(57)【要約】  新規なスタテリン系融合ペプチドを提供する。この融合ペプチドは、DSSEEKFLRで示されるスタテリンペプチドまたは機能的に等価なその変異体と、エナメル質表面の獲得被膜のタンパク質またはペプチドとが融合したものである。本発明のスタテリン系融合ペプチドは、歯質脱灰の処置に有効である。さらに、ハイドロゲルカプセルに封入された、スタテリン、スタテリン系融合ペプチド、ヒスタチンなどのエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドも提供する。
2017530134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DSSEEKFLRで示されるスタテリンペプチドまたは機能的に等価なその変異体と、第２のエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドとが融合したスタテリン系融合ペプチド。
【請求項２】
前記第２のエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドが、エナメル質表面の獲得被膜（ＡＥＰ）のペプチドである、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項３】
前記第２のエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドが、前記スタテリンタンパク質またはそのペプチド断片である、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項４】
前記第２のエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドが、ヒスタチンまたは機能的に等価なヒスタチンの変異体もしくは断片である、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項５】
前記第２のエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドが、ヒスタチン−１、ヒスタチン−３および機能的に等価なこれらの断片からなる群から選択される、請求項４に記載の融合ペプチド。
【請求項６】
前記機能的に等価な断片が、ヒスタチン−５およびRKFHEKHHSHRGYRから選択される、請求項５に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
DSpSpEEKFLR-DSpSpEEKFLRで示される、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項８】
DSpSpEEKFLR-RKFHEKHHSHRGYRで示される、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項９】
請求項１に記載のスタテリン系融合ペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１０】
経口投与用に製剤化された請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
液剤、錠剤、カプセル剤、散剤、ゲル剤またはペースト剤である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載のスタテリン系融合ペプチドを歯に接触させるステップを含む、歯質脱灰を処置する方法。
【請求項１３】
約１００ｎｇ〜１００μｇの用量で歯に接触させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記融合ペプチドを、フッ化物、カゼインリン酸化ペプチド、非晶質リン酸カルシウム、ホワイトニング剤、デンタルシーラント剤、清涼剤、抗菌剤、薬用植物由来のハーブ抽出物およびこれらの組み合わせと併せて使用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生体適合性ハイドロゲルカプセルに封入された、カプセル化エナメル質保護タンパク質またはカプセル化エナメル質保護ペプチド。
【請求項１６】
前記生体適合性ハイドロゲルが、キトサン、アルギン酸塩、コラーゲン、ポリ（アリルアミン）または機能的に等価なこれらの誘導体のハイドロゲル、およびこれらのハイドロゲルの混合物からなる群から選択される、請求項１５のカプセル化タンパク質またはカプセル化ペプチド。
【請求項１７】
前記タンパク質またはペプチドが、スタテリンもしくは機能的に等価なスタテリンのペプチド、ヒスタチンタンパク質もしくは機能的に等価なヒスタチンタンパク質のペプチドまたは請求項１に記載の融合ペプチドである、請求項１５に記載のカプセル化タンパク質またはカプセル化ペプチド。
【請求項１８】
前記ハイドロゲルがキトサンハイドロゲルである、請求項１６に記載のカプセル化タンパク質またはカプセル化ペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドが、スタテリン、DSpSpEEKFLR、DSpSpEEKFLR-DSpSpEEKFLRD、SpSpEEKFLR-RKFHEKHHSHRGYR、ヒスタチン−１、ヒスタチン−３、ヒスタチン−５および機能的に等価なヒスタチン断片からなる群から選択される、請求項１７に記載のカプセル化タンパク質またはカプセル化ペプチド。
【請求項２０】
請求項１５に記載のハイドロゲルカプセル化エナメル質保護タンパク質またはハイドロゲルカプセル化エナメル質保護ペプチドを口腔内に投与するステップを含む、歯の脱灰を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全体として、スタテリン系融合ペプチドを含む、歯質脱灰の処置に有効な合成プロテイナーゼ耐性ペプチド、ならびに歯質脱灰の処置に有効なタンパク質およびペプチドの送達システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、今日口腔衛生は、健康全般、福祉および生活の質の重要な指標となっている。口腔衛生は、世界的に最も重要な健康管理問題の１つであるが、残念なことに社会経済的な理由や認識不足などのさまざまな理由により極めて軽視されている。口腔衛生不良は、より深刻な、時として健康を損ねる恐れのある合併症の発症につながる。例えば、口腔衛生不良は、循環器系疾患、脳卒中、糖尿病の発症、肝臓障害、有害な呼吸器系合併症、妊娠合併症といった、多くの場合厳しい結果を招く健康問題の発症に直接的または間接的に関与すると考えられている。
【０００３】
う歯は、カナダ国民にとって最も一般的な慢性疾患である。何百万人ものカナダ人が歯を失い、痛みに耐え、循環器系疾患、糖尿病、妊娠転帰不良、肺感染症などといった全身疾患の原因となる口腔感染症を発症している。２００４年のカナダ全体での歯科医療費は、推定で８８億ドルであるとされている。直接的なコストの面からみると、カナダにおいて歯科医療は、さまざまな年齢層で構成される国民の大多数が支払う医療費において、循環器系疾患に次いで２番目に高額な疾患に分類される。ヒトの口腔は、種々の微生物が密接に結びついて共生している多種共生集落の最もよい例の一つである。この集落には、球菌、桿菌、放線菌といった形態や、その他の運動性または非運動性の形態を有する種々のグラム陽性菌およびグラム陰性菌が含まれており、種々の酵母、真菌およびウイルスなども含まれる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養、ＰＣＲ増幅、１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子タイピングおよびピロシーケンス技術に基づいて控えめに見積もっても、この集落には１０００を超える種類の微生物が存在しており、これらの微生物は、唾液中の浮遊形態として、また歯や口内の他の表面において特異性の高い協力関係のもとで形成される多層構造の混合種バイオフィルムとして共存している。このバイオフィルムは、相互付着および共凝集の過程におけるＡＥＰとの相互作用により、また遺伝的に多様な微生物間の特異的な細胞間相互作用、例えば、キャプノサイトファガ・ジンジバリス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）とアクチノマイセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）との間の細胞間相互作用や、プレボテラ・レーシェイ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｌｏｅｓｃｈｅｉｉ）とストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）との間の細胞間相互作用などにより形成される。
【０００４】
口腔内において、エナメル質表面の獲得被膜（ＡＥＰ）は、歯のエナメル質表面の保護被覆として作用する外皮または薄膜のようなものである。ＡＥＰは、特定の唾液タンパク質、断片、低分子ペプチド、無傷の天然タンパク質、脂質、炭水化物および食物粒子で構成される複雑な多層構造を有する生体内異種混合物である。ＡＥＰは、口腔内においてエナメル質表面と微生物バイオフィルムの第１層との間の界面として機能する。ＡＥＰは、エナメル質の脱灰抑制、再石灰化の促進、咀嚼時のエナメル質の物理的損傷の低減、およびＡＥＰ上の早期定着菌群の構成の調節によって、歯の表面を保護する。また、ＡＥＰは、口腔カンジダ症の病原体であるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎ）およびう歯の病原体であるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）を含む、多数の日和見病原微生物のドッキングプラットホームとしても作用する。これらの病原菌は、他の早期定着菌群や後期定着菌群との相互付着および共凝集によりＡＥＰ上に多層状のバイオフィルムを形成する。バイオフィルムは、複数種の生物で構成される、非常に複雑で、代謝的に相互依存した、独立した集落である。バイオフィルムは、ＡＥＰタンパク質と口腔内微生物群との間の、複雑な種間および種内の相互作用により形成される。バイオフィルムは主として、水（約９６〜９７％）、炭水化物（１〜２％）およびタンパク質（＜１％）で構成される。バイオフィルムには、栄養、酵素や代謝産物の交換、細胞間コミュニケーションおよび老廃物や他の溶質の捕集を容易にするための流路や流体で満たされた細胞間隙のネットワークが非常に複雑にはりめぐらされている。このネットワークは、コロニー密度の違いによる老廃物の局所的な蓄積や除去にもつながり、異なるｐＨ勾配の微小環境をもたらす。
【０００５】
バイオフィルムという集落の構成は、ＡＥＰタンパク質の構成や、微生物とＡＥＰの構成タンパク質との間の非常に特異的な相互作用により厳密に決められている。ＡＥＰに関与する主要な唾液タンパク質ファミリーとしては、酸性プロリンリッチタンパク質（ａＰＲＰ）、塩基性ＰＲＰ、α−アミラーゼ、ＭＵＣ５Ｂ、アグルチニン、シスタチン、ヒスタチンおよびスタテリンが挙げられる。ＡＥＰの形成自体は、初期に起こる、獲得被膜タンパク質の歯のエナメル質への吸着過程であり、この過程は、段階的かつ動的に、極めて競合的かつ選択的に行われる。ＡＥＰには、唾液中に存在する約２３００種のタンパク質のおよそ５％が存在する。う歯の発生には、まず口内の細菌が歯構造に付着してコロニーを形成し、バイオフィルム（一般に歯垢と呼ばれる）を形成する過程が必須である。歯面にコロニーを形成する生物の種類および量を決定づける主な因子がＡＥＰである。ＡＥＰは、歯面に比較的不溶性の構造を形成し、この構造が、歯のミネラル相と歯垢との間の界面として作用する。ＡＥＰは、１）エナメル質脱灰に対する部分的保護、２）エナメル質再石灰化の促進、３）歯面における結晶成長の防止、４）咀嚼時の摩擦力の低減、および５）早期定着菌群の付着に対する作用といった歯のミネラル恒常性にとって望ましい多くの特徴を有している。獲得被膜は口腔内バイオフィルムの発達のための固体支持体として機能するので、ＡＥＰの構成は予防歯科の分野において非常に興味深い課題である。さらに、バイオフィルムには微生物自体が産生する細胞外高分子物質（ＥＰＳ）が含まれており、これがバイオフィルムの不浸透性かつ保護的被覆として機能することから、バイオフィルムは浮遊微生物よりも抗菌剤に対して高い耐性を有する。バイオフィルムは、最もよく利用されている抗生物質に対してだけでなく、ヒト免疫細胞の食作用に対しても耐性がある。バイオフィルムの制御や除去は非常に困難である。近年、宿主の自然防御機構に対する病原微生物の広範な耐性や、多くの利用可能な抗生物質やその他の殺菌剤に対する多剤耐性（ＭＤＲ）が出現していることは、口腔内の健康および健康全般において世界的により深刻な脅威となっている。
【０００６】
エナメル質表面の獲得被膜（ＡＥＰ）の特性の解明に向けて多くの研究が行われている。ＡＥＰ内のタンパク質は、主に唾液腺、細菌産生物、歯肉溝浸出液または口腔粘膜に由来する。しかし、ＡＥＰペプチドは、細菌によるこれらのタンパク質の分解産物であり、親タンパク質の機能的特性を保持している可能性や、その特性が増強されている可能性がある。ＡＥＰは、ａ）細菌の代謝により産生された酸の中和、およびｂ）再石灰化のための選択的透過膜としての作用によって、歯の恒常性において重要な役割を果たしている。ＡＥＰはさらに、早期定着菌群の構成を決定づける一因となっており、これらの菌群によって最終的に微生物バイオフィルムが形成される。成熟したＡＥＰのプロテオームには、１５０ｋＤａ〜５ｋＤａの１３０種類を超える種々の天然タンパク質およびリン酸化タンパク質が含まれており、その約５０％が低分子ペプチドであることが明らかにされている。これらのタンパク質は、ＡＥＰの発達において想定されるそれぞれの役割に基づいて、Ｃａ２＋結合タンパク質、ＰＯ４−結合タンパク質および他の唾液タンパク質と相互作用するタンパク質の３つの主要な群に分類される。また、ＡＥＰタンパク質は、想定されるそれぞれの生物学的機能、例えば、炎症反応、免疫防御、抗菌活性および再石灰化能力などによりさらに分類される。唾液およびＡＥＰに関するより難解な研究課題、例えばタンパク質相互作用、診断および合成類縁体に関する研究課題は、いまだ数多く残されたままで、完全な解明には至っていない。
【０００７】
ＡＥＰの主要タンパク質の１つはスタテリンであり、スタテリンは、第１リン酸カルシウムおよび第２リン酸カルシウムの析出に対する強い抑制効果を有し、唾液を過飽和な状態にして、エナメル質表面の再石灰化を助ける役割を有する。スタテリンの機能性ペプチドは、Ｎ末端に存在する。近年、この領域に由来する天然のＡＥＰペプチドが、エナメル質表面の獲得被膜の構成要素として同定された。このペプチドは、９個のアミノ酸DSpSpEEKFLR（式中、Spはリン酸化セリンである）からなる。ＤＲ９と呼ばれるこのペプチド鎖は、他の天然スタテリンペプチドと比較して、すべての試験濃度においてハイドロキシアパタイトの成長抑制に有意な効果（ｐ＜０．０５）を示した。
【０００８】
上記のことから、口腔内の健康維持に有効なタンパク質および／またはペプチド断片を同定することができれば望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
スタテリン系融合ペプチドが、歯質脱灰の処置、例えば、エナメル質表面の再石灰化を要する症状の治療に有効であることが今般見出された。
【００１０】
したがって、本発明の一態様において、DSSEEKFLRで示されるスタテリンペプチドまたはその機能的に等価なペプチドと、エナメル質表面の獲得被膜のタンパク質またはペプチドとが融合した新規なスタテリン系融合ペプチドを提供する。
【００１１】
本発明の別の一態様において、歯質脱灰を処置する方法を提供する。この方法は、歯のエナメル質表面にスタテリン系融合ペプチドを十分な時間接触させて処置を行うステップを含む。
【００１２】
さらなる一態様において、ハイドロゲルカプセルに封入されたエナメル質保護タンパク質／ペプチドを提供する。
【００１３】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態を、下記の「発明を実施するための形態」において図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトのスタテリン（Ａ）、ヒスタチン−１（Ｂ）、ヒスタチン−３（Ｃ）およびヒスタチン−５（Ｄ）のアミノ酸配列を示した図である。
【図２】異なるｐＨ条件下で１２０分間インキュベートした場合の、キトサンナノ粒子カプセルに封入されたウシ血清アルブミンの放出挙動を示したグラフである。
【図３】キトサンナノ粒子が、ヒスタチン５をタンパク質分解から保護することを示したグラフである。
【図４】リン酸カルシウムの結晶成長に対するキトサンナノ粒子またはＤＲ−９ペプチドの抑制効果を示したグラフである。
【図５】キトサンナノ粒子（ＣＳｎ）カプセルに封入されたヒスタチン５（Ｈｉｓ５）の存在下または非存在下におけるストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９の増殖動態を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一態様において、DSSEEKFLRで示されるスタテリンペプチド（配列番号１）または機能的に等価なその変異体と、第２のエナメル質表面の獲得被膜のタンパク質またはペプチドとが融合した新規なスタテリン系融合ペプチドを提供する。このスタテリン系融合ペプチドは歯質脱灰の処置に有効である。
【００１６】
本発明の融合ペプチドは、DSSEEKFLRで示されるスタテリンペプチドまたは機能的に等価なその変異体を含む。このスタテリンペプチドまたは本明細書に開示の他のタンパク質およびペプチド（ヒスタチンタンパク質およびヒスタチンペプチドなど）に関する「機能的に等価な変異体」という用語には、天然または非天然の変異体であって、スタテリンペプチドの生物学的活性、例えば歯質脱灰の処置効果を本質的に保持している変異体が包含される。前記スタテリンペプチドを非天然かつ人工的な方法で改変し、例えば活性または安定性が向上した、治療的使用により望ましい特徴を有する機能的に等価な変異体を得てもよい。したがって、前記スタテリンペプチドの機能的に等価な変異体には、前記スタテリンペプチドの類縁体、断片および誘導体が含まれる。
【００１７】
本発明における前記スタテリンペプチドの機能的に等価な類縁体は、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失により得られたものであってもよい。アミノ酸の付加または欠失には、機能的に等価なペプチドを得るための、ペプチド末端における付加または欠失と、ペプチド内部の付加または欠失の両方が含まれる。アミノ酸の付加または欠失の好適な例としては、タンパク質内の活性とは密接な関わりのない位置での付加または欠失などが挙げられる。アミノ酸の付加に関しては、一実施形態において、（図１に示すように）スタテリンタンパク質内に天然に存在する１以上のアミノ酸が、例えば、前記スタテリンペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されていてもよい。また、前記スタテリンペプチド内のアミノ酸置換、特に保存的アミノ酸置換によっても、前記スタテリンペプチドの機能的に等価な類縁体を得ることができる。保存的置換の例としては、非極性（疎水性）残基、例えば、アラニン、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンと別の非極性（疎水性）残基、例えば、アラニン、イソロイシン、バリンもしくはメチオニンとの置換；極性（親水性）残基と別の極性残基との置換、例えば、アルギニンとリジンとの置換、グルタミンとアスパラギンとの置換、グルタミンとグルタミン酸との置換、アスパラギンとアスパラギン酸との置換、グリシンとセリンとの置換など；塩基性残基、例えば、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンと別の塩基性残基との置換；または酸性残基、例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸と別の酸性残基との置換が挙げられる。
【００１８】
本発明における前記スタテリンペプチドの機能的に等価な誘導体は、１以上のアミノ酸残基が化学的に変換されたスタテリンペプチドまたはその類縁体もしくは断片である。この変換は、アミノ酸のアミノ基もしくはカルボキシル基または側鎖「Ｒ」基のいずれで行われてもよい。ペプチド内のアミノ酸の変換によって、例えば安定性または活性の向上といったより望ましい特徴を付与することができる。このような誘導体分子としては、例えば、以下に限定されるものではないが、分子内の遊離のアミノ基が変換されて、例えば、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基が形成された分子が挙げられる。また、遊離のカルボキシル基が変換されて、例えば、塩、メチルエステルやエチルエステルなどのエステルまたはヒドラジドが形成されたものであってもよい。また、遊離のヒドロキシル基が変換されて、例えば、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体が形成されたものであってもよい。さらに、本発明における誘導体には、２０種類の標準アミノ酸の天然のアミノ酸誘導体を１以上含有するペプチドも包含される。例えば、リジンが５−ヒドロキシリジンに置換されたペプチド、セリンがホモセリンに置換されたペプチド、リジンがオルニチンに置換されたペプチドなどが含まれる。また、DSpSpEEKFLRなどのリン酸化誘導体も包含される。また、化学的分解または酵素的分解を防ぐためにペプチド末端が変換されたもの、例えば、Ｎ末端がアセチル化されたものも包含される。
【００１９】
前記スタテリンペプチドおよび機能的に等価なその変異体は、十分に確立された標準的な固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）により作製することができる。固相ペプチド合成の２つの方法として、ＢＯＣ法およびＦＭＯＣ法が挙げられる。また、前記スタテリンペプチドおよび機能的に等価なその変異体は、組換え技術に基づく多数の適切な方法のいずれかを用いて作製することも可能である。このような方法は当業者によって十分に確立されたものであり、遺伝子組換えを施した宿主細胞内でスタテリンペプチドをコードする核酸が発現されることは理解されるであろう。スタテリンペプチドをコードするＤＮＡは、タンパク質の配列および核酸配列が公知であれば、当分野において周知の自動化された方法によりデノボ合成することができる。
【００２０】
機能的に等価な変異体は、必ずしも前記スタテリンペプチドと同一の活性を有する必要はないが、歯質脱灰の処置に有効とされる十分な活性を有するものであり、例えば、前記スタテリンペプチドの生物学的活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％以上の活性を有する。
【００２１】
本発明の融合ペプチド生成物は、前記スタテリンペプチドを、第２のエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドと融合させることによって得られる。第２のエナメル質保護タンパク質／ペプチドは、エナメル質表面の獲得被膜（ＡＥＰ）のペプチドであってもよく、また合成のエナメル質保護ペプチドであってもよく、また起源の異なるエナメル質保護ペプチド、例えば、ヨーグルト抽出物などのミルクに由来するカゼインリン酸化ペプチドであってもよい。一実施形態において、第２のエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドは、前記スタテリンタンパク質またはスタテリンペプチドであってもよく（すなわち、二量体を形成してもよく）、前記スタテリンペプチドの機能的に等価なペプチドであってもよい。別の一実施形態において、第２のエナメル質保護ペプチドは、ヒスタチンまたはヒスタチンの断片であってもよい。例えば、第２のエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドが、ヒスタチン−１、ヒスタチン−３もしくはヒスタチン−５（ヒスタチン３のＴｙｒ−２４におけるタンパク質切断により生成される）、機能的に等価なこれらの断片、またはこれらのいずれかに由来する機能的に等価な天然もしくは合成の変異体であってもよい。該断片の好適な例としては、ヒスタチン−５の断片、例えば、ＲＲ１４と呼ばれるRKFHEKHHSHRGYR（配列番号１０）や、前述した通り、機能的に等価なその変異体が挙げられる。さらなる一実施形態において、本発明の融合ペプチドは、前記スタテリンペプチドまたは別のスタテリンペプチドのコピーをさらに１以上含んでもよく、前記第２のエナメル質保護ペプチドまたは別のエナメル質保護ペプチドのコピーをさらに１以上含んでもよい。
【００２２】
本発明の融合ペプチドは、十分に確立された方法により、過去に報告されている方法と同様にして作製することができる。前記スタテリンペプチドと第２のエナメル質保護ペプチドとの融合は、連結要素を介さず、直接ペプチド結合により行われるが、融合ペプチドの機能に影響を与えるリンカーを利用してもよい。
【００２３】
本発明において、融合ペプチドは、調製して適切に精製した後、哺乳動物の歯質脱灰の処置に利用することができる。本明細書で用いられる「処置する」、「処置すること」および「処置」という用語は、歯質脱灰の進行を緩和する方法、その進行を逆行（すなわち、再石灰化）させる方法、その進行の程度を低減させる方法、およびその進行を防止する方法を含む、歯質脱灰を好ましく改変する方法、ならびにカンジダ症、歯肉炎、その他の口腔疾患などの処置に有効な方法を意味する。歯質脱灰とは、一般に口腔内の厳しい酸性環境により、歯の硬組織（例えば、エナメル質、象牙質および／またはセメント質）が破壊される現象をいう。脱灰などの好ましくない症状は口腔内の有害な微生物に起因するものであり、例えば、Ｓ．ミュータンスおよびＣ．アルビカンスなどにより引き起こされる。したがって、歯質脱灰は、虫歯もしくはう歯および／または歯牙侵食につながる恐れがある。本明細書で用いられる「哺乳動物」という用語は、以下に限定されるものではないが、ヒトや、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの家畜を包含することを意図するものである。
【００２４】
融合ペプチドは、本発明の一実施形態による歯質脱灰の処置において、単独で投与してもよく、薬学的に許容される少なくとも１つのアジュバントと組み合わせて投与してもよい。「薬学的に許容される」という表現は、医薬分野および獣医学分野において使用が許容されていること、すなわち、許容できない毒性を示すなどの不適な点が認められないことを意味する。薬学的に許容されるアジュバントの例としては、ペプチド系薬剤または核酸系薬剤とともに従来使用されているアジュバント、例えば希釈剤、賦形剤などが挙げられる。一般に、医薬製剤に関する手引書として、「Remington's: The Science and Practice of Pharmacy」，21st Ed.,Lippincott Williams & Wilkins, 2005を参考にすることができる。アジュバントの選択は、組成物の所望の投与様式に依存する。錠剤、カプセル剤、液剤または懸濁液剤の形態で経口投与される組成物は、デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、例えばピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油およびコーン油；ポリオール、例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；寒天；アルギン酸；水；等張食塩水およびリン酸緩衝溶液などのアジュバントを用いて調製される。また、湿潤剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、安定化剤、錠剤化剤、酸化防止剤、保存料、着色剤および香味剤を配合してもよい。局所適用されるクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤または軟膏剤は、トリグリセリド基剤などの適切な基剤を用いて調製することができ、さらに界面活性剤を配合してもよい。アジュバントとして適切な噴射剤を用いたエアロゾル製剤を調製することも可能である。また、組成物には、投与方式に拘わらず、上記以外のアジュバントを配合してもよく、例えば、長期保存期間中の微生物増殖を防止するために抗菌剤を組成物に配合してもよい。
【００２５】
歯質脱灰を処置するために、治療有効量の融合ペプチドを哺乳動物に投与する。「治療有効量」という用語は、有益な効果が得られるのに十分な用量であって、重篤な有害事象を引き起こす可能性がある用量を超えない範囲のスタテリン融合ペプチドの量である。治療上有効な融合ペプチドの用量は、処置対象となる症状の特性、処置される個々の個体などの多くの要因によって決定されるものである。適切な用量としては、歯のエナメル質からのミネラル喪失量を統計学的に有意に低減させるのに十分な量が挙げられる。一実施形態において、約１００ｎｇ〜１００μｇの範囲の用量が適切である。
【００２６】
本発明による処置において、融合ペプチドは、歯への送達に適切な経路によって投与することができる。例えば、経口投与または局所適用が挙げられる。一実施形態において、融合ペプチドはデンタルリンスとして使用する液剤の形態で提供され、十分な時間口に含んで歯の表面全体に行き渡らせることによって歯質脱灰の処置を行う。また、融合ペプチドは、（水などの適切な液体に加えることによって）リンスとして使用する液剤とすることができる固体の形態、例えば、錠剤、カプセル剤または散剤の形態で提供することもできる。別の一実施形態において、融合ペプチドは、歯に局所適用するための、または歯磨き用のゲル剤またはペースト剤の形態で提供される。また、融合ペプチドは、チューインガムやその他のチュアブル型の食品もしくは非食品（例えば、おしゃぶり用品、動物用チュートイ、骨型のチュアブル剤など）、フィルム／ゲル状シートまたはウエハースとして提供することも可能であり、また歯科衛生製品、例えば、歯ブラシ、デンタルフロス、デンタルピックなどの歯の清掃に用いられる器具および口腔内で使用するその他の医療器具へのコーティングに用いることもできる。
【００２７】
本発明の方法において歯質脱灰の処置効果を高めるために、融合ペプチドを第２の治療薬と併せて哺乳動物に投与することができることは、当業者であれば十分に理解できるであろう。第２の治療薬と融合ペプチドは、合剤として、またはそれぞれ単剤として、同時に投与することができる。また、第２の治療薬は、融合ペプチドの投与前または投与後に投与することもできる。このような第２の治療薬の例としては、歯質脱灰の処置に有効な別の薬剤が挙げられ、以下に限定されるものではないが、具体的には、フッ化物、カゼインリン酸化ペプチド、非晶質リン酸カルシウム、過酸化物や重炭酸ナトリウムなどのホワイトニング剤、シーラント剤、清涼剤および／または抗菌剤、薬用植物由来のハーブ抽出物（例えば、Ｍｅｓｗａｋ（商標）（サルバドラ・ペルシカと称される植物の抽出物）、センダン（アザディラクタ・インディカと称される植物）、クルミなどの粉末形態または繊維状形態）ならびにこれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００２８】
融合ペプチドは、該融合ペプチドをコードする核酸構築物として投与してもよい。したがって、DSSEEKFLRなどのスタテリンペプチド、そのリン酸化型（DSpSpEEKFLR）または機能的に等価なこれらの変異体をコードする核酸配列と、第２のエナメル質表面の獲得被膜のタンパク質またはペプチドをコードする核酸とが融合した構築物を、歯質脱灰の処置に使用してもよい。このような構築物は、核酸の投与に適切な任意の方法により、治療有効量（例えば、約１００ｎｇ〜１００μｇ）の融合ペプチドの発現に十分な用量で哺乳動物に投与することができる。
【００２９】
本発明の別の一態様において、エナメル質保護タンパク質／ペプチドを、歯質脱灰を処置するための、口腔内投与用の生体適合性高分子送達システムとして提供する。好適なエナメル質保護タンパク質またはエナメル質保護ペプチドとしては、エナメル質の脱灰抑制、再石灰化の促進、咀嚼時のエナメル質の物理的損傷の低減、ならびに微生物のコロニー形成および微生物による損傷の防止によって、歯面を保護するタンパク質またはペプチドが挙げられる。好適なエナメル質保護タンパク質／ペプチドの例としては、以下に限定されるものではないが、本明細書に記載の融合ペプチド、スタテリンもしくはその機能的に等価なペプチド、またはヒスタチンタンパク質／ペプチド（例えば、本明細書に記載されている、ヒスタチン−１、ヒスタチン−３、ヒスタチン−５または機能的に等価なこれらの断片）が挙げられる。例えば、キトサン、アルギン酸塩、コラーゲンもしくはポリ（アリルアミン）のハイドロゲル、機能的に等価なこれらの誘導体のハイドロゲル（例えば、生体適合性およびカプセル化特性が保持されている、上記ハイドロゲルの変形体）またはこれらの混合物などのハイドロゲル送達システムは、カプセルに封入されたタンパク質／ペプチドの制御放出が可能な生体適合性粒子であり、このシステムによって、口腔内の厳しい環境でのタンパク質／ペプチドの分解を防ぐことができる。タンパク質の放出は、物理的刺激または化学的刺激、例えば、ｐＨ、イオン強度、温度、磁場または生体分子を操作することによって誘導される。例えば、キトサンは、キトサンのｐＨ感受性により、カプセルに封入されたエナメル質保護タンパク質／ペプチドの制御放出が可能である。ｐＨ値が６．５を超えると、キトサンマトリックスの脱プロトン化により、キトサン高分子間の斥力が低下する。これにより、キトサン細孔が収縮、狭窄および閉鎖して、エナメル質保護タンパク質／ペプチドの放出が阻止される。一方、口腔内が酸性条件（ｐＨ３〜５）になると、プロトン化によりキトサン高分子間の斥力が増加する。これにより、キトサンマトリックスが膨張して細孔が開口し、カプセルに封入されたエナメル質保護タンパク質／ペプチドが、時間的かつ空間的に特定の環境要因に応じた様式で放出される。同様に、アルギン酸塩も、周囲環境のイオン強度に基づいて、カプセルに封入されたタンパク質／ペプチドの制御放出が可能である。例えば、正常なイオン強度（唾液のイオン強度など）においては、アルギン酸塩カプセルは内包物を保持しているが、イオン強度が上昇すると、アルギン酸塩カプセルから内包物が放出される。
【００３０】
ハイドロゲルカプセル封入タンパク質および／またはハイドロゲルカプセル封入ペプチドを調製する方法としては、選択したハイドロゲル溶液およびタンパク質／ペプチドを、従来使用されている陰イオン架橋剤（ピロリン酸塩（ＰＰｉ）およびトリポリリン酸塩（ＴＰＰ）など）と、適切なｐＨ（５〜６）において組み合わせてゲル化させ、好ましくは５〜２０ｎｍの範囲の直径、例えば、約１０ｎｍの平均直径を有するナノ粒子を形成させる方法が挙げられる。ナノ粒子内に封入されるタンパク質またはペプチドの量は、使用するタンパク質／ペプチドによって異なるが、概してナノグラム範囲の量を封入することができる。
【００３１】
ハイドロゲルカプセル封入タンパク質ナノ粒子および／またはハイドロゲルカプセル封入ペプチドナノ粒子は、歯質脱灰の処置に使用するスタテリン系融合ペプチドにおいて記載した上述の方法と同様にして製剤化して使用することができる。例えば、経口製剤または局所適用製剤とすることが好ましい。適切な用量としては、歯のエナメル質からのミネラル喪失量を統計学的に有意に低減させるのに十分な量が挙げられる。一実施形態において、適切なナノ粒子の用量は、約１００ｎｇ〜１００μｇの範囲のエナメル質保護タンパク質／ペプチドが送達されるのに必要な量である。
【００３２】
さらにこのナノ粒子は、前述した通り、効果の増強を目的として、第２の治療薬と併用してもよく、例えば、第２の治療薬と組み合わせて使用してもよく、第２の治療薬と同時に使用してもよく、第２の治療薬の使用前もしくは使用後に使用してもよい。
【００３３】
本発明の実施形態について、以下の特定の実施例で説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものとして解釈するべきではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１
スタテリン系融合ペプチド
材料および方法
エナメル質の試料調製を、過去に報告されている方法と同様にして行った（Siqueira et. al. 2010, J Dent Res. 2010; 89: 626-630、当該文献の関連する内容は参照により本明細書に組み込まれるものとする）。簡潔に述べると、無傷のヒト第１永久大臼歯を洗浄してすすいだ後、切片化した。歯根を除去した後、ダイヤモンドナイフを使用して、歯冠を４つの薄い矢状切片（それぞれ厚さ３００μｍ）に切り分け、次いで、サンドペーパーを用いて１５０μｍの厚さになるまで研磨した。各試験片を、天然のエナメル質表面に２ｍｍの窓を残して、光硬化歯科用接着剤（３Ｍ  ＥＳＰＥ  Ｓｃｏｔｃｈｂｏｎｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）およびネイルエナメルの層でコーティングした。
【００３５】
表１に示すように、試料を無作為に７つの群（Ｎ＝１２／群）に分けた。
【表１】
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【００３６】
各試験片を、１ｍｇ／ｍＬの構築ペプチドの溶液または蒸留水（対照群）に浸漬し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、これらを１ｍＬの脱灰溶液（０．０５Ｍ  酢酸；２．２ｍＭ  ＣａＣｌ２；２．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；ｐＨ４．５）に３７℃で１２日間浸漬した。その後、これらを蒸留水で完全にすすぎ、ろ紙を用いて乾燥させ、残存する酸残留物をすべて除去した。各試験片を浸漬した１ｍＬの酸溶液を用いて、脱灰過程中にエナメル質から遊離したカルシウムおよびリン酸塩の濃度を調べた。
【００３７】
酸溶液中のカルシウム濃度の測定は、定量的比色カルシウム測定アッセイ（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）およびＵＶ−可視分光光度計を用いて行い、波長６１２ｎｍにおける光学密度を求めた。リン酸塩濃度の測定は、比色アッセイ（ＰｉＣｏｌｏｒＬｏｃｋ（商標）Ｇｏｌｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ．Ｋ．）およびＵＶ−可視分光光度計を用いて行い、波長６３５ｎｍにおける光学密度を求めた。すべての試料について２連制で分析を行った。統計解析は、ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙの範囲検定を用いて行った。
【００３８】
結果
リン酸塩濃度およびカルシウム濃度の平均値および標準偏差を表２に示す。文字を共有していない平均値は有意差があることを意味する。
【表２】
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【００３９】
リン酸塩およびカルシウムのいずれにおいても、相対的に同様の結果が得られた。架橋により機能ドメインを連結したもの（ＤＲ９−ＶＰＡＧＬ−ＲＲ１４およびＤＲ９−ＶＰＬＳＬ−ＲＲ１４）では、対照との比較において、脱灰抑制の増強は認められなかった。ＤＲ９−ＤＲ９でコーティングした試料ではミネラルの喪失量が最も少なく、エナメル質の脱灰抑制の増強が示された。組合せペプチド（ＤＲ９−ＲＲ１４）は、これらの群の中間の値を示し、対照とＤＲ９−ＤＲ９の両方に対して有意差が示された。
【００４０】
結論
スタテリンとヒスタチンのそれぞれの機能ドメインを特定のアミノ酸配列（架橋）で連結させたものでは、ミネラル恒常性における機能改善は全く認められなかった。組合せペプチド（ＤＲ９−ＲＲ１４）は、前駆タンパク質の一つであるスタテリンの生物学的機能の維持が可能である。ＤＲ９−ＤＲ９において、ＤＲ９単独およびスタテリン単独と比べて、エナメル質の脱灰抑制の増強が見られたことから、機能ドメインの多重化が強力なタンパク質進化経路であることが明らかとなった。
【００４１】
実施例２
キトサンマイクロ粒子
キトサンマイクロ粒子の構築：キトサンをさまざまな濃度（０．０５％、０．１％、０．２５％および０．３５％）で０．１〜２％の酢酸に溶解し、これらのキトサン溶液を、スプレー乾燥機で乾燥させ、キトサンマイクロ粒子を作製した。均質で粒径の揃った粒子を作製するために、スプレー乾燥のパラメーターとして、入口温度（１５７〜１７５℃）、出口温度（９７〜１０５℃）および液体供給流速（１．５〜５ｍｌ／分）の最適化検討を行った。得られたＣＰ粒子のサイズ範囲、表面形態およびトポグラフィーに関する特性は、ゼータサイザーおよび走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて調べた。予備実験データから、キトサン粒子の構築が可能であることが示された。本実験は、０．２５％（ｗ／ｖ）キトサン含有０．１％（ｖ／ｖ）酢酸溶液を使用し、入口温度１５８℃、出口温度９７℃、流速１．５ｍｌ／分で行った。収集した粒子をＳＥＭによる画像化に供したところ、粒子のサイズ範囲は１．５〜３．０μｍであった。
【００４２】
キトサンナノ粒子の構築：キトサンナノ粒子を、イオン性ゲル化法を用いて構築した。上記と同一濃度のキトサンを、酢酸（キトサンの濃度の１．７５倍）に溶解し、各キトサン溶液とナトリウムトリポリ五リン酸（ＳＴＰＰ）溶液（ｖ／ｖ）を混合して、ナノ粒子を構築した。均質で粒径の揃った単分散性の粒子を構築するために、イオン性ゲル化における種々のパラメーター、例えば、キトサン濃度、キトサン／ＳＴＰＰ質量比およびキトサン溶液のｐＨの最適化検討を行った。得られたキトサン粒子のサイズ範囲、表面電荷、形態およびトポグラフィーに関する特性は、ゼータサイザー、ゼータ電位およびＴＥＭを用いて調べた。パイロット実験において、ＣＳ／ＳＴＰＰイオン性ゲル化反応によりキトサンナノ粒子を構築した。キトサン０．２５％（ｗ／ｖ）を、０〜０．５％のＴｗｅｅｎ−８０界面活性剤ともに酢酸溶液（ｖ／ｖ）（キトサンの濃度の１．７５倍）に加えて、マグネチックスターラーで一晩中撹拌しながら溶解した。得られた溶液のｐＨを、１〜２ＭのＮａＯＨで４．０〜５．９に調整した。ＳＴＰＰ溶液（０．２１〜６．７２ｍｇ／ｍｌ）をキトサン溶液に滴下しながら、マグネチックスターラーを用いて２００〜１２００ｒｐｍで一晩中混合した。キトサン粒子を凍結乾燥して、ＴＥＭに供した。コロイド懸濁液に対して、動的レーザー散乱（ＤＬＳ）による流体力学ゼータサイジングを行ったところ、ナノ粒子のゼータサイズ分布は９．８〜１１．８ｎｍの範囲であり、平均径は１０．５ｎｍであった。
【００４３】
別の実験として、０．０１％〜０．１％の濃度範囲のキトサンを含有するＨＣｌ（８ｍＭ；７μｌ  １２Ｍ  ＨＣｌ／１０ｍｌキトサン溶液、ｖ／ｖ）溶液を用いて、キトサン／ＴＰＰイオン性ゲル化反応により、キトサンナノ粒子を構築した。トリポリリン酸塩（ＴＰＰ）濃度は０．０１〜０．１％の範囲とした。キトサンおよびＴＰＰを含有する溶液の初期ｐＨは５．５に設定した。撹拌速度は８００ｒｐｍに設定した。ＴＰＰの最終濃度は０．０１〜０．０２２％の範囲とした。ナノ懸濁液の最終ｐＨは、５．６〜６．０の範囲とした。これらすべてのパラメーターで実験を行い、キトサンナノ粒子の粒径を測定した。得られたキトサンナノ粒子の特性を、動的レーザー光散乱およびゼータ電位を用いて調べた。キトサンナノ粒子の流体力学的径は、１２０〜７５０ｎｍの範囲であった。さらに、キトサンナノ粒子は表面正電荷を示し、２６．２±１．８〜１１．６±２．８ｍＶの範囲のゼータ電位を示した。
【００４４】
キトサンマイクロ粒子カプセルおよびキトサンナノ粒子カプセルへのＡＥＰの封入：キトサンマイクロ粒子およびキトサンナノ粒子を構築するために最適化したパラメーターに基づいて、ＡＥＰとキトサン溶液を直接混合した。上記と同様にしてキトサンマイクロ粒子およびキトサンナノ粒子を構築し、得られた粒子の特性をゼータサイジングおよびＳＥＭにより調べた。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）および／または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、カプセル封入操作の前後の遊離ペプチド量を測定することにより、カプセル封入の程度を求めた。
【００４５】
ヒスタチン５、ＤＲ−９、ＲＲ−１４およびウシ血清アルブミンのキトサンカプセルへの封入を行い、キトサンカプセル封入率を求めた。ＥＬＩＳＡアッセイにより、カプセルに封入されずに残ったタンパク質またはペプチドの量を測定した。その結果、カプセル封入されたペプチドまたはタンパク質の種類によって異なるが、タンパク質／ペプチドのカプセル封入効率は７５％〜９３％であることが分かった（表２）。
【表３】
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【００４６】
ＤＲ−９が封入されたキトサンナノ粒子は、２５．５３±１．４０のゼータ電位を示した。したがって、キトサンカプセル化により、ＡＥＰタンパク質／ペプチドの口腔内への送達および分布を容易にする安定なナノ粒子が作製された。
【００４７】
ｐＨ誘導性放出機序：カプセル封入ペプチドの放出実験を、酸性から塩基性に及ぶ広範囲のｐＨ値（３、４、４．５、５、５．５、６．８、７、７．４および１１）を有するバッファーを用いて行った。この実験で使用するｐＨ値は、最も一般的な口腔環境エピソード、例えば、歯牙侵食（ｐＨ３）、う歯（ｐＨ４．５〜５．５）または唾液の生理的ｐＨ（ｐＨ６．８）と関連するように注意深く選択した。キトサンカプセルに封入された８００μＭ相当のペプチドを、５ｍｌのさまざまなｐＨのバッファー中で３７℃または室温において３５ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした。所定の時間間隔（０分、５分後、１０分後、３０分後、６０分後、１２０分後および３００分後）で、キトサンから放出されたペプチドの量を測定した。各時点におけるペプチドの放出レベルの測定には、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた。さらに、ｐＨ誘導性の膨張および収縮によるキトサン粒子のサイズ変化を、ゼータサイジングおよびＳＥＭにより上記と同様にして測定した。
【００４８】
キトサンカプセル封入ウシ血清アルブミンナノ粒子を、ｐＨ７．０（リン酸バッファー）、ｐＨ５．０（酢酸バッファー）またはｐＨ３．０（酢酸）のバッファー中でインキュベートした。ＥＬＩＳＡアッセイにより、各ｐＨ条件で処理したキトサンナノ粒子からのタンパク質放出量を求めた。ｐＨ３．０（歯牙侵食に関連するｐＨ）およびｐＨ５．０（う歯に関連するｐＨ）におけるウシ血清アルブミンの放出量は、ｐＨ７．０（天然の唾液ｐＨに関連するｐＨ）に晒した場合より、それぞれ３５倍および１７倍高かった（図２）。
【００４９】
プロテアーゼからの保護：キトサンカプセルに封入した４００μＭ相当の唾液タンパク質を１：５希釈した全唾液上清に加え、３７℃で０分間、３０分間、６０分間および１２０分間インキュベートした。予備実験において、唾液の希釈は分解反応を遅らせ、唾液タンパク質の分析を容易にすることが示された。対照として、キトサンカプセルに封入していない４００μＭの上記選択した唾液タンパク質を、１：５希釈した全唾液上清とともに同じ時間インキュベートした。キトサンカプセルに封入した唾液タンパク質を、蒸留水中、３７℃で同じ時間インキュベートした第２の対照も用いた。全唾液上清の添加直後（ｔ＝０）および所定の時間インキュベーションした後、試料を取り出して、５分間煮沸し、タンパク質分解活性を失活させた。煮沸後、試料を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に供し、各インキュベーション時間におけるキトサンカプセルに封入した（またはキトサンカプセルに封入していない）唾液タンパク質の残存／分解レベルを求めた。簡潔に述べると、試料を乾燥させ、０．１％ＴＦＡに再懸濁し、０．２２μｍフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）で清澄化して、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｗａｔｆｏｒｄ、ＵＫ）に連結されたＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ  ２１８ＭＳ、４．６×２５０ｍｍ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）にロードした。被験唾液タンパク質およびその分解物と考えられるタンパク質断片を、８０％のアセトニトリル、１９．９％のＨ２Ｏおよび０．１％のＴＦＡを含有するバッファーＢの０％〜５５％の直線勾配で、１．３ｍｌ／分で１１０分かけて溶出した。ＲＰ−ＨＰＬＣの溶出液を２１４ｎｍおよび２３０ｎｍにおいてモニターした。各インキュベーション時間における未分解の被験唾液タンパク質に関するピーク面積を測定し、それぞれ百分率値に変換した。
【００５０】
キトサンナノ粒子カプセルに封入されたヒスタチン５およびカプセル封入されていないヒスタチン５を、１：５希釈した全唾液上清中でインキュベートした。その結果、キトサンナノ粒子により、ヒスタチン５をタンパク質分解から保護することができ、結果として、全唾液環境においてこのタンパク質の寿命が延長されることが示された（図３）。
【００５１】
キトサンカプセル封入ＡＥＰタンパク質／ペプチドによる、過飽和リン酸カルシウム溶液の自然析出の抑制：キトサンカプセル封入ＡＥＰタンパク質／ペプチドが結晶成長を防止する能力を有するか否か調べるために、マイクロタイタープレートを、タンパク質／ペプチドを含有するＨＥＰＥＳバッファーで室温で１時間コーティングした。ウェルを洗浄し、次いでリン酸塩（１５ｍＭ；ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）およびＣａＣｌ２（５０ｍＭ）を含有する溶液を加えた。この溶液を室温で４時間インキュベートし、ハイドロキシアパタイトの結晶形成を誘導した。その後、溶液を除去し、５％アリザリンレッドＳ（ｐＨ４．２）を加え、次いで塩化セチルピリジニウムを加えた。結晶形成の確認は、分光光度分析により５７０ｎｍの吸光度を測定して行った。
【００５２】
その結果、キトサンナノ粒子および（カプセル封入されていない）ＤＲ−９はいずれも、阻害因子を全く含まない群と比較して、全ての試験濃度においてリン酸カルシウムの結晶成長を統計学的に有意に阻害することが示された（図４）。このデータは、低分子の天然ＡＥＰペプチドであるＤＲ−９およびキトサンナノ粒子が、１）望ましくないリン酸カルシウムの結晶形成の防止、２）エナメル質再石灰化の促進、および３）歯石形成の阻害において有益な効果を有することを示している。したがって、特定のＡＥＰタンパク質／ペプチド、例えば、ＤＲ−９をキトサンナノ粒子カプセルに封入することにより、リン酸カルシウムの結晶形成を阻害する効果の増強が期待される。
【００５３】
キトサンカプセル封入唾液タンパク質のエナメル質脱灰に対する効果：ヒトエナメル質の薄片を用いて、脱灰実験を行った。エナメル質のミネラル量の分析には、マイクロラジオグラフィーを用いた。選択したキトサンカプセル封入唾液タンパク質のエナメル質脱灰に対する影響を調べるために、まず、樹脂コーティングしたエナメル質切片を、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のキトサンカプセル封入唾液タンパク質を含有する溶液と３７℃で２時間接触させた。う歯の酸性環境を再現するために、キトサンカプセル封入唾液タンパク質および対照切片を、それぞれ、２．２ｍＭのＣａＣｌ２、２．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４および５ｍＭの酢酸を含有する３ｍｌの脱灰溶液（ｐＨ４．５）を含むチューブに入れた。試料を穏やかに撹拌しながら３７℃で１２日間インキュベートした。すべての溶液には、静菌剤として３ｍＭのアジ化ナトリウムを加えてある。脱灰期間が終了した直後、試験片を十分に蒸留水で洗浄し、ろ紙で乾燥させた。ミネラルの喪失量を、酸性条件への曝露前後に撮影したマイクロラジオグラフィーを比較することによって評価した。
【００５４】
エナメル質薄片を、記載した通りに調製し、キトサンナノ粒子、キトサンナノ粒子カプセルに封入されたＤＲ−９、ＤＲ−９または０．０５％のＮａＦ（至適基準群）でコーティングした。ＡＥＰを模して、エナメル質試験片にあらかじめ耳下腺唾液を吸着させたものも用意した（表３）。吸着は、穏やかに撹拌しながら３７℃で２時間行った。その後、エナメル質試験片を蒸留水で洗浄し、脱灰溶液（ｐＨ４．５）に１２日間浸漬した。この溶液を用いてエナメル質から遊離したカルシウムおよびリン酸塩の量を測定した。すべてのコーティング群において、コーティングされていない群（対照）より統計学的に有意に高い保護力が認められた。ＤＲ−９群においては、脱灰に対して中程度の保護力が認められたが、キトサンナノ粒子カプセルに封入されたＤＲ−９群およびＮａＦ群における酸からの保護力はそれより優れていた（表３）。
【表４】
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【００５５】
Ｓ．ミュータンスの増殖に対するキトサンカプセル封入ヒスタチン５の効果：Ｓ．ミュータンスＵＡ１５９株の増殖に対するキトサンカプセル封入ヒスタチン５（ＣＳｎｐ−Ｈｉｓ５）および対照の効果を、（Mashburn-Warren et al. Mol Microbiol, 2010. 78(3): p. 589-606に記載の）化学的合成培地（ＣＤＭ）（ｐＨ５）を用いて調べた。誘導期（初期）のＳ．ミュータンスの菌体を１２μｇ／ｍＬのキトサンカプセル封入ヒスタチン５構築物（ＣＳｎｐ−Ｈｉｓ５）と接触させることにより、キトサンを添加しなかった対照と比べて、その増殖が完全に抑えられた（図５）。一方、Ｓ．ミュータンスを空のキトサンナノ粒子（ＣＳｎｐ）と接触させた場合は、Ｓ．ミュータンスの増殖は弱まるが、消滅はしなかった（図５）。
【００５６】
ペプチドのＳ．ミュータンスのバイオフィルム形成に対する効果のスクリーニング：１０μｇ／ｍＬのキトサンカプセル封入ヒスタチン５（ＣＳｎｐ−Ｈｉｓ−５）ナノ粒子を含有する化学合成培地（ＣＤＭ）（ｐＨ５）を加えたポリスチレンマイクロタイタープレートで、３７℃および５％ＣＯ２の条件下、１８時間インキュベートして、Ｓ．ミュータンスＵＡ１５９のバイオフィルムを形成させた。対照のバイオフィルムとして、未封入のキトサンベクター（ＣＳｎｐ）を含むＣＤＭ培地中、または０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む１ｍＭリン酸カルシウムバッファー中でバイオフィルムを形成させた。インキュベーション後、上清を除去し、バイオフィルムを乾燥させ、０．１％クリスタルバイオレット溶液で染色した。
【００５７】
共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いて、バイオフィルムの成長を評価した。その結果、バイオフィルムの形成は、ＣＳｎｐを含有する対照およびＣＳｎｐを含有しない対照と比べて、１０μｇ／ｍＬのＣＳｎｐ−Ｈｉｓ５の存在下で有意に抑制されることが示された。さらに、ヒスタチン５非含有ＣＳｎｐ群では、バイオフィルムの成長が部分的に抑制されることが示され、ここでもまた、酸性環境下においてキトサンナノ粒子が細菌に対して抗菌効果を有することが明らかとなった。したがって、キトサンカプセルへのＡＥＰタンパク質／ペプチドの封入は、キトサンによるカプセル形成とＡＥＰペプチド／タンパク質の抗菌活性との相乗効果により、これらの化合物のＳ．ミュータンスに対する生物学的活性を増強させることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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