(57)【要約】  本発明は、特殊化非天然起源ペプチドが、ナトリウムチャネルに結合してナトリウムチャネルの活性化を阻害する能力に関する。本発明は、さらに、ナトリウム吸収および流体量を調節する方法、および、ナトリウムチャネルに対する特殊化非天然起源ペプチドの結合を調整することにより、ナトリウム吸収の調整に反応性の疾患を治療する方法に関する。
2017536334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号１１６）
を含むペプチドであって、
ここで：
Ｘ１は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ２は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ３は、バリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ４は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ５は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ６は、アスパラギン酸または天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ７は、グルタミンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；および
Ｘ８は、トレオニンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換である；
ペプチド、または、それらの機能性フラグメント。
【請求項２】
以下の配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２（配列番号１１７）
を含むペプチドであって、
ここで：
Ｘ１は、ロイシン、ノルロイシン、またはバリンであり；
Ｘ２は、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、（２Ｒ，５Ｓ）−５−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、または３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンであり；
Ｘ３は、バリン、ロイシン、ノルロイシン、またはＮ−メチルバリンであり；
Ｘ４は、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、（２Ｒ，５Ｓ）−５−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、または３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンであり；
Ｘ５は、ロイシン、ノルロイシン、またはバリンであり；
Ｘ６は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり；
Ｘ７は、グルタミンまたはアスパラギンであり；および
Ｘ８は、トレオニン、セリン、またはＬ−α−メチルセリンである；
ペプチド、または、それらの機能性フラグメント。
【請求項３】
請求項１または２のペプチドであって、
配列番号４〜１１５のいずれか１つの配列を含む、
ペプチド。
【請求項４】
以下の配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５（配列番号１１８）
を含むペプチドであって、
ここで：
Ｘ１は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ２は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ３は、バリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ４は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ５は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ６は、アスパラギン酸または天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ７は、グルタミンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ８は、トレオニンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ９は、トレオニンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１０は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１１は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１２は、アスパラギンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１３は、バリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１４は、アスパラギンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；および
Ｘ１５は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換である；
ペプチド、または、それらの機能性フラグメント。
【請求項５】
請求項４のペプチドであって、
配列番号１２０の配列を含む、
ペプチド。
【請求項６】
配列番号１２７または配列番号１２８の配列を含む、
ペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項のペプチドであって、
Ｎ末がアセチル化されていて、および／または、Ｃ末がアミド化されている、
ペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項のペプチドであって、
前記ペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸または少なくとも１つの末端修飾を含む、
ペプチド。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか一項のペプチドであって、
Ｎ末および／またはＣ末に、少なくとも１つのＤ−アラニンをさらに含む、
ペプチド。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項のペプチドを含む、
キット。
【請求項１１】
ナトリウムチャネルの活性化を阻害する方法であって、
ナトリウムチャネルを、請求項１から９のいずれか一項のペプチドと接触させるステップを含む、
方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、
前記ナトリウムチャネルは、上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）である、
方法。
【請求項１３】
請求項１１の方法であって、
前記ナトリウムチャネルは、単離された細胞に存在する、
方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法であって、
前記の単離された細胞は、上皮細胞培養物の一部である、
方法。
【請求項１５】
請求項１１の方法であって、
前記ナトリウムチャネルは、動物内の細胞に存在する、
方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法であって、
前記動物は、疾患モデルである、
方法。
【請求項１７】
請求項１１の方法であって、
前記ナトリウムチャネルを前記ペプチドと接触させる方法は、前記ペプチドを、前記ナトリウムチャネルを含む細胞に送達するステップを含む、
方法。
【請求項１８】
請求項１１の方法であって、
前記ナトリウムチャネルの活性化が、少なくとも２０％阻害される、
方法。
【請求項１９】
請求項１１の方法であって、
前記ナトリウムチャネルの活性化が、少なくとも５０％阻害される、
方法。
【請求項２０】
請求項１１の方法であって、
前記ナトリウムチャネルの活性化が、少なくとも９０％阻害される、
方法。
【請求項２１】
ナトリウムチャネルを通したナトリウム吸収を阻害する方法であって、
前記ナトリウムチャネルを、請求項１から９のいずれか一項のペプチドと接触させるステップを含む、
方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法であって、
前記ナトリウムチャネルは、ＥＮａＣである、
方法。
【請求項２３】
上皮粘膜表面をおおう流体量を増加させる方法であって、
前記上皮粘膜表面上に存在するナトリウムチャネルを、請求項１から９のいずれか一項のペプチドと接触させるステップを含む、
方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法であって、
前記ナトリウムチャネルは、ＥＮａＣである、
方法。
【請求項２５】
細胞の表面上に存在するナトリウムチャネルのレベルを低減させる方法であって、
前記ナトリウムチャネルを、請求項１から９のいずれか一項のペプチドと接触させるステップを含む、
方法。
【請求項２６】
請求項２５の方法であって、
前記ナトリウムチャネルは、ＥＮａＣである、
方法。
【請求項２７】
それを必要とする対象における、上皮粘膜表面を横切るナトリウム吸収の阻害に反応性の疾患を治療する方法であって、
前記対象に、治療的に有効量の請求項１から９のいずれか一項のペプチドを送達するステップを含む、
方法。
【請求項２８】
請求項２７の方法であって、
前記ナトリウムチャネルは、ＥＮａＣである、
方法。
【請求項２９】
請求項２７の方法であって、
前記疾患は、肺疾患である、
方法。
【請求項３０】
請求項２７の方法であって、
前記肺疾患は、嚢胞性線維症である、
方法。
【請求項３１】
請求項２７の方法であって、
前記肺疾患は、非嚢胞性線維症気管支拡張症である、
方法。
【請求項３２】
請求項２７の方法であって、
前記肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患である、
方法。
【請求項３３】
請求項２７の方法であって、
前記肺疾患は、急性または慢性の気管支炎である、
方法。
【請求項３４】
請求項２７の方法であって、
前記肺疾患は、喘息である、
方法。
【請求項３５】
請求項２７の方法であって、
前記疾患は、胃腸疾患である、
方法。
【請求項３６】
請求項３５の方法であって、
前記胃腸疾患は、炎症性腸疾患である、
方法。
【請求項３７】
請求項２７の方法であって、
前記疾患は、腎疾患である、
方法。
【請求項３８】
それを必要とする対象において、塩分平衡、血液量、および／または血圧を調節する方法であって、
前記対象に、治療的に有効量の請求項１から９のいずれか一項のペプチドを送達するステップを含む、
方法。
【請求項３９】
請求項２７の方法であって、
前記のペプチドを送達するステップは、前記対象における細胞の表面上に存在するナトリウムチャネルのレベルを低減させる、
方法。
【請求項４０】
それを必要とする対象において、肺疾患、胃腸疾患、腎疾患、または心血管系の疾患の症状を治療する方法であって、
前記対象に、治療的に有効量の請求項１から９のいずれか一項のペプチドを投与するステップを含む、
方法。
【請求項４１】
請求項４０の方法であって、
前記肺疾患は、嚢胞性線維症、非嚢胞性線維症気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患、急性または慢性の気管支炎、または喘息である、
方法。
【請求項４２】
請求項４０の方法であって、
前記胃腸疾患は、炎症性腸疾患である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の記載］
［０００１］本出願は、２０１４年１０月８日に出願された、米国仮出願第６２／０６１，４６１号の利益を主張し、その内容全体は、参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
［本発明の分野］
［０００２］本発明は、ナトリウムチャネルに結合してナトリウムチャネルの活性を阻害する改善された能力を有する、特殊化非天然起源ペプチドである最適化ペプチドに関する。本発明は、さらに、ナトリウム吸収および流体量を調節する方法、および、ナトリウムチャネルの活性によりナトリウム吸収の調整に反応性の疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
［０００３］上皮粘膜表面は、量および成分が正確に制御された流体におおわれている。気道では、気道表面液体の薄い膜が、効率的な粘液クリアランスのための潤滑剤として作用することにより、哺乳類の気道を感染から保護するのを助ける（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５９１：４３７７（２０１３），Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：５７１（２００２））。この層は、粘液クリアランス中に頭側に移動し、２つの気道が収束するときに蓄積する過剰の液体は、上皮Ｎａ＋チャネル（ＥＮａＣ）を通過するＮａ＋を用いたＮａ＋調整型の気道表面液体吸収によって除去される（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５９１：４３７７（２０１３），Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：５７１（２００２））。批判的に、ＥＮａＣ活性が気道において調節されるメカニズムは、あまり理解されていない。最近になって、気道表面液体内の分子レギュレーターが、容量検出シグナルとして作用することができて、その希釈または濃縮は、イオン輸送速度を制御する特定の細胞表面受容体を、必要に応じて、気道表面液体を吸収または分泌のいずれかに変更することができるという証拠が蓄積している（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１５９：２５６（２００７））。調節される標的の１つとして、ＥＮａＣは、活性になってＮａ＋を導くために、細胞内フューリン−タイプのプロテアーゼおよび／またはプロスタシンのような細胞外チャネル活性化プロテアーゼ（ＣＡＰ）によって切断されなければならない（Ｐｌａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．７８：２３（２００７）；Ｒｏｓｓｉｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｏｃ．１：４（２００４）；Ｖａｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：６０７（１９９７）；Ｃｈｒａｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１：１２７（１９９８））。また、ＥＮａＣは、トリプシンのような外因的なセリンプロテアーゼによって切断および活性化され得て、プロテアーゼ阻害剤アプロチニンにより弱められる作用である（Ｖａｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：６０７（１９９７））。ヒト気管支上皮培養物が、生来の気道表面液体が洗い流されたＵｓｓｉｎｇチャンバー内に乗せられた場合、ＥＮａＣは主に活性であり、細胞が付着したプロテアーゼが優勢であることを示す（Ｂｒｉｄｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８１：Ｌ１６（２００１）；Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：８３３８（２００２））。対照的に、薄い膜の状態では、生来の気道表面液体が存在する場合は、ＥＮａＣ活性は低下し、気道表面液体が、可溶性プロテアーゼ阻害剤を含むことを示す（Ｍｙｅｒｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２７９４２（２００６）；Ｔａｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７：５９１（２００６）；Ｇａｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｐｆｌｅｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ，４６０：１−１７）。
【０００４】
［０００４］最近になって，Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌａｔｅ  Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｎａｓａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｌｏｎｅ（ＳＰＬＵＮＣ１）タンパク質は、気道表面液体内の全タンパク質の１０％まで含み、経鼻洗浄および気管分泌物の両方において容易に検出され得ることが示されている（Ｂｉｎｇｌｅ，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｃｒａｖｅｎ，Ｃ．Ｊ．（２００２）ＰＬＵＮＣ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｐｐｅｒ  ａｉｒｗａｙｓ  ａｎｄ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｘ  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １１，９３７；Ｃａｍｐｏｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＬＵＮＣ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｃｈｅｏｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０，１８４；Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｍ．，Ｓｔａｈｌｂｏｍ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｔａｇｅｓｓｏｎ，Ｃ．（２００１）；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｉｒｗａｙ  ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ，ｐａｌａｔｅ  ｌｕｎｇ  ｎａｓａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｌｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎａｓａｌ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２２，１７９５）。ＳＰＬＵＮＣ１は、ＥＮａＣが発現される表面上皮の粘膜表面上に分泌され得るので、容量検出分子であると考えられる（Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．８３：１２０１（２００８）；Ｂｉｎｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０５：４９１（２００５））。さらに、ＳＰＬＵＮＣ１は、そのＮ末ドメインを介してＥＮａＣの阻害剤として機能するサブドメインを含むことが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
［０００５］本発明は、結合してイオン輸送を阻害することによるナトリウムチャネルの調節におけるＳＰＬＵＮＣ１の特性を模倣して、ナトリウム吸収および流体量を調節してナトリウム吸収の調整に反応性の疾患を治療する、新規の特殊化非天然起源ペプチドを開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
［０００６］本発明は、ナトリウムチャネルの活性を調節するための、特殊化非天然起源ペプチドの設計に部分的に基づく。したがって、一態様では、本発明は、ナトリウムチャネルの活性化を阻害する方法に関し、ナトリウムチャネルを、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントと接触させるステップを含む。一実施態様では、ナトリウムチャネルは、上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）である。一実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントは、ナトリウムチャネルに結合する。
【０００７】
［０００７］本発明の別の態様は、ナトリウムチャネルを通したナトリウム吸収を阻害する方法に関し、ナトリウムチャネルを、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントと接触させるステップを含む。一実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントは、ナトリウムチャネルに結合する。
【０００８】
［０００８］本発明のさらなる態様は、上皮粘膜表面をおおう流体量を増加させる方法に関し、上皮粘膜表面上に存在するナトリウムチャネルを、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントと接触させるステップを含む。一実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントは、ナトリウムチャネルに結合する。
【０００９】
［０００９］本発明の別の態様は、細胞の表面上に存在するナトリウムチャネルのレベルを低減する方法に関し、ナトリウムチャネルを、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントと接触させるステップを含む。一実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントは、ナトリウムチャネルに結合する。
【００１０】
［００１０］本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象における、上皮粘膜表面を横切るナトリウム吸収の阻害に反応性の疾患を治療する方法に関し、治療的に有効量の特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントを対象に送達するステップを含む。一実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントは、ナトリウムチャネルに結合する。
【００１１】
［００１１］本発明の別の態様は、それを必要とする対象において、塩分平衡、血液量、および／または血圧を調節する方法に関し、治療的に有効量の特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントを対象に送達するステップを含む。一実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントは、ナトリウムチャネルに結合する。
【００１２】
［００１２］本発明の別の態様は、ＰＬＵＮＣタンパク質のナトリウムチャネル結合ドメインを模倣してナトリウムチャネルに結合する特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントに関し、ここで、プロテアーゼによるナトリウムチャネルの切断は、ペプチドに結合した場合は阻害される。
【００１３】
［００１３］本発明の別の態様は、本発明のペプチドを含むキットに関する。
【００１４】
［００１４］本発明の別の態様は、それを必要とする対象における、ナトリウム吸収の阻害に反応性の疾患を治療するための薬剤の調製のための、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントの使用に関する。
【００１５】
［００１５］本発明のこれらおよび他の態様を、以下に本発明の説明においてより詳細に示す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
［００１６］  
【図１】Ｓ１８の配列を示す（配列番号１）。赤の強調は、ＥＮａＣ相互作用に必須な残基であり、一方で、青の強調は、寄与しないことが見いだされた残基である。［００１７］
【図２Ａ−２Ｂ】最初の半分（ＬＰＶＰＬＤＱＴ（配列番号１１３）を示すが、Ｓ１８の残部（ＤＱＴＬＰＬＮＶＮＰ（配列番号１１４）は、ＥＮａＣの阻害およびＡＳＬの高さの保存に必要でない。［００１８］
【図３Ａ】配列番号２の横にＤ−アラニンがあるにもかかわらず、Ｓ１８（配列番号１）およびａａＬＰＶＰＬＤＱＴＬＰＬＮＶＮＰａａ（配列番号２）が、同等の効力および有効性を有することを示す。
【図３Ｂ】（配列番号３）の横にＤ−アラニンがあるにもかかわらず、Ｓ１８、およびａａＬＰＶＰＬＤＱＴａａ（配列番号３）が、同等の効力および有効性を有することを示す。また、図３Ａは、ａａＬＰＮｌｅＰＬＤＱＴａａ（配列番号５）を含むペプチドのサンプルの相対的効力も示し、それは、Ｓ１８または配列番号４と比較して増大した効力を示す。［００１９］
【図４】Ｓ１８および配列番号５のさらなる比較、および配列番号５の増大した効力を示す。［００２０］
【図５Ａ−５Ｕ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるα−ＥＮａＣの内部移行に対する様々なペプチドの効果、および、ＧＦＰ−タグ化α−ＥＮａＣが、βおよびγＥＮａＣと同時発現される場合の細胞生存能力に対する効果を分析する実験の結果を示す。ＥＣ５０値を、いくつかの図の下に示す。これらの図において、ＡＤＧは、配列：ＮＨ３−ＡＤＧＧＬＬＬＬＮＮＰＰＰＰＱＴＶＶ−ＮＨ２（配列番号１４３）を有するネガティブコントロールペプチドである。これらの実験で用いたペプチドは、Ｓ１８（配列番号１）、配列番号２、配列番号１４１、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１２８、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３１、配列番号１３９；配列番号１４０、配列番号１４４および配列番号１２７であった。また、それぞれＮ末およびＣ末の両方にａａキャップを有する配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１３６のペプチドもこれらの実験で用いた。また、アミロリドも示され、それは、別のメカニズムによってＥＮａＣを阻害し、細胞の表面上の機能性受容体の量を低減させない。［００２１］
【図６】ＧＦＰ−タグ化α−ＥＮａＣがγＥＮａＣとのみ同時発現されて、β−ＥＮａＣとはされない場合の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるα−ＥＮａＣの内部移行に対する様々なペプチドの効果を分析する実験の結果を示す。この図において、配列番号１４３（ネガティブコントロールペプチド）および水（ビヒクル）コントロールは、Ｓ１８（配列番号１）および配列番号１２８とともに用いられる。配列番号１および配列番号１２８は、β−ＥＮａＣが同時発現される場合、α−ＥＮａＣの減少に効果的であるが、β−ＥＮａＣが存在しない場合には、この実験において効果は見られない。［００２２］
【図７Ａ】Ｓ１８ペプチド（配列番号１）による処置後の、βＥＮａＣ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ：ＦＶＢマウスの生存（％）に対する効果を分析する実験の結果を示す。Ｓ１８（１００ｍＭ溶液）を、１μＬ／ｇ体重で１日あたり３回投与した。［００２３］
【図７Ｂ】吸入される配列番号１４２または配列番号１２８による処置後の、βＥＮａＣ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ：ＦＶＢマウスの生存（％）に対する効果を分析する実験の結果を示す。［００２４］
【図７Ｃ−７Ｄ】配列番号１２９または配列番号１２８による処置後の、βＥＮａＣ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ：Ｃ３Ｈマウスの生存（％）に対する効果を分析する実験の結果を示す。［００２５］
【図７Ｅ】配列番号１２８の１日１回の用量による治療後の、βＥＮａＣ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ：Ｃ３Ｈマウスの生存（％）（左パネル）および体重増加（右パネル）に対する効果を分析する実験の結果を示す。［００２６］
【図７Ｆ】配列番号１２７、配列番号１３４、または配列番号１３６による処置後の、βＥＮａＣ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ：Ｃ３Ｈマウスの生存（％）に対する効果を分析する実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［００２７］ここで本発明は、本発明の好ましい実施態様を示す添付の図面に関して、より詳細に説明される。しかしながら、本発明は異なる形態で実現され得て、本明細書に示す実施態様に制限されると解釈すべきでない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝達するように提供される。
【００１８】
［００２８］別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において、本発明の説明で用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためだけであり、本発明の限定を意図しない。本明細書で引用される全ての刊行物、特許出願、特許、特許公報および他の参考文献は、その参考文献が示されている文および／または段落に関連のある教示に関して、それらの全体で参照により援用される。
【００１９】
［００２９］アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コード、または三文字コードのいずれかによって、どちらも３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用に従って、本明細書において表される。
【００２０】
［００３０］本発明の説明および添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の提示をしない限り、複数形を同様に含むことが意図される。
【００２１】
［００３１］また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある列挙された項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的に（「または」）と解釈された場合は、組み合わせの欠失を指し、および包含する。
【００２２】
［００３２］本発明のペプチド配列に適用される用語「から本質的になる」（および文法上の変型）は、列挙された配列（例えば、配列番号）、および、ペプチドの機能が実質的に変更されないように、列挙された配列のＮ末および／またはＣ末上の合計１０以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の追加のアミノ酸の、両方からなるペプチドを意味する。合計１０以下の追加のアミノ酸は、両末端上の追加のアミノ酸を合わせた合計数を含む。本発明のペプチドに適用される用語「実質的に変更された」は、列挙された配列からなるペプチドの活性と比較して、少なくとも約５０％またはそれよりも高い、（例えば、ナトリウムチャネルまたは特殊化非天然起源ペプチドに対する）結合活性の増加または減少を指す。
【００２３】
［００３３］用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」または「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、規定されたレベルまたは活性の亢進（例えば増加）または阻害（例えば減少）を指す。
【００２４】
［００３４］用語「亢進する」または「増加する」は、規定されたパラメーターの少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、または実に１５倍の増加を指す。
【００２５】
［００３５］本明細書において用いられる用語「阻害する」または「減少する」またはそれらの文法上の変型は、規定されたレベルまたは活性の、少なくとも約１５％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはそれより多くの、減少または縮小を指す。特定の実施態様では、阻害または減少は、わずかな、または本質的に検出できない活性（せいぜい取るに足らない量、例えば、約１０％または実に５％未満）を生じる。
【００２６】
［００３６］特殊化非天然起源ペプチドおよびナトリウムチャネルに関して用いられる、用語「接触する」またはその文法上の変型は、一方が他方に生物学的効果を与えるように、特殊化非天然起源ペプチドおよびナトリウムチャネルを互いに十分に極めて接近させることを指す。一部の実施態様では、用語「接触する」は、ナトリウムチャネルに対する、特殊化非天然起源ペプチドの結合を意味する。
【００２７】
［００３７］本明細書において用いられる「治療的に効果的な」量は、いくらかの改善または利益を対象に提供する量である。言い換えると、「治療的に効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和、または減少を与える量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、治療的効果は完全または治癒的である必要はないことを当業者は理解するだろう。
【００２８】
［００３８］用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ）」により、対象の状態の重症度が、減少され、または少なくとも部分的に改善または改変されること、および、少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和または減少が達成されることが意図される。
【００２９】
［００３９］ペプチドに適用される用語「フラグメント」は、参照のペプチドまたはアミノ酸配列と比較して減少した長さであり、参照のペプチドまたはアミノ酸配列と同一の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、および／またはからなる、アミノ酸配列を意味することが理解されよう。本発明に係るそのようなペプチドフラグメントは、適切な場合は、それが構成要素である、より大きなポリペプチド内に含まれてよい。一部の実施態様では、そのようなフラグメントは、本発明に係るペプチドまたはアミノ酸配列の少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く連続したアミノ酸の長さを有するペプチドを含む、から本質的になる、および／または、からなることができる。他の実施態様では、そのようなフラグメントは、本発明に係るペプチドまたはアミノ酸配列の約１０、９、８、７、６、５、４、またはそれより少ない連続したアミノ酸よりも少ない長さを有するペプチドを含む、から本質的になる、および／または、からなることができる。
【００３０】
［００４０］本明細書において用いられる用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を交換可能に用いられ、および包含する。
【００３１】
［００４１］「融合タンパク質」は、天然には一緒に融合されることが知られていない、２つ（またはそれより多くの）異なるポリペプチドをコードする２つの異種ヌクレオチド配列またはそのフラグメントが、正しい翻訳リーディングフレームで一緒に融合される場合に生産されるポリペプチドである。例示的な融合ポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース−結合タンパク質、またはレポータータンパク質（例えば、グリーン蛍光タンパク質、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、ヘマグルチニン、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧエピトープなどの全てまたは一部に対する、本発明のペプチド（またはそのフラグメント）の融合を含む。
【００３２】
［００４２］本明細書において用いられる、「機能性」ペプチドまたは「機能性フラグメント」は、そのペプチドと正常に関連する少なくとも１つの生物学的活性（例えば、ナトリウムチャネルへの結合または阻害）を実質的に保つものである。特定の実施態様では、「機能性」ペプチドまたは「機能性フラグメント」は、改変されていないペプチドが保有する活性の全てを実質的に保つ。生物学的活性を「実質的に保つ」とは、ペプチドが、生来のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを保つことを意味する（生来のペプチドよりも高いレベルの活性さえも有し得る）。「非機能性」ペプチドは、ペプチドと正常に関連する検出可能な生物学的活性をわずかに示す、または本質的に示さないものである（例えば、せいぜい、取るに足らない量のみ、例えば、約１０％または実に５％未満）。タンパク質結合およびナトリウムチャネル阻害活性のような生物学的活性は、当技術分野でよく知られていて本明細書に記載されるアッセイを用いて測定することができる。
【００３３】
［００４３］本明細書において用いられる用語「約」は、例えば、ポリペプチド量、投与量、時間、温度、酵素活性または他の生物学的活性など、測定可能な値について言及する場合、規定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００３４】
［００４４］本発明の第一の態様は、特殊化非天然起源ペプチドが、ナトリウムチャネルに結合してナトリウムチャネルの活性化を防ぎ、それによりナトリウムイオンの流れを阻害する能力に関する。したがって、本発明の一態様は、ナトリウムチャネルの活性化を阻害する方法に関し、ナトリウムチャネルを、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントと接触させる（例えば、結合させる）ステップを含む。一実施態様では、ナトリウムチャネルは、上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）、例えば、ヒトＥＮａＣ、または非ヒト哺乳類ＥＮａＣである。別の実施態様では、ナトリウムチャネルは、酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）のようなＥＮａＣと、配列および／または構造が似たものである。ナトリウムチャネル活性化の阻害は、当技術分野で知られている、または本明細書に開示される、任意の方法により測定することができ、制限されずに、膜を横切る、細胞を横切る、または、天然または人工のライニングを横切る、潜在能力の変化またはナトリウムの流れの測定を含む。阻害は、少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり得る。
【００３５】
［００４５］ナトリウムチャネルの活性を阻害する方法は、例えば、単離されたナトリウムチャネル、人工膜内のナトリウムチャネル、または細胞内のナトリウムチャネルに対して行なうことができる。一実施態様では、ナトリウムチャネルは、単離された細胞内、例えば、培養された一次細胞または細胞株内に存在する。別の実施態様では、単離された細胞は、上皮細胞培養物の一部、例えば、天然または人工の上皮ライニング、例えば、イオンの流れおよび／または潜在能力のような特性がライニングを横切って測定され得るデバイス（例えばＵｓｓｉｎｇチャンバー）内の細胞培養物である。別の実施態様では、細胞は、単離された組織または組織培養物の一部である。さらなる実施態様では、細胞は、動物、例えば、疾患モデルである動物、または治療が必要な対象内に存在し得る。
【００３６】
［００４６］一実施態様では、ナトリウムチャネルを、特殊化非天然起源ペプチドと接触させる（例えば結合させる）ステップは、ナトリウムチャネルを含む細胞に、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントまたはホモログを送達するステップを含む。
【００３７】
［００４７］本明細書において用いられる、用語「ホモログ」は、特殊化非天然起源ペプチドに対する改変により、開示された特殊化非天然起源ペプチドとは異なるが、開示される非天然起源ペプチドの生物学的活性を有意に保持するポリペプチドを指すために用いられる。小さな改変は、制限されずに、１または数個のアミノ酸側鎖における変更、１または数個のアミノ酸に対する変更（欠失、挿入、および置換を含む）、１または数個の原子の立体化学における変更、および小さな誘導体化を含み、制限されずに、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、および、グリコシルホスファチジルイノシトールの添加を含む。本明細書において用いられる用語「実質的に保持する」は、天然起源ペプチドの活性（例えば、ナトリウムチャネルに対する結合）の少なくとも約２０％、例えば、約３０％、４０％、５０％またはそれより多くを保持する、ペプチドのフラグメント、ホモログ、または他の変異体を指す。他の生物学的活性は、ペプチドに応じて、酵素活性、受容体結合、リガンド結合、増殖因子の誘導、細胞シグナル伝達のイベントなどを含み得る。
【００３８】
［００４８］一実施態様では、当該方法は、単離された特殊化非天然起源ペプチドを、ナトリウムチャネルを含む細胞に送達するステップを含む。例示的な実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドは、開示の特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントを含む、から本質的になる、またはからなる。別の実施態様では、単離された特殊化非天然起源ペプチドは、公知のアミノ酸配列またはその機能性フラグメントと、少なくとも７０％同一の、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、アミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、ペプチドは、天然または非天然のアミノ酸による１つまたは複数の保存的置換および／または非天然アミノ酸の１つまたは複数の付加を有する、ＰＬＵＮＣタンパク質の天然のアミノ酸配列の一部を含む。保存的置換は以下に記載される。一部の実施態様では、ペプチドは、以下に記載の１つまたは複数の末端修飾を含む。
【００３９】
［００４９］本発明のペプチドの非限定的な例を、以下の表１に開示する。一部の実施態様では、本発明のペプチドは、１つまたは複数のさらなる残基をアミノ−および／またはカルボキシル−末端に含んでよい。一部の実施態様では、１つまたは複数のさらなる残基は、Ｄ−アラニンである。例えば、ペプチドは、１または２個のＤ−アラニンを、アミノ−および／またはカルボキシル−末端に含んでよい。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
［００５０］また、本発明の特殊化非天然起源ペプチドは、機能性部分またはフラグメントも含む。フラグメントの長さは、ペプチドの生物学的活性（例えば、ナトリウムチャネル結合活性）を実質的に保持する限り重大でない。例示的なフラグメントは、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの、特殊化非天然起源ペプチドの連続するアミノ酸を含む。他の実施態様では、フラグメントは、特殊化非天然起源ペプチドの、約１０、９、８、７、６、５、または４個の連続するアミノ酸しか含まない。
【００４２】
［００５１］同様に、本発明は、特殊化非天然起源ペプチドペプチドまたはその機能性フラグメントを含む、融合ポリペプチドも包含することを、当業者は理解するであろう。別の代替として、融合タンパク質は、レポーター分子を含み得る。他の実施態様では、融合タンパク質は、ペプチドの活性、例えば、ターゲッティング、結合、または酵素活性または機能と、同一または異なる、機能または活性を提供するポリペプチドを含んでよい。
【００４３】
［００５２］同様に、本明細書に具体的に開示されるペプチドは、典型的に、アミノ酸配列における置換に耐容であり、生物学的活性を実質的に保持することが理解されよう。本明細書に具体的に開示されるもの以外の本発明のペプチドを特定するために、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどの、相対的同一性または相違性を含む、当技術分野で知られている任意の特性に基づき得る。
【００４４】
［００５３］本明細書に具体的に開示されるもの以外のペプチドをコードするアミノ酸配列の特定において、アミノ酸のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮し得る。タンパク質に対する、相互作用の生物学的機能の提供におけるハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５（１９８２）；ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｈｅｒｅｉｎ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｅｎｔｉｒｅｔｙを参照）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性は、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、それは次に、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとタンパク質の相互作用を規定することが認められている。
【００４５】
［００５４］それぞれのアミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づきハイドロパシー指標が割り当てられていて（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ｉｄ．）、それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００４６】
［００５５］したがって、アミノ酸（またはアミノ酸配列）のハイドロパシー指標は、本明細書に具体的に開示されるペプチドを改変する場合に考慮され得る。
【００４７】
［００５６］また、アミノ酸の置換は、親水性に基づいてなされ得ることも、当技術分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体で参照により本明細書中に援用される）は、その隣接アミノ酸の親水性により支配されるタンパク質の最も高い局所的な平均親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関することを述べている。
【００４８】
［００５７］米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（±３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±Ｉ）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００４９】
［００５８］したがって、アミノ酸（またはアミノ酸配列）の親水性は、本明細書に具体的に開示されるものを超えるさらなるペプチドを特定する場合に考慮され得る。
【００５０】
［００５９］本発明のペプチド（およびそのフラグメント）は、本明細書に開示されるペプチド配列と、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高いアミノ酸配列同一性を有するペプチドを含む。
【００５１】
［００６０］当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか特定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実行によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。
【００５２】
［００６１］有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから多数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブアライメント法の簡易化を用いて；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。
【００５３】
［００６２］有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３（１９９３）に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得した。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。
【００５４】
［００６３］さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）により報告されるギャップ化ＢＬＡＳＴである。
【００５５】
［００６４］アミノ酸配列同一性の値（％）は、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も実際の残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されるギャップは無視する）。
【００５６】
［００６５］アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含み得る。加えて、本明細書に具体的に開示されるペプチドよりも多い、または少ない、アミノ酸を含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性（％）は、アミノ酸の合計数に対する、同一のアミノ酸の数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、その、より短い配列におけるアミノ酸の数を用いて決定される。同一性（％）計算においては、相対的重さは、配列変動、例えば挿入、欠失、置換などの様々な兆候に割り当てられない。
【００５７】
［００６６］一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列変動は「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算のための、以下に記載される加重したスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性（％）は、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も実際の残基を有するものである。
【００５８】
［００６７］本発明のペプチドおよびフラグメントは、関連のあるポリペプチドのインビボでの生存を促進するブロッキング剤の添加により、アミノ−および／またはカルボキシル−末端において、インビボ使用のために改変され得る。これは、細胞の取り込み前に、プロテアーゼによってペプチド末端が分解される傾向があるような状況において有用であり得る。そのようなブロッキング剤は、制限されずに、投与されるペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端残基に付加することのできる、さらなる関連するまたは関連のないペプチド配列を含み得る。これは、ペプチド合成中に化学的に、または、任意の適切な方法による組み換えＤＮＡ技術によって、なされ得る。例えば、１つまたは複数の非天然起源アミノ酸、例えばＤ−アラニンを、末端に付加することができる。あるいは、ブロッキング剤、例えばピログルタミン酸または当技術分野で知られている他の分子を、アミノおよび／またはカルボキシル末端残基に付加することができ、または、アミノ末端のアミノ基またはカルボキシル末端のカルボキシル基は、異なる部分で置き換えることができる。加えて、ペプチド末端は、例えば、Ｎ末のアセチル化および／またはＣ末のアミド化によって改変され得る。同様に、ペプチドは、投与前に、薬学的に許容できる「担体」タンパク質に共有または非共有的に結合することができる。
【００５９】
［００６８］一実施態様では、本発明のペプチドまたはそのフラグメントは、対象に直接投与される。一般に、本発明の化合物は、薬学的に許容できる担体（例えば、生理食塩水）中に懸濁されて、経口で、または静脈内注入により投与され、または、皮下、筋肉内、髄腔内に、腹腔内、直腸内に、膣内に、鼻腔内に、胃内に、気管内に、または肺内に投与される。別の実施態様では、気管内または肺内送達は、標準的な噴霧器、ジェット噴霧器、ワイヤーメッシュ噴霧器、ドライパウダー吸入器、または定量吸入器を用いて達成され得る。それらは、疾患または障害の部位、例えば肺、腎臓、または腸に、直接送達され得る。必要とされる用量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の病気の性質；対象のサイズ、体重、表面積、年齢、および性別；投与される他の薬；および主治医の判断に依存する。適切な用量は、０．０１〜１００．０μｇ／ｋｇの範囲内である。利用可能である様々なペプチド、フラグメントおよびホモログ、および、様々な投与経路の異なる効率を考慮すると、必要とされる用量の幅広い変動が予期される。例えば、経口投与は、ｉ．ｖ．注射による投与よりも高い用量を必要とすることが予期される。これらの用量レベルにおける変動は、当技術分野においてよく理解されている最適化のための標準的な経験的ルーチンを用いて調節することができる。投与は、１回または複数回（例えば、２−、３−、４−、６−、８−、１０−；２０−、５０−、１００−、１５０−、またはより多くの倍数（ｆｏｌｄ））であり得る。適切な送達ビヒクル（例えば、ポリマー微粒子または埋め込み可能デバイス）内の、ペプチド、フラグメントおよびホモログのカプセル封入は、特に経口送達に関して、送達効率を増大させ得る。
【００６０】
［００６９］特定の実施態様によれば、ペプチドまたはそのフラグメントは、インビボで、特定の細胞または組織に標的化することができる。リポソームを含む標的化送達ビヒクルおよび標的化システムは、当技術分野で知られている。例えば、リポソームは、リポソームにより取り込まれる抗体、可溶性受容体またはリガンドのような標的化剤を用いて特定の標的細胞または組織を標的化して、標的化分子が結合することのできる特定の細胞または組織を標的化することができる。標的化リポソームは、例えば、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５５００（１９８６）；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３９７９（１９８７）；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３９７３（１９８７）；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９５７，７３５  ｔｏ  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．に記載されていて、それぞれ、その全体で参照により本明細書中に援用される）。
【００６１】
［００７０］本発明の別の態様は、ナトリウムチャネルを通したナトリウム吸収を阻害する方法に関し、ナトリウムチャネルを、特殊化非天然起源ペプチドまたはそのフラグメントと接触させる（例えば、結合させる）ステップを含む。ナトリウム吸収の阻害は、当技術分野で知られている、または本明細書に開示される、任意の技術により測定され得る。
【００６２】
［００７１］本発明の別の態様は、上皮粘膜表面をおおう流体量を増加させる方法に関し、上皮粘膜表面上に存在するナトリウムチャネルを、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントまたはホモログと接触させる（例えば、結合させる）ステップを含む。上皮粘膜表面をおおう流体量は、当技術分野で知られている、または本明細書に開示される、任意の技術により測定され得る。
【００６３】
［００７２］本発明のさらなる態様は、細胞の表面上に存在するナトリウムチャネルのレベルを低下させる方法に関し、ナトリウムチャネルを、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントまたはホモログと、接触させる（例えば、結合させる）ステップを含む。
【００６４】
［００７３］本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象における、上皮粘膜表面を横切るナトリウム吸収の阻害に反応性の疾患を治療する方法に関し、治療的に有効量の特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントまたはホモログを、対象に送達するステップを含む。一実施態様では、本発明は、それを必要とする対象における、上皮粘膜表面を横切るナトリウム吸収の阻害に反応性の疾患の症状を治療する方法を包含し、配列番号２〜１２８から選択される配列を含むペプチドを対象に投与するステップを含む。本発明の方法における疾患は、非限定的な例では、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、非嚢胞性線維症気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患、急性または慢性気管支炎、または喘息）、胃腸疾患（例えば、炎症性腸疾患）、腎疾患、または心血管系の疾患であり得る。
【００６５】
［００７４］本発明の別の態様は、それを必要とする対象における、塩分平衡、血液量、および／または血圧を調節する方法に関し、治療的に有効量の特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントまたはホモログを、対象に送達するステップを含む。
【００６６】
［００７５］本発明の第三の態様は、本明細書に開示の方法を行なうために用いることのできる産物に関する。したがって、本発明の一態様は、以下の配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号１１６）
を含むペプチドであって、
ここで：
Ｘ１は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ２は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ３は、バリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ４は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ５は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ６は、アスパラギン酸または天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ７は、グルタミンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；および
Ｘ８は、トレオニンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換である；
ペプチド、またはそれらの機能性フラグメントに関する。
【００６７】
［００７６］本発明の別の態様は、以下の配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号１１７）
を含むペプチドであって、
ここで：
Ｘ１は、ロイシン、ノルロイシン、またはバリンであり；
Ｘ２は、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、（２Ｒ，５Ｓ）−５−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、または３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンであり；
Ｘ３は、バリン、ロイシン、ノルロイシン、またはＮ−メチルバリンであり；
Ｘ４は、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、（２Ｒ，５Ｓ）−５−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、または３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンであり；
Ｘ５は、ロイシン、ノルロイシン、またはバリンであり；
Ｘ６は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり；
Ｘ７は、グルタミンまたはアスパラギンであり；および
Ｘ８は、トレオニン、セリン、またはＬ−α−メチルセリンである；
ペプチド、または、それらの機能性フラグメントに関する。
【００６８】
［００７７］本発明のさらなる態様は、以下の配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５（配列番号１１８）
を含むペプチドであって、
ここで：Ｘ１は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ２は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ３は、バリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ４は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ５は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ６は、アスパラギン酸または天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ７は、グルタミンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ８は、トレオニンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ９は、トレオニンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１０は、ロイシンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１１は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１２は、アスパラギンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１３は、バリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１４は、アスパラギンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換であり；
Ｘ１５は、プロリンまたは天然または非天然アミノ酸での保存的置換である；
ペプチド、または、それらの機能性フラグメントに関する。
【００６９】
［００７８］一部の実施態様では、ペプチドは、配列番号４〜１４２および配列番号１４４からなる群より選択される配列を含む。一実施態様では、ペプチドは、配列番号５または配列番号１２２の配列を含む。一実施態様では、ペプチドは、配列番号２（ａａＬＰＶＰＬＤＱＴＬＰＬＮＶＮＰａａ）または配列番号１１９の配列を含む。一実施態様では、ペプチドは、配列番号１２７または配列番号１２８（ａａＬＰＩＰＬＤＱＴａａ）の配列を含む。
【００７０】
［００７９］特定の実施態様では、本発明のペプチドは、例えば、分解に対してペプチドを保護するための、少なくとも１つの修飾末端を含む。一部の実施態様では、Ｎ末はアセチル化され、および／または、Ｃ末はアミド化される。一部の実施態様では、ペプチドは、配列番号１０〜１２７、１２９、１３０、１３３、１３４、または１３６〜１４０のいずれか１つの配列を含み、さらに、アミノ−および／またはカルボキシル−末端に、１または２つのＤ−アラニンを含む。
【００７１】
［００８０］特定の実施態様では、本発明のペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸（例えば、１、２、３個、またはそれより多い）、または、少なくとも１つの末端修飾（例えば、１または２個）を含む。一部の実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸および少なくとも１つの末端修飾を含む。
【００７２】
［００８１］特定の実施態様では、ペプチドは、ＰＬＵＮＣタンパク質のナトリウムチャネル結合ドメインを模倣する。ナトリウムチャネル結合ドメインは、ＰＬＵＮＣタンパク質全長と実質的に同一のナトリウムチャネルに対する結合活性を有することが要求されるＰＬＵＮＣタンパク質の最小限フラグメントである。用語「実質的に同一の結合活性」は、タンパク質全長の結合活性の少なくとも約５０％である活性、例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、または９０％の結合活性を指す。一部の実施態様では、ペプチドは、ＰＬＵＮＣタンパク質全長と少なくとも同一の結合活性を有する。一実施態様では、ナトリウムチャネルは、ＥＮａＣ、例えば、ヒトＥＮａＣである。別の実施態様では、ナトリウムチャネルは、酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）などのＥＮａＣと、配列および／または構造が似たものである。
【００７３】
［００８２］本発明のペプチドは、場合により、他の治療薬とともに送達され得る。さらなる治療薬は、本発明のペプチドと同時に送達され得る。本明細書において用いられる単語「同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）」は、組み合わせた効果を生じるのに十分に近い時間を意味し、（すなわち、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）は、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）であり得て、または、互いの前または後の短い期間内に生じる２以上のイベントであり得る）。本発明の一実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドは嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）の機能を調節する化合物と同時に患者に送達されて、特殊化非天然起源ペプチドおよびＣＦＴＲを標的とする薬剤の組み合わせた活性は、ＣＦＴＲを標的とする薬剤単独よりも優れた活性を有する。本発明の別の実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドは、粘膜溶解化合物とともに同時に患者に送達されて、特殊化非天然起源ペプチドおよび粘膜溶解薬の組み合わせた活性は、粘膜溶解薬単独よりも優れた活性を有する。本発明のさらに別の実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドは、長時間作用型β２刺激薬（ｌｏｎｇ  ａｃｔｉｎｇ  Ｂ−ａｇｏｎｉｓｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＬＡＢＡ）と同時に患者に送達されて、特殊化非天然起源ペプチドおよびＬＡＢＡ薬の組み合わせた活性は、ＬＡＢＡ単独よりも優れた活性を有する。本発明のさらに別の実施態様では、特殊化非天然起源ペプチドは、グルココルチコイドアゴニストと同時に患者に送達されて、特殊化非天然起源ペプチドおよびグルココルチコイド薬の組み合わせた活性は、グルココルチコイド単独よりも優れた活性を有する。
【００７４】
［００８３］本発明の別の態様は、本発明のペプチドを含んで本発明の方法を行なうのに有用なキットに関する。キットは、方法を行なうためのさらなる試薬（例えば、バッファー、容器、さらなる治療薬）ならびに説明書をさらに含んでよい。
【００７５】
［００８４］さらなる態様として、本発明は、上述した任意の治療的効果（例えば、ナトリウム吸収の調節）を達成するための、医薬製剤およびその投与方法を提供する。医薬製剤は、薬学的に許容できる担体中に、上述の任意の試薬、例えば、特殊化非天然起源ペプチドまたはその機能性フラグメントを含み得る。
【００７６】
［００８５］「薬学的に許容できる」とは、生物学的または他の点で望ましくないものではない物質を意味し、すなわち、その物質は、任意の望ましくない生物学的効果、例えば毒性を引き起こさずに対象に投与することができる。
【００７７】
［００８６］本発明の製剤は、場合により、薬剤、医薬品、担体、アジュバント、分散剤、希釈剤などを含み得る。
【００７８】
［００８７］本発明のペプチドは、公知技術に従って、調剤担体での投与のために製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（９ｔｈＥｄ．１９９５）を参照。本発明による医薬製剤の製造において、ペプチド（生理的に許容できるその塩を含む）は、とりわけ、許容できる担体と典型的に混合される。担体は、固体または液体、または両方であり得て、好ましくは、０．０１または０．５％から９５％または９９％までのペプチド重量を含み得る錠剤などの単位用量製剤として、ペプチドとともに製剤化される。１つまたは複数のペプチドを、本発明の製剤に組み込むことができ、よく知られた任意の薬学技術により調製することができる。
【００７９】
［００８８］本発明のさらなる態様は、インビボで対象を治療する方法であり、薬学的に許容できる担体中に本発明のペプチドを含む医薬組成物を、対象に投与するステップを含み、ここで、医薬組成物は、治療的に有効量で投与される。それを必要とするヒト対象または動物への、本発明のペプチドの投与は、化合物の投与に関して当技術分野で知られている任意の手段によるものであり得る。
【００８０】
［００８９］本発明の製剤は、経口、直腸、局所、口腔（例えば舌下）、膣、非経口（例えば、皮下、骨格筋、心筋、横隔膜筋および平滑筋を含む筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内）、局所（すなわち、気道表面を含む、皮膚および粘膜表面の両方）、鼻腔内、経皮、関節内、髄腔内、および吸入投与、門脈内送達による肝臓への投与、ならびに、直接の臓器注入（例えば、肝臓内、中枢神経系への送達のための脳内、膵臓内、または、腫瘍または腫瘍周辺組織内）に適切なものを含む。任意の所定の場合における最も適切な経路は、治療される状態の性質および重症度、および、用いられる特定のペプチドの性質に依存する。
【００８１】
［００９０］注入のために、担体は、典型的に液体、例えば滅菌された発熱性物質除去水、滅菌された正常の生理食塩水、高張生理食塩水、発熱性物質除去リン酸緩衝生理食塩水溶液、電子制菌水、またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ［Ｒ］（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）である。投与の他の方法については、担体は固体または液体のいずれかであり得る。
【００８２】
［００９１］経口投与については、ペプチドは、カプセル、錠剤、および粉のような固形製剤、または、エリキシル剤、シロップ、および懸濁液のような液体剤形で投与され得る。ペプチドは、不活性成分および粉末化担体、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルカン、炭酸マグネシウムなどとともに、ゼラチンカプセル中にカプセル封入され得る。望ましい色、風味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の望ましい特性を与えるために加えることのできるさらなる不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白インクなどである。同様の希釈剤を用いて圧縮錠剤を作ることができる。錠剤およびカプセルの両方とも、長期間にわたって薬剤の連続的な放出を与える徐放性産物として製造することができる。圧縮錠剤は、糖衣またはフィルムコーティングされ得て、任意の不快な風味をマスクし得て、および、大気から錠剤を保護し得て、または、消化管における選択的崩壊のために腸溶性コーティングされ得る。経口投与のための液体剤形は、患者受容を増大させるための着色および風味付けを含み得る。
【００８３】
［００９２］口腔（舌下）投与に適切な製剤は、風味付きのベース、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に化合物を含むのど飴；および、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのような不活性ベース中に化合物を含むトローチを含む。
【００８４】
［００９３］非経口投与に適切な本発明の製剤は、滅菌された水性および非水性のペプチド注入溶液を含み、その製剤は、好ましくは意図されるレシピエントの血液と等張である。これらの製剤は、意図されるレシピエントの血液と等張の製剤を与える、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および溶質を含み得る。水性および非水性の滅菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含み得る。製剤は、単位／用量または複数回−用量の容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に存在し得て、使用の直前に、滅菌液体担体、例えば、生理食塩水または注射用水の添加のみ必要とする凍結−乾燥（凍結乾燥）状態で保管され得る。
【００８５】
［００９４］即席の注射溶液および懸濁液は、前述した種類の滅菌された粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。例えば、本発明の一態様では、密封容器内の単位剤形中に本発明のペプチドを含む、注射可能な、安定した、滅菌組成物が提供される。ペプチドまたは塩は、適切な薬学的に許容できる担体で再構成することのできる凍結乾燥物の形態で提供されて、対象へのその注射が適切な液体組成物を形成する。単位剤形は、典型的に、約１ｍｇ〜約１０ｇのペプチドまたは塩を含む。ペプチドまたは塩が実質的に水に不溶性である場合、十分な量の薬学的に許容できる乳化剤を十分な量で用いて水性担体中にペプチドまたは塩を乳化することができる。そのような有用な乳化剤の１つは、ホスファチジルコリンである。
【００８６】
［００９５］直腸投与に適切な製剤は、好ましくは単位用量の坐薬として提供される。これらは、ペプチドを、１つまたは複数のココアバターのような従来の固形担体と混合して、それから、生じる混合物を成形することにより調製することができる。
【００８７】
［００９６］皮膚への局所適用に適切な製剤は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、エアロゾル、またはオイルの形態をとる。用いることのできる担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮エンハンサー、および、それらの２以上の組み合わせを含む。
【００８８】
［００９７］経皮投与に適切な製剤は、長期間レシピエントの表皮と密接に接触したままにするために適用される別々のパッチとして提供され得る。また、経皮投与に適切な製剤は、イオン導入により送達することもできて（例えば、Ｔｙｌｅ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照）、典型的に、場合により緩衝されたペプチド水溶液の形態をとる。適切な製剤は、シトレートまたはｂｉｓ／ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、０．１〜０．２Ｍの化合物を含む。
【００８９】
［００９８］ペプチドは代替的に、経鼻投与のために製剤化され得て、または、他の方法で任意の適切な手段により対象の肺に投与され得て、例えば、対象が吸入するペプチドを含む呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液により投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であり得る。用語「エアロゾル」は、任意のガス中の（ｇａｓ−ｂｏｒｎｅ）懸濁相を含み、それは細気管支または鼻腔内に吸入され得る。具体的には、エアロゾルは、定量吸入器または噴霧器内またはミスト機内で生産され得る液滴のガス中の懸濁液を含む。また、エアロゾルは、空気または他の担体ガス内に懸濁された乾燥粉末組成物も含み、それは、例えば吸入器からの通気により送達することができる。Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ＆Ｊｏｎｅｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｔｒａｃｔ，Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ（１９８７）；Ｇｏｎｄａ（１９９０）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ６：２７３−３１３；ａｎｄ  Ｒａｅｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２７：１４３（１９９２）を参照。ペプチドを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知の加圧駆動型エアロゾル噴霧器または超音波噴霧器などを用いて任意の適切な手段により生産することができる。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照。ペプチドを含む固形粒子のエアロゾルは、調剤分野で公知の技術により、任意の固形微粒子薬物エアロゾル発生器を用いて同様に生産することができる。
【００９０】
［００９９］あるいは、例えば、デポーまたは徐放性製剤で、全身性よりむしろ局所の様式で、ペプチドを投与することができる。
【００９１】
［０１００］さらに、本発明は、本明細書に開示のペプチドおよびその塩のリポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成する技術は、当技術分野でよく知られている。ペプチドまたはその塩が水溶性の塩である場合、従来のリポソーム技術を用いて、それは脂質ベシクル内に取り込まれ得る。そのような場合には、ペプチドまたは塩の水溶性に起因して、ペプチドまたは塩は、リポソームの親水性の中央またはコア内に実質的に取り込まれる（ｅｎｔｒａｉｎｅｄ）。用いられる脂質層は、任意の従来の組成物であり得て、コレステロールを含んでよく、またはコレステロールを含まないでよい。目的のペプチドまたは塩が水に不溶性である場合、再度、従来のリポソーム形成技術を用いて、塩が疎水性脂質二重層内に実質的に含まれ得て、リポソームの構造を形成する。いずれかの場合において、生産されるリポソームは、標準的な超音波処理および均質化技術の使用を介して、サイズを減少させることができる。
【００９２】
［０１０１］本明細書に開示のペプチドまたはその塩を含むリポソーム製剤は、凍結乾燥して、水などの薬学的に許容できる担体により再構成され得る凍結乾燥物を生産して、リポソーム懸濁液を再生することができる。
【００９３】
［０１０２］水に不溶性のペプチドの場合、水に不溶性のペプチドを含む医薬組成物は、例えば、水性ベースのエマルション中に調製され得る。そのような場合、組成物は、所望の量のペプチドを乳化するのに十分な量の薬学的に許容できる乳化剤を含む。特に有用な乳化剤は、ホスファチジルコリンおよびレシチンを含む。
【００９４】
［０１０３］特定の実施態様では、ペプチドは、治療的に有効量で対象に投与され、その用語は上記に定義される。薬学的に活性のペプチドの用量は、当技術分野で知られている方法により決定することができ、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ）を参照。任意の特定のペプチドの治療的に効果的な用量は、ペプチドごとに、および患者ごとに多少変化し、患者の状態および送達経路に依存する。一般命題として、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量は治療的有効性があり、塩が用いられる場合を含み全ての重量はペプチドの重量に基づいて計算される。より高いレベルでの毒性懸念は、静脈内用量を、より低いレベル、例えば約１０ｍｇ／ｋｇまでに制限することができ、塩が用いられる場合を含み全ての重量はペプチドの重量に基づいて計算される。約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量は、経口投与のために用いることができる。典型的に、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量は、筋肉内注射に用いることができる。特定の用量は、静脈内または経口投与のために、約１μｍｏｌ／ｋｇから５０μｍｏｌ／ｋｇまで、より具体的には、それぞれ、約２２μｍｏｌ／ｋｇまで、および３３μｍｏｌ／ｋｇまでのペプチドである。
【００９５】
［０１０４］本発明の特定の実施態様では、１回を超える投与（例えば、２、３、４回、またはより多くの投与）を、様々な時間間隔にわたって用いて（例えば、毎時間、毎日、毎週、毎月など）、治療的効果を達成することができる。
【００９６】
［０１０５］本発明は、獣医および医療用途での使用を見つける。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含み、哺乳類が好ましい。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、およびキジを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、ウシ属、ヒツジ、ヤギ、ウマ科、ネコ科、イヌ科、ウサギ目などを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、若年、および成人を含む。
【００９７】
［０１０６］本発明は、その中における非常に多くの改変および変動が当業者に明らかであるので例示としてのみ意図される、以下の実施例においてより具体的に記載される。
【実施例】
【００９８】
［実施例１］
実験方法
［０１０７］組織取得および細胞培養：ＵＮＣ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＩＲＢ（Ｔａｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７：５９１（２００６））により承認されるプロトコルの下で、前述したようにヒト気管支組織からの酵素的消化により細胞を回収した。ヒト余剰ドナー肺（ｈｕｍａｎ  ｅｘｃｅｓｓ  ｄｏｎｏｒ  ｌｕｎｇ）および摘出レシピエント肺を、肺移植のときに主幹または腰部気管支の部分から取得して、細胞を酵素的消化により回収した。全ての調製物は、改変された気管支上皮培地内の空気−液体界面に維持して、ヒト胎盤ＶＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされた１２ｍｍ  Ｔ−Ｃｌｅａｒインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）上に蒔いた２〜５週後に用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、ヒト気管支上皮培養粘膜表面の洗浄に用いた。
【００９９】
［０１０８］共焦点顕微鏡：気道表面液体をラベルするために、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−デキストラン（２ｍｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むリンガーを、ヒト気管支上皮培養粘膜表面に添加した。パーフルオロカーボンを粘膜的に（ｍｕｃｏｓａｌｌｙ）添加して、気道表面液体の蒸発を防ぎ、培養物を、６３×グリセロール液浸対物レンズを備えるＬｅｉｃａ  ＳＰ８共焦点顕微鏡のステージ上に、１００μｌリンガーを含むチャンバー内に置いた。培養物あたり１０点をスキャンして、平均気道表面液体の高さを決定した。共焦点顕微鏡に関して、ヒト気管支上皮培養物を、１１６ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨＣＯ３、５．１ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＴＥＳ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４を含む改変リンガー溶液内に、漿膜的に（ｓｅｒｏｓａｌｌｙ）浸した。他のときは全て、ヒト気管支上皮培養物は、５％ＣＯ２ガス封入２４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３を含む改変ＢＥＧＭ増殖培地内に維持した。パーフルオロカーボン（ＦＣ−７７）を３Ｍから取得して、以前に報告されたとおり、ＡＳＬの高さに対して効果はなかった。
【０１００】
［０１０９］α−ＥＮａＣの内部移行：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｇｆｐ−αＥＮａＣでトランスフェクトして、ｇｆｐは、製造業者の説明書のとおりに、および以前に公表されたとおりに、３８４ウェルプレート内でリポフェクタミンを用いて、ＥＮａＣおよび未標識βＥＮａＣおよびγＥＮａＣのＮ末に融合された（例えば、Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３  Ｄｅｃ；３０５（１２）：Ｌ９９０−Ｌ１００１．ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｌｕｎｇ．００１０３．２０１３．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｏｃｔ；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ｏｃｔ  １；１１０（４０）：１５９７３−８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３１１９９９１１０．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｓｅｐ  １６．；Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４  Ｄｅｃ  １；５９２（Ｐｔ  ２３）：５２５１−６８を参照）。２４時間後、ペプチドまたはビヒクルコントロールをｔ＝０で添加して、３時間後にＴｅｃａｎ  Ｍ１０００プレートリーダーを用いて蛍光を読んだ。蛍光は、４８８および５１０ｎｍと読まれた。
【０１０１】
［０１１０］図６は、ＧＦＰ−タグ化α−ＥＮａＣが、β−ＥＮａＣではなくγＥＮａＣのみと同時発現された場合に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるα−ＥＮａＣの内部移行に対する、様々なペプチドの効果を分析する実験の結果を示す。この図では、配列番号１４３（ネガティブコントロールペプチド）および水（ビヒクル）コントロールは、Ｓ１８（配列番号１、および配列番号１２８とともに用いられる。配列番号１および配列番号１２８は、β−ＥＮａＣが同時発現される場合に、α−ＥＮａＣの減少に効果的であるが、β−ＥＮａＣが存在しない場合、この実験において効果は見られない。
【０１０２】
［０１１１］βＥＮａＣマウスでの有効性試験：ＣＦ患者同様に、βＥＮａＣ−Ｔｇマウスは、出生時には疾患がないが、閉塞性肺疾患をすぐに発症する（Ｚｈｏｕ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７８，１２４５−１２５６（２００８））。Ｃ５７ＢＬ：ＦＶＢおよびＣ５７ＢＬ：Ｃ３Ｈ混合株は、それぞれ９０％および５０％の死亡率であり、これらのバックグラウンドでの疾患の再現性は十分に高く、約８〜１０匹の動物／群のｎで信頼性のあるデータが生じている。さらに、βＥＮａＣ−Ｔｇマウスは、ヒトでのＣＦ／ＣＯＰＤに似た様式で治療的介入に応答し、肺疾患の発症は、出生時の肺疾患の阻害に続いて防ぐことができる（Ｌｉｖｒａｇｈｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２，４３５７−４３６７（２００９））。Ｓ１８−由来のペプチドまたはビヒクルを、マウスの並行コホートにおいて、１日１〜３回、鼻腔内点滴（１μｌ／ｇ体重）によって１４日間投与した。マウスを毎日計量して、利尿効果が見られた場合は、排泄量を滅菌生理食塩水の皮下注射で置き換えた。処置の最後に、マウスを表現型分析のために屠殺した。
【０１０３】
［０１１２］統計分析：全てのデータは、ｎの実験について平均±ＳＥとして示す。３以上の別個のドナーから採取した気道培養物を各試験に用いて、各卵母細胞試験を、３つの別個の場合で繰り返した。平均間の違いを、実験に応じて適切に、対応または独立ｔ検定またはそれらのノンパラメトリック同等物を用いて、統計的有意性について試験した。そのような比較から、Ｐ≦０．０５を生じる違いを有意であると判断した。全ての結合分析は、Ｈｉｌｌの方程式に適合した。
【０１０４】
［実施例２］
特殊化非天然起源ペプチドの特定
［０１１３］トリプシン感受性ＥＮａＣ活性の減少と並行する、正常なヒト気管支上皮培養物が気道表面液体の高さを７μｍに調節する能力に基づいて、我々は以前に、ＳＰＬＵＮＣ１由来のペプチド（すなわち、Ｓ１８；図１）が、単回投与の後に、２４時間まで、μＭ以下の範囲内のＥＣ５０でＥＮａＣを阻害し得ることを示した（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。Ｓ１８はタンパク質分解に耐性があり熱安定性であるが、我々は、Ｓ１８のサイズを低減させてその安定性を増大および／またはその効力を増大させることができるかどうか試験した。これらの作用のいずれも、薬剤としてのその有用性を増大させる。
【０１０５】
［０１１４］我々のアラニン−スキャンデータを確認するために、我々は、サブシーケンスＡのペプチド（ＬＰＶＰＬＤＱＴ（配列番号１１３）；図１）を作成した。コントロールとして、我々は、帯電中間領域（ＤＱＴ）を含むオーバーラップする２ｎｄペプチド、ならびにサブシーケンスＢ（ＤＱＴＬＰＬＮＶＮＰ（配列番号１１４））を作成した。図２に示すように、ＬＰＶＰＬＤＱＴ（配列番号１１３）は、Ｓ１８と同様の活性を保持したが、ＤＱＴＬＰＬＮＶＮＰ（配列番号１１４）は不活性であった。しかしながら、プロテアーゼに対する感受性を我々が調べたさらなる実験は、ＬＰＶＰＬＤＱＴ（配列番号１１３）は、ＥＮａＣがもたらす流体吸収を阻害し得るが、このペプチドは、タンパク質分解的な分解をより起こしやすいことが示された。したがって我々は、新規のペプチドを作成して、Ｃ末およびＮ末を一組のＤ−アラニンと隣接させた（小文字の「ａ」として示される）。ペプチドを３０μＭでＨＢＥＣに粘膜的に添加して、ＡＳＬの高さを、ＸＺ−共焦点顕微鏡によって３時間後に測定した。図２Ａは、Ｓ１８のＮ末領域（ＬＰＶＰＬＤＱＴ）（配列番号１１３）と、オーバーラップするがＣ末セグメント（ＤＱＴＬＰＬＮＶＮＰ）（配列番号１１４）の比較を示す。図２Ｂでは、Ｄ−アラニンを、Ｓｕｂ−Ｓ１８ペプチドＬＰＶＰＬＤＱＴ（配列番号１１３）およびＬＰＶＰＬＤＱＴＬＰＬ（配列番号１１５）に添加して、ＬＰＶＰＬＤＱＴ（配列番号１１３）の安定性を増大させた。Ｄ−アラニンは、小文字のａとして示す。全てｎ＝６〜９である。データは、平均±ＳＥＭとして示す。
【０１０６】
［０１１５］１５マーおよび８マーは、Ｓ１８に対して比較した場合に、同一の活性を示した（図２Ａ〜２Ｂ）。それから我々は、Ｓ１８、対、ペプチドａａＬＰＶＰＬＤＱＴａａ（配列番号３）に関して、用量反応全体を作成した。Ｓ１８およびａａＬＰＶＰＬＤＱＴａａ（配列番号３）は、同一の用量反応を生じ（図３Ａ）、ペプチドを短くすること、および、それを非天然アミノ酸と隣接させることは、その効力または有効性に影響しないことが示された。次に我々は、配列番号２の配列に基づき、いくつかの新規のペプチドを作成した。ここで、プロリンは典型的にペプチド内によじれを提供するので、それらは変更されず、その代わりに我々は、他のアミノ酸の保存的置換を体系的に行なった。用量反応を図３Ｂに示す。このグラフ上にいくつかの線が存在するので、エラーバーおよびデータ記号は省略したことに留意する。しかしながら、これらのデータは、対の気道培養物を用いて同時に得られたので、それらの比較は妥当である。明らかに、配列番号５（ａａＬＰＮｌｅＰＬＤＱＴａａ）は、Ｓ１８と比較して効力のｌｏｇ倍の増加を示し、一方で、配列番号９（ａａＬＰＶＰＬＤＱＳａａ）および配列番号６（ａａＬＰＶＰＮｌｅＤＱＴａａ）は、それぞれ減少した効力および有効性を示す（図３Ｂ）。図３Ｂに含まれる他の配列は、配列番号４（ａａＮｌｅＰＶＰＬＤＱＴａａ）、配列番号７（ａａＬＰＶＰＬＤＮＴａａ）および配列番号８（ａａＬＰＶＰＬＥＱＴａａ）である。
【０１０７】
［０１１６］気道細胞の新鮮なバッチを用いて、我々は、配列番号５に対するさらなる用量反応を行なった（図４）。見ることができるように、このペプチドは、Ｓ１８と比較して効力の有意な増大を与えて、ＩＣ５０は３０ｎＭであった。
【０１０８】
［０１１７］ペプチドがαＥＮａＣの内部移行を調節する能力を試験した。これらの実験による結果を図５Ａ〜５Ｕに示す。ＡＤＧは、配列：ＮＨ３−ＡＤＧＧＬＬＬＬＮＮＰＰＰＰＱＴＶＶ−ＮＨ２（配列番号１４３）を有するネガティブコントロールペプチドである。これらの実験で用いられるペプチドは、Ｓ１８（配列番号１）、配列番号２、配列番号１４１、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１２８、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３１、配列番号１３９；配列番号１４０、配列番号１４４および配列番号１２７であった。また、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１３６のペプチドもこれらの実験で用いられて、それぞれＮ末およびＣ末の両方にａａキャップを有した。また、別のメカニズムによってＥＮａＣを阻害し、細胞表面上の機能性受容体の量を低下させない、アミロリドも示される。これらの結果は、ＳＰＬＵＮＣペプチドが、その活性を阻害するＥＮａＣ機能の破壊を引き起こすことを示す。
【０１０９】
［０１１８］ペプチドの有効性を、βＥＮａＣマウスにおいて試験した。これらの実験による結果を図７Ａ〜７Ｆに示す。吸入される配列番号１２８による１４日の処置は、βＥＮａＣ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ：ＦＶＢマウスの増加した生存（％）で、吸入される配列番号１４２よりも効果的だった（図７Ｂ）。また、配列番号１２８による１４日の処置も、βＥＮａＣ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ：Ｃ３Ｈマウスの生存（％）を増大させた（図７Ｃおよび７Ｄ）。配列番号１２８による１日１回の投与は、βＥＮａＣ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ：Ｃ３Ｈマウスの生存（％）を増大させた（図７Ｅ、左パネル）。図７Ｅの右パネルは、配列番号１２８は利尿効果が無かったことを示す。図７Ｆは、配列番号１２７による処置は、ＥＮａＣ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ：Ｃ３Ｈマウスの生存（％）を増大させたことを示す。実験で用いた他のペプチドの配列は、配列番号１２９、配列番号１３４、および配列番号１３６であった。
［０１１９］前述のものは本発明の例示であり、それを限定するものと解釈されない。本発明は、以下の特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲の等価物はそれに含まれる。
【図１】
2017536334.tif 000009
【図２Ａ−２Ｂ】
2017536334.tif 000010
【図３Ａ】
2017536334.tif 000011
【図３Ｂ】
2017536334.tif 000012
【図４】
2017536334.tif 000013
【図５Ａ】
2017536334.tif 000014
【図５Ｂ】
2017536334.tif 000015
【図５Ｃ】
2017536334.tif 000016
【図５Ｄ】
2017536334.tif 000017
【図５Ｅ】
2017536334.tif 000018
【図５Ｆ】
2017536334.tif 000019
【図５Ｇ】
2017536334.tif 000020
【図５Ｈ】
2017536334.tif 000021
【図５Ｉ】
2017536334.tif 000022
【図５Ｊ】
2017536334.tif 000023
【図５Ｋ】
2017536334.tif 000024
【図５Ｌ】
2017536334.tif 000025
【図５Ｍ】
2017536334.tif 000026
【図５Ｎ】
2017536334.tif 000027
【図５Ｏ】
2017536334.tif 000028
【図５Ｐ】
2017536334.tif 000029
【図５Ｑ】
2017536334.tif 000030
【図５Ｒ】
2017536334.tif 000031
【図５Ｓ】
2017536334.tif 000032
【図５Ｔ】
2017536334.tif 000033
【図５Ｕ】
2017536334.tif 000034
【図６】
2017536334.tif 000035
【図７Ａ】
2017536334.tif 000036
【図７Ｂ】
2017536334.tif 000037
【図７Ｃ】
2017536334.tif 000038
【図７Ｄ】
2017536334.tif 000039
【図７Ｅ】
2017536334.tif 000040
【図７Ｆ】
2017536334.tif 000041
【配列表】
2017536334000001.app
【国際調査報告】
2017536334.tif 000042
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