(57)【要約】  本発明は癌の予防法および治療法に関する。具体的には、抗癌免疫応答を誘発することが可能なタンパク質のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）またはそのペプチドフラグメント提供される。具体的には、本発明は、ＴＤＯもしくはそれに由来するペプチドまたはＴＤＯ特異的Ｔ細胞の癌治療への使用に関する。したがって、本発明は、癌治療としての任意選択で他の免疫療法と併用し得る抗癌ワクチンおよび養子移植するかワクチン接種によってｉｎ  ｖｉｖｏで誘導されるＴＤＯ特異的Ｔ細胞に関する。本明細書に提供される薬物を癌の化学療法と併用し得ることは本発明の一態様である。さらなる態様は、上記のものと同じ手段による感染症の予防法および治療法に関するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）以下のもの：
（ｉ）配列番号１のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）；
（ｉｉ）配列番号１のＴＤＯの連続するアミノ酸配列を含む、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント；
（ｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメントである、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のポリペプチドの機能的相同体であって、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、かつ／または最大３個のアミノ酸が置換されている以外は配列番号１の連続するアミノ酸配列と同一の配列からなる免疫原活性のあるポリペプチドである、機能的相同体；
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチド；
（ｖｉ）１）、２）、３）および４）のいずれかのポリペプチドをコードする核酸
のうちの１つまたは複数のものと、
ｂ）アジュバントと
を含む、薬物として使用するワクチン組成物。
【請求項２】
アミノ酸１４４、１５１、３２８および／または３４２のうちの１つまたは複数のものが別のアミノ酸に変異しているか欠失している配列番号１のＴＤＯの変異体あるいは免疫原活性のあるそのペプチドフラグメントを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記免疫原活性のあるペプチドフラグメントが、５〜５０個のアミノ酸の範囲の連続する配列からなる、請求項１〜２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記免疫原活性のあるペプチドフラグメントが、
ａ）配列番号１の８〜１１個のアミノ酸の範囲の連続する配列および／または
ｂ）配列番号１の１８〜３０個のアミノ酸の範囲の連続する配列または
ｃ）最大２個のアミノ酸が置換されているａ）もしくはｂ）の機能的相同体
である、請求項１〜３のいずれか記載のワクチン組成物。
【請求項５】
ＴＤＯの発現を特徴とする臨床病態が認められる個体に投与したとき、配列番号１のＴＤＯまたはそれと少なくとも７０％の配列同一性を有する機能的相同体を発現する癌および／または抗原提示細胞に対する免疫応答を誘発することが可能である、請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記個体に細胞性免疫応答を誘発することが可能である、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記個体に、ＴＤＯを発現する細胞を特異的に認識する細胞性免疫応答を誘発することが可能である、請求項１〜６のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記薬物が、癌の治療または予防のためのものである、請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記薬物が、感染症の治療または予防のためのものである、請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
以下の特徴：
ａ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる測定で、臨床病態が認められる個体のＰＢＬ集団に少なくともＰＢＬ  １０４個当たり１個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することが可能であり、かつ／または
ｂ）腫瘍組織でのエピトープペプチドに反応性のＣＴＬのｉｎ  ｓｉｔｕ検出が可能である、
ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＤＯ特異的Ｔ細胞の増殖を誘導することが可能である
のうちの少なくとも１つのものを有するＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドを含む、請求項１〜９のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
ＭＨＣクラスＩ分子によって拘束されるペプチドフラグメントを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
ＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるペプチドフラグメントを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
臨床病態が認められる個体のＰＢＬ集団に少なくともＰＢＬ  １０４個当たり１０個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することが可能なペプチドフラグメントを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
配列番号１のＴＤＯまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体が発現する臨床病態が認められる個体のＰＢＬ集団にＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することが可能なペプチドフラグメントを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記癌疾患が、腫瘤を形成する癌疾患である、請求項８および請求項１０〜１４のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドフラグメントが、最大５０個のアミノ酸残基、例えば最大４５個のアミノ酸残基、例えば最大４０個のアミノ酸残基など、例えば最大３５個のアミノ酸残基、例えば最大３０個のアミノ酸残基など、例えば最大２５個のアミノ酸残基、例えば２０〜２５個のアミノ酸残基などからなる、請求項１〜１５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドフラグメントが、最大２０個のアミノ酸残基、例えば最大１９個のアミノ酸残基、例えば最大１８個のアミノ酸残基など、例えば最大１７個のアミノ酸残基、例えば最大１６個のアミノ酸残基など、例えば最大１５個のアミノ酸残基、例えば最大１４個のアミノ酸残基など、例えば最大１３個のアミノ酸残基、例えば最大１２個のアミノ酸残基など、例えば最大１１個のアミノ酸残基、例えば８〜１０個のアミノ酸残基などからなる、請求項１〜１６のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドフラグメントが、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８および上記のもののいずれかの機能的相同体からなる群から選択され、前記機能的相同体が、最大３個のアミノ酸が置換されている以外は同一の配列のポリペプチドである、請求項１〜１７のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドフラグメントが配列番号６および／または配列番号９である、請求項１〜１８のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドフラグメントが配列番号１７および／または配列番号１８である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、配列番号１の連続するアミノ酸配列を含む最大１００個のアミノ酸、例えば最大８０個のアミノ酸など、例えば最大６０個のアミノ酸、例えば最大４０個のアミノ酸など、例えば最大３０個のアミノ酸のポリペプチドである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、配列番号１の連続するアミノ酸配列を含む最大２０個のアミノ酸、例えば最大１５個のアミノ酸のポリペプチドである、請求項１〜１６に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、配列番号１の最大１００個の連続するアミノ酸、例えば最大８０個の連続するアミノ酸など、例えば最大６０個の連続するアミノ酸、例えば最大４０個の連続するアミノ酸など、例えば最大３０個の連続するアミノ酸、例えば最大２０個の連続するアミノ酸など、例えば最大１５個の連続するアミノ酸のポリペプチドであって、ただし、最大３個のアミノ酸が置換されていてよいポリペプチドであり、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択される配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記連続するアミノ酸配列が、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１３および上記のもののうちのいずれかの機能的相同体からなる群より選択され、前記機能的相同体が、最大３個のアミノ酸が置換されている以外は同一の配列のポリペプチドである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
前記連続するアミノ酸配列が、配列番号１７、配列番号１８および上記のもののうちのいずれかの機能的相同体からなる群より選択され、前記機能的相同体が、最大３個のアミノ酸が置換されている以外は同一の配列のポリペプチドである、請求項２１に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
前記ワクチンが、ワクチン接種した個体に、ＴＤＯ発現癌細胞および／またはＴＤＯ発現抗原提示細胞に対する細胞毒性効果を有する調節Ｔ細胞の産生を誘発する、請求項１〜２５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
対象に臨床効果を誘発することが可能であり、前記臨床効果が、疾患の安定、部分奏効または完全寛解を特徴とする、請求項１〜２６のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
ＴＤＯではないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択される、免疫原活性のあるタンパク質またはペプチドフラグメントをさらに含む、請求項１〜２７のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
前記アジュバントが、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバントおよびイミダゾキニリン（ｉｍｉｄａｚｏｃｈｉｎｉｌｉｎｅ）からなる群より選択される、請求項１〜２８のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
前記アジュバントがＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡアジュバントである、請求項１〜２９のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
前記アジュバントがＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７２０である、請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
前記アジュバントがＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１である、請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
前記アジュバントがＧＭ−ＣＳＦである、請求項１〜２９のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
前記免疫原活性のあるペプチドフラグメントまたは前記免疫原活性のあるペプチドフラグメントをコードする核酸を含む抗原提示細胞を含む、請求項１〜３３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項３４に記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
前記核酸が、請求項２〜４および請求項１０〜２５のいずれかで定められるペプチドをコードする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
前記核酸がベクター内に含まれている、請求項１〜３６のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
前記ベクターが、ウイルスベクターおよび細菌ベクターからなる群より選択される、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
前記ベクターが、Ｔ細胞刺激性ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項３７または３８のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
ＴＤＯが発現する癌疾患の治療のためのものである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項４１】
ＡＰＣでのＴＤＯ発現を引き起こす炎症の治療のためのものである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項４２】
請求項１〜３９のいずれかに記載のワクチン組成物と、第二の有効成分とを含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項４３】
前記第二の有効成分が免疫刺激性組成物である、請求項４２に記載のワクチン組成物を含むキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項４４】
前記さらなる免疫刺激性組成物が、１つまたは複数のインターロイキンを含む、請求項４２または４３のいずれかに記載のキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項４５】
前記インターロイキンが、ＩＬ−２および／またはＩＬ−２１から選択される、請求項４２〜４４のいずれかに記載のキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項４６】
請求項１〜３９のいずれかに記載のワクチン組成物を含み、前記第二の有効成分が抗癌剤である、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項４７】
前記抗癌剤が化学療法剤である、請求項４６に記載のキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項４８】
前記化学療法剤が、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、レナリドマイド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、レブリミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンから選択される、請求項４６または４７のいずれかに記載のキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項４９】
請求項１〜３９のいずれかに記載のワクチン組成物を含み、前記第二の有効成分が抗生物質である、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項５０】
前記前記抗生物質が、アモキシシリン、ペニシリン、アシクロビルおよび／またはビダラビンから選択される、請求項４９に記載のワクチン組成物を含むキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項５１】
提供される組成物を同時に、または逐次的に投与する、請求項４２〜５０のいずれかに記載のキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）。
【請求項５２】
臨床病態が認められる個体のＴＤＯに反応性のＰＢＬまたは腫瘍組織中のＴ細胞の有無をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで診断するための組成物であって、請求項１〜４および請求項１０〜２５のいずれかで定められるペプチドフラグメントを含む、組成物。
【請求項５３】
臨床病態が認められる個体のＴＤＯに反応性のＰＢＬまたは腫瘍組織中のＴ細胞の有無をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで診断するための診断キットであって、請求項１〜４および請求項１０〜２５のいずれかで定められるペプチドフラグメントを含む、診断キット。
【請求項５４】
請求項１〜４および請求項１０〜２５のいずれかで定められるペプチドフラグメントと、クラスＩ  ＨＬＡ分子もしくはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントとの複合体。
【請求項５５】
単量体である、請求項５４に記載の複合体。
【請求項５６】
多量体である、請求項５４に記載の複合体。
【請求項５７】
臨床病態が認められる個体においてＴＤＯ反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法であって、腫瘍組織または血液試料と請求項５２に記載の複合体とを接触させることと、前記複合体と前記組織または前記血液細胞との結合を検出することとを含む、方法。
【請求項５８】
請求項１〜４および請求項１０〜２５のいずれかで定められるペプチドフラグメントと特異的に結合することが可能な分子。
【請求項５９】
抗体またはそのフラグメントである、請求項５８に記載の分子。
【請求項６０】
Ｔ細胞受容体である、請求項５８または５９のいずれかに記載の分子。
【請求項６１】
請求項５８〜６０に記載の分子の結合をブロックすることが可能な分子。
【請求項６２】
ＴＤＯの発現を特徴とする臨床病態を治療するか、これに罹患するリスクを低減する方法であって、前記臨床病態が認められる個体に有効量の請求項１〜３９のいずれかに記載の組成物、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の分子または請求項４２〜５１のいずれかに記載のキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）を投与することを含む、方法。
【請求項６３】
治療する前記臨床病態が、ＴＤＯが発現する癌疾患である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
さらなる癌治療と組み合わせる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記さらなる治療が、化学療法、放射線療法、免疫刺激物質での治療、遺伝子治療、抗体での治療および樹状細胞を用いる治療からなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
治療する前記臨床病態が、ＡＰＣでのＴＤＯ発現を引き起こす感染症である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記感染症に対するさらなる治療と組み合わせる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記さらなる治療が、化学療法、免疫刺激物質での治療、遺伝子治療、抗体での治療および樹状細胞を用いる治療からなる群より選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＴＤＯまたは前記免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントを、１個体あたり５０μｇ〜５００μｇの範囲、例えば８０μｇ〜３００μｇの範囲、例えば１００μｇ〜２５０μｇの範囲などの用量で投与し、前記個体が、好ましくはヒトである、請求項６２〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
臨床病態の治療または予防のための薬物の製造への請求項１〜３９のいずれかに記載のワクチン組成物、請求項４２〜５０のいずれか１項に記載のキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）または請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の分子の使用。
【請求項７１】
治療する疾患が、ＴＤＯが発現する癌疾患である、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
さらなる癌治療と組み合わせる、請求項７０または７１のいずれかに記載の使用。
【請求項７３】
前記さらなる治療が、化学療法、放射線療法、免疫刺激物質での治療、遺伝子治療、抗体での治療および樹状細胞を用いる治療からなる群より選択される、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
治療する前記臨床病態が、ＡＰＣでのＴＤＯ発現を引き起こす感染症である、請求項７０に記載の使用。
【請求項７５】
前記感染症に対するさらなる治療と組み合わせる、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
前記さらなる治療が、化学療法、免疫刺激物質での治療、遺伝子治療、抗体での治療および樹状細胞を用いる治療からなる群より選択される、請求項７４に記載の使用。
【請求項７７】
免疫感作をモニターする方法であって、
ａ）個体の血液試料を準備する段階と、
ｂ）配列番号１のＴＤＯもしくはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体、前記ＴＤＯもしくは前記その機能的相同体の連続する配列を含む免疫原活性のあるペプチドフラグメントまたは前記ＴＤＯもしくは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸を準備する段階と、
ｃ）前記血液試料が、前記タンパク質またはペプチドと特異的に結合する抗体またはＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうかを判定する段階と、
ｄ）それにより、前記個体に前記タンパク質またはペプチドに対する免疫応答が生じたかどうかを判定する段階と
を含む、方法。
【請求項７８】
前記ペプチドフラグメントが、請求項１〜４および請求項１０〜２５のいずれか１項で定められるペプチドフラグメントである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
癌および／または炎症などのＴＤＯの発現を原因とする臨床病態の治療または予防に使用する、配列番号１のＴＤＯもしくは最大３個のアミノ酸が置換されている以外は同一の配列のポリペプチドであるその機能的相同体の連続する配列を含む、免疫原活性のあるＴＤＯペプチドフラグメントまたは前記ＴＤＯペプチドフラグメントをコードする核酸。
【請求項８０】
請求項２〜４および請求項１０〜２５のいずれか１項で定められる通りである、請求項７９に記載のペプチドフラグメント。
【請求項８１】
癌の治療または予防に使用する、請求項７９および８０のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予防および治療の分野に関する。具体的には、抗癌免疫応答を誘発することが可能なタンパク質のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）またはそのペプチドフラグメントが提供される。具体的には、本発明は、ＴＤＯもしくはそれに由来するペプチドまたはＴＤＯ特異的Ｔ細胞の癌治療への使用に関する。したがって、本発明は、癌治療としての任意選択で他の免疫療法と併用し得る抗癌ワクチンおよび養子移植されるかワクチン接種によってｉｎ  ｖｉｖｏで誘導されるＴＤＯ特異的Ｔ細胞に関する。本明細書に提供される薬物を癌の化学療法と併用し得ることは本発明の一態様である。さらなる態様は、上記のものと同じ手段による感染症の予防法および治療法に関する。
【０００２】
このほか、癌および感染症の治療、診断および予後予測へのＴＤＯおよびその免疫原性ペプチドフラグメントの使用が提供される。
【背景技術】
【０００３】
免疫系は、種々の病原体に応答したときに自己免疫が起きないよう厳密に制御されている。感染細胞または形質転換細胞の破壊と自己寛容を同時に可能にするこのエナンチオスタシス（ｅｎａｎｔｉｏｓｔａｓｉｓ）は、複数のフィードバック機序によって監視されている。ところが、自己免疫を防止する機序の一部を癌が乗っ取り免疫逃避する。この免疫破壊の逃避は、必須栄養素の枯渇および免疫抑制性代謝産物の蓄積を含めた複数の機序に基づくものである。したがって、腫瘍微小環境内の代謝が変化することによって抗原特異的免疫応答が回避される。この点に関して、必須アミノ酸であるＬ−トリプトファンの代謝の異常が種々の癌で記載されている。注目すべきなのは、微生物の最適な増殖には高濃度の利用可能なトリプトファンを必要とするため、トリプトファンレベルの制御が病原体の侵入に対する宿主防御の重要な一部となっている点である。
【０００４】
Ｌ−（およびＤ−）トリプトファンからＮ−ホルミルキヌレニンへの分解は、ヘムジオキシゲナーゼのトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）およびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によって触媒される。ＴＤＯとＩＤＯに配列相同性はない。ＴＤＯとＩＤＯは、異なる機序によるものではあるが、ともにトリプトファン酸化の第一の律速段階を触媒してキヌレニンを生じさせる。さらに、ＩＤＯは、Ｉ型およびＩＩ型のインターフェロンなどの炎症性サイトカインによってアップレギュレートされることから、不均衡な免疫応答を制御する重要な対抗制御酵素の１つと考えられている。
【０００５】
免疫応答に対するトリプトファン代謝の影響は十分に確立されている。Ｔ細胞がセリン／トレオニン−プロテインキナーゼＧＣＮ２を介してトリプトファンのレベル低下を感知し、次いでこれが増殖抑制を引き起こす。さらに、トリプトファンの分解産物であるキヌレニンがアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）に結合し、ＡＨＲシグナル伝達が活性化されると、調節Ｔ細胞の形成が誘導される。
【０００６】
癌でのＴＤＯの機能についてはほとんど明らかにされていない。生理的条件下では、ＴＤＯはほぼ例外なく肝臓に多量に発現するほか、これより低レベルではあるが、脳にも発現する。最近、起源の異なる腫瘍、特にメラノーマ、膀胱癌、肝細胞癌および膠芽腫にＴＤＯが発現することが記載されている（Ｐｉｌｏｔｔｅら，２０１２）。種々の組織型の一連のヒト腫瘍細胞系１０４種類のうち、２０種類の腫瘍がＴＤＯのみを発現し、１７種類がＩＤＯのみを発現し、１６種類が両酵素を発現した（Ｐｉｌｏｔｔｅら，２０１２）。さらに、前臨床モデルでは、腫瘍によるＴＤＯ発現が免疫感作マウスによる拒絶を抑制した（Ｐｉｌｏｔｔｅら，２０１２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＴＤＯの発現およびＴＤＯが誘導すると思われる癌免疫抑制が癌治療の問題点の１つとなっている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
癌免疫抑制の問題は、新規なＴ細胞標的としてのＴＤＯと提供する本発明によって解決される。ＴＤＯの機能を抑制する代わりに、本発明は、ＴＤＯを発現する細胞を認識するＴＤＯ特異的Ｔ細胞を活性化することが可能なペプチドおよび組成物を提供する。
【０００９】
したがって、本発明は、ＴＤＯ発現癌細胞を直接標的とすることによって、またＴＤＯ発現癌細胞を殺滅することによって癌疾患を治療する材料および方法を提供する。このことは、Ｔ細胞がＴＤＯ発現細胞を認識できるようにすることによって実施される。興味深いことに、本発明は、ＴＤＯ発現細胞が他の免疫療法の所望の効果に拮抗するにも関わらず、ＴＤＯ発現細胞に対する細胞障害性免疫応を生じさせ得ることを開示する。
【００１０】
同様に、本発明は、通常、免疫応答を引き起こし得るその他の疾患、例えば感染症を治療する材料および方法を提供する。本発明の方法では、Ｔ細胞がＴＤＯ発現ＡＰＣ／ＤＣを殺滅できるようにする。
【００１１】
したがって、本発明は、癌細胞の免疫抑制酵素ＴＤＯの発現を利用し、このようなＴＤＯ発現細胞を標的とするものである。
【００１２】
興味深いことに、本発明は、ＴＤＯを特異的に認識するＴ細胞が健常な個体にみられることを明らかにする（のちの実施例１を参照されたい）。このことから、自己タンパク質ＴＤＯに対する寛容性が喪失することがわかる。本発明はこのＴＤＯに対する寛容性の喪失を利用するものであり、したがって、本発明の一態様は、驚くべきことに自己タンパク質ＴＤＯに対する免疫応答を生じさせる得るワクチン組成物を提供することである。
【００１３】
本発明は、
ａ）以下のもの：
（ｉ）配列番号１のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）；
（ｉｉ）配列番号１のＴＤＯの連続するアミノ酸配列を含む、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント；
（ｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメントである、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント；
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のポリペプチドの機能的相同体であって、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、かつ／または最大３個のアミノ酸が置換されている以外は配列番号１の連続するアミノ酸配列と同一の配列からなる免疫原活性のあるポリペプチドである、機能的相同体；
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチド；
（ｖｉ）１）、２）、３）および４）のいずれかのポリペプチドをコードする核酸
のうちの１つまたは複数のものと、
ｂ）アジュバントと
を含む、ワクチン組成物を提供する。
【００１４】
ワクチン組成物は、薬物として使用し得るほか、例えば、ＴＤＯが発現する癌疾患の治療またはＡＰＣでのＴＤＯ発現を引き起こす感染症の治療のためのものであり得る。
【００１５】
本発明はほかにも、ワクチン組成物と第二の有効成分とを含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）を提供する。
【００１６】
本発明はこのほか、臨床病態が認められる個体のＴＤＯに対して反応性のＰＢＬ中または腫瘍組織中にＴ細胞が存在するかどうかをｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで診断する組成物を提供し、この組成物は、ＴＤＯのペプチドフラグメント、例えば本明細書の「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」、「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」および「ＭＨＣ」の節にのちに記載するいずれかのＴＤＯのペプチドフラグメントを含む。
【００１７】
本発明はさらに、臨床病態が認められる個体のＴＤＯに対して反応性のＰＢＬ中または腫瘍組織中にＴ細胞が存在するかどうかをｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで診断する診断キットを提供し、このキットは、ＴＤＯのペプチドフラグメント、例えば本明細書の「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」、「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」および「ＭＨＣ」の節にのちに記載するいずれかのＴＤＯのペプチドフラグメントを含む。
【００１８】
本発明はほかにも、ＴＤＯのペプチドフラグメントとクラスＩ  ＨＬＡ分子もしくはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントとの複合体について記載する。前記ペプチドフラグメントは、例えば本明細書の「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」、「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」および「ＭＨＣ」の節にのちに記載するいずれかのＴＤＯのペプチドフラグメントであり得る。
【００１９】
本発明はさらに、臨床病態が認められる個体にＴＤＯ反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法を開示し、この方法は、腫瘍組織または血液試料と、上記のＴＤＯのペプチドフラグメントを含む複合体とを接触させることと、複合体と組織または血液細胞との結合を検出することとを含む。
【００２０】
本発明はほかにも、ＴＤＯのペプチドフラグメント、例えば本明細書の「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」、「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」および「ＭＨＣ」の節にのちに記載するいずれかのＴＤＯのペプチドフラグメントと特異的に結合することが可能な分子を開示する。
【００２１】
本発明はこのほか、ＴＤＯの発現を特徴とする臨床病態を治療する方法を提供し、この方法は、前記臨床病態が認められる個体に有効量の本発明のワクチン組成物、本発明のキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）、本発明の組成物および／または免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント、例えば本明細書の「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」、「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」および「ＭＨＣ」の節にのちに記載するいずれかのＴＤＯのペプチドフラグメントを投与することを含む。
【００２２】
本発明はほかにも、臨床病態、例えば癌および／または炎症の治療または予防のための薬物の製造への本発明のワクチン組成物の使用を提供する。
【００２３】
本発明はこのほか、免疫感作をモニターする方法を提供し、前記方法は、
ｃ）個体の血液試料を準備する段階と、
ｄ）配列番号１のＴＤＯもしくはそれと少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体、前記ＴＤＯもしくは前記その機能的相同体の連続する配列を含む免疫原活性のあるペプチドフラグメントまたは前記ＴＤＯもしくは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸を準備する段階と、
ｅ）前記血液試料が、タンパク質またはペプチドと特異的に結合する抗体またはＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうかを判定する段階と、
ｆ）それにより、前記個体に前記タンパク質またはペプチドに対する免疫応答が生じたかどうかを判定する段階と
を含む。
【００２４】
さらに、本発明は、癌および／または感染症などのＴＤＯの発現を原因とする臨床病態の治療または予防に使用する、配列番号１のＴＤＯもしくは最大３個のアミノ酸が置換されている以外は同一の配列のポリペプチドであるその機能的相同体の連続する配列を含む、免疫原活性のあるＴＤＯペプチドフラグメントまたは前記ＴＤＯペプチドフラグメントをコードする核酸を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＴＤＯに対する自然なＴ細胞応答を示す図である。（Ａ）ＴＤＯ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を検出するため、ＨＬＡ−Ａ２に拘束されることが予測されるＴ細胞エピトープを１５種類合成して、ＨＬＡ−Ａ２＋癌患者６例の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を検討した。ＰＢＭＣ試料を１週間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチドおよびＩＬ−２により１回刺激した後、関連するＴＤＯペプチドを加えたものまたは加えないものを３つ組でＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ用に５×１０５細胞／ウェルで播いた。ＰＢＭＣ  ５×１０５個当たりのＴＤＯ特異的ＩＦＮγ放出細胞数の平均値を計算した。癌患者１４例および健常ドナー１４例を対象にＴＤＯ１２３〜１３２（ＫＬＬＶＱＱＦＳＩＬ）に対するＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を検討した。Ｔ細胞をペプチドで１回刺激した後、ＴＤＯ１２３〜１３２（Ｂ）、ＴＤＯ２００〜２０８（Ｄ）、ＴＤＯ３０９〜３１７（Ｆ）、ＴＤＯ３６４〜３７２（Ｈ）または陰性対照ペプチド（ＨＩＶｐｏｌ４７６〜４８４（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ））を加えたものを３つ組でＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ用に３×１０５細胞／ウェルで播いた。ドットプロットは、バックグラウンドを減算した３つ組の陽性ウェルのスポットカウント数の平均値を示している。様々な癌患者または健常ドナーのＰＢＭＣを用いたＴＤＯ１２３〜１３２（Ｃ）、ＴＤＯ２００〜２０８（Ｅ）、ＴＤＯ３０９〜３１７（Ｇ）、ＴＤＯ３６４〜３７２（Ｉ）およびＨＩＶｐｏｌ４７６〜４８４に対するＥＬＩＳＰＯＴ実験の例である。
【図２】ＴＤＯ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す図である。ＴＤＯ特異的Ｔ細胞の四量体解析；四量体であるＨＬＡ−Ａ２／ＴＤＯ１２３〜１３２−ＰＥ、ＨＬＡ−Ａ２／ＴＤＯ１２３〜１３２−ＡＰＣを用いたフローサイトメトリー染色によって可視化した乳癌患者（ＢＣ１）のＰＢＭＣ中のＴＤＯ１２３〜１３２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）またはＴＤＯ３０９〜３１７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）の例。染色は、ｅｘ  ｖｉｖｏで直接実施したもの（左）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチド刺激した後に実施したもの（中央）およびＦＡＣＳによって分取し四量体陽性細胞を増殖した後に実施したもの（右）である。
【図３】ＴＤＯ特異的Ｔ細胞の細胞溶解能を示す図である。（Ａ）関連するＴＤＯ１２３〜１３２ペプチド（点）または無関係なＴＤＯペプチドＴＤＯ３０９〜３１７（四角）のいずれかでパルス標識したＴ２細胞をＴＤＯ１２３〜１３２特異的Ｔ細胞培養物によって溶解させ、５１Ｃｒ放出アッセイにより試験したもの。Ｘ軸はエフェクター：標的比を表す。（Ｂ）エフェクターと標的の比を変えてＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ細胞系のＦＭ−５５Ｍ１およびＦＭ−８６、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ２３１ならびにＡＭＬ細胞系ＵＫＥ−１をＴＤＯ１２３〜１３２特異的Ｔ細胞によって溶解させ、５１Ｃｒ放出によりアッセイした。さらに、陰性対照としてメラノーマ細胞系Ａ２０５８（ＨＬＡ−Ａ２陰性）を試験した。（Ｃ）関連するＴＤＯ３０９〜３１７ペプチド（四角）または無関係なＴＤＯペプチドＴＤＯ１２３〜１３２（点）のいずれかでパルス標識したＴ２細胞をＴＤＯ３０９〜３１７特異的Ｔ細胞培養によって溶解させ、５１Ｃｒ放出アッセイにより試験したもの。（Ｄ）エフェクターと標的の比を変えてＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ細胞系のＦＭ−５５Ｍ１およびＦＭ−８６、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ２３１ならびにＡＭＬ細胞系ＵＫＥ−１をＴＤＯ３０９〜３１７特異的Ｔ細胞によって溶解させ、５１Ｃｒ放出によりアッセイした。さらに、陰性対照としてメラノーマ細胞系Ａ２０５８（ＨＬＡ−Ａ２陰性）を試験した。
【図４】Ａ．ＴＤＯ  ｍＲＮＡまたはＭｏｃｋをトランスフェクトした自家樹状細胞およびペプチドのＴＤＯ１２３〜１３２またはＴＤＯ３０９〜３１７のみを添加した対照ウェルに対するＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す図である。Ｂ．ＴＤＯ１２３〜１３２、ＴＤＯ３０９〜３１７またはそれぞれに対応する長いペプチドのＴＤＯ１１８〜１３７およびＴＤＯ３０３〜３２２を負荷したＴ２細胞に対するＴＤＯ１２３〜１３２特異的ＩＬ２増殖Ｔ細胞培養物の細胞傷害性を示す図である。短いペプチドはアッセイ直前に添加し、長いペプチドは前夜に添加した。Ｘ軸はエフェクター：標的比を表す。
【図５】健常者および癌患者のＴＤＯに対する自然なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す図である。ＩＦＮγ（Ａ、Ｂ）、ＴＮＦα（Ｃ、Ｄ）、ＩＬ−１７（Ｅ、Ｆ）またはＩＬ−１０（Ｇ、Ｈ）ＥＬＩＳＰＯＴによりＴＤＯ１１８〜１３７（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）またはＴＤＯ３０３〜３２２（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）に対するＴ細胞応答を測定した。各患者について、３回反復実験で得られたＴＤＯ特異的細胞の平均数（バックグランド減算後）をＰＢＭＣ  ５×１０５個当たりの数値として計算した。健常者１９例（ＨＤ）、癌患者２１例（Ｐｔ）（ＭＭ患者２０例とＢＣ患者１例）のＰＢＭＣを解析した。マン・ホイットニーの検定によるｐ値（ｐ＜０，０５）のみを示している。
【図６】検討したメラノーマ患者の臨床経過を示す図である。（Ａ）ＴＤＯ３０３〜３２２特異的ＩＬ−１７放出Ｔ細胞が認められるメラノーマ患者（点線）およびＴＤＯ３０３〜３２２特異的ＩＬ−１７  Ｔ細胞が認められないメラノーマ患者（実線）の血液試料採取日から死亡日までと定められるＯＳのカプラン・マイヤー推定値。（Ｂ）ＴＤＯ３０３〜３２２特異的ＩＬ−１０放出Ｔ細胞が認められるメラノーマ患者（点線）およびＴＤＯ３０３〜３２２特異的ＩＬ−１０  Ｔ細胞が認められないメラノーマ患者（実線）の血液試料採取日から死亡日までと定められるＯＳのカプラン・マイヤー推定値。（Ｃ）ＴＤＯ３０３〜３２２特異的ＩＬ−１７放出Ｔ細胞が認められＩＬ−１０放出細胞が認められないメラノーマ患者（点線）およびＴＤＯ３０３〜３２２特異的ＩＬ−１０  Ｔ細胞が認められＩＬ−１７放出細胞が認められないメラノーマ患者（実線）の血液試料採取日から死亡日までと定められるＯＳのカプラン・マイヤー推定値。
【図７】ＥＬＩＳＰＯＴによって示された統計的に有意なＴＤＯ応答の例を示す図である。ノンパラメトリックな分布によらないリサンプリング（ＤＦＲ）法により抗原刺激ウェルと陰性対照の統計学的比較を可能にした。バーは、対照ペプチド（ＨＩＶｐｏｌ４６８〜４７６）（白）またはＴＤＯ由来ペプチド（黒）の（Ａ）ＴＤＯ１２３〜１３２、（Ｂ）ＴＤＯ２００〜２０８、（Ｃ）ＴＤＯ３０９〜３１７、（Ｄ）ＴＤＯ３６４〜３７２（黒）を加えたウェルの平均スポットカウント数を表す。エラーバーは標準偏差を表す。細胞数は３×１０５細胞／ウェルとした。
【図８】ＴＤＯ由来ペプチドに対する応答がｅｘ  ｖｉｖｏで直接検出することが可能であることを示す図である。様々な癌患者のＰＢＭＣにおけるＴＤＯ１２３〜１３２（黒）、ＴＤＯ２００〜２０８（濃灰色）およびＴＤＯ３０９〜３１７（薄灰色）に応答したｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ。実験はいずれも三重反復で実施した。細胞数は９*１０５細胞／ウェルとした。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明の主要な目的は、癌などの任意の増殖性障害の予防、同障害のリスクの低減または同障害の治療に薬物として使用する、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）もしくはその免疫学的に活性なポリペプチドフラグメント、それを含むポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含むワクチン組成物を提供することである。
【００２７】
定義
アジュバント：投与する免疫原性決定因子／抗原／核酸構築物との混合物の形で前記決定因子に対する免疫応答を増大させるか、別の方法で修正する任意の物質。
【００２８】
抗原：クローンとして分布する免疫受容体（Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体）と結合することができる任意の物質。通常、ペプチド、ポリペプチドまたは多量体ポリペプチドである。抗原は免疫応答を誘発することが可能であるのが好ましい。
【００２９】
ＡＰＣ：抗原提示細胞。ＡＰＣとは、その表面にＭＨＣと複合体を形成した外来抗原を提示する細胞のことである。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこの複合体を認識し得る。ＡＰＣは、プロフェッショナルＡＰＣ（樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞の３種類がある）または非プロフェッショナルＡＰＣ（ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合複合体タンパク質が恒常的に発現することはなく、ＩＦＮ−γなどの特定のサイトカインによって非プロフェッショナルＡＰＣが刺激されたときにのみ発現する）２種類に分類される。
【００３０】
追加免疫：２回目の接種または投与による追加免疫とは、ワクチンなどの免疫感作薬剤を追加で投与することであり、初回投与後に実施して、同じ薬剤を前回投与することによって誘発された免疫応答を維持するものである。
【００３１】
担体：抗原が結合する実体または化合物のことであり、免疫応答の誘導を補助する。
【００３２】
キメラタンパク質：遺伝子全体もしくはその一部または一連の（非）ランダム核酸を２つ以上同時にスプライシングすることによって作製したヌクレオチドがコードする、遺伝子操作されたタンパク質。
【００３３】
臨床病態：治療を必要とする病態のことであり、本明細書では、特にＴＤＯの発現を原因とする病態を指す。このような病態の例としては、癌などの増殖性障害および感染症が挙げられる。
【００３４】
補体：抗体の働きを「補完」するよう働く複雑な一連の血中タンパク質。補体は細菌を破壊し、炎症を生じさせ、免疫反応を調節する。
【００３５】
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔリンパ球。Ｔ細胞受容体とともにＣＤ８を発現し、したがってクラスＩ分子が提示する抗原に応答することができる、Ｔ細胞のサブグループ。
【００３６】
送達媒体：ヌクレオチド配列もしくはポリペプチドまたはその両方を少なくとも１つの媒質から別の媒質へ輸送することができる実体。
【００３７】
ＤＣ：樹状細胞。ＤＣ（１つまたは複数）は免疫細胞であり、哺乳動物の免疫系の一部を形成する。その主な機能は、抗原物質を処理し、それを表面上で免疫系の他の細胞に提示することであり、したがって抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する。
【００３８】
フラグメント：核酸またはポリペプチドの非完全長部分を表すのに用いられる。したがって、フラグメントそれ自体も、それぞれ核酸またはポリペプチドである。
【００３９】
機能的相同体：機能的相同体は、野生型のポリペプチドと少なくともある程度の配列同一性を示し、元の機能の少なくとも一側面を保持している任意のポリペプチドであり得る。本明細書では、ＴＤＯの機能的相同体とは、ＴＤＯと少なくともある程度の配列同一性を有し、ＴＤＯを発現する細胞に対する免疫応答を誘導する能力を有するポリペプチドのことである。免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントの機能的相同体とは、ＴＤＯのペプチドフラグメントと少なくともある程度の配列同一性を有し、ＴＤＯを発現する細胞に対する免疫応答を誘導する能力を有するペプチドのことである。
【００４０】
免疫原活性のあるペプチド：少なくとも１個体に投与した後に免疫応答を誘発することが可能なペプチド。
【００４１】
個体：一般に鳥類、哺乳類、魚類、両生類または爬虫類の任意の種または亜種のことであるが、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【００４２】
感染症：本明細書では、「感染症」という用語は、疾患を引き起こす因子の宿主生物体への侵入が関与する任意の種の臨床病態に関連する。具体的には、感染症は、個体への病原体の侵入が関与する臨床病態を指す。
【００４３】
単離：本明細書に開示される核酸、ポリペプチドおよび抗体に関連して使用されるものであり、「単離」は、天然の環境、通常、細胞環境の成分から同定され、分離および／または回収されたものを指す。本発明の核酸、ポリペプチドおよび抗体は単離されているものが好ましく、本発明のワクチンをはじめとする組成物は、単離された核酸、ポリペプチドまたは単離された抗体を含むのが好ましい。
【００４４】
ＭＨＣ：主要組織適合複合体のことであり、ＭＨＣの２つの主要なサブクラスとしてクラスＩとクラスＩＩが存在する。
【００４５】
核酸：遺伝情報を運搬するヌクレオチドの鎖または配列。本発明では、核酸は一般にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のことである。
【００４６】
核酸構築物：遺伝子操作された核酸の１つ。通常、複数のエレメント、例えば遺伝子またはそのフラグメント、ｃＤＮＡ、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡテール、リンカー、ポリリンカー、作動可能なリンカー、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、マーカー、停止コドン、その他の調節エレメント、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をはじめとするエレメントなどを含む。
【００４７】
作動可能なリンカー：核酸またはポリペプチドの生物学的プロセシングが確実に遂行されるように核酸構築物または（キメラ）ポリペプチドの２つの部分を結合させる一続きのヌクレオチドまたはアミノ酸残基。
【００４８】
病原体：疾患の特定の原因因子、特に宿主に疾患を引き起こし得るウイルス、細菌、プリオンまたは寄生虫などの生物学的因子のことであり、感染因子とも呼ばれる。
【００４９】
ＰＢＬ：末梢血細胞とは、赤血球、白血球および血小板からなる血液の細胞性成分のことであり、血液の循環プール内にみられ、リンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔離されることはない。
【００５０】
ＰＢＭＣ：末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とは、円形の核を有するリンパ球または単球などの血液細胞のことである。これらの血液細胞は、感染症と戦い侵入物に適応するのに極めて重要な免疫系の成分である。リンパ球集団はＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８陽性が約７５％）、Ｂ細胞およびＮＫ細胞（併せて約２５％）からなるものである。
【００５１】
ポリペプチド：配列を定める複数のアミノ酸残基がアミド結合によって共有結合したもの。この用語はオリゴペプチドおよびペプチドと同じように使用される。ポリペプチドという用語は、当該技術分野で公知の通り、化学反応または酵素触媒による反応によって導入される翻訳後修飾も包含する。この用語は、ポリペプチドの変異体またはフラグメントを指すことがある。
【００５２】
医薬担体：添加剤または安定剤とも呼ばれ、使用する用量および濃度で細胞または個体に曝露しても無毒である。医薬担体は多くの場合、ｐＨ緩衝水溶液である。医薬担体の例としては、リン酸、クエン酸をはじめとする有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含めた抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジなどン；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含めた単糖類、二糖類をはじめとする炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形態の対イオン；ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプルロニック（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００５３】
複数：少なくとも２つ。
【００５４】
増殖性障害：本明細書では、良性または悪性の任意の前腫瘍性または腫瘍性の疾患のことであり、この場合、「腫瘍性」は細胞の異常な増殖を指す。増殖性障害の非限定的な例には癌がある。
【００５５】
プロモーター：ＤＮＡ鎖の中にある結合部位の１つであり、ＲＮＡポリメラーゼがこれに結合して、近接する１つまたは複数の構造遺伝子によるメッセンジャーＲＮＡの転写が開始される。
【００５６】
シグナルペプチド：細胞内でのタンパク質の最終的な位置を決定する短いアミノ酸配列のことであり、局在化ペプチドとも呼ばれる。
【００５７】
界面活性剤：液体に溶かすとその液体の表面張力を低下させることが可能な表面活性剤。界面活性剤は、親水性の極性基と疎水性の非極性基とを含む化合物であり、多くの場合、脂肪鎖で構成されている。
【００５８】
ＴＤＯ：トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ。本明細書では、野生型ヒトＴＤＯが配列番号１で定められる。
【００５９】
ＴＤＯｘｘｘ〜ｙｙｙ：本明細書で使用されるこの命名法は、配列番号１のアミノ酸ｘｘｘ〜ｙｙｙからなるＴＤＯのポリペプチドフラグメントを指す。
【００６０】
Ｔｒｅｇ：調節Ｔ細胞／Ｔリンパ球。
【００６１】
治療：本明細書で使用される「治療」という用語は、治癒させる治療、改善する治療、疾患の症状を軽減する治療および／または疾患進行を遅らせる治療を指し得る。
【００６２】
ワクチン：個体、特に哺乳動物、好ましくはヒトに免疫応答を誘導することが可能な物質または組成物。本文中では免疫原性組成物とも呼ばれる。ある因子に対する免疫応答とは、生物体に記憶を誘導することにより、一次応答ではなく二次応答で前記因子に対処して、その宿主生物体に対する影響を軽減する体液性応答、抗体応答および／または細胞性応答のことである。前記因子は病原体であり得る。本発明においては、因子は癌細胞であるのが好ましい。本発明のワクチンは、臨床病態に遭遇するリスクを低減するための予防法および／または臨床病態を治療する治療薬として投与し得る。組成物は、抗原（１つまたは複数）、１つまたは複数の抗原をコードする核酸構築物、担体、アジュバントおよび医薬担体のうちの１つまたは複数のものを含み得る。
【００６３】
変異体：所与の基準核酸またはポリペプチドの「変異体」は、前記基準核酸またはポリペプチドとある程度の配列相同性／同一性を示すが、前記基準核酸またはポリペプチドと同一ではない核酸またはポリペプチドを指す。
【００６４】
ワクチン組成物
本発明の１つの態様は、以下のもの：
１）トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）であって、本明細書の「トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ」の節にのちに記載するいずれかのＴＤＯであり得るもの；
２）ＴＤＯの連続するアミノ酸配列を含む免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントであって、本明細書の「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」の節にのちに記載するいずれかのペプチドであり得るもの；
３）免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントであって、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメント、例えば「ＭＨＣ」の節に記載されるＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメントのいずれかなどであるもの；
４）１）、２）および３）のポリペプチドの機能的相同体；
５）１）、２）、３）および４）のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチドであって、本明細書の「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」の節にのちに記載するいずれかのポリペプチドであり得るもの；
６）１）、２）、３）および４）のいずれかのポリペプチドをコードする核酸
のうちの１つまたは複数のものを含むワクチン組成物を提供することである。
【００６５】
上記の１）〜４）に加えて、前記ワクチン組成物はほかにも、アジュバントであって、例えば本明細書の「アジュバント」の節にのちに記載するいずれかのアジュバントであり得るものを含むのが好ましい。
【００６６】
本発明のワクチンに含まれ得るＴＤＯのペプチドフラグメントは、例えば、本明細書の「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」および「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」の節にのちに記載するものである。本発明のワクチン組成物に使用し得る機能的相同体は、本明細書の「トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ」、「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」、「機能的相同体」および「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」の節にのちに記載するものである。
【００６７】
トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ
トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）は、Ｌ−トリプトファンからＮ−ホルミルキヌレニンへの分解に関与する酵素の１つである。トリプトファンの異化がトリプトファンを枯渇させ、これによりＴ細胞応答が抑制され、哺乳動物の妊娠、腫瘍抵抗性、慢性感染症、自己免疫およびアレルギー性炎症での免疫寛容を促進する。
【００６８】
具体的には、ＴＤＯは以下の反応：
Ｌ−トリプトファン＋Ｏ２＝Ｎ−ホルミル−Ｌ−キヌレニンを触媒することが可能な酵素となり得る。
【００６９】
本発明によるＴＤＯは任意の有用なＴＤＯであり得る。一般に、ＴＤＯは、本発明のワクチン組成物で治療することを意図する種と同じ種のＴＤＯであるのが好ましい。本発明の好ましい実施形態では、ワクチン組成物はヒトへの投与を意図するものであり、したがって、ＴＤＯはヒトＴＤＯであり得る。野生型ヒトＴＤＯのアミノ酸配列は、本明細書の配列番号１で示されるものである。
【００７０】
したがって、ＴＤＯは好ましくは、配列番号１のＴＤＯまたは配列番号１のＴＤＯと少なくとも７０％の配列同一性を有するその機能的相同体であり得、したがって、機能的相同体は好ましくは、配列番号１のヒトＴＤＯと少なくとも７５％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性などの少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも９１％の配列同一性などの少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９２％の配列同一性などの少なくとも９１％の配列同一性、例えば少なくとも９４％の配列同一性などの少なくとも９３％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性などの少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性などの少なくとも９７％の配列同一性、例えば９９％の配列同一性を有する。
【００７１】
ＴＤＯの機能的相同体および配列同一性を決定する方法については、のちに本明細書の「機能的相同体」の節でさらに詳細に記載する。
【００７２】
ＴＤＯは望ましくない活性を有する可能性があるため、本発明の一実施形態では、ワクチン組成物は、変異体ＴＤＯであって、上記の反応を触媒することができないものまたは上記の反応のみを触媒し、活性が最大でも配列番号１のＴＤＯの１０％であるものを含む。このような変異体ＴＤＯは、具体的には、アミノ酸１４４、１５１、３２８および／または３４２のうちの１つまたは複数のものが別のアミノ酸に変異しているか、欠失している配列番号１のＴＤＯであり得る。本発明においては、ＴＤＯの「機能的相同体」は、野生型ＴＤＯの触媒活性はもたないが、ＴＤＯを発現する細胞に対する免疫応答を誘導する能力を有する変異体ＴＤＯであり得る。
【００７３】
免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント
野生型ヒトＴＤＯ、すなわち、天然に存在する非変異型のタンパク質は配列番号１で示されるものである。本発明は、ＴＤＯ；ＴＤＯの免疫学的に活性なペプチドフラグメント；最大２個のアミノ酸が置換されているＴＤＯのペプチドフラグメント；および／または配列番号１との少なくとも７０％の配列同一性を含むＴＤＯの機能的相同体を含むワクチン組成物を包含する。ポリペプチドフラグメントという用語は、本明細書では、配列番号１から直接誘導するか、配列番号１と同一になるよう合成した任意の非完全長（配列番号１と比較して）の一続きのアミノ酸残基を定義するのに使用される。
【００７４】
機能的相同体は、野生型ヒトＴＤＯなどの野生型ＴＤＯと配列は異なっているが、依然として癌細胞およびＤＣなどのＴＤＯ発現細胞に対する免疫応答を誘導する可能である、完全長のＴＤＯまたはＴＤＯのフラグメントと定義され得る。上記の細胞に発現するＴＤＯは、野生型のＴＤＯまたは内因性に変異したＴＤＯ（先天性変異体または細胞分裂などの際に生じた変異など）であり得る。機能的相同体は、野生型ＴＤＯの変異型または選択的スプライスバリアントであり得る。別の態様では、ＴＤＯの機能的相同体は、本明細書でのちに記載するものと定義される。機能的相同体は、特に限定されないが、ｅｘ  ｖｉｖｏで導入された１つもしくは複数の変異ならびに／あるいは１つもしくは複数の配列欠失および／または付加を有する組換え型の完全長ＴＤＯまたはフラグメントＴＤＯであり得る。
【００７５】
したがって、特定の実施形態では、本発明の免疫原活性のあるペプチドフラグメントは、配列番号１で示されるＴＤＯまたはその機能的相同体の最大３００個のアミノ酸残基などの最大４００個のアミノ酸残基、例えば最大１００個のアミノ酸残基などの最大２００個のアミノ酸残基、例えば最大５０個のアミノ酸残基、例えば最大４０個のアミノ酸残基などの最大４５個のアミノ酸残基、例えば最大３０個のアミノ酸残基などの最大３５個のアミノ酸残基、例えば１８〜２５個の連続するアミノ酸などの最大２５個のアミノ酸残基からなり；機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されている、例えば最大１個のアミノ酸が置換されている以外は同一の配列のポリペプチドである。前記免疫原活性のあるペプチドフラグメントはこのほか、配列番号１で示されるＴＤＯの最大３００個のアミノ酸残基などの最大４００個のアミノ酸残基、例えば最大１００個のアミノ酸残基などの最大２００個のアミノ酸残基、例えば最大５０個のアミノ酸残基、例えば最大４０個のアミノ酸残基などの最大４５個のアミノ酸残基など、例えば最大３０個のアミノ酸残基などの最大３５個のアミノ酸残基、例えば１８〜２５個の連続するアミノ酸などの最大２５個のアミノ酸残基からなるものであり得、アミノ酸１４４、１５１、３２８および／または３４２のうちの１つまたは複数のものが別のアミノ酸に変異しているか、欠失している。
【００７６】
本発明の好ましい一実施形態では、免疫原活性のあるペプチドフラグメントは、配列番号１で示されるＴＤＯまたはその機能的相同体の１８〜２５個の範囲のアミノ酸、好ましくは２０個の連続するアミノ酸からなり；機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されているなど、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど以外は同一の配列のポリペプチドである。
【００７７】
したがって、また別の特定の実施形態では、本発明の免疫原活性のあるペプチドフラグメントは、配列番号１のＴＤＯまたは機能的相同体の最大２５個のアミノ酸残基、例えば最大２４個のアミノ酸残基など、例えば最大２３個のアミノ酸残基など、例えば最大２２個のアミノ酸残基など、例えば最大２１個のアミノ酸残基など、例えば最大２０個のアミノ酸残基など、例えば最大１９個のアミノ酸残基、例えば最大１８個のアミノ酸残基など、例えば最大１７個のアミノ酸残基、例えば最大１６個のアミノ酸残基など、例えば最大１５個のアミノ酸残基、例えば最大１４個のアミノ酸残基など、例えば最大１３個のアミノ酸残基、例えば最大１２個のアミノ酸残基など、例えば最大１１個のアミノ酸残基、例えば８〜１０個の連続するアミノ酸などからなり；機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されているなど、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど以外は同一の配列のポリペプチドである。
【００７８】
本発明の好ましい一実施形態では、免疫原活性のあるペプチドは、ＴＤＯの最大１０個の連続するアミノ酸基、配列番号１で示されるＴＤＯまたはその機能的相同体の例えば最大９個の連続するアミノ酸基など、例えば８個の連続するアミノ酸基など、例えば７個の連続するアミノ酸基などを含み；機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されているなど、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど以外は同一であるポリペプチドである。具体的には、免疫原活性のあるペプチドは、配列番号１のＴＤＯの１０個の連続するアミノ酸基からなるものであり得るか、免疫原活性のあるペプチドは、配列番号１のＴＤＯの９個の連続するアミノ酸基からなるものであり得る。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態では、免疫原活性のあるペプチドは、表１に挙げるペプチドまたはその機能的相同体からなる群より選択されるものであり得；機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されているなど、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど以外は同一の配列のポリペプチドである。
【００８０】
【表１】
2017533182.tif 000002
【００８１】
本発明の好ましい実施形態では、免疫原活性のあるペプチドは：
ａ）配列番号３（ＴＤＯ２００〜２０８）；
ｂ）配列番号６（ＴＤＯ１２３〜１３２）；
ｃ）配列番号９（ＴＤＯ３０９〜３１７）；
ｄ）配列番号１３（ＴＤＯ３６４〜３７２）；
ｅ）配列番号１７（ＴＤＯ１１８〜１３７）；
ｆ）配列番号１８（ＴＤＯ３０３〜３２２）；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のいずれかに記載のポリペプチドの機能的相同体
からなる群より選択され；機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されているなど、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど以外は同一の配列のポリペプチドである。
【００８２】
本発明のその他のペプチドは、配列番号１のＴＤＯまたは配列番号１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するその機能的相同体の４〜１２０個、好ましくは８〜１００個、より好ましくは１０〜７５個、さらにより好ましくは１２〜６０個、さらにより好ましくは１５〜４０個、例えば１８〜２５個の隣接するアミノ酸を含む（またはより好ましくは、これよりなる）ものである。
【００８３】
機能的相同体
ＴＤＯの機能的相同体またはその免疫原活性のあるフラグメントは、ＴＤＯ、特に配列番号１のＴＤＯと同じく免疫原活性があり、これと少なくともある程度の配列同一性を有する、ポリペプチドである。
【００８４】
短いポリペプチド、例えば１００個のアミノ酸よりも短いポリペプチドなど、例えば５０個のアミノ酸よりも短いポリペプチドなど、例えば２５個のアミノ酸よりも短いポリペプチドの場合、機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されているなど、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど以外は同一の配列の免疫原活性のあるポリペプチドであり得る。
【００８５】
あるいは、機能的相同体は、配列番号１のＴＤＯと少なくとも７０％の配列同一性を有する免疫原活性のあるポリペプチドであり得、したがって、機能的相同体は好ましくは、配列番号１のヒトＴＤＯと少なくとも７５％の配列同一性、例えば少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性など、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９１％の配列同一性など、例えば少なくとも９１％の配列同一性、例えば少なくとも９２％の配列同一性など、例えば少なくとも９３％の配列同一性、例えば少なくとも９４％の配列同一性など、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性など、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性など、例えば９９％の配列同一性を有する。
【００８６】
配列同一性は、多数の周知のアルゴリズムを用い、多数の異なるギャップペナルティを適用して計算することができる。配列同一性は、完全長の参照配列、完全長の配列番号１と比較して計算する。相同体の検索および配列同一性の計算には任意の配列アライメントツール、例えば特に限定されないが、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＬＡＬＩＧＮなどを用い得る。さらに、検索アルゴリズムとともに、任意のよく知られた置換行列、例えば特に限定されないが、ＰＡＭ行列、ＢＬＯＳＳＵＭ行列またはＰＳＳＭ行列などを適宜用い得る。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムでＰＳＳＭ（位置特異的スコア行列）を用い得る。さらに、ギャップ開始およびギャップ伸長に対し様々なペナルティを用いて配列アライメントを実施し得る。例えば、ギャップ開始ペナルティが５〜１２の範囲、ギャップ伸長ペナルティが１〜２の範囲のＢＬＡＳＴアルゴリズムを用い得る。
【００８７】
機能的相同体は、ヒトタンパク質には通常生じることがないユビキチン化、標識（例えば、放射性核種、種々の酵素などによるもの）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などの化学修飾またはオルニチンなどのアミノ酸の挿入（または化学合成による置換）による化学修飾をさらに含み得るが、機能的等価物は化学修飾を含まないのが好ましい。
【００８８】
配列番号１のＴＤＯの配列に対して何らかのアミノ酸残基の配列の改変を施すのであれば、保存的置換が好ましい。当業者には、あるアミノ酸を１つまたは複数の化学的特性および／または物理的特性を共通にもつ別のアミノ酸で置換する「保存的」アミノ酸置換を実施し評価する方法が公知である。保存的アミノ酸置換であれば、タンパク質の機能性に影響を及ぼす可能性が低くなる。アミノ酸は、共通する特性によって分類され得る。保存的アミノ酸置換は、所定のアミノ酸のグループ内のあるアミノ酸を同じグループ内の別のアミノ酸で置換することであり、所定のグループ内のアミノ酸は同じ特性または実質的に同じ特性を示す。
【００８９】
したがって、本発明の一実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号１のＴＤＯの８〜５０個のアミノ酸の範囲、好ましくは８〜１０個のアミノ酸または２０〜２５個のアミノ酸の範囲の連続する配列からなるポリペプチドを含み、ここでは、最大３個のアミノ酸が置換されており、置換は保存的であるのが好ましい。
【００９０】
ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド
本発明にはほかにも、本発明のワクチン組成物がＴＤＯまたはそのフラグメントのいずれかを含むポリペプチドを含み得ることが含まれる。したがって、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントは、例えば、本明細書のこの節に記載されるＴＤＯフラグメントを含むポリペプチドのうちのいずれかであり得る。
【００９１】
具体的には、このようなポリペプチドは、完全長のＴＤＯ、例えば本明細書の「トリプトファン２，３−でオキシゲナーゼ」の節で上に記載したいずれかのＴＤＯなどを含み得る。例えば、ポリペプチドは、配列番号１のＴＤＯまたはそれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％など、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性などを有するその機能的相同体を含み得る。具体的には、このようなポリペプチドは、配列番号１のＴＤＯに加えて、最大１００個、例えば最大５０個など、例えば最大２５個、例えば最大１０個などのアミノ酸を含み得る。
【００９２】
本発明にはこのほか、ワクチン組成物がＴＤＯのフラグメント、例えば本明細書の「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」で上に記載したいずれかのフラグメントなどを含むポリペプチドを含み得ることが含まれる。前記ポリペプチドはこのほか、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメント、例えば「ＭＨＣ」の節に記載するいずれかのＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメントなどである、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントのいずれかを含み得る。
【００９３】
したがって、前記ポリペプチドは、配列番号１の連続するアミノ酸配列を含む最大４００個のアミノ酸、例えば最大３００個のアミノ酸など、例えば最大２００個のアミノ酸、例えば最大１００個のアミノ酸など、例えば最大５０個のアミノ酸のポリペプチドであり得、配列番号１の連続するアミノ酸配列は、配列番号１のＴＤＯまたはその機能的相同体の最大５０個のアミノ酸残基、例えば最大４５個のアミノ酸残基、例えば最大４０個のアミノ酸残基など、例えば最大３５個のアミノ酸残基、例えば最大３０個のアミノ酸残基など、例えば最大２５個のアミノ酸残基、例えば１８〜２５個の範囲など、例えば８〜１０個の範囲などの連続するアミノ酸からなる。
【００９４】
具体的には、前記ポリペプチドは、配列番号１の連続するアミノ酸配列を含む最大１００個のアミノ酸、例えば最大８０個のアミノ酸など、例えば最大６０個のアミノ酸、例えば最大４０個のアミノ酸など、例えば最大３０個のアミノ酸のポリペプチドであり得、前記配列番号１の連続するアミノ酸配列は、配列番号１のＴＤＯまたはその機能的相同体の１８〜２５個の範囲、例えば２０個の連続するアミノ酸からなる。したがって、前記ポリペプチドは：
ａ）配列番号３（ＴＤＯ２００〜２０８）；
ｂ）配列番号６（ＴＤＯ１２３〜１３２）；
ｃ）配列番号９（ＴＤＯ３０９〜３１７）；
ｄ）配列番号１３（ＴＤＯ３６４〜３７２）；
ｅ）配列番号１７（ＴＤＯ１１８〜１３７）；
ｆ）配列番号１８（ＴＤＯ３０３〜３２２）；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のいずれかに記載のポリペプチドの機能的相同体
からなる群より選択される免疫原活性のあるペプチドを含む最大１００個のアミノ酸、例えば最大８０個のアミノ酸、例えば最大６０個のアミノ酸、例えば最大４０個のアミノ酸など、例えば最大３０個のアミノ酸のポリペプチドであり得；機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されているなど、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど以外は同一の配列のポリペプチドである。
【００９５】
一実施形態では、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントは、配列番号１のＴＤＯまたはその機能的相同体の最大４００個のアミノ酸の連続する配列（例えば最大３００個の連続するアミノ酸など）、例えば最大２００個の連続するアミノ酸（例えば最大１００個の連続するアミノ酸など）、例えば最大５０個の連続するアミノ酸、例えば最大４５個の連続するアミノ酸残基（例えば最大４０個の連続するアミノ酸残基など）、例えば最大３５個の連続するアミノ酸残基（例えば最大３０個の連続するアミノ酸残基など）、例えば最大２５個の連続するアミノ酸残基（例えば１８〜２５個の範囲、８〜１０個の範囲など連続するアミノ酸など）を含むか、これよりなるポリペプチドであり得、例えば最大２個のアミノ酸が置換されている、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど、最大３個のアミノ酸が置換されており、前記ＴＤＯのペプチドフラグメントは：
ａ）配列番号３（ＴＤＯ２００〜２０８）；
ｂ）配列番号６（ＴＤＯ１２３〜１３２）；
ｃ）配列番号９（ＴＤＯ３０９〜３１７）；
ｄ）配列番号１３（ＴＤＯ３６４〜３７２）；
ｅ）配列番号１７（ＴＤＯ１１８〜１３７）；
ｆ）配列番号１８（ＴＤＯ３０３〜３２２）；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のいずれかに記載のポリペプチドの機能的相同体
からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含み；機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されているなど、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど以外は同一の配列のポリペプチドである。
【００９６】
前記ポリペプチドはこのほか、配列番号１の連続するアミノ酸配列を含む最大１００個のアミノ酸、例えば最大５０個のアミノ酸など、例えば最大３０個のアミノ酸、例えば最大２０個のアミノ酸など、例えば最大１５個のアミノ酸のポリペプチドであり得、前記配列番号１の連続するアミノ酸配列は、配列番号１のＴＤＯまたはその機能的相同体の８〜１０個の範囲、例えば９〜１０個の連続するアミノ酸からなる。したがって、前記ポリペプチドは：
ａ）配列番号３（ＴＤＯ２００〜２０８）；
ｂ）配列番号６（ＴＤＯ１２３〜１３２）；
ｃ）配列番号９（ＴＤＯ３０９〜３１７）；
ｄ）配列番号１３（ＴＤＯ３６４〜３７２）；および
ｅ）ａ）〜ｄ）のいずれかに記載のポリペプチドの機能的相同体
からなる群より選択される免疫原活性のあるペプチドを含む最大１００個のアミノ酸、例えば最大５０個のアミノ酸など、例えば最大３０個のアミノ酸、例えば最大２０個のアミノ酸など、例えば最大１５個のアミノ酸のポリペプチドであり得：機能的相同体は、最大３個のアミノ酸が置換されている、例えば最大２個のアミノ酸が置換されているなど、例えば最大１個のアミノ酸が置換されているなど以外は同一の配列のポリペプチドである。
【００９７】
ＭＨＣ
本発明には、ＴＤＯの免疫原活性のあるペプチドフラグメントがＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメント、例えばこの節に記載するいずれかのＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメントなどであり得ることが含まれる。
【００９８】
ＭＨＣ分子にはＭＨＣクラスＩ分子とＭＨＣクラスＩＩ分子の２種類がある。ＭＨＣクラスＩ分子は、適応免疫応答の主要なエフェクター細胞であるＣＤ８  Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は主として抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現し、ＡＰＣのうち最も重要なのは樹状細胞であると思われる。ＡＰＣはナイーブＴ細胞のほかにも、免疫系の他の細胞も刺激する。ＡＰＣはＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞の両方を刺激する。
【００９９】
一実施形態では、本発明は、免疫原活性のあるＴＤＯペプチド（任意選択で、これよりも大きいペプチドおよび／またはワクチン組成物に含まれる）であって、配列番号１のＴＤＯまたはその機能的相同体の８〜１０個の連続するアミノ酸からなるＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントであり、配列番号１のうち最大２個のアミノ酸が置換されている、免疫原活性のあるＴＤＯペプチドを提供し、このペプチドは、いくつかの特徴のうちの少なくとも１つを有することを特徴とし、そのうちの１つは、それが拘束されているクラスＩ  ＨＬＡ分子と、クラスＩ  ＨＬＡ分子の最大値の半分を回収することが可能なペプチドの量（Ｃ５０値）によって測定されるある親和性で結合することができることであり、その親和性は、本明細書に記載されるアセンブリ結合アッセイによって求めると最大５０μＭとなる。このアセンブリアッセイは、ペプチド輸送体欠損細胞系Ｔ２にペプチドを負荷した後のＨＬＡ分子の安定化に基づくものである。次いで、立体構造依存型抗体を用いて、正確に折り畳まれた安定なＨＬＡ重鎖を免疫沈降させ、ペプチドの結合を定量化する。この実施形態のペプチドは、配列番号１のＴＤＯまたは配列番号１のうち最大２個のアミノ酸が置換されているその機能的相同体の最大２００個、好ましくは最大１００個、より好ましくは最大５０個、さらにより好ましくは最大２５個、さらにより好ましくは最大２０個、さらにより好ましくは最大１５個、例えば最大１０個など、例えば８〜１０の範囲の連続するアミノ酸を含む（またはより好ましくは、これよりなる）ものである。
【０１００】
このアッセイは、候補ペプチドが所与のＨＬＡ対立遺伝子分子と上記の親和性で結合する能力をスクリーニングする簡便な手段となる。好ましい実施形態では、本発明のペプチドフラグメントは、最大３０μＭ、例えば最大１０μＭ、最大５μＭおよび最大２μＭのＣ５０値を含めた最大２０μＭであるＣ５０値などのＣ５０値を有するものである。
【０１０１】
別の好ましい実施形態では、配列番号１のＴＤＯまたはその機能的相同体の新規なＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメントであって、配列番号１のうち最大２個のアミノ酸が置換されているペプチドフラグメント（本明細書では「ペプチド」とも呼ばれる）が提供され、このペプチドは、本明細書でのちに記載するいくつかの特徴のうち少なくとも１つ有することを特徴とする。この実施形態のペプチドは、配列番号１のＴＤＯまたはその機能的相同体の４〜１２０個、好ましくは８〜１００個、より好ましくは１０〜７５個、さらにより好ましくは１２〜６０個、さらにより好ましくは１５〜４０個、例えば１８〜２５個の連続するアミノ酸を含む（またはより好ましくは、これよりなる）ものであり、配列番号１のうち最大２個、好ましくは最大１個のアミノ酸が置換されている。
【０１０２】
したがって、配列番号１のＴＤＯまたはその機能的相同体の８〜１０個のアミノ酸の新規なＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたは配列番号１のＴＤＯまたはその機能的相同体の１８〜２５個のアミノ酸の新規なＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメントであって、配列番号１のうち最大２個のアミノ酸が置換されており、本明細書でのちに記載するいくつかの特徴のうち少なくとも１つを有することを特徴とし、その１つが、それが拘束されているクラスＩ  ＨＬＡ分子またはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子と結合することができることである、ペプチドフラグメントが提供される。
【０１０３】
特定の実施形態では、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有するＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドであるペプチドフラグメントが提供される：
（ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる測定で、少なくとも１例の癌患者のＰＢＬ集団に少なくともＰＢＬ  １０４個当たり１個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することが可能であり、かつ／または
（ｉｉ）腫瘍組織でのエピトープペプチドに反応性のＣＴＬのｉｎ  ｓｉｔｕ検出が可能である。
（ｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＤＯ特異的Ｔ細胞の増殖を誘導することが可能である。  
【０１０４】
本発明によるより好ましいペプチドは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、例えば本明細書の実施例１にのちに記載するＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定される特異的Ｔ細胞応答を生じさせることが可能なペプチドである。一部のペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩと高い親和性で結合することはないが、依然としてＥＬＩＳＰＯＴによって測定されるＴ細胞応答を生じさせ得る。ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩと高い親和性で結合することが可能なその他のペプチドも、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定されるＴ細胞応答を生じさせる。両種類のペプチドはともに本発明による好ましいペプチドである。
【０１０５】
したがって、本発明による好ましいペプチドは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定される特異的Ｔ細胞応答を生じさせることが可能なペプチドであり、ここでは、細胞１０８個当たり、より好ましくは細胞１０７個当たり、さらにより好ましくは細胞１０６個当たり、さらにより好ましくは細胞１０５個当たり、例えば細胞１０４個当たり５０個超のペプチド特異的スポットが測定される。
【０１０６】
本発明による最も好ましいペプチドは、ＴＤＯの発現を特徴とする臨床病態が認められる個体に細胞性免疫応答を誘発することが可能なペプチドであり、臨床病態は、好ましくは癌または感染症であり、最も好ましくは癌である。
【０１０７】
本発明による好ましいペプチドは、ＴＤＯを発現する細胞に対する特異的細胞性免疫応答を誘発することが可能である。したがって、ペプチドは好ましくは、ＴＤＯを発現する細胞を認識するＴＤＯ特異的Ｔ細胞を活性化することができる。
【０１０８】
上記のように、ＨＬＡ系はヒト主要組織適合性（ＭＨＣ）系である。ＭＨＣ系は一般に、移植抗原、胸腺依存性免疫応答、特定の補体因子および特定の疾患の素因といった様々な特徴を制御している。より具体的には、ＭＨＣは３種類の異なる分子、すなわち、ＭＨＣのより全般的な特徴を決定するクラスＩ分子、クラスＩＩ分子およびクラスＩＩＩ分子をコードする。これらの分子のうち、クラスＩ分子はいわゆるＨＬＡ−Ａ分子、ＨＬＡ−Ｂ分子およびＨＬＡ−Ｃ分子のことであり、大部分の有核細胞および血小板の表面に提示される。
【０１０９】
本発明のペプチドは、特定のＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ分子と結合することができる（同分子に拘束される）ことを特徴とする。したがって、一実施形態では、ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ９、ＨＬＡ−Ａ１０、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａｗ１９、ＨＬＡ−Ａ２３（９）、ＨＬＡ−Ａ２４（９）、ＨＬＡ−Ａ２５（１０）、ＨＬＡ−Ａ２６（１０）、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３０（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３１（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３２（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３３（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３４（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ３６、ＨＬＡ−Ａｗ４３、ＨＬＡ−Ａｗ６６（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ６８（２８）、ＨＬＡ−Ａ６９（２８）を含めたＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ分子によって拘束されるものである。本明細書全体を通して、より簡潔な名称も使用され、この場合、主要な数字表示のみが使用され、例えば、ＨＬＡ−Ａｗ１９およびＨＬＡ−Ａ２４（４９）の代わりにそれぞれＨＬＡ−Ａ１９またはＨＬＡ−Ａ２４が使用される。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ種に拘束される。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ種のＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ３に拘束される。
【０１１０】
さらなる有用な実施形態では、本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１２、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ１６、ＨＬＡ−Ｂ１７、ＨＬＡ−Ｂ１８、ＨＬＡ−Ｂ２１、ＨＬＡ−Ｂｗ２２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂｗ４１、ＨＬＡ−Ｂｗ４２、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂｗ４６およびＨＬＡ−Ｂｗ４７のうちのいずれかを含めたＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ分子に拘束されるペプチドである。本発明の特定の実施形態では、本発明のペプチドが結合することが可能なＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ種は、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７およびＨＬＡ−Ｂ５１から選択されるものである。
【０１１１】
さらなる有用な実施形態では、本発明のペプチドは、特に限定されないが、ＨＬＡ−Ｃｗ１、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ４、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７およびＨＬＡ−Ｃｗ１のうちのいずれかを含めたＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｃ分子に拘束されるペプチドである。
【０１１２】
さらなる有用な実施形態では、本発明のペプチドは、特に限定されないが、ＨＬＡ−ＤＰＡ−１、ＨＬＡ−ＤＰＢ−１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢおよびこれらのグループの全対立遺伝子ならびにＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯのうちのいずれかを含めたＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ分子に拘束されるペプチドである。
【０１１３】
特定のＨＬＡ分子との結合能を有する可能性のあるペプチドの選択は、所与の特定のＨＬＡ分子と結合する既知の配列のアライメントにより、ペプチド内の特定の位置での少数の関連アミノ酸の優勢度を明らかにすることによって実施することができる。このような優勢なアミノ酸残基は「アンカー残基」または「アンカー残基モチーフ」とも呼ばれる。アクセス可能なデータベースにみることができる既知の配列データに基づくこのような比較的簡単な方法によって、特定のＨＬＡ分子と結合する可能性のあるペプチドをＴＤＯから導くことができる。様々なＨＬＡ分子に関するこのような分析の代表的な例を下の表に挙げる：
【表２】
2017533182.tif 000003
2017533182.tif 000004
【０１１４】
したがって、一例として、ＨＬＡ−Ａ３との結合能を有する可能性のあるノナペプチドは、以下の配列：Ｘａａ−Ｌ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｋ、Ｘａａ−Ｌ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｙ；Ｘａａ−Ｌ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＦまたはＸａａ−Ｖ−Ｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｋ（Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す）のうちの１つを有し得る。同様にして、任意の他のＨＬＡ分子との結合能を有する可能性のある配列を設計することができる。当業者であれば所与のＨＬＡ分子に対するさらなる「アンカー残基モチーフ」を特定することが可能であることが理解されよう。
【０１１５】
本発明のペプチドは、由来するＴＤＯの天然の配列である配列を有し得る。しかし、例えば上記の手順に基づいて、所与のＨＬＡ分子に関するアンカー残基モチーフを特定し、少なくとも１つのアミノ酸残基を置換、欠失または付加させて配列を修正することによって、任意の所与のＨＬＡ分子に対してより高い親和性を有するペプチドをそのような天然の配列から導き得る。
【０１１６】
したがって、有用な実施形態では、本発明のポリペプチドは、表に挙げた特定のＨＬＡ対立遺伝子それぞれに対して、表に示したいずれかのアミノ酸残基を配列中に含むペプチドを含む。
【０１１７】
したがって、本発明のペプチドは、ＴＤＯ由来の連続する配列を含み、ペプチドが、好ましくは上の表に示した所与のＨＬＡ−Ａ特異的ペプチドのアンカー残基のうちの１つまたは複数、好ましくはすべてを含むように、１〜１０個の範囲、好ましくは１〜５個の範囲、より好ましくは１〜３個の範囲、さらにより好ましくは１〜２個の範囲、さらにより好ましくは１個のアミノ酸が別のアミノ酸に置き換わっている、上記のいずれかのペプチドであり得る。
【０１１８】
本発明の好ましいペプチドが拘束される好ましいＨＬＡ種の例としては、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ種が挙げられ、より好ましくは、ペプチドはＨＬＡ−Ａ３またはＨＬＡ−Ａ２に拘束される。あるいは、好ましいＨＬＡ種としては、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７およびＨＬＡ−Ｂ５１からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ種が挙げられる。
【０１１９】
本発明のポリペプチドを特定する１つの方法は以下の段階を含む：特定のＨＬＡ分子、例えば所与の集団に高い割合でみられるＨＬＡ分子を選択すること、上記のアライメント解析を実施してＴＤＯタンパク質中の「アンカー残基モチーフ」を特定すること、特定されたアンカー残基を１つまたは複数含む適切な大きさのペプチドを単離または構築すること、および得られたペプチドが、実施例１に記載するＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる測定で、癌患者のＰＢＬ集団に少なくともＰＢＬ  １０４個当たり１個の頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することができるかどうかを試験すること。
【０１２０】
本発明の一態様では、８〜１０個のアミノ酸残基長より長いＴＤＯ由来ペプチドが提供される。８〜１０個のアミノ酸超の長いポリペプチドはプロテアソームによって処理されて短くなり、ＨＬＡ分子と結合する。したがって、長さが８〜１０個のアミノ酸残基超のポリペプチドを投与すると、「長い」ＴＤＯのポリペプチド／タンパク質／タンパク質フラグメント／変異体は細胞質ゾル中、プロテアソームによって一続きのさらに短いペプチドにｉｎ  ｖｉｖｏで処理される。プロテアソームに処理されて様々な異なる短いペプチドになり得る長めのポリペプチドを用いることの利点は、１つのペプチドで、特定のＨＬＡクラスの拘束される１つの８〜１０個のアミノ酸のペプチドよりも多くのＨＬＡクラスが標的化され得るという点にある。
【０１２１】
驚くべきことに、本発明の一部のペプチドは、置換が不要となるのに十分な高い親和性でＭＨＣ分子と結合し、本明細書に示される抗原として直ちに使用できる。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、ＴＤＯタンパク質（配列番号１）、それに由来するポリペプチドフラグメント、同様の変異体、完全長および部分長のＴＤＯの機能的相同体、ＴＤＯの隣接するペプチドならびその機能的相同体のうちの１つまたは複数のものを含む。より好ましくは、ワクチン組成物は表１に挙げたいずれかの配列を含む。極めて好ましくは、ワクチン組成物は、配列番号３（ＴＤＯ２００〜２０８）；配列番号６（ＴＤＯ１２３〜１３２）；配列番号９（ＴＤＯ３０９〜３１７）；配列番号１３（ＴＤＯ３６４〜３７２）；配列番号１７（ＴＤＯ１１８〜１３７）；および／または配列番号１８（ＴＤＯ３０３〜３２２）のペプチドを含む。
【０１２２】
本発明のペプチドの重要な特徴は、それがＰＢＬ集団中、癌および／または感染症が認められる個体のＡＰＣ上または腫瘍／新生物細胞（標的細胞）上の特定のペプチドを特異的に認識するＩＮＦ−γ産生応答Ｔ細胞、すなわち細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を認識または誘発することが可能であることである。この活性は、個体のＰＢＬ、ＡＰＣまたは腫瘍細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供することによって容易に測定される。アッセイの前に、アッセイする細胞を被験ペプチドと接触させることによって刺激するのが有利であり得る。好ましくは、ペプチドは、本明細書で用いられるＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる測定で、少なくともＰＢＬ  １０４個当たり１個の頻度でＩＮＦ−γ産生Ｔ細胞を誘発または認識することが可能である。より好ましくは、頻度は少なくともＰＢＬ  １０４個当たり５個、より好ましくは少なくともＰＢＬ  １０４個当たり１０個、例えば少なくともＰＢＬ  １０４個当たり５０個または１００個などである。
【０１２３】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＴＤＯペプチド特異的Ｔ細胞応答をモニターする強力なツールである。本明細書の知見から示唆される主なものとして、本発明のペプチドが癌細胞および／またはＴＤＯ発現ＡＰＣ上に発現しＨＬＡ分子と複合体を形成するということがある。これにより、このような癌細胞がＣＴＬによって破壊されやすくなり、癌および感染症への対策としてＴＤＯ免疫感作を実施することの有用性が強調される。メラノーマ患者のＰＢＬにＨＬＡ拘束性ＴＤＯ由来ペプチドエピトープに対する自発的なＣＴＬ応答がみられることは、ＴＤＯ免疫原性ペプチドの免疫療法としての可能性を示している。
【０１２４】
本発明の一実施形態では、本発明のペプチドは、臨床病態が認められる個体のＰＢＬ集団であって、配列番号１のＴＤＯまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体が発現するＰＢＬ集団に、ＩＮＦ−γ産生細胞を誘発することが可能である。臨床病態は、好ましくは癌および／または感染症であり、最も好ましくは癌である。
【０１２５】
個体
本発明のワクチン組成物での治療の対象となる個体は、臨床病態が認められる個体である。個体は、好ましくは哺乳動物種の個体、最も好ましくはヒトである。個体は、老若を問わず任意の年齢であってよく、雌雄いずれであってもよい。個体に認められる臨床病態は、癌などの腫瘍性疾患または微生物感染症もしくはウイルス感染症、例えばＨＩＶなどの感染症であり得る。
【０１２６】
本発明の一実施形態は、癌の治療、リスク低減、安定化または予防のためのワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、微生物感染またはウイルス感染などの感染に由来する疾患の治療、リスク低減、安定化または予防のためのワクチンを提供する。
【０１２７】
癌
本発明のワクチン組成物は、臨床病態の予防、リスク低減または治療に使用し得る。好ましくは、臨床病態は、ＴＤＯの発現を原因とするものまたはこれを特徴とするものである。ＴＤＯは、配列番号１で示されるＴＤＯであり得るか、野生型のいずれかのＴＤＯと少なくとも７０％の同一性を有する相同体であり得るが、機能的である必要はない。ここでは、ＴＤＯの発現レベル（発現とは、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、前駆体タンパク質、完全にプロセシングされたタンパク質などの発現のことである）は臨床病態が認められない個体のレベル以上であることが理解される。
【０１２８】
本発明の一実施形態では、臨床病態は前腫瘍性障害または腫瘍性障害などの増殖性障害である。本発明の好ましい実施形態では、臨床病態は癌である。癌（悪性新生物）とは、１群の細胞が制御不能な増殖（正常範囲を超える増殖および分裂）、浸潤（隣接組織への侵入およびその破壊）および時には転移（リンパまたは血液を介して体の他の部位に拡散すること）といった特徴を示す種類の疾患のことである。癌にはこの３つの悪性特性があることから、自然治癒が見込まれ、浸潤も転移もしない良性腫瘍と区別される。白血病のような一部のものを除き、大部分の癌は腫瘤を形成する。
【０１２９】
本発明のワクチンの投与によって治療、管理および／または予防され得る癌の例として挙げられる癌の非限定的なグループとして、結腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウイルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠芽腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、シュワン細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽細胞腫、白血病およびリンパ腫、急性リンパ球性白血病および急性骨髄球性真性赤血球増加症、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症およびＨ鎖病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、直腸癌、泌尿器癌、子宮癌、口腔癌、皮膚癌、胃癌癌、脳腫瘍、肝臓癌、喉頭癌、食道癌、乳腺腫瘍、小児ヌル急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、胸腺ＡＬＬ、Ｂ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病、骨髄単球様白血病、急性巨核球様白血病、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病およびＴ細胞白血病、小型および大型非小細胞肺癌、急性顆粒球性白血病、胚細胞腫瘍、子宮内膜癌、胃癌、頭頸部癌、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病および甲状腺癌がある。
【０１３０】
好ましい実施形態では、本発明によるワクチン組成物は対象に臨床効果を誘発することが可能であり、ここでは、臨床効果は疾患の安定を特徴とし得るものであり、好ましい実施形態では、臨床効果は部分奏効を特徴とし得るものであるか、好ましくは、臨床効果は癌の完全寛解を特徴とし得るものである。好ましくは、癌は、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、血液癌（白血病など）、結腸癌および腎細胞癌からなる群より選択されるものである。
【０１３１】
本発明の一態様では、ワクチン組成物は個体に臨床効果を誘発することが可能である。一実施形態では、臨床効果は安定（それ以上悪化も進行もみられない）を特徴とし得るものであり、好ましい実施形態では、臨床効果は部分奏効を特徴とし得るものであるか、好ましくは、臨床効果は癌または感染症の完全寛解を特徴とし得るものである。臨床効果は、本明細書でのちに記載する通りに判定され得る。
【０１３２】
本発明の別の態様では、ワクチン組成物は対象に臨床効果を誘発することが可能であり、ここでは、臨床効果は、最も大きい標的病変の最長直径の合計の減少を特徴とするものである。この減少は、本明細書でのちに記載する通りに判定され得る。
【０１３３】
ベースライン時、罹患している全器官を代表して１器官当たり最大５か所、計１０か所の測定可能な病変をいずれも、標的病変として特定し、記録および測定するべきである。
・標的病変は、その大きさ（直径が最大となる病変）および（撮像技術によって、または臨床的に実施される）正確な反復測定への適性に基づいて選択するべきである。
・全標的病変の最長直径（ＬＤ）の合計を計算し、ベースライン合計ＬＤとして報告する。ベースライン合計ＬＤは、目的とする腫瘍の特徴を明らかにするための基準として用いる。
・その他のあらゆる病変（または疾患部位）は非標的病変とするべきであり、ベースライン時に記録もするべきである。このような病変の測定を実施する必要はないが、追跡調査全体を通じてそれぞれの有無は記録するべきである。
【０１３４】
標的病変の評価
・完全奏効（ＣＲ）：全標的病変が消失している。
・部分奏効（ＰＲ）：ベースライン合計ＬＤを基準として標的病変のＬＤの合計が少なくとも３０％減少している。
・進行（ＰＤ）：治療開始時から記録した合計ＬＤの最小値を基準として、標的病変のＬＤの合計が少なくとも２０％増加しているか、病変が新たに１つまたは複数出現している。
・安定（ＳＤ）：治療開始時から記録した合計ＬＤの最小値を基準として、ＰＲと見なされる程度の退縮もＰＤと見なされる程度の増大も認められない。
【０１３５】
非標的病変の評価
・完全奏効（ＣＲ）：全非標的病変の消失および腫瘍マーカーレベルの正常化が認められる。
・不完全奏効／安定（ＳＤ）：１つもしくは複数の非標的病変の残存および／または正常範囲を超える腫瘍マーカーレベルの維持が認められる。
・進行（ＰＤ）：１つもしくは複数の新たな病変の出現および／または既に存在している非標的病変の明白な進行が認められる。
【０１３６】
本発明の一実施形態では、本明細書に挙げるいずれかのタンパク質および／またはポリペプチドを含むワクチン組成物は、対象に臨床効果を誘発することが可能であり、臨床効果は、最も大きい標的病変の最長直径の合計の減少を特徴とするものである。
【０１３７】
本発明のワクチン組成物は、ＴＤＯを発現する癌が認められる個体に投与すると、配列番号１のＴＤＯまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体を発現する癌に対する免疫応答を誘発することが可能であることが企図される。本発明のワクチン組成物は、ワクチン接種した個体に癌細胞に対する細胞毒性効果を有するエフェクターＴ細胞、ＴＤＯ発現ＡＰＣの産生を誘発し、かつ／または対象の腫瘍間質への抗原特異的Ｔ細胞の浸潤を誘導することが可能である。
【０１３８】
ＰＢＬ集団に免疫応答を誘発することが可能なことに加えて、本発明のペプチドは、ｉｎ  ｓｉｔｕで、すなわち固形腫瘍組織内で細胞溶解性免疫応答を誘発することが可能であることも企図される。このことは例えば、ＨＬＡ−ペプチド複合体を準備し、例えば多量体化して検出可能な標識を付与し、このような複合体を免疫組織化学染色に用いて、腫瘍組織中に本発明のエピトープペプチドと反応性のＣＴＬを検出することによって示され得る。したがって、本発明のペプチドのさらなる重要な特徴は、腫瘍組織中にエピトープペプチドと反応性のＣＴＬをｉｎ  ｓｉｔｕで検出可能なことである。
【０１３９】
このほか、本発明のペプチドは、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面にＨＬＡとペプチドとの複合体を提示させることが可能であり、次いでこの複合体が細胞溶解性Ｔ細胞のエピトープまたは標的として働くことに加えて、Ｂ細胞応答などの他のタイプの免疫応答を誘発して複合体に対する抗体の産生および／または遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を生じさせ得ることが企図される。後者のタイプの免疫応答は、本発明のペプチドを注射した部位の発赤および触知可能な硬結と定義される。
【０１４０】
本発明の１つの目的は、配列番号１のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）もしくは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体、前記ＴＤＯもしくは前記その機能的相同体の連続する配列を含む免疫原活性のあるペプチドフラグメントまたは前記ＴＤＯもしくは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸と、アジュバントとを含む、癌の予防、リスク低減または治療のためのワクチン組成物を提供することである。
【０１４１】
癌の併用治療
いくつかの場合には、本発明の治療法をさらなる癌治療、例えば化学療法、放射線療法、免疫刺激物質での治療、遺伝子治療、抗体での治療および樹状細胞を用いる治療などと組み合わせるのが適切である。
【０１４２】
腫瘍細胞でのＴＤＯの発現が増大することにより免疫系が阻害されることから、本発明に開示されるＴＤＯベースの免疫療法と、細胞傷害性化学療法および／または別の抗癌免疫療法との併用は癌治療に効果的な方法である。このような治療薬は、本明細書では「第二の有効成分」とも呼ばれる。
【０１４３】
本発明のワクチン組成物との共投与（逐次的投与または同時投与）の点で適切な化学療法剤の例としては、特に限定されないが、全トランスレチノイン酸、アクチミド、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、レナリドマイド、ロイコボリン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、レブリミド、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンが挙げられる。一実施形態では、本発明の薬剤と併用する化学療法剤そのものが、異なる化学療法剤の組合せであり得る。適切は組合せとしては、ＦＯＬＦＯＸおよびＩＦＬが挙げられる。ＦＯＬＦＯＸは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリンおよびオキサリプラチンを含む組合せである。ＩＦＬ治療は、イリノテカン、５−ＦＵおよびロイコボリンを含むものである。
【０１４４】
また別の第二の有効成分は、腫瘍の治療に別個に、同時にまたは組み合わせて使用するキナーゼ阻害剤であり得る。適切なキナーゼ阻害剤には、抗腫瘍活性を有することがわかっているキナーゼ阻害剤（ゲフィチニブ（イレッサ）およびエルロチニブ（タルセバ）など）があり、これらを前記ペプチドと併用し得る。このほか、腎細胞癌の治療に効果があることがわかっているスニチニブリンゴ酸塩およびソラフェニブなどの受容体チロシンキナーゼ阻害剤も第二の有効成分として使用するのに適している。
【０１４５】
第二の有効成分のさらなる例には、免疫刺激物質、例えばサイトカインおよび抗体がある。サイトカインなどは、特に限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ型ＩＦＮ、インターロイキン２１、インターロイキン２、インターロイキン１２およびインターロイキン１５からなる群より選択され得る。抗体は、好ましくは抗ＣＤ４０抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体などの免疫刺激抗体である。免疫刺激物質はほかにも、免疫を抑制する細胞（例えば、調節Ｔ細胞）または因子を枯渇させることが可能な物質であり得、前記物質は、例えばＥ３ユビキチンリガーゼであり得る。Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＨＥＣＴ、ＲＩＮＧおよびＵボックスタンパク質）は、免疫細胞機能を調節する重要な分子として登場したものであり、タンパク質分解による破壊に特異的な阻害分子を標的とすることによって、感染時の免疫応答の調節に関与し得る。現時点ではこのほか、数種類のＨＥＣＴタンパク質およびＲＩＮＧ  Ｅ３タンパク質が免疫自己寛容の誘導および維持と関係があることがわかっており、ｃ−Ｃｂｌ、Ｃｂｌ−ｂ、ＧＲＡＩＬ、ＩｔｃｈおよびＮｅｄｄ４はそれぞれ、Ｔ細胞増殖因子の産生および増殖を負に調節するものである。
【０１４６】
一実施形態では、ＴＤＯ由来ポリペプチドを含む本発明のワクチン組成物を、免疫刺激物質などの第二の有効成分と組み合わせて投与する。免疫刺激物質は、好ましくは、ＩＬ−２１もしくはＩＬ−２などのインターロイキンまたは化学療法剤である。
【０１４７】
本発明のワクチン組成物はほかにも、ＴＤＯに加えて１つまたは複数の追加の抗原を含み得る。前記抗原は、例えば、癌関連タンパク質に由来する免疫原活性のあるペプチドであり得る。
【０１４８】
したがって、本発明のワクチン組成物は、ＴＤＯおよび／またはその免疫原活性のあるペプチドフラグメントに加えてほかにも、以下のもの：
１）ＩＤＯ
２）ＩＤＯの免疫原活性のあるペプチドフラグメント
３）１）または２）の機能的相同体
４）１）、２）または３）を含むポリペプチド
５）１）、２）、３）または４）のいずれかをコードする核酸
のうちの１つまたは複数のものを含み得る。
【０１４９】
前記ＩＤＯは、具体的には、国際公開第２００９／１４３８４３号の配列番号１のＩＤＯ、同第２００９／１４３８４３号の配列番号１３のＩＤＯ、同第２００９／１４３８４３号の配列番号１４のＩＤＯ、同第２００９／１４３８４３号の配列番号１５のＩＤＯ、同第２００９／１４３８４３号の配列番号１６のＩＤＯであり得る。国際公開第２００９／１４３８４３号には、有用なＩＤＯの免疫原活性のあるペプチドフラグメントで本発明のワクチン組成物に含ませ得るものが記載されている。
【０１５０】
本発明のワクチン組成物は、ＴＤＯおよび／またはその免疫原活性のあるペプチドフラグメントに加えてほかにも、以下のもの：
１）ＰＤ−Ｌ１
２）ＰＤ−Ｌ１の免疫原活性のあるペプチドフラグメント
３）１）または２）の機能的相同体
４）１）、２）または３）を含むポリペプチド
５）１）、２）、３）または４）のいずれかをコードする核酸
のうちの１つまたは複数のものを含み得る。
【０１５１】
前記ＰＤ−Ｌ１は、具体的には、国際公開第２０１３／０５６７１６号の配列番号１のＰＤ−Ｌ１であり得る。国際公開第２０１３／０５６７１６号には、有用なＰＤ−Ｌ１の免疫原活性のあるペプチドフラグメントで本発明のワクチン組成物に含ませ得るものが記載されている。
【０１５２】
感染症
本発明の別の実施形態では、本明細書に開示されるワクチン組成物は、炎症性病態を治療または予防するものである。
【０１５３】
本明細書で使用される「炎症性病態」という用語は、炎症などの免疫応答を生じる任意の種類の臨床病態に関連し、したがって、感染症、慢性感染症、自己免疫病態およびアレルギー性炎症を包含する。したがって、感染症、慢性感染症、自己免疫状態およびアレルギー性炎症などの炎症性病態はいずれも、本発明に適した臨床病態であり、したがって、本明細書の記載に従って対処されるものである。
【０１５４】
炎症とは、損傷細胞または刺激物などの有害な刺激に対する血管組織の複雑な生物学的応答のことである。有害な刺激を除去することおよび組織の治癒過程を開始することが生物体による防御的試みである。炎症は、急性のものと慢性のものとに分類され得る。急性炎症は、有害な刺激に対する身体の最初の応答であり、血液から損傷組織内への血漿および白血球の移動が増大することによって達成される。生化学的諸事象のカスケードが伝播し、局所血管系、免疫系および損傷組織内の種々の細胞に及ぶ炎症性応答に発達させる。慢性炎症として知られる長期間にわたる炎症は、炎症部位に存在する細胞の種類が進行性のものに移行するものであり、組織の破壊と炎症過程からの治癒が同時に起こるのが特徴である。いずれの場合も、ＡＰＣなどの免疫系の細胞にＴＤＯが発現し、したがって、感染症および炎症は、本発明のワクチン組成物の投与によって治療されるか、予防されるか、リスクが軽減される臨床病態である。ワクチン組成物は、好ましくはＴＤＯタンパク質、それに由来するタンパク質フラグメント、ポリペプチドもしくはペプチドまたはそのいずれかの機能的相同体を含む。
【０１５５】
炎症による障害で本発明と関係のあるものの例としては、特に限定されないが、アレルギー性炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、感染症、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、移植拒絶反応および血管炎が挙げられる。
【０１５６】
慢性炎症
慢性炎症は本発明で特に重要なものである。慢性炎症は、活動性炎症、組織破壊および修復の試みが同時に起こることを特徴とする病的状態である。慢性炎症を起こした組織には、血管新生と線維症をみる単核免疫細胞（単球、マクロファージ、リンパ球および形質細胞）の浸潤、組織破壊および治癒の試みといった特徴がみられる。
【０１５７】
急性炎症では、刺激の除去によって炎症組織への単球（しかるべき活性化を受けるとマクロファージになる）の動員が停止し、既に存在するマクロファージがリンパ管から組織の外に出る。しかし、慢性炎症を起こした組織では刺激が存続し、このため、単球の動員が維持され、既に存在するマクロファージが定位置に係留され、（特にアテローム斑では）マクロファージの増殖が刺激される。
【０１５８】
本発明の１つの目的は、配列番号１のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体、前記ＴＤＯもしくは前記その機能的相同体の連続する配列を含む免疫原活性のあるペプチドフラグメントまたは前記ＴＤＯもしくは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸と、アジュバントとを含む、慢性炎症の予防、リスク低減または治療のためのワクチン組成物を提供することである。
【０１５９】
感染症
本発明のワクチン組成物は、臨床病態の予防、リスク低減または治療に使用し得る。本発明の好ましい実施形態では、臨床病態は感染症である。感染症は、感染症が認められる個体にＴＤＯの発現増大を誘導することが可能な細菌、ウイルス、寄生虫および／または真菌などの任意の感染病原体によって助長されるものであり得、好ましくは、感染症は慢性疾患であるか、慢性疾患になるリスクがあるものである。発明の背景に記載したように、ＴＤＯの発現増大は、ＴＤＯを発現する生物体からトリプトファンを欠乏させることによって、その近傍の微生物因子に直接効果を及ぼす。しかし、ＴＤＯ発現細胞がＡＰＣである場合、ＴＤＯ発現の増大がＴｒｅｇ細胞の活性を阻害するため、この方法が裏目に出る。したがって、本発明の一態様は、ＴＤＯのタンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチドおよび／またはそのいずれかの変異体を含む、感染病原体を原因とする疾患の治療、改善（重症度の軽減）、安定化および／または予防のためのワクチン組成物を提供することである。
【０１６０】
感染症はウイルスを原因とするものであり得、治療に本発明のワクチン組成物を投与し得るウイルス性疾患としては、特に限定されないが、以下のウイルス性疾患が挙げられる：ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連複合症候群、水疱瘡（水痘）、感冒、サイトメガロウイルス感染症、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、単純ヘルペス、帯状疱疹、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血発熱、感染性単核球症、流行性耳下腺炎、ノロウイルス、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、痘瘡（痘瘡）、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル病および黄熱。好ましくは、癌を引き起こし得るＨＩＶ／ＡＩＤＳおよびウイルス感染症が認められる個体にワクチン組成物を投与する。ヒトの癌の原因となる主なウイルスには、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびヒトＴリンパ好性ウイルスがあり、したがって、本発明の１つの目的は、これらのウイルス感染症の治療または治療の一環として投与することである。
【０１６１】
本発明に適した細菌感染症の例としては、特に限定されないが、炭疽、細菌性髄膜炎、ボツリヌス中毒、ブルセラ症、カンピロバクター症、猫ひっかき病、コレラ、ジフテリア、発疹チフス、淋病、膿痂疹、レジオネラ症、ライ病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、リウマチ熱、ＭＲＳＡ感染症、ノカルジア症、百日咳（百日咳）、ペスト、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、チフスおよび尿路感染症が挙げられる。本発明の１つの目的は、細菌感染の治療、予防および／またリスク低減のためのワクチンを提供することである。
【０１６２】
本発明のさらなる態様は、寄生虫感染症、例えば特に限定されないが、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、回虫症、バベシア症、シャーガス病、肝吸虫症、クリプトスポリジウム症、嚢虫症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、自由生活アメーバ感染症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、カラ・アザール、リーシュマニア症、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ症、蟯虫感染症、疥癬、住血吸虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、旋毛虫症、鞭虫症、トリコモナス症およびトリパノソーマ症など；真菌感染症、例えば特に限定されないが、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症、足白癬など；プリオン感染症、例えば特に限定されないが、伝染性海綿状脳症、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー−致死性家族性不眠症およびアルパース症候群などの治療、予防および／またはリスク低減のためのワクチン組成物を提供することであり、したがって、本発明の１つの目的は、寄生虫、真菌またはプリオンによる感染症の治療または治療の一環としてすることである。
【０１６３】
感染症の併用治療
さらに、本発明によるワクチン組成物の投与による任意の感染症の治療を、さらなる（第二の）有効成分とともに、またはさらなる治療、例えば抗生物質治療、化学療法、免疫刺激物質での治療、樹状細胞、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤などを用いる治療などと組み合わせて実施することが提供される。
【０１６４】
感染症の治療に本発明のワクチンと併用し得る第二の有効成分の例としては、特に限定されないが、抗生物質が挙げられる。本明細書の抗生物質という用語は、抗細菌活性、抗真菌活性、抗ウイルス活性および／または抗寄生虫活性を示す物質を指し、本発明に適したものの例としては、特に限定されないが、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、クロラムフェニコール、フルオロキノロン、シプロフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、トロバフロキサシン、グリコペプチド、バンコマイシン、リンコサミド、クリンダマイシン、マクロライド／ケトライド、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフォテタン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフジニル、セフジトレン、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、モノバクタム、アズトレオナム、ニトロイミダゾール、メトロニダゾール、オキサゾリジノン、リネゾリド、ペニシリン、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、アンピシリン、スルバクタム、バカンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸塩、ストレプトグラミン、キヌプリスチン、ダルホプリスチン、スルホンアミド／スルファメトキサゾール、トリメトプリム、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、アゾール抗真菌剤のクロトリマゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ボリコナゾール、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、エキノキャンディン、キャスポファンギン、ミカファンギン、シクロピロクス、フルシトシン、グリセオフルビンおよびテルビナフィンが挙げられる。適したものにはほかにも、抗ウイルス剤、例えばビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビルおよびバルサイト（バルガンシクロビル）、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）：ＡＺＴ（ジドブジン）、ｄｄＩ（ジダノシン）、ｄｄＣ（ザルシタビン）、ｄ４Ｔ（スタブジン）、３ＴＣ（ラミブジン）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）：ネビラピン、デラビルジン、プロテアーゼ阻害剤：サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、リバビリン、アマンタジン／リマンタジン、リレンザおよびタミフル、プレコナリル、インターフェロンがある。
【０１６５】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの抗生物質と組み合わせた、ＴＤＯ由来のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはその機能的相同体を含む感染症の治療のためのワクチン組成物に関する。好ましくは、本発明のワクチン組成物を慢性感染症、例えばＨＩＶの治療に使用し、したがって、抗ウイルス剤などの上記のいずれかの抗生物質と併用する。
【０１６６】
自己免疫疾患
自己免疫疾患は、生物体が自身の（分子下レベルに及ぶ）構成要素を自己として認識することができず、その結果、自身の細胞および組織に対して免疫応答が生じたときに起こるものである。このような異常な免疫応答によって生じる任意の疾患を自己免疫疾患と呼び、本発明に重要なものである。その例としては、特に限定されないが、セリアック病、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病および関節リウマチ（ＲＡ）が挙げられる。
【０１６７】
本発明の１つの目的は、配列番号１のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）もしくは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体、前記ＴＤＯもしくは前記その機能的相同体の連続する配列を含む免疫原活性のあるペプチドフラグメントまたは前記ＴＤＯもしくは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸と、アジュバントとを含む、自己免疫疾患の予防、リスク低減または治療のためのワクチン組成物を提供することである。
【０１６８】
自己免疫疾患の併用治療
自己免疫疾患に現在用いられている治療法は通常、免疫抑制療法、抗炎症療法または対症療法である。橋本甲状腺炎または１型糖尿病の治療に用いられるホルモン補充療法などの非免疫療法の結果は、自己侵襲的な応答となる。食餌操作はセリアック病の重症度を抑えるものである。ステロイド治療またはＮＳＡＩＤ治療は多数の疾患の炎症症状を抑えるものである。慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパチー（ＣＩＤＰ）およびギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）には免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の静脈内製剤が用いられる。ＴＮＦαアンタゴニストであるエタネルセプトなどのより特異的な免疫調節療法剤は、ＲＡの治療に有用であることが示されている。このような免疫療法では、感染症の易罹患性などの有害作用のリスクが高くなることがある。
【０１６９】
蠕虫療法は上記の観察結果に基づいて開発されたものであり、個体に特定の腸内線虫（蠕虫）を接種する。現在用いられている治療法には、２種類のよく似た治療法、すなわち、鉤虫としてよく知られるアメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）またはブタ鞭虫卵としてよく知られるＴｒｉｃｈｕｒｉｓ  Ｓｕｉｓ  Ｏｖａのいずれかを接種するものがある。この方法がクローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー、多発性硬化症および慢性炎症性障害を含めた様々な自己免疫障害の治療に極めて効果的であることを示す研究がある。
【０１７０】
一実施形態では、本明細書に開示されるワクチンを上記のいずれかの薬物などの第二の有効成分および自己免疫疾患に対する治療法と併用する。
【０１７１】
アレルギー性炎症
アレルギーは、アトピーと呼ばれることも多い免疫系の障害のことである。アレルギー反応は、アレルゲンとして知られる環境物質に対して起こり、後天性で予測可能かつ急激な反応である。厳密に言えば、アレルギーは４種類の過敏症のうちの１つであり、Ｉ型（または即時型）過敏症と呼ばれる。アレルギーは、ＩｇＥとして知られる抗体の一種によって肥満細胞および好塩基球と呼ばれる特定の白血球が過剰に活性化され、これにより極端な炎症性応答が生じることを特徴とする。よくみられるアレルギー反応としては、湿疹、じんま疹、枯草熱、喘息、食物アレルギーのほか、スズメバチおよびミツバチなどの刺咬昆虫の毒に対する反応が挙げられる。
【０１７２】
アレルギー性炎症は、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎およびいくつかの眼アレルギー疾患を含めたいくつかの障害または医学的状態の重要な病態生理学的特徴の１つである。
【０１７３】
本発明の１つの目的は、配列番号１のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）もしくは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体、前記ＴＤＯもしくは前記その機能的相同体の連続する配列を含む免疫原活性のあるペプチドフラグメントまたは前記ＴＤＯもしくは前記ペプチドフラグメントをコードする核酸と、アジュバントとを含む、アレルギー性炎症の予防、リスク低減または治療のためのワクチン組成物を提供することである。
【０１７４】
アレルギー性炎症の併用治療
アレルギー性炎症の治療には薬物療法および免疫療法の２種類の治療法がある。
【０１７５】
薬物療法は、拮抗薬を用いて、アレルギー性メディエーターの作用を遮断するか、細胞および脱顆粒過程の活性化を妨げることである。このような拮抗薬としては、抗ヒスタミン剤、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、エピネフリン（アドレナリン）、テオフィリン、クロモリンナトリウムおよび抗ロイコトリエン剤、例えばモンテルカスト（シングレア）またはザフィルルカスト（アコレート）など；抗コリン剤、うっ血除去剤、肥満細胞安定剤が挙げられるほか、好酸球の走化性を低下させると考えられているその他の化合物もよく用いられる。
【０１７６】
免疫療法は、問題のアレルゲンを投与量を徐々に増加させながら個体に接種する脱感作治療または減感作治療である。第二の形態の免疫療法では、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体の静脈内注射を実施する。第三の種類の舌下免疫療法は、食物および常在菌などの非病原性抗原に対する経口免疫寛容を利用する経口投与療法である。
【０１７７】
一実施形態では、本明細書に開示されるワクチンを上記のいずれかの薬物などの第二の有効成分およびアレルギー性炎症に対する治療と併用する。
【０１７８】
医薬組成物
本発明は、個体のＴＤＯ発現による臨床的障害の治療、リスク低減および／または予防が可能な医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、具体的にはワクチン組成物であり得る。本発明のワクチン組成物は、ポリペプチドおよび／または核酸分子などの抗原を含む「従来の」ワクチン組成物であり得る。これらはほかにも、個体に由来し、のちに処理を施した改変細胞などの細胞を含む組成物または抗体もしくはＴＣＲなどの複合体分子を含む組成物の形態であり得る。
【０１７９】
一般に、ワクチンとは、個体に免疫応答を誘導することが可能な物質または組成物のことである。組成物は、抗原（１つまたは複数）（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸など）などの「有効成分」、特に１つまたは複数の抗原を含む核酸構築物、細胞（例えば、養子移植のための負荷ＡＰＣまたはＴ細胞）、複合体分子（抗体、ＴＣＲおよびＭＨＣ複合体など）、担体、アジュバントおよび医薬担体のうちの１つまたは複数のものを含み得る。以下では、本発明によるワクチン組成物の種々の成分をさらに詳細に開示する。
【０１８０】
本発明のワクチン組成物は、癌および／または感染症（ＴＤＯの発現をもたらす）が認められる個体に投与したとき、配列番号１のＴＤＯまたは配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体を発現する癌、ＤＣまたはＡＰＣに対する免疫応答を誘発することが可能である。好ましい実施形態では、臨床病態は癌である。本発明のワクチン組成物は、ワクチン接種した個体に、ＴＤＯを発現する癌細胞、ＡＰＣおよびＤＣに対する細胞毒性効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を誘発し、かつ／または対象の腫瘍間質への抗原特異的Ｔ細胞の浸潤を誘導することが可能である。
【０１８１】
抗原をはじめとする有効成分
タンパク質／ポリペプチドベースのワクチン組成物
本発明のペプチドは、驚くほどの高い親和性で結合し（図２を参照されたい）、本明細書に示される抗原として直ちに使用できる。好ましくは、本発明のワクチン組成物は以下のもの：
１）本明細書の「トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ」の節にのちに記載するいずれかのＴＤＯであり得るトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）；
２）本明細書の「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」の節にのちに記載するいずれかのペプチドであり得る、ＴＤＯの連続するアミノ酸配列を含む免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント；
３）ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメント、例えば「ＭＨＣ」の節に記載するいずれかのＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドフラグメントまたはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドフラグメントなどである、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント；
４）１）、２）および３）のポリペプチドの機能的相同体；
５）本明細書の「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」の節にのちに記載するいずれかのポリペプチドであり得る、１）、２）、３）および４）のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチド；
６）１）、２）、３）および４）のいずれかのポリペプチドをコードする核酸
のうちの１つまたは複数のものを含む。
【０１８２】
本発明のワクチン組成物の抗原の選択は、当業者が決定することができるパラメータによって決まる。既に述べたように、本発明の様々なペプチドはそれぞれ、特定のＨＬＡ分子によって細胞表面に提示されるものである。したがって、治療する対象をＨＬＡ表現型で分類する場合、その特定のＨＬＡ分子と結合することがわかっている１つまたは複数のペプチドを選択する。あるいは、所与の集団での種々のＨＬＡ表現型の保有率に基づいて目的とする抗原を選択する。一例を挙げれば、ＨＬＡ−Ａ２は白人集団で最も保有率の高い表現型であり、したがって、ＨＬＡ−Ａ２と結合するペプチドを含有する組成物であれば、その集団の大部分で活性を示すことになる。さらに、本発明の抗原／ペプチドを表２に示されるアンカー残基モチーフに従い修正して、特定のＨＬＡ分子との結合を増強し得る。
【０１８３】
本発明の組成物はこのほか、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント、例えば「免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント」、「ＴＤＯまたはそのフラグメントを含むポリペプチド」および「ＭＨＣ」の節に記載されるいずれかのペプチドを２つ以上組み合わせたものを含有し得る。前記免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントは、それぞれが異なるＨＬＡ分子と特異的に相互作用するため、標的集団のカバーされる割合が高くなり得る。したがって、例を挙げれば、医薬組成物は、ＨＬＡ−Ａ分子によって拘束されるペプチドとＨＬＡ−Ｂ分子によって拘束されるペプチドとを組み合わせたもの、例えば、標的集団のＨＬＡ表現型の保有率に対応するＨＬＡ−Ａ分子とＨＬＡ−Ｂ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２とＨＬＡ−Ｂ３５などを含むものを含有し得る。さらに、組成物は、ＨＬＡ−Ｃ分子によって拘束されるペプチドを含み得る。
【０１８４】
ペプチドベースのワクチンの場合、抗原取込みとは無関係に外因性に負荷し、宿主の抗原提示細胞に処理させることによって提示を可能にする「ＭＨＣの準備が整った（ＭＨＣ−ｒｅａｄｙ）」形態でエピトープを投与することができる。本発明のペプチドは、短い「ＭＨＣの準備が整った」形態のペプチドおよびプロテアソームによる処理が必要な長い形態のペプチドの両方を含み、したがって、多数の腫瘍抗原を標的とすることが可能なより複雑なワクチン組成物が得られる。ワクチンの標的となるＨＬＡ群が多様になるほど、ワクチンが多様な集団で機能する可能性が高くなる。
【０１８５】
多エピトープワクチン組成物
本発明はほかにも、免疫原性の高い多エピトープワクチンに関する。好ましくは、このようなワクチンは、最適な免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントを、任意選択で、本明細書でのちに記載する他の適したペプチドおよび／またはアジュバントと組み合わせて、同時に送達されるよう設計するべきである。本発明は、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントを、任意選択で、本明細書でのちに記載するＴＤＯに属するものでも由来するものでもないさらなるタンパク質もしくはペプチドフラグメントおよび／またはアジュバントと組み合わせて含む、このような多エピトープワクチンを包含する。より複雑な組成のワクチンの開発に拍車をかける重要な要因の１つは、例えば慎重に選択したＣＴＬおよびＴｈ細胞のエピトープをまとめて含むか、これをコードするワクチンを設計することによって、多数の腫瘍抗原を標的とすることを望む気持ちである。したがって、本発明は一態様では、クラスＩ拘束性ＴＤＯエピトープおよびクラスＩＩ拘束性ＴＤＯエピトープの両方を含むワクチン組成物に関する。
【０１８６】
したがって、本発明のペプチドは、短い「ＭＨＣの準備が整った」形態のペプチド（クラスＩ拘束性）およびプロテアソームによる処理が必要な長い形態のペプチド（クラスＩＩ拘束性）の両方を含む。したがって、本発明による組成物は、本明細書で既に定義したクラスＩ拘束性エピトープおよび／またはクラスＩＩ拘束性エピトープを含む多エピトープワクチンとして提供され得る。
【０１８７】
核酸ベースのワクチン組成物
本発明によるワクチン組成物は、ＴＤＯポリペプチドまたはその免疫学的に活性なペプチドフラグメントをコードする核酸を含み得る。したがって、前記核酸は上記のいずれかのタンパク質およびペプチドフラグメントをコードし得る。核酸は例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＰＮＡであり得、好ましくは、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０１８８】
本発明の核酸は、発現ベクターなどの任意の適切なベクター内に含まれ得る。多数のベクターが利用可能であり、当業者であれば、特定の目的に有用なベクターを選択することができよう。ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス粒子または人工染色体の形態であり得る。様々な方法によってしかるべき核酸配列をベクターに挿入することができ、例えば、当該技術分野で周知の技術を用いて、ＤＮＡをしかるべき制限酵素部位（１つまたは複数）に挿入し得る。本発明による核酸配列とは別に、ベクターは、シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終止配列のうちの１つまたは複数のものをさらに含み得る。ベクターはこのほか、追加の配列、例えばエンハンサー、ポリＡテール、リンカー、ポリリンカー、作動可能なリンカー、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、停止コドン、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および組込み用の宿主相同配列をはじめとする境界の定まったエレメントなどを含み得る。核酸構築物を設計する方法は当該技術分野で周知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい）。ベクターは、適切な細胞内で核酸の発現を指令する調節核酸配列と作動可能に連結された核酸を含む、発現ベクターであるのが好ましい。本発明の範囲では、前記調節核酸配列は一般に、哺乳動物細胞内、好ましくはヒト細胞内、よりこのましくは抗原提示細胞内で発現を指令することが可能なものであるべきである。
【０１８９】
好ましい一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。ベクターはこのほか、弱毒化細菌ベクターなどの細菌ベクターであり得る。弱毒化細菌ベクターは、感染および残留させる部位に持続的な粘膜免疫応答を誘導するために使用し得る。ベクターとして様々な組換え細菌を使用することができ、例えば、細菌ベクターは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）からなる群より選択され得る。一般に、マウスでは異種抗原ＨＰＶ１６  Ｌ１またはＥ７に対する免疫が誘導され、強力なＣＴＬ誘導および腫瘍退縮がみられる。ベクターは、Ｔ細胞刺激性ポリペプチドをコードする核酸をさらに含み得る。
【０１９０】
負荷ＡＰＣ
有用な実施形態では、個体の抗原提示細胞（ＡＰＣ）にＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子を負荷することによって、個体からＰＢＬを単離し、その細胞をペプチドとインキュベートした後、元の個体に注射することによって、あるいは個体から前駆体ＡＰＣを単離し、サイトカインおよび抗原を用いてその細胞をプロフェッショナルＡＰＣに分化させた後、元の個体に注射することによって、本発明のペプチドが投与され、これにより癌疾患に対する免疫原性応答が誘発される。
【０１９１】
したがって、本発明の一態様は、ＴＤＯもしくはその免疫学的に活性なペプチドフラグメントまたは前記タンパク質もしくは前記免疫学的に活性なペプチドフラグメントをコードする核酸を含む抗原提示細胞を含む、ワクチン組成物を提供することである。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に抗原を提示することが可能な任意の細胞であり得る。好ましい抗原提示細胞は樹状細胞である。樹状細胞（ＤＣ）は、任意の適切なプロトコル、例えば本明細書でのちに記載するプロトコルに従った治療方法で調製し使用し得る。当業者には、このプロトコルが、様々なＨＬＡ型および様々な疾患を有する個体に使用するべく適合させ得るものであることが理解されよう。
【０１９２】
樹状細胞（ＤＣ）を３７℃で１時間、５０μｇ／ｍｌのＨＬＡ拘束性ペプチド（ＧＭＰ品質で合成したもの）でパルス標識することができ、第１日と第１４日およびその後４週間毎にペプチドと細胞５×１０６個を皮下に投与し、ワクチン接種を５回実施した後、さらに白血球除去を実施する。臨床使用するＤＣの作製および品質管理は、基本的にＮｉｃｏｌｅｔｔｅら（２００７）に記載されている通りに実施することができる。
【０１９３】
したがって、本発明の一実施形態では、ＴＤＯの発現を特徴する臨床病態が認められる個体を治療する方法であって、好ましくは臨床病態が癌または感染症である方法は、個体の抗原提示細胞（ＡＰＣ）にｅｘ  ｖｉｖｏでペプチドを提示した後、処理済みのＡＰＣを元の個体に注射することによってペプチドを投与するという方法である。これを実施する方法には、少なくとも２つの選択肢がある。１つの選択肢は、個体からＡＰＣを単離し、ＭＨＣクラスＩ分子をペプチドとインキュベートする（同分子にペプチドを負荷する）ことである。ＭＨＣクラスＩ分子に負荷するとは、ＡＰＣをペプチドとインキュベートして、そのペプチドに特異定なＭＨＣクラスＩ分子を有するＡＰＣとペプチドとを結合させ、それをＴ細胞に提示できるようにすることを意味する。次いで、ＡＰＣを個体に再び注射する。もう一方の方法は、樹状細胞の生物学の分野で最近なされた発見に依存するものである。この場合、個体から単球（樹状細胞前駆体である）を単離し、サイトカインおよび抗原を用いることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロフェッショナルＡＰＣ（または樹状細胞）に分化させる。次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成したＤＣをペプチドでパルス標識し、個体に注射する。
【０１９４】
養子免疫療法／養子移植
本発明の重要な一態様は、ＴＤＯ特異的Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、これを個体に養子移植することに関する。養子移植は、既に特異的免疫応答を生じさせることが可能な状態にある免疫系の主要な構成要素を医師が直接個体に移植することを意味する。
【０１９５】
本発明の１つの目的は、例えば養子移植に有用であり得るＴＤＯ特異的Ｔ細胞を提供することである。ＴＤＯペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体またはＴＤＯペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体と特異的に結合することが可能なＴ細胞受容体を含む単離Ｔ細胞を個体に養子移植することができ、前記Ｔ細胞は好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖したＴ細胞であり、ＴＤＯペプチドは、本明細書に既に記載したいずれかの免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントであり得る。Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する方法は当業者に周知である。本発明はこのほか、ＭＨＣ拘束性ＴＤＯペプチド複合体と特異的に結合することが可能なＴ細胞受容体を含むＴ細胞を癌疾患が認められるヒトなどの個体に投与することを含み、ＴＤＯ由来ペプチドが、本明細書に既に記載したいずれかのＴＤＯペプチドである、治療法に関する。本発明はさらに、ＴＤＯまたはそのペプチドフラグメントと特異的に結合することが可能なＴ細胞受容体を含むＴ細胞を、癌または感染症の治療のための薬物の調製に使用すること関する。Ｔ細胞自家移植は、基本的にＷａｌｔｅｒら（１９９５）に記載されている通りに実施し得る。
【０１９６】
ＴＣＲ導入
さらに別の実施形態では、このようなＴ細胞を養子移植する前に放射線を照射して、個体内での増殖を制御し得る。ＴＣＲ遺伝子導入によってＴ細胞の特異性を遺伝的に改変することが可能である（Ｅｎｇｅｌｓら，２００７）。これにより、ＴＤＯペプチド特異性を有するＴ細胞を個体に導入することが可能になる。一般に、養子免疫療法にＴ細胞を使用するのは魅力的であり、その理由として、無腫瘍環境または無ウイルス環境でＴ細胞を増殖し、注入前にＴ細胞機能を解析することが可能になることが挙げられる。養子移植にＴＣＲ遺伝子改変Ｔ細胞（異種ＴＣＲの発現を指令する発現で形質転換したＴ細胞など）を適用することには、Ｔ細胞系の導入と比較して以下のような複数の利点がある：（ｉ）一般に、再指令されたＴ細胞の作製が適用できる。（ｉｉ）親和性が高いＴＣＲまたは親和性が極めて高いＴＣＲを選択または作出して、Ｔ細胞の改変に使用することができる。（ｉｉｉ）コドン最適化ＴＣＲまたはマウス化ＴＣＲを用いて、安定化したＴＣＲの表面発現を向上させることにより、結合力の高いＴ細胞を作製することができる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の導入によるＴ細胞特異性の遺伝的改変は、基本的にＭｏｒｇａｎら（２００６）に記載されている通りに実施し得る。
【０１９７】
ＴＣＲトランスフェクション
既知の抗腫瘍反応性を有するＴＣＲを一次ヒトＴリンパ球に遺伝的に導入することができる。腫瘍特異的ＣＴＬクローンのＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖をコードする遺伝子を一次Ｔ細胞にトランスフェクトし、このようにして、腫瘍抗原に対する特異性を有するＴ細胞を再プログラミングすることができる。ＰＢＬにはＴＣＲ  ＲＮＡをエレクトロポレーションによりトランスフェクトする（Ｓｃｈａｆｔら，２００６）。あるいは、レトロウイルスベクターを用いるＴＣＲ遺伝子導入によって、新たな特異性を有するＴ細胞を得ることができる（Ｍｏｒｇａｎら，２００６）。しかし、レトロウイルスベクターのプロウイルスがトランスフェクト細胞のゲノムにランダムに組み込まれ、次いで細胞増殖が妨害される可能性がある。ＴＣＲをコードするＲＮＡをＴ細胞にエレクトロポレーションすれば、ＲＮＡがトランスフェクト細胞内に存在するのは一時的なものにとどまり、ゲノムに組み込まれることがないため、この欠点が克服される（Ｓｃｈａｆｔら，２００６）。さらに、細胞のトランスフェクションは、研究室で日常的に用いられているものである。
【０１９８】
アジュバントおよび担体
本発明によるワクチン組成物は、アジュバントおよび／または担体を含むのが好ましい。有用なアジュバントおよび担体の例はのちに挙げる。したがって、ＴＤＯポリペプチド、免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントもしくはその機能的相同体、それを含むポリペプチドまたはそれをコードする核酸は、本発明の組成物中でアジュバントおよび／または担体と結合し得る。
【０１９９】
アジュバントは、ワクチン組成物に混合してＴＤＯまたは免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントに対する免疫応答を増大させるか、別の方法で修正する、任意の物質であり、さらに以下を参照されたい。担体は、ＴＤＯまたはそのペプチドフラグメントが結合することが可能であり、これにより、特に本発明のペプチドの提示を補助する足場構造、例えばポリペプチドまたは多糖である。
【０２００】
本発明のペプチドの多くは比較的小分子であり、このため、本明細書に記載される組成物中でペプチドと種々の材料、例えばアジュバントおよび／または担体などとを結合させてワクチン、免疫原性組成物などを作製する必要がある。アジュバントとは、広義には、免疫応答を促進する物質のことである。アジュバントを全般的に論じたものが、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版，１９８６）の６１〜６３ページに記載されている。Ｇｏｄｉｎｇは、目的とする抗原が低分子量であるか、免疫原性が低い場合、免疫原性の担体と結合させることが推奨されるとしている。このような担体分子の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミンおよびニワトリ免疫グロブリンが挙げられる。このほか、種々のサポニン抽出物が免疫原性組成物のアジュバントとして有用であることが示唆されている。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、周知のサイトカインをアジュバントとして用いることが提案されている（国際公開第９７／２８８１６号）。
【０２０１】
担体は、アジュバントとは独立して存在し得る。担体の機能は、例えば、特にペプチドフラグメントの分子量を増大させて、その活性または免疫原性を増大させること、安定性を付与すること、生物活性を増大させること、または血清中半減期を増大させることであり得る。さらに、担体は、ＴＤＯタンパク質、ポリペプチド、機能的相同体またはそのペプチドフラグメントをＴ細胞に提示するのを補助し得る。担体は当業者に公知の任意の適切な担体、例えばタンパク質または抗原提示細胞であり得る。担体タンパク質は、特に限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えばトランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリンなどまたはインスリンもしくはパルミチン酸などホルモンであり得る。ヒトの免疫感作には、担体は、ヒトに許容され安全な生理的に許容される担体でなければならない。しかし、破傷風トキソイドおよび／またはジフテリアトキソイドは、本発明の一実施形態では適切な担体となる。あるいは、担体はデキストラン、例えばセファロースであり得る。
【０２０２】
したがって、本発明の一態様は、組成物中に存在するＴＤＯタンパク質、ポリペプチドフラグメント、変異体またはそれに由来するペプチドは、例えば、上記のタンパク質または例えば樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞のような担体と結合しているものである。
【０２０３】
アジュバントは、例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルヌラミル（ｎｏｒｎｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミウル（ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｕｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも呼ばれる）、ＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）の２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０．ＲＴＭ．エマルジョン、リポ多糖類および脂質Ａを含めたその種々の誘導体、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣ酸およびポリＡＵ酸）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のワックスＤ、結核、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）およびブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属のメンバーにみられる物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ（米国特許第５８７６７号および同第５，５５４，３７２号を参照されたい）、脂質Ａ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１ならびにＱＳ−２１からなる群より選択され得る。本発明に使用するのに好ましいアジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュバント（ベルギーのＳｅｐｐｉｃ社から入手可能）、好ましくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１などの油／界面活性剤ベースのアジュバントが挙げられる。その他の好ましいアジュバントとして、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含むアジュバントなどがある。他の好ましいアジュバントとしてはさらに、ポリＩ：ＣなどのウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバントがある。イミダゾキニリン（ｉｍｉｄａｚｏｃｈｉｎｉｌｉｎｅ）はまた別の好ましいアジュバントの例である。最も好ましいアジュバントは、ヒトでの使用に適したアジュバントである。
【０２０４】
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュバント（いずれもベルギーのＳｅｐｐｉｃ社から入手可能）は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−７０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２５、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−７２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−７０８、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−７６３Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２０７、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２６４、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−２７、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−３５、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１Ｆ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ０１６ＤおよびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳからなる群、好ましくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳおよびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−７２０からなる群、より好ましくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１からなる群より選択され得る。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１（Ｓｅｐｐｉｃ社）は、様々な界面活性剤と非代謝性の鉱油、代謝性の油または両者の混合物とを組み合わせた油／界面活性剤ベースのアジュバントである。これらは、ＴＤＯまたはそのペプチドフラグメントを含む水溶液とのエマルジョンとして使用するよう調製される。界面活性剤はオレイン酸マンニドである。ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ社；Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、フラミンガム、マサチューセッツ州）は高純度に精製された水溶性のサポニンであり、水溶液として取り扱う。ＱＳ−２１およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１アジュバントは滅菌使い捨てバイアルに入れて提供され得る。
【０２０５】
よく知られているサイトカインＧＭ−ＣＳＦは、もう１つの本発明の好ましいアジュバントである。ＧＭ−ＣＳＦは１０年間アジュバントとして用いられており、好ましくは、国際公開第９７／２８８１６号に記載されているＧＭ−ＣＳＦであり得る。
【０２０６】
本発明に従って使用することが可能なアジュバントの望ましい機能性を下の表に挙げる。
【０２０７】
【表３】
2017533182.tif 000005
【０２０８】
本発明によるワクチン組成物は、２つ以上のアジュバントを含み得る。さらに、本発明は、上記のいずれかのものまたはその組合せを含めた任意のアジュバント物質および／または担体をさらに含む治療用組成物を包含する。このほか、ＴＤＯタンパク質、その変異体またはペプチドフラグメントとアジュバントを任意のしかるべき順序で別個に投与し得ることが企図される。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１もしくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０などのＭｏｎｔａｎｉｄｅアジュバントまたはＧＭ−ＣＳＦアジュバントを含む。
【０２０９】
したがって、本発明は、上記のいずれかのものまたはその組合せを含めたアジュバント物質をさらに含む治療用組成物を包含する。このほか、抗原、すなわち本発明のペプチドとアジュバントを同時に、またはしかるべき順序で別個に投与し得ることが企図される。
【０２１０】
用量および投与
ワクチン組成物中の本発明のＴＤＯまたは免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントの量は、具体的な用途に応じて異なり得る。しかし、ペプチド組成物の単回用量は、好ましくは約１０μｇ〜約５０００μｇ、より好ましくは約５０μｇ〜約２５００μｇ、例えば約１００μｇ〜約１０００μｇなどの間のいずれかの量である。特に、治療する個体がヒトである本発明の実施形態では、単回用量は、ＴＤＯまたは前記免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントが５０μｇ〜５００μｇの範囲、例えば８０μｇ〜３００μｇの範囲、例えば１００μｇ〜２５０μｇの範囲となり得る。多くの場合、ワクチン組成物は長期間にわたって反復して投与される。例えば、ワクチン組成物を少なくとも２回、好ましくは少なくとも５回、より好ましくは少なくとも１０回、例えば１０〜２０回の範囲で投与し得る。ワクチン組成物はほかにも、連続的に投与され得る。投与は任意の有用な頻度で反復し得る。したがって、例えば、ワクチン組成物を週１回、例えば２週間に１回など、例えば３週間に１回、例えば月１回など、例えば２か月に１回、例えば３か月に１回など、例えば半年に１回、例えば年１回などで投与し得る。特に、ワクチン組成物は連続的に投与され得る。投与頻度は前記期間の間で変化し得る。一実施形態では、ワクチン組成物を１〜３か月に１回、連続的に投与する。投与様式としては、真皮内投与、皮下投与、静脈内投与、持効製剤の形態での埋植などが挙げられる。当該技術分野で公知のあらゆる形態の投与が本明細書に包含される。このほか、注射用免疫原性ペプチド組成物の製剤化に適することが当該技術分野で公知のあらゆる従来の剤形、例えば凍結乾燥形態および必要に応じて従来の薬学的に許容される担体、希釈剤、保存剤、補助剤、緩衝剤成分などを含有する液剤、懸濁剤または乳濁剤などの形態が包含される。
【０２１１】
医薬組成物は、当業者に知られている任意の従来のプロトコルを用いて調製および投与し得る。実施例３〜５に、本発明によるワクチン組成物の調製の非限定的な例のほかにも、ワクチンなどの投与の非限定的な例を記載する。当業者には、このプロトコルが、本明細書に記載される任意のワクチンに容易に適用され得ることが理解されよう。本発明のさらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、ＴＤＯの発現を特徴とする臨床病態、例えば癌および感染症などが認められる個体の治療に有用である。
【０２１２】
本発明の組成物の免疫防御効果は、当業者に公知のいくつかの方法を用いて判定することができる。このほか、免疫感作後のＤＴＨ反応の出現および／またはワクチン組成物のペプチド（１つまたは複数）を特異的認識する抗体の検出によって、良好な免疫応答を判定し得る。
【０２１３】
本発明によるワクチン組成物は、治療有効量で個体に投与し得る。有効量は、個体の状態、体重、性別および年齢などの様々な因子に応じて異なり得る。その他の因子としては、投与様式が挙げられる。
【０２１４】
医薬組成物は、皮下、局所、経口および筋肉内などの様々な経路によって個体に提供し得る。医薬組成物の投与は経口的または非経口的に実施する。非経口送達の方法としては、局所投与、動脈内投与（組織への直接投与）、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与、髄腔内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与または鼻腔内投与が挙げられる。本発明にはこのほか、ワクチン組成物での予防および治療の方法に使用するのに適した局所医薬製剤、経口医薬製剤、全身医薬製剤および非経口医薬製剤を提供するという目的がある。
【０２１５】
例えば、ワクチン組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれ持効製剤および徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤などの経口剤形の形で、または注射によって投与することができる。同様に、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下、閉塞の有無を問わない局所または筋肉内の形態で投与してもよく、いずれも製薬分野の当業者に周知の形態を用いるものである。本明細書に記載されるいずれかの化合物を含み、有効であるが毒性のない量のワクチンを予防剤または治療剤として用いることができる。このほか、注射用の免疫原性ペプチド組成物の製剤化に適することが当該技術分野で公知のあらゆる従来の剤形、例えば凍結乾燥形態および必要に応じて従来の薬学的に許容される担体、希釈剤、保存剤、アジュバント、緩衝剤成分などを含有する液剤、懸濁剤または乳濁剤などの形態が包含される。
【０２１６】
本発明によるワクチン組成物の好ましい投与様式としては、特に限定されないが、静脈内投与などの全身投与または皮下投与、真皮内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、経口投与、経直腸投与、経膣投与、経肺投与のほか、一般に任意の形態の粘膜投与が挙げられる。さらに、本明細書に挙げるいずれかの投与形態の手段が本発明に含まれることは、本発明の範囲内のことである。
【０２１７】
本発明によるワクチンは、１回または２回、３回、４回もしくは５回などの任意の回数投与することができる。ワクチンを２回以上投与すると、生じる免疫応答を追加刺激する効果が得られる。ワクチンを前回の投与とは異なる形態で、または異なる身体部位に投与することによって、ワクチンをさらに追加接種することができる。追加接種は、同種追加接種または異種追加接種のいずれかである。同種追加接種は、１回目の接種とその後の接種が同じ構築物、より具体的には同じ送達媒体、特に同じウイルスベクターを含む場合のことである。異種追加接種は、同一の構築物が異なるウイルスベクター内に含まれる場合のことである。
【０２１８】
第二の有効成分
本明細書に提供されるワクチン組成物を第二の有効成分と併用することは、本発明の一態様である。ワクチン組成物と第二の有効成分の投与は、逐次的投与または同時投与であり得る。第二の有効成分の例については、癌および感染症ともに既に記載した。ワクチン組成物と、治療する所与の臨床病態に適した他の治療法とを併用し得ることは、さらなる態様である。このような治療法としては、外科手術、化学療法、遺伝子治療、免疫刺激物質または抗体を挙げ得るが、当業者であれば、所与の状況に適した併用治療を決定することができる。
【０２１９】
いくつかの場合には、本発明の治療法と、さらなる医学的治療、例えば化学療法、放射線療法、免疫刺激物質での治療、遺伝子治療、抗体および／または抗生物質での治療ならびに樹状細胞を用いる治療などとを組み合わせるのが適切である。
【０２２０】
診断および予後予測のツール
本発明のペプチドは、癌疾患および感染症に対して適用範囲の広い診断および予後予測の方法を開発するための土台となる。したがって、他の有用な実施形態では、本発明の組成物は、個体のＴＤＯ発現細胞の有無をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで診断するための組成物である。この診断方法は、ＰＢＬまたは腫瘍組織中にＴＤＯ反応性Ｔ細胞を検出することに基づくものである。
【０２２１】
したがって、個体のＰＢＬまたは腫瘍組織中のＴＤＯ反応性Ｔ細胞の有無をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで診断する診断キットであって、本発明の１つまたは複数のペプチドを含むキットと、個体に上記の反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法であって、腫瘍組織または血液試料と、本発明のペプチドとクラスＩ  ＨＬＡ分子もしくはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントの複合体とを接触させることと、複合体と組織または血液細胞との結合を検出することとを含む方法とが提供される。一態様では、本発明は、本明細書に記載されるように診断試薬として有用な、本発明のペプチドとクラスＩ    ＨＬＡ分子もしくはクラスＩＩ  ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントの複合体を提供する。このような複合体は単量体または多量体であり得る。
【０２２２】
また別の有用な診断または予後予測の方法は、異種動物種の抗体、例えば、ヒトの本発明の免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントに対するマウス抗体を作製することに基づくものであり、次いでこの抗体を、例えばそのペプチドを提示する癌細胞の有無を診断するのに使用することができる。このような免疫感作の目的には、ペプチドの量は、既に記載したようなｉｎ  ｖｉｖｏ治療の過程で使用するものよりも少ない量であり得る。一般に、好ましい用量は、ペプチドが約１μｇ〜約７５０μｇの範囲のものであり得る。このほか、本発明のペプチドによる免疫感作に基づくモノクローナル抗体を作製することが可能である。したがって、本発明はほかにも、分子、具体的には本発明のペプチドと特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（そのフラグメントを含む）およびそのような結合をブロックすることが可能な分子、例えば本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に対して生じさせた抗体に関する。本発明はさらに、本発明のペプチドまたはタンパク質と特異的に結合することが可能な単離Ｔ細胞受容体およびそれをコードする単離核酸に関する。このようなＴ細胞受容体は、例えば、当業者に周知の標準的な技術を用いてタンパク質またはペプチドに特異的なＴ細胞からクローン化し得る。
【０２２３】
一態様では、本発明はほかにも、本明細書に記載されるＴＤＯおよび／またはそのペプチドフラグメントと特異的に結合することが可能なＴ細胞受容体を含む単離Ｔ細胞に関する。単離Ｔ細胞はＣＤ８  Ｔ細胞またはＣＤ４  Ｔ細胞であり得る。単離Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖したＴ細胞であるのが好ましい。Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する方法は当業者に周知である。このようなＴ細胞は、具体的には養子移植または自家細胞移植による癌の治療に有用であり得る。したがって、本発明はほかにも、Ｔ細胞を含む医薬組成物ならびに必要とする個体、例えば癌および／または感染症が認められる個体などにＴＤＯまたはそのペプチドフラグメントと特異的に結合することが可能なＴ細胞受容体を含むＴ細胞を投与することを含む、治療法に関する。自家細胞移植は、基本的にＷａｌｔｅｒら（１９９５）に記載されている通りに実施し得る。
【０２２４】
本発明は、癌および感染症、好ましくは癌などのＴＤＯの発現を特徴とする臨床病態を治療、予防、緩和または治癒する手段であって、疾患が認められる個体に、例えば抗体、Ｔ細胞受容体または本明細書に記載されるキット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）であり得る、本明細書に明記される有効量の組成物、ペプチドフラグメントと特異的に結合することが可能な分子を投与することを含む、手段を提供する。したがって、本発明のさらなる態様は、配列番号１のＴＤＯの発現による臨床病態を治療する方法を提供することである。前記臨床病態は、例えば癌または炎症性病態であり得る。
【０２２５】
免疫感作のモニタリング
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物はワクチン組成物である。したがって、本発明が目的とし、本発明の一態様でもあることは、本発明のワクチン組成物を投与した個体の免疫感作をモニターすることである。したがって、医薬組成物は、癌および／または感染症に対する免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物またはワクチンであり得る。本明細書で使用される「免疫原性組成物またはワクチン」という表現は、癌細胞、ＡＰＣまたはＤＣなどのＴＤＯ発現細胞に対して少なくとも１つのタイプの免疫応答を誘発する組成物を指す。したがって、このような免疫応答は、細胞表面に提示されるＨＬＡ／ペプチド複合体を認識することが可能なＣＴＬが生じ、それにより細胞溶解が起こる、すなわちワクチンが、ワクチン接種した対象に癌細胞に対する細胞毒性効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を誘発する、ＣＴＬ応答；抗癌抗体の産生を生じさせるＢ細胞応答；および／またはＤＴＨ型の免疫応答のうちのいずれかであり得る。本発明の１つの目的は、本発明の組成物を個体に投与した後、上記のいずれかの反応をモニターすることによって、前記個体の免疫感作をモニターすることである。
【０２２６】
一態様では、本発明は、免疫感作をモニターする方法に関するものであり、前記方法は、
ｉ）個体の血液試料を準備する段階と、
ｉｉ）本明細書に記載されるいずれかのタンパク質またはペプチドであり得るＴＤＯまたはそのペプチドフラグメントを提供する段階と、
ｉｉｉ）前記血液試料が、前記タンパク質またはペプチドと特異的に結合する抗体またはＴ細胞受容体を含むＴ細胞を含むかどうかを判定する段階と、
ｉｖ）それにより、前記個体に前記タンパク質またはペプチドに対する免疫応答が生じたかどうかを判定することと
を含む。
【０２２７】
個体は、好ましくはヒト、例えばＴＤＯもしくは免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメントまたは前記タンパク質もしくはペプチドをコードする核酸で免疫感作したヒトである。
【０２２８】
キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）
本発明はほかにも、
・本明細書に記載されるいずれかのワクチン組成物、ならびに／あるいは
・ＴＤＯタンパク質またはその機能的相同体、ならびに／あるいは
・本明細書に記載されるいずれかの免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント、その機能的相同体および／またはそれに由来するペプチド、ならびに／あるいは
・上の２つの箇条書きのタンパク質をコードするいずれかの核酸と、
キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）の使用方法に関する指示書とを含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）に関する。
【０２２９】
本発明はほかにも、
・本明細書に記載されるいずれかのワクチン組成物、ならびに／あるいは
・ＴＤＯタンパク質またはその機能的相同体、ならびに／あるいは
・本明細書に記載されるいずれかの免疫原活性のあるＴＤＯのペプチドフラグメント、その機能的相同体および／またはそれに由来するペプチド、ならびに／あるいは
・上の２つの箇条書きのタンパク質をコードするいずれかの核酸と、
第二の有効成分とを含む、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）に関する。
【０２３０】
好ましくは、治療する臨床病態に応じて第二の有効成分を選択し、癌を治療する場合、例えば上に挙げた化学療法剤から第二の有効成分を選択する。同様に、微生物／ウイルス感染症を治療する場合、第二の有効成分を抗生物質および／または抗ウイルス剤とするのが好ましい。
【０２３１】
キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）の構成要素は個々の組成物中に含まれているのが好ましいが、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）の構成要素がいずれも同じ組成物中に含まれている場合が本発明の範囲に含まれる。したがって、キット・オブ・パーツ（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）の構成要素は同時に、または任意の順序で逐次的に投与し得る。
【０２３２】
【表４】
2017533182.tif 000006
【０２３３】
実施例
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これらの実施例は本発明の限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２３４】
実施例１
この実施例では、Ｔ細胞反応性を生じさせる様々なＴＤＯ由来エピトープを開示する。さらに、健常ドナーおよび癌患者の両方でＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞が自発的に媒介するＴＤＯに対する反応性について記載する。しかし、健常者と悪性疾患患者との間でＴＤＯ特異的Ｔ細胞の表現型が異なっていたのは興味深いことである。
【０２３５】
材料および方法
患者
メラノーマ（ＭＭ）患者、乳癌（ＢＣ）患者および健常ドナー（ＨＤ）から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取した。癌患者では、採血と任意の種類の抗癌治療との間に少なくとも４週間の間隔を設けた。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離を用いてＰＢＭＣを分離し、ＨＬＡの種類を判定し（大学病院臨床免疫学部、コペンハーゲン、デンマーク）、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ブロンドビー、デンマーク）を加えたウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ社、ネールム、デンマーク）中で凍結させた。上記のいずれかの測定前に、患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。プロトコルは、デンマーク首都圏の科学倫理委員会による承認を受け、ヘルシンキ宣言の条項に従って実施した。ＨＤ  ＰＢＭＣは州立病院の血液バンクから入手した。
【０２３６】
腫瘍細胞系
細胞系ＦＭ−５５Ｍ１およびＦＭ−８６はＥＳＴ−ＤＡＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｚｉｎ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／ｅｓｔｄａｂ／）から提供されたものであり、Ａ２０５８およびＭＤＡ−ＭＢ２３１はＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ＡＴＣＣ．ｏｒｇ）から入手したものであり、ＵＫＥ−１（Ｚｅｅｂｅｒｇら，２０１３）はＷ．Ｆｉｅｄｌｅｒ（エッペドルフ（Ｅｐｐｅｄｏｒｆ）大学病院、ハンブルク、ドイツ）の厚意により提供されたものである。いずれの細胞系も１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社）で維持した。
【０２３７】
ペプチド
公開されているデータベースＳＹＦＰＥＩＴＨＩを用いることにより、ＨＬＡ−Ａ２に拘束される可能性のあるエピトープに関してＴＤＯのアミノ酸配列をスクリーニングした。１５種類のペプチドを選択し、ＴＡＧ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ社（コペンハーゲン、デンマーク）で合成した。一度凍結乾燥させたペプチドを製造業者の推奨に従って水またはＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）に溶解させ、それを−２０℃にてアリコートで保管し、凍結融解サイクルを回避した。ペプチドはＴＤＯ４０〜４８（ＬＩＹＧＮＹＬＨＬ）（配列番号５）、ＴＤＯ６５〜７４（ＫＩＨＤＥＨＬＦＩＩ）（配列番号７）、ＴＤＯ７２〜８１（ＦＩＩＴＨＱＡＹＥＬ）（配列番号４）、ＴＤＯ８５〜９３（ＱＩＬＷＥＬＤＳＶ）（配列番号１０）、ＴＤＯ１２３〜１３２（ＫＬＬＶＱＱＦＳＩＬ）（配列番号６）、ＴＤＯ１３０〜１３８（ＳＩＬＥＴＭＴＡＬ）（配列番号１１）、ＴＤＯ１５９〜１６８（ＲＬＬＥＮＫＩＧＶＬ）（配列番号２）、ＴＤＯ１９２〜２０１（ＬＬＫＳＥＱＥＫＴＬ）（配列番号８）、ＴＤＯ２００〜２０８（ＴＬＬＥＬＶＥＡＷＬ）（配列番号３）、ＴＤＯ２２５〜２３４（ＫＬＥＫＮＩＴＲＧＬ）（配列番号１４）、ＴＤＯ２７６〜２８４（ＬＬＳＫＧＥＲＲＬ）（配列番号１２）、ＴＤＯ３０９〜３１７（ＱＬＬＴＳＬＭＤＩ）（配列番号９）、ＴＤＯ３６４〜３７２（ＤＬＦＮＬＳＴＹＬ）（配列番号１３）、ＴＤＯ３７２〜３８１（ＬＩＰＲＨＷＩＰＫＭ）（配列番号１５）およびＴＤＯ３８０〜３８９（ＫＭＮＰＴＩＨＫＦＬ）（配列番号１６）であった。陰性対照および陽性対照には、ＨＩＶ由来ペプチドのＨＩＶｐｏｌ４６８〜４７６（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）（配列番号１９）およびＣＭＶｐｐ６５４９５〜５０３（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（配列番号２０）をそれぞれ用いた。さらに、ＴＤＯ１２３〜１３２およびＴＤＯ３０９〜３１７をそれぞれ含む長いペプチド（２０個のアミノ酸）を合成した。これらはＴＤＯ１１８〜１３７（ＶＳＶＩＬＫＬＬＶＱＱＦＳＩＬＥＴＭＴＡ）（配列番号１７）およびＴＤＯ３０３〜３２２（ＲＦＱＶＰＦＱＬＬＴＳＬＭＤＩＤＳＬＭＴ）（配列番号１８）という名称であり、ともに予測アルゴリズムＳＹＦＰＥＩＴＨＩによって示唆された潜在的なクラスＩＩ拘束性エピトープをいくつか含んでいた。
【０２３８】
ＨＬＡペプチド交換技術およびＭＨＣ  ＥＬＩＳＡ
既に記載されている通り（Ｔｏｅｂｅｓら，２００６）にＵＶ交換法とサンドイッチＥＬＩＳＡ法とを組み合わせることによって、ＨＬＡ−ペプチド親和性を測定した。簡潔に述べれば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にＨＬＡ−Ａ２の軽鎖および重鎖を産生させ、ＵＶ感受性リガンドでリフォールディングさせた。この条件リガンドをＵＶ光に１時間曝露して切断し、目的とするペプチドで置換した。ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体をＥＬＩＳＡに加えた後、複合体の親和性を吸光度として測定した。ＨＬＡ−Ａ２に対して高い親和性を示すことが詳細に記載されている２種類のペプチド（ＨＩＶｐｏｌ４６８〜４７６およびＣＭＶｐｐ６５４９５〜５０３）を陽性対照として用い、置換ペプチドを含まない試料を陰性対照として用いた。陽性対照は４つ組で作製し、ＴＤＯペプチドは３つ組で作製した。
【０２３９】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
この試験では、ＣＩＰ（ｈｔｔｐ：／／ｃｉｍｔ．ｅｕ／ｃｉｍｔ／ｆｉｌｅｓ／ｄｌ／ｃｉｐ＿ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｐｄｆ）が提供するガイドラインに従ってＥＬＩＳＰＯＴを実施した。既に記載されている通りに（Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，２０１２）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、サイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１０）を放出するペプチドエピトープ特異的エフェクター細胞を定量化した。一部の実験では、分析前にＰＢＭＣを一度、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチドにより刺激した。一部の実験では、抗原提示細胞として自家ＤＣ  １０４個をウェルに加えた。ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２．０  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．−Ｅｕｒｏｐｅ社、ボン、ドイツ）を用いてスポットをカウントした。一部の実験では、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グルノーブル、フランス）を製造業者の指示通りに用いてＣＤ４＋細胞を単離した。これにより純度の高い培養物（ＣＤ４＋が９７％超）が得られ、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）およびフローサイトメトリー（ＦＣＭ）についてのちに記載するように、これを表面抗体で染色することにより確認した。
【０２４０】
ＥＬＩＳＰＯＴ応答の境界は、実験的方法または統計学的方法のいずれかとした。実験的方法は「シグナル対ノイズ」比に基づくものであり、応答の閾値はＰＢＭＣ  １０５個当たりの特異的スポットが６個超であるとする。図６では、ＰＢＭＣ  ５×１０５個当たりの特異的スポットを４０超に増加させている。図８に例示するように、ノンパラメトリックな分布によらないリサンプリング（ＤＦＲ）法によって抗原刺激ウェルと陰性対照ウェルを統計学的に比較することが可能である。マン・ホイットニーの検定により、ＴＤＯ１１８〜１３７またはＴＤＯ３０３〜３２２に応答した所与のサイトカインの放出を患者群および健常ドナー群との間で比較した。Ｐ値＜０．０５を有意であると見なした。
【０２４１】
ＴＤＯ特異的Ｔ細胞系の生成
ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社）中、ウェルのプラスチック表面にＰＢＭＣを１時間付着させた後、付着細胞を除去することによって、ＤＣを生成した。付着細胞を５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ社、コペンハーゲン、デンマーク）中、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ロンドン、イギリス）および２５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）で処理し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿環境中に置いた。第６日、細胞にＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６それぞれ１０００Ｕ／ｍｌと１μｇ／ｍｌのＰＧＥ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）とからなる成熟カクテルを加えた。第８日、成熟ＤＣを回収し、恒温器内でＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ社）中１００μＭのＴＤＯペプチドを４時間負荷した。洗浄後、５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中、ペプチド負荷ＤＣと自家ＰＢＬとを混合した。翌日、ＩＬ−１２およびＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を最終濃度がそれぞれ２０Ｕ／ｍｌおよび４０Ｕ／ｍｌになるまで加えた。このようにして培養物を７日置きに２回刺激した。１００μＭのＴＤＯペプチドを負荷した放射線照射（２５Ｇｙ）自家ＰＢＬを用いてさらなる刺激を実施した。ＰＢＬで刺激した翌日、培養物にＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ社、コペンハーゲン、デンマーク）を最終濃度４０Ｕ／ｍｌになるまで添加した。
【０２４２】
ＦＣＭおよび細胞分取
ＭＨＣ四量体を負荷したペプチドを各フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｒｈｉｎ）（ＰＥ）２．５μｌで染色した。２×１０６個以下のＴ細胞を染色し、ＴＤＯペプチドまたはＨＩＶｐｏｌ４６８〜４７６ペプチドのいずれかを負荷したアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート四量体を陰性対照として用いた。２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ社）５０μｌ中、恒温器内で１５分間染色を実施した。次いで、αＣＤ３−ＡｍＣｙａｎとαＣＤ４−Ｆｉｔｃ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、アルバスルン、デンマーク）とαＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（ＤＡＫＯ社、グロストルプ、デンマーク）とからなる抗体混合物およびｎｅａｒ  ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ネールム、デンマーク）を直接加え、細胞を４℃の暗所に３０分間置いた。２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ社）で洗浄した後、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により四量体陽性ＣＤ８＋細胞を分取した。ＴＤＯ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞をＸ−ｖｉｖｏ  １５培地（Ｌｏｎｚａ社）中５μＭのＴＤＯ３０３〜３２２で刺激し、ＭＡＣＳ  ＩＦＮγ分泌アッセイ検出キット（ＰＥ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、ルンド、スウェーデン）を用いてＩＦＮγ分泌細胞を検出した。次いで、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によりＰＥ陽性細胞を放射線照射（３０Ｇｙ）自家ＰＢＭＣ  １０４個中に分取した。
【０２４３】
急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）
分取した特異的Ｔ細胞の急速増殖を以下の通りに実施した：５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および６０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（プロロイキン；Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）を添加したＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ社）中、５％ＣＯ２、３７℃で一晩、細胞を静止させた。翌日、フィーダー細胞を調製した：健常ドナー３例のＰＢＬ計２０*１０６個に放射線を照射し（２５Ｇｙ）、洗浄し、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ社）２ｍｌ中、１：１：１の比で混合した。２時間後、試料細胞とフィーダー細胞とを混合し、培地２０ｍｌ中、ＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）を最終濃度が６０００Ｕ／ｍｌになるまで、αＣＤ３  ａｂ  ＯＫＴ３（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、フランクフルト、ドイツ）を最終濃度が３０ｎｇ／ｍｌになるまで一緒に添加した。３〜４日毎に、細胞数の最大値を５×１０５細胞／ｍｌに調節し、新鮮なＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）を６０００Ｕ／ｍｌになるまで加えた。
【０２４４】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
ＰＢＭＣを恒温器内でＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（１：１０００希釈、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の存在下、５μＭの関連するペプチドまたは対照ペプチドで５時間刺激した。次いで、細胞分取について記載した通りに、２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ社）で細胞を２回洗浄し、表面抗原で染色した。２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ社）で細胞を洗浄した後、細胞を固定し、固定／透過処理緩衝液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で少なくとも３０分間透過処理し、２回洗浄した後、ＩＦＮγ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）およびＴＮＦα−ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に特異的な抗体で染色した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータで少なくとも５０，０００個のＣＤ４＋Ｔ細胞を記録し、Ｄｉｖａソフトウェアパッケージ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でデータを解析した。
【０２４５】
細胞傷害性アッセイ
従来のクロム放出アッセイを記載されている通りに用いて、生成したＴ細胞系の細胞傷害能の評価を実施した。簡潔に述べれば、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社）１００μｌ中、標的腫瘍細胞系を３７℃で１時間、１００μＣｉ５１Ｃｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、スコウルネ、デンマーク）で標識した。標的細胞を洗浄した後、恒温器内で様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でエフェクター細胞と４時間インキュベートした。次いで、ガンマ細胞カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ  １４７０  Ａｕｔｏｍａｔｉｃガンマカウンター）を用いて上清中の放射活性量を測定した。
【０２４６】
結果
健常ドナーおよび癌患者の末梢血中のＴＤＯ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の有無
十分に定義されたＨＬＡ結合モチーフ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら，１９９９）に基づいて、ＴＤＯアミノ酸配列から導かれた潜在的なＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞エピトープを特定した。結合親和性の予測値が最も高い１５種類の９〜１０量体のペプチドを合成した後、これを用いて、癌患者６例のＰＢＭＣについて自発的Ｔ細胞応答の有無をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりスクリーニングした。この分析から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１ラウンド刺激した後、ペプチドＴＤＯ１２３〜１３２（ＫＬＬＶＱＱＦＳＩＬ）（配列番号６）、ＴＤＯ２００〜２０８（ＴＬＬＥＬＶＥＡＷＬ）（配列番号３）、ＴＤＯ３０９〜３１７（ＱＬＬＴＳＬＭＤＩ）（配列番号９）およびＴＤＯ３６４〜３７２（ＤＬＦＮＬＳＴＹＬ）（配列番号１３）に応答したＩＦＮγ産生Ｔ細胞が存在することが明らかになった（図１Ａを参照されたい）。注目すべきなのは、上記のペプチドのうち数種類で２例以上の患者にＴ細胞応答が検出されたことである。このような有望な観察結果に促され、本発明者らは、４種類のＴＤＯ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔ細胞エピトープを用いて、さらに１４例の癌患者から採取したＰＢＭＣおよび健常ドナー１４例のＰＢＭＣのＴＤＯ反応性Ｔ細胞の有無を分析し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで１ラウンド刺激した後、再び分析を実施した。図１に示されるように、４種類のペプチドのいずれに対しても、癌患者および健常ドナーの両方にＴ細胞応答が検出された。驚くべきことに、両群とも応答の強度および頻度はほぼ同じであった。ノンパラメトリックな分布によらないリサンプリング（ＤＦＲ）法によって、抗原刺激ウェルと陰性対照とを統計学的に比較することが可能である。有意な応答の例を補足図面１に示す。さらに、ＴＤＯ反応性Ｔ細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで直接検出された（図８を参照されたい）。
【０２４７】
ＴＤＯ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞系の生成および機能的特徴付け
可溶性ペプチド／ＭＨＣ複合体の導入により特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出および特徴付けに革命がもたらされた（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら，１９９９）。ＴＤＯ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞系を樹立するため、癌患者のＰＢＭＣをＴＤＯペプチドであるＴＤＯ１２３〜１３２またはＴＤＯ３０９〜３１７を負荷した自家樹状細胞でそれぞれ５〜４回繰り返し刺激した。このようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激することにより、２色四量体染色による測定でＴＤＯ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の大幅な増大がみられた（図２を参照されたい）。急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）によってさらに増殖するため、蛍光活性化細胞分取によってＴＤＯ１２３〜１３２反応性およびＴＤＯ３０９〜３１７反応性のＴ細胞を濃縮した。ＲＥＰを用いた後、得られたＴ細胞系の特異性を四量体染色によって確認したところ、純度が９７．１％および９９．６％であることが明らかになった（図２を参照されたい）。このＴ細胞系が、ＴＡＰ欠損ペプチドでパルス標識したＴ２細胞またはＨＬＡが一致するＴＤＯ発現腫瘍細胞のいずれかを溶解させることができるかどうかを試験した。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、ＴＤＯ特異的Ｔ細胞培養物は、増殖に用いたものと同じＴＤＯペプチドでパルス標識したＴ２細胞は効率的に溶解させたが、無関係な異なるＴＤＯ由来ペプチドでパルス標識したＴ２細胞では効率的な溶解はみられなかった。最も重要なのは、ＴＤＯ特異的Ｔ細胞が、起源の組織が異なるＨＬＡ−Ａ２＋癌細胞系は効率的に溶解させたが、ＨＬＡ−Ａ２−癌細胞では効率的な溶解がみられなかったことである（図３Ｃおよび３Ｄを参照されたい）。ＴＤＯ発現癌細胞系の溶解は一様ではなかった。具体的には、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ２３１はＴＤＯ１２３〜１３２特異的Ｔ細胞系およびＴＤＯ３０９〜３１７特異的Ｔ細胞系の両方によって殺滅され、後者のＴ細胞系の方が殺作用の効率が高いことが明らかになった。一方、ＨＬＡ−Ａ２＋白血病細胞系ＵＫＥ−１はＴＤＯ１２３〜１３２特異的Ｔ細胞によって極めて効率的に溶解したが、ＴＤＯ３０９〜３１７特異的Ｔ細胞では辛うじて溶解するにとどまった。ＴＤＯ１２３〜１３２特異的Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ細胞系のＦＭ−５５Ｍ１およびＦＭ−８６を溶解させることはなかったが、この２つの細胞系はＴＤＯ３０９〜３１７特異的Ｔ細胞によって効率的に溶解した。最後に、ＨＬＡ−Ａ２−ＴＤＯ＋メラノーマ細胞系Ａ２０５８はいずれのＴ細胞系でも溶解しなかった。
【０２４８】
免疫細胞のＴＤＯ依存性の認識
ＴＤＯ特異的Ｔ細胞がＴＤＯ  ｍＲＮＡをトランスフェクトした自家成熟ＤＣを認識することができるかどうかを試験するため、ＴＤＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトした自家ＤＣを作製した後、ＥＬＩＳＰＯＴで分析した。この実験では、ＴＤＯ３０９〜３１７特異的Ｔ細胞がＴＤＯでトランスフェクトしたＤＣを特異的に認識することが明らかになった（図４Ａを参照されたい）。これまでに、ＴＡＰ欠損細胞系Ｔ２が長いペプチドを極めて効率的に処理して、表面のＨＬＡ−Ａ２に提示することがわかっている。最小限のエピトープ（ＴＤＯ１２３〜１３２（ＫＬＬＶＱＱＦＳＩＬ）（配列番号６）およびＴＤＯ３０９〜３１７（ＱＬＬＴＳＬＭＤＩ）（配列番号９）の２つを含む２０個のアミノ酸のペプチド２種類を合成した。ＴＤＯ１１８〜１３７（ＶＳＶ  ＩＬＫ  ＬＬＶ  ＱＱＦ  ＳＩＬ  ＥＴＭ  ＴＡ）（配列番号１７）はエピトープＴＤＯ１２３〜１３２を含み、ＴＤＯ３０３〜３２２（ＲＦＱ  ＶＰＦ  ＱＬＬ  ＴＳＬ  ＭＤＩ  ＤＳＬ  ＭＴ）（配列番号１８）はエピトープＴＤＯ３０９〜３１７を含む。次いで、Ｔ２細胞がこの２種類の長いペプチドを交差提示することができるかどうかを分析した。このことに関して、Ｔ２細胞にＴＤＯ１１８〜１３７またはＴＤＯ３０３〜３２２のいずれかを一晩負荷した後、これを標準的な細胞傷害性アッセイに用いた。図４Ｂに示されるように、短いペプチドを負荷しても、それに対応する長いペプチドを負荷しても、Ｔ２細胞の溶解が観察された、すなわち、ＴＤＯ１２３〜１３２特異的細胞は、ＴＤＯ１２３〜１３２ペプチドまたはＴＤＯ１１８〜１３７ペプチドでパルス標識したＴ２細胞は溶解させたが、ＴＤＯ３０９〜３１７またはＴＤＯ３０３〜３２２のいずれかでパルス標識した場合は溶解させなかった。したがって、長いＴＤＯ由来ペプチドは、Ｔ２細胞のＨＬＡ−Ａ２との関連で取り込まれて交差提示される。
【０２４９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴＤＯを認識する
ＴＤＯの免疫原性をさらに精細に検討するため、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７ＡのＥＬＩＳＰＯＴアッセイに２種類の長いペプチドＴＤＯ１１８〜１３７およびＴＤＯ３０３〜３２２を用いた（結果は図５に示す）。癌患者および健常ドナーともにペプチド特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答がみられた。ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞に関しては、２つのコホート間に差はみられなかった。しかし、長いＴＤＯペプチドに応答してＴＮＦαを産生する細胞は健常ドナーの方が頻度が高く、ＴＤＯ１１８〜１３７では、この差は有意性の高いものであった（ｐ＜０．０００１）。ペプチド刺激に応答したＩＬ−１０およびＩＬ−１７の産生は癌患者に限られていた。ＴＤＯ３０３〜３２２では、この差は統計的に有意なものであった（それぞれｐ＝０．００５１およびｐ＜０．０００１）。癌患者から得たＰＢＭＣが長いＴＤＯペプチドに応答して放出したＩＬ−１７およびＩＬ−１０は、広範囲にわたる免疫調節機能を発揮し、癌患者の臨床経過に関与すると考えられてきた。長いＴＤＯ３０３〜３２２ペプチドに応答してＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１０を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が臨床経過と相関することから、ＩＬ−１７産生細胞およびＩＬ−１０産生細胞の有無が生存率（ＯＳ）に明白な影響を及ぼすことがわたった。つまり、ＩＬ−１７Ａを放出するＣＤ４＋細胞を特徴とする患者には、ＩＬ−１７Ａ応答がみられない患者に比してＯＳが改善される傾向があった（図６Ａを参照されたい）；これに対し、ＴＤＯペプチドに応答してＩＬ−１０を放出するＣＤ４＋Ｔ細胞を有する患者ではＯＳが低下している（図６Ｂを参照されたい）。このようなＯＳの差は、ＩＬ−１７＋／ＩＬ−１０−産生Ｔ細胞またはＩＬ−１７−／ＩＬ−１０＋産生Ｔ細胞のいずれかを有する患者を比較した場合にさらに大きいものとなった。ＴＤＯ３０３〜３２２ペプチドに応答して１７＋／ＩＬ−１０−を産生する細胞が存在する患者の方が生存率がはるかに高かった（図６Ｃを参照されたい）。
【０２５０】
本発明は、ＴＤＯが、癌患者および健常ドナーの両方に容易に検出可能な自然なＴ細胞応答の標的となることを開示するものである。注目すべきなのは、ＴＤＯに特異的なＣＤ４  Ｔ細胞応答およびＣＤ８  Ｔ細胞応答が、健常ドナーと患者に同じ頻度で存在することである。したがって、健常ドナーは自己タンパク質ＴＤＯに対する強力な免疫応答を有すると思われる。しかし、興味深いことに、ＴＤＯ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、健常ドナーと癌患者とで機能的特徴が異なっていた。健常ドナーでは、ＴＤＯ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴＮＦαおよびＩＦＮγを放出したが、調節サイトカインであるＩＬ−１７もＩＬ−１０も放出しなかった。実際、ＴＮＦαを産生するＴＤＯ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は、癌患者よりも健常ドナーの方が有意に高かった。このことから、ＴＤＯが必ずしも健常者に寛容を誘導するものではないことがわかる。
【０２５１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、免疫抑制分子ＴＤＯに由来するエピトープに応答して、サイトカインの放出または場合によっては細胞溶解による免疫調節機能を発揮し得る。したがって、ＴＤＯに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞はともに、ＴＤＯ発現細胞によって誘導される免疫寛容状態を抑制することにより免疫応答を微調整する役割を果たすものと思われる。しかし、癌患者では、ＣＤ４＋ＴＤＯ反応性Ｔ細胞の表現型はさらに複雑なものである。つまり、細胞がＴＤＯエピトープに応答すると、ＩＦＮγおよびＴＮＦαに加えてＩＬ−１７およびＩＬ−１０も産生した。ＩＬ−１７の産生は、自己免疫および癌を含めた多数の病的状態に関与する一部のＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１７細胞）を定義するものである。注目すべきなのは、Ｔｈ１７細胞には、抗腫瘍免疫を促進することによって癌に対して何らかの防御的役割を果たしていると考えられている点である。腫瘍浸潤Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１７に加えてＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＴＮＦなどの他のサイトカインも発現する。注目すべきなのは、一部のＴＤＯ特異的Ｔｈ１７細胞がこれと同様のエフェクターＴ細胞サイトカインプロファイルを示すということである。さらに、ＴＤＯ特異的ＩＬ−１７応答を有する癌患者にはＯＳが改善される傾向がみられた。
【０２５２】
一方、癌患者では、ＴＤＯエピトープに応答したＩＬ−１０の放出が観察された。ＩＬ−１０は、とりわけＴｒｅｇが産生する免疫抑制性サイトカインの１つである。Ｔｒｅｇは、免疫の恒常性を維持するほか、自己抗原に対する寛容性を保証するのに重要である。したがって、ＴＤＯ特異的ＴｒｅｇがＴＤＯ媒介性免疫抑制を増強し、それにより癌細胞の免疫逃避を促進するとも考えられる。このため、ＩＬ−１０を産生するＴＤＯ反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞を有する患者には、ＯＳが改善される傾向がみられた。ＴＤＯペプチドに応答するＩＬ−１７＋／ＩＬ−１０−産生Ｔ細胞を有する患者とＴＤＯペプチドに応答するＩＬ−１７−／ＩＬ−１０＋産生Ｔ細胞を有する患者のＯＳの差は顕著なものであった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖したＣＤ８＋ＴＤＯ反応性Ｔ細胞の機能の特徴付けから、この細胞は、起源が異なりＨＬＡの一致する腫瘍細胞を殺滅することが明らかになった。
【０２５３】
（参考文献）
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月29日(2017.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2017533182.tif 000027
2017533182.tif 000028
2017533182.tif 000029