(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、対象とするタンパク質の中で、またはＮ末端ペプチド／ポリペプチドとＣ末端ペプチド／ポリペプチドとの間で内部に挿入される実質的に非発光性のペプチド／ポリペプチドタグである。内部に挿入されたタグと、また実質的に非発光性である相補体ポリペプチド／ペプチドとの相互作用により生物発光レポーター複合体の形成が生じる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端断片と、Ｃ末端断片と、内部タグとを含むポリペプチドであって、前記内部タグが、対象とするタンパク質の中に挿入された配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記内部タグが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記Ｎ末端断片及び前記Ｃ末端断片の両方が、少なくとも２アミノ酸の長さである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｎ末端断片及び／又は前記Ｃ末端断片が、少なくとも２０アミノ酸の長さである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記内部タグが、配列番号２のペプチドに比べて１つ以上の形質の向上を示し、前記形質が、配列番号４４０のポリペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び配列番号４４０のポリペプチドと組み合わせたときの生物発光活性から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記内部タグの前記アミノ酸配列が、表１のペプチドから選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｎ末端断片と前記Ｃ末端断片とが、前記内部タグの非存在下で直接連結される場合、対象とする第１のタンパク質の配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記内部タグが、リンカーペプチドによって前記Ｎ末端断片及び／又は前記Ｃ末端断片に接続される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
【請求項９】
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドと、
（ｂ）配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ポリペプチドを含む第２のポリペプチドと、
を含む、生物発光複合体。
【請求項１０】
前記内部タグ及び前記相補体ポリペプチドが、互いに低親和性を有する、請求項９に記載の生物発光複合体。
【請求項１１】
前記第２のポリペプチドが、対象とする第２のタンパク質との融合体である、請求項１０に記載の生物発光複合体。
【請求項１２】
前記融合体が、内部融合体又は従来の融合体である、請求項１１に記載の生物発光複合体。
【請求項１３】
前記対象とする第２のタンパク質が、前記Ｎ末端断片及び／又は前記Ｃ末端断片のすべて又は一部に対して高親和性を有する、請求項１２に記載の生物発光複合体。
【請求項１４】
前記第２のポリペプチドが、対象とする分子に連結されている、請求項１０に記載の生物発光複合体。
【請求項１５】
前記Ｎ末端断片及び／又は前記Ｃ末端断片のすべて又は一部が、前記対象とする分子に対して高親和性を有する、請求項１４に記載の生物発光複合体。
【請求項１６】
セレンテラジン基質を更に含む、請求項９に記載の生物発光複合体。
【請求項１７】
前記内部タグ及び前記相補体ポリペプチドが、互いに高親和性を有する、請求項９に記載の生物発光複合体。
【請求項１８】
前記第２のポリペプチドが、融合ポリペプチドではないか、又は対象とする分子に連結されていない、請求項９に記載の生物発光複合体。
【請求項１９】
前記相補体ポリペプチドの前記アミノ酸配列が、表２のペプチドから選択される、請求項９に記載の生物発光複合体。
【請求項２０】
Ｎ末端断片と、Ｃ末端断片と、内部タグとを含むポリペプチドであって、前記内部タグが、対象とするタンパク質の中に挿入された配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、検出ペプチドが配列番号２のポリペプチドに接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、前記ポリペプチド。
【請求項２１】
前記Ｎ末端断片及び前記Ｃ末端断片の両方が、少なくとも２０アミノ酸の長さである、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記Ｎ末端断片及び／又は前記Ｃ末端断片が、少なくとも５０アミノ酸の長さである、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記内部タグが、配列番号４４０のペプチドと比べて１つ以上の形質の向上を示し、前記形質が、配列番号２のポリペプチドに対する親和性、発現、細胞内溶解性、細胞内安定性、及び配列番号２のポリペプチドと組み合わせたときの生物発光活性から選択される、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記内部タグの前記アミノ酸配列が、表２のペプチドから選択される、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記Ｎ末端断片及び前記Ｃ末端断片が、前記内部タグの非存在下で直接連結される場合、対象とする第１のタンパク質の配列を含む、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２０に記載のポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
【請求項２７】
（ａ）請求項２０に記載のポリペプチドと、
（ｂ）配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ペプチドと、
を含む、生物発光複合体。
【請求項２８】
前記内部タグ及び前記相補体ペプチドが、互いに低親和性を有する、請求項２７に記載の生物発光複合体。
【請求項２９】
前記相補体ペプチドが、対象とする第２のタンパク質との融合体である、請求項２８に記載の生物発光複合体。
【請求項３０】
前記融合体が、内部融合体又は従来の融合体である、請求項２９に記載の生物発光複合体。
【請求項３１】
前記対象とする第２のタンパク質が、前記Ｎ末端断片及び／又は前記Ｃ末端断片のすべて又は一部に対して高親和性を有する、請求項３０に記載の生物発光複合体。
【請求項３２】
前記相補体ペプチドが、対象とする分子に連結されている、請求項２８に記載の生物発光複合体。
【請求項３３】
前記Ｎ末端断片及び／又は前記Ｃ末端断片のすべて又は一部が、前記対象とする分子に対して高親和性を有する、請求項２７に記載の生物発光複合体。
【請求項３４】
セレンテラジン基質を更に含む、請求項２７に記載の生物発光複合体。
【請求項３５】
前記内部タグ及び前記相補体ペプチドが、互いに高親和性を有する、請求項２７に記載の生物発光複合体。
【請求項３６】
前記相補体ペプチドが、表１の前記ペプチドから選択される、請求項２７に記載の生物発光複合体。
【請求項３７】
前記相補体ペプチドが、融合ポリペプチドではないか、又は対象とする分子に連結されていない、請求項９に記載の生物発光複合体。
【請求項３８】
第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での安定な相互作用の検出方法であって、
（ａ）内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもＣ末端にもないように、内部タグを第１のアミノ酸配列に挿入することによって内部融合体を作り出す工程であって、前記内部タグが、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記内部タグが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｂ）第２のアミノ酸配列と相補体ポリペプチドとの第２の融合体を作り出す工程であって、前記相補体ポリペプチドが、配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記相補体ポリペプチドが配列番号２のペプチドに接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｃ）前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間で見込まれる安定な相互作用を生じさせる条件に、前記内部融合体と、第２の融合体と、セレンテラジン基質とを置く工程と、
（ｄ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間での安定な相互作用を示す、工程と、
を含む、前記検出方法。
【請求項３９】
前記第２の融合体が、内部融合体又は従来の融合体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記内部融合体が、前記第１のアミノ酸配列と前記内部タグとをコードする第１の核酸配列から発現され、前記第２の融合体が、前記第２のアミノ酸配列と前記相補体ポリペプチドとをコードする第２の核酸配列から発現される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
単一のベクターが、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列とを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、別個のベクターにある、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
工程（ａ）及び（ｂ）が、細胞内で前記内部融合体と第２の融合体とを発現させる工程を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での安定な相互作用の検出方法であって、
（ａ）内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもＣ末端にもないように、内部タグを第１のアミノ酸配列に挿入することによって内部融合体を作り出す工程であって、前記内部タグが、配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記内部タグが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｂ）第２のアミノ酸配列と相補体ペプチドとの第２の融合体を作り出す工程であって、前記相補体ペプチドが、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記相補体ペプチドが配列番号４４０のポリペプチドに接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｃ）前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間で見込まれる安定な相互作用を生じさせる条件に、前記内部融合体と、第２の融合体と、セレンテラジン基質とを置く工程と、
（ｄ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間での安定な相互作用を示す、工程と、
を含む、前記検出方法。
【請求項４５】
前記第２の融合体が、内部融合体又は従来の融合体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記内部融合体が、前記第１のアミノ酸配列と前記内部タグとをコードする第１の核酸配列から発現され、前記第２の融合体が、前記第２のアミノ酸配列と前記相補体ペプチドとをコードする第２の核酸配列から発現される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
単一のベクターが、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列とを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列が、別個のベクターにある、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ａ）及び（ｂ）が、細胞内で前記内部融合体と第２の融合体とを発現させる工程を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
試料における標的ポリペプチドの検出方法であって、
（ａ）内部タグが標的ポリペプチドのＮ末端にもＣ末端にもないように、内部タグを標的ポリペプチドに挿入することによって内部融合体を作り出す工程であって、前記内部タグが、配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記内部タグが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｂ）前記試料に
（ｉ）配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ペプチドと、
（ｉｉ）セレンテラジン基質と、
を加える工程と、
（ｃ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記試料における前記標的ポリペプチドの存在を示す、工程と、
を含む、前記検出方法。
【請求項５１】
前記試料が、細胞を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
工程（ａ）が、前記細胞内で前記内部融合体を発現させる工程を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
工程（ｂ）（ｉ）が、前記細胞中の前記相補体ペプチドを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
試料における標的ポリペプチドの検出方法であって、
（ａ）内部タグが標的ポリペプチドのＮ末端にもＣ末端にもないように、内部タグを標的ポリペプチドに挿入することによって内部融合体を作り出す工程であって、前記内部タグが、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記内部タグが配列番号４４０のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｂ）前記試料に
（ｉ）配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ポリペプチドと、
（ｉｉ）セレンテラジン基質と、
を加える工程と、
（ｃ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記試料における前記標的ポリペプチドの存在を示す、工程と、
を含む、前記検出方法。
【請求項５５】
前記試料が、細胞を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
工程（ａ）が、前記細胞内で前記内部融合体を発現させる工程を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
工程（ｂ）（ｉ）が、前記細胞中の前記相補体ポリペプチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
検出試薬であって、
（ａ）配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む相補体ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列番号２のペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、相補体ポリペプチドと、
（ｂ）前記ポリペプチドと配列番号２のペプチドとによって生成される生物発光複合体のための基質と、
を含む、前記検出試薬。
【請求項５９】
検出試薬であって、
（ａ）配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む相補体ペプチドであって、前記ペプチドが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、相補体ペプチドと、
（ｂ）前記ペプチドと配列番号４４０のポリペプチドとによって生成される生物発光複合体のための基質と、
を含む、前記検出試薬。
【請求項６０】
第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用の、潜在的阻害剤による変化の検出方法であって、
（ａ）内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもＣ末端にもないように、内部タグを第１のアミノ酸配列に挿入することによって内部融合体を作り出す工程であって、前記内部タグが、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記内部タグが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｂ）第２のアミノ酸配列と相補体ポリペプチドとの第２の融合体を作り出す工程であって、前記相補体ポリペプチドが、配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記相補体ポリペプチドが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｃ）前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間で見込まれる安定な相互作用を生じさせる条件に、前記内部融合体と、第２の融合体と、セレンテラジン基質とを置く工程と、
（ｄ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間での安定な相互作用を示す、工程と、
（ｅ）前記内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質とに潜在的阻害剤を加える工程と、
（ｆ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程と、
（ｇ）工程（ｄ）と（ｆ）の前記生物発光シグナルを比較する工程であって、工程（ｄ）から工程（ｆ）への生物発光シグナルの低下が、前記潜在的阻害剤による前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間での前記相互作用の阻害を示す、工程と、
を含む、前記検出方法。
【請求項６１】
工程（ａ）及び（ｂ）が、細胞内で前記内部融合体と第２の融合体とを発現させる工程を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記潜在的阻害剤が、ペプチド又は小分子である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用の、潜在的阻害剤による変化の検出方法であって、
（ａ）内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもＣ末端にもないように、内部タグを第１のアミノ酸配列に挿入することによって内部融合体を作り出す工程であって、前記内部タグが、配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記内部タグが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｂ）第２のアミノ酸配列と相補体ポリペプチドとの第２の融合体を作り出す工程であって、前記相補体ポリペプチドが、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記相補体ポリペプチドが配列番号４４０のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、工程と、
（ｃ）前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間で見込まれる安定な相互作用を生じさせる条件に、前記内部融合体と、第２の融合体と、セレンテラジン基質とを置く工程と、
（ｄ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの検出が、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間での安定な相互作用を示す、工程と、
（ｅ）前記内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質とに潜在的阻害剤を加える工程と、
（ｆ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程と、
（ｇ）工程（ｄ）と（ｆ）の前記生物発光シグナルを比較する工程であって、工程（ｄ）から工程（ｆ）への生物発光シグナルの低下が、前記潜在的阻害剤による前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列との間での前記相互作用の阻害を示す、工程と、
を含む、前記検出方法。
【請求項６１】
工程（ａ）及び（ｂ）が、細胞内で前記内部融合体と第２の融合体を発現させる工程を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記潜在的阻害剤が、ペプチド又は小分子である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
第１のアミノ酸配列の構造配座の決定方法であって、
（ａ）内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもＣ末端にもないように、内部タグを第１のアミノ酸配列に挿入することによって内部融合体を作り出す工程であって、前記内部タグが、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記内部タグが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成され、前記第１のアミノ酸配列の第１の構造配座が、前記内部タグへのアクセスを妨害し、前記第１のアミノ酸配列の第２の構造配座が、前記内部タグへのアクセスを可能にする、工程と、
（ｂ）前記内部融合体と、（ｉ）配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ポリペプチド又は（ｉｉ）第２のアミノ酸配列及び前記相補体ポリペプチドの第２の融合体のいずれかとをセレンテラジン基質の存在下に置く工程と、
（ｃ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの非存在が、前記第１のアミノ酸配列が前記第１の構造配座を採用していることを示し、前記生物発光シグナルの存在が、前記第１のアミノ酸配列が前記第２の構造配座を採用していることを示す、工程と
を含む、前記決定方法。
【請求項６４】
工程（ｃ）が、
（ｉ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの非存在が、前記第１のアミノ酸配列が前記第１の構造配座を採用していることを示す、工程と、
（ｉｉ）前記第１のアミノ酸配列において配座変化を誘導する工程と、
（ｉｉｉ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの存在が、前記第１のアミノ酸配列が前記第２の構造配座を採用していることを示す、工程と
を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
配座変化を誘導する工程が、前記第１のアミノ酸配列の一部を切断するプロテアーゼを加えること、前記第１のアミノ酸配列に結合する作用剤の添加、及びアッセイ条件を変更することから選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
第１のアミノ酸配列の構造配座の決定方法であって、
（ａ）内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもＣ末端にもないように、内部タグを第１のアミノ酸配列に挿入することによって内部融合体を作り出す工程であって、前記内部タグが、配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、前記内部タグが配列番号２のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成され、前記第１のアミノ酸配列の第１の構造配座が、前記内部タグへのアクセスを妨害し、前記第１のアミノ酸配列の第２の構造配座が、前記内部タグへのアクセスを可能にする、工程と、
（ｂ）前記内部融合体と、（ｉ）配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ペプチド又は（ｉｉ）第２のアミノ酸配列及び前記相補体ペプチドの第２の融合体のいずれかとをセレンテラジン基質の存在下に置く工程と、
（ｃ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの非存在が、前記第１のアミノ酸配列が前記第１の構造配座を採用していることを示し、前記生物発光シグナルの存在が、前記第１のアミノ酸配列が前記第２の構造配座を採用していることを示す、工程と
を含む、前記決定方法。
【請求項６７】
工程（ｃ）が
（ｉ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの非存在が、前記第１のアミノ酸配列が前記第１の構造配座を採用していることを示す、工程と、
（ｉｉ）前記第１のアミノ酸配列において配座変化を誘導する工程と、
（ｉｉｉ）存在する場合には、放射された生物発光シグナルを検出する工程であって、前記生物発光シグナルの存在が、前記第１のアミノ酸配列が前記第２の構造配座を採用していることを示す、工程と
を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
配座変化を誘導する工程が、前記第１のアミノ酸配列の一部を切断するプロテアーゼを加えること、前記第１のアミノ酸配列に結合する作用剤の添加、及びアッセイ条件を変更することから選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
Ｎ末端断片と、Ｃ末端断片と、２つ以上の内部タグとを含むポリペプチドであって、前記内部タグが、対象とするタンパク質の中に挿入された配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記内部タグの１つ以上が配列番号４４０のポリペプチドに接触すると、セレンテラジン基質の存在下で、検出可能な生物発光シグナルが生成される、前記ポリペプチド。
【請求項７０】
前記２つ以上の内部タグが、２つの内部タグである、請求項６９に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
前記２つ以上の内部タグが、互いに直接接続されている、請求項６９に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
前記２つ以上の内部タグが、１つ以上のリンカーによって分離されている、請求項６９に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
前記２つ以上の内部タグが、対象とするタンパク質又はポリペプチド内の単一の位置に挿入されている、請求項６９に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
前記２つ以上の内部タグが、対象とするタンパク質又はポリペプチド内の２つ以上の位置に挿入されている、請求項６９に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
前記２つ以上の内部タグが、同一のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
２つ以上のまたは２つ以上の内部タグが、同一ではないアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１４年９月１２日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６２／０４９，８７５号に対する優先権を主張する。
【０００２】
分野
本明細書で提供されるのは、対象とするタンパク質の中で、またはＮ末端ペプチド／ポリペプチドとＣ末端ペプチド／ポリペプチドとの間で内部に挿入される実質的に非発光性のペプチド／ポリペプチドタグである。内部に挿入されたタグの相補体ポリペプチド／ペプチドとの相互作用により生物発光レポーター複合体が生じる。
【背景技術】
【０００３】
レポーターまたは親和性タグによってタンパク質にタグを付けることはタンパク質の機能及び挙動を解析するのに一般に使用される。一般に、対象とするタンパク質のＣ末端またはＮ末端を用いて遺伝子融合を生成する。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で提供されるのは、対象とするタンパク質の中で、またはＮ末端ペプチド／ポリペプチドとＣ末端ペプチド／ポリペプチドとの間で内部に挿入される実質的に非発光性のペプチド／ポリペプチドタグである。内部に挿入されたタグの相補体ポリペプチド／ペプチドとの相互作用により生物発光レポーター複合体が生じる。
【０００５】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、その中に挿入された内部タグを伴ったタンパク質またはポリペプチドを含む組成物、系、方法等である。一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｃ末端ペプチド／ポリペプチドとＮ末端ペプチド／ポリペプチドとの間に挿入された内部タグを含む組成物、系、方法等である。特定の実施形態では、構造相補体配列（または内部タグ）も提供される（たとえば、遊離のまたは融合として（たとえば、内部のもしくは末端の））。一部の実施形態では、内部タグ及び構造相補体は双方とも実質的に不活性である（たとえば、酵素活性を欠いている（たとえば、実質的に非発光性等））。一部の実施形態では、内部タグ及び構造相補体は互いに高い親和性を有し、溶液にて一緒であれば、複合体（たとえば、安定な複合体）を形成する。他の実施形態では、内部タグ及び構造相補体は互いに低い親和性を有し、外部の因子／力（たとえば、内部タグ及び構造相補体に融合される相互作用要素）によって一緒にされない限り、複合体（たとえば、安定な複合体）を形成しない。一部の実施形態では、内部タグと構造相補体との複合体は検出可能な活性（たとえば、基質の存在下での発光）を生じる。
【０００６】
一部の実施形態では、内部融合体が提供される。一部の実施形態では、内部タグの配列（たとえば、構造相補体と複合体形成すると検出可能な活性を生じるもの）は、対象とするタンパク質の配列またはポリペプチド配列の中で内部に存在する。一部の実施形態では、内部タグは、（ｉ）構造相補体と共に活性のある複合体を形成する内部タグの能力及び（ｉｉ）対象とするタンパク質またはポリペプチドの構造上または活性上の特徴を維持する位置にて対象とするタンパク質またはポリペプチドの配列の中に存在する。一部の実施形態では、対象とするタンパク質またはポリペプチドの対象とする１以上のドメインの構造または活性は、対象とするポリペプチドまたはタンパク質の配列の中での内部タグの存在によって中断されない。一部の実施形態では、内部タグは、それが対象とするタンパク質の表面で表面にアクセス可能に露出されるように対象とするタンパク質の中の位置にて存在する。一部の実施形態では、内部タグは、対象とするタンパク質の構造及び／または活性に対する崩壊を低減する／最少にするように対象とするタンパク質のループにて存在する。
【０００７】
一部の実施形態では、内部タグの配列（たとえば、構造相補体と共に複合体形成すると検出可能な活性を生じるもの）は、Ｃ末端ペプチド／ポリペプチドとＮ末端ペプチド／ポリペプチドとの間で内部に存在する。一部の実施形態では、内部タグは、（ｉ）構造相補体と共に活性のある複合体を形成する内部タグの能力及び（ｉｉ）Ｃ末端及びＮ末端のペプチド／ポリペプチドの構造上または活性上の特徴を維持する位置にてＣ末端及びＮ末端のペプチド／ポリペプチドに連結される。
【０００８】
一部の実施形態では、内部タグ及び相補体ペプチド／ポリペプチドは同一の多重ドメインタンパク質の別々のドメインに融合される及び／またはドメイン内に挿入される。タンパク質の折り畳みまたは配座変化の際、内部タグと相補体との複合体に由来する活性が検出可能である。
【０００９】
一部の実施形態では、内部タグの使用方法が提供される。以下の実施形態の一部は内部タグ及び対象とするタンパク質と共に使用するために記載されている。しかしながら、適宜、それらはＮ末端ペプチド／ポリペプチドとＣ末端ペプチド／ポリペプチドとの間での内部タグと共に使用されてもよい。
【００１０】
一部の実施形態では、会合の際、活性のある複合体を形成する内部タグ及び構造相補体を用いて対象とするタンパク質／ポリペプチドの存在及び／または位置を検出する方法が提供される。一部の実施形態では、内部タグを伴ったポリペプチドの試料（たとえば、細胞、細胞内の位置、試験管内試料等）における存在及び／または位置は、内部タグに対する高い親和性を有する遊離の構造相補体を試料に加えることによって判定される。複合体形成によって生じる活性の検出は対象とするタンパク質／ポリペプチドの存在及び／または位置を示す。一部の実施形態では、内部タグと構造相補体との活性のある複合体は、試験管内試料、細胞溶解物、生きている細胞の中、生きている生物の中等を含むが、これらに限定されない環境にて検出される。
【００１１】
一部の実施形態では、会合の際、活性のある複合体を形成する内部タグ及び構造相補体を用いて対象とするタンパク質と選択される相互作用の相手（たとえば、核酸、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、小分子、脂質等）との間での相互作用を検出する方法が提供される。一部の実施形態では、（ｉ）内部タグを伴った対象とするタンパク質と（ｉｉ）内部タグに対する低い親和性を有する構造相補体に連結された相互作用の相手（たとえば、核酸、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、小分子、脂質等）との相互作用は、内部タグと構造相補体との間で活性のある複合体を形成する際に検出される。一部の実施形態では、相互作用は試験管内試料、細胞溶解物、生きている細胞の中、生きている生物の中等を含むが、これらに限定されない環境にて検出される。
【００１２】
一部の実施形態では、内部タグ及び相補体ペプチド／ポリペプチド（相補体による内部標識または末端標識）によって対象とするタンパク質を標識することによって対象とするタンパク質の中での分子内相互作用を検出する方法が提供される。内部タグと相補体との複合体の形成によって配座変化、折り畳みまたは他の分子内相互作用が検出される。
【００１３】
一部の実施形態では、対象とするタンパク質またはポリペプチドの中に存在する内部タグとその構造相補体の相補性の効率（及び活性のある複合体の形成及び検出可能な発光）は、（ｉ）対象とするタンパク質またはポリペプチドにおける配座変化（たとえば、内部タグの構造相補体へのアクセス性に影響を与える配座変化）、（ｉｉ）対象とするタンパク質またはポリペプチドの分子相互作用（たとえば、薬物との）、及び／または環境変化（たとえば、条件に対する変化）の１以上によって影響を受ける。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ｉ）前から存在するタンパク質の断片ではない、（ｉｉ）実質的に非発光性である、（ｉｉｉ）対象とするタンパク質の中で内部に挿入される、及び（ｉｖ）構造的に相補性のポリペプチド及び／またはペプチドと共に発光複合体を形成するペプチドタグ及び／またはポリペプチドタグを含む組成物である。本明細書で提供されるのはまた、その相補体ポリペプチド及び／またはペプチドとの内部ペプチド及び／またはポリペプチドタグの発光複合体、及びそのような複合体の形成の際、任意で検出可能な生物発光シグナルを生成する方法である。一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、その１以上が、一緒にすると生物発光複合体を作る内部タンパク質タグとして提供される、２以上の実質的に非発光性のペプチド及び／またはポリペプチドである。一部の実施形態では、実質的に非発光性のペプチド及び／またはポリペプチド内部タグとその相補体ポリペプチド／ペプチドとが生物発光複合体を組み立てる。一部の実施形態では、相補体ペプチド／ポリペプチドも内部タグである。他の実施形態では、相補体は末端（たとえば、Ｃ末端のＮ末端）タグである。他の実施形態では、相補体は別のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と会合しない（たとえば、遊離である）。一部の実施形態では、その１以上が内部タンパク質タグである３以上の実質的に非発光性のペプチド及び／またはポリペプチド単位が生物発光複合体を組み立てる（たとえば、三元複合体、三次複合体等）。一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、さもなければ実質的に非発光性の内部タグとその実質的に非発光性の構造相補体との生物発光複合体の形成を介して、内部でタグ付けされたタンパク質またはポリペプチドを検出する技術である。一部の実施形態では、対象とするタンパク質と別の部分（たとえば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、小分子等）との間の相互作用は、対象とするタンパク質の実質的に非発光性の内部タグと内部タグの実質的に非発光性の構造相補体との間での生物発光複合体の形成を検出することによって特定される。一部の実施形態では、そのような組成物は、試験管内試料、細胞溶解物、生きている細胞の中、生きている生物の中等を含むが、これらに限定されない環境にて提供される。
【００１５】
一部の実施形態では、タンパク質の異なる領域間、または多重ドメインタンパク質のドメイン間での相互作用は異なる領域／ドメインを内部タグと相補体で標識することによって検出される。内部タグと相補体の複合体に由来する活性はタンパク質内の相互作用（たとえば、配座変化、折り畳み等）を示す。
【００１６】
一部の実施形態では、実質的に非発光性の内部タグと実質的に非発光性のその構造相補体との複合体は適当な基質の高エネルギー状態への化学反応を触媒し、光が放射される。一部の実施形態では、内部タンパク質タグとその構造相補体との生物発光複合体は基質（たとえば、セレンテラジン、フリマジン等）の存在下で発光を示す。
【００１７】
本明細書に記載されている実施形態は主として、（たとえば、少なくとも１つの実質的に非発光性のタグと実質的に非発光性のその相補体を含む）相補性の発光複合体の形成を記載し、それを参照するけれども、本技術が他の検出可能な特質（たとえば、他の酵素活性、蛍光色素分子の生成、発色団の生成等）に同等に適用できることが言及される。発光に関して本明細書に記載されている実施形態は、実質的に非酵素的に活性があるアミノ酸鎖（たとえば、前から存在するタンパク質の断片ではないペプチド及び／またはポリペプチド）である内部タグと、特定された検出可能な活性（たとえば、酵素活性）も欠く、その実質的に相補性のポリペプチド／ペプチドと、酵素的に活性があるそれらの複合体とに適用されると見なされるべきである。本明細書で提供されるのは、実質的に非酵素的に活性がある内部タグと実質的に非酵素的に活性があるその相補体ペプチド／ポリペプチドとの会合の際、検出可能な活性（たとえば、酵素活性）を生成する方法である。
【００１８】
本発明はさらに、対象とするタンパク質に内部タグを挿入し、内部タグの構造相補体によって他の部分にタグ付けする（たとえば、内部で標識される、末端標識される等）ことによってタンパク質（またはポリペプチド）と別の部分（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、小分子等）との間での分子相互作用（たとえば、一時的な会合、安定な会合、複合体の形成等）の検出のためのアッセイに関し、その際、対象とするタンパク質と他の部分との間での分子相互作用の非存在下ではシグナルは生じない（たとえば、実質的にシグナルはない）が、対象とするタンパク質と他の部分との間での相互作用の際に内部タグとその相補体との検出可能な（たとえば、生物発光性の）複合体が生成される。そのような実施形態では、生物発光複合体の構築は対象とするタンパク質と他の部分の分子相互作用によって行われる。対象とするタンパク質と他の部分が十分に安定な相互作用で関わり合うのであれば、内部タグとその相補体との生物発光複合体が生じ、生物発光シグナルが生成される。対象とするタンパク質と他の部分が十分に安定な相互作用で関わり合うことができなければ、生物発光複合体は生じない、またはごく弱く生じ、生物発光シグナルは生成されない、または実質的に低減される（たとえば、実質的に検出できない、本質的に検出できない、安定な対照シグナルに比べて差別的に検出できる等）。一部の実施形態では、検出可能な生物発光シグナルの大きさは、対象とするタンパク質と他の部分との間での分子相互作用の量、強度、好ましさ及び／または安定性に比例する（たとえば、直接的に比例する）。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号２との１００％未満（たとえば、２０％．．．３０％．．．４０％．．．５０％．．．６０％．．．７０％．．．８０％，９０％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む内部タグであり、その際、該ペプチドが配列番号４４０の相補体ポリペプチドに接触すると検出可能な生物発光シグナルが生成される。一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む内部タグであり、その際、該ペプチドが配列番号４４０の構造的に相補性のポリペプチドに接触すると検出可能な生物発光シグナルが生成される。一部の実施形態では、内部タグが、配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性を有するポリペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。特定の実施形態では、内部タグが配列番号４４０もしくはその一部を含むまたは配列番号４４０もしくはその一部からなるポリペプチドと会合すると検出可能な生物発光シグナルが生成される、またはそれが実質的に上昇する。これらの配列に限定されないが、ペプチドのアミノ酸配列は配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列から選択されてもよい。一部の実施形態では、対象とするタンパク質またはポリペプチドに挿入された（たとえば、タンパク質またはポリペプチドのＣ末端またはＮ末端ではない）上述の内部タグを含むポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、内部タグの構造相補体は単独で、または別の部分（たとえば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、脂質、小分子等）の（たとえば、内部のまたは末端の）タグとして提供される。特定の実施形態では、（ａ）内部タグ（たとえば、Ｎ末端またはＣ末端に位置しない）を有する第１のポリペプチドと、（ｂ）内部タグの構造相補体を含むペプチドまたはポリペプチドとを含む生物発光複合体が提供され、その際、会合すれば、内部タグ及びその構造相補体は適当な基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルを放射する。一部の実施形態では、内部タグは、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、内部タグが基質の存在下で配列番号４４０の構造的に相補性のポリペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。
【００２０】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、配列番号４４０との１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む内部タグであり、その際、内部タグが基質の存在下で配列番号２のペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む内部タグを提供し、その際、内部タグが配列番号２のペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。一部の実施形態では、内部タグが、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性を有するペプチドと接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。そのような配列に限定されないが、内部タグの配列は、配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸配列の１つから選択されてもよい。一部の実施形態では、適当な基質の存在下で内部タグが配列番号２のペプチドと会合すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。特定の実施形態では、（ａ）内部タグを有する（Ｎ末端またはＣ末端に位置しない）第１のポリペプチドと、（ｂ）内部タグの構造相補体を含むペプチドまたはポリペプチドとを含む生物発光複合体が提供され、その際、会合すれば、内部タグ及びその構造相補体は適当な基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルを放射する。一部の実施形態では、内部タグは配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、内部が基質の存在下で配列番号２の構造的に相補性のペプチドに接触すると、検出可能な生物発光シグナルが生成される。
【００２１】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されているペプチド、ポリペプチド（たとえば、内部タグを含む、末端タグを含む、等）、タンパク質（たとえば、内部タグを含む、末端タグを含む、等）、融合タンパク質等のいずれかをコードする核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、オリゴヌクレオチド、ベクター等である。一部の実施形態では、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５（たとえば、ペプチド内部タグをコードする、ペプチド構造相補体をコードする）及び／または配列番号４４１〜２１５６（たとえば、ポリペプチド内部タグをコードする、ポリペプチド構造相補体をコードする）の核酸配列の１つを含むまたは１つからなる核酸が提供される。一部の実施形態では、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５及び／または配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列が提供される。
【００２２】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）配列番号２との１００％未満の配列同一性（＜９９％、＜９５％、＜９０％、＜８０％、＜７０％、＜６０％、＜５０％、等）を有するアミノ酸配列を含む内部タグ（Ｎ末端またはＣ末端ではない）を有する第１のポリペプチドと、（ｂ）配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（たとえば、内部でまたは末端で）第２のポリペプチドとを含む生物発光複合体であり、その際、生物発光複合体は基質の存在下で検出可能な生物発光を示す。特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む内部タグを含むポリペプチドと、（ｂ）配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む生物発光複合体であり、その際、生物発光複合体は基質の存在下で検出可能な生物発光を示す。
【００２３】
種々の実施形態では、（ａ）前から存在するタンパク質の断片ではない内部タグ配列を含む第１のアミノ酸配列と、（ｂ）前から存在するタンパク質の断片ではないアミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列とを含む生物発光複合体が提供され、その際、生物発光複合体は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列が会合すると検出可能な生物発光を示す。
【００２４】
一部の実施形態では、ポリペプチドを相互作用させることが提供され、その際、第１のポリペプチドは内部タグ（その配列内の一部で挿入されたアミノ酸配列（たとえば、Ｎ末端またはＣ末端ではない）を含み、かつ第２のポリペプチドは構造相補体タグ（たとえば、内部タグに構造的に相補性である内部にまたは末端に位置するアミノ酸配列）を含む。第１と第２のポリペプチドの相互作用の際に、内部タグと構造相補体タグが会合して生物発光複合体を形成する。一部の実施形態では、相互作用するポリペプチドの相互作用は生物発光複合体の生物発光に基づいて評価される。特定の実施形態では、内部タグと構造相補体タグとの間での相互作用（たとえば、非共有結合性の相互作用（たとえば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性の相互作用等）、共有結合性の相互作用（たとえば、ジスルフィド結合）等）は、相互作用するポリペプチドの非存在下では有意な生物発光複合体の形成を生じない。一部の実施形態では、そのような系は細胞内に存在する（たとえば、発現する）。
【００２５】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ポリペプチド配列内に挿入された第１の実質的に非発光性の要素と、（ｂ）分子実体（たとえば、小分子等）に連結された第２の実質的に非発光性の要素（たとえば、遊離の、ポリペプチドに連結された（内部にまたは末端に）とを含む生物発光複合体であり、その際、各非発光性の要素は前から存在するタンパク質の断片ではない。
【００２６】
本明細書に記載されている種々の実施形態は、たとえば、（ａ）第１のアミノ酸配列の中に内部タグを挿入し、第２のアミノ酸配列に相補体配列を連結する（たとえば、内部にまたは末端に）工程であって、その際、内部タグ及び相補体配列は前から存在するタンパク質の断片ではなく、内部タグ及び相補体配列の複合体は検出可能な生物発光シグナル（たとえば、内部タグ及び相補体配列と別々に対して実質的に上昇した生物発光）を放射し、内部タグ及び相補体配列の相互作用（たとえば、非共有結合性）は追加の安定化する及び／または凝集する条件の非存在下では複合体を形成するには不十分であり、またはごく弱く形成し、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の相互作用が追加の安定化する及び／または凝集する力を提供して内部タグと相補体配列との複合体を生成することと、（ｂ）工程（ａ）のタグ付けされた第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列を第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の間で相互作用を生じさせる条件に置く工程と、（ｃ）適当な基質の存在下で内部タグと相補体配列との複合体によって放射される生物発光シグナルを検出する工程とを含む、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の間での相互作用を検出する方法を提供し、その際、生物発光シグナルの検出は第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の間での相互作用を指し示す。一部の実施形態では、第１のアミノ酸配列及び内部タグは内部融合を含む。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列及び相補体配列は内部融合または従来の融合を含む。一部の実施形態では、第１の融合タンパク質（たとえば、内部タグを含む）及び第２の融合タンパク質（たとえば、相補体配列を含む）はさらに、融合された要素間でリンカーを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は前記融合タンパク質をコードする核酸から発現する。一部の実施形態では、単一のベクターが双方の融合タンパク質を含む。他の実施形態では、第１と第２の融合タンパク質は別々のベクターから発現する。
【００２７】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｎ末端断片と、Ｃ末端断片と、内部タグとを含むポリペプチドであり、その際、内部タグは対象とするタンパク質の中に挿入された配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、内部タグが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成される。一部の実施形態では、Ｎ末端断片及びＣ末端断片は双方とも長さ少なくとも２０アミノ酸である。一部の実施形態では、Ｎ末端断片及び／またはＣ末端断片は長さ少なくとも５０アミノ酸である。一部の実施形態では、内部タグは配列番号２のペプチドに比べて１以上の形質の向上を示し、その際、形質は、配列番号４４０のポリペプチドに対する親和性、配列番号４４０のポリペプチドと組み合わせた場合の発現、細胞内溶解性、細胞内安定性及び生物発光活性から選択される。一部の実施形態では、内部タグは表１のペプチドから選択される。一部の実施形態では、Ｎ末端断片及びＣ末端断片は、内部タグの非存在下で直接連結されるならば対象とする第１のタンパク質の配列を含む。一部の実施形態では、内部でタグ付けされたポリペプチドをコードする配列を含む核酸が提供される。一部の実施形態では、（ａ）内部でタグ付けされたポリペプチドと、（ｂ）配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ポリペプチドを含む第２のポリペプチドとを含む生物発光複合体が提供される。一部の実施形態では、内部タグ及び相補体ポリペプチドは互いに対して低い親和性を有する。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは対象とする第２のタンパク質との融合体である。一部の実施形態では、融合体は内部融合体または従来の融合体である。一部の実施形態では、対象とする第２のタンパク質はＮ末端断片及び／またはＣ末端断片のすべてまたは一部に対する親和性を有する。一部の実施形態では、親和性は、第１もしくは第２のタンパク質もしくは双方に対する構造的修飾（たとえば、翻訳後修飾）によって、または第３の分子（たとえば、薬物、核酸、タンパク質等）との相互作用によって変えられてもよい。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは対象とする分子に連結される。一部の実施形態では、Ｎ末端断片及び／またはＣ末端断片のすべてまたは一部は、対象とする分子に対する親和性を有する。一部の実施形態では、生物発光複合体はさらにセレンテラジン基質（たとえば、フリマジン）を含む。一部の実施形態では、内部タグ及び相補体ポリペプチドは互いに対して高い親和性を有する。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは融合ポリペプチドではなく、または対象とする分子に連結されない。一部の実施形態では、相補体ポリペプチドは表２のペプチドから選択される。
【００２８】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｎ末端断片と、Ｃ末端断片と、内部タグとを含むポリペプチドであり、その際、内部タグは対象とするタンパク質の中に挿入された配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、検出ペプチドが配列番号２のポリペプチドと接触すると、基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成される。一部の実施形態では、Ｎ末端断片及びＣ末端断片は双方とも長さ少なくとも２０アミノ酸である。一部の実施形態では、Ｎ末端断片及び／またはＣ末端断片は長さ少なくとも５０アミノ酸である。一部の実施形態では、内部タグは配列番号４４０のペプチドに比べて１以上の形質の向上を示し、その際、形質は、配列番号２のポリペプチドに対する親和性、配列番号２のポリペプチドと組み合わせた場合の発現、細胞内溶解性、細胞内安定性及び生物発光活性から選択される。一部の実施形態では、内部タグは表２のペプチドから選択される。一部の実施形態では、Ｎ末端断片及びＣ末端断片は、内部タグの非存在下で直接連結されるならば対象とする第１のタンパク質の配列を含む。一部の実施形態では、内部でタグ付けされたポリペプチドをコードする配列を含む核酸が提供される。一部の実施形態では、（ａ）内部でタグ付けされたポリペプチドと、（ｂ）配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ポリペプチドとを含む生物発光複合体が提供される。一部の実施形態では、内部タグ及び相補体ポリペプチドは互いに対して低い親和性を有する。一部の実施形態では、相補体ペプチドは対象とする第２のタンパク質との融合体である。一部の実施形態では、融合体は内部融合体または従来の融合体である。一部の実施形態では、対象とする第２のタンパク質はＮ末端断片及び／またはＣ末端断片のすべてまたは一部に対する親和性を有する。一部の実施形態では、親和性は、第１もしくは第２のタンパク質もしくは双方に対する構造的修飾（たとえば、翻訳後修飾）によって、または第３の分子（たとえば、薬物、核酸、タンパク質等）との相互作用によって変えられてもよい。一部の実施形態では、相補体ペプチドは対象とする分子に連結される。一部の実施形態では、Ｎ末端断片及び／またはＣ末端断片のすべてまたは一部は、対象とする分子に対する高い親和性を有する。一部の実施形態では、生物発光複合体はさらにセレンテラジン基質を含む。一部の実施形態では、内部タグ及び相補体ペプチドは互いに対して高い親和性を有する。一部の実施形態では、相補体ペプチドは表１のペプチドから選択される。一部の実施形態では、相補体ペプチドは融合ポリペプチドではなく、または対象とする分子に連結されない。
【００２９】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）第１のアミノ酸配列の中に内部タグを挿入することによって内部融合体を作り出すので、前記内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもなく、Ｃ末端にもないこと、その際、内部タグが配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、内部タグが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｂ）第２のアミノ酸配列と相補体ポリペプチドとの第２の融合体を作り出すこと、その際、相補体ポリペプチドが配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、相補体ポリペプチドが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｃ）第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間で見込まれる相互作用を生じさせる条件に内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質とを置くことと、（ｄ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出すること、その際、生物発光シグナルの検出は第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用を指し示すこととを含む、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用を検出する方法である。一部の実施形態では、相互作用は、生きている細胞または生物にて、細胞または生物によって放射された生物発光シグナルを検出することによって検出される。一部の実施形態では、細胞の環境の変化の結果生じる相互作用の変化は、変化した環境が存在しない対照細胞に対する放射された生物発光シグナルの差異を検出することによって検出される。一部の実施形態では、変化した環境は、培養培地に分子（たとえば、薬物）を加えたまたはそれから分子を取り除いた結果である。一部の実施形態では、第２の融合体は内部融合体または従来の融合体である。一部の実施形態では、内部融合体は第１のアミノ酸配列と内部タグをコードする第１の核酸配列から発現し、第２の融合体は第２のアミノ酸配列と相補体ポリペプチドをコードする第２の核酸配列から発現する。一部の実施形態では、単一のベクターが第１の核酸配列と第２の核酸配列とを含む。一部の実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は別々のベクターにある。一部の実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）は細胞内にて内部融合体と第２の融合体を発現させることを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）第１のアミノ酸配列の中に内部タグを挿入することによって内部融合体を作り出すので、前記内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもなく、Ｃ末端にもないこと、その際、内部タグが配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、内部タグが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｂ）第２のアミノ酸配列と相補体ペプチドとの第２の融合体を作り出すこと、その際、相補体ペプチドが配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、相補体ペプチドが配列番号２のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｃ）第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間で見込まれる相互作用を生じさせる条件に内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質とを置くことと、（ｄ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出すること、その際、生物発光シグナルの検出は第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用を指し示すこととを含む、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用を検出する方法である。一部の実施形態では、第２の融合体は内部融合体または従来の融合体である。一部の実施形態では、内部融合体は第１のアミノ酸配列と内部タグをコードする第１の核酸配列から発現し、第２の融合体は第２のアミノ酸配列と相補体ペプチドをコードする第２の核酸配列から発現する。一部の実施形態では、単一のベクターが第１の核酸配列と第２の核酸配列とを含む。一部の実施形態では、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は別々のベクターにある。一部の実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）は細胞内にて内部融合体と第２の融合体を発現させることを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）標的ポリペプチドの中に内部タグを挿入することによって内部融合体を作り出すので、前記内部タグが標的ポリペプチドのＮ末端にもなく、Ｃ末端にもないこと、その際、内部タグが配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、内部タグが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｂ）前記試料に（ｉ）配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ペプチドと（ｉｉ）セレンテラジン基質とを加えることと、（ｃ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出すること、その際、生物発光シグナルの検出は試料における標的ポリペプチドの存在を指し示すこととを含む、試料にて標的ポリペプチドを検出する方法である。一部の実施形態では、試料は細胞を含む。一部の実施形態では、工程（ａ）は前記細胞にて前記内部融合体を発現させることを含む。一部の実施形態では、工程（ｂ）（ｉ）は前記細胞にて前記相補体ペプチドを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）標的ポリペプチドの中に内部タグを挿入することによって内部融合体を作り出すので、前記内部タグが標的ポリペプチドのＮ末端にもなく、Ｃ末端にもないこと、その際、内部タグが配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、内部タグが配列番号４４０のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｂ）前記試料に（ｉ）配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ポリペプチドと（ｉｉ）セレンテラジン基質とを加えることと、（ｃ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出すること、その際、生物発光シグナルの検出は試料における標的ポリペプチドの存在を指し示すこととを含む、試料にて標的ポリペプチドを検出する方法である。一部の実施形態では、試料は細胞を含む。一部の実施形態では、工程（ａ）は前記細胞にて前記内部融合体を発現させることを含む。一部の実施形態では、工程（ｂ）（ｉ）は前記細胞にて前記相補体ポリペプチドを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ポリペプチドが配列番号２のペプチドと接触すると、基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成される、配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む相補体ポリペプチドと、（ｂ）前記ポリペプチドと配列番号２のペプチドとによって生成される生物発光複合体のための基質とを含む検出試薬である。
【００３４】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）ペプチドが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成される、配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む相補体ペプチドと、（ｂ）前記ペプチドと配列番号４４０のポリペプチドとによって生成される生物発光複合体のための基質とを含む検出試薬である。
【００３５】
特定の実施形態では、内部タグ及び／または構造相補体は配列番号２または配列番号４４０との１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、そのような内部タグ及び構造相補体は本明細書に記載されている任意の実施形態で使用され、本明細書に記載されている他のペプチドまたはポリペプチドと共に使用される。
【００３６】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）第１のアミノ酸配列の中に内部タグを挿入することによって内部融合体を作り出すので、前記内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもなく、Ｃ末端にもないこと、その際、内部タグが配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、内部タグが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｂ）第２のアミノ酸配列と相補体ポリペプチドとの第２の融合体を作り出すこと、その際、相補体ポリペプチドが配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、相補体ポリペプチドが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｃ）第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間で見込まれる相互作用を生じさせる条件に内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質を置くことと、（ｄ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出することと、（ｅ）内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質とに作用剤を加えることと、（ｆ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出することと、（ｇ）工程（ｄ）と工程（ｆ）の生物発光シグナルを比較すること、その際、工程（ｄ）から工程（ｆ）までの生物発光シグナルの変化は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用の作用剤による変化を指し示すこととを含む、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用の変化を検出する方法である。一部の実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）は細胞内で内部融合体及び第２の融合体を発現させることを含む。一部の実施形態では、作用剤はペプチドまたは小分子である。一部の実施形態では、作用剤は相互作用の阻害剤であり、その際、低下した相互作用は生物発光シグナルの低下によって検出される。一部の実施形態では、作用剤は相互作用の活性化剤であり、増大した相互作用は生物発光シグナルの上昇によって検出される。
【００３７】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）第１のアミノ酸配列の中に内部タグを挿入することによって内部融合体を作り出すので、前記内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもなく、Ｃ末端にもないこと、その際、内部タグが配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、内部タグが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｂ）第２のアミノ酸配列と相補体ポリペプチドとの第２の融合体を作り出すこと、その際、相補体ポリペプチドが配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、相補体ポリペプチドが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成されることと、（ｃ）第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間で見込まれる相互作用を生じさせる条件に内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質とを置くことと、（ｄ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出することと、（ｅ）内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質とに作用剤を加えることと、（ｆ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出することと、（ｇ）工程（ｄ）と工程（ｆ）の生物発光シグナルを比較すること、その際、工程（ｄ）から工程（ｆ）までの生物発光シグナルの変化は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用の作用剤による変化を指し示すこととを含む、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間での相互作用の変化を検出する方法である。一部の実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）は細胞内で内部融合体及び第２の融合体を発現させることを含む。一部の実施形態では、作用剤はペプチドまたは小分子である。一部の実施形態では、作用剤は相互作用の阻害剤であり、その際、低下した相互作用は生物発光シグナルの低下によって検出される。一部の実施形態では、作用剤は相互作用の活性化剤であり、増大した相互作用は生物発光シグナルの上昇によって検出される。
【００３８】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）第１のアミノ酸配列の中に内部タグを挿入することによって内部融合体を作り出すので、前記内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもなく、Ｃ末端にもないこと、その際、内部タグが配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、内部タグが配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成され、第１のアミノ酸配列の第１の構造配座が第１のアミノ酸配列の第２の構造配座に対して内部タグへのアクセスを変化させることと、（ｂ）内部タグと（ｉ）配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ポリペプチドまたは（ｉｉ）第２のアミノ酸配列と相補体ポリペプチドとの第２の融合体とをセレンテラジン基質の存在下に置くことと、（ｃ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出することと、（ｄ）内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質とに作用剤を加えることと、（ｅ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出することと、（ｆ）工程（ｃ）と工程（ｅ）の生物発光シグナルを比較すること、その際、工程（ｃ）から工程（ｅ）までの生物発光シグナルの変化は作用剤による第１のアミノ酸配列の配座の変化を指し示すこととを含む、第１のアミノ酸配列の構造配座における作用剤による変化を検出する方法である。一部の実施形態では、配座変化を誘導することは、第１のアミノ酸配列の一部を切断するプロテアーゼを加えること、第１のアミノ酸配列に結合する作用剤の添加、及びアッセイ条件を変えることから選択される。
【００３９】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ａ）第１のアミノ酸配列の中に内部タグを挿入することによって内部融合体を作り出すので、前記内部タグが第１のアミノ酸配列のＮ末端にもなく、Ｃ末端にもないこと、その際、内部タグが配列番号４４０との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有し、内部タグが配列番号２のペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成され、第１のアミノ酸配列の第１の構造配座が第１のアミノ酸配列の第２の構造配座に比べて内部タグへのアクセスを変化させることと、（ｂ）内部タグと（ｉ）配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有する相補体ペプチドまたは（ｉｉ）第２のアミノ酸配列と相補体ペプチドとの第２の融合体とをセレンテラジン基質の存在下に置くことと、（ｃ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出することと、（ｄ）内部融合体と第２の融合体とセレンテラジン基質とに作用剤を加えることと、（ｅ）存在するならば、放射された生物発光シグナルを検出することと、（ｆ）工程（ｃ）と工程（ｅ）の生物発光シグナルを比較すること、その際、工程（ｃ）から工程（ｅ）までの生物発光シグナルの変化は作用剤による第１のアミノ酸配列の配座の変化を指し示すことと含む、第１のアミノ酸配列の構造配座における作用剤による変化を検出する方法である。一部の実施形態では、配座変化を誘導することは、第１のアミノ酸配列の一部を切断するプロテアーゼを加えること、第１のアミノ酸配列に結合する作用剤を加えること、及びアッセイ条件を変えることから選択される。
【００４０】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｎ末端断片とＣ末端断片と２以上の内部タグを含むポリペプチドであり、その際、内部タグは対象とするタンパク質の中に挿入された配列番号２との１００％未満でかつ３０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、内部タグの１以上が配列番号４４０のポリペプチドと接触すると、セレンテラジン基質の存在下で検出可能な生物発光シグナルが生成される。一部の実施形態では、２以上の内部タグは２つの内部タグ（たとえば、直列タグ）である。一部の実施形態では、２以上の内部タグは互いに直接接続される。一部の実施形態では、２以上の内部タグは１以上のリンカー（たとえば、ペプチドリンカー）によって分離される。一部の実施形態では、２以上の内部タグは対象とするタンパク質またはポリペプチドの中での単一の位置にて挿入される。一部の実施形態では、２以上の内部タグは対象とするタンパク質またはポリペプチドの中での２以上の位置にて挿入される。一部の実施形態では、２以上の内部タグは同一アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、２以上のまたは２以上の内部タグは同一ではないアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、２以上の内部タグは、相補体配列との親和性に影響を有してもよいし、または有さなくてもよいが、内部タグまたは直列タグの電荷全体をさらに荷電するようにまたは中性に近いように変化させるアミノ酸置換を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】内部タグ（たとえば、ＮＬｐｅｐまたはＮＬｐｏｌｙ）が対象とする第１のタンパク質（ＰＯＩ１）に内部ループとして挿入され、相補体配列（たとえば、ＮＬｐｅｐまたはＮＬｐｏｌｙ）が対象とする第２のタンパク質（ＰＯＩ２）に末端で融合される例となる実施形態を示す模式図である。内部タグ及び相補体配列は互いに低い親和性を有するので、それらは外部の力の非存在下では複合体を形成することにおいて効果はない（たとえば、検出できないまたは無視できる量の複合体を生じる）。内部タグ及び相補体配列は別々に実質的に非発光性であるけれども、ＰＯＩ１及びＰＯＩ２の相互作用の際、内部タグと相補体配列との間で生物発光複合体が形成される。
【図２】内部タグ（たとえば、ＮＬｐｅｐまたはＮＬｐｏｌｙ）が対象とする第１のタンパク質（ＰＯＩ１）に挿入され、遊離の相補体配列（たとえば、ＮＬｐｅｐまたはＮＬｐｏｌｙ）が提供される例となる実施形態を示す模式図である。この例では、内部タグは、対象とするタンパク質が相補体配列によって内部タグをアクセス可能にする配座変化を経験した後でのみアクセス可能である位置に置かれる。内部タグ及び相補体配列は、内部タグ及び相補体配列が会合すると複合体が生じるように互いに高い親和性を有する。内部タグ及び相補体配列が同一試料に存在する場合、それらの間で生物発光複合体が形成される。
【図３】内部タグ（たとえば、ＮＬｐｅｐまたはＮＬｐｏｌｙ）及びその相補体配列が対象とするポリペプチド（ＰＯＩ１）に挿入される／融合される例となる実施形態を示す模式図である。この例では、内部タグは、対象とするタンパク質が相補体配列によって内部タグをアクセス可能にする配座変化を経験した後でのみアクセス可能である位置に置かれる。内部タグ及び相補体配列は、内部タグ及び相補体配列が会合すると複合体が生じるように互いに高い親和性を有する。内部タグ及び相補体配列が同一試料に存在する場合、それらの間で生物発光複合体が形成される。
【図４】ＨＡＬＯＴＡＧタンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）に挿入された高親和性ＮＬペプチド８６とＮＬｐｏｌｙ１ＩＳの構造的な相補性を示す代表的な実験の結果を示す図である。この実験では、指示された構築物についての発現構築物でＨｅＬａ細胞に形質移入した。細胞を２４時間インキュベートした。ＮＡＮＯＬＵＣ基質フリマジンの添加に続いて各試料の発光を測定した。
【図５】それに挿入された高親和性ＮＬペプチド８６を有するＨＡＬＯＴＡＧタンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）の機能を示す画像である。
【図６】プロテインＧに融合されたＮＬｐｏｌｙ１１Ｓと内部でタグ付けされたＮＬｐｅｐ１１４標的タンパク質との間での抗体主導のＮＡＮＯＬＵＣ生物発光相補性を手段として、アッセイ成分をどのように使用して標的タンパク質への抗体の結合をスクリーニングするのかを示す模式図である。内部のｐｅｐ１１４タグを含有する標的はＩＬ６シグナルペプチド（ＳＰ）と共に哺乳類細胞の培養物で発現する。ＳＰは標的を分泌経路に向ける。培地（＋／−）細胞にて標的をアッセイすることができる。例では、ラージビット（１１Ｓ−プロテインＧ融合タンパク質）の精製調製物及び試験抗体を哺乳類細胞の培養物に直接加えた。ラージビットのプロテインＧドメインは重鎖定常ドメイン２と３の間の試験抗体のＦｃ領域に結合する。試験抗体が標的に結合するのであれば、ラージビットとスモールビットが一体となりフリマジンによって検出される活性のある発光複合体を形成することができる。
【図７】対照として役立つＣ末端上での邪魔のない、または内部タグとしてポリペプチド間に置かれたＮＬｐｅｐ１１４タグを伴った対象とする標的タンパク質の構成を示す図である。ＶＥＧＦＡは、この標的タンパク質が概念データの証明で役立つのでここで示される。対象とする可溶性標的タンパク質を使用することができる。ＨＴ（Ｈａｌｏｔａｇ）、１１４（スモールビット）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＦＬＡＧ（ＦＬＡＧオクタペプチド）、ＡＴＧ１９１５：末端スモールビットを伴う対照標的；ＡＴＧ１９１７：２つの大きなドメイン間でスモールビットを伴う実験標的、及びＡＴＧ１９４６：大型ドメイン１つと小型ドメイン１つの間でスモールビットを伴う実験標的。
【図８】抗体濃度依存性での生物発光の上昇によって測定されるようなＮＬｐｅｐ１１４でタグ付けされたＶＥＧＦＡ標的タンパク質への抗ＶＥＧＦＡ特異抗体の結合の検出による標的抗体特異的なＮＡＮＯＬＵＣ生物発光相補性を示す図である。生物発光におけるこの上昇は、アイソタイプ対照が光を生じなかった（データは示さず）ので、抗体：標的特異的であった。
【図９】シグナル倍率／バックグランドとしての標的抗体特異的なＮＡＮＯＬＵＣ生物発光相補性を示す図である。抗体が存在しないアッセイ成分のバックグランドを超える抗体の存在下での生物発光の上昇によって測定されるようなＮＬｐｅｐ１１４でタグ付けされたＶＥＧＦＡ標的タンパク質に結合する抗ＶＥＧＦＡ特異抗体の検出のシグナルウインドウ。ＲＬＵにおけるバックグランドを超えるシグナルは、図８で得られたデータから算出し、使用した濃度範囲にわたって抗ＶＥＧＦＡ抗体を増やすことに応答して７５〜４５０倍増大することが見いだされた。
【図１０】生物発光の相補性の用量反応を介した抗ＶＥＧＦＡ抗体の相対的な親和性によって示されるように、標的に対する抗体の親和性はＮＬｐｅｐ１１４の位置によって変化しないことを示す図である。３つのＶＥＧＦＡ標的構築物についてのＥＣ50値は図８で生成された用量反応曲線から算出されたように示される。
【図１１】ＮＬｐｅｐ１１４でタグ付けされた標的タンパク質との内在性標的タンパク質の競合及びＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを融合したプロテインＧと内部でタグ付けされたＮＬｐｅｐ１１４標的タンパク質との間での抗体が主導するＮＡＮＯＬＵＣ生物発光相補性を手段として、アッセイ成分をどのように使用して予測データ解析と共に内在性の標的タンパク質を定量するのかを示す模式図である。対象とする内在性の標的タンパク質の定量を可能にするように構成されたアッセイ成分。同じ標的タンパク質ｐｅｐ１１４融合体と１１Ｓ−プロテインＧ融合体を用いて、内在性の標的タンパク質が増えるにつれてシグナルの減少を生じる結合競合を介して内在性の標的タンパク質の量を定量することができる。
【図１２】内部タグ付けで使用される１１４直列ペプチドの模式図及び配列を示す。
【図１３】ＦＫＢＰ／Ｆｒｂ融合タンパク質の模式図を示す。示されるのは、ＦＫＢＰまたはＦｒｂのＣ末端またはＮ末端に融合されたＮＬｐｏｌｙ１１Ｓの融合体、及びＦＫＢＰまたはＦｒｂの中にて異なる位置での内部タグ（ＮＬｐｅｐ１１４直列ペプチド＝２×ＮＬｐｅｐ１１４）の統合である。内部タグの統合部位の位置は、宿主タンパク質の隣接するアミノ酸位置によって示される（たとえば、ＡＡ１２／１３はＦＫＢＰのアミノ酸１２と１３の間での２×ＮＬｐｅｐ１１４の統合を示す）。
【図１４】本明細書に記載されている内部タグ付けを用いた、ラパマイシンが誘導するＦＫＢＰ／Ｆｒｂのタンパク質／タンパク質の相互作用を明らかにする図である。ＮＬｐｅｐ１１４直列ペプチドの位置は、Ｃ末端として（Ｃ−１１４）、または宿主タンパク質のＮ末端側で隣接するアミノ酸によって（たとえば、１２はＦＫＢＰ内のＡＡ１２と１３の間での統合を示す）示される。
【図１５】図１５で示した結果の無処理試料とラパマイシンで処理した試料との間の相対的な変化（応答比）への変換を示す図である。応答比は、方程式：応答比＝ＲＬＵラパマイシン／ＲＬＵ無処理を用いて算出される。
【図１６】本明細書に記載されている内部タグ付けを用いたラパマイシンによるＦＫＢＰ／Ｆｒｂ相互作用の用量依存性の誘導を示す図である。
【図１７】本明細書に記載されている内部タグ付けを用いたラパマイシン誘導のＦＫＢＰ／Ｆｒｂ相互作用の動態測定を示す図である。結果はすべて、対数尺度（左）または線形尺度（右）にてプロットした測定の単位としての相対光単位（ＲＬＵ）を用いて示す。
【図１８】図１７で示した結果（左のグラフ）の標準化した図を示す。標準化のために、各個々の分量について得られた最低値と最高値を参照点（それぞれ０％と１００％）として使用した。
【００４２】
定義
本明細書で使用されるとき、用語「内部タグ」は別のポリペプチドまたはタンパク質の中に（たとえば、Ｎ末端またはＣ末端ではない）挿入されるペプチドまたはポリペプチドの配列を指す。内部タグは、それがその中に挿入されるペプチドまたはポリペプチドの配列に検出、単離、局在化、会合等の１以上の特徴を提供してもよい。内部タグはポリペプチドまたはタンパク質のＮ−及びＣ−末端部分に直接接続されてもよいし、または１以上のリンカーによって接続されてもよい。一部の実施形態では、リンカー自体が官能性を提供してもよい。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「実質的に」は、引用される特色、パラメータ及び／または値が正確に達成される必要はないが、たとえば、忍容性、測定誤差、測定精度の限度及び当業者に既知の他の因子を含む偏差または変動が、特色が提供するように意図された効果を不可能にしない量で存在してもよいことを意味する。実質的に非存在である特色または特徴（たとえば、実質的に非発光性）は、使用されるアッセイのノイズの範囲内にある、バックグランドに達しない、または検出能を下回るものであってもよい。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、用語「生物発光」は、酵素、タンパク質、タンパク質複合体または他の生体分子（たとえば、生物発光複合体）によって触媒される、または可能にされる化学反応による光の生成及び放射を指す。典型的な実施形態では、生物発光実体（たとえば、生物発光タンパク質または生物発光複合体）のための基質は生物発光実体によって高エネルギー反応生成物に変換され、反応生成物はそれに続いて、それがさらに安定な形態に変換するにつれて光を放射する。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「相補性の」は、互いにハイブリッド形成する、二量体化するまたはさもなければ複合体を形成することができる２以上の構造要素（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子等）の特色を指す。たとえば、「相補性のペプチドまたはポリペプチド」は一緒になって複合体を形成することができる。相補性の要素は、（たとえば、相互作用要素から）安定な複合体を形成するために、たとえば、相補性のために適正な配座に要素を置くために、相補性の要素を同時局在させるために、相補性のための相互作用エネルギーを低下させるために等で支援を必要としてもよい。一部の実施形態では、「相補体配列」、「相補体」または「構造相補体」は、別の配列（たとえば、内部タグの）の構造相補体であるアミノ酸配列である。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「複合体」は、互いに直接及び／または間接的に接触する分子（たとえば、ペプチドまたはポリペプチド）の集合体または凝集体を指す。態様の１つでは、「接触」、さらに詳しくは「直接接触」は、たとえば、ファンデルワールス力、水素結合、イオン性相互作用及び疎水性相互作用等のような分子間の非共有結合性の引力相互作用が分子の相互作用に影響を及ぼすように２以上の分子が十分に密接であることを意味する。本明細書で使用されるとき、用語「複合体」は、特に記載されない限り、２つ以上の分子（たとえば、ペプチド、ポリペプチドまたはそれらの組み合わせ）の集合体を指す。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「非発光性の」は、可視スペクトルでの光としてのエネルギーを放射しない（たとえば、基質の存在下または非存在下で）特色を示す実体（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、複合体、タンパク質等）を指す。所与のアッセイで実体が検出可能な発光を示さない場合、それは非発光性と呼ばれてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「非発光性の」は用語「実質的に非発光性の」と同義である。特定のアッセイの意図する目的を妨害しないように発光が十分に最少限である場合、実体は「非発光性」である。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「非発光性ペプチド」（ＮＬｐｅｐ）及び「非発光性ポリペプチド」（ＮＬｐｏｌｙ）は、標準的な条件下（たとえば、生理的条件、アッセイ条件等）でかつ典型的な計装（たとえば、ルミノメータ等）にて、（たとえば、基質の存在下または非存在下で）実質的に発光を示さない、または実際検出できない（たとえば、ノイズに満たない）量を示すペプチドまたはポリペプチド（たとえば、内部タグ、相補体配列等）を指す。一部の実施形態では、そのような非発光性のペプチド及びポリペプチドが、本明細書に記載されている基準に従って集まって生物発光複合体を形成する。本明細書で使用されるとき、「非発光性要素」は非発光性のペプチドまたは非発光性のポリペプチドである。用語「生物発光複合体」は２以上の非発光性のペプチド及び／または非発光性のポリペプチドの構築された複合体を指す。生物発光複合体は生物発光複合体の基質を高エネルギーの反応生成物に変換することを触媒し、または可能にし、反応生成物はその後、それがさらに安定な形態に変換するにつれて光を放射する。複合体化しない場合、生物発光複合体を形成する２つの非発光性要素は「非発光性対」と呼ばれてもよい。生物発光複合体が３以上の非発光性のペプチド及び／または非発光性のポリペプチドによって形成されるのであれば、生物発光複合体の複合体化しない構成成分は非発光性基と呼ばれてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「非発光性複合体」は、生物発光複合体の基質を高エネルギーの反応生成物に変換することを実質的に触媒しない２以上の要素（たとえば、ペプチド、ポリペプチド等）の複合体を指す。一部の実施形態では、「非発光性複合体」は、発光複合体を形成するのに追加の非発光性要素（たとえば、第３の要素）を必要とする。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「相互作用要素」は、非発光性要素（たとえば、内部タグ及び相補体配列）または、非発光性基（たとえば、内部タグ及び相補体配列）の対を一緒にして生物発光複合体を形成するのを支援する部分を指す。典型的な実施形態では、本発明はそのようなメカニズムに限定されず、メカニズムの理解は本発明を実践するのに必要とされないが、相互作用要素の対（別称「相互作用の対」）は非発光性要素の対（たとえば、非発光性のペプチド／ポリペプチドの対）に連結され、２つの相互作用要素の間での引力相互作用は生物発光複合体の形成を促す。相互作用要素は好適なメカニズム（たとえば、非発光性の対／基を極めて近接させること、非発光性の対／基を相互作用のための適正な配座に置くこと、複合体形成の活性化エネルギーを減らすこと、それらの組み合わせ等）による生物発光複合体の形成を促してもよい。相互作用要素は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、小分子、補因子、核酸、脂質、炭水化物、抗体、ポリマー、粒子等であってもよい。相互作用の対は２つの同一の相互作用要素（すなわち、ホモペア）または２つの異なる相互作用要素（すなわち、ヘテロペア）で作られてもよい。ヘテロペアの場合、相互作用要素は同じ種類の部分（たとえば、ポリペプチド）または異なる種類の部分（たとえば、ポリペプチドと小分子）であってもよい。相互作用の対による複合体形成が検討される一部の実施形態では、相互作用の対は「標的対」または「対象とする対」と呼ばれてもよく、個々の相互作用要素は「標的要素」（たとえば、「標的ペプチド」、「標的ポリペプチド」等）または対象とする要素（「対象とするペプチド」、「対象とするポリペプチド」等）と呼ばれる。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「前から存在するタンパク質」は、特定の事象または日付に先立って物理的な存在にあったアミノ酸配列を指す。「前から存在するタンパク質の断片ではないペプチド」は、ペプチドの設計及び／または合成に先立って物理的な存在にあったタンパク質の（たとえば、合成のまたは天然に存在する）断片またはサブ配列ではない短いアミノ酸鎖である。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、用語「断片」は、さらに大きな全実体（たとえば、タンパク質、ポリペプチド、酵素等）の解離または「断片化」の結果生じるペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなものとして同じ配列を有するように調製されたペプチドもしくはポリペプチドを指す。したがって、断片は、それが作られ、及び／または設計される全実体（たとえば、タンパク質、ポリペプチド、酵素等）のサブ配列である。前から存在する全タンパク質のサブ配列ではないペプチドまたはポリペプチドは断片ではない（たとえば、前から存在するタンパク質の断片ではない）。「前から存在する生物発光タンパク質の断片ではない」ペプチドまたはポリペプチドは、（１）ペプチドまたはポリペプチドの設計及び／または合成に先立って物理的な存在にあった、かつ（２）実質的な生物発光活性を示すタンパク質（天然または合成）のサブ配列ではないアミノ酸鎖である。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、用語「サブ配列」は、別のさらに大きなペプチドまたはポリペプチドとの１００％配列同一性を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。サブ配列はさらに大きなアミノ酸鎖の一部についての完全な配列一致である。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「配列同一性」は、２つのポリマー配列（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、核酸等）がモノマーサブユニットの同一の連続的な組成を有する程度を指す。用語「配列類似性」は２つのポリマー配列（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、核酸等）が類似のポリマー配列を有する程度を指す。たとえば、類似のアミノ酸は、同じ生物物理学的な特徴を共有し、かつファミリー、たとえば、酸性（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電で極性（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）にグループ分けすることができるものである。「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）は、（１）比較のウインドウ（たとえば、さらに長い配列の長さ、さらに短い配列の長さ、特定されたウインドウ）にわたって２つの最適に並べた配列を比較し、（２）同一の（または類似の）モノマーを含有する位置の数を決定して（たとえば、双方の配列に同じアミノ酸が存在する、双方の配列に類似のアミノ酸が存在する）、一致した位置の数を得、（３）一致した位置の数を比較ウインドウ（たとえば、さらに長い配列の長さ、さらに短い配列の長さ、特定されたウインドウ）の位置の総数で割り、（４）結果に１００を乗じてパーセント配列同一性またはパーセント配列類似性を得ることによって算出される。たとえば、ペプチドＡとペプチドＢが双方とも長さ２０アミノ酸であり、１つの位置を除いてすべての位置で同一アミノ酸を有するのであれば、ペプチドＡとペプチドＢは９５％の配列同一性を有する。同一でない位置でのアミノ酸が同一の生物物理学的特徴（たとえば、双方とも酸性だった）を共有していたとすると、ペプチドＡとペプチドＢは１００％の配列類似性を有することになる。別の例として、ペプチドＣが長さ２０アミノ酸であり、ペプチドＤが長さ１５アミノ酸であり、ペプチドＤにおける１５アミノ酸のうち１４がペプチドＣの一部のそれと同一であるとすると、ペプチドＣとペプチドＤは７０％の配列同一性を有するが、ペプチドＤはペプチドＣの最適な比較ウインドウに対して９３．３％の配列同一性を有する。本明細書で「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）を算出する目的では、並べられた配列におけるギャップはその位置でのミスマッチとして処理される。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「生理的条件」は、たとえば、生きている細胞と適合性のある温度、ｐＨ、塩分濃度、化学組成等の大部分の水性の条件等の、生きている細胞と適合性のあるいかなる条件も包含する。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、用語「試料」は最も広義で使用される。ある意味で、それは、任意の供給源と同様に生物試料及び環境試料から得られる検体または培養物を含むことにする。生物試料は動物（ヒトを含む）から得られてもよく、流体、固体、組織及び気体を包含する。生物試料には、血漿、血清等のような血液製剤が含まれる。試料はまた、細胞溶解物、または本明細書に記載されているペプチド及び／またはポリペプチドの精製された形態を指してもよい。細胞溶解物には、溶解剤で溶解されている細胞、または、たとえば、ウサギ網状赤血球もしくはコムギ胚芽の溶解物のような溶解物が含まれてもよい。試料には無細胞発現系も含まれてもよい。環境試料には、表面物質、土壌、水及び工業試料のような環境物質が挙げられる。しかしながら、そのような試料は本発明に適用できる試料の種類を限定すると解釈されるべきではない。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、特定されない限り、用語「ペプチド」及び「ポリペプチドの」はペプチドアミド結合（−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−−）によって主鎖を介して連結される２以上のアミノ酸のポリマー化合物を指す。用語「ペプチド」は通常短いアミノ酸ポリマー（たとえば、２５未満のアミノ酸を有する鎖）を指すのに対して用語「ポリペプチド」は通常長いアミノ酸ポリマー（たとえば、２５を超えるアミノ酸を有する鎖）を指す。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「融合体」、「融合ポリペプチド」及び「融合タンパク質」は、第２の異なるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（たとえば、検出可能な配列、単離可能な配列、タグ等）に連結された対象とする第１のタンパク質またはポリペプチド（たとえば、標的配列等）を含有するキメラタンパク質を指す。用語「内部融合体」は本明細書で使用されるとき、第２のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が第１の配列内のある位置に（たとえば、Ｎ末端またはＣ末端ではない）挿入される融合体を指す。用語「従来の融合体」は第１のポリペプチドまたはタンパク質と第２のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が末端から末端までで融合される（たとえば、Ｃ末端からＮ末端まで、またはＮ末端からＣ末端まで）融合体を指す。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、用語「セレンテラジン」または「セレンテラジン基質」は天然に存在する（「ネイティブな」）セレンテラジンを指す。本明細書で使用されるとき、用語「セレンテラジン」または「セレンテラジン基質」は、その開示が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２００３／０４０１００、米国特許出願番号１２／０５６，０７３（段落［００８６］）、及び米国特許第８，６６９，１０３号にて開示されたものに加えて、フリマジン、セレンテラジン−ｎ、セレンテラジン−ｆ、セレンテラジン−ｈ、セレンテラジン−ｈｃｐ、セレンテラジン−ｃｐ、セレンテラジン−ｃ、セレンテラジン−ｅ、セレンテラジン−ｆｃｐ、ビス−デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン−ｈｈ」）、セレンテラジン−ｉ、セレンテラジン−ｉｃｐ、セレンテラジン−ｖ、及び２−メチルセレンテラジンを含む、ネイティブなセレンテラジンと同様に合成の、たとえば、その誘導体または変異体及び天然の類似体を指す。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、用語「低親和性」は、生理的条件またはアッセイ条件よりも実質的に高い（たとえば、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍以上）濃度を除いて、弱すぎて実体間で十分な複合体形成を生じない２つの実体（たとえば、タンパク質／タンパク質）間の分子間相互作用を記載する。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、用語「高親和性」は、生理的条件下またはアッセイ条件下で検出可能な複合体形成を生成するために十分な強度である２つの実体間の分子間相互作用を記載する。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
レポーターによるタンパク質のタグ付けはタンパク質の機能及び挙動を分析するために一般的に使用される。一般に、遺伝子融合は、対象とするタンパク質のＣ末端またはＮ末端を用いて生成される。しかしながら、特定の場合、双方の末端が対象とするタンパク質の機能に関わるので、タンパク質の生理的機能を変えることなく修飾することができない。本明細書に記載されている実施形態は、たとえば、Ｎ末端またはＣ末端の修飾を必要とすることなくタンパク質／タンパク質の相互作用の解析を可能にする。実施形態はさらにＮ末端またはＣ末端の修飾を必要とすることなく、タンパク質の検出及び／または局在確認（たとえば、細胞性のまたは細胞内の局在確認）を可能にする。種々のタンパク質は構成の変化をもたらす修飾を受け、宿主タンパク質の構成に基づいた構造的相補性にアクセスできる内部ペプチド／ポリペプチドタグを使用することは、完全長のタンパク質を用いたバイオセンサーの生成を可能にする。したがって、本明細書で提供されるのは、対象とするタンパク質の中で内部に挿入される実質的に非発光性のペプチド／ポリペプチドタグである。内部に挿入されたタグと実質的に非発光性である相補体ポリペプチド／ペプチドとの相互作用により生物発光レポーター複合体の形成が生じる。
【００６２】
本明細書で提供されるのは、タンパク質またはポリペプチドの内部タグ（たとえば、ペプチドまたはポリペプチド）とその構造相補体（たとえば、遊離のまたは融合体（たとえば、内部または末端の）とからの生物発光複合体の構築のための組成物及び方法である。一部の実施形態では、内部タグ及び／または構造相補体は前から存在するタンパク質の断片ではない（たとえば、既知のポリペプチド配列の相補性のサブ配列ではない）。特に、生物発光活性は、内部タグの実質的に非発光性のペプチド構造相補体の配列による構造的な相補性を介してタンパク質／ポリペプチドの実質的に非発光性の内部タグに付与される。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象とするタンパク質／ポリペプチドの存在を検出するために使用するための、及び分子の相互作用（たとえば、タンパク質／タンパク質、タンパク質／ＤＮＡ、タンパク質／ＲＮＡ、タンパク質／小分子等）をモニタリングするための、実質的に非発光性の内部タグ及び構造相補体である。本明細書で提供されるのはまた、種々の生物発光複合体の形成の際に可変の親和性及び発光を有する相互交換可能な内部タグ及び構造相補体の配列（たとえば、ペプチド及びポリペプチド）の相補性パネルである（たとえば、高親和性／高発光の対、中程度の親和性／高発光の対、低親和性／中程度の発光の対等）。内部タグ及び構造相補体の様々な組み合わせを利用することは、低いものから高いものに及ぶ親和性、発光及び他の可変の特徴の種々の対を含む適合性の系を提供する。この適合性によって、対象とするタンパク質及びその分子相互作用の検出／モニタリングが対象とする特定の分子（複数可）に微調整されるのが可能になり、モニターすることができる分子相互作用の範囲が非常に高いまたは非常に低い親和性を伴う相互作用を含むように拡大される。さらに本明細書で提供されるのは、内部タグ、構造相補体及びそれらのパネルを開発し、調べる方法である。
【００６４】
一部の実施形態では、内部タグと構造相補体単独との間での親和性は、活性のある（たとえば、生物発光性の）複合体を形成し、結果として生じるシグナル（たとえば、生物発光シグナル）を生成には不十分である。しかしながら、構造相補体が内部でタグ付けされたポリペプチドと相互作用する相互作用部分（たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子等）に融合され、繋がれ、または連結されれば、そのときは、その相互作用（たとえば、対象とするポリペプチドと相互作用部分との複合体形成）は生物発光複合体の形成を促進する。そのような実施形態では、基質の存在下での生物発光複合体からのシグナルは、対象とするポリペプチドと統合部分（別称、相互作用複合体）との複合体の形成についての指標として役立つ。相互作用複合体が形成されれば、次いで生物発光複合体が形成され、生物発光シグナルが生成され、次いでそれは（たとえば、基質の存在下で）検出する／測定する／モニターすることができる。相互作用複合体が形成できなければ（たとえば、不都合な条件のせいで、相互作用要素間の不安定な相互作用のせいで、不適合な相互作用要素のせいで等）、そのときは安定な生物発光複合体は生じず、生物発光シグナルは生成されない。
【００６５】
特定の実施形態では、内部でタグ付けされたポリペプチド及びそれと相互作用する（たとえば、複合体を形成する）第２の部分は相互作用対として知られる。一部の実施形態では、相互作用対は対象とする２つの分子（たとえば、対象とするタンパク質）を含む。一部の実施形態では、相互作用対の少なくとも一方のメンバーは内部でタグ付けされる。一部の実施形態では、相互作用対の双方のメンバーが内部でタグ付けされる（たとえば、構造的に相補性の内部タグによって）。一部の実施形態では、相互作用対の一方のメンバーは内部でタグ付けされ、他方は末端でタグ付けされる。たとえば、対象とするタンパク質に内部タグを挿入し、（たとえば、内部タグ、末端タグ等）対象とする分子を内部タグの構造相補体に繋ぐことによって対象とするタンパク質と対象とする第２の分子（たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子等）との相互作用を検出するためにアッセイが実施される。対象とするタンパク質と対象とする分子が相互作用するのであれば（たとえば、一時的に相互作用する、安定して相互作用する、等）、内部タグと構造相補体は好適な配座で極めて近接して活性のある複合体（たとえば、生物発光複合体）を形成し、シグナルが生成され／検出される（たとえば、基質の存在下で）。対象とするタンパク質と対象とする分子との間での相互作用の非存在下では、内部タグと構造相補体は十分に安定な方法で相互作用せず、シグナルは生成されない、またはごく弱く生成されるにすぎない。そのような実施形態は、複合体形成に対する阻害剤の効果、複合体形成に対する変異の効果、複合体形成に対する条件（たとえば、温度、ｐＨ等）の効果、小分子（たとえば、治療剤候補）の標的分子との相互作用、等を検討するために使用される。
【００６６】
一部の実施形態では、遊離の構造相補体との活性のある（たとえば、生物発光性の）複合体の形成によって、対象とする内部でタグ付けされたタンパク質がモニターされる（たとえば、検出される、局在確認される、等）。そのような実施形態では、内部タグ及び構造相補体は、内部でタグ付けされたタンパク質と遊離の構造相補体の双方が存在する場合、検出可能な複合体が生じるように互いに十分に高い親和性で選択される。
【００６７】
異なる内部タグ及び構造相補体の対は、相互作用複合体の異なる強度、持続時間及び／または安定性を必要として活性のある（たとえば、生物発光性の）複合体の形成を生じてもよい。一部の実施形態では、検出可能な（たとえば、生物発光性の）シグナルを生成するには安定な相互作用複合体が必要とされる。他の実施形態では、弱いまたは一時的な相互作用複合体でさえ活性のある（たとえば、生物発光性の）複合体の形成を生じる。一部の実施形態では、相互作用複合体の強度は結果として生じる（たとえば、生物発光性の）シグナルの強度に直接比例する。一部の内部タグと構造相補体の対は、高いミリモル解離定数（たとえば、Ｋd＞１００ｍＭ）を持つ相互作用対（たとえば、対象とする内部でタグ付けされたタンパク質と相互作用相手）と組み合わせると検出可能なシグナルを生成する。他の内部タグと構造相補体の対は、検出可能なシグナルを伴った生物発光複合体を生成するために、低いミリモル（たとえば、Ｋd＜１００ｍＭ）、マイクロモル（たとえば、Ｋd＜１ｍＭ）、ナノモル（たとえば、Ｋd＜１μＭ）またはさらにピコモル（たとえば、Ｋd＜１ｎＭ）の解離定数を持つ相互作用対を必要とする。さらに他の内部タグと構造相補体の対は、相互作用対の非存在下で活性のある複合体を形成する。
【００６８】
一部の実施形態では、内部タグと構造相補体の一方または双方は前から存在するタンパク質の断片ではない。一部の実施形態では、内部タグと構造相補体の一方または双方は前から存在する生物発光タンパク質の断片ではない。一部の実施形態では、内部タグも構造相補体も前から存在するタンパク質の断片ではない。一部の実施形態では、内部タグも構造相補体も前から存在する生物発光タンパク質の断片ではない。
【００６９】
一部の実施形態では、内部タグと構造相補体は双方とも単独では実質的に不活性（たとえば、非発光性）である。特定の実施形態では、好適な条件（たとえば、生理的条件に置かれると、実質的に非発光性の内部タグ及び実質的に非発光性のその構造相補体は相互作用して生物発光複合体を形成し、基質の存在下で生物発光シグナルを生成する。一部の実施形態では、内部タグとその構造相補体は互いの存在下にて低レベルの活性（たとえば、生物発光）を生じるが、特定の設定の条件下で検出可能な活性（たとえば、生物発光）の有意な上昇を経験する。
【００７０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている組成物及び方法は１以上の相互作用要素を含む。典型的な実施形態では、相互作用要素は、内部タグの構造相補体に連結され、内部でタグ付けされたタンパク質との複合体を会合してまたは形成して、内部タグとその構造相補体の複合体の構築を促す部分（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、小分子、核酸、脂質、炭水化物等）である。
【００７１】
一部の実施形態では、相互作用対は、内部でタグ付けされたタンパク質またはポリペプチドと、内部でタグ付けされたタンパク質またはポリペプチドと相互作用する他の好適な化学部分とを含んで、内部タグとその構造相補体との活性のある複合体の構築を促す。相互作用対は、たとえば、内部でタグ付けされたタンパク質と、核酸、ポリペプチド、タンパク質、リガンド、小分子、抗体、脂質等とからなってもよい。内部でタグ付けされたタンパク質またはポリペプチドと相互作用することが可能である分子実体は本明細書の一部の実施形態で使用されてもよい。
【００７２】
一部の実施形態では、本明細書の組成物及び方法は、標的分子（たとえば、内部でタグ付けされたタンパク質及び（潜在的な）相互作用相手）の対間での相互作用を検討するための有用なアッセイ（たとえば、試験管内、生体内、そのままで、動物全体等）を提供する。
【００７３】
一部の実施形態では、内部タグと相互作用対に連結された構造相補体との間での複合体（たとえば、生物発光複合体）の形成を促すために、内部でタグ付けされたタンパク質とその相互作用相手との間で相互作用を誘導するためにリガンド、基質、補因子等の存在が必要である。一部の実施形態では、生物発光複合体からのシグナルを検出することは、リガンド、基質、補因子等の存在を示す。
【００７４】
一部の実施形態では、内部タグ及びその構造相補体は単一のアミノ酸鎖（たとえば、Ｎ−（アミノ酸配列１）−（内部タグ）−（アミノ酸配列２）−（構造相補体）−Ｃ等）に存在する。一部の実施形態では、対象とするタンパク質の折り畳みは活性のある複合体（たとえば、生物発光複合体）の形成を生じる。
【００７５】
一部の実施形態では、内部でタグ付けされたタンパク質と、相互作用ペプチドまたはポリペプチド及び内部タグの構造相補体の融合体とが同一細胞内で発現する。そのような実施形態では、内部でタグ付けされたタンパク質と、相互作用ペプチドまたはポリペプチド及び内部タグの構造相補体の融合体とが細胞から精製され、及び／または単離され、または細胞内にて相互作用がアッセイされる。一部の実施形態では、内部でタグ付けされたタンパク質と、相互作用ペプチドまたはポリペプチド及び内部タグの構造相補体の融合体とが安定して発現する。一部の実施形態では、内部でタグ付けされたタンパク質と、相互作用ペプチドまたはポリペプチド及び内部タグの構造相補体の融合体とが一時的に発現する。他の実施形態では、内部でタグ付けされたタンパク質と、相互作用ペプチドまたはポリペプチド及び内部タグの構造相補体の融合体とが別々の細胞で発現し、シグナル検出のために（たとえば、精製及び／または単離に続いて）組み合わせられる。一部の実施形態では、内部でタグ付けされたタンパク質と、相互作用ペプチドまたはポリペプチド及び内部タグの構造相補体と融合体とが細胞溶解物（たとえば、ウサギ網状赤血球溶解物）または無細胞系で発現する。
【００７６】
特定の実施形態では、本明細書に記載されているペプチド、ポリペプチド、融合ポリペプチド、融合タンパク質等をコードする核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ベクター等が提供される。そのような核酸及びベクターは発現、形質転換、形質移入、注入等に使用されてもよい。
【００７７】
一部の実施形態では、内部タグは、リンカーによってポリペプチド配列に連結される（たとえば、そのＮ末端で、そのＣ末端で、両末端で）。一部の実施形態では、構造相補体はリンカーによって対象とする分子（たとえば、対象とするタンパク質）に連結される（たとえば、そのＮ末端で、そのＣ末端で、両末端で）。一部の実施形態では、リンカーは接続を提供し、要素間で所望の量の空間／間隔を可能にする。特定の実施形態では、リンカーは結合される要素間で適当な連結の化学的性質を提供する。一部の実施形態では、リンカーは２つの要素（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、小分子等）を結合する、接続するまたは繋ぐことが可能である好適な化学部分である。一部の実施形態では、リンカーは、１以上の反復または非反復のモノマー単位のポリマー（たとえば、核酸、アミノ酸、炭素含有ポリマー、炭素鎖等）である。多種多様なリンカーが使用されてもよい。一部の実施形態では、リンカーは単一の共有結合である。一部の実施形態では、リンカーは、１〜２０の非水素原子（たとえば、Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳ）を有する線状または分岐状、環状または複素環状の、飽和または不飽和の構造を含み、アルキル、エーテル、チオエーテル、イミン、カルボン酸、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジドの結合及び芳香族またはヘテロ芳香族の結合の組み合わせで構成される。一部の実施形態では、リンカーは２０の非水素原子より長い（たとえば、２１の非水素原子、２５の非水素原子、３０の非水素原子、４０の非水素原子、５０の非水素原子、１００の非水素原子等）。一部の実施形態では、リンカーは、（水素原子に加えて）Ｃ、Ｎ、Ｐ、Ｏ及びＳ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、        ４８、４９、または５０の非水素原子）の群から選択される１〜５０の非水素原子を含む。
【００７８】
本発明は利用できるリンカーの種類によって限定されない。シグナル要素と相互作用要素は直接（たとえば、単一の共有結合から成るリンカー）結合され、または好適なリンカーを介して結合される。本発明は特定のリンカー基に限定されない。種々のリンカー基が熟考され、好適なリンカーは、アルキル基、メチレン炭素鎖、エーテル、ポリエーテル、アルキルアミドリンカー、ペプチドリンカー、修飾されたペプチドリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）リンカー、ストレプトアビジン／ビオチンリンカー、またはアビジン／ビオチンリンカー、ポリアミノ酸（たとえば、ポリリジン）、官能化ＰＥＧ、多糖類、グリコサミノグリカン、樹状ポリマー（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ９３／０６８６８及びＴｏｍａｌｉａらによる．ｉｎ  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２９：１３８−１７５（１９９０）、ＰＥＧ／キレート剤ポリマー（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷ９４／０８６２９、Ｗ０９４／０９０５６及びＷ０９６／２６７５４）、オリゴヌクレオチドリンカー、リン脂質誘導体、アルケニル鎖、アルキニル鎖、ジスルフィドまたはそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。
【００７９】
一部の実施形態では、リンカーは切断可能である（たとえば、酵素的に（たとえば、ＴＥＶプロテアーゼ部位）、化学的に、光誘導で等）。
【００８０】
一部の実施形態では、実質的に非発光性の内部タグはペプチド及び／またはポリペプチドの配列に直接結合される。一部の実施形態では、２以上の内部タグが対象とするポリペプチドの内部の位置に存在する。一部の実施形態では、１以上の内部タグがレポーター機能ではなくリンカー機能の役目を果たす。
【００８１】
一部の実施形態では、実質的に非発光性の内部タグ及びその構造相補体には、既存のルシフェラーゼ（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第８，５５７，９７０号、米国特許出願２０１４／０１２０５４８、米国特許第８，６６９，１０３号、米国特許出願１４／１６０，２７８、及び米国特許出願１４／１６０，２８２にて記載されたようなホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、増強Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）の一部に対する１００％未満の配列同一性及び／または配列類似性が提供される。本発明の特定の実施形態には、配列番号２１５７（たとえば、完全なＮＡＮＯＬＵＣ配列）のすべてまたは一部（たとえば、＞５、＞８、＞１０、＞１２、＞１５、＞２０、＜１５、＜１８、＜２０、＜２２、＜２５、＜３０、＜４０、及びそれによって定義される範囲）との１００％未満、しかし、３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性を持つ実質的に非発光性の内部タグと実質的に非発光性の構造相補体との生物発光複合体の形成が関与する。一部の実施形態では、実質的に非発光性の内部タグ及び実質的に非発光性の構造相補体には、配列番号２１５７（たとえば、生物発光複合体と相互作用するペプチド及び／またはポリペプチド）の一部（たとえば、＞５、＞８、＞１０、＞１２、＞１５、＞２０、＜１５、＜１８、＜２０、＜２２、＜２５、＜３０、＜４０、及びそれによって定義される範囲）との１００％未満の、しかし、３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列類似性が提供される。一部の実施形態では、配列番号２１５７の約２５アミノ酸以下の部分との１００％未満の、しかし、３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性及び／または配列類似性を有する実質的に非発光性の内部タグと実質的に非発光性の構造相補体とが提供され、その際、そのようなペプチドは、適当な条件下（たとえば、相互作用対によって安定化される）にて、配列番号２１５７の別の部分との１００％未満の、しかし、３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性及び／または配列類似性を有するポリペプチドと組み合わせると生物発光複合体を形成する。同様に、配列番号２１５７の一部との１００％未満の、しかし、４０％を超える（たとえば、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性及び／または配列類似性を有する実質的に非発光性の内部タグと実質的に非発光性の構造相補体とが提供され、その際、そのような実質的に非発光性のタグと実質的に非発光性の構造相補体は、適当な条件下（たとえば、相互作用対によって安定化される）にて配列番号２１５７の別の部分との１００％未満の、しかし、３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性及び／または配列類似性を有するペプチドと組み合わせると生物発光複合体を形成する。一部の実施形態では、配列番号２との１００％未満の、しかし、３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性及び／または配列類似性を持つ実質的に非発光性のタグと実質的に非発光性の構造相補体とが提供される。一部の実施形態では、配列番号４４０との１００％未満の、しかし、３０％を超える（たとえば、＞３０％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％）配列同一性及び／または配列類似性を持つ実質的に非発光性のタグと実質的に非発光性の構造相補体とが提供される。
【００８２】
一部の実施形態では、本発明の実施形態で使用される内部タグ及び／または構造相補体には、ＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＬＡ（配列番号２）に由来する１以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を伴うペプチドが含まれる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、表１のアミノ酸配列、及び／または表１の核酸配列（表１のペプチド配列をコードする）を含む核酸を含む内部タグ及び／または構造相補体である。
【００８３】
表１．例となる内部タグ及び／または構造相補体のペプチド配列
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【００８４】
特定の実施形態では、表１のペプチドが提供される（たとえば、内部タグまたは内部タグの構造相補体として）。一部の実施形態では、内部タグまたは構造相補体はＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＬＡ（配列番号２）及び／または表１でリストにしたペプチドのいずれかとの単一アミノ酸の差異を含む。一部の実施形態では、内部タグまたは構造相補体はＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＬＡ（配列番号２）及び／または表１でリストにしたペプチドのいずれかとの２以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、８、９、１０等）のアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態では、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列の１つを含む内部タグまたは構造相補体が提供される。一部の実施形態では、１以上の付加、置換及び／または欠失を伴う配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列の１つを含む内部タグまたは構造相補体が提供される。一部の実施形態では、内部タグ、構造相補体、またはその一部は配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列の１以上との７０％を超える（たとえば、７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）配列同一性を含む。一部の実施形態では、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５の配列をコードする核酸の１つを含む核酸が提供される。一部の実施形態では、１以上の付加、置換及び／または欠失を伴う配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５の核酸配列の１つを含む核酸が提供される。一部の実施形態では、核酸またはその一部は配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５の核酸配列の１以上との７０％を超える（たとえば、７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）配列同一性を含む。一部の実施形態では、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列の１つをコードする核酸が提供される。一部の実施形態では、１以上の付加、置換及び／または欠失を伴う配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列の１つをコードする核酸が提供される。一部の実施形態では、配列番号３〜４３８及び２１６２〜２３６５のアミノ酸配列の１以上との７０％を超える（たとえば、７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）配列同一性を持つアミノ酸をコードする核酸が提供される。
【００８５】
特定の実施形態では、表１の核酸が提供される。一部の実施形態では、表１のペプチドをコードする核酸が提供される。一部の実施形態では、別のポリペプチド配列に挿入された表１のペプチドをコードする核酸が提供される。一部の実施形態では、本発明の核酸は、ＭＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＬＡ（配列番号２）及び／または表１でリストにしたペプチド（たとえば、ポリペプチド配列に挿入された）のいずれかとの単一アミノ酸の差異を含むペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸は、ＭＧＶＴＧＷＲＬＣＫＲＩＬＡ（配列番号２）及び／または表１でリストにしたペプチド（たとえば、ポリペプチド配列に挿入された）のいずれかとの２以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、８、９、１０等）のアミノ酸の差異を含むペプチドをコードする。一部の実施形態では、表１における核酸の１つの配列（たとえば、ポリペプチド配列に挿入される）を含む核酸が提供される。一部の実施形態では、１以上の付加、置換及び／または欠失を伴う表１の核酸の１つを含む核酸が提供される。一部の実施形態では、核酸またはその一部は、表１の核酸の１以上（たとえば、ポリペプチド配列に挿入される）との７０％を超える（たとえば、７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）配列同一性を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている実施形態で使用される内部タグ及び／または内部タグの構造相補体には、配列番号４４０に由来する１以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を伴うポリペプチドが含まれる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、表２のアミノ酸配列、及び／または表２の核酸配列を含む核酸を含む内部タグまたは内部タグの構造相補体である。
【００８７】
表２．例となる内部タグ及び／または構造相補体のポリペプチド配列
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【００８８】
表２（配列番号４４１〜１２９８）のポリペプチド及びコーディング核酸配列はすべてＮ末端Ｍｅｔ残基（アミノ酸）またはＡＴＧ開始コドン（核酸）を含有する。一部の実施形態では、表２のポリペプチド及びコーディング核酸配列はＮ末端Ｍｅｔ残基（アミノ酸）またはＡＴＧ開始コドン（核酸）を伴わずに提供される（配列番号１２９９〜２１５６）。
【００８９】
特定の実施形態では、内部タグ及び／または構造相補体は配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーの１つを含む。一部の実施形態では、内部タグ及び／または構造相補体は配列番号４４０との単一のアミノ酸差異を含む。一部の実施形態では、内部タグ及び／または構造相補体は、配列番号４４０及び／または配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーのいずれかとの２以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０．．．３５．．．４０．．．４５．．．５０、以上）のアミノ酸差異を含む。一部の実施形態では、１以上の付加、置換及び／または欠失を伴う配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーの１つの配列を含む内部タグ及び／または構造相補体が提供される。一部の実施形態では、内部タグ及び／または構造相補体またはその一部は、配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーの１以上との７０％を超える（たとえば、＞７１％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９１％、＞９２％、＞９３％、＞９４％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、または＞９９％）配列同一性を含む。
【００９０】
特定の実施形態では、表２の核酸が提供される。一部の実施形態では、表２のポリペプチド（たとえば、対象とするポリペプチドに挿入される）をコードする核酸が提供される。一部の実施形態では、本発明の核酸は、配列番号４４０及び／または配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーのいずれか（たとえば、対象とするポリペプチドに挿入された）との単一のアミノ酸差異を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸は、配列番号４４０及び／または表２でリストにされたポリペプチドのいずれか（たとえば、対象とするポリペプチドに挿入される）との２以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０．．．３５．．．４０．．．４５．．．５０、以上）のアミノ酸差異を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、配列番号４４１〜２１５６の核酸ポリマーの１つ（たとえば、対象とするポリペプチドに挿入される）の配列を含む核酸が提供される。一部の実施形態では、１以上の付加、置換及び／または欠失を伴う配列番号４４１〜２１５６の核酸ポリマーの１つの配列を含む核酸が提供される。一部の実施形態では、核酸またはその一部は、配列番号４４１〜２１５６の核酸ポリマーの１以上（たとえば、対象とするポリペプチドに挿入される）との７０％を超える（たとえば、＞７１％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９１％、＞９２％、＞９３％、＞９４％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、または＞９９％）配列同一性を含む。一部の実施形態では、核酸またはその一部は、配列番号４４１〜２１５６のアミノ酸ポリマーの１以上（たとえば、対象とするポリペプチドに挿入される）との７０％を超える（たとえば、＞７１％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９１％、＞９２％、＞９３％、＞９４％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、または＞９９％）配列同一性を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、配列番号４４１〜２１５６のポリペプチドの１つ（たとえば、対象とするポリペプチドに挿入される）をコードする核酸が提供される。一部の実施形態では、１以上の付加、置換及び／または欠失を伴う配列番号４４１〜２１５６のポリペプチドの１つ（たとえば、対象とするポリペプチドに挿入される）をコードする核酸が提供される。
【００９１】
本発明は、基礎研究、医学研究、分子診断等を含む種々の分野で有用である組成物及び方法を提供する。本明細書に記載されている試薬及びアッセイは特定の適用に限定されず、有用な適用は本発明の範囲内にあると見なされるべきである。
【００９２】
本発明の実施形態を利用する典型的な適用には、タンパク質／タンパク質の相互作用（たとえば、ヘテロ二量体、ホモ二量体）（図１を参照）、タンパク質／ＲＮＡの相互作用、タンパク質／ＤＮＡの相互作用、タンパク質／小分子の相互作用、または分子実体の他の組み合わせのモニタリング／検出が関与する。対象とするタンパク質は内部でタグ付けされ、対象とする第２の実体は構造相補体に連結される。特定のアッセイ条件下で検出可能なシグナルが生成されると、そのとき、対象とするタンパク質と対象とする実体との相互作用が推測される。そのようなアッセイは、好適な条件下（たとえば、試験管内、生体内、そのままで、動物全体等）で分子の相互作用をモニターするのに有用であり、たとえば、創薬、分子経路を解明すること、複合体構築の平衡または動態の態様を検討すること、高処理能力のスクリーニング、近接センサー等にて使用される。
【００９３】
本発明の実施形態を利用する他の典型的な適用には、タンパク質またはポリペプチドの検出または局在確認（たとえば、細胞での局在確認、細胞内局在確認、等）が関与する。試料における対象とするタンパク質は内部でタグ付けされ、構造相補体が試料に添加される。特定のアッセイ条件下で検出可能なシグナルが生成されると、そのとき、対象とするタンパク質の存在または位置が推測される。そのようなアッセイは好適な条件下（たとえば、試験管内、生体内、そのままで、動物全体等）でタンパク質を検出するまたは局在確認するのに有用であり、たとえば、創薬、分子経路を解明すること、複合体構築の平衡または動態の態様を検討すること、高処理能力のスクリーニング、近接センサー等にて使用される。
【００９４】
一部の実施形態では、既知の特徴（たとえば、スペクトルの特徴、対の相互親和性）の内部タグ及び構造相補体を用いて、対象とするタンパク質及び潜在的に会合する対象とする実体（タンパク質、核酸、小分子等）との親和性を解明し、またはその相互作用を理解する。他の実施形態では、よく特徴付けられた相互作用対を用いて内部タグ及び構造相補体の特徴（たとえば、スペクトルの特徴、対の相互親和性）を決定する。
【００９５】
本明細書に記載されている実施形態は薬物スクリーニング及び／または薬物開発で使用される。たとえば、小分子薬物または小分子のライブラリ全体（たとえば、構造相補体で標識された）の内部でタグ付けされた対象とする標的タンパク質（たとえば、治療用標的）との相互作用は、１以上の関連する条件（たとえば、生理的条件、病状等）下でモニターされる。他の実施形態では、２つの実体（たとえば、受容体とリガンド、タンパク質／タンパク質等）間の相互作用を高めるまたは阻害する小分子薬物または小分子のライブラリ全体の能力がアッセイされる。一部の実施形態では、高処理能力形式にて薬物スクリーニングの応用を行って、何万もの異なる分子の標的への結合の検出を可能にし、または他の実体の結合に対するこれら分子の効果を調べる。
【００９６】
一部の実施形態では、本発明は生きている生物（たとえば、細菌、酵母、真核生物、哺乳類、霊長類、ヒト等）及び／または細胞における分子相互作用の検出を提供する。一部の実施形態では、内部でタグ付けされたタンパク質と相補体で標識されたタンパク質が細胞にてまたは生物全体にて同時発現し、シグナルが検出され、相互作用複合体の形成と関連付けられる。一部の実施形態では、細胞は、ベクター（たとえば、内部でタグ付けされたタンパク質、相補体で標識されたタンパク質等をコードする）で一時的に及び／または安定的に形質転換される、または形質移入される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアッセイを実施するのに必要な成分（たとえば、内部でタグ付けされたタンパク質、相補体で標識されたタンパク質等）をコードする遺伝子導入生物が生成される。他の実施形態では、ベクターは生物全体に注入される。
【００９７】
本発明はまた、内部タグ及び構造相補体及びそれらから生じる生物発光複合体の設計及び／または最適化の方法を提供する。本明細書に記載されている実施形態に一致する非発光性の対／基及び／またはそのパネルの設計のための好適な方法は本発明の範囲内である。
【実施例】
【００９８】
実施例１
本発明の実施形態の開発の間に実験を行って、実験モデルとしての非発光性ポリペプチドＮＬｐｏｌｙ１１Ｓと高親和性非発光性ペプチドＮＬｐｅｐ８６との間での構造的な相補性を明らかにした。ＮＬｐｅｐ８６の挿入のための標的としてＨａｌｏＴａｇを選択した。ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質の中での種々の部位（挿入部位：１８／１９、３２／３３、７８／７９、９８／９９）にて直列型のＮＬｐｅｐ８６（高親和性、配列ＧＳＳＧ−［ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ］−Ｅ−［ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ］−ＧＳＳＧ）を挿入することによって多数のＨａｌｏＴａｇ／ＮＬｐｅｐ８６融合タンパク質を生成した。当初の実験は、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓと示したＨａｌｏＴａｇ／ＮＬｐｅｐ８６融合タンパク質で一時的に形質移入したＨｅＬａ細胞で行った。結果は、ＮＬｐｏｌｙ１１ＳとＨａｌｏＴａｇ内の様々な位置に挿入したＮＬｐｅｐ８６との間で構造な相補性を達成することが可能であることを示している（図４）。ＴＭＲ−ＨＴリガンドで標識した細胞のＢＲＥＴ（ＨａｌｏＴａｇリガンドを結合する修飾されたＨａｌｏＴａｇの能力を必要とする）（図４）または画像化（図５）によってＨａｌｏＴａｇの機能を測定した。ＮＬｐｅｐ８６の挿入はＨａｌｏＴａｇの機能に適合することが明らかにされた（図５）。内部融合体を用いた構造的な相補性の観察された効率は、ＮＬｐｏｌｙ１１ＳとＮＬｐｅｐ８６を用いたＮ末端またはＣ末端のＮＬｐｅｐ８６のＨａｌｏＴａｇへの融合に対して１〜４０％の間で変化する。
【００９９】
実施例２
ＮＬｐｅｐ１１４で内部にタグ付けした標的タンパク質とＮＬｐｏｌｙ１１Ｓでタグ付けしたプロテインＧとを用いて試験抗体が主導するＮＡＮＯＬＵＣの生物発光相補性を明らかにする実験を実施した。
【０１００】
プロテインＧ−１１Ｓの構築、発現及び精製
ＡＴＧ−２０７１（ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓでタグ付けしたプロテインＧ）プラスミド（配列番号２５７６）：免疫グロブリンＧに結合するプロテインＧ［Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１９９０９］に由来するアミノ酸３０３〜４９７を合成遺伝子（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）から増幅し、６×Ｈｉｓタグを付加し、リンカーＮＬｐｏｌｙ１１Ｓを含有するｐＦ５Ｋ（Ｆｌｅｘｉベクター、ＣＭＶプロモータ）にクローニングした。次いで細菌発現のために、６×Ｈｉｓ−プロテインＧ−ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ融合体をｐＦ１Ａ（Ｆｌｅｘｉベクター、Ｔ７プロモータ；Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。
【０１０１】
グルコース／ラムノース自己誘導法によって大腸菌の発現系にてＮＬｐｏｌｙ１１Ｓでタグ付けしたプロテインＧを産生させた。手短には、製造元が推奨するプロトコールを用いてプラスミドＡＴＧ−２０７１で大腸菌ＫＲＸ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を形質転換し、抗生剤を含有するＬＢ培地（５０ｍｌ）にて振盪しながら（２７５ｒｐｍ）３７℃で１７〜２２時間増殖させた。このスターター培養物を２５０ｍｌの自己誘導培地（グルコースとラムノース（各０．０５％）と抗生剤を伴ったＬＢ培地）にて希釈し（１：１００）、振盪しながら（２７５ｒｐｍ）２５℃で１７〜２２時間増殖させた。遠心分離（５，０００×ｇで４℃にて２０分間）によって細胞を回収し、培地を取り除き、細菌細胞のペレットを−２０℃で保存した。
【０１０２】
ペレットにした細胞を５０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），５００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのイミダゾール，０．５×のＦａｓｔＢｒｅａｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ），１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｍｅｇａ），０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）及び２５０単位のＲＱ１  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にて再浮遊させ、次いで時々混合しながら常温にて３０分間インキュベートした。遠心分離（４℃にて１５，０００×ｇで２０分間）によって可溶性分画を分離し、出発緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）で平衡化した５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にかけた（１ｍｌ／分）。試料の適用後、４ＣＶの出発緩衝液で樹脂を洗浄した。結合したタンパク質を２０ＣＶの線形勾配、０〜１００％の最終緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのイミダゾール）によって溶出した。分画（２．５ｍｌ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって解析した。十分量の主要な４１ｋＤａのバンド（ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ｐＧ）と軽微な混入物を伴ったものをプールし、１×ＰＢＳに対して透析し、−２０℃で保存した。
【０１０３】
ＶＥＧＦＡ構築物についての発現プラスミド構築の方法
ＮＬｐｅｐ１１４及び／またはＦＬＡＧオクタペプチド（双方とも合成遺伝子；Ｇｅｎｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）のいずれかに融合させたＶＥＧＦＡ−１６５をベクターｐＣＩＨＮ（Ｆｌｅｘｉベクター，ＣＭＶプロモータ；Ｐｒｏｍｅｇａ）に移すことによってＶＥＧＦ構築物ＡＴＧ−１９１５（配列番号２５７７）、−１９１７（配列番号２５７８）及び−１９４６（配列番号２５７９）を作った。このベクターはＩＬ６分泌シグナルと共にＮ末端のＨａｌｏＴａｇを含有する。
【０１０４】
一般的な細胞形質移入のプロトコール
１：１０の質量比にて１０ｕｇの総ＤＮＡでＮＬｐｅｐ１１４標的融合体構築物ＤＮＡをキャリアＤＮＡ（ｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）；Ｐｒｏｍｅｇａ）にて希釈した。製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコールに従って、１：３（ｕｇＤＮＡ／ｕｌＦｕＧＥＮＥ）の比でＤＮＡ：ＦｕＧＥＮＥ複合体を形成した。ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）にて２×１０5個／ｍｌの密度で浮遊させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）の２０部（容積／容積）と１部の形質移入複合体を混合した。細胞（５０ｕｌ／ウェル）を９６穴組織培養プレートに分配し、３７℃／５％ＣＯ2で加湿したインキュベータにて１８〜２４時間インキュベートした。
【０１０５】
標的抗体が主導するＮＡＮＯＬＵＣ生物発光相補性
上記で記載したような３種のＮＬｐｅｐ１１４−ＶＥＧＦＡのＤＮＡによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）に形質移入し、一晩インキュベートした。培地を等量のｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で置き換えることによって同一条件下で細胞を４時間血清飢餓状態に置いた。１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ（１５）ｐＧを０．５ｕｇ／ｍｌの最終濃度（１２ｎＭ）で加えた（２５ｕｌ／ウェル）。１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）における抗ＶＥＤＦ抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、＃２９３）を０〜０．７３ｕｇ／ｍｌ（０〜５．３ｎＭ）の最終濃度で加えた（２５ｕｌ／ウェル）。ＬＣＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、１００ｕｌ／ウェル、１０ｕＭの最終濃度）の添加の後、ＩｎｇｉｎｉｔｙＦ５００マイクロタイタープレートリーダー（Ｔａｃａｎ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１０６】
図６〜１１は、一緒にインキュベートすると、ＮＬｐｅｐ１１４−ＶＥＧＦ融合タンパク質とＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ−プロテインＧ融合タンパク質と未修飾の抗−ＶＥＧＦ抗体とが一緒になって活性のあるルシフェラーゼ複合体を形成することを明らかにしている。シグナルは測定可能ではあるが、抗体の非存在下では極度に低い。ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４相互作用の高いＫDを考えると、促進性ではない相補性は使用される濃度では極度に低いはずである。このことは、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ断片が若干低いレベルの残留ルシフェラーゼ活性を有することを示している。ＡＴＧ−１９１５（ＨＴ−ＶＥＧＦ−１１４）については、抗ＶＥＧＦ抗体の濃度が０から０．７３ｕｇ／ｍｌ（０〜５．３ｎＭ）に上昇するにつれてこのバックグランドシグナルは４００倍を超えて上昇した。
【０１０７】
ＮＬｐｅｐ１１４タグのコンテキストはシステム全体の性能に影響を及ぼす。Ｃ末端（外側）のＮＬｐｅｐ１１４タグを伴うＡＴＧ−１９１５は最も高いシグナルを有する。Ｃ末端ＦＬＡＧ配列（ＡＴＧ−１９４６）の添加によってＮＬｐｅｐ１１４タグがやや内部移行すると、この構築物は４０％のシグナル喪失を被る。２つの大きなドメイン間に置かれると、シグナルは５倍低下する（ＡＴＧ−１９１７）。総シグナルはＮＬｐｅｐ１１４タグの位置で変化する一方で、算出されるＥＣ50は一定のままであることに留意のこと。ＮＬｐｅｐ１１４タグのコンテキストは相補性のレベルを変えるが、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ／ＮＬｐｅｐ１１４対の親和性を変えることはない。
【０１０８】
実施例３
結合対ＦＫＢＰとＦｒｂを用いて促進性のＮＡＮＯＬＵＣ生物発光相補性を明らかにする実験を実施した（図１３）。
【０１０９】
形質移入はすべて、プレートに播くことに先立って形質移入複合体を細胞の浮遊液と混合することにより逆形質移入として行った。手短には、５００ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭと５ｕｇのＤＮＡと１５ｕＬのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する形質移入ミックス（１枚の９６穴プレートに十分な）を作った。相補性対（Ｆｒｂ−Ｘ／ＦＫＢＰ−Ｙ）のＤＮＡは１：１の比だった。
【０１１０】
形質移入については、相補性対のＤＮＡを希釈しないで、または１：５０の希釈で使用した。キャリアＤＮＡとしてｐＧＥＭ３Ｚを用いて総ＤＮＡ含量を５ｕｇに合わせた。穏やかなボルテックスによって形質移入ミックスを混合し、使用に先立って室温で５〜１０分間インキュベートした。
【０１１１】
トリプシン処理によって細胞を回収し、洗浄し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにて２×１０5個／ｍｌの濃度に希釈した。形質移入については、０．５ｍｌの形質移入ミックスを１０ｍｌの細胞浮遊液に加えた。次いで白色９６穴組織培養プレート（ウェル当たり１００ｕｌ）のウェルに細胞浮遊液を入れ、３７℃にて一晩インキュベートした。
【０１１２】
形質移入した細胞で３つの異なるアッセイを行った。
ａ）単一濃度のラパマイシンを用いたエンドポイントアッセイ（図１４及び１５）
形質移入した細胞上の増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を吸引によって取り除き、ラパマイシン（１ｍＭ）とフリマジン（１０ｍＭ）を含む１００ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭを加えた。細胞を室温で１０分間インキュベートし、ＢＭＧ  ＣｌａｒｉｏｓｔａｒまたはＧｌｏｍａｘ  Ｍｕｌｔｉプラスプレートリーダーで発光を読み取った。
ｂ）エンドポイントアッセイ：ラパマイシンの用量反応（図１６）
形質移入した細胞上の増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を吸引によって取り除き、ラパマイシンの連続希釈とフリマジン（１０ｍＭ）を含む１００ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭを加えた。細胞を室温で１０分間インキュベートし、ＢＭＧ  ＣｌａｒｉｏｓｔａｒまたはＧｌｏｍａｘ  Ｍｕｌｔｉプラスプレートリーダーで発光を読み取った。
ｃ）動態アッセイ（図１７及び１８）
形質移入した細胞上の増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を吸引によって取り除き、フリマジン（１０ｍＭ）を含む５０ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭを加えた。発光の検出はＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーで開始し、ラパマイシン（１ｍＭ）とフリマジン（１０ｍＭ）を含む５０ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭを細胞上に注入した。発光を連続的に読み取った。
【０１１３】
実施例４
内部の高親和性ＮＬｐｅｐは種々の実施形態で使用される。Ｎ末端もＣ末端もタンパク質タグの連結について魅力的な点を表さない場合が生じる。たとえば、
１）タンパク質の末端が所望の細胞局在に存在しない。たとえば、所与の膜タンパク質について、細胞外の部位でタグを有することが所望であってもよいが、双方の末端は細胞内にある。
２）タグの末端付加がタンパク質／タンパク質の相互作用を妨害する。たとえば、多数の膜タンパク質（たとえば、ＡＤＲＢ２）は、まさにＣ末端にＰＤＺ結合モチーフを有する。Ｃ末端タグの付加はこれらの相互作用を無効にし、適正なタンパク質の機能を変化させる。
３）タグにとって末端が許容するよりもタンパク質の所与の位置に空間的に接近して置かれることが望まれる。
４）Ｎ末端でのタグの配置が適正なシグナル配列の機能及び切断を妨げる。
５）末端がすでに他のタグまたは融合タンパク質にために使用されている。
【０１１４】
実施例５
内部の高親和性ＮＬｐｅｐは膜タンパク質の表面発現の測定に使用される。細胞表面に発現した所与のタンパク質の量を測定することが一般に望まれる。これは、
・受容体の活性化及び内部移行
・エンドソームからの受容体の再利用
・調節されたエキソサイトーシス
・タンパク質の輸送及び分泌
に関する検討を可能にする。
【０１１５】
一部の実施形態では、精製されたＮＬｐｏｌｙ、たとえば、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓ、タンパク質に加えてフリマジン基質を細胞外媒体に加えることができるように以下の実験を構成した。原形質膜の細胞外側での高親和性ＮＬｐｅｐ配列、たとえば、ＮＬｐｅｐ８０との相補性は自然発生的な相補性をもたらすことができ、表面上のタンパク質の量に直接比例する発光シグナルを生じる。
【０１１６】
ａ）嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）のＦ５０８ｄｅｌ変異は嚢胞性線維症の最も一般的な原因であり、タンパク質が原形質膜に正しく標的化されるのを妨げ、代わりにそれが分解される。表面への輸送の増加を促進することができる小分子シャペロンが特定されている。そのような小分子をスクリーニングするために、ＣＦＴＲの表面発現を定量するための単純な発光アッセイを有することは有益である。
【０１１７】
高親和性のＮＬｐｅｐによってＣＦＴＲにタグ付けすることは表面発現の定量を可能にするが、ＣＦＴＲのＮ末端及びＣ末端は双方ともに細胞内にある。したがって、ＮＬｐｅｐタグをタンパク質の細胞外ループの１つに置く。一部の実施形態では、Ｆｌａｇエピトープタグを残基Ａｓｎ９０１の後に予め置いて細胞外タグを提供する。ＣＦＴＲのＦ５０８ｄｅｌ変異体における同じ位置での高親和性ＮＬｐｅｐ配列の挿入は以下の１以上を可能にする。
１）原形質膜でのタンパク質の量の単純な定量。化合物ライブラリ及び適正な輸送を促進することが知られている陽性対照化合物で細胞を処理し、ＮＬｐｏｌｙ、たとえば、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓとフリマジンとの存在下で生細胞にて発光を測定する。
２）細胞におけるタンパク質の総量を定量するためにＮＬｐｏｌｙ、たとえば、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓとフリマジンとを含有する溶解試薬で細胞を処理する。タンパク質分解の低下は蛍光シグナルを増やすことになる。
３）緩衝液中のＮＬｐｏｌｙ、たとえば、ＮＬｐｏｌｙ１１Ｓとフリマジンとのブロット膜への添加によってタンパク質ブロットにおけるバンドのシフトとして、変異中に生じるＣＦＴＲのグリコシル化が容易に検出される。
【０１１８】
ｂ）原形質膜の内外での神経伝達物質受容体の輸送は厳しく調節されている。ＡＭＰＡ受容体（ＡＭＰＡＲ）は迅速な興奮性シナプス伝達に介在し、シナプス強度はシナプス後膜におけるＡＭＰＡＲの組成によって決定され、それはＡＭＰＡＲサブユニットの調節された輸送によって制御される。ＡＭＰＡ受容体の細胞外ループに高親和性ＮＬｐｅｐを挿入することによってタンパク質のレベル及びエキソサイトーシスとエンドサイトーシスの動態の簡単な測定が可能になる。
【０１１９】
上記明細書で言及された出版物及び特許はすべて参照によって本明細書に組み入れられる。本発明の記載されている方法及び系の種々の改変及び変化は本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は特定の実施形態と関連して記載されているが、請求されるような本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、関連する分野の当業者に自明である本発明を実施するための記載されている方法の種々の改変は本発明の範囲内にあるように意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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