(57)【要約】【解決手段】  本発明は側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマー及びその応用を開示した。前記ポリマーはジチオ五員環官能基を有する環状カーボネートモノマーから活性制御可能な開環重合により得られ、その分子量が制御可能であり、また、分子量分布がより狭く、保護と脱保護の過程を必要としなく、本発明に係る環状カーボネートモノマーから開環重合して得られたポリマーは生分解性を有し、薬物放出システムの制御に用いられ、製造した腫瘍標的還元感受性可逆的架橋のナノ薬物担体は体内での長期循環を支持するが、腫瘍細胞に極めて集中しており、かつ細胞内で速やかに解架橋して薬物を放出し、腫瘍細胞を高効率に特異的に殺せる。また、当該生分解性ポリマーは組織工学用足場とバイオチップコート層等において応用が期待される。【選択図】図１
2017517622.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジチオ五員環官能基を有する環状カーボネートモノマー単位を含む側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーであって、前記側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーの化学構造式は以下の構造式の１種であり、
【化１】
2017517622.tif 000027
式中、Ｒ１は以下の基から選ばれる一種であり、
【化２】
2017517622.tif 000028
式中、ｋ＝２０〜２５０、Ｒ４は以下の基から選ばれる一種であり、
【化３】
2017517622.tif 000029
Ｒ２は以下の基から選ばれる一種であり、
【化４】
2017517622.tif 000030
Ｒ３は以下の基から選ばれる一種であり、
【化５】
2017517622.tif 000031
或いは、
【化６】
2017517622.tif 000032
式中、ａ＝２、３或いは４、ｂ＝２０〜２５０であり、
前記側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーの分子量が８００〜１０００００Ｄａであることを特徴とする、側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマー。
【請求項２】
前記側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーの分子鎖に含まれるジチオ五員環官能基の環状カーボネートモノマーの単位数が４〜５０であることを特徴とする、請求項１に記載の側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマー。
【請求項３】
前記側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーの分子量が３０００〜７００００Ｄａである、請求項１又は２に記載の側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーの薬物徐放性担体の製造における応用。
【請求項４】
前記側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーの分子量が５０００〜１０００００Ｄａである、請求項１又は２に記載の側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーの生体組織工学用足場材料の製造における応用。
【請求項５】
前記側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーの分子量が８００〜１００００Ｄａである、請求項１又は２に記載の側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーのバイオチップコート層の製造における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生分解性ポリマー材料及びその応用に関し、具体的には側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマー及びその応用に関し、医薬材料分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性ポリマーは非常に独特な性能を有する。例えば通常、よい生体適合性を有し、体内で分解できて、分解生成物は人体に吸収されるか、或いは人体の正常な生理的経路を通じて体外に排出されるので、手術用縫合糸、骨固定用の器具、生体組織工学用足場材料、薬物徐放性担体等の生物医学の各分野に広く応用される。その中で、合成した生分解性ポリマーは免疫原性が比較的低く、分解性や機械性等の性能がいずれも簡単に制御できるので、特に注目されている。合成した生分解性ポリマーは主に脂肪族ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミノ酸、ポリリン酸エステル、ポリ無水物、ポリオルソエステル等がある。その中で、ポリカーボネート、例えばポリトリメチレン環状カーボネート（ＰＴＭＣ）と、脂肪族ポリエステル、例えばポリグリコライド（ＰＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ラクチド−グリコライド共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）等は最も常用されている生分解性ポリマーであり、既に米国食品医療品局（ＦＤＡ）により許可された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、従来の生分解性ポリマー、例えばＰＴＭＣ、ＰＣＬ、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ等は構造が比較的単一であり、修飾に用いられる官能基が少なく、安定して循環する薬物ナノ担体或いは安定した表面修飾コート層を提供しがたいことが多い。
【０００４】
ポリカーボネートの分解生成物は主に二酸化炭素と中性のジオールであり、酸性の分解生成物を産生しない。機能性の環状カーボネートモノマーは多くの環状エステル系モノマー、例えばＧＡ、ＬＡ、ε−ＣＬ等、及びその他の環状カーボネートモノマーと共重合して、性能が異なる生分解性ポリマーが得られる。
【０００５】
また、従来技術では、開環重合過程において、環状カーボネートモノマーの構造における活性基が反応しやすいので、環状カーボネートモノマーから機能性ポリマーを製造する際に、いずれも保護と脱保護の工程を経ることが必要で、製造過程が煩雑になる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
技術的解決手段
本発明の目的は、側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーを提供することである。
【０００７】
上記の目的を達するために、本発明は以下の具体的な技術手段を特徴とする。
【０００８】
化学構造式が以下の構造式の１種である、側鎖にジチオ五員環官能基を有するポリマー：
【０００９】
【化１】
2017517622.tif 000003
式中、Ｒ１は以下の基から選ばれる一種であり、
【００１０】
【化２】
2017517622.tif 000004
式中、ｋ＝２０〜２５０、Ｒ４は以下の基から選ばれる一種であり、
【００１１】
【化３】
2017517622.tif 000005
Ｒ２は以下の基から選ばれる一種であり、
【００１２】
【化４】
2017517622.tif 000006
Ｒ３は以下の基から選ばれる一種であり、
【００１３】
【化５】
2017517622.tif 000007
或いは
【００１４】
【化６】
2017517622.tif 000008
式中、ａ＝２、３或いは４、ｂ＝２０〜２５０であり、
前記側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーの分子量が８００〜１０００００Ｄａである。
【００１５】
上記の技術手段において、側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーの分子鎖に含まれるジチオ五員環官能基の繰り返し単位数が４〜５０である。
【００１６】
上記の側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーは、開始剤の存在下で、溶媒中で、ジチオ五員環官能基を有する環状カーボネートモノマーが開環重合して得られるものであり、或いはジチオ五員環官能基を有する環状カーボネートモノマーと他の環状エステルモノマー、環状カーボネートモノマーが開環重合して得られるものであり、前記他の環状カーボネートモノマーはトリメチレン環状カーボネート（ＴＭＣ）を含み、前記他の環状エステルモノマーはカプロラクトン（ε−ＣＬ）、ラクチド（ＬＡ）、或いはグリコライド（ＧＡ）を含む。
【００１７】
前記ジチオ五員環官能基を有する環状カーボネートモノマーの化学構造式は下記の通りである。
【００１８】
【化７】
2017517622.tif 000009
該化合物は以下の工程により製造し得られる。
【００１９】
（１）硫化水素ナトリウム一水和物（ＮａＳＨ・Ｈ２Ｏ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ジブロモネオペンチルグリコールを定圧ファンネルによりゆっくり滴下し、５０℃で４８時間反応し、反応が終了した後、反応物を減圧蒸留して溶媒のＤＭＦを除去し、次に蒸留水で希釈し、酢酸エチルで四回抽出し、最後に有機相を回転蒸発して黄色の粘稠状化合物Ａを得る。
【００２０】
上記の化合物Ａの化学構造式は下記の通りである。
【００２１】
【化８】
2017517622.tif 000010
【００２２】
（２）化合物Ａをテトラヒドロフラン溶液に保存し、空気中に２４時間酸化して化合物Ｂが得られ、上記の化合物Ｂの化学構造式は下記の通りである。
【００２３】
【化９】
2017517622.tif 000011
【００２４】
（３）窒素ガス雰囲気において、化合物Ｂとクロロギ酸エチルを乾燥したテトラヒドロフランに溶解した後、定圧ファンネルによりトリエチルアミンをゆっくり滴下し、氷水浴において４時間反応し、反応が終了した後、ろ過し、ろ液を回転濃縮し、更にジエチルエーテルで３〜５回再結晶して、黄色の結晶、即ちジチオ五員環官能基を有する環状カーボネートモノマーを得る。
【００２５】
上記の環状カーボネートモノマーはジクロロメタンにおいて、ポリエチレングリコールを開始剤として、ビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛を触媒として開環重合し、ブロックポリマーを形成し、その反応式は下記の通りである。
【００２６】
【化１０】
2017517622.tif 000012
【００２７】
上記の側鎖にジチオ五員環官能基を有するカーボネートポリマーは生物分解性を有し、ナノ粒子（粒子径２０〜２５０ｎｍ）を製造でき、抗がん剤を担持することができ、ポリマーナノ粒子は触媒量の還元剤、例えばジチオトレイトール或いはグルタチオンの触媒下で安定した化学的架橋を形成し、生体内で長期循環するが、細胞に入った後は、細胞内で還元性物質が大量に存在する環境下で速やかに解架橋して、薬物を放出し、効率的に腫瘍細胞を殺す。本発明の初めて製造したポリマーは良好な生体適合性を有し、薬物の担体として使用する場合、抗腫瘍薬物の生体内での循環時間を増やし、薬物の腫瘍部位での集積率を向上させ、薬物の正常組織に対する損傷を回避し、腫瘍細胞を効果的に殺せるとともに、正常細胞に対する影響が少ない。
【００２８】
従って、本発明は上記の側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーの薬物徐放性担体の製造における応用を保護請求し、前記側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーの分子量が３０００〜７００００Ｄａである。
【００２９】
また、上記の側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーは化学的架橋を形成して架橋ナノ担体を獲得した後、当該架橋ナノ担体の表面に、腫瘍細胞特異的標的分子、例えばＲＧＤポリペプチド、核酸アプタマー、抗体、葉酸、又は乳糖等をカップリングすることにより、腫瘍細胞に取り込まれるナノドラッグの量を大幅に増加できる。
【００３０】
上記の側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーは生物分解性を有し、生体組織足場を製造でき、ポリマーは触媒量の還元性物質、例えばジチオトレイトール或いはグルタチオンが存在する環境下で、ポリマーの可逆架橋を促した後、静電紡糸により繊維を製造でき、このような繊維は修飾により、細胞をよく粘着でき、架橋により繊維の安定性を大幅向上でき、組織部位においてそれをより安定させ、足場が不安定で離脱しやすい弊害を回避できるから、本発明は上記の側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーの生体組織工学用足場材料の製造における応用を保護請求し、前記側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーの分子量が５０００〜１０００００Ｄａである。
【００３１】
本発明は更に上記の側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーのバイオチップコート層の製造における応用を保護請求し、前記側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーの分子量は８００〜１００００Ｄａである。上記の側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーはバイオチップコート層として生体組織足場と類似し、触媒量の還元剤、例えばジチオトレイトール或いはグルタチオンの触媒下で安定した化学的架橋を形成し、バイオチップコート層を体内でより安定させて、非特異的吸着を減少して、生物組成成分含有量の測定ノイズを減少する。
【発明の効果】
【００３２】
有利な効果
上記の態様を実施することにより、本発明は従来技術と比べると、以下の利点を有する。
【００３３】
１．本発明は初めてジチオ五員環官能基を有する環状カーボネートモノマーを利用して活性制御可能な開環単独重合或いは他のカーボネートモノマー、環状エステルモノマーとの共重合により分子量の制御が可能で、分子量分布がより狭い生分解性ポリマーを得た。Ｓ−Ｓ五員環基は環状カーボネートモノマーの開環重合に影響しないため、重合工程において従来技術における保護と脱保護の工程を不要としなく、操作工程を簡単化した。
【００３４】
２．本発明が開示した側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーは優れた生分解性を有し、薬物放出システムを制御するのに用いられ、腫瘍標的還元感受性可逆架橋のナノ薬物担体を製造でき、生体内での長期循環を支え、癌細胞が極めて集中した細胞内で速やかに解架橋して、薬物を放出し、効率的で特異的に癌細胞を殺す。
【００３５】
３．本発明が開示した環状カーボネートモノマーは製造が簡単で、該環状カーボネートモノマーから簡単に開環重合して側鎖にジチオ五員環官能基を有する生分解性ポリマーが得られ、当該ポリマーは更に自己組織化して薬物放出システムの制御、組織工学、バイオチップコート層に用いられ、生物材料分野において良好な応用価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例２のポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ２．５ｋ−ｃｏ−ＣＬ３．９ｋ）のＨ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実施例１５のポリマーＰ（ＣＤＣ−ｃｏ−ＣＬ）（６．２１ｋ）−ＰＥＧ（０．５ｋ）−Ｐ（ＣＤＣ−ｃｏ−ＣＬ）（６．２１ｋ）の核磁気共鳴スペクトルである。
【図３】実施例１６のポリマーミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの粒子分布図である。
【図４】実施例１７の架橋ミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの高度希釈下での粒子径変化図である。
【図５】実施例１７の架橋ミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの還元性物質のグルタチオンの存在下での粒子径変化図である。
【図６】実施例１７の架橋ミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋのＲａｗ２６４．７とＭＣＦ−７細胞に対する毒性結果図である。
【図７】実施例１８のＤＯＸ担持架橋ミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの生体外放出結果図である。
【図８】実施例１８のＤＯＸ担持架橋ミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋのＲａｗ２６４．７とＭＣＦ−７細胞に対する毒性図である。
【図９】実施例１９の架橋ポリマーベシクルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の粒子径分布及び投影型電子顕微鏡写真図である。
【図１０】実施例１９の標的架橋ベシクルナノ粒子ｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のＵ８７ＭＧ細胞に対する毒性図である。
【図１１】実施例１９のＤＯＸ担持標的架橋ベシクルナノ粒子のＵ８７ＭＧ細胞に対する毒性図である。
【図１２】実施例２０のＤＯＸ担持架橋ナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋのマウス体内での血液循環図である。
【図１３】実施例２１のＤＯＸ担持架橋ナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの黒色腫担持マウスに対する生物分布結果図である。
【図１４】実施例２２のＤＯＸ担持ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫担持マウスに対する治療結果図である。
【図１５】実施例２３のＤＯＸ担持標的架橋ベシクルのマウス体内での血液循環図である。
【図１６】実施例２４のＤＯＸ担持標的架橋ベシクルのヒト脳悪性神経膠腫担持マウス体内での生物分布図である。
【図１７】実施例２５のＤＯＸ担持標的架橋ベシクルのヒト脳悪性神経膠腫担持マウスに対する治療効果図である。
【図１８】実施例２６のＤＯＸ担持標的ベシクルの黒色腫担持マウスに対する治療効果図である。
【図１９】実施例２７のＤＯＸ担持標的架橋ベシクルの肺がん担持マウスの体内生物分布図である。
【図２０】実施例２８のＰＥＧ５ｋ−ＰＬＧＡ７．８ｋ−ＰＣＤＣ１．７ｋ表面修飾の金ナノロッドのＴＥＭ図である。
【図２１】実施例３０のポリマーＰＣＬとＰ（ＣＤＣ０．８ｋ−ｃｏ−ＣＬ９２ｋ）の成膜後に生理食塩水に二週間浸漬した後の写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、実施例と図面により、本発明を更に記述する。
【実施例１】
【００３８】
ジチオ五員環官能基を有する環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）の合成
【００３９】
【化１１】
2017517622.tif 000013
【００４０】
１、硫化水素ナトリウム一水和物（２８．２５ｇ、３８１．７ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４００ｍＬに溶解し、完全に溶解するまで５０℃で加熱し、ジブロモネオペンチルグリコール（２０ｇ、７６．４ｍｍｏｌ）を一滴ずつ滴下し、４８時間反応させた。反応物を減圧蒸留して溶媒ＤＭＦを除去し、次に蒸留水２００ｍＬで希釈し、酢酸エチル２５０ｍＬで四回抽出し、最後に有機相を回転蒸発して黄色の粘稠状化合物Ａを得、収率は７０％であった。
【００４１】
２、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４００ｍＬに溶解した化合物Ａを空気中に２４時間放置し、分子間のメルカプト基を酸化してＳ−Ｓ結合を形成し、化合物Ｂが得られ、収率＞９８％であった。
【００４２】
３、窒素ガスの保護下で、化合物Ｂ（１１．７ｇ、７０．５ｍｍｏｌ）を乾燥したＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解して、完全に溶解するまでに攪拌した。続いて０℃まで冷却し、クロロギ酸エチル（１５．６５ｍＬ、１１９．８ｍｍｏｌ）を加え、次にＥｔ３Ｎ（２２．８３ｍＬ、１２０．０ｍｍｏｌ）を一滴ずつ滴下した。滴下が完了した後、当該系を氷水浴条件下で引き続いて４時間反応させた。反応が完了した後、生成したＥｔ３Ｎ・ＨＣｌをろ過して取り除き、ろ液を回転濃縮し、最後にジエチルエーテルで再結晶を複数回行って、黄色の結晶、即ちジチオ五員環官能基を有する環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）を得、収率は６４％であった。
【実施例２】
【００４３】
両ブロックの側鎖にジチオ五員環官能基を有するポリマーＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの合成
窒素ガス環境下で、ＣＤＣモノマー０．３ｇ（１．５６ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン２ｍＬを密閉反応器に加え、次に分子量が５０００のポリエチレングリコール０．５ｇ（０．１ｍｍｏｌ）と触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉して、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過し真空乾燥して生成物ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋを得た。
【００４４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２）、３．３０（ｍ，−ＯＣＨ３）、４．０５（ｓ，−ＣＨ２ＯＣＯＣＨＣＨ２−）、４．０７（ｓ，−ＯＣＨ２ＣＣＨ２Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ２）。
【００４５】
【化１２】
2017517622.tif 000014
式中、ｍ＝１１３．６、ｎ＝１４．６。
【実施例３】
【００４６】
両ブロックの側鎖にジチオ五員環を含むポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ２．５ｋ−ｃｏ−ＣＬ３．９ｋ）の合成
窒素ガス環境下で、ＣＤＣモノマー０．２８ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）とカプロラクトン（ε−ＣＬ）０．４ｇ（３．５１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次に分子量が５０００のポリエチレングリコール０．５ｇ（０．１ｍｍｏｌ）と０．１ｍｏｌ／Ｌの触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉して、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することで生成物ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ２．５ｋ−ｃｏ−ＣＬ３．９ｋ）を得た。ＧＰＣ測定による分子量は１４．０ｋＤａ、分子量分布は１．５６であった。
【００４７】
【化１３】
2017517622.tif 000015
式中、ｍ＝１１３．６、ｘ＝３４．２、ｙ＝１３．０、ｎ＝４７．２。
【００４８】
図１は上記のポリマーの核磁気共鳴スペクトルである。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．４０（ｍ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１．６５（ｍ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、２．３０（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２）、３．３０（ｍ，−ＯＣＨ３）、４．０３（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．０５（ｓ，−ＣＨ２ＯＣＯＣＨＣＨ２−）、４．０７（ｓ，−ＯＣＨ２ＣＣＨ２Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ２）。
【実施例４】
【００４９】
両ブロックの側鎖にジチオ五員環を含むポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＣＬ１４ｋ）の合成
窒素ガス環境下で、ＣＤＣモノマー０．５ｇ（２．６ｍｍｏｌ）とカプロラクトン（ε−ＣＬ）１．５ｇ（１３．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次に分子量が５０００のポリエチレングリコール０．５ｇ（０．１ｍｍｏｌ）と触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉して、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することで生成物のＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．８ｋ−ｃｏ−ＣＬ１４ｋ）を得、ＧＰＣ測定による分子量は３０．６ｋＤａ、分子量分布は１．３４であった。
【００５０】
【化１４】
2017517622.tif 000016
式中、ｍ＝１１３．６、ｘ＝１２２．８、ｙ＝１９．８、ｎ＝１４２。
【実施例５】
【００５１】
両ブロックの側鎖にジチオ五員環を含むポリマーＰＥＧ１．９ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．９ｋ−ｃｏ−ＣＬ３．８ｋ）の合成
窒素ガス環境下で、ＣＤＣモノマー０．４ｇ（２．１ｍｍｏｌ）とカプロラクトン（ε−ＣＬ）０．４ｇ（３．５１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次に分子量が１９００のポリエチレングリコール０．４ｇ（０．２１ｍｍｏｌ）と触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉して、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することでＰＥＧ１．９ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．９ｋ−ｃｏ−ＣＬ３．８ｋ）を得た。ＧＰＣ測定による分子量は０．９６ｋＤａ、分子量分布は１．３５であった。
【００５２】
【化１５】
2017517622.tif 000017
式中、ｍ＝４３．２、ｘ＝３３．３、ｙ＝２０．３、ｎ＝５３．６。
【実施例６】
【００５３】
側鎖にジチオ五員環官能基を有するポリマーＡｌｋ−ＰＣＤＣ２．８ｋの合成
窒素ガス環境下で、ＣＤＣモノマー０．３ｇ（１．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次に精製したプロパルギルアルコール１ｍｍｏｌ／Ｌと触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉して、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することで単独重合物Ａｌｋ−ＰＣＤＣ２．８ｋを得た。
【実施例７】
【００５４】
側鎖にジチオ五員環を含むカーボネートポリマーｉＰｒ−Ｐ（ＣＤＣ０．８ｋ−ｃｏ−ＣＬ９２ｋ）の合成
窒素ガス環境下で、ＣＤＣモノマー０．１ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）とカプロラクトンモノマー（ＣＬ）１０ｇ（８７．７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍＬに溶解したε−ＣＬを、密閉反応器に加え、次にイソプロパノール６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）と触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉して、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて２日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することで生成物ｉＰｒ−Ｐ（ＣＤＣ−ｃｏ−ＣＬ）（０．８ｋ−９２ｋ）を得た。ＧＰＣ測定による分子量は１０２．３ｋＤａ、分子量分布は１．３６であった。
【００５５】
【化１６】
2017517622.tif 000018
式中、ｘ＝４．２、ｙ＝８０．７、ｎ＝８４．９。
【実施例８】
【００５６】
トリブロックの側鎖にジチオ五員環を含むポリマーＰＥＧ５ｋ−ＰＣＤＣ１．０ｋ−ＰＣＬ３．２ｋの合成
窒素ガス環境下で、ＣＤＣモノマー０．１２ｇ（１．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次に分子量が５０００のポリエチレングリコール０．５ｇ（０．３１ｍｍｏｌ）と触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉し、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、更に、グローブボックスの窒素ガスの保護下でカプロラクトン（ε−ＣＬ）０．３５ｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を加え、引き続き１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することで生成物のトリブロックポリマーＰＥＧ５ｋ−ＰＣＤＣ１．０ｋ−ＰＣＬ３．２ｋを得た。ＧＰＣ測定による分子量は１０．４ｋＤａ、分子量分布は１．４５であった。
【００５７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．４０（ｍ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１．６５（ｍ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、２．３０（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２）、３．３０（ｍ，−ＯＣＨ３）、４．０３（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．０５（ｓ，−ＣＨ２ＯＣＯＣＨＣＨ２−）、４．０７（ｓ，−ＯＣＨ２ＣＣＨ２Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ２）。
【実施例９】
【００５８】
両ブロックの側鎖にジチオ五員環を含むＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．２ｋ−ｃｏ−ＴＭＢＰＥＣ３．５ｋ）の合成
窒素ガス環境下で、ＣＤＣモノマー０．４ｇ（２．１ｍｍｏｌ）と２，４，６−トリメトキシベンジルアセタールペンタエリトリトールカーボネートモノマー（ＴＭＢＰＥＣ）０．４ｇ（１．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次に、分子量５０００のポリエチレングリコール０．５ｇ（０．１ｍｍｏｌ）と触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉して、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することで両ブロックポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ３．２ｋ−ｃｏ−ＴＭＢＰＥＣ３．５ｋ）を得た。ＧＰＣ測定による分子量は１２．４ｋＤａ、分子量分布は１．４７であった。
【００５９】
【化１７】
2017517622.tif 000019
式中、ｍ＝１１３．６、ｘ＝１６．７、ｙ＝１０．２、ｎ＝２６．９。
【実施例１０】
【００６０】
トリブロックの側鎖にジチオ五員環官能基を有するＰＥＧ１．９ｋ−ＰＣＬ１．８ｋ−ＰＣＤＣ０．７ｋの合成
窒素ガス環境下で、カプロラクトン（ε−ＣＬ）０．２ｇ（１．７６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ｍＬに溶解し、密閉反応器に入れて、次に、分子量が１９００のポリエチレングリコール０．１９ｇ（０．１ｍｍｏｌ）と触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉し、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、更に、グローブボックスの窒素ガスの保護下でＣＤＣモノマー８０ｍｇ（０．４２ｍｍｏｌ）を加え、引き続いて１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することでトリブロックポリマーＰＥＧ１．９ｋ−ＰＣＬ１．８ｋ−ＰＣＤＣ０．７ｋを得た。ＧＰＣ測定による分子量は０．６４ｋＤａ、分子量分布は１．３２であった。
【００６１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．４０（ｍ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１．６５（ｍ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、２．３０（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２）、３．３０（ｍ，−ＯＣＨ３）、４．０３（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．０５（ｓ，−ＣＨ２ＯＣＯＣＨＣＨ２−）、４．０７（ｓ，−ＯＣＨ２ＣＣＨ２Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ２）。
【実施例１１】
【００６２】
両ブロックの側鎖にジチオ五員環を含むポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の合成
窒素ガス環境下で、ＣＤＣモノマー０．１ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）とトリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）０．４ｇ（３．８５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、密閉反応器に加え、次に分子量が５０００のポリエチレングリコール０．１ｇ（０．０２ｍｍｏｌ）と０．１ｍｏｌ／Ｌの触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉して、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することで両ブロックポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．０ｋ）を得た。ＧＰＣ測定による分子量は３４．５ｋＤａ、分子量分布は１．４８であった。
【００６３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：２．０８（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２）、３．３０（ｍ，−ＯＣＨ３）、３．６５（ｔ，−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．２８（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ２）。
【００６４】
【化１８】
2017517622.tif 000020
式中、ｍ＝１１３．６、ｘ＝２５．５、ｙ＝１８６．３、ｎ＝２１１．８。
【実施例１２】
【００６５】
ｉＲＧＤポリペプチド修飾の両ブロックの側鎖にジチオ五員環を含む標的ポリマーｉＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）の合成
ポリマーｉＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）の合成は二つの工程を備え、マレイミド機能化ポリマーＭａｌ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）を合成する工程１は実施例１１と同じであり、ただ分子量が５０００のｍＰＥＧを分子量が６０００ＤａのＭａｌ−ＰＥＧに置き換えて重合を引き起こすだけである。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：２．０８（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２）、３．３０（ｍ，−ＯＣＨ３）、３．６５（ｔ，−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．２８（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ２）、６．７０（ｓ，Ｍａｌ）。ＧＰＣ測定による分子量は３８．６ｋＤａ、分子量分布は１．４２であった。
【００６６】
【化１９】
2017517622.tif 000021
式中、ｍ＝１３６．４、ｘ＝２４．８、ｙ＝１８８．４、ｎ＝２１３．２。
【００６７】
工程２はポリペプチドｉＲＧＤと上記で得られたポリマーとのマイケル付加反応である。まず、ポリマーＭａｌ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）をＤＭＦに溶解し、ＰＢ緩衝液を滴下することでナノ粒子を形成し、透析して有機溶媒を除去した後、２倍モル量のｉＲＧＤを加え、３０℃で２日反応させ、透析して、結合していない遊離ｉＲＧＤを除去し、冷凍乾燥して、最終生成物のｉＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）を得た。核磁気共鳴とＢＣＡタンパク質キットの計算から、ｉＲＧＤグラフト率が９２％であることが分かった。
【実施例１３】
【００６８】
ｃＲＧＤポリペプチド修飾の両ブロックの側鎖にジチオ五員環を含む標的ポリマーｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の合成
ポリマーｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）の合成は実施例１２と類似しており、二つの工程を備え、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド修飾ポリマーＮＨＳ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）を合成する工程１は実施例１１と類似しており、ただ分子量が５０００ＤａのｍＰＥＧを分子量が６０００ＤａのＮＨＳ−ＰＥＧに置き換えることで重合を引き起こすだけである。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：２．０８（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２）、３．３０（ｍ，−ＯＣＨ３）、３．６５（ｔ，−ＯＣＨ２  ＣＨ２Ｏ−）、４．２８（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ２），２．３（ｓ，ＮＨＳ）。ＧＰＣ測定による分子量は３７．６ｋＤａ、分子量分布は１．３８であった。
【００６９】
【化２０】
2017517622.tif 000022
式中、ｍ＝１３６．４、ｘ＝２４．０、ｙ＝１７８．８、ｎ＝２０２．８。
【００７０】
工程２はポリペプチドｃＲＧＤと得られた上記のポリマーをアミド化反応により結合することである。まず、上記のポリマーをＤＭＦに溶解して、２倍モル量のｃＲＧＤを加え、３０℃で２日反応した後、透析することで結合していない遊離ｃＲＧＤを除去し、冷凍乾燥して、最終生成物のｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）を得、核磁気共鳴とＢＣＡタンパク質キットの計算から、ｃＲＧＤグラフト率が８８％であることが分かった。
【実施例１４】
【００７１】
トリブロックの側鎖にジチオ五員環を含むポリマーＰＥＧ５ｋ−ＰＬＡ７．８ｋ−ＰＣＤＣ１．７ｋの合成
窒素ガス環境下で、ラクチド（ＬＡ）０．４５ｇ（３．１３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、密閉反応器に入れて、次に、分子量が５０００のポリエチレングリコール０．２５ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）と触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、続いて反応器を密閉し、グローブボックスから転出し、４０℃のオイルバスに入れて１日反応した後、更に、グローブボックスの窒素ガスの保護下でＣＤＣモノマー１００ｍｇ（０．５２ｍｍｏｌ）を加え、引き続いて１日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することでトリブロックポリマーＰＥＧ５ｋ−ＰＬＡ７．８ｋ−ＰＣＤＣ１．７ｋを得た。ＧＰＣ測定による分子量は１６．８ｋＤａ、分子量分布は１．４７であった。
【００７２】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．５９（ｍ，−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−）、３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２）、３．３０（ｍ，−ＯＣＨ３）、３．６５（ｍ，−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．０７（ｓ，−ＯＣＨ２ＣＣＨ２Ｏ−）、５．０７（ｍ，−ＣＯＣＨ（ＣＨ３）。
【００７３】
【化２１】
2017517622.tif 000023
式中、ｍ＝１１３．６、ｘ＝１２２．２、ｙ＝８．９、ｎ＝１３１．１。
【実施例１５】
【００７４】
トリブロックの側鎖にジチオ五員環を含むポリマーＰ（ＣＤＣ−ｃｏ−ＣＬ）（６．２１ｋ）−ＰＥＧ（０．５ｋ）−Ｐ（ＣＤＣ−ｃｏ−ＣＬ）（６．２１ｋ）の合成
窒素ガス環境下で、ε−ＣＬ１．５ｇ（１３．２ｍｍｏｌ）とＣＤＣモノマー０．０６２５ｇ（０．３２５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン８ｍＬに溶解し、密閉反応器に加えた後、ＰＥＧ５００を０．０５ｇ（０．０１ｍｍｏｌ）と触媒のビス（ビストリメチルシリル）アミド亜鉛のジクロロメタン溶液１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を加え、一日反応した後、氷酢酸で反応を停止し、氷冷したジエチルエーテルに沈澱させて、最終的には、ろ過して真空乾燥することでトリブロックポリマーＰ（ＣＤＣ−ｃｏ−ＣＬ）（６．２１ｋ）−ＰＥＧ（０．５ｋ）−Ｐ（ＣＤＣ−ｃｏ−ＣＬ）（６．２１ｋ）を得た。ＧＰＣ測定による分子量は１４．６ｋＤａ、分子量分布は１．３８であった。
【００７５】
図２は上記のポリマーの核磁気共鳴スペクトルであり、１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．４０（ｍ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１．６５（ｍ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、２．３０（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、３．０８（ｓ，−ＣＣＨ２）、４．０３（ｔ，−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、４．０５（ｓ，−ＣＨ２ＯＣＯＣＨＣＨ２−）、４．０７（ｓ，−ＯＣＨ２ＣＣＨ２Ｏ−）、４．３１（ｍ，−ＣＣＨ２）。
【００７６】
【化２２】
2017517622.tif 000024
式中、ｍ＝１１．４、ｘ＝６．３、ｙ＝４３．９、ｎ＝５１．２。
【００７７】
以上の結果から分かるように、一連のポリマーに対して特徴付けることで、ＣＤＣの開環重合と共重合は制御可能であり、その分子量は設計と一致し、ポリマーの分子量分布がより狭い。
【実施例１６】
【００７８】
ポリマーミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの製造
透析法によりポリマーナノ粒子を製造する。ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋのＤＭＦ溶液２００μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）をリン酸塩緩衝液８００μＬ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＰＢ）に滴下し、透析バッグ（ＭＷＣＯ  ３５００）に装入して夜通し透析し、水を五回交換し、透析媒体はＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）である。得られたミセルナノ粒子は動的光散乱式粒度解析装置（ＤＬＳ）により測定した結果、寸法が１７３ｎｍであり、かつ粒子径分布が非常に狭かった。図面３を参照されたい。
【実施例１７】
【００７９】
ポリマーミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの架橋、解架橋、細胞毒性
ミセルナノ粒子水溶液に窒素ガスを２０分間吹き付けて、空気を追い出した後、密閉反応器内のナノ粒子溶液（１ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、３．２１×１０−５ｍｍｏｌ）に、２次蒸留水に溶解したジチオトレイトール（ＤＴＴ）１０μＬ（０．００７ｍｇ、４．６７×１０−５ｍｍｏｌ、リポ酸官能基のモル数１０％）を加え、密閉の室温下で攪拌して１日反応させた。１日透析した後、粒子の寸法を測定した結果、１５０ｎｍであり、架橋しない粒子径より約１５％小さかった。架橋したナノ粒子は濃度をＣＭＣ以下に希釈した後、その粒子径と粒子径分布は殆ど変わらなく、生理条件下で安定していることから、Ｓ−Ｓ架橋によりナノ粒子の安定性を大幅向上できることが分かった。図４を参照されたい。
【００８０】
Ｓ−Ｓ結合は還元剤、例えばグルタチオン（ＧＳＨ）或いはＤＴＴにより断裂しやすい。窒素ガス保護及び３７℃条件下で、架橋ナノ粒子溶液に窒素ガスを１０分間吹き付けた後、ＧＳＨを加えミセルナノ粒子溶液における最終濃度を１０ｍＭとした。ＤＬＳによりナノ粒子の解架橋による粒子径の変化状況を追跡した。図５のように、還元ＧＳＨを１０ｍＭ加えた後、架橋ナノ粒子の粒子径が時間の経過に伴って徐々に破壊され、ポリマーにおけるジスルフィド環が大量の還元物質の存在下で切断されることを示した。細胞質においても高濃度のＧＳＨが存在するため、製造したナノドラッグは安定して循環するが、細胞に取り込まれた後、速やかに解離して、薬物を放出できる。
【００８１】
ＭＴＴ法により架橋ナノ粒子の細胞毒性を測定した。使用された細胞は、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞）とＲａｗ２６４．７（マウスマクロファージ）である。１×１０４個／ｍＬでＨｅＬａ或いはＲａｗ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに１ウェル１００μＬで接種し、細胞が壁に接着するまで培養した後、実験組に濃度が異なるミセルナノ粒子を含む培養液を加え、また、細胞空白対照ウェルと培地空白ウェル（平行の４つ重複ウェル）を別途設置した。２４時間培養した後、９６ウェルプレートを取り出し、ＭＴＴ（５．０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、引き続いて４時間培養した後、各ウェルに１５０μＬ  ＤＭＳＯを加え生成した結晶子を溶解し、ウェルリーダーにより４９２ｎｍで吸光度（Ａ）を測定し、培地空白ウェルによりゼロ調整を行い、細胞生存率を計算した。
【００８２】
【数１】
2017517622.tif 000025
式中、ＡＴは試験組の４９２ｎｍでの吸光度であり、ＡＣは空白対照組の４９２ｎｍでの吸光度である。ポリマー濃度はそれぞれ０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍｇ／ｍＬである。図６はナノ粒子の細胞毒性結果であり、図から分かるように、ミセルナ粒子の濃度が０．１から０．５ｍｇ／ｍＬに向上した時に、Ｒａｗ２６４．７とＭＣＦ−７細胞の生存率は依然に８５％より高く、ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋミセルナノ粒子が良好な生体適合性を有することを示した。
【実施例１８】
【００８３】
架橋ナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの薬物担持、体外放出及び細胞毒性
ドキソルビシン（ＤＯＸ）を薬物とし、全ての操作は遮光下で行った。まず、ドキソルビシンの塩酸塩を除去し、操作として、ＤＯＸ  １．２  ｍｇ（０．００２ｍｍｏｌ）を２２５μＬのＤＭＳＯに溶解し、トリエチルアミン０．５８ｍＬ（ｍ＝０．４１９ｍｇ，０．００４ｍｍｏｌ）を加えて、１２時間攪拌し、上澄みを吸引した。ＤＯＸのＤＭＳＯ溶液の濃度は５．０ｍｇ／ｍＬであった。ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋをＤＭＦに溶解し、所定の薬物とポリマーとの質量比でＤＯＸのＤＭＳＯ溶液と均一に混合し、攪拌しながら、その体積の４倍の２次蒸留水をゆっくり加え、次に水で透析した。
【００８４】
薬物担持ナノ粒子の架橋も実施例１７の架橋方法に従って行った。架橋ＤＯＸ担持ミセルナノ粒子溶液１００μＬを冷凍乾燥した後、３．０ｍＬ  ＤＭＳＯに溶解し、蛍光分光光度計により測定し、ＤＯＸの標準曲線と合わせて封入率を計算する。
【００８５】
薬物担持量（ＤＬＣ）と封入率（ＤＬＥ）は以下の式に基づいて計算した。
薬物担持量（ｗｔ．％）＝（薬物重量／ポリマー重量）×１００
封入率（％）＝（薬物担持重量／薬物の全投入量）×１００
【００８６】
表１にＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋミセルナノ粒子のＤＯＸに対する担持をまとめた。該ミセルナノ粒子は高効率の担持作用を有していた。
【００８７】
表１  架橋ドキソルビシン担持ポリマーナノ粒子における薬物担持量、封入率の結果
【００８８】
【表１】
2017517622.tif 000026
【００８９】
ＤＯＸの体外放出実験は３７℃の恒温回転振動培養器で振動（２００ｒｐｍ）しながら行い、１組にそれぞれ二つの複製サンプルがある。第１組は、架橋ＤＯＸ担持のミセルナノ粒子が１０ｍＭ  ＧＳＨを添加した模擬細胞内還元環境ＰＢ（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）に放出し、第２組は、架橋ＤＯＸ担持のミセルナノ粒子がＰＢ（１０ｍＭ，ｐＨ  ７．４）に放出し、薬物担持ミセルナノ粒子の濃度が２５ｍｇ／Ｌであり、０．５ｍＬを取って透析バッグ（ＭＷＣＯ：１２，０００〜１４，０００）に入れて、試験管毎に対応の透析溶媒２５ｍＬを加え、所定の時間毎に、５．０ｍＬ透析バッグの外部媒体を取って測定するとともに、試験管に５．０ｍＬの相応する媒体を追加した。ＥＤＩＮＢＵＲＧＨ  ＦＬＳ９２０蛍光計により溶液に含まれる薬物の濃度を測定した。図７はＤＯＸの累積放出量と時間の関係であり、図から分かるように、模擬腫瘍細胞内にＧＳＨを加えた後、ＧＳＨを添加しないサンプルより明らかに速く放出され、薬物担持架橋ミセルナノ粒子が１０ｍＭのＧＳＨの存在下で効果的に薬物を放出できることが示された。
【００９０】
ＤＯＸ担持のＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋ架橋ナノ粒子は、ＭＴＴ法によりマウスマクロファージＲａｗ２６４．７、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７等に対する毒性を測定し、薬物担持未架橋ミセルナノ粒子及び遊離薬物を対照とした。Ｒａｗ２６４．７細胞を例とすると、Ｒａｗ２６４．７細胞を１×１０４個／ｍＬで９６ウェルプレートに接種し、１ウェルに１００μＬとし、細胞が壁に接着するまでに培養した後、実験組はそれぞれ０．０１、０．１、１、５、１０、５０、１００μｇ／ｍＬのＤＯＸ担持架橋ナノ粒子溶液及び遊離ＤＯＸを含有する新鮮な培養液を加え、培養ボックスで４８時間培養した後、９６ウェルプレートを取り出し、ＭＴＴ（５．０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、引き続いて４時間培養した後、ウェル毎に１５０μＬ  ＤＭＳＯを加え生成した結晶子を溶解し、ウェルリーダーにより４９２ｎｍでその吸光度（Ａ）を測定し、培地空白ウェルによりゼロ調整を行い、細胞生存率を計算した。
【００９１】
図８は上記の薬物担持架橋ミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋのＲａｗ  ２６４．７とＭＣＦ−７細胞に対する毒性であり、図からＤＯＸ担持架橋ミセルナノ粒子のＲａｗ  ２６４．７細胞に対する半数致死濃度が４．８９μｇ／ｍＬであり、ＭＣＦ−７細胞に対する半数致死濃度が２．３１μｇ／ｍＬであることが分かる。よって当該ＤＯＸ担持の架橋ナノ粒子は細胞内で効果的に薬物を放出して腫瘍細胞を殺すことができる。
【実施例１９】
【００９２】
架橋ポリマーベシクルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の形成、生体適合性、薬物担持架橋ベシクルのＭＣＦ−７、Ｕ８７−ＭＧ、Ａ５４９細胞に対する毒性
実施例１６と同様に、ポリマーＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）はナノ粒子を形成でき、ＴＥＭとＣＬＳＭ等の測定により、その構造がポリマーベシクル構造であることが分かった。図９を参照されたい。図９Ａから分かるように、ＤＬＳで測定した結果、形成したナノベシクルは１００ｎｍ程度であり、かつ粒子径分布が非常に狭く、図９Ｂから分かるように、ＴＥＭで測定した結果、ベシクルは中空構造を有する。実施例１７と同様に、得られたベシクルは架橋でき、且つ還元感受性の解架橋性を有し、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞、Ｕ８７ＭＧヒト脳神経膠腫細胞、Ａ５４９肺がん細胞等に対するその毒性試験は実施例１８に従って操作した。ベシクル濃度が０．３ｍｇ／ｍＬから１．５ｍｇ／ｍＬに向上した時に、２４時間培養した後、ＭＣＦ−７、Ｕ８７ＭＧ、Ａ５４９細胞の生存率は依然に８５％〜１１０％であり、当該ナノベシクルが良好な生体適合性を有することを示した。図１０を参照されたい。ｃＲＧＤ標的薬物担持架橋ベシクルのＵ８７ＭＧヒト脳神経膠腫に対する毒性は図１１に示され、図面から分かるように、標的ｃＲＧＤポリマーの重量割合が１０％から３０％に向上した時に、半数致死率は３．５７μｇ／ｍＬから１．３２μｇ／ｍＬに低下し、遊離型薬物に近づき或いはより低くなり、標的のない薬物担持架橋ベシクルより、２．３〜６．４倍と低下した。
【００９３】
ＤＯＸ・ＨＣｌの担持はｐＨ勾配法により行い、ベシクル内外のｐＨ差により親水性ＤＯＸを包む。１０％〜３０％の割合が異なる薬物投入量により薬物担持架橋ベシクルを製造し、透析して包まれていない遊離型薬物を除去し、ＤＬＳで測定した結果、架橋ベシクルの粒子径が１０５〜１２４ｎｍであり、粒子径分布は依然０．１０〜０．１５と非常に狭く、親水性ＤＯＸに対する包み効率が非常に高い（６３％〜７７％）。
【実施例２０】
【００９４】
薬物担持のＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋ架橋ナノ粒子のマウス体内での血行測定
実験において、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６黒マウス（中科院上海生命科学院実験動物センター）を使用し、体重を量った後、均等に組分けをし、薬物担持ナノ粒子と遊離型薬物を尾静脈注射でマウス体内に注射し、ＤＯＸ薬物量は１０ｍｇ／ｋｇであり、０、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４時間に約１０μＬ定点採血し、差量法により血液重量を正確に量り、血液に濃度が１％のトリトン１００μＬとＤＭＦ  ５００μＬを添加して抽出した（２０ｍＭのＤＴＴ、１ＭのＨＣｌを含有する）。遠心分離（２００００回転／分間、２０分間）した後、上澄みを取り、蛍光により各時点でのＤＯＸ量を測定した。
【００９５】
図１２はＤＯＸ担持架橋ナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋのマウス体内での血行図であり、横座標は時間であり、縦座標は血液１ｇにおけるＤＯＸ量のＤＯＸ全注射量に占める割合（ＩＤ％／ｇ）である。図面から分かるように、ＤＯＸの循環時間は非常に短く、２時間で既にＤＯＸを検出しにくくなり、一方、架橋ナノ粒子は２４時間後依然４ＩＤ％／ｇである。マウス体内での排出半減期は４．６７時間と算出されたが、ＤＯＸは僅か０．２１時間であった。従って、薬物担持架橋ナノ粒子はマウス体内で安定しており、より長い循環時間を有する。
【実施例２１】
【００９６】
薬物担持ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫担持マウスへの生物分布
実験において、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６黒マウス（中科院上海生命科学院実験動物センター）を使用し、体重を量った後、均等に組分けをし、１×１０６個Ｂ１６黒色腫細胞を皮下注射し、約二週間後、腫瘍の大きさは１００〜２００ｍｍ３となったときに、薬物担持ナノ粒子とＤＯＸを尾静脈注射でマウス体内に注射し（ＤＯＸ薬物量は１０ｍｇ／ｋｇである）、６、１２、２４時間後マウスを殺し、腫瘍及び心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓組織を取り出し、洗浄して重量を量った後、１％のトリトン５００μＬを加え、ホモジナイザーにより磨砕し、更にＤＭＦ  ９００μＬを加えて抽出した（２０ｍＭのＤＴＴ、１ＭのＨＣｌを含有する）。遠心分離（２００００回転／分間、２０分間）した後、上澄みを取り、蛍光により各時点でのＤＯＸ量を測定した。
【００９７】
図１３は、ＤＯＸ担持架橋ナノ粒子ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋの黒色腫担持マウスへの生物分布結果図であり、横座標は組織器官であり、縦座標は腫瘍又は組織１ｇにおけるＤＯＸ量のＤＯＸ全注射量に占める割合（ＩＤ％／ｇ）である。薬物担持ナノ粒子は６、１２、２４時間での腫瘍蓄積量がそれぞれ３．１２、２．９３、２．５２ＩＤ％／ｇであり、ＤＯＸの１．０５、０．５２、０．２９ＩＤ％／ｇに対して３〜１２倍増加し、薬物担持架橋ナノ粒子がＥＰＲ効果により腫瘍箇所により多く蓄積し、且つ持続可能な時間がより長くなることを示した。
【実施例２２】
【００９８】
薬物担持ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫担持マウスに対する治療実験
実験において、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６黒マウス（中科院上海生命科学院実験動物センター）を使用し、体重を量った後、平均に組分けをし、１×１０６個Ｂ１６黒色腫細胞を皮下注射し、約一週間後、腫瘍の大きさが３０〜５０ｍｍ３となったときに、薬物担持ナノ粒子とＤＯＸを０日、２日、４日、６日、８日に尾静脈注射でマウス体内に注射し、薬物担持ナノ粒子におけるＤＯＸ量は１０、２０、３０ｍｇ／ｋｇであり、ＤＯＸ薬物量は１０ｍｇ／ｋｇであり、０〜１５日間、毎日各組のマウスの体重を量り、ノギスにより腫瘍体積を正確に量り、腫瘍体積の計算方法はＶ＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）／２である（Ｌは腫瘍の長さであり、Ｗは腫瘍の幅であり、Ｈは腫瘍の厚さである）。引き続いて４６日目までマウスの生存を観察した。
【００９９】
図１４はＤＯＸ担持ＰＥＧ５ｋ−ｂ−ＰＣＤＣ２．８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫担持マウスに対する治療結果図であり、図Ａは腫瘍成長の抑制曲線であり、図Ｂはマウスの体重変化曲線であり、図Ｃはマウスの生存曲線である。図１４から分かるように、ＤＯＸ濃度が３０ｍｇ／ｋｇであり、ＤＯＸ担持ナノ粒子治療の１６日後、腫瘍が明らかに抑制され、ところが、ＤＯＸは腫瘍の成長を抑制できるが、マウスに対する毒性副作用がかなり大きい。薬物担持ナノ粒子におけるＤＯＸ濃度が３０ｍｇ／ｋｇであっても、マウスの体重は殆ど変わらないことから、薬物担持ナノ粒子がマウスに対する毒性副作用を有しないことを示し、ところが、ＤＯＸ組のマウスの体重は７日目に２３％低下することから、ＤＯＸのマウスに対する副作用が非常に大きいことを示した。同様に、ＤＯＸ濃度が３０ｍｇ／ｋｇであり、ＤＯＸ担持のナノ粒子治療の４６日後の同組のマウスはいずれも生存しているが、ＤＯＸ治療は１０日目までに全部死亡し、対照とするＰＢＳ組のマウスも３５日目までに全部死亡した。従って、当該薬物担持ナノ粒子は腫瘍の成長を効果的に抑制できて、マウスに対して毒性副作用がなく、腫瘍担持マウスの生存時間を延長できる。
【実施例２３】
【０１００】
薬物担持標的架橋ベシクルｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の血液循環検討
実験は体重が１８〜２０ｇ程度であり、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃヌードマウス（中科院上海生命科学院実験動物センター）を使用し、体重を量った後、平均に組分けをする。ベシクルはｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）とＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）から異なる割合で構成され、細胞実験結果により、ｃＲＧＤ割合が２０％である時に、粒子径は１００ｎｍであり、粒子径分布は０．１０であり、標的効果は最も優れていた。標的薬物担持ベシクルｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ、薬物担持ベシクルＣＬＰｓ、対照とする未架橋標的ベシクルｃＲＧＤ２０／ＰＥＧ−ＰＴＭＣ、ＤＯＸ・ＨＣｌを尾静脈注射でマウス体内に注射し（ＤＯＸ薬物量１０ｍｇ／ｋｇ）、０、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４時間に約１０μＬ定点採血し、差量法により血液重量を正確に計算し、更に濃度１％のトリトン１００μＬとＤＭＦ５００μＬを添加して抽出した（２０ｍＭのＤＴＴ、１ＭのＨＣｌを含有する）。遠心分離（２００００回転／分間、２０分間）した後、上澄みを取り、蛍光により各時点でのＤＯＸ量を測定した。
【０１０１】
図１５はＤＯＸ担持標的架橋ベシクルのマウス体内での血行図であり、横座標は時間であり、縦座標は血液１ｇにおけるＤＯＸのＤＯＸ全注射量に占める割合（ＩＤ％／ｇ）である。図１５から分かるように、ＤＯＸ・ＨＣｌの循環時間はかなり短く、２時間で既にＤＯＸを検出しにくくなり、ところが、架橋ベシクルは２４時間後依然と８ＩＤ％／ｇである。計算により、標的薬物担持架橋ベシクル、薬物担持架橋ベシクル、未架橋の標的ベシクルのマウス体内での排出半減期はそれぞれ４．４９、４．２６、１．４５時間であるが、ＤＯＸ・ＨＣｌは僅か０．２７時間であり、標的薬物担持架橋ベシクルはマウス体内で安定して、より長い循環時間を有することが分かった。
【実施例２４】
【０１０２】
薬物担持標的架橋ベシクルｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のヒト脳悪性神経膠腫担持マウスでの体内生物分布検討
実験において、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＢａｌｂ／ヌードマウス（中科院上海生命科学院実験動物センター）を使用し、体重を量った後、平均に組分けをし、５×１０６個のＵ８７ＭＧヒト脳悪性神経膠腫細胞を皮下注射し、約３〜４週間後、腫瘍の大きさは１００〜２００ｍｍ３となったときに、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ、ＣＬＰｓ、ＤＯＸ・ＨＣｌを尾静脈注射でマウス体内に注射し（ＤＯＸ薬物量は１０ｍｇ／ｋｇ）、４時間後マウスを殺し、腫瘍及び心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓組織を取り出し、洗浄して重量を量った後、１％のトリトン５００μＬを加え、ホモジナイザーにより磨砕し、更にＤＭＦ９００μＬを加えて抽出した（２０ｍＭのＤＴＴ、１ＭのＨＣｌを含有する）。遠心分離（２００００回転／分間、２０分間）した後、上澄みを取り、蛍光により各時点のＤＯＸ量を測定した。
【０１０３】
図１６は、ＤＯＸ担持標的架橋ベシクルのヒト脳悪性神経膠腫担持マウス体内の生物分布図であり、横座標は組織器官であり、縦座標は腫瘍又は組織１ｇにおけるＤＯＸのＤＯＸ全注射量に占める割合（ＩＤ％／ｇ）である。図面から分かるように、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ、ＣＬＰｓ、ＤＯＸ・ＨＣｌを注射してから４時間後、腫瘍に蓄積したＤＯＸ量はそれぞれ６．７８、２．１５、０．８２ＩＤ％／ｇであり、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓはＣＬＰｓとＤＯＸ・ＨＣｌの３倍、９倍であり、薬物担持標的架橋ベシクルが能動的標的化により腫瘍部位に多く蓄積することを示した。
【実施例２５】
【０１０４】
薬物担持標的架橋ベシクルｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のヒト脳悪性神経膠腫担持マウスの治療への応用
実験において、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃヌードマウス（中科院上海生命科学院実験動物センター）を使用し、体重を量った後、平均に組分けをし、５×１０６個のＵ８７ＭＧヒト脳悪性神経膠腫を皮下注射し、約二週間後、腫瘍大きさは３０〜５０ｍｍ３となったときに、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ、ＣＬＰｓ、未架橋の標的ナノベシクル（ｃＲＧＤ２０／ＰＥＧ−ＰＴＭＣ）、ＤＯＸ・ＨＣｌ及びＰＢＳをそれぞれ０、４、８、１２日に尾静脈注射でマウス体内に注射した（ＤＯＸ薬物量は１０ｍｇ／ｋｇ）。０日から１８日目まで、二日毎にマウスの体重を量り、ノギスにより腫瘍体積を正確に測定し、腫瘍体積計算方法はＶ＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）／２である（Ｌは腫瘍の長さであり、Ｗは腫瘍の幅であり、Ｈは腫瘍の厚みである）。引き続いて４５日目までマウスの生存を観察した。
【０１０５】
図１７はＤＯＸ担持標的架橋ベシクルｃＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．６ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１８．６ｋ）／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）のヒト脳悪性神経膠腫担持マウスに対する治療効果であり、図Ａは腫瘍成長を抑制する曲線であり、図Ｂはマウス体重の変化曲線であり、図Ｃはマウスの生存曲線である。図１７により、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ治療組では１８日目に腫瘍が明らかに抑制されたが、ＣＬＰｓ或いはｃＲＧＤ２０／ＰＥＧ−ｂ−ＰＴＭＣで治療した腫瘍はいずれもある程度成長したことが分かる。ＤＯＸ・ＨＣｌも腫瘍の成長を抑制できるが、ＤＯＸ・ＨＣｌ組のマウス体重は１２日の時点で２１％低下し、これはマウスに対する毒性副作用が大きいことを示す。それに対して、ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ、ＣＬＰｓ或いはｃＲＧＤ２０／ＰＥＧ−ｂ−ＰＴＭＣ組のマウスは殆ど体重に変化がなく、これは薬物担持ナノ粒子がマウスに対して毒性副作用がないことを示す。ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ治療組では４５日後全部生存しているが、ＤＯＸ・ＨＣｌ組のマウスは１３日の時点で既に全部死亡し、生理食塩水組のマウスも２８日の時点で全部死亡した。従って、薬物担持標的架橋ベシクルは腫瘍の成長を効果的に抑制でき、また、マウスに対する毒性副作用がなく、腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができる。
【実施例２６】
【０１０６】
薬物担持標的架橋ベシクルｉＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の黒色腫担持マウスに対する治療実験
ベシクルはｉＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）とＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の異なる割合により混合してなる。ｉＲＧＤ（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ＲＧＤ）ポリマーの含有量が０、２５％、５０％、１００％である時に得られたベシクルの粒子径はそれぞれ１１０ｎｍ程度であり、粒子径分布は０．１２であった。ｉＲＧＤ分子は腫瘍細胞を標的とする作用を有するだけではく、また、腫瘍細胞及び組織を透過するよう介導する作用を有し、一定量の遊離ｉＲＧＤ分子を添加すると、腫瘍組織を透過するナノ粒子を増やすことができる。ＤＯＸ・ＨＣｌはｐＨ勾配法により担持され、一般的な効率は６０〜８０％である。
【０１０７】
実験において、体重が１８〜２０ｇ程度、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６黒マウス（中科院上海生命科学院実験動物センター）を使用し、体重を量った後、平均に組分けをし、１×１０６個の黒色腫細胞を皮下注射し、約一週間後、腫瘍の大きさは３０〜５０ｍｍ３となったときに、含有率が０、２５％、５０％、１００％であるｉＲＧＤポリマー担持架橋ベシクル、ＤＯＸ・ＨＣｌ及びＰＢＳを０、３、６、９、１２日目に尾静脈注射で黒色腫担持マウス体内に注射した（ＤＯＸ・ＨＣｌ薬物量：１０ｍｇ／ｋｇ）。０から２０日目まで、毎日マウスの体重を量り、ノギスにより腫瘍体積を正確に測定し、腫瘍体積計算方法はＶ＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）／２である（Ｌは腫瘍の長さであり、Ｗは腫瘍の幅であり、Ｈは腫瘍の厚みである）。引き続いて４６日目までマウスの生存を観察した。
【０１０８】
図１８はＤＯＸ担持標的ベシクルｉＲＧＤ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の黒色腫担持マウスに対する治療実験であり、図Ａは腫瘍成長の抑制曲線であり、図Ｂはマウスの体重変化曲線であり、図Ｃはマウスの生存曲線である。図１８から分かるように、ｉＲＧＤ割合が５０％である時に、ｉＲＧＤ５０／ＣＬＰｓ治療組では、２０日間の治療後、腫瘍の成長が明らかに抑制されたが、ｉＲＧＤ割合が高すぎても低すぎてもナノパーティクルの腫瘍組織への取り込みに影響を与える。同様に、ＤＯＸ・ＨＣｌも腫瘍の成長を抑制できるが、マウスに対する毒性副作用が大きく、マウスの体重は８日の時点で２０％低下した。全ての割合のｉＲＧＤ薬物担持架橋ベシクルの各組において、マウスの体重に殆ど変化がなく、これはマウスに対して毒性副作用がないことを示す。ｉＲＧＤ５０／ＣＬＰｓ組は治療４３日後、マウスはまだ全部生存しているが、ＤＯＸ・ＨＣｌ組では毒性が大きいので、１０日の時点で全部死亡し、また、ＰＢＳ組でも、マウスは２９日の時点で全部死亡した。従って、標的薬物担持架橋ベシクルは腫瘍の成長を効果的に抑制できて、マウスに対して毒性副作用がなく、腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができる。
【実施例２７】
【０１０９】
薬物担持標的架橋ベシクルｃＮＧＱ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の体内血行、肺がん担持マウスでの生物分布及び腫瘍抑制実験
ポリマーｃＮＧＱ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）の合成は実施例１３と類似しており、即ち、まずＮＨＳ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）を合成した後、標的分子ｃＮＧＱアミド化反応によりポリマーＰＥＧ末端に結合させ、ＢＣＡキットにより検出したところ、ｃＮＧＱのグラフト率が８７％であった。ベシクルはｃＮＧＱ−ＰＥＧ６ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．８ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９．２ｋ）／ＰＥＧ５ｋ−Ｐ（ＣＤＣ４．９ｋ−ｃｏ−ＴＭＣ１９ｋ）の異なる割合により混合してなる。ＤＯＸ・ＨＣｌはｐＨ勾配法により担持され、一般的な効率は６０〜８０％である。体外細胞実験の結果から分かるように、ｃＮＧＱの割合は２０％である時に、標的効果は最も優れ、得られた薬物担持標的架橋ベシクル（ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ）はヌードマウス体内で血液循環半減期が４．７８時間であった。実施例２４と同様に、ヌードマウスの皮下に肺がんＡ５４９腫瘍モデルを築き、尾静脈注射で近赤外分子修飾ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓを注射し、小動物のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験により、ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓは腫瘍部位に速やかに蓄積し、かつ、４８時間後、腫瘍部位の蛍光はまだ強いことが分かった。生物分布結果から分かるように、ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓは８時間後に腫瘍部位での蓄積は９ＩＤ％／ｇに達し、対照となる血管標的架橋ナノ粒子（ｃＲＧＤ２０／ＣＬＰｓ）、未標的架橋ナノ粒子（ＣＬＰｓ）、ＤＯＸ・ＨＣｌより高く、かつ他の臓器より高かった。図１９のＤＯＸ担持標的架橋ベシクルの肺がん担持マウス体内での生物分布図を参照されたい。
【０１１０】
実施例２５と類似する方法により皮下注射してＡ５４９肺がん腫瘍モデルと、生物発光付きＡ５４９肺がん同所性腫瘍モデルを構築した。後者はｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装置により生物発光をモニタリングし、更に腫瘍成長状況を監視することができる。０、４、８、１２日目に尾静脈注射して投与することで、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装置により監視した生物発光において、ｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓ治療組のマウス肺部の蛍光が顕著に減少することが示され、これはｃＮＧＱ２０／ＣＬＰｓが肺がんによくターゲティングできて、腫瘍の成長を効果的に抑制できることを示す。
【実施例２８】
【０１１１】
ＤＯＸ担持ＰＥＧ５ｋ−ＰＬＧＡ７．８ｋ−ＰＣＤＣ１．７ｋ表面修飾金ナノロッド及びＮＩＲ誘発による薬物放出
トリブロックポリマーＰＥＧ５ｋ−ＰＬＧＡ７．８ｋ−ＰＣＤＣ１．７ｋナノ粒子修飾の金ナノロッドの製造：激しく攪拌しながら、ＤＭＳＯに溶解したポリマー溶液（２ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）を金ナノロッドの分散液（５ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ）に滴下し、４時間攪拌し、遠心分離を二回行って結合しなかったポリマーを除去し、再びリン酸緩衝液に分散し、ＴＧＡにより金ロッドに修飾しているポリマーの収率を測定し、単独のポリマーと比べると、ポリマー修飾金ロッドの収率は８０％であった（理論的には、１００％投入する）。
【０１１２】
ポリマー修飾金ナノロッドの薬物担持においては、上記で得られたポリマー修飾金ナノロッド溶液に、１０％、２０％、３０％でＤＭＳＯに溶解したＤＯＸを一滴ずつ滴下し、３０分間攪拌した後、室温で１２時間培養し、また、１２時間透析して遊離している小分子薬物を除去し、透析媒体はｐＨ７．４のリン酸緩衝液であり、その後、蛍光測定によりＤＯＸに対する封入効率は７０〜９０％であった。これからポリマー修飾金ナノロッドは小分子疎水性薬物を高効率に封入できることが分かった。図２０はＰＥＧ５ｋ−ＰＬＧＡ７．８ｋ−ＰＣＤＣ１．７ｋで表面修飾した金ナノロッドのＴＥＭ図であり、ＴＥＭ測定による金ロッドの長さは約６０ｎｍであり、分布が均一であることが分かった。
【０１１３】
ＮＩＲ誘発によるポリマー修飾金ナノロッドのＤＯＸ放出：ポリマー修飾金ナノロッドを分散した１０ｍＬリン酸緩衝液に、１時間おきに強度０．２Ｗ／ｃｍ２、波長８０８ｎｍの赤外線で５分間照射し、特定の時間間隔で５００μＬ溶液を取って、遠心分離し、上澄みの蛍光を測定することにより、放出したＤＯＸの含有量を分析した。蛍光検出により、光照射したポリマー修飾金ナノロッドの薬物放出率は９２％であり、光照射していない対照組（放出率が僅か１８％である）より遥かに速いことから、このようなポリマー修飾金ナノロッド材料は近赤外誘発による薬物放出に応用できることが分かった。
【実施例２９】
【０１１４】
ポリマーＰＥＧ１．９ｋ−ＰＣＤＣ０．８ｋのプラズモン共鳴装置（ＳＰＲ）のセンサー表面への修飾
事前に王水でＳＰＲセンサーの金表面を処理した後、エタノールで洗浄して乾燥した直後、トリブロックポリマーＰＥＧ１．９ｋ−ＰＣＤＣ０．８ｋ（１ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ）を溶解したＴＨＦに添加した。緩やかに振動しながら２４時間反応した後、センサーシートを取り出し、三回洗浄し、ＸＰＳ、楕円偏光計、ＳＰＲでセンサーの金シートに修飾しているＰＥＧ１．９ｋの表面密度を測定したところ、２０ｎｍｏｌ／ｃｍ２であった。ポリマーにより修飾されたセンサーチップを従来のチップと比べると、非特異的吸着を減少でき、測定安定性を向上できる等の利点があり、生物医薬品等の分野において幅広く応用できる。
【実施例３０】
【０１１５】
ポリマーＰ（ＣＤＣ０．８ｋ−ｃｏ−ＣＬ９２ｋ）が架橋した後、生分解性足場材料として用いられる
ポリマーＰ（ＣＤＣ０．８ｋ−ｃｏ−ＣＬ９２ｋ）をクロロホルム（４０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、１×１ｃｍ２のガラスシートに成膜し（スキャッフォルド材料）、真空乾燥装置で４８時間乾燥して溶媒を完全に除去し、熱風銃により４０℃で１０分間加熱してＳ−Ｓ五員環を加熱して架橋させた後、生理食塩水に二週間浸漬した。ガラスシートには依然として損傷がないが、対照組とするＰＣＬフィルムシートは既に剥離していることがわかった。図２１を参照されたい。ポリマーＰＣＬとＰ（ＣＤＣ０．８ｋ−ｃｏ−ＣＬ９２ｋ）が成膜後に生理食塩水に二週間浸漬した後の写真図である。図から分かるように、側鎖にチオ五員環官能基を有するポリマーはその足場材料の安定性を増強できて、生物足場材料として応用できる。
【図１】
2017517622.tif 000033
【図２】
2017517622.tif 000034
【図３】
2017517622.tif 000035
【図４】
2017517622.tif 000036
【図５】
2017517622.tif 000037
【図６】
2017517622.tif 000038
【図７】
2017517622.tif 000039
【図８】
2017517622.tif 000040
【図９】
2017517622.tif 000041
【図１０】
2017517622.tif 000042
【図１１】
2017517622.tif 000043
【図１２】
2017517622.tif 000044
【図１３】
2017517622.tif 000045
【図１４】
2017517622.tif 000046
【図１５】
2017517622.tif 000047
【図１６】
2017517622.tif 000048
【図１７】
2017517622.tif 000049
【図１８】
2017517622.tif 000050
【図１９】
2017517622.tif 000051
【図２０】
2017517622.tif 000052
【図２１】
2017517622.tif 000053
【国際調査報告】
2017517622.tif 000054
2017517622.tif 000055
2017517622.tif 000056
2017517622.tif 000057