(57)【要約】  本発明は、少なくとも２つの実質的に非混和性である液体間の界面を形成するように自己組織化する、ペプチドなどの両親媒性小分子を用いたエマルジョンの形成に関する。エマルジョンは、食品、化粧品、生活様式製品、被覆、触媒反応、カプセル化、薬物送達、および／または細胞アッセイなどにおける、さまざまな技術分野で用途を見出すことができる。また、そのようなエマルジョンの作製方法、加えてエマルジョンの安定性を特定の用途に合わせる方法も提供する。
2017517281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの実質的に非混和性である液体間の界面で形成された両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項２】
ペプチドが、長さが２〜５個のアミノ酸、または２〜４個のアミノ酸である、請求項１に記載の両親媒性ペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項３】
ペプチドが未修飾ペプチドである、請求項１または２に記載のエマルジョン。
【請求項４】
アミノ酸またはペプチドが修飾されたＮ末端を含む、請求項１または２に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項５】
アミノ酸またはペプチドのＮ末端アミノ酸が、アミドまたは他の適切な結合を介してアミノ酸へ結合する修飾基を含む、請求項４に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項６】
ペプチドのアミノ酸が１つまたは複数の芳香族基を含むように修飾されている、請求項４または５に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項７】
１つのまたは複数の芳香族基が、単一もしくは多数の環状構造（例えば、多環芳香族炭化水素）および／または複素環および／または単素環構造を含む、請求項６に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項８】
１つまたは複数の芳香族基が、１つ、２つ、３つ、または４つの縮合環構造を含み、それぞれの環が同一であるかまたは異なっていてよい、請求項７に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項９】
前記１つまたは複数の芳香族基が、アントラセン、アセナフテン、フルオレン、フェナレン、テトラセン、ピレン、フェナントレン、ナフタレンおよびクリセン（ｃｈｙｓｅｎｅ）、フェニルアセチル、ならびにプリン、ピリミジン、プテリジン、アロキサジン、フェノキサジンおよびフェノチアジンなどの複素環構造を含む、請求項６に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項１０】
１つまたは複数の芳香族基が、１つまたは複数の芳香族環上に存在する置換基によって前記アミノ酸へ結合する、請求項８または９に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項１１】
置換基が、反応性のＣ１−Ｃ４アルキル、アルキルオキシ、アルキルアミノ、リン酸、カルボン酸、アミノ、アルコール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン化物、または１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを含む、請求項１０に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項１２】
１つまたは複数の芳香族基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボナート（ＦＭＯＣ−）Ｓｕ）、Ｃ１−Ｃ４アルキル置換ピレン、ならびに天然および合成ヌクレオチドなどの構造を含む、フレン（ｆｕｒｅｎｅ）、ピレン、プリン、およびピリミジンを含む、請求項７から１１に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項１３】
アミノ酸またはペプチドが、Ｎ末端において、Ｃ末端において、および／またはペプチド骨格上に修飾を含んでおり、例えば１つまたは複数のアミノ酸がリン酸化されている、請求項１から１２のいずれか１項に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項１４】
配列ＹＬ、ＹＡ、ＹＳ、ＦＦ、ＦＦＦ、およびＹＬ（アミノ酸を識別する一般的な１文字コードを使用している）を含むかまたはこれらからなる、請求項１から１３のいずれか１項に記載の両親媒性ペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項１５】
ＦＭＯＣまたはピレン基を含むようにＮ末端アミノ酸（すなわち、例えば、ＹＬの場合はＹ）において修飾されている、請求項１３に記載の両親媒性ペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項１６】
配列ＫＹＷ、ＫＦＦ、ＫＹＦ、ＦＦＤ、またはＤＦＦを含むかまたはこれらからなる、請求項１または２に記載の両親媒性ペプチドの自己組織化ネットワークを含む、エマルジョン。
【請求項１７】
塩が存在しないとき、少なくとも１週間、２週間、４週間、２カ月、６カ月、１２カ月、またはそれを超える期間にわたって安定したままである、請求項１から１６のいずれか１項に記載の両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョン。
【請求項１８】
エマルジョンを形成するために、少なくとも２つの実質的に非混和性である液体を、請求項１から１８のいずれか１項に記載のアミノ酸またはペプチドの存在下で混合することを含む、エマルジョンの作製方法。
【請求項１９】
エマルジョンを形成するために、少なくとも２つの実質的に非混和性である液体を、リン酸化ペプチドおよびホスファターゼの存在下で混合することを含む、エマルジョンの作製方法。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか１項に記載のエマルジョンまたはエマルジョンの作製方法であって、エマルジョンが、さらに医薬物質、染料、風味増強剤、または農薬などの薬剤を含む、エマルジョンまたはエマルジョンの作製方法。
【請求項２１】
請求項１から１７のいずれか１項に記載のエマルジョン、または請求項１８または１９に記載のエマルジョンを含む、食品調製物の製造に使用するためのエマルジョン。
【請求項２２】
請求項１から１７のいずれか１項に記載のエマルジョン、または請求項１８または１９に記載のエマルジョンを含む食物製品であって、エマルジョンが食品等級油を含む、食物製品。
【請求項２３】
エマルジョンが、食用の油または脂肪、具体的には、ココナツ油、パーム油、パーム核油、オリーブ油、大豆油、キャノーラ油（菜種油）、カボチャ種子油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ピーナッツ油、ブドウ種子油、ゴマ油、アルガン油、米糠油、および他の植物油などの植物油または植物性脂肪、ならびにバターおよびラードを含む動物系油などの食品等級油を含む、請求項２１または２２に記載のエマルジョンまたは食物製品。
【請求項２４】
エマルジョンを形成することが可能であるようなペプチドを仮想的に識別する方法であって、有機性溶液／水性溶液界面における凝集傾向（ＡＰ*）を選択することを含み、水性溶液中で凝集傾向（ＡＰ）を示すペプチドを最初に選択することと、その後、有機性溶液／水性溶液界面でのその凝集傾向（ＡＰ*）に対してペプチドを選択することとを含む、方法。
【請求項２５】
ＡＰ決定に加えて、またはＡＰ決定の代替方法として、ペプチドに対する凝集傾向の親水性調節測定値（ＡＰH）が決定され、ＡＰHは、ペプチドに対する親水性の測定値を基にしたペプチドに対する凝集傾向（ＡＰ）の測定値を調節することによって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ペプチドのＡＰHの決定が、式：ＡＰH＝（ＡＰ’）α（ｌｏｇＰ）’の使用を含み、式中、αは数値定数であり、０．５から５の間の値を有し、１から４の間でもよく、さらに１から３の間でもよく、ｌｏｇＰはペプチドに対する親水性の測定値、およびアポストロフィは正規化を示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
有機性溶液／水性溶液界面においてＡＰ*を示すペプチドを合成することをさらに含み、かつ有機性溶液／水性溶液界面を凝集するその能力、または有機性溶液と水性溶液との間のエマルジョンを形成する性能に関して、このように合成されたペプチドをテストしてもよいことを含む、請求項２４から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
それぞれのペプチドのＡＰ／ＡＰHを計算することによって多数のペプチドをスクリーニングすることと、計算されたＡＰ／ＡＰHに基づいて複数のペプチドを識別することとを含む、ペプチド（例えば、トリペプチド）を仮想スクリーニングする方法。
【請求項２９】
高いおよび／または閾値を超えるＡＰ／ＡＰH値を有するとして識別されるペプチドが、ＡＰ*決定のために選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
シミュレーションからのペプチドのＡＰ*を示すことをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
複数のペプチドのそれぞれのＡＰ*が、それぞれのシミュレーションから決定され、シミュレーションは、分子動力学シミュレーションを含み得る、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
所与のペプチドのＡＰ／ＡＰH／ＡＰ*が、分子動力学シミュレーション開始時の溶媒接触可能表面積と分子動力学シミュレーション終了時の溶媒接触可能表面積との間の比を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
有機性溶液／水性溶液界面において自己凝集が可能なペプチドを含むペプチド凝集体を生成する方法であって、水性溶液中でのペプチドの凝集傾向（ＡＰ）の測定値を決定することによってペプチドを識別すること、ここで識別はペプチドに対する親水性（ＡＰH）の測定値を基にしてもよく、ペプチドが有機性溶液／水性溶液界面で自己凝集することが可能かどうかをシミュレーションすることによって識別すること、および有機性溶液／水性溶液界面において自己凝集が可能であるとして識別されるペプチドを合成することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つの実質的に非混和性である液体間の界面を形成するように自己組織化する、ペプチドなどの両親媒性小分子を用いたエマルジョンの形成に関する。エマルジョンは、食品、化粧品、生活様式製品、被覆、触媒反応、カプセル化、薬物送達、および／または細胞アッセイなどにおける、さまざまな技術分野で用途を見出すことができる。また、そのようなエマルジョンの作製方法、加えてエマルジョンの安定性を特定の用途に合わせる方法も提供する。また、自己組織化が可能であること、およびエマルジョンの形成に有用であり得ることが予想される、ペプチドを識別するためのスクリーニング方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
カプセル化および相分離のための界面活性剤系エマルジョンは、食品、化粧品、被覆、触媒反応、カプセル化、薬物送達、および細胞アッセイにおいて広く利用されてきた。新しい界面安定化戦略の発展が、次世代の乳化技術の進歩の鍵である。従来の界面活性剤は、毒性、温度、ｐＨおよび塩に対する限定的な安定性などの欠点を有する。従来のエマルジョン系を補うために、新規の界面活性剤としての、生体適合性コポリマー、脂質、およびポリペプチド；ネットワークフィルムを形成する、生体高分子およびタンパク質；または固体粒子ベースおよびポリマーソームベースのピッケリングエマルジョンを用いた多くの試みがなされてきた。それにもかかわらず、さらなるマルジョン系が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、界面ネットワークを生成し、エマルジョンを安定化させるための、芳香族基で置換されたアミノ酸およびペプチドなどの両親媒性小分子の使用に基づく。本発明はまた、自己組織化が可能であることが予想され、したがって、エマルジョンの発展に有用であり得る、ペプチドの識別を可能にするコンピュータースクリーニング方法に基づく。そのため、界面活性剤の吸収によるエマルジョンの安定化に代わるものとして、本発明は、多目的なエマルジョン安定化系としての、界面におけるナノ構造ネットワークを提供する。この試みは、分子間芳香族πスタッキングおよび水素結合相互作用の間のバランスを利用することによる分子設計を介した調節可能な特性を兼ね備え、従来の界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と比較すると、高温でのおよび塩存在下での長期にわたる高い安定性を伴う。酵素的加水分解および他の触媒手段、例えば、１つの基または複数の基を除去して、エマルジョンを安定化または不安定化させること、ならびに／あるいはエマルジョンを安定化または不安定化させるためにｐＨおよび／または温度を変えるなどの化学的／物理的変更を適用することによって、エマルジョンを凝集または分散させることも可能である。
【０００４】
自己組織化小分子は、刺激応答性生体適合性などの利点を有する、構造化された材料およびゲルのようなポリマーに代わるものとしていっそう調査されている。１つの実施形態において、本発明は、疎水性合成芳香族部分によってキャップされたＮ末端を有する親水性短鎖（例えば、ジ−またはトリ−）ペプチド配列を含む、芳香族基で置換されたアミノ酸およびペプチドの両親媒性物質の自己組織化に関する。他の実施形態において、ペプチドは、特定のペプチドの一部であるアミノ酸上に天然で存在する芳香族基を単に含むことができる。本発明者らは、これらの分子が、微液滴における局在性の組織化を含むさまざまな形態および特性を有する、分子自己組織化を介した、ナノ構造を生成するための多目的構成要素であることを示す。
第一の態様によれば、本発明は、少なくとも２つの実質的に非混和性である液体間の界面で形成された両親媒性のアミノ酸またはペプチドの自己組織化ネットワークを含むエマルジョンを提供する。
【０００５】
本明細書において使用される「エマルジョン」という用語は、第二の液体中に懸濁または分散させた第一の液体の懸濁剤または分散剤を指し、第一の液体は第二の液体と難溶性または非混和性、すなわち、実質的にまたは完全に非混和性である。実質的とは、２つの液体の少なくとも９０％、９５％、または９８％が非混和性であることを意味し、第一の液体は分散相と呼ばれ、第二の液体は連続相と呼ばれる。分散相は、不均質なまたは均一な方式で、連続相全体に分散される液滴を形成することができる。エマルジョンの実例としては、油が分散相を形成し、水／水性溶液が連続相を形成する、水／水性溶液中油エマルジョン、および水が分散相を形成し、油が連続相を形成する、油中水エマルジョンが含まれる。さらに、第一の非連続相の液滴が第二の非連続相の小液滴を含み、その第二の非連続相の組成が第一の非連続相を含む連続相と類似してよくまたは類似しなくてもよい、「多重エマルジョン」を形成することができる。多重エマルジョンの実例としては、油が第一の非連続相を形成し、水が第二の非連続相を形成する、水中油中水エマルジョン、および水が第一の非連続相を形成し、油が第二の非連続相を形成する、油中水中油エマルジョンが含まれる。薬物、染料、風味増強剤、農薬、および類似のものなどの他の薬剤を液滴中に捕捉し、よって乳化することが可能であることが望ましい場合がある。
【０００６】
本発明は、エマルジョンが最大限に使用される食品産業において、特定の用途を見出すことができる。このようなエマルジョンは、食用の油または脂肪、具体的には植物油または植物脂肪を含むことができる。食品をベースとする用途に特に使用することができる油としては、ココナツ油、パーム油、パーム核油、オリーブ油、大豆油、キャノーラ油（菜種油）、カボチャ種子油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ピーナッツ油、ブドウ種子油、ゴマ油、アルガン油、米糠油、および他の植物油、ならびにバターおよびラードのような動物系油が含まれる。
【０００７】
本発明のアミノ酸およびペプチドは、両親媒性であり、低分子量を有し、少数のアミノ酸を含む。ペプチドは、一般的に、２〜５個のアミノ酸を含む。ペプチドは、より好ましくは、長さが２〜４個のアミノ酸であり得る。１つの実施形態において、ペプチドは、ジペプチドまたはトリペプチドである。「両親媒性」という用語は、親水性および疎水性の両方の領域を有するペプチドまたは分子を指す。「両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）」および「両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）」は同意語であり、本明細書においては区別しないで使用する。「親水性」という用語は、水および他の極性溶媒に引き付けられる、分子または分子の一部を指す。親水性の分子または分子の一部は、極性および／または電荷を有しているか、あるいは水または極性溶媒との水素結合などの相互作用を形成する能力を有する。「疎水性」という用語は、水および他の極性溶媒に反発するまたは反発される分子または分子の一部を指す。疎水性分子または分子の一部は、非極性を有し、電荷を有さず、非極性溶媒に引き付けられる。
【０００８】
本発明のペプチドは、ＦｍｏｃまたはＢｏｃで保護されたアミノ酸残基を使用し、その後、適切な場合には除去することができる、固相合成または液相合成などの、当技術分野で公知の方法によって調製することができる。あるいは、ペプチドは、当技術分野で使用される公知の組み換え技術、例えば、標準的な微生物培養技術、遺伝子組み換え微生物、および組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 <rd>Edition), 2001, CSHL Press）。ペプチドは、天然タンパク質または組み換え技術によって発現されたタンパク質、あるいはより大きいペプチド配列を酵素消化することによって得ることもできる。さらに、それらは酵素的ペプチド合成によって生成することができる。ペプチドは、上記の合成または組み換え合成の後でさらに修飾することができる。
本明細書において使用されるように、「アミノ酸」という用語は、［α］−アミノ酸または［β］−アミノ酸を指し、Ｌ−またはＤ−異性体とすることができる。アミノ酸は、自然発生または非自然発生のアミノ酸とすることができる。アミノ酸は、さらに［α］−位または［β］−位で、基と置換することもでき、その基は（ヘテロ）芳香族基、脂肪族基とすることができ、水素結合供与体または受容体を含むことができる。これらは、蛍光性基、（半）導体性基、または糖類、ヌクレオチド、および類似のものなどの生物活性基とすることができる。
【０００９】
適切な［β］−アミノ酸としては、配座的に制限された［β］−アミノ酸が含まれる。環状［β］−アミノ酸は、配座的に制限され、かつ一般的に酵素的分解が不可能である。適切な環状［β］−アミノ酸としては、シス−およびトランス−２−アミノシクロプロピルカルボン酸、２−アミノシクロブチルカルボン酸およびシクロブテニルカルボン酸、２−アミノシクロペンチルカルボン酸およびシクロペンテニルカルボン酸、２−アミノシクロヘキシルカルボン酸およびシクロヘキセニルカルボン酸、ならびに２−アミノノルボルナンカルボン酸、ならびにそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００１０】
本明細書において使用される「非自然発生アミノ酸」という用語は、自然発生（遺伝子がコードされた）Ｌ−［α］−アミノ酸には発生しない側鎖を有するアミノ酸を指す。非天然アミノ酸および誘導体の例としては、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、シトルリン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【００１１】
１つの実施形態において、アミノ酸は修飾されているか、またはペプチドは修飾されたＮ末端を含むことができる。すなわち、Ｎ末端アミノ酸は、一般的にアミドまたは他の適切な結合を介してＮ末端アミノ酸へ結合する修飾基を含むことができる。同様に、単一のアミノ酸の場合、アミノ酸はアミドまたは他の適切な結合を介して修飾することができる。修飾基は、全体的に疎水性性質を有することが好ましい。これによって、基は疎水特性および親水特性を有することができると理解されるが、基全体は疎水性の性質を有すると理解される。疎水性基の例としては、−ＣＨ２−鎖状構造および炭化水素環状構造が含まれる。
【００１２】
修飾基は、１つまたは複数の芳香族基を含むことできることがより好ましい。芳香族基としては、単一または多数の環状構造（例えば、多環芳香族炭化水素）を含むことができ、かつ複素環構造および／または単素環構造を含むことができる。一般的に、芳香族基は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上の縮合環構造を含むことができ、それぞれの環が同一であるかまたは異なっていてよい。代表的な基としては、アントラセン、アセナフテン、フルオレン、フェナレン、テトラセン、ピレン、フェナントレン、ナフタレン、およびクリセン（ｃｈｙｓｅｎｅ）、フェニルアセチル、ならびにプリン、ピリミジン、プテリジン、アロキサジン、フェノキサジンおよびフェノチアジンなどの複素環構造が含まれる。芳香族基は、１つまたは複数の芳香族環上に存在する置換基によって、アミノ酸へ結合することができる。このような置換基としては、反応性のＣ１−Ｃ４アルキル、アルキルオキシ、アルキルアミノ、リン酸、カルボン酸、アミノ、アルコール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン化物、または１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、および当技術分野において公知の類似の基を含むことができる。好ましい芳香族基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、９−フルオレニルメチルスクシンイミジルカルボナート（ＦＭＯＣ−）Ｓｕ）、Ｃ１−Ｃ４アルキル置換ピレン、および当技術分野において公知の天然および合成のヌクレオチドなどの構造を含む、フレン（ｆｕｒｅｎｅ）、ピレン、プリン、およびピリミジンをベースにしていてもよい。任意の１つの芳香族基または任意の複数の芳香族基の総分子量は一般的に、４００分子量未満、さらには３００分子量などの５００分子量未満であると予想される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、上記に加えてまたは代わりのものとして、Ｎ末端において、Ｃ末端において、および／またはペプチド骨格上に修飾を含む。例えば、ペプチドのＮ末端またはＣ末端を修飾することができるか、またはペプチド骨格内のアミノ酸残基の側鎖を修飾することができる。適切なＮ末端修飾の例としては、直鎖または分岐の、アルキル基またはアリール基を含むカルボン酸を用いたアシル化が含まれるが、これらに限定されない。適切なアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、およびオクタデシル基が含まれるが、これらに限定されない。ペプチドのＮ末端における遊離アミノ基は、ホルミル基またはベンゾキシカルボニル基を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の他の修飾基の添加によって修飾することもできる。適切な疎水性基を含むカルボン酸を用いたアシル化によるＮ末端の修飾は、流体界面に対するペプチドの親和性を高めることを可能にすることができる。ペプチドの遊離アミノ基は、アミノクマリン、ビオチン、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセタート、ヒドラジノニコチンアミド、または４−メチルクマリル−７−アミドなどの分子の適切な活性化誘導体を使用することによって、金属結合、蛍光性基、電気伝導性基、半導体性基、または分光的なもしくは生物学的な活性種などのさらなる官能性部分で修飾することもでき、そのため、さらなる官能性をペプチドへ与えることができる。
【００１４】
適切なＣ末端修飾の例としては、アンモニアまたはアミンを含有する直鎖または分岐のアルキル基またはアリール基を用いたアミド化、あるいはアルコールを含有する直鎖もしくは分岐のアルキル基を用いたまたはフェノールもしくはまたは芳香族アルコールを用いたエステル化が含まれるが、これらに限定されない。適切なアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、およびオクタデシル基が含まれるが、これらに限定されない。適切な疎水性基を含むアミンを用いたアミド化によるＣ末端の修飾は、流体−流体界面に対するペプチドの親和性を高めることを可能にすることができる。ペプチドのＣ末端における遊離カルボキシラート基は、Ｎ−オキシスクシンイミド基を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の他の修飾基の添加によって修飾することもできる。
【００１５】
ペプチド内のアミノ酸残基の側鎖カルボキシラート基、例えば、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基の側鎖カルボキシラートも、アンモニアまたは直鎖もしくは分岐のアルキル基もしくはアリール基を含有するアミンを用いたアミド化によって、または直鎖もしくは分岐のアルキル基を含有するアルコール、フェノールまたは芳香族アルコールを用いたエステル化によって、修飾することができる。適切なアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、およびオクタデシル基が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
ペプチド内のアミノ酸残基の側鎖のアルコール基もしくはフェノール基、例えば、セリン残基、スレオニン残基、もしくはチロシン残基の側鎖のアルコール基もしくはフェノール基、もしくはリジン残基の遊離アミノ基；ペプチド内の、アスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、およびアルギニン残基などのアミノ残基の側鎖遊離アミノ基；またはシステイン残基の側鎖チオール基を含むがそれに限定されない、ペプチド内のアミノ酸残基の側鎖遊離チオール基も、直鎖または分岐のアルキル基またはアリール基を含むカルボン酸を用いたエステル化によって、修飾することができる。適切なアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、およびオクタデシル基が含まれるが、これらに限定されない。適切な疎水性基を含むカルボン酸を用いたエステル化による、ペプチド内のアミノ酸残基の側鎖のアルコール基またはフェノール基の修飾は、流体界面に対するペプチドの親和性を高めることを可能にすることができる。ペプチド内のアミノ酸残基の側鎖のアルコール基またはフェノール基も、酵素的または化学的リン酸化によって可逆的に修飾することができ、そのため、ペプチド上の電荷、加えてペプチドの特定の金属イオンへの結合能力が変更される。
【００１７】
本発明に従って使用するための例示的なペプチドとしては、ペプチドＹＬ、ＹＡ、ＹＳ、ＦＦ、ＦＦＦ、およびＹＬ（アミノ酸を識別する一般的な１文字コードを使用している）が含まれ、これらは、ＦＭＯＣまたはピレン基を含むようにＮ末端アミノ酸（すなわち、例えば、ＹＬの場合はＹ）において修飾されている。さらなる詳細に関してはスキーム１ｃを参照のこと。
コンピュータースクリーニングによって、本発明者らは、トリペプチドなどの未修飾ペプチドを識別した。それらのペプチドは自己凝集し、したがってエマルジョン形成が可能であることが予想され、かつ後に実験的に確認された。そのため、さらなる実施形態において、トリペプチドなどの未修飾ペプチドを含むエマルジョンが提供され、そのペプチドは少なくとも２つの実質的に非混和性である液体間の界面で自己組織化ネットワークを形成する。
【００１８】
未修飾という用語は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて、またはペプチド自体の骨格に沿って、ペプチドを形成するアミノ酸の化学構造にいかなる追加の修飾も含まない天然または非天然アミノ酸から形成されたペプチドを指すと理解されるものとする。本発明においてエマルジョンの形成に使用される例示的な未修飾ペプチドとしては、トリペプチドＫＹＷ、ＫＦＦ、ＫＹＦ、ＦＦＤ、およびＤＦＦ（アミノ酸を識別するための一般的な１文字コードを使用している）が含まれる。
本発明者らは、前述のコンピューター技術を使用し、その技術を、エマルジョンの形成に関連する使用に適応させた。前述の技術は、技術を有する読者向けの、その内容全体が本明細書に組み込まれるFrederix et al. 2011 and 2015に記載されている。
【００１９】
要約すると、Frederix et al. 2011 and 2015において以前に報告されているコンピュータースクリーニングプロトコルは、水中での自己組織化が予想されるペプチドの識別に適用することができる。初回スクリーニングから、乳化剤として作用するような化合物の必須条件として考えることができる、繊維および二層構造を形成する潜在力を示すペプチドのサブセットを識別することができる。少なくとも２つの実質的に非混和性である液体間のエマルジョンを形成することが予想できるペプチドを識別するために、ＭＡＲＴＩＮＩの粗視化力場（ｃｏａｒｓｅ−ｇｒａｉｎｅｄ  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ）、Marrink et al 2007を用い、さらに、水および非混和性の水／溶媒溶液の両方の中で９．６μ秒間シミュレーションされたペプチドの選択が、この初回スクリーニングによって可能になる。
【００２０】
そのため、さらなる態様において、本発明は仮想スクリーニング方法を提供する。この方法は、エマルジョンが最も形成されやすくなる特定の特性を有する、トリペプチドなどのペプチドの種類を識別することができるように、８０００個のトリペプチド配列を仮想的方式で研究すること、およびエマルジョン形成に対するそれらの傾向を推定することを可能にする。
本発明の態様は、有機性溶液／水性溶液界面において凝集体を形成するペプチドの傾向に対する仮想スクリーニング方法の発展に基づく。
【００２１】
有機性溶液／水性溶液界面において凝集体を形成する潜在力があるとして、上記仮想スクリーニングから識別されるペプチドは、有機性／水性混合物のエマルジョンを形成することが可能であるこのようなペプチドのその後の任意の実証実験のために選択することができる。
そのため、さらなる態様において、エマルジョンを形成することが可能であるようなペプチドを仮想的に識別する方法が提供され、その方法は、有機性溶液／水性溶液界面における凝集傾向（ＡＰ*）を選択することを含む。その方法には、水性溶液中で凝集傾向（ＡＰ）を示すペプチドを最初に選択することと、その後、有機性溶液／水性溶液界面におけるその凝集傾向（ＡＰ*）に対してペプチドを選択することとを含むことができる。
【００２２】
本方法は、最初にＡＰを決定することができ、かつ、水性溶液中で適切なＡＰを示すペプチドのみを、有機性溶液／水性溶液界面におけるＡＰ*を決定するために選択するような、２段階で行うことができる。
ＡＰ決定に加えて、またはＡＰ決定の代替方法として、ペプチドに対する凝集傾向の親水性調節測定値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ−ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）（ＡＰH）を決定することができる。ＡＰHは、ペプチドに対する親水性の測定値を基にしたペプチドの凝集傾向（ＡＰ）の測定値を調節することによって決定される。
親水性の測定値を基にしたＡＰを調節することによって、改良された凝集傾向の測定値を得ることができる。ＡＰHは、溶液中で凝集体を形成するペプチドの傾向に関して、ペプチドを仮想スクリーニングする方法を提供するために使用することができる。
【００２３】
親水性の測定値としては、ペプチド中のアミノ酸に対するＷｉｍｌｅｙ−Ｗｈｉｔｅ全残基疎水性の和、または任意の類似する疎水性スケール（ＫｙｔｅおよびＤｏｏＬｉｔｔｌｅのスケール［Kyte J, Doolittle RF. J Mol Biol. 1982 May 5;157(1):105-32.］、またはペプチドの相対的な疎水性／親水性を順位付けるためのアミノ酸の疎水性に関連するＨｅｓｓａおよびＨｅｉｊｎｅのスケール［Hessa T, Kim H, Bihlmaier K, Lundin C, Boekel J, Andersson H, Nilsson I, White SH, von Heijne G. Nature. 2005 Jan 27;433(7024):377-81］など）を含むことができる。
ペプチドに対する親水性の測定値を基にしたそのペプチドのＡＰの調節には、ＡＰを冪乗して、疎水性の測定値を掛けることを含むことができる。
親水性の測定値を基にしてＡＰを調節する前に、ＡＰおよび疎水性の測定値のうちの少なくとも１つは正規化されてもよい。
【００２４】
ペプチドのＡＰHの決定は、式：ＡＰH＝（ＡＰ’）α（ｌｏｇＰ）’の使用を含んでいてもよく、式中、αは数値定数、ｌｏｇＰはペプチドに対する親水性の測定値、およびアポストロフィは正規化を示す。αは０．５から５の間の値を有してもよく、１から４の間でもよく、さらに１から３の間でもよい。
上式中のαの値を変えると、ＡＰと親水性の測定値との間の重み付けを相対的に変化させることができる。ＡＰHの値、例えば、ＡＰHの閾値が決まると、ＡＰHの値をαの値によって決めることができる。
ペプチドとしては、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、またはさらに大きいペプチドを含むことができる。ペプチドは、トリペプチドであることが好ましい。
ペプチドのＡＰ*、ＡＰ、および／またはＡＰHの識別には、ペプチドに対して決定されたＡＰ*、ＡＰおよび／またはＡＰHが、ＡＰ*、ＡＰおよび／またはＡＰHの閾値を満たすかまたは超えるかどうかを決定することを含むことができる。
【００２５】
ＡＰ*／ＡＰ／ＡＰHに対しての閾値は、閾値を満たすかまたは超えるＡＰ*／ＡＰ／ＡＰHの値を有するペプチドが、高い凝集傾向を有すると考えて、決定することができる。高いＡＰ／ＡＰH値を有するペプチドを、ＡＰ*を決定するために選択することができる。高いＡＰ*を有するペプチドを選択し、合成することができる。そのため、本方法はさらに、有機性溶液／水性溶液界面においてＡＰ*を示すペプチドを合成することを含むことができ、かつ有機性溶液／水性溶液界面で凝集するその能力、または有機性溶液と水性溶液との間のエマルジョンを形成する性能に関して、このように合成されたペプチドをテストすることを含んでもよい。
ペプチドは、複数のペプチドのうちの１つであり、ペプチドの識別は、それぞれの複数のペプチドのＡＰ*／ＡＰ／ＡＰHを決定することと、複数のペプチドに対して決定されたＡＰ*／ＡＰ／ＡＰHを基にした複数のペプチドのうちの少なくとも１つを識別することとを含む。
【００２６】
複数のペプチドとしては、例えば、複数のトリペプチドを含むことができる。複数のペプチドとしては、自然発生アミノ酸によってコードされたペプチドの、実質的に可能な全ての組み合わせを含むことができる。例えば、トリペプチドに関しては、８，０００個のペプチド（２０3、２０は自然発生アミノ酸の数）がある。この試みは、シトルリン、ノルバリン、その他、ならびにＮ末端およびＣ末端が保護されたアミノ酸などの、非天然アミノ酸を含むように、概念上、拡大することができる。
ペプチド（例えば、トリペプチド）を仮想スクリーニングする方法は、それぞれのペプチドのＡＰ／ＡＰHを計算することによって多数のペプチドをスクリーニングし、計算されたＡＰ／ＡＰHに基づいてペプチドを識別することを含むことができる。ＡＰHによってペプチドを識別すると、状況次第で、ＡＰ単独による識別よりも、凝集に関してより有望な候補物質をもたらすことができる。
【００２７】
複数のペプチドに対して決定されたＡＰ／ＡＰHを基にした複数のペプチドのうちの少なくとも１つの識別には、複数のペプチドのサブセットを識別することを含むことができる。そのサブセットは、最も高いＡＰ／ＡＰHを有するペプチドを含む。
複数のペプチドのサブセットとしては、最も高いＡＰ／ＡＰHを有する１００個のペプチドなどの一部分を含むことができ、最も高いＡＰ／ＡＰHを有する２００個のペプチドなどの一部分を含んでいてもよく、さらに最も高いＡＰ／ＡＰHを有する４００個のペプチドの一部分を含んでいてもよい。
複数のペプチドのサブセットとしては、最も高いＡＰ／ＡＰHを有する複数のペプチドの１０％を含むことができ、最も高いＡＰ／ＡＰを有する複数のペプチドの５％を含んでいてもよく、さらに最も高いＡＰ／ＡＰHを有する複数のペプチドの２％を含んでいてもよい。
複数のペプチドからＡＰ／ＡＰHによって識別されるペプチドの数は、複数のもののなかのペプチドの数によって決まる。例えば、８，０００個の可能性のあるトリペプチドから、４００個のペプチドのサブセット（全ペプチドの５％）を選択することができる。
【００２８】
複数のペプチドのサブセットの識別には、ＡＰ／ＡＰHの閾値よりも大きいまたはＡＰ／ＡＰHの閾値以上の、ＡＰ／ＡＰHを有する複数のペプチド中の全てのペプチドを識別することを含むことができる。
閾値は、複数のペプチド中のそれぞれのペプチドのＡＰ／ＡＰHを計算することによって、かつ所望のサイズのサブセットをもたらす閾値を設定することによって、決定することができる。閾値は、凝集に成功したペプチドのＡＰ／ＡＰHの情報に基づいて決定することができる。
高いおよび／または上回るＡＰ／ＡＰH値を有すると識別されるペプチドのサブセットを、ＡＰ*決定のために選択することができる。
【００２９】
本方法はさらに、シミュレーションからのペプチドのＡＰ*を示すことを含む。シミュレーションからのペプチドのＡＰ*の表示には、有機性／水性溶液混合物中のペプチドに対する分子動力学シミュレーションを実施することと、その結果を表示することとを含むことができる。発明者は、コンピューター用モニターまたは類似のものなどのモニター上に表示される凝集体形成の視覚表示を介して、表示された結果を見ることができる。あるいは、凝集体形成は、有機性溶液／水性溶液界面において形成される、シミュレーションされた凝集体を識別するように設計された画像処理分析ソフトウェアを介して決定することができる。
複数のペプチドがある場合には、本方法は、分子動力学シミュレーションを含み得るそれぞれのシミュレーションから、それぞれの複数のペプチドのＡＰ*を得ることを含むことができる。
【００３０】
所与のペプチドのＡＰ／ＡＰH／ＡＰ*としては、分子動力学シミュレーション開始時の溶媒接触可能表面積と分子動力学シミュレーション終了時の溶媒接触可能表面積との間の比を含むことができる。
上述の方法は、個々のアミノ酸それぞれのプロトン化の程度を考慮して、かつ／またはトリペプチドなどの一部の特定のペプチド配列の時に、さらに改良することができる。ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端、ならびに特定の露出されたアミノ酸側鎖は、周囲のｐＨおよび凝集状態によって、プロトン化形態と脱プロトン化形態との間で切り替え可能であり、本発明者らは、ペプチドの凝集またはゲル化は、ｐＨの変化に影響され得ることを観察した。したがって、異なるｐＨ環境内でのトリペプチドの凝集能力のスクリーニングは、標準的な粗視化ビーズを改良することによって達成することができる。この粗視化ビーズは、中性ｐＨに対してパラメータ化され、代替のプロトン化状態の側鎖を表す。例えば、プロトン化Ｎ末端ビーズ（ＮＨ3+）を利用する代わりに、中性Ｎ末端ビーズ（ＮＨ2）ビーズを、ｐＨ１０を超える変化の影響を試験するために使用することができ、そのために、Ｎ末端は脱プロトン化されるはずである。
【００３１】
さらなる態様において、有機性溶液／水性溶液界面において自己凝集が可能なペプチドを含む、ペプチド凝集体の生成方法が提供され、その方法は、水性溶液中でのペプチドの凝集傾向（ＡＰ）の測定値を決定することによってペプチドを識別し、ペプチドに対する親水性（ＡＰH）の測定値を基にしてもよいことと、ペプチドが有機性溶液／水性溶液界面で自己凝集することが可能かどうかをシミュレーションによって識別し、ペプチドを合成してよいこととを含む。
ペプチドは、複数のペプチドのうちの１つとすることができ、ペプチドの識別には、それぞれの複数のペプチドに対してＡＰ／ＡＰHを決定することと、有機性溶液／水性溶液界面において自己凝集体を形成することが可能なペプチドのＡＰ*の決定および選択のために、複数のペプチドうちのの少なくとも１つを識別することとを含むことができる。
【００３２】
このようにして識別されたペプチドの配列を観察することによって、特定の自己組織化挙動を有するペプチドの種類を識別することができる。例えば、それらのペプチドは、例えば芳香族残基、陰イオン性残基、陽イオン性残基、Ｈ結合残基を特定の位置に含んでいる。
さらなる態様において、上記方法のいずれかによって得ることができるペプチドまたはナノ構造が提供される。
一般的に、本発明のペプチドは、１〜５００ｍＭ、例えば１０〜２００ｍＭ、１５〜１００ｍＭ、または２０〜６０ｍＭの濃度で、有機性溶液／水性溶液界面において凝集することができる。
【００３３】
本発明者らは、本発明のペプチドのアミノ酸組成、および／またはアミノ酸／ペプチドに行うことができる修飾は、エマルジョン形成および／またはエマルジョン安定化特性に対して影響を与えることができでることを観察した。そのため、アミノ酸／ペプチドのアミノ酸組成、および／または修飾基を変えることによって、ペプチドの自己組織化特性および得られたエマルジョンの結果として生じる特性を変えることが可能である。このことは、例えば、エマルジョンの安定性（温度変化、イオン強度、特定の小分子の存在、溶媒の存在、圧力、ひずみ、超音波、または可聴音への暴露に対する）、特定の非混和性液体とのエマルジョン形成能力、分散体または連続相を形成する液体の能力、液滴サイズおよび／またはエマルジョンの臨界濃度、ポリマー溶液の配列選択的安定化、ＤＮＡ、タンパク質などの生体高分子を含む溶液の安定化、生体液中、細胞内部、組織中のエマルジョンの安定化、光、圧力、生体分子の存在、イオン強度、酵素、超音波、磁場、電場に対する反応性、またはそれらの組み合わせに影響を与えることができる。そのため、アミノ酸、アミノ酸配列、および／または修飾基を変化させることによって、エルジョン特性をもたらすことが可能である。このことは、技術を有する聞き手によって、本明細書ならびに「Microemulsions: Properties and Applications (2008) CRC pressおよび「Emulsions and emulsion stability: Surfactant Science Series/61」(2005) CRC pressで教示されるような適切な手段および実験により、容易にテストできる。
【００３４】
本発明のアミノ酸／ペプチドは、液体−液体界面において、自己組織化された繊維または構造を作り出すために十分な強度を伴って互いに相互作用することが可能になるような、十分な濃度で提供されることが理解される。これらの繊維または構造は、繊維、球状の凝集体、テープ、２Ｄシート、または他のナノ構造などを多く含むネットワークまたはフィルムを形成することができる。一般的に、アミノ酸／ペプチドは、１〜５０ｍＭ、例えば５〜２５ｍＭ、７．５〜１５ｍＭ、特に１０ｍＭの濃度で提供される。しかしながら、単に、選ばれた非混和性液体とともにさまざまな濃度のペプチドをテストし、どの濃度でエマルジョンが形成され得るかを観察することによって、エマルジョン形成に適した濃度を決定することも可能である。そのため、使用されるペプチドおよび液体によって、エマルジョンを形成するためのペプチドの濃度は、上記で定義される範囲外であってもよい。
【００３５】
第一液体の第二液体に対する体積比は、一般的には１：２０〜２０：１の範囲、より好都合には１：１０〜１０：１である。
「自己組織化された」または「自己組織化」という用語は、アミノ酸／ペプチドが、一般的にナノメートル寸法内の、規則正しい繊維、テープ、球、シート、または関連する構造へ、自発的に（または、ｐＨ変化、イオン強度、溶媒極性、光、音、酵素作用、触媒反応などの刺激を適用することによって誘発されて）組織化することが可能であること意味すると理解される。
【００３６】
本発明のエマルジョンは、好都合なことに、激しく振とうまたは混合せずに形成することができる。例えば、本発明者らは、単に手で振とうすることによって、本発明によるエマルジョンを作製した。
ペプチド繊維またはナノ構造は、同じアミノ酸配列を有するアミノ酸／ペプチド、または１つより多い異なったアミノ酸配列を有するペプチド混合物から形成することができる。アミノ酸／ペプチドは、より大きいペプチドまたはタンパク質などの他の高分子と組み合わせて、繊維または他のナノ構造体を形成することもできる。いくつかの実施形態において、繊維または構造体を形成するアミノ酸／ペプチドは、同じアミノ酸配列を有し、そのため、「均質なアミノ酸／ペプチド組織化体」を形成する。他の実施形態において、２つ以上の異なるアミノ酸／ペプチドは、「均質なアミノ酸および／またはペプチド組織化体」を形成する。
【００３７】
本明細書において使用される「界面」という用語は、２つの隣接する非混和性液体間の共通の境界を形成する表面を指す。液体−液体界面は、油および水などの、２つの非混和性液体間の共通の境界を形成する表面である。
有利には、本発明のエマルジョンは、長期間にわたり安定にすることができ、ＳＤＳなどの他の界面活性剤で形成されたエマルジョンと区別可能である。好ましい実施形態において、本発明のエマルジョンは、塩が存在しないとき、少なくとも１週間、２週間、４週間、２カ月、６カ月、１２カ月、またはそれを超える期間にわたって、リン酸塩、塩化物、またはチオシアン酸塩などの１００ｍＭの塩の存在下では、少なくとも１２時間、２４時間、２日間、またはそれを超える期間にわたって安定したままであり、ならびに／あるいは、５０〜７０℃で２〜４時間など、６０℃で３時間などの、熱への暴露に対して安定である。あるいは、本発明のエマルジョンは、第一の温度で安定であり得るが、第二の温度では解乳化する恐れがある。例えば、特定のペプチドは、室温でエマルジョンを形成することがおそらく可能であるが、４０℃、５０℃、６０℃、またはそれを超える温度などの高温では、解乳化する。
【００３８】
有利には、解乳化（すなわちエマルジョンの破壊）は、必要とされる場合は、１つまたは複数のタンパク分解酵素を添加することによってもたらすことができる。例えば、本発明のエマルジョンは、タンパク分解酵素であるサーモリシンを添加することによって解乳化することができる。想定され得る代替酵素の種類としては、ペプチド分子の両親媒性バランスを変化させる、エステラーゼおよびホスファターゼが含まれる。例えば、アゾベンゼンなどの、特定の波長への暴露時に構造変化を起こす、光で切り替え可能な単位の導入を含む他の切り替え手段も想定することができる。これは、アミノ酸のＮ末端で、またはアミノ酸の側鎖として、導入することができる。
【００３９】
さらなる態様において、エマルジョンの作製方法が提供され、その方法は、エマルジョンを形成するために、少なくとも２つの実質的に非混和性である液体を、本明細書において記述されるようなアミノ酸／ペプチド存在下で混合することを含む。少なくとも２つの非混和性液体を準備し、そこへアミノ酸／ペプチドを添加するかまたはアミノ酸／ペプチドを１つまたは複数の該非混和性液体へ添加してから、さらに、１つの非混和性液体または複数の非混和性液体を、アミノ酸／ペプチドを含む非混和性液と接触させることができる。
アミノ酸／ペプチドは、エマルジョンの形成が可能な濃度で準備されなくてはならないことが、理解されよう。適切な濃度範囲および／またはそれを決定する方法は、本明細書において記述される。
【００４０】
他の任意の方法ステップが、エマルジョン成分に関連する上記説明から理解されよう。この方法ステップは、簡単には繰り返されないはずであるが、技術を有する読者によって行われる。
本発明は、通常ならば油または水溶液／水中に溶解するのみかまたは適切に分散する、本明細書上記で特定される医薬物質または他の薬剤などの、薬剤を含むエマルジョンを提供するために使用することができる。例えば、医薬物質または他の薬剤を本発明のエマルジョンに取り込もうとする場合、最初のエマルジョンを調製する前に、薬剤を最初に油性相または有機性相に含ませてもよい。いくつかの実施形態において、医薬物質または他の薬剤は、油性／有機性相に溶解する。他の実施形態において、医薬物質または他の薬剤は、油性／有機性相に溶解しない。
非医薬品溶媒の非存在下での調製が容易であり、さまざまな医薬品を運ぶことができ、生物学的条件下での安定性を含む適切な薬物動態学的特性を有し、および／または特定の組織もしくは受容体へ医薬品を送達する、医薬送達担体が必要とされる。さらに、これらの医薬品送達賦形剤は、医薬品をカプセル化または遮蔽し、それを免疫クリアランスからマスクする一方で、濃縮様式で所望の作用部位に送達するべきである。Ｔ細胞の副免疫原性活性化を誘発するために、少量の医薬品（例えば抗原タンパク質）を特定の種類の細胞（例えば樹状細胞）に標的化様式で送達するための、医薬品送達担体がさらに必要とされる。あるいは、医薬品の濃縮ボーラス、例えば化学療法剤も、標的細胞を殺すように、また標的化様式で細胞に送達するべきである。本発明のエマルジョンは、この点に用途を見いだすことができる。そのため、さらなる実施形態において、本発明は医薬物質をさらに含むエマルジョンをさらに提供する−この医薬品としては、小薬物分子、加えて核酸、タンパク質、抗体および抗体フラグメント、ならびに類似のものを含むことができる。
【００４１】
本発明のエマルジョンは、農業、食品、化粧品、および／または触媒反応の分野において用途を見出すこともできる。例えば農産業において、エマルジョンは、殺虫剤、殺菌剤、および農薬のための送達賦形剤として使用される。これらの不水溶性殺生物剤は、通常は機械設備を用いて噴霧することによって、極めて低レベルで農作物に散布されなければならない。化粧品において、エマルジョンは、多くの毛髪および皮膚のコンディショニング剤のための送達媒体である。
多くの食物製品はエマルジョンの形態である。サラダドレッシング、グレービーソースおよび他のソース、ホイップ済みのデザートのトッピング、ピーナッツバター、ならびにアイスクリームも、種々の食用脂肪および食用油のエマルジョンの例である。食物製品の物理的形態に影響を与えることに加えて、乳化された油が舌を覆い、変化した「食感」を製品にもたらすために、エマルジョンは味に影響を与える。
【００４２】
食品産業での用途を見出すことができるエマルジョンに関しては、エマルジョンは、例えばＵＨＴ製品などのすぐに使用できる形式、および粉末プレミックスまたはペースト濃縮物などの、プレミックスまたは濃縮物の形態の両方で提供され、これらが出来上がるときに効果的なエマルジョンとなる。このようなエマルジョンは、加工（および天然）デンプン、安定化剤、ガム、および乳化剤（またはそれらの組み合わせ）などのさまざまな材料によって安定化することができる。
本発明のペプチドエマルジョン配合物は、食物製品に使用される現存の天然材料または非天然材料の代用および／または減少を可能にすることができる、ゲル化特性、乳化特性、安定化特性、および共組織化特性が立証されている。さらに、本発明のペプチドエマルジョン配合物は、新しいまたは特有の感触を与えることができ、デザート、グレーズまたはソース、生クリーム代替品、酵素ペースト、およびアイシング／フィリングまたはケーキ／最終加工品（ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ’ｓ）などのさまざまな用途に活用することができ、冷蔵製品および冷凍製品、ならびに（周囲）室温で保存することができる製品に用途を見出すことができる、特有の特性をもたらすことができる。
【００４３】
本発明のエマルジョンを使用して適切に配合された食物製品は、１つまたは複数の下記の重要な技術的／機能的態様を示し得ることが想定される。
粘度
製品は、用途：被覆、粘着、食感、感触、取り扱い、塗布、加工によって正確な粘度を必要とする。
【００４４】
安定性
製品の安定性は、製造／使用における種々の段階にわたって必須である：
加工：
全ての加工段階にわたって、均質な製品を保証するための安定性。不安定な製品は、エマルジョンが崩壊し、設備内に材料が蓄積し、結果として製品が燃焼／閉塞する潜在的なリスクがある。加工における安定な製品が可能になると予想される。
包装：
包装に対して一貫した製品（異なる製品／加工に対して種々の温度で：最終用途に対して正確な製品特性を保証するため）
顧客の使用：
一貫した製品および最終製品の性能
貯蔵期間：
均質な製品に対する消費者の期待：分離が、製品性能（滅菌、香味、感触：感覚刺激性プロファイル）に悪影響を与えないことが明らかであり得る一方で、その外観が、分離を伴う製品問題があるという影響を使用者に与える恐れがある。ここでは安定性が必須である。
製品包装形式：
ＵＨＴにおいて、例えば、製品形式が大きくなるにつれ、エマルジョンに対する圧力およびその結果生じる力が大きくなり、分離がより急速に明らかになる。このことは、製品形式に適用される貯蔵期間に影響を及ぼす。一般的に０．５〜１Ｌの製品は、１２カ月の貯蔵期間を有し、一般的に１０Ｌおよび２５Ｌは、９カ月の貯蔵期間を有し、一般的に１０００Ｌは６カ月の貯蔵期間を有する。
熱可逆性：
製品の粘度はさまざまな温度で変化する。粘度制御は、加工デンプンから生じる１つの態様である：ペプチド配合物を使用すると、この制御をもたらすことができる。さらなる発展分野は、デザートである。液体ゲルは、ＵＨＴ加工すること、およびゲルにその活性点を下回る冷却を行うことを介して作ることができる。その後、再加熱するとこのゲルは再活性化され、最終消費者がそれを冷却すると、このゲルは固まるであろう。類似の様式でゲル化するペプチド配合物は、類似の製品を提供すると予想される。
【００４５】
原材料の代替品
加工（および天然）デンプン、安定化剤、ガム、および乳化剤（またはそれらの組み合わせ）を、本発明のペプチドエマルジョン配合物と置き換えることができる。
【００４６】
固相製品の乳化および制御（チョコレート／ペースト製品マトリックスにおけるレシチンの効果）
コストに関して、レシチンはチョコレートに不可欠である。ココアバターの量は、レシチン存在下で減らすことができ、上掛けおよび成形に要求される流動性が依然として必要とされている。ペプチド配合物は、界面活性剤特性を有する機能的な代用品として潜在的に作用することができる。ペースト濃縮マトリックスにおいて、機能的乳化特性は、新しいペースト形式の感触を可能にすることができるが、発酵品（すなわち、パンおよびロールパン）などの最終製品においてより明らかになるであろう。乳化剤の使用は、気泡安定性のための膜の形成、気泡形成の規則性、最終製品の感触、生地の伸展性、生地の状態、生地の安定性、および貯蔵期間に及ぶ。
【００４７】
食品および非食品における、曝気、気泡形成、または発泡（およびその安定性）
生クリーム代替品（ＤＣＡ）において高体積のホイップおよび安定性性能をもたらすために、多数の材料が、多くの場合必要とされる。ペプチド配合物は、気泡形成ひいては発泡を可能にすることができ、これらはＤＣＡおよび他の潜在的産業における非食品泡の両方に使用することができる。材料の機能性が既存の合成物を超えて改良され得るために、安定性性能が高いことが予想される。
【００４８】
熱処理中のタンパク質の安定性
ペプチドを卵などの熱に弱い材料と組み合わせて使用すると、熱に暴露したときのタンパク質変性阻害剤として作用することができる。例えば、ＵＨＴ配合物において使用される卵は、加工中に蓄積する恐れがある、変性、ひいては粘度増大または微粒子形成のために問題になる恐れがある。
【００４９】
材料の機能的特性の強化
ペプチドを使用すると、既存の材料と組み合わせたときに結合および／または作用すること、例えば卵白の結合および性能の「ブースト」などによって、既存の高コストで高機能性な材料の使用の減少を促進することができる。このことは卵白に限定されず（例えば、乳タンパク質などの他の材料の潜在的強化）、多数の食材用途にわたって適用することができる。
【００５０】
熱／加工条件
食品産業では、本発明が適合すると予想される多数の加工条件（多くの場合はその組合せ）が使用される。これらの条件は、ＵＨＴから低温殺菌加工ステップまで、加えて最小限の加工を含み、食品産業製品カテゴリー全体にわたりフレッシュレディトゥイート（Ｆｒｅｓｈ  Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｅａｔ）製品をもたらす。
【００５１】
本発明は、実施例を介し、かつ図１〜１２を参照して、さらに記述する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】（ａ）油／水界面における芳香族短鎖ペプチド両親媒性物質の繊維ネットワークの自己組織化および形成の画である。（ｂ）ペプチド繊維ネットワークによって安定化された水中油液滴の画である。（ｃ）Ｆｍｏｃ−ＹＬ、Ｆｍｏｃ−ＹＡ、Ｆｍｏｃ−ＹＳ、Ｆｍｏｃ−ＦＦ、Ｆｍｏｃ−ＦＦＦ、およびピレン−ＹＬを含む、芳香族ペプチド誘導体の化学構造である。
【図２】（ａ）その中で、１０ｍｍｏｌ・Ｌ-1のＦｍｏｃ−ＹＬリン酸緩衝液（ｐＨ８）をクロロホルムへ手動で撹拌しながら添加することによって、水中クロロホルムエマルジョン（白色泡状層）が調製された、ガラス瓶の光学写真である。左から右へ、緩衝液とクロロホルムとの体積比が１：９、３：７、５：５、７：３から、９：１へと変わり、サンプルは、Ｗ１Ｃ９、Ｗ３Ｃ７、Ｗ５Ｃ５、Ｗ７Ｃ３、およびＷ９Ｃ１と名付けられる。（ｂ）水相中にＦＩＴＣを含むＦｍｏｃ−ＹＬネットワークによって安定化された、水中クロロホルムエマルジョン液滴（サンプルＷ３Ｃ７）の蛍光顕微鏡画像である。スケール棒は５０μｍである。（ｃ）ＴｈＴ標識Ｆｍｏｃ−ＹＬネットワークによって安定化された、水中クロロホルムエマルジョン液滴（サンプルＷ３Ｃ７）の蛍光顕微鏡画像である。スケール棒は５０μｍである。（ｄ）クロロホルム（黒）、Ｄ2Ｏリン酸緩衝液（ｐＨ８）（赤）、および界面安定化エマルジョン（青）中での、Ｆｍｏｃ−ＹＬの自己組織化のＦＴＩＲスペクトルである。（ｅ）水中クロロホルムエマルジョンを安定化させる、クロロホルム／水界面でのＦｍｏｃ−ＹＬネットワークのＳＥＭ顕微鏡写真である。サンプルは凍結乾燥条件で調製される。スケール棒は５０μｍ（左）および２μｍ（右）である。（ｆ）クロロホルム／水界面におけるＦｍｏｃ−ＹＬマイクロカプセルのＳＥＭ顕微鏡写真である。サンプルは空気乾燥条件で調製され、スケール棒は２μｍである。
【図３】（ａ）水相中にＦＩＴＣを含む、Ｆｍｏｃ−ＹＡ（左）およびＦｍｏｃ−ＹＳ（右）ネットワークによって安定化された、水中クロロホルムエマルジョン液滴の蛍光顕微鏡画像である。スケール棒は５０μｍである。（ｂ）１０ｍｍｏｌ・Ｌ-1のＦｍｏｃ−ＹＬ、Ｆｍｏｃ−ＹＡ、およびＦｍｏｃ−ＹＳのＤ2Ｏリン酸緩衝液（ｐＨ８）中のＦＴＩＲスペクトルである。（ｃ）計算された分配係数（ｃＬｏｇＰ）、水とクロロホルムとの間で測定されたペプチドの分配値および界面での蓄積値、Ｆｍｏｃ−ＹＬ、Ｆｍｏｃ−ＹＡ、およびＦｍｏｃ−ＹＳの臨界エマルジョン濃度、ならびにエマルジョン液滴の平均径との表である。（ｄ）水相中にＦＩＴＣを含むＦｍｏｃ−ＦＦによって安定化された、水中クロロホルムエマルジョン液滴の蛍光顕微鏡画像である。（ｅ）水相中にＦＩＴＣを含むＦｍｏｃ−ＦＦＦによって安定化されたクロロホルム中水エマルジョン液滴の蛍光顕微鏡画像である。（ｆ）ピレン−ＹＬによって安定化された水中クロロホルムエマルジョン液滴の蛍光顕微鏡画像である。スケール棒は５０μｍである。
【図４】（ａ）その中で、１０ｍｍｏｌ・Ｌ-1のＳＤＳ溶液およびＦｍｏｃ−ＹＬリン酸緩衝液を用いて手動で撹拌することにより、水中クロロホルムエマルジョン（白色泡状層）が調製された、ガラス瓶の光学写真である。上部画像が新たに調製されたエマルジョンを示し、かつ下部画像が２週間インキュベートした後のエマルジョンを示す。（ｂ）その中で、１０ｍｍｏｌ・Ｌ-1のＳＤＳ溶液およびＦｍｏｃ−ＹＬリン酸緩衝液を用いて手動で撹拌することにより、水中クロロホルムエマルジョン（白色泡状層）が調製された、ガラス瓶の光学写真である。上部画像が新たに調製されたエマルジョンを示し、かつ下部画像が６０℃で３時間加熱したエマルジョンを示す。（ｃ）その中で、１００ｍＭのリン酸緩衝液、塩化物緩衝液、およびチオシアン酸緩衝液中の、１０ｍｍｏｌ・Ｌ-1のＳＤＳおよびＦｍｏｃ−ＹＬを用いて、手動で撹拌することにより水中クロロホルムエマルジョン（白色泡状層）が調製された、ガラス瓶の光学写真である。上部画像が新たに調製されたエマルジョンを示し、かつ下部画像が２４時間インキュベートしたエマルジョンを示す。
【図５】（ａ）１ｍｇ・ｍＬ-1のサーモリシン緩衝液を、２ｍｍｏｌ・Ｌ-1のＦｍｏｃ−ＹＬ緩衝液で安定化させた水中クロロホルムエマルジョン液滴へ添加してから０、２０、４０、６０秒後の光学顕微鏡画像である。スケール棒は５０μｍである。（ｂ）１ｍｇ・ｍＬ-1のサーモリシンリン酸緩衝液を、２ｍｍｏｌ・Ｌ-1のＦｍｏｃ−ＹＬ緩衝液で安定化させた水中クロロホルムエマルジョン液滴へ添加してから０、２０、４０、６０秒後のサイズ分布のヒストグラムである。（ｃ）その中で、エマルジョンが形成された瓶の光学写真（左）、およびその中で、サーモリシンの添加でエマルジョンが解乳化された瓶の光学写真（左）である。１０分後に、エマルジョンは、１ｍｇ・ｍＬ-1のサーモリシンの非存在下（左）および存在下（右）において、２ｍｍｏｌ・Ｌ-1Ｆｍｏｃ−ＹＬ緩衝液で安定化された。
【図６】コンピューターによる、安定化されたエマルジョンの図表である。Ａ）トリペプチドＫＹＦ／ＫＦＦ／ＫＹＷ／ＤＦＦ／ＦＦＤである。Ｂ）自己組織化ナノ構造を示す、水溶液ＭＤシミュレーションである。Ｃ）自己組織化安定化エマルジョン液滴である。シミュレーション時間は９．６μ秒である。
【図７】ペプチドエマルジョンの実験的観察である。Ａ）それぞれのトリペプチドから形成されたエマルジョンである。Ｂ）ｉ）スダンＩＩで、ｉｉ）チオフラビンＴで、ｉｉｉ）両方を重ねて、標識されたＫＹＷの蛍光顕微鏡であり、スケール棒は１０μｍである。Ｃ）水性状態のサンプルのＦＴＩＲ、Ｄ）エマルジョン状態のサンプルのＦＴＩＲであり、アミドＩ領域を示す。
【図８】Ａ）３０℃、Ｂ）６０℃でのペプチドエマルジョンに対する温度の影響である。
【図９】（ａ）クロロホルム／水二相系におけるアルカリホスファターゼ脱リン酸化前後のＦｍｏｃ−ＹｐＬ挙動の略図であり、界面活性剤型挙動に従い１時間後に二相にゆっくりと戻るＦｍｏｃ−ＹｐＬに反して、エマルジョンを安定化させるＦｍｏｃ−ＹＬの能力を示す。青緑色が水、黄色がクロロホルム、緑がアルカリホスファターゼを表わす。（ｂ）芳香族ペプチド両親媒性物質Ｆｍｏｃ−ＹｐＬおよびＦｍｏｃ−ＹＬの化学構造である。（ｃ）アルカリホスファターゼの構造である。
【図１０】（ａ）Ｆｍｏｃ−ＹｐＬの拡大ＴＥＭ画像（ＥＳＩからのオリジナルは図Ｓ１にある）および肉眼的外観、ならびに（ｂ）Ｆｍｏｃ−ＹＬのＴＥＭ画像であり、ナノ繊維ネットワークおよび自己支持ヒドロゲルに自己組織化を開始するためのアルカリホスファターゼの重要性を示す（２％モリブデン酸アンモニウム染色）。（ｃ）Ｆｍｏｃ−ＹｐＬ（０時間）および酵素添加から２４時間後に達した後のＦｍｏｃ−ＹＬの、正規化された蛍光発光スペクトルである（ＥＳＩからの非正規化データは図Ｓ３に含まれる）（励起２８０ｎｍ）。（ｄ）フルオレニルピークが酵素添加の前および２４時間後に観察され、赤方偏移を示す（Ｆｍｏｃ−ＹｐＬ対照を除く）、λ最大波長の図である。（ｅ）Ｆｍｏｃ−ＹｐＬおよびＦｍｏｃ−ＹＬのアミド領域のＦＴＩＲ吸光度である。（ｆ）逆相ＨＰＬＣによってモニターされたＦｍｏｃ−ＹｐＬからＦｍｏｃ−ＹＬへの脱リン酸化である。
【図１１】ａ）２週間後に完全に解乳化され、アルカリホスファターゼを添加すると、エマルジョンを形成するＦｍｏｃ−ＹｐＬの能力に加えて、手で５秒間振とうした直後、および１時間／２週間後の、クロロホルム／水二相系におけるＦｍｏｃ−ＹｐＬおよびＦｍｏｃ−ＹＬの挙動を示すガラス瓶の光学写真である。（ｂ）水相中にＦＩＴＣを含むＦｍｏｃ−ＹＬのナノ繊維ネットワークによって安定化された水中クロロホルムエマルジョンの蛍光顕微鏡法画像である。スケール棒は１００μｍである。（ｃ）水中クロロホルムエマルジョン液滴のＳＥＭ画像である。スケール棒は１μｍである。挿入画像は、拡大された水中クロロホルム液滴を示す。スケール棒は１０μｍである。（ｄ）緩衝液中および二相系中での逆相ＨＰＬＣによってモニターされた脱リン酸化であり、アルカリホスファターゼがクロロホルム／水系で活性であることを示す。（ｅ）解乳化されたＦｍｏｃ−ＹｐＬへ異なるタイミングでアルカリホスファターゼを添加したときの、逆相ＨＰＬＣによってモニターされた脱リン酸化である。
【図１２】（ａ）２００ナノ秒後のＦｍｏｃ−ＹｐＬ系のスナップ写真である。Ｆｍｏｃが青色、チロシンおよびロイシンが赤色、リン酸基が黒色、イオンが灰色、水が赤、およびオクタノールが青緑で表される。挿入画像は、２つの分子間の１つのＴｙｒ−Ｔｙｒ  Ｈ結合、および界面活性剤型挙動を示し、元素によって着色されている。（ｂ）２００ナノ秒後のＦｍｏｃ−ＹＬ系のスナップ写真である。Ｆｍｏｃが青色、チロシンおよびロイシンが赤色、水が赤、およびオクタノールが青緑で表される。挿入画像は、２つの分子間のＦｍｏｃ−ＬｅｕおよびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ  Ｈ結合を示す。（ｃ）二相系におけるシミュレーション中の、Ｆｍｏｃ−ＹｐＬ分子間の１分子当たりの水素結合である。（ｄ）シミュレーション中の、Ｆｍｏｃ−ＹＬ分子間の１分子当たりの水素結合である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
この研究において、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはピレン（Ｐｙｒ）を、さまざまな疎水性基および官能性基を有する、ジまたはトリペプチドである、チロシン−ロイシン（ＹＬ）、チロシン−アラニン（ＹＡ）、チロシン−セリン（ＹＳ）、ジフェニルアラニン（ＦＦ）、およびトリフェニルアラニン（ＦＦＦ）と組み合わせることによって例示される、一連の芳香族短鎖ペプチド両親媒性物質が開示される（図１）。有機性／水性界面でのこれらのペプチド両親媒性自己組織化は、安定性が高いマイクロカプセル繊維ネットワークを急速に形成する。親水性頭部および疎水性尾部を有する従来の界面活性剤の界面における吸収とは異なり、芳香族π−πスタッキングおよびペプチドの水素結合によって自己組織化したナノ構造は、水性（または有機性）媒体中で有機性（または水）液滴が安定化するように配列される（図１ｂ）。
【００５４】
有機性／水性界面における芳香族ペプチド両親媒性物質研究の最初の興味は、芳香族ペプチドＦｍｏｃ−ＹＬがリン酸緩衝液（１０ｍＭ）およびクロロホルム（２５ｍＭ）の両方にゲルを形成することの観察から始まった。低濃度のＦｍｏｃ−ＹＬ（０．５ｍＭ）は、水性相と有機性相との間に移動し、平衡分布に達することを示した。さまざまな体積のクロロホルムを、１０ｍＭのＦｍｏｃ−ＹＬ緩衝液へ８０℃で添加することによって（緩衝液とクロロホルムとの体積比は１：９、３：７、５：５、７：３から、９：１へと変わる）、手で５秒間振とうした後に、図２ａで示されるように、エマルジョンが瓶中に形成される。予想外なことに、これらは数か月間安定したままであり、形成されたペプチド層は、優れたバリアをもたらし、合着を阻止することを示す。画像中で示されるように、乳状層はエマルジョンであり、上部および下部の透明層はそれぞれ水性相およびクロロホルム相である。ＵＶ−Ｖｉｓを使用し、水相に残ったＦｍｏｃ−ＹＬとクロロホルムに移動したＦｍｏｃ−ＹＬの量を決定した。フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）を使用し、蛍光顕微鏡法によって画像化するために、エマルジョン層中の水性相を標識した。図２ｂは、Ｆｍｏｃ−ＹＬによって乳化が安定化された後の水中クロロホルムエマルジョン形態を示す。
【００５５】
クロロホルム／水界面におけるＦｍｏｃ−ＹＬの吸収は、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルによって、各相の濃度を測定することにより定量化することができ、残余が界面において吸収されたものとなる。ＵＶ分析に基づいて、５０：５０の水／クロロホルム系では、クロロホルム／水界面で吸収されたＦｍｏｃ−ＹＬの量は１．９ｍｍｏｌ・ｍ-2と計算することができる。Ｆｍｏｃ−ＹＬの稠密単層の計算された最大吸収は、３．４μｍｏｌ・ｍ-2であり、界面で吸収されたＦｍｏｃ−ＹＬは、単層ではなくフィルムから構成されることが示される。
【００５６】
クロロホルム／水界面におけるペプチド界面フィルムの構造を、顕微鏡法および分光法技術の範囲を用いて調査した。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を、自己組織化ペプチド構造を標識するために使用した。Ｆｍｏｃ−ＹＬをＴｈＴとともに両溶媒中に溶解した後では、水中での発光が少なく、クロロホルム中での発光がほぼ観察されないが、ゲル化時に（２４時間）、水およびクロロホルムの両方に強い発光が出現し、自己組織化βシート様繊維構造が形成されることが立証される。続いて、ＴｈＴは、界面フィルムを標識するために使用され、図２ｃは、Ｆｍｏｃ−ＹＬシェルが有機液滴を安定化することを示し、界面におけるペプチドβシート様構造の自己組織化を示唆する。
【００５７】
次いで、赤外線分光法を使用し、水中、クロロホルム中、および界面における、Ｆｍｏｃ−ＹＬ繊維構造の自己組織化を支えるＨ−結合相互作用を決定した。図２ｄは、アミド部分およびカルバマート部分に対してそれぞれ１６２３および１６８４ｃｍ-1にピークを有する、規則正しく配列されたβシート様配置中のペプチドに典型的な、Ｄ2Ｏ中での赤外吸収スペクトルを示す。クロロホルム中では、これらのピークは、１６５２ｃｍ-1にさらなる吸収を伴って、１６３２および１６８７ｃｍ-1に観察され、あまり秩序だっていないＨ−結合ネットワークの存在を示す。さらに、水中では、Ｃ末端のカルボキシレート基へ割り当てられたピークが１５８８ｃｍ-1で見出されたが、クロロホルム中では、ピークは１７０８ｃｍ-1で観察され、有機溶媒におけるＣ末端のプロトン化が示された。界面では、Ｆｍｏｃ−ＹＬは、２つのピークを有するクロロホルム系と類似した構造を適合させ、あまり秩序だっていないβシート様環境を示す（１６２３および１６４１ｃｍ-1）。Ｃ末端は、（１５８８ｃｍ-1）のピークによって示されるように、依然として（一部において）脱プロトン化されており、ナノ構造ネットワークが水性相中に主に位置していることを示唆した。
【００５８】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用し、界面のＦｍｏｃ−ＹＬフィルムを可視化した。凍結乾燥を使用して、構造が保持されたサンプルを調製した。図２ｅは、界面における繊維ネットワークを示す。図２ｆは、空気乾燥条件時の、溶媒蒸発、結果として起こる収縮後に、マイクロカプセルとして残ったペプチド安定化エマルジョン液滴を示す。
乳化に影響を与える疎水性および化学基などの芳香族ペプチド両親媒性物質の特性は、芳香族基またはペプチド配列を変化させることによって変えることができる。ペプチド配列上の１つのアミノ酸を、チロシン−ロイシン（ＹＬ）、チロシン−アラニン（ＹＡ）からチロシン−セリン（ＹＳ）に疎水性を低下させつつ変えることによって、一連のペプチド両親媒性物質を調製した。Ｆｍｏｃ−ＹＡは、緩衝液およびクロロホルム（３０ｍＭ）の両方でゲルを形成することができるが、Ｆｍｏｃ−ＹＳは、これらの条件下、水性媒質中のみでゲルを形成する。原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像によって、緩衝液におけるＦｍｏｃ−ＹＬ、Ｆｍｏｃ−ＹＡ、およびＦｍｏｃ−ＹＳゲルの、繊維構造の形成が示され、それらの一方向性に組織化する傾向が立証される。図３ａは、Ｆｍｏｃ−ＹＡおよびＦｍｏｃ−ＹＳも、水中クロロホルムエマルジョンを安定化することができることを示す。赤外線スペクトル（図３ｂ）により、水性媒質において、βシート様Ｈ−結合の存在がＦｍｏｃ−ＹＬおよびＦｍｏｃ−ＹＡ中に確認され、Ｆｍｏｃ−ＹＳへの寄与はよりいっそう弱い。図３ｃには、計算された分配係数（ｃＬｏｇＰ）、水とクロロホルムとの間で測定されたペプチドの分配値および界面での蓄積値が記載される。これらの値は、Ｆｍｏｃ−ＹＬ、Ｆｍｏｃ−ＹＡ、およびＦｍｏｃ−ＹＳの臨界エマルジョン濃度（乳化実験から得られる）ならびにエマルジョン液滴の平均径と相関する。より疎水性のペプチド両親媒性物質、およびペプチド骨格間のより強いＨ−結合相互作用が、クロロホルム／水界面におけるより強い吸収を引き起こし、その結果、エマルジョン液滴サイズの減少および臨界エマルジョン濃度の低下がもたらされることが立証される。
【００５９】
さらに疎水性を高めるために、ジ−およびトリ−フェニルアラニンをペプチド配列（Ｆｍｏｃ−ＦＦおよびＦｍｏｃ−ＦＦＦ）としてテストした。Ｆｍｏｃ−ＦＦは、ナノ繊維構造（ＲＥＦ）を形成することはすでに立証されていた。図３ｄは、ＦＩＴＣで標識化された自己組織化繊維が、界面においてクロロホルム液滴を安定化させることを示す。Ｆｍｏｃ−ＦＦＦ両親媒性物質は、水相に溶解するにはあまりにも疎水性になりすぎるが、クロロホルムには溶解する。１０ｍＭのＦｍｏｃ−ＦＦＦクロロホルム溶液を調製し、ＦＩＴＣを含む緩衝液へ添加し、乳化すると、エマルジョン液滴のコアは、クロロホルム中水エマルジョンの形成を示す蛍光を発する（図３ｅ）。Ｆｍｏｃ基をピレンで置き換えると、両親媒性物質およびエマルジョン系に本質的な蛍光特性が与えられる。図３ｆは、ピレン−ＹＬの自己組織化によって安定化された、青色発光を有する水中クロロホルムエマルジョンの形成を示す。エマルジョン系をさらに最適化しかつ機能化するために、ペプチド配列および芳香族部分の変化を可能にすると予想されることが、示された結果に基づいて明らかに期待される。
【００６０】
エマルジョンを安定化するために、芳香族ペプチド両親媒性物質の自己組織化バリアの使用に注目すると、従来の界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）よりも、エマルジョンの安定性は劇的に高められる。図４ａは、室温でそれらを２週間放置した後、ＳＤＳによって安定化されたエマルジョンは、解乳化されかつ相分離しているが、Ｆｍｏｃ−ＹＬによって安定化されたエマルジョンは安定したままであることを示す。Ｆｍｏｃ−ＹＬ安定化エマルジョンは、６０℃に３時間暴露した後、明らかな変化が観察されることなく、熱安定であり、これはＳＤＳの挙動に匹敵する（図４ｂ）。１００ｍＭのリン酸塩溶液、塩化物溶液、およびチオシアン酸溶液において、１０ｍＭ  ＳＤＳ安定化エマルジョンは、図４ｃで示されるように２４時間後に相分離するが、Ｆｍｏｃ−ＹＬネットワークは、塩の効果に影響されることはなかった。本発明者らは、Ｆｍｏｃ−ＹＬは、クロロホルムの代わりに、水中ヘキサデカンエマルジョンおよび水中鉱油エマルジョンの両方を安定化することも可能にしたことを観察し、この試みをさまざまな有機媒体にも一般的に適用できるようにした。
【００６１】
エマルジョン系を安定化するために、ペプチド自己組織化を使用する他の極めて重要な利点は、適切な酵素を用いた安定化フィルムを消化する能力である。タンパク質分解酵素は、ペプチド結合を開裂させ、両親媒性物質の解離をもたらす酵素である。図５ａおよび５ｂは、サーモリシンをＦｍｏｃ−ＹＬ安定化エマルジョンへ添加した後、エマルジョン液滴は解乳化され、６０秒でより大きな液滴に合着することを示す。開裂反応の変換が、水性媒質中でサーモリシンによって触媒され、５０％に達し、１０分後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって検出されるときに、完全な解乳化および相分離が図５ｃで観察された。
【００６２】
以前に報告されているコンピュータースクリーニングプロトコル1-2が、水中での自己組織化が可能なトリペプチドの識別に適用された。約８０００個のこの初回スクリーニングから、乳化剤として作用する化合物の前提条件として考えられる、繊維および二層構造を形成する潜在力を示すペプチドのサブセットが識別された。このプロセスにより、ＭＡＲＴＩＮＩの粗視化力場3を用い、水および水／オクタン溶液中でさらに９．６μ秒間シミュレーションされた、５つのトリペプチド（図６Ａ）が選択された。
【００６３】
ＫＹＷ、ＫＦＦ、およびＫＹＦが、ヒドロゲルを形成することが可能なトリペプチドとしてすでに識別されていた。水中でこれらのペプチドをシミュレーションすることにより、自己組織化繊維を示す、伸展されたフィブリル構造（図６Ｂ）が得られる。しかしながら、さらなる２つのペプチド：ＦＦＤおよびＤＦＦを識別すると、さらに水中でシミュレーションした後に、これらは二層のような構造への自己組織化を示した（図６Ｂ）。この新しい構造は、潜在的な両親媒性挙動を示すため、エマルジョンを形成するための有力な候補物質になり得ることを示唆する。
【００６４】
二相系におけるトリペプチドのシミュレーションは、オクタン／水溶媒ボックスの使用によってモデル化された。その後、それぞれのトリペプチドに、二相系中で新たに９．６μ秒のシミュレーションを行い、水性溶液内でオクタンを安定化することが可能であるかどうかを決定した。シミュレーションにより、水／オクタン界面で組織化されたペプチドとともに、液滴としての有機溶媒の組織化が示される。予想通りに、疎水性基とともに集合したペプチドを液滴の有機コアに暴露すると、それによって２つの相間の界面張力が低下する。同様に、親水性基は、水相に対するバリアとして作用する。このような組織化におけるペプチドの配置は、ペプチドが、界面を安定化させる両親媒性物質として作用することを示す。トリペプチドが、界面周囲にナノ繊維を形成できないことは、モデルのサイズ限界と関連する。シミュレーションには、３００個のペプチドが含まれるが、これらは繊維へ自己組織化するときに、オクタン液滴をカプセル化するための十分な被覆はもたらさない。それにもかかわらず、有機性相および水性相の両方と相互作用するトリペプチドの能力は、乳化剤として作用するこれらの分子に対する肯定的な指標として考えられ、したがって、この予測をテストするために研究室での実験を行った。
【００６５】
９８％を超える純度の５つのトリペプチドを購入した。その後、それぞれのトリペプチドを水中に溶解し、ｐＨを、中性のｐＨである約７．５に変えた。エマルジョンを作るために、スダンＩＩ標識菜種油１００μＬをそれぞれの系へ添加した。菜種油は、食品に規定された油の比較により選ばれた。各サンプルに対して均質化を５秒間行い、その後、安定なエマルジョンが形成されたことを保証するためにサンプルを２４時間保存した。得られたエマルジョンの外観検査により、５つのトリペプチドにわたってさまざまな安定性が明らかになった。ＫＹＦ、ＫＦＦ、およびＫＹＷは、ＤＦＦおよびＦＦＤよりも安定化されたエマルジョンを形成し、このことは、水性状態で観察されるようなナノ繊維を形成するこれらのトリペプチドの能力が、エマルジョンの安定性において極めて重要な役割を果し得ることを示唆する。サンプルの不透明度（図７Ａ）は、界面活性剤様乳化剤（ＦＦＤおよびＤＦＦ）と繊維乳化剤（ＫＹＦ、ＫＦＦ、ＫＦＷ）との間で異なり、水性相内での油の完全な分散のため、より不透明なエマルジョンが高い安定性を示す。本発明者らは、エマルジョンは、植物油などの他の油を使用し、識別されたペプチドと組み合わせて形成し得ることも観察した。
【００６６】
蛍光顕微鏡法をそれぞれのサンプルに対して行い、液滴のサイズおよび分布を識別し、同様にペプチドが界面でどのように相互作用するかも識別した。スダンＩＩで有機性相を標識すると、安定化された有機液滴を含む混合物が明らかになった。ペプチド領域（βシート形態）を標識するチオフラビンＴ4を導入することにより、ＫＹＷは、液滴の界面に局在することが示された。このことは、ＫＹＷの場合、トリペプチドは界面においてフィブリルへと自己組織化し、様々なＦｍｏｃ−ジペプチドに関して本明細書において観察されるように、液滴を安定化させるネットワークを作ることを示唆する。２つの染料の組み合わせると、トリペプチドの液滴表面への局在化がさらに強調され、界面から離れた領域の感度はごくわずかとなる。
【００６７】
トリペプチドが、界面において、界面活性剤様の方式で凝集するのではなく、自己組織化ナノスケールネットワーク構造を形成することを確認するため、ＦＴＩＲ分光法を行い、ペプチドの自己組織化を示す重要な相互作用を識別した。構造を特徴づけるために、トリペプチドに対する研究を、水性相中で最初に実施した。ＫＹＦ、ＫＦＦ、およびＫＦＷは、自己組織化し、ＦＦＤおよびＤＦＦは自己組織化しないことが知られている（図７Ｃ）。ペプチドのナノ構造への凝集に対して、赤外線分光法で有意な変化が観察される。最初に、約１６２５ｃｍ-1および１６５０ｃｍ-1周囲の非常に強いＩＲピークは、繊維形成ペプチド中に存在する、ペプチド鎖のアミド基間の強い水素結合を示す。同様に、１５６０ｃｍ-1周囲のより大きなブロードピークは、脱プロトン化されたカルボキシレート基ＣＯＯ-を示す。このピークの、溶液状態からゲル状態へのシフトおよび広がりは、対応する末端基または側基のどちらかの間に塩橋が導入されたことを示す。このことは、全体的に広範囲な安定構造を与える２つの自己組織化構造間に水素結合を伴う、ペプチド間の頭部対尾部（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）相互作用を提示する。二相系において、エマルジョンが形成され、繊維（ＫＹＦ、ＫＦＦ、ＫＹＷ）を形成するサンプルは、水性相中で観察されるスペクトルと同一のＦＴＩＲスペクトルを有する。このことは、類似した繊維ネットワークが形成され、したがって、これらの液滴がナノ繊維ネットワークによって最も安定化されやすいことを示す。対照的に、水性系と二相系間との間でＦＦＤおよびＤＦＦに対するＦＴＩＲスペクトルを比較すると、エマルジョン状態でのピークの出現が、液滴を安定化させるナノ構造の形成を示すことが明らかである。これらのピークは、ペプチド骨格のＣ＝Ｏ伸長に相当する。これは水性状態では観察されないために、このことは、油を導入すると、これらのペプチドの自己組織化プロセスが引き起こされることを示唆する。ピークは比較的弱いが、シングルピークは、従来の界面活性剤モデルと類似した方式で組織化している、ペプチドの並列配置を示すことができる。
【００６８】
環境要因によってエマルジョンの分離を誘発する能力は、さまざまな適用分野で有用な特性である。5特に、種々の温度でエマルジョンを分解する能力は、食品産業におけるエマルジョンの用途に対して興味を持つことになる重要な特性である。6したがって、５つのペプチドごとに、エマルジョンの熱安定性を調査した。各サンプルを、湯浴中に入れ、エマルジョンを１０℃間隔でモニターした（図８）。
【００６９】
温度が上昇するにつれ、エマルジョンは２つの異なる層へ分離する。この解乳化は、６０℃で、ＫＹＦ以外の全てのサンプルに観察されるが、ＫＹＦは乳化状態のままである。このことは、ＫＹＦが、他のサンプルよりも熱に対して耐性が高く、配列によって熱耐性が調節される可能性があることを示す。全温度範囲にわたって、ＤＦＦおよびＦＦＤは比較的早く解乳化することが明らかであるが、このことはこれらのペプチドが強い乳化剤ではないということだけではなく、従来の界面活性剤は熱安定性問題を有するという最初の観察と関連する。ＫＦＦは約４０℃で破壊され始めて、ＫＹＷは５０℃で破壊され、ヒドロゲルの強さが、エマルジョンの安定性に正比例することを示唆する。
切り替え可能なまたは刺激反応性の界面活性能力は、特定の産業プロセス段階におけるエマルジョンの（非）活性化に対して魅力的である。特定の要因を適用することによって、乳化能力の制御が可能であり、これは所望の段階においてマルジョンを生成／破壊する迅速で効率的な方法である。
【００７０】
水性相における、前駆物質Ｆｍｏｃ−リン酸チロシン−ロイシン（Ｆｍｏｃ−ＹｐＬ、図９ｂ）のＦｍｏｃ−チロシン−ロイシン（Ｆｍｏｃ−ＹＬ、図１ｂ）へのアルカリホスファターゼを用いた酵素的変換を研究した。自己組織化プロセスを誘発するための酵素の能力が確立されると、実験の第二部では、クロロホルム／水界面における両親媒性物質Ｆｍｏｃ−ＹＬ繊維のオンデマンドな形成を調査し、界面活性剤吸着二相混合物をネットワーク安定化エマルジョンへ変換した（図９ａ）。
【００７１】
結果および考察
Ｆｍｏｃ−ＹｐＬのＦｍｏｃ−ＹＬへの酵素的変換
脱プロトン化されたリン酸基間の静電反発力のために、前駆物質溶液である１０ｍＭＦｍｏｃ−ＹｐＬの０．６Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８は、ゲルを形成することができず、繊維形成の形跡を全く示さない（図１０ａ）。アルカリホスファターゼを添加すると、前駆物質Ｆｍｏｃ−ＹｐＬの透明溶液が、Ｆｍｏｃ−ＹＬへ変換され、ヒドロゲルをもたらすナノ繊維ネットワークが生成された（図１０ｂ）。逆相ＨＰＬＣによって脱リン酸化反応をモニターすると（図１０ｆ）、２時間後に約９０％のＦｍｏｃ−ＹｐＬがＦｍｏｃ−ＹＬに変換され、２４時間以内にＦｍｏｃ−ＹＬへの完全な変換が達成されることが明らかになった（図１０ｆ）。
【００７２】
酵素的に誘発されたエマルジョン
クロロホルムを、１：１の体積比で５ｍＭのＦｍｏｃ−ＹｐＬ緩衝液へ添加し、手で５秒間振とうするときに、エマルジョンが形成される。Ｆｍｏｃ−ＹｐＬは界面活性剤様の挙動に従い、形成された泡によって見ることができ、両親媒性物質は脂／水界面へ吸収する。しかしながら、Ｆｍｏｃ−ＹｐＬの構造は、界面を効果的に安定化できないことを意味し、１時間後に解乳化が生じる（図４ａ）。一方、アルカリホスファターゼをＦｍｏｃ−ＹｐＬを含む二相系へ添加し、手で振とうすると、すでに立証されているように、水とクロロホルムとの間の界面においてＦｍｏｃ−ＹＬのナノ構造が自己組織化され、数カ月間安定なエマルジョンを生成する（図１１ａ）。酵素誘発による自己組織化は、乳化に対する制御を一時的に可能にし、アルカリホスファターゼをＦｍｏｃ−ＹｐＬ二相系へ添加することによって達成される（図１１ａ）。
【００７３】
【表１】
2017517281.tif 000003
分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを行い、二相環境中に秩序構造を形成するためのＦｍｏｃ−ＹｐＬおよびＦｍｏｃ−ＹＬの能力を調査した。Ｆｍｏｃ−ＹｐＬまたはＦｍｏｃ−ＹＬの分子６０個を、ＴＩＰ３Ｐ水およびオクタノールを含む大きいボックスの水相中に無作為に分散させた。溶媒の界面に向かって凝集するＦｍｏｃ−ＹｐＬおよびＦｍｏｃ−ＹＬの両方の傾向を、シミュレーション中で観察した（図１２ａおよび図１２ｂにおける２００ナノ秒シミュレーションの最終スナップ写真を参照のこと）。系の最終スナップ写真から、両方の系が、溶媒の界面において組織化することが可能であるが、Ｆｍｏｃ−ＹｐＬは、ボックスの長さに沿って均一に分散し、オクタノール溶媒への浸透は最小限であり、主にＦｍｏｃ残基およびＬｅｕ残基に生じることが明らかである（図６ａ）。対照的に、Ｆｍｏｃ−ＹＬはより規則正しい凝集体を形成することが可能であり、この凝集体は、結果として得られる繊維様構造がオクタノール相中へ分配することを可能にし（図１２ｂ）、分配実験の結果と一致する（表１）。
【００７４】
結論
結論として、芳香族基を含んでもよい短鎖ペプチドを使用すると、有機性／水性界面においてナノ繊維ネットワークへ自己組織化し、さまざまな水中油または油中水のエマルジョンを乳化および安定化させることを立証する。界面でペプチドマイクロカプセルを形成すると、従来の界面活性剤、例えばＳＤＳと比較して、温度および多様な塩に対し長期の高い安定性がもたらされる。いくつかの実施形態において、ペプチド両親媒性物質を、芳香族部分およびペプチド配列を変えることよって設計し、エマルジョン安定性、液滴サイズおよび／または臨界エマルジョン濃度を操作することができる。特定のペプチドマイクロカプセルは、生理的条件下でまたは高温に反応して、オンデマンドな解乳化が可能なタンパク質分解酵素の存在下で解離することができる。芳香族成分をヌクレオチドまたは他の適切な基などの生体適合リガンドで置き換えることによって、または記述されるような未修飾の自己組織化芳香族ペプチドを使用することによって、適切な分子を、十分な生体適合性類似体を含むように設計することが予想される。本明細書において示される界面ネットワークは、例えば、薬物の送達および放出、ならびに食品産業における潜在的な用途を伴うカプセル化およびコンパートメント化を促進する。
【００７５】
二相系で自己組織化し、エマルジョンを安定化することが可能な、非保護トリペプチドが最初に報告される。これらのエマルジョンは、周囲温度および高温の両方で広範囲の安定性を示し、これは調節可能でありかつ配列によって決まる広範囲な特性をもたらした。特に、繊維構造が、従来の界面活性剤モデルと比較して、より安定なエマルジョンを形成することが示された。
【００７６】
有機性／水性界面において酵素的に自己組織化させ、水中クロロホルムエマルジョンを安定化させるための、芳香族ジペプチド両親媒性物質の使用の可能性が立証された。Ｆｍｏｃ−ＹＬは、非組織化前駆物質Ｆｍｏｃ−ＹｐＬからのその酵素的生成の後に、水中で自己組織化することが可能であることが立証された。自己組織化Ｆｍｏｃ−ＹＬは、π−スタッキングおよびＨ−結合を含む非共有結合相互作用によって、ナノ繊維を形成することが示された。二相系中にあるときは、酵素的に誘発されたＦｍｏｃ−ＹＬは、クロロホルム／水界面においてナノ繊維ネットワークへ自己組織化し、水中クロロホルム液滴を安定化させ、エマルジョンを生成し、このエマルジョンは数カ月間安定である。エマルジョンの安定性およびさまざまなタイミングで酵素を添加することによる乳化能力切り替えの可能性は、エマルジョン形成を必要とする、化学的かつその他のプロセスにおけるいくつかの用途に対して、極めて有望なツールをもたらす。
【００７７】
材料および方法
材料
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（９７％）、Ｈ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（≧９８．０％）、Ａｌａ−ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（≧９８．０％）、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−Ｓｅｒ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩（≧９８．０％）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（＞９９．５％）、トリフルオロ酢酸（９９％）、水酸化ナトリウム、ピレン−１−酢酸、フルオレセインイソチオシアナート異性体Ｉ（≧９０％）、チオフラビンＴ、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物（ＡＣＳ試薬、９８．０％〜１０２．０％）、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物（ＡＣＳ試薬、９８．０％〜１０２．０％）、ヘキサデカン（９９％）、および鉱油は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入し、そのまま使用した。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＯＨは、ＢＡＣＨＥＭ社より購入した。２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。リン酸緩衝液（ｐＨ８）は、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ９４ｍｇおよびＮａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ２．５ｇを、水１００ｍｌ中に溶解することによって調製した。Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ（ＮＭｅ2）2−ＯＨ（５３７．５５ｇ・ｍｏｌ-1）は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ（４０３．４３ｇ・ｍｏｌ-1）、Ｌ−ロイシンｔｅｒｔ−ブチル塩酸塩（２２３．７４ｇ・ｍｏｌ-1）、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで発現するウシ由来アルカリホスファターゼ（タンパク質１ｍｇ当たり５０００Ｕ、１ｍＬ当たりタンパク質２０ｍｇ、０．０４９ｍＬ、見かけ分子量１６０ｋＤａ）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社より提供された。１酵素単位は、アルカリホスファターゼが、ｐＨ９．８および３７℃で１分当たり１μｍｏｌの４−ニトロフェニルリン酸塩を加水分解する量に相当する。
【００７８】
修飾ペプチドの合成
Ｆｍｏｃ−ＹＬ−ＯＨの合成：
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ（１ｇ、２．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（０．６６３ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）、およびＨＢＴＵ（０．９４１ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡ（１．０８ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ）の添加とともに無水ジメチルホルムアミド（約１５ｍｌ）中に溶解した。混合物を２４時間撹拌した。生成物を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（約３０ｍＬ）の添加によって沈殿させ、酢酸エチル（約５０ｍＬ）中へ抽出した。混合物を、等体積の、飽和食塩水、１Ｍ塩酸、および食塩水で洗浄した。得られた有機性相を、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、酢酸エチルは、真空下で蒸発させることによって除去した。次いで、得られた固体を、溶出液としてジクロロメタン中の２．５％メタノールを使用することにより、カラムクロマトグラフィーによって精製した。分画を、スポットを可視化するためのＵＶ（２５４ｎｍ）光下で、ＴＬＣを使用してテストした。化合物を含む分画を合わせ、溶媒を真空下で除去した。サンプルをジクロロメタン中に溶解し、トリフルオロ酢酸１０ｍＬを添加することによって、ｔ−Ｂｕの除去を行った。混合物を２４時間撹拌した。ジクロロメタンを、真空下で蒸発させることによって除去し、ＴＦＡを、トルエン（約１０ｍＬ）およびＴＨＦ（約２ｍＬ）を用いて除去した。溶媒を、真空下で蒸発させることによって除去した（３回行った）。得られた固体を、冷却ジエチルエーテルを用いて６回洗浄し、生成物を真空下で乾燥した。
他のＦｍｏｃ−ジペプチド（Ｆｍｏｃ−ＹＡ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−ＹＳ−ＯＨ）の合成は、Ｆｍｏｃ−ＹＬと同じ実験手順に従う。
【００７９】
スキーム
【化１】
2017517281.tif 000004
Fmoc-YL-OH
HPLC (214 nm)純度 = 97.00 %. δH (DMSO, 500 MHz): 12.6 (1H, s, OH), 9.2 (1H, s, Tyr OH), 8.34 - 8.32 (1H, NH d, J = 8 Hz), 7.89 - 7.87 (2H, d, J = 7.5 Hz, 2 フルオレニルAr-CH), 7.66 - 7.62 (2H, m, 2 フルオレニルAr-CH), 7.55 - 7.53 (1H, d, J = 9 Hz, NH), 7.43 - 7.39 (2H, m, 2 フルオレニルAr-CH), 7.34 - 7.27 (2H, m, 2 フルオレニルAr-CH), 7.10 - 7.09 (2H, d, j = 8.3 Hz, 2 Tyr Ar-CH), 6.64 - 6.62 (2H, d, J = 8.35 Hz, 2 Tyr Ar-CH), 4.25 - 4.10 (5H, m, フルオレニルCH, フルオレニルCH2およびCαH), 2.92 - 2.91 (1H, m, Tyr CH), 2.73 - 2.71 (1H, m, Tyr CH), 1.68 -1.62 (1H, m, Leu CH) 1.55-1.52 (2H, m Leu CH2), 0.9-0.83 (6H, m Leu 2CH3) MS (ES+): m/z 517.2, [M + H]+.
Fmoc-YA-OH
HPLC (214 nm)純度= 99.00 %. δH (DMSO, 500 MHz): 12.5 (1H, s, OH), 9.1 (1H, s, Tyr OH), 8.28 - 8.26 (1H, d, J = 8 Hz, NH), 7.88 - 7.87 (2H, d, J = 7.5 Hz, 2 フルオレニルAr-CH), 7.65 - 7.61 (2H, m, 2 フルオレニルAr-CH), 7.53 - 7.51 (1H, d, J = 9 Hz, NH), 7.43 - 7.39 (2H, m, 2 フルオレニルAr-CH), 7.34 - 7.28 (2H, m, 2 フルオレニルAr-CH), 7.10 - 7.09 (2H, d, j = 8.3 Hz, 2 Tyr Ar-CH), 6.64 - 6.62 (2H, d, J = 8.35 Hz, 2 Tyr Ar-CH), 4.19 - 4.10 (5H, m, フルオレニルCH, フルオレニルCH2およびCαH), 2.92 - 2.91 (1H, m, Tyr CH), 2.73 - 2.71 (1H, m, 1Tyr CH), 1.33-1.29 (3H, Ala CH3) MS (ES+): m/z 475.07, [M + H]+.
Fmoc-YS-OH
HPLC (214 nm)純度 = 97.5.00 %. δH (DMSO, 500 MHz): 12.5 (1H, s, OH), 9.1 (1H, s, Tyr OH), 8.28 - 8.26 (1H, d, J = 8 Hz, NH), 7.88 - 7.87 (2H, d, J = 7.5 Hz, 2 フルオレニルAr-CH), 7.65 - 7.61 (2H, m, 2 フルオレニルAr-CH), 7.53 - 7.51 (1H, d, J = 9 Hz, NH), 7.43 - 7.39 (2H, m, 2 フルオレニルAr-CH), 7.34 - 7.28 (2H, m, 2 フルオレニルAr-CH), 7.10 - 7.09 (2H, d, j = 8.3 Hz, 2 Tyr Ar-CH), 6.64 - 6.62 (2H, d, J = 8.35 Hz, 2 Tyr Ar-CH), 4.7 - 4.6 (1H, m CαH) 4.19 - 4.10 (4H, m, フルオレニルCH, フルオレニルCH2およびCαH), 2.92 - 2.91 (3H, m, 1Tyr CH, Ser CH2), 2.73 - 2.71 (1H, m, Tyr CH). MS (ES+): m/z 491.00 [M + H]+.
【００８０】
Ｐｙｒ−ＹＬ−ＯＨの合成：
ピレン−１−酢酸（０．５０ｇ、１．９２ｍｍｏｌ）、Ｌ−チロシンｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．４６ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）、およびＨＢＴＵ（０．７４０、１．９５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ１０ｍＬ中で混合した。ＤＩＰＥＡ  ０．８９ｍＬ（４．８ｍｍｏｌ）を、この溶液に添加し、混合物を、窒素雰囲気下で一晩撹拌した。反応後、１Ｎ  ＮａＨＣＯ3２０ｍＬおよび１Ｎ塩酸２０ｍＬで連続的に洗浄し、その後、生成物を酢酸エチル５０ｍＬで抽出し、次いで、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒の蒸発後、この化合物を、溶出液としてジクロロメタン／メタノール（９５：５）（０．７ｇ、７５％）を使用したシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製した。次いで、化合物（０．６ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル基を、乾燥ジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）と１５時間反応させることによって除去した。溶媒および過剰なトリフルオロ酢酸を、真空下で除去すると、ピレン−Ｙ酸（０．５３ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）が得られた。次いで、ピレン−Ｙ酸（０．５２ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）、Ｌ−ロイシンｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩（０．２３ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．４７、１．２５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ０．５８ｍＬ（３．１ｍｍｏｌ）との、乾燥ＤＭＦ１０ｍＬ中でのペプチドカップリング反応によって、ピレン−ＹＬ−Ｏｔｂｕを得た。純粋な生成物（０．３８ｇ、５２％）を、溶出液としてジクロロメタン／メタノール（９５：５）を使用した、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって得た。最後に、ピレン−ＹＬ−Ｏｔｂｕ（０．３ｇ、０．５０６ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル基を、トリフルオロ酢酸を用いて除去し、純粋なピレン−ＴＬ（０．２７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.79-0.83 (m, 6H, ロイシン部分のCH3), 1.48-1.57 (m, 3H, ロイシン部分のCHおよびCH2), 2.7-2.95 (m, 2H, チロシン部分のCH2), 4.1 (s, 2H, ピレンペプチドリンカーのCH2), 4.22-4.28 (m, 1H, ロイシン部分のキラルCH), 4.52-4.58 (m, 1H, チロシン部分のキラルCH), 6.63 (d, 2H, OH基のオルト位のCH 3J = 8.0 Hz), 7.0 (d, 2H, OH基のメタ位のCH, 3J = 8.0 Hz),  7.86 (d, 1H, ピレン芳香族CH 3J = 8.0 Hz), 8.07-8.1 (m, 1H, ピレン芳香族CH), 8.16-8.16 (m, 2H, ピレン芳香族CHおよびアミドNH), 8.18-8.27 (m, 4H, ピレン芳香族CHおよびアミドNH), 8.41-8.43 (m, 3H, ピレン芳香族CH). ESI-MS: m/z: C33H32N2O5の計算値: 536.23 [M+]; 実測値: 559.27 [M+ +Na].
Ｆｍｏｃ−ＦＦおよびＦｍｏｃ−ＦＦＦは、ＢｉｏｇｅｌＸ社およびＢＡＣＨＥＭ社よりそれぞれ購入した。
【００８１】
エマルジョンの調製
１０ｍＭのＦｍｏｃ−ＹＬ溶液を、Ｆｍｏｃ−ＹＬ  ５．３２ｍｇをリン酸緩衝液１ｍＬに溶解することによって調製した。さまざまな体積のクロロホルムを、Ｆｍｏｃ−ＹＬ緩衝液へ８０℃で添加し（緩衝液とクロロホルムとの体積比は１：９、３：７、５：５、７：３から、９：１へと変わり、総体積は常に１ｍＬであった）、手で５秒間振とうした後、瓶中にエマルジョンが形成された。ＳＥＭ、ＩＲ、安定性、平均粒子径、臨界エマルジョン濃度、および解乳化測定のために、緩衝液とクロロホルムとの体積比を７：３で固定した。研究された全ての芳香族ペプチド両親媒性物質（Ｆｍｏｃ−ＹＡ、Ｆｍｏｃ−ＹＳ、Ｐｙｒ−ＹＬ、Ｆｍｏｃ−ＦＦ、およびＦｍｏｃ−ＦＦＦ）の濃度は、臨界エマルジョン濃度（０．１〜１０ｍＭ）および解乳化測定（２ｍＭ）での決定を除いて、１０ｍＭであった。
【００８２】
特性評価
Ｆｍｏｃ−ＹＬマイクロカプセルの構造を、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ８００電界放出走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用し、１０ｋｅＶの加速電圧で決定した。Ｆｍｏｃ−ＹＬ、ＹＡ、およびＹＳの移動を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（ＪＡＳ．Ｃ．Ｏ  Ｖ−６６０分光光度計）によって分析した。Ｆｍｏｃ−ＹＬゲルの形成およびＴｈＴの標識を、蛍光分光法（ＪＡＳ．Ｃ．Ｏ  ＦＰ−６５００蛍光分光計）によって行った。高分解能マススペクトル（ＨＲＭＳ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ上に記録した。４００．１（１Ｈ）ＮＭＲスペクトルを、室温で、内部標準として過重水素化溶媒を使用して、Ｂｒｕｃｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ４００分光計上に記録した。
【００８３】
エマルジョン液滴を、蛍光顕微鏡法によって特徴付けた。機器は倒立顕微鏡（ＡＸＩＯ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ａ１、Ｚｅｉｓｓ社）の上に取り付けられ、画像はＥＭＣＣＤ  ＬｕｃａＲカメラ（Ａｎｄｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用して得た。画像（明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡法を使用）は、Ｚｅｉｓｓ社ｘ２０乾燥対物レンズおよび蛍光色素分子を画像化するために取り付けられた適切なフィルターを使用して得た。画像は、ＩｍａｇｅＪを使用して分析した。
Ｆｍｏｃ−ＹＬ、ＹＡ、ＹＳの繊維構造を、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）によって決定した。画像は、タッピングモードで操作されたＶｅｅｃｏ  ｄｉＩＮＮＯＶＡ走査型プローブ顕微鏡（ＶＥＥＣＯ／ＢＲＵＫＥＲ社、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、空気中、周囲条件下で雲母表面を走査することによって得た。溶液２０μｌを、ＡＦＭ支持スタブ（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｓｔｕｂ）へ取り付けられ、埃のない環境下で一晩空気乾燥し、整えられかつ新たに切断された雲母板（Ｇ２５０−２雲母板１”ｘ１”ｘ０．００６”Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ、Ｅｓｓｅｘ、ＵＫ）上に置いた。ＡＦＭ走査を、５１２×５１２ピクセル解像度で行った。一般的な走査パラメータは下記のとおりであった：タッピング周波数３０８ｋＨｚ、積分ゲインおよび比例ゲイン各０．３および０．５、設定点０．５〜８Ｖ、および走査速度１．０Ｈｚ。
【００８４】
βシート様配置を、赤外吸収スペクトルによって決定した。このスペクトルは、１ｃｍ-1の解像度で、１サンプル当たり２５回の走査で平均化し、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｖｅｒｔｅｘ  ７０分光計上に記録された。サンプルを、５０μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）スペーサーを用いて隔てられた２つの２ｍｍのＣａＦ2ウィンドウの間に入れた。
コンピュータースクリーニング：
ペプチド構造は、ＶＭＤスクリプトツールを介して得られ、ｍａｒｔｉｎｉｚｅ．ｐｙスクリプトを使用したＭＡＲＴＩＮＩ  ＣＧ表示へ変換した。ＣＧペプチド分子３００個を、１２．５ｘ１２．５ｘ１２．５ｎｍ3の寸法のボックス中に無作為に挿入し、ＣＧ水で溶媒和した。３００個のイオン（Ｃｌ-またはＮａ+）を系へ添加し、電荷を完全に中和する。オクタン分子１０００個を添加した二相系に対し同じ手順を行う。オクタンの添加を、水／ペプチド混合物へ行い、水の実験的密度（９９９ｋｇ  ｍ-3）に近い密度を得た。これは、最小化された水／トリペプチドボックスを最小化されたオクタンボックスと合わせることによって行われた。
【００８５】
最小化ボックスは、ＣＧポテンシャルの柔軟性のため、時間のスケーリングによって、２５フェムト秒のタイムステップで５００，０００ステップ（１２．５ナノ秒シミュレーションタイム、約５０ナノ秒リアルタイムの間に平衡化した7。Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎアルゴリズムを使用し、温度（３００Ｋ）および圧力（１ｂａｒ）を一定に維持する。周期的境界条件が有効であった。
それぞれの系を、９．６マイクロ秒間（シミュレーション時間）シミュレーションし、その後、最後のフレームを使用して最終的な構造を識別した。
【００８６】
実験的検証：
９８％を超える純度のペプチドをＢａｃｈｅｍ社より購入した。
ペプチドを水中に溶解し、ｐＨを、中性ｐＨの約７．５に変えることによって、ペプチドの調製を行った。
スダンＩＩ標識菜種油１００μＬをそれぞれの系へ添加した。それぞれのサンプルに対して均質化を５秒間行い、その後、安定なエマルジョンが形成されたことを保証するためにサンプルを２４時間保存した。
【００８７】
ＦＴＩＲ
ＦＴＩＲサンプルは、２つの２ｍｍのＣａＦ２ウィンドウの間の標準的なＩＲ  Ｈａｒｒｉｎｋセル内に含まれていた。５０μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）スペーサーを、スペーサー間に入れた。スペクトルを、１ｃｍ-1のスペクトル解像度で、２５回の走査を平均化することによって、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｖｅｒｔｅｘ  ７０分光計上に記録した。
蛍光顕微鏡法
サンプルをスライドガラス上に置き、カバーガラスを最上部に置くことによって、蛍光顕微鏡サンプルを調製した。シリカ油一滴をサンプル上に置き、潤滑な表面にした。サンプルを、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００正立蛍光顕微鏡上で、ｘ１０００倍率で測定した。
【００８８】
時間安定性
これらの最初の観察によって、ゲル化挙動を示すサンプルは、他の構造を形成するサンプルより安定なエマルジョンを形成する傾向があることが示される。このことは、フィブリル形成が、安定なエマルジョンを形成する界面で自己組織化するペプチドの能力に対して大きな重要性を有することを示唆する。油液滴周囲のフィブリルは、液滴の融合を阻害する。観察されるように、１６８時間にわたる時間安定性により、ＫＹＦ、ＫＦＦ、およびＫＹＷに対してわずかな解乳化が示されるか、または解乳化は示されないが、繊維を形成しないＦＦＤおよびＤＦＦペプチドに対しては明らかな解乳化が観察される。この観察により、フィブリルの形成が、エマルジョンの安定化に対する主な原動力であることが示唆される。フィブリル形成の重要性が、エマルジョンの安定化に対して極めて重要であることが示された。乳化前後のＦＴＩＲの比較により、液滴を安定化する助けとなる重要な相互作用が示される。
【００８９】
温度研究により、エマルジョンが破壊され始める範囲が示される。ＫＹＦは、すべての温度範囲にわたって相対的に安定であることが示される。温度を３０〜４０℃に上昇させることにより、ＫＦＦの破壊が示される。ＫＹＷは、約４０〜５０℃のわずかに高い温度で破壊される。ＤＦＦおよびＦＦＤは、低温で相対的に不安定化し、温度を上昇させるとわずかな変化を引き起こすことがわかる。
リン酸塩（Ｐｈｏｐｈａｔｓｅ）実験
ゲルの調製
１０ｍＭの合成Ｆｍｏｃ−ＹｐＬを、０．６Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８  ９５０μＬで調製し、直ちにアルカリホスファターゼ５０μＬ（０．０５５５Ｕ・μＬ-1、または５５．５３Ｕ・ｍＬ-1の酵素濃度）を添加し、室温でボルテックスおよび超音波処理を行った。他に記述がある場合を除き、全ての特性評価を２４時間後に行った。Ｆｍｏｃ−ＹｐＬ前駆物質に関しては、調製は、酵素を添加しないことを除いて、同じであった。
【００９０】
エマルジョン調製
Ｆｍｏｃ−ＹｐＬを、前述と同様の方法で調製したが、ヒドロゲルの形成を回避するために５ｍＭの濃度で調製した。Ｆｍｏｃ−ＹｐＬを緩衝液で調製してから２４時間後に、アルカリホスファターゼを添加することに加えて（完全な脱リン酸化を確実にするために）、クロロホルム５００μＬをサンプル５００μＬに添加し、手で５秒間振とうし、５０：５０の水中クロロホルムエマルジョンを作製した。
オンデマンド活性化テスト
系がオンデマンドで切り替え可能かどうかをチェックするために、アルカリホスファターゼを５０：５０の水中クロロホルムＦｍｏｃ−ＹｐＬサンプルに直ちに添加し、さらに、調製してから１週間後、２週間後、および１か月後に、酵素をＦｍｏｃ−ＹｐＬの解乳化二相系に添加した。写真を撮り、逆相ＨＰＬＣによって、脱リン酸化を評価した。
【００９１】
計算
分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを、ＮＡＭＤ（ナノスケール分子動力学）プログラムで、ＣＨＡＲＭＭ力場を使用して行った。それぞれの系を、３００Ｋで最小化し、急降下技術を用い、次いで５５ピコ秒間で０〜３００Ｋに徐々に加熱してから、４４５ピコ秒間平衡化させると、安定化された系に達する。最終的に、この系は、１ａｔｍおよび３００ＫのＮＰＴアンサンブル内で２００ナノ秒間実行した。２．０フェムト秒ステップを使用し、非結合相互作用に対する１２Åのカットオフとともに、ニュートンの運動方程式を積分した。三次元座標における周期的境界条件を使用した。
【００９２】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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