(57)【要約】【課題】疼痛及び疥癬のための治療薬、並びに疼痛及び疥癬の処置又は予防におけるそれらの使用を提供する。【解決手段】本発明は、Ｔｍｅｍ１００ペプチド及びその変異体の組成物、並びに疾患又は状態の処置又は予防におけるそれらの使用に関する。【選択図】図１
2017507182.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＰＡ１機能に関連された状態を処置又は予防し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる方法であって、有効量のＴｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを投与することを備える、ＴＲＰＡ１機能に関連された状態を処置又は予防し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる方法。
【請求項２】
ＴＲＰＡ１機能に関連された疾患又は状態の症状を予防、処置又は緩和し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる方法であって、それを必要とする対象者に、Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを投与することを備える、ＴＲＰＡ１機能に関連された疾患又は状態の症状を予防、処置又は緩和し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる方法。
【請求項３】
細胞におけるＴＲＰＡ１機能を阻害する方法であって、細胞に、有効量のＴｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを投与することを備え、それによって、前記細胞における前記ＴＲＰＡ１機能を阻害する、細胞におけるＴＲＰＡ１機能を阻害する方法。
【請求項４】
前記ＴＲＰＡ１機能は、ＴＲＰＶ１と関連がある、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、ＴＲＰＡ１とＴＲＰＶ１との関連性を向上させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＲＰＡ１機能は、内側ＴＲＰＡ１媒介電流、外側ＴＲＰＡ１媒介電流、ＴＲＰＡ１媒介イオン流出又はＴＲＰＡ１媒介の神経細胞の過剰興奮性である、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列或いはそのフラグメントにおける一以上の変異を有するポリペプチドを備える、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号１７からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを備える、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、細胞に供給され、前記細胞は、感覚神経である、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記感覚神経の細胞体は、後根神経節（ＤＲＧ）にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
疼痛の症状を予防、処置又は緩和するために使用される、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
疥癬の症状を予防、処置又は緩和するために使用される、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
前記疼痛は、急性疼痛又は慢性疼痛である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、一以上の薬物と組み合わせて投与される、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、一以上のＴＲＰＶ１阻害剤、ＴＲＰＶ３阻害剤、ＴＲＰＶ４阻害剤又はＴＲＰＭ８阻害剤と組み合わせて投与される、請求項１〜１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
ＴＲＰＡ１の活性化に関連する状態を処置又は予防し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる医薬組成物であって、有効量のＴｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを備える、ＴＲＰＡ１の活性化に関連する状態を処置又は予防し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる医薬組成物。
【請求項１７】
前記Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列或いはそのフラグメントにおける一以上の変異を有するポリペプチドを備える、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを備える、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを備える、単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はそのフラグメントを備える核酸配列によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列又はそのフラグメントを備える、単離された核酸。
【請求項２２】
配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを備えるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える、単離された核酸。
【請求項２３】
原核細胞及び真核細胞の少なくとも一つにおいて複製し、請求項２１又は２２に記載の前記単離された核酸を備える、発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の前記発現ベクターを備えるとともに、前記ポリペプチドを発現する細胞。
【請求項２５】
前記ポリペプチドを発現するために、細胞培養培地中で請求項２４に記載の前記細胞を培養することを備える、ポリペプチドを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本特許出願は、２０１４年２月２４日に出願された、その全体において参照によって本明細書中に援用される、米国特許出願第６１／９４３，６１５号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
（連邦委託研究の下で行われた発明に対する権利の声明）
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた、認可番号１Ｒ０１ＧＭ０８７３６９によって支持された。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
熱的、機械的及び化学的刺激に対する過敏症は、種々の疼痛状態（例えば、関節炎、組織損傷、術後状態等）、肺疾患（例えば、喘息及び慢性閉塞性肺疾患）、及び下部尿路障害を含めて、多くの衰弱性疾患の主症状の一つである。末梢知覚神経節の内部の神経可塑性は、過敏症において重要な役割を果たす。過敏症を引き起こす広範囲の外部刺激は、知覚神経節ニューロンによって検出されることが、認識されている。この多様な範囲の刺激は、それらを識別するのに必要な同様に多種多様な分子の異質性を反映しており、一過性受容器電位（ＴＲＰ）チャネルは、そのような感覚の種類に重要な役割を果たす。細胞内の膜電位及びイオン流出の調整におけるイオンチャネルの中心的重要性を前提として、特定のイオンチャネルを促進又は阻害することができる研究ツールとして及び可能な治療薬として、非常に興味深い。
【０００４】
一つのそのようなチャネルは、一過性受容器電位Ａ１（ＴＲＰＡ１）チャネルである。ＴＲＰＡ１は、カルシウム透過チャンネル、特に、非選択性のカルシウム透過カチオンチャネルである。カルシウムイオンに加えて、ＴＲＰＡ１チャネルは、他のカチオン、例えば、ナトリウムに対して透過性である。このように、ＴＲＰＡ１チャネルは、カルシウム及びナトリウムイオン等のカチオンの流出を調整することによって、膜電位を調整する。ＴＲＰＡ１は、感覚神経において見られ、炎症と痛みとを結合するシグナル伝達受容体として機能する。ＴＲＰＡ１の活性化によって、侵害受容ニューロンの点火を誘導する及び脊髄における中枢性感作を駆動することによって、痛みが引き起こされることができる。ＴＲＰＡ１刺激は、また、ＮＫ‐Ａ、サブスタンスＰ及び（血管拡張を誘導するとともに、免疫細胞を補充するのを助ける）ＣＧＲＰ等の炎症誘発性の神経ペプチドの放出に通じる、感覚神経の点火を増加させることができる。リポソーム過酸化（ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の間に放出される４‐ヒドロキシノネナール、ＣＯＸ酵素によって合成されるシクロペンタンプロスタグランジン、酸化ストレスによって生成される過酸化水素を含む）炎症の間に生成される種々の内在性の反応性化合物は、ＴＲＰＡ１を活性化する。ＴＲＰＡ１は、また、天然物、環境刺激物、両親媒性分子及び薬物を含む、種々の刺激によって活性化されることができる。ＴＲＰＡ１の活性化は、また、寒さに対してＴＲＰＡ１を感作する。さらに、ＴＲＰＡ１における機能獲得型変異によって、家族性エピソード性疼痛症候群（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｅｐｉｓｏｄｉｃ  ｐａｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が引き起こされ、この疾患に罹患している患者は、寒さによって増幅される偶発性疼痛を有する。このように、ＴＲＰＡ１は、神経損傷、冷感異痛及び炎症性疼痛に関連された痛みを含む、痛みにおいて役割を果たすと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，５８８，５８５号明細書
【非特許文献１】（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｃ．Ａ．  Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，  Ｆ．  Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９２））
【非特許文献２】Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎy
【非特許文献３】Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ‐  Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅ．Ｓ．  Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｇｒｅｎ，  Ｅｄｓ．，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ７  Ｍａｓｓ．  （１９９１））
【非特許文献４】Ｆａｕｃｈｅｒｅ，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  １５：２９  （１９８６）
【非特許文献５】Ｖｅｂｅｒ  ａｎd  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２  （１９８５）
【非特許文献６】Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３０：１２２９  （１９８７）
【非特許文献７】Ａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ４３：３５７５‐３５９４
【非特許文献８】Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１：３８７（１９９２）
【非特許文献９】Ｍ．  Ｒｅｓｈ，  ２０１３  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２３（１０）：  ｐＲ４３１−ｐＲ４３５
【非特許文献１０】Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１1
【非特許文献１１】Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃs  ２：  ４８２  ４８９  （１９８１）
【非特許文献１２】Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）
【非特許文献１３】Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９０：５８７３−５８７７  （１９９３）
【非特許文献１４】ＴＨＥ  ＮＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＸＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：３３８９−３４０２  （１９９１）
【非特許文献１５】Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２  （１９９７）
【非特許文献１６】Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃs  ２：  ４８２  ４８９  （１９８１）
【非特許文献１７】Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３２：  １１８０‐１  １８７（１９９３）
【非特許文献１８】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １２（１０）：８７９−８８４  （１９９９)
【非特許文献１９】Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：．４１２‐４１７（１９９７）
【非特許文献２０】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第２０版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２０００）
【非特許文献２１】Ｚｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ‘ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：５６６２−５０６６  （１９８４）
【非特許文献２２】Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  （１９９０））
【非特許文献２３】Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅr  ９２  （６）：８７７‐８８２
【非特許文献２４】Ｊａｑｕｅｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＪＢＣ  ２７４（１１）：  ７３２５‐３３
【非特許文献２５】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  （２００３）  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５５：  ９４９−９６５
【非特許文献２６】Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ―Ｍｕｎｒｏ  （２００４）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２５：  ２９９−３０５
【非特許文献２７】Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ＯＦ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０４：  ５６−６２
【非特許文献２８】ＭｃＧａｒａｕｇｈｔｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １４０：  １３８１
【非特許文献２９】Ｈｏｎｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ
【非特許文献３０】Ｘａｎｔｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ  Ｐａｉｎ  ５：  Ｓｌ
【非特許文献３１】Ｃｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４
【非特許文献３２】Ｖａｌｅｎｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４８：  ６５８‐６７２
【非特許文献３３】Ｗｅｓｓｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｐａｉｎ  ７３：３０９−３１７
【非特許文献３４】Ｋｉｍｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ２８８（６）：Ｇ１２６６‐７３
【非特許文献３５】Ｒｉａｚｉｍａｎｄ  （２００４），  ＢＪＵ．  ９４：  １５８−１６３
【非特許文献３６】Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｏｒｋｉｎ，  １９９８，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ８１０：  ９３‐９９
【非特許文献３７】Ｎｏｚａｋｉ‐Ｔａｇｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｋｓｈ，  １９９８，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔ  ２５４：  ２５‐  ２８
【非特許文献３８】Ｊｕｎ  ａｎｄ  Ｙａｋｓｈ，  １９９８，  Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ  ８６：  ３４８‐３５４
【非特許文献３９】Ｙａｋｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９０：  ２３８６‐２４０２
【非特許文献４０】Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｐａｉｎ  ３２：  ７７−８８
【非特許文献４１】Ｎａｇａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０６：  ４９０‐４９７
【非特許文献４２】“Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ”，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ａｎｄ  ＣＯ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １９６９又は
【非特許文献４３】“Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｆｅｅｄｓ  ａｎｄ  Ｆｅｅｄｉｎｇ”  Ｏ  ａｎｄ  Ｂ  ｂｏｏｋｓ，  Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，  Ｏｒｅ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １９７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
イオンチャネルの誤制御は、しばしば、病的状態を関連付けられるため、ＴＲＰチャネルを含むイオンチャネルの一以上の機能を調整することができるペプチド又はそのフラグメントを同定及び製造することが、望ましいであろう。そのようなペプチド及びそのフラグメントは、疼痛及び疥癬等の状態を処置及び予防するための種々のインビトロ及びインビボ使用を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＴＲＰＡ１は、痛み検知ニューロンにおいて発現されるイオンチャネルであり、疼痛及び疥癬において重要な役割を果たす。本発明は、膜タンパク質である、Ｔｍｅｍ１００（Ｐｉｒｔ２としても知られ、本明細書中において互換的に使用される）が、ＴＲＰＡ１のレギュレータとして機能するという知見に基づいている。本発明は、ＴＲＰＡ１の活性を強力に阻害するとともに、急性及び慢性疼痛をブロックするＴｍｅｍ１００変異タンパク質（Ｔ１００‐Ｍｕｔ；Ｐ２‐ＭｕｔＣＰＰとしても知られ、本明細書中において互換的に使用される）由来の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を開示する。それに伴って、本発明は、疼痛及び疥癬のための治療薬を記載する。
【０００８】
本発明は、ＴＲＰＡ１機能に関連された状態を処置又は予防し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる方法を特色とし、有効量のＴｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを投与することを備える。例えば、有効量のＴｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、０．１〜１０００μｌ用量の０．１〜１０００μＭのヒトＴ１００‐Ｍｕｔペプチド、例えば、１０μｌ用量の１０〜２００μＭのヒトＴ１００‐Ｍｕｔペプチドを備える。最終的に、主治医又は獣医は、適量及び投与計画を決定するだろう。Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、一か月に一度、一か月に二度、一週間に一度、一週間に二度、一日に一度、又は１２時間毎、８時間毎、４時間毎、２時間毎又は１時間毎に投与される。
【０００９】
本発明は、ＴＲＰＡ１機能に関連された疾患又は状態の症状を予防、処置又は緩和し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる方法を特色とし、それを必要とする対象者に、Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを投与することを備える。
【００１０】
本発明は、細胞におけるＴＲＰＡ１機能を阻害する方法を特色とし、細胞に、有効量のＴｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを投与することを備え、それによって、細胞におけるＴＲＰＡ１機能を阻害する。
【００１１】
ＴＲＰＡ１機能は、ＴＲＰＶ１と関連がある。Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、ＴＲＰＡ１とＴＲＰＶ１との関連性を向上させる。
【００１２】
ＴＲＰＡ１機能は、内側ＴＲＰＡ１媒介電流、外側ＴＲＰＡ１媒介電流、ＴＲＰＡ１媒介イオン流出又はＴＲＰＡ１媒介の神経細胞の過剰興奮性である。
【００１３】
Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、後記の配列表の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列或いはそのフラグメントにおける一以上の変異を有するポリペプチドを備える。
【００１４】
Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１７からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを備える。
【００１５】
Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、細胞に供給され、細胞は、感覚神経である。
【００１６】
感覚神経の細胞体は、後根神経節（ＤＲＧ）にある。
【００１７】
方法は、疼痛の症状を予防、処置又は緩和するために使用される。
【００１８】
方法は、疥癬の症状を予防、処置又は緩和するために使用される。一態様において、疼痛は、急性疼痛又は慢性疼痛である。
【００１９】
Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、一以上の薬物と組み合わせて投与される。
【００２０】
Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、一以上のＴＲＰＶ１阻害剤、ＴＲＰＶ３阻害剤、ＴＲＰＶ４阻害剤又はＴＲＰＭ８阻害剤と組み合わせて投与される。
【００２１】
本発明は、ＴＲＰＡ１の活性化に関連する状態を処置又は予防し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる薬物を特色とし、有効量のＴｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを備える。
【００２２】
Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列或いはそのフラグメントにおける一以上の変異を有するポリペプチドを備える。
【００２３】
Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを備える。
【００２４】
他の局面において、本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを備える単離されたポリペプチドを特色とする。
【００２５】
本発明は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を備える核酸配列によってコードされる単離されたポリペプチド又はそのフラグメントを特色とする。
【００２６】
本発明は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を備える単離された核酸又はそのフラグメントを特色とする。
【００２７】
本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を備えるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える単離された核酸又はそのフラグメントを特色とする。
【００２８】
本発明は、原核細胞及び真核細胞の少なくとも一つにおいて複製し、上記局面の何れか一つの核酸を備える発現ベクターを特色とする。
【００２９】
本発明は、請求項の発現ベクターを備えるとともに、ポリペプチドを発現する細胞を特色とする。
【００３０】
本発明は、ポリペプチドを発現するために、細胞培養培地中で細胞を培養することを備えるポリペプチドを生成する方法を特色とする。
【００３１】
（定義）
【００３２】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段のはっきりした指示がない限り、複数形を含む。特に記述されない限り又は文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用される場合、用語「ｏｒ」は、包括的であると理解される。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」等は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有することができ、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」等を意味することができる。「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ」は、同様に、米国特許法において帰する意味を有することができ、該用語は制限がなく、記載されるものの根拠又は特徴が、記載されるもの以上の存在によって変更されない限り、記載されるもの以上の存在を許容するが、従来技術の実施形態を排除する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「投与する」は、結果的に薬物が対象者の体内にある態様で、対象者に、薬物又は薬物を含む組成物を供給する手段として、本明細書中で定義されている。そのような投与は、注入（例えば、皮下の、静脈内の、非経口的に、腹腔内に、髄腔内の、皮内の）によって、局所投与によって、又は吸入（例えば、経口の又は経鼻の）によって、経口、経皮（例えば、膣、直腸、口腔粘膜）を含むが、これらに限定されない、任意の経路によって行われることができる。製剤は、もちろん、それそれぞれの投与経路に適した剤形によって与えられる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「薬物」は、小分子化学化合物、抗体、核酸分子又はポリペプチド、或いは、それらのフラグメントを意味する。用語「化合物」及び「薬物」は、本発明のペプチド又はそれらのフラグメントを言うために、互換的に使用される。本発明の化合物は、ペプチド又はそれらのフラグメントである。そのような化合物は、ＴＲＰＡ１の機能に結合して阻害することができる。他の典型的な化合物は、核酸、例えば、ＴＲＰＡ１アンチセンスオリゴヌクレオチド又はＴＲＰＡ１  ＲＮＡｉ構築物である。そのような化合物は、ＴＲＰＡ１の発現を抑制し、それによって、ＴＲＰＡ１の活性を阻害することができる。阻害剤として作用する他の典型的な化合物として、リボザイムが挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「組成物」は、製剤処方における本発明の任意の化合物又は薬物を意味し、化合物及び薬物と互換的に使用される。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「類似体」は、同一ではないが、類似した機能的又は構造的特徴を有する薬物を意味する。典型的なアナログは、本発明の薬物に対して同様の生理活性的、物理的又は化学的特性を有するペプチド、ペプチドフラグメント又は変異体である。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「拮抗剤」及び「阻害剤」は、ＴＲＰＡ１等のイオンチャネルの活性を抑制するため等の、生物学的活性を減少させるか抑制する薬物を言うために互換的に使用される。ＴＲＰＡ１阻害剤として、本明細書中に開示される構造的及び／又は機能的特性の任意の組合せを有する阻害剤が挙げられる。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「組み合わせ」は、併用療法の部分とし得て有用な化合物又は非薬物療法の群を包含する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「疾患」は、細胞、組織又は器官の正常機能を損傷させるか細胞、組織又は器官の正常機能に干渉する任意の状態又は障害を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、抑制又は処置の標記方法に関して、用語「有効量の」、例えば、ＴＲＰＡ１拮抗剤は、望ましい投与計画の部分として適用される場合、望ましい臨床的又は機能的結果をもたらす調剤中の拮抗剤の量をいう。理論によって束縛されることなく、本発明のＴＲＰＡ１拮抗剤の有効量として、ＴＲＰＡ１チャネルの一以上のインビトロ又はインビボ機能を減少させるのに効果的なＴＲＰＡ１拮抗剤の量が挙げられる。典型的な機能として、膜分極化（例えば、拮抗剤が、細胞の過分極を促進する）、イオン流出、細胞中のイオン濃度、外向き電流及び内向き電流が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＴＲＰＡ１機能に拮抗する薬物として、ＴＲＰＡ１のインビトロ又はインビボ機能活性に拮抗する薬物が挙げられる。特定の機能活性が、インビトロアッセイにおいてのみ容易に観察可能である場合、インビトロアッセイにおけるＴＲＰＡ１機能を阻害するための薬物能力は、その薬物の活性ための合理的な代理（ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ  ｐｒｏｘｙ）として役立つ。有効量は、ＴＲＰＡ１媒介電流を抑制するのに十分な量及び／又はＴＲＰＡ１媒介イオン流出を抑制するのに十分な量である。
【００４１】
本発明のＴＲＰＡ１阻害剤は、一以上の他のイオンチャネルに対する、それらの活性又は活性の欠如に従って、特徴付けられる。他のイオンチャネルが言及される場合、そのような他のイオンチャネルの機能の阻害は、同様に定義される。例えば、イオンチャネルの阻害又はイオンチャネルの活性化は、拮抗剤が、他のイオンチャネルの一以上の機能活性を阻害することを意味する。そのような機能として、特定のイオンチャネルによって媒介される電流、イオン流出又は膜分極化が挙げられる。
【００４２】
「フラグメント」によって、ポリペプチド又は核酸分子の部分が意味される。この部分は、対象の核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を含む。フラグメントは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００或いは１０００のヌクレオチド又はアミノ酸を含む。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの何れかの、ヌクレオチドの重合系、或いは両タイプのヌクレオチドの修飾系をいう。用語「核酸」は、また、同等物として、ヌクレオチド類似体から生成されたＲＮＡ又はＤＮＡの類似体、及び記載される実施形態に適用可能なものとして、（センス又はアンチセンス等の）単鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、連邦又は州政府の規制当局によって承認された又は承認可能なであること、或いは、ヒトを含む、動物における使用のための米国薬局方又は他の一般的に認識される薬局方に掲載されたこと、をいう。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「防止する」は、当該技術分野において承認され、局所再発（例えば、疼痛）等の状態、癌等の疾患、心不全等の複合症候群又は任意の他の医学的状態に関して使用される場合、当該分野において十分に理解されており、薬物を受けていない対象者に関して、対象者における医学的状態の症状の頻度を低減させるか、又は、症状の発症を遅延させる薬物の投与を含む。従って、癌の予防として、例えば、統計学的及び／又は臨床的に有意な量によって、例えば、未処置の対照集団に関して予防処置を受ける患者の集団における検出可能な癌性増殖の数を低減させること、及び／又は処置された集団対未処置の対象集団における検出可能な癌性増殖の出現を遅延させること、を含む。感染の予防として、例えば、処置された集団対未処置の対象集団における感染の診断の数を低減させること、及び／又は処置された集団対未処置の対象集団における感染の症状の発症を遅延させること、を含む。疼痛の予防として、例えば、処置された集団対未処置の対象集団における対象者によって経験された痛覚の大きさを低減させること、或いは痛覚を遅延させること、を含む。
【００４６】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「オリゴペプチド」は、α炭素が、一方のアミノ酸のα炭素のカルボキシル基と、他方のアミノ酸のα炭素のアミノ基との間の縮合反応によって形成されるペプチド結合を介して、結合される（一般的に，Ｌ型‐アミノ酸であるが、Ｄ型アミノ酸は、また、熟慮される）アミノ酸の鎖である。幾つかの場合において、鎖の一端の末端アミノ酸（例えば、アミノ末端）は、遊離アミノ基を有するのに対して、鎖の他端の末端アミノ酸（例えば、カルボキシ末端）は、遊離カルボキシル基を有する。そういうものとして、用語「アミノ末端」（略してＮ‐末端）は、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸上の遊離α‐アミノ基をいうか、ペプチド内部の任意の他の位置のアミノ酸のα‐アミノ基（ペプチド結合に参加している場合、イミノ基）をいう。用語「カルボキシ末端」（略してＣ‐末端）は、ペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸上の遊離カルボキシ基をいうか、ペプチド内部の任意の他の位置のアミノ酸のカルボキシ基をいう。
【００４７】
一般的に、ペプチドを形成するアミノ酸は、順に番号付けされ、アミノ末端から始まり、ペプチドのカルボキシ末端に向かう方向において増加する。従って、一方のアミノ酸が他方のアミノ酸に「続く」と言われる場合、そのアミノ酸は、先行するアミノ酸よりペプチドのカルボキシ末端に近接して位置決めされる。
【００４８】
「ポリペプチド」によって、内部のモノマが、アミド結合を介して一緒に結合されるアミノ酸残基であるポリマが意味される。アミノ酸がαアミノ酸である場合、Ｌ‐光学異性体又はＤ‐光学異性体の何れかが使用されることができ、Ｌ‐光学異性体は、天然において好まれている。本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質又はアミド化タンパク質等の修飾された配列を含むが、これらに限定されるものではない。用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質、及び、組み換えで又は合成的に生成されるタンパク質をカバーすることを特に意図されている。典型的なポリペプチドとして、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、相同体、相同分子種、パラログ、フラグメント、並びに上述の他の同等物、変異体及び類似体が挙げられる。
【００４９】
幾つかの場合において、本発明の任意のポリペプチドに関連して、「ペプチド」又は「ポリペプチド」への言及は、天然のペプチド（分解生成物、合成的に合成されたペプチド又は組み換えペプチドの何れか）及びペプチド類似体であり、例えば、ペプチドをより安定的にする一方で、体内又はより細胞内に貫通可能な修飾を有し得る、ぺプトイド及びセミぺプトイド等の、ペプチド模倣薬（一般的に、合成的に合成されたペプチド）を含むことを意味される。そのような修飾として、そのそれぞれが、本発明の付加的な実施形態と示す骨格修飾及び残基修飾を含むがこれらに限定されない、Ｎ末端、Ｃ末端又はペプチド結合修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当該分野において公知であり、例えば、非特許文献１に明示されている。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「配列同一性」は、比較ウインドウ上で、（すなわち、核酸に対してヌクレオチド毎を基本に、又はポリペプチドに対してアミノ酸毎を基本に）配列が同一であることを意味する。用語「配列同一性の百分率」は、比較ウインドウ上で、二つの最適に整列された配列を比較するとともに、その結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって、算出される。配列同一性を算出するための方法は、当業者に公知であり、以下にさらに詳細に述べられる。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、二つの相補的なポリヌクレオチド鎖の間の特定のハイブリダイゼーションを促進し、二倍体を形成する条件をいう。ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度及びｐＨで、所定のポリヌクレオチド二倍体に対して、熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択されることができる。相補的なポリヌクレオチド鎖の長さ及びそれらのＧＣ含量は、二倍体のＴｍ、及びそれによって、所望のハイブリダイゼーションの特異性を獲得するために必要なハイブリダイゼーション条件を決定するだろう。Ｔｍは、ポリヌクレオチド配列の５０％が、完全に適合された相補鎖とハイブリダイズする（一定のイオン強度及びｐＨ下での）温度である。特定の場合において、特定の二倍体に対するＴｍと略等しくなるように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを増加させることが望ましい。特定の場合において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６５℃での０．２×ＳＳＣ洗浄工程を含む。
【００５２】
用語「患者」又は「対象者」は、処置、観察又は実験の対象である動物をいう。例示のみによって、対象者として、ヒトを含むがこれに限定されない哺乳動物、非ヒト霊長目、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコ等の、非ヒト哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は他の薬物は、精製及び／又は単離される。特に、本明細書中で使用される場合、「単離された」又は「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質は、他の細胞物質、組み換え技術によって生成される場合の培地、化学前駆体又は化学的に合成される場合の他の化学物質を、実質的に含まない。精製された化合物は、目的の化合物の少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。好ましくは、調製は、目的の化合物の少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも９０重量％、及び最も好ましくは、少なくとも９９重量％である。例えば、精製された化合物は、所望の化合物の少なくとも９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％、又は１００重量％である化合物である。純度は、任意の適切な標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって、測定される。精製された又は単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、その天然に存在する状態において、それに隣接する遺伝子又は配列を含まない。精製された又は単離されたポリペプチドは、その天然に存在する状態において、それに隣接するアミノ酸又は配列を含まない。精製されたは、また、ヒトの対象者に対する投与にとって安全な、例えば、感染性又は毒性因子がないある程度の無菌状態を定義する。
【００５４】
同様に、「実質的に純粋な」によって、それに天然に付随する成分から分離されたヌクレオチド又はポリペプチドが意味される。一般的に、ヌクレオチド及びポリペプチドは、それらが、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％又は９９重量％である場合、実質的に純粋であり、それらが天然に関連されるタンパク質及び天然に存在する有機分子を有さない。
【００５５】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に修飾された変異体」は、同一の又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらのポリヌクレオチドをいうか、ポリヌクレオチドが、アミノ酸配列をコードせず、実質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの退化のために、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ，ＣＧＣ，ＣＧＡ，ＣＧＧ，ＡＧＡ及びＡＧＧは、全て、アミノ酸のアルギニンをコードしている。このように、アルギニンがコドンによって特定されている各位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの何れかに変更されることができる。そのような核酸変異は、「サイレント置換」又は「サイレント変異」であり、「保存的に修飾された変異体」の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中に記載される全てのポリヌクレオチド配列は、また、特に明記しない限り、全ての可能なサイレント変異を記載する。従って、サイレント置換は、アミノ酸をコードする全ての核酸配列の暗示された特徴である。当業者は、通常、メチオニンに対する唯一のコドンである、ＡＵＧを除く）核酸中の各コドンは、標準的な技術によって、機能的に同一の分子を生成するために、修飾されることができることを認識するだろう。
【００５６】
同様に、アミノ酸配列中の一又は数個のアミノ酸における「保存的アミノ酸置換」は、
高い類似性を有する異なるアミノ酸で置換され、また、特定のアミノ酸配列に、又はアミノ酸をコードする特定の核酸配列に、大いに類似しているとして容易に同定される。任意の特定配列のそのような保存的に置換された変異は、本発明の特徴である。コードされた配列中の単一のアミノ酸又は数％のアミノ酸（一般的に、５％未満、より一般的に、１％未満）を変更、付与又は削除する個々の置換、欠失又は付加は、変更によって、アミノ酸の、化学的に類似したアミノ酸への置換に通じる「保存的に修飾された変異体」である。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換テーブルは、当該分野において公知であり、例えば、参照によって本明細書中に援用される、非特許文献２を参照されたい。以下の六つのグループは、互いに対して保存的置換であると考えられるアミノ酸の例示である；１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ），３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５７】
非保存的アミノ酸置換は、（ａ）置換の領域におけるアミノ酸骨格の構造、（ｂ）アミノ酸の帯電又は疎水性、又は（ｃ）アミノ酸側鎖のバルクにおける変化から生じることができる。タンパク質特性における最も大きな変化を生むとことが一般的に予測される置換は、（ａ）親水性残基が、疎水性残基に対して（又は、によって）置換される、（ｂ）プロリンが、任意の他の残基に対して（又は、によって）置換される、（ｃ）大きな側鎖、例えば、フェニルアラニンを有する残基が、側鎖を有さない残基、例えば、グリシンに対して（又は、によって）置換される、（ｄ）正電性の側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル又はヒスタジル（ｈｉｓｔａｄｙｌ）が、負電性の残基、例えば、グルタミル又はアスパルチルに対して（又は、によって）置換される置換である。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用に従う。非特許文献３を参照されたい。２０個の従来のアミノ酸、α‐，α‐二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ‐アルキルアミノ酸、乳酸、及び多の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ‐アミノ酸）は、また、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。特殊なアミノ酸（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）の例として、４  ヒドロキシプロリン、γ‐カルボキシグルタミン酸、ε‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルレジン、ε‐Ｎ‐アセチルリジン、Ｏ‐ホスホセリン、Ｎ‐アセチルセリン、Ｎ‐ホルミルメチオニン、３‐メチルヒスチジン、５‐ヒドロキシリジン、δ‐Ｎ‐メチルアルギニン及び他の同様のアミノ酸、並びにイミノ酸  （例えば、４‐ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で使用されるポリペプチド表記において、標準的な使用及び慣例に従って、左側方向は、アミノ末端方向であり、右側方向は、カルボキシ末端方向である。
【００５９】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの薬物に類似する特性を有する非ペプチド薬物として、製薬産業において一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」又は「ペプチド模倣薬」と呼ばれる非特許文献４，５及び６を参照のこと。本明細書中で使用される場合、「ペプチド模倣物」は、ペプチドに構造的に類似している有機化合物をいう。ペプチド模倣物は、一般的に、分子の特徴を変更するために、現存するペプチドから設計される。改良された特徴として、例えば、酵素的分解に対する抵抗性等の改良された安定性、向上された生物学的活性、制限された好ましい形態による改良された親和性及び合成のし易さ等を挙げることができる。ペプチドに比しペプチド模倣物における構造的修飾として、骨格修飾及び側鎖修飾を挙げることができる。そのような化合物は、コンピュータ分子モデリングを用いて、しばしば開発されている。
【００６０】
治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物は、同等の治療的又は予防的効果を生むために使用され得る。例えば、参照によって本明細書中に援用される、非特許文献７を参照されたい。一般的に、ペプチド模倣薬は、ヒト抗体等の、パラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性又は薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、当該分野において公知の方法によって、‐‐ＣＨ２ＮＨ‐、‐‐ＣＨ２Ｓ‐、‐‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐‐、‐‐ＣＨ＝ＣＨ‐‐（シス及びトランス）、‐‐ＣＯＣＨ２‐‐、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２‐‐及び‐ＣＨ２ＳＯ‐‐からなる群より選択される結合によって選択的に置換される一以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の一以上のアミノ酸の同じタイプのアミノ酸での系統的置換（例えば、Ｌ‐リジンの代わりにＤ‐リジン）は、より安定的なペプチドを産生するために使用され得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列変異を備える拘束性ペプチドは、当該分野において公知の方法によって（非特許文献８）、例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することが可能な内部システイン残基を付加することによって、産生され得る。
【００６１】
本明細書中に述べられているように、幾つかの局面において、本明細書中に記載されるペプチドは、修飾される。例えば、幾つかの場合において、二つのアミノ酸の間の従来のペプチド結合（すなわち、一方の分子のカルボキシル基が、他方の分子のアミノ基と反応し、水（Ｈ２Ｏ）の分子を放出する場合、二つの分子間に形成された化学結合）は、生体液中の得られた分子をより安定的にするための異なる結合に変化される。
【００６２】
幾つかの場合において、ペプチドは、環状ペプチドであり、アミノ末端及びカルボキシル末端、アミノ末端及び側鎖、カルボキシル末端及び側鎖、又は側鎖及び側鎖は、環を形成する共有結合を用いて結合される。環状ペプチドは、消化の過程に対して極度に抵抗性であり、環状ペプチドは、ヒト消化管内で生存可能となる。この特徴によって、環状ペプチドは、経口で送達されるタンパク質ベースの薬物に対して、魅力的なものとなる。
【００６３】
他の場合において、本明細書中に記載されるペプチドのアミノ酸は、修飾される。例えば、修飾は、アミノ酸の欠失、特定のアミノ酸に対する特定のアミノ酸の化学修飾（例えば、アミド化、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、ピログルタミン酸の形成、メチオニン上のスルファ基の酸化／還元、又は同様の小分子の付加）を含み得る。
【００６４】
幾つかの場合において、本明細書中に記載されるＴｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、一以上の脂質修飾を備える。少なくとも五つの異なるタイプの脂質は、タンパク質に共有結合されることができる；脂肪酸、イソプレノイド、ステロール、リン脂質及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー。例えば、参照によって本明細書中に援用される、非特許文献９を参照されたい。タンパク質は、一以上のタイプの脂質、例えば、ミリスチン酸塩＋パルミチン酸塩、パルミチン酸塩＋コレステロール、ファルネシル＋パルミチン酸塩を含むことができる。各タイプの脂質部分は、異なる脂質転移酵素によって結合され、各修飾は、修飾されたタンパク質に異なる特性を付与する。脂質修飾の最も共通する結果は、膜に対する親和性の増加である。しかしながら、ミリストイル又はプレニル基の結合は、また、分子内及び分子間のタンパク質‐タンパク質相互作用を促進することができる。他の重要な概念は、可逆性である．タンパク質と、チオエステル結合されたパルミチン酸塩又はＧＰＩアンカーの何れかとの間の共有結合は、それぞれ、チオエステラーゼ及びホスホリパーゼの作用によって、破壊されることができる。対照的に、ミリスチン酸塩或いはイソプレノイドファルネシル又はジェラニルジェラニルの何れも、修飾されたタンパク質から、物理的に除去されない。
【００６５】
必要に応じて、本明細書中に記載されるＴｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、ペプチドを細胞膜透過性にするために、任意の脂質修飾、例えば、パルミトイル（Ｐａｌ）又はミリスチル（Ｍｙｒ）基を含む。親油基で修飾するための適切な位置として、ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端が挙げられるが、ペプチドは、ペプチド内部の任意のアミノ酸位置で、脂質修飾され得る。
【００６６】
「単離された核酸」によって、核酸が由来する有機体の天然に存在するゲノム内でそれに隣接する遺伝子がないことを意味される。用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の部分であるが、それが天然に存在する有機体のゲノム内の分子の部分に隣接する核酸配列の両方によって隣接されないＤＮＡ、（ｂ）得られる分子が，任意の天然に存在するベクター又はゲノムＤＮＡと同一でないように、ベクター内に、或いは原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれる核酸、（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されるフラグメント、又は制限フラグメント等の分離分子、及び（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の部分である組換えヌクレオチド配列をカバーする。本発明に係る単離された核酸分子は、さらに、合成的に生成された分子、並びに、化学的に変更された及び／又は修飾された骨格を有する任意の核酸を含む。例えば、単離された核酸は、精製されたｃＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドである。単離された核酸分子は、また、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子を含む。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＴＲＰＡ１」、「ＴＲＰＡ１タンパク質」及び「ＴＲＰＡ１チャネル」は、本出願を通して、互換的に使用される。これらの用語は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０１５６２８（ヒト）、アクセッション番号ＮＰ＿８０８４４９（まうす）、アクセッション番号ＮＰ＿９９７４９１（ラット）に記載のアミノ酸配列、又は同等のポリペプチド、或いは、その機能的生物活性フラグメントを含むイオンチャネル（例えば、ポリペプチド）をいう。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｍｅｍ１００」（又はＰｉｒｔ２）は、ＴＲＰＡ１のレギュレータとして機能する膜タンパク質をいう。特定の場合において、Ｔｍｅｍ１００は、配列番号１（以下に示される、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ  Ｎ．  ＮＰ＿００１０９３１１０）又は配列番号２（以下に示される、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ  Ｎｏ．  ＮＰ＿０８０７０９）に記載のアミノ酸配列を含む、からなる、又は主成分とするポリペプチドをいう。
【００６９】
Ｔｍｅｍ１００は、Ｔｍｅｍ１００の機能を保持するとともに、（ｉ）配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列の全て又は部分、（ｉｉ）１〜約２，３，５，７，１０，１５，２０，３０，５０，７５又はそれ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、及び（ｉｖ）その機能的フラグメントを含むポリペプチドを含む。本開示のポリペプチドは、また、配列番号１又は配列番号２の同族体、例えば、相同分子種及びパラログを含む。
【００７０】
用語「Ｔｍｅｍ１００変異体」は、配列番号１又は配列番号２における一以上の変更を含むポリぺペプチド、又はそのフラグメントをいうことを意味される。変更は、一以上のアミノ酸付加、欠失又は置換であり得る。
【００７１】
Ｔｍｅｍ１００変異体は、以下に示されるように、配列番号５又は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、からなる、又は主成分とするポリペプチド、又はそのフラグメントを含む。
【００７２】
Ｔｍｅｍ１００変異体は、以下に示されるように、配列番号７又は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、からなる、又は主成分とするポリペプチド、又はそのフラグメントを含む。好ましくは、これらのＴｍｅｍ１００変異体ポリペプチドは、それらを細胞膜透過性にするために、それらのＮ末端にパルミトイル（Ｐａｌ）又はミリスチル（Ｍｙｒ）基を含む。
【００７３】
用語「Ｔｍｅｍ１００」（又はＴＭＥＭ１００）は、さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列番号３（以下に示される、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１０９９６４０）又は配列番号４（以下に示される、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０２６４３３）に記載のポリヌクレオチド配列からなる、又は主成分とする配列を含む、核酸をいう。
【００７４】
用語「Ｔｍｅｍ１００変異体」は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列番号９又は配列番号１０に記載のポリヌクレオチド配列からなる、又は主成分とする配列を含む、核酸をいう。
【００７５】
用語「Ｔｍｅｍ１００変異体」は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列番号１１又は配列番号１２に記載のポリヌクレオチド配列からなる、又は主成分とする配列を含む、核酸をいう。
【００７６】
本開示の核酸は、配列番号３，４，９，１０，１１又は１２のヌクレオチド配列、配列番号３，４，９，１０，１１又は１２に少なくとも７０％，７５％，８０％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％又は９９％同一のヌクレオチド配列、配列番号３，４，９，１０，１１又は１２に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、本開示のポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列番号３，４，９又は１０のアミノ酸配列と少なくとも約７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，９８％，９９％相同性の又は同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本開示のポリペプチドの活性を有するとともに、配列番号３，４，９，１０，１１又は１２と少なくとも約７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，９８％，９９％又はそれ以上の相同性又は同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列番号３，４，９，１０，１１又は１２の対立遺伝子変異型等の、１〜約２，３，５，７，１０，１５，２０，３０，５０，７５又はそれ以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失により異なるヌクレオチド配列、配列番号３，４，９，１０，１１又は１２から由来するとともに、進化的に関連された核酸、並びに、本発明の前述の及び他の核酸の全てに対して、遺伝子コードの縮退の補完及び遺伝子コードの縮退から生じるヌクレオチド配列の、全て又は部分を含むことができる。本開示の核酸は、また、配列番号３，４，９又は１０の同族体、例えば、相同分子種及びパラログ、並びに特定の有機体（例えば、宿主細胞）内の発現のために最適化されたコドンであった配列番号３，４，９，１０，１１又は１２の変異体を含む。明記されていない場合でも、当業者は、Ｔｍｅｍ１００が、核酸をいうのか又はタンパク質をいうのかを、容易に評価することができる。
【００７７】
Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１のの関連性を弱め、それによって、ＴＲＰＶ１によるＴＲＰＡ１の阻害を解除する。「Ｔｍｅｍ１００変異体」は、反対の効果を発揮する。すなわち、「Ｔｍｅｍ１００変異体」は、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１のの関連性を向上させ、ＴＲＰＡ１を抑制する。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、用語「ｐｒｅｖｅｎｔ」、「ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ」、「ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ」、「ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」等は、疾患又は状態を有さないが、疾患又は状態を発展させる危険性又は可能性のある、対象者における疾患又は状態を発展させる可能性を低減することをいう。
【００７９】
用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、予防的及び／又は治療的処置を含む。用語「予防的又は治療的」処置は、当該技術分野において承認され、一以上の対象薬物のホストに投与することを含む。対象薬物が、望ましくない状態（例えば、ホスト動物の疾患又は他の望ましくない状態）の臨床症状の前に投与される場合、処置は予防的であるが（すなわち、処置は、望ましくない状態を発展させることに対して、ホストを保護する）、対象薬物が、望ましくない状態の臨床症状の後に投与される場合、処置は治療的である（すなわち、処置は、存在する望ましくない状態又はその副作用を軽減する、改善する又は安定させることを意図される）。
【００８０】
本明細書中に提供される範囲は、範囲内の値の全てに対して省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、任意の数字、数字の組合せ、又は１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９又は５０からなる群からの部分範囲を含むと理解される。
【００８１】
本明細書中の変数の任意の定義における化学基のリストの記載は、任意の単一基又はリストの基の組合せとしてのその変数の定義を含む。本明細書中の変数又は局面のための実施形態の記載は、任意の単一の実施形態として、或いは、任意の他の実施形態又はその部分と組み合わせて、その実施形態を含む。
【００８２】
本明細書中に提供される任意の組成物、薬物又は方法は、本明細書中に提供される一以上の任意の他の任意の組成物、薬物及び方法と組み合わせられることができる。
【００８３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下のその好ましい実施形態の記載から、及び特許請求の範囲から明らかであろう。別段の記載がある場合を除き、本明細書中で使用される全ての技術的及び化学的用語は、この発明が属する当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法及び材料と同じ又は同等の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用されることができるが、適切な方法及び材料について、以下に説明される。本明細書中に引用される全ての公開された外国出願及び特許出願は、参照によって本明細書中に援用される。本明細書中に引用されるアクセッション番号によって示唆されるＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩ登録は、参照によって本明細書中に援用される。本明細書中に引用される全ての他の公開された引用文献、文献、原稿及び科学文献は、参照によって本明細書中に援用される。コンフリクトの場合、定義を含めて、本明細書が制御するだろう。さらに、材料、方法及び例は、例示に過ぎず、限定することを意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
図１Ａ〜図１Ｆは、Ｔｍｅｍ１００が、ＴＲＰＡ１／ＴＲＰＶ１陽性ペプチド作動性ＤＲＧニューロンにおいて発現されることを示す。
【図１Ａ】Ｔｍｅｍ１００の構造の概略図である。Ｔｍｅｍ１００は、そのＣ末端に、推定のＴＲＰＡ１結合部位（ＫＲＲ）を有する二つの膜貫通タンパク質である。Ｎ末端及びＣ末端の両方は、細胞内であり、ループ領域は、細胞外である。「ＰＭ」；形質膜。
【図１Ｂ】Ｔｍｅｍ１００発現細胞が、２４％のＬ４‐Ｌ６ＤＲＧニューロンを備えることを示すグラフである。それらは、主として、小径であるが、中径から大径ニューロンが、また、存在する。Ｔｍｅｍ１００発現ニューロンの平均直径は、１５．７μｍであり、中央値は、１４．３μｍである（３匹のマウスからのＤＲＧ）。
【図１Ｃ】他のＤＲＧ標識を用いたＴｍｅｍ１００‐ＧＦＰの二重染色のイメージを示す。バー；５０μｍ。
【図１Ｄ】Ｔｍｅｍ１００及び他のＤＲＧ標識の共発現の定量化の表である（３匹のマウスからのＤＲＧ、データは、平均値±標準誤差として示される）。
【図１Ｅ】Ｔｍｅｍ１００と他のＤＲＧ標識との関係を示す図である。
【図１Ｆ】Ｔｍｅｍ１００と他のＤＲＧ標識との関係を示す図である。  Ｔｍｅｍ１００は、多数のＣＧＲＰ＋ＤＲＧニューロンに対する標識である（図１Ｅ）。殆どのＴＲＰＡ１＋ＤＲＧニューロンは、Ｔｍｅｍ１００を発現する（図１Ｆ）。  図２Ａ〜図２Ｊは、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスが、ＴＲＰＡ１関連行動における選択的欠損を示すのに対して、ＴＲＰＶ１関連行動は、影響されないことを示す。
【図２Ａ】Ｔｍｅｍ１００条件付きＫＯストラテジーの概略図である。
【図２Ｂ】条件付きＫＯ株におけるＴｍｅｍ１００遺伝子の欠失が、ＤＲＧの抗Ｔｍｅｍ１００免疫染色によって、実証されたイメージを示す。バー；５０μｍ。
【図２Ｃ】Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯ（Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌ）マウスのベースライン機械的感受性（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が、コントロール集団（Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋マウス）のベースライン機械的感受性（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）と同等であることを示すグラフである。試験された力で、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯ及びコントロール集団（ＣＫＯに対してｎ＝１０、コントロール集団対してｎ＝１３）の間で、反応速度における有意差はなかった。
【図２Ｄ】Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスが、０．２％ＭＯ注射の後、減少された急性生体防御行動（ａｃｕｔｅ  ｎｏｃｉｆｅｎｓｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）を示したことを示唆するグラフである。（ホワイトバー：Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋；グレーバー：Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌ；ブラックバー：Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌ。足をなめる（ｌｉｃｋｉｎｇ）及び足を振り回す（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ）総時間：Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋において８６±６．２秒、Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌにおいて８６±１１．１秒、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯにおいて５７±９．３秒、Ａｖｉｌ-Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋及びＴｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌに対してｎ=１３、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯに対してｎ=１０)*ｐ＜０．０５，**ｐ＜０．０１。
【図２Ｅ】Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスは、ＭＯ注射の後、減少された機械的痛覚過敏（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）を示したことを示唆するグラフである（Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋に対してｎ＝１１、Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌに対してｎ＝９、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯに対してｎ＝１０)。
【図２Ｆ】カプサイシン誘導性の生体防御行動（ｎｏｃｉｆｅｎｓｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒｓ）（０．６μｇ）は、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯとコントロール集団(Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋  ｍｉｃｅマウス)との間で同様であることを示すグラフである。足をなめる（ｌｉｃｋｉｎｇ）及び足を振り回す（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ）時間：Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋において４５±５．７秒対Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯにおいて８６±１１．１秒、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯにおいて５３．７±８．３秒、ＣＫＯにおいてｎ＝１２及びコントロールにおいてｎ＝１０；ｐ＝０．４０）。
【図２Ｇ】Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスが、減少された機械的痛覚過敏を示すが、ＣＦＡ注射後に、無傷の温熱性痛覚過敏を示すことを示唆するグラフである。ＣＦＡ注射の１及び２日後、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスは、両方のコントロール集団より高い収縮閾値を有したが、痛みを伴う熱刺激に対する応答は、変わらないままであった（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋に対してｎ＝１６；ＴｍｅＭ１００ｆｌ／ｆｌに対してｎ＝１０、ＴｍｅＭ１００  ＣＫＯに対してｎ＝１８）。
【図２Ｈ】Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスが、減少された機械的痛覚過敏を示すが、ＣＦＡ注射後に、無傷の温熱性痛覚過敏を示すことを示唆するグラフである。ＣＦＡ注射の１及び２日後、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスは、両方のコントロール集団より高い収縮閾値を有したが、痛みを伴う熱刺激に対する応答は、変わらないままであった。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋に対してｎ＝９、ＴｍｅＭ１００ｆｌ／ｆｌに対してｎ＝１０、ＴｍｅＭ１００  ＣＫＯに対してｎ＝１１）。
【図２Ｉ】ホットプレート及び尾浸漬（ｔａｉｌ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ）試験における生体防御反応は、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスにおいて無傷であったことを示唆するグラフである。指摘された温度で、ＣＫＯとコントロール集団（Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋マウス)との間の待機時間における差異はなかった（それぞれ、コントロール及びＣＫＯに対して、ｎ＝９及び１３）。全ての統計は、図２Ｃを除いて、対応のないｔ‐検定であり、ボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析（tｗｏ‐ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）が使用される。データは、平均値±標準誤差として示される。
【図２Ｊ】ホットプレート及び尾浸漬（ｔａｉｌ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ）試験における生体防御反応は、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスにおいて無傷であったことを示唆するグラフである。指摘された温度で、ＣＫＯとコントロール集団（Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋マウス)との間の待機時間における差異はなかった（それぞれ、コントロール及びＣＫＯに対して、ｎ＝１３及び１０）。全ての統計は、図２Ｃを除いて、対応のないｔ‐検定であり、ボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析（tｗｏ‐ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）が使用される。データは、平均値±標準誤差として示される。  図３Ａ〜図３Ｇは、Ｔｍｅｍ１００が、ＴＲＰＶ１依存的に、ＴＲＰＡ１によって媒介される応答を向上させることを示唆する。
【図３Ａ】Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスのＤＲＧニューロンにおけるＴＲＰＡ１活性は減少されるのに対して、ＴＲＰＶ１活性は、相対的に変化されなかったことを示すグラフである。１０μＭのカラシ油（ＭＯ）及び２５０μＭの桂皮アルデヒド（ＣＡ）に応答するニューロンの割合は、ＣＫＯ株においてより低かったが、１００ｎＭのカプサイシン（ＣＡＰ）及び１００μＭのメントールに応答するニューロンの割合は、ＣＫＯとコントロール集団との間で同様であった（各試薬は、三匹のマウスで三回より多く試験された。３００より多いＩＢ４細胞が、ＭＯ，ＣＡ及びＣＡＰ集団において評価され、２９７より多い細胞が、ＭＥＮ集団において評価された。全ての統計は、対応のないｔ‐検定である。エラーバーは、標準誤差を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。
【図３Ｂ】７又は２５μＭのＭＯ（１分適用）によって誘導される平均電流は、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯからのＤＲＧニューロンにおいてより低いが、１５０μＭのＭＯが適用される場合、有意な差がないことを示すグラフである。カラム中の数は、応答する細胞の数／試験される細胞の数を示す。３匹より多いマウスが、各集団から試験され、全ての統計は、対応のない（ａｎｕｎｐａｉｒｅｄ）ｔ‐検定である。全てのエラーバーは、標準誤差を示す。＊＊ｐ＜０．０１
【図３Ｃ】Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋及びＡｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌマウスからのＭＯ誘導性電流の代表的なトレースを示す。
【図３Ｄ】１００ｎＭ  ＣＡＰ（３０秒適用)によって誘導される平均電流は、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯ及びコントロールマウスからのＤＲＧニューロンの間絵同様であることを示唆するグラフである。カラム中の数は、応答する細胞の数／試験される細胞の数を示す。３匹より多いマウスが、各集団から試験され、全ての統計は、対応のない（ａｎｕｎｐａｉｒｅｄ）ｔ‐検定である。エラーバーは、標準誤差を示す。
【図３Ｅ】Ａｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋及びＡｖｉｌ‐Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌマウスからのＣＡＰ誘導性電流の代表的なトレースを示す。
【図３Ｆ】ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００（１：１：４）発現ＣＨＯ細胞におけるＭＯ（１０μＭ）依存性（ｇａｔｅｄ）細胞全膜電位固定（Ｖｈ＝−６０ｍＶ）電流密度を示すグラフである。分析される細胞の数及び応答される細胞の数は、バー内部に示される。統計は、対応のない（ａｎｕｎｐａｉｒｅｄ）ｔ‐検定である（＊＊ｐ＜０．０１）。エラーバーは、標準誤差を示す。
【図３Ｇ】ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００（１：１：４）発現ＣＨＯ細胞における内へのＭＯ（１０μＭ）誘発性（ｅｖｏｋｅｄ）のＣａ２＋流出を示すグラフである。応答される細胞の数は、バー内部に示される。統計は、対応のない（ａｎｕｎｐａｉｒｅｄ）ｔ‐検定である（＊＊ｐ＜０．００１）。データは、平均値±標準誤差として示される。  図４Ａ〜図４Ｅは、ＴＲＰＡ１‐Ｖ１複合体におけるＴｍｅｍ１００の状況依存的制御を示す。
【図４Ａ】ＴＲＰＡ１対ＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍ１００（Ｔ１００）（１：４モル比)、及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）対ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００（１：１：４）を発現するＣＨＯ細胞におけるＶｈ＝‐６０ｍでのメインコンダクタンスのＭＯ（１０μＭ）‐誘導性の（Ａ）及びＣＡＰ（１００ｎＭ）‐誘導性の（Ｂ）単一チャネル開口確率（Ｐｏ）を示すグラフである。構成は、細胞接着型パッチであり、分析される細胞のうち応答される細胞の数は、バー内部に示される。統計は、全てのカラム間の比較のためのボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）である（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。エラーバーは、標準誤差を示す。
【図４Ｂ】ＴＲＰＡ１対ＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍ１００（Ｔ１００）（１：４モル比)、及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）対ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００（１：１：４）を発現するＣＨＯ細胞におけるＶｈ＝‐６０ｍでのメインコンダクタンスのＭＯ（１０μＭ）‐誘導性の（Ａ）及びＣＡＰ（１００ｎＭ）‐誘導性の（Ｂ）単一チャネル開口確率（Ｐｏ）を示すグラフである。構成は、細胞接着型パッチであり、分析される細胞のうち応答される細胞の数は、バー内部に示される。統計は、全てのカラム間の比較のためのボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）である（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。エラーバーは、標準誤差を示す。
【図４Ｃ】ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１‐発現及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００‐発現ＣＨＯ細胞におけるＭＯ依存性（ｇａｔｅｄ）電流に対するＶｈ＝−６０ｍＶで５秒間の代表的な単一チャネル記録を示す。Ｃは、閉状態であり、ｏ１，ｏ２及びｏ３は、パッチ内の三つの独立したチャネルに対する開状態を示す。
【図４Ｄ】ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１‐発現及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００‐発現ＣＨＯ細胞におけるＣＡＰ依存性（ｇａｔｅｄ）電流に対する４秒間の代表的な単一チャネル記録を示す。Ｃは、閉状態であり、ｏ１，ｏ２及びｏ３は、パッチ内の三つの独立したチャネルに対する開状態を示す。
【図４Ｅ】所定の作動薬及び発現される遺伝子に対するＴｍｅｍ１００（Ｔ１００）の単一チャネルコンダクタンス（ｐＳ）に関するデータ及びＰｏ変化における効果の要約表である。単一チャネルコンダクタンスの値は、図１２Ａ〜図１２Ｋから得られた。データは、平均値±標準誤差として示される。
【図５Ａ−Ｆ】Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１とＴＲＰＶ１との相互作用を低下させるが、Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ突然変異体は、相互作用を増強することを示す図である。図５Ａは、Ｔｍｅｍ１００抗体及びＴＲＰＶ１抗体によるＣｏ−ＩＰ、並びにＴＲＰＡ１抗体、ＴＲＰＶ１抗体、及びＴｍｅｍ１００抗体によるマウスＤＲＧ溶解産物のウエスタンブロッティングの画像である。Ｔｍｅｍ１００、ＴＲＰＡ１、及びＴＲＰＶ１は、ＤＲＧニューロンで複合体を形成する。図５Ｂは、ＴＲＰＶ１発現細胞でのＴＲＰＶ１及び全長ｍｙｃ−Ｔｍｅｍ１００のＣｏ−ＩＰの画像である。結果は、Ｔｍｅｍ１００とＴＲＰＶ１とが相互作用することを示す。図５Ｃは、ＴＲＰＡ１−Ｖ１共発現細胞でのＴＲＰＡ１及び全長ｍｙｃ−Ｔｍｅｍ１００のＣｏ−ＩＰの画像である。Ｔｍｅｍ１００は、様々な希釈でＴＲＰＡ１と結合する。図５Ｄは、様々なＴＲＰ並びにＴｍｅｍ１００タンパク質のフラグメント及びＴｍｅｍ１００−３Ｑタンパク質のフラグメントによるＧＳＴプルダウンの画像である。ＴＲＰＶ１は、ＷＴ  Ｔｍｅｍ１００（ＧＳＴ−Ｃ−ＷＴ）のＣ−末端及びＴｍｅｍｌ００−３Ｑ（ＧＳＴ−Ｃ−３Ｑ）のＣ−末端の両方によりプルダウンされる。また、ＴＲＰＶ１は、ＷＴ  Ｔｍｅｍ１００のＮ末端（ＧＳＴ−Ｎ）によりプルダウンされる。しかしながら、ＴＲＰＡ１は、ＷＴ  Ｔｍｅｍ１００のＣ末端によってのみプルダウンされるが、この相互作用は、Ｑ−Ｑ−Ｑ突然変異により消失する。非結合ＧＳＴ（ＧＳＴ）及び各ＴＲＰを発現する細胞に由来する溶解産物は、陰性対照としての役目を果たす。図５Ｅは、ＴＲＰＡ１−Ｖ１相互作用に対するＴｍｅｍ１００の効果に関する、ＴＩＲＦ顕微鏡法によるＦＲＥＴ結果を示すグラフである。それぞれＲｈｏ−ｐＹＣ及び膜係留ＹＦＰ＋ＴＲＰＶ１−ＣＦＰで代わりに形質移入したＲｈｏ−ｐＹＣ群（系の最大効果に関する陽性対照）及びＭ−Ｖ１（陰性対照）群を除き、全ての群をＴＲＰＶ１−ＣＦＰ及びＴＲＰＡ１−ＹＦＰで形質移入した。ＦＲＥＴ効率は、Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ形質移入細胞（Ａ１−Ｖ１−３Ｑ）が最も高く、その次が空ベクター形質移入群（Ａ１−Ｖ１）であり、野生型Ｔｍｅｍ１００（Ａ１−Ｖ１−ＷＴ）で形質移入した細胞が最も低かった。統計は、一元配置分散分析である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。データは平均±標準誤差として示されている。図５Ｆは、図５Ｅのデータを要約した表である。
【図６Ａ−Ｇ】ＴＲＰＡ１−Ｖ１複合体でのＴｍｅｍｌ００−３Ｑ突然変異体の状況依存性制御を示す図である。図６Ａ及び６Ｂは、ＴＲＰＡ１対ＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ（Ｔ１００−３Ｑ）（１：４モル比）及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）対ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ（Ｔ１００−３Ｑ）（１：１：４）を発現するＣＨＯ細胞での、Ｖｈ＝−６０ｍＶにおけるメインコンダクタンスのＭＯ（１０μＭ）誘導性（図６Ａ）及びＣＡＰ（１００ｎＭ）誘導性（図６Ｂ）単一チャネル開口確率（ＰＯ）を示すグラフである。統計は、図４と同様に一元配置分散分析である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ＮＳ：有意差なし。図６Ｃ及び６Ｄは、ＴＲＰＶ１＋ＴＲＰＡ１発現ＣＨＯ細胞対ＴＲＰＶ１＋ＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ発現ＣＨＯ細胞での、Ｖｈ＝−６０ｍＶにおけるＭＯ開口電流（図６Ｃ）及びＣＡＰ開口電流（図６Ｄ）の代表的な単一チャネル記録トレースが示されている。トレースの長さは４秒間である。図６Ｅは、Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑの単一チャネルコンダクタンス（ｐＳ）のデータ及びＰＯ変化に対する効果が、発現させた所与のアゴニスト及び遺伝子毎に要約されている表である。単一チャネルコンダクタンスの値は、図１２から導き出した。図６Ｆは、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）発現ＣＨＯ細胞及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ（１：１：４）発現ＣＨＯ細胞での、ＭＯ（１０μＭ）開口全細胞電圧クランプ（Ｖｈ＝−６０ｍＶ）電流密度を示す図である。結果は、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１細胞では、１３８．９±２９．９２ｐＡ／ｐＦであったのに対して、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ細胞では、３９．１６±１２．５ｐＡ／ｐＦであった。統計は、対応のないｔ−検定である（＊＊ｐ＜０．０１）。図６Ｇは、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）発現ＣＨＯ細胞及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ（ｌ：ｌ：４）発現ＣＨＯ細胞内への、ＭＯ（１０μＭ）誘発性Ｃａ２＋流入を示すグラフである。結果は、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１細胞では、４６３．１±２６．８ｎＭであったのに対し、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ細胞では、３２１±１８．２ｎＭであった。応答／試験した細胞数は、棒グラフ内に示されている。統計は、対応のないｔ−検定である（＊＊＊ｐ＜０．００１）。データは平均±標準誤差として示されている。
【図７Ａ−Ｉ】Ｔ１００−Ｍｕｔ細胞透過性ペプチド（Ｔ１００−Ｍｕｔ）が、ＴＲＰＡ１関連疼痛を緩和することを示す図である。図７Ａには、細胞透過性ペプチドＴ１００−Ｍｕｔ（配列番号８）の配列、スクランブルペプチド（配列番号１５）の配列、Ｔ１００−ＷＴ（配列番号１４）の配列、及びＴｍｅｍ１００（ＷＴ）のＷＴ（配列番号１３）Ｃ末端配列が示されている。Ｍｙｒ：ミリストイル化。図７Ｂは、Ｔ１００−Ｍｕｔ処置（２００ｎＭ）ＤＲＧニューロンのカルシウムイメージングデータのグラフである。（ＭＯ：スクランブルでは１２±１．３％であったのに対して、Ｔ１００−Ｍｕｔ処置群では４．６±０．９％であった；ＣＡＰ：スクランブルでは１６±１．３％であったのに対して、Ｔ１００−Ｍｕｔでは１５±６．５％であった；３匹のマウスのＤＲＧ）。図７Ｃは、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のカルシウムイメージングデータのグラフである。Ｔ１００−Ｍｕｔ（２００ｎＭ）で前処理すると、５００ｎＭのＭＯに応答する細胞の割合が減少したが、Ｔ１００−ＷＴは、そのような効果をもたらさなかった（スクランブルでは１８±２．８％、Ｔ１００−Ｍｕｔでは６±２．４％、及び１７±０．６％、３回反復、＊ｐ＜０．０５）。図７Ｄは、Ｔ１００−Ｍｕｔ（２ｍＭの５μｌ）での前処理により、ＭＯ誘導性急性侵害防御行動（ｎ＝６、＊＊ｐ＜０．０１）及び機械的痛覚過敏が緩和されたこと（スクランブルでは０．１±０．０３ｇであったのに対して、Ｔ１００−Ｍｕｔでは０．４±０．１１ｇ；ｎ＝１３、＊ｐ＜０．０５）を示すグラフである。図７Ｅは、Ｔ１００−Ｍｕｔ（２ｍＭの５μｌ）での前処理により、ＣＦＡ誘導性機械的痛覚過敏は緩和されたが（スクランブルでは０．０５±０．０ｇであったのに対して、Ｔ１００−Ｍｕｔでは０．４３±０．１ｇ；ｎ＝１０、＊＊＊ｐ＜０．００１）、温熱性痛覚過敏は緩和されなかった（スクランブルでは３．９±０．６秒であったのに対して、Ｔ１００−Ｍｕｔでは４．３±０．５秒；ｎ＝１０、ｐ＝０．６３）ことを示すグラフである。図７Ｆは、皮内カプサイシン注射（０．６μｇ）により誘導された急性侵害防御行動が、Ｔ１００−Ｍｕｔ処置ＷＴマウス及びスクランブルペプチド処置（２ｍＭ）ＷＴマウスで類似していたこと（スクランブルでは７０±１１秒であったのに対して、Ｔ１００−Ｍｕｔでは６５±９秒；ｎ＝８、ｐ＝０．７３）を示すグラフである。図７Ｇは、パクリタキセル（タキソール）を注射した野生型マウスでは、注射後７日目に械的痛覚過敏が観察されたことを示すグラフである。痛覚過敏は、Ｔ１００−Ｍｕｔの皮内注射により緩和された（スクランブル対照ペプチド（白抜き棒グラフ）は、ｎ＝７；Ｔ１００−Ｍｕｔペプチド（黒色棒グラフ）は、ｎ＝８；＊ｐ＜０．０５）。図７Ｈ及び７Ｉには、ＴＲＰＶ１−／−マウスでは、Ｔ１００−Ｍｕｔが、ＷＴマウスで観察されたようなＭＯ誘導性急性疼痛（図７Ｈ）及び機械的痛覚過敏（図７Ｉ）を撹乱しなかったことが示されている。（（図７Ｈ）では、ｎ＝８、ｐ＝０．９１、及び（図７Ｉ）では、０．６４）。統計は全て、対応のないｔ−検定であり、データは、平均±標準誤差として示されている。
【図８Ａ−Ｄ】ＴＲＰＡ１のみ（図８Ａ）、ＷＴ  Ｔｍｅｍ１００（図８Ｂ）、Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ（図８Ｃ）、及びＴ１００−Ｍｕｔ  ＣＰＰ（図８Ｄ）に対するＴＲＰＶ１の調節効果の図式モデルを示す図である（ミリストイル化基は、オレンジ色波状線により示されているように、原形質膜に挿入されている）。ＴＲＰＡ１とＴＲＰＶ１との距離は、結合度を表す（距離が小さいほど、結合は強力である）。マイナス記号の数及び緑色矢印の大きさは、ＴＲＰＶ１によるＴＲＰＡ１阻害の相対強度を表す。
【図９Ａ−Ｉ】図１Ａ〜図１Ｆと関連する図である。図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃは、Ｔｍｅｍ１００−ｍｙｃ構築体で形質移入したＦ１１細胞系を界面活性剤で処置すると（図９Ａ）、原形質膜においてのみＴｍｅｍ１００−ｍｙｃシグナルが視認されることを示す画像である。同様の結果が、Ｎ末端基を標的とする抗Ｔｍｅｍ１００抗体で処置したＴｍｅｍ１００形質移入細胞系で得られた（図９Ｂ）。界面活性剤処置をしないと、シグナルは検出されなかった（図９Ｃ）。図９Ｄは、Ｔｍｅｍ１００−ｍｙｃで形質移入したＦ１１細胞系の明視野像及びｃ−ｍｙｃ染色を比較することにより、Ｔｍｅｍ１００が主に原形質膜に局在化することが示唆されたことを示す画像である（合計１３４個の細胞を分析した）。図９Ｅは、Ｔｍｅｍｌ００＋／ＧＦＰマウス系を生成するためのＴｍｅｍ１００  ＧＦＰノックイン戦略の概略を示す図である。Ｔｍｅｍ１００のオープンリーディングフレーム（ＣＤＳ）を、ファルネシル化高感度ＧＦＰ及びＡＣＥプロモータ−Ｃｒｅリコンビナーゼネ−ネオマイシン選択カセット（ＡＣＥ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−Ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を含む標的構築体に置換した。図９Ｆは、Ｔｍｅｍ１００ＧＦＰ／＋マウスでの抗ＧＦＰ（緑色）抗体及び抗Ｔｍｅｍ１００（赤色）抗体の二重染色より、ＧＦＰが、ＤＲＧにおけるＴｍｅｍ１００の代用マーカであることが確認されたことを示す画像である。図９Ｇは、ＤＲＧでのＴＲＰＡ１及びＩＢ４の二重染色の画像である。抗ＴＲＰＡ１抗体は、ＴＲＰＡ１  ＫＯマウスに由来するＤＲＧでのバックグラウンドシグナルが測定可能なレベルではないため、特異的である。更に、ＴＲＰＡ１は、ＩＢ４＋ニューロンでは発現されない。図９Ｈ及び９Ｉは、Ｔｍｅｍ１００が、炎症後にＤＲＧニューロンで上方制御されることを示す。図９Ｈは、Ｌ４  ＤＲＧでのＴｍｅｍ１００発現ニューロンの割合が、ＣＦＡモデルでは、対側のＬ４  ＤＲＧニューロン（対照）と比較して、１日目及び４日目にて増加したことを示すグラフである。（３匹のマウスのＤＲＧ、１日目は、＊＊ｐ＜０．０１；４日目は、＊ｐ＜０．０５。）図９Ｉは、１日目のＬ４  ＤＲＧでの抗Ｔｍｅｍ１００抗体による免疫蛍光染色の画像を示す。データは全て、対応のないスチューデントｔ−検定を使用して分析した。棒グラフは全て、平均±標準誤差として示されている。
【図１０Ａ−Ｉ】図２Ａ〜図２Ｊと関連する図である。図１０Ａ〜１０Ｃは、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１のレベルが、Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯマウスに由来するＤＲＧでは変更されないことを示す。図１０Ａは、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋マウス、及びＡｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌ（Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯ）マウスに由来する抗ＴＲＰＶ１抗体、抗ＴＲＰＡ１抗体、抗Ｔｍｅｍ１００抗体、及び抗アクチン抗体を使用したウエスタンブロットの画像を示す。図１０Ｂは、ＴＲＰＡ１／アクチンバンド強度の結果をまとめたグラフである。（ｎ＝８；ｐ＝０．７９；Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍｌ００＋／＋では、１０８±２１；Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯでは、１１６±２０）。図１０Ｃは、ＴＲＰＶ１／アクチンバンド強度の結果をまとめたグラフである。（ｎ＝８；ｐ＝０．５８；Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍｌ００＋／＋では、３８±８；Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯでは、３１±９）。図１０Ｄ〜１０Ｆは、発生学的及び形態学的異常が、Ｔｍｅｍ１００コンディショナルノックアウト（Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯ）マウスでは観察されなかったことを示す。図１０Ｄは、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ＧＦＰ／ｆｌマウスでのＤＲＧマーカの免疫蛍光染色を定量化した表である。試験したマーカはいずれも、Ｔｍｅｍ１００欠損マウスの一次感覚ニューロンにおける細胞型特異的異常の証拠を示さなかった。（各マーカは、ｎ＞３；８週齢の雄）。図１０Ｅは、成体マウスの腰髄でのＧＦＰ（緑色）及びＣＧＲＰ（赤色）の二重染色の画像を示す。図１０Ｆは、成体マウスの腰髄でのＧＦＰ（緑色）及びＩＢ４（赤色）の二重染色の画像を示す。図１０Ｇは、ＭＯにより誘導される急性疼痛表現型が用量依存的であることを示すグラフである。０．０２％では、Ｎ＝６であり、０．２％では、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；＋／＋が１３で、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；ｆｌ／ｆｌが１１であり、２％では、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；＋／＋が９で、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；ｆｌ／ｆｌが６である。＊＊ｐ＜０．０１。データは全て、対応のないスチューデントｔ−検定を使用して分析した。棒グラフは全て、平均±標準誤差として示されている。図１０Ｈ及び図１０Ｉは、Ｔｍｅｍ１００欠損マウスでは寒冷誘導活性が変更されないことを示すグラフである。図１０Ｈは、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋群とＡｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌ群とには、浴灌流により温度を２２．５から１３．８℃に冷却することにより活性化されるＤＲＧニューロンの割合に有意差がないことを示すグラフである。（Ｎ＝１９；Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋では１６±２及びＡｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌでは１２±４；ｐ＝０．４１）。図１０Ｉは、Ｔｍｅｍ１００欠損マウスでは、０度の冷却板により誘発される急性疼痛が変更されないことを示すグラフである。Ｎ＝７。データは全て、スチューデントｔ−検定を使用して分析した。棒グラフは全て、平均±標準誤差として示されている。
【図１１Ａ−Ｍ】図３Ａ〜図３Ｇと関連する図である。図１１Ａ〜１１Ｃは、ＤＲＧニューロン及び異種系におけるＭＯの用量応答を示す。図１１Ａは、異なる濃度のＭＯによる、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋ＤＲＧニューロン及びＡｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌＤＲＧニューロンのカルシウムイメージングのグラフである。５、２０、及び７０μΜは、それぞれＮ＝３、６、及び９である。＊＊＊ｐ＜０．００１。分析にはスチューデントｔ−検定を適用した。図１Ｂは、様々な濃度のＭＯによるＤＲＧニューロンの全細胞記録を定量化したグラフである（１、１０、２５、５０、１００、及び３００μΜは、Ｎ＝７、１０、１２、１０、１２、及び９である）。図１１Ｃは、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１又はＴＲＰＡ１のみを発現するＣＨＯ細胞の単一チャネル記録をそれぞれ定量化したグラフである（０．１、１、１０、２５、５０、１００、及び３００μΜは、Ｎ＝６、７、１０、１０、１０、９、及び９である）。図１１Ｄ〜１１Ｆは、Ｔｍｅｍ１００が、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１膜輸送に有意な効果を示さないことを示す。図１１Ｄは、ｍｙｃ−ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ１、及びＴｍｅｍ１００又はＴｍｅｍ１００−３Ｑ突然変異体のいずれかを発現するＣＨＯ細胞のビオチン化アッセイの画像である。ベータ１インテグリン及びベータアクチンを、それぞれビオチン化膜画分及び細胞質画分の陽性対照として使用した。図１１Ｅは、ＴＲＰＡ１のビオチン化画分のレベルを定量化したグラフである。ＴＲＰＡ１／ベータ１インテグリン比を算出し、ｍｙｃ−ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１のみ（ベクターと表記）で形質移入した群での比に対して正規化した。その結果、野生型（ＷＴ）Ｔｍｅｍ１００形質移入細胞（Ｔ１００）又はＴｍｅｍ１００−３Ｑ突然変異体形質移入細胞（Ｔ１００−３Ｑ）では、ベクター群と比較して有意差は示唆されなかった。しかしながら、このデータは、Ｔｍｅｍ１００が存在するとＴＲＰＡ１の表面レベルが減少し、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ突然変異体が共発現されるとＴＲＰＡ１の表面レベルが増加する傾向があることを示唆する。図１１Ｆは、ＴＲＰＶ１のビオチン化部分のレベルを定量化したグラフである。図１１Ｅと同じ方法で、結果を分析した。そのデータによると、ＷＴ  Ｔｍｅｍ１００及びＴｍｅｍ１００−３Ｑ突然変異体は、ＴＲＰＶ１の表面への輸送を変更しないことが示唆される（（図１１Ｅ）及び（図１１Ｆ）では、ｎ＝４；ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析を、図（図１１Ｅ）及び（図１１Ｆ）で実施した；ＮＳ：有意性なし）。図１１Ｇ〜１１Ｍは、Ｔｍｅｍ１００が存在すると、別の発現系：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でも、ＭＯ及びＣＡにより誘発されるＴＲＰＡ１活性が増強されることを示す。図１１Ｇ及び１１Ｈは、ＴＲＰＡ１活性に対するＴｍｅｍ１００の効果増強には、ＴＲＰＶ１が必要であることを示すグラフである。ＴＲＰＡ１−Ｖ１−発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、Ｔｍｅｍ１００は、１００ｎＭのＭＯ及び５μΜのＣＡに応答する細胞の割合を増加させた。ＴＲＰＶ１をＴＲＰＭ８に置換すると、こうしたＴｍｅｍ１００の効果増強はなくなり、ＴＲＰＡ１とＴＲＰＭ８との相互作用は示されなかった。ＴＲＰＡ１の活性化は、カルシウムイメージングでモニタした。各群は、４回以上試験した；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。統計は、ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析である。エラーバーは全て標準誤差を表す。試験した細胞の基線３４０／３８０比は、著しくは異なっていなかった（ＴＲＰＡ１＋Ｖ１：１．１±０．０３；ＴＲＰＡ１＋Ｖ１＋Ｔｍｅｍ１００：１．１±０．０４；ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＭ８＋Ｔｍｅｍ１００：０．９５±０．０４）。図１１Ｉは、１：１：１の比率でＴｍｅｍ１００を有するか又はＴｍｅｍ１００を有しないＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１発現ＣＨＯ細胞の単一チャネル記録を定量化したグラフである。応答細胞の数は、棒グラフ内に表記されている。図１１Ｊは、Ｔｍｅｍ１００が、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１を両方とも発現する細胞でのＴＲＰＡ１活性の効力を増加させることを示すグラフである。異種系では、Ｔｍｅｍ１００は、ＣＡのＥＣ５０を低下させた（Ａ１＋Ｖ１＋Ｔｍｅｍ１００では、ＥＣ５０＝２１μΜ、及びＡ１＋Ｖ１では５７μΜ；各濃度は、４回以上試験した）。＊ｐ＜０．０５。図１１Ｋは、様々なＭＯ濃度下での、Ｔｍｅｍ１００を有するか又はＴｍｅｍ１００を有しないＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１発現ＣＨＯ細胞の単一チャネル記録を定量化したグラフである。Ｎ＝５〜８／試行。＊＊ｐ＜０．０１。図１１Ｋ及び１１Ｍは、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のカルシウムイメージングを定量化したグラフである。１００ｎＭのＭＯ及び１０μΜのＣＡに応答する細胞の割合は、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ欠損群と比較して、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ形質移入群では有意により低かった（３回反復；＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１）。統計は、ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析である；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。エラーバーは全て標準誤差を表す。
【図１２Ａ−Ｋ】図４Ａ〜図４Ｅと関連する図である。図１２Ａ〜図１２Ｄは、ＴＲＰＡ１−Ｖ１複合体でのＴｍｅｍｌ００の状況依存性制御を示す。図１２Ａ及び１２Ｂは、ＴＲＰＡ１対ＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍ１００（１：４モル比）及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）対ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００（１：１：４）を発現するＣＨＯ細胞での、Ｖｈ＝−６０ｍＶにおけるＭＯ（１０μΜ）誘導性（図１２Ａ）及びＣＡＰ（１００ｎＭ）誘導性（図１２Ｂ）単一チャネル活性（ＮＰＯ）を定量化したグラフである。ＮＰＯ測定により、メインコンダクタンス及びサブコンダクタンスを含む、全ての記録されたコンダクタンスが説明された。構成は、細胞付着パッチであり、分析したもの中で応答したパッチの数は、棒グラフ内に示されている。ＮＰＯ：ＭＯ  ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１では０．６±０．１１であったのに対して、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００ＣＨＯ細胞では１．０５±０．１４であった；ＴＲＰＡ１では１．１５±０．１５であったのに対して、ＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍ１００ＣＨＯ細胞では０．６４±０．１８であった。ＣＡＰ−  ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１では０．８１±０．１２であったのに対して、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００ＣＨＯ細胞では０．８２±０．１４であった；ＴＲＰＶ１では０．８１±０．０７であったのに対して、ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００細胞では０．４５±０．１であった。統計は、対応のないｔ−検定及びボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析である（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。エラーバーは全て標準誤差を表す。図１２Ｃ及び１２Ｄは、ＴＲＰＡ１発現ＣＨＯ細胞及びＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍ１００発現ＣＨＯ細胞での、Ｖｈ＝−６０ｍＶにおける代表的な単一チャネル記録を示しており、ＭＯ開口電流（図１２Ｃ）の場合は５秒間であり、ＣＡＰ開口電流（図１２Ｄ）の場合は４秒間である。トレースの長さは４秒間であり、発現されたタンパク質は、トレースの下に示されている。トレースの右側の垂直バーは４ｐＡを表す；ｃは閉状態である；ｏ１、ｏ２、及びｏ３は、パッチの３つの独立チャネルの開状態を示す。図１２Ｅ〜図１２Ｊは、Ｔｍｅｍ１００及びＴｍｅｍ１００−３Ｑ突然変異体の存在下及び非存在下での単一チャネル電流−電圧関連性の特徴を示す図である。図１２Ｅ、１２Ｇ、及び１２Ｉは、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍ１００（１：４モル比）、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）、又はＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００（１：１：４）（図１２Ｅ）；ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ（１：４）（図１２Ｇ）；ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ（１：１：４）（図１２Ｉ）を発現するＣＨＯ細胞での、カラシ油（ＭＯ；１０μＭ）開口単一チャネル電流−電圧関係性（Ｉ−Ｖ）のグラフである。構成は、細胞付着パッチである。パッチでのＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の共発現は、ＭＯ及びＣＡＰの両方に対する応答により確認した。メイン単一チャネルコンダクタンスのＩ−Ｖが示されている。記録した細胞の数：ｎ＝５〜８。図１２Ｆ、１２Ｊ、及び１２Ｊは、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１���０（１：４）、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）、及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００（１：１：４）（図１２Ｆ）；ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ（１：４）（図１２Ｈ）；ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）又はＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ（１：１：４）（図１２Ｊ）を発現するＣＨＯ細胞での、ＣＡＰ（１００ｎＭ）開口単一チャネルＩ−Ｖ関係性のグラフである。構成は、細胞付着パッチである。ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１を共発現するＣＨＯ細胞は、ＣＡＰ及びＭＯの両方に応答した。メイン単一チャネルコンダクタンスのＩ−Ｖが示されている。記録した細胞の数：ｎ＝５〜７。図１２Ｋは、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋マウス及びＡｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌマウスに由来するＭＯ（５０μＭ）非応答性（ＭＯ−）ＤＲＧニューロン及びＭＯ応答性（ＭＯ＋）ＤＲＧニューロンでの、カプサイシン（１００ｎＭ）誘発電流の全細胞記録を定量化したグラフである。ボックス内の数字は、試験したカプサイシン応答性ニューロンの数を表す。棒グラフは全て、平均±標準誤差として示されている。
【図１３Ａ−Ｄ】図５Ａ〜図５Ｆと関連しており、Ｔｍｅｍ１００、ＴＲＰＡ１、及びＴＲＰＶ１の相互作用を示す図である。図１３Ａは、Ｃ末端及びＴＲＰＶ１のＧＳＴプルダウンの定量化グラフである。ＴＲＰＶ１とＴｍｅｍ１００−３ＱのＣ末端との結合増加が観察された。Ｎ＝４；＊＊ｐ＜０．０１。図１３Ｂは、ＧＳＴでタグ付けした様々なＴｍｅｍ１００フラグメントとのＴＲＰＶ１のＧＳＴプルダウンの画像である。ＴＲＰＶ１プルダウンは、ＧＳＴ−Ｃ−ＷＴ群と比較して、ＧＳＴ−Ｃ−３Ｑ群で増強される。図１３Ｃは、ＴＲＰＶ１とＴｍｅｍ１００（Ｔ１００）との相互作用をＦＲＥＴ−ＴＩＲＦ測定したグラフである。Ｔｍｅｍ１００とＴＲＰＶ１との相互作用は、ＴＲＰＡ１を加えても変更されない。図１３Ｄは、ＴＲＰＡ１とＴｍｅｍ１００（Ｔ１００）との相互作用をＦＲＥＴ−ＴＩＲＦ測定したグラフである。ＴＲＰＡ１とＴｍｅｍ１００との相互作用は、ＴＲＰＶ１が存在すると有意に増加する。図５Ａ〜５Ｆの実験と同様に、Ｒｈｏ−ｐＹＣを、系の最大効果の陽性対照として使用した。Ｍ−Ｖ１は陰性対照だった。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。棒グラフは全て、平均±標準誤差として示されている。
【図１４Ａ−Ｄ】図６Ａ〜６Ｇと関連しており、ＴＲＰＡ１−Ｖ１複合体でのＴｍｅｍｌ００−３Ｑの状況依存性制御を示す図である。図１４Ａ及び１４Ｂは、ＴＲＰＡ１対ＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍｌ００−３Ｑ（Ｔ１００−３Ｑ）（１：４モル比）及びＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１（１：１）対ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ（１：１：４）を発現するＣＨＯ細胞での、Ｖｈ＝−６０ｍＶにおけるＭＯ（１０μＭ）誘導性（図１４Ａ）及びＣＡＰ（１００ｎＭ）誘導性（図１４Ｂ）単一チャネル活性（ＮＰＯ）を示すグラフである。ＮＰＯ：ＭＯ  ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１では０．５５±０．０９であったのに対して、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ  ＣＨＯ細胞では０．１６±０．０６であった；ＴＲＰＡ１では０．９８±０．１８であったのに対して、ＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ細胞では１．０５±０．１４であった。ＣＡＰ  ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１では、１．０４±０．２３であったのに対して、ＴＲＰＡ１＋ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ細胞では、１．０８±０．１７であった；ＴＲＰＶ１では、１．３±０．１６であったのに対して、ＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ細胞では、０．７３±０．１２だった。統計は、対応のないｔ−検定及びボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析である（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ＮＳ：有意差なし）。エラーバーは全て標準誤差を表す。図１４Ｃ及び図１４Ｄは、ＴＲＰＡ１発現ＣＨＯ細胞及びＴＲＰＡ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ発現ＣＨＯ細胞（図１４Ｃ）でのＭＯ開口電流の、並びにＴＲＰＶ１発現ＣＨＯ細胞及びＴＲＰＶ１＋Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ発現ＣＨＯ細胞（図１４Ｄ）でのＣＡＰ開口電流の、Ｖｈ＝−６０ｍＶにおける代表的な単一チャネル記録トレースを示す。トレースの長さは４秒間であり、発現されたタンパク質は、トレースの下に示されている。トレースの右側の垂直バーは４ｐＡを表し；ｃは閉状態である；ｏ１、ｏ２、及びｏ３は、パッチの３つの独立チャネルの開状態を示す。
【図１５Ａ−Ｄ】図７Ａ〜７Ｉと関連しており、Ｔ１００−Ｍｕｔ、Ｆ２に由来する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の短縮型も、異種系及び疼痛行動モデルでのＴＲＰＡ１活性の抑制に有効であることを示す図である。図１５Ａは、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１を発現するＨＥＫ２９３細胞のカルシウムイメージングデータのグラフである。３つの短縮ＣＰＰ（上部の配列）の中で、Ｆ２のみが（２μΜ）、スクランブルと比較して、ＣＡ（１０μΜ）に応答する細胞の割合を有意に低減した（３回反復）。図１５Ａでは、上部の配列（Ｔｍｅｍ１００）：配列番号８；Ｆ１：配列番号１６；Ｆ２：配列番号１７；及びＦ３：配列番号１８。＊ｐ＜０．０５。図１５Ｂに示されているように、Ｆ２（配列番号１７）（５μｌ  １００μΜ；皮内注射）も、パクリタキセル誘導性機械的痛覚過敏の抑制に有効である。Ｎ＝５；＊＊＊ｐ＜０．０１。図１５Ｃ及び１５Ｄは、白抜きボックス：スクランブル；黒色ボックス：Ｆ２を示すグラフである。ヒトＴ１００−３Ｑペプチド（ｈ−Τ１００）及びＨＣ−０３００３１の髄腔内注射は、ラットの神経障害性機械的過敏症を用量依存的に阻害する。図１５Ｃは、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）されたラットにｈ−Ｔ１００を髄腔内注射すると（１０〜１００μΜ、１０μｌ、ｎ＝７〜８／用量）、同側足逃避閾値（ＰＷＴ）が投薬前レベルから用量依存的に増加し、機械的過敏症の緩和を反映したことを定量化したグラフを示す。スクランブルペプチド（１００μΜ、１０μｌ、ｎ＝６）及び賦形剤（ｎ＝５）の髄腔内注射は、効果を示さなかった。薬物注射後の対側ＰＷＴに有意な変化はなかった。図１５Ｄは、選択的ＴＲＰＡ１受容体拮抗剤（アンタゴニスト）であるＨＣ−０３００３１（１０〜２００μΜ、１０μｌ、ｎ＝６／用量）の髄腔内注射も、ＳＮＬラットの同側ＰＷＴを用量依存的な様式で増加させたことを定量化したグラフである。賦形剤の髄腔内注射（ｎ＝６）は、効果を示さなかった。対側ＰＷＴは、薬物処置後に有意な変化を示さなかった。Ｔ１００−Ｍｕｔペプチドは、ＨＣ０３００３１（５８．２μΜ、１０μｌ）よりも低い疼痛阻害のＥＣ５０（２９．３μΜ、１０μｌ）を示す。＊Ｐ＜０．０５、投薬前との比較。一元配置反復測定分散分析。棒グラフは全て、平均±標準誤差として示されている。
【図１６Ａ−Ｂ】Ｐ２−Ｍｕｔ（Ｔ１００−Ｍｕｔ；配列番号７）が、進行中の疼痛を阻害することを示す図である。図１６Ａは、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）されたラットに、Ｐ２−Ｍｕｔを髄腔内注射すると（５０μΜ、１０μｌ、ｎ＝１０）、ラットは、薬物と対になっているチャンバーにいる時間が増加し、それに応じてスクランブルペプチドと対になっているチャンバーにいる時間が減少したことを示すグラフである。Ｐ２−Ｍｕｔと対になっているチャンバーの差異スコア（差異スコア＝「後順化時間」−「前順化時間」）は、スクランブルと対になっているチャンバーの差異スコアよりも有意に大きく、進行中の神経障害性疼痛の緩和を反映していた。しかしながら、Ｐ２−Ｍｕｔは、偽手術ラット（ｎ＝８）ではチャンバー嗜好性を誘導しなかった。この結果は、神経損傷がないと薬物に報酬効果はなく、ＳＮＬラットがＰ２−Ｍｕｔと対になっているチャンバーを嗜好することは、薬物誘導性疼痛軽減の結果であることを示唆する。図１６Ｂは、別の実験においてガバペンチンを全身性投与すると（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、ＳＮＬラットがガバペンチンと対になっているチャンバーにいる時間が有意に増加し（ｎ＝８）、それに応じて生理食塩水と対になっているチャンバーにいる時間が減少したことを示すグラフである。しかしながら、ガバペンチンは、偽手術ラット（ｎ＝８）ではチャンバー嗜好を誘導しなかった。ＳＮＬラットの場合、差異スコアは、ガバペンチンと対になっているチャンバーと生理食塩水と対になっているチャンバーとに有意差があったが、偽手術ラットでは有意差はなかった。＊ｐ＜０．０５、対応のあるｔ−検定による。
【図１７】Ｐｉｒｔ２−ＣＫＯ（Ｔｍｅｍ１００−ＣＫＯ）マウスにおける死亡掻痒行動を示すグラフである。Ｙ軸は、背中へのヒスタミン注射後の最初の３０分間の引掻傷の数を表している。Ｐｉｒｔ２−ＣＫＯ（Ｔｍｅｍ１００  ＣＫＯ）マウスは、ロバストな掻痒行動の減少を示した。（対照及びＣＫＯは、ｎ＝１０及び１１）。
【図１８】脊髄神経結紮（ＳＮＬ）された野生型マウスでは、結紮の６日後に機械的痛覚過敏が観察されることを示す図である。Ｔｍｅｍ１００ペプチド（ＣＰＰ）配列番号１７の皮内注射は、ＳＮＬ誘導性機械的痛覚過敏を阻止した。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１は、疼痛の重要なメディエータであり、複合体を形成することが知られてきた。本発明は、ＴＲＰＡ１‐Ｖ１複合体の増強モジュレータとして、Ｔｍｅｍ１００ペプチド及び変異体又はその誘導体の同定に、少なくとも部分的に基づいている。
【００８６】
疼痛は、多くの衰弱性疾患の主症状であり、世界中で重篤な社会的及び健康上の負担を引き起こす。後根神経節（ＤＲＧ）におけるイオンチャネル及び受容体は、侵害刺激の検出に関与しており、それらの可撓性は、疼痛の重症度の増大に寄与することが知られている（Ｗｏｏｌｆ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔｉｇａｎ, １９９９）。ＴＲＰ（一過性受容器電位）チャネルは、この目的を理解するとともに、処置を開発するための新たな標的である（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｅｌｌ, ２００７）。多量体を形成するそれらの能力（Ｇｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ.,２００２；  Ｈｅｌｌｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．,２００５；  Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．,２００２； Ｓｃｈａｅｆｅｒ,２００５； Ｓｔｒuｂｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．,２００１；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．,１９９７）は、チャネル制御の多様性及び複雑性、並びに痛覚の調節のための潜在的な影響を広げる（Ｊｅｓｋｅ  ｅｔ ａｌ．,２０１１；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．,２０１１；  Ｐａｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．,２０１１； Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ.,２００９）。ＴＲＰチャネルの中で、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１は、ＤＲＧニューロンにおいて、重要かつ広く研究された疼痛シグナルの分子センサ及びメディエータである（Ｂａｕｔｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．,２００６；  Ｃａｔｅｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；  Ｃａｔｅｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．,１９９７）。全てではないにしても、非殆どのＴＲＰＡ１＋ＤＲＧニューロンは、ＴＲＰＶ１を共発現することは、十分に裏付けされている（Ｂａｕｔｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．,２００６；  Ｓｔｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．,２００３）。最近の研究によって、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１は、異種発現システム及び感覚神経において複合体を形成することができることが示唆されたが（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．,２０１４；  ＭｃＭａｈｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ,２００６；  Ｓａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．,２００９；  Ｓｔａｒｕｓｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．,２０１０）、侵害受容経路（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙ）における複合体の機能的重要性及び調節は、不明である。
【００８７】
Ｔｍｅｍ１００（Ｐｉｒｔ２としても知られる）は、侵害受容経路（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙ）におけるＴＲＰＡ１‐Ｖ１複合体の調節のための候補として、同定された。Ｔｍｅｍ１００は、脊椎動物において項度に保存された１３４個のアミノ酸、二つの膜貫通タンパク質である（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．,２０１０）。Ｔｍｅｍ１００は、ＤＲＧを除く他の器官において見られ、血管、神経管腹側及び脊索に発現される（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．,２０１０）。Ｔｍｅｍ１００は、腎臓発生（Ｇｅｏｒｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．,２００９）、脈管形成（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．,２０１０）及び肺癌細胞浸潤（Ｆｒｕｌｌａｎｔｉ  ｅｔ   ａｌ．,２０１２）等のプロセスに関連があることが示されてきた。しかしながら、本明細書中に記載される発明の前に、神経系におけるこれらの効果の発生機序及びＴｍｅｍ１００の役割について、殆ど知られていなかった。
【００８８】
本明細書中に記載されるデータは、Ｔｍｅｍ１００が、インビトロ及びインビボにおけるＴＲＰＡ１を活性を向上させることを示す。興味深いことに、この制御は、ＴＲＰＶ１の存在に依存する。ＤＲＧにおいて、Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１と共発現される。Ｔｍｅｍ１００は、ＤＲＧニューロン及び異種系の両方において、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１と複合体を形成する。Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１が、共に、膜パッチ中に存在する場合、チャネルの開口確率を増加させることによって、ＴＲＰＡ１関連の活性を選択的に増大させる。Ｔｍｅｍ１００変異マウスは、炎症性の機械的痛覚過敏及びＴＲＰＶ１ではなくＴＲＰＡ１媒介の疼痛における減少を示す。機構的に、Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の関連性を弱め、それによって、ＴＲＰＶ１によるＴＲＰＡ１の阻害を解除する（Ｓａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．,２００９）。Ｔｍｅｍ１００変異体である、Ｔｍｅｍ１００‐３Ｑは、反対の効果を発揮する。すなわち、Ｔｍｅｍ１００‐３Ｑは、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１のの関連性を向上させ、ＴＲＰＡ１を強力に抑制する。この抑制を利用して、持続性雄疼痛を遮断するための新たな戦略が開発され、本明細書中に記載された。Ｔｍｅｍ１００‐３ＱのＣ末端を模倣するとともに、ＴＲＰＶ１依存的に、ＴＲＰＡ１によって媒介される活性及び疼痛を選択的に抑制する細胞膜透過性ペプチドが、本明細書中に記載される。
【００８９】
ＴＲＰチャネルは、少なくとも六つのグループに分類されてきた；ＴＲＰＣ（短い）、ＴＲＰＶ（バニロイド）、ＴＲＰＭ（長い、メラスタチン)、ＴＲＰＰ（ポリシスチン）、ＴＲＰＭＬ（ムコリピン）及びＴＲＰＡ（ＡＮＫＴＭｌ）。ＴＲＰＣグループは、配列相同性及び機能的類似性に基づいて、四つのサブファミリーに分類されることができる（ＴＲＰＣｌ、ＴＲＰＣ４，５、ＴＲＰＣ３，６，７及びＴＲＰＣ２）。現在、ＴＲＰＶファミリーは、六つのメンバーを有する。ＴＲＰＶ５及びＴＲＰＶ６は、ＴＲＰＶｌ、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３又はＴＲＰＶ４よりも、互いにより密接に関連されている。ＴＲＰＡｌは、ＴＲＰＶ３に最も密接に関連され、ＴＲＰＶ５及びＴＲＰＶ６よりも、ＴＲＰＶｌ及びＴＲＰＶ２により密接に関連されている。ＴＲＰＭファミリーは、八つのメンバーを有する。成分としては、以下のものが挙げられる；構成メンバーＴＲＰＭｌ（メラスタチン又はＬＴＲＰＣｌ）、ＴＲＰＭ３（ＫＩＡＡｌ６１６又はＬＴＲＰＣ３）、ＴＲＰＭ７（ＴＲＰ‐ＰＬＩＫ、ＣｈａＫ（ｌ）、ＬＴＲＰＣ７）、ＴＲＰＭ６（ＣｈａＫ２）、ＴＲＰＭ２（ＴＲＰＣ７又はＬＴＲＰＣ２）又はＴＲＰＭ８（Ｔｒｐ‐ｐ８又はＣＭＲｌ）、ＴＲＰＭ５（Ｍｔｒｌ又はＬＴＲＰＣ５）及びＴＲＰＭ４（ＦＬＪ２００４１又はＬＴＲＰＣ４）。ＴＲＰＡファミリーの唯一の哺乳類メンバーは、ＡＮＫＴＭｌである。ＴＲＰＭＬファミリーは、ムコリピンからなり、ＴＲＰＭＬｌ（ムコリピン１）、ＴＲＰＭＬ２（ムコリピン２）及びＴＲＰＭＬ３（ムコリピン３）を含む。ＴＲＰＰファミリーは、二つのグループのチャネルからなる；六つの膜貫通領域を有すると予測されるもの及び１１個の膜貫通領域を有すると予測されるもの。ＴＲＰＰ２（ＰＫＤ２）、ＴＲＰＰ３（ＰＫＤ２Ｌ１）、ＴＲＰＰ５（ＰＫＤ２Ｌ２）は、全て、六つの膜貫通領域を有すると予測される。ＴＲＰＰｌ（ＰＫＤｌ３ ＰＣｌ）５ ＰＫＤ‐ＲＥＪ及びＰＫＤ‐ＩＬlは、全て、１１個の膜貫通領域を有すると考えられる。
【００９０】
ＴＲＰチャネルは、細胞恒常性の調節に関連する大きくかつ重要なチャネルのクラスを構成する。本発明は、少なくとも一つのＴＲＰファミリーメンバーを調節する方法及び薬物を提供する。具体的には、本発明は、ＴＲＰＡｌの機能に拮抗するための方法及び薬物を提供する。ＴＲＰＡ１の機能の調節は、細胞内のカルシウム恒常性、ナトリウム恒常性、細胞内カルシウム濃度、膜分極（静止膜電位）、及び／又は陽イオンレベルを調節するための手段を提供する。一以上のＴＲＰＡ１機能を調節することができる薬物は、カルシウム恒常性の維持、ナトリウム恒常性の維持、細胞内カルシウム濃度の調節、膜分極（膜電位）の調節、陽イオンレベルの調節、及び／又は、カルシウム恒常性、ナトリウム恒常性、カルシウム又はナトリウム恒常性不全、又は（低興奮性及び過剰興奮性を含む）膜分極／過分極に関連付けられる疾患、障害又は状態を処置又は予防すること、及び／又は、ＴＲＰＡ１発現又は機能の制御又は誤制御に関連付けられる疾患、障害又は状態を処置又は予防すること、を含むが、これらに限定されない、多くの曲面において有用である。
【００９１】
本願は、ＴＲＰＡ１機能を調節することができる薬物及び該薬物を使用する方法を提供する。
【００９２】
好ましくは、これらの本明細書中に記載されるＴｍｅｍ１００変異体ポリペプチドは、それらを細胞膜透過性にするために、それらのＮ末端に、脂質修飾、例えば、パルミトイル（Ｐａｌ）又はミリスチル（Ｍｙｒ）基を含む。
【００９３】
パルミトイル化は、一般的に、膜タンパク質である、タンパク質のシステイン、セリン又はスレオニン残基への、パルミチン酸等の、脂肪酸の共有結合である。パルミトイル化は、タンパク質の疎水性を高めるとともに、それらの膜結合性に寄与する。パルミトイル化は、また、膜分画間のタンパク質の細胞内輸送において、及びタンパク質間相互作用の調節において、重要な役割を果たす。プレニル化及びミリストイル化とは対照的に、パルミトイル化は、通常、可逆的である（パルミチン酸とタンパク質との間の結合は、しばしばチオエステル結合であるため)。逆反応は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼによって触媒される。パルミトイル化は、動的な、翻訳後プロセスであるため、細胞内局在性、タンパク質間相互作用、又はタンパク質の結合能力を変更するために、細胞によって利用される。
【００９４】
ミリストイル化は、ミリスチン酸から得られる、ミリストイル基が、Ｎ末端グリシン残基のαアミノ基に対して、アミド結合によって共有結合される、不可逆の、タンパク質の脂質修飾である。ミリスチン酸は、ｎ‐テトラデカン酸の系統名を有する１４個の炭素の飽和脂肪酸（１４：０）である。この修飾は、同時翻訳で又は翻訳後の何れかで、付与されることができる。Ｎ‐ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）は、細胞の細胞質内で、ミリスチン酸付加反応を触媒する。この脂質化事象は、動物、植物、菌類、原生動物及びウイルスを含む多くの有機体の間で共通である。ミリストイル化は、弱いタンパク質間及びタンパク質‐脂質相互作用を許容し、膜標的化、タンパク質間相互作用における重要な役割を果たし、種々のシグナル伝達経路において広く機能する。
（組成物又は薬物）
【００９５】
一局面において、本発明は、特定のＴＲＰＡ１抑制ポリペプチド及び核酸を備える、からなる、又は主成分とする組成物又は薬物及び医薬組成物を提供する。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、核酸及びポリペプチド組成物を言うために使用される場合、用語「単離された」は、それらが天然に存在する状態以外の状態で存在する核酸及び又はポリペプチドを言う。換言すれば、「単離された」は、他のタンパク質及びタンパク質が内在的に見出される細胞成分からのある程度の分離を示すために使用される。このような文脈において使用される場合、「単離された」は、タンパク質又は核酸が、精製された形で供給されることを、必ずしも意味しない。さらに、用語「単離された」は、ポリペプチド又は核酸が、有機体から分離されることを意味することを意図されない。寧ろ、用語「単離された」は、また、組換え的に産生された核酸及びポリペプチドを含む。
【００９７】
本発明は、また、Ｔｍｅｍ１００ペプチド又はそのフラグメント、或いはＴｍｅｍ１００変異ペプチド又はそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを包含する。本発明は、また、単離されたポリペプチドを包含する。
【００９８】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドに対するコード配列のみを含むポリヌクレオチド、並びに付加的なコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態で又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含み、二本鎖又は一本鎖であり得、一本鎖は、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
【００９９】
本発明は、配列番号５又は配列番号６において示されるアミノ酸配列を備える、からなる、又は主成分とする単離されたポリペプチド、又はそのフラグメントを提供する。
【０１００】
本発明は、配列番号７又は配列番号８において示されるアミノ酸配列を備える、からなる、又は主成分とする単離されたポリペプチド、又はそのフラグメントを提供する。
【０１０１】
本発明は、配列番号９又は配列番号１０を備える、からなる、又は主成分とする核酸配列によってコードされる単離されたポリペプチドを提供する。
【０１０２】
本発明は、配列番号１１又は配列番号１２において示されるヌクレオチド配列を備える、からなる、又は主成分とする核酸配列によってコードされる単離されたポリペプチドを提供する。
【０１０３】
本発明は、さらに，ポリヌクレオチドの変異体、例えば、フラグメント、類似体及び誘導体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在するポリヌクレオチドの対立遺伝子多型又は天然に存在しないポリヌクレオチドの変異体であり得る。ポリヌクレオチドは、開示されたポリペプチドの天然に存在するコード配列の対立遺伝子多型であるコード配列を有することができる。当技術分野で周知のように、対立遺伝子多型は、例えば、一以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有するポリヌクレオチド配列の代替形式であり、コードされたポリペプチドの機能を、実質的に変更しない。
【０１０４】
ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌に役立つポリヌクレオチドに対して、同じリーディングフレーム内で融合された成熟型ポリペプチドに対するコード配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）を含むことができる。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、ポリペプチドの成熟形態を形成するために、宿主細胞によって切断されたリーダー配列を有することができる。ポリヌクレオチドは、また、成熟タンパク質及び付加的な５’アミノ酸残基である前駆タンパク質をコードすることができる。プロ配列を有する成熟タンパク質は、前駆タンパク質であり、タンパク質の不活性型である。一度プロ配列が切断されると、活性型の成熟タンパク質が残る。
【０１０５】
ポリヌクレオチドは、例えば、コードされたポリペプチドの精製を許容するマーカー配列に対して、同じリーディングフレーム内で融合された成熟型ポリペプチドに対するコード配列を含むことができる。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合される成熟型ポリペプチドの精製を提供するために、ｐＱＥ‐９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジン（配列番号２０）タグであり得るか、又はマーカー配列は、哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ‐７細胞）が使用される場合、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から得られたヘマグルチニンタグ（ＨＡ）であり得る。付加的なタグとして、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質タグ）、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、チオレドキシンタグ、ＴＣタグ、Ｔｙタグ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０６】
本発明は、配列番号１又は配列番号３において示されるアミノ酸配列を備える、からなる、又は主成分とするポリヌクレオチドに、少なくとも８０％同一の、少なくとも８５％同一の、少なくとも９０％同一の、少なくとも９５％同一の、或いは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％同一のヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、又はそのフラグメントを提供する。
【０１０７】
参照ヌクレオチド配列に、少なくとも、例えば、９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当り五つの点突然変異まで含むことができることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列に同一であることが、意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失されるか、他のヌクレオチドで置換されることができる、或いは、参照配列内の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入されることができる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列のアミノ又はカルボキシ末端位置で、或いは、参照配列内のヌクレオチド間で独立して又は参照配列の内部の一以上の隣接グループで散在されて、それらの末端位置間の任意の位置で、生じることができる。
【０１０８】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、参照配列に、少なくとも８０％同一の、少なくとも８５％同一の、少なくとも９０％同一の、及び幾つかの実施形態において、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ベストフィットプログラム（非特許文献１０：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１1)等の、既知のコンピュータプログラムを通常に使用して決定されることができる。ベストフィットは、二つの配列間の相同性の最良セグメントを見つけるために、非特許文献１１：Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃs  ２：  ４８２  ４８９  （１９８１）の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用する。特定の配列が、例えば、本発明に係る参照配列に、９５％同一であるかどうか決定するために、ベストフィット又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータは、同一性の割合が参照ヌクレオチド配列の全長に亘って算出されるように、及び参照配列内のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
【０１０９】
ポリヌクレオチド変異は、コード領域、非コード領域、又はその両方の領域における変更を含むことができる。幾つかの例において、ポリヌクレオチド変異は、サイレント置換、付加又は欠失を生じる変更を含むが、コードされたポリペプチドの特性又は活性を変更しない。幾つかの例において、ヌクレオチド変異は、遺伝子コードの縮退に起因するサイレント置換によって生成される。ポリヌクレオチド変異は、種々の理由のために、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、大腸菌等の細菌宿主によって好まれるコドンに変更する）ために生成されることができる。
【０１１０】
二以上の核酸又はポリペプチドに関連して、用語「同一性」又は「パーセント同一性」は、配列同一性の部分として任意の保存的アミノ酸置換を考慮せず、最大一致のために（必要であれば、ギャップを導入して）、比較及びアラインされた場合、同じであるか、同じである特定の割合のヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する二以上の配列又は部分列をいう。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いて、或いは目視によって測定される。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用される、種々のアルゴリズム及びソフトウェアが、当該分野において公知である。一つのそのような配列アラインメントアルゴリズムの非限定例は、非特許文献１２に記載されるアルゴリズムであり、非特許文献１３において改変されるとともに、非特許文献１４内に組み込まれている。Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、非特許文献１５に記載されるように使用される。ＢＬＡＳＴ‐２，ＷＵ‐ＢＬＡＳＴ‐２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）），ＡＬＩＧＮ，ＡＬＩＧＮ‐２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又はＭｅｇａｌｉｇｎ  （ＤＮＡＳＴＡＲ）は、配列をアラインするために使用されることができる付加的な公開されているソフトウェアプログラムである。二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアにおけるＧＡＰプログラムを用いて（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス並びに４０，５０，６０，７０又は９０のギャップ荷重（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）及び１，２，３，４，５又は６の長さ荷重（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）を用いて）、決定される。ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを組み込み、（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスの何れか、並びに１６，１４，１２，１０，８，６又は４のギャップ荷重（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）及び１，２，３，４，５の長さ荷重（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔを用いて）、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定するために使用される。ヌクレオチド又はアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１‐１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて決定される。例えば、パーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（第２版）を用いて、及び残基表（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）及び４のギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）と一緒にＰＡＭ１２０を用いて、決定される。特定のアラインメントソフトウェアによる最大アラインメントのための適切なパラメータは、当業者によって決定されることができる。幾つかの例において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが、使用される。幾つかの例において、第一のアミノ酸配列の第二のアミノ酸配列に対するパーセント同一性「Ｘ」は、１００Ｘ（��／Ｚ）として算出され、Ｙは、（目視又は特定の配列アラインメントプログラムによってアラインされる）第一及び第二配列のアラインメントにおける完全一致として点数化されるアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第二配列における残基の総数である。第一配列の長さが第二配列より長い場合、第一配列の第二配列に対するパーセント同一性は、第二配列の第一配列に対するパーセント同一性より長くなるだろう。
【０１１１】
非限定例として、任意の特定のポリヌクレオチドが、参照配列に対して、一定割合の配列同一性を有する(例えば、少なくとも８０％同一で、少なくとも８５％同一で、少なくとも９０％同一で、及び幾つかの例において、少なくとも９５％，９６％，９７％，９８％又は９９％同一である)場合、特定の例において、ベストフィットプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１1)を使用して決定されることができる。ベストフィットは、二つの配列間の相同性の最良セグメントを見つけるために、非特許文献１６：Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃs  ２：  ４８２  ４８９  （１９８１）の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用する。特定の配列が、例えば、本発明に係る参照配列に、９５％同一であるかどうか決定するために、ベストフィット又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータは、同一性の割合が参照ヌクレオチド配列の全長に亘って算出されるように、及び参照配列内のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
【０１１２】
一例において、本発明の二つの核酸又はポリペプチドが実質的に同一であるは、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視によって測定されるように、最大一致のために比較及びアラインされた場合、それらが、少なくとも７０％，少なくとも７５％，少なくとも８０％，少なくとも８５％，少なくとも９０％，及び幾つかの例において、少なくとも９５％，９６％，９７％，９８％，９９％ヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性を有することを意味する。同一性は、少なくとも約５、少なくとも約１０、約２０、約４０〜６０残基長、又はそれらの間の任意の整数値である配列の領域に亘って、又は６０〜８０残基、少なくとも約９０〜１００残基より長い領域亘って、存在することができるか、配列は、比較されている配列の全長に亘って、実質的に同一である。
【０１１３】
「保存的アミノ酸置換」は、一方のアミノ酸残基が、同じ側鎖を有する他方のアミノ酸残基で置換されるものである。同じ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含めて、当該分野において定義されてきた。例えば、フェニルアラニンのチロシンへの置換は、保存的置換である。好ましくは、本発明のポリペプチド及び抗体の配列中の保存的置換は、アミノ酸配列を含むポリペプチド又は抗体の、抗原への結合を破棄しない。抗原結合を消失させないヌクレオチド及びアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当該分野において周知である（例えば、非特許文献１７、非特許文献１８及び非特許文献１９を参照のこと）。
【０１１４】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドであり得る。本発明の幾つかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造又は機能の有意な効果を有することなく、変更されることができることが、当該分野において認識されるだろう。そのような変異として、欠失、挿入、転置、繰り返し、及びタイプ置換が挙げられる。
【０１１５】
ポリペプチド及び類似体は、さらに、タンパク質の通常部分ではない付加的な化学的部分を含むように改変されることができる。それらの誘導体化された部分は、タンパク質の溶解度、生物学的半減期又は吸収を改善することができる。それらの部分は、また、タンパク質の任意の望ましい副作用等を低減又は消失させることができる。それらの部分のための概要は、非特許文献２０に見られることができる。
【０１１６】
本明細書中に記載される単離されたポイペプチドは、当該分野において公知の任意の適切な方法によって生成されることができる。そのような方法は、直接タンパク質合成方法から、単離されたポリペプチド列配列をコードするとともに、適切な形質転換された宿主内でそれらの配列を発現するＤＮＡ配列を構築することまで及ぶ。幾つかの例において、ＤＮＡ配列は、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離すること又は合成することによって、組換え技術を用いて構築される。必要に応じて、配列は、その機能的類似体を供給するために、部位特異的な突然変異誘発によって、変異誘発されることができる。例えば、非特許文献２１及び特許文献１を参照のこと。
【０１１７】
目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成によって、構築されることが可能である。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、及び目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好まれるそれらのコドンを選択することで、設計されることができる。標準的な方法が、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するために、適用されることができる。例えば、完全なアミノ酸配列は、折り返し翻訳された（ｂａｃｋ‐ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）遺伝子を構築するために使用されることができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマが、合成されることができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードする幾つかの小オリゴヌクレオチドは、合成され、その後結合されることができる。それぞれのオリゴヌクレオチドは、一般的に、相補的集合体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）のための５’又は３’突出部を含む。
【０１１８】
本発明は、原核細胞及び真核細胞の少なくとも一つにおいて複製する、発現ベクターを提供する。発現ベクターは、前述のＴＲＰＡ１抑制性核酸の何れかを含む。同様に、細胞が、発現された核酸によってコードされるＴＲＰＡ１抑制タンパク質を発現する、これらの発現ベクターを備える細胞が、提供される。
【０１１９】
さらに、ポリペプチドを産生する方法が、提供される。該方法は、ポリペプチドを発現するために、適切な細胞培養培地中で、前述の細胞（例えば、ＴＲＰＡ１抑制ポリペプチド）の一つを培養することを含む。上述のように、本発明は、本明細書中で提供されるように、ＴＲＰＡ１抑制タンパク質のためのコード配列を含む発現ベクターを考慮する。「ベクター」は、他のＤＮＡセグメントが結合される、プラスミド、ファージ又はコスミド等の、レプリコンである。用語「ベクター」は、それが結合された他の核酸を輸送することが可能な核酸分子をいう。一つのタイプのベクターは、染色体外複製の可能な核酸であるエピソームである。それらが結合される核酸の自己複製及び／又は発現の可能なベクターが、また、使用される。それらが動作可能に結合される遺伝子の発現を指揮することが可能なベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」と言われる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、それらのベクター形式において染色体に結合されない環状二本鎖ＤＮＡループを一般的にいう「プラスミド」の形態である。ｚしかしながら、本発明は、同等の機能を果たすとともに、これに続いて当該分野において公知となる発現ベクターのそのような他の形態を含むことを意図される。
【０１２０】
ＤＮＡ又は核酸「コード配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれる場合、インビボでポリペプチドに転写及び翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって、決定される。本発明のコード配列として、真核性ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核性（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、コード配列の３’に位置される。
【０１２１】
核酸又はＤＮＡ制御配列又は制御要素は、宿主細胞においてコード配列の発現を提供及び／又は制御するプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化シグナル及びターミネータ等の、転写及び翻訳制御配列である。特定例の真核性イオンチャネル及び検出可能なマーカーの発現を指揮するための制御配列は、当該技術分野において承認されており、多数の十分理解された基準によって選択される。制御配列の例は、非特許文献２２に記載されている。例えば、それに動作可能に結合される場合、ＤＮＡ配列の発現を制御する多種多様の発現制御配列の何れかは、イオンチャネル検出可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列を発現するために、これらのベクターにおいて使用される。そのような有用な発現制御配列として、例えば、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、β２チューブリン、アデノウイルス又はサイトメガロウイルス前初期プロモータ、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ又はＴＲＣシステム、発現が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって指揮されるＴ７プロモータ、３‐ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素のためのプロモータ、酸性ホスファターゼ、例えば、Ｐｈｏ５５のプロモータ、酵母α交配因子のプロモータ、及び原核又は真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られる他の配列、並びに、それらの種々の組合せ、が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択等の因子に依存することが、理解されるできである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び抗生物質マーカー等の、ベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現は、また、考慮されるべきである。
【０１２２】
本発明は、原核又は真核細胞中のＴＲＰＡ１抑制タンパク質の発現を誘導することができる任意のプロモータの使用を考慮する。本明細書中で使用される場合、用語「プロモータ」は、プロモータに動作可能に連結される選択されたＤＮＡ配列の発現を制御するとともに、細胞内の選択されたＤＮＡ配列の発現に影響するＤＮＡ配列を意味する。「プロモータ」は、一般的に、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合可能であるとともに、コード配列の転写を開始するＤＮＡ制御要素である。例えば、プロモータ配列は、転写開始部位によって、その３’末端に結合され、上記バックグラウンドを検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又は要素を含むために、上流（５’方向）に延びる。プロモータ配列の内部に、転写開始部位、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合領域が見つかっている。真核生物プロモータは、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＡＴ」ボックスをしばしば含むが、必ずしも含んでいない。誘導プロモータを含めて、種々のプロモータは、本発明の種々のベクターを誘導するために使用される。用語「プロモータ」は、また、原核生物及び／又は真核生物プロモータ並びにプロモータ要素を包含する。本明細書中で使用される用語「プロモータ」は、「細胞特異的」プロモータ、すなわち、特異的細胞（例えば、特異的組織の細胞）においてのみ選択されたＤＮＡ配列の発現に影響するプロモータを包含する。用語「プロモータ」は、また、主として一つの組織における選択されたＤＮＡの発現を制御するが、同様に他の組織における発現を引き起こす、所謂「リーキー」（ｌｅａｋｙ）プロモータをカバーする。用語「プロモータ」は、また、非組織特異的プロモータ及び構成的に発現する、又は誘導的である（すなわち、発現レベルが制御されることができる）プロモータを包含する。
【０１２３】
発現ベクターを発現する細胞は、ＴＲＰＡ１抑制タンパク質の発現を確認するために測定される。例えば、タンパク質発現は、ウェスタンブロット分析、免疫細胞化学又は免疫組織化学を用いて確認される。さらに又は或いは、ＴＲＰＡ１機能は、例えば、イオン流出を評価するためのカルシウムイメージング分析又は電流を評価するための電気生理学的方法（例えば、パッチクランプ分析）を用いて測定されることができる。
【０１２４】
（方法）
【０１２５】
本発明は、一般的に、疼痛又は疥癬を処置するための方法を提供する。
【０１２６】
ある局面において、本発明は、ＴＲＰＡ１機能に関連された状態を処置又は予防し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる方法を特色とし、有効量のＴｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを投与することを備える。
【０１２７】
本発明は、また、ＴＲＰＡ１機能に関連された疾患又は状態の症状を予防、処置又は緩和し、低減されたＴＲＰＡ１活性が重症度を低減させることができる方法を提供し、それを必要とする対象者に、Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを投与することを備える。
【０１２８】
本発明は、また、細胞におけるＴＲＰＡ１機能を阻害する方法を提供し、細胞に、有効量のＴｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを投与することを備え、それによって、細胞におけるＴＲＰＡ１機能を阻害する。
【０１２９】
ある実施形態において、ＴＲＰＡ１機能は、ＴＲＰＶ１と関連がある。好ましくは、Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、ＴＲＰＡ１とＴＲＰＶ１との関連性を向上させる。
【０１３０】
ＴＲＰＡ１機能は、内側ＴＲＰＡ１媒介電流、外側ＴＲＰＡ１媒介電流又はＴＲＰＡ１媒介イオン流出である。
【０１３１】
本明細書中で議論される場合、Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチドは、配列番号１又はそのフラグメント配列、或いは配列番号３又はそのフラグメントを備える。
【０１３２】
方法の他の例において、Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、細胞に供給され、細胞は、感覚神経である。感覚神経は、好ましくは、後根神経節（ＤＲＧ）にある。
【０１３３】
本明細書中に記載される方法の何れかは、疼痛の症状を予防、処置又は緩和するために、或いは、疥癬の症状を予防、処置又は緩和するために使用される。
【０１３４】
Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、以下により詳細に述べられるように、単独で又は一以上の薬物と組み合わせて投与される。Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントは、一以上のＴＲＰＶ１阻害剤、ＴＲＰＶ３阻害剤、ＴＲＰＶ４阻害剤又はＴＲＰＭ８阻害剤と組み合わせて投与される。
【０１３５】
ＴＲＰＶファミリーメンバーに加えて、他のＴＲＰチャネルは、疼痛受容及び／又は痛覚に関与してきた。例えば、ＴＲＰＭ８を含む特定のＴＲＰＡＭチャネルは、疼痛の受容及び／又は知覚に関与してきた。従って，特定例において、本発明の方法は、（ｉ）本明細書中に記載されるＴＲＰＡ１阻害剤及びＴＲＰＭ８阻害剤の組合せ、（ｉｉ）ＴＲＰＡ１阻害剤、ＴＲＰＭ８阻害剤、及び一以上の選択されたＴＲＰＶ１及び／又はＴＲＰＶ３阻害剤の組合せ、（ｉｉｉ）ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＭ８の機能を阻害する相互ＴＲＰ阻害剤、又は（ｉｖ）ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＭ８、並びに一以上のＴＲＰＶ１及びＴＲＰＶ３の機能を阻害するパン阻害剤（ｐａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を投与することによって、疼痛を処置することを含む。
【０１３６】
（疾患及び障害）
【０１３７】
本発明は、インビトロ又はインビボでのＴＲＰＡ１チャネルの機能を阻害するための方法及び組成物を提供する。例示的な機能として、ＴＲＰＡ１媒介電流が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明は、ＴＲＰＡ１媒介の神経細胞の過剰興奮性を阻害するための方法及び組成物を提供する。本発明は、ＴＲＰＡ１タンパク質のレベル及び／又は活性を調整する組成物を投与することによって、疾患又は障害或いは状態を予防又は処置するための方法を提供する。組成物は、ＴＲＰＡ１タンパク質の発現レベル及び／又は活性を選択的に阻害する。換言すれば、特定の実施形態において、組成物は、一以上の他のイオンチャネルの活性に比し、ＴＲＰＡ１タンパク質の活性を優先的に阻害する。
【０１３８】
本明細書中に提供される疾患及び障害を予防又は処置するための方法の特定例において、疾患又は障害は、例えば、疼痛又は触れられた時の感受性であり得る。例えば、疼痛は、疾患又は障害、例えば、癌性疼痛、皮膚疾患又は障害、神経変性疾患又は障害（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び加齢、炎症性疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、神経炎症疾患、多発性硬化症、及び免疫系の疾患）、癌（例えば、脂肪肉腫）又は他の増殖性疾患、腎臓病及び肝臓病、糖尿病等の代謝疾患に関連している。さらなる疾患及び状態として、術後疼痛、ヘルペス後神経痛、失禁及び帯状疱疹が挙げられる。
【０１３９】
本明細書中に提供される組成物及び方法は、上述の皮膚癌に加えて、リンパ網状起源（ｌｙｍｐｈｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｏｒｉｇｉｎ）の悪性腫瘍、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肺癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌及び直腸癌を含むが、これらに限定されない、悪性腫瘍の処置に関連して使用される。細胞内カルシウムレベルは、癌細胞における細胞増殖に重要な役割を果たす（非特許文献２３）。
【０１４０】
さらに、癌に又は癌の処置に関連した疼痛は、慢性疼痛の重大な原因である。骨の癌、例えば、骨肉腫は、例外的に苦痛であると考えられるため、進行性骨癌に罹患した患者は、き強力かつ持続的な疼痛を我慢するために、鎮痛剤を必要とする。従って、本発明のＴＲＰＡ１拮抗薬は、疼痛、例えば、癌に又は癌の処置に関連した疼痛の処置のために、有意に可能に治療的であることを示す。
【０１４１】
ＴＲＰＡ１が、形質転換された細胞中で差次的に発現されることを考えると、ＴＲＰＡ１ブロッカーは、また、形質転換された細胞の増殖に影響を与えるため、疾患を遅らせるための有用な方法である(非特許文献２４を参照のこと)。従って、ＴＲＰＡ１拮抗薬は、癌性疼痛の原因及び症状の両方を緩和することができる。
【０１４２】
癌の処置は、疼痛を伴うのみならず、それらは、健康な組織に対して毒性でさえあり得る。化学療法剤の中には疼痛を伴う神経障害を引き起こし得るものもある。従って、本発明のＴＲＰＡ１拮抗薬は、神経障害を引き起こす癌の処置に関連付けられた疼痛及び／又は炎症の処置のために、有意に可能に治療的であることを示す。
【０１４３】
本明細書中に提供される疾患及び障害を予防又は処置するための方法の他の特定例において、疾患又は障害は、疥癬であり得る。皮膚疾患の中には、疥癬（掻痒）を伴うものが多い。掻痒及び疼痛は、多くの機構的類似性（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ）を共有する。掻痒及び疼痛は、Ｃ線維の活性化に関連があり、掻痒及び疼痛は、温度及び炎症性メディエータにおける増加によって、強化され、鎮静剤を用いて抑制されることができる。幾つかの例において、神経細胞の興奮性、特に、Ｃ線維の興奮性の減少によって、透析法、皮膚炎、妊娠、ツタウルシ、アレルギー、乾皮症、化学療法及び湿疹に関連された掻痒が、緩和される。
【０１４４】
本明細書中に提供される組成物及び方法は、また、炎症性疾患の処置に関連して使用される。これらの疾患として、喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、骨関節炎、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、多発性硬化症等の神経炎症疾患、、及び免疫系の疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４５】
本明細書中に記載されるＴＲＰＡ１を阻害する組成物は、前述の又は以下の疾患又は状態の何れかに関連付けられる疼痛の処置を含めて、前述の又は以下の疾患又は状態の何れかの処置において使用されることができる。処置の方法において使用される場合、阻害剤は、意図された投与経路に基づいて、選択及び製剤化されることができる。阻害剤は、原因となる疾患又は状態を処置するために、又は疾患又は状態の症状を軽減するために、使用されることができる。例示的な症状としては、疾患又は状態に関連付けられた疼痛、例えば、疼痛及び接触に対する感受性、或いは疼痛関連の疾患又は障害が挙げられる。本明細書中に提供される組成物及び方法は、疼痛、或いは疼痛及び接触に対する感受性の予防又は処置に関連して使用される。疼痛、或いは疼痛及び接触に対する感受性は、糖尿病性神経障害、乳房痛、乾癬、湿疹、皮膚炎、火傷、ヘルペス後神経痛（帯状疱疹）、侵害受容性疼痛、末梢神経障害性及び中枢神経障害性疼痛、慢性疼痛、癌性及び腫瘍疼痛、脊髄損傷、挫傷及び外傷誘発痛、偏頭痛、脳血管及び脈管の痛み、鎌状赤血球症の痛み、関節リウマチの痛み、骨関節炎及び関節リウマチの兆候及び症状の処置を含む筋骨格痛、口腔、顎関節症を含む口腔顔面及び顔面痛、及び癌関連の、腰背部又は骨盤の痛み、外科的切開に関連した痛み、炎症性及び非炎症性疼痛、内臓痛、心因性疼痛及び、軟部組織の炎症性疼痛、線維筋痛関連の痛み及び反射性交感神経性ジストロフィー、並びに、腎結石又は尿路感染症から生じる痛み、が挙げられるが、これらに限定されるものではない、種々の疾患、障害又は状態において、指摘されている。
【０１４６】
本発明の組成物及び方法は、慢性及び急性疼痛の処置において使用される。幾つかの例において、慢性又は急性疼痛は、障害、加齢又は疾患の結果である。
【０１４７】
疼痛は、一般的に、慢性疼痛及び急性疼痛として分類されることができる。疼痛の二つのカテゴリーは、持続時間及び原因となる機構が異なる。慢性疼痛は、持続的であるのみならず、一般的に、現在利用できる鎮痛薬、非ステロイド抗炎症性薬、及びオピオイドを用いた処置に、よく反応しない。
【０１４８】
慢性疼痛の二つの広い下位カテゴリーは、神経障害性疼痛及び癌性疼痛である（非特許文献２５）。神経障害性疼痛は、ダメージ（例えば、疾患、障害、加齢）から神経系（例えば、神経、脊髄、中枢神経系，末梢神経系）に生じる疼痛を言う。幾つかの例において、癌関連の疼痛は、腫瘍浸潤、神経圧迫、腫瘍によって分泌される物質、又は特定の治療計画（例えば、放射線療法、化学療法、外科的処置）によって、引き起こされる。
【０１４９】
疼痛は、また、しばしば、侵害受容性、炎症性、又は神経障害性として、機構的に分類される。侵害受容性疼痛は、例えば、温度の変化又は急激な変化、酸への暴露、化学薬品への暴露、力への暴露、及び圧力への暴露を伴って経験される疼痛である。疼痛性刺激の受容によって、インパルスが、後根神経節に送信される。反応は、一般的に、反射反応（例えば、刺激からの退避）及び情動反応の組合せである。炎症は、障害又は疾患に対する免疫系の応答である。障害又は疾患に対応して、マクロファージ、マスト細胞、好中球、及び免疫系の他の細胞が、漸加される。サイトカイン及び他の因子（例えば、ヒスタミン、セロトニン、ブラジキニン、プロスタグランジン、ＡＴＰ、Ｈ＋、神経成長因子、ＴＮＦα、エンドセリン、インターロイキン）の放出と一緒に、この細胞の浸潤は、発熱、膨張及び疼痛を引き起こし得る。炎症の疼痛に対する現在の処置として、Ｃｏｘ２阻害剤及びオピオイドが挙げられる。神経障害性疼痛は、ダメージ（例えば、疾患、障害、加齢）から神経系（例えば、神経、脊髄、中枢神経系，末梢神経系）に生じる疼痛を言う。神経障害性疼痛に対する現在の処置として、三環系抗鬱薬、抗痙攣薬、Ｎａ＋チャネル遮断薬、ＮＭＤＡ受容体拮抗剤、及びオピオイドが挙げられる。疼痛を研究するための多数の動物モデルがある。種々のモデルは、障害、疾患又は他の状態から生じる疼痛をシミュレートするために、種々の薬物又は手順を使用する（非特許文献２６（例えば、表１を参照のこと)）。検証された動物の行動特性が、次に、観察されることができる。動物において疼痛を低減する化合物又は手順は、試験用化合物又は手順の存在下及び非存在下において、検証された動物の行動特性を観察することによって、容易に試験されることができる。
【０１５０】
慢性疼痛を研究するために使用される例示的な行動試験として、自発性疼痛、異痛及び痛覚過敏の試験が挙げられる。自発性疼痛を評価するために、姿勢、歩行、防衛兆候（例えば、足舐め（ｐａｗ  ｌｉｃｋｉｎｇ）、過剰な毛繕い、過剰な探査行動、障害を受けた身体部分の防御、及び自傷）が、観察されることができる。誘発された疼痛を測定するために、行動反応は、熱への暴露（例えば、熱傷モデル）を伴って、調査されることができる。
【０１５１】
疼痛の実験動物モデルとして、Ｃｈｕｎｇモデル、カラゲナン誘導型痛覚過敏モデル、完全フロイントアジュバント誘導型痛覚過敏モデル、熱傷モデル、ホルマリンモデル、及びベネットモデルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。（炎症のない）神経障害性疼痛のＣｈｕｎｇモデルは、一以上の脊髄神経を結紮することを含む（非特許文献１０）。脊髄神経の結紮によって、侵害性熱刺激、冷感異痛及び進行中の疼痛を含めて、動物における種々の行動変化が生じる。ＴＲＰＡ１に拮抗する化合物は、結紮された動物に投与され、それらの化合物が、これらの結紮を消失させ、化合物の非存在下で観察される動物に比し、行動変化を誘導するかどうかを、評価することができる。
【０１５２】
カラゲナン誘導型痛覚過敏及び完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘導型痛覚過敏は、炎症性疼痛のモデルである（非特許文献２７、２８及び２９）。ＴＲＰＡ１を阻害する組成物は、カラゲナン又はＣＦＡ投与の動物に投与され、それらの化合物が、化合物の非存在下で観察される動物に比し、侵害性熱刺激を消失させるかどうかを、評価することができる。さらに、冷感及び／又は機械的過敏性を消失させるために、ＴＲＰＡ１機能に拮抗する化合物の能力は、また、これらのモデルにおいて、評価されることができる。一般的に、カラゲナン誘導型痛覚過敏モデルは、急性炎症性疼痛を模倣すると考えられ、ＣＦＡモデルは、慢性疼痛及び慢性炎症性疼痛を模倣すると考えられる。
【０１５３】
ベネットモデルは、慢性疼痛をミラーリングするために、足の遷延性局所貧血を使用する（非特許文献３０）。これによって、術後疼痛、複合性局所疼痛症候群及び反射性交感神経性ジストロフィーを含む、慢性疼痛のための動物モデルが提供される。遷延性局所貧血は、機械的刺激に対する痛覚過敏、冷感に対する感受性、疼痛行動（例えば、足の振動動作、舐める動作、及び／又は好意）、並びに痛覚過敏を含む、動物における行動変化を誘導する。ＴＲＰＡ１に拮抗する組成物は、検証される動物に投与され、それらの組成物が、化合物の非存在下で観察される動物に比し、これらの行動の何れか又は全てを消失させるかどうかを、評価することができる。同様の実験は、術後疼痛を模倣するために使用され得る熱傷又はＵＶ火傷モデルにおいて行われることができる。
【０１５４】
神経障害性疼痛のさらなるモデルとして、脊髄損傷に基づいた中枢疼痛モデルが挙げられる。慢性疼痛は、例えば、脊髄の外科的に露出される領域上に重錘を落とすことによって（例えば、重錘落下モデル）、脊髄損傷を誘発することにより、発生される。脊髄損傷は、さらに、脊髄を押し潰す又は圧縮することによって、神経毒を送達することによって、光化学を用いることによって、或いは、脊髄を半切除することによって、誘発される（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  （２００３））。
【０１５５】
神経障害性疼痛のさらなるモデルとして、末梢神経障害モデルが挙げられる。用語「末梢神経障害」は、種々の疾患、状態及び障害を包含する。当業者は、調査対象の特定の状態又は疾患を考慮して、適切なモデルを容易に選択することができる。例示的なモデルとして、神経腫モデル、ベネットモデル、Ｓｅｌｔｚｅｒモデル、Ｃｈｕｎｇモデル（Ｌ５又はＬ５/Ｌ６で結紮）、坐骨神経低温剥離（ｓｃｉａｔｉｃ  ｃｒｙｏｎｅｕｒｏｌｙｓｉｓ）モデル、下位尾側トランク（ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ｃａｕｄａｌ  ｔｒｕｎｋ）切除モデル、及び坐骨炎症性神経炎モデルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。炎症性疼痛の例示的モデルは、ラットの足底内ブラジキニン注射モデルが挙げられる。手短に言えば、動物のベースライン温度感受性は、Ｈａｒｇｒｅａｖｅ装置上で評価される。次に、ＴＲＰＡ１遮断薬が、全身的に投与される。それに続いて、ブラジキニンが、足内に注入され、痛覚過敏が形成されるようになる。次に、熱逃避潜時が、次の数時間に亘って複数の時点で測定される（非特許文献３１）。
【０１５６】
特定の疾患に関連付けられる神経障害性疼痛の例示的なモデルは、また、利用可能である。糖尿病及び帯状疱疹は、神経障害性疼痛によってしばしば伴われる二つの疾患である。急性帯状疱疹の事例に従っても、患者の中には、ヘルペス後神経痛に苦しみ続けるとともに、長年に亘って持続痛を経験する者もいる。帯状疱疹及び／又はヘルペス後神経痛によって引き起こされる神経障害性疼痛は、ヘルペス後神経痛モデル（ＰＨＮ）において研究されることができる。糖尿病性神経障害は、糖尿病マウスモデル、並びに糖尿病性神経障害の化学的誘発モデルにおいて、研究されることができる（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  （２００３））。
【０１５７】
癌性疼痛は、多数の原因の何れかを有し、例えば、化学療法剤又は腫瘍浸潤に関連された癌性疼痛を調査するために、非常に多くの動物モデルが存在する。毒素関連の癌性疼痛の例示的なモデルとして、ビンクリスチン誘発性の末梢神経障害モデル、タキソール誘発性の末梢神経障害モデル及びシスプラチン誘発性の末梢神経障害モデルが挙げられる（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  （２００３））。腫瘍浸潤によって引き起こされる癌性疼痛の例示的なモデルとして、癌浸潤疼痛モデル（ＣＩＰ）が挙げられる。
【０１５８】
原発性及び転移性の骨癌は、酷い疼痛に関連付けられる。マウス大腿骨の癌性疼痛モデル（ＦＢＣ）、マウス踵骨の癌性疼痛モデル（ＣＢＣ）及びラット脛骨の癌性疼痛モデル（ＴＢＣ）を含む、幾つかの骨癌性疼痛モデルが存在する。
【０１５９】
前述の慢性疼痛モデルの何れかに加えて、ＴＲＰＡ１を阻害する組成物は、一以上の急性疼痛モデルにおいて試験されることができる（非特許文献３２）。化合物が、慢性疼痛、急性疼痛、又は両方の疼痛のモデルにおいて試験されるかどうかに拘らず、これらの研究は、一般的に（排他的ではないが）、例えば、マウス、ラット又はモルモットにおいて、行われる。さらに、化合物は、疼痛のインビトロアッセイを提供する種々の細胞株において、試験されることができる（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  （２００３））。
【０１６０】
疼痛に対する処置を探している多くの個人は、内臓痛に苦しむ。内臓痛の動物モデルとして、炎症性子宮痛（非特許文献３３）、過敏性腸症候群を模倣するための消化管内へのカラシ油の注入（非特許文献３４）、過活動膀胱又は膀胱炎を模倣するための膀胱内へのカラシ油の注入（非特許文献３５）のラットモデルが挙げられる。ＴＲＰＡ１化合物の有効性は、ライジング、胃腸炎又は膀胱興奮性における減少によって、評価されることができる。
【０１６１】
前述の動物モデルは、疼痛の研究において信頼されている。以下に、疼痛の研究におけるこれらのモデルの使用を記載するさらなる例示的な引用文献を示す：熱傷モデル（非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８）、ホルマリンモデル（非特許文献３９)、カラギナンモデル（非特許文献４０）及びＣＦＡモデル（非特許文献４１）。
【０１６２】
（投与）
【０１６３】
製剤処方（組成物）として、本発明のＴＲＰＡ１阻害剤を投与することが好ましい。本発明に係る組成物は、ヒト又は獣医学において使用するための任意の便利な態様で、投与するために調製される。選択された投与経路に拘らず、適切な水和物の形で使用される、本発明の組成物、及び／又は本発明の医薬品は、以下に記載されるような薬理学的に許容される用量で、又は当業者に公知の他の従来法によって、調製される。
【０１６４】
従って、本発明の他の曲面は、本明細書中に記載される治療的有効量の一以上の薬物を備え、一以上の薬理学的に許容される担体（添加剤）及び／又は希釈剤と一緒に調製される、医薬組成物を提供する。以下に詳細に述べられるように、幾つかの例において、本発明の医薬組成物は、以下の投与のために適用される投与を含めて、固形又は液状で投与するために、特に調製される：（１）経口投与、例えば、飲薬（水溶液又は非水溶液或いは懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト、（２）例えば、滅菌液又は懸濁液として、例えば、皮下注射、筋肉内注射又は静脈注射による、非経口投与、（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏又はスプレーとして、局所適用、（４）例えば、ペッサリ、クリーム又はフォームとして、膣内に又は直腸内に、或いは、（５）吸入用に。しかしながら、特定の例において、対象薬物は、滅菌水中で容易に溶解又は懸濁される。特定の例において、医薬品は、非発熱性である、すなわち、患者の体温を上昇させない。
【０１６５】
本明細書中で使用される用語「治療的有効量」は、動物内の細胞の少なくとも亜母集団においてＴＲＰＡ１機能を阻害することによって、ある所望の治療効果を生じるために有効で、それによって、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利点／危険比で、処置された細胞における機能の生物学的結果を遮断する本発明の化合物、材料、又は化合物を含む組成物の量を意味する。
【０１６６】
本明細書中で使用される用語「全身性投与」、「全身性に投与される」、「抹消投与」及び「抹消投与される」は、中枢神経系に直接以外の化合物、薬物又は他の材料の投与を意味し、それが、患者の系に入り、代謝及び他の同様のプロセス、例えば、皮下投与を受ける。
【０１６７】
用語「薬理学的に受容される」は、合理的な利点／危険比に比例して、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、或いは他の問題又は合併症を有することなく、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した、それらの化合物、材料、組成物、及び／又は用量をいうために、本明細書中で使用される。
【０１６８】
本明細書中で使用される用語「薬理学的に受容される担体」は、一つの器官、又は身体の部分から、他の器官、又は身体の部分へ、対象の拮抗剤を運搬又は輸送することに関連する、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料等の、薬理学的に受容される材料、組成物又は媒体を意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合可能であるという意味で、「受容可能」でなければならず、患者に対して有害であってはならない。薬理学的に受容される担体として作用することができる材料の幾つかの例として、（1）ラクトース、グルコース及びスクロース等の糖類;、（２）コーンスターチ及びジャガイモデンプン等のデンプン、（３）セルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース等のその誘導体、（４）トラガント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（7）タルク、（８）ココアバター及び坐薬ワックス等の賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油等の油、（１０）プロピレングリコール等のグリコール、（１０）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール等のポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝溶液、及び（２１）医薬製剤において使用される他の非毒性適合性の物質、が挙げられる。
【０１６９】
湿潤剤、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム等の、乳化剤及び滑沢剤、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び香料、保存剤及び抗酸化剤は、また、組成物中に存在することができる。 
【０１７０】
本発明の製剤は、経口、鼻腔、局所（頬側及び舌下を含む）直腸、膣及び／又は非経口投与に適したものを含む。製剤は、好都合には単位剤形で提示され、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製されることができる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、処置される宿主、特定の投与モードに依存して変化するだろう。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、一般的に、治療効果を生じる化合物の量であろう。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、活性成分の約１パーセントから約９９パーセントまで、好ましくは、約５パーセントから約７０パーセントまで、最も好ましくは、約１０パーセントから約３０パーセントまでの範囲であろう。
【０１７１】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、（風味の基準、通常は、スクロース及びアカシア又はトラガントを使用する）ロゼンジ、粉末、顆粒の形態であり、或いは、水性又は非水性液中の溶液又は懸濁液として、又は水中油型又は油中水型液体エマルジョンとして、もしくはエリキシル剤又はシロップとして、又は、（ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア等の不活性基剤を使用する）芳香錠、及び／又は洗口剤等であり、それぞれは、活性成分として本発明の化合物の所定量を含む。さらなる例において、本発明の組成物は、また、巨丸剤、舐剤復はペーストとして投与される。
【０１７２】
経口投与（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒等）のための本発明の固体剤形において、活性成分は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム等の、、１以上の薬理学的に許容される担体、及び／又は以下の何れかと混合される；（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸等の充填剤又は増量剤、（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシア等の結合剤、（３）グリセロール等の湿潤剤、（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤、（５）パラフィン等の溶解遅延剤、（６）第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤、（７）例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール等の湿潤剤、（８）カオリン及びベントナイト粘土等の吸収剤; （9）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物等の潤滑剤、並びに（１０）着色剤。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、医薬組成物は、また、幾つかの例において、緩衝剤を含む。同様のタイプの固体組成物は、また、ラクトース又は乳糖、並びに高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を用いて、軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として、使用されることができる。
【０１７３】
本発明の薬剤を含む錠剤は、必要に応じて１以上の副成分とともに、圧縮又は成形によって作製されることができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性又は分散剤を用いて調製される。成形錠剤は、適切な機械で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することによって作製される。
【０１７４】
錠剤、並びに糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒剤等の本発明の医薬組成物の他の固体剤形は、必要に応じて、医薬品製剤分野において周知の腸溶コーティング及び他のコーティング等の、コーティング及びシェルを用いて、スコア化又は調製される。それらは、また、例えば、所望の放出特性、他のポリマーマトリクス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを提供するために、種々の割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、その中の活性成分の徐放又は制御放出を提供するように、処方される。これらは、例えば、細菌保持フィルタを介した濾過によって、或いは、使用直前に滅菌水に溶解されることができる滅菌固体組成物又は幾つかの他の滅菌注射用媒体の形態で、滅菌剤を組み込むことによって、滅菌される。これらの組成物は、また、必要に応じて、不透明化剤を含有し、必要に応じて、遅延様式で、胃腸管の特定の部分においてのみ、又は優先的に、活性成分を放出する組成物である。使用されることができる包埋組成物の例として、重合物質及びワックスが挙げられる。活性成分は、また、適切な場合、１種以上の上記賦形剤とともに、マイクロカプセルの形態であり得る。
【０１７５】
本発明の化合物の経口投与のための液体剤形は、薬理学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、液体剤形は、当分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３‐ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含む。
【０１７６】
不活性希釈剤以外に、経口組成物は、また、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤及び保存剤等のアジュバントを含むことができる。 
【０１７７】
代替的に又は付加的に、組成物は、カテーテル、ステント、ワイヤ、又は他の腔内装置を介して送達するために、製剤化されることができる。そのような装置を介した送達は、例えば、膀胱、尿道、尿管、直腸、小腸に対する送達、又は髄腔内送達のために、特に有用である。
【０１７８】
膣内投与に適した本発明の製剤は、また、適切であることが当技術分野で知られているような担体を含有するペッサリ、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤を含む。
【０１７９】
本発明の化合物の局所又は経皮投与のための剤形として、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が挙げられる。活性化合物は、薬理学的に許容される担体と、及び必要とされる任意の保存剤、緩衝剤又は推進剤と、無菌条件下で混合される。
【０１８０】
軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はそれらの混合物等の賦形剤を含有する。
【０１８１】
粉末及びスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物等の賦形剤を含有することができる。スプレーは、さらに、ブタン及びプロパン等のクロロフルオロ炭化水素及び揮発性の非置換炭化水素等の通常の推進剤を含有することができる。
【０１８２】
経皮パッチは、本発明の化合物の身体への制御された送達を提供するというさらなる利点を有する。そのような剤形は、適切な媒体中に化合物を溶解又は分散させることによって、製造されることができる。吸収促進剤は、また、皮膚を横切る化合物の流れを増大させるために使用されることができる。そのような流れの速度は、速度制御膜を提供するか、ポリマーマトリクス又はゲル中に化合物を分散させるかの何れかによって、制御されることができる。
【０１８３】
眼科用製剤、眼軟膏剤、粉末、溶液等は、また、本発明の範囲内であると考えられる。      
【０１８４】
本明細書中で使用される用語「非経口投与」及び「非経口で投与される」は、通常、注射による、腸内及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨下の注射及び注入を含むが、これらに限定されない。
【０１８５】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬理学的に許容される滅菌等張水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液又は乳濁液、或いは投与直前に無菌注射溶液又は分散液に再構成される滅菌粉末と組み合わせて、本発明の一つ以上の化合物を含み、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、製剤を意図された受容者の血液と等張にする溶質、もしくは懸濁剤又は増粘剤を含有する。
【０１８６】
本発明の医薬組成物において使用される適切な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用有機エステル類が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材料の使用によって、分散液の場合、必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持されることができる。
【０１８７】
これらの組成物は、また、幾つかの例において、防腐剤、湿潤剤、乳化剤又は分散剤等のアジュバントを含む。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含めることによって確保される。幾つかの例において、組成物中に、糖、塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが望ましい。さらに、注射可能な医薬品形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらされる。
【０１８８】
幾つかの場合において、薬物の効果を延長するために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶質又は非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成される。薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、順に、結晶サイズ及び結晶形態に依存する。或いは、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクル中に溶解又は懸濁することによって、達成される。
【０１８９】
注射用デポー製剤は、ポリラクチド‐ポリグリコリド等の生分解性ポリマ中に対象化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって、作製される。ポリマに対する薬物の比率及び使用される特定のポリマの性質に応じて、薬物放出の速度は、制御されることができる。他の生分解性ポリマの例として、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、また、身体組織に適合するリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによって調製される。
【０１９０】
本発明の組成物が、ヒト及び動物に対して、薬剤として投与される場合、それらは、薬理学的に許容される担体と組み合わせた活性成分の、例えば、０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）を含むそれ自体又は医薬組成物として、与えられることができる。
【０１９１】
動物飼料への本発明の活性化合物の添加は、好ましくは、有効量の活性化合物を含有する適切な飼料プレミックスを調製し、完全な飼料にプレミックスを組み込むことによって、達成される。
【０１９２】
或いは、活性成分を含む中間濃縮物又は飼料サプリメントは、飼料中に混合されることができる。このような飼料プレミックス及び完成飼料をが調製され、投与される方法は、参考図書（例えば、非特許文献４２又は４３）に記載されている。
【０１９３】
導入の方法は、また、充電式又は生分解性デバイスによって提供される。種々の徐放性ポリマデバイスが、タンパク質性の生物製剤を含む、薬物の制御された送達のために、近年において開発され、インビボで試験されている。生分解性及び非分解性の両方のポリマを含む、（ヒドロゲルを含む）種々の生体適合性ポリマは、特定の標的部位における化合物の持続放出のためのインプラントを形成するために、使用すされることができる。
【０１９４】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を有することなく、特定の患者、組成物、及び投与方法に対する所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を獲得するために、変化される。
【０１９５】
選択される用量レベルは、使用される本発明の特定の化合物の活性、或いはそのエステル、塩又はアミド、投与経路、投与時間、使用される特定化合物の排泄の速度、処置の持続時間、他の薬物、使用される特定化合物と組み合わせて使用される化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態及び既往歴、並びに医学分野で周知の同様の因子を含む、種々の要因に依存するだろう。当該技術分野における通常の技術を有する医師又は獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を、容易に決定及び処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために、必要とされるレベルよりも低いレベルで、医薬組成物に用いられる本発明の化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。最終的に、担当医師又は獣医師は、適切な量及び投与計画を決定するだろう。
【０１９６】
一般的に、本発明の化合物の適切な一日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である化合物の量であろう。このような有効用量は、一般的に、上述の要因に依存する。一般に、患者に対する本発明の化合物の静脈内、脳室内、心室内及び皮下投与量は、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０００１から約１００ｍｇの範囲であろう。
【０１９７】
所望の場合、活性組成物の有効な一日用量は、必要に応じて、単位剤形で、一日を通して適切な間隔で別々に投与された、２回、３回、４回、５回、６回以上のサブ用量として投与される。
【０１９８】
この治療を受ける患者は、霊長類、特にヒト、及びウマ、ウシ、ブタやヒツジ等の他の哺乳動物、そして一般的な家禽及びペットを含む、必要とする任意の動物である。
【０１９９】
本発明の化合物は、そのまま、或いは薬理学的に許容される及び／又は無菌の担体との混合物で、投与されることができ、また、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド及びグリコペプチド等の他の抗菌剤と組み合わせて、投与されることができる。
【０２００】
このように、結合治療は、その後の治療が投与された場合、最初に投与された治療の治療効果が依然として検出可能であるように、活性化合物の連続的な、同時かつ別々の投与を含む。
【０２０１】
本発明は、上記の医薬組成物及び製剤の何れかにおける対象化合物の製剤を考慮する。また、本発明は、前述の投与経路の何れかを介する投与を考慮する。
【０２０２】
当業者は、処置される状態並びに処置される患者の全体的な健康状態、年齢及びサイズに基づいて、適切な製剤及び投与経路を選択することができる。 
【０２０３】
（併用療法）
【０２０４】
本発明の他の曲面は、一以上の他の治療剤が、本明細書中に記載されるＴＲＰＡ１阻害剤と共に投与される併用療法を提供する。このような併用処置は、処置の個々の成分の同時の、連続的な又は別個の投与によって達成される。特定の例において、本発明の組成物は、鎮痛剤と一緒に投与される。適切な鎮痛剤としては、オピオイド、グルココルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、ナフチルアルカノン、オキシカム、パラ‐アミノフェノール誘導体、プロピオン酸、プロピオン酸誘導体、サリチル酸塩、フェナメート、フェナメート誘導体、、ピロゾール（ｐｙｒｏｚｏｌｅｓ）、及びピロゾール誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。そのような鎮痛性化合物の例としては、コデイン、ヒドロコドン、ヒドロモルフォン、レボルファノール（ｌｅｖｏｒｐｈａｍｏｌ）、モルヒネ、オキシコドン、オキシモルホン、ブトルファノール、デゾシン、ナルブフィン、ペンタゾシン、エトドラク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ナブメトン、ピロキシカム、アセトアミノフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、オキサプロジン、アスピリン、ジフルニサル、メクロフェナム酸、メフェナム酸、プレドニゾロン、及びデキサメタゾンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい鎮痛薬は、非ステロイド性抗炎症剤及びオピオイド（好ましくは、モルヒネ）である。
【０２０５】
特定の例において、本発明の組成物は、非ステロイド性抗炎症性化合物と組み合わせて投与される。適切な非ステロイド系抗炎症化合物としては、ピロキシカム、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、ケトロラック、オキサプロジン、トルメチン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、イブプロフェン、メフェナム酸、スリンダク、アパゾン、フェニルブタゾン、アスピリン、セレコキシブ、及びロフェコキシブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
特定の例において、本発明の組成物は、抗ウイルス剤と組み合わせて投与される。適切な抗ウイルス剤としては、アマンタジン、アシクロビル、シドフォビル、デスシクロビル、デオキシアシクロビル、ファムシクロビル、ホスカルネット、ガンシクロビル、ペンシクロビル、アジドウリジン、アナスマイシン、アマンタジン、ブロモビニルデオクシジン（ｂｒｏｍｏｖｉｎｙｌｄｅｏｘｕｓｉｄｉｎｅ）、クロロビニルデオクシジン（ｃｈｌｏｒｏｖｉｎｙｌｄｅｏｘｕｓｉｄｉｎｅ）、シタルビン（ｃｙｔａｒｂｉｎｅ）、ジダノシン、デオキシノジリマイシン、ジデオキシシチジン（ｄｉｄｅｏｘｙｃｉｔｉｄｉｎｅ）、ジデオキシイノシン、ジデオキシヌクレオシド、エドクスジン（ｅｄｏｘｕｉｄｉｎｅ）、エンビロキシム、フィアシタビン（ｆｉａｃｉｔａｂｉｎｅ）、ホスカルネット、フィアルウリジン、フルオロチミジン、フロクスウリジン、ヒペリシン、インターフェロン、インターロイキン、イセチオン酸塩、ネビラピン、ペンタミジン、リバビリン、リマンタジン、スタビルジン（ｓｔａｖｉｒｄｉｎｅ）、サルグラモスチン(ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｎ)、スラミン、トリコサンチン、トリブロモチミジン、トリクロロチミジン、ビダラビン、ジドビリジン（ｚｉｄｏｖｉｒｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン、３‐アジド‐３‐デオキシチミジン、２’，３‐ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、２’，３’‐ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）、２’，３’‐ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、２’，３’‐ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）、２’，３’‐ジデオキシ‐ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、Ｔ‐デオキシ‐３’‐チア‐シトシン（３ＴＧ又はラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｍｅ））、2ｔ，３’‐ジデオキシ‐２’‐フルオロアデノシン、２’，３’‐ジデオキシ‐２’‐フルオロイノシン、２’，３’‐ジデオキシ‐２’‐フルオロチミジン、２’，３’‐ジデオキシ‐２’‐フルオロシトシン、２Ｉ３’‐ジデオキシ‐２Ｉ，３Ｉ‐ジデヒドロ‐２’‐フルオロチミジン（Ｆｄ４Ｔ）、２’，３’‐ジデオキシ‐２’‐ベータ‐フルオロアデノシン（Ｆ‐ｄｄＡ）、２’，３’‐ジデオキシ‐２’‐ベータ‐フルオロイノシン（Ｆ‐ｄｄｌ）、及び２’５３’‐ジデオキシ‐２’‐ベータ‐フルオロシトシン（Ｆ‐ｄｄＣ）、ホスホモノギ酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｍｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ）、トリフルオロチミジン、３’アジド‐３’チミジン（ＡＺＴ）、ジデオキシイノシン（ｄｄｌ）、及びイドキシウリジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
特定の例において、本発明の組成物は、抗菌剤と共に投与される。適切な抗菌剤はとして、塩酸アマンファジン（ａｍａｎｆａｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、硫酸アマンファジン（ａｍａｎｆａｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アミカシン、硫酸アミカシン、アモグリコシド（ａｍｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）、アモキシシリン、アンピシリン、amsamycins、バシトラシン、β-ラクタム、カンジシジン、カプレオマイシン、カルベニシリン、セファレキシン、セファロリジン、セファロチン、セファゾリン、セファピリン、セフラジン、セファログリシン、キロムフェニコルス（ｃｈｉｌｏｍｐｈｅｎｉｃｏｌｓ）、クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン（ｃｈｌｏｓｈｅｘｉｄｉｎｅ  ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、塩酸クロルヘキシジン、クロロキシン、クロルキラルドール（ｃｈｌｏｒｑｕｉｒａｌｄｏｌ）、塩酸クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、サーキュリン、クリンダマイシン、クリンダマイシン塩酸塩、クロトリマゾール、クロキサシリン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジヨードヒドロキシキン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エタンブトール塩酸塩、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシンステアリン酸塩、ファルネソール、フロキサシリン、ゲンタマイシン、硫酸ゲンタマイシン、グラミシジン、グリセオフルビン（ｇｉｓｅｏｆｕｌｖｉｎ）、ハロプロジン、ハロキノール、ヘキサクロロフェン、イミノサイクリン、ヨードクロルヒドロキシキン、カナマイシン、カナマイシン硫酸塩、リンコマイシン、リネオマイシン、リネオマイシン塩酸塩、マクロライド、メクロサイクリン、メタサイクリン、メタサイクリン塩酸塩、メテナミン、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、メチシリン、メトロニダゾール、ミコナゾール、ミコナゾール塩酸塩、ミノサイクリン、ミノサイクリン塩酸塩、ムピロシン、ナフシリン、ネオマイシン、ネオマイシン硫酸塩、ネチルマイシン、ネチルマイシン硫酸塩、ニトロフラゾン、ノルフロキサシン、ナイスタチン、オクトピロックス、オレアンドマイシン、オルセファロスポリン、オキサシリン、オキシテアクリン、オキシテトラサイクリン塩酸塩、パラクロロメタキシレノール、パロモマイシン、パロモマイシン硫酸塩、ペニシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ペンタミジン、ペンタミジン塩酸塩、フェネチシリン、ポリミキシン、キノロン、ストレプトマイシン硫酸塩、テトラサイクリン、トブラマイシン、トルナフタート、トリクロサン、トリファンピン、リファマイシン、ロリテトラサイクリン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、 - テトラサイクリン、トブラマイシン、トブラマイシン硫酸塩、トリクロカルバン、トリクロサン、トリメトプリム・スルファメトキサゾール、タイロシン、バンコマイシン、及びタイロスリシンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の例において、本発明の化合物は、鎮咳剤、充血除去剤又は去痰剤と一緒に投与される。
【０２０８】
例えば、ＴＲＰＡｌ阻害剤が、疼痛及び/又はレチノイドの炎症効果を低減するために使用することができる、対象ＴＲＰＡｌ阻害剤と一緒に投与されるレチノイドの例として、、例えば、レチノイン酸のような化合物（シス及びトランスの両方）、レチノール、アダパレン、ビタミンＡ及びタザロテンが挙げられるが、これらに限定されない。レチノイドは、にきび、乾癬、酒さ、しわ、並びに皮膚癌、及び黒色腫及び日光角化症等の癌の前駆体を処置するのに有用である。
【０２０９】
同様に、対象ＴＲＰＡ１阻害剤は、過酸化ベンゾイル、アルファヒドロキシ酸、フルーツ酸、グリコール酸、サリチル酸、アゼライン酸、トリクロロ酢酸、乳酸及びピロクトンを含む、角質溶解剤と組み合わせて使用されることができる。 
【０２１０】
対象ＴＲＰＡ１阻害剤は、抗ざ瘡剤、抗湿疹剤及び抗乾癬剤と共に使用されることができる。対象ＴＲＰＡ１阻害剤は、また、皮膚保護剤、例えば、アラントイン及びエスクリンと共に使用されることができる。
【０２１１】
特定の例において、本発明の二つ以上の組成物は、組み合わせて投与される。本発明の二つ以上の組成物は、共同で投与される場合、二つ以上の組成物は、同様の選択性プロフィール及び機能活性を有するか、二つ以上の化合物は、異なる選択性プロフィール及び機能活性を有する。一例として、二つ以上の組成物は、両方とも、ＴＲＰＶｌ、ＴＲＰＶ５及びＴＲＰＶ６に対するＴＲＰＡ１の機能に拮抗するための約１０、１００又は１０００倍の選択性であり（例えば、二つ以上の化合物が、同様の選択性プロフィールを有する）、さらに、同様のＴＣ５０（例えば、同様の機能活性）でＴＲＰＡ１の機能を阻害する。或いは、二つ以上の組成物の一方は、ＴＲＰＡ１を選択的に阻害するのに対して、二つ以上の組成物の他方は、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶｌの両方を阻害する（例えば、二つ以上の化合物は、異なる選択性プロファイルを有する）。類似の又は異なる特性を有する本発明の二種以上の化合物の組み合わせの投与が、企図される。特定の例において、本発明の組成物は、異なるチャネルの機能に拮抗する一以上の付加的な化合物と共に投与される。一例として、本発明の組成物は、共同ＴＲＰＶｌ、ＴＲＰＭ８及び／又はＴＲＰＶ３に拮抗する一種以上の化合物と共に投与される。ＴＲＰＶｌ、ＴＰＲＭ８又はＴＲＰＶ３に拮抗する化合物は、ＴＲＰＶｌ、ＴＲＰＭ８又はＴＲＰＶ３のために選択的である（例えば、ＴＲＰＡ１より１０、１００又は１０００倍より強く、ＴＲＰＶｌ又はＴＲＰＶ３を阻害する）。或いは、ＴＲＰＶｌ又はＴＲＰＶ３に拮抗する化合物は、他のＴＲＰチャネルと交差反応する。
【０２１２】
特定の他の例において、本発明の組成物は、処置される特定の損傷、疾患、状態又は障害のために適切な一以上の付加的な薬剤又は治療計画と共に投与される。
【０２１３】
（キット）
【０２１４】
本発明は、また、Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド、例えば、配列番号１又はそのフラグメント、配列番号３又はそのフラグメントを含むＴｍｅｍ１００変異ポリペプチドを含むキットを特徴とする。
【０２１５】
キットは、また、細胞、例えば、感覚神経に、Ｔｍｅｍ１００変異ポリペプチド又はそのフラグメントを提供するための指示を含む。 
【０２１６】
キットは、疼痛の症状を予防、処置又は軽減し、疥癬の症状を予防、処置又は軽減するのに使用するための指示を含む。 
【０２１７】
（実施例）
【０２１８】
Ｐｉｒｔの発見は、一過性受容器電位（ＴＲＰ）チャネルマルチサブユニット複合体の制御のためのモデルを提供する。これは、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの９０％以上に発現され、ＴＲＰＶｌ（Ｋｉｍら、２００８）及びＴＲＰＭ８（Ｔａｎｇら。、２０１３）の正の調節因子として同定されてきた。最初に、Ｐｉｒｔは、侵害受容ニューロンにおいて特異的に発現される遺伝子を発見するために、新生児の野生型及びＮｇｎ１−/−マウス後根神経節（ＤＲＧ）を用いたｃＤＮＡサブトラクティブスクリーン（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｓｃｒｅｅｎ）によって同定された（Ｄｏｎｇら、２００１）。Ｐｉｒｔタンパク質は、ＴＲＰＶｌ及びＴＲＰＭ８と、独立して複合体を形成し、それらのアゴニストに対するこれらのチャネルの応答を増強する。行動レベルでは、これらのＴＲＰチャネルと関連する疼痛も低減される。Ｐｉｒｔ−/−マウスは、例えば、熱、寒さ、そしてカプサイシン及びイシリンのような化学薬品等の侵害刺激に対する弱毒化された応答を実証した。Ｐｉｒｔ−/−マウスは、また、幅広い起痒物質（ｐｒｕｒｉｔｏｇｅｎ）によって誘発された疥癬反応の大幅な不足を明らかにした（Ｐａｔｅｌら、２０１１）。それにもかかわらず、Ｐｉｒｔは、ＴＲＰＡ１の活性を制御することが可能であることを示す証拠が欠如している（Ｋｉｍら、２００８）。ここで、研究によって、ＴＲＰを調節し、様々なＴＲＰチャネル複合体におけるそれらの機能を変更する他のＰｉｒｔ様タンパク質及びペプチドについて説明する。
【０２１９】
Ｐｉｒｔのタンパク質配列を使用して、別の遺伝子、その類似の構造及び生化学的特性が与えられたＴｍｅｍ１００の作業名で、Ｔｍｅｍ１００が同定された。Ｐｉｒｔと同様に、Ｔｍｅｍ１００は、Ｎ末端及びＣ末端の両方が細胞内でかつ脊椎動物において高度に保存されたアミノ酸配列を有する１３４アミノ酸の二回膜貫通タンパク質である（Ｍｏｏｎら、２０１０）。したがって、ＰｉｒｔとＰｉｒｔ２の両方（すなわち、ＴＭＥＭ１００）は、同様のタンパク質サイズ、膜トポロジー（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ）及び機能を有し、すなわち、ＤＧＲニューロンにおけるＴＲＰチャネルを制御する。
【０２２０】
Ｐｉｒｔの限定された発現パターンとは異なり、Ｔｍｅｍ１００は、ＤＲＧ以外の他の臓器において広く発現される。これは、背部大動脈で早くも胎生９．５日（Ｅ９．５）、及び他の血管、神経管腹側及び脊索で、Ｅ１０．５からＥ１２．５に発現される（Ｍｏｏｎら、２０１０）。これは、腎臓の発生（Ｇｅｏｒｇａｓら、２００９）、脈管形成（Ｍｏｏｎら、２０１０、Ｓｏｍｅｋａｗａら、２０１２）、肺癌細胞浸潤性（Ｆｒｕｌｌａｎｔｉら、２０１２）、アフリカ系アメリカ人における身長（Ｃａｒｔｙら、２０１２）、及びアポトーシス（Ｙａｍａｚａｋｉら、２０１１）と関連することが報告されている。しかしながら、神経系におけるこれらのＴｍｅｍ１００関連の効果及びその役割の基礎となるメカニズムについて、ほとんど知られていない。
【０２２１】
多くの証拠によって、ＴＲＰチャネルは、ヘテロ四量体チャネル複合体に組み立てることが可能であることが、示されている。この現象は、当初、ＴＲＰＣチャネルについて報告された：ＴＲＰＣ１は、ラット脳において、ＴＲＰＣ４及びＴＲＰＣ５と共集合する（Ｓｔｒuｂｉｎｇら、２００１）。哺乳動物において、ＴＲＰＣ（Ｇｏｅｌら、２００２；Ｈｏｆｍａｎｎら、２００２；Ｓｔｒuｂｉｎｇら、２００３）、ＴＲＰＶ（Ｈｅｌｌｗｉｇら、２００５；Ｒｕｔｔｅｒら、２００５；Ｓｍｉｔｈら、２００２）、ＴＲＰＭ（Ｃｈｕｂａｎｏｖら、２００４）、及びＴＲＰＰ（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２００５）ファミリーからのチャネルを含む種々のＴＲＰチャネル複合体の形成が、実証されてきた。したがって、ＴＲＰは、同じサブファミリー（例えば、ＴＲＰＶｌ及びＴＲＰＶ３）（Ｃｈｅｎｇら、２０１２）内及びサブファミリー（例えば、ＴＲＰＶ４及びＴＲＰＰ２）（Ｋｏｔｔｇｅｎら、２００８）を越えて、ヘテロ化（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｚｅ）することができる。サブユニット組成物は、得られたチャネル複合体の生物物理学的及び制御特性に影響を与える（Ｘｕら、１９９７）。これらは、独特の生物物理学的及び薬理学的特性を有し、異なる経路を介して調節される（チェンら、２０１２）。ＴＲＰＡｌ‐ＴＲＰＶｌ（ＴＲＰＡｌ‐ＶＬ）複合体は、独特の生物物理学的特性を持つ感覚神経に存在することが実証された（Ｓａｌａｓら、２００９；Ｓｔａｒｕｓｃｈｅｎｋｏら、２０１０）。ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶｌは、疼痛及び過敏症の末梢及び中枢機構に大いに貢献しているため（Ｊｕｌｉｕｓ、２０１３）、ＴＲＰＡｌ‐Ｖｌ複合体は、臨床的に重要であり得る。また、このＴＲＰチャネル複合体の制御は、種々の病態生理学的状態における疼痛及び過敏症の管理において、特異性を提供することができる。
【０２２２】
本研究は、ＴＲＰＡｌ‐Ｖｌ複合体の増強修飾因子として、Ｔｍｅｍ１００を同定する。Ｔｍｅｍ１００は、ペプチド性ＤＲＧニューロンにおいて、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶｌと共発現される。Ｔｍｅｍ１００欠損マウスは、炎症性過敏症、及びＴＲＰＶｌではない、ＴＲＰＡ１媒介疼痛の減少を示す。異種システムにおける単一チャネル記録は、Ｔｍｅｍ１００が、ＴＲＰＶｌ依存的に、ＴＲＰＡｌ‐Ｖｌ複合体におけるＴＲＰＡ１活性を選択的に増強することを明らかにしている。機構的に、Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１とＴＲＰＶｌとの関連性を弱め、それによって、ＴＲＰＶｌによるＴＲＰＡ１の阻害を解除する。Ｔｍｅｍ１００変異体、Ｔｍｅｍ１００‐３Ｑは、逆の効果を発揮する、すなわち、Ｔｍｅｍ１００‐３Ｑは、ＴＲＰＡｌとＴＲＰＶｌとの関連性を高め、ＴＲＰＡｌを強力に阻害する。驚くべきことに、Ｔｍｅｍ１００‐３ＱのＣ末端配列を共有する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、ＴＲＰＶｌの存在下でその効果を模倣し、ＴＲＰＡｌ媒介疼痛を選択的に阻害する。本明細書に記載された研究は、ＴＲＰＡｌ‐ＶＩ複合体の状況依存的（ｃｏｎｔｅｘｔ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）調節を明らかにし、Ｔｍｅｍｌ００‐３Ｑ  ＣＰＰは、疼痛管理のための新規治療を示す。
【０２２３】
研究によって、膜アダプタータンパク質、Ｔｍｅｍｌ００が、ＴＲＰＡｌとＴＲＰＶｌとの間の物理的会合を制御する、推定ＴＲＰＡｌ‐ＶＩ複合体モデルが、提案される（図８）。さらなる研究は、二つのチャネルがＴｍｅｍｌ００の非存在下で共発現される場合（図４Ａ、８Ａ）、ＴＲＰＡｌ活性がＴＲＰＶｌによって阻害されることを実証する（Ｓａｌａｓら、２００９）。Ｔｍｅｍｌ００が存在する場合、ＴＲＰＡｌ活性がＴＲＰＶｌ依存的に増強される（図２Ａ〜２Ｊ、図４Ａ〜図４Ｅ）。Ｔｍｅｍｌ００の存在は、両方のチャネルとの物理的相互作用によって、ＴＲＰＡ１‐Ｖ１関連性を弱め（図５Ｅ、８Ｂ）、ＴＲＰＡｌの脱抑制と、ＴＲＰＡ１‐Ｖ１複合体におけるＴＲＰＡｌ関連活性に対する正味の好影響を生じる。また、（ＴＲＰＶｌとのより強い相互作用を有し、ＴＲＰＡｌとの相互作用を有さない、図５及び図１３Ａ〜１３Ｄ）Ｔｍｅｍｌ００‐３Ｑは、逆の効果を発揮し、ＴＲＰＡｌとＴＲＰＶｌとの間の物理的会合を強くし（図５Ｅ）、ＴＲＰＶｌによるＴＲＰＡｌ阻害が増加される（図８Ｃ、８Ｄ）。Ｔｍｅｍ１００の特異性は、それが、ＴＲＰＡ１‐Ｖ１複合体に対する制御の実現可能なモデルを提供するだけでなく、選択性及び状況依存性を示すことです。
【０２２４】
Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡｌ‐ＶＩ複合体においてＴＲＰＡｌアゴニストに対する応答を優先的に増強する一方で、ＴＲＰＶｌアゴニストに対する応答は、比較的変化しないままである。この現象は、単一チャネルから行動レベルにまでずっと一致している。電気生理学的及び生化学的結果は、Ｔｍｅｍ１００が、単独でＴＲＰＡｌ及びＴＲＰＶｌに物理的に関連し、それらを調節することができることを示す。しかしながら、これらの規制効果は、ＴＲＰＡｌ及びＴＲＰＶｌホモマーの両方に対して、本質的に抑制的である。。興味深いことに、Ｔｍｅｍ１００の阻害効果は、ＤＲＧニューロンと及び行動アッセイにおいて観察されなかった。一つの可能な説明は、殆どのＴＲＰＡ１+  ＤＲＧニューロンは、また、ＴＲＰＶｌを発現するということである。。したがって、ＴＲＰＡ１ホモマーの量が、正常又は病理学的状態のＤＲＧニューロンにおいて最小であり得る（Ｄｉｏｇｅｎｅｓら、２００７）。代替の可能性は、Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１‐Ｖ１複合体以外のチャネルを調節し、他の表現型に寄与していることである（Ｓｏｍｅｋａｗａら、２０１２）。異種発現系からのデータは、Ｔｍｅｍ１００が、ＴＲＰＶｌ＋／ＴＲＰＡｌ−  ＤＲＧニューロンにおけるＣＡＰ媒介性応答を阻害することを示唆した。一つの説明は、Ｔｍｅｍ１００が、ＴＲＰＶｌ＋／ＴＲＰＡｌ−ニューロンのサブセットに低い発現レベルを有することである（図１）。研究によって、この可能性が試験されるだろう。
【０２２５】
Ｔｍｅｍ１００の発見は、また、ネイティブ感覚ニューロン対異種システムにおいて報告されたＴＲＰＡｌ媒介電流に対するＴＲＰＶｌの矛盾した効果を調整する（Ｓａｌａｓら、２００９）。ＭＯ‐誘導電流は、ＴＲＰＶｌ−／−マウスからの感覚ニューロンにおいてより小さかった。ＴＲＰＶｌは、異種システムにおけるＴＲＰＡｌを阻害するので、これは、電流の予期された増加と対照的である。本明細書に記載されたデータは、基礎となるメカニズムの説明を提供する。Ｔｍｅｍ１００−／−ＤＲＧニューロンでは、異種システムに見られるように、ＴＲＰＡ１媒介活性が、恐らくＴＲＰＶｌの抑制効果に起因して、Ｔｍｅｍ１００＋／＋ニューロンに比べて低下された。異種の研究によって、Ｔｍｅｍ１００自体も、ＴＲＰＶｌの非存在下でＴＲＰＡｌ活性を阻害することが示される（図４Ａ及びＳ４Ａににおける「Ａ１」と「Ａ１＋Ｔ１００」のカラムを比較すること）。ＴＲＰＶｌ−／−マウスからのＴＲＰＡ１＋感覚ニューロンは、依然としてＴｍｅｍ１００を発現するため、ＭＯ依存性電流は、Ｔｍｅｍ１００によって阻害されるだろう。この阻害は、すなわち、以前の研究（Ｓａｌａｓら、２００９）、及び本明細書に提供されるデータ（図７Ｄ及び７Ｈ中のオープンバーを比較すること）が、ＴＲＰＶｌ−／−ＤＲＧニューロン及びマウスで発見したものである。従って、Ｔｍｅｍ１００の修飾作用を考慮して、異種細胞及びネイティブのニューロンから収集されたデータは、現在一致し、ＴＲＰＶｌとＴＲＰＡｌとの間の相互作用が、ＴＲＰＶｌによるＴＲＰＡｌの抑制につながることを示唆している。 
【０２２６】
幾つかの証拠は、Ｔｍｅｍ１００が、疼痛及び炎症に重要な役割を果たしていることを示す。まず、ＮＳＡＩＤ及び免疫抑制剤による処置は、その発現を低下させる（Ｙａｍａｚａｋｉら、２０１１）。第二に、炎症性疼痛は、Ｔｍｅｍ１００感覚ニューロン特異的ノックアウトマウスにおいて減少される。第三に、Ｔｍｅｍ１００は、ペプチド性ＤＲＧニューロンでもっぱら発現され、神経性炎症のために重要である（図１Ｈ）。最後に、ＴＲＰＡｌ及びＴＲＰＶｌは、両方とも、Ｔｍｅｍ１００修飾の重要な標的であり、炎症性疼痛の重要な調節因子である（Ｂａｕｔｉｓｔａら、２００６；Ｃａｔｅｒｉｎａら、２０００）。従って、この経路を妨害するアプローチは、病理学的条件下で疼痛を制御するための特異性を提供し、その結果、疼痛管理に重要であろう。
【０２２７】
Ｔ１００−Ｍｕｔの細胞透過性ペプチドの発見とその後の特徴付けは、疼痛管理のための道です。Ｔ１００−Ｍｕｔの阻害効果の程度は、他の強力なＴＲＰＡｌ拮抗剤の程度に匹敵する（ｄａ  Ｃｏｓｔａら、２０１０；ＭｃＮａｍａｒａら、２００７；Ｐｅｔｒｕｓら、２００７）。このアプローチの主な利点は、特異性を最大化し、それによって、他の組織で発現されるＴＲＰホモマーの代わりに、ＴＲＰＡ１‐Ｖ１複合体を特異的に標的にすることによって、薬物の副作用の可能性を最小にすることである。従って、Ｔｍｅｍ１００に関して本明細書に記載及び提案された研究は、疼痛の処理、調節及び管理のより良い理解に通じる。
【０２２８】
（実施例１：材料と方法）
【０２２９】
（Ｔｍｅｍ１００ＧＦＰノックインマウス系統の作製）
【０２３０】
マウスＤＲＧ由来の全長Ｔｍｅｍ１００ｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、その後に発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングした。Ｔｍｅｍ１００ターゲティング構築物のアームを、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡからサブクローニングした。遺伝子欠失構築物は、Ｔｍｅｍ１００の全コード領域を含むエクソン３が排除されていた。ＰｍｅＩ制限部位及びＡｓｃＩ制限部位を、ＥＧＦＰｆ‐ＡＣＮカセットが２つのアームの中央に配置することができるように操作した。ネガティブ選択マーカー（ＤＴＡ）を、相同組換え率を増加させるために右側のアームの外側に配置した。Ｔｍｅｍ１００ＧＦＰ／＋マウスを、ジョンホプキンス大学のＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙがターゲティング構築物を使用して作製した。変異対立遺伝子の作製及びＡＣＮカセットの切り出しを、ＰＣＲ及びサザンブロッティングによって検証した。
【０２３１】
（Ｔｍｅｍ１００コンディショナルノックアウトマウスの作製）
【０２３２】
全Ｔｍｅｍ１００ゲノム配列を含むＢＡＣクローンを、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入し、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって改変した（Ｌｉｕら，２００３）。最終遺伝子ターゲティングベクターは、２つのｌｏｘＰ部位に隣接したエクソン３及びＰＧＫ−Ｎｅｏカセットを含む。２つの相同性アームのサイズはそれぞれ１．９ｋｂ及び６．０ｋｂである。Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／＋マウスを、ジョンホプキンス大学のＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙがターゲティング構築物を使用して作製した。ＥＳ細胞中の相同組換えを、ロングレンジＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ，０４８２９０３４００１）を使用した両アームについてのＰＣＲ及び配列決定によって検証した。ＰＣＲによって生殖系列伝達を確認した。Ｆ１子孫をＦｌｐＥマウスと交配させてＰＧＫ−Ｎｅｏカセットを排除し、ＮｅｏカセットをターゲティングするＰＣＲによって結果を検証した。行動研究のために、マウスを、ＷＴ  Ｃ５７／ＢＬ６と５世代を超えて交雑させた後、Ａｖｉｌ＋／ＣＲＥ系統と交配させた。
【０２３３】
（ＤＲＧライセートのウェスタンブロット）
【０２３４】
頚椎レベルから腰椎レベルまでに由来するＤＲＧを、３００μＬのＰＢＳ及びプロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８３４０）を含む２％ＳＤＳ中に回収した。超音波処理後、溶液を１８，０００ｒｃｆにて４℃で５分間遠心分離した。上清を回収し、−８０℃で保存した。ウェスタンブロットのために、ＤＲＧライセートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｔｍｅｍ１００検出のために１０％又は１５％）によって分離し、ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＲＰＮ３０３Ｆ）にウェット式で転写した。メンブレンを、５％ミルクを含むＴＢＳＴにて３０分間ブロッキングした。以下の一次抗体を使用した：５０００倍希釈抗Ｔｍｅｍ１００、１０００倍希釈抗ＴＲＰＶ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｒ１３０）、及び１０００倍希釈抗ＴＲＰＡ１（Ｎｏｖｕｓ，ＮＢ  １１０−４０７６３）。視覚化のための二次抗体は、ロバ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体及びロバ抗マウスＨＲＰ抱合抗体（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含んでいた。シグナルの強度を、ＩｍａｇｅＪを使用して分析した。
【０２３５】
（免疫共沈降（Ｃｏ−ＩＰ））
【０２３６】
Ｔｒｐｖ１、Ｔｒｐａ１、及びＴｍｅｍ１００−ｍｙｃでトランスフェクトした全レベル又はＣＨＯ細胞由来のＤＲＧを使用した。ホールセルＤＲＧ又はＣＨＯ細胞のライセートをトランスフェクションの２４時間後に生成し、１μｇのｍｙｃ抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又は１μｇのＴＲＰＶ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｒ１３０）のいずれかを使用して記載のように（Ａｋｏｐｉａｎら、２００７）Ｃｏ−ＩＰを行った。免疫共沈降物及び細胞ライセートのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、１０００倍希釈抗ＴＲＰＶ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｒ１３０）、５００倍希釈抗Ｔｍｅｍ１００抗体、１０００倍希釈抗ＴＲＰＡ１（Ｎｏｖｕｓ）、又は１０００倍希釈抗ｍｙｃ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して免疫ブロットした。視覚化のための二次抗体は、ロバ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体及びロバ抗マウスＨＲＰ抱合抗体（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含んでいた。
【０２３７】
（ＧＳＴプルダウン）
【０２３８】
ＧＳＴ−Ｎ、ＧＳＴ−Ｃ融合物、及びＧＳＴ構築物（２μｇ）を、リポフェクタミン２０００を使用して２μｇのＴｒｐａ１、Ｔｒｐｖ１、Ｔｒｐｍ８、及びＴｒｐｖ２の各構築物と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、５００μＬのＩＰ緩衝液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋プロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳ）で溶解した。超音波処理及び１３，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間の遠心分離後、上清をグルタチオン−アガロースビーズ（ＧＥ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とインキュベートした。結合したタンパク質を、２×タンパク質サンプル緩衝液中での５０℃で１０分間の加熱によってビーズから溶出させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、２５００倍希釈ウサギポリクローナル抗ＴＲＰＶ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｒ１３０）、１０００倍希釈ウサギ抗ＴＲＰＡ１抗体（Ｎｏｖｕｓ）、５０００倍希釈抗ＧＳＴ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ７３６０）、又は１００００倍希釈ロバ抗ウサギＨＲＰ抱合抗体（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＮＡ９３４Ｖ）で免疫ブロットした。
【０２３９】
（行動アッセイ）
【０２４０】
（ホットプレート法）
【０２４１】
マウスを、温度制御された金属プレート（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  ８，Ｍｏｄｅｌ  ３９）上の円筒形の透明なプレキシガラスに入れた。急性生体防御反応の潜時を、後ろ足を持ち上げること及び／又は舐めること、振り回すこと、又はジャンプすることによって決定した。
【０２４２】
（尾部浸漬試験）
【０２４３】
マウスを、５０ｍＬコニカルチューブ製の装置中に拘束した。マウス尾部を、指定の温度に設定した水浴中に暴露した。
【０２４４】
（フォンフレイ法）
【０２４５】
マウスを金属メッシュ上の透明なプラスチック製ボックス（４．５×５×１０ｃｍ）に入れ、試験前に３０分間馴化させた。各マウスを、手作業にて特定の力で５回を超えて試験し、５回のうちの５０％を超えて反応を惹起するのに必要な最低の力を閾値とした。
【０２４６】
（カラシ油注射）
【０２４７】
ハミルトン針（８０３００）を使用して、マウスの後足に６μＬの０．２％カラシ油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ３７７４３０）を皮内注射した。マウスを円筒形のプレキシガラスに入れ、足を舐めること及び振り回すことに費やした時間の合計を、注射から最初の１０分間にわたって記録した。注射の３０分後及び６０分後、マウスを、フォンフレイフィラメントを使用して、機械的痛覚過敏についてアッセイした。
【０２４８】
（ハーグリーブス試験）
【０２４９】
マウスを、ガラスプラットフォーム（Ｐｌａｎｔａｒ  Ｔｅｓｔ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＩＩＴＣ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）上の透明なプラスチック製ボックス（４．５×５×１０ｃｍ）下に置いた。放射熱を最大出力の１８％に調整し、足の中央に照射した。各マウスを、３回を超えて試験し、各試験を、２０分間隔で行った。
【０２５０】
（完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）注射）
【０２５１】
マウスに、６μＬの５０％乳化完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｆ５８８１）を含む生理食塩水を注射した。
【０２５２】
（カプサイシン注射）
【０２５３】
マウスに、６μＬのカプサイシン（０．１μｇ／μＬの生理食塩水／１０％エタノール／０．５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液）を後足に注射した。マウスを円筒形のプレキシガラスに入れ、足を舐めること及び振り回すことに費やした時間の合計を、注射から最初の１０分間にわたって記録した。
【０２５４】
（パクリタキセル注射）
【０２５５】
以前に記載のように（Ｍａｔｅｒａｚｚｉら，２０１２）、マウスに、６ｍｇ／ｋｇの用量のパクリタキセル（Ｓｉｇｍａ  Ｔ７１９１）を腹腔内注射した。パクリタキセル注射の７日後、細胞透過性ペプチド注射の注射前及び４時間後に、マウスを、フォンフレイ法を使用して、機械的痛覚過敏についてアッセイした。
【０２５６】
（コールドプレート試験）
【０２５７】
氷床上の金属プレートを、−２０℃のフリーザー中で冷却した。試験中、プレートを、温度プローブによる測定によって０℃に加温した。活発な後足の持ち上げ及び／又は後足の振り回し／舐めることを評価した。
【０２５８】
（ラットＬ５ＳＮＬ）
【０２５９】
改変Ｌ５ＳＮＬモデルを、以前に記載のように作製した（Ｈｅら，２０１４；Ｓｈｅｃｈｔｅｒら，２０１３）。雄スプレーグ・ドーリーラット（２００〜３５０ｇ，Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、２％イソフルランで麻酔した。左Ｌ５脊髄神経を６−０絹糸縫合糸で結紮し、遠心側で切断した。筋層を４−０クロミックグット縫合糸で閉じ、皮膚を金属クリップで閉じた。髄腔内カテーテルの植込みのために、ラットの環椎後頭膜に小さな切り込みを入れ、この切り込みに生理食塩水を充填したＰＥ−１０チューブ片（６〜７ｃｍ）を挿入した（Ｈｅら，２０１４）。実験完了後、リドカイン（４００μｇ／２０μｌ，Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ）の注射によって髄腔内薬物送達を確認し、それにより、下肢の一過性の運動麻痺が認められた。機械的刺激を中断するための過敏症を、一連のフォンフレイフィラメント（０．３８〜１５．１ｇ）を後足底面の試験領域に４〜６秒間適用することによるアップダウン法を使用して決定した（Ｃｈａｐｌａｎら，１９９４；Ｈｅら，２０１４）。ＰＷＴを、Ｄｉｘｏｎの式（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）にしたがって決定した。ＳＮＬを受けたが、ＳＮＬ５日目後までに機械的過敏症を発症しなかった（ＳＮＬ前ベースラインからのＰＷＴの減少が５０％超）ラット及び処置後に運動機能障害又は健康状態の悪化が生じたラットをその後の行動研究から排除し、データを分析しなかった。ＨＣ−０３００３１を、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）から購入した。両薬物を、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５％Ｔｗｅｅｎ８０、及び８５％滅菌生理食塩水に溶解した。髄腔内経路によって注射される最終使用溶液は、１％未満のＤＭＳＯを含んでいた。各研究での動物の使用数は、類似の研究に伴う経験及び検出力計算に基づいていた。動物を異なる処置群に無作為に割り付け、試験者を薬物処置について盲検化して選択及び観察の偏りを軽減した。実験完了後、データポイントを排除しなかった。ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ６．０ソフトウェア（ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｓａ，ＯＫ）を使用して、全統計分析を行った。テューキーのｈｏｎｅｓｔｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＨＳＤ）事後検定を使用して、特定のデータポイントを比較した。多重比較のためにボンフェローニ補正を適用した。両側検定を行い、データを平均±標準誤差と表記する；全試験において、Ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【０２６０】
（カルシウム画像化）
【０２６１】
カルシウム画像化アッセイを、以前に記載のように行った（Ｌｉｕら，２００９）。細胞に、２μΜのｆｕｒａ２−アセトメトキシエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、ＤＲＧ及び細胞株のためにそれぞれ暗所にて室温で３０分間又は３７℃で４５分間ロードした。洗浄後、細胞を３４０ｎｍ及び３８０ｎｍでの励起で画像化して、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｓ）下及びＬａｍｂｄａ１０Ｂシャッター（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して細胞内遊離カルシウムを検出した。細胞を、カルシウム画像化緩衝液（ｐＨ７．４５、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣ１、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース、１．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、容量オスモル濃度を２９０ｍＯｓｍに増加させるためのスクロースを添加）中に浸漬させた。試薬及び緩衝液を、重力灌流システム（カラシ油（Ｓｉｇｍａ  ３７７４３０）、桂皮アルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ｃ８０６８７）、メントール（Ｓｉｇｍａ  Ｍ２７８０）、及びカプサイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｍ２０２８）を含む）にて流速２ｍＬ／ｓで適用した。高ベースライン３４０／３８０値（１．５超）の細胞を、分析のために排除した。ＤＲＧニューロンについて、各試験の終了時、ＩＢ４染色を、２００倍希釈で（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １２１４１２）洗浄前に室中で１６０秒間行った。ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＢＲ  ２．３０ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、画像を処理し、解析した。応答細胞を、ベースラインを超える３４０／３８０比が２０％超増加した細胞と定義した。カルシウムの細胞内補正を、以前に記載のように行った（Ａｋｏｐｉａｎら，２００７）。データを、実験者を遺伝子型又はトランスフェクトした構築物について盲検化して分析した。
【０２６２】
（細胞培養）
【０２６３】
３〜４週齢のマウス由来のＤＲＧを、冷ＤＨ１０培地（９０％ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）中に回収し、コラゲナーゼ（１．６５ｍｇ／ｍＬ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ＣＬＳＩ）及びディスパーゼ（３．５５ｍｇ／ｍＬ、ＧＩＢＣＯ１７１０５−０４１）を含むＨＢＳＳの酵素溶液にて３７℃で３０分間処理した。粉砕及び遠心分離後、細胞を、ＤＨ１０に再懸濁し、ポリ−Ｄ−リジン（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）及びラミニン（１０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングしたカバーガラス上にプレートし、インキュベーター中にて３７℃で一晩培養した。ニューロンを２４時間以内に試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ−７細胞、及びＣＨＯ細胞を、９０％ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなる培地中で培養した。ＣＨＯ細胞についてはＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ  ３５０５０−０６１）も添加した。カルシウム画像化のために、細胞を、ポリ−Ｄ−リジン（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）でコーティングしたカバーガラス上にプレートした。ＨＥＫ細胞研究では、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ１、及び指定の構築物（すなわち、Ｔｍｅｍ１００又はＴｍｅｍ１００−３Ｑ変異体）の両方を発現する細胞を基準とする。ｍＣｈｅｒｒｙ：ＴＲＰＶ１：Ｔｍｅｍ１００を、１：８：８の比でＴＲＰＡ１安定細胞株（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＮ．Ｔｉｇｕｅから入手）にトランスフェクトし、リポフェクタミン２０００を使用したトランスフェクションの１８時間後に構築物を発現する細胞のマーカーとしてｍＣｈｅｒｒｙを使用した。Ｔｍｅｍ１００＋ＴＲＰＶ１＋ＴＲＰＡ１トリプル陽性細胞のトランスフェクション効率は２７±３％である。この効率を、ｍＣｈｅｒｒｙ（＋）を明視野中の総細胞数で除することによって決定した。
【０２６４】
（電気生理学）
【０２６５】
セルアタッチ単一チャネル法又はホールセル電位固定法で２２〜２４℃にて小型から中程度のマウスＤＲＧニューロン（１５〜３５ｐＦ）の細胞体又はＣＨＯ細胞からの記録を行った。ホールセル法について、保持電位（Ｖｈ）は−６０ｍＶである。データを入手し、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器及びｐＣＬＡＭＰ９．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して分析した。ホウケイ酸ガラスピペット（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を引き、（ホールセルピペット溶液中及び単一チャネルピペット溶液中で）３〜５ΜΩの抵抗が得られるようにポリッシュした。ホールセル法について７〜１０ΜΩまで割り当てた場合にアクセス抵抗（Ｒｓ）が補正された（４０〜８０％）。ホールセル記録データを、０．５ｋＨｚでフィルタリングし、２ｋＨｚでサンプリングした。ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の単流の休止時間（τ）が０．５秒を超えたので、単一チャネル電流を、８ポールローパスベッセルフィルタを使用して０．１ｋＨｚでフィルタリングし、０．５ｋＨｚでサンプリングした。記録中にＲｓが２０％を超えて変化したか、リーク電流が１００ｐＡを超えたか、入力抵抗が２００ΜΩ未満であった場合に、ホールセル記録データを拒絶した。電流は、その振幅が表示されたノイズの５倍である場合（平均二乗の平方根で）に正と見なした。
【０２６６】
単一チャネルの単位電流（ｉ）を、振幅ヒストグラムのベストフィットガウス分布から決定した。単一チャネル活性を、ＮＰｏ＝Ｉ／ｉ（式中、Ｉはパッチ内の平均総電流であり、ｉはこの電位での単位電流である）として分析した。メインコンダクタンスの開確率（Ｐｏ）を、図中に示す。単一チャネル勾配コンダクタンスのために、正及び負の保持電位について個別に直線フィッティングを使用した。図中に示した勾配コンダクタンスを、負の保持電位（−６０〜０ｍＶ）のフィッティングから決定した。単一チャネル記録データを、Ｃｌａｍｐｆｉｔ９ソフトウェアを使用して分析した。これは、現在のトレースを分析し、パッチ中のチャネル数（Ｎ）、多数のサブコンダクタンスの存在状態、及びメインコンダクタンスが何なのかを決定する「事象検出解析」機能を有する。Ｐｏ測定の精度を上げるために、３つ未満のチャネルを含むパッチのみを使用した。ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の両方を含むパッチについて、同数のＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１を有するパッチのみを使用した。これを、各記録において、ＭＯを適用し、次いでＣＡＰを適用することによってモニタリングした。
【０２６７】
ホールセルパッチ記録のための標準外液（ＳＥＳ）は、以下を含んでいた（単位はｍＭ）：１４０  ＮａＣｌ、５  ＫＣ１、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、１０  Ｄ−グルコース、及び１０  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）。ビヒクル（０．０１％ＤＭＳＯ）を、外液に添加した。ＴＲＰ電流の単一チャネル記録のための浴液（ＳＥＳ−ＳＣｈ）は、以下からなった（単位はｍＭ）：１００  グルコン酸カリウム、４  ＫＣ１、１  ＭｇＣｌ２、１  ＥＧＴＡ、１０  Ｄ−グルコース、及び１０  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）。ホールセル法のための標準ピペット溶液（ＳＩＳ）は、以下を含んでいた（単位はｍＭ）：１４０  ＫＣ１、１  ＭｇＣｌ２、１  ＣａＣｌ２、１０  ＥＧＴＡ、１０  Ｄ−グルコース、１０  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）。単一チャネル記録のためのピペット溶液（ＳＩＳ−ＳＣｈ）は、以下であった（ｍＭ）：１００  グルコン酸ナトリウム、１０  ＮａＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、２  ＣａＣｌ２、１０  Ｄ−グルコース、及び１０  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）。薬物を、コンピュータ制御された急速圧力駆動８チャネルシステム（ＶａｌｖｅＬｉｎｋ８；ＡｕｔｏＭａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して適用した。細胞のベースライン活性を、薬物適用の１〜２分前に記録した。薬物適用期間を、図の説明文に記載している。トレースの単一チャネル分析を、薬物適用開始から１０秒後〜３０秒後に行った。
【０２６８】
（免疫蛍光染色）
【０２６９】
８〜１２週齢の成体マウスをペントバルビタールで麻酔し、２０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４；４℃）で灌流後、２５ｍｌの４％パラホルムアルデヒド及び１４％ピクリン酸を含むＰＢＳ（４℃）で灌流した。灌流後、脊髄及び脊髄後根神経節（ＤＲＧ）を、切開した。ＤＲＧを、４％パラホルムアルデヒド及び１４％ピクリン酸中にて４℃で３０分間後固定し、脊髄を１時間固定した。全組織を、２０％スクロースを含むＰＢＳにて４℃で一晩凍結保護し、ＯＣＴ中にて−８０℃で保存した。染色前に、２０μｍの切片を、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１０分間後固定し、０．１％ＰＢＳＴで洗浄した。１０％ヤギ血清を含むＰＢＳＴ中にて室温で１時間ブロッキング後、切片を一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０００倍希釈）、ニワトリ抗ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０００倍希釈）、ウサギ抗ＣＧＲＰ（Ｂａｃｈｅｍ  Ｔ−４２３９、１０００倍希釈）、ウサギ抗ＮＦ２００（Ｓｉｇｍａ  Ｎ４１４２、１０００倍希釈）、ウサギ抗ＴＲＰＶ１（Ｃａｔｅｒｉｎａ博士からの分与、１０００倍希釈）、ＩＢ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １−２１４１２、１：２００）、マウス抗ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ３７７、１：３００）、及びウサギ抗ＴＲＰＡ１（Ｓｃｈｍｉｄｔ博士からの分与、２００倍希釈）。２日目に、切片を二次抗体と室温で１時間インキュベートした。以下の二次抗体を使用した：ヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１１０３６、Ａｌｅｘａ５６８抱合；Ａ１１０３４、Ａｌｅｘａ４８８抱合）、ヤギ抗ニワトリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１１０３９、Ａｌｅｘａ４８８抱合）、ヤギ抗ラット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１１４３４、Ａｌｅｘａ５５５抱合）、及びヤギ抗マウスＩｇＧｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ‐２１１２４、Ａｌｅｘａ５６８抱合；Ａ−２１１２１、Ａｌｅｘａ４８８抱合）。全二次抗体を、ブロッキング溶液で３００倍希釈した。切片をＰＢＳＴで洗浄し、フルオロマウント−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＢｉｏＴｅｃｈ）を使用してマウントした。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡システムを使用して画像を得た。
【０２７０】
（生体染色）
【０２７１】
Ｆ１１細胞株を、リポフェクタミン２０００プロトコールにしたがって０．６μｇのｐｃＤＮＡ３．１−Ｔｍｅｍ１００−ｍｙｃ又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｔｍｅｍ１００＋０．２μｇｍＣｈｅｒｒｙのいずれかでトランスフェクトした。２日目に、細胞をトリプシン処理し、ポリ−Ｄ−リジンをコーティングした１５０ｍｍカバーガラス上にプレートした。非界面活性剤処置（ＮＤＴ）群を、１％ヤギ血清を含むＰＢＳからなる緩衝液で３回洗浄した。界面活性剤処置（ＤＴ）群を、４％ＰＦＡを含むＰＢＳにて室温で１５分間固定し、１％ヤギ血清を含む０．１％ＰＢＳＴからなる緩衝液で洗浄した。洗浄後、カバーガラスを、１０％ヤギ血清を含むその各洗浄緩衝液中にて室温で１５分間ブロッキングした。これらを、一次抗体（２００倍希釈マウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体、９Ｂ１１、Ｉｍｇ／ｍＬ）又は１０００倍希釈ウサギ抗Ｔｍｅｍ１００抗体と室温で１時間インキュベートし、３回洗浄した。これらを、二次抗体（１０００倍希釈ヤギ抗マウスＩｇＧ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と室温で３０分間インキュベートした。
【０２７２】
（全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法及びフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ））
【０２７３】
ｐＥＹＦＰ−ＴＲＰＡ１（Ｃ末端部分上のＹＦＰ）、ｐＥＣＦＰ−ＴＲＰＶ１（Ｃ末端部分上のＣＦＰ）、及びｐＥＹＦＰ−Ｎｌの発現ベクターを、以前に記載のように（Ｓｔａｒｕｓｃｈｅｎｋｏら，２０１０）ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２３１１）を使用してＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。平らな形状であり、それにより、ＴＩＲＦ−ＦＲＥＴ分析に適切であるので、ＣＯＳ−７細胞を選択した。さらに、ＣＨＯ細胞及びＣＯＳ細胞が同一レベルでＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１を発現することが以前に示されている（Ｓｔａｒｕｓｃｈｅｎｋｏら，２０１０）。固定細胞由来のデータを、テキサス大学サンアントニオ健康科学センター及びジョンホプキンス大学という個別の施設で収集した。各群を、全長ｐｃＤＮＡ３．１−Ｔｍｅｍ１００、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ、又はｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓで同時トランスフェクトし、ガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ，Ｐ３５Ｇ−１．０−１４−Ｃ）上にプレートした。ＦＲＥＴを、本質的に以前に記載のように行った（Ｓｔａｒｕｓｃｈｅｎｋｏら，２０１０）。簡潔に述べれば、トランスフェクションから２日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１５分間固定し、次いで、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）（エバネッセント場とも呼ぶ）顕微鏡法を使用してｐｌａｉｎ  Ａｐｏ  ＴＩＲＦ  ６０倍高解像度（１．４５ＮＡ）油浸対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００Ｕ倒立顕微鏡にて室温で画像化した。ＣＦＰ及びＹＦＰの各フルオロフォアを、励起波長を選択するために使用される音響光学可変波長フィルタ（Ｐｒａｉｒｉｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を使用してそれぞれ４４２−ｎｍ  Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔデュアルパルス固体レーザー及び５１４−ｎｍアルゴンイオンレーザーにて励起した。ＣＦＰ及びＹＦＰからの発光は、発光を分割するための５０５−ｎｍダイクロイックフィルタを使用した画像分割デバイス（Ｄｕａｌ−Ｖｉｅｗ，Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を通過し、次いで、４７０＋１５ｎｍ及び５５０＋２５ｎｍの各発光フィルタをそれぞれ通過した。蛍光画像を収集し、ＰＣ動作Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアに接続された１６ビットの冷却電荷結合素子カメラ（Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２Ｆ；Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で処理した。
【０２７４】
各細胞を、全出力で２分間のアルゴンイオンレーザー（５１４ｎｍ）によって光脱色した。ＴＩＲＦ照明を使用したチャネルの総細胞プールよりもカバーガラスに隣接する原形質膜中及び原形質膜付近の膜タンパク質の光脱色が優先されることが以前に証明されていた（Ｓｔａｒｕｓｃｈｅｎｋｏら，２０１０）。ＦＲＥＴ効率を、光脱色後のＣＦＰの増加率として以下の式で計算した：
％ＦＲＥＴ＝（ＣＦＰｐｏｓｔ−ＣＦＰｐｒｅ）／ＣＦＰｐｏｓｔ
（式中、ＣＦＰｐｏｓｔ及びＣＦＰｐｒｅは、それぞれそのバックグラウンドを差し引いた光脱色後及び光脱色前の細胞内のＣＦＰ発光の平均グレー値である）。全画像をＩｍａｇｅＪで解析した。
【０２７５】
（細胞透過性ペプチド）
【０２７６】
Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ変異タンパク質のＣ末端の最後の２８アミノ酸由来の配列を合成し、Ｔｗｅｎｔｙｆｉｒｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓによってそのＮ末端をミリストイル化した（ｍｙｒ−ＷＫＶＲＱＲＮＫＫＶＱＱＱＥＳＱＴＡＬＶＶＮＱＲＣＬＦＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号８）。同一の組成のスクランブルペプチドを合成し、このペプチドは、任意の公知のタンパク質と類似していなかった（ｍｙｒ−ＱＲＶＬＥＱＶＬＱＮＷＳＲＲＡＮＶＫＱＡＱＫＦＱＶＫＣＴ−ＣＯＯＨ）（配列番号１５）。カルシウム画像化アッセイのために、ペプチドを、最終濃度が２００ｎＭとなるようにカルシウム画像化緩衝液に添加し、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。マウス行動アッセイのために、ペプチド（５μＬ、２ｍＭ）を、試験の少なくとも３０分前に後足に皮下注射した。ラット行動アッセイのために、ヒトＴ１００−３Ｑ（ｈ−Τ１００）（Ｔｍｅｍ１００中のヒト配列のＣ末端に基づいて変異したパルミトイル化細胞透過性ペプチド）を適用した。配列は、パルミトイル−ＷＫＶＲＱＲＳＫＫＡＱＱＱＥＳＱＴＡＬＶＡＮＱＲＳＬＦＡ−ＣＯＯＨ（配列番号７）である。
【０２７７】
（統計的分析）
【０２７８】
エラーバーを、平均±標準誤差として示す。テキスト中の数値データを、平均±標準誤差として示す。ｎは、分析したマウス、各応答細胞、又は各試験の数を示す。２群間の統計比較を、対応のない両側スチューデントｔ検定によって行った。複数の群を、一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニの事後検定（各カラムを他の全カラムと比較した）を使用して比較及び分析した。要素として遺伝子型及び時間を使用した群間の相違を、ボンフェローニの多重比較事後検定を使用した二元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。検出力解析を使用して、サンプルサイズが正しいことが証明された。ｐ＜０．０５の差を、統計的に有意と見なした。代表的なデータは、生物学的に少なくとも３回繰り返され、類似の結果が得られた実験に由来する。
【０２７９】
（実施例２：Ｔｍｅｍ１００はペプチド作動性ＤＲＧニューロンで発現した２回膜貫通タンパク質をコードする）
【０２８０】
Ｔｍｅｍ１００のトポロジーを、その細胞内での局在及び分布を理解するために調査した。タンパク質構造分析（ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＳＯＳＵＩ，Ｎａｇｏｙａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）は、Ｔｍｅｍ１００が２回膜貫通タンパク質であることを示している（図１Ａ）。Ｔｍｅｍ１００−ｍｙｃ構築物を、ｃ−ｍｙｃを使用してＦ１１細胞株のＣ末端にトランスフェクトし、抗ｍｙｃ抗体で染色した。Ｔｍｅｍ１００は、膜透過処理後のみ原形質膜で可視化された（図９Ａ、Ｃ）。Ｎ末端に対して抗Ｔｍｅｍ１００抗体を使用した場合に類似の結果が得られた（図９Ｂ）。染色により、シグナルが主に原形質膜内に局在することも示された（図９Ｄ）。データは、Ｔｍｅｍ１００は、その大部分が原形質膜に局在し、この局在がＮ末端及びＣ末端の両方の細胞内局在である２回膜貫通タンパク質であることを示す。
【０２８１】
Ｔｍｅｍ１００発現ＤＲＧニューロンを特徴づけるために、Ｔｍｅｍ１００の開かれた読み取り枠がＧＦＰに置換されたノックイン系統を作製した（Ｔｍｅｍ１００ＧＦＰ／＋；図９Ｅ、Ｆ）。抗Ｔｍｅｍ１００抗体標識により、ＧＦＰがＴｍｅｍ１００ＧＦＰ／＋マウス系統のＴｍｅｍ１００＋ＤＲＧニューロン中で特異的に発現されることが確認された（図９Ｆ）。ＧＦＰをマーカーとして使用して、Ｔｍｅｍ１００が２４％の腰椎ＤＲＧニューロン（主なサイズは小型及び中型）で発現することが見出された（図ＩＢ）。Ｔｍｅｍ１００ＧＦＰ／＋系統において異なるＤＲＧニューロンマーカーをＧＦＰで二重染色した（図１Ｃ、Ｄ、及び９Ｇ）。９５％のＴｍｅｍ１００＋ニューロンがＣＧＲＰを発現し、８８．４％のＣＧＲＰ＋ニューロンがＴｍｅｍ１００を発現する。Ｔｍｅｍ１００＋ニューロンのサブセットにおいてＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の両方が同時発現される。対照的に、Ｔｍｅｍ１００＋ニューロンは、ＩＢ４に陽性であることは稀である（図１Ｃ、Ｄ、及び１１）。これらの結果は、Ｔｍｅｍ１００がペプチド作動性ＤＲＧニューロン中で主に発現され（図ＩＥ）、その多くがＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１に二重陽性を示す（図ＩＦ）ことが示唆される（Ｂａｕｔｉｓｔａら，２００６；Ｓｔｏｒｙら，２００３）。最近の研究により、ＴＲＰＡ１がＩＢ４＋非ペプチド作動性ニューロン中で機能的に発現されることが示されている（Ｂａｒａｂａｓら，２０１２）。分離したＤＲＧニューロンの培養条件は、ＴＲＰＡ１の発現に影響を及ぼし得る。他方では、抗ＴＲＰＡ１抗体の感受性により、ＩＢ４＋ニューロン中のＴＲＰＡ１発現が失われる。さらに、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）注射によって誘導された炎症条件下においてＤＲＧ中のＴｍｅｍ１００発現ニューロン数が有意に増加することが見出された（図９Ｈ、Ｉ）。まとめると、発現データは、Ｔｍｅｍ１００が疼痛の調整に関与することを示唆する。
【０２８２】
（実施例３：感覚ニューロン中のＴｍｅｍ１００の選択的排除が機械的痛覚過敏及びＴＲＰＡ１関連侵害受容を軽減する）
【０２８３】
Ｔｍｅｍ１００の大域ノックアウトがＥ１０．５で致命的であるので（Ｍｏｏｎら、２０１０）、侵害受容性経路中のＴｍｅｍ１００の機能（Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌ；図２Ａ）を研究するためにコンディショナルノックアウトマウスを作製した。Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌマウスを雄アドビリン＋／ＣＲＥ（Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ）マウスと交配させて、ＤＲＧの一次知覚ニューロン中のＴｍｅｍ１００を選択的に排除した（Ｈａｓｅｇａｗａら，２００７）。これらのマウスは生存可能であり、野生型（ＷＴ）、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋、Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌ、及びＡｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌの各マウスの間で肉眼での概観及び行動に顕著な相違は認められなかった。ウサギ抗Ｔｍｅｍ１００抗体を使用した免疫蛍光染色及びウェスタンブロッティングによってＤＲＧ中のＴｍｅｍ１００タンパク質の欠失が確認された（図２Ｂ及び１０Ａ）。Ｔｍｅｍ１００が排除された場合、ＤＲＧ中でＴＲＰＡ１発現及びＴＲＰＶ１発現の有意な変化は認められなかった（図１０Ａ〜Ｃ）。さらに、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ＧＦＰ／ｆｌ系統由来のＤＲＧ及び脊髄における発生的表現型及び形態学的表現型を評価し、結果はいかなる関連する欠陥も示唆されなかった（図１０Ｄ〜Ｆ）。
【０２８４】
次に、Ｔｍｅｍ１００ＤＲＧコンディショナルノックアウトマウス（すなわち、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌ（Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯ））に対する行動試験を実施することによってＴｍｅｍ１００が侵害受容及び痛覚過敏／異痛症で役割を果たすかどうかを決定した。これらのマウスは、ナイーブ条件下で正常な機械的感受性を示した（図２Ｃ）。しかし、Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯマウスは、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋及びＴｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌコントロールと比較してカラシ油（ＭＯ；ＴＲＰＡ１のアゴニスト（Ｂａｕｔｉｓｔａら，２００６；Ｋｗａｎら，２００６））によって誘導された急性侵害防御行動が減少した（図２Ｄ及び１０Ｇ）。マウス後足へのＭＯの注射によって生じたＴＲＰＡ１依存性機械的痛覚過敏（Ｂａｕｔｉｓｔａら，２００６）も、Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯマウスにおいて有意に減少した（図２Ｅ）。機械的に誘導された疼痛の平均閾値は、両コントロール群において０．０６ｇまで減少し、この減少は、Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯマウスにおいて有意により高かった（０．３４ｇ）。後足へのＣＦＡの注射によって生じた炎症性疼痛モデルでは、Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯマウスはまた機械的痛覚過敏が軽減し（図２Ｇ）、これは炎症性機械的痛覚過敏におけるＴＲＰＡ１の関与についての以前の報告（Ｐｅｔｒｕｓら，２００７）と一致していた。機械的侵害受容性の閾値は、２日目にＡｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋マウス及びＴｍｅｍ１００ｆｌ／ｆｌマウスにおいてそれぞれ０．１８ｇ及び０．１１ｇに減少したが、Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯマウスにおいては０．４３ｇであった。これらのデータは、ＤＲＧ中のＴｍｅｍ１００の欠失により炎症性機械的痛覚過敏及び急性ＴＲＰＡ１関連侵害受容が実質的に減少することを示す。
【０２８５】
興味深いことに、ＴＲＰＶ１関連急性侵害受容性行動及び痛覚過敏は、Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯマウスで比較的落ち着いたままであった。Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯマウスは、後足におけるカプサイシン誘導性急性侵害防御行動のいかなる有意な欠損も認められなかった（図２Ｆ）。尾部浸漬試験及びホットプレート試験でも変異マウスにおけるいかなる欠損も明らかにできなかった（図２Ｉ及び２Ｊ）。さらに、ＣＦＡ誘導性熱痛覚過敏（ＴＲＰＶ１欠失後にほとんど完全に逆行するが、ＴＲＰＡ１の薬理学的遮断後に不変である（Ｃａｔｅｒｉｎａら、２０００；Ｐｅｔｒｕｓら、２００７））も、Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯマウスにおいて不変であった（図２Ｈ）。これらの動物において寒冷誘導性疼痛も試験し、結果は、この様式がＴｍｅｍ１００の排除によって影響を受けないことが示唆される（図１０Ｈ、Ｉ）。
【０２８６】
（実施例４：ＴＲＰＡ１媒介性応答はＴｍｅｍ１００ＣＫＯマウス由来のＤＲＧニューロンにおいて選択的に軽減される）
【０２８７】
細胞レベルでのＴｍｅｍ１００の機能を調査するために、Ｔｍｅｍ１００ＣＫＯマウス由来の培養ＤＲＧニューロンを、カルシウム画像化及びホールセル電気生理学記録を使用して試験した。結果は、Ｔｍｅｍ１００が欠失している場合、ＤＲＧニューロンのＴＲＰＡ１媒介性活動の選択的軽減が示されたが、ＴＲＰＶ１媒介性活動やＴＲＰＭ８媒介性活動の選択的減少は示されなかった。カルシウム画像化において、ＩＢ４＋ニューロンの大部分がＴｍｅｍ１００を発現しないので、ＩＢ４陰性ＤＲＧニューロンのみを分析した（培養条件では、４．８±０．８％のＩＢ４＋ニューロンのみがＴｍｅｍ１００を発現し、５．２±０．５％のＴｍｅｍ１００＋ニューロンがＩＢ４＋であった；３匹のマウス由来の９００を超えるニューロンを各マーカーについて分析した）。ＭＯ及び代替のＴＲＰＡ１特異的アゴニストである桂皮アルデヒド（ＣＡ）に対するＤＲＧニューロンの応答率は、Ｔｍｅｍ１００を排除した場合に有意に低かった（Ｂａｎｄｅｌｌら、２００４）（図３Ａ及び１１Ａ）。Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋マウス（すなわち、コントロール）由来のＤＲＧニューロンは、それぞれ１４％及び１７％がＭＯ及びＣＡに応答し、この割合はＴｍｅｍ１００ＣＫＯ群において６％及び８％に低下した。逆に、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋マウス及びＴｍｅｍ１００ＣＫＯマウスの両方において３１％のＩＢ４陰性ＤＲＧニューロンがカプサイシンに応答したので、ＴＲＰＶ１活性を有するＤＲＧニューロンの比率は不変であった。メントールもコントロールとして使用したが、メントールはこの濃度でＴＲＰＭ８によってほとんどが媒介され（Ｂａｕｔｉｓｔａら，２００６；Ｄｈａｋａら，２００７）、コントロールとＴｍｅｍ１００ＣＫＯニューロンとの間でメントールに対するニューロン応答率は相違しなかった（図３Ａ）。
【０２８８】
Ｔｍｅｍ１００によるＴＲＰＡ１媒介性電流及びＴＲＰＶ１媒介性電流の制御を調査するためにＤＲＧニューロンのホールセルパッチクランプ記録を行った。カプサイシン（ＣＡＰ）応答性ニューロンにおける７μＭ及び２５μΜのＭＯ（図１１Ｂ中の用量応答曲線に基づく）によって誘発された電流は、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋ニューロンと比較してＴｍｅｍ１００ＣＫＯマウス由来のＤＲＧニューロンにおいて有意に小さかった（図３Ｂ、Ｃ）。この所見は、Ｔｍｅｍ１００がＴＲＰＡ１活性を増強することも示していた。
【０２８９】
ＴＲＰＶ１媒介性応答に対するＴｍｅｍ１００の効果も試験した。ＤＲＧニューロンにおけるＣＡＰ（１００ｎＭ）誘発性電流は、Ａｖｉｌ−Ｃｒｅ；Ｔｍｅｍ１００＋／＋マウスとＴｍｅｍ１００ＣＫＯマウスとの間で有意に異ならなかった（図３Ｄ、Ｅ）。したがって、Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＶ１活性に対する調整効果は示さない。
【０２９０】
（実施例５：Ｔｍｅｍ１００は、異種発現系におけるＴＲＰＡ１活性を増強する）
【０２９１】
行動分析及び細胞分析の両方により未変性Ｔｍｅｍ１００がＴＲＰＡ１を正に制御することが示唆されるので、次に、異種系において類似の効果を得ることが可能であるかを問うた。野生型ニューロン及びＴｍｅｍ１００−／−ＤＲＧニューロンの状況を模倣するために、Ｔｍｅｍ１００の存在下又は非存在下におけるＣＨＯ細胞中でのＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の同時発現を行った。ＭＯ誘発ホールセル電流密度及び細胞内カルシウム蓄積は、Ｔｍｅｍ１００がＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１と共に存在する場合に有意により高かった（図３Ｆ、Ｇ）。ビオチン化アッセイにより、野生型Ｔｍｅｍ１００がＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１の両方と同時発現した場合に原形質膜上のＴＲＰＡ１レベルが減少する傾向が明らかとなったのに対して（統計的に有意ではない）、原形質膜上のＴＲＰＶ１レベルは不変であった（図１１Ｄ−Ｆ）。原形質膜へのＴＲＰＡ１輸送に対するＴｍｅｍ１００の効果がチャネル活性の増大に対する効果と逆であるので、ホールセルに対するＴｍｅｍ１００の真の効果は、ＴＲＰＡ１チャネルの膜輸送に対する効果の低下を考慮した場合にさらに強い。
【０２９２】
Ｔｍｅｍ１００の作用を別の異種発現系で再生することができることを証明するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の同時発現を行った。Ｔｍｅｍ１００はＣＡ及びＭＯに対してそれぞれ３０％及び２０％の細胞が応答したのに対して、Ｔｍｅｍ１００を使用しないコントロール群においては同一のアゴニストに対して１３％及び８％の細胞しか応答しなかった。興味深いことに、この増強は、ＴＲＰＶ１をＴＲＰＭ８に置換した場合に無効になり（図１１Ｇ、Ｈ）、ＴＲＰＭ８がＴＲＰＶ１のようなＴＲＰＡ１に対する阻害効果を持たないことが示唆された。さらに、Ｔｍｅｍ１００はまた、コントロール群と比較してＣＡに対するＥＣ５０をほぼ１／３に低下させた（図１１Ｊ）。これらの結果は、Ｔｍｅｍ１００がホールセルレベルでのＴＲＰＡ１活性を選択的に増強することを示唆している。重要なことに、この正の効果にはＴＲＰＶ１が存在することが必要である。
【０２９３】
（実施例６：Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１−Ｖ１複合体の単一チャネル開確率をカラシ油に対しては選択的に増加させるが、カプサイシンに対してはそうではない）
【０２９４】
ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１のチャネル特性に対するＴｍｅｍ１００の効果を分析するために、セルアタッチ法による単一チャネル記録を行った。Ｔｍｅｍ１００、ＴＲＰＡ１、及びＴＲＰＶ１の種々の組み合わせを発現するＣＨＯ細胞を使用して、ＭＯ及びＣＡＰに対する応答における開確率（Ｐｏ）、単一チャネル活性（ＮＰｏ）、及びコンダクタンスを調査した。パッチ記録におけるＴＲＰＡ１−Ｖ１の存在を、ＣＡＰ及びＭＯの両方に対する単一チャネル応答を用いて確認した。Ｔｍｅｍ１００がＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１と同時発現された場合、ＴＲＰＡ１のＰｏが実質的に増加した；ＴＲＰＡ１の単位単一チャネルコンダクタンスは増加しなかった（図４Ａ、４Ｅ、１１Ｋ、及び１２Ｅ）。Ｔｍｅｍ１００の存在により、ＭＯ及びＣＡに応答する細胞の割合もより高くなった（図１１Ｌ、１１Ｍ）。異なるトランスフェクション比のＴｍｅｍ１００を用いた実験において依然として類似の結果が得られたので、この調整は、ＴＲＰＡ１又はＴＲＰＶ１に対するＴｍｅｍ１００の比に基づいた用量依存効果ではない（図１１Ｉ）。興味深いことに、ＴＲＰＶ１の非存在下でのＴｍｅｍ１００のＴＲＰＡ１との同時発現により、メインコンダクタンス及び単位単一チャネルコンダクタンスの両方についてＴＲＰＡ１のＰｏが有意に減少した（図４Ａ、４Ｅ、１２Ｃ、及び１２Ｅ）。異種発現系及び感覚ニューロンの両方におけるＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１の記録は、複数の単一チャネルサブコンダクタンス状態を示す（Ｎａｇａｔａら，２００５；Ｐｒｅｍｋｕｍａｒら，２００２；Ｓｔａｒｕｓｃｈｅｎｋｏら，２０１０）。このサブコンダクタンスはホールセル応答に影響を及ぼすであろう。したがって、サブコンダクタンスの分布を試験するために、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の単一チャネル活性（ＮＰｏ）に対するＴｍｅｍ１００の効果も分析した。図１２Ａは、Ｔｍｅｍ１００が、Ｐｏに影響を及ぼすのと同一の方法でＴＲＰＡ１のＮＰｏを制御する（すなわち、Ｔｍｅｍ１００がＴＲＰＶ１の存在下でＴＲＰＡ１  ＮＰｏを増加させ、ＴＲＰＶ１が存在しない場合にその活性を減少させる）ことを示している。
【０２９５】
ＴＲＰＶ１の単一チャネルＰｏ及び単位コンダクタンスは、ＣＡＰの適用によって評価したところ、パッチ中にＴＲＰＡ１も存在する場合は相対的にＴｍｅｍ１００の影響を受けなかった（図４Ｂ、４Ｅ、及び１２Ｆ）。しかし、Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＶ１のみを発現するＣＨＯ細胞における単一チャネルのＣＡＰ応答を減少させた；この効果は、ＤＲＧニューロンで遙かに弱かった（図１２Ｋ）。まとめると、これらの結果は、Ｔｍｅｍ１００が内在性のＴＲＰＡ１活性の増加にＴＲＰＶ１が必要であることを示唆している。Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の２つが同時発現されない場合にＴＲＰＡ１チャネル及びＴＲＰＶ１チャネルのそれぞれの内在性活性を阻害する。
【０２９６】
（実施例７：Ｔｍｅｍ１００はＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の両方に結合する）
【０２９７】
Ｔｍｅｍ１００のＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１との機能的相互作用が感覚ニューロン中でアセンブリされた複合体に起因する可能性を試験するために、ＤＲＧライセート由来の免疫共沈降（ｃｏ−ＩＰ）実験を行った。結果は、マウスＤＲＧにおいてＴｍｅｍ１００が内因性のＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１と複合体を形成することを示す（図５Ａ）。さらに、各タンパク質の複合体形成への寄与を調査するために、ＴＲＰＡ１又はＴＲＰＶ１のいずれかと共にＴｍｅｍ１００を同時発現する異種細胞を使用したｃｏ−ＩＰ実験を行った。全長Ｔｍｅｍ１００−ｍｙｃを使用したＣｏ−ＩＰは、Ｔｍｅｍ１００がＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１と個別に複合体を形成することを示唆していた（図５Ｂ、Ｃ）。異なるＴｍｅｍ１００フラグメントを使用したグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン研究により、そのＮ末端及びＣ末端の結合特性をさらに明確に特徴づけた。ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の両方を、Ｔｍｅｍ１００のＣ末端フラグメントを使用して個別にプルダウンすることができるが、Ｔｍｅｍ１００のＮ末端を使用した同一条件ではＴＲＰＶ１のみがプルダウンされた（図５Ｄ）。これらの結果は、Ｔｍｅｍ１００がＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１と物理的に相互作用することができることを示す。
【０２９８】
Ｔｍｅｍ１００のＣ末端中のＫ−Ｒ−Ｒ配列は、正電荷であり、脊椎動物において保存されているので、この配列を標的にした（Ｍｏｏｎら，２０１０）。この配列の機能的有意性を調査するために、この配列を無電荷のＱ−Ｑ−Ｑ配列に変異させた（Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ変異体）。興味深いことに、Ｑ−Ｑ−Ｑ変異は、ＴＲＰＡ１結合及びＴＲＰＶ１結合に異なる効果を発揮するようであった。ＴＲＰＡ１については、Ｑ−Ｑ−Ｑ変異をＣ末端に導入すると（ＧＳＴ−Ｃ−３Ｑ）結合が消失した。ＴＲＰＶ１については、この変異によって結合が弱くならないようであり、その代わりに増強された（図５Ｄ及び１３Ａ、Ｂ）。これらのデータは、Ｔｍｅｍ１００のＣ末端はＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の両方に結合するが、これら２つのチャネルへのその結合部位は異なることを示す。したがって、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑは、野生型Ｔｍｅｍ１００と比較してＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１に対して異なる調整効果を発揮することができる。
【０２９９】
（実施例８：野生型Ｔｍｅｍ１００は、ＴＲＰＡ１−Ｖ１の物理的会合を弱めるのに対して、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑは増強する）
【０３００】
フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）及び全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法を使用して、ＴＲＰＡ１−Ｖ１複合体に対するＴｍｅｍ１００の調整機構の物理的証拠を調査した。ＴＲＰＶ１−ＣＦＰ及びＴＲＰＡ１−ＹＦＰを同時発現する細胞は、ＴＲＰＶ１−ＣＦＰ及び膜係留ＹＦＰを同時発現する細胞よりＦＲＥＴ効率が有意に高かった（図５Ｅにおける「Ａ１−Ｖ１」対「Ｍ−Ｖ１」）。これは、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１が原形質膜内で複合体を形成することを意味する。顕著には、野生型Ｔｍｅｍ１００は表面ＴＲＰＡ１−Ｖ１相互作用を弱め、ＦＲＥＴ効率を、ＴＲＰＡ１−Ｖ１のみを発現する細胞の効率と比較して３４％低下させた。対照的に、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑ変異体は、ＴＲＰＡ１−ＴＲＰＶ１相互作用を４３％増大させた（図５Ｅ、Ｆ）。これらのデータは、Ｔｍｅｍ１００がＴＲＰＡ１／ＴＲＰＶ１複合体の物理的相互作用を調整し、野生型Ｔｍｅｍ１００及びＴｍｅｍ１００−３Ｑがこれらの相互作用に逆の効果を発揮することが示唆される。個別のＦＲＥＴ−ＴＩＲＦ実験では、ＴＲＰＡ１とＴｍｅｍ１００との間の物理的相互作用はＴＲＰＶ１の存在下でさらに増大することが見出されたのに対して、ＴＲＰＶ１とＴｍｅｍ１００との間の物理的相互作用はＴＲＰＡ１に影響を受けない（図１３Ｃ、Ｄ）。さらに、ＴＲＰＡ１とＴｍｅｍ１００との相互作用は、ＴＲＰＶ１とＴｍｅｍ１００との間の相互作用より弱い（図１３Ｃ、Ｄにおける「Ｖ１−Ｔ１００」カラムと「Ａ１−Ｔ１００」カラムとの比較）。ＦＲＥＴデータは、３つの成分間の優先的相互作用を示唆している。この結果はまた、３つのタンパク質間の物理的相互作用はアロステリック相互作用ではないが、特定の相互作用ドメインを介して生じることを示す。
【０３０１】
（実施例９：Ｔｍｅｍ１００−３Ｑは、ＴＲＰＡ１−Ｖ１複合体中のＴＲＰＡ１媒介性単一チャネル活性を選択的に阻害する）
【０３０２】
Ｔｍｅｍ１００−３Ｑのさらなる機能調査により、変異Ｔｍｅｍ１００が−６０ｍＶでＴＲＰＡ１媒介性単一チャネル特性に対して野生型Ｔｍｅｍ１００と逆の効果があることが明らかとなった（図６Ａ〜Ｅ及び１４Ａ〜Ｄ）。ＴＲＰＡ１−Ｖ１同時発現細胞において、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑが単一チャネルのＭＯ誘発性Ｐｏを有意に減少させ、単位コンダクタンスを中程度に変化させることが見出された（図６Ａ、Ｅ、及び１４）。同様に、ホールセルのＭＯ活性化電流密度は、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑを持たないコントロール細胞よりもＴｍｅｍ１００−３Ｑを含むＴＲＰＡ１−Ｖ１同時発現細胞で有意に低かった（図６Ｆ）。カルシウム画像化アッセイによって類似の結果を得た（図６Ｇ）。Ｔｍｅｍ１００−３Ｑはまた、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の両方を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＭＯ及びＣＡに応答した細胞の割合を低下させた（図１１Ｌ、Ｍ）。ＴＲＰＡ１−Ｖ１細胞におけるＭＯ応答と異なり、ＴＲＰＡ１−Ｖ１細胞においてＣＡＰによって誘導されたＴＲＰＶ１媒介性単一チャネル活性は、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑの存在下で相対的に不変であった（図６Ｂ、Ｄ、Ｅ）。
【０３０３】
野生型Ｔｍｅｍ１００と同様に、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑはまた、ＴＲＰＡ１及びＴＲＰＶ１の各ホモポリマーに状況依存的な調整効果を発揮する。Ｔｍｅｍ１００−３Ｑは、ＴＲＰＶ１のみを発現する細胞の単一チャネル応答を軽減させたのに対して、ＴＲＰＡ１のみを含む細胞においてＴＲＰＡ１応答に効果がなかった（図６Ａ、Ｂ）。ＴＲＰＶ１発現ＣＨＯ細胞由来のＣＡＰ応答は、Ｔｍｅｍ１００−３Ｑを添加するとＮＰｏだけでなくそのＰｏも低下させることを示した（図６Ｂ、１４Ｂ、Ｄ）。対照的に、ＴＲＰＡ１媒介性単一チャネルの開確率（Ｐｏ）又は活性（ＮＰｏ）に対するＴｍｅｍ１００−３Ｑの調整効果は、ＴＲＰＡ１発現細胞で認められなかった（図６Ａ、１４Ａ、Ｃ）。要約すれば、これらのデータは、Ｔｍｅｍ１００−３ＱがＴＲＰＶ１の存在下のみで内因性及びホールセルのＴＲＰＡ１活性に影響をおよぼすことを示唆している。
【０３０４】
（実施例１０：Ｔｍｅｍ１００−３Ｑを模倣する細胞透過性ペプチドは、ＴＲＰＡ１活性を弱化し、疼痛を抑制する）
【０３０５】
細胞研究及び行動研究の両方においてＴＲＰＡ１媒介性活性を選択的に弱化するために、細胞透過性ペプチド（細胞内タンパク質活性を有効に調整するために使用されているアプローチ）を利用した（Ｋｏｒｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，２０１２）。Ｔ１００−Ｍｕｔ（Ｔｍｅｍ１００−３ＱのＣ末端配列を共有するペプチド）（図７Ａ）をデザインし、合成した。さらに、このペプチドのＮ末端を、ペプチドを原形質膜の細胞内側に透過して局在化させるミリストイル化基と抱合し（Ｎｅｌｓｏｎら，２００７）、それによりＴｍｅｍ１００−３Ｑのトポロジーを模倣した（図８Ｄ）。
【０３０６】
細胞レベルで、Ｔ１００−Ｍｕｔは、ＴＲＰＡ１−Ｖ１複合体におけるＴＲＰＡ１媒介性活性の低下によって全長Ｔｍｅｍ１００−３Ｑの効果を模倣していた。Ｔ１００−Ｍｕｔの前処理により、ＩＢ４陰性ＤＲＧニューロン内の１０μΜ  ＭＯに対する応答が選択的に減少した（図７Ｂ）。しかし、ペプチドは、同一集団中の１００ｎＭ  ＣＡＰに対する応答に効果がなかった（図７Ｂ）。結果は、異種系で非常に一貫性があった。Ｔ１００−Ｍｕｔ処置により、ＭＯに応答する細胞の割合が６５％低下した（図７Ｃ）。これらの結果は、Ｔ１００−Ｍｕｔが主にＴＲＰＡ１関連活性を低下させるが、ＴＲＰＶ１関連活性を低下させなかったことを示唆している。野生型Ｃ末端を有する配列を共有するＣＰＰ（Ｔ１００−ＷＴ）も試験した。結果は、Ｔ１００−ＷＴがＴＲＰＡ１−Ｖ１複合体に対する調整効果を持たないことを示す（図７Ｃ）。
【０３０７】
次に、Ｔ１００−Ｍｕｔが疼痛行動に対して対応する阻害効果を有するかどうかを試験した。Ｔ１００−Ｍｕｔ注射した野生型動物は、ＭＯ誘導性の疼痛行動が軽減したことを示した（図７Ｄ）。Ｔ１００−Ｍｕｔ処置は、スクランブルペプチド処置群（８０±９ｓ）と比較して急性侵害防御行動が有意に減少した（３６±６ｓ）。機械的痛覚過敏もＴ１００−Ｍｕｔによって有意に弱化された（図７Ｄ）。しかし、Ｔ１００−Ｍｕｔは、ＣＡＰによって誘導された急性侵害防御行動を変化させなかった（図７Ｆ）。ＣＦＡモデルで以下の類似の結果が得られた：Ｔ１００−Ｍｕｔ処置の３時間後、マウスは、機械的痛覚過敏が弱化したが熱痛覚過敏は弱化しなかった（図７Ｅ）。機械的痛覚過敏の閾値は、Ｔ１００−Ｍｕｔ処置群で有意に高かった。これら２群間で熱痛覚過敏レベルは類似していた。Ｔ１００−Ｍｕｔはまた、パクリタキセル（タキソール）（副作用としてＴＲＰＡ１依存性神経障害を発症する一般的に使用される化学療法薬）（Ｍａｔｅｒａｚｚｉら，２０１２）によって誘導された機械的痛覚過敏を緩和した（図７Ｇ）。さらに、Ｔ１００−Ｍｕｔの最初の１８アミノ酸からなる短縮ＣＰＰ（Ｆ２と呼ぶ）は同一の阻害効果を得ることができるのに対して、Ｔ１００−ＭｕｔのＣ末端の異なる領域を含む２つの他の短縮ＣＰＰは効果がなかった（図１５Ａ、Ｂ）。まとめると、これらのデータは、Ｔｍｅｍ１００のＣ末端の最初の４つのアミノ酸、すなわち、「ＷＫＶＲ」（配列番号２１）及び３Ｑ変異がＴＲＰＡ１／Ｖ１複合体におけるＴＲＰＡ１に対するＴＭＥＭ１００−３Ｑの阻害効果に不可欠であること、そして、この効果がＴＭＥＭ１００−３ＱのＴＲＰＶ１との相互作用の増強に起因する可能性が高いことを示唆している。さらに、Ｔｒｐｖ１−／−マウスにおけるＭＯ誘導性急性疼痛及び機械的痛覚過敏に対してはＴ１００−Ｍｕｔの効果はなかった（図７Ｈ、Ｉ）。Ｔ１００−Ｍｕｔ及びＨＣ−０３００３１（直接ＴＲＰＡ１拮抗剤）（Ｅｉｄら，２００８）の効果も比較し、Ｔ１００−ＭｕｔがＴＲＰＡ１拮抗剤として神経因性疼痛に対して類似又はより良好な阻害有効性及び阻害効力を示すことが見出された（図１５Ｃ、Ｄ）。これらの行動データは、Ｔ１００−ＭｕｔがＴＲＰＡ１関連疼痛を選択的に緩和し、この効果がＴＲＰＶ１依存性であることを証明している。
【０３０８】
（実施例１１：Ｔｍｅｍ１００変異ペプチドは進行中の疼痛を遮断する）
【０３０９】
患者にとって最も厄介な進行中の（すなわち、自発性の）疼痛は、処置及び動物における研究が困難である。条件付け場所嗜好性試験は、非誘発性の進行中の疼痛の存在及び疼痛緩和を明らかにするために首尾よく開発されており、動物が疼痛緩和処置と組み合わせた状況を優先することに基づいている。条件付け場所嗜好性はまた、疼痛の有害な側面を把握することもできる。顕著には、多くの研究により、齧歯類の条件付け場所嗜好性試験がヒトへの臨床処置の有効性を的確に反映していることが示されている。したがって、この試験は、進行中の疼痛の新規の処置の潜在的有効性及び緩和機構を調査するための強力なアプローチである。２つの以前の研究では、条件付け場所嗜好性試験によって進行中の疼痛におけるＴＲＰＡ１の役割が試験されている。しかし、両研究では、アンタゴニストによるＴＲＰＡ１の阻害が誘発された機械的痛覚過敏を強力に遮断するが、慢性疼痛モデルによって誘導された進行中の疼痛を遮断しなかった。これらの結果は、誘発された疼痛と進行中の疼痛の異なる機構を強調している。これらの研究で使用したアンタゴニスト（ＨＣ０３００３１及びＣｈｅｍ５８６１５２８）がＴＲＰＡ１単量体を標的にするので、Ｔ１００−ＭｕｔがＴＲＰＡ１／Ｖ１複合体の調整によって進行中の疼痛を抑制することができる可能性がある。この可能性を、条件付け場所嗜好性試験を使用してＳＮＬ誘導性の進行中の疼痛を有する齧歯類において試験した。データは、１回の用量が１０μｌの５０μΜヒトＴ１００−Ｍｕｔペプチド（Ｐ２−Ｍｕｔとも呼ばれる）のＳＮＬラットへの髄腔内注射により頑強な条件付け場所嗜好性が誘導されることを示し、それによりＴ１００−Ｍｕｔが進行中の疼痛を実際に遮断することが示唆され；スクランブルペプチドは効果がなかった（図１６Ａ）。ポジティブコントロールとしてガバペンチン（神経因性疼痛を緩和することが公知の鎮痛薬）を全身投与した（図１６Ｂ）。
【０３１０】
（実施例１２：コンディショナルノックアウトマウスモデルにおけるＴｍｅｍ１００及び掻痒）
【０３１１】
現在のエビデンスではＴｍｅｍ１００は掻痒で役割を果たすことが示唆されている。Ｔｍｅｍ１００コンディショナルノックアウトマウスには掻痒表現型が存在する：これらのマウスは背中へのヒスタミン注射による引っ掻き応答が欠損している（図１６）。一定範囲の掻痒表現型を調査するために、多様な掻痒誘発物質が、Ｔｍｅｍ１００欠損ＤＲＧニューロンに対するカルシウム画像化において、及び、Ｔｍｅｍ１００コンディショナルノックアウトマウスに対する行動アッセイによって試験されるであろう。
【０３１２】
（実施例１３：ヒトＴｍｅｍ１００−３Ｑ  ＣＰＰは、神経損傷による神経因性疼痛を緩和する）
【０３１３】
脊髄神経結紮（ＳＮＬ）を行った野生型マウスでは、結紮の６日後に機械的痛覚過敏が認められる。ヒトＴｍｅｍ１００−３ＱのＣ末端に合わせたパルミトイル化（Ｐａｌ）ＣＰＰは、ＳＮＬにおける神経因性疼痛／機械的異痛症を緩和する。ｎ＝６、＊６日目のＣＰＰ処置から４時間後にｐ＜０．０５。スクランブルペプチド：白抜きのバー；ヒトＰ２−Ｍｕｔ（Ｔ１００−Ｍｕｔ）：黒色のバー（図１７）。ペプチド（２ｍＭで５μｌ）を、後足に皮内注射した。ＳＮＬ実験で使用したＣＰＰの配列は以下である：
【０３１４】
ヒトＰ２−Ｍｕｔ（Ｔ１００−Ｍｕｔ）Ｐａｌ−ＷＫＶＲＱＲＳＫＫＡＱＱＱＥＳＱＴＡＬＶＡＮＱＲＳＬＦＡ−ＯＨ（配列番号７）；スクランブルＰａｌ−ＱＲＡＬＥＱＶＬＱＮＷＳＲＲＡＮＶＫＱＡＱＫＦＱＶＫＳＴ−ＯＨ（配列番号１９）。Ｐａｌ−各ＣＰＰのＮ末端のパルミトイル化。
【０３１５】
（実施例１４：ＴＲＰＶ１とＴＲＰＡ１との間の機能的相互作用）
【０３１６】
ＴＲＰＶ１とＴＲＰＡ１との間の機能的相互作用は、幾つかの方法で生じ得（Ｊｕｌｉｕｓ、２０１３）、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１は、細胞内経路の活性化によって相互の活性を調整することができる。例えば、ＴＲＰＡ１の活性化によりＣａ２＋が流入し、それによりＣａ２＋依存性ホスファターゼが誘発されてＴＲＰＶ１活性を脱感作し得る（Ａｋｏｐｉａｎら，２００７）。あるいは、ＴＲＰＡ１惹起性Ｃａ２＋流入によりプロテインキナーゼＡ活性が促進され、それによりＴＲＰＶ１チャネルを感作することができる（Ｓｐａｈｎら，２０１４）。行動実験により、ＭＯによるＴＲＰＡ１活性化によってｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＲＰＶ１応答の機能的脱感作が起こることが証明された（Ｊａｃｑｕｏｔら，２００５；Ｒｕｐａｒｅｌら，２００８）。同様に、ＴＲＰＶ１の活性化によってｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＲＰＡ１活性を減少させることができる（Ａｋｏｐｉａｎら，２００７；Ｊａｃｑｕｏｔら，２００５；Ｒｕｐａｒｅｌら，２００８）。これらの機能的ＴＲＰＶ１−ＴＲＰＡ１相互作用の重要な要因は、チャネルが連続的に活性化される必要があることである。
【０３１７】
本明細書中に記載のように、別の機構は、複合体内でのＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１の相互作用であり得る。実際に、ＴＲＰチャネルがチャネル複合体にアセンブリすることができることが証明されている（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，２００５；Ｓｔｒｕｂｉｎｇら，２００３）。ＴＲＰ複合体内での物理的相互作用は、チャネルの高次構造を変化させ、従って、各ＴＲＰチャネルの生物物理学的な特性及び調節上の特性に影響を及ぼす（Ｘｕら，１９９７）。ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１が異種発現系及び感覚ニューロンにおいて複合体を形成することができることが証明された（Ａｋｏｐｉａｎら，２００７；Ｆｉｓｃｈｅｒら，２０１４；Ｓｔａｒｕｓｃｈｅｎｋｏら，２０１０）。かかる複合体の形成は、ＴＲＰＡ１の性質に強く影響を及ぼし得る（Ｐａｔｉｌら，２０１１；Ｓａｌａｓら，２００９）。したがって、本明細書中に記載のように、感覚ニューロン中のＴＲＰＶ１−ＴＲＰＡ１複合体の組成及び機能が解明され、複合体内での制御のためのＴＲＰＶ１活性の要件も解明される。
【０３１８】
（参照による援用）
【０３１９】
本明細書中に開示の全ての特許、公開された特許出願、及び他の文献は、その全体が本明細書中で参考として明確に援用される。
【０３２０】
（均等物）
【０３２１】
当業者は、日常的実験しか使用せずに本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態の多数の均等物を認識するか確認することができる。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０３２２】
本明細書中の任意の変数の定義中の要素のリストには、列挙した要素の任意の単一の要素又は組み合わせ（又はサブコンビネーション）としての変数の定義が含まれる。本明細書中の実施形態には、任意の単一の実施形態、任意の他の実施形態との組み合わせ、又はその一部として実施形態が含まれる。
【０３２３】
（他の実施形態）
【０３２４】
本発明をその詳細な説明と併せて記載しているが、前述の説明は、本発明を例示することを意図すると同時に、本発明の範囲を制限せず、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって制限される。他の態様、利点、及び修正形態は、以下の特許請求の範囲の範囲に含まれる。
【０３２５】
本明細書中で参照された特許及び科学論文は、当業者に利用可能な知識を提供する。本明細書中に引用された全ての米国特許及び公開又は非公開の米国特許出願は、参考として援用される。本明細書中に引用された全ての公開外国特許及び親出願は、本明細書中で参考として援用される。本明細書中に引用された受入番号によって示したＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩの提出物は、参考として援用される。本明細書中に引用された全ての他の公開された文献、書類、原稿、及び科学論文は、本明細書中で参考として援用される。
【０３２６】
本発明をその好ましい実施形態を参照して特に表示及び記載しているが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなくその形態及び詳細を多様に変化させることができることが、当業者によって理解されるであろう。
【図１】
2017507182.tif 000003
【図２】
2017507182.tif 000004
【図３】
2017507182.tif 000005
【図４】
2017507182.tif 000006
【図５】
2017507182.tif 000007
【図６】
2017507182.tif 000008
【図７】
2017507182.tif 000009
【図８】
2017507182.tif 000010
【図９】
2017507182.tif 000011
【図１０】
2017507182.tif 000012
【図１１】
2017507182.tif 000013
【図１２】
2017507182.tif 000014
【図１３】
2017507182.tif 000015
【図１４】
2017507182.tif 000016
【図１５】
2017507182.tif 000017
【図１６】
2017507182.tif 000018
【図１７】
2017507182.tif 000019
【図１８】
2017507182.tif 000020
【配列表】
2017507182000001.app
【国際調査報告】
2017507182.tif 000021
2017507182.tif 000022
2017507182.tif 000023
2017507182.tif 000024