(57)【要約】  ｍＲＮＡプロファイリングによる体液の同定は、法医学サンプルから状況的「活性レベル」情報の抽出を可能にし得る。従って、法医学的な体液／組織同定のための基本形の複合デジタル遺伝子発現法は、色分けされたプローブ（例えば、NanoString（登録商標））の溶液ハイブリダイゼーションに基づいて提供される。例えば、単一の体液からのサンプルにおける遺伝子発現に関するモデルが提供され、そして、体液の混合物へと拡張される。サンプル中の体液量の最尤推定値の算出が実施され、そしてサンプル中の各体液の存在について試験するための尤度比の使用が説明される。方法／アルゴリズムが、説明されるが、組織および細胞の検出のための在来型アルゴリズムと異なり、複数のサンプルを通じて偽陽性体液の同定をゼロにすることを可能にできる。斯かるプロトコールは、以前は信頼できなかったケースワーク（例えば、法医学的）検査室におけるｍＲＮＡプロファイリングの日常的な使用を容易にし得る。
2017530693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
法医学的な生物学的サンプルを同定するための方法であって：
分析のための少なくとも１つの生物学的サンプルを得；
生物学的サンプルから全ＲＮＡを抽出し；
少なくとも１つのアッセイにおいて少なくとも１つのプローブと全ＲＮＡとをハイブリダイズさせ；そして
複数のコードセットを使用した少なくとも１つのアッセイを分析すること、
を含み、ここで、分析が、
サンプル中で定量化する１セットの遺伝子を決定し；
該遺伝子セットの各遺伝子について遺伝子発現対数関数を作成することによって該遺伝子セット中の各遺伝子の遺伝子発現をモデル化し；そして
該遺伝子セットの各遺伝子のモデル化された遺伝子発現に基づいて生物学的サンプル中の生物学的物質の量の最尤推定値を作成することを含む、方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルが、組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質が、皮膚、静脈血、膣分泌物、唾液、月経血、精液、およびバイオ粒子のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的サンプルが、少なくとも２つの生物学的物質を含み得る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記全ＲＮＡが、精製を伴った直接溶解および精製を伴わない直接溶解のうちの少なくとも一方を使用して生物学的サンプルから抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生物学的サンプルからの全ＲＮＡの抽出が、約５分間、７５℃にて生物学的サンプルを溶解することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのプローブが、レポータープローブおよび捕捉プローブのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のコードセットが、遺伝子セットを標的とするプローブ対を指定する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数のコードセットが：
静脈血の遺伝子ＡＬＡＳ２、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＡＭ１ＣＡ１、ＡＮＫ１、ＡＱＰ９、ＡＲＨＧＡＰ２６、Ｃ１ＱＲ１、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＳＰ２、ＣＤ３Ｇ、ＧＹＰＡ、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＨＭＢＳ（ＰＢＧＤ）、ＭＮＤＡ、ＮＣＦＳ２、およびＳＰＴＢ；
月経血の遺伝子ＬＥＦＴＹ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１０、およびＭＭＰ１１；
唾液の遺伝子ＨＴＮ３、ＭＵＣ７、Ｓ．ミュータンス １６Ｓ、Ｓ．ミュータンス ｐｒｏＣ、Ｓ．ミュータンス ｒｅｌＡ、Ｓ．ミュータンス ｒｐｌＡ、Ｓ．ミュータンス ｒｐｏＢ、Ｓ．ミュータンス ｒｐｏＳ、Ｓ．サリバリウス １６Ｓ、Ｓ．サリバリウス ｐｒｏＣ、Ｓ．サリバリウス ｒｅｌＡ、Ｓ．サリバリウス ｒｐｌＡ、Ｓ．サリバリウス ｒｐｏＢ、Ｓ．サリバリウス ｒｐｏＳ、ＳＭＲ３Ｂ、およびＳＴＡＴＨ；
精液の遺伝子ＩＺＵＭＯ１、ＭＳＰ、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＰＲＭ１、ＰＲＭ２、ＳＥＭＧ１、ＳＥＭＧ２、およびＴＧＭ４；
皮膚の遺伝子ＣＣＬ２７、ＩＬ１Ｆ７、ＫＲＴ９、ＬＣＥ１Ｃ、およびＬＣＥ２Ｄ；
膣分泌物の遺伝子ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ｂ７Ｐ１、ＤＫＫ４、ＦＵＴ６、ＩＬ１９、ＭＹＯＺ１、およびＮＯＸＯ１；ならびに
参照遺伝子Ｂ２Ｍ、ＣＯＸ１、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１、ＰＰＩＨ、Ｓ１５、ＴＣＥＡ１、ＴＦＲＣ、ＵＢＣ、およびＵＢＥ２Ｄ２、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のコードセットが、陽性対照プローブおよび陰性対照プローブのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記陰性対照プローブが、分析におけるバックグラウンドノイズを評価するために使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子発現対数関数が、以下の関数：
【化１】
2017530693.tif 000029
｛式中、ｙｉは、生物学的サンプルの遺伝子発現プロフィールであり、Ｎは、遺伝子セットの量であり、Ｘは、複数の生物学的物質中の複数の遺伝子の予想される割合を表す行列であり、βｉは、生物学的物質ｉ中のすべての生物学的物質の量を表すベクトルであり、σ２は、複数の遺伝子における全遺伝子の対数スケールの一般分散であり、およびＩは、単位行列である｝を使用してモデル化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記最尤推定値が、以下の関数：
【化２】
2017530693.tif 000030
を使用して作成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの生物学的サンプル中の物質の存在を推定する方法であって：
生物学的サンプル内で検出するための１セットの生物学的物質を決定し；
該生物学的物質セット中の各生物学的物質について、生物学的物質の１セットの独特な遺伝子中の各遺伝子の発現をモデル化し；
生物学的物質の独特な遺伝子セット中の各遺伝子のモデル化された発現を使用して予想される遺伝子割合モデルを作成し；
生物学的サンプル内の生物学的物質セットの大量の各生物学的物質を含む物質モデルを作成し；
予想される遺伝子割合モデルと物質モデルとを使用することによって予想される遺伝子発現モデルを作成し；
予想される遺伝子発現モデルを使用して生物学的サンプル中で発現される遺伝子を推定し；
生物学的サンプルにおける推定遺伝子発現を使用して生物学的物質セットにおける各生物学的物質の最尤推定値（ＭＬＥ）に基づく推定サンプルプロフィールを作成し；
生物学的物質セットにおける各生物学的物質について尤度比を算出し、そして、該尤度比が、該生物学的物質が生物学的サンプル中に含まれている可能性がどの程度か示し；そして、
算出された尤度比に基づいて生物学的物質セットにおける各生物学的物質が生物学的サンプル中に存在するか否か判定することを含む。
【請求項１５】
前記生物学的サンプルが、組織サンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的物質セット中の各生物学的物質が、皮膚、静脈血、膣分泌物、唾液、月経血、精液、およびバイオ粒子のうちの少なくとも１つである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的物質セット中の各生物学的物質の独特な遺伝子セットにおける各遺伝子のモデル化された発現が、生物学的物質セット中の各生物学的物質に関する遺伝子発現ベクトルとして表され、ここで、該遺伝子発現ベクトルが：
【化３】
2017530693.tif 000031
｛式中、ｙｉｊは、生物学的物質ｉ中の独特な遺伝子セット中の遺伝子ｊの発現に価する｝と表される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記予想される遺伝子割合モデルが、生物学的物質セット中の各生物学的物質に関する各遺伝子発現ベクトルを含む予想される遺伝子割合の行列である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記物質モデルが物質ベクトルであり、かつここで、予想される遺伝子発現モデルを、予想される遺伝子割合モデルに物質ベクトルを乗じることによって作成している、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子発現モデルが、関数：
【化４】
2017530693.tif 000032
｛式中、ｙｉは、生物学的サンプルｉ中の生物学的物質セット中の各生物学的物質に関する独特な遺伝子セットの各遺伝子のモデル化された発現であり、Ｎは、独特な遺伝子セットの遺伝子量であり、Ｘは、予想される遺伝子割合モデルであり、βｉは、生物学的サンプルｉの生物学的物質の割合のモデルであり、Ｉは単位行列であり、およびσ２は、生物学的サンプルセット中の各生物学的サンプルに関する独特な遺伝子セットの各遺伝子の平均分散である｝によって表される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的物質セット中の各生物学的物質のＭＬＥが、
各生物学的サンプルに関する独特な遺伝子セットの各遺伝子に関する観察された遺伝子発現と、予想される遺伝子発現モデルから得られた各生物学的サンプルに関する独特な遺伝子セットの各遺伝子に関する予想される遺伝子発現の差の合計である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的物質セット中の各生物学的物質のＭＬＥが、関数：
【化５】
2017530693.tif 000033
｛式中、生物学的物質セット中に負の量の各生物学的物質が存在しないとき、
【化６】
2017530693.tif 000034
は、各生物学的サンプルに関する独特な遺伝子セットの各遺伝子について観察された遺伝子発現ｙｉと、各生物学的サンプルに関する独特な遺伝子セットの各遺伝子について予想される遺伝子発現Ｘβとの間で２乗誤差の合計を最小化する｝によって算出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記尤度比が、関数：
【化７】
2017530693.tif 000035
を使用して、生物学的サンプル中の生物学的物質の存在の尤度と、生物学的サンプル中の生物学的物質の不存在の尤度との比を算出することによって表され、
ここで、生物学的サンプル中の生物学的物質の存在の尤度が、関数内のＭＬＥを使用して算出され；
ここで、生物学的サンプル中の生物学的物質の不存在の尤度が、関数内の制約されたＭＬＥを使用して算出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記制約されたＭＬＥが、生物学的サンプル中の生物学的物質の量をゼロに設定したときに算出されたＭＬＥである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法を実施するために構成されたシステム。
【請求項２６】
前記システムが、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法の１若しくは複数のステップを実施するためのコンピュータープロセッサを含む、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記生物学的物質セット中の各生物学的物質のＭＬＥが、関数：
【化８】
2017530693.tif 000036
｛式中、Ｓは、生物学的サンプル中の生物学的物質セットに関する１セットのＭＬＥ値であり、式中、ペナルティー（β）は、βの要素に対する更なるペナルティーを表し、および式中、関数は、βの要素が負にならないように制約される｝によって算出される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月８日に出願された米国仮出願番号第６２／０３５，０１９号の利益を主張する。前述の特許出願の内容は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
生物学的サンプルは、異なるタイプの物質（例えば、腫瘍細胞と正常細胞、複数の微生物の混合物、異なる生体液の混合物、免疫細胞の混合物、および／または同類のものなどの異なるタイプの細胞）の混合物を含んでいることが多い。一般的に、デコンボリューションは、物質内の既知の遺伝子発現パターンに基づいて所定のサンプル中の物質の割合を推定するために、および／または所定のサンプル中に既知の物質比で与えられた各タイプの物質内の平均遺伝子発現プロフィールを推定するために使用される。
【０００３】
従来のデコンボリューション方法は、サンプル混合物データの加法モデル：Ｅ（Ｙ）＝ＸＢ、を仮定することが多く、ここで、Ｙはｎ個のサンプルとｐ個の遺伝子における遺伝子発現のｎ＊ｐ行列であり、ＸはＫ細胞型におけるｐ個の遺伝子の典型的な遺伝子発現のｐ＊Ｋ行列であり、およびＢは各サンプル中の各細胞型の量のｎ＊Ｋ行列である。加法モデルでは通例、サンプル中の遺伝子転写物の量が各サンプルの細胞亜集団中の転写産物の量であると仮定する。さらに、加法モデルを使用することによって、事前の実験が細胞型の典型的な遺伝子発現プロフィールＸに関する推定を可能にするのであれば、ＸとＹから細胞型の量Ｂの行列を推定することが可能である。あるいは、（例えば、発現プロファイリングの前にセルソーターを通してサンプルを流すことによって）Ｂが既知であれば、各細胞型の平均発現プロフィールが推定され得る。
あるサンプルタイプに独特であると予想される遺伝子の同一性や同定可能性を確実にするためのパラメーターに対する制約条件のような事前情報の導入によって、一部の科学者はＢとＸを同時に推定するために伝統的にこのモデルを使用した。
【０００４】
しかしながら、加法モデルは多くの方法で問題が多い。例えば、遺伝子発現データは、（既に対数スケールで存在しているｑＰＣＲデータを除いて）分析前には対数変化していることが多く、そして一般的に、示差的発現は加法的増加ではなく、倍数変化で計測される。データを変換することによって、および／またはそれを加法モデルに組み込むための様式でそれを利用することによって、精度が失われる可能性があり、そして不正確な結果（例えば、サンプル中の物質の偽陽性および／または偽陰性、あるいは混合割合および／または細胞型遺伝子発現プロフィールの非効率な推定）をもたらす。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書中に開示した方法は、より正確な遺伝子発現を算出するために加法モデルと対数ベースの算出の両方を使用したデコンボリューション方法を説明する。この利便は、これだけに限定されるものではないが、法医学分析で遭遇する体液混合物および／または類似したサンプル混合物を含めたサンプル混合物について分析するとき、著しく有益なものであると予想される。特に、対数または乗法スケールと加法モデルを使用した統計的方法を本明細書中に記載し、そしてそれは、サンプル中の種々の標的遺伝子の遺伝子発現に基づいてサンプル中の所定の体液の量を算出できる。
【０００６】
いくつかの実施形態において、法医学的な生物学的サンプルを同定するための方法は、分析のための少なくとも１つの生物学的サンプルを得、生物学的サンプルから全ＲＮＡを抽出し、少なくとも１つのアッセイにおいて少なくとも１つのプローブと全ＲＮＡとをハイブリダイズさせ、そして複数のコードセットを使用した少なくとも１つのアッセイを分析することを含み得る。分析の実施の一部において、アッセイは、サンプル中で定量化するための１セットの遺伝子を決定し、該遺伝子セットの各遺伝子について遺伝子発現対数関数を作成することによって該遺伝子セット中の各遺伝子の遺伝子発現をモデル化し、そして該遺伝子セットの各遺伝子のモデル化された遺伝子発現に基づいて生物学的サンプル中の生物学的物質の量の最尤推定値を作成することを含み得る。
【０００７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの生物学的サンプル中の物質の存在を推定する方法は、生物学的サンプル内で検出するための１セットの生物学的物質を決定し、該生物学的物質セット中の各生物学的物質について生物学的物質の１セットの独特な遺伝子中の各遺伝子の発現をモデル化し、そして生物学的物質の独特な遺伝子セット中の各遺伝子のモデル化された発現を使用して予想される遺伝子割合モデルを作成することを含み得る。いくつかの実施形態において、該方法は、生物学的サンプル内の生物学的物質セットの大量の各生物学的物質を含む物質モデルを作成し、予想される遺伝子割合モデルと物質モデルとを使用することによって予想される遺伝子発現モデルを作成し、そして予想される遺伝子発現モデルを使用して生物学的サンプル中で発現される遺伝子を推定することをさらに含んでもよい。さらに、該方法は、生物学的サンプルにおける推定遺伝子発現を使用して生物学的物質セットにおける各生物学的物質の最尤推定値に基づく推定サンプルプロフィールを作成し、生物学的物質セットにおける各生物学的物質について尤度比(likelihood ratio)を算出し、ここで、該尤度比とは、該生物学的物質が生物学的サンプル中に含まれている可能性がどの程度か示しており、そして算出された尤度比に基づいて生物学的物質セットにおける各生物学的物質が生物学的サンプル中に存在するか否か判定することを含み得る。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した装置、方法、およびシステムは、５分間直接細胞溶解プロトコール（five minute direct lysis protocol）した特異的ｍＲＮＡ標的へのバーコードプローブの多重溶液ハイブリダイゼーションによって、一般的な法医学的に関連している体液および／またはさまざまなサンプル中に存在する可能性があるさまざまな物質を同定できる。最小限の実地の要件を有するこの簡易型プロトコールは、ケースワーク検査室におけるｍＲＮＡプロファイリングの日常的な使用を容易にし得る。大抵の遺伝子発現に基づく選別装置とは対照的に、アルゴリズムは、正しくサンプルを呼び出す能力を最適化するように機械学習アルゴリズムをトレーニングすることを伴ってはならない；むしろ、それは、体液サンプルにおける遺伝子発現の生物学的に合理的なモデルを規定してもよく、そして、特定の体液の存在を証明するサンプルの根拠力を評価するモデルを使用する。このアルゴリズムは、各体液タイプの検出のための対数尤度の算出を可能にし、法廷の場においてアルゴリズムの結果をより弁護可能にし得る。
【０００９】
本開示のいくつかの実施形態によるアプローチの更なる恩恵は、それが、トレーニングに使用されるものを含めたすべてのサンプルに対してアルゴリズムの評価を可能にする点である：アルゴリズムが体液混合物における遺伝子発現の従来のモデルに基づく場合、そのパラメーターがモデル性能に関係ないと推定され得るので、該アルゴリズムは、トレーニングデータの過剰適合を最小限にし得る。
【００１０】
いくつかの実施において、本明細書中に記載した装置、方法、およびシステムは、遺伝子発現データ、タンパク質データ、代謝産物データ、およびｍｉＲＮＡ発現データ、および／または対数スケールの変動性に伴うその他のデータにも適用され得る。いくつかの実施形態において、ここで記載した方法のアウトプットは、分類、クラスタリング、および／または他の機械学習の問題に使用できる。いくつかの実施形態において、ここで記載した方法は、サンプルまたはクラス間の示差的な遺伝子発現について試験するために使用できる。いくつかの実施形態において、ここで記載した方法は、サンプルタイプにおける遺伝子の発現について試験するために使用できる。
【００１１】
好ましい実施形態において、NanoString Technologies（登録商標）のnCounter（登録商標）システムおよび方法が使用されている。特定のｍＲＮＡ標的を結合および同定するためのプローブおよび方法は、例えばＵＳ２００３／００１３０９１、ＵＳ２００７／０１６６７０８、ＵＳ２０１０／００１５６０７、ＵＳ２０１０／０２６１０２６、ＵＳ２０１０／０２６２３７４、ＵＳ２０１０／０１１２７１０、ＵＳ２０１０／００４７９２４、およびＵＳ２０１４／０３７１０８８に記載されており、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
【００１２】
本明細書中に記載したいずれの態様または実施形態も、本明細書中に開示されるいずれの他の態様または実施形態とも組み合わせることができる。開示はその詳細な説明と関連づけて記載された一方で、上記の説明は例示することを意図したものであって、添付の請求項の範囲によって規定される開示の範囲を制限することを意図していない。他の態様、利点、および修飾も以下の請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
特許または出願ファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも１枚の図面を含んでいる。カラー図面を伴った本願の特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の請求と支払いにより特許庁によって提供される。
【００１４】
【図１】図１は、いくつかの例示的な実施形態における各組織についてのアルゴリズムの真陽性率（ＴＰＲ）と偽陽性率（ＦＰＲ）を示す代表的なＲＯＣカーブを示す。
【００１５】
【図２】図２は、いくつかの例示的な実施形態における５つの混合物サンプルでのアルゴリズムの代表的な性能結果を示す。
【００１６】
【図３】図３は、いくつかの例示的な実施形態におけるサンプル組成の算出を例示する論理フローチャートを示す。
【００１７】
【図４】図４は、本明細書中に開示した直接溶解プロトコールに従って調製したサンプルの代表的な性能結果と、本明細書中に開示した精製プロトコールに従って調製したサンプルの代表的な性能結果との比較を示す。
【００１８】
【図５】図５は、いくつかの例示的な実施形態における９１個の単一起源サンプルのアルゴリズムの代表的な性能結果を示す。
【００１９】
【図６】図６は、いくつかの例示的な実施形態における２３個の単一起源の、適当なＲＮＡサンプルのアルゴリズムの代表的な性能結果を示す。
【００２０】
【図７Ａ−Ｆ】図７Ａ〜Ｆは、同じ体液タイプの異なるサンプルの遺伝子発現プロフィールを示す一連のプロットを示す。図７Ａは、血液（ＢＤ）の遺伝子発現プロフィールの一貫性を示す。図７Ｂは、精液（ＳＥ）の遺伝子発現プロフィールの一貫性を示す。図７Ｃは、唾液（ＳＡ）の遺伝子発現プロフィールの一貫性を示す。図７Ｄは、膣分泌物（ＶＳ）の遺伝子発現プロフィールの一貫性を示す。図７Ｅは、月経血（ＭＢ）の遺伝子発現プロフィールの一貫性を示す。図７Ｆは、皮膚（ＳＫ）の遺伝子発現プロフィールの一貫性を示す。各点は１つの遺伝子であり；遺伝子はそれらの固有の体液タイプによって着色される。名目上の血液の遺伝子は赤色であり、精液の遺伝子は青色であり、唾液の遺伝子は緑色であり、膣分泌物の遺伝子は黄色であり、月経血の遺伝子はピンク色であり、皮膚の遺伝子は紫色であり、およびすべての細胞型に現れるハウスキーピング遺伝子は黒色である。血液（ＢＤ）。
【００２１】
【図８】図８は、互いの体液に対する各体液の平均遺伝子発現プロフィールをプロットする。遺伝子は、図７Ａ〜７Ｆと同様に着色される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
【００２３】
いくつかの実施形態において、統計解析は、サンプルの組成およびサンプル内の遺伝子発現を判定するために、少なくとも１つの同定可能な物質を含むサンプルに対して実施されてもよい。いくつかの実施形態において、模範的な事例は、複数の物質（例えば、皮膚、静脈血、膣分泌物、唾液、月経血、精液、およびバイオ粒子）を含む法医学サンプル、および／または複数の物質（例えば、生物学的物質）を含むあらゆるサンプル（例えば、生物学的サンプル）を含んでもよく、そしてそれは、例えば、各物質中に存在することが知られている標的遺伝子の遺伝子発現を使用して、同定されるおよび／または定量化される必要があり得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、図３に関して、当業者は、サンプル３０２（例えば、複数の物質を含む生物学的サンプル）を入手することができ、そして、全ＲＮＡ量は、精製を伴った直接溶解と精製を伴わない直接溶解の少なくとも１つを使用してサンプル３０４から抽出され得る。いくつかの実施において、直接溶解は、指定された期間、例えば約５分間、７５℃にてサンプルを溶解することを含んでもよい。ＲＮＡは、ユーザーによって指定されたプローブ（例えば、レポータープローブおよび捕捉プローブ）、あるいはサンプルおよび／またはサンプル内に存在すると推測される物質に特異的に設計されたコンピューターで作成した複数のコードセットとハイブリダイズされ得る３０６。例えば、上記の法医学的な物質のいずれかを伴った法医学的な組織サンプルに関して、複数のコードセットは、例えば静脈血の遺伝子ＡＬＡＳ２、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＡＭ１ＣＡ１、ＡＮＫ１、ＡＱＰ９、ＡＲＨＧＡＰ２６、Ｃ１ＱＲ１、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＳＰ２、ＣＤ３Ｇ、ＧＹＰＡ、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＨＭＢＳ（ＰＢＧＤ）、ＭＮＤＡ、ＮＣＦＳ２、およびＳＰＴＢ、月経血の遺伝子ＬＥＦＴＹ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１０、およびＭＭＰ１１、唾液の遺伝子ＨＴＮ３、ＭＵＣ７、Ｓ．ミュータンス（S. mutans）１６Ｓ、Ｓ．ミュータンス ｐｒｏＣ、Ｓ．ミュータンス ｒｅｌＡ、Ｓ．ミュータンス ｒｐｌＡ、Ｓ．ミュータンス ｒｐｏＢ、Ｓ．ミュータンス ｒｐｏＳ、Ｓ．サリバリウス（S. salivarius）１６Ｓ、Ｓ．サリバリウス ｐｒｏＣ、Ｓ．サリバリウス ｒｅｌＡ、Ｓ．サリバリウス ｒｐｌＡ、Ｓ．サリバリウス ｒｐｏＢ、Ｓ．サリバリウス ｒｐｏＳ、ＳＭＲ３Ｂ、およびＳＴＡＴＨ、精液の遺伝子ＩＺＵＭＯ１、ＭＳＰ、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＰＲＭ１、ＰＲＭ２、ＳＥＭＧ１、ＳＥＭＧ２、およびＴＧＭ４、皮膚の遺伝子ＣＣＬ２７、ＩＬ１Ｆ７、ＫＲＴ９、ＬＣＥ１Ｃ、およびＬＣＥ２Ｄ、膣分泌物の遺伝子ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ｂ７Ｐ１、ＤＫＫ４、ＦＵＴ６、ＩＬ１９、ＭＹＯＺ１、およびＮＯＸＯ１、ならびに参照遺伝子Ｂ２Ｍ、ＣＯＸ１、ＨＰＲＴ１、ＰＧＫ１、ＰＰＩＨ、Ｓ１５、ＴＣＥＡ１、ＴＦＲＣ、ＵＢＣ、およびＵＢＥ２Ｄ２など、各物質について複数の独特な遺伝子が指定されてもよい３０８。また、複数のコードセットには、前記の代表的な遺伝子を追跡するために複数のプローブおよび／または類似物質を指定してもよい。同様の複数のコードセットは、様々なタイプのサンプルに関して、任意数の物質の任意数の遺伝子について作成され得る。
いくつかの実施において、複数のコードセットは、例えば、遺伝子を検出するため（例えば、陽性対照プローブ）、およびサンプルの分析におけるバックグラウンドノイズを計測するため（例えば、陰性対照プローブ）の両方のために、陽性対照プローブおよび陰性対照プローブのうちの少なくとも１つを含み得る。
統計的方法
【００２５】
ケースワークサンプルの３つの代表的な特性は次のものを含む：それらは、（ｉ）２個以上の体液の混合物を含み、（ｉｉ）サイズが制限され、および（ｉｉｉ）部分的にまたは高度に分解される可能性があることが多い。これにより、ケースワークサンプルに対処するための１つの代表的なアプローチは、以下のとおりである：
−体液サンプルにおける遺伝子発現の確率分布をモデル化する。
−サンプル中の各体液のレベルについて最尤推定値（ＭＬＥ）を算出するため、および各体液の推定レベルを提供するサンプルのプロフィールの対数尤度を算出するためにモデルを使用する。
−所定の体液が存在するまたは存在しない所定のサンプルプロフィールの尤度を比較する尤度比を構成する。
特定の体液がモデル内に含まれるときに、サンプルプロフィールがはるかに高い可能性がある場合には、我々は、体液がサンプル中に存在すると結論づけてもよい。
混合サンプルにおける遺伝子発現のモデル化
【００２６】
いくつかの実施形態において、遺伝子発現は、対数（乗法）スケールに対して最も良くモデル化され得る。例えば、遺伝子の発現レベルの倍増は、一般的に、その発現レベルを半分に減らす規模に匹敵する変化と考えられ得るので、２００個から４００個のｍＲＮＡ転写物への遺伝子の増加は、遺伝子が２０００カウントから４０００カウントに増加する場合の遺伝子発現と大きく異なる。しかしながら、混合物の数学的処理は加法的であってもよい。例えば、サンプルが、半分は血液であり、半分は唾液であった場合、遺伝子の累積発現レベルは、各組織サンプルにおける発現レベルの加法からもたらされ得る。そのため、混合物に対する各体液の寄与は、線形スケールに対してモデル化され得るが、観察された発現と予測された発現の間の矛盾は、対数スケールにより計測され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、単一体液からのサンプルにおける遺伝子発現のモデルが規定され、次に、体液の混合物に拡張され得る。いくつかの実施において、さまざまなモデルが、コンピュータデバイス上で実行、作成、保存、および／または利用され得る。そこから、サンプル中の体液量の最尤推定量（ＭＬＥ）の算出、およびサンプル中の体液の存在に関する試験に対する尤度比の使用が記載され得る。
単一体液からのサンプルにおける遺伝子発現のモデル化
【００２８】
いくつかの実施形態において、各遺伝子は、各体液中で全遺伝子発現の所定の割合を示す。例えば、平均的な血液サンプルでは、当業者は、全ＲＮＡの１５％がＨＢＢであり、１％がＡＬＡＳ１である、などと予想されるであろう。いくつかの実施形態において、これらは、予想される割合ＸＨＢＢ、ＸＡＬＡＳ１、などと呼ぶこともできる。そのため、所定の血液サンプルでは、予想される遺伝子発現のベクトルは、β（ＸＨＢＢ、ＸＡＬＡＳ１、．．．）Ｔとなり得、ここで、βはサンプル中のＲＮＡの総量である。
【００２９】
生物学的ノイズおよび技術的ノイズの両方に起因して、実際の発現はその期待値付近で変動し得る。遺伝子発現の乗法的な自然挙動に従って、変動性は、対数正規分布から生じるものとしてモデル化され得、ここで、各遺伝子は等しく可変であると仮定されてもよい。次に、サンプル中の単一遺伝子の発現は、次の代表的な関数を使用してモデル化できる３１０：
【化１】
2017530693.tif 000003
ここで、ｙＨＢＢは、サンプル中のＨＢＢの発現であり得、そして、σ２は、その期待値付近のＨＢＢ発現の（対数スケールでの）分散であり得る。
体液の混合物における遺伝子発現のモデル化
【００３０】
混合物のモデルは、単一体液サンプルのモデルから誘導され得る３１２。表記目的のために、行列はボールド体の大文字で、ベクトルはボールド体の小文字で、およびスカラー量は小文字で表され得る。サンプルはｉ∈（１、．．．、ｎ）、遺伝子はｊ∈（１、．．．、ｐ）、および組織はｋ∈（１、．．．、Ｋ）の指数を付され得る。所定のサンプルの遺伝子発現プロフィールは、ｙｉ＝（ｙｉ１、．．．、ｙｉｐ）Ｔとなり得、ここで、ｙｉｊはサンプルｉ中の遺伝子ｊの発現を表す。βｉＫは、サンプルｉ中の体液ｋの量であり得、βｉ＝（βｉ１、．．．、βｉＫ）はサンプルｉ中のすべての体液の量のベクトルであり得る３１６。最後に、行列Ｘは、Ｘのｊｔｈ列およびｋｔｈ列の要素であるｘｊｋを用いて、各体液タイプｋ中の各遺伝子ｊの予想される割合を表すために規定され得３１４、体液ｋからのサンプル中の遺伝子ｊの予想される割合を表す。いくつかの実施において、ｐ遺伝子の対数変換した発現レベルの共分散行列は、Σと記号で表され得る。さらに、行列ＡのＬｐノルムは｜｜Ａ｜｜Ｐ（例えば、ここで、いくつかの実施においてｐ＝２）と表され得る。
【００３１】
図３に関して、体液の混合物中のｍＲＮＡ分子の数が混合物の各成分中のｍＲＮＡ分子の数であり得ると仮定すると、当業者は、サンプルＩ中の遺伝子ｊの予想されるカウントを：
【化２】
2017530693.tif 000004
と書き表すことができ、そして、いくつかの実施形態において、サンプルの全体の予想される遺伝子発現ベクトルの式は：
【化３】
2017530693.tif 000005
となり得る３２０。
【００３２】
一方、遺伝子発現の変動性が対数スケール上で起こると仮定すると、サンプル中の遺伝子発現は：
【化４】
2017530693.tif 000006
とモデル化でき３１８、ここで、Ｉは単位行列であり、およびσ２は全遺伝子の（対数スケールの）一般分散である。（Ｅ（ｙｉ）＝Ｘβｉである場合、（Ｅ（ｌｏｇ（ｙｉ））≠ｌｏｇ（Ｘβｉ）であることに留意すべきである）。しかしながら、本出願で考慮された値の下では、Ｅ（ｌｏｇ（ｙｉ））は、ｌｏｇ（Ｘβｉ）に非常に近く近似する。いくつかの実施形態において、遺伝子の共分散行列を完全に推定するために必要なデータが失われているおよび／または存在しない場合、当業者はσ２Ｉでその近似値を見いだし得る。
【００３３】
体液中の遺伝子発現に上記モデルを適用する前に、当業者は、２つのパラメーター：Ｘ、例えば、遺伝子発現の予想される割合の行列、およびσ２、例えば、遺伝子発現の分散を推定し得る。Ｘ行列の推定は、先に記載されている。σ２、全遺伝子に共通の対数スケールでの分散は、各体液中の各遺伝子の平均分散と推定され得る。いくつかの実施において、Ｘは、合計して１になる列を有するようにスケーリングされ得る；他の実施において、Ｘの代わりにβがスケーリングされてもよく、さまざまな別の値に対して、行列がスケーリングされることも、および／または行列の一方もしくは両方がスケーリングされることもない。
サンプル中の各体液量の最尤推定値
【００３４】
通常、対数遺伝子発現がその期待値の対数付近まで拡張され、各遺伝子が等しく変動性であるという仮定の下で、βｉのＭＬＥ３２２は、次のように算出できる：
【化５】
2017530693.tif 000007
すなわち、
【化６】
2017530693.tif 000008
は、観察された遺伝子発現ｙｉと予測された遺伝子発現Ｘβとの間で対数スケールにおける２乗誤差の合計を最小化し、βのすべての要素が負でない（サンプルは負の量の体液を有することができない）という制約条件に依存する。この発現に対する閉形式解が存在しない場合、数値法がそれを最適化するために使用され得る（Byrd et al, SIAM J. Scientific Computing, 1995）。発現は、βにおいて凸状でないが；しかしながら、その推定は、異なる初期条件に対して合理的にロバストであり得、非常に類似した対数尤度を有する同様の推定を返した。
【００３５】
アルゴリズムが、アッセイのバックグラウンドの遺伝子発現値を当てはめようと試みるそれ自体が努力しすぎる危険性があり得る、いくつかの実施形態において、その後のレイヤーの複雑性がモデルに追加され得る。例えば、各体液についてβタームを当てはめることに加えて、全遺伝子に対して等しい加重でＸ行列の対応する列と共に、βはバックグラウンドに加えられ得る。バックグラウンドβタームは、各遺伝子に対してある数以下（例えば、１５カウント）にしか寄与しないようにさらに制約され得る。同じ理由から、全遺伝子の発現値は、平均バックグラウンドカウントの合理的な推定を引き出すために５カウントで切り捨てられ得る３２４。
体液の存在を試験するための尤度比の使用
【００３６】
いずれかの所定のサンプルｙｉでは、当業者は、体液が存在するか判定することもできる。いくつかの実施形態において、これは、βｉの各要素が０と等しいか否かを試験することを伴ってもよい。代表的なアプローチの１つは、０に近づけるように問題となっている組織に対応するβｉｊタームを用いて、
【化７】
2017530693.tif 000009
下および制約された
【化８】
2017530693.tif 000010
下でデータの尤度を算出することである３２６。完全なＭＬＥおよび制約されたＭＬＥ下での尤度比は問題の組織の存在の証拠を要約し得る。
【００３７】
ＭＬＥを提供するデータの対数尤度の算出は、予測された遺伝子発現の対数付近に通常分布する対数遺伝子発現に関与し得る。定数までは、
【化９】
2017530693.tif 000011
を提供するｙｉの対数尤度は：
【化１０】
2017530693.tif 000012
である。
【００３８】
体液ｊがサンプルｉ中に存在するか否か試験するために、我々は、ｙｉおよび
【化１１】
2017530693.tif 000013
を使用し、また一方でｙｉおよび制約された
【化１２】
2017530693.tif 000014
を使用して上式を評価し、さらに我々は尤度比を算出する。尤度比に由来する得られた値は、サンプル組成物による包含が予想されるものを示し得る３２８。いくつかの実施において、上記の算出のすべてが電子計算デバイスにより処理され得る。いくつかの実施において、次に、電子計算デバイスは、例えば、電子計算デバイスに作動的に連結された、およびデジタルグラフィカルユーザーインターフェース、および／または同類のものにアウトプットを表示するように構成されたディスプレイ・モジュールによって、ユーザーに対してサンプル組成アウトプットが提供され得る３３０。
【００３９】
いくつかの実施において、電子計算デバイスは、例えば、推定されるＸまたはβ行列、および任意のＸまたはβ行列、および／または同類のものの間の対数尤度比に基づいて、推定されるＸまたはβ値付近の信頼区間を決定し、実装してもよい。
推定された遺伝子発現に基づくサンプル中の物質割合の推定
【００４０】
いくつかの実施において、電子計算デバイスは、例えば、ペナルティー値および／または同様の定数を使用して、サンプル（例えば、組織サンプル、および／または同類のもの）中の各物質（例えば、細胞型および／または同類のもの）の割合を算出し得る。推定は、以下の代表的な関数に類似した関数を使用して算出され得る：
【化１３】
2017530693.tif 000015
ここで、Ｓ＝サンプル中の物質の割合であり、ここで、関数はβの要素がすべて負でないという制約条件を受け、そしてここで、ペナルティー（β）は、βの要素に対するペナルティー（β）は、（これだけに限定されるものではないが、「弾性ネット」ペナルティー、Ｄａｎｔｚｉｇセレクタ、Ｌｐペナルティー、グループ型または融合型ｌａｓｓｏペナルティー、適当である場合には、それらの組み合わせ、および／または同類のものを含めた）βの要素に対する更なるペナルティーを表す。いくつかの実施において、βはＫ＊１行列であり得る。
サンプル中の物質割合に基づく各物質の遺伝子発現プロフィールの推定
【００４１】
いくつかの実施において、サンプル中の物質の推定割合の先の等式は、電子計算デバイスがまた、サンプル中に存在することが推定される各物質の遺伝子発現プロフィールも推定できるように、電子計算デバイスによって改変され得る。例えば、遺伝子ｊに関して、その発現はｙ’＝（ｙ１、ｊ、．．．、ｙｎｊ）Ｔとしてｎサンプルにおいて書き表され得る。各物質の遺伝子ｊの予想される発現は、ｘ’＝（Ｘｊ、１、．．．、Ｘｊ、Ｋ）Ｔとして表されることができ、ここで、Ｘは、先の方程式に類似した、遺伝子発現の予想される割合の行列と規定される。ｎサンプル中のＫ細胞型のそれぞれの推定される割合の行列を（βＴ）ｎ＊Ｋとする。いくつかの実施において、（βＴ）ｎ＊Ｋは、複合サンプルの包摂によるＫ＊ｎ行列であり得る。
【００４２】
上記の値を使用して、ｘ’は、以下の代表的な関数：
【化１４】
2017530693.tif 000016
に類似した関数を使用して算出され得、ここで、ＧＥ＝各物質の遺伝子発現プロフィールであり、およびここで、関数は、ｘ’の要素がすべて負でないという制約条件を受ける。
さらなる応用
【００４３】
いくつかの実施において、Ｘおよびβが未知である場合には、ＧＥとＳが、共同で両方の行列を一緒に推定するために組み合わせられてもよい。例えば、Ｘまたはβのいずれかについて最も合理的な推定を用いて開始することが可能であれば、当業者は、両方の行列の値において推定値が収束するまで、βからＸを推定することとその逆を繰り返し得る。
【００４４】
いくつかの実施において、（例えば、癌細胞が正常組織と混合されたとき、正常細胞における遺伝子発現よりも、癌における遺伝子発現がはるかに変動性であることに起因して）Ｘの１つの列が未知であり、かつ、他の列が既知である場合には、統計的方法は、Ｘ行列の最も利用可能な推定を使用してβを推定し得る（例えば、癌細胞と正常細胞が分析される場合には、当業者は、Ｘの未知の列に癌細胞の平均的な遺伝子発現プロフィールを使用してもよい）。次に、不確実な発現プロフィール（例えば、Ｘの未知の列）を有する物質における発現は、以下の代表的な関数に類似した関数を使用して推定され得る：
【化１５】
2017530693.tif 000017
ここで、Ｘ−ｋは、不確実な列を有していないＸ行列であり、およびここで、β−ｋは、不確実な物質型のタームを有していないβベクトルである。
【００４５】
いくつかの実施において、当業者はまた、各物質の共分散行列Σを推定することも可能にし得る。次に、物質特異的な共分散行列Σ１、．．．、Σｋを使用して、統計的方法は物質特異的な行列に基づく大局的共分散行列Σを洗練することも可能にし得る。例えば、βを推定するために、（例えば、最尤推定値、罰則付き最尤推定値、実証的な共分散行列、および／または同類のものに基づいて）適当な大局的共分散行列Σを選んだ後に、電子計算デバイスは、サンプルのための新しい共分散行列Σを決定するために推定されるβおよびΣ１、．．．、Σｋを使用し得る。電子計算デバイスは、収束および／または同類のものまで、共分散行列Σを算出するために、βを推定し続け、そして、それと物質特異的な行列を使用し得る。
【００４６】
この明細書および添付の請求項で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の明確な文脈指示のない限り、複数の指示物も含む。
【００４７】
具体的に記載されるかまたは文脈から明白でない限り、本明細書中に使用される場合、「または」という語句は、包括的であると理解されるので、「または」と「および」の両方を網羅する。
【００４８】
具体的に記載されるかまたは文脈から明白でない限り、本明細書中に使用される場合、「約」という語句は、例えば、当該技術分野における標準的な許容性の範囲内、例えば、平均の２標準偏差の範囲内にあると理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％の範囲内と理解され得る。別段文脈から明確でない限り、本明細書中に提供されたすべての数値が、「約」という語句によって修飾される。
【００４９】
別段の規定がない限り、本明細書中に使用されるすべての学術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載したものと類似したまたは同等の他のプローブ、組成物、方法、およびキットが本発明の実施において使用可能であるが、好ましい材料および方法を本明細書中に記載している。本明細書中に使用される専門用語は、特定の実施形態だけを記載する目的のためのものであって、制限することを意図するものではないことは、理解されるべきである。
【実施例】
【００５０】
ｍＲＮＡバイオマーカーの選択
いくつかの実施形態において、５７種の体液／組織特異的遺伝子、および１０種のハウスキーピング遺伝子対照の「コードセット」（例えば、複数のコードセット）（表１）（そしてそれは、８００種を標的化するシステムの技術的能力の十分な範囲内である）を利用し得る。システムの高い多重処理能力を利用するために、特定の体液に高度に特異的であることが実証されているバイオマーカー（例えば、精液のＰＲＭ２およびＳＥＭＧ１）を、より低い程度の組織特異性が示されているもの（例えば、膣分泌物のＭＹＯＺ１および唾液のＭＵＣ７）と同様に含み得る。また、表２および表３も参照のこと。
【００５１】
表１．NanoString（登録商標）Custom Codesetにおける体液特異的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子
【表１−１】
2017530693.tif 000018
【表１−２】
2017530693.tif 000019
【００５２】
表２：試験したサンプルの一覧
【表２】
2017530693.tif 000020
染み付け＝５０μｌの染み付け；スワブ−体液を染み込ませたスワブ（無菌の綿）
環境サンプル（血液、精液、唾液）−綿布上
全ＲＮＡ−商業的供給源（方法を参照のこと）
【００５３】
表３．サンプルの説明およびアッセイ入力（完全なサンプルセット）
【表３−１】
2017530693.tif 000021
【表３−２】
2017530693.tif 000022
【表３−３】
2017530693.tif 000023
Ｅｎｖ＝環境；直接溶解（ＦＧ）＝forensicGEM(商標)；直接溶解（ＲＧ）＝RNAGEM(商標)
予想される体液プロフィールの推定
【００５４】
いくつかの実施形態において、データセットは、大きく変動するＲＮＡ濃度のサンプルを含んでもよく、また、頻繁にアッセイのバックグラウンドノイズになるより低い濃度のサンプル中に遺伝子を含んでもよい。各体液の平均遺伝子発現プロフィールの正確な推定を確実にするために、高発現レベルのハウスキーピング遺伝子を有するサンプルがさらに処理するために保持され得る。
【００５５】
体液の混合物中の遺伝子発現のモデルに関する開示に記載したモデルによれば、いくつかの実施形態において、各体液中の遺伝子の相対発現レベルが得られる；言い換えると、総シグネチャー遺伝子発現の割合は、所定の体液中の各遺伝子から予想した。これは、ほとんどの遺伝子発現に基づく選別装置とは対照的であり、そして、その選別装置は、得ることが不可能ではないにしても、困難であり得る、各遺伝子の絶対発現レベルにより注目する。そのため、各サンプルは、大局的に正規化され、そして、すべての発現値の合計が１つの値（例えば、１）となり得るように、および各遺伝子の発現値が合計シグネチャー遺伝子発現の割合となり得るように、再スケーリングされる。次に、各体液内の平均正規化発現値を伴った各体液中の各遺伝子の予想される発現割合を推定し得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、５個の代表的な体液および皮膚は、大きく異なる遺伝子発現プロフィールを実証する可能性があり、シグネチャー遺伝子は同じ体液のサンプル間で異なる可能性はあるが、体液間でのそれらの差は更に大きい可能性がある。少なくともいくつかの体液では、平均発現プロフィールは、体液の推定上の特徴遺伝子の高い発現を呈し得るが、この傾向は、一部の状況下で唾液サンプルでは明らかに弱くなり得る（図５〜８を参照のこと）。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ＨＢＢ発現は、血液プロフィールを支配することができ、血中のＡＬＡＳ２レベルが他の遺伝子のレベルをはるかに超えて得るが、例えば、ＡＬＡＳ２、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＡＭ１ＣＡ１、ＡＮＫ１、ＡＱＰ９、ＡＲＨＧＡＰ２６、Ｃ１ＱＲ１、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＳＰ２、ＣＤ３Ｇ、ＧＹＰＡ、ＨＢＡ、ＨＭＢＳ（ＰＢＧＤ）、ＭＮＤＡ、ＮＣＦＳ２、ＳＰＴＢなどの他の血液マーカーをはるかに超越している。推定上の血液マーカーＡＮＫ１は、血液サンプル中では豊富であり得ないが、唾液サンプルにおいて最も顕著に現れ得る。いくつかの状況において、精液サンプル中での発現は、精液特異的遺伝子ＩＺＵＭＯ１、ＭＳＰ、ＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＰＲＭ１、ＰＲＭ２、ＳＥＭＧ１、ＳＥＭＧ２、およびＴＧＭ４から主として生じ得るが、他の遺伝子、特にＨＢＢもまた、検出可能であり得る。唾液サンプルは、例えばＨＴＮ３、ＭＵＣ７、Ｓ．ミュータンス １６Ｓ、Ｓ．ミュータンス ｐｒｏＣ、Ｓ．ミュータンス ｒｅｌＡ、Ｓ．ミュータンス ｒｐｌＡ、Ｓ．ミュータンス ｒｐｏＢ、Ｓ．ミュータンス ｒｐｏＳ、Ｓ．サリバリウス １６Ｓ、Ｓ．サリバリウス ｐｒｏＣ、Ｓ．サリバリウス ｒｅｌＡ、Ｓ．サリバリウス ｒｐｌＡ、Ｓ．サリバリウス ｒｐｏＢ、Ｓ．サリバリウス ｒｐｏＳ、ＳＭＲ３Ｂ、およびＳＴＡＴＨなどの唾液特異的遺伝子による最も広汎なプロフィールを有することができ、いくつかの状況において、計測した発現の２８％しか寄与していない。膣分泌物サンプルは、高く上昇したレベルの、例えばＤＫＫ４、ＣＹＰ２Ｂ７Ｐ１およびある程度のＦＵＴ６などの腟マーカーを有し得る。月経血サンプルは、ＬＥＦＴＹ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１０、およびＭＭＰ１１を含めたそれらの独特の遺伝子の高い発現を示し得る。また、月経血サンプルは、血液（ＨＢＢ、ＡＬＡＳ２）および膣分泌物（ＣＹＰ２Ｂ７Ｐ１）バイオマーカーも含み得る。皮膚サンプルは、例えばＬＣＥ１Ｃ、ＩＬ１Ｆ７およびＣＣＬ２７などの皮膚遺伝子の高い発現を示し得るが、これらの遺伝子はまた、膣分泌物および月経血においてもわずかに上昇し得る。いくつかの状況において、一つには斯かる調製物における内皮組織混入の潜在的存在に起因して、ＨＢＢは、市販の皮膚調製物において最も普及している遺伝子であり得る。
【００５８】
遺伝子の少なくとも一部が、唾液サンプル中の総発現のうちの無視できない割合で存在し得る。唾液中で高度に発現した遺伝子を計測した場合、唾液中の他の体液特徴的な遺伝子の相対発現は劇的に縮小し得る。
サンプルの体液組成物を予測するための遺伝子発現の使用
【００５９】
先に記載したように、体液検出法のためのいくつかの実施形態による代表的なアルゴリズムを提供する。以下は、サンプルの体液組成を予測する性能の概要である。１００の尤度比カットオフは、体液が所定のサンプル中で検出されるか否かを明らかにするために使用し得る。いくつかの実施形態において、それらの尤度比が１００を超えている場合には、体液は検出されたものが呼び出され得る。アルゴリズムは、正しい体液を同定するのに成功し得る。所定の物質の独特の遺伝子に一般的に情報提供がない（例えば、物質に関して独特かつ容易に検出される遺伝子がわずかしかない）場合、情報提供のある遺伝子データ不存在下での算出を改善する方法を決めるために、アルゴリズムの洗練が実施されてもよい。いくつかの実施形態において、サンプルが分解されず、および／または非非常に小さい場合に、アルゴリズムの感度は改善され得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、アルゴリズムは、ＬＲ＞１００カットオフを変えることによってより良い性能を達成し得る。図１は、いくつかの実施形態による代表的な法医学的な体液タイプの検出に関する真陽性率（ＴＰＲ）および偽陽性率（ＦＰＲ）の代表的なＲＯＣ曲線を示す。ＬＲ閾値がアルゴリズムを緩和し、そして、偽陽性と偽陰性の両方をより多く返し得る。例えば、月経血、唾液および皮膚などのいくつかの物質について、ＲＯＣ曲線は、ＬＲ閾値の控え目な緩和が、ＦＰＲを少しも増やすことなくＴＰＲの大きな増加をもたらし得ることを明らかにする。いくつかの実施形態において、点は、１００のＬＲカットオフを使用して達成された成果を示す。よって、ＬＲカットオフの変更は、他の誤差の増大をもたらすことなく、サンプル物質の検出を改善し得る。
体液混合物
【００６１】
体液の混合物について判別する方法の能力の予備的な表示として、５個の混合物は、各体液からの５０μｌを染み込ませたまたは単独の綿棒の１／２を組み合わせることによって調製し得る。代表的な混合物は、４種類のバイナリ（２×膣分泌物／精液、２×血液／唾液）および１種の三成分混合物（精液／唾液／膣分泌物）を含む場合がある。血液／唾液および膣分泌物／精液は、技術的なものとは対照的に生物学的な複製物であり得る。識別閾値として１００のＬＲを使用すると、混合物のいくつかは、言い換えれば、膣分泌物／精液の１つおよび血液／唾液サンプルの１つを正確に呼び出し得る（例えば、図２）。いくつかの実施形態において、５個の代表的な混合物サンプルのそれぞれについて、棒グラフのプロットは、各体液タイプの存在の尤度比を示す。点線は１００のＬＲを示す。意義深いことには、代表的なサンプルに対して本明細書中に開示した統計的方法を利用するとき、偽陽性は全く観察できなかった。
日常的に使用する５分間ＲＮＡ直接溶解法の開発
【００６２】
日常的な分析を容易にするために、５分間の室温細胞溶解プロトコールを、先に概説した手順を用いる法医学サンプル処理のための標準的なＲＮＡ単離に代わる手段として利用し得る。その方法は、高濃度のグアニジンチオシアナート、ならびに専用の界面活性剤ミックスを含むQIAGENのＲＬＴバッファーに基づく。また、β−メルカプトエタノール（１％ ｖ／ｖ）が、溶解物中のＲＮＡｓｅｓを不活性化するために使用前に加えられてもよい。多くの直接溶解試薬と異なって、ＲＬＴバッファーは、多くの生化学反応、例えばハイブリダイゼーションなどが起こるのを許容する。放出された核酸は、主に一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの形態であり得、その後者は、そのため、一本鎖プローブにハイブリダイズできない。この事実は、相同ＤＮＡ配列および他の試薬に対するアッセイプローブのＤＮＡ力価の不足を伴い、よって、ＲＮＡ分析感度および特異性を増強し得る。
【００６３】
同じ原料物質からの標準的なＲＮＡ単離／精製と直接溶解プロトコールとのアッセイの再現性は、同等であり得る。一般に、高度の発現を加減した全遺伝子に関する２つのプロトコール間で、素晴らしい一致を観察し得る。該プロトコール間の相関関係は、わずかしか発現されていない遺伝子については破壊される可能性があり、消失標的を計測するときの、アッセイにおけるより大きなノイズを反映している。溶解物濃度が現行手法によって信頼性高く測定できないので、反復の間での最も劇的な相違は、溶解および精製ＲＮＡ間のＲＮＡ入力量における予想される変動性に起因し得る。溶解および精製プロトコール間で観察された一致は、単純に、５分間溶解プロトコールが、日常的な法医学的なケースワークのワークフローの効果的な選択肢となるであろうことを示唆している（図４を参照のこと）。
【００６４】
さらに、トレーニングから除かれたサンプルは、過剰適合を受けてはならない。いくつかの実施形態において、アルゴリズムは、すべての体液タイプの識別閾値としてＬＲ＞１００を利用し得る；他の実施形態において、体液に特異的な閾値を使用した代替アプローチを利用してもよい。
【００６５】
いくつかの実施において、コードセットの更なる最適化が可能であり得る。例えば、完全なコードセットとのハイブリダイゼーションの前に、ＨＢＢ ＲＮＡに相補的な特異的に設計した非標識オリゴヌクレオチドの正確な所定の量を添加してＨＢＢシグナルを減弱することは、低レベルの血管組織生産物の汚染から生じる偽陽性を回避する助けとなり得る。これらは、標識プローブとのハイブリダイゼーション反応を拮抗阻害する。血液バイオマーカーの１つを減弱する必要性とは対照的に、唾液バイオマーカーのシグナルは賦活されてもよい。シグナル強化は、単一のＨＴＮ３ ｍＲＮＡに結合する複数のプローブを設計することによって達成し得る。加えて、最新のプローブは、ＨＴＮ３とＨＴＮ１の両方にハイブリダイズするように設計されてもよく、その後者はまた、唾液に特異的でもある。ＨＴＮ３強化ストラテジーが期待に添わずに終わった場合、ＲＮＡ−Ｓｅｑ試験によって同定した代替の新規バイオマーカーが用いられてもよい。いくつかの実施形態において、ＡＮＫＩプローブを再合成または再設計してもよく、同様のアプローチを、任意の非最適実施バイオマーカーを用いて実施し得る。いくつかの実施形態において、追加の体液特異的バイオマーカー（例えば、膣由来の共生細菌、例えばラクトバチスル属（Lactobacillus sp.）など）もまた、分析成果を改善するために組み込まれ得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、アルゴリズムは、例えば、図２に示されているように、体液の混合物を判別し得る。いくつかの混合物が、誤った陽性結果を伴わないアッセイアルゴリズムを使用して完全に呼び出され得る、そして、一部の成分体液が、任意の「偽陰性」混合物中で同定され得る。偽陰性混合物では、誤った体液である、唾液が、他のサンプルをはるかに超えたレベルで検出され得る。ハウスキーピング遺伝子が、分析に十分な特質および量のＲＮＡが存在することを示すために、および正規化目的のために、遺伝子発現アッセイに加えられ得る（Hanson et al, Forensic Sci Rev., 2010; Haas et al, Forensic Sci Int Genet., 2014; Juusola and Ballantyne, J Forensic Sci., 2007）。ハウスキーピング遺伝子の不均等な発現のため、正規化群としてのそれらの値は疑わしい（Moreno et al, J. Forensic Sci., 2012; Vandesompele et al, Genome Biol., 2002）。いくつかの実施形態において、開示したアルゴリズムは、ハウスキーピング遺伝子を用いた正規化を必要としないので、この目的のために必要とされない。しかしながら、それらの存在は、分析のために好適なＲＮＡの回収を示すことができ、そのため、アッセイにおける特定の有用性を有し続けている。
【００６７】
当該出願内に存在する、これだけに限定されるものではないが、特許、特許出願、文献、ウェブページ、書籍などを含めた刊行物または他の文書に対する任意のまたはすべての参照は、内容が本開示の実施形態と矛盾しない限り（その場合、本明細書中に存在するものが優勢であるものとする）、その全体を参照によって本明細書中に援用する。参照したものは、本願の出願日前のそれらの開示を単に提供する。本明細書中に開示したいずれの発明も先願発明の効力によって斯かる構成要素がもっと前に起こったものとする権利を与えることがないことは、認められた事実と解釈されるべきである。
【００６８】
本明細書中に装置、方法、およびシステムの代表的な実施形態を記載したが、斯かる実施形態に対する他の修飾が可能である。これらの実施形態は、説明のためだけに記載されているものであって、制限するものではない。他の実施形態も可能なので、開示によって網羅されており、そしてそれは、本明細書中に含まれた教示から明らかでなる。よって、開示の幅と範囲は、先に記載した実施形態のいずれによっても制限されるものではなく、本開示およびそれらの同等物によって支持された請求項によってのみ規定されるものとする。さらに、先の開示で示されたフローチャートおよび／または添付の図面は、望ましい結果を達成するために、示された具体的な程度または連続した順序を求められない。そのうえ、対象の開示の実施形態は、遺伝子発現やサンプルの利用に対応する任意のおよびすべての要素を含めた、その他の開示された方法、システム、およびデバイスからの任意のおよびすべての要素をさらに含み得る、方法、システム、およびデバイスを含み得る。言い換えれば、一方のおよび／または別の開示された実施形態は、他の開示された実施形態由来の要素と交換可能であり得る。加えて、開示されている実施形態の１若しくは複数の特徴／要素は、取り出され、特許可能な対象をさらにもたらし得る（そして、これにより、対象の開示に関するより一層さらなる実施形態をもたらす）。より一層さらに、本開示のいくつかの実施形態は、従来技術で開示されたある特徴および／または別の特徴をわざわざ必要とせずに、従来技術から識別され得る（例えば、いくつかの実施形態は、負の制限を含み得る）。本明細書中に開示した実施形態の一部は、提示され得る本開示によって支持される多数の請求項から成る以下の代表的な請求項の少なくとも一部の範囲内にある。
【００６９】
【化１６】
2017530693.tif 000024
【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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