(57)【要約】  本発明は試料中のＲＮＡの検出方法であって、以下、（ａ）特定量の桿状ウイルス様粒子を試料と混合し、該桿状ウイルス様粒子がリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、（ｉ）該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｉｉ）該ウイルスコートが桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含み；（ｂ）該試料からＲＮＡを単離し；そして（ｃ）異種配列を含むＲＮＡを検出すること、を含む、方法を提供する。
2017505143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＲＮＡの検出方法であって、以下、
（ａ）特定量の桿状ウイルス様粒子を試料と混合し、該桿状ウイルス様粒子がリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、
（ｉ）該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列（ｏｒｉｇｉｎ−ｏｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び異種配列を含み；かつ
（ｉｉ）該ウイルスコートが桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含み；
（ｂ）該試料からＲＮＡを単離し；そして
（ｃ）異種配列を含むＲＮＡを検出すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記構築起点配列が１５０から３００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の試料中のＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
前記構築起点が３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、
（Ａ）配列番号２の配列；又は
（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は
（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、
を含む、配列である、請求項１又は２に記載の試料中のＲＮＡの検出方法。
【請求項４】
前記構築起点配列が直接リボ核酸分子の３´末端にある、請求項１から３のいずれか一項に記載の試料中のＲＮＡの検出方法。
【請求項５】
ＲＮＡの定量的検出を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の試料中のＲＮＡの検出方法。
【請求項６】
試料中の目的の第２のＲＮＡの検出をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の試料中のＲＮＡの検出方法。
【請求項７】
目的のＲＮＡと異種配列を有するＲＮＡとの比率が決定されるステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の試料中のＲＮＡの検出方法。
【請求項８】
前記目的のＲＮＡ及び前記異種配列を有するＲＮＡが、同一の検出方法によって検出される、請求項５から７のいずれか一項に記載の試料中のＲＮＡの検出方法。
【請求項９】
前記検出方法が、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、その他の核酸増幅法、例えば核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ノーザンブロット、及び／又は分岐ＤＮＡを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の試料中のＲＮＡの検出方法。
【請求項１０】
前記桿状ウイルスがタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）である、請求項１から９のいずれか一項に記載の試料中のＲＮＡの検出方法。
【請求項１１】
ＲＮＡ分解及び／又はＲＮＡ定量化のための、内部ＲＮＡ標準として又は陽性対照としての桿状ウイルス様粒子の使用であって、該桿状ウイルス様粒子がリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、
（ａ）該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ、
（ｂ）該ウイルスコートが桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含む、使用。
【請求項１２】
リボ核酸分子及びウイルスコートを含む桿状ウイルス様粒子であって、
（ａ）該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を含み、該構築起点配列が１５０から３００ヌクレオチドの長さを有し；かつ、
（ｂ）該ウイルスコートが桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含む、桿状ウイルス様粒子。
【請求項１３】
前記構築起点が３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、
（Ａ）配列番号２の配列；又は
（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は
（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、
を含む、配列である、請求項１２に記載の桿状ウイルス様粒子。
【請求項１４】
前記構築起点配列が直接リボ核酸分子の３´末端にある、請求項１２又は１３に記載の桿状ウイルス様粒子。
【請求項１５】
前記桿状ウイルスがタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の桿状ウイルス様粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のＲＮＡの検出方法であって、該方法はリボ核酸分子及びウイルスコートを含む桿状ウイルス様粒子の使用を含み、該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列（ｏｒｉｇｉｎ−ｏｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び異種配列を含む、方法に関する。本発明に係る桿状ウイルス様粒子中で異種ＲＮＡをカプシド形成することは、ＲＮＡを分解から保護する。
【背景技術】
【０００２】
技術背景
ユビキタスなＲＮａｓｅによるＲＮＡの急速な分解は、ＲＮＡの実験的な取扱い中に障害となる。特に、生物試料から得られるＲＮＡの分析は試料中に内在的に存在するＲＮａｓｅの存在によって複雑化する。生物試料から得られるＲＮＡの分析におけるさらなる問題は、安定な内部標準がないことである。しかしながら生物試料中の特定のＲＮＡの絶対的定量は、例えばＨＩＶ又はＨＣＶによる感染などのウイルス感染を有する患者の診断及び治療の重要な部分である。したがって、試料中のＲＮＡの定量化を改善し、かつ試料の実験的な取扱い又は保存中にＲＮＡ分解の程度を決定することを助けるＲＮＡ標準の必要がある。
【０００３】
先行技術は、バクテリオファージＭＳ２のタンパク質を用いるＲＮＡのカプシド形成によって、ＲＮＡがリボヌクレアーゼから保護されることを提示した（米国特許第５，６７７，１２４号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１９２６８９号明細書）。カプシド形成されたＲＮＡは、ファージＲＮＡ及び試料中のＲＮＡの定量化のためのＲＮＡ標準として使用することができる、外来配列のハイブリッドであった。ＭＳ２のカプシド形成されたＲＮＡは「Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ」として知られている。ＭＳ２バクテリオファージは、１８０のコートタンパク質及び単一のＡタンパク質から構成される正２０面体構造である。線状、一本鎖ＲＮＡ（＋）ゲノムはサイズが約４ｋｂである。ファージの正２０面体構造及び直径で約２７ｎｍの固定サイズのため、ＭＳ２ゲノムに挿入され得る外来ＲＮＡの長さは約２ｋｂに限られる。また、ＭＳ２の自然宿主は哺乳動物の腸内にも見られる腸内細菌である。したがって、臨床設定における診断のためのファージＭＳ２の使用は、復帰又は野生型ファージとの交配のリスクを負う。
【０００４】
さらに、分子診断におけるＲＮＡ標準としての使用のためにＱｂｅｔａファージの誘導体でＲＮＡをカプシド形成することが提案されている（Ｖｉｌｌａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ｐ．３５５５〜６３）。ＭＳ２と同様に、Ｑｂｅｔａは、正２０面体対称で、例えば自然宿主としてＥ．コリ（ｃｏｌｉ）を有する、レヴィウイルス科のウイルスファミリーのメンバーである。その結果、Ｑｂｅｔａのカプシド形成はＭＳ２のカプシド形成と同じサイズ制限及び潜在的な安全上の問題を有する。
【０００５】
Ｓｌｅａｔら（１９８６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５５：２９９〜３０８）は、ＲＮＡを桿状ＴＭＶ粒子に組み込むことを試みた。この目的のためにＲＮＡコンストラクトが使用され、約４４０ｎｔの長さを有するＴＭＶの構築起点（ＯＡＳ）配列を含んだ。完全なＴＭＶ様粒子の構築は選択された配列の一部に限られたことが示された。実施例のいずれにおいても、構築工程は１．５〜１．６ｋｂ超のＲＮＡ転写産物に進展しなかった。他の著者は非常に短いＯＡＳ配列を使用した。例えば、Ｔｕｒｎｅｒら（１９８８、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０３：５３１〜５４７）は、７５ｎｔの長さを有するＴＭＶのＯＡＳ配列がＴＭＶ構築に十分であったことを公表した。しかしながら、本発明者らは、パッケージ化されたＲＮＡが異種の非ＴＭＶ配列を含む場合、当該技術分野で他者により提案された非常に短くも長くもないＯＡＳコンストラクトが安定なＶＬＰの構築を容易にすることを発見した。それゆえ、該コンストラクトはＲＮＡ標準としての商業的応用に必要とされる長期安定性を欠く。その結果、これら粒子は、例えばＲＮＡの検出のための市販の製品及びキットにおける標準としての使用には適さない。
【０００６】
したがって、当該技術分野において、安定なＲＮＡを提供し、かつ、異種ＲＮＡ配列をパッケージするために普遍的に使用できるＲＮＡパッケージングシステムの必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、試料中のＲＮＡの検出方法であって、以下、（ａ）特定量の桿状ウイルス様粒子を試料と混合し、該桿状ウイルス様粒子がリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、（ｉ）該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｉｉ）該ウイルスコートが桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含み；（ｂ）該試料からＲＮＡを単離し；そして（ｃ）異種配列を含むＲＮＡを検出すること、を含む、方法を提供する。
【０００８】
本発明は、内部ＲＮＡ標準として又は陽性対照としての役割を果たすことができる異種ＲＮＡをカプシド形成する特に有利なウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及び該ＶＬＰを使用する方法を提供する。例えば、本発明のＶＬＰは試料の処理又は増幅工程を観察するための陽性対照として使用することができる。ＶＬＰは臨床検査室で安全に使用することができる。ＶＬＰは、桿状ウイルスのウイルスコート、及び桿状ウイルスの構築起点配列を含むＲＮＡを用いて調製される。ＶＬＰのタンパク質コートはＲＮａｓｅ消化からＲＮＡ分子を保護する。
【０００９】
本発明の重要な利点は、ウイルスコートの長さがＲＮＡ分子の長さに自動的に適合されるため、ＶＬＰ内のＲＮＡのサイズは本質的にサイズの制限を受けないという事実にある。したがって該ＲＮＡは２００〜１００，０００ヌクレオチドを含み得る。用語「ヌクレオチド」（ｎｔ）及び「リボヌクレオチド」は本明細書中で互換的に用いられる。用語「ヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子の文脈におけるデオキシリボヌクレオチドを言うと同時に、ＲＮＡ分子の文脈においてリボヌクレオチドを言う、ということが理解されるであろう。
【００１０】
本発明のさらなる利点は、本発明のＶＬＰは植物細胞に自然に感染するウイルスに由来するという事実にあり、それはＶＬＰの安全性を高める。
【００１１】
本発明の実施形態のさらなる利点は、ＲＮＡ標準としてのそれらの商業的使用のための必須の前提条件であり、かつこれらの製品の保存及び輸送における実用を可能にする、桿状ウイルス様粒子の良好な安定性によって提供される。
【００１２】
本発明はさらに、ＲＮＡ分解及び／又は定量化のための内部ＲＮＡ標準として又は陽性対照としての桿状ウイルス様粒子の使用であって、該桿状ウイルス様粒子がリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、
（ａ）該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ
（ｂ）該ウイルスコートが桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含む、
使用を提供する。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、ＶＬＰが上記で定義されたリボ核酸分子及びウイルスコートを含むような桿状ウイルス様粒子に関する。本発明の桿状ウイルス様粒子のリボ核酸分子に含まれる構築起点配列は、１５０から３００ヌクレオチドの長さを有する。この長さを有する構築起点配列を使用することは、効率的かつ普遍的な（すなわち異種配列と無関係である）パッケージングのための必要な配列及び構造要素を提供し、同時に不安定要素を含まない。
【００１４】
関連する態様では、本発明は、リボ核酸分子及びウイルスコートを含む桿状ウイルス様粒子の製造のための方法であって、以下、
（ａ）リボ核酸分子及び桿状ウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を混合し、該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び少なくとも１つの異種配列を含み；
（ｂ）ステップａ）の前にリボ核酸分子及び／又は少なくとも１種のコートタンパク質を加熱し、及び／又は、ステップａ）の後に混合物を約３０℃と約１００℃との間の温度まで、好ましくは約７０℃まで、より好ましくは約４０℃まで、少なくとも１度加熱すること、
を含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明の最も好ましい実施形態によれば、桿状ウイルス様の粒子はタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に由来する、すなわちＴＭＶコートタンパク質及びＴＭＶ構築起点配列（又はＯＡＳ）を含む。したがって、ＯＡＳは好ましくは３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、
（Ａ）配列番号２；又は
（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は
（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、
を含む、配列である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】以下の処理後のアガロースゲル電気泳動：レーン１：完全な消化をもたらす、コートタンパク質の非存在下でのＲＮａｓｅ  Ａ（０．１ｎｇ／μｌ）有りのＩＶＴ−ＲＮＡ（約０．１μｇ／μｌ）のインキュベーション。レーン２：コートタンパク質の非存在下及びＲＮａｓｅの非存在下での対照反応。レーン３：ＲＮａｓｅ処理なし、コートタンパク質（約２μｇ／μｌ）有りの構築反応後のＩＶＴ−ＲＮＡ（約０．１μｇ／μｌ）。レーン４：ＲＮａｓｅ処理（約０．１ｎｇ／μｌ）有り及びコートタンパク質（約２μｇ／μｌ）有りの構築反応後のＩＶＴ−ＲＮＡ（約０．１μｇ／μｌ）、劣化保護は明らかである。
【図２】ｃＤＮＡ希釈系列による標準曲線。
【図３】長期間のＲＮａｓｅとインコーテッドＲＮＡのインキュベーション。保護されていない、遊離ＲＮＡ（■、点線）は非常に低いレベルまで急速に減少した。一方で、異なるＲＮａｓｅレベル（●１Ｕ／アッセイ、○０．１Ｕ／アッセイ）による有意な分解及び有意差は、インコーテッドＲＮＡ粒子内のＲＮＡについて観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明の方法は、任意の試料、すなわち任意の起源の試料中のＲＮＡの検出を可能にする。試料は任意の試料、例えば実験室試料、生物試料、又は臨床試料であってもよい。好ましい実施形態では、試料はリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。試料は細胞を含んでもよく、又は無細胞であってもよい。試料は固体又は液体でもよい。好ましくは、試料は液体、例えば水溶液である。
【００１８】
実験室試料は、実験室設定での実験中に生成される試料、例えばＲＮＡの化学的、生化学的又は細胞合成中に生成される試料である。細胞又は無細胞系におけるＲＮＡの合成に適した方法は当業者に知られている。ＲＮＡの化学合成は例えば固相合成によって行うことができる。固相合成において、リボ核酸オリゴヌクレオチドのビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ）は例えばビーズ上に固定化され、そして反応溶液中で段階的に合成される。生化学的ＲＮＡ合成は、例えばＭｉｌｂｕｒｎらによって米国特許第５，２５６，５５５号明細書に記載された反応における、例えばイン・ビトロのＲＮＡの転写によって行われる。ＲＮＡのイン・ビトロ転写中に、ＲＮＡ分子は、単離され精製されたＲＮＡポリメラーゼ酵素によって、標的配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む鋳型ＤＮＡ、ＤＴＴ及び好適な金属イオン例えばマグネシウム、マンガン、コバルト等を含有する緩衝系、ならびにリボヌクレオシド三リン酸（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）（ＮＴＰ）を用いて合成される。
【００１９】
生物試料は、生物、例えば細菌、真菌、植物、又は動物、例えば脊椎動物、例えば哺乳動物に由来する試料である。さらに、用語「生物試料」は、細胞が生物有機体をそれらの起源とする場合、細胞又は細胞の集合体に由来する試料も含む。したがって、生物試料は細胞培養又は組織培養由来の試料であってもよい。
【００２０】
臨床試料は個体から得られる試料であって、該個体は好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。例えば、臨床試料は、体液、例えば血液、尿、唾液、脳脊髄液など；組織、例えば臓器、皮膚、腫瘍など；及び糞便、からなる群から選択される試料であってもよい。
【００２１】
上記の試料中のＲＮＡの検出方法のステップ（ａ）では、特定量の桿状ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が試料と混合される。ＶＬＰはウイルスに類似しているが、しかしながら、本発明の最も好ましい実施形態ではＶＬＰは複製欠損性である。したがって、ＶＬＰはウイルス複製の必須要素を欠く。それにもかかわらず、本発明に係るＶＬＰはＶＬＰ構築に必須である遺伝要素を含む。好ましい実施形態では、ＶＬＰは、ＶＬＰの構築に必須であるウイルスゲノムのそれらの要素のみを含み、ウイルスゲノムのさらなる要素を含まない。例えば、桿状ウイルスがＴＭＶである場合、ＶＬＰは好ましくはＴＭＶ構築起点配列のみを含み、さらなるＴＭＶ配列を含まない。より好ましくは、桿状ウイルスはＴＭＶであり、該ＶＬＰはＴＭＶ構築起点配列のみを含み、さらなるＴＭＶ配列を含まず、そして、該構築起点は３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、
（Ａ）配列番号２の配列；又は
（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は
（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、
を含む、配列である。
【００２２】
ＶＬＰは桿状である、すなわちＶＬＰは球体、例えば球状又は正２０面体の構造を有さない。したがって、ウイルスの長さが含まれるリボ核酸分子の長さに依存するのに対し、桿状ＶＬＰはほぼ一定の直径を有する。桿状体は、リボ核酸分子を含むらせん構造で例えばコートタンパク質を含む。リボ核酸分子の位置はらせんの内側又は外側とすることができる。ＶＬＰの直径は、好ましくは約１８ｎｍ、通常は約１０と約２５ｎｍとの間である。例えばＶＬＰは、少なくとも１０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、又は少なくとも５００ｎｍの長さを有してもよい。好ましくは、ＶＬＰは少なくとも３００ｎｍの長さを有する。より好ましくは、ＶＬＰは少なくとも５００ｎｍの長さを有する。ＶＬＰの長さは、例えば１０〜２０００ｎｍ（すなわち１０ｎｍから２０００ｎｍまで）、５０〜２０００ｎｍ、３００〜２０００ｎｍ、４００〜２０００ｎｍ、又は５００〜２０００ｎｍであってもよい。しかしながら、ＶＬＰはまた、より長い、例えば１０〜１００００ｎｍ、５０〜１００００ｎｍ、３００〜１００００ｎｍ、４００〜１００００ｎｍ又は５００〜１００００ｎｍであってもよい。
【００２３】
ＶＬＰは任意の標準的な混合手段によって試料と混合される。ステップ（ａ）における混合は、ＶＬＰを試料に添加するステップ（ａ１）、及び／又は、ＶＬＰと試料とを混合するステップ（ａ２）を含むことができる。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、ＶＬＰを試料に添加するステップ（ａ１）、及び得られる溶液を混合するステップ（ａ２）を含む。例えば、ＶＬＰはピペット操作、注入、拡散などによって試料に添加されてもよい。混合、すなわち試料及びＶＬＰの均質な混合物の形成は、例えばピペット操作、振とう、例えば穏やかな又は激しい振とう、回転などによるものであってもよい。しかしながら、混合はまた、拡散、例えばＶＬＰ及び試料がエントロピーを介して混合されるまで待つことによるもの、又は超音波などで促進される拡散によるものであってもよい。
【００２４】
ステップ（ａ）では特定量のＶＬＰが使用される。特定量とは、混合前又は混合時にその量が既知であるか、容易に測定できる場合の量である。手順のこの方法の利点は、ＶＬＰに含まれる異種ＲＮＡを標準として使用することができるという事実にある。ＶＬＰは例えば既知の濃度及び容積で使用されてもよい。当業者はＶＬＰの濃度又は絶対量の測定方法を知っている。コートタンパク質の数及びリボ核酸分子の数はＶＬＰ粒子の数と相関する。単一のＶＬＰ中のコートタンパク質の数は既知の封入されたリボ核酸分子の長さによって決定されるため、コートタンパク質の数はＶＬＰ分子の数と相関する。それゆえ、コートタンパク質又はリボ核酸の濃度又は量の測定に適した方法は、ＶＬＰの濃度又は量を測定することにも適しており、逆も同様である。コートタンパク質の濃度又は量の測定を可能にする方法は、例えば標準的なタンパク質濃度の測定、例えばＵＶ吸収の測定、キサントプロテインで、ミロンによる、ニンヒドリンで、ビウレットでの検出、ブラッドフォード試験、ローリーによる測定、ＢＣＡ反応などである。リボ核酸の濃度又は量の測定方法は、例えば、ＯＤ260nm及びＯＤ280nmでの光学密度の測定、蛍光の測定、電気泳動分析、キャピラリー電気泳動、リン酸含量の測定、ＲＮＡの酵素加水分解後のヌクレオチド量の定量化、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析などである。ＯＤ260nm及びＯＤ280nmでの光学密度は、定義された波長測定値又はＵＶスペクトルから得られる。蛍光は、臭化エチジウム、ＳＹＢＲなどのような核酸結合色素と組み合わせて測定することができる。電気泳動分析は、染色されるアガロースゲルを用いて行うことができる。キャピラリー電気泳動は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  ２２００などのような装置を用いて行うことができる。ＲＮＡの酵素加水分解後のヌクレオチド量の定量化は、上述のＯＤ260nm及びＯＤ280nmでの光学密度を測定することによって達成できる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析に適した装置は、例えばＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  Ｑである。
【００２５】
上に示したように、ＶＬＰはリボ核酸分子及びウイルスコートを含む。好ましい実施形態では、ＶＬＰはリボ核酸及びウイルスコートから成る。しかしながら、ＶＬＰは、物理的なイオン又は共有結合によって結合される他の分子、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペプチドなどをさらに含んでもよい。
【００２６】
リボ核酸（ＲＮＡ）分子はリボヌクレオチドの鎖である。ＲＮＡ分子はリボヌクレオチドから成ることが好ましい。しかしながら、ＲＮＡ分子は、リボース及び／又は塩基の修飾を含む修飾されたリボヌクレオチド（ｎｔ）をさらに含んでもよい。好適なリボース修飾は例えば、メチル化、例えばホスホチオエートのようなリン酸修飾などからなる群から選択される。好適な塩基修飾は例えば、メチル化、例えば５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）のような例えばピリミジン塩基の５´位のメチル化、；例えばプソイドウリジン（ｐｓｅｕｄｏ−Ｕ）のような、異性化；などからなる群から選択される。さらに、ＲＮＡ分子はまた、他の化学修飾、例えば１又は複数のビオチン、ＰＥＧ、ペプチドの付加、逆位のジヌクレオチド、例えばキャップ構造などを含んでもよい。
【００２７】
好ましくは、ＶＬＰに含まれるリボ核酸は単分節（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）である、すなわちＶＬＰはリボ核酸の単一の分子を含む。ＲＮＡ分子が一本鎖、すなわち一本鎖ＲＮＡであることも好ましい。しかしながら、ＲＮＡ分子は二次及び三次構造要素を有し得るので、これは、ＲＮＡ分子が例えば二重らせんを形成する部分を含むことができるということを排除するものではない。例えばＴＭＶの天然ＲＮＡゲノム（配列番号６）はヘアピンループ構造を形成する。それは、ＲＮＡを含まないウイルスコアの周りにらせん構造を形成する。しかしながら、ウイルスコートの形成が阻害されず、かつ、ＲＮａｓｅ及びヌクレアーゼに対する保護が維持される限り、本ＶＬＰに含まれるＲＮＡ分子の構造は、上記の考慮事項によって限定されるものではない。ＲＮＡ分子は、線状、環状又は分岐状、例えば１又は複数の分岐を有する分岐状である。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は線状である。
【００２８】
好ましくは、ＲＮＡ分子は一本鎖ＲＮＡのＲＮＡ分子、例えば一本鎖ＲＮＡ（＋）又は一本鎖ＲＮＡ（−）分子である。
【００２９】
ＲＮＡ分子によって含まれる異種ＲＮＡ配列はセンス又はアンチセンス配列であってもよい、すなわち、塩基の所望の配列を有する、又は所望の配列の逆相補体であってもよい。
【００３０】
原理的には、ウイルスコートの長さはＲＮＡ分子の長さに適合されるため、ＲＮＡ分子はサイズの制限を受けない。それゆえ、ＲＮＡ分子は、ほぼＯＡＳの長さである約１５０又は２００リボヌクレオチドと同じくらい短くてもよい。しかしながら、ＲＮＡ分子はまた、数百又は数千リボヌクレオチドの長さを有してもよい。例えば、ＲＮＡ分子は、少なくとも１５０リボヌクレオチド、少なくとも２００リボヌクレオチド、少なくとも３５０リボヌクレオチド、少なくとも５００リボヌクレオチド、少なくとも１０００リボヌクレオチド、少なくとも２０００リボヌクレオチド、少なくとも５０００リボヌクレオチド、少なくとも６０００リボヌクレオチド、少なくとも７０００リボヌクレオチド、少なくとも８０００リボヌクレオチド、又は少なくとも９０００リボヌクレオチドの長さを有することができる。好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は少なくとも２０００リボヌクレオチドの長さを有する。ＲＮＡ分子が少なくとも５５００リボヌクレオチドの長さを有することはさらに好ましい。ＲＮＡ分子はさらに数千又は数万リボヌクレオチドまでの長さを有してもよい。したがって、ＲＮＡ分子の長さは、例えば１５０〜１００，０００リボヌクレオチド、２００〜１００，０００リボヌクレオチド、３５０〜１００，０００リボヌクレオチド、５００〜１００，０００リボヌクレオチド、１０００〜１００，０００リボヌクレオチド、２０００〜１００，０００リボヌクレオチド、５０００〜１００，０００リボヌクレオチド、６０００〜１００，０００リボヌクレオチド、７０００〜１００，０００リボヌクレオチド、８０００〜１００，０００リボヌクレオチド、又は９０００〜１００，０００リボヌクレオチドであってもよい。
【００３１】
リボ核酸分子は、桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を含む。
【００３２】
ＲＮＡ分子中のＯＡＳはイン・ビトロでＶＬＰの自己構築を提供する。ウイルスコートタンパク質は最初にＲＮＡ分子中のＯＡＳ配列に結合し、それによって構築開始構造を与え、そこからＶＬＰはＲＮＡ分子が完全にカプシド形成されるまで、さらなるコートタンパク質の繰り返しの添加によってその後成長することができる。本発明の意味における用語「構築起点配列」は、必ずしも完全長の野生型ＯＡＳ配列を言わない。代わりに、それは、ＶＬＰの効率的な構築及び良好な長期安定性を保証する野生型ＯＡＳ配列の任意の断片又は変異体を言う。効率的な構築及び良好な長期安定性の評価のための方法は当該技術分野において既知であり、例えば本明細書中の他の箇所にも記載される。
【００３３】
ＯＡＳは任意の桿状ＲＮＡウイルス由来のＯＡＳであってもよいが、しかしながら、ＯＡＳ及び少なくとも１種のコートタンパク質は同一のウイルスに由来することが好ましい。特に好ましい実施形態では、ＯＡＳ及び少なくとも１つの少なくとも１種のコートタンパク質はＴＭＶに由来する、すなわちＴＭＶのＯＡＳ及び少なくとも１つのＴＭＶコートタンパク質である。特に言及しない限り「ＴＭＶ」は野生型ＴＭＶを言うということが理解されるであろう。したがって、好ましくはＯＡＳ及び少なくとも１種のコートタンパク質は野生型ＴＭＶに由来する。言い換えれば、本発明に係る桿状ウイルス様粒子及び本発明の方法における使用のための桿状ウイルス様粒子は、好ましくはリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、（ｉ）該リボ核酸分子はＴＭＶの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｉｉ）該ウイルスコートはＴＭＶの少なくとも１種のコートタンパク質を含む。
【００３４】
それにもかかわらず、ＴＭＶのＯＡＳの突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）又は変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）、及び突然変異体又は変異体ＴＭＶコートタンパク質も、本発明の方法又はＶＬＰに使用することができる。ＴＭＶのＯＡＳの突然変異体又は変異体、及び突然変異体又は変異体ＴＭＶコートタンパク質は、野生型ＯＡＳ又は野生型コートタンパク質と比較して、ＶＬＰ構築効率及び／又はＶＬＰ安定性に関して同一又は改善された特性を有する。したがって、代替のコートタンパク質又はコートタンパク質の混合物も使用することができる。
【００３５】
本発明の最も好ましい実施形態では、ＶＬＰはＴＭＶに由来し、かつ、ＯＡＳはＴＭＶのＯＡＳである。ＴＭＶ構築配列のコア、すなわち構築に必要な最小限のＯＡＳ配列は、Ｔｕｒｎｅｒら（１９８８、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０３：５３１〜５４７）によって、ＴＭＶゲノム（配列番号６）の５´末端から５４４４と５５１８残基との間に内在的に位置する７５ヌクレオチドの配列（配列番号９）として同定された。したがって、ＯＡＳは配列番号９を含んでもよい。本発明の文脈において、ＴＭＶのＯＡＳのさらなる断片（配列番号１、配列番号２及び配列番号１０）が、得られる粒子の構築効率及び安定性について分析された。配列番号１は、ＴＭＶゲノム（配列番号６）の５´末端から５４２０と５５４６残基との間に内在的に位置する。配列番号２は、ＴＭＶゲノム（配列番号６）の５´末端から５３１３と５５４６残基との間に内在的に位置する。配列番号１０は、ＴＭＶゲノム（配列番号６）の５´末端から５１００と５６９２残基との間に内在的に位置する。したがって、代わりに、ＯＡＳは例えば配列番号２であってもよい。
【００３６】
驚くべきことに、本発明の文脈において、ＯＡＳの長さは、桿状ウイルス様粒子の効率的な構築、粒子の長期安定性、及び任意の異種ＲＮＡ配列に対するシステムの普遍的な適用性にとって決定的であるということが見出された。特に、本明細書中の他の箇所で概説されるように、本発明者らは驚くべきことに、ＴＭＶのＯＡＳの２３４ｎｔの配列（配列番号２）が、ウイルス構築に特に適しており、かつ、１２７又は５９３ヌクレオチドの長さを有するＯＡＳ配列（それぞれ配列番号１及び１０）に対して、得られる粒子の安定性及び構築効率に優れているということを見出した。配列番号２は配列番号１及び配列番号１０よりも優れていることが見出されたが、本発明に係るＴＭＶのＯＡＳはわずかにより長く又はより短くすることもできる、すなわち、限られた数のヌクレオチドが、得られるＶＬＰの構築効率又は長期安定性に影響することなく、配列番号２から追加又は削除され得るということが理解されるであろう。
【００３７】
具体的には、言及された有利な特性は１５０から３００リボヌクレオチドの長さを有するＯＡＳ´によって達成されるということが見出された。それゆえ、ＯＡＳは、１５０から３００、１６０から２９０、１７０から２８０、１９０から２８０、２１０から２６０、又は２３０から２４０のリボヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、ＯＡＳは１５０から３００リボヌクレオチドの長さを有する。好ましい実施形態では、ＯＡＳは１９０から２８０リボヌクレオチドの長さを有する。さらに好ましい実施形態では、ＯＡＳは２１０から２６０リボヌクレオチドの長さを有する。例えば、本発明に係る桿状ウイルス様粒子及び本発明の方法における使用のための桿状ウイルス様粒子は、好ましくはリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、（ｉ）該リボ核酸分子がＴＭＶの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｉｉ）該ウイルスコートがＴＭＶの少なくとも１種のコートタンパク質を含み、該構築起点が１５０から３００ｎｔの長さを有する配列である。
【００３８】
言い換えれば、ＯＡＳは３００ヌクレオチドまでの長さを有することになる。例えば、ＯＡＳは、３００まで、２９０まで、２８０まで、２７０まで、２６０まで、２５０まで、又は２４０までのリボヌクレオチドの長さを有する。
【００３９】
それにもかかわらず、ＯＡＳは少なくとも２３４ヌクレオチドの長さを有する配列を含むことが好ましい。それゆえ、ＯＡＳは好ましくは、２３４から３００、２３４から２９０、２３４から２８０、２３４から２８０、２３４から２６０、又は２３４から２４０リボヌクレオチドの長さを有する。一実施形態では、ＯＡＳは、２３４から３００リボヌクレオチドの長さを有する。好ましい実施形態では、ＯＡＳは２３４から２８０リボヌクレオチドの長さを有する。さらに好ましい実施形態では、ＯＡＳは２３４から２６０リボヌクレオチドの長さを有する。
【００４０】
このことは、リボ核酸分子が、桿状ウイルスのＯＡＳに属するさらなるリボヌクレオチド又は配列を含まないことを意味する。桿状ウイルスにおけるＯＡＳの位置はよく知られているか、当該技術分野で知られている標準的な試験方法によって決定することができる。例えば、ＴＭＶのＯＡＳは〜４４０ｂｐの長さを有し得ることが知られている（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５５：２９９〜３０８）。例えば異種配列に属するヌクレオチドからのＯＡＳ配列の識別を可能にする方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、ＯＡＳの配列は科学論文又はデータベースから得ることができる。あるいは、ＯＡＳ配列は、例えば欠失突然変異体のシークエンシング実験及び機能解析によって実験的に得ることもできる。ＯＡＳの配列についての一例は配列番号２である。その後ＯＡＳ配列は、コンピューターアラインメントツール及び例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、本発明のリボ核酸分子へとアラインすることができる。それによって、当業者は、リボ核酸分子中の配列がＯＡＳ、例えば：（Ａ）配列番号２の配列；又は（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（Ｃ）（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、であるかどうかを容易に決定することができる。
【００４１】
好ましくは、リボ核酸分子は、桿状ＲＮＡウイルス由来の（上記で定義したＯＡＳ配列以外の）さらなるリボヌクレオチド（配列）を含まない。例えば、桿状ウイルスがＴＭＶである場合、リボ核酸分子はＴＭＶのＯＡＳに属するヌクレオチドのみを含み、かつ、好ましくはＴＭＶゲノムの他の領域からのヌクレオチドを含まないこととなる。本発明に係るＯＡＳの短さは、下流アッセイ（例えば異種配列を検出するＲＴ−ＰＣＲアッセイ）によるウイルス骨格配列の干渉のリスクが大幅に低下するというさらなる利点を提供する。
【００４２】
ＯＡＳは好ましくは、配列番号２又はホモログあるいはそれらの断片を含む。言い換えれば、構築起点は、３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、
（Ａ）配列番号２の配列；又は
（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は
（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、
を含む、配列である。
【００４３】
例えば、本発明に係る桿状ウイルス様粒子及び本発明の方法における使用のための桿状ウイルス様粒子は、好ましくはリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、（ｉ）該リボ核酸分子がＴＭＶの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｉｉ）該ウイルスコートがＴＭＶの少なくとも１種のコートタンパク質を含み、該構築起点が３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、
（Ａ）配列番号２の配列；又は
（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は
（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、
を含む、配列である、桿状ウイルス様粒子である。
【００４４】
好ましい実施形態（Ａ）では、ＯＡＳは配列番号２を含み又は配列番号２からなる、すなわち配列番号２に示される配列を有する。本実施形態では、ＯＡＳは２３４から３００ヌクレオチドの長さを有する配列である。さらなる実施形態（Ｂ）では、ＯＡＳは、３００ヌクレオチドまでの長さ、及び配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列である。具体的には、配列番号２の配列は、効率的な構築を誘導するＯＡＳの能力に影響を与えることなく、付加、欠失、又はヌクレオチドの数の突然変異によって改変することができる。当業者は好適な突然変異を設計することができる。例えば、ＯＡＳは二本鎖領域を有するヘアピン構造を含むということが当該技術分野で知られている。したがって突然変異は、好ましくは、二本鎖内の塩基対を形成する両方のヌクレオチドが、同様に塩基対を形成することができる他のヌクレオチドによって置換されることを意味する、補償的突然変異である。上に示したように、配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有するＯＡＳ配列は、配列番号２と比較してＶＬＰ構築効率及び／又はＶＬＰ安定性に関して同一又は改善された特性を有する。
【００４５】
したがって、３００ヌクレオチドまでの長さ、及び配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有するＯＡＳ配列は、配列番号２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有することができる。一実施形態では、配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有するＯＡＳ配列は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する。さらに好ましい実施形態では、配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有するＯＡＳ配列は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する。最も好ましい実施形態では、配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有するＯＡＳ配列は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する。言い換えれば、配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有するＯＡＳ配列は、配列番号２と、８５％から１００％、８６％から１００％、８７％から１００％、８８％から１００％、８９％から１００％、９０％から１００％、９１％から１００％、９２％から１００％、９３％から１００％、９４％から１００％、９５％から１００％、９６％から１００％、９７％から１００％、９８％から１００％、又は９９％から１００％の同一性を有する。さらなる実施形態では、ＯＡＳは、（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片を含む、３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列である。具体的には、該断片は、少なくとも１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０又は２３０ヌクレオチドの長さを有する。好ましい実施形態では、断片は少なくとも２００ヌクレオチドの長さを有する。さらに好ましい実施形態では、断片は少なくとも２２０ヌクレオチドの長さを有する。
【００４６】
（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、すなわち配列番号２又は配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有する配列の断片は、機能的なＯＡＳである。このことは、断片が配列番号２と比較してＶＬＰ構築効率及び／又はＶＬＰ安定性に関して同一又は改善された特性を有することを意味する。好ましくは、断片は、配列番号９又はその機能的な突然変異体及び変異体、すなわちＴＭＶ粒子の構築に必要とされる最小の７５ｎｔ配列を含む。本配列の機能的な突然変異体及び変異体は、例えば補償的突然変異を含み、かつ、配列番号９と比較して、得られるＶＬＰの構築効率及び安定性に関して同一又は改善された特性を有する。（Ｂ）において上記で概説したように、配列番号９の機能的な突然変異体及び変異体は、配列番号９と、少なくとも８５％の同一性、好ましくは９０％の同一性、より好ましくは９５％の同一性を有することとなる。
【００４７】
配列番号９に関して、（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片は配列番号９の５´及び３´に付加的なヌクレオチドを含むことができる。例えば、本発明の文脈において、ＴＭＶのＯＡＳ由来の約３０ヌクレオチドを配列番号９の３´末端に付加することは有利であるということが見出された。具体的には、（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片が、配列番号９及びＴＭＶのＯＡＳ由来の約２８のさらに連続したヌクレオチドを配列番号９の３´末端に含むことが好ましい。「約」２８ヌクレオチドとは、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドを付加することができることを意味する。しかしながらこれは、さらなるＴＭＶのＯＡＳヌクレオチドが配列番号９の３´末端に付加され得ることを排除するものではない。（Ｂ）において上記で概説したように、断片はまた、配列番号９と少なくとも８５％の相同性を有する配列、及びＴＭＶのＯＡＳ由来の約２８のさらに連続したヌクレオチドを配列番号９の３´末端に含むことができる。好ましくは、（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片は、配列番号９、及び配列番号９の３´末端にＴＭＶのＯＡＳ由来の２８（以下）の連続したヌクレオチドを含み、又はそれらと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。
【００４８】
配列番号９及び上述した３´配列又はそれらと少なくとも８５％を有する配列に関して、（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片は、ＴＭＶのＯＡＳ由来の付加的なヌクレオチドを配列番号９の５´に含むことができる。例えば、断片は、配列番号９の５´末端にＴＭＶのＯＡＳ由来の４７から１９７の連続したヌクレオチドを含み、又はそれらと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むことができる。好ましくは、断片は、配列番号９の５´末端にＴＭＶのＯＡＳ由来の約１３１の連続したヌクレオチドを含み、又はそれらと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む（配列番号２と同様）。それにもかかわらず、構築はＯＡＳの３´末端から始まるので、より多くのヌクレオチドが配列番号９から５´に付加され得るということが理解されるであろう。
【００４９】
該ＯＡＳは、構築効率、得られる粒子の安定性、及び実質的に任意の異種ＲＮＡ配列のパッケージングを開始する能力に関して、配列番号２と比較して同一又は改善された特性を有するということが理解されるであろう。
【００５０】
ウイルス構築はＯＡＳの３´末端から始まる。内在的に、ＴＭＶのＯＡＳ配列はウイルスゲノムＲＮＡの３´末端から１Ｋｂに位置する。驚くべきことに、桿状ウイルスの内在性ＲＮＡゲノムからの非必須の３´配列の省略、すなわちまさに３´末端におけるＯＡＳの配置は、ＶＬＰの構築を改善するということが見出された。本発明者らは、所望のＲＮＡコンストラクトにおける配列の制約なしにこの直接の３´末端の配置を可能にする、ＤＮＡ鋳型を構築する方法を確立した。本方法は、インサート特異的ＰＣＲ及び生成されたＰＣＲ産物からのＲＮＡ合成を使用する。手順の詳細は本明細書中の実施例の節で後述する。したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、ＯＡＳは直接リボ核酸分子の３´末端にある。本文脈における「直接」とは、本質的にＯＡＳ配列とリボ核酸分子の３´末端との間にさらなるヌクレオチドがないことを意味する。しかしながら、リボ核酸分子は少数のヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドを、ＯＡＳ配列から３´に含んでもよいということが理解されることになる。好ましくは、リボ核酸分子はＯＡＳに属さない（非ＯＡＳヌクレオチドの）１０未満のヌクレオチドをＯＡＳ配列から３´に含む。本発明の特に好ましい実施形態では、ＶＬＰはＴＭＶコートタンパク質及びＴＭＶのＯＡＳを含み、該ＯＡＳは直接リボ核酸分子の３´末端にある（ＯＡＳと３´末端との間の単一の付加的な３´末端のｎｔなしに）。例えば、本発明に係る桿状ウイルス様粒子及び本発明の方法における使用のための桿状ウイルス様粒子は、好ましくはリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、（ｉ）該リボ核酸分子がＴＭＶの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｉｉ）該ウイルスコートがＴＭＶの少なくとも１種のコートタンパク質を含み、該構築起点が３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって以下、（Ａ）配列番号２の配列；又は（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、を含む配列であって、そして該ＯＡＳが直接リボ核酸分子の３´末端にある（単一の付加的な３´末端のｎｔのない）、桿状ウイルス様粒子である。特に好ましい一実施形態では、本発明に係る桿状ＶＬＰ及び本発明の方法における使用のための桿状ＶＬＰは、好ましくはリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、（ｉ）該リボ核酸分子がＴＭＶの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｉｉ）該ウイルスコートがＴＭＶの少なくとも１種のコートタンパク質を含み、該構築起点が配列番号２の配列を含む３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、そして該ＯＡＳが直接リボ核酸分子の３´末端にある（単一の付加的な３´末端のｎｔのない）、桿状ＶＬＰである。
【００５１】
ＯＡＳの長さ及び位置は、得られる桿状ウイルス様粒子に特に高い安定性を与える。したがって、本発明の粒子は保存中に安定である。「安定な」とは、全ウイルス様粒子の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％が保存中に損傷を受けていないままである、すなわちＲＮａｓｅなどによって分解されないことを意味する。損傷を受けていないウイルス様粒子の検出方法は当該技術分野で知られており、本明細書中の他の箇所にも記載される。例えば、粒子の安定性はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるサイクル閾値（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ  ｖａｌｕｅ）Ｃｔが保存中に１ユニット超で変化しない場合、粒子は安定であるとみなされる。したがって、好ましい実施形態では、本発明のＶＬＰ及び本発明の方法における使用のためのＶＬＰは安定であって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるサイクル閾値Ｃｔが保存中に１ユニット超で変化しない場合、ＶＬＰは安定であるとみなされる。
【００５２】
保存は、例えば−３０℃から−１０℃、例えば約−２０℃であってもよい。保存はドライアイス上での輸送を含んでもよい。保存はまた、（市販の製品に必要とされるように）いくつかの凍結融解サイクルを含んでもよい。さらに、保存は数ヶ月までとすることができる。例えば、保存及び／又は取扱いは、３７℃で３週間まで又は−２０℃で１２ヶ月超とすることができる。したがって、ＶＬＰの安定性を試験するために、ＶＬＰの保存は例えば−３０℃から−１０℃で、２０から２５日間としてもよい。したがって、好ましい実施形態では、本発明のＶＬＰ及び本発明の方法における使用のためのＶＬＰは安定であって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるサイクル閾値Ｃｔが保存中に１ユニット超で変化しない場合、ＶＬＰは安定であるとみなされ、ここで、保存は−３０℃から−１０℃で２０から２５日間である。それにもかかわらず、ＶＬＰはまた、より高い温度で特に安定であることが示された。したがって、別の実施形態では、本発明のＶＬＰ及び本発明の方法における使用のためのＶＬＰは安定であって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるサイクル閾値Ｃｔが保存中に１ユニット超で変化しない場合、ＶＬＰは安定であるとみなされ、ここで、保存は約３７℃で２０から２５日間である。
【００５３】
桿状ＲＮＡウイルスは好ましくは植物特異的ウイルスであり、好ましくはビルガウイルス科のウイルス、例えばフロウイルス属、ホルデイウイルス属、ペクルウイルス属、ポモウイルス属、タバモウイルス属、及びトブラウイルス属からのウイルスからなる群から選択される。桿状ウイルスがタバモウイルス属のウイルスであることは特に好ましい。タバモウイルス属のウイルスは、例えばタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、キュウリ緑斑モザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｔｔｌｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＧＭＭＶ）、トウガラシ微斑ウイルス（Ｐｅｐｐｅｒ  ｍｉｌｄ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＰＭＭｏＶ）、オドントグロッサム輪点ウイルス（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＯＲＳＶ）及びトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）である。特に好ましい実施形態では、桿状ＲＮＡウイルスは、例えば配列番号６に示されるゲノム配列によって表されるＴＭＶなどの、ＴＭＶである。
【００５４】
さらに、植物特異的ウイルスはまた、アルファフレキシウイルス科のウイルス、例えばアレキシウイルス属、ボトレックスウイルス属（Ｂｏｔｒｅｘｖｉｒｕｓ）、ロラウイルス属、マンダリウイルス属、ポテックスウイルス属（例えばジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、クローバーイエローモザイクウイルス（Ｃｌｏｖｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣｌＹＭＶ）、シンビジウムモザイクウイルス（ＣｙｍＭＶ））、及びスクレロダルナウイルス属（Ｓｃｌｅｒｏｄａｒｎａｖｉｒｕｓ）からのウイルスであってもよい。あるいは、植物特異的ウイルスはまた、ポティウイルス科のウイルス、例えばブランビウイルス属、バイモウイルス属、イポモウイルス属、マクルラウイルス属、ポアセウイルス属、ポティウイルス属、ライモウイルス属、及びトリティモウイルス属からのウイルスであってもよい。
【００５５】
ＲＮＡ分子によって含まれる異種配列は任意のＲＮＡ配列であってもよい。本発明の意味における「異種」とは、前記桿状ＲＮＡウイルスのゲノム由来でない配列である。これは、ＲＮＡ分子が内在的に生じるウイルスの配列ではなく、実験的に生成されることを意味する。
【００５６】
ウイルスＯＡＳ及び異種配列を含むＲＮＡ分子の生成のための方法は当業者に知られている。任意の標準的なクローニング方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら．（２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、３ rd  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって記載されたものが使用されてもよい。例えば、ＲＮＡ分子はＤＮＡ鋳型からの転写、例えばイン・ビトロの転写によって生成されてもよい。ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡ分子をコードする配列を含む任意のＤＮＡ分子、例えば環状又は線状ＤＮＡ分子であってもよい。好ましくは、ＤＮＡ鋳型は二本鎖である。好適な転写ベクター系は当該技術分野で知られている。好適なベクターは好ましくはＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、例えばＴ７、ＳＰ６、及び／又はＴ３などを含む。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、分散されてベクターに含まれ、又は、例えばＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に続いて異種配列さらに続いてＯＡＳを含む合成配列を有するベクターに挿入されてもよい。したがって、例えばｐＧＥＭベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から）を使用することができる。
【００５７】
例えば、異種配列は、マーカー配列、真核生物のｍＲＮＡ配列、合成配列及び／又は病原体由来の配列であってもよい。病原体は好ましくは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、Ｇ型肝炎、エンテロウイルス、又は血液媒介病原体からなる群から選択される。
【００５８】
ＲＮＡ分子について上述のように、異種配列も原理的にはそのサイズに制限されない。該配列は少数のリボヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０リボヌクレオチドと同じくらい短くてもよい。しかしながら、異種配列は、より長く、例えば少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、少なくとも１５００、少なくとも１６００、少なくとも１７００、少なくとも１８００、少なくとも１９００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００又は少なくとも９０００リボヌクレオチドとすることもできる。好ましい実施形態では、異種配列は少なくとも１２００リボヌクレオチドの長さを有する。さらに好ましい実施形態では、異種配列は少なくとも２０００リボヌクレオチドの長さを有する。異種配列はさらに数千又は数万までのリボヌクレオチドの長さを有してもよい。したがって、異種配列の長さは、例えば２００〜１００，０００リボヌクレオチド、３５０〜１００，０００リボヌクレオチド、５００〜１００，０００リボヌクレオチド、１０００〜１００，０００リボヌクレオチド、２０００〜１００，０００リボヌクレオチド、５０００〜１００，０００リボヌクレオチド、６０００〜１００，０００リボヌクレオチド、７０００〜１００，０００リボヌクレオチド、８０００〜１００，０００リボヌクレオチド、又は９０００〜１００，０００リボヌクレオチドであってもよい。
【００５９】
その結果、本発明の好ましい実施形態は、試料中のＲＮＡの検出方法であって、以下、
（ａ）特定量のＴＭＶウイルス様粒子を試料と混合し、該ＴＭＶ粒子がリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、
（ｉ）該リボ核酸分子がＴＭＶ構築起点配列及び異種配列を含み、該異種配列が２０００〜１００，０００リボヌクレオチドの長さを有し、かつ該構築起点が３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、
（Ａ）配列番号２の配列；又は
（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は
（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、
を含む配列であり；かつ
（ｉｉ）該ウイルスコートがＴＭＶの少なくとも１種のコートタンパク質を含み；
（ｂ）該試料からＲＮＡを単離し；そして
（ｃ）異種配列を含むＲＮＡを検出すること、
を含む、方法を提供する。
【００６０】
本発明の方法の好ましい実施形態では、異種配列は、ステップａ）における混合前の試料中に存在しない。そして、異種配列の検出を仮説的に歪めることができるバックグラウンドシグナルが無い。しかしながら、混合前の試料中の少量の異種配列は本方法の結果に著しく影響しないということが明らかである。
【００６１】
ＲＮＡ分子はまた、上記配列を超えて、すなわち桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を超えて含むことができる。例えば、ＲＮＡ分子は、桿状ＲＮＡウイルスの１又は複数の付加的な配列を含んでもよい。さらに、ＲＮＡ分子は、例えば、ウイルスＲＮＡ配列セグメント、例えばＨＩＶ、ＨＣＶ、インフルエンザなどのようなウイルスに由来するウイルスＲＮＡ配列セグメント；ｍＲＮＡ配列セグメント、例えばｂｃｒ／ａｂｌ、ＥＧＦＲなどをコードするｍＲＮＡのセグメント；合成制御配列；などからなる群から選択される、１又は複数の付加的な異種配列を含んでもよい。好ましくは、合成制御配列は試料中に存在しない。
【００６２】
本発明の一実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＶＬＰの構築を助ける、すなわち改善し及び／又は促進する少なくとも１つの付加的配列を含む。ＶＬＰの構築を助ける配列は、例えば５´キャップ構造；（ｉ）普遍的な５´リーダー及び（ｉｉ）５´リーダーに相補的な配列の組み合わせ；ならびにポリ（Ａ）ストレッチ、からなる群から選択することができる。
【００６３】
好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は分子の５´末端に位置する５´キャップ構造を含む。本発明の意味における５´キャップ構造は、５´から５´三リン酸結合を介してＲＮＡ分子に結合されたグアノシンヌクレオチドを含む。好適な５´キャップ構造は、例えばｍ7Ｇｐｐｐ（内在性キャップ）、ｍ7ＧｐｐｐＧｍ（内在性キャップ１構造）、３´−Ｏ−メチル−ｍ7Ｇｐｐｐ  （アンチリバースキャップアナログ（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｕｅ）（ＡＲＣＡ）のキャップ構造）、及び２´−Ｏ−メチル−ｍ7Ｇｐｐｐ（ＡＲＣＡのキャップ構造）からなる群から選択される。「ｍ」はヌクレオチドの塩基における指示された位置のメチル化である。「Ｇ」はグアノシンである。「ｐ」はリン酸基である。「Ｏ」は酸素である。
【００６４】
さらなる実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子の５´末端又はその近くに位置する普遍的な５´リーダー及び５´リーダーに相補的な配列を含む。５´リーダーに相補的な配列は、異種配列とＯＡＳとの間に、あるいはＲＮＡ分子の３´末端又はその近くに位置することができる。「近く」とは、５００ヌクレオチド未満、好ましくは１００ヌクレオチド未満、そしてより好ましくは５０ヌクレオチド未満の距離における位置として理解されることとなる。普遍的な５´リーダーは、例えば配列番号３に示されるものであってもよい。そのとき５´リーダーの相補体は配列番号４に示される配列又はそれらの変異体であろう。好ましくは、変異体は、セグメントあたり６リボヌクレオチドの最小の連続した長さを有する、配列番号４の１又は複数のセグメントを含む。
【００６５】
さらに別の実施形態では、ＲＮＡ分子は、例えばＯＡＳ配列に隣接した、ポリ（Ａ）ストレッチを含む。「隣接した」とは、５´の又は３´のいずれかを意味する。さらに、「隣接した」とは、配列間に、例えば１０未満、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、７０未満、８０未満、９０未満又は１００未満などの、限られた数のヌクレオチドのみがあり、又はヌクレオチドがないことを意味する。
【００６６】
ウイルスコートは、ウイルス又はＶＬＰのタンパク質の殻である。通常、それは、同じコートタンパク質の種類又は異なる種類のコートタンパク質の、いくつかのタンパク質モノマー、コートタンパク質からなる。ウイルスコートは桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含む。したがって、ウイルスコートは、桿状ＲＮＡウイルスの１、２、３、４又はより多い種類のコートタンパク質、例えば１から５種の間のコートタンパク質を含んでもよい。さらに、それはまた、異なる桿状ＲＮＡウイルス由来の２以上の種類のコートタンパク質を含んでもよい。タンパク質の種類はアミノ酸配列によって別の種類のコートタンパク質とは異なる。桿状ウイルスのいくつかの種類のコートタンパク質は当該技術分野で記載されている。
【００６７】
特に好ましい実施形態では、コートタンパク質の種類は配列番号５に示されるＴＭＶのコートタンパク質である。このコートタンパク質は、ＴＭＶゲノム（配列番号６）中の位置５７１２〜６１９１においてオープンリーディングフレームによってコードされる。
【００６８】
それゆえ本発明は、配列番号５を含むＴＭＶコートタンパク質、ならびに異種配列と配列番号２を含むＴＭＶのＯＡＳとを含んでなる一本鎖ＲＮＡ、を含むＶＬＰ、あるいはこれらからなるＶＬＰを提供する。本発明はさらに上述の方法及び使用におけるこれらのＶＬＰの使用を提供する。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は従って、配列番号５を含むＴＭＶコートタンパク質、ならびに、５´キャップ構造、異種配列、普遍的な５´リーダー、及び配列番号２を含むＴＭＶのＯＡＳ及びポリ（Ａ）ストレッチを含んでなる一本鎖ＲＮＡを含むＶＬＰ、あるいはこれらからなるＶＬＰを提供する。本発明はさらに上述の方法及び使用におけるこれらのＶＬＰの使用を提供する。
【００７０】
さらなる実施形態では、コートタンパク質の種類は、野生型コートタンパク質、あるいは遺伝的に及び／又は化学的に修飾されたコートタンパク質であってもよい。修飾されたコートタンパク質は、例えば野生型コートタンパク質の突然変異体又は変異体であってもよい。例えば、コートタンパク質の配列中のアミノ酸の変化は、もとのアミノ酸との極性、電荷、溶解性、疎水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行われてもよい。あるいは、アミノ酸の変化は反応性部分、例えばリシンにおけるアミノ基、システインにおけるチオール基、又はセリンにおける水酸基を導入する。さらに修飾は、例えばビオチン、ＰＥＧなど、コートタンパク質へのマーカー分子の導入であってもよい。
【００７１】
用語「突然変異体」は、機能的に同等なタンパク質、例えば、内在性コートタンパク質と比較して、ＶＬＰへのタンパク質の構築及び構築されたＶＬＰにおけるＲＮＡの保護に関して、実質的に同一又は改善された特性を有する突然変異体として理解されるべきである。本文脈における「改善された」とは通常、ＶＬＰへのより速い及び／又はより安定な構築、及び／又は、ＲＮＡのより良好な保護を意味する。しかしながら、例えばＲＮＡ分子の細胞内放出を容易にするために、より安定性が低いＶＬＰを生成することも改善であり得る。これらすべての突然変異体は本発明の一部である。現在好ましい突然変異体では、タンパク質中のアミノ酸の５％未満、又は１％未満、又はさらに０．１％未満が、内在性コートタンパク質と比較して、別のアミノ酸でシフトされ又は欠失していた。
【００７２】
本文脈において、用語「変異体」は、例えばＶＬＰへのタンパク質の構築及び構築されたＶＬＰにおけるＲＮＡの保護に関して、例えば実質的に同一又は改善された特性を有する、本発明のコートタンパク質と機能的に同等であるタンパク質として理解されるべきである。適切なスクリーニング技術を用いて同定され得るそのような変異体は、本発明の一部である。
【００７３】
本発明に係るＶＬＰ中のコートタンパク質モノマーの絶対数は、ＲＮＡ分子の長さに依存する。例えば、自然発生のＴＭＶは、そのカプシド殻中にコートタンパク質の２１３０個のモノマー及び約６４００リボヌクレオチドのゲノム長を有する。ＴＭＶにはコートタンパク質モノマーあたり３リボヌクレオチドがある。したがって、好ましい実施形態では、コートタンパク質の数は、ＲＮＡ分子の３リボヌクレオチドあたり約１である。
【００７４】
好ましくは、ウイルスコートはＲＮＡ分子を囲む桿状のらせん構造である。例えば、桿状のらせん構造はタンパク質モノマーから構築され得る。タンパク質モノマーはコートタンパク質である。
【００７５】
ウイルスコートタンパク質の製造のための方法は当該技術分野で知られている。例えば、該タンパク質は、感染した植物で作られたウイルス調製物から単離され、イン・ビトロで無細胞系において、あるいは例えばＫａｄｒｉら（２０１３、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８９：３２８〜３４０）によって記述された、Ｅ．コリ又は酵母など、真核生物又は細菌の細胞において発現されてもよい。対応する発現コンストラクトは、当該技術分野の標準的な方法によってクローニングできる。
【００７６】
本発明の方法のステップｂ）では、ＲＮＡは試料から単離される。ＲＮＡ単離のための好適な方法は当該技術分野で知られている。当該技術分野で知られている任意の標準的なＲＮＡ単離方法は、ＶＬＰからＲＮＡを遊離させ、ならびに試料からＲＮＡを単離することに適している。例えば、ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉによって開発された酸性グアニジンチオシアナート−フェノール−クロロホルム（ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）抽出法によって単離されてもよく、それは例えばＴｒｉｚｏｌ  ｋｉｔ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で；Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０の方法で；市販されているカラムベースのＲＮＡ単離キットなどで、実施される。本発明の好ましい実施形態では、ＲＮＡはカラムベースのＲＮＡ単離キットでステップｂ）において単離される。
【００７７】
好適なＲＮＡ単離のためのカラムベースキットは例えばＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ及びＱＩＡａｍｐ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））である。ＲＮＡが単離後に実質的に純粋であること、すなわちＲＮＡが、ヌクレアーゼ、ＧＴＣ又はフェノールのような変性試薬、アルコール又はクロロホルムのような有機溶媒のような、後続のＲＮＡ試料の処理を妨げるであろう化合物を本質的に含有しないことが好ましい。さらに、単離されたＲＮＡの調製物が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ならびに低分子ＲＮＡ、例えばｔＲＮＡｓ及び５Ｓ  ｒＲＮＡを実質的に含まないことが好ましい。
【００７８】
当然ながら、当業者はリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）によるコンタミネーションを避けるために、ＲＮＡの単離及びその後の取扱い中に注意するであろう。コンタミネーションを避けるための手段も当該技術分野でよく知られており、例えば無菌のＲＮａｓｅフリーの材料の使用、ＲＮＡ安定化剤、及びＲＮＡの凍結保存が挙げられる。
【００７９】
さらに、ステップｃ）は好ましくはステップｂ）の直後に行われる。あるいは、単離されたＲＮＡはＲＮＡの検出までエタノール沈殿で水溶液として又は懸濁液として凍結され保存することができる。
【００８０】
本発明に係る方法のステップｃ）では、異種配列を含むＲＮＡが検出される。異種配列の検出のためのいくつかの方法は当該技術分野で知られている。特定のＲＮＡ配列の検出のための任意の方法は好適である。以下の検出方法の一つを行う前に、ＲＮＡは逆転写によってＤＮＡへと変換され得る。逆転写反応のための成分及びプロトコルは当該技術分野で広く知られている。
【００８１】
例えば、異種ＲＮＡ配列は、配列特異的なプライマー又はプローブにより検出することができる。配列特異的なプライマーは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸配列に基づく増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）のようなその他の核酸増幅法に使用することができる。配列特異的なプローブは、例えばノーザンブロット、又は分岐ＤＮＡなど非常に高い感度を有する最新版に、例えばＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（アフィメトリクス／パノミクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｐａｎｏｍｉｃｓ））又はＮＣｏｕｎｔｅｒ技術（ナノスフィア（ＮａｎｏＳｐｈｅｒｅ））に使用され得る。
【００８２】
特に好ましい実施形態では、ＲＮＡの検出は定量的検出である、すなわち本方法はＲＮＡの定量的検出を含む。ＲＮＡの定量的検出のための方法も当該技術分野で広く知られている。定量的検出は同じ方法で、すなわち定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＮＡＳＢＡアッセイ、又は定量的プローブベースアッセイ、例えば分岐ＤＮＡに基づくアッセイ、例えばＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（アフィメトリクス／パノミクス）もしくはＮＣｏｕｎｔｅｒ技術（ナノスフィア）などによって、達成することができる。
【００８３】
さらなる実施形態では、試料中のＲＮＡの検出方法は、試料中の目的の第２のＲＮＡの検出をさらに含む。この目的のＲＮＡは、好ましくは試料からのＲＮＡである。例えば、目的のＲＮＡは、マーカーＲＮＡ、例えばウイルス感染のためのマーカー、ハウスキーピング遺伝子の転写産物、又は腫瘍特性のためのバイオマーカーであってもよい。
【００８４】
この目的のＲＮＡの検出は、目的のＲＮＡの量を標準化する方法の使用を可能にする。ＶＬＰに含まれるＲＮＡ分子はＲＮａｓｅから保護される。その結果、ＶＬＰの特定量ひいては異種ＲＮＡ配列は、ＶＬＰからのＲＮＡの単離まで、試料及びＶＬＰの混合物の取扱い中に一定のままであろう。したがって異種ＲＮＡ配列は、内部ＲＮＡ標準として又は陽性対照として使用することができる。目的の第２のＲＮＡの検出量は異種ＲＮＡ配列の検出量に対して正規化することができる。したがって、さらなる実施形態では、該方法は、目的のＲＮＡと異種配列を有するＲＮＡとの比率が決定されるステップを含む。
【００８５】
さらなる実施形態では、該方法は、目的のＲＮＡと異種配列を有するＲＮＡとの比率が、本発明の方法を使用して異なる時間で及び／又は異なる試料により決定された参照比率と比較される別のステップを含む。例えば、１つの試料は、本発明の方法が異なる時間で適用される２以上の部分に分割されてもよい。このように、例えば、ＲＮａｓｅによるコンタミネーションが試験され得る。さらに、例えば疾患の発症を監視するために異なる時点で同じ患者から得られた試料により決定された比率と参照比率とを比較することが可能である。加えて、比率及び参照比率はまた、健康な及び悪性腫瘍を有する個体の試料から決定されてもよい。
【００８６】
系統的な誤りによる潜在的な不正確さを避けるために、両方のＲＮＡの検出は同一の検出方法によって行われることがさらに好ましい。したがって、目的のＲＮＡ及び異種配列を有するＲＮＡが同一の検出方法によって検出されることが好ましい。具体的には、両方のＲＮＡの量が同一の検出方法によって決定される。それゆえ該検出方法は、異種ＲＮＡ配列の検出に適している上述の任意の方法とすることができる。
【００８７】
本態様によれば、本発明はしたがって、試料中のＲＮＡの定量的検出のための方法であって、以下、
（ａ）特定量のＴＭＶウイルス様粒子を試料と混合し、該ＴＭＶ粒子がリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、
（ｉ）該リボ核酸分子がＴＭＶ構築起点配列及び異種配列を含み、該異種配列が２０００〜１００，０００リボヌクレオチドの長さを有し、かつ該構築起点が３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、
（Ａ）配列番号２の配列；又は
（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は
（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、
を含む、配列であり、かつ
（ｉｉ）該ウイルスコートがＴＭＶの少なくとも１種のコートタンパク質を含み；
（ｂ）該試料からＲＮＡを単離し；そして
（ｃ）異種配列を含むＲＮＡ及び試料中の目的の第２のＲＮＡを検出し、目的のＲＮＡと異種配列を有するＲＮＡとの比率が同一の検出方法によって決定されること、
を含む、方法を提供する。
【００８８】
検出されたＲＮＡ量は絶対値又は相対値であってもよい。上述のように、検出は定量的であることが好ましい。したがって、ＲＮＡの検出は好ましくは絶対値をもたらす。そのような絶対値は、例えば重量によって、例えばグラムで、分子数によって、例えばモル量又はコピー数で表すことができる。それにもかかわらず、ＲＮＡの検出は相対値ももたらすことができる。例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ中に、異なるプライマーセットによる検出は鋳型濃度の絶対値をもたらさない。それゆえ、その値は標準値、例えば検出されたハウスキーピング遺伝子（複数）に正規化することができる。同じ目的がＶＬＰコート化されたＲＮＡ分子によって果たされ得る。
【００８９】
別の態様では、本発明は、ＲＮＡ分解及び／又は定量化のための、内部ＲＮＡ標準として又は陽性対照としての桿状ウイルス様粒子の使用であって、該桿状ウイルス様粒子がリボ核酸分子及びウイルスコートを含み、ここで、（ａ）該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｂ）該ウイルスコートが桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含む、使用に関する。先に概説したように、構築起点配列は好ましくは１５０から３００ヌクレオチドの長さを有する。より好ましくは、構築起点は３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、（Ａ）配列番号２の配列；又は（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、を含む、配列である。また、構築起点配列は好ましくは直接リボ核酸分子の３´末端にある。
【００９０】
実験では、陽性対照は使用される方法論の検証としての役割を果たす。本発明の方法では、ＶＬＰ中にカプシド形成されたＲＮＡ分子はＲＮａｓｅから保護され、そして異種配列の検出をもたらすこととなる。したがって、本方法を行う者は、異種配列の検出が無いことは手順中の他の誤りによるものであろうことを確認することができる。その結果、本発明のＶＬＰはＲＮＡ分解及び／又は定量化のための陽性対象としての役割を果たすことに非常に適している。
【００９１】
異なる態様では、本発明は、イン・ビトロ例えば無細胞系における又は宿主細胞における異種配列の発現のための桿状ウイルス様粒子の使用に関する。宿主細胞は好ましくは、植物細胞、動物細胞、及び酵母細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、本使用は、ＶＬＰによる宿主細胞の感染又はトランスフェクションを含む。
【００９２】
さらなる態様では、本発明は、リボ核酸分子及びウイルスコートを含む桿状ウイルス様粒子であって、（ａ）該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｂ）該ウイルスコートが桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含み、該構築起点配列が１５０から３００ヌクレオチドの長さを有する、桿状ウイルス様粒子に関する。より好ましくは、構築起点は３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、（Ａ）配列番号２の配列；又は（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、を含む、配列である。好ましい実施形態では、構築起点配列は、配列番号２又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、あるいはこれらからなる。特に好ましい実施形態では、本発明は、リボ核酸分子及びウイルスコートを含む桿状ウイルス様粒子であって、（ａ）該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び異種配列を含み；かつ（ｂ）該ウイルスコートが桿状ＲＮＡウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を含み；該桿状ＲＮＡウイルスがＴＭＶであり；該構築起点が３００ヌクレオチドまでの長さを有する配列であって、以下、（Ａ）配列番号２の配列；又は（Ｂ）配列番号２の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列；又は（Ｃ）少なくとも１５０ヌクレオチドの長さを有する（Ａ）もしくは（Ｂ）の断片、を含む配列であり；そして該構築起点配列が直接リボ核酸分子の３´末端にある、桿状ウイルス様粒子に関する。
【００９３】
桿状ウイルス、例えばＴＭＶは、自発的な反応においてＯＡＳを含むＲＮＡ分子及びコートタンパク質からイン・ビトロで構築することができるということが当該技術分野で知られている。この構築はＯＡＳから開始される。原理的には、構築工程は、残りのＲＮＡ分子の配列又は長さから独立であり、それによって実質的に影響を受けない。それにもかかわらず、特に、長いＲＮＡ分子又は強い二次及び三次構造を有するＲＮＡによる構築は、以下の製造方法によって改善することができる。
【００９４】
一般に、桿状ウイルスのイン・ビトロ構築のための有益な条件は、当該技術分野において、例えばＢｕｔｌｅｒ（１９８４、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、６５：２５３〜２７９）、Ｄｕｒｈａｍ（１９７２、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、６７：２８９〜３０５）、Ｗｕら（２０１０、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ、４：４５３１〜８）及びＭｕｅｌｌｅｒら（２０１０、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６６：７７〜８５）によって記述され、本発明の製造方法に使用することができる。例えば、以下の製造方法の一実施形態では、ｐＨは約７である。以下の製造方法はイン・ビトロの方法である。以下の製造方法は、混合ステップ中に細菌又は真核生物の発現系を使用しない。
【００９５】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、リボ核酸分子及びウイルスコートを含む桿状ウイルス様粒子の製造のための方法であって、以下、ａ）リボ核酸分子及び桿状ウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を混合し、該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び少なくとも１つの異種配列を含み；ｂ）ステップａ）の前にリボ核酸分子及び／又は少なくとも１種のコートタンパク質を加熱し、及び／又は、ステップａ）の後に混合物を約３０℃と約１００℃との間の温度まで、好ましくは約７０℃まで少なくとも１度加熱すること、を含む、方法に関係している。
【００９６】
本製造工程のステップａ）では、リボ核酸分子及び桿状ウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質が混合される。リボ核酸分子及び少なくとも１種のコートタンパク質は、試料中のＲＮＡの検出方法のための上述の特性を有する。混合は当該技術分野で知られている方法によって達成され得る。混合に適している方法は、例えばＶＬＰ及び試料の混合のために上述のものである。
【００９７】
本製造工程のステップｂ）では、リボ核酸分子及び／又は少なくとも１種のコートタンパク質はステップａ）の前に加熱される、及び／又は、混合物は少なくとも１度ステップａ）の後に約３０℃と約１００℃との間の温度まで、好ましくは約７０℃まで加熱される。本発明者らは驚くべきことに、これら加熱ステップはＶＬＰの製造を助けることができるということを見出した。おそらく、熱はタンパク質及びＲＮＡの特定の強い二次及び／又は三次構造を破壊し、それによってウイルス粒子の構築を助ける。それゆえ、本製造工程は例えば強い二次及び／又は三次構造を有するＲＮＡ分子のためである。
【００９８】
加熱は実験室での実践の標準的な手段によって達成され得る。例えば、加熱は、ウォーターバス、加熱ブロック、インキュベーター、サーモサイクラ―などによる加熱であってもよい。
【００９９】
加熱は、タンパク質又はＲＮＡ調製物における上述の構造を破壊するのに適している温度まで行われる。例えば、加熱は、約３０℃と約１００℃との間、約５０℃と約９０℃との間、又は約６０℃と約８０℃との間の温度までであってもよい。好ましくは、リボ核酸分子の加熱は約７０℃の温度までである。少なくとも１つのコートタンパク質、又はＲＮＡ分子及び少なくとも１つのコートタンパク質の混合物の加熱は、好ましくは約４０℃まで、より好ましくは約３０℃までである。
【０１００】
好ましい実施形態では、リボ核酸分子は、ステップａ）の前に約３０℃と約１００℃との間の温度まで、好ましくは約７０℃まで加熱される。さらなる実施形態では、少なくとも１種のコートタンパク質は、ステップａ）の前に約３０℃と約１００℃との間の温度まで、好ましくは約４０℃まで、より好ましくは約３０℃まで加熱される。さらに別の実施形態では、ＲＮＡ分子及び少なくとも１つのコートタンパク質の混合物は、少なくとも１度ステップａ）の後に約３０℃と約１００℃との間の温度まで、好ましくは約４０℃まで、より好ましくは約３０℃まで加熱される。
【０１０１】
混合物を少なくとも１度加熱することは、混合物が１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又はより多く加熱されてもよいことを意味する。したがって、混合物は、例えば１〜３０、１〜２０、又は１〜１０回、加熱されてもよい。構築工程中の連続した加熱及び冷却によってＶＬＰ構築を助けることは特に好ましい。
【０１０２】
加熱ステップの間、混合物はそのまま冷やすか、外部的な手段によって冷却される。例えば、混合物は加熱ステップの間に５０℃まで、３７℃まで、室温まで、又は４℃まで冷やされてもよい。
【０１０３】
冷却は実験室での実践の標準的な手段によるものであってもよい。例えば、冷却は、ウォーターバス、加熱ブロック、インキュベーター、サーモサイクラ―、氷上、冷凍庫、冷蔵庫、低温室などでの、冷却であってもよい。
【０１０４】
加熱は、例えば３０秒、１分、５分、１０分間又はより長くてもよい。冷却は、例えば３０秒、１分、５分、１０分間、又はより長くてもよい。
【０１０５】
好ましくは、ＲＮＡ分子、少なくとも１種のコートタンパク質及び／又は得られる混合物は溶液中、例えば水溶液中にある。当業者は、核酸及びタンパク質分子に適している水溶液を知っている。例えば、一定のｐＨへの溶液の緩衝はそれら生体分子を安定に保つことが知られている。それゆえ、溶液は、例えばリン酸緩衝液、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、などからなる群から選択される緩衝液を含んでもよい。さらに、溶液は塩、例えばナトリウム又はカリウム塩を含んでもよい。
【０１０６】
さらなる態様では、本発明は、リボ核酸分子及びウイルスコートを含む桿状ウイルス様粒子の製造のための方法であって、以下、ａ）リボ核酸分子及び桿状ウイルスの少なくとも１種のコートタンパク質を混合し、該リボ核酸分子が桿状ＲＮＡウイルスの構築起点配列及び少なくとも１つの異種配列を含み；かつ、ｂ）変性化合物及び／又は界面活性剤を、ステップａ）の前に該リボ核酸分子及び／又は該少なくとも１種のコートタンパク質に、及び／又は、ステップａ）の後に混合物に、添加すること、を含む、方法を提供する。
【０１０７】
驚くべきことに、界面活性剤又は変性化合物が製造工程中にＶＬＰの構築を助けるということが本発明者らによって見出された。
【０１０８】
ステップｂ）における添加は、当該技術分野で標準的な方法によって行われ得る。例えば、試料中のＲＮＡの検出方法のステップａ１）における、試料へのＶＬＰの添加のための上述の任意の添加方法は、ＶＬＰの製造のための本方法における変性化合物及び／又は界面活性剤の添加にも使用することができる。おそらく、変性化合物又は界面活性剤は、タンパク質及びＲＮＡの特定の強い二次及び／又は三次構造を破壊し、それによってウイルス粒子の構築を助ける。それゆえ、本製造工程は例えば強い二次及び／又は三次構造を有するＲＮＡ分子のためである。
【０１０９】
好適な変性化合物は、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、尿素、グアニジウムイソチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ならびにアルコール、例えばエタノール、イソプロパノール及びグリセロールである。しかしながら、当業者は直接的な方法でさらに好適な変性化合物を見つけることができるであろう。
【０１１０】
変性力に応じて、変性化合物は、０．１から５０％の間、１から４０％の間、５から３０％の間、１０から２０％の間の最終濃度まで添加される。変性化合物が強ければ強いほど、前述の変性化合物の少ない量が使用されるようになることは明らかである。例えば、ＤＭＳＯならびにアルコール、例えばエタノール、イソプロパノール及びグリセロールは、弱い変性剤であると知られており、したがって、０．１から５０％の間の最終濃度まで添加されることになる。尿素、ホルムアミド及びグアニジウムイソチオシアネートはより強い変性化合物であると知られており、したがって、０．１から１０％の間の最終濃度まで添加されることになる。
【０１１１】
好適な界面活性剤は、例えば非イオン性界面活性剤、例えばトリトンＸ  １００、及びポリソルベート界面活性剤、例えばポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）又はポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）からなる群から選択される。しかしながら、当業者は直接的な方法でさらに好適な界面活性剤を見つけることができるであろう。
【０１１２】
界面活性剤は、０．１から１０％の間の最終濃度まで添加される。
【０１１３】
好ましい実施形態では、変性化合物及び／又は界面活性剤は、ステップａ）の前にリボ核酸分子に添加される。さらなる実施形態では、変性化合物及び／又は界面活性剤は、ステップａ）の前に少なくとも１種のコートタンパク質に添加される。さらに別の実施形態では、変性化合物及び／又は界面活性剤は、ステップａ）の後にＲＮＡ分子及び少なくとも１つのコートタンパク質の混合物に添加される。
【０１１４】
本明細書中に開示される桿状ウイルス様粒子の製造のための方法は、桿状ウイルス様粒子の平均の長さが構築中又は構築後に少なくとも１度決定されるステップをさらに含んでもよい。上述のように、桿状ＶＬＰの長さは、封入されたＲＮＡ分子の長さに直接相関する。予想されるＶＬＰの長さは、ＲＮＡ分子のリボヌクレオチドの数に基づいて、リボヌクレオチドの数を２１で割ることによって、計算することができる。例えば、完全なＴＭＶのＲＮＡ（約６４００ｎｔ）を含む粒子は約３００ｎｍの長さを有する（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ、４：４５３１〜８）。ウイルスの長さとＲＮＡ分子との間の上述の相関関係の結果、ＶＬＰ構築の進行は、ＶＬＰの長さの測定によって観察することができる。ＶＬＰの平均の長さの測定に適している方法は、例えば電子顕微鏡法、動的光散乱法、比濁法などである。任意のさらに好適な技術も明らかに使用することができる。
【０１１５】
本明細書で引用される全ての文献は、参照によって本明細書に完全に取り込まれる。
【０１１６】
本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載される主題の全ての変更及び等価物を含む。また、それらの全ての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書に特に示されず又は文脈に明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【実施例】
【０１１７】
以下の実施例は、本発明を例示するが、その範囲を限定するものではないことを意図する。実施例ＩからＩＩＩは、遺伝子合成で始まり、そしてインコーテッド（Ｉｎｃｏａｔｅｄ）ＲＮＡ粒子をもたらす手順を提供し、保護アッセイによる品質管理を含む。
【０１１８】
実施例Ｉ
「インコーテッドＲＮＡ」における構築のためのＩＶＴ−ＲＮＡの合成
以下の実験プロトコルは多数の異なる配列を用いて行われており、したがって一般的なプロトコルの一般的な用語で説明される。
【０１１９】
目的の標的配列は２つのフランキング配列領域と組み合わされ、以下の特徴を有する「遺伝子コンストラクト」を得た。
５´領域：Ｔ７プロモーター配列（１７ｂｐ）、続いて普遍的な５´リーダー配列（７８ｂｐ）
コア領域：目的の標的配列（本質的に任意の長さが可能であり、数百又は数千のｂｐ）
３´領域：選択されるＯＡＳ配列（２３４ｂｐ）
【０１２０】
「遺伝子コンストラクト」の図式的な表示：
Ｔ７プロモーター−５´リーダー配列−目的の標的−ＯＡＳ
【０１２１】
遺伝子コンストラクトを、標準プラスミド、例えばｐｅｘＡ（ユーロフィンズＭＷＧ  ＧｍｂＨ）におけるクローンとしてコンストラクトを提供する、サービスプロバイダ（ユーロフィンズ  ＭＷＧ  ＧｍｂＨ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  ＧｍｂＨ））から得た。選択されたクローンをインサートの完全なシークエンシングによって十分に特徴づけ、注文された遺伝子コンストラクト配列との完全な同一性を確認した。
【０１２２】
次のステップで、鋳型をプラスミド由来のプライマー、例えば以下を用いて、インサート特異的ＰＣＲによって生成した。
・ｐｅｘＡフォワードプライマー  ５´−ＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧ、
及び
・ＯＡＳ特異的プライマー  ＴＭＶ−１  ５´−ＣＣＧＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＡＡＣＴＴＴＧＣ、これはＯＡＳ配列要素の３´末端でハイブリダイズする。
【０１２３】
得られるＰＣＲ産物を精製し、キャピラリー電気泳動によって分析した。
【０１２４】
精製されたＤＮＡ鋳型をＩＶＴ反応に使用し、得られたＩＶＴ−ＲＮＡ産物を精製し、キャピラリー電気泳動によって分析した。
【０１２５】
ａ）インサート特異的ＰＣＲによる鋳型ＤＮＡ
プラスミドＤＮＡ（約２００ｐｇ又は約０．１ｆｍｏｌｅ）を、２５μｌの２ｘＩｍｍｏｍｉｘ（バイオライン（Ｂｉｏｌｉｎｅ）  ＧｍｂＨ）＋５００ｎＭのＰｒｉｍｅｒｍｉｘ（等モルのｐｅｘＡフォワード＋ＴＭＶ−１）と、５０μｌの総容量で組み合わせた。ＰＣＲを、酵素活性化のための１０分間９５℃で最初のインキュベーション、次いで３０サイクル：３０秒９５℃で、２５秒５１℃で、４５秒７２℃で、４分７２℃での最終伸長によって行った。
【０１２６】
ＰＣＲ産物を、標準的なスピンカラム手順によって、「Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（ロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））又は「ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔ」（ザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を使用して精製した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）  ＧｍｂＨ）で、及びキャピラリー電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００又はＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ  ２２００）によって分析した。
【０１２７】
ｂ）ＩＶＴ−ＲＮＡ合成
精製されたＰＣＲ産物（１０μｌ、上述のステップ（ａ）から生成されたＰＣＲ産物の約１０％）を、２５μｌの総容量でＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ  ｋｉｔ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いてＩＶＴ反応に使用した。ＩＶＴ反応を一晩（約１６時間）３７℃で行った。鋳型ＤＮＡを、２つのその後のインキュベーション、それぞれ１μｌのＤＮａｓｅ  １（アンビロン）又は１μｌのＴｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ（アンビロン）との、そして３０分間３７℃でのインキュベーションによって消化した。
【０１２８】
ＩＶＴ−ＲＮＡ産物を、標準的なスピンカラム手順により、「ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して精製した。精製されたＩＶＴ−ＲＮＡ産物を、Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（エッペンドルフＧｍｂＨ）で及びキャピラリー電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００又はＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎ  ２２００）によって分析した。
【０１２９】
実施例ＩＩＡ
「インコーテッドＲＮＡ」粒子を生成するためのＩＶＴ−ＲＮＡ及びＴＭＶコートタンパク質の構築
ＴＭＶコートタンパク質を、公表された手順に従って、感染されたタバコ植物から得た。Ｍｕｅｌｌｅｒら（２０１０、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６６：７７〜８５）参照。
【０１３０】
「インコーテッドＲＮＡ」粒子の構築のために、リン酸ナトリウムカリウム緩衝液（ＳＰＰ、５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中の過剰のＴＭＶコートタンパク質を、約２５：１から２０：１（タンパク質：ＲＮＡ）の範囲の重量比で精製ＩＶＴ−ＲＮＡと直接混合し、一晩（１６〜２０時間）３０℃でインキュベートした。
【０１３１】
代替手法では、ＩＶＴ−ＲＮＡを１０分間７０℃で予熱し、０，０１℃／秒の速度で３０℃までの徐冷工程に続く。その後、上述のようにＲＮＡをコートタンパク質と混合した。本構築反応のアリコートを「インコーテッドＲＮＡ」の成功した生成のための試験（実施例ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢに後述の方法に従う）に使用した。
【０１３２】
「インコーテッドＲＮＡ」を、以下のようにＰＥＧ（ポリエチレングリコール）での沈殿によって構築混合物から回収した。
【０１３３】
ＰＥＧ  ６０００（４％の最終濃度）を添加し、少なくとも１５分間氷上でインキュベートした後、少なくとも１５分間４℃、１０，０００ｘｇから２０，０００ｘｇでの遠心分離に続く。上清を捨て、ペレットを１０ｍＭのＳＰＰ緩衝液に溶解した。
【０１３４】
実施例ＩＩＢ
１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む「インコーテッドＲＮＡ」粒子を生成するためのＩＶＴ−１６Ｓ  ｒＲＮＡ及びＴＭＶコートタンパク質の構築
多くの成功した使用される目的の標的配列の２つは、１６Ｓ  ｒＲＮＡドメインＩ及び完全な１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列であった。リボソームＲＮＡ、ｒＲＮＡは、リボソームのＲＮＡ成分であり、おそらくリボソームにおけるその機能に必要とされる特に強い二次構造を有することで知られている。これらの強い二次構造及びＲＮＡの長さのために、これらのＲＮＡをウイルス粒子にパッケージすることができなかったと考えられた。
【０１３５】
実施例Ｉに上述されたインサート特異的ＰＣＲに使用されるＤＮＡ鋳型は、配列番号７（１６Ｓ  ｒＲＮＡドメインＩ）及び配列番号８（完全な１６Ｓ  ｒＲＮＡ）に示される。上述の手順に従って、鋳型は３´末端に２３４ｎｔの長いＯＡＳ配列（配列番号２）も含む。このＯＡＳはＴＭＶ様粒子の効率的な構築を保証し、さらに、得られた粒子も特に安定であるということが見出された（以下の実施例Ｘを比較）。全てのステップは上述のとおり行った。
【０１３６】
１６Ｓ  ｒＲＮＡドメインＩ又は完全な１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列のいずれかを含む精製されたＩＶＴ−ＲＮＡ産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００で、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ、すなわちキャピラリー電気泳動をとりわけ用いて分析した。両方のＲＮＡは電気泳動図において単一のきれいなピークとして見えたということが見出され、パッケージング手順の前にその完全性を実証した。
【０１３７】
「インコーテッドＲＮＡ」粒子の構築のために、過剰のＴＭＶコートタンパク質を上述のように精製されたＩＶＴ−ＲＮＡと直接混合し、一晩（１６〜２０時間）３０℃でインキュベートした。実施例ＩＩＩＢに後述のＲＮａｓｅ試験を用いて、完全長の１６Ｓ  ｒＲＮＡドメインＩ又は完全長の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列のいずれかを含んだウイルス様ＴＭＶ粒子を構築中に得たことが示された。具体的には、ＲＮＡコンストラクトは３´末端にＯＡＳを含み、ｒＲＮＡ配列が続き、そしてＲＴ−ＰＣＲアンプリコン配列がｒＲＮＡ配列の後に最も端の５´末端に位置する。パッケージングは３´末端から始まり、アンプリコン配列の保護は、ＲＮＡコンストラクトの完全なパッケージング後にのみ達成される。さらに試験は、これらの配列のいずれかのパッケージングが非常に安定なＴＭＶ様粒子をもたらすことを実証した。分析は二連で、ドライアイス凍結ステップ及び少なくとも３ヶ月間−２０℃での保存を含む複数の凍結融解サイクルの後に行った。
【０１３８】
実施例ＩＩＩ
「インコーテッドＲＮＡ」の成功した生成のための試験
試験原理：遊離ＲＮＡをＲＮａｓｅでの処理によって分解する一方で、「インコーテッドＲＮＡ」粒子に含まれるＲＮＡを分解から保護する。
【０１３９】
実施例ＩＩＩＡ
従来のＲＮａｓｅ保護アッセイ
試験手順の原理は以前に記載されている（Ｇａｄｄｉｐａｔｉ、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １６：７３０３〜７３１３）。
【０１４０】
分解からの保護について試験するために、膵臓リボヌクレアーゼＡを０．１μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、インキュベーションは１５分間３０℃で進められた。その後、プロテイナーゼＫを１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、インキュベーションをさらに３０分間３０℃で続ける。次にＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｖａｎａｄｙｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘ及びＳＤＳを１％の最終濃度まで添加し、１０分間３７℃でのインキュベーションに続いた。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．５（１００ｍＭの最終濃度）の添加の後、１０分間６５℃でのインキュベーションに続いた。次にホルムアミド緩衝液を加え（２４％ホルムアミド＋０．００５％のＳＤＳ＋０．００５％ブロモフェノールブルー＋０．０００２５％キシレンシアノール＋０．２５ｍＭのＥＤＴＡの最終濃度）、１５分間６５℃でのインキュベーションに続いた。次に、試料を天然アガロース（１ｘＴＢＥ中の２％アガロース、０．５μｇ／ｍｌのＥｔＢｒ）上にロードし、電気泳動を５Ｖ／ｃｍで９０分間行った。少なくとも３０分間水中で脱染色した後、画像をトランスイルミネーター上で撮影する。
【０１４１】
実施例ＩＩＩＢ
定量的ＲＴ−ＰＣＲと組み合わされたＲＮａｓｅ保護アッセイ
ａ）試験手順の原理
分解からの保護について試験するために、希釈されたインコーテッドＲＮＡ粒子（約１０8コピー／μl）を、熱不安定性ＲＮａｓｅ  Ｉ（０．０１Ｕ／μｌ）及び１２０分間３７℃でのインキュベーションでチャレンジした。その後、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔで単離した。以下の対象反応を行った：（ｉ）ＲＮａｓｅなしのインキュベーション、（ｉｉ）インコーテッドＲＮＡ粒子をＲＮａｓｅとのインキュベーション前に破壊した。単離されたＩＶＴ−ＲＮＡの量を２ステップＲＴ−ＰＣＲアッセイで決定した：ｃＤＮＡ合成の後、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００装置でのリアルタイムＰＣＲに続く。
【０１４２】
ｂ）ＲＴ−ＰＣＲアッセイのためのプライマー及びプローブの設計
標的配列は普遍的な５´リーダー配列（７８ｂｐ）であり、プライマー及びプローブ配列は以下であった。
５−ＵＮＩ−Ｆ  ５´−ｇＡｇＡＣｇＡＡＴＴｇｇｇＣＣＣＴＣＴ
５−ＵＮＩ−Ｒ  ５´−ＡｇｇｇＣｇＡＡＴＴＣＴｇＣＡｇＡＴＡＴＣＣ
【０１４３】
得られたＰＣＲ産物（７２ｂｐ）の検出を、ＴａｑＭａｎ型プローブ  ５−Ｕｎｉ−ＴＭ  ５´−ＦＡＭ−ｇｇａｔａｔｃｔｇｃａｇａａｔｔｃｇｃｃｃｔ−ＢＢＱを使用して行った。
【０１４４】
この手法は、ＲＴ−ＰＣＲ標的配列が普遍的な５´末端配列内に位置したという利点を有する。従って、これら定量的なアッセイはすべてのインコーテッドＲＮＡコンストラクトに使用することができ、それらは以下の２つの試験結果を与える。
（ｉ）ＲＮａｓｅによる分解からの保護の実証。
（ｉｉ）インコーテッドＲＮＡ調製物中のＩＶＴ−ＲＮＡコピー数の決定。
【０１４５】
ｃ）ｃＤＮＡ合成
異なる処理から得られる遊離のＩＶＴ−ＲＮＡを、プライマー５−ＵＮＩ−ＲでのｃＤＮＡ合成に使用した。全ての試薬はバイオラインＧｍｂＨ（ルッケンヴァルデ）から、プライマー及びプローブはＴＩＢ  ＭＯＬＢＩＯＬ  ＧｍｂＨ（ベルリン）から得た：３μｌのＲＮＡ試料＋２μｌ  １０ｘ  ＲＴ−緩衝液＋２μｌ  ２ｍＭのｄＮＴＰ＋１μｌのプライマー５−ＵＮＩ−Ｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）＋０．５μｌの逆転写酵素を混合し、１時間３７℃でインキュベーションの後、１０分間７２℃での酵素の不活動に続き、その後試料を氷上に置いた。
【０１４６】
ｄ）リアルタイムＰＣＲアッセイ
以下の定量的リアルタイムＰＣＲのために、５μｌのｃＤＮＡを、１０μｌ  ２ｘＩｍｍｏｍｉｘ（バイオラインＧｍｂＨ）＋１μｌのプライマー５−ＵＮＩ−Ｆ（１０ｐｍｏｌｅ）＋１μｌのプライマー５−ＵＮＩ−Ｒ（１０ｐｍｏｌｅ）＋１μｌのプローブ５−Ｕｎｉ−ＴＭ（５ｐｍｏｌｅ）＋５´−ＦＡＭ−ｇｇａｔａｔｃｔｇｃａｇａａｔｔｃｇｃｃｃｔ−ＢＢＱ＋２μｌの水を含む、１５μｌのマスターミックスと混合した。
【０１４７】
リアルタイムＰＣＲをＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００装置（キアゲンＧｍｂＨ）を用いて行った。反応パラメータをこの表１に示し、実施例の結果を表２に示す。
【０１４８】
【表１】
2017505143.tif 000003
【０１４９】
【表２】
2017505143.tif 000004
【０１５０】
結論：
これらの結果が示すように、ＩＶＴ−ＲＮＡは加熱による粒子の破壊後にＲＮａｓｅによる分解に利用しやすくなる。
【０１５１】
粒子が損傷を受けていない場合、ＩＶＴ−ＲＮＡはＲＮａｓｅによる分解から保護される。
【０１５２】
ＩＩＢ対ＩＩＩＡの利点：非常に少ない量のインコーテッドＲＮＡ粒子が必要とされ、手順はより簡単であり、より少ないステップを含み、より速く、そして定量的データをもたらす。
【０１５３】
ｅ）コピー数の測定のための定量的ＲＴ−ＰＣＲの応用
アッセイを上述のように、１０8コピー／μｌから１０3コピー／μｌの範囲のコピー数を有するｃＤＮＡの希釈系列を使用して行った。
【０１５４】
得られる標準曲線を図２に示し、以下の式によって表す。
標準曲線（１）濃度＝１０ｅｘｐ（−０，２９８ｘＣＴ＋１１，９２９）
標準曲線（２）ＣＴ＝−３，３５９ｘｌｏｇ（濃度）＋４０，０７１
【０１５５】
実施例ＩＶ
ＲＮａｓｅによる分解に対するインコーテッドＲＮＡの安定性
安定性試験を、ＲＮＡ粒子（約１０8コピー／μｌ）、及び２つの濃度の熱不安定性ＲＮａｓｅ  Ｉ（３Ｕ／アッセイ及び０．３Ｕ／アッセイ）とのインキュベーションで、３７℃、１２０分と２０時間との間のインキュベーション時間で行った。
【０１５６】
その後、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔを用いて単離した。単離されたＩＶＴ−ＲＮＡの量を２ステップＲＴ−ＰＣＲアッセイで決定した：ｃＤＮＡ合成の後、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  ３０００装置を用いたリアルタイムＰＣＲに続く。全ての手順を上述（実施例ＩＩＩＢ）のとおり行った。
【０１５７】
結果は図３に示され、ＲＮａｓｅの存在下でインコーテッドＲＮＡは安定であり、したがってこの酵素の活性から保護されることを示す。
【０１５８】
実施例Ｖ
凍結融解後のインコーテッドＲＮＡの安定性
インコーテッドＲＮＡを、１回の凍結融解サイクル（１ｘ  凍結）後に、すなわちｏ／ｎで融解＋アッセイ翌日で、あるいは、２回の凍結融解サイクル（２ｘ  凍結）後に、すなわちｏ／ｎで融解＋再凍結ｏ／ｎで融解及びアッセイ翌日で、分析した。凍結を−２０℃で又はドライアイスで行った。
【０１５９】
インコーテッドＲＮＡ粒子の安定性を、ＲＮａｓｅ処理後のＣｔ値の変化に基づいて観察した。ＲＴ−ＰＣＲアッセイを前述のとおり行った。例えば、インコーテッドＲＮＡ粒子が損傷を受けていないままである、すなわち実質的に処理に影響を受けていない場合、Ｃｔ値の変化は±０．５を超えない。
【０１６０】
結果
凍結／融解安定性試験の結果を以下の表に示す。
【０１６１】
【表３】
2017505143.tif 000005
【０１６２】
上記結果から、ＲＴ−ＰＣＲアッセイのＣｔ値は、凍結融解及びＲＮＡｓｅ処理後に±０．５超で変化しなかったことが分かる。従って、インコーテッドＲＮＡ粒子はこれらの処理中に安定である。
【０１６３】
実施例ＶＩ
−２０℃での長期保存期間後のインコーテッドＲＮＡの安定性
インコーテッドＲＮＡ粒子を含む３つのアリコートＷＩ、ＷＩＩ及びＷＩＩＩを調製し、それぞれ５つの試験試料に分けた。全ての試料を特定の試験日まで凍結し−２０℃で保存した：試料をその後融解し、上述のようにＲＮａｓｅ処理及びＲＴ  ＰＣＲによって分析した。
結果：
【０１６４】
【表４】
2017505143.tif 000006
【０１６５】
結論
インコーテッドＲＮＡ粒子は−２０℃で安定であった。１４１日（２０週間）後、ＲＮａｓｅからの保護は維持され、Ｃｔ値は１８±０．５の範囲内にとどまる。
【０１６６】
実施例ＶＩＩ
＋３７℃で「加速劣化（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ａｇｉｎｇ）」におけるインコーテッドＲＮＡの安定性
加速劣化とは、迅速な方法で製品の寿命又は貯蔵寿命を確立するための人工的な手順である。得られるデータは、材料に対する劣化の影響を想定する条件に基づく。製品は、製品の有効期限（１年、２年など）に主張される期間を想定する成功した加速劣化試験結果に基づいて市場に発売することができる。ここで用いられる医療機器の加速劣化の規格は、ＡＳＴＭ  Ｆ１９８０−０７（２０１１）である。
【０１６７】
加速劣化の計算は、温度の１０℃上昇が化学反応の速度を２倍にすることを本質的に述べるアレニウスの式に基づく。以下の式を使用する：
ステップ１：ＡＡＲ＝Ｑ１０(AAT-AT)/10)
ステップ２：ＡＡＴＤ＝ＤＲＴＡ／ＡＡＲ
【０１６８】
式中、ＡＡＲ：加速劣化率；ＡＡＴＤ：加速劣化時間持続（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ａｇｉｎｇ  Ｔｉｍｅ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ）；ＤＲＴＡ：所望の実時間劣化（Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ａｇｉｎｇ）；ＡＡＴ：加速劣化温度；ＡＴ：周囲温度；Ｑ１０：加速劣化因子（Ｑ１０＝２は工業規格であり、Ｑ１０＝１．８はより保守的なオプションである）。これは、加速劣化試験持続の計算に４つの変数が使用されることを意味する：試験温度（℃）、保存温度（℃）、Ｑ１０（反応速度係数（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ  Ｆａｃｔｏｒ））、Ｑ１０のための保守的な数は医療機器のための２である、及びリアルタイム等価（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、すなわち日数。
【０１６９】
３７℃（試験温度）及び−２０℃（保存温度）についてのＡＡＲは、以下の両方のＱ１０値について計算することができる。
Ｑ１０＝２．０  ＝＞  ＡＡＲ＝５１．９８
Ｑ１０＝１．８  ＝＞  ＡＡＲ＝２８．５１
【０１７０】
試験の設計及び結果
３つのアリコートＷＩ、ＷＩＩ及びＷＩＩＩをインコーテッドＲＮＡから調製し、５つの試験試料に分けた。全ての試料を、試料を特定の試験日に分析するまで、３７℃（インキュベーターオーブン）でインキュベートした。分析は前述されたＲＮａｓｅとのインキュベーション及び安定な粒子のＲＴ  ＰＣＲ検出による。
【０１７１】
【表５】
2017505143.tif 000007
【０１７２】
結論
上記、すなわちＣｔ値の変化に基づいて、粒子は３７℃で少なくとも約２２日間安定であるということが分かる。４３日後のみに、増加した変動性及び増加したＣｔ値を観察した。Ｃｔ値の１の増加は、粒子の約５０％が損傷を受けていないままであったことを示す。
【０１７３】
２１日の最小粒子安定性で、−２０℃の保存温度での計算された安定性は、以下のとおりである。
Ｑ１０＝２について１０９１日又は約３年；及び
Ｑ１０＝１．８について５９９日又は約２０ヶ月
【０１７４】
実施例ＶＩＩＩ
異なるＴＭＶのＯＡＳ配列の試験
当該技術分野において、ＴＭＶ由来の７５ｎｔの最小配列がパッケージングに十分であろうことが、Ｔｕｒｎｅｒら（１９８８、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０３：５３１〜５４７）によって報告されている。他のグループは、４００ｎｔ超の長さを有するＴＭＶのＯＡＳを使用した（Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５５：２９９〜３０８）。しかしながら、多くの異種ＲＮＡはそれらのＯＡＳでパッケージできないことが見出され、したがって工業環境におけるＴＭＶ様粒子の効率的な使用を妨げた。さらに、ＶＬＰ構築が起こる場合に、得られる粒子はそれらが不安定であったため、実験における保存及び使用に適していなかったということが見出された。
【０１７５】
それゆえ、いくつかのＯＡＳの長さを、それらの構築効率及び得られるコンストラクトの安定性について試験した。特に、３つのＯＡＳの変形を分析し、それぞれ１２７、２３４及び５９３ヌクレオチドの長さを有した。全てのＯＡＳは、Ｔｕｒｎｅｒによって公開された最小の７５ｎｔの長さのＯＡＳ配列（配列番号９、ＴＭＶゲノム中の位置５４４４〜５５１８）を含んだ。
試験されたＯＡＳを以下のように称した。
Ｎｅｕ３−１：１２７ｎｔ、配列番号１、ＴＭＶゲノム中の位置５４２０〜５５４６；
Ｎｅｕ３−２：２３４ｎｔ、配列番号２、ＴＭＶゲノム中の位置５３１３〜５５４６；及び
Ｎｅｕ３−３：５９３ｎｔ、配列番号１０、ＴＭＶゲノム中の位置５１００〜５６９２
【０１７６】
コンストラクトは、目的の異種標的配列をさらに含んだ。
【０１７７】
Ｎｅｕ３−１及びＮｅｕ３−３のＯＡＳコンストラクトでのＶＬＰ構築は非効率的であったということが見出された。上述のＲＮａｓｅアッセイ及びその後のＲＴ−ＰＣＴ分析における分析の後に、ＲＮＡはこれらのコンストラクトを使用して検出されなかった。対照的に、Ｎｅｕ３−２のコンストラクトでの構築は非常に効率的であった。ＲＮＡはこのＯＡＳ配列を含む粒子において効率的に保護された。
【０１７８】
また、先の実施例ですでに示されたように、Ｎｅｕ３−２の２３４ｎｔのＯＡＳの使用は、保存、輸送ひいては工業環境における粒子の使用を可能にする、特に安定な粒子を提供することも見出された。
【０１７９】
驚くべきことに、Ｎｅｕ３−２のＯＡＳ配列は種々のＲＮＡ配列のための普遍的な構築起点配列として好適であるということもその後観察された。現在まで、任意の試験された異種ＲＮＡ配列を、リボソームＲＮＡを含むこのＯＡＳ配列でパッケージすることに成功した。
【０１８０】
参考文献
米国特許第５，６７７，１２４号明細書；
米国出願公開第２００２／０１９２６８９号明細書；
Ｖｉｌｌａｎｏｖａら、２００７、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ｐ．３５５５〜６３；
Ｓｌｅａｔら、１９８６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５５：２９９〜３０８、
Ｔｕｒｎｅｒら、１９８８、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０３：５３１〜５４７；
米国特許第５，２５６，５５５号明細書
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、３rd  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；
Ｋａｄｒｉら、（２０１３、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８９：３２８〜３４０；
Ｂｕｔｌｅｒ、１９８４、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、６５：２５３〜２７９；
Ｄｕｒｈａｍ、１９７２、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、６７：２８９〜３０５、
Ｗｕら、２０１０、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ、４：４５３１〜８；
Ｍｕｅｌｌｅｒら、２０１０、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６６：７７〜８５；
Ｗｕら、２０１０、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ、４：４５３１〜８
【図１】
2017505143.tif 000008
【図２】
2017505143.tif 000009
【図３】
2017505143.tif 000010
【配列表】
2017505143000001.app
【国際調査報告】
2017505143.tif 000011
2017505143.tif 000012
2017505143.tif 000013