(57)【要約】  本発明は、T細胞エピトープのT細胞認識を試験するための改善されたスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
T細胞がT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する方法であって、
-  少なくとも1つのB細胞において、Bcl-6及び/又はSTAT5の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
-  前記少なくとも1つのB細胞において、抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
-  前記少なくとも1つのB細胞の、B細胞培養物への増殖を可能にする工程、
-  前記B細胞培養物のB細胞を、少なくとも1つの化合物と共にインキュベートする工程、
-  得られたB細胞を、T細胞と共にインキュベートする工程、及び
-  少なくとも1つのT細胞が、前記少なくとも1つの化合物の少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記B細胞を、少なくとも1つのペプチドと共にインキュベートする工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも1つのペプチドが、5から40の間のアミノ酸、好ましくは8から35の間のアミノ酸又は9から31の間のアミノ酸の長さを有する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記B細胞が、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも5つ、好ましくは少なくとも10の異なるペプチドと共にインキュベートされる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記T細胞が、CD8+細胞障害性T細胞及び/又はCD4+ヘルパーT細胞を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも1つのB細胞及び前記T細胞が、同じヒト個体由来である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記T細胞エピトープが、修飾自己抗原由来、又は非自己抗原由来、又は自己抗原由来である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記T細胞エピトープが、腫瘍特異的T細胞エピトープである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍が、黒色腫又は上皮がんである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記T細胞エピトープが、病原体由来である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記病原体が、ウイルス、細菌又は寄生虫である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記T細胞エピトープが、自己抗原由来である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも1つのT細胞が前記T細胞エピトープの少なくとも1つを認識したかどうかが、前記少なくとも1つのT細胞が活性化されるかどうかを決定することにより決定される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記T細胞活性化が、サイトカイン放出を測定することにより決定される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物の少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するT細胞を含む医薬を調製する工程を更に含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
T細胞により認識される少なくとも1つのT細胞エピトープを同定する工程を更に含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも1つのT細胞エピトープを含む、免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンを調製する工程を更に含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
表面上に前記少なくとも1つのT細胞エピトープを表示する抗原提示細胞、好ましくはB細胞を含む、免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンを調製する工程を更に含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記B細胞が、障害に罹患しているか又は罹患していた個体由来のT細胞と共にインキュベートされる、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体が、がん、好ましくは黒色腫又は上皮がんに罹患しているか又は罹患していた、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記個体が、病原体、好ましくはウイルス、細菌又は寄生虫に罹患しているか又は罹患していた、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
前記個体が、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症、糖尿病又はセリアック病に罹患しているか又は罹患していた、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
前記T細胞が、前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、24%よりも低く、より好ましくは23%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、より好ましくは5%よりも低いことを特徴とする、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記T細胞が、前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低いことを特徴とする、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記T細胞が、前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低いことを特徴とする、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、24%よりも低く、より好ましくは23%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、より好ましくは5%よりも低い、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低い、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低い、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患又は前記障害が、がん、好ましくは黒色腫又は上皮がん、感染性疾患、好ましくはウイルス感染、細菌感染又は寄生虫感染、及び自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症、糖尿病又はセリアック病からなる群から選択される、請求項23から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗アポトーシス核酸が、好ましくはBCL2ファミリーの抗アポトーシス分子、好ましくは、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10、又はそれらの機能性部分若しくはホモログ、最も好ましくはBcl-xL又はMcl 1をコードする遺伝子を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項1から30のいずれか一項に記載の方法を用いて得られる場合の、障害関連T細胞エピトープ、好ましくは腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体由来のT細胞エピトープ又は自己抗原由来のT細胞エピトープを認識するT細胞を含む医薬。
【請求項３２】
請求項1から30のいずれか一項に記載の方法を用いて得られる場合の、障害関連T細胞エピトープ、好ましくは腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体由来のT細胞エピトープ又は自己抗原由来のT細胞エピトープを含む、免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチン。
【請求項３３】
目的のエピトープを提示するためのB細胞の使用であって、前記B細胞のin vitroでの複製寿命が、前記B細胞において、Bcl-6及び/又はSTAT5の発現を誘導、増強及び/又は維持することにより、並びに前記B細胞において、抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持することにより延長されることを特徴とする使用。
【請求項３４】
前記エピトープが、T細胞エピトープである、請求項33に記載の使用。
【請求項３５】
前記T細胞が、CD4+T細胞又はCD8+T細胞である、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学及び医薬品の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
T細胞応答は、哺乳動物免疫系において重要な役割を果たす。例えば、CD8+細胞障害性T細胞(CTL)は、病原体に感染した細胞及び腫瘍細胞に対抗するのに重要な役割を果たす。免疫応答はまた、CTLを活性化して、抗体産生B細胞の成熟を誘導する、例えばインターフェロンガンマ(通常、IFN-γ又はIFNgと略記)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)及びインターロイキン2(IL-2)等の多重エフェクターサイトカインの産生を介して、CD4+ヘルパーT細胞により誘発される。腫瘍治療に関してますます検討されている養子細胞療法は、in vivoで起きるT細胞応答を利用している。この療法中、腫瘍特異的T細胞を患者から単離して、ex vivoで培養する。続いて、腫瘍特異的T細胞を、好ましくは免疫調節性細胞を排除するために化学療法誘導性リンパ球枯渇(lymphodepletion)後に患者へ再導入させて、抗腫瘍応答の増加をもたらす。例えば、Rosenberg等、2011は、IL-2を併用した自己CD8+CTL含有腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子移入による転移性黒色腫患者の治療について記載する。高い応答率が観察され、この研究では、黒色腫患者の22%が、完全な腫瘍退縮を達成した。Tran等、2014は、上皮がんの免疫療法について記載する。CD4+T細胞を患者から入手して、腫瘍特異的突然変異を有するペプチドを提示する自己樹状細胞(DC)と共にインキュベートした。1つの腫瘍特異的突然変異に特異的なT細胞クローンが見出されており、患者へのこれらのT細胞の注入は、腫瘍退縮及び疾患の安定化の延長をもたらした。
【０００３】
樹状細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)であり、それらは、主要組織適合複合体I又はII(MHC-I又はMHC-II)の状況で抗原を提示するのに特に適している。したがって、DCは、T細胞エピトープを提示して、所望の特異性を有するT細胞を同定するための第1の選択肢の細胞である。しかしながら、成熟DCは、長期培養で増殖させることができないため、単球は、個体の大量の血液又は骨髄から新たに入手しなくてはならず、短命なDC培養物は、所与のT細胞選択手順が実施可能になる前に、毎回調製されなくてはならない。これは、時間がかかり、高価であり、個体に著しい不快感を与える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO 2007/067046
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Christopherson, K.S.等  PNAS 89、6314〜8頁(1992)
【非特許文献２】Guzman, L.M.等  Bacteriol 177、4121〜4130頁(1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、T細胞がT細胞エピトープを認識するかどうかを決定するための最適化された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明の一態様は、T細胞がT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する方法であって、
-  少なくとも1つのB細胞において、BCL6の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
-  前記少なくとも1つのB細胞において、抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
-  前記少なくとも1つのB細胞の、B細胞培養物への増殖を可能にする工程、
-  前記B細胞培養物のB細胞を、少なくとも1つの化合物と共にインキュベートする工程、
-  得られたB細胞を、T細胞と共にインキュベートする工程、及び
-  少なくとも1つのT細胞が、前記少なくとも1つの化合物の少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する工程
を含む方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明による方法の興味深い用途の1つは、T細胞エピトープに関するスクリーニングアッセイである。この実施形態では、まず、in vitroでのB細胞培養物を得る。次に、この培養物由来のB細胞を、潜在的なT細胞エピトープであるか、又は潜在的なT細胞エピトープをコードする試験化合物と共にそれらをインキュベートすることにより、抗原提示細胞として使用し、その結果、潜在的なT細胞エピトープが、MHCの状況でB細胞表面に表示される。続いて、T細胞が潜在的なT細胞エピトープのいずれかを認識するかどうかを試験するために、負荷されたB細胞をT細胞と共にインキュベートする。これは、例えば、T細胞が試験エピトープのいずれかに結合されるかどうかを決定することにより試験される。好ましくは、T細胞活性化が測定される。例えば、T細胞がサイトカインを産生するかどうかを試験すること、又はT細胞が増殖するかどうかを試験すること等のT細胞活性化を決定する各種方法が、当該技術分野で公知である。腫瘍特異的T細胞が探索される場合、多くの腫瘍特異的T細胞が、IFNgを産生するため、インターフェロンガンマ放出が測定されることが好ましい。試験エピトープがT細胞により認識される場合、それは通常、更なる研究のために、例えば、免疫原性組成物若しくはワクチンの開発のために、及び/又は当該エピトープの存在に関連付けられる疾患に対してT細胞応答を誘発若しくはブーストするために選択される。一実施形態では、このようなT細胞応答は、例えばがん又は病原性感染等の前記エピトープの存在に関連付けられる疾患に罹患しているか又は罹患する危険性のある個体へのエピトープの投与により、in vivoで誘発又はブーストされる。或いは、本発明による方法を用いて同定されたT細胞エピトープに対するT細胞応答は、好ましくは、前記エピトープの存在に関連付けられる疾患に罹患しているか又は罹患する危険性のある個体由来のT細胞を使用して、in vitroで誘発され、その後、T細胞は培養されて、続いて、前記疾患に対する医薬又は予防剤として個体へ投与される。
【０００９】
本発明による方法の別の用途は、公知のT細胞エピトープに対するT細胞の存在に関するスクリーニングアッセイである。この実施形態では、上述のB細胞培養物由来のB細胞を、1つ又は複数の公知のT細胞エピトープと共にインキュベートする。同様に、T細胞エピトープが、MHCの状況でB細胞表面に表示される。次に、エピトープで負荷されたB細胞を試料由来のT細胞と共にインキュベートして、その試料がT細胞エピトープの1つ又は複数を認識するT細胞を含有するかどうかを試験する。それに該当するようであれば、例えば、試料を得た個体(の少なくとも1人)が、試験したT細胞エピトープの少なくとも1つに対して、in vivoでT細胞応答を示すと結論付けることができる。これは、例えば、ある特定の治療又はワクチン接種手順が成功したことを意味し得る。
【００１０】
本明細書で使用する場合、T細胞エピトープは、MHC分子により結合され、且つT細胞により、例えばCD8+CTL又はCD4+ヘルパーT細胞等により認識される能力を有するアミノ酸配列を意味する。
【００１１】
本発明で使用される場合の化合物は通常、アミノ酸残基又はアミノ酸残基をコードする核酸配列を含む。前記化合物は、好ましくはタンパク質若しくは(ポリ)ペプチド、又はタンパク質若しくは(ポリ)ペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子である。化合物は通常、1つ又は複数の公知のT細胞エピトープを含むか、或いはそれは、1つ又は複数のT細胞エピトープの存在に関して試験される。好ましくは、前記化合物は、タンパク質又は(ポリ)ペプチドである。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸並びに非天然又は人工アミノ酸を包含する。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「核酸分子」及び「核酸配列」という用語は、ヌクレオチド鎖、好ましくはDNA又はRNAを指す。他の実施形態では、核酸分子は、例えば、DNA/RNAヘリックス、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)及び/又はリボザイム等の他の種類の核酸構造を含む。
【００１４】
本明細書で使用する場合、T細胞は、それがMHCの状況でエピトープに特異的に結合する場合に、T細胞エピトープを「認識する」。これは、前記T細胞が他の抗原よりも前記エピトープを優先的に結合することを意味する。T細胞は通常、そのT細胞受容体(TCR)を介してT細胞エピトープを結合する。T細胞の、ある特定の化合物への非特異的な結合又は固着は、「認識している」という用語に包含されない。
【００１５】
B細胞を、化合物と共に、又はT細胞と共に「インキュベートすること」という用語は、B細胞と化合物又はT細胞との間で相互作用が可能になるような十分長い時間、B細胞を化合物又はT細胞に曝露することを意味する。通常、前記化合物がペプチドである場合、インキュベーション時間は、タンパク質に関するインキュベーション時間よりも大幅に短くてよい。タンパク質はまず、タンパク質由来のペプチドがB細胞の表面に表示される前に、B細胞によりプロセシングされなくてならないのに対して、ペプチドは通常、内在化(internalization)及びプロセシングの必要性なく、B細胞のMHC分子を直接的に結合することができる。一実施形態では、B細胞をペプチドと共に、約15〜25時間、好ましくは約18〜24時間インキュベートする。次に、ペプチドを負荷したB細胞を好ましくは、T細胞と共に、約5〜50時間、好ましくは約6〜48時間インキュベートする。前記化合物が、タンパク質又は(ポリ)ペプチドをコードする核酸分子である場合、B細胞は、前記核酸分子で形質導入又はトランスフェクトされて、前記核酸分子の翻訳及び前記コードタンパク質又は(ポリ)ペプチドの細胞内産生をもたらす。核酸分子によるB細胞の形質導入又はトランスフェクションは、当該技術分野で一般的に公知の方法を用いて達成することができる。このような方法として、ウイルスベクター粒子媒介性形質導入、マイクロインジェクション、並びにリン酸カルシウム沈殿、リポソーム、ポリカチオン、マグネトフェクション及びエレクトロポレーションに基づく方法等の標準的な核酸トランスフェクション方法が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１６】
本発明による方法の重要な利点は、数週、数か月又は更には数年を含む長期間維持することができるin vitroでのB細胞培養物を使用するという事実である。APCが必要とされる毎に、スクリーニングアッセイのために、B細胞をこのようなB細胞培養物から採取することができる。したがって、B細胞のみを一度個体から収集する必要があり、その後、それらは培養状態のまま維持され、続くアッセイに利用可能な状態に維持される。これは、樹状細胞の使用を上回る重要な利点である。
【００１７】
更に、本発明者等は、驚くべきことに、本発明の方法を用いると、試験エピトープ以外のエピトープに対するT細胞活性化(バックグラウンドシグナル又はバックグラウンドノイズ)が特に低いことを発見したので、本発明による方法は、高い感度でT細胞エピトープ認識の検出を可能にする。これは、例えば、エプスタインバーウイルス(EBV)不死化B細胞を抗原提示細胞として使用する場合の結果と対比する。例えば、図4では、高レベルのバックグラウンドシグナルに起因して、ドット(APCとしてEBV不死化B細胞を使用したT細胞活性化)のどれが関連するかどうかを確立することは非常に困難である。他方で、本発明による方法を用いて得られるT細胞活性化シグナル(三角)は、低い(又は更には存在しない)バックグラウンドノイズの結果としてはっきりと検出可能である。したがって、バックグラウンドシグナル伝達が非常に低いため、関連するT細胞エピトープが即座に明らかとなるため、シグナルが弱い場合でさえ、本発明による方法は、T細胞エピトープに関する遥かにより正確で、且つ感度の高いスクリーニング方法を提供する。このような弱いシグナルは、例えば、比較的低い程度のT細胞活性化により引き起こされ得るか、又は少数のエピトープを認識するT細胞が、アッセイ中に存在し得る。EBV不死化B細胞が使用される従来技術の既存の方法では、多くの関連するシグナルは、それらが大きなバックグラウンドノイズと区別することができないために見逃されているのに対して、本発明による方法では、関連するT細胞エピトープは、より良好に検出される。
【００１８】
長期間にわたりin vitroで培養されるB細胞が使用されるため、本発明による方法を用いて得られる特に良好な結果及び低いバックグラウンドノイズは驚くべきことである。これらのB細胞は、「形質芽細胞様状態」で残存し、in vitroでのB細胞が、複製すること及び抗体産生の両方が可能であることを意味する。自然の状況では、形質芽細胞は、in vivoではほんの短命である。抗体は通常、それらの増殖する能力を失っている形質細胞へ分化されたB細胞により産生される。したがって、本発明で使用する長期間の「形質芽細胞様培養物」は、実際には存在しない特有の細胞である。これらの細胞は、非天然特性を有する。例えば、それらのサイズは、天然のin vivoでの形質芽細胞と比較した場合により大きく、それらは、CD40、CD80、CD86、ICOSLのような共刺激分子を高度に発現する。したがって、このような非天然B細胞をT細胞と共にインキュベートする場合、バックグラウンドノイズが予想された。しかしながら、驚くべきことに、本発明による方法は、このような低いバックグラウンドノイズを含むため、非常に感度の高いアッセイが可能となった。
【００１９】
したがって、非天然環境中に存在し、且つB細胞の特徴に影響を及ぼす非天然処理を受けたin vitroでの培養B細胞が使用されるため、非常に低いレベルのバックグラウンドノイズは驚くべきことである。更に、好ましい実施形態では、B細胞は、多くの場合、例えば、緑色蛍光タンパク質等の非天然検出可能標識を含有する1つ又は複数の外因性核酸分子を含有する。したがって、in vitroでの得られたB細胞は、それらの天然の対応物とは異なり、試験アッセイの投与エピトープとは独立してT細胞を活性化すると予想された。けれども、本発明による方法を用いると、バックグラウンドノイズは、驚くべきことに、非常に感度の高い試験アッセイが利用可能となっているような程度に回避される。したがって、本発明による方法は、長寿命であり、個体から一度入手されれば十分であるB細胞を使用して、T細胞エピトープのT細胞認識に関する非常に感度の高く、正確で単純なスクリーニングアッセイを可能にするため、既存の従来技術の方法よりも好ましい。単球の収集の繰り返し、及びDCへのこれらの細胞の分化はもはや必要ではなく、それにより、処理時間、費用及び個体の不快感の程度が低減される。
【００２０】
本発明による方法の更なる利点は、アッセイで使用される長期間の「形質芽細胞様」B細胞が、in vivoにおけるそれらの天然の対応物よりも大きいことである。これは、より多くのMHCがB細胞の表面に存在し、その結果、より多数のエピトープが表示され得ることを意味する。これはまた、本発明のアッセイの感度を増加させる。
【００２１】
B細胞は、以前は抗原提示細胞として使用されてきた。例えば、Schultze等は、黒色腫特異的T細胞を生成するために、CD40活性化B細胞が、健常な個体由来のT細胞へ、黒色腫由来のペプチドを提示するためにAPCとして使用される方法を記載している。しかしながら、健常な個体由来のT細胞をT細胞エピトープと共にインキュベートすることによる抗原特異的T細胞の生成は、上述の感度の懸念を包含しない。目的のT細胞の低濃度の検出が問題である場合、本発明によるスクリーニング方法は、特に有利である。
【００２２】
各種の化合物が、本発明によるスクリーニング方法における使用に適している。例えば、B細胞により内在化されて、プロセシングされたタンパク質を使用してもよく、次に、ペプチド断片が、それらの表面で表示される。T細胞がこのようなペプチドを結合して、活性化されるようになる場合、前記タンパク質は、T細胞により認識されるT細胞エピトープを含むと結論付けられる。
【００２３】
好ましい実施形態では、B細胞をペプチドと共にインキュベートする。これは、ペプチドの少なくとも幾つかが、B細胞の表面MHCに直接結合されて、その結果、B細胞による内部プロセシングがこれらのペプチドに必要ではないという利点を提供する。これは、より速いエピトープ提示、したがってより短いアッセイ時間を可能にする。本発明の培養B細胞は通常、MHCと複合して、それらの表面ですでにペプチドを表示するが、これらのMHC結合性ペプチドの多くは、投与エピトープにより容易に置き換えられ、T細胞活性化に関して続いて試験されるMHC-試験ペプチド複合体をもたらす。
【００２４】
効率的なT細胞認識を可能にするために、前記ペプチドは好ましくは、5から40の間のアミノ酸、好ましくは5から35の間のアミノ酸、より好ましくは8から35の間のアミノ酸又は9から31の間のアミノ酸又は10から31の間のアミノ酸又は11から31の間のアミノ酸又は8から20の間のアミノ酸又は9から20の間のアミノ酸又は10から20の間のアミノ酸又は11から20の間のアミノ酸又は8から15の間のアミノ酸又は8から12の間のアミノ酸又は8から11の間のアミノ酸の長さを有し、効率的なMHC結合及び表面提示を可能にする。当業者により周知であるように、MHCクラスIにより提示されるT細胞エピトープは通常、8から11の間のアミノ酸の長さを有するのに対して、MHCクラスIIにより提示されるT細胞エピトープは通常、11から20の間のアミノ酸の長さを有する。したがって、類似の長さを有する試験ペプチドは、これがMHC結合を促進するため有利である。しかしながら、実施例で示されるように、より長いペプチドはまた、潜在的なT細胞エピトープを試験するのに適している。このようなより長いペプチドは、内在化されて、且つB細胞によりプロセシングされるか、又はMHCに直接結合される。MHC-IIは、より大きなペプチドと結合しそれを提示させることが特によくできる。したがって、より長いペプチドは、CD4+T細胞エピトープ認識を試験するのに特に適している。
【００２５】
本明細書で使用する場合、数的範囲は、当該範囲の上限値及び下限値を含む。したがって、「xからyの間のアミノ酸の長さを有するペプチド」という用語は、x個のアミノ酸の長さを有するペプチド、及びy個のアミノ酸の長さを有するペプチド、並びにこれらの値の間の長さを有するペプチドを包含する。
【００２６】
或いは、タンパク質又は(ポリ)ペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を使用することができる。その場合、B細胞を前記核酸分子で形質導入又はトランスフェクトして、前記核酸配列の翻訳及び前記コードタンパク質又はポリ(ペプチド)の細胞内産生をもたらす。このようなタンパク質及びこのようなペプチドの断片は、任意にB細胞によりプロセシングされた後に、B細胞表面で表示される。
【００２７】
種々の試験エピトープのT細胞認識を試験することが可能であるために、前記B細胞を、好ましくは種々の種類のペプチドと共に、又は種々の種類のペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子と共に、好ましくは少なくとも2個、少なくとも3個又は少なくとも4個の異なるペプチド若しくはコード核酸配列、好ましくはペプチドと共にインキュベートすることが好ましい。更なる実施形態では、前記細胞を、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個又は少なくとも10個の異なるペプチド又はコード核酸配列、好ましくはペプチドと共にインキュベートする。種々のエピトープ間を区別することが可能であるために、B細胞は好ましくは、空間的にアドレス可能な位置に存在する。各位置で、1つ又は複数の化合物がB細胞へ投与される。T細胞認識が、ある特定の位置で存在するようである場合、どのエピトープが認識されるかどうかを決定することができる。一実施形態では、幾つかのタンパク質又はペプチド混合物が使用される。例えば、B細胞は、種々のウェル中に存在し、各ウェルを種々のタンパク質/ペプチド混合物と共にインキュベートする。続いて、1つのウェル中で、T細胞認識が行われるようである場合、当該特定のウェルの混合物のタンパク質及び/又はペプチドは通常、どのエピトープが認識されるかどうかを決定するために、続いて個別に試験される。T細胞認識がある特定のウェル中で存在しない場合、当該ウェルへ投与された混合物全体を無視することができる。
【００２８】
T細胞エピトープのT細胞認識は、当該技術分野で公知の各種方法で測定することができる。1つの好ましい方法は、T細胞活性化の測定である。エピトープの認識時に、T細胞は通常、活性化されるようになり、それは例えば、インターフェロンガンマ放出の程度を決定することにより測定可能である。したがって、本発明の一実施形態では、好ましくはT細胞によるサイトカイン放出を測定することにより、T細胞が活性化されるかどうかを決定することにより、前記T細胞が少なくとも1つのエピトープで認識されたかどうかが決定される。一実施形態では、インターフェロンガンマ放出が測定される。
【００２９】
一実施形態では、本発明による化合物を負荷したB細胞(好ましくは、タンパク質を負荷、ペプチドを負荷、又は核酸分子を負荷したB細胞)を、CD8+CTLと共にインキュベートする。更なる実施形態では、本発明による化合物を負荷したB細胞を、CD4+ヘルパーT細胞と共にインキュベートする。
【００３０】
CD8+CTLは、腫瘍細胞、並びに病原体により感染される細胞に対抗するのに重要な役割を果たす。通常、CD8+CTLの特異性は、Davis等, 2011に記載されるように、例えばペプチド-MHC-I多量体等の非細胞性ペプチド-MHC-I複合体を使用して試験することができる。ペプチドを負荷したMHCに対するT細胞受容体(TCR)の親和性がとても低く、その結果単一のペプチド-MHC複合体は、試験アッセイを実施するのに十分な強度でT細胞を結合することが不可能であるため、ペプチド-MHC多量体が使用される。Davis等, 2011に記載されるように、本発明者等の一人により開発されている紫外線(UV)感受性ペプチドを有するMHC多量体、通常四量体が使用されることが好ましい。これらのUV感受性ペプチドは、UV光により切断され、その後、得られたMHC多量体に試験ペプチドを負荷して、T細胞結合アッセイに使用する。
【００３１】
ペプチド-MHC多量体は、CD8+T細胞結合アッセイを実施するための良好なツールを提供するが、これらの多量体は、必ずしも適切であるわけではない。例えば、ペプチド-MHC多量体を用いる場合、試験ペプチドへのT細胞の結合のみを決定することができる。例えば活性化等のこれらのT細胞の生物活性は、これらの多量体を用いて試験されない。更に、MHC多量体は、各MHC対立遺伝子に利用可能ではない。したがって、ある特定の個体が、集団中に一般的に存在しないMHC対立遺伝子を発現するようである場合、これらの珍しいMHC対立遺伝子の多量体は通常、利用可能ではない。このような場合、このような個体のT細胞の結合特性は、既存のMHC多量体を用いて測定することができない。
【００３２】
したがって、CD8+T細胞の生物活性が研究されるべきである場合、又は珍しいMHC-I対立遺伝子を有する個体由来のT細胞が試験される場合、ペプチド-MHC多量体は通常、不適切である。したがって、B細胞がT細胞用のAPCとして使用される本発明による方法が好ましい。
【００３３】
更に、本発明による方法はまた、CD4+T細胞を試験するのに好ましい。in vivoで、CD4+ヘルパーT細胞は、多重エフェクターサイトカインの産生を介して抗病原体応答及び抗腫瘍応答を誘発し、それらは、CTLを活性化して、抗体産生B細胞の成熟を誘導する。がん患者の養子細胞療法に関して、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を使用することが好ましい。通常、TILでは、CD4+T細胞の比率が、CD8+CTLの比率よりも高い。したがって、CD4+T細胞エピトープの調査は、養子細胞療法のための重要な応用である。CD4+細胞の使用は、これが、有効なT細胞応答を提供するのに対して、リンパ球枯渇の必要性が、CD8+CTLの使用と比較した場合に減少するため有利である。同様に、医薬又はワクチンにおけるCD4+T細胞エピトープの使用は、このような医薬又はワクチンが通常、個体において有効な免疫応答を誘発するため有利である。したがって、CD4+T細胞エピトープ認識の決定は、好ましい実施形態である。しかしながら、ペプチド結合部位が唯一のポリペプチドから構成されるMHC-I分子とは対照的に、MHC-II分子は、2つの異なるポリペプチドから構成されるペプチド結合部位を有するので、UV感受性の交換可能なペプチドを有するMHCクラスII多量体の産生は、ペプチド-MHC-I多量体の産生よりも困難である。ペプチド-MHC-II多量体は、一般的に利用可能でないため、また同様に、ペプチド-MHC-II多量体は、T細胞活性化を決定するのに使用することができないという事実を考慮して、またMHC-IIは、ある特定の種類の細胞でのみ発現されるという事実を考慮して、B細胞がCD4+T細胞エピトープ認識を試験するのにAPCとして使用される本発明による方法が、特に好ましい実施形態である。
【００３４】
1つの特定の実施形態は、前記少なくとも1つのB細胞及び前記T細胞が同じヒト個体由来である本発明による方法を提供する。この実施形態では、ある特定のエピトープのT細胞認識が、ある特定の障害に対する医薬としてT細胞を使用する目的で試験される場合に特に有利である。興味深い用途の1つは、養子細胞療法である。疾患を患う患者は多くの場合、疾患に対する免疫応答を示す。がんの場合、このような免疫応答は通常、腫瘍中に存在するタンパク質突然変異に向けられるが、個体の元の健常組織には向けられず、その結果、突然変異は、非自己として認識される。このような突然変異を本明細書では「腫瘍特異的突然変異」又は「腫瘍特異的アミノ酸配列」と称し(同種のアミノ酸配列は、同様に他の疾患又は病原体でも生じ得るが)、得られた抗原を通常、「修飾自己抗原」と称する。更に、「疾患特異的T細胞エピトープ」は、個体におけるその存在が疾患と関連付けられるT細胞エピトープとして本明細書で定義される。疾患特異的T細胞エピトープは例えば、病原体の表面タンパク質由来のT細胞エピトープを含む。同種のT細胞エピトープは、各種疾患又は病原体で生じ得るが、通常、個体の健常組織中に存在しないか、又はかなり低い程度で存在する。
【００３５】
しかしながら、個体の免疫応答は多くの場合、例えば回避機序及び/又は免疫調節性細胞に起因して、疾患に対抗するのに十分ではない。このような場合、患者由来のT細胞は好ましくは、本発明による方法で試験される。同じ患者由来のB細胞を使用する場合、自己B細胞は、同種B細胞と比較した場合にT細胞にとってあまり免疫原性ではないので、バックグラウンドシグナルは更に低減される。したがって、養子細胞療法に関して、患者由来のB細胞は、腫瘍特異的又は病原体特異的アミノ酸配列等の疾患特異的T細胞エピトープを含むか、又はコードする化合物と共にインキュベートすることが好ましく、T細胞認識は、同じ患者由来のT細胞を使用して試験される。
【００３６】
このような疾患特異的エピトープを認識するT細胞は、好ましくはin vitroで増殖させて、続いて、患者へ投与して、それは、例えば、抗腫瘍又は抗病原体T細胞応答をもたらす。或いは、又は更に、患者の免疫系をブーストするために、患者のT細胞により認識される疾患特異的T細胞エピトープを患者に投与して、免疫応答の増強をもたらす。このような疾患特異的T細胞エピトープは、それ自体として、又は例えばオリゴペプチド、タンパク質、エピトープ-担体複合体、若しくはエピトープ-MHC複合体等のより大きな複合体の一部として投与されてもよい。一実施形態では、このような疾患特異的T細胞エピトープは、抗原提示細胞、好ましくは、本発明による方法で調製されるようなB細胞培養物由来のB細胞に結合される。このようなAPCの投与は、in vivoで抗腫瘍応答を誘発又はブーストする。
【００３７】
1つの好ましい実施形態は、前記T細胞エピトープが修飾自己抗原由来である本発明による方法を提供する。前記T細胞エピトープは好ましくは、腫瘍特異的アミノ酸配列を含む。前記腫瘍は、任意の種類の腫瘍であり得る。好ましい例は、黒色腫、上皮がん、肺扁平上皮癌、肺腺癌、胃がん、食道がん、肺小細胞癌、結腸直腸がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、頭部及び頸部がん、腎明細胞がん、B細胞リンパ腫、腎乳頭がん、乳がん、膵臓がん、骨髄腫、卵巣がん、前立腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、CLL、嫌色素性腎細胞癌、甲状腺がん、ALL、AML及び毛様細胞性星状細胞腫である。好ましくは、前記T細胞エピトープは、黒色腫特異的エピトープ又は上皮がん特異的エピトープである。また、B細胞が、がん、好ましくは黒色腫又は上皮がんに罹患しているか又は罹患していた個体由来のT細胞と共にインキュベートされる本発明による方法が提供される。
【００３８】
別の好ましい実施形態は、前記T細胞エピトープが、非自己抗原由来、好ましくは病原体由来である本発明による方法を提供する。前記病原体は、これらの病原体が通常、in vivoで細胞媒介性免疫応答を起こすため、好ましくは、ウイルス、細菌又は寄生虫である。一実施形態では、例えば、ある特定の病原体に対するT細胞ワクチンを開発するために、ペプチドは、前記病原体の表面タンパク質の配列に基づいて産生される。本明細書で記載するようなB細胞培養物由来のB細胞を、これらのペプチドと共に、続いてT細胞と共にインキュベートする。好ましくは、先に前記病原体へ曝露された個体由来であるT細胞が使用され、その結果、メモリーT細胞が存在する。1つ又は複数の試験ペプチドが、T細胞により認識されるようである場合、これらのペプチドは、前記病原体に対するワクチンに関する候補物である。同様に、本発明によるこのようなスクリーニング方法の感度が重要である。
【００３９】
したがって、B細胞が、病原体、好ましくはウイルス、細菌又は寄生虫に罹患しているか又は罹患していた個体由来のT細胞と共にインキュベートされる本発明による方法もまた提供される。
【００４０】
別の好ましい実施形態は、前記T細胞エピトープが自己抗原由来である本発明による方法を提供する。これは、このようなT細胞エピトープが、個体において天然に存在するタンパク質(又は核酸)中に存在することを意味し、ここで、エピトープは、個体の免疫系により一般的に許容されるが、エピトープは、自己免疫疾患を患う個体の免疫系により認識される。このような自己免疫疾患の非限定的な例として、I型糖尿病(インスリン産生膵細胞に対する免疫応答)、多発性硬化症(神経細胞の絶縁カバーに対する免疫応答)及びグルテンタンパク質への曝露により免疫系が小腸組織と交差反応するセリアック病が挙げられる。幾つかの実施形態では、本発明によるスクリーニング方法は、試料が、自己抗原を認識するT細胞を含むかどうかを決定するために使用される。例えば、Bcl-6及びBcl-xLの発現が誘導、増強及び/又は維持されたB細胞を、1つ又は複数の自己抗原(又はそれらに由来するペプチド)と共にインキュベートして、その後、T細胞エピトープは、B細胞の表面に表示される。続いて、B細胞を、試料由来のT細胞と共にインキュベートする。1つ又は複数のT細胞エピトープが、前記試料由来のT細胞により結合されるようである場合、前記試料は、自己抗原を認識するT細胞を含むと結論付けられる。次に、このような試料は通常、ある特定の自己免疫疾患に特異的であると分類される。続いて、幾つかの実施形態では、この結果は、試料が入手された個体が、自己免疫疾患に罹患しているか又は罹患する危険性があるかどうかを決定するのに使用される。
【００４１】
幾つかの実施形態では、潜在的な自己免疫T細胞エピトープに関して試験するために、本発明によるスクリーニングアッセイが実施される。これらの実施形態によれば、Bcl-6及びBcl-xLの発現が、誘導、増強及び/又は維持されたB細胞を、1つ又は複数の試験化合物、好ましくはペプチドと共にインキュベートして、その後、ペプチドを負荷したB細胞を、自己免疫患者由来のT細胞と共にインキュベートする。続いて、これらのT細胞により結合されるようであるペプチドを、例えば更なる自己免疫研究のために選択する。
【００４２】
したがって、B細胞が、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症、糖尿病又はセリアック病に罹患しているか又は罹患していた個体由来のT細胞と共にインキュベートされる本発明による方法もまた提供される。
【００４３】
本明細書で使用する場合、修飾自己抗原「由来の」又は非自己抗原「由来の」又は自己抗原「由来の」T細胞エピトープは、前記配列がまた、それぞれ、前記修飾自己抗原又は非自己抗原又は自己抗原の上或いは中に存在するT細胞エピトープ配列を意味する。前記T細胞エピトープは、例えば、前記抗原から入手されるペプチドであってもよく(例えば、B細胞による抗原の内在化及びプロセシングを介して、その後、T細胞エピトープは、MHCの状況でB細胞の表面で提示される)、或いは前記T細胞エピトープは、例えば、組換え細胞ペプチド産生プラットフォーム又は化学的ペプチド合成機を使用して、人工的に産生され得る。したがって、ある特定の抗原「由来の」T細胞エピトープは、前記抗原から物理的に入手される必要はない。代わりに、このようなT細胞エピトープの配列が一度公知であると、前記T細胞エピトープは、別個に産生されてもよい。前記T細胞エピトープは好ましくは、ペプチドを含む。幾つかの実施形態では、前記T細胞エピトープは、タンパク質又はポリペプチド又は他のタンパク質様化合物の一部である。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「B細胞」という用語は、個体から入手されたB細胞、又はこのようなB細胞から生じるB細胞を意味する。前記個体は好ましくは、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、類人猿、サル、ウシ、ヒツジ、イヌ又はネコ等の哺乳動物である。1つの好ましい実施形態では、前記個体は、ヒト個体又はウサギである。個体のB細胞から生じるB細胞の例は、1回又は複数回の細胞分裂サイクル後にin vitroで形成される個体由来のB細胞の子孫である。このような子孫は例えば、ex vivoでのB細胞培養物を含む。
【００４５】
ex vivoでのB細胞培養物は、B細胞及び/又はそれらの子孫を含有する培養物である。他の種類の細胞もまた、培養物中に存在してもよい。例えば、CD40陽性L細胞及び/又はEL4B5細胞等のB細胞刺激細胞もまた通常、本発明で使用するB細胞培養物中に存在する。更に、B細胞が入手された個体由来の試料中にも存在していた他の種類の細胞は、依然としてB細胞培養物中に存在し得る。B細胞培養条件で存在する場合、このような非B細胞は通常、B細胞と比較した場合に増殖することがあまり可能ではなく、その結果、このような混入細胞の数は通常、経時的に減少する。好ましくは、B細胞培養物の細胞の少なくとも70%がB細胞である。より好ましくは、前記B細胞培養物の細胞の少なくとも75%、80%、85%、90%又は95%がB細胞である。一実施形態では、B細胞並びにCD40陽性L細胞及び/又はEL4B5細胞等のB細胞刺激細胞は、本明細書で使用する場合、B細胞培養物中に存在する、本質的に唯一の種類の細胞である。幾つかの実施形態では、前記B細胞培養物の本質的に全ての細胞がB細胞である。
【００４６】
Bcl-6は、正常なB細胞及びT細胞の発生及び成熟に必要とされ、また胚中心の形成に必要とされる転写リプレッサーをコードする。Bcl-6は、胚中心B細胞で高度に発現されるのに対して、それは、形質細胞ではほとんど発現されない。Bcl-6は、形質細胞への活性化B細胞の分化を抑制する。本発明による方法では、Bcl-6発現産物は、ex vivoで培養物のB細胞中に依然として存在する。Bcl-6発現産物の存在は、抗アポトーシス核酸の存在と共に、B細胞の複製寿命を延長させる。Bcl-6の発現は好ましくは、Bcl-6発現促進化合物を、培養に使用する元のB細胞へ投与することにより、又はこのような化合物の存在下でB細胞を培養することにより、誘導、増強又は維持される。
【００４７】
したがって、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現が、
-  前記B細胞に、Bcl-6の発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物を供給する工程、及び/又は
-  Bcl-6の発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養する工程
により誘導、増強及び/又は維持される本発明による方法が更に提供される。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「Bcl-6」という用語はまた、非ヒト哺乳動物中に存在するBcl-6ホモログ等のそのホモログを包含する。
【００４９】
Bcl-6の発現を直接的又は間接的に増強することが可能な各種化合物は、当該技術分野で公知である。このような化合物は例えば、シグナル伝達性転写因子5(STAT5)タンパク質又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/又はそれらをコードする核酸配列を含む。STAT5は、Bcl-6発現を増強することが可能なシグナル伝達物質である。STAT5の2つの公知の形態STAT5a及びSTAT5bが存在し、それらは、2つの異なる縦列連結遺伝子によりコードされる。STAT5若しくはそのホモログの投与及び/又は活性化は、Bcl-6のレベルの増強をもたらす。したがって、STAT5、又はそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体は、Bcl-6の発現を直接的に増加させることが可能である。したがって、
-  少なくとも1つのB細胞におけるSTAT5の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
-  前記少なくとも1つのB細胞における抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
-  B細胞培養物への前記少なくとも1つのB細胞の増殖を可能にする工程、
-  前記B細胞培養物のB細胞を、少なくとも1つの化合物と共にインキュベートする工程、
-  得られたB細胞を、T細胞と共にインキュベートする工程、及び
-  少なくとも1つのT細胞が、前記少なくとも1つの化合物の少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する工程
を含む、本発明による方法が提供される。また、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現が、前記B細胞に、STAT5を、又はそのホモログを、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体を供給することにより誘導、増強及び/又は維持される本発明による方法が提供される。或いは、又は更に、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現は、前記B細胞に、STAT5、又はそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を供給することにより、或いはSTAT5の存在下で、又はそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体の存在下で、前記B細胞を培養することにより誘導、増強及び/又は維持される。
【００５０】
STAT5の存在は、Bcl-6の量を直接的に増加させる。また、Bcl-6の発現を間接的に増加させることも可能である。これは、例えば、順にSTAT5、若しくはそのホモログを直接的又は間接的に活性化すること、及び/又はSTAT5の発現、若しくはそのホモログの発現を増加させることが可能である、ある特定の化合物の量を調節することにより行われる。したがって、一実施形態では、内因性及び/又は外因性STAT5の発現及び/又は活性、或いはそのホモログの発現が増加される。
【００５１】
本明細書で使用する場合、例えば、Bcl-6又はSTAT5又はBlimp-1の「ホモログ」という用語は、ぞれぞれ、Bcl-6又はSTAT5又はBlimp-1に相当する哺乳動物タンパク質を意味し、それが、ヒトB細胞におけるBcl-6又はSTAT5又はBlimp-1の機能と比較した場合に、非ヒトB細胞において、相当する類似した機能を有することを意味する。
【００５２】
B細胞に、Bcl-6をコードするか、或いはそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を供給することは好ましい。このように、前記B細胞において、Bcl-6発現産物の量を直接的に調節することが可能である。したがって、また、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現が、前記B細胞に、Bcl-6をコードするか、或いはBcl-6のホモログ、又は機能性部分、若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を供給することにより誘導、増強及び/又は維持される本発明による方法が提供される。一実施形態では、前記核酸分子は、構成的に活性であり、Bcl-6、又はそのホモログ、機能性部分若しくは機能性誘導体が、調節因子の存在に関係なく、連続して発現されることを意味する。別の実施形態では、前記核酸分子は、誘導性であり、それらの発現が、少なくとも1つの誘導因子及び/又はリプレッサーにより調節されることを意味する。このように、前記核酸分子の発現は、随意に調節される。例えば、Tet-On及びTet-Off発現系(例えば、Tet-On(登録商標)及びTet-Off(登録商標) Advanced Inducible Gene Expression Systems、Clontech社)は、目的の核酸配列の誘導性発現に使用することができる。これらの系では、転写活性化因子(tTA)の発現は、テトラサイクリン(TC)の存在(Tet-On)若しくは非存在(Tet-Off)又はドキシサイクリン(dox)のような誘導体により調節される。原則として、tTAは、大腸菌(Escherichia coli)Tetリプレッサータンパク質(TetR)及び単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルストランス活性化ドメインVP16から構成される。tTAは、Tetオペレーター(TetO)DNA配列及びプロモーター配列、例えばヒトサイトメガロウイルス(hCMV)プロモーターを含むテトラサイクリン応答要素(TRE)の制御下で目的の核酸配列の転写を調節する。例えば、Bcl6、或いはそのホモログ又は機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列は、このプロモーターの下流に配置させることができる。
【００５３】
Tet-off系では、tTAは、TC又はdoxの非存在下でTREへ結合して、目的の核酸配列の転写が活性化されるのに対して、TC又はdoxの存在下では、tTAは、TREを結合することができず、目的の核酸配列の発現は阻害される。対照的に、Tet-on系は、doxの存在下で唯一TREを結合させることができる逆tTA(rtTA)を使用する。目的の核酸配列の転写は、doxの非存在下で阻害され、doxの存在下で活性化される。
【００５４】
別の実施形態では、誘導性発現は、例えば、エクジソン誘導性遺伝子発現系(例えば、RheoSwitch(登録商標)、New England Biolabs社)等のホルモン誘導性遺伝子発現系を使用して実行される(Christopherson, K.S.等  PNAS 89、6314〜8頁(1992))。エクジソンは、例えばキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)由来の昆虫ステロイドホルモンである。エクジソン受容体でトランスフェクトした細胞では、エクジソン受容体(Ecr)及びレチノイドX受容体(RXR)からなるヘテロ二量体が、エクジソン、ムリステロンA及びポナステロンA等のその類縁体の1つ、及び非ステロイドエクジソンアゴニストから選択されるエクジソンアゴニストの存在下で形成される。アゴニストの存在下では、Ecr及びRXRは、発現カセット上に存在するエクジソン応答要素に相互作用して、それに結合する。したがって、エクジソン応答要素の下流で発現カセットに配置される目的の核酸配列の発現は、B細胞をエクジソンアゴニストへ曝露することにより誘導される。
【００５５】
本発明の更に別の実施形態では、誘導性発現は、アラビノース誘導性遺伝子発現系(例えば、pBAD/gIIIキット、Invitrogen社)を使用して実行される(Guzman, L. M.等  Bacteriol 177、4121〜4130頁(1995))。アラビノースは、5つの炭素原子を含有する単糖である。続いて、アラビノース誘導性プロモーターPBADでトランスフェクトした細胞では、PBADの下流に配置される目的の核酸配列の発現は、アラビノースの存在下で誘導され得る。
【００５６】
また、Bcl-6タンパク質、或いはそのホモログ又は機能性部分若しくは機能性誘導体(をコードする核酸分子)を使用することが可能であり、ここで、前記Bcl-6或いはホモログ又は機能性部分若しくは機能性誘導体の活性は、少なくとも1つの誘導因子及び/又はリプレッサーにより調節される。非限定的な例は、調節要素がBcl-6の少なくとも一部をコードする配列に融合される融合タンパク質である。例えば、エストロゲン受容体(ER)はBcl-6に融合されて、融合タンパク質ER-Bcl-6を生じる。この融合タンパク質は、それが、細胞質ゾルにおいて熱ショックタンパク質と複合体を形成するので不活性である。外因性誘導因子4-ヒドロキシ-タモキシフェン(4HT)の投与時に、融合タンパク質ER-Bcl-6は、熱ショックタンパク質から解離して、その結果、融合タンパク質のBcl-6部分が活性になる。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「抗アポトーシス核酸分子」という用語は、B細胞においてアポトーシスを遅延及び/又は防止することが可能である核酸分子を指す。好ましくは、前記抗アポトーシス核酸分子は、本発明で使用する場合のB細胞培養物中に通常存在する形質芽細胞様B細胞においてアポトーシスを遅延及び/又は防止することが可能である。好ましくは、外因性核酸分子を含む抗アポトーシス核酸分子が使用される。これは、B細胞において天然で発現されない核酸配列が使用されるか、又は天然に存在する核酸配列の更なるコピーが使用されることを意味し、その結果、得られたB細胞における発現は、in vivoで天然B細胞と比較した場合に増強される。各種抗アポトーシス核酸分子が、当該技術分野で公知であり、その結果、各種実施形態が利用可能である。好ましくは、抗アポトーシスBcl-2タンパク質は、B細胞における良好なアポトーシス阻害因子であるため、Bcl-2ファミリーの抗アポトーシスの成員である抗アポトーシス核酸分子が使用される。Bcl-2ファミリー(そのファミリーは、アポトーシス促進性及び抗アポトーシスタンパク質の両方を含む)により制御される多くのプロセスは、アポトーシスのミトコンドリア経路に関する。Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、A1、Bcl2L10及びMcl-1は概して、ミトコンドリア外膜と一体化されるため、抗アポトーシスBcl-2ファミリーの成員であるBcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-2関連タンパク質A1(Bcl2-A1又はA1とも名付けられる)、Bcl-2様10(Bcl2L10)及びMcl-1、或いはそれらのホモログ、又はそれらの機能性部分若しくは機能性誘導体の使用が好ましい。それらは、ミトコンドリア膜完全性を保護するために、Bcl-2ファミリーに属するアポトーシス促進性タンパク質を直接的に結合及び阻害する。
【００５８】
したがって、好ましい実施形態は、前記抗アポトーシス核酸分子が、Bcl2ファミリー、好ましくはBcl-xL又はMcl-1又はBcl-2又はA1又はBcl-w又はBcl2L10、或いはそれらのホモログ、又はそれらの機能性部分若しくは機能性誘導体の抗アポトーシス遺伝子を含む本発明による方法を提供する。
【００５９】
一実施形態では、Bcl-xL又はMcl-1又はBcl-2又はA1又はBcl-w又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの発現は、これらの抗アポトーシス遺伝子のいずれかの発現を促進することが可能な少なくとも1つの化合物を、B細胞へ投与することにより、又はこのような化合物の存在下で、B細胞を培養することにより誘導、増強又は維持される。したがって、
-  前記B細胞に、Bcl-xL及び/又はMcl-1及び/又はBcl-2及び/又はA1及び/又はBcl-w及び/又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物を供給する工程、及び/又は
-  Bcl-xL及び/又はMcl-1及び/又はBcl-2及び/又はA1及び/又はBcl-w及び/又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養する工程
を含む本発明による方法が更に提供される。
【００６０】
しかしながら、好ましくは、B細胞に、好ましくはBcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10、並びにそれらのホモログ、及びそれらの機能性部分及びそれらの機能性誘導体からなる群から選択されるBcl2ファミリーの抗アポトーシス遺伝子をコードする少なくとも1つの核酸分子を供給する。このように、前記B細胞において発現産物の量を直接的に増強することが可能である。したがって、また、前記B細胞に、好ましくはBcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10、並びにそれらのホモログ、及びそれらの機能性部分及び機能性誘導体からなる群から選択されるBcl2ファミリーの抗アポトーシス遺伝子をコードする少なくとも1つの核酸分子を供給する工程を含む、本発明による方法が提供される。一実施形態では、前記核酸分子は、構成的に活性であり、前記核酸分子は、連続して発現されることを意味する。別の実施形態では、前記核酸分子は、誘導性であり、それらの発現が、少なくとも1つの誘導因子及び/又はリプレッサーにより調節されることを意味する。当該技術分野で公知の誘導性核酸発現系の非限定的な例は、本明細書で前に記載している。
【００６１】
特に好ましい実施形態では、前記抗アポトーシス核酸分子は、Bcl-xL又はMcl-1、或いはそれらのホモログ、又はそれらの機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする。本発明によれば、Bcl-6及びBcl-xLの組合せは、B細胞の複製寿命を増加させることが特に十分可能であり、それにより得られた形質芽細胞様B細胞の長期培養物を形成させる。同じことが、Bcl-6及びMcl-1の組合せにも当てはまる。最も好ましくは、前記抗アポトーシス核酸は、Bcl-xL又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする。
【００６２】
Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの機能性部分は、それぞれ、天然のBcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10、或いはそれらのホモログと比較した場合に、B細胞の複製寿命を増加させる同じ能力を有する(種類についてであり、量については必ずしも同じではない)タンパク質様分子である。このような機能性部分は、例えば前記能力に関与にされないか、又はほんのごくわずか関与されるアミノ酸を欠如している。
【００６３】
例えば、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10の、又はそれらのホモログの機能性部分は、それぞれ、完全長Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10、又はそれらのホモログと同じ種類の抗アポトーシス特性を保持した(種類についてであり、量についてはは必ずしも同じではない)、それぞれ、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10の、又はそれらのホモログの断片として、本明細書で定義される。Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10の、或いはそれらのホモログの機能性部分は通常、B細胞においてアポトーシスを遅延及び/又は防止することが可能である、それぞれ、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10の、或いはそれらのホモログのより短い断片である。このような機能性部分は、例えばBcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10の抗アポトーシス活性に著しく寄与しない配列を欠如している。Bcl-6の、又はそのホモログの機能性部分は通常、同様にB細胞の複製寿命を増加させることが可能であるBcl-6のより短い断片、又はそのホモログのより短い断片である。
【００６４】
Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10の、或いはそれらのホモログの機能性誘導体は、変更されているが、B細胞の複製寿命を増加させるその能力を維持した(種類については維持したが、量については必ずしも維持しなかった)、それぞれ、Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10タンパク質、又はそれらのホモログとして定義される。機能性誘導体は、多くの方法で、例えば保存的アミノ酸置換によって提供され、保存的アミノ酸置換では、全体的な官能性(functioning)が著しく影響されないように、アミノ酸の1つが、一般的に類似した特性(サイズ、疎水性等)を有する別のアミノ酸で置換される。或いは、機能性誘導体は例えば、検出可能標識、又は誘導性化合物を有する融合タンパク質を含む。
【００６５】
Bcl-6発現及び抗アポトーシス核酸分子の発現を増加させること以外に、B細胞において、Blimp-1、又はそのホモログの発現を誘導、増強及び/又は維持することもまた有利である。したがって、一態様は、前記少なくとも1つのB細胞において、Blimp-1、又はそのホモログの発現を誘導、増強及び/又は維持することを更に含む、本発明による方法を提供する。
【００６６】
B細胞におけるBlimp-1の、又はそのホモログの発現の程度は、様々な方法で調節される。一実施形態では、B細胞に、Blimp-1の、又はそのホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能である化合物を供給する。更に、又は或いは、B細胞は、Blimp-1の、又はそのホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物の存在下で培養される。したがって、
-  前記B細胞に、Blimp-1の発現、又はBlimp-1ホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物を供給する工程、及び/又は
-  Blimp-1の発現、又はBlimp-1ホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養する工程
を更に含む、本発明による方法が更に提供される。
【００６７】
Blimp-1発現を増加させることが可能な前記化合物は、最も好ましくはIL21を含む。したがって、本発明の1つの好ましい実施形態では、B細胞は、培養時間の少なくとも一部中に、IL21の存在下で培養される。
【００６８】
別の実施形態では、Blimp-1発現を増加させることが可能な前記化合物は、シグナル伝達性転写因子3(STAT3)タンパク質又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/又はそれらをコードする核酸分子を含む。STAT3は、B細胞発生及び分化に関与されるシグナル伝達物質である。STAT3は、Blimp-1発現をアップレギュレートすることが可能である。1つの好ましい実施形態では、B細胞に、STAT3又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を供給し、ここで、前記核酸分子の発現は、リプレッサーの外因性誘導因子により調節され、その結果、STAT3発現の程度は、随意に調節される。例えば、上述する誘導性発現系の1つが使用される。一実施形態では、STAT3、又は機能性部分若しくは機能性誘導体、及びERを含む融合産物が使用される。例えば、B細胞に、融合タンパク質ER-STAT3としてエストロゲン受容体(ER)及びSTAT3をコードする核酸分子を供給する。この融合タンパク質は、それが、細胞質ゾルにおいて熱ショックタンパク質と複合体を形成するので不活性である。このように、STAT3は、核に到達することは不可能であり、Blimp-1発現は増強されない。外因性誘導因子4-ヒドロキシ-タモキシフェン(4HT)の投与時に、融合タンパク質ER-STAT3は、熱ショックタンパク質から解離して、その結果、STAT3は、核に入ること、及びBlimp-1発現を活性化させることが可能である。
【００６９】
本明細書で使用する場合、STAT3の機能性部分は、天然のSTAT3と比較した場合に、Blimp-1の、又はそのホモログの発現を増加させる同じ能力を有する(種類についてであり、量については必ずしも同じではない)STAT3の断片として定義される。このような機能性部分は、例えば前記能力に関与にされないか、又はほんのごくわずか関与されるアミノ酸を欠如している。
【００７０】
STAT3の機能性誘導体は、変更されているが、Blimp-1の、又はそのホモログの発現を増加させるその能力を維持した(種類については維持したが、量については必ずしも維持しなかった)、STAT3タンパク質として定義される。機能性誘導体は、多くの方法で、例えば保存的アミノ酸置換によって提供され、保存的アミノ酸置換では、全体的な官能性が著しく影響されないように、アミノ酸の1つが、一般的に類似した特性(サイズ、疎水性等)を有する別のアミノ酸で置換される。或いは、機能性誘導体は例えば、検出可能標識、又は誘導性化合物を有する融合タンパク質を含む。
【００７１】
STAT3は、Blimp-1の発現を増加させることが可能であるため、STAT3の活性及び/又は発現を増加させることが可能な化合物を投与することにより、Blimp-1の、又はBlimp-1ホモログの発現を間接的に増加させることも可能である。したがって、一実施形態では、B細胞に、STAT3の活性を増強することが可能である化合物を供給して、その結果、Blimp-1の、又はBlimp-1ホモログの発現が、間接的に増強される。
【００７２】
STAT3は、様々な方法で活性化される。好ましくは、STAT3は、B細胞にサイトカインを供給することにより活性化される。B細胞分化に天然で関与されるサイトカインは、STATタンパク質を調節するのに非常に有効である。STAT3の非常に有効な活性化因子は、IL21及びIL6であるが、IL2、IL7、IL10、IL15及びIL27もまた、STAT3を活性化することが公知である。更に、先天免疫に関与されるToll様受容体(TLR)もまた、STAT3を活性化することが可能である。したがって、一実施形態は、前記B細胞が、IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15及び/又はIL27の存在下で培養される本発明の方法を提供する。Blimp-1発現がBCL6により相殺される場合でさえ、IL21は、Blimp-1発現をアップレギュレートするのに特に適しているため、IL21が使用されることが最も好ましい。
【００７３】
更に、又は或いは、突然変異ヤヌスキナーゼ(JAK)、又はJAKの突然変異ホモログは、STAT3を活性化させるために使用される。天然で、JAKは、それ自体が、少なくとも1つのサイトカインにより活性化されていた後に、STAT3をリン酸化することが可能である。サイトカインの存在とは独立してSTAT3を活性化することが可能な突然変異ヤヌスキナーゼ、又はJAKの突然変異ホモログは、本発明による方法で特に適している。
【００７４】
更に別の実施形態では、Blimp-1の、又はBlimp-1ホモログの発現は、B細胞に、サイトカインシグナル伝達の抑制因子(SOCS)タンパク質、又はSOCSホモログを供給することにより、及び/又は前記細胞内で、SOCSタンパク質又はSOCSホモログを活性化することにより増加される。或いは、又は更に、Blimp-1の発現、又はBlimp-1ホモログの発現を増加させるために、E-タンパク質E47、E12、E2-2及びHEBのうちの少なくとも1つが使用される。E47は、E-タンパク質と呼ばれるヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質のファミリーに属する転写因子である。リンパ球発生に関与される4つのE-タンパク質E12、E47、E2-2及びHEBが存在する。E12及びE47は、異なってスプライシングされるE2Aと呼ばれる1つの遺伝子によりコードされる。Eタンパク質は、腫瘍抑制因子として記載されている。E47の特異的標的のうちの1つが、Socsl及びSocs3遺伝子である。
【００７５】
したがって、一態様は、前記B細胞に、Blimp-1の発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物を供給することにより、及び/又はBlimp-1の発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養することにより、B細胞においてBlimp-1の発現を更に増加させる本発明による方法を提供し、ここで、前記化合物は、
-  STAT3又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/又は
-  STAT3を活性化することが可能な化合物、及び/又は
-  STAT3の発現を増強することが可能な化合物、及び/又は
-  IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15、IL27、SOCSタンパク質、E-タンパク質E47、E12、E2-2又はHEBのうちの1つ、突然変異ヤヌスキナーゼ及び/又はSTAT3、或いはそのホモログ又は機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列
を含む。
【００７６】
最も好ましくは、前記化合物はIL21である。
【００７７】
上述するように、本発明による方法は、好ましくは腫瘍、病原体及び/又は自己免疫疾患に対する医薬及びワクチンを開発するのに特に適している。したがって、一態様は、試験化合物の、又は試験化合物によりコードされる少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するT細胞を含む医薬を調製する工程を更に含む、本発明のよる方法を提供する。また、本発明による方法を用いて入手される場合、疾患特異的エピトープ、好ましくは腫瘍特異的エピトープ又は病原体若しくは自己抗原由来のT細胞エピトープを認識するT細胞を含む医薬が、更に提供される。前記医薬は好ましくは、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を更に含む。前記医薬は好ましくは、黒色腫、上皮がん、肺扁平上皮癌、肺腺癌、胃がん、食道がん、肺小細胞癌、結腸直腸がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、頭部及び頸部がん、腎明細胞がん、B細胞リンパ腫、腎乳頭がん、乳がん、膵臓がん、骨髄腫、卵巣がん、前立腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、CLL、嫌色素性腎細胞癌、甲状腺がん、ALL、AML又は毛様細胞性星状細胞腫に対する医薬である。最も好ましくは、前記医薬は、黒色腫又は上皮がんに対するものである。
【００７８】
幾つかの実施形態では、前記医薬は、好ましくはウイルス、細菌又は寄生虫により引き起こされる感染性疾患に対するものである。
【００７９】
本明細書で使用する場合、ある特定の疾患「に対する医薬」という用語は、前記医薬が、前記疾患の発病又は進行を、少なくとも部分的に治療又は防止又は遅延することが可能であることを意味する。更に、又は或いは、前記医薬は、前記疾患の少なくとも1つの症状を少なくとも部分的に軽減することが可能である。
【００８０】
別の態様は、試験アッセイにおいてT細胞により認識される少なくとも1つのT細胞エピトープを同定する工程を更に含む、本発明による方法を提供する。T細胞により認識されるこのようなエピトープは好ましくは、免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンを調製するのに使用される。
【００８１】
更なる態様は、試験アッセイにおいてT細胞により認識される少なくとも1つのT細胞エピトープを、その表面に表示するB細胞を含む免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンを調製する工程を更に含む、本発明による方法を提供する。本発明による免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンは好ましくは、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を更に含む。
【００８２】
本発明による方法を用いて入手される場合、疾患特異的T細胞エピトープ、好ましくは腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体若しくは自己抗原由来のT細胞エピトープを含む免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンもまた提供される。前記T細胞エピトープは、本明細書で使用する場合、抗原提示細胞、好ましくはB細胞の表面上に表示され得る。
【００８３】
先で論述するように、本発明による方法の利点の1つは、入手される非常に低い程度(存在したとしても)のバックグラウンドシグナルであり、その結果、より一層低い程度のT細胞認識が検出され得る。これは、試験化合物を負荷したB細胞が、障害を患う個体由来のT細胞と共にインキュベートされる場合に特に有利である。前記個体内の疾患特異的T細胞レベルが低い場合、これらの低量のT細胞によるエピトープ認識は、ほとんどの個体において比較的高頻度のEBV特異的T細胞により引き起こされる多くのバックグラウンドシグナルに起因して、既存のEBV不死化B細胞アッセイにおいて容易に見逃される。本発明による方法は、これに対する解決策を提供する。実施例に示すように、少数のT細胞エピトープを認識するT細胞でも、本発明による方法を用いて検出可能である。例えば、APCとしてEBV不死化B細胞を使用する場合、唯一の非常に卓越した疾患特異的T細胞応答が検出され、ここで、目的のT細胞の量は、注入細胞産物内の総T細胞の24%もの多さであった。他方で、Bcl-6及びBcl-xLの発現が誘導、増強及び/又は維持されるB細胞を使用する本発明による方法を使用する場合、遥かに低い頻度で、0.264〜0.053%もの低いT細胞応答でも検出することが可能となった(図3b及び図3c)。したがって、1つの好ましい実施形態は、前記T細胞が前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、24%よりも低く、より好ましくは23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、より好ましくは5%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法を提供する。
【００８４】
好ましい実施形態では、前記T細胞が前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。
【００８５】
更に好ましい実施形態では、前記T細胞は、前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低いことを特徴とする。一実施形態では、前記比率は、0.264%から0.053%の間である。更なる実施形態では、前記比率は、0.264%以下である。更なる実施形態では、前記比率は、0.246%以下である。更なる実施形態では、前記比率は、0.096%以下である。更なる実施形態では、前記比率は、0.053%以下である。
【００８６】
また、前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、24%よりも低く、より好ましくは23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、より好ましくは5%よりも低い、本発明による方法が提供される。
【００８７】
好ましい実施形態では、前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低い、本発明による方法が提供される。
【００８８】
更に好ましい実施形態では、前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低い、本発明による方法が提供される。一実施形態では、前記割合は、0.264%から0.053%の間である。更なる実施形態では、前記割合は、0.264%以下である。更なる実施形態では、前記割合は、0.246%以下である。更なる実施形態では、前記割合は、0.096%以下である。更なる実施形態では、前記割合は、0.053%以下である。
【００８９】
前記疾患又は前記障害は、好ましくは:
-  がん、好ましくは黒色腫又は上皮がん、及び
-  感染性疾患、好ましくはウイルス感染、細菌感染又は寄生虫感染、及び
-  自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症、糖尿病又はセリアック病
からなる群から選択される。
【００９０】
1つの好ましい実施形態では、前記T細胞は、CD4+T細胞である。したがって、1つの好ましい態様は、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD4+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における濃度が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD4+T細胞の総量の24%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法を提供する。試料又はT細胞培養物におけるCD4+T細胞の総量と比較した、目的のある特定のCD4+T細胞の比率は、頻度と呼ばれる。好ましくは、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の頻度は、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD4+T細胞の総量の23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、及び更により好ましくは5%よりも低い。一実施形態では、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の頻度は、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、総CD4+細胞の1.7%から4.5%の間である。
【００９１】
好ましい実施形態では、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD4+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における濃度が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD4+T細胞の総量の1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。
【００９２】
更に好ましい実施形態では、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD4+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における濃度が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD4+T細胞の総量の1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。一実施形態では、前記CD4+T細胞濃度は、0.264%から0.053%の間である。更なる実施形態では、前記濃度は、0.264%以下である。更なる実施形態では、前記濃度は、0.246%以下である。更なる実施形態では、前記濃度は、0.096%以下である。更なる実施形態では、前記濃度は、0.053%以下である。
【００９３】
前記疾患と関連付けられる前記T細胞エピトープは好ましくは、腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体由来のT細胞エピトープ又は自己抗原由来のT細胞エピトープである。
【００９４】
同様に、低レベルのCD8+T細胞は、本発明による方法を用いて検出可能である。したがって、1つの好ましい態様は、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD8+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD8+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における比率が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量の24%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法を提供する。好ましくは、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD8+T細胞の頻度は、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量の23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、及び更により好ましくは5%よりも低い。
【００９５】
好ましい実施形態では、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD8+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD8+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における比率が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量の1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。
【００９６】
更に好ましい実施形態では、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD8+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD8+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における比率が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量の1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。上述するように、前記疾患と関連付けられる前記T細胞エピトープは好ましくは、腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体由来のT細胞エピトープ又は自己抗原由来のT細胞エピトープである。
【００９７】
また、障害に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料における、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物における、T細胞の総数に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに、好ましくは腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体由来のT細胞エピトープ又は自己抗原由来のT細胞エピトープに特異的であるT細胞の比率が、前記試料において、又は前記得られたT細胞培養物において、T細胞の総量の24%よりも低く、より好ましくは23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、及び更により好ましくは5%よりも低い、本発明による方法が提供される。幾つかの実施形態では、前記試料における、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物におけるT細胞の総数に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるT細胞の、前記試料における、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物における前記比率は、前記試料において、又は前記in vitroでのT細胞培養物において、T細胞の総量の1.7%から4.5%の間であり、好ましくは1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低く、より好ましくは1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低い。1つの好ましい実施形態では、前記T細胞は、CD4+T細胞である。
【００９８】
本発明の別の態様は、目的のエピトープを提示するためのB細胞の使用であって、前記B細胞のin vitroでの複製寿命が、前記B細胞において、Bcl-6及び/又はSTAT5の発現を誘導、増強及び/又は維持することにより、並びに前記B細胞において、抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持することにより延長されることを特徴とする使用を提供する。前記エピトープは、好ましくはT細胞エピトープである。
【００９９】
一実施形態では、本発明による方法は、ある特定の(試験)化合物に対するB細胞の親和性を試験するのに使用される。この実施形態では、B細胞を、例えばB細胞の表面でMHC分子へ直接結合することができないタンパク質又はポリペプチド等の大きな化合物と共にインキュベートする。代わりに、化合物は、B細胞受容体(BCR)を介して内在化されてもよく、或いはされなくてもよい。内在化される場合、化合物はプロセシングされて、続いてB細部の表面で表示される。次に、B細胞をT細胞と共にインキュベートする。T細胞が、アッセイで使用された化合物に由来する表面結合性ペプチドを認識するようである場合、B細胞は、前記化合物を効率的に内在化させることが可能であったと結論付けられる。したがって、このように、B細胞が、1つ又は複数の試験化合物に対して高い親和性を有するかどうかが決定される。次に、1つ又は複数の試験化合物に対する親和性を有するB細胞は、更なる使用のために選択され得る。幾つかの実施形態では、所与の試験化合物に対する幾つかのB細胞の親和性が、互いに比較される。これは、例えば段階希釈実験を使用して可能であり、ここで、B細胞を、減少濃度の所与の試験化合物と共にインキュベートする場合に、T細胞活性化が依然として起きるかどうかが決定される。続いて、試験化合物に対する1つ又は複数の他のB細胞の親和性と比較した場合に、前記試験化合物に対してより高い親和性を有するB細胞が、選択されることが好ましい。
【０１００】
更なる実施形態では、少なくとも1つのB細胞エピトープ及び少なくとも1つのT細胞エピトープの両方を含む化合物が使用される本発明による方法が提供される。B細胞と、このような化合物とのインキュベーションは、化合物由来のペプチドの効率的な内在化及び提示もたらし、得られたB細胞はまた、特に高いT細胞応答を誘発することが可能である。
【０１０１】
本発明は、下記実施例で更に説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定せず、本発明を明確にするのに役立つにすぎない。
【０１０２】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】腫瘍病巣におけるネオ抗原特異的CD4+T細胞の同定に関する実験設定を示す図である。RNA-シーケンシングと組み合わせた腫瘍及び健常材料の全エクソームシーケンシングは、確認されるRNA発現を有する遺伝子内の腫瘍特異的な非同義的突然変異を同定する。この情報を使用して、一方の側上に同定された突然変異それぞれを15アミノ酸伸長させた31アミノ酸長のペプチドで構成される推定ネオエピトープのライブラリーを創出した。Bcl-6及びBcl-xLのレトロウイルス遺伝子移入により不死化された自己B細胞は、対象の全てのMHC-クラスIIハプロタイプに対するCD4+T細胞反応性のプロファイリングを可能にする。ネオ抗原ペプチドを負荷したBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞による同じ対象の黒色腫病巣から入手されるCD4+T細胞の刺激は、高い感度で既存のCD4+T細胞反応性の検出を可能にする。
【図２】分析した黒色腫病巣における突然変異状況の特徴を示す図である。
【図３ａ】ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD4+T細胞の検出を示す図である。(a)ペプチドを負荷した自己B細胞と、in vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞との48時間の共培養後の培養上清中の平均IFN-γ濃度(n=2〜3)。点線は、非負荷B細胞との共培養後のCD4+T細胞の平均IFN-γ産生を示す。誤差棒は、s.d.を表す。CIRH1P>LP=0.0026、GARTV>AP=0.0645、ASAP1P>LP=0.0063、RND3P>SP=0.0061。
【図３ｂｃ】ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD4+T細胞の検出を示す図である。(b,c)(b)NKIRTIL018及び(c)NKIRTIL034に関するin vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞とのペプチドを負荷した自己B細胞の共培養の24時間後の細胞内IFN-γレベルの検出。代表的な実験由来の単一の生CD4+T細胞を表すフローサイトメトリープロット。対照は、非負荷B細胞との共培養後の単一の生CD4+,IFN-γ+T細胞の頻度を示す。棒グラフは、多重実験(n=3)にわたる平均IFN-γ濃度を表す。誤差棒は、s.d.を表す。CIRH1P>LP<0.0001、GARTV>AP=0.0028、ASAP1P>LP=0.0012、RND3P>SP=0.0037。
【図４】BCL-6/BCL-XL又はエプスタインバーウイルス(EBV)不死化自己B細胞を使用した黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD4+T細胞の検出を示す図である。NKIRTIL018に由来するBCL-6/BCL-XL(三角)又はEBV感染(丸)による安定なトランスフェクションにより不死化されたペプチドを負荷した自己B細胞とのin vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞の48時間の共培養後の培養上清におけるIFN-γ濃度。
【図５ａ】推定ネオエピトープに応答した腫瘍内CD4+T細胞によるTH1、TH2及びTH17サイトカインの検出を示す図である。(a)NKIRTIL018由来のin vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞とのペプチドを負荷した自己B細胞の48時間の共培養後の培養上清におけるサイトカイン濃度。点線は、CD4+T細胞と、非負荷B細胞との共培養後のサイトカイン濃度を示す。
【図５ｂ】推定ネオエピトープに応答した腫瘍内CD4+T細胞によるTH1、TH2及びTH17サイトカインの検出を示す図である。(b)NKIRTIL034由来のin vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞とのペプチドを負荷した自己B細胞の48時間の共培養後の培養上清におけるサイトカイン濃度。点線は、CD4+T細胞と、非負荷B細胞との共培養後のサイトカイン濃度を示す。
【図６】非自己突然変異ペプチドライブラリーに対する腫瘍内CD4+T細胞の交差反応性の分析を示す図である。各々他の対象のペプチドライブラリーで負荷した自己B細胞との(a)NKIRTIL018及び(b)NKIRTIL034から入手されるin vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞の48時間の共培養後の培養上清におけるIFN-γ濃度。点線は、非負荷B細胞との共培養後のCD4+T細胞のIFN-γ産生を示す。NKIRTIL018及びNKIRTIL034の同定されたネオエピトープを陽性対照試料として使用した。
【図７ａ】ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD4+T細胞の単離及び特徴付けを示す図である。(a)非負荷(白い棒)又はペプチドを負荷した(黒い棒)自己B細胞とのNKIRTIL018に由来するCIRH1P>L反応性CD4+T細胞クローンの48時間の共培養後の培養上清におけるIFN-γ濃度。
【図７ｂ】ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD4+T細胞の単離及び特徴付けを示す図である。(b)NKIRTIL018及びNKIRTIL034のネオ抗原反応性CD4+T細胞クローン間でのT細胞受容体(TCR)レパートリー多様性。数字は、異なるTCRクロノタイプを示す;灰色のセグメントは、少なくとも2つの分析されるT細胞クローンで同定されるTCRクロノタイプを示す。
【図７ｃ】ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD4+T細胞の単離及び特徴付けを示す図である。(c)指示濃度の突然変異ペプチド(白四角)又は野生型ペプチド(黒丸)で負荷した自己B細胞とのNKIRTIL018に由来するネオ抗原反応性CD4+T細胞クローンの48時間の共培養後の培養上清におけるIFN-γ濃度。TCRクロノタイプは、(b)で決定されるように示される。
【図７ｄ】ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD4+T細胞の単離及び特徴付けを示す図である。(d)突然変異ペプチドの切断型変異体で負荷した自己B細胞とのNKIRTIL018に由来するネオ抗原反応性CD4+T細胞クローンの48時間の共培養後の培養上清における平均IFN-γ濃度(n=2)。誤差棒は、s.d.を表す。CIRH1P>LP=0.1012及びP=0.1514、ASAP1P>LP=0.0005及びP=0.0474。
【図８】ヒト黒色腫病巣由来のネオエピトープ反応性CD4+T細胞の単離を示す図である。非負荷(白い棒)又はペプチドを負荷した(黒い棒)自己B細胞との(a)NKIRTIL018に由来するGARTV>A及びASAP1P>L反応性CD4+T細胞クローン及び(b)NKIRTIL034に由来するRND3P>S反応性CD4+T細胞クローンの48時間の共培養後の培養上清におけるIFN-γ濃度。
【図９】NKIRTIL018のネオ抗原反応性T細胞クローンによる突然変異及び野生型ペプチドの認識を示す図である。指示濃度の突然変異ペプチド(白四角)又は野生型ペプチド(黒丸)で負荷した自己B細胞とのNKIRTIL018に由来するGART1V>A反応性CD4+T細胞クローンの48時間の共培養後の培養上清におけるIFN-γ濃度。
【図１０】養子T細胞療法に使用されるネオ抗原反応性CD4+T細胞産物の同定及び列挙を示す図である。(a)in vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞とのペプチドを負荷した自己B細胞の48時間の共培養後の培養上清における平均IFNγ濃度。点線は、非負荷B細胞との共培養後のCD4+T細胞の平均IFNγ産生を示す。(b)in vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞、又はNKIRTIL027のTIL注入産物のいずれかとのペプチドを負荷した自己B細胞の24時間の共培養後の細胞内IFNγレベルの検出。フローサイトメトリープロットは、代表的な実験由来の単一の生CD4+IFNγ+T細胞を表す。棒グラフは、多重実験にわたる平均IFNγ濃度を表す(n=3)。P=0.0061(in vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞)及び0.0011(TIL注入産物)。誤差棒は、s.d.を表す。(c)自己腫瘍細胞との、又はRPS12V>Iペプチドを負荷したEBV不死化B細胞との16時間の共培養後の対象BOのT細胞注入産物内のCD4+T細胞上でのCD137の発現。フローサイトメトリープロットは、単一の生CD4+T細胞を表す。
【図１１】ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD8+T細胞の検出を示す図である。(a)in vitroで増殖させた腫瘍内CD8+T細胞で自己B細胞上に負荷した582個の異なる31-AAペプチドの48時間の共培養後の培養上清におけるIFN-g濃度(n=1)。(b)非負荷B細胞、無関係ペプチドで負荷したB細胞、及びTTC37A>V31-AAペプチドで負荷したB細胞の48時間の共培養後の培養上清におけるIFN-g濃度。(c)TTC37 11量体エピトープで負荷したHLA-A*01:01多量体による染色後のCD8+多量体+T細胞の割合。
【実施例】
【０１０４】
(実施例1)
突然変異抗原に対する腫瘍内CD4+T細胞反応性は、ヒト黒色腫で一般的に観察される
方法
TIL材料、腫瘍細胞株及びBcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞の生成。PBMC及びTIL材料は、署名されたインフォームドコンセントを受けて、且つNKI-AVLでの医療倫理委員会(Medisch Ethische Toetsingscommissie)の承認後に適用可能である場合に、オランダのガイドラインに従って、ステージIVの黒色腫を有する個体から入手した。
【０１０５】
PBMC材料は、フィコール-アイソパック密度遠心分離により調製した。TIL材料及び短期腫瘍株は、切除した黒色腫病巣から入手した。新鮮な腫瘍材料を、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)、0.01mg ml-1のプルモザイム(Roche社)及び1mg ml-1のコラゲナーゼIV型(BD Biosciences社)を補充したRPMI 1640(Life Technologies社)中で一晩、細分化(minced)及び消化させた。腫瘍株は、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及び10%(v/v)の熱失活させたウシ胎児血清(Sigma-Aldrich社)を補充したRPMI 1640中での得られた細胞懸濁液の培養により入手した。TILは、ペニシリン-ストレプトマイシン、10%(v/v)AB血清(Sanquin Blood Supply and Life Technologies社)、L-グルタミン(Life Technologies社)及び6000IU ml-1のrhIL-2(Novartis社)を補充したRPMI 1640中で懸濁細胞を培養することにより入手した。
【０１０６】
PBMC材料由来の自己B細胞は、これまでに説明されているように15、16、AIMM Therapeutics社による提携契約の一部としてBcl-6/Bcl-xL遺伝子移入により不死化させた。詳細な説明に関してはまた、WO 2007/067046を参照されたい。Bcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(Hyclone社)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及び50ng ml-1 rm-IL21(AIMM Therapeutics社)により補充されたIMDM(Life Technologies社)中で培養して、CD40Lを発現する照射(50Gy)マウスL細胞線維芽細胞(2:1のB細胞/L細胞比)により3〜5日毎に刺激した。
【０１０７】
エクソームシーケンシング。ゲノムDNAを、DNeasy精製キット(Qiagen社)を使用して細胞ペレットから抽出して、Covaris S220 Focused-ultrasonicator(Woburn社)を使用して断片化した。Illumina TruSeq DNAライブラリー調製キットを使用して、DNAライブラリーを創出した。エクソン配列は、修飾を伴うAgilent社のプロトコールに従って、Sure Select Human All Exon 50Mb Target Enrichmentシステム(Agilent社)でDNA断片を捕獲して濃縮させた28。1:2の標準物質ベイト反応物を使用して、ハイブリダイゼーション混合物中のBlock#3を、カスタムNKI-Block#3で置き換えて、TruSeq DNAライブラリーを支持し、そこでは、インデックスは、更なるブロッキングを要する。NKI-Block#3は、16.6μg/μlで等量の2つのDNAオリゴ(IDT-DNA)からなる:
NKI3.1
5'AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGC CGTCTTCTGCTTG/3'ddC/3'
NKI3.2
5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT GCTCTTCCGATCT/3'ddC/3'
【０１０８】
捕獲したライブラリー断片を2つのフラクションに分割して、Illumina P5及びP7オリゴヌクレオチド(IDT-DNA社)を使用して、両方をPCR濃縮した(13サイクル)。
P5プライマー:5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCT3'、
P7プライマー:5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG3'。
【０１０９】
両方のPCR反応は、BioAnalyzer DNA 7500チップ(Agilent社)で定量化して、同様に、Illumina HiSeq2000シーケンサーでのペアエンド75bpシーケンシング用に10nM濃度へ組み合わせて、希釈した。BWAバージョン0.5.10を使用して、読取りをヒト参照ゲノムGRCh37へ整列させた20。PCR複製物は、Picard(http://picard.sourceforge.net)を使用してフィルタリングさせて、挿入及び欠失(挿入欠失)付近の再整列を、GATKツールキットを使用して実施した21。
【０１１０】
体細胞単一ヌクレオチド変異体(SNV)は、Somatic-sniperを使用して要求され22、腫瘍及び対照の両方における34を上回る体細胞スコアカットオフ及び最低4回の読取りを使用してフィルタリングした。体細胞挿入欠失は、GATK体細胞挿入欠失検出器を使用して要求され、25%の最小変異頻度を使用して、また挿入欠失を示す少なくとも5回の読取りを有してフィルタリングした。検出される体細胞変異体の近傍にある生殖系列変異体は、Samtoolsを使用して同定され23、最小被覆率並びにそれぞれ、10回及び6回の読取りの最小数の交互読取りを使用してフィルタリングされた。次に、SNPeff24を使用して、Ensembl遺伝子ビルドバージョン65に対する全ての変異体の効果を予測した。カスタムPerIスクリプト及びEnsembl APIを使用して、コード変異体はcDNA配列へと編集され、続いて、タンパク質配列へ翻訳された。これらのタンパク質配列は、正常(生殖系列変異体のみ)及び腫瘍試料(生殖系列変異体及び腫瘍特異的突然変異)に関して別個に生成させた。
【０１１１】
RNA-シーケンシング。RNAは、TriZol試薬(Life Technologies社)を使用して単離した。ポリA選択RNAライブラリーは、TruSeq RNAライブラリープロトコール(Illumina社)を使用して調製され、ペアエンド50bpシーケンシングをIllumina HiSeq2000で実施した。Tophat 1.4を使用して、読取りをヒト参照ゲノムGRCh37へ整列させた25。Cufflinksを使用して、発現値をFPKMとして算出した26。
【０１１２】
ペプチド合成。ペプチドは、NKIペプチド合成施設(アムステルダム)で、前負荷させたWang樹脂を使用してSYRO IIロボットを用いて標準的なFmoc固相ペプチド化学を使用して、活性化因子及び基材としてPyBop及びDipeaを用いて合成した。
【０１１３】
TIL由来のCD4+T細胞材料の生成及びネオ抗原反応性の検出。細胞選別は、FACSAria I(BD Biosciences社)又はMoFlo Astrios(Beckman Coulter社)で実施した。バルクCD4+T細胞集団は、CD8(BD Biosciences社;SK1;1:50)及びCD4(BD Biosciences社;SK3;1:50)に対する生きた単一CD4+T細胞染色した抗体の選別により、冷凍保存したTIL材料から生成させた。10%AB血清(Life Technologies社)、Glutamax(Life Technologies社)を補充したRPMI 1640及びAIM-Vの1:1(v/v)培地混合物(Life Technologies社)中で、30ng ml-1のCD3特異的抗体(OKT-3; Janssen-Cilag社)及び3,000IU ml-1 rh-IL-2(Novartis社)を使用して、T細胞/支持細胞比1:200で、単離した生きた単一CD4+CD8-T細胞を増殖させて、ネオエピトープに対するT細胞反応性の決定に使用される純粋なCD4+T細胞集団(日常的に97%を上回るCD4+)を入手した。
【０１１４】
ネオエピトープ反応性CD4+T細胞の検出。1ウェル当たり1×105個のBcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞に、10%(v/v)ウシ胎児血清(Hyclone社)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及び50ng ml-1のrm-IL21(AIMM Therapeutics社)により補充されたIMDM培地(Life Technologies社)200μl中で18〜24時間、96丸底プレートにおいてペプチド(別記されない限りは、20μg ml-1)を負荷した。その後、培地を除去して、10%(v/v)AB血清(Life Technologies社)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及び50ng ml-1のrm-IL21(AIMM Therapeutics社)により補充されたRPMI 1640(Life Technologies社)200μl中で、1ウェル当たり1×105個のCD4+T細胞を添加した。48時間後、培養上清を収集して、製造業者のガイドラインに従って、ヒトTH1/TH2/TH17サイトメトリービーズアレイ(BD Biosciences社)又はIFN-γ  FlexビーズE7サイトメトリービーズアレイ(BD Biosciences社)を使用して分析した。フローサイトメトリーによるIFN-γの細胞内レベルの検出に関して、CD4+T細胞を、ペプチドを負荷したB細胞で24時間刺激した。続いて、製造業者のガイドラインに従って、死滅細胞の排除のためのIR-Dye(Life Technologies社)、Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences社)及びIFN-γに対する抗体(BD Biosciences社;25723;1:50)を使用して、細胞を染色した。生IFN-γ産生CD4+T細胞の単離に関して、T細胞を、ペプチドを負荷したB細胞で6時間刺激した。続いて、IFN-γ分泌キャプチャーキット(Miltenyi Biotec社)及びCD4用の抗体(BD Biosciences社;SK3;1:50)を使用して、細胞を染色した。単一の生IFN-γ産生CD4+T細胞をフローサイトメトリーにより選別して、10%AB血清(Life Technologies社)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及びGlutamax(Life Technologies社)で補充されたRPMI 1640及びAIM-Vの1:1(v/v)培地混合物(Life Technologies社)200μl中で、2×105個の照射PBMC、30ng ml-1のCD3特異的抗体(OKT-3;Janssen-Cilag社)及び3,000IU ml-1の組換えヒトIL-2(Novartis社)を含有する96ウェル丸底プ培養レート中に回収した。7日後、100μlを、rh-IL-2(最終3,000IU ml-1)で補充した新鮮な培地と交換して、14日後にネオエピトープに応答したIFN-γを評価することにより、T細胞特異性が確認された。
【０１１５】
TCR配列の同定。T細胞クローンのcDNAを生成及び使用して、Illumina TruSeq DNAライブラリー調製キットを用いてDNAライブラリーを調製した。得られたDNAライブラリーを、ペアエンド150bp化学を使用して、Illumina MiSeqシーケンサーで配列決定した。FASTQファイルにおける配列決定の読取りをヒトゲノムへマッピングして、BWA20及びSAMtools23を使用してNCBI36/hgl8を構築した。得られたBAMファイルにおけるPCR複製物は、Picard(http://picard.sourceforge.net)を使用してフィルタリングさせた。CDR3 TCR配列は、これまでに報告されるように同定した27。TCRα及びβ配列は、社内で開発したパイソンスクリプトで付与した。
【０１１６】
統計分析。サイトカイン産生T細胞のサイトカイン濃度及び頻度の差を、両側スチューデントt検定を使用して比較した。0.05未満のP値を有意であるとみなした;有意性は、P<0.05(*)、P<0.01(**)及びP<0.001(***)として示した。
【０１１７】
結果
ヒトのがんにおける突然変異の結果として生じる腫瘍特異的ネオ抗原1、2は、臨床上使用されるがん免疫療法の有効性にとって重要であると考えられる3〜5。腫瘍特異的CD4+T細胞応答は公知であり、増えてきた証拠により、ネオ抗原は、腫瘍内CD8+T細胞によりに一般的に認識され得ることが示唆される3、4、6一方で、ネオ抗原特異的CD4+T細胞が、ヒト腫瘍内に一般的に存在するかどうかは未知である。ここで、本発明者等は、不死化Bcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞を使用して、腫瘍エクソームシーケンシングにより同定される推定ネオエピトープに対するCD4+T細胞応答の発生を測定する。このアプローチを使用して、本発明者等は、養子T細胞療法後の臨床応答を実証する黒色腫患者を含む、分析した5人の黒色腫患者のうち4人で、ネオ抗原反応性CD4+T細胞の存在を示す。
【０１１８】
I)がん免疫療法の有効性におけるCD4+T細胞に関する役割を支持する証拠7〜12、II)突然変異荷重と、免疫療法に対する臨床応答との間の提唱される相関性13、及びIII)ネオ抗原特異的CD4+T細胞が、転移性胆管細胞癌における腫瘍退縮を媒介し得るという最近の観察10に基づいて、本発明者等は、ネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性が、ヒトのがんにおいて稀な現象であるか、又は一般的な現象であるかどうかを理解していくことを望む。黒色腫の平均突然変異荷重は高い1。更に、黒色腫の細胞療法のために生成される腫瘍浸潤リンパ球(TIL)産物14は、通常はかなりの割合のCD4+T細胞を含有し、臨床効果を潜在的に媒介する7、10。これらのデータのため、本発明者等は、様々な突然変異荷重を用いて、一連の黒色腫検体においてネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性の発生を検査することを選択した。
【０１１９】
これらの腫瘍内の非同義的体細胞突然変異に対する腫瘍内CD4+T細胞応答の発生を評価するために、本発明者等は、全エクソームシーケンシング及びRNA-シーケンシングデータを使用して、まず、発現遺伝子内の一連の腫瘍特異的な非同義的突然変異全体を同定した。続いて、これらの突然変異ペプチドのいずれかに対するCD4+T細胞反応性を、突然変異ペプチドで負荷したレトロウイルスによりBcl-6及びBcl-xL不死化自己B細胞を用いることで分析した15、16(WO 2007/067046も参照)(図1)。
【０１２０】
このスクリーニングプラットフォームは、対症的転移巣切除術を受けた患者由来の3つの黒色腫病巣、NKIRTIL018、NKIRTIL034及びNKIRTIL045の分析により確証された。3つの腫瘍全てが、予想されるUV誘導性の突然変異痕跡を示した一方で、総合的な突然変異荷重は大幅に変化した(範囲:180〜464の体細胞突然変異、図2)1、2。平均して153個の突然変異(範囲:99〜187)が、候補物ネオエピトープとして同定された(確認されるRNA発現を有する遺伝子における腫瘍特異的な非同義的突然変異として定義される)。次に、個々の突然変異を網羅するペプチド(31アミノ酸)を、Bcl-6/Bcl-xL不死化自己B細胞上へ負荷させて、得られた標的を、in vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞と共にインキュベートした(日常的に97%を上回るCD4+)。続いて、本発明者等は、TH1、TH2及びTH17サイトカインIFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、IL-4、IL-6及びIL-17aの存在に関して、培養上清を評価した。対象となるNKIRTIL018に関して、腫瘍由来のCD4+T細胞のIFN-γ産生は、3つの突然変異遺伝子産物CIRH1A P333L(CIRH1AP>L)、GART V551A(GARTV>A)、及びASAP1 P941L(ASAP1P>L)に応答して観察された(図3a)。
【０１２１】
重要なことに、これらのネオ抗原特異的CD4+T細胞の検出は、自己Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞を使用する場合に観察される一定の低いバックグラウンドの結果として容易に実行可能であった。逆に、これらのネオ抗原特異的CD4+T細胞の検出は、自己エプスタインバーウイルス(EBV)不死化B細胞では不可能であった(図4)。
【０１２２】
これにより、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用は、EBV不死化B細胞の使用よりも優れていることが実証される。
【０１２３】
対象となるNKIRTIL034の黒色腫由来のCD4+T細胞はまた、この場合はRhoファミリーGTPアーゼ3 RND P49S(RND3P>S)内の突然変異に対してネオ抗原反応性を示した。最低の突然変異荷重を有する対象であるNKIRTIL027においてのみ、TH-サイトカインの産生により測定する場合のネオ抗原に対する反応性は、腫瘍内CD4+T細胞区画内で観察されなかった(図3a、データは示していない)。NKIRTIL018及びNKIRTIL034の黒色腫病巣内のネオ抗原反応性CD4+T細胞の存在は、抗原刺激時の細胞内IFN-γレベルの分析により確認した(図3b、図3c)。注目すべきことに、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞が使用されるこの実験では、非負荷B細胞との共培養後の単一の生CD4+IFN-γ+T細胞の対照頻度は、0.078%(図3b)又は0.277%(図3c)であった。これは、非負荷Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞と共に共培養したCD4+T細胞のほんの0.078%又は0.277%のみが、IFN-γ産生(T細胞活性化を示す)を表示したことを意味する。重要なことに、これらの対照頻度は、EBV不死化B細胞を使用した場合に得られる1.98%の対照頻度よりも遥かに低かった(実施例3及び図10cを参照)。
【０１２４】
図3b及び図3cに示すように、CIRH1aP>L認識T細胞の頻度は、0.096%(即ち、0.174%-対照頻度0.078%)であった。GARTV>A認識T細胞の頻度は、0.053%(即ち、0.131%-対照頻度0.078%)であった。ASAP1P>L認識T細胞の頻度は、0.264%(即ち、0.342%-対照頻度0.078%)であり、RND3P>S認識T細胞の頻度は、0.246%(即ち、0.523%-対照頻度0.277%)であった。したがって、ネオ抗原認識T細胞は、非常に低頻度で存在したことが明らかである。それにもかかわらず、それらは、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞がT細胞ネオ抗原提示用に使用される本発明による非常に感度の高いスクリーニング方法のおかげで、依然として検出され得る。これらのT細胞は、抗原提示細胞としてEBV不死化B細胞を使用して検出されていない。
【０１２５】
ネオ抗原反応性CD4+T細胞は、試験した他のサイトカインのいずれの産生も示さなかった(図5)。
【０１２６】
T細胞受容体は、多数の異なるエピトープとの相互作用時にT細胞機能を誘発することができ、前記スクリーンでは、多様なT細胞プールが、相当の一連のペプチドの認識に関して試験される。したがって、本発明者等は、観察されるT細胞反応性が、T細胞交差反応性ではなく、本当のネオ抗原駆動型T細胞応答を表したかどうかを、一連の確証スクリーンにおいて評価した。これらのスクリーンでは、NKIRTIL018及びNKIRTIL034のCD4+T細胞プールの、他の対象の一連の潜在的なネオエピトープに対して反応する能力を評価した。この分析により他の対象のネオエピトープのいずれも認識されなかったため、腫瘍由来のCD4+T細胞によるIFN-γ産生が、患者ミュータノーム(mutanome)特異的であることが示され(図6)、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用によって同定されるネオ抗原反応性のCD4+T細胞の存在が、自己黒色腫における抗原の発現により駆動される真のネオ抗原特異的CD4+T細胞応答を反映することを示した。
【０１２７】
これらの黒色腫患者において、ネオ抗原反応性CD4+T細胞区画を更に特徴付けるために、本発明者等は、抗原特異的IFN-γ産生CD4+T細胞の単離により、TILからネオエピトープ反応性CD4+T細胞クローンのパネルを作成した(図7+図8)。ネオ抗原反応性CD4+T細胞の、突然変異同族ペプチドと、その親配列との間を識別する能力を評価するために、ネオ抗原特異的CD4+T細胞を、種々の濃度のいずれかのペプチドで刺激した(図7c+図9)。ASAP1P>L、CIRH1AP>L又はGARTV>Aのいずれかに特異的なT細胞クローン全てに関して、突然変異体ペプチドの認識を、親ペプチドの認識に必要とされる濃度よりも、およそ100〜1,000倍を上回る低い濃度で検出可能であった(図7c+図9)。したがって、自己ミュータノームセットに対するそれらの制限、及びその野生型対応物を上回る突然変異体ペプチドのそれらの優先的認識の両方により、これらの腫瘍常在性CD4+T細胞応答を、真のネオ抗原駆動型T細胞応答として定義する。
【０１２８】
同定されたネオエピトープの2つの切断型により、13アミノ酸(RKITFLHRCLISC;CIRH1AP>L)及び19アミノ酸(KPPPGDLPLKPTELAPKPQ;ASAP1P>L)のペプチドが、依然として高い効率で認識されることが明らかとなった(図7c)。両方のエピトープに関して、突然変異残基は、T細胞活性化におけるこのアミノ酸の必須の役割と一致して、切断型エピトープ内の中心位置に位置していた17、18。4つの同定されたネオエピトープそれぞれに関して、TCRアルファ-ベータ配列は、T細胞クローンの小さなセット(8〜11)に関して得られた。この分析により、ネオエピトープ特異的T細胞応答のTCRレパートリーは概して、オリゴクローナルからポリクローナルまで様々であり、これらの4つのエピトープに関して2〜7個の同定されたTCRクロノタイプを有することが実証された(図7b)。したがって、これらの4つのエピトープに対するネオ抗原特異的T細胞応答は、稀なネオ抗原反応性CD4+T細胞の成長(outgrowth)に起因せず、オリゴクローナルからポリクローナルまで様々である。
【０１２９】
(実施例2)
ネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性が、がんエクソームデータに基づいて容易に検出できること(図3)、及び高頻度のネオ抗原特異的CD4+T細胞を含有するT細胞産物が、胆管細胞癌の部分的退縮を媒介することが近年示されたこと10の観察に基づいて、本発明者等は、ネオ抗原反応性CD4+T細胞区画がまた、養子T細胞療法時に臨床応答を受ける黒色腫患者に普及しているかどうかを分析した。
【０１３０】
第1の患者であるNKIRTIL027は、TIL療法時に部分的臨床応答を示したステージIVの黒色腫患者であった。エクソームシーケンシングにより、この患者の腫瘍における非常に高い突然変異バーデン(burden)が明らかとなった(総計1393個の体細胞突然変異)(図2)。Bcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞を、582個の候補物ネオエピトープの一群で負荷して、非同義的及びRNA発現される突然変異に関するフィルタリング後に同定して、自己黒色腫病巣から増殖させたCD4+T細胞に対する標的として使用した。顕著なことに、この分析により、培養上清におけるIFN-γ産生及びIFN-γ産生の細胞内検出による独立した確認により検出されるように、7つの異なる突然変異遺伝子産物(CPT1A G212S(CPT1AG>S)、HERC4 P768S(HERC4P>S)、GYLTL1B D597E(GYLTL1BD>E)、KRTAP4-11 P187S(KRTAP4-llP>S)、LEMD2 P495L(LEMD2P>L)、DTNBP1 D334H(DTNBP1D>H)、MFSD9 P219L(MFSD9P>L))に対するCD4+T細胞反応性を同定した。特に、この分析により、IFNγ分泌により検出されるように、2 P495L(LEMD2P>L)を含有する突然変異遺伝子産物LEMドメインに対して強力なCD4+T細胞反応性が同定された(図10a)。
【０１３１】
注目すべきことに、対象NKIRTIL027へ注入されたT細胞産物は、かなりの割合のCD4+T細胞を含有していた(全てのCD3+T細胞の70%、データは示していない)。したがって、本発明者等は、養子T細胞療法に使用されるT細胞産物内のネオ抗原反応性CD4+T細胞の頻度を評価した。この分析により、総CD4+T細胞の2.9%(範囲:1.7〜4.5%)の平均頻度を有する注入細胞産物内の7つの異なるネオエピトープ反応性CD4+T細胞集団の存在が明らかとなった。図10bは、細胞内サイトカイン染色により、養子T細胞療法に使用されるT細胞産物内で観察されたLEMD2P>L反応性CD4+T細胞(総CD4+T細胞の3.8%)を表す。
【０１３２】
注目すべきことに、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞が使用されたこの実験ではまた、非負荷B細胞との共培養後の単一の生CD4+,IFN-γ+T細胞の対照頻度は、0.52%(自己黒色腫病巣由来のin vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞)及び0.20%(養子T細胞療法に使用されるTIL注入産物)であった;図10bを参照されたい。重要なことに、これらの対照頻度は、EBV不死化B細胞が使用される場合に得られた対照頻度1.98%よりも遥かに低い(実施例3及び図10cを参照)。
【０１３３】
in vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞におけるLEMD2P>L認識T細胞の頻度は、4.74%(即ち、5.26%-対照頻度0.52%)であった。養子T細胞療法に使用されるTIL注入産物におけるLEMD2P>L認識T細胞の頻度は、3.33%(即ち、3.53%-対照頻度0.20%)であった。
【０１３４】
(実施例3)
次に、本発明者等は、自己腫瘍細胞による末梢血単核球(PBMC)の刺激により得られるin vitroで増殖させた自己腫瘍特異的T細胞の多重注入を受容したステージIVの黒色腫患者(BO)におけるネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性を分析した(ref 19)。治療後に、この患者は、完全な腫瘍寛解を受け、7年間今も継続している。更に、T細胞産物内に存在するCD4+T細胞は、自己黒色腫株の強力な認識を示した(図10c)。Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞は、この対象にはまだ利用可能でなかったため、より大きなバックグラウンドノイズにもかかわらず、自己EBV不死化B細胞を使用しなくてはならなかった。EBV不死化B細胞を、この患者で検出される発現遺伝子内の501個の非同義的突然変異を包含する31量体ペプチドで負荷した。EBV形質転換APCの使用に起因したより高いバックグラウンドノイズにもかかわらず、このスクリーンは、リボソームタンパク質S12の突然変異体バージョン(RPS12 V104I)に向けられた1つの顕著なCD4+T細胞応答(注入産物内の総CD4+T細胞の24%;即ち、26.0%-対照頻度1.98%)を同定した(図10c)。
【０１３５】
注目すべきことに、EBV不死化B細胞を使用したこの実験では、非負荷B細胞との共培養後の単一の生CD4+,IFN-γ+T細胞の対照頻度は、1.98%である。これは、非負荷EBV不死化B細胞と共に共培養したCD4+T細胞の1.98%が、IFN-γ産生(T細胞活性化を示す)を表示したことを意味する。重要なことに、この対照頻度は、実施例1で見られた4つのネオエピトープ特異的T細胞それぞれの頻度よりも遥かに高い。図3b及び図3cに示すように、CIRH1aP>L認識T細胞の頻度は、0.096%(即ち、0.174%-対照頻度0.078%)であった。GARTV>A認識T細胞の頻度は、0.053%(即ち、0.131%-対照頻度0.078%)であった。ASAP1P>L認識T細胞の頻度は、0.264%(即ち、0.342%-対照頻度0.078%)であり、RND3P>S認識T細胞の頻度は、0.246%(即ち、0.523%-対照頻度0.277%)であった。これらの低濃度のネオエピトープ特異的T細胞が、EBV不死化B細胞を使用する場合に存在する遥かに高いバックグラウンドノイズに鑑みて、EBV不死化B細胞を使用して検出されなかったことは明らかである。したがって、EBV不死化B細胞をAPCとして使用した場合、実施例1で同定される4つのネオエピトープ特異的T細胞全てを見逃してきた。これにより、T細胞(ネオ)エピトープ提示APCとしてのBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用の優位性が強調される。
【０１３６】
結論
前記データは、WO 2007/067046に従う方法で不死化されるB細胞が、T細胞エピトープのT細胞認識を試験するための好ましいAPCであることを示す。
【０１３７】
実施例1及び実施例2に示すように、EBV不死化B細胞は、高レベルのバックグラウンドノイズを提供するので、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用は、EBV不死化B細胞の使用よりも優れている。逆に、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞をAPCとして使用する場合、バックグラウンドノイズは、存在したとしても遥かに低い。これは、例えば図4に示される。
【０１３８】
これはまた、APCとしてのBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用で得られる図3b及び図3cの低い対照頻度(それぞれ、0.078%及び0.277%)と、APCとしてのEBV不死化B細胞の使用で得られる図10の高い対照頻度(1.98%)との間の比較からも明らかである。実際に、図10の対照頻度は、図3に表すネオエピトープ特異的T細胞の頻度よりも遥かに高い。
【０１３９】
その結果として、より感度の高い検出方法が、本発明により提供され、それにより、低頻度で存在するT細胞の検出が可能となる。例えば、総CD4+T細胞の2.9%の平均頻度を有する7つの異なるネオエピトープ反応性CD4+T細胞集団が、APCとしてBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞を使用して、実施例1で同定された。EBV不死化B細胞を用いた場合、総CD4+T細胞の24%の遥かに高い頻度を有する唯一の顕著なCD4+T細胞応答が検出された(即ち、26.0%-対照頻度1.98%)。
【０１４０】
(実施例4)
ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD8+T細胞の検出
この実施例は、ネオエピトープ特異的CD4+T細胞応答の同定に関してこれまでの実施例で記載されるような、APCとしてのBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用がまた、ネオエピトープ特異的CD8+T細胞応答を同定するのにも適していることを示す。
【０１４１】
患者NKIRTIL027のエクソーム及びRNAシーケンシングデータ(実施例2を参照)に基づいて、0 FPKMを上回るRNA発現を有する582個の腫瘍特異的単一ヌクレオチド変異体を同定した。これらの突然変異を包含する31アミノ酸のペプチドを合成して、Bcl-6/Bcl-xL不死化自己B細胞上に負荷した。CD8濃縮腫瘍浸潤T細胞(TIL)との48個の共培養を実施して、IFNg濃度を培養上清で測定した。CD8濃縮TIlと、1つのペプチド(TTC37A>V)とのインキュベーションは、バックグラウンドを超える(即ち、非負荷B細胞の対照シグナルを超える)シグナルをもたらした。これは、図11aに示される。この結果の確証として、IFNg濃度が培養上清で測定された別個の共培養を実施した(図11b)。並行して、エピトープ予測を実施し、ここでは、31個のAAエピトープをnetMHCpanへ供給して、患者のHLA-A及びHLA-B対立遺伝子に対する親和性に関して試験した。推定候補物11量体エピトープは、HLA-A*01:01に結合すると予測された。HLA-A*01:01 TTC37A>V多量体を生成させて、2つの異なる蛍光色素にコンジュゲートされた。CD8+濃縮T細胞産物の染色は、全てのCD8+T細胞の0.737%の二重陽性多量体染色をもたらした(図11c)。
【０１４２】
ネオエピトープ特異的CD8及びCD4制限T細胞応答の両方のスクリーニングのためのAPCとしてのBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用の利用可能性は、がん免疫療法の分野で、この分析プラットフォームの価値を大いに高める。
【０１４３】
実施例1〜4の参考文献
[参考文献]
2017520276.tif 000002
2017520276.tif 000003
2017520276.tif 000004
【図１】
2017520276.tif 000005
【図２】
2017520276.tif 000006
【図３ａ】
2017520276.tif 000007
【図３ｂｃ】
2017520276.tif 000008
【図４】
2017520276.tif 000009
【図５ａ】
2017520276.tif 000010
【図５ｂ】
2017520276.tif 000011
【図６ａ】
2017520276.tif 000012
【図６ｂ】
2017520276.tif 000013
【図７ａ】
2017520276.tif 000014
【図７ｂ】
2017520276.tif 000015
【図７ｃ】
2017520276.tif 000016
【図７ｄ】
2017520276.tif 000017
【図８ａ】
2017520276.tif 000018
【図８ｂ】
2017520276.tif 000019
【図９】
2017520276.tif 000020
【図１０】
2017520276.tif 000021
【図１１】
2017520276.tif 000022
【国際調査報告】
2017520276.tif 000023
2017520276.tif 000024
2017520276.tif 000025
2017520276.tif 000026
2017520276.tif 000027