(57)【要約】本明細書において、幹細胞および/または前駆細胞の集団から赤血球(RBC)を産生するための方法が開示される。該幹細胞または該前駆細胞の少なくとも1個において、SH2B3タンパク質活性が低下し、SH2B3 mRNAレベルが低下し、かつ/またはSH2B3タンパク質レベルが低下する。本明細書において提供される方法は、SH2B3阻害もSH2B3破壊も有さない幹細胞および/または前駆細胞の同じ集団を用いる方法と比較して、向上した量および/または質を有するRBCの産生を可能にする。また、本明細書に記載の方法を用いて産生された該RBCの使用方法もまた本明細書において提供される。2017536826.tif 000025
2017536826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(iv) 幹細胞および/または前駆細胞の集団においてSH2B3を阻害する段階；
(v) 該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、赤血球(RBC)への少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階；ならびに
(vi) RBCの集団を回収する段階
を含む、該幹細胞および/または前駆細胞の集団からRBCをエクスビボで産生する方法。
【請求項２】
前記阻害する段階が、SH2B3タンパク質レベル、SH2B3 mRNAレベル、SH2B3タンパク質活性、またはそれらの組み合わせを低下させる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害する段階が、前記幹細胞および/または前駆細胞の集団を、SH2B3遺伝子についての幹細胞または前駆細胞からの標的切除のためのゲノム編集物質と接触させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノム編集物質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/CRISPR関連(CRISPR associated)(Cas)システム、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノム編集物質がベクター内に存在する、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害する段階が、前記幹細胞および/または前駆細胞の集団をSH2B3のアンタゴニストと接触させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項７】
前記SH2B3のアンタゴニストが、無機分子、有機分子、核酸、核酸類似体または核酸誘導体、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、抗体またはその抗原結合断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記SH2B3のアンタゴニストが、SH2B3タンパク質のSH2ドメイン、PHドメイン、またはSH2ドメインとPHドメインとの両方に特異的に結合する、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
前記SH2B3のアンタゴニストが、SH2B3の発現を阻害するRNAi物質である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記RNAi物質が、SH2B3 mRNAにハイブリダイズするmiRNA、siRNA、shRNA、dsRNAである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞および/または前駆細胞の集団が、造血幹細胞、造血前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)、胚性幹細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記幹細胞および/または前駆細胞の集団由来のRBCの増大を高める、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
RBCの質を向上させる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞および/または前駆細胞の集団が哺乳動物起源のものである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞および/または前駆細胞の集団がヒト起源のものである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記RBCが白血球濾過またはフローサイトメトリー選別によって単離される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞および/または前駆細胞の集団がドナー対象から得られる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞および/または前駆細胞の集団が、前記ドナー対象の末梢血単核細胞、臍帯血、骨髄、臍帯組織、またはG-CSF動員末梢血に由来する、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
それを必要とする対象にRBCの集団を投与する段階をさらに含み、
該RBCが、ドナー対象から得られた幹細胞および/または前駆細胞の集団から産生される、
請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞の集団がiPSCである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法に従って産生されたRBCの集団。
【請求項２２】
RBCの集団と幹細胞および/または前駆細胞の集団とを含む混合物であって、該RBCが、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法に従って産生されている、混合物。
【請求項２３】
請求項21に記載のRBCの集団を含む血液バンク。
【請求項２４】
RBCの複数の集団が低温貯蔵のために調製されている、請求項23に記載の血液バンク。
【請求項２５】
幹細胞および/または前駆細胞の集団と、少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞から分化した少なくとも1個のRBCと、SH2B3のアンタゴニストとを含む、細胞培養培地。
【請求項２６】
(iii) 幹細胞および/または前駆細胞の集団をSH2B3のアンタゴニストと接触させ、かつ、該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、赤血球(RBC)への少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階であって、該SH2B3のアンタゴニストが、SH2B3タンパク質の活性を低下させるか、またはSH2B3 mRNAもしくはSH2B3タンパク質のレベルを低下させる、段階；ならびに
(iv) RBCの集団を回収する段階
を含む、該幹細胞および/または前駆細胞の集団をRBCに分化するように誘導する方法。
【請求項２７】
(iii) 幹細胞および/または前駆細胞の集団をゲノム編集物質と接触させ、かつ、該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、赤血球(RBC)への少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階であって、該ゲノム編集物質が、少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞からSH2B3遺伝子を切除する、段階；ならびに
(iv) RBCの集団を回収する段階
を含む、該幹細胞および/または前駆細胞の集団をRBCに分化するように誘導する方法。
【請求項２８】
RBCの有効量を対象に投与する段階を含む、RBCの集団を該対象に投与する方法であって、該RBCが、SH2B3のアンタゴニストの有効量とエクスビボまたはインビトロで接触したことがあり、該SH2B3のアンタゴニストが、SH2B3タンパク質の活性を低下させるか、またはSH2B3 mRNAもしくはSH2B3タンパク質のレベルを低下させる、方法。
【請求項２９】
RBCの有効量を対象に投与する段階を含む、RBCの集団を該対象に投与する方法であって、該RBCが、ゲノム編集物質の有効量とエクスビボまたはインビトロで接触したことがある幹細胞および/または前駆細胞の集団から産生されており、該ゲノム編集物質が、少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞からSH2B3遺伝子を切除する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年11月24日に出願された米国仮特許出願第62/083,439号の35 U.S.C. 119(e)の下での優先権を主張するものであり、この出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された助成金番号R01DK103794およびR21HL120791の下で米政府の支援によりなされたものである。米政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、幹細胞および/または前駆細胞からの赤血球産生に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
赤血球(RBC)の輸血は、多くの臨床的および外科的用途に日常的に使用されている。アメリカ血液バンク協会によると、米国では毎年2900万ユニットの血液成分が輸血されている。この方法は多くの命を救ってきた。このような輸血の需要は、医療の進歩や人口の高齢化に伴い増加し続けている。
【０００５】
献血された血液はRBCの主な供給源である。しかし、献血の量および/または質は保証されていない。造血性および多能性幹細胞源を用いたエクスビボでの赤血球(RBC)の産生は、可能な輸血代替品として大いに興味深い領域である。エクスビボで産生されたRBCは、臨床試験においてレシピエントに首尾よく輸血されて、このアプローチの有効性が実証されている(Giarratana et al., Blood, 2011)。
【０００６】
細胞補充療法のための供給源としての幹細胞の使用に関しては、大きな興奮を覚える(Fox et al., 2014)。造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)からインビトロで分化させた赤血球(RBC)は、臨床試験においてレシピエントに成功裏に輸血されており(Giarratana et al., 2011; Migliaccio et al., 2012)、ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工PSC (iPSC)を含む多能性幹細胞(PSC)を用いた同様のアプローチが研究中である(Kobari et al., 2012; Slukvin, 2013; Sturgeon et al., 2013)。しかしながら、RBC産生のためにこれらの幹細胞源を利用することは、完全に成熟した細胞の収量の低さによって制限され、このプロセスを高価で、非効率的なものにしている(Migliaccio et al., 2012; Rousseau et al., 2014)。こうした大きな制限を取り除くことは、血液供給を管理する能力を高める可能性がある(Williamson and Devine, 2013)。したがって、RBCのエクスビボ産生に存在する大きな制限は、治療目的のために十分な量のRBCを産生する能力にある。一般的には、ほんのわずかな単位(unit)がコスト効率の良い方法で産生されるにすぎない。
【０００７】
したがって、当技術分野には幹細胞および/または前駆細胞からRBCをエクスビボで産生するための改善された方法の満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本発明は、一部には、幹細胞および/または前駆細胞の集団におけるSH2B3遺伝子の阻害が、その幹細胞および/または前駆細胞の集団から分化した赤血球(RBC)の量および質を向上させることができるという発見に基づいている。特に、本発明者は、SH2B3発現をノックダウンするためにshRNAまたはCRISPR/Cas9を用いて、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)が、CD235aマーカーの増加およびCD71表面マーカーの減少によって示されるように、成熟RBCに分化され得ることを実証した。したがって、本発明者は、幹細胞および/または前駆細胞の集団からRBCをエクスビボで産生するために、SH2B3の阻害を使用することができることを見出した。
【０００９】
それゆえに、一局面では、本発明は、幹細胞および/または前駆細胞の集団から赤血球(RBC)をエクスビボで産生する方法を提供し、この方法は、(i)幹細胞および/または前駆細胞の集団においてSH2B3を阻害する段階；(ii)該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、RBCへの少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階；ならびに(iii)RBCの集団を回収する段階を含む。
【００１０】
いくつかの態様では、SH2B3を阻害する段階は、SH2B3タンパク質レベル、SH2B3 mRNAレベル、SH2B3タンパク質活性、またはそれらの組み合わせを低下させる。
【００１１】
いくつかの態様では、SH2B3を阻害する段階は、幹細胞および/または前駆細胞の集団を、SH2B3遺伝子についての少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞からの標的切除のためのゲノム編集物質と接触させることを含む。
【００１２】
いくつかの態様では、SH2B3を阻害する段階は、幹細胞および/または前駆細胞の集団を、SH2B3のアンタゴニストと接触させることを含む。
【００１３】
一局面では、本発明は、幹細胞および/または前駆細胞の集団を赤血球(RBC)に分化するように誘導する方法を提供し、この方法は、(i)幹細胞および/または前駆細胞の集団をSH2B3のアンタゴニストと接触させ、かつ、該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、RBCへの少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階であって、該SH2B3のアンタゴニストが、SH2B3タンパク質の活性を低下させるか、またはSH2B3 mRNAもしくはSH2B3タンパク質のレベルを低下させる、段階；ならびに(ii)RBCの集団を回収する段階を含む。
【００１４】
一局面では、本発明は、幹細胞および/または前駆細胞の集団を赤血球(RBC)に分化するように誘導する方法を提供し、この方法は、(i)幹細胞および/または前駆細胞の集団をゲノム編集物質と接触させ、かつ、該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、RBCへの少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階であって、該ゲノム編集物質が、少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞からSH2B3遺伝子を切除する、段階；ならびに(ii)RBCの集団を回収する段階を含む。
【００１５】
前述の局面のいくつかの態様では、ゲノム編集物質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/CRISPR関連(CRISPR associated)(Cas)システム、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群より選択される。
【００１６】
前述の局面のいくつかの態様では、ゲノム編集物質はベクター内に存在する。
【００１７】
前述の局面のいくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、無機分子、有機分子、核酸、核酸類似体または核酸誘導体、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、抗体またはその抗原結合断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１８】
前述の局面のいくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、SH2B3タンパク質のSH2ドメイン、PHドメイン、またはSH2ドメインとPHドメインとの両方に特異的に結合する。
【００１９】
前述の局面のいくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、SH2B3の発現を阻害するRNAi物質である。
【００２０】
前述の局面のいくつかの態様では、RNAi物質は、SH2B3 mRNAにハイブリダイズするsiRNA、shRNA、dsRNAである。
【００２１】
前述の局面のいくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞の集団は、造血幹細胞、造血前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)、胚性幹細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２２】
前述の局面のいくつかの態様では、前記方法は、幹細胞および/または前駆細胞の集団由来のRBCの増大を高める。
【００２３】
前述の局面のいくつかの態様では、前記方法は、RBCの質を向上させる。
【００２４】
前述の局面のいくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞の集団は、哺乳動物起源のものである。
【００２５】
前述の局面のいくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞の集団は、ヒト起源のものである。
【００２６】
前述の局面のいくつかの態様では、RBCは、白血球濾過またはフローサイトメトリー選別によって単離される。
【００２７】
前述の局面のいくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞の集団は、ドナー対象から得られる。
【００２８】
前述の局面のいくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞の集団は、ドナー対象の末梢血単核細胞、臍帯血、骨髄、臍帯組織、またはG-CSF動員末梢血に由来する。
【００２９】
前述の局面のいくつかの態様では、前記方法は、それを必要とする対象にRBCの集団を投与する段階をさらに含み、該RBCは、ドナー対象から得られた幹細胞および/または前駆細胞の集団から産生される。
【００３０】
前述の局面のいくつかの態様では、幹細胞の集団はiPSCである。
【００３１】
本発明の別の局面は、本明細書に記載の方法に従って産生されたRBCの集団に関する。
【００３２】
本発明の別の局面は、RBCの集団と幹細胞および/または前駆細胞の集団とを含む混合物に関し、該RBCは、本明細書に記載の方法に従って産生される。
【００３３】
本発明の別の局面は、本明細書に記載の方法に従って産生されたRBCの集団を含む血液バンクに関する。
【００３４】
本発明の別の局面は、幹細胞および/または前駆細胞の集団と、少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞から分化した少なくとも1個のRBCと、SH2B3のアンタゴニストとを含む、細胞培養培地に関する。
【００３５】
本発明の別の局面は、RBCの有効量を対象に投与する段階を含む、RBCの集団を対象に投与する方法に関し、該RBCはSH2B3のアンタゴニストの有効量とエクスビボまたはインビトロで接触したことがあり、SH2B3のアンタゴニストは、SH2B3タンパク質の活性を低下させるか、またはSH2B3 mRNAもしくはSH2B3タンパク質のレベルを低下させる。
【００３６】
本発明の別の局面は、RBCの有効量を対象に投与する段階を含む、RBCの集団を対象に投与する方法に関し、該RBCはゲノム編集物質の有効量とエクスビボまたはインビトロで接触させた幹細胞および/または前駆細胞の集団から産生され、該ゲノム編集物質は少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞からSH2B3遺伝子を切除する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本特許または本出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも1つの図面が含まれる。カラー図面を含む本特許または本特許出願公報のコピーは、要請および必要な手数料の納付に応じて当局によって提供される。
【図１】図1A〜1Cは、臍帯血および成人(骨髄および動員末梢血)供給源からのCD34+造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の同期分化を可能にする3相培養システムを示す。図1Aは、SH2B3の阻害を用いた、成熟RBCへのヒトCD34+ HSPCの分化方法を示す単純化したスキームを示す。図1Bは、sh83 (SEQ ID NO: 1)およびsh84 (SEQ ID NO: 2) SH2B3 shRNAによる感染の8日後のSH2B3タンパク質レベルを示すウェスタンブロットを示し、sh83およびsh84 shRNAが培養物中のSH2B3タンパク質のレベルを効果的に低下させることを示している。図1Cは、示された分化日におけるメイ・グリュンワルド・ギムザ染色したSH2B3-KD (sh83および/またはsh84 SH2B3 shRNA処理)細胞の代表的な細胞遠心分離画像を示す。
【図２】分化を受けた細胞が、対照と比較したときかなり正常に、表現型表面マーカーCD71およびCD235aを用いて評価されたことを示す。
【図３】図3A〜3Bは、SH2B3レベルの低下により、細胞が成熟RBCになる方へより効果的に分化することを示す。図3Aは、sh83および/またはsh84 shRNA処理細胞対対照のCD235a表面マーカー発現の代表的なヒストグラムプロットを示す。図3Bは、sh83および/またはsh84 shRNA処理細胞対対照のCD71表面マーカー発現の代表的なプロットを示す。SH2B3ノックダウン(sh83およびsh84 SH2B3 shRNA)培養物では、shLuc対照におけるよりも初期の段階でより多くの細胞がCD235aを獲得し、CD71を失う。
【図４】分化18日目にCD235aおよびHoechst 33342で染色した細胞を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示し、培養の後期(16〜18日目)に、より多くの細胞が成熟RBCに典型的である脱核を受けた(ボックス内に示される)ことを示す。数字は、示されたゲート±SD内の、脱核したRBCを示すCD235a+/Hoechst 33342-細胞の平均パーセンテージを表す。
【図５】示された分化日におけるメイ・グリュンワルド・ギムザ染色した対照およびSH2B3-KD (sh83およびsh84 SH2B3 shRNA処理)細胞の代表的な細胞遠心分離画像を示す。結果は、SH2B3レベルの低下により、細胞がより早く形態学的レベルで成熟し、かつより多くのヘモグロビンを獲得したことを示す。左上のパネルにスケールバーを表示する。
【図６】対照またはSH2B3 KD末梢血動員CD34+ HSPCの平均増幅を示し、よりロバストな赤血球分化に加えて、SH2B3-KD細胞(sh83およびsh84 SH2B3 shRNAを使用)が対照を上回って増大したことを示している。示された値は、平均±平均の標準誤差である(異なるドナーを用いた＞3回の実験を代表するn＝3の独立した実験)。
【図７】造血幹細胞におけるSH2B3抑制による赤血球系細胞の改善された増大を示す。図7は、成人動員末梢血に由来する対照およびSH2B3 KD (sh83およびsh84 shRNA処理)サンプルについて観察された、脱核したRBC (CD235a+/Hoechst 33342-)の平均収量を示し、脱核したRBCの収量を考慮すると、SH2B3レベルの低下により全体的な収量が3〜5倍増加したことを示している。比較は両側スチューデントt検定により行った(n＝3の独立した実験；*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001)。
【図８】図8A〜8Cは、造血幹細胞におけるSH2B3抑制による赤血球系細胞の改善された増大を示す。図8Aは、対照およびSH2B3-KD成人HSPC由来赤血球系細胞について観察された蛍光膜色素PKHのシグナル低下を示す。フローサイトメトリーで測定された、5日目と比較した9日目のPKHシグナルの比が示される。値は平均±標準偏差であり、対照に対して正規化した。比較は両側スチューデントt検定により行った(n＝3； **P＜0.01, ***P＜0.001)。図8Bは、培養5日目と9日目の間に成人HPSC由来赤血球系細胞について観察されたPKHシグナル低下に基づく細胞分裂の絶対数を示す。値は平均±標準偏差を表す。比較は両側スチューデントt検定により行った(n＝3； *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)。図8Cは、PKHシグナル低下および細胞分裂を計算するためのアルゴリズムを示す。
【図９】末梢血動員CD34+細胞に由来する成熟RBCの18日目のエオシン-5-マレイミドシグナルを示す代表的なヒストグラムプロットを示し、該細胞が対照細胞と類似するエオシン-5-マレイミド蛍光レベルを有し、それらが対照細胞と同様に成熟したことを示している。
【図１０】付着分化(adherent differentiation)の概略図である。CRISPR/Cas9を用いて、SH2B3ノックアウト(KO)ヒト胚性幹細胞(hESC)株を作製した。同質遺伝子(isogenic)対照を単離した。これらの細胞を、造血分化を受けるように誘導した。この方法を用いて造血前駆細胞が得られた時点で、それらを次いで、図の下部に示されるように、赤血球系統へと分化させた。
【図１１】SH2B3 KO hESCが、対照と同様にまたは対照より良好に、分化したことを示す。SH2B3 KO (CRISPR/Cas9システムを用いて作製)および同質遺伝子対照が、赤血球表面表現型マーカーCD71およびCD235aの染色により示される。
【図１２】図12A〜12Bは、造血および多能性幹細胞におけるSH2B3抑制による赤血球系細胞の改善された増大を示す。図12Aおよび12Bは、同質遺伝子hESCクローンの2つの独立した対に由来するHPCの赤血球系細胞増大を示す；SH2B3ノックアウトBB5株(KO BB5)(図12A)およびSH2B3ノックアウトDB3 (KO DB3)(図12B)は、それらの野生型同質遺伝子対照(WT)と比較したとき、CRISPR/Cas9によるSH2B3 KOを有する細胞が対照よりもかなりの程度に増大したことを示している。したがって、CRISPR/Cas9によるSH2B3 KOは、異なるKOクローン(例えば、KO BB5およびKO DB3クローン)を用いて一貫した増大の向上を、それらのそれぞれの同質遺伝子対照(例えば、それぞれWT BB5およびWT DB3)と比較して、示す。50,000個の細胞から開始する総細胞数を様々な時点で平均±SDとして示す。比較は両側スチューデントt検定により行った(n＝3； *p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001, ****p＜0.0001)。
【図１３】図13A〜13Cは、初代HSPCにおけるSH2B3のインビトロ抑制を示す。図13Aは、成熟RBCへのヒトCD34+ HSPCの分化を示す単純化したスキームを示す。図13Bは、対照(対照shLucで処理した細胞についてのLuc-KD)およびSH2B3-KDサンプルの平均遺伝子発現値の散布図を示す(shLuc、sh83 shRNA、およびsh84 shRNAについてn＝3の独立したサンプル)。決定係数(r)が示される。図13Cは、SH2B3-KDサンプル対対照における遺伝子の相対的発現を比較する、遺伝子セット濃縮分析からの濃縮プロファイルを示す。初期赤血球前駆細胞をより分化した細胞と比較することによって誘導された赤血球分化シグネチャーを示す濃縮プロットが示される(修正コルモゴロフ-スミルノフ(Kolmogorov-Smirnov)統計的検定を用いてp＜0.0001)。
【図１４】図14A〜14Eは、造血および多能性幹細胞におけるSH2B3抑制による赤血球系細胞の改善された増大を示す。図14Aは、臍帯血HSPCに由来する対照およびSH2B3 KD (sh83およびsh84 shRNA)サンプルについて観察された脱核したRBC （CD235a+/Hoechst 33342-）の平均収量を示す。示された値は平均±SDであり、対照に対して正規化した。比較は両側スチューデントt検定により行った(n＝3の独立した実験； *p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001)。図14Bは、CD34+増大期を含むより効率的な分化プロトコールを用いて、成人動員末梢血前駆細胞に由来する対照およびSH2B3 KDサンプルについて観察された、脱核したRBC (CD235a+/Hoechst 33342-)の平均収量を示す。比較は両側スチューデントt検定により行った(n＝4; ***p＜0.001)。図14Cは、RBCへのhESCの分化を示す単純化したスキームを示す。hESCを逐次的サイトカイン組み合わせ中で培養して多能性造血前駆細胞(HPC)の産生を誘導し、HPCを8日目頃に培地に放出した。HPCを回収し、赤血球分化を支援するためにEPOおよびSCFを含む培地でさらに培養した。図14Dは、HPC選択後の示された培養日におけるメイ・グリュンワルド・ギムザ染色した対照およびSH2B3-KO赤芽球の代表的なサイトスピン画像を示す。図14Eは、SH2B3-KOおよび同質遺伝子WT hESCに由来する赤芽球上のCD71およびCD235aの発現を示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【図１５】図15A〜15Eは、SH2B3抑制後のHSPCに由来する赤血球系細胞の特性解析を示す(図14に関連する)。図15Aは、示されたEPO濃度について観察された成人HSPCの相対的増大を示す。赤血球増大は、18日目にフローサイトメトリー解析によって観察されたCD235a陽性細胞のパーセンテージについて補正された、18日目までの総細胞増大として計算される。示された値は平均±標準偏差であり、1U/mLで観察された増大に対して正規化される(濃度あたりn＝3)。図15Bは、成人HSPCの示された赤血球分化日におけるアネキシンV陽性(+)アポトーシスを起こしたまたは死滅した対照およびSH2B3-KDサンプルの頻度を示す棒グラフを示す。値は、平均パーセンテージ±標準偏差を示す。両側スチューデントt検定を行った(n＝3, n.s.＝有意でない)。図15Cは、サイトカイン飢餓とEPOおよびSCFによる刺激の後の対照(shLuc)またはSH2B3 (sh84) shRNAを形質導入されたヒトTF-1赤血球系細胞株におけるリン酸化STAT5 (pSTAT5)およびリン酸化KIT Y568 (pKIT Y568)の活性化を示すウェスタンブロットを示す。サイトカイン飢餓の前に細胞をピューロマイシン中で48時間選択した。pKIT Y568は、細胞の血清飢餓により完全に取り除くことができ、血清単独によるベースライン刺激を示唆する。STAT5活性化は、EPO受容体のような、特定のサイトカイン受容体の下流でのみ起こる。図15Dは、一晩のサイトカイン飢餓を受けた、またはEPOで2時間刺激した後の、TF-1赤血球系細胞におけるSH2B3抑制によるEPO応答遺伝子CISHおよびPIM1の発現を示す。値は、平均±標準偏差を表す。比較は両側スチューデントt検定により行った(n＝3； *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)。図15Eは、示されるような各種EPOおよびSCF濃度でのCD235a陽性細胞について補正された成人HSPCの相対的増大を示す。培養は、方法において説明される、3相システムでの分化に先立って増大段階を含むより効率的な分化プロトコールを用いて行い、EPOおよびSCF濃度は全ての相で変化した。示された値は、平均±平均の標準偏差である。比較は両側スチューデントt検定により行った(n＝3； **P＜0.01, ***P＜0.001)。
【図１６】図16A〜16Hは、SH2B3ノックダウンHSPCおよび多能性幹細胞からの赤血球系細胞の特性解析を示す(図16A〜16Hは、図14A〜14Eに関連する）。図16Aは、成人CD34+細胞に由来する18日目の成熟RBC上のRh血液抗原発現を示す代表的なヒストグラムプロットを示す。図16Bは、示された時点で成人CD34+細胞から作製された対照およびSH2B3-KDの成熟RBCについて観察されたピルビン酸キナーゼ活性を示す。示された値は、平均±標準偏差である(n＝2の独立した実験)。図16Cは、成人RBCに由来するRBCゴーストからの主要な膜タンパク質バンドを示すクマシーブルー染色したSDS-PAGEゲルを示す。図16Dは、培養中に産生されたRBCからの溶血物中の成熟ヘモグロビンサブタイプのヘモグロビン高速液体クロマトグラフィー分析を示す。HbFおよびHbA2のピークは、対応するピークの上にラベルを有するクロマトグラムにおいて陰影付けされている。図16Eは、SH2B3遺伝子のエキソン3においてCas9タンパク質による二本鎖切断(DSB)を引き起こすために、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する示されたSH2B3 DNA配列を標的とするために用いられた単一ガイドRNA (gRNA)を示す概略図である。図16Fは、CRISPR/Cas9にターゲティングされたhESCの配列を示す。PAM配列はボールドで強調表示され、予測される切断部位はPAMの3塩基上流である。SH2B3にフレームシフト突然変異を有する、1つのホモ接合型クローンDB3ならびに2つの複合ヘテロ接合型クローンBB5およびBF4の対立遺伝子配列が示される。センスDNA配列が示されることに留意されたい。図16Gは、SH2B3-KOを有するhESC由来HPCおよび同質遺伝子対照の細胞増大の結果を示す。この実験では分化開始後9日目にHPCを回収した。総細胞数は、様々な時点での平均±標準偏差として示される。示された各培養日に両側スチューデントt検定を用いて比較を行った(n＝3; NS＝有意でない; *P＜0.05; **P＜0.01)。図16Hは、定量的RT-PCRで測定された、HPC分化の10日目のhESC由来赤血球系細胞(SH2B3 KOまたはWT対立遺伝子のいずれかを有する)におけるグロビン遺伝子発現を示す。β-アクチンに対する発現がlog10スケールで示される(グループあたりn＝3)。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
詳細な説明
本発明は、幹細胞および/または前駆細胞などの供給源から量および質の向上した赤血球(RBC)を産生するための方法、システム、および組成物、ならびにキットに関する。特に、SH2B3は、これらの供給源からのRBC産生の重要な負の調節因子として本明細書で同定された。すなわち、本発明者は、SH2B3が幹細胞および/または前駆細胞からのRBCの産生を阻害することを見出した。本明細書に示されるように、本発明者は、SH2B3のタンパク質レベルおよび/もしくはmRNAレベルを低下させること、および/または供給源の幹細胞もしくは前駆細胞のゲノムから遺伝子編集アプローチ(例えば、CRISPR/Cas9またはCRISPR/Cpf1の使用)を用いてSH2B3遺伝子を除去することが、これらの供給源からの量および質の向上したRBCの生成を可能にすることを見出した。
【００３９】
かくして、本発明は、例えば標準的な輸血の代替品として、幹細胞および/または前駆細胞からRBCを産生し、かつその収量を高めるための方法、組成物およびキットにおけるSH2B3の阻害に関する。したがって、本発明の局面および態様は、RBC産生用の幹細胞および/または前駆細胞においてSH2B3を阻害するための方法および組成物、ならびにそれらの使用方法に関する。AhR、Prox1および/またはSH2B3の阻害が多能性造血細胞(MHC)の増大を高めることは、WO2013/019857において以前に報告されている。しかし、本発明とは対照的に、WO2013/019857は、RBCへのMHCの分化またはRBCの回収について記載していない。したがって、WO2013/019857は、幹細胞および/または前駆細胞におけるSH2B3の阻害が、これらの細胞から分化したRBCの量および/または質を向上させ得ることを記載も実証もしていない。
【００４０】
一局面では、本発明は、幹細胞および/または前駆細胞の集団から赤血球(RBC)をエクスビボで産生する方法を提供し、この方法は、(i)幹細胞および/または前駆細胞の集団においてSH2B3を阻害する段階；(ii)該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、RBCへの少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階；ならびに(iii)RBCの集団を回収する段階を含む。
【００４１】
本明細書には、細胞におけるまたは哺乳動物におけるSH2B3 mRNAまたはタンパク質の発現を減少させる組成物および方法が記載される。また、幹細胞および/または前駆細胞からのエクスビボでのRBCの産生および/または増大を促進するための組成物および方法も記載され、したがって、患者に利用可能な輸血および/または血液バンクのRBC量の増加が可能になると同時に、同移植材料の効力および/または潜在的可能性が高くなる。いくつかの態様では、該組成物および方法は、SH2B3の阻害物質で処理されていないか、またはSH2B3遺伝子が(すなわち、本明細書中に開示される遺伝子編集の手法を用いて)ノックアウトされていない幹細胞および/または前駆細胞と比較して、エクスビボで幹細胞および/または前駆細胞からのRBCの収量の増加を可能にする。いくつかの態様では、該組成物および方法は、O- (O, Rh-)の血液型を有するドナー対象から得られた幹細胞および/または前駆細胞からのRBCの収量の増加を可能にし、それにより、万能供血者からのRBCの無制限供給の増加を可能にする。また、インビボでのRBC増大を高めるための、そのようなiRNA組成物の投与も意図される。
【００４２】
定義
特に明記しない限り、または文脈から暗示されない限り、以下の用語および語句は以下に提供される意味を含む。明示的に別段の定めをしない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、その用語または語句が関連する技術分野で獲得している意味を排除しない。定義は、特定の態様を説明するのに役立つように提供され、クレームされた発明を限定するものではない。なぜなら、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。さらに、文脈から特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００４３】
本明細書で使用する用語「SH2B3」は、特定の文脈の前後関係に応じて、SH2B3タンパク質またはSH2B3タンパク質をコードする核酸のいずれかを指す。SH2B3 (SH2Bアダプタータンパク質3またはLnkとしても公知である；NCBI遺伝子ID：10019)は、細胞内アダプタータンパク質ファミリーのメンバーである。ホモ・サピエンス(homo sapiens)のSH2B3のmRNAは、少なくとも2つのアイソフォーム(NCBIアクセッション番号：NM_005475、NM_001291424)を有することが公知である。SH2B3は主にリンパ球および造血前駆細胞で発現されており、初期のリンパ球造血を調節している。
【００４４】
本明細書で使用する用語「エクスビボ」は、生物(例えば、哺乳動物)から得られた生物学的細胞がその生物の外で培養される状況または状態を指す。
【００４５】
本明細書で使用する用語「幹細胞」は、増殖して、より多くの前駆細胞を生じさせることが可能な未分化細胞を指し、該前駆細胞は多数の母細胞を生成する能力があり、次に、その母細胞は分化したまたは分化可能な娘細胞を生じさせることができる。娘細胞それ自体は、増殖して、子孫を産生するように誘導され、その後、該子孫は、親の発生能を有する1個または複数個の細胞をも保持しながら、1つまたは複数の成熟細胞型に分化することができる。
【００４６】
細胞の分化は、典型的には多くの細胞分裂を通して起こる複雑なプロセスである。分化した細胞は多能性細胞から生じることができ、その多能性細胞自体も多能性細胞に由来するといった具合である。これらの多能性細胞の各々は幹細胞とみなすことができるが、それぞれが生み出し得る細胞型の範囲はかなり変動し得る。いくつかの分化した細胞もまた、より大きな発生能の細胞を生じさせる能力がある。このような能力は固有のものであってもよいか、または様々な因子で処理して人工的に誘導されてもよい。多くの生物学的事例において、幹細胞は、複数の異なる細胞型の子孫を産生することができるため、「多能性」であるが、これは「幹細胞らしさ」(stem-ness)には必要でない。自己複製は幹細胞の定義のもう一つの古典的な部分であり、本文書で使用する場合それは必須である。理論的には、自己複製は2つの主要なメカニズムのいずれかによって起こり得る。幹細胞は非対称に分裂することができ、一方の娘は幹状態を保持し、他方の娘はいくつかの異なる他の特定の機能および表現型を発現する。あるいは、集団内の幹細胞の一部は対称的に2つの幹に分裂することができ、その結果、いくつかの幹細胞を全体として集団内に維持する一方で、集団内の他の細胞は分化した子孫のみを生じさせる。形式的には、幹細胞として始まる細胞は、より分化した表現型に向かって進行するが、その後「逆転」して、あまり分化していない表現型、すなわち幹細胞または幹細胞様の表現型を再発現する可能性があり、これは当業者によって「脱分化」、「再プログラミング」または「逆分化」としばしば呼ばれている。
【００４７】
用語「前駆細胞」または「始原細胞」は、本明細書では交換可能に使用され、それが分化によって生み出すことのできる細胞と比べて、より原始的である(すなわち、完全に分化した細胞よりも発生経路に沿って早い段階にある)細胞表現型を有する細胞を指す。多くの場合、前駆細胞は著しいまたは非常に高い増殖能をも有する。前駆細胞は、発生経路および細胞が発生し分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞型または単一の分化細胞型を生じさせることができる。
【００４８】
本明細書で使用する用語「多能性」は、異なる条件下で、2つ以上の分化細胞型に、好ましくは3つ全ての生殖細胞層に特徴的な細胞型に、分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイを用いて、2つ以上の細胞型に、好ましくは3つ全ての胚葉に、分化する能力によって主に特徴づけられる。多能性はまた、胚性幹(ES)細胞マーカーの発現によっても証明されるが、多能性についての好適な試験は、3つの胚葉の各々の細胞に分化する能力の実証である。留意すべきは、このような細胞を単に培養するだけでは、それらが自然に多能性にならないことである。再プログラミングされた多能性細胞(例えば、人工多能性幹(iPS)細胞、この用語は本明細書において定義される)はまた、一般には培養下で限られた数だけ分裂する能力を備えた初代細胞の親と比べて、成長潜在力を失うことなく長期継代する能力の特性を備えている。
【００４９】
用語「胚性幹細胞」または「ES細胞」は、交換可能に使用され、胚性胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指す(米国特許第5,843,780号、第6,200,806号参照)。このような細胞は、体細胞核移植から誘導された胚盤胞の内部細胞塊から同様に得ることができる(例えば、米国特許第5,945,577号、第5,994,619号、第6,235,970号参照)。胚性幹細胞の際立った特徴は胚性幹細胞の表現型を特定する。したがって、ある細胞が胚性幹細胞のユニークな特徴を1つまたは複数有して、その細胞を他の細胞から区別することができる場合、その細胞は胚性幹細胞の表現型を有する。典型的な胚性幹細胞の際立った特徴としては、限定するものではないが、遺伝子発現プロファイル、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する応答性などが挙げられる。
【００５０】
本明細書で使用する用語「造血幹細胞」または「HSC」は、リンパ球、赤血球もしくは骨髄細胞系統の前駆細胞に分化することができるか、またはさらなる分化を開始することなく幹細胞集団として増殖することができる、多能性幹細胞またはリンパ系もしくは骨髄系(骨髄由来)の幹細胞を指す。HSCは、骨髄、末梢血、臍帯血、または胚性幹細胞から単離することができる。HSCは、赤血球(erythrocyte)(赤血球(red blood cell))、血小板、顆粒球(好中球、好塩基球、好酸球など)、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球、およびナチュラルキラー細胞のような細胞を形成することができる。HSCは自己複製が可能であり、細胞分裂後に幹細胞として残ることができる。HSCはまた、分化が可能であり、成熟造血細胞になるための経路を開始することもできる。HSCはまた、その移動もしくは遊走において調節され得るか、またはアポトーシスもしくはプログラム細胞死によって調節され得る。
【００５１】
本明細書で使用する用語「造血前駆細胞」または「HPC」は、該細胞が適切なサイトカインまたは一群のサイトカインにさらに暴露される場合に、それらが造血細胞系統に沿ってさらに分化する発生段階にまで分化した原始造血細胞を指す。HSCとは対照的に、造血前駆細胞は限られた自己複製が可能であるにすぎない。本明細書で使用する「造血前駆細胞」はまた、造血前駆細胞の分化から誘導されかつ分化成熟した造血細胞の直接前駆体である「前駆細胞」をも含む。本明細書で使用する用語「造血前駆細胞」としては、限定するものではないが、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞(GM-CFC)、巨核球コロニー形成細胞(Mk-CFC)、バースト形成単位赤芽球(BFU-E)、B細胞コロニー形成細胞(B-CFC)およびT細胞コロニー形成細胞(T-CFC)が挙げられる。「前駆細胞」としては、限定するものではないが、コロニー形成単位赤芽球(CFU-E)、顆粒球コロニー形成細胞(G-CFC)、コロニー形成細胞好塩基球(CFC-Bas)、コロニー形成細胞好酸球(CFC-Eo)およびマクロファージコロニー形成細胞(M-CFC)が挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用する用語「造血幹細胞および前駆細胞」または「HSPC」は、造血幹細胞と造血前駆細胞の混合物を指す。
【００５３】
本明細書で使用する用語「増大する」および「増大」は、実質的に分化なしの細胞増殖、すなわち、細胞集団の増加に伴って分化が起こらない、このような集団の増加を指す。
【００５４】
細胞の個体発生において、形容詞「分化した」または「分化する」は、相対的な用語であり、「分化した細胞」は、比較される細胞よりも発生経路をさらに下って進んでいる細胞である。したがって、幹細胞は、系統制限された前駆細胞(例えば、造血幹細胞)に分化することができ、これは次に発生経路をさらに下って他のタイプの前駆細胞(例えば、胸腺細胞、Tリンパ球前駆体)に分化し、その後最終段階の分化細胞に分化することができ、その分化細胞は特定の組織型において特徴的な役割を果たし、それ以上増殖する能力を保持してもしなくてもよい。
【００５５】
本明細書において言及される「細胞培養培地」(本明細書では「培養培地」または「培地」ともいう)という用語は、細胞の生存能力を維持しかつ増殖を支援する栄養素を含有する、細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、以下のいずれかを適切な組み合わせで含むことができる：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、およびペプチド成長因子のような他の成分など。特定の細胞型のために通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
【００５６】
用語「増加した」、「増加する」、「高める」、または「増やす」はすべて、一般に、統計的に有意な量での細胞(例えば、幹細胞、前駆細胞、またはRBC)の数の増加または細胞の質の向上を意味するために本明細書で使用され；誤解を避けるために記すと、用語「増加した」、「増加する」、「増やす」、または「高める」は、基準レベルと比較して、少なくとも約10％の増加、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、もしくは100％までの増加、あるいは、対照または基準レベルと比較して、少なくとも約2倍の増加、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍の増加、少なくとも約25倍の増加、少なくとも約50倍の増加、少なくとも約100倍の増加、もしくは100倍超の増加を意味する。対照サンプルまたは対照レベルは、本明細書では、例えば正常なまたは破壊されていないSH2B3遺伝子機能を有する、同じ生物学的供給源から得られた幹細胞および/または前駆細胞の集団を記載するために使用される。
【００５７】
用語「低下する」、「減少した」、「減少」、「低下」、または「阻害する」はすべて、一般に、統計的に有意な量での低下を意味するために本明細書で使用される。しかし、誤解を避けるために記すと、「減少した」、「減少」もしくは「低下」、または「阻害する」は、典型的には、基準レベルと比較して、少なくとも約5％〜10％の低下、例えば、少なくとも約20％の低下、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の低下(すなわち、基準サンプルと比較してレベルの消失)、または基準レベルと比較して10〜100％の低下を意味する。
【００５８】
用語「統計的に有意」または「有意に」は、統計的有意性を指し、一般に2標準偏差(2SD)またはそれより大きい差を意味する。
【００５９】
本明細書で使用する用語「有意な」または「有意に」は、「統計的に」という用語によって修飾されているように解釈されるべきである。
【００６０】
本明細書で使用する用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはその類似体の単位を組み込んだ任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。一本鎖核酸は、変性された二本鎖DNAの一方の核酸鎖であり得る。あるいは、それは二本鎖DNAに由来しない一本鎖核酸であってもよい。いくつかの態様では、核酸はDNAであり得る。いくつかの態様では、核酸はRNAであり得る。適切な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAなどのDNAである。他の適切な核酸分子は、mRNAなどのRNAである。
【００６１】
本明細書で使用する用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、隣接するアミノ酸残基のαアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を指定するために、本明細書で交換可能に使用される。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾アミノ酸(例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など)およびアミノ酸類似体を含めて、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」はしばしば比較的大きなポリペプチドに関して使用される一方で、用語「ペプチド」はしばしば小さなポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野でのこれらの用語の使用は重複する。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、遺伝子産物とその断片を指す場合、本明細書では交換可能に使用される。したがって、典型的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オーソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の同等物、変異体、断片および類似体が含まれる。
【００６２】
本明細書で使用する「抗体」は、抗体を天然で産生する任意の種に由来しようと、組換えDNA技術によって作製されようと、血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、または細菌から単離されようと、IgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgE分子、またはその抗原特異的抗体断片(Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、閉鎖立体配座の多重特異性抗体、ジスルフィド結合scfv、ダイアボディを含むが、これらに限定されない)を指す。
【００６３】
本明細書に記載される「抗原」は、抗体の相補性決定領域(CDR)を含む結合部位によって結合される分子である。典型的には、抗原は抗体リガンドによって結合され、インビボで抗体応答を引き出すことが可能である。抗原はポリペプチド、タンパク質、核酸もしくは他の分子、またはその一部であり得る。用語「抗原決定基」は、抗原結合分子によって、さらに特定すると該分子の抗原結合部位によって、認識される抗原上のエピトープを指す。
【００６４】
本明細書で使用する用語「抗体試薬」は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体、または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含むことができる。いくつかの態様では、抗体試薬は、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含むことができる。例えば、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書ではVHと略記する)および軽(L)鎖可変領域(本明細書ではVLと略記する)を含み得る。別の例では、抗体は2つの重(H)鎖可変領域と2つの軽(L)鎖可変領域を含む。用語「抗体試薬」は、完全な抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片(例えば、一本鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFvおよびドメイン抗体(dAb) 断片(例えば、de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39参照されたく；これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる))を包含する。抗体はIgA、IgG、IgE、IgD、IgM (ならびにそのサブタイプおよび組み合わせ)の構造的特徴を有する。抗体はマウス、ウサギ、ブタ、ラットおよび霊長類(ヒトおよび非ヒト霊長類)を含む任意の供給源由来ならびに霊長類化抗体由来であり得る。抗体には、ミニボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体なども含まれる。
【００６５】
VHおよびVL領域は、「フレームワーク領域」(「FR」)と呼ばれる、より保存されている領域が組み入れられた、「相補性決定領域」(「CDR」)と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。フレームワーク領域とCDRの範囲は正確に定義されている(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を参照されたく；これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)。各VHおよびVLは、典型的には、3つのCDRと4つのFRから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で配置されている：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
【００６６】
用語「抗原結合断片」または「抗原結合ドメイン」は、本明細書において交換可能に使用され、関心対象の標的に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の1つまたは複数の断片を指すために使用される。全長抗体の用語「抗原結合断片」に包含される結合断片の例には、以下が含まれる：(i) VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる1価断片である、Fab断片；(ii) ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む2価断片である、F(ab')2断片；(iii) VHドメインとCH1ドメインからなる、Fd断片；(iv) 抗体の単一アームのVLドメインとVHドメインからなる、Fv断片；(v) VHドメインまたはVLドメインからなる、dAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546；その全体が参照により本明細書に組み入れられる)；および(vi)特異的抗原結合の機能性を保持する、単離された相補性決定領域(CDR)。
【００６７】
本明細書で使用する用語「特異的結合」は、2つの分子、化合物、細胞および/または粒子間の化学的相互作用を指し、そこでは、第1の実体(entity)が、非標的である第3の実体に結合するよりも、高い特異性および親和性で第2の標的実体に結合する。いくつかの態様では、特異的結合は、第1の実体の第2の標的実体に対する親和性を指すことができ、この親和性は、第3の非標的実体に対する親和性の少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍であるか、またはそれを上回る。所与の標的に特異的な試薬は、用いられるアッセイの条件下で、その標的に対して特異的結合を示す試薬である。特定の態様では、特異的結合は、およそ≦10-8 M、≦10-9 M、≦10-10 M、またはそれ未満の解離定数によって示される。
【００６８】
本明細書で使用する「発現レベル」は、細胞中またはサンプル中に存在するmRNA分子および/または所与の遺伝子によってコードされるポリペプチド分子の数を指す。発現レベルは、基準レベルに対して増加または減少させることができる。
【００６９】
本明細書で使用する用語「iRNA物質」または「RNAi物質」は、その用語が本明細書で定義されるRNAを含む作用物質を指し、それはRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)経路を介してRNA転写産物の標的切断を媒介する。一態様では、本明細書に記載のiRNAは、幹細胞もしくは前駆細胞、例えばHSC、または哺乳動物においてSH2B3/Lnkの発現を阻害する。
【００７０】
本明細書で使用する「標的配列」は、一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNAを含めて、遺伝子の転写中に形成されたメッセンジャーRNA (mRNA)分子のヌクレオチド配列の連続した部分を指す。該配列の標的部分は、少なくとも、iRNA物質の特異的結合部位として、および/またはその部位またはその付近でのiRNA依存性切断のための基質として機能するのに十分な長さである。例えば、標的配列は、一般に長さが9〜36ヌクレオチド、例えば長さが15〜30ヌクレオチドであり、それらの間の全ての部分範囲を含む。非限定的な例として、標的配列は、15〜30ヌクレオチド、15〜26ヌクレオチド、15〜23ヌクレオチド、15〜22ヌクレオチド、15〜21ヌクレオチド、15〜20ヌクレオチド、15〜19ヌクレオチド、15〜18ヌクレオチド、15〜17ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、18〜26ヌクレオチド、18〜23ヌクレオチド、18〜22ヌクレオチド、18〜21ヌクレオチド、18〜20ヌクレオチド、19〜30ヌクレオチド、19〜26ヌクレオチド、19〜23ヌクレオチド、19〜22ヌクレオチド、19〜21ヌクレオチド、19〜20ヌクレオチド、20〜30ヌクレオチド、20〜26ヌクレオチド、20〜25ヌクレオチド、20〜24ヌクレオチド、20〜23ヌクレオチド、20〜22ヌクレオチド、20〜21ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、21〜26ヌクレオチド、21〜25ヌクレオチド、21〜24ヌクレオチド、21〜23ヌクレオチド、または21〜22ヌクレオチドであり得る。
【００７１】
本明細書で使用する用語「配列を含む鎖」は、標準ヌクレオチド命名法を用いて記載された配列によって示されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００７２】
本明細書で使用する場合、特段の指示がない限り、用語「相補的」は、第2のヌクレオチド配列に関して第1のヌクレオチド配列を説明するために使用する場合、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと特定の条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を指し、当業者には理解されよう。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であってよく、ストリンジェントな条件は、以下を含むことができる：400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃または70℃で12〜16時間、その後洗浄。他の条件、例えば生体内で遭遇する可能性のある生理的に適切な条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従って、2つの配列の相補性の試験に最も適切な条件のセットを決定することができよう。
【００７３】
iRNA内の相補配列、例えば本明細書に記載のdsRNA内の相補配列は、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。このような配列は、本明細書では互いに対して「完全に相補的」と呼ばれる。しかし、第1の配列が本明細書で第2の配列に対して「実質的に相補的」と呼ばれる場合、これら2つの配列は完全に相補的であり得るか、またはそれらは、最終的な適用、例えばRISC経路による遺伝子発現の阻害、に最も適切な条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、30塩基対までの二本鎖についてのハイブリダイゼーションの際に、1つまたは複数、しかし一般的には5、4、3、または2つ以下のミスマッチ塩基対を形成することができる。しかし、2つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に、1つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングを相補性の決定に関するミスマッチと見なしてはならない。例えば、21ヌクレオチド長の1つのオリゴヌクレオチドと23ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むdsRNA (長い方のオリゴヌクレオチドは、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な21ヌクレオチドの配列を含む)は、それでもなお、本明細書に記載の目的のために「完全に相補的」と称することができる。
【００７４】
本明細書で使用する「相補」配列はまた、それらのハイブリダイズする能力に関して上記の要件が満たされる限りでは、非ワトソン-クリック塩基対および/または非天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよいか、またはそれらから完全に形成されてもよい。このような非ワトソン-クリック塩基対には、G：Uゆらぎ塩基対またはフーグスティーン塩基対が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはiRNA物質のアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに関して使用することができ、それらの使用の前後関係から理解されるであろう。
【００７６】
本明細書で使用する場合、メッセンジャーRNA (mRNA)「の少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、関心対象のmRNA (例えば、SH2B3をコードするmRNA)の連続した部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がmRNAの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、該mRNAの少なくとも一部に相補的である。
【００７７】
本明細書で使用する用語「二本鎖RNA」または「dsRNA」は、標的RNAに関して「センス」および「アンチセンス」方向を有するとされる、2本の逆平行かつ実質的に相補的な核酸鎖を含む、ハイブリダイズした二本鎖領域を有するRNA分子または分子の複合体を含むiRNAを指す。二本鎖領域は、RISC経路を介して所望の標的RNAの特異的抑制を可能にするどのような長さのものであってもよいが、典型的には9〜36塩基対の長さ、例えば15〜30塩基対の長さである。9〜36塩基対の二本鎖を考えると、該二本鎖は、この範囲内の任意の長さ、例えば、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36塩基対であってよく、また、これらの間の任意の部分範囲、例えば、限定するものではないが、15〜30塩基対、15〜26塩基対、15〜23塩基対、15〜22塩基対、15〜21塩基対、15〜20塩基対、15〜19塩基対、15〜18塩基対、15〜17塩基対、18〜30塩基対、18〜26塩基対、18〜23塩基対、18〜22塩基対、18〜21塩基対、18〜20塩基対、19〜30塩基対、19〜26塩基対、19〜23塩基対、19〜22塩基対、19〜21塩基対、19〜20塩基対、20〜30塩基対、20〜26塩基対、20〜25塩基対、20〜24塩基対、20〜23塩基対、20〜22塩基対、20〜21塩基対、21〜30塩基対、21〜26塩基対、21〜25塩基対、21〜24塩基対、21〜23塩基対、または21〜22塩基対であってよい。Dicerおよび類似の酵素によるプロセシングによって細胞内で生成されたdsRNAは、一般に長さが19〜22塩基対の範囲にある。dsDNAの二本鎖領域の一方の鎖は、標的RNAの領域に実質的に相補的な配列を含む。二本鎖構造を形成する2つの鎖は、少なくとも1つの自己相補的領域を有する単一RNA分子由来であり得るか、または2つまたはそれ以上の別個のRNA分子から形成され得る。二本鎖領域が単一分子の2つの鎖から形成される場合、その分子は、二本鎖構造を形成している一方の鎖の3'末端と他方の鎖の5'末端との間のヌクレオチドの一本鎖(本明細書では「ヘアピンループ」という)によって分離された二本鎖領域を有することができる。ヘアピンループは、少なくとも1個の不対ヌクレオチドを含むことができ；いくつかの態様では、ヘアピンループは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも23個、またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含むことができる。dsRNAの2つの実質的に相補的な鎖が別々のRNA分子に含まれる場合、それらの分子は、必ずしも必要ではないが、共有結合で連結され得る。2つの鎖がヘアピンループ以外の手段によって共有結合で連結される場合、その連結構造は「リンカー」と呼ばれる。用語「siRNA」は、本明細書では、上記のようなdsRNAを指すためにも使用される。
【００７８】
当業者であれば、用語「RNA分子」または「リボ核酸分子」は、天然に発現されるかまたは見出されるRNA分子だけでなく、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の1つまたは複数のリボヌクレオチド/リボヌクレオシド類似体またはリボヌクレオチド/リボヌクレオシド誘導体を含むRNAの類似体および誘導体をも含むことを認識するであろう。厳密に言えば、「リボヌクレオシド」はヌクレオシド塩基とリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は1、2、または3個のリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかし、用語「リボヌクレオシド」および「リボヌクレオチド」は、本明細書で使用するとき、同等であると見なすことができる。RNAは核酸塩基構造またはリボース-リン酸骨格構造において、例えば以下に記載するように、修飾することができる。しかし、リボヌクレオシド類似体またはリボヌクレオシド誘導体を含む分子は、二本鎖を形成する能力を保持しなければならない。非限定的な例として、RNA分子はまた、少なくとも1つの修飾リボヌクレオシドを含むことができ、そのような修飾リボヌクレオシドとしては、限定するものではないが、2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、5'ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックド(locked)ヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾ヌクレオシド、2'-アミノ修飾ヌクレオシド、2'-アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデートもしくは非天然塩基を含むヌクレオシド、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。あるいは、RNA分子は修飾リボヌクレオシドを少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、またはそれ以上、dsRNA分子の全長まで、含むことができる。修飾は、RNA分子中のこのような複数の修飾リボヌクレオシドのそれぞれについて同一である必要はない。一態様では、本明細書に記載の方法および組成物における使用が意図される修飾RNAは、必要な二本鎖構造を形成する能力を有し、かつRISC経路を介して標的RNAの特異的抑制を可能にするかまたは媒介するペプチド核酸(PNA)である。
【００７９】
一局面では、修飾リボヌクレオシドには、デオキシリボヌクレオシドが含まれる。そのような場合、iRNA物質は1個または複数個のデオキシヌクレオシドを含むことができ、例えば、デオキシヌクレオシドオーバーハング、またはdsRNAの二本鎖部分内の1個または複数個のデオキシヌクレオシドなどである。しかしながら、用語「iRNA」に包含される二本鎖DNA分子がいかなる状況においても存在しないことは自明である。
【００８０】
一局面では、RNA干渉物質は、標的RNAの切断を指示するために標的RNA配列と相互作用する一本鎖RNAを含む。理論に縛られることを望むものではないが、植物および無脊椎動物細胞に導入された長い二本鎖RNAは、Dicerとして公知であるIII型エンドヌクレアーゼによってsiRNAに分解されると考えられる(Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485)。リボヌクレアーゼIII様酵素であるDicerは、特徴的な2塩基3'オーバーハングを有する19〜23塩基対の低分子干渉RNAへとdsRNAをプロセシングする(Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363)。次いで、siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に取り込まれ、そこでは1種または複数種のヘリカーゼがsiRNA二本鎖を巻き戻して、相補的アンチセンス鎖が標的認識をガイドできるようにする(Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309)。適切な標的mRNAに結合すると、RISC内の1つまたは複数種のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188)。したがって、一局面では、本明細書に記載の技術は、標的遺伝子のサイレンシングをもたらすためにRISC複合体の形成を促進する一本鎖RNAに関する。
【００８１】
本明細書で使用する用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、iRNAの二本鎖構造、例えばdsRNA、から突出する少なくとも1個の不対ヌクレオチドを指す。例えば、dsRNAの一方の鎖の3'末端が他方の鎖の5'末端を越えて延在する場合、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。dsRNAは、少なくとも1個のヌクレオチドのオーバーハングを含むことができるか；あるいは、オーバーハングは、少なくとも2個のヌクレオチド、少なくとも3個のヌクレオチド、少なくとも4個のヌクレオチド、少なくとも5個のヌクレオチド、またはそれ以上を含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド/ヌクレオシドなどの、ヌクレオチド/ヌクレオシド類似体を含むか、または該類似体からなることができる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはこれらの任意の組み合わせ上にあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、dsRNAのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの5'末端、3'末端、または両末端に存在し得る。
【００８２】
一態様では、dsRNAのアンチセンス鎖は、3'末端および/または5'末端に1〜10ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一態様では、dsRNAのセンス鎖は、3'末端および/または5'末端に1〜10ヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の態様では、オーバーハング中のヌクレオチドの1個または複数個は、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
【００８３】
dsRNAまたはdsDNAに関して本明細書で使用する用語「平滑」または「平滑末端化」は、dsRNAまたはdsDNA分子の所与の末端に不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が存在しないこと、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。dsRNAまたはdsDNAの一方または両方の末端は平滑であり得る。dsRNAまたはdsDNAの両端が平滑である場合、dsRNAまたはdsDNAは平滑末端であるといわれる。明確にすると、「平滑末端化」dsRNAまたはdsDNAは、両端が平滑であるdsRNAまたはdsDNAであり、すなわち該分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。ほとんどの場合、そのような分子はその全長にわたって二本鎖である。対照的に、「付着末端」は、少なくとも1個または複数個(典型的には2〜5個またはそれ以上)のヌクレオチドのオーバーハングを有するdsDNAまたはdsRNA分子を指す。
【００８４】
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むiRNA、例えばdsRNA、の鎖を指す。本明細書で使用する用語「相補性の領域」は、本明細書で定義されるような配列、例えば標的配列、に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が標的配列に十分に相補的でない場合、ミスマッチは該分子の内部または末端領域に存在し得る。一般的に、最も許容されるミスマッチは、末端領域にあり、例えば5'および/または3'末端の5、4、3、または2ヌクレオチド以内にある。
【００８５】
本明細書で使用する用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含むiRNAの鎖を意味する。
【００８６】
一態様では、本明細書で使用する用語「SNALP」は、安定な核酸-脂質粒子を指す。SNALPは、核酸、例えば、iRNA、またはそれからiRNAが転写されるプラスミドを含む縮小した水性内部を覆う脂質の小胞を表す。SNALPは、例えば、米国特許出願公開同第20060240093号、同第20070135372号、および国際出願番号WO2009082817に記載されている。これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。「SNALP」製剤の例は、本明細書の他の箇所に記載される。
【００８７】
本明細書で使用する表現「〜の発現を阻害する」とは、SH2B3阻害物質(例えば、本明細書に記載されるiRNA組成物)で処理した細胞におけるSH2B3をコードする遺伝子の遺伝子発現が、未処理細胞におけるSH2B3の発現と比較して、少なくとも部分的に減少することを指す。
【００８８】
本明細書において、用語「〜をサイレントにする」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方制御する」、「〜の発現を抑制する」などは、それらがSH2B3を指す限りでは、SH2B3をコードする遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指し、そうした抑制は、その遺伝子が転写されるがSH2B3の発現が阻害されるように処理されている第1の細胞または細胞群から単離または検出され得るSH2B3をコードするmRNAの量が、第1の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第2の細胞または細胞群(対照細胞)と比較して、減少していることにより明らかにされる。阻害の程度は通常、
2017536826.tif 000003
により表される。
【００８９】
あるいは、阻害の程度は、遺伝子発現と機能的に関連しているパラメータ、例えば遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または特定の表現型を示す細胞の数、の減少によってもたらされる。原理的には、遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム工学によって発現している任意の細胞において、適切なアッセイにより測定することができる。しかし、所与のiRNA (または遺伝子編集手段)がSH2B3をコードする遺伝子の発現をある程度阻害するかどうかを判断するために基準が必要とされ、それ故に該基準が本明細書に記載の技術に包含される場合、以下の実施例に提供されるアッセイはそのような基準として役立つであろう。
【００９０】
例えば、ある場合に、SH2B3の発現は、本明細書において特徴となっているiRNAの投与によって、少なくとも約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％抑制される。いくつかの態様では、細胞内のSH2B3をコードする遺伝子は、本明細書において特徴となっているiRNAまたは遺伝子編集手段(すなわち、CRISPR/Cas9またはCRISPR/Cpf1)の投与によって、少なくとも約60％、70％、または80％もしくは80％以上抑制される。いくつかの態様では、SH2B3をコードする遺伝子は、本明細書に記載されるiRNA(または遺伝子編集手段)の投与によって、少なくとも約85％、90％、95％、98％、99％、またはそれ以上抑制される。
【００９１】
iRNAに言及するとき、「細胞に導入する」とは、当業者には理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を促進するかまたは起こさせることを意味する。iRNAの吸収または取り込みは、自発的な拡散性もしくは能動性の細胞プロセスを介して、または補助剤もしくはデバイスによって起こり得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず；iRNAはまた、生体の一部である「細胞に導入する」こともできる。このような場合、細胞への導入には、生体への送達が含まれる。例えば、インビボ送達のために、iRNAは組織部位に注入されるか、または全身的に投与される。インビボ送達はまた、例えば、米国特許第5,032,401号および同第5,607,677号、ならびに米国特許出願公開第2005/0281781号(これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記載されるような、β-グルカン送達システムによって行うことができる。細胞へのインビトロ導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法が含まれる。さらなるアプローチは、本明細書で後述されるか、または当技術分野で公知である。
【００９２】
用語「対象」および「個体」は、本明細書では交換可能に使用され、動物、例えば本明細書に記載の方法で使用するための細胞を得ることができるヒト(すなわち、ドナー対象)および/または本明細書に記載の細胞による予防的処置を含む処置が施されるヒト、すなわちレシピエント対象を指す。ヒト対象などの特定の動物に特異的な状態または病状の処置では、対象という用語はその特定の動物を指す。本明細書では交換可能に使用される「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、雌ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などの哺乳動物が含まれる。用語「対象」はまた、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚類を含むがこれらに限定されない、あらゆる脊椎動物を包含する。しかし、有利には、対象は、ヒトのような哺乳動物、または飼育された哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどのようなもしくは生産用の哺乳動物、例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタなどのような他の哺乳動物である。
【００９３】
本明細書で使用する用語「投与する」は、所望の部位に薬剤を少なくとも部分的に送達させる方法または経路によって、本明細書に開示される化合物を対象に配置することを指す。本明細書に開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。投与は全身的または局所的であり得る。
【００９４】
本明細書で使用する用語「有効量」は、SH2B3のアンタゴニストを記載するために使用する場合、SH2B3タンパク質の活性、またはSH2B3 mRNAもしくはSH2B3タンパク質のレベルを、少なくとも10％、例えば、少なくとも10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、または少なくとも約90％低下させるのに十分な量を指す。
【００９５】
細胞生物学および分子生物学における一般用語の定義は、"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 第19版, Merck Research Laboratories発行, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (編), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.発行, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, Jones & Bartlett Publishing発行, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.発行, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)およびCurrent Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al.編に見出すことができる。
【００９６】
他に記載がない限り、本発明は、例えば下記の参照文献に記載されるような、標準的な方法を用いて実施した：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmel編, Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al.編, John Wiley and Sons, Inc.); Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al.編, John Wiley and Sons, Inc.); およびCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 著者R. Ian Freshney, 出版: Wiley-Liss; 第5版 (2005); Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes編, Academic Press, 第1版, 1998)；それらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９７】
本明細書で使用する用語「含む(comprising)」または「含む(comprises)」は、ある態様に有用である組成物、方法およびその各構成要素に関して使用されるが、有用であろうとなかろうと、不特定要素を含むように開かれている。
【００９８】
本明細書で使用する用語「本質的に〜からなる」は、所与の態様に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基本的かつ新規なまたは機能的な特徴に実質的に影響を与えない要素の存在を容認する。
【００９９】
実施例以外で、または他に指示がある場合を除き、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表す全ての数字は、いかなる場合も用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。用語「約」は、パーセンテージと関連して使用される場合、言及される値の±1％を意味し得る。例えば、約100は99から101を意味する。
【０１００】
本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。用語「含む(comprises)」は「包含する(includes)」を意味する。略語「例えば(e.g.)」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「e.g.」は用語「例えば(for example)」と同義である。
【０１０１】
多能性幹細胞および前駆細胞
いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞の集団は、造血幹細胞、造血前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)、胚性幹細胞、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１０２】
いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞の集団は哺乳動物由来である。いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞の集団はヒト由来である。
【０１０３】
いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞は自己ドナーから得られる。すなわち、幹細胞または前駆細胞のドナーは、そのような幹細胞および/または前駆細胞から誘導されたRBCのレシピエントでもある。いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞は、同種ドナー、例えば、輸血を必要とする対象の兄弟姉妹、親、または他の親族から得ることができる。自己献血および/または同種献血から恩恵を受けることができる患者の例は、当技術分野で周知であり、自己免疫疾患、血液疾患もしくは障害、免疫疾患もしくは障害、または他の関連する疾患または症状を有する患者が含まれるが、これらに限定されない。RBC適合性は当技術分野で周知であり、表1に要約される。
【０１０４】
（表１）赤血球適合表
2017536826.tif 000004
【０１０５】
いくつかの態様において、幹細胞の集団は造血幹細胞の集団である。HSCはCD34+細胞を含んでも含まなくてもよいことが当技術分野で公知である。CD34+細胞は、CD34細胞表面マーカーを発現する未成熟細胞である。CD34+細胞は、幹細胞特性を有する細胞の亜集団を含むと考えられる。HSCには、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞(例えば、リンパ系幹細胞)、および/または特定の造血系統への分化の方向が決定された(committed)幹細胞が含まれる。特定の造血系統への分化の方向が決定された幹細胞は、T細胞系統、B細胞系統、樹状細胞系統、ランゲルハンス細胞系統および/またはリンパ系組織特異的マクロファージ細胞系統のものであり得る。また、HSCは長期HSC (LT-HSC)および短期HSC (ST-HSC)をも指す。長期幹細胞は、典型的には、移植後の多分化系統生着(multilineage engraftment)への長期間(3ヶ月超)にわたる貢献を含む。短期幹細胞は、典型的には、3ヶ月より短い期間存続し、かつ/または多分化系統ではないものである。LT-HSCおよびST-HSCは、例えば、それらの細胞表面マーカーの発現に基づいて区別される。LT-HSCは、CD34-、SCA-1+、Thyl.l+/lo、C-kit+、Un-、CD135-、Slamfl/CD150+であり、一方ST-HSCは、CD34+、SCA-1+、Thy1.1+/lo、C-kit+、lin-、CD135-、Slamfl/CD150+、Mac-1 (CDlIb)loである(Handbook of Stem Cells. Lanza, R.P. et al. (編) Elsevier Academic Press Burlington, MA (2004))。さらに、ST-HSCは、LT-HSCよりも静止していることが少なく(すなわち、より活発であり)、より増殖性である。LT-HSCは無制限の自己複製を有する(すなわち、成人期を通して生存する)が、ST-HSCは自己複製が限られている(すなわち、限られた期間のみ生存する)。これらのHSCのいずれも、本明細書に記載の方法において有利に使用することができる。
【０１０６】
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法、組成物およびキットで使用するために包含される造血幹細胞(HSC)は、造血系統の全ての細胞を生成するように分化することができる原始的な細胞を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法および組成物で使用するために包含されるHSCはまた、自己複製する能力と、顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板(例えば、巨核芽球、血小板産出巨核球、血小板)、および/または単球(例えば、単球、マクロファージ)を含む、より成熟した血液細胞に分化する能力を有する。発生の間、造血部位は胎児肝臓から骨髄に移行し、その後骨髄は成人期を通して造血部位であり続ける。
【０１０７】
いくつかの態様では、幹細胞または前駆細胞は、O型の血液型でありそのため万能供血者(universal donor)である、ドナー対象から得られる。いくつかの態様では、幹細胞または前駆細胞は、O陰性(O-)の血液型(すなわち、O型、Rh因子陰性)であり、それゆえに万能供血者であるドナー対象から得られる。いくつかの態様では、幹細胞または前駆細胞またはHSCは、AB型の血液型でありかつ血漿の万能供血者である、対象から得られる。いくつかの態様では、幹細胞または前駆細胞は、レシピエント対象と同じ民族的背景の対象から得られる。
【０１０８】
（表２）異なる民族的背景における異なる血液型の分布を示す。
2017536826.tif 000005
【０１０９】
HSCは、血液製剤から得ることができる。血液製剤には、体内から、または造血起源の細胞を含む体内の器官から得られる製剤が含まれる。そのような供給源として、未分画骨髄、末梢血単核細胞、臍帯血、臍帯組織、末梢血(例えば、G-CSF動員末梢血)、肝臓、胸腺、リンパおよび脾臓が挙げられる。上記の粗製または未分画血液製剤の全ては、造血幹細胞の特性を有する細胞について、多くの方法で濃縮することができる。例えば、より成熟した分化細胞は、それらが発現する細胞表面分子によって選択される。任意で、血液製剤はCD34+細胞を選択することにより分画される。CD34+細胞は、自己複製および多能性化が可能な細胞の亜集団を含む。このような選択は、例えば市販の磁気抗CD34ビーズ(Dynal社, Lake Success, NY)を用いて、達成される。未分画血液製剤は、任意で、ドナーから直接得られるか、または凍結保存から回収される。
【０１１０】
HSC増大用の供給源には、大動脈-生殖腺-中腎(AGM)由来の細胞、胚性幹細胞(ESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)も含まれる。ESCは当技術分野において周知であり、商業的または学術的な供給源から得ることができる(Thomson et al., 282 Sci. 1145-47 (1998))。iPSCは、特定の遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって、非多能性細胞、典型的には成人の体細胞、から人工的に誘導されるタイプの多能性幹細胞である(Baker, Nature Rep. Stem Cells (Dec. 6, 2007); Vogel & Holden, 23 Sci. 1224-25 (2007))。ESC、AGM、およびiPSCは、動物またはヒトの供給源から誘導することができる。AGM幹細胞は、大動脈内で生まれ、胎児肝臓にコロニーを形成する細胞である。
【０１１１】
いくつかの態様では、幹細胞の集団はiPSCの集団である。用語「人工多能性幹細胞」または「iPSC」または「iPS細胞」は、分化した細胞(例えば、体細胞)の分化状態を多能性細胞へと再プログラミングすることから誘導された細胞を指す。人工多能性幹細胞は、(a)自己複製することができ、かつ(b)生物のあらゆる種類の細胞を産生するように分化することができる。iPS細胞は、ES細胞様の形態を有し、大きな核-細胞質比、明確な境界および顕著な核小体を有する平坦なコロニーとして増殖する。また、iPS細胞は、当業者に公知の1つまたは複数の重要な多能性マーカーを発現し、こうしたマーカーには、限定するものではないが、アルカリホスファターゼ、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、T AI60、TRA I81、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT、およびzfp42が含まれる。iPS細胞は、「再プログラミング因子」、すなわち、転写を変化させるように細胞に作用し、それによって細胞を多能性に再プログラミングする生物学的に活性な因子の1種または複数種を、例えばカクテルを細胞に提供することによって作製され得る。iPS細胞を作製して特徴決定する方法の例は、例えば、出願番号US20090047263、US20090068742、US20090191159、US20090227032、US20090246875、およびUS20090304646に見出すことができ、それぞれの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１２】
いくつかの態様では、幹細胞の集団は、核移植幹細胞(NT-ESC)またはヒトNT-ESC (hNT-ESC)の集団である。体細胞核移植(SCNT)により多能性幹細胞を作製するための方法は、当技術分野において周知であり、米国特許第5,843,780号および同第6,200,806号に開示される方法を含むだけでなく、体細胞核移植由来の胚盤胞の内部細胞塊からESCを取得する方法が米国特許第5,945,577号；同第5,994,619号；同第6,235,970号に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらに、SCNTの効率を高めるための方法は、2015年9月15日に出願された国際出願PCT/US15/50178に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。胚性幹細胞の際立った特徴は胚性幹細胞の表現型を特定する。したがって、ある細胞が胚性幹細胞のユニークな特徴を1つまたは複数有し、結果的にその細胞を他の細胞から区別することができるならば、その細胞は胚性幹細胞の表現型を有している。典型的な胚性幹細胞の際立った特徴としては、限定するものではないが、遺伝子発現プロファイル、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する応答性などが挙げられる。
【０１１３】
本明細書に記載される開示内容は、好ましい態様において、ヒトをクローニングするためのプロセス、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセス、産業上もしくは商業上の目的のためのヒト胚の使用、またはヒトもしくは動物に実質的な医学的利益を与えることなしに、苦痛をもたらす可能性がある動物の遺伝的同一性を改変するためのプロセスには関係しておらず、また、このようなプロセスから得られる動物にも関係していない。
【０１１４】
いくつかの態様において、前駆細胞の集団は造血前駆細胞の集団である。造血前駆細胞は、例えば骨髄、末梢血および臍帯血を含めて、様々な供給源から得ることができる。造血前駆細胞はまた、前駆細胞ドナーの末梢血からも得ることができる。末梢血から該細胞を採取する前に、骨髄から血液側(blood compartment)への細胞移動を促進するために、顆粒球コロニー刺激因子などのサイトカインでドナーを処置することができる。静脈内チューブを介して細胞を回収し、移植用の白血球を単離するために濾過することができる。得られた白血球集団(すなわち、様々な成熟度の幹細胞、前駆細胞および白血球の混合物)は、異種混合物として移植したり、または当業者に公知の細胞表面マーカーを用いて、造血前駆細胞をさらに単離したりすることが可能である。
【０１１５】
造血前駆細胞は、この用語を本明細書で使用する場合、造血系統の1つの型または複数の型の成熟細胞型に分化する能力があるが、長期間自己複製する能力はない。そのため、造血前駆細胞は造血を回復させて、3〜4ヶ月間維持することができ(Marshak, D. R., et al. (2001). Stem cell biology, Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press)、個体に造血前駆細胞を移植した直後の期間の回復にとって重要である。移植に有用な造血前駆細胞は、例えば、骨髄、末梢血、および臍帯血を含めて、様々な供給源から得ることができる。
【０１１６】
骨髄は、針で骨を穿刺し、骨髄細胞をシリンジで取り出すことにより得ることができる(本明細書では「骨髄穿刺液」と呼ぶ)。造血前駆細胞は、造血前駆細胞に特異的な表面マーカーを用いることにより、移植前に骨髄穿刺液から単離されるか、あるいは全骨髄を本明細書に記載の方法で処置される個体に移植することができる。
【０１１７】
造血前駆細胞および/または異種造血前駆細胞集団は、ヒト臍帯血および/または胎盤血から単離することもできる。このような血液は、当技術分野で公知のいくつかの方法によって採取することができる。例えば、臍帯血はHSPCの豊富な供給源であるため(Nakahata & Ogawa, 70 J. Clin. Invest. 1324-28 (1982); Prindull et al., 67 Acta. Paediatr. Scand. 413-16 (1978); Tchernia et al., 97(3) J. Lab. Clin. Med. 322-31 (1981)参照)、新生児の血液の優れた供給源は臍帯と胎盤である。凍結保存に先立って、新生児の血液は、臍帯からの直接ドレナージによって、かつ/または娩出された胎盤の根元および拡張した静脈での針吸引によって得ることができる。例えば、米国特許第7,160,714号；同第5,114,672号；同第5,004,681号；米国特許出願第10/076,180号、米国特許出願公開第20030032179号を参照されたい。実際、臍帯血幹細胞は、化学療法の骨髄破壊的用量での治療後に悪性および非悪性疾患の小児において造血を再構成するために使用されている。Sirchia & Rebulla, 84 Haematologica 738-47 (1999)。また、Laughlin 27 Bone Marrow Transplant. 1-6 (2001); 米国特許第6,852,534号も参照されたい。さらに、臍帯血中の幹細胞および前駆細胞は、成人骨髄中のものよりも、培養下でより大きな増殖能力があるようであると報告されている。Salahuddin et al., 58 Blood 931-38 (1981); Cappellini et al., 57 Brit. J. Haematol. 61-70 (1984)。
【０１１８】
あるいは、胎児の血液は、超音波によって誘導される針の使用により(Daffos et al., 153 Am. J. Obstet. Gynecol. 655-60 (1985); Daffos et al., 146 Am. J. Obstet. Gynecol. 985-87 (1983))、胎盤穿刺により(Valenti, 115 Am. J. Obstet. Gynecol. 851-53 (1973); Cao et al., 19 J. Med. Genet. 81-87 (1982))、胎児鏡検査により(Rodeck, in Prenatal Diagnosis, (Rodeck & Nicolaides編, Royal College of Obstetricians & Gynaecologists, London, 1984))、胎盤の根元の胎児循環から採取して、凍結保存することができる。実際、臍帯血および胎盤に加えて、絨毛膜絨毛および羊水は多能性胎児幹細胞の供給源である(WO2003 042405参照)。
【０１１９】
臍帯血の採取、処理、保存のための様々なキットおよび採取装置が公知である。例えば、米国特許第7,147,626号；米国特許出願第7,131,958号を参照されたい。採取は滅菌条件下で行う必要があり、血液は抗凝固剤で処理され得る。そのような抗凝固剤としては、例えば、クエン酸・リン酸・ブドウ糖、酸性クエン酸ブドウ糖、オルシーバー液(Alsever & Ainslie, 41 N.Y. St. J. Med. 126-35 (1941))、DeGowin's液(DeGowin et al., 114 JAMA 850-55 (1940))、Edglugate-Mg (Smith et al., 38 J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 573-85 (1959))、Rous-Turner液(Rous & Turner, 23 J. Exp. Med. 219-37 (1916))、他のグルコース混合液、ヘパリン、またはビスクマ酢酸エチルが挙げられる。Hum, Storage of Blood 26-160 (Acad. Press, NY, 1968)を参照されたい。
【０１２０】
当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載される様々な方法を用いて、採取された臍帯血をHSPCについて濃縮することができる。これらには、平衡密度遠心分離、単位重力における速度沈降、免疫再設定(immune rosetting)および免疫付着、対向流遠心エルトリエーション、Tリンパ球枯渇、ならびに蛍光活性化細胞選別が単独または組み合わせで含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第5,004,681号を参照されたい。
【０１２１】
いくつかの態様では、HSPCは、低温で調製された血液から得ることができる。いくつかの態様では、採取された血液は、以下のような凍結保護剤の添加によって低温保存用に調製される：DMSO (Lovelock & Bishop, 183 Nature 1394-95 (1959); Ashwood-Smith 190 Nature 1204-05 (1961))、グリセロール、ポリビニルピロリジン(Rinfret, 85 Ann. N.Y. Acad. Sci. 576-94 (1960))、ポリエチレングリコール(Sloviter & Ravdin, 196 Nature 899-900 (1962))、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、i-エリスリトール、D-リビトール、D-マンニトール(Rowe, 3(1) Cryobiology 12-18 (1966))、D-ソルビトール、i-イノシトール、D-ラクトース、塩化コリン(Bender et al., 15 J. Appl. Physiol. 520-24 (1960))、アミノ酸(Phan & Bender, 20 Exp. Cell Res. 651-54 (1960))、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート(Lovelock, 56 Biochem. J. 265-70 (1954))、および無機塩類(Phan & Bender, 104 Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1960))。血漿の添加(例えば、20％〜25％の濃度まで)は、DMSOの保護効果を増強することができる。
【０１２２】
採取された血液は、低温保存のために制御された速度で冷却する必要がある。異なる凍結保護剤および異なる細胞型は、異なる最適冷却速度を有する。例えば、Rapatz, 5 Cryobiology 18-25 (1968); Rowe & Rinfret, 20 Blood 636-37 (1962); Rowe, 3 Cryobiology 12-18 (1966); Lewis et al., 7 Transfusion 17-32 (1967); Mazur, 168 Science 939-49 (1970)を参照されたい。HSPC源の操作、凍結保存、長期貯蔵のための考慮事項および手順は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第4,199,022号；米国特許第3,753,357号；米国特許第4,559,298号；米国特許第5,004,681号を参照されたい。血液保存のための様々な装置が関連するプロトコールと共に存在する。米国特許第6,226,997号；米国特許第7,179,643号。
【０１２３】
HSPCのための血液の解凍および再構成における考慮事項も、当技術分野で公知である。米国特許第7,179,643号；米国特許第5,004,681号。血液はまた、凝集を防止するために(Spitzer, 45 Cancer 3075-85 (1980); Stiff et al., 20 Cryobiology 17-24 (1983)参照)、かつ毒性の凍結保護剤を除去するために(米国特許第5,004,681号)、処理され得る。
【０１２４】
幹細胞および/または前駆細胞を血液源から単離するための方法は、当技術分野で公知であり、ここで詳細に記載することはない。例えば、造血幹細胞は、造血幹細胞の表面抗原、例えばCD34、に結合する市販の抗体を用いて、当業者に公知の方法により単離することができる。
【０１２５】
一般的に、本明細書に記載の細胞は、当技術分野で利用可能であり周知の培養培地中に維持し、かつ増大させることができる。そのような培地としては、限定するものではないが、ダルベッコ改変イーグル培地、F-12K(商標)、イーグル最小必須培地(商標)(DMEM)、DMEM F12培地RTM、無血清(Serum-Free)(商標)RPMI-1640培地(商標)、イスコフ改変ダルベッコ培地(商標)(IMDM)が挙げられる。造血細胞を培養して増大させるための多くの培地は、ピルビン酸ナトリウム含有または不含の低グルコース処方物としても入手可能である。
【０１２６】
また、本明細書では、細胞培養培地に哺乳動物血清を補充することも意図される。血清は、多くの場合、生存と増大に必要な細胞因子および成分を含有する。血清の例には、ウシ胎児血清(FBS)、ウシ血清(BS)、仔ウシ血清(CS)、仔ウシ胎児血清(FCS)、新生仔ウシ血清(NCS)、ヤギ血清(GS)、ウマ血清(HS)、ヒト血清、ニワトリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、血清代替品およびウシ胚液が含まれる。当然、補体カスケードの成分を不活性化するために必要とみなされるならば、血清を55〜65℃で熱不活性化することができる。
【０１２７】
また、最適な増殖と増大に必要な微量元素を細胞に供給するために、追加の補充物を有利に使用することができる。このような補充物には、例えば、インスリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウムおよびそれらの組み合わせが含まれる。これらの成分は、限定するものではないが、(HBSS)、アール塩(EARLE'S SALT)(商標)、ハンクス平衡塩溶液、抗酸化補充物、MCDB-201(商標)、生理食塩溶液(PBS)、アスコルビン酸およびアスコルビン酸-2-リン酸、ならびに追加のアミノ酸類を含む塩溶液中に含めることができる。多くの細胞培養培地は既にアミノ酸類を含有するが、いくつかのアミノ酸は、細胞を培養する前に補充を必要とする。そのようなアミノ酸としては、限定するものではないが、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-システイン、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リシン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリンが挙げられる。これらの補充物の適切な濃度を決定することは、当業者の技量の範囲内である。
【０１２８】
ホルモンもまた、本明細書に記載の細胞培養物中で有利に使用することができ、限定するものではないが、D-アルドステロン、ジエチルスチルベストロール(DES)、デキサメタゾン、β-エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン/ヒト成長ホルモン(HGH)、チロトロピン、チロキシンおよびL-チロニンが含まれる。
【０１２９】
脂質および脂質担体もまた、細胞のタイプおよび分化した細胞の運命に応じて、細胞培養培地を補充するために使用することができる。そのような脂質および担体としては、限定するものではないが、とりわけ、コレステロール、アルブミン結合型リノール酸、シクロデキストリン、アルブミン結合型リノール酸およびオレイン酸、非結合型リノール酸、アルブミン結合型リノール酸-オレイン酸-アラキドン酸、ならびにアルブミン非結合型および結合型オレイン酸を挙げることができる。
【０１３０】
HSPCは、低血清または無血清培地で培養することができる。細胞の培養に使用される無血清培地は、例えば、米国特許第7,015,037号に記載されている。多くの細胞は、無血清または低血清培地で増殖されてきた。例えば、該培地には、1種または複数種の成長因子を補充することができる。一般に使用される成長因子には、骨形態形成タンパク質、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、表皮成長因子、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3リガンドおよびl'-3が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第7,169,610号；同第7,109,032号；同第7,037,721号；同第6,617,161号；同第6,617,159号；同第6,372,210号；同第6,224,860号；同第6,037,174号；同第5,908,782号；同第5,766,951号；同第5,397,706号；および同第4,657,866号を参照されたく；これらの全ては、無血清培地中での細胞の増殖を教示するために参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３１】
培養中の細胞は、懸濁液中に維持されるか、または細胞外マトリックス成分などの固体支持体に付着され得る。幹細胞は、しばしば、固体支持体へのそれらの付着を促進するさらなる因子を必要とし、例えば、I型およびII型コラーゲン、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」およびフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ポリ-Dおよびポリ-L-リシン、トロンボスポンジンおよびビトロネクチンなどの因子である。HSPCはまた、限定するものではないが、Corning低付着プレートなどの低付着フラスコ内で培養することができる。
【０１３２】
一態様では、造血幹細胞および/または前駆細胞は、それらをRBCに分化させ、そのRBCを回収し、続いてそれを必要とする個体に移植するために、造血細胞の集団を、本明細書に記載される少なくとも1種のSH2B3阻害物質(すなわち、SH2B3 iRNAまたは遺伝子編集システム)を含む組成物と接触させることによって、エクスビボで処理される。SH2B3阻害物質の有効濃度は、例えば、連続希釈を実施し、適切なインビトロアッセイまたは他の適切なシステムで有効性を試験することによって、当業者により決定され得る。造血幹細胞および/または前駆細胞を処理するための例示的な濃度範囲は、限定するものではないが、約1ナノモル〜約10ミリモル；約1mM〜約5mM；約1nM〜約500nM；約500nM〜約1,000nM；約1nM〜約1,000nM；約1μM〜約1,000μM；1μM〜約500μM；約1μM〜約100μM；約1μM〜約10μMである。一態様では、該濃度範囲は約5μM〜約500μMである。
【０１３３】
HSPCは、様々な時間にわたって処理することができる。適切な時間は、当業者によって決定され得る。例えば、細胞は、数分間、例えば5分、10分、15分、30分などにわたって処理することができるか、または数時間、例えば1時間、2時間、3時間、4時間、24時間まで、または数日間にもわたって処理することができる。一態様では、本明細書に記載の少なくとも1種のiRNAを含有する組成物を含まない培地に交換する前に、該細胞を2時間処理する。
【０１３４】
ひとたび培養下で樹立されたら、HSPC集団を増やすために本明細書に記載のように処理された細胞および/または未処理の細胞は、そのまま使用されるか、あるいは、例えば40％ FCSおよび10％ DMSOを含むDMEMを用いて、凍結ストックとして凍結保存することができる。培養細胞の凍結ストックを調製するための他の方法も、当業者に利用可能である。
【０１３５】
さらに、本明細書に開示される方法および組成物を用いて得られたRBCは、本明細書に記載の方法によって増大させることができ、その後、RBC凍結保存のための当技術分野で公知の技術を用いて凍結保存することができる。したがって、凍結保存を使用すると、RBCを維持することができ、その結果、対象が輸血を必要とすると判断されたとき、RBCを解凍して対象に移植することが可能である。
【０１３６】
SH2B3を阻害するための方法
SH2B3の阻害は、SH2B3タンパク質レベルの低下、SH2B3 mRNAレベルの低下、SH2B3タンパク質活性の低下、またはそれらの組み合わせをもたらし得る。SH2B3の阻害は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて行うことができ、例えば、限定するものではないが、ゲノム編集、遺伝子サイレンシング、正常SH2B3タンパク質活性の破壊、およびそれらの組み合わせが用いられる。
【０１３７】
いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞が増大および/または濃縮される前に、該細胞においてSH2B3を阻害することができる。いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞は、SH2B3阻害に先立って、増大および/または濃縮される。
【０１３８】
いくつかの態様では、SH2B3の阻害は、幹細胞および/または前駆細胞の集団を、SH2B3遺伝子についての少なくとも1個の幹細胞からの標的切除のためのゲノム編集物質と接触させることを含む。本明細書で使用する用語「ゲノム編集物質」は、生物のゲノム中のあるヌクレオチド配列を改変することができる化合物または組成物を指す。いくつかの態様では、ゲノム編集物質は、標的ゲノムから特定のヌクレオチド配列を切除することができる。いくつかの態様では、ゲノム編集物質は、特定のヌクレオチド配列の機能を、例えば該配列中の1つまたは複数の結合を切断することによって、破壊することができる。ゲノム編集は、ヌクレアーゼ媒介変異誘発、化学的変異誘発、放射線変異誘発、またはメガヌクレアーゼ媒介変異誘発などのプロセスを介して達成することができる。
【０１３９】
いくつかの態様では、ゲノム編集物質は、DNA結合メンバーとヌクレアーゼを含み、その場合、DNA結合メンバーは該ヌクレアーゼを標的部位に局在化させ、その後、該標的部位が該ヌクレアーゼによって切断される。
【０１４０】
いくつかの態様では、ゲノム編集物質はCRISPR/Casシステムである。いくつかの態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPR/Cas9であり、これは米国特許第8,697,359号および米国特許出願第2015/0291966号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。別の態様では、CRISPR/CasシステムはCRISPR/Cpf1であり、これはZetsche et al., 2015; Cell 163(3); 759-777 "Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System"に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。CRISPR/Casは、ゲノム工学に使用することができる、細菌システムに基づいた遺伝子工学的ヌクレアーゼシステムである。これは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答(adaptive immune response)の一部に基づいている。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入すると、侵入者のDNAのセグメントは、「免疫」応答によってCRISPR RNA (crRNA)に変換される。次いで、このcrRNAは、tracrRNAと呼ばれる別のタイプのRNAと、部分的相補性の領域を介して、会合して、Cas9またはCpf1ヌクレアーゼを、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的DNA中のcrRNAに相同な領域にガイドする。Cas9は、crRNA転写産物に含まれる20ヌクレオチドのガイド配列によって特定される部位での二本鎖切断(DSB)で、平滑末端を生じるように該DNAを切断する。Cas9は、部位特異的なDNA認識および切断のためにcrRNAとtracrRNAの両方を必要とする。このシステムは、現在、crRNAとtracrRNAを1つの分子(「単一ガイドRNA」)に合体させることができるように設計されており、この単一ガイドRNAのcrRNA等価部分は、Cas9ヌクレアーゼをガイドして所望の配列を標的とするように設計することができる(Jinek et al., (2012) Science 337, p. 816-821; Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471; およびDavid Segal, (2013) eLife 2:e00563を参照されたい)。別の態様では、CRISPR/Cpf1が使用され、この場合、Cpf1は、遺伝子編集複合体中にただ1つのRNA鋳型を必要とし、DNAを切断して5' TリッチPAMの遠位側に5ntの互い違いの切断(staggered cut)を生じ、(Cas9を使用する場合のような平滑末端ではなく)付着末端をもたらす。いくつかの態様では、置換遺伝子がSH2B3遺伝子の代わりに使用され、例えば、マーカー遺伝子、またはいくつかの態様では、細胞死遺伝子を使用することができ、該細胞死遺伝子は、誘導性プロモーターに機能的に連結され、それにより、改変(すなわち、SH2B3遺伝子欠損)細胞が対象に移植された後にそれらを排除する必要がある場合には、誘導性プロモーターからの発現を開始させる薬剤を用いて、そのような改変細胞の特異的に誘導できる細胞死を可能にすることができる。したがって、CRISPR/Cas (cas9またはcpf1)システムは、ゲノム中の所望の標的で二本鎖切断(すなわち、平滑末端(すなわち、cas9を使用)または付着末端(すなわち、cpf1を使用))をもたらすように設計することができ、二本鎖切断の修復は、誤りがちな修復(error prone repair)の増加を引き起こす修復阻害物質の使用によって影響され得る。
【０１４１】
少なくとも3つのタイプのCRISPR/Casシステムが存在し、これら全てはRNAとCasタンパク質を組み込んでいる。タイプIおよびタイプIIIの両方は、pre-crRNAをプロセシングするCasエンドヌクレアーゼを有し、pre-crRNAが完全にcrRNAにプロセシングされると、マルチCasタンパク質複合体をアセンブルして、crRNAに相補的な核酸を切断することが可能である。タイプII CRISPR (Cas9によって例示される)は、最もよく特徴づけされたシステムの1つである。Cas9タンパク質は少なくとも2つのヌクレアーゼドメインを有し、一方のヌクレアーゼドメインはHNHエンドヌクレアーゼに類似し、他方はRuvエンドヌクレアーゼドメインに類似する。HNH型ドメインはcrRNAに相補的なDNA鎖の切断に関与していると考えられるが、Ruvドメインは非相補鎖を切断する。
【０１４２】
いくつかの態様では、Casタンパク質は、天然に存在するCasタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。本明細書で使用する場合、天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」とは、天然配列ポリペプチドと質的な生物学的特性を共有する化合物である。「機能的誘導体」としては、対応する天然配列ポリペプチドと生物学的活性を共有するという条件で、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で意図される生物学的活性は、DNA基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合修飾体、およびそれらの融合体を包含する。
【０１４３】
本明細書で使用する場合、「Casポリペプチド」は、全長Casポリペプチド、Casポリペプチドの酵素的に活性な断片、およびCasポリペプチドまたはその断片の酵素的に活性な誘導体を包含する。Casポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Casタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合修飾体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
Casタンパク質およびCasポリペプチドは、細胞から得られるか、または化学合成されるか、またはこれら2つの方法の併用によって得ることができる。その細胞は、天然でCasタンパク質を産生する細胞、または天然でCasタンパク質を産生し、かつより高い発現レベルで内因性Casタンパク質を産生するように、もしくは内因性Casと同じまたは異なるCasをコードする外因的に導入された核酸からCasタンパク質を産生するように、遺伝子操作された細胞であり得る。その細胞は、天然でCasタンパク質を産生せず、Casタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得る。
【０１４５】
CRISPR/Casシステムはまた、遺伝子発現を阻害するためにも使用され得る。Leiら((2013) Cell 152(5):1173-1183)は、エンドヌクレアーゼ活性をなくして、触媒的に死んでいるCas9が、ガイドRNAと共発現されると、転写伸長、RNAポリメラーゼ結合または転写因子結合を特異的に妨害し得るDNA認識複合体を生成することを示している。このシステムは、CRISPR干渉(CRISPRi)と呼ばれ、標的遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。
【０１４６】
さらに、Casタンパク質は、その切断ドメインに変異を含むものが開発されており、該変異は、それらをDSB誘導不能にし、代わりに標的DNAにニックを導入するものである。具体的には、該Casヌクレアーゼは、標的DNAのセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ切断するための、2つのヌクレアーゼドメイン、HNHおよびRuvC様を含む。そのため、ヌクレアーゼドメインの1つだけが機能的であるように該Casヌクレアーゼを操作し、それによってCasニッカーゼを生成することができる。
【０１４７】
Cas9関連CRISPR/Casシステムは、2つのRNA非コード成分：tracrRNAおよびpre-crRNAアレイを含み、pre-crRNAアレイは、同一のダイレクトリピート(DR)によって間隔をおいて配置されたヌクレアーゼガイド配列(スペーサー)を含む。ゲノム編集を行うためにCRISPR/Casシステムを使用するためには、これらのRNAの両方の機能が存在しなければならない(Cong et al., (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143参照)。いくつかの態様では、tracrRNAおよびpre-crRNAは、別々の発現構築物を介して、または別々のRNAとして供給される。他の態様では、キメラRNAが構築され、この場合、操作された成熟crRNA(標的特異性を付与する)をtracrRNA (Cas9との相互作用を提供する)に融合させて、キメラcr-RNA-tracrRNAハイブリッド(単一ガイドRNAとも呼ばれる)を生成させる。
【０１４８】
Cpf1システムはCRISPR/Cas9システムに関連するが、Cpf1タンパク質はCas9と非常に異なっており、CRISPRを有するいくつかの細菌中に存在している。Cpf1とCas9は、Cas9がDNAを切断するために2つのRNA分子を必要とし、Cpf1は1つだけを必要とするという点で、異なって作用する。これらのタンパク質はまた、異なる場所でDNAを切断し、編集するための部位を選択する際に、より多くの選択肢を研究者らに提供する。Cpf1はまた、DNAを異なる方法で切断する。Cas9はDNA分子の両方の鎖を同じ位置で切断して、「平滑」末端をあとに残す。対照的に、Cpf1は一方の鎖を他方の鎖よりも長く残して、「付着」末端を生成し、切断部位に異常/ランダムDNAが挿入される機会を低減させ、さらにCpf1切断部位に挿入されるDNAのより良好なコントロールを可能にする。Cas9によって残された切断部は、2つの末端を一緒にくっつけることによって修復される傾向があり、それはエラーを残す可能性がある。対照的に、Cpf1付着末端切断は、より正確で頻繁な挿入を可能にする。
【０１４９】
いくつかの態様では、ゲノム編集物質はZFNである。ZFNは一般に、ジンクフィンガーDNA結合タンパク質およびDNA切断ドメインを含む。本明細書で使用する場合、「ジンクフィンガーDNA結合タンパク質」または「ジンクフィンガーDNA結合ドメイン」は、1つまたは複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でDNAに結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーは、その構造が亜鉛イオンの配位によって安定化されている結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質(ZFP)と略される。ジンクフィンガー結合ドメインは、予め決められたヌクレオチド配列に結合するように「操作する」ことができる。ジンクフィンガータンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、その設計/組成が主として合理的基準から生じる、天然には存在しないタンパク質である。設計の合理的基準には、既存のZFPの設計および結合データの情報を保存するデータベース内の情報を処理するための置換ルールおよびコンピュータアルゴリズムの適用が含まれる。
【０１５０】
いくつかの態様では、ゲノム編集物質はTALENである。本明細書で使用する用語「転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ」または「TALエフェクターヌクレアーゼ」または「TALEN」は、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって作製された人工制限エンドヌクレアーゼのクラスを指す。いくつかの態様では、TALENは、他のTALENの助けなしに二本鎖DNAを切断することができる単量体のTALENである。「TALEN」という用語はまた、同じ部位でDNAを切断するために一緒に作用するように設計された一対のTALENの一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に作用するTALENは、左TALENおよび右TALENと呼ぶことができ、これはDNAの左右像(handedness)を指定している。
【０１５１】
いくつかの態様では、ゲノム編集物質の組み合わせを使用することができる。
【０１５２】
いくつかの態様では、CRISPR/Cas、TALEN、またはZFN分子(例えば、ペプチドおよび/またはペプチド/核酸複合体)は、細胞、例えば、培養した幹細胞または前駆細胞に導入され得るが、CRISPR/Cas、TALEN、またはZFN分子の存在が一過性であり、その細胞の子孫において検出されないように導入される。いくつかの態様では、CRISPR/Cas、TALEN、またはZFN分子をコードする核酸(例えば、ペプチドおよび/またはペプチド/核酸複合体の部分をコードする複数の核酸)は、細胞、例えば、培養した幹細胞または前駆細胞に導入され得るが、該核酸が細胞中に一過性に存在し、CRISPR/Cas、TALEN、またはZFN分子をコードする核酸ならびにCRISPR/Cas、TALEN、またはZFN分子それ自体がその細胞の子孫において検出されないように導入される。いくつかの態様では、CRISPR/Cas、TALEN、またはZFN分子をコードする核酸(例えば、ペプチドおよび/またはペプチド/核酸複合体の部分をコードする複数の核酸)は、細胞、例えば、培養した幹細胞または前駆細胞に導入され得るが、該核酸が細胞内に維持され(例えば、ゲノムに組み込まれ)、かつCRISPR/Cas、TALEN、もしくはZFN分子をコードする核酸および/またはCRISPR/Cas、TALEN、もしくはZFN分子がその細胞の子孫において検出されるように導入される。
【０１５３】
ゲノム編集物質は、任意の適切な手段によって標的細胞に送達され得る。いくつかの態様では、ゲノム編集物質(例えば、CRISPR/Cas、TALEN、またはZFN)はタンパク質であり、タンパク質を細胞に送達するための適切な手段、例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム送達、およびナノ材料に基づく送達など、によって送達することができる。
【０１５４】
ゲノム編集物質はまた、ヌクレオチド配列によってコードされ得る。いくつかの態様では、ゲノム編集物質は、当業者に公知のベクターを用いて送達することができる。本発明において利用可能なウイルスベクターシステムとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：(a)アデノウイルスベクター；(b)レトロウイルスベクター；(c)アデノ随伴ウイルスベクター；(d)単純ヘルペスウイルスベクター；(e) SV 40ベクター；(f)ポリオーマウイルスベクター；(g)パピローマウイルスベクター；(h)ピコルナウイルスベクター；(i)オルソポックスなどのポックスウイルスベクター、例えばワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えばカナリア痘または鶏痘；(j)ヘルパー依存性またはガットレス(gutless)アデノウイルス；(k)レンチウイルスベクター；(l)アデノウイルスベクター；および(m)ヘルペスウイルスベクター。米国特許第6,534,261号; 同第6,607,882号; 同第6,824,978号; 同第6,933,113号; 同第6,979,539号; 同第7,013,219号; および同第7,163,824号を参照されたく；これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。また、複製欠損ウイルスも有利であり得る。
【０１５５】
いくつかの態様では、プラスミド発現ベクターを使用することができる。プラスミド発現ベクターとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：大腸菌(E. coli)宿主細胞、例えばBL21、BL21(DE3)、AD494(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)、Origami(DE3) (Novagen(登録商標)社)におけるタンパク質発現のためのpcDNA3.1、pETベクター(Novagen(登録商標)社)、pGEXベクター(GE Life Sciences社)、およびpMALベクター(New England labs社)；哺乳動物細胞株、例えばCHO、COS、HEK-293、Jurkat、MCF-7における発現のための強力なCMVプロモーターベースのpcDNA3.1 (Invitrogen(商標)社)およびpCIneoベクター(Promega社)；哺乳動物細胞におけるアデノウイルス媒介遺伝子導入および発現のための複製不能アデノウイルスベクターpAdeno X、pAd5F35、pLP-Adeno-X-CMV (Clontech(登録商標)社)、pAd/CMV/V5-DEST、pAd-DESTベクター(Invitrogen(商標)社)；哺乳動物細胞におけるレトロウイルス媒介遺伝子導入および発現のためのClontech社からのRetro-X(商標)システムと共に使用されるpLNCX2、pLXSN、およびpLAPSNレトロウイルスベクター；レンチウイルス媒介遺伝子導入および哺乳動物細胞での発現のためのpLenti4/V5-DEST(商標)、pLenti6/V5-DEST(商標)、およびpLenti6.2/V5-GW/lacZ (INVITROGEN(商標)社)；哺乳動物細胞におけるアデノ随伴ウイルス媒介遺伝子導入および発現のためのpAAV-MCSおよびpAAV-IRES-hrGFPのようなアデノウイルス関連ウイルス発現ベクター。
【０１５６】
ベクターは、細胞ゲノムに組み込まれても、組み込まれなくてもよい。構築物は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、エピソーム複製能を有するベクター、例えばEPVベクターおよびEBVベクター、に組み込むことができる。
【０１５７】
1つまたは複数のZFP、TALEN、CRISPR/Cas分子が細胞に導入される場合、ZFP、TALEN、CRISPR/Cas分子は、同じベクター上または異なるベクター上に担持され得る。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、1つまたは複数のZFP、TALEN、CRISPR/Cas分子をコードする配列を含むことができる。
【０１５８】
また、非ウイルスベースの送達方法を用いて、操作されたZFP、CRISPR/Cas分子、および/またはTALENをコードする核酸を細胞(例えば、幹細胞および/または前駆細胞)に導入することもできる。核酸の非ウイルス送達方法には、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ウイロゾーム(virosome)、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質-核酸コンジュゲート、裸のDNA、mRNA、人工ビリオン、および薬剤増強されたDNAの取り込みが含まれる。
【０１５９】
さらなる例示的な核酸送達システムには、Amaxa(登録商標) Biosystems社(Cologne, ドイツ)、Maxcyte社(Rockville, Md.)、BTX Molecular Delivery Systems社(Holliston, Mass.)、およびCopernicus Therapeutics社により提供されるものが含まれる(例えば、米国特許第6,008,336号を参照されたい)。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、米国特許第4,946,787号、および米国特許第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質には、FelgnerのWO91/17424、WO91/16024に記載のものが含まれる。
【０１６０】
ゲノム編集技術のさらなる詳細は、例えば、Takashi Yamamotoによる"Targeted Genome Editing Using Site-Specific Nucleases: ZFNs, TALENs, and the CRISPR/Cas9 System" (Springer, 2015)に見出すことができ、ゲノム編集に関する教示のために、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６１】
SH2B3アンタゴニスト
いくつかの態様では、SH2B3の阻害は、幹細胞および/または前駆細胞の集団をSH2B3のアンタゴニストと接触させることを含む。本明細書で使用する用語「SH2B3のアンタゴニスト」は、SH2B3のレベルおよび/または活性を低下させる任意の物質を指す。用語「SH2B3のアンタゴニスト」は、SH2B3の発現および/または活性を少なくとも10％、例えば、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％低下させる物質を指す。SH2B3のアンタゴニストの例には、限定するものではないが、無機分子、有機分子、核酸、核酸類似体または核酸誘導体、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、抗体またはその抗原結合断片、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１６２】
いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、本明細書では核酸作用物質とも呼ばれる、核酸またはその核酸類似体もしくは核酸誘導体である。当業者には理解されるように、一本鎖の記述はその相補鎖の配列をも規定する。したがって、核酸は、記述された一本鎖の相補鎖をも包含する。
【０１６３】
制限なしに、核酸作用物質は一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖核酸作用物質は、例えば内部自己相補性が存在する場合には、二本鎖領域を含むことができ、二本鎖核酸作用物質は一本鎖領域を含むことができる。核酸は所望の長さであってよい。特定の態様では、核酸の長さは約10〜100ヌクレオチドの範囲であり得る。様々な関連する態様では、一本鎖、二本鎖、および三本鎖の核酸作用物質は、長さが約10〜約50ヌクレオチド、約20〜約50ヌクレオチド、約15〜約30ヌクレオチド、約20〜約30ヌクレオチドの範囲であり得る。いくつかの態様では、核酸作用物質の長さは約9〜約39ヌクレオチドである。いくつかの他の態様では、核酸作用物質の長さは少なくとも30ヌクレオチドである。
【０１６４】
核酸作用物質は、当技術分野で公知の修飾ヌクレオシドを含むことができる。修飾は、例えば、核酸作用物質の安定性、溶解性、または活性を変更する細胞成分もしくは細胞外成分と核酸作用物質との相互作用を変えることができる。場合によっては、二本鎖核酸作用物質の一方または両方の鎖を修飾することが望ましいことがある。ある場合には、2本の鎖は異なる修飾を含むだろう。他の場合には、複数の異なる修飾を各鎖に含めることができる。所与の鎖上の種々の修飾は互いに異なってよく、また、他の鎖上の種々の修飾と異なってもよい。例えば、一方の鎖は1つの修飾を含むことができ、別の鎖は異なる修飾を含むことができる。他の場合には、一方の鎖は2つまたはそれ以上の異なる修飾を含むことができ、他方の鎖は第1の鎖上の少なくとも2つの修飾とは異なる修飾を含むことができる。
【０１６５】
いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、本明細書ではsiRNA、RNAi物質またはiRNA物質と呼ばれる、RNA干渉を誘導するのに有効な一本鎖および二本鎖核酸作用物質である。SH2B3においてRNA干渉を誘導するのに適したiRNA物質は、例えばWO2013/019857に開示されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６６】
SH2B3のRNAi阻害物質
一態様では、iRNA物質は、細胞、例えばヒト幹細胞および/または前駆細胞の集団中の細胞、におけるSH2B3をコードする遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)を含み、ここで、dsRNAは、SH2B3をコードする遺伝子の発現の際に形成されるmRNAの少なくとも一部に相補的な相補領域を有するアンチセンス鎖を含み、ここで、相補領域は長さが30ヌクレオチドまたはそれ未満であり、一般には長さが19〜24ヌクレオチドであり、ここで、dsRNAは、遺伝子SH2B3を発現する細胞に接触するかまたは該細胞に導入されると、例えばPCRもしくは分岐DNA(bDNA)ベースの方法によって、またはイムノアッセイもしくはウェスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法によってアッセイしたとき、該遺伝子の発現を少なくとも10％阻害する。細胞培養におけるSH2B3の発現は、例えばbDNAもしくはTaqManアッセイで、SH2B3 mRNAレベルを測定することによって、または、例えばウェスタンブロッティングもしくはフローサイトメトリー技術を用いた、免疫蛍光分析などで、タンパク質レベルを測定することによって、アッセイすることができる。
【０１６７】
いくつかの態様では、iRNA物質はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当業者は、一本鎖オリゴヌクレオチドが相補的な標的配列にハイブリダイズし、翻訳機構の標的RNA転写産物へのアクセスを妨げ、それによりタンパク質合成を妨げることを十分に理解している。一本鎖オリゴヌクレオチドはまた、相補的RNAにハイブリダイズすることができ、該RNA標的はその後RNase Hなどの酵素によって切断され、したがって、標的RNAの翻訳を妨げることができる。あるいは、またはさらに、一本鎖オリゴヌクレオチドは、標的配列のRISC媒介切断を介して標的配列の発現を調節することができ、すなわち、一本鎖オリゴヌクレオチドは一本鎖RNAi物質として作用する。本明細書で使用する「一本鎖RNAi物質」は、単一分子から構成されるRNAi物質である。一本鎖RNAi物質は、鎖内対合によって形成された二本鎖領域を含むことができ、例えば、それはヘアピンまたはパンハンドル構造であるか、または該構造を含み得る。
【０１６８】
いくつかの態様では、iRNA物質は、RNA干渉(RNAi)を介した標的遺伝子発現のサイレンシングに使用することができるタイトなヘアピンターンを作るRNAの配列の、小さなヘアピンRNAまたは短鎖ヘアピンRNA (shRNA)である。
【０１６９】
理論に縛られることを望むものではないが、SH2B3は、別名SH2Bアダプタータンパク質3またはLnk (NCBI遺伝子ID: 10019)としても公知であり、細胞内アダプタータンパク質ファミリーのメンバーであると考えられる。ホモサピエンスのSH2B3のmRNAは、少なくとも2つのアイソフォーム(NCBIアクセッション番号：NM_005475.5(転写変異体1)およびNM_001291424(転写変異体2))を有することが公知である。転写変異体1によってコードされるSH2B3は、NP_005466.1 (SEQ ID NO: 51)のアミノ酸配列を有し、以下の通りである:
2017536826.tif 000006
。
【０１７０】
SH2B3遺伝子の阻害は、当業者に一般的に公知である方法に従う遺伝子サイレンシングRNAi分子によることができる。例えば、ヒトSH2B3 (GenBank番号：NM_005475.5またはNM_001291424)に特異的にターゲティングされた遺伝子サイレンシングsiRNAオリゴヌクレオチド二本鎖を使用して、容易にSH2B3発現をノックダウンすることができる。SH2B3 mRNAは、siRNAを用いて首尾よくターゲティングされ得；他のsiRNA分子は、標的mRNAの既知の配列に基づいて、当業者によって容易に作製され得る。誤解を避けるために記すと、ヒトSH2B3の配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NM_005475.5 (SEQ ID NO: 52)で提供される。したがって、誤解を避けるために記すと、当業者は、RNAi (RNAサイレンシング)物質などの核酸阻害物質を、以下の通りであるNM_001005735.1 (SEQ ID NO: 52)の核酸配列に対して設計することができる:
2017536826.tif 000007
2017536826.tif 000008
2017536826.tif 000009
。
【０１７１】
いくつかの態様では、SH2B3を標的とするためのshRNAは、
2017536826.tif 000010
のヌクレオチド配列、またはその少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、もしくは少なくとも25個連続したヌクレオチドの断片を有する。
【０１７２】
いくつかの態様では、SH2B3を標的とするためのshRNAは、
2017536826.tif 000011
のヌクレオチド配列、またはその少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、もしくは少なくとも25個連続したヌクレオチドの断片を有する。
【０１７３】
いくつかの態様では、SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2のポリヌクレオチドまたはその少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、もしくは少なくとも25個連続したヌクレオチドの断片は、SH2B3を標的とするために組み合わせて使用することができる。
【０１７４】
いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストはmiRNA (「miR」とも呼ばれる)である。SH2B3を標的とすることが示されているmiRとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：miR-153、miR-9、miR-181、miR-101、miR-384/384-3p、miR-124/506、miR-320/320abcd、miR-138、miR-421、miR-320/320abcd、miR-30a/30a-5p/30b/30b-5p/30cde/384-5p、miR-134、miR-488、miR-300、miR-148/152、miR-202/202-3p、miR-30a/30a-5p/30b/30b-5p/30cde/384-5p、miR-384/384-3p、miR-138、miR-33/33ab、miR-125/351、miR-326/330/330-5p、miR-326/330/330-5p、miR-23ab、miR-144、miR-448、およびlet-7/98。
【０１７５】
一般的に、核酸分子を送達する方法はどれも、本明細書に記載の核酸作用物質と共に使用するために適合させることができる。
【０１７６】
RNA干渉物質、例えばsiRNA、またはRNA干渉物質を含むベクターを、取り込みのために、標的細胞、例えば幹細胞および/または前駆細胞に送達する方法には、siRNAなどのRNA干渉物質を含む組成物の注入、またはsiRNAなどのRNA干渉物質を含む組成物と該細胞との直接接触が含まれる。別の態様では、RNA干渉物質、例えばsiRNAは、静脈、動脈、小静脈、または小動脈のような任意の血管に、例えばハイドロダイナミック注入法またはカテーテル挿入法によって、直接注入することができる。投与は単回注入でも、2回またはそれ以上の注入でもよい。RNA干渉物質は、薬学的に許容される担体中に含めて送達される。1種または複数種のRNA干渉物質を同時に使用することができる。一態様では、特定の細胞がRNA干渉により標的とされて、潜在的副作用を制限する。この方法は、例えば、細胞ターゲティング部分とRNA干渉結合部分とを含む複合体または融合分子を使用することができ、該複合体または融合分子はRNA干渉を効果的に細胞に送達するために使用される。例えば、抗体-プロタミン融合タンパク質は、siRNAと混合したときsiRNAに結合し、該抗体によって認識される抗原を発現する細胞にsiRNAを選択的に送達し、結果的に、該抗原を発現する細胞においてのみ遺伝子発現のサイレンシングをもたらす。siRNAまたはRNA干渉誘導分子結合部分は、タンパク質またはタンパク質の核酸結合ドメインもしくは断片であり、該結合部分はターゲティング部分の一部に融合される。ターゲティング部分の位置は、構築物のカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれか、または融合タンパク質の中ほどであり得る。また、ウイルス媒介送達機構は、Xia, H. et al. ((2002) Nat Biotechnol 20(10):1006)に記載されるように、インビトロおよびインビボで細胞にsiRNAを送達するために用いられることができる。shRNAのプラスミドまたはウイルス媒介送達機構はまた、インビトロおよびインビボで細胞にshRNAを送達するために用いられることができ、Rubinson, D.A., et al. ((2003) Nat. Genet. 33:401-406)およびStewart, S.A., et al. ((2003) RNA 9:493-501)に記載される通りである。RNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAは、以下の活性の1つまたは複数を行う成分と共に導入され得る：細胞によるsiRNAなどのRNA干渉物質の取り込みを高める活性；一本鎖のアニーリングを阻害する活性；一本鎖を安定化させるか、さもなければ標的細胞への送達を促進する活性；およびSH2B3などの標的遺伝子の阻害を増加させる活性。特定のRNA干渉物質の用量は、特定の標的遺伝子のRNA干渉、例えば翻訳後遺伝子サイレンシング(PTGS)をもたらし、それによって標的遺伝子発現の阻害または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻害をもたらすのに必要な量である。
【０１７７】
オリゴヌクレオチド修飾
いくつかの態様では、本明細書に開示される本発明の局面で使用するためのSH2B3を阻害するRNAi物質は、オリゴヌクレオチド修飾を含むことができる。未修飾オリゴヌクレオチドは、いくつかの適用において最適ではない場合があり、例えば、未修飾オリゴヌクレオチドは、例えば細胞ヌクレアーゼによる、分解を受けやすい傾向がある。しかし、オリゴヌクレオチドのサブユニットの1つまたは複数への化学修飾は、改善された特性を付与することができ、例えば、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安定にすることができる。典型的なオリゴヌクレオチド修飾は、以下の1つまたは複数を含み得る：(i)ホスホジエステル糖間結合の非結合ホスフェート酸素の一方もしくは両方および/または結合ホスフェート酸素の1個または複数個の改変、例えば置換；(ii)リボース糖の構成成分、例えばリボース糖上の2'ヒドロキシルの改変、例えば置換；(iii)ホスフェート部分の「デホスホ」(dephospho)リンカーによる全面的置換；(iv)天然に存在する塩基の非天然塩基による修飾または置換；(v)リボース-リン酸骨格の置換または修飾、例えば、ペプチド核酸(PNA)；(vi)オリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換、またはオリゴヌクレオチドの3'もしくは5'末端のいずれかへの、ある成分のコンジュゲーション、例えばリガンドのコンジュゲーション；ならびに(vii)糖の修飾、例えば6員環。
【０１７８】
この文脈で使用する置換、修飾、改変などの用語は、何らかのプロセスの制限を意味するものではなく、例えば、修飾は、基準物質または天然に存在するリボ核酸から開始して、修飾リボ核酸を生成するようにそれを修飾しなければならないことを意味するものではなく、むしろ修飾は、天然に存在する分子からの差異を単に示すにすぎない。後述するように、修飾、例えば本明細書に記載の修飾は、非対称修飾として提供され得る。
【０１７９】
本明細書に記載の修飾は、唯一の修飾であるか、または複数のヌクレオチドに含まれる唯一のタイプの修飾であるか、または本明細書に記載の1つまたは複数の他の修飾と組み合わせることができる。本明細書に記載の修飾はまた、1つのオリゴヌクレオチド上に組み合わせることができ、例えば、オリゴヌクレオチドの異なるヌクレオチドが本明細書に記載の異なる修飾を有する。
【０１８０】
本明細書には、SH2B3の発現を阻害するiRNA物質が記載される。一態様では、iRNA物質は、エクスビボで細胞、例えば血液またはUCBから得られたHSPC、におけるSH2B3の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を含み、ここで、該dsRNAは、SH2B3の発現において形成されるmRNAの少なくとも一部に相補的な相補領域を有するアンチセンス鎖を含み、該相補領域は長さが30ヌクレオチドまたはそれ未満であり、一般には長さが19〜24ヌクレオチドであり、ここで、該dsRNAは、SH2B3をコードする遺伝子を発現する細胞に接触するかまたは該細胞に導入されると、例えばPCRもしくは分岐DNA (bDNA)ベースの方法によって、またはイムノアッセイもしくはウェスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法によってアッセイしたとき、該遺伝子の発現を少なくとも10％阻害する。HSPCなどの細胞培養におけるSH2B3の発現は、例えばbDNAもしくはTaqManアッセイで、SH2B3のmRNAレベルを測定することによって、または、例えばウェスタンブロッティングもしくはフローサイトメトリー技術を用いた、免疫蛍光分析などで、タンパク質レベルを測定することによって、アッセイすることができる。
【０１８１】
dsRNAは、dsRNAが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成するために相補的な2本のRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列に対して実質的に相補的な、一般には完全に相補的な、相補領域を含む。標的配列は、SH2B3 mRNAの配列、例えば本明細書に開示されるSEQ ID NO: 52の配列から誘導することができる。他方の鎖(センス鎖)は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、その結果、2本の鎖は、適切な条件下で組み合わされると、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するようになる。一般的に、二本鎖構造は、15〜30塩基対、より一般的には18〜25、さらに一般的には19〜24、最も一般的には19〜21塩基対の長さである。同様に、標的配列に対する相補領域は、15〜30ヌクレオチド、より一般的には18〜25、さらに一般的には19〜24、最も一般的には19〜21ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、dsRNAは15〜20ヌクレオチドの長さであり、他の態様では、dsRNAは25〜30ヌクレオチドの長さである。当業者には認識されるように、切断の標的とされるRNAの標的領域は、ほとんどの場合、より大きなRNA分子、しばしばmRNA分子、の一部である。適切な場合、mRNA標的の「一部」は、RNAi誘導切断(すなわち、RISC経路を介する切断)の基質となるのに十分な長さのmRNA標的の連続した配列である。9塩基対程度の短い二本鎖を有するdsRNAは、ある状況下では、RNAi誘導型RNA切断を媒介することができる。ほとんどの場合、標的は少なくとも15ヌクレオチドの長さ、好ましくは15〜30ヌクレオチドの長さである。
【０１８２】
当業者はまた、二本鎖領域、例えば9〜36、例えば15〜30塩基対の二本鎖領域が、dsRNAの主要機能部分であることを認識するであろう。したがって、一態様では、それが、所望のRNAを切断の標的とする、例えば15〜30塩基対の、機能的二本鎖にプロセシングされるようになる限りでは、30塩基対を超える二本鎖領域を有するRNA分子またはRNA分子の複合体はdsRNAである。したがって、当業者は、一態様では、miRNAがdsRNAであることを認識するであろう。別の態様では、dsRNAは天然に存在するmiRNAではない。別の態様では、SH2B3の発現を標的とするのに有用なiRNA物質が、より大きなdsRNAの切断によって標的細胞内で生成されない。
【０１８３】
本明細書に記載のdsRNAは、1つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。dsRNAは、例えば、Biosearch社、Applied Biosystems社から市販されているような、自動DNA合成機の使用により、以下でさらに説明するように、当技術分野で公知の標準方法によって合成することができる。一態様では、SH2B3をコードする遺伝子はヒト遺伝子である。別の態様では、SH2B3をコードする遺伝子はマウスまたはラット遺伝子である。
【０１８４】
一局面では、dsRNAは、センス鎖とアンチセンス配列の少なくとも2つのヌクレオチド配列を含み、センス鎖はSEQ ID NO: 52である。この局面では、2つの配列の一方は2つの配列の他方と相補的であり、それらの配列の1つはSH2B3 mRNAの配列に対して実質的に相補的である。本明細書の他の箇所に記載され、当技術分野で公知であるように、dsRNAの相補配列は、単一核酸分子の自己相補領域として含めることができ、別個のオリゴヌクレオチド上にあるのとは対照的である。
【０１８５】
当業者は、20〜23塩基対、特に21塩基対、の二本鎖構造を有するdsRNAが、RNA干渉を誘導する上で特に有効であるとされていることを十分に理解している(Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888)。しかしながら、他の当業者は、より短いまたはより長いRNA二本鎖構造もまた有効であり得ることを見出した。上記の態様では、表2〜7に提供された配列識別子によって同定されるオリゴヌクレオチド配列の性質に基づいて、本明細書に記載のdsRNAは、少なくとも21ntの長さの少なくとも1本の鎖を含むことができる。表2〜7の配列の1つから一方または両方の末端のほんの数ヌクレオチドを差し引いたより短い二本鎖は、上記のdsRNAと比較して同様に有効であり得ることが当然期待される。したがって、SEQ ID NO: 1または2の配列の1つ由来の少なくとも15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上の連続したヌクレオチドの部分配列を有し、かつSH2B3をコードする遺伝子の発現を阻害するその能力が全配列を含むdsRNAと5、10、15、20、25、または30％以下の阻害によって異なるdsRNAは、本明細書に記載の技術に従って意図される。
【０１８６】
標的配列は一般的に15〜30ヌクレオチドの長さであるが、所与の標的RNAの切断を導くためのこの範囲内の特定の配列の適合性にはかなりの幅がある。様々なソフトウェアパッケージおよび本明細書に記載のガイドラインは、所与の遺伝子標的のための最適な標的配列を同定するための指針を提供するが、実証的アプローチを採用することもでき、その場合には、所与のサイズ(非限定的な例として、21ヌクレオチド)の「ウィンドウ」または「マスク」を、標的RNA配列上に文字通りに(literally)または文字通りでなく(figuratively)(例えば、インシリコ)配置して、標的配列として機能し得るサイズ範囲内の配列を同定する。配列「ウィンドウ」を、最初の標的配列位置の上流または下流で1ヌクレオチドずつ漸進的に移動させることによって、可能性のある配列の完全なセットが選択された所与の標的サイズについて同定されるまで、次の潜在的な標的配列を同定することができる。最適に機能する配列を同定するためのこのプロセスは、(本明細書に記載の、または当技術分野で公知のアッセイを用いて)同定された配列の系統的合成および試験と相まって、iRNA物質により標的とされた場合に、標的遺伝子発現の最大阻害を媒介するRNA配列を同定することができる。したがって、例えば表2〜7の配列識別子により同定された配列は、有効な標的配列を表すが、阻害効率のさらなる最適化は、同等またはより良好な阻害特性を有する配列を同定するために、所与の配列の上流または下流で1ヌクレオチドずつ漸進的に「ウィンドウをウォーキングする」(walking the window)ことによって、達成され得ると考えられる。
【０１８７】
さらに、配列識別子NO：1または2によって同定された任意の配列について、さらなる最適化は、ヌクレオチドを系統的に追加または除去して、より長いまたはより短い配列を作製し、これらの配列と、より長いまたはより短いサイズのウィンドウをそのポイントから標的RNAの上または下にウォーキングすることにより作製された配列を試験することによって、達成され得ると考えられる。ここでもまた、新しい候補標的を作製するためのこのアプローチを、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載の阻害アッセイでこれらの標的配列に基づくiRNAの有効性について試験することと組み合わせることは、阻害効率のさらなる改善につながる可能性がある。さらに、そのような最適化された配列は、例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加または変化、あるいは発現阻害物質としての該分子をさらに最適化すための、当技術分野で公知のおよび/または本明細書で説明される他の修飾(例えば、血清安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜貫通送達の増強、特定の位置または細胞型へのターゲティング、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加など)によって、調整することができる。
【０１８８】
本明細書に記載のiRNAは、標的配列に対する1つまたは複数のミスマッチを含むことができる。一態様では、本明細書に記載のiRNAは、3つ以下のミスマッチを含む。iRNAのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域は相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。iRNAのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、そのミスマッチは、相補性の領域の5'末端または3'末端から最後の5ヌクレオチド以内となるように制限されることが好ましい。例えば、SH2B3をコードする遺伝子の領域に相補的な23ヌクレオチドiRNA物質のRNA鎖の場合、該RNA鎖は一般に、中央の13ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含まない。本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の方法を用いて、標的配列とのミスマッチを含むiRNAがSH2B3の発現を阻害するのに有効であるか否かを判定することができる。ミスマッチを有するiRNAのSH2B3発現の阻害における効果を考慮することは、特に、SH2B3遺伝子に対する相補性の特定の領域が集団内で多型配列変異を有することが公知である場合には、重要である。
【０１８９】
一態様では、dsRNAの少なくとも1つの末端は、1〜4ヌクレオチド、一般に1または2ヌクレオチドの、一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを有するdsRNAは、それらの平滑末端の対応物と比較して予想外に優れた阻害特性を有する。さらに別の態様では、iRNA、例えばdsRNA、のRNAは、安定性または他の有益な特性を高めるために化学的に修飾される。本明細書に記載の技術において取り上げられた核酸は、当技術分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み入れられる"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S. L. et al. (編), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USAに記載される方法、によって合成および/または修飾することができる。修飾には、例えば、以下が含まれる：(a)末端修飾、例えば5'末端修飾(リン酸化、コンジュゲーション、逆位結合など)、3'末端修飾(コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、逆位結合など)、(b)塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、またはパートナーの拡大されたレパートリーと塩基対合する塩基、塩基の除去(脱塩基ヌクレオチド)、またはコンジュゲート化塩基による置換、(c)糖修飾(例えば、2'位または4'位)または糖の置換、ならびに(d)骨格修飾、例えば、ホスホジエステル結合の修飾または置換。本明細書に記載の態様において有用なRNA化合物の特定の例には、修飾された骨格を含むRNAまたは天然のヌクレオシド間結合を含まないRNAが含まれるが、これらに限定されない。修飾された骨格を有するRNAは、とりわけ、骨格中にリン原子がないものを含む。本明細書の目的のために、また、当技術分野で時々言及されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾RNAもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。特定の態様では、修飾RNAは、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有する。
【０１９０】
修飾RNA骨格には、例えば、以下が含まれる：ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば3'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば3'-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'または2'-5'から5'-2'に結合している逆極性を有するもの。様々な塩、混合塩、および遊離酸の形態も含まれる。
【０１９１】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、限定するものではないが、米国特許第3,687,808号; 同第4,469,863号; 同第4,476,301号; 同第5,023,243号; 同第5,177,195; 同第5,188,897号; 同第5,264,423号; 同第5,276,019号; 同第5,278,302号; 同第5,286,717号; 同第5,321,131号; 同第5,399,676号; 同第5,405,939号; 同第5,453,496号; 同第5,455,233号; 同第5,466,677号; 同第5,476,925号; 同第5,519,126号; 同第5,536,821号; 同第5,541,316号; 同第5,550,111号; 同第5,563,253号; 同第5,571,799号; 同第5,587,361号; 同第5,625,050号; 同第6,028,188号; 同第6,124,445号; 同第6,160,109号; 同第6,169,170号; 同第6,172,209号; 同第6,239,265号; 同第6,277,603号; 同第6,326,199号; 同第6,346,614号; 同第6,444,423号; 同第6,531,590号; 同第6,534,639号; 同第6,608,035号; 同第6,683,167号; 同第6,858,715号; 同第6,867,294号; 同第6,878,805号; 同第7,015,315号; 同第7,041,816号; 同第7,273,933号; 同第7,321,029号; および米国再発行特許第39464号が含まれ；これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９２】
リン原子を含まない修飾RNA骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、以下を有するものが含まれる：モルホリノ結合(ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される)；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにN、O、SおよびCH2構成部分が混在する他のもの。
【０１９３】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、限定するものではないが、米国特許第5,034,506号; 同第5,166,315号; 同第5,185,444号; 同第5,214,134号; 同第5,216,141号; 同第5,235,033号; 同第5,64,562号; 同第5,264,564号; 同第5,405,938号; 同第5,434,257号; 同第5,466,677号; 同第5,470,967号; 同第5,489,677号; 同第5,541,307号; 同第5,561,225号; 同第5,596,086号; 同第5,602,240号; 同第5,608,046号; 同第5,610,289号; 同第5,618,704号; 同第5,623,070号; 同第5,663,312号; 同第5,633,360号; 同第5,677,437号; および同第5,677,439号が含まれ；これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９４】
他の態様では、iRNAでの使用に適したRNA模倣体が意図され、そこでは、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格、が新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の1つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたRNA模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物では、RNAの糖骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持されて、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、限定するものではないが、米国特許第5,539,082号; 同第5,714,331号; および同第5,719,262号が含まれ、これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。PNA化合物のさらなる教示は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
【０１９５】
リン酸基の修飾：糖間結合におけるリン酸基は、酸素の1つを異なる置換基で置換することによって修飾することができる。RNAリン酸糖間結合へのこの修飾の1つの結果は、核酸分解に対する該オリゴヌクレオチドの抵抗性の増加であり得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。いくつかの態様では、糖間結合中の非架橋ホスフェート酸素原子の1つは、以下のいずれかによって置換され得る：S、Se、BR3 (Rは水素、アルキル、アリールである)、C (すなわち、アルキル基、アリール基など)、H、NR2 (Rは水素、置換されてもよいアルキルまたはアリールである)、またはOR (Rは置換されてもよいアルキルまたはアリールである)。修飾されてないリン酸基のリン原子はアキラルである。しかし、非架橋酸素の1つを上記原子または原子団の1つで置換すると、リン原子がキラルになり；換言すれば、このように修飾されたリン酸基のリン原子は立体中心(stereogenic center)である。立体中心のリン原子は、「R」立体配置(本明細書ではRp)または「S」立体配置(本明細書ではSp)のいずれかを保持し得る。
【０１９６】
ホスホロジチオエートは、架橋していない両方の酸素が硫黄で置換される。ホスホロジチオエートのリン中心はアキラルであり、オリゴヌクレオチドのジアステレオマーの形成を不可能にする。したがって、理論に縛られることを望むものではないが、キラル中心を排除する両方の非架橋酸素への修飾、例えば、ホスホロジチオエートの形成は、ジアステレオマー混合物を生成できない点で望ましいと考えられる。したがって、非架橋酸素は、独立して、O、S、Se、B、C、H、N、またはOR (Rはアルキルまたはアリールである)のいずれかであり得る。
【０１９７】
リン酸リンカーはまた、架橋酸素(すなわち、リン酸をヌクレオシドに結合する酸素)を、窒素(架橋ホスホロアミデート)、硫黄(架橋ホスホロチオエート)および炭素(架橋メチレンホスホネート)で置換することによって修飾することもできる。この置換は、結合酸素のいずれか一方で、または両方の結合酸素で起こり得る。架橋酸素がヌクレオシドの3'-酸素である場合、炭素での置換が好適である。架橋酸素がヌクレオシドの5'-酸素である場合は、窒素での置換が好適である。
【０１９８】
リン酸に結合した酸素の少なくとも1つが置換されているか、またはリン酸基が非リン基で置換されている、修飾されたリン酸結合は、「非ホスホジエステル糖間結合」または「非ホスホジエステルリンカー」とも呼ばれる。
【０１９９】
リン酸基の置換：リン酸基は、非リン含有コネクタ、例えばデホスホ(dephospho)リンカー、で置換することができる。デホスホリンカーは、本明細書では非ホスホジエステルリンカーとも呼ばれる。理論に縛られることを望むものではないが、荷電したホスホジエステル基は核酸分解の反応中心であるため、中性構造模倣体とのその置換は、ヌクレアーゼ安定性の向上をもたらすはずであると考えられる。やはり、理論に縛られることを望むものではないが、いくつかの態様では、荷電したリン酸基が中性の部分/基(moiety)で置換される改変を導入することが望ましい場合がある。
【０２００】
リン酸基と置換できる部分/基の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：アミド(例えばアミド-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5')およびアミド-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5'))、ヒドロキシルアミノ、シロキサン(ジアルキルシロキサン)、カルボキサミド、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、カルボン酸エステル、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルフィド、スルホネート、スルホンアミド、スルホン酸エステル、チオホルムアセタール(3'-S-CH2-O-5')、ホルムアセタール(3'-O-CH2-O-5')、オキシム、メチレンイミノ、メチレンカルボニルアミノ、メチレンメチルイミノ(MMI, 3'-CH2-N(CH3)-O-5')、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノ、エーテル(C3'-O-C5')、チオエーテル(C3'-S-C5')、チオアセトアミド(C3'-N(H)-C(=O)-CH2-S-C5'、C3'-O-P(O)-O-SS-C5'、C3'-CH2-NH-NH-C5'、3'-NHP(O)(OCH3)-O-5'および3'-NHP(O)(OCH3)-O-5'、ならびにN、O、SおよびCH2構成部分が混在する非イオン性結合。例えば、Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook編, ACS Symposium Series 580; Chapters 3および4, (pp. 40-65)を参照されたい。好ましい態様には、メチレンメチルイミノ(MMI)、メチレンカルボニルアミノ、アミド、カルバメートおよびエチレンオキシドリンカーが含まれる。
【０２０１】
当業者は、場合によっては、非架橋酸素の置換が、隣接する2'-OHによる糖間結合の切断の高まりにつながり得ることを十分に認識しており、したがって、多くの場合、非架橋酸素の修飾は、2'-OHの修飾、例えば、隣接する糖間結合の切断に関与しない修飾、例えばアラビノース糖、2'-O-アルキル、2'-F、LNAおよびENAを必要とする可能性がある。
【０２０２】
好ましい非ホスホジエステル糖間結合には、ホスホロチオエート、Sp異性体の少なくとも1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはそれ以上のエナンチオマー過剰率を有するホスホロチオエート、Rp異性体の少なくとも1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはそれ以上のエナンチオマー過剰率を有するホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホネート(例えば、メチルホスホネート)、セレノホスフェート、ホスホロアミデート(例えば、N-アルキルホスホロアミデート)およびボラノホスホネートが含まれる。
【０２０３】
リボホスフェート(ribophosphate)骨格の置換：また、オリゴヌクレオチド模倣足場を構築することもでき、その場合には、リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ抵抗性のヌクレオシドまたはヌクレオチド代用物によって置換される。理論に縛られることを望むものではないが、繰り返し荷電された骨格の不在は、ポリアニオンを認識するタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ)への結合を減少させると考えられる。やはり、理論に縛られることを望むものではないが、いくつかの態様では、塩基が中性の代用骨格でつながれる改変を導入することが望ましい場合がある。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、ペプチド核酸(PNA)、アミノエチルグリシルPNA (aegPNA)および骨格延長ピロリジンPNA (bepPNA)ヌクレオシド代用物が挙げられる。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドはペプチド核酸であり、例えば、オリゴヌクレオチドのリボホスフェート骨格はペプチド核酸(PNA)で完全に置換される。
【０２０４】
糖の修飾：オリゴヌクレオチドは、核酸の全てまたは一部の糖基の修飾を含むことができる。例えば、2'位(H, DNA; またはOH, RNA）は、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾され得る。理論に縛られることを望むものではないが、2'-ヒドロキシルはもはや脱プロトン化されて2'-アルコキシドイオンを形成することができないので、安定性の向上が期待される。2'-アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃による分解を触媒することができる。再び理論に縛られることを望むものではないが、いくつかの態様では、2'位でのアルコキシド形成が不可能である改変を導入することが望ましい場合がある。
【０２０５】
「オキシ」-2'ヒドロキシル基修飾の例としては、以下が挙げられる：アルコキシまたはアリールオキシ(OR、例えば、R＝H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖)；ポリエチレングリコール(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR、n＝1〜50；「ロックド」核酸(LNA)、ここでは、2'位の酸素が同じリボース糖の4'炭素に(CH2)n、n＝1〜4で連結されており、好ましくはnは1 (LNA)または2 (ENA)である；O-アミンまたはO-(CH2)nアミン (n＝1〜10、アミン＝NH2; アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミンまたはポリアミノ)；およびO-CH2CH2(NCH2CH2NMe2)2。
【０２０６】
「デオキシ」修飾の例としては、以下が挙げられる：ハロ(例えば、フルオロ)；アミノ(例えば、NH2; アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-アミン (アミン＝NH2; アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ)；-NHC(O)R (R＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖)；シアノ；メルカプト；アルキル-チオ-アルキル；チオアルコキシ；チオアルキル；アルキル；シクロアルキル；アリール；アルケニルおよびアルキニル、これらは、例えばアミノ官能基で、置換されていてもよい。
【０２０７】
糖基はまた、リボース糖中の対応する炭素とは反対の立体化学配置を有する1個または複数個の炭素を含むことができる。こうして、オリゴヌクレオチドは、糖として例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含むことができる。同様に、2'位の修飾はアラビノース立体配置で存在し得る。用語「アラビノース立体配置」は、2'-OHがアラビノース中にあるのと同じ立体配置でリボースのC2'上に置換基を配置することを指す。
【０２０８】
ヌクレオチドは、糖上の1'位にα結合、例えばα-ヌクレオシドを有することができる。該モノマーはまた、4'位に反対の立体配置をもつことができ、例えば、C5'およびH4'またはそれらに取って代わる置換基は相互に交換される。C5'およびH4'またはそれらに取って代わる置換基が相互に交換されている場合、糖は4'位で修飾されていると言われる。
【０２０９】
オリゴヌクレオチドはまた、脱塩基糖(abasic sugar)、すなわちC-1'に核酸塩基を欠くか、またはC1'に核酸塩基の代わりに他の化学基を有するモノマーを含むことができる。例えば、米国特許第5,998,203号を参照されたく；その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。これらの脱塩基糖は、構成糖原子の1つまたは複数に修飾をさらに含むことができる。オリゴヌクレオチドはまた、L異性体である1種または複数種の糖、例えばL-ヌクレオシドを含むことができる。糖基への修飾はまた、4'-Oを硫黄、置換されてもよい窒素またはCH2基で置換することを含み得る。いくつかの態様では、C1'と核酸塩基との間の結合はα配置である。
【０２１０】
オリゴヌクレオチドの修飾はまた、非環式ヌクレオチドを含むことができ、その場合、リボース炭素(例えば、C1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'、C1'-O4')間のC-C結合は不在であり、かつ/またはリボース炭素もしくは酸素(例えば、C1'、C2'、C3'、C4'またはO4')の少なくとも1つは、独立してまたは組み合わせで該ヌクレオチドから不在となる。いくつかの態様では、非環式ヌクレオチドは、
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であり、ここで、Bは修飾されたまたは修飾されていない核酸塩基であり；R1およびR2は独立してH、ハロゲン、OR3、またはアルキルであり；R3はH、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖である。
【０２１１】
好ましい糖修飾は、2'-O-Me (2'-O-メチル)、2'-O-MOE (2'-O-メトキシエチル)、2'-F、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル] (2'-O-NMA)、2'-S-メチル、2'-O-CH2-(4'-C) (LNA)、2'-O-CH2CH2-(4'-C) (ENA)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、および2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)である。
【０２１２】
特定のヌクレオチドがその2'位を介して次のヌクレオチドに連結される場合、本明細書に記載の糖修飾は、その特定のヌクレオチド、例えばその2'位を介して連結されるヌクレオチド、の糖の3'位に配置され得ると理解すべきである。3'位の修飾はキシロース立体配置で存在し得る。用語「キシロース立体配置」は、3'-OHがキシロース糖中に存在するのと同じ立体配置でリボースのC3'上に置換基を配置することを指す。
【０２１３】
C4'および/またはC1'に結合した水素は、直鎖または分枝鎖の、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニルで置き換えることができ、その場合、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルの骨格は、O、S、S(O)、SO2、N(R')、C(O)、N(R')C(O)O、OC(O)N(R')、CH(R')、リン含有結合、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよい複素環、または置換されてもよいシクロアルキルの1つまたは複数を含むことができ、ここで、R'は水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクリルまたはヘテロシクリルであり、これらの各々は置換されていてもよい。いくつかの態様では、5'末端ヌクレオチドのC4'に結合した水素が置換される。
【０２１４】
いくつかの態様では、C4'およびC5'は、一緒になって、好ましくは少なくとも1つの-PX(Y)-を含む、置換されてもよい複素環を形成し、ここで、XはH、OH、OM、SH、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアルキルアミノ、または置換されてもよいジアルキルアミノであり、ここでMは、それぞれ独立して、全体の電荷が+1であるアルカリ金属または遷移金属であり；YはO、S、またはNR'であり、ここでR'は水素、置換されてもよい脂肪族である。好ましくは、この修飾はオリゴヌクレオチドの5'末端にある。
【０２１５】
核酸塩基の修飾：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルは、核酸中に見出される最も一般的な塩基(または核酸塩基)である。これらの塩基は、改善された特性を有するオリゴヌクレオチドを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ抵抗性のオリゴヌクレオチドは、これらの塩基または合成および天然核酸塩基(例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン、イソグアノシンまたはツベルシジン)および上記修飾のいずれか1つにより調製することができる。あるいは、上記塩基のいずれかの置換または修飾された類似体および「ユニバーサル塩基」を用いることができる。天然の塩基が非天然および/またはユニバーサル塩基で置換される場合、そのヌクレオチドは本明細書では修飾された核酸塩基および/または核酸塩基の修飾を含むと言われる。修飾された核酸塩基および/または核酸塩基の修飾はまた、コンジュゲートされた部分を含む、例えば本明細書に記載のリガンドを含む、天然、非天然、およびユニバーサル塩基を含む。核酸塩基とのコンジュゲーションに好適なコンジュゲート部分は、適切なアルキル、アルケニルまたはリンカーを介してアミド結合により核酸塩基にコンジュゲートされ得るカチオン性アミノ基を含む。
【０２１６】
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基(当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い)の修飾または置換を含むこともできる。本明細書で使用する場合、「修飾されていない」もしくは「未修飾」核酸塩基または「天然」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン(A)およびグアニン(G)ならびにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)を含む。修飾された核酸塩基には、以下のような他の合成および天然核酸塩基が含まれる：イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン、イソグアノシン、ツベルシジン、2-(ハロ)アデニン、2-(アルキル)アデニン、2-(プロピル)アデニン、2-(アミノ)アデニン、2-(アミノアルキル)アデニン、2-(アミノプロピル)アデニン、2-(メチルチオ)-N6-(イソペンテニル)アデニン、6-(アルキル)アデニン、6-(メチル)アデニン、7-(デアザ)アデニン、8-(アルケニル)アデニン、8-(アルキル)アデニン、8-(アルキニル)アデニン、8-(アミノ)アデニン、8-(ハロ)アデニン、8-(ヒドロキシル)アデニン、8-(チオアルキル)アデニン、8-(チオール)アデニン、N6-(イソペンチル)アデニン、N6-(メチル)アデニン、N6, N6-(ジメチル)アデニン、2-(アルキル)グアニン、2-(プロピル)グアニン、6-(アルキル)グアニン、6-(メチル)グアニン、7-(アルキル)グアニン、7-(メチル)グアニン、7-(デアザ)グアニン、8-(アルキル)グアニン、8-(アルケニル)グアニン、8-(アルキニル)グアニン、8-(アミノ)グアニン、8-(ハロ)グアニン、8-(ヒドロキシル)グアニン、8-(チオアルキル)グアニン、8-(チオール)グアニン、N-(メチル)グアニン、2-(チオ)シトシン、3-(デアザ)-5-(アザ)シトシン、3-(アルキル)シトシン、3-(メチル)シトシン、5-(アルキル)シトシン、5-(アルキニル)シトシン、5-(ハロ)シトシン、5-(メチル)シトシン、5-(プロピニル)シトシン、5-(プロピニル)シトシン、5-(トリフルオロメチル)シトシン、6-(アゾ)シトシン、N4-(アセチル)シトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウラシル、2-(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2-(チオ)ウラシル、4-(チオ)ウラシル、5-(メチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2,4-(ジチオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2,4-(ジチオ)ウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-(アルキル)ウラシル、5-(アルキニル)ウラシル、5-(アリルアミノ)ウラシル、5-(アミノアリル)ウラシル、5-(アミノアルキル)ウラシル、5-(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5-(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5-(シアノアルキル)ウラシル、5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル、5-(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5-(ハロ)ウラシル、5-(メトキシ)ウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(トリフルオロメチル)ウラシル、6-(アゾ)ウラシル、ジヒドロウラシル、N3-(メチル)ウラシル、5-ウラシル(すなわち、シュードウラシル)、2-(チオ)シュードウラシル、4-(チオ)シュードウラシル、2,4-(ジチオ)シュードウラシル、5-(アルキル)シュードウラシル、5-(メチル)シュードウラシル、5-(アルキル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-4-(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)-4-(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-2,4-(���チオ)シュードウラシル、5-(メチル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1-置換シュードウラシル、1-置換2(チオ)-シュードウラシル、1-置換4-(チオ)シュードウラシル、1-置換2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-4-(チオ)シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-4-(チオ)シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン、ツベルシジン、イソグアノシン、イノシニル、2-アザ-イノシニル、7-デアザ-イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、3-(メチル)イソカルボスチリル、5-(メチル)イソカルボスチリル、3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリル、7-(アザ)インドリル、6-(メチル)-7-(アザ)インドリル、イミダゾピリジニル、9-(メチル)-イミダゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリル、7-(プロピニル)イソカルボスチリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、2,4,5-(トリメチル)フェニル、4-(メチル)インドリル、4,6-(ジメチル)インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンズイミダゾール、4-(メチル)ベンズイミダゾール、6-(アゾ)チミン、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、6-(アザ)ピリミジン、2-(アミノ)プリン、2,6-(ジアミノ)プリン、5-置換ピリミジン、N2-置換プリン、N6-置換プリン、O6-置換プリン、置換1,2,4-トリアゾール、ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、パラ-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ビス-オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、パラ-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ビス-オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-7-アミノ-ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-ピリドピリミジン-3-イル、またはそのO-アルキル化もしくはN-アルキル化誘導体。あるいは、上記塩基および「ユニバーサル塩基」の置換または修飾類似体を使用することができる。
【０２１７】
本明細書で使用されるユニバーサル核酸塩基は、融解挙動、細胞内酵素による認識またはオリゴヌクレオチド二本鎖の活性に実質的に影響を及ぼすことなく、4つ全ての天然に存在する核酸塩基と塩基対合することができる修飾された核酸塩基である。いくつかの代表的なユニバーサル核酸塩基としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：2,4-ジフルオロトルエン、ニトロピロリル、ニトロインドリル、8-アザ-7-デアザアデニン、4-フルオロ-6-メチルベンズイミダゾール、4-メチルベンズイミダゾール、3-メチルイソカルボスチリル、5-メチルイソカルボスチリル、3-メチル-7-プロピニルイソカルボスチリル、7-アザインドリル、6-メチル-7-アザインドリル、イミダゾピリジニル、9-メチル-イミダゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリル、7-プロピニルイソカルボスチリル、プロピニル-7-アザインドリル、2,4,5-トリメチルフェニル、4-メチルインドリル、4,6-ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、およびその構造的誘導体(例えば、Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447を参照されたい)。
【０２１８】
さらなる核酸塩基には、以下に開示されたものが含まれる：米国特許第3,687,808号；2009年3月26日に出願された国際出願番号PCT/US09/038425；Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pp.858-859, Kroschwitz, J. I.編, John Wiley & Sons, 1990；English et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613；Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijin, P.編, Wiley-VCH, 2008；およびSanghvi, Y.S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pp.289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B.編, CRC Press, 1993。上記の全ての内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１９】
末端の修飾：オリゴヌクレオチドのインビボ適用は、血清および/または血液中のヌクレアーゼの存在により制限され得る。したがって、場合によっては、オリゴヌクレオチドの3'末端、5'末端または両方の末端を修飾して、オリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼに対して抵抗性にすることが好ましい。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、3'(3'-キャップ)、5'(5'-キャップ)または両方の末端にキャップ構造を含む。ある態様では、オリゴヌクレオチドは3'-キャップを含む。別の態様では、オリゴヌクレオチドは5'-キャップを含む。さらに別の態様では、オリゴヌクレオチドは3'キャップと5'キャップの両方を含む。当然のことながら、オリゴヌクレオチドが3'キャップと5'キャップの両方を含む場合、そのようなキャップは同じであってもまたは異なっていてもよい。
【０２２０】
本明細書で使用する「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学的修飾を指す。例えば、米国特許第5,998,203号および国際特許公報WO03/70918を参照されたく；これらの内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２１】
代表的な5'-キャップには、限定するものではないが、以下が含まれる：リガンド、5'-5'-逆位ヌクレオチド、5'-5'-逆位脱塩基ヌクレオチド残基、2'-5'結合、5'-アミノ、5'-アミノ-アルキルホスフェート、5'-ヘキシルホスフェート、5'-アミノヘキシルホスフェート、架橋および/または非架橋5'-ホスホロアミデート、架橋および/または非架橋5'-ホスホロチオエートおよび/または5'-ホスホロジチオエート、架橋または非架橋5'-メチルホスホネート、末端の2ヌクレオチド間の非ホスホジエステル糖間結合、4',5'-メチレンヌクレオチド、I-(β-D-エリトロフラノシル)ヌクレオチド、4'-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L-ヌクレオチド、α-ヌクレオチド、修飾核酸塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、threo-ペントフラノシルヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、非環式3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5'-メルカプトヌクレオチド、および5'-1,4-ブタンジオールホスフェート。
【０２２２】
代表的な3'-キャップには、限定するものではないが、以下が含まれる：リガンド、3'-3'-逆位ヌクレオチド、3'-3'-逆位脱塩基ヌクレオチド残基、3'-2'-逆位ヌクレオチド部分、3'-2'-逆位脱塩基部分、2'-5'結合、3'-アミノ、3'-アミノ-アルキルホスフェート、3'-ヘキシルホスフェート、3'-アミノヘキシルホスフェート、架橋および/または非架橋3'-ホスホロアミデート、架橋および/または非架橋3'-ホスホロチオエートおよび/または3'-ホスホロジチオエート、架橋または非架橋3'-メチルホスホネート、末端の2ヌクレオチド間の非ホスホジエステル糖間結合、I-(β-D-エリトロフラノシル)ヌクレオチド、4'-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L-ヌクレオチド、α-ヌクレオチド、修飾核酸塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、threo-ペントフラノシルヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、非環式3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、および3'-1,4-ブタンジオールホスフェート。詳細については、参照により本明細書に組み入れられるBeaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925を参照されたい。
【０２２３】
本発明に従う他の3'および/または5'キャップは、2009年7月7日に出願された米国仮特許出願第61/223,665号に記載されており、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２４】
オリゴヌクレオチドの3'および/または5'末端はまた、標識部分、例えばフルオロフォア(例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3またはCy5色素)または保護基(例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素またはエステルに基づく)などの、他の機能性分子実体にコンジュゲートすることもできる。機能性分子実体は、リン酸基および/またはリンカーを介して糖に結合され得る。リンカーの末端原子は、リン酸基の連結原子、または糖のC-3'もしくはC-5' O、N、SもしくはC基に接続するか、またはそれを置換することができる。あるいは、リンカーは、ヌクレオチド代用物(例えば、PNA)の末端原子に接続するか、または該原子を置換することができる。
【０２２５】
活性を調節するのに有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体による5'末端の修飾が含まれる。例えば、いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの5'末端は、リン酸化されるか、または5'末端にホスホリル類似体を含む。5'-リン酸修飾は、RISC媒介遺伝子サイレンシングに適合するものを含むことができる。5'末端の修飾はまた、対象の免疫系を刺激または阻害するのに有用であり得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの5'末端は、下記の修飾：
2017536826.tif 000013
を含み、ここで、W、X、およびYは、それぞれ独立して、O、OR (Rは水素、アルキル、アリールである)、S、Se、BR3 (Rは水素、アルキル、アリールである)、BH3-、C (すなわち、アルキル基、アリール基など)、H、NR2 (Rは水素、アルキル、アリールである)、またはOR (Rは水素、アルキル、アリールである)からなる群より選択され；AおよびZは、それぞれ独立して個別に、非存在、O、S、CH2、NR (Rは水素、アルキル、アリールである)、または置換されてもよいアルキレンであり、該アルキレンの主鎖は、内部および/または末端にO、S、SSおよびNR (Rは水素、アルキル、アリールである)の1つまたは複数を含むことができ；かつnは0〜2である。いくつかの態様では、nは1または2である。Aは糖の5'炭素に結合された酸素を置換していることが理解される。
【０２２６】
いくつかの態様では、5'末端ヌクレオチドのC5'上の一方または両方の水素は、ハロゲン、例えばF、で置き換えることができる。
【０２２７】
代表的な5'-修飾には、限定するものではないが、以下が含まれる：5'-モノリン酸((HO)2(O)P-O-5'); 5'-ジリン酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-トリリン酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-モノチオリン酸(ホスホロチオエート; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-モノジチオリン酸(ホスホロジチオエート; (HO)(HS)(S)P-O-5'); 5'-ホスホロチオラート((HO)2(O)P-S-5'); 5'-α-チオトリリン酸; 5'-β-チオトリリン酸; 5'-γ-チオトリリン酸; 5'-ホスホロアミデート((HO)2(O)P-NH-5'、(HO)(NH2)(O)P-O-5')。他の5'-修飾には、5'-アルキルホスホネート(R(OH)(O)P-O-5'、R＝アルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど)、5'-アルキルエーテルホスホネート(R(OH)(O)P-O-5'、R＝アルキルエーテル、例えばメトキシメチル(CH2OMe)、エトキシメチルなど)が含まれる。その他の代表的な5'-修飾には、Zが少なくとも1回置換されてもよいアルキルである場合、例えば、((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'、((HO)2(X)P-[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'；ジアルキル末端リン酸およびリン酸模倣体: HO[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、H2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、H[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、Me2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'、HO[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'、H2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'、H[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'、Me2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'が含まれ、ここで、aおよびbはそれぞれ独立して1〜10である。他の態様には、酸素および/または硫黄のBH3、BH3-および/またはSeによる置換が含まれる。
【０２２８】
末端修飾は分布をモニタリングするにも有用であり、そのような場合に、追加される好ましい基には、フルオロフォア、例えば、フルオレセインまたはAlexa色素、例えばAlexa 488が含まれる。末端修飾はまた、取り込みを高めるのに有用であり得、そのために有用な修飾には、ターゲティングリガンドが含まれる。末端修飾はまた、オリゴヌクレオチドを別の部分に架橋するのに有用であり得；そのために有用な修飾には、マイトマイシンC、ソラレンおよびその誘導体が含まれる。
【０２２９】
リガンド：多種多様な実体、例えばリガンドを、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リガンドは、天然に存在する分子、または組換えもしくは合成分子を含み得る。代表的なリガンドとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：ポリリシン(PLL)、ポリL-アスパラギン酸、ポリL-グルタミン酸、スチレン-無水マレイン酸コポリマー、ポリ(L-ラクチド-コ-グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル-無水マレイン酸コポリマー、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG、例えばPEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2-エチルアクリル酸)、N-イソプロピルアクリルアミドポリマー、ポリホスファゼン、ポリエチレンイミン、カチオン性基、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド-ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの4級塩、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性プロテインA、ムチン、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、アプタマー、アシアロフェチュイン、ヒアルロナン、プロコラーゲン、免疫グロブリン(例えば、抗体)、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、糖-アルブミンコンジュゲート、インターカレート剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、ソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(例えば、TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA）、親油性分子(例えば、ステロイド、胆汁酸、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビスO(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン)、ペプチド(例えば、αヘリックスペプチド、両親媒性ペプチド、RGDペプチド、細胞膜透過性ペプチド、エンドソーム溶解性/融合性ペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、ナプロキセン、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状化合物のEu3+錯体)、ジニトロフェニル、HRP、AP、抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、レクチン、炭水化物、多価炭水化物、ビタミン(例えば、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンK、ビタミンB、例えば葉酸、B12、リボフラビン、ビオチンおよびピリドキサール)、ビタミン補因子、リポ多糖、p38 MAPキナーゼの活性化因子、NF-κBの活性化因子、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシン、ミオセルビン、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン-1β、γインターフェロン、天然または組換え低密度リポタンパク質(LDL)、天然または組換え高密度リポタンパク質(HDL)、および細胞膜透過剤(例えば、αへリックス細胞膜透過剤)。
【０２３０】
ペプチドおよびペプチド模倣リガンドには、天然または修飾ペプチドを有するもの、例えば、DもしくはLペプチド；α、β、もしくはγペプチド；N-メチルペプチド；アザペプチド；1つまたは複数のアミドを有するペプチド、すなわち、1つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメートもしくはスルホニル尿素結合で置換された結合を有するペプチド；または環状ペプチドが含まれる。ペプチド模倣体(本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる)は、天然ペプチドと同様の特定された三次元構造に折りたたむことが可能な分子である。ペプチドまたはペプチド模倣リガンドは、約5〜50個のアミノ酸長、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50個のアミノ酸長であり得る。
【０２３１】
代表的な両親媒性ペプチドとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：セクロピン、ライコトキシン(lycotoxin)、パラダキシン、ブフォリン、CPF、ボンビニン様ペプチド(BLP)、カテリシジン、セラトトキシン、S. クラバ(S. clava)ペプチド、メクラウナギ(hagfish)腸内抗微生物ペプチド(HFIAP)、マガイニン、ブレビニン-2、デルマセプチン、メリチン、リューロシジン(pleurocidin)、H2Aペプチド、アフリカツメガエル(Xenopus)ペプチド、エスカレンチニス-1 (esculentinis-1)、およびカエリン(caerin)。
【０２３２】
本明細書で使用する用語「エンドソーム溶解性リガンド」は、エンドソーム溶解特性を有する分子を指す。エンドソーム溶解性リガンドは、本発明の組成物もしくはその成分の溶解、および/または、細胞内のエンドソーム、リソソーム、小胞体(ER)、ゴルジ体、微小管、ペルオキシソーム、もしくは他の小胞体などの細胞コンパートメントから細胞質への本発明の組成物またはその成分の輸送を促進する。いくつかの代表的なエンドソーム溶解性リガンドとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、直鎖または分枝ポリエチレンイミン(PEI)、直鎖および分枝ポリアミン、例えばスペルミン、カチオン性の直鎖および分枝ポリアミン、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスクされたオリゴもしくはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール/ポリケタール、オルトエステル、マスクされたまたはマスクされていないカチオンまたはアニオン電荷を有する直鎖または分枝ポリマー、マスクされたまたはマスクされていないカチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマー、ポリアニオン性ペプチド、ポリアニオン性ペプチド模倣体、pH感受性ペプチド、天然および合成融合性脂質、天然および合成カチオン性脂質。
【０２３３】
代表的なエンドソーム溶解性/融合性ペプチドとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：
2017536826.tif 000014
。
【０２３４】
理論に縛られることを望むものではないが、融合性脂質は膜と融合し、結果として膜を不安定化させると考えられる。融合性脂質は、通常、小さなヘッド基および不飽和アシル鎖を有する。代表的な融合性脂質としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：1,2-ジオレオイル-sn-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール(Di-Lin)、N-メチル(2,2-ジ((9Z, 12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)-1,3-ジオキソラン-4-イル)メタンアミン(DLin-k-DMA)およびN-メチル-2-(2,2-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)-1,3-ジオキソラン-4-イル)エタンアミン。
【０２３５】
本発明に従うエンドソーム溶解活性を有する合成ポリマーは、米国特許出願公開第2009/0048410号; 同第2009/0023890号; 同第2008/0287630号; 同第2008/0287628号; 同第2008/0281044号; 同第2008/0281041号; 同第2008/0269450号; 同第2007/0105804号; 同第2007/0036865号; および同第2004/0198687号に記載されており、これらの全ての内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３６】
代表的な細胞透過性ペプチドとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：
2017536826.tif 000015
。
【０２３７】
代表的なカチオン性基には、限定するものではないが、例えば、以下から誘導されるプロトン化アミノ基が含まれる：O-アミン (アミン＝NH2; アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)；アミノアルコキシ、例えばO(CH2)nアミン(例えば、アミン＝NH2; アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)；アミノ(例えば、NH2; アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸)；およびNH(CH2CH2NH)nCH2CH2-アミン (アミン＝NH2; アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ)。
【０２３８】
本明細書で使用する用語「ターゲティングリガンド」とは、選択された標的、例えば、細胞、細胞型、組織、器官、身体の領域に対して、またはコンパートメント、例えば細胞、組織、もしくは器官のコンパートメントに対して増強された親和性を提供する任意の分子を指す。いくつかの代表的なターゲティングリガンドとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：抗体、抗原、葉酸、受容体リガンド、炭水化物、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリン、GCPII、ソマトスタチン、LDLおよびHDLリガンド。
【０２３９】
炭水化物ベースのターゲティングリガンドとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：D-ガラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-D-ガラクトース(GalNAc)、多価GalNAc、例えばGalNAc2およびGalNAc3；D-マンノース、多価マンノース、多価ラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸およびレクチン。多価という用語は、2つ以上の単糖単位が存在することを示す。このような単糖サブユニットは、グリコシド結合を介して互いに結合されるか、または足場分子に連結され得る。
【０２４０】
リガンドとして本発明に従う多数の葉酸および葉酸類似体は、米国特許第2,816,110号; 同第51410,104号; 同第5,552,545号; 同第6,335,434号; および同第7,128,893号に記載されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４１】
本明細書で使用する用語「PK調節リガンド」および「PKモジュレーター」は、オリゴヌクレオチドの薬物動態を調節することができる分子を指す。いくつかの代表的なPKモジュレーターとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：親油性分子、胆汁酸、ステロール、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ビタミン、脂肪酸、フェノキサジン、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、スプロフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、PEG、ビオチン、およびトランスサイレチン結合リガンド(例えば、テトラヨードチロ酢酸、2,4,6-トリヨードフェノールおよびフルフェナム酸)。また、いくつかのホスホロチオエート糖間結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清タンパク質に結合することが公知であり、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、約5〜30ヌクレオチド(例えば、5〜25ヌクレオチド、好ましくは5〜20ヌクレオチド、例えば5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド)を含み、かつ主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドもまた、リガンド(例えば、PK調節リガンド)として本発明に適している。PK調節オリゴヌクレオチドは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、またはそれ以上のホスホロチオエート結合および/またはホスホロジチオエート結合を含むことができる。いくつかの態様では、PK調節オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合および/またはホスホロジチオエート結合である。さらに、血清成分(例えば、血清タンパク質)に結合するアプタマーも、PK調節リガンドとして本発明に適している。血清成分(例えば、血清タンパク質)への結合は、Oravcova, et al., Journal of Chromatography B (1996), 677:1-27に記載されるような、アルブミン結合アッセイから予測することができる。
【０２４２】
2つまたはそれ以上のリガンドが存在する場合、それらのリガンドはすべて同じ特性を有しても、すべて異なる特性を有してもよいか、または一部のリガンドは同じ特性を有し、他のリガンドは異なる特性を有する。例えば、リガンドは、ターゲティング特性を有するか、エンドソーム溶解活性を有するか、またはPK調節特性を有することができる。好ましい態様では、全てのリガンドは異なる特性を有する。
【０２４３】
リガンドは、オリゴヌクレオチドに様々な位置で結合し、例えば、3'末端、5'末端および/または内部位置で結合することができる。2つまたはそれ以上のリガンドが存在する場合、リガンドはオリゴヌクレオチドの両末端に存在し得る。好ましい態様では、リガンドは介在するテザー/リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合される。リガンドまたはテザーリガンド(tethered ligand)は、モノマーが成長中の鎖に組み込まれる場合には、該モノマー上に存在し得る。いくつかの態様では、リガンドは、「前駆体」モノマーを成長中の鎖に組み込んだ後に、該「前駆体」モノマーへのカップリングにより取り込むことができる。例えば、アミノ末端テザーを有する(すなわち、関連するリガンドを有しない)モノマー、例えばモノマー-リンカー-NH2を成長中のオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことができる。その後の操作では、すなわち前駆体モノマーを該鎖に組み込んだ後、求電子基を有する、例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、該リガンドの求電子基を前駆体モノマーのテザーの末端求核基とカップリングさせることによって、前駆体モノマーに後で結合させることができる。
【０２４４】
別の例では、クリックケミストリー(Click Chemistry)反応に参加するのに適した化学基を有するモノマーは、例えばアジドまたはアルキン末端テザー/リンカーを取り込むことができる。その後の操作では、すなわち前駆体モノマーを該鎖に組み込んだ後、相補的な化学基、例えばアルキンまたはアジドを有する、リガンドは、アルキンとアジドを一緒にカップリングさせることによって、前駆体モノマーに結合させることができる。
【０２４５】
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合には、リガンドを一方または両方の鎖に結合させることができる。
【０２４６】
いくつかの態様では、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートされ得る。プリン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションは、環内および環外原子を含む任意の位置で起こり得る。いくつかの態様では、プリン核酸塩基の2位、6位、7位または8位がコンジュゲート部分に結合される。ピリミジン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションもまた、任意の位置で起こり得る。いくつかの態様では、ピリミジン核酸塩基の2位、5位および6位がコンジュゲート部分で置換され得る。リガンドが核酸塩基にコンジュゲートされる場合、好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨げない位置、すなわち塩基対合に必要な水素結合相互作用を妨げない位置である。
【０２４７】
ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは、任意の炭素原子で起こり得る。コンジュゲート部分に結合させることができる糖部分の炭素原子の例には、2'、3'、および5'炭素原子が含まれる。1'位もまた、例えば脱塩基残基において、コンジュゲート部分に結合され得る。ヌクレオシド間結合もまた、コンジュゲート部分を担持することができる。リン含有結合(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなど)の場合、コンジュゲート部分は、リン原子に、またはリン原子に結合したO、NもしくはS原子に直接結合され得る。アミンまたはアミド含有ヌクレオシド間結合(例えば、PNA)の場合は、コンジュゲート部分を、該アミンもしくはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に結合させることができる。
【０２４８】
オリゴマー化合物のコンジュゲートを調製するための多くの方法がある。一般的に、オリゴマー化合物は、オリゴマー化合物上の反応性基(例えば、OH、SH、アミン、カルボキシル、アルデヒドなど)をコンジュゲート部分上の反応性基と接触させることによって、コンジュゲート部分に結合される。いくつかの態様では、一方の反応性基は求電子性であり、他方は求核性である。
【０２４９】
例えば、求電子基はカルボニル含有官能基であり、求核基はアミンまたはチオールであり得る。核酸および関連するオリゴマー化合物を、連結基を用いてまたは用いないで、コンジュゲートするための方法は、文献に、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるManoharan in Antisense Research and Applications, Crooke and LeBleu編, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, Chapter 17などに、十分に記載されている。
【０２５０】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許には、限定するものではないが、米国特許第4,828,979号; 同第4,948,882号; 同第5,218,105号; 同第5,525,465号; 同第5,541,313号; 同第5,545,730号; 同第5,552,538号; 同第5,578,717号; 同第5,580,731号; 同第5,580,731号; 同第5,591,584号; 同第5,109,124号; 同第5,118,802号; 同第5,138,045号; 同第5,414,077号; 同第5,486,603号; 同第5,512,439号; 同第5,578,718号; 同第5,608,046号; 同第4,587,044号; 同第4,605,735号; 同第4,667,025号; 同第4,762,779号; 同第4,789,737号; 同第4,824,941号; 同第4,835,263号; 同第4,876,335号; 同第4,904,582号; 同第4,958,013号; 同第5,082,830号; 同第5,112,963号; 同第5,214,136号; 同第5,082,830号; 同第5,112,963号; 同第5,149,782号; 同第5,214,136号; 同第5,245,022号; 同第5,254,469号; 同第5,258,506号; 同第5,262,536号; 同第5,272,250号; 同第5,292,873号; 同第5,317,098号; 同第5,371,241号; 同第5,391,723号; 同第5,416,203号; 同第5,451,463号; 同第5,510,475号; 同第5,512,667号; 同第5,514,785号; 同第5,565,552号; 同第5,567,810号; 同第5,574,142号; 同第5,585,481号; 同第5,587,371号; 同第5,595,726号; 同第5,597,696号; 同第5,599,923号; 同第5,599,928号; 同第5,672,662号; 同第5,688,941号; 同第5,714,166号; 同第6,153,737号; 同第6,172,208号; 同第6,300,319号; 同第6,335,434号; 同第6,335,437号; 同第6,395,437号; 同第6,444,806号; 同第6,486,308号; 同第6,525,031号; 同第6,528,631号; 同第6,559,279号が含まれ; これらの全ての内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５１】
リガンドキャリア：いくつかの態様では、リガンド、例えばエンドソーム溶解性リガンド、ターゲティングリガンドまたは他のリガンドは、化学合成中に成長するオリゴヌクレオチド鎖に後で組み込まれるモノマーに連結される。このようなモノマーは、本明細書ではキャリアモノマーとも呼ばれる。キャリアモノマーは環式基または非環式基であり；環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、[1,3]-ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンからなる群より選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。いくつかの態様では、環式キャリアモノマーは、4-ヒドロキシプロリンまたはその誘導体のようなピロリジニルをベースとする。
【０２５２】
本発明に従う代表的なリガンドおよびリガンドコンジュゲートされたモノマーは、2004年8月10日出願の米国特許出願第10/916,185号；2004年9月21日出願の同第10/946,873号；2004年11月9日出願の同第10/985,426号；2007年8月3日出願の同第10/833,934号；2005年4月27日出願の同第11/115,989号；2005年4月29日出願の同第11/119,533号；2005年8月4日出願の同第11/197,753号；2007年11月21日出願の同第11/944,227号；2008年12月4日出願の同第12/328,528号；および2008年12月4日出願の同第12/328,537号に記載されており、これらの内容はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明に従うリガンドおよびリガンドコンジュゲートされたモノマーはまた、2004年1月21日出願の国際出願番号PCT/US04/001461；2004年4月5日出願のPCT/US04/010586；2005年4月9日出願のPCT/US04/011255；2005年4月27日出願のPCT/US05/014472；2005年4月29日出願のPCT/US05/015305；2005年8月4日出願のPCT/US05/027722；2008年4月23日出願のPCT/US08/061289；2008年7月30日出願のPCT/US08/071576；2008年12月4日出願のPCT/US08/085574；および2009年4月10日出願のPCT/US09/40274に記載されており、これらの内容はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５３】
リンカー：いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドと、他の成分、例えばリガンドまたはリガンド担持モノマーとの間の共有結合には、リンカーが介在し得る。このリンカーは、用途に応じて、切断可能なリンカーまたは切断不能なリンカーとすることができる。本明細書で使用する「切断可能なリンカー」は、様々な条件下で切断することができるリンカーを指す。切断に適した条件には、pH、UV照射、酵素活性、温度、加水分解、脱離および置換反応、酸化還元反応、および結合の熱力学的特性が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、所望の標的への輸送後にオリゴヌクレオチドを放出させるために、使用することができる。コンジュゲーションもしくはカップリング相互作用の意図された本質、または所望の生物学的効果により、リンカー基の選択が決定されるであろう。
【０２５４】
本明細書で使用する用語「リンカー」は、化合物の2つの部分を連結する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合を含むか、あるいは酸素もしくは硫黄などの原子、NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NHなどの単位、または原子の鎖、例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクロアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールを含み、ここで、1つまたは複数のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(R1)2、C(O)、切断可能な連結基、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環によって中断または終結され得；ここで、R1は水素、アシル、脂肪族または置換された脂肪族である。
【０２５５】
いくつかの態様では、リンカーは分枝状リンカーである。分枝状リンカーの分岐点は、少なくとも3価であるが、4価、5価もしくは6価の原子、またはそのような多重原子価を示す基であってもよい。いくつかの態様では、分岐点は、-N、-N(Q)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C、または-N(Q)C(O)O-Cであり；ここで、Qは、個別に独立して、Hまたは置換されてもよいアルキルである。いくつかの態様では、分岐点はグリセロールまたはその誘導体である。
【０２５６】
切断可能な連結基：切断可能な連結基は、細胞外では十分に安定であるが、標的細胞に侵入すると切断されて、リンカーが一緒に保持している2つの部分を放出するものである。好ましい態様では、切断可能な連結基は、対象の血液または血清中よりも標的細胞内でまたは第1の基準条件(例えば、細胞内条件を模倣するまたは示すように選択される)下で少なくとも10倍またはそれ以上、好ましくは少なくとも100倍速く切断されるか、あるいは第2の基準条件(例えば、血液または血清中に見出される条件を模倣するまたは示すように選択される)下で切断される。
【０２５７】
切断可能な連結基は、切断剤、例えばpH、酸化還元電位または分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清または血液中よりも細胞内により高いレベルまたは活性で広く存在しているか、または見出される。このような分解剤の例には、以下が含まれる：特定の基質のために選択されるか、または基質特異性をもたないレドックス剤、例えば、細胞中に存在する酸化もしくは還元酵素、またはメルカプタンのような、還元によりレドックス切断可能な連結基を分解できる還元剤；エステラーゼ；アミダーゼ；エンドソームまたは酸性環境を作り出すことができる薬剤、例えば、pHを5またはそれ未満にする薬剤；一般酸として作用することによって酸切断可能な連結基を加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ(基質特異性であり得る)およびプロテアーゼ、ならびにホスファターゼ。
【０２５８】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な連結基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な連結基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結することができる。肝細胞はエステラーゼが豊富であり、そのため、リンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも肝細胞においてより効率的に切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型には、肺、腎皮質、および精巣の細胞が含まれる。
【０２５９】
ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などの、ペプチダーゼが豊富な細胞型を標的とする場合に使用することができる。
【０２６０】
いくつかの態様では、切断可能な連結基は、血液もしくは血清(または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)と比較して、細胞内(または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)で少なくとも1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、10、25、50または100倍速く切断される。いくつかの態様では、切断可能な連結基は、細胞内(または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)と比較して、血液中(または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)で90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％または1％未満切断される。
【０２６１】
代表的な切断可能な連結基としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：レドックス切断可能な連結基(例えば、-S-S-および-C(R)2-S-S-、ここでRはHまたはC1〜C6アルキルであり、少なくとも1つのRはC1〜C6アルキル、例えばCH3またはCH2CH3である)；リン酸ベースの切断可能な連結基(例えば、-O-P(O)(OR)-O-、-O-P(S)(OR)-O-、-O-P(S)(SR)-O-、-S-P(O)(OR)-O-、-O-P(O)(OR)-S-、-S-P(O)(OR)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(OR)-O-、-O-P(O)(R)-O-、-O-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-O-、-S-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-S-、-O-P(S)(R)-S-、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S- P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、および-O-P(S)(H)-S-、ここでRは置換されてもよい直鎖または分枝C1〜C10アルキルである)；酸切断可能な連結基(例えば、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステル、-C=NN-および-OC(O)-)；エステルベースの切断可能な連結基(例えば、-C(O)O-)；ペプチドベースの切断可能な連結基(例えば、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される連結基、例えば-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-、ここでRAおよびRBは2つの隣接するアミノ酸のR基である)。ペプチドベースの切断可能な連結基は2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、ペプチドベースの切断可能な結合は、細胞内に見出されるペプチダーゼまたはプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。
【０２６２】
いくつかの態様では、酸切断可能な連結基は、約6.5またはそれ未満(例えば、約6.5、6.0、5.5、5.0、またはそれ未満)のpHを有する酸性環境において、または一般酸として作用することができる酵素のような作用剤によって、切断可能である。
【０２６３】
一般的な参照文献：オリゴヌクレオチド修飾のための一般的な参照文献を以下に述べる。いくつかの態様では、本発明に従って使用されるSH2B3およびオリゴヌクレオチドを阻害するRNAi物質は、固相合成によって合成することができ、例えば、"Oligonucleotide synthesis, a practical approach", M. J. Gait編, IRL Press, 1984; "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", F. Eckstein編, IRL Press, 1991 (特に、Chapter 1, Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis; Chapter 2, Oligoribonucleotide synthesis; Chapter 3, 2'-O-Methyloligoribonucleotides: synthesis and applications; Chapter 4, Phosphorothioate oligonucleotides; Chapter 5, Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates; Chapter 6, Synthesis of oligo-2'-deoxyribonucleoside methylphosphonates; およびChapter 7, Oligodeoxynucleotides containing modified bases)を参照されたい。他の特に有用な合成方法、試薬、ブロッキング基および反応条件は、Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311;およびBeaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194; またはその中で言及される文献に記載されている。WO00/44895、WO01/75164またはWO02/44321に記載された修飾は、本明細書において使用することができる。本明細書に列挙された全ての刊行物、特許および公開特許出願の開示内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６４】
リン酸基修飾の参照文献：ホスフィネートオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第5,508,270号に記載される。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第4,469,863号に記載される。ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第5,256,775号または米国特許第5,366,878号に記載される。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第5,023,243号に記載される。ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第5,130,302号および第5,177,198号に記載される。3'-デオキシ-3'-アミノホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第5,476,925号に記載される。3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、An, H, et al. J. Org. Chem. 2001, 66, 2789-2801に記載される。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、Sproat et al. Nucleosides Nucleotides 1988, 7,651およびCrosstick et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4693に記載される。
【０２６５】
リン酸基の置換の参照文献：本明細書ではMMI連結オリゴヌクレオシドとしても特定される、メチレンメチルイミノ連結されたオリゴヌクレオシド、本明細書ではMDH連結オリゴヌクレオシドとしても特定される、メチレンジメチルヒドラゾ連結されたオリゴヌクレオシド、本明細書ではアミド-3連結オリゴヌクレオシドとしても特定される、 メチレンカルボニルアミノ連結されたオリゴヌクレオシド、および本明細書ではアミド-4連結オリゴヌクレオシドとしても特定される、メチレンアミノカルボニル連結されたオリゴヌクレオシド、ならびに、例えばMMI結合とPOまたはPS結合を交互に有する、糖間結合が混在する化合物は、米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号および国際出願番号PCT/US92/04294およびPCT/US92/04305 (それぞれWO92/20822およびWO92/20823として公開)に記載されるように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特許第5,264,562号および同第5,264,564号に記載されるように調製することができる。エチレンオキシド連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特許第5,223,618号に記載されるように調製することができる。シロキサン置換は、Cormier, J.F. et al. Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4583に記載される。カーボネート置換は、Tittensor, J.R. J. Chem. Soc. C 1971, 1933に記載される。カルボキシメチル置換は、Edge, M.D. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1991に記載される。カルバメート置換は、Stirchak, E.P. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 6129に記載される。
【０２６６】
リン酸-リボース骨格の置換の参照文献：シクロブチル糖代用化合物は、米国特許第5,359,044号に記載されるように調製することができる。ピロリジン糖代用物は、米国特許第5,519,134号に記載されるように調製することができる。モルホリノ糖代用物は、米国特許第5,142,047号および第5,235,033号、ならびに他の関連特許公開に記載されるように調製することができる。ペプチド核酸(PNA)はそれ自体公知であり、Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23中で言及された種々の方法のいずれかに従って調製することができる。それらはまた、米国特許第5,539,083号に従って調製することも可能である。
【０２６７】
糖修飾の参照文献：2'修飾に対する修飾は、Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134およびその中の全ての文献に見出すことができる。リボースに対する特定の修飾は、以下の参照文献に見出すことができる：2'-フルオロ(Kawasaki et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841)、2'-MOE (Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938)、「LNA」(Wengel, J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301-310)。
【０２６８】
核酸塩基修飾の参照文献：上記の修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基のうちのいくつかの調製を教示する代表的な米国特許には、限定するものではないが、上記の米国特許第3,687,808号、ならびに米国特許同第4,845,205号; 同第5,130,30号; 同第5,134,066号; 同第5,175,273号; 同第5,367,066号; 同第5,432,272号; 同第5,457,187号; 同第5,457,191号; 同第5,459,255号; 同第5,484,908号; 同第5,502,177号; 同第5,525,711号; 同第5,552,540号; 同第5,587,469号; 同第5,594,121号; 同第5,596,091号; 同第5,614,617号; 同第5,681,941号; 同第5,750,692号; 同第6,015,886号; 同第6,147,200号; 同第6,166,197号; 同第6,222,025号; 同第6,235,887号; 同第6,380,368号; 同第6,528,640号; 同第6,639,062号; 同第6,617,438号; 同第7,045,610号; 同第7,427,672号; および同第7,495,088号が含まれ；これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６９】
末端修飾の参照文献：末端修飾は、Manoharan, M. et al. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12, 103-128 (2002)およびその中の文献に記載される。
【０２７０】
オリゴヌクレオチド内の修飾の配置(例えば、SH2B3を阻害するRNAi物質内の配置)
SH2B3を阻害するRNAi物質などのオリゴヌクレオチドは、サブユニットまたはモノマーのポリマーであるため、本明細書に記載される修飾の多くは、オリゴヌクレオチド内で繰り返される位置、例えば、核酸塩基、糖、リン酸部分、またはリン酸部分の非架橋酸素で起こり得る。所与のオリゴヌクレオチド中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、実際、上記の修飾の2つ以上を、単一のオリゴヌクレオチドに、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ、組み込むことができる。
【０２７１】
ある場合には、修飾はオリゴヌクレオチド中の全ての対象位置で起こるが、多くの場合、実際にはほとんどの場合、そうではない。一例として、修飾は3'または5'末端位置で起こるか、内部領域で起こるか、3'、5'または両方の末端領域で、例えば、オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの位置で、または最後の2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10ヌクレオチドの位置で起こり得る。いくつかの態様では、末端ヌクレオチドは修飾を含まない。
【０２７２】
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの少なくとも一端の末端ヌクレオチドまたは最後の2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10ヌクレオチドはすべて、少なくとも1つの修飾を含む。いくつかの態様では、その修飾は同じである。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの両端の末端ヌクレオチドまたは最後の2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10ヌクレオチドはすべて、少なくとも1つの修飾を含む。オリゴヌクレオチドの一端での修飾のタイプおよび修飾ヌクレオチドの数は、オリゴヌクレオチドの他端での修飾のタイプおよび修飾ヌクレオチドの数とは無関係であることを理解すべきである。
【０２７３】
オリゴヌクレオチドが二本鎖または部分的に二本鎖である場合、修飾は二本鎖領域、一本鎖領域、または二本鎖領域と一本鎖領域の両方で起こり得る。いくつかの態様では、本明細書に記載される修飾は、標的切断部位の領域に対応する領域には起こらない。例えば、非架橋酸素位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端で起こるか、末端領域で、例えば、鎖の末端ヌクレオチドまたは最後の2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10ヌクレオチドの位置で起こるか、あるいは二本鎖領域および一本鎖領域で、特に末端で、起こり得る。
【０２７４】
いくつかの修飾は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの特定の位置、例えば、鎖の内部位置、またはオリゴヌクレオチドの5'もしくは3'末端に含められる。オリゴヌクレオチド上の修飾の好ましい位置は、そのオリゴヌクレオチドに好ましい特性を付与することができる。例えば、特定の修飾の好ましい位置は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性に対する増加した抵抗性を付与し得る。
【０２７５】
SH2B3を阻害するRNAi物質およびその模倣体の製造
いくつかの態様では、本明細書に開示されるSH2B3を阻害するRNAi物質は、液相もしくは固相有機合成を用いて、または酵素的に当技術分野で公知の方法により調製することができる。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点を提供する。そのような合成のための当技術分野で公知の他の手段はどれも、追加的にまたは代替的に使用することができる。同様の技術を用いて、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製することも公知である。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド化合物は、二段階法を用いて調製することができる。最初に、二本鎖分子の各鎖を別々に調製する。次に、成分鎖をアニーリングする。
【０２７６】
マイクロRNAはまた、宿主における病原体の調節に関与している。例えば、Jopling, C.L., et al., Science (2005) vol. 309, pp 1577-1581を参照されたい。
【０２７７】
合成方法にかかわらず、オリゴヌクレオチドは、製剤に適切な溶液(例えば、水性および/または有機溶液)中で調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチド調製物を沈殿させ、純粋な再蒸留水に再溶解し、凍結乾燥する。次いで、乾燥したオリゴヌクレオチドを、意図する製剤プロセスに適した溶液中に再懸濁することができる。
【０２７８】
特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許または係属中の特許出願に見ることができる：ポリアミンコンジュゲート化オリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第5,138,045号および同第5,218,105号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのモノマーに向けられた米国特許第5,212,295号；修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第5,378,825号および同第5,541,307号；骨格修飾されたオリゴヌクレオチドおよび還元的カップリングによるその調製に向けられた米国特許第5,386,023号；3-デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基およびその合成方法に向けられた米国特許第5,457,191号；N-2置換プリンに基づく修飾核酸塩基に向けられた米国特許第5,459,255号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製方法に向けられた米国特許第5,521,302号；ペプチド核酸に向けられた米国特許第5,539,082号；βラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第5,554,746号；オリゴヌクレオチド合成のための方法および材料に向けられた米国特許第5,571,902号；アルキルチオ基を有し、このような基が、ヌクレオシドの様々な位置のいずれかに結合される他の部分へのリンカーとして使用することができるヌクレオシドに向けられた、米国特許第5,578,718号；高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第5,587,361号および同第5,599,797号；2'-O-アルキルグアノシンおよび関連化合物、例えば2,6-ジアミノプリン化合物、の調製方法に向けられた米国特許第5,506,351号；N-2置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第5,587,469号；3-デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第5,587,470号；コンジュゲート化4'-デスメチルヌクレオシド類似体に向けられた米国特許第5,223,168号および米国特許第5,608,046号；骨格修飾オリゴヌクレオチド類似体に向けられた米国特許第5,602,240号および同第5,610,289号；ならびに、とりわけ、2'-フルオロ-オリゴヌクレオチドの合成方法に向けられた米国特許第6,262,241号および同第5,459,255号。
【０２７９】
さらに、いくつかの態様では、SH2B3を阻害するRNAi物質は、当業者に周知の様々な技術によって、組換えにより産生されるか、またはインビトロで合成され得る。
【０２８０】
SH2B3を阻害するRNAi物質は、その組換え体を調製する(すなわち、当業者に周知の技術によって単離または精製することができる組換え核酸を産生するための遺伝子工学的技術を使用する)ことによって得ることができる。このアプローチは、適切な培地中で宿主細胞の培養物を増殖させ、該細胞から、または該細胞が増殖している培養物からSH2B3を阻害するRNAi物質を精製することを含む。例えば、該方法は、SH2B3を阻害するRNAi物質を産生するための方法であって、SH2B3を阻害するRNAi物質をコードする核酸を含む適切な発現ベクターを含有する宿主細胞を、コードされたRNAi物質の発現を可能にする条件下で培養する、方法を含む。培養物から、培地から、または宿主細胞から調製された溶解物からRNAiを回収し、さらに精製することができる。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核生物の宿主細胞、酵母細胞などの下等真核生物の宿主細胞、または細菌細胞などの原核細胞であり得る。RNAi物質をコードする核酸を含有するベクターの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって行うことができる(Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986))。こうした方法は、例えば、RNAi物質がmiRNAまたは同種のものである場合に有用である。
【０２８１】
任意の宿主/ベクターシステムを用いて、SH2B3を阻害する1つまたは複数のRNAi物質を発現させることができる。これらには、HeLa細胞および酵母などの真核細胞宿主、ならびに大腸菌(E. coli)および枯草菌(B. subtilis)などの原核細胞宿主が含まれるが、これらに限定されない。SH2B3を阻害するRNAi物質、例えばSH2B3を阻害するmiRNAは、適切なプロモーターの制御下にある。原核細胞および真核細胞宿主と共に使用するのに適したクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載される。好ましい態様では、SH2B3を阻害するRNAi物質、例えばmiRNAは、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現システムの例としては、以下が挙げられる：C127、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト腎臓293細胞、ヒト表皮A431細胞、ヒトColo205細胞、3T3細胞、CV-1細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常2倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から誘導された細胞株、初代移植片、HeLa細胞、マウスL細胞、BILK、HL-60、U937、HaKまたはJurkat細胞。
【０２８２】
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、ポリアデニル化部位、転写終結配列、および5'フランキング非転写配列を含む。SV40ウイルスゲノムに由来するDNA配列、例えば、SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供することができる。潜在的に適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevsiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイウェロマイセス属(Klayveromyces)株、カンジダ属(Candida)、またはSH2B3を阻害するRNAi物質、例えばmiRNAを発現することができる酵母株が含まれる。潜在的に適切な細菌株には、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、またはSH2B3を阻害するRNAi物質、例えばmiRNAを発現することができる細菌株が含まれる。
【０２８３】
別のアプローチでは、SH2B3を阻害するRNAi物質、例えばmiRNAをコードするゲノムDNAを単離し、該ゲノムDNAを哺乳動物発現システムにおいて発現させ、必要に応じて患者に投与するためにRNAを精製し修飾する。いくつかの態様では、miRNAである、SH2B3を阻害するRNAi物質は、プレmiRNAの形態であり、これは、所望により(すなわち、安定性または細胞取り込みを増進させるために)修飾することができる。
【０２８４】
SH2B3を阻害するRNAi物質、例えばshRNAまたはmiRNA、のDNA配列の知識は、内在性miRNAの発現を可能にするまたは増加させるために、細胞の改変を可能にする。細胞は、全体的にまたは部分的に、天然に存在するプロモーターを異種プロモーターの全部または一部と置き換えることにより、miRNA発現を増加させるように(例えば、相同組換えによって)改変することができ、その結果、該細胞はSH2B3を阻害するRNAi物質、例えばmiRNAを、より高いレベルで発現するようになる。異種プロモーターは、それがSH2B3を阻害する所望のRNAi物質、例えばmiRNAコード配列、に機能的に連結されるような方法で、挿入される。例えば、Transkaryotic Therapies社によるPCT国際公報番号WO94/12650、Cell Genesys社によるPCT国際公報番号WO92/20808、およびApplied Research Systems社によるPCT国際公報番号WO91/09955を参照されたい。細胞はまた、SH2B3を阻害するRNAi物質を含む内在性遺伝子を誘導性調節エレメントの制御下で発現するように操作することができ、その場合、内在性遺伝子の調節配列は相同組換えによって置換されてもよい。遺伝子活性化技術は、Chappelによる米国特許第5,272,071号；Sherwinらによる米国特許第5,578,461号；SeldenらによるPCT/US92/09627 (WO93/09222)；およびSkoultchiらによるPCT/US90/06436 (WO91/06667)に記載される。SH2B3を阻害するRNAi物質を調製するには、形質転換された宿主細胞を、SH2B3を阻害するRNAi物質の発現に適した培養条件下で培養する。その結果発現された、SH2B3を阻害するRNAi物質を、次に、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーなどの公知の精製プロセスを用いて、そのような培養物(すなわち、培地または細胞抽出物)から精製することができる。SH2B3を阻害するRNAi物質、例えばmiRの精製はまた、以下のカラム工程を含むことができる：該タンパク質に結合する物質を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンA-アガロース、ヘパリン-トヨパール(toyopearl)(商標)またはシバクロンブルー3GAセファロース(Sepharose)(商標)のような親和性樹脂上での1回もしくは複数回のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのような樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む1回もしくは複数回の工程；イムノアフィニティークロマトグラフィー、または相補的cDNAアフィニティークロマトグラフィー。
【０２８５】
SH2B3を阻害するRNAi物質はまた、SH2B3を阻害するRNAi物質をコードするヌクレオチド配列を含有する体細胞または生殖細胞を特徴とするトランスジェニック動物の産物として発現させることもできる。SH2B3を阻害するRNAi物質をコードするDNAおよび適切な調節エレメントを含有するベクターは、相同組換えを用いて動物の生殖系列に挿入され(Capecchi, Science t 244:1288-1292 (1989))、結果的に、それらはSH2B3を阻害するRNAi物質を発現するようになる。トランスジェニック動物、好ましくは非ヒト哺乳動物は、Robinsonらによる米国特許第5,489,743号およびOntario Cancer InstituteによるPCT公報番号WO94/28122に記載される方法を用いて作製される。いくつかの態様では、SH2B3を阻害するRNAi物質は、上記のトランスジェニック動物から単離された細胞または組織から単離され得る。
【０２８６】
1つのアプローチでは、SH2B3を阻害するRNAi物質は、合成的に、例えば当業者に公知の合成方法で核酸を化学合成することによって、得ることができる。次いで、合成されたSH2B3を阻害するRNAi物質は、当技術分野で公知の方法により精製することができる。核酸の化学合成法には、ホスホトリエステル、ホスフェートもしくはホスホロアミダイト化学および固相技術を用いるインビトロ化学合成、またはデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を介するものが含まれるが、これらに限定されない(Bhongleの米国特許第5,705,629号参照)。
【０２８７】
いくつかの状況下では、例えば、増進したヌクレアーゼ安定性が望まれる場合には、核酸類似体および/または修飾されたヌクレオシド間結合を有する、核酸が好ましい場合がある。修飾されたヌクレオシド間結合を含む核酸もまた、当技術分野で周知の試薬および方法を用いて合成することができる。例えば、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、メトキシエチルホスホロアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセチアミデート、カルバメート、ジメチリン-スルフィド(-CH2-S-CH2)、ジメチレン-スルホキシド(-CH2-SO-CH2)、ジメチレン-スルホン(-CH2-SO2-CH2)、2'-O-アルキル、および2'-デオキシ-2'-フルオロホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を含む核酸の合成方法は、当技術分野で周知である(Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31:335およびその中に引用された参照文献を参照されたい)。Cookらの米国特許第5,614,617号および同第5,223,618号、Acevedoらの同第5,714,606号、Cookらの同第5,378,825号、Buhrらの同第5,672,697号および第5,466,786号、Cookらの同第5,777,092号、De Mesmackerらの同第5,602,240号、Cookらの同第5,610,289号、ならびにWangの同第5,858,988号もまた、向上したヌクレアーゼ安定性と細胞取り込みのための核酸類似体を記載している。
【０２８８】
いくつかの態様では、SH2B3を阻害するRNAi物質は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,642,751号に開示されるような、ロックドヌクレオチドを含むことができる。本明細書に開示されるSH2B3を阻害するRNAi物質のモチーフの他の化学修飾は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる米国出願US 2012/0148664およびUS 2014/0066491に開示される。別の態様では、本明細書に開示されるSH2B3を阻害するRNAi物質は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる国際出願WO2012061810およびWO2012061810に開示されるような、塩基修飾オリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０２８９】
オリゴヌクレオチド製剤：
製剤化されたオリゴヌクレオチド組成物は、様々な状態をとることができる。ある例では、該組成物は、少なくとも部分的に結晶性、一様に結晶性、および/または無水(例えば、80、50、30、20または10％未満の水)であり得る。別の例では、オリゴヌクレオチドは、水相、例えば水を含む溶液中に存在する。
【０２９０】
水相または結晶性組成物は、例えば、リポソーム(特に水相用)または粒子(例えば、結晶性組成物に適切であり得るような微粒子)などの送達ビヒクルに組み込むことができる。一般的に、オリゴヌクレオチド組成物は、意図された投与方法に適合する様式で製剤化される。
【０２９１】
特定の態様では、該組成物は、以下の方法の少なくとも1つによって調製される：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、もしくはこれらの技術の組み合わせ；または脂質を用いる超音波処理、フリーズ・ドライ、凝縮および他の自己集合。
【０２９２】
オリゴヌクレオチド調製物は、別の薬剤と組み合わせて、例えば、別の治療薬またはオリゴヌクレオチドを安定化する薬剤、例えばオリゴヌクレオチドと複合してオリゴヌクレオチド-タンパク質複合体を形成するタンパク質と組み合わせて、製剤化することができる。さらに他の薬剤としては、キレート剤、例えばEDTA (例えば、Mg2+などの2価陽イオンを除去するため)、塩、DNAse阻害物質、RNAse阻害物質(例えば、RNAsinなどの広い特異性のRNAse阻害物質)などが挙げられる。
【０２９３】
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド調製物は、少なくとも第2の治療薬(例えば、RNAまたはDNA以外の薬剤)を含む。オリゴヌクレオチド調製物と共に製剤化することができる例示的な治療薬には、限定するものではないが、以下に見出されるものが含まれる：Harrison's Principles of Internal Medicine, 第17版, 2008, McGraw-Hill N.Y., NY; 米国医師用卓上参照書(Physicians Desk Reference), 第63版, 2008, Thomson Reuters, N.Y., N.Y.; Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第11版, 2005, McGraw-Hill N.Y., NY; 米国薬局方(United States Pharmacopeia), 国民医薬品集(The National Formulary), USP-32 NF-27, 2008, U.S. Pharmacopeia, Rockville, MD; これら全ての完全な内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２９４】
いくつかの態様では、第2の治療薬は抗高血圧薬または降圧薬である。
【０２９５】
代表的なオリゴヌクレオチド製剤
リポソーム：本発明のオリゴヌクレオチド(例えば、SH2B3を阻害するRNAi物質)は、リポソーム中に製剤化することができる。本明細書で使用する場合、リポソームは、水性の内部を囲む脂質含有膜を有する構造体である。リポソームは1つまたは複数の脂質膜を有し得る。いくつかの態様では、リポソームは約100nm未満の平均直径を有する。より好ましい態様は、約30〜70nm、最も好ましくは約40〜60nmの平均直径を有するリポソームを提供する。大オリゴラメラ小胞および多重ラメラ小胞は、複数の、通常は同心の膜層を有し、典型的には100nmより大きい。いくつかの非同心膜を有するリポソーム、すなわち、より大きい小胞内に含まれるいくつかのより小さい小胞は、多胞性小胞(multivesicular vesicle)と呼ばれる。
【０２９６】
リポソームは、1種または複数種の追加の脂質および/または他の成分、例えばコレステロールなどのステロールをさらに含むことができる。追加の脂質は、脂質酸化を防止する、二重層を安定化する、形成中の凝集を減らす、またはリガンドをリポソーム表面に付着させるといった、様々な目的のためにリポソーム組成物中に含めることができる。両親媒性、中性、カチオン性、アニオン性脂質、およびプログラム可能な融合脂質を含めて、多くの追加の脂質および/または他の成分が存在し得る。このような脂質および/または成分は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。リポソームの1つまたは複数の成分は、リガンド、例えばターゲティングリガンドを含み得る。
【０２９７】
リポソーム組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって調製することができる。例えば、米国特許第4,235,871号; 同第4,737,323号; 同第4,897,355号; および同第5,171,678号; 公開された国際出願WO96/14057およびWO96/37194; Feigner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci , USA (1987) 8:7413-7417; Bangham, et al., M. Mol. Biol. (1965) 23:238; Olson, et al., Biochim. Biophys. Acta (1979) 557:9; Szoka, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1978) 75:4194; Mayhew, et al., Biochim. Biophys. Acta (1984) 775:169; Kim, et al., Biochim. Biophys. Acta (1983) 728:339; ならびにFukunaga, et al., Endocrinol. (1984) 115:757を参照されたい。
【０２９８】
ミセルおよび他の膜製剤：いくつかの態様では、本明細書に開示するオリゴヌクレオチド(例えば、SH2B3を阻害するRNAi物質)を調製して、ミセルとして製剤化することが可能である。本明細書で使用する「ミセル」とは、特定のタイプの分子集合体であり、そこでは、該分子の全ての疎水性部分が内側に向けられ、親水性部分が周囲の水相と接触したままになるように、両親媒性分子が球状構造に配置される。環境が疎水性である場合には、逆の配置が存在する。
【０２９９】
いくつかの態様では、製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも1種の両親媒性担体から形成されたミセルを含み、その際、該ミセルは約100nm未満の平均直径を有することが好ましい。より好ましい態様は、約50nm未満の平均直径を有するミセルを提供し、さらにより好ましい態様は、約30nm未満、または約20nm未満の平均直径を有するミセルを提供する。
【０３００】
ミセル製剤は、オリゴヌクレオチド組成物の水溶液、アルカリ金属C8〜C22アルキル硫酸塩、および両親媒性担体を混合することによって調製することができる。両親媒性担体は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時または添加後に加えることができる。ミセルは、該成分の実質的にどのような種類の混合でも形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するために激しい混合が用いられる。
【０３０１】
エマルション：いくつかの態様では、本明細書に開示するオリゴヌクレオチド(例えば、SH2B3を阻害するRNAi物質)を調製して、エマルションとして製剤化することが可能である。本明細書で使用する「エマルション」とは、一方の液体が液滴の形で別の液体中に分散された不均質システムである。エマルションは、多くの場合、互いに密接に混和して分散している2つの不混和性液相を含む2相システムである。エマルションの相のいずれかは、エマルション型軟膏基剤およびクリームの場合のように、半固体または固体であり得る。オリゴヌクレオチドは、水相、油相中の溶液として、またはそれ自体の別個の相として存在することができる。
【０３０２】
いくつかの態様では、該組成物はマイクロエマルションとして製剤化される。本明細書で使用する「マイクロエマルション」とは、単一の光学的等方性の、熱力学的に安定な溶液である水、油、および両親媒性物質のシステムを指す。マイクロエマルションはまた、表面活性分子の界面膜によって安定化された2つの不混和性液体の熱力学的に安定した、等方的に透明な分散体を含む。
【０３０３】
皮膚科学的、経口的、および非経口的経路によるエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献に概説され、例えば、Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199のIdson; Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245のRosoff; およびPharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (編), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335のBlockを参照されたく、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３０４】
脂質粒子：いくつかの態様では、本明細書に開示するオリゴヌクレオチド(例えば、SH2B3を阻害するRNAi物質)を調製して、脂質粒子として製剤化することが可能であり、例えば、製剤化脂質粒子(FLiP)は、(a)親油性物質にコンジュゲートされた本発明のオリゴヌクレオチドと、(b)該コンジュゲート化オリゴヌクレオチドが凝集、混合、または会合された少なくとも1つの脂質成分、例えばエマルション、リポソーム、単離されたリポタンパク質、再構成リポタンパク質またはリン脂質とを含む。脂質成分に対するオリゴヌクレオチドの化学量論比は1：1であり得る。あるいは、化学量論比は、1：多数(many)、多数：1、または多数：多数とすることができ、ここで「多数」は2またはそれ以上である。
【０３０５】
FLiPは、オリゴヌクレオチドと親油性リンカー分子を介して凝集、混合または会合したトリアシルグリセロール、リン脂質、グリセロール、および1種または数種の脂質結合タンパク質を含むことができる。驚くべきことに、上記の脂質と組み合わせた1種または数種の脂質結合タンパク質のために、FLiPは、肝臓、腸、腎臓、ステロイド産生臓器、心臓、肺および/または筋肉組織に対して親和性を示すことが見出された。したがって、これらのFLiPは、こうした組織へのオリゴヌクレオチドのためのキャリアとして役に立つことができる。例えば、脂質コンジュゲート化オリゴヌクレオチド、例えばコレステロールコンジュゲート化オリゴヌクレオチドは、HDLおよびLDLリポタンパク質粒子に結合し、該リポタンパク質粒子は、それらのそれぞれの受容体に結合すると、細胞取り込みを媒介し、こうして、肝臓、腸、腎臓およびステロイド産生臓器へのオリゴヌクレオチド送達を誘導する。Wolfrum et al. Nature Biotech. (2007), 25:1145-1157を参照されたい。
【０３０６】
FLiPは、15〜25％のトリアシルグリセロール、約0.5〜2％のリン脂質および1〜3％のグリセロール、ならびに1種または数種の脂質結合タンパク質を含む脂質粒子であり得る。FLiPは、約15〜25％のトリアシルグリセロール、約1〜2％のリン脂質、約2〜3％のグリセロール、および1種または数種の脂質結合タンパク質を有する脂質粒子であり得る。いくつかの態様では、脂質粒子は、約20％のトリアシルグリセロール、約1.2％のリン脂質および約2.25％のグリセロール、ならびに1種または数種の脂質結合タンパク質を含む。
【０３０７】
FLiPのための別の好適な脂質成分は、リポタンパク質、例えば単離されたリポタンパク質、より好ましくは再構成されたリポタンパク質である。代表的なリポタンパク質には、キロミクロン、VLDL(超低密度リポタンパク質)、IDL(中間密度リポタンパク質)、LDL(低密度リポタンパク質)およびHDL(高密度リポタンパク質)が含まれる。再構成リポタンパク質を生産する方法は当技術分野で公知であり、例えば、A. Jones, Experimental Lung Res. 6, 255-270 (1984); 米国特許第4,643,988号および同第5,128,318号; PCT公報WO87/02062; カナダ国特許第2,138,925号を参照されたい。特にアポリポタンパク質A-I、A-II、A-IV、apoC、およびapoEについての、再構成リポタンパク質を生産する他の方法は、A. Jonas, Methods in Enzymology 128, 553-582 (1986)およびG. Franceschini et al. J. Biol. Chem., 260(30), 16321-25 (1985)に記載される。
【０３０８】
FLiPのための好ましい脂質成分の1つはイントラリピドである。イントラリピド(Intralipid)(登録商標)は、ヒトに使用するための最初の安全な脂肪乳剤の商標名である。イントラリピド(登録商標)20％(20％静脈内脂肪乳剤)は、20％の大豆油、1.2％の卵黄リン脂質、2.25％のグリセリン、および注射用水で構成される。他の適切な油、例えばサフラワー油がFLiPの脂質成分を生成するのに役立ち得ることは、さらに本発明の範囲内である。
【０３０９】
FLiPは、約20〜50nmまたは約30〜50nm、例えば約35nmまたは約40nmのサイズ範囲であり得る。いくつかの態様では、FLiPは少なくとも約100nmの粒子サイズを有する。あるいは、FLiPは、リポソームベースまたはエマルションベースとして特徴付けられようとも、約100〜150nm、例えば約110nm、約120nm、約130nm、または約140nmであり得る。複数のFLiPを凝集させて一緒に送達することもできるので、そのサイズは100nmよりも大きくなり得る。
【０３１０】
脂質粒子を作製するための方法は、(a)脂質成分を、化学的に修飾され得る1種または数種の親油性物質(例えば、コレステロール)コンジュゲート化オリゴヌクレオチドと混合する工程；および(b)この混合物を分別する工程；を含む。いくつかの態様では、この方法は、粒子サイズが30〜50nm、好ましくは約40nmの画分を選択する追加の工程を含む。
【０３１１】
本発明に従ういくつかの代表的な脂質粒子製剤は、2009年3月26日出願の米国特許出願第12/412,206号に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３１２】
酵母細胞壁粒子：いくつかの態様では、本明細書に開示するオリゴヌクレオチド(例えば、SH2B3を阻害するRNAi物質)は、酵母細胞壁粒子(「YCWP」)中に製剤化される。酵母細胞壁粒子は、抽出された酵母細胞壁外部と、ペイロード(例えば、オリゴヌクレオチド)を含むコアとを含む。該粒子の外部は、酵母グルカン(例えば、βグルカン、β-1,3-グルカン、β-1,6-グルカン)、酵母マンナン、またはそれらの組み合わせを含む。酵母細胞壁粒子は、典型的には直径約1〜4μmの球状粒子である。
【０３１３】
酵母細胞壁粒子の調製は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第4,992,540号; 同第5,082,936号; 同第5,028,703号; 同第5,032,401号; 同第5,322,841号; 同第5,401,727号; 同第5,504,079号; 同第5,607,677号; 同第5,741,495号; 同第5,830,463号; 同第5,968,811号; 同第6,444,448号; および同第6,476,003号、米国特許出願公開第2003/0216346号および同第2004/0014715号、ならびに国際出願公報WO2002/12348に記載されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。薬物送達のための酵母細胞様粒子の応用例は、例えば、米国特許第5,032,401号; 同第5,607,677号; 同第5,741,495号; および同第5,830,463号、ならびに米国特許出願公開2005/0281781および同第2008/0044438号に記載されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2009/0226528号は、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための酵母細胞壁粒子を用いた核酸の製剤化を記載している。
【０３１４】
オリゴヌクレオチドのためのさらなる例示的な製剤は、米国特許第4,897,355号; 同第4,394,448号; 同第4,235,871号; 同第4,231,877号; 同第4,224,179号; 同第4,753,788号; 同第4,673,567号; 同第4,247,411号; 同第4,814,270号; 同第5,567,434号; 同第5,552,157号; 同第5,565,213号; 同第5,738,868号; 同第5,795,587号; 同第5,922,859号; および同第6,077,663号； 2007年9月21日出願の国際出願番号PCT/US07/079203; 2007年10月3日出願のPCT/US07/080331; 2008年5月28日出願の米国特許出願第12/123,922号; 米国特許出願公開第2006/0240093号および同第2007/0135372号および2008年1月2日出願の米国仮出願第61/018,616号; 2008年3月26日出願の同第61/039,748号; 2008年4月15日出願の同第61/045,228号; 2008年4月22日出願の同第61/047,087号; 2008年5月21日出願の同第61/051,528号; および同第61/113,179号(2008年11月10日出願)に記載されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。Behr (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389およびLewis et al. (1996) PNAS 93:3176-3181もまた、本発明に従うオリゴヌクレオチドのための製剤を記載しており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３１５】
SH2B3の小分子阻害物質
SH2B3タンパク質は、SH2ドメインとPHドメインの両方を有し、そのいずれかまたは両方がペプチドおよび小分子阻害物質の開発のための標的となり得る。D. Kraskouskaya, et al., Chem Soc Rev. 2013 Apr 21;42(8):3337-70を参照されたい。いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、SH2B3タンパク質のSH2ドメインに特異的に結合する。いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、SH2B3タンパク質のPHドメインに特異的に結合する。いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、SH2B3タンパク質のSH2ドメインとPHドメインとの両方に特異的に結合する。
【０３１６】
いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは小分子である。本明細書で使用する用語「小分子」は、約5kD未満の分子量を有する天然または合成分子、約5kD未満、約2kD未満、もしくは約1kD未満の分子量を有する有機または無機化合物を指す。
【０３１７】
いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、50μM未満のIC50を示すことができ、例えば、SH2B3のアンタゴニストは、約50μM〜約5nM、または5nM未満のIC50を有する。例えば、いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、約50μM〜約25μM、約25μM〜約10μM、約10μM〜約5μM、約5μM〜約1μM、約1μM〜約500nM、約500nM〜約400nM、約400nM〜約300nM、約300nM〜約250nM、約250nM〜約200nM、約200nM〜約150nM、約150nM〜約100nM、約100nM〜約50nM、約50nM〜約30nM、約30nM〜約25nM、約25nM〜約20nM、約20nM〜約15nM、約15nM〜約10nM、約10nM〜約5nM、または約5nM未満のIC50を有する。
【０３１８】
いくつかの態様では、SH2B3のアンタゴニストは、抗SH2B3抗体分子またはその抗原結合断片であり得る。適切な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、組換え、一本鎖、Fab、Fab'、Fsc、RvおよびF(ab')2断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、中和抗体を抗SH2B3抗体として使用することができる。抗体は、抗原で免疫することによって、ウサギまたはマウスのような動物において容易に産生される。免疫されたたマウスは、ハイブリドーマ作製用のB細胞の供給源を提供するために特に有用であり、ハイブリドーマは次に大量のモノクローナル抗体を産生させるために培養される。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、該分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なる免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDの1つに分類され得る。特定のクラスには、IgG1、IgG2などのサブクラスもある。さらに、ヒトにおいて、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。本明細書での抗体への言及は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの言及を含む。
【０３１９】
抗体は、広範囲の標的抗原およびハプテンに対する高い結合親和力および固有の特異性を提供する。本明細書に開示される方法の実施に有用なモノクローナル抗体は、全抗体およびその断片を含み、ハイブリドーマ合成、組換えDNA技術およびタンパク質合成などの従来の技術に従って作製される。
【０３２０】
SH2B3ポリペプチドまたはその一部もしくは断片は、抗原として機能することができ、さらに、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的な技術を用いて、該抗原と免疫特異的に結合する抗体を作製するための免疫原として使用することができる。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも10個のアミノ酸残基、または少なくとも15個のアミノ酸残基、または少なくとも20個のアミノ酸残基、または少なくとも30個のアミノ酸残基を含む。
【０３２１】
有用なモノクローナル抗体および断片は、いずれかの種(ヒトを含む)に由来するか、または2つ以上の種由来の配列を用いるキメラタンパク質として形成され得る。ヒトモノクローナル抗体または「ヒト化」マウス抗体も、本発明に従って使用することができる。例えば、マウスモノクローナル抗体は、マウスFv領域(すなわち、抗原結合部位を含む)またはその相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト定常ドメイン領域およびFc領域をコードするヌクレオチド配列と遺伝的に再結合させることによって「ヒト化」することができる。ヒト化されたターゲティング部分は、宿主レシピエントにおける該抗体またはポリペプチドの免疫反応性を低下させることが認識されており、欧州特許出願第0,411,893 A2号に開示されるのと同様の方法で、半減期の増加および起こりうる有害な免疫反応の低減を可能にする。マウスモノクローナル抗体は、好ましくはヒト化形態で使用されるべきである。抗原結合活性は、抗体の可変部分(Fv)の軽鎖および重鎖上に(それぞれ3つ)位置する6つの相補性決定領域(CDR)のアミノ酸の配列および立体構造によって決定される。短鎖ペプチドスペーサー配列を介して連結された軽鎖の可変領域(VL)と重鎖の可変領域(VH)で構成された、25kDaの一本鎖Fv (scFv)分子は、抗体剤のサイズを最小化するための1つの選択肢である。scFvは、特異的に結合するものを同定するために、多数の異なる抗体断片を調製してスクリーニングするためのさらなる選択肢を提供する。scFvの遺伝子を含む繊維状ファージの表面にscFv分子をディスプレイさせる技術が開発されている。広範囲の抗原特異性を有するscFv分子は、scFvファージライブラリの単一の大きなプール中に存在し得る。
【０３２２】
キメラ抗体は、異なる動物種に由来する2つ以上のセグメントまたは部分を特徴とする免疫グロブリン分子である。一般的に、キメラ抗体の可変領域はマウスモノクローナル抗体などの非ヒト哺乳動物抗体に由来し、その免疫グロブリン定常領域はヒト免疫グロブリン分子に由来する。好ましくは、両方の領域およびその組み合わせは、ルーチンに測定して、低い免疫原性を有する。
【０３２３】
抗SH2B3抗体は、Thermo Scientific、Sigma Aldrich、Atlas Antibodies、およびR＆D Systemsなどの販売会社から市販されている。
【０３２４】
幹細胞および/または前駆細胞を培養する方法は、当技術分野で周知である。一般的に、本明細書に記載の細胞は、当技術分野で利用可能であり周知の培養培地中で培養することができる。そのような培地には、ダルベッコ改変イーグル培地、F-12K(登録商標)、イーグル最小必須培地(登録商標)(DMEM)、DMEM F12培地(登録商標)、血清フリー(登録商標)RPMI-1640培地(登録商標)、イスコフ改変ダルベッコ培地(登録商標)(IMDM)が含まれるが、これらに限定されない。幹細胞および/または前駆細胞を培養して増大させるための多くの培地は、ピルビン酸ナトリウム含有または不含の低グルコース処方物としても入手可能である。
【０３２５】
また、本明細書では、細胞培養培地に哺乳動物血清を補充することも意図される。血清は、多くの場合、生存と増大に必要な細胞因子および成分を含有する。血清の例には、ウシ胎児血清(FBS)、ウシ血清(BS)、仔ウシ血清(CS)、仔ウシ胎児血清(FCS)、新生仔ウシ血清(NCS)、ヤギ血清(GS)、ウマ血清(HS)、ヒト血清(例えば、ヒトAB血清)、ニワトリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、血清代替品およびウシ胚液が含まれる。当然、補体カスケードの成分を不活性化するために必要とみなされるならば、血清を55〜65℃で熱不活性化することができる。ヒトAB血漿のような血漿も使用することができる。
【０３２６】
成長因子を細胞培養培地に添加することができる。造血成長因子としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：あらゆるインターロイキン(IL-1〜IL-16)、インターフェロン(IFN-α、βおよびγ)、エリスロポエチン(EPO)、幹細胞因子(SCF)、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、腫瘍増殖因子β、腫瘍壊死因子α、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、フィンズ(fins)様チロシンキナーゼ-3リガンド(Flt3-リガンド)、ならびにEGF (上皮成長因子)、VEGF (血管内皮細胞成長因子)、LIF (白血病阻止因子)。また、トロンボポエチン(TPO)またはMGDF(マスト増殖由来因子)を使用することもできる。これらの成長因子の多くは市販されている。最もよく使用される成長因子の混合物は、G-CSF、GM-CSF、SCF、IL-1、IL-3およびIL-6を含む。使用される成長因子のほとんどは、組換えDNA技術によって産生されて、様々な程度に精製される。いくつかの成長因子は、標準的な生化学的手法により腫瘍細胞株の培地から精製される。広く使用されている成長因子はPIXY 321であり、これは、組換え技術によって産生され、GM-CSFとIL-3との両方の活性を示す。
【０３２７】
培養に使用される成長因子の量は、該因子調製物の活性および使用する成長因子類の組み合わせに依存する。典型的には、濃度は0.5〜500ng/mLの範囲である。いくつかの成長因子は他の成長因子と相乗的に作用するので、各成長因子の最適な濃度は、個々の培養条件について決定する必要がある。
【０３２８】
追加の補充物はまた、最適な成長および増大のために必要な微量元素を細胞に供給するために、有利に使用され得る。そのような補充物には、例えば、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、亜セレン酸ナトリウムおよびこれらの組み合わせが含まれる。これらの成分は、限定するものではないが、(HBSS)、アール塩(登録商標)、ハンクス平衡塩溶液、抗酸化補充物、MCDB-201(著作権)、生理食塩溶液(PBS)、アスコルビン酸およびアスコルビン酸-2-リン酸、ならびに追加のアミノ酸類を含む塩溶液中に含めることができる。多くの細胞培養培地は既にアミノ酸類を含有するが、いくつかは、細胞を培養する前に補充を必要とする。そのようなアミノ酸としては、限定するものではないが、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-システイン、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リシン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリンが挙げられる。これらの補充物の適切な濃度を決定することは、当業者の技量の範囲内である。
【０３２９】
ホルモンもまた、本明細書に記載の細胞培養物中で有利に使用することができ、限定するものではないが、D-アルドステロン、ジエチルスチルベストロール(DES)、デキサメタゾン、β-エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン/ヒト成長ホルモン(HGH)、チロトロピン、チロキシンおよびL-チロニンが含まれる。
【０３３０】
脂質および脂質担体もまた、細胞の種類および分化細胞の運命に応じて、細胞培養培地を補充するために使用することができる。そのような脂質および担体としては、限定するものではないが、とりわけ、コレステロール、アルブミン結合型リノール酸、シクロデキストリン、アルブミン結合型リノール酸およびオレイン酸、非結合型リノール酸を挙げることができる。
【０３３１】
また、フィーダー細胞層の使用も本明細書に記載の方法のために意図される。フィーダー細胞は、幹細胞などの偏好性の培養細胞の成長を支持するために使用される。フィーダー細胞は、細胞分裂を抑制するが活動代謝を可能にするようにγ線照射されている正常細胞である。培養下で、フィーダー層は、他の細胞の基底不活性化層として働き、それら自体のさらなる成長または分裂を行わずに細胞内因子を供給する(Lim, J. W. and Bodnar, A., 2002)。典型的なフィーダー層細胞の例には、ヒト2倍体肺細胞、マウス胚性線維芽細胞およびSwissマウス胚性線維芽細胞が含まれるが、幹細胞および/または前駆細胞の最適な成長、生存、および増大を可能にする上で有利な細胞内成分および因子を供給することができるならば、どのような分裂終了細胞であってもよい。多くの場合、白血病阻止因子(LIF)が抗分化特性を有するので、フィーダー細胞層は、幹細胞および/または前駆細胞を未分化の増殖状態に保つ必要はない。したがって、LIFの補充を用いて、細胞を未分化の状態に維持することができる。
【０３３２】
細胞は、低血清または無血清の培地で培養することができる。細胞を培養するために使用される無血清培地は、例えば、米国特許第7,015,037号に記載される。多くの細胞は、無血清または低血清の培地で増殖されてきた。例えば、該培地には1種または複数種の成長因子を補充することができる。よく使用される成長因子には、骨形態形成タンパク質、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子および上皮成長因子、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3リガンドならびにΓ-3が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第7,169,610号; 同第7,109,032号; 同第7,037,721号; 同第6,617,161号; 同第6,617,159号; 同第6,372,210号; 同第6,224,860号; 同第6,037,174号; 同第5,908,782号; 同第5,766,951号; 同第5,397,706号; および同第4,657,866号を参照されたく；これらはすべて、無血清培地中での細胞の成長を教示するために参照により本明細書に組み入れられる。
【０３３３】
培養中の細胞は、懸濁液中で維持されるか、または細胞外マトリックス成分などの固体支持体に付着させて維持される。幹細胞および/または前駆細胞は、固体支持体へのそれらの付着を促進する追加の因子をしばしば必要とし、そうした因子には、例えば、I型およびII型コラーゲン、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」およびフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ポリ-Dおよびポリ-L-リシン、トロンボスポンジンおよびビトロネクチンがある。幹細胞および/または前駆細胞はまた、Corning低付着プレートなどであるがこれに限定されない低付着フラスコ内で培養することもできる。
【０３３４】
いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞は、成長因子の組成が細胞増殖および分化の過程で変化する多相(例えば3相)培養システムで培養することができる。例えば、IL-3、SCFおよびEPOは細胞増殖および分化の初期段階で使用され、SCFおよびEPOは中間段階で使用され、EPOは細胞増殖および分化の最終段階で使用される。
【０３３５】
いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞は、少なくとも1.0単位/mlのEPO、少なくとも1.2単位/mlのEPO、少なくとも1.4単位/mlのEPO、少なくとも1.6単位/mlのEPO、少なくとも1.8単位/mlのEPO、少なくとも2.0単位/mlのEPO、少なくとも2.2単位/mlのEPO、少なくとも2.4単位/mlのEPO、少なくとも2.6単位/mlのEPO、少なくとも2.8単位/mlのEPO、少なくとも3.0単位/mlのEPO、少なくとも3.2単位/mlのEPO、少なくとも3.4単位/mlのEPO、少なくとも3.6単位/mlのEPO、少なくとも3.8単位/mlのEPO、または少なくとも4.0単位/mlのEPOの存在下で培養される。
【０３３６】
いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞は、少なくとも1ng/mlのIL-3、少なくとも2ng/mlのIL-3、少なくとも3ng/mlのIL-3、少なくとも4ng/mlのIL-3、少なくとも5ng/mlのIL-3、少なくとも6ng/mlのIL-3、少なくとも7ng/mlのIL-3、少なくとも8ng/mlのIL-3、少なくとも9ng/mlのIL-3、少なくとも10ng/mlのIL-3、少なくとも11ng/mlのIL-3、少なくとも12ng/mlのIL-3、少なくとも13ng/mlのIL-3、少なくとも14ng/mlのIL-3、少なくとも15ng/mlのIL-3、少なくとも16ng/mlのIL-3、少なくとも17ng/mlのIL-3、少なくとも18ng/mlのIL-3、少なくとも19ng/mlのIL-3、少なくとも20ng/mlのIL-3、少なくとも21ng/mlのIL-3、少なくとも22ng/mlのIL-3、少なくとも23ng/mlのIL-3、少なくとも24ng/mlのIL-3、または少なくとも25ng/mlのIL-3の存在下で培養される。
【０３３７】
いくつかの態様では、幹細胞および/または前駆細胞は、少なくとも1ng/mlのSCF、少なくとも2ng/mlのSCF、少なくとも3ng/mlのSCF、少なくとも4ng/mlのSCF、少なくとも5ng/mlのSCF、少なくとも6ng/mlのSCF、少なくとも7ng/mlのSCF、少なくとも8ng/mlのSCF、少なくとも9ng/mlのSCF、少なくとも10ng/mlのSCF、少なくとも15ng/mlのSCF、少なくとも20ng/mlのSCF、少なくとも25ng/mlのSCF、少なくとも30ng/mlのSCF、少なくとも35ng/mlのSCF、少なくとも40ng/mlのSCF、少なくとも45ng/mlのSCF、少なくとも50ng/mlのSCF、少なくとも55ng/mlのSCF、少なくとも60ng/mlのSCF、少なくとも65ng/mlのSCF、少なくとも70ng/mlのSCF、少なくとも75ng/mlのSCF、少なくとも80ng/mlのSCF、少なくとも85ng/mlのSCF、少なくとも90ng/mlのSCF、少なくとも95ng/mlのSCF、少なくとも100ng/mlのSCF、少なくとも150ng/mlのSCF、少なくとも200ng/mlのSCF、少なくとも250ng/mlのSCF、少なくとも300ng/mlのSCF、少なくとも350ng/mlのSCF、少なくとも400ng/mlのSCF、少なくとも450ng/mlのSCF、または少なくとも500ng/mlのSCFの存在下で培養される。
【０３３８】
いくつかの態様では、HSCは、IL-3、SCF、EPO、ヒトAB血漿、ヒトAB血清、トランスフェリン、ヘパリンおよびインスリンの存在下で培養される。
【０３３９】
RBCの産生のための幹細胞の細胞培養培地は、例えば、US20140255369およびUS8206979に開示されており、その各々の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３４０】
RBCを含む組成物
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、SH2B3阻害なしの同じ集団の幹細胞および/または前駆細胞を使用する方法と比較して、RBCの量を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、または少なくとも500％増加させることができる。
【０３４１】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、SH2B3阻害なしの同じ集団の幹細胞および/または前駆細胞を使用する方法と比較して、RBCの質を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、または少なくとも500％向上させることができる。RBCの質は、脱核したRBCの割合が増加する場合、適切な成熟マーカーを有するRBCの頻度が増加する場合、ヘモグロビン産生(hemoglobinization)が改善される場合、またはそれらの組み合わせの場合に、向上すると考えられる。成熟マーカーには、CD235a(グリコホリンA)、Rh抗原、CD44、および成熟赤血球上に発現される様々な他の血液型の表面発現が含まれる。
【０３４２】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、SH2B3阻害なしの同じ集団の幹細胞および/または前駆細胞を使用する方法と比較して、成熟に向かうRBCの割合を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、または少なくとも500％増加させることができる。
【０３４３】
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法は、HSPCをSH2B3アンタゴニストと所定の時間接触させることを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法は、HSPCをSH2B3アンタゴニストと、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約10時間、少なくとも約12時間、12〜24時間、24〜32時間、32〜48時間、1〜2日間、3〜4日間、または4日間より長い所定の時間、接触させることを含む。
【０３４４】
いくつかの態様では、前記接触は、第1相(1〜7日目)の分化の前または間の予め選択した期間にわたって、すなわち、培養培地(ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)、幹細胞因子(SCF)、およびIL-3を含む)ならびに少なくとも1種のSH2B3アンタゴニストの存在下で、行われる。いくつかの態様では、前記接触は、第1相(1〜7日目)の分化の前または間に、すなわち、培養培地(ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)、幹細胞因子(SCF)、およびIL-3を含む)ならびに少なくとも1種のSH2B3アンタゴニストの存在下で行われる。
【０３４５】
いくつかの態様では、SH2B3アンタゴニストは、第2相(7〜12日目)の分化の前または間の予め選択した期間にわたって、すなわち、培養培地(ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)、および幹細胞因子(SCF)を含む)および少なくとも1種のSH2B3の存在下で、HSPCと接触する。いくつかの態様では、SH2B3アンタゴニストは、第3相(12〜18日目)の分化の前または間の予め選択した期間にわたって、すなわち、培養培地(ヘパリン、ホロトランスフェリン、およびエリスロポエチン(Epo)を含む)および少なくとも1種のSH2B3アンタゴニストの存在下で、HSPCと接触する。
【０３４６】
いくつかの態様では、成熟RBCの集団は7〜21日で産生される。いくつかの態様では、成熟RBCの集団は7〜18日で産生される。いくつかの態様では、成熟RBCの集団は7〜16日で産生される。いくつかの態様では、成熟RBCの集団は7〜14日で産生される。いくつかの態様では、成熟RBCの集団は7〜12日で産生される。いくつかの態様では、成熟RBCの集団は7日未満で産生される。
【０３４７】
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法および組成物は、本明細書に開示される方法によって作製されたRBCを含む。いくつかの態様では、本発明は、RBCを、それらが由来した多能性幹細胞または前駆細胞(すなわち、HSPC)と組み合わせた混合物を包含し、いくつかの態様では、該混合物は、該混合物の全細胞集団中に約25％未満、約20％未満、約15％未満、約13％未満、約12％未満、約11％未満、約10％未満、約9％未満、約8％未満、約7％未満、約6％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、または約1％未満の幹細胞または前駆細胞を含む。
【０３４８】
いくつかの態様では、RBCは、細胞の混合集団における大多数の細胞型である。例えば、前記方法は本明細書に記載の細胞集団を生成するか、または本明細書に記載の混合物は、少なくとも約99％、少なくとも約98％、少なくとも約97％、少なくとも約96％、少なくとも約95％、少なくとも約94％、少なくとも約93％、少なくとも約92％、少なくとも約91％、少なくとも約90％、少なくとも約89％、少なくとも約87％、少なくとも約86％、少なくとも約85％、少なくとも約84％、少なくとも約83％、少なくとも約82％、少なくとも約81％、少なくとも約80％、少なくとも約79％、少なくとも約78％、少なくとも約77％、少なくとも約76％、少なくとも約75％、少なくとも約74％、少なくとも約73％、少なくとも約72％、少なくとも約71％、少なくとも約70％、少なくとも約69％、少なくとも約68％、少なくとも約67％、少なくとも約65％、少なくとも約64％、少なくとも約63％、少なくとも約62％、少なくとも約61％、少なくとも約60％、少なくとも約59％、少なくとも約58％、少なくとも約57％、少なくとも約56％、少なくとも約55％、または少なくとも約50％のRBCを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法を用いて生成される混合物もしくは培養物または細胞集団におけるRBCのパーセンテージは、フィーダー細胞または培養を維持するために使用した他の細胞には関係なく、計算される。
【０３４９】
本明細書に記載の方法および組成物を用いて産生されたRBCは、血液バンクに保存することができる。いくつかの態様では、RBCは凍結保存培地中または貯蔵培地中に存在する。いくつかの態様では、RBCは、適切な貯蔵培地中に+4℃またはそれより低い温度、例えば-20℃で貯蔵される。血液バンクは、様々な治療用途だけでなく、研究用途にも用いられ得る、RBCの大きなプールを提供することができる。例えば、健康上の理由により輸血が必要である場合、例えば対象が手術を受ける予定である場合、および/または後日に輸血を必要とする場合(例えば、骨髄移植を受けているなど)、貯蔵されたRBCは、将来使用するためのRBCの供給源として役立ち得る。いくつかの態様では、RBCは、スポーツ目的のために、例えばスポーツイベントの前の輸血のために、バンクで保管することができる。貯蔵されたRBCは、自己使用のための、例えばドナーの将来の治療のための、細胞の供給源としても役立ち得る。いくつかの態様では、貯蔵されたRBCは、ドナーの血縁者の将来の治療のための細胞の供給源としても役立つことができる。貯蔵されたRBCはまた、ドナーの承諾があれば、血液型の一致した他の個体による臨床使用のための細胞の供給源として役立ち得る。血液型の適合性は表1に示される。また、本明細書に記載の方法および組成物は、稀な血液型、例えばダフィー(Duffy)陰性血液のためのRBCを生成するために使用することができる。本明細書に記載の方法および組成物は、一生涯の間に血液型を変える対象、例えば、A型でありかつO型の骨髄移植を受ける、対象のためのRBCを生成するために使用することができる。
【０３５０】
RBCの貯蔵条件は当技術分野において周知である。ルーチン血液貯蔵は、貯蔵RBC濃厚液パックについて42日または6週間である。RBCの長期貯蔵方法は、当技術分野で周知であり、米国特許第4,585,735号、同第4,675,185号、同第4,943,287号、同第5,789,151号、同第6,150,085号、同第8,071,282号、同第8,968,992号、米国特許出願第2012/0329036号、同第2001/0049089号、同第2014/0091047号、同第2015/0190309号、同第2014/0086892号に記載され；これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３５１】
本発明の別の局面は、本明細書に開示される方法を用いて産生されたRBCおよび本明細書に開示される少なくとも1種のSH2B3阻害物質を含む細胞培養培地に関する。いくつかの態様では、細胞培養培地はRBCと少なくとも1種のSH2B3アンタゴニストを含有する。いくつかの態様では、該SH2B3はsiRNA物質である。いくつかの態様では、該組成物は、第1相(1〜7日目)の分化のための培地(ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)、幹細胞因子(SCF)、およびIL-3を含む)および少なくとも1種のSH2B3アンタゴニストを含有する培養培地を含む。いくつかの態様では、該組成物は、第2相(7〜12日目)の分化のための培地(ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo) 、および幹細胞因子(SCF)を含む)および少なくとも1種のSH2B3を含有する培養培地を含む。いくつかの態様では、該組成物は、第3相(12〜18日目)の分化のための培地(ヘパリン、ホロトランスフェリン、およびエリスロポエチン(Epo)を含む)および少なくとも1種のSH2B3アンタゴニストを含有する培養培地を含む。
【０３５２】
RBCの回収
RBCは、当技術分野で公知の方法を用いて単離され得る。例えば、白血球濾過またはフローサイトメトリー選別によってRBCを単離することができる。いくつかの態様では、RBCは、CD235aマーカーの陽性選択およびCD71マーカーの陰性選択に基づいて回収することができる。
【０３５３】
いくつかの態様では、RBCは白血球濾過を用いて単離される。白血球濾過では、ほぼ全ての有核細胞がフィルターの使用によって除去されるので、実質的に純粋なRBCの集団が得られる。白血球濾過は、大規模なRBC単離のための有用な方法である。
【０３５４】
治療用途
本明細書に記載の方法のいずれかに従って産生されたRBCは、様々な治療用途に使用することができる。RBC輸血を、種々の理由および障害のためにそうした治療を必要とする患者に使用することは、当技術分野において周知であり、アプローチは標準的な医療行為である。本明細書に記載されかつ/または本開示の方法に従って産生されたRBCは、輸血に現在使用されているのと同じアプローチおよび条件を用いて、患者を治療するために使用することができる。
【０３５５】
特定の態様では、本開示は、本開示の赤血球の集団、または本開示の方法のいずれかに従って作製された赤血球の集団を、赤血球の欠乏を特徴とする障害を有する対象に投与することによって、赤血球の欠乏を特徴とする疾患または障害を治療、予防、または診断する方法に関する。
【０３５６】
本明細書で使用する「赤血球の欠乏」とは、正常な赤血球量を有する対象における赤血球の量よりも約20％〜約900％低い赤血球の量を有する対象；または正常な赤血球量を有する対象における赤血球の量よりも約10倍〜約1,000倍低い赤血球の量を有する対象をいう。
【０３５７】
赤血球の欠乏を特徴とする障害としては、限定するものではないが、下記の障害が挙げられる：貧血(例えば、先天性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血、鉄欠乏性貧血、鎌状赤血球貧血、球状赤血球症、溶血性貧血、無セルロプラスミン血症、アデノシンデアミナーゼ上昇活性、アデニル酸キナーゼ欠乏症、アルドラーゼ欠損症、αサラセミア−形質またはキャリア、無トランスフェリン血症、常染色体優性鉄芽球性貧血、常染色体劣性鉄芽球性貧血、βサラセミア−形質またはキャリア、βサラセミア・メジャー(および中間型)、血小板減少症を伴うCDA (GATA I変異)、複合ヘテロ接合性鎌状赤血球障害、先天性有棘赤血球増加症、先天性赤血球形成異常性貧血I型、先天性赤血球形成異常性貧血II型、先天性赤血球形成異常性貧血III型、δβサラセミア、ダイアモンド・ブラックファン(Diamond-Blackfan)貧血、DMT 1欠乏性貧血、家族性再生不良性貧血、ファンコニ貧血、γグルタミルシステイン合成酵素欠損症、GLRX5関連鉄芽球性貧血、ブドウ糖リン酸イソメセーゼ欠損症、グルコース-6-リン酸脱水素酵素欠損症、グルタチオン還元酵素欠損症、グルタチオン合成酵素欠損症、ヘモグロビンC症、ヘモグロビンD症、ヘモグロビンE症、ヘモグロビンH症、ヘモグロビンレポア、貧血を伴うヘモグロビンM、遺伝性楕円赤血球症、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症、遺伝性球状赤血球症、遺伝性有口赤血球症、ヘキソキナーゼ欠損症、胎児水腫、イマースルンド・グレスベック(Imerslund-Grasbeck)症候群、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血、カーンズ・セイヤー(Kearns-Sayre)症候群、レシチンコレステロールアシル転移酵素欠損症、ミトコンドリアミオパチー鉄芽球性貧血、サラセミア、先天性赤血球異形成貧血、奇形を伴う汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ピアソン症候群、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ピリミジン5ヌクレオチダーゼ欠損症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、鎌状赤血球貧血、鎌状赤血球形質、運動失調を伴う鉄芽球性貧血、SLC25A38関連鉄芽球性貧血、チアミン反応性巨赤芽球性貧血、トリオースリン酸イソメラーゼ欠損症、不安定ヘモグロビン、ウォルフラム(Wolfram)症候群、およびX連鎖鉄芽球性貧血)、ゴーシェ病、溶血、好中球減少症、血小板減少症、顆粒球減少症、血友病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞慢性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞様リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、プレB細胞急性リンパ性白血病、プレT細胞急性リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、難治性白血病、またはこれらの組み合わせ。
【０３５８】
いくつかの態様では、赤血球の欠乏を特徴とする障害は、(部分的にまたは完全に)化学療法、化学薬品暴露、放射線療法、および/または放射線暴露の1つまたは複数に起因する。いくつかの態様では、本開示のいずれかの方法によって作製された赤血球の集団は、化学療法および/もしくは放射線療法または1種または複数種の関心対象のタンパク質と共投与される。
【０３５９】
いくつかの態様では、本開示の赤血球集団および/または本開示のいずれかの方法に従って作製された赤血球集団は、それを必要とする対象、例えば血液の喪失に苦しむ対象に投与または輸血される。血液の喪失は、とりわけ、例えば内もしくは外出血(bleeding)、出血(hemorrhage)、事故、外傷、または外科手術の結果であり得る。
【０３６０】
本開示の赤血球集団の1つまたは複数による治療はまた、出血を伴ういくつかの感染症に有用であり、例えば、限定するものではないが、RNAウイルスの科(アレナウイルス科(Arenaviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、フィロウイルス科(Filoviridae)、およびフラビウイルス科(Flaviviridae))はウイルス性出血熱に関連している。ウイルス性出血熱の例には、ラッサ熱、エボラ、マールブルグ、リフトバレー熱、デング熱および黄熱病が含まれるが、これらに限定されない。
【０３６１】
緊急輸血が必要とされる態様では、本明細書に記載されかつ/または本開示のいずれかの方法に従って作製された多量の赤血球が個体に投与される。他の態様では、作製された赤血球集団の持続的輸血が個体に施される。
【０３６２】
いくつかの疾患、障害、および/または状態の治療においては、本開示の関心対象の1種または複数種のタンパク質のための送達システムとなるように適合された赤血球を投与することが有用である。当技術分野で公知でありかつ本明細書に開示されるタンパク質の送達システムとなるように赤血球を適合させる方法はどれも使用することができる。開示された関心対象のタンパク質による治療から利益を得るであろう、当技術分野で公知でありかつ本明細書に開示された疾患、障害および/または状態はどれも、本開示の方法で治療することができ、例えば、限定するものではないが、以下が含まれる：造血成長因子を必要とする対象、急性炎症状態、サイトカインストーム状態、サイトカインストームを伴う臨床兆候、癌、血管の異常調節(例えば、凍傷、癌に関連した血管収縮、またはリウマチ性関節など)、急性心筋梗塞、分娩中の産科的使用、急性および/または持続性片頭痛、免疫ブースターを必要とする対象、凝血塊のリスクが高い対象、肺塞栓症のリスクが高い対象、心血管疾患、免疫疾患および/または障害、ならびに自己免疫疾患および/または障害。
【０３６３】
本明細書に記載の方法において使用するための対象へのRBCの代表的な投与方法としては、注入が挙げられるが、これに限定されない。「注入」には、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内および胸骨内注射および輸液が含まれる。本明細書で使用する語句「非経口投与」および「非経口投与される」は、経腸および局所投与以外の、通常は注入による投与方法を指し、限定するものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内および胸骨内注射および輸液が含まれる。
【０３６４】
キット
SH2B3の阻害物質を用いて幹細胞および/または前駆細胞からRBCの集団を作製するためのキットも本明細書に提供される。いくつかの態様では、キットは、(a) SH2B3アンタゴニストを含む第1の容器；(b) ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)、幹細胞因子(SCF)およびIL-3を含む、幹細胞または前駆細胞からのRBCの第1相(1日目〜7日目)の成熟に必要な成長因子を含む第2の容器；(c) ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)および幹細胞因子(SCF)を含む、幹細胞からのRBCの第2相(7日目〜12日目)の成熟に必要な成長因子を含む第3の容器；(d) ヘパリン、ホロトランスフェリンおよびエリスロポエチン(Epo)を含む、幹細胞または前駆細胞からのRBCの第3相(12日目〜18日目)の成熟に必要な成長因子を含む第4の容器を含む。
【０３６５】
いくつかの態様では、第1、第2、第3、または第4の容器内の個々の成分は、粉末、例えば凍結乾燥粉末の形態であり得る。粉末は使用時に再調製することができる。いくつかの態様では、第1、第2、または第3の容器内の個々の成分は、液体の形態であってもよい。
【０３６６】
いくつかの態様では、前記キットは、基本細胞培養培地(例えば、粉末または液体の形態)の1つまたは複数の容器をさらに含むことができる。その粉末は、使用時に水性溶液(例えば、水)中に再調製することができる。細胞培養の基本培地の例には、限定するものではないが、以下が含まれる：IMDM、最小必須培地(MEM)、イーグル培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物(Nutrient Mixture) F-12 (DMEM F12)、F-10栄養混合物、ハムF-10栄養混合物、ハムF12栄養混合物、199培地、RPMI、RPMI 1640、血清低減培地、基礎培地(BME)、DMEM/F12 (1：1)など、およびこれらの組み合わせ。いくつかの態様では、前記キットは血清、例えばヒトAB血漿、ヒトAB血清をさらに含む。いくつかの態様では、前記キットは抗生物質、例えばペニシリンおよび/またはストレプトマイシンを含む。
【０３６７】
いくつかの態様では、前記キットは、多能性幹細胞または他の幹細胞、例えばCD34+細胞を含む造血細胞、の1つまたは複数のバイアルをさらに含むことができる。
【０３６８】
いくつかの態様では、前記キットは、細胞培養デバイスをさらに含むことができる。細胞培養デバイスの例には、トランスウェル、マイクロウェル、マイクロ流体デバイス、バイオリアクター、培養プレート、またはこれらの任意の組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、前記キットはマイクロ流体デバイスをさらに含み得る。いくつかの態様では、マイクロ流体デバイスは、オーガン・オン・ア・チップ(organ-on-a-chip)デバイスとすることができる。例えば、一態様では、オーガン・オン・ア・チップデバイスは、国際特許出願番号WO2015/138034およびWO2015/138032、ならびに/または米国特許第8,647,861号に記載されるようなデバイスであり、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。第1のチャネルおよび第2のチャネルは、実質的に等しい(例えば、10％以内もしくは5％以内またはそれ未満)高さ、または異なる高さのものであってよい。いくつかの態様では、第1のチャネルと第2のチャネルの高さの比は、約2：1から約10：1の範囲であり得る。いくつかの態様では、第1のチャネルと第2のチャネルの高さの比は、約5：1であり得る。
【０３６９】
いくつかの態様では、前記キットは、各容器が多能性マーカーまたはrbcマーカーに特異的に結合する検出可能な標識を含む、1つまたは複数の容器をさらに含むことができる。
【０３７０】
いくつかの態様では、前記キットは、本明細書に開示される方法に従って多能性幹細胞または前駆細胞からのrbcの作製を行うためのキットの使用説明書をさらに含むことができる。
【０３７１】
本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、したがって変更することができることを理解されたい。本明細書で使用する専門用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【０３７２】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、文脈上明白に他の意味を示さない限り、単数形は複数形を含み、逆もまた同様である。実施例以外で、または他に指示がある場合を除き、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表す全ての数字は、用語「約」によっていかなる場合も修飾されると理解されたい。
【０３７３】
本発明のいくつかの態様は、以下の番号付き項目のいずれかにおいて定義され得る。
1.  (i) 幹細胞および/または前駆細胞の集団においてSH2B3を阻害する段階；
(ii) 該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、赤血球(RBC)への少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階；ならびに
(iii) RBCの集団を回収する段階
を含む、該幹細胞および/または前駆細胞の集団からRBCをエクスビボで産生する方法。
2.  前記阻害する段階が、SH2B3タンパク質レベル、SH2B3 mRNAレベル、SH2B3タンパク質活性、またはそれらの組み合わせを低下させる、項目1に記載の方法。
3.  前記阻害する段階が、前記幹細胞および/または前駆細胞の集団を、SH2B3遺伝子についての少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞からの標的切除のためのゲノム編集物質と接触させることを含む、項目1または2に記載の方法。
4.  前記ゲノム編集物質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/CRISPR関連(CRISPR associated)(Cas)システム、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群より選択される、項目3に記載の方法。
5.  前記ゲノム編集物質がベクター内に存在する、項目3または4に記載の方法。
6.  前記阻害する段階が、前記幹細胞および/または前駆細胞の集団をSH2B3のアンタゴニストと接触させることを含む、項目1または2に記載の方法。
7.  前記SH2B3のアンタゴニストが、無機分子、有機分子、核酸、核酸類似体または核酸誘導体、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、抗体またはその抗原結合断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目6に記載の方法。
8.  前記SH2B3のアンタゴニストが、SH2B3タンパク質のSH2ドメイン、PHドメイン、またはSH2ドメインとPHドメインとの両方に特異的に結合する、項目6または7に記載の方法。
9.  前記SH2B3のアンタゴニストが、SH2B3の発現を阻害するRNAi物質である、項目6〜8のいずれかに記載の方法。
10.  前記RNAi物質が、SH2B3 mRNAにハイブリダイズする、siRNA、shRNA、dsRNAである、項目9に記載の方法。
11.  前記幹細胞および/または前駆細胞の集団が、造血幹細胞、造血前駆細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)、胚性幹細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目1〜10のいずれかに記載の方法。
12.  前記幹細胞および/または前駆細胞の集団由来のRBCの増大を高める、項目1〜11のいずれかに記載の方法。
13.  RBCの質を向上させる、項目1〜12のいずれかに記載の方法。
14.  前記幹細胞および/または前駆細胞の集団が哺乳動物起源のものである、項目1〜13のいずれかに記載の方法。
15.  前記幹細胞および/または前駆細胞の集団がヒト起源のものである、項目14に記載の方法。
16.  前記RBCが白血球濾過またはフローサイトメトリー選別によって単離される、項目1〜15のいずれかに記載の方法。
17.  前記幹細胞および/または前駆細胞の集団がドナー対象から得られる、項目1〜16のいずれかに記載の方法。
18.  前記幹細胞および/または前駆細胞の集団が、前記ドナー対象の末梢血単核細胞、臍帯血、骨髄、臍帯組織、またはG-CSF動員末梢血に由来する、項目17に記載の方法。
19.  それを必要とする対象にRBCの集団を投与する段階をさらに含み、
該RBCが、ドナー対象から得られた幹細胞および/または前駆細胞の集団から産生される、
項目17または18に記載の方法。
20.  前記幹細胞の集団がiPSCである、項目19に記載の方法。
21.  項目1〜19のいずれかに記載の方法に従って産生されたRBCの集団。
22.  RBCの集団と幹細胞および/または前駆細胞の集団とを含む混合物であって、該RBCが、項目1〜19のいずれかに記載の方法に従って産生されている、混合物。
23.  項目21に記載のRBCの集団を含む血液バンク。
24.  RBCの複数の集団が低温貯蔵のために調製されている、項目23に記載の血液バンク。
25.  幹細胞および/または前駆細胞の集団と、少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞から分化した少なくとも1個のRBCと、SH2B3のアンタゴニストとを含む、細胞培養培地。
26.  (i) 幹細胞および/または前駆細胞の集団をSH2B3のアンタゴニストと接触させ、かつ、該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、赤血球(RBC)への少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階であって、該SH2B3のアンタゴニストが、SH2B3タンパク質の活性を低下させるか、またはSH2B3 mRNAもしくはSH2B3タンパク質のレベルを低下させる、段階；ならびに
(ii) RBCの集団を回収する段階
を含む、該幹細胞および/または前駆細胞の集団をRBCに分化するように誘導する方法。
27.  (i) 幹細胞および/または前駆細胞の集団をゲノム編集物質と接触させ、かつ、該幹細胞および/または前駆細胞の集団を、赤血球(RBC)への少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞の分化を誘導するのに十分な時間培養する段階であって、該ゲノム編集物質が、少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞からSH2B3遺伝子を切除する、段階；ならびに
(ii) RBCの集団を回収する段階
を含む、該幹細胞および/または前駆細胞の集団をRBCに分化するように誘導する方法。
28.  RBCの有効量を対象に投与する段階を含む、RBCの集団を該対象に投与する方法であって、該RBCが、SH2B3のアンタゴニストの有効量とエクスビボまたはインビトロで接触したことがあり、該SH2B3のアンタゴニストが、SH2B3タンパク質の活性を低下させるか、またはSH2B3 mRNAもしくはSH2B3タンパク質のレベルを低下させる、方法。
29.  RBCの有効量を対象に投与する段階を含む、RBCの集団を該対象に投与する方法であって、該RBCが、ゲノム編集物質の有効量とエクスビボまたはインビトロで接触したことがある幹細胞および/または前駆細胞の集団から産生されており、該ゲノム編集物質が、少なくとも1個の幹細胞または前駆細胞からSH2B3遺伝子を切除する、方法。
30.  幹細胞および/または前駆細胞の集団と少なくとも1種のSH2B3アンタゴニストとを含む細胞培養培地であって、
a.  ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)、幹細胞因子(SCF)、およびIL-3を含む、第1相(1日目〜7日目)の分化培地；または
b.  ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)、および幹細胞因子(SCF)を含む、第2相(7日目〜12日目)の分化培地；または
c.  ヘパリン、ホロトランスフェリン、およびエリスロポエチン(Epo)を含む、第3相(12日目〜18日目)の分化培地
から選択される、細胞培養培地。
31.  幹細胞および/または前駆細胞から分化した少なくとも1個のRBCをさらに含む、項目30に記載の培養培地。
32.  少なくとも1個のRBCと少なくとも1種のSH2B3アンタゴニストとを含む細胞培養培地であって、
a.  ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)、幹細胞因子(SCF)、およびIL-3を含む、第1相(1日目〜7日目)の分化培地；または
b.  ヘパリン、ホロトランスフェリン、エリスロポエチン(Epo)、および幹細胞因子(SCF)を含む、第2相(7日目〜12日目)の分化培地；または
c.  ヘパリン、ホロトランスフェリン、およびエリスロポエチン(Epo)を含む、第3相(12日目〜18日目)の分化培地
から選択される、細胞培養培地。
33.  前記幹細胞および/または前駆細胞の集団が、O型の血液型であるヒト対象から得られる、項目1〜19のいずれかに記載の方法。
34.  前記ヒト対象がO-型(O型、Rh-)の血液型を有する、項目33に記載の方法。
【０３７４】
既知の方法、デバイス、および材料はどれも本発明の実施または試験に使用することができるが、これに関する方法、デバイスおよび材料は本明細書において説明される。
【０３７５】
好ましい態様を本明細書で詳細に描写し説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなく、様々な改変、追加、置換などを行うことができることは当業者には明らかであろう。したがって、これらは、以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内にあるとみなされる。さらに、まだ示されていない限り、本明細書に記載され例示された様々な態様のいずれか1つは、本明細書に開示された他の態様のいずれかに示される特徴を組み込むように、さらに改変され得ることが当業者には理解されよう。
【０３７６】
参照文献、交付済み特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む、本出願全体を通して引用された全ての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書に記載の技術に関連して使用される可能性のある刊行物に記載の方法論を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。こうした刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示のためだけに提供される。これに関連して何ごとも、先行発明であるという理由でまたはその他の理由で、そのような開示に先行する権利が本発明者らにはないことを承認するものとして、解釈されるべきでない。これらの文書の日付に関する記述または内容に関する表明はすべて、本出願人らが入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認をも構成しない。
【０３７７】
本開示の態様の説明は、網羅的であることを意図するものでも、その開示を開示された厳密な形態に限定するものでもない。本開示の特定の態様および実施例は、説明の目的で本明細書に記載されるが、当業者には認識されるように、本開示の範囲内で様々な均等な変更が可能である。例えば、方法のステップまたは機能は所与の順序で提示されるが、別の態様は異なる順序で機能を果たすことができるか、または機能を実質的に同時に果たすことができる。本明細書に提供される本開示の教示は、適宜、他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載の様々な態様は、さらなる態様を提供するために組み合わせることができる。本開示の局面は、上記の参照文献および出願の組成物、機能、および概念を用いて、本開示のさらなる態様を提供するために、必要に応じて、改変することができる。
【０３７８】
前述の態様のいずれかの特定の要素は、組み合わされるか、または他の態様における要素に代替される。さらに、本開示の特定の態様に関連する利点は、これらの態様の文脈において説明されてきたが、他の態様もそのような利点を示すことがあり、全ての態様が本開示の範囲内に入るためにそのような利点を必ず示す必要があるとは限らない。
【実施例】
【０３７９】
以下の実施例では、本発明のいくつかの態様および局面を例示する。当業者であれば、本発明の精神または範囲を変更することなく、様々な改変、追加、置換などを行うことができ、そのような改変および変形は、以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内に包含されることが明らかであろう。本明細書に記載の技術は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらの実施例は決してさらなる限定として解釈されるべきでない。
【０３８０】
材料および方法
293T細胞培養およびレンチウイルス産生
293T細胞は、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中に30％〜90％のコンフルエンシーで維持した。レンチウイルス産生のために、Fugene 6試薬(Roche社)をメーカーのプロトコールに従って用いて、293T細胞に、VSV-GエンベロープおよびpdΔ8.9パッケージングベクターと共に下記の構築物をトランスフェクトした。翌日、培地を第1相初代細胞培養培地(EPO、IL-3およびSCFを含まない)に変え、ウイルス上清を回収し、トランスフェクションの48時間後に45マイクロメートルのフィルターで濾過した。TF-1ヒト赤血球系細胞は、維持のために10％FBSおよび2ng/ml GM-CSFを補充し、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI培地中で培養した。サイトカイン飢餓のために、全てのサイトカインを除去し、細胞をFBSのみで一晩維持した。EPOおよびSCFを時間0で添加し、その後分析のために後続の時点で回収した。
【０３８１】
初代CD34+細胞の単離および供給源
G-CSF動員末梢血、骨髄または臍帯血からのCD34+細胞は、Ficoll密度勾配上での単核細胞精製後に、Ultrapure Microbeadキット(Miltenyi Biotech社)をメーカーのプロトコールに従って用いた陽性磁気選別によって精製した。以下に記載するように、PE結合抗ヒトCD34抗体(8012-0349、eBioscience社)を用いて精製後にフローサイトメトリーによって評価すると、少なくとも95％の純度に達した。
【０３８２】
初代細胞培養およびレンチウイルス感染
3相培養プロトコールを用いて、細胞を成熟RBCに分化させた。第1相(0〜7日目)では、細胞を、2％ヒトAB血漿、3％ヒトAB血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、3IU/mLヘパリン、10μg/mLインスリン、200μg/mLホロトランスフェリン、1IUエリスロポエチン(Epo)、10ng/mL幹細胞因子(SCF)および1ng/mL IL-3を補充したIMDM中、105〜106細胞/ミリリットル(mL)の密度で培養した。第2相(7〜12日目)では、IL-3を培地から除いた。第3相(12〜18日目)では、IL-3とSCFの両方を培地から除外し、ホロトランスフェリン濃度を1mg/mLに上げて、106細胞/mLの密度で培養した。細胞を37℃および5％CO2で培養した。レンチウイルス感染のために、培地を1日目に、8μg/mLポリブレンおよびEPO、IL-3、SCFと一緒にウイルス上清に交換し、室温で90分間、2000rpmでスピンした。感染の12時間後、細胞を1μg/mLピューロマイシン中に36〜48時間入れた。
【０３８３】
別のアプローチとして、本発明者らはまた、赤血球分化の開始および第1相培養の開始に先立って、合計5日間持続する増大期を追加することによって、上記の赤血球培養法の改良法を開発した。最近の研究は、このようなアプローチが赤血球系細胞の著しい増大をもたらし、成熟RBC産生を改善し得ることを示している(Lee et al., 2015)。これらの報告された知見と同様に、本発明者らは、これが増進した増大および本発明者らの標準的な3相培養法に匹敵する分化を可能にすることを発見した。増大期の間中、＞85％の細胞がCD34+のままである。この増大培地は、本発明者らが以前に記載したように(Sankaran et al., 2011; Sankaran et al., 2008)、StemSpan II無血清増大培地(Stem Cell Technologies社)と、FLT3L、IL-3、IL-6およびSCFからなる1×CC100サイトカインミックス(Stem Cell Technologies社)から構成された。培地を2〜3日ごとに交換し、細胞を105〜106細胞/ミリリットル(mL)の密度で維持した。この増大期の2日目にレンチウイルス感染を行い、上記のように選別を行った。
【０３８４】
ウェスタンブロッティング
培養9日目に1〜2×106個の細胞を回収し、PBSで2回洗浄し、RIPA緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1％SDS、1％NP-40、0.25％デオキシコール酸ナトリウム)に再懸濁し、断続的に混合しながら氷上で30分間、オルトバナジン酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害物質カクテルおよびPMSFの存在下に溶解した。遠心分離により細胞残渣を除去した後、上清を新しいチューブに移し、ローディングダイ(Loading Dye)と混合し、95℃で5分間インキュベートしてタンパク質濃度を測定した。プレキャストゲル(BioRad社)および1％Tris-Glycine-SDSランニングバッファーを用いてSDS-PAGE分析を行った。タンパク質をトリス/グリシン中の10％メタノール中でニトロセルロースメンブレンに移行させた。メンブレンを、3％BSAを補充したTBS-Tで1時間ブロックし、一次抗体と室温で1時間または4℃で一晩インキュベートした。TBS-T中で10分間4回洗浄した後、メンブレンを二次抗体と室温で1時間インキュベートした。TBS-T中でさらに40分間洗浄し、ECL基質(BioRad社)中で5分間インキュベートした後、サイエンティフィック・イメージング・フィルム(scientific imaging film)を処理済みのメンブレンに暴露してタンパク質を可視化した。LNK/SH2B3ヒツジポリクローナル抗体(AF5888, R&D Systems社)およびGAPDHマウスモノクローナル抗体(6C5, sc-32233, Santa Cruz社)を一次抗体として使用し、ヤギ抗マウス(170-5047, BIORAD社)およびロバ抗ヒツジ(713-035-147, Jackson Immuno Research社) HRP結合抗体を二次試薬として使用した。示されたウェスタンブロットでは、細胞を典型的には培養9日目に採取した。
【０３８５】
フローサイトメトリー
細胞を採取し、FACS緩衝液(PBS＋3％BSA)中で300×gにて5分間2回洗浄した。分化解析のために、続いて、細胞を、FACS緩衝液中1：20希釈の下記の抗体を用いて氷上で10〜15分間染色した：APC結合された抗ヒトCD235a (17-9987, eBioscience社)、FITC結合された抗ヒトCD71 (11-0719, eBioscience社)、PE結合された抗ヒトCD41a (12-0419, eBioscience社)およびPE結合された抗ヒトCD11b (12-0118, eBioscience社)。指示がある場合は、細胞を1μg/mLのHoechst 33342 (Life Technologies社)でさらに染色し、室温で20分間インキュベーションを行った。未結合の抗体をFACS緩衝液で2回洗浄して除去し、その後、ペレットを1：20希釈のヨウ化プロピジウム(PI)染料(00-6990, eBioscience社)を補充したFACS緩衝液中に再懸濁し、続いてFACS Canto IIまたはLSR II (BD Bioscience社)フローサイトメーターで分析するためにFACSチューブに移した。Flow Joe (Tristar社)およびFACS Diva (BD Bioscience社)ソフトウェアパッケージを用いて細胞を分析し、PI陽性細胞、細胞残渣および凝集物を分析からゲートアウトした。
【０３８６】
メイ・グリュンワルド・ギムザ染色
約50,000〜200,000個の細胞を採取し、300×gで5分間1回洗浄し、200μLのFACS緩衝液に再懸濁し、ポリ-L-リシンをコーティングした顕微鏡スライド上にShandon 4 (Thermo Scientific社)細胞遠心分離機を用いて300rpmで4分間スピンした。目に見える場合には、乾燥したスライドをメイ・グリュンワルド溶液(Sigma-Aldrich社)に5分間移し、H2O中で30秒ずつ4回すすぎ、ギムザ溶液(Sigma-Aldrich社)に15分間移した。スライドを上述のように洗浄し、乾燥させた後、カバースリップを取り付け、翌日検査した。示された全ての画像は、AxioVisionソフトウェア(Zeiss社)を用いて倍率100×で撮影した。
【０３８７】
構築物
以下の配列を有する、SH2B3を標的とするshRNA構築物を使用した：
2017536826.tif 000016
。両構築物とも、pLKO.1-puroレンチウイルスベクター内にあった。レンチウイルスベクターpLKO-GFPおよびpLKO.1-puroルシフェラーゼを対照として使用した(Broad Institute of MIT and HarvardのRNAi consortium)。
【０３８８】
細胞分裂分析
分化5日目に、同数のSH2B3-KD細胞および対照細胞を、PKH26 (PKH26GL, Sigma Aldrich社)でメーカーのプロトコールに従って標識した。手短に述べると、細胞をIMDM (血清の添加なし)で洗浄し、希釈剤C中に再懸濁させた。染色の直前に、4×10-6MのPKH色素溶液を調製し、細胞懸濁液に等容量で速やかに添加した。5分のインキュベーション後、ヒトAB血清の添加により染色反応を停止させ、EPO、SCF、またはIL-3を含まない第1相培地で3回洗浄することによって未結合染料を除去した。PKH26の平均蛍光強度(MFI)は、Canto 2 (BD Bioscience社)フローサイトメーターで、標識の直後および分化7日目と9日目に取得した。細胞分裂の数xは、以前に記載されたように(Sankaran et al. 2012)概算された： x＝(log((MFI 0h)/(MFI yh)))/(log2))。
【０３８９】
エオシン-5-マレイミド(EMA)-結合試験
2〜4×106個の細胞を採取し、PBSで洗浄し、続いてKing et al. (2000)に最近記載されたようにエオシン-5-マレイミド(Life Technologies社)で標識した。手短に述べると、ペレット化した成熟RBCを25μLの0.5mg/mL EMAに再懸濁し、慎重に断続的に混合しながら暗所で1時間インキュベートした。未結合色素をPBS＋3％BSAで3回洗浄することにより除去し、その後、細胞を1：20希釈のAPC結合された抗ヒトCD235a (eBioscience社)と共に室温でさらに10分間インキュベートした。上述したように未結合抗体を除去した後、ペレットをFACS緩衝液に再懸濁させ、サンプルをCanto 2 (BD Bioscience社)フローサイトメーターで解析したところ、EMAの放出が564〜606nmでPEチャネルにおいて検出された。
【０３９０】
アドヴィア(Advia)
分化17日目に約5×107個の細胞を採取し、スピンし、300μLのPBSに再懸濁して、アドヴィア2120i (Siemens Healthcare社)で分析した。
【０３９１】
遺伝子発現解析
マイクロアレイ(GeneChip Human Gene 2.0 ST Array, Affymetrix社)は、SH2B3 KDサンプル(sh83およびsh84)および対照サンプル(shLuc)について赤芽球(分化7日目)で実施した。生ファイル(raw file)は、R 3.2 (Carvalho and Irizarry, 2010)中のオリゴパッケージからのRMAアルゴリズムを用いて処理し、正規化した。示差的発現解析(differential expression analysis)は、limma (Ritchie et al., 2015)を用いて行った。ヒートマップは、0.5より大きいlog2倍率変化(fold change)および0.001のp値閾値でSH2B3 KDにおいて有意に上方制御された遺伝子の正規化発現値(Zスコア)について表示される。遺伝子セット濃縮分析(gene set enrichment analysis)(GSEA)は、対照サンプルと組み合わせたSH2B3 KDを標準的なオプションと比較することによって実施したが、ただし、各グループにつきn＝3のサンプルが存在したので、サンプル順列の代わりに遺伝子セット順列を使用した(Subramanian et al., 2005)。本発明者らは、コロニー形成単位赤血球系細胞(CD71+/CD235a-)と比較して、中間型赤芽球(CD71+/CD235a+)において有意に高い発現を示した上位200の遺伝子を同定することによって、赤血球分化シグネチャー遺伝子セットを誘導した(Merryweather-Clarke et al., 2011)。全てのデータは、アクセッションGSE67219でGene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)に登録された。
【０３９２】
ヒトESCにおけるCRISPR/Cas9ゲノム編集
ヒト胚性幹細胞株(hESC; HUES9)におけるSH2B3ノックアウトのために、コドン最適化されたストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9およびEGFPをCAGプロモーターにより共発現するプラスミドと、ガイドRNA (gRNA)をヒトU6プロモーターにより発現するプラスミドとを共トランスフェクトした。SH2B3を標的とするために、以下のプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を使用した：
2017536826.tif 000017
。
【０３９３】
あるいは、gRNAを使用した：
2017536826.tif 000018
。
【０３９４】
hESCは、最初に、Geltrexマトリックスをコーティングした組織培養プレート上でペニシリン/ストレプトマイシンを補充したmTeSR1中に培養した。ROCKiの存在下にアクターゼ(Accutase)を用いて細胞を解離させ、続いて、単一のキュベット内で各プラスミド25μgを1000万個の単細胞にエレクトロポレートした。細胞を再プレーティングし、48〜72時間後にアクターゼで処理し、回収して、PBS中に再懸濁させた。EGFP発現細胞をFACS (FACSAria II, BD Bioscience社)で選別し、増殖培地に15,000細胞/プレートでプレーティングし、7〜10日間回復させた。その後、単一コロニーを手作業で採取し、96ウェルプレートのウェルに個別に再プレーティングし、ほぼコンフルエンスになるまでさらに7日間増殖させ、アクターゼ処理して凍結ストックを生成した。PCRスクリーニングを用いて、SH2B3において複合ヘテロ接合型またはホモ接合型フレームシフト欠失を有するコロニーを同定した。系統BB5、DB3、およびBF4は、SH2B3のノックアウトを生じるホモ接合型または複合ヘテロ接合型フレームシフト突然変異を有し、分化解析に使用された。本発明者らは、分化解析の対照としてインタクトな野生型SH2B3対立遺伝子を有する同質遺伝子系統BA3、BA6、およびBB1を使用した。
【０３９５】
hES細胞の維持および赤血球分化
hESCは、0.75〜1.0×106個のマウス胚線維芽細胞(MEF)を含む6ウェル組織培養プレートにおいて、20％KSR、100μL非必須アミノ酸溶液、50U/mLペニシリン、50g/mLストレプトマイシン、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.075重炭酸ナトリウム、および0.1mMβ-メルカプトフェノールを補充したDMEMを含有するHES培地中に、該培地を毎日交換して、37℃、5％ CO2で90％の最大コンフルエンシーにて維持した。継代のために、細胞をTrypLEで処理し、培地ですすぎ、アポトーシスを防止するために10μMのROCKiを添加した後、コロニーを小さな塊に掻き取り、吸引し、混合した後にHES培地中1/7の全体希釈でMEF含有プレート上に再プレーティングした。MEF枯渇のために、hESCを上記のように採取し、マトリゲル(Matrigel)コーティングディッシュに、5ng/mL bFGFおよび10μM ROCKiを含有するHES培地中1〜1.5×105細胞/mLの密度で37℃、5％ CO2、5％ O2および90％ N2にて再プレーティングした。24時間ごとに、ROCKiを除いた新鮮な培地と交換することにより細胞に栄養補給した。MEF枯渇後2〜3日で約70％コンフルエンスに達した後、逐次的に培地とサイトカインを変える1日あたりの栄養補給計画、表3に表示で細胞を培養することによって造血前駆細胞(HPC)への分化を開始させた。明るくて丸い、ゆるく付着したHPCが上清を慎重に除去することによって回収されるまで、細胞をマトリゲルコーティングディッシュに37℃、5％ CO2、5％ O2および90％ N2で8〜9日間保持した。続いて、細胞のアリコートを採取し、フローサイトメトリーを下記のように実施して、CD41aおよびCD235a二重陽性多能性HPCの存在について評価した。原始赤芽球へのさらなる分化のために、HPCを335×gでスピンし、50μg/mlアスコルビン酸、0.45mM MTG、50ng/ml SCFおよび2単位/ml EPOを補充したSFDを含有する赤血球増大培地(EEM)に再懸濁させた。培地を1〜2日ごとに交換した。細胞を血球計数器で注意深く計数し、示された時点でフローサイトメトリーにより解析した。
【０３９６】
（表３）培養培地および補充物を示す、HPCへのPSCの分化の予定表
2017536826.tif 000019
* すべて2mMグルタミン、50μg/mLアスコルビン酸、および4×10-4モノチオグリセロールを補充した。
** 0.5％ N2、ビタミンAなしの1％ B27、および0.05％ BSAを補充した。
*** サイトカイン濃度、単位はng/mL。
【０３９７】
統計分析
全てのペアワイズ比較は、対応のない両側スチューデントt検定によって評価した。P値が0.05未満である場合は、結果を有意であるとみなした。
【０３９８】
実施例1
多能性幹細胞および多分化能性幹細胞は、細胞および組織補充療法のための潜在的な供給源である。例えば、幹細胞由来の赤血球(RBC)は、献血された血液の代替候補であるが、収量および品質にはいまだ課題が残る。ここで、本発明者らは、ヒト集団遺伝学的研究から導き出された洞察の適用が幹細胞からのRBC産生を増強し得ることを実証する。本発明者らは、SH2B3遺伝子がサイトカインシグナル伝達の負の制御因子をコードしており、この遺伝子の天然に存在する機能喪失変異体がインビボでRBC数を増加させることを発見した。初代ヒト造血幹細胞および前駆細胞におけるSH2B3の標的抑制は、インビトロ誘導されたRBCの成熟および全体的な収量を高めた。さらに、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR/Cas9ゲノム編集によるSH2B3の不活性化が、分化を保ったままでの赤血球系細胞の増大の向上を可能にすることを実証する。こうして、本発明者らは、再生医療用の細胞および組織の産生を改善するためにゲノム編集アプローチを使用することができることを実証する。
【０３９９】
細胞補充療法のための供給源としての幹細胞の使用に関しては、大きな興奮を覚える(Fox et al., 2014)。造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)からインビトロで分化させた赤血球(RBC)は、臨床試験においてレシピエントに成功裏に輸血されており(Giarratana et al., 2011; Migliaccio et al., 2012)、ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工PSC (iPSC)を含む多能性幹細胞(PSC)を用いた同様のアプローチが研究中である(Kobari et al., 2012; Slukvin, 2013; Sturgeon et al., 2013)。しかしながら、RBC産生のためにこれらの幹細胞源を用いることは、完全に成熟した細胞の低い収量によって制限され、このプロセスを高価にし、非効率的にしている(Migliaccio et al., 2012; Rousseau et al., 2014)。こうした大きな制限を取り除くことは、血液供給を管理する能力を高めることができるであろう(Williamson and Devine, 2013)。
【０４００】
現在行われている多くの努力は、様々な幹細胞源からのRBC産生を改善するために培養方法を最適化することに焦点を合わせている(Huang et al., 2015; Rousseau et al., 2014)。補完的なアプローチは、インビボでRBC産生を調節しているヒト遺伝子をインビトロで操作して、このプロセスを増強することができるかどうかを検討することである。RBC形質の最近のゲノムワイド関連解析(GWAS)およびその後のファインマッピングは、SH2B3遺伝子における共通のコーディング一塩基多型(SNP)(rs3184504)を同定した；それは、インビボでヘモグロビンレベルおよびRBC数と有意に関連するR262W置換をもたらす(van der Harst et al., 2012)。SH2B3は、造血サイトカインシグナル伝達を負に調節するSH2-およびPH-ドメイン含有タンパク質である。SH2B3にヌル突然変異を有するマウスは、正常なヘモグロビンおよびRBC数を有しており、RBC産生(赤血球生成)におけるヒト特異的機能を示唆している(Bersenev et al., 2008; Velazquez et al., 2002)。増加したRBC数およびヘモグロビンレベルに関連するrs3184504変異体は、ハイポモルフ(hypomorphic：遺伝子機能が低下した)対立遺伝子であると考えられる(McMullin et al., 2011; van der Harst et al., 2012)。この可能性と合致して、希少な機能喪失型(loss-of-function)(LoF) SH2B3対立遺伝子は、RBC数およびヘモグロビンレベルのより大きな上昇(赤血球増加症)と関連している(Lasho et al., 2010; Spolverini et al., 2013)。この観察を集団ベースのコホートに拡張するために、本発明者らは、全エクソーム配列決定を受けた4,678人のグループを調べて、SH2B3において希少な推定上の損傷型ミスセンスまたはLoF変異体を有する個体間でより高いヘモグロビン/ヘマトクリット値を観察した(データは示さず)。
【０４０１】
本発明者らは次に、SH2B3の抑制がインビトロで赤血球生成を増強できるか否かを試験した。本発明者らは、赤血球に分化するように誘導された成人CD34+ HSPCにおいて、SH2B3を標的とする短鎖ヘアピンRNA (shRNA)を発現させるために、レンチウイルスベクターを使用した(図13Aおよび図1B)。sh83 (SEQ ID NO: 1)およびsh84 (SEQ ID NO: 2) shRNAを有するSH2B3ノックアウト(例えば、機能喪失またはLoF)培養物は、対照と同様に分化したが、細胞表面表現型検査で解析したとき、赤血球成熟(CD71の喪失およびCD235aの獲得)が早期に起こった(図3Aおよび3B)。興味深いことに、本発明者らは、SH2B3ノックアウト赤芽球において1.6倍から2倍の脱核の増加を観察した(図4)。これらの観察は、改善された成熟、より良好なヘモグロビン産生、およびより多くの脱核を示した細胞形態の分析によって確認された(図5)。SH2B3ノックアウト培養物からの赤芽球の遺伝子発現解析は、対照のものと全体的に類似するプロファイルを示した(図13C)ものの、最終赤血球成熟に関連する遺伝子の発現が高まった(図13D)。本発明者らは、脱核後の培養物を数日間維持したが、SH2B3ノックアウト培養物と比較して、対照において成熟のいかなる改善をも観察しなかった。
【０４０２】
SH2B3ノックアウトを有する細胞は赤血球分化をより容易に受けたと考えられたので、本発明者らは、それらの増殖能が抑制されるかどうかを評価した。増殖能の抑制はRBC収量を損なうと考えられる。驚くべきことに、SH2B3ノックアウトを有する成人HSPCは、対照と比較して、かなりの程度まで増大した(図7および図6)。全体的な増大の増加は、分化プロセスの複数の段階にわたって起こり、SH2B3抑制が異なる分化段階で多数のシグナル伝達経路を増強することを示唆している(図6)。観察された効果は、準最適(suboptimal)なサイトカイン濃度によるものではなかった。というのは、細胞は、それらが最大の増大を示したときのエリスロポエチン(EPO)および他のサイトカインの濃度で培養されたからである(図15A)(Abkowitz et al., 1991)。全体的に、成熟RBCの収量は、SH2B3の抑制によって3倍〜5倍に増えた(図7)。本発明者らは、成人HSPCと比較して赤血球分化の間に10倍高い増大を示すことが公知であるCD34+臍帯血HSPCにおいて、同様のSH2B3ノックダウンを行った(Giarratana et al., 2011; Migliaccio et al., 2012; Rousseau et al., 2014)。これらの培養物において、SH2B3ノックアウトは、脱核したRBCの収量を2〜4倍さらに向上させた(図14A)。さらに、本発明者らは、成人CD34+ HSPCを用いる前駆細胞増大段階を組み込んだ、最近記載された培養法の改良法をも用いた(Lee et al., 2015; Ludwig et al., 2014; Sankaran et al., 2011)。この場合には、本発明者らは、RBCの増大および全収量の5〜7倍のさらに大きな増加を観察し(図14B)、HSPCからのRBC産生を増やすためのSH2B3抑制の一般化可能性を実証した。
【０４０３】
実施例2
本発明者らは次に、SH2B3の抑制が赤血球の分化および増大を増強することができるメカニズムについて検討した。アネキシンV染色によって評価したアポトーシス細胞の割合は、成人HSPCにおけるSH2B3抑制によって変化しなかった(図15B)。SH2B3ノックアウトを有する細胞は、試験した4日間の分化期間にわたって0.5〜1の追加の細胞分裂を遂げた(図8A, 8B)(Sankaran et al., 2012)。SH2B3は、EPO、KIT、およびインテグリン受容体を含めて、赤血球生成に関与する複数の細胞表面シグナル伝達受容体の下流のシグナル伝達を負に調節する(Gery and Koeffler, 2013; McMullin et al., 2011)。それに応じて、STAT5およびKIT受容体のリン酸化、ならびに初期のEPO応答遺伝子の発現は、SH2B3抑制によって高まった(図15Cおよび図15D)(Moraga et al., 2015)。本発明者らは、SH2B3抑制時に観察された増強に対するEPO経路とKIT/SCF経路の両方の重要性を、HSPC分化培養物中の両サイトカインの濃度を制限することによって、確認した(図15E)。SH2B3の抑制は、EPOまたはSCFのレベルを低下させたベースライン対照と同様の赤血球増大を可能にし、初代赤血球系細胞における両方の経路でのSH2B3の役割を強調している。したがって、SH2B3のノックアウトまたは阻害は、EPOおよびKITの両方のシグナル伝達経路を増強することによって、赤血球の増大および成熟を促進すると考えられる。
【０４０４】
実施例3
本発明者らは、SH2B3のノックアウトまたは阻害によってヒトHSPCからの赤血球系細胞の産生が増加するようであることを発見したので、インビトロで産生されたRBCが対照のものから変化したかどうかを調べた。RBCの平均体積は、対照およびSH2B3ノックアウト培養物から生じるものの間で同様であった(sh83 (SEQ ID NO: 1)およびsh84 (SEQ ID NO: 2) SH2B3 shRNAでの110.1および104.7フェムトリットルと比較して、対照では平均108.7)。これらの値は、ヒト成人に見出される網状赤血球(未成熟RBC、培養物中で産生されたものと同等)についての103〜126フェムトリットルの正常範囲内であった(d'Onofrio et al., 1995)。さらに、SH2B3 shRNAノックアウトはヘモグロビン産生を改善し、平均ヘモグロビン含量がsh83およびsh84処理細胞ではそれぞれ27および26.7ピコグラム(pg)であったのに対して、対照では25.4であった(ヒト成人網状赤血球は一般に25.9〜30.6pgの濃度を有する；d'Onofrio et al., 1995)。遺伝性球状赤血球症のような、RBC膜の障害は、色素エオシン-5-マレイミド(EMA)の結合の変化によって臨床的に診断される(Perrotta et al., 2008)。本発明者らは、EMA染色がSH2B3 LoF RBCと対照とで同等であることを観察し、RBC細胞骨格の正常な形成が示唆される(図9)。さらに、Rh式血液型(図16A)およびCD44を含むRBC抗原の表面発現、ならびに細胞質ピルビン酸キナーゼ酵素の活性は、SH2B3 LoF RBCと対照の間で類似していた(図16B)。SH2B3ノックアウトおよび対照細胞からのRBCゴーストは、正常なRBC成熟のための独立した測定をもたらして、同一のタンパク質パターンを示した(図16C)。本発明者らはまた、SH2B3 shRNAノックアウトにより胎児ヘモグロビン(HbF)産生のわずかな増加を伴って正常なヘモグロビンサブユニットがRBC中に存在することを発見したが、これは、赤血球生成の初期段階での加速により観測される既知のHbF増加と一致している(図16D)(Sankaran and Orkin, 2013)。まとめると、これらの結果は、分化および増大における著しい改善にもかかわらず、RBC生理学がSH2B3ノックアウトHSPCに由来する細胞において損なわれなかったことを実証する。
【０４０５】
全体として、本発明者らは、SH2B3発現を減らすことが、輸血目的のためのRBCのインビトロ産生を改善し得ることを実証した。初代CD34+ HSPCへのウイルス媒介性shRNA送達は、大規模では実用的でない場合があるが、RBC産生に使用可能な自己複製細胞株においてSH2B3遺伝子を破壊することは可能なはずである(Rousseau et al., 2014)。有望な最近の進歩(Hirose et al., 2013; Huang et al., 2014; Kurita et al., 2013)にもかかわらず、不死化ヒト細胞株は成熟RBCへの一貫した分化を可能にしない。しかし、PSCは、十分に確立されたプロトコールにより赤血球系統に容易に分化することが可能である(Huang et al., 2015; Kobari et al., 2012; Mills et al., 2014; Slukvin, 2013; Sturgeon et al., 2014)(図16E)。
【０４０６】
実施例4
ここでは、本発明者らはまた、CRISPR/Cas9媒介ゲノム編集を使用して、SH2B3のホモ接合型フレームシフト欠失またはインタクトなWT対立遺伝子のいずれかを有する同質遺伝子hESC株を操作した(図16Eおよび16F)(Ding et al., 2013a, 2013b; Gupta and Musunuru, 2014; Veres et al., 2014)。hESCをインビトロで分化させて、赤血球、巨核球および骨髄の潜在能力を有する多能性造血前駆細胞(HPC)を作製した(Kennedyet al., 2012; Mills et al., 2014; Sturgeon et al., 2013)(図14E)。多能性CD41a+/CD235a+ HPCの収量には、WTおよびSH2B3ノックアウトhESCの分化の間に差異が認められなかった(Mills et al., 2014)。しかし、試験した複数の独立した同質遺伝子hESC株において、SH2B3の喪失は赤血球系細胞の産生を3倍超増やした(図12A、図12Bおよび図16G)。
【０４０７】
重要なことに、成熟するWTおよびSH2B3ノックアウト赤芽球は、同様の形態、赤血球系細胞表面マーカーの発現、およびグロビン遺伝子発現パターンを示した(図13D、図15Eおよび図16H)。PSC赤血球分化プロトコールは、引き続き洗練(refinement)を遂げており、RBCの製造についてまだ最適化されておらず、主に、卵黄嚢から発生的に生じるものと同等の造血の初期波(earliest waves of hematopoiesis)を生成するが(Kobari et al., 2012; Slukvin, 2013; Sturgeon et al., 2014)、現在の知見は、SH2B3の安定した摂動(perturbation)が改善された赤血球の分化および増大を可能にし得ることを実証している。
【０４０８】
現在のインビトロ分化プロトコールを用いてHSPCから産生された1単位のRBCは、8,000〜15,000ドルの費用がかかるが、通常のドナー由来の単位はこの金額の10分の1未満であると推定される(Migliaccio et al., 2012; Rousseau et al., 2014)。培養法の改良およびバイオリアクターなどのシステムの使用は、このプロセスを改善する上で極めて有益であり得るが、赤血球生成を刺激するための幹細胞源の内因性の改変は、このプロセスをさらに最適化するはずである。本発明者らが知る限り、それはこれまでに試験されたことがない。
【０４０９】
ここで、本発明者らは、SH2B3遺伝子をかき乱す(perturb)ことによって、例えばSH2B3機能を阻害することによって、幹細胞由来の造血前駆細胞が増大して赤血球系統に分化する能力を向上させることができることを実証した。重要なことに、本発明者らは、本明細書中で、SH3B3を阻害することによる増大と分化の両方の改善が、そのような培養物中のサイトカイン濃度を単に最適化することによって通常達成され得る最大の増大を上回ることを実証しており、これは、内因性の調節経路を標的とすることの補完的利益を示している。SH2B3抑制から生じる収量の増加により、現在のアプローチの1/5より少ない概算コストで、かつより少ない出発幹細胞数で、HSPCからRBCを産生することが可能になる。したがって、単一RBC単位は2,500万個のCD34 HSPCを必要とすると推定され、SH2B3の摂動は、必要な出発細胞数を500万個に減らすであろう(Migliaccio et al., 2012)。さらなる技術の進歩により、このプロセスのコストと効率は両方ともさらに改善される可能性がある。重要なことに、本発明者らの発見は、SH2B3の阻害が、使用した分化方法にかかわらず、様々なヒト幹細胞源からの赤血球分化を改善すること、およびこのプロセスが治療目的に使用され、血液供給の増え続ける需要に貢献できること、を示唆している(Williamson and Devine, 2013)。
【０４１０】
参照文献
本明細書および実施例に引用された全ての参照文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月25日(2017.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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