(57)【要約】ナイーブＴ細胞を含み、稀な前駆体細胞を含む抗原特異的Ｔ細胞を、濃縮しかつ培養下で増殖させる。濃縮及び増殖は、養子移入によるより有効な免疫療法のためのプラットホーム、ならびに、候補ペプチド抗原のライブラリーとのＴ細胞反応性を決定することによる個別化免疫療法のためのプラットホームを提供する。2017529080.tif 000018
2017529080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的Ｔ細胞集団を調製するための方法であって、
患者または適切なドナー由来のＴ細胞を含む試料を提供する段階と、
前記試料を、常磁性であり、かつ表面上にＭＨＣ−ペプチド抗原提示複合体を含む第１の粒子集団と接触させる段階であって、前記粒子が直径約１０〜約５００ｎｍである、前記段階と、
前記常磁性粒子に近接して磁場を配置する段階と、
前記磁気粒子と会合した抗原特異的Ｔ細胞を回収する段階と
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記抗原特異的Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、または制御性Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原特異的Ｔ細胞がＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞が患者由来であり、前記患者が癌患者である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が固形腫瘍である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が、黒色腫、結腸癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腺管癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮内膜癌、精巣癌、胃癌、異形成口腔粘膜、ポリープ症、頭頸部癌、侵襲性口腔癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、中皮腫、移行細胞及び扁平細胞泌尿器癌、脳癌、神経芽腫、及び神経膠腫である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が黒色腫である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が血液学的悪性腫瘍である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原特異的Ｔ細胞がＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球及び／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞が患者由来であり、前記患者が感染性疾患を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞であり、前記患者が自己免疫疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞を含む前記試料が、養子移入レシピエントとＨＬＡが適合する適切なドナー由来のものであり、前記回収された抗原特異的Ｔ細胞が前記レシピエントに養子移入される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞を含む前記試料が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、以前活性化されたＴ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞を含む前記試料が、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、または腫瘍由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ細胞を含む前記試料が、白血球取り出しによって単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、または制御性Ｔ細胞に関して濃縮されている、請求項１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、ＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞に関して、前記細胞を磁場に置くことによって濃縮される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１０６個のＣＤ８濃縮細胞が、接触させる段階、配置する段階、及び回収する段階によって、抗原特異的Ｔ細胞濃縮のために単離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
表面上にＭＨＣ−ペプチド抗原提示複合体を含む前記常磁性粒子が、鉄デキストランビーズを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
表面上にＭＨＣ−ペプチド抗原提示複合体を含む前記常磁性粒子が、リンパ球共刺激リガンドをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原提示複合体がＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ複合体である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原提示複合体が単量体または二量体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原提示複合体が二量体であり、前記複合体が、ジスルフィド結合によって結合する免疫グロブリン重鎖配列とＭＨＣの融合を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫グロブリン配列がＩｇＧ配列である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＭＨＣが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、またはＨＬＡ−Ｅを含むＭＨＣクラスＩ複合体である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＨＣがＨＬＡ−Ａ２である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫グロブリン配列が、ヒト化モノクローナル抗体配列である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記リンパ球共刺激リガンドが、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０Ｌ）、Ｂ７ｈ（Ｂ７ＲＰ−１）、ＣＤ４０、ＬＩＧＨＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、及び４−１ＢＢに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片からなる群より選択される１つ以上である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記共刺激リガンドが、モノクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、及び一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記モノクローナル抗体または断片がヒト化されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記共刺激リガンドが、ＣＤ２８に対するヒト化マウスモノクローナル抗体または完全ヒト抗体である、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記共刺激リガンドがヒト化モノクローナル抗体９．３またはその抗原結合断片である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記磁気粒子が、約２０〜約２００ｎｍ内のサイズを有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗原提示複合体及び前記共刺激リガンドが、前記常磁性粒子の前記表面に共有結合している、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記粒子が実質的に球状である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記粒子が非球状である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
約３〜約１０の異なる抗原が、前記常磁性粒子集団において前記抗原提示複合体によって提示される、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗原提示複合体が腫瘍関連抗原を提示する、請求項４に記載の方法。
【請求項３９】
前記回収された抗原特異的Ｔ細胞が、抗原特異的ナイーブＴ細胞に関して濃縮されている、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記回収された抗原特異的Ｔ細胞を、約２日間〜約９週間培養下で増殖させる、請求項２０〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞を、磁場の存在下で培養下で増殖させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗原特異的Ｔ細胞を、約５日間〜約２週間、または約５日間〜約１０日間、培養下で増殖させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗原特異的濃縮Ｔ細胞を、約１週間培養下で増殖させ、その後、任意で、第２のラウンドの濃縮及び増殖を行う、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
２、３、４、または５ラウンドの濃縮及び増殖を行う、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも約５％の抗原特異的Ｔ細胞を生じる、請求項１または４４に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも約１０％の抗原特異的Ｔ細胞、または少なくとも約１５％の抗原特異的Ｔ細胞、または少なくとも約２０％の抗原特異的Ｔ細胞、または少なくとも約２５％の抗原特異的Ｔ細胞を生じる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも約１０６個、または少なくとも約１０７個の抗原特異的Ｔ細胞が得られる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも約１０６個、または少なくとも約１０７個の抗原特異的Ｔ細胞が、養子免疫療法として、患者レシピエントに投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｔ細胞抗原またはＴ細胞レパートリーの成分を同定するための方法であって、
対象由来のＴ細胞を含む試料を提供する段階と、
各々、その表面上にＭＨＣ−ペプチド抗原提示複合体を含む常磁性粒子のライブラリーに対して、単離されたＴ細胞をスクリーニングする段階であって、前記粒子が直径約１０〜約５００ｎｍであり、各粒子が候補ペプチド抗原を提示する、前記段階と、
前記対象のＴ細胞の活性化を引き起こす、１つ以上のペプチド抗原を同定する段階と
を含む、前記方法。
【請求項５０】
前記対象が癌患者である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記候補ペプチドが、前記患者の癌の遺伝子分析から予測されるペプチド抗原を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記スクリーニングする段階が、前記対象のＴ細胞及び前記常磁性粒子のライブラリーを、磁場の存在下でインキュベーションすることを含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象のＴ細胞の活性化が、任意で免疫化学若しくはＲＴ−ＰＣＲによって測定されるサイトカイン発現によって同定されるか、または前記対象のＴ細胞の活性化が、Ｔ細胞活性化を示す細胞内シグナル伝達を測定することによって同定される、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
選択されたペプチド抗原が人工的抗原提示細胞上に負荷され、前記患者に投与される、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記同定された抗原を認識するＴ細胞をエクスビボで濃縮しかつ増殖させて、前記対象に投与する、請求項４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が免疫疾患を有することが疑われ、前記常磁性粒子が、自己免疫疾患及び／または免疫疾患を示す候補ペプチドのライブラリーを提示する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が感染性疾患を有することが疑われ、前記常磁性粒子が、感染性疾患を示す候補ペプチドのライブラリーを提示する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記同定された抗原を認識するＴ細胞が、
患者または適切なドナー由来のＴ細胞を含む試料を提供するプロセスと、
密度勾配遠心分離またはフローサイトメトリーによって、抗原特異的Ｔ細胞を回収するプロセスと、によって濃縮される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記回収されたＴ細胞を表現型的に特徴付ける段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
前記回収されたＴ細胞を培養下で増殖させる段階をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項６１】
前記回収されたＴ細胞を前記磁気粒子から単離する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
前記単離されたＴ細胞を、疾患の治療のために、前記疾患を有するレシピエントに注射する段階をさらに含む、請求項１または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記回収されたＴ細胞をエクスビボで培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
前記回収されたＴ細胞が、前記試料中に１０−６個未満のＴ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６５】
前記試料が、養子移入レシピエントに対してＨＬＡ不適合である適切なドナー由来のＴ細胞を含み、前記回収された抗原特異的Ｔ細胞が前記レシピエントに養子移入される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗原提示複合体及び前記共刺激リガンドが、抗体によって前記常磁性粒子の表面に結合される、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗原提示複合体が、前記患者の腫瘍の遺伝子分析から予測されるネオ抗原を提示し、前記ネオ抗原が、パッセンジャー突然変異、ドライバー突然変異、癌遺伝子形成突然変異、及び腫瘍抑制因子破壊突然変異からなる群より選択される突然変異によって形成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗原提示複合体が、前記患者の腫瘍の遺伝子分析から予測される抗原を提示する、請求項４に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗原を前記患者にワクチン接種する段階をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗原で前記患者のＴ細胞を刺激する段階をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗原特異的Ｔ細胞が１つ以上の活性化マーカーを発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項７２】
前記常磁性粒子が、その表面上に、少なくとも５つのＭＨＣ−ペプチド抗原提示複合体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項７３】
前記常磁性粒子が、その表面上に、少なくとも１０のＭＨＣ−ペプチド抗原提示複合体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項７４】
前記常磁性粒子が、その表面上に、少なくとも５つのリンパ球共刺激リガンド分子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項７５】
前記常磁性粒子が、その表面上に、少なくとも１０のリンパ球共刺激リガンド分子を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項７６】
前記常磁性粒子が、その表面上に、ＭＨＣ−ペプチド抗原提示複合体を含み、前記試料を、リンパ球共刺激リガンドを含む第２の粒子とさらに接触させる、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記疾患が慢性感染性疾患である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７８】
前記接触させる段階が、前記集団の限界希釈を使用する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７９】
前記抗原特異的Ｔ細胞からｍＲＮＡを単離する段階と、前記ｍＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡに対して配列決定反応を実行する段階と、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８０】
前記常磁性粒子が検出可能に標識され、前記方法が、Ｔ細胞活性化マーカーの発現に関して、前記抗原特異的Ｔ細胞をアッセイすることをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項８１】
前記抗原提示複合体及び前記共刺激リガンドが、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン結合対によって、前記常磁性粒子の表面に結合される、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記表現型の特徴付けが、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、Ｔｉｍ−３、Ｌａｇ−３、及びＩＣＳからなる群より選択されるマーカーに関してアッセイすることを含む、請求項５９記載の方法。
【請求項８３】
前記スクリーニングする段階の前に、抗原に特異的である前記試料中のＴ細胞に関して濃縮する段階をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願の主題は、免疫療法に関し、かつ２０１４年３月１３日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２５８８９に開示される主題に関連し、該文献の内容は本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
抗原特異的ナイーブ（ｎａｉｖｅ）前駆体は１００万あたり１個程度のことがあるほど稀であるため、抗原特異的Ｔ細胞の増殖は複雑である。養子療法に必要な多数の（例えば）腫瘍特異的Ｔ細胞を生成するために、従来法ではリンパ球を何週間にも渡って抗原で刺激し、多くの場合労働力を要するプロセスでＴ細胞選択及びサブクローニングが続く。
【０００３】
療法及び診断の両方の目的のため、ナイーブ前駆体から、多数かつ高頻度で抗原特異的Ｔ細胞を迅速に生成するか、または候補ペプチド抗原に対するＴ細胞反応を迅速に同定することが可能な技術が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
多様な態様において、本発明は、ナイーブＴ細胞由来のものを含み、かつ稀な前駆体細胞由来のものを含む、抗原特異的Ｔ細胞の迅速な濃縮及び培養下での増殖を提供する。本発明は、それによって、より有効な免疫療法（例えば養子移入によるもの）のためのプラットホームを提供する。本発明は、候補ペプチド抗原のライブラリーに対するＴ細胞反応性を決定することによって、患者リンパ球から抗原特異的Ｔ細胞反応を迅速に同定するためのプラットホーム、及び個別化免疫療法のためのプラットホームをさらに提供する。
【０００５】
本発明は、多様な実施形態において、ナノスケールの人工的抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用し、該細胞は、免疫細胞、例えば抗原特異的Ｔリンパ球、例えばＣＴＬを捕捉し、かつこれらの細胞に刺激シグナルを送達する。ａＡＰＣ上に存在するシグナルには、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）（クラスＩまたはクラスＩＩ）の状態で提示される抗原性ペプチドであるシグナル１、及びＴ細胞反応を調節する１つ以上の共刺激リガンドであるシグナル２が含まれ得る。いくつかの実施形態において、シグナル２は、ＣＤ２８に結合し、かつこれを介して活性化するリガンドである。多様な実施形態において、粒子材料は常磁性であり、好ましくは生体適合性であり、例えばデキストランコーティングされた酸化鉄粒子である。常磁性粒子は、磁場の適用によって磁性捕捉または「濃縮」を可能にし、それとともに濃縮細胞画分内での抗原特異的リンパ球の活性化及びそれに続く増殖を可能にし、これもまた磁場の適用によって増進される。
【０００６】
いくつかの態様において、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞集団を調製するための方法を提供する。本方法は、患者からＴ細胞を含む試料を提供することを含む。いくつかの実施形態において、患者に、抗原特異的Ｔ細胞を養子移入する必要がある。試料はＰＢＭＣ試料、または白血球取り出しによって得られる試料であってもよい。試料は、関心対象のＴ細胞、例えばＣＤ８＋  Ｔ細胞及び／またはナイーブＴ細胞に関して濃縮されていてもよい。Ｔ細胞を含有する試料を、関心対象の疾患に共通の（例えば腫瘍型）抗原を提示する、及び／または個別化ベースで選択された１つ以上の抗原を提示する、常磁性ａＡＰＣ集団と接触させる。特定の実施形態において、各ａＡＰＣビーズは単一の抗原を提示し、各々異なる抗原を提示するａＡＰＣビーズのカクテルが濃縮／増殖に用いられる。常磁性特性を利用して、磁石を近接して配置しそれによって非会合細胞からａＡＰＣ会合細胞を分離することによって、抗原特異的Ｔ細胞に関して試料を捕捉するかまたは「濃縮」する。回収したＴ細胞は、ａＡＰＣと培養することによってインビトロで増殖可能であり、かつ磁場の存在によって、抗原特異的細胞の増殖がさらに増進される。抗原特異的細胞の最適な増殖（及びさらなる純度）のため、濃縮及び増殖プロセスを１回以上反復してもよい。
【０００７】
特定の実施形態において、方法は、抗原特異的Ｔ細胞の約１０００〜１０，０００倍（以上）の増殖を提供し、約１０８を超える抗原特異的Ｔ細胞が、例えば１〜３週間のスパンで生成される。生じた細胞を患者に投与して疾患を治療することも可能である。同時移入された無関係の細胞からの増殖シグナルに関する競合が、関心対象の抗腫瘍Ｔ細胞の恒常的な増殖を有意に減弱させ得るため、抗原特異的頻度は、移入後の最適増殖のための独立した重要なパラメータである。
【０００８】
さらに他の態様において、本発明は、個別化ベースでＴ細胞抗原を選択するための方法を提供する。例えば、各々候補抗原性ペプチドを提示するａＡＰＣのアレイまたはライブラリーを、対象または患者由来のＴ細胞を用いてスクリーニングし、各ａＡＰＣ−ペプチドに対するＴ細胞の反応を決定するかまたは定量化する。例えば、サイトカイン発現またはＴ細胞活性化の他の代理マーカーの発現によって、Ｔ細胞反応を定量化することも可能である。例示的なアッセイプラットホームには、免疫化学、例えばＥＬＩＳＡ、または例えばＲＴ−ＰＣＲによる発現された遺伝子の増幅が含まれる。他の実施形態において、Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞活性化の指標である細胞内シグナル伝達事象、例えばカルシウムシグナル伝達を測定することによって、定量化される。こうしたアッセイに、当該技術分野に知られる任意の多様な比色アッセイを使用することも可能である。
【０００９】
最もロバストな反応を示すペプチド抗原が免疫療法のために選択され、免疫療法にはいくつかの実施形態において養子免疫療法が含まれ、これは、抗原特異的Ｔ細胞の濃縮及び増殖によって達成可能である。いくつかの実施形態においては、特に癌免疫療法のため、患者の腫瘍を遺伝子分析し、患者のユニークな腫瘍突然変異シグネチャーから腫瘍抗原を予測する。これらの予測された抗原（「ネオ抗原」）を合成し、ａＡＰＣプラットホームを用いて、患者のＴ細胞に対してスクリーニングする。ひとたび反応性抗原が同定／確認されたら、本明細書に記載する濃縮及び増殖プロトコルのため、ａＡＰＣを調製することも可能であるし、またはいくつかの実施形態において、ａＡＰＣを患者に直接投与することも可能である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、患者または対象のＴ細胞を、各々異なる候補ペプチド抗原を提示する常磁性ａＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングする。この選別は、対象または患者のＴ細胞レパートリーに関する豊富な情報を提供することも可能であり、その結果は、診断または予後判定目的のために有用である。例えば、突然変異タンパク質、過剰発現されたタンパク質、及び／または他の腫瘍関連抗原に対するＴ細胞抗腫瘍反応の数及び同一性をバイオマーカーとして用いて、リスクを層別化するか、免疫療法の有効性を観察するか、または免疫療法治療の転帰を予測することも可能である。さらに、こうしたＴ細胞反応の数若しくは強度は、疾患進行リスクに反比例することも可能であるし、または化学療法に対する耐性若しくは無反応性を予測することも可能である。他の実施形態において、各々、候補ペプチド抗原を提示するナノＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対して、対象または患者のＴ細胞がスクリーニングされ、Ｔ細胞反応の存在、またはこれらのＴ細胞反応の数若しくは強度は、例えば、自己免疫疾患を同定するか、または患者が無症候性腫瘍を有することを同定することによって、患者の健康に関する情報を提供する。これらの実施形態において、プロセスは潜在的な疾患状態を同定するだけでなく、疾患生物学の最初の理解を提供する。
【００１１】
本発明は、これによって、抗原特異的免疫細胞のエクスビボでの検出、濃縮、活性化、及び／または増殖が、療法的にまたは診断的に望ましい、癌、自己免疫疾患、及び他の疾患を含む、いくつかのＴ細胞関連疾患または状態において、診断上の及び療法上の進歩を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、以下の詳細な説明に基づいて、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図面の説明
【図１】抗原特異的Ｔ細胞の濃縮及び増殖のための実施形態の模式図を提示する。（図１Ａ）ＭＨＣ−Ｉｇ二量体（シグナル１）及び共刺激抗ＣＤ２８抗体（シグナル２）を５０〜１００ｎｍの鉄−デキストランナノ粒子にカップリングすることによって、ナノスケールの人工的抗原提示細胞（ナノａＡＰＣ）の実施形態を合成する。（図１Ｂ）磁気濃縮の模式図。ナノａＡＰＣに結合した抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、「濃縮」段階において、磁気カラム中に保持され、一方、非同族（ｎｏｎ−ｃｏｇｎａｔｅ）細胞は、結合する可能性がより低い。次いで、濃縮Ｔ細胞をナノａＡＰＣによって活性化し、「増殖」段階において、増殖させる。
【図２】ナノａＡＰＣが仲介する抗原特異的Ｔ細胞の濃縮。（図２Ａ）ナノａＡＰＣは、１０００倍超ポリクローナルであるＴｈｙ１．２＋  Ｂ６脾臓細胞のプールから、同族であるＴｈｙ１．１＋  ｐｍｅｌ細胞の抗原特異的濃縮を仲介する。（図２Ｂ）増加する量のナノａＡＰＣを適用して、（図２Ａ）におけるように実行したｐｍｅｌの濃縮後に回収された、抗原特異的細胞頻度及び回収された細胞パーセントの要約。（図２Ｃ）ナノａＡＰＣによる内因性Ｄｂ−ｇｐ１００脾臓細胞の濃縮（上部）。非同族Ｋｂ−Ｔｒｐ２細胞の頻度は濃縮後も増加しない（下部）。
【図３】濃縮後の抗原特異的Ｔ細胞の増殖。（図３Ａ）増殖に対する濃縮の効果を評価するために用いた細胞分画の模式図。粒子に結合した抗原特異的Ｔ細胞は磁気カラムで捕捉され（陽性画分）、一方、結合していない細胞は通過する（陰性画分）。陰性画分を陽性画分に戻して、濃縮の影響を取り消すことも可能である（陽性＋陰性）。（図３Ｂ）Ｋｂ−Ｔｒｐ２ナノａＡＰＣが濃縮された結果としての、培養７日後に生成される抗原特異的細胞頻度の増加。陰性（左）、陽性（中央）及び陽性＋陰性（右）画分を７日間培養し、次いで、同族Ｋｂ−Ｔｒｐ２（上部）及び対照Ｋｂ−ＳＩＩＮＦ（下部）二量体で染色する。（図３Ｃ）細胞を濃縮した際、Ｋｂ−Ｔｒｐ２細胞頻度は１０〜１５倍増加（＊、ｔ検定によって、ｐ＜０．００１）。（図３Ｄ）同族ナノａＡＰＣで７日間濃縮した後の、Ｄｂ−ｇｐ１００、Ｋｂ−ＳＩＩＮＦ、及びＬｄ−Ａ５ナノａＡＰＣ増殖の、代表的なＦＡＣＳプロット。（図３Ｅ）示したナノａＡＰＣで濃縮し、活性化した後の、抗原特異的細胞パーセント（左）及び抗原特異的細胞総数（右）の要約。（図３Ｆ）３つの抗原（Ｄｂ−ｇｐ１００、Ｋｂ−ＳＩＩＮＦ、Ｋｂ−Ｔｒｐ２）で同時に濃縮、増殖させた。各抗原に対する、同じＴ細胞培養物由来の抗原特異性の代表的なＦＡＣＳプロット。（図３Ｇ）個々にまたは一緒に濃縮しかつ増殖させた際の、示した３つの抗原に対して生成される抗原特異性（左）及び抗原特異的細胞総数（右）の比較。
【図４】濃縮しかつ増殖させたＴ細胞の養子移入は、腫瘍排除を仲介する。（図４Ａ）養子移入後の増殖に対する、リンパ枯渇及びバイスタンダー競合減少の影響。無関係なＢ６細胞が１０６個または１０７個のいずれかで存在する状態で１０５個のｐｍｅｌ  Ｔ細胞を養子移入する１日前に、Ｂ６マウスを、処置しないか、または５００ｃＧｙガンマ照射でリンパ枯渇させた。リンパ枯渇、及びより少ないバイスタンダー細胞の投与はどちらも、脾臓及びリンパ節から回収されるｐｍｅｌ  Ｔ細胞の頻度を増加させた（2元配置ＡＮＯＶＡによって、ｐ＜０．０１）。（図４Ｂ）（図４Ａ）で回収したＴｈｙ１．１＋  ｐｍｅｌ細胞の総数。（図４Ｃ）養子移入の前に７日間培養したＫｂ−Ｔｒｐ２及びＤｂ−ｇｐ１００濃縮＋増殖リンパ球は、黒色腫増殖を阻害した（2元配置ＡＮＯＶＡによって、ｐ＜０．０１、８匹のマウス／群）。マウスは、８日前に皮下に黒色腫を注射され、かつ１日前に５００ｃＧｙガンマ照射で照射された。非同族の、濃縮しかつ増殖させたリンパ球（ＳＩＩＮＦ）は、腫瘍増殖を阻害せず（未処置に比較して）、一方、同族の、濃縮しかつ増殖させたリンパ球（Ｔｒｐ２＋ｇｐ１００）は、腫瘍増殖を阻害した。（図４Ｄ）（図４Ｃ）からの動物の生存。Ｋｂ−Ｔｒｐ２及びＤｂ−ｇｐ１００処置群において、２／８のマウスが腫瘍の完全な排除を示し、非同族及び未処置群と比較して、有意により長い生存であった（マンテル−コックスによって、ｐ＜０．０１）。
【図５】ヒト抗腫瘍反応の増大。ＣＤ８＋  ＰＢＭＣを、健康なドナーから単離し、１週間の濃縮及び増殖プロトコルを用いて増殖させた。（図５Ａ）ＣＤ８単離直後（第０日、左）、ならびに濃縮及び増殖１週間後（第７日、右）のＡ２−ＮＹ−ＥＳＯ１（上部）及びＡ２−ＭＡＲＴ１（下部）特異的細胞の代表的な染色及び頻度。（図５Ｂ）示したナノａＡＰＣでの濃縮／増殖後の抗原特異的細胞頻度パーセント（上部）及び抗原特異的細胞総数（下部）の要約。異なるドナーを用いた３回の実験から得た結果。
【図６】ネオエピトープによる増殖。（図６Ａ）Ｂ１６及びＣＴ２６ミュートーム（ｍｕｔｏｍｅ）に関する候補ペプチドを生成するためのプロセスの模式図。一塩基対置換（ＳＢＳ）部周囲の１７mer配列を、ＭＨＣＮｅｔ予測アルゴリズムによって、ＭＨＣ結合に関して評価する。（図６Ｂ）同族（上部）及び非同族（下部）ＭＨＣに対するネオエピトープに対して、ナノａＡＰＣ  Ｅ＋Ｅで７日間増殖させた細胞の代表的な結合。（図６Ｃ）Ｅ＋Ｅ  １週間後に得られる総ネオエピトープ特異的細胞。
【図７】マイクロａＡＰＣは、抗原特異的濃縮に関して有効でない。（図７Ａ）結合したビーズの蛍光標識によって特徴付けられる、マイクロ（上部）及びナノ（下部）ａＡＰＣの同族ｐＭＥＬ（赤）または非同族２Ｃ（青）ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合。ビーズ不含（灰色）バックグラウンドを対照として示す。（図７Ｂ）マイクロａＡＰＣは、同族細胞を濃縮しない。Ｔｈｙ１．１＋  ｐｍｅｌ細胞を、ポリクローナルなＴｈｙ１．２＋  Ｂ６脾臓細胞と、１：１０００の比でインキュベーションし、Ｄｂ−ＧＰ１００微粒子を用いて濃縮を試みた。Ｔｈｙ１．１＋細胞の頻度は、濃縮後に有意に増加しなかった。（図７Ｃ）マイクロａＡＰＣの増加する量を適用して図７Ｃにおけるように行った、抗原特異的細胞頻度及び回収された細胞のパーセント。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
養子免疫療法は、エクスビボでの免疫細胞の活性化及び増殖を伴い、生じた細胞を患者に移入して、疾患、例えば癌を治療する。例えば、養子移入による抗原特異的細胞傷害性（ＣＤ８＋）リンパ球（ＣＴＬ）反応の導入は、十分な数及び頻度の、活性化された抗原特異的であるＣＴＬが、稀な前駆体細胞由来のものを含めて比較的短期間で生成可能であるならば、魅力的な療法であり得る。このアプローチは、いくつかの実施形態において、疾患の再発を防止する長期記憶でさえ生成可能である。癌免疫療法、及びＣＴＬを用いる免疫療法に加えて、本発明は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞を含む他の免疫細胞にも使用を見出し、したがって、とりわけ、感染性疾患及び自己免疫疾患のための免疫療法に広く適用可能である。
【００１５】
１つの態様において、本発明は、免疫エフェクター細胞、例えば抗原特異的Ｔリンパ球、例えばＣＴＬを捕捉し、かつこれらの細胞に刺激シグナルを送達する、人工的抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。いくつかの実施形態において、これらのａＡＰＣは、養子免疫療法のための強力なツールを提供する。ａＡＰＣ上に存在するＴ細胞活性化を支持するシグナルには、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）、クラスＩまたはクラスＩＩの状態で提示され、かつ抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する抗原性ペプチドであるシグナル１、及びＴ細胞反応を調節する１つ以上の共刺激リガンドであるシグナル２が含まれる。この系のいくつかの実施形態において、シグナル１は、単量体、二量体または多量体ＭＨＣ構築物によって与えられる。二量体構築物は、いくつかの実施形態において、免疫グロブリン重鎖配列の可変領域またはＣＨ１領域の融合によって生成される。ＭＨＣ複合体には、１つ以上の抗原性ペプチドが負荷され、シグナル２は、Ｂ７．１（Ｔ細胞受容体ＣＤ２８の天然リガンド）またはＣＤ２８に対する活性化抗体のいずれかである。どちらのリガンドも、マイクロスケール（４．５μｍ）またはナノスケールビーズの表面に直接、化学的にカップリングされて、人工的抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を生成することも可能である。いくつかの実施形態において、粒子材料は常磁性であり、磁場の適用によって磁気捕捉または「濃縮」を可能にし、それに続く濃縮細胞画分内での抗原特異的リンパ球の増殖を可能にし、これもまた磁場の適用によって増進される。他の実施形態において、常磁性特性は、ナイーブ細胞由来のものであっても、迅速なＴ細胞反応（例えば活性化）を支持し、こうした反応はインビトロで数分から数時間以内に検出可能である。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明は、養子移入のための抗原特異的Ｔ細胞集団を調製するための方法を提供する。本方法は、抗原特異的Ｔ細胞の養子移入の必要がある患者からＴ細胞を含む試料を提供することを含む。本明細書に詳細に記載するように、各々、ＭＨＣ（クラスＩまたはＩＩ）の状態で関心対象のペプチド抗原を提示しかつそれによって試料中の抗原特異的Ｔ細胞（稀にしか提示されないナイーブ抗原特異的細胞を含む）と結合する常磁性ａＡＰＣ集団と、Ｔ細胞またはＴ細胞を含有する試料とを接触させる。ａＡＰＣは、関心対象の疾患（例えば腫瘍型）に共通の抗原を提示してもよいし、または個別化ベースで選択された１つ以上の抗原を提示してもよい。常磁性特性を利用して、例えば、非会合細胞からａＡＰＣ会合細胞を分離するために磁石を用いることによって、抗原特異的Ｔ細胞を捕捉するか、またはこうした細胞に関して試料を「濃縮」することも可能である。回収されたＴ細胞、例えば常磁性ａＡＰＣ粒子と会合したままである細胞を、ａＡＰＣの存在下で、インビトロで増殖させてもよく、抗原特異的細胞の増殖をさらに、磁場の存在によって増進させる。理論によって束縛されることは望ましくないが、抗原特異的Ｔ細胞に結合した常磁性ａＡＰＣは、磁場の存在下で、Ｔ細胞受容体クラスター形成を促進するであろうと考えられる。増殖段階は、いくつかの実施形態において、約３日間〜約２週間、または約５日間〜約１０日間（例えば約１週間）実行可能である。次いで、抗原特異的細胞の最適な増殖（及びさらなる純度）のため、濃縮及び増殖プロセスを１回以上、反復してもよい。濃縮及び増殖の続くラウンドのため、さらなるａＡＰＣをＴ細胞に添加して、試料中のより多量の抗原特異的Ｔ細胞集団の増殖を支持することも可能である。特定の実施形態において、増殖の最終ラウンド（例えばラウンド２、３、４、または５）はインビボで行われ、ここで生体適合性ナノＡＰＣを、増殖させたＴ細胞集団に添加し、次いで、患者内に注入する。
【００１７】
特定の実施形態において、本方法は、抗原特異的Ｔ細胞の約１０００〜１０，０００倍（以上）の増殖を提供し、約１０８個より多い抗原特異的Ｔ細胞が、例えば約１ヶ月未満、または約３週間未満、または約２週間未満、または約１週間のスパンで生成される。生じる細胞を患者に投与して疾患を治療することも可能である。いくつかの実施形態において、生じる抗原特異的Ｔ細胞集団と一緒に、ａＡＰＣを患者に投与してもよい。
【００１８】
さらに他の態様において、本発明は、個別化ベースでＴ細胞抗原を選択するための方法を提供する。例えば特定の実施形態において、各々候補抗原性ペプチドを提示するａＡＰＣのアレイまたはライブラリーを、対象または患者由来のＴ細胞で（いくつかの実施形態においては、磁場の存在下で）スクリーニングし、各ａＡＰＣ−ペプチドに対するＴ細胞の反応を決定するかまたは定量化する。いくつかの実施形態において、例えば、サイトカイン発現またはＴ細胞活性化の他の代理マーカーの発現を定量化することによって（例えば、免疫化学反応、または発現された遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによるなどの増幅によって）、Ｔ細胞反応を分子的に定量化してもよい。いくつかの実施形態において、定量化する段階は、培養中に、約１５時間〜４８時間の間で行う。他の実施形態において、Ｔ細胞反応は、細胞内シグナル伝達（例えばＣａ２＋シグナル伝達、またはＴ細胞活性化中の初期に起こる他のシグナル伝達）を検出することによって決定され、したがって、ナノａＡＰＣとの培養中、約１５分間〜約５時間（例えば約１５分間〜約２時間以内）で定量化可能である。最もロバストな反応を示すペプチドを、いくつかの実施形態において、本明細書記載の養子免疫療法を含む免疫療法のために選択する。いくつかの実施形態において、特に癌免疫療法のため、患者の腫瘍を遺伝子分析して（例えば次世代配列決定を用いて）、患者のユニークな腫瘍突然変異シグネチャーから腫瘍抗原を予測する。これらの予測された抗原（「ネオ抗原」）を合成し、本明細書記載のａＡＰＣプラットホームを用いて、患者のＴ細胞に対してスクリーニングする。ひとたび反応性抗原を同定し／確認したら、本明細書に記載する濃縮及び増殖プロトコルのためにａＡＰＣを調製することも可能であるし、またはいくつかの実施形態において、ａＡＰＣを患者に直接投与することも可能である。
【００１９】
いくつかの態様において、対象または患者のＴ細胞を、各常磁性ナノａＡＰＣがペプチド抗原を提示する、常磁性ナノａＡＰＣ（本明細書に記載する通り）のアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングする。各々に対するＴ細胞反応を、本明細書に記載するように決定するかまたは定量化し、患者のＴ細胞レパートリー、したがって、対象または患者の状態に関する有用な情報を提供する。
【００２０】
例えば、突然変異タンパク質、過剰発現されたタンパク質、及び／または他の腫瘍関連抗原に対するＴ細胞抗腫瘍反応の数及び同一性をバイオマーカーとして用いて、リスクを層別化してもよく、いくつかの実施形態において、これは、薬剤耐性若しくは薬剤感受性に関する反応プロファイルを分類するか、または免疫療法（例えばチェックポイント阻害剤療法または養子Ｔ細胞移入療法）のための候補として反応プロファイルを層別化する、コンピュータ実装分類子アルゴリズムを伴うことも可能である。例えば、こうしたＴ細胞反応の数または強度は、疾患進行の高リスクに反比例することも可能であるし、及び／または免疫療法に対する患者のあり得る反応に直接関連することも可能であり、これには、チェックポイント阻害剤療法、養子Ｔ細胞移入、または癌のための他の免疫療法の１つ以上が含まれることも可能である。
【００２１】
さらに他の態様及び実施形態において、患者のＴ細胞を、各々が候補ペプチド抗原を提示する、常磁性ナノａＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングする。例えば、アレイまたはライブラリーは、腫瘍関連抗原を提示してもよいし、または自己抗原を提示してもよいし、または多様な感染性疾患に関連するＴ細胞抗原を提示してもよい。アレイまたはライブラリーを患者Ｔ細胞とインキュベーションすることによって、かつＴ細胞受容体クラスター形成を進めるための磁場の存在下で、Ｔ細胞反応の存在、及び／またはこれらのＴ細胞反応の数若しくは強度を迅速に決定可能である。この情報は、例えば、無症候性腫瘍、自己免疫疾患若しくは免疫疾患、または感染性疾患の診断に有用であり、かつこれは、潜在的な病原性または療法性Ｔ細胞、Ｔ細胞抗原を含む、疾患生物学の最初の理解、及び薬剤または免疫療法ターゲットに相当する、関心対象のＴ細胞受容体の理解を提供可能である。
【００２２】
本発明の多様な態様の多様な代替実施形態を以下に詳細に記載する。
【００２３】
本発明は、エクスビボでの抗原特異的免疫細胞の検出、濃縮及び／または増殖が、療法的にまたは診断的に望ましい、癌及び他の疾患のための免疫療法を提供する。本発明は、一般的に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞、及び制御性Ｔ細胞を含む、抗原特異的Ｔ細胞の検出、濃縮及び／または増殖に適用可能である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、患者は癌患者である。患者への養子移入のためのエクスビボの抗原特異的ＣＴＬの濃縮及び増殖は、ロバストな抗腫瘍免疫反応を提供する。本方法に従って治療または評価され得る癌には、歴史的に、劣った免疫反応しか誘発しないかまたは高率の再発を有する癌が含まれる。例示的な癌には、癌腫、肉腫、及びリンパ腫を含む、多様なタイプの固形腫瘍が含まれる。多様な実施形態において、癌は、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、結腸癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腺管癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮内膜癌、精巣癌、胃癌、異形成口腔粘膜、ポリープ症、頭頸部癌、侵襲性口腔癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、中皮腫、移行細胞及び扁平細胞泌尿器癌（ｕｒｉｎａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、脳癌、神経芽腫、及び神経膠腫である。いくつかの実施形態において、癌は、血液学的悪性腫瘍、例えば慢性骨髄性白血病、小児期急性白血病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、悪性皮膚Ｔ細胞、菌状息肉症、非ＭＦ皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ腫瘍丘疹症、Ｔ細胞リッチ皮膚リンパ過形成、及び円板状エリテマトーデスである。
【００２５】
多様な実施形態において、癌は、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶである。いくつかの実施形態において、癌は転移性及び／または再発性である。いくつかの実施形態において、癌は発症前であり、かつ本明細書に記載するスクリーニング系において検出される（例えば結腸癌、膵臓癌、または早期検出が困難である他の癌）。
【００２６】
いくつかの実施形態において、患者は感染性疾患を有する。感染性疾患は、患者への養子移入のための抗原特異的免疫細胞（例えばＣＤ８＋またはＣＤ４＋  Ｔ細胞）のエクスビボでの濃縮及び増殖が、生産的な免疫反応を増進するかまたは提供することも可能であるものであってもよい。治療可能な感染性疾患には、細菌、ウイルス、プリオン、真菌、寄生虫、蠕虫等によって引き起こされるものが含まれる。こうした疾患には、ＡＩＤＳ、肝炎、ＣＭＶ感染、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）が含まれる。例えば、ＣＭＶは臓器移植患者に見られる最も一般的なウイルス性病原体であり、かつ骨髄または末梢血幹細胞移植を経た患者において、罹患率及び死亡率の主因である。これは、これらの患者の免疫無防備状態によるものであり、これによって、血清陽性患者における不顕性ウイルスの再活性化、または血清陰性個体における日和見感染が可能になる。これらの治療に対する有用な代替法は、移植処置開始前の、患者に由来するまたは適切なドナーに由来するウイルス特異的ＣＴＬの生成を伴う予防的免疫療法措置である。ＰＴＬＤは、移植患者のかなりの割合で起こり、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）感染から生じる。ＥＢＶ感染は、米国において、成人集団のおよそ９０％に存在すると考えられる。活性ウイルス複製及び感染は、免疫系によるチェックで維持されるが、ＣＭＶの場合のように、移植療法によって免疫無防備性となった個体は、調節性Ｔ細胞集団を失い、このためウイルス再活性化が可能になる。これは、移植プロトコルに対する深刻な障害に相当する。ＥＢＶはまた、多様な血液学的及び非血液学的癌における腫瘍促進にも関与し得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、患者は、自己免疫疾患を有し、この場合、患者への養子移入のための制御性Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、Ｆｏｘｐ３＋）のエクスビボでの濃縮及び増殖は、有害な免疫反応を弱め得る。治療可能な自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、尋常性天疱瘡、アジソン病、疱疹状皮膚炎、セリアック病、及び橋本甲状腺炎が含まれる。いくつかの実施形態において、患者は、自己免疫疾患または免疫状態（例えば前文に記載するもの）を有することが疑われ、本明細書に記載するような常磁性ナノａＡＰＣのライブラリーに対するＴ細胞反応の評価は、免疫状態を同定するかまたは確認するために有用である。
【００２８】
したがって、多様な実施形態において、本発明は、抗原特異性Ｔ細胞、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞、または制御性Ｔ細胞の濃縮及び増殖を含む。いくつかの実施形態において、本発明は抗原特異的ＣＴＬの濃縮及び増殖を含む。前駆体Ｔ細胞は、患者から、またはＨＬＡが適合する適切なドナーから得られ得る。前駆体Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多くの供給源から得られ得る。いくつかの実施形態において、試料は患者由来のＰＢＭＣ試料である。いくつかの態様において、ＰＢＭＣ試料を用いて、関心対象のＴ細胞集団、例えばＣＤ８＋、ＣＤ４＋または制御性Ｔ細胞を単離する。いくつかの実施形態において、前駆体Ｔ細胞は、当業者に知られる任意の多くの技術、例えばＦｉｃｏｌｌ分離法にいより、対象から収集される血液部分から得られる。例えば、個体の循環血液由来の前駆体Ｔ細胞は、アフェレーシスまたは白血球取り出しによって得られ得る。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞及び前駆体Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。白血球取り出しは、白血球を血液試料から分離する、実験室処置である。
【００２９】
アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、続くプロセシング段階のため、細胞を適切な緩衝液または培地に入れてもよい。当業者に知られる方法によって、例えば製造者の指示に従って、半自動「フロースルー」遠心分離（例えばＣｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサー）を用いることによって、洗浄する段階を達成してもよい。洗浄後、細胞を多様な生体適合性緩衝液、例えばＣａ不含、Ｍｇ不含ＰＢＳ中に再懸濁してもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。
【００３０】
望ましい場合、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配によって遠心分離することにより単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から前駆体Ｔ細胞を単離してもよい。
【００３１】
望ましい場合、存在し得る他の細胞から、Ｔ細胞の下位集団を分離してもよい。例えば、Ｔ細胞の特定の下位集団、例えばＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋  Ｔ細胞を、陽性または陰性選択技術によってさらに単離することも可能である。他の濃縮技術には、例えば細胞上に存在する陰性選択される細胞表面マーカーに対して向けられるモノクローナル抗体のカクテルを用いた、陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞ソーティング及び／または選択が含まれる。
【００３２】
特定の実施形態において、白血球取り出しによって白血球を収集し、続いて、既知の方法、例えば商業的に入手可能な磁気濃縮カラムを用いて、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に関して濃縮する。次いで、ａＡＰＣ試薬とともに磁気濃縮を用いて、ＣＤ８濃縮細胞を抗原特異的Ｔ細胞に関して濃縮する。多様な実施形態において、少なくとも約１０５個、または少なくとも約１０６個、または少なくとも約１０７個のＣＤ８濃縮細胞を、抗原特異的Ｔ細胞濃縮のために単離する。
【００３３】
多様な実施形態において、免疫細胞（例えばＣＤ８＋  Ｔ細胞）を含む試料を、磁気特性を有する人工的抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させる。常磁性物質は、磁場に対して小さい陽性感受性を有する。これらの物質は磁場に誘引され、かつこれらの物質は外部の磁場が取り除かれた際、磁性特性を保持しない。例示的な常磁性物質には、限定なしに、マグネシウム、モリブデン、リチウム、タンタル、及び酸化鉄が含まれる。磁性濃縮に適した常磁性ビーズは商業的に入手可能である（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）、ＭＡＣＳ  ＭＩＣＲＯＢＥＡＤＳ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。いくつかの実施形態において、ａＡＰＣ粒子は、鉄デキストランビーズ（例えばデキストランコーティングされた酸化鉄ビーズ）である。
【００３４】
特定の実施形態において、ａＡＰＣは少なくとも２つのリガンド、抗原提示複合体（ペプチド−ＭＨＣ）、及びリンパ球活性化リガンドを含有する。
【００３５】
抗原提示複合体は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体に対して提示するための抗原を収容する抗原結合溝部を含む。抗原提示複合体は、例えばＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子であってもよく、二量体または多量体ＭＨＣを提供するよう連結されるかまたは繋がれることも可能である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣは単量体であるが、アビディティ及び活性化には、ナノ粒子上の緊密な会合で十分である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣは二量体である。二量体ＭＨＣクラスＩ構築物を免疫グロブリン重鎖配列への融合によって構築してもよく、これらは次いで、１つ以上のジスルフィド結合によって（かつ結合した軽鎖を伴って）結合する。いくつかの実施形態において、シグナル１複合体は、非古典的ＭＨＣ様分子、例えばＣＤ１ファミリーのメンバー（例えばＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、及びＣＤ１ｅ）である。ＭＨＣ多量体は、ペプチドまたは化学的リンカーを介して直接繋ぐことによって生成されてもよいし、またはビオチン部分を介したストレプトアビジンとの会合によって多量体にすることも可能である。いくつかの実施形態において、抗原提示複合体は、免疫グロブリン配列との融合を伴う、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子複合体であり、これは、免疫グロブリン主鎖によって提供される安定性及び分泌効率に基づいて、非常に安定でありかつ産生するのが容易である。
【００３６】
免疫グロブリン配列を有するＭＨＣクラスＩ分子複合体は、米国特許第６，２６８，４１１号に記載され、該特許はその全体が本明細書に援用される。これらのＭＨＣクラスＩ分子複合体は、免疫グロブリン重鎖の端で、コンホメーション的に損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）様式で形成され得る。抗原性ペプチドが結合するＭＨＣクラスＩ分子複合体は、抗原特異的リンパ球受容体（例えばＴ細胞受容体）に安定して結合可能である。多様な実施形態において、免疫グロブリン重鎖配列は全長ではないが、Ｉｇヒンジ領域、ならびにＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３ドメインの１つ以上を含む。Ｉｇ配列は、可変領域を含んでもまたは含まなくてもよいが、可変領域配列が存在する場合、可変領域は、全長または部分的であってもよい。複合体は、さらに免疫グロブリン軽鎖を含んでもよい。
【００３７】
例示的なＭＨＣクラスＩ分子複合体は、少なくとも２つの融合タンパク質を含む。第１の融合タンパク質は、第１のＭＨＣクラスＩ  α鎖及び第１の免疫グロブリン重鎖（またはヒンジ領域を含むその一部）を含み、第２の融合タンパク質は、第２のＭＨＣクラスＩ  α鎖及び第２の免疫グロブリン重鎖（またはヒンジ領域を含むその一部）を含む。第１及び第２の免疫グロブリン重鎖は会合して、ＭＨＣクラスＩ分子複合体を形成し、該複合体は、２つのＭＨＣクラスＩペプチド結合溝部を含む。免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、またはＩｇＡの重鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ重鎖を用いて、ＭＨＣクラスＩ分子複合体を形成する。多価ＭＨＣクラスＩ分子複合体が望ましい場合、ＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖を用いて、それぞれ、五価または四価分子を提供してもよい。
【００３８】
例示的なクラスＩ分子には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅが含まれ、これらを個々に、または任意の組み合わせで使用してもよい。いくつかの実施形態において、抗原提示複合体は、ＨＬＡ−Ａ２リガンドである。
【００３９】
例示的なＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、米国特許第６，４５８，３５４号、米国特許第６，０１５，８８４号、米国特許第６，１４０，１１３号、及び米国特許第６，４４８，０７１号に記載され、これらの特許はその全体が本明細書に援用される。ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体は、少なくとも４つの融合タンパク質を含む。２つの第１の融合タンパク質は、（ｉ）免疫グロブリン重鎖（またはヒンジ領域を含むその一部）及び（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外ドメインを含む。２つの第２の融合タンパク質は、（ｉ）免疫グロブリンκまたはλ軽鎖（またはその一部）及び（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメインを含む。２つの第１の及び２つの第２の融合タンパク質が会合して、ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を形成する。第１の融合タンパク質各々のＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外ドメイン及び第２の融合タンパク質各々のＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合溝部を形成する。
【００４０】
免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、またはＩｇＡの重鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１重鎖を用いて、２つの抗原結合溝部を含む、二価分子複合体を形成する。任意で重鎖可変領域が含まれてもよい。ＩｇＭまたはＩｇＡ重鎖を用いて、それぞれ、五価または四価分子複合体を提供してもよい。
【００４１】
ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体の融合タンパク質は、免疫グロブリン鎖及びＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの細胞外ドメインの間に挿入されたペプチドリンカーを含んでもよい。リンカー配列の長さは、抗原結合及び受容体架橋の度合いを制御するために必要な柔軟性に応じて、多様であってもよい。
【００４２】
免疫グロブリン配列は、いくつかの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体配列である。
【００４３】
シグナル２は、一般的に、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子であり、すなわち前駆体Ｔ細胞に、または抗原特異的Ｔ細胞に対する生物学的影響を有する分子である。こうした生物学的影響には、例えば、前駆体Ｔ細胞の、ＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞（例えばＴｈ１、Ｔｈ２）、または制御性Ｔ細胞への分化、及び／またはＴ細胞の増殖が含まれる。したがって、Ｔ細胞に影響を及ぼす分子には、Ｔ細胞共刺激分子、接着分子、Ｔ細胞増殖因子、及び制御性Ｔ細胞誘導分子が含まれる。いくつかの実施形態において、ａＡＰＣは少なくとも１つのこうしたリガンドを含み、任意でａＡＰＣは少なくとも２つ、３つ、または４つのこうしたリガンドを含む。
【００４４】
特定の実施形態において、シグナル２は、Ｔ細胞共刺激分子である。Ｔ細胞共刺激分子は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化に寄与する。こうした分子には、限定されるわけではないが、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０Ｌ）、Ｂ７ｈ（Ｂ７ＲＰ−１）、ＣＤ４０、ＬＩＧＨＴに特異的に結合する分子（抗体を含む）、ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する抗体、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体、及び４−１ＢＢに特異的に結合する抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、共刺激分子（シグナル２）は、抗体（例えばモノクローナル抗体）またはその一部、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、または一本鎖抗体、または他の抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化モノクローナル抗体若しくは抗原結合活性を有するその一部であるか、または完全ヒト抗体若しくは抗原結合活性を有するその部分である。
【００４５】
ナノａＡＰＣに有用な接着分子を用いて、ナノａＡＰＣのＴ細胞へのまたはＴ細胞前駆体への接着を仲介してもよい。有用な接着分子には、例えば、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３が含まれる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、シグナル１は、ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体によって提供され、シグナル２は、Ｂ７．１−Ｉｇまたは抗ＣＤ２８によって提供される。例示的な抗ＣＤ２８モノクローナル抗体は、９．３  ｍＡｂ（Ｔａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３  １７７：１６５）であり、該抗体は、特定の実施形態においてヒト化され、及び／または損なわれていない完全な抗体またはその抗原結合断片として、ビーズにコンジュゲートされてもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態は、Ｔ細胞増殖因子を使用し、該因子は、Ｔ細胞の増殖及び／または分化に影響を及ぼす。Ｔ細胞増殖因子の例には、サイトカイン（例えばインターロイキン、インターフェロン）及びスーパー抗原が含まれる。望ましい場合、融合タンパク質を含む分子複合体中にサイトカインが存在してもよく、またはａＡＰＣによって被包されていてもよい。特に有用なサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１ガンマインターフェロン、及びＣＸＣＬ１０が含まれる。任意で、サイトカインは、増殖段階中に、培地成分によって単独で提供される。
【００４８】
ナノ粒子は、任意の材料で作製されていてもよく、材料は、望ましい磁性特性に関して適切に選択されてもよく、例えば、金属、例えば鉄、ニッケル、コバルト、または希土類金属の合金を含んでもよい。常磁性材料にはまた、マグネシウム、モリブデン、リチウム、タンタル、及び酸化鉄も含まれてもよい。物質（細胞を含む）の濃縮に適した常磁性ビーズが商業的に入手可能であり、これには鉄デキストランビーズ、例えばデキストランコーティングされた酸化鉄ビーズが含まれる。磁性特性が必要でない本発明の態様において、ナノ粒子はまた、非金属または有機（例えばポリマー性）材料、例えばセルロース、セラミックス、ガラス、ナイロン、ポリスチレン、ゴム、プラスチック、またはラテックスで作製されてもよい。ナノ粒子を調製するための例示的な材料には、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びそのコポリマーがあり、該材料をこれらの実施形態と組み合わせて使用してもよい。使用可能なポリマー及びコポリマーを含む他の材料には、本明細書にその全体が援用される、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２５８８９に記載されるものが含まれる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、磁気粒子は生体適合性である。これは、ａＡＰＣが、濃縮しかつ増殖させた細胞と会合して患者に送達される実施形態において特に重要である。例えば、いくつかの実施形態において、磁気粒子は、生体適合性鉄デキストラン常磁性ビーズである。
【００５０】
多様な実施形態において、粒子は、約１０〜約５００ｎｍ、または約２０〜約２００ｎｍ内のサイズ（例えば平均直径）を有する。特に、ａＡＰＣを患者に送達する実施形態において、マイクロスケールａＡＰＣはリンパ管によって運ぶには大きすぎ、皮下注射した際は注射部位に留まる。静脈内注射すると、これらは毛細血管床に留まる。実際、マイクロスケールのビーズの劣った輸送は、ａＡＰＣが最適免疫療法のため輸送されるべきである場合の研究を妨げてきた。ナノａＡＰＣの輸送及び生体分布は、マイクロスケールａＡＰＣよりもより効率的であるようである。例えば、ａＡＰＣが最も有効である２つの潜在的な部位は、ナイーブ及び記憶Ｔ細胞が常在するリンパ節、ならびに腫瘍自体である。約５０〜約２００ｎｍ直径のナノ粒子は、リンパ管に取り込まれ、リンパ節に輸送され、したがって、Ｔ細胞のより大きなプールへのアクセスを獲得し得る。本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２５８８９に記載されるように、ナノａＡＰＣの皮下注射は、対照または静脈内注射ビーズよりも、より少ない腫瘍増殖を生じた。
【００５１】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を患者に注入する直前にナノサイズのａＡＰＣを用いて抗原特異的Ｔ細胞を再濃縮すると、例えば、マイクロサイズのａＡＰＣを細胞とともに患者に注入する場合の影響であり得る、静脈及び動脈の閉塞を回避するであろう。
【００５２】
細胞−ナノ粒子界面での受容体−リガンド相互作用は、よく理解されていない。しかし、ナノ粒子結合及び細胞活性化は、膜空間構造に影響されやすく、これは特に、Ｔ細胞活性化中に重要であって、磁場を用いて、クラスター結合ナノ粒子を操作して、活性化を増進させることも可能である。ＷＯ／２０１４／１５０１３２を参照されたい。例えば、Ｔ細胞活性化は、持続的に増進されるナノスケールＴＣＲクラスター形成の状態を誘導し、ナノ粒子は、より大きい粒子が影響されにくい方式で、このクラスター形成の影響をうけやすい。ＷＯ／２０１４／１５０１３２を参照されたい。
【００５３】
さらに、ＴＣＲクラスターとナノ粒子の相互作用を利用して、受容体誘発を増進することも可能である。Ｔ細胞活性化は、シグナル伝達タンパク質の凝集によって仲介され、数百ナノメートルに渡る「シグナル伝達クラスター」が、Ｔ細胞−ＡＰＣ接触部位の周辺に最初に形成され、内側に移動する。本明細書に記載するように、外部磁場を用いて、抗原特異的Ｔ細胞（稀なナイーブ細胞を含む）を濃縮し、ＴＣＲに結合した磁気ナノａＡＰＣの凝集を行わせて、ＴＣＲクラスターの凝集及びナイーブＴ細胞の活性化増進を生じることも可能である。磁場は常磁性粒子に対して、適切に強い力を発揮し得るが、それ以外では生物学的に不活性であり、このため、粒子の振る舞いを調節する強力なツールとなっている。常磁性ナノａＡＰＣに結合したＴ細胞は、外部適用される磁場の存在下で活性化される。ナノａＡＰＣはそれ自体磁化され、磁場供給源及び磁場中の近傍のナノ粒子の両方に付着し、ビーズ及びしたがってＴＣＲ凝集を誘導して、ａＡＰＣ仲介活性化をブーストする。ＷＯ／２０１４／１５０１３２を参照されたい。
【００５４】
ナノａＡＰＣは、より多くのＴＣＲに結合し、かつナイーブＴ細胞に比較して、以前活性化されたものより大きな活性化を誘導する。さらに、外部磁場を適用すると、ナイーブ細胞上のナノａＡＰＣ凝集が誘導され、インビトロで、かつその後のインビボ養子移入での両方で、Ｔ細胞増殖を増進する。重要なことに、黒色腫養子免疫療法モデルにおいて、磁場中でナノａＡＰＣによって活性化されたＴ細胞は、腫瘍排除を仲介する。したがって、適用された磁場を用いると、そうでなければ刺激に対して不十分にしか反応しない、ナイーブＴ細胞集団の活性化が可能になる。ナイーブＴ細胞は、癌免疫療法に関して、より分化したサブタイプよりもより有効であることが示されてきているため、これは重要な特徴であり、高い増殖能及び長期の強いＴ細胞反応を生成する能力を伴う。したがって、ナノａＡＰＣをＴ細胞の磁場増進活性化に用いて、ナイーブ前駆体から増殖させた抗原特異的Ｔ細胞の収量及び活性を増加させて、例えば感染性疾患、癌、若しくは自己免疫疾患を有する患者のための細胞療法を改善するか、または免疫抑制患者に対する予防的保護を提供することも可能である。
【００５５】
吸着によって、または共有結合を含む直接化学結合によって、分子を直接、ナノ粒子に付着させることも可能である。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６を参照されたい。求核基、脱離基、または求電子基を含む、多様な化学的官能性で、分子自体を直接活性化してもよい。活性化官能基には、ハロゲン化アルキル及びアシル、アミン、スルフィドリル、アルデヒド、不飽和結合、ヒドラジド、イソシアネート、イソチオシアネート、ケトン、及び化学結合を活性化することが知られる他の基が含まれる。あるいは、小分子カップリング試薬の使用によって、分子をナノ粒子に結合させてもよい。カップリング試薬の限定されない例には、カルボジイミド、マレイミド、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビスクロロエチルアミン、二官能性アルデヒド、例えばグルタルアルデヒド、無水物等が含まれる。他の実施形態において、アフィニティ結合、例えば当該技術分野に周知であるようなビオチン−ストレプトアビジン連結またはカップリングによって、分子をナノ粒子にカップリングしてもよい。例えば、共有または非共有結合によって、ストレプトアビジンをナノ粒子に結合させてもよいし、当該技術分野に周知の方法を用いて、ビオチン化分子を合成してもよい。
【００５６】
ナノ粒子への共有結合を意図する場合、典型的にはリンカーを介して、適切な反応物質への共有結合に利用可能な、１つ以上の化学部分または官能基を含有するポリマーで支持体をコーティングしてもよい。例えば、アミノ酸ポリマーは、適切なリンカーを介して、共有結合的に分子にカップリングするために利用可能である基、例えばリジンのεアミノ基を有してもよい。本開示はまた、ナノ粒子上に第２のコーティングを施し、これらの官能基を提供することも意図する。
【００５７】
活性化化学反応を用いて、ナノ粒子表面への分子の特異的で安定な付着を可能にしてもよい。官能基にタンパク質を付着させるために使用可能な多くの方法がある。例えば、一般的な架橋グルタルアルデヒドを用いて、二ステッププロセスで、アミン化ナノ粒子表面にタンパク質アミン基を付着させてもよい。生じる連結は、加水分解に対して安定である。他の方法には、タンパク質上のアミンと反応するｎ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含有する架橋剤、アミン、スルフィドリル、またはヒスチジン含有タンパク質と反応する活性ハロゲンを含有する架橋剤、アミンまたはスルフィドリル基と反応するエポキシドを含有する架橋剤、マレイミド基及びスルフィドリル基の間のコンジュゲート、ならびにペンダント糖部分の過ヨウ素酸酸化後の還元アミン化によるタンパク質アルデヒド基の形成の使用が含まれる。
【００５８】
同じナノ粒子上の特定のリガンドの比は、抗原または共刺激リガンド提示におけるナノ粒子有効性を増加させるために多様であってもよい。例えば、ナノ粒子を、多様な比、例えば約３０：１、約２５：１、約２０：１、約１５：１、約１０：１、約５：１、約３：１、約２：１、約１：１、約０．５：１、約０．３：１、約０．２：１、約０．１：１、または約０．０３：１のＨＬＡ−Ａ２−Ｉｇ及び抗ＣＤ２８とカップリングさせてもよい。支持体にカップリングさせるタンパク質の総量は、例えば粒子あたり約２５０ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。サイトカイン放出及び増殖などのエフェクター機能は、シグナル１対シグナル２に関して、Ｔ細胞活性化及び分化とは異なる要求を有し得るため、これらの機能を別個に決定してもよい。
【００５９】
ナノ粒子の立体配置は、不規則な形状から球状まで、及び／または不均一若しくは不規則な表面を有するものから平滑な表面を有するものまで、多様であることも可能である。非球体ａＡＰＣは、本明細書にその全体が援用されるＷＯ  ２０１３／０８６５００に記載される。
【００６０】
ａＡＰＣは、Ｔ細胞に抗原を提示し、したがって、これを用いて、ナイーブＴ細胞由来のもの含む抗原特異的Ｔ細胞の、濃縮および増殖の両方が可能である。ペプチド抗原は、望ましい療法、例えば、癌、癌のタイプ、感染性疾患等に基づいて、選択されるであろう。いくつかの実施形態において、本方法は、癌患者を治療するために行われ、患者に特異的なネオ抗原が同定され、ａＡＰＣに負荷するために合成される。いくつかの実施形態において、腫瘍の遺伝子分析（例えば核酸配列決定）後、予測バイオインフォマティクスによって、３〜１０種のネオ抗原を同定する。本明細書に示すように、本方法における機能性の損失をまったく伴わずに、いくつかの抗原を（別個のａＡＰＣ上で）一緒に使用することも可能である。いくつかの実施形態において、抗原は、天然非突然変異癌抗原であり、こうしたものは多く知られる。個別化ベースで抗原を同定するためのこのプロセスを、以下により詳細に記載する。
【００６１】
多様な抗原を抗原提示複合体に結合させてもよい。抗原の性質は、用いる抗原提示複合体のタイプに応じる。例えば、ペプチド抗原をＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩペプチド結合溝部に結合させてもよい。非古典的ＭＨＣ様分子を用いて、リン脂質、複合炭水化物等（例えば細菌膜成分、例えばミコール酸及びリポアラビノマンナン）を提示してもよい。免疫反応を誘導可能な任意のペプチドを、抗原提示複合体に結合させてもよい。抗原性ペプチドには、腫瘍関連抗原、自己抗原、同種抗原、及び感染性病原体の抗原が含まれる。
【００６２】
「腫瘍関連抗原」には、由来する腫瘍によってもっぱら発現されるユニークな腫瘍抗原、多くの腫瘍において発現されるが、正常成人組織においては発現されない共通の腫瘍抗原（癌胎児性抗原）、及び腫瘍が発生した正常組織によってもまた発現される組織特異的抗原が含まれる。腫瘍関連抗原は、例えば、胚性抗原、異常な翻訳後修飾を含む抗原、分化抗原、突然変異癌遺伝子または腫瘍抑制因子の産物、融合タンパク質、または癌ウイルスタンパク質であってもよい。
【００６３】
多様な腫瘍関連抗原が当該技術分野に知られており、かつこれらの多くは商業的に入手可能である。癌胎児性及び胚性抗原には、癌胚性抗原及びアルファ−フェトプロテイン（通常、発生中の胚においてのみ高発現されるが、しばしば、それぞれ肝臓及び結腸の腫瘍によっても高発現される）、ＭＡＧＥ−１及びＭＡＧＥ−３（黒色腫、乳癌、及び神経膠腫において発現される）、胎盤アルカリホスファターゼ・シアリル−ルイスＸ（腺癌において発現される）、ＣＡ−１２５及びＣＡ−１９（胃腸、肝臓及び婦人科腫瘍において発現される）、ＴＡＧ−７２（結腸直腸腫瘍において発現される）、上皮糖タンパク質２（多くの癌腫において発現される）、膵臓癌胎児性抗原、５Ｔ４（胃癌において発現される）、アルファフェトプロテイン受容体（多数の腫瘍タイプ、特に乳房腫瘍において発現される）、及びＭ２Ａ（生殖細胞新生物において発現される）が含まれる。
【００６４】
腫瘍関連分化抗原には、チロシナーゼ（黒色腫において発現される）及び特定の表面免疫グロブリン（リンパ腫において発現される）が含まれる。
【００６５】
突然変異癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子産物には、Ｒａｓ及びｐ５３が含まれ、これらはどちらも多くの腫瘍タイプにおいて発現され、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（乳癌及び婦人科学的癌において発現される）、ＥＧＦ−Ｒ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、網膜芽細胞腫遺伝子産物、ｍｙｃ（肺癌と関連）、ｒａｓ、ｐ５３、乳房腫瘍と関連する非突然変異体、ＭＡＧＥ−１、及びＭＡＧＥ−３（黒色腫、肺、及び他の癌と関連）が含まれる。融合タンパク質には、慢性骨髄性白血病において発現されるＢＣＲ−ＡＢＬが含まれる。癌ウイルスタンパク質には、子宮頸癌で見出されるＨＰＶ  １６型、Ｅ６、及びＥ７が含まれる。
【００６６】
組織特異的抗原には、メラノトランスフェリン及びＭＵＣ１（膵臓癌及び乳癌において発現される）、ＣＤ１０（以前、共通急性リンパ芽球性白血球抗原、またはＣＡＬＬＡとして知られた）または表面免疫グロブリン（Ｂ細胞白血病及びリンパ腫において発現される）、ＩＬ−２受容体のα鎖、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋（Ｔ細胞白血病及びリンパ腫において発現される）、前立腺特異的抗原及び前立腺酸ホスファターゼ（前立腺癌において発現される）、ＧＰ１００、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ−１、チロシナーゼ、ｇｐ７５／ブラウン、ＢＡＧＥ、及びＳ−１００（黒色腫において発現される）、サイトケラチン（多様な癌において発現される）、ならびにＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７（リンパ腫において発現される）が含まれる。
【００６７】
腫瘍関連抗原にはまた、改変糖脂質及び糖タンパク質抗原、例えばノイラミン酸含有糖スフィンゴ脂質（例えば、ＧＭ２及びＧＤ２、黒色腫及びいくつかの脳腫瘍において発現される）、血液群抗原、特に癌において異常発現され得るＴ及びシアリルＴｎ抗原、ならびにムチン、例えばＣＡ−１２５及びＣＡ−１９−９（卵巣癌上で発現される）または過少グリコシル化ＭＵＣ−１（乳癌及び膵臓癌上で発現される）も含まれる。
【００６８】
「感染性病原体の抗原」には、原生動物、細菌、真菌（単細胞及び多細胞両方）、ウイルス、プリオン、細胞内寄生虫、蠕虫、及び免疫反応を誘導可能な他の感染性病原体が含まれる。
【００６９】
細菌抗原には、グラム陽性球菌、グラム陽性桿菌、グラム陰性細菌、嫌気性細菌、例えばアクチノミセス科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、バルトネラ科（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、ボルデテラ科（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｅ）、カプトファガス科（Ｃａｐｔｏｐｈａｇａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、レジオネラ科（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、ミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ミコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、スピロヘータ科（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ）、ビブリオ科（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）の生物、ならびにアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エリシペロトリクス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エウィンゲラ属（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ガードネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レビネア属（Ｌｅｖｉｎｅａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ストレプトバチルス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びトロフェリマ属（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ）が含まれる。
【００７０】
原生動物感染性病原体の抗原には、マラリア原虫、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、トリパノゾーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種及び住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種が含まれる。
【００７１】
真菌抗原には、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、パラコクシジオイデス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｃｉｏｉｄｅｓ）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、ケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）の生物、黒色真菌腫及び菌腫を誘導する生物、ならびに白癬菌属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、ミクロスポルム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、エピデルモフィトン属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、及びマラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）の生物の抗原が含まれる。
【００７２】
ウイルスペプチド抗原には、限定されるわけではないが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、及びＣＭＶのものが含まれる。特に有用なウイルスペプチド抗原には、ＨＩＶタンパク質、例えばＨＩＶ  ｇａｇタンパク質（限定されるわけではないが、膜係留（ＭＡ）タンパク質、コアカプシド（ＣＡ）タンパク質及びヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質が含まれる）、ＨＩＶポリメラーゼ、インフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質及びインフルエンザウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）、肝炎ｅタンパク質（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ型肝炎抗原等が含まれる。
【００７３】
抗原性ペプチドを含む抗原を、本明細書にその全体が援用される米国特許第６，２６８，４１１号に記載されるように、能動的にまたは受動的に、のいずれかで、抗原提示複合体の抗原結合溝部に結合させてもよい。任意で、抗原性ペプチドをペプチド結合溝部に共有結合させてもよい。
【００７４】
望ましい場合、ペプチドを繋ぐことにより、ペプチド結合溝部に抗原性ペプチドを連結させてもよい。例えば、多数のクラスＩ  ＭＨＣ分子の結晶学的分析は、β２Ｍのアミノ末端が、ＭＨＣ−ペプチド結合溝部中に常在する抗原性ペプチドのカルボキシル末端から、およそ２０．５オングストロームと非常に近いことを示す。したがって、長さおよそ１３アミノ酸の比較的短いリンカー配列を用いて、β２Ｍのアミノ末端にペプチドを繋ぐことも可能である。配列が適切である場合、そのペプチドはＭＨＣ結合溝に結合するであろう（米国特許第６，２６８，４１１号を参照されたい）。
【００７５】
磁気濃縮または他の細胞ソーティング若しくは捕捉技術を用いて、結合していない細胞から、ａＡＰＣに結合した抗原特異的Ｔ細胞を分離してもよい。この目的のために使用可能な他のプロセスには、フローサイトメトリー及び他のクロマトグラフィ手段（例えば抗原提示複合体または本明細書に記載の他のリガンドの固定を伴う）が含まれる。１つの実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞を、ビーズ、例えば抗原提示複合体／抗ＣＤ２８コンジュゲート常磁性ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））と、望ましい抗原特異的Ｔ細胞の陽性選択に十分な期間、インキュベーションすることによって単離する（または濃縮する）。
【００７６】
いくつかの実施形態において、例えばＣＤ４４に対する抗体を用いて、Ｔ細胞集団の以前活性であったＴ細胞を実質的に枯渇させて、ナイーブＴ細胞が濃縮された集団を残すことも可能である。この集団へのナノａＡＰＣの結合は、ナイーブＴ細胞を実質的に活性化させないが、その精製を可能にする。
【００７７】
さらに他の実施形態において、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＢ細胞（または他の免疫エフェクター細胞）をターゲットとするリガンドを、常磁性ナノ粒子内に取り込んで、かつこれらの細胞集団に関して磁気的に濃縮して、任意で、以下に記載するように培養下で増殖させるために用いることも可能である。さらなる免疫エフェクター細胞リガンドは、その全体が本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２５８８９に記載される。
【００７８】
理論によって束縛されることは望ましくないが、望ましくない細胞を除去すると、サイトカイン及び増殖シグナルに関する競合が減少し、抑制細胞が除去されることも可能であるし、または単純に、関心対象の細胞を増殖させるためのより多くの物理的空間が提供され得る。
【００７９】
次いで、磁場を生じるための磁石に近接させて培養下で濃縮Ｔ細胞を増殖させ、ａＡＰＣ結合細胞のＴ細胞受容体クラスター形成を増進させる。培養を、多様な時間（例えば約０．５、２、６、１２、３６、４８、または７２時間、ならびに連続刺激）、ナノａＡＰＣで刺激してもよい。非常に濃縮された抗原特異的Ｔ細胞培養において、刺激時間の効果を評価してもよい。抗原特異的Ｔ細胞を、培養液に戻し、当該技術分野に知られるように、細胞増殖、増殖速度、多様なエフェクター機能等に関して分析してもよい。こうした条件は、望ましい抗原特異的Ｔ細胞反応に応じて多様であり得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を約２日間〜約３週間、またはいくつかの実施形態において，約５日間〜約２週間、または約５日間〜約１０日間、培養下で増殖させる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を約１週間、培養下で増殖させ、その後、第２の濃縮及び増殖段階を任意で行う。いくつかの実施形態において、２、３、４、または５回の濃縮及び増殖ラウンドを行う。
【００８０】
１回以上の濃縮及び増殖のラウンド後、試料の抗原特異的Ｔ細胞成分は、細胞の少なくとも約１％、またはいくつかの実施形態において、試料中の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％であろう。さらに、これらのＴ細胞は、一般的に、活性化状態を示す。患者から単離された元来の試料から、多様な実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞を、約１００倍〜約１０，０００倍、例えば多様な実施形態において、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、または少なくとも約５，０００倍増殖させる。濃縮及び増殖の１回以上のラウンドの後、少なくとも約１０６個、または少なくとも約１０７個、または少なくとも約１０８個、または少なくとも約１０９個の抗原特異的Ｔ細胞が得られる。
【００８１】
Ｔ細胞前駆体の増殖、活性化及び分化に対するナノａＡＰＣの影響を、当業者に知られる任意のいくつかの方法でアッセイしてもよい。増殖アッセイを用いて、各タイプのＴ細胞に特異的なマーカーを検出することにより、ＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞、または制御性Ｔ細胞の培養液中での増加を決定することによって、機能の迅速な決定を達成してもよい。こうしたマーカーは当該技術分野で既知である。サイトカイン産生に関して、またはクロム放出アッセイを用いて細胞溶解活性に関してアッセイすることによって、ＣＴＬを検出してもよい。
【００８２】
適切なエフェクター機能を持つ抗原特異的Ｔ細胞を生成することに加えて、抗原特異的Ｔ細胞有効性に関する別のパラメータは、Ｔ細胞が病態部位に移動することを可能にする、ホーミング受容体の発現である（Ｓａｌｌｕｓｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，７０８−１２，１９９９、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ＆  Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，９２−９７，２０００）。
【００８３】
例えば、エフェクターＣＴＬ有効性は、ホーミング受容体の以下の表現型、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、及びＣＣＲ７−に関連づけられてきている。したがって、ナノａＡＰＣ誘導及び／または増殖ＣＴＬ集団は、これらのホーミング受容体の発現に関して特徴付け可能である。ホーミング受容体発現は、初期刺激条件に関連づけられる複雑な特質である。おそらく、これは、共刺激複合体ならびにサイトカイン環境の両方によって制御される。関連づけられてきている１つの重要なサイトカインはＩＬ−１２である（Ｓａｌｉｏら，２００１）。以下に論じるように、ナノａＡＰＣは、生物学的転帰パラメータを最適化するため、個々に別々の成分（例えばＴ細胞エフェクター分子及び抗原提示複合体）を変動させる潜在能力を提供する。任意で、ＩＬ−１２などのサイトカインが、初期誘導培養に含まれて、抗原特異的Ｔ細胞集団におけるホーミング受容体プロファイルに影響を及ぼすことも可能である。
【００８４】
任意で、同じナノａＡＰＣまたは第２のナノａＡＰＣのいずれかとともに、第１の細胞集団中の抗原特異的Ｔ細胞の数に比較して、増加した数の抗原特異的Ｔ細胞を含む、第２の細胞集団を形成するために十分な期間、抗原特異的Ｔ細胞を含む細胞集団のインキュベーションを続けることも可能である。典型的には、こうしたインキュベーションを３〜２１日間、好ましくは７〜１０日間行う。
【００８５】
適切なインキュベーション条件（培地、温度等）には、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体を培養するために用いられるもの、ならびにＤＣまたは人工的抗原提示細胞を用いて、抗原特異的Ｔ細胞の形成を誘導するために当該技術分野に知られるものが含まれる。例えば、Ｌａｔｏｕｃｈｅ  ＆  Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，４０５−０９，Ａｐｒｉｌ  ２０００、Ｌｅｖｉｎｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，５９２１−３０，１９９７、Ｍａｕｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，１４３−４８，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００２を参照されたい。また、以下の特定の実施例も参照されたい。
【００８６】
増殖シグナルの度合いを評価するため、抗原特異的Ｔ細胞集団をＣＦＳＥで標識して、細胞分裂の速度及び数に関して分析してもよい。抗原が結合したナノａＡＰＣで１〜２ラウンド刺激した後、Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識してもよい。その時点で、抗原特異的Ｔ細胞は、総細胞集団の２〜１０％に相当するはずである。抗原特異的Ｔ細胞の分裂速度及び数をＣＦＳＥの喪失によって追跡可能であるように、抗原特異的染色を用いて、抗原特異的Ｔ細胞を検出してもよい。刺激後の多様な時間（例えば、１２、２４、３６、４８、及び７２時間）で、抗原提示複合体染色及びＣＦＳＥの両方に関して、細胞を分析してもよい。抗原が結合していないナノａＡＰＣでの刺激を用いて、増殖のベースラインレベルを決定してもよい。任意で、当該技術分野に知られるように、３Ｈ−チミジンを観察することによって、増殖を検出してもよい。
【００８７】
ナノａＡＰＣを用いて得られる抗原特異的Ｔ細胞を、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、リンパ内投与、及び腫瘍内投与を含む、任意の適切な経路によって、患者に投与してもよい。患者には、ヒト及び獣医学的患者が含まれる。
【００８８】
抗原特異的制御性Ｔ細胞を用いて免疫抑制効果を達成して、例えば移植患者において、移植片対宿主病を治療するか若しくは防止し、または上記に列挙されるものなどの自己免疫疾患若しくはアレルギーを治療するか若しくは防止することも可能である。制御性Ｔ細胞の使用は、例えば、本明細書にその全体が援用される、ＵＳ  ２００３／００４９６９６、ＵＳ  ２００２／００９０７２４、ＵＳ  ２００２／００９０３５７、ＵＳ  ２００２／００３４５００、及びＵＳ  ２００３／００６４０６７に開示される。
【００８９】
これらの方法に従って調製される抗原特異的Ｔ細胞を、約５〜１０×１０６ＣＴＬ／体重ｋｇ（約７×１０８ＣＴＬ／治療）から最大約３．３×１０９ＣＴＬ／体重ｋｇ（約６×１０９ＣＴＬ／治療）の範囲の用量で、患者に投与してもよい（Ｗａｌｔｅｒら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３３，１０３８−４４，１９９５、Ｙｅｅら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２，１６３７−４４，２０００）。他の実施形態において、患者は、静脈内投与用量あたり、約１０３、約５×１０３、約１０４、約５×１０４、約１０５、約５×１０５、約１０６、約５×１０６、約１０７、約５×１０７、約１０８、約５×１０８、約１０９、約５×１０９、または約１０１０個の細胞を投与されてもよい。さらに他の実施形態において、患者は、例えば、２００μｌボーラス中、約８×１０６または約１２×１０６個の細胞の結節内注射を投与されてもよい。細胞を投与されるナノＡＰＣの用量には、用量あたり約１０３、約５×１０３、約１０４、約５×１０４、約１０５、約５×１０５、約１０６、約５×１０６、約１０７、約５×１０７、約１０８、約５×１０８、約１０９、約５×１０９、または約１０１０個のナノａＡＰＣが含まれる。
【００９０】
例示的な実施形態において、濃縮及び増殖プロセスを、患者から得られた同じ試料に対して反復して行う。第０日にＴ細胞集団を濃縮し、活性化し、その後、適切な期間（例えば約３〜２０日）培養する。続いて、ナノａＡＰＣを再び用いて、関心対象の抗原に対して濃縮しかつ増殖させ、さらに集団純度を増加させかつさらなるＴ細胞増殖のためにさらなる刺激を提供する。続いて、ナノａＡＰＣ及び濃縮Ｔ細胞の混合物を、再び、適切な期間、インビトロで培養するか、またはインビボでのさらなる増殖及び療法効果のため、患者に直接再注入する。望ましい増殖が達成されるまで、濃縮及び増殖を任意の回数、反復してもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、各々異なる抗原に対するナノａＡＰＣのカクテルを一度に用いて、多数の抗原に対する抗原Ｔ細胞を同時に濃縮し、かつ増殖させてもよい。この実施形態において、各々異なるＭＨＣ−ペプチドを有する多数の異なるナノａＡＰＣバッチを組み合わせて、関心対象の各抗原に対するＴ細胞を同時に濃縮するために用いる。生じるＴ細胞プールは、これらの各抗原に対して濃縮され、活性化され、したがって、多数の抗原に対する反応物を同時に培養可能である。これらの抗原を単一の療法介入、例えば単一の腫瘍上に存在する多数の抗原に関連づけることも可能である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、患者は、養子移入による抗原特異的Ｔ細胞を投与される前に、または患者の腫瘍の遺伝子分析によってインビトロで同定されたネオ抗原を有するａＡＰＣを直接投与される前に、１つ以上のチェックポイント阻害剤での免疫療法を受ける。多様な実施形態において、チェックポイント阻害剤（単数または複数）は、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の１つ以上をターゲットとし、これには、こうしたターゲットに対する抗体、例えばモノクローナル抗体、またはその一部、あるいはそのヒト化または完全ヒト型が含まれてもよい。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤療法は、イピリムマブまたはキートルーダ（ペンブロリズマブ）を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、患者は、約１〜５ラウンド（例えば、１、２、３、４または５ラウンド）の養子免疫療法を受ける。いくつかの実施形態において、養子免疫療法の各投与を、チェックポイント阻害剤療法ラウンドと同時に、またはその後に（例えば約１日〜約１週間後）行う。いくつかの実施形態において、養子免疫療法を、チェックポイント阻害療法の約１日後、約２日後、または約３日後に提供する。
【００９４】
さらに他の実施形態において、患者へのナノａＡＰＣの養子移入または直接注入は、ビーズ上のリガンドとして、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の１つ以上をターゲットとするリガンドを含む。これらの実施形態において、本方法は、可溶性チェックポイント阻害剤療法を投与する、特定の副作用を回避し得る。
【００９５】
個別化療法のための方法
いくつかの態様において、本発明は、個別化癌免疫療法のための方法を提供する。患者が反応するであろう抗原を同定するためにａＡＰＣを用い、その後、適切なペプチドを負荷したａＡＰＣを患者に投与するか、またはエクスビボで抗原特異的Ｔ細胞を濃縮しかつ増殖させて、本方法を達成する。
【００９６】
ゲノム規模の配列決定は、癌生物学の我々の理解を劇的に改変した。癌の配列決定は、多くのヒト癌の発生に関与する分子プロセスに関する重要なデータをもたらしてきた。３つの主な細胞プロセスである（１）細胞の運命、（２）細胞生存及び（３）ゲノム維持、を制御する経路に関与する重要な遺伝子において、それを推進する突然変異が同定されてきている。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，１５４６−５８（２０１３）。
【００９７】
ゲノム規模配列決定はまた、癌免疫療法に対する我々のアプローチを改革する潜在能力を有する。配列決定データは、癌免疫療法のための共通のならびに個別化ターゲットの両方に関する情報を提供可能である。原理的には、突然変異タンパク質は、免疫系に対して外来性であり、かつ推定上の腫瘍特異的抗原である。実際、配列決定努力によって、数千とはいかなくとも数百の潜在的に適切な免疫ターゲットが定義されてきた。限定される研究によって、これらのネオエピトープは癌患者において見られ得るか、または癌ワクチンによって誘導可能であることが示されてきている。しかし、特定の癌に対するこうした反応の頻度、及びこうした反応が患者間で共有される度合いはよく知られていない。腫瘍特異的免疫反応の我々の理解が限定される主な理由の１つは、潜在的に免疫学的に適切なターゲットを検証するための現在のアプローチが厄介であり、時間が掛かるためである。
【００９８】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、癌において、ネオ抗原に対するＴ細胞反応の検出のためのハイスループットプラットホームに基づくアプローチを提供する。このアプローチは、癌抗原に対する低頻度Ｔ細胞反応であっても検出するために、本明細書記載のａＡＰＣプラットホームを用いる。こうした反応の頻度及び個人間の変動を理解することは、癌ワクチン及び個別化癌免疫療法の設計のための重要な暗示を与えるであろう。
【００９９】
中枢性トレランスは、自己タンパク質に対するＴ細胞反応を抑止するが、発癌性突然変異は、Ｔ細胞反応を形成可能なネオエピトープを誘導する。全エクソーム配列決定由来の突然変異一覧は、こうしたネオエピトープを同定するための出発点を提供する。ＨＬＡ結合予測アルゴリズム（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ６０９４（２００９）を用いると、各癌が最大７〜１０のネオエピトープを有し得ると予測されてきている。同様のアプローチは、数百の腫瘍ネオエピトープがあると概算した。しかし、こうしたアルゴリズムは、Ｔ細胞反応を予測する正確性が低い可能性もあり、予測されるＨＬＡ結合エピトープのわずか１０％しかＨＬＡの状態において結合しないと予期される（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  Ｃ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３０，３０９−１８（２０１０））。したがって、予測されるエピトープについて、潜在的なネオエピトープに対するＴ細胞反応の存在に関して検証しなければならない。
【０１００】
特定の実施形態において、ナノａＡＰＣ系を用いて、多様な癌において、または特定の患者の癌において、Ｔ細胞反応を誘導するネオエピトープに関してスクリーニングする。癌を、例えば全エクソーム配列決定によって遺伝子分析してもよい。例えば、２４の進行した腺癌のパネルのうち、腫瘍あたり平均約５０の突然変異が同定された。分析したおよそ２０，０００遺伝子のうち、１３２７が少なくとも１つの突然変異を有し、１４８が２つ以上の突然変異を有した。９７４のミスセンス突然変異が同定され、少数のさらなる数の欠失及び挿入があった。
【０１０１】
突然変異タンパク質における重複する９アミノ酸ウィンドウから、候補ペプチドのリストを生成してもよい。突然変異アミノ酸を含有するすべての９ＡＡウィンドウ、及び各タンパク質由来の２つの、突然変異がない「対照」を選択する。ＮｅｔＭＨＣ及び安定化マトリックス法（ＳＭＭ）を含むＭＨＣ結合予測アルゴリズムのコンセンサスを用いて、ＭＨＣ結合に関して、これらの候補ペプチドをコンピュータによって評価する。ナノａＡＰＣ及びＭＨＣ結合アルゴリズムは、主にＨＬＡ−Ａ２アレルに関して開発されてきている。扱いやすい数の突然変異含有ペプチド（約５００）及び突然変異のない対照ペプチド（約５０）が同定されるまで、コンセンサス予測の感受性カットオフを調整してもよい。
【０１０２】
次いで、ペプチドライブラリーを合成する。ＭＨＣ（例えばＡ２）を有するａＡＰＣをマルチウェルプレート中に置き、ペプチドを受動的に負荷する。ＣＤ８  Ｔ細胞をＡ２陽性の健康なドナー及びＡ２陽性の膵臓癌患者（または他の癌若しくは本明細書記載の疾患）の両方のＰＢＭＣから単離してもよい。続いて、単離したＴ細胞を、濃縮段階用のプレート中で、負荷済みのａＡＰＣとインキュベーションする。インキュベーション後、プレートを磁場に置き、ａＡＰＣに結合しない不適切なＴ細胞を含有する上清を除去する。ａＡＰＣに結合した、残ったＴ細胞を７〜２１日間、培養しかつ増殖させる。ａＡＰＣでの再刺激及び細胞内ＩＦＮγ蛍光染色によって、抗原特異的増殖を評価する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、患者のＴ細胞をナノＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングして、結果を診断または予後判定目的のために用いる。例えば、突然変異タンパク質、過剰発現タンパク質、及び／または腫瘍関連抗原に対するＴ細胞抗腫瘍反応の数及び同一性をバイオマーカーとして用いて、リスクを層別化することも可能である。例えば、こうしたＴ細胞反応の数は、疾患進行のリスク、または化学療法に対する耐性若しくは非反応性のリスクに反比例し得る。他の実施形態において、患者のＴ細胞をナノＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングして、Ｔ細胞反応の存在、またはこれらのＴ細胞反応の数若しくは強度が、患者が無症候性腫瘍を有することを同定する、及び／または腫瘍生物学の最初の理解を提供する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、患者または対象のＴ細胞を、各々異なる候補ペプチド抗原を提示する常磁性ａＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングする。この選別は、対象または患者のＴ細胞レパートリーに関する豊富な情報を提供することも可能であり、結果は、診断または予後判定目的に有用である。例えば、突然変異タンパク質、過剰発現タンパク質、及び／または腫瘍関連抗原に対するＴ細胞抗腫瘍反応の数及び同一性をバイオマーカーとして用いて、リスクを層別化し、免疫療法の有効性を観察し、または免疫療法治療の転帰を予測することも可能である。さらに、こうしたＴ細胞反応の数または強度は、疾患進行のリスクに反比例する可能性もあるし、または化学療法に対する耐性若しくは非反応性の予測因子である可能性もある。他の実施形態において、対象または患者のＴ細胞を、各々候補ペプチド抗原を提示するナノＡＰＣのアレイまたはライブラリーに対してスクリーニングして、Ｔ細胞反応の存在、またはこれらのＴ細胞反応の数若しくは強度が、例えば自己免疫疾患を同定するか、または患者が無症候性腫瘍を有することを同定することによって、患者の健康状態に関する情報を提供する。これらの実施形態において、プロセスは、潜在的な疾患状態を同定するだけでなく、疾患生物学の最初の理解を提供する。
【０１０５】
試薬／キット
本発明の別の態様において、ナノａＡＰＣを、濃縮及び増殖プロセスを実行するための成分とともに、キット中に提供することも可能である。ナノａＡＰＣのための適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む多様な材料から形成されてもよい。容器は無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。任意で、１つ以上の異なる抗原をナノａＡＰＣに結合させてもよいし、または別個に供給してもよい。キットは、あるいはまたはさらに、１つ以上のマルチウェルプレートまたはＴ細胞用の培養プレートを含んでもよい。いくつかの実施形態において、キットは、ａＡＰＣＳ、磁石、及び任意で、試験管及び／または磁気濃縮を実行するための溶液若しくは緩衝液を含む。
【０１０６】
キットは、薬学的に許容され得る緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液を含む第２の容器をさらに含んでもよい。これはまた、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、最終使用者に有用な他の材料も含有してもよい。
【０１０７】
キットはまた、抗原特異的Ｔ細胞活性化または増殖の度合い及び有効性を評価するための試薬、例えば特定のマーカータンパク質に対する抗体、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子複合体、ＴＣＲ分子複合体、抗クローン形質抗体等を含有してもよい。
【０１０８】
キットはまた、抗原特異的Ｔ細胞を誘導し、抗原特異的Ｔ細胞を増殖させ、多様なプロトコルにおいて、キット中のナノａＡＰＣを用いる方法のための記載がなされた説明書を含有する添付文書も含有してもよい。添付文書は、未承認のドラフト添付文書であってもよいし、または食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関によって認可された添付文書であってもよい。
【実施例】
【０１０９】
実施例１
養子Ｔ細胞療法は、継続性のある癌の退縮を仲介し得る。ナイーブＴ細胞から、機能する多数の腫瘍特異的Ｔ細胞を迅速に生成するため、本発明者らは、磁気カラム中で、稀な腫瘍特異的Ｔ細胞を濃縮すると同時に活性化することが可能な、ナノスケールの常磁性人工的抗原提示細胞を用いる、濃縮＋増殖戦略を開発した。濃縮＋増殖は、マウス及びヒト腫瘍特異的Ｔ細胞の１０００倍を超える増殖を生じ、濃縮＋増殖によって生成した腫瘍特異的ＣＴＬで処置したマウスは、有意により少ない腫瘍増殖を有した。濃縮＋増殖によって、費用効率的で再現性のある様式の多数の腫瘍特異的Ｔ細胞の生成を合理化することは、自己腫瘍免疫療法プロトコルの強力な補強となり得る。
【０１１０】
腫瘍特異的Ｔ細胞の養子移入は、継続性のある癌の退縮を仲介し得る１。あらかじめ存在する抗腫瘍用反応物は、少数の癌患者からしか培養可能でないが２、腫瘍抗原でナイーブ前駆体細胞を刺激することによって、非常に多様な腫瘍抗原に特異的なＴ細胞を生成可能である３。この培養プロセスは、各個々の患者に関して生成しなければならない複雑な生物製剤である４自己抗原提示細胞及びフィーダー細胞に頼っており、養子免疫療法のコスト及び複雑性を有意に増加させている。
【０１１１】
腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖は、腫瘍特異的ナイーブ前駆体が、１００万あたり１個という少なさであるほど稀であることによって、さらに複雑になる５〜７。有効な療法のために必要な多数の腫瘍特異的Ｔ細胞を生成するため８〜１０、リンパ球を何週間にも渡って抗原で反復刺激し、多くの場合、その後Ｔ細胞選択及びサブクローニングを行う１１。この労働力を要するプロセスは、最終細胞産物中の腫瘍特異的Ｔ細胞の総数及び抗原特異的頻度（または「純度」）の両方を増加させる。同時移入された無関係の細胞からの増殖シグナルに関する競合が、関心対象の抗腫瘍Ｔ細胞の恒常的な増殖を有意に減弱させるため、抗原特異的頻度は、移入後の最適な増殖のための独立した重要なパラメータである１２〜１４。
【０１１２】
したがって、細胞性ＡＰＣまたはフィーダー細胞の追加的な費用及び複雑性を伴わずに、ナイーブ前駆体から腫瘍特異的Ｔ細胞を多数及び高頻度で迅速に生成可能な技術が必要とされている。本発明は、したがって、ナノスケールの人工的抗原提示細胞（ナノａＡＰＣ）を用いた、Ｔ細胞濃縮及び増殖戦略を提供する。本明細書に例示するナノａＡＰＣは、内因性ＡＰＣによって送達される２つの活性化シグナル：ＭＨＣの状態で提示されＴＣＲに結合する同族抗原性ペプチドであるシグナル１；及びＴ細胞反応を調節しかつ有効な活性化を促進するいくつかの共刺激受容体の１つであるシグナル２、で機能化される、直径５０〜１００ｎｍの常磁性鉄デキストランナノ粒子である（図１、上部）。したがって、常磁性ナノａＡＰＣは、磁気濃縮カラムにおいて、同族Ｔ細胞を捕捉し、抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導することが可能である（図１、下部）。
【０１１３】
ナイーブポリクローナルマウスＣＤ８＋  Ｔリンパ球とナノａＡＰＣをインキュベーションし、細胞−粒子混合物を磁気カラムに通過させ、溶出させ、次いで磁石結合画分を培養することによって、ナノａＡＰＣでの濃縮を行う（図１）。濃縮有効性を評価するため、Ｄｂ−ｇｐ１００黒色腫抗原に特異的な、既知の数のＴｈｙ１．１＋  ｐｍｅｌ  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、１：１０００の比で、Ｂ６マウス由来のＴｈｙ１．２＋  ＣＤ８  Ｔ細胞と混合した。ｐｍｅｌ  ｇｐ１００特異的ａＡＰＣで濃縮した後、抗原特異的ｐｍｅｌ  Ｔ細胞の頻度は、用量依存的様式で、濃縮前の０．０７％から、濃縮後の１．１７％に、１０倍超増加した（図２Ａ）。Ｔ細胞とインキュベーションしたナノａＡＰＣの量を最適化すると、濃縮効率が増加し、添加したｐｍｅｌ  Ｔ細胞の最大９５％の回収が生じた（図２Ｂ）。
【０１１４】
内因性Ｂ６  ＣＤ８＋脾臓細胞からの野生型Ｄｂ−ｇｐ１００細胞の濃縮を、可溶性ＭＨＣ五量体での染色によって評価した。Ｄｂ−ｇｐ１００特異的頻度は、濃縮前には検出可能なレベル以下であったが、その後、０．３０％に増加した。Ｄｂ−ｇｐ１００粒子とインキュベーションした非特異的Ｋｂ−Ｔｒｐ２細胞の頻度は増加しなかった（図２Ｃ）。
【０１１５】
濃縮後、濃縮細胞の磁石結合画分（陽性画分）及びナノａＡＰＣを溶出させ、インビトロで培養した。続く増殖に対する濃縮の効果を研究するため、陰性画分（ナノａＡＰＣに結合しないＣＤ８＋  Ｔ細胞）を収集し、陽性画分に戻すことによって、対照試料において濃縮法を「取り消し」た（図３Ａ）。
【０１１６】
濃縮は、増殖後の抗原特異的頻度及びＴ細胞総数を有意に増加させた。Ｋｂ−Ｔｒｐ２ナノａＡＰＣで７日間濃縮した後、陰性＋陽性の非濃縮群由来では細胞の１．４６％であったのに比較して、陽性画分から増殖させた細胞の１７．６％が、Ｋｂ−Ｔｒｐ２特異的であった（図３Ｂ）。陰性＋陽性画分ではより多くの細胞総数であったにも関わらず、濃縮法は、抗原特異的細胞総数について２〜３倍の増加を生じた。本発明者らは、総Ｔ細胞増殖の増加がリンパ増殖性サイトカインに関する競合減少によって仲介され得ると仮定する。
【０１１７】
濃縮＋増殖アプローチは、ｇｐ１００（Ｄｂ−ｇｐ１００）、Ｋｂ拘束性オボアルブミン抗原ＳＩＩＮ（Ｋｂ−ＳＩＩＮ）、及び結腸癌抗原Ｌｄ−ＡＨ１／Ａ５（Ｌｄ−Ａ５）を含む、多様な腫瘍及びモデルＴ細胞抗原に広く適用可能であった（図３Ｄ、３Ｅ）。抗原特異的細胞の絶対数及び頻度は、抗原依存性であった。Ｋｂ−ＳＩＩＮ反応は、一貫して、１週間後、２０％の抗原特異的細胞を生じたが、Ｄｂ−ｇｐ１００特異性はおよそ５％であり、Ｌｄ−Ａ５は総Ｔ細胞のおよそ７．５％であった。
【０１１８】
関心対象の抗原に関する既知の前駆体頻度からＴ細胞増殖を概算した（表１）。外来抗原に対するＣＤ８反応の前駆体頻度は、１０ｓ〜１００ｓ／１０７の範囲であり７、Ｔｒｐ２などの自己抗原に関しては、この範囲の下限であると予期される。Ｄｂ−ｇｐ１００に関する前駆体頻度は、１０７中の１０であり５、Ｋｂ−ＳＩＩＮＦに関しては、１０７中の４０〜３５０であることが測定されている。１週間後、１０７個のポリクローナルＣＤ８  Ｔ細胞から、１５０，０００個のＴｒｐ２特異的細胞が生成され、したがって、本発明者らは、Ｔｒｐ２特異的増殖が、１００〜１０００倍の間であると概算する。比較すると、１０７個のＴ細胞から、およそ３５，０００個のＤｂ−ｇｐ１００及び１５０，０００個のＫｂ−ＳＩＩＮＦ特異的Ｔ細胞が生成され、各抗原に対して、最大５，０００倍の増殖があることが示された。これはインビボでのウイルス感染後に観察されるロバストな増殖に匹敵する１８。
【０１１９】
これらの概算を検証するため、本発明者らは、ナイーブＴ細胞集団を、Ｔ細胞分裂のラウンドごとに半分に希釈される増殖マーカー色素ＣＦＳＥで標識した。Ｅ＋Ｅの４日後、Ｋｂ−Ｔｒｐ２四量体結合Ｔ細胞は、検出可能限界以下までそのＣＦＳＥを希釈した。ナノａＡＰＣの中程度の用量で刺激したトランスジェニックｐｍｅｌ  Ｔ細胞を比較のために用い、これらの細胞は、ＣＦＳＥ蛍光の多数のピークを示し、分裂が２〜７ラウンドであることが示された。これにより、本発明者らは、濃縮＋増殖Ｔｒｐ２特異的Ｔ細胞が、７ラウンドより多くの分裂を完了したと決定することが可能であり、これは、わずか４日後に２５６倍より多く増殖したことと一致した。増殖Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ低ＣＤ４４高エフェクター記憶表現型を示し、これはロバストな活性化及び増殖と一致した。
【０１２０】
Ｅ＋ＥによるＴ細胞増殖を、Ｔｒｐ２ペプチドでパルス処理した成熟骨髄由来樹状細胞を用いた増殖と比較した。１０００万個のナイーブリンパ球の刺激は、２±０．５×１０４個のＴｒｐ２特異的Ｔ細胞を生じ、抗原特異的頻度は、０．５〜２．８５％であり、Ｅ＋Ｅで達成されるものより数及び頻度がおよそ１０倍低かった。これは、ヒトにおけるＡＰＣ及び人工的ＡＰＣによる増殖と一致し、この場合、刺激１週間後の抗原特異的反応は、しばしば検出不能である１９。
【０１２１】
多数の腫瘍抗原に対するＴ細胞反応の同時生成は、単一のナイーブＴ細胞集団から生成される抗腫瘍Ｔ細胞の数を増加させ、単一の抗原の下方制御による腫瘍免疫エスケープの可能性を減少させるであろう２０〜２２。本発明者らは、したがって、多数の抗腫瘍集団を同時に生成するための一ステップＥ＋Ｅプロトコルを発展させた。
【０１２２】
ナイーブリンパ球を、各々、標準的な単一抗原用量で、Ｄｂ−ｇｐ１００、Ｋｂ−ＳＩＩＮＦ、及びＫｂ−Ｔｒｐ２  ＭＨＣ二量体を有するナノａＡＰＣとインキュベーションした。「三重」Ｅ＋Ｅの１週間後、関心対象の各抗原に対する五量体染色によって、抗原特異的Ｔ細胞を検出した（図３Ｆ）。各集団の頻度は、１つのみの抗原で刺激した対照試料で見られるものよりも低く（図３Ｇ）、一方、個々にまたは同時に単離されても、抗原特異的細胞総数は同じであった（2元配置ＡＮＯＶＡによって、ｐ＞０．４）（図３Ｇ）。したがって、三重Ｅ＋Ｅプロトコルは、各腫瘍特異的Ｔ細胞集団に関して、任意の単一抗原対照と同程度に効率的であった。
【０１２３】
養子移入した腫瘍特異的Ｔ細胞は、同時移入した非腫瘍特異的バイスタンダー細胞と、増殖シグナルに関して競合する１２〜１４。しかし、この効果は、濃縮＋増殖中に起こるように、インビトロで以前活性化されていたＴ細胞の抗原特異的増殖に関しては立証されてきていなかった。
【０１２４】
したがって、本発明者らは、腫瘍特異的ｐｍｅｌ  Ｔ細胞及びポリクローナル野生型Ｂ６細胞を、Ｅ＋Ｅを用いて、及び用いずに達成された抗原特異的頻度とほぼ同じ比で合わせた（それぞれ１０％及び１％）。各群において、投与されるｐｍｅｌ  Ｔ細胞の総数は同じ（１０５個）であり、バイスタンダーＴ細胞の量のみが異なる（１０６個または１０７個）。より少ない（１０６個）バイスタンダー細胞を投与されたマウスにおいて、ｐｍｅｌ  Ｔ細胞の最大数及び最高の頻度が観察された（図４Ａ及びＢ）。およそ５．５±１．５×１０５個のｐｍｅｌ  Ｔ細胞がこれらの動物の脾臓及びリンパ節から回収された（図４Ｂ）。１０７個のバイスタンダー細胞を投与された動物からは、１．４±０．７×１０５個のｐｍｅｌ  Ｔ細胞しか回収されなかった（テューキーの事後検定を伴う2元配置ＡＮＯＶＡによって、ｐ＜０．０５）。したがって、同時移入細胞から競合を除くことによって、移入後の生着及び増殖が増進された。
【０１２５】
さらに、腫瘍特異的Ｔ細胞は、増殖シグナルに関して、宿主細胞と競合するので２４、これは養子移入前に宿主の放射線及び化学療法に基づくリンパ枯渇を行う動機を与えてきた２５，２６。したがって、１０６個または１０７個のバイスタンダー細胞を投与される動物は、移入の２４時間前に５００ｃＧｙガンマ照射で照射されるか、または未処置のままとされ、４つの実験群が設けられた。照射されなかった動物は、生着が劣り、１０６個または１０７個のバイスタンダー群のいずれにおいても、０．３×１０５個のｐｍｅｌ  Ｔ細胞未満しか回収されなかった（図４Ａ及びＢ）。したがって、移入されたバイスタンダーリンパ球及び／または宿主リンパ球の両方の除去は、宿主における養子移入腫瘍特異的Ｔ細胞の収量を有意に増加させた。
【０１２６】
本発明者らは次に、ナノａＡＰＣでの濃縮＋増殖によって生成された腫瘍特異的リンパ球が、確立された黒色腫の排除を仲介することを確認した。免疫原性が劣る侵襲性黒色腫モデルであるＢ１６−Ｆ１０細胞を、Ｂ６宿主マウス内に皮下移植して、腫瘍が触診可能になるまで８日間増殖させた。平行して、天然Ｂ６ドナーマウスからＣＤ８リンパ球を単離し、Ｄｂ−ＧＰ１００及びＫｂ−Ｔｒｐ２抗原に対して濃縮＋増殖させ、次いでリンパ枯渇の１日後に、宿主内に移入した。
【０１２７】
腫瘍特異的Ｅ＋Ｅドナーリンパ球を投与された動物は、未処置マウス、または無関係のＫｂ−ＳＩＩＮＦ抗原に対して生成された同等数のリンパ球を投与されたマウスよりも、有意に腫瘍増殖がより少なかった（図４Ｃ）。腫瘍注射の１８日後、Ｋｂ−ＳＩＩＮＦ処置マウスに関して１４４±１１ｍｍ２であり、Ｄｂ−ｇｐ１００／Ｋｂ−Ｔｒｐ２マウスに関して２２±９ｍｍ２であったのに比較して、未処置マウスの平均腫瘍面積は１３０±１２ｍｍ２であった（テューキーの事後検定を伴うＡＮＯＶＡによって、ｐ＜０．０５）。
【０１２８】
未処置及びＫｂ−ＳＩＩＮＦ処置群のすべてのマウスを、第２２日までに、過剰な腫瘍負荷が理由で屠殺した。これに比較して、Ｄｂ−ｇｐ１００／Ｋｂ−Ｔｒｐ２群では、第２４日まで屠殺されるマウスはなく、移植２ヶ月後でも、２／８のマウスでは腫瘍は検出不能であった（マンテル−コックスによって、ｐ＜０．０１）。生存中央値は、未処置（２０日）または非同族処置（２０日）群よりもＥ＋Ｅ処置群（２８日）で有意に長かった。ナイーブ細胞から１週間しか培養しなかったＥ＋Ｅリンパ球は、確立されたＢ１６黒色腫を遅延させ、いくつかの例では完全に排除可能であった。
【０１２９】
ＨＬＡ−Ａ２で機能化されたナノａＡＰＣによる濃縮＋増殖はまた、ナイーブリンパ球からのヒト抗腫瘍反応物を増殖させる際にも有効である。ヒトＣＤ８＋リンパ球を、健康なドナーの末梢血単核細胞から単離し、ＮＹ−ＥＳＯ１またはＭＡＲＴ１腫瘍抗原のいずれかを有するナノａＡＰＣでＥ＋Ｅを行った。１週間後、４４，０００±２１，０００のＮＹ−ＥＳＯ１特異的細胞が生成され、これはおよそ１０００倍の前駆体増殖に相当した（表１、図５）。ＭＡＲＴ１反応に関して、１週間で８３，０００±３７，０００が生成され、これは、およそ１００倍の増殖に相当し、健康なドナー２７においてさえ見られる、ＭＡＲＴ１反応の高い前駆体頻度を反映した（表１、図５）。したがって、濃縮＋増殖は、マウスＴ細胞には限定されず、ナイーブ低頻度抗腫瘍ヒトＣＴＬの増殖のためにもロバストなアプローチである。
【０１３０】
癌のための養子免疫療法の広い適用は、腫瘍特異的細胞の費用効率的でかつ好適な供給源の入手可能性によって制限される。ここで、本発明者らは、１週間に１０００倍を超えて、ナイーブ細胞から多数の高頻度の腫瘍特異的リンパ球を迅速に増殖させるための合理化された技術を開発した。本発明者らはさらに、濃縮によって不適切なバイスタンダー細胞を除去すると、インビトロ培養中、及びインビボでの養子移入後の両方で、腫瘍特異的Ｔ細胞に対して有意な生存及び増殖上の利点が与えられることを立証する。
【０１３１】
Ｔ細胞増殖後、ＭＨＣ四量体を用いて、抗原特異的Ｔ細胞を濃縮可能である２８〜３０一方、本発明者らのプラットホームは、単一の試薬で濃縮及び増殖の実行を可能にすることによって、このプロセスを単純化する。さらに、共刺激の非存在下で、多量体ＭＨＣによるＴＣＲの架橋は、Ｔ細胞アポトーシスまたはアネルギーを誘導可能であり３１〜３３、四量体結合後、抗原特異的細胞のうち最大で半数の欠失が生じた。したがって、Ｔ細胞濃縮及び増殖両方のための単一プラットホームの使用は、現存するプロトコルを単純化し、改善する。
【０１３２】
ここで、リンパ球が抗癌ＴＣＲまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作することによって、腫瘍特異的Ｔ細胞を生成可能であり１、該細胞は、増加する利用可能性に対して有望なアプローチであるが、内因性トレランス機構によって調節されていない外来受容体を使用すると、理論的には、交差反応性及び毒性の可能性が増加し、試験においては有意な毒性が観察される３４。自己黒色腫浸潤性リンパ球は、臨床試験において非常に有効であることが証明されているが、すべての黒色腫患者からは培養不能でありまたは大部分の他の癌に関しては培養不能である２。
【０１３３】
内因性ナイーブ細胞からの反応を生成するための信頼性がある方法は、したがって、利用可能性及び安全性の両方を増加させ得る３。既存のプロトコルは、ナイーブ細胞由来の反応物を伴う有望な結果を示してきた３５，３６が、注入あたりに投与される１０８〜１０１０個の腫瘍反応性Ｔ細胞３６〜３８を生じるために、数週間から数ヶ月掛かる反復刺激及びクローニングに頼っており、高額の費用及び複雑さを生じる。Ｅ＋Ｅは、既存の試みに比較して、総数及び純度の両方に関して有望な新規アプローチであり、より短い期間で、ロバストな増殖を生じる。例えば、培養１週間後の樹状細胞に基づくアプローチでのＮＹ−ＥＳＯ１の増殖は、検出不能であるかまたは報告されないかのいずれかであり、１０００倍の増殖で４〜２７％の抗原特異的純度の達成を生じ、すべてより顕著である。対照的に、いくつかのグループが、高い前駆体頻度のＭＡＲＴ１反応物の有効な増殖を報告している。例えば、Ｗｏｌｆｌら３９によって記載されるＤＣに基づく新規ＡＣＥ−ＣＤ８プラットホームは、ヒトＣＤ８細胞の増殖のための要件を定義し、最適化するのを補助する際に非常に有用であり、かつ１０日間の印象的な増殖を示す、よく特徴付けられた系であり、インビトロの最適なＭＡＲＴ１増殖を補助するために、培養条件のさらなる最適化が必要であることを示唆する。にもかかわらず、臨床的に必要とされ得るＴ細胞の量を生成するため、ＤＣに基づくＡＣＥ−ＣＤ８プラットホームはなお、増殖または非抗原特異的技術の使用のために、ＤＣの毎週の培養物を生成するため、潜在的に多数回の患者からのプラズマフェレーシスを必要とするであろう。ナノａＡＰＣに基づくＥ＋Ｅは、こうした制約にはさらされない。
【０１３４】
腫瘍特異的Ｔ細胞前駆体の頻度が１００万あたりおよそ１〜１０であり、単回の白血球取り出し物から、およそ０．５×１０１０個のＣＤ８  Ｔ細胞が採取され、Ｅ＋Ｅで１０００〜５０００倍の増殖が観察されると仮定すると、１週間に１０８個を超える抗原特異的Ｔ細胞が生成可能である。多数の抗原を同時に増殖すると、この数はさらに増加し、注入のための十分な細胞が得られる。したがって、細胞性ＡＰＣを培養する必要がなくなり、かつ多数の高頻度腫瘍特異的Ｔ細胞の生成を合理化することによって、濃縮＋増殖は、自己腫瘍免疫療法プロトコルの強力な補強になり得る。
【０１３５】
方法
マウス及び試薬。Ｐｍｅｌ  ＴＣＲ／Ｔｈｙ１ａ  Ｒａｇ−／−トランスジェニックマウスをホモ接合体で維持した。Ｃ５７ＢＬ／６ｊ及びＢａｌｂ／Ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バーハーバー）より購入した。ジョンズホプキンス大学施設管理委員会に従って、すべてのマウスを飼育した。蛍光標識モノクローナル抗体を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。
【０１３６】
ＭＨＣ−Ｉｇ二量体及びナノａＡＰＣの調製。記載されたように、可溶性ＭＨＣ−Ｉｇ二量体、Ｋｂ−Ｉｇ、Ｄｂ−Ｉｇ、及びＡ２−Ｉｇを調製し、これにペプチドを負荷した１９。記載されたように、ＭＨＣ−Ｉｇ二量体及び抗ＣＤ２８抗体（３７．５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、ＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に直接コンジュゲートすることによって、ナノａＡＰＣを製造した１５。
【０１３７】
リンパ球単離。マウス脾臓及びリンパ節のホモジナイズ、その後、ＲＢＣの低張溶解から、マウスリンパ球を得た。製造者のプロトコルに従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（ドイツ・ケルン）のＣＤ８ノータッチ単離キット及び磁気濃縮カラムを用いて、細胞傷害性リンパ球を単離した。適用可能な場合、細胞をカルボキシフルオレセイン・スクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で、３７℃で１５分間標識し、次いで徹底的に洗浄した。ヒト研究のため、ジョンズホプキンス大学の倫理委員会は本研究を承認し、すべての健康な志願者は書面のインフォームドコンセントを提出した。ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーのＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離（リンパ球分離培地Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって得た。続いて、製造者のプロトコルに従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（ドイツ・ケルン）のＣＤ８ノータッチ単離キット及び磁気濃縮カラムを用いて、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離した。精製ＣＤ８＋  Ｔ細胞をナノａＡＰＣで、４℃で１時間染色し、ＭＳ−カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を利用して、磁気的に濃縮した。
【０１３８】
濃縮及び増殖。１０００万個のＣＤ８濃縮リンパ球を、１０μｌのナノａＡＰＣと、４℃で１時間インキュベーションした。続いて細胞−粒子混合物を磁気濃縮カラムに通過させ、陰性画分を収集し、そして陽性画分を溶出させた。単離画分を混合し、９６ウェル丸底プレート中、１０％ヒト自己血清及び３％  Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）を補充した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中、９６ウェル丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）において、５％  ＣＯ２を提供する加湿インキュベーター中で、３７℃で１週間培養した。培地及びＴＣＧＦを週１回補充した。ＦＡＣＳ分析を利用して、四量体及びＭＨＣ−Ｉｇ染色によって、ＣＴＬの特異性を第０日及び第７日に観察した。
【０１３９】
バイスタンダーインビボ実験。ｐｍｅｌ及び野生型Ｂ６  ＣＤ８＋  Ｔリンパ球の混合物を、示す比で混合した。養子移入前に、２０μｌのＤｂ−ｇｐ１００ナノａＡＰＣと細胞混合物を１週間培養した。示した群において、養子移入の１日前に、ＭＳＤ  Ｎｏｒｄｉｏｎ  ＧａｍｍａｃｅｌｌデュアルＣｓ１３７供給源（ジョンズホプキンス分子画像化センター）で、致死量以下の照射（５００ｃＧｙ）によって、宿主マウスにおいて一過性リンパ球減少症を誘導した。養子移入当日及び翌日の両方で、マウスを３０，０００単位の腹腔内ＩＬ−２で処置した。養子移入の７日後及び２０日後、群あたり３匹のマウスを屠殺し、末梢血、脾臓、ならびに鼠径、頸部及び腋窩リンパ節からリンパ球を単離し、次いで抗Ｔｈｙ１．１抗体で染色した。
【０１４０】
腫瘍排除実験。３×１０５個のＢ１６黒色腫細胞を、養子Ｔ細胞移入の１０日前に皮下注射したことを除いて、上述のように腫瘍排除実験を行った。上述のように、養子移入の１日前に、一過性のリンパ減少症を誘導した。各ドナー由来の１０００万のナイーブリンパ球を用いて、各腫瘍宿主（ドナーあたり最大３の宿主）に関して抗原特異的細胞を生成し、これは培養１週間後におよそ２×１０５個の腫瘍特異的Ｔ細胞が生成され、移入されたことに相当した。養子移入当日及び翌日の両方で、マウスを３０，０００単位の腹腔内ＩＬ−２で処置した。デジタルノギスを用いて、腫瘍増殖を２日間隔で観察した。腫瘍がひとたび１５０ｍｍ２に到達したら、マウスを屠殺した。
【０１４１】
（表１）抗原特異的Ｔ細胞増殖。１０００万個のリンパ球あたりの概算されるＴ細胞前駆体頻度。１０００万個のリンパ球から生成される抗原特異的細胞（参照を含む）。
2017529080.tif 000003
【０１４２】
実施例２
ネオ抗原の増殖
これまでに記載された腫瘍抗原は、腫瘍において過剰発現されるタンパク質由来の既知の「共通の抗原」であり、多数の患者由来の腫瘍上に存在し、または腫瘍間で共有される。ゲノム規模配列決定の出現により、大部分の癌が、患者のＭＨＣに結合する可能性があるクローン性非同義一塩基対置換を含有することが示されてきており、これによって、免疫療法のための新しい道が開かれた２９。続く分析はこのアイディアを補強した３８〜４５。これらの「ネオ抗原」は、腫瘍ターゲットとして、共通の抗原よりも理論的な利点、例えば腫瘍組織に対するより高い特異性及び潜在的により高いアフィニティのＴＣＲ−ＭＨＣ相互作用を有する。しかし、突然変異のパターンは各癌においてユニークであり、迅速な個別化同定及びこれらのネオ抗原のターゲティングのための方法を開発しなければならない。
【０１４３】
濃縮＋増殖を用いて、ネオ抗原に対するＴ細胞反応を生成するため、本発明者らは、マウス黒色腫株Ｂ１６及び結腸癌株ＣＴ２６に関して記載される公表された「ミュートーム」を利用した４６，４７。簡潔には、ゲノム及びトランスクリプトームデータセットを合わせて、発現される一塩基対置換を同定した（図６Ａ）。各ＳＢＳの上流及び下流の８または９個の隣接アミノ酸をインシリコで抽出した。次いで、これらの約１７アミノ酸配列を、人工的ニューラルネットワークを用いてヒトＨＬＡならびにマウスＭＨＣアレルへのペプチドの結合を予測するアルゴリズムであるＮｅｔＭＨＣによってプロセシングした４８。このアルゴリズムは、ＣＴ２６及びＢ１６に関して、長さ８〜１０アミノ酸のアミノ酸ネオエピトープを予測した（表２）。広い範囲の予測されるアフィニティを示す７つの候補ペプチドであって、２つがＣＴ２６由来であり、５つがＢ１６由来であるペプチドを合成し、これを用いて、ネオエピトープ特異的ナノａＡＰＣを生成した。これらのネオエピトープを有するナノａＡＰＣを用いたＥ＋Ｅを次いで実行し、第７日にＭＨＣ多量体で評価した。
【０１４４】
第７日由来の抗原特異的培養物を、試験した２つのＣＴ２６由来候補ペプチド（ＦＰＳ及びＳＡＦ）の両方に関して同定した。図６Ｂは、Ｌｄ−ＦＰＳ及びＬｄ−ＳＡＦ活性化試料の代表的な第７日同族ＭＨＣ染色を示す。Ｂ１６ミュートーム由来のペプチドは、反応性（Ｄｂ−ＹＴＧ）及び非反応性（Ｋｂ−ＬＡＹ）染色パターンを示し（図６Ｂ）、調べた全体のうち２／５のペプチド（Ｄｂ−ＹＴＧ及びＫｂ−ＶＤＷ）が強い反応を示し、２／５が中程度の反応を示し（Ｄｂ−ＩＡＭ及びＤｂ−ＲＴＦ）、１／５が非反応性であった（Ｋｂ−ＬＡＹ）。ＮｅｔＭＨＣによって予測されるようなＭＨＣに対するペプチドアフィニティ（表２）はＥ＋Ｅ反応を正確には予測せず；強い反応因子ＹＴＧ及びＶＤＷはそれぞれ、９９１及び９０６６ｎＭで低い予測アフィニティを有し、一方、非反応因子ＬＡＹ及び不確かな反応因子ＩＡＭはそれぞれ、６９及び５ｎＭで高い予測アフィニティを有した。総合すると、第７日で生成される細胞の総数は、共通の抗原Ｄｂ−ＧＰ１００及びＬｄ−Ａ５で観察されるものとほぼ同じで、１５，０００〜４０，０００個の範囲である（図６Ｃ）が、共通の抗原Ｋｂ−ＴＲＰ２及びＫｂ−ＳＩＩＮより少なかった。
【０１４５】
（表２）候補ネオエピトープ
2017529080.tif 000004
ＮｅｔＭＨＣによって予測されるようなＭＨＣアフィニティを含む、Ｂ１６腫瘍由来のネオエピトープを含有する候補ペプチド配列のリスト
【０１４６】
実施例２のみの参考文献
2017529080.tif 000005
2017529080.tif 000006
2017529080.tif 000007
2017529080.tif 000008
2017529080.tif 000009
2017529080.tif 000010
2017529080.tif 000011
2017529080.tif 000012
2017529080.tif 000013
【０１４７】
実施例２を除く出願全体の参考文献
2017529080.tif 000014
2017529080.tif 000015
2017529080.tif 000016
2017529080.tif 000017
【図１】
2017529080.tif 000019
【図２】
2017529080.tif 000020
【図３】
2017529080.tif 000021
【図４】
2017529080.tif 000022
【図５】
2017529080.tif 000023
【図６】
2017529080.tif 000024
【図７】
2017529080.tif 000025
【国際調査報告】
2017529080.tif 000026
2017529080.tif 000027
2017529080.tif 000028
2017529080.tif 000029