(57)【要約】本開示は、クロマトグラフィープロセスを使用してＤＮａｓｅなどのタンパク質を精製するための組成物及び方法を提供する。本方法は、単一のクロマトグラフィーステップ、及び高濃度の塩緩衝液の使用を含む。本開示は、試料からのタンパク質の精製のための方法を提供し、この方法は、クロマトグラフィーカラムに前記試料を負荷するステップ、及び非常に高い伝導度を有する少なくとも１種の緩衝液で前記カラムを洗浄するステップを含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約５０ｍＳ／ｃｍ、約６０ｍＳ／ｃｍ、約７０ｍＳ／ｃｍ、約８０ｍＳ／ｃｍ、またはそれ以上の伝導度を有する。さらなる実施形態では、前記タンパク質は、非常に高い伝導度の緩衝液を用いる洗浄の後、溶出緩衝液を用いて前記カラムから溶出される。2017519838.tif 000003
2017519838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィーカラムに試料を負荷するステップ、
洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄するステップであって、前記洗浄緩衝液が、８０ｍＳ／ｃｍ以上の伝導度を有する、ステップ、及び
溶出緩衝液で前記カラムからタンパク質を溶出させるステップ
を含む、前記試料からの前記タンパク質の精製のための方法。
【請求項２】
前記洗浄緩衝液が、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、及びＣＨ３ＣＯＯＮａから成る群から選択される塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記洗浄緩衝液が、濃度約０．８Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶出緩衝液が、８０ｍＳ／ｃｍ以上の伝導度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記溶出緩衝液が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＮａＯＡｃから成る群から選択される塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶出緩衝液が、濃度約１ＭのＮａＣｌを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの洗浄するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第１の洗浄するステップが、２ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度を有する緩衝液で前記カラムを洗浄することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第３の洗浄するステップをさらに含み、前記第３の洗浄するステップが、２ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度を有する緩衝液で前記カラムを洗浄することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素がＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮａｓｅが組換えＤＮａｓｅである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素がＤＮａｓｅであり、かつ前記方法に使用される前記緩衝液がＣａＣｌ２を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法に使用される前記緩衝液が、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記クロマトグラフィーカラムが、イオン交換カラムまたは混合モードクロマトグラフィーカラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記混合モードカラムがマルチモーダル陰イオン交換体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記混合モードカラムがＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅカラムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料が細胞培養試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
負荷される前記試料のｐＨが５．０〜９．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
負荷される前記試料の前記ｐＨが６．０〜８．０である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
負荷される前記試料の前記ｐＨが約７．０である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
負荷される前記試料の前記ｐＨが、前記タンパク質のｐＩと同じかまたはそれよりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記洗浄緩衝液のｐＨが約５．０〜約９．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記洗浄緩衝液の前記ｐＨが約７．０である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶出緩衝液のｐＨが約５．０〜約９．０である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶出緩衝液の前記ｐＨが約７．０である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記クロマトグラフィーカラムに前記試料を負荷するステップの前に、前記試料に界面活性剤を添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記界面活性剤が、０．５％の最終濃度で前記試料に添加される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
界面活性剤を細胞培養試料に添加するステップ；
混合モードクロマトグラフィーカラムに前記試料を直接負荷するステップ；
第１の洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄するステップ；
第２の洗浄緩衝液で前記カラムを洗浄するステップ；及び
溶出緩衝液で前記カラムからＤＮａｓｅを溶出させるステップ
を含む、前記細胞培養試料からのＤＮａｓｅの精製のための方法。
【請求項３１】
前記第２の洗浄緩衝液及び前記溶出緩衝液が各々、８０ｍＳ／ｃｍ以上の伝導度を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の洗浄緩衝液が、０．８Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記溶出緩衝液が、１ＭのＮａＣｌを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
約８０ｍＳ／ｃｍ以上の伝導度を有する洗浄緩衝液及び約８０ｍＳ／ｃｍ以上の伝導度を有する溶出緩衝液を含む、キット。
【請求項３５】
前記洗浄緩衝液が、約０．８Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含み、かつ前記溶出緩衝液が、約１ＭのＮａＣｌを含む、請求項３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月２５日出願の米国特許仮出願第６２，０１７，１５３号明細書の優先権を主張し、その内容全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
研究的及び商業的使用に有用である、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などの酵素を含むタンパク質は、組換え手法を使用して産生されることができるか、またはタンパク質が天然に産生される細胞から精製されることができる。いずれの場合も、このようなタンパク質の精製は、使用に好適なタンパク質の生成において重要なステップである。ＤＮａｓｅ及びその他のタンパク質は、クロマトグラフィー法を使用して一般的に精製され、この方法は２種以上のクロマトグラフィーカラムの使用を伴う方法を含む。しかしながら、簡便で高純度及び高収率の両方を提供する、ＤＮａｓｅなどの酵素の精製方法に関して、当該技術分野には満たされていない要求が明らかに存在する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、試料からのタンパク質の精製のための方法を提供し、この方法はクロマトグラフィーカラムに試料を負荷するステップ、及び非常に高い伝導度を有する少なくとも１種の緩衝液でカラムを洗浄するステップを含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約５０ｍＳ／ｃｍ、約６０ｍＳ／ｃｍ、約７０ｍＳ／ｃｍ、約８０ｍＳ／ｃｍ、またはそれ以上の伝導度を有する。さらなる実施形態では、タンパク質は、非常に高い伝導度の緩衝液を用いる洗浄の後、溶出緩衝液を用いてカラムから溶出される。またさらなる実施形態では、溶出緩衝液も非常に高い伝導度を有する。よりさらなる実施形態では、溶出緩衝液は、約５０ｍＳ／ｃｍ、約６０ｍＳ／ｃｍ、約７０ｍＳ／ｃｍ、約８０ｍＳ／ｃｍ、またはそれ以上の伝導度を有する。
【０００４】
いくつかの実施形態では、非常に高い伝導度を有する洗浄緩衝液は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、及びＣＨ３ＣＯＯＮａから成る群から選択される塩を含む。さらなる実施形態では、洗浄緩衝液は、０．８Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＮａＯＡｃから成る群から選択される塩を含む。さらなる実施形態では、溶出緩衝液は、１ＭのＮａＣｌを含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも２つの洗浄するステップを含む。さらなる実施形態では、本方法は第１の洗浄するステップを含み、カラムは低い伝導度を有する緩衝液で洗浄される。さらなる実施形態では、低い伝導度を有する緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍまたは約１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。このような実施形態では、第２の洗浄するステップは、非常に高い伝導度の緩衝液でカラムを洗浄することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）低い伝導度を有する第１の緩衝液でカラムを洗浄するステップ；（ｉｉ）非常に高い伝導度を有する第２の緩衝液でカラムを洗浄するステップ；及び（ｉｉｉ）低い伝導度を有する第３の緩衝液でカラムを洗浄するステップを含む、３つの洗浄するステップを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第３の洗浄するステップは、同じ緩衝液を使用する。いくつかの実施形態では、緩衝液のうち１種以上がＣａＣｌ２を含む。さらなる実施形態では、緩衝液は、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質は、任意のタンパク質である。さらなる実施形態では、タンパク質は、細胞により産生される任意のタンパク質である。細胞はタンパク質を天然に産生してよいか、または細胞は関心対象のタンパク質を発現するように遺伝子改変されてよい。したがって、いくつかの実施形態では、試料は細胞培養物から採取されてカラムに負荷される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅなどの酵素である。特定の実施形態では、タンパク質は組換えＤＮａｓｅである。
【０００７】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、イオン交換カラム、例えば陰イオン交換カラムまたは陽イオン交換カラムなどである。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、混合モードクロマトグラフィーカラムであり、例えば混合モードクロマトグラフィーカラムは、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅカラムなどのマルチモーダル陰イオン交換体である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムに負荷される試料は、約５．０〜約９．０のｐＨ、または約６．０〜約８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、負荷される試料のｐＨは、約７．０である。いくつかの実施形態では、負荷される試料のｐＨは、試料中のタンパク質のｐＩとほぼ同じである。その他の実施形態では、負荷される試料のｐＨは、タンパク質のｐＩよりも高い。例えば、いくつかの実施形態では、ｐＨは約５．０〜約９．０であり、関心対象のタンパク質のｐＩは、約２．５〜約４．５である。特定の実施形態では、タンパク質はＤＮａｓｅであり、負荷される試料のｐＨは約５．０〜約９．０である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、高い伝導度の洗浄緩衝液、低い伝導度の洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液のｐＨは、約５．０〜約９．０である。さらなる実施形態では、高い伝導度の洗浄緩衝液、低い伝導度の洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液のｐＨは、約６．０〜約８．０である。さらなる実施形態では、高い伝導度の洗浄緩衝液、低い伝導度の洗浄緩衝液、及び／または溶出緩衝液のｐＨは、約７．０である。
【００１０】
一態様では、本開示は、試料からタンパク質を精製するための方法を提供し、この方法はクロマトグラフィーカラムに試料を負荷するステップの前の試料に対する界面活性剤を含む。界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びＮＰ４０から成る群から選択されてよい。いくつかの実施形態では、界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００であり、試料中の界面活性剤の最終濃度は、約０．１％〜約１％、または約０．５％である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、当該技術分野において既知の方法、例えばＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析などを使用してタンパク質の純度を評価するステップをさらに含む。
【００１２】
一態様では、本開示は、細胞培養試料からのＤＮａｓｅの精製のための方法を提供し、この方法は（ｉ）ＤＮａｓｅを発現する細胞から採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）を収集するステップ、（ｉｉ）界面活性剤をＨＣＣＦ試料に添加するステップ、（ｉｉｉ）混合モードクロマトグラフィーカラムに試料を負荷するステップ、（ｉｖ）１ｍＭのＣａＣｌ２を含む第１の洗浄緩衝液でカラムを洗浄するステップ、（ｖ）０．８Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４及び１ｍＭのＣａＣｌ２を含む第２の洗浄緩衝液でカラムを洗浄するステップ、ならびに（ｖｉ）１．０ＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＣａＣｌ２を含む溶出緩衝液で、カラムからＤＮａｓｅを溶出させるステップを含む。さらなる実施形態では、本方法は、ステップ（ｖ）と（ｖｉ）との間に、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む洗浄緩衝液でカラムを洗浄することを含む第３の洗浄するステップをさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、試薬の組み合わせまたはキットを提供する。いくつかの実施形態では、試薬の組み合わせまたはキットは、本明細書に記載されるような非常に高い伝導度の洗浄緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、試薬の組み合わせまたはキットは、本明細書に記載されるような非常に高い伝導度の洗浄緩衝液及び非常に高い伝導度の溶出緩衝液の両方を含む。さらなる実施形態では、試薬の組み合わせまたはキットは、約８０ｍＳ／ｃｍ以上の伝導度を有する洗浄緩衝液及び約８０ｍＳ／ｃｍ以上の伝導度を有する溶出緩衝液を含む。さらなる実施形態では、洗浄緩衝液は約０．８Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含み、かつ溶出緩衝液は約１ＭのＮａＣｌを含む。またさらなる実施形態では、洗浄緩衝液及び溶出緩衝液は各々、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＨＣＣＦ試料からのＤＮａｓｅの精製を示すクロマトグラムである。
【図２】ＤＮａｓｅ精製実験からの、様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーン１は、マーカーレーンである。レーン２は、非結合不純物（カラムに結合されない不純物）を示す。レーン３は、第２の洗浄によってカラムから洗い流された結合不純物を示す。レーン４は、溶出したＤＮａｓｅを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
一態様では、本開示は、試料からタンパク質を精製するクロマトグラフィー法を提供する。予想外にも、本発明者らは、高濃度の塩緩衝液を使用してクロマトグラフィーによりタンパク質を精製することができることを見出した。いくつかの実施形態では、本開示は、クロマトグラフィーカラムに試料を直接負荷することにより、タンパク質が試料から精製され得ることを提供する。さらなる実施形態では、負荷の後に、高濃度の塩緩衝液を使用した洗浄するステップ及び／または溶出ステップを行う。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、タンパク質を含有する試料の特性もしくは成分を大幅に改変する必要なく、及び／またはクロマトグラフィーカラムの最低限の調整で試料からのタンパク質の精製を有利に可能にする。例えば、本明細書で提供される方法は、負荷される試料の伝導度、ｐＨ、またはその他の特性を改変する必要なく、またタンパク質を含有する試料の限外濾過、透析濾過、または希釈の必要なく、試料からのタンパク質の精製を可能にする。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、非常に高い伝導度を有する１種以上の高濃度の塩緩衝液を使用したクロマトグラフィーによる、タンパク質の精製のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は少なくとも２つの洗浄するステップ、すなわち非結合不純物を除去する一方のステップ、結合不純物を除去する他方のステップを含む。さらなる実施形態では、本方法は、低い伝導度を有する高塩緩衝液を使用して非結合不純物を除去する第１の洗浄ステップ；非常に高い伝導度を有する高塩緩衝液を使用して、関心対象のタンパク質を溶出することなく結合不純物を除去する第２の洗浄ステップ；及びカラムから生成物を溶出させる、高い伝導度を有する高塩緩衝液を使用した溶出ステップを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、クロマトグラフィーによるタンパク質の精製のための方法を提供し、この方法はクロマトグラフィーカラムに直接タンパク質を含む試料を負荷するステップ、非常に高い伝導度を有する高塩緩衝液でカラムを洗浄するステップ、及び非常に高い伝導度を有する高塩緩衝液でカラムからタンパク質を溶出させるステップを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、単一のクロマトグラフィーステップを使用して高純度タンパク質を得る方法を提供する。
【００１８】
本明細書で提供される方法を使用して、細胞で天然に産生されるタンパク質及び組換え手法を使用して細胞で産生されるタンパク質を含む、任意のタンパク質を精製してよい。いくつかの実施形態では、タンパク質は酵素である。さらなる実施形態では、酵素はデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法に使用される緩衝液はＣａＣｌ２を含み、これはＤＮａｓｅ活性に不可欠である。その他の実施形態では、酵素はリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、タンパク質を含有する試料は、高い伝導度においてカラムに直接負荷される。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質を含有する試料は、約８ｍＳ／ｃｍ超、約９ｍＳ／ｃｍ超、約１０ｍＳ／ｃｍ超、約１１ｍＳ／ｃｍ超、約１２ｍＳ／ｃｍ超、約１３ｍＳ／ｃｍ超、約１４ｍＳ／ｃｍ超、約１５ｍＳ／ｃｍ超、約２０ｍＳ／ｃｍ超、または約２５ｍＳ／ｃｍ超の伝導度においてカラムに負荷される。いくつかの実施形態では、タンパク質を含有する試料は、約６ｍＳ／ｃｍ〜約２５ｍＳ／ｃｍまたは約８ｍＳ／ｃｍ〜約１５ｍＳ／ｃｍ、または約９．５ｍＳ／ｃｍ〜約１４．５ｍＳ／ｃｍ、または約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度においてカラムに負荷される。いくつかの実施形態では、タンパク質はカラムに結合し、多量の不純物はカラムに結合しない。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質はカラムに結合し、不純物の約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上の不純物がカラムに結合しない。
【００２０】
いくつかの実施形態では、負荷されるタンパク質のｐＨは、０〜１４．０である。いくつかの実施形態では、負荷されるタンパク質のｐＨは、約３．０〜１０．０である。いくつかの実施形態では、負荷されるタンパク質のｐＨは、約４．０〜９．０である。いくつかの実施形態では、負荷されるタンパク質のｐＨは、約５．０〜８．０である。いくつかの実施形態では、負荷されるタンパク質のｐＨは、約７．０である。その他の実施形態では、負荷されるタンパク質のｐＨは、約１．０、約２．０、約３．０、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、約１０．０、約１１．０、約１２．０、約１３．０、または約１４．０である。試料のｐＨは、当業者に周知の方法に従って試験及び負荷されてよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、タンパク質はＤＮａｓｅであり、負荷される試料のｐＨは約４．５〜１４．０である。さらなる実施形態では、タンパク質はＤＮａｓｅであり、負荷される試料のｐＨは約６．０〜８．０である。さらなる実施形態では、タンパク質はＤＮａｓｅであり、負荷される試料のｐＨは約７．０である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、カラムは、結合不純物を除去するために非常に高い伝導度の高塩洗浄緩衝液を使用して洗浄される。非常に高い伝導度の洗浄緩衝液中の塩は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、及びＣＨ３ＣＯＯＮａから選択されてよいが、これらに限定されない。特定の実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液は、約０．４Ｍ〜約１．５Ｍの濃度で（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。さらなる実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液は、約０．５Ｍ〜約１．２Ｍの濃度で（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。さらなる実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液は、約０．６Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。さらなる実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液は、約０．８Ｍの濃度で（ＮＨ４）２ＳＯ４をさらに含む。別の実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液は、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度でＣａＣｌ２をさらに含む。さらなる実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液は、約１ｍＭの濃度でＣａＣｌ２をさらに含む。いくつかの実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液は、０．８Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液による洗浄は、カラムから結合不純物を除去する。例えば、いくつかの実施形態では、洗浄は結合不純物の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を除去する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、非常に高い伝導度の高塩緩衝液（本明細書では溶出緩衝液と称する）を使用してカラムから溶出される。溶出緩衝液中の塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＮａＯＡｃから選択されてよいが、これらに限定されない。特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの濃度でＮａＣｌを含む。さらなる実施形態では、溶出緩衝液は、約０．７Ｍ〜約１．３Ｍの濃度でＮａＣｌを含む。さらなる実施形態では、溶出緩衝液は、約０．９Ｍ〜約１．１Ｍの濃度でＮａＣｌを含む。さらなる実施形態では、溶出緩衝液は、約１．０Ｍの濃度でＮａＣｌをさらに含む。別の実施形態では、溶出緩衝液は、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度でＣａＣｌ２をさらに含む。さらなる実施形態では、溶出緩衝液は、約１ｍＭの濃度でＣａＣｌ２をさらに含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、１．０ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２及び５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、関心対象の結合タンパク質の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を溶出する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液または溶出緩衝液のｐＨは、約５．０〜９．０である。さらなる実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液または溶出緩衝液のｐＨは、約６．０〜８．０である。さらなる実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液または溶出緩衝液のｐＨは、約７．０である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液及び溶出緩衝液は各々、約７０ｍＳ／ｃｍ超、約７５ｍＳ／ｃｍ超、約８０ｍＳ／ｃｍ超、約８５ｍＳ／ｃｍ超、約９０ｍＳ／ｃｍ超、約９５ｍＳ／ｃｍ超、または約１００ｍＳ／ｃｍ超の伝導度を有する。いくつかの実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液または溶出緩衝液の伝導度は、約２５ｍＳ／ｃｍ〜１００ｍＳ／ｃｍ、または約４０ｍＳ／ｃｍ〜１００ｍＳ／ｃｍ、または約５０ｍＳ／ｃｍ〜９０ｍＳ／ｃｍ、または約７０ｍＳ／ｃｍ〜９０ｍＳ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液または溶出緩衝液は、約７０ｍＳ／ｃｍ、約７５ｍＳ／ｃｍ、約８０ｍＳ／ｃｍ、約８５ｍＳ／ｃｍ、約９０ｍＳ／ｃｍ、約９５ｍＳ／ｃｍ、または約１００ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。
【００２８】
非常に高い伝導度の洗浄緩衝液または溶出緩衝液は、本明細書で例示される塩で得られる結果をもたらす任意の塩を含んでよい。例えば、限定されることなく、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、または同様の結果をもたらし得る任意の塩を含んでよい。特定の実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液は、（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。溶出緩衝液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＯＡｃ、または同様の結果をもたらす任意の塩を、これらに限定されることなく含んでよい。特定の実施形態では、溶出緩衝液はＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液または溶出緩衝液は、２種以上の塩を含む。当業者は、２つの緩衝液中の（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＮａＣｌの濃度、または（ＮＨ４）２ＳＯ４もしくはＮａＣｌと等価の塩の濃度は、ある程度まで変更され得るが、なお同様の結果をもたらすと理解するだろう。
【００２９】
いくつかの実施形態では、非常に高い伝導度の洗浄緩衝液と溶出緩衝液との間の伝導度における差異は小さい。例えば、いくつかの実施形態では、非常に高い濃度の塩緩衝液  ０．８Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を洗浄緩衝液として使用し、非常に高い濃度の塩緩衝液  １．０Ｍ  ＮａＣｌを溶出緩衝液として使用する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、１つ以上の追加の洗浄ステップをさらに含み、洗浄緩衝液は低い伝導度の緩衝液である。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は第１の洗浄ステップを含み、第１の洗浄緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍ未満、または約１ｍＳ／ｃｍ未満、または約０．５ｍＳ／ｃｍ未満の低い伝導度を有する。いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約５ｍＳ／ｃｍ、または約０．５ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍ、または約１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。いくつかの実施形態では、低い伝導度の洗浄緩衝液のｐＨは、負荷される試料のｐＨと同じである。いくつかの実施形態では、低い伝導度の洗浄緩衝液のｐＨは、約５．０〜約９．０、または約６．０〜約８．０、または約７．０である。いくつかの実施形態では、低い伝導度の洗浄緩衝液は、ＣａＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、任意の残存する非結合不純物を除去する。いくつかの実施形態では、本方法は、低い伝導度の緩衝液を使用した第１の洗浄ステップ；非常に高い伝導度の高塩濃度緩衝液を使用した第２の洗浄ステップ；及び低い伝導度の緩衝液を使用した第３の洗浄ステップを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本方法は以下のステップを含む：約７．０のｐＨで約９．５〜約１４ｍＳ／ｃｍの高い伝導度においてクロマトグラフィーカラムに直接試料を負荷するステップ；約７．０のｐＨで約１ｍＳ／ｃｍの低い伝導度を有する洗浄緩衝液でカラムを洗浄するステップ；約７．０のｐＨで約８０ｍＳ／ｃｍ以上の伝導度を有する非常に高い伝導度の緩衝液でカラムを洗浄するステップ；約７．０のｐＨで約１ｍＳ／ｃｍの低い伝導度を有する洗浄緩衝液でカラムを洗浄するステップ；及び約７．０のｐＨで約８０ｍＳ／ｃｍ以上の伝導度を有する非常に高い伝導度の緩衝液を使用して、カラムからタンパク質を溶出させるステップ。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、クロマトグラフィーカラムに試料を負荷するステップの前に、試料に界面活性剤を添加するステップを含む。界面活性剤は当該技術分野において既知であり、この界面活性剤としては、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テトラデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びＮＰ４０が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。理論に束縛されるものではないが、試料への界面活性剤の添加は、試料のウイルスを効果的に不活化する。当業者は、本明細書で提供される方法に従って、試料に添加する界面活性剤の適切な量を容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、試料中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最終濃度は、約０．０１％〜１０％、または約０．０５％〜５％、または約０．１％〜１％、または約０．５％である。
【００３３】
別段の規定がない限り、本明細書における全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは等価の任意の方法及び材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料は本明細書に記載される。
【００３４】
「約」という用語は、本明細書で使用する場合、「約」が修飾する対象のプラスマイナス１０パーセントを指す。本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「低い伝導度」という用語は約５ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度を指し；「高い伝導度」という用語は約５ｍＳ／ｃｍ〜約２５ｍＳ／ｃｍの伝導度を指し；「非常に高い伝導度」という用語は２５ｍＳ／ｃｍ超の伝導度、例えば少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、または少なくとも約８０ｍＳ／ｃｍの伝導度を指す。
【００３６】
本開示は、細胞培養物からタンパク質を精製するための方法を提供する。本明細書で使用する場合、「細胞株」または「細胞培養物」は、インビトロで成長または維持される細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞またはより上位の真核細胞を示す。タンパク質は細胞により天然に産生されてよいか、または組換え方法により産生されてよい。組換え方法としては、外因性ポリヌクレオチド、例えば組換えプラスミドまたはベクターなどの投与により、宿主細胞を遺伝子改変することが挙げられる。組換え方法は当該技術分野において周知であり、例えば（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）、及びその他の実験室用教科書に記載されている。
【００３７】
クロマトグラフィーの材料及び方法は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅ．Ｈｅｆｔｍａｎｎ，２００４）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、本開示において有用なクロマトグラフィー材料としては、混合モード（例えば、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、またはヒドロキシアパタイト）、イオン交換（すなわち、陽イオン交換、陰イオン交換）、親和性、疎水性相互作用、逆相、サイズ排除、及び吸着材料が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、アガロース、セルロース、シリカ、及びポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）（ＰＳＤＶＢ）を含む、多くの支持体も考慮する。カラムのサイズ（すなわち、直径及び長さ）は、いくつかの要因、例えば負荷される材料の体積、精製されるタンパク質の濃度、及び所望の分解能または純度などに依存するだろうこともまた、当業者は理解するであろう。
【００３８】
本明細書で提供される方法を使用して精製されるタンパク質の純度は、当該技術分野において既知の任意の方法によって測定されてよく、この方法としては還元もしくは非還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、キャピラリー電気泳動、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析、またはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
引用された全ての刊行物は、あらゆる目的のためにその内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書で述べられた刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書において、本発明は、先行発明によってこのような公開に先行する権利が付与されないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００４０】
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されてきたが、本発明はさらなる修正が可能であり、本出願は、一般に本発明の原理に従い、本発明が関連する技術分野において既知または通例の実施となるような、また以上に記載されている本質的な特徴に適用されてよいような、また添付の特許請求の範囲に従うような、本開示からのこのような逸脱を含む、本発明のあらゆる変化形態、用途、または改変を対象とすることを意図すると理解されるだろう。
【実施例】
【００４１】
実施例１．ＤＮａｓｅの精製
組換えＤＮａｓｅを、ＤＮａｓｅ遺伝子を発現する細胞培養物中で発現させた。
【００４２】
細胞培養物の上清を採取し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）に０．５％の最終濃度まで添加した。得られた試料は、本明細書に記載されているようなｐＨ及び伝導度を有した。このＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した試料を、混合モードイオン交換樹脂のＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅに負荷した。これらの条件下では、ＤＮａｓｅは樹脂に結合し、多量の不純物は樹脂に結合しなかった。負荷後、任意の残存する非結合不純物を、ｐＨ７．０で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に１ｍＭのＣａＣｌ２を含有する低い伝導度の緩衝液でカラムから洗浄した。結合不純物を、ｐＨ７．０で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に０．８Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２を含有する緩衝液で洗浄することによりカラムから除去した。これらの結合不純物の除去後、カラムをｐＨ７．０で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に１ｍＭのＣａＣｌ２を含有する低い伝導度の緩衝液で洗浄し、ＤＮａｓｅをｐＨ７．０で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中に１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２を含有する緩衝液で溶出させた。流速は１００ｃｍ／時であった。
【００４３】
本研究の結果を図１及び図２に示し、これらはＨＣＣＦから精製したＤＮａｓｅの超高純度を実証している。図１は、実験から得られるクロマトグラムを示す。図２は、各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。特に、図２のレーン４は、溶出ステップ後のＤＮａｓｅの超高純度を示す。
【００４４】
総合すると、本研究の結果は驚くべきことに、単一のクロマトグラフィーカラムを使用して、高い伝導度条件においてＤＮａｓｅ含有試料をカラムに直接負荷し、続いて非常に高い伝導度の洗浄、及び非常に高い伝導度の溶出緩衝液を使用した溶出を行い、ＤＮａｓｅを含有する試料を高度に精製することができる精製方法を示した。部分的には、混合モード樹脂に対する最適な負荷条件は、ｐＨが負荷ステップでのタンパク質の等電点（ｐＩ）をはるかに下回る条件であると予想していたので、結果は驚くべきものであった。しかしながら、本明細書で提供される方法では、負荷のｐＨ（本明細書で例示される方法では約７．０）は、ＤＮａｓｅのｐＩ（約４．０〜４．５）をはるかに上回った。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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