(57)【要約】  本開示は、Ａ）  容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で連続培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができる前記ステップ、およびＢ）  ステップａ）から製造された前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ、を含んでなる前記アデノウイルスの連続製造方法であって、ウイルス感染および製造用の生細胞を、連続製造期間前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持し、１回以上の培地交換または添加と、１回以上の細胞交換または添加とを含んでなる、前記方法に関する。本開示は、前記方法から得られる、または得られ得るウイルス集団にも及ぶ。【選択図】  図９
2017529070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）  容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で連続培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができる前記ステップ、および
Ｂ）  ステップａ）から製造された前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ、
を含んでなる前記アデノウイルスの連続製造方法であって、
ウイルス感染および製造用の生細胞を、連続製造期間前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持し、
１回以上の培地交換または添加を含んでなり、感染後の１つ以上の時点で、少なくとも一部の細胞を交換する、または細胞を添加する、前記方法。
【請求項２】
前記ウイルスがＡｄ１１などのＢ群アデノウイルスからのヘキソンおよび繊維を有し、特に前記ウイルスがＥｎＡｄである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスが複製能を有す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記連続製造期間が２回以上のウイルス複製サイクルを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
各ウイルス複製サイクルが、３０〜３００時間、例えば７０〜３００時間または６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００時間などの３０〜１００時間の範囲内にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
感染後の１つ以上の時点で、５０，０００以上の細胞当りウイルス粒子を製造する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ウイルス感染および製造用の生細胞を、培養物への細胞の添加によって、前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
感染後の１つ以上の時点で、細胞を前記培養物から取り出す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、Ａ５４９、ＰｅｒＣ６、およびＧＭＫを含んでなる群から選択され、特にＨＥＫ２９３である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
感染多重度が、５〜５０ｖｐ／細胞、例えば１０〜２０ｖｐ／細胞などの５〜４９ｖｐ／細胞、特に１２．５ｖｐ／細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞を出発濃度が１〜４×１０６のウイルスに感染させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
灌流培養を用いる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
浮遊培養を用いる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
懸垂培養を用いる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＣｓＣｌ勾配法、イオン交換クロマトグラフィー、特に陰イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップ、およびそれらの組み合わせから選択される精製ステップをさらに含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
１回以上の培地交換または添加を含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
貯蔵に適するバッファー中に前記ウイルスを配合することをさらに含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ａ．  容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができ、前記ウイルスの出発播種密度が１〜２×１０６ｖｐ／ｍｌの範囲内（１×１０６ｖｐ／ｍｌなど）にあり、感染多重度が１０〜１５ｖｐ／細胞などの５〜２０ｖｐ／細胞の範囲内にあり、特に１２．５ｖｐ／細胞である、前記ステップ、および
ｂ．  ウイルス感染後２４〜７５時間の期間に溶解ステップを実施して前記細胞から前記ウイルスを収集するステップであって、例えば前記溶解ステップを感染後６６，６７、６８、または６９時間など感染後６５〜７０時間で実施する、前記ステップ、
を含んでなる前記アデノウイルスの製造方法。
【請求項１９】
前記ウイルスがＢ群ウイルス、例えばＥｎＡｄである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１回以上の培地交換または添加を含んでなる、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
感染後の１つ以上の時点で、少なくとも一部の細胞を交換する、または細胞を添加する、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法から得られる、または得られ得るウイルスまたは配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、特定のアデノウイルス、例えばキメラ型アデノウイルス、および／または複製能を有するアデノウイルス、および／またはＢ群ウイルスの製造方法、ならびに前記方法から得られるウイルス製品に関する。
【０００２】
本明細書は、２０１４年８月２７日に出願されたＧＢ１４１５１５４．２および２０１４年９月３日に出願されたＧＢ１４１５５８１．６からの優先権を主張し、これらは両方とも、本明細書の一部を構成するものとして援用される。
【背景技術】
【０００３】
現今では、医薬品分野は、ウイルスのヒトへの使用のための治療薬としての可能性を実現しつつある。今日まで、ＯＮＸＹ−１５（ＯＮＹＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｕｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈより入手可能）由来のウイルスは、限られた数の国々で、頭頸部癌における使用が承認されている。しかしながら、多くのウイルスが現在臨床試験段階にあり、うまくいけば、これらのウイルスの一部がヒトでの使用のために登録されることになるであろう。
【０００４】
多くのウイルス療法は、アデノウイルスをベースとしており、例えばＥｎＡｄ（ＣｏｌｏＡｄ１）は、キメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルス（国際公開第２００５／１１８８２５号）であり、現在結腸直腸癌の治療のための臨床試験段階にある。
【０００５】
これらのアデノウイルスをベースとする治療薬は、臨床試験と登録後の需要の両方を賄うのに適した量で、適正製造基準（ＧＭＰ）に準拠した条件下で製造される必要がある。
【０００６】
製造方法の一部として、インビトロで、例えば細胞浮遊培養で、ウイルスを哺乳類細胞内で増殖させる。ウイルスをこれらの細胞から細胞溶解によって回収し、その後精製する。図１は、Kamen & Henry 2004 (J Gene Med. 6: pages 184-192)からの抜粋であり、ＧＭＰグレードのアデノウイルスの製造に関する方法の模式図を示す。なお、ウイルス複製後、細胞を溶解する。
【０００７】
溶解後の細胞からの夾雑ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、重大な問題であり得、治療用アデノウイルス最終製品から可能な限り取り除かなければならない。このことは、国際公開第２０１１／０４５３８１号の出願で詳細が記載されており、この出願では、細胞の溶解、細胞浮遊液中でのＤＮＡの断片化または沈殿、および細胞浮遊液の清澄化が記載されており、タンジェンシャルフローが採用されている。また、ＤＮアーゼでのＤＮＡ消化が、図１で第３ステップとして示されている。
【０００８】
成功となる組み換え型アデノウイルスの方法を開発するためには、基礎的な宿主細胞株の生理および代謝；組み換え型ウイルス、ならびに細胞株とウイルスの相互作用についての詳細な理解が必要とされる。本質的に、方法は、特定の種類のウイルスまたはウイルスベクターに応じた調節を必要とする。
【０００９】
また、臨床での使用に適した組み換え型ウイルスの製造コストは、比較的高い。製造効率を高める、例えばウイルスの収率を上げる改良法が、規制承認を得る組み換え型ウイルス製品について臨床上の需要を満たし得ることを保証するため、および製造コストを削減するために必要とされている。
【００１０】
驚くべきことに、本発明者は、細胞培地からウイルスを単離し、細胞を溶解する必要性を回避し、それによってウイルス製品中のＤＮＡおよびＨＣＰの夾雑の出発レベルを著しく減少させ得る連続的方法によって、特定のアデノウイルス、例えば、複製能を有するアデノウイルス、およびキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルス、およびＢ群アデノウイルスを製造できることを立証した。
【００１１】
また、本発明者は、ウイルス、例えばＢ群ウイルス製品を所与の時点で培養物中のどこに存在させるのか、すなわち、上清中に存在させるのか、または細胞ペレットに結合させるのかについて制御を可能にするパラメーターを確立した。このことは、方法を必要に応じて調節することを可能にする。
【発明の概要】
【００１２】
従って、本開示は、
アデノウイルス（例えばＢ群アデノウイルス）の連続製造方法であって、
ａ．容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で連続培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができる前記ステップ、および
ｂ．ステップａ）から製造された前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ、
を含んでなり、ウイルス感染および製造用の生細胞を、連続製造期間前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持する前記方法を与える。
【００１３】
従って、本開示は、複製能を有するアデノウイルス；Ｂ群ウイルス、アデノウイルスデスプロテイン（death protein）をコードしない、または発現しないアデノウイルス、Ｅ２Ｂ領域を含んでなるゲノムを有する複製可能である、または複製欠損であるキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスであって、前記Ｅ２Ｂ領域が第１のアデノウイルス血清型に由来する塩基配列および第２の異なるアデノウイルス血清型に由来する塩基配列を含んでなり、前記第１および第２の血清型がアデノウイルスサブ群Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、またはＦからそれぞれ選択される、前記キメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルス、ならびにそれらのうち２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるウイルスの連続製造方法であって、
ａ．容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で連続培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができる前記ステップ、および
ｂ．ステップａ）から製造された前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ、
を含んでなり、ウイルス感染および製造用の生細胞を、連続製造期間前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持する前記方法を与える。
従って、一実施形態において、本開示は、
複製能を有するアデノウイルス；または
Ｅ２Ｂ領域を含んでなるゲノムを有する複製可能である、もしくは複製欠損であるキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスであって、前記Ｅ２Ｂ領域が第１のアデノウイルス血清型に由来する塩基配列および第２の異なるアデノウイルス血清型に由来する塩基配列を含んでなり、前記第１および第２の血清型がアデノウイルスサブ群Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、もしくはＦからそれぞれ選択される、前記キメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルス、
の連続製造方法であって、
ａ．容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で連続培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができる前記ステップ、および
ｂ．ステップａ）から製造された前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ、
を含んでなり、ウイルス感染および製造用の生細胞を、連続製造期間前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持する前記方法を与える。
一つの独立した態様において、Ｂ型アデノウイルスの連続製造方法であって、
ａ．容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で連続培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができる前記ステップ、および
ｂ．ステップａ）から製造された前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ、
を含んでなり、ウイルス感染および製造用の生細胞を、連続製造期間前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持する前記方法が与えられる。
【００１４】
一実施形態において、Ｂ型アデノウイルスは、Ｅ２Ｂ領域を含んでなるゲノムを有するキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスであって、前記Ｅ２Ｂ領域が第１のアデノウイルス血清型に由来する塩基配列および第２の異なるアデノウイルス血清型に由来する塩基配列を含んでなり、前記第１および第２の血清型がアデノウイルスサブ群Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、またはＦからそれぞれ選択される、前記キメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスである。
【００１５】
一実施形態において、腫瘍崩壊性ウイルスは、同じ血清型、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐからの繊維、ヘキソンタンパク質、およびペントンタンパク質を有し、これらは、例えばＡｄ１１ｐのゲノム配列の３０８１２〜３１７８９、１８２５４〜２１１００、および１３６８２〜１５３６７の位置に見られ、これらのヌクレオチドの位置は、ジェンバンクＩＤ２１７３０７３９９（アクセッション番号：ＧＣ６８９２０８）に対応している。
【００１６】
一実施形態において、アデノウイルスは、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄとしても知られており、以前はＥｎＡｄとして知られていた）である。ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖは、本明細書で用いられる場合、配列番号１２のキメラ型アデノウイルスを意味する。これは、野生型アデノウイルスに比べて治療上の特性が向上している、複製能を有する腫瘍崩壊性キメラ型アデノウイルスである（国際公開第２００５／１１８８２５号を参照されたい）。ＥｎＡｄは、Ａｄ１１ｐおよびＡｄ３からのＤＮＡを特徴付けるキメラ型Ｅ２Ｂ領域を有し、Ｅ３／Ｅ４には欠損がある。ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖにおける構造的変化は、Ａｄ１１ｐよりも約３．５ｋｂ小さいゲノムをもたらし、このことにより、導入遺伝子の挿入のための余分な「スペース」が与えられる。
【００１７】
ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２もまた、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖと類似のキメラ型アデノウイルスであり、ゲノムに余分な「スペース」を同様に有する（国際公開第２００８／０８０００３号を参照されたい）。従って、一実施形態において、アデノウイルスは、ＯｖＡｄ１またはＯｖＡｄ２である。
【００１８】
一実施形態において、Ｂ群アデノウイルスは、式（I）：
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ  （I）
を含んでなるゲノムを含んでなり、
式中：
Ｂ１は、結合であるか、またはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、もしくはＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含んでなり；
ＢＡは、Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４であり；
Ｂ２は、結合であるか、またはＥ３を含んでなり、
ＢＸは、結合であるか、または制限部位、１つ以上の導入遺伝子、もしくは両方を含んでなるＤＮＡ配列であり；
ＢＢはＬ５を含んでなり；
ＢＹは、結合であるか、または制限部位、１つ以上の導入遺伝子、もしくは両方を含んでなるＤＮＡ配列であり；
Ｂ３は、結合であるか、またはＥ４を含んでなり、
ＢＸおよびＢＹのうち少なくとも１つは、結合ではなく、例えば、ＢＸおよびＢＹのうち少なくとも１つは、導入遺伝子、制限部位、または両方を含んでなり、例えば導入遺伝子を含んでなる。
従って、一実施形態において、Ｂ型アデノウイルスが複製能を有する、本開示に係る連続方法が与えられる。
【００１９】
式（I）：
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ
の配列を含んでなる複製能を有するＢ群アデノウイルスであって、
式中：
Ｂ１は、結合であるか、またはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、もしくはＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含んでなり；
ＢＡは、−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含んでなり；
Ｂ２は、結合であるか、またはＥ３を含んでなり；
ＢＸは、結合であるか、または制限部位、１つ以上の導入遺伝子、もしくは両方を含んでなるＤＮＡ配列であり；
ＢＢはＬ５を含んでなり；
ＢＹは、導入遺伝子およびスプライスアクセプター配列を含んでなる導入遺伝子カセットを含んでなり；かつ
Ｂ３は、結合であるか、またはＥ４を含んでなり、
前記導入遺伝子カセットが、Ｅ４および主要後期プロモーターからなる群から選択される内在性プロモーターの制御下にあり、前記導入遺伝子カセットが、偏りのない挿入が起こるトランスポゾンを含まない、前記複製能を有するＢ群アデノウイルス。
【００２０】
式（I）のウイルスは、本明細書の一部を構成するものとして援用される国際公開第２０１５／０５９３０３号に開示されている。
【００２１】
一実施形態において、アデノウイルスは、本明細書で配列表に開示されている配列である。
【００２２】
一実施形態において、本開示の方法に用いられるウイルスは、完全長のアデノウイルスゲノムよりも小さいゲノムを含有し、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくはそれ以上のアデノウイルスゲノム、または５０％、６０％、７０％、８０％、もしくはそれ以上のアデノウイルスゲノムとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含有する。
【００２３】
一実施形態において、本開示のウイルスは、Ｅ３領域の一部または全体が欠失されている。理論に拘束されることを望むものではないが、発明者は、この領域の部分的または完全な欠失が、ウイルス複製の速度を上げ得、場合によっては、インビボでの有益な特性を与え得ると考えている。
【００２４】
一実施形態において、本開示に用いられるウイルスは、Ｅ４領域の一部または全体が欠失されている。理論に拘束されることを望むものではないが、発明者は、Ｅ４領域の部分的な欠失が、ウイルス複製の速度を上げ得、場合によっては、インビボでの有益な特性を与え得ると考えている。
【００２５】
一実施形態において、本開示に用いられるウイルスは、その複製能を保持するようなＥ４領域の部分的な欠失がある。
【００２６】
一実施形態において、本開示に用いられるウイルスは、必要に応じて、Ｅ３領域の一部または全体が欠失されており、Ｅ４領域の一部または全体が欠失されている。
【００２７】
一実施形態において、アデノウイルスは、Ｂ群アデノウイルス、例えばＡｄ１１またはＥｎＡｄからのヘキソンおよび繊維を有す。
【００２８】
一実施形態において、Ｂサブ群（Ａｄ１１など、特にＳｌｏｂｉｔｓｋｉ系統としても知られているＡｄ１１ｐ）の繊維およびヘキソンを有するアデノウイルスであって、例えばＥ３の一部もしくは全体、および／またはＥ４領域の一部または全体が欠失している前記アデノウイルスの連続製造方法であって、
ａ．容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で連続培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができる前記ステップ、および
ｂ．ステップａ）からの前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ、
を含んでなり、ウイルス感染および製造用の生細胞を、連続製造期間前記ウイルスの複製に適したレベルに培養物中で維持する前記方法が与えられる。
【００２９】
一実施形態において、本開示で用いられるウイルスは、導入遺伝子を含んでなっても良い。
【００３０】
一実施形態において、Ｂ型アデノウイルスなどの本開示のアデノウイルスは、複製可能であるか、または複製欠損である。
【００３１】
一実施形態において、アデノウイルスは、複製能を有するか、複製欠損であり、例えば、複製能を有す。複製欠損であるアデノウイルスも、本明細書でウイルスベクターと呼ばれる。
【００３２】
一実施形態において、キメラ型ウイルスは、複製能を有するか、複製能欠損であり、例えば、複製能を有す。
【００３３】
一実施形態において、本開示で用いられるウイルスは、機能性アデノウイルスデスプロテイン（death protein）またはその機能性断片を発現せず、特に、アデノウイルスデスプロテイン（death protein）またはその断片を発現しない。
【００３４】
一実施形態において、本開示のウイルスは、機能性アデノウイルスデスプロテイン（death protein）またはその機能性断片をコードするＤＮＡ配列を含まず、特に、アデノウイルスデスプロテイン（death protein）またはその断片をコードする配列を含まない。
【００３５】
一実施形態において、本開示で用いられるアデノウイルスは、コクサッキーウイルス・アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）を介して細胞に感染するアデノウイルスではない。
【００３６】
一実施形態において、本開示で用いられるアデノウイルスは、ＣＤ４６を介して細胞に感染するアデノウイルスであり、例えばＢ群アデノウイルスである。
【００３７】
一実施形態において、ウイルス、例えば複製能を有するウイルスは、Ｃ群ウイルスではない。
【００３８】
一実施形態において、ウイルス、例えば複製能を有するウイルスは、Ａｄ５ではない。
【００３９】
一実施形態において、連続製造期間は、２ウイルスサイクル以上であり、例えば７０〜３００時間である。
【００４０】
一実施形態において、方法は、収集ステップを２つ以上含んでなる。
【００４１】
一実施形態において、方法は、感染後３０時間または３５時間など２４時間以上で開始され、例えば方法が終了するまで続く、ウイルスの連続収集を含んでなる。
【００４２】
一実施形態において、例えば方法の最後に、特に細胞中に留まっているウイルスを回収するために、１回の細胞溶解ステップがある。
【００４３】
一実施形態において、方法は、収集したウイルスの１つ以上の画分をまとめることを含んでなる。
【００４４】
一実施形態において、方法は、例えば、２４、３０、３５、４０、４５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７２、７５、８０、８５、９０、９５、または９６時間などの１つ以上の時点で独立して選択される、培養物中への新鮮細胞の１回以上の添加、例えば、１、２、３、４、または５回の添加を行うステップを含んでなる。
【００４５】
一実施形態において、方法は、新鮮培地を添加する１つ以上のステップを含んでなる。一実施形態において、方法は、例えば、感染後２４、３０、３５、４０、４５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７２、７５、８０、８５、９０、９５、または９６時間など感染後１２〜９６時間の任意の時点で、１回以上培地を交換または添加することを含んでなる。
【００４６】
一実施形態において、方法は、
例えば、２４、３０、３５、４０、４５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７２、７５、８０、８５、９０、９５、または９６時間などの１つ以上の時点で独立して選択される、培養物中への新鮮細胞の１回以上の添加、例えば、１、２、３、４、または５回の添加を行うステップ、および
例えば、感染後２４、３０、３５、４０、４５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７２、７５、８０、８５、９０、９５、または９６時間など感染後１２〜９６時間の任意の時点で、新鮮培地を添加する、または培地を交換するステップ、を含んでなる。
【００４７】
一実施形態において、細胞を、出発濃度が１〜９×１０５、１〜９×１０６、１〜９×１０７、１〜９×１０８、１〜９×１０９ｖｐ／ｍｌなど１〜９×１０４ｖｐ／ｍｌ以上、特に１〜５×１０７ｖｐ／ｍｌ、特に１×１０６ｖｐ／ｍｌとしては例えば約１×１０６ｖｐ／ｍｌ、４〜５×１０６ｖｐ／ｍｌである、ウイルスに感染させる。
【００４８】
一実施形態において、感染多重度（ＭＯＩ）は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３１．２５、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５など２〜７５の範囲内にあり、例えば、１２．５、３１．２５、または５０である。一実施形態において、感染多重度は、１２．５ｖｐ／細胞など１０〜１５ｖｐ／細胞の範囲内にある。
【００４９】
一実施形態において、ＭＯＩは、２〜５０ｖｐ／細胞の範囲内、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｖｐ／細胞など５〜２０ｖｐ／細胞の範囲内にあり、例えば１２．５ｖｐ／細胞である。
【００５０】
一実施形態において、播種密度は１．９×１０６または４×１０６であり、感染多重度は５０である。
【００５１】
一実施形態において、播種密度は１×１０６ｖｐ／ｍｌなど１〜１．９×１０６ｖｐ／ｍｌの範囲内にあり、感染多重度は１２．５など１０〜１５の範囲内にある。
【００５２】
本開示の一実施形態において、用いられる培養法は、灌流培養である。
【００５３】
本開示の一実施形態において、用いられる細胞は、付着性である。
【００５４】
本開示の一実施形態において、用いられる細胞は、浮遊培養に適する。
【００５５】
一実施形態において、本開示の方法で用いられる培養法は、浮遊培養、付着培養（adherent culture）、灌流培養、またはそれらの組み合わせであり、例えば浮遊培養である。
【００５６】
本開示に係る連続製造方法は、以下の利点：臨床での使用のために十分な量のウイルスを製造可能にすることによって製造効率を高めること、キャンペーン生産に費やす時間を削減し、ひいては商品のコストを削減すること、および複数のマスターウイルスシードストックを準備する必要性を最小限にするという点において製造の複雑性を低減し、それによりコストも削減し得ること、のうち１つ以上を有するという点において有利である。
【００５７】
本明細書に記載の方法のその他の利点として、例えば収率の増加によって、方法の規模を縮小させることができることが挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明者は、細胞当りのレベルが高いウイルスを細胞が製造することを可能にするパラメーターを確立した。この独立した態様において、培養法は、例えば、出発播種細胞密度が低いことと併せて感染多重度が低いことによって特徴付けられる。
【００５９】
従って、一つの独立した態様において、アデノウイルスの複製に適した細胞を感染させる方法であって、出発播種密度が１．５×１０６ｖｐ／ｍｌ以下など２×１０６ｖｐ／ｍｌ以下であり、例えば１×１０６ｖｐ／ｍｌであり、感染多重度が１４、１３、１２．５、１２、１１または１０など１５以下であり、例えば１２．５である、前記方法が与えられる。
【００６０】
従って、一つの独立した態様において、アデノウイルスの複製に適した細胞を感染させる方法であって、出発播種密度が１．９×１０６であり、感染多重度が５０ｐｐｃである、前記方法が与えられる。
【００６１】
ある時点で、例えば約７２時間以上で、２００，０００細胞当りウイルス粒子という高い収率が、本明細書に記載の条件を採用すると、達成され得る。一実施形態において、例えば４８、５０、５５、６０、６５、または７０時間後に、細胞当り製造されたウイルスは、１００，０００を超える。
【００６２】
培養法が低い播種密度および低い感染多重度を採用するこの実施形態において、ウイルスを容易に収集し得る。
【００６３】
また、本発明者は、方法のパラメーターを変えることによって、ウイルスをどこに存在させるのか、例えば細胞中、上清中、またはそれらの組み合わせに存在させるのかに対する制御が与えられ得ることを立証した。このことは、本開示のさらなる態様を形成する。
【００６４】
特に、低い感染多重度と低い播種密度によって、ウイルス製品は圧倒的に細胞中に存在するようになるが、方法が終了に近くなると、ウイルスは上清にも見られる。また、低い感染多重度と低い播種密度は、特に培地を変えたときに、非常に高い細胞当りの収率を与えた。
【００６５】
また、高い感染多重度と高い播種密度によって、方法が終了に近くなると、ウイルス粒子の大部分は上清に存在するようになる。
【００６６】
高い感染多重度と低い播種密度によって、方法が終了に近くなると、ウイルス製品のほとんどは上清中に得られる。
【００６７】
対照的に、低い感染多重度と高い播種密度によって、特に培地を変えなかったときに、細胞中にウイルスが得られた。
【００６８】
中程度の感染多重度と中程度の播種密度によって、特に培地の交換がなかったときに、上清および細胞中にウイルス製品が得られる。
【００６９】
さらに、高い感染多重度と高い播種密度によって、培地の交換があってもなくても、主に上清中にウイルス製品が得られるようである。
【００７０】
このように、驚くべきことに、方法のパラメーターを制御することにより、ウイルス製品の所在を制御し得る。一実施形態において、上清と宿主細胞への組み換え型ウイルス（特に本明細書に記載のアデノウイルス）の分配を制御する方法であって、ａ）宿主細胞培養物（特に哺乳類細胞、例えば、特に浮遊培養物としては、本明細書に記載の哺乳類細胞）を与えること、ｂ）播種密度、感染多重度、および感染期間（培養期間）を選択して、上清および宿主細胞から選択される所望の場所にウイルス製品を与えること、ｃ）培養上清および宿主細胞中の組み換え型ウイルスの収率を適切な時点で測定すること、ならびにｄ）ステップ（ｃ）で測定した上清中および細胞中での収率を比較し、ステップｂ）で選択した播種密度および感染多重度を維持するか、または播種密度、感染多重度、もしくは両方を変えて、上清と細胞への組み換え型ウイルスの分配を換えるかを選び、組み換え型ウイルスの１次回収に適合させること、を含む前記方法が与えられる。
【００７１】
一実施形態において、本開示に係るパラメーターを制御する方法は、異なる条件について、すなわち、播種密度、感染多重度、または両方が第１の方法で用いたパラメーターから変えられている方法と、並行して実施するステップを含んでなり、このことによって、２つの異なる方法の比較が可能となる。
【００７２】
一実施形態において、８０％以上の組み換え型ウイルスは、上清中にあり、例えば、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％が上清中に存在する。
【００７３】
一実施形態において、例えば本明細書に定義されているように、低い感染多重度を採用し、低い播種密度を採用する場合、４８〜６５時間の感染期間に亘って、８０％以上の組み換え型ウイルスは、細胞中にあり、例えば、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％が細胞中に存在する。また、培地交換又は添加は、収率を最大化するのに役立ち得る。
【００７４】
従って、一つの独立した態様において、アデノウイルス（例えばＢ群アデノウイルスなどの本明細書に記載のウイルス）の製造方法であって、
ａ．容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができ、前記ウイルスの出発播種密度が（１×１０６ｖｐ／ｍｌなど）１〜２×１０６ｖｐ／ｍｌの範囲内にあり、感染多重度が１０〜１５などの５〜２０の範囲内にあり、特に１２．５である、前記ステップ、および
ｂ．ウイルス感染後２４〜７５時間の期間に溶解ステップを実施して前記細胞から前記ウイルスを収集するステップであって、例えば前記溶解ステップを感染後６６，６７、６８、または６９時間など感染後６５〜７０時間に実施する、前記ステップ、
を含んでなる前記方法が与えられる。
【００７５】
一実施形態において、方法は、ＧＭＰ製造法である。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本開示の詳細な説明
本開示のウイルスは、文脈上他を意味しない限り、キメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスを含む、複製可能である、複製能を有する、または複製欠損であるアデノウイルスを総称するように本明細書で通常用いられている。
【００７７】
複製可能とは、本明細書で用いられる場合、複製能を有するウイルスまたは細胞内で選択的に複製し得るウイルスを意味する。癌細胞内で選択的に複製するウイルスは、ｐ５３遺伝子など癌細胞でアップレギュレーションされている遺伝子又はタンパク質を複製に必要とするウイルスである。
【００７８】
複製能を有するウイルスとは、本明細書で用いられる場合、Ｅ１領域がコードするタンパク質などの必須のウイルスタンパク質をコードする補完的細胞株（パッケージング細胞株とも呼ばれる）の補助なく複製可能であるウイルス、およびヘルパーウイルスの補助なく複製可能であるウイルスを意味する。
【００７９】
一実施形態において、ウイルスは、複製能を有する。
【００８０】
複製欠損のウイルスは、ベクターであり、複製可能であるためには、パッケージング細胞株またはヘルパーウイルスの使用を必要とする。
【００８１】
アデノウイルスとは、用いられる場合、文脈上他を意味しない限り、複製能を有するアデノウイルスまたは複製欠損、例えばＢ群ウイルス、特にＡｄ１１ｐなどのＡｄ１１を通常意味するものとする。場合によって、アデノウイルスは、複製能を有するウイルスのみを意味するように用いられることがあるが、このことは、文脈から明らかであろう。
【００８２】
一実施形態において、アデノウイルスは、複製能を有する。
【００８３】
アデノウイルスベクターとは、複製欠損のアデノウイルスを通常意味するものとする。
【００８４】
Ｂサブ群（Ｂ群またはＢ型）とは、本明細書で用いられる場合、Ｂ群アデノウイルスからの繊維およびヘキソンを少なくとも有するウイルス、例えば、Ｂ群ウイルスからの実質的にゲノム全体を有するウイルスなどのＢ群ウイルスからのカプシド全体を有するウイルスを意味する。一実施形態において、Ｂ群ウイルスは、アデノウイルスデスプロテイン（death protein）、例えばＵｎｉｐｒｏｔ番号がＰ２４９３５のタンパク質などの１１．６４ＫダルトンのＡＤＰタンパク質をコードしない。
【００８５】
今日までに調べられているヒトアデノウイルスの全ゲノムは、同じ一般的構成を有する。すなわち、特定の機能をコードする遺伝子は、ウイルスゲノムの同じ位置にある（本明細書では構造要素と呼ばれる）。ウイルスゲノムの各末端は、ウイルス複製に必要な逆方向末端反復（またはＩＴＲ）として知られる短い配列を有す。ウイルスゲノムは、５つの初期転写単位（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４）、３つの後発型初期単位（IX、IVａ２、およびＥ２後期）、ならびにプロセッシングされて５つのファミリーの後期ｍＲＮＡ（Ｌ１〜Ｌ５）を生じる１つの後期単位（主要後期）を含む。初期遺伝子がコードするタンパク質は、主に、複製および宿主細胞の感染に対する応答の調節に関与し、一方、後期遺伝子は、ウイルスの構造タンパク質をコードする。初期遺伝子は、頭に文字Ｅが付き、後期遺伝子は、頭に文字Ｌが付く。
【００８６】
アデノウイルスのゲノムはぎっしりと詰まった状態であり、すなわち、非コード配列がほとんどなく、それ故に、導入遺伝子を挿入するのに適した位置を見つけるのが困難であり得る。本発明者は、導入遺伝子が許容される２つのＤＮＡ領域を特定した。特に、特定した部位は、抗体をコードする導入遺伝子など複雑な導入遺伝子を収容するのに適している。すなわち、式（I）のウイルス中の位置ＢＸおよび／または位置ＢＹの導入遺伝子は、ウイルスの生存率、腫瘍崩壊性などの元来の特性、または複製に悪影響を与えることなく発現される。
【００８７】
一実施形態において、アデノウイルスは、Ｅ３領域に部分的または完全な欠失がある。
【００８８】
Ｅ３領域の一部が欠失しているとは、本明細書で用いられる場合、Ｅ３領域の少なくとも一部、例えば、１〜９９％の範囲が欠失していることを意味し、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、または９８％が欠失していることを意味する。
【００８９】
一実施形態において、アデノウイルスは、Ｅ４領域に部分的な欠失がある。ウイルスは、Ｅ４領域の一部のみが欠失している場合、複製能を有したまま維持され得る。
【００９０】
Ｅ４領域の一部が欠失しているとは、本明細書で用いられる場合、Ｅ４領域の少なくとも一部、例えば、１〜９９％の範囲が欠失していることを意味し、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、または９８％が欠失していることを意味する。本開示のアデノウイルスにおいて、複製を可能にするのに十分なＥ４が保持されるべきである。
【００９１】
キメラ（またはキメラ型ウイルス）とは、本明細書で用いられる場合、通常、２つ以上の異なる血清型、例えば群Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦから独立して選択される血清型からのゲノムＤＮＡを含んでなるアデノウイルスを意味し、複製可能である、複製能を有する、または複製欠損であるキメラ型腫瘍崩壊性ウイルスなどを意味するものとする。一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスは、複製能を有し、例えば、ＥｎＡｄ、ＯｖＡｄ１、またはＯｖＡｄ２である。
【００９２】
一実施形態において、キメラ型ウイルスは、ＥｎＡｄ（配列番号１２）またはその派生物、例えば導入遺伝子を組み込むように構成された派生物であり、これらの例は以下で論じる。
【００９３】
一実施形態において、キメラは、Ｅ３領域に部分的または完全な欠失がある。
【００９４】
Ｅ３領域の一部が欠失しているとは、本明細書で用いられる場合、Ｅ３領域の少なくとも一部、例えば、１〜９９％の範囲が欠失していることを意味し、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、または９８％が欠失していることを意味する。
【００９５】
一実施形態において、キメラは、Ｅ４領域に部分的または完全な欠失がある。
【００９６】
Ｅ４領域の一部が欠失しているとは、本明細書で用いられる場合、Ｅ４領域の少なくとも一部、例えば、１〜９９％の範囲が欠失していることを意味し、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、または９８％が欠失していることを意味する。本開示のアデノウイルスにおいて、複製を可能にするのに十分なＥ４が保持されるべきである。
【００９７】
導入遺伝子とは、本明細書で用いられる場合、ウイルスにとって反自然的（外来性）であるか、ウイルスのその特定の位置に通常は見られない遺伝子である、ゲノム配列に挿入された遺伝子を意味する。導入遺伝子の例は、以下で挙げる。また、導入遺伝子は、本明細書で用いられる場合、挿入されたときに完全長遺伝子の機能、または機能の大部分を実行するのに適した遺伝子の一部である、遺伝子の機能性断片も含む。
【００９８】
導入遺伝子およびコード配列は、文脈上他を意味しない限り、ウイルスゲノムへの挿入との関連において、本明細書で交換可能に使用される。コード配列とは、本明細書で用いられる場合、例えば、機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。通常、コード配列は、対象の機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする導入遺伝子に対するｃＤＮＡである。対象の機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、以下で説明する。
【００９９】
ウイルスゲノムがＤＮＡのコード配列を含むことは明らかである。ウイルスのゲノム配列内の内在性（自然発生の遺伝子）は、本明細書との関連において、非自然的位置もしくは非自然的環境に存在するように、または非自然的機能を有するように組み換え技術により改変されていない限り、導入遺伝子としてみなされない。
【０１００】
一実施形態において、導入遺伝子とは、本明細書で用いられる場合、１つの生物体から単離され、異なる生物体、すなわち、本開示のウイルスに導入された遺伝子またはｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡのセグメントを意味する。一実施形態において、このＤＮＡの外来セグメントは、機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を生産する能力を保持し得る。
【０１０１】
従って、一実施形態において、挿入される導入遺伝子は、ヒトまたはヒト化タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする。
【０１０２】
一実施形態において、挿入される導入遺伝子は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマなどからの、非ヒトタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチド（非ヒト哺乳類タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドなど）、またはＲＮＡ分子をコードする。有利なことに、本開示のウイルスは、導入遺伝子を癌性細胞の中に運ぶことを可能にする。従って、非ヒト配列（タンパク質など）に対してヒト患者が起こす応答は、この細胞内輸送により最小化され得る。
【０１０３】
ＤＮＡ配列は、１、２、３、または４個の導入遺伝子など１個以上の導入遺伝子を含んでなり得、例えば１または２個の導入遺伝子を含んでなり得る。
【０１０４】
導入遺伝子カセットは、１、２、３、または４個の導入遺伝子など１個以上の導入遺伝子を含んでなり得、例えば１または２個の導入遺伝子を含んでなり得る。
【０１０５】
導入遺伝子カセットとは、本明細書で用いられる場合、１つ以上の導入遺伝子をコードする１つ以上のコード配列の形態のＤＮＡ配列、および１つ以上の調節要素を意味する。
【０１０６】
導入遺伝子カセットは、１つ以上のモノシストロニックおよび／またはポリシストロニックｍＲＮＡ配列をコードし得る。
【０１０７】
一実施形態において、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、モノシストロニックまたはポリシストロニックｍＲＮＡをコードし、例えば、該カセットは、内在性プロモーターもしくは外来性プロモーターまたはそれらの組み合わせの制御下でのアデノウイルスゲノムへのある位置での挿入に適している。
【０１０８】
モノシストロニックｍＲＮＡとは、本明細書で用いられる場合、１つの機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を意味する。
【０１０９】
一実施形態において、導入遺伝子カセットは、モノシストロニックｍＲＮＡをコードする。
【０１１０】
一実施形態において、導入遺伝子カセットとは、モノシストロニックｍＲＮＡをコードするカセットとの関連において、（導入遺伝子が活性化する場所および時期を決定し得る調節配列である）外来性プロモーター、または（ｍＲＮＡ分子がスプライセオソームにより切断され得る時期を決定する調節配列である）スプライス部位、通常対象のタンパク質に対するｃＤＮＡ由来であるコード配列（すなわち、導入遺伝子）を含んでいても良いＤＮＡのセグメントを意味し、ポリＡシグナル配列およびターミネーター配列を含んでいても良い。
【０１１１】
一実施形態において、導入遺伝子カセットは、１つ以上のポリシストロニックｍＲＮＡ配列をコードし得る。
【０１１２】
ポリシストロニックｍＲＮＡとは、本明細書で用いられる場合、２つ以上の機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはそれらの組み合わせをコードするｍＲＮＡ分子を意味する。一実施形態において、導入遺伝子カセットは、ポリシストロニックｍＲＮＡをコードする。
【０１１３】
一実施形態において、導入遺伝子カセットは、ポリシストロニックｍＲＮＡをコードするカセットとの関連において、（導入遺伝子が活性化する場所および時期を決定し得る調節配列である）外来性プロモーター、または（ｍＲＮＡ分子がスプライセオソームにより切断され得る時期を決定する調節配列である）スプライス部位、通常対象のタンパク質またはペプチドに対するｃＤＮＡ由来である２つ以上のコード配列（すなわち、導入遺伝子）を含んでいても良いＤＮＡのセグメントを含み、例えば、各コード配列は、それぞれがＩＲＥＳまたは２Ａペプチドのどちらかにより隔てられている。転写される最後のコード配列の後に、該カセットは、必要に応じて、ポリＡ配列およびターミネーター配列を含んでも良い。
【０１１４】
一実施形態において、導入遺伝子カセットは、モノシストロニックｍＲＮＡと、その後にポリシストロニックｍＲＮＡをコードする。別の実施形態において、導入遺伝子カセットは、ポリシストロニックｍＲＮＡと、その後にモノシストロニックｍＲＮＡをコードする。
【０１１５】
一実施形態において、ＢＸは、１、２、３、または４個の制限部位など制限部位を含んでなり、例えば、１または２個の制限部位を含んでなる。一実施形態において、ＢＸは、１個以上の導入遺伝子を含んでなり、例えば、１または２個の導入遺伝子を含んでなる。一実施形態において、ＢＸは、１または２個の導入遺伝子など１個以上の導入遺伝子および２または３個の制限部位など１個以上の制限部位を含んでなり、特に制限部位が遺伝子またはＤＮＡ配列を挟んでいる場合、ゲノムから特異的に遺伝子が切り取られること、および／または置換されることを可能にするように遺伝子を含んでなる。あるいは、制限部位は、各遺伝子を挟んでいても良く、例えば、２個の導入遺伝子がある場合、遺伝子が選択的に切り取られること、および／または置換されることを確実に可能にするために、３つの異なる制限部位が必要である。一実施形態において、１つ以上、例えば全ての導入遺伝子は、導入遺伝子カセットの形態である。一実施形態において、ＢＸは、配列番号１０を含んでなる。一実施形態において、配列番号１０は、例えば導入遺伝子によって、分断される。実施形態において、配列番号１０は、分断されない。一実施形態において、ＢＸは、制限部位を含まない。一実施形態において、ＢＸは、結合である。一実施形態において、ＢＸは、１つ以上の導入遺伝子を含んでなるか、または１つ以上の導入遺伝子からなる。
【０１１６】
一実施形態において、ＢＹは、１、２、３、または４個の制限部位など制限部位を含んでなり、例えば、１または２個の制限部位を含んでなる。一実施形態において、ＢＹは、１個以上の導入遺伝子を含んでなり、例えば、１または２個の導入遺伝子を含んでなる。一実施形態において、ＢＹは、１または２個の導入遺伝子など１個以上の導入遺伝子および２または３個の制限部位など１個以上の制限部位を含んでなり、特に制限部位が遺伝子またはＤＮＡ配列を挟んでいる場合、ゲノムから特異的に遺伝子が切り取られること、および／または置換されることを可能にするように遺伝子を含んでなる。あるいは、制限部位は、各遺伝子を挟んでいても良く、例えば、２個の導入遺伝子がある場合、遺伝子が選択的に切り取られること、および／または置換されることを確実に可能にするために、３つの異なる制限部位が必要である。一実施形態において、１つ以上、例えば全ての導入遺伝子は、導入遺伝子カセットの形態である。一実施形態において、ＢＹは、配列番号１１を含んでなる。一実施形態において、配列番号１１は、例えば導入遺伝子によって、分断される。実施形態において、配列番号１１は、分断されない。一実施形態において、ＢＹは、制限部位を含まない。一実施形態において、ＢＹは、結合である。一実施形態において、ＢＹは、１つ以上の導入遺伝子を含んでなるか、または１つ以上の導入遺伝子からなる。
【０１１７】
一実施形態において、ＢＸおよびＢＹは、それぞれ、１、２、３、または４個の制限部位など制限部位を含んでなり、例えば、１または２個の制限部位を含んでなる。一実施形態において、ＢＸおよびＢＹは、それぞれ、１個以上の導入遺伝子を含んでなり、例えば、１または２個の導入遺伝子を含んでなる。一実施形態において、ＢＸおよびＢＹは、それぞれ、例えば、１または２個の導入遺伝子など１個以上の導入遺伝子および２または３個の制限部位など１個以上の制限部位を含んでなり、特に制限部位が遺伝子またはＤＮＡ配列を挟んでいる場合、ゲノムから特異的に遺伝子が切り取られること、および／または置換されることを可能にするように遺伝子を含んでなる。あるいは、制限部位は、各遺伝子を挟んでいても良く、例えば、２個の導入遺伝子がある場合、遺伝子が選択的に切り取られること、および／または置換されることを確実に可能にするために、３つの異なる制限部位が必要である。一実施形態において、１つ以上、例えば全ての導入遺伝子は、導入遺伝子カセットの形態である。一実施形態において、ＢＸおよびＢＹは、それぞれ、配列番号１０および配列番号１１を含んでなる。一実施形態において、ＢＸおよびＢＹは、制限部位を含まない。一実施形態において、ＢＸは結合であり、ＢＹは結合ではない。一実施形態において、ＢＹは結合であり、ＢＸは結合ではない。
【０１１８】
一実施形態において、導入遺伝子は、ＢＸ内にある。一実施形態において、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、ＢＹ内にある。一実施形態において、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、ＢＸおよびＢＹ内にあり、例えば、それぞれの場所で、導入遺伝子は同じであっても良く、または異なっていても良い。
【０１１９】
当該ウイルスコンストラクト内の導入遺伝子を、初期遺伝子から除かれる位置に挿入することが有利であるが、その理由は、このことによって、ウイルスの遺伝子発現または複製速度に影響を与える可能性が減ることにある。
【０１２０】
一つの独立した態様において、血清型１１の複製能を有する腫瘍崩壊性アデノウイルスまたはそのウイルス派生物であって、繊維、ヘキソン、およびカプシドが血清型１１であり、ウイルスゲノムが、治療用抗体または抗体結合断片をコードするＤＮＡ配列を含んでなり、前記ＤＮＡ配列が、Ｅ４および主要後期プロモーターからなるものから選択される、アデノウイルスにとって内在性のプロモーターの制御下にあり、その結果導入遺伝子がウイルス複製を干渉せず、例えば、治療用抗体または抗体結合断片をコードするＤＮＡ配列が、Ｅ４プロモーターの制御下、あるいは腫瘍後期プロモーターの制御下にあり、特に、治療用抗体または抗体結合断片をコードするＤＮＡ配列がウイルスのゲノム配列内で（すなわち、ウイルスの配列の３’末端方向に）Ｌ５の後に位置する、前記アデノウイルスまたはそのウイルス派生物が与えられる。有利なことに、内在性プロモーターの使用によって、導入遺伝子の挿入に利用可能なスペースの量が最大化される。
【０１２１】
有利なことに、これらのプロモーターの制御下にあるときに、ウイルスは、複製能を保持し、かつ、完全長抗体としての抗体、または適当な結合断片、またはその他のタンパク質を発現することができる。従って、選択された抗体またはその他のタンパク質は、癌細胞によって発現され得る。内在性プロモーターを用いると、抗体、断片、またはその他のタンパク質を発現するために挿入される必要がある導入遺伝子カセットのサイズが小さくなるので、内在性プロモーターを用いることが有利であり得る。すなわち外来性プロモーターが含まれる必要はないので、導入遺伝子カセットは、小さくなり得る。
【０１２２】
また、導入遺伝子を継続して転写するようになり、不適切な濃度の抗体または断片をもたらし得る構成的外来性プロモーターとは対照的に、ウイルス中の内在性プロモーターを用いることは、ウイルスが複製するときにのみ導入遺伝子が発現されるので、治療上有利であり得る。
【０１２３】
一実施形態において、抗体または断片の発現は、主要後期プロモーターの制御下にある。
【０１２４】
一実施形態において、抗体または断片の発現は、Ｅ４プロモーターの制御下にある。
【０１２５】
一つの独立した態様において、血清型１１の複製能を有する腫瘍崩壊性アデノウイルスまたはそのウイルス派生物であって、繊維、ヘキソン、およびカプシドが血清型１１であり、ウイルスゲノムが、治療用抗体または抗体結合断片をコードするＤＮＡ配列を含んでなり、前記ＤＮＡ配列が、ウイルス複製サイクルの後期に発現されるウイルスゲノムの一部に位置し、その結果導入遺伝子がウイルス複製を干渉せず、前記ＤＮＡ配列がアデノウイルスにとって外来性のプロモーターの制御下にあり、例えば、治療用抗体または抗体結合断片をコードするＤＮＡ配列が、ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、特に、治療用抗体または抗体結合断片をコードするＤＮＡ配列がウイルスのゲノム配列内で（すなわち、ウイルスの配列の３’末端方向に）Ｌ５の後に位置する、前記アデノウイルスまたはそのウイルス派生物が与えられる。
【０１２６】
外来性プロモーターを用いることは、抗体または断片を強く、かつ構成的に発現することができるので、有利であり得、いくつかの状況で、例えば、患者が非常に広汎性の癌である場合に、特に有用であり得る。
【０１２７】
一実施形態において、抗体または断片の発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【０１２８】
一実施形態において、外来性プロモーターは、このＤＮＡ配列と関連があり、例えば、抗体または断片をコードする発現カセットの一部である。
【０１２９】
一実施形態において、抗体または断片をコードするＤＮＡ配列は、ウイルス配列内でＬ５遺伝子の後に位置する。有利なことに、本発明者は、ウイルスのライフサイクルまたはベクターの安定性に悪影響を与えることなく、外来性または内在性プロモーターの制御下で、様々な導入遺伝子をＢＸおよび／またはＢＹに挿入することができることを立証した。
【０１３０】
一実施形態において、導入遺伝子は、１つ以上のコード配列（すなわち、１つ以上の導入遺伝子）、ならびに以下：
i．  外来性プロモーターまたはスプライスアクセプターなどの遺伝子発現のレギュレーター
ii．  内部リボソーム進入（ＩＲＥＳ）ＤＮＡ配列；
iii．  自己切断効率が高い２ＡペプチドをコードするＤＮＡ配列；
iv．  ポリアデニレーション配列をコードするＤＮＡ配列、および
v．  それらの組み合わせ
から独立して選択される任意の１つ以上の要素を含んでなる導入遺伝子カセットの一部である。
【０１３１】
従って、一実施形態において、導入遺伝子カセットは、i）またはii）またはiii）またはiv）を含んでなる。
【０１３２】
一実施形態において、導入遺伝子カセットは、i）およびii）、またはi）およびiii）、またはi）およびiv）、またはii）およびiii）、またはii）およびiv）、またはiii）およびiv）を含んでなる。
【０１３３】
一実施形態において、導入遺伝子カセットは、i）およびii）およびiii）、またはi）およびii）およびiv）、またはi）およびiii）およびiv）、またはii）およびiii）およびiv）を含んでなる。
【０１３４】
一実施形態において、導入遺伝子カセットは、i）およびii）およびiii）およびiv）を含んでなる。
【０１３５】
一実施形態において、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、例えばタンパク質コード配列の始まりに、ｍＲＮＡの翻訳を補助するＫｏｚａｋ配列を含んでなる。
【０１３６】
アデノウイルスに適当な位置で組み込まれたときに、ＩＴＲの機能を保持する。一実施形態において、５’ＩＴＲは、約１ｂｐ〜１３８ｂｐの配列番号１２からの配列、または全長に亘って配列番号１２からの配列と９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含んでなり、またはからなり、特に、約１ｂｐ〜１３８ｂｐの配列番号１２からなる配列を含んでなる、またはからなる。
【０１３７】
３’ＩＴＲとは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスに適当な位置で組み込まれたときにＩＴＲの機能を保持する、アデノウイルスの３’末端からのＩＴＲの一部または全体を意味する。一実施形態において、３’ＩＴＲは、約３２１８９ｂｐ〜３２３２６ｂｐの配列番号１２からの配列、または 全長に亘って配列番号１２からの配列と９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含んでなり、またはからなり、特に、約３２１８９ｂｐ〜３２３２６ｂｐの配列番号１２からなる配列を含んでなる、またはからなる。
【０１３８】
Ｂ１とは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスからのＥ１Ａの一部または全体、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域の一部または全体、ならびにアデノウイルスのＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域のそれぞれの一部または全体をコードするＤＮＡ配列を意味する。
【０１３９】
Ｂ１が結合であるとき、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ配列は、ウイルスから取り除かれることになる。一実施形態において、Ｂ１は結合であり、従って、ウイルスはベクターである。
【０１４０】
一実施形態において、Ｂ１は、導入遺伝子をさらに含んでなる。Ｅ１領域は、Ｅ１領域に分断するように（すなわち、配列の「中央」に）挿入され得る導入遺伝子を収容し得るか、またはＥ１領域の一部または全体が欠失して、遺伝物質を収容するより広い空間を与え得ることが、当業で知られている。
【０１４１】
Ｅ１Ａとは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスのＥ１Ａ領域の一部または全体をコードするＤＮＡ配列を意味する。ここでＥ１Ａ領域は、ポリペプチド／タンパク質Ｅ１Ａを意味する。Ｅ１Ａ遺伝子がコードするタンパク質が、保存的または非保存的アミノ酸変化を有し、それにより、野生型と同じ機能（すなわち、対応する非変異タンパク質）、野生型タンパク質と比べて向上した機能、野生型タンパク質と比べて機能がないなど低下した機能、もしくは野生型タンパク質と比べて新しい機能、またはこれらの組み合わせを必要に応じて有するように、Ｅ１Ａは変異されていても良い。
【０１４２】
Ｅ１Ｂとは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域（すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質）の一部または全体をコードするＤＮＡ配列を意味し、Ｅ１Ｂ遺伝子／領域がコードするタンパク質が、保存的または非保存的アミノ酸変化を有し、それにより、野生型と同じ機能（すなわち、対応する非変異タンパク質）、野生型タンパク質と比べて向上した機能、野生型タンパク質と比べて機能がないなど低下した機能、もしくは野生型タンパク質と比べて新しい機能、またはこれらの組み合わせを必要に応じて有するように、Ｅ１Ｂは変異されていても良い。
【０１４３】
従って、Ｂ１は、野生型Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂなど野生型Ｅ１領域に対して改変がなされている、またはなされていないことがあり得る。当業者は、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂが存在または（部分的に）欠失もしくは変異しているかどうかを簡単に特定することができる。
【０１４４】
野生型とは、本明細書で用いられる場合、公知のアデノウイルスを意味する。公知のアデノウイルスは、配列が利用可能であるかに関わらず、同定され名称を付けられたアデノウイルスである。
【０１４５】
一実施形態において、Ｂ１は、１３９ｂｐ〜３９３２ｂｐの配列番号１２からの配列を有す。
【０１４６】
ＢＡとは、本明細書で用いられる場合、必要に応じて任意の非コード配列を含む、Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４領域をコードするＤＮＡ配列を意味する。通常、この配列は、導入遺伝子を含まないものとする。一実施形態において、該配列は、公知のアデノウイルス、例えば表１に示されている血清型、特にＢ群ウイルス、例えばＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１、またはそれらの組み合わせ、例えばＡｄ３、Ａｄ１１、またはそれらの組み合わせ、からの連続した配列と実質的に類似または同一である。一実施形態において、Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４とは、これらの要素および該領域に関連するその他の構造要素を含んでなることを意味し、例えば、ＢＡは、例えば以下：ＩＶ２Ａ  ＩＶ２ａ−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４のように、タンパク質IV２ａをコードする配列を通常含むものとする。
【０１４７】
一実施形態において、Ｅ２Ｂ領域はキメラ型である。すなわち、２つ以上の異なるアデノウイルスの血清型から、例えばＡｄ３およびＡｄ１１ｐなどのＡｄ１１からのＤＮＡ配列を含んでなる。一実施形態において、Ｅ２Ｂ領域は、５０６８ｂｐ〜１０３５５ｂｐの配列番号１２からの配列、または全長に亘って配列番号１２からの配列と９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の配列を有す。
【０１４８】
一実施形態において、要素ＢＡ中のＥ２Ｂは、（国際公開第２００５／１１８８２５号に開示されている配列番号３に対応する）配列番号４７に示されている配列を含んでなる。
【０１４９】
一実施形態において、ＢＡは、３９３３ｂｐ〜２７１８４ｂｐの配列番号１２からの配列を有す。
【０１５０】
Ｅ３とは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスのＥ３領域（すなわち、タンパク質／ポリペプチド）の一部または全体をコードするＤＮＡ配列を意味し、Ｅ３遺伝子がコードするタンパク質が、保存的または非保存的アミノ酸変化を有し、それにより、野生型と同じ機能（対応する未変異タンパク質）、野生型タンパク質と比べて向上した機能、野生型タンパク質と比べて機能がないなど低下した機能、もしくは野生型タンパク質と比べて新しい機能、またはこれらの組み合わせを必要に応じて有するように、Ｅ３は変異されていても良い。
【０１５１】
一実施形態において、Ｅ３領域は、表１に与えられているアデノウイルスの血清型またはそれらの組み合わせ、特にＢ群血清型、例えばＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１、またはそれらの組み合わせ、例えばＡｄ３、Ａｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）、またはそれらの組み合わせ、を形成する。
【０１５２】
一実施形態において、Ｅ３領域は、部分的に欠失しており、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％欠失している。
【０１５３】
一実施形態において、Ｂ２は結合であり、Ｅ３領域をコードするＤＮＡは存在しない。
【０１５４】
一実施形態において、Ｅ３領域をコードするＤＮＡは、導入遺伝子によって置換されているか、または分断されていることがあり得る。「導入遺伝子で置換されたＥ３領域」とは、本明細書で用いられる場合、導入遺伝子で置換されたＥ３領域の一部または全体を含む。
【０１５５】
一実施形態において、Ｂ２領域は、２７１８５ｂｐ〜２８１６５ｂｐの配列番号１２からの配列を含んでなる。
【０１５６】
一実施形態において、Ｂ２は、２７１８５ｂｐ〜２８１６５ｂｐの配列番号１２からの配列からなる。
【０１５７】
ＢＸとは、本明細書で用いられる場合、ＢＢ内のＬ５遺伝子の５’末端近傍のＤＮＡ配列を意味する。Ｌ５遺伝子の５’末端近傍または近位とは、本明細書で用いられる場合、Ｌ５遺伝子の５’末端またはそこに先天的に付随する非コード領域に隣接（近接）していること、すなわち、Ｌ５遺伝子の５’プライム末端またはそこに先天的に付随する非コード領域に隣接または近接していることを意味する。あるいは、近傍または近位とは、Ｌ５遺伝子と近く、従ってＢＸ領域とＬ５遺伝子の５’末端との間にコード配列がないことを意味し得る。
【０１５８】
従って、一実施形態において、ＢＸは、Ｌ５遺伝子のコード配列の始まりを例えば表すＬ５の塩基と直接連結している。
【０１５９】
従って、一実施形態において、ＢＸは、非コード配列の始まりを例えば表すＬ５の塩基と直接連結しているか、またはＬ５に天然に付随する非コード領域と直接結合している。Ｌ５に天然に付随する非コード領域とは、本明細書で用いられる場合、Ｌ５遺伝子の一部であるか、またはＬ５遺伝子に近接しているが別の遺伝子の一部ではない非コード領域全体の一部を意味する。
【０１６０】
一実施形態において、ＢＸは、配列番号１０の配列を含んでなる。この配列は、導入遺伝子（もしくは導入遺伝子カセット）、制限部位、またはそれらの組み合わせを例えば含んでなるＤＮＡ配列が挿入されても良い人工非コード配列である。この配列は、緩衝物として働き、導入遺伝子の正確な位置に対してある程度の自由度を許容する一方で、ウイルスの安定性および生存率への破壊的な影響を最小化するという点から有利である。
【０１６１】
挿入は、配列番号１０内の５’末端から３’末端の任意の場所で、またはｂｐ１〜２０１の間の任意のポイントで、例えば塩基対１／２、２／３、３／４、４／５、５／６、６／７、７／８、８／９、９／１０、１０／１１、１１／１２、１２／１３、１３／１４、１４／１５、１５／１６、１６／１７、１７／１８、１８／１９、１９／２０、２０／２１、２１／２２、２２／２３、２３／２４、２４／２５、２５／２６、２６／２７、２７／２８、２８／２９、２９／３０、３０／３１、３１／３２、３２／３３、３３／３４、３４／３５、３５／３６、３６／３７、３７／３８、３８／３９、３９／４０、４０／４１、４１／４２、４２／４３、４３／４４、４４／４５、４５／４６、４６／４７、４７／４８、４８／４９、４９／５０、５０／５１、５１／５２、５２／５３、５３／５４、５４／５５、５５／５６、５６／５７、５７／５８、５８／５９、５９／６０、６０／６１、６１／６２、６２／６３、６３／６４、６４／６５、６５／６６、６６／６７、６７／６８、６８／６９、６９／７０、７０／７１、７１／７２、７２／７３、７３／７４、７４／７５、７５／７６、７６／７７、７７／７８、７８／７９、７９／８０、８０／８１、８１／８２、８２／８３、８３／８４、８４／８５、８５／８６、８６／８７、８７／８８、８８／８９、８９／９０、９０／９１、９１／９２、９２／９３、９３／９４、９４／９５、９５／９６、９６／９７、９７／９８、９８／９９、９９／１００、１００／１０１、１０１／１０２、１０２／１０３、１０３／１０４、１０４／１０５、１０５／１０６、１０６／１０７、１０７／１０８、１０８／１０９、１０９／１１０、１１０／１１１、１１１／１１２、１１２／１１３、１１３／１１４、１１４／１１５、１１５／１１６、１１６／１１７、１１７／１１８、１１８／１１９、１１９／１２０、１２０／１２１、１２１／１２２、１２２／１２３、１２３／１２４、１２４／１２５、１２５／１２６、１２６／１２７、１２７／１２８、１２８／１２９、１２９／１３０、１３０／１３１、１３１／１３２、１３２／１３３、１３３／１３４、１３４／１３５、１３５／１３６、１３６／１３７、１３７／１３８、１３８／１３９、１３９／１４０、１４０／１４１、１４１／１４２、１４２／１４３、１４３／１４４、１４４／１４５、１４５／１４６、１４６／１４７、１４７／１４８、１４８／１４９、１５０／１５１、１５１／１５２、１５２／１５３、１５３／１５４、１５４／１５５、１５５／１５６、１５６／１５７、１５７／１５８、１５８／１５９、１５９／１６０、１６０／１６１、１６１／１６２、１６２／１６３、１６３／１６４、１６４／１６５、１６５／１６６、１６６／１６７、１６７／１６８、１６８／１６９、１６９／１７０、１７０／１７１、１７１／１７２、１７２／１７３、１７３／１７４、１７４／１７５、１７５／１７６、１７６／１７７、１７７／１７８、１７８／１７９、１７９／１８０、１８０／１８１、１８１／１８２、１８２／１８３、１８３／１８４、１８４／１８５、１８５／１８６、１８６／１８７、１８７／１８８、１８９／１９０、１９０／１９１、１９１／１９２、１９２／１９３、１９３／１９４、１９４／１９５、１９５／１９６、１９６／１９７、１９７／１９８、１９８／１９９、１９９／２００、または２００／２０１の間で起こり得る。
【０１６２】
一実施形態において、ＢＸは、配列番号１２のｂｐ２７とｂｐ２８の間、または位置２８１９２ｂｐと位置２８１９３ｂｐの間に相当する場所にＤＮＡ配列が挿入されている配列番号１０を含んでなる。
【０１６３】
一実施形態において、挿入は制限部位挿入である。一実施形態において、制限部位挿入は、１または２個の制限部位を含んでなる。一実施形態において、制限部位は、２個の制限部位を含んでなる１９ｂｐの制限部位挿入である。一実施形態において、制限部位挿入は、１個の制限部位を含んでなる９ｂｐの制限部位挿入である。一実施形態において、制限部位挿入は、１または２個の制限部位と、１個以上の導入遺伝子、例えば１または２個の導入遺伝子とを含んでなる。一実施形態において、制限部位は、２個の制限部位と、１個以上の導入遺伝子、例えば１または２個の導入遺伝子とを含んでなる１９ｂｐの制限部位挿入である。一実施形態において、制限部位挿入は、１個の制限部位と、１、２、または３個の導入遺伝子などの１個以上の導入遺伝子、例えば１または２個の導入遺伝子とを含んでなる９ｂｐの制限部位挿入である。一実施形態において、２個の制限部位は、（例えば導入遺伝子カセット内の）２個など１個以上の導入遺伝子を挟む。一実施形態において、ＢＸが２個の制限部位を含んでなるとき、前記制限部位は、互いに異なる。一実施形態において、ＢＸ内の前記１個以上の制限部位は、制限部位が挿入された特定のアデノウイルスゲノム内の非天然型のものである。一実施形態において、ＢＸ内の前記１個以上の制限部位は、アデノウイルスゲノム内の他の場所に位置する他の制限部位とは異なり、例えば、天然型制限部位および／またはＢＹに導入された制限部位などのゲノムの他の部分に導入された制限部位とは異なる。従って、一実施形態において、制限部位は、セクション内のＤＮＡが特異的に切断されることを可能にする。
【０１６４】
有利なことに、「ユニークな」制限部位の使用は、ただ適当な制限酵素を用いることにより、選択性を与え、ウイルスゲノムが切断される場所を制御する。
【０１６５】
特異的に切断とは、本明細書で用いられる場合、制限部位に特異的な酵素を使用する場合に、所望の位置でのみウイルスを切断することを意味し、前記位置は通常１つの位置であるが、場合によっては位置の組であり得る。位置の組とは、本明細書で用いられる場合、同じ酵素により切断されるように設計されている（すなわち、互いが区別されることができない）、互いに近位にある２つの制限部位を意味する。
【０１６６】
一実施形態において、制限部位挿入は、配列番号５５である。
【０１６７】
一実施形態において、ＢＸは、２８１６６ｂｐ〜２８３６６ｂｐの配列番号１２からの配列を有す。
【０１６８】
一実施形態において、ＢＸは、結合である。
【０１６９】
ＢＢとは、本明細書で用いられる場合、Ｌ５領域をコードするＤＮＡ配列を意味する。本明細書で用いられる場合、Ｌ５領域とは、文脈に応じて、繊維ポリペプチド／タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を意味する。繊維遺伝子／領域は、アデノウイルスの主要カプシド成分である繊維タンパク質をコードする。繊維は、受容体認識において機能を果たし、アデノウイルスが選択的に細胞に結合し感染する能力に寄与する。
【０１７０】
本開示のウイルスにおいて、繊維は、任意のアデノウイルスの血清型からのものであり得、繊維を異なる血清型の繊維と交換した結果としてキメラ型であるアデノウイルスが知られている。一実施形態において、繊維は、Ｂ群ウイルスからのものであり、特にＡｄ１１ｐなどのＡｄ１１からのものである。
【０１７１】
一実施形態において、ＢＢは、２８３６７ｂｐ〜２９３４４ｂｐの配列番号１２からの配列を有す。
【０１７２】
ＢＹに関連するＤＮＡ配列とは、本明細書で用いられる場合、ＢＢのＬ５遺伝子の３’末端近傍のＤＮＡ配列を意味する。Ｌ５遺伝子の３’末端近傍または近位とは、本明細書で用いられる場合、Ｌ５遺伝子の３’末端またはそこに先天的に付随する非コード領域に隣接（近接）していること、すなわち、Ｌ５遺伝子の３’プライム末端またはそこに先天的に付随する非コード領域（すなわち、Ｌ５にとって内在性の非コード配列の全体もしくは一部）に隣接または近接していることを意味する。あるいは、近傍または近位とは、Ｌ５遺伝子と近く、従ってＢＹ領域とＬ５遺伝子の３’末端との間にコード配列がないことを意味し得る。
【０１７３】
従って、一実施形態において、ＢＹは、コード配列の「終わり」を例えば表すＬ５の塩基と直接連結している。
【０１７４】
従って、一実施形態において、ＢＹは、非コード配列の「終わり」を表すＬ５の塩基と直接連結しているか、またはＬ５に天然に付随する非コード領域と直接結合している。
【０１７５】
先天および天然は、本明細書で交換可能に使用される。一実施形態において、ＢＹは、配列番号１１の配列を含んでなる。この配列は、導入遺伝子（もしくは導入遺伝子カセット）、制限部位、またはそれらの組み合わせを例えば含んでなるＤＮＡ配列が挿入されても良い非コード配列である。この配列は、緩衝物として働き、導入遺伝子の正確な位置に対してある程度の自由度を許容する一方で、ウイルスの安定性および生存率への破壊的な影響を最小化するという点から有利である。
【０１７６】
挿入は、配列番号１１内の５’末端から３’末端の任意の場所で、またはｂｐ１〜３５の間の任意のポイントで、例えば塩基対１／２、２／３、３／４、４／５、５／６、６／７、７／８、８／９、９／１０、１０／１１、１１／１２、１２／１３、１３／１４、１４／１５、１５／１６、１６／１７、１７／１８、１８／１９、１９／２０、２０／２１、２１／２２、２２／２３、２３／２４、２４／２５、２５／２６、２６／２７、２７／２８、２８／２９、２９／３０、３０／３１、３１／３２、３２／３３、３３／３４、または３４／３５の間で起こり得る。
【０１７７】
一実施形態において、ＢＹは、配列番号１２で位置ｂｐ１２と位置ｂｐ１３の間、または２９３５６ｂｐと２９３５７ｂｐに相当する場所にＤＮＡ配列が挿入されている配列番号１１を含んでなる。一実施形態において、挿入は制限部位挿入である。一実施形態において、制限部位挿入は、１または２個の制限部位を含んでなる。一実施形態において、制限部位は、２個の制限部位を含んでなる１９ｂｐの制限部位挿入である。一実施形態において、制限部位挿入は、１個の制限部位を含んでなる９ｂｐの制限部位挿入である。一実施形態において、制限部位挿入は、１または２個の制限部位と、１、２、または３個の導入遺伝子など１個以上の導入遺伝子、例えば１または２個の導入遺伝子とを含んでなる。一実施形態において、制限部位は、２個の制限部位と、１個以上の導入遺伝子、例えば１または２個の導入遺伝子とを含んでなる１９ｂｐの制限部位挿入である。一実施形態において、制限部位挿入は、1個の制限部位と、１個以上の導入遺伝子、例えば１または２個の導入遺伝子とを含んでなる９ｂｐの制限部位挿入である。一実施形態において、２個の制限部位は、（例えば導入遺伝子カセット内の）２個など１個以上の導入遺伝子を挟む。一実施形態において、ＢＹが２個の制限部位を含んでなるとき、前記制限部位は、互いに異なる。一実施形態において、ＢＹ内の前記１個以上の制限部位は、制限部位が挿入された特定のアデノウイルスゲノム内の（ユニークなものなど）非天然型のものである。一実施形態において、ＢＹ内の前記１個以上の制限部位は、アデノウイルスゲノム内の他の場所に位置する他の制限部位とは異なり、例えば、天然型制限部位またはＢＸなどのゲノムの他の部分に導入された制限部位とは異なる。従って、一実施形態において、制限部位は、セクション内のＤＮＡが特異的に切断されることを可能にする。
【０１７８】
一実施形態において、制限部位挿入は、配列番号５４である。
【０１７９】
一実施形態において、ＢＹは、２９３４５ｂｐ〜２９３７９ｂｐの配列番号１２からの配列を有す。
【０１８０】
一実施形態において、ＢＹは、結合である。
【０１８１】
一実施形態において、挿入は、配列番号１１でｂｐ１２の後である。
【０１８２】
一実施形態において、挿入は、配列番号１２の位置２９３５６ｂｐの辺りである。
【０１８３】
一実施形態において、挿入は、１、２、または３個など１個以上の導入遺伝子、例えば１または２個の導入遺伝子を含んでなる導入遺伝子カセットである。
【０１８４】
Ｅ４とは、本明細書で用いられる場合、アデノウイルスのＥ４領域（すなわち、ポリペプチド／タンパク質領域）の一部または全体をコードするＤＮＡ配列を意味し、Ｅ４遺伝子がコードするタンパク質が、保存的または非保存的アミノ酸変化を有し、野生型と同じ機能（対応する未変異タンパク質）、野生型タンパク質と比べて向上した機能、野生型タンパク質と比べて機能がないなど低下した機能、もしくは野生型タンパク質と比べて新しい機能、またはこれらの組み合わせを必要に応じて有するように、Ｅ４は変異されていても良い。
【０１８５】
一実施形態において、Ｅ４領域は、部分的に欠失しており、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％欠失している。一実施形態において、Ｅ４領域は、３２１８８ｂｐ〜２９３８０ｂｐの配列番号１２からの配列を有す。
【０１８６】
一実施形態において、Ｂ３は結合であり、すなわち、Ｅ４は存在しない。
【０１８７】
一実施形態において、Ｂ３は、３２１８８ｂｐ〜２９３８０ｂｐの配列番号１２からなる配列を有す。
【０１８８】
本明細書で用いられる場合、数値範囲は、端点を含む。
【０１８９】
当業者であれば、式（I）などの本明細書の式中の要素が、近接しており、本明細書に言及されている非コードＤＮＡ配列ならびに遺伝子およびコードＤＮＡ配列（構造的特徴部）を含み得ることを理解するであろう。１つ以上の実施形態において、本開示の式は、アデノウイルスゲノム内の天然型配列を説明しようとするものである。この関連において、式がゲノムの関連するセクションを特徴付ける主要な要素を表しており、ゲノムの一続きのＤＮＡについて余すことなく説明することを意図するものではないことが、当業者には明らかであろう。
【０１９０】
Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３、およびＥ４は、本明細書で用いられる場合、それぞれ独立して、本明細書に記載の各領域の野生型およびその同等物、変異型、または部分的な欠失型を意味し、特に公知のアデノウイルスからの野生型配列を意味する。
【０１９１】
「挿入」とは、本明細書で用いられる場合、所与のＤＮＡ配列の基準セグメントの５’末端、３’末端、または内部のいずれかに、基準配列を分断するように組み込まれるＤＮＡ配列を意味する。基準配列は、挿入の位置に対する基準点として用いられる基準配列である。本開示との関連において、挿入は、通常、配列番号１０または配列番号１１のどちらかの内部で起こる。挿入は、制限部位挿入、導入遺伝子カセット、または両方のいずれかであり得る。配列が分断されるとき、ウイルスは、依然として元の配列を含んでなるが、通常、挿入を挟む２つの断片として存在するようになる。
【０１９２】
一実施形態において、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、Ｔｎ７トランスポゾンまたはその一部など偏りのない挿入が起こるトランスポゾンを含まない。Ｔｎ７トランスポゾンとは、本明細書で用いられる場合、国際公開第２００８／０８０００３号に記載の偏りのない挿入が起こるトランスポゾンを意味する。
【０１９３】
連続製造方法とは、本明細書で用いられる場合、本開示に従って定義されるウイルスの製造方法であり、特に、前記方法の１つ以上または２つ以上の時点で製造されたウイルス粒子が、細胞当り５０，０００以上の例えば複製能を有するキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスなどの本明細書に記載のウイルスである場合など、各細胞により製造されるウイルスが非連続方法と比べて増加するような前記方法であって、ウイルスが２回以上の複製サイクルを有する前記方法である。
【０１９４】
感染後の細胞に追加の細胞を補充せず、複製されたウイルスを収集するために細胞を例えば溶解するか、または、１回のウイルス複製サイクルおよびそこからのウイルスの回収の後に細胞を廃棄する不連続培養と、連続方法は、反対のものである。本開示の方法の一部として、ウイルスを含む無細胞上清を、ウイルスの下流の精製のために、複数回または連続的に収集しても良い。一実施形態において、収集は、細胞培養期間の終了時ではない。
【０１９５】
一実施形態において、１つ以上の時点で細胞当り製造されたウイルス粒子は、７５，０００以上、例えば８０，０００；９０，０００；１００，０００；１５０，０００；１７５，０００；１８０，０００、または１９５，０００である。
【０１９６】
これらの範囲の細胞当りのウイルスの収率は、所与のウイルスに対して関連のパラメーターを選択することにより達成される。これらの収率を達成するために重要なパラメーターは、出発播種密度、感染多重度（ＭＯＩ）、培地の交換、および方法の期間である。理論に拘束されることを望むものではないが、これらのパラメーターを制御することは、収率に関して方法を制御することを可能にし、ウイルス製品をどこに存在させるのか、すなわち、上清中、細胞中、または両方に存在させるのかに対する制御も与え得る。
【０１９７】
低い感染多重度とは、本明細書で用いられる場合、感染多重度が１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２．５、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５など２０未満であることを意味する。
【０１９８】
高い感染多重度とは、本明細書で用いられる場合、感染多重度が４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５以上など４５以上であることを意味し、例えば１００であることを意味する。
【０１９９】
低い播種密度とは、本明細書で用いられる場合、播種密度が１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、または０．５×１０６以下など２×１０６以下であることを意味する。
【０２００】
高い播種密度とは、本明細書で用いられる場合、例えば、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５×１０６以上など３．５×１０６以上である。  
【０２０１】
方法の一実施形態において、哺乳類細胞を、１〜９×１０５、１〜９×１０６、１〜９×１０７、１〜９×１０８、１〜９×１０９など１〜９×１０４ｖｐ／ｍｌ以上、特に１〜５×１０６ｖｐ／ｍｌまたは２．５〜５×１０８ｖｐ／ｍｌの出発濃度で感染させる。
【０２０２】
一実施形態において、哺乳類細胞を、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３．０、または４×１０６ｖｐ／ｍｌなど１〜４×１０６ｖｐ／ｍｌの出発播種濃度で感染させる。
【０２０３】
方法の一実施形態において、哺乳類細胞を、約１〜２００ｐｐｃ、例えば、５０ｐｐｃなど４０〜１２０ｐｐｃで１×１０６ｖｐ／ｍｌの出発濃度で感染させる。
【０２０４】
ｐｐｃは、本明細書で用いられる場合、細胞当りのウイルス粒子の数を表す。ｐｐｃおよび感染多重度は、本明細書で交換可能に用いられる。
【０２０５】
一実施形態において、培養中のキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスなどのウイルスは、２０〜１５０細胞当り粒子（ｐｐｃ）、例えば４０〜１００ｐｐｃ、特に５０ｐｐｃの範囲の濃度である。この濃度は、出発播種密度とは対照的に、培養工程の間の濃度である。ウイルス濃度の値が低いこと、例えば５０ｐｐｃなど１００ｐｐｃ未満、特に１５、１４、１３、１２．５、１２、１１、または１０など２０以下であることは、有利であり得る。利点として、１つ以上の以下の特性、特に細胞の生存率を収集前に測定したときに、ウイルス濃度が高い培養物と比べて細胞の生存率が増すこと、および、細胞当りのウイルス粒子製造レベルが高いこと、が挙げられ得る。
【０２０６】
一実施形態において、培養物中の細胞数を、培養物中のウイルスのレベルと合うように調節する。例えば、細胞を培養物（固定相中の細胞など）に加える、または培養物の細胞増殖を調節して、感染多重度（ＭＯＩ）をほぼ一定に維持する細胞数を与える。
【０２０７】
ウイルス製造は、細胞密度にも依存する。一実施形態において、細胞密度は、１００万〜１０００万細胞／ｍｌ、例えば２００万〜１０００万細胞／ｍｌの範囲内にある。
【０２０８】
「方法が終了に近くなると」とは、本明細書で用いられる場合、方法が実行中の期間の最後の４０％、例えば、６５、７０，７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９以降など感染後約６０時間以降を意味する。
【０２０９】
「ウイルス感染および製造用の生細胞を、前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持する」とは、本明細書で用いられる場合、望ましく有用で標準的な収率のウイルスを生じるレベルに生細胞を維持することを意味する。
【０２１０】
生細胞は、ウイルスが感染できる、および／または複製しているウイルスを支持できる細胞であり、特に、ウイルスが感染できる、および／または複製しているウイルスを支持できる健康な細胞である。
【０２１１】
細胞の生存率が低いと、細胞溶解が起こり得、時間が経つとウイルスを攻撃するようになる酵素またはタンパク質に細胞を晒し得る。しかしながら、細胞培養などの動的工程において、あるパーセンテージ、例えば小さいパーセンテージの細胞が溶解され得る。このことは、実際面で、重大な問題を引き起こすことは通常ない。
【０２１２】
生存不能な細胞は、死細胞、溶解細胞、ウイルス複製に関して不活性な細胞であるとする。
【０２１３】
漏出細胞は、透過性が高い膜を有する細胞である。
【０２１４】
興味深いことに、製造方法中に培養物に加えられる細胞は、比較的急速に、例えば約２４時間以内に、高い透過性を呈するように見える、すなわち、生死判定用色素により染色される。それでもやはり、感染性ウイルス粒子を含む高いレベルのウイルス粒子が依然として製造されるので、このことは、不利であるようには見えない。
【０２１５】
細胞の生存率を検査する方法は、当業者に知られており、細胞のサンプルを取り、生存不能である細胞に浸透し染色し、漏出細胞にも浸透する生死判定用染色剤でサンプルを検査する方法が挙げられる。
【０２１６】
細胞生存率アッセイは、以下の技術のうち１つ以上に基づくものであり得る。
１．  細胞溶解または膜漏出アッセイ：このカテゴリーは、細胞膜がもはや無傷ではないときに容易に検出され得る全細胞に共通の安定な酵素である乳酸デヒドロゲナーゼのアッセイを含む。例として、ヨウ化プロピジウム、トリパンブルー、および７−アミノアクチノマイシンＤが挙げられる。
２．  ミトコンドリア活性またはカスパーゼアッセイ：レサズリンおよびホルマザン（ＭＴＴ／ＸＴＴ）は、細胞死の前兆となるアポトーシス過程の様々な段階について分析し得る。
３．  機能分析：細胞機能のアッセイは、分析される細胞の種類に対する特異性が高くなり得る。例えば、運動性は、広く使用されている精子細胞機能のアッセイである。受精能は、配偶子の生存を分析するために通常使用され得る。赤血球は、変形能、浸透圧脆弱性、溶血、ＡＴＰレベル、およびヘモグロビン含有量について分析されている。
４．  ゲノムおよびプロテオームアッセイ：ＤＮＡマイクロアレイおよびタンパク質チップを使用して、ストレス経路の活性化について細胞を分析し得る。
【０２１７】
細胞の生存率を分析するために用いられる検査の一般的なリストは、以下を含む。ＡＴＰ検査、カルセインＡＭ、クローン原性アッセイ、エチジウムホモダイマーアッセイ、エバンスブルー、フルオレセインジアセテート加水分解／ヨウ化プロピジウム染色（ＦＤＡ／ＰＩ染色）、フローサイトメトリー、ホルマザンベースのアッセイ（ＭＴＴ／ＸＴＴ）、緑色蛍光タンパク質、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、メチルバイオレット、ヨウ化プロピジウム、壊死細胞、アポトーシス細胞、および正常細胞を区別できるＤＮＡ染色、レサズリン、トリパンブルー、生細胞排除色素（死細胞の細胞膜のみ通過する色素）、およびＴＵＮＥＬアッセイ。
【０２１８】
従って、細胞の生存率は、例えばトリパンブルー（および光学顕微鏡検査）または７−アミノ−アクチノマイシンＤ、６７０ｎｍで放射する生体染色色素（または市販の使用準備済の７ＡＤＤの溶液であるＶｉａＰｒｏｂｅ）およびフローサイトメトリーで、当業者に知られている技術を用いて、細胞染色により検査され得る。染色剤が細胞に浸透する場合、細胞は生存不能であると見なされる。色素を吸収しない細胞は、生存能を有すると見なされる。例示的方法では、約１００μＬの細胞浮遊液当り約５μＬの７ＡＡＤおよび約５μＬのアネキシンＶ（アポトーシス中に露出されるリン脂質外層のホスファチジルセリンに結合するリン脂質結合タンパク質）を用いても良い。この混合物を、光が無いところで約１５分間周囲温度でインキュベートしても良い。次に、フローサイトメトリーを用いて分析を実施しても良い。例えば、MG Wing, AMP Montgomery, S. Songsivilai and JV Watson.  An Improved Method for the Detection of Cell Surface Antigens in Samples of Low Viability using Flow Cytometry.  J Immunol Methods 126: 21-27 1990を参照されたい。
【０２１９】
一実施形態において、酸素摂取量または酸素移動量を使用して、細胞の生存率を評価する。まだウイルスを複製できる漏出細胞は、トリパンブルーなどの試薬で染色され得るので、これは、細胞の生存率を分析する１つのより適当な方法であり得る。従って、この方法は、死／溶解細胞と漏出細胞を区別するために使用され得る。
【０２２０】
驚くべきことに、本発明者は、方法のいくつかの実施形態を採用すると、特に新鮮細胞を添加しないときに、感染後、本明細書に記載の連続製造期間に亘って、細胞が高い生存率（例えば、この状況における８０〜９０％の生存率は、生死判定用色素で染色されない）を維持することを、発見した。従って、一実施形態において、収集および方法は、十分な細胞が生存能を保持する限り、続き得る。
【０２２１】
培地の交換がなく、ウイルス複製を支持する細胞の添加または取り換えがない一実施形態において、細胞の生存率は、方法の間約５０〜１００％であり、例えば、ＥｎＡｄに感染したとき、９６時間の時点（すなわち、感染後９６時間）で、６０〜９５％であり、例えば９０％の生存率（すなわち、９０％の細胞が生死判定用色素で染色されていなかった）である。
【０２２２】
一実施形態において、細胞の生存率は、方法の間約５０〜１００％であり、例えば、ＮＧ７６に感染したとき、９６時間の時点（すなわち、感染後９６時間）で、６０〜９０％であり、例えば、特に新鮮細胞を添加しないときに、８３％の生存率（すなわち、８３％の細胞が生死判定用色素で染色されていなかった）である。
【０２２３】
一実施形態において、細胞の生存率は、方法の間約５０〜１００％であり、例えば、ＮＧ１３５に感染したとき、９６時間の時点（すなわち、感染後９６時間）で、６０〜９０％であり、例えば、特に新鮮細胞を添加しないときに、８５％の生存率（すなわち、８５％の細胞が生死判定用色素で染色されていなかった）である。
【０２２４】
一実施形態において、細胞の生存率は、方法の間約５０〜１００％であり、例えば、Ａｄ１１に感染したとき、９６時間の時点（すなわち、感染後９６時間）で、８０〜９０％である。例えば、特に新鮮細胞を添加しないときに、８５％の生存率（すなわち、８５％の細胞が生死判定用色素で染色されていなかった）。
【０２２５】
一実施形態において、培養法は、１回以上の細胞の添加または交換を含んでなる。本明細書で用いられる細胞添加とは、細胞の一部または全部を補充し、必要に応じて死細胞を取り出すことを意味する。細胞の交換とは、本明細書で用いられる場合、少なくとも一部の細胞を取り出し、新鮮細胞を添加することを意味する。
【０２２６】
一実施形態において、連続製造期間中、生存不能の細胞を取り換えて、継続性／持続性のウイルス複製の期間、および継続性／持続性のウイルスの培養培地への放出を維持し、例えば、ウイルス複製レベルは方法の間変動し得るが、ウイルス複製は連続的（すなわち、非断続的）である。
【０２２７】
一実施形態において、新しく添加した細胞の生存率は、重要な因子であり得、従って、細胞培養物全体に亘る細胞の生存率を測定した場合（すなわち、生死判定染色用色素により検査した場合）、十分な量のウイルスを複製し続けるのに十分な細胞があれば、生存率は、実際５０％未満であり得る。しかしながら、色素染色は、生存不能細胞と漏出細胞を必ずしも区別しない。
【０２２８】
理論に拘束されることを望むものではないが、漏出性であり得る細胞は、生存能を有してウイルスを製造するようにも見える。
【０２２９】
場合によって、方法で用いられる７０％以上の細胞は、本方法により細胞に加えられるストレスに例えば起因して、漏出性であり得る。しかしながら、このことは、ウイルス製造中の細胞の性能にほとんど影響を与えないように見える。従って、本方法において、生死判定用色素が細胞を染色する場合でさえ、細胞は、ウイルスを製造するのに十分な生存能を保持し得る。本開示に係る方法において、新しい細胞を培養物に添加する場合、振盪フラスコで実施する試験において、新鮮細胞を添加した後でさえ、生死判定用染色剤で着色する細胞は、非常に多い、例えば７０％の細胞集団であり得る。それでもやはり、バイオリアクター法は、哺乳類細胞でウイルス製造を実施するのに特に適しており、バイオリアクター法からの細胞の染色量は少ない場合がある。
【０２３０】
一実施形態において、本開示に係る方法をバイオリアクターで実施する。
【０２３１】
好適なバイオリアクターシステムの例は、マイクロファイバーが例えば詰められた完全一体型で高密度のバイオリアクターであるｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターである。このシステムは、付着細胞の培養に特に好適である。均一に分布した培地循環は、内臓の磁気駆動インペラーにより達成され、低いずり応力および高い細胞の生存率が確保される。細胞培養培地は、固定床を通って底部から上部へと流れる。上部では、培地は、薄膜として外壁を流れ落ち、外壁でＯ２を取り込み、バイオリアクター内で高いＫＬａ．を維持する。この酸素添加は、穏やかな攪拌およびバイオマスの固定化と共に、コンパクトなｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターが、高い細胞密度を達成および維持することを可能にするので、生産性は、はるかに大きい攪拌槽ユニットに劣らない。さらなる詳細については例えば以下を参照されたい。
http://www.pall.com/main/biopharmaceuticals/product.page?lid=hw7uq21l
【０２３２】
継続性または持続性のウイルス複製の期間は、ウイルスが１回を超える複製サイクルのための時間を有する（すなわち、２回以上の複製サイクルを有する）期間である。複製サイクルでは、所与のウイルスが、細胞に入り複製し、ウイルスおよび／またはウイルス粒子が、細胞から放出され、次いで、ウイルスまたはその子孫が、細胞に感染し始め、複製を進行する。
【０２３３】
ウイルスの製造方法は、本明細書で用いられる場合、ウイルスが複製し、それによりウイルス粒子の数が増える方法を意味するように意図されている。特に、該製造は、治療用製品を製造するのに十分な数のウイルス粒子を与えるものであり、例えば１〜９×１０５〜１〜９×１０２０以上の範囲の粒子が製造され得、例えば１〜９×１０８〜１〜９×１０１５の範囲のウイルス粒子、特に、１〜９×１０１０または１〜９×１０１５のウイルス粒子が、１０Ｌのバッチから製造され得る。
【０２３４】
一実施形態において、収率は、リットル当り約１〜２×１０１４ｖｐである。
【０２３５】
一実施形態において、細胞当りのウイルス製造量は、５０，０００ウイルス粒子以上であり、例えば、１つ以上の時点で、５５，０００；６０，０００；６５，０００；７０，０００；７５，０００；８０，０００；９０，０００；９５，０００；１００，０００；１０５，０００；１１０，０００；１１５，０００；１２０，０００；１２５，０００；１３０，０００；１３５，０００；１４０，０００；１４５，０００；１５０，０００；１５５，０００；１６０，０００；１６５，０００；１７０，０００；１７５，０００；１７６，０００；１７７，０００；１７８，０００；１７９，０００；１８０，０００；１８１，０００；１８２，０００；１８３，０００；１８４，０００；１８５，０００；１８６，０００；１８７，０００；１８８，０００；１８９，０００；１９０，０００；１９１，０００；１９２，０００；１９３，０００；１９４，０００；１９５，０００；１９６，０００；１９７，０００；１９８，０００；１９９，０００；２００，０００；２０１，０００；２０２，０００細胞当りウイルス粒子以上を含んでなる群から独立して選択される。
【０２３６】
連続製造期間は、本明細書で用いられる場合、単純に、所与のキャンペーン生産の期間である。概して、本発明の方法は、４８時間以上、例えば７０、８０、８４、８６、９０、９６、１００、１０８、１２０、１２４、１２８、１３２、１４４、１５６、１６８、１８０、１９２、２０４、２１６、２２８、２４０時間以上（ここで、前記値は、＋／−３時間である）、例えば、１４４時間〜２４０時間の範囲内、例えば１５６、１６８、１８０、１９２、２０４、２１６、２２８、または２４０時間である、連続製造期間を有するものとする。
【０２３７】
一実施形態において、培養期間は、１４４〜２４０時間など７０〜３００時間の範囲内にあり、例えば１４４、１５６、１６８、１８０、１９２、２０４、２１６、２２８、または２４０時間である。
【０２３８】
一実施形態において、連続製造方法は、細胞を１００時間を超えて培養することを特徴とする。
【０２３９】
一実施形態において、本開示の連続製造方法は、１００時間以下の感染後培養期間および１回以上の培地の交換または添加および１回以上の細胞の交換または細胞の添加により特徴づけられる。
【０２４０】
一実施形態において、連続製造は、感染後３５〜９６時間の範囲内にある。
【０２４１】
有利なことに、本開示のウイルスは、培養法が７０時間以上に延長される場合でさえも、分解しないように見える。ウイルスの分解は、ウイルスの感染力を分析することによりチェックされ得る。ウイルスの感染力は、ウイルス粒子が分解するにつれて減少する。
【０２４２】
最大全ウイルス製造量は、本明細書で用いられる場合、細胞当り製造されたウイルス粒子の総数を意味し、上清および細胞中のウイルス粒子を含む。
【０２４３】
一実施形態において、最大全ウイルス製造量は、感染後約４０〜６０時間およびその倍数の時間で、例えば感染後４９、９８、１４７などの時間で達成される。
【０２４４】
一実施形態において、最大全ウイルス製造量は、感染後約７０〜９０時間およびその倍数の時間で、例えば感染後１４０〜１８０時間で達成される。
【０２４５】
一実施形態において、最大全ウイルス収率は、感染後約６０〜９６時間で達成される。
【０２４６】
方法における１回以上の培地の交換／取り換えは、ウイルス収率に大きなプラスの影響を有するように見える。一実施形態において、細胞を取り出すことなく培地を交換する。一実施形態において、５〜１００％の培地を１つ以上の時点で交換する。一実施形態において、培地および細胞を取り出し、例えば（細胞浮遊培養法の）１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０％以上の細胞浮遊液を取り出し、新鮮培地および細胞と取り換える。
【０２４７】
一実施形態において、方法の間１回以上培地を添加する。このことは、宿主細胞が指数関数的増殖期にあるときに特に有利であり得る。
【０２４８】
一実施形態において、培養法は、１回以上の培地の交換を含んでなる。このことは、細胞の増殖、収率などを最適化するために有利であり得る。培地の交換を採用する場合、交換される培地からウイルス粒子を回収することが必要であり得る。これらの粒子は、ウイルスの収率を確実に最適化するために、主要なウイルスバッチとまとめられ得る。同様の技術を灌流法の培地でも採用して、ウイルスの回収を最適化し得る。
【０２４９】
一実施形態において、培養法は、培地交換ステップを含まない。このことは、ウイルス粒子が全く失われないので、収率が最適化され得るため、有利であり得る。
【０２５０】
一実施形態において、培地および／または細胞は、定期的に補充または補給される。
【０２５１】
一実施形態において、方法の間に、例えば不連続の時点で、または連続的に、細胞を回収する。
【０２５２】
哺乳類細胞の培養に好適な培地として、シグマアルドリッチからのＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）培地、例えばＨＥＫ２９３細胞用無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）２９３、ＣＨＯ細胞用無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＡＣＦ  ＣＨＯ培地、ＣＨＯ細胞用無血清培地であるＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ加水分解フュージョン培地サプリメント（hydrolysate fusion media supplement）、Ｌｏｎｚａ  ＲＭＰＩからの培地（ＨＥＰＥＳおよびＬ−グルタミン含有ＲＭＰＩ  １６４０、Ｌ−グルタミン含有または非含有ＲＭＰＩ  １６４０、およびウルトラグルタミン（UltraGlutamine）含有ＲＭＰＩ  １６４０など）、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ならびにＳＦＭＩＩ培地が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２５３】
一実施形態において、培地は無血清である。このことは、規制当局での製造方法の登録が容易となるので、有利である。
【０２５４】
新鮮培地の添加は、本明細書で用いられる場合、栄養分および成分が細胞の増殖を支持するのに適したレベルである、すなわち、枯渇していない培地の添加を意味する。
【０２５５】
培地交換は、本明細書で用いられる場合、方法で用いられる培地の一部または全体を取り換えることを意味し、例えば、培地の一部を取り出し新鮮細胞を加えることを意味する。
【０２５６】
「ステップａ）から製造された前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ」とは、本明細書で用いられる場合、方法から得られたウイルスを上清から単離する１つ以上のステップを意味する。方法は、必要に応じて、例えば方法の最後に細胞からウイルスを回収するための、および／または培養物から取り出された細胞からウイルスを回収するための、細胞溶解ステップも含んでなり得る。
【０２５７】
「単離が細胞溶解ステップの後ではない」とは、本明細書で用いられる場合、製造方法の１つ以上の時点での回収が特異的な溶解ステップを含まないことを意味するように意図されている。すなわち、培養物中の全部または大部分の細胞を溶解するように条件が設計されているステップは、化学的溶解ステップ、酵素溶解ステップ、溶解バッファーステップ、機械的溶解ステップ、または遠心分離もしくは凍結融解などの物理的溶解ステップを例えば用いない。
【０２５８】
大部分とは、本明細書で用いられる場合、大多数、例えば８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％を意味する。
【０２５９】
一実施形態において、ウイルスが細胞から上清へ放出された後、収集を開始し、（例えば循環培地からの回収による）その時点以後の連続的な収集、もしくは不連続の時点、例えば４０〜５０時間、６０〜７０時間、８０〜１００時間、１２０〜１５０時間、１６０〜２００時間、２００〜２５０時間での収集、またはそれらの組み合わせを実施する。ウイルス全部ではないが特定の量のウイルスが上清から連続的かつ特定の時点で取り出される組み合わせでは、取り出されるウイルスの量は、増加または減少する。
【０２６０】
ウイルスの収集は、ウイルス複製を続けるために、十分なウイルスを培養物中に残すべきである。このことは、例えば、ＭＯＩをモニタリングし、本明細書に記載の範囲内にＭＯＩを保ち、達成され得る。
【０２６１】
一実施形態において、方法の最後の１時点でウイルス全部を収集する。
【０２６２】
一実施形態において、方法の最後の１時点でウイルス全部の収集はしない。
【０２６３】
一実施形態において、本開示の方法は、１つ以上のろ過ステップを含んでなる。細胞および不純物を残留させ、それによりウイルスがフィルターの孔を通過するようにするろ過を必要に応じて選択し得る。あるいは、ウイルスを残留させ不純物を通過させるろ過を選択しても良い。一実施形態において、ろ過技術の組み合わせを本開示の方法に用いる。
【０２６４】
ウイルスは、ろ過により上清から取り出され得、例えば、ウイルスを通過させるが細胞および他の細胞培養成分（不純物）を残留させるのに十分な孔を有するフィルターが用いられ得る。一実施形態において、０．１〜１０ミクロンの範囲、例えば０．２ミクロンのフィルターが用いられる。一実施形態において、段階的ろ過を用いる。例えば、１０ミクロンのフィルターの後に、１〜５ミクロンの範囲などの小さいフィルターを用い、その次に、０．２ミクロンなどのさらに小さいフィルターを用いる。
【０２６５】
一実施形態において、タンジェンシャルフローろ過などのダイアフィルトレーションを用いる。フィルターのサイズおよび条件を、ウイルスを選択的に抽出するように選択し得る。好適であり得るフィルターの例として、ＴＦＦメンブレン３００Ｋ  ＮＭＷＣおよびその同等物が挙げられる。
【０２６６】
一実施形態において、カットオフが約３００ｋＤａであるダイアフィルトレーションシステムは、通常、９０％以上のウイルス粒子を残留させる一方で、夾雑物は除去するので、適当であり得る。
【０２６７】
含まれるウイルスの一部または全部を抽出した後に残る上清を、必要に応じて、さらに処理してウイルスをさらに抽出し全収率を増加させること、培養系へと必要に応じてある量の新鮮培地もしくはその成分と共に戻すこと、もしくは廃棄すること、またはそれらの組み合わせが可能である。
【０２６８】
一実施形態において、（上清から取り出されたウイルスとは対照的に）細胞から単離されたウイルスの画分（画分が１つである場合も含む）では、上清から単離されたウイルスに添加する前に、１回以上の精製ステップが実施される。
【０２６９】
一実施形態において、（上清から取り出されたウイルスとは対照的に）細胞から単離されたウイルスの画分（画分が１つである場合も含む）では、上清から単離されたウイルスに添加する前に、１回以上の精製ステップが実施されない。
【０２７０】
一実施形態において、９０％を超えるウイルス、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％、例えば９５％以上、特に９８％以上のウイルスが、４８時間の時点およびその倍数の時間の時点で上清中に存在する。
【０２７１】
一実施形態において、かなりの量のウイルスが３８時間後に培地中にある。例えば、５０％を超える、特に７０％を超えるウイルスが、３８時間後、およびその倍数時間後、例えば７６、１１４、１５２、１９０、２２８時間などの時間後、培地中にある。
【０２７２】
一実施形態において、５０％以上、例えば５５、６０、６５、７０、７５％以上のウイルスが約６５時間までには上清中にある。
【０２７３】
一実施形態において、７０％以上、例えば７５、７６、７７、７８、７９、８０％以上のウイルスが約７２時間までには上清中にある。
【０２７４】
一実施形態において、８０％以上、例えば８５、８６、８７、８８、８９、８０％以上のウイルスが約９６時間までには上清中にある。
【０２７５】
一実施形態において、６４時間の時点で、すなわち６４時間後、ＣＶＬペレット中に、１０％未満の検出可能なウイルス、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、１％の検出可能なウイルスがある。ＣＶＬは、本明細書で用いられる場合、粗ウイルス溶解物を意味する。
【０２７６】
一実施形態において、複製後のウイルスは、実質的に全細胞についてほぼ同時に、細胞を出るため、上清中のウイルスがピークに達する特定の時点がある。文脈上他を意味しない限り、ウイルス複製サイクルは、本明細書で用いられる場合、方法におけるウイルスのピークを意味し、例えば、第１のウイルスのピークは、第１のウイルス複製サイクルの終わりと第２のウイルスの複製サイクルの始まりを示す。この方法の特性は、同時に培養される細胞を使用することにより達成されて、細胞が同調して任意の所与の瞬間で細胞のライフサイクルの同じまたはほぼ同じ段階にあることを確実にし得る。あるいは、様々な異なる細胞を用いて、この特性をならし、連続的に複製されるウイルスを与え得る。
【０２７７】
培地または上清中のウイルスのレベルをＨＰＬＣまたはその他の技術によりモニタリングできる。
【０２７８】
通常、培地に添加する細胞は、培養物中に用いられている細胞と同じ種類であるとする。
【０２７９】
培養物に添加する細胞は、本培養への添加により適するように、例えば、本培養の細胞と混合するために、細胞のライフライフサイクルの適合性段階にあることを確実にするように、前培養されていても良い。
【０２８０】
有利なことに、生細胞のレベルが増加した場合、ウイルス複製がウイルス粒子の絶対数を増加させたときに、ウイルスが感染に細胞を利用できるため、非常に効率的な方法が与えられる。一実施形態において、集団のその他の特性が、細胞の交換または添加により変えられ、例えば膜透過性が増加され得る。
【０２８１】
一実施形態において、ウイルスの感染および複製中、対数期増殖を支持および維持するように確立された条件下で細胞を維持する。従って、一実施形態において、少なくともある割合の細胞集団は、方法における任意の所与の時点で対数増殖期にあり、例えば、１０〜８０％、例えば２０〜５０％の細胞が増殖期にある。対数増殖期は、本明細書で用いられる場合、細胞が、利用可能な栄養分、基質、および細胞により放出される産物による阻害が制限因子ではない増殖培地条件下で指数関数的に増殖していることを意味する。
【０２８２】
細胞培養は、技術的な必要性に応じて、灌流培養、流加培養、バッチ培養、定常状態培養、連続培養、またはそれらのうち１つ以上からなる組み合わせを用い得、特に、灌流培養を用い得る。
【０２８３】
一実施形態において、方法は灌流法であり、例えば連続的灌流法である。
【０２８４】
「由来」とは、本明細書で用いられる場合、例えば、ＤＮＡ断片が、アデノウイルスから取られた場合、またはアデノウイルスに元々見られる配列に対応する場合を意味する。この言葉は、配列を得る方法を制限することを意図されてはおらず、例えば、本開示に係るウイルスに用いられる配列は、合成されたものであっても良い。
【０２８５】
一実施形態において、派生物は、元のＤＮＡ配列に対して全長に亘って１００％の配列同一性を有す。
【０２８６】
一実施形態において、派生物は、元のＤＮＡ配列に対して９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性または類似性を有す。
【０２８７】
一実施形態において、派生物は、ストリンジェントな条件下で元のＤＮＡ配列とハイブリダイズする。
【０２８８】
本明細書で用いられる場合、「ストリンジェンシー」は、通常、約Ｔｍ（融解温度）−５０℃（プローブのＴｍ以下５℃）からＴｍ以下約２０℃〜２５℃の範囲で生じる。当業者が理解するように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して、同一のポリヌクレオチド配列を特定もしくは検出、または類似もしくは関連のポリヌクレオチド配列を特定もしくは検出することができる。本明細書で用いられる場合、用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に９５％以上、例えば９７％以上の同一性がある場合に、ハイブリダイゼーションが通常起こり得ることを意味する。
【０２８９】
本明細書で用いられる場合、「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で用いられる場合、「ポリヌクレオチド鎖が塩基対合により相補鎖と結合するあらゆる過程」を含むものとする（Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994）。
【０２９０】
有利なことに、本方法は、細胞溶解ステップを回避することができるため、細胞からの夾雑ＤＮＡまたはタンパク質の出発濃度が低いので、ウイルスの下流処理を単純化し得る。このことは、下流処理で用いられる試薬、設備、および時間が削減され得るので、コストの節約をもたらし得る。また、このことは、夾雑ＤＮＡの最終濃度が低い、かつ／または大きい断片の夾雑細胞性ＤＮＡおよびタンパク質の濃度が低い、純度の高さをもたらし得る。
【０２９１】
さらに、ウイルスを細胞の酵素へ晒すことが、ウイルスを細胞からのヌクレアーゼなどの潜在的な分解剤に晒すことを最小化する細胞溶解の回避によって、最小化される。このことは、ウイルスのより高い安定性および／または感染力などにより測定される潜在能をもたらし得る。
【０２９２】
興味深いことに、本開示のウイルスは、細胞を出た後、細胞に付着しないので、上清から容易に回収することができる。このことは、本方法を容易にする、本明細書に記載の特定のウイルスに特徴的な現象であり得る。対照的に、野生型Ａｄ５は、細胞に付着すると考えられている。実際、本明細書で論じられる時間枠で、野生型Ａｄ５ウイルス粒子は上清中に実質的に存在しないという結果が示されている。
【０２９３】
理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態において、細胞を出て細胞に付着しない能力および／または速いウイルス複製サイクルは、キメラ型Ｅ２Ｂ領域および／またはＥ３の一部の欠失および／またはＥ４領域の欠失に関連し得る。
【０２９４】
理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態において、細胞を出て細胞に付着しない能力および／または速いウイルス複製サイクルは、Ｂ群カプシド、例えばＡｄ１１カプシドに関連し得る。
【０２９５】
一実施形態において、細胞への付着性の欠如は、腫瘍崩壊性ウイルスのヘキソンおよび繊維に関連し得、例えば、この点で、Ａｄ１１などのＢ群アデノウイルスからのウイルスカプシドは、本開示の複製能を有するウイルスおよびキメラ型ウイルスにとって特に有利であり得る。
【０２９６】
速いウイルス複製サイクルは、本明細書で用いられる場合、感染後５０時間以下の期間に少なくとも一部のウイルスが上清に排出されるように完了するサイクルを意味する。
【０２９７】
一実施形態において、公知の標準システムを用いて、本明細書に記載の方法により製造したウイルスを処理する。
【０２９８】
一実施形態において、例えば、連続方法が実際ノンストップである場合、すなわち、数日間とは対照的に数週間および数ヶ月間など非常に長期間のキャンペーンで実施される場合、培養培地のインラインのタンジェンシャルフローろ過を与えるように培養容器を改造して、ＤＮＡおよび細胞片などの夾雑物が蓄積するのを回避し得る。１つの可能な配置が図２で示されており、この配置では、タンジェンシャルフローろ過システムが培養容器に隣接して与えられている。培養容器とタンジェンシャルフローシステムとの間の界面は、図２で平坦な界面として示されている。しかしながら、界面は任意の好適な形状であっても良く、例えば、タンジェンシャルフローろ過は、培養容器の周囲のジャケットとして配置されていても良い。
【０２９９】
容器との界面は、タンジェンシャルフローフィルターメンブレンに関しては、選択的透過性メンブレンである。一実施形態において、メンブレンは、３００Ｋ  ＮＭＷＣ  ＴＦＦである。
【０３００】
図２の配置は、好適な配置のただの一例であり、例えばウイルス抽出後の培地は、培養へと再利用され得、ポンプは異なるように配置され得る。
【０３０１】
従って、一実施形態において、培養容器を伴うタンジェンシャルフローシステムは、培養物から夾雑物を取り除く。従って、一実施形態において、細胞培養容器は、タンジェンシャルフロー界面を含んでなり、例えば、圧力差がある状態で維持されて、培養物からの細胞片および夾雑物の除去を可能にし、それによって培養が維持され得る期間を長くする。
【０３０２】
一実施形態において、培養容器を伴うタンジェンシャルフローシステムは、培養物からウイルスを取り出すので、ウイルスの収集に用いられ得る。
【０３０３】
分離システムは、ウイルスをウイルスの１次回収、または２次回収として取り出し得る。分離システムは、廃棄するための出口も有しても良い。
【０３０４】
一実施形態において、分離システムは、存在しなくても良い。
【０３０５】
容器とは、本明細書で用いられる場合、細胞を培養するための使用に好適な任意の入れ物を意味し、例えば、培養バッグ、ポット、ボトル、キューブ、チューブ、バイオリアクターなどを意味する。一実施形態において、容器は、ガス透過性メンブレンを含んでなっても良い。
【０３０６】
一実施形態において、培養は、浮遊培養である。別の実施形態において、培養は、付着培養である。
【０３０７】
哺乳類細胞は、哺乳類由来の細胞である。一実施形態において、哺乳類細胞は、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、Ａ５４９、ＰｅｒＣ６、およびＧＭＫを含んでなる群から選択され、特にＨＥＫ２９３またはＡ５４９細胞である。一実施形態において、培養物に添加される細胞は、成長が速い細胞であり、例えば２９３−Ｆである。一実施形態において、用いられる細胞／細胞株は、キャプシド形成細胞株ではなく、つまり、ウイルス複製を促進する導入遺伝子をウイルスに与えるパッケージング細胞株である。
【０３０８】
ポリマー球（マイクロキャリアとも呼ばれるマイクロビーズ）上などで培養された付着細胞、またはホローファイバーに結合した付着細胞を、攪拌槽バイオリアクターで浮遊液中で用いることができる。
【０３０９】
少なくともＨＥＫ、ＣＨＯ、およびＡ５４９は、付着性細胞株にすることができる。
【０３１０】
哺乳類細胞の培養とは、本明細書で用いられる場合、細胞を生体外で制御された条件下で増殖させる方法を意味する。好適な条件は、当業者に知られており、３７℃などの温度を含み得る。ＣＯ２レベルは、制御される必要がある場合があり、例えば、１０％未満、例えば５％のレベルに維持される。これについての詳細は、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques and Specialised Applications Edition Six R. Ian Freshney, Basic Cell Culture (Practical Approach) Second Edition Edited by J.M. Davisというテキストに与えられている。
【０３１１】
通常、本開示のウイルスに感染させる前に細胞を培養して十分な数を生じさせるものとする。これらの方法は、当業者に知られているか、または公表されたプロトコルもしくは文献で容易に得られる。
【０３１２】
通常、細胞を、商業規模、例えば５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、７００Ｌ、８００Ｌ、９００、１０００Ｌなどで、培養するものとする。一実施形態において、本開示に係る連続方法の規模は、１５０Ｌ以下である。
【０３１３】
キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスおよび／または複製能を有するＢ群アデノウイルスなどの本開示のウイルスは、Ａｄ５などのベクターとして使用されるアデノウイルスの特性とは異なる特性を有し、この例として、比較的短い培養期間に亘って細胞溶解を必要とせずに培地から回収され得ることが挙げられる。Ａｄ５（Ｃ群ウイルス）のＥ３領域にコードされているアデノウイルスデスプロテイン（death protein）は、ウイルスが細胞を出るのに必要であると長い間考えられていたので、このことは、当業で予想されていたことに反する。従って、理論に拘束されることを望むものではないが、Ｂ群ウイルスは、細胞を出る機構を有するように見える。
【０３１４】
さらに、キメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスなどの本開示のウイルスは、細胞を出た後細胞に結合または付着しないように見え、また、このことは、特に細胞培養条件が最適化されるときに、上清からの回収を容易にする。
【０３１５】
一実施形態において、方法を約４０℃以下の温度、例えば約３５〜３９℃、例えば３７℃で実施する。
【０３１６】
一実施形態において、方法を、１０％未満の二酸化炭素濃度、例えば約４〜６％ＣＯ２、例えば５％ＣＯ２で実施する。
【０３１７】
一実施形態において、方法を、６〜８の範囲内のｐＨ、例えばｐＨ７．４で実施する。
【０３１８】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルス粒子などのウイルスを含む培地をろ過して、細胞を取り出し、さらなる下流処理のための粗上清を与える。
【０３１９】
一実施形態において、タンジェンシャルフローろ過を用いる。
【０３２０】
一実施形態において、セルロース系デプスフィルターを有するミリポアのＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＰＯＤシステムを用いて培地をろ過する。Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）デプスフィルター培地は、スケーラブルなディスポーザブル形式のＰｏｄフィルターシステムとして提供される。Ｐｏｄフィルターシステムは、細胞培養など種々多様な１次および２次清澄アプリケーションに適している。
【０３２１】
Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄフィルターは、特定のアプリケーションニーズに合わせて、メディアのグレードごとに３種類のシリーズとして利用可能である。Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＤＥ、ＣＥ、およびＨＣメディアは、正の表面電荷特性と密度勾配マトリクスを介して、最適なパフォーマンスを届ける。一実施形態において、ろ過を、タンジェンシャルフロー技術を使用し、例えば、ペリコン（Pellicon）ミニカセットメンブレンホルダー、圧力センサー、ミキサーを有する１０リットルの循環タンク、濃縮液流量計、計量器、給水ポンプ、移送ポンプ、配管、およびバルブを含んでなるＣｏｇｅｎｔ（商標）Ｍシステムを用いて、実施する。システムのコントロールおよびオペレーションは、半自動式ダイアフィルトレーション／濃縮を除いて、手動式である。オペレーターは、ポンプ速度、全バルブ、および操作手順を手動でコントロールする。また、必要に応じて、このステップで最後のバッファーにウイルスを配合し得る。
【０３２２】
一実施形態において、下流処理は、８μｍのカプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２  ８μｍ）と、次いで３．０μｍ／０．８μｍのカプセルフィルター（Ｓａｒｔｏｃｌｅａｎ  ＣＡ，３．０μｍ／０．８μｍ，０．２ｍ２）が直列してなる清澄アセンブリを含んでなる。
【０３２３】
従って、一実施形態において、ろ過ステップでは、濃縮され調整されたアデノウイルス材料は、最終またはほぼ最終の配合物として与えられる。
【０３２４】
一実施形態において、方法は、２つ以上のろ過ステップを含んでなる。
【０３２５】
一実施形態において、下流処理は、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＰＯＤシステム３５ＣＥおよび５０ＣＥカセットと、次いでオプティキャップ（opticap）ＸＬ１０エクスプレス０．５／０．２μｍメンブレンフィルターとを直列で含んでなる。
【０３２６】
一実施形態において、方法は、ＣｓＣｌ勾配法、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、特に陰イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップ、およびそれらの組み合わせから選択される精製ステップをさらに含んでなる。
【０３２７】
イオン交換クロマトグラフィーは、ＤＮＡと非常に強く結合し、通常、あらゆる残留ＤＮＡが取り除かれる場である。イオン交換樹脂／膜は、ウイルスとＤＮＡの両方に結合し、塩勾配溶離中、ウイルスは、通常、最初に（低い塩勾配で）カラムから溶離し、ＤＮＡは、ＤＮＡの樹脂との相互作用がウイルスよりも強いので、はるかに高い塩濃度で溶離される。
【０３２８】
一実施形態において、クロマトグラフィーステップは、ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓから例えば入手可能な一体型技術を用いる。
【０３２９】
一実施形態において、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ（第４級アミンメンブレン精製法）を精製ステップとして用いる。
【０３３０】
一実施形態において、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  ＲＥＳＩＮを精製ステップで用いる。
【０３３１】
一実施形態において、単離したウイルスの下流処理で、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、次いでＳｏｕｒｃｅ  Ｑ  ＲＥＳＩＮを用いる。
【０３３２】
一実施形態において、単離したウイルスの下流処理で、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ、次いでＣＩＭ（登録商標）一体型カラム（ＣＩＭ−ＱＡ；第４級アミンメンブレン精製法）を用いる。
【０３３３】
一実施形態において、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑを精製ステップで用いる。
【０３３４】
製造方法のクロマトグラフィー段階（すなわち、捕捉および洗練ステップ）の間、数個のカラムを直列で連結しても良く、これにより、第１のカラムから抜け出る製品が直列した第２のカラムに捕捉されるので、第１のカラムは、材料のロスなく、結合能力を超えて過負荷状態になり得る。連続的マルチカラム製造法の原理は、製品流とは反対方向のカラムの（シミュレーションした）動きを生むので、向流クロマトグラフィー法と呼ばれる。
【０３３５】
３つ以上のカラムが向流クロマトグラフィー法で必要となることがあり、（結合能力を超えて過負荷状態になった）第１のカラムは、洗浄ステップ、溶離、再生、および再平衡化ステップを経て処理され、製品を捕捉するようにインラインで戻されるのに十分な時間を有し、一方で、一連のカラムのうち別の（製品で飽和した）カラムは、上記で概説された洗浄ステップから再平衡化ステップを受ける。各精製が行われる間中、通常クロマトグラフィーメディアの耐用期間、カラムを何回もサイクル運転する。
【０３３６】
一実施形態において、精製後、製造されたウイルスは、８０ｎｇ／ｍＬ未満の夾雑ＤＮＡ、例えば６０ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの夾雑ＤＮＡを含む。
【０３３７】
一実施形態において、実質的に全ての夾雑ＤＮＡ断片は、７００塩基対以下、例えば５００ｂｐ以下、例えば２００ｂｐ以下である。
【０３３８】
一実施形態において、精製されたウイルス製品中の残留宿主細胞タンパク質含有量は、特にＥＬＩＳＡアッセイにより測定したとき、２０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１５ｎｇ／ｍＬ以下である。
【０３３９】
一実施形態において、精製されたウイルス製品中の残留トゥイーン（tween）は、０．１ｍｇ／ｍＬ以下、例えば０．０５ｍｇ／ｍＬ以下である。
【０３４０】
ベンゾナーゼ（メルク）を１００Ｕ／ｍＬ使用して、宿主細胞ＤＮＡを消化する。ベンゾナーゼ処理を３０分間＋３７℃で実施する。ベンゾナーゼを１時間室温で高塩濃度のインキュベーションで止めた。また、ベンゾナーゼを使用して細胞性ＤＮＡを分解することは、必要に応じて、回避されるか削減されても良く、このことは有利であり得る。特に、ベンゾナーゼの除去および残留ベンゾナーゼがないことを示すための検査は、回避され得る。一実施形態において、ベンゾナーゼを本方法で用いない。
【０３４１】
一実施形態において、精製されたウイルス製品中の残留ベンゾナーゼ含有量は、１ｎｇ／ｍＬ以下、例えば０．５ｎｇ／ｍＬ以下である。
【０３４２】
本願の関連において、培地およびメディアは、交換可能に使用され得る。
【０３４３】
腫瘍崩壊性ウイルスは、癌細胞に選択的に感染し、例えば細胞の溶解、または癌細胞中での選択的な複製により、細胞死を促進するウイルスである。
【０３４４】
癌細胞に選択的に感染するウイルスは、正常で健康な細胞と比べて、高い癌細胞への感染率を示すウイルスである。
【０３４５】
本開示のキメラ型ウイルスは、腫瘍細胞のパネル、例えばＨＴ−２９、ＤＬＤ−１、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＳ１０３４、ＳＷ４０３、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８、およびＣｏｌｏ３２０ＤＭなどの結腸腫瘍細胞株での溶解能を調べることにより、特定の腫瘍型に対する特異性を評価され得る。このような評価のために、任意の利用可能な結腸腫瘍細胞株を用い得る。
【０３４６】
前立腺細胞株として、ＤＵ１４５およびＰＣ−３細胞が挙げられる。膵臓細胞株として、Ｐａｎｃ−１が挙げられる。乳房腫瘍細胞株として、ＭＤＡ２３１細胞株が挙げられ、卵巣細胞株として、ＯＶＣＡＲ−３細胞株が挙げられる。肺癌細胞株として、Ａ５４９が挙げられる。造血細胞株として、ラージおよびダウディＢリンパ性細胞、Ｋ５６２赤芽球様細胞、Ｕ９３７骨髄性細胞、およびＨＳＢ２  Ｔリンパ性細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。その他の利用可能な腫瘍細胞株が同様に有用であり得る。
【０３４７】
非キメラ型を含む腫瘍崩壊性ウイルス、例えばＡｄ１１、例えばＡｄ１１ｐを、これらの細胞株で同様に評価し得る。
【０３４８】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスは、アポトーシス性であり、すなわち、プログラム細胞死を促進する。
【０３４９】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスは、細胞溶解性である。本開示のキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスの細胞溶解活性を代表的な腫瘍細胞株で測定し、例えばＣサブ群に属するアデノウイルス、好ましくはＡｄ５を標準として用いて（すなわち、潜在能を１とし）、データを潜在能の測定値に変換することができる。細胞溶解活性を測定する好適な方法は、ＭＴＳアッセイである（本明細書の一部を構成するものとして援用される国際公開第２００５／１１８８２５号の実施例４、図２を参照されたい）。
【０３５０】
一実施形態において、本開示のキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスは、細胞壊死を引き起こす。
【０３５１】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスは、癌細胞に関する治療指数が高い。
【０３５２】
「治療指数」または「治療濃度域」は、関連の癌細胞株でのキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスの潜在能を正常（すなわち非癌性）細胞株での同じアデノウイルスの潜在能で割ることにより求められ得る、所与のアデノウイルスの腫瘍崩壊潜在性を示す数値を意味する。
【０３５３】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスは、結腸癌細胞、乳癌細胞、頭頸部癌、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、造血腫瘍細胞、白血病細胞、グリオーマ細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、メラノーマ細胞、肉腫細胞、肝臓癌細胞、腎臓癌細胞、膀胱癌細胞、および転移性癌細胞を含んでなる群から選択される１つ以上の癌細胞において治療指数が高い。
【０３５４】
キメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスは、本明細書で用いられる場合、２つ以上の異なるアデノウイルスの血清型由来のＤＮＡ配列を有するＥ２Ｂ領域を含んでなり、腫瘍崩壊性であるアデノウイルスを意味する。
【０３５５】
現在約５６のアデノウイルスの血清型がある。表１は、アデノウイルスの血清型の分類を示す。
【０３５６】
【表１】
2017529070.tif 000003
【０３５７】
Ｅ２Ｂ領域は、アデノウイルスで既知の領域であり、ウイルスゲノムの約１８％を示す。Ｅ２Ｂ領域は、タンパク質IVａ２、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質をコードすると考えられている。Ａｄ１１のＳｌｏｂｉｔｓｋｉ系統（Ａｄ１１ｐとも呼ばれる）において、これらのタンパク質は、ゲノム配列でそれぞれ５５８８〜３９６４、８４３５〜５０６７、および１０３４２〜８４３８の位置でコードされており、Ｅ２Ｂ領域は、１０３４２〜３９５０に及ぶ。Ｅ２Ｂ領域の正確な位置は、他の血清型では変わり得るが、今日までに調べられている全てのヒトアデノウイルスゲノムは、同じ一般的構成を有するので、Ｅ２Ｂ領域の機能は保存されている。
【０３５８】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスなどの本開示のウイルスは、Ｂサブ群ヘキソンを有す。
【０３５９】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスなどの本開示のウイルスは、Ａｄ１１ヘキソン、例えばＡ１１ｐヘキソンを有す。
【０３６０】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスなどの本開示のウイルスは、Ｂサブ群繊維を有す。
【０３６１】
一つにおいて、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスなどの本開示のウイルスは、Ａｄ１１繊維、例えばＡ１１ｐ繊維を有す。
【０３６２】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスなどの本開示のウイルスは、同じ血清型、例えばＢサブ群アデノウイルス、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐからの繊維およびヘキソンタンパク質を有す。
【０３６３】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスなどの本開示のウイルスは、同じ血清型、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐからの繊維、ヘキソンタンパク質、およびペントンタンパク質を有し、これらは、例えばＡｄ１１ｐのゲノム配列の３０８１１〜３１７８８、１８２５４〜２１１００、および１３６８２〜１５３６７の位置に見られる。
【０３６４】
第１のウイルスとは異なる血清型のウイルスは、同じサブ群または異なるサブ群からであっても良いが、必ず異なる血清型からであるとする。一実施形態において、組み合わせは、以下のようである。（第１のＡｄ血清型：第２のＡｄ血清型）：ＡＡ、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＦ、ＢＧ、ＣＣ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＣＧ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＥＥ、ＥＦ、ＥＧ、ＦＦ、ＦＧ、およびＧＧ。
【０３６５】
一実施形態において、キメラ型Ｅ２Ｂ領域は、Ａｄ３およびＡｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）由来である。
【０３６６】
一実施形態において、Ｅ２Ｂ領域は、本明細書で配列番号４７に示されている配列である。
【０３６７】
一実施形態において、ウイルスは、Ａｄ１１などのＢ群アデノウイルスからのヘキソンおよび繊維を有し、特に前記ウイルスは、ＣｏｌｏＡｄ１である。
【０３６８】
一実施形態において、夾雑ＤＮＡ含有量が８０ｎｇ／ｍＬ未満である単離され精製されたＥｎＡｄを与えられる。
【０３６９】
ＥｎＡｄは、国際公開第２００５／１１８８２５に開示されており、該ウイルスの全配列が本明細書、すなわち配列番号１２で与えられている。
【０３７０】
代替的なキメラ型腫瘍崩壊性ウイルスとして、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２が挙げられ、これらはそれぞれ、国際公開第２００８／０８０００３号に開示されている配列番号２および３であり、本明細書の一部を構成するものとして援用される。
【０３７１】
一実施形態において、本開示のキメラ型腫瘍崩壊性ウイルスなどの本開示のウイルスは、導入遺伝子への１つ以上の制限部位を含んでなる。一実施形態において、制限部位は、後期遺伝子、例えばＬ５の中にあるか、または隣接している。
【０３７２】
一実施形態において、本開示のキメラ型腫瘍崩壊性ウイルスなどの本開示のウイルスは、１つ以上の導入遺伝子、例えば治療用ペプチドまたはタンパク質配列をコードする１つ以上の導入遺伝子を含んでなる。
【０３７３】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスは、１つ以上の導入遺伝子をコードする。好適な導入遺伝子として、ｐ５３などのいわゆる自殺遺伝子；ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧ−ＣＳＦなどのサイトカイン、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−アルファまたはベータなどのI型インターフェロン、ＩＦＮ−ガンマなどのII型インターフェロン）、ＴＮＦ（例えば、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦベータ）、ＴＧＦ−ベータ、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ１２０をコードするポリヌクレオチド配列；モノクローナル抗体、例えばトラスツザマブ（trastuzamab）、セツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、エプラツズマブ、抗ＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、および抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＦＧＦ抗体、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、および抗ＰＤＬ１抗体を含むチェックポイントインヒビター抗体、もしくはそれらの標的抗原結合断片、またはＮＹ−ＥＳＯ１、ＷＴ１、ＭＡＧＥ−Ａ３などの腫瘍関連抗原をコードするポリヌクレオチド、ならびに当業で公知のその他が挙げられる。
【０３７４】
様々な異なる種類の導入遺伝子およびそれらの組み合わせは、それ自身が腫瘍または免疫応答を調節するように作用し、かつ治療的に作用する分子をコードする、またはこのような分子の活性を直接的もしくは非直接的に阻害、活性化、もしくは増強する因子である、と考えられている。このような分子として、タンパク質リガンドまたはリガンドの活性結合断片、抗体（完全長または断片、例えばＦｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、またはより小さな特異的結合断片）、またはその他の標的特異性結合タンパク質またはペプチド（例えば、ファージディスプレイなどの技術により選択され得るものなど）、天然または合成の結合受容体、リガンドまたは断片、標的をコードする遺伝子の転写または翻訳を制御する特異性分子（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子、転写因子）が挙げられる。分子は、その活性、安定性、特異性などを高めるように、他のペプチド配列との融合タンパク質の形態であっても良い（例えば、二量体を形成して安定性を高めるように、リガンドを免疫グロブリンＦｃ領域と融合しても良く、リガンドを樹状細胞などの抗原提示細胞に対する特異性を有する抗体または抗体断片（例えば、抗ＤＥＣ−２０５、抗マンノース受容体、抗ｄｅｃｔｉｎ）と融合しても良い）。導入遺伝は、「挿入を有しているアデノウイルス」に感染した細胞の検出、腫瘍または流入領域リンパ管およびリンパ節などのイメージングのために例えば使用され得る、レポーター遺伝子をコードしても良い。
【０３７５】
一実施形態において、キメラ型腫瘍崩壊性ウイルスに感染した癌細胞を溶解して、導入遺伝子がコードするタンパク質を含み得る細胞の内容物を放出させる。
【０３７６】
一実施形態において、細胞で複製された全ウイルスの４０〜９３％以上は、培地から回収可能であり、例えば、全ウイルスの４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、または９２％が回収可能であり、例えば全ウイルスの９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％が回収可能である。
【０３７７】
一実施形態において、方法はＧＭＰ製造法であり、例えばｃＧＭＰ製造法である。
【０３７８】
一実施形態において、方法は、貯蔵に適するバッファー中にウイルスを配合するステップをさらに含んでなる。
【０３７９】
一実施形態において、形成物は、室温での貯蔵に適する。
【０３８０】
一実施形態において、形成物は、４℃以下での貯蔵に適する。
【０３８１】
一実施形態において、形成物は凍結されている。
【０３８２】
一実施形態において、本開示は、本方法から得られる、または得られ得るウイルスまたはウイルス配合物にまで及ぶ。
【０３８３】
この明細書の関連において、「含んでなる」は、「含む」として解釈されるべきである。
【０３８４】
また、特定の要素を含んでなる本発明の態様は、関連の要素から「なる」または「本質的になる」代替的実施形態にまで及ぶことが意図されている。
【０３８５】
本明細書の発明の全ての根底にある基礎技術は同じであるので、本発明の複数の実施形態は、本開示の異なる別個の態様に関連する場合でさえも、技術的に必要である場合には、組み合わされても良い。
【０３８６】
実施形態は、特定の特徴／要素を含んでなるものとして本明細書に記載されている。また、本開示は、前記特徴／要素からなる、または本質的になる別の実施形態にまで及ぶ。
【０３８７】
特許および出願などの技術文献は、本明細書の一部を構成するものとして援用される。
【０３８８】
本明細書に具体的かつ明示的に記載されているあらゆる実施形態は、単独で、または１つ以上の他の実施形態と組みわされて、除くクレーム（disclaimer）の基礎を形成し得る。
【０３８９】
本発明を、添付の図面に関する以下の実施例において、例示のためだけにさらに説明する。
【０３９０】
項
１．複製能を有するアデノウイルス；または
Ｅ２Ｂ領域を含んでなるゲノムを有する複製可能である、または複製欠損であるキメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルスであって、前記Ｅ２Ｂ領域が第１のアデノウイルス血清型に由来する塩基配列および第２の異なるアデノウイルス血清型に由来する塩基配列を含んでなり、前記第１および第２の血清型がアデノウイルスサブ群Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、またはＦからそれぞれ選択される、前記キメラ型腫瘍崩壊性アデノウイルス、
の連続製造方法であって、
Ａ）容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で連続培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができる前記ステップ、および
Ｂ）ステップａ）から製造された前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ、
を含んでなり、ウイルス感染および製造用の生細胞を、連続製造期間前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持する前記方法。
または
１．Ｂ群アデノウイルス
の連続製造方法であって
Ｃ）容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で連続培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができる前記ステップ、および
Ｄ）ステップａ）から製造された前記ウイルスを前記培地から単離するステップであって、前記ウイルスの単離が細胞溶解ステップの後ではない前記ステップ、
を含んでなり、ウイルス感染および製造用の生細胞を、連続製造期間前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持する前記方法。
２．前記ウイルスがＡｄ１１などのＢ群アデノウイルスからのヘキソンおよび繊維を有し、特に前記ウイルスが群ＣｏｌｏＡｄ１から選択される、項１に記載の方法。
３．前記ウイルスが複製能を有す、項１または２に記載の方法。
４．前記連続製造期間が２回以上のウイルス複製サイクルを含んでなる、項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
５．各ウイルス複製サイクルが７０〜３００時間の範囲内にある、項４に記載の方法。
６．ウイルス感染および製造用の生細胞を、培養物を増大させるために細胞をさらに添加することによって、前記ウイルスの複製に適したレベルに前記容器内で維持する、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
７．前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、ＰｅｒＣ６、およびＧＭＫを含んでなる群から選択され、特にＨＥＫ２９３である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
８．培養が５Ｌ以上の規模である、項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．培養中のウイルスが、４０〜１５０ｐｐｃ、例えば５０〜１００ｐｐｃの範囲内の濃度である、項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
１０．前記細胞を、１〜９×１０４ｖｐ／ｍｌ以上、例えば１〜９×１０５、１〜９×１０６、１〜９×１０７、１〜９×１０８、１〜９×１０９、特に４〜５×１０６ｖｐ／ｍｌの出発ウイルス濃度で感染させる、項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
１１．腫瘍崩壊性ウイルスの画分を与え、異なる方法の同じステップで作製された前記腫瘍崩壊性ウイルスの第２の画分を第１の画分とまとめるさらなるステップを含んでなる、項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．灌流培養を用いる、項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．浮遊培養を用いる、項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．懸垂培養を用いる、項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
１５  ＧＭＰ製造法である、項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．フィルターがタンジェンシャルフィルターである、項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．ＣｓＣｌ勾配法、イオン交換クロマトグラフィー、特に陰イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップ、およびそれらの組み合わせから選択される精製ステップをさらに含んでなる、項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．全ウイルスの４０〜９３％が前記培地から回収可能である、項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．ａ．容器内で、アデノウイルスに感染した哺乳類細胞を、前記細胞を支持するのに適した培地の存在下で培養して前記ウイルスを複製させるステップであって、前記細胞がウイルス複製を支持することができ、前記ウイルスの出発播種密度が１〜２×１０６ｖｐ／ｍｌの範囲内（１×１０６ｖｐ／ｍｌなど）にあり、感染多重度が１０〜１５ｖｐ／細胞などの５〜２０ｖｐ／細胞の範囲内にあり、特に１２．５ｖｐ／細胞である、前記ステップ、および
ｂ．ウイルス感染後２４〜７５時間の期間に溶解ステップを実施して前記細胞から前記ウイルスを収集するステップであって、例えば前記溶解ステップを感染後６６，６７、６８、または６９時間など感染後６５〜７０時間で実施する、前記ステップ、
を含んでなる前記アデノウイルスの製造方法。
２０．  貯蔵に適するバッファー中に前記ウイルスを配合することをさらに含んでなる、項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．  本明細書、例えば項１〜２０のいずれか一項に記載の方法から得られる、または得られ得るウイルスまたは配合物。
【０３９１】
配列
配列番号１  抗ＶＥＧＦ完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−７７ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’分岐スプライスアクセプター配列（ｂＳＡ）、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、ＩＲＥＳ、５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号２  抗ＶＥＧＦ完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−１３５ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ショートスプライスアクセプター配列（ＳＳＡ）、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、ＩＲＥＳ、５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号３  領域ＢＹに挿入されている、抗ＶＥＧＦ完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットを含んでなる、ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＳＳＡ、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、ＳＳＡ、および５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列を含む。
配列番号４  領域ＢＹに挿入されている、抗ＶＥＧＦ完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットを含んでなる、ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＳＳＡ、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、ＳＳＡ、５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号５  抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−７４ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ｂＳＡ、５’リーダーを有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号６  Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−７８ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ｂＳＡ、５’リーダーおよび３’６×ヒスチジン配列を有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖ配列、ならびにポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号７  Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−７６ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＣＭＶプロモーター、５’リーダーおよび３’６×ヒスチジン配列を有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖ配列、ならびにポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号８  抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−７３ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＣＭＶプロモーター、５’リーダーを有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号９  抗ＶＥＧＦ完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−１３４ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＣＭＶプロモーター、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、ＩＲＥＳ、５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号１０  ＥｎＡｄゲノムのｂｐ２８１６６〜２８３６６に相当し、これを含むＢＸ  ＤＮＡ配列。
配列番号１１  ＥｎＡｄゲノムのｂｐ２９３４５〜２９３７９に相当し、これを含むＢＹ  ＤＮＡ配列。
配列番号１２  ＥｎＡｄゲノム。
配列番号１３  ＣＭＶ外来性プロモーター。
配列番号１４  ＰＧＫ外来性プロモーター。
配列番号１５  ＣＢＡ外来性プロモーター。
配列番号１６  ショートスプライスアクセプター（ＳＳＡ）。ヌル（Null）配列
配列番号１７  スプライスアクセプター（ＳＡ）。
配列番号１８  分岐スプライスアクセプター（ｂＳＡ）。
配列番号１９  内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）。
配列番号２０  ポリアデニレーション配列。
配列番号２１  リーダー配列（ＨｕＶＨ）。
配列番号２２  リーダー配列（ＨＧ３）。
配列番号２３  ヒスチジンタグ。
配列番号２４  Ｖ５タグ。
配列番号２５  Ｐ２Ａペプチド。
配列番号２６  Ｆ２Ａペプチド。
配列番号２７  Ｅ２Ａペプチド。
配列番号２８  Ｔ２Ａペプチド。
配列番号２９  抗ＶＥＧＦ  ａｂ  ＶＨ鎖アミノ酸配列。
配列番号３０  抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＶＨ鎖アミノ酸配列。
配列番号３１  抗ＶＥＧＦ  ａｂ  ＶＬ鎖アミノ酸配列。
配列番号３２  抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＶＬ鎖アミノ酸配列。
配列番号３３  ヒトＩｇＧ１定常重鎖アミノ酸配列。
配列番号３４  ヒトＩｇＧ１改変定常重鎖アミノ酸配列。
配列番号３５  ヒトカッパー定常軽鎖アミノ酸配列。
配列番号３６  抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖアミノ酸配列。
配列番号３７  抗ＰＤ−Ｌ１  ＳｃＦｖアミノ酸配列。
配列番号３８  緑色蛍光タンパク質アミノ酸配列。
配列番号３９  ルシフェラーゼアミノ酸配列。
配列番号４０  ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）アミノ酸配列。
配列番号４１  ヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）アミノ酸配列。
配列番号４２  ヒトインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）アミノ酸配列。
配列番号４３  ヒト癌／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）アミノ酸配列。
配列番号４４  ヒトＭＵＣ−１アミノ酸配列。
配列番号４５  コザック配列。ｇｃｃａｃｃａｔｇ（ヌル（Null）配列）
配列番号４６  抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−１７７ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＣＭＶプロモーター、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、ＩＲＥＳ、５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号４７  ＥｎＡｄゲノムのＥ２Ｂ領域（ｂｐ１０３５５〜５０６８）に相当するＤＮＡ配列。
配列番号４８  Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−１６７ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ＳＳＡ、５’リーダーを有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号４９  領域ＢＹに挿入されている、サイトカインであるＩＦＮγをコードする導入遺伝子カセット、を含んでなるＮＧ−９５ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ＣＭＶプロモーター、ＩＦＮγｃＤＮＡ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号５０  領域ＢＹに挿入されている、サイトカインであるＩＦＮαをコードする導入遺伝子カセット、を含んでなるＮＧ−９７ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ＣＭＶプロモーター、ＩＦＮαｃＤＮＡ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号５１  サイトカインであるＩＦＮγをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−９２ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ｂＳＡ、ＩＦＮγｃＤＮＡ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号５２  サイトカインであるＩＦＮαをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−９６ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ｂＳＡ、ＩＦＮαｃＤＮＡ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号５３  サイトカインであるＴＮＦαをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−１３９ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ＳＳＡ、ＴＮＦαｃＤＮＡ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号５４  制限部位挿入（ＢＹ）。
配列番号５５  制限部位挿入（ＢＸ）。
配列番号５６  腫瘍関連抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−２２０ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ＰＧＫプロモーター、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃＤＮＡ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号５７  腫瘍関連抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−２１７ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ＣＭＶプロモーター、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃＤＮＡ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号５８  抗ＣＴＬＡ−４完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−２４２ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＳＳＡ、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、ＩＲＥＳ、５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号５９  抗ＶＥＧＦ完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−１６５ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＳＳＡ、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、Ｐ２Ａペプチド配列、５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号６０  抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−１９０ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＳＳＡ、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、Ｐ２Ａペプチド配列、５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号６１  Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを有する抗ＰＤ−Ｌ１  ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−２２１ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ＳＳＡ、５’リーダーおよび３’６×ヒスチジン配列を有する抗ＰＤ−Ｌ１  ＳｃＦｖ配列、ならびにポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号６２  抗ＶＥＧＦ完全長抗体をコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−２５８ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＣＭＶプロモーター、５’リーダーを有するａｂ重鎖配列、Ｐ２Ａペプチド配列、５’リーダーを有するａｂ軽鎖配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号６３  ＢＸおよびＢＹ領域に挿入されているユニークな制限部位を有するＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−１８５ウイルスゲノム配列。
配列番号６４  バクテリア複製起点（ｐ１５Ａ）、抗生物質耐性遺伝子（ＫａｎＲ）、およびＢＹ領域に挿入されているユニークな制限部位を有するＥｎＡｄゲノム配列を含んでなるｐＮＧ−３３（ｐＣｏｌｏＡｄ２．４）ＤＮＡプラスミド。
配列番号６５  バクテリア複製起点（ｐ１５Ａ）、抗生物質耐性遺伝子（ＫａｎＲ）、ならびにＢＸおよびＢＹ領域に挿入されているユニークな制限部位を有するＥｎＡｄゲノム配列を含んでなるｐＮＧ-１８５（ｐＣｏｌｏＡｄ２．６）ＤＮＡプラスミド。
配列番号６６  領域ＢＹに挿入されている、ｓｈＲＮＡ〜ＧＡＰＤＨをコードする導入遺伝子カセット、を含んでなるＮＧ−ｓｈ０１ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、Ｕ６  ＲＮＡ  ｐｏｌIIIプロモーターおよびｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。
配列番号６７  ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）アミノ酸配列。
配列番号６８  領域ＢＹに挿入されている、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）をコードする導入遺伝子カセット、を含んでなるＮＧ−２８０ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、５’ＳＳＡ、ＮＩＳ  ｃＤＮＡ配列、および３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号６９  抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖおよび抗ＰＤ−Ｌ１  ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−２７２ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ＳＳＡ、５’リーダーおよび３’６×Ｈｉｓタグを有する抗ＰＤ−Ｌ１  ＳｃＦｖ配列、Ｐ２Ａペプチド配列、５’リーダーおよび３’Ｖ５−タグを有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖ配列、ならびに３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号７０  抗ＣＴＬＡ−４ＶＨ鎖アミノ酸配列。
配列番号７１  抗ＣＴＬＡ−４ＶＬ鎖アミノ酸配列。
配列番号７２  抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子カセットが領域Ｂｘに挿入されているＥｎＡｄゲノムを含んでなるＮＧ−２５７ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ｂＳＡ、５’リーダーおよび３’６×Ｈｉｓタグを有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖ配列、ならびに３’ポリ（Ａ）配列を含む。
配列番号７３  抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子カセットが領域Ｂｘに挿入されており、抗ＰＤ−Ｌ１  ＳｃＦｖをコードする第２の導入遺伝子カセットが領域ＢＹに挿入されているＥｎＡｄゲノム、を含んでなるＮＧ−２８１ウイルスゲノム配列。導入遺伝子カセットは、ｂＳＡ、５’リーダーおよび３’６×Ｈｉｓタグを有する抗ＶＥＧＦ  ＳｃＦｖ配列、ならびに３’ポリ（Ａ）配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【０３９２】
【図１】アデノウイルス製造方法の略図を示す。
【図２】連続的ウイルス製造用細胞培養装置を示す。
【図３】収率に対する播種密度のプロットを示す。
【図４】振盪フラスコＡおよびＢについて、感染多重度が１２．５、播種細胞密度が１×１０６であり、培地交換をしたときの、感染後の様々な時点での細胞当り製造されたウイルスのプロットを示す。
【図５】振盪フラスコＣおよびＤについて、感染多重度が１２．５、播種細胞密度が４×１０６であり、培地交換をしないときの、感染後の様々な時点での細胞当り製造されたウイルスのプロットを示す。
【図６】培地交換はウイルスの収率を増加させることを示す。
【図７】感染期間に対する細胞の生存率のパーセンテージを示す。
【図８】ＤＯＥ（？？）について感染後の様々な時点での細胞の生存率のパーセンテージを示す。感染多重度が１２．５、播種密度が１×１０６であり、培地交換をしたときの、フラスコＡおよびＢ
【図９】ＤＯＥフラスコＡおよびＢについて、感染多重度が１２．５、播種密度が１×１０６であり、培地交換をしたときの、感染後の様々な時点での上清中のウイルスのパーセンテージを示す。
【図１０】ＤＯＥフラスコＣおよびＤについて、感染多重度が１２．５、播種密度が４×１０６であり、培地交換をしないときの、感染後の様々な時点での上清中のウイルスのパーセンテージを示す。
【図１１】１２．５ｐｐｃのＭＯＩ、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で細胞をＥｎＡｄに感染させたときの、５Ｌのバイオリアクター法のウイルス製品の分布を示す。
【図１２】１．９×１０６細胞／ｍｌの播種密度を採用する方法について、細胞当り製造されたウイルス粒子の総数を経時的に示す。培養物を５０ｐｐｃでＥｎＡｄに感染させた。
【図１３】１２．５ｐｐｃおよび１×１０６ｖｐ／ｍｌの播種密度を採用する方法について、細胞の生存率を経時的に示す。
【図１４】５０ｐｐｃおよび１．９×１０６ｖｐ／ｍｌの播種密度を採用する方法について、細胞の生存率を経時的に示す。
【図１５】１×１０６ｖｐ／ｍｌの播種密度および１２．５ｐｐｃを採用する方法、ならびに１．９×１０６ｖｐ／ｍｌおよび５０ｐｐｃを採用する第２の方法の２つの方法についてのバイオリアクターデータを示す。
【図１６】２．２×１０６生細胞／ｍＬの播種密度および５０ｐｐｃの感染を採用する方法について、細胞の生存率を経時的に示す。
【図１７】２．２×１０６生細胞／ｍＬの播種密度および５０ｐｐｃの感染を採用する方法について、細胞の分布を示す。
【図１８】２．２×１０６生細胞／ｍＬの播種密度を採用し、５０ｐｐｃで感染させたが、細胞浮遊液の取り出しも新鮮細胞および培地の添加も行わなかったコントロールの培養物の生存率を示す。
【図１９】２．２×１０６生細胞／ｍＬの播種密度を採用し、５０ｐｐｃで感染させたが、細胞浮遊液の取り出しも新鮮細胞および培地の添加も行わなかったコントロールの培養物についてウイルスの分布を示す。
【図２０】２．２×１０６生細胞／ｍＬの播種密度および５０ｐｐｃの感染を採用した方法、ならびに細胞浮遊液の取り出しも新鮮細胞および培地の添加も行わなかったコントロールの方法について累積的なウイルスの分布を示す。
【図２１】振盪フラスコ実験で１．０×１０６生細胞／ｍＬおよび１２．５ｐｐｃの感染を採用する方法について、細胞の生存率を経時的に示す。
【図２２】振盪フラスコ実験で１．０×１０６生細胞／ｍＬおよび１２．５ｐｐｃの感染を採用する方法について、ウイルスの分布を経時的に示す。
【図２３】振盪フラスコ実験で１．０×１０６生細胞／ｍＬおよび１２．５ｐｐｃの感染を採用し、細胞浮遊液の取り出しも新鮮細胞および培地の添加も行わなかったコントロールの方法について、細胞の生存率を経時的に示す。
【図２４】振盪フラスコ実験で１．０×１０６生細胞／ｍＬおよび１２．５ｐｐｃの感染を採用し、細胞浮遊液の取り出しも新鮮細胞および培地の添加も行わなかったコントロールの方法について、ウイルスの分布を経時的に示す。
【図２５】振盪フラスコ実験で１．０×１０６生細胞／ｍＬおよび１２．５ｐｐｃの感染を採用した方法、ならびに細胞浮遊液の取り出しも新鮮細胞および培地の添加も行わなかったコントロールの方法について、累計ウイルス収率を示す。
【図２６】１．０×１０６生細胞／ｍＬおよび１２．５ｐｐｃの感染を採用し、９５％の浮遊液を様々な時点で取り出し、細胞密度が１．０×１０６生細胞／ｍｌの新鮮培地中の４７．５ｍＬの非感染細胞と取り換えた方法における細胞の生存率を示す。
【図２７】１．０×１０６生細胞／ｍＬおよび１２．５ｐｐｃの感染を採用し、９５％の浮遊液を様々な時点で取り出し、細胞密度が１．０×１０６生細胞／ｍｌの新鮮培地中の４７．５ｍＬの非感染細胞と取り換えた方法におけるウイルスの分布を示す。
【図２８】１．０×１０６生細胞／ｍＬおよび１２．５ｐｐｃの感染を採用し、９５％の浮遊液を様々な時点で取り出し、細胞密度が１．０×１０６生細胞／ｍｌの新鮮培地中の４７．５ｍＬの非感染細胞と取り換えた方法、ならびにコントロールの方法における累計ウイルスを示す。
【実施例】
【０３９３】
実施例１
浮遊培養および無血清培地に順応したＨＥＫ２９３細胞を増殖させ、１００ｒｐｍの複数の１２５ｍＬ振盪フラスコ中の３０ｍＬのＥＸ−ＣＥＬＬ無血清培地中で＞９０％の生存率で１×１０６生細胞／ｍＬの細胞密度に拡大させる。次に、フラスコの一部を５０細胞当りウイルス粒子（ｐｐｃ）の感染多重度（ＭＯＩ）を用いてＥｎＡｄウイルスに感染させ、一方、残りのフラスコを非感染のままにし、継代により０．５〜２×１０６生細胞／ｍＬの細胞密度、生存率＞７５％に維持し、以下に示すように感染させた細胞培養物に組み入れるために使用する。感染後の様々な時点で、振盪フラスコの１つから１０ｍＬの培養物を取り出し、１×１０６生細胞／ｍＬ、＞９０％の生存率の１０ＭＬの新鮮ＥＸ−ＣＥＬＬ培地中の非感染ＨＥＫ２９３細胞と取り変える。１０ｍＬの感染させた細胞培養浮遊液を遠心分離し、上清を分析用に貯蔵し、細胞ペレットを１ｍＬの新鮮培地に溶解（３×凍結融解）し、次に、遠心分離により清澄化し、その後分析用に貯蔵する。次に、感染させた振盪フラスコ培養物を、細胞生存率が＜７５％に減少するまで再培養し、次に、培養を中止し、培養物を遠心分離し、処理して上清および細胞溶解物画分（上記）を得、分析用に貯蔵する。実験の間中、Ｂｕｒｋｅｒ細胞血球計およびトリパンブルー染色ならびにｐＨ測定を用いる細胞数および生存率の計測のために、浮遊液の少量のアリコート（５０μｌ）を各フラスコから取り出す。
【０３９４】
細胞溶解物サンプルおよび上清サンプル中の全ての、および感染性のＥｎＡｄ粒子を、ＨＰＬＣおよび免疫染色感染アッセイにより、それぞれ測定する。上清サンプル中の宿主細胞のＤＮＡの量を、リアルタイムｑＰＣＲにより測定し、上清中の宿主細胞のタンパク質の量を、親和性精製されたヤギ抗ＨＥＫ抗血清を用いるＨＥＫ２９３宿主細胞由来タンパク質ＥＬＩＳＡ（Host Cell Protein ELISA）キットを使用して測定する。全ＥｎＡｄウイルス収率ならびに宿主細胞のＤＮＡおよびタンパク質のレベルを、様々な処理時点について比較した。
【０３９５】
実施例２
実施例１に記載の実験手順を採用するが、様々な時点で３０ｍＬの浮遊液のうち１５ｍＬを取り出し、１０ｍＬの容積ではなく、１５ｍＬの新鮮培地中の非感染細胞と取り換える。
【０３９６】
実施例３
実施例１に記載の実験手順を採用するが、この実験においては、感染させた培養フラスコに組み入れる新鮮非感染細胞を、同じフラスコから取り出したウイルス含有上清に再浮遊させ（分析用の２×５００μｌのアリコートを戻しながら）、容積を１０ｍＬに調製し、その後元のフラスコに組み入れる。
【０３９７】
実施例４
実施例３に記載の実験手順を採用するが、様々な時点で３０ｍＬの浮遊液のうち１５ｍＬを取り出し、１０ｍＬの容積ではなく、１５ｍＬのウイルス含有上清中に再浮遊された非感染細胞と取り換える。
【０３９８】
実施例５〜８
一連の４つの他の実験は、実施例１〜４で詳説した手順を用いるが、浮遊液を取り出して新鮮細胞と取り換える一連の手順の後に実験を終了するのではなく、浮遊液を取り出して新鮮細胞と取り換える手順を繰り返して培養物を維持し、（例えば、細胞片もしくは他の細胞生産物の蓄積または十分な栄養分の欠如により）十分な生細胞の維持が持続できなくなるまで、この手順を続ける。浮遊液の取り出しおよび取り換えの頻度は、毎日実施される細胞数および生存率情報ならびに目視観測により導かれる。
【０３９９】
実施例９
１つのバイアルの浮遊ＨＥＫ２９３細胞を融解し、振盪フラスコ中で拡大させた後、５Ｌの攪拌槽（ガラス容器）バイオリアクター中の３Ｌのワーキング容積に拡大させる。バイオリアクターコントローラーを、３７℃、ｐＨの設定値が７．４、溶存酸素（ＤＯ）が５０、気流速度が１００ｍＬ／分、攪拌が１００ｒｐｍというパラメーターに設定した。バイオリアクターシステムを平衡化した後、初期容積が１．５ＬのＥＸ−ＣＥＬＬ培養培地を５×１０５細胞／ｍＬの生細胞密度で播種し、次に、３Ｌのワーキング容積に拡大させ、＞９０％の生存率を維持し、ＥｎＡｄウイルスに感染させるために、１．８〜２．２×１０６細胞／ｍＬの密度を目標とする。灌流および培地交換を、３Ｌの段階で、ホローファイバータンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）により開始する。ＴＦＦカートリッジは、０．２μｍの細孔径、０．５ｍｍの内径、および７９０ｃｍ２の表面積を有した。ＴＦＦアセンブリを、オートクレーブにより予め滅菌し、次に無菌配管溶接機を使用することにより、バイオリアクターに取り付けた。ペリスタポンプを使用して、細胞培養物がＴＦＦシステムを再循環するようにする。濃縮液ラインに背圧をかけず、一方で、第２のペリスタポンプを透過液ラインに置いて、測定した流量を系外に与える。灌流流量を１日当り１容器容積（すなわち、３Ｌ／２４時間）に設定した。目標の細胞密度に達したら、培養物を５０ｐｐｃのＭＯＩでＥｎＡｄに感染させた。
【０４００】
バイオリアクター培養と平行して、ＨＥＫ２９３細胞の振盪フラスコ培養を構築し、定期的な継代により０．５〜２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度と＞９０％の生存率で維持し、これらの細胞を非感染細胞の源として使用して、記載のバイオリアクターに添加する。
【０４０１】
灌流透過液の収集を感染後４８時間で始めた。灌流透過液サンプルを一定間隔の時点で取り、第２の浮遊フラスコからの非感染細胞をバイオリアクター中の感染細胞に組み入れ、細胞密度を２×１０６細胞／ｍＬ、細胞生存率を＞７５％生存率に維持する。細胞透過液サンプル中の全ての、および感染性のＥｎＡｄ粒子を、ＨＰＬＣおよび免疫染色感染アッセイにより、それぞれ測定した。上清サンプル中の宿主細胞のＤＮＡの量を、リアルタイムｑＰＣＲにより測定し、宿主細胞のタンパク質の量を、親和性精製されたヤギ抗ＨＥＫ抗血清を用いるＨＥＫ２９３宿主細胞由来タンパク質ＥＬＩＳＡ（Host Cell Protein ELISA）キットを使用して測定した。全ＥｎＡｄウイルス収率ならびに宿主細胞のＤＮＡおよびタンパク質のレベルを、様々な時点で比較する。バイオリアクター培養物を、細胞生存率が５０％を超えて維持されることができなくなるまで、灌流および新鮮非感染細胞取り換え手順により活性に維持する。
【０４０２】
収集したウイルス含有透過液サンプルをプールし、本明細書に記載の連続製造の要素なく製造された適当な標準ウイルス製剤と分析的アッセイデータを比較できるように、（以下で概説する）ＥｎＡｄウイルスのＧＭＰ製造用に予め構築した方法によりウイルスを精製する。
【０４０３】
ＥｎＡｄウイルスの精製
様々な時点でバイオリアクターから収集した無細胞透過液サンプルからウイルスを精製する。最初に、これらの透過液サンプルをＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）で処理して、宿主細胞ＤＮＡを消化し、次に、濃縮し、バッファーをタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）により交換し、２つの異なる陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用するＥｎＡｄの選択的捕捉および溶離を含む下流のツーステップの精製方法の第１ステップのための準備とする。第１の１次捕捉ステップ（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ樹脂）を実施し、次に、第２の「洗練」精製ステップ（例えば、ＣＩＭ−Ｑ）を実施して、宿主細胞残留物をさらに減らす。次に、精製したウイルスを、第２のＴＦＦステップを使用してバッファー交換して最終配合物にし、その後材料を−８０℃で凍結保存し、その後分析する。
【０４０４】
実施例１０
ＨＥＫ２９３細胞のＥｎＡｄ感染に１００のＭＯＩを用いて、実施例９に記載した実験手順を採用する。
【０４０５】
実施例１１
この実験のために、実験計画法（ＤＯＥ）に従い、ウイルス収率および上清または細胞への分布に関する様々な培養パラメーターの効果を評価するために、ＪＭＰソフトウェアを使用してカスタマイズした。この研究計画のために使用した様々な変数、各変数の範囲、および応答を表１に示す。
【０４０６】
【表２】
2017529070.tif 000004
【０４０７】
ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）からの１つのバイアルのＨＥＫ２９３細胞を３７℃で融解し、６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ２９３培地（増殖培地）を使用して、７５ｃｍ２の細胞培養フラスコに拡大させた。インキュベーションの４日後、細胞をさらに継代し（継代１）、＞１．０×１０６生細胞／ｍＬの密度での１．２×１０７細胞の生細胞数が達成されたら（継代１から約３〜５日後）、細胞を無菌振盪フラスコに移した（継代２）。培養物をモニタリングし、細胞数が２倍になり≧１．２×１０６生細胞／ｍＬになったときに、細胞を約３または４日おきにさらに経代した。細胞増殖段階の間中、細胞密度が０．５〜０．６×１０６生細胞／ｍＬの最低細胞密度で維持されていることを確証するために、計数により細胞数をモニタリングした。
【０４０８】
細胞数の計数を、自動細胞カウンタ（インビトロジェン（Invitrogen））およびトリパンブルー染色（インビトロジェン（Invitrogen））を使用して実施した。実験に必要な細胞が生成するまで、１Ｌの無菌振盪フラスコでさらに細胞数を拡大させた。
【０４０９】
細胞浮遊液を３００ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを新鮮増殖培地に再浮遊させ、振盪フラスコに各フラスコ中４０ｍｌのワーキング容積で細胞浮遊液を移し、播種細胞密度を表２に従って調整した。各振盪フラスコを適切にラベルした。
【０４１０】
【表３】
2017529070.tif 000005
注：１．００Ｅ＋０６，１ｅ６および１×１０６；４．００Ｅ＋０７，４ｅ７および４×１０７などは、対応する細胞数の記述語である。
【０４１１】
１つのバイアルのＥｎＡｄワーキングウイルスシードストック（ＷＶＳＳ）を−７０℃の貯蔵庫から取り出し、室温で融解した。振盪フラスコＡからＩの感染を、表２に記載の感染多重度（ＭＯＩまたはｐｐｃ）を用いて実施した。ネガティブコントロールフラスコは、感染させなかったが、感染期間の間中、維持した。全てのフラスコを、＋３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍの振盪インキュベーターに入れた。振盪フラスコＡ、Ｂ、Ｇ、およびＩにおいて、感染後２４時間に、３００ｇで５分間の遠心分離後上清を取り出し、４０ｍｌの新鮮増殖培地中の細胞ペレットを各フラスコに再浮遊させることにより、培地交換を行った。
【０４１２】
【表４】
2017529070.tif 000006
【０４１３】
感染後４０、４８、６０、および７２時間に、各フラスコから分析のために４．１ｍｌのサンプルを取り、感染後９６時間に、残りの全細胞浮遊液を収集した。各時点で２×５００μｌのサンプルを細胞数および生存率の分析に使用した。残りの４．０ｍｌを、上清と細胞ペレットにおけるウイルスの分布の分析のために使用した。これを、感染させた細胞培養浮遊液を遠心分離し、上清を分析用に貯蔵し、細胞ペレットを新鮮培地に溶解（３×凍結融解）し、次に、遠心分離により清澄化し、その後分析用に貯蔵することにより、測定した。
【０４１４】
粗ウイルス溶解物（ＣＶＬ）サンプルおよび上清（ＳＮ）サンプル中の全ウイルス粒子濃度（ｖｐ）をＡＥＸ−ＨＰＬＣアッセイにより測定した。ＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析の間、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、溶離の運転の開始時に溶離し、従ってＨＣＰ含有量も、クロマトグラムの分析およびＨＣＰピーク面積の大きさにより求められ得ることが分かった。
【０４１５】
細胞の生存率のパーセンテージおよびトリパンブルー染色された細胞のパーセンテージ（死細胞および「漏出」細胞の両方を表し、「漏出」細胞は、機能的にまだ死んではいないが、膜の完全性が損なわれており、その結果トリパンブルー色素が「漏出」細胞内に入ることができる）を、表４に表す。振盪フラスコ培養当りのウイルス粒子の総数および各サンプル時点に関するＳＮおよびＣＶＬ中のウイルス粒子のパーセンテージを、表５に表す。
【０４１６】
このＤＯＥ実験からの結果を、ＪＭＰソフトウェア分析を使用して「最小二乗適合モデル」を用いて適合させ、様々な変数とウイルス収率（ｖｐ／細胞）に関連する応答に対する変数の効果との間の関係性を評価した。１）播種密度とＤＯＩ；２）ＭＯＩとＤＯＩ、および３）培地交換とＤＯＩという３つの相互関係が、細胞当り収率モデルにおいて有意であると認められた。
【０４１７】
播種密度は、全ウイルス製造量に対して最も大きな統計効果を有した。より低い細胞播種密度で、より高い細胞当り収率が観察された（図３）。細胞当りウイルス収率が５９２２ｖｐ／細胞という著しく低い場合の（１２．５ｐｐｃで感染させた）４ｅ６細胞／ｍｌと比べて（図３および５）、１９８，１４３ｖｐ／細胞という最高の収率が、（１２．５ｐｐｃで感染させた）１ｅ６細胞／ｍｌという最低の細胞密度で観察された（図３および４）。フラスコ当り全ウイルス収率は、より高い細胞密度とＭＯＩ条件（フラスコＩ）で最も高かった。
【０４１８】
培地交換もまた、収率に対して有意な統計効果を有した（図６）。感染後２４時間で培地交換をした振盪フラスコ（振盪フラスコＡ、Ｂ、Ｇ、およびＩ）は、培地交換をしなかった振盪フラスコと比べてウイルス収率が高かった。結果を図４、５、および６に示す。
【０４１９】
より長い感染期間（ＤＯＩ）では、細胞生存率は減少し、漏出細胞および死細胞のパーセンテージは増加した。生存率および漏出／死の％を表４に表し、図７および８に示す。漏出細胞は、無傷の細胞膜を有するように見えるが、前記細胞膜がトリパンブルー染色に対して透過性である細胞として定義される。死細胞は、トリパンブルーで染色されるが、細胞膜は、もはや無傷ではない。
【０４２０】
１ｅ６細胞／ｍｌの播種密度で、１２．５ｐｐｃで感染させ、培地交換をしたとき、感染後９６時間に、９３％を超えるウイルスが上清中に観察された（図９）。４ｅ６細胞／ｍｌというより高い細胞密度で、同じ１２．５ｐｐｃで感染させ、培地交換をしなかったとき、上清中にウイルスは全く観察されなかった（図１０）。
【０４２１】
【表５】
2017529070.tif 000007
【０４２２】
【表６】
2017529070.tif 000008
【０４２３】
実施例１２
振盪フラスコにおける実施例１１に記載の実験から示された重要なＤＯＥパラメーターは、５Ｌバイオリアクター内で評価された。ＨＥＫ２９３細胞の増殖およびバイオリアクターの準備を実施例９に記載のように実施した。細胞数の計数を自動細胞カウンタおよびトリパンブルー染色を使用して実施した。振盪フラスコ中で生細胞が合計で７．５ｅ８細胞に達したら、細胞を５Ｌのバイオリアクターに播種するために使用した。目標細胞密度である１ｅ６細胞／ｍＬに達したときに、バイオリアクターを１２．５ｐｐｃのＭＯＩでＥｎＡｄに感染させた。
【０４２４】
感染後２４、４０、４８、６５、および７０時間に、サンプル（２０ｍｌ）を細胞数、生存率、全ウイルス濃度のために取った。上清を遠心分離により細胞から分離し、ＡＥＸ−ＨＰＬＣによるウイルス粒子濃度の分析を実施するまで、−８０℃で貯蔵した。細胞ペレットサンプルを実施例１１に概説されているように製造し、ＨＰＬＣ分析まで−８０℃で貯蔵した。結果を表６に示す。
【０４２５】
これらの条件下で、全ての時点について、ウイルスの大部分はＣＶＬに存在し（図１１）、感染後７１時間まで、上清中に存在するウイルスは少ない。感染後７１時間では、９６％のＥｎＡｄウイルスが細胞ペレット中に観察され（表６および図１１）、たった４％が上清中に存在した（表６）。合計で４２８，８６８のウイルス粒子が化学的溶解により細胞から抽出され、細胞片は清澄化により除去された（表６の溶解後の数値を参照）。
【０４２６】
１２．５ｐｐｃでの感染から７１時間後の細胞生存率は、Ｔ０で８５％であるのに比べて、５８％であった（図１３）。５０ｐｐｃでの感染から７１時間後では（実施例１３を参照）、細胞生存率は、概して３０％以下であった。
【０４２７】
【表７】
2017529070.tif 000009
【０４２８】
実施例１３
感染時の目標細胞密度を１．９ｅ６細胞／ｍｌにして実施例１２に記載の実験手順を採用し、培養物を５０ｐｐｃのＭＯＩでＥｎＡｄに感染させた。感染後２４、４８、６０、および７０時間に、サンプルを取った。サンプルのウイルス粒子濃度をＡＥＸ−ＨＰＬＣで分析した。結果を表７に示す。
【０４２９】
感染後７１時間に、５９％（８９，４８５ｖｐ）のＥｎＡｄウイルスが、上清中に観察され（表８）、４１％（６３，０８１ｖｐ）が細胞ウイルス溶解物中に存在した（表７および図１２）。合計で２１３，９８１のウイルス粒子が化学的溶解により細胞から抽出され、細胞片は清澄化により除去された（表７の溶解後の数値を参照）。
【０４３０】
この実験において、５０ｐｐｃで感染させた１．９ｅ６細胞／ｍＬのバイオリアクター培養パラメーターは、１２．５ｐｐｃで感染させた１ｅ６細胞／ｍＬで４２８，８６８ｖｐ／細胞を製造した実施例１２で概説されたパラメーターと比べて、半分の収率（２１３９８１ｖｐ／細胞）をもたらした。
【０４３１】
５０ｐｐｃでの感染から７１時間後の細胞生存率は、Ｔ０で９６％であるのに比べて、２６％であった（図１４）。（実施例１２で）１２．５ｐｐｃでの感染から７１時間後の細胞生存率は、Ｔ０で８５％であるのに比べて、５８％であった（図１３）。感染時の低いＭＯＩ（１２．５ｐｐｃ）は、この研究と比べて実施例１２において溶解後のウイルス製造量が２倍高いことに寄与する可能性がある、７１時間でのより高い（感染後）細胞生存率（５８％）の主な原因となり得る（図１５）。
【０４３２】
【表８】
2017529070.tif 000010
【０４３３】
実施例１４
実施例１に記載の実験手順を採用したが、２５ｍｌの振盪フラスコのワーキング容積、２．２×１０６生細胞／ｍＬの細胞密度、および５０ｐｐｃでの感染を用いた。連続製造方法の原理を探究するために、様々な時点で２５ｍＬの細胞浮遊液のうち２０ｍＬ（８０％）を取り出し、新鮮培地中の開始時と同じ細胞密度（２．２×１０６生細胞／ｍＬ）の２０ｍＬの非感染細胞と取り換えた。実験を７日間続け、各日（１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、および７日目）に、細胞数、生存率、ならびに上清およびＣＶＬ中の全ウイルス濃度のために２０ｍＬの感染後サンプルを取った。感染後の細胞数の計数を血球計およびトリパンブルー染色（インビトロジェン（Invitrogen））を使用して実施した。上清を遠心分離により細胞から分離し、ＡＥＸ−ＨＰＬＣによるウイルス粒子濃度の分析のために、−８０℃で貯蔵した。細胞ペレットサンプルを実施例１１に概説されているように製造し、ＨＰＬＣ分析まで−８０℃で貯蔵した。生存率の結果を表８に示し、上清およびＣＶＬに関するＨＰＬＣの結果を表９に示す。
【０４３４】
この実験のための実験コントロールとしてコントロール振盪フラスコを、２５ｍｌのワーキング容積、２．２×１０６生細胞／ｍＬの細胞密度、および５０ｐｐｃでの感染を用いて、準備した。感染後のこれらのコントロールフラスコでは、細胞浮遊液の取り出し、または新鮮細胞および培地の添加を行わなかった。これらのコントロールを感染後３日目に終了させた。細胞数および生存率を毎日評価し、細胞数、生存率、および全ウイルス濃度のために感染後３日目のサンプルを取った。ＨＰＬＣによる上清およびＣＶＬの分析のために、サンプルを実施例１１に記載のように処理した。結果を表９に示す。
【０４３５】
細胞生存率は、１日目に９４％であったが、時間とともに減少し、７日目には５％という最低の生存率になった。漏出細胞のパーセンテージは、時間とともに増加し、７日目には最大量（８６％）となった（表８および図１６を参照）。また、コントロールの細胞生存率は、１日目に９４％であったが、減少して、３日目には最低の生存率（３４％）になった。漏出細胞のパーセンテージは、時間とともに増加し、３日目には最高（６４％）となった（表８および図１８）。
【０４３６】
【表９】
2017529070.tif 000011
【０４３７】
上清中のウイルスのパーセンテージは、３日目から７日目まで変化し、５日目および６日目に最大であった（それぞれ、４６％および４７％）。７日目までには、上清中に存在するのは、たった１７％となった（表９および図１７）。コントロールは、３日目では、７４％のウイルスが上清中に存在した（図１９）。コントロールＣＶＬでは、３日目には細胞中に残ったウイルスはたった２６％となったが、連続製造試験のフラスコにおいては、１〜７日目には、≧５３％が細胞中に残り、７日目には、細胞中に８３％が存在した（表９、図１９）。
【０４３８】
この研究では、感染させた細胞培養物に７日間に亘り毎日新鮮非感染細胞を添加することにより生じた全累積ウイルス粒子は、１．３６ｅ１３ｖｐであり、これは、コントロールフラスコで生じた量（２．０ｅ１２ｖｐ）よりも７倍高かった。７日間に亘る上清中の全量は、３．７ｅ１２ｖｐであり、これは、全ｖｐ（１．３６ｅ１３ｖｐ）のうちの２７％を表し、７３％は７日間ＣＶＬ中に存在した。これと比較すると、コントロールのウイルス分布では、上清中に７４％（１．５ｅ１２ｖｐ）が存在し、ＣＶＬ中に２６％（５．２ｅ１１ｖｐ）が存在した（表９および１０、図２０）。
【０４３９】
【表１０】
2017529070.tif 000012
【０４４０】
【表１１】
2017529070.tif 000013
【０４４１】
実施例１５
実施例１４に記載の実験手順を採用したが、５０ｍｌの振盪フラスコのワーキング容積、１．０×１０６生細胞／ｍＬの細胞密度、および１２．５ｐｐｃでの感染を用いた。様々な時点で、５０ｍＬの浮遊液のうち４０ｍＬ（８０％）を取り出し、新鮮培地中の１．０×１０６生細胞／ｍＬの４０ｍＬの非感染細胞と取り換えた。実験を５日間続け、各日（１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目）に、細胞数、生存率、および全ウイルス濃度のために感染後サンプルを取った。感染後の細胞数の計数を血球計およびトリパンブルー染色（インビトロジェン（Invitrogen））を使用して実施した。上清を遠心分離により細胞から分離し、ＡＥＸ−ＨＰＬＣによるウイルス粒子濃度の分析を実施するまで、−８０℃で貯蔵した。細胞ペレットサンプルを実施例１１に概説されているように製造し、ＨＰＬＣ分析まで−８０℃で貯蔵した。生存率の結果を表１１に示す。上清およびＣＶＬに関するＨＰＬＣの結果は、表１２にある。
【０４４２】
細胞生存率は、１日目に７８％であったが、時間とともに減少し、７日目には最低の生存率（１６％）になった。漏出細胞のパーセンテージは、時間とともに増加し、３日目には最大量（８２％）となった（表１１および図２１）。コントロールの細胞生存率は、１日目に７３％であったが、減少して、３日目には最低の生存率（２３％）が記録された。漏出細胞のパーセンテージは、時間とともに増加し、３日目には最高（７０％）となった（図２３）。
【０４４３】
【表１２】
2017529070.tif 000014
【０４４４】
上清中のウイルスのパーセンテージは、１日目から５日目まで変化し、４日目に最大であった（それぞれ２８％ ）。５日目までには、上清中に存在するのは、たった１８％となった（表１２および図２２）。３日目にコントロール（細胞および培地の取り出しおよび取り換えをしなかったフラスコ）では、ウイルスの８１％が上清中に存在し、１９％がＣＶＬ中に存在した。
【０４４５】
このコントロールＣＶＬでは、３日目には細胞中に残ったウイルスはたった１９％となったが、毎日細胞および培地の取り換えを行ったフラスコにおいては、１〜５日目には、≧７２％が細胞に結合したままであり、５日目には、細胞ペレット中に８２％が存在した（表１２）。
【０４４６】
この研究において、感染させた細胞に５日間に亘り新鮮非感染細胞を添加することにより生じた全ウイルス粒子は、２．３３ｅ１３ｖｐであり、これは、コントロールで生じた量（７．６ｅ１２ｖｐ）よりも３倍高かった。５日間に亘る上清中の全量は、４．４ｅ１２ｖｐであり、これは、全ｖｐ（２．３３ｅ１３）のうちの１９％を表し、８１％は５日間ＣＶＬ中に存在した。これと比較すると、コントロール培養物のウイルス分布では、上清中に８１％（６．１０ｅ１２）が存在し、ＣＶＬ中に１９％（１．４８ｅ１２）が存在した（表１２および１３、図２５）。
【０４４７】
【表１３】
2017529070.tif 000015
【０４４８】
【表１４】
2017529070.tif 000016
【０４４９】
実施例１６
実施例１５に記載の実験手順を採用したが、様々な時点で５０ｍＬの浮遊液のうち４７．５ｍＬ（９５％）を取り出し、新鮮培地中の１．０×１０６生細胞／ｍＬの同じ細胞密度の４７．５ｍＬの非感染細胞と取り換えた。実施例１５の研究と平行してこの研究を行い、同じコントロールフラスコを用いた。生存率の結果を表１４に示す。上清およびＣＶＬに関するＨＰＬＣの結果を、表１５に示す。
【０４５０】
細胞生存率は、１日目に７８％であったが、時間とともに減少し、5日目には最低の生存率（１６％）になった。漏出細胞のパーセンテージは、時間とともに増加し、５日目には最大量（７７％）となった（表１４および図２６）。コントロールの細胞生存率は、１日目に７３％であったが、減少して、３日目には最低の生存率（２３％）を記録した。漏出細胞のパーセンテージは、時間とともに増加し、３日目には最高（７０％）となった（図２３）。
【０４５１】
【表１５】
2017529070.tif 000017
【０４５２】
１〜５日目では、上清中にウイルスは存在せず、全ウイルスは、ＣＶＬ中に残った（表１５および図２７）。
【０４５３】
この実験では、５日間に亘り毎日、浮遊液を取り出し、感染させた細胞に新鮮非感染細胞を添加することにより生じた全ウイルス粒子は、１．９６ｅ１３ｖｐであり、これは、コントロールで生じた量（７．６ｅ１２）よりも３倍高かった。５日間に亘るＣＶＬ中のウイルスの全量は、１．９６ｅ１３ｖｐであり、これは、全ｖｐ（１．９６ｅ１３）のうちの１００％を表した。これと比較すると、コントロールのウイルス分布では、上清中に８１％（６．１０ｅ１２）が存在し、ＣＶＬ中に１９％（１．４８ｅ１２）が存在した（表１６および図２８）。
【０４５４】
【表１６】
2017529070.tif 000018
【０４５５】
【表１７】
2017529070.tif 000019
【図１】
2017529070.tif 000020
【図２】
2017529070.tif 000021
【図３】
2017529070.tif 000022
【図４】
2017529070.tif 000023
【図５】
2017529070.tif 000024
【図６】
2017529070.tif 000025
【図７】
2017529070.tif 000026
【図８】
2017529070.tif 000027
【図９】
2017529070.tif 000028
【図１０】
2017529070.tif 000029
【図１１】
2017529070.tif 000030
【図１２】
2017529070.tif 000031
【図１３】
2017529070.tif 000032
【図１４】
2017529070.tif 000033
【図１５】
2017529070.tif 000034
【図１６】
2017529070.tif 000035
【図１７】
2017529070.tif 000036
【図１８】
2017529070.tif 000037
【図１９】
2017529070.tif 000038
【図２０】
2017529070.tif 000039
【図２１】
2017529070.tif 000040
【図２２】
2017529070.tif 000041
【図２３】
2017529070.tif 000042
【図２４】
2017529070.tif 000043
【図２５】
2017529070.tif 000044
【図２６】
2017529070.tif 000045
【図２７】
2017529070.tif 000046
【図２８】
2017529070.tif 000047
【配列表】
2017529070000001.app
【国際調査報告】
2017529070.tif 000048
2017529070.tif 000049
2017529070.tif 000050
2017529070.tif 000051
2017529070.tif 000052
2017529070.tif 000053
2017529070.tif 000054
2017529070.tif 000055