(57)【要約】  本発明は、抗原ＣＤ１２３に特異的な新世代のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（多重鎖ＣＡＲと称される）に関する。このようなＣＡＲは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原ＣＤ１２３を発現する悪性細胞に再指向させるためのものである。これらのＣＡＲを構成するアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドは、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体により近いフレキシブルなアーキテクチャを形成する膜近傍位置においてアセンブルするように設計される。本発明は、特に免疫療法に使用するための、前記多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクター、および表面においてそれらを発現する単離された細胞を包含する。本発明は、癌、特に白血病を処置するための効率的な養子免疫療法戦略への道を開く。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−細胞外ＣＤ１２３リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド
を含む、ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）。
【請求項２】
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド
をさらに含む、請求項１に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）。
【請求項３】
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
をさらに含む、請求項２に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）。
【請求項４】
ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＣＤ１２３リガンド結合ドメインが、ＣＤ１２３に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記ＶＨが、配列番号：１３、１５、１７、１９、２１および２３から選択される１つと少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項４に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記ＶＬが、配列番号：１４、１６、１８、２０、２２および２４から選択される１つと少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチドを含む、請求項１に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項７】
ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖が、ＣＤ８α、ＩｇＧ１またはＦｃＲＩＩＩαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されている、請求項１に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記ヒンジが、配列番号：２と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項９】
ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲゼータ鎖、ＦＣεＲβ鎖、ＦｃεＲＩγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１０】
前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータに由来する、請求項９に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記シグナル伝達ドメインが、配列番号：１０と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１０に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記第２または第３のポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む、請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
前記共刺激ドメインが４−１ＢＢに由来し、配列番号：６と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１２に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記共刺激ドメインがＣＤ２８に由来し、配列番号：７と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項１２に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１５】
請求項１に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、表６において抗ＣＤ１２３  ７Ｇ３、抗ＣＤ１２３  Ｏｌｄ４、抗ＣＤ１２３  ２６２９２、抗ＣＤ１２３  ３２７１６、抗ＣＤ１２３  Ｋｌｏｎ４３、抗ＣＤ１２３  １２Ｆ１と称される全長アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１８】
免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞の表面において、少なくとも１つの請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を発現させること
を含む、方法。
【請求項１９】
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）少なくとも１つの請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む、請求項１８に記載の免疫細胞操作方法。
【請求項２０】
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させること
を含む、請求項１８に記載の免疫細胞操作方法。
【請求項２１】
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む、請求項１８に記載の免疫細胞操作方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法から得られる、単離された免疫細胞。
【請求項２３】
少なくとも１つの請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を含む、単離された免疫細胞。
【請求項２４】
医薬として使用するための、請求項２２または２３に記載の単離された免疫細胞。
【請求項２５】
ＮＫ細胞、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の単離された細胞。
【請求項２６】
それを必要とする患者を処置するための方法であって、
ａ）請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる免疫細胞を提供すること；
ｂ）前記Ｔ細胞を前記患者に投与すること
を含む、方法。
【請求項２７】
前記免疫細胞が、ドナーから回収されるものである、請求項２６に記載の患者処置方法。
【請求項２８】
前記免疫細胞が、患者から回収されるものである、請求項２６に記載の患者処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗原ＣＤ１２３に特異的な新世代のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（多重鎖ＣＡＲと称される）に関する。このようなＣＡＲは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原ＣＤ１２３を発現する悪性細胞に再指向させるためのものである。これらのＣＡＲを構成するアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドは、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体により近いフレキシブルなアーキテクチャを形成する膜近傍位置においてアセンブルするように設計される。本発明は、特に免疫療法に使用するための、前記多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクター、および表面においてそれらを発現する単離された細胞を包含する。本発明は、癌、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するための効率的な養子免疫療法戦略への道を開く。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的Ｔ細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法のために使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の増大または遺伝子操作を通したＴ細胞の再指向のいずれかによって生成され得る（Ｐａｒｋ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２９（１１）：  ５５０−５５７）。ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の移入は、移植に関連するウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。
【０００３】
Ｔ細胞における新規特異性は、トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Ｊｅｎａ，  Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｂｌｏｏｄ．  １１６（７）：  １０３５−１０４４）。ＣＡＲは、１つ以上のシグナリングドメインに結合して一本鎖融合分子を形成するターゲティング部分からなる合成受容体である。しかしながら、このアプローチは、抗原ＣＤ１９を有する悪性Ｂ細胞をターゲティングすることによって、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者に関してのみ効果的であることがこれまでに証明されている（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３６５：７２５−７３３）。
【０００４】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の誘導処置は、ほぼ５０年間ほとんど変化しておらず、ＡＭＬは依然として、予後不良の疾患である。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄における未成熟骨髄細胞の急速な増殖を特徴とする疾患であり、造血機能不全をもたらす。標準的な誘導化学療法は完全寛解を誘導し得るが、最終的には多くの患者が再発して死亡することから、ＡＭＬの新規治療薬の開発が求められている。
【０００５】
ＡＭＬ細胞の免疫表現型決定における最近の進歩により、将来の治療の標的として作用し得るいくつかのＡＭＬ関連細胞表面抗原が明らかにされている。インターロイキン３受容体アルファ鎖（ＩＬ−３Ｒα；ＣＤ１２３−ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００１２５４６４２）は、正常な造血幹細胞と比較してＡＭＬ腫瘍細胞で過剰発現されるので、免疫療法の標的候補として同定されている。加えて、ＣＤ１２３特異的治療薬に関する２つの第Ｉ相試験が完了し、両薬物は優れた安全性プロファイルを示した（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＩＤ：ＮＣＴ００４０１７３９およびＮＣＴ００３９７５７９）。
【０００６】
残念なことに、これらのＣＤ１２３ターゲティング薬は有効性が限られており、抗白血病活性を観察するためには、別のより強力なＣＤ１２３ターゲティング治療が必要であることが示唆されている。
【０００７】
これに関して、ＣＡＲアプローチは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と比較していくつかの利点を提供し、より効率的な生体内分布、およびサイトカインの放出を介した免疫系との改善された相乗作用を示した。また、長期にわたる細胞性免疫応答の発生の可能性は、経時的に疾患を持続的に制御する可能性を提供し得る。
【０００８】
自己細胞の養子移入後にこのような治療を受けている患者では、ＣＡＲアプローチで観察される欠点または副作用（例えば、高サイトカイン血症）が報告されている。
【０００９】
したがって、進行性ＣＬＬを有する患者では、自己ＣＤ１９特異的ＣＡＲ改変Ｔ細胞による大きな腫瘍塊の破壊は、腫瘍溶解症候群をもたらした。
【００１０】
さらに、同種Ｔ細胞の注入後には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の可能性がある。
したがって、宿主にとってより効率的で低毒性な新たなＣＤ１２３ターゲティング治療の開発が必要である。
【００１１】
悪性細胞または感染細胞をターゲティングし得る治療グレードの人工免疫細胞を開発する状況において、本発明者らは、天然のものに近い改善されたＣＡＲアーキテクチャであって、任意の細胞外単一特異的または多重特異的リガンド結合ドメインを使用して作用する可能性が高い改善されたＣＡＲアーキテクチャを研究した。国際公開第２０１４０３９５２３号では、本発明の別個のポリペプチドサブユニットを含む新世代のＣＡＲ（多重鎖ＣＡＲと称される）が記載されている。このアーキテクチャによれば、シグナリングドメインおよび共刺激ドメインは、異なるポリペプチド鎖上に配置される。このような多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩアルファ鎖の高親和性ＩｇＥ結合ドメインを細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）で置換することによって、ＦｃεＲＩから生成され得る一方で、ＦｃεＲＩベータおよび／またはガンマ鎖のＮ末端および／またはＣ末端尾部は、それぞれシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインに融合される。細胞外リガンド結合ドメインは、Ｔ細胞の特異性を細胞標的に再指向させる役割を有し、シグナル伝達ドメインは、免疫細胞応答を活性化する。ＦｃεＲＩ由来のアルファ、ベータおよびガンマポリペプチド由来の異なるポリペプチドが、膜近傍位置にある膜貫通ポリペプチドであるという事実は、ＣＡＲに対するよりフレキシブルなアーキテクチャを提供して、標的分子に対する特異性を改善し、免疫細胞のバックグラウンド活性化を減少させる。
【００１２】
今回、本発明者らは、マーカーとしてＣＤ１２３を有する悪性細胞をターゲティングするのに特に適切なｓｃＦｖ細胞外ドメイン結合ＣＤ１２３を有する多重鎖ＣＡＲを設計した。これを達成した一方で、白血病、特にＡＭＬを処置または予防するためにＣＤ１２３陽性細胞に対して効率的に作用する抗体は、これまでにほとんど記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０１４０３９５２３号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐａｒｋ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２９（１１）：  ５５０−５５７
【非特許文献２】Ｊｅｎａ，  Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｂｌｏｏｄ．  １１６（７）：  １０３５−１０４４
【非特許文献３】Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３６５：７２５−７３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的のために、今回、本発明者らは、抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを発現するＴ細胞を提供した。これらの新たな抗ＣＤ１２３  ＣＡＲの設計およびアーキテクチャによって、ならびに本人工免疫細胞の特性によって、人工免疫細胞の作用および活性の動態は、逃れることができる腫瘍細胞がほとんどなく、長期効果が観察され、ＧＶＨＤおよび副作用が軽減される（毒性効果がより少ない）ほど予期外に改変されている。
【００１６】
これらの独自のＣＡＲは、ＣＤ１２３陽性Ｔ細胞（特に、ＡＭＬ中に発生する悪性ＣＤ１２３陽性細胞）に特異的に結合してその生存に影響を与え、これらの悪性細胞の生存可能性を選択的に変化させ、サイトカイン放出を含む毒性副作用をほとんど示さないと予想される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
【表１】
2017519502.tif 000002
【００１８】
【表２】
2017519502.tif 000003
【００１９】
【表３】
2017519502.tif 000004
【００２０】
【表４】
2017519502.tif 000005
【００２１】
【表５】
2017519502.tif 000006
【００２２】
【表６−１】
2017519502.tif 000007
【００２３】
【表６−２】
2017519502.tif 000008
【００２４】
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語はすべて、遺伝子治療、生化学、遺伝学および分子生物学の領域の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５８４８号の文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
適切な方法および材料が本明細書およびＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５８４８に記載されるが、本明細書に記載されるものに類似しているかまたは等価であるすべての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。
【００２６】
本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を利用するであろう。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ，２０００，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎ  Ｉｎｃ，Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，ＵＳＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，ｅｄｓ．−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）ａｎｄ  Ｖｏｌ．１８５，“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；およびＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。
【００２７】
特に、本発明は、
−細胞外ＣＤ１２３リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド
を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００２８】
本発明は、
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチドをさらに含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００２９】
本発明は、
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチドをさらに含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００３０】
本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＣＤ１２３リガンド結合ドメインが、ＣＤ１２３に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である上記のいずれか１つのＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３１】
本発明は、前記ＶＨが、配列番号：１３、１５、１７、１９、２１および２３から選択される１つと少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３２】
本発明は、前記ＶＬが、配列番号：１４、１６、１８、２０、２２および２４から選択される１つと少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチドを含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３３】
本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖が、ＣＤ８α、ＩｇＧ１またはＦｃＲＩＩＩαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されている上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３４】
本発明は、前記ヒンジが、配列番号：２と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３５】
本発明は、ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲゼータ鎖、ＦＣεＲβ鎖、ＦｃεＲＩγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む上記のいずれか１つのＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３６】
本発明は、前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータに由来する上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３７】
本発明は、前記シグナル伝達ドメインが、配列番号：１０と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３８】
本発明は、前記第２または第３のポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００３９】
本発明は、前記共刺激ドメインが４−１ＢＢに由来し、配列番号：６と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００４０】
本発明は、前記共刺激ドメインがＣＤ２８に由来し、配列番号：７と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００４１】
本発明は、上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、表６において抗ＣＤ１２３  ７Ｇ３、抗ＣＤ１２３  Ｏｌｄ４、抗ＣＤ１２３  ２６２９２、抗ＣＤ１２３  ３２７１６、抗ＣＤ１２３  Ｋｌｏｎ４３、抗ＣＤ１２３  １２Ｆ１と称される全長アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４２】
本発明は、上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００４３】
本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞の表面において、少なくとも１つの上記多重鎖キメラ抗原受容体を発現させること
を含む方法を提供する。
【００４４】
本発明は、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）少なくとも１つの上記多重鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む上記免疫細胞操作方法を提供する。
【００４５】
本発明はまた、以下の工程：
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させること
を含む上記免疫細胞操作方法を提供する。
【００４６】
本発明は、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む上記免疫細胞操作方法を提供する。
【００４７】
本発明は、上記方法から得られる単離された免疫細胞を提供する。
本発明は、少なくとも１つの上記多重鎖キメラ抗原受容体を含む単離された免疫細胞を提供する。
【００４８】
本発明は、ＮＫ細胞、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する上記単離された細胞を提供する。
【００４９】
本発明は、医薬として使用するための上記単離された免疫細胞を提供する。
本発明はさらに、それを必要とする患者を処置するための方法であって、
ａ）上記方法によって得られる免疫細胞を提供すること；
ｂ）前記Ｔ細胞を前記患者に投与すること
を含む方法を提供する。
【００５０】
本発明は、前記免疫細胞が、ドナーまたは患者から回収されるものである上記患者処置方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の多重鎖ＣＡＲアーキテクチャが由来する天然ＦｃεＲＩの概略図。
【図２】本発明のＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性構築物の一般構造。
【図３】本発明のＣＤ１２３特異的多重鎖ＣＡＲの異なるアーキテクチャ。左から右へ：（ＣＤ３ゼータのＩＴＡＭに融合された）ポリペプチドガンマ、（ＳｃＦｖに融合された）ポリペプチドアルファ、（ＣＤ２８または４１ＢＢのいずれか由来の共刺激ドメインに融合された）ポリペプチドベータ。ＡおよびＢ：ポリペプチドベータは、４１ＢＢ由来の共刺激ドメインに融合されており、ＶＬおよびＶＨ断片は逆の順序である。ＣおよびＤ：ポリペプチドベータは、ＣＤ２８由来の共刺激ドメインに融合されており、ＶＬおよびＶＨ断片は逆の順序である。  図３Ｃおよび図４では、ＶＬおよびＶＨ断片は、図３Ｄの構成と比較して逆の順序である。図３Ｃおよび図４では、細胞外ＣＤ１２３リガンド結合ドメインのＶＬ断片は、高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチドに、より正確には、ＣＤ８断片と、高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖の断片とを含むペプチドに融合されている。
【図４】アルファ断片が、ＣＤ８断片を含むポリペプチドとＶＨ断片とに連結されたＶＬ断片を含み、ベータ鎖が、ベータ鎖のＣ末端に位置する共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインが４１ＢＢ（ｍｃ１２３−４１ＢＢ）またはＣＤ２８（ｍｃ１２３−ＣＤ２８）に由来する本発明のＣＤ１２３特異的多重鎖ＣＡＲの２つのアーキテクチャ（ｍｃ１２３−４１ＢＢおよびｍｃ１２３−ＣＤ２８）。
【図５】ＭＯＩ  ５で形質導入した８日後に評価したｍｃＣＡＲ  ｍｃ１２３−ＣＤ２８の発現レベル。ヒトＣＤ１２３タンパク質の細胞外ドメインがマウスＩｇＧ１由来Ｆｃ断片に融合されたものを含有する組換え融合タンパク質を使用して、ＣＡＲ検出を実施した。ＰＥ結合抗Ｆｃ抗体を使用してＣＡＲ／ＣＤ１２３−Ｆｃ複合体を検出し、フローサイトメトリーによって分析した。ＮＴＤは、非形質導入細胞を表す。
【図６】ＭＯＩ  ５で形質導入した８日後に評価したｍｃＣＡＲ  ｍｃ１２３−４１ＢＢの発現レベル。ヒトＣＤ１２３タンパク質の細胞外ドメインがマウスＩｇＧ１由来Ｆｃ断片に融合されたものを含有する組換え融合タンパク質を使用して、ＣＡＲ検出を実施した。ＰＥ結合抗Ｆｃ抗体を使用してＣＡＲ／ＣＤ１２３−Ｆｃ複合体を検出し、フローサイトメトリーによって分析した。ＮＴＤは、非形質導入細胞を表す。
【図７】異なるレベルのＣＤ１２３を発現する細胞（ＫＧ１ａ＜ＭＯＬＭ１３＜ＲＰＭＩ８２２６）と共に、またはＣＤ１２３を発現しない細胞（ダウディ）と共に６時間共培養した場合の、一本鎖（ｓｃ）ＣＡＲおよびｍｃＣＡＲを発現するＴ細胞の脱顆粒活性。共培養と同じ条件で単独で培養したＴ細胞、および陽性コントロール（ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化した細胞）の脱顆粒活性も示されている；フローサイトメトリーによって、（ＣＤ８＋細胞の中の）ＣＤ１０７ａ＋細胞の％を測定することによって、脱顆粒活性を決定した。少なくとも３つの別個のドナーにおいて、実験を行った。
【図８】ｍｃＣＡＲ−Ｔ細胞の特異的細胞溶解活性。Ｔ細胞を、ダウディ＋ＫＧ１ａ、ダウディ＋ＭＯＬＭ１３またはダウディ＋ＲＰＭＩ−８２２６細胞と共に４時間共培養した。共培養の終了時に各細胞株の細胞生存率を決定し、各条件について、特異的細胞溶解率を計算した。得られた結果は、ＣＤ１２３をターゲティングする両ｍｃＣＡＲがＴ細胞で発現され、ＣＤ１２３＋標的細胞に対して同程度の活性を有することを示している。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲ
本発明は、
−細胞外ＣＤ１２３リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド
を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００５３】
本発明は、
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチドをさらに含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００５４】
本発明は、
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチドを含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００５５】
ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲまたは抗ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）は、ＣＤ１２３に特異的に結合する多重鎖キメラ抗原受容体を意味し、好ましくは、ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原は、ＣＤ１２３に特異的に結合し、ＣＤ１２３発現細胞、特にＣＤ１２３発現癌細胞の生存に影響を与える多重鎖キメラ抗原受容体を意味する。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明は、
−細胞外ＣＤ１２３リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド、
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド；および
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、
細胞外ＣＤ１２３リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド、
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド；および
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）であって、
モノクローナル抗ＣＤ１２３抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む前記細胞外リガンド結合ドメインが、以下のＣＤＲ配列：
ＧＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号：２６）、ＲＳＫＡＤＧＹＴＴ（配列番号：２７）、ＡＲＤＡＡＹＹＳＹＹＳＰＥＧＡＭＤＹ（配列番号：２８）およびＱＮＶＤＳＡ（配列番号：２９）、ＳＡＳ（配列番号：３０）、ＱＱＹＹＳＴＰＷＴ（配列番号：３１）
を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００５８】
一実施形態では、本発明は、
−細胞外ＣＤ１２３リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の第１の膜貫通ポリペプチド、
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド；および
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）であって、
モノクローナル抗ＣＤ１２３抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む前記細胞外リガンド結合ドメインが、以下のＣＤＲ配列：
ＧＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号：４４）、ＲＳＫＡＤＧＹＴＴ（配列番号：４５）、ＡＲＤＡＡＹＹＳＹＹＳＰＥＧＡＭＤＹ（配列番号：４６）およびＱＮＶＤＳＡ（配列番号：４７）、ＳＡＳ（配列番号：４８）、ＱＱＹＹＳＴＰＷＴ（配列番号：４９）、ならびにＶＨとＶＬとの間のヒンジ（アルファ鎖）を含み、
−前記シグナル伝達ドメイン（または細胞質膜貫通ドメイン）が、ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン（ガンマ鎖）を含み、
−前記共刺激ドメインが、４−１ＢＢまたはＣＤ２８由来の共刺激膜貫通ドメイン（ベータ鎖）を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００５９】
さらにより好ましい実施形態では、本発明は、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む上記実施形態のいずれかのＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）、または以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００６０】
この実施形態では、本発明は、ポリペプチド配列が以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６と少なくとも９０％の同一性を有するか、またはポリペプチド配列が以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７と少なくとも９０％の同一性を有するＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００６１】
本発明は、ポリペプチド配列が以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６と少なくとも９５％の同一性を有するか、またはポリペプチド配列が以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７と少なくとも９５％の同一性を有するＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００６２】
本発明は、ポリペプチド配列が以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６と少なくとも９８％の同一性を有するか、またはポリペプチド配列が以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７と少なくとも９８％の同一性を有するＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００６３】
本発明は、ポリペプチド配列が以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６と少なくとも９９％の同一性を有するか、またはポリペプチド配列が以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７と少なくとも９９％の同一性を有するＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００６４】
すべての上記実施形態では、前記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ）は、ＣＤ１２３発現細胞に結合し、および／または前記ＣＤ１２３発現癌細胞の生存に影響を与える特性を継続的または一時的に保持する。
【００６５】
本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＣＤ１２３リガンド結合ドメインが、ＣＤ１２３に対する特異性を付与する好ましくは抗体「Ｋｌｏｎ４３」由来の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００６６】
好ましい実施形態では、本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＣＤ１２３リガンド結合ドメインが、ＣＤ１２３に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含む抗体「Ｋｌｏｎ４３」由来の（またはそれと少なくとも９０％〜９９％の同一性を有する）一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるか、またはヒトＣＤ１２３に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含むヒト化「Ｋｌｏｎ４３」抗体に由来する上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００６７】
より好ましい実施形態では、本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖に融合された前記ＣＤ１２３リガンド結合ドメインが、配列番号：２１および配列番号：２２と９０％〜１００％の同一性を有する抗体「Ｋｌｏｎ４３」由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００６８】
本発明は、前記ＶＨが、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１および配列番号：２３から選択されるポリペプチド配列の１つと少なくとも１００％〜少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００６９】
本発明は、前記ＶＬが、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２および配列番号：２４から選択されるポリペプチド配列の１つと少なくとも１００％〜少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７０】
本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖が、ＣＤ８α、ＩｇＧ１またはＦｃＲＩＩＩαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されている上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７１】
本発明は、前記ヒンジが、配列番号：２と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。好ましい一実施形態では、前記ヒンジは、配列番号：２のポリペプチドを含む。
【００７２】
本発明は、ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲゼータ鎖、ＦＣεＲβ鎖、ＦｃεＲＩγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７３】
本発明は、ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインがＴＣＲゼータ鎖に由来する上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７４】
本発明は、ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインがＦＣεＲβ鎖に由来する上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７５】
本発明は、ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインがＦｃεＲＩγ鎖に由来する上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７６】
本発明は、ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７７】
本発明は、前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータに由来する上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供し、好ましくは、本発明は、前記シグナル伝達ドメインが、配列番号：１０と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。一実施形態では、前記シグナル伝達ドメインは、配列番号：１０のポリペプチド配列を含む。
【００７８】
本発明は、前記第２または第３のポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明は、前記第２または第３のポリペプチドが、ＣＤ２８由来の共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明は、前記第２または第３のポリペプチドが、４−１ＢＢ由来の共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
【００８１】
本発明は、前記共刺激ドメインが４−１ＢＢに由来し、配列番号：６と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。一実施形態では、前記共刺激ドメインは４−１ＢＢに由来し、配列番号：６のポリペプチド配列を含む。
【００８２】
本発明は、前記共刺激ドメインがＣＤ２８に由来し、配列番号：７と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。一実施形態では、前記共刺激ドメインはＣＤ２８に由来し、配列番号：７を有するポリペプチド配列を含む。
【００８３】
本発明は、上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、表６において抗ＣＤ１２３  ７Ｇ３、抗ＣＤ１２３  Ｏｌｄ４、抗ＣＤ１２３  ２６２９２、抗ＣＤ１２３  ３２７１６、抗ＣＤ１２３  Ｋｌｏｎ４３、抗ＣＤ１２３  １２Ｆ１と称される全長アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００８４】
好ましい実施形態では、本発明は、上記に開示されるＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、抗ＣＤ１２３  Ｋｌｏｎ４３  ＶＨおよびＶＬの全長アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは配列番号：２１および配列番号：２２と少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００８５】
より好ましい実施形態では、本発明は、上記に開示されるＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、抗ＣＤ１２３  Ｋｌｏｎ４３  ＶＨおよびＶＬの全長アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは配列番号：２１および配列番号：２２と少なくとも９０％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００８６】
別のより好ましい実施形態では、本発明は、上記に開示されるＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、抗ＣＤ１２３  Ｋｌｏｎ４３  ＶＨおよびＶＬの全長アミノ酸配列、好ましくは配列番号：２１および配列番号：２２と１００％の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【００８７】
本発明は、好ましくは、
−ＣＤ１２３に対する特異性を付与する重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むＣＤ１２３に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインに融合された高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のアルファ鎖由来の第１の膜貫通ポリペプチド、
−シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第２の膜貫通ポリペプチド；および
−共刺激ドメインを含むＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖由来の第３の膜貫通ポリペプチド
を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００８８】
一実施形態では、モノクローナル抗ＣＤ１２３抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む前記細胞外リガンド結合ドメインは、以下のＣＤＲ配列：
ＧＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号：２６）、ＲＳＫＡＤＧＹＴＴ（配列番号：２７）、ＡＲＤＡＡＹＹＳＹＹＳＰＥＧＡＭＤＹ（配列番号：２８）およびＱＮＶＤＳＡ（配列番号：２９）、ＳＡＳ（配列番号：３０）、ＱＱＹＹＳＴＰＷＴ（配列番号：３１）を含む。
【００８９】
より好ましい実施形態では、本発明は、以下のＣＤＲ配列：
ＧＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号：４４）、ＲＳＫＡＤＧＹＴＴ（配列番号：４５）、ＡＲＤＡＡＹＹＳＹＹＳＰＥＧＡＭＤＹ（配列番号：４６）およびＱＮＶＤＳＡ（配列番号：４７）、ＳＡＳ（配列番号：４８）、ＱＱＹＹＳＴＰＷＴ（配列番号：４９）を含み、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６、または以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７をさらに含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体（ｍｃ  ＣＡＲ）を提供する。
【００９０】
本発明は、ＦｃεＲＩの前記アルファ鎖が、ＣＤ８α、ＩｇＧ１またはＦｃＲＩＩＩαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されており、好ましくは、前記ヒンジが配列番号：２のポリペプチドを含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００９１】
本発明は、ＦｃεＲＩのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲゼータ鎖、ＦＣεＲβ鎖、ＦｃεＲＩγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、好ましくは、前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータに由来し、より好ましくは、配列番号：１０のポリペプチド配列を含む上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００９２】
本発明は、前記第２または第３の膜貫通ポリペプチドが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
【００９３】
本発明は、前記第２または第３の膜貫通ポリペプチドが、ＣＤ２８および／４−１ＢＢから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
【００９４】
有利には、本発明は、前記共刺激ドメインが４−１ＢＢに由来し、配列番号：６のポリペプチドを含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００９５】
本発明はまた、前記共刺激ドメインがＣＤ２８に由来し、配列番号：７のポリペプチド配列を含む上記ＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００９６】
本発明は、上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００９７】
本発明は、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするか、または以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００９８】
本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするか、または以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするベクターを提供する。
【００９９】
上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を持つ免疫細胞を操作する方法であって、以下の工程：
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞の表面において、少なくとも１つの上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３多重鎖キメラ抗原受容体を発現させること
を含む方法は、本発明の一部である。
【０１００】
一実施形態では、本発明は、上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を持つ免疫細胞を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）上記のいずれか１つに記載のＣＤ１２３多重鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードし；好ましくは、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６をコードするか、または以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む方法を提供する。
【０１０１】
好ましい実施形態では、前記免疫細胞操作方法は、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させること
を含む。
【０１０２】
好ましい実施形態では、前記免疫細胞操作方法は、
（ａ）免疫細胞を提供すること；
（ｂ）各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記実施形態のいずれか１つに記載のＣＤ１２３多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること；
（ｃ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
をさらに含む。
【０１０３】
したがって、本発明は、上記実施形態のいずれか１つに記載の方法から得られる単離された免疫細胞、好ましくは、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含むＣＤ１２３多重鎖キメラ抗原受容体を発現する単離された免疫細胞、または以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含むＣＤ１２３特異的多重鎖キメラ抗原受容体を発現する単離された免疫細胞を提供する。
【０１０４】
細胞
本発明は、単離された細胞を提供し、前記単離された細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球からなる群より選択され、好ましくは、前記単離された細胞は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）をさらに含む。
【０１０５】
本発明は、単離された細胞を提供し、前記単離された細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球からなる群より選択され、好ましくは、前記単離された細胞は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）をさらに含む単離された細胞を提供する。
【０１０６】
好ましい実施形態では、本発明で提供される前記単離された細胞は、単離された免疫Ｔ細胞であり、前記単離された免疫Ｔ細胞は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を発現する。
【０１０７】
別の好ましい実施形態では、前記単離された免疫細胞は、単離された免疫Ｔ細胞であり、前記単離された免疫Ｔ細胞は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を発現する。
【０１０８】
一実施形態では、前記単離された免疫細胞はさらに操作され、本発明の少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む単離された人工初代免疫細胞である。
【０１０９】
好ましい実施形態では、前記単離された人工初代免疫細胞は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む。
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、前記単離された人工初代免疫細胞は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む。
【０１１１】
医薬組成物
一態様では、本発明は、上記のように医薬組成物を提供する。
【０１１２】
本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を持つ少なくとも１つの初代細胞とを含む医薬組成物を提供する。
【０１１３】
一実施形態では、前記医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を持つ少なくとも１つの初代細胞とを含む。
【０１１４】
一実施形態では、前記医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルと、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を持つ少なくとも１つの初代細胞とを含む。
【０１１５】
医薬
本発明は、医薬として使用するための上記実施形態に記載の単離された免疫細胞、好ましくは、医薬として使用するための単離された免疫Ｔ細胞であって、本発明のＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離された免疫Ｔ細胞を提供する。
【０１１６】
有利には、医薬として使用するための前記単離された免疫Ｔ細胞は、上記実施形態に記載の少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを含む。より有利には、本出願は、医薬として使用するための単離された免疫Ｔ細胞であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを含む単離された免疫Ｔ細胞、または医薬として使用するための単離された免疫Ｔ細胞であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを含む単離された免疫Ｔ細胞を提供する。
【０１１７】
さらにより有利には、本出願は、医薬として使用するための単離された免疫Ｔ細胞であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを含む単離された免疫Ｔ細胞、または医薬として使用するための単離された免疫Ｔ細胞であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを含む単離された免疫Ｔ細胞を提供する。
【０１１８】
治療適応症
本発明の抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを含むＴ細胞は、ＣＤ１２３発現細胞、特に過剰なＣＤ１２３発現細胞を特徴とする前悪性または悪性癌症状と診断された患者において、処置として提供される。このような症状は、血液学的癌、例えば白血病、リンパ性悪性腫瘍または悪性リンパ増殖性障害、癌腫、芽細胞腫および肉腫ならびに黒色腫で見られる。
【０１１９】
本出願は、癌腫、芽細胞腫および肉腫ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫および黒色腫の処置のためのＴ細胞であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを含むＴ細胞を提供する。
【０１２０】
したがって、本出願は、癌腫、芽細胞腫および肉腫ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫および黒色腫の処置のためのＴ細胞であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを含むＴ細胞を提供する。
【０１２１】
好ましい実施形態では、本出願は、白血病またはリンパ性悪性腫瘍の処置のためのＴ細胞であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを含むＴ細胞を提供する。
【０１２２】
好ましい実施形態では、本出願は、白血病またはリンパ性悪性腫瘍の処置のためのＴ細胞であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを含むＴ細胞を提供する。
【０１２３】
本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄異形成症候群の処置に使用するためのＴ細胞であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６、または配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７のいずれかを含む抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを含むＴ細胞を提供する。
【０１２４】
一実施形態では、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６、または配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７のいずれかを含む抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを含むＴ細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の処置のために提供される。
【０１２５】
一実施形態では、本出願は、難治性／再発性ＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された免疫Ｔ細胞であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離された免疫Ｔ細胞または難治性／再発性ＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された免疫Ｔ細胞であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離された免疫Ｔ細胞を提供する。
【０１２６】
本発明は、ＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された免疫ＮＫ細胞であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離された免疫ＮＫ細胞またはＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された免疫ＮＫ細胞であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離された免疫ＮＫ細胞を提供する。
【０１２７】
本発明は、ＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された炎症性Ｔリンパ球であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離された炎症性Ｔリンパ球またはＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された炎症性Ｔリンパ球であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離された炎症性Ｔリンパ球を提供する。
【０１２８】
本発明は、ＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための細胞傷害性Ｔリンパ球であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ細胞傷害性Ｔリンパ球、またはＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された細胞傷害性Ｔリンパ球であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離された細胞傷害性Ｔリンパ球を提供する。
【０１２９】
本発明は、ＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための調節性Ｔリンパ球であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ調節性Ｔリンパ球、またはＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された調節性Ｔリンパ球であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離された調節性Ｔリンパ球を提供する。
【０１３０】
本発明は、ＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するためのヘルパーＴリンパ球であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つヘルパーＴリンパ球またはＡＭＬを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離されたヘルパーＴリンパ球であって、以下のペプチド配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つのＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲを持つ単離されたヘルパーＴリンパ球を提供する。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、医薬として使用するための上記医薬組成物を提供する。
好ましい態様では、本発明は、病理学的症状、例えば癌、特に造血細胞の癌、より具体的にはＡＭＬまたはＭＭの予防または処置のための医薬として使用するための医薬組成物を提供する。
【０１３２】
好ましい実施形態では、前記病理学的症状は、難治性／再発性ＡＭＬである。
ＡＭＬを予防または処置するための医薬として使用するための本発明の医薬組成物は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６、または配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを含む人工初代免疫細胞、好ましくは初代免疫Ｔ細胞と、少なくとも１つの薬学的に許容され得るビヒクルとを含む。
【０１３３】
好ましくは、本発明は、それを必要とする患者を処置するための方法であって、
ａ）上記実施形態のいずれか１つに記載の方法によって得られる単離された免疫Ｔ細胞を提供すること；
ｂ）前記Ｔ細胞を前記患者に投与すること
を含み、
前記患者が、ＡＭＬ、ＭＭ、ＡＬＬ  ＣＬＬから選択される癌、好ましくはＡＭＬ、より好ましくは難治性／再発性ＡＭＬを患っている方法を提供する。
【０１３４】
本発明は、前記免疫細胞が、ドナーから回収されるものである上記患者処置方法を提供する。
【０１３５】
本発明は、前記免疫細胞が、患者、好ましくは患者自体、前記方法によって処置すべき患者から回収されるものである上記患者処置方法を提供する。
【０１３６】
多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、免疫療法において使用される免疫細胞に特に適合された多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【０１３７】
一般に、本発明の多重鎖ＣＡＲは、少なくとも：
−少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む１つの膜貫通ポリペプチド；および
−少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む１つの膜貫通ポリペプチド
を、前記ポリペプチドが共にアセンブルして多重鎖キメラ抗原受容体を形成するように含む。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。より好ましくは、前記ドメインは、ＣＤ１２３細胞表面分子と相互作用することができるであろう。
【０１３９】
本発明は、図２、図３または図４に示されているならびに請求項１、２および／または３に記載の構造を有する抗ＣＤ１２３多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（１２３  ｍｃＣＡＲ抗ＣＤ１２３  ｍｃ）であって、前記構造が、以下のＣＤＲ配列：
ＧＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号：２６）、ＲＳＫＡＤＧＹＴＴ（配列番号：２７）、ＡＲＤＡＡＹＹＳＹＹＳＰＥＧＡＭＤＹ（配列番号：２８）およびＱＮＶＤＳＡ（配列番号：２９）、ＳＡＳ（配列番号：３０）、ＱＱＹＹＳＴＰＷＴ（配列番号：３１）、ならびにＶＨとＶＬとの間のヒンジ（アルファ鎖）
を含むモノクローナル抗ＣＤ１２３抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインＶＨおよびＶＬを含み、
−前記構造が、
−ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞質膜貫通ドメイン（ガンマ鎖）および
−４−１ＢＢまたはＣＤ２８由来の共刺激膜貫通ドメイン（ベータ鎖）
をさらに含む抗ＣＤ１２３多重鎖キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（１２３  ｍｃＣＡＲ抗ＣＤ１２３  ｍｃ）を提供する。
【０１４０】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を提供する。
【０１４１】
別では、本発明は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を提供する。
【０１４２】
より好ましい実施形態では、前記抗ＣＤ１２３  ＣＡＲは、これらの配列を用いて構築され、図４に示されている構成に対応する。
【０１４３】
好ましい実施形態では、前記細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＤ１２３に特異的な標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）可変断片がフレキシブルリンカーによって連結されたものを含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖは、好ましくは表５において配列番号：１３〜２４、より好ましくは配列番号：２１および２２として提供される抗ＣＤ１２３  ｓｃＦＶである。ｓｃＦｖ以外のＣＤ１２３特異的結合ドメイン、例えば非限定的な例として、ラクダ科動物もしくはサメ類（ＶＮＡＲ）単一ドメイン抗体断片、または受容体リガンド、例えば血管内皮成長因子ポリペプチド、インテグリン結合ペプチド、ヘレグリンもしくはＩＬ−１３突然変異タンパク質、抗体結合ドメイン、抗体超可変ループもしくはＣＤＲもまた、リンパ球の所定のターゲティングに使用され得る。
【０１４４】
好ましい実施形態では、前記第１の膜貫通ポリペプチドは、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にストーク領域をさらに含む。本明細書で使用される「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインにさらなる可動性および接近性を与えるために用いられる。ストーク領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。ストーク領域は、天然分子のすべてもしくは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、もしくはＣＤ２８の細胞外領域のすべてもしくは一部、または抗体定常領域のすべてもしくは一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は天然ストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のストーク配列であり得る。好ましい実施形態では、前記ストーク領域は、ヒトＣＤ８アルファ鎖の一部である（例えばＮＰ＿００１１３９３４５．１）（配列番号：２）。
【０１４５】
したがって、免疫細胞における多重鎖ＣＡＲの発現は、限定されないが、各腫瘍関連表面抗原を有する悪性細胞、またはウイルス特異的表面抗原を有するウイルス感染細胞、または系統特異的もしくは組織特異的表面抗原を有する標的細胞を含む所定の標的を選択的に排除する改変細胞をもたらす。
【０１４６】
標的抗原のダウンレギュレーションまたは突然変異は、一般に、癌細胞において観察され、抗原喪失エスケープ変異体を作成する。したがって、腫瘍エスケープをオフセットし、免疫細胞をより標的特異的にするために、多重鎖ＣＡＲは、いくつかの細胞外リガンド結合ドメインを含み得、標的中の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を増強する。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上にタンデムに配置され得、場合により、リンカーによって分離され得る。別の実施形態では、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、多重鎖ＣＡＲを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に配置され得る。別の実施形態では、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を発現させることを含む方法に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む方法に関する。特定の実施形態では、免疫細胞操作方法は、細胞の表面において、シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩベータおよび／またはガンマ鎖の少なくとも一部と、異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合されたＦｃεＲＩアルファ鎖の複数の部分とを発現させることを含む。より具体的な実施形態では、前記方法は、シグナル伝達ドメインに融合されたＦｃεＲＩベータおよび／またはガンマ鎖の一部と、異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合された複数のＦｃεＲＩアルファ鎖とをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む。多重鎖ＣＡＲの集団は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の多重鎖ＣＡＲを意味する。本発明の異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的中の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を増強し得る。
【０１４７】
細胞
本発明はまた、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を含む単離された免疫細胞に関する。
【０１４８】
本発明の多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すれば、シグナル伝達ドメインは、多重鎖ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指令するタンパク質の部分を指す。
【０１４９】
多重鎖ＣＡＲにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するＦｃ受容体またはＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の任意の誘導体または変異体および合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナリング配列の２つの別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）を含む。一次細胞質シグナリング配列は、ＩＴＡＭの免疫受容活性化チロシンモチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内尾部に見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例としては、非限定的な例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられ得る。好ましい実施形態では、多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン、またはＦｃεＲＩベータもしくはガンマ鎖の細胞質内ドメインを含み得る。
【０１５０】
特定の実施形態では、本発明の多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。
【０１５１】
「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、限定されないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが挙げられ得る。共刺激リガンドはまた、とりわけ、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどの、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含する。
【０１５２】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、これに限定されないが、増殖などの、細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびトールリガンド受容体が挙げられる。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【０１５３】
別の特定の実施形態では、前記シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦＲ関連因子２（ＴＲＡＦ２）結合モチーフ（共刺激ＴＮＦＲメンバーファミリーの細胞質内尾部）である。共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの細胞質尾部は、主要な保存的モチーフ（Ｐ／Ｓ／Ａ）Ｘ（Ｑ／Ｅ）Ｅ）またはマイナーモチーフ（ＰＸＱＸＸＤ）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）からなるＴＲＡＦ２結合モチーフを含有する。ＴＲＡＦタンパク質は、受容体の三量化に応じて、多くのＴＮＦＲの細胞内尾部に動員される。
【０１５４】
好ましい実施形態では、本発明の多重鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。
【０１５５】
適切な膜貫通ポリペプチドの顕著な特徴は、免疫細胞、特に、リンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面において発現され、所定の標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指令するために一緒に相互作用する能力を含む。細胞外リガンド結合ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む本発明の多重鎖ＣＡＲの異なる膜貫通ポリペプチドは、一緒に相互作用して、標的リガンドとの結合後のシグナル伝達に関与し、免疫応答を誘導する。膜貫通ドメインは、天然起源に由来し得るか、または合成起源に由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、もしくはδなどのＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ２受容体のｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）、もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体ＩＩＩのサブユニット鎖またはＣＤタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。
【０１５６】
「由来する」という用語は、Ｆｃε受容体の配列の１つ以上のアミノ酸改変を含むＦｃε受容体のものと等価であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このようなアミノ酸改変は、アミノ酸置換、欠失、付加またはそれらの改変の任意の組み合わせを含み得、Ｆｃ受容体のものと比べてＦｃ結合領域の生物学的活性を変化させ得る。一方、特定のＦｃ受容体由来のＦｃ結合領域は、Ｆｃ受容体のものと比べてＦｃ結合領域の生物学的活性を実質的に変化させない１つ以上のアミノ酸改変を含み得る。この種のアミノ酸改変は、典型的には、保存的アミノ酸置換を含むであろう。
【０１５７】
特定の実施形態では、多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩ鎖由来の膜貫通ポリペプチドを含む。より具体的な実施形態では、ＦｃεＲＩ鎖は、細胞外ドメインが細胞外リガンド結合ドメイン、好ましくはＣＤ１２３に対するｓｃＦＶで置換されたＦｃεＲＩα鎖である。
【０１５８】
より具体的な実施形態では、前記多重鎖ＣＡＲは、ＦｃεＲＩアルファ鎖の一部およびＦｃεＲＩベータ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記ＦｃεＲＩ鎖が一緒に自発的に二量体化して二量体キメラ抗原受容体を形成するように含み得る。別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原は、ＦｃεＲＩアルファ鎖の一部およびＦｃεＲＩガンマ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記ＦｃεＲＩ鎖が一緒に自発的に三量体化して三量体キメラ抗原受容体を形成するように含み、別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原受容体は、ＦｃεＲＩアルファ鎖の一部およびＦｃεＲＩベータ鎖の一部およびＦｃεＲＩガンマ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記ＦｃεＲＩ鎖が一緒に自発的に四量体化して四量体キメラ抗原受容体を形成するように含み得る。
【０１５９】
非限定的な例として、様々なバージョン（アーキテクチャ）の多重鎖ＣＡＲが図３に示されている。好ましい実施形態では、２つのバージョン（アーキテクチャ）の多重鎖ＣＡＲが図４に示されている。より好ましい実施形態では、本発明の多重鎖ＣＡＲは、表６に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態では、多重鎖ＣＡＲは、このようなアミノ酸配列と、または多重鎖ポリペプチド構造を構成するポリペプチドの１つ、２つもしくは３つをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１６０】
より好ましい実施形態では、本発明は、以下のＣＤＲ配列：
ＧＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号：２６）、ＲＳＫＡＤＧＹＴＴ（配列番号：２７）、ＡＲＤＡＡＹＹＳＹＹＳＰＥＧＡＭＤＹ（配列番号：２８）およびＱＮＶＤＳＡ（配列番号：２９）、ＳＡＳ（配列番号：３０）、ＱＱＹＹＳＴＰＷＴ（配列番号：３１）、ならびにＶＨとＶＬとの間のヒンジ（アルファ鎖）を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む本発明の多重鎖抗ＣＤ１２３  ＣＡＲを持つ細胞であって、
前記多重鎖抗ＣＤ１２３  ＣＡＲが、
−ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞質膜貫通ドメイン（ガンマ鎖）および
−４−１ＢＢまたはＣＤ２８由来の共刺激膜貫通ドメイン（ベータ鎖）
をさらに含む細胞を提供する。
【０１６１】
より好ましい実施形態では、本発明は、以下の配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６、または以下の配列：配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む本発明の多重鎖抗ＣＤ１２３  ＣＡＲを持つ細胞を提供する。
【０１６２】
「同一性」は、２つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的のためにアライメントされ得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有する位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であるＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、２つの配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドとの少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。他に示されない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰが使用される時、パーセント類似性は、ＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示す；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、従来の手段によって、特に、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって入手され得る。
【０１６３】
ポリヌクレオチド、ベクター
本発明はまた、本発明の上記多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。本発明は、多重鎖ＣＡＲに含まれ得る本明細書に開示される膜貫通ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含む）を提供する。特に、本発明は、上記多重鎖ＣＡＲを構成する少なくとも１つの膜貫通ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、上記多重鎖ＣＡＲを構成する膜貫通ポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【０１６４】
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのウイルスベクター、例えばバキュロウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのプラスミドもしくはウイルスベクター、例えばレンチウイルス）中に存在し得る。
【０１６５】
特定の実施形態では、異なる核酸配列は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば２Ａペプチドをコードする配列を含む１つのポリヌクレオチドまたはベクターに含められ得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：  １０１３−１０２５  （２００１）；  Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：  １３−２１  （１９９７）；  Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ａｎｄ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２８（１３）：  ４２２７−４２３９  （２００８）；  Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ  １３：  ８０３−８１０  （２００７）を参照のこと）。「コドン」は、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明では、２Ａペプチドは、多重鎖ＣＡＲの異なるポリペプチドを細胞に発現させるために使用した。
【０１６６】
ＦｃεＲなどの膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に指向させるために、（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、ＦＣεＲのものであり得るか、または別の分泌タンパク質（例えば、ｔ−ＰＡ）に由来し得るか、またはデノボ合成され得る。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。すなわち、２つの配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路に指向されるよう配置される。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に配置されるが、特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に配置され得る（例えば、Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、ＦｃεＲＩアルファ鎖（ＮＰ＿００１９９２．１）の残基１〜２５を含み、配列番号：５のアミノ酸配列を有する。
【０１６７】
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化は、目的の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に稀であるコドンを、このような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することを指し、このようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。
【０１６８】
本発明はまた、本発明の抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。
【０１６９】
好ましい実施形態では、本発明の抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲをコードする前記ポリヌクレオチド、ベクターは、以下のＣＤＲ配列：
ＧＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号：２６）、ＲＳＫＡＤＧＹＴＴ（配列番号：２７）、ＡＲＤＡＡＹＹＳＹＹＳＰＥＧＡＭＤＹ（配列番号：２８）およびＱＮＶＤＳＡ（配列番号：２９）、ＳＡＳ（配列番号：３０）、ＱＱＹＹＳＴＰＷＴ（配列番号：３１）、ならびにＶＨとＶＬとの間のヒンジ（アルファ鎖）
−ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞質膜貫通ドメイン（ガンマ鎖）および
−４−１ＢＢまたはＣＤ２８由来の共刺激膜貫通ドメイン（ベータ鎖）
を含む抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲをコードする。
【０１７０】
本発明は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。
【０１７１】
別の実施形態では、本発明は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。
【０１７２】
免疫細胞を操作する方法
包含される特定の実施形態では、本発明は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法であって、前記多重鎖ＣＡＲを構成するポリペプチドを前記免疫細胞に導入すること、および前記細胞を増大させることを含む方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、細胞を提供すること、および前記細胞の表面において、少なくとも１つの上記多重鎖ＣＡＲを発現させることを含む方法に関する。特定の実施形態では、前記方法は、少なくとも１つの上記多重鎖ＣＡＲを構成するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで細胞を形質転換すること、および前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させることを含む。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明は、免疫療法のための細胞を調製する方法であって、前記多重鎖ＣＡＲを構成する異なるポリペプチドを前記細胞に導入すること、および前記細胞を増大させることを含む方法に関する。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、細胞において安定に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含められる。
【０１７４】
本発明は、免疫療法のための初代免疫細胞を調製する方法であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む前記抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を構成するポリペプチドを前記初代免疫細胞に導入することを含む方法に関する。
【０１７５】
別の実施形態では、本発明は、免疫療法のための初代免疫細胞を調製する方法であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む前記抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を構成するポリペプチドを前記免疫細胞に導入することを含む方法を提供する。
【０１７６】
送達方法
上記様々な方法は、場合によりＤＮＡ末端処理酵素または外因性核酸と共に、多重鎖ＣＡＲ、ｐＴアルファまたはその機能的変異体、低頻度切断エンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＡＲを細胞に導入することを含む。
【０１７７】
非限定的な例として、前記多重鎖ＣＡＲは、１つまたは異なるプラスミド性ベクターによってコードされる導入遺伝子として導入され得る。異なる導入遺伝子は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば２Ａペプチドをコードする配列を含む１つのベクターに含められ得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされる２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：１０１３−１０２５（２００１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：１３−２１（１９９７）；Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ａｎｄ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２８（１３）：４２２７−４２３９（２００８）；Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  １３：８０３−８１０（２００７）を参照のこと）。「コドン」は、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明では、２Ａペプチドは、低頻度切断エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ末端処理酵素または多重鎖ＣＡＲの異なるポリペプチドを細胞に発現させるために使用した。
【０１７８】
前記プラスミドベクターはまた、前記ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーを含有し得る。
【０１７９】
ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、前記ポリペプチドは、細胞外で生産され、次いで、細胞に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を動物細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞に導入され得る。例えば、一過性形質転換法としては、例えば、微量注入、エレクトロポレーションまたは微粒子銃が挙げられる。前記ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含められ得る。
【０１８０】
−エレクトロポレーション
本発明の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションによって細胞に直接導入されるｍＲＮＡであり得る。本発明者らは、Ｔ細胞におけるｍＲＮＡエレクトロポレーションの最適条件を決定した。
【０１８１】
本発明者は、パルス電場を用いることで、材料を細胞に送達するために生細胞を一過的に透過処理するのを可能にするｃｙｔｏＰｕｌｓｅ技術を使用した。この技術は、ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ）エレクトロポレーション波形の使用に基づいており、パルス持続時間、強度、ならびにパルス間の間隔の正確な制御を与える（米国特許第６，０１０，６１３号および国際公開第２００４０８３３７９号）。高いトランスフェクション効率と最低限の死のための最高条件に達するために、これらのパラメータはすべて変更することができる。基本的には、最初の高電場パルスによって孔が形成するのに対して、その後の低電場パルスによってポリヌクレオチドは細胞内に移動する。本発明の一態様では、本発明者は、Ｔ細胞におけるｍＲＮＡの＞９５％トランスフェクション効率の達成につながった工程、およびＴ細胞において様々な種類のタンパク質を一過的に発現させるためのエレクトロポレーションプロトコールの使用について説明する。特に、本発明は、Ｔ細胞を形質転換する方法であって、前記Ｔ細胞をＲＮＡと接触させること、ならびに
（ａ）電圧範囲が２２５０〜３０００Ｖ／センチメートルであり、パルス幅が０．１ｍｓであり、工程（ａ）の電気パルスと（ｂ）の電気パルスとの間のパルス間隔が０．２〜１０ｍｓである、１回の電気パルス、
（ｂ）電圧範囲が２２５０〜３０００Ｖであり、パルス幅が１００ｍｓであり、工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が１００ｍｓである、１回の電気パルス；および
（ｃ）電圧が３２５Ｖであり、パルス幅が０．２ｍｓであり、４回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が２ｍｓである、４回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをＴ細胞に適用することを含む方法に関する。
【０１８２】
特定の実施形態では、Ｔ細胞を形質転換する方法は、前記Ｔ細胞をＲＮＡと接触させること、ならびに
（ａ）電圧が２２５０Ｖ、２３００Ｖ、２３５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２５５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２６００Ｖ、２７００Ｖ、２８００Ｖ、２９００Ｖ、または３０００Ｖ／センチメートルであり、パルス幅が０．１ｍｓであり、工程（ａ）の電気パルスと（ｂ）の電気パルスとの間のパルス間隔が０．２ｍｓ、０．５ｍｓ、１ｍｓ、２ｍｓ、３ｍｓ、４ｍｓ、５ｍｓ、６ｍｓ、７ｍｓ、８ｍｓ、９ｍｓ、または１０ｍｓである、１回の電気パルス、
（ｂ）電圧範囲が２２５０Ｖ、２２５０Ｖ、２３００Ｖ、２３５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２５５０Ｖ、２４００Ｖ、２４５０Ｖ、２５００Ｖ、２６００Ｖ、２７００Ｖ、２８００Ｖ、２９００Ｖ、または３０００Ｖであり、パルス幅が１００ｍｓであり、工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が１００ｍｓである、１回の電気パルス、および
（ｃ）電圧が３２５Ｖであり、パルス幅が０．２ｍｓであり、４回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が２ｍｓである、４回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをＴ細胞に適用することを含む。
【０１８３】
上記値域に含まれる任意の値が、本出願において開示される。エレクトロポレーション培地は、当技術分野で公知の任意の適切な培地であり得る。好ましくは、エレクトロポレーション培地は、０．０１〜１．０ミリシーメンスの範囲の伝導率を有する。
【０１８４】
特定の実施形態では、非限定的な例として、前記ＲＮＡは、低頻度切断エンドヌクレアーゼ、低頻度切断エンドヌクレアーゼの１つのモノマー、例えば半ＴＡＬＥヌクレアーゼ、キメラ抗原受容体、多重鎖キメラ抗原受容体の少なくとも１つの成分、ｐＴアルファまたはその機能的変異体、外因性核酸、１つさらなる触媒ドメインをコードする。
【０１８５】
人工Ｔ細胞
本発明はまた、前記細胞操作方法によって得られやすい単離された細胞または細胞株に関する。特に、前記単離された細胞は、少なくとも１つの上記多重鎖ＣＡＲを含む。別の実施形態では、前記単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖ＣＡＲの集団を含む。特に、前記単離された細胞は、少なくとも１つの多重鎖ＣＡＲを構成するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む。
【０１８６】
以前に記載されている方法のいずれか１つによって得られる単離された免疫細胞、好ましくはＴ細胞も、本発明の範囲内に包含される。
【０１８７】
前記免疫細胞は、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞を指す。本発明の前記免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
【０１８８】
好ましい実施形態では、前記単離された細胞は、単離された幹ＣＤ３４＋細胞であり、前記単離された幹ＣＤ３４＋細胞は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む。
【０１８９】
別の好ましい実施形態では、前記単離された細胞は、単離された幹ＣＤ３４＋細胞であり、前記単離された幹ＣＤ３４＋細胞は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む。
【０１９０】
前記単離された細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群より選択されるＴ細胞であり得る。別の実施形態では、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。
【０１９１】
本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して被験体から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から得られ得る。本発明の特定の実施形態では、当業者に入手可能であり公知である多数のＴ細胞株が使用され得る。別の実施形態では、前記細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の実施形態では、前記細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。以前に記載されている方法による形質転換Ｔ細胞から得られる細胞株も、本発明の範囲内に包含される。免疫抑制処置に対して耐性であり、以前の方法によって得られやすい改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。前述のように、このような細胞はまた、例えば、ＣＤ５２、ＧＲ、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＨＬＡ遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子、例えばＰＤ１およびＣＴＬＡ−４からなる群より選択される１つもしくは複数の遺伝子を不活性化するように遺伝的に操作され得るか、またはｐＴアルファの導入遺伝子を発現し得る。
【０１９２】
別の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ遺伝子および／またはＴＣＲベータ遺伝子を不活性化することによって、本発明の細胞において非機能的になる。上記戦略は、より具体的にはＧｖＨＤを避けるために使用される。本発明の特定の態様は、個体由来の改変細胞を得るための方法であって、前記細胞が、主要組織適合複合体シグナル伝達経路と無関係に増殖し得る方法である。前記方法は、以下の工程：
（ａ）前記個体から細胞を回収する工程；
（ｂ）ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ遺伝子を不活性化することによって、前記細胞をエクスビボで遺伝子改変する工程；
（ｃ）適切な条件下で、遺伝子改変Ｔ細胞をインビトロで培養して前記細胞を増幅する工程
を含む。
【０１９３】
本発明は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む初代人工Ｔ細胞を提供する。
【０１９４】
本発明は、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む初代人工Ｔ細胞を提供する。
【０１９５】
主要組織適合複合体シグナル伝達経路と無関係に増殖し得る改変細胞であって、この方法によって得られやすい改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。前記改変細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を処置するために、本発明の特定の態様において使用され得る；したがって、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を処置する方法であって、不活性化ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む有効量の改変細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置することを含む方法は、本発明の範囲内である。
【０１９６】
より好ましい実施形態では、前記方法は、
（ａ）好ましくは細胞培養物由来のまたは血液サンプル由来のＴ細胞を提供すること；
（ｂ）ＤＮＡ切断によって、好ましくは二本鎖切断によって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子を選択的に不活性化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸で前記Ｔ細胞を形質転換すること；
（ｃ）前記低頻度切断エンドヌクレアーゼを前記Ｔ細胞に発現させること；
（ｄ）細胞表面上においてＴＣＲを発現しない形質転換Ｔ細胞を分類すること；
（ｅ）前記細胞を増大させること
を含む。
【０１９７】
別の実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼであり得る。好ましい実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。好ましい方法および関連ＴＡＬＥヌクレアーゼは、国際公開第２０１３１７６９１５号に記載されている。
【０１９８】
本発明は、誘導する宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応が初代非人工Ｔ細胞よりも５０％〜１００％少ない初代人工Ｔ細胞であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む初代人工Ｔ細胞を提供する。
【０１９９】
本発明は、誘導する宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応が初代非人工Ｔ細胞よりも５０％〜１００％少ない初代人工Ｔ細胞であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含む初代人工Ｔ細胞を提供する。
【０２００】
化学療法に対して耐性の抗ＣＤ１２３免疫細胞
本発明の好ましい実施形態によれば、抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを持つ免疫細胞は、化学療法薬（特に、プリンヌクレオチド類似体（ＰＮＡ））に対して耐性であるように操作され、養子免疫療法および化学療法を組み合わせるための癌処置に適切である。プリンヌクレオチド類似体は、多くの癌処置（特に、白血病）の化学療法組成物に含まれる。それは、ＡＭＬにおける標準治療として特に使用されている。最も広く使用されているＰＮＡは、単独または組み合わせのクロファラビン、フルダラビンおよびシタラビンである。ＰＮＡは、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）活性を有する酵素［ＥＣ２．７．１．７４］によって、一リン酸、二リン酸および三リン酸ＰＮＡに代謝される。それらの三リン酸形態、特にクロファラビン（ｃｌｏｒｏｆａｒａｂｉｎｅ）三リン酸は、ＤＮＡ合成でＡＴＰと競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）の強力な阻害剤である。
【０２０１】
したがって、本発明は、プリン類似体薬物に対して耐性であり、ＣＤ１２３陽性悪性細胞をターゲティングし得るエクスビボ免疫細胞（好ましくは、Ｔ細胞）を生産する方法を含む。前記方法は、以下の工程：
（ａ）患者（自己処置）またはドナー由来の免疫細胞を提供すること；
（ｂ）デオキシシチジンキナーゼ活性（ｄｃＫ−ＥＣ２．７．１．７４）を有する酵素を発現する遺伝子、特にヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１６３３）を特異的にターゲティングする低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列で、前記免疫細胞をトランスフェクトすること、
（ｃ）前記エンドヌクレアーゼを前記免疫細胞に発現させて、前記ｄｃｋ遺伝子の標的化不活性化を達成すること；
（ｄ）場合により前記プリン類似体薬物の存在下で、工程ｃ）で得られた人工免疫細胞を増大させること；および
（ｅ）前記抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを前記免疫細胞に導入すること
の１つまたは複数を含む。
【０２０２】
本発明者らは、特にＴＡＬ−ヌクレアーゼを使用することにより前記細胞へのｄｃＫ遺伝子発現の不活性化を媒介することによって、プリンヌクレオチド類似体、より具体的にはクロファラビンおよび／またはフルダラビンに対して耐性の抗ＣＤ１２３  Ｔ細胞の作製に成功した。好ましくは、国際公開第２０１３１７６９１５号に記載されているようにエレクトロポレーションを使用することによって、ｃｄｋ遺伝子に対する特異的ＴＡＬ−ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを使用してＴ細胞をトランスフェクトして、ＣＤ１２３を有する細胞に対するＴ細胞細胞傷害活性を維持しつつ、薬物に対する有意な耐性を誘導した。
【０２０３】
したがって、本出願は、白血病の処置のための抗ＣＤ１２３Ｔ細胞であって、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活性化されている抗ＣＤ１２３Ｔ細胞を提供する。
【０２０４】
本発明は、白血病、好ましくはＡＭＬの処置のための初代人工Ｔ細胞であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：６を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含み、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活性化されている初代人工Ｔ細胞を提供する。
【０２０５】
本発明は、白血病、好ましくはＡＭＬの処置のための初代人工Ｔ細胞であって、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２１、配列番号：３、配列番号：２２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：５および配列番号：７を含む少なくとも１つの抗ＣＤ１２３多重鎖（ＣＡＲ）を含み、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活性化されている初代人工Ｔ細胞を提供する。
【０２０６】
Ｔ細胞の活性化および増大
Ｔ細胞は、Ｔ細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；米国特許第６，５３４，０５５号；米国特許第６，９０５，６８０号；米国特許第６，６９２，９６４号；米国特許第５，８５８，３５８号；米国特許第６，８８７，４６６号；米国特許第６，９０５，６８１号；米国特許第７，１４４，５７５号；米国特許第７，０６７，３１８号；米国特許第７，１７２，８６９号；米国特許第７，２３２，５６６号；米国特許第７，１７５，８４３号；米国特許第５，８８３，２２３号；米国特許第６，９０５，８７４号；米国特許第６，７９７，５１４号；米国特許第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を一般に使用して、活性化させ増大させることができる。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。
【０２０７】
一般に、本発明のＴ細胞は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３  ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激してＴ細胞のための活性化シグナルを作出する薬剤との接触によって増大する。
【０２０８】
例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの分裂促進性レクチンなどの化学物質が、Ｔ細胞のための活性化シグナルを作出するために使用され得る。
【０２０９】
非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあり得るか、または表面に結合され得る。当業者であれば容易に理解し得るように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。本発明のさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞を薬剤コーティングビーズと結合させ、続いて、ビーズおよび細胞を分離し、次いで、細胞を培養する。代替的な実施形態では、培養前に、薬剤コーティングビーズおよび細胞を分離せず、一緒に培養する。Ｔ細胞培養のために適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、１Ｌ−４、１Ｌ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、−１０、−２、１Ｌ−１５、ＴＧＦｐおよびＴＮＦ−、または当業者に公知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  ５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞の増殖のための他の添加剤としては、限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｉ）などの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが追加されているか、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはＴ細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補充されているＲＰＭＩ  １６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養物にのみ含まれ、被験体へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件；例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。
【０２１０】
別の特定の実施形態では、前記細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させ得る。前記細胞はまた、前記細胞を被験体に投与した後、インビボで、例えば、被験体の血液中で増大させ得る。
【０２１１】
治療用途
別の実施形態では、以前に記載されているような異なる方法によって得られる単離された細胞または前記単離された細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。別の実施形態では、前記医薬は、ＣＤ１２３陽性細胞に関連する病変と診断された患者における癌または感染症を処置するために使用され得る。別の実施形態では、本発明の前記単離された細胞または前記単離された細胞由来の細胞株は、癌、特にＡＭＬの処置のための医薬の製造に使用され得る。
【０２１２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者を処置するための方法であって、以下の工程：
（ａ）以前に記載されている方法のいずれか１つによって入手可能な免疫細胞を提供すること；
（ｂ）前記形質転換免疫細胞を前記患者に投与すること
の少なくとも１つを含む方法に依拠する。
【０２１３】
一実施形態では、本発明の前記Ｔ細胞は、頑強なインビボＴ細胞増大を受けることができ、より長時間にわたり、存続することができる。
【０２１４】
前記処置は、寛解的、治癒的または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。自己は、患者を処置するために使用される細胞、細胞株または細胞の集団が、前記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性ドナーに起因することを意味する。同種は、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、前記患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。
【０２１５】
典型的にはドナーから得られたＴ細胞の非同種反応性細胞への形質転換を可能にする限り、本発明は、同種免疫療法に特に適切である。これは、標準的なプロトコールの下で行われ得、必要に応じて何回も再現され得る。得られた改変Ｔ細胞をプールし、１人または複数の患者に投与し得るので、「既製」治療製品として利用可能である。
【０２１６】
開示される方法と共に使用され得る細胞は、先のセクションに記載されている。前記処置は、癌、ウイルス感染、自己免疫障害または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と診断された患者を処置するために使用され得る。処置され得る癌としては、血管新生していないかまたはまだ実質的に血管新生していない腫瘍、および血管新生した腫瘍が挙げられる。癌は、非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫など）を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。本発明の多重鎖ＣＡＲで処置すべき癌の種類としては、限定されないが、癌腫、芽細胞腫、肉腫および特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性の腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫および黒色腫が挙げられる。成人の腫瘍／癌および小児の腫瘍／癌も挙げられる。
【０２１７】
前記処置は、寛解的、治癒的または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。自己は、患者を処置するために使用される細胞、細胞株または細胞の集団が、前記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性ドナーに起因することを意味する。同種は、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、前記患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。
【０２１８】
開示される方法で使用され得る細胞は、先のセクションに記載されている。前記予防的または治療的処置は、ＣＤ１２３発現細胞、特に過剰なＣＤ１２３発現細胞を特徴とする前悪性または悪性癌症状と診断された患者を処置するために使用され得る。このような症状は、血液学的癌、例えば白血病または悪性リンパ増殖性障害で見られる。
【０２１９】
それは、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群から選択される１つ以上の抗癌療法と組み合わせた処置であり得る。
【０２２０】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施すことができる。実際、本発明は、好ましくは、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化のため、少なくとも１つの免疫抑制剤に対して耐性にされた細胞または細胞の集団に依拠する。この態様では、免疫抑制処置は、患者における本発明のＴ細胞の選択および増大を支援するべきである。本発明の細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込みまたは移植を含む、任意の便利な様式で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者に投与され得る。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
【０２２１】
細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、体重１ｋｇ当たり１０４〜１０９個の細胞、好ましくは、体重１ｋｇ当たり１０５〜１０６個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、単回投与される。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量は、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。
【０２２２】
別の実施形態では、前記有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。前記投与は、静脈内投与であり得る。前記投与は、腫瘍内への注射によって直接行われ得る。
【０２２３】
本発明の特定の実施形態では、細胞は、限定されないが、抗ウイルス治療、シドホビルおよびインターロイキン２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても公知）などの薬剤による処置、またはＭＳ患者のためのナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｉｍａｂ）処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｔｉｍａｂ）処置、またはＰＭＬ患者のための他の処置を含む多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体またはＣＡＭ  ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、もしくは他の抗体治療などの他の免疫除去剤、シトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５，  １  １；  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎ．  ７３：３１６−３２１，  １９９１；  Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｔｒｒ．  Ｏｐｉｎ．ｍｍ  ｎ．  ５：７６３−７７３，  ９３）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（ＸＲＴ）、シクロホスファミドなどの化学療法剤、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用したＴ細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時にまたは後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去治療の後に投与される。例えば、一実施形態では、被験体は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。特定の実施形態では、移植の後、被験体は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態では、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。本明細書に記載される方法のいずれか１つによって得られる前記改変細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を処置するために、本発明の特定の態様において使用され得る；したがって、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を処置する方法であって、不活性化ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む有効量の改変（人工）細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置することを含む方法は、本発明の範囲内である。
【０２２４】
本出願では、患者または被験体は、非ヒト霊長類またはヒトを意味する。
ドナーは、健常個体または疾患を患っている個体を意味する。
【０２２５】
「再発性」という用語は、治療後に癌が寛解した被験体が再び癌細胞を有する状況を指す。
【０２２６】
「難治性または抵抗性」という用語は、被験体または哺乳動物が、集中処置後であっても体内に残存癌細胞を有する状況を指す。
【０２２７】
「薬剤耐性」という用語は、疾患が１つまたは複数の薬物の処置に応答しない状態を指す。薬剤耐性は、内因性（または一次耐性）（これは、疾患が１つまたは複数の薬物に決して応答しないことを意味する）であり得るか、またはそれは、獲得性（これは、疾患が、その疾患が以前に応答した１つまたは複数の薬物に応答しないことを意味する）（二次耐性）であり得る。特定の実施形態では、薬剤耐性は、内因性である。特定の実施形態では、薬剤耐性は、獲得性である。
【０２２８】
「血液悪性腫瘍」または「血液癌」という用語は、体の血液骨髄および／またはリンパ組織の癌を指す。血液悪性腫瘍の例としては、例えば、骨髄異形成、白血病、リンパ腫、例えば皮膚リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病（ホジキンリンパ腫とも称される）、および骨髄腫、例えば急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好中球性白血病（ＣＮＬ）、急性未分化白血病（ＡＵＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、成人Ｔ細胞ＡＬＬ、三血球系骨髄異形成を伴うＡＭＬ（ＡＭＬ／ＴＭＤＳ）、混合系統白血病（ＭＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）が挙げられる。
【０２２９】
「白血病」という用語は、限定されないが、慢性リンパ球性白血病または慢性リンパ性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄系白血病または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性骨髄芽球性白血病を含む血液形成組織の悪性新生物を指す。
【０２３０】
本発明の抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲ発現細胞を使用して処置され得るＡＭＬまたはＡＭＬサブタイプは、特に、ＣＤ１２３陽性悪性細胞（ＣＤ１２３−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍａｌｉｇｎａｔ  ｃｅｌｌｓ）の関与にかかわらず、急性骨髄芽球性白血病、最小分化急性骨髄芽球性白血病、未成熟急性骨髄芽球性白血病、顆粒球成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、前骨髄球性または急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄単球性白血病、骨髄好酸球増加症を伴う骨髄単球性、急性単芽球性白血病（Ｍ５ａ）または急性単球性白血病（Ｍ５ｂ）、急性赤白血病（赤白血病を含む）（Ｍ６ａ）および非常に珍しい純粋な赤白血病（Ｍ６ｂ）、急性巨核芽球性白血病、急性好塩基球性白血病、骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症であり得る。
【０２３１】
ＡＭＬサブタイプはまた、有毛細胞白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病を含む。
【０２３２】
本発明の抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲ発現細胞を使用して処置され得るＡＭＬまたはＡＭＬサブタイプは、特定の遺伝子異常を伴うＡＭＬであり得る。分類は、導入療法に対する応答、再発リスク、生存を予測する核型の能力に基づいている。
【０２３３】
したがって、本発明の抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲ発現細胞を使用して処置され得るＡＭＬは、第８染色体と第２１染色体との間の転座を伴うＡＭＬ、第１６染色体における転座または逆位を伴うＡＭＬ、第９染色体と第１１染色体との間の転座を伴うＡＭＬ、第１５染色体と第１７染色体との間の転座を伴うＡＰＬ（Ｍ３）、第６染色体と第９染色体との間の転座を伴うＡＭＬ、第３染色体における転座または逆位を伴うＡＭＬ、第１染色体と第２２染色体との間の転座を伴うＡＭＬ（巨核芽球性）であり得る。
【０２３４】
本発明は、これらの特定の細胞遺伝学的マーカーに関連するＡＭＬの処置のために特に有用である。
【０２３５】
本発明はまた、ＡＭＬの特定の細胞遺伝学的サブセットを有する患者（例えば、オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）１６−１９を使用して同定されたｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）を有する患者）の処置のための、および高用量のシタラビンの反復投与を使用して同定されたｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）またはｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）／ｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）を有する患者の処置のための抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲ発現細胞を提供する。
【０２３６】
好ましくは、本発明は、異常性（例えば、−５／ｄｅｌ（５ｑ），−７、３ｑの異常または複合核型）を有するＡＭＬ罹患患者であって、完全寛解率および生存率が低いことが示されている者の処置のための抗ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲ発現細胞を提供する。
【０２３７】
特定の実施形態では、「含む」は、「〜中に存在する」を意味する。
一般的方法
国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５８４８号の文献に開示されているすべての方法は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３８】
−初代Ｔ細胞培養
フィコール密度勾配媒質（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＥＦＳ（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって提供されるバフィーコートサンプルから、Ｔ細胞を精製した。ＰＢＭＣ層を回収し、市販のＴ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｔ細胞を精製した。２０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、５％ヒト血清（Ｓｅｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ活性化剤ＣＤ３／ＣＤ２８を補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中、１：１のビーズ：細胞比（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、精製Ｔ細胞を活性化した。活性化後に、細胞を成長させ、２０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）および５％ヒト血清（Ｓｅｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。
【０２３９】
−ＡＭＬおよびクロファラビン、フルダラビンまたはシタラビン耐性ＡＭＬのモデル
最初、ＭＯＬＭ１３細胞株は、初期骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、過剰な芽球を伴う不応性貧血、ＲＡＥＢ）後の１９９５年に再発した急性骨髄性白血病ＡＭＬ  ＦＡＢ  Ｍ５ａを有する２０歳の男性の末梢血から樹立された。ＭＯＬＭ１３−Ｌｕｃ細胞株およびｄｃｋノックアウトＭＯＬＭ１３−Ｌｕｃ細胞株（クロファラビン、フルダラビンまたはシタラビン耐性ＭＯＬＭ１３−Ｌｕｃ細胞株）を樹立するために、デオキシシチジンキナーゼ活性（ｄｃＫ−ＥＣ２．７．１．７４）を有する酵素を発現する遺伝子（すなわち、ヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１６３３））を特異的にターゲティングする低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列で、ならびにＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルス（ａｍｓｂｉｏ  ＬＶＰ４３８−ＰＢＳ）で、ＭＯＬＭ１３細胞（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ５５４）をトランスフェクトした。
【０２４０】
−ネオマイシン（ｒｅｆ  １０１３１−０２７，Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｉｎｔ−Ａｕｂｉｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、ＧＦＰ陽性細胞を選択した。ｃｄｋ  ＫＯ  ＭＯＬＭ１３−Ｌｕｃ細胞のクロファラビン、フルダラビンまたはシタラビン耐性を、クロファラビン、フルダラビンまたはシタラビンの存在下で試験した。
【０２４１】
−Ｔ細胞の形質導入およびＣＡＲの検出
組換えレンチウイルスベクターによるＴ細胞の形質導入を、Ｔ細胞の精製／活性化の３日後に行った。Ｖｅｃｔａｌｙｓ  ＳＡ（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって、ＨＥＫ−２９３細胞におけるゲノムおよびヘルパープラスミドのトランスフェクションによって、レンチウイルスベクターを生産した。形質導入当たり１０６個の細胞を使用して５の感染多重度で、形質導入を行った。ヒトＣＤ１２３タンパク質の細胞外ドメインとマウスＩｇＧ１  Ｆｃ断片（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ製）との融合物からなる組換えタンパク質を使用して、Ｔ細胞の表面におけるＣＡＲ検出を行った。該タンパク質のマウスＦｃ部分をターゲティングするＰＥ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＣＡＲ分子に対するこのタンパク質の結合を検出し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２４２】
−脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７ａの動員）
９６ウェルプレート（細胞４０，０００個／ウェル）において、Ｔ細胞を、等量のＣＤ１２３タンパク質発現または非発現細胞と共にインキュベートした。最終容量１００μｌのＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で、共培養物を５％ＣＯ２、３７℃で６時間維持した。細胞刺激の間、共培養の開始時に、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）および１×Ｍｏｎｅｎｓｉｎ溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に、蛍光抗ＣＤ１０７ａ抗体（ＡＰＣ結合、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製）を追加することによって、ＣＤ１０７ａ染色を行った。６時間のインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素（ｅＦｌｕｏｒ７８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）および蛍光色素結合抗ＣＤ８（ＰＥ結合、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２４３】
ＣＤ８＋細胞の中のＣＤ１０７ａ染色の平均蛍光シグナル強度（ＭＦＩ）を決定することによって、ＣＤ８＋／ＣＤ１０７ａ＋細胞の％として、脱顆粒活性を決定した。ｍｃＣＡＲまたはｓｃＣＡＲによるＴ細胞の形質導入の８〜１０日後に、脱顆粒アッセイを行った。
【０２４４】
−細胞傷害性アッセイ
９６ウェルプレート（細胞１００，０００個／ウェル）において、Ｔ細胞を、１０，０００個の（様々なレベルのＣＤ１２３を発現する）標的細胞および１０，０００個のコントロール（ＣＤ１２３ｎｅｇ）細胞と共に同じウェルにおいてインキュベートした。ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ｍｃＣＡＲ＋Ｔ細胞またはｓｃＣＡＲ＋Ｔ細胞）と共に共培養する前に、標的細胞およびコントロール細胞を蛍光細胞内色素（ＣＦＳＥまたはＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で標識した。共培養物を５％ＣＯ２、３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素（ｅＦｌｕｏｒ７８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団（標的細胞またはＣＤ１２３ｎｅｇコントロール細胞）の生存を決定し、特異的細胞溶解の％を計算した。ｍＲＮＡトランスフェクションの４８時間後に、細胞傷害性アッセイを行った。
【０２４５】
−抗腫瘍マウスモデル
−動物飼育および実験手順は、実験動物の管理および使用に関するフランスおよび欧州の規制およびＮＲＣガイドにしたがって、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ（Ｄｉｊｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／）が行った。
【０２４６】
−免疫欠損雌性ＮＯＧ（ＮＯＧ）マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＩ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）マウス（ＮＯＤは、非肥満糖尿病を表す）（６〜８週齢）は、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｒｙ，Ｄａｎｅｍａｒｋ）から入手した。
【０２４７】
−実験の一方の治療群では、クロファラビンまたはフルダラビンをマウスに投与した。
−それぞれＡＭＬおよびクロファラビン耐性ＡＭＬマウスモデルとして、ＭＯＬＭ１３−ルシフェラーゼ細胞またはクロファラビン耐性ＭＯＬＭ１３−ルシフェラーゼ細胞をマウスに静脈内（ｉｖ）注射した。
【０２４８】
次いで、（腫瘍細胞株の注射の７日後に）異なる用量のｍｃＣＡＲ＋Ｔ細胞もしくはｓｃＣＡＲ＋Ｔ細胞（１０４〜５×１０６）を、またはＣＡＲレンチウイルスベクターで形質導入しなかったＴ細胞をマウスに静脈内（ｉｖ）注射した。
【０２４９】
異なる動物における腫瘍進行を追跡するために、Ｔ細胞の注射の前日（Ｄ−１）に、ならびにＴ細胞の注射後７日目および１４日目に、生物発光シグナルを決定した。結果は、図４に示されているように、ｍｃＣＡＲ＋Ｔ細胞で処置したマウスにおける腫瘍進行の用量依存的な変化を示している。
【０２５０】
本出願で使用した抗ＣＤ１２３  ｓｃＣＡＲの配列は、以下の通りであった：
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLALIRSKADGYTTEYSASVKGRFTLSRDDSQSILYLQMNALRPEDSATYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSMADYKDIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQNVDSAVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGRGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSTPWTFGGGTKLEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号：２５）
臨床エッセイ
条件の例：
新たにＡＭＬと診断されたと患者。
【０２５１】
再発性もしくは難治性ＡＭＬ患者、または集中処置対象外のＡＭＬ患者。
ＣＤ１２３特異的多重鎖ＣＡＲの実施例
Ａ．多重鎖ＣＡＲの設計（図２、図３、図４）
ＣＤ１２３抗原をターゲティングする多重鎖ＣＡＲを、ＩｇＥに対する高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）に基づいて設計した。肥満細胞および好塩基球上において発現されるＦｃεＲＩ（図１）は、アレルギー反応をトリガーする。それは、単一のαサブユニット、単一のβサブユニットおよび２つのジスルフィド結合γサブユニットから構成される四量体複合体である。αサブユニットは、ＩｇＥ結合ドメインを含有する。βおよびγサブユニットは、シグナル伝達を媒介するＩＴＡＭを含有する。あらゆる多重鎖ＣＡＲにおいて、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインを削除し、それぞれ表５においてμと称される各ｓｃＦｖで置換し、ＦｃＲβ鎖および／またはＦｃＲγ鎖のＣＤ８αヒンジ（配列番号：２）およびＩＴＡＭを削除した。得られた構造は、表６に詳述されている構造を有していた。
【０２５２】
Ｂ．Ｔ細胞における一過性発現（図５、図６）
ポリシストロン性ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後に、ヒトＴ細胞において、多重鎖ＣＡＲを発現させ得る。
【０２５３】
ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥキットおよび線状化プラスミド（テンプレートとして）を使用して生産したキャップ化およびポリアデニル化ポリシストロン性ｍＲＮＡをＴ細胞にエレクトロポレーションした。テンプレートとして使用したプラスミドは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、続いて、異なるＣＡＲ変異体をコードするポリシストロン性ＤＮＡ配列を含有していた。
【０２５４】
以下のプロトコールにしたがって、ＣｙｔｏＬＶＴ−Ｓデバイス（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）を使用して、ヒトＴ細胞へのポリシストロン性ｍＲＮＡのエレクトロポレーションを行った：抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズで数日間（３〜５）予備活性化した５×１０６個のＴ細胞およびＩＬ２をＣｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ緩衝液Ｔに再懸濁し、０．４ｃｍキュベットにおいて、ＰＢＭＣ３  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔａｂｌｅ１４を使用して、４５μｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。
【０２５５】
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、固定可能な生存色素ｅＦｌｕｏｒ−７８０およびＰＥ結合特異的ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２５６】
ポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作した生Ｔ細胞は、それらの表面において多重鎖ＣＡＲを発現した。
【０２５７】
図５および図６の結果は、ＭＯＩ  ５で形質導入した８日後に評価した各ｍｃＣＡＲの発現レベルを示す。ヒトＣＤ１２３タンパク質の細胞外ドメインがマウスＩｇＧ１由来のＦｃ断片と融合したものを含有する組換えタンパク質を使用して、ＣＡＲ検出を行った。ＰＥ結合抗Ｆｃ抗体を用いてＣＡＲ／ＣＤ１２３−Ｆｃ複合体を検出し、フローサイトメトリーによって分析した。ＮＴＤは、非形質導入細胞を表す。コントロールと比較して、図５は、８９．９％のｍｃ１２３−ＣＤ２８発現細胞を示し、図６は、８７．９％のｍｃ１２３−４１ＢＢ発現細胞を示す。
【０２５８】
Ｃ．多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞は、標的細胞との共培養後に脱顆粒する（図７）。
【０２５９】
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするかまたは一本鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５８４８号に記載されているように調製した。次いで、細胞を、標的（ダウディ）、（異なるレベルのＣＤ１２３を発現する）ＫＧ１、ＭＯＬＭ１３もしくはＲＰＭＩ８２２６（ＫＧ１ａ＜ＭＯＬＭ１３＜ＲＰＭＩ８２２６）またはコントロール（Ｋ５６２）細胞と共に６時間共培養した。
【０２６０】
次いで、フローサイトメトリーによってＣＤ８＋Ｔ細胞を分析して、それらの表面における脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現を検出した。データは、ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを発現するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞が、コントロール細胞との共培養ではなくＣＤ１２３発現標的細胞との共培養後に、脱顆粒することを示している。
【０２６１】
共培養と同じ条件において単独で培養したＴ細胞、および陽性コントロール（ＰＭＡ／イオノマイシンで活性化した細胞）の脱顆粒活性も図７に示されている。フローサイトメトリーによって、（ＣＤ８＋細胞の中の）ＣＤ１０７ａ＋細胞の％を測定することによって、脱顆粒活性を決定した。少なくとも３つの別個のドナーにおいて、実験を行った。
【０２６２】
Ｄ．標的細胞との共培養後の、多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞におけるサイトカインの分泌
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、標的（ダウディ）またはコントロール（Ｋ５６２）細胞と共に２４時間共培養した。次いで、上清を回収し、ＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキットを使用して分析して、Ｔ細胞によって産生されたサイトカインを定量した。アッセイにより、多重鎖ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞は、コントロール細胞との共培養ではなくＣＤ１２３発現標的細胞との共培養後に、ＩＦＮγ、ＩＬ８およびＩＬ５を産生することが示された。
【０２６３】
興味深いことに、同じ用量で使用した場合、抗ＣＤ１２３  ｍｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗ＣＤ１２３  ｓｃＣＡＲ−Ｔ細胞よりも低レベルのサイトカイン放出を誘導し、より少ない二次効果が観察され、Ｔ細胞はより耐性が高く、したがってより低毒性であると考えられる。
【０２６４】
Ｅ．多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞は、標的細胞を溶解する（図８）
エレクトロポレーションの２４時間後に、多重鎖ＣＡＲをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡを使用して操作したヒトＴ細胞を、標的（ダウディ）またはコントロール（Ｋ５６２）細胞と共に４時間共培養した。次いで、フローサイトメトリーによって標的細胞を分析して、それらの生存を分析したところ、ＣＤ１２３多重鎖ＣＡＲを発現する異なる細胞が、コントロール細胞ではなくＣＤ１２３発現標的細胞を溶解することが示された。
【０２６５】
図８の結果は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異的細胞溶解活性を示す。Ｔ細胞を、ダウディ＋ＫＧ１ａ、ダウディ＋ＭＯＬＭ１３またはダウディ＋ＲＰＭＩ−８２２６細胞と共に４時間共培養した。共培養の終了時に各細胞株の細胞生存率を決定し、各条件について、特異的細胞溶解率を計算した。
【０２６６】
図８の結果は、ＣＤ１２３をターゲティングする両ｍｃＣＡＲが、ＣＤ１２３＋標的細胞に対して同程度の細胞溶解活性を有することを示している。
【０２６７】
Ｆ−多重鎖ＣＡＲを一過性発現するヒトＴ細胞は、抗腫瘍活性を有する
また、２つのＣＡＲを使用して、腫瘍樹立マウスモデルにおける抗腫瘍インビボ実験を行った。非形質導入ヒトＴ細胞の静脈内（ｉｖ）注射の７日前に（ｃｄｋ  ｗｔまたはｃｄｋ  ＫＯ）ＭＯＬＭ１３−ルシフェラーゼ細胞を、または異なる用量の抗ＣＤ１２３  ｍｃＣＡＲ＋Ｔ細胞（１０４〜５×１０６個）（ＴＣＲ  ＫＯ薬剤耐性人工細胞）を免疫欠損マウスに静脈内（ｉｖ）注射した。結果は、マウスにおける抗ＣＤ１２３  ｍｃＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量依存的な抗腫瘍活性を示している。
【０２６８】
Ｇ−ＧＶＨＤに関する臨床データ
得られたデータは、ＴＣＲ  ＫＯ  ＣＤ１２３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性が、ＴＣＲ  ＫＯ  ＣＤ１２３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のものと類似することを示している。これらの細胞で処置した個体では、細胞と比較して、ＫＯ  ＣＤ１２３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の寛容性の劇的な改善（ＴＣＲ発現細胞と比較してＧＶＨＤが約５０％〜８０％減少）が測定されている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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