ＺＳＣＡＮ１０補充のＡ−ｉＰＳＣのメチル化パターンは、遺伝子発現パターンと同様に、Ｙ−ｉＰＳＣよりもＥＳＣのメチル化パターンに近いことが予想される。
【０１８１】
同じ実験を、Ａ−ｉＰＳＣにおいて、ＺＳＣＡＮ１０補充の代わりにＧＬＵＴ３補充を用いて繰り返すことができる。結果は質的に同じであると予想される。
【０１８２】
【表３】
2017536132.tif 000005
【０１８３】
実施例９
ＺＳＣＡＮ１０はエキソソームに結合して上方調節する
さらなる研究において、本発明者らは、Ａ−ｉＰＳＣにおいてＺＳＣＡＮ１０がＧＰＸ２の発現を阻害する機構のより良い理解を得ることを試みた。ＧＰＸ２配列の解析は、ＧＰＸ２遺伝子が高度に保存されたＡＲＥ配列を含むことを明らかにした（Ｓｉｎｇｈら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３５（６）：６３９−５０（２００６年））。興味深いことに、ｍＲＮＡの分解を媒介するエキソソームはＡＲＥ配列を標的にしてｍＲＮＡの崩壊を誘導することが知られている（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２１（１−２）：１６５−１７４（２００２年）；ＳｃｈｍｉｄらＴｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２００８年１０月；３３（１０）：５０１−１０．）。
【０１８４】
ｍＲＮＡ代謝回転は、一連のタンパク質をコードする転写物のレベルの調節において役割を果たす高度に調節されたプロセスである（Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．  １３（４）：２４６−２５９（２０１２年））。ＧＰＸ２におけるＡＲＥ配列の存在を考慮して、本発明者らは、Ａ−ｉＰＳＣにおいて上方調節された６０個の遺伝子（Ｙ−ｉＰＳＣ／ＥＳＣおよびＡ−ｉＰＳＣ−ｚｓｃａｎ１０と比較して上方調節）のＡＲＥ配列の濃縮解析を実施した。遺伝子濃縮解析（図１１Ａのヒストグラム）は、任意の存在する転写物がＵＵＡＵＵＵＡ（Ａ／Ｕ）（Ａ／Ｕ）のＡＲＥ配列を持つ可能性が７であるので、ランダムな機会のみに基づいて６０個の遺伝子サンプル中においてＡＲＥ配列を含む１４個の遺伝子を見つけるという確率は非常に低い（ｐ＝０．０１２２４）ことを示す。対照群は、マイクロアレイＩＬＬＵＭＩＮＡ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｍｏｕｓｅｒｅｆ−８  ｖ２．０に基づく１８，２９９個の非重複最長アンサンブル転写産物であった。このように、Ａ−ｉＰＳＣの濃縮解析は、ＡＲＥ配列を持つ遺伝子の大幅な上方調節を示し、これは非機能性のエキソソームの結果である可能性が高い。
【０１８５】
ＺＳＣＡＮ１０に関連するタイプの相互作用をより深く理解するために、クロマチンＩＰとＤＮＡ配列決定を組み合わせたクロマチン免疫沈降シーケンシング（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）を行った。ＣｈＩＰ−ＳｅｑはＤＮＡ−タンパク質相互作用を検出するので、ＺＳＣＡＮ１０によって制御されるタンパク質のネットワークに関する知識を提供することができる。このエキソソームは１１のエキソヌクレアーゼの複合体を構成する。ＺＳＣＡＮ１０がＡ−ｉＰＳＣにおいてエキソソームを介してＧＰＸ２を制御するという仮説を検証するために、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑを実施し、結果は、実際にＺＳＣＡＮがエキソソームサブユニットに結合することを示した。ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣを本研究における対照として使用した。さらに、図１１Ｂに示すように、ＺＣＳＡＮ１０はエキソソームを上方調節する。Ａ−ｉＰＳＣは、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣよりもエキソソームコアサブユニットＥＸＯＳＣ１、ＥＸＯＳＣ２およびＥＸＯＳＣ５の低いｍＲＮＡレベルを含む。重要なことに、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の過剰発現は、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣで観察されるものに匹敵するＥＸＯＳＣ１、ＥＸＯＳＣ２およびＥＸＯＳＣ５レベルの回復をもたらし、ＺＳＣＡＮ１０が様々なエキソソームサブユニットの発現を調節することを確認した。内在性ｍＲＮＡレベルをβ−アクチンに対して標準化した。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
【０１８６】
実施例１０
ＡＲＥ配列を介したＺＳＣＡＮ１０によるＧＰＸ２の調節は、エキソソームによって媒介される
実施例９に記載された所見の機能的関連性を拡大するために、高レベルのエキソソームを含むＥＳＣ（図１１Ｂ）において、ＥＸＯＳＣ２、ＥＸＯＳＣ８、またはその両方を枯渇させた。ｓｈＲＮＡを用いたエキソソームのノックダウン後、ＧＰＸ２のｍＲＮＡをＱ−ＰＣＲにより決定した。ＥＳＣは低い発現レベルのＧＰＸ２を含むが、エキソソームの枯渇はＧＰＸ２のｍＲＮＡの劇的な増加をもたらした（図１２Ａ）。この増加は、Ａ−ｉＰＳＣで観察されたレベルと同様であった。ＤＮＡ断片化アッセイは、エキソソーム欠損細胞が、Ａ−ｉＰＳＣのような、フレオマイシン処理（２時間、３０μｇ／ｍｌ）後の低いアポトーシス応答を示すことを実証し（図１２Ｂ）、ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、グルコース代謝およびゲノム安定性をＹ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣとおよそ同じレベルに維持することにおけるエキソソームの機能的重要性をさらに確認した（図１２Ｂ）。
【０１８７】
実施例１１
ドナーに依存して、老齢のヒトドナー由来のｉＰＳ細胞は、異なる再プログラミング効率、ＤＮＡ損傷応答、および構造的染色体異常を示す
実施例１に開示された所見は、老齢マウスに由来するｉＰＳ細胞が、若年マウス由来で製造されるｉＰＳＣより高いゲノム不安定性および低いアポトーシス活性を示すことを示した。動物細胞で観察された結果がヒト細胞に匹敵するかどうかを調べるために、若年者および高齢者に由来するｉ−ＰＳＣを作製し、それらの再プログラミング効率を評価した。図１３Ａに示すように、マウスで観察された老化表現型もヒトＡ−ｉＰＳＣに存在していた。しかしながら、同様の年齢の個人間でプログラミング効率に有意差があった。ヒトｉＰＳＣにおけるＤＮＡ損傷応答を解析し、再プログラミング効率に関する知見と合致しているかどうかを検証するために、細胞を２本鎖破壊誘発薬剤フレオマイシン（３０μｇ／ｍｌ）で４時間処理した。
【０１８８】
イムノブロット分析は、特定のドナーからのＡ−ｉＰＳＣにおける鈍いＤＮＡ損傷応答を明らかにした（図１３Ｂ、ドナーＡＧ４、ＡＧ８、「Ｂ」および「Ｓ」を参照されたい）。さらに、ドナーＡＧ４からのＡ−ｉＰＳＣの核型検査は構造的染色体異常を示した（図１３Ｃ）。ドナーＡＧ８由来のＡ−ｉＰＳＣに関して、結果は最終的なものではなく、この患者由来のＡ−ｉＰＳＣが正常または異常なＤＮＡ損傷応答を示すか否かについてさらに確認される。最後に、異なるマウス株から生成されたＡ−ｉＰＳＣについても同様の結果が得られた。遺伝的バックグランドがＤＮＡ損傷応答に影響するか否かを決定するために、２つの異なるマウス株からＡ−ｉＰＳＣを生成し、フレオマイシン（３０μｇ／ｍｌ）で４時間処理した。ｐ５３タンパク質レベルをＤＮＡ損傷応答の指標として使用した。図１３Ｄに示すように、Ｂ６１２９バックグラウンドのマウスに由来するＡ−ｉＰＳＣが、より高い頻度で正常なＤＮＡ損傷応答（ｐ５３の活性化によって示される）を示す一方で、Ｂ６ＣＢＡバックグラウンドのマウス由来のＡ−ｉＰＳＣは、鈍化したＤＮＡ損傷応答を示した。これらの所見は、再プログラミング効率、染色体安定性、ならびにＡ−ｉＰＳＣに関連するＤＮＡ損傷応答が、それらが由来する個体または動物の遺伝的バックグランドに実質的に一部は依存することを示している。それにもかかわらず、本開示の材料および試薬の使用は、それらが遺伝的特性またはエピジェネティックな形質のいずれかまたはその両方に作用するかどうかにかかわらず、Ａ−ｉＰＳＣの品質を改善するであろう。
【０１８９】
６個の追加のヒトＡ−ｉＰＳＣクローンの分析が、不完全なＤＮＡ損傷応答を明らかにする（図１３Ｅ）一方で、「Ａ−ｉＰＳＣ−アウトライアー」と呼ばれる１つのＡ−ｉＰＳＣクローンはＡＴＭのリン酸化によって示されるＤＮＡ損傷応答の適切な活性化を示した。不完全なＤＮＡ損傷応答を示したヒトＡ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の過剰発現は、その異常を救済した（図１３Ｈ）。図１３Ｇおよび１３Ｈの比較は、ヒトＡ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の過剰発現が、ヒトＹ−ｉＰＳＣにおいて観察されるものと同様のＤＮＡ損傷応答の回復をもたらすことを示す（図１３Ｇ）。
【０１９０】
「Ａ−ｉＰＳＣアウトライアー」は、ＺＳＣＡＮ１０の正常な発現レベルのために適切なＤＮＡ損傷応答を維持すると仮定された。確かに、本発明者らは、「Ａ−ｉＰＳＣアウトライアー」におけるＺＳＣＡＮ１０のｍＲＮＡ発現はＥＳＣで観察されるレベルと同様であるが、一方で不完全なＤＮＡ損傷応答を示すクローンにおけるＺＳＣＡＮ１０発現は低いことを観察した（図１３Ｉ）。ＺＳＣＡＮ１０のｍＲＮＡレベルは、Ａ−ｉＰＳＣが適切なＤＮＡ損傷応答を誘発する能力と相関するため、ＺＳＣＡＮ１０は、ゲノム完全性の適切なバイオマーカーとして役立ち得、ここでより高いＺＳＣＡＮ１０レベルが改善されたゲノム完全性と相関する。
【０１９１】
実施例１２
ＺＳＣＡＮ１０はＧＳＳに結合し、その発現を下方調節する
実施例８で議論したように、グルコース代謝は、組織ホメオスタシスおよび再プログラミングの両方に必須である。グルタチオン合成酵素（ＧＳＳ）は、γ−グルタミルシステイン（ｃ−ＧＣ）およびグリシンからのＧＳＨの合成の第２段階および最終段階を触媒する酵素である。ＥＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０結合部位のゲノムワイドマッピングは、ＧＳＳを含む３５００個を超える標的遺伝子を同定した（Ｙｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８４（４５）：３１３２７−３１３３５（２００９年））。したがって、アポトーシスおよびＤＮＡ損傷応答におけるグルタチオン活性の重要性を考慮すると、ＺＳＣＡＮ１０は、少なくとも部分的に、特にヒトにおいて、ＧＳＳを介してその機能を発揮し得ると仮定された。
【０１９２】
この仮説を検証するために、ＺＳＣＡＮ１０がＧＳＳプロモーターに直接的に結合する能力をマウス細胞で最初に試験した。Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ＩＰ（ＣｈＩＰ）ｑＰＣＲは：（１）タンパク質をＤＮＡに架橋すること；（２）クロマチンを単離すること；（３）クロマチン断片化；（４）目的タンパク質に対する抗体による免疫沈降；（５）ＤＮＡ回収；および（６）ＤＮＡ配列に関連する因子のＰＣＲ同定、を含む、ＣｈＩＰの一般的な工程を使用して実施した。本実施例では、ＩｇＧアイソタイプを陰性対照として用いる一方で、ＺＳＣＡＮ１０特異的抗体を用いてＺＳＣＡＮ１０−ＤＮＡ複合体をプルダウンした。ＤＮＡの回収後、ＧＳＳ特異的プライマーをＧＳＳプロモーター配列の検出に使用した。実験はＹ−ｉＰＳＣとＡ−ｉＰＳＣの両方で行った。図１４Ｂに示すように、ＧＳＳプロモーターへのＺＳＣＡＮ１０の結合はマウスＹ−ｉＰＳおよびＡ−ｉＰＳ細胞の両方で検出されたが、ＩｇＧ対照はＧＳＳプロモーターのｑＰＣＲによる検出をもたらさなかった。
【０１９３】
ＧＳＳ発現の調節におけるＺＳＣＡＮ１０の役割をさらに確認するために、ＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、およびＡ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０細胞でＧＳＳのｍＲＮＡレベルを評価した。図１４Ｃに示すように、ヒトＡ−ｉＰＳＣは、Ｙ−ｉＰＳＣおよびＥＳＣと比較して有意に高いレベルのＧＳＳを発現する。重要なことに、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の過剰発現は、ＥＳＣおよびＹ−ｉＰＳＣで観察されるレベルと匹敵するレベルまたはそれ以下のレベルへのＧＳＳの下方調節をもたらす。
【０１９４】
まとめると、図１４Ｂ〜１４Ｄに記載される結果は、ＺＳＣＡＮ１０がＧＳＳプロモーターへの直接結合を介してＧＳＳ発現を調節することを実証する（図１４Ａ）。これらの知見は、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳの阻害が、Ａ−ｉＰＳＣにおけるもののようなＺＳＣＡＮ１０発現の低下によるｉＰＳ細胞の発がん性を、低下することを示唆する。これは以下の実験で確認された。
【０１９５】
実施例１３
過剰活性化されたＧＳＳの減少を介したＺＳＣＡＮ１０によるＡ−ｉＰＳＣにおけるアポトーシスおよびＤＮＡ損傷の異常の回復
実施例１２に記載された所見を考慮し、本発明者らはさらに、アポトーシスおよびＤＮＡ損傷応答を含むがこれに限定されないヒト細胞の発がん性に関連するプロセスにおいてＧＳＳが役割を果たすと仮定した。アポトーシスにおけるＧＳＳの役割を評価するために、ＤＮＡ断片化アッセイを実施した。簡単に説明すると、マウスＥＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ−ＧＳＳ、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣＺＳＣＡＮ１０およびＧＳＳのｓｈＲＮＡ発現を含むＡ−ｉＰＳＣのＤＮＡ断片化アッセイを行った（図１４Ｄ）。簡潔には、細胞を３０μｇ／ｍｌのフレオマイシンで２時間処理し、フレオマイシン処理の１５時間後に分析のためにサンプルを回収した。蛍光を画像定量解析によって決定した。実施例１（図２）に見られる観察と同様に、より低いアポトーシス応答がＡ−ｉＰＳＣにおいて検出され、これはＺＳＣＡＮ１０過剰発現（Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０）によって回復した（図１４Ｄ）。さらに、ｓｈＲＮＡを用いたＡ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳのノックダウン（Ａ−ｉＰＳＣ−ｓｈＧＳＳ）は、これらの細胞におけるアポトーシス異常を救済した（図１４Ｄ）。アポトーシス応答のような発がん性を媒介するＧＳＳの役割のさらなる実証として、Ｙ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳの過剰発現が、Ｙ−ｉＰＳＣと比較してより低いアポトーシス応答を生じた（図１４Ｄ）。まとめると、これらの所見は、ＧＳＳ阻害が、Ａ−ｉＰＳＣに関連するより低いアポトーシス応答を回復させることを示す。
【０１９６】
実施例５は、Ａ−ｉＰＳＣにおいて異常なＤＮＡ損傷応答が、ＺＳＣＡＮ１０の一過性発現で回復されることを実証した。Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳの役割をさらに明らかにするために、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ｓｈＧＳＳ（図１４Ｅ）およびＹ−ｉＰＳＣ−ＧＳＳ（図１４Ｆ）において、フレオマイシン処理（２時間、３０μｇ／ｍｌ）を行った。細胞を回収し、ｐ−ＡＴＭ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。β−アクチンをローディング標準として使用した。図１４Ｅに示すように、ｓｈＲＮＡを用いたＡ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳの阻害は、ＡＴＭリン酸化を回復させた。さらに、Ｙ−ｉＰＳＣにおけるＧＳＳの過剰発現は、ＡＴＭリン酸化をもたらさなかった（図１４Ｆ）。したがって、ＧＳＳ発現はＤＮＡ損傷応答の異常をもたらす一方で、ＧＳＳ阻害は異常を救済する。
【０１９７】
次いで、本発明者らは、ヒト細胞におけるＧＳＳレベルを評価しようと試みた。マウスのデータによると、ＧＳＳレベルは、ヒトＥＳＣで観察されたレベルと比較して不完全なＤＮＡ損傷応答を示すＡ−ｉＰＳＣにおいて有意に高かった（図１４Ｇ）。さらに、正常なＤＮＡ損傷応答を示すＡ−ｉＰＳＣ細胞は、低レベルのＧＳＳを示し（図１４Ｇ）、ＺＳＣＡＮ１０と同様の概念を支持し、ＧＳＳはゲノム完全性の良好なバイオマーカーとしても役立ち得る。
【０１９８】
まとめると、これらの結果は、過剰活性化されたＧＳＳが、Ａ−ｉＰＳＣにおいて観察される異常なアポトーシスおよび異常なＤＮＡ損傷応答の両方を媒介する一方で、ＧＳＳの阻害は、それらの異常の回復を導くことを示す。
【０１９９】
実施例１４
ＺＳＣＡＮ１０の添加によるＡ−ｉＰＳＣの再プログラミングおよび多能性改善
次いで、本発明者らは、線維芽細胞（Ａ−ＳＣ、Ｙ−ＳＣ）、ｉＰＳＣ（Ａ−ｉＰＳＣ、Ｙ−ｉＰＳＣ、Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０）およびＥＳ細胞（ＥＳＣ）の異なる型のマウス細胞間の有意差を決定しようと試みた。図１５Ａは、各細胞型の全遺伝子発現プロファイルを使用する主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図１５Ｂは、遺伝子発現プロファイル全体の教師なしクラスタリング分析を示す。図１５Ｂのヒートマップは、ピアソン相関係数によって測定されたペアワイズ遺伝子発現類似性を示す。最後に、図１５Ｃは、線維芽細胞および種々のｉＰＳ細胞におけるＥＳ細胞特異的遺伝子の相対発現レベルのヒートマップを示す。ＥＳ細胞特異的遺伝子は、成人および若年の線維芽細胞における平均発現よりもＥＳ細胞において３倍またはそれ以上の発現レベルを有するものとして定義された。ヒートマップは、ＥＳ細胞に対する相対発現の倍数差を示す。結果は表４にまとめられ、再プログラミングおよび多能性ネットワーク遺伝子がコア因子共占有によって定義される。７個のコア因子共占有（Ｋｉｍら、Ｃｅｌｌ  １３２（６）１０４９−６１（２００８年））とＥＳＣ特異的遺伝子の数（ＥＳＣにおいて、示されたサンプルを２倍またはそれ以上超える）との相関を試験して、多能性ネットワークと再プログラミングの間の機能的関連性を検証した。この分析で試験したコア因子は、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｄａｘ１、Ｎａｃ１およびＺｆｐ２８１である。ＥＳＣにおいて豊富な遺伝子の数およびそれらのコア因子共占有（７ＴＦから０ＴＦまで）が示されている。
【０２００】
【表４】
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【０２０１】
表４に示す結果は、Ｙ−ｉＰＳＣとＥＳＣとの間で示差的に発現される遺伝子の数よりも、ＥＳＣと比較してＡ−ｉＰＳＣにおいて、より多くの数の遺伝子が差異的に発現されることを示す。しかしながら、Ａ−ｉＰＳＣ細胞におけるＺＳＣＡＮ１０の過剰発現は、差異的に発現する遺伝子の数の減少をもたらした。さらに、ＺＣＳＡＮ１０の過剰発現は、Ｙ−ｉＰＳＣとＥＳＣとの間で観察される遺伝子発現の差異と同様の遺伝子発現の差異（Ａ−ｉＰＳＣ−ＺＳＣＡＮ１０とＥＳＣとの間の差異）を導く。したがって、Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０の発現は、再プログラミングおよび多能性特性においてＡ−ｉＰＳＣをＹ−ｉＰＳＣに似せることによって、再プログラミングおよび多能性ネットワークの全体的な遺伝子発現に影響を及ぼす。
【０２０２】
この開示に記載された研究から、ＺＳＣＡＮ１０は、誘導多能性幹細胞における重要な共調節因子であることが明らかになった。
【０２０３】
本開示の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されない。
【０２０４】
特許、特許出願または非特許文献であるかに関わらず、本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照によりそのすべてが組み入れられる。
【０２０５】
実施形態
Ａ．  Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、ゲノム安定性およびグルコース代謝の少なくとも１つの改善を改善するための使用であって、Ａ−ｉＰＳＣの再プログラミングの補助として、（ｉ）多能性因子ＺＳＣＡＮ１０；（ｉｉ）多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーターＧＬＵＴ３；および（ｉｉｉ）エキソソームサブユニットの少なくとも１つをＡ−ｉＰＳＣに補充して、前記ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、グルコース代謝およびゲノム安定性の少なくとも１つを実質的にＹ−ｉＰＳＣのレベルに近似するレベルに回復させることを含む、使用。
【０２０６】
Ｂ．  ＧＰＸ２またはＧＳＳの過剰発現が、以下の：
Ａ−ｉＰＳＣを多能性因子ＺＳＣＡＮ１０で補充すること；および／または
Ａ−ｉＰＳＣに多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーター３であるＧＬＵＴ３を補充すること；および
Ａ−ｉＰＳＣをエキソソームサブユニットで補充すること
の少なくとも１つによって阻害され、
前記補充は再プログラミング多能性因子を補助するものであり、かつ前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＤＮＡ損傷応答、アポトーシスおよびゲノム安定性の１つまたはそれ以上において実質的な救出を達成するのに有効な量である、
実施形態Ａの使用。
【０２０７】
Ｃ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣが維持されている培地にＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットを添加することによって行われる、実施形態ＡまたはＢの使用。
【０２０８】
Ｄ．  前記補充が、前記細胞において、ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの発現を増加させることによって実施される、実施形態Ａ〜Ｃの１つの使用。
【０２０９】
Ｅ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットのレベルを胚性幹細胞（ＥＳＣ）のそれらのレベルの約５０％またはそれ以上に回復させるのに十分である、実施形態Ａ〜Ｄの１つの使用。
【０２１０】
Ｆ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をＥＳＣのそれの約８０％〜約１２０％の範囲内に減少させるのに十分である、実施形態Ａ〜Ｅの１つの使用。
【０２１１】
Ｇ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのゲノム安定性をおよそＹ−ｉＰＳＣのそれにまで回復させるのに十分である、実施形態Ａ〜Ｆの１つの使用。
【０２１２】
Ｈ．  ゲノム安定性が、高三倍体クローンの発生によって測定される、実施形態Ａ〜Ｇの１つの使用。
【０２１３】
Ｉ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのアポトーシス率をほぼＹ−ｉＰＳＣのそれに回復させるのに十分である、実施形態Ａ〜Ｈの１つの使用。
【０２１４】
Ｊ．  前記アポトーシス率が、ＤＮＡ損傷剤に応答するＤＮＡ断片化アッセイによって測定される、実施形態Ｉの使用。
【０２１５】
Ｋ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答をほぼＹ−ｉＰＳＣのそれに回復させるのに十分である、実施形態Ａ〜Ｊの１つの使用。
【０２１６】
Ｌ．  ＤＮＡ損傷応答が、ＤＮＡ損傷剤に応答するＡＴＭまたはＨ２ＡＸのリン酸化によって測定される、実施形態Ｋの使用。
【０２１７】
Ｍ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をおよそＹ−ｉＰＳＣのそれに低下させるのに十分である、実施形態Ａ〜Ｋの１つの使用。
【０２１８】
Ｎ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２レベルをおよそＹ−ｉＰＳＣのそれまで低下させるのに十分である、実施形態Ｎの使用。
【０２１９】
Ｏ．  前記細胞におけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの発現が、前記細胞を、前記ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３の核酸を含むベクターでトランスフェクトすることによって増加する、実施形態Ａ〜Ｎの１つの使用。
【０２２０】
Ｐ．  前記ＺＳＣＡＮ１０をコードする核酸を含むベクターの発現が一過性である実施形態Ｏの使用。
【０２２１】
Ｑ．  老齢ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ａ−ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させるための使用であって、前記Ａ−ｉＰＳＣが若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して、過剰のグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、
前記方法が、
前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）の過剰発現を直接的および／または間接的に阻害することにより、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を阻害して前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオン／Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスを実質的に回復させることを含む、使用。
【０２２２】
Ｒ．  Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答およびゲノム安定性の少なくとも１つを改善するための方法であって、（ｉ）多能性因子ＺＳＣＡＮ１０、（ｉｉ）多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーターＧＬＵＴ３および（ｉｉｉ）エキソソームサブユニットの少なくとも１つをＡ−ｉＰＳＣに補充することを含み、それぞれが再プログラミングの補充として、前記ＤＮＡ損傷応答およびゲノム安定性の少なくとも１つを４−ｉＰＳＣのそれらに近似するレベルまで部分的または完全に回復する、方法。
【０２２３】
ＡＡ．  前記補充が、ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットを前記Ａ−ｉＰＳＣが維持されている培地に添加することによって行われる、実施形態ＱまたはＲの使用。
【０２２４】
ＢＢ．  前記補充が、前記細胞における、ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの発現を増加させることによって行われる、実施形態ＱまたはＲの１つの使用。
【０２２５】
ＣＣ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３のレベルを胚性幹細胞（ＥＳＣ）のそれらのレベルの約５０％またはそれ以上に回復させるのに十分である、実施形態ＱまたはＲの１つの使用。
【０２２６】
ＤＤ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をＥＳＣのそれの約８０％〜約１２０％の範囲内に減少させるのに十分である、先行する実施形態Ｏの１つの使用。
【０２２７】
ＥＥ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのゲノム安定性をおよそＹ−ｉＰＳＣのそれにまで回復させるのに十分である、先行する実施形態の１つの使用。
【０２２８】
ＦＦ．  ゲノム安定性が、高三倍体クローンの発生によって測定されるのと同様に測定される、先行する実施形態の１つの使用。
【０２２９】
ＧＧ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのアポトーシス率をほぼＹ−ｉＰＳＣのそれに回復させるのに十分である、先行する実施形態の１つの使用。
【０２３０】
ＨＨ．  前記アポトーシス率が、ＤＮＡ損傷剤に応答するＤＮＡ断片化アッセイによって測定される、実施形態ＧＧの使用。
【０２３１】
ＩＩ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答をほぼＹ−ｉＰＳＣのそれに回復させるのに十分である、先行する実施形態の１つの使用。
【０２３２】
ＪＪ．  ＤＮＡ損傷応答が、ＤＮＡ損傷剤に応答するＡＴＭまたはＨ２ＡＸのリン酸化によって測定される、実施形態ＩＩの使用。
【０２３３】
ＫＫ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をおよそＹ−ｉＰＳＣのそれに低下させるのに十分である、先行する実施形態の１つの使用。
【０２３４】
ＬＬ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＧＰＸ２レベルをおよそＹ−ｉＰＳＣのそれまで低下させるのに十分である、実施形態ＫＫの使用。
【０２３５】
ＭＭ．  前記細胞におけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３の発現が、前記細胞を、前記ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットの核酸を含むベクターでトランスフェクトすることによって増加する、先行する実施形態の１つの使用。
【０２３６】
ＮＮ．  前記ＺＳＣＡＮ１０またはエキソソームサブユニットをコードする核酸を含むベクターの発現が一過性である実施形態ＭＭの使用。
【０２３７】
ＯＯ．  誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させるための使用であって、前記細胞がゲノム不安定性、アポトーシスの異常、ＤＮＡ損傷応答の異常およびグルコース代謝における異常の１つまたはそれ以上を有し、かつ胚性幹細胞または若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して、過剰のグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、
前記方法が、
前記ｉＰＳＣにおけるグルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）の過剰発現を直接的および／または間接的に阻害することにより、前記におけるグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を阻害して前記ｉＰＳＣにおけるホメオスタシスを部分的または完全に回復させる、使用。
【０２３８】
ＰＰ．  老齢ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ａ−ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させるための使用であって、前記Ａ−ｉＰＳＣが若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して、過剰のグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、
前記方法が
前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）の過剰発現を直接的および／または間接的に阻害することにより、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を阻害して前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオン／Ｈ２Ｏ２ホメオスタシスを部分的にまたは完全に回復させることを含む、使用。
【０２３９】
ＱＱ．  誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の発がん性を低下させるための使用であって、前記細胞がゲノム不安定性、アポトーシスの異常、ＤＮＡ損傷応答の異常およびグルコース代謝における異常の１つまたはそれ以上を有し、かつ胚性幹細胞または若年ドナー由来の誘導多能性幹細胞（Ｙ−ｉＰＳＣ）と比較して、過剰のグルタチオン媒介性Ｈ２Ｏ２除去活性を示し、
前記方法が、
（ｉ）多能性因子ＺＳＣＡＮ１０、（ｉｉ）多能性幹細胞特異的グルコーストランスポーターＧＬＵＴ３および（ｉｉｉ）エキソソームサブユニットの少なくとも１つをＡ−ｉＰＳＣに補充することを含み、それぞれが再プログラミングの補充として、前記ＤＮＡ損傷応答、アポトーシス応答、グルコース代謝およびゲノム安定性の少なくとも１つをＹ−ｉＰＳＣまたはＥＳＣのそれらに実質的に同一のレベルまで実質的に回復する、使用。
【０２４０】
ＲＲ．  前記補充が、ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットを前記Ａ−ｉＰＳＣが維持されている培地に添加することによって行われる、実施形態ＰＰまたはＱＱの使用。
【０２４１】
ＳＳ．  前記補充が、前記細胞における、ＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３の発現を増加させることによって行われる、実施形態ＰＰまたはＱＱの使用。
【０２４２】
ＴＴ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるＺＳＣＡＮ１０および／またはＧＬＵＴ３および／またはエキソソームサブユニットのレベルを胚性幹細胞（ＥＳＣ）のそれらのレベルの約５０％またはそれ以上に回復させるのに十分である、実施形態ＳＳの使用。
【０２４３】
ＵＵ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣにおけるグルタチオンの酸化能をＥＳＣのそれの約８０％〜約１２０％の範囲内に減少させるのに十分である、実施形態ＰＰまたはＱＱの使用。
【０２４４】
ＶＶ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのゲノム安定性をおよそＹ−ｉＰＳＣのそれにまで回復させるのに十分である、実施形態ＰＰまたはＱＱの使用。
【０２４５】
ＷＷ．  ゲノム安定性が、異数性クローンの発生によって測定される、実施形態ＶＶの使用。
【０２４６】
ＸＸ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのアポトーシス率をほぼＹ−ｉＰＳＣのそれに回復させるのに十分である、実施形態ＰＰまたはＱＱの使用。
【０２４７】
ＹＹ．  前記アポトーシス率が、ＤＮＡ損傷剤に応答するＤＮＡ断片化アッセイによって測定される、請求項２６の使用。
【０２４８】
ＺＺ．  前記補充が、前記Ａ−ｉＰＳＣのＤＮＡ損傷応答をほぼＹ−ｉＰＳＣのそれに回復させるのに十分である、実施形態ＰＰまたはＱＱの使用。
【０２４９】
ＡＡＡ．  前記再プログラミング因子がＹａｍａｎａｋａ因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣである、実施形態Ｂの使用。
【０２５０】
ＢＢＢ．  前記再プログラミング多能性因子が、Ｙａｍａｎａｋａのそれらの群より選択され、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣの１つまたはそれ以上が以下の：因子（ＬＩＮ２８＋Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｐａｘ５ｓｈＲＮＡ、Ｃ／ＥＢＰａ、ｐ５３．ｓｉＲＮＡ、ＵＴＦ１、ＤＮＭＴｓｈＲＮＡ、Ｗｎｔ３ａ、ＳＶ４０ＬＴ（Ｔ）、ｈＴＥＲＴ）または化合物（ＢＩＸ−０１２９４、ＢａｙＫ８６４４、ＲＧ１０８、ＡＺＡ、デキサメタゾン、ＶＰＡ、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＰＤ０２５９０１＋ＣＨＩＲ９９０２１（２ｉ）、Ａ−８３−０１）のように置換されている、実施形態Ｂの使用。
【０２５１】
ＣＣＣ．  前記再プログラミング多能性因子が、Ｙａｍａｎａｋａのそれらの群より選択され、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＭＹＣの１つまたはそれ以上が以下の：ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８がＫｌｆ４およびＭＹＣと置換される；ｅｓｒｂがＫｌｆ４と置換される；ＳＶ４０  ＬＴ（Ｔ）がＫｌｆ４、ＭＹＣ、ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇと置換される；ＢＩＸ−０１２９４がＳＯＸ２およびＯＣＴ４と置換される；ＶＰＡがＫｌｆ４およびＭＹＣと置換される、のように置換されている、実施形態Ｂの使用。
【０２５２】
ＤＤＤ．  前記補充が、エキソソームサブユニットによって行われ、エキソソームサブユニットが、以下のＥＸＯＳＣ１、ＥＸＯＳＣ２、ＥＸＯＳＣ３、ＥＸＯＳＣ４、ＥＸＯＳＣ５、ＥＸＯＳＣ６、ＥＸＯＳＣ７、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＯＳＣ９、ＥＸＯＳＣ１０およびｈＤｉｓ３の１つまたはそれ以上である、実施形態Ａの使用。
【０２５３】
ＥＥＥ．  前記補充が、Ａ−ｉＰＳＣへのＤＮＡ遺伝子送達によって、またはＲＮＡ送達によって、またはタンパク質の送達によって行われる、実施形態Ｂの使用。
【０２５４】
配列表への手引き（配列番号）
配列番号１：ヒトＺＳＣＡＮ１０タンパク質配列
配列番号２：ヒトＺＳＣＡＮ１０ＤＮＡ配列
配列番号３：ヒトＺＳＣＡＮ１０転写変異体１、ＤＮＡ配列
配列番号４：ヒトＺｓｃａｎ１０転写変異体１、タンパク質配列
配列番号５：マウスＺＳＣＡＮ１０タンパク質配列
配列番号６：マウスＺＳＣＡＮ１０ＤＮＡ配列
配列番号７：マウスＺＳＣＡＮ１０転写変異体１、ＤＮＡ配列
配列番号８：マウスＺＳＣＡＮ１０転写変異体１、タンパク質配列
配列番号９：ヒトＧＰＸ２ＤＮＡ配列
配列番号１０：マウスＧＰＸ、ＤＮＡ配列
配列番号１１：ヒトＧＬＵＴ３、ＤＮＡ配列
配列番号１２：マウスＧＬＵＴ、ＤＮＡ配列
配列番号１３：ヒトＧＳＳ、タンパク質配列
配列番号１４：ヒトＧＳＳ、ゲノムＤＮＡ配列
配列番号１５：マウスＧＳＳ、ＤＮＡ配列
配列番号１６：マウスＧＳＳ、タンパク質配列
【０２５５】
ヒトＺｓｃａｎ１０
【表５】
2017536132.tif 000007
【表６】
2017536132.tif 000008
【表７】
2017536132.tif 000009
【表８】
2017536132.tif 000010
【表９】
2017536132.tif 000011
【０２５６】
マウスＺｓｃａｎ１０
【表１０】
2017536132.tif 000012
【表１１】
2017536132.tif 000013
【表１２】
2017536132.tif 000014
【表１３】
2017536132.tif 000015
【表１４】
2017536132.tif 000016
【０２５７】
ヒトＧＰＸ２転写物ｍＲＮＡ
【表１５】
2017536132.tif 000017
【表１６】
2017536132.tif 000018
【０２５８】
Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓグルタチオンペルオキシダーゼ２（Ｇｐｘ２）、ｍＲＮＡ
【表１７】
2017536132.tif 000019
【表１８】
2017536132.tif 000020
【０２５９】
ヒトおよびマウスのＧＬＵＴ３ＤＮＡ配列
【表１９】
2017536132.tif 000021
【表２０】
2017536132.tif 000022
【表２１】
2017536132.tif 000023
【表２２】
2017536132.tif 000024
【０２６０】
ヒトＧＳＳゲノムＤＮＡ
【表２３】
2017536132.tif 000025
【表２４】
2017536132.tif 000026
【表２５】
2017536132.tif 000027
【表２６】
2017536132.tif 000028
【表２７】
2017536132.tif 000029
【表２８】
2017536132.tif 000030
【表２９】
2017536132.tif 000031
【表３０】
2017536132.tif 000032
【表３１】
2017536132.tif 000033
【表３２】
2017536132.tif 000034
【表３３】
2017536132.tif 000035
【表３４】
2017536132.tif 000036
【表３５】
2017536132.tif 000037
【表３６】
2017536132.tif 000038
【表３７】
2017536132.tif 000039
【表３８】
2017536132.tif 000040
【表３９】
2017536132.tif 000041
【表４０】
2017536132.tif 000042
【表４１】
2017536132.tif 000043
【表４２】
2017536132.tif 000044
【表４３】
2017536132.tif 000045
【表４４】
2017536132.tif 000046
【表４５】
2017536132.tif 000047
【０２６１】
ヒトＧＳＳタンパク質配列
【表４６】
2017536132.tif 000048
【０２６２】
Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓグルタチオン合成酵素ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：６０１２ＩＭＡＧＥ：３５９３９１３）完全長ｃｄｓ
【表４７】
2017536132.tif 000049
【表４８】
2017536132.tif 000050
【０２６３】
グルタチオン合成酵素（ＧＳＳ）［Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ］タンパク質配列
【表４９】
2017536132.tif 000051
【表５０】
2017536132.tif 000052
【図１Ａａｎｄ１Ｂ】
2017536132.tif 000053
【図１Ｃａｎｄ１Ｄ】
2017536132.tif 000054
【図１Ｅ】
2017536132.tif 000055
【図１Ｆ】
2017536132.tif 000056
【図１Ｇ】
2017536132.tif 000057
【図２】
2017536132.tif 000058
【図３】
2017536132.tif 000059
【図４】
2017536132.tif 000060
【図５Ａ】
2017536132.tif 000061
【図５Ｂ】
2017536132.tif 000062
【図５Ｃ】
2017536132.tif 000063
【図５Ｄ】
2017536132.tif 000064
【図５Ｅ】
2017536132.tif 000065
【図６Ａ】
2017536132.tif 000066
【図６Ｂ】
2017536132.tif 000067
【図６Ｃ】
2017536132.tif 000068
【図６Ｄ】
2017536132.tif 000069
【図６Ｅ】
2017536132.tif 000070
【図６Ｆ】
2017536132.tif 000071
【図６Ｇ】
2017536132.tif 000072
【図７Ａ】
2017536132.tif 000073
【図７Ｂ】
2017536132.tif 000074
【図８Ａ】
2017536132.tif 000075
【図８Ｂ】
2017536132.tif 000076
【図９Ａ】
2017536132.tif 000077
【図９Ｂ】
2017536132.tif 000078
【図９Ｃ】
2017536132.tif 000079
【図９Ｄ】
2017536132.tif 000080
【図９Ｅ】
2017536132.tif 000081
【図１０Ａ】
2017536132.tif 000082
【図１０Ｂ】
2017536132.tif 000083
【図１０Ｃ】
2017536132.tif 000084
【図１０Ｄ】
2017536132.tif 000085
【図１０Ｅ】
2017536132.tif 000086
【図１０Ｆ】
2017536132.tif 000087
【図１０Ｇ】
2017536132.tif 000088
【図１１Ａ】
2017536132.tif 000089
【図１１Ｂ】
2017536132.tif 000090
【図１２Ａ】
2017536132.tif 000091
【図１２Ｂ】
2017536132.tif 000092
【図１３Ａ】
2017536132.tif 000093
【図１３Ｂ】
2017536132.tif 000094
【図１３Ｃ】
2017536132.tif 000095
【図１３Ｄ】
2017536132.tif 000096
【図１３Ｅ】
2017536132.tif 000097
【図１３Ｆ】
2017536132.tif 000098
【図１３Ｇ】
2017536132.tif 000099
【図１３Ｈ】
2017536132.tif 000100
【図１３Ｉ】
2017536132.tif 000101
【図１４Ａ】
2017536132.tif 000102
【図１４Ｂ】
2017536132.tif 000103
【図１４Ｃ】
2017536132.tif 000104
【図１４Ｄ】
2017536132.tif 000105
【図１４Ｅ】
2017536132.tif 000106
【図１４Ｆ】
2017536132.tif 000107
【図１４Ｇ】
2017536132.tif 000108
【図１５Ａ】
2017536132.tif 000109
【図１５Ｂ】
2017536132.tif 000110
【図１５Ｃ】
2017536132.tif 000111
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月20日(2017.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017536132000001.app
【国際調査報告】
2017536132.tif 000112
2017536132.tif 000113
2017536132.tif 000114
2017536132.tif 000115