(57)【要約】本発明は、ピオシン類として知られる細菌由来抗生物質を用いる細菌性呼吸器感染症の処置に関する。特に、本発明は、そのような感染症の処置のための、肺投与により投与されるＳ型ピオシン類の使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌性呼吸器感染症の予防または処置の方法における使用のためのＳ型ピオシンであって、該ピオシンが、肺投与により送達されるＳ型ピオシン。
【請求項２】
対象における細菌性呼吸器感染症の予防または処置のための方法であって、Ｓ型ピオシンが、該対象に肺投与により送達される方法。
【請求項３】
請求項１に記載の使用のためのＳ型ピオシンまたは請求項２に記載の方法であって、該感染性細菌が、シュードモナス・エルジノーサを含む、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該処置されるべき対象が、細菌性肺炎を有する、または細菌性肺炎を発現するリスクがある、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項５】
請求項４に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該処置されるべき対象が、弱められた気道機能および／または弱められた免疫機能を有する、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該処置されるべき対象が、嚢胞性繊維症または慢性閉塞性肺疾患を患っている、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項７】
請求項４または請求項５に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該対象が、癌患者またはうっ血性心不全もしくはＡＩＤＳに冒されている患者である、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該処置されるべき対象が、市中感染性肺炎、人工呼吸器関連肺炎または院内感染性肺炎を有する、またはそれらを発現するリスクがある、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項９】
前記の請求項のいずれか１項に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該Ｓ型ピオシンが、Ｓ２、ＳＤ２、Ｓ５またはＡＰ４１標的化部分を含む、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項１０】
請求項９に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該ピオシンが、Ｓ５標的化部分を含む、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項１１】
先行する請求項のいずれか１項に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該Ｓ型ピオシンが、Ｓ２、ＳＤ２、Ｓ５またはＡＰ４１エフェクター部分を含む、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該Ｓ型ピオシンが、Ｓ５エフェクター部分を含む、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれか１項に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該Ｓ型ピオシンが、ＳＤ２、ＳＤ２、Ｓ５、ＡＰ４１またはＬ１ピオシンである、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該Ｓ型ピオシンが、Ｓ５ピオシンである、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれか１項に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、２種類以上のピオシン類の組み合わせが該対象に投与される、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該組み合わせが、Ｓ５ピオシン、Ｌ１ピオシン、Ｓ２ピオシン、ＳＤ２ピオシンおよび／またはＡＰ４１ピオシンを含む、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＳ型ピオシンまたは方法であって、該組み合わせが、Ｌ１ピオシンおよびＳ２ピオシン；Ｌ１ピオシンおよびＡＰ４１ピオシン；Ｓ２ピオシンおよびＡＰ４１ピオシン；またはＬ１ピオシン、Ｓ２ピオシンおよびＡＰ４１ピオシンを、場合によりＳ５ピオシンおよび／またはＳＤ２ピオシンとの組み合わせで含む、Ｓ型ピオシンまたは方法。
【請求項１８】
Ｓ型ピオシンを提供することおよび前記のＳ型ピオシンを肺投与のために配合することを含む、細菌性呼吸器感染症の予防または処置のための医薬品を調製する方法。
【請求項１９】
療法組成物の対象への肺投与のためのデバイスであって、該組成物が、Ｓ型ピオシンを含むデバイス。
【請求項２０】
吸入器またはネブライザーである、請求項１９に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌性呼吸器感染症の処置に、特にピオシン類として知られる細菌由来抗生物質のそのような感染症を処置するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性病原体、例えばシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および大腸菌に関して、療法選択肢は、しばしば限られている。これは、抗生物質耐性決定因子の水平獲得および多くのクラスの抗生物質の有効性を重度に制限する高度に不透過性の外膜の存在による１−３。日和見性病原体Ｐ．エルジノーサの場合、全ての利用可能な抗生物質に対する耐性を有する臨床分離株が世界中で流行しており、臨床分離株の１８〜２５％は多剤耐性である１，４。加えて、Ｐ．エルジノーサの慢性感染症の間に多剤耐性バイオフィルムを形成する能力および長引く抗生物質療法の間の抗生物質耐性表現型変異体の出現は、この病原体を既存の抗生物質で本質的に処置できなくし得る５−７。下気道のＰ．エルジノーサによる慢性感染は、強い抗生物質療法を受けているにもかかわらず４１．５年の予測生存期間の中央値を有する嚢胞性繊維症を有する患者における死亡率の主因である（２０１１）８。加えて、Ｐ．エルジノーサによる感染は、人工呼吸器関連肺炎のような院内感染症の主な増大しつつある原因である。Ｐ．エルジノーサ感染は、西側世界における死亡の主因である慢性閉塞性肺疾患の発病とも関係している。従って、ここ数十年間これらの処置が困難な細菌に対して有効な新規の低分子抗生物質をほとんどもたらしていない開発パイプラインを増強するために、抗生物質開発に関する代わりの戦略を考える緊急の必要性が存在する１３−１５。
【０００３】
有効な抗生物質の発見のための代わりの戦略は、多くの細菌により種内競争のために産生される強力な狭いスペクトルの抗生物質を利用することである。Ｐ．エルジノーサ、Ｋ．ニューモニエおよび大腸菌では、これらは、それぞれＳ型ピオシン類、クレブシン類（ｋｌｅｂｉｃｉｎｓ）およびコリシン類として知られる多ドメインタンパク質性抗生物質の形態をとる１６−１８。これらのバクテリオシン類は、グラム陰性細菌に関するアキレス腱である既存の活性な栄養素取り込み経路の貯卵（ｐａｒａｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ）を通してグラム陰性外膜を効率的に越えるように進化してきた１９−２４。これらのタンパク質性抗生物質の細胞標的は、高度に保存されており、最も一般的にはＤＮＡ、ｒＲＮＡもしくはｔＲＮＡを標的とするヌクレアーゼ活性または細胞質膜を標的とする孔形成活性の形をとる細胞毒性活性を有する１７。今日までに特性付けられたピオシン類に関して、ピオシンＳ１、Ｓ２、Ｓ３およびＡＰ４１は、ＤＮアーゼ活性を示し、ピオシンＳ４は、ｔＲＮアーゼであり、ピオシンＳ５は、孔形成毒素であることが知られている１６。最近記載されたレクチン様ピオシンＬ１に関しては、細胞殺傷の機序は未知である。
【発明の概要】
【０００４】
ピオシン類は、Ｐ．エルジノーサに対する比類無き効力を示し、ピオシンＳ２は、Ｐ．エルジノーサ感染症の無脊椎動物モデルにおいて有効である２５が、ピオシン類は、臨床使用に関する良好な候補であることは以前に示唆されておらず、示されてもいない。細菌由来のポリペプチドとして、それらは、肺中の細菌性タンパク質の存在は敏感な呼吸器組織に非常に有害であり得る免疫応答を誘発することが予想されるであろうため、気道を冒す病気の処置における使用に関して特に不適切であるようであると考えられる。
【０００５】
驚くべきことに、本発明者らは、Ｓ型ピオシン類は、肺にうまく送達されて、免疫応答を誘発することも他の組織の損傷を引き起こすこともなく細菌負荷における劇的な低減を提供し得ることを見出している。
【０００６】
本発明は、細菌性呼吸器感染症の予防または処置の方法における使用のためのＳ型ピオシンを提供し、ここで、ピオシンは、肺投与により送達される。
本発明は、さらに、細菌性呼吸器感染症の予防または処置のための医薬品の製造におけるＳ型ピオシンの使用を提供し、ここで、ピオシンは、肺投与により送達される。
【０００７】
本発明は、さらに、細菌性呼吸器感染症の予防または処置のための方法を提供し、ここで、Ｓ型ピオシンは、対象に肺投与により送達される。
感染性細菌は、典型的にはシュードモナス属の種、例えばシュードモナス・エルジノーサを含む。
【０００８】
処置されるべき対象は、感染の結果として細菌性肺炎を有する可能性があるか、または発現するリスクがある可能性がある。従って、Ｓ型ピオシン類は、細菌性肺炎の予防および／または処置のために用いられることができる。
【０００９】
処置されるべき対象は、弱められた気道機能および／または弱められた免疫機能を有し得る。
処置されるべき対象は、嚢胞性繊維症または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を患っている可能性がある。あるいは、対象は、癌患者（特に化学療法を受けている患者）またはうっ血性心不全もしくはＡＩＤＳに冒されている患者である可能性がある。
【００１０】
処置されるべき対象は、市中感染性肺炎および院内感染症、例えば人工呼吸器関連肺炎および院内感染性肺炎を有する、または発現するリスクがある可能性がある。
下記でより詳細に記載されるように、Ｓ型ピオシン類は、標的化部分およびエフェクター部分を含む。
【００１１】
Ｓ型ピオシンは、例えばＳ２、ＳＤ２、Ｓ５またはＡＰ４１標的化部分を含むことができる。ある態様において、ピオシンは、Ｓ５標的化部分を含む。
加えて、またはあるいは、Ｓ型ピオシンは、例えばＳ２、ＳＤ２、Ｓ５またはＡＰ４１エフェクター部分を含むことができる。あるいは、それは、コリシンからの、例えばＥ２またはＥ３コリシンからの細胞毒性ドメインを含むことができる。ある態様において、ピオシンは、Ｓ５エフェクター部分を含む。
【００１２】
ある態様において、Ｓ型ピオシンは、ＳＤ２、ＳＤ２、Ｓ５、ＡＰ４１またはＬ１ピオシン、例えばＳ５ピオシンである。
２種類以上のピオシン類の組み合わせが対象に投与されることが、望ましい可能性がある。組み合わせは、少なくとも２種類の異なる受容体特異性および／またはエフェクター活性を有するＳ型ピオシン類を含むことができる。
【００１３】
組み合わせは、Ｓ５ピオシンを含むことができる。
組み合わせは、Ｌ１ピオシンを含むことができる。
組み合わせは、Ｓ２ピオシンを含むことができる。
【００１４】
組み合わせは、ＡＰ４１ピオシンを含むことができる。
組み合わせは、ＳＤ２ピオシンを含むことができる。
組み合わせは、Ｌ１ピオシンおよびＳ２ピオシン；Ｌ１ピオシンおよびＡＰ４１ピオシン；Ｓ２ピオシンおよびＡＰ４１ピオシン；またはＬ１ピオシン、Ｓ２ピオシンおよびＡＰ４１ピオシンを含むことができる。これらの組み合わせのいずれも、さらにＳ５ピオシンおよび／またはＳＤ２ピオシンを含むことができる。どの他のピオシン類が存在していても、その組み合わせはＳ５ピオシンを含むことが望ましい可能性がある。
【００１５】
本発明は、さらに、Ｓ型ピオシンを提供することおよび前記のＳ型ピオシンを肺投与のために配合することを含む、細菌性呼吸器感染症の予防または処置のための医薬品の調製の方法を提供する。
【００１６】
Ｓ型ピオシンは、組み換え法により発現されたものであることができる。
その方法は、Ｓ型ピオシンを組み換えにより発現させ、場合によりＳ型ピオシンを単離する工程を含むことができる。
【００１７】
本発明は、さらに、有効薬剤の対象への肺投与のためのデバイスを提供し、そのデバイスは、Ｓ型ピオシンを含む。そのデバイスは、例えば、吸入器（例えば計量吸入器、乾燥粉末吸入器）またはネブライザー（例えば超音波ネブライザー、ジェットネブライザー、振動メッシュネブライザー）であることができる。
【００１８】
本発明は、ここで、例として、そして限定としてではなく、添付の図面および実施例への参照により、より詳細に記載されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ピオシンで処置されたマウスからのＰ．エルジノーサＰ８の細菌回収。全てのピオシン類は、３ｍｇ  ｍｌ−１で与えられた。ホモジナイズされた肺のＣＦＵ計数により決定された細菌の計数、（ａ）マウスは、感染の６時間前にピオシンで処置され、全てのマウスは、感染の５時間後に屠殺された（ｃｕｌｌｅｄ）（ｂ）マウスは、感染の６時間前にピオシンで処置され、ピオシンで処置されたマウスは、２４時間まで生存した（ｃ）マウスは、感染の１時間後にピオシンで処置され、全てのマウスは、感染の４．５時間後に屠殺された（ｄ）マウスは、感染の１時間後にピオシンで処置され、ピオシンで処置されたマウスは、２４時間まで生存した。ａ）ｂ）およびｄ）においてピオシンＳ５で処置されたマウスからコロニーは回収されなかった。棒は、平均±ＳＥＭを表し、＊は、ボンフェローニ補正を適用した片側マン・ホイットニーＵ検定による対照に対する処置の比較に関する統計的有意性を意味する。
【図２】Ｐ．エルジノーサＰ８感染マウスのピオシンＳ５およびトブラマイシン処置。（Ａ）マウスは、感染の１時間後に処置され、全てのマウスは、感染の４．５時間後に屠殺された（Ｂ）マウスは、感染の１時間後に処置され、Ｓ５  ３０ｎｇ  ｍｌ−１およびトブラマイシン３００μｇ  ｍｌ−１で処置されたマウスは、２４時間まで生存した。全ての他のマウスは、感染の５．５時間後に屠殺された。棒は、平均±ＳＥＭを表し、＊は、ボンフェローニ補正を適用した片側マン・ホイットニーＵ検定による対照に対する処置の比較に関する統計的有意性を意味する。
【図３】ピオシン類に対する獲得寛容は、ある範囲のピオシン類で処置することにより克服され得る。（ａ）ピオシンＳ５、ＡＰ４１およびＬ１の細胞毒性活性を決定するためのスポット試験。２００μｇ  ｍｌ−１の精製されたタンパク質を、細菌の増殖している菌叢の上にスポットした。透明な領域は、ピオシンの細胞毒性を示す。Ｐ８ＡＰ４１Ｔは、Ｐ８のＡＰ４１耐性株であり、Ｐ８ＡＰ４１Ｔ＊は、（ｂ）において示されている未処置の対照マウスから回収されたＰ８ＡＰ４１Ｔ株である。（ｂ）（ａ）において示されているＰ８ＡＰ４１Ｔに感染させられ、次いで感染の１時間後に３ｍｇ  ｍｌ−１のピオシンを用いて処置されたマウスに関する細菌計数。ピオシンで処置されたマウスは、２４時間まで生存した。ピオシンＳ５で処置されたマウスからはコロニーは回収されなかった。棒は、平均±ＳＥＭを表し、＊は、ボンフェローニ補正を適用した片側マン・ホイットニーＵ検定による対照に対する処置の比較に関する統計的有意性を意味する。
【図４】Ｐ．エルジノーサＰ８に感染したマウスの処置に関するピオシンの組み合わせ。マウスは、感染の１時間後に３００μｇ  ｍｌ−１のストック濃度のピオシン類を用いて処置された；ピオシンで処置されたマウスは、２４時間まで生存した。棒は、平均±ＳＥＭを表し、＊は、ボンフェローニ補正を適用した片側マン・ホイットニーＵ検定による対照に対する処置の比較に関する統計的有意性を意味する。
【図５】図１（ｃ）および（ｄ）における実験の生物学的反復。ピオシンで処置されたマウスからのＰ．エルジノーサＰ８細菌回収。全てのピオシン類は、３ｍｇ  ｍｌ−１で与えられた。ホモジナイズされた肺のＣＦＵ計数により決定された細菌計数。ピオシンで処置されたマウスからの計数が、ＰＢＳで処置されたマウスからの計数に対して比較された（ａ）マウスは、感染の１時間後にピオシンで処置され、全てのマウスは、感染の４．５時間後に屠殺された。（ｂ）マウスは、感染の１時間後にピオシンで処置され、ピオシンで処置されたマウスは、２４時間まで生存した。棒は、平均±ＳＥＭを表し、＊は、ボンフェローニ補正を適用した片側マン・ホイットニーＵ検定による対照に対する処置の比較に関する統計的有意性を意味する。
【図６】図２（ａ）における実験の反復。Ｐ．エルジノーサＰ８に感染したマウスのピオシンＳ５およびトブラマイシン処置。マウスは、感染の１時間後に処置され、全てのマウスは、感染の４．５時間後に屠殺された。棒は、平均±ＳＥＭを表し、＊は、ボンフェローニ補正を適用した片側マン・ホイットニーＵ検定による対照に対する処置の比較に関する統計的有意性を意味する。
【図７】Ｐ．エルジノーサＰＡ０１に感染したマウスの処置のためのピオシンＳＤ２．マウスは、感染の１時間後に３ｍｇ  ｍｌ−１のストック濃度のピオシンＳＤ２を用いて処置された。対照のマウスは、感染の６時間後に屠殺され、ピオシンＳＤ２で処置されたマウスは、２４時間まで生存した。棒は、平均±ＳＥＭを表し、＊は、ボンフェローニ補正を適用した片側マン・ホイットニーＵ検定による対照に対する処置の比較に関する統計的有意性を意味する。
【図８】ピオシンＳ５は、ピオシンＳ５抗体の存在下で致命的なＰ．エルジノーサ感染症に対する保護を与えることができる。（ａ）ピオシンＳ５またはＰＢＳに鼻内で繰り返し曝露し、続いてＰ．エルジノーサＰ８に感染し、感染後にピオシンＳ５またはＰＢＳで処置されたマウスに関する細菌計数。細菌計数は、ホモジナイズされた肺からのＣＦＵ計数により決定された。多数回用量のピオシンＳ５（７５ｕｇ／用量）が、４週間にわたって２週間離して３回投与された。１３週目に、マウスはＰ．エルジノーサＰ８に感染させられ、感染の１時間後にピオシンＳ５（７５μｇ）またはＰＢＳで処置された。＊は、ボンフェローニ補正を適用した片側マン・ホイットニーＵ検定による対照に対する処置の比較に関する統計的有意性を意味する。（ｂ）（ａにおいて記載されたように）ピオシンＳ５またはＰＢＳに繰り返し曝露したマウスに関するＩｇＧおよびＩｇＡ血清レベル。対照群は、ピオシンＳ５（７５μｇ／用量）をフロイント完全／不完全と共に２週間離して３回皮下投与された。棒は、平均±ＳＥＭを表す。（ｃ）および（ｄ）は、マウスが腹腔内（Ｉ．Ｐ．）経路を介してピオシンＳ５に繰り返し曝露したことを除いて、（ａ）および（ｂ）と同様であった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ピオシン類
ピオシン類は、シュードモナス属の種、特にＰ．エルジノーサにより産生され、それに対して有効であるタンパク質性抗微生物毒素である。
【００２１】
ピオシン類は、一般に３つのクラス、すなわちＳ型、Ｒ型およびＦ型に分けられる。
Ｒ型（桿様）およびＦ型（柔軟かつ非収縮性）ピオシン類は、両方ともファージの尾部タンパク質（それぞれＰ２ファージおよびラムダファージ由来）に関連しており、細菌の膜に孔を形成することにより作用する。
【００２２】
Ｓ型（可溶性）ピオシン類は、（それらが進化的に関連していると信じられている）コリシン類に類似した特徴的な多ドメイン構造を有する。用語“ピオシン”は、本明細書において、文脈が別途要求する場合を除いて、Ｓ型ピオシン類を指すように用いられている。Ｓ型ピオシン類を産生する生物は、それらが対応するピオシン類に対する拮抗物質として作用する“免疫タンパク質”も産生するため、通常はそれら自身のピオシン類による影響を受けない。
【００２３】
Ｓ型ピオシン類は、標的化部分およびエフェクター部分を含む。典型的には、標的化部分は、分子のＮ末端にあり、エフェクター部分は、Ｃ末端にある。しかし、これらの部分の順序は、機能に関して必須ではない可能性がある。従って、Ｎ末端のエフェクター部分およびＣ末端の標的化部分を有するピオシン分子の使用も、意図されている。
【００２４】
エフェクター部分は、単一の独立して折り畳まれたドメインを構成することができる。標的化部分は、単一の独立して折り畳まれたドメインを構成することもでき、または２個以上の独立して折り畳まれたドメインに細分されていることもできる。
【００２５】
標的化部分は、標的生物の表面にある（すなわちグラム陰性外膜にある）受容体に結合し、外膜を越えるピオシンの移行を媒介する。誤解を避けるために記すと、用語“受容体”は、単に、標的生物上の分子であって、それに標的化部分が結合する分子を示すために用いられており、単一の生物により発現される分子の対に関して通常意図される意味における協同的受容体−リガンド相互作用を意味するように受け取られるべきではない。
【００２６】
一般に、ピオシンの標的化部分は、ピオシンの種および株特異性（または向性）を決定する。それらが結合する受容体は、しばしばシュードモナス菌に、例えばシュードモナス属に、またはさらにはＰ．エルジノーサもしくはその株に特異的である。
【００２７】
ほとんどの天然存在Ｓ型ピオシンの標的化部分は、３個までの同定可能な部分領域（ｓｕｂ−ｒｅｇｉｏｎｓ）を含有する特徴的なモジュラー構造を有し、そのそれぞれは、別々に折り畳まれたドメインに相当する可能性があり、または認識可能な二次構造を欠いており従って分子の柔軟な領域を形成している可能性もある。これらの部分領域は、しばしば文献において受容体結合領域、未知の機能の領域、および移行領域と呼ばれており、典型的には（排他的にではないが）Ｎ〜Ｃ末端方向の順序で存在する。しかし、これらのタンパク質は、十分に特性付けられておらず、割り当てられた機能は、正しくない可能性がある。従って、これらの領域は、本明細書においてそれぞれ標的化部分の領域Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩと呼ばれるであろう。
【００２８】
特定の理論により束縛されることを望むわけでは一切ないが、領域Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩは、少なくともある程度までピオシン分子間で互換的である可能性があり、領域ＩＩは、全体が、または一部が不要である可能性があると信じられている。従って、標的化部分は、少なくとも領域Ｉ配列および領域ＩＩＩ配列が場合により領域ＩＩ配列、その断片、またはペプチドリンカーにより隔てられたものを含むことができる。領域Ｉ、領域ＩＩまたは断片もしくはリンカー（存在するならば）、および領域ＩＩＩは、Ｎ〜Ｃ末端方向の順序で存在することが、望ましい可能性がある。
【００２９】
エフェクター部分は、典型的には、一度外膜を越えると、細胞殺傷活性を有する。それは、周辺質において作用する可能性があり、またはその細胞殺傷作用を及ぼすために細胞質への輸送を必要とする可能性もある。機序にかかわらず、エフェクター部分は、ピオシン分子の“細胞毒性”部分と呼ばれることができる。
【００３０】
ピオシン分子のエフェクターまたは細胞毒性部分は、典型的には孔形成性または酵素的である。孔形成性ピオシン類、例えばピオシンＳ５は、標的細胞を、細胞質膜の脱分極により殺す。酵素的ピオシン類は、典型的には細胞質においてヌクレアーゼとして作用し、ＤＮアーゼ活性を有する酵素（例えばピオシンＳ１、Ｓ２、ＳＤ２、Ｓ３およびＡＰ４１）およびｔＲＮアーゼ活性を有する酵素（例えばピオシンＳ４）を含む。
【００３１】
エフェクター部分が作用する標的は、細菌王国にわたって高度に保存されている傾向があり、それらの作用機序は、他の抗細菌毒素、例えばコリシン類のエフェクタードメインの作用機序に類似している。実際、Ｅ２またはＥ３コリシンのどちらかからのエフェクター部分に連結されたＳ１またはＳ２ピオシンからの標的化部分を含有するキメラピオシン類は、シュードモナス菌殺傷活性を保持していることが、実証されている３７。従って、ピオシンは、エフェクター部分としてのあらゆる適切な抗細菌タンパク質またはタンパク質ドメインを、そのタンパク質またはドメインが１以上のシュードモナス菌生物に対する細胞毒性活性を保持している限り、含むことができる。例えば、エフェクター構成要素は、コリシン、例えば（それに限定されないが）Ｅ２またはＥ３コリシンからの細胞毒性ドメインであることができる。
【００３２】
ピオシンＳ２
Ｓ２ピオシン類の標的化ドメインは、ＴｏｎＢ依存性鉄シデロフォア受容体ＦｐｖＡＩに結合する。Ｓ２エフェクタードメインは、ＤＮアーゼ活性を有する。
【００３３】
Ｓ２ピオシンの一例は、次の配列を有する：
【００３４】
【化１】
2017529398.tif 000002
【００３５】
Ｓ２ピオシンの標的化部分は、次の配列を有する：
【００３６】
【化２】
2017529398.tif 000003
【００３７】
Ｓ２標的化部分の領域Ｉは、次の配列を有する：
【００３８】
【化３】
2017529398.tif 000004
【００３９】
Ｓ２標的化部分の領域ＩＩは、次の配列を有する：
【００４０】
【化４】
2017529398.tif 000005
【００４１】
Ｓ２標的化部分の領域ＩＩＩは、次の配列を有する：
【００４２】
【化５】
2017529398.tif 000006
【００４３】
Ｓ２ピオシンのエフェクター部分は、次の配列を有する：
【００４４】
【化６】
2017529398.tif 000007
【００４５】
ピオシンＳＤ２
原型的ＳＤ２ピオシン配列は、McCaughey et al.により記載されている（印刷中）。ＳＤ２ピオシン類の標的化ドメインは、Ｐ．エルジノーサからのリポ多糖類（ＬＰＳ）に、より具体的には主にＤ−ラムノースのホモポリマーであるＬＰＳ内の共通多糖抗原（ＣＰＡ）に結合するが、特異的結合は、殺菌のために必要ではない可能性がある。ＳＤ２エフェクタードメインは、ｔＲＮアーゼ活性を有すると信じられている。
【００４６】
ＳＤ２ピオシンの一例は、次の配列を有する：
【００４７】
【化７】
2017529398.tif 000008
【００４８】
ＳＤ２ピオシンの標的化部分は、次の配列を有する：
【００４９】
【化８】
2017529398.tif 000009
【００５０】
ＳＤ２標的化部分の領域Ｉは、次の配列を有する：
【００５１】
【化９】
2017529398.tif 000010
【００５２】
前記のピオシンＳＤ２標的化部分の領域ＩＩ：
【００５３】
【化１０】
2017529398.tif 000011
【００５４】
ＳＤ２標的化部分の領域ＩＩＩは、次の配列を有する：
【００５５】
【化１１】
2017529398.tif 000012
【００５６】
ＳＤ２ピオシンのエフェクター部分は、次の配列を有する：
【００５７】
【化１２】
2017529398.tif 000013
【００５８】
ピオシンＳ５
Ｓ５ピオシンの標的化部分は、ＴｏｎＢ依存性鉄シデロフォア受容体ＦｐｔＡに結合する。Ｓ５エフェクタードメインは、孔形成活性を有する。
【００５９】
ピオシンＳ５の標的化部分の配列分析は、領域ＩＩＩは領域ＩのＮ末端に存在する可能性があることおよび領域ＩＩは存在しない可能性があることを示唆している。
Ｓ５ピオシンの一例は、次の配列を有する：
【００６０】
【化１３】
2017529398.tif 000014
【００６１】
Ｓ５ピオシンの標的化部分は、次の配列を有する：
【００６２】
【化１４】
2017529398.tif 000015
【００６３】
Ｓ５標的化部分の領域Ｉは、次の配列を有する：
【００６４】
【化１５】
2017529398.tif 000016
【００６５】
Ｓ５標的化部分の領域ＩＩＩは、次の配列を有する：
【００６６】
【化１６】
2017529398.tif 000017
【００６７】
Ｓ５ピオシンのエフェクター部分は、次の配列を有する：
【００６８】
【化１７】
2017529398.tif 000018
【００６９】
ピオシンＡＰ４１
ＡＰ４１ピオシン類のエフェクタードメインは、ＤＮアーゼ活性を有する。
ＡＰ４１ピオシンの一例は、次の配列を有する：
【００７０】
【化１８】
2017529398.tif 000019
【００７１】
ＡＰ４１ピオシンの標的化部分は、次の配列を有する：
【００７２】
【化１９】
2017529398.tif 000020
【００７３】
ＡＰ４１標的化部分の領域Ｉは、次の配列を有する：
【００７４】
【化２０】
2017529398.tif 000021
【００７５】
ＡＰ４１標的化部分の領域ＩＩは、次の配列を有する：
【００７６】
【化２１】
2017529398.tif 000022
【００７７】
ＡＰ４１標的化部分の領域ＩＩＩは、次の配列を有する：
【００７８】
【化２２】
2017529398.tif 000023
【００７９】
ＡＰ４１ピオシンのエフェクター部分は、次の配列を有する：
【００８０】
【化２３】
2017529398.tif 000024
【００８１】
ピオシンＬ１
ピオシンＬ１は、“レクチン様”ピオシンと考えられることができ、それは、細菌表面上の炭水化物部分に結合する。Ｐ．エルジノーサ上のその受容体は、ＬＰＳ、より具体的にはＬＰＳ内の共通多糖抗原（ＣＰＡ）であると信じられており、それは、主にＤ−ラムノースのホモポリマーである。
【００８２】
本明細書の目的に関して、それは可溶性であり、ファージ尾部タンパク質に対する相同性を有しない（従って、Ｒ型またはＦ型ピオシン類と容易に分類可能ではない）ため、それは、Ｓ型ピオシンと考えられる。
【００８３】
Ｌ１ピオシンの一例は、次の配列を有する：
【００８４】
【化２４】
2017529398.tif 000025
【００８５】
４つの下線の引かれた配列は、炭水化物結合モチーフに相当すると信じられている。Ｌ１ピオシンは、典型的には、コンセンサス配列Ｑ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｎ／Ｄ−Ｘ−Ｖ／Ｇ−Ｙ／Ｆを有する１、２、３または４個の炭水化物結合モチーフを含む。
【００８６】
従って、本発明における使用のためのＳ型ピオシンは、標的化部分を含み、それは、以下：
ピオシンＳ２、ＳＤ２、Ｓ５またはＡＰ４１からの領域Ｉ配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、９、１５および２０）に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する領域Ｉ配列；
ピオシンＳ２、ＳＤ２、Ｓ５またはＡＰ４１からの領域ＩＩＩ配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、１１、１６および２２）に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する領域ＩＩＩ配列；
および場合により
ピオシンＳ２、ＳＤ２またはＡＰ４１からの領域ＩＩ配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１０および２１）に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する領域ＩＩ配列；
を含み得る。
【００８７】
標的化部分は、ピオシンＳ２、ＳＤ２、Ｓ５またはＡＰ４１からの標的化部分配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、８、１４および１９）に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【００８８】
そのような標的化部分は、それぞれＳ２、ＳＤ２、Ｓ５およびＡＰ４１標的化部分と記載されることができる。典型的には、それらは、本明細書で提供された典型的な配列と同じ受容体に結合するであろう。
【００８９】
本発明における使用のためのＳ型ピオシンは、ピオシンＳ２、ＳＤ２、Ｓ５またはＡＰ４１からのエフェクター領域配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、１２、１７および２３）に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るエフェクター部分を含む。そのようなエフェクター部分は、それぞれＳ２、ＳＤ２、Ｓ５およびＡＰ４１エフェクター部分と記載されることができる。典型的には、それらは、提供された典型的な配列と同じ細胞毒性活性（すなわちＤＮアーゼ（Ｓ２、ＳＤ２、ＡＰ４１）または孔形成（Ｓ５））を有する。
【００９０】
あるいは、エフェクター部分は、コリシンからの細胞毒性ドメイン（例えばコリシンＥ１、Ｅ３、Ｅ９、Ｄ、Ｉａ、Ｅ２、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ５、Ａ、Ｂ、Ｎ、ＭまたはＳ４からの細胞毒性ドメイン。典型的な配列が、国際公開第２０１４／００９７４４号において提供されている）またはあらゆる他の適切な細胞毒性タンパク質からの細胞毒性ドメインであることができる。
【００９１】
ピオシン分子は、上記で提供されたピオシンＳ２、ＳＤ２、Ｓ５、ＡＰ４１またはＬ１の典型的な配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、７、１３、１８および２４）に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。そのような分子は、それぞれＳＤ２、ＳＤ２、Ｓ５、ＡＰ４１またはＬ１ピオシン類と記載されることができる。典型的には、それらは、提供された典型的な配列と同じ受容体に結合し、同じ細胞毒性活性を有する。Ｌｌピオシンは、典型的には１、２、３または４個の炭水化物結合モチーフを含み、それは、それぞれが上記で示されたコンセンサス配列に従う。ある態様において、Ｌ１ピオシンは、上記のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４において下線が引かれた特異的な炭水化物結合モチーフの１個、２個、３個または４個全部を含む。
【００９２】
参照配列に関するパーセント（％）アミノ酸配列同一性は、配列をアラインメントし、必要であれば最大パーセントの配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義されており、保存的置換は配列同一性の一部としては一切考慮しない。％同一性の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２(Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))により決定されることができる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを使用し、そのほとんどは、デフォルト値に設定される。調節可能なパラメーターは、以下の値を用いて設定される：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップ割合＝０．１２５、ワード閾値（ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝１１。％アミノ酸配列同一性の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定されるような一致する同一の残基の数を参照配列の残基の総数（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により参照配列中に導入されたギャップは、無視される）で割って１００を掛けたものにより決定される。
【００９３】
ピオシンタンパク質は、あらゆる適切な方法により合成または精製されることができる。例えば、それらは、天然にそれらを発現する生物（シュードモナス属の種）から精製されることができ、それらは、化学的方法により合成されることができ、それらは、無細胞系で発現されることができ、またはそれらは、関連するピオシンをコードしている核酸を含む非シュードモナス属の宿主細胞により発現されることもできる。
【００９４】
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であることができるが、ピオシン類はそれら自体が細菌性タンパク質であるため、原核細胞宿主が好ましい可能性がある。原核細胞宿主は、グラム陽性またはグラム陰性であることができる。大腸菌は、一般的なグラム陽性宿主細胞の例であり、それは、例えば下記の実施例において記載されるように所望のピオシンをコードする核酸の導入によりピオシン類を発現するように容易に設計されることができる。
【００９５】
ピオシン類は、典型的にはプラスミド上にコードされている。従って、宿主細胞は、ピオシンをコードするプラスミドを導入することによりピオシン産生のために設計されることができるが、染色体に組み込まれる発現コンストラクトを含む他の発現ベクターまたはコンストラクトが、用いられることができる。
【００９６】
ある場合では、宿主細胞は、ピオシンに感受性であることができる。そのような場合には、その宿主細胞が相補的免疫タンパク質（すなわちピオシンの活性に拮抗することができるタンパク質）をコードする核酸も含み、その免疫タンパク質を発現することができることが、望ましい。例えば、ピオシンＳ２、ＳＤ２およびＡＰ４１が大腸菌中で発現される場合、免疫タンパク質の同時発現が望ましい。ピオシンＬ１およびＳ５は、典型的には免疫タンパク質の非存在下で大腸菌中で発現されることができる。ピオシンおよび免疫タンパク質は、同じ発現コンストラクト（例えばプラスミド）上に、またたは異なる発現コンストラクト上にコードされていることができる。
【００９７】
免疫タンパク質配列の例は、以下のタンパク質を含む：
ピオシンＳ２免疫タンパク質：
【００９８】
【化２５】
2017529398.tif 000026
【００９９】
ピオシンＳＤ２免疫タンパク質：
【０１００】
【化２６】
2017529398.tif 000027
【０１０１】
ピオシンＳ５免疫タンパク質：
【０１０２】
【化２７】
2017529398.tif 000028
【０１０３】
ピオシンＡＰ４１免疫タンパク質：
【０１０４】
【化２８】
2017529398.tif 000029
【０１０５】
ピオシン類が宿主細胞から放出される機序は、十分に特性付けられていない。非シュードモナス属の宿主細胞において発現された場合、特定のピオシン類は、自然に分泌されることができ、従って培地から回収されることができる。他のピオシン類に関して、ピオシンを細胞自体から例えば適切な溶解および精製手順により回収することが好都合である可能性がある。当業者は、彼らの個々の必要性ならびに関係する特定の細胞およびタンパク質に従って適切なプロトコルを設計することが十分に可能である。
【０１０６】
処置に関する対象および条件
本発明の材料および方法は、シュードモナス属、特にシュードモナス・エルジノーサによる感染およびそのような感染と関係する細菌性肺炎の予防および／または処置に適している。
【０１０７】
感染症は、急性または慢性である可能性がある。
下気道のＰ．エルジノーサ感染は、嚢胞性繊維症（ここで、それは死亡率の主因に相当する）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する患者において特に一般的である。うっ血性心不全を有する患者、ＡＩＤＳ患者、および例えば癌（特に化学療法）、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、サルコイドーシス、巣状分節性糸球体硬化症、クローン病、ベーチェット病、天疱瘡、潰瘍性大腸炎等に関する免疫抑制薬物療法を受けている、または他の免疫抑制療法を受けている患者を含め、弱められた気道機能および／または弱められた免疫機能を有する他の患者も、感染しやすい可能性がある。
【０１０８】
シュードモナス属と関係する、またはそれにより引き起こされる急性の病気は、市中感染性肺炎および院内感染症、例えば人工呼吸器関連肺炎および院内感染性肺炎を含む。
Ｐ．エルジノーサの臨床株の間の変動性により、全てのピオシン類が全ての株に対して有効であることができるわけではないことは、理解されるであろう。ピオシンの有効性または毒性に影響を及ぼす要因は、異なる株の間の免疫タンパク質の差次的分布およびピオシンの標的化部分により結合される表面受容体における遺伝的変動性を含む。
【０１０９】
投与されるべきピオシンは、Ｐ．エルジノーサの感染性株の１種類以上に対して有効であるべきである。従って、対象由来の感染性株（単数または複数）の試料を提供し、前記の株（単数または複数）の同一性を決定し、それに応じて投与されるべきピオシン（類）を選択することが、望ましい可能性がある。
【０１１０】
例えば、感染が株Ｐ５を含む場合、Ｓ２以外のピオシンを投与することが、望ましい可能性がある。同様に、感染が株Ｅ２を含む場合、Ｓ２およびＡＰ４１以外のピオシンを投与することが、望ましい可能性がある。感染が株Ｐ１７を含む場合、Ｌ１以外のピオシンを投与することが、望ましい可能性がある。当然、あらゆる感染は、１種類より多くの細菌株を含み得るため、これらのピオシン類を複数のピオシン類を含むカクテルの一部として含めることが、なお望ましい可能性がある。しかし、通常は、優勢な種または株（単数または複数）に対する活性を有する１種類以上のピオシン類を投与することも、賢明であろう。
【０１１１】
加えて、またはあるいは、対象由来の感染性株（単数または複数）の試料を提供し、ピオシンまたは複数のピオシン類をその感染性株の１種類以上に対するインビトロでの毒性に関して試験し、そして対象の処置における使用に関する適切な毒性を有する１種類以上のピオシン類を選択することが、望ましい可能性がある。
【０１１２】
上記の方法は、対象から試料を得る工程を含むことができ、または既に得られた試料を利用することもできる。
典型的には、処置されるべき対象は、哺乳類である。対象は、典型的にはヒトであるが、あらゆる他の霊長類（大型類人猿、旧世界猿または新世界猿）、または飼育動物、実験動物もしくは家畜、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ類（例えばウサギ）、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジもしくはヤギであることもできる。
【０１１３】
医薬組成物
本発明の目的のためのピオシン類の送達は、肺投与による。用語“肺投与”は、有効薬剤が気道を介して肺に送達されるあらゆる適切な送達法を包含することが、意図されている。
【０１１４】
肺投与の最も一般的な方法は、経口および／または経鼻吸入である。代替案として、気管内点滴注入が、用いられることができるが、これは、典型的にはヒトの対象への臨床投与のための適切な経路とは考えられていない。
【０１１５】
有効薬剤、すなわちＳ型ピオシン類は、典型的には療法組成物または薬学的に許容可能な組成物において提供される。それらは、あらゆる適切な様式で、例えば液体または固体（典型的には粉末）形態で、肺投与のために配合されることができる。配合物は、吸入器（例えば計量吸入器、乾燥粉末吸入器）、ネブライザー（例えば超音波ネブライザー、ジェットネブライザー、振動メッシュネブライザー）等を含むあらゆる適切な機序または送達デバイスにより送達されることができる。
【０１１６】
従って、本発明は、さらに、療法組成物の対象への肺投与のためのデバイスを提供し、その組成物は、本明細書において他の箇所で記載されるＳ型ピオシンを含む。そのデバイスは、吸入器（例えば計量吸入器、乾燥粉末吸入器）またはネブライザー（例えば超音波ネブライザー、ジェットネブライザー、振動メッシュネブライザー）であることができる。
【０１１７】
送達のための組成物は、有効薬剤の１種類以上に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、キャリヤー、緩衝剤、安定化剤または当業者に周知の他の材料を含むことができる。そのような材料は、非毒性であるべきであり、有効成分の有効性に干渉すべきでない。キャリヤーまたは他の材料の正確な性質は、用いられる予定の配合物および送達デバイスの正確な性質に依存し得る。
【０１１８】
液体組成物は、一般に水性キャリヤー、例えば水または生理食塩水溶液を含む。デキストロースもしくは他の糖類の溶液またはグリコール類、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールが、含まれることができる。
【０１１９】
エマルジョンおよびナノ粒子封入物（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｓ）（両方とも脂質を用いる）も、用いられることができる。
固体（例えば粉末）製剤は、糖類、シクロデキストリン類等のようなキャリヤーを利用することができる。それらは、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、溶媒沈殿、ジェット製粉等を含むあらゆる適切な方法により調製されることができる。
【０１２０】
全ての場合において、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれることができる。
投与は、好ましくは“予防的有効量”または“療法上有効量”（場合によるが、予防は療法と考えられることができる）においてであり、これは、個人に利益を示すために十分である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置されているものの性質および重症度に依存するであろう。処置の処方、例えば投与量等に関する決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には処置されるべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および専門家に既知の他の要因を考慮する。上記で言及された技法およびプロトコルの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第20版, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins出版において見付けられることができる。
【０１２１】
本発明者らは、ピオシン類への繰り返しの曝露は処置の有効性を有意に損なわないことを示している。従って、処置の過程は、一回の投与または多数回の投与を含む、またはそれで構成されることができる。多数回用量計画は、２回、３回、４回、５回、またはさらにはより多くの個々の投与、例えば１０回までの投与を含む、またはそれで構成されることができる。連続する用量は、独立して、あらゆる適切な時間間隔、例えば１２時間まで、１日まで、１週間まで、２週間まで、または１ヵ月までの間隔を空けられることができる。
【０１２２】
組成物は、処置されるべき病気に応じて、単独で、または他の処置との組み合わせで、同時にまたは連続的に（どちらでもよい）投与されることができる。
【実施例】
【０１２３】
方法
研究設計。この研究の目的は、急性Ｐ．エルジノーサ肺感染のマウスモデルにおけるピオシン類の有効性を示すことおよび感染の非存在下でのピオシン処置が有害ではないことを示すことであった。全ての実験に関して、体重１５〜２１ｇの６週齢のメスのマウス病原体を有しないＣ５７／ＢＬ６マウスが、用いられた（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国）。全てのマウスは、適宜飼料および水を与えられ、実験の間、群で収容された。検出力計算が、試料サイズ（全ての処置実験に関してｎ＝６）を予め決定するために用いられた。マウスは、採点システムにより決定されるように必要とされた場合は、屠殺され、または予め決定された２４時間の時点で屠殺された。全てのマウスは、異常値を含め、統計分析に含まれた。実験は、１回のみかまたは１回繰り返してのどちらかで実施された（それぞれの実験に関して定められた）。
【０１２４】
倫理記載。全ての動物実験は、ＵＫ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔに従って実施され、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｌｉｃｅｎｓｅの下で認可され、グラスゴー大学の動物実験委員会により承認された。動物試験は、この研究ではランダム化されず、盲検法は不可能であった。グラスゴー大学の動物実験委員会により割り当てられたプロジェクトライセンス番号は、６０／４３６１であった。
【０１２５】
ピオシン類のクローニングおよび精製。ピオシンＡＰ４１およびその免疫タンパク質（ＩｍＡＰ４１）をコードする遺伝子が、Ｐ．エルジノーサＣ７６３のゲノムＤＮＡから、ピオシンをコードする遺伝子の開始点にＮｄｅＩ部位を導入するように設計されたプライマー（ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＧＧ）およびＩｍＡＰ４１をコードする遺伝子の停止コドンの代わりにＸｈｏＩ部位を導入するように設計されたプライマー（ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  Ｇ）を用いてＰＣＲにより増幅された。ＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩにより消化され、大腸菌発現ベクターｐＥＴ２１ａの対応する部位中にライゲーションされてｐＥＴＰｙｏＡＰ４１を与え、それは、ピオシンＡＰ４１−ＩｍＡＰ４１複合体の生成のために用いられ、ここで、ＩｍＡＰ４１は、Ｃ末端のＨｉｓ６タグを担持している。ピオシンＳ５をコードする遺伝子が、同様に、ＰＡＯ１株のゲノムＤＮＡから、遺伝子の開始点にＮｄｅＩ部位を導入するように設計されたプライマー（ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＴＧＡ  ＣＡＡ  ＣＧＡ  ＡＧＴ  ＡＣ）および停止コドンの後にＸｈｏＩ部位を導入するように設計されたプライマー（ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＧＣ）を用いて増幅され、消化されたＰＣＲ産物が、ｐＥＴ１５ｂ中にライゲーションされてｐＥＴＰｙｏＳ５を与え、それは、Ｎ末端のＨｉｓ６タグを有するピオシンＳ５をコードしている。ピオシンＡＰ４１およびＳ５は、関連するプラスミドを担持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳから過剰発現された。タンパク質の産生が、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導され、細胞は、３７℃においてさらに４時間増殖し、遠心分離により回収された。細胞は、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．５）中で再懸濁され、ＭＳＥ  Ｓｏｎｉｐｒｅｐ  １５０（Ｗｏｌｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて溶解され、細胞破砕片が遠心分離により分離された。その無細胞溶解物が、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．５）中で平衡化された５−ｍｌ  Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけられ、５〜５００ｍＭイミダゾール勾配にわたって溶離された。残っている混入物は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ２６／６００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのゲル濾過クロマトグラフィーにより除去された。ピオシンＬ１およびピオシンＳ２−ＩｍＳ２複合体は、以前に記載されたように精製された（２５，３２）。ピオシン類は、５ｋＤａの分子量カットオフを有する遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０）を用いて濃縮され、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中に一夜透析された。混入しているリポ多糖類（ｌｉｐｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＬＰＳ）は、１ｍｌ自然流下式内毒素除去カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて除去され、タンパク質は、０．２μＭシリンジフィルターを��いてフィルター滅菌された。ピオシン類は、小分けされて必要になるまで−８０℃で保管された。
【０１２６】
ピオシン感受性アッセイ：重層スポットプレート法。軟寒天重層スポットプレートが、３５の方法を用いて実施された。１５０μｌのＯＤ６００ｎｍ＝０．６の試験株培養物が、６ｍｌの０．８％軟寒天に添加され、ＬＢ寒天プレート上に注がれた。５μｌの様々な濃度のバクテリオシン、肺ホモジネートまたは血液が、プレート上にスポットされ、３７℃で２４時間インキュベートされた。
【０１２７】
ピオシンの送達。未感染の肺へのピオシン送達に関して、２５μｌの３ｍｇ  ｍｌ−１のピオシン（ｎ＝４）が、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）による麻酔の導入後に鼻内経路により送達された。マウスは、２４時間の時点で二酸化炭素窒息により屠殺された。カニューレが、気管中に挿入され、肺が、一定圧力における１０％ホルマリン溶液の２分間の穏やかな注入によりインサイチュで固定された。次いで、肺が取り出され、さらなる固定剤を含む容器中に置かれた。組織学処理およびヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色が、グラスゴー大学の獣医学学校内の獣医学診断サービス実験室により実施された。高解像度のスライドの全体画像が、Ｌｅｉｃａ  ＳＣＮ４００スライドスキャナー上で捕捉され、スライドが、２人の独立した評価人により、気管支周囲の浸潤物および肺胞の関与（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）に関して盲検で採点された。
【０１２８】
急性肺感染症のモデル。メスのＣ５７／ＢＬ６マウスが、鼻内におおよそ１０７ＣＦＵの選択されたＰ．エルジノーサ株を含有する２５μｌの細菌培養物を接種された３６。抗生物質処置が、感染の６時間前または１時間後のどちらかに施され、それらは１回のみ施された。ＰＢＳ中で溶解したピオシン類またはトブラマイシンが、上記のように鼻内投与により投与された。２つの異なるエンドポイントが、これらの実験において用いられた。未処置の対照と比較した肺の細菌負荷における低減を決定するため、実験における全てのマウスが、同じ時点（感染の４〜６時間後）において二酸化炭素窒息により屠殺された。マウスがピオシンまたはトブラマイシン処置後に感染を生き延びることができるかどうかを決定するため、マウスは密接にモニターされ、採点システムにより決定されるように必要とされた場合は二酸化炭素窒息により屠殺され、または予め決定された２４時間の時点で屠殺された。ピオシンで処置された未感染のマウスは、ピオシン処置由来の有害な作用がないことを確かめるために、第１系列の実験において対照として用いられた。これらの対照は、ピオシンが有害ではないことが一度明らかであったら、後の実験において用いられる動物の数を減らすために中止された。ＣＦＵの決定に関して、肺は無菌的に取り出され、ホモジナイズされるまで７５０μｌのＰＢＳ中で氷上で保たれた。ホモジナイズされた肺の１０倍系列希釈物が、シュードモナス選択寒天（１リットルあたり２０ｇペプトン、１．５ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇグリセロール、１５ｇ寒天、０．０２５ｇ  Ｉｒｇａｓａｎ）上に蒔かれ、３７℃で２４時間、次いで室温で２４時間インキュベートされた後、コロニーが計数された。
【０１２９】
繰り返しのピオシン曝露。ピオシンＳ５またはＰＢＳが、鼻内経路（Ｉ．Ｎ．群と呼ばれる）または腹腔内経路（Ｉ．Ｐ．群と呼ばれる）のどちらかを介した投与により２週間離して３回与えられた。Ｉ．Ｎ．投与に関して、群は、ＰＢＳおよびピオシンＳ５（７５μｇ；３ｍｇ  ｍｌ−１において２５μｌ）であった。Ｉ．Ｐ．投与に関して、群は、ピオシンＳ５（７５μｇ；７５０μｇ  ｍｌ−１において１００μｌ）であった。ＰＢＳ  Ｉ．Ｎ．群は、Ｉ．Ｐ．群に関する対照群の役目を果たした。第１曝露の１３週間後、マウス（ｎ＝５）は、鼻内でＰ．エルジノーサＰ８に感染させられ（Ｉ．Ｎ．群は、１．４×１０７ＣＦＵを感染させられ、Ｉ．Ｐ．群は、５．０×１０６ＣＦＵを感染させられた）、前記のように感染の１時間後に７５μｇのピオシンＳ５またはＰＢＳで鼻内で処置された。
【０１３０】
ピオシンＳ５特異的抗体力価の間接ＥＬＩＳＡによる決定。ＩｇＧおよびＩｇＡ応答の分析のため、血液が、二酸化炭素窒息の直後に心臓穿刺により得られた。血清が、試料の１３，５００ｇにおける１０分間の遠心分離、続いて上清の収集により得られた。血清は、−８０℃で保管された。Ｇｒｅｉｎｅｒ  ９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）が、ＰＢＳ中の精製された組み換えピオシンＳ５（７．５μｇ  ｍｌ−１、５０μｌ／ウェル）タンパク質で４℃において一夜コートされた。プレートは、リン酸緩衝生理食塩水＋０．０５％  ＴＷＥＥＮ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄され、次いで１５０μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で３７℃で１時間ブロッキングされた。洗浄後、ブロッキング緩衝液中１／５０の希釈度で開始して５倍系列希釈された試料が添加され、３７℃で２時間インキュベートされた。ピオシンＳ５＋フロイント完全／不完全を皮下で４週間にわたって３回与えられたマウスからの血清が、陽性対照として用いられ、コートされていないウェルが、陰性対照として用いられた。個々のマウスからの血清が、分析され、複製試料が、別の日に実施された。ＰＢＳＴによる洗浄後、５０μｌのＰＢＳＴ／０．１％  ＢＳＡ中の抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ペルオキシダーゼ抗体（（１／１０００希釈）Ｓｉｇｍａ、英国）または抗マウスＩｇＡ（ａ鎖特異的）−ペルオキシダーゼ抗体（（１／２５０希釈）Ｓｉｇｍａ、英国）が、添加され、プレートが、３７℃で１時間インキュベートされた。プレートは、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）錠剤（Ｓｉｇｍａ、英国）を用いて現像され、反応は３Ｍ  ＨＣｌを用いて停止された。光学密度（ＯＤ）が、ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートリーダー（ＢＭＧ  ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を用いて４５０ｎｍにおいて読み取られた。
【０１３１】
統計学。小さい標本サイズのため、非パラメトリック検定が、分析のために用いられた。クラスカル・ウォリス一元配置分散分析法が、標本が同じ分布に由来するかどうかを試験するために用いられた。次いで、ボンフェローニ補正を用いて多重比較に関して調整されたＰ≦０．０５の有意性閾値を用いる片側マン・ホイットニーＵ検定が、特定の標本対を有意差に関して分析するために用いられた。全てのマウスは、異常値を含め、統計分析に含められた。
【０１３２】
結果
ピオシン類は、マウスの肺中で安定であり、炎症も組織損傷も引き起こさない
ピオシン類が肺に有効に送達され得るかどうかおよびそれらがこの環境において安定であるかどうかを決定するため、組み換えピオシンＳ２、Ｓ５、ＡＰ４１およびＬ１が、健康なＣ５７／ＢＬ６マウスに鼻内投与された。２４時間のインキュベーション期間の後、上行大静脈の葉が、処置されたマウスから取り出され、ホモジナイズされ、Ｐ．エルジノーサの増殖している菌叢（ほとんどのピオシン類に関してＰ８株およびピオシンＳ２に関してＰ１７株）の上にスポットすることにより活性なピオシンの存在に関して試験された。Ｐ．エルジノーサの殺菌が、ピオシンＬ１、Ｓ２およびＳ５で処置されたマウスからの肺ホモジネートに関して検出されたが、ピオシンＡＰ４１またはＰＢＳで処置されたマウスからのホモジネートにおいては観察されなかった（データは示されていない）。これらのデータは、ピオシン類が、鼻内投与後に肺を通して十分に分布し、ピオシンＬ１、Ｓ２およびＳ５の場合、この環境で安定であることを示している。ピオシンＡ４１に関して、活性は検出されなかった。これは、Ｐ．エルジノーサ指標株の感受性によるものである可能性があり、または、このピオシンは他の試験されたピオシン類よりもインビボでより急速に分解され得ることを示している可能性もある。ピオシン類が宿主に有害であり得るかどうかを確かめるため、ピオシン類は、鼻内に再度投与され、２４時間後にピオシンで処置された肺が固定された。ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて可視化された肺組織は、次いで気管支周囲の浸潤物および肺胞のマクロファージの関与に関して採点された。ピオシンで処置された肺は、そのような特徴の徴候を示さず、ＰＢＳで処置された組織と識別できず、これは、タンパク質抗生物質のこの多様な群のいずれの１回の高濃度用量の投与も、明白な炎症または組織損傷をもたらさないことを示している（データは示されていない）。
【０１３３】
ピオシン類は、致死性のＰ．エルジノーサ感染症に対する保護を与えることができる
ピオシン類が肺における細菌負荷を低減するために十分に有効であるかどうかを決定するため、ピオシンＳ２、Ｓ５、ＡＰ４１およびＬ１（３ｍｇ  ｍｌ−１）、または対照マウスに関してはＰＢＳが、Ｐ．エルジノーサＰ８の通常は致死的である用量（おおよそ１０７ＣＦＵ）による感染の６時間前に鼻内投与された。全てのマウスは、感染の４時間後に屠殺され、肺ホモジネートからの生存可能な細菌の計数が、決定された（図１ａ）。全てのピオシン類は、細菌負荷を低減したが、この時点では、有効性における差は気付かれず、ピオシンＳ２、ＡＰ４１およびＬ１は、細菌数をそれぞれおおよそ２５倍、６５０倍および１５００倍低減した。ピオシンＳ５の場合、生存可能な細菌は回収されなかった。
【０１３４】
ピオシン活性がＰ．エルジノーサの通常は致死的である用量に対する保護を与えるのに十分であるかどうかを決定するため、マウスは、同様にＰ．エルジノーサＰ８による感染の６時間前にピオシン類で予め処置され、疾患に関してモニターされ、病気の臨床スコアの予め決定された重症度に達した際に屠殺された。ＰＢＳ対照マウスの６匹の内の５匹は、感染の５時間後の時点で屠殺され、一方で全てのピオシンで処置されたマウスは、２４時間の時点における実験のエンドポイントまで生存した。この時点における生存可能な細菌の計数は、ピオシンＳ２、ＡＰ４１およびＬ１に関する類似の殺菌活性を示しており、それは、全て１０，０００倍より大きく細菌計数を有意に低減した。また、この時点で、ピオシンＳ５で処置されたマウスから生存可能な細菌は回収されなかった（図１ｂ）。
【０１３５】
類似の実験が、ピオシンＳＤ２を用いて実施された。Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝６）が、おおよそ１．５×１０７ＣＦＵのＰ．エルジノーサＰＡ０１に感染させられ、感染の１時間後に３ｍｇ  ｍｌ−１のピオシンＳＤ２で処置された。感染したマウスは、疾患に関してモニターされ、十分な臨床スコアに達した場合、あるいは実験のエンドポイントである感染の２４時間後において屠殺された。ピオシンＳＤ２で処置されたマウスは、２４時間の時点の実験のエンドポイントまで生存し、対照のマウスは、感染の６時間後に屠殺された。肺の細菌負荷が決定され、対照のマウスは、感染の６時間後におおよそ２×１０５ＣＦＵ／肺を有していた。ピオシンＳＤ２マウスに関して、コロニーがないか、または１０ＣＦＵ／肺のどちらかが、感染の２４時間後に回収された（図７）。
【０１３６】
次いで、感染後の投与において細菌数を低減するピオシン類の能力が、決定された。Ｐ．エルジノーサＰ８に感染したマウスが、感染の１時間後に３ｍｇ  ｍｌ−１のピオシンＳ２、Ｓ５、ＡＰ４１およびＬ１で処置された。これらの実験において、マウスは、感染の４．５時間後の時点で屠殺され、肺ホモジネートからの細菌の計数が、ＰＢＳで処置された対照に対して比較された。前処置実験と類似して、ピオシンＳ５は、細菌数の低減において最大の有効性を示したが、この実験では、生存可能な細菌が、６匹のＳ５処置マウスの内の３匹から回収された。ピオシンＬ１、Ｓ２、およびＡＰ４１は、細菌負荷をそれぞれおおよそ２０、８０および１３０倍有意に低減した（図１ｃ）。この実験は、繰り返され、再度全てのピオシン処置群は、有意に低減した細菌計数を示した（図５ａ）。
【０１３７】
感染後のピオシン処置が致死的なＰ．エルジノーサ感染に対して保護を与えるかどうかを決定するため、マウスは、同様にＰ．エルジノーサＰ８に感染させられ、感染の１時間後に３ｍｇ  ｍｌ−１のピオシンＳ２、Ｓ５、ＡＰ４１およびＬ１で処置された。感染したマウスは、疾患に関してモニターされ、十分な臨床スコアに達した場合、あるいは実験のエンドポイントである感染の２４時間後において屠殺された。全てのＰＢＳで処置されたマウスは、感染の４．５時間後に屠殺され、全てのピオシンで処置されたマウスは、２４時間の時点の実験のエンドポイントまで生存した。肺の細菌負荷が決定され、またもピオシンＳ５は、最大の有効性を示し、６匹のピオシンＳ５で処置されたマウスのいずれからも細菌は回収されなかった。加えて、ピオシンＳ２、Ｌ１およびＡＰ４１は、このモデルにおいても非常に有効であり、４対数単位を超えて細菌計数を有意に低減した（図１ｄ）。この実験は、繰り返され、再度全てのピオシンで処置されたマウスは、２４時間まで生存し、細菌の計数は、同様に有意に低減した（図５ｂ）。従って、ピオシン類は、肺における細菌負荷の低減において非常に有効であり、感染の前および後に投与された際に、致死的なＰ．エルジノーサ感染症に対する保護を与えることができる。
【０１３８】
Ｐ．エルジノーサの株は、表現型が多様であるため、我々は、ピオシン類の３種類の追加の分離株：Ｐ．エルジノーサＰ１７およびＰ．エルジノーサＰ５（粘液性）（両方とも嚢胞性繊維症患者からのもの）ならびにＰ．エルジノーサＥ２（環境分離株）に対する有効性を試験した。ピオシンＳ２は、インビトロではＰ．エルジノーサＰ５またはＰ．エルジノーサＥ２に対して有効ではなく、従って、インビボでこれらの株を処置するためには用いられず、同様に、ピオシンＬ１は、Ｐ．エルジノーサＰ１７に対しては用いられなかった。全ての３種類のＰ．エルジノーサ株は、急性肺感染症のモデルにおけるＰ．エルジノーサＰ８の病毒性のレベルに類似した病毒性のレベルを示し、Ｐ．エルジノーサＰ５、Ｐ１７およびＥ２に感染した対照は、全てそれぞれ感染後４．５時間、４時間および５．５時間の時点で屠殺を必要とした。ピオシンＳ５、Ｌ１およびＳ２で処置された、Ｐ．エルジノーサＰ１７、Ｐ５またはＥ２に感染したマウスは、全て２４時間の実験のエンドポイントまで生存し、生存可能な細菌の計数は、有意に低いレベルまで低減したか、または存在しないかのどちらかであった（表１）。対照的に、ピオシンＡ４１によるＰ．エルジノーサＥ２の処置は、保護を与えることができず、これらのマウスは、感染後５．５時間の時点で屠殺された。Ｐ．エルジノーサＥ２に感染し、ＡＰ４１で処置されたマウスからの肺ホモジネートは、対照マウスと比較して１０倍しか低減しなかった高レベルの生存可能な細菌を含有していた（表１）。しかし、ピオシンＡ４１処置は、Ｐ．エルジノーサＰ５感染マウスに関して、およびＰ．エルジノーサＰ１７感染マウスの６匹の内の５匹に関して成功した。従って、ピオシン類は、Ｐ．エルジノーサの多様な株に対して強い有効性を示し、ピオシンＳ５処置は、細菌負荷の低減への最大の作用を示す。
【０１３９】
【表１】
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【０１４０】
ピオシンＳ５は、トブラマイシンと比較してマウスの肺においてＰ．エルジノーサの向上した殺菌を示す
ピオシンの有効性を現行の第一線処置と比較するため、我々は、ピオシンＳ５を、嚢胞性繊維症を有する患者におけるＰ．エルジノーサ肺感染に関する吸入式処置として広く用いられているトブラマイシンと比較した。マウスは、前記のようにＰ．エルジノーサＰ８に感染させられ、感染の１時間後に３０もしくは３ｍｇ  ｍｌ−１のトブラマイシンまたは０．３もしくは３ｍｇ  ｍｌ−１のピオシンＳ５のどちらかにより処置され、感染の４．５時間後に屠殺され、生存可能な細菌の計数が、肺ホモジネートから決定された。全ての４つの処置は、ＰＢＳ対照と比較して細菌負荷を有意に低減した。両方の濃度におけるピオシンＳ５は、細菌負荷を、トブラマイシンよりも大きい程度まで低減した（図２ａ）。この実験は、繰り返され、再度ピオシンＳ５は、細菌の計数をトブラマイシンより大きい程度まで低減した（図６）。ピオシンＳ５のトブラマイシンと比較した相対的な効力を決定するため、Ｐ．エルジノーサＰ８感染マウスを、３０ｎｇ  ｍｌ−１、３００ｐｇ  ｍｌ−１または３ｐｇ  ｍｌ−１のピオシンＳ５および３００μｇ  ｍｌ−１、３μｇ  ｍｌ−１または３０ｎｇ  ｍｌ−１のトブラマイシンで処置した。３０ｎｇ  ｍｌ−１のピオシンＳ５で処置された群および３００μｇ  ｍｌ−１のトブラマイシンで処置された群は、２４時間まで生存し、全ての他の群は、感染の重症度により感染の５．５時間後に屠殺された。感染の２４時間後に、３０ｎｇ  ｍｌ−１のピオシンＳ５および３００μｇ  ｍｌ−１のトブラマイシンは、両方ともＰＢＳ対照と比較して細菌の計数を有意に低減した（図２ｂ）。これらの結果は、ピオシンＳ５が有効である最も低い濃度は、３０ｎｇ  ｍｌ−１〜３００ｐｇ  ｍｌ−１にあり、トブラマイシンが有効である最も低い濃度は、３００μｇ  ｍｌ−１〜３μｇ  ｍｌ−１にあることを示している。従って、ピオシンＳ５は、この感染のモデルにおいてトブラマイシンより少なくとも１００倍強力である（表２）。
【０１４１】
【表２】
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【０１４２】
ピオシンＳ５がこのモデルにおいて１ｎＭ未満の濃度で有効であることを確かめた後、我々は、以前に用いられた濃度よりも低い濃度におけるピオシンＳ２、Ｌ１およびＡＰ４１の有効性を試験した。全ての３種類のピオシン類は、３００μｇ  ｍｌ−１および３０μｇ  ｍｌ−１で用いられた。症状の重症度により、３０μｇ  ｍｌ−１のピオシンＬ１で処置された６匹のマウスの内の３匹およびＰＢＳ対照マウスは、感染の６時間後の時点で屠殺された。両方の濃度のピオシンＳ２およびＡＰ４１で処置された全てのマウスならびに３００μｇ  ｍｌ−１のピオシンＬ１で処置されたマウスは、感染の２４時間後における実験のエンドポイントまで生存した（表Ｓ１）。従って、Ｐ．エルジノーサＰ８に対して、ピオシンＳ２およびＡＰ４１の最小有効濃度は、３０μｇ  ｍｌ−１以下であり、ピオシンＬ１の最小有効濃度は、３０〜３００μｇ  ｍｌ−１である。表Ｓ１は、インビボで試験された全てのピオシン類が、トブラマイシンと比較可能である、またはトブラマイシンより大きい効力を示したことを、示している。
【０１４３】
ピオシン耐性および緩和戦略
ピオシン耐性または抵抗性が、インビボでのピオシン処置の際に獲得されるかどうかを決定するため、この研究で論じられた全ての実験における２４時間のエンドポイントまで感染を生存したマウスから回収された生存可能な細菌が、ピオシン感受性に関して試験された。これらの実験から、ピオシン抵抗性コロニーは分離されなかった。しかし、我々は、ピオシンＡ４１に対する増大した耐性（おおよそ１０００倍）を示したピオシンＡＰ４１（感染後３ｍｇ  ｍｌ−１）で処置された細菌からの単一の分離株（Ｐ８ＡＰ４１Ｔ）を得た。重要なことだが、ピオシンＳ５およびＬ１に対する感受性は、このピオシンＡＰ４１耐性株においてインビトロで影響を受けておらず（図３ａ）、これは、マウスがＰ８ＡＰ４１Ｔに感染した際にインビボでも事実であることも、示されている。感染の６時間後に屠殺されたＰＢＳ対照とは対照的に、ピオシン処置された（３ｍｇ  ｍｌ−１）Ｐ８ＡＰ４１Ｔ感染マウスは、２４時間の時点の実験のエンドポイントまで生存し、肺ホモジネートにおいて有意に低減した細菌数を有していた（図３ｂ）。興味深いことに、これは、ピオシンＬ１、Ｓ２、Ｓ５を用いた処置に対してだけでなく、ピオシンＡＰ４１を用いた処置にも当てはまり、これは、このピオシンＡＰ４１耐性変異体は、なお高濃度のピオシンＡＰ４１を用いてうまく処置されることができることを、示している。ピオシン感受性試験は、この株は、感染の間ピオシンＡＰ４１に耐性のままであることを示した（図３ａ）。
【０１４４】
この研究において用いられた４種類のピオシン類は、全てＰ．エルジノーサにおける異なる栄養素取り込み受容体に寄生するため、ピオシン耐性の出現を防ぐための明白な戦略は、２種類以上のピオシン類の組み合わせからなる‘ピオシンカクテル’を用いることである。従って、我々は、Ｐ．エルジノーサＰ８の急性肺感染モデルにおいて２種類以上のピオシン類の組み合わせの有効性を試験した。以下のピオシンの組み合わせが、試験された：Ｌ１／Ｓ２、Ｌ１／ＡＰ４１、Ｓ２／ＡＰ４１およびＬ１／Ｓ２／ＡＰ４１（全てのピオシン類は、３００μｇ  ｍｌ−１で試験された）。ＰＢＳ対照マウスは、感染の４．５時間後に屠殺され、全てのピオシン処置されたマウスは、２４時間まで生存した。生存可能な細菌が、ピオシン処置されたマウスから低レベルで回収され、Ｌ１／Ｓ２／ＡＰ４１の組み合わせに関して、細菌は、６匹の処置されたマウスの内の１匹のみから回収され、これは、ピオシンの組み合わせが、個々のピオシン類の使用を超える増進された有効性を示すことを、示している（図４）。多数のピオシン類での処置後に回収された細菌に関しては、ピオシン抵抗性または耐性は、観察されなかった。
【０１４５】
ピオシンＳ５は、ピオシンＳ５抗体の存在下で、致死的なＰ．エルジノーサ感染症に対する保護を与えることができる
ピオシン類に対する繰り返される曝露が処置に有害な抗体反応を引き起こすかどうかを確かめるため、マウスは、抗体反応を誘発するためにピオシンＳ５に繰り返し曝露させられ、ピオシン処置の有効性が、前記のようにＰ．エルジノーサＰ８による感染の後に決定された。ピオシンＳ５は、鼻内（Ｉ．Ｎ．）経路または腹腔内（Ｉ．Ｐ．）経路のどちらかを介して、それぞれの投与の間を２週間空けて３回投与された。最初の処置の１３週間後、マウス（ｎ＝５）は、Ｐ．エルジノーサＰ８を鼻内感染させられ（Ｉ．Ｎ．群は、１．４×１０７ＣＦＵを感染させられ、Ｉ．Ｐ．群は、５．０×１０６ＣＦＵを感染させられた）、感染の１時間後に７５μｇのピオシンＳ５またはＰＢＳを用いて鼻内処置された。感染の前にＰＢＳのみを鼻内投与された対照群も、含まれた。Ｉ．Ｎ．群に関して、全てのピオシンＳ５処置されたマウスは、２４時間の時点まで生存したが、全てのＰＢＳで処置されたマウスは、症状の重症度により感染の５時間後に屠殺された。肺の細菌負荷が決定され、生存可能な細菌は、ピオシンＳ５処置されたマウスのいずれからも回収されなかった（図８ａ）。ピオシンＳ５特異的ＩｇＧおよびＩｇＡのレベルが、それぞれのマウスに関して分析された。これらのマウスにおいて検出されたＩｇＡ抗体は存在しなかった；しかし、以前にピオシンＳ５に曝露したマウスにおいて低レベルの（フロイント完全／不完全対照群よりも１０倍低い）ＩｇＧが存在した（図８ｂ）。Ｉ．Ｐ．経路を介してピオシンＳ５に繰り返し曝露したマウスに関して、感染後にピオシンＳ５で鼻内処置されたマウスは、全て２４時間の時点まで生存し、ＰＢＳで処置されたマウスは、症状の重症度により感染の５時間後に屠殺された。肺の細菌負荷が決定され、生存可能な細菌は、ピオシンＳ５処置されたマウスのいずれからも回収されなかった（図８ｃ）。ピオシンＳ５特異的ＩｇＧのレベルは、ピオシンＳ５のみの群において非常に低く（フロイント完全／不完全対照群よりも１０００倍低い）、ピオシンＳ５特異的ＩｇＡは、検出されなかった（図８ｄ）。従って、ピオシンＳ５は、繰り返しの投与の後に、そしてピオシンＳ５特異的抗体の存在下で、強い有効性を示す。
【０１４６】
論考
この研究において、我々は、ピオシン類が、肺に直接送達された場合に急性Ｐ．エルジノーサ肺感染症の致死的モデルにおいて細菌負荷の低減および保護の提供において非常に有効であることを示している。特に、ピオシンＳ５は、Ｐ．エルジノーサ肺感染症を処置するために広く用いられている抗生物質であるトブラマイシンの最小有効濃度よりも少なくとも１００倍低い濃度で保護を与えることが示された。インビボで試験された全てのピオシン類は、トブラマイシンと比較可能な、またはトブラマイシンより大きい効力を示した。加えて、これらの高度に安定な染色体にコードされるピオシン類の高濃度での投与は、肺における明白な炎症または組織損傷をもたらさなかった。まとめると、これらのデータは、ピオシン類がＰ．エルジノーサ肺感染症の処置に関する有用な療法薬を作る可能性を有することを、示唆している。これらは、嚢胞性繊維症、院内感染性および人工呼吸器関連肺炎ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）と関係するＰ．エルジノーサ感染症を含み、その全てが、現在の満たされていない医学的必要性の領域である１０，１１。実際、関連するコリシン様およびレクチン様バクテリオシン類は、抗生物質耐性である頻度の高い病原体、例えばクレブシエラ・ニューモニエおよびバークホルデリア属の種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．）による呼吸器感染症の処置のための有用な療法薬も作り得る。
【０１４７】
それらの効力に加えて、コリシン様バクテリオシン類の追加の利点は、それらの狭い殺菌のスペクトルである。これは、細菌感染症をうまく処置する一方で正常な細菌叢を完全なままにする可能性を可能にする。広いスペクトルの抗生物質の使用および腸内菌共生バランス失調と関係する十分に確立された厄介な問題は、抗生物質関連下痢およびクロストリジウム・ディフィシル感染症を含む２６，２７。より最近になって、微生物の不均衡は、ある範囲の慢性疾患、例えばクローン病、糖尿病、肥満およびリウマチ性関節炎において役割を果たしていることが示唆されている２８−３１。
【０１４８】
この研究において試験されたピオシン類の内で、ピオシンＳ２およびＳ５に関する受容体は、それぞれＴｏｎＢ依存性鉄シデロフォア受容体ＦｐｖＡＩおよびＦｐｔＡであることが知られており２１，２２、ピオシンＬ１に関する受容体は、リポ多糖類の共通多糖抗原（ＣＰＡ）であることが最近示されている３２。しかし、ピオシンＡＰ４１に関する受容体は、発見されていないままである。ＦｐｔＡおよびＣＰＡは、Ｐ．エルジノーサの株の間で広く分布していることが知られており３３、興味深いことに、Ｐ．エルジノーサによるＣＰＡ産生は、嚢胞性繊維症の肺において上方制御されていることが示されており３４、これは、ピオシンＬ１が、インビトロ活性が検出されることができない株に対してインビボで有効である可能性があることを意味している。異なる細胞表面受容体を標的とするピオシン類の‘カクテル’を用いることは、獲得されるピオシン抵抗性の機会を低減し、ピオシン産生株中のピオシン特異的免疫タンパク質遺伝子の存在により付与される抵抗性の可能性も低減するであろう。しかし、ピオシンＡＰ４１およびＳ５は多様な環境および臨床分離株の収集物中の株の８７％に対して有効であるため、本来備わっているピオシン特異的免疫は、これらの抗微生物物質の大きな制限ではない。
【０１４９】
本発明は、上記の典型的な態様と合わせて記載されてきたが、多くの均等な改変およびバリエーションが、本開示を与えられた際に、当業者には明らかであろう。従って、述べられた本発明の典型的な態様は、説明的であり、限定的ではないと考えられる。記載された態様に対する様々な変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされることができる。本明細書で引用された全ての文書は、参照により明確に援用される。
【０１５０】
参考文献
【０１５１】
【化２９】
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【０１５２】
【化３０】
2017529398.tif 000033
【０１５３】
【化３１】
2017529398.tif 000034
【０１５４】
【化３２】
2017529398.tif 000035
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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