(57)【要約】  抗ＣＸＣＲ３抗体に関するまたはそれらに由来する組成物および方法を開示する。より具体的には、ＣＸＣＲ３に結合する完全ヒト抗体、このような抗体のＣＸＣＲ３結合断片および誘導体、ならびにこれらの断片を含むＣＸＣＲ３結合ポリペプチドを開示する。さらにまた、このような抗体、抗体断片および誘導体ならびにポリペプチドをコードする核酸、このようなポリヌクレオチドを含む細胞、このような抗体、抗体断片および誘導体ならびにポリペプチドを作製するための方法、ならびにこのような抗体、抗体断片および誘導体ならびにポリペプチドを使用するための方法が開示され、これには、種々の炎症性障害および種々のがんを含めたＣＸＣＲ３関連障害または状態を有する対象を治療または診断する方法が含まれる。
2017529331.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＸＣＲ３エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する完全ヒト抗体。
【請求項２】
配列番号１／配列番号２（本明細書において３２Ｂ１２と称する。）、配列番号３／配列番号４（本明細書において３２Ｄ１２と称する。）、配列番号５／配列番号６（本明細書においてＨ１と称する。）、配列番号７／配列番号８（本明細書においてＢ７と称する。）、配列番号９／配列番号１０（本明細書においてＣ１２と称する。）、配列番号１１／配列番号１２（本明細書においてＤ１２と称する。）、配列番号１３／配列番号１４（本明細書においてＥ１と称する。）、配列番号１５／配列番号１６（本明細書においてＧ１２と称する。）、配列番号１７／配列番号１８（本明細書において３Ａ３と称する。）、配列番号１９／配列番号２０（本明細書において３Ａ５と称する。）、配列番号２１／配列番号２２（本明細書において３Ａ１１と称する。）、配列番号２３／配列番号２４（本明細書において３Ｂ１２と称する。）、配列番号２５／配列番号２６（本明細書において３Ｃ１１と称する。）、配列番号２７／配列番号２８（本明細書において４Ｃ３と称する。）、配列番号２９／配列番号３０（本明細書においてＢ１２と称する。）、配列番号３１／配列番号３２（本明細書においてＣ４と称する。）、配列番号３１／配列番号３３（本明細書においてＦ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３４（本明細書において２Ａ３と称する。）、配列番号３１／配列番号３５（本明細書において３Ａ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３６（本明細書において３Ａ８と称する。）、配列番号３１／配列番号３７（本明細書において４Ｄ５と称する。）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項１に記載の完全ヒト抗体。
【請求項３】
重鎖由来の可変ドメイン領域と軽鎖由来の可変ドメイン領域を有する完全ヒト抗体Ｆａｂ断片であって、重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片。
【請求項４】
配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項３に記載の完全ヒト抗体Ｆａｂ断片。
【請求項５】
重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域、ならびに重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体であって、重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、一本鎖ヒト抗体。
【請求項６】
一本鎖完全ヒト抗体が配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項５に記載の完全ヒト一本鎖抗体。
【請求項７】
完全ヒト一本鎖抗体が、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、一本鎖完全ヒト抗体が、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項５に記載の完全ヒト一本鎖抗体。
【請求項８】
有効量の抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドを投与することを含む、広範囲の哺乳動物のがんを治療し、または炎症性疾患もしくは自己免疫疾患を治療するための方法であって、抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドが、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＸＣＲ３エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有する完全ヒト抗体Ｆａｂ断片、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域、および重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択され、
完全ヒト抗体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
完全ヒト抗体Ｆａｂ断片が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
一本鎖ヒト抗体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する方法。
【請求項９】
完全ヒト抗体が、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項８に記載の広範囲の哺乳動物のがんを治療するための方法。
【請求項１０】
完全ヒト抗体Ｆａｂ断片が、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、抗体が、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項８に記載の広範囲の哺乳動物のがんを治療するための方法。
【請求項１１】
完全ヒト一本鎖抗体が、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、一本鎖完全ヒト抗体が、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項８に記載の広範囲の哺乳動物のがんを治療するための方法。
【請求項１２】
治療されるべき広範囲の哺乳動物のがんがＣＸＣＲ３陽性がんである、請求項８に記載の広範囲の哺乳動物のがんを治療するための方法。
【請求項１３】
広範囲の哺乳動物のがんが、癌腫、白血病、リンパ腫、前立腺がん、非小細胞肺がん、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、胃がん、頭頸部がん、メラノーマ、骨肉腫、腸および結腸のがん、ならびに様々な転移性がんからなる群から選択される、請求項８に記載の広範囲の哺乳動物のがんを治療するための方法。
【請求項１４】
有効量の抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドを投与することを含む、炎症性障害を治療するための方法であって、抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドが、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＸＣＲ３エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有する完全ヒト抗体Ｆａｂ断片、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域、および重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択され、
完全ヒト抗体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
完全ヒト抗体Ｆａｂ断片が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
一本鎖ヒト抗体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する方法。
【請求項１５】
完全ヒト抗体が、重鎖と軽鎖の両方を有し、抗体が、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項１４に記載の炎症性障害を治療するための方法。
【請求項１６】
完全ヒト抗体Ｆａｂ断片が、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、抗体が、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項１４に記載の炎症性障害を治療するための方法。
【請求項１７】
完全ヒト一本鎖抗体が、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、一本鎖完全ヒト抗体が、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項１４に記載の炎症性障害を治療するための方法。
【請求項１８】
治療されるべき炎症性障害が、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、１型糖尿病、移植拒絶、慢性Ｃ型肝炎、マラリアおよびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項１４に記載の炎症性障害を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗ＣＸＣＲ３抗体に関するまたはこれらに由来する組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、ＣＸＣＲ３に結合するヒト抗体、このような抗体のＣＸＣＲ３結合断片および誘導体、ならびにこのような断片を含むＣＸＣＲ３結合ポリペプチドを提供する。さらにまた、本開示は、このような抗体、抗体断片および誘導体ならびにポリペプチドをコードする核酸、このようなポリヌクレオチドを含む細胞、このような抗体、抗体断片および誘導体ならびにポリペプチドを作製するための方法、ならびにこのような抗体、抗体断片および誘導体ならびにポリペプチドを使用するための方法を提供し、これには、種々の炎症性障害および種々のがんを含む、ＣＸＣＲ３関連障害または状態を有する対象を治療または診断する方法が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体−３（ＣＸＣＲ３）は、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの特定の白血球上に発現される。ＣＸＣＲ３受容体は、インターフェロンガンマ誘導性の１０ｋＤタンパク質（ＩＰ−１０）、ガンマインターフェロンによって誘導されるモノカイン（ＭＩＧ；Ｍｉｇ）、インターフェロン誘導性のＴ細胞アルファ化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ）およびＢ細胞誘引性のケモカイン−１（ＢＣＡ−１）などのリガンドを結合する。ＣＸＣＲ３のある種の形態はまた、血小板因子−４（ＰＦ−４、Ｌａｓａｇｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１５３７−１５４９頁、２００３年）に結合する。いくつかのＣＸＣＲ３リガンド（ＩＰ−１０、ＭＩＧおよびＩ−ＴＡＣ）の発現は、炎症の有力なメディエーターであるインターフェロンまたは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）によって組織内で誘導される（Ｆａｒｂｅｒ、Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６１：２４６−２５７頁、２００７年；Ｐｉａｌｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：９６１−９７２頁、１９９８年；およびＣｏｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２００９−２０２１頁、１９９８年）。これらの知見から、炎症中に、ＣＸＣＲ３のリガンドの発現がアップレギュレートされ、炎症組織へのＣＸＣＲ３＋リンパ球の動員が生じると仮定されている。浸潤するＣＸＣＲ３＋リンパ球は、炎症の有害な病理学的作用に寄与し得る。したがって、ＣＸＣＲ３の活性を阻害することは、有益な抗炎症作用を有し得る。したがって、ＣＸＣＲ３機能を阻害する治療剤が必要とされる。
【０００３】
ケモカインとそれらの受容体の間の相互作用は、白血球移動の制御において重要なステップである。ケモカインはまた、細胞関連サイトカイン応答の誘導および増強を含む、走化性に依存しない様々な作用を媒介する。
【０００４】
ヒト細胞表面タンパク質ＣＤ１８３は、ＩＰ１０（インターフェロン−γ誘導性の１０ｋＤａタンパク質）、Ｍｉｇ（インターフェロン−γによって誘導されるモノカイン）およびＩ−ＴＡＣ（インターフェロン誘導性のＴ細胞α化学誘引物質）を含む３つのケモカインについて選択性を有するＧタンパク質共役受容体である。これらの３つのケモカインは、１つのアミノ酸残基が４つの高度に保存されたＣｙｓ残基の最初の２つを分離する「ＣＸＣ」ケモカインの構造サブファミリーに属する。歴史的に、ＣＤ１８３は、発見された第３のＣＸＣケモカイン受容体であり、したがって、ＣＤ１８３は、一般的に「ＣＸＣＲ３」と称されている。ＣＸＣＲ３へのケモカインの結合は、白血球トラフィック、最も重要なことにインテグリン活性化、細胞骨格変化および走化性移動に関与する細胞応答を誘導する。ＣＸＣＲ３は、エフェクター／メモリーＴ細胞上に、および／または多くのタイプの炎症組織に存在するＴ細胞（例えば、Ｔヘルパー１細胞もしくはＴｈ１細胞およびＣＤ８＋Ｔｃｌ細胞）に発現される。さらに、ＩＰ１０、ＭｉｇおよびＩ−ＴＡＣは、通常、炎症性病変の局所細胞によって産生され、これは、ＣＸＣＲ３およびそのケモカインが白血球の炎症部位への動員に関与することを示唆している。したがって、ＣＸＣＲ３は、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺炎、乾癬、１型糖尿病および移植拒絶反応などの多様な炎症性および免疫性疾患および障害の治療および診断に使用され得る抗体およびアンタゴニストの開発の標的である。ＣＸＣＲ３はＢ細胞リンパ腫のサブセット上に発現するため、ＣＸＣＲ３はまた、リンパ腫および白血病の治療および診断の標的であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＰＦ−４、Ｌａｓａｇｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１５３７−１５４９頁、２００３年
【非特許文献２】Ｆａｒｂｅｒ、Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６１：２４６−２５７頁、２００７年
【非特許文献３】Ｐｉａｌｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：９６１−９７２頁、１９９８年
【非特許文献４】Ｃｏｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２００９−２０２１頁、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、治療剤として使用することができる、改良された抗ＣＸＣＲ３抗体の必要性が当該技術分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本開示は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＸＣＲ３エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する完全ヒト抗体を提供する。好ましくは、完全ヒト抗体は、重鎖と軽鎖の両方を有し、ここで、抗体は、配列番号１／配列番号２（本明細書において３２Ｂ１２と称する。）、配列番号３／配列番号４（本明細書において３２Ｄ１２と称する。）、配列番号５／配列番号６（本明細書においてＨ１と称する。）、配列番号７／配列番号８（本明細書においてＢ７と称する。）、配列番号９／配列番号１０（本明細書においてＣ１２と称する。）、配列番号１１／配列番号１２（本明細書においてＤ１２と称する。）、配列番号１３／配列番号１４（本明細書においてＥ１と称する。）、配列番号１５／配列番号１６（本明細書においてＧ１２と称する。）、配列番号１７／配列番号１８（本明細書において３Ａ３と称する。）、配列番号１９／配列番号２０（本明細書において３Ａ５と称する。）、配列番号２１／配列番号２２（本明細書において３Ａ１１と称する。）、配列番号２３／配列番号２４（本明細書において３Ｂ１２と称する。）、配列番号２５／配列番号２６（本明細書において３Ｃ１１と称する。）、配列番号２７／配列番号２８（本明細書において４Ｃ３と称する。）、配列番号２９／配列番号３０（本明細書においてＢ１２と称する。）、配列番号３１／配列番号３２（本明細書においてＣ４と称する。）、配列番号３１／配列番号３３（本明細書においてＦ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３４（本明細書において２Ａ３と称する。）、配列番号３１／配列番号３５（本明細書において３Ａ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３６（本明細書において３Ａ８と称する。）、配列番号３１／配列番号３７（本明細書において４Ｄ５と称する。）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【０００８】
本開示は、重鎖由来の可変ドメイン領域と軽鎖由来の可変ドメイン領域を有する完全ヒト抗体Ｆａｂ断片であって、重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片を提供する。好ましくは、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、ここで、抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【０００９】
本開示は、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域、ならびに重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体であって、重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、一本鎖ヒト抗体を提供する。好ましくは、完全ヒト一本鎖抗体は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、ここで、一本鎖完全ヒト抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１０】
本開示は、有効量の抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドを投与することを含む、広範囲の哺乳動物のがんを治療するための方法をさらに提供し、ここで、抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドは、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＸＣＲ３エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有する完全ヒト抗体Ｆａｂ断片、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域、および重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択され、
完全ヒト抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
一本鎖ヒト抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１１】
好ましくは、完全ヒト抗体は、重鎖と軽鎖の両方を有し、ここで、抗体は、配列番号１／配列番号２（本明細書において３２Ｂ１２と称する。）、配列番号３／配列番号４（本明細書において３２Ｄ１２と称する。）、配列番号５／配列番号６（本明細書においてＨ１と称する。）、配列番号７／配列番号８（本明細書においてＢ７と称する。）、配列番号９／配列番号１０（本明細書においてＣ１２と称する。）、配列番号１１／配列番号１２（本明細書においてＤ１２と称する。）、配列番号１３／配列番号１４（本明細書においてＥ１と称する。）、配列番号１５／配列番号１６（本明細書においてＧ１２と称する。）、配列番号１７／配列番号１８（本明細書において３Ａ３と称する。）、配列番号１９／配列番号２０（本明細書において３Ａ５と称する。）、配列番号２１／配列番号２２（本明細書において３Ａ１１と称する。）、配列番号２３／配列番号２４（本明細書において３Ｂ１２と称する。）、配列番号２５／配列番号２６（本明細書において３Ｃ１１と称する。）、配列番号２７／配列番号２８（本明細書において４Ｃ３と称する。）、配列番号２９／配列番号３０（本明細書においてＢ１２と称する。）、配列番号３１／配列番号３２（本明細書においてＣ４と称する。）、配列番号３１／配列番号３３（本明細書においてＦ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３４（本明細書において２Ａ３と称する。）、配列番号３１／配列番号３５（本明細書において３Ａ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３６（本明細書において３Ａ８と称する。）、配列番号３１／配列番号３７（本明細書において４Ｄ５と称する。）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、ここで、抗体は、配列番号１／配列番号２（本明細書において３２Ｂ１２と称する。）、配列番号３／配列番号４（本明細書において３２Ｄ１２と称する。）、配列番号５／配列番号６（本明細書においてＨ１と称する。）、配列番号７／配列番号８（本明細書においてＢ７と称する。）、配列番号９／配列番号１０（本明細書においてＣ１２と称する。）、配列番号１１／配列番号１２（本明細書においてＤ１２と称する。）、配列番号１３／配列番号１４（本明細書においてＥ１と称する。）、配列番号１５／配列番号１６（本明細書においてＧ１２と称する。）、配列番号１７／配列番号１８（本明細書において３Ａ３と称する。）、配列番号１９／配列番号２０（本明細書において３Ａ５と称する。）、配列番号２１／配列番号２２（本明細書において３Ａ１１と称する。）、配列番号２３／配列番号２４（本明細書において３Ｂ１２と称する。）、配列番号２５／配列番号２６（本明細書において３Ｃ１１と称する。）、配列番号２７／配列番号２８（本明細書において４Ｃ３と称する。）、配列番号２９／配列番号３０（本明細書においてＢ１２と称する。）、配列番号３１／配列番号３２（本明細書においてＣ４と称する。）、配列番号３１／配列番号３３（本明細書においてＦ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３４（本明細書において２Ａ３と称する。）、配列番号３１／配列番号３５（本明細書において３Ａ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３６（本明細書において３Ａ８と称する。）、配列番号３１／配列番号３７（本明細書において４Ｄ５と称する。）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、完全ヒト一本鎖抗体は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、ここで、一本鎖完全ヒト抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１２】
好ましくは、治療されるべき広範囲の哺乳動物のがんは、ＣＸＣＲ３陽性がんである。好ましくは、治療されるべき広範囲の哺乳動物のがんは、白血病、リンパ腫、がん腫、前立腺がん、非小細胞肺がん、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、胃がん、頭頸部がん、メラノーマ、骨肉腫、腸および結腸がん、および様々な転移性がんからなる群から選択される。
【００１３】
さらに、本開示は、有効量の抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドを投与することを含む、炎症性障害を治療するための方法を提供し、ここで、抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドは、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＸＣＲ３エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有する完全ヒト抗体Ｆａｂ断片、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域、および重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択され、
完全ヒト抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
一本鎖ヒト抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１４】
好ましくは、完全ヒト抗体は、重鎖と軽鎖の両方を有し、抗体は、配列番号１／配列番号２（本明細書において３２Ｂ１２と称する。）、配列番号３／配列番号４（本明細書において３２Ｄ１２と称する。）、配列番号５／配列番号６（本明細書においてＨ１と称する。）、配列番号７／配列番号８（本明細書においてＢ７と称する。）、配列番号９／配列番号１０（本明細書においてＣ１２と称する。）、配列番号１１／配列番号１２（本明細書においてＤ１２と称する。）、配列番号１３／配列番号１４（本明細書においてＥ１と称する。）、配列番号１５／配列番号１６（本明細書においてＧ１２と称する。）、配列番号１７／配列番号１８（本明細書において３Ａ３と称する。）、配列番号１９／配列番号２０（本明細書において３Ａ５と称する。）、配列番号２１／配列番号２２（本明細書において３Ａ１１と称する。）、配列番号２３／配列番号２４（本明細書において３Ｂ１２と称する。）、配列番号２５／配列番号２６（本明細書において３Ｃ１１と称する。）、配列番号２７／配列番号２８（本明細書において４Ｃ３と称する。）、配列番号２９／配列番号３０（本明細書においてＢ１２と称する。）、配列番号３１／配列番号３２（本明細書においてＣ４と称する。）、配列番号３１／配列番号３３（本明細書においてＦ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３４（本明細書において２Ａ３と称する。）、配列番号３１／配列番号３５（本明細書において３Ａ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３６（本明細書において３Ａ８と称する。）、配列番号３１／配列番号３７（本明細書において４Ｄ５と称する。）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、抗体は、配列番号１／配列番号２（本明細書において３２Ｂ１２と称する。）、配列番号３／配列番号４（本明細書において３２Ｄ１２と称する。）、配列番号５／配列番号６（本明細書においてＨ１と称する。）、配列番号７／配列番号８（本明細書においてＢ７と称する。）、配列番号９／配列番号１０（本明細書においてＣ１２と称する。）、配列番号１１／配列番号１２（本明細書においてＤ１２と称する。）、配列番号１３／配列番号１４（本明細書においてＥ１と称する。）、配列番号１５／配列番号１６（本明細書においてＧ１２と称する。）、配列番号１７／配列番号１８（本明細書において３Ａ３と称する。）、配列番号１９／配列番号２０（本明細書において３Ａ５と称する。）、配列番号２１／配列番号２２（本明細書において３Ａ１１と称する。）、配列番号２３／配列番号２４（本明細書において３Ｂ１２と称する。）、配列番号２５／配列番号２６（本明細書において３Ｃ１１と称する。）、配列番号２７／配列番号２８（本明細書において４Ｃ３と称する。）、配列番号２９／配列番号３０（本明細書においてＢ１２と称する。）、配列番号３１／配列番号３２（本明細書においてＣ４と称する。）、配列番号３１／配列番号３３（本明細書においてＦ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３４（本明細書において２Ａ３と称する。）、配列番号３１／配列番号３５（本明細書において３Ａ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３６（本明細書において３Ａ８と称する。）、配列番号３１／配列番号３７（本明細書において４Ｄ５と称する。）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、完全ヒト一本鎖抗体は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、一本鎖完全ヒト抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１５】
好ましくは、治療されるべき炎症性障害は、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、１型糖尿病、移植拒絶、慢性Ｃ型肝炎、マラリアおよびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＣＨＯ−ＣＸＣＲ３細胞への抗ＣＸＣＲ３抗体３２Ｂ１２の結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＸＣＲ３エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する完全ヒト抗体を提供する。好ましくは、完全ヒト抗体は、重鎖と軽鎖の両方を有し、ここで、抗体は、配列番号１／配列番号２（本明細書において３２Ｂ１２と称する。）、配列番号３／配列番号４（本明細書において３２Ｄ１２と称する。）、配列番号５／配列番号６（本明細書においてＨ１と称する。）、配列番号７／配列番号８（本明細書においてＢ７と称する。）、配列番号９／配列番号１０（本明細書においてＣ１２と称する。）、配列番号１１／配列番号１２（本明細書においてＤ１２と称する。）、配列番号１３／配列番号１４（本明細書においてＥ１と称する。）、配列番号１５／配列番号１６（本明細書においてＧ１２と称する。）、配列番号１７／配列番号１８（本明細書において３Ａ３と称する。）、配列番号１９／配列番号２０（本明細書において３Ａ５と称する。）、配列番号２１／配列番号２２（本明細書において３Ａ１１と称する。）、配列番号２３／配列番号２４（本明細書において３Ｂ１２と称する。）、配列番号２５／配列番号２６（本明細書において３Ｃ１１と称する。）、配列番号２７／配列番号２８（本明細書において４Ｃ３と称する。）、配列番号２９／配列番号３０（本明細書においてＢ１２と称する。）、配列番号３１／配列番号３２（本明細書においてＣ４と称する。）、配列番号３１／配列番号３３（本明細書においてＦ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３４（本明細書において２Ａ３と称する。）、配列番号３１／配列番号３５（本明細書において３Ａ７と称する。）、配列番号３１／配列番号３６（本明細書において３Ａ８と称する。）、配列番号３１／配列番号３７（本明細書において４Ｄ５と称する。）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１８】
本開示は、重鎖由来の可変ドメイン領域と軽鎖由来の可変ドメイン領域を有する完全ヒト抗体Ｆａｂ断片であって、重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片を提供する。好ましくは、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、ここで、抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００１９】
本開示は、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域、ならびに重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体であって、重鎖可変ドメイン配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、軽鎖可変ドメイン配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、一本鎖ヒト抗体を提供する。好ましくは、完全ヒト一本鎖抗体は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、ここで、一本鎖完全ヒト抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００２０】
さらに、本開示は、有効量の抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドを投与することを含む、広範囲の哺乳動物のがんを治療し、または炎症性疾患もしくは自己免疫疾患を治療するための方法を提供し、ここで、抗ＣＸＣＲ３ポリペプチドは、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性でＣＸＣＲ３エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域を有する完全ヒト抗体Ｆａｂ断片、重鎖由来の可変ドメイン領域および軽鎖由来の可変ドメイン領域、および重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域を連結するペプチドリンカーを有する一本鎖ヒト抗体、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択され、
完全ヒト抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有し、
一本鎖ヒト抗体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００２１】
好ましくは、完全ヒト抗体は、重鎖と軽鎖の両方を有し、ここで、抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、ここで、抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。好ましくは、完全ヒト一本鎖抗体は、重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、ここで、一本鎖完全ヒト抗体は、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、配列番号７／配列番号８、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、配列番号１５／配列番号１６、配列番号１７／配列番号１８、配列番号１９／配列番号２０、配列番号２１／配列番号２２、配列番号２３／配列番号２４、配列番号２５／配列番号２６、配列番号２７／配列番号２８、配列番号２９／配列番号３０、配列番号３１／配列番号３２、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３１／配列番号３４、配列番号３１／配列番号３５、配列番号３１／配列番号３６、配列番号３１／配列番号３７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００２２】
好ましくは、治療されるべき広範囲の哺乳動物のがんは、ＣＸＣＲ３陽性がんである。好ましくは、治療されるべき広範囲の哺乳動物のがんは、白血病、リンパ腫、がん腫、前立腺がん、非小細胞肺がん、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、胃がん、頭頸部がん、メラノーマ、骨肉腫、腸および結腸がん、および様々な転移性がんからなる群から選択される。好ましくは、治療されるべき炎症性障害は、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、１型糖尿病、移植拒絶、慢性Ｃ型肝炎、マラリアおよびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
【００２３】
「抗原結合タンパク質」は、抗原に結合する部分を含み、任意に、抗原結合部分が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する立体構造を取ることを可能にする骨格またはフレームワーク部分を含む、タンパク質である。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体および抗体類似体が挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、ＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体が移植された代替のタンパク質骨格または人工骨格を含んでいてもよい。このような骨格には、限定されないが、例えば、抗原結合タンパク質の３次元構造を安定化させるために導入される突然変異を含む抗体由来の骨格、ならびに、例えば、生体適合性ポリマーを含む全合成骨格が含まれる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら、２００３年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５３，Ｉｓｓｕｅ  １：１２１−１２９頁；Ｒｏｑｕｅら、２００４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０巻：６３９−６５４頁を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、ならびにフィブロネクチン成分を骨格として利用する抗体模倣体に基づく骨格を使用することができる。
【００２４】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一ポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０から７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う、約１００から１１０個またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う、定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって繋がれており、重鎖がさらに約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編集．、２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９年））（全ての目的で参照により全体として組み込まれる。）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【００２５】
天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって繋がれている、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の、同一の一般的構造を示す。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖と重鎖の両方とも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４ドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔら、ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２、１９９１年の定義に従って行われる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸の他の付番方式としては、ＩＭＧＴ．ＲＴＭ（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９巻：１８５−２０３頁；２００５年）、およびＡＨｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７−６７０頁；２００１年）挙げられる。
【００２６】
抗体は、種々の抗原特異性を有する免疫グロブリンを含む、血清または血漿のような供給源から得ることができる。このような抗体を親和性精製するとき、これらは、特定の抗原特異性が富化され得る。このような抗体の富化調製物は、通常、特定の抗原に対して特異的結合活性を有する約１０％未満の抗体で作製される。これらの調製物を数回の親和性精製を行うことにより、抗原に対して特異的結合活性を有する抗体の割合を増加することができる。この方法で製造された抗体は、多くの場合、「単一特異的」抗体と呼ばれる。単一特異的抗体調製物は、特定の抗原に対する特異的結合活性を有する約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または９９．９％の抗体で構成され得る。
【００２７】
「抗体」とは、他に特記されない限り、特異的結合について、インタクトな抗体と競合する、インタクトな免疫グロブリンまたはその抗原結合部分を意味する。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって、製造され得る。抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびポリペプチドに特異的抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが挙げられる。
【００２８】
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合される２つのＦａｂ断片を有する二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖ断片は、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；ｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨもしくはＶＬドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号、および第６，６９６，２４５号、ならびに米国特許出願第２００２／０２５１２号、第２００４／０２０２９９５号、第２００４／００３８２９１号、第２００４／０００９５０７号、第２００３／００３９９５８号、ならびにＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４−５４６頁、１９８９年）。
【００２９】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域が、リンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して繋がれている、連続的なタンパク質鎖を形成する抗体であり、このリンカーは、タンパク質鎖がそれ自体折り畳まれて一価の抗原結合部位を形成するのに十分に長い（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３−２６頁およびＨｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５巻：５８７９−８３頁）。ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖の２つのドメイン同士を対合させるには短すぎ、故に、各ドメインを別のポリペプチド鎖の相補性ドメインと対合させるのを可能にするリンカーによって繋がれているＶＨおよびＶＬドメインを含む（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０巻：６４４４−４８頁、１９９３年、およびＰｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２巻：１１２１−２３頁、１９９４年）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一のとき、それらの対合からもたらされるダイアボディは２つの同一の抗原結合部位を有することになる。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ、同じでありまたは異なっていてよい、３つおよび４つの抗原結合部位を形成する、抗体である。
【００３０】
所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、上記のＫａｂａｔら；上記のＬｅｆｒａｎｃらおよび／または上記のＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎに記載のシステムを使用して、同定することができる。１つ以上のＣＤＲを、共有結合的または非共有結合的に分子に組み込み、抗原結合タンパク質を作製することができる。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲをより大きなポリペプチド鎖の一部として組み込むことができ、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合させることができ、またはＣＤＲを非共有結合的に組み込むことができる。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が、目的とされる特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。
【００３１】
抗原結合タンパク質は、１つ以上の結合部位を有し得る。１を超える結合部位があるとき、結合部位は、互いに同一であってもよくまたは異なってもよい。例えば、天然に存在するヒト免疫グロブリンは、典型的には、２つの同一な結合部位を有し、一方で、「二重特異性」または「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００３２】
用語「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つ以上の可変領域および定常領域を有する全ての抗体が含まれる。一実施形態において、可変ドメインおよび定常ドメインの全てが、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、種々の方法で調製することができ、その例は以下に記載され、ヒト重鎖および／もしくは軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子修飾された、マウスの目的とされる抗原での免疫付与によるものを含む。
【００３３】
ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または付加によって非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有し、そのため、ヒト化抗体は、ヒト対象に投与されるとき、非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘発する可能性が低く、および／または重篤度がより低い免疫応答を誘導する。一実施形態において、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークドメインおよび定常ドメイン内のある種のアミノ酸を突然変異させてヒト化抗体を作製する。別の実施形態において、ヒト抗体に由来する定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合する。別の実施形態において、非ヒト抗体の１つ以上のＣＤＲ配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、ヒト対象に投与したときに、非ヒト抗体の免疫原性の可能性を低減させるように変化させる。ここで、この変化させたアミノ酸残基は、抗体のその抗原への免疫特異的結合にとって重要ではなく、またはアミノ酸配列への変更は、ヒト化抗体の抗原への結合が非ヒト抗体の抗原への結合よりも著しく悪くならないように保存的変更である。ヒト化抗体の作製方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号および第５，８７７，２９３号に見出すことができる。
【００３４】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体に由来する１つ以上の領域と、１つ以上の他の抗体に由来する１つ以上の領域を含有する抗体を意味する。一実施形態において、ＣＤＲの１つ以上は、ヒト抗ＣＸＣＲ３抗体に由来する。別の実施形態において、ＣＤＲの全ては、ヒト抗ＣＸＣＲ３抗体に由来する。別の実施形態において、１を超えるヒト抗ＣＸＣＲ３抗体に由来するＣＤＲを混合し、マッチさせてキメラ抗体とする。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗ＰＡＲ−２抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ１、第２のヒト抗ＣＸＣＲ３抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第３の抗ＣＸＣＲ３抗体に由来する重鎖に由来するＣＤＲを含み得る。他の組み合わせも可能である。
【００３５】
さらに、フレームワーク領域は、同じ抗ＣＸＣＲ３抗体の１つに由来し、ヒト抗体のような１つ以上の異なる抗体に由来し、またはヒト化抗体に由来し得る。キメラ抗体の１つの例において、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種に由来し、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と、同一であり、相同であり、またはそれに由来するが、一方で、その鎖の残りの部分は、別の種に由来し、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と、同一であり、相同であり、またはそれに由来する。所望の生物学的活性（すなわち、ＣＸＣＲ３に特異的に結合する能力）を示す、このような抗体の断片もまた含まれる。
【００３６】
「中和抗体」または「阻害性抗体」は、過剰量の抗ＣＸＣＲ３抗体が、実施例において、本明細書に記載されるアッセイなどのアッセイを用いて、少なくとも約２０％活性化の量を減少させる場合に、ＣＸＣＲ３の活性化を阻害する抗体である。種々の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＣＸＣＲ３の活性化の量を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％および９９．９％減少させる。
【００３７】
抗体の断片または類似体は、本明細書に記載の指示に従い、当該技術分野において公知の技術を用いて、当業者によって容易に調製することが可能である。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くに存在する。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公のまたは特許の配列データベースと比較することにより同定が可能である。コンピューターによる比較方法が、公知の構造および／または機能をもつ他のタンパク質中に存在する配列モチーフまたは予想されるタンパク質コンフォメーションのドメインを同定するために用いることができる。公知の３次元構造へ折り畳まれているタンパク質配列を同定する方法が知られている。Ｂｏｗｉｅら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３巻：１６４頁を参照されたい。
【００３８】
「ＣＤＲ移植抗体」は、特定の種またはアイソタイプの抗体由来の１つ以上のＣＤＲ、および同一でありまたは異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークを含む抗体である。
【００３９】
「多重特異的抗体」は、１つ以上の抗原上の１を超えるエピトープを認識する抗体である。抗体のこのタイプのサブクラスは、同一でありまたは異なる抗原上の２つの異なるエピトープを認識する「二重特異的抗体」である。
【００４０】
抗原結合タンパク質は、それが、１ナノモル以下の解離定数で抗原に結合するとき、抗原（例えば、ヒトＣＸＣＲ３）に「特異的に結合する」。
【００４１】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」または「抗原結合部位」とは、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質の抗原に対する特異性および親和性に貢献するアミノ酸残基（または他の部分）を含む、抗原結合タンパク質の一部である。その抗原に特異的に結合する抗体に関して、これは、そのＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部を含む。
【００４２】
「エピトープ」は、抗原結合タンパク質によって（例えば、抗体によって）結合される分子の部分である。エピトープは、分子の接触していない部分（例えば、ポリペプチド中、ポリペプチドの一次配列にて互いに連続しないが、ポリペプチドの三次構造および四次構造に関しては、抗原結合タンパク質によって結合されるのに十分近いアミノ酸残基）を含んでいてもよい。
【００４３】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、ＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）の一部）を用いて、そのデフォルトパラメーターを用いて配列を比較することにより決定される。
【００４４】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書中、互換的に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド、核酸および天然に存在しないヌクレオチド類似体）を用いて作製されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。一実施形態において、本発明の核酸分子は、抗体、または断片、その誘導体、突然変異体もしくは変異体をコードする隣接するオープンリーディングフレームを含む。
【００４５】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、それらの配列が、１つのポリヌクレオチド中の各ヌクレオチドが、ギャップの導入がなく、およびそれぞれの配列の５’末端または３’末端に不対ヌクレオチドがなく、他のポリヌクレオチド中のその相補的ヌクレオチドと反対になるように、逆並行方向に整列され得るとき、互いの「相補体」である。ポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチドが適度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズし得るとき、別のポリヌクレオチドに「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、その相補体ではない別のポリヌクレオチドに相補的であってよい。
【００４６】
「ベクター」は、細胞にそれと結合された別の核酸を導入するために使用され得る核酸である。１つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、付加的核酸部分がそこに結合され得る、直線状または環状の二本鎖ＤＮＡ分子を意味する。別のタイプのベクターは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）であり、付加的ＤＮＡ部分がウイルスゲノム中に導入され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律的に複製可能である（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。「発現ベクター」は、目的のポリヌクレオチドを発現させ得るタイプのベクターである。
【００４７】
ヌクレオチド配列は、調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、時期または場所）に影響を与えるとき、調節配列に「作動可能に連結されている」。「調節配列」は、それが作動可能に連結されている核酸の発現（例えば、発現のレベル、時期または場所）に影響を与える核酸である。調節配列は、例えば、調節核酸に直接、または１つ以上の他の分子（例えば、調節配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介して、その影響を及ぼし得る。調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。調節配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ，およびＢａｒｏｎら、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３巻：３６０５−０６頁に記載されている。
【００４８】
「宿主細胞」は、核酸、例えば、本発明の核酸を発現するために使用され得る細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、または真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の菌類）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであり得る。宿主細胞の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１年、Ｃｅｌｌ  ２３巻：１７５頁参照）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯおよび血清不含有培地中で増殖させたその関係細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、１９９８年、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８巻：３１頁参照）のようなそれらの誘導株、またはＤＨＦＲ中に欠損を有するＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７巻：４２１６−２０頁参照）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）（ＭｃＭａｈａｎら、１９９１年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０巻：２８２１頁参照）、２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３のようなヒト胎児性腎臓細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換した霊長動物細胞株、正常２倍体細胞、インビトロでの一次組織培養物に由来する細胞株、初代移植細胞、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。典型的に、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされ得て、次に、宿主細胞中で発現され得る培養細胞である。語句「組換え宿主細胞」は、発現されるべき核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされている宿主細胞を示すために用いられ得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、核酸と作動可能に連結されるように、調節配列が宿主細胞中に導入されない限り、所望のレベルでそれを発現しない細胞であり得る。宿主細胞なる用語は、特定の対象細胞のみを意味するのではなく、このような細胞の後代系統または可能性のある後代系統を意味することが理解される。ある種の修飾がその後代において、例えば突然変異または環境の影響により起こり得るため、このような後代系統は、実際に、親細胞と同一ではない場合があるが、それでも本明細書において用いられる用語の範囲内に包含される。
【００４９】
好ましくは、治療されるべき哺乳動物のがんは、卵巣癌、結腸癌、乳癌または肝癌腫細胞株、骨髄腫、神経芽細胞由来ＣＮＳ腫瘍、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病、Ｔ細胞由来白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、肥満細胞由来腫瘍、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５０】
本開示のポリペプチドは、当該技術分野において公知の任意の標準的な方法を用いて生成することができる。一例において、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を組換え発現ベクターに挿入し、発現を促進させる条件下でＤＮＡ配列を発現させることにより、組換えＤＮＡ法によって生成される。
【００５１】
本明細書に開示される種々のポリペプチドのいずれかをコードする核酸を化学的に合成することができる。細胞における発現を向上させるようにコドン使用頻度を選択することができる。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。特殊なコドン使用頻度パターンは、Ｅ．コリおよび他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞用に開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３年、１００（２）：４３８−４２頁；Ｓｉｎｃｌａｉｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００２年（１）：９６−１０５頁；Ｃｏｎｎｅｌｌ  Ｎ  Ｄ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１年、１２（５）：４４６−９頁；Ｍａｋｒｉｄｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９６年、６０（３）：５１２−３８頁；およびＳｈａｒｐら、Ｙｅａｓｔ．１９９１年、７（７）：６５７−７８頁を参照されたい。
【００５２】
核酸操作のための一般的技術は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２ｅｄ．、１９８９年、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年）および定期的な更新版に記載されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳の調節エレメントに作動可能に連結される。このような調節エレメントには、転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。宿主において複製する能力は、通常、複製起源により付与され、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組み込む。
【００５３】
組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するために有用であり得る、任意のタイプのタンパク質タグ配列を含むことができる。タンパク質タグの例としては、限定されないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグが挙げられる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞の宿主を用いた使用に適したクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８５年）に見出すことができる。
【００５４】
発現構築物は、宿主細胞に適した方法を用いて宿主細胞に導入される。核酸を宿主細胞に導入するための種々の方法は、当該技術分野において公知であり、限定されないが、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；リポフェクション；および感染（ベクターが感染性因子である。）が挙げられる。適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞が含まれる。
【００５５】
適切な細菌には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．コリまたはバチラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）が含まれる。好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロミセス属種由来の酵母はまた、ポリペプチドの生成に使用され得る。また、種々の哺乳動物細胞または昆虫細胞の培養システムを用いて、組換えタンパク質を発現させることができる。昆虫細胞における異種タンパク質の生成のためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：４７、１９８８年）に概説される。適切な哺乳動物の宿主細胞株の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児性腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が含まれる。精製ポリペプチドは、適切な宿主／ベクター系を培養して、組換えタンパク質を発現させることにより調製される。多くの適用に関して、少量の本明細書に開示されるポリペプチドの多くが、好ましい発現方法としてＥ．コリにおいて発現される。次に、タンパク質を培養培地または細胞抽出物から精製する。
【００５６】
本明細書に開示されるタンパク質はまた、細胞翻訳システムを用いて生成され得る。このような目的に関して、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロで転写され、ｍＲＮＡを生成するために、および利用される特定の無細胞系（哺乳動物細胞または酵母のような真核生物の無細胞翻訳系または細菌のような原核生物の無細胞翻訳系）においてｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするために修飾される必要がある。
【００５７】
また、ＣＸＣＲ３結合ポリペプチドは、化学合成（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ  ｅｄ．、１９８４年、Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＩＩに記載される方法）により生成され得る。タンパク質への修飾はまた、化学合成により生成され得る。
【００５８】
本開示のポリペプチドは、タンパク質化学の分野において一般的に公知であるタンパク質の単離／精製法により精製され得る。限定されない例としては、抽出、再結晶、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる。）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。精製後、ポリペプチドは、異なる緩衝液に交換され、および／または、限定されないが、濾過および透析を含むが、当該技術分野において公知である種々の方法のいずれかにより富化され得る。
【００５９】
精製されたポリペプチドは、好ましくは、少なくとも８５％純度、より好ましくは少なくとも９５％純度、最も好ましくは少なくとも９８％純度である。純度の正確な数値に関わらず、ポリペプチドは、医薬品として使用するために十分に純粋である。
【００６０】
ポリペプチドの翻訳後修飾
ある種の実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含み得る。タンパク質の翻訳後修飾の例としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）、ビオチン化またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が挙げられる。結果として、修飾された可溶性ポリペプチドは、脂質、多糖または単糖、およびリン酸塩のような非アミノ酸エレメントを含み得る。グリコシル化の好ましい形態は、１つ以上のシアル酸部分をポリペプチドにコンジュゲートさせるシアリル化である。シアル酸部分は、溶解性および血清半減期を改善し、一方、タンパク質の免疫遺伝学的解析の可能性を減少させる。Ｒａｊｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００１年、３１；４０（３０）：８８６８−７６頁を参照されたい。
【００６１】
１つの具体的な実施形態において、目的の可溶性ポリペプチドの修飾形態は、目的の可溶性ポリペプチドに非タンパク質性ポリマーを結合したものを含む。１つの具体的な実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンであり、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に記載されているようなものである。修飾されたポリペプチドの例には、ＰＥＧ化された抗体が含まれる。
【００６２】
ＰＥＧは、市販されているまたは当該技術分野において周知である方法（ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．３、１３８−１６１頁）によるエチレングリコールの開環重合により調製することができる、水溶性ポリマーである。用語「ＰＥＧ」は、ＰＥＧのサイズまたは末端での修飾にかかわらず、任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広く用いられ、式：Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（１）（式中、ｎは、２０から２３００であり、Ｘは、Ｈまたは末端修飾、例えばＣ１−４アルキルである。）によって表すことができる。一実施形態において、本発明のＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシまたはメトキシで終わる、すなわち、ＸがＨまたはＣＨ３である（「メトキシＰＥＧ」）。ＰＥＧは、結合反応に必要なさらなる化学基を含み得る；それは、分子の化学合成の結果生じる；または分子の一部の最適距離のためのスペーサーである。加えて、このようなＰＥＧは、互いに結合した１つ以上のＰＥＧ側鎖で構成され得る。１を超えるＰＥＧ鎖を含むＰＥＧは、多腕型（ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄ）または分岐型ＰＥＧと呼ばれる。分岐型ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの種々のポリオールに酸化ポリエチレンを付加することによって製造することができる。例えば、４アーム型ＰＥＧは、ペンタエリスリトールおよび酸化エチレンから製造され得る。分岐型ＰＥＧは、例えば、欧州特許出願公開第０４７３０８４Ａ号および米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。ＰＥＧの一形態は、リシンの一級アミノ基を介して結合された２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）を含む（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６巻（１９９５年）６２−６９頁）。
【００６３】
ＰＥＧは周知であるが、これは、ＰＥＧ化された１０Ｆｎ３ポリペプチドがＰＥＧ化され、リガンド結合活性を保持することができるという最初の実証である。好ましい実施形態において、ＰＥＧ化１０Ｆｎ３ポリペプチドは、部位特異的ＰＥＧ化によって、特に、ＰＥＧをＮ末端またはＣ末端のシステイン部位にコンジュゲートさせることによって生成される。したがって、本開示は、改良された薬物動態学的特性を有する標的結合１０Ｆｎ３ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、１０Ｆｎ３ドメインのループの少なくとも１つが標的結合に関与する、約８０個から約１５０個のアミノ酸を有する１０Ｆｎ３ドメイン；および１０Ｆｎ３ポリペプチドが１００ｎＭ未満のＫＤで標的に結合し、哺乳動物において３０ｍＬ／時間／ｋｇ未満のクリアランス速度を有する、共有結合ＰＥＧ部分を含む。ＰＥＧ部分は、Ｃｙｓ残基への結合によるなどの部位特異的ＰＥＧ化によって１０Ｆｎ３ポリペプチドに結合されてもよく、この場合、Ｃｙｓ残基は、０Ｆｎ３ポリペプチドのＮ末端に、またはＮ末端と最もＮ末端のβ鎖もしくはβ様鎖との間に、または１０Ｆｎ３ポリペプチドのＣ末端に、またはＣ末端と最もＣ末端のβ鎖もしくはβ様鎖との間に位置してもよい。Ｃｙｓ残基は、他の位置に、同様に、特に、標的結合に関与しないループのいずれかに位置付けられてもよい。ＰＥＧ部分はまた、アミンへのコンジュゲーションによるものを含む、他の化学によって結合されてもよい。
【００６４】
ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧコンジュゲーションは、一般的に、ＰＥＧの活性化、および活性化されたＰＥＧ−中間体の標的タンパク質／ペプチドへのまたはリンカーへの直接的なカップリングを伴い、後者は、その後、活性化され、標的タンパク質／ペプチドにカップリングされる（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２、３５７１頁（１９７７年）およびＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２、３５８２頁（１９７７年）、ＺａｌｉｐｓｋｙらおよびＨａｒｒｉｓら、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編集）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年；Ｃｈａｐ．２１  ａｎｄ  ２２）を参照されたい）。ＰＥＧ分子を含む結合ポリペプチドはまた、コンジュゲートされたタンパク質として知られているが、結合されるＰＥＧ分子を欠損しているタンパク質はコンジュゲートされないものを指すことができることに留意されたい。
【００６５】
ＣＸＣＲ３結合ポリペプチドにコンジュゲートするために、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａ（ｎは２０から２３００）である、様々な分子量形態のＰＥＧを選択することができる。ＰＥＧ中の反復単位「ｎ」の数は、ダルトンに記載された分子量に近似される。活性化されたリンカー上のＰＥＧの合わせた分子量は、医薬用途に適していることが好ましい。したがって、一実施形態において、ＰＥＧ分子の分子量は、１００，０００Ｄａを超えない。例えば、各々のＰＥＧ分子が１２，０００Ｄａ（各ｎは約２７０である）の同一分子量を有する３つのＰＥＧ分子がリンカーに結合される場合、リンカー上のＰＥＧの全分子量は約３６，０００Ｄａ（合計ｎは約８２０である）である。リンカーに結合したＰＥＧの分子量はまた、異なっていてもよく、例えば、リンカー上の３つの分子のうち、２つのＰＥＧ分子は各々５，０００Ｄａ（各ｎは約１１０である）であり、１つのＰＥＧ分子は１２，０００Ｄａ（ｎは約２７０である）であってもよい。
【００６６】
本開示の特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３結合ポリペプチドは、式：−ＣＯ−（ＣＨ２）Ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲの１つのポリ（エチレングリコール）基に共有結合され、ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（すなわち、カルボニル）は、結合ポリペプチドのアミノ基の１つとアミド結合を形成し；Ｒは、低級アルキルであり；ｘは２または３であり；ｍは、約４５０から約９５０であり；ｎおよびｍは、コンジュゲートから結合ポリペプチドを差し引いた分子量が約１０から４０ｋＤａとなるように選択される。一実施形態において、リジンの結合ポリペプチドの６−アミノ基は、利用可能な（遊離）アミノ基である。
【００６７】
上記コンジュゲートは、式（ＩＩ）：Ｐ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ（ＩＩ）によってより具体的に示すことができ、ここで、Ｐは、本明細書に記載される結合ポリペプチドの基であり（すなわち、式（ＩＩ）において示されるカルボニルとアミド結合を形成するアミノ基および複数のアミノ基を含まない）；ここで、Ｒは、低級アルキルであり；ｘは２または３であり；ｍは、約４５０から約９５０であり、コンジュゲートから結合ポリペプチドを差し引いた分子量が約１０から約４０ｋＤａとなるように選択される。本明細書で使用する時、「ｍ」の所与の範囲は方向性の意味を有する。「ｍ」の範囲は、いずれの場合においても、正確に、ＰＥＧ基の分子量によって決定される。
【００６８】
当業者は、例えば、ペグ化された結合ポリペプチドをどのように治療的に使用するか、所要の投薬量、血中維持時間、タンパク質分解抵抗性、免疫原性、および他の考慮事項に基づき、ＰＥＧの適切な分子量を選択できる。タンパク質の特性を増強するためのＰＥＧおよびその使用についての考察については、Ｋａｔｒｅ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０：９１−１１４頁（１９９３年）を参照されたい。
【００６９】
一実施形態において、ＰＥＧ分子を活性化して、リジンなどの結合ポリペプチド上のアミノ基と反応させ得る（Ｂｅｎｃｈａｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３１、２５（１９８３年）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１、１４１（１９８５年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ａｄｒｓ  ９−１１０  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４６９（１９９９年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｅｕｒｏｐ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．、１９、１１７７−１１８３頁（１９８３年）；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、  １２、１１９−１２８（１９９０年））。
【００７０】
１つの具体的な実施形態において、ＰＥＧの炭酸エステルを使用して、ＰＥＧ結合ポリペプチドコンジュゲートを形成する。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）をＰＥＧとの反応に使用して、活性な混合されたＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートを形成し、その後、これをリンカーの求核性基または結合ポリペプチドのアミノ基と反応させ得る（米国特許第５，２８１，６９８号および同第５，９３２，４６２号を参照されたい）。同様のタイプの反応において、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カーボネートおよびジ−（２−ピリジル）カーボネートをＰＥＧと反応させて、それぞれＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合カーボネートを形成し得る（米国特許第５，３８２，６５７号）。
【００７１】
１０Ｆｎ３ポリペプチドのペグ化は、最先端の方法により、例えば、結合ポリペプチドと求電子的に活性なＰＥＧの反応により実施され得る（供給業者：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｃｏｒｐ．ｃｏｍ）。本発明の好ましいＰＥＧ試薬は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート類（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、ブタノエート（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートまたは分枝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、例えば、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳである（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６（１９９５年）６２−６９頁）。このような方法を使用して、結合ポリペプチドリジンのｆ−アミノ基または結合ポリペプチドのＮ末端アミノ基をペグ化し得る。
【００７２】
別の実施形態において、ＰＥＧ分子を結合ポリペプチド上のスルフヒドリル基と結合させ得る（Ｓａｒｔｏｒｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７、４５（１９９１年）；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．、７、３６３−３６８（１９９６年）；Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０年）８、３４３；米国特許第５，７６６，８９７号）。米国特許第６，６１０，２８１号および同第５，７６６，８９７号は、スルフヒドリル基と結合し得る、反応性ＰＥＧ種の例を記載する。
【００７３】
ＰＥＧ分子が結合ポリペプチド上のシステイン残基とコンジュゲートするいくつかの実施形態において、システイン残基は、結合ポリペプチドに元々あり、一方、他の実施形態において、１つ以上のシステイン残基は、結合ポリペプチドに遺伝子操作される。突然変異を結合ポリペプチドのコード配列に導入し、システイン残基を作製し得る。これは、例えば、１つ以上のアミノ酸残基のシステインへの突然変異により達成され得る。システイン残基に突然変異させるのに好ましいアミノ酸は、セリン、スレオニン、アラニンおよび他の親水性残基を含む。好ましくは、システインに突然変異させる残基は、表面露出した残基である。一次配列またはタンパク質に基づき残基の表面可触性を予測するアルゴリズムは当該技術分野において周知である。あるいは、結合ポリペプチドがそれに基づいて設計および展開されたフレームワークの結晶構造が解かれているなら、表面残基は、結合ポリペプチドのアミノ酸配列の比較により予測でき（Ｈｉｍａｎｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ（２００１年）２０−２７；４１４（６８６６）：９３３−８参照）、したがって、表面露出残基が同定される。一実施形態において、システイン残基は、Ｎ末端および／もしくはＣ末端でまたはその付近で、またはループ領域で結合ポリペプチドに導入される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ペグ化された結合ポリペプチドは、Ｎ末端アミノ酸のアルファアミノ基に共有結合により結合したＰＥＧ分子を含む。部位特異的なＮ末端還元的アミノ化は、Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、（２００１年）ＪＰＥＴ、２９７、１０５９および米国特許第５，８２４，７８４号に記載されている。他の利用可能な求核性アミノ基を利用するタンパク質の還元的アミノ化のためのＰＥＧ−アルデヒドの使用は、米国特許第４，００２，５３１号、Ｗｉｅｄｅｒら（１９７９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４、１２５７９およびＣｈａｍｏｗら（１９９４年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５、１３３に記載されている。
【００７５】
別の実施形態において、ペグ化された結合ポリペプチドは、リンカーに共有結合により結合した１つ以上のＰＥＧ分子を含み、該リンカーは、次に、結合ポリペプチドのＮ末端でアミノ酸残基のアルファアミノ基に結合する。このようなアプローチは、米国特許公開第２００２／００４４９２１号およびＷＯ０９４／０１４５１号に開示されている。
【００７６】
一実施形態において、結合ポリペプチドは、Ｃ末端でペグ化される。具体的な実施形態において、タンパク質は、Ｃ末端アジド−メチオニンの導入、続くシュタウディンガー反応を介するメチル−ＰＥＧ−トリアリールホスフィン化合物のコンジュゲーションによりＣ末端でペグ化される。このＣ末端コンジュゲーション法はＣａｚａｌｉｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００４年；１５（５）：１００５−１００９に記載されている。
【００７７】
結合ポリペプチドのモノペグ化はまた、ＷＯ９４／０１４５１号に記載されている一般的方法に従って生成され得る。ＷＯ９４／０１４５１号は、修飾末端アミノ酸アルファ炭素反応基を有する組換えポリペプチドを製造するための方法を記載している。本方法のステップは、組換えポリペプチドの形成、ならびにＮ末端アルファ−アミンおよびＣ末端アルファ−カルボキシルの１つ以上の生物学的に付加された保護基による保護を伴う。次に、ポリペプチドを化学保護剤と反応させて、反応性側鎖基を選択的に保護し、それにより側鎖基を修飾から守る。続いて、ポリペプチドを生物学的保護基に特異的な開裂剤で開裂して、非保護末端アミノ酸アルファ炭素反応基を形成する。非保護末端アミノ酸アルファ炭素反応基を化学修飾剤で修飾する。次に、側鎖保護末端修飾単鎖配列一コピーポリペプチドを側鎖基において脱保護して、末端修飾された組換え単一コピーポリペプチドを形成する。本方法におけるステップの数および順番は、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸での選択的修飾を達成するために多様であり得る。
【００７８】
コンジュゲーション反応における結合ポリペプチド対活性化ＰＥＧの比は約１：０．５から１：５０、約１：１から１：３０、または約１：５から１：１５であり得る。種々の水性緩衝液を本方法で使用して、結合ポリペプチドへのＰＥＧの共有結合的付加を触媒することができる。一実施形態において、使用される緩衝液のｐＨは約７．０から９．０である。別の実施形態において、ｐＨは、わずかに塩基性範囲にあり、例えば、約７．５から８．５である。中性ｐＨ範囲に近いｐＫａを有する緩衝液、例えば、リン酸緩衝液を使用し得る。
【００７９】
分子ふるい（例えば、ゲル濾過）およびイオン交換クロマトグラフィーなどの当該技術分野において公知である慣用の分離および精製技術を使用して、ペグ化された結合ポリペプチドを精製することができる。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、分離してもよい。分離され得る生成物は、モノ−、ジ−、トリ−、ポリ−および非ペグ化された結合ポリペプチド、ならびに遊離ＰＥＧを含む。モノ−ＰＥＧコンジュゲートのパーセンテージは、組成物中のモノ−ＰＥＧのパーセンテージを上げるために溶出ピーク周辺の広い画分をプールすることにより制御することができる。約９０％のモノ−ＰＥＧコンジュゲートが収率および活性の良好なバランスを表す。コンジュゲートの、例えば、少なくとも９２％または少なくとも９６％がモノ−ＰＥＧ種である組成物が望ましい場合がある。本発明の一実施形態において、モノ−ＰＥＧコンジュゲートのパーセンテージは、９０％から９６％である。
【００８０】
一実施形態において、本発明のペグ化された結合ポリペプチドは、１つ、２つまたはそれを超えるＰＥＧ部分を含む。一実施形態において、ＰＥＧ部分は、タンパク質の表面上にある、および／または標的リガンドと接触する表面から離れた、アミノ酸残基に結合する。一実施形態において、ＰＥＧ結合ポリペプチドにおけるＰＥＧの複合または総分子量は、約３，０００Ｄａから６０，０００Ｄａ、場合により約１０，０００Ｄａから３６，０００Ｄａである。一実施形態において、ペグ化された結合ポリペプチドにおけるＰＥＧは、実質的に直線状の直鎖ＰＥＧである。
【００８１】
本発明の一実施形態において、ペグ化された結合ポリペプチドにおけるＰＥＧは、ヒドロキシルアミンアッセイ、例えば、４５０ｍＭのヒドロキシルアミン（ｐＨ６．５）を使用して８から１６時間、室温にてペグ化されたアミノ酸残基から加水分解されず、したがって、安定である。一実施形態において、組成物の８０％超が、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、安定なモノ−ＰＥＧ結合ポリペプチドである。
【００８２】
別の実施形態において、本発明のペグ化された結合ポリペプチドは、好ましくは、修飾されていないタンパク質に関連する生物学的活性の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を保持する。一実施形態において、生物学的活性は、ＫＤ、ｋｏｎまたはｋｏｆｆによって評価されるように、ＣＸＣＲ３に結合するその能力を指す。１つの特定の実施形態において、ペグ化された結合ポリペプチドタンパク質は、ペグ化されていない結合ポリペプチドと比較して、ＣＸＣＲ３への結合の増加を示す。
【００８３】
ＰＥＧ修飾ポリペプチドの血清クリアランス率は、非修飾結合ポリペプチドのクリアランス率と比べて、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはさらには９０％減少し得る。ＰＥＧ修飾ポリペプチドは、非修飾タンパク質の半減期と比べて増大された半減期（ｔ１／２）を有し得る。ＰＥＧ結合ポリペプチドの半減期は、非修飾結合ポリペプチドの半減期と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％またはさらには１０００％増大され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質の半減期は、インビトロで、例えば、緩衝化生理食塩水または血清中で決定される。他の実施形態において、タンパク質の半減期は、インビボでの半減期であり、例えば、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減期である。
【００８４】
治療製剤および投与様式
本開示は、ＣＸＣＲ３生物学的活性の阻害に応答する状態を治療するまたは病前状態を予防するための方法を特徴とする。好ましい例は、炎症または細胞の過剰増殖を特徴とする状態である。投与のための技術および投与量は、特定の種類のポリペプチドおよび処置されるべき特定の病状によって変わるが、当業者により容易に決定することができる。一般的に、監督当局は、治療剤として使用されるタンパク質試薬が、許容される低レベルの発熱物質を有するように製剤化されることを要求する。したがって、治療製剤は、一般的に、それらが実質的に発熱物質を含まない、または少なくとも適切な監督当局（例えば、ＦＤＡ）により決定される、許容されるレベル未満の発熱物質を含む点で、他の製剤と区別される。
【００８５】
本開示の治療組成物は、医薬として許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに、単一の投与量形態で投与され得る。投与は、非限定的な例として、非経腸（例えば、静脈内、皮下）、経口または局所であり得る。さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸を用いる任意の遺伝子治療技術、例えばネイキッドＤＮＡ送達、組換え遺伝子およびベクター、患者の細胞のエクスビボでの操作を含む細胞ベースの送達などを用いることができる。
【００８６】
組成物は、経口投与用の丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤または持続放出錠；または静脈内、皮下もしくは非経腸投与用の液剤；局所投与用のゲル、ローション、軟膏、クリームもしくはポリマーまたは他の持続放出ビヒクルの形態であり得る。
【００８７】
製剤の製造方法関する当該技術分野において周知の方法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０ｔｈ  ｅｄ．、編集、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ  Ｒ．、２０００年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ）に見出される。非経腸投与用製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物由来のオイルまたは水素化ナフタレンを含むことができる。生体適合性の生分解可能なラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、化合物の放出を制御するために使用することができる。ナノ粒子製剤（例えば、生分解可能なナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）は、化合物の生体内分布を制御するために使用することができる。他の有用な可能性のある非経腸送達系には、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み式点滴システムおよびリポソームが含まれる。製剤中の化合物の濃度は、投与される薬物の投薬量、および投与経路を含む、多数の因子に応じて変化する。
【００８８】
ポリペプチドは、任意に、製薬分野で通常使用される非毒性の酸付加塩または金属錯体のような医薬として許容される塩として投与されてもよい。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸のような有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースのようなポリマー酸；および、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸のような無機酸が含まれる。金属錯体には、亜鉛、鉄などが含まれる。一例において、ポリペプチドは、熱安定性を増加させるために、酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。
【００８９】
経口使用のための製剤としては、非毒性の医薬として許容される賦形剤との混合物中に有効成分を含有する錠剤が含まれる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤および抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油またはタルク）であり得る。
【００９０】
経口使用のための製剤はまた、チュアブル錠として、または硬質ゼラチンカプセルとして与えられてもよく、ここで、有効成分は、不活性固体希釈剤とともにまたは軟質ゼラチンカプセルとして混合され、有効成分は水または油媒体とともに混合される。
【００９１】
治療的に有効な投薬量とは、投与された場合に治療効果を生じる投薬量を意味する。正確な投薬量は、処置される障害に依存し、当業者により公知の技術を用いて確かめられ得る。一般的に、ポリペプチドは、１日あたり約０．０１μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日あたり０．１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇで投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば、１日１回、２回、３回または４回）、または好ましくは低頻度で（例えば、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、月に一回または年に４回）投与され得る。さらに、当該技術分野において公知であるように、年齢ならびに体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時期、薬物相互作用および疾患の重症度による調整が必要であり、当業者により常套実験にて確認され得る。
【００９２】
例示的使用
本明細書に記載されるＣＸＣＲ３結合タンパク質およびそれらの関連する改変体は、多数の治療用途および診断用途において有用である。これらには、ＣＸＣＲ３への結合と競合するまたは結合をブロックすることによるＣＸＣＲ３の生物学的活性の阻害、ならびに細胞毒性または造影性部分の細胞への送達、好ましくはＣＸＣＲ３を発現する細胞への送達が含まれる。これらの分子のサイズが小さく、構造が安定している点は、薬物の製造、迅速なクリアランスが望まれる特定の用途のための身体からの迅速なクリアランス、または適切であるもしくはこのような特徴を有する分子を用いて改善される新規のデリバリーシステムとしての製剤化に関して特に有益であり得る。
【００９３】
ＣＸＣＲ３生物学的活性の阻害剤としての有効性に基づいて、本開示のポリペプチドは、多数のがん状態、ならびに胸水および腹水などのがんに起因する合併症、結腸直腸がん、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および膵臓がんに対して有効である。がんの非制限的な例には、膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、軟骨がん、結腸腎臓がん、肝臓がん、肺がん、リンパ節がん、神経組織がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、骨格筋がん、皮膚がん、脊髄がん、脾臓がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、気管がん、泌尿生殖器管がん、尿管がん、尿道がん、子宮がん、または膣がんで挙げられる。
【００９４】
ＣＸＣＲ３結合ポリペプチドは、単独で投与することができ、または化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的処置またはこれらの任意の組み合わせのような１つ以上のさらなる療法と組み合わせて投与することができる。上記の他の治療戦略のもとで、長期治療が同様に可能であり、アジュバント療法もまた可能である。好ましくは、乳がんにおいて、組み合わせる場合は、ハーセプチンまたは他のＨｅｒ−２療法と併用される。
【００９５】
このような方法のある種の実施形態において、１つ以上のポリペプチド治療剤は、共に（同時に）または異なる時点において（連続的に）投与され得る。さらに、ポリペプチド治療薬は、がんを治療するためのまたは血管新生を阻害するための別のタイプの化合物とともに投与することができる。
【００９６】
特定の実施形態において、本発明の対象とする抗ＣＸＣＲ３抗体剤は、単独で使用し得る。あるいは、本薬剤は、増殖性障害（例えば、腫瘍）の治療または予防を目的とする他の従来の抗がん治療アプローチと組み合わせて使用されてもよい。例えば、このような方法は、予防的がん予防、手術後のがんの再発および転移の予防、ならびに他の従来のがん療法のアジュバントとして使用することができる。本開示は、従来のがん療法（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法、および外科手術）の有効性が、本ポリペプチド治療剤の使用によって増強され得ることを認識する。
【００９７】
多様な従来の化合物は、抗新生物活性を有することが示されている。これらの化合物は、固形腫瘍を収縮させ、転移および更なる増殖を阻止し、または白血病もしくは骨髄の悪性腫瘍中の悪性細胞数を減少させるための化学療法における薬剤として使用されている。化学療法は、種々の悪性腫瘍の治療において効果的であったが、多くの抗新生物化合物は、望ましくない副作用を誘発する。２つ以上の異なる治療を組み合わせる場合、治療は相乗的に働く可能性があり、各々の治療の投薬量を減少させることができ、それにより、高い投薬量での各々の化合物によってもたらされる有害な副作用を減少させ得ることが示されている。難治性の悪性腫瘍は、２つ以上の異なる治療の組み合わせ療法に反応する場合がある。
【００９８】
本発明のポリペプチド治療剤が、別の従来の抗新生物剤と併用して、同時にまたは連続して投与される場合、このような治療剤は、抗新生物剤の治療効果を高める、またはこのような抗新生物剤に対する細胞耐性を克服することが見出される場合がある。これにより、抗新生物剤の投与量を減少させ、それにより、望ましくない副作用を低下させ、または耐性細胞における抗新生物剤の有効性を回復させることができる。
【００９９】
組み合わせ抗腫瘍治療に使用され得る医薬化合物には、単に例示にすぎないが、以下が含まれる：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔｍｉｎｅ）、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン。
【０１００】
ある種の化学療法的な抗腫瘍化合物は、それらの活性機序によって、例えば、以下のグループに分類することができる：代謝拮抗剤／抗がん剤、例えば、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロキシウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）、およびプリン類似体、葉酸拮抗剤および関連する阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；天然の生成物を含む抗増殖剤／抗分裂剤、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）などの微細管分裂剤、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビン、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ傷害剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホラミド、およびエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンおよびそれら自身のアスパラギンを合成する能力を持たない誘導体細胞を全身に代謝させるＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖性／抗分裂性アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロランブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；葉酸類似体（メトトレキサート）などの抗増殖性／抗分裂性代謝拮抗剤；プラチナ調整複合体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝血剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビンの阻害剤）；線維素溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲン活性化剤、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；移動抑制剤；分泌抑制剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリマス（ＦＫ−５０６）、シロリマス（ラパマイシン）、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェチール）；抗血管形成化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）および増殖因子阻害剤（例えば、ＶＥＧＦ阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断剤；窒素酸化物供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導物質（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害物質（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトセシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｅｄｎｉｓｏｌｏｎ）、プレドニゾン、およびプレドニゾロン）；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア性機能障害誘導剤およびカスパーゼ活性化剤；ならびにクロマチン分裂剤。
【０１０１】
併用療法の性質に応じて、ポリペプチド治療薬の投与は、他の治療が投与されている間および／またはその後に継続されてもよい。ポリペプチド治療剤の投与は、単回投薬でまたは複数回投薬で行うことができる。いくつかの例において、ポリペプチド治療剤の投与は、従来の治療の少なくとも数日前に開始されるが、他の例において、投与は、従来の治療の投与の直前または投与時のいずれかで開始される。
【０１０２】
診断用途の一例において、不適切な血管新生によって特徴付けられる状態を有すると疑われる患者由来の、血清または組織生検などの生物学的試料は、本開示の検出可能に標識されたポリペプチドと接触させて、ＣＸＣＲ３のレベルを検出する。次に、検出されたＣＸＣＲ３のレベルは、標識されたポリペプチドとも接触させた正常な試料において検出されたＣＸＣＲ３のレベルと比較する。ＣＸＣＲ３のレベルの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の増加は、診断指標とみなすことができる。
【０１０３】
特定の実施形態において、ＣＸＣＲ３結合ポリペプチドは、検出可能され得る標識（例えば、標識は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）にさらに結合される。活性部分は、放射性薬剤であってもよく、例えば、鉄キレートなどの放射性重金属、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素またはガリウムの陽電子放出体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｔ、１３２Ｉ、または９９Ｔｃが挙げられる。このような部分に結合された結合剤は、造影剤として使用されてもよく、ヒトなどの哺乳動物における診断使用に有効な量で投与され、次に、造影剤の局在および蓄積が検出される。造影剤の局在および蓄積は、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法または陽電子放射断層撮影法によって検出することができる。ＣＸＣＲ３に対するＣＸＣＲ３結合ポリペプチドを用いた免疫シンチグラフィーを用いて、がんおよび血管系を検出および／または診断することができる。例えば、９９テクネチウム、１１１インジウム、または１２５ヨウ素で標識されたＣＸＣＲ３マーカーに対する結合ポリペプチドのいずれも、このような画像化に効果的に使用され得る。当業者に明らかであるように、投与される放射性同位体の量は、放射性同位元素に依存する。当業者は、活性成分として使用される所定の放射性核種の比活性およびエネルギーに基づいて、投与される造影剤の量を容易に処方することができる。典型的には、造影剤の用量当たり０．１−１００ミリキュリー、好ましくは１−１０ミリキュリー、最も頻繁には２−５ミリキュリーが投与される。したがって、放射性部分にコンジュゲートされた標的化部分を含む造影剤として有用な本発明の組成物は、０．１−１００ミリキュリー、いくつかの実施形態において、好ましくは１−１０ミリキュリー、いくつかの実施形態において、好ましくは２−５ミリキュリー、いくつかの実施形態において、より好ましくは１−５ミリキュリーを含む。
【０１０４】
ＣＸＣＲ３結合ポリペプチドはまた、ＣＸＣＲ３を発現する細胞または組織に更なる治療剤（限定されないが、薬物化合物、化学療法化合物、および放射線療法化合物を含む）を送達させるために使用することができる。一例において、ＣＸＣＲ３結合ポリペプチドは、ＣＸＣＲ３を発現する腫瘍細胞または組織への化学療法剤の標的化された送達のための化学療法剤に融合される。
【０１０５】
ＣＸＣＲ３結合ポリペプチドは、研究、診断および治療用途を含む様々な用途において有用である。例えば、それらは、受容体またはその一部を単離および／または精製し、受容体構造（例えば、立体構造）および機能を研究するために使用することができる。
【０１０６】
特定の態様において、種々の結合ポリペプチドを用いて、例えば、内皮細胞（例えば、静脈内皮細胞）上またはＣＸＣＲ３遺伝子でトランスフェクトされた細胞上でのＣＸＣＲ３発現を検出または測定することができる。したがって、それらはまた、診断または研究目的のために、細胞選別および画像化（例えば、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別）などの用途において有用性を有する。
【０１０７】
ある種の実施形態において、断片の結合ポリペプチドは、診断目的のために標識されていても標識されていなくてもよい。典型的には、診断アッセイは、結合ポリペプチドがＣＸＣＲ３に結合することによって生ずる複合体の形成を検出することを伴う。結合ポリペプチドまたはその断片は、抗体と同様に、直接標識され得る。様々な標識が使用でき、限定されないが、放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素の基質、酵素補助因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）が挙げられる。多数の適切な免疫アッセイが当業者に公知である（例えば、米国特許第３，８１７，８２７号；第３，８５０，７５２号；第３，９０１，６５４号；および第４，０９８，８７６号を参照されたい。）。標識されない場合、結合ポリペプチドは、凝集アッセイ法などのアッセイにて使用できる。また、標識されていない結合ポリペプチドは、結合ポリペプチドまたは他の適切な試薬（例えば、標識されたプロテインＡ）と反応性のある標識抗体などの、結合ポリペプチドを検出するために使用できる別の（１つ以上の）適切な試薬と併用することもできる。
【０１０８】
一実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、目的とするポリペプチドが酵素にコンジュゲートする酵素免疫アッセイに利用することができる。ＣＸＣＲ３タンパク質を含む生物学的サンプルが目的とする結合ポリペプチドと混合される場合、結合ポリペプチドとＣＸＣＲ３タンパク質の間で結合が生じる。一実施形態において、ＣＸＣＲ３タンパク質を発現する細胞（例えば、内皮細胞）を含むサンプルが、目的とする抗体と混合され、結合ポリペプチドと結合ポリペプチドによって認識されるＣＸＣＲ３タンパク質を有する細胞の間で結合が生じる。これらの結合細胞は、結合しなかった試薬から分離され、細胞に特異的に結合した結合ポリペプチド−酵素コンジュゲートの存在は、例えば、サンプルと、酵素が作用すると色または他の検出可能な変化を生じさせる酵素の基質とを接触させることにより決定される。別の実施形態において、目的とする結合ポリペプチドは、標識されていなくてもよく、目的とする結合ポリペプチドを認識する第２の標識ポリペプチド（例えば、抗体）を加えることができる。
【０１０９】
ある種の態様において、生物学的サンプル中にＣＸＣＲ３タンパク質が存在することを検出する際に使用するためのキットもまた製造することができる。このようなキットは、ＣＸＣＲ３タンパク質または該受容体の部分に結合するＣＸＣＲ３結合ポリペプチド、ならびに結合ポリペプチドと受容体タンパク質またはその部分との間の複合体の存在を検出するのに適切な１つ以上の補助試薬を含む。本発明のポリペプチド組成物は、単独でまたは他のエピトープに特異的なさらなる抗体と組み合わせて、凍結乾燥形態で提供され得る。標識されていてもよくまたは標識されていなくてもよい結合ポリペプチドおよび／または抗体は、補助成分（例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸塩および炭酸塩のような緩衝剤、安定化剤、賦形剤、殺生物剤および／または不活性タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン）と共にキットに含み得る。例えば、結合ポリペプチドおよび／または抗体は、補助成分との凍結乾燥された混合物として提供され、または、補助成分は、使用者が組み合わせるために別々に提供され得る。一般に、これらの補助材料は、活性な結合ポリペプチドまたは抗体の量を基準にして約５重量％未満で存在し、通常、ポリペプチドまたは抗体濃度を基準にして少なくとも約０．００１重量％の総量で存在する。結合ポリペプチドに結合することができる二次抗体を使用する場合、このような抗体は、キット中、例えば、別個のバイアルまたは容器中に提供され得る。二次抗体は、存在する場合、典型的には標識され、上記の抗体製剤に類似した方法で製剤することができる。
【０１１０】
同様に、本開示はまた、ＣＸＣＲ３の発現を検出および／または定量するための方法を提供し、ここで、細胞またはその画分（例えば、膜画分）を含む組成物は、結合するのに適した条件下で、ＣＸＣＲ３または受容体の一部に結合する結合ポリペプチドと接触させ、結合をモニターする。結合ポリペプチドの検出は、結合ポリペプチドとＣＸＣＲ３またはその一部の間の複合体の形成を示し、受容体の存在を示す。ポリペプチドの細胞への結合は、実施例に記載されているものなどの標準的な方法によって決定することができる。この方法は、個体由来の細胞上のＣＸＣＲ３の発現を検出するために使用することができる。場合により、内皮細胞の表面上のＣＸＣＲ３の定量的発現は、例えば、フローサイトメトリーによって評価することができ、染色強度は、疾患の感受性、進行またはリスクと相関させることができる。
【０１１１】
本開示はまた、特定の疾患に対する哺乳動物の感受性を検出する方法を提供する。例示すると、本方法は、哺乳動物の細胞上に存在するＣＸＣＲ３の量および／または哺乳動物におけるＣＸＣＲ３陽性細胞の数に基づいて、進行する疾患に対する哺乳動物の感受性を検出するために使用され得る。
【０１１２】
ポリペプチド配列は、標準の一文字表記または三文字表記を用いて示される。特記しない限り、各ポリペプチド配列は、左にアミノ末端および右にカルボキシ末端を有する；各々の一本鎖核酸配列、および各々の二本鎖核酸配列の上の鎖は、左に５’末端および右に３’末端を有する。また、特定のポリペプチド配列は、それが参照配列とどの程度異なるかを説明するために記載され得る。
【０１１３】
以下の用語は、他に指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
【０１１４】
用語「ＣＸＣＲ３阻害剤」および「ＣＸＣＲ３アンタゴニスト」は、互換的に使用される。各々は、ＣＸＣＲ３の少なくとも１つの機能を検出可能に阻害する分子である。逆に、「ＣＸＣＲ３アゴニスト」は、ＣＸＣＲ３の少なくとも１つの機能を検出可能に増加させる分子である。ＣＸＣＲ３阻害剤によって引き起こされる阻害は、アッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。ＣＸＣＲ３の機能の任意のアッセイを使用することができ、その例が本明細書に提供されている。ＣＸＣＲ３阻害剤によって阻害され得るまたはＣＸＣＲ３アゴニストによって増加され得る、ＣＸＣＲ３の機能の例には、がん細胞増殖またはアポトーシス（プログラム細胞死）などが含まれる。ＣＸＣＲ３阻害剤およびＣＸＣＲ３アゴニストのタイプの例としては、限定されないが、ＣＸＣＲ３結合ポリペプチド、例えば、抗原結合タンパク質（例えば、ＣＸＣＲ３阻害抗原結合タンパク質）、抗体、抗体断片および抗体誘導体が挙げられる。
【０１１５】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」はそれぞれ、ペプチド結合により互いに繋がれている２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を意味する。これらの用語は、例えば、タンパク質配列の天然および人工のタンパク質、タンパク質断片およびポリペプチド類似体（例えば、突然変異体、改変体および融合タンパク質）、ならびに翻訳後修飾、または他には共有結合もしくは非共有結合的に修飾されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体または重合体であってもよい。
【０１１６】
ポリペプチド（例えば、抗体）の「改変体」は、１つ以上のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列に対して、アミノ酸配列に挿入、欠失および／または置換されている、アミノ酸配列を含む。開示される改変体には、例えば、融合タンパク質が含まれる。
【０１１７】
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、別の化学部分（例えば、ポリエチレングリコールまたはアルブミン、例えばヒト血清アルブミン）へのコンジュゲーション、リン酸化およびグリコシル化によって、化学的に修飾されているポリペプチド（例えば、抗体）である。他に特記しない限り、用語「抗体」には、２つの完全長の重鎖および２つの完全長の軽鎖を含む抗体に加えて、それらの誘導体、改変体、断片および変異タンパク質が含まれ、以下に例が記載される。
【０１１８】
「抗原結合タンパク質」は、抗原に結合する部分を含むタンパク質であり、任意に、抗原結合部分が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する構造を取ることを可能にする、骨格またはフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体および抗体類似体が含まれる。抗原結合タンパク質は、例えば、ＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体が移植された、代替のタンパク質骨格または人工骨格を含んでいてもよい。このような骨格には、限定されないが、例えば、抗原結合タンパク質の３次元構造を安定化させるために導入される、突然変異を含む抗体由来の骨格、ならびに、例えば、生体適合性ポリマーを含む全合成骨格が含まれる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら、２００３年、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ５３、Ｉｓｓｕｅ  １：１２１−１２９頁；Ｒｏｑｕｅら、２００４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０巻：６３９−６５４頁を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、ならびにフィブロネクチン成分を骨格として利用する抗体模倣物に基づく骨格を、使用することができる。
【０１１９】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有してもよい。「免疫グロブリン」は四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、各々の四量体は、２つの同一なポリペプチド鎖対で構成され、それぞれの対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０から７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に最初に関与する約１００から１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に最初に関与する定常領域を画定する。ヒトの軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義する。好ましくは、本明細書に記載される抗ＣＸＣＲ３抗体は、重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＬのアミノ酸配列中の可変ドメイン領域配列により特徴付けられる。好ましい抗体は、カッパＩｇＧ抗体であるＡ６である。軽鎖および重鎖内において、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合し、重鎖はまた約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．、編集、２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。各々の軽鎖／重鎖の対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【０１２０】
「多重特異的抗体」は、１つ以上の抗原上の１を超えるエピトープを認識する抗体である。このタイプの抗体のサブクラスは、同一でありまたは異なる抗原上の２つの異なるエピトープを認識する「二重特異的抗体」である。
【０１２１】
抗原結合タンパク質は、１ナノモル以下の解離定数で抗原に結合する場合、抗原（例えば、ヒトＣＸＣＲ３）に特異的に結合する」。
【０１２２】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」または「抗原結合部位」は、抗原と相互作用し、抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性に貢献するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する抗原結合タンパク質の部分である。その抗原に特異的に結合する抗体に関して、これは、そのＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部を含む。
【０１２３】
「エピトープ」は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）によって結合される分子の部分である。エピトープは、分子の非連続な部分（例えば、ポリペプチド中、ポリペプチドの一次配列では連続していないが、ポリペプチド三次および四次構造において、抗原結合タンパク質によって互いに結合されるのに十分近い、アミノ酸残基）を含み得る。
【０１２４】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「相同性パーセント」は、デフォルトパラメーターを用いるＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３の一部  （Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して配列を比較することにより決定される。
【０１２５】
「宿主細胞」は、核酸を発現するために用いることができる細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、Ｅ．コリであってもよく、または真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコもしくはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞もしくは昆虫細胞）またはハイブリドーマであってもよい。宿主細胞の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１年、Ｃｅｌｌ  ２３巻：１７５頁）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯおよび血清不含有培地中で増殖させた関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、１９９８年、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８巻：３１頁）のようなそれらの誘導株、またはＤＨＦＲを欠損しているＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７巻：４２１６−２０頁）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）（ＭｃＭａｈａｎら、１９９１年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０巻：２８２１頁）、２９３、２９３  ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３のようなヒト胎児性腎臓細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長動物細胞株、正常な二倍体細胞、インビトロでの一次組織培養物に由来する細胞株、初代移植細胞、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。典型的に、宿主細胞は、宿主細胞中で発現され得るポリペプチドをコードする核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされ得る培養細胞である。語句「組換え宿主細胞」は、発現されるべき核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされている宿主細胞を示すために用いることができる。宿主細胞はまた、核酸を含むが、核酸と作動可能に連結されるように、調節配列が宿主細胞内に導入されない限り、所望のレベルでそれを発現しない細胞であり得る。上記用語「宿主細胞」は、特定の対象細胞のみに言及するのではなく、このような細胞の後代系統または可能性のある後代系統にも言及することが理解される。ある種の修飾がその後代において、例えば、突然変異または環境の影響により起こり得るため、このような後代系統は、実際、親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で用いる用語の範囲内になおも含まれる。
【０１２６】
抗原結合タンパク質
抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体突然変異タンパク質、および抗体改変体）は、ＣＸＣＲ３（好ましくはヒトＣＸＣＲ３）に結合するポリペプチドである。抗原結合タンパク質には、ＣＸＣＲ３の生物学的活性を阻害する抗原結合タンパク質が含まれる。
【０１２７】
１つ以上の抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーは、ＣＸＣＲ３アンタゴニストとして用いられてもよい。オリゴマーは、共有的に結合したもしくは非共有的に結合した、二量体、三量体またはそれ以上のオリゴマーの形態であってもよい。２つ以上の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーは、用途が企図され、一例としては、ホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが含まれる。
【０１２８】
一実施形態は、抗原結合タンパク質に融合されたペプチド部分間の共有的または非共有的相互作用を介して繋がれている複数の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーを対象とする。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。ロイシンジッパー、および抗体に由来するある種のポリペプチドは、以下により詳細に記載される通り、それに結合された抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促進し得るペプチドに含まれる。
【０１２９】
特定の実施形態において、オリゴマーは、２から４個の抗原結合タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合タンパク質は、上記の形態のうちの任意のもの、例えば、改変体または断片であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、ＣＸＣＲ３結合活性を有する抗原結合タンパク質を含む。
【０１３０】
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製される。抗体由来のポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを含む。）に融合された、ある種の非相同性ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８巻：１０５３５頁；Ｂｙｒｎら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４巻：６７７頁；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、１９９２年「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌ．４、１０．１９．１−１０．１９．１１頁に記載されている。
【０１３１】
一実施形態は、抗ＣＸＣＲ３抗体のＣＸＣＲ３結合断片を抗体のＦｃ領域に融合させることによって作製された、２つの融合タンパク質を含む二量体を対象とする。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞において遺伝子融合体を発現させ、発現した融合タンパク質を抗体分子に酷似するように構築することによって作製することができ、その後、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成されて、二量体が得られる。
【０１３２】
用語「Ｆｃポリペプチド」には、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドの天然および突然変異形態が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断形態もまた含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそこから形成されたオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上の親和性クロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。
【０１３３】
オリゴマー抗原結合タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々は、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定されたものであり（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０巻：１７５９頁）、それ以来、種々の異なるタンパク質で見出されている。公知のロイシンジッパーには、天然に存在するペプチドおよび二量体化または三量体化するこれらの誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質の生成に適したロイシンジッパードメインの例は、国際公開第ＷＯ９４／１０３０８号に記載され、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅら、１９９４年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４巻：１９１頁に記載されている。それに融合された非相同性タンパク質の安定な三量体化を可能にする、修飾されたロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら、１９９４年、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６巻：２６７−７８頁に記載されている。１つのアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドに融合された、抗ＣＸＣＲ３抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞において発現され、形成される可溶性オリゴマー抗ＣＸＣＲ３抗体断片または誘導体が、培養上清から回収される。
【０１３４】
本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合断片は、従来技術により生成することができる。このような断片の例には、限定されないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。
【０１３５】
本開示は、ＣＸＣＲ３に結合するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて、例えば、免疫化スケジュール終了後のトランスジェニック動物から回収した脾臓細胞を不死化することにより生成することができる。脾臓細胞は、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成することにより不死化することができる。ハイブリドーマ生成融合手法において使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体産生であり、高融合効率であり、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）だけの増殖を支持するある種の選択的培地中での増殖を不可能とさせる酵素欠乏を有する。マウス融合物において使用するための適切な細胞株の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌが含まれ；ラット融合物において使用するための細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３；Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４８２１０が含まれる。細胞融合物に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【０１３６】
ＣＸＣＲ３に対する抗原結合タンパク質は、例えば、インビトロまたはインビボのいずれかでＣＸＣＲ３ポリペプチドの存在を検出するためのアッセイにおいて使用することができる。また、抗原結合タンパク質は、免疫親和性クロマトグラフィーによるＣＸＣＲ３タンパク質の精製において使用されてもよい。遮断抗原結合タンパク質は、本明細書に開示される方法において使用され得る。ＣＸＣＲ３アンタゴニストとして機能するこのような抗原結合タンパク質は、限定されないが、種々のがんを含む任意のＣＸＣＲ３誘導状態の治療に使用することができる。
【０１３７】
抗原結合タンパク質は、ＣＸＣＲ３誘導による生物学的活性を阻害するために、インビトロ手法において使用され、またはインビボにおいて投与されてもよい。例を本明細書に記載するＣＸＣＲ３のタンパク分解性活性化が（直接的または間接的）に原因となるまたはそれが増悪させる障害は、それゆえに治療され得る。一実施形態において、本発明は、ＣＸＣＲ３誘導による生物学的活性の減少に有効な量でＣＸＣＲ３遮断抗原結合タンパク質を、それを必要とする哺乳動物にインビボで投与することを含む治療法を提供する。
【０１３８】
抗原結合タンパク質は、ＣＸＣＲ３の生物学的活性を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体を含む。
【０１３９】
抗原結合タンパク質は、多数の従来技術のいずれかにより生成され得る。例えば、それらを天然に発現する細胞から精製することができ（例えば、抗体を、それを産生するハイブリドーマから精製することができる。）、または組換え発現系において、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて生成することができる。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｋｅｎｎｅｔら（編集）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０年）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（編集）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８年）を参照されたい。
【０１４０】
当該技術分野において公知である任意の発現系を用いて、本発明の組換えポリペプチドを作製することができる。一般に、宿主細胞は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。用いることができる宿主細胞の中には、原核生物、酵母または高等真核細胞が含まれる。原核生物は、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．コリまたはバチリ（ｂａｃｉｌｌｉ）を含む。高等真核細胞は、昆虫細胞および哺乳動物起源の確立された細胞株を含む。適切な哺乳動物の宿主細胞株の例としては、サル腎細胞のＣＯＳ−７系統（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１年、Ｃｅｌｌ  ２３巻：１７５頁）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株およびＭｃＭａｈａｎら、１９９１年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０巻：２８２１頁に記載されるアフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）が含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主とともに使用するのに適したクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８５年）に記載されている。
【０１４１】
形質転換細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養され、ポリペプチドを慣用のタンパク質精製手法により回収することができる。このような精製手法の１つは、例えば、それに結合したＣＸＣＲ３の全てまたは一部（例えば、細胞外ドメイン）を含むマトリックス上の親和性クロマトグラフィーの使用を含む。本明細書において使用が意図されるポリペプチドは、実質的に内在物質の汚染がない、実質的に均一な組換え哺乳動物の抗ＣＸＣＲ３抗体ポリペプチドを含む。
【０１４２】
抗原結合タンパク質は、多数の公知技術のいずれかにより生成され、所望の特性についてスクリーニングすることができる。これらの技術のいくつかは、対象とする抗原結合タンパク質（例えば、抗ＣＸＣＲ３抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部）をコードする核酸を単離し、組換えＤＮＡ技術を介して核酸を操作することを伴う。核酸を、対象とする別の核酸と融合させ、または、例えば１つ以上のアミノ酸残基を付加、欠失または置換するように（例えば、突然変異誘発または他の従来技術により）改変してもよい。
【０１４３】
一本鎖抗体は、一本のポリペプチド鎖を得るように、アミノ酸架橋（短いペプチドリンカー）を介して、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片の結合により形成することができる。このような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することにより生成されている。得られたポリペプチドは、２つの可変ドメインの間の可動性リンカーの長さに応じて、折り畳まれて抗原結合モノマーを形成することができ、または多量体（例えば、二量体、三量体もしくは四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔら、１９９７年、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０巻：４２３頁；Ｋｏｒｔｔら、２００１年、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８巻：９５−１０８頁）。異なるＶＬおよびＶＨ含有ポリペプチドを合わせることにより、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら、２００１年、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８巻：３１−４０頁）。一本鎖抗体の生成のために開発された技術は、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３頁；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５巻：５８７９頁；Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４巻：５４４頁、ｄｅ  Ｇｒａａｆら、２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８巻：３７９−８７頁に記載のものを含む。
【０１４４】
目的とする抗体から異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を導く技術、すなわち、サブクラススイッチングが知られている。したがって、例えば、ＩｇＧ抗体をＩｇＭ抗体から誘導することができ、その逆も可能である。このような技術は、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体と異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物学的特性も示す新しい抗体の生成を可能にする。組換えＤＮＡ技術を用いることができる。クローニングされた、特定の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば、所望の抗体アイソタイプの定常ドメインをコードするＤＮＡを、このような手法において用いることができる（Ｌａｎｔｔｏら、２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８巻：３０３−１６頁）。さらに、ＩｇＧ４が望ましい場合、ＩｇＧ４抗体を不均一にし得るＨ鎖内のジスルフィド結合を形成する傾向を軽減するために、ヒンジ領域（Ｂｌｏｏｍら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６巻：４０７頁）に点突然変異（ＣＰＳＣＰ−＞ＣＰＰＣＰ）を導入することが望ましい場合もある。
【０１４５】
特定の実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、ＣＸＣＲ３に対して少なくとも１０６の結合親和性（Ｋａ）を有する。他の実施形態において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または少なくとも１０１０のＫａを示す。別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書の実施例に記載される抗体と実質的に同じＫａを示す。
【０１４６】
別の実施形態おいて、本開示は、ＣＸＣＲ３からの低解離速度を有する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、１×１０−４から１０−１以下のＫｏｆｆを有する。別の実施形態において、Ｋｏｆｆは５×１０−５から１０−１以下である。別の実施形態において、Ｋｏｆｆは、本明細書に記載される抗体と実質的に同じである。別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＣＸＣＲ３に、本明細書に記載される抗体と実質的に同じＫｏｆｆで結合する。
【０１４７】
別の態様において、本開示は、ＣＸＣＲ３の活性を阻害する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。別の実施形態において、ＩＣ５０は１００ｎＭ以下であり；別の実施形態において、ＩＣ５０は１０ｎＭ以下である。別の実施形態において、ＩＣ５０は、本明細書の実施例に記載される抗体と実質的に同じである。別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載される抗体と実質的に同じＩＣ５０でＣＸＣＲ３の活性を阻害する。
【０１４８】
別の態様において、本開示は、細胞表面上に発現されるヒトＣＸＣＲ３と結合し、このように結合したとき、細胞表面上のＣＸＣＲ３の量を有意に減少させることなく、細胞におけるＣＸＣＲ３シグナル伝達活性を阻害する、抗原結合タンパク質を提供する。細胞表面上および／または細胞内部のＣＸＣＲ３の量を決定または推定するための任意の方法を用いることができる。他の実施形態において、抗原結合タンパク質のＣＸＣＲ３発現細胞への結合は、細胞表面ＣＸＣＲ３の内在化を約７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、１％または０．１％未満にさせる。
【０１４９】
別の態様において、本開示は、インビトロまたはインビボで（例えば、ヒト対象に投与する場合）少なくとも１日の半減期を有する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、４日以上の半減期を有する。別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、８日以上の半減期を有する。別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、非誘導体化または非修飾の抗原結合タンパク質と比較して半減期が長くなるように、誘導体化または修飾される。別の実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書において参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ００／０９５６０号に記載されるように、血清半減期を延長させる、１つ以上の点突然変異を含有する。
【０１５０】
本開示は、さらに、多重特異的抗原結合タンパク質、例えば、二重特異的抗原結合タンパク質、例えば、２つの異なる抗原結合部位または領域を介して、２つの異なるＣＸＣＲ３のエピトープ、またはＣＸＣＲ３のエピトープと別の分子のエピトープに結合する抗原結合タンパク質を提供する。さらに、本明細書に開示される二重特異的抗原結合タンパク質は、本明細書に記載される抗体のうちの１つのものに由来するＣＸＣＲ３結合部位、および他の刊行物を参照することにより本明細書に記載されるものを含む、本明細書に記載される抗体のうちの別のものに由来のする第二のＣＸＣＲ３結合領域を含むことができる。代わりに、二重特異的抗原結合タンパク質は、本明細書に記載される抗体のうちの１つのものに由来する抗原結合部位、および当該技術分野において公知である別のＣＸＣＲ３抗体に由来する、または公知の方法もしくは本明細書に記載される方法により生成される抗体に由来する第二の抗原結合部位を含んでいてもよい。
【０１５１】
二重特異的抗体を調製するための多数の方法が当該技術分野において知られている。このような方法は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５巻：５３７頁に記載されるハイブリッド−ハイブリドーマ、および抗体断片の化学的カップリング（Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻：８１頁；Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９巻：２３６７頁；米国特許第６，０１０，９０２号）の使用を含む。さらに、二重特異的抗体は、組換え手段により、例えば、ロイシンジッパー部分（すなわち、優勢にヘテロ二量体を形成するＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８巻：１５４７頁）または米国特許第５，５８２，９９６号に記載される他の鍵孔と鍵の相互作用的ドメイン構造の使用により生成され得る。さらに有用な技術は、米国特許第５，９５９，０８３号および第５，８０７，７０６号に記載されるものを含む。
【０１５２】
別の態様において、抗原結合タンパク質は、抗体の誘導体を含む。誘導体化された抗体は、特定の使用における半減期の増加のような所望の特性を抗体に与える任意の分子または物質を含み得る。誘導体化された抗体は、例えば、検出可能（または標識）部分（例えば、放射性、比色、抗原性または酵素分子、検出可能ビーズ（例えば、磁気または電極（例えば、金ビーズ）、または別の分子と結合する分子（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）、治療的もしくは診断的な部分（例えば、放射性、細胞毒性または医薬として活性な部分）、または特定の使用（例えば、対象、例えばヒト対象への投与または他のインビボまたはインビトロ使用）のための抗体の適性を増加させる分子を含み得る。抗体を誘導体化させるために使用することができる分子の例としては、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。抗体のアルブミン結合およびペグ化誘導体は、当該技術分野において周知の技術を用いて生成され得る。一実施形態において、抗体は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ改変体にコンジュゲートされ、または他には結合させる。ＴＴＲまたはＴＴＲ改変体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される化学物質で化学修飾され得る。
【０１５３】
９５％相同性
本開示は、可変ドメイン領域のアミノ酸配列によって構造的に特徴付けられる多数の抗体を提供する。しかしながら、アミノ酸配列は、それらの特定の標的へのそれらの高度の結合を保持しながらいくらかの変化を受けることができる。より具体的には、可変ドメイン領域の多数のアミノ酸は保存的置換で変化させることができ、得られた抗体の結合特性が、野生型抗体配列の結合特性と相違しないことが予測できる。抗体可変ドメインには、抗原と直接的に相互作用せず、および抗原結合に影響を及ぼさず、抗体構造を決定するために重要ではない多数のアミノ酸がある。例えば、開示された抗体のいずれかにおける予測された非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラス由来の別のアミノ酸残基で置換される。抗原結合を排除しないアミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７頁（１９９３年）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４頁（１９９９年）；Ｂｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４１２−４１７頁（１９９７年）を参照されたい）。Ｎｅａｒら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３６９−３７７頁、１９９３年は、部位特異的突然変異誘発による結合にどのように影響を及ぼすかまたは影響を及ぼさないかを説明している。Ｎｅａｒらは、抗原結合を変化させる可能性が高いと考えた残基だけを突然変異させた。大部分は、結合親和性（Ｎｅａｒら、表３）および種々の形態のジゴキシンへの結合（Ｎｅａｒら、表２）への適度または負の効果を有した。
【０１５４】
適応症
一態様において、本開示は、対象を治療する方法を提供する。この方法は、例えば、対象に一般的に有益な影響を及ぼすことができ、例えば、対象の予想される寿命を延ばすことができる。あるいは、該方法は、例えば、疾患、障害、状態、または病気（「状態」）を治療、予防、治癒、緩和、または改善（「治療」）することができる。治療されるべき状態の中には、ＣＸＣＲ３の不適切な発現または活性によって特徴付けられる状態がある。このようないくつかの状態において、発現または活性レベルが高すぎであり、治療は本明細書に記載されるＣＸＣＲ３アンタゴニストを投与することを含む。障害または状態はがん関連である。特に、これらのがんとしては、限定されないが、乳癌、肺癌、卵巣癌および結腸癌腫、ならびに種々の骨髄腫が挙げられる。
【０１５５】
この開示の抗原結合タンパク質で治療可能または予防可能な特定の医学的状態および疾患には、様々ながんが含まれる。
【０１５６】
治療方法および抗原結合タンパク質の投与
本明細書において提供される特定の方法は、ＣＸＣＲ３結合抗原結合タンパク質を対象に投与することにより、特定の状態で役割を果たすＣＸＣＲ３誘導性の生物学的応答を低下させることを含む。特定の実施形態において、本発明の方法は、内因性ＣＸＣＲ３をＣＸＣＲ３結合抗原結合タンパク質と、例えば、対象への投与またはエクスビボ手法において、接触させることを含む。
【０１５７】
用語「治療」は、障害の少なくとも１つの症状もしくは他の態様の緩和または予防、もしくは疾患重症度の低下などを包含する。抗原結合タンパク質は、実施可能な治療剤を構成するために、完全な治癒に影響を及ぼす必要はなく、疾患の症状または兆候を根絶させる必要はない。関連分野において認識されているように、治療剤として使用される薬物は、所与の疾患状態の重症度を低下させることができるが、有用な治療剤とみなされるべき疾患のあらゆる兆候を消失する必要はない。同様に、予防的に投与される治療は、実施可能な予防剤を構成するために、状態の発症を予防するのに完全に有効である必要はない。同様に、（例えば、症状の数もしくは重症度を減らすことによって、または別の治療の有効性を高めることによって、または別の有益な効果を生じさせることによって）疾患の影響を軽減させること、または対象において疾患が起こるもしくは悪化する可能性を低減させることが十分である。本発明の一実施形態は、特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを超えた、持続的な改善を誘導するのに十分な量および時間で患者にＣＸＣＲ３アンタゴニストを投与することを含む方法に関する。
【０１５８】
関連する分野において理解されているように、本開示の抗体およびその断片を含む医薬組成物は、適応症に適切な方法で対象に投与される。医薬組成物は、限定されないが、非経口的、局所的または吸入によるなどの任意の適切な技術によって投与することができる。注入される場合、医薬組成物は、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介して、ボーラス注射により、または連続注入により投与することができる。経皮送達およびインプラントからの徐放と同様に、例えば、疾患または傷害の部位での局所投与が考慮される。吸入による送達には、例えば、鼻または経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態の拮抗薬の吸入などが含まれる。他の選択肢としては、点眼薬；丸薬、シロップ、ロゼンジまたはチューインガムを含む経口製剤；ローション、ジェル、スプレー、および軟膏などの局所用製剤が挙げられる。
【０１５９】
エクスビボ手法における抗原結合タンパク質の使用もまた意図される。例えば、患者の血液または他の体液は、エクスビボでＣＸＣＲ３に結合する抗原結合タンパク質と接触させることができる。抗原結合タンパク質は、適切な不溶性マトリックスまたは固体支持材料に結合され得る。
【０１６０】
有利には、抗原結合タンパク質は、生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤などの１つ以上の追加成分を含む組成物の形態で投与される。任意に、組成物は、１つ以上の生理活性剤、例えば、非排他的な例が本明細書に提供される、第２の炎症抑制物質または免疫抑制物質、抗血管新生物質、鎮痛物質などをさらに含む。様々な特定の実施形態において、組成物は、ＣＸＣＲ３結合抗原結合タンパク質に加えて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの生理活性物質を含む。
【０１６１】
併用療法
別の態様において、本開示は、ＣＸＣＲ３阻害抗原結合タンパク質および１つ以上の他の治療薬を用いて対象を治療するための方法を提供する。一実施形態において、このような併用療法は、例えば、腫瘍中の複数の部位または分子標的を攻撃することによって、相乗効果または相加効果を達成する。本発明と関連して使用することができる併用療法の種類には、単一疾患関連経路の複数の節、標的細胞の複数の経路、および標的組織内の複数の細胞型を（必要に応じて）阻害または活性化することが含まれる。
【０１６２】
別の実施形態において、併用療法は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを超える、本明細書に記載されるＣＸＣＲ３アゴニストまたはアンタゴニストを対象に投与することを含む。別の実施形態において、この方法は、ＣＸＣＲ３媒介性シグナル伝達を（直接的または間接的に）ともに阻害または活性化する２つ以上の治療を対象に投与することを含む。このような方法の例には、２つ以上のＣＸＣＲ３阻害抗原結合タンパク質の組み合わせ、ＣＸＣＲ３阻害抗原結合タンパク質と、抗がん特性を有する１つ以上の他の治療部分（例えば、細胞傷害剤および／または免疫調節物質）の組み合わせ、または抗原結合タンパク質を阻害するＣＸＣＲ３と１つ以上の他の治療（例えば、外科手術または放射線）の組み合わせを用いることが含まれる。さらに、１つ以上の抗ＣＸＣＲ３抗体または抗体誘導体は、１つ以上の分子または他の治療と組み合わせて使用することができ、ここで、他の分子（単数もしくは複数）および／または治療（単数もしくは複数）は、ＣＸＣＲ３に直接結合せずおよびＣＸＣＲ３に影響を及ぼさないが、この組み合わせは、治療される状態の治療または予防に有効である。一実施形態において、１つ以上の分子（単数もしくは複数）および／または治療（単数もしくは複数）は、治療中に１つ以上の他の分子（単数もしくは複数）または治療（単数もしくは複数）によって引き起こされる状態、例えば、吐き気、疲労、脱毛症、悪液質、不眠症などを治療または予防する。分子および／または他の治療の組み合わせが使用されるあらゆる場合において、個々の分子（単数もしくは複数）および／または治療（単数もしくは複数）は、例えば、同時に、連続して、または交互に、効果的である任意の順序で、任意の時間長で投与することができる。一実施形態において、治療方法は、第２の治療過程を開始する前に、１つの分子による治療または他の治療の第１の過程を完了することを含む。治療の第１の過程の終了と治療の第２の過程の開始の間の時間長は、治療の全過程が効果的である任意の時間長であり得、例えば、秒、分、時間、日、月、週またはさらには年が含まれる。
【０１６３】
別の実施形態において、本方法は、本明細書に記載されている１つ以上のＣＸＣＲ３アンタゴニスト、および１つ以上の他の治療（例えば、療法または緩和治療）を投与することを含む。方法が１を超える治療を対象に投与することを含む場合、投与の順序、タイミング、数、濃度および容量は、治療の医学的要件および限界によってのみ制限され、すなわち、２つの治療が、対象に、例えば同時に、連続して、交互に、または任意の他の処方計画に従って投与され得ることは理解すべきである。
【実施例】
【０１６４】
［実施例１］
この実施例は、安定な細胞株上に発現したＣＸＣＲ３への抗ＣＸＣＲ３抗体の特異的結合を決定するための細胞結合アッセイを示す。ＣＨＯ−ＣＸＣＲ３細胞は、非酵素的細胞解離緩衝液−ＰＢＳベース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１３１５１−０１４）を用いて培養フラスコから取り出された。細胞を１×１０６細胞／ｍｌでＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清）に再懸濁させ、５０μｌ（０．５×１０５細胞）を９６ウェルプレートのウェルに分注した。同時に、無関係なタンパク質を発現するＣＨＯ細胞を同様に処理した。２つの異なる最終濃度、多くの場合、５および１０μｇ／ｍｌを与える抗体のアリコートを細胞に添加し、１時間、４℃でインキュベートし、次に、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で１：５００に希釈された、５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＰＥコンジュゲートした二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃２０４０−０９）に再懸濁された。細胞をさらに３０分間、４℃でインキュベートし、次に、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を最終容量３０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーターを用いて分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、ＦＬ−２Ｈチャネルにおける蛍光の中央値を測定した。各抗体のＣＨＯ−ＣＸＣＲ３細胞株への結合を、対照ＣＨＯ細胞株への結合と比較した。ＣＨＯ−ＣＸＣＲ３細胞に対する特異的結合を示した抗体のリストを表１に示す。
【０１６５】
【表１】
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【０１６６】
［実施例２」
この実施例は、ヒトＣＸＣＲ３に結合する抗ＣＸＣＲ３抗体のＥＣ５０を決定するための細胞結合アッセイを示す。この実施例は、最大細胞結合および５０％結合飽和が達せられる濃度（ＥＣ５０）に関して、これらの抗体の結合特性を示す。この実施例において、ＣＨＯ−ＣＸＣＲ３細胞は、非酵素的細胞解離緩衝液−ＰＢＳベース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１３１５１−０１４）を用いて培養フラスコから取り出された。細胞を１×１０６細胞／ｍｌでＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清）に再懸濁させ、５０μｌ（０．５×１０５細胞）を９６ウェルプレートのウェルに分注した。播種された細胞をスピンダウンし、上清を捨てた。細胞は、連続希釈された濃度の抗体を含有する３０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に三連で再懸濁された。プレートを１時間、４℃でインキュベートし、次に、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で１：５００に希釈された、５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＰＥコンジュゲートした二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃２０４０−０９）に再懸濁された。細胞をさらに３０分間、４℃でインキュベートし、次に、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を最終容量３０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーターを用いて分析した。ＦＬ−２Ｈチャネルにおける蛍光の中央値は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて測定され、ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムにデータをプロットし、可変スロープ非線形回帰を用いて分析することにより決定された。結果を表２に示す。
【０１６７】
【表２】
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【０１６８】
［実施例３］
この実施例は、マウスＣＸＣＲ３に結合する抗ＣＸＣＲ３抗体のＥＣ５０を決定するための細胞結合アッセイを示す。この実施例は、最大細胞結合および５０％結合飽和が達せられる濃度（ＥＣ５０）に関して、これらの抗体の結合特性を示す。この実施例において、マウスＢ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ、＃ＣＲＬ−６４７５）は、非酵素的細胞解離緩衝液−ＰＢＳベース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１３１５１−０１４）を用いて培養フラスコから取り出された。細胞を回収し、洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌでＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清）に再懸濁させ、５０μｌ（０．５×１０５細胞）を９６ウェルプレートのウェルに分注した。播種された細胞をスピンダウンし、上清を捨てた。細胞は、連続希釈された濃度の抗体を含有する３０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に三連で再懸濁された。プレートを１時間、４℃でインキュベートし、次に、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液で１：５００に希釈された、５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＰＥコンジュゲートした二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃２０４０−０９）に再懸濁された。細胞をさらに３０分間、４℃でインキュベートし、次に、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を最終容量３０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーターを用いて分析した。ＦＬ−２Ｈチャネルにおける蛍光の中央値は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて測定され、ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムにデータをプロットし、可変スロープ非線形回帰を用いて分析することにより決定された。結果を表３に示す。
【０１６９】
【表３】
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【０１７０】
［実施例４］
この実施例において、ＣＨＯ−ＣＸＣＲ３細胞は、非酵素的細胞解離緩衝液−ＰＢＳベース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１３１５１−０１４）を用いて培養フラスコから取り出された。細胞を１×１０６細胞／ｍｌで、アジ化ナトリウムを含むＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清）に再懸濁させ、８００μｌを各抗体についてチューブに分注した。抗体を最終濃度が５μｇ／ｍｌになるように添加し、室温で１時間インキュベートした。試料を氷上に置き、様々な時点での１０５μｌのアリコートを９６ウェルプレート中の１９０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に添加し、３分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を１０５μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を含有する別の９６ウェルプレートに二連で分注し（５０μｌ）、室温でインキュベートした。すべての時間点を回収した後、プレートを３分間遠心分離し、上清を捨て、細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：５００に希釈された、５０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）−ＰＥコンジュゲートした二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＃２０４０−０９）に再懸濁された。細胞を３０分間、４℃でインキュベートし、次に、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を最終容量３０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔフローサイトメーターを用いて分析した。経時的なクローン３２Ｂ１２の結合を図１に示す。
【０１７１】
［実施例５］
この実施例は、抗体ＣＸＣＲ３抗体を用いたカルシウムアッセイを示す。ＣＨＯ−ＣＸＣＲ３細胞（ヒトＣＸＣＲ３遺伝子でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞）をカルシウムアッセイに使用した。０．１×１０５細胞は、３８４ウェルプレート（＃７８１０９１、Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルあたり２０μｌの増殖培地に播種され、２０時間インキュベートされた。増殖培地は、Ｆ−１２Ｋ（＃２１１２７、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１０％ＦＢＳである。５μｌの連続希釈された抗体を２０μｌの細胞に添加し、２０分間、室温でインキュベートした。次に、０．５ｍＭプロベネシド（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ８７６１−２５Ｇ）を含む、２５μｌのカルシウム４アッセイキット試薬（Ｒ８１４２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）は、抗体とともにプレインキュベートされた２５μｌの細胞に添加された。３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートし、続いて、１５分間、室温でインキュベートした後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３上での検出中に、１２．５μｌの５×投薬量のリガンドをチャレンジアゴニストとしてプレートの各ウェルに添加した。アッセイに用いられた各リガンドの最終濃度は、２００ｎＭのＣＸＣＬ９（＃３００−２６、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１６４ｎＭのＣＸＣＬ１０（＃３００−１２、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および６０ｎＭのＣＸＣＬ１１（＃３００−４６、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）であった。表に示された各抗体のＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ５を使用して算出された。各々に対応するリガンドとの各抗体のＩＣ５０を表４に示す。各ＩＣ５０値は平均（ｎ＝２）を表す。対照抗体は、Ｒ＆Ｄのもの（カタログ番号ＭＡＢ  １６０、Ｒ＆Ｄ）である。
【０１７２】
【表４】
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【０１７３】
［実施例６］
この実施例は、活性化されたヒトＴ細胞を用いた走化性アッセイを記載する。抗ＣＤ３（１ｎｇ／ｍｌ）により２日間活性化された初代ヒトＴ細胞を調製のために用いた。化学走性アッセイは、５μｍのポリカーボネート膜で隔てられた２つの区画を有する９６ウェル走化性チャンバー（ＣｈｅｍｏＴＸ；ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて設定された。走化性のために使用されるアッセイ緩衝液は、ＲＰＭＩ＋０．５％ＢＳＡであった。連続希釈された濃度の抗体は、活性化されたＴ細胞（２５μｌのアッセイ緩衝液中の０．１×１０６細胞）とともに室温で２０分間プレインキュベートされた。リガンドであるＣＸＣＬ９（３０ｎＭ）、ＣＸＣＬ１Ｏ（１２．５ｎＭ）およびＣＸＣＬ１１（０．３ｎＭ））をそれぞれ下部チャンバー内のプレートのウェルにロードし、一方、抗体とともにプレインキュベートされた細胞を膜の上部にロードした。３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、下部チャンバー内に移動した細胞は、不透明白色９６ウェルプレートに移され、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ＧＬＯ（カタログ番号Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに１０分間、室温でインキュベートされた。各ウェルの細胞から発生した発光シグナルを蛍光プレートリーダー（ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって検出した。表に示された各ｍＡｂのＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ５によって算出された。対応するリガンドに対する各ｍＡｂのＩＣ５０を表５に示す。各ＩＣ５０値は平均（ｎ＝２）を表す。対照抗体は、Ｒ＆Ｄのもの（カタログ番号ＭＡＢ  １６０、Ｒ＆Ｄ）である。
【０１７４】
【表５】
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【０１７５】
【表６】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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