(57)【要約】  心筋球由来細胞（ＣＤＣ）およびＣＤＣ由来エキソソームの作製および治療適用に関する組成物および技術が本明細書に記載される。これらの細胞およびそれらの分泌小胞は、サイトカイン、成長因子、転写因子、核酸（マイクロＲＮＡなどの非コード核酸を含む）を含む生物学的因子であって、多くの治療効果を開始および促進するように働く生物学的因子のユニークな環境を含有する。エキソソームおよびそれらの「カーゴ」内容物、例えばマイクロＲＮＡは、傷害心臓におけるアポトーシス、炎症および線維化を有利に調節し得る。したがって、ＣＤＣ由来エキソソームは、組織修復のための新規な「無細胞」治療候補である。
2017530158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置の方法であって、
慢性退行性筋疾患に続発する心不全の処置を必要とする被験体を選択することと、
複数のエキソソームを含む組成物を前記被験体に投与することと
を含み、
前記複数のエキソソームが、無血清培地中で成長した心筋球由来細胞（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ；ＣＤＣ）から単離されたものであり、直径約９０ｎｍ〜約２００ｎｍのエキソソームを含み、ＣＤ８１＋、ＣＤ６３＋または両方であり、さらに、前記組成物の投与が前記被験体を処置する、方法。
【請求項２】
前記慢性退行性筋疾患がデュシェンヌ筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物の投与が、単回用量で約１〜約１００ｍｇのエキソソームタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単回用量を前記被験体に複数回投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組成物の投与が注射を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記注射が経皮注射を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記注射が心筋内へ直接的である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
組成物の投与が心筋注入を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
心筋注入が動脈内または静脈内である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体の処置が、線維化の減少、炎症の減少、ミトコンドリア機能の増加および／または心筋形成の増加をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
線維化の減少が、コラーゲン蓄積の減少を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
コラーゲンが、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
炎症の減少が、細胞質核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）の増加、脂肪酸過酸化最終生成物の減少、炎症細胞の数の減少、および／または抗酸化物質の発現のアップレギュレートを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
抗酸化物質が、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）およびグルタミン酸−システインリガーゼ触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
炎症細胞が、ＣＤ６８＋マクロファージおよびＣＤ３＋Ｔ細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ミトコンドリア機能の増加が、ミトコンドリア超微細構造の増加および／またはミトコンドリア生合成の増加を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ミトコンドリア機能の増加が、核ＰＰＡＲ−γコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）発現の増加を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記エキソソームが、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ１４８ａ、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５およびｍｉＲ−２３ａからなる群より選択される１つ以上のマイクロＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
処置の方法であって、
慢性筋疾患に続発する心不全の処置を必要とする被験体を選択することと、
心筋球由来細胞（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ；ＣＤＣ）を含む組成物を投与することと
を含み、
前記組成物の投与が前記被験体を処置する、方法。
【請求項２０】
前記慢性筋疾患がデュシェンヌ筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
成物の投与が、単回用量で約１×１０5個〜約１×１０8個またはそれを超えるＣＤＣを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
組成物の投与が心筋注入を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
心筋注入が冠動脈内である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
心筋注入が動脈内または静脈内である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体の処置が、線維化の減少、炎症の減少、ミトコンドリア機能の増加および／または心筋形成の増加をもたらす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
線維化の減少が、コラーゲン蓄積の減少を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
コラーゲンが、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
炎症の減少が、細胞質核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）の増加、脂肪酸過酸化最終生成物の減少、炎症細胞の数の減少、および／または抗酸化物質の発現のアップレギュレートを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
抗酸化物質が、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）およびグルタミン酸−システインリガーゼ触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
炎症細胞が、ＣＤ６８＋マクロファージおよびＣＤ３＋Ｔ細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ミトコンドリア機能の増加が、ミトコンドリア超微細構造の増加および／またはミトコンドリア生合成の増加を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ミトコンドリア機能の増加が、核ＰＰＡＲ−γコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）発現の増加を含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって認められたＲ０１  ＨＬ０８３１０９に基づいて政府支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、心疾患の処置を含む治療的使用のための、細胞およびそれらの抽出物（特に、細胞エキソソーム）の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
米国では、約２０，０００人の少年および青年がデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に罹患している。中心的な原因は、ジストロフィン複合体の遺伝子異常であり、骨格筋および心臓組織に対する二次的損傷を伴う。実質的にすべての患者がコルチコステロイドで処置されるが、有効であると証明された処置はない。ＤＭＤに続発する心不全（ＨＦ）は、１５歳超の年齢の実質的にすべてのＤＭＤ患者が罹患しており、しばしば死の原因となる。ＤＭＤ関連ＨＦは、積極的に、初期発作（ジストロフィン複合体の遺伝子異常）から、心臓の構造および機能の無症候性異常（ステージＢ）、明白な症候性ＨＦ（ステージＣ）、進行性ＨＦ（ステージＤ）、そして死に至る。ＨＦの進行は、高い入院リスク、および全体的なヘルスケア資源の消耗に関連する。ＤＭＤ関連ＨＦの経過中の死亡様式としては、突然心臓死（これは、ＨＦが悪化するにつれて増加する）または循環虚脱に至る進行性ＨＦが挙げられる。また、ＤＭＤの後期における障害の多くは、骨格筋疾患ではなくＨＦによるものである。したがって、ＤＭＤ  ＨＦは、革新的治療のための放置されている重要な標的である。
【０００４】
心臓関連疾患および症状の治療の非常に有望な手段としては、梗塞心筋における再生、血管新生および機能的改善を刺激することができる心筋球由来細胞（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ；ＣＤＣ）が挙げられる。ＣＤＣを用いる以前のまたは進行中の試験は、ステージＢ（心機能は低下しているが、ＨＦの症候はまだ現れていない）の成人患者を対象とする。ＤＭＤ関連ＨＦでは、治療アプローチは、ステージＣおよびＤに対して最も劇的であり得る。これらの後期疾患は、最適な内科治療（これもまた、ＤＭＤ患者における疾患進行を実際に遅延することは示されていない）にもかかわらず、高い死亡率（１年当たり２０％超）に関連する。排他的な共存症により、心臓移植は、ＤＭＤ患者の選択肢ではない。これらの患者はまた、機械的循環支援デバイスの候補ではない。要約すると、現在利用可能な処置は、ＤＭＤ関連ＨＦの基礎となる病態生理（これは、機能的心筋の喪失、および生きている心筋の瘢痕への変換である）に対処しない。
【０００５】
興味深いことに、ＣＤＣの肯定的な治療利益は、間接的な機構を介して生じ、新たに再生された心筋および血管系のほとんどは、内因性起源のものであることを示唆する証拠が増加している。恐らくは、ＣＤＣが、多くの成長因子およびサイトカインを分泌する豊富な生物学的工場であるという事実により、注射した細胞が除去された後においても、ＣＤＣの有益な治療効果が何とか長く持続する。これらの好ましい因子が、ＣＤＣによって産生される細胞エキソソーム（多小胞エンドソームが原形質膜と融合した場合に細胞によって分泌される脂質二重層ナノ小胞）中に存在し得るかを理解することが重要な関心事である。これらのプロセスで分泌されたエキソソームの役割の確認はまだ検討されておらず、ＣＤＣによって開始される再生を管理するこれらのプロセスの理解は、新たな治療アプローチを開拓する可能性がある。既存の治療は、ＤＭＤ  ＨＦの進行を止めることができないので、ＣＤＣ由来エキソソームは、ＨＦの動物モデルで観察された様々な相乗的機構をリクルートすることによって、満たされていない主な医療ニーズに有効に対処し得る。これは、内因性幹細胞を心筋傷害部位に誘引し、心筋および血管への分化を促進して、場合によりＨＦの病態生理を回復させる能力を含む。従来の治療が後期患者に対して利用不可能であることを考慮すると、細胞治療の代替としてのエキソソームベースのアプローチの潜在的利益は特に魅力的である。ＣＤＣ由来エキソソームが、疾患の自然経過を根本的に変化させ得る可能性が存在する。
【０００６】
ＣＤＣ由来エキソソームの作製および治療適用に関する組成物および技術が本明細書に記載される。これらの生物学的分子は、サイトカイン、成長因子、転写因子、核酸（マイクロＲＮＡなどの非コード核酸を含む）を含む生物学的因子であって、ＣＤＣの治療効果の多くを開始および促進するように働く生物学的因子のユニークな環境を含有する。本発明者の研究は、エキソソームおよびそれらの構成マイクロＲＮＡが、傷害心臓におけるアポトーシス、炎症および線維化を有利に調節して機能回復をもたらし、組織生存を増加させることを実証する。したがって、ＣＤＣ由来エキソソームは、組織修復のための新規な「無細胞」治療候補である。
【発明の概要】
【０００７】
処置の方法であって、慢性退行性筋疾患に続発する心不全の処置を必要とする被験体を選択することと、複数のエキソソームを含む組成物を前記被験体に投与することを含み、前記複数のエキソソームが、無血清培地中で成長した心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から単離されたものであり、直径約９０ｎｍ〜約２００ｎｍのエキソソームを含み、ＣＤ８１＋、ＣＤ６３＋または両方であり、さらに、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書に記載される。他の実施形態では、慢性退行性筋疾患は、デュシェンヌ筋ジストロフィーである。他の実施形態では、組成物の投与は、単回用量で約１〜約１００ｍｇのエキソソームタンパク質を含む。他の実施形態では、単回用量を被験体に複数回投与する。他の実施形態では、組成物の投与は、注射を含む。他の実施形態では、注射は、経皮注射を含む。他の実施形態では、注射は、心筋内へ直接的である。他の実施形態では、組成物の投与は、心筋注入を含む。他の実施形態では、心筋注入は、動脈内または静脈内である。他の実施形態では、被験体の処置は、線維化の減少、炎症の減少、ミトコンドリア機能の増加および／または心筋形成の増加をもたらす。他の実施形態では、線維化の減少は、コラーゲン蓄積の減少を含む。他の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含む。他の実施形態では、炎症の減少は、細胞質核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）の増加、脂肪酸過酸化最終生成物の減少、炎症細胞の数の減少、および／または抗酸化物質の発現のアップレギュレートを含む。他の実施形態では、抗酸化物質は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、グルタミン酸−システインリガーゼ触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットを含む。他の実施形態では、炎症細胞は、ＣＤ６８＋マクロファージおよびＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、ミトコンドリア超微細構造の増加および／またはミトコンドリア生合成の増加を含む。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、核ＰＰＡＲ−γコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）発現の増加を含む。他の実施形態では、エキソソームは、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ１４８ａ、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５およびｍｉＲ−２３ａからなる群より選択される１つ以上のマイクロＲＮＡを含む。
【０００８】
処置の方法であって、慢性筋疾患に続発する心不全の処置を必要とする被験体を選択することと、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む組成物を投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書にさらに記載される。他の実施形態では、慢性筋疾患は、デュシェンヌ筋ジストロフィーである。他の実施形態では、組成物の投与は、単回用量で約１×１０5個〜約１×１０8個またはそれを超えるＣＤＣを含む。他の実施形態では、組成物の投与は、心筋注入を含む。他の実施形態では、心筋注入は、冠動脈内である。他の実施形態では、心筋注入は、動脈内または静脈内である。他の実施形態では、被験体の処置は、線維化の減少、炎症の減少、ミトコンドリア機能の増加および／または心筋形成の増加をもたらす。他の実施形態では、線維化の減少は、コラーゲン蓄積の減少を含む。他の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含む。他の実施形態では、炎症の減少は、細胞質核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）の増加、脂肪酸過酸化最終生成物の減少、炎症細胞の数の減少、および／または抗酸化物質の発現のアップレギュレートを含む。他の実施形態では、抗酸化物質は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、グルタミン酸−システインリガーゼ触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットを含む。他の実施形態では、炎症細胞は、ＣＤ６８＋マクロファージおよびＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、ミトコンドリア超微細構造の増加および／またはミトコンドリア生合成の増加を含む。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、核ＰＰＡＲ−γコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）発現の増加を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】心筋球由来細胞エキソソームの特性評価。（Ａ）心筋球由来細胞（ＣＤＣ）および正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来エキソソームペレットで測定した、両サンプルからの馴化培地と比較でのＲＮＡ含量。（Ｂ）エキソソームＲＮＡは、エキソソームの脂質二重層膜によってＲＮａｓｅ分解から保護される。ｔｒｉｔｏｎの存在下または非存在下で、エキソソームペレットをＲＮａｓｅＡで処理して、ＲＮａｓｅ媒介性分解からの保護を評価した。すべてのサンプルをプロテイナーゼＫで処理して、複合体を解離させた（さもなければこれは、ＲＮＡを遮蔽し得る）（ｎ＝技術的反復４回）。（Ｃ）ＣＤＣおよびＮＨＤＦエキソソームは、質量分析によって明らかになったように、普遍的なエキソソームマーカーを発現する。（Ｄ）保存されているＣＤ６３マーカーの発現に基づく、ＣＤＣおよびＮＨＤＦ馴化培地からのエキソソーム定量（ｎ＝技術的反復３回）。（Ｅ）ＣＤＣから単離したエキソソームの透過型電子顕微鏡による視覚化。３つの集団（サイズ別）が示されている。（Ｆ）透過型電子顕微鏡画像から測定したＣＤＣ由来エキソソームのサイズ分布；ｎ＝カウントしたエキソソーム１００個。ＣＤＣエキソソームは、血管新生を促進し、インビトロで新生ラット心筋細胞（ＮＲＣＭ）の生存および増殖を促進する。
【図２】ＣＤＣエキソソームは、ＭＩ後のマウス心臓において構造的および機能的利益をもたらす（Ａ）急性モデルでは、ＳＣＩＤ  ＢｅｉｇｅマウスはＭＩを経験しており、ＣＤＣエキソソーム、ＮＨＤＦエキソソームまたはビヒクル（対照）を心臓に注射した。１日目、１５日目および３０日目に、動物（ｎ＝動物８匹／群）をエコーし、次いで、組織学的分析のために屠殺した。ＣＤＣエキソソームは、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）を増加させる。（Ｂ〜Ｅ）ＣＤＣエキソソームの構造的利益。３つの各群由来の心臓のマッソントリクローム染色切片（Ｂ）およびプール形態学的分析（Ｃ〜Ｅ；ｎ＝心臓３つ／群）は、ＣＤＣエキソソームを注射した心臓における瘢痕の減少および生存心筋量の増加を明らかにしている。（Ｆ）慢性モデルでは、３カ月齢のＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウス（ｎ＝動物６匹／群）は、ＭＩを経験した。３週間後に、ＣＤＣエキソソームまたは対照を動物に心筋内注射した。注射２４時間前（２１日目）および３週間後（４２日目）に、機能測定を行い、その後、動物を組織学的分析のために屠殺した。（Ｇ〜Ｊ）急性ＭＩモデルと同様に、ＣＤＣエキソソームは、慢性ＭＩのモデルのマウス心臓（ｎ＝心臓４つ／群）において機能的および構造的利益をもたらす。テューキー事後検定および両側スチューデントｔ検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１および***ｐ＜０．００１。データは、平均およびＳＥＭとして表されている。図８および９も参照のこと。
【図３】エキソソーム阻害は、ＣＤＣによる利益を減少させる。（Ａ）ＧＷ４８６９は、ＣＤＣにおけるエキソソーム産生を用量依存的に阻害した（ｎ＝技術的反復３回）。（Ｂ）ＧＷ４８６９は、ＧＷ４８６９またはその溶媒ＤＭＳＯで処理したＣＤＣのカルセインアッセイによって示されるように、ＣＤＣ生存率に影響を与えない（ｎ＝技術的反復４回）。（ＣおよびＤ）チャンバースライド上で、新生ラット心筋細胞（ＮＲＣＭ）を培養し、ＧＷ４８６９またはＤＭＳＯのいずれかに曝露したＣＤＣによって馴化した培地で処理した。次いで、ＮＲＣＭを培養培地で処理し、５日後、Ｋｉ６７およびＴＵＮＥＬについてスライドを染色して、増殖およびアポトーシスを評価した（ｎ＝技術的反復４回／群）。（Ｅ）左心室駆出率のプールデータ（ｎ＝動物８匹／群）。（Ｆ〜Ｉ）２つの群の代表的なマッソントリクローム染色心臓切片（Ｆ）およびプール形態学的分析（Ｇ〜Ｉ；ｎ＝心臓４つ／群）は、ＧＷ８６９処理ＣＤＣを注射した心臓における瘢痕量、生存心筋量および梗塞壁厚（ＩＷＴ）のプールデータで明らかなように、ＣＤＣによる利益の減損を明らかにしている。スチューデントｔ検定を使用して、*ｐ＜０．０５および**ｐ＜０．０１。データは、平均およびＳＥＭとして表されている。図１０も参照のこと。
【図４】ｍｉＲ−１４６ａは、ＣＤＣエキソソームにおいて非常に豊富であり、インビトロおよびインビボで治療利益を与える。（Ａ）ＮＨＤＦエキソソームと比較した、ＣＤＣエキソソームにおけるマイクロＲＮＡ存在量の倍率変化（ｎ＝４回の独立した実験）。ＣＤＣエキソソームおよびＮＨＤＦエキソソームから、全ＲＮＡ（マイクロＲＮＡを含む）を単離した。マイクロＲＮＡアレイによって、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。（Ｂ）ＣＤＣエキソソームとＮＨＤＦエキソソームと間の可変マイクロＲＮＡプロファイルを示すベン図。フォントサイズは、各マイクロＲＮＡの差次的発現の規模を反映する。（Ｃ）ＣＤＣ由来エキソソームで処理した梗塞マウス心臓は、ＮＨＤＦエキソソーム処理心臓と比較して高レベルのｍｉＲ−１４６ａを有する（ｎ＝動物２匹／群、技術的反復３回／群）。（Ｄ）ｍｉＲ−１４６ａは、ストレス負荷された新生ラット心筋細胞を保護する。８０ｎＭ  ｍｉＲ−１４６ａ模倣物または模倣物対照で心筋細胞を前処理し、次いで、無血清培地中で１００ｍＭ過酸化水素に２．５時間曝露した（ｎ＝技術的反復４回；研究対象の新生ラット心筋細胞は、３匹の異なる母からの２０〜３０匹の仔ラットに由来していた）。（Ｅ）ｍｉＲ−１４６ａ処理心筋細胞と模倣物対照処理心筋細胞との間のｍＲＮＡ存在量の倍率差を示すマイクロアレイデータ。ｍｉＲ−１４６ａは、ストレス負荷された新生ラット心筋細胞におけるＩｒａｋ１およびＴｒａｆ６を抑制する。（Ｆ）急性ＭＩ後に、ｍｉＲ−１４６ａ欠損動物は、心機能および心構造が重度に損なわれている。左室駆出率のプールデータ（ｎ＝動物８匹／群）。（Ｇ〜Ｊ）３つの群の代表的なマッソントリクローム染色心臓切片（Ｇ）およびプール形態学的分析（Ｈ〜Ｊ；ｎ＝心臓４つ／群）は、ＧＷ８６９処理ＣＤＣを注射した心臓における瘢痕量、生存心筋量および梗塞壁厚（ＩＷＴ）のプールデータで明らかなように、ＣＤＣによる利益の減損を明らかにしている。*ｐ＜０．０５、｛ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１および｛｛スチューデントｔ検定を使用して、ｐ＜０．０１（*ＫＯ対ＷＴ；｛ＫＯ対ＫＯ−Ｒ）。データは、平均およびＳＥＭとして表されている。図１１および１２も参照のこと。
【図５】ｍｉＲ−１４６Ａは、ＭＬの急性および慢性マウスモデルにおける収縮機能を改善する（Ａ）ＣＤＣエキソソームのｍｉＲ−１４６ａノックダウンは、ストレス負荷されたＮＲＶＭをインビトロで保護するそれらの能力を低下させる（ｎ＝技術的反復３回；新生ラット心筋細胞は、３匹の異なる母からの２０〜３０匹の仔ラットに由来していた）。ｍｉＲ−１４６ａ阻害剤、またはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓマイクロＲＮＡベースの配列を有するヘアピン対照（ＨＰ−ＣＴＲＬ）のいずれかで、ＣＤＣをトランスフェクトした。（Ｂ〜Ｆ）急性ＭＩプロトコールデータ。左室駆出率の時間経過（ｎ＝動物６匹／群；Ｂ）。２つの各群の代表的なマッソントリクローム染色心臓切片（Ｃ）およびプール形態学的分析（ｎ＝心臓４つ／群）は、マイクロＲＮＡ対照と比較した、ｍｉＲ−１４６ａで処理した動物における瘢痕量の減少、生存心筋量の増加および梗塞壁厚の増加を明らかにしている（Ｄ〜Ｆ）。（Ｇ〜Ｌ）ｍｉＲ−１４６ａは、慢性ＭＩのマウスモデルのＣＤＣエキソソーム処理心臓に見られる構造的および機能的利益のいくつかを再現する（ＭＩ後２１日目に注射したｍｉＲ−１４６ａ模倣物または模倣物対照；ｎ＝動物６匹／群）。３週間後（４２日目）に、ｍｉＲ−１４６ａで処理した動物は、対照と同程度の心機能を示したが（Ｇ）、有害なリモデリングは有意に減少した（Ｈ）。瘢痕量も同様であった（Ｉ）。生存率および梗塞壁厚は、有意な構造的利益であったが（ＪおよびＫ）、瘢痕量は減少しなかった（Ｉ）。スチューデントｔ検定を使用して、分析を行った；*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１および***ｐ＜０．００１。データは、平均およびＳＥＭとして表されている。図１２および１３も参照のこと。
【図６】ｍｉＲ−１４６ａは、ＭＩ病理に関与する遺伝子をターゲティングする。（ＡおよびＢ）ｍｉＲ−１４６Ａまたは模倣物対照を注射した７日後の慢性ＭＩマウス心臓における公知のｍｉＲ−１４６ａ標的のダウンレギュレーション。（Ａ）ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＳＭＡＤ４、ＮＯＸ４およびＭＰＯ（好中球浸潤のマーカー）のウエスタンブロット。１群当たり２つの心臓からプールしたタンパク質溶解物を各ウェルにロードしており、ブロットは、２匹の各動物のプールサンプルを表す（ｎ＝技術的反復４回）。（Ｂ）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した（Ａ）のブロットのデンシトメトリー分析。（Ｃ）本発明者らの研究仮説の略図。ＣＤＣは、傷害心筋において機能的および構造的利益を主にパラクリン的に促進する。ＣＤＣは、傷害心筋における利益を媒介するマイクロＲＮＡを含有するエキソソームを分泌する。これらのマイクロＲＮＡは、様々な心筋区画における転写産物をターゲティングし、ＭＩ後に心機能の増加、生存組織の増加および瘢痕の減少が最終的にもたらされる。
【図７】ＣＤＣからのエキソソームの単離。（Ａ）エキソソームの単離およびエキソソームの精製のグラフ表示。（Ｂ）１５日間の無血清馴化期間にわたってＣＤＣで実施した細胞生存（カルセイン）および細胞死（エチジウムホモダイマー−１）アッセイ。（Ｃ）無血清馴化前後のＣＤＣの代表的な画像。
【図８】ＣＤＣエキソソームは、急性ＭＩのマウスモデルにおける炎症を低減する。（Ａ）４０個の炎症促進性マーカーの代表的なタンパク質アレイ。（Ｂ）ＣＤＣエキソソーム、ＮＨＤＦエキソソームまたは対照で処理したマウス心臓における炎症性タンパク質の定量。データは、１群当たり３つのマウス心臓からのものである。一元配置ＡＮＯＶＡ（９５％ＣＩ）を使用して、分析を行った（ｎ＝心臓３つ／群）。データは、平均および平均の標準誤差として表されている。
【図９】ＣＤＣエキソソームは、ＭＩ後のマウス心臓において構造的および機能的利益をもたらす。ＣＤＣエキソソームは、慢性ＭＩのマウスモデルにおいて機能的改善を刺激し、有害なリモデリングおよび心肥大を軽減する。ＣＤＣエキソソームで処理した動物は、部分面積変化（Ａ）、収縮末期容積（Ｂ）および拡張末期容積（Ｃ）（Ａ〜Ｃ、ｎ＝動物６匹／群）によって示されるように、対照と比較して有意な機能的改善を示した。ＣＤＣエキソソームで処理した動物はまた、瘢痕（Ｄ）である組織切片の周囲の割合、コムギ胚芽凝集素およびＤＡＰＩ（Ｆ）で染色することによって測定した心筋細胞肥大の減少（Ｅ）、ならびに梗塞領域における血管新生の増加（Ｇ）に見られるように、構造的改善を示した。ＣＤＣエキソソーム処理動物の境界領域では、対照と比較して少ない心筋細胞死が観察された。（Ｈ、Ｉ）（Ｄ〜Ｉ  ｎ＝心臓４つ／群）スチューデントｔ検定を使用して、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。スケールバーはすべて、５０μｍを表す。データは、平均および平均の標準誤差として表されている。
【図１０】ＣＤＣにおけるエキソソーム分泌の阻害は、インビトロでＣＤＣの保護効果を低下させる。５０μΜ  Ｈ２０２で新生ラット心室筋細胞を１５分間ストレス負荷し、続いて、５μΜのスピロエポキシド、２０μΜのＧＷ４８６９またはビヒクル（ＤＭＳＯ）で前処理したＣＤＣでトランスウェル処理した。（Ａ）ＴＵＮＥＬ染色（赤色）、ファロイジン（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）を使用して、細胞死を測定した。（Ｂ）カウントした全細胞のＴＵＮＥＬ陽性心筋細胞核の割合として表される４つの群のプールデータ（ｎ＝技術的反復３回、新生ラット心筋細胞は、３匹の異なる母からの２０〜３０匹の仔ラットに由来していた）（Ｂ）。スチューデントｔ検定を使用して、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。スケールバーはすべて、５０μｍを表す。データは、平均および平均の標準誤差として表されている。
【図１１】Ｍｉｒ  ＰＣＲアレイのヒートマップは、最も差次的に発現されたマイクロＲＮＡとしてＭｉｒ−１４６ａを同定する。ＰＣＲアレイプレートレイアウト上にオーバーレイしたＣＤＣエキソソームとＮＨＤＦエキソソームとの間の転写産物の差次的な存在量の調節倍率のデータを示すヒートマップ。
【図１２】ｍｉＲ−１４６ａは、ストレス負荷された新生ラット心筋細胞を保護する。（Ａ）８０ｎＭ  ｍｉＲ−１４６ａ模倣物または模倣物対照で心筋細胞を前処理し、次いで、５ｍＭ塩化コバルトに２時間曝露した（ｎ＝技術的反復４回／群、新生ラット心筋細胞は、３匹の異なる母からの２０〜３０匹の仔ラットに由来していた）（Ｂ、Ｃ）ｍｉｒ−１４６ａヘアピン阻害剤でトランスフェクトしたＣＤＣに由来するＣＤＣエキソソーム。エキソソームは馴化培地に由来し、エキソソームにおけるｑＰＣＲによって、ｍｉｒｌ４６ａノックダウンを確認した。（Ｃ）対照と比較した、１４６ａフリーエキソソームで処理したＮＲＶＭにおけるｍｉｒ−１４６ａレベルの低下（ｎ＝技術的反復３回／群、新生ラット心筋細胞は、３匹の異なる母からの２０〜３０匹の仔ラットに由来していた）。影響を受けた経路を示すトランスクリプトームデータに由来する経路分析および（Ｂ）マイクロアレイデータ分析に基づく推定ハブとしてのＭＹＣ活性化を示す経路図。
【図１３】ｍｉＲ−１４６ａは、ＣＤＣエキソソームの全部ではないが一部の効果を再現する。ｍｉＲ−１４６ａは、慢性ＭＩのマウスモデルにおいて有害なリモデリングおよび心肥大を軽減する。（Ａ、Ｃ）ＣＤＣエキソソームで処理した動物は、部分面積変化（Ａ）、収縮末期容積（Ｂ）および拡張末期容積（ＡＣ、ｎ＝動物６匹／群）によって示されるように、対照と比較して有意な機能的改善を示さなかった。しかしながら、瘢痕（Ｄ）である組織切片の周囲の割合、コムギ胚芽凝集素およびＤＡＰＩで染色することによって測定した心筋細胞肥大の減少（Ｅ）に見られるように、構造的改善が認められた。２つの群間で、血管新生の差異は観察されなかった（Ｇ）。ｍｉｒ  １４６ａ処理動物の境界領域では、対照と比較して少ない心筋細胞死が観察された。（Ｈ、Ｉ）（Ｄ〜Ｉ  ｎ＝心臓４つ／群）スチューデントｔ検定を使用して、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。スケールバーはすべて、５０μｍを表す。データは、平均および平均の標準誤差として表されている。
【図１４】ＣＤＣ処理は、Ｎｒｆ２抗酸化経路の活性を強化し、Ｎｒｆ２下流遺伝子産物の発現を増加させた。（Ａ）ビヒクル（Ｍｄｘ＋ビヒクル）またはＣＤＣ（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）で処理した３週間後のｍｄｘマウス心臓におけるＮｒｆ２を示す代表的な免疫組織化学的画像。年齢適合野生型マウス（ＣＴＬ）は、対照としての役割を果たした。（Ｂ）および（Ｃ）：ビヒクルまたはＣＤＣで処理した３週間後のｍｄｘマウス心臓における細胞質および核Ｎｒｆ２含量（Ｂ）およびＮｒｆ２下流遺伝子産物（ＨＯ−１、グルタミン酸−システインリガーゼの調節（ＧＣＬＭ）および触媒（ＧＣＬＣ）サブユニット、ＳＯＤ−１、カタラーゼおよびＳＯＤ−２）のタンパク質存在量（Ｃ）を実証する代表的なウエスタンブロットおよびプールデータ。１０カ月齢時に、実験マウスをリクルートした。ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスでは、細胞質におけるリン酸化Ｎｒｆ２（Ｎｒｆ２−ｐｓ４０）の顕著な増加は、核Ｎｒｆ２含量の増大およびＮｒｆ２下流遺伝子産物の発現の増加を伴っていた（Ｂ、Ｃ）。データは、平均±ＳＥＭである；各群でｎ＝７。†Ｍｄｘ＋ビヒクルおよび対照（ＣＴＬ；野生型）との対比で、Ｐ＜０．０５；スケールバー：５μｍ。
【図１５】Ｍｄｘマウスの心臓組織では、ＣＤＣ処理は、ミトコンドリアの構造および含量を顕著に回復させ、呼吸鎖サブユニットの発現を増強した。（Ａ）：ビヒクル（Ｍｄｘ＋ビヒクル）またはＣＤＣ（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）で処理した３週間後のｍｄｘマウスにおける心筋細胞ミトコンドリアの透過型電子顕微鏡の代表的な画像。１０カ月齢のｍｄｘマウスの心筋細胞では、クリステが変化した（円形／管状の）細長いミトコンドリアが優勢であった。ＣＤＣ処理は、心筋細胞のミトコンドリアサイズおよびクリステ構造（層状クリステ）を有意に回復させた。（Ｂ）：処理３週間後のビヒクル／ＣＤＣ処理Ｍｄｘマウスおよび年齢適合野生型マウス（ＣＴＬ）の心臓組織における核Ｎｒｆｌタンパク質含量ならびに細胞質および核ミトコンドリア転写因子Ａ（ｍｔＴＦＡ）のタンパク質存在量を示す代表的なウエスタンブロットおよびプールデータ。（Ｃ）：処理３週間後の実験動物の心臓組織におけるミトコンドリアＤＮＡコピー数／細胞を実証する棒グラフ。（Ｄ）：ビヒクル（Ｍｄｘ＋ビヒクル）およびＣＤＣ（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）で処理した３週間後のＭｄｘマウスの心臓組織におけるミトコンドリア呼吸鎖サブユニットのタンパク質含量を示す代表的なウエスタンブロットおよびプールデータ。ＮｒｆｌおよびｍｔＴＦＡの同時アップレギュレーションは、ミトコンドリアＤＮＡコピー数の増加に関連しており、ミトコンドリア呼吸鎖サブユニットの発現の回復を伴っていた。ＰＣ*：陽性対照。データは、平均±ＳＥＭである；各群でｎ＝７。†Ｍｄｘ＋ビヒクルおよび対照（ＣＴＬ；野生型）との対比で、Ｐ＜０．０５；††Ｍｄｘ＋ＣＤＣおよび対照（ＣＴＬ；野生型）との対比で、Ｐ＜０．００１。
【図１６】１０カ月齢のＭｄｘマウスの心臓における超微細構造変性変化は、ＣＤＣで処理した３週間後に顕著に減少した。（Ａ）：１０カ月齢のＭｄｘマウスにおける非晶質タンパク質の細胞内蓄積、サルコメアの広範な破壊および不規則性（Ｚストリーミング）、ならびに原線維間ミトコンドリアの無秩序な変化を示す心筋細胞の透過型電子顕微鏡の代表的な画像。心筋内注射３週間後に、ＣＤＣは、心筋細胞の変性変化を顕著に減少させた。（Ｂ）：野生型対照マウス（ＣＴＬ）ならびに処理３週間後のビヒクル−（Ｍｄｘ＋ビヒクル）およびＣＤＣ処理Ｍｄｘマウス（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）のミトコンドリアにおけるミトコンドリアの平均長ならびに円形クリステの総数および割合（％）を示す棒グラフ。データは、平均±ＳＥＭである；†Ｍｄｘ＋ＣＤＣおよび対照（ＣＴＬ；野生型）との対比で、Ｐ＜０．００５；††Ｍｄｘ＋ビヒクルおよび対照（ＣＴＬ；野生型）との対比で、Ｐ＜０．００５。
【図１７】ＣＤＣ処理は、心臓コラーゲン含量および線維化を減少させた。ビヒクル（Ｍｄｘ＋ビヒクル）またはＣＤＣ（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）で処理した３週間後のｍｄｘマウス心臓における線維化およびコラーゲン含量を表す代表的なマッソントリクローム画像（Ａ）ならびにウエスタンブロットおよびプールデータ（Ｂ）。年齢適合野生型マウス（ＣＴＬ）は、対照としての役割を果たした。コラーゲンのバンドサイズ：９０〜１５０ｋＤａ。データは、平均±ＳＥＭである；各群でｎ＝７；†Ｍｄｘ＋ＣＤＣおよび対照（ＣＴＬ；野生型）との対比で、Ｐ＜０．０１。スケールバー：１ｍｍ
【図１８】ＣＤＣ処理は、心筋細胞のサイクリングおよび増殖を増加させ、心臓系列に分化するＣ−Ｋｉｔ陽性細胞（Ｃ−Ｋｉｔ＋Ｎｋｘ２．５＋）の数を増大させた。１０カ月齢時に処理したＭｄｘマウスの代表的な免疫組織化学的画像およびプールデータ（（Ａ）〜（Ｃ）；Ｋｉ６７（Ａ）、ａｕｒｏｒａ  Ｂ（Ｂ）、ｃ−ｋｉｔおよびＮｋｘ２．５（Ｃ）について染色したＣＴＬ［野生型］、ビヒクルおよびＣＤＣ処理Ｍｄｘマウス心臓）。矢印は、Ｋｉ６７＋（Ａ）およびａｕｒｏｒａ  Ｂ＋（Ｂ）心筋細胞、ならびにｃ−ｋｉｔおよびＮｋｘ２．５の両方について陽性の細胞（Ｃ）を指す。サイクリング（Ｋｉ６７＋）および増殖（Ａｕｒｏｒａ  Ｂ＋）心筋細胞の比率は、Ｋｉ６７＋およびａｕｒｏｒａ  Ｂ＋心筋細胞の数を強拡大視野（ＨＰＦ）当たりの心筋細胞の総数で割ったものとして表されている（プールデータ（Ａ）、（Ｂ））。ｃ−ｋｉｔ＋Ｎｋｘ２．５＋細胞の割合は、ｃ−ｋｉｔ＋Ｎｋｘ２．５＋細胞の数をＨＰＦ当たりの心筋細胞の総数で割ったものとして計算した（プールデータ（Ｃ））。細胞膜の染色および描写のために、ＷＧＡ（コムギ胚芽凝集素）を適用した。データは、平均±ＳＥＭである；各群でｎ＝７。†Ｍｄｘ＋ビヒクルおよび対照（ＣＴＬ；野生型）との対比で、Ｐ＜０．０１。スケールバー：１０μｍ。
【図１９】心筋球由来細胞（ＣＤＣ）移植後の機能的利益。左心室駆出率（ＥＦ）ならびにＬＶ拡張末期（ＬＶ  ＥＤＶ）および収縮末期（ＬＶ  ＥＳＶ）容積のプールデータは、１０カ月齢時にＣＤＣを投与したＭｄｘマウスでは、ＣＤＣ移植が、３カ月間にわたるＥＦ、ＬＶ  ＥＤＶおよびＬＶ  ＥＳＶの持続的改善をもたらしたことを示す。データは、平均±ＳＥＭである；ｎ＝５（対照野生型）およびｎ＝１２（Ｍｄｘ＋ビヒクル、Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）。*Ｇｑ＋ＣＤＣとの対比で、Ｐ＜０．０５；***Ｇｑ＋ＣＤＣ．との対比で、Ｐ＜０．００１。
【図２０】ＣＤＣ処理による最大運動能力の改善。年齢適合野生型マウス（ＣＴＬ）およびビヒクル（Ｍｄｘ＋ビヒクル）またはＣＤＣ（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）で処理した１０カ月齢のＭｄｘマウスを、ＣＤＣ／ビヒクル処理３週間後から高強度運動（疲労するまで、平均速度を２分ごとに段階的に増加させた）に週１回供した。ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスでは、ビヒクル処理マウスと比べて、運動能力の持続的改善が観察された。データは、平均±ＳＥＭである；ｎ＝６（対照野生型）およびｎ＝１１（Ｍｄｘ＋ビヒクル、Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）。*Ｇｑ＋ビヒクルとの対比で、Ｐ＜０．０５。
【図２１】ヒトＣＤＣ由来エキソソームの移植後の機能的利益。左心室駆出率（ＥＦ）ならびにＬＶ拡張末期（ＬＶ  ＥＤＶ）および収縮末期（ＬＶ  ＥＳＶ）容積のプールデータは、１０カ月齢のＭｄｘマウスでは、エキソソーム移植が、心筋内注射３週間後にＥＦ、ＬＶ  ＥＤＶおよびＬＶ  ＥＳＶの改善をもたらしたことを示す。データは、平均±ＳＥＭである；各群でｎ＝１１。*Ｇｑ＋ＣＤＣとの対比で、Ｐ＜０．０５。
【図２２】ＣＤＣ由来エキソソームは、心臓コラーゲン含量および線維化を低減する。ビヒクル（Ｍｄｘ＋ビヒクル）またはエキソソーム（Ｍｄｘ＋ＸＯ）で処理した３週間後のｍｄｘマウス心臓におけるコラーゲンＩおよびＩＩＩタンパク質含量を示す代表的なウエスタンブロットおよびプールデータ。年齢適合野生型マウス（ＣＴＬ）は、対照としての役割を果たした。コラーゲンのバンドサイズ：９０〜１５０ｋＤａ。データは、平均±ＳＥＭである；各群でｎ＝７。†Ｍｄｘ＋ＸＯおよび対照（ＣＴＬ；野生型）との対比で、Ｐ＜０．０１。
【図２３】ｍｄｘマウスにおけるＣＤＣ移植によって改善された機能、生存および抗酸化経路。Ａ：ベースライン時（１０カ月齢）および３カ月後（それぞれｎ＝１２）の注射に応じた、ＣＤＣ注射ｍｄｘマウス（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）およびビヒクル注射ｍｄｘマウス（Ｍｄｘ＋ビヒクル）における駆出率（ＥＦ）。Ｂ：ＣＤＣまたはビヒクルを投与した３週間後から高強度トレッドミル運動に週１回供したマウスにおける運動能力（ＣＴＬ：ｎ＝７；Ｍｄｘ＋ビヒクルおよびＭｄｘ＋ＣＤＣ：それぞれｎ＝１１）。Ｃ：Ｂと同じ動物における生存率のカプラン・マイヤー分析は、ビヒクル処理ｍｄｘマウスでは、ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスまたは野生型対照よりも、生存率が低いことを示す（ｐ＜０．００１、ログランク検定）；しかしながら、後者の２つの群は、統計的に同程度であった。Ｄ：ビヒクルまたはＣＤＣを投与した３週間後のｍｄｘマウス心臓におけるＮｒｆ２の免疫組織化学的画像。年齢適合野生型マウス（ＣＴＬ）は、対照としての役割を果たした。スケールバー：１０μｍ。Ｅ：ビヒクルまたはＣＤＣを投与した３週間後のｍｄｘマウス心臓におけるリン酸化Ａｋｔ（Ａｋｔ−ｐT308）、細胞質リン酸化Ｎｒｆ２（Ｎｒｆ２−ｐS40）、核Ｎｒｆ２および下流遺伝子産物（ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ−２）、およびグルタミン酸−システインリガーゼ（ＧＣＬＣ）の触媒サブユニットのタンパク質存在量のウエスタンブロットおよびプールデータ（ｎ＝４〜６）。Ｆ：注射３週間後の心筋マロンジアルデヒドタンパク質付加物のプールデータおよび代表的なウエスタンブロットは、Ｍｄｘ＋ＣＤＣにおける酸化ストレスの軽減を示す。プールデータは、平均±ＳＥＭである。*Ｍｄｘ＋ＣＤＣとの対比で、Ｐ＜０．０５；＃Ｍｄｘ＋ＣＤＣとの対比で、Ｐ＜０．００５；†Ｍｄｘ＋ビヒクルおよびＣＴＬ（ＷＴ、野生型マウス）との対比で、Ｐ＜０．０５；‡Ｍｄｘ＋ＣＤＣおよびＣＴＬ（ＷＴ、野生型マウス）との対比で、Ｐ＜０．００２。
【図２４】ｍｄｘマウス心臓におけるＣＤＣ移植によって軽減されたミトコンドリア機能不全および炎症。Ａ：ビヒクル（Ｍｄｘ＋ビヒクル）またはＣＤＣ（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）を投与した３週間後のｍｄｘマウス心臓の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。年齢適合野生型マウス（ＣＴＬ）は、対照としての役割を果たした。Ｂ：ＴＥＭ画像のミトコンドリアの数。Ｃ：処理３週間後の心臓組織におけるミトコンドリアＤＮＡコピー数（核ゲノム当たり）。Ｄ：処理３週間後のＣＴＬおよびｍｄｘマウス由来の心臓組織におけるミトコンドリア呼吸鎖サブユニットの代表的なウエスタンブロットおよびプールデータ（ｎ＝４〜６／群）。Ｅ：ＣＴＬおよび処理３週間後のＣＤＣまたはビヒクル処理ｍｄｘマウスの心臓から単離したミトコンドリアの酸素消費速度（ＯＣＲ）（ＣＴＬ：ｎ＝３；Ｍｄｘ＋ビヒクルおよびＭｄｘ＋ＣＤＣ：それぞれｎ＝８）。示されている場合には、酸化的リン酸化の基質（ピルビン酸、リンゴ酸およびＡＤＰ）、選択的脱共役剤（ＦＣＣＰ）および遮断剤（オリゴマイシン［Ｏｌｉｇ．］；アンチマイシンおよびロテノン［Ａｎｔｉ．＆Ｒｏｔ．］）を適用した。Ｆ：ｍｄｘマウス心臓におけるＣＤＣ投与３日後および３週間後のミトコンドリアＰＩＮＫ１および核ＰＰＡＲγコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）のタンパク質存在量を示すウエスタンブロットおよびプールデータ（ｎ＝４〜６）。Ｇ：炎症細胞マーカーＣＤ６８、ＣＤ２０およびＣＤ３について染色した心臓の免疫組織化学的画像。Ｈ：ｍｄｘマウス心臓における示されている炎症細胞の平均数を表すウエスタンブロット、プールデータおよび棒グラフ（右下）。ＣＤＣ処理マウスでは、ＣＤ６８＋マクロファージ（上段）およびＣＤ３＋Ｔ細胞（下段）の蓄積は、ＮＦ−κＢ経路の阻害に関連して減少していた。データは、平均±ＳＥＭである。†Ｍｄｘ＋ビヒクルおよびＣＴＬ（ＷＴ、野生型マウス）との対比で、Ｐ＜０．０５；‡Ｍｄｘ＋ＣＤＣおよびＣＴＬ（ＷＴ、野生型マウス）との対比で、Ｐ＜０．００３；＊Ｍｄｘ＋ＣＤＣとの対比で、Ｐ＜０．０５。スケールバー：５μｍ（Ａ）；１０μｍ（Ｇ）。
【図２５】ＣＤＣエキソソームは、ｍｄｘマウスにおいてＣＤＣの利益を再現する。Ａ：ｍｄｘマウスにおける２回の各ＣＤＣエキソソーム逐次注射による少なくとも３カ月間にわたる持続的な機能的利益（ｎ＝１１）。ＢおよびＣ：ＣＤＣエキソソームを注射した３週間後における心臓コラーゲン含量の減少（Ｂ）および心筋形成の増強（Ｃ）。心臓コラーゲンＩＡおよびＩＩＩＡ（Ｂ）のウエスタンブロットおよびプールデータ、ならびに免疫組織化学的画像およびプールデータ（Ｃ：Ｋｉ６７［Ｃ１］およびＡｕｒｏｒａ  Ｂ［Ｃ２］について染色したＣＴＬ［野生型］、ビヒクルおよびＣＤＣエキソソーム処理［Ｍｄｘ＋ＸＯ］ｍｄｘマウス心臓；ｎ＝４〜６／群）。矢印は、Ｋｉ６７+（ＣＩ）およびＡｕｒｏｒａ  Ｂ+（Ｃ２）心筋細胞を指す。細胞膜の染色および描写のために、ＷＧＡ（コムギ胚芽凝集素）を適用した。データは、平均±ＳＥＭである；*Ｍｄｘ＋ＸＯとの対比で、Ｐ＜０．０５；†Ｍｄｘ＋ビヒクルおよびＣＴＬ（ＷＴ、野生型マウス）との対比で、Ｐ＜０．０２；‡Ｍｄｘ＋ＸＯおよびＣＴＬ（ＷＴ、野生型マウス）との対比で、Ｐ＜０．０１、スケールバー：１０μｍ。
【図２６】ヒトデュシェンヌ心筋細胞におけるＣＤＣエキソソームおよびｍｄｘマウスにおけるｍｉＲ−１４８。Ａ：１Ｈｚバーストペーシング中に測定した正常およびデュシェンヌヒトｉＰＳ由来心筋細胞のカルシウムトランジェント。評価１週間前にビヒクル（ＤＭＤ  ＣＭ）またはＣＤＣエキソソーム（ＤＭＤ  ＣＭ＋ＸＯ）でプライミングしたデュシェンヌ心筋細胞。カルシウムトランジェントの棒グラフ：ピーク到達時間および交互脈（心拍間隔のカルシウムトランジェント振幅の変動）。Ｂ：酸素消費速度（ＯＣＲ）測定１週間前にＣＤＣエキソソーム［ＤＭＤ  ＣＭ（ＣＤＣ−ＸＯ）］または正常ヒト真皮線維芽細胞由来エキソソーム［ＮＨＤＦ、対照として；ＤＭＤ  ＣＭ（ＮＨＤＦ−ＸＯ+）］でプライミングしたヒトデュシェンヌ心筋細胞におけるＯＣＲ。正常（正常ＣＭ）および非処理デュシェンヌ心筋細胞（ＤＭＤ  ＣＭ）を並行して研究した。略語については、図２の凡例を参照のこと。Ｃ：正常酸素馴化培地（ｎ＝２）から単離したＣＤＣエキソソームと比較した、低酸素馴化培地（２％Ｏ２）から単離したＣＤＣエキソソームにおけるマイクロＲＮＡの差次的発現（２０超の配列ヒットを有するｍｉＲのみを含む）。Ｄ：ｍｉＲ−１４８模倣物の心筋内注射は、処理３週間後のｍｄｘマウス心臓において心機能を部分的に回復した。Ｅ：ｍｉＲ−１４８処理３週間後のｍｄｘマウス心臓における核ｐ６５（左）およびリン酸化Ａｋｔ（右）のウエスタンブロットおよびプールデータ。Ｆ：デュシェンヌ心筋症で機能する病態生理学的機構ならびにＣＤＣおよびそれらのエキソソーム（ＸＯ）によってリクルートされる細胞機構の模式図。すべてのデータは、ボックスプロットを除いて平均±ＳＥＭである（平均±ＳＤ）。
【図２７】心筋球由来細胞（ＣＤＣ）、ＣＤＣエキソソーム（ＣＤＣ−ＸＯ）およびｍｉＲ−１４８投与後のＬＶ拡張末期（ＬＶ  ＥＤＶ）および収縮末期（ＬＶ  ＥＳＶ）容積。ＣＤＣおよびＣＤＣ−ＸＯ移植は、プラセボと比べて、ｍｄｘマウスにおいて、１回目および２回目（３カ月間隔）の両方の注射後に３カ月間にわたるＬＶ  ＥＤＶおよびＬＶ  ＥＳＶの持続的改善をもたらした。ｍｉＲ１４８注射３週間後に、ＬＶ  ＥＤＶおよびＬＶ  ＥＳＶは部分的に改善した。データは、平均±ＳＥＭである；各群でｎ＝１２。＃Ｍｄｘ＋ビヒクルとの対比で、Ｐ＜０．０５。
【図２８】移植１週間後、２週間後および３週間後のＣＤＣの生着率。１週間の時点のＣＤＣの生着率は約８％であり、２週間の時点では１％超であった。３週間で、生存ＣＤＣを検出することができなかった（各時点でｎ＝３）。
【図２９】ｍｄｘマウスにおけるＣＤＣ処理による心筋形成および線維化の減少。ｍｄｘマウスにおけるＣＤＣ注射３週間後の心筋形成の増強（ＡおよびＢ）ならびに心筋線維化（Ｃ）およびコラーゲン含量（Ｄ）の減少。代表的な免疫組織化学的画像およびプールデータ（ＡおよびＢ：Ｋｉ６７［Ａ］およびＡｕｒｏｒａ  Ｂ［Ｂ］について染色したＣＴＬ［野生型］、ビヒクルおよびＣＤＣ処理［Ｍｄｘ＋ＣＤＣ］ｍｄｘマウス心臓；ｎ＝４〜６／群）。矢印は、Ｋｉ６７+（Ａ）およびＡｕｒｏｒａ  Ｂ+（Ｂ）心筋細胞を指す。心臓コラーゲンＩＡおよびＩＩＩＡを示す代表的なマッソントリクローム画像（Ｃ）ならびにウエスタンブロットおよびプールデータ（Ｄ）。データは、平均±ＳＥＭである；Ｍｄｘ＋ビヒクルおよびＣＴＬ（対照）との対比で、Ｐ＜０．０５；＃Ｍｄｘ＋ＣＤＣおよびＣＴＬ（対照）との対比で、Ｐ＜０．０５。スケールバー：１０μｍ（Ａ）。
【図３０】低酸素馴化培地から単離したＣＤＣエキソソームにおけるマイクロＲＮＡの倍率変化。低酸素条件下（２％Ｏ2）と、正常酸素馴化培地から単離したＣＤＣエキソソームと比較の比較；１０倍超かつ２０倍未満の倍率変化が含まれていた。エキソソームから抽出した低分子ＲＮＡのｍｉＲＮＡ配列ライブラリー調製のために、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用した。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用して、エキソソームからＲＮＡを抽出した。
【図３１】超遠心分離によって単離したエキソソームを、ナノ粒子追跡によって分析した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００システム（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用してビデオを収集し、ＮＴＡソフトウェア（バージョン２．３）を使用して分析した（最小予想粒子サイズ、最小トラック長およびぼかしの設定はすべて、自動に設定した）。カメラシャッタースピードを３０．０１ミリ秒に固定し、カメラゲインを５００に設定した。カメラ感度および検出閾値をそれぞれほぼ最大（１５または１６）および最小（３または４）に設定して、小粒子を表示させた。２４〜２７℃の範囲で、周囲温度を手動で記録した。各サンプルについて、記録間に１０秒間の遅延を入れた６０秒間のビデオを５回記録して、５つのリプリケートヒストグラムを作製し、これを平均化した。サイズ／濃度を示す代表的な５つのリプリケートヒストグラム。５回反復で計算した平均濃度の標準誤差は、右のグラフにおいて赤色で示されている。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、完全に記載されているかのようにその全体が参照により組み込まれる。特に定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２２ndｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，２０１２）；Ｈｏｒｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３rdｅｄ．，ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）；Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７thｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２０１３）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３rdｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８，２０１２）；およびＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願で使用される用語の多くに関する一般的なガイドを当業者に提供する。抗体の調製方法の参考文献については、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ndｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，２０１３）；Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６  Ｊｕｌ，６（７）：５１１−９；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，米国特許第５，５８５，０８９号（１９９６  Ｄｅｃ）；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｍａｒ  ２４，３３２（６１６２）：３２３−７を参照のこと。
【００１１】
当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法および材料であって、本発明の実施に使用され得る方法および材料を認識する。実際、本発明は、記載されている方法および材料に決して限定されない。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【００１２】
本明細書の説明および以下の特許請求の範囲を通して使用される「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味は、特に文脈上明確な指示がない限り、複数の対象を含む。また、本明細書の説明で使用される「ｉｎ」の意味は、特に文脈上明確な指示がない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。
【００１３】
早期死亡につながる厄介な遺伝病であるデュシェンヌ筋ジストロフィーは、心臓および骨格筋に影響を与える。実際、心筋症は、デュシェンヌ患者の主な死因である。心筋症のための承認された処置はなく、エキソンスキッピングなどの新規のデュシェンヌ特異的実験アプローチは、心臓に有益ではない。本明細書では、本発明者らは、心筋梗塞後の治療的再生のための先進臨床試験において、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）が、ｍｄｘマウスにおけるデュシェンヌ心筋症の重要な病態生理学的特徴（酸化ストレス、炎症、線維化およびミトコンドリア機能不全）を回復させることを実証する。ヒトＣＤＣによって分泌されるエキソソームは、ｍｄｘマウスにおいてＣＤＣの利益を再現し、ヒトデュシェンヌ心筋細胞におけるカルシウムサイクリングおよびミトコンドリア呼吸の異常を回復させる。
【００１４】
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）におけるジストロフィンの欠如は、膜の脆弱性および二次的な筋肉損傷（骨格および心臓の両方）をもたらす。早期障害は主に骨格筋障害によるものであるが、心不全が最も一般的な死因である。現在利用可能な処置モダリティは、ＤＭＤ関連心不全、機能的心筋の喪失、および生きている心筋の瘢痕への変換の基礎となる病態生理に対処しない。心筋球由来細胞（ＣＤＣ）は、実行可能な治療選択肢であり得る。心筋梗塞におけるＣＤＣのファースト・イン・ヒューマンＣＡＤＵＣＥＵＳ試験では、健常心筋が再生し、瘢痕が減少した；現在、これらの知見は、同種異系ＣＤＣの無作為化プラセボ対照多施設臨床試験でさらに試験されている。前臨床試験は、ＣＤＣが再生的であるだけではなく、抗炎症性および抗線維性でもあることを示している；それらは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を含む非コードＲＮＡを積載したエキソソームの分泌を介して間接的に作用する。心筋梗塞のマウスモデルでは、ＣＤＣエキソソームは、ＣＤＣの機能的および構造的利益を模倣する一方、エキソソーム生合成の遮断は、ＣＤＣを非有効的にする。臨床データおよび作用機構を考慮して、本発明者らは、ＣＤＣがデュシェンヌ心筋症の処置に有用であり得ると推論した。目標は、ジストロフィンを代替することではなく、再生をリクルートし、線維化を回復させ、炎症をターゲティングすることによって、ジストロフィン欠損の病態生理学的結果を補うことである。
【００１５】
エキソソーム（生物学的因子の豊富な環境を含有する分泌脂質小胞）は、幹細胞が、隣接細胞（罹患細胞または傷害細胞を含む）に対するそれらの生物学的効果を高めるための強力なパラクリンシグナルを提供する。タンパク質、生物活性脂質および核酸「カーゴ」の封入および輸送によって、これらの天然送達デバイスは、受容細胞において有意な表現型的および機能的変化を誘導することができ、これが再生プログラムの活性化をもたらすという認識が高まっている。幹細胞によって開始される再生におけるこのような間接的機構の役割は、幹細胞が投与され、組織および器官における送達部位から除去された後でもなお、再生プロセスが持続し、内因性組織から生じるという証拠が増加していることによって強く示唆される。
【００１６】
幹細胞再生活性の「パラクリン仮説」は、幹細胞によって分泌されるエキソソームベースの臨床適用が、幹細胞それ自体の移植および送達と比較して優れており、または異なる利点を提供し得るというパラダイムシフトをもたらした。特に、間葉系間質（ＭＳＣ）、（骨髄幹細胞）単核細胞（ＭＮＣ）細胞、免疫細胞（樹状細胞およびＣＤ３４＋）、ヒト神経細胞（ｈＮＳＣ）などの、実証された治療能力を有するいくつかの細胞型の上清から、幹細胞由来エキソソームが同定および単離されている。心臓病との関連では、ヒト心筋球由来細胞（ＣＤＣ）は、心筋および血管系を改善することが公知である。ＣＤＣによって産生されるものを含む幹細胞由来エキソソームは、「無細胞」治療を開発するための強力かつ豊富な供給源を提供し得る。
【００１７】
加えて、エキソソームベースの「無細胞」治療は、細胞治療とは対照的に、再生医療において異なる利点を提供する。免疫原性または腫瘍形成能が低減しているかまたは存在しない非生存実体として、これらの特徴は、安全性の問題を著しく取り除く。例えば、幹細胞由来エキソソームは、ＭＨＣ複合体分子を含む膜結合タンパク質の含量が低い結果として、親細胞よりも免疫原性が低い。生細胞の投与をそれらの分泌エキソソームで代替することにより、生存可能な複製細胞の移植に関連する安全性の懸念および限界の多くが緩和される。加えて、エキソソームによって生物活性成分が脂質小胞に封入されることにより、インビボにおける分解から内容物を保護することが可能になり、それにより、サイトカイン、成長因子、転写因子およびＲＮＡなどの可溶性分子の送達に関連することが多い障害が除かれる可能性がある。投与に関するこの相対的容易性は、最終的には、患者への反復的および持続的な送達を可能にし、それにより、罹患組織および／または機能不全組織の再生および修復の可能性を最大化し得る。
【００１８】
また、規定条件下におけるエキソソーム生産は、より容易な製造およびスケールアップの機会を可能にする。エキソソームの製造は、従来の生物薬理学的製品の製造に似ているので、投与量および生物学的活性試験のための生産および品質管理における標準化が可能である。さらに、培養液中のエキソソームの耐久性は、一定期間にわたってエキソソームが分泌される培養培地からそれらを回収することによって、大量のエキソソームを取得することを可能にする。
【００１９】
エキソソームが、異なる細胞型間の細胞間伝達に関与することは現在では十分に立証されているが、元の親細胞内におけるそれらの産生機構および標的受容細胞に対する効果に関しては、多くが未発見である。エキソソームは、免疫調節プロセス、血管新生、腫瘍成長に関連する内皮細胞の遊走、または虚血再灌流傷害における損傷の減少を含む、多数の細胞、組織および生理学的プロセスに関与することが報告されている。心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの細胞によって分泌されるエキソソームが、それらの親細胞の治療利益を再現することができるか、または場合によりこのような治療利益の達成に不可欠であるかを立証することは、重要な科学的関心事である。
【００２０】
エキソソームの一般的特徴。広範囲の細胞型によって分泌されるエキソソームは、サイトカイン、成長因子、転写因子、脂質ならびにコード核酸および非コード核酸を含む様々な生物学的因子が豊富な脂質二重層小胞である。エキソソームは、血液、尿、羊水、間質腔および細胞外空間に見られる。エンドソーム起源のこれらのエキソサイトーシス小胞は、４０〜１００ｎｍのサイズを含む３０〜２００ｎｍのサイズの範囲であり得、電子顕微鏡によって見るとカップ状の形態を有する。それらの初期形成は、細胞膜の内側への出芽により開始してエンドソームを形成し、その後、後期エンドソームの境界膜が陥入して多小胞体（ＭＶＢ）が形成される。ＭＶＢと原形質膜との融合は、エキソソームとして公知の小胞の形成を通じて、細胞外空間への内部小胞の放出をもたらす。
【００２１】
記載されているように、エキソソームの「カーゴ」内容物は、親細胞起源に関連する生物学的因子の異なるサブセットを含有するので、それらの親細胞起源を反映する（形成時の親細胞の細胞調節状態を含む）。エキソソーム内の異なるタンパク質（サイトカインおよび成長因子を含む）、脂質、コードＲＮＡ分子および非コードＲＮＡ分子の豊富な生物学的環境はすべて必ず、それらの親細胞に由来する。豊富な多くの細胞質ゾル誘導体を含有することに加えて、エキソソームは、膜表面において膜結合受容体の細胞外ドメインをさらに発現する。
【００２２】
記載される封入および形成プロセスは必ず、形成時の親細胞起源および調節状態に基づいて、エキソソーム組成の不均一性をもたらす。それにもかかわらず、一般的な出芽形成および放出機構は、それらの起源の結果として生じる一般的な一連の特徴、例えばエンドソーム関連タンパク質（例えば、Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅ、ＳＮＡＲＥ、アネキシンおよびフロチリン）、原形質膜またはエンドソームにおいてマイクロドメインにクラスタ化することが公知のタンパク質（４つの膜貫通ドメインテトラスパニン、例えばＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３およびＣＤ３７）、脂質ラフト関連タンパク質（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質およびフロチリン）、コレステロール、スフィンゴミエリンおよびヘキソシルセラミドなどを確立する。
【００２３】
それらの小胞起源を反映するこれらのコア成分に加えて、エキソソームの重要な特性は、シグナル伝達プロセスに関連するｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの両方を含有する実証された能力であり、両カーゴｍＲＮＡは、受容細胞において翻訳されることができ、またはマイクロＲＮＡは、受容細胞において標的ｍＲＮＡを機能的に分解する。遺伝子発現に影響を及ぼすことができる他の非コードＲＮＡもまた、エキソソーム中に存在し得る。エキソソームへのｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ集団の選択的取り込みを制御するプロセスは、完全に理解されていないが、エキソソームのカーゴＲＮＡは元の細胞のＲＮＡプロファイルと比較して豊富であると報告している研究によって明らかにされているように、ＲＮＡ分子がエキソソームに無作為的ではなく選択的に取り込まれることは明らかである。このようなＲＮＡ分子が、疾患病因および再生プロセスにおいてどのような役割を果たすかの理解が進んでいることを考慮して、エキソソームにおけるＲＮＡ分子の存在、および標的受容細胞に影響を与える明確な効力は、治療アプローチにおいて展開され得る重要な特徴を示唆している。
【００２４】
重要なことに、エキソソームの天然二重層膜封入は、カーゴ内容物が、分解せずに血流中または組織内で存続または遊走することを可能にする保護および制御された内部微小環境を提供する。細胞外環境へのそれらの放出は、脂質リガンド受容体相互作用（エンドサイトーシス取り込みによる内在化）によって、または小胞と細胞膜との直接的な融合によって媒介される細胞表面への接着を介した受容細胞との相互作用を可能にする。これらのプロセスは、標的細胞へのエキソソームカーゴ内容物の放出をもたらす。
【００２５】
エキソソーム−細胞相互作用の最終結果は、抗原提示、転写因子、サイトカイン、成長因子、核酸、例えばｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの輸送を含むいくつかの異なる機構のいずれかによって誘導されるように、標的受容細胞における遺伝子経路の調節である。幹細胞との関連では、胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来エキソソームは、ｍＲＮＡおよびタンパク質を造血前駆細胞に往復させる／輸送することが実証されている。他の研究により、成体幹細胞由来エキソソームもまた、転写、増殖および細胞免疫調節の制御に関与するいくつかの細胞機能に関連する選択的パターンのｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびプレマイクロＲＮＡを往復させることが示されている。
【００２６】
エキソソームの単離および調製。エキソソームの単離は、それらの分離および分析のための一般的な生化学的および生物物理学的特徴の利用に依拠する。例えば、分画超遠心分離は、分泌されたエキソソームを培養細胞の上清から単離する主要技術となっている。このアプローチは、比較的低い浮遊密度を利用することによって、非膜性粒子からエキソソームを分離することを可能にする。サイズ排除は、生化学的に類似するが生物物理的に異なる微小小胞であって、最大１，０００ｎｍのより大きな直径を有する微小小胞からそれらを分離することを可能にする。浮遊速度の差異はさらに、異なるサイズのエキソソームを分離することを可能にする。一般に、エキソソームのサイズは、４０〜１００ｎｍのサイズを含む３０〜２００ｎｍの範囲の直径を有する。さらなる精製は、目的の特定のエキソソームの特定の特性に依拠し得る。これは、例えば、目的のタンパク質との免疫吸着を使用して、原形質外配向性または外部配向性を有する特定の小胞を選択することを含む。
【００２７】
現在の方法（分画遠心分離、不連続密度勾配、免疫親和性、限外ろ過および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））の中でも、分画超遠心分離は、エキソソームの単離に最も一般的に使用されるものである。この技術は、２０００×ｇから１０，０００×ｇに増加する遠心力を利用して、１００，０００×ｇでエキソソームペレットから中サイズおよび大サイズの粒子ならびに細胞残屑を分離する。遠心分離は単独で、馴化培地からエキソソームを有意に分離／収集することを可能にするが、一般的な混入物質である様々なタンパク質凝集体、遺伝物質、培地由来の微粒子および細胞残屑を除去するには不十分である。エキソソーム精製の高い特異性は、限外ろ過と組み合わせた連続遠心分離、またはスクロース密度勾配の平衡密度勾配遠心分離を展開して、より高純度のエキソソーム調製（浮遊密度１．１〜１．２ｇ／ｍｌ）または調製における別個のシュガークッションの適用を提供し得る。
【００２８】
重要なことに、限外ろ過は、生物学的活性を損なわずに、エキソソームを精製するために使用することができる。非中性ｐＨまたは非生理学的塩濃度の使用を回避するために、異なる孔径を有する膜（例えば、より小さな粒子を排除するために、１００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）およびゲルろ過）が使用されている。現在利用可能な接線流ろ過（ＴＦＦ）システムは、（１０，０００Ｌ超に）スケーリング可能であり、エキソソーム画分を精製するだけではなく濃縮することが可能であり、このようなアプローチは、分画遠心分離よりも所要時間が少ない。調製物が生理学的なｐＨおよび塩濃度で維持されるので、エキソソームを均一なサイズの粒子に精製し、それらの生物学的活性を保存するために、ＨＰＬＣも使用され得る。
【００２９】
他の化学的方法は、場合によりさらなる一連の遠心分離またはろ過と組み合わせて、体積排除ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））に加えて、沈殿技術のためにエキソソームの差次的な溶解度を利用する。例えば、沈殿試薬ＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）を馴化細胞培地に追加して、エキソソーム集団を迅速かつ容易に沈殿させ得るが、この技術によって調製されたペレットの再懸濁は困難であり得る。フローフィールドフロー分画（ＦｌＦＦＦ）は、巨大分子（例えば、タンパク質）およびナノサイズからマイクロサイズの粒子（例えば、細胞小器官および細胞）を分離および特性評価するために使用される溶出系技術であり、培養培地からエキソソームを分画するために適用されて成功している。
【００３０】
一般的な生化学的および生物物理学的特徴に依拠するこれらの技術の他に、集中的な技術が、目的の特定のエキソソームを単離するために適用され得る。これは、抗体免疫親和性に依拠して、特定のエキソソーム関連抗原を認識することを含む。記載されているように、エキソソームは、膜表面において膜結合受容体の細胞外ドメインをさらに発現する。これは、共通の抗原プロファイルに基づいて、それらの親細胞起源に関連するエキソソームを単離および分離するための好適な機会を提供する。磁気ビーズ、クロマトグラフィーマトリックス、プレートまたはマイクロ流体デバイスの併用は、目的の親細胞からのそれらの産生または関連細胞調節状態に関係し得るような目的の特定のエキソソーム集団を単離することを可能にする。他の親和性捕捉方法は、エキソソーム表面上の特定の糖残基に結合するレクチンを使用する。
【００３１】
エキソソームベースの治療。エキソソームベースの治療を開発することの主な目的は、低いリスクで、または細胞治療が利用不可能な状況で、細胞治療の利益を提供し得る「無細胞」治療を作ることである。例えば、特に後期のデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）関連心不全（ＨＦ）は、重大な排他的併存疾患を示し、後期ＣおよびＤの場合には、細胞、組織、心臓または機械的移植が選択肢となり得ない。記載されているように、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）などの細胞ベースの治療の治療利益は、内因性起源から生じる再生心筋および血管系を伴う間接的機構によって生じると思われる。ＣＤＣによって産生される細胞エキソソームは、疾患進行を改善するだけではなく、罹患組織および／または機能不全組織を修復および再生するような様式で、新たな治療アプローチのための成長因子、転写因子、サイトカインおよび核酸の生産および送達を可能にする。これに関して、ＣＤＣ由来エキソソームは、相乗的機構をリクルートして内因性幹細胞を心筋傷害部位に誘引し、心筋および血管への分化を促進し、それにより、ＨＦの病態生理を回復させることによって、満たされていない主な医療ニーズに有効に対処し得る。
【００３２】
より具体的には、ＤＭＤは、様々な病理学的特徴によって例示されるように、筋障害（筋線維における細胞膜損傷）を特徴とするＸ連鎖劣性障害である。これは、発症から３〜５年で始まる骨格筋の衰弱、発症から約１３年の時点の進行性衰弱、車椅子依存を含む。重要なことに、心筋症は、発症から１３年未満では患者の１／３で発症し、発症から１８年未満では患者の１／２に増加し、１８年以降ではすべての患者で発症することが観察されている。拡張型心筋症は、左心室後底部支線維化を含む；伝導異常は主に、心房内：異常ＡＶ結節伝導を伴うＳＶＴである。患者は、ＧＩおよび尿路系の障害をさらに含む血管系機能不全を含む平滑筋障害をさらに患い得る。一般的な予後は、呼吸不全または心筋症による死亡である。これらの臨床的特徴の基礎は、ジストロフィンの喪失が細胞膜の損傷、および細胞内への細胞外Ｃａ2+の漏出をもたらすジストロフィン遺伝子突然変異（欠失）である。高い細胞内レベルは、最終的に、酸化ストレスおよび／またはニトロソ化ストレスおよび炎症の増加ならびにカルパインの活性化をもたらす。これらの効果の組み合わせは、筋肉タンパク質分解およびアポトーシスをもたらし、上記分解特徴につながる。
【００３３】
ＤＭＤ患者のこの病態生理（酸化ストレスおよび／またはニトロソ化トストレスの増加、炎症の増強、プロアポトーシスおよびリモデリング状態の状況を含む）に基づいて、ＣＤＣを伴う治療アプローチは、疾患の経過を回復に向かわせる上で有意な利益を提供し得る。ＣＤＣは、再生能力の増強に加えて、抗酸化効果、抗炎症効果、抗アポトーシス効果、抗リモデリング効果を促進すると実証されている。これに関して、ＣＤＣ投与はＤＭＤの遅延／回復に有益であり、ＣＤＣ由来エキソソーム集団は、細胞ベースの治療に関連する障害を回避しながら、これらの利益をもたらすことを可能にすることが示唆される。
【００３４】
特に、幹細胞由来エキソソームは、親細胞よりも免疫原性が低い可能性がある。生細胞の投与を分泌エキソソームで代替する可能性により、生存可能な細胞の移植に関連する安全性の懸念および限界の多くが緩和される。加えて、エキソソームによって生物活性成分が脂質小胞に封入されることにより、インビボにおける分解から内容物を保護することが可能になり、それにより、提供すべき濃度の増加を潜在的に可能にしながら、サイトカイン、成長因子、転写因子およびＲＮＡなどの可溶性分子の送達に関連することが多い障害が除かれる可能性がある。特に、ＤＭＤなどの慢性疾患の場合、患者への反復送達および持続送達は、細胞ベースの治療では困難または危険であろう様式で、罹患組織および／または機能不全組織の再生および修復の可能性を最大化し得る。これらの利益の十分な実現は、ＣＤＣなどの幹細胞によって分泌されるエキソソームが単独で、それらの親細胞の治療利益を再現することができるか、またはこれらのプロセスにおいて不可欠である可能性があるかについての理解の向上を必要とする。このようなプロセスにおけるエキソソームの役割の確認は、デバイスベースの薬理学的な介入または手術がこのような被験体に対して賢明な処置方式とはなり得ないので、新たな治療アプローチにおけるそれらの適用（例えば、細胞の移植または投与が利用不可能である被験体（例えば、後期心疾患）における「無細胞」使用）を可能にする。当技術分野では、細胞それ自体の投与または移植を伴う機構を用いずに幹細胞再生の利益をもたらす手段を同定することに対する大きな必要性が存在する。
【００３５】
エキソソームを伴う「無細胞」方法を介して、損傷組織または罹患組織の修復または再生において有意な利益を提供する組成物および方法および組成物が本明細書に記載される。具体的には、ヒト心筋球由来細胞（ＣＤＣ）由来エキソソームは、瘢痕サイズの減少、生存可能な心筋の再生において有効であると実証される。このような結果は、ＣＤＣ細胞治療の主な利益が、ＣＤＣにおいて豊富であると本発明者らが同定した特定のマイクロＲＮＡを含むエキソソームによって媒介されることを裏付けている。
【００３６】
処置の方法であって、慢性退行性筋疾患に続発する心不全の処置を必要とする被験体を選択することと、複数のエキソソームを含む組成物を前記被験体に投与することを含み、前記複数のエキソソームが、無血清培地中で成長した心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から単離されたものであり、直径約９０ｎｍ〜約２００ｎｍのエキソソームを含み、ＣＤ８１＋、ＣＤ６３＋または両方であり、さらに、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書に記載される。他の実施形態では、慢性退行性筋疾患は、デュシェンヌ筋ジストロフィーである。他の実施形態では、組成物の投与は、単回用量で約１〜約１００ｍｇのエキソソームタンパク質を含む。他の実施形態では、単回用量を被験体に複数回投与する。他の実施形態では、組成物の投与は、注射を含む。他の実施形態では、注射は、経皮注射を含む。他の実施形態では、注射は、心筋内へ直接的である。他の実施形態では、組成物の投与は、心筋注入を含む。他の実施形態では、心筋注入は、動脈内または静脈内である。他の実施形態では、被験体の処置は、線維化の減少、炎症の減少、ミトコンドリア機能の増加および／または心筋形成の増加をもたらす。他の実施形態では、線維化の減少は、コラーゲン蓄積の減少を含む。他の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含む。他の実施形態では、炎症の減少は、細胞質核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）の増加、脂肪酸過酸化最終生成物の減少、炎症細胞の数の減少、および／または抗酸化物質の発現のアップレギュレートを含む。他の実施形態では、抗酸化物質は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、グルタミン酸−システインリガーゼ触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットを含む。他の実施形態では、炎症細胞は、ＣＤ６８＋マクロファージおよびＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、ミトコンドリア超微細構造の増加および／またはミトコンドリア生合成の増加を含む。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、核ＰＰＡＲ−γコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）発現の増加を含む。他の実施形態では、エキソソームは、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ１４８ａ、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５およびｍｉＲ−２３ａからなる群より選択される１つ以上のマイクロＲＮＡを含む。
【００３７】
処置の方法であって、慢性筋疾患に続発する心不全の処置を必要とする被験体を選択することと、および心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む組成物を投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書にさらに記載される。他の実施形態では、慢性筋疾患は、デュシェンヌ筋ジストロフィーである。他の実施形態では、組成物の投与は、単回用量で約１×１０5個〜約１×１０8個またはそれを超えるＣＤＣを含む。別の例では、投与されるＣＤＣの数は、エキソソーム投与量の別のベースラインとして、冠動脈当たり２５００万個の冠動脈内ＣＤＣ（すなわち、合計７５００万個のＣＤＣ）を含む。様々な実施形態では、ＣＤＣの数は、エキソソーム投与量の別のベースラインとして、単回用量で１×１０5個、１×１０6個、１×１０7個、１×１０8個、１×１０9個のＣＤＣを含む。特定の場合では、これは、体重に比例し得る（総ＣＤＣ用量で、体重１ｋｇ当たり１００，０００〜１００万個のＣＤＣの範囲）。他の実施形態では、組成物の投与は、心筋注入を含む。他の実施形態では、心筋注入は、冠動脈内である。他の実施形態では、心筋注入は、動脈内または静脈内である。他の実施形態では、被験体の処置は、線維化の減少、炎症の減少、ミトコンドリア機能の増加および／または心筋形成の増加をもたらす。他の実施形態では、線維化の減少は、コラーゲン蓄積の減少を含む。他の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩおよび／またはコラーゲンＩＩＩを含む。他の実施形態では、炎症の減少は、細胞質核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）の増加、脂肪酸過酸化最終生成物の減少、炎症細胞の数の減少、および／または抗酸化物質の発現のアップレギュレートを含む。他の実施形態では、抗酸化物質は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、グルタミン酸−システインリガーゼ触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットを含む。他の実施形態では、炎症細胞は、ＣＤ６８＋マクロファージおよびＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、ミトコンドリア超微細構造の増加および／またはミトコンドリア生合成の増加を含む。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、核ＰＰＡＲ−γコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）発現の増加を含む。さらなる例は、米国特許出願第１１／６６６，６８５号、米国特許出願第１２／６２２，１４３号および米国特許出願第１２／６２２，１０６号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に見られる。
【００３８】
複数のエキソソームを含む組成物が本明細書に記載される。特定の実施形態では、複数のエキソソームは、細胞集団を提供すること、前記細胞集団から複数のエキソソームを単離することを含む方法によって作製される。
【００３９】
様々な実施形態では、細胞は、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、体内の様々な体細胞源、例えば線維芽細胞、血液および造血幹細胞（ｈＳＣ）、免疫細胞、骨および骨髄、神経組織などのいずれか１つに由来する多能性幹細胞（ｐＳＣ）、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、ｈＳＣ、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。様々な実施形態では、細胞は、ヒト生検組織由来の幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞である。様々な実施形態では、細胞は幹細胞であり、始原細胞および／または前駆細胞は初代培養物である。様々な実施形態では、細胞は、連続継代が可能な細胞株を構成し得る幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞である。
【００４０】
様々な実施形態では、複数のエキソソームは、細胞集団の上清から単離される。これは、例えば、継代培養することができる細胞株をさらに含む培養液中の細胞集団によって馴化された培地中に分泌されたエキソソームを含む。特定の実施形態では、細胞は、無血清培地中で培養される。特定の実施形態では、エキソソームが単離される場合、培養液中の細胞は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９０％またはそれを超えるコンフルエンスに増殖される。特定の実施形態では、細胞集団は、遺伝子操作されている。これは、例えば、内因性遺伝子が除去され、および／または安定的で持続的な様式で外因性が導入されているノックアウト（ＫＯ）またはトランスジェニック（ＴＧ）細胞株を含む。これは、当技術分野で公知の任意のいくつかの方法、例えばｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどの導入を介した、細胞集団内の１つ以上の遺伝子ならびに関連コードおよび非コード転写産物の一過性ノックダウンをさらに含む。これは、当技術分野で公知の任意のいくつかの方法、例えばベクター、プラスミド、人工プラスミド、複製および／または非複製ウイルスなどの導入を介した、細胞集団内の１つ以上の遺伝子ならびに関連コードおよび非コード転写産物の一過性発現をさらに含む。他の実施形態では、細胞集団は、複数のエキソソームを単離する時点で、またはそれと実質的に同時に、細胞の調節状態を変化させる様式で、環境条件（例えば、低酸素）への曝露、小分子の追加、外因性因子（例えば、成長因子、サイトカイン）の存在／非存在によって変化されている。例えば、細胞の部分的または完全な分化を促進し、その後、複数のエキソソームを生成するために、分化剤を幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞の集団に追加し得る。様々な実施形態では、細胞の調節状態の変化は、複数のエキソソームにおける１つ以上のエキソソームの組成を変化させる。
【００４１】
様々な実施形態では、複数のエキソソームは、直径約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、例えば、直径約１０ｎｍ〜約１５ｎｍ、約１５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２５ｎｍ、約２５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約３５ｎｍ、約３５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ３  約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約９５ｎｍ、約９５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１０５ｎｍ、約１０５ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約１１０ｎｍ〜約１１５ｎｍ、約１１５ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約１２０ｎｍ〜約１２５ｎｍ、約１２５ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約１３０ｎｍ〜約１３５ｎｍ、約１３５ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約１４０ｎｍ〜約１４５ｎｍ、約１４５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約１５０〜約２００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約２５０ｎｍまたはそれを超える直径の１つ以上のエキソソームを含む。
【００４２】
様々な実施形態では、複数のエキソソームは、バイオマーカーを発現する１つ以上のエキソソームを含む。特定の実施形態では、バイオマーカーは、テトラスパニンである。他の実施形態では、テトラスパニンは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３およびＣＤ３７を含む群から選択される１つ以上である。他の実施形態では、エキソソームは、１つ以上の脂質ラフト関連タンパク質（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質およびフロチリン）、コレステロール、スフィンゴミエリンおよび／またはヘキソシルセラミドを発現する。
【００４３】
複数の実施形態では、複数のエキソソームは、生物学的タンパク質を含有する１つ以上のエキソソームを含む。様々な実施形態では、生物学的タンパク質としては、転写因子、サイトカイン、成長因子、および標的細胞におけるシグナル伝達経路を調節することができる類似タンパク質が挙げられる。様々な実施形態では、生物学的タンパク質は、組織の再生および／または機能改善を促進することができる。様々な実施形態では、生物学的タンパク質は、Ｉｒａｋ１、Ｔｒａｆ６、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路、ＮＯＸ−４、ＳＭＡＤ−４および／またはＴＧＦ−βに関係する経路を調節することができる。他の実施形態では、生物学的タンパク質は、エキソソームの形成および細胞質ゾルタンパク質（例えば、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、１４−３−３ε、ＰＫＭ２、ＧＷ１８２およびＡＧ０２）のパッケージングに関係する。
【００４４】
他の実施形態では、複数のエキソソームは、シグナル伝達脂質を含有する１つ以上のエキソソームを含む。これは、セラミドおよび誘導体を含む。他の実施形態では、複数のエキソソームは、コード核酸および／または非コード核酸を含有する１つ以上のエキソソームを含む。
【００４５】
複数の実施形態では、複数のエキソソームは、マイクロＲＮＡを含有する１つ以上のエキソソームを含む。様々な実施形態では、これらのマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５および／またはｍｉＲ−２３ａを含み得る。複数の実施形態では、複数のエキソソームは、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５および／またはｍｉＲ−２３ａの少なくとも１つが豊富な１つ以上のエキソソームを含む。複数の実施形態では、複数のエキソソームは、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２４の少なくとも１つが豊富な１つ以上のエキソソームを含む。豊富さは、例えば、治療状況において有益な利益を提供しない細胞（例えば、線維芽細胞）と比較して、このような有益な利益を提供する細胞（例えば、心筋球由来細胞（ＣＤＣ））から生成された際の記載されているマイクロＲＮＡの１つ以上の量を比較することによって測定され得る。豊富さはまた、絶対量で、または例えば標準化希釈系列と比較した相対量で測定され得る。
【００４６】
他の実施形態では、複数のエキソソームは、マイクロＲＮＡを含有する１つ以上のエキソソームを含み得る。これは、当技術分野で公知の様々なマイクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ２７−ａ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉｒ−１９ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉｒ−２７ｂ、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１９ａ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉｒ−２１０、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２、ｌｅｔ−７ｆおよび／またはｍｉＲ−１４６ａを含む。
【００４７】
他の実施形態では、複数のエキソソームは、マイクロＲＮＡを含有する１つ以上のエキソソームを含み得る。これは、当技術分野で公知の様々なマイクロＲＮＡは、例えばｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ９２ａ、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３４、ｍｉ−Ｒ３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３６３およびｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−４９９を含む。当技術分野で公知の他のマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ９２ａ、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３４、ｍｉ−Ｒ３４ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３６３およびｍｉＲ−３０ｂおよび／またはｍｉＲ−４９９を含む。
【００４８】
複数の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、細胞および／または細胞によって馴化された培地の遠心分離を含む。複数の実施形態では、超遠心分離が使用される。複数の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、サイズ排除ろ過によるものである。他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、不連続密度勾配、免疫親和性、限外ろ過および／または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、分画超遠心分離は、１０００〜２０００×ｇ、２０００〜３０００×ｇ、３０００〜４０００×ｇ、４０００〜５０００×ｇ、５０００×ｇ〜６０００×ｇ、６０００〜７０００×ｇ、７０００〜８０００×ｇ、８０００〜９０００×ｇ、９０００〜１０，０００×ｇ、１０，０００×ｇまでまたはそれを超える遠心力を使用して、細胞に由来する複数のエキソソームから、より大きなサイズの粒子を分離することを含む。特定の実施形態では、分画超遠心分離は、１０，０００〜２０，０００×ｇ、２０，０００〜３０，０００×ｇ、３０，０００〜４０，０００×ｇ、４０，０００〜５０，０００×ｇ、５０，０００×ｇ〜６０，０００×ｇ、６０，０００〜７０，０００×ｇ、７０，０００〜８０，０００×ｇ、８０，０００〜９０，０００×ｇ、９０，０００〜１００，０００×ｇ、１０，０００×ｇまでまたはそれを超える遠心力を使用して、細胞に由来する複数のエキソソームから、より大きなサイズの粒子を分離することを含む。
【００５０】
他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、ろ過または限外ろ過の使用を含む。特定の実施形態では、異なる孔径を有するサイズ排除膜が使用される。例えば、サイズ排除膜は、０．１〜０．５μＭ、０．５〜１．０μＭ、１〜２．５μＭ、２．５〜５μＭ、５μＭまたはそれを超える孔径を有するフィルタの使用を含み得る。特定の実施形態では、孔径は、約０．２μＭである。特定の実施形態では、ろ過または限外ろ過は、１００〜５００ダルトン（Ｄａ）、５００〜１ｋＤａ、１〜２ｋＤａ、２〜５ｋＤａ、５〜１０ｋＤａ、１０〜２５ｋＤａ、２５〜５０ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、１００〜２５０ｋＤａ、２５０〜５００ｋＤａの範囲、５００ｋＤａまたはそれを超えるサイズ排除を含む。特定の実施形態では、サイズ排除は、約２〜５ｋＤａである。特定の実施形態では、サイズ排除は、約３ｋＤａである。他の実施形態では、ろ過または限外ろ過は、１００〜５００ダルトン（Ｄａ）、５００〜１ｋＤａ、１〜２ｋＤａ、２〜５ｋＤａ、５〜１０ｋＤａ、１０〜２５ｋＤａ、２５〜５０ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、１００〜２５０ｋＤａ、２５０〜５００ｋＤａの範囲、５００ｋＤａまたはそれを超える粒子を単離することができる中空糸膜の使用を含む。特定の実施形態では、サイズ排除は、約２〜５ｋＤａである。特定の実施形態では、サイズ排除は、約３ｋＤａである。他の実施形態では、１００〜５００ダルトン（Ｄａ）、５００〜１ｋＤａ、１〜２ｋＤａ、２〜５ｋＤａ、５〜１０ｋＤａ、１０〜２５ｋＤａ、２５〜５０ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、１００〜２５０ｋＤａ、２５０〜５００ｋＤａの範囲、５００ｋＤａまたはそれを超える粒子を単離することができる分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ゲルろ過。特定の実施形態では、サイズ排除は、約２〜５ｋＤａである。特定の実施形態では、サイズ排除は、約３ｋＤａである。様々な実施形態では、このようなシステムは、可変流体流動システムと組み合わせて使用される。
【００５１】
他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、エキソソーム画分を精製および／または濃縮するために使用される接線流ろ過（ＴＦＦ）システムの使用を含む。他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、エキソソームを均一サイズの粒子に精製するためにも使用することができる（ＨＰＬＣ）の使用を含む。様々な実施形態では、使用される密度勾配は、例えば、スクロース密度勾配における遠心分離、または調製における別個のシュガークッションの適用である。
【００５２】
他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、沈殿試薬の使用を含む。例えば、沈殿試薬ＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）を馴化細胞培地に追加して、エキソソーム集団を迅速かつ容易に沈殿させ得る。他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、使用される体積排除ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の使用を含み、これが使用される。別の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、溶出技術であるフローフィールドフロー分画（ＦｌＦＦＦ）の使用を含む。
【００５３】
特定の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、特定のバイオマーカーを有しまたは特定の生物学的分子を含有する１つ以上のエキソソームを単離するための１つ以上の捕捉剤の使用を含む。一実施形態では、１つ以上の捕捉剤は、少なくとも１つの抗体を含む。例えば、エキソソーム関連抗原を認識する抗体免疫親和性は、特定のエキソソームを捕捉するために使用される。他の実施形態では、少なくとも１つの抗体は、磁気ビーズ、クロマトグラフィーマトリックス、プレートまたはマイクロ流体デバイスなどの固定面にコンジュゲートされ、それにより、目的の特定のエキソソーム集団を単離することが可能になる。他の実施形態では、細胞集団からの複数のエキソソームの単離は、抗体ではない１つ以上の捕捉剤の使用を含む。これは、例えば、エキソソーム表面上の目的の対応する分子、例えば受容体または他のカップリング分子に相補的な抗原的特徴を提示する「ベイト」分子の使用を含む。一実施形態では、非抗体捕捉剤は、エキソソーム表面上の多糖残基に結合することができるレクチンである。
【００５４】
様々な実施形態では、ＣＤＣは、哺乳動物のものである。他の実施形態では、ＣＤＣは、ヒトのものである。上記に開示されているように、いくつかの実施形態では、上記のものと類似の機構によって単離され得る合成エキソソームが作製される。様々な実施形態では、複数のエキソソームである組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物である。
【００５５】
様々な実施形態では、複数のエキソソームは、３０〜３００ｎｍのサイズの範囲である。様々な実施形態では、複数のエキソソームは、４０〜１００ｎｍのサイズの範囲である。特定の実施形態では、複数のエキソソームは、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）エキソソームである。特定の実施形態では、複数のエキソソームは、ＣＤ６３＋であるエキソソームを含む。様々な実施形態では、エキソソームは、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５および／またはｍｉＲ−２３ａを含む。他の実施形態では、エキソソームは、２〜５ｋＤａ、例えば３ｋＤａである。エキソソームを伴う組成物および技術に関する他の例または実施形態は、国際公開第２０１４／０２８，４９３号（これは、参照により本明細書に全体的に組み込まれる）に示されている。
【００５６】
処置の方法であって、処置を必要とする被験体を選択することと、複数のエキソソームを含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体を処置する方法が本明細書に記載される。特定の実施形態では、被験体は、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状の処置を必要とする。他の実施形態では、組織の損傷または機能不全を伴う疾患および／または症状は、心疾患である。他の実施形態では、複数のエキソソームは、１つ以上のマイクロＲＮＡを含むエキソソームを含む。
【００５７】
特定の実施形態では、複数のエキソソームは、細胞集団を提供することと、細胞集団から複数のエキソソームを単離することを含む方法によって作製される。様々な実施形態では、細胞は、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、体内の様々な体細胞源、例えば線維芽細胞、血液および造血幹細胞（ｈＳＣ）、免疫細胞、骨および骨髄、神経組織などのいずれか１つに由来する多能性幹細胞（ｐＳＣ）、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。他の実施形態では、幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞は、ｈＳＣ、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を含む。様々な実施形態では、細胞は、ヒト生検組織由来の幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞である。様々な実施形態では、細胞は幹細胞であり、始原細胞および／または前駆細胞は初代培養物である。様々な実施形態では、細胞は、連続継代が可能な細胞株を構成し得る幹細胞、始原細胞および／または前駆細胞である。特定の実施形態では、エキソソームは、合成のものである。
【００５８】
様々な実施形態では、複数のエキソソームは、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）に由来する。他の実施形態では、複数のエキソソームは、１つ以上の生物学的分子を含むエキソソームを含む。他の実施形態では、複数のエキソソームは、ＣＤＣに由来する場合には、非ＣＤＣ源に由来するエキソソームと比較して、１つ以上の生物学的分子が豊富なエキソソームを含む。様々な実施形態では、１つ以上の生物学的分子は、タンパク質、成長因子、サイトカイン、転写因子および／または形態形成因子である。他の実施形態では、複数のエキソソームは、１つ以上の生物学的分子が豊富なエキソソームを含み、ＣＤＣに由来する場合には、非ＣＤＣ源に由来するエキソソームと比較して豊富なマイクロＲＮＡをさらに含むマイクロＲＮＡを含むエキソソームを含む。様々な実施形態では、これらのマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５および／またはｍｉＲ−２３ａを含み得る。複数の実施形態では、複数のエキソソームは、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２４の少なくとも１つが豊富な１つ以上のエキソソームを含む。
【００５９】
様々な実施形態では、ＣＤＣは、哺乳動物のものである。他の実施形態では、ＣＤＣは、ヒトのものである。特定の実施形態では、エキソソームは、合成のものである。特定の実施形態では、合成エキソソームは、ＣＤＣ由来エキソソームと実質的に類似の内容物（例えば、マイクロＲＮＡ、生物学的分子）を有する。
【００６０】
様々な実施形態では、複数のエキソソームの投与は、損傷組織もしくは機能不全組織における遺伝子発現を変化させ、損傷組織の生存能力を改善し、および／または個体における新たな組織の再生もしくは産生を増強する。様々な実施形態では、これらの効果を達成するために投与されるエキソソームの量は、１×１０6個〜１×１０7個、１×１０7個〜１×１０8個、１×１０8個〜１×１０9個、１×１０9個〜１×１０10個、１×１０10個〜１×１０11個、１×１０11個〜１×１０12個の範囲、１×１０12個またはそれを超える量である。他の実施形態では、エキソソームの数は、細胞治療方法のための臨床関連用量で使用される細胞数に関連する。例えば、３ｍＬ／３×１０5個のＣＤＣは、冠動脈内投与において治療利益を提供することができることが実証されているので、複数のエキソソームは、細胞治療方法のための臨床関連用量の細胞数から求められる。様々な実施形態では、投与は、反復投与であり得る。別の例では、投与されるＣＤＣの数は、エキソソーム投与量の別のベースラインとして、冠動脈当たり２５００万個の冠動脈内ＣＤＣ（すなわち、合計７５００万個のＣＤＣ）を含む。様々な実施形態では、ＣＤＣの数は、エキソソーム投与量の別のベースラインとして、単回用量で１×１０5個、１×１０6個、１×１０7個、１×１０8個、１×１０9個のＣＤＣを含む。特定の場合では、これは、体重に比例し得る（総ＣＤＣ用量で、体重１ｋｇ当たり１００，０００〜１００万個のＣＤＣの範囲）。様々な実施形態では、エキソソーム量は、タンパク質量、例えば１〜１０ｍｇ、１０〜２５ｍｇ、２５〜５０ｍｇ、５０〜７５ｍｇ、７５〜１００ｍｇまたは１００ｍｇまたはそれを超えるエキソソームタンパク質を含む投与量によって定義され得る。
【００６１】
有効用量範囲、投与レジメンおよび投与経路の定義は、蛍光標識エキソソームを使用し、標的組織保持（これは、スクリーニング基準として５分間、１０分間、１５分間、３０分間または３０分間を超えて測定した場合にバックグラウンドの１０倍超、５０倍超または１００倍超であり得る）を測定した研究によってガイドされ得る。特定の実施形態では、３０分間の時点で測定したバックグラウンドの１００倍超が低用量および高用量のベースライン測定値であり、次いで、（例えば、ＭＲＩエンドポイント：瘢痕サイズ、全体的および局所的な機能を使用して）安全性および生物活性について評価される。様々な実施形態では、単回用量は、２回、３回、４回、４回以上の逐次用量と比較される。様々な実施形態では、投与は、反復投与であり得る。様々な実施形態では、急性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。様々な実施形態では、慢性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。
【００６２】
様々な実施形態では、被験体へのエキソソームの投与は、当技術分野で公知の技術のいずれかによって行われる。いくつかの実施形態では、これは、経皮送達を含む。他の実施形態では、心筋注入が使用され、例えば冠動脈内カテーテルが使用される。様々な実施形態では、送達は、動脈内または静脈内であり得る。さらなる送達部位としては、任意の１つ以上の心臓区画、例えば動脈部位、静脈部位および／または心室部位が挙げられる。特定の実施形態では、投与は、前記部位または罹患組織および／もしくは機能不全組織と異なる組織または器官部位への送達を含み得る。特定の実施形態では、送達は、吸入または経口投与によるものである。
【００６３】
様々な実施形態では、複数のエキソソームの投与は、損傷組織もしくは機能不全組織における遺伝子発現を変化させ、損傷組織の生存能力を改善し、および／または個体における新たな組織の再生もしくは産生を増強する。様々な実施形態では、エキソソームの投与は、組織における機能的改善をもたらす。複数の実施形態では、損傷組織または機能不全組織は、心臓組織を含む。
【００６４】
例えば、心臓組織が損傷または機能不全である特定の実施形態では、機能的改善は、（他の機能的改善の中でも）心拍出量、収縮性、心室機能の増加および／または不整脈の減少を含み得る。他の組織では、神経損傷の処置に応じた認知の増強、肺損傷の処置に応じた血液酸素移動の改善、損傷免疫学的関連組織の処置に応じた免疫機能の改善などの機能の改善も実現され得る。
【００６５】
様々な実施形態では、複数のエキソソームの投与は、損傷組織もしくは機能不全組織における遺伝子発現を変化させ、損傷組織の生存能力を改善し、および／または個体における新たな組織の再生もしくは産生を増強する。様々な実施形態では、エキソソームの投与は、組織において機能的改善をもたらす。複数の実施形態では、損傷組織または機能不全組織は、骨格筋組織を含む。
【００６６】
例えば、骨格筋組織が損傷しているまたは機能不全である特定の実施形態では、機能的改善は、収縮力の増加、歩行能力の改善（例えば、６分間歩行試験結果の増加）、座位から立ち上がる能力の改善、臥位もしくは背臥位から座る能力の改善、または手先の器用さ（マウスのポインティングおよび／またはクリック）の改善を含み得る。
【００６７】
様々な実施形態では、損傷組織または機能不全組織は、急性事象による修復、再生または機能の改善を必要とする。急性事象としては、限定されないが、外傷、例えば裂傷、挫傷または衝突損傷、ショック、血液または酸素流の喪失、感染、化学曝露または熱曝露、毒曝露または毒物曝露、薬物の過剰使用または過剰曝露などが挙げられる。他の実施形態では、損傷組織は心臓組織であり、急性事象は心筋梗塞を含む。いくつかの実施形態では、エキソソームの投与は、梗塞を受けている領域における心臓壁厚の増加をもたらす。
【００６８】
他の実施形態では、組織はまた、慢性疾患、例えば鬱血性心不全（デュシェンヌ筋ジストロフィー、虚血性心疾患、高血圧症、心臓弁膜症、拡張型心筋症、感染症、糖尿病などの疾患に続発する症状を含む）などによる損傷を受ける。様々な実施形態では、投与は、反復投与、例えば２回、３回、４回、４回以上の逐次投与であり得る。様々な実施形態では、急性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。様々な実施形態では、慢性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。
【００６９】
他の損傷原因としては、限定されないが、傷害、加齢性変性症、癌および感染症も挙げられる。複数の実施形態では、再生細胞は、修復または再生を必要とするものと同じ組織型に由来する。複数の他の実施形態では、再生細胞は、修復または再生を必要とする組織以外の組織型に由来する。
【００７０】
特定の実施形態では、処置の方法は、心臓関連疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択することと、複数のエキソソームを含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物の投与は、前記被験体を処置する。様々な実施形態では、心臓関連疾患および／または症状は、デュシェンヌ筋ジストロフィー関連心不全をさらに含む心不全を含む。様々な実施形態では、複数のエキソソームは、３０〜３００ｎｍのサイズの範囲である。様々な実施形態では、複数のエキソソームは、４０〜１００ｎｍのサイズの範囲である。特定の実施形態では、複数のエキソソームは、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）エキソソームである。特定の実施形態では、複数のエキソソームは、ＣＤ６３＋であるエキソソームを含む。様々な実施形態では、エキソソームは、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５および／またはｍｉＲ−２３ａを含む。他の実施形態では、エキソソームは、２〜５ｋＤａ、例えば３ｋＤａである。他の実施形態では、組成物の投与は、１×１０8個、１×１０8個〜１×１０9個、１×１０9個〜１×１０10個、１×１０10個〜１×１０11個、１×１０11個〜１×１０12個、１×１０12個またはそれ以上のエキソソームの投与量を含む。例えば、３ｍＬ／３×１０5個のＣＤＣは、冠動脈内投与において治療利益を提供することができることが実証されているので、複数のエキソソームは、細胞治療方法のための臨床関連用量の細胞数から求められる。様々な実施形態では、投与は、反復投与であり得る。別の例では、投与されるＣＤＣの数は、エキソソーム投与量の別のベースラインとして、冠動脈当たり２５００万個の冠動脈内ＣＤＣ（すなわち、合計７５００万個のＣＤＣ）を含む。様々な実施形態では、ＣＤＣの数は、単回用量で１×１０5個、１×１０6個、１×１０7個、１×１０8個、１×１０9個のＣＤＣを含む。特定の場合では、これは、体重に比例し得る（総ＣＤＣ用量で、体重１ｋｇ当たり１００，０００〜１００万個のＣＤＣの範囲）。様々な実施形態では、エキソソーム量は、タンパク質量、例えば１〜１０ｍｇ、１０〜２５ｍｇ、２５〜５０ｍｇ、５０〜７５ｍｇ、７５〜１００ｍｇまたは１００ｍｇまたはそれ以上のエキソソームタンパク質を含む投与量によって定義され得る。様々な実施形態では、組成物の投与は、エキソソームの複数回投与を含む。様々な実施形態では、急性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。様々な実施形態では、慢性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。他の実施形態では、組成物の投与は、経皮注射を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、心筋注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、冠動脈内カテーテルの使用を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、動脈内送達または静脈内送達を含む。
【００７１】
被験体における心機能を改善する方法であって、被験体を選択することと、複数のエキソソームを含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物の投与が前記被験体における心機能を改善する方法が本明細書にさらに記載される。他の実施形態では、心機能の改善は、例えば、ベースライン駆出量の改善によって実証され得る。他の実施形態では、心機能の改善は、生存組織の増加、瘢痕量の減少、壁厚の改善、傷害部位の再生リモデリング、血管新生（ａｎｔｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の増強、心筋形成効果の改善、アポトーシスの減少、および／または炎症促進性サイトカインレベルの減少に関する。
【００７２】
特定の実施形態では、心機能を改善する方法は、心臓関連疾患および／または症状の処置を必要とする被験体を選択することと、複数のエキソソームを含む組成物を前記個体に投与することとを含み、前記組成物の投与は、前記被験体を処置する。様々な実施形態では、心臓関連疾患および／または症状は、デュシェンヌ筋ジストロフィー関連心不全をさらに含む心不全を含む。様々な実施形態では、複数のエキソソームは、３０〜３００ｎｍのサイズの範囲である。様々な実施形態では、複数のエキソソームは、４０〜１００ｎｍのサイズの範囲である。特定の実施形態では、複数のエキソソームは、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）エキソソームである。特定の実施形態では、複数のエキソソームは、ＣＤ６３＋であるエキソソームを含む。様々な実施形態では、エキソソームは、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５および／またはｍｉＲ−２３ａを含む。他の実施形態では、エキソソームは、２〜５ｋＤａ、例えば３ｋＤａである。他の実施形態では、組成物の投与は、１×１０8個、１×１０8個〜１×１０9個、１×１０9個〜１×１０10個、１×１０10個〜１×１０11個、１×１０11個〜１×１０12個、１×１０12個またはそれを超えるエキソソームの投与量を含む。例えば、３ｍＬ／３×１０5個のＣＤＣは、冠動脈内投与において治療利益を提供することができることが実証されているので、複数のエキソソームは、細胞治療方法のための臨床関連用量の細胞数から求められる。様々な実施形態では、投与は、反復投与であり得る。別の例では、投与されるＣＤＣの数は、エキソソーム投与量の別のベースラインとして、冠動脈当たり２５００万個の冠動脈内ＣＤＣ（すなわち、合計７５００万個のＣＤＣ）を含む。様々な実施形態では、ＣＤＣの数は、単回用量で１×１０5個、１×１０6個、１×１０7個、１×１０8個、１×１０9個のＣＤＣを含む。特定の場合では、これは、体重に比例し得る（総ＣＤＣ用量で、体重１ｋｇ当たり１００，０００〜１００万個のＣＤＣの範囲）。様々な実施形態では、エキソソーム量は、タンパク質量、例えば１〜１０ｍｇ、１０〜２５ｍｇ、２５〜５０ｍｇ、５０〜７５ｍｇ、７５〜１００ｍｇまたは１００ｍｇまたはそれを超えるエキソソームタンパク質を含む投与量によって定義され得る。様々な実施形態では、組成物の投与は、エキソソームの複数回投与を含む。様々な実施形態では、急性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。様々な実施形態では、慢性疾患および／または症状の処置のために、反復投与または逐次投与が提供される。他の実施形態では、組成物の投与は、経皮注射を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、心筋注入を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、冠動脈内カテーテルの使用を含む。他の実施形態では、組成物の投与は、動脈内送達または静脈内送達を含む。
【００７３】
本明細書では、本発明者らは、心筋梗塞後の治療的再生のための先進臨床試験において、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）が、ｍｄｘマウスにおけるデュシェンヌ心筋症の重要な病態生理学的特徴（酸化ストレス、炎症、線維化およびミトコンドリア機能不全）を回復させることを実証する。ヒトＣＤＣによって分泌されるエキソソームは、ｍｄｘマウスにおいてＣＤＣの利益を再現し、ヒトデュシェンヌ心筋細胞におけるカルシウムサイクリングおよびミトコンドリア呼吸の異常を回復させる。ＣＤＣおよびそれらのエキソソームは両方とも、ｍｄｘマウスにおいて心機能を改善する；ＣＤＣの単回注射は、最大運動能力を増加させ、生存を改善するために十分である。ＣＤＣエキソソームにおいて豊富なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４８ａ）の送達は、ＣＤＣおよびＣＤＣエキソソームの重要な効果を模倣する。したがって、ＣＤＣは、ｍｉＲ−１４８ａを含むシグナル伝達分子のエキソソーム媒介性輸送を介して、デュシェンヌ心筋症を改善する。本知見は、デュシェンヌ心筋症を有する患者においてＣＤＣを臨床試験する動機になる。
【実施例】
【００７４】
実施例１
ＣＤＣの培養
心室中隔の右心室面からの心内膜生検は、死亡した組織ドナーの健常心臓から得られる。心筋球由来細胞は、以前に記載されているように誘導した。Ｍａｋｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）．“Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｒｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ（ＣＡＤＵＣＥＵＳ）：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  １  ｔｒｉａｌ．”Ｌａｎｃｅｔ  ３７９，８９５−９０４（２０１２）（これは、参照により本明細書に全体的に組み込まれる）を参照のこと。
【００７５】
簡潔に言えば、心臓生検を小さな断片に細分化し、コラゲナーゼで短時間消化する。次いで、外植片を、２０ｍｇ／ｍｌフィブロネクチンコーティングディッシュ上で培養した。間質様扁平細胞および相明円形細胞は、組織断片から自発的に成長し、２〜３週間でコンフルエンスに達する。０．２５％トリプシンを使用してこれらの細胞を採取し、２０ｍｇ／ｍｌポリｄ−リシン上で懸濁培養して、自己凝集性心筋球を形成する。心筋球をフィブロネクチンコーティングディッシュに播種し、継代することによって、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を得る。２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．１ｍｌの２−メルカプトエタノールを補充したＩＭＤＭ基本培地を使用して、すべての培養物を５％ＣＯ２、３７℃で維持する。
【００７６】
実施例２
培地の馴化およびエキソソームの精製
４継代のＣＤＣから、エキソソームを採取する。正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（対照として有益な利益を提供しない対照として以前に利用されていた細胞）から、エキソソームを単離することもできる。
【００７７】
無血清培地中、１００％コンフルエンスで、ＣＤＣおよびＮＨＤＦを１５日間馴化する。次いで、吸引した培地を３，０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞残屑を除去する。次いで、Ｅｘｏｑｕｉｃｋエキソソーム沈殿溶液を使用して、エキソソームを単離した。
【００７８】
エキソソームペレットを適切な培地に再懸濁し、アッセイに使用する。保存されているエキソソームマーカーＣＤ６３の発現を、ＥＬＩＳＡを使用して検証する。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して、エキソソームペレットのＲＮＡ含量も定量することができる。ｍｉＲ−１４６ａ欠損エキソソームの作製のために、懸濁液中、ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲ−１４６ａヘアピン阻害剤またはｍｉＲＩＤＩＡＮヘアピン対照でＣＤＣをトランスフェクションし、フィブロネクチンコーティングフラスコ上に播種する。無血清馴化培地（４８時間馴化）から、エキソソームを単離する。
【００７９】
実施例３
エキソソームＲＮＡの分解
エキソソームペレットを２ｍｌのＰＢＳに懸濁することによって、エキソソームＲＮＡ分解を実施する。１つのサンプルに、１００ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加して、５％のｔｒｉｔｏｎ濃度を達成する。０．４ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ処理によって、エキソソームを３７℃で１０分間処理する。０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫによって、サンプルを３７℃で２０分間さらに処理する。マイクロＲＮＡ単離キットを使用して、サンプルからＲＮＡを精製する。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、ＲＮＡレベルを測定する。
【００８０】
実施例４
エキソソームペレットの質量分析
消化のために、フィルタ支援サンプル調製（ＦＡＳＰ）法を使用して、タンパク質を調製する。Ｑｕｂｉｔｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを使用して、濃度を測定する。トリプシンを１：４０の酵素対基質比で追加し、３７℃のヒートブロック上で、サンプルを一晩インキュベートする。デバイスを遠心分離し、ろ液を回収した。消化したペプチドを、Ｃ１８  ｓｔｏｐ−ａｎｄ−ｇｏ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＳＴＡＧＥ）チップを使用して脱塩する。強陰イオン交換ＳＴＡＧＥチップクロマトグラフィーによって、ペプチドを分画する。Ｃ１８  ＳＴＡＧＥチップからペプチドを溶出し、乾燥させる。液体クロマトグラフィータンデム質量分析を用いて、各画分を分析する。サンプルを内径２ｃｍ×１００ｍｍのトラップカラムにロードする。分析カラムは、プルドチップエミッターを備える内径１３ｃｍ×７５ｍｍの溶融シリカである。データ依存的な取得によって、４００〜１，４００ｍ／ｚのフルスキャンで上位１５のイオンからタンデム質量スペクトルを取得するように、質量分析計をプログラミングする。ｍｓｃｏｎｖｅｒｔを使用して、質量分析計のＲＡＷデータファイルをＭＧＦ形式に変換する。Ｘ！Ｈｕｎｔｅｒを使用して、その時点においてＧＰＭで利用可能な最新のスペクトルライブラリーに対して、ＭＧＦファイルをサーチする。また、ネイティブスコアリングアルゴリズムおよびｋ−スコアスコアリングアルゴリズムの両方を使用するＸ！！Ｔａｎｄｅｍを使用して、ＯＭＳＳＡによって、ＭＧＦファイルをサーチする。タンパク質は、Ｘ！！Ｔａｎｄｅｍでは０．０１以下のペプチドＥ値スコア、ＯＭＳＳＡでは０．０１以下、０．００１以下、ならびにＸ！Ｈｕｎｔｅｒサーチでは０．５以上のシータ値、ならびにＸ！！ＴａｎｄｅｍおよびＸ！Ｈｕｎｔｅｒでは０．０００１以下のタンパク質Ｅ値スコアを有する１つ以上のユニークなペプチドを有することが必要である。
【００８１】
実施例５
筋細胞の単離、血管新生アッセイ
エキソソーム適用の効果を立証する研究のために、様々な細胞型を使用することができる。例えば、１〜２日齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ仔ラットから新生ラット心筋細胞（ＮＲＣＭ）を単離し、単層培養することができる。別の有用な供給源は、血管新生をアッセイするために成長因子欠乏マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にプレーティングされたヒト臍静脈静脈内皮細胞を含む。
【００８２】
次いで、細胞を、それぞれ７×１０8個および４．０×１０8個のＣＤＣエキソソームまたはＮＨＤＦエキソソームと共にインキュベートする。用量の差異は、馴化中の細胞からの異なるエキソソーム産出量を反映する。細胞は、同様の条件下でエキソソームを産生することができたので、相対用量は、インビボにおける相対的なエキソソーム産生を表し得る。４時間後に、管形成を測定した。
【００８３】
実施例６
インビトロ心筋細胞アッセイ、エキソソーム処理
本発明者らは、１．５×１０4個のＮＲＣＭをフィブロネクチンコーティング８チャンバースライドにプレーティングした。５日後に、培地を、それぞれ３．５×１０8個または２×１０8個のＣＤＣまたはＮＨＤＦエキソソームを含有する新たな新鮮培地と交換する。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒドによって４℃で３０分間固定する。チャンバーを冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ブロッキングし、Ｄａｋｏ／０．１％サポニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃で１時間透過処理する。細胞を、ウサギ抗Ｋｉ−６７（１：１００）一次抗体およびマウス抗ａ−サルコメアアクチニン（Ａｂｅａｍ）と共にインキュベートする（一晩、４℃）。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＴＵＮＥＬ染色溶液中、ヤギ抗マウス（Ｃｙ５）およびヤギ抗ウサギ（ＦＩＴＣ）と共に３７℃で１時間インキュベートする。次いで、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、１：８，０００  ４０，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール染色溶液で染色し、Ｐｒｏｌｏｎｇ退色防止溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウントする。共焦点顕微鏡法を使用して、スライドをイメージングした。
【００８４】
実施例７
心筋細胞ストレスアッセイ
第１の傷害モデルは、フィブロネクチンコーティング１２ウェルプレート上に単層でプレーティングし、４０ｎＭのｍｉＲ−１４６ａまたは模倣物のいずれかで２４時間処理したＮＲＣＭの使用を含むことができる。次いで、培地を交換し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、過酸化水素（無血清培地中１００ｍＭ  Ｈ２Ｏ２、２時間）または塩化コバルト（無血清培地中５ｍＭＣｏＣｌ２、２時間）を使用して、細胞にストレス負荷する。細胞をＰＢＳで洗浄し、暗条件下、２０ｍＭカルセインＰＢＳ溶液によって３７℃で２０分間処理することによって、生存率を測定する。Ｓｏｆｔ  Ｍａｘ  Ｐｒｏ  ５  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、蛍光を読み取る。１ウェル当たりのデータは、９回の連続測定の平均である。
【００８５】
第２のモデルは、６ウェルプレート中で、心筋細胞を２５ｍｍプレコーティングガラスカバースリップ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にプレーティングすることを含む。５０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を使用して、細胞に１５分間ストレス負荷し、続いて、ＣＤＣを含有するトランスウェルメンブレンインサートと共にインキュベートし、またはＣＤＣエキソソームと共に４時間インキュベートする。次いで、上記で説明されているように、細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、分析のために染色する。
【００８６】
実施例８
ＣＤＣにおけるエキソソーム阻害
Ｔ１７５フラスコ中で、ＣＤＣをコンフルエンスまで成長させる。インビトロ研究では、２０ｍＭ  ＧＷ４８６９（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の無血清培地、または等量のＤＭＳＯを含有する無血清培地中で、ＣＤＣを１５日間馴化した。心筋細胞ストレスのインビトロトランスウェルインサートアッセイでは、２０ｍＭ  ＧＷ４８６９（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）または５ｍＭスピロエポキシド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でＣＤＣを１２時間処理することができる。ＣＤＣをＰＢＳで３回洗浄し、無血清培地と交換する。処理したＣＤＣを含有するインサートを、心筋細胞を含有する６ウェルプレートに追加する。インビボ研究では、２０ｍＭ  ＧＷ４８６９または等量のＤＭＳＯでＣＤＣを１２時間処理する。注射前に、ＣＤＣフラスコをＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、カウントする；動物１匹当たり１０5個のＣＤＣを注射した。
【００８７】
実施例９
急性および慢性心筋梗塞モデル
３カ月齢の雄性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ｂｅｉｇｅマウスをイソフルランで麻酔する。外科的準備の後に、側方開胸のために、２ｃｍの垂直切開を鎖骨中線に入れる。７−０シルクを使用して、左前下行を結紮した。エキソソーム、マイクロＲＮＡ、ＣＤＣまたは培地対照を、動物の２つの梗塞周辺部位に、４０ｍｌ／注射の容量で注射する。
【００８８】
ＭＩの慢性モデルでは、いかなる処理も施さずに、動物を上記のように梗塞させる。３週間後に、上記と同じように、処理を動物に行う。エキソソーム処理では、ペレットをイスコフ改変ダルベッコ（ＩＭＤＭ）基礎培地に再懸濁する。それぞれ２．８×１０9個および１．５６×１０9個のＣＤＣおよびＮＨＤＦエキソソームを動物に注射する。８０ｎｇのｍｉＰｖ−１４６ａまたはマイクロＲＮＡ模倣物対照をマイクロＲＮＡ処理動物に注射する。簡潔に言えば、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）トランスフェクション試薬およびＩＭＤＭ基礎培地中で、ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉＲ−１４６ａまたはｍｉＲＩＤＩＡＮ陰性対照をボルテックスし、室温で１０分間インキュベートして、複合体を形成させる。マイクロＲＮＡ複合体を注射用ＩＭＤＭに再懸濁する。ＣＤＣ処理では、１０5個のＣＤＣを前記のように動物に注射する。
【００８９】
心エコー検査。手術２４時間後（ベースライン）、１４日後および４週間後に、Ｖｅｖｏ  ７７０イメージングシステム（Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ）を使用して、心エコー検査によって、ＳＣＩＤ  ｂｅｉｇｅマウスを評価する。全身浅麻酔の誘導後に、最大左心室径のレベルで、心臓を長軸像で３Ｄイメージングする。Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３．８ソフトウェアを用いて、ＬＶ拡張末期領域およびＬＶ収縮末期領域の２Ｄ像から、左心室駆出率を測定することができる。１時間点あたり各動物を複数回測定し、平均を統計分析に使用する。
【００９０】
実施例１０
組織学
ＭＩの４週間後に、動物を屠殺する。心臓を採取し、横切断をＭＩ縫合の少し上に入れる。次いで、先端部分を、最適切断温度溶液中のベースモールド／包埋リングブロックに包埋する。冷２−メチルブタンに浸漬することによって、ブロックを急速凍結する。心臓を厚さ５ｍＭで切片化する。
【００９１】
実施例１１
マッソントリクローム染色
心臓１つ当たり合計４個の切片を含有する２つのスライドを、マッソントリクローム染色を使用して染色する。簡潔に言えば、ブアン溶液中で、切片を一晩処理する。次いで、スライドを流水下で１０分間リンスし、ワイゲルトヘマトキシリンで５分間染色する。その後、スライドをリンスし、スカーレット酸フクシンで５分間染色し、再びリンスする。次いで、リンタングステン／リンモリブデン、アニリンブルーおよび２％酢酸で、スライドをそれぞれ５分間さらに染色する。次いで、スライドをリンスし、乾燥し、ＤＰＸマウント媒体を使用してマウントした。
【００９２】
実施例１２
形態計測
Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して、心臓切片の形態計測分析を実施した。簡潔に言えば、染色切片の２Ｄ画像を青色、赤色および緑色のチャネルに分割する（青色のみを使用した）。各切片における青色の面積および強度を測定して梗塞サイズを計算することによって、梗塞サイズを立証することができる。心臓１つ当たり分析した４個の切片の梗塞率を平均化することによって、生存心筋量および梗塞量の割合を計算した。梗塞組織または生存組織の生成物、平均マウス心臓の高さ（３ｍｍ）および心臓組織の比重（１．０５ｇ／ｍｌ）として、梗塞量および生存心筋量を計算した。梗塞の最薄面積を測定することによって、梗塞壁厚を計算する。有意な肥大および有害なリモデリングが起こったＭＩの慢性モデルでは、組織における心筋細胞の生成量に基づいて、各心臓の生存心筋量を調整することができる。
【００９３】
垂直に切片化した心筋細胞（赤色の細胞質および中央の可視的な核を有する円形細胞として定義される）の断面積を測定することによって、筋細胞の量を求める。本発明者らは、心臓１つ当たり少なくとも２５個の筋細胞を測定した。円筒形の簡便な仮定を使用して、筋細胞の体積を定量する；体積に心筋細胞の比重（１．１５ｍｇ／ｍｌ）を掛けることによって、質量を求めた。各マウス心臓の生存心筋量を、その心臓における心筋細胞の量で割った。
【００９４】
実施例１３
ＣＤＣエキソソームは、血管新生を増強し、心筋細胞の生存および増殖を促進する
培養ヒトＣＤＣ（または、治療的に不活性な対照として正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ））によって１５日間馴化した無血清培地から、エキソソームを単離する（オンラインで入手可能な図７）。培地を定期的に交換しなかったにもかかわらず、馴化期間の終了までに、ほとんどのＣＤＣが依然として生存していた（図７Ｂおよび７Ｃ）。精製エキソソームペレットは、ＲＮＡが豊富であった（図１Ａ）。本発明者らは、５％ｔｒｉｔｏｎの存在下でペレットをＲＮａｓｅＡに曝露し（図１Ｂ）、プロテイナーゼＫを追加して、ＲＮＡを遮蔽し得るタンパク質複合体を解離させることによって、ＲＮＡがエキソソーム内に存在することを確認した。質量分析により、保存されているエキソソーム生合成タンパク質（ＣＤ６３を含む）（図１Ｃ）の存在を確認し、本発明者らは、エキソソームの収量を定量するためにこれを使用した（図１Ｄ）。透過型電子顕微鏡により、ほとんどのエキソソームは直径３０〜９０ｎｍであることが明らかになったが、血管細胞由来エキソソームの報告と一致して、より小さな粒子およびより大きな粒子も存在していた（図１Ｅおよび１Ｆ）。インビトロアッセイにより、血管新生、心筋細胞増殖およびアポトーシスに対するＣＤＣエキソソームの主な効果が明らかになった。
【００９５】
ＮＨＤＦエキソソームではなくＣＤＣエキソソームは、ヒト臍帯内皮細胞における管形成（血管新生の増強の指標）を促進した（図１Ｇ）。ＣＤＣエキソソーム処理新生心筋細胞は、より高い割合のＫｉ６７陽性核によって証明されるように、ＮＨＤＦエキソソームまたは培地のみに曝露したものよりも増殖した（図１Ｈ）。加えて、ＣＤＣエキソソーム処理心筋細胞は、より少ない末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）陽性核を示した（図１Ｉ）。したがって、ＣＤＣエキソソームは、血管新生を刺激し、心筋細胞増殖を促進し、プログラム化細胞死を減少させる。これらの効果は、親ＣＤＣのものを再現している。
【００９６】
実施例１４
ＣＤＣエキソソームは、ＭＩ後に心機能を改善し、構造的利益を付与し、生存心筋量を増加させる
ＣＤＣは、動物およびヒトの両方において、梗塞心筋における機能的改善および再生を刺激することが公知であるが、ＣＤＣ由来エキソソームがこれらのプロセスを再現することができるか、またはこれらのプロセスに不可欠であるかは、本技術の主な重要事項である。確立された前臨床モデルにおける治療有効性を評価するために、本発明者らは、免疫不全マウスにおいて急性ＭＩを誘発し、次いで、ＣＤＣエキソソーム、ＮＨＤＦエキソソームまたは無血清培地をＭＩ境界領域に注射した。
【００９７】
注射１５日後および３０日後に、ＣＤＣエキソソームを注射した動物では、ＮＨＤＦエキソソームまたは培地対照と比較して、全体的な心機能が優れていた（図２Ａ）。組織学的レベルでは、ＣＤＣエキソソーム処理心臓は、ＮＨＤＦエキソソームおよび培地対照と比較して、瘢痕量の減少、生存心筋量の増加および梗塞壁厚の増加を示した（図２Ｂ〜２Ｅ）。ＣＤＣエキソソーム処理心臓では、炎症促進性サイトカインレベルもより低かった（図８）。これらすべての点において、ＣＤＣエキソソームは、ＣＤＣそれ自体の公知の利益を模倣している。
【００９８】
急性ＭＩモデルは、生理活性を評価するために広く使用されているが、心臓保護効果と真の再生とを区別することができない。これを区別するために、本発明者らは別の一連の実験を実施し、本発明者らは、ＭＩの２１日後（この時点で、心筋瘢痕は十分に確立されている）に、エキソソームを注射した。３週間後に、ＣＤＣエキソソームを注射した心臓は、複数の構造的および機能的利益：駆出率の改善（図２Ｆ；さらに機能的面積変化の改善、図９Ａ）、瘢痕量の減少（図２Ｇの代表的な画像および図２Ｈのプールデータ）、生存心筋量の増加（図２Ｉ）および梗塞壁の肥厚（図２Ｊ）を示した。また、ＣＤＣエキソソームで処理した心臓は、著しく変形した対照心臓と比べて、腔拡大の減少（図９Ｂおよび９Ｃ）、梗塞周囲の縮小（図９Ｄ）および代償筋細胞肥大の減少（図９Ｅおよび９Ｆ）を示した。ＣＤＣエキソソーム処理心臓では、微小血管の密度が増加し（図２Ｋおよび９Ｇ）、アポトーシス心筋細胞核が低頻度であった（図９Ｈおよび９Ｉ）。確立された瘢痕の状況における新たな心筋の正味の成長は、治療的再生の中心的な基準を満たしている；機能の改善および有害なリモデリングの軽減は、生理学的に重要な組織変化の証拠である。本発明者らは、ＣＤＣエキソソームが実際に真の心臓再生を媒介し、血管新生および組織保存を促すと結論付ける。
【００９９】
実施例１５
エキソソーム分泌の阻害はＣＤＣの利益を減少させる
エキソソームがＣＤＣ移植の治療効果を媒介するのであれば、エキソソーム分泌の阻害は、前記利益を遮断すると論理的に予想される。この考えを試験するために、本発明者らは、ＧＷ４８６９（エキソソーム放出を防止する中性スフィンゴミエリナーゼの可逆的阻害剤）でＣＤＣを処理した。ＧＷ４８６９への曝露は、エキソソーム産生を用量依存的に遮断し（図３Ａ）、２０ｍＭ（明らかな短期的細胞毒性害を伴わない用量；例えば、増殖の障害はない；図３Ｂ）で完全に抑制した。
【０１００】
ＧＷ４８６９処理ＣＤＣによって馴化した培地は心筋細胞増殖を増強せず、アポトーシスを軽減しなかったので、エキソソーム放出の抑制は、インビトロにおけるＣＤＣの間接的利益を無効化した（図３Ｃおよび３Ｄ）。スピロエポキシド（中性スフィンゴミエリナーゼの特異的な不可逆的阻害剤）は、ストレス負荷した心筋細胞に対するＧＷ４８６９の抗アポトーシス効果を模倣した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。インビボでは、ＣＤＣのすべての予想治療効果を与えたビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）の対照とは対照的に、ＧＷ４８６９で前処理したＣＤＣは、急性ＭＩにおいて機能的（図３Ｅ）または構造的（図３Ｆ〜３Ｉ）利益を与えなかった。したがって、ＣＤＣによるエキソソーム分泌は、インビトロおよびインビボにおけるＣＤＣ媒介性利益に必要である。
【０１０１】
実施例１６
ＣＤＣエキソソームは、ＭＩ病理において重要な役割を果たすｍｉＲ−１４６ａが豊富である
ＣＤＣエキソソームの治療利益の根拠を調査するために、本発明者らは、８８個の最も良く定義されたマイクロＲＮＡのＰＣＲマイクロアレイを使用して、それらのマイクロＲＮＡレパートリーをＮＨＤＦエキソソームのものと比較した。２つの細胞型のマイクロＲＮＡ含量は、劇的に異なっていた。２つの群では、４３個のマイクロＲＮＡが差次的に存在していた；これらの中で、ｍｉＲ−１４６ａは、ＣＤＣエキソソームにおいて最も豊富であった（ＮＨＤＦエキソソームよりも２６２倍多かった；図４Ａ、４Ｂおよび１１）。さらに、ＣＤＣエキソソームを注射した動物由来のＭＩ後心臓では、ＮＨＤＦエキソソームを注射したものと比較して、ｍｉＲ−１４６ａの組織レベルが増加していたが（図４Ｃ）、これは、ＣＤＣエキソソームがｍｉＲ−１４６ａ輸送を介して作用し得るという考えを説得力のあるものにする。ｍｉＲ−１４６ａ模倣物への新生ラット心筋細胞の曝露は、心筋細胞生存率を増加させ、酸化ストレスから保護した（図４Ｄおよび１２Ａ）。全トランスクリプトームマイクロアレイにより、Ｉｒａｋ１およびＴｒａｆ６（これら２つは、ｍｉＲ−１４６ａの公知の標的であるＴＬＲ−ＮＦｋＢ線のシグナル伝達メディエーターである）のダウンレギュレーションが明らかになった（図４Ｅ）。本発明の経路分析により、細胞生存、細胞周期、細胞組織化および形態に関与する経路の変化（これらはすべて、虚血傷害に関連し（図１１Ｄ）、基礎転写因子Ｍｙｃとの関連性を共有する（図１１Ｅ））が示された。心筋傷害におけるｍｉＲ−１４６ａの生物学的役割を証明するために、本発明者らは、ｍｉＲ−１４６ａノックアウト（１４６ａＫＯ）マウスにおいて急性ＭＩを誘発し、それらと、同系統の野生型マウス（ＷＴ）、およびＭＩ時にｍｉＲ−１４６ａ模倣物の注射によって「レスキューされる」１４６ａＫＯマウス（１４６ａＫＯ−Ｒ）とを比較した。
【０１０２】
ＭＩ後に、１４６ａＫＯマウスは、ＷＴまたは１４６ａＫＯ−Ｒと比較して、心機能の障害および有害なリモデリングを強く示した（図４Ｆおよび４Ｇ）。組織学的分析により、ＷＴまたは１４６ａＫＯ−Ｒではなく１４６ａＫＯでは、瘢痕量の有意な増加（図４Ｈ）および梗塞壁厚の減少が明らかになった（図４Ｊ）。１４６ａＫＯ−Ｒ群では、生存心筋量が最大であったが（図４Ｉ）、これは恐らく、注射したｍｉＲ−１４６ａ模倣物の超生理学的効果を示している。これらの知見は、ＭＩにおけるｍｉＲ−１４６ａの重要な役割を示しており、ｍｉＲ−１４６ａがＣＤＣエキソソームの治療利益のいくつかを媒介し得ることを推測する理由を与える。
【０１０３】
重要なことに、本発明者らは、ｍｉＲ−１４６ａが、心筋梗塞のマウスモデルにおいて、梗塞壁厚の肥厚および生存組織の増加をもたらすことをさらに立証した。より大きなエキソソーム効果に対するｍｉＲ−１４６ａの寄与を調査するために、本発明者らは、ｍｉＲ−１４６ａヘアピン阻害剤（または対照ヘアピン）でＣＤＣをトランスフェクトし、続いて、培地を馴化し、エキソソームを単離することによって、ｍｉＲ−１４６ａ欠損エキソソームを開発した。得られたエキソソームに対する、および対照またはｍｉＲ−１４６ａ欠損エキソソームのいずれかに曝露したＮＲＶＭに対するｑＰＣＲによって、ｍｉＲ−１４６ａのノックダウンの成功を確認した（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。未処理ＮＲＶＭ（左の柱、図５Ａ）のＴＵＮＥＬ陽性と、対照ＣＤＣエキソソームで処理したＮＲＶＭ（右の柱、図５Ａ）のものとを比較することによって、ＣＤＣエキソソームの抗アポトーシス効果は明白であった。ｍｉＲ−１４６ａ欠損エキソソームが付与した酸化ストレスからの保護は、対照ＣＤＣエキソソームよりも少なかったが、アポトーシスの抑制は依然として有意であった。これらのデータは、ｍｉＲ−１４６ａが、ＣＤＣエキソソームの有益な効果の全部ではないが一部の基礎となることを示唆している。インビボでこの問題をさらに証明するために、本発明者は、ｍｉＲ−１４６ａ模倣物またはマイクロＲＮＡ模倣物対照のいずれかを注射した以外は図２と同じＭＩモデルを用いた。急性ＭＩ中にｍｉＲ−１４６ａ模倣物を注射したマウスは、ポンプ機能の改善（図５Ｂ）、瘢痕量の減少、および生存心臓組織の増加を示した（図５Ｃ〜５Ｆ）。再生をより厳密に研究することができる慢性ＭＩモデルでは、ｍｉＲ−１４６ａで処理した動物は、ごくわずかな統計的に有意ではない機能的改善を示した（図５Ｇおよび１３Ａ）。さらに、組織学的分析により、瘢痕量の差異は示されなかった（図５Ｈおよび５Ｉ）。しかしながら、ｍｉＲ−１４６ａ模倣物で処理した心臓は、対照よりも、生存組織の増加、梗塞壁の肥厚（図５Ｊおよび５Ｋ）、および有害なリモデリングの減少を示した（図１３Ｂ〜１３Ｄ）。血管新生の評価により、２つの群間で有意差は示されなかった（図５Ｌおよび図１３Ｇ）。しかしながら、インビトロデータ（図５Ａ）と一致して、ｍｉＲ−１４６ａ注射心臓では、心筋細胞アポトーシスの頻度の低下が観察された（図１３Ｈおよび１３Ｉ）。したがって、慢性ＭＩモデルでは、ｍｉＲ−１４６ａは、心筋形成および抗アポトーシス効果を再現するが、ＣＤＣエキソソームの他の機能的および構造的利益を再現しない（図２Ｆ〜２Ｊおよび９Ａ〜９Ｃを参照のこと）。外因性ｍｉＲ−１４６ａは、Ｉｒａｋ−１およびＴｒａｆ６（これらは両方とも、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路に関与する）のターゲティングを介して、虚血／再灌流傷害を抑制することが公知である。先天性免疫の基礎となるＴＬＲシグナル伝達は、ＭＩを含む無菌性炎症の病理において主要な役割を果たす。
【０１０４】
ＣＤＣエキソソームによる炎症促進性サイトカインの減少（図８）ならびにｍｉＲ−１４６ａによるＩｒａｋ１およびＴｒａｆ６の抑制（図４Ｃ）（これは、ＣＤＣエキソソームを注射した心臓では増大する）は、ＴＬＲシグナル伝達の鈍化と一致する。加えて、ｍｉＲ−１４６ａは、ＮＯＸ−４（これは酸化ストレスを与え、心臓傷害を促進することが示されている）およびＳＭＡＤ４（形質転換成長因子ｂ（ＴＧＦ−ｂ）線維化経路のメンバー）を抑制する。これらの標的が実際にダウンレギュレートされることを確認するために、本発明者らは、ｍｉＲ−１４６ａによる処理の７日後に、慢性ＭＩ心臓のウエスタンブロットを実施した。実際、ｍｉＲ−１４６ａ処理心臓では、模倣物対照と比較して、上記標的のすべてがサイレンシングされていた（図６Ａおよび６Ｂ）。本発明者らはまた、ミエロペルオキシダーゼのレベル（好中球浸潤の代理）がより低いことを見出した。
【０１０５】
実施例１７
異なるマウス系統間におけるベースライン駆出率の差異
本発明者らは、これらの動物の著しく高いベースライン駆出率を観察した。この差異は、ノックアウトに使用したマウス系統（Ｃ５７ＢＬ６）のバックグラウンドの差異に起因すると推測された。本稿におけるすべての他の実験において、使用したマウスの系統は、ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅである。ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスは、成熟Ｂ細胞およびＴ細胞ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠く。傷害に対するそれらの反応が異なるので、免疫能力のこの基本的差異は、ベースライン測定値の違いの主な原因である可能性が高い。ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスは、ヒト細胞（これは、ＣＤＣおよびエキソソームの供給源である）に対して許容性であるので、本稿の実験のほとんどにおいて、本発明者は、ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスを選択した。しかしながら、１４６ａＫＯマウスの適切な対照は、ＢＬ６バックグラウンドと同じバックグラウンド系統の野生型であった。これは、以前に立証されている。系統は、心筋梗塞後の創傷治癒の重要な決定因子であることが以前に示されている。
【０１０６】
実施例１８
免疫浸潤に対するｍｉＲ−１４６ａの効果
炎症性免疫応答の軽減は、それを必ずしも完全に無効化するわけではない。マクロファージを含む先天性免疫細胞は、再生を促進する役割を果たすことが示されている。さらに、本発明者らの研究室の未発表データは、マクロファージ輸送はＣＤＣ処理によって影響を受けないが、ＣＤＣで処理したマクロファージは、Ｍ１（炎症促進性）から抗炎症性および治癒促進性の表現型Ｍ２に切り替わることを示している。
【０１０７】
実施例１９
考察
心筋球由来細胞は、ヒト梗塞心臓の治療的再生を誘導することが示されている。伝統的に不可逆的であると考えられていた傷害の形態では、ＣＤＣは、瘢痕の縮小および新たな機能的心筋の成長をもたらした。同様の効果は、動物モデルにおいて確認されている。本明細書では、本発明者らは、エキソソームがＣＤＣ誘導性治療的再生を再現すること、およびエキソソーム産生の阻害がＣＤＣの利益を損なうことを示す。エキソソームは、パラクリン機構を介して細胞挙動を変化させる能力を有するマイクロＲＮＡを含有する（図６Ｂ）。これらの中で、本発明者らは、ＣＤＣエキソソームでは、ｍｉＲ−１４６ａが特に豊富であると同定した。単独で投与した場合、ｍｉＲ−１４６ａは、ＣＤＣおよびＣＤＣエキソソームの顕著な利益の全部ではないが一部を再現する（図３）。同様に、ｍｉＲ−１４６ａ欠乏エキソソームは、ｍｉＲ−１４６ａが存在する場合よりも弱いが、心筋細胞アポトーシスを依然として抑制することができた（図５Ａ）。ＭＩの慢性モデル（瘢痕が永続的である）におけるｍｉＲ−１４６ａによる心臓の処理は、治療的再生の特徴である生存心筋量の増加を再現するが、ＣＤＣエキソソームの２つの重要で有益な効果（瘢痕量の減少および全体的な機能の改善）を模倣することができない：恐らくはｍｉＲ−１４６ａによって誘発される血管新生は不十分であるので、生存心筋の増加は、機能を高めるために十分ではない。本発明者らは、ｍｉＲ−１４６ａが、ＣＤＣエキソソームの効果の媒介において部分的に重要な役割を果たすが、単独で包括的な治療効果を与えるには十分ではないと結論付ける。レパートリーにおける他のマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４６ａと同義的なまたはおそらくは相乗的な効果を発揮し得る。例えば、ｍｉＲ−２２（ＣＤＣエキソソームにおいて非常に豊富な別のマイクロＲＮＡ）は、心臓ストレスに対する適応反応に重要であることが示されている。同様に、ｍｉＲ−２４（ＣＤＣエキソソームにおいても確認されている）は、フリン（線維化促進性ＴＧＦ−ｂシグナル伝達経路のメンバー）をターゲティングすることによって、心臓線維化を調節する；ＭＩのモデルにおけるｍｉＲ−２４の過剰発現は、心筋瘢痕形成を減少させた。ＣＤＣエキソソームの利益に関するメディエーターとしてのこれらのマイクロＲＮＡの潜在的な役割は単独で、またはｍｉＲ−１４６ａと組み合わせて研究中である。ＣＤＣエキソソーム内の活性成分の精査は有益であるが、ナノ小胞の解体は、治療的観点から非生産的であり得る。ＣＤＣエキソソームは本来的に細胞透過性であり、それらの脂質二重層コートは、粒子が細胞間を往復する際の分解からペイロードを保護するので、インタクトな粒子それ自体が、疾患適用に適切なものであり得る。
【０１０８】
傷害心臓へのＣＤＣ由来エキソソームの注射は、ＣＤＣ移植の構造的および機能的利益を模倣する；反対に、ＣＤＣによるエキソソーム分泌の阻害は、移植ＣＤＣの治療利益を無効化する。すべてのエキソソームが有益であるわけではない：真皮線維芽細胞（治療的に不活性な対照細胞）由来エキソソームの注射は、有益ではなかった。ＤＣエキソソームは、傷害心臓における左心室（ＬＶ）リモデリングおよび線維化を軽減しながら、急性心筋細胞死および炎症性サイトカイン放出を減少させた。マイクロＲＮＡアレイは、ＣＤＣエキソソームにおいて高度にアップレギュレートされるいくつかの「特徴的なマイクロＲＮＡ」を明らかにしている。対照的に、質量分析は、ＣＤＣエキソソームのタンパク質組成が従来的であり、線維芽細胞エキソソームのものと同程度であることを示している。
【０１０９】
本研究は、エキソソームおよびそれらが含有するマイクロＲＮＡが、ＣＤＣ誘導性心臓再生の重要なメディエーターであることを示唆している。ＣＤＣは、多様だが協調的な効果を発揮する：それらは、内因性始原細胞をリクルートし、生存心臓細胞の増殖を促す；一方、注射したＣＤＣは、ＭＩ後の不適応性ＬＶリモデリング、アポトーシス、炎症および組織線維化を抑制する。ＣＤＣが、共同で多様な効果をもたらす一連の個々の成長因子およびサイトカインを分泌する可能性があるが、エキソソーム内のマスターレギュレーターマイクロＲＮＡの関与は、多数の分泌タンパク質因子の複雑な混合物がなくても、様々な効果を互いに結びつけるのに役立つであろう。また、マイクロＲＮＡは、組織中では短命であるにもかかわらず、長期の利益および傷害微小環境の基本的変化をもたらし、ＣＤＣの持続的利益を正当化するために役立つことが公知である。ＣＤＣエキソソームは、「永続的」傷害の状況で再生をもたらすことができると最初に示された細胞型によって与えられる豊富なシグナル伝達情報を含有し、生細胞を移植しなくてもＣＤＣと同じ利益を与える。すべてのこれらの理由により、ＣＤＣエキソソームは、無細胞治療候補としてさらなる開発に値する。
【０１１０】
本明細書に記載される結果に基づいて、ＣＤＣエキソソームは、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に関連する心不全（ＨＦ）の処理など、心臓関連症状を処理することができることが実証された。細胞によって分泌されたエキソソームは、親細胞の治療利益を再現することができ、記載されているノックダウン研究に基づいて、このような治療利益の達成に不可欠と思われる。重要なことに、これらの結果により、様々なタンパク質およびＲＮＡの豊富な生物学的カーゴ内で、マイクロＲＮＡが、再生プロセスの活性化において中心的な役割を果たすことがさらに判明したが、これは、臨床治療における適用が有力であることを示唆している。エキソソームは、製造上の利点、定義および特性評価に関する相対的容易性、腫瘍原性および免疫原性の欠如、ならびに細胞、組織、器官または機械的移植が利用不可能な治療状況における投与可能性を含め、伝統的な細胞ベースの治療を超える有意な利点を有する。したがって、ＣＤＣエキソソームは、生物学的治療の重大な進歩である。
【０１１１】
実施例２０
統計分析
すべての結果は、平均±ＳＥＭとして示されている；交互脈の結果は、平均±ＳＤとして示されている。それぞれコルモゴロフ・スミルノフ検定およびレーベン検定を使用して、データセットの正規性および等分散性を試験した。両方とも確認された場合、ｔ検定または分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定を、統計的有意性の決定に使用した；正規性または等分散性のいずれかが保証されなかった場合、ノンパラメトリック検定（ウイルコクソン検定またはクラスカル・ワリス検定とそれに続くダン事後検定）を適用した（ＳＰＳＳ  ＩＩ，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）。検出力分析について、予備データは利用不可能であった。初期パイロットプロジェクトとして１群当たり動物４匹のサンプルサイズで、実験を計画した。パイロットプロジェクトの結果から、本発明者らは、その後の研究を行うことができた。本研究は、記載されているように、臨床前報告基準に準拠していた。
【０１１２】
実施例２１
心エコー検査
Ｖｅｖｏ  ７７０イメージングシステム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、１回目のＣＤＣ／ＣＤＣエキソソーム（ＣＤＣ−ＸＯ）注射２日前（ベースライン）および３週間後、２カ月後および３カ月後に、ならびに２回目のＣＤＣ／ＣＤＣ−ＸＯ注射３週間後、２カ月後および３カ月後に、心エコー検査研究を実施した。同じイメージングシステムを使用して、ベースライン（２日前）およびｍｉＲ１４８ａ模倣物注射３週間後に、心エコー検査研究を実施した。全身浅麻酔の誘導後に、最大ＬＶ径のレベルで、心臓をイメージングした。Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓバージョン１．３．８ソフトウェアを用いて、２次元長軸像から、ＬＶ駆出率（ＬＶＥＦ）を測定した。左心室（ＬＶ）拡張末期および収縮末期容積の変化：１回目および２回目のＣＤＣまたはＣＤＣ−ＸＯ移植は、プラセボと比べて、少なくとも６カ月間にわたるｍｄｘマウスにおけるＬＶ拡張末期（ＬＶ  ＥＤＶ）および収縮末期（ＬＶ  ＥＳＶ）容積の持続的改善をもたらした。ｍｉＲ−１４８ａの送達は、ＬＶ  ＥＤＶおよびＬＶ  ＥＳＶを部分的に改善した（図２７）。
【０１１３】
実施例２２
トレッドミル運動試験
ＣＤＣ／ビヒクル注射３週間後からＥｘｅｒ−３／６オープントレッドミル（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を用いて、運動能力を週１回評価した（術前１週間にｍｄｘマウスのサブセットにおいて測定した運動能力は、術後３週間にＭｄｘ＋ビヒクル群において測定したものと同等であった；データは示さず）。順応期間（１０ｍ／分で２０分間）後、トレッドミル運動中は、マウスが疲労するまで、平均速度の段階的な増加（１ｍ／分）を２分間ごとに適用した（ショッカーで１０秒間超過ごす；トレッドミル中は、マウスがトラックに留まるのを支援するために、軽く押し続けた）。続いて、マウスをケージに戻し、総距離を記録した。週１回の運動を３カ月間行った後に、死亡率の評価のために、ＣＤＣ／ビヒクルｍｄｘマウスを、野生型年齢適合性マウスと一緒に追跡した。トレッドミルプロトコールは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ3のガイドラインに準拠していた。
【０１１４】
実施例２３
ＣＤＣの増殖
記載されているように2、野生型系統適合マウス心臓（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎＪ野生型マウス心臓）から、マウスＣＤＣを増殖させた。簡潔に言えば、心室組織を約１ｍｍの外植片に細分化し、部分的に酵素消化し、接着性（フィブロネクチンコーティング）培養皿にプレーティングした。これらの外植片が自発的に産生した増殖細胞（外植片由来細胞）を、コンフルエント後に採取し、懸濁培養液にプレーティング（ポリ−Ｄ−リジンコーティングディッシュ上に細胞１０5個／ｍＬ）して、三次元心筋球の自己集合を可能にした、続いて、心筋球を接着性培養皿上に再プレーティングしてＣＤＣを得、これを、すべての実験において１継代目で使用した。
【０１１５】
実施例２４
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によるＣＤＣ生着の評価
ＣＤＣ注射１週間後、２週間後および３週間後に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、細胞生着を評価した。ＴａｑＭａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、Ｙ染色体上に位置するＳＲＹ遺伝子を生着マーカーとして検出することを可能にするために、雄性ＣＤＣを注射した。全マウス心臓を採取し、計量し、ホモジナイズした。注射したＣＤＣから単離したゲノムＤＮＡの複数の希釈物を用いて、標準曲線を作成した。対照として非注射マウス心臓由来の等量のゲノムＤＮＡで、すべてのサンプルをスパイクした。各反応では、５０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用した。リアルタイムＰＣＲを３回反復で実施した。標準曲線から生着を定量した。１週間の時点のＣＤＣの生着率は約８％であり、２週間の時点では１％未満であった。３週間で、生存ＣＤＣを検出することができなかった（図２８）。
【０１１６】
実施例２５
ＣＤＣ注射後の心筋細胞増殖および心臓コラーゲン含量
各心臓の先端部、中央部および基底部由来のパラフィン包埋切片を、マッソントリクローム染色ならびにＫｉ６７およびａｕｒｏｒａ  Ｂに対する抗体による免疫染色に使用した。コラーゲンＩＡ１およびコラーゲンＩＩＩＡ１の心筋存在量を、ウエスタンブロット分析によって測定した（図２９）。
【０１１７】
実施例２６
エキソソーム
低酸素状態（２％Ｏ2、デフォルト状態）または正常酸素状態（２０％Ｏ2、単にエキソソームのＲＮＡ含量を比較する研究のため）において、ヒトＣＤＣ（ＣＤＣ−ＸＯ）［または対照として正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）］によって一晩（２４時間）馴化した無血清培地から、エキソソームを単離した。３００ｇ（１０分間）および１０，０００ｇ（３０分間）の連続遠心分離ならびに０．２２ミクロンフィルタによるろ過の後に、超遠心分離（１００，０００ｇ、１時間）を使用して、馴化培地からエキソソームを単離した。単離したエキソソームを、ＲＮＡ抽出および続いてＲＮＡ配列決定に供し（図３０）、またはＰＢＳに再懸濁し（インビボおよびインビトロ実験の場合）、それぞれマイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）およびＮａｎｏｓｉｇｈｔ粒子カウンターを使用して、エキソソームとタンパク質との比を測定した（図３１）。予備的用量反応研究により、低酸素ＣＤＣ由来タンパク質１ｇ当たり２×１０7個および１×１０9個のエキソソームが、インビボおよびインビトロ実験のための有効用量であることが判明した。ＮＨＤＦエキソソームを適用した実験では、同様の濃度のエキソソームを使用した。記載されているように、超遠心分離またはＥｘｏｑｕｉｃｋキット（ＳＢＩ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって単離したエキソソームを使用して、予備的パイロットインビボ実験を実施して、２つの単離方法で同様の結果を得た。
【０１１８】
実施例２７
ＣＤＣ、ＣＤＣエキソソームおよびｍｉＲ−１４８の注射
ＣＤＣ移植のプロセスを最適化するために、予備的用量反応実験を実施したところ、虚血マウスモデルおよび非虚血マウスモデルにおける先の用量範囲実験と一致して、１回目の注射では１×１０5個の細胞および２回目の注射（１回目の注射３カ月後）では１×１０4個の細胞が、有効用量であることが判明した。合計で細胞１×１０5個／４０μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１回目の注射）または細胞１×１０4／４０μＬ  ＰＢＳ（２回目の注射）またはＰＢＳのみを、記載されている４点間で等分して左心室（ＬＶ）心筋に注射した。ＬＶを３つの領域（基底、中間および先端）に視覚的に分け、基底領域に１回注射し、中央領域に２回注射し、先端領域に１回注射した。ＣＤＣ（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ、ｎ＝１２）またはビヒクル［プラセボ：Ｍｄｘ＋ビヒクル（ＰＢＳ）、ｎ＝１２］（３カ月間隔）を１０カ月齢のＣＤＣ／ｍｄｘおよびビヒクル／ｍｄｘマウスにそれぞれ２回注射した。開胸術中に、２８1／2ゲージ針によって、注射を行った。動物が全身麻酔（デクスメデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）／ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）；ＩＰ；術前に１回）中に、すべての外科手術を行った。心筋へのＣＤＣエキソソームおよびｍｉＲ−１４８の注射のために、同様のプロトコールを使用したｍｉＲ−１４８ａ模倣物（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、２μｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）と総容量４０μｌ、室温で３０分間混合し、上記のように心臓１つ当たり４点に注射した。
【０１１９】
実施例２８
組織学
１回目のＣＤＣ／ＣＤＣ−ＸＯ注射３週間後（ＣＴＬ：ｎ＝４；Ｍｄｘ＋ビヒクル：ｎ＝６；Ｍｄｘ＋ＣＤＣ／Ｍｄｘ＋ＣＤＣ−ＸＯ：それぞれｎ＝６）または３カ月後（ＣＴＬ：ｎ＝４；Ｍｄｘ＋ビヒクル：ｎ＝６；Ｍｄｘ＋ＣＤＣ／Ｍｄｘ＋ＣＤＣ−ＸＯ：ｎ＝６）およびｍｉＲ−１４８注射３週間後（ｎ＝６）に、マウスを屠殺した。組織学のために、各心臓の先端部、中央部および基底部由来のパラフィン包埋切片を使用した。線維化の評価のために、マッソントリクローム染色（ＨＴ１５  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  Ｓｔａｉｎ［Ｍａｓｓｏｎ］  Ｋｉｔ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を実施した。それぞれマウスＣＤ３、ＣＤ２０およびＣＤ６８に対する抗体による免疫染色によって、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを評価し、各心臓の先端領域（３個の切片；５０μｍ間隔）、中央領域（４個の切片；５０μｍ間隔）および基底領域（３個の切片；５０μｍ間隔）から無作為に選択した１０個の各切片から細胞を１０視野（倍率２０倍）でカウントして、各心臓における平均細胞数を計算した。活性なサイクリングおよび増殖（Ｋｉ６７+およびＡｕｒｏｒａ  Ｂ+）心筋細胞を同様にカウントし、記載されているように、Ｋｉ６７+およびＡｕｒｏｒａ  Ｂ+心筋細胞の数を強拡大視野（ＨＰＦ）当たりの心筋細胞の総数で割ったものとして、サイクリング画分および増殖画分をそれぞれ表した。各心臓について、測定結果を平均化した。免疫蛍光染色：低ｐＨ緩衝液（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）中で熱誘導性エピトープ回復を行い、続いて、１％サポニン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；３％サポニンを含有するタンパク質ブロッキング溶液をＫｉ６７の免疫蛍光染色に適用した）を含有するタンパク質ブロッキング溶液（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で２時間透過処理／ブロッキングした。続いて、各心臓の先端部、中央部および基底部由来の５μｍ切片の免疫蛍光染色のために、一次抗体のタンパク質ブロッキング溶液を４℃で一晩適用した。ＰＢＳで３回洗浄（各１０分間）した後に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を検出に使用した。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５  Ｘ共焦点顕微鏡システムによって、画像を撮影した。マウス  Ｋｉ−６７（ＳＰ６；１：５０；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、ＷＧＡ（コムギ胚芽凝集素；１：２００；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｎｒｆ２（Ｃ２０；１：５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ａｕｒｏｒａ  Ｂ（１：２５０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に対する抗体を使用して、免疫蛍光染色を行った。免疫ペルオキシダーゼ染色：Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ；ＣＤ６８）およびＣｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ（Ｒｏｃｋｌｉｎ，ＣＡ；ＣＤ３，ＣＤ２０）の予め希釈されているウサギモノクローナル抗体を使用して、ＣＤ３、ＣＤ２０およびＣＤ６８の免疫組織化学的検出を５μｍ切片で実施した。高ｐＨ  ＥＲ２緩衝液（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）中でオンボード熱誘導性エピトープ回復法を使用して、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ−Ｍａｘ  Ｖｅｎｔａｎａ自動スライド染色機（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）によって、染色を行った。Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ+ウサギ検出システムおよびＤａｋｏ  ＤＡＢ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して、染色を可視化した。続いて、メイヤーヘマトキシリンでスライドを１分間対比染色し、カバーガラスで覆った。電子顕微鏡法：１ｍｍ2の立方体を２％グルタルアルデヒドに浸漬することによって、各心臓由来の後壁の先端部（１つの立方体）、中央部（右側サブ部分、中央サブ部分および左側サブ部分から３つの立方体）および基底部（右側サブ部分、中央サブ部分および左側サブ部分から３つの立方体）（ＣＴＬ：ｎ＝３；Ｍｄｘ＋ビヒクル：ｎ＝３；Ｍｄｘ＋ＣＤＣ：ｎ＝３）を固定し、オスミウムで後固定し、エポンに包埋した。切片を銀厚で切断し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、ＡＭＴデジタルカメラシステムを備えるＪＥＯＬ  １０１０を用いて観察した。
【０１２０】
実施例２９
ウエスタンブロット
ウエスタンブロットを実施して、Ｎｒｆ２シグナル伝達［Ｎｒｆ２、リン酸化Ｎｒｆ２（Ｎｒｆ２−ｐs40）およびＮｒｆ２下流遺伝子産物：ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、およびグルタミン酸−システインリガーゼ（ＧＣＬＣ）の触媒サブユニット］、Ｎｒｆ２リン酸化［リン酸化Ａｋｔ（Ａｋｔ−ｐ308）］、酸化的リン酸化［ＣＩ（ＮＤＵＦＢ８サブユニット）、ＣＩＩ（ＳＤＨＢサブユニット）、ＣＩＶ（ＭＴＣＯｌサブユニット）、ＣＩＩＩ（ＵＱＣＲＣ２サブユニット）およびＣＶ（ＡＴＰＳＡサブユニット）］、ミトコンドリア生合成（ＰＧＣ−１）、マイトファジー（ＰＩＮＫ１）、炎症（ＮＦ−κΒおよびＭＣＰ−１）および線維化（コラーゲンＩＡ１およびコラーゲンＩＩＩＡ１）に寄与する標的タンパク質の心筋存在量を比較した。ウエスタンブロッティング（ＷＢ）によって、マロンジアルデヒドタンパク質付加物（酸化ストレスのマーカー）の心筋密度も測定した。各心臓の先端部、中央部および基底部由来のサンプル（各１ｍｍ厚の横断面）を混合し、ホモジナイズし、製造業者の説明書（ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＮｕＣＬＥＡＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にしたがって、核画分および細胞質画分を抽出した。呼吸測定のセクションに記載されているように、新鮮な全心臓（ＣＴＬ：ｎ＝３；Ｍｄｘ＋ビヒクル：ｎ＝８；Ｍｄｘ＋ＣＤＣ：ｎ＝８）からミトコンドリアを抽出した。ＷＢ分析のための細胞質抽出物、核抽出物およびミトコンドリア抽出物を−８０℃で保存した。マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）によって、抽出物中のタンパク質濃度を決定した。以下の抗体を使用してウエスタンブロット分析によって、細胞質画分、核画分およびミトコンドリア画分の標的タンパク質を測定した：マウスＮｒｆ２、ＨＯ−１、カタラーゼ、ＳＯＤ−２、ＧＣＬＣ、コラーゲンＩＡ１およびコラーゲンＩＩＩＡ１ならびにＰＧＣ−１に対する抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入し、リン酸化Ｎｒｆ２（Ｎｒｆ２−ｐs40；Ｂｉｏｒｂｙｔ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、呼吸鎖サブユニット（全ＯＸＰＨＯＳ齧歯類ＷＢ抗体カクテル抗体）、マロンジアルデヒド、クエン酸シンターゼおよびＴＢＰ（Ａｂｅａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＡｋｔおよびＡｋｔ−ｐT308、ΙκΒ−α、ρ−ΙκΒ−α（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）、ＰＩＮＫ１、ＭＣＰ−１およびＮＦ−κΒ  ｐ６５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）抗体は、引用されている供給業者から購入した。核（ＴＢＰ）、細胞質ゾルおよびミトコンドリア（クエン酸シンターゼ）標的タンパク質のハウスキーピングタンパク質の測定のために、ＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タンパク質）およびクエン酸シンターゼに対する抗体を使用した。ウエスタンブロット法：簡潔に言えば、８、１０および４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎ��，ＮＹ）上で、２０μｇのタンパク質を含有するアリコートを１２０Ｖで２時間分画し、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に転写した。ブロッキング緩衝液（１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および５％脱脂乳）中で膜を１時間インキュベートし、次いで、表１に記載されている最適希釈で所定の抗体を含有する同じ緩衝液中で一晩インキュベートした。
【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
膜を１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間にわたって３回洗浄してから、１：１０００〜３０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ、抗マウスＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）および抗ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する緩衝液（１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および３％脱脂乳）中で２時間インキュベートした。膜を１×ＴＢＳ、０．０５％＞Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間にわたって３回洗浄し、ＥＣＬ化学発光剤（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用してオートルミノグラフィーによって顕色した。目的のタンパク質の発現を正常化したハウスキーピングタンパク質として、クエン酸シンターゼおよびＴＢＰを使用した。全Ａｋｔ、Ｎｒｆ２およびＩκＢ−αに対して、リン酸化Ａｋｔ、Ｎｒｆ２およびＩκＢ−αを正規化した。非還元非変性条件下で、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩのウエスタンブロット分析を行った。
【０１２３】
実施例３０
ミトコンドリアＤＮＡ
製造業者の説明書（ＮｏｖａＱＵＡＮＴ（商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｏ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒａｔｉｏ  ｋｉｔ，ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）にしたがってＰＣＲフォーマットを使用して、ミトコンドリアＤＮＡと核ＤＮＡとの比を測定するために、全心臓組織から抽出したＤＮＡ（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を使用した。
【０１２４】
実施例３１
呼吸測定
イソフルラン麻酔後に、頚部脱臼によってマウスを屠殺した。心臓を直ぐに摘出し、ＰＢＳでリンスし、１ｍＬの氷冷ＨＥＳ緩衝液（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中でポリトロンによってホモジナイズした。溶解物を４℃、１０００ｇで５分間スピンダウンして、破砕されていない細胞および大きな残屑を除去した。次いで、上清を４℃、７０００ｇで１０分間スピンダウンして、粗細胞質ゾルからミトコンドリアが豊富な画分を分離した。ペレットを１ｍＬのＨＥＳ緩衝液（ＷＢのための溶解緩衝液の一部）に再懸濁した。タンパク質の定量を実施し、ＨＥＳ緩衝液で調整して、５０μＬの緩衝液中に１０μｇのタンパク質を含有するサンプルを得、これを２４ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養プレートにロードし、これを４℃、２０００ｇで２０分間スピンダウンして、プレート表面へのミトコンドリア接着を可能にした。次いで、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４ミトコンドリアストレス試験の前に、４５０μＬ  ＭＡＳ緩衝液（７０ｍＭスクロース、２２０ｍＭマンニトール、５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２％脂肪酸不含ＢＳＡ、ｐＨ７．４）を追加した。５ｍＭ／５ｍＭピルビン酸／リンゴ酸および０．２５ｍＭ  ＡＤＰを使用し、続いて、１μＭオリゴマイシン、１μＭ  ＦＣＣＰ、１μＭアンチマイシン、５００ｎＭロテノンの混合物を使用して、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を刺激した。サンプル溶解物中でクエン酸シンターゼ活性を測定して、試験のためにロードした実際のミトコンドリアの量について正規化した。記載されているように、Ｓｅａｈｏｒｓｅ（商標）ＸＦ９６  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ分析器を使用して、正常およびヒトデュシェンヌｉＰｓ細胞由来心筋細胞に対するＳｅａｈｏｒｓｅ呼吸測定を実施した。
【０１２５】
実施例３２
細胞内Ｃａ２＋の記録
５μＭの蛍光カルシウム感受性色素Ｃａｌ−５２０（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）をｉＰＳ由来心筋細胞に３０分間ロードし、チャンバベースの両側に配置した２本の白金線（約１ｃｍの間隔）を介して２０Ｖの振幅と共に０．２ミリ秒二乗の電圧パルスを送達するＩｏｎ−Ｏｐｔｉｘ  Ｍｙｏｐａｃｅｒ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ  Ｃｏｒｐ）を使用して、周波数１Ｈｚの電場刺激によってペーシングした。本発明者らは、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５−ＩＩ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．；Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のｘｙｔモード（２Ｄ）を使用して、細胞内Ｃａ2+をイメージングした。４８８ｎｍレーザーでＣａｌ５２０を励起し、視野サイズに応じて３６〜７ミリ秒／フレームのスキャン速度で、１０倍対物レンズ（Ｌｅｉｃａ：Ｎ  ＰＬＡＮ  １０×／０．２５）を用いて、その発光（＞５０５ｎｍ）を収集した。Ｃａ2+濃度に比例する蛍光強度（Ｆ）を、ベースライン蛍光Ｆ０（Ｆ／Ｆ０）に対して正規化した。ソフトウェアＣｌａｍｐｆｉｔ（ｖｅｒ．１０．２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ピーク到達時間およびＣａ2+トランジェント振幅（Ｆ／Ｆ０）を分析した。各群における心拍間隔の交互脈を、１Ｈｚペーシングの５〜１０秒間隔で計算した。ペーシング中に各細胞の各トランジェント振幅（各群でｎ＝細胞１０個）を測定し、平均および標準偏差を計算し、群間で比較した。
【０１２６】
実施例３３
ｍｄｘマウスにおけるＣＤＣ移植によって改善された機能、生存および抗酸化経路
ｍｄｘマウスにおける第１用量および第２用量（より低用量）のＣＤＣの心筋内注射は、プラセボと比べて、少なくとも６カ月間にわたる（駆出率［ＥＦ］によって表される）左心室機能および容積の持続的改善をもたらした（図２３Ａおよび２７）。ＥＦにおけるＣＤＣ誘導性改善は、生存ＣＤＣがｍｄｘ心臓において検出不可能であった時点（ＣＤＣ送達の３週間後；図２８）を超えて持続した。ＥＦの改善に加えて、ＣＤＣ注射は、歩行機能を増強した（図２３Ｂ）。年齢適合野生型マウス（ＣＴＬ）および１０カ月齢のｍｄｘマウス（心機能の評価について研究したｍｄｘマウスとは異なる）を、ＣＤＣまたはビヒクル投与の３週間後から、高強度トレッドミル運動に週１回供した。ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスは、ビヒクル処理ｍｄｘマウスと比べて、それを測定した３カ月間にわたって、最大運動能力の実質的な増加を示した；２つの群では、生存も異なっていた（図２３Ｃ）。約２３カ月齢までに、ビヒクル処理ｍｄｘマウスはすべて死亡したのに対して、ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスの５０％超は依然として生存していた（図２３Ｃ）。ＣＤＣの注射は、Ｎｒｆ２抗酸化経路の活性化および下流遺伝子産物のアップレギュレーションをもたらした（図２３Ｅ）。同時に、酸化ストレスが軽減した（図２３Ｆ）。細胞質では、Ｎｒｆ２は通常、そのリプレッサー分子Ｋｅａｐ１への結合を介して隔離される。酸化ストレス（およびＡｋｔなどのプロテインキナーゼによるＮｒｆ２リン酸化）は、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１複合体の解離を引き起こし、その結果、Ｎｒｆ２の核移行および抗酸化酵素の転写活性化が起こる。ｍｄｘ心臓では、（酸化ストレスに応じて予想どおり）リン酸化Ａｋｔならびに細胞質および核Ｎｒｆ２のレベルが高かった；ＣＤＣ処理は、それらのタンパク質レベルをさらに増加させた（図２３Ｅ）。結果として、ＣＤＣ処理ｍｄｘ心臓では、下流エフェクターのヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、およびグルタミン酸−システインリガーゼ（ＧＣＬＣ）の触媒サブユニットがアップレギュレートされ（図２３Ｅ）、マロンジアルデヒド付加物（脂肪酸過酸化最終生成物；図２３Ｆ）が著しく減少していた。組織学的分析により、線維化は、典型的なビヒクル処理ｍｄｘ心臓では広範であったが、ＣＤＣ処理ｍｄｘ心臓では非常に少なかった（年齢適合野生型［ＷＴ］対照と同程度）ことが明らかになった。同様に、ウエスタンブロット分析により、ＣＤＣ処理は、処理３週間後のｍｄｘ心臓組織におけるコラーゲンＩおよびＩＩＩの蓄積を大きく回復させたことが示された（図２９）。
【０１２７】
実施例３４
ｍｄｘマウス心臓におけるＣＤＣ移植によって軽減されたミトコンドリア機能不全および炎症
筋ジストロフィー関連心不全では、ミトコンドリアの構造および機能が異常である。ｍｄｘ心臓では、ＣＤＣ注射３週間後に、ミトコンドリア完全性が改善した：ＣＤＣは、ミトコンドリア超微細構造を回復させ（図２４Ａ）、ミトコンドリアＤＮＡコピー数を増加させ（ミトコンドリア数ではない；図２４ＢおよびＣ）、呼吸鎖サブユニットのレベルを増大させ（図２４Ｄ）、単離したｍｄｘミトコンドリアの不十分な呼吸能を正常化した（図２４Ｅ）。
【０１２８】
ミトコンドリア生合成およびマイトファジーの重要なレギュレーターであるそれぞれＰＧＣ−１（核ＰＰＡＲγコアクチベーター１）およびＰＩＮＫ１は、ＣＤＣ処理３日後ではアップレギュレートしており、ＣＤＣ処理３週間後ではダウンレギュレートしていたが（図２４Ｆ）、これは、最初の損傷ミトコンドリアのターンオーバーと、それに続く安定なコンピテントミトコンドリアを伴う再増殖と一致する。注目すべきことに、ｍｄｘマウス心臓においてＣＤＣ処理３週間後に観察されたミトコンドリア完全性の改善およびミトコンドリアターンオーバーの減少は、抗酸化酵素のアップレギュレーションならびに酸化ストレスおよび炎症の減少に関連していた（図２４ＧおよびＨ）。ビヒクルｍｄｘ心臓では、炎症促進性サイトカインおよびケモカインのマスターレギュレーターであるＮＦκＢが活性化していた：リン酸化ΙκΒおよび核ｐ６５含量の増加は、ＭＣＰ１（単球走化性タンパク質１）の顕著なアップレギュレーションならびにＣＤ６８+マクロファージおよびＣＤ３+Ｔ細胞の蓄積を伴っていた。ＣＤＣ注射３週間後のｍｄｘ心臓では、ＣＤＣ処理は、ＮＦκＢの活性化を逆転させ、炎症細胞の数を減少させた（図２４ＧおよびＨ）。本発明者らはまた、心筋形成に対するＣＤＣの効果を証明した。ビヒクル処理ｍｄｘ心臓は、恐らくは進行中の心筋細胞喪失の代償として、サイクリング（Ｋｉ６７+）および増殖（ａｕｒｏｒａ  Ｂ+）心筋細胞の数の数倍の増加を示した（図２９）。ＣＤＣは、虚血モデルおよび非虚血モデルにおける内因性心筋形成を増加させることが公知である。同様に、ｍｄｘ心臓では、ＣＤＣ処理は、Ｋｉ６７+およびａｕｒｏｒａ  Ｂ+心筋細胞の顕著な増加によって証明されるように、心筋形成を促進した（図２９）。
【０１２９】
実施例３５
ＣＤＣ分泌エキソソームは、ｍｄｘマウスにおいてＣＤＣの利益を再現する。
ＣＤＣによって分泌されたエキソソーム（ＣＤＣエキソソーム）は、心筋梗塞のマウスモデルにおいてＣＤＣの機能的および構造的利益を模倣する。ＤＭＤのｍｄｘマウスモデルでは、同様に、ＣＤＣの機能的、抗線維化および心筋形成利益は、低酸素ＣＤＣによって馴化した培地から単離したエキソソームの投与によって再現される。２回反復用量のヒトＣＤＣエキソソームの心筋内注射（３カ月間隔）は、ビヒクル処理マウスと比べて、ｍｄｘマウスにおいてＥＦの持続的改善をもたらした（図２５Ａおよび図２７）。一方、ＣＤＣエキソソーム注射ｍｄｘ心臓では、サイクリング（Ｋｉ６７+、図２５Ｃ１）および増殖（ａｕｒｏｒａ  Ｂ+、図２５Ｃ２）心筋細胞の数の顕著な増加と共に、コラーゲンＩおよびＩＩＩの量が減少していた（図２５Ｂ）。
【０１３０】
実施例３６
ヒトデシェンヌ心筋細胞におけるＣＤＣエキソソーム、およびｍｄｘマウスにおけるｍｉＲ−１４８ａ。デュシェンヌヒトｉＰＳ由来心筋細胞（ＤＭＤ  ＣＭ）は、ｍｄｘマウス心臓においても見られる多くの表現型の欠陥を示す。酸素消費速度（ＯＣＲ）の減少（これは、ｍｄｘ心臓のミトコンドリアにおいて観察されたものを思い起こさせる（図２４Ｅ））および異常なカルシウムサイクリングが、報告されている欠陥である21。１週間前にＣＤＣエキソソームでＤＭＤ  ＣＭをプライミングするとＯＣＲが正常化したが、正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦエキソソーム）由来エキソソームによるプライミングは効果がなかった。１Ｈｚのバーストペーシング中の心拍間隔のカルシウムトランジェントの変化（催不整脈性の尺度）は、ＣＤＣエキソソームでＤＭＤ  ＣＭをプライミングすることによって同様に抑制された（図２６ＡおよびＢ）。低酸素ＣＤＣおよび正常酸素ＣＤＣから単離したＣＤＣエキソソームのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）含量の比較により、ｍｉＲ発現の差異（図２６Ｃ）、および低酸素におけるｍｉＲ−１４８ａの顕著な増大が明らかになった。本発明者らのＣＤＣエキソソームを低酸素下で成長させたことを考慮して、本発明者らは、ｍｉＲ−１４８ａ投与の効果を試験した。ｍｉＲ−１４８ａ模倣物の心筋内注射３週間後では、ｍｉＲ−１４８ａによってＥＦ率は部分的に回復し、ＮＦκＢは抑制されたが、リン酸化Ａｋｔレベルは減少した（図２６ＤおよびＥ）。リン酸化Ａｋｔの変化は、ＣＤＣ注射で見られるものと逆方向であるが（図２３Ｅ）、これは、ｍｉＲ−１４８ａが、ＣＤＣおよびＣＤＣエキソソームの効果の全部ではないが一部を模倣することを示している。
【０１３１】
【表２】
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【０１３２】
実施例３７
考察
ＤＭＤ患者では、心疾患は、骨格筋症の診断後１０年以上現れない可能性があるが、心筋症は、それが明白になったら急速に進行する。連続心臓磁気共鳴イメージング研究により、線維化は、最初は心臓のごく一部に限定されることが多いが、その後は迅速かつ無情に拡大することが明らかになった23。結果は、全体的な心機能の障害および早期死亡である。ＤＭＤ心筋症の進行を停止させ、予防しまたは遅延させる有効な処理はない。ＣＤＣが、ＤＭＤにおいて有益であり得る再生効果を発揮することを認識して、本発明者は、早期のＤＭＤ心筋症においてＣＤＣ注射の効果を試験した。本発明者らは、ＣＤＣが、ポンプ機能を改善し、運動能力を増加させ、生存を増強しながら、ｍｄｘ心臓において線維化および炎症を軽減することを発見した。ＣＤＣの顕著な利益は、ＣＤＣエキソソームによって再現された。本発明者の知見は、ＣＤＣが、（限定されないが）ｍｉＲ−１４８ａを含む遺伝的シグナルを積載したエキソソームを分泌することによって作用するという仮説を裏付けている。これらのエキソソームは周囲の心筋に取り込まれ、ＤＭＤ心筋症の基礎となる複数の病態生理学的経路をアンタゴナイズする。一連の効果は相乗的である：酸化ストレス、炎症および線維化は鈍化する一方、心筋形成およびミトコンドリア機能は増大する。ＣＤＣおよびそれらのエキソソームは進行を防ぐだけではなく、ＤＭＤ心筋症の中心的な機能障害を実際に回復させるという点で、この結果は注目に値する。ジストロフィンをターゲティングせずに、死亡率および運動能力の大きな改善が起こるが、これは、ＤＭＤ治療が非常に有効であるために、根本的な遺伝的原因の修正が不要であるという考えを証明している。ＣＤＣが既に先進臨床試験中であることを考慮して、本発明者の結果は、ＤＭＤ心筋症を有する患者においてＣＤＣの臨床試験を開始することを支持する。実際、本知見に基づいて、ＨＯＰＥ−デュシェンヌ試験は、ＤＭＤに続発する心不全の被験体において、多血管冠動脈内注入によって投与した同種異系ＣＤＣの安全性および忍容性を直ぐ調査するであろう。
【０１３３】
上記の様々な方法および技術は、本発明を実行するための多くの方法を提供する。当然のことながら、本明細書に記載される任意の特定の実施形態にしたがって、記載されているすべての目的または利点を必ずしも達成することができるわけではないことを理解すべきである。したがって、例えば、当業者であれば、本明細書で教示または示唆され得るような他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書で教示される１つの利点または利点群を達成または最適化するように、前記方法を実施することができると認識する。本明細書では、様々な有利および不利な代替策が言及される。いくつかの好ましい実施形態は、１つの、別のまたは複数の有利な特徴を特に組み入れ、他のものは、１つの、別のまたは複数の不利な特徴を特に除外し、さらに他のものは、１つの、別のまたは複数の有利な特徴を組み入れることによって、本発明の不利な特徴を特に軽減することを理解すべきである。
【０１３４】
さらに、当業者であれば、異なる実施形態から様々な特徴の適用可能性を認識する。同様に、当業者であれば、上記様々な要素、特徴および工程ならびにこのような各要素、特徴または工程の他の公知の均等物を融合および適合して、本明細書に記載される原理にしたがって方法を実施し得る。多様な実施形態では、様々な要素、特徴および工程の中で、いくつかのものが特に組み入れられ、他のものが特に除外され得る。
【０１３５】
特定の実施形態および実施例との関連で本発明を開示したが、当業者であれば、本発明の実施形態は、具体的に開示されている実施形態を超えて他の代替的な実施形態ならびに／またはその使用および改変および均等物に拡大されることを理解する。
【０１３６】
本発明の実施形態では、多くのバリエーションおよび代替要素が開示されている。またさらなるバリエーションおよび代替要素は、当業者に明らかである。これらのバリエーションは、限定されないが、心筋球由来細胞の供給源、心臓生検（外植片由来細胞）にもしくは心臓由来細胞（心筋球）の自己会合クラスタに直接由来する細胞、このような細胞によって産生されたエキソソーム、このような細胞によって産生されたエキソソームを単離、特性評価または変化する方法、ならびに本発明の教示によって作られる生成物の特定の使用である。本発明の様々な実施形態は、これらのバリエーションまたは要素のいずれかを特に組み入れまたは除外し得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を記載および特許請求するために使用される成分の量、濃度、反応条件などの特性を表す数字は、いくつかの場合では、「約」という用語によって修飾されると理解すべきである。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、特定の実施形態が得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告されている有効桁数を考慮して、通常の四捨五入技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広範囲を示す数値範囲およびパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示されている数値は、可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態に示されている数値は、それらの各試験測定結果に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含有し得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態の説明との関連で使用される（特に、以下の特許請求の範囲との関連で使用される）「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の言及は、単数形および複数形の両方を包含すると解釈され得る。本明細書における値域の記載は、この範囲内の個々の各値を個別に参照する簡略な方法となることを意図するに過ぎない。特に本明細書で指示がない限り、個々の各値は、それが個別に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、特に本明細書で指示がない限り、または特に文脈上明確な矛盾がない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書における特定の実施形態に関して提供される任意のおよびすべての実施例または例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く説明するためのものに過ぎず、別様に特許請求されている本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な特許請求の範囲に記載されている任意の要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１３９】
本明細書に開示される本発明の代替要素または実施形態の分類は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは個別に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素の他のメンバーと任意に組み合わせて参照および特許請求され得る。グループの１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由により、グループに組み入れられ得、またはグループから削除され得る。任意のこのような組入または削除が生じた場合、本明細書は、改変されたグループを含有するとみなされるので、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの記載要件を満たす。
【０１４０】
本発明を実行するために本発明者らが把握する最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上記説明を読めば、当業者にとって明らかである。当業者であれば、このようなバリエーションを適切に用いることができ、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外の方法で実施され得ると考えられる。したがって、本発明の多くの実施形態は、準拠法によって許容されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題のすべての改変物および均等物を含む。また、特に本明細書で指示がない限り、または特に文脈上明確な矛盾がない限り、上記要素の任意の組み合わせがそのすべての可能なバリエーションで本発明によって包含される。
【０１４１】
さらに、本明細書を通して、多数の言及が特許および刊行物に対してなされている。上記で引用されている参考文献および刊行物はそれぞれ、それらの全体が参照により本明細書に個々に組み込まれる。
【０１４２】
最後に、本明細書に開示される本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解すべきである。用いられ得る他の改変は、本発明の範囲内であり得る。したがって、限定ではなく例として、本明細書の教示にしたがって、本発明の代替構成が利用され得る。したがって、本発明の実施形態は、厳密に示され記載されているものに限定されない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図５Ａ】
2017530158.tif 000044
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
2017530158.tif 000093
【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
2017530158.tif 000106
【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【図２４ｅ】
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【図２４ｆ】
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【図２４ｇ】
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【図２４ｈ】
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【図２５Ａ】
2017530158.tif 000120
【図２５ｂ】
2017530158.tif 000121
【図２５ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２６ｄ】
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【図２６ｅ】
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【図２６ｆ】
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【国際調査報告】
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