(57)【要約】  １つ以上の腫瘍抑制因子遺伝子のヘテロ接合性改変を有するようにゲノム改変されている動物が開示される。
2017533716.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム改変腫瘍抑制因子遺伝子を含むブタまたは細胞または胚。
【請求項２】
前記腫瘍抑制因子遺伝子がＮＦ１遺伝子および／またはＴＰ５３遺伝子である、請求項１に記載のブタ、細胞または胚。
【請求項３】
前記遺伝子が第１２染色体上に存在する、前記のいずれかに記載のブタ、細胞または胚。
【請求項４】
前記改変ＮＦ１遺伝子がヒトにおけるアルギニン１９４７に相当する位置における改変を含む、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項５】
前記改変ＮＦ１遺伝子および／または前記改変ＴＰ５３遺伝子が未成熟終止コドンを含むように改変されている、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項６】
前記ＮＦ１遺伝子のヘテロ接合性改変を有する、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項７】
前記ＴＰ５３遺伝子のヘテロ接合性改変を有する、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項８】
前記ＮＦ１遺伝子および前記ＴＰ５３遺伝子の両方の改変を有する、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項９】
前記改変がシスである、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項１０】
前記ＮＦ１遺伝子の一方のアレルが野生型アレルである、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項１１】
前記ＴＰ５３遺伝子の一方のアレルが野生型アレルである、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項１２】
前記ＮＦ１遺伝子の一方のアレルが野生型アレルであり、但し、前記野生型ＮＦ１アレルが１つ以上のサイレント突然変異を有する、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項１３】
前記ＴＰ５３遺伝子の一方のアレルが野生型アレルであり、但し、前記野生型ＴＰ５３アレルが１つ以上のサイレント突然変異を有する、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項１４】
前記ＮＦ１アレルの前記１つ以上のサイレント突然変異が１つ以上の制限酵素のための攻撃の部位を提供する、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項１５】
前記ＴＰ５３アレルの前記１つ以上のサイレント突然変異が１つ以上の制限酵素のための攻撃の部位を提供する、請求項１１に記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項１６】
ミニブタおよび／またはオッサバウブタおよび／またはランドレースブタおよび／またはファウンダーおよび／またはＦ１である、請求項１に記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項１７】
初代および／または低継代ブタ、細胞または胚である、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚。
【請求項１８】
接合体、卵母細胞、配偶子、精子、または胚／割球のメンバーである、前記のいずれかに記載の細胞。
【請求項１９】
標的化エンドヌクレアーゼおよび／または相同依存性修復テンプレートの使用を含む、前記のいずれかに記載のブタまたは細胞または胚を作製する方法。
【請求項２０】
動物が前記細胞からクローニングされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞または胚中に、
標的染色体ＤＮＡ部位に指向される標的化エンドヌクレアーゼ；
前記標的染色体ＤＮＡ部位に対して外因性である第１の配列を含む、前記標的染色体ＤＮＡ部位と相同性である第１のＨＤＲテンプレート；および
前記標的染色体ＤＮＡ部位に対して外因性である第２の配列を含む、前記標的染色体ＤＮＡ部位と相同性である第２のＨＤＲテンプレート
を導入することを含む、１つ以上の遺伝子改変を有する動物、細胞、または胚を作製する方法。
【請求項２２】
前記第２の配列が前記標的ＤＮＡ染色体部位と同一である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の配列が前記標的ＤＮＡ染色体部位と９９％の同一性を有する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の配列が前記標的ＤＮＡ染色体部位と９５％の同一性を有する、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の配列が、１つ以上のサイレント突然変異を除いて前記標的ＤＮＡ染色体部位と同一である、請求項２１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上のサイレント突然変異中の変化塩基数が１〜６である、請求項２１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の配列が、１つ以上の制限酵素による開裂を可能にする配列の変化を除いて前記標的ＤＮＡ染色体部位と同一である、請求項２１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記外因性配列が（ｉ）天然で見出されるアレル；（ｉｉ）同一種において見出されるアレル；（ｉｉｉ）同一種の別の品種において見出されるアレル；（ｉｖ）異なる種からのアレル；（ｖ）遺伝子のノックアウトを作出する配列；（ｖｉ）発現性選択マーカー；（ｖｉｉｉ）誘導性プロモーター；（ｉｘ）ランディングパッド；または（ｘ）ｉ〜ｉｘの任意の組合せを含む、請求項２１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記動物、細胞、または胚が、前記第１のＨＤＲテンプレートにより作製された前記遺伝子改変についてヘテロ接合性である、請求項２１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子改変が１つ以上の腫瘍抑制因子遺伝子の改変である、請求項２１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
改変ＮＦ１および／またはＴＰ５３部位を作製するために適用される、請求項２１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のＨＤＲテンプレートと前記第２のＨＤＲテンプレートとの比を調整することをさらに含む、請求項２１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のテンプレートが第１の制限酵素のための第１の部位を含み、かつ前記第２のテンプレートが第２の制限酵素のための第２の部位を含む、請求項２１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の部位および前記第２の部位を含む細胞を同定することを含む、遺伝子改変について複数の細胞をスクリーニングすることを含む、請求項２１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
１つ以上のゲノム改変腫瘍抑制因子遺伝子を含み、前記１つ以上の遺伝子がヘテロ接合的に改変されている、動物または細胞または胚。
【請求項３６】
請求項２１〜３３のいずれかに記載の方法により作製される、請求項３５に記載の動物または細胞または胚。
【請求項３７】
前記改変遺伝子の一方のアレルが野生型アレルであり、但し、前記野生型ＮＦ１アレルが１つ以上のサイレント突然変異を有する、請求項３５または３６に記載の動物または細胞または胚。
【請求項３８】
前記１つ以上のサイレント突然変異が制限酵素のための攻撃の部位を提供する、請求項３５〜３７のいずれかに記載の動物または細胞または胚。
【請求項３９】
１つ以上の制限酵素のための攻撃の部位を提供する前記１つ以上の遺伝子の一方または両方のアレルにおける改変を含む、請求項３５〜３８のいずれかに記載の動物または細胞または胚。
【請求項４０】
家畜、ウシ、ブタ、ミニブタおよび／またはオッサバウブタおよび／またはランドレースブタおよび／またはファウンダーおよび／またはＦ１である、請求項３５〜３９のいずれかに記載の動物または細胞または胚。
【請求項４１】
初代および／または動物および／または低継代（１３継代未満）である、請求項３５〜４０のいずれかに記載の細胞。
【請求項４２】
接合体、卵母細胞、配偶子、精子、または胚／割球のメンバーである、請求項３５〜４１のいずれかに記載の細胞。
【請求項４３】
細胞、胚または動物をゲノム改変するための標的化エンドヌクレアーゼの使用であって、前記改変が１つ以上の腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異を含む、使用。
【請求項４４】
前記改変が、
標的染色体ＤＮＡ部位に対して外因性である第１の配列を含む、前記標的染色体ＤＮＡ部位と相同性である第１のＨＤＲテンプレート、および
前記標的染色体ＤＮＡ部位に対して外因性である第２の配列を含む、前記標的染色体ＤＮＡ部位と相同性である第２のＨＤＲテンプレート
をさらに含む、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記第２の配列が前記標的ＤＮＡ染色体部位と同一である、請求項４３または４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記第２の配列が前記標的ＤＮＡ染色体部位と９９％の同一性を有する、請求項４３〜４５のいずれかに記載の使用。
【請求項４７】
前記第２の配列が前記標的ＤＮＡ染色体部位と９５％の同一性を有する、請求項４３〜４６のいずれかに記載の使用。
【請求項４８】
前記第２の配列が、１つ以上のサイレント突然変異を除いて前記標的ＤＮＡ染色体部位と同一である、請求項４３〜４７のいずれかに記載の使用。
【請求項４９】
前記１つ以上のサイレント突然変異中の変化塩基数が１〜６である、請求項４３〜４８のいずれかに記載の使用。
【請求項５０】
前記第２の配列が、１つ以上の制限酵素による開裂を可能にする配列の変化を除いて前記標的ＤＮＡ染色体部位と同一である、請求項４３〜４９のいずれかに記載の使用。
【請求項５１】
前記外因性配列が（ｉ）天然で見出されるアレル；（ｉｉ）同一種において見出されるアレル；（ｉｉｉ）同一種の別の品種において見出されるアレル；（ｉｖ）異なる種からのアレル；（ｖ）遺伝子のノックアウトを作出する配列；（ｖｉ）発現性選択マーカー；（ｖｉｉｉ）誘導性プロモーター；（ｉｘ）ランディングパッド；または（ｘ）ｉ〜ｉｘの任意の組合せを含む、請求項４３〜５０のいずれかに記載の使用。
【請求項５２】
前記動物、細胞、または胚が、前記第１のＨＤＲテンプレートにより作製された前記遺伝子改変についてヘテロ接合性である、請求項４３〜５１のいずれかに記載の使用。
【請求項５３】
前記遺伝子改変が１つ以上の腫瘍抑制因子遺伝子の改変である、請求項４３〜５２のいずれかに記載の使用。
【請求項５４】
改変ＮＦ１および／またはＴＰ５３部位を作製するために適用される、請求項４３〜５３のいずれかに記載の使用。
【請求項５５】
前記第１のＨＤＲテンプレートと前記第２のＨＤＲテンプレートとの比を調整することをさらに含む、請求項４３〜５４のいずれかに記載の使用。
【請求項５６】
前記第１のテンプレートが第１の制限酵素のための第１の部位を含み、かつ前記第２のテンプレートが第２の制限酵素のための第２の部位を含む、請求項４３〜５５のいずれかに記載の使用。
【請求項５７】
１つ以上の改変腫瘍抑制因子遺伝子を有する細胞または胚の、それから動物をクローニングするための使用。
【請求項５８】
前記１つ以上の腫瘍抑制因子遺伝子がヘテロ接合的に改変されている、請求項５７に記載の細胞または胚の使用。
【請求項５９】
前記改変がＮＦ１遺伝子および／またはＴＰ５３遺伝子の改変を含む、請求項５７または５８に記載の細胞または胚の使用。
【請求項６０】
前記１つ以上の改変がシスで作製される、請求項５７〜５９のいずれかに記載の細胞または胚の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１４年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／０７８，８５７号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
技術分野は、遺伝子改変動物に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経線維腫症１型（ＮＦ１）は、最も蔓延している遺伝障害の１つであり、３，０００生児出生当たり１人に生じ、米国のみで１００，０００人を超える罹患者がいる。ＮＦ１は、ニューロフィブロミン１（ＮＦ１）遺伝子中の体細胞突然変異により引き起こされ、症例の５０％は遺伝性であり、症例の５０％は新たな突然変異である。ＮＦ１は、患者が骨格異常、脊柱側弯症、学習不能、高血圧および癲癇を示すことが多いため、消耗性疾患である［非特許文献１］。ＮＦ１患者は、その体内の末梢神経の全体にわたり神経線維腫として公知の良性腫瘍を発症する潜在性も有する。神経線維腫は良性であるが、それは顕著な疼痛および運動性の問題を引き起こし得る。さらに、二次性遺伝子変化は、患者の１０％において神経線維腫の悪性転換を引き起こし、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）の発症をもたらす［非特許文献２］。ＭＰＮＳＴは、高度に侵襲性であり、致死性の肉腫であり、現在、ＭＰＮＳＴのための唯一の治療選択肢は、完全な外科的切除または高用量の非特異的化学療法のいずれかである［非特許文献２］。神経との密接な関連のため、外科的切除は実用可能でないことが多く、化学療法は不成功に終わることが多い。これらの腫瘍のための標的療法の開発においてかなりの労力がなされている一方、診療所において有望な効力は示されておらず、ＭＰＮＳＴは、ＮＦ１患者についての主な死因のままである。ＮＦ１患者は、複数の他の腫瘍型に加え、視覚経路グリオーマ、星状細胞腫および若年性骨髄単球性白血病の発症についてのより高いリスクも有する［非特許文献３］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＳＡ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＪＭ．ＮＦ１  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ  １．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．２０００；１５１（１）：３３−４０．
【非特許文献２】Ｕｐａｄｈｙａｙａ  Ｍ，Ｋｌｕｗｅ  Ｌ，Ｓｐｕｒｌｏｃｋ  Ｇ，Ｍｏｎｅｍ  Ｂ，Ｍａｊｏｕｎｉｅ  Ｅ，Ｍａｎｔｒｉｐｒａｇａｄａ  Ｋ，Ｒｕｇｇｉｅｒｉ  Ｍ，Ｃｈｕｚｈａｎｏｖａ  Ｎ，Ｅｖａｎｓ  ＤＧ，Ｆｅｒｎｅｒ  Ｒ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｎ，Ｇｕｈａ  Ａ  ａｎｄ  Ｍａｕｔｎｅｒ  Ｖ．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ＮＦ１  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｉｎ  ＮＦ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｒｓ（ＭＰＮＳＴｓ）．Ｈｕｍａｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．２００８；２９（１）：７４−８２．
【非特許文献３】Ｂｉｋｏｗｓｋａ−Ｏｐａｌａｃｈ  Ｂ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｏｗｓｋａ  Ｔ．［Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  １−ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ］．Ｍｅｄｙｃｙｎａ  ｗｉｅｋｕ  ｒｏｚｗｏｊｏｗｅｇｏ．２０１３；１７（４）：３３４−３４０．
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ヒトおよびブタについてのＮＦ１遺伝子およびタンパク質アラインメントである。ＮＦ１は、ヒトおよびブタ間で高度に保存されている。ブタエキソン４２はヒトエキソン４０に対応し、この領域中のアミノ酸配列も高度に保存されている。アミノ酸アルギニン１９４７（Ｒ１９４７）は、ヒト患者において突然変異していることが多く、このアミノ酸はブタにおいて保存されている。
【図２】ＮＦ１ブタ遺伝子中のＲ１９４７Ｘ突然変異を作出するためのＴＡＬＥＮ設計である。ブタＮＦ１エキソン４２を上段に示す。エキソン４２を拡大して３つのＴＡＬＥＮペアのＴＡＬＥＮ結合部位、およびアルギニン１９４７（Ｒ１９４７）アミノ酸を示す。
【図３Ａ−Ｄ】ブタＮＦ１遺伝子中のＲ１９４７Ｘ突然変異を誘導するためのＴＡＬＥＮおよび相同依存性修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）の利用である。Ａ．ＮＦ１遺伝子のエキソン４２についての野生型（ＷＴ）配列を上段に示す。ＴＡＬＥＮはこの遺伝子座について設計し（ｓｓＮＦ１  ４２．３ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬＥＮ結合部位を下線で示す（赤色）。Ｒ１９４７Ｘ突然変異（大文字は、ＷＴ配列からの変化塩基対である）、およびＲＦＬＰ分析のための新規制限酵素部位（赤色、下線）を誘導するように９０塩基対のＨＤＲオリゴを設計した。得られたＲ１９４７Ｘアレルを下段に示す。Ｂ．摂氏３０度における３日間のインキュベーション後の細胞集団のＲＦＬＰ分析は、３つ全てのＴＡＬＥＮが変動率においてＨＤＲを誘導し得ることを示し、３つのＴＡＬＥＮのうち、ｓｓＮＦ１  ４２．１が最も活性であり（５４．２％のアレル改変）、ｓｓＮＦ１  ４２．２が中程度に活性であり（４５．１％のアレル改変）、ｓｓＮＦ１  ４２．３が最小活性である（２７．２％のアレル改変）。Ｃ．２４個のクローンのＲＦＬＰ分析は、３６５塩基対における未切断（ＷＴ）バンドならびに１９１および１７４塩基対における消化ＨＤＲアレルに対応するバンドを示す。＊は、ヘテロ接合性クローンを規定する。Ｄ．２つのクローンについての配列決定分析は、ＷＴアレルおよびＨＤＲアレルの両方を実証する。
【図４Ａ−Ｃ】ＴＡＬＥＮ活性は、腫瘍抑制因子遺伝子についてヘテロ接合性であるクローンを単離する能力と相関する。Ａ．グラフは、ｓｓＮＦ１  ４２．２処理細胞から単離され、予測比と比較されたＲＦＬＰによるＷＴ、ヘテロ接合性、またはホモ接合性であるクローンの割合を示す。ホモ接合性クローンの割合を予測するため：（３日目のＲＦＬＰ活性）＾２。ヘテロ接合性クローンの割合を予測するため：（３日目のＲＦＬＰ活性×２）（１〜３日目のＲＦＬＰ活性）。ｓｓＮＦ１  ４２．３よりも高い活性を有するｓｓＮＦ１  ４２．２について、かなり多い遺伝子改変が観察され、ホモ接合性ＫＯクローンへのバイアスが見られた。Ｂ．より小さい活性を有するＴＡＬＥＮペアのｓｓＮＦ１  ４２．３について、予測されるとおり、より少ないホモ接合性ＫＯクローンが回収され、ＷＴ、ヘテロ接合性およびホモ接合性クローンの比は、予測されるものとかなり近かった。Ｃ．グラフは、ｓｓＮＦ１  ４２．２およびｓｓＮＦ１  ４２．３ＴＡＬＥＮについての変動活性を示す。ＲＦＬＰによる１０個のヘテロ接合性クローンを配列決定分析のために選択した。ｓｓＮＦ１  ４２．３よりもかなり高いＴＡＬＥＮ活性を有するｓｓＮＦ１  ４２．２は、ＷＴアレル中のインデルを有する９０％の配列決定クローンをもたらした一方、ｓｓＮＦ１  ４２．３ＴＡＬＥＮ処理細胞からのクローンの３０％のみがインデルを示した。
【図５】ブタにおいてシスでＮＦ１およびＴＰ５３を改変するためのＴＡＬＥＮ設計である。ＮＦ１およびＴＰ５３は、ブタにおける第１２染色体（ヒトにおいては第１７染色体）上で近接して位置する。ＴＡＬＥＮは、ＮＦ１中のＲ１９４７Ｘ突然変異およびＴＰ５３中のＹ１５５Ｘ突然変異を作出するように設計した。所望の突然変異に対するＴＡＬＥＮ結合部位を上段に示す。
【図６Ａ−Ｂ】ブタＮＦ１遺伝子中のＲ１９４７Ｘ突然変異およびブタＴＰ５３遺伝子中のＹ１５５Ｘ突然変異を誘導するためのＴＡＬＥＮおよび相同依存性修復（ＨＤＲ）の利用である。Ａ．初代ブタ線維芽細胞中に同時形質移入した場合、ｓｓＮＦ１  ４２．３ＴＡＬＥＮは、ＲＦＬＰ分析による２５．５％のアレル改変をもたらし、ｓｓＴＰ５３  Ｅ６ＴＡＬＥＮは、細胞分析による１１．８％の切断をもたらした。Ｂ．２４個のクローンのＲＦＬＰ分析は、未切断（ＷＴ）バンドならびにＮＦ１およびＴＰ５３の両方についての消化ＨＤＲアレルに対応するバンドを示す。＊は、ヘテロ接合性クローンを規定する。＊は、ＮＦ１およびＴＰ５３の両方についてヘテロ接合性であるクローンを規定する。ＲＦＬＰ分析は、クローンの８．９％がＮＦ１についてＲＦＬＰによるヘテロ接合性であり、クローンの３．７％がＮＦ１およびＴＰ５３の両方についてＲＦＬＰによるヘテロ接合性であることを実証したが、配列決定された全てのクローンは、ＮＦ１またはＴＰ５３のいずれかまたはその両方のＷＴアレル上のインデルを含有した。
【図７】高解像度融解分析についての融解曲線は、ＴＰ５３についてヘテロ接合性であるクローンを同定する。
【図８Ａ−Ｃ】ＮＦ１ヘテロ接合性ブタは、Ｒａｓ活性の増加を実証する。Ａ、ランドレース農場ブタおよびオッサバウミニブタについてのＳＣＮＴ実験の結果を示す表である。Ｂ、ＷＴ線維芽細胞（左）およびＮＦ１Ｒ１９４７Ｘ／＋線維芽細胞（右）のウエスタンブロットである。染色は、突然変異細胞中のＲａｓの増加活性を示す。細胞溶解物は、０、５および１５分において回収した。Ｃ、総Ｒａｓ（上段）またはＧＡＰＤＨ（下段）に正規化されたＲａｓ−ＧＴＰである。両方の分析において、ＮＦ１Ｒ１９４７Ｘ／＋（ＮＦ１Ｈｅｔ）細胞は、ＮＦ１ＷＴ細胞と比較して増加したＲａｓ活性を示す。
【図９Ａ−Ｄ】ＮＦ１ヘテロ接合性ブタは、ＮＦ１関連表現型を有する。出生したＮＦ１Ｒ１９４７Ｘ／＋オッサバウミニブタの全ては、変動程度の低色素沈着を示す。仔ブタの全ては、それらの顔面部上で淡黄色／褐色の低色素沈着を示し（９Ａ、上段）、１頭の仔ブタは、その背部上で白色の低色素沈着を示した（９Ａ、下段）。９Ｂ．ＮＦ１Ｒ１９４７Ｘ／＋オッサバウミニブタの２頭は、巨視的観察（９Ｂ、左）およびＸ線イメージング（９Ｂ、右）の両方による解剖時に脊椎湾曲および潜在的な脊椎側弯症の徴候を示した。脊椎側弯症は、ＮＦ１患者の約２０％において報告されている。９Ｃ．ＮＦ１Ｒ１９４７Ｘ／＋オッサバウミニブタの多くの１頭において観察された複数のカフェオレスポットの存在を同定する表である。９Ｄ、１〜４は、９Ｃにおいて同定されたスポットの写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
いくつかのマウスモデルがＮＦ１を研究するために開発されている一方、そのマウスモデルは、ヒト疾患をモデリングするその能力に関して制約を有し、新規イメージング技術および外科的介入の開発に不十分なモデルである。本明細書において、ＮＦ１病因、疾患発症および進行、新規イメージングおよび外科的技術の適用、ならびに前臨床薬物試験をより良好に理解するために使用することができるＮＦ１のブタモデルを確立する材料および方法が提供される。さらに、本モデルはＴＰ５３遺伝子のノックアウトから利益を享受し、その実施形態を提示する。
【０００７】
この研究の過程において、本発明者らは、当初、ＮＦ１および／またはＴＰ５３３ノックアウトについてヘテロ接合性である細胞を作製し得なかった。この研究過程において、以下の作用理論が開発されたが、しかしながら、本発明は、この理論化機序に限定されるものではない。問題は、ＮＦ１およびＴＰ５３が腫瘍抑制因子遺伝子であることが認識された。遺伝子改変を作製する方法は、最初に細胞において研究され、細胞を改変し、それらを複製させてから試験することを含む。細胞は、クローニングにより動物を作製するために使用されている家畜細胞である。これに関して、初代細胞について、ならびに細胞の最小の複製および／または継代について有効な方法を作出することが重要であり、それは有効な遺伝子改変を作製するためのさらなる困難である。腫瘍抑制因子遺伝子はノックアウトされているため、腫瘍抑制因子遺伝子のノックアウトについてホモ接合性である細胞がヘテロ接合性または野生型である細胞よりも好まれた。
【０００８】
この現実化について、改変を作製するいくつかの異なるアプローチを試みた。目的の１つがシスのＮＦ１およびＴＰ５３の両方のノックアウトについてヘテロ接合性である家畜細胞を作製することであったため、追加の拘束が存在した。これらのアプローチの１つは、標的腫瘍抑制因子遺伝子を標的化エンドヌクレアーゼにより切断し、同一遺伝子に２つの相同依存性修復（ＨＤＲ）テンプレートを提供することであった。ＨＤＲテンプレートの１つは、ノックアウトを作出することが意図される変化を有した。しかし、第２のＨＤＲテンプレートは、野生型遺伝子を有した。このアプローチは、以下の実施例のとおり有効であった。
【０００９】
別のアプローチも２つのテンプレートを使用し、テンプレートの一方は野生型遺伝子との配列同一性をほぼ有する。しかし、ほぼ野生型のＨＤＲテンプレートの存在の容易な検出を提供するために小さい変化を作製した。新規制限酵素部位を提供するためにサイレント突然変異を作製した。ノックアウトアレルは、それ自体のユニーク制限部位を有するように改変した。次いで、細胞を試験して両方の変化が存在するか否かを決定することができた。
【００１０】
腫瘍抑制因子遺伝子
実施例は、２つの異なる腫瘍抑制因子遺伝子の改変を記載する。したがって、腫瘍抑制因子遺伝子、例えば、以下のものを一般に改変することができる。
ＴＰ５３  腫瘍タンパク質ｐ５３
ＰＴＥＮ  ホスファターゼテンシンホモログ
ＲＢＩ（ｐＲＢまたはＲＢ１）網膜芽細胞腫１
Ｓｍａｄ４  Ｓｍａｄファミリーメンバー４
ＢＵＢＩＢ（ＢＵＢ１）ベンズイミダゾール非阻害出芽
ＢＲＣＡｌ  早発性乳癌１
ＢＲＣＡ２  早発性乳癌２
ＳＴ１４  腫瘍形成性の抑制因子１４
ｐＶＨＬ  フォンヒッペル・リンドウ腫瘍抑制因子
ＣＤ９５  Ｆａｓ受容体
ＳＴ５  腫瘍形成性の抑制因子５
ＹＰＥＬ３  イッピー（Ｙｉｐｐｅｅ）様３
ＳＴ７  腫瘍形成性の抑制因子７
ＮＦ２  ニューロフィブロミン２（マーリン）
ＴＳＣ１  結節性硬化症１
ＴＳＣ２  結節性硬化症２
ＣＤＫＮ２Ａ  サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ
ＰＴＣＨ  パッチド
【００１１】
他の箇所に記載のとおり、改変は、挿入／欠失（インデル）、フレームシフト、天然または野生型アレルによる破壊、ノックアウトおよび抑制などであり得る。
【００１２】
遺伝子改変動物
染色体改変について単アレル性または両アレル性である動物を作製することができる。例えば、本発明者らは、相同依存性組換え（ＨＤＲ）の方法を使用して動物の染色体中への外因性遺伝子の変化または挿入を作製した。ツール、例えば、ＴＡＬＥＮおよびリコンビナーゼ融合タンパク質、ならびに慣用の方法は、本明細書の他の箇所に考察される。本発明者らの実験室は、改変細胞の多遺伝子集団からクローニングする場合の非常に優れたクローニング効率を既に実証しており、単離コロニーについての体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によるクローニング効率の変動を回避するためにこのアプローチを提唱している（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。遺伝子改変およびＳＣＮＴの連続サイクルによりこの負荷を低減させた場合もある（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）が、これは技術的に困難であり、莫大な費用がかかる。ＳＣＮＴ前に両アレルＫＯ細胞を定型的に生成する能力は、大型動物の遺伝子操作における大きい進歩である。両アレルノックアウトは、他の方法、例えば、ＺＦＮおよび希釈クローニングを使用して不死細胞系において達成されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。別のグループは近年、市販のＺＦＮ試薬を使用してブタＧＧＴＡ１の両アレルＫＯを実証し（Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、両アレルヌル細胞をＧＧＴＡ１依存性表面エピトープの不存在についてＦＡＣＳにより濃縮することができる。これらの研究は、ある有用な概念を実証する一方、それらは動物または家畜を改変することができることを示すものではない。なぜなら、簡易なクローン希釈は一般に初代線維芽細胞単離株に適しておらず（線維芽細胞は低密度における成長が不十分である）、ヌル細胞についての生物学的濃縮が大多数の遺伝子に利用可能でないためである。
【００１３】
実験結果は、標的化ヌクレアーゼ系が意図されるコグネート部位においてｄｓＤＮＡを有効に切断していることを示した。標的化ヌクレアーゼ系は、タンパク質−ＤＮＡ結合により、または核酸−ＤＮＡ結合によりコグネートＤＮＡに結合するモチーフを含む。本明細書において報告される効率は顕著である。本発明者らは、それらの効率をさらに増加させるさらなる技術を他の箇所に開示した。
【００１４】
本発明の実施形態は、遺伝子改変動物を作製する方法であって、胚または細胞を、標的化ヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、ガイド型ＲＮＡ、リコンビナーゼ融合分子）（標的化ヌクレアーゼは、胚または細胞中の標的染色体部位に特異的に結合して細胞染色体の変化を作出する）をコードするベクターまたはｍＲＮＡに曝露し、細胞を代理母中でクローニングし、または胚を代理母中に移植すること（代理母は、それにより、レポーター遺伝子を有さず、標的化された染色体部位においてのみ遺伝子改変されている動物を妊娠する）を含む方法を含む。標的化部位は、本明細書に記載の部位、例えば、本明細書に記載の種々の遺伝子であり得る。テンプレートドライブ遺伝子移入法が、本明細書において詳述される。本発明の実施形態は、例えば、非ヒト動物、または任意の種の細胞の腫瘍抑制因子遺伝子を改変するためのＨＤＲテンプレートによるテンプレートドライブ遺伝子移入を含む。
【００１５】
本方法、および本明細書における一般的方法は、細胞および動物を指す。これらは、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、トリ、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択することができる。家畜という用語は、食料または生物学的材料のための商品として育成される飼育動物を意味する。偶蹄目という用語は、それぞれの足に通常２本、または４本のこともある偶数の指を有する偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の有蹄哺乳動物を意味し、それとしては、ウシ、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジ、およびヤギが挙げられる。
【００１６】
相同組換え修復（ＨＤＲ）
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）病変を修復するための細胞内機序である。この修復機序は、病変部位と有意な相同性を有する配列を有するＨＤＲテンプレートが存在する場合、細胞により使用され得る。特異的結合は、生物学分野において一般に使用される用語であり、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で標的に結合し、一般に複数の非共有結合性相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などを含む分子を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、相補的配列を有する核酸間の特異的結合の形態である。タンパク質も、例えば、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系において、またはＧａｌ４モチーフによりＤＮＡに特異的に結合し得る。アレルの遺伝子移入は、テンプレートガイド型プロセスを用いて内因性アレルを上回って外因性アレルをコピーするプロセスを指す。内因性アレルは実際に切り出され、一部の状況において外因性核酸アレルにより置き換えられ得るが、現行の理論は、そのプロセスはコピー機序であるということである。アレルは遺伝子対であるため、それらの間には有意な相同性が存在する。アレルは、タンパク質をコードする遺伝子であり得、またはそれは他の機能、例えば生物活性ＲＮＡ鎖をコードする機能もしくは調節タンパク質もしくはＲＮＡを受容するための部位を提供する機能を有し得る。
【００１７】
ＨＤＲテンプレートは、遺伝子移入されるアレルを含む核酸である。テンプレートは、ｄｓＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。ｓｓＤＮＡテンプレートは、好ましくは約２０〜約５０００残基であるが、他の長さを使用することができる。当業者は、明示範囲内の全ての範囲および値、例えば５００〜１５００残基、２０〜１００残基などが企図されることを直ちに認識する。テンプレートは、内因性アレルに隣接するＤＮＡまたは置き換えるべきＤＮＡとの相同性を提供するフランキング配列をさらに含み得る。テンプレートは標的化ヌクレアーゼ系に結合される配列も含み得、したがって、その系のＤＮＡ結合メンバーについてのコグネート結合部位である。コグネートという用語は、典型的には、相互作用する２つの生体分子、例えば、受容体およびそのリガンドを指す。ＨＤＲプロセスに関して、生体分子の一方は目的の、すなわち、コグネートＤＮＡ部位またはタンパク質部位と結合する配列を用いて設計することができる。
【００１８】
標的化ヌクレアーゼ系
ゲノム編集ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、バイオテクノロジー、遺伝子療法および多くの生物における機能的ゲノム研究の分野に影響を及ぼしている。ごく最近、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が、相補的ＲＮＡ分子によりその標的部位に指向される。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＥＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別のそのようなツールである。これらは、標的化ヌクレアーゼ系の例であり、これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるＤＮＡ結合メンバーを有する。次いで、その部位はヌクレアーゼにより切断される。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合しているヌクレアーゼを有する。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、標的ＤＮＡ上で互いに遭遇するコグネートである。ＤＮＡ結合メンバーは、染色体ＤＮＡ中にコグネート配列を有する。ＤＮＡ結合メンバーは、典型的には、目的部位においても、その近傍においても核酸分解作用が生じないように目的コグネート配列に照らして設計される。ある実施形態は、全てのそのような系、例として限定されるものではないが、ヌクレアーゼ再開裂を最小化する実施形態、目的残基において正確にＳＮＰを作製するための実施形態、およびＤＮＡ結合部位において遺伝子移入されるアレルの配置に適用可能である。本明細書における実施例は、ＴＡＬＥＮを用いて実施した。他の実施形態は、他の標的化エンドヌクレアーゼを使用して同一プロセスおよび動物に指向される。
【００１９】
ＴＡＬＥＮ
本明細書において使用されるＴＡＬＥＮという用語は広義であり、別のＴＡＬＥＮからの支援なしで二本鎖ＤＮＡを開裂し得る単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同一部位においてＤＮＡを開裂するために一緒に機能するように遺伝子操作されたＴＡＬＥＮのペアの一方または両方のメンバーを指すために使用される。一緒に機能するＴＡＬＥＮは、ＤＮＡまたはＴＡＬＥＮペアの掌性を参照する左側ＴＡＬＥＮおよび右側ＴＡＬＥＮと称することができる。
【００２０】
それぞれのＤＮＡ結合リピートが標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を担うＴＡＬについての暗号が報告されている（ＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）。残基は、ＤＮＡ配列を標的化するようにアセンブルされ得る。手短に述べると、ＴＡＬＥＮの結合のための標的部位が決定され、ヌクレアーゼおよび標的部位を認識する一連のＲＶＤを含む融合分子が作出される。結合時、ヌクレアーゼがＤＮＡを開裂し、その結果、切断末端における遺伝子改変を作製するように細胞修復機序が作動し得る。ＴＡＬＥＮという用語は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、それ自体機能的な単量体ＴＡＬＥＮおよび別の単量体ＴＡＬＥＮとの二量体化を要求する他のものを含む。二量体化は、両方の単量体ＴＡＬＥＮが同一である場合にはホモ二量体ＴＡＬＥＮをもたらし得、または単量体ＴＡＬＥＮが異なる場合にはヘテロ二量体ＴＡＬＥＮをもたらし得る。ＴＡＬＥＮは、２つの主要な真核ＤＮＡ修復経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換え修復により不死化ヒト細胞における遺伝子改変を誘導することが示されている。ＴＡＬＥＮは、ペアで用いられることが多いが、単量体ＴＡＬＥＮも公知である。ＴＡＬＥＮ（および他の遺伝子ツール）による処理のための細胞としては、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞が挙げられる。一部の実施形態において、ＴＡＬエフェクターは、他のタンパク質ドメイン（例えば非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）を特異的ヌクレオチド配列に標的化するために使用することができる。例えば、ＴＡＬエフェクターは、限定されるものではないが、ＤＮＡ２０相互作用酵素（例えば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポゼース、またはリガーゼ）、転写活性化因子もしくはリプレッサー、または他のタンパク質、例えば、ヒストンと相互作用し、またはそれを改変するタンパク質からのタンパク質ドメインに連結され得る。このようなＴＡＬエフェクター融合物の適用としては、例えば、エピジェネティック調節因子の作出または改変、ＤＮＡ中の部位特異的挿入、欠失、または修復の作製、遺伝子発現の制御、およびクロマチン構造の改変が挙げられる。
【００２１】
ヌクレアーゼという用語は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（開裂）を触媒し得る任意の野生型またはバリアント酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定例としては、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＡｌｗＩが挙げられる。エンドヌクレアーゼはまた、典型的には約１２〜４５塩基対（ｂｐ）長、より好ましくは１４〜４５ｂｐ長のポリヌクレオチド認識部位を有する場合での希少切断（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼを含む。希少切断エンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖分解（ＤＳＢ）を誘導する。希少切断エンドヌクレアーゼは、例えば、標的化エンドヌクレアーゼ、遺伝子操作されたジンクフィンガードメインと制限酵素、例えば、ＦｏｋＩまたは化学エンドヌクレアーゼの触媒ドメインとの融合物から得られるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。化学エンドヌクレアーゼにおいて、化学またはペプチド性開裂因子は、核酸のポリマーまたは特異的標的配列を認識する別のＤＮＡのいずれかにコンジュゲートされ、それにより開裂活性を特異的配列に標的化する。化学エンドヌクレアーゼはまた、特異的ＤＮＡ配列に結合することが公知のオルトフェナントロリン、ＤＮＡ開裂分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の合成ヌクレアーゼ様コンジュゲートを包含する。このような化学エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−Ｓｅｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｌ  Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｅｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｔｉ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｅｅ  ＩＬ  １−Ｓｅｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｌ  ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍａｖ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｅｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｋａ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−３０  Ｍｓｈ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｌ  ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｌ  ＰＩ−Ｆａｅ  Ｌ  ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｌ  ＰＩ−Ｔａｇ  Ｌ  ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００２２】
ＴＡＬＥＮまたは他のツールにより作製される遺伝子改変は、例えば、挿入、欠失、外因性核酸断片の挿入、および置換からなるリストから選択することができる。挿入という用語は、染色体中への文字どおりの挿入または修復のためのテンプレートとしての外因性配列の使用のいずれかを意味するために広義に使用される。一般に、標的ＤＮＡ部位が同定され、その部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮペアが作出される。ＴＡＬＥＮは、例えば、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはＴＡＬＥＮをコードするベクターにより、細胞または胚に送達される。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡを開裂して二本鎖分解を作製し、次いでそれを修復し、インデルの作出をもたらすことが多く、または染色体中に挿入され、もしくは改変配列による分解の修復のためのテンプレートとして機能する、同伴する外因性核酸中に含有される配列もしくは多型を取り込む。このテンプレートによりドライブされる修復は、染色体を変化させるための有用なプロセスであり、細胞染色体の有効な変化を提供する。
【００２３】
外因性核酸という用語は、細胞または胚に添加される核酸を意味し、核酸が天然に細胞中に存在する核酸配列と同一であるか異なるかとは無関係である。核酸断片という用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれらの一部を含む。細胞または胚は、例えば、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、トリ、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択することができる。
【００２４】
一部の実施形態は、ＴＡＬＥＮペアを家畜および／または偶蹄目細胞または胚中に導入し、ＴＡＬＥＮペアにより特異的に結合される部位における細胞または胚のＤＮＡの遺伝子改変を作製し、細胞から家畜動物／偶蹄目を生産することを含む、遺伝子改変家畜動物および／または偶蹄目を作製する組成物または方法を含む。例えば、接合体、線維芽細胞、または胚中への直接注射を細胞または胚に対して使用することができる。あるいは、ＴＡＬＥＮおよび／または他の因子は、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはベクターを導入するための多くの公知の技術のいずれかを使用して細胞中に導入することができる。遺伝子改変動物は、公知の方法、例えば妊娠宿主中への胚の移植、または種々のクローニング法に従って胚または細胞から作製することができる。「ＴＡＬＥＮにより特異的に結合される部位における細胞のＤＮＡの遺伝子改変」などの語句は、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合された場合にＴＡＬＥＮ上のヌクレアーゼにより切断される部位において遺伝子改変が作製されることを意味する。ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮペアが結合する場所を正確に切断するのではなく、２つの結合部位間の規定部位において切断する。
【００２５】
一部の実施形態は、動物のクローニングに使用される組成物または細胞の処理を含む。細胞は、家畜および／または偶蹄目細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合体、生殖細胞、始原生殖細胞、または幹細胞であり得る。例えば、実施形態は、培養下の複数の初代細胞をＴＡＬＥＮタンパク質または１つもしくは複数のＴＡＬＥＮをコードする核酸に曝露することを含む、遺伝子改変を作出する組成物または方法である。ＴＡＬＥＮは、例えば、ｍＲＮＡまたはベクター中のＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質として、または核酸断片として導入することができる。
【００２６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合させることにより生成される人工的制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように遺伝子操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複合体ゲノム内のユニーク配列を標的化することが可能になる。内因性ＤＮＡ修復機序を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを変更することができる。ＺＦＮは、遺伝子を不活性化させる方法において使用することができる。
【００２７】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約３０アミノ酸を有し、安定的構造にフォールドする。それぞれのフィンガーは主に、ＤＮＡ基質内のトリプレットに結合する。キー位置におけるアミノ酸残基は、ＤＮＡ部位との配列特異的相互作用の大部分に寄与する。これらのアミノ酸は、必要な構造を保存するために残留アミノ酸を維持しながら変化し得る。より長いＤＮＡ配列への結合は、いくつかのドメインをタンデムに連結することにより達成される。他の機能性、例えば、非特異的ＦｏｋＩ開裂ドメイン（Ｎ）、転写活性化因子ドメイン（Ａ）、転写リプレッサードメイン（Ｒ）およびメチラーゼ（Ｍ）は、ＺＦＰに融合させて、それぞれのＺＦＮ、ジンクフィンガー転写活性化因子（ＺＦＡ）、ジンクフィンガー転写リプレッサー（ＺＦＲ、およびジンクフィンガーメチラーゼ（ＺＦＭ）を形成することができる。遺伝子改変動物の作製のためにジンクフィンガーおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するための材料および方法は、例えば、米国特許第８，１０６，２５５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１９２２９８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１５９号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／０２８１３０６号明細書に開示されている。
【００２８】
ベクターおよび核酸
ノックアウト目的のため、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、または他の目的のため、種々の核酸を細胞に導入することができる。本明細書において使用される核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸アナログ、および二本鎖または一本鎖（すなわちセンスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸アナログは、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するため、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変することができる。デオキシリボースリン酸骨格は、それぞれの塩基部分が６員モルホリノ環に連結しているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格がシュードペプチド骨格により置き換えられており、４つの塩基が保持されるペプチド核酸を産生するように改変することができる。
【００２９】
標的核酸配列は、調節領域、例えば、プロモーターに作動可能に連結させることができる。調節領域は、ブタ調節領域であり得、または他種からのものであり得る。本明細書において使用される作動可能に連結させるとは、標的核酸の転写を可能にし、または容易にするような手法で核酸配列に対する調節領域を位置付けることを指す。
【００３０】
一般に、あるタイプのプロモーターは、標的核酸配列に作動可能に連結させることができる。プロモーターの例としては、限定されるものではないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および特定の刺激に応答性または不応答性のプロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、顕著な組織特異的も時間的特異性も伴わずに核酸分子の発現を容易にするプロモーターを使用することができる（すなわち構成的プロモーター）。ベータ−アクチンプロモーター、例えば、ニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを使用することができるとともに、ウイルスプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。一部の実施形態において、ニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターおよびＣＭＶエンハンサーの融合物がプロモーターとして使用される。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５６３，２００１およびＫｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：８２１，１９９６参照。
【００３１】
核酸構築物において有用であり得る追加の調節領域としては、限定されるものではないが、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、内部リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性因子、またはイントロンが挙げられる。このような調節領域は、必須でない場合があるが、それらはｍＲＮＡの転写、安定性、翻訳効率などに影響することにより発現を増加させ得る。このような調節領域は、細胞中の核酸の最適な発現を得ることが望まれる核酸構築物中に含めることができる。しかしながら、そのような追加の因子を用いずに十分な発現を得ることができることもある。
【００３２】
シグナルペプチドまたは選択マーカーをコードする核酸構築物を使用することができる。シグナルペプチドは、コードポリペプチドが特定の細胞位置（例えば細胞表面）に指向されるように使用することができる。選択マーカーの非限定例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。このようなマーカーは、培養下の安定的な形質転換体を選択するのに有用である。他の選択マーカーとしては、蛍光ポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
【００３３】
一部の実施形態において、選択マーカーをコードする配列は、リコンビナーゼ、例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどについての認識配列によりフランキングさせることができる。例えば、選択マーカーは、選択マーカーを構築物から切り出すことができるようにｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される３４ｂｐ認識部位）またはＦＲＴ認識部位によりフランキングさせることができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の概説については、Ｏｒｂａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：６８６１，１９９２、およびＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ６：７，２００４参照。選択マーカー遺伝子により中断されるＣｒｅもしくはＦｌｐを活性化可能な導入遺伝子を含有するトランスポゾンを使用して導入遺伝子の条件的発現を有するトランスジェニック動物を得ることもできる。例えば、マーカー／導入遺伝子の発現をドライブするプロモーターは、ユビキタスまたは組織特異的のいずれかであり得、それはＦ０動物（例えば、ブタ）におけるマーカーのユビキタスまたは組織特異的発現をもたらす。導入遺伝子の組織特異的な活性化は、例えば、マーカーに中断された導入遺伝子をユビキタスに発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐを組織特異的に発現するブタとを交配することにより、またはマーカーに中断された導入遺伝子を組織特異的に発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼをユビキタスに発現するブタとを交配することにより達成することができる。導入遺伝子の発現の制御またはマーカーの切り出しの制御により、導入遺伝子の発現が可能になる。
【００３４】
一部の実施形態において、外因性核酸は、ポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、後続のコードポリペプチドの操作を容易にするため（例えば、局在化または検出を容易にするため）に設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、コードされるタグがポリペプチドのカルボキシルもしくはアミノ末端のいずれかに位置するようにポリペプチドをコードする核酸配列中に挿入することができる。コードされるタグの非限定例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。
【００３５】
核酸構築物は、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してメチル化することができる。一般に、核酸構築物は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびＳｓｓＩ  ＣｐＧ−メチラーゼと緩衝液中で３７℃においてインキュベートすることができる。過剰メチル化は、構築物を１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと３７℃において１時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によりアッセイすることにより確認することができる。
【００３６】
核酸構築物は、任意のタイプの胚、胎児または成体偶蹄目／家畜細胞、例として、例えば、生殖細胞、例えば、卵母細胞または卵、前駆細胞、成体または胚性幹細胞、始原生殖細胞、腎細胞、例えば、ＰＫ−１５細胞、島細胞、ベータ細胞、肝細胞、または線維芽細胞、例えば、皮膚線維芽細胞中に種々の技術を使用して導入することができる。技術の非限定例としては、トランスポゾン系、細胞に感染し得る組換えウイルス、またはリポソームまたは核酸を細胞に送達し得る他の非ウイルス的方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、もしくはリン酸カルシウム沈殿の使用が挙げられる。
【００３７】
トランスポゾン系において、核酸構築物の転写単位、すなわち外因性核酸配列に作動可能に連結される調節領域は、トランスポゾンの逆方向リピートによりフランキングされる。いくつかのトランスポゾン系、例として、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号明細書および米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書参照）；Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３，２００３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７，２００７；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２，２００７）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７：４５８９，２００７）；およびＰａｓｓｐｏｒｔが、核酸を細胞、例として、マウス、ヒト、およびブタ細胞中に導入するために開発されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンが特に有用である。トランスポゼースは、外因性核酸と同一の核酸構築物上でコードされるタンパク質として送達することができ、別個の核酸構築物上で導入することができ、またはｍＲＮＡ（例えば、インビトロ転写およびキャップ化ｍＲＮＡ）として提供することができる。
【００３８】
核酸は、ベクター中に取り込むことができる。ベクターは、担体から標的ＤＮＡ中に移動するように設計された任意の規定のＤＮＡセグメントを含む広義語である。ベクターは、発現ベクター、またはゲノムもしくは他の標的化ＤＮＡ配列、例えば、エピソーム、プラスミド、もしくはさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメント中へのＤＮＡ挿入を生じさせるために必要とされる構成要素のセットであるベクター系と称することができる。動物における遺伝子送達に使用されるベクター系、例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび統合ファージウイルス）、および非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）は、２つの基本構成要素：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）からなるベクターと、２）トランスポゼース、リコンビナーゼ、またはベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列に挿入する他のインテグラーゼ酵素とを有する。ベクターは、１つ以上の発現制御配列を含む１つ以上の発現カセットを含有することが最も多く、発現制御配列は、それぞれ別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【００３９】
多くの異なるタイプのベクターが公知である。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターが公知である。哺乳動物発現プラスミドは、典型的には、複製起点、好適なプロモーターおよび任意選択のエンハンサー、およびさらには任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’フランキング非転写配列を有する。ベクターの例としては、プラスミド（別のタイプのベクターの担体でもあり得る）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、改変ＨＩＶ−１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ因子、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
【００４０】
本明細書において使用される核酸という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指し、例として、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成）ＤＮＡ、ならびに天然および化学修飾核酸、例えば合成塩基または代替骨格を含む。核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわちセンスまたはアンチセンスの一本鎖）であり得る。トランスジェニックという用語は、本明細書において広義に使用され、遺伝子材料が遺伝子操作技術を使用して変更された遺伝子改変生物または遺伝子操作生物を指す。したがって、ノックアウト偶蹄目は、外因性遺伝子または核酸が動物またはその子孫において発現されるか否かに無関係にトランスジェニックである。
【００４１】
遺伝子改変動物
動物は、ＴＡＬＥＮまたは他の遺伝子操作ツール、例として、リコンビナーゼ融合タンパク質、または公知の種々のベクターを使用して改変することができる。このようなツールにより作製される遺伝子改変は、遺伝子の破壊を含み得る。遺伝子の破壊という用語は、機能的遺伝子産物の形成を阻止することを指す。遺伝子産物は、その正常な（野生型）機能を実行する場合にのみ機能的である。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止し、遺伝子によりコードされる配列ならびに／または動物における遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／もしくはオペレーター中での１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む。破壊される遺伝子は、例えば、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するための遺伝子の変更、干渉ＲＮＡ、または外因性遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現により破壊することができる。遺伝子改変動物の材料および方法は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書、２０１２年５月９日に出願された同第１３／４６７，５８８号明細書、および２００９年１１月１０日に出願された同第１２／６２２，８８６号明細書にさらに詳述されており、矛盾する場合、本明細書が優先する。トランス作用性という用語は、異なる分子からの標的遺伝子に対して（すなわち分子間で）作用するプロセスを指す。トランス作用因子は、通常、遺伝子を含有するＤＮＡ配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質（またはマイクロＲＮＡもしくは他の拡散性分子）をコードする。トランス作用性遺伝子は、標的遺伝子と同一の染色体上に存在し得るが、活性は、中間タンパク質またはそれがコードするＲＮＡを介するものである。トランス作用性遺伝子の実施形態は、例えば標的化エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子である。ドミナントネガティブを使用する遺伝子の不活性化は、一般にトランス作用因子を含む。シス調節性またはシス作用性という用語は、タンパク質もＲＮＡもコードしない場合の作用を意味する一方、遺伝子不活性化に関して、これは、一般に遺伝子のコード部分、または機能的遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／またはオペレーターの不活性化を意味する。
【００４２】
ノックアウト動物を作製するのに遺伝子を不活化するため、および／またはファウンダー動物を生産するのに核酸構築物を動物中に導入するため、ノックアウトまたは核酸構築物がゲノム中に組み込まれている動物系統を作製するため、当技術分野において公知の種々の技術を使用することができる。このような技術としては、限定されるものではないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、生殖系列中へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−１６５２，１９８５）、胚性幹細胞中への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１，１９８９）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４，１９８３）、精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４２３０−１４２３５，２００２；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１８：１９−２３，２００６）、および体細胞、例えば、卵丘もしくは乳腺細胞、または成体、胎児、もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換とそれに続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３，１９９７；およびＷａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：３６９−３７４，１９９８）が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞核移植が特に有用な技術である。ゲノム改変されている動物は、その生殖系列細胞を含むその細胞の全てが遺伝子改変を有する動物である。遺伝子改変がモザイクである動物を生産する方法が使用される場合、動物を同系交配することができ、ゲノム改変されている子孫を選択することができる。例えば、モザイク動物を作製するため、その細胞が胚盤胞状態において改変される場合、クローニングを使用することができ、または単一細胞が改変される場合、ゲノム改変が生じ得る。
【００４３】
典型的には、前核マイクロインジェクションにおいて、核酸構築物を受精卵中に導入し、精子頭部および卵からの遺伝子材料を含有する前核が原形質内で可視的であるため、１または２つの細胞受精卵を使用する。前核段階の受精卵は、インビトロまたはインビボ（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される）で得ることができる。体外受精卵は、以下のとおり生産することができる。例えば、ブタ卵巣を食肉処理場において回収し、輸送中、２２〜２８℃において維持することができる。卵巣を洗浄し、卵胞吸引のために単離することができ、５０ｍＬのコニカル遠心管中に１８ゲージ針を使用して真空下で４〜８ｍｍに及ぶ卵胞を吸引することができる。卵胞液および吸引された卵母細胞は、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）によりプレフィルターに通してリンスすることができる。コンパクトな卵丘塊により包囲される卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子、１０％のブタ卵胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍＬずつの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が補給されたＴＣＭ−１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中に加湿空気下で３８．７℃および５％のＣＯ２において約２２時間配置することができる。続いて、卵母細胞を、ｃＡＭＰも、ｍＰＭＳＧも、ｈＣＧも含有しない新たなＴＣＭ−１９９成熟培地に移し、さらに２２時間インキュベートすることができる。成熟卵母細胞は、それらの卵丘細胞から、０．１％のヒアルロニダーゼ中での１分間のボルテックス処理により剥がすことができる。
【００４４】
ブタについては、成熟卵母細胞を、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ５ウェル受精用ディッシュ内、５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地系（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中で受精させることができる。体外受精（ＩＶＦ）の準備において、新たに採取したまたは凍結した雄ブタ精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ  Ｍｅｄｉｕｍ中に４×１０５個の精子になるように再懸濁させることができる。精子濃度は、コンピュータ支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）により分析することができる。最終的な体外授精は、雄ブタに応じて約４０運動精子／卵母細胞の最終濃度において、１０μｌの量で実施することができる。全ての授精卵母細胞を３８．７℃、５．０％のＣＯ２雰囲気において６時間インキュベートする。授精から６時間後、推定される接合体をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄し、０．５ｍＬの同一培地に移すことができる。この系は、通常、ほとんどの雄ブタにおいて２０〜３０％の胚盤胞を定型的に生産し得、多精受精率は１０〜３０％である。
【００４５】
線状核酸構築物は、前核の１つに注射することができる。次いで、注射された卵を、レシピエント雌に（例えば、レシピエント雌の卵管中に）移植し、レシピエント雌中の発生を可能にしてトランスジェニック動物を生産することができる。特に、体外受精胚は、１５，０００×ｇにおいて５分間遠心分離して脂質を沈降させ、前核を可視化することができる。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴ注射器を使用して注射することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚の卵割および胚盤胞形成の率ならびに品質を記録することができる。
【００４６】
胚は、非同調性レシピエントの子宮に外科的に移植することができる。典型的には、５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して、１００〜２００（例えば１５０〜２００）個の胚を卵管の膨大部−峡部接合部に堆積させることができる。術後に妊娠のリアルタイム超音波検査を実施することができる。
【００４７】
体細胞核移植において、上記の核酸構築物を含むトランスジェニック偶蹄目細胞（例えば、トランスジェニックブタ細胞またはウシ細胞）、例えば、胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳部線維芽細胞、または顆粒膜細胞を除核卵母細胞中に導入して複合細胞を樹立することができる。卵母細胞は、極体近傍における透明帯部分切開を行い、次いで切開領域において細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、鋭い斜角先端を有するインジェクションピペットを使用してトランスジェニック細胞を第２減数分裂時に停止した除核卵母細胞中に注射する。慣習として、第２減数分裂時に停止した卵母細胞は「卵」と称される。ブタまたはウシ胚の生産後（例えば、卵母細胞の融合および活性化により）、活性化から約２０〜２４時間後、胚をレシピエント雌の輸卵管に移植する。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１２５６−１２５８，１９９８および米国特許第６，５４８，７４１号明細書参照。ブタについては、胚の移植から約２０〜２１日後にレシピエント雌における妊娠を確認することができる。
【００４８】
標準的な育種技術を使用して初期のヘテロ接合性ファウンダー動物から外因性核酸についてホモ接合性である動物を作出することができる。しかしながら、ホモ接合性が要求されない場合がある。本明細書に記載のトランスジェニックブタは、他の目的のブタと交配することができる。
【００４９】
一部の実施形態において、目的の核酸および選択マーカーは、別個のトランスポゾン上に提供し、選択マーカーを有するトランスポゾンの量が目的の核酸を含有するトランスポゾンを大きく上回る（５〜１０倍過剰）同等でない量で胚または細胞のいずれかに提供することができる。目的の核酸を発現するトランスジェニック細胞または動物は、選択マーカーの存在および発現に基づき単離することができる。トランスポゾンが正確かつ非連鎖的（独立した転位イベント）にゲノム中に組み込まれるため、目的の核酸および選択マーカーは遺伝的に連鎖しておらず、標準的な育種を介した遺伝的分離により容易に分離することができる。したがって、後続の世代において選択マーカーを保持すること（公共の安全の立場からある程度懸念される課題）に制約されないトランスジェニック動物を生産することができる。
【００５０】
トランスジェニック動物が生成されたら、標準的な技術を使用して外因性核酸の発現をアッセイすることができる。初期スクリーニングは、構築物の組込みが生じたか否かを決定するためのサザンブロット分析により達成することができる。サザン分析の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹのセクション９．３７−９．５２参照。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術も初期スクリーニングにおいて使用することができる。ＰＣＲは、標的核酸を増幅させる手順または技術を指す。一般に、目的の領域またはそれを超える領域の末端の配列情報を用いて、増幅させるべきテンプレートの逆鎖と配列が同一または類似するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを使用して全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡからの配列を含むＤＮＡおよびＲＮＡの規定の配列を増幅させることができる。プライマーは、典型的には、１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド長〜数百ヌクレオチド長の範囲であり得る。ＰＣＲは、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己保持配列複製、または核酸配列に基づく増幅により増幅させることができる。例えば、Ｌｅｗｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２：１，１９９２；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４，１９９０；およびＷｅｉｓｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２９２，１９９１参照。胚は、胚盤胞期においてＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、およびスプリンケレット（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ）ＰＣＲによる分析用に個々に処理することができる（例えば、Ｄｕｐｕｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：４４９５，２００２参照）。
【００５１】
トランスジェニックブタの組織中のポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、例えば、動物から得られる組織試料のノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、ウエスタン分析、免疫測定、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む技術を使用して評価することができる。
【００５２】
干渉ＲＮＡ
種々の干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）が公知である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、相同遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、ｄｓＲＮＡを低分子の２１〜２３ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮアーゼ（ｄｓＲＮアーゼ、例えばダイサー）およびｓｓＲＮアーゼ（例えば、Ａｒｇｏｎａｕｔ２またはＡｇｏ２）を含有する。ＲＩＳＣは、開裂可能な標的を見出すためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の両方が公知である。遺伝子改変動物における遺伝子を破壊する方法は、標的遺伝子および／または核酸の発現が低減するように、標的遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。
【００５３】
例えば、外因性核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導し得る。例えば、標的ＤＮＡと相同性である二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用してそのＤＮＡの発現を低減させることができる。ｓｉＲＮＡのための構築物は、例えば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６，１９９８；Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３４３，１９９２；Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：３１５３，１９９６；Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ  Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１６６，１９９９；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４５１，１９９９；およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ  Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７，１９９８に記載のとおり産生することができる。ｓｈＲＮＡのための構築物は、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１，２００６により記載のとおりに産生することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは、アニールし、短鎖ヘアピンを形成し得る相補的領域を含有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写される。
【００５４】
特異的遺伝子に指向される単一の個々の機能的ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを見出す確率は高い。ｓｉＲＮＡの特異的配列の予測可能性は、例えば、約５０％であるが、多数の干渉ＲＮＡを、それらの少なくとも１つが有効である良好な信頼性で作製することができる。
【００５５】
実施形態は、遺伝子、例えば、発生段階において選択的な遺伝子に対して指向されるＲＮＡｉを発現する、インビトロ細胞、インビボ細胞、および遺伝子改変動物、例えば、家畜動物を含む。ＲＮＡｉは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣおよびｍｉＲＮＡからなる群から選択することができる。
【００５６】
実施形態は、１つ以上の腫瘍抑制因子遺伝子を阻害するＲＮＡｉを発現するように改変された動物を含む。
【００５７】
誘導性系
誘導性系を使用して遺伝子の発現を制御することができる。遺伝子の発現の時空間的制御を可能にする種々の誘導性系が公知である。いくつかは、トランスジェニック動物においてインビボで機能的であることが判明している。誘導性系という用語は、慣習的なプロモーターおよび誘導性遺伝子発現因子を含む。
【００５８】
実施形態は、１つ以上の腫瘍抑制因子遺伝子を誘導的に制御するように改変された動物を含む。対照は、ターンオンまたはターンオフするための陽性または陰性であり得る。
【００５９】
誘導性系の一例は、核酸の転写を制御するために使用することができるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−ｏｎプロモーター系である。この系において、突然変異Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインに融合させてテトラサイクリン制御性転写活性化因子（ｔＴＡ）を作出し、これはｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により調節される。抗生物質の不存在下では転写が最小限である一方、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では転写が誘導される。代替的な誘導性系としては、エクジソンまたはラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは、エクジソン受容体およびウルトラスピラクル遺伝子（ＵＳＰ）の産物のヘテロ二量体により産生が調節される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはエクジソンの類似体、例えば、ムリステロンＡによる処理により誘導される。誘導性系を誘発するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。
【００６０】
より一般に使用される誘導性系の中には、テトラサイクリン誘導性系およびＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（構成的または誘導性のいずれか）がある。テトラサイクリン誘導性系は、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）／リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を含む。これらの系をインビボで使用するための方法は、２系統の遺伝子改変動物を生成することを含む。１つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下で活性化因子（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。トランスジェニック動物の別のセットは、目的の遺伝子（または改変すべき遺伝子）の発現がｔＴＡ／ｒｔＴＡトランス活性化因子についての標的配列の制御下にある（またはｌｏｘＰ配列によりフランキングされている）アクセプターを発現する。２つのマウス株を交配させることにより、遺伝子発現の制御が提供される。
【００６１】
テトラサイクリン依存性調節系（ｔｅｔ系）は、２つの構成要素、すなわちテトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）および下流ｃＤＮＡの発現を制御するｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターに、テトラサイクリン依存的に依存する。テトラサイクリンまたはその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）の不存在下では、ｔＴＡはｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を可能にする。しかしながら、ドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡはその標的と相互作用し得ず、転写は生じない。ｔＴＡを使用するｔｅｔ系は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが転写下方調節を可能にするため、ｔｅｔ−ＯＦＦと称される。テトラサイクリンまたはその誘導体の投与により、インビボでの導入遺伝子発現の時間的制御が可能になる。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンの不存在下では機能的でないが、トランス活性化のためにリガンドの存在を要求するｔＴＡのバリアントである。したがって、このｔｅｔ系はｔｅｔ−ＯＮと称される。ｔｅｔ系は、例えば、レポーター遺伝子、癌遺伝子、またはシグナリングカスケードに関与するタンパク質をコードするいくつかの導入遺伝子の誘導性発現のため、インビボで使用されている。
【００６２】
Ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、２つの区別されるＣｒｅ認識配列、すなわちｌｏｘＰ部位間のクロスオーバーによる部位特異的組換えを触媒するＣｒｅリコンビナーゼを使用する。２つのｌｏｘＰ配列間に導入されたＤＮＡ配列（ｆｌｏｘ化ＤＮＡと称される）がＣｒｅ媒介組換えにより切り出される。空間的制御（組織特異的または細胞特異的プロモーターによる）または時間的制御（誘導性系による）のいずれかを使用するトランスジェニック動物におけるＣｒｅ発現の制御は、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの切り出しの制御をもたらす。１つの適用は、条件的遺伝子不活性化（条件的ノックアウト）を対象とする。別のアプローチは、ｆｌｏｘ化終止コドンがプロモーター配列および目的のＤＮＡ間に挿入されるタンパク質過剰発現を対象とする。遺伝子改変動物は、Ｃｒｅが発現されてｆｌｏｘ化終止コドンの切り出しがもたらされるまで導入遺伝子を発現しない。この系は、組織特異的腫瘍形成およびＢリンパ球におけるアンチジーン受容体発現の制御に適用されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼも開発されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、元のＣｒｅリコンビナーゼおよび特異的リガンド結合ドメインを含有する融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能的活性は、融合タンパク質中のこの特異的ドメインに結合し得る外部リガンドに依存的である。
【００６３】
実施形態は、誘導性系の制御下にある遺伝子を含むインビトロ細胞、インビボ細胞、および遺伝子改変動物、例えば、家畜動物を含む。動物の遺伝子改変は、ゲノミックまたはモザイクであり得る。誘導性系は、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、およびＨｉｆ１アルファからなる群から選択することができる。一実施形態は、本明細書に記載の遺伝子である。
【００６４】
ドミナントネガティブ
したがって、遺伝子は、除去またはＲＮＡｉ抑制によってだけでなく、その遺伝子産物の通常の機能に対して阻害効果を有するタンパク質のドミナントネガティブバリアントの作出／発現によっても破壊することができる。ドミナントネガティブ（ＤＮ）遺伝子の発現は、表現型の変更をもたらし得、ａ）タイトレーション効果；（ＤＮは、内因性遺伝子の協調的因子または通常標的のいずれかについて内因性遺伝子産物と、その同一の活性を構成せずに受動的に競合する）、ｂ）ドミナントネガティブ遺伝子産物が通常の遺伝子機能に要求されるプロセスに能動的に干渉するポイズンピル（またはモンキーレンチ）効果、ｃ）ＤＮが遺伝子機能の負の制御因子を能動的に刺激するフィードバック効果により発揮される。ドミナントネガティブは、腫瘍抑制因子遺伝子を遮断するように作製することができる。
【００６５】
ファウンダー動物、動物系統、形質、および生殖
ファウンダー動物は、クローニングおよび本明細書に記載の他の方法により生産することができる。ファウンダーは、接合体または初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変についてホモ接合性であり得る。同様に、ヘテロ接合性であるファウンダーを作製することもできる。ファウンダーはゲノム改変することができ、これは、そのゲノムにおける細胞の全てが改変を受けていることを意味する。ファウンダーは、ベクターが典型的には胚盤胞段階において胚中の複数の細胞の１つに導入される場合に生じ得るように、改変についてモザイクであり得る。モザイク動物の子孫を試験してゲノム改変子孫を同定することができる。動物系統は、有性生殖させることができ、または生殖補助技術により生殖させることができ、異種またはホモ接合性の子孫が常に改変を発現する動物のプールが作出されている場合、樹立される。
【００６６】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、標的化ヌクレアーゼ系を、リコンビナーゼ（例えば、ＲｅｃＡタンパク質、Ｒａｄ５１）またはＤＮＡ組換えに関連する他のＤＮＡ結合タンパク質とともに投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞ＤＮＡを探索してその配列と実質的に相同なＤＮＡ配列を見出す。例えば、リコンビナーゼは、ＨＤＲのためのテンプレートとして機能する核酸配列と複合し得る。次いで、リコンビナーゼはＨＤＲテンプレートと複合してフィラメントを形成し、細胞内に配置される。リコンビナーゼおよび／またはリコンビナーゼと複合するＨＤＲテンプレートは、細胞または胚中に、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはリコンビナーゼをコードするベクターを用いて配置することができる。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合には本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞中で２つの相対的に長いＤＮＡ鎖間での相対的に短いＤＮＡ片の連結を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼとしては、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、およびＦＬＰが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージからのＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌中に見出される１９８アミノ酸から構成される２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、ＤＮＡ開裂および組換えの開始を活性部位セリンに依存するＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖分解の修復を支援するＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌ＲｅｃＡおよび酵母Ｒａｄ５１と相同性である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位によりフランキングされる規定の配列を欠失させるための実験において使用される酵素である。ＦＬＰは、パン酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素（ＦＬＰまたはＦｌｐ）を指す。
【００６７】
本明細書において、「ＲｅｃＡ」または「ＲｅｃＡタンパク質」は、同一の機能、特に、（ｉ）後続のＤＮＡポリメラーゼによる伸長のために、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをその相同な標的に適切に位置付けする能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のために二本鎖核酸をトポロジー的に調製する能力；および（ｉｉｉ）ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体が相補的配列を効率的に見出してそれに結合する能力の本質的に全部または大部分を有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを指す。最良に特徴付けされたＲｅｃＡタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのものであり、そのタンパク質の元のアレル型に加えて、いくつかの突然変異体ＲｅｃＡ様タンパク質、例えば、ＲｅｃＡ８０３が同定されている。さらに、多くの生物、例として、例えば、酵母、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、哺乳動物、例として、ヒト、および植物は、ＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質としては、例えば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２、およびＤＭＣ１が挙げられる。組換えタンパク質の一実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌源からのＲｅｃＡタンパク質、または別の生物からの相同組換えタンパク質であり得る。
【００６８】
組成物およびキット
本発明はまた、例えば、部位特異的エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９、ＺＮＦ、ＴＡＬＥＮ、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合物をコードする核酸分子、そのポリペプチドを含有する組成物およびキット、そのような核酸分子もしくはポリペプチド、または遺伝子操作細胞系を含有する組成物を提供する。示される腫瘍抑制因子アレルの変更に有効なＨＤＲも提供することができる。このようなアイテムは、例えば、研究ツールとして、または治療的に使用することができる。
【実施例】
【００６９】
実施例１
標的部位を選択するためのブタおよびヒトＮＦ１遺伝子間の保存領域の同定
ＮＦ１患者は、腫瘍抑制因子遺伝子ニューロフィブロミン（ＮＦ１）全体にわたる広範な突然変異を示す。ナンセンス突然変異（Ｒ１９４７Ｘ）がＮＦ１患者における最も高頻度の変更として同定されており、全てのＮＦ１突然変異の１〜２パーセントを占める［１］。Ｒ１９４７はブタのエキソン４２中に見出され、それはヒトにおけるエキソン４０と高度に保存されており、したがって、本発明者らは、ヒトにおいて一般に見出されるＲ１９４７Ｘ突然変異をブタゲノム中に遺伝子操作してＮＦ１の大型動物モデルを作出するように選択した。図１は、ヒトおよびブタについてのＮＦ１遺伝子およびタンパク質のアラインメントである。
【００７０】
実施例２
ブタＮＦ１遺伝子中のヘテロ接合性Ｒ１９４７Ｘ突然変異を遺伝子操作するためのＴＡＬＥＮの設計
本発明者らは、ＮＦ１遺伝子のブタゲノム中のエキソン４２（ヒトゲノム中のエキソン４０に対応する）を標的化するＴＡＬＥＮペアと、終止コドン、フレームシフト、および新規制限酵素部位を導入するためのＨＤＲ構築物とを使用してＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）媒介相同依存性修復（ＨＤＲ）によりブタにおいてヒトＮＦ１  Ｒ１９４７Ｘ突然変異を模倣するように選択し、これにより制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析によりクローンを迅速に分析することを可能にした（図２および３Ａ）。３つのＮＦ１  ＴＡＬＥＮをオッサバウブタ初代線維芽細胞中に、ＴＡＬＥＮ結合部位を変化させ、ＴＡＬＥＮ再切断を阻止する新規ＲＦＬＰ部位に加えてＲ１９４７Ｘ突然変異を誘導するように設計されたＨＤＲオリゴとともに形質移入した（図２および３Ａ）。摂氏３０度におけるインキュベーションの３日後、ＲＦＬＰ分析によりＨＤＲを誘導するそれぞれのＴＡＬＥＮの能力について細胞集団を分析した（図３Ｂ）。この分析により、３つ全てのＴＡＬＥＮが変動率において活性であることが示された（図３Ｂ）。ＴＡＬＥＮおよびＨＤＲ構築物による処理後、クローンは、改変アレルを同定するため、およびヘテロ接合性ＮＦ１ノックアウトクローンを得るための（ＲＦＬＰ）分析を受けた（図３Ｃ）。ＲＦＬＰにより得られたヘテロ接合性クローンのそれぞれを配列決定して野生型およびＨＤＲアレルの両方の存在を確認し、クロマチン移入クローニング技術に使用してＮＦＲ１９４７／＋ブタを生成することができる（図３Ｄ）。
【００７１】
実施例３
ＴＡＬＥＮ活性は、腫瘍抑制因子遺伝子についてヘテロ接合性であるクローンを単離する能力と相関する
腫瘍抑制因子遺伝子の両方のコピーの損失についての選択的利点が存在するため、ＮＦ１についてヘテロ接合性であるクローンを単離するための新規技術が要求される。ＴＡＬＥＮ  ｓｓＮＦ１  ４２．２を、ｓｓＮＦ１  ４２．１（５４．２％）およびｓｓＮＦ１  ４２．３（２７．２％）（本発明者らが予測したものは、それぞれ高すぎるまたは低すぎる活性を有し得る）と比較してその中間活性（４５．１％）に起因して選択してＮＦ１  Ｒ１９４７Ｘヘテロ接合性クローンを作出する試みにおいて使用した。細胞をｓｓＮＦ１  ４２．２により処理した場合、４１／８９個（４６．１％）のクローンがＲＦＬＰによりＮＦ１  Ｒ１９４７Ｘについてヘテロ接合性であることが示された（図４Ａ）。興味深いことに、回収されたクローンの４１．６％は、ホモ接合性ＫＯであることが示され、予測されるもの（２０．３％、式については図の凡例を参照）よりもかなり高い率であり、それは、ＮＦ１アレルを両方とも損失する選択圧が存在することを示唆する（図４Ａ）。ＮＦ１の両方のコピーを損失するこの選択圧は、ＮＦ１が腫瘍抑制因子遺伝子であるため、ホモ接合性損失を有する細胞が、ＷＴまたはＮＦ１についてヘテロ接合性である細胞に対して成長および／または生存利点を有する可能性が高い事実から生じる。ＴＯＰＯクローニングおよび配列決定分析時、ｓｓＮＦ１  ４２．３ＴＡＬＥＮ処理細胞から単離された１／１０個（１０％）のクローンのみが、ＨＤＲアレルおよびＷＴアレルの両方についてヘテロ接合性であった（図４Ｃ）。９／１０個のクローン（９０％）がＨＤＲアレルについてヘテロ接合性であり、ＷＴアレル中の小さい挿入または欠失（インデル）を示した（図４Ｃ）。本発明者らは、ＷＴアレル中に見られるインデルが過剰なＴＡＬＥＮ活性および非機能的であるべき遺伝子の両方のコピーについての選択的利点の両方に起因し得ることを仮定したため、本発明者らは、ＲＦＬＰにより評価された２７．２％の活性のみを有するＴＡＬＥＮのｓｓＮＦ１  ４２．３を確立した（図３Ｂ）。ｓｓＮＦ１  ４２．３は、ｓｓＮＦ１  ４２．２と同様にＲＦＬＰによるヘテロ接合性で現れたより少数のクローンをもたらした（３５／９１個のクローン、３８．５％）が、ＷＴ、ヘテロ接合体、およびホモ接合体の比率は、予測されるものと完全に類似した（図４Ｂ）。これらのクローンをＴＯＰＯクローニングし、それぞれのアレルを配列決定した場合、３／１０個のクローン（３０％）のみがＨＤＲアレルについてヘテロ接合性であることが見出され、ＷＴアレル中の小さいインデルを示した一方、７／１０個（７０％）のクローンがＨＤＲアレルおよびＷＴアレルの両方についてヘテロ接合性であった（図４Ｃ）。これらの実験は、腫瘍抑制因子遺伝子のホモ接合性ノックアウトについての選択的利点が存在すること、および高い活性を有するＴＡＬＥＮがＨＤＲまたはインデルのいずれかによる両方のアレル中の改変を示す可能性が高いことを示す。この技術的困難は、ＮＦ１について実証されたとおり、より低い活性を有するＴＡＬＥＮを使用することにより克服することができる（図４Ｃ）。
【００７２】
実施例４
ＷＴクランプ法
腫瘍抑制因子遺伝子についてヘテロ接合性ノックアウトである細胞の作出における技術的困難に対処する別の方法は、２つのＨＤＲオリゴを同時に使用して遺伝子のそれぞれのアレルを別個に改変することであり、「ＷＴクランプ」と称される方法である。一方のＨＤＲオリゴはＫＯアレルを誘導し、他方のものはＷＴアレルを維持する一方、再切断および後続のインデルを阻止する（表１）。実施例１からの結果に基づくと、高度に活性なＴＡＬＥＮは、遺伝子の両方のアレルを切断する傾向を有することが明らかである。ＮＦ１のために設計されたＨＤＲオリゴを用いて、ＨＤＲが生じる場合、ＴＡＬＥＮ結合部位の変化に起因してＨＤＲ改変アレルの再切断を阻止する（図２Ａ）。再切断は、スペーサー長の変化を誘導することにより阻止することもできることに留意すべきであるが、ＮＦ１についてこのアプローチは採用しなかった。実施例１において、ｓｓＮＦ１  ４２．２は、高度に活性なＴＡＬＥＮであり、それは予測されるよりも低い率におけるヘテロ接合性クローンの回収をもたらす（図４）。さらに、ＷＴアレルの再切断は、インデルを含有するクローンの大きい比率（９０％）をもたらす（図４）。低減した活性を有するＴＡＬＥＮ、例えば、ｓｓＮＦ１  ４２．３の使用は、この問題を克服するのに役立ち、ＷＴアレル上のインデルを有さないヘテロ接合性クローンのより高い収率（７０％）をもたらす一方、低減した活性を有するＴＡＬＥＮは、最初にＲＦＬＰによるヘテロ接合性であるより少数のクローンを生じさせ、それは、腫瘍抑制因子遺伝子についてヘテロ接合性であるクローンの回収を技術的に困難にする（図４Ｃ）。さらに、ＲＦＬＰアレルおよび非改変ＷＴアレルを有するヘテロ接合体を選択する方法は存在せず、したがって、全てのクローンは、ＴＯＰＯクローンでなければならず、配列決定しなければならず、時間がかかり、資源量の多いアプローチとなる。
【００７３】
【表１】
2017533716.tif 000003
【００７４】
この困難を克服するため、本発明者らは、サイレントヌクレオチド変化を第２のアレル中に投入し、再切断および後続のインデルを阻止し、ヘテロ接合体を同定するためのクローンのより効率的なスクリーニングのための新規制限酵素部位を作出する第２のＨＤＲオリゴを確立することにより、ＷＴアレルの再切断を阻止することができる新たな方法を考案した。表１は、この方法を実証する実施例を提供する。
【００７５】
ＷＴクランプ法は、ＴＡＬＥＮが高度に特異的であり、標的配列の単一ヌクレオチドに結合する１つのＲＶＤを含有するモジュールである事実を利用する。ＨＤＲ中のそれぞれのコドンの不安定塩基を変化させることによってサイレント突然変異を作製することにより、本発明者らは、ＨＤＲが生じた後のＴＡＬＥＮのこの遺伝子座の再切断を阻止し、ＨＤＲ−ＷＴアレル中のインデルを阻止することができる。さらに、特異的サイレント塩基対変化を遺伝子操作することにより、得られるＨＤＲ−ＷＴアレルは、目下、新規制限酵素部位、この場合、ＲＦＬＰを効率的に使用して本発明者らのコロニーを介してスクリーニングを可能にするＢｃｅＡＩを含有する。サイレント塩基対変化は、それぞれのアミノ酸について類似レベルにおいて使用されるコドンを使用するためにブタコドン使用頻度データベースを使用して作製したことに留意すべきである。この方法の適用において、本発明者らは、ＨｉｎｄＩＩＩにより切断されるアレル（Ｒ１９４７Ｘ  ＨＤＲアレルを表す）およびＢｃｅＡ１により切断されるアレル（ＨＤＲ−ＷＴアレルを表す）を有するコロニーを簡易にスクリーニングする。このＷＴクランプ法により、腫瘍抑制因子遺伝子、例えば、ＮＦ１についてヘテロ接合性であるコロニーのより効率的な単離が可能になる。
【００７６】
実施例５
複数の遺伝子に対するＷＴクランプ法の適用
癌において、複数の突然変異を誘導することが必要であることが多い。ＮＦ１の場合、疾患進行に関与することが多い２つの腫瘍抑制因子遺伝子のＮＦ１およびＴＰ５３が、同一染色体上で近接（連結）している。したがって、本発明者らは、２つの腫瘍抑制因子遺伝子ＮＦ１およびＴＰ５３をシスでノックアウトして動物をＮＦ１患者に見られる悪性腫瘍、例として、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）に罹患しやすくする実験を設計した。これは、シスでヘテロ接合的に突然変異すべきこれらの遺伝子について共通の現象であり、ヘテロ接合性の損失を受け、ＮＦ１およびＴＰ５３の両方についてヌルである細胞をもたらす［４〜６］。この遺伝子変化は、複数のタイプの悪性腫瘍の腫瘍新生をドライブし、動物モデルにおけるこの変化の遺伝子操作は、この疾患を理解するために重要である［４〜６］。シスの複数の遺伝子編集は、標的部位間の大きい欠失を作出する傾向に起因して極めて困難である。本発明者らは、１０．３％の率において生じるｓｓＤＭＤ遺伝子座における大きい欠失（６．５ｋＢ）の発生を既に実証している［７］。この例は、両方の標的化遺伝子が腫瘍抑制因子遺伝子である事実によりさらに混同され、したがって、腫瘍抑制因子遺伝子のホモ接合性損失を回避する新規アプローチおよび染色体上の互いに近傍の２つの位置中のＤＮＡの切断による大きい欠失を回避する方針が要求される。
【００７７】
上記と類似の方法を使用して第１２染色体上でＮＦ１遺伝子に連結しているブタＴＰ５３遺伝子（ｓｓＴＰ５３  Ｅ６）のためのＴＡＬＥＮおよびＨＤＲオリゴを開発および試験した（図５）［７］。ＴＰ５３の一般に突然変異しているエキソン６中のナンセンス突然変異を導入するＴＡＬＥＮおよびＨＤＲオリゴは、１７％の効率において機能する［７］。ＮＦ１およびＴＰ５３突然変異の両方を有する線維芽細胞系を作出する多重アプローチを採用した場合、ｓｓＮＦ１  ４２．３はＨＤＲを２５．５％の率において誘導し、ｓｓＴＰ５３  Ｅ６は１１．８％の率において切断された（図６Ａ）。ｓｓＮＦ１  ４２．３およびｓｓＴＰ５３  Ｅ６の両方をオッサバウ細胞中にそれらのそれぞれのＨＤＲオリゴと形質移入する多重アプローチを使用して、本発明者らは、ＮＦ１−／＋；ＴＰ５３−／＋クローンを３．７％（７／１９０個のクローン）の率において回収した（図６Ｂ）。ｓｓＴＰ５３  Ｅ６はＨＤＲを誘導し得ないことが多い一方、依然としてインデルを誘導するのに十分高い率において切断することが多いため、本発明者らは、高解像度融解分析を実施してＴＰ５３アレルのいずれかがＨＤＲの不存在下でヘテロ接合的にインデルを含有するか否かを決定した。本発明者らは、両方の遺伝子について潜在的にヘテロ接合性である合計１７個のクローンについて、ＲＦＬＰによるＮＦ１についてヘテロ接合性であり、高解像度融解分析によるＴＰ５３によるヘテロ接合性である１０個のクローンを同定した（材料および方法参照）。本発明者らは、両方の遺伝子についてヘテロ接合性である１７個全てのクローンを配列決定し、６／１７個のＮＦ１ヘテロ接合体がＷＴアレル中のインデルを含有し、２／１７個のＴＰ５３ヘテロ接合体がＷＴアレル中のインデルを含有し、高解像度融解分析により同定された７／１０個のＴＰ５３ヘテロ接合体が事実上ＷＴであることを見出した。合計、１７／１９０個（８．９％）のクローンがＲＦＬＰによるＮＦ１についてヘテロ接合性であり、７／１９０個（３．７％）のクローンがＲＦＬＰによるＮＦ１およびＴＰ５３の両方についてヘテロ接合性であり、１７／１７個のクローンは、ＮＦ１またはＴＰ５３のいずれかまたはその両方の野生型アレル上のインデルを含有した。これは、ＮＦ１およびＴＰ５３の両方についてヘテロ接合性であるクローンをもたらさなかった。
【００７８】
ＮＦ１およびＴＰ５３の両方についてヘテロ接合性であるクローンの単離の困難を克服するため、本発明者らは、以下のアプローチを提案した：
形質移入反応中のより少ないＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを使用し、または低減した活性を有するＴＡＬＥＮを設計することによりＴＡＬＥＮの活性を低減させる。
１．摂氏３０度における時間を低減させることにより再切断を阻止する。
２．再切断および後続のインデルを阻止し、ＲＦＬＰによる野生型アレルについての効率的なスクリーニングを可能にする野生型アレルのためのＨＤＲオリゴを設計する（実施例４に記載）。
【００７９】
ＮＦ１およびＴＰ５３の両方についてヘテロ接合性であるクローンを同定したら、ＮＦ１およびＴＰ５３突然変異がシスで生じるクローンの同定を既に記載の放射線ハイブリッドマッピングにより行う［８］。
【００８０】
材料および方法
ＴＡＬＥＮ設計
候補ＴＡＬＥＮ標的ＤＮＡ配列およびＲＶＤ配列は、既に記載のとおりオンラインツール「ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ  ２．０」を使用して同定した［９］。ＴＡＬＥＮ標的ＤＮＡ配列は、ニューロフィブロミン（ＮＦ１）遺伝子のブタ（ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）エキソン４２中で選択し、それはアルギニン１９４７（Ｒ１９４７）が位置するＮＦ１遺伝子のヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）エキソン４０に対応する。インプットＤＮＡ配列は、Ｒ１９４７の上流および下流の４５塩基対である。Ｒ１９４７Ｘナンセンス突然変異を突然変異させるように選択した。なぜなら、それは、神経線維腫症１型（ＮＦ１）患者において観察される最も高頻度な変更であるためである［１０］。ＴＰ５３遺伝子を標的化するように設計されたＴＡＬＥＮを、ブタ（ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）エキソン６中で、Ｙ１５５Ｘ突然変異［１１］を誘導するように設計した。表２は、設計されたＴＡＬＥＮのリストを提供する。
【００８１】
【表２】
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【００８２】
ドナー修復テンプレート設計
相同依存性修復（ＨＤＲ）オリゴは、ＮＦ１遺伝子中のＲ１９４７Ｘ突然変異を遺伝子操作するように設計した。このＨＤＲオリゴは、ブタ（ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）ＮＦ１エキソン４２と相同性である配列の８２塩基対、Ｒ→Ｘアミノ酸変化をもたらすＣ→Ｔ突然変異、および相同組換えが事実上生じたか否かを決定するためのクローンに対する簡易な制限長多型（ＲＦＬＰ）アッセイの実施を可能にする新規ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位（ＡＡＧＣＴＴ）を含有する。ＨＤＲオリゴは、ＴＰ５３遺伝子中のＹ１５５Ｘ突然変異を遺伝子操作するように設計した。このＨＤＲオリゴは、ブタ（ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）ＴＰ５３エキソン６と相同性である配列の８３塩基対、ＴＡＬＥＮ結合部位をフランキングする２つの塩基対変化、Ｙ→Ｘアミノ酸変化をもたらすＣ→Ｔ突然変異、相同組換えが事実上生じたか否かを決定するためのクローンに対するＲＦＬＰアッセイの実施を可能にする新規ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位（ＡＡＧＣＴＴ）を含有する。これらの９０ｍｅｒオリゴヌクレオチドテンプレートは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより１００ｎモル合成で合成し、標準的脱塩により精製し、４００ｕＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡに再懸濁させた。設計されたＨＤＲオリゴを以下の表３に示し、太字は野生型（ＷＴ）配列からの変化を示し、大文字は制限部位を構成する導入残基を表す。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
ＴＡＬＥＮ産生
ＴＡＬＥＮは、既に記載のとおり産生した［９］。プラスミドは、ＲＣＩｓｃｒｉｐｔ−ＧｏｌｄｙＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＩＤ  ３８１４３）を使用してＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙプロトコルに従って最終ディスティネーションベクターとして構築した［１２］。アセンブルされたＲＣＩｓｃｒｉｐｔベクターは、ＱＩＡＰＲＥＰスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＳａｃＩにより線形化し、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ３キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してインビトロＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ転写のためのテンプレートとして使用した。
【００８５】
組織培養および形質移入
ブタ線維芽細胞は、摂氏３７または３０度（示されるとおり）において、１０％のウシ胎仔血清、１００Ｉ．Ｕ．／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｕｇ／ｍＬのアポトランスフェリン、２５ｎｇ／ｕＬのｒｈＥＧＦ、および２０ｎｇ／ｕＬのｒｈＩＧＦが補給されたＤＭＥＭ中で５％のＣＯ２において維持した。Ｎｅｏｎ形質移入システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＴＡＬＥＮおよびＨＤＲオリゴを送達した。７０〜１００％のコンフルエンシーにおける低継代のオッサバウまたはランドレースブタ線維芽細胞を１：２で分割し、翌日に７０〜８０％コンフルエンシーにおいて回収した。ｍＲＮＡ  ＴＡＬＥＮおよびＨＤＲオリゴを有する「Ｒ」緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で約６００，０００個の細胞を再懸濁させ、以下のパラメータを使用して１００μＬのチップ中でエレクトロポレートした：入力電圧：１８００Ｖ；パルス幅：２０ｍｓ；パルス数：１。目的の特異的遺伝子のための０．５〜２ｕｇのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよび０．１〜０．４ｎｍｏｌのＨＤＲオリゴをそれぞれ形質移入のために含めた。形質移入された細胞を摂氏３０度において２または３日間培養し、次いで、遺伝子編集効率について分析し、コロニーのためにプレーティングした。
【００８６】
クローン誘導
形質移入の２または３日後、５０〜２５０個の細胞を１０ｃｍディッシュ上に播種し、個々のコロニーが直径約５ｍｍに達するまで培養した。ＴｒｙｐＬＥおよびＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の８ｍＬの１：４（容量／容量）混合物を添加し、コロニーを吸引し、４８ウェルディッシュおよびレプリカ９６ウェルディッシュのウェル中に移し、同一条件下で培養した。コンフルエンスに達したコロニーを冷凍保存およびゲノタイピングのための試料調製のために回収した。
【００８７】
冷凍保存
細胞をスピンダウンし、９０％のウシ胎仔血清（Ａｔｌａｓ）および１０％のジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ）からなる冷凍保存媒体中で再懸濁させることにより冷凍保存のための試料を調製した。試料を最初に摂氏−８０度において４時間凍結させ（ｆｒｏｚｅｎ  ｄｏｗｎ）、長期保存のために液体窒素に移した。
【００８８】
試料調製
３日目における形質移入された細胞集団を６ウェルディッシュのウェルから回収し、約１０％を、２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫが新たに補給された２０μｌの１×ＰＣＲ適合性溶解緩衝液：１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．４５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（容量／容量）、０．４５％のＴｗｅｅｎ−２０（容量／容量）中で再懸濁させた。溶解物をサーマルサイクラー中で以下のプログラムを使用して処理した：５５℃、６０分間、９５℃、１５分間。２０〜３０μｌの溶解緩衝液を使用して希釈クローニングからのコロニー試料を上記のとおり処理した。
【００８９】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒ突然変異検出およびＲＦＬＰ分析
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉＦｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１μｌの細胞溶解物と製造業者の推奨に従って使用して、目的部位をフランキングするＰＣＲを実施した。それぞれの部位のためのプライマーを表４に列挙する。集団中の突然変異の頻度は、ＳＵＲＶＥＹＯＲ突然変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）により製造業者の推奨に従って上記のとおり１０ｕｌのＰＣＲ産物を使用して分析した。ＲＦＬＰ分析は、表５に示される制限酵素を使用して１０μｌの上記ＰＣＲ反応物に対して実施した。ＳｕｒｖｅｙｏｒおよびＲＦＬＰ反応物を１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分解し、臭化エチジウム染色により可視化した。バンドの密度測定はＩｍａｇｅＪを使用して実施し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ反応物の突然変異率は既に記載のとおり計算した［１３］。ＨＤＲパーセントは、ＲＦＬＰ断片の合計強度を、親バンド＋ＲＦＬＰ断片の合計強度により割ることにより計算した。コロニーのＲＦＬＰ分析を同様に処理し、但し、ＰＣＲ産物を１×ＡＣＣＵＳＴＡＲＴ  ＩＩ  ＧＥＬＴＲＡＣＫ  ＳＵＰＥＲＭＩＸ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により増幅させ、２．５％のアガロースゲル上で分解した。
【００９０】
【表４】
2017533716.tif 000006
【００９１】
【表５】
2017533716.tif 000007
【００９２】
高分解能融解分析
高分解能融解分析は、１：１０希釈された２μＬの細胞溶解物（上記のとおり）、２ｕＭの高分解能融解プライマー（表６）、１×ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＭＥＬＴ  ＳＵＰＥＲＭＩＸ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して行った。反応は、５５度のアニーリング温度および４０サイクルを用いる２ステッププロトコルを使用してＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ機器中で実行した。融解曲線は、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ高分解能融解分析を使用して分析した。ヘテロ接合性クローンは、図７に示される特徴プロファイルにより同定した。
【００９３】
【表６】
2017533716.tif 000008
【００９４】
アンプリコン配列決定および分析
形質移入された集団からＤＮＡを単離し、１×ＡＣＣＵＳＴＡＲＴ  ＩＩ  ＧＥＬＴＲＡＣＫ  ＳＵＰＥＲＭＩＸ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりクローニングおよび増幅させた。ＰＣＲ産物の一部を２．５％のアガロースゲル上で分解してサイズを確認してからＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲクリーンアップを行った。試料は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒに提出し、標準的サンガー配列決定を使用して配列決定に供した。アレルがヘテロ接合性である試料について、新たなＰＣＲ産物をｐＣＲ４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にＴＯＰＯ−ＴＡクローニングし、個々のＴＯＰＯクローンを第２のＰＣＲ反応用テンプレートとして使用して目的領域を増幅させてから、ＭＩＮＥＬＵＴＥ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲクリーンアップを行った。
【００９５】
実施例６
Ｒａｓ過剰活性を示すＮｆ１ヘテロ接合性ブタの生産
３ラウンドの体細胞核移植を、ＮＦ１遺伝子中のＲ１９４７Ｘ突然変異についてヘテロ接合性である雄ランドレース細胞に対して実施した。３ラウンドのクローニングおよび胚移植から１頭の妊娠ブタを樹立し、それは４頭の仔ブタを出産し、２頭は死産し、１頭は２日齢において死亡し、１頭は９３日齢において死亡した、図８Ａ。驚くべきことに、ランドレース遺伝子バックグラウンド中でＮＦ１関連表現型は観察されなかった。続いて、３ラウンドの体細胞核移植を、ＮＦ１遺伝子中のＲ１９４７Ｘ突然変異についてヘテロ接合性である雄オッサバウミニブタ細胞に対して実施した。３ラウンドのクローニングおよび胚移植から２頭の妊娠ブタを樹立し、合計８頭の仔ブタ（一方のリッターから３頭、および他方のリッターから５頭）が出生された、図９Ａ。３頭の仔ブタは、１、５、および２４日において死亡した。複数の動物がカフェオレスポットおよび潜在的な脊柱側弯症の徴候を示した、図９Ａ〜Ｄ。５頭のＮＦ１  Ｒ１９４７Ｘ／＋オッサバウミニブタが生存したままである。
【００９６】
活性Ｒａｓ（Ｒａｓ−ＧＴＰ）は、ＧＴＰ結合Ｒａｓをグルタチオンアガロース樹脂に係留されたＧＳＴ−Ｒａｆ１  Ｒａｓ結合ドメインによりプルダウンさせる活性Ｒａｓプルダウンキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量した。細胞を血清刺激前に１２時間血清飢餓状態にし、血清刺激の０、５、および１５分後において、ならびに基礎血清刺激時（非血清飢餓）において細胞溶解物を回収した。ＮＦ１野生型（ＷＴ）およびＮＦ１ヘテロ接合性（Ｒ１９４７Ｘ／＋）細胞の両方は、血清飢餓の５分後にＲａｓ−ＧＴＰレベルのピークを示す、図８Ｂ。Ｒａｓ−ＧＴＰを総Ｒａｓ（図８Ｃ、上段）またはＧＡＰＤＨ（図８Ｃ、下段）のいずれかに正規化した場合、ＮＦ１  Ｒ１９４７Ｘ／＋（ＮＦ１  Ｈｅｔ）細胞は、ＮＦ１  ＷＴ細胞と比較して増加したＲａｓ活性を示す。Ｒａｓ−ＧＴＰレベルは、血清刺激の１５分後にＮＦ１  ＷＴ細胞と比較してＮＦ１  Ｒ１９４７Ｘ／＋（ＮＦ１  Ｈｅｔ）細胞についてより高いままである。これらの結果は、ヒトにおいて同定され、ブタに移植されたＲ１９４７Ｘ突然変異が、事実上、神経線維腫症の病因に関与することを示す。さらに、これは、Ｒａｓがこの病因における不可欠な部分を担うことを示す。さらに、これは、ＮＦ１突然変異がＲａｓ過剰活性における役割を担うことを示す。
【００９７】
ＮＦ１ヘテロ接合性ブタは、ＮＦ１関連表現型を有する。図９Ａ〜Ｃは、神経線維腫症の表現型を示す出生ＮＦ１Ｒ１９４７Ｘ／＋オッサバウミニブタの表現型の例を提供する。図９Ａ、ＮＦ１Ｒ１９４７Ｘ／＋オッサバウミニブタの顔面部の淡黄色／褐色の低色素沈着（上段）および背部上の白色の低色素沈着（下段）である。図９Ｂ、ＮＦ１Ｒ１９４７Ｘ／＋オッサバウミニブタの２頭は、巨視的観察（左）およびＸ線イメージング（右）の両方による解剖時に脊椎湾曲および潜在的な脊椎側弯症の徴候を示した。図９Ｃ、カフェオレスポットは、ＮＦ１Ｒ１９４７Ｘ／＋オッサバウミニブタの多くにおいて観察された。表（左）は、単一動物において見られた１１個のカフェオレスポットを記載し、病変の写真は示されるとおりである。カフェオレスポットはＮＦ１患者において極端に共通しており、ヒトにおけるＮＦ１診断のための基準として使用される。図９Ｄ、１〜４は、９Ｃの１〜４に対応するスポットの写真である。
【００９８】
実施例７
ＮＦ１およびＴＰ５３中の誘導された突然変異がシスであるかトランスであるかを決定するためのＳＮＰの同定
本発明者らは、ＴＡＬＥＮ媒介相同依存性修復により誘導されたＮＦ１  Ｒ１９４７ＸまたはＴＰ５３  Ｓ１１９Ｘ突然変異の５，１００塩基対内の潜在的ＳＮＰを同定した（表７および８）。同定されたＳＮＰの１つ以上を使用してＮＦ１  Ｒ１９４７Ｘ突然変異が生じた染色体、およびＴＰ５３  Ｓ１１９Ｘ突然変異が生じた染色体を同定する。ＮＦ１およびＴＰ５３遺伝子を保有する第１２染色体上のこの遺伝子座の放射線ハイブリッドマップから回収されたデータにより、本発明者らは、ＮＦ１  Ｒ１９４７ＸおよびＴＰ５３  Ｓ１１９Ｘ突然変異が同一染色体上で生じるクローンを同定することができる。
【００９９】
【表７】
2017533716.tif 000009
【０１００】
【表８】
2017533716.tif 000010
【０１０１】
１〜５０まで連続して列挙される以下の段落は、本開示の種々の態様を提供する。一実施形態において、第１の段落（１）において、本開示は、以下を提供する：
１．ゲノム改変ＮＦ１遺伝子および／または改変されているＴＰ５３遺伝子を含むブタまたは細胞または胚。
２．改変されているＮＦ１遺伝子がヒトにおけるアルギニン１９４７に相当する位置における改変を含む、段落１のブタまたは細胞または胚。
３．改変されているＮＦ１遺伝子および／または改変されているＴＰ５３遺伝子が未成熟終止コドンを含むように改変されている、段落１および２のブタまたは細胞または胚。
４．ＮＦ１遺伝子のヘテロ接合性改変を有する、段落１〜３のいずれかのブタまたは細胞または胚。
５．ＴＰ５３遺伝子のヘテロ接合性改変を有する、段落１〜４のいずれかのブタまたは細胞または胚。
６．ＮＦ１遺伝子およびＴＰ５３遺伝子の両方の改変を有する、段落１〜５のいずれかのブタまたは細胞または胚。
７．改変がシスである、段落１〜６のいずれかのブタまたは細胞または胚。
８．ＮＦ１遺伝子の一方のアレルが野生型アレルである、段落１〜７のいずれかのブタまたは細胞または胚。
９．ＴＰ５３遺伝子の一方のアレルが野生型アレルである、段落１〜８のいずれかのブタまたは細胞または胚。
１０．ＮＦ１遺伝子の一方のアレルが野生型アレルであり、但し、野生型ＮＦ１アレルが少なくとも１つのサイレント突然変異を有する、段落１〜９のいずれかのブタまたは細胞または胚。あるいは、１、２、３、４、または５つのサイレント突然変異のみを有する。
１１．ＴＰ５３遺伝子の一方のアレルが野生型アレルであり、但し、野生型ＴＰ５３アレルが少なくとも１つのサイレント突然変異を有する、段落１〜１０のいずれかのブタまたは細胞または胚。あるいは、１、２、３、４、または５つのサイレント突然変異のみを有する。
１２．サイレント突然変異が制限酵素のための攻撃の部位を提供する、段落１〜１１のいずれかのブタまたは細胞または胚。例：１、２、３、４、または５つの部位を提供し、部位は単一酵素に特異的であり、または複数の制限酵素のための部位を提供する１、２、３、４、５つのサイレント突然変異。
１３．改変のため、制限酵素のための攻撃の部位を提供する改変（サイレントまたはその他）を有する、段落１〜１２のいずれかのブタまたは細胞または胚。例：１、２、３、４、または５つの部位を提供し、部位は単一酵素に特異的であり、または複数の制限酵素のための部位を提供する１、２、３、４、５つのサイレント突然変異。
１４．ミニブタおよび／またはオッサバウブタおよび／またはランドレースブタおよび／またはファウンダーおよび／またはＦ１である、段落１〜１３のいずれかのブタまたは細胞または胚。
１５．初代および／またはブタおよび／または低継代（１３継代未満）である、段落１〜１４のいずれかの細胞。
１６．接合体、卵母細胞、配偶子、精子、または胚／割球のメンバーである、段落１〜１５のいずれかの細胞。
１７．標的化エンドヌクレアーゼおよび／または相同依存性修復テンプレートの使用を含む、段落１〜１６のいずれかを作製する方法。細胞を使用して、例えば、クローニングにより動物を作製することができる。
１８．細胞または胚中に、
標的染色体ＤＮＡ部位に指向される標的化エンドヌクレアーゼ、
標的染色体ＤＮＡ部位に対して外因性である第１の配列を含む、標的染色体ＤＮＡ部位と相同性である第１のＨＤＲテンプレート、および
標的染色体ＤＮＡ部位に対して外因性である第２の配列を含む、標的染色体ＤＮＡ部位と相同性である第２のＨＤＲテンプレート
を導入することを含む、動物、細胞、または胚を作製する方法。
１９．第２の配列が標的ＤＮＡ染色体部位と同一である、段落１８の方法。
２０．第２の配列が標的ＤＮＡ染色体部位と９９％の同一性を有する、段落１８および１９の方法。あるいは、９５〜９９．９９％の値；当業者は、この範囲内の全ての範囲および値、例えば、９７、９９．８、少なくとも９５％が企図および支持されることを直ちに認識する。
２１．第２の配列が標的ＤＮＡ染色体部位と同一であり、但し、（ｉ）サイレント突然変異が１つ以上であり；（ｉｉ）塩基数が１〜５の範囲である、段落１８〜２０の方法。例えば、サイレント突然変異の数は１〜５であり得る。
２２．第２の配列が、所定の制限酵素による開裂を可能にする配列の変化を除いて標的ＤＮＡ染色体部位と同一である、段落１８〜２１のいずれかの方法。さらなる方法は、任意数、例えば、１〜５つのそのような変化を提供する。
２３．外因性配列が（ｉ）天然で見出されるアレル；（ｉｉ）同一種において見出されるアレル；（ｉｉｉ）同一種の別の品種において見出されるアレル（同一品種において存在しないアレル）；（ｉｖ）異なる種からのアレル（同一種からのものでないアレル）；（ｖ）遺伝子のノックアウトを作出する配列；（ｖｉ）発現性選択マーカー（例えば、抗生物質、蛍光タンパク質）；（ｖｉｉｉ）誘導性プロモーター；（ｉｘ）ランディングパッド；または（ｘ）ｉ〜ｉｘの任意の組合せを適宜含み、またはそれである、段落１８〜２２のいずれかの方法。
２４．動物、細胞、または動物が、第１のＨＤＲテンプレートにより作製された遺伝子改変についてヘテロ接合性である、段落１８〜２３のいずれかの方法。
２５．改変ＮＦ１および／またはＴＰ５３部位を作製するために適用される、段落１８〜２４のいずれかの方法。
２６．改変腫瘍抑制因子遺伝子を作製するために適用される、段落１８〜２４のいずれかの方法。
２７．第１のＨＤＲテンプレートと第２のＨＤＲテンプレートとの比を調整することをさらに含む、段落１８〜２６のいずれかの方法。
２８．第１のテンプレートが第１の制限酵素のための第１の部位を含み、かつ第２のテンプレートが第２の制限酵素のための第２の部位を含む、段落１８〜２７のいずれかの方法。前記第１の部位および第２の部位は、標的部位および／または標的染色体および／または品種および／または種および／または動物に対して新規である。あるいは、３つ以上、例えば、３〜１０個の数、例えば、４、５、６、７、８、９つの制限酵素部位が存在するため、追加のユニーク酵素のための追加の部位を含む。
２９．第１の部位および第２の部位を含む細胞を同定することを含む、遺伝子改変について複数の細胞をスクリーニングすることを含む、段落１８〜２８のいずれかの方法。または３〜１０個の部位である。
３０．ゲノム改変腫瘍抑制因子遺伝子を含み、前記遺伝子がヘテロ接合的に改変されている、動物または細胞または胚。
３１．１８〜３０のいずれかの方法により作製される、段落３０の動物または細胞または胚。
３２．改変遺伝子の一方のアレルが野生型アレルであり、但し、野生型ＮＦ１アレルが少なくとも１つのサイレント突然変異を有する、段落３０〜３１のいずれかの動物または細胞または胚。あるいは、１、２、３、４、または５つのサイレント突然変異のみを有する。
３３．サイレント突然変異が制限酵素のための攻撃の部位を提供する、段落３０〜３２のいずれかの動物または細胞または胚。例：１、２、３、４、または５つの部位を提供し、部位は単一酵素に特異的であり、または複数の制限酵素のための部位を提供する１、２、３、４、５つのサイレント突然変異。
３４．改変のため、制限酵素のための攻撃の部位を提供する、遺伝子（改変が達成された後の遺伝子の一方または両方のアレル）における改変（サイレントまたはその他）を含む、段落３０〜３３のいずれかの動物または細胞または胚。例：１、２、３、４、または５つの部位を提供し、部位は単一酵素に特異的であり、または複数の制限酵素のための部位を提供する１、２、３、４、５つの突然変異。
３５．家畜、ウシ、ブタ、ミニブタおよび／またはオッサバウブタおよび／またはランドレースブタおよび／またはファウンダーおよび／またはＦ１である、段落３０〜３４のいずれかの動物または細胞または胚。
３６．初代および／または動物および／または低継代（１３継代未満）である、段落３０〜３５のいずれかの細胞。
３７．接合体、卵母細胞、配偶子、精子、または胚／割球のメンバーである、段落３０〜３６のいずれかの細胞。
【０１０２】
参考文献
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８．Ｓｅｒｖｉｎ  Ｂ，Ｆａｒａｕｔ  Ｔ，Ｉａｎｎｕｃｃｅｌｌｉ  Ｎ，Ｚｅｌｅｎｉｋａ  Ｄ  ａｎｄ  Ｍｉｌａｎ  Ｄ．Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍａｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｉｇ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．ＢＭＣ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１２；１３：５８５．
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１０．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＳＡ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＪＭ．ＮＦ１  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ  １．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．２０００；１５１（１）：３３−４０．
１１．Ｃａｒｌｓｏｎ  ＤＦ，Ｔａｎ  Ｗ，Ｌｉｌｌｉｃｏ  ＳＧ，Ｓｔｖｅｒａｋｏｖａ  Ｄ，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  Ｃ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｍ，Ｖｏｙｔａｓ  ＤＦ，Ｌｏｎｇ  ＣＲ，Ｗｈｉｔｅｌａｗ  ＣＢ  ａｎｄ  Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ  ＳＣ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｉｎ  ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．２０１２；１０９（４３）：１７３８２−１７３８７．
１２．Ｃｅｒｍａｋ  Ｔ，Ｄｏｙｌｅ  ＥＬ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｍ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｃ，Ｂａｌｌｅｒ  ＪＡ，Ｓｏｍｉａ  ＮＶ，Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＡＪ  ａｎｄ  Ｖｏｙｔａｓ  ＤＦ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｍ  ＴＡＬＥＮ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１；３９（１２）：ｅ８２．
１３．Ｇｕｓｃｈｉｎ  ＤＹ，Ｗａｉｔｅ  ＡＪ，Ｋａｔｉｂａｈ  ＧＥ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＣ，Ｈｏｌｍｅｓ  ＭＣ  ａｎｄ  Ｒｅｂａｒ  ＥＪ．Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０；６４９：２４７−２５６．
【図１】
2017533716.tif 000011
【図２】
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【図３】
2017533716.tif 000013
【図４】
2017533716.tif 000014
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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