(57)【要約】  本発明は、高濃度の塩、低濃度の糖及び低濃度のグリシンを含む新規なアルブミンフリーの第ＶＩＩＩ因子調製製剤を提供する。主要な結晶性成分である高濃度の塩は安定性及び優れたケーキ構造をもたらす。低濃度の糖及びグリシンは、結晶化していない非晶質塩をある程度含む複合非晶質マトリックスを生成させ、それによって第ＶＩＩＩ因子を安定化させる。この製剤は、安定化に高イオン強度の環境を必要とするＢ−ドメイン切断第ＶＩＩＩ因子に特に適している。スクロースに少量のグリシンを添加することにより塩の結晶化が抑制され、それによって、グリシン、スクロース及び塩を含む非晶質マトリックスが得られる。この非晶質マトリックスは、第ＶＩＩＩ因子を３種の安定化剤、即ちアミノ酸（グリシン）、糖（スクロース又はトレハロース）及び塩（ＮａＣｌ）により安定化する安定化環境となる。この種の非晶質マトリックスは凍結乾燥時及び凍結乾燥品として保存される期間に亘り第ＶＩＩＩ因子を安定化することができる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
水で再調製した場合に、
ＮａＣｌを約２５０〜３２０ｍＭ以下と、
ｐＨを６．５〜７．５にすることができる緩衝剤を約５０ｍＭ以下と、
ＣａＣｌ２を約１〜５ｍＭ以下と、
二糖を約１０〜２５ｍＭ以下と、
グリシンを約２０〜８０ｍＭ以下と、
第ＶＩＩＩ因子を約５０〜３０００ＩＵ／ｍＬ以下と、
を含む、安定なアルブミンフリー第ＶＩＩＩ因子凍結乾燥調製製剤。
【請求項２】
前記緩衝剤はヒスチジンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
非イオン性界面活性剤を臨界ミセル濃度を超える量で更に含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤はポリソルベート８０及びポリソルベート２０から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記二糖はスクロース又はトレハロースである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＦＶＩＩＩは組換えＦＶＩＩＩである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｒＦＶＩＩＩは、８，０００〜１５，０００ＩＵ／ｍｇの間の比活性を有するＢ−ドメイン切断タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
水で再調製した場合、
ＮａＣｌを約３０８ｍＭ以下と、
ｐＨを６．５〜７．５にすることができるヒスチジンを約５０ｍＭ以下と、
ＣａＣｌ２を約１〜５ｍＭ以下と、
スクロース又はトレハロースを約１０〜２５ｍＭ以下と、
グリシンを約４０〜８０ｍＭ以下と、
Ｂ−ドメイン切断組換え第ＶＩＩＩ因子を約５０〜３０００ＩＵ以下と、
を含む、安定なアルブミンフリー組換え第ＶＩＩＩ因子凍結乾燥調製製剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の調製製剤又は組成物の、血友病を治療するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年４月１日に出願された米国特許出願第６１／９７３，２８１の関連出願であり、米国特許法第１１９条の下でこの出願に基づく優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に医薬製剤に関し、より詳細には、高イオン強度のマトリックス中にタンパク質安定化剤として少量の糖及び少量のグリシンを含むがアルブミンは含まない（アルブミンフリー）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）が安定化された凍結乾燥製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルブミンフリーの組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）製剤に、安定化及び製剤化を目的として塩化ナトリウム、グリシン、マンニトール、スクロース、トレハロース、ヒスチジン、塩化カルシウム等のマトリックス添加剤を添加したものは数多く市販されている。アルブミンフリーの第ＶＩＩＩ因子製剤に優れたケーキ構造を付与するためには、タンパク質の非晶質マトリックス中に多量の結晶化した添加剤を存在させることが必要であると考えられている。従って、第ＶＩＩＩ因子の製剤化においては、塩、グリシン及びマンニトールが高濃度で添加され、凍結乾燥の凍結段階においてマトリックスを凍結させた後、結晶性添加剤の共晶温度でアニーリングすることによってこれらの添加剤を意図的に結晶化させることが行われてきた。凍結乾燥品の非晶質マトリックス内で第ＶＩＩＩ因子を保護及び安定化するために、少量の安定化剤、好ましくはスクロース又はトレハロースが製剤に添加される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
サマリー
本発明は、高濃度の塩及び低濃度のスクロース及び低濃度のグリシンを含むマトリックス中に第ＶＩＩＩ因子を含有させたアルブミンフリーの第ＶＩＩＩ因子製剤であって、血友病の治療に適した医薬的に許容される凍結乾燥製剤である。驚くべきことに、製剤に少量のグリシンを添加することによって、良質なケーキ構造、凍結乾燥後の高いＦＶＩＩＩ活性回復率、及び高塩濃度マトリックス中にスクロースのみを含む製剤と同等の安定性プロファイルが得られた。更に驚くべきことに、少量のグリシン（３〜６ｍｇ／ｍＬ、４０〜８０ｍＭ）を添加することによって凍結マトリックスの最大濃縮相ガラス転移温度（primary glass transition temperature）が−４５℃から−３８℃に上昇し、これにより製剤の凍結乾燥が容易になった。第ＶＩＩＩ因子にはＮａＣｌ濃度が高い環境の方が有利であり、スクロース／グリシンを凍結させたマトリックスはスクロースのみを含むマトリックスよりもＮａＣｌ含有量が高くなるようである。この驚くべき観測結果は、第ＶＩＩＩ因子凍結乾燥製剤の安定性向上にも有利となる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、水で再調製した場合、ＮａＣｌを約３００〜３２０ｍＭ以下と、ｐＨを約６．５〜約７．５とすることができる緩衝剤、好ましくはヒスチジンを約５０ｍＭ以下と、ＣａＣｌ２を約１〜５ｍＭ以下と、二糖、好ましくはスクロース又はトレハロースを約１０〜２５ｍＭ以下と、グリシンを約２０〜８０ｍＭ以下と、第ＶＩＩＩ因子を約５０〜２０００ＩＵ／ｍＬ以下とを含む、アルブミンフリーの安定なＦＶＩＩＩ凍結乾燥調製製剤を提供する。更に本発明の組成物は、非イオン性界面活性剤、好ましくはＴｗｅｅｎ−２０（ポリソルベート２０）又はＴｗｅｅｎ−８０（ポリソルベート８０）を臨界ミセル濃度を超える量、好ましくは５０〜１５０ｐｐｍの濃度で含むことができる。ＦＶＩＩＩは、８，０００〜１５，０００ＩＵ／ｍｇの間の比活性（化学発色法により測定）を有するＢ−ドメイン切断組換え第ＶＩＩＩ因子であることが好ましい。
【０００６】
好ましいアルブミンフリーの安定な組換えＦＶＩＩＩ凍結乾燥調製製剤は、水で再調製した場合、ＮａＣｌを約３０８ｍＭ以下と、ｐＨを６．５〜７．５にすることができるヒスチジンを約５０ｍＭ以下と、ＣａＣｌ２を約１〜５ｍＭ以下と、スクロース又はトレハロースを約１０〜２５ｍＭ以下と、グリシンを約４０〜８０ｍＭ以下と、Ｂ−ドメイン切断組換え第ＶＩＩＩ因子を約５０〜３０００ＩＵ以下とから構成される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ＮａＣｌ（１８ｍｇ／ｍＬ）及びスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）を含み、グリシンを含まないＦＶＩＩＩ製剤の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により得られた昇温サーモグラムである。ｙ軸は熱流（ｍＷ）を表し、ｘ軸は温度（℃）を表す。２回の主要な熱的事象を「Ａ」及び「Ｂ」で示す。最大濃縮相ガラス転移（Ｔｇ’）を「Ａ」で示す。Ｔｇ’の中間点は−４５．５℃である。事象「Ｂ」は、凍結したマトリックス内で結晶化しているＮａＣｌの共晶融解を表し、その温度は−２１．８℃である。ＮａＣｌの融解エンタルピーは１２Ｊ／ｇであった。
【図２】図２は、ＮａＣｌ（１８ｍｇ／ｍＬ）及びスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）と共にグリシン（６ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により得られた昇温サーモグラムである。ｙ軸は熱流（ｍＷ）を表し、ｘ軸は温度（℃）を表す。２回の主要な熱的事象を「Ａ」及び「Ｂ」で示す。最大濃縮相ガラス転移（Ｔｇ’）を「Ａ」で示す。Ｔｇ’の中間点は−３８．３℃である。事象「Ｂ」は凍結したマトリックス内で結晶化しているＮａＣｌの共晶融解を表し、その温度は−２３．４℃である。ＮａＣｌの融解エンタルピーは６．４Ｊ／ｇであった。
【図３】図３は、凍結乾燥後の第ＶＩＩＩ因子の活性回復率に関する応答曲面グラフである。この応答曲面は、高塩濃度のＦＶＩＩＩ製剤において少量のスクロース及び少量のグリシンが相互作用（交互作用）することにより、凍結乾燥後に高い回復率が得られる（円で示す領域）ことを示している。ｘ軸は糖（スクロース）濃度（ｍＭ）、ｙ軸はグリシン濃度（ｍＭ）を表し、垂直方向のｚ軸は第ＶＩＩＩ因子の初期活性（ＩＵ／ｍＬ）に対する回復率を表す。この応答曲面に示した製剤は全てＮａＣｌ（２０８ｍＭ）を含み、マンニトールを含まない。黒塗りの領域は凍結乾燥後の回復率が高い設計空間を表す。
【図４】図４は、凍結乾燥後のケーキ外観に関する応答曲面グラフである。ｘ軸は糖（スクロース）濃度（ｍＭ）、ｙ軸はグリシン濃度（ｍＭ）を表す。垂直方向のｚ軸はケーキ構造の外観的品質であり、ケーキ外観が非常に優れているものを５とし、ケーキ外観が悪い／コラプスしているものを１とした。この応答曲面に示した製剤は全てＮａＣｌ（２４８ｍＭ）を含み、マンニトールを含まない。この複雑な応答曲面は、高塩濃度のＦＶＩＩＩ製剤において少量のスクロース及び少量のグリシンが相互作用することにより、凍結乾燥後に良好なケーキ構造が得られる（黒塗りの円で示す領域）ことを示している。
【図５】図５は、高塩濃度のＦＶＩＩＩ製剤において少量のスクロース及び少量のグリシンが相互作用することにより、ＦＶＩＩＩ活性が初期活性の９０％を超える非常に高い安定性が得られる（黒塗りの円で示す領域）ことを示す等値面グラフである。この応答曲面に示す製剤は全てＮａＣｌ（２２８ｍＭ）を含み、マンニトールを含まない。ｘ軸はグリシン濃度（ｍＭ）、ｙ軸は糖（スクロース）濃度（ｍＭ）を表す。これらの等値線は第ＶＩＩＩ因子の初期活性（ＩＵ／ｍＬ）（時間＝０）に対する比率に相当し、例えば、０．９０の等値線は、４０℃で８週間保存した後の活性（効力）が初期活性の９０％であることを表している。太線の内側の領域は実際に試験を実施した製剤の設計空間であり、外側の領域は実験計画法による統計解析から予測した数値である。
【図６】図６は、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤（黒菱形を結ぶ線）並びにＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）及び少量のグリシン（３ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤（黒正方形を結ぶ破線）を２５℃で１２週間保存した場合の安定性を示すものである。ｘ軸は２５℃における保存期間（単位：週）を表し、ｙ軸はＦＶＩＩＩの初期活性に対する比率を表す。
【図７】図７は、ＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤（黒菱形を結ぶ線）並びにＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）及び少量のグリシン（３ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤（黒正方形を結ぶ破線）を４０℃で１２週間保存した場合の安定性を示すものである。ｘ軸は４０℃における保存期間（単位：週）を表し、ｙ軸はＦＶＩＩＩの初期活性に対する比率を表す。
【図８】図８は、スクロース又はスクロース／グリシンを含むＢ−ドメイン切断組換えＦＶＩＩＩ（ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ）凍結乾燥調製製剤の安定性を示すものであり、用量の異なる２種類の製剤を５℃で保存する試験を行った結果である。グラフＡ（上）は用量２０００ＩＵの製剤に関する結果であり、グラフＢは用量２５０ＩＵの製剤に関する結果である。点模様の棒グラフはＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤に対応し、横縞模様の棒グラフはＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）及び少量のグリシン（３ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤に対応する。ｘ軸は５℃における保存期間（単位：週）を表し、ｙ軸は効力（初期値に対する％）を表す。エラーバーはトリプリケートで作製したバイアルの標準偏差である。
【図９】図９は、スクロース又はスクロース／グリシンを含むＢ−ドメイン切断ｒＦＶＩＩＩ凍結乾燥調製製剤の安定性を示すものであり、用量の異なる２種類の製剤を２５℃で保存する試験を行った結果である。グラフＡ（上）は用量２０００ＩＵの製剤に関する結果であり、グラフＢは用量２５０ＩＵの製剤に関する結果である。点模様の棒グラフはＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤に対応し、横縞模様の棒グラフはＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）及び少量のグリシン（３ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤に対応する。ｘ軸は２５℃における保存期間（単位：週）を表し、ｙ軸は効力（初期値に対する％）を表す。エラーバーはトリプリケートで作製したバイアルの標準偏差である。
【図１０】図１０は、スクロース又はスクロース／グリシンを含むＢ−ドメイン切断ｒＦＶＩＩＩ凍結乾燥調製製剤の安定性を示すものであり、用量の異なる２種類の製剤を加速温度（４０℃）で保存する試験を行った結果である。グラフＡ（上）は用量２０００ＩＵの製剤に関する結果であり、グラフＢは用量２５０ＩＵの製剤に関する結果である。点模様の棒グラフはＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤に対応し、横縞模様の棒グラフはＮａＣｌ（３０８ｍＭ）及び少量のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ）及び少量のグリシン（３ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＶＩＩＩ製剤に対応する。ｘ軸は４０℃における保存期間（単位：週）を表し、ｙ軸は効力（初期値に対する％）を表す。エラーバーはトリプリケートで作製したバイアルの標準偏差である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
目的
本発明の目的は、アルブミンの非存在下においても安定な医薬的に許容される第ＶＩＩＩ因子製剤を提供することにある。ＦＶＩＩＩは、好ましくは組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）であり、最も好ましくはＢ−ドメイン切断組換えＦＶＩＩＩ（ＢＤＤｒＦＶＩＩＩ）である。本発明者は、糖、好ましくは二糖、最も好ましくはスクロース又はトレハロースをグリシンと併用することにより、このような安定性が得られると共に、凍結乾燥後に良質のケーキが形成されることを見出した。糖濃度は１０〜２５ｍＭが好ましい。
【０００９】
特に本発明の製剤は、ＮａＣｌを約２５０〜４００ｍＭ、好ましくは２５０〜３２０ｍＭ、最も好ましくは３０８ｍＭ（１８ｍｇ／ｍＬ）を含む高イオン強度製剤と少量（２０〜８０ｍＭ、好ましくは４０〜８０ｍＭ（０．３〜０．６重量％））のグリシンを更に含む。驚くべきことに、グリシンを添加することにより、凍結時に起こるＮａＣｌの結晶化が一部抑制されるようであり、従って、ＦＶＩＩＩを安定化させる非晶質の塩／スクロース／グリシンマトリックスが得られる。
【００１０】
製剤にグリシンを添加することによって製剤マトリックスの最大濃縮相ガラス転移温度が約７℃上昇し、従って、製剤の一次乾燥をより高い棚温で行うことが容易になる。また、少量のグリシンは、凍結乾燥品の全体的な安定性を損なわず、製剤に良好なケーキ構造をもたらす。ＮａＣｌ／スクロース／グリシン製剤はＮａＣｌ／スクロース製剤と類似の安定性プロファイルを示す。
【００１１】
ｐＨを約６．５〜約７．５にすることができる緩衝剤等の他の成分を添加することもできる。好ましい緩衝剤はヒスチジンである。ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）やポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）等の非イオン性界面活性剤を臨界ミセル濃度を超える濃度で添加することもできる。更に、好ましい調製製剤を得るためにＣａＣ１２を１〜５ｍＭ添加することができる。
【００１２】
具体的な実施形態
実施例１
スクロースのみを含む高イオン強度のＦＶＩＩＩ製剤及びスクロース／グリシンを含む高イオン強度のＦＶＩＩＩ製剤の熱的性質を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて評価した。驚くべきことに、図１及び図２に示すように、少量のグリシンを添加することによって製剤マトリックスの最大濃縮相ガラス転移温度が約７℃上昇した。ＮａＣｌの共晶融解エンタルピーが−２１℃から−２３℃に変化したことから分かるように、スクロース／グリシンマトリックス内で結晶化しているＮａＣｌの量は、スクロースのみの製剤中で結晶化している量のほぼ半分であった。この結果は、スクロース／グリシンマトリックスの方が非晶質ＮａＣｌ含有量がはるかに高いことを強く示唆している。
【００１３】
実施例２
各添加剤が凍結乾燥製剤に与える影響を評価するために多変数実験計画（ＤＯＥ）法をＦＶＩＩＩ製剤に対して実施した。凍結乾燥後のＦＶＩＩＩ活性回復率、ケーキの構造的外観、加速条件下における安定性（４０℃で８週間保存）等のパラメータを評価した。
【００１４】
図３〜５に各製剤のＤＯＥ解析を示す。図３のグラフに示す黒塗りの領域は凍結乾燥後の回復率が高い領域である。ケーキ構造の良否を１〜５の評点を用いて定性的に評価した。５は堅固な良質のケーキであることを表し、１はケーキがコラプスしていることを表す。図４はケーキ構造に関するＤＯＥの結果である。少量のスクロース及び少量のグリシンを含む対応する塩濃度の製剤（黒塗りの円で示す領域）において非常に優れたケーキ構造が観測された。図５は安定性に関するデータのグラフであり、少量のスクロース及び少量のグリシンを含む製剤（黒塗りの円で示す領域）において良好な安定性が観測された。
【００１５】
これらの結果を総括すると、少量のスクロース及び少量のグリシンを含む製剤は、凍結乾燥後の回復率が高く、良好なケーキ構造を呈し、加速温度（４０℃）で８週間保存した後も非常に高い安定性を示す。
【００１６】
実施例３
高濃度の塩（３０８ｍＭ）及び低濃度のスクロース（１８ｍＭ）を含むＦＶＩＩＩ製剤（図６及び図７の実線）又は高濃度の塩（３０８ｍＭ）、低濃度のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ、１８ｍＭ）及び低濃度のグリシン（３ｍｇ／ｍＬ、８０ｍＭ）を含むＦＶＩＩＩ製剤（図６及び図７の破線）中におけるＦＶＩＩＩの安定性を、保存温度（２〜８℃）及び加速温度（４０℃）で１２週間に亘り評価した。図６は２〜８℃における安定性のデータであり、図７は４０℃における安定性のデータである。両製剤は１２週間の調査期間に亘り類似した安定プロファイルを示す。
【００１７】
実施例４
異なる保存条件下における高用量製剤（２０００ＩＵ／バイアル）及び低用量製剤（２５０ＩＵ／バイアル）中のＦＶＩＩＩの安定性を図８、図９及び図１０に示す。２種類の製剤、即ち、高濃度の塩（３０８ｍＭ）及び低濃度のスクロース（１８ｍＭ）を含む製剤（図８、図９及び図１０の点模様の棒グラフ）又は高濃度の塩（３０８ｍＭ）、低濃度のスクロース（６ｍｇ／ｍＬ、１８ｍＭ）及び低濃度のグリシン（３ｍｇ／ｍＬ、８０ｍＭ）を含む製剤（図８、図９及び図１０の横縞模様の棒グラフ）を２〜８℃で１６週間及び加速温度（２５℃及び４０℃）で１２週間評価した。両製剤は１２週間の調査期間に亘り類似した安定性プロファイルを示す。
【００１８】
上の実施例は本発明を説明するためのものであり、当業者であれば変形例を想起すると解釈されたい。従って、本発明の範囲は請求項によってのみ限定される。
【図１】
2017509659.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2017509659.tif 000012
【図１０Ａ】
2017509659.tif 000013
【図１０Ｂ】
2017509659.tif 000014
【国際調査報告】
2017509659.tif 000015