(57)【要約】  β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であり、この宿主細胞は、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼが欠乏するように改変されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼが欠乏するように改変されている宿主細胞。
【請求項２】
トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼが欠乏するように改変されている宿主細胞。
【請求項３】
前記宿主細胞はアミラーゼが欠乏するように改変されている、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞が変異誘発により改変されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞が遺伝子操作により改変されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドが本質的に不活性である、宿主細胞。
【請求項７】
トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドが本質的に不活性である、宿主細胞。
【請求項８】
更に、アミラーゼ活性を有するポリペプチドが本質的に不活性である、請求項６または７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記本質的に不活性なセルラーゼポリペプチド、マンナナーゼポリペプチドおよびペクチナーゼポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼポリペプチドが酵素活性に関して機能的に不活性である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記セルラーゼ活性を有するポリペプチド、前記マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼ活性を有するポリペプチドが変異誘発により本質的に不活性にされている、請求項６〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記セルラーゼ活性を有するポリペプチド、前記マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼ活性を有するポリペプチドが遺伝子操作により本質的に不活性にされている、請求項６〜９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記変異誘発が化学的なまたは物理的な変異誘発である、請求項４もしくは１０またはこれらに従属する請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記遺伝子操作が、一段階遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的変異誘発、欠失、ＲＮＡ干渉またはアンチセンスＲＮＡである、請求項５もしくは１１またはこれらに従属する請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が細菌である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が乳酸菌である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞がＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１４または１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドが、
ａ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｄ．ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれる核酸配列またはｉｉ）ｉ）の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｅ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
ｆ．配列番号１、２、３、４または５の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、前記β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、前記β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを含み、望ましくないセルロース酵素副活性、マンナナーゼ酵素副活性およびペクチナーゼ酵素副活性の量が低減しているポリペプチド組成物を生成する方法であって、前記β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドならびにペクチナーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞を準備すること、ならびに前記セルロース活性、前記マンナナーゼ活性および前記ペクチナーゼ活性を不活性化させることを含む方法。
【請求項２１】
アミラーゼ活性を有するポリペプチドを不活性化させることを更に含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記セルラーゼ活性を有するポリペプチド、前記マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼ活性を有するポリペプチドを変異誘発により本質的に不活性にする、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異誘発が化学的なまたは物理的な変異誘発である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記セルラーゼ活性を有するポリペプチド、前記マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよび前記ペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択で前記アミラーゼ活性を有するポリペプチドを遺伝子操作により本質的に不活性にする、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子操作が、一段階遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的変異誘発、欠失、ＲＮＡ干渉またはアンチセンスＲＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が細菌である、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が乳酸菌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞がＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドが、
ａ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｄ．ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれる核酸配列またはｉｉ）ｉ）の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｅ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
ｆ．配列番号１、２、３、４または５の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞を、β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換する、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、前記β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現するのに適した条件下にて培養培地中で請求項１〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養すること、ならびに任意選択で、前記培養培地または前記宿主細胞から、前記β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項３３】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項３２に記載の方法を使用して製造されている、β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド。
【請求項３４】
セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有しないまたは実質的に有しない請求項３３に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド。
【請求項３５】
請求項３３または３４に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドであって、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性を有しておらず、または実質的に有しておらず、その結果、粘度の相対的低下として示される粘度の低下が、酵素も水も添加していない親水コロイド溶液と比較した請求項１〜１９のいずれか一項で定義するβ−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有する酵素を添加した親水コロイド含有溶液の粘度から算出される少なくとも０．８５もしくは少なくとも０．９またはより低い、ポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞または請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の方法を使用して製造されているβ−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを含むポリペプチド組成物。
【請求項３７】
セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有しないまたは実質的に有しない請求項３６に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３８】
請求項３６または３７に記載のポリペプチド組成物であって、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性を有しておらず、または実質的に有しておらず、その結果、粘度の相対的低下として示される粘度の低下が、酵素も水も添加していない親水コロイド溶液と比較した請求項１〜１７のいずれか一項で定義するβ−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有する酵素を添加した親水コロイド含有溶液の粘度から算出される少なくとも０．８５もしくは少なくとも０．９またはより低い、ポリペプチド組成物。
【請求項３９】
請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および／もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物を含む乳製品。
【請求項４０】
乳製品を製造する方法であって、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および／もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物を、ラクトースを含む乳製品に添加することを含む方法。
【請求項４１】
ＧＯＳを含む乳製品を製造する方法であって、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および／もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の組成物を、ラクトースを含む乳製品に添加することを含む方法。
【請求項４２】
乳製品を調製するための、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および／もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４３】
ＧＯＳを含む乳製品を調製するための、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のβ−ガラクトシダーゼ活性および／もしくはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４４】
セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼを発現する宿主細胞から調製されるβ−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドの使用と比較した乳製品の粘度および／またはテクスチャの低下を防止するための、請求項４２または４３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、望ましくない酵素が不活性化されている宿主細胞、および不必要な特性が低減されている食品の製造で使用する酵素組成物の調製でのこの宿主細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品の化学的性質を改善するための酵素の使用が広く普及している。また、牛乳およびその他の動物由来の基質の加工では、酵素の使用により、最終製品に大きな価値が付与される。
【０００３】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、グリコシド結合によって連結された２つ以上、典型的には９つまでのガラクトース分子を含む、ヒトおよび動物では消化されない炭水化物である。ＧＯＳは、さらに１つ以上のグルコース分子も含む場合もある。ＧＯＳの有益な作用の１つは、それらが例えば消費者に生理学的利益をもたらす細菌などの有益な結腸微生物の増殖を選択的に刺激することによって、プレバイオティクス化合物として作用する能力である。確定された健康効果は、様々なタイプの食品のための食品成分としてのＧＯＳへの関心の高まりを生じさせてきた。
【０００４】
酵素であるβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）は、通例はラクトースを単糖であるＤ−グルコースおよびＤ−ガラクトースに加水分解する。β−ガラクトシダーゼの通常の酵素反応では、この酵素はラクトースを加水分解し、ガラクトース−酵素錯体中のガラクトース単糖に一過性で結合してガラクトースを水の水酸基に移動させ、結果としてＤ−ガラクトースおよびＤ−グルコースの遊離を生じさせる。しかしラクトース濃度が高い場合は、β−ガラクトシダーゼは、それによってガラクトオリゴ糖が生成されるトランスガラクトシル化と呼ばれる工程においてガラクトースをＤ−ガラクトースもしくはＤ−グルコースの水酸基に移動させることができる。さらにラクトース濃度が高い場合は、一部のβ−ガラクトシダーゼはガラクトースをラクトースもしくは高次オリゴ糖の水酸基へ移動させることができる。
【０００５】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属は、様々な乳製品を発酵させるために乳業において最も一般的に使用される細菌培養のタイプの１つである。さらにビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属含有製品の経口摂取は、健康促進効果を有する。この効果は、腸内容物のｐＨ低下によってだけではなく、さらに例えば抗生物質の摂取によって腸内細菌叢が乱されている個体における腸内細菌叢をビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が再生する能力によって達成される。ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属はさらに、潜在的に有害な腸内微生物を打ち負かす能力を有している。
【０００６】
ガラクトオリゴ糖は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の増殖を増強することが知られている。この効果は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が炭素源としてガラクトオリゴ糖を活用する固有の能力を通して達成される可能性が高い。ガラクトオリゴ糖の栄養補助食品は、さらに多数の長期にわたる疾患予防効果を有すると考えられる。例えば、ガラクトオリゴ糖の摂取は、ラットにおける結腸直腸癌の発生に対して高度に予防効果を有することが証明されている。このため、栄養補助食品や乳製品を改良する目的で業界において使用するためのガラクトオリゴ糖を製造するための安価で効率的な方法の開発に大きな関心が集まっている。
【０００７】
およそ５８０個のアミノ酸（ＢＩＦ３−ｄ３）で切断された（ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼは、水中に溶解されたラクトースを含有する溶液中のトランスガラクトシル化酵素であると説明されている（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：６４７−６５２）。国際公開第０１／９０３１７号パンフレットもまた、トランスガラクトシル化酵素であるとして切断変異体（ＯＬＧＡ３４７）について記載しており、国際公開第２０１２／０１０５９７号パンフレットでは、ＯＬＧＡ３４７がガラクトース部分をＤ−フルクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンおよびキシロースに移動させることが証明された。
【０００８】
国際公開第２００９／０７１５３９号パンフレットでは、ＢＩＦ３−ｄ３とは異なるやり方で切断された断片が、ミルク中で試験した場合に、効率的な加水分解および極めて低生産量のＧＯＳを生じさせると記載されている。
【０００９】
国際公開第２０１３／１８２６８６号パンフレットでは、トランスガラクトシル化対加水分解活性の有用な比率を有する、そこで例えばミルクベース製品などの低ラクトース濃度でさえ、ラクトースとともにインキュベートした場合にＧＯＳの効率的生産者であるポリペプチドについて記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、乳製品中においてラクトースからｉｎ  ｓｉｔｕでＧＯＳの形態の食物繊維を製造する改善された方法を提供することが必要とされている。本発明はこの必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
酵素副活性（ｅｎｚｙｍｅ  ｓｉｄｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は概して、活性がプロセスまたは製品に悪影響を及ぼす不必要な酵素を示す。この不必要な酵素は、例えば産生宿主の副産物として酵素生成物中に主に見出され、そのような酵素の商業的応用を妨げる場合がある。乳製品用途は、少量のセルラーゼ酵素、ペクチナーゼ酵素、アミラーゼ酵素およびマンナナーゼ酵素に対して特に敏感であり、なぜならば、多くの乳製品は、親水コロイド（例えばＣＭＣ、ＧＵＡＲ、デンプンおよびペクチン）により製剤化される／安定化されるからである（表１を参照されたい）。
【００１２】
【表１】
2017533712.tif 000002
【００１３】
ここで、本発明者らは、β−ガラクトシダーゼ活性を含み、任意選択でトランスガラクトシル化活性を有する製品であって、セルロース、マンナナーゼ、ペクチナーゼおよびアミラーゼのレベルが低下している製品、またはこの製品から製造されるＧＯＳを開発することができた。親水コロイドは、増粘剤、ゲル化剤および安定剤として多数の食品および飲料品に重要な貢献をする。本発明は、親水コロイドの使用に由来する所望の特性が保持されるだけでなく、更に食品および飲料品がＧＯＳの形態で食物繊維を保持することができる、そのような食品および飲料品の供給を可能にする。
【００１４】
親水コロイドまたはゴムは、水中に分散させた場合に粘性分散体および／またはゲルを形成する特性を特徴とする多様な長鎖ポリマーである。これらの物質は、樹木または低木からの滲出液、植物または海藻からの抽出物、種子または穀物からの粉末、発酵プロセスからのゴム状粘液、および多くのその他の天然産物で最初に発見された。多数のヒドロキシル基の存在により、これらの物質の、これらの物質を親水性化合物にする結合用水分子に対する親和性が著しく増加する。更に、このヒドロキシル基により、真の溶液と懸濁液との中間である分散液が生成され、コロイドの特性が示される。これら２種の特性をまとめると、これらの物質は「親水性コロイド」または「親水コロイド」と適宜称される。
【００１５】
親水コロイドは、食品中で下記のような多様な機能的特性を有する：増粘、ゲル化、乳化、安定化、コーティング等。親水コロイドは、加熱処理された乳製品中における数百万分の一のカラギーナンからゼリー菓子中における高レベルのアカシアガム、デンプンまたはゼラチンまでの範囲のレベルで使用される場合に、食品特性に大きな影響を及ぼす。食品での親水コロイドの幅広い使用の主な理由は、この親水コロイドの食品システムのレオロジーを変更する能力である。この能力として、食品システムの２種の基本的特性、即ち流動挙動（粘度）および機械的固体特性（テクスチャ（ｔｅｘｔｕｒｅ））が挙げられる。食品システムのテクスチャおよび／または粘度の変更は、この食品システムの感覚的特性を変更するのに役立ち、従って、親水コロイドは、特定の目的を果たすための重要な食品添加剤として使用される。いくつかの親水コロイドは、世界中の多くの国において認可されている食品添加剤のカテゴリーに属することが明らかである。スープ、グレービー、サラダドレッシング、ソースおよびトッピング等の様々な食品配合物は、好ましい粘度および食感を達成するための添加剤として親水コロイドを使用する。この親水コロイドは、アイスクリーム、ジャム、ゼリー、ゲル化したデザート、ケーキおよびキャンディのような多くの食品でも使用されて所望のテクスチャを作り出す。
【００１６】
機能的な特質に加えて、将来の容認（場合によっては肯定的な推奨）が、線維が身体の自然な機能および健康に多くの生理学的利益を付与するという認識からもたらされ得る。
【００１７】
親水コロイドの水結合特性に起因して、親水コロイドは食品のテクスチャおよび食感に大きな影響を及ぼし、テクスチャ革新の機会を創出することが多い。この製品のいくつかはタンパク質とも相互作用し、これはタンパク質の安定化および保護に有用な特性である。本発明は、親水コロイドの使用に基づく溶液であって、親水コロイドの使用に由来する上述した所望の特性が保持されるだけでなく、更に食品および飲料品がＧＯＳの形態で食物繊維を含むこともできる、溶液を提供する。
【００１８】
培養製品では、親水コロイドは滑らかなテクスチャおよび光沢のある外観を付与する。親水コロイドは、還元乳固形剤のコストを最適化することができ、有効期間全体にわたりテクスチャを維持することもできる。親水コロイドはまた、特に培養製品にとってより高い消費温度にて身体を改善する。本発明は、親水コロイドの使用に基づく溶液であって、親水コロイドの使用に由来する上述した所望の特性が保持されるだけでなく、更に食品および飲料品がＧＯＳの形態で食物繊維を含むこともできる、溶液を提供する。
【００１９】
乳製品および低ｐＨタンパク質飲料では、親水コロイドは乳およびダイズタンパク質を安定化させることができ、沈降および乳清オフ（ｗｈｅｙ  ｏｆｆ）を予防することができ、広範囲のテクスチャを可能にする。更により多くの親水コロイドは、配合物のテクスチャを還元乳固形分、糖および／または脂肪で置き換えることができ、それにより、より低脂肪の食品を製造することができる。本発明は、親水コロイドの使用に基づく溶液であって、親水コロイドの使用に由来する上述した所望の特性が保持されるだけでなく、更に食品および飲料品がＧＯＳの形態で食物繊維を含むこともできる、溶液を提供する。
【００２０】
本発明は、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを含む酵素組成物であるが、下記の酵素：セルロース、マンナナーゼ、ペクチナーゼおよび任意選択でアミラーゼに起因する活性を有しないまたは実質的に有しない酵素組成物を提供することにより、上記問題に対処する。
【００２１】
本発明の第１の態様によれば、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼが欠乏するように改変されている宿主細胞が提供される。
【００２２】
好ましい実施形態では、本発明で使用するβ−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドはトランスガラクトシル化活性を有する。
【００２３】
本発明の第２の態様によれば、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼが欠乏するように改変されている宿主細胞が提供される。
【００２４】
好ましくは、この宿主細胞はアミラーゼも欠乏するように改変されている。
【００２５】
一実施形態では、この宿主細胞は、従来の変異誘発技術により改変されている。
【００２６】
別の実施形態では、この宿主細胞は、従来の遺伝子操作技術により改変されている。
【００２７】
本発明の第３の態様によれば、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドが本質的に不活性である、宿主細胞が提供される。
【００２８】
本発明の第４の態様によれば、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドが本質的に不活性である、宿主細胞が提供される。
【００２９】
好ましくは、この宿主細胞では更に、アミラーゼ活性を有するポリペプチドが本質的に不活性である。
【００３０】
第３のおよび第４の態様での一実施形態では、本質的に不活性なセルラーゼポリペプチド、マンナナーゼポリペプチドおよびペクチナーゼポリペプチドならびに任意選択でアミラーゼポリペプチドは、酵素活性に関して機能的に不活性である。
【００３１】
一実施形態では、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択でアミラーゼ活性を有するポリペプチドは、従来の変異誘発技術により本質的に不活性にされている。
【００３２】
別の実施形態では、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択でアミラーゼ活性を有するポリペプチドは、従来の遺伝子操作技術により本質的に不活性にされている。
【００３３】
用いることができる従来の変異誘発技術は、化学的なまたは物理的な変異誘発である。
【００３４】
用いることができる従来の遺伝子操作技術は、一段階遺伝子破壊（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、マーカー挿入、部位特異的変異誘発、欠失、ＲＮＡ干渉またはアンチセンスＲＮＡである。
【００３５】
好ましくは、この宿主細胞は細菌である。
【００３６】
この宿主細胞は乳酸菌であることができる。
【００３７】
好ましくは、この宿主細胞はＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００３８】
好ましくは、本発明で用いるトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドは、
ａ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｄ．ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれる核酸配列またはｉｉ）ｉ）の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｅ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
ｆ．配列番号１、２、３、４または５の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される。
【００３９】
一実施形態では、この宿主細胞は、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
【００４０】
一実施形態では、この宿主細胞は、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換されている。
【００４１】
一実施形態では、この宿主細胞は、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
【００４２】
一実施形態では、この宿主細胞は、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換されている。
【００４３】
本発明の第５の態様によれば、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを含み、望ましくないセルロース酵素副活性、マンナナーゼ酵素副活性およびペクチナーゼ酵素副活性の量が低減しているポリペプチド組成物を生成する方法であって、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞を準備すること、ならびに前記セルロース活性、前記マンナナーゼ活性および前記ペクチナーゼ活性を不活性化させることを含む方法が提供される。
【００４４】
本発明の第６の態様によれば、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを含み、望ましくないセルロース酵素副活性、マンナナーゼ酵素副活性およびペクチナーゼ酵素副活性の量が低減しているポリペプチド組成物を生成する方法であって、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる宿主細胞を準備すること、ならびに前記セルロース活性、前記マンナナーゼ活性および前記ペクチナーゼ活性を不活性化させることを含む方法が提供される。
【００４５】
好ましくは、この方法は、アミラーゼ活性を有するポリペプチドを不活性化させることを更に含む。
【００４６】
この方法の一実施形態では、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択でアミラーゼ活性を有するポリペプチドを、従来の変異誘発技術により本質的に不活性にする。
【００４７】
この方法の別の実施形態では、セルラーゼ活性を有するポリペプチド、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドおよびペクチナーゼ活性を有するポリペプチドならびに任意選択でアミラーゼ活性を有するポリペプチドを、遺伝子操作により本質的に不活性にする。
【００４８】
好ましくは、この方法では、宿主細胞は細菌である。
【００４９】
一実施形態では、この方法では、宿主細胞は乳酸菌である。
【００５０】
好ましくは、この方法では、宿主細胞はＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００５１】
好ましくは、この方法では、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドは、
ａ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｄ．ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれる核酸配列またはｉｉ）ｉ）の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｅ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
ｆ．配列番号１、２、３、４または５の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される。
【００５２】
この方法の一実施形態では、宿主細胞は、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
【００５３】
この方法の別の実施形態では、宿主細胞を、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換する。
【００５４】
この方法の一実施形態では、宿主細胞は、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
【００５５】
この方法の別の実施形態では、宿主細胞を、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換する。
【００５６】
本発明の第７の態様によれば、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現するのに適した条件下にて培養培地中で本発明の宿主細胞を培養すること、および任意選択で、培養培地または宿主細胞から、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを回収することを含む方法が提供される。
【００５７】
本発明の第８の態様によれば、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現するのに適した条件下にて培養培地中で本発明の宿主細胞を培養すること、および任意選択で、培養培地または宿主細胞から、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを回収することを含む方法が提供される。
【００５８】
本発明の第９の態様によれば、本発明の宿主細胞または本発明の方法を使用して製造されている、β−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。
【００５９】
本発明に係るβ−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドは、好ましくは、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有しない、または実質的に有しない。
【００６０】
一実施形態では、本発明に係るβ−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドは、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性を有しておらず、または実質的に有しておらず、その結果、粘度の相対的低下として示される粘度の低下は、酵素も水も添加していない親水コロイド溶液と比較したβ−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを添加した親水コロイド含有溶液の粘度から算出される少なくとも０．８５もしくは少なくとも０．９またはより低い。
【００６１】
本発明の第１０の態様によれば、本発明の宿主細胞または本発明の方法を使用して製造されているβ−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを含むポリペプチド組成物が提供される。
【００６２】
本発明の第１１の態様によれば、本発明の宿主細胞または本発明の方法を使用して製造されている、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドが提供される。
【００６３】
本発明に係るトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドは、好ましくは、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有しない、または実質的に有しない。
【００６４】
一実施形態では、本発明に係るトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドは、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性を有しておらず、または実質的に有しておらず、その結果、粘度の相対的低下として示される粘度の低下は、酵素も水も添加していない親水コロイド溶液と比較したトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを添加した親水コロイド含有溶液の粘度から算出される少なくとも０．８５もしくは少なくとも０．９またはより低い。
【００６５】
本発明の第１２の態様によれば、本発明の宿主細胞または本発明の方法を使用して製造されているトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを含むポリペプチド組成物が提供される。
【００６６】
好ましくは、本発明のポリペプチド組成物は、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有しない、または実質的に有しない。
【００６７】
一実施形態では、このポリペプチド組成物は、セルロース活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性を有しておらず、または実質的に有しておらず、その結果、粘度の相対的低下として示される粘度の低下は、酵素も水も添加していない親水コロイド溶液と比較した本発明のポリペプチド組成物を添加した親水コロイド含有溶液の粘度から算出される少なくとも０．８５もしくは少なくとも０．９またはより低い。
【００６８】
本発明の第１３の態様によれば、本発明のβ−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドまたは本発明のポリペプチド組成物を含む乳製品が提供される。
【００６９】
本発明の第１４の態様によれば、乳製品を製造する方法であって、本発明のβ−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドまたは本発明のポリペプチド組成物を、ラクトースを含む乳製品に添加することを含む方法が提供される。
【００７０】
本発明の第１５の態様によれば、ＧＯＳを含む乳製品を製造する方法であって、本発明のβ−ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドまたは本発明のポリペプチド組成物を、ラクトースを含む乳製品に添加することを含む方法が提供される。
【００７１】
本発明の第１６の態様によれば、乳製品を調製するための、本発明に係るトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは本発明に係るポリペプチド組成物の使用が提供される。
【００７２】
本発明の第１７の態様によれば、ＧＯＳを含む乳製品を調製するための、本発明に係るトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは本発明に係るポリペプチド組成物の使用が提供される。
【００７３】
本発明の第１８の態様によれば、本発明のトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは本発明のポリペプチド組成物を含む乳製品が提供される。
【００７４】
本発明の第１９の態様によれば、乳製品を製造する方法であって、本発明のトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは本発明のポリペプチド組成物を、ラクトースを含む乳製品に添加することを含む方法が提供される。
【００７５】
本発明の第２０の態様によれば、ＧＯＳを含む乳製品を製造する方法であって、本発明のトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは本発明のポリペプチド組成物を、ラクトースを含む乳製品に添加することを含む方法が提供される。
【００７６】
本発明の第２１の態様によれば、乳製品を調製するための、本発明に係るトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは本発明に係るポリペプチド組成物の使用が提供される。
【００７７】
本発明の第２２の態様によれば、ＧＯＳを含む乳製品を調製するための、本発明に係るトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドまたは本発明に係るポリペプチド組成物の使用が提供される。
【００７８】
一実施形態では、本発明の使用は、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼを発現する宿主細胞から調製されるトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドの使用と比較した乳製品の粘度および／またはテクスチャの低下を防止するためである。
【００７９】
本発明は、ラクトースを含む組成物（例えば乳製品）中におけるＧＯＳ食物線維のｉｎ  ｓｉｔｕでの製造に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】Ｖｉｓｃｏｍａｎで同じ速度を使用してデータを取得する場合にのみ線形関数を得ることができることを示すグラフである。
【図２】Ｖｉｓｃｏｍａｎで速度２を使用して粘度を測定した標準物質である試料１の希釈液に関してＬＮ（ＭＵ／Ｋｇ）に対してプロットした相対粘度と、ＬＮ（ＭＵ／Ｋｇ）に対してプロットした、速度１で測定した試料１の１〜４ＭＵ／Ｋｇ試料および速度２で測定した試料１の５〜８０ＭＵ／Ｋｇ試料に関する相対粘度とを示すグラフである。
【図３】相対粘度の標準曲線を示すグラフである。
【図４】標準物質の相対粘度値をＬＮ（ＣＭＣＵ／ｇ）に対してプロットし、０．２４２〜０．８８５の相対粘度内で線形であることを示すグラフである。
【図５】４０℃（図５ａ）または４℃（図５ｂ）のいずれかでインキュベートした時間に対してプロットした相対粘度を示すグラフである。
【００８１】
配列表
配列番号１（本明細書では（ＢＩＦ＿９１７）とも称する）は、配列番号２２の８８７アミノ酸切断断片である。
配列番号２（本明細書では（ＢＩＦ＿９９５）とも称する）は、配列番号２２の９６５アミノ酸切断断片である。
配列番号３（本明細書では（ＢＩＦ＿１０６８）とも称する）は、配列番号２２の１０３８アミノ酸切断断片である。
配列番号４（本明細書では（ＢＩＦ＿１１７２）とも称する）は、配列番号２２の１１４２アミノ酸切断断片である。
配列番号５（本明細書では（ＢＩＦ＿１２４１）とも称する）は、配列番号２２の１２１１アミノ酸切断断片である。
配列番号６（本明細書では（ＢＩＦ＿１３２６）とも称する）は、配列番号２２の１２９６アミノ酸切断断片である。
配列番号７は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）グリコシドヒドロラーゼ触媒コアである。
配列番号８は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ＢＩＦ＿９１７をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ＢＩＦ＿９９５をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、ＢＩＦ＿１０６８をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、ＢＩＦ＿１１７２をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、ＢＩＦ＿１２４１をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、ＢＩＦ＿１３２６をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、上記のＢＩＦ変異体を生成するためのフォワードプライマーである。
配列番号１６は、ＢＩＦ９１７のためのリバースプライマーである。
配列番号１７は、ＢＩＦ９９５のためのリバースプライマーである。
配列番号１８は、ＢＩＦ１０６８のためのリバースプライマーである。
配列番号１９は、ＢＩＦ１２４１のためのリバースプライマーである。
配列番号２０は、ＢＩＦ１３２６のためのリバースプライマーである。
配列番号２１は、ＢＩＦ１４７８のためのリバースプライマーである。
配列番号２２は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼである。
配列番号２３は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼのシグナル配列である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
定義
本発明の詳細な説明にしたがって、下記の略語および用語の定義が適用される。本明細書で使用する単数形「１つの」および「その」は、状況が明白に他のことを指示していない限り、複数形を含むことに留意されたい。したがって、例えば「１つのポリペプチド」との言及には複数のそのようなポリペプチドが含まれ、「調製物」との言及には１つ以上の調製物および当業者には知られているそれらの同等物などが含まれる。
【００８３】
他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者によって通例理解される意味と同一の意味を有する。下記には、以下の用語を提供する。
【００８４】
「トランスガラクトシラーゼ」は、特に、ガラクトースをＤ−ガラクトースもしくはＤ−グルコースの水酸基に移動させることができ、それによってガラクトオリゴ糖が生成される酵素を意味している。１つの態様では、トランスガラクトシラーゼは、所与の時間に生成されるガラクトースの量が生成されるグルコースの量より少ないラクトース上の酵素反応によって同定される。
【００８５】
本発明の状況では、用語「トランスガラクトシル化活性」は、ガラクトース部分の水以外の分子への移動を意味する。この活性は、反応中の所与の時間に生成された［グルコース］−［ガラクトース］として測定するか、または反応中の所与の時間に生成されたＧＯＳの直接的定量により測定することができる。この測定は、実施例に示したＨＰＬＣ法などの数種の方法で実施することができる。トランスガラクトシル化活性を比較する場合は、例えば、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０重量／重量％などの所定の初期のラクトース濃度で実施されてきた。
【００８６】
本発明の状況では、用語「β−ガラクトシダーゼ活性」は、酵素が例えばラクトースなどのβ−ガラクトシドをグルコースおよびガラクトースなどの単糖へ加水分解する能力を意味する。
【００８７】
トランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性を計算する状況では、β−ガラクトシダーゼ活性は、反応の間の所与の時間で生成された［ガラクトース］として測定される。この測定は実施例に示したＨＰＬＣ法などの数種の方法で実施することができる。
【００８８】
本発明の状況では、オルト−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＯＮＰＧ）を使用する用語「トランスガラクトシル化活性の比率」は、以下のように計算した：比率は、受容体が存在するＡｂｓ４２０を受容体が存在しないＡｂｓ４２０で割って１００を掛けることによって計算する。指数が１００以下の変異体は純粋な加水分解変異体であり、他方１００より高い指数は相対的トランスガラクトシル化活性を示す。
【００８９】
トランスガラクトシル化活性の比率＝（Ａｂｓ４２０＋セロビオース／Ａｂｓ４２０−セロビオース）＊１００％（式中、Ａｂｓ４２０＋セロビオースは、反応中にセロビオースを含む以下で説明する方法３を用いて４２０ｎｍで読み取られた吸光度であり、Ａｂｓ４２０−セロビオースは、以下で説明する方法３を用いて反応中にセロビオースを含まない４２０ｎｍで読み取られた吸光度である。上記の方程式は、吸光度が０．５〜１．０である希釈液に対してのみ該当する。
【００９０】
１つの態様では、本発明に関するいずれかの酵素の活性は、１５分間の反応後、３０分間の反応後、６０分間の反応後、９０分間の反応後、１２０分間の反応後もしくは１８０分間の反応後に測定される。したがって１つの態様では、１つの例として、相対的トランスガラクトシル化活性は、例えば酵素の添加１５分後、例えば酵素の添加３０分後、例えば酵素の添加６０分後、例えば酵素の添加９０分後、例えば酵素の添加１２０分後もしくは例えば酵素の添加１８０分後に測定される。
【００９１】
本発明の状況では、用語「ガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比率」は（［グルコース］−［ガラクトース］／［ガラクトース］）を意味する。
【００９２】
本発明の状況では、用語［グルコース］は、ＨＰＬＣ法により重量％で測定したグルコース濃度を意味する。
【００９３】
本発明の状況では、用語［ガラクトース］は、ＨＰＬＣ法により重量％で測定したガラクトース濃度を意味する。
【００９４】
本発明の状況では、用語「ラクトースがガラクトシル化されている」は、例えば、ガラクトース分子が、ラクトース分子中にいずれかの遊離水酸基に共役結合した、または例えばアロラクトースを形成するために内部トランスガラクトシル化によって生成されたようにラクトース分子に共役結合していることを意味する。
【００９５】
本発明の状況では、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）製造における本明細書に開示したポリペプチドの性能の評価を「ミルクベース・アッセイ」（模擬ヨーグルト用途）において試験した。１００μＬの体積を用いるバッチ実験は、９８．６０重量／体積％の新鮮低温殺菌低脂肪乳（Ａｒｌａ  Ｍｉｎｉ−ｍａｅｌｋ）および１．４重量／体積％のＮｕｔｒｉｌａｃ  ＹＱ−５０７５ホエイ成分（Ａｒｌａ）からなるヨーグルトミックスを用いて９６ウェルＭＴＰプレート中で実施した。Ｎｕｔｒｉｌａｃ  ＹＱ−５０７５を完全に水和させるため、この混合物を２０時間攪拌し続け、その後にｐＨを確実に６．５とするために２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を添加した。このヨーグルトベースは、プレーンで、または追加のラクトース、フコース、マルトース、キシロースもしくは塩などの様々な補助食品とともにのいずれかで使用した。９０μＬのヨーグルトを１０μＬの精製酵素もしくは粗発酵素と混合し、テープで密封して４３℃で３時間インキュベートした。この反応は、１００μＬの１０％のＮａ２ＣＯ３によって停止させた。サンプルは、−２０℃で貯蔵した。ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ラクトース、グルコースおよびガラクトースの定量は、ＨＰＬＣによって実施した。サンプルの分析は、Ｄｉｎｏｎｅｘ  ＩＣＳ  ３０００で実施した。ＩＣパラメーターは、次の通りであった：移動相：１５０ｍＭのＮａＯＨ、流量：均一濃度、０．２５ｍＬ／分、カラム：Ｃａｒｂｏｐａｃ  ＰＡ１、カラム温度：室温、注入量：１０μＬ、検出器：ＰＡＤ、統合：手作業、サンプル調製：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１００倍に希釈（０．１ｍＬのサンプル＋９．９ｍＬの水）および０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過する、定量：標準物質のピーク面積に対する百分率でのピーク面積。ＧＯＳシロップ（Ｖｉａｎａｌ  ＧＯＳ、Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ  Ｃａｍｐｉｎａ）をＧＯＳ定量のための標準物質として用いた。
【００９６】
トランス−ガラクトシル化活性を、国際公開第２０１３／１８２６８６号パンフレットで説明されているＨＰＬＳ定量アッセイまたは酵素アッセイにより測定することができる。
【００９７】
本発明の状況では、用語「そのポリペプチドがスプレー乾燥されている」は、そのポリペプチドが、溶液中もしくは懸濁液中のポリペプチドを水の除去に適切な温度および適切な期間にわたってスプレー乾燥する工程によって得られていることを意味する。
【００９８】
本発明の状況では、用語「そのポリペプチドが溶液中にある」は、溶液から沈殿させずに溶媒中に溶解性であるポリペプチドに関する。このための溶媒には、例えば水性バッファーもしくは塩溶液、発酵ブロスまたは発現宿主の細胞質などの、ポリペプチドがその中で発生し得る任意の環境が含まれる。
【００９９】
本発明の状況では、用語「安定剤」は、例えば、ポリオール、例えば、グリセロールもしくはプロピレングリコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸もしくはホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）などのポリペプチドを安定化させる任意の安定化剤を意味する。１つの態様では、安定剤はポリオールではない、またはポリオールは０．１重量％以下の濃度で存在する。
【０１００】
用語「単離された」は、ポリペプチドが、自然界において配列が天然に関連するおよび自然界で見出される少なくとも１種のその他の成分を少なくとも実質的に含まないこと、ならびに／またはセルロース、マンナナーゼ（ｍａｎｎａｎｏｓｅ）、ペクチナーゼもしくはアミラーゼを実質的に含まないことを意味する。一態様では、「単離ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に少なくとも３０％純粋である、少なくとも４０％純粋である、少なくとも６０％純粋である、少なくとも８０％純粋である、少なくとも９０％純粋であるおよび少なくとも９５％純粋であるポリペプチドを意味する。
【０１０１】
例えば、用語「セルラーゼを実質的に含まない」は、本明細書では、最大で１０重量％の、好ましくは最大で８重量％の、より好ましくは最大で６重量％の、より好ましくは最大で５重量％の、より好ましくは最大で４重量％の、最大で３重量％の、更により好ましくは最大で２重量％の、最も好ましくは最大で１重量％のおよび更に最も好ましくは最大で０．５重量％のセルラーゼを含む調製物を意味する。従って、本明細書では、用語「実質的に含まない」を用語「単離ポリペプチド」および「単離形態のポリペプチド」と同義であると見なすことができる。
【０１０２】
例えば、用語「マンナナーゼを実質的に含まない」は、本明細書では、最大で１０重量％の、好ましくは最大で８重量％の、より好ましくは最大で６重量％の、より好ましくは最大で５重量％の、より好ましくは最大で４重量％の、最大で３重量％の、更により好ましくは最大で２重量％の、最も好ましくは最大で１重量％のおよび更に最も好ましくは最大で０．５重量％のマンナナーゼを含む調製物を意味する。従って、本明細書では、用語「実質的に含まない」を用語「単離ポリペプチド」および「単離形態のポリペプチド」と同義であると見なすことができる。
【０１０３】
例えば、用語「ペクチナーゼを実質的に含まない」は、本明細書では、最大で１０重量％の、好ましくは最大で８重量％の、より好ましくは最大で６重量％の、より好ましくは最大で５重量％の、より好ましくは最大で４重量％の、最大で３重量％の、更により好ましくは最大で２重量％の、最も好ましくは最大で１重量％のおよび更に最も好ましくは最大で０．５重量％のペクチナーゼを含む調製物を意味する。従って、本明細書では、用語「実質的に含まない」を用語「単離ポリペプチド」および「単離形態のポリペプチド」と同義であると見なすことができる。
【０１０４】
例えば、用語「アミラーゼを実質的に含まない」は、本明細書では、最大で１０重量％の、好ましくは最大で８重量％の、より好ましくは最大で６重量％の、より好ましくは最大で５重量％の、より好ましくは最大で４重量％の、最大で３重量％の、更により好ましくは最大で２重量％の、最も好ましくは最大で１重量％のおよび更に最も好ましくは最大で０．５重量％のアミラーゼを含む調製物を意味する。従って、本明細書では、用語「実質的に含まない」を用語「単離ポリペプチド」および「単離形態のポリペプチド」と同義であると見なすことができる。
【０１０５】
用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、本明細書においてそれが自然に関連している他のポリペプチド物質を最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、より好ましくは最大６重量％、より好ましくは最大５重量％、より好ましくは最大４重量％、最大３重量％、いっそうより好ましくは最大２重量％、最も好ましくは最大１重量％およびいっそう最も好ましくは最大０．５重量％を含有していることを意味する。このため、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中に存在する総ポリペプチド物質の重量に比して少なくとも９２重量％純粋、好ましくは少なくとも９４重量％純粋、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋、より好ましくは少なくとも９８重量％純粋、いっそうより好ましくは少なくとも９９重量％純粋、最も好ましくは９９．５重量％純粋、いっそう最も好ましくは１００重量％純粋であることが好ましい。本明細書に開示したポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋形にある。特に、ポリペプチドは、「本質的に純粋形」である、すなわちポリペプチド調製物は、それと自然に関連している他のポリペプチド物質を本質的に含んでいないことが好ましい。これは、例えば、周知の組換え法または伝統的な精製方法によってポリペプチドを調製することによって達成できる。本明細書では、用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、用語「単離ポリペプチド」および「単離形にあるポリペプチド」と同義語である。
【０１０６】
用語「精製（された）」または「純粋」の語は、所定の成分が高レベル状態−例えば、少なくとも約５１％純粋、例えば少なくとも５１％純粋、または少なくとも約７５％純粋、例えば少なくとも７５％純粋、または少なくとも約８０％純粋、例えば少なくとも８０％純粋、または少なくとも約９０％純粋、例えば少なくとも９０％純粋、または少なくとも約９５％純粋、例えば少なくとも９５％純粋または少なくとも約９８％純粋、例えば少なくとも９８％純粋で存在することを意味する。この成分は、望ましくは組成物中に存在する主要な活性成分である。
【０１０７】
本発明に関連する用語「微生物」には、本発明によるヌクレオチド配列または本明細書に定義した特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができた任意の「微生物」およびまたはそれらから得られた生成物が含まれる。本発明の状況では、「微生物」は、ミルク基質を発酵させることのできる任意の細菌もしくは真菌を含むことができる。
【０１０８】
本発明に関連する用語「宿主細胞」には、本明細書で定義した特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または上記に定義され、本明細書で定義した特異性を有するポリペプチドの製造に使用される発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞が含まれる。１つの態様では、この製造は組換え製造である。
【０１０９】
用語「ミルク」は、本発明の状況では、例えば牛、羊、ヤギ、バッファローまたはラクダなどの任意の哺乳動物から得られた乳分泌物であると理解すべきである。
【０１１０】
本発明の状況では、用語「ミルクベース基質」は、任意の生乳物質および／または加工乳物質またはミルク成分由来の物質を意味する。有用なミルクベース基質には、ラクトース、例えば全乳もしくは低脂肪乳、脱脂乳、バターミルク、再構成粉乳、コンデンスミルク、粉乳の溶液、ＵＨＴ乳（超高温熱処理乳）、乳清、乳清透過物、酸性乳清またはクリームを含む任意のミルクまたはミルク様製品の溶液／懸濁液が含まれるがそれらに限定されない。好ましくは、ミルクベース基質は、ミルクまたは脱脂粉乳の水溶液である。ミルクベース基質は、生乳より高度に濃縮される場合がある。１つの実施形態では、ミルクベース基質は、少なくとも０．２、好ましくは少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６または最も好ましくは少なくとも０．７のタンパク質対ラクトースの比率を有する。ミルクベース基質は、当技術分野において公知の方法によって均質化および／または低温殺菌することができる。
【０１１１】
本明細書で使用する「均質化する工程」は、可溶性懸濁液もしくはエマルジョンを得るための集中的混合を意味する。「均質化する工程」は、乳脂肪がもはやミルクから分離しないほど小さなサイズに破壊できるように実施することができる。これはミルクを小さい開口部に高圧で通過させることにより達成できる。
【０１１２】
本明細書で使用する「低温殺菌する工程」は、ミルクベース基質中の例えば微生物などの生菌の存在を減少させる、または排除することを意味する。好ましくは、低温殺菌は、特定時間にわたり特定温度を維持することにより達成される。特定温度は、通常は加熱する工程によって達成される。温度および持続時間は、例えば有害細菌などの所定の細菌を殺滅もしくは不活性化するため、および／またはミルク中の酵素を不活性化するために選択することができる。その後には急速冷却工程が続いてよい。本発明の状況における「食品」もしくは「食品組成物」は、動物またはヒトによる消費に好適な任意の食べられる食料品もしくは飼料製品であってよい。
【０１１３】
本発明の状況における「乳製品」は、主要成分の１つがミルクベースである任意の食品であってよい。好ましくは、主要成分は、ミルクベースである。より好ましくは、主要成分は、トランスガラクトシル化活性を有する酵素で処理されているミルクベース基質である。
【０１１４】
本発明の状況では、「主要成分の１つ」は、その構成成分が乳製品の全乾燥物質の２０％超、好ましくは３０％超または４０％超を構成する乾燥物質を有する構成成分を意味するが、他方「主要成分」は、乳製品の全乾燥物質の５０％超、好ましくは６０％超または７０％超を構成する乾燥物質を有する構成成分を意味する。
【０１１５】
本発明の状況における「発酵乳製品」は、任意のタイプの発酵が製造工程の一部を形成する任意の乳製品であると理解すべきである。発酵乳製品の例は、ヨーグルト、バターミルク、生クリーム、クォークおよびフロマージュ・フレなどの製品が含まれる。発酵乳製品のまた別の例は、チーズである。発酵乳製品は、当技術分野において公知の任意の方法によって製造できる。
【０１１６】
用語「発酵」は、例えばスターター培養物などの微生物の作用を通した炭水化物からアルコールもしくは酸への変換を意味する。１つの態様では、発酵は、ラクトースから乳酸への変換を含む。
【０１１７】
本発明の状況では、「微生物」は、ミルク基質を発酵させることのできる任意の細菌もしくは真菌を含むことができる。
【０１１８】
本発明の状況では、用語「Ｐｆａｍドメイン」は、タンパク質配列内で複数の配列アラインメントおよび隠れマルコフモチーフの存在に基づいてＰｆａｍ−ＡもしくはＰｆａｍ−Ｂのいずれかであると同定される領域を意味する（“Ｔｈｅ  Ｐｆａｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ”：Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｔａｔｅ，Ｐ．Ｃｏｇｇｉｌｌ，Ａ．Ｈｅｇｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｐｏｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｌ．Ｇａｖｉｎ，Ｐ．Ｇｕｎｅｓｅｋａｒａｎ，Ｇ．Ｃｅｒｉｃ，Ｋ．Ｆｏｒｓｌｕｎｄ，Ｌ．Ｈｏｌｍ，Ｅ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０）Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ３８：Ｄ２１１−２２２．）。Ｐｆａｍドメインの例としては、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ  ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）を挙げることができる。
【０１１９】
本明細書で使用する用語「発現」は、それによりポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される工程を意味する。この工程は、転写および翻訳の両方を含む。
【０１２０】
本明細書で使用する「形質転換細胞」には、細菌細胞および真菌細胞の両方を含む、組換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されている細胞が含まれる。形質転換は、典型的には細胞内への１つ以上のヌクレオチド配列の挿入によって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列であってよい、すなわち、例えば融合タンパク質などの形質転換されなければならない細胞にとって自然ではない配列である。
【０１２１】
本明細書で使用する「機能的に連結した」は、本明細書に記載した成分がそれらの所定の方法において機能することを許容する関係にあることを意味する。例えば、コーディング配列に機能的に連結した調節配列は、コーディング配列の発現がコントロール配列と適合する条件下で達成されるような方法でライゲートされる。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、核酸を１種または複数種の細胞型に導入するように設計されているポリヌクレオチド配列を意味する。ベクターとして、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットおよび同類のものが挙げられる。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、用語「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスを意味する。このプロセスは転写および翻訳の両方を含む。発現は、ポリペプチドを産生するための宿主生物の使用を含んでもよい。宿主生物（単に宿主とも称される）として原核生物および真核生物を挙げることができ、一部の実施形態では細菌種および真菌種を挙げることができる。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」は、ＤＮＡコード配列（例えば遺伝子配列）を含むＤＮＡ構築物を意味しており、このＤＮＡコード配列は、このコード配列の宿主中での発現に影響を及ぼすことができる１種または複数種の適切な制御配列に作動可能に連結されている。そのような制御配列として、転写を引き起こすためのプロモーター、そのような転写を制御するための任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。このベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単に潜在的なゲノム挿入物であることができる。適切な宿主中に形質転換されると、このベクターは宿主ゲノムから独立して複製して機能し得る、または場合によってはゲノム自体に組み込まれ得る。発現ベクターの中で最も一般的に使用される形態はプラスミドである。しかしながら、この説明は、等価な機能を果たし、当分野で知られているまたは知られるようになる発現ベクターのそのようなその他の形態を含むように意図されている。
【０１２５】
「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与する調節配列を意味する。プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよいし構成的プロモーターであってもよい。使用することができる誘導性プロモーターの非限定的な例は、誘導性プロモーターであるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１である。
【０１２６】
用語「作動可能に連結されている」は、複数の要素が、これらの要素が機能的に関連することを可能にするように配置されている並置を意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、このプロモーターはこのコード配列に作動可能に連結されている。
【０１２７】
「転写制御下」は、ポリヌクレオチド配列の転写が、このポリヌクレオチド配列が転写の開始に寄与するまたは転写を促進する要素に作動可能に連結されていることに依存することを示す、当分野で十分に理解されている用語である。
【０１２８】
「翻訳制御下」は、ｍＲＮＡが形成された後に起こる調節プロセスを示す、当分野で十分に理解されている用語である。
【０１２９】
「遺伝子」はポリペプチドの産生に関与するＤＮＡセグメントを意味しており、この遺伝子として、コード領域の前後の領域および個々のコーディングセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）が挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、ポリペプチドの発現のためにポリペプチドの産生用の組換え発現ベクターが形質移入され得る細胞または細胞株を意味する。宿主細胞として単一宿主細胞の子孫が挙げられ、この子孫は、天然の、偶発的なまたは意図的な変異に起因して、元の親細胞と（形態学的にまたは全ゲノム補体で）必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞として、発現ベクターによりｉｎ  ｖｉｖｏで形質移入されたまたは形質転換された細胞が挙げられる。
【０１３０】
用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して使用する場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の改変により改変されていること、または細胞がそのように改変されている細胞に由来することを示す。そのため、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内には見出されない遺伝子を発現する、または別の状況では異常に発現されている、低く発現されているもしくは全く発現されていない天然遺伝子を発現させる。
【０１３１】
「シグナル配列」（「プレ配列」、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」または「リーダーペプチド」とも呼ばれる）は、細胞からの成熟型のタンパク質の分泌を促進するタンパク質のＮ−末端部分に結合しているアミノ酸の配列を意味する（例えば配列番号５）。このシグナル配列は、ポリペプチドの標的を分泌経路に設定し、新生ポリペプチドが小胞体膜中で転位置されると、この新生ポリペプチドから切断される。成熟形態の細胞外タンパク質（例えば配列番号１）は、分泌プロセス中に切断されるシグナル配列を欠いている。
【０１３２】
用語「選択マーカー」または「選択可能マーカー」は、導入された核酸またはベクターを含む宿主の選択を容易にする、宿主細胞中で発現することができる遺伝子を意味する。選択可能マーカーの例として、抗微生物性物質（例えばハイグロマイシン、ブレオマイシンもしくはクロラムフェニコール）および／または栄養上の利点等の代謝上の利点を宿主細胞に付与する遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３３】
用語「培養する」は、液体または固体の培養培地中で、増殖に適した条件下にて微生物細胞の集団を増殖させることを意味する。用語「培養培地」は、このプロセスで使用する培地を意味する
【０１３４】
核酸配列を細胞に挿入するという文脈での用語「導入される」は、「形質移入」、「形質転換」または「形質導入」を含み、真核細胞または原核細胞への核酸配列の組み込みを意味しており、これらの細胞では、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）中に組み込まれ得る、自律レプリコンに変換され得る、または一時的に発現され得る。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、用語「形質転換される」、「安定的に形質転換される」および「遺伝子導入」は、ゲノム中に組み込まれたまたは複数世代にわたって維持されるエピソームプラスミドとして非天然の（例えば異種の）核酸配列を有する細胞を意味する。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、用語「改変」および「変更」は互換的に使用され、変わることまたは変化することを意味する。ポリペプチドを改変するまたは変更するという文脈で、これらの用語は、アミノ鎖配列を直接的にもしくはコードする核酸を変えることにより変えること、または例えば酵素をグリコシル化することによりポリペプチドの構造を変えることを意味することができる。
【０１３７】
本発明の実行は、別途指示しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の従来の技術を用いることができ、これらは当分野の技術範囲内である。そのような技術は文献で完全に説明されており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）およびＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０）で完全に説明されている。
【０１３８】
本明細書中で別途定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明で使用する用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書で説明する方法および材料と類似のまたは等価のあらゆる方法および材料を、本発明の実行または試験で使用することができる。
【０１３９】
別途指示しない限り、核酸を５’から３’の方向で左から右へと記載し、アミノ酸配列をアミノからカルボキシの方向で左から右へと記載する。本明細書に記載する数値範囲は、この範囲を画定する数字を含む。酵素生成物中では、少量の不必要な酵素活性は産生宿主に主に由来し、酵素副活性と称される。本発明は、不必要な酵素副活性を低減させることを対象とする。好ましくは、乳製品用途での酵素活性をこの用途に適したＰｈおよび温度で測定すべきである。乳ではｐＨは６．４から６．８まで様々であり、ヨーグルト：ｐＨ約４、調整粉乳ｐＨ５．９〜７．３、モッツァレラｐＨ５．２〜５．５およびマヨネーズｐＨ４である。最適には、望ましくない活性のレベルを、意図された用途それぞれでの適用試験によって決定することができる。
【０１４０】
セルラーゼ
一態様では、本発明は、セルラーゼ活性を有しないまたは実質的に有しない組成物に関する。別の態様では、本発明は、セルラーゼをコードする遺伝子が不活性化されている新規の細菌を提供する。そのような組成物は、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを含む。本発明に係る宿主細胞は、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現することができる。そのようなトランスガラクトシル化活性は、製品中のラクトースからＧＯＳが生成され得る（即ち好ましくはポリペプチドが組成物中に存在する）レベルで存在すべきである、または宿主細胞が、組成物もしくは宿主細胞が添加されている乳製品中に存在するラクトースからＧＯＳの形態の食物繊維が生成され得るレベルでポリペプチドを発現することができるレベルで存在すべきである。
【０１４１】
セルラーゼは、セルロース（ベータ−１，４−グルカン結合またはベータＤ−グルコシド結合）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖および同類のものを形成する酵素である。セルラーゼは伝統的に、下記の３つの主要なクラスに分類されている：エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）およびベータ−グルコシダーゼ（［ベータ］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）。一実施形態によれば、不活性化されているセルラーゼ遺伝子はｂｇＬＣエンドグルカナーゼである。
【０１４２】
マンナナーゼ
マンナナーゼは、マンナンとして知られている化合物を分解する酵素である。この多糖は単糖マンノースで構成されており、自然界において広く見出される。多くの植物（および例えばこれらの植物の種子）では、マンナンは炭水化物貯蔵所としての機能を果たす。一態様では、この酵素はマンナナーゼの群から選択され、具体的には、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼから選択される。一実施形態によれば、不活性化されているマンナナーゼ遺伝子はｇｍｕＧマンナナーゼである。
【０１４３】
ペクチナーゼ
ペクチナーゼは、植物の細胞壁中で見出される多糖であるペクチンを分解する酵素である。一般にペクチン酵素と呼ばれているが、このペクチン酵素として、ペクトリアーゼ、ペクトザイムおよびポリガラクツロナーゼが挙げられる。最も研究されているおよび広く使用されている市販のペクチナーゼの１つはポリガラクツロナーゼである。一実施形態によれば、不活性化されているペクチナーゼ遺伝子はｐｅｌペクチン酸リアーゼである。
【０１４４】
アミラーゼ
アミラーゼは、デンプンの糖への加水分解を触媒する酵素である。アミラーゼはヒトおよびいくつかのその他の哺乳動物の唾液中に存在し、消化の化学プロセスを開始する。脾臓および唾液腺は、アミラーゼ（アルファアミラーゼ）を生成して食事のデンプンを二糖および三糖へと加水分解し、これら二糖および三糖はその他の酵素によりグルコースへと変換され、身体にエネルギーが供給される。植物およびいくつかの細菌もアミラーゼを産生する。特定のアミラーゼタンパク質はギリシャ文字で表される。全てのアミラーゼはグリコシド加水分解酵素であり、α−１，４−グリコシド結合に作用する。好ましくは、本発明は（ＥＣ３．２．１．１）（ＣＡＳ＃９０１４−７１−５）（別名：１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ；グリコゲナーゼ）の不活性化を更に含む。一実施形態によれば、不活性化されているアミラーゼ遺伝子はａｍｙＥアルファ−アミラーゼである。
【０１４５】
一態様では、用語「アミラーゼ」は、本明細書で使用する場合、［アルファ］−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．Ｉ）、［ベータ］−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）および［ガンマ］−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３．）等のアミラーゼを意味する。
【０１４６】
同一性の程度
２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメーター「同一性」によって記載される。
【０１４７】
１つの実施形態では、クエリー配列と参照配列との配列同一性の程度は、１）２つの配列を任意の好適なアラインメントプログラムによってデフォルトのスコアリングマトリックスおよびデフォルトのｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙを使用して整列させる工程、２）正確なマッチ数を同定する工程であって、このとき正確なマッチはアラインメントプログラムがアラインメントにおいて所定の位置上にある２つの整列させた配列内の同一アミノ酸もしくはヌクレオチドを同定している場合である工程、および３）正確なマッチ数を参照配列の長さで割る工程によって決定される。
【０１４８】
１つの実施形態では、クエリー配列と参照配列との配列同一性の程度は、１）２つの配列を任意の好適なアラインメントプログラムによってデフォルトのスコアリングマトリックスおよびデフォルトのｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙを使用して整列させる工程、２）正確なマッチ数を同定する工程であって、このとき正確なマッチはアラインメントプログラムがアラインメントにおいて所定の位置上にある２つの整列させた配列内の同一アミノ酸もしくはヌクレオチドを同定している場合である工程、および３）正確なマッチ数を２つの配列の内で最長配列の長さで割る工程によって決定される。
【０１４９】
また別の実施形態では、クエリー配列と参照配列との配列同一性の程度は、１）２つの配列を任意の好適なアラインメントプログラムによってデフォルトのスコアリングマトリックスおよびデフォルトのｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙを使用して整列させる工程、２）正確なマッチ数を同定する工程であって、このとき正確なマッチはアラインメントプログラムがアラインメントにおいて所定の位置上にある２つの整列させた配列内の同一アミノ酸もしくはヌクレオチドを同定している場合である工程、および３）正確なマッチ数を「アラインメント長」で割る工程であって、このときアラインメント長は、配列のｇａｐおよび突出部分を含む全アラインメントの長さである工程によって決定される。
【０１５０】
配列同一性の比較は、目測で、または通常は、容易に利用可能な配列比較プログラムを活用して実施することができる。これらの市販で入手可能なコンピュータープログラムは、２つ以上の配列を整列させて、２つ以上の配列間の相違を生じさせた可能性がある進化的事象を裁量に反映する複雑な比較アルゴリズムを使用する。このため、これらのアルゴリズムは、同一もしくは類似のアミノ酸のアラインメントを与える、およびｇａｐ、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎのｐｅｎａｌｔｙを与えるスコアリングシステムおよび非類似アミノ酸のアラインメントを用いて機能する。比較アルゴリズムのスコアリングシステムには：
ｉ）ｇａｐが挿入された時間毎のｐｅｎａｌｔｙスコアの指定（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙスコア）、
ｉｉ）既存のｇａｐが割増位置を伴って伸長する各時間のｐｅｎａｌｔｙスコアの指定（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙスコア）、
ｉｉｉ）同一アミノ酸がアライメントされた時点の高スコアの指定、および
ｉｖ）非同一アミノ酸がアラインメントされた時点の可変スコアの指定、が含まれる。
【０１５１】
大多数のアラインメントプログラムは、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙが修飾されることを許容する。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウエアを使用する場合にはデフォルト値を使用することが好ましい。
【０１５２】
非同一アミノ酸のアラインメントに対して与えられるスコアは、置換マトリックスとも呼ばれるスコアリングマトリックスにしたがって指定される。そのような置換マトリックスにおいて提供されるスコアは、進化中に１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換される可能性が変動し、置換対象のアミノ酸の物理的／化学的性質に依存するという事実を反映している。例えば、１つの極性アミノ酸がまた別の極性アミノ酸と置換される可能性は、疎水性アミノ酸と置換される場合に比較して高い。このため、スコアリングマトリックスは同一アミノ酸に対して最高スコア、非同一であるが類似のアミノ酸に対してはより低いスコア、および非同一で非類似のアミノ酸に対してはいっそう低いスコアを指定するであろう。最も頻回に使用されるスコアリングマトリックスは、ＰＡＭマトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８），Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２））およびＧｏｎｎｅｔマトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））である。
【０１５３】
そのようなアラインメントを実施するために好適なコンピュータープログラムには、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）ならびにＣｌｕｓｔａｌＶ、ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）が含まれるがそれらに限定されない。選りすぐりの様々なアラインメントツールは、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ．のＥｘＰＡＳｙ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓサーバーから入手できる。配列アラインメントを実施できるソフトウエアのまた別の例は、現在はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／に見いだすことができる全米バイオテクノロジー情報センターのウェブページから入手でき、最初にＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５；４０３−４１０に記載されたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）である。
【０１５４】
本発明の好ましい実施形態では、アラインメントプログラムは、配列の全長にわたるアラインメントを最適化する、グローバルアラインメントプログラムを実施する。また別の好ましい実施形態では、グローバルアラインメントプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓａｕｌ  Ｂ．；およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｄ．（１９７０），“Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８（３）：４４３−５３）に基づく。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いてグローバルアラインメントを実施する最新プログラムの例は、どちらもｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／から入手可能であるＥＭＢＯＳＳ  ＮｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ  Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒプログラムである。ＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅは、２つの配列の全体の長さの最適な（ｇａｐを含む）アラインメントを見いだすために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムを使用して最適なグローバル配列アラインメントを実施する。ＥＭＢＯＳＳ  Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒは、より大きな配列をグローバルに整列させることを可能にするＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントの修飾を使用する。１つの実施形態では、配列はグローバルアラインメントプログラムによって整列させられ、配列同一性はプログラムによって同定された正確なマッチの数を「アラインメント長」で割ることによって計算されるが、このときアラインメント長はｇａｐおよび配列の突出部分を含む全アラインメントの長さである。
【０１５５】
また別の実施形態では、グローバルアラインメントプログラムはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用し、配列同一性はプログラムによって同定された正確なマッチの数を「アラインメント長」で割ることによって計算されるが、このときアラインメント長はｇａｐおよび配列の突出部分を含む全アラインメントの長さである。
【０１５６】
さらに別の実施形態では、グローバルアラインメントプログラムは、ＥＭＢＯＳＳ  ＮｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ  Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒからなる群から選択され、配列同一性はプログラムによって同定された正確なマッチの数を「アラインメント長」で割ることによって計算されるが、このときアラインメント長はｇａｐおよび配列の突出部分を含む全アラインメントの長さである。
【０１５７】
ソフトウエアがアラインメントを生成すると、類似性率（％）および配列同一性率（％）を計算することが可能である。ソフトウエアは、典型的にはこれを配列比較の一部として実行し、数的結果を生成する。
【０１５８】
１つの実施形態では、配列アラインメントを実施するためにＣｌｕｓｔａｌＷソフトウエアを使用するのが好ましい。好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いたアラインメントは、ペアワイズアラインメントのために下記のパラメーターを用いて実施される：
【０１５９】
【表２】
2017533712.tif 000003
【０１６０】
ＣｌｕｓｔａｌＷ２は、例えば、インターネット上でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ研究所によってＥＭＢＬ−ＥＢＩウェブページｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのｔｏｏｌｓ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ−ＣｌｕｓｔａｌＷ２の下で入手可能にされている。現在、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ツールの正確なアドレスは、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２である。
【０１６１】
また別の実施形態では、配列アラインメントを実施するためにプログラムＡｌｉｇｎ  Ｘ  ｉｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するのが好ましい。１つの実施形態では、Ｅｘｐ１０がデフォルト設定を用いて使用可能にされている：
Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ：１０
Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：０．０５
Ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ｒａｎｇｅ：８
【０１６２】
また別の実施形態では、１つのアミノ酸配列とまた別のアミノ酸配列との、またはまた別のアミノ酸配列とのアラインメントは、スコアマトリックス：ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２およびＶｅｃｔｏｒＮＴＩペアワイズアラインメント設定の使用によって決定される。
【０１６３】
【表３】
2017533712.tif 000004
【０１６４】
１つの実施形態では、１つのアミノ酸配列とまた別のアミノ酸配列との、またはまた別のアミノ酸配列との同一性率（％）は、ワードサイズ３およびトランスガラクトシル化活性を有する置換マトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ  ６２を用いるＢｌａｓｔによって決定される。
【０１６５】
ポリペプチド
１つの実施形態では、本明細書に開示した発明は、３重量／重量％の初期ラクトース濃度以上の濃度で、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１もしくは少なくとも１２のトランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比率を有するポリペプチドを使用する。１つの態様では、本明細書に開示した発明は、グリコシドヒドロラーゼ触媒コアが配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用する。
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）および／またはＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ  ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）ドメインを含有するポリペプチドを使用する。
【０１６６】
１つの態様では、本明細書において、細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）を含有するポリペプチドが開示される。
【０１６７】
１つの実施形態では、本明細書において、下記からなる群から選択されるトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドが開示される：
ｇ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｈ．配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｉ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大１，３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｊ．ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３からなる核酸配列、またはｉｉ）ｉ）の相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、
ｋ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
ｌ．配列番号１、２、３、４または５の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される。
【０１６８】
別の態様では、本明細書で開示する発明は、
ａ．配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で１３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｂ．配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大で９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、
ｃ．ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれる核酸配列またはｉｉ）ｉ）の相補鎖と少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
ｄ．配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対してまたは成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに
ｅ．配列番号１、２、３、４または５の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または保存的置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを用いる。
【０１６９】
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４もしくは５の成熟アミノ酸配列との少なくとも６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドを使用する。
【０１７０】
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、配列番号１の成熟アミノ酸配列との９０％配列同一性を有するポリペプチドを使用する。
【０１７１】
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、配列番号２の成熟アミノ酸配列との９０％配列同一性を有するポリペプチドを使用する。
【０１７２】
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、配列番号３の成熟アミノ酸配列との９６．５％配列同一性を有するポリペプチドを使用する。
【０１７３】
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、配列番号４の成熟アミノ酸配列との９６．５％配列同一性を有するポリペプチドを使用する。
【０１７４】
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、配列番号５の成熟アミノ酸配列との９６．５％配列同一性を有するポリペプチドを使用する。
【０１７５】
１つの実施形態では、本明細書に開示した発明は、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列を含む、またはそれらからなるポリペプチドを使用する。
【０１７６】
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）に由来するポリペプチドを使用する。
【０１７７】
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、６．５〜７．５の最適ｐＨを有するポリペプチドを使用する。
【０１７８】
１つの態様では、本明細書に開示した発明は、例えば４２〜６０℃などの３０〜６０℃の最適温度を有するポリペプチドを使用する。
【０１７９】
炭水化物への活性を有するポリペプチドは、それらの基質特異性に基づくＩＵＢＭＢ分類システムまたは現行の１２５種のグリコシドヒドロラーゼファミリーの１つへのＣａＺｙ割当てのいずれかを使用して分類することができる。ＣａＺｙデータベースでは、割当ては、基質および生成物の立体化学の知識と組み合わせた配列および構造の両方に関する情報に基づいている。
【０１８０】
本明細書では、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含む好適な宿主菌株（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））中で発現生成物である場合に、トランスガラクトシル化活性を示す前記核酸配列の唯一のポリペプチド発現生成物であるポリペプチドの使用が開示される。これは、当業者には公知の下記の技術を使用することによって評価することができる。評価対象のサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥを受けさせられ、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎシステムなどのタンパク質定量のために適切な染料を使用して可視化される。ゲルは、次に例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎシステムなどの適切な密度計スキャナーを使用してスキャンされ、結果として生じた画像がダイナミックレンジ内にあることが確証される。配列番号８に由来する任意の変異体／断片に対応するバンドが定量され、ポリペプチドのパーセンテージは：問題のポリペプチドの百分率＝問題のポリペプチド／（トランスガラクトシル化活性を示す全ポリペプチドの合計）＊１００として計算される。組成物中の配列番号８に由来するポリペプチド変異体／断片の総数は、当業者には公知の方法によってポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによって配列番号８に由来する断片を検出することによって決定できる。
【０１８１】
本明細書に開示したポリペプチドは、酵素内に含有された少なくとも２つの別個の機能的ドメインを含む。最初に、ポリペプチドは、下記に記載するようなグリコシドヒドロラーゼ触媒コアを含有するはずである。触媒コアは、関連するグリコシドヒドロラーゼファミリーのＧＨ−Ａクランに属するはずである。ＧＨ−Ａクランは、保持機構によってグリコシド結合を開裂することを特徴とし、ＴＩＭバレルフォールドに基づく触媒ドメインを有する（Ｗｉｅｒｅｎｇａ，２００１，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４９２（３），ｐ１９３−８）。この触媒ドメインは、バレルドメインの第４および第７ストランドから生じるプロトン供与体および求核基として作用する２つのグルタミン酸残基を含有する（Ｊｅｎｋｉｎｓ，１９９５，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６２（３），ｐ２８１−５）。ＴＩＭバレルの全体構造は、８本のβストランドおよび８本のαヘリックスからなる（β／α）８フォールドである。１つの態様では、本明細書に開示したグリコシドヒドロラーゼ触媒コアは、グリコシドヒドロラーゼファミリーＧＨ−２およびＧＨ−Ａクランに属する全ＴＩＭバレル酵素であるＧＨ−３５のいずれかに属する。また別の態様では、グリコシドヒドロラーゼ触媒コアは、ＧＨ−２もしくはＧＨ−３５ファミリーに属する。また別の態様では、グリコシドヒドロラーゼ触媒コアは、ＧＨ−２ファミリーに属する。一般的基準は、これらの酵素がいわゆる保持酵素であるので、基質の立体化学が生成物内で保存されていることである（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，１９９７，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，７（５），６３７−４４）。
【０１８２】
１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、β（１→４）構造を有する炭水化物結合への活性を有する。この活性は効果的に、これらの酵素をβ−ガラクトシダーゼのＩＵＭＢＭＢ  ＥＣ３．２．１．２３クラスに分類する。この活性は、例えば、色素生成アグリコン（ＸＧａｌ）とともにパラ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）、オルト−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）またはβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなどの合成基質を利用することによって決定できるが、それらに限定されない。酵素がβ−ガラクトシダーゼのＥＣ３．２．１．２３クラスに属するかどうかを決定する代替法としては、ラクトースなどの基質とともにインキュベートし、例えば酵素決定法、ＨＰＬＣ、ＴＬＣもしくは当業者には公知の他の方法によってグルコースの遊離を測定することである。
【０１８３】
ポリペプチドの機能的実体を予測するためには、数種の利用可能な好適な公衆リポジトリ、例えばＰｆａｍ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１０）３８（ｓｕｐｐｌ  １）：Ｄ２１１−Ｄ２２２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｐ９８５）およびＩｎｔｅｒｐｒｏ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００９）３７（ｓｕｐｐｌ  １）：Ｄ２１１−Ｄ２１５．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ７８５）などを適用できる。そのような分析を実施する場合は、分析は、好適な保存データベースから入手できるポリペプチドの全長配列上で実施されなければならないことを明白にすべきである。
【０１８４】
また別の態様では、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ  ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）から選択される１つ以上のＰｆａｍドメインを含有するポリペプチドが提供される。さらにまた別の態様では、ＰｆａｍドメインＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ  ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）を含有するポリペプチドが提供される。さらにまた別の態様では、ポリペプチドの触媒ドメインを構成するＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）およびＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ  ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）ドメインを含有するポリペプチドが使用される。
【０１８５】
更なる態様では、本明細書で開示されており、１８０分等の１５分、３０分または１８０分の反応後の３７℃および５重量／重量％のラクトースでの乳ベースのアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定した場合にトランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比が少なくとも１、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または少なくとも１２であるポリペプチドを使用する。更なる態様では、このポリペプチドはビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）に由来する。
【０１８６】
１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、１５、３０もしくは１８０分間、例えば１８０分間の反応後に、３７℃および５重量／重量％のラクトースでのミルクベースアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定して、初期ラクトースの２０％超、３０％超、４０％超、５０％までがトランスガラクトシル化されているようなトランスガラクトシル化活性を有する。
【０１８７】
また別の態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、１５、３０もしくは１８０分間、例えば１８０分間の反応後に、３７℃および５重量／重量％のラクトースでのミルクベースアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定して、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満のラクトースが加水分解されているようなβ−ガラクトシダーゼ活性を有する。
【０１８８】
１つの態様では、β−ガラクトシダーゼ活性および／またはトランスガラクトシル化活性は、方法４に規定された２．１３ＬＡＵに対応して１００ｐｐｍの濃度で測定される。一般用語では、酵素活性の単位は、国際公開第２００３／１８６２８６号パンフレットに方法４として開示され、以下の実施例セクション４において再現したアッセイにしたがって測定することができる。
【０１８９】
また別の態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、下記の特徴：
ａ）１５、３０もしくは１８０分間、例えば１８０分間の反応後に、３７℃および５重量／重量％のラクトースでのミルクベースのアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定して、少なくとも１、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または少なくとも１２のトランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比率を有する、および／または
ｂ）１５、３０もしくは１８０分間、例えば１８０分間の反応後に、３７℃および５重量／重量％のラクトースでのミルクベースアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定して、初期ラクトースの２０％超、３０％超、４０％超および５０％までがトランスガラクトシル化されているようなトランスガラクトシル化活性を有する、の内の１つ以上を有する。
【０１９０】
１つの態様では、配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは、最大１，３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。また別の態様では、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性、例えば前記配列同一性が例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。また別の態様では、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。さらにまた別の態様では、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する、例えば前記ポリペプチドが配列番号１との例えば少なくとも９０％、例えば，少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。また別の態様では、配列番号２との少なくとも９６．５％の配列同一性を有する、例えば前記ポリペプチドが配列番号２との少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド。１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、最大９７５個のアミノ酸残基、例えば最大９７０個のアミノ酸残基、例えば最大９５０個のアミノ酸残基、例えば最大９４０個のアミノ酸残基、最大９３０個のアミノ酸残基、最大９２０個のアミノ酸残基、最大９１０個のアミノ酸残基、最大９００個のアミノ酸残基、最大８９５個のアミノ酸残基もしくは最大８９０個のアミノ酸残基からなり、提供される。１つの態様では、特定のポリペプチドは８８７もしくは９６５個のアミノ酸残基からなり、提供される。１つの態様では、配列番号２との少なくとも９７％の配列同一性、例えば前記配列同一性が例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の同一性であるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９７５個のアミノ酸残基、例えば最大９７０個もしくは少なくとも９６５個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。１つの態様では、配列番号２と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが使用される。
【０１９１】
また別の好ましい態様では、配列番号１、２、３、４もしくは５を含むポリペプチドが提供される。さらに別の好ましい態様では、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列からなるポリペプチド、特に配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが使用される。
【０１９２】
また別の態様では、配列番号３との少なくとも９６．５％の配列同一性、例えば前記配列同一性が例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは少なくとも１００％の配列同一性であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、最大１，３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。
【０１９３】
また別の態様では、前記ポリペプチドが配列番号５との少なくとも９８．５％、例えば少なくとも９９％もしくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。１つの態様では、そのようなポリペプチドは、最大１，２９０個のアミノ酸残基、例えば最大１，２８０個、最大１，２７０個、最大１，２６０個、最大１，２５０個、最大１，２４０個、最大１，２３０個、最大１，２２０個もしくは最大１，２１５個のアミノ酸残基からなり、提供される。１つの好ましい態様では、１，２１１個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが使用される。
【０１９４】
また別の態様では、前記ポリペプチドが配列番号４との少なくとも９６％、例えば少なくとも少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。１つの態様では、最大１，２１０個のアミノ酸残基、例えば最大１，２００個、最大１，１９０個、最大１，１８０個、最大１，１７０個、最大１，１６０個、最大１，１５０個もしくは最大１，１４５個のアミノ酸残基、例えば１，１４２個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが使用される。
【０１９５】
また別の態様では、前記ポリペプチドが配列番号３との少なくとも９６．５％、例えば少なくとも少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドが提供される。１つの態様では、最大１，１３０個のアミノ酸残基、例えば最大１，１２０個、最大１，１１０個、最大１，１００個、最大１，０９０個、最大１，０８０個、最大１，０７０個、最大１，０６０個、最大１，０５０個、最大１，０５５個もしくは最大１，０４０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが提供される。１つの好ましい態様では、１，０３８個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが使用される。
【０１９６】
また別の態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、１００％超、例えば１５０％超、１７５％超もしくは２００％超のトランスガラクトシル化活性の比率を有する。
【０１９７】
タンパク質は、一般に、通例ドメインと呼ばれる１つ以上の機能的領域から構成される。異なるタンパク質中に様々な組み合わせで様々なドメインが存在することは、自然に見いだされる多様なタンパク質レパートリーを生じさせる。ドメインを記載する１つの方法は、“Ｔｈｅ  Ｐｆａｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ”：Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｔａｔｅ，Ｐ．Ｃｏｇｇｉｌｌ，Ａ．Ｈｅｇｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｐｏｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｌ．Ｇａｖｉｎ，Ｐ．Ｇｕｎｅｓｅｋａｒａｎ，Ｇ．Ｃｅｒｉｃ，Ｋ．Ｆｏｒｓｌｕｎｄ，Ｌ．Ｈｏｌｍ，Ｅ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０）Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ３８：Ｄ２１１−２２２に記載されたタンパク質ドメインファミリーの大きな集団であるＰｆａｍデータベースを用いることによる。各ファミリーは、複数の配列アラインメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）によって表示される。本明細書で提供するポリペプチドは、好ましくは、ＰｆａｍドメインＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ  ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）の内の１つ以上を含有する。１つの態様では、本明細書で提供するポリペプチドは、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ２Ｎ（ＰＦ０２８３７）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ（ＰＦ００７０３）、Ｇｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ  ２Ｃ（ＰＦ０２８３６）および細菌性Ｉｇ様ドメイン（第４群）（ＰＦ０７５３２）を含有する。
【０１９８】
１つの態様では、本明細書で使用するポリペプチドは、４〜９、例えば５〜８、例えば５．５〜７．５、例えば６．５〜７．５などのｐＨ範囲にわたって有用なトランスガラクトシル化活性を有する。
【０１９９】
本発明は、本明細書に定義したアミノ酸または本明細書に定義した特定の特性を有するポリペプチドとの所定の程度の配列同一性もしくは配列相同性を有するポリペプチドの使用を含む。本発明は、特に、下記に定義する配列番号１、２、３、４もしくは５またはそれらの相同体のいずれか１つとのある程度の配列同一性を有するポリペプチドの使用を含む。
【０２００】
相同性アミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドと比較して機能的トランスガラクトシル化活性を保持する、および／またはトランスガラクトシル化活性を増強するポリペプチドを提供する、および／またはコードするはずである。
【０２０１】
本発明の状況では、相同配列は主題配列と少なくとも６６％、７０％、７５％、７８％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である可能性があるアミノ酸配列を含むと考えられる。典型的には、相同体は、主題アミノ酸配列と同一活性部位などを含むであろう。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるが、本発明の状況では、相同性は配列同一性によって表現するのが好ましい。
【０２０２】
したがって、本発明はさらに、本明細書に定義したタンパク質もしくはポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列、特別には下記に定義する配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列の変異体、相同体および誘導体の使用を含む。
【０２０３】
下記に定義した配列番号１、２、３、４もしくは５の変異体、相同体および誘導体は、さらにサイレントな変化を生成し、結果として機能的に同等の物質を生じさせるアミノ酸残基の欠失、挿入もしくは置換もまた有する可能性がある。意図的なアミノ酸置換は、その物質の二次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる；正荷電アミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれる；ならびに類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を備えるアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
【０２０４】
本発明はさらに、発生する可能性がある、つまり同種置換、例えば塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性などの保存的置換（置換および交換は、本明細書ではどちらも既存のアミノ酸残基と代替残基との入れ替えを意味するために使用される）も含む。非保存的置換もまた、１クラスの残基からまた別のクラス、または非天然アミノ酸、例えばオルニチン（下記ではＺと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下ではＢと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以下ではＯと呼ぶ）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの包含を含むクラスの残基から発生する可能性がある。
【０２０５】
作成できる可能性がある保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、ヒドロキシルアミノ酸（セリン、トレオニン）、大きいアミノ酸（フェニルアラニンおよびトリプトファン）ならびに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン）のグループ内にある。
【０２０６】
１つの態様では、本発明において使用されるポリペプチド配列は、精製形にある。
【０２０７】
１つの態様では、本発明において使用されるポリペプチドもしくはタンパク質は、単離形にある。
【０２０８】
１つの態様では、本発明のポリペプチドは、組換え生成される。
【０２０９】
変異ポリペプチドには、配列番号１または２との所定のパーセント、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。
【０２１０】
変異ポリペプチドには、配列番号３、４または５との所定のパーセント、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる。
【０２１１】
１つの態様では、本明細書で使用されるポリペプチドは、本明細書では配列番号２２として示したビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５に含有されるトランスガラクトシラーゼをコードするヌクレオチド配列によってコードされる成熟ポリペプチドのアミノ酸配列との少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号１、２、３、４もしくは５に関して検討される配列同一性および官能性に関する全ての考察および制限は、これらのポリペプチドおよびヌクレオチドの配列同一性および官能性に必要な変更を加えて適用される。
【０２１２】
１つの態様では、主題アミノ酸配列は、配列番号１、２、３、４もしくは５であり、主題ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３である。
【０２１３】
１つの態様では、ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端から１つ以上（数個）のアミノ酸が欠失している断片であり、このときこの断片はトランスガラクトシル化活性を有する。
【０２１４】
１つの態様では、断片は、少なくとも５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０もしくは１，０００個のアミノ酸残基を含有する。
【０２１５】
また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、５００〜１，３００アミノ酸残基である。また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、６００〜１，３００アミノ酸である。また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、７００〜１，３００アミノ酸である。また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、８００〜１，３００アミノ酸である。また別の態様では、ポリペプチド変異体の長さは、８００〜１，３００アミノ酸である。
【０２１６】
宿主細胞中での多様体の発現を評価するために、アッセイは、発現されたタンパク質、対応するｍＲＮＡまたはβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。例えば、適切なアッセイとして、適切に標識されたハイブリダイジングプローブを使用する、ノーザンブロッティングおよびサザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）およびｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションが挙げられる。適切なアッセイは、試料中の活性を測定することも含む。多様体の活性の適切なアッセイとして、ＯＮＰＧをベースとするアッセイまたは反応混合物（例えば本明細書の方法および実施例で説明する反応混合物）中のグルコースを測定することが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１７】
配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチド変異体
１つの態様では、配列番号１、２、３、４もしくは５に比較して、例えば改良されたトランスガラクトシル化などの変化した特性を実行する１つ以上の位置で置換を有する配列番号１、２、３、４もしくは５の変異体が使用される。そのような変異ポリペプチドは、本文献においては便宜的に、「変異ポリペプチド」、「ポリペプチド変異体」または「変異体」とも呼ばれる。１つの態様では、本明細書に定義したポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドに比較して改良されたトランスガラクトシル化活性を有する。また別の態様では、本明細書に定義したポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドに比較して改良された反応速度を有する。
【０２１８】
本明細書で使用するポリペプチドおよび変異ポリペプチドは、トランスガラクトシル化活性を含む。
【０２１９】
１つの態様では、トランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比率は、３重量／重量％の初期ラクトース濃度を超える濃度などの３０分間の反応後には、少なくとも０．５、例えば少なくとも１、例えば少なくとも１．５または例えば少なくとも２である。
【０２２０】
１つの態様では、トランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比率は、３重量／重量％の初期ラクトース濃度を超える濃度などの３０分間の反応後に、少なくとも２．５、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１１もしくは例えば少なくとも１２である。
【０２２１】
１つの態様では、本明細書に定義したポリペプチドおよび変異体は、微生物起源に、特に糸状真菌もしくは酵母または細菌に由来する可能性がある。酵素は、例えば、Ａｇａｒｉｃｕｓ、例えばＡ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ；Ａｓｃｏｖａｇｉｎｏｓｐｏｒａ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、例えばＡ．ｎｉｇｅｒ，Ａ．ａｗａｍｏｒｉ，Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ，Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，Ａ．ｏｒｙｚａｅ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ；Ｃｈａｅｔｏｔｏｍａｓｔｉａ；Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ、例えばＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ；Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、例えばＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｋ．ｌａｃｔｉｓ；Ｍｕｃｏｒ、例えばＭ．ｊａｖａｎｉｃｕｓ，Ｍ．ｍｕｃｅｄｏ，Ｍ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、例えばＮ．ｃｒａｓｓａ；Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、例えばＲ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ；Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、例えばＲ．ａｒｒｈｉｚｕｓ，Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ；Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ、例えばＳ．ｌｉｂｅｒｔｉａｎａ；Ｔｏｒｕｌａ；Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ；Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、例えばＴ．ｒｕｂｒｕｍ；Ｗｈｅｔｚｅｌｉｎｉａ、例えばＷ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ、例えばＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂ．ｎｏｖａｌｉｓ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ，Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、例えばＢ．Ｉｏｎｇｕｍ，Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ，Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ；Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、例えばＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、例えばＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ；Ｄｉｐｌｏｄｉａ、例えばＤ．ｇｏｓｓｙｐｉｎａ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、例えばＥ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ  Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ，Ｅ．ｔａｒｄａ；Ｅｒｗｉｎｉａ、例えばＥ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えばＥ．ｃｏｌｉ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、例えばＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｍｉｒｉｏｃｏｃｃｕｍ；Ｍｙｒｏｔｈｅｓｉｕｍ；Ｍｕｃｏｒ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、例えばＮ．ｃｒａｓｓａ；Ｐｒｏｔｅｕｓ、例えばＰ．ｖｕｌｇａｒｉｓ；Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、例えばＰ．ｓｔｕａｒｔｉｉ；Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ、例えばＰｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ，Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、例えばＲ．ｔｏｒｑｕｅｓ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳ．ｌｉｑｕｅｆａｓｃｉｅｎｓ，Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ、例えばＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，ｅ．ｇ．．Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ，Ｓ．ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ，Ｓ．ｖｉｏｌｅｃｅｏｒｕｂｅｒ；Ｔｒａｍｅｔｅｓ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、例えばＴ．ｒｅｅｓｅｉ，Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ、例えばＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの菌株に由来する可能性がある。
【０２２２】
本明細書に定義したポリペプチドもしくは変異ポリペプチドを含む単離および／または精製ポリペプチドが提供される。１つの実施形態では、変異ポリペプチドは、ポリペプチド（配列番号１、２、３、４もしくは５）の成熟形である。１つの態様では、変異体には、Ｃ末端ドメインが含まれる。
【０２２３】
１つの態様では、本明細書に定義した変異ポリペプチドには、１〜約２５個の間のアミノ酸残基が配列番号１、２、３、４もしくは５と比較して付加されている、または欠失している変異体が含まれる。１つの態様では、本明細書に定義した変異ポリペプチドには、１〜２５個の間のアミノ酸残基が配列番号１、２、３、４もしくは５と比較して置換、付加されている、または欠失している変異体が含まれる。１つの態様では、変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列を有し、このとき１〜約２５個の間の任意の数のアミノ酸が置換されている。また別の態様では、変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列を有し、このとき３〜１２個の間の任意の数のアミノ酸が置換されている。また別の態様では、変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列を有し、このとき５〜９個の間の任意の数のアミノ酸が置換されている。
【０２２４】
１つの態様では配列番号１、２、３、４もしくは５の内の少なくとも２個、また別の態様では少なくとも３個、およびさらにまた別の態様では少なくとも５個のアミノ酸が置換されている。１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５を有する。１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、配列番号１、２、３、４もしくは５の配列を有するが、このときＮ末端における１０、例えば９、例えば８、例えば７、例えば６、例えば５、例えば４、例えば３、例えば２、例えば１個のアミノ酸が置換されている、および／または欠失している。
【０２２５】
酵素およびそれらの酵素変異体は、それらの核酸および一次ポリペプチド配列、三次元構造モデリングおよび／またはそれらの特異的活性によって特徴付けることができる。本明細書に定義したポリペプチドもしくはポリペプチド変異体の追加の特徴には、例えば、安定性、ｐＨ範囲、酸化安定性および熱安定性が含まれる。発現および酵素活性のレベルは、当業者には公知の標準的アッセイを使用すると評価できる。また別の態様では、変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５を備えるポリペプチドに比較して改良された性能特性、例えば高温、例えば６５〜８５℃で改良された安定性を示す。
【０２２６】
ポリペプチド変異体は、配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドとの少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を用いて本明細書に定義したように提供される。
【０２２７】
ヌクレオチド
１つの態様では、本発明は、超低ストリンジェンシー条件下、好ましくは低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中−高ストリンジェンシー条件下、いっそうより好ましくは高ストリンジェンシー条件下、および最も好ましくは超高ストリンジェンシー条件下で、ｉ）配列番号１、２、３、４もしくは５の成熟ポリペプチドをコードする配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に含まれる核酸配列；ｉｉ）ｉ）のｃＤＮＡ配列、またはｉｉｉ）ｉ）もしくはｉｉ）の相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる上述したトランスガラクトシル化活性を有する単離ポリペプチドを使用する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３の部分配列は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチドまたは好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含有する。さらに、部分配列は、ラクターゼ活性を有するポリペプチド断片をコードする可能性がある。
【０２２８】
配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３のヌクレオチド配列もしくはそれらの部分配列ならびに配列番号１、２、３、４もしくは５のアミノ酸配列もしくはそれらの断片は、当業者には周知の方法にしたがって様々な属もしくは種の菌株由来のトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定およびクローン化するための核酸プローブを設計するために使用できる。特に、そのようなプローブは、その中の対応する遺伝子を同定および単離するために、標準サウザンブロッティング手順にしたがって、問題の属もしくは種のゲノムもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用できる。そのようなプローブは、全配列より相当に短い可能性があるが、長さが少なくとも１４個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個および最も好ましくは少なくとも７０個のヌクレオチドでなければならない。しかし、核酸プローブは、長さが少なくとも１００個のヌクレオチドであるのが好ましい。例えば、核酸プローブは、長さが少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチドまたは最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドであってよい。いっそうより長いプローブ、長さが例えば少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも好ましくは７００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８００ヌクレオチドまたは最も好ましくは少なくとも９００ヌクレオチドである核酸プローブを使用できる。ＤＮＡプローブおよびＲＮＡプローブの両方を使用できる。これらのプローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチンもしくはアビジンを用いて）標識される。そのようなプローブは、本発明によって含まれる。
【０２２９】
このため、そのような他の生物から調製されたゲノムＤＮＡライブラリーは、上述したプローブとハイブリダイズする、およびラクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングすることができる。そのような他の生物からのゲノムもしくは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法または他の分離技術によって分離することができる。ライブラリー由来のＤＮＡもしくは分離ＤＮＡは、ニトロセルロースもしくは他の好適な担体材料上に移して固定化することができる。配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３もしくはそれらの部分配列と相同性であるクローンもしくはＤＮＡを同定するためには、サウザンブロットにおいて担体材料が使用される。
【０２３０】
本発明のためには、ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列が配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３に示したヌクレオチド配列、その相補鎖またはそれらの部分配列に、超低から超高ストリンジェンシー条件下で対応する標識核酸プローブにハイブリダイズすることを示している。これらの条件下で核酸プローブがそれにハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを使用して検出することができる。
【０２３１】
核酸プローブは、配列番号９、１０、１１、１２もしくは１３の成熟ポリペプチドコーディング領域であってよい。
【０２３２】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブに対しては、最適には１２〜２４時間の標準サウザンブロッティング手順にしたがって、超低〜超高ストリンジェンシー条件が５×のＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００ｇ／ｍＬの剪断および変性サケ精液ＤＮＡならびに超低および低ストリンジェンシーに対しては２５％のホルムアミド、中および中高ストリンジェンシーに対しては３５％のホルムアミドまたは高および超高ストリンジェンシーに対しては５０％のホルムアミドいずれか中の４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションであると定義されている。
【０２３３】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブに対しては、担体材料は、２×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、いっそうより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）および最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）で最終的にそれぞれ１５分間ずつ３回洗浄される。
【０２３４】
特定の実施形態では、洗浄は、０．２×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、いっそうより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）および最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）で実施される。また別の特定の実施形態では、洗浄は、０．１×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、いっそうより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）および最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）で実施される。
【０２３５】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブに対しては、ストリンジェンシー条件は、標準サウザンブロッティング手順にしたがって、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１×のデンハルト溶液、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰおよび０．２ｍｇ／ｍＬの酵母ＲＮＡ中で、ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ４８：１３９０）にしたがった計算を使用して計算Ｔｍより約５℃〜約１０℃下でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後洗浄として定義されている。長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブに対しては、担体材料は、１５分間にわたり６×のＳＣＣ＋０．１％のＳＤＳ中で１回および計算Ｔｍより約５℃〜約１０℃下で６×のＳＳＣを使用してそれぞれ１５分間ずつ２回洗浄される。
【０２３６】
塩含有ハイブリダイゼーション条件下では、有効Ｔｍは上首尾のハイブリダイゼーションのためにプローブとフィルター結合ＤＮＡとの間に必要とされる同一性の程度を制御するＴｍである。有効Ｔｍは、様々なストリンジェンシー条件下で２つのＤＮＡがハイブリダイズするために必要とされる同一性の程度を決定するために下記の式を使用して決定することができる。
【０２３７】
有効Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（ホルムアミドの比率）
（ｗｗｗ．ｎｄｓｕ．ｎｏｄａｋ．ｅｄｕ／ｉｎｓｔｒｕｃｔ／ｍｃｃｌｅａｎ／ｐｌｓｃ７３１／ｄｎａ／ｄｎａ６．ｈｔｍを参照されたい）
配列番号１０のＧ＋Ｃ含量は４２％であり、配列番号１１のＧ＋Ｃ含量は４４％である。中ストリンジェンシーに対しては、ホルムアミドは３５％であり、５×のＳＳＰＥに対するＮａ＋濃度は０．７５Ｍである。
【０２３８】
また別の重要な関係は、２つのＤＮＡの１％のミスマッチがＴｍを１．４℃低下させることである。４２℃の中ストリンジェンシー条件下で２つのＤＮＡがハイブリダイズするために必要とされる同一性の程度を決定するためには、下記の式が使用される：
相同性率（％）＝１００−［（有効Ｔｍ−ハイブリダイゼーション温度）／１．４］
（ｗｗｗ．ｎｄｓｕ．ｎｏｄａｋ．ｅｄｕ／ｉｎｓｔｒｕｃｔ／ｍｃｃｌｅａｎ／ｐｌｓｃ７３１／ｄｎａ／ｄｎａ６．ｈｔｍを参照されたい）
【０２３９】
変異核酸には、配列番号１、２、３、４もしくは５をコードする核酸との所定のパーセント、例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドをコードできる核酸が提供される。また別の態様では、本明細書に開示した核酸は、配列番号９、１０、１１、１２または１３と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である核酸配列を有する。
【０２４０】
本明細書に記載した核酸を含むプラスミドを使用できる。
【０２４１】
本明細書に記載した核酸を含む、または本明細書に記載したポリペプチドを発現できる発現ベクターを使用できる。
【０２４２】
本明細書に定義し、本明細書に規定したポリペプチド変異体のいずれかをコードする核酸に相補的な核酸が提供される。さらに、相補体にハイブリダイズすることができる核酸も提供される。また別の実施形態では、本明細書に記載した方法および組成物において使用するための配列は、合成配列である。それには、例えば酵母などの宿主生物内で発現するための最適なコドンを使用して作成された配列が含まれるがそれらに限定されない。
【０２４３】
本明細書に提供したポリペプチド変異体は、当技術分野において周知の手法にしたがって、合成的に、または宿主細胞内での組換え発現を通して生成することができる。１つの態様では、本明細書に開示したポリペプチドは、組換えポリペプチドである。本明細書に定義した発現ポリペプチド変異体は、任意選択的に使用前に単離される。
【０２４４】
また別の実施形態では、本明細書に定義したポリペプチド変異体は、発現後に精製される。ポリペプチド変異体の遺伝子修飾および組換え生産の方法は、例えば、米国特許第７，３７１，５５２号明細書、同第７，１６６，４５３号明細書；同第６，８９０，５７２号明細書；および同第６，６６７，０６５号明細書および米国公開公報特許第２００７／０１４１６９３号明細書；同第２００７／００７２２７０号明細書；同第２００７／００２０７３１号明細書；同第２００７／００２０７２７号明細書；同第２００６／００７３５８３号明細書；同第２００６／００１９３４７号明細書；同第２００６／００１８９９７号明細書；同第２００６／０００８８９０号明細書；同第２００６／０００８８８８号明細書；および同第２００５／０１３７１１１号明細書に記載されている。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、プライマー、ベクター、選択方法、宿主細胞、発現ポリペプチド変異体の精製および再構成ならびに酵素アッセイのために有用なバッファー、ｐＨ範囲、Ｃａ２＋濃度、基質濃度および酵素濃度を含む本明細書に定義したポリペプチド変異体の特性解析を含むこれらの開示の重要な教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４５】
配列番号１、２、３、４または５のタンパク質、または配列番号１、２、３、４もしくは５のタンパク質をコードする核酸との少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列をコードする核酸配列が提供される。１つの実施形態では、核酸配列は、配列番号９、１０、１１、１２または１３の核酸との少なくとも約６０％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【０２４６】
ベクター
１つの態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含むベクターを使用する。１つの態様では、細菌細胞がそのベクターを含む。一部の実施形態では、変異体をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物は、コーディング配列と機能的に連結した調節配列を含む発現ベクター内の宿主細胞に移される。ベクターは、真菌宿主細胞ゲノム内に統合して、宿主細胞内に導入されると複製できる任意のベクターであってよい。ミズーリ大学のＦＧＳＣ菌株カタログは、好適なベクターを列挙している。好適な発現ベクターおよび／または組込み型ベクターの追加の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＵＡＬ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１），ｐｐ．３９６−４２８；および米国特許第５，８７４，２７６号明細書に提供されている。典型的なベクターには、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８、ｐＵＣ１００およびｐＥＮＴＲ／Ｄ、ｐＤＯＮＴＭ２０１、ｐＤＯＮＲＴＭ２２１、ｐＥＮＴＲＴＭ、ｐＧＥＭ（登録商標）３ＺおよびｐＧＥＭ（登録商標）４Ｚが含まれる。細菌細胞中で使用するための典型には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での複製を許容するｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９ならびに例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属における複製を許容するｐＥ１９４が含まれる。
【０２４７】
一部の実施形態では、変異体をコードする核酸は、宿主細胞内での転写を可能にする好適なプロモーターに機能的に連結している。プロモーターは、宿主細胞にとって同種もしくは異種いずれかであるタンパク質をコードする遺伝子由来であってよい。プロモーターの好適な非限定的な例には、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２プロモーターが含まれる。１つの実施形態では、プロモーターは、宿主細胞にとって天然であるプロモーターである。例えば、Ｐ．サッカロフィラ（Ｐ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）が宿主である場合、プロモーターは天然Ｐ．サッカロフィラ（Ｐ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）プロモーターである。「誘導性プロモーター」は、環境的調節および発生的調節下で活性であるプロモーターである。また別の実施形態では、プロモーターは、宿主細胞にとって異種であるプロモーターである。
【０２４８】
一部の実施形態では、コーディング配列は、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列と機能的に連結している。また別の態様では、代表的なシグナルペプチドは、配列番号２７である。代表的なシグナルペプチドは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ前駆体の天然シグナル配列である配列番号９である。他の実施形態では、シグナル配列をコードするＤＮＡは、他の細胞外枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）前駆体由来のシグナル配列をコードするヌクレオチド配列で置換される。１つの実施形態では、シグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのすぐ上流およびフレーム内にある。シグナル配列は、宿主細胞と同一種から選択することができる。
【０２４９】
追加の実施形態では、真菌宿主細胞内に導入すべきＤＮＡ構築物もしくはベクターを含むシグナル配列およびプロモーター配列は同一起源に由来する。一部の実施形態では、発現ベクターはさらに、終止配列を含む。１つの実施形態では、終止配列およびプロモーター配列は、同一起源に由来する。また別の実施形態では、終止配列は、宿主細胞にとって同種である。
【０２５０】
一部の実施形態では、発現ベクターは選択可能なマーカーを含む。好適な選択可能なマーカーの例には、抗微生物剤、例えばハイグロマイシンもしくはフレオマイシンに耐性を付与するマーカーが含まれる。栄養選択的マーカーは、さらに好適であり、ａｍｄＳ、ａｒｇＢおよびｐｙｒ４が含まれる。１つの実施形態では、選択的マーカーは、酵素アセトアミダーゼをコードするａｍｄＳ遺伝子である：ａｍｄＳ遺伝子は、形質転換細胞が窒素源としてのアセトアミド上で増殖することを許容する。選択的マーカーとしてのＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子の使用は、Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５−４７９（１９８５）およびＰｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６１：１５５−１６４（１９８７）に記載されている。
【０２５１】
変異体をコードするポリヌクレオチドを備えるＤＮＡ構築物を含む好適な発現ベクターは、所定の宿主生物内で自律的に複製できる、または宿主のＤＮＡに組み込むことができる任意のベクターであってよい。一部の実施形態では、発現ベクターはプラスミドである。一部の実施形態では、遺伝子の発現を得るための２つのタイプの発現ベクターが企図されている。第１発現ベクターは、その中のプロモーター、コーディング領域およびターミネーター全部が発現対象の遺伝子を起源とするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子切断は、その独自の転写および翻訳調節配列の制御下で発現対象のドメインから離れるために望ましくないＤＮＡ配列を欠失させることによって入手される。第２のタイプの発現ベクターは、前組立てされ、高レベルの転写および選択可能なマーカーのために必要とされる配列を含有する。一部の実施形態では、遺伝子またはその一部に対するコーディング領域は、それが発現構築物およびターミネーター配列の転写制御下にあるようにこの汎用発現ベクター内に挿入される。一部の実施形態では、遺伝子もしくはその一部は、強力なｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入される。
【０２５２】
宿主／宿主細胞の発現
また別の態様では、本明細書に記載したプラスミドまたは本明細書に記載した発現ベクターを含む、好ましくはそれらを用いて形質転換された宿主細胞が使用される。
【０２５３】
また別の態様では、本明細書に記載したポリペプチドを発現できる細胞が使用される。
【０２５４】
１つの態様では、本明細書に記載した宿主細胞または本明細書に記載した細胞は、細菌細胞、真菌細胞もしくは酵母細胞である。
【０２５５】
また別の態様では、宿主細胞は、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属からなる群より選択される。
【０２５６】
また別の態様では、宿主細胞細胞は、ルミノコッカス・ハンセニイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からなる群から選択される。
【０２５７】
また別の実施形態では、好適な宿主細胞には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．ツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）もしくはＳ．ムリナス（Ｓ．ｍｕｒｉｎｕｓ）からなる群より選択されるグラム陽性細菌、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）もしくはシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）であるグラム陰性細菌が含まれる。１つの態様では、宿主細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ）もしくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。１つの態様では、宿主細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、発現タンパク質は下記でさらに詳述するように、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シグナル配列を含むように遺伝子組換えされる。
【０２５８】
一部の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１、２、３、４または５のポリペプチドとの少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を用いて本明細書に定義したポリペプチド変異体を発現するように遺伝子組換えされる。一部の実施形態では、本明細書に定義したポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４または５のタンパク質または配列番号１、２、３、４または５のタンパク質をコードする核酸との少なくとも約６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列をコードするであろう。１つの実施形態では、核酸配列は、配列番号９、１０、１１、１２または１３の核酸との少なくとも約６０％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【０２５９】
変異誘発
セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している宿主細胞またはこれらの酵素が本質的に不活性である宿主細胞を、組換え遺伝子操作技術を使用する遺伝子工学により、この宿主を変異誘発にかけることにより、または両方により得ることができる。本発明のセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼをコードする遺伝子の改変または不活性化は、親細胞を変異誘発にかけ、この親細胞と比べてこれらの酵素を発現する能力が低い変異細胞を選択することにより起こり得る。特異的であってもよいしランダムであってもよい変異誘発を、例えば、適切な物理的なもしくは化学的な変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、またはＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発（ＰＣＲ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）にかけることにより実施することができる。更に、この変異誘発を、これらの変異誘発剤の任意の組合せの使用により実施することができる。
【０２６０】
本目的に適した物理的なまたは化学的な変異誘発剤の例として、ガンマ線もしくは紫外（ＵＶ）線、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸およびヌクレオチド類似体が挙げられる。そのような薬剤を使用する場合、選択した変異誘発剤の存在下でおよび適切な条件下にて、変異誘発させる親細胞をインキュベートし、遺伝子の発現の低下を示す変異細胞を選択することにより、変異誘発を概して実施する。あるいは、そのような株を遺伝子技術を使用して単離することができ、例えば、ハイブリダイゼーションまたは交配、およびプロトプラスト融合または遺伝子多様性を誘発するためのあらゆるその他の古典的遺伝子技術を使用して単離することができる。その後、得られた、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している株を、これらの酵素の発現レベルをモニタリングすることにより選択することができる。任意選択で、その後、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している株を、宿主細胞中で発現させる目的の所与の遺伝子の発現レベルを測定することにより選択する。酵素活性が低下している株の選択を、培養ブロス中で、培養上清中で、透過細胞中でまたは細胞溶解物中で酵素活性を直接測定することより行なってもよい。
【０２６１】
組換えＤＮＡ技術
あるいは、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性および任意選択でアミラーゼ活性の量が低減している宿主細胞またはこれらの酵素が本質的に不活性である宿主細胞を、組換えＤＮＡ技術を使用して構築してもよい。例えば一段階遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的変異誘発、欠失、ＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡ等の遺伝子不活性化用のまたは遺伝子破壊用のいくつかの技術が当分野で説明されており、これら全てを使用して、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性が低下している工業的製造株を得るために、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性の合成を低減させる、阻害するまたは妨げることができる。また、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼの遺伝子の発現を指示する制御配列の改変によるセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼの不活性化も本発明の一部である。この一例は、遺伝子破壊によるプロモーター活性の低下である。好ましくはセルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性をコードする遺伝子を妨げることにより、より好ましくは酵素活性をコードする遺伝子にマーカー遺伝子を挿入することにより、最も好ましくは、酵素コード領域の一部または全てをゲノムから除去することにより、現代の遺伝子改変技術を使用して、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している組換え株を得ることができる。そのような遺伝子不活性を実施する方法が多くの異なる微生物に関して説明されており、当業者に知られている（即ち欧州特許第３５７１２７号明細書を参照されたい）。これにより、変異細胞中でのセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼの発現を低減させることができる、または消失させることができる。これらの技術を使用して改変される宿主株によるが、この手順を数回繰り返して、セルラーゼコード配列、マンナナーゼコード配列およびペクチナーゼコード配列ならびに任意選択でアミラーゼコード配列の全てまたは大部分を除去することができる。
【０２６２】
セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼ等の宿主遺伝子の改変または不活性化を、この遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を使用する、確立されたアンチセンス技術により実施してもよい。より具体的には、この遺伝子の発現を、このヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することにより低減させることができ、または消失させることでき、この相補的なヌクレオチド配列は細胞中で転写され得、この細胞中で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。そのため、相補的アンチセンスヌクレオチド配列をｍＲＮＡにハイブリダイズさせることを可能にする条件下では、翻訳されるタンパク質の量は低減される、またはなくなる。アンチセンスＲＮＡの発現がＮｇｉａｍら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：７７５−７８２，２０００）およびＺｒｅｎｎｅｒら（Ｐｌａｎｔａ  １９０：２４７−２５２，１９９３）に例示されている。
【０２６３】
宿主遺伝子の改変、下方制御または不活性化をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術により得てもよい（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｌｅｔｔ．２３７：３１７−３２４，２００４）。より具体的には、糸状真菌細胞による遺伝子の発現を、発現が影響を受けるヌクレオチド配列の同一のセンス部分およびアンチセンス部分を、間にヌクレオチドスペーサーを挟んで一列にクローニングし、発現ベクター中に挿入し、この発現ベクターを細胞（この細胞では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が転写され、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる、より短いｓｉＲＮＡへとプロセシングされ得る）中に導入することにより、低減させることができる、または消失させることができる。ｄｓＲＮＡが転写された後、小さい（２１〜２３個の）ヌクレオチドｓｉＲＮＡ断片の形成により、影響を受けるｍＲＮＡの標的分解が起こり得る。特定のｍＲＮＡの消失は様々な程度であることができる。国際公開第２００５／０５６７２号パンフレットおよび国際公開第２００５／０２６３５６号パンフレットで説明されているＲＮＡ干渉技術を使用して、宿主遺伝子の改変、下方制御または不活性化を行なうことができる。
【０２６４】
上記で説明した方法のいずれかにより改変されており、または不活性化されており、先に定義したのと同じアッセイを使用して測定した場合に同一条件下で培養した親細胞と比べて生じるセルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性が低い、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している宿主細胞は、別のヌクレオチド配列を有してもよい。
【０２６５】
古典的遺伝子技術または組換えＤＮＡ技術により単離されているまたは構築されている、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性および任意選択でアミラーゼ活性が低下しているそのような工業的製造株を、最終製品が食物繊維を含むことを必要とする関連工業プロセスに使用することができる。好ましくは、この株を、トランスガラクトシル化活性を有する、工業的に関連する酵素の製造に使用する。より好ましくは、この株を、食品工業で使用する酵素の製造に使用し、更により好ましくは、この酵素を乳製品の加工で使用する。最も好ましくは、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性が低下しているそのような工業的製造株を、ラクトースからのＧＯＳの製造に使用する。
【０２６６】
好ましくは、本発明のセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している宿主細胞は、あるモデル反応（実施例２、３または４での実験情報を参照されたい）で検出する場合に、５０％未満の検出可能な細胞内のまたは細胞外のセルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有する株である。より好ましくは、本発明のセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している株は、５０％未満のセルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有する株である。より好ましくは、本発明のセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している株は、あるモデル反応で検出する場合に、この株が由来する宿主細胞のセルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性の２５％未満であり、好ましくは１０％未満であり、より好ましくは５％未満であり、より好ましくは１％未満であるセルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性を有する株であり、最も好ましくは、本発明の欠乏宿主細胞中ではセルラーゼ活性、マンナナーゼ活性およびペクチナーゼ活性ならびに任意選択でアミラーゼ活性が検出不能である。
【０２６７】
ポリペプチド検出用の多種多様なシステムが当業者に知られている。検出システムとして、ポリペプチドまたは酵素活性の検出用のあらゆる可能なアッセイが挙げられる。例えば、このアッセイシステムとして、比色分析、光測定、蛍光測定、比濁分析、粘度測定、免疫学、生物学、クロマトグラフに基づくアッセイおよびその他の利用可能なアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６８】
好ましくは、製造されたポリペプチドが酵素である場合、あるモデル反応（実施例２、３または４を参照されたい）でのこの酵素の活性の測定により、製造された活性酵素の量を決定する。
【０２６９】
更に好ましい実施形態によれば、本発明のセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している宿主細胞は、この株が、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現構築物で形質転換されている場合、前記株は、この株が由来する野生型株もセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している宿主細胞と同じ発現構築物で形質転換される際にこの野生型株が同じ培養条件下で産生するであろうポリペプチドの量を少なくとも産生するという事実を特徴とする。
【０２７０】
好ましくは、本発明のセルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している株は、同じ培養条件下で、この株が由来する野生型株と比べてトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを同量または多く産生する株である。より好ましくは、セルラーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼならびに任意選択でアミラーゼが欠乏している株は、同じ培養条件下で、この株が由来する野生型と比べてこの指定のポリペプチドを多く産生する。
【０２７１】
トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドの製造
更に別の実施形態によれば、本発明は、セルラーゼ活性、マンナナーゼ活性、ペクチナーゼ活性および／またはアミラーゼ活性が欠乏している宿主細胞中でヌクレオチド配列を転写する方法であって、転写される配列が、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードし、この方法が、
（ａ）（ｉ）プロモーター、（ｉｖ）このポリペプチドコードする下流ヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）翻訳停止シグナルおよび（ｉｖ）転写停止シグナルを含む本発明の宿主細胞を培養培地中で培養すること、
（ｂ）この宿主細胞中でこのポリペプチドを発現させること、ならびに
（ｃ）任意選択で、この培養培地またはこの宿主細胞からこのポリペプチドを回収すること
を含む、方法に関する。
【０２７２】
この欠乏株を、好ましくは本発明の方法に従って製造する。この欠乏株を、当分野で既知の方法を使用して、所望のポリペプチドの産生に適した栄養培地中で増殖させることができる、または維持することができる。例えば、適切な培地中でならびにポリペプチドの発現および／または単離を可能にする条件下で、細胞を固体基材上に蒔いてもよく、フラスコ中で振盪させてもよく、実験室用のまたは工業用の発酵槽中において小規模または大規模の発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体式の発酵等）で培養してもよい。当分野で既知の方法を使用して、炭素源および窒素源ならびに無機塩を含む適切な栄養培地中で培養を行なう（例えばＢｅｎｎｅｔｔ  ＆  ＬａＳｕｒｅ，ｅｄｓ．，Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＣＡ，１９９１を参照されたい）。適切な培地は商業的供給業者から入手可能である、または（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中で）公開されている組成物を使用して適切な培養を調製してもよい。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、この培地からポリペプチドを直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞溶解物からポリペプチドを回収することができる。
【０２７３】
結果として生じるポリペプチドを、当分野で既知の方法により単離することができる。例えば、このポリペプチドを、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿が挙げられるがこれらに限定されない従来の方法により栄養培地から単離することができる。次いで、単離したポリペプチドを、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマト分画もしくはサイズ排除）、電気泳動（例えば予備等電点電気泳動）、溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（例えば、アセトンもしくは硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出（例えば、カオトロープ、塩もしくはｐＨ）が挙げられるがこれらに限定されない当分野で既知の様々な方法により更に精製することができる。例えばＪａｎｓｏｎ  ＆  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｓ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい。
【０２７４】
このポリペプチドを、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドに特異的である当分野で既知の方法を使用して検出することができる。この検出方法として、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、酵素基質の消失またはＳＤＳ−ＰＡＧＥを挙げることができる。例えば、酵素アッセイを使用してポリペプチドの活性を測定することができる。多くの酵素に関して酵素活性を測定するための方法が当分野で知られている。
【０２７５】
ポリペプチドを製造する方法
更なる態様では、本明細書で説明するポリペプチドを発現させる方法は、本明細書で説明する宿主細胞または細胞を得ること、およびこの細胞または宿主細胞からトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現させること、ならびに任意選択で、このポリペプチドを精製することを含む。そのようなポリペプチドを本発明で使用することができる。
【０２７６】
宿主細胞の形質転換、発現および培養
ＤＮＡ構築物またはベクターの宿主細胞中への導入として、形質転換；電気穿孔；核微量注入；形質導入；形質移入、例えばリポフェクション媒介性のおよびＤＥＡＥ−デキストリン媒介性の形質移入；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション；ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイル（ＤＮＡ−ｃｏａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）による高速衝撃（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；ならびにプロトプラスト融合等の技術が挙げられる。一般的な形質転換技術が当分野で知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），上記参照，ｃｈａｐｔｅｒ  ９、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），上記参照およびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６（１９８９）を参照されたい。
【０２７７】
当分野で既知の方法を使用して形質転換体を選択することができる。
【０２７８】
ポリペプチドおよびポリペプチド組成物を固定化する方法および製剤化する方法
当分野で既知の方法に従ってポリペプチド組成物を調製することができ、このポリペプチド組成物は液体組成物の形態であってもよいし乾燥組成物の形態であってもよい。例えば、ポリペプチド組成物は顆粒状の形態であってもよいし微顆粒状の形態であってもよい。この組成物に含めるポリペプチドを、当分野で既知の方法に従って安定化させることができる。
【０２７９】
用途
下記に、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド組成物の好ましい使用の例を示す。
【０２８０】
一態様では、本明細書で開示するのは、ラクトースを含む基質を本明細書で説明するポリペプチドまたはポリペプチド組成物で処理することにより食品を製造する方法である。
【０２８１】
一態様では、本明細書で開示するのは、ラクトースを含む乳ベースの基質を本明細書で説明するポリペプチドまたはポリペプチド組成物で処理することにより乳製品を製造する方法である。
【０２８２】
一態様では、このラクトースを含む基質を加水分解ベータ−ガラクトシダーゼで更に処理する。
【０２８３】
本発明に従って調製した食品成分の形態等の酵素調製物は、用途および／または適用の様式および／または投与の様式に応じて、溶液の形態であってもよいし固体としての形態であってもよい。固体形態は、乾燥酵素粉末または顆粒状酵素のいずれかであることができる。
【０２８４】
乾燥酵素製剤の例として、噴霧乾燥製品、ミキサー造粒製品、層状製品（例えば流動床顆粒）、押し出し顆粒またはペレット化顆粒、小球化製品、凍結乾燥製品が挙げられる。
【０２８５】
本発明に従って調製した食品成分の形態等の酵素調製物は、用途および／または適用の様式および／または投与の様式に応じて、溶液の形態であってもよいし固体としての形態であってもよい。固体形態は、乾燥酵素粉末または顆粒状酵素のいずれかであることができる。
【０２８６】
１つの態様では、本明細書に記載した細胞またはポリペプチドもしくはポリペプチド組成物を含む組成物、好ましくは食品組成物、より好ましくは乳製品が提供される。
【０２８７】
さらに、本明細書には、配列番号２２との少なくとも７０重量／重量％、例えば７２重量／重量％、７４重量／重量％、７４重量／重量％、７８重量／重量％、８０重量／重量％、８２重量／重量％、８４重量／重量％、８６重量／重量％、８８重量／重量％、９０重量／重量％の配列同一性を有する組成物中のポリペプチドの総量に基づいて本明細書に開示した少なくとも５重量／重量％、例えば約１０重量／重量％、１５重量／重量％、２０重量／重量％、２５重量／重量％、３０重量／重量％、３５重量／重量％、４０重量／重量％、４５重量／重量％、５０重量／重量％の１つ以上のポリペプチドを含む組成物が開示される。これは、当業者には公知の下記の技術を使用することによって評価することができる。評価対象のサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥを受けさせられ、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎシステムなどのタンパク質定量のために適切な染料を使用して可視化される。ゲルは、次に例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎシステムなどの適切な密度計スキャナーを使用してスキャンされ、結果として生じた画像がダイナミックレンジ内にあることが確証される。配列番号８に由来する任意の変異体／断片に対応するバンドが定量され、ポリペプチドのパーセンテージは：問題のポリペプチドの百分率＝問題のポリペプチド／（トランスガラクトシル化活性を示す全ポリペプチドの合計）＊１００として計算される。組成物中の配列番号８に由来するポリペプチド変異体／断片の総数は、当業者には公知の方法によってポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによって配列番号８に由来する断片を検出することによって決定できる。
【０２８８】
１つの態様では、本発明による組成物は、配列番号１、２、３、４および５からなるポリペプチドからなる群から選択された１つ以上のポリペプチドを含む。また別の態様では、本組成物は、配列番号１、２および３からなるポリペプチドからなる群から選択された１つ以上のポリペプチドを含む。さらにまた別の態様では、本組成物は、配列番号１および２からなるポリペプチドからなる群から選択された１つ以上のポリペプチドを含む。
【０２８９】
１つの態様では、本発明は、本発明による酵素錯体、酵素担体および任意選択的に安定剤および／または防腐剤を含む酵素錯体調製物を提供する。
【０２９０】
本発明の更なる態様では、酵素担体は、グリセロールまたは水からなる群から選択される。一実施形態では、酵素担体はポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールまたはソルビトール）を含まない。
【０２９１】
更なる態様では、本調製物／組成物は安定剤を含む。一態様では、この安定剤は、無機塩、ポリオール、糖およびこれらの組合せからなる群から選択される。一態様では、この安定剤は塩化カリウム等の無機塩である。別の態様では、ポリオールは、グリセロール、プロピレングリコールまたはソルビトールである。別の態様では、安定剤はポリオールではなく、例えばグリセロール、プロピレングリコールまたはソルビトールではない。更に別の態様では、糖は小分子炭水化物であり、具体的にはグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびサッカロース等のいくつかの甘味性の糖のいずれかである。
【０２９２】
更に別の態様では、本調製物は防腐剤を含む。一態様では、この防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンゾエート、ソルベートもしくはその他の食品に認可された防腐剤またはこれらの混合物である。
【０２９３】
本発明の方法を、固定化された酵素、例えば固定化されたラクターゼまたはその他のガラクトオリゴ糖産生酵素で実行することができる。この酵素を、あらゆる有機支持体または無機支持体に固定化することができる。例示的な無機支持体として、アルミナ、セライト、Ｄｏｗｅｘ−１−クロライド、ガラスビーズおよびシリカゲルが挙げられる。例示的な有機支持体として、ＤＥＡＥ−セルロース、アルギン酸ヒドロゲルもしくはアルギン酸ビーズまたは等価物が挙げられる。本発明の様々な態様では、ラクターゼの固定化を、無機支持体上への物理的吸着により最適化することができる。本発明の実行に使用する酵素を、水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液およびリン酸緩衝溶液等の様々な媒体中で固定化することができる。酵素をあらゆるタイプの基材に固定化することができ、例えばフィルタ、線維、カラム、ビーズ、コロイド、ゲル、ヒドロゲル、メッシュおよび同類のものに固定化することができる。
【０２９４】
一態様では、ラクトースを含む乳ベースの基質を本明細書で説明するポリペプチドまたはポリペプチド組成物で処理することにより乳製品を製造する方法が提供される。更なる態様では、ラクトースを含む乳ベースの基質を１５分の反応後に６０％超の、例えば７０％超、例えば７５％超の相対トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドで処理することにより乳製品を製造する方法が提供される。一態様では、この相対トランスガラクトシル化活性は３０分の反応後に３超である。更なる態様では、相対トランスガラクトシル化活性は３０分の反応後に６超である。更なる態様では、相対トランスガラクトシル化活性は３０分の反応後に１２超である。一態様では、本明細書で説明するポリペプチドまたはポリペプチド組成物による処理を酵素の活性に最適な温度で行なう方法が提供される。更なる態様では、このポリペプチドまたはポリペプチド組成物を０．０１〜１０００ｐｐｍの濃度で乳ベースの基質に添加する。更なる態様では、このポリペプチドまたはポリペプチド組成物を０．１〜１００ｐｐｍの濃度で乳ベースの基質に添加する。更なる態様では、このポリペプチドまたはポリペプチド組成物を１〜１０ｐｐｍの濃度で乳ベースの基質に添加する。一態様では、微生物により乳製品等の基質を発酵させることを更に含む方法が提供される。更なる態様では、この乳製品はヨーグルトである。更なる態様では、このポリペプチドまたはポリペプチド組成物および微生物による処理を本質的に同時に実施する。一態様では、このポリペプチドまたはポリペプチドおよび微生物を、本質的に同時に乳ベースの基質に添加する。
【０２９５】
一態様では、本明細書で説明する細胞またはポリペプチドまたはポリペプチド組成物を含む乳製品が提供される。一態様では、本明細書で定義するポリペプチドまたはポリペプチド組成物を０．０１〜１０００ｐｐｍの濃度で添加する。
【０２９６】
一態様では、本明細書で定義するポリペプチドまたはポリペプチド組成物によりｉｎ  ｓｉｔｕで形成されたＧＯＳを含む乳製品が提供される。一態様では、本明細書で定義する細胞を含む乳製品が提供される。
【０２９７】
本明細書に記載した乳製品は、例えば、スキムミルク、低脂肪乳、全乳、クリーム、ＵＨＴ乳、延長された貯蔵寿命を有するミルク、発酵乳製品、チーズ、ヨーグルト、バター、デイリースプレッド、バターミルク、酸性化ミルク飲料、サワークリーム、ホエイベース飲料、アイスクリーム、コンデンスミルク、加糖練乳もしくはフレーバードミルク飲料であってよい。乳製品は、当技術分野において公知の任意の方法によって製造できる。
【０２９８】
乳製品は、追加して、非ミルク成分、例えば植物性成分、例えば植物油、植物性タンパク質および／または植物性炭水化物を含むことができる。乳製品は、さらに添加物、例えば酵素、矯味剤、微生物培養、例えばプロバイオティクス培養、塩、甘味料、糖、酸、果実、果汁または当技術分野において乳製品の成分もしくは添加物として公知の任意の他の成分を含むことができる。
【０２９９】
本発明の１つの実施形態では、１つ以上のミルク成分および／またはミルク分画は、乳製品の少なくとも５０重量／重量％、例えば少なくとも７０重量／重量％、例えば少なくとも８０重量／重量％、好ましくは少なくとも９０重量／重量％を占める。
【０３００】
本発明の１つの実施形態では、トランスガラクトシル化活性を有する本明細書に定義した酵素を用いて処理されている１つ以上のミルクベース基質は、乳製品の少なくとも５０重量／重量％、例えば少なくとも７０重量／重量％、例えば少なくとも８０重量／重量％、好ましくは少なくとも９０重量／重量％を占める。
【０３０１】
本発明の１つの実施形態では、乳製品は、予備製造ガラクトオリゴ糖の添加によって強化されていない乳製品である。
【０３０２】
本発明の１つの実施形態では、ポリペプチド処理ミルクベース基質は、乳製品中の１つの成分として使用される前には乾燥させられない。
【０３０３】
本発明の１つの実施形態では、乳製品は、アイスクリームである。本発明の状況では、アイスクリームは、任意の種類のアイスクリーム、例えば高脂肪アイスクリーム、低脂肪アイスクリームまたはヨーグルトもしくは他の発酵乳製品をベースとするアイスクリームであってよい。アイスクリームは、当技術分野において公知の任意の方法によって製造できる。
【０３０４】
本発明の１つの実施形態では、乳製品は、ミルクもしくはコンデンスミルクである。
【０３０５】
本発明の１つの実施形態では、乳製品は、ＵＨＴ乳である。本発明の状況におけるＵＨＴ乳は、細菌胞子を含む全微生物を殺滅することが意図される滅菌手順を受けているミルクである。ＵＨＴ（超高温）処理は、例えば、１３０℃で３０秒間の熱処理または１４５℃での１秒間の熱処理であってよい。
【０３０６】
本発明の１つの好ましい実施形態では、乳製品は、ＥＳＬ乳である。本発明の状況におけるＥＳＬ乳は、精密濾過および／または熱処理に起因して延長された貯蔵寿命を有し、２〜５℃での貯蔵寿命で、少なくとも１５日間、好ましくは少なくとも２０日間にわたり鮮度を維持することができるミルクである。
【０３０７】
本発明のまた別の好ましい実施形態では、乳製品は、発酵乳製品、例えばヨーグルトである。
【０３０８】
大多数の発酵乳製品のために使用される微生物は、一般に乳酸菌と呼ばれる細菌の群から選択される。本明細書で使用する用語「乳酸菌」は、糖を発酵させて主として生成される酸としての乳酸、酢酸およびプロピオン酸を含む酸を生成するグラム陽性菌、微好気性菌もしくは嫌気性菌を指定する。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ロイコノストック種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．）、シュードロイコノストック種（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．）、ペプチドコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ブレビバクテリウム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）およびプロピオニバクテリウム種（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）を含むラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目内で見いだされる。さらに、嫌気性菌、単独もしくは乳酸菌と組み合わせて食品培養として頻回に使用されるビフィドバクテリア、すなわちビフィドバクテリウム種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）に属する乳酸産生菌は、一般に乳酸菌の群に含まれる。
【０３０９】
乳酸菌は、通常は、バルクスターター増殖のための冷凍もしくはフリーズドライ培養として、または発酵乳製品を製造するための発酵容器内もしくはバット内への直接接種のために企図されたいわゆる「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｖａｔ  Ｓｅｔ」（ＤＶＳ）培養としてのいずれかで乳業に供給される。そのような培養は、一般に、「スターター培養物」もしくは「スターター」と呼ばれる。
【０３１０】
乳酸菌の通例使用されるスターター培養物菌株は、一般に約３０℃の最適増殖温度を有する中温性生物および約４０〜４５℃の範囲内の最適増殖温度を有する高温性生物に分けられる。中温性群に属する典型的な生物には、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス亜種クレモリス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、シュードロイコノストック・メセンテロイデス亜種クレモリス（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス次亜種ジアセチルラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ）およびラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）が含まれる。高温性乳酸菌種には、例として、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が含まれる。さらに、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）を含むビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する嫌気性細菌も通例は乳製品スターター培養物として使用され、一般に乳酸菌の群に含まれる。さらに、プロピオニバクテリウムの種は、特にチーズの製造における乳製品スターター培養物として使用される。さらに、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する生物は、通例は食品スターター培養物として使用される。
【０３１１】
微生物スターター培養物の別の群は、特に所定のタイプのチーズおよび飲料の製造において使用される酵母培養物および糸状菌の培養物を含む真菌培養物である。真菌の例には、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カンディダム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリクム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、トルラ・ケフィア（Ｔｏｒｕｌａ  ｋｅｆｉｒ）、サッカロミセス・ケフィア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｅｆｉｒ）およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。
【０３１２】
本発明の１つの実施形態では、ミルクベース基質の発酵のために使用される微生物は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）またはストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）である。
【０３１３】
本発明の方法において使用できる発酵工程は当技術分野において周知であり、当業者であれば、例えば温度、酸素、微生物の量および特性、例えば炭水化物、香味料、鉱物、酵素などの添加物および処理時間などを好適な工程条件を選択する方法を知っているであろう。明らかに、発酵条件は、本発明の達成を支持できるように選択される。
【０３１４】
発酵の結果として、ミルクベース基質のｐＨが低下させられるであろう。本発明の発酵乳製品のｐＨは、３．５〜６の範囲内、例えば３．５〜５の範囲内、好ましくは３．８〜４．８の範囲内であってよい。
【０３１５】
一態様では、オリゴ糖を製造するためにポリペプチドまたはポリペプチド組成物を使用する方法または上述した細胞型のいずれか１つまたは複数を使用する方法が提供される。このオリゴ糖は、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、乳果オリゴ糖およびキシロオリゴ糖を含むがこれらに限定されない。
【０３１６】
本発明の一実施形態では、ポリペプチドを発現する細胞を例えばラクツロース、トレハロース、ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトースまたはセロビオース等の二糖基質を含む培地中でインキュベートすることにより、オリゴ糖を産生させる。このインキュベーションを、オリゴ糖が産生される条件下で行なう。この細胞は、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、栄養補助食品およびプロバイオティック食品（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｃｏｍｅｓｔｉｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）からなる群から選択される製品の一部であってもよい。あるいは、このオリゴ糖を回収し、その後、目的の製品の調製前後にこの製品に添加することができる。
【０３１７】
１つの態様では、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、栄養補助食品およびプロバイオティクス食用製品からなる群から選択される生成物を製造するための本明細書に開示した細胞の使用が提供される。
【０３１８】
１つの態様では、本明細書に記載したポリペプチドまたはポリペプチド組成物は、チーズ製品を調製するため、およびチーズ製品を製造するための方法において使用できる。チーズ製品は、例えば、クリームチーズ、カッテージチーズおよびプロセスチーズからなる群から選択することができる。ポリペプチドまたはポリペプチド組成物を加えることによって、チーズは有意に増加したレベルのガラクトオリゴ糖および低下したレベルのラクトースを含有することができる。１つの態様では、最終チーズ製品中のラクトースレベルは、少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％およびより好ましくは少なくとも約７５％まで低下させることができる。ポリペプチドまたはポリペプチド組成物は、チーズ製品中のラクトースを大多数のラクトース不耐性個体が許容できる量である一食当たり約１ｇ未満へ減少させるために使用できる。
【０３１９】
本明細書に提供したチーズ製品は、増加した可溶性繊維含量、減少したカロリー含量、優れた官能特性、改良された質感および香味料を有する栄養強化チーズ製品である。さらに、本明細書に記載したポリペプチドは、ＧＯＳがラクトースもしくはその加水分解生成物よりはるかに緩徐に吸収されるため、チーズ製品の血糖インデックスを低下させることができる。最後に、ポリペプチドまたはポリペプチド組成物は、ＧＯＳが驚くべきことにクリームチーズ製品に改良された質感を提供し、そこで安定剤の使用の減少を許容するので、または離漿を生じずに増加した含水量を許容することにより、チーズ製品、特にクリームチーズ製品の製造コストを減少させることができる。
【０３２０】
また別の態様では、本明細書に記載したポリペプチドまたはポリペプチド組成物および炭水化物基質を含む組成物が提供される。また別の態様では、炭水化物基質は、二糖である。また別の態様では、二糖は、例えばラクツロース、トレハロース、ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトースもしくはセロビオースである。さらにまた別の態様では、炭水化物基質は、ラクトースである。組成物は、オリゴ糖が生成されるように調製される。本明細書に記載したポリペプチドは、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、栄養補助食品およびプロバイオティクス食用製品からなる群から選択される製品の一部であってよい。１つの態様では、本明細書に記載したポリペプチドおよび安定剤を含む組成物が提供される。安定剤の例は、例えば、ポリオール、例えば、グリセロールもしくはプロピレングリコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸またはホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）である。
【０３２１】
一態様では、ガラクトオリゴ糖を製造するための、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドもしくはポリペプチド組成物または本明細書で開示する細胞の使用が提供される。一態様では、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、栄養補助食品およびプロバイオティック食品からなる群から選択される製品の一部とするガラクトオリゴ糖を製造するための、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドもしくはポリペプチド組成物または本明細書で開示する細胞の使用が提供される。一態様では、この製品はヨーグルト、チーズまたは発酵乳製品である。一態様では、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を増強すべくガラクトオリゴ糖を製造するための、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドもしくはポリペプチド組成物または本明細書で開示する細胞の使用が提供される。一態様では、混合培養発酵でのビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を増強すべくガラクトオリゴ糖を製造するための、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドもしくはポリペプチド組成物または本明細書で開示する細胞の使用が提供される。
【０３２２】
一態様では、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドまたはポリペプチド組成物を製造する方法であって、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で適切な培養培地中において本明細書で開示する細胞を培養すること、および結果として生じるポリペプチドを培養物から回収することを含む方法が提供される。ガラクトオリゴ糖を製造する方法であって、本明細書で開示するポリペプチドもしくはポリペプチド組成物または本明細書で開示する細胞と、ラクトースを含む乳ベースの溶液とを接触させることを含む方法が提供される。
【０３２３】
オリゴ糖の添加により、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のみまたは混合培養物中のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のいずれかの増殖を増強することができる。
【０３２４】
ミルク製品のラクトースを単糖もしくはＧＯＳへ転換させる酵素による処理は、数種の利点を有する。第一に、この製品は、さもなければ例えば鼓腸や下痢などの症状を示すであろう乳糖不耐性を有する人々が摂取することができる。第二に、ラクターゼを用いて処理された乳製品は、グルコースおよびガラクトースの認識される甘味がラクトースに比較して高いために、類似の未処理製品より高い甘味を有するであろう。この効果は、最終製品の高甘味が望ましく、摂取される製品中の炭水化物の正味の減少が可能になる、例えばヨーグルトやアイスクリームなどの用途にとっては特に興味深い。第３に、アイスクリーム製造では、ラクトース分子がラクトースの相対的低溶解度のために結晶化するザラザラ化（ｓａｎｄｉｎｅｓｓ）と呼ばれる現象がしばしば見られる。ラクトースが単糖もしくはＧＯＳに転換されると、アイスクリームの口の中での感覚は未処理製品に比較してはるかに改善される。ラクトース結晶化に起因する砂状感覚の存在を排除することができ、脱脂粉乳を乳清粉末と取り替えることによって原料コストを低下させることができる。酵素処理の主要な効果は、甘味の増加であった。
【０３２５】
一態様では、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドまたはポリペプチド組成物を、その他の酵素、例えばプロテアーゼ（例えばキモシンまたはレンニン）、リパーゼ（例えばホスホリパーゼ）、アミラーゼ、トランスフェラーゼおよびラクターゼと一緒に使用することができる。一態様では、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドをラクターゼと一緒に使用することができる。このことは、特に低ラクトースレベルでの本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドによる処理後に残留ラクトースを低減させることが望ましい場合に、特に有用であることができる。一実施形態では、この酵素は細菌由来のラクターゼであり、例えばビフィドバクテリアセアエ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科由来のラクターゼであり、例えば特に国際公開第２００９／０７１５３９号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１８２６８６号パンフレットで説明されているラクターゼ等のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のラクターゼである。
【実施例】
【０３２６】
実施例１−本発明に係る宿主細胞の構築
この実施例の宿主細胞はＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する。
【０３２７】
ａｍｙＥアルファ−アミラーゼ遺伝子の除去：組換えＤＮＡ技術により、野生型遺伝子（ａｍｙＥ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成した欠失をＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に導入した。活性およびサザンブロットによりａｍｙＥ欠失をモニタリングした。この宿主株中には異種ＤＮＡが残存していなかった。
【０３２８】
スペクチノマイシンマーカーによるｂｇｌＣエンドグルカナーゼ遺伝子の置き換え：ｂｇｌＣ遺伝子を欠失させるために、ｃｒｅ−ｌｏｘ法を用いる戦略を用いた。上流および下流のｂｇｌＣ配列をクローニングし、（欠失させる）中央部分を、形質転換での選択を可能にするｌｏｘＰ−スペクチノマイシンカセットで置き換えた。このスペクチノマイシンを選択する構築物でＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を形質転換させ、クローニングした多様体でゲノムｇｂｌＣ遺伝子を置き換えた。エンドグルカナーゼｂｇｌＣ遺伝子座の欠失に組み込まれたスペクチノマイシンマーカーを含む株由来のゲノムＤＮＡを使用して、天然形質転換受容性（ｎａｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）により株を形質転換させた。陽性クローンをスペクチノマイシン耐性により決定した。スペクチノマイシン耐性遺伝子を、この遺伝子の除去を可能にするｌｏｘＰ配列で挟んだ。
【０３２９】
テトラサイクリンマーカーによるｇｍｕＧマンナナーゼ遺伝子の置き換え：ｂｇｌＣ遺伝子の場合と同じ技術を使用するがスペクチノマイシンマーカーの代わりにテトラサイクリンマーカーを使用して、マンナナーゼｇｍｕＧを欠失させた。テトラサイクリン含有培地上で形質転換体を選択し、陽性クローンをＰＣＲで確認した。
【０３３０】
スペクチノマイシンマーカーによるｐｅｌペクチン酸リアーゼ遺伝子の置き換え：ｐｅｌ  ＯＲＦをスペクチノマイシンマーカーで置き換えることにより、ｂｇｌＣ遺伝子の場合に使用したのと同じ技術を使用してペクチン酸リアーゼ遺伝子ｐｅｌを欠失させた。スペクチノマイシンプレート上で形質転換体を選択し、ｃＰＣＲでスクリーニングした。
【０３３１】
ＢＩＦ９１７遺伝子の導入：「ＢＩＦ９１７」として国際公開第２０１３／１８２６２６号パンフレットに開示されているβ−ガラクトシダーゼのコード配列を、この公報に記載されている方法を使用してＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で形質転換させた。大まかに言うと、この公報には、ＧｅｎｅＡＲＴ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入したバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現に最適化されているコドンを有するビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）完全長（１７５２個の残基）遺伝子をコードするように設計されている合成遺伝子（配列番号８）を使用するポリペプチドの製造が説明されている。
【０３３２】
合成遺伝子の選択領域の特異的増幅を可能にするリバースプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）トランケーション変異体を構築した。
【０３３３】
フォワードプライマー：
【化１】
2017533712.tif 000005
【０３３４】
トランケーション変異体および対応するリバースプライマーの配列番号を下記の表２に示す。
【０３３５】
【表４】
2017533712.tif 000006
【０３３６】
固有の制限部位ＳｐｅＩおよびＰａｃＩを使用して合成遺伝子をｐＢＮｓｐｅバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発現ベクター中にクローニングし、単離したプラスミドをバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に形質転換させた。形質転換体を、選択として１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含むＬＢプレート上に再度画線した。
【０３３７】
β−ガラクトシダーゼ活性の測定
酵素活性は、市販で入手できる基質２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｎ１１２７）を使用して測定した。
ＯＮＰＧ（水なし）アクセプター
１００ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ６．０）
１２．３ｍＭのＯＮＰＧ
アクセプターが補給されたＯＮＰＧ
１００ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ６．０）
２０ｍＭのセロビオース
１２．３ｍＭのＯＮＰＧ
停止液
１０％のＮａ２ＣＯ３
【０３３８】
精製酵素の１０μＬの希釈系列は、アクセプターを含む、または含まない９０μＬのＯＮＰＧバッファーを含有するマイクロタイタープレートのウエル内に加えた。サンプルを混合し、１０分間にわたり３７℃でインキュベートし、引き続いて１００μＬの停止液を各ウエルに加えて反応を終了させた。吸光度測定値は、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウエアパッケージによって制御されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー上で４２０ｎｍで記録した。
【０３３９】
トランスガラクトシル化活性の比率は、下記のように計算した：
吸光度が０．５〜１．０の間にあった希釈液に対して、トランスガラクトシル化活性の比率＝（Ａｂｓ４２０＋セロビオース／Ａｂｓ４２０−セロビオース）＊１００。
【０３４０】
ＬＡＵ活性の決定
原理：
本アッセイ法の原理は、ラクターゼが３７℃で２−ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を２−ｏ−ニトロフェノール（ＯＮＰ）およびガラクトースに加水分解することにある。反応は炭酸ナトリウムを用いて停止させ、遊離したＯＮＰを４２０ｎｍで分光光度計または比色計で測定する。
【０３４１】
試薬：
ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）（１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．４）、１０ｍＭのＣａＣｌ２）：１９．５２ｇのＭＥＳ水和物（Ｍｗ：１９５．２ｇ／モル、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｍ８２５０−２５０Ｇ）および１．４７０ｇのＣａＣｌ２二水和物（Ｍｗ：１４７．０１ｇ／モル、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）を１，０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中に溶解させ、１０ＭのＮａＯＨによってｐＨを６．４に調整する。この溶液を０．２μｍフィルターに通して濾過し、１カ月間まで４℃で貯蔵する。ＯＮＰＧ基質（ｐＨ６．４）（１２．２８ｍＭのＯＮＰＧ、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．４）、１０ｍＭのＣａＣｌ２）：０．３７０ｇの２−ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ、Ｍｗ：３０１．５５ｇ／モル、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｎ１１２７）を１００ｍＬのＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）中に溶解させ、４℃の暗所で７日間まで貯蔵する。停止試薬（１０％のＮａ２ＣＯ３）：２０．０ｇのＮａ２ＣＯ３を２００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中に溶解させ、この溶液を０．２μｍのフィルターに通して濾過し、室温で１カ月間まで貯蔵する。
【０３４２】
手順：
酵素サンプルの希釈系列をＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）中で作成し、１０μＬの各サンプル希釈液を、９０μＬのＯＮＰＧ基質（ｐＨ６．４）を含有するマイクロタイタープレート（９６ウエルフォーマット）に移した。サンプルを混合し、５分間にわたり３７℃でサーモミキサー（Ｃｏｍｆｏｒｔ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用してインキュベートし、引き続いて１００μＬの停止液を各ウエルに加えて反応を終了させた。酵素サンプルの代わりにＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）を使用してブランクを構築した。４２０ｎｍでのブランクに比較した吸光度の増加をＥＬＩＳＡリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）で測定した。
【０３４３】
酵素活性の計算：
ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．４）中の２−ｏ−ニトロフェノール（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号３３４４４−２５Ｇ）のモル吸光係数を決定した（０．５９９８×１０−６Ｍ−１×ｃｍ−１）。１単位（Ｕ）のラクターゼ活性（ＬＡＵ）は、１分当たり１モルのＯＮＰＧの加水分解に対応すると定義された。２００μＬの全反応体積を備えるマイクロタイタープレート（０．５２ｃｍの光路）を使用すると、酵素サンプル１ｍＬ当たりのラクターゼ活性は、下記の方程式を使用して計算することができる：
【数１】
2017533712.tif 000007
【０３４４】
本明細書に配列番号１として示したＢＩＦ９１７についての比活性の計算：
ＢＩＦ９１７濃度の決定：
標的酵素（ＢＩＦ９１７）および切断生成物の定量は、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ  ｆｒｅｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して決定した。任意のｋＤのＳｔａｉｎ  ｆｒｅｅプレキャストゲル、４〜２０％のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１８ウエル（Ｃｏｍｂ、製品３４５−０４１８）をＳｅｒｖａ  Ｔｒｉｓ−グリシン／ＳＤＳバッファー（ＢｉｏＲａｄ、製品番号４２５２９）とともに使用した。ゲルは、以下のパラメーターを用いてランした：２００Ｖ、１２０ｍＡ、２５Ｗ、５０分間。ＢＳＡ（１．４３ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号５００−０００７）をタンパク質標準物質として使用し、トリプトファン含量の相関を伴うバンド強度を用いた定量のためにはＳｔａｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）をＩｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウエア（ＢｉｏＲａｄ）とともに使用した。ＢＩＦ９１７の特異的ＬＡＵ活性は、２つの独立発酵の（方法１に記載したように）粗発酵素（限外濾過濃縮液）から５つの異なる希釈液を使用して決定した（表１を参照されたい）。
【０３４５】
ＢＩＦ９１７の比活性は、２１．３ＬＡＵ／ｍｇもしくは０．０２１３ＬＡＵ／ｐｐｍであると見いだされた。
【０３４６】
【表５】
2017533712.tif 000008
【０３４７】
実施例２
試験：１
アッセイ：Ｐ−マンナナーゼ活性、還元糖（ＭＵ）
この試験方法を使用して、マンナナーゼ活性をＭＵ（マンナナーゼ単位）単位で決定することができる。
目的  このアッセイはマンナナーゼ活性のＱＡ／ＱＣモニタリングに適している。
原理  このアッセイは、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）基質へのエンド−１，４−Ｐ−Ｄマンナナーゼの作用による還元糖の放出を測定する。ジニトロサリチル酸反応を使用して、添加する酵素活性に比例する還元糖含有量の増加を測定する。
【０３４８】
手順
１．材料および機器
１．１  遠心分離機、３５００ｒｐｍが可能
１．２  ４０℃に設定した水浴
１．３  ６０℃に設定した水浴
１．４  沸騰水浴
１．５  ポジティブディスプレイスメントピペットおよびチップ（Ｒａｎｉｎ  Ｉｎｃ．）
１．６  ボルテックス
１．７  １６×１００ｍｍガラス試験管（キャップ付）
１．８  タイマー
１．９  メスフラスコ、メスシリンダー、ビーカー
１．１０  磁気撹拌子および撹拌／ホットプレート
１．１１  焼結ガラスろ過用漏斗
１．１２  ｐＨメーター
１．１３  分析用天秤
１．１４  調製用天秤
１．１５  温度計
１．１６  氷水浴
１．１７  分光光度計、５４０ｎｍの読み取りが可能
１．１８  使い捨てチップを有する可変ピペット装置（１ｍｌ）
１．２０  ガラス器具用のオーブンまたはオートクレーブ
【０３４９】
２．試薬：下記の試薬または等価物を使用する
２．１  水酸化アンモニウム、濃縮（２８〜３０％）
２．２  Ｔｒｉｓ−ヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）−塩酸塩
２．３  水酸化ナトリウムペレット
２．４  ３，５−ジニトロサリチル酸、９８％、（ＤＮＳ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．＃１２８８４８
２．５  ローカストビーンガム、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＃Ｇ０７５３
２．６  酒石酸カリウムナトリウム、四水和物、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．＃２１７２５５
２．７  脱イオン水
２．８  １−プロパノール
【０３５０】
３．試薬の調製
３．１  水酸化アンモニウム１．５％
３．１．１  脱イオン水を使用して、メスフラスコ中で３０％水酸化アンモニウム５ｍｌを１００ｍｌに希釈する。
３．２  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液
３．２．１  Ｔｒｉｓ−塩酸塩１５．６７ｇｍを脱イオン水、約１９００ｍｌに溶解させる。水酸化アンモニウム（１．５％）でｐＨを７．５±０．０５に調整し、脱イオン水で２０００ｍｌに希釈する。この溶液を室温で少なくとも２週間にわたり保持することができる。
３．３  水酸化ナトリウム１０．６７％
３．３．１  水酸化ナトリウムペレット３２．０ｇｍを脱イオン水２００ｍｌに添加する。溶解するまで撹拌して冷却する。脱イオン水で３００ｍｌにする。
【０３５１】
３．４  ＤＮＳ試薬
（ａ）２Ｌビーカー中でＤＮＳ２０ｇｍを脱イオン水１０００ｍｌに懸濁させる。１０．６７％水酸化ナトリウム溶液３００ｍｌを添加する。
（ｂ）溶液が透明になるまで、加熱した撹拌プレート上で懸濁液を温める。この温度は５０℃を超えるべきではない。
（ｃ）継続的に混合しつつ、この溶液に酒石酸カリウムナトリウム四水和物６００ｇｍを徐々に添加する。溶液を室温にする。
（ｄ）この溶液を脱イオン水で２０００ｍｌに希釈し、必要な場合には、粗い焼結ガラスフィルタ（ｃｏｕｒｓｅ  ｓｉｎｔｅｒｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ）に通してろ過する。室温にて暗い琥珀色のボトル中で保存する。この溶液は少なくとも２ヶ月にわたり良好である。
【０３５２】
３．５  ローカストビーンガム（ＬＢＧ）基質溶液
３．５．１  基質が接触する全てのガラス器具が非常に清潔でマンナナーゼ汚染の可能性がないことを確認する。１−プロパノール洗浄または１２０℃でのベーキングが推奨される。
５．１．１  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液５００ｍｌを１０００ｍｌビーカーに入れる。このビーカーを沸騰水浴中に入れてまたは加熱した撹拌プレートに置いて、ビーカー中の温度を８０℃にする。ローカストビーンガム１．４ｇｍを非常に緩やかに添加しつつ、この溶液を迅速に撹拌する。混合を減速し、この溶液を６０分にわたり水浴中において６０℃で保持する。室温まで冷却する。脱イオン水で５００ｍｌに調整する。１０分にわたり３，５００ｒｐｍで遠心分離する。基質として透明な上清を使用する。
【０３５３】
３．６  酵素標準物質の調製
３．６．１  あるロットのマンナナーゼ最終製品を標準物質として選択する。この最終製品を、このロットの分析証明書で報告されているＭＵ値と等しく設定する。この物質を使用して、ＭＵ／リットルで既知の濃度の試料を使用する３点標準曲線を作成する。この標準物質の正味の吸光度が試薬ブランクの減算後にアッセイの線形範囲内に入るように、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液を使用してこの標準物質を適宜希釈する。このアッセイの線形範囲は０．１７および０．５２ＡＡである。標準曲線および０．０５０〜０．１４０ＭＵ／リットルの試料濃度は概して、このアッセイの線形範囲内に入る。
【０３５４】
３．７  液体試料の調製
３．７．１  第４節で概説するアッセイ反応が５４０ｎｍで０．１７〜０．５２ＡＡに入るように各試料（重量／体積）をＴｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈する。
３．７．２  希釈した酵素溶液を氷上で保存する。最良の結果のために、希釈した酵素溶液を１時間以内にアッセイすべきである。
【０３５５】
４．アッセイ手順
４．１  酵素試料−酵素試料は２重でアッセイすべきである。
４．１．１  ２０分にわたり１６×１００ガラス試験管中で４０℃にてＬＧＢ基質２ｍｌを平衡化する。
４．１．２  酵素試料希釈液０．５ｍｌを添加し、混合し、正確に１０分にわたりインキュベートする。
４．１．３  ＤＮＳ溶液３．０ｍｌを添加して混合することにより、反応を停止させる。
４．１．４  各試験管の上部をキャップで覆って蒸発を防止しつつ、沸騰水浴中で１５分にわたり試料を沸騰させる。５０分にわたり氷水浴中で冷却する。１０分にわたり試料を室温に平衡化する。
５．１．１  脱イオン水ブランクに対する５４０ｎｍでの吸光度を読み取る。試薬ブランクの減算後の吸光度は０．１７〜０．５２ＡＡであるべきである。
【０３５６】
４．２  試薬ブランク
４．２．１  ブランクを単独で実行することができる。この反応コントロールは、ＬＢＧ基質中にまたは酵素試料中に存在する還元糖に関するものである。
５．１．１  ２０分にわたり１６×１００ガラス試験管中で４０℃にてＬＢＧ基質２ｍｌを平衡化する。
５．１．２  更に１０分にわたりインキュベートする。
５．１．３  ＤＮＳ溶液３．０ｍｌを添加して混合する。酵素希釈液０．５ｍｌを添加して再度混合する。
５．１．４  試験管の上部をキャップで覆って蒸発を防止しつつ、沸騰水浴中で１５分にわたり沸騰させる。５分にわたり氷水浴中で冷却する。１０分にわたり試料を室温に平衡化する。
５．１．５  脱イオンブランクに対する５４０ｎｍでの吸光度を読み取る。
【０３５７】
５．算出
５．１  正味の吸光度を決定するために、全ての標準物質および試料の吸光度測定値から平均試薬／酵素ブランクを減算する。
５．２  正味の吸光度がｙ軸上であり濃度（ＭＵ／リットル）がｘ軸上である線形回帰を使用して、標準曲線を作成する。
５．３  相関係数は＞０．９９８でなければならない。
５．４  線形回帰から各試料の濃度を決定する。
５．５  液体の場合：マンナナーゼＭＵ／試料ｋｇ＝曲線（ＭＵ／リットル）＊試料希釈係数（全体積（リットル）／試料重量（ｋｇ））からの値
【０３５８】
実施例３
試験２：エンドグルカナーゼ活性、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）活性
目的  この試験方法を使用して、セルラーゼのエンドヌクレアーゼ活性をＣＭＣ単位で決定することができる。注記：ＩＵ／ｇまたはＩＵ／ｍｌ（国際単位）で報告されているセルラーゼはそれぞれ、ＣＭＣ／ｇまたはＣＭＣ／ｍｌと等しい。
原理  このアッセイは、ＣＭＣ基質へのセルラーゼの作用による還元糖の放出を測定する。３，５ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）との反応によって測定する場合、還元糖の放出速度は酵素活性に比例する。１ＣＭＣ単位は、このアッセイの条件下で１分当たりグルコース還元糖当量１＾．ｍｏｌを生成するのに必要とされる酵素の量と定義される。この方法では、活性を、割り当てたＣＭＣ単位を有する酵素標準物質と比較して測定する。
【０３５９】
手順
１．０  材料および機器
１．１８  １８×１５０ｍｍ試験管
１．１９  大理石
１．２０  キュベット
１．２１  ポジティブディスプレイスメントピペットおよびチップ、Ｒａｎｉｎ  Ｉｎｃ．
１．２２  ｐＨメーター
１．２３  ５０℃に設定した水浴
１．２４  氷浴
１．２５  沸騰水浴
１．２６  分光光度計
１．２７  マグネチックスターラ
１．２８  ストップウォッチ
１．２９  粗いガラスフィルタ（著作権）、ＶＷＲ  ＫＴ９３７００−４７
１．３０  暗い琥珀色のボトル
１．３１  ポジティブディスプレイスメントピペット
１．３２  ボルテックサー（Ｖｏｒｔｅｘｅｒ）
１．３３  試験管立て
２．０  試薬：下記の試薬または等価物を使用する。
２．９  カルボキシメチルセルロースナトリウム塩Ｆｌｕｋａ  ２１９００  置換度は０．７０〜０．８５でなければならない
２．１０  ３，５−ジニトロサリチル酸、ナトリウム塩（ＤＮＳ）、Ｍｅｒｃｋ  １０８４６
２．１１  酒石酸カリウムナトリウム、四水和物、Ｍｅｒｃｋ  ８０８７
２．１２  水酸化ナトリウム、試薬等級
２．１３  氷酢酸、試薬等級
３．０  試薬の調製
３．１  ０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．８
３．１．１  蒸留水９００ｍＬに氷酢酸２．８５ｍＬを添加する。磁気撹拌子で撹拌しつつ、５０％水酸化ナトリウムでｐＨを４．８に調整する。総体積を蒸留水で１リットルにする。
３．４  １０．６７％（重量／体積）水酸化ナトリウム溶液
３．２．１  水酸化ナトリウムペレット３２．０ｇを蒸留水２００ｍＬに添加する。溶解するまで撹拌して冷却する。蒸留水で３００ｍＬにする。
３．５  １％ＣＭＣ基質溶液
３．３．１  酢酸ナトリウム緩衝液９９ｍＬにＣＭＣ１．００ｇを添加する。完全に混ざり合うまで撹拌し、使用前に少なくとも１時間にわたり４℃で保持する。この溶液は４℃で３日にわたり安定である。
３．６  １％の３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）
（ｅ）ＤＮＳ２０．０ｇを蒸留水１０００ｍＬに懸濁させ、混合しつつ１０．６７％水酸化ナトリウム溶液３００ｍＬを徐々に添加する。
（ｆ）溶液が透明になるまで、５０℃（１２２゜Ｆ）に設定した水浴中で懸濁液を温める。この水浴の温度は５０℃を超えるべきではない。
３．４．３  継続的に混合しつつ、この溶液に酒石酸カリウムナトリウム四水和物６００ｇｍを徐々に添加する。
３．４．４  この溶液を蒸留水で２０００ｍＬに希釈し、粗いガラスフィルタに通してろ過する。室温にて暗い琥珀色のボトル中で保存する。この溶液は２ヶ月にわたり安定である。この溶液は使用前には透明でなければならない。
【０３６０】
４．１  顆粒試料の調製
３．７．２  第４．５節で概説するアッセイ反応から得られる正味の吸光度が０．４〜０．５に入るように、顆粒試料を酢酸緩衝液に溶解させる。約０．２ＣＭＣ／ｍＬでの調製物は概して、所望の吸光度を得ることができる。
３．７．３  試料を調製する際に、顆粒を少なくとも１００ｍｇ秤量する。磁気撹拌を使用して４．１．１により酢酸緩衝液で適宜溶解させる。５．１での算出のために、顆粒濃度をｍｇ／ｍＬで記録する。少なくとも２０分にわたり中速で混合する。希釈試料を氷上で保存する。少なくとも２時間にわたり安定。
３．７．４  一部の試料は混合時間後に微細なスラリーを形成するであろうことに留置されたい。代表的なスラリー試料を採取して４．５でのアッセイを実施すべきである。
４．１．１  各顆粒試料の調製を３重で実施する。
４．２  液体試料の調製
４．１．３  第４．５節で概説するアッセイ反応から得られる正味の吸光度が０．４〜０．５に入るように、各試料を酢酸緩衝液で希釈する。約０．２ＣＭＣ／ｍＬでの調製物は概して、所望の吸光度を得ることができる。
４．１．４  試料を調製する際に、ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して液体試料を少なくとも０．１０ｍＬで等分する。希釈試料を氷上で保存する。少なくとも２時間にわたり安定。
４．１．５  各液体試料の調製を３重で実施する。
４．３  ワーキング標準物質の調製
４．４
４．３．１  あるロットのセルラーゼ最終製品（液体または顆粒のいずれか）を標準物質として選択する。この最終製品を、このロットの分析証明書で報告されているＭＵ値と等しく設定する。この物質を使用して、４．１または４．２により既知のＣＭＣ／ｍＬのワーキング標準物質を調製する。第４．５節で概説するアッセイ反応から得られる正味の吸光度が０．４〜０．５に入るように、酢酸緩衝液を使用してこの標準物質を希釈する。約０．２ＣＭＣ／ｍＬでの標準物質溶液の調製物は概して、所望の吸光度を得ることができる。
４．３．２  ワーキング標準物質の活性をＣＭＣ／ｍＬで記録する。この活性を、第５．１節および第５．２節での算出で使用する。
４．３．３  この標準物質を３重で調製する。
４．４  ブランク溶液
４．４．１  第４．５節でのブランク酵素溶液として酢酸緩衝液を使用する。各ブランク酵素溶液を２重で実行する。
４．５  酵素アッセイ反応
４．５．１  １０〜１５分にわたり１８×１５０ｍｍガラス試験管中で５０℃にてＣＭＣ基質１．００ｍＬをインキュベートし、試験管立てに立てる。
４．５．２  ２０秒の間隔で、このＣＭＣ基質に、ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して酵素希釈液およびブランク１．００ｍＬを添加する。１０分にわたり５０℃（１２２゜Ｆ）で各反応物を混合してインキュベートする。
４．５．３  ４．５．２と同じ時間間隔で、ＤＮＳ溶液３．０ｍＬを添加して混合する。
４．５．４  試験管および試験管立てを沸騰水浴中に置いて、正確に５分にわたり全ての反応混合物＋ＤＮＳを沸騰させる。試験管の上部を大理石で覆って沸騰中の蒸発を予防する。全ての試料、標準物質およびブランクを一緒に沸騰させるべきである。沸騰後、試験管を氷浴中で冷却する。
４．５．５  ゼロ吸光度としての蒸留水に対する５４０ｎｍでの酵素試料およびブランクの吸光度を測定する。
４．５．６  平均試料吸光度および平均標準物質吸光度から平均ブランク吸光度を減算する。この正味の吸光度は０．４〜０．５であるべきである。そうでない場合、このアッセイを繰り返すべきである。
４．５．７  このアッセイでは、各酵素試料を３重で実行する。
【０３６１】
５．０  算出
５．１  顆粒試料での活性を下記のように算出する：
ＣＭＣ／ｇ（またはＩＵ／ｇ）＝（試料の正味の吸光度）（ワーキング標準物質のＣＭＣ／ｍＬ）（１０００ｍｇ／ｇ）（ワーキング標準物質の正味の吸光度）（顆粒ｍｇ／酢酸緩衝液ｍＬ）
５．２  液体試料での活性を下記のように算出する：
ＣＭＣ／ｍＬ（またはＩＵ／ｍｌ）＝（試料の正味の吸光度）（ワーキング標準物質のＣＭＣ／ｍＬ）（試料の希釈度）（ワーキング標準物質の正味の吸光度）
注記：ＩＵ／ｇまたはＩＵ／ｍｌ（国際単位）で報告されているセルラーゼはそれぞれ、ＣＭＣ／ｇまたはＣＭＣ／ｍｌと等しい。
【０３６２】
実施例４
試験３
Ｖｉｓｃｏｍａｎをベースとする粘度法（Ｖｉｓｃｏｍａｎ−ｂａｓｅｄ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用する。この方法は、非常に低いレベルのマンナナーゼ活性、アミラーゼ活性、ＣＭＣアーゼ活性およびペクチナーゼ活性の検出に現在使用され得る。（有用な粘度法は、参照により援用される米国特許出願公開第２０１３／００４５４９８号明細書にも開示されている）。親水コロイドは酵素により切断され、それにより親水コロイド溶液の粘度が低下する。粘度の低下は、Ｈ２Ｏを添加した親水コロイド試料の粘度に対する酵素添加親水コロイド試料の粘度から算出した相対粘度値として示される。従って、この値は常に１〜０であり、１は試料の粘度の低下がないことを意味する。
【０３６３】
基質は、ＧＵＡＲ、デンプン、ＣＭＣまたはペクチンである。
【０３６４】
基質に応じて下記の２種の緩衝液を使用する。
Ｍｃｌｌｖａｉｎｅのクエン酸リン酸塩：
Ａ）０．１Ｍクエン酸塩、Ｃ６Ｈ８Ｏ７  ２１．０ｇ、Ｈ２Ｏ／脱塩水１Ｌ
Ｂ）０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム、Ｎａ２ＨＰＯ４  ３５．６ｇ、２Ｈ２Ｏ／脱塩水１Ｌ。有効期間：３ヶ月
緩衝液ｐＨ４．０＝Ａ  ７１．５０ｍｌ＋Ｂ  ２８．５０ｍｌ（メスシリンダー中）
緩衝液ｐＨ６．７＝Ａ  ２５．００ｍｌ＋Ｂ  ７５．００ｍｌ
【０３６５】
基質濃度：
【０３６６】
【表６】
2017533712.tif 000009
【０３６７】
基質溶液の調製：
特定の基質に使用する緩衝液を水で５倍に希釈し、磁石付きホットプレート上でブルーキャップボトル中にて加熱する。親水コロイドを秤量し、緩衝液が泡立つ場合には、希釈されるまで（約３０分）激しく撹拌しつつ粉末を振りかける。デンプンの場合、基質の追加時に加熱を止めてボトルの蓋を外し、基質が吹きこぼれるのを避けることが推奨され、全ては塊の形成等を防止するためである。デンプン溶液を除いて、親水コロイド溶液を４０℃まで冷却する。デンプンは、レトログラデーションを防止するために、使用するまで５０℃で保存しなければならない。
【０３６８】
試料処理
ブランクを含む各試料用の基質５ｍｌをＷｈｅａｔｏｎガラスに移す。この基質溶液５ｍｌに酵素試料または試料の希釈液（水で作製した）１００μｌを添加して混合する。同体積がブランク試料に適用される限り、試料を最大で５００μＬ添加することができる。試料を２０時間にわたり４０℃でインキュベートし、次いで試料を氷上に置くことにより反応を停止させる。次いで、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄを使用する粘度測定のために、試料を１０℃で調節する。
【０３６９】
実施例５
酵素副活性スクリーニング
比較するために、試料１と市販のＧＯＤＯ  ＹＮＬ２ラクターゼとでスクリーニングを行なった。試料１は、セルロース、マンナナーゼおよびペクチナーゼが不活性化されていないＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞により産生されたトランスガラクトシル化活性を有する酵素を含むポリペプチド組成物である。このアッセイおよび結果を表２に列挙する。試料１はＧＯＤＯ  ＹＮＬ２ラクターゼと比較してマンナナーゼ活性およびＣＭＣアーゼ活性のレベルが有意に高いことを観測した。
【０３７０】
【表７】
2017533712.tif 000010
【０３７１】
マンナナーゼレベルおよびセルラーゼレベルの半定量化
粘度変化をほとんど観測することができなくなるまで試料を希釈することにより、試料１中に存在するセルラーゼおよびマンナナーゼのレベルを評価した。軟化酵素（ｍａｃｅｒａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）を試験して、発酵中にダイズ培地中で使用する場合に、この軟化酵素が、最終生成物中に存在するマンナナーゼおよびセルラーゼのレベルに影響を及ぼすかどうかを決定した。この軟化酵素は既知のセルラーゼであり、従って、セルラーゼ活性が期待されるであろうことから、この軟化酵素をマンナナーゼ活性に関してのみ試験した。希釈度（表３を参照されたい）は、この軟化酵素でのマンナナーゼ活性の高レベルならびに試料でのマンナナーゼ活性およびセルラーゼ活性の両方の高レベルを示す。軟化酵素中に存在するマンナナーゼ活性のレベルのみで、存在するマンナナーゼレベルを説明することができなかった。なぜならば、軟化酵素のＦ１０．０００希釈では相対粘度が１付近であったのに対して、試料１では相対粘度を１付近にするためにはＦ１００．０００を超えて希釈する必要があったからである。
【０３７２】
示した希釈の軟化酵素ストックまたは試料１  １００μＬを加えたＧＵＡＲ溶液またはＣＭＣ溶液の相対粘度。軟化酵素ストックは、発酵中に酵素をダイズ培地に添加する場合に作製される希釈液に対応する軟化試料の５４倍希釈液である。
【０３７３】
【表８】
2017533712.tif 000011
【０３７４】
ペクチナーゼ、マンナナーゼおよびセルラーゼに関してノックアウトされた新たな宿主株での副活性スクリーニング。
Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株（試料２）からペクチナーゼ、セルラーゼおよびマンナナーゼをノックアウトし、次いで、副活性の存在に関して再試験することを決定した。新たな株を使用した最初の３Ｋ発酵（３Ｋ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の試料を分析用に受け取った。３Ｋ試料からの結果と試料１を使用した結果とを比較すると、試料２を使用するとペクチナーゼ、セルラーゼおよびマンナナーゼに対する副活性レベルが低いことが明らかであった（表４を参照されたい）。
【０３７５】
【表９】
2017533712.tif 000012
【０３７６】
Ｇｉｌｓｏｎ  Ｖｉｓｃｏｍａｎを使用する粘度アッセイの詳述
ヨーグルト用途でのマンナナーゼ活性およびセルラーゼ活性の閾値を決定するために、粘度低下に基づくマンナナーゼ活性およびセルラーゼ活性の定量化用のアッセイを使用した。このアッセイの場合、Ｂｉｏｌａｂ  Ａ／ＳのＶｉｓｃｏｍａｎピペットマンを使用して、各試料の粘度を測定した。
【０３７７】
Ｖｉｓｃｏｍａｎを使用して試料内の変動を測定するために、試験３に従って作製した０．５％ＧＵＡＲ基質で粘度を測定した。６種の異なる基質調製物で試料測定を３回行なった。６種の実行で見られる最大変動は約４％であった。安全を期すために、試料内の変動の限度を５％に設定した。ブランク試料の変動が酵素添加試料の変動と重複しないように、本発明者らは、１０％を超えて粘度変化を観測する必要があるだろう。このことは、試料がマンナナーゼ活性を含んでいたと言うためには、相対粘度は０．９未満であるべきであることを意味する。従って、標準曲線の相対粘度に関する上限を０．８５に設定した。
【０３７８】
【表１０】
2017533712.tif 000013
【０３７９】
マンナナーゼ粘度アッセイに適した酵素希釈範囲を、標準物質６９９ＭＵ／Ｋｇ）を使用して試験した。マンナナーゼ活性を含む試料（試料１）も試験した。相対粘度をＬＮ（ＭＵ／Ｋｇ）に対してプロットした場合にデータが直線を示すことが最小二乗法により分かった（図２を参照されたい）。ＧＵＡＲ基質での標準酵素希釈液による６種の実行から、Ｒ２≧０．９８である直線は０．２５〜０．８５の範囲内で示されると結論付けた（データは示さない）。試験の量を制限するために、相対粘度値の規格値を、使用する全ての基質に関して≧０．２５および≦０．８５に設定した。
【０３８０】
図２のグラフは、Ｖｉｓｃｏｍａｎで速度２を使用して粘度を測定した標準物質である試料１の希釈液に関してＬＮ（ＭＵ／Ｋｇ）に対してプロットした相対粘度を示す。また、図２のグラフは、ＬＮ（ＭＵ／Ｋｇ）に対してプロットした、速度１で測定した試料１の１〜４ＭＵ／Ｋｇ試料および速度２で測定した試料１の５〜８０ＭＵ／Ｋｇ試料に関する相対粘度も示す。
【０３８１】
加えて、Ｖｉｓｃｏｍａｎで同じ速度を使用してデータを取得する場合にのみ線形関数を得ることができることも明らかであった（図１を参照されたい）。このデータを、Ｖｉｓｃｏｍａｎで同じ速度を使用して得ている。低粘度試料はこのアッセイに最適であり、従って、全ての試料を、粘度が４００ｍＰａ・ｓ未満であることを意味する速度２を使用して測定すべきである。従って、基質ブランク試料は速度２でＶｉｓｃｏｍａｎにより測定する場合に６０〜１３０ｍＰａ・ｓの粘度を有するべきであると定義した。
【０３８２】
定量的マンナナーゼアッセイ：
相対粘度に基づいて定量的マンナナーゼアッセイを設定するために、発明者らは、比色マンナナーゼアッセイからの確立されたコントロールおよび標準物質４５０ＭＵ／Ｋｇを使用した。試料１、試料２および軟化酵素のマンナナーゼ活性を測定した。直線を外挿することにより、検出限界は粉末（１０ｍＬ中で最大１ｇ）の場合には約０．００３ＭＵ／Ｋｇであり液体の場合には０．０００３ＭＵ／Ｋｇであることが分かる。
【０３８３】
試験３で説明したように各試料を処理したが、Ｖｉｓｃｏｍａｎを使用して粘度を測定した。４点標準曲線を使用して各試料のマンナナーゼ活性を算出した。下記の表は図３に関連する。
【０３８４】
【表１１】
2017533712.tif 000014
【０３８５】
計算結果は、試料２のマンナナーゼ活性が主に軟化酵素（ダイズ培地中に軟化酵素を添加する場合に希釈液に対応する５４で除算されている３ＭＵ／Ｋｇ）に由来することを示す。従って、マンナナーゼ遺伝子が宿主株から効率的にノックアウトされていることを確認することができる。
【０３８６】
定量的セルラーゼアッセイ
コントロール２２２２ＣＭＣＵ／ｇおよび標準物質２３０６ＣＭＣＵ／ｇを使用して、相対粘度に基づいて定量的セルラーゼアッセイを設定した。標準物質の相対粘度値をＬＮ（ＣＭＣＵ／ｇ）に対してプロットし、０．２４２〜０．８８５の相対粘度内で線形であることを確認した（図４を参照されたい）。直線を外挿することにより、このアッセイの検出限界は液体の場合には約０．００２ＣＭＣＵ／ｇであり粉末の場合には０．０２ＣＭＣＵ／ｇであることが分かる。
【０３８７】
軟化酵素による発酵からのおよび軟化酵素によらない発酵からの２種の追加の試料を、既存の試料と一緒にセルラーゼ活性に関して試験した。結果は、発酵中におけるダイズ培地中での軟化酵素の添加により、一部の活性がまだ存在していたが宿主株からのセルラーゼのノックアウトが有効であった（３４ＣＭＣＵ／ｇ対約４ＣＭＣＵ／ｇ）ことを示す（表６および図４を参照されたい）。
【０３８８】
【表１２】
2017533712.tif 000015
【０３８９】
ヨーグルト用途でのセルラーゼ閾値
ヨーグルト用途のためのセルラーゼ閾値を確立するために、飲用ヨーグルトを、粘度アッセイに使用したセルラーゼコントロールで処理した。飲用ヨーグルト（ＭＩＬＲＡＭ、Ｋｅｆｉｒ  Ｄｒｉｎｋ、Ｅｒｄｂｅｅｒｅ；ＢＢ１４−０２−１４）を、各試料に関して２重にしたＷｈｅａｔｏｎグラス中で５ｍＬに等分した。（１０００ｍＬ中に０．０８１ｍＬ）のストック希釈液を更に４種の新たな試料に１０倍に希釈した。各試料１００μＬおよびブランク試料用のｄｄＨ２Ｏ  １００μＬを各ヨーグルト５ｍＬに添加した。次いで、試料を４℃または４０℃のいずれかで貯蔵した。様々な時点で、速度２でＶｉｓｃｏｍａｎを使用して粘度を測定した。
【０３９０】
相対粘度を、希釈試料のａ）４０℃またはｂ）４℃での（ａ）時間（ｂ）日間のインキュベーション時間に対してプロットした。各希釈液に関してヨーグルトのＣＭＣＵ／ｍＬを記録する。
【０３９１】
結果を、４０℃（図５ａ）または４℃（図５ｂ）のいずれかでインキュベートした時間に対してプロットした相対粘度として表す。これらの曲線は同様の経時的推移を示し、時間のかかる４℃インキュベーションアッセイの代わりの加速アッセイとして４０℃インキュベーションを使用することができたことを示す。
【０３９２】
閾値を算出するために、許容レベルのセルラーゼ活性が貯蔵期間内に粘度を１０％未満低下させるだろうと定義した。図５ｂで示すデータに基づいて、観測した最高比活性が初期速度を表すであろうと仮定して、各データ点に関して比活性（相対粘度低下／ＣＭＣＵ／ヨーグルトｐｒ．ｍＬ／時間）を算出した。
【０３９３】
最高比活性は、各時間でヨーグルト１ｍＬ中にて粘度が９６０％ｐｒ．ＣＭＣＵ低下するであろうということを意味する９．６の相対粘度低下／ＣＭＣＵ／ヨーグルトｐｒｍＬ／時間であることが分かった。次いで、１０％の粘度低下を可能にするＣＭＣＵ／ｍＬ閾値を、様々な貯蔵期間に関して算出することができた（表７を参照されたい）。
【０３９４】
閾値＝０．１／（比活性＊貯蔵の時間）
【０３９５】
１ヶ月貯蔵の場合は閾値を下記のように算出する；０．１／（９．６＊７２０）＝１．４５×１０−５
【０３９６】
【表１３】
2017533712.tif 000016
【０３９７】
計算結果と図５ｂのデータとを比較すると、計算結果は、４℃で１ヶ月の期間にわたりインキュベートした全ての希釈液に関して得られたデータと相関することが分かる。３．６×１０−６ＣＭＣＵ／ｍＬ以下のレベルでは１ヶ月以内に粘度が１０％を超えて低下しなかったのに対して、３．６×１０−６ＣＭＣＵ／ｍＬ超では粘度が１０％を超えて低下した。
【０３９８】
結論
ペクチナーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子およびマンナナーゼ遺伝子は宿主株から効率的にノックアウトされている。
【０３９９】
上記の明細書に言及した全刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載した方法およびシステムの様々な修飾および変動は、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、当業者には明白になるであろう。本発明は特定の好ましい実施形態と結び付けて記載してきたが、本明細書で要求した本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定すべきではないと理解すべきである。実際に、化学、生化学、生物学または関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するための本明細書に記載した様式の様々な修飾は、下記の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが企図されている。
【０４００】
配列表
【化２】
2017533712.tif 000017
【化３】
2017533712.tif 000018
【化４】
2017533712.tif 000019
【化５】
2017533712.tif 000020
【化６】
2017533712.tif 000021
【化７】
2017533712.tif 000022
【化８】
2017533712.tif 000023
【化９】
2017533712.tif 000024
【化１０】
2017533712.tif 000025
【化１１】
2017533712.tif 000026
【化１２】
2017533712.tif 000027
【化１３】
2017533712.tif 000028
【化１４】
2017533712.tif 000029
＞配列番号１６  ＢＩＦ９１７のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＣ
＞配列番号１７  ＢＩＦ９９５のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＴＧＣＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＴＣＡＡＴＣＡ
＞配列番号１８  ＢＩＦ１０６８のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＴＴＧＴＣＧＣＴＧ
＞配列番号１９  ＢＩＦ１２４１のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴ
＞配列番号２０  ＢＩＦ１３２６のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＣＡ
＞配列番号２１  ＢＩＦ１４７８のためのリバースプライマー
ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＴＣＴＣＡＧＴＣＴＡＡＴＴＴＣＧＣＴＴＧＣＧＣ
【化１５】
2017533712.tif 000030
＞配列番号２３  ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼのシグナル配列
Ｖｒｓｋｋｌｗｉｓｌｌｆａｌａｌｉｆｔｍａｆｇｓｔｓｓａｑａ
【図１】
2017533712.tif 000031
【図２】
2017533712.tif 000032
【図３】
2017533712.tif 000033
【図４】
2017533712.tif 000034
【図５ａ−５ｂ】
2017533712.tif 000035
【配列表】
2017533712000001.app
【国際調査報告】
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