(57)【要約】  本開示は、抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメイン並びに抗原ＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメインを含む多特異性分子、前記多特異性分子を含む組成物、処置、例えば、自己免疫疾患の処置におけるそれぞれの使用に関する。
2017529061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメイン並びに抗原ＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメインを含む多特異性分子。
【請求項２】
結合ドメイン（単数又は複数）が、関連する抗原に特異的な抗体可変領域を含む、請求項１に記載の多特異性分子。
【請求項３】
それぞれの結合ドメインが２つの抗体可変ドメインを含む、請求項１又は請求項２に記載の多特異性分子。
【請求項４】
２つの抗体可変ドメインがＶＨ／ＶＬ対である、請求項３に記載の多特異性分子。
【請求項５】
分子が二重特異性又は三重特異性である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項６】
分子が融合タンパク質である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項７】
分子フォーマットが、ダイアボディ、ｓｃダイアボディ、トリアボディ、直列型ｓｃＦｖ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、トリボディ、直列型ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、Ｉｇ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｉｇ、Ｖ−Ｉｇ、Ｉｇ−Ｖ、Ｄｕｏｂｏｄｙ及びＤＶＤ−Ｉｇから選択される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項８】
それぞれの結合ドメインが単一特異性である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項９】
多特異性分子が、ＣＤ４５に特異的である結合ドメインを１つ以下並びにＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに特異的である結合ドメインを１つ以下含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１０】
ＣＤ４５に特異的な結合ドメイン並びにＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメインが、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ及びｄｓｓｃＦｖから独立して選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１１】
ＣＤ７９ｂに対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１では配列番号７８、ＣＤＲＨ２では配列番号７９及びＣＤＲＨ３では配列番号８０で与えられる配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１２】
ＣＤ７９ｂに対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１では配列番号８８、ＣＤＲＨ２では配列番号８９及びＣＤＲＨ３では配列番号９０で与えられる配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１３】
ＣＤ７９ｂに対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１では配列番号７５、ＣＤＲＬ２では配列番号７６及びＣＤＲＬ３では配列番号７７で与えられる配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１４】
ＣＤ７９ｂに対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１では配列番号８５、ＣＤＲＬ２では配列番号８６及びＣＤＲＬ３では配列番号８７で与えられる配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１５】
ＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１では配列番号９８、ＣＤＲＨ２では配列番号９９及びＣＤＲＨ３では配列番号１００で与えられる配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１６】
ＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１では配列番号１０８、ＣＤＲＨ２では配列番号１０９及びＣＤＲＨ３では配列番号１１０で与えられる配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１７】
ＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１では配列番号１１８、ＣＤＲＨ２では配列番号１１９及びＣＤＲＨ３では配列番号１２０で与えられる配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１８】
ＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１では配列番号１２８、ＣＤＲＨ２では配列番号１２９及びＣＤＲＨ３では配列番号１３０で与えられる配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項１９】
ＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１では配列番号９５、ＣＤＲＬ２では配列番号９６及びＣＤＲＬ３では配列番号９７で与えられる配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項２０】
ＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１では配列番号１０５、ＣＤＲＬ２では配列番号１０６及びＣＤＲＬ３では配列番号１０７で与えられる配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項２１】
ＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１では配列番号１１５、ＣＤＲＬ２では配列番号１１６及びＣＤＲＬ３では配列番号１１７で与えられる配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項２２】
ＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１では配列番号１２５、ＣＤＲＬ２では配列番号１２６及びＣＤＲＬ３では配列番号１２７で与えられる配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項２３】
結合ドメインがヒト化されている、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項２４】
１つ又は複数のＣＤＲにおける１つ又は複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、請求項１１から２３までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項２５】
１つ又は複数のシステイン残基が別のアミノ酸で置換されている、請求項２４に記載の多特異性分子。
【請求項２６】
１つ又は複数のアスパラギン酸異性化部位及び／又はアスパラギン脱アミノ部位及び／又はグリコシル化部位が、１つ又は複数のＣＤＲにおいて１つ又は複数のアミノ酸を置換することにより取り除かれている、請求項２４又は請求項２５に記載の多特異性分子。
【請求項２７】
ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに特異的な結合ドメインをさらに含む、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の多特異性分子。
【請求項２８】
請求項１から２７までのいずれか一項に定義される１つ又は複数の多特異性タンパク質を含む組成物。
【請求項２９】
請求項１から２７までのいずれか一項に定義される多特異性タンパク質又はその成分をコードするヌクレオチド配列。
【請求項３０】
請求項２９に定義されるヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３１】
治療において使用するための、請求項１から２７までのいずれか一項に記載される多特異性タンパク質又は請求項２８に記載される組成物。
【請求項３２】
治療において使用するための、特に本明細書に記載される状態又は障害の処置のための薬物の製造のための、請求項１から２７までのいずれか一項に記載される多特異性タンパク質又は請求項２８に記載される組成物の使用。
【請求項３３】
請求項１から２７までのいずれか一項に記載される多特異性タンパク質又は請求項２８に記載される組成物の治療的有効量の投与を含む、患者を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗原ＣＤ４５及びＣＤ７９に少なくとも二重特異性である分子、前記分子を含む製剤、並びに処置におけるそれらのうちのいずれか１つの使用に関する。本開示は、前記分子及び前記製剤を調製する方法にも及ぶ。独立した態様では、本開示は、本明細書に記載される新規抗体配列及び断片にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的機構はシグナルの極端に複雑なカスケードであり、この絡まりを解いて理解するのは困難である。そのようなシグナル伝達の例はＢ細胞を活性化するのに必要なシグナル伝達である。Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）は膜免疫グロブリン（ｍＩｇ）分子と関連Ｉｇα／Ｉｇβ（ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ）ヘテロ二量体（α／β）で構成されている。ｍＩｇサブユニットは抗原に結合して、受容体凝集をもたらし、α／βサブユニットはシグナルを細胞内部へ伝達する。ＢＣＲ凝集はＳｒｃファミリーキナーゼ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、及びＦｙｎ並びにＳｙｋ及びＢｔｋチロシンキナーゼを急速に活性化する。これにより、ＢＣＲ、上述のチロシンキナーゼ、ＣＤ１９及びＢＬＮＫなどのアダプタータンパク質、並びにＰＬＣγ２、ＰＩ３Ｋ、及びＶａｖなどのシグナル伝達酵素で構成された「シグナロソーム」が形成され始める。
【０００３】
シグナロソームから発するシグナルは、キナーゼ、ＧＴＰアーゼ、及び転写因子を伴う複数のシグナル伝達カスケードを活性化する。これにより細胞代謝、遺伝子発現、及び細胞骨格系に変化が生じる。ＢＣＲシグナル伝達が複雑であることによって、生存、寛容（アネルギー）又はアポトーシス、増殖、及び抗体産生細胞又は記憶Ｂ細胞への分化を含む、多くの異なる結果が可能になる。応答の結果は、細胞の成熟状態、抗原の性質、ＢＣＲシグナル伝達の大きさと持続期間、並びにＣＤ４０、ＩＬ−２１受容体、及びＢＡＦＦ−Ｒなどの他の受容体からのシグナルによって決定される。
【０００４】
多くの他の膜貫通型タンパク質は、その一部は受容体であるが、ＢＣＲシグナル伝達の特定のエレメントを調節する。ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＰＩＲ−Ｂ、及びＦｃγＲＩＩＢ１（ＣＤ３２）を含めた、これらのエレメントのいくつか。ＢＣＲシグナル伝達の大きさと持続期間は、Ｌｙｎ／ＣＤ２２／ＳＨＰ−１経路、Ｃｂｐ／Ｃｓｋ経路、ＳＨＩＰ、Ｃｂ１、Ｄｏｋ−１、Ｄｏｋ−３、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＰＩＲ−Ｂ、及びＢＣＲの内部移行を伴うループを含むネガティブフィードバックループにより限定される。
【０００５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、Ｂ細胞は、抗原を捕捉しそれをその細胞表面に提示する抗原提示細胞により活性化されることが多い。そのような膜結合性抗原によるＢ細胞の活性化には、ＢＣＲ誘導細胞骨格再編成が必要である。
【０００６】
自己反応性Ｂ細胞は、直接的に又は間接的に自己免疫状態を引き起こす又は悪化させることがある病原性自己抗体の産生の原因である。ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の枯渇を使用していくつかの自己免疫状態が首尾よく処置されており、こうしてＢ細胞がいくつかの自己免疫疾患を引き起こす又は維持するのに重要な役割を果たしていることが決定的に確証された。Ｂ細胞枯渇は成功している治療上の選択肢であったが、Ｂ細胞の成長及び活性化状態を制御することも、Ｂ細胞機能を調節する効果的な方法になり得るという証拠も存在する。したがって、Ｂ細胞を枯渇させず、いくつかの副作用に関連していることが明らかにされている、Ｂ細胞免疫の長期にわたる抑制なしにＢ細胞を制御する柔軟性を提供する、代わりの戦略があれば望ましいと考えられる。さらに、Ｂ細胞応答又は活性のすべてが有害であるわけではなく、証拠によれば制御性Ｂ細胞集団の維持は保護的になり得ることが示唆されている。そのようなアプローチは、不適切な又は過剰なＢｃＲシグナル伝達によって異常なＢ細胞機能が引き起こされる疾患では効果的なはずである。例には、炎症、自己免疫及びがんが含まれるが、これらに限定されない。特に興味深いのは、ＢｃＲシグナル伝達を直接必要とする、又は液性免疫応答の阻害若しくは刺激を必要とする疾患である。
【０００７】
二重特異性抗体は次世代のバイオ薬物治療において大きな役割を果たすと広く予想されている（D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798）。二重特異性抗体は、さらに大きな割合の患者において優れた長期にわたる広い効力をもたらす潜在力がある。これは、一般疾患経路内で異なる抗原に同時に共結合し、それによって多重度を減少させることにより、又は独立した経路由来の抗原を標的として相加的な若しくは相乗的な効果を提供することにより達成することが可能である。
【０００８】
現在まで、Ｂ細胞を除去することなくＢ細胞の機能を阻害する戦略はＣＤ３２ｂ（ＦｃｇＲＩＩＢ）による天然の制御機構を利用することに焦点を合わせてきた。これらの戦略には、ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３２ｂ（Veri et al., Arthritis & Rheumatism 2010 62 1933-1943）、ＣＤ１９／ＣＤ３２ｂ（Karnell et al., J.Immunol 2014 192 1480-1490）に対する二重特異性抗体、及びＣＤ３２ｂ結合が増強されているＦｃを有するＣＤ１９に対する抗体（Chu et al., Arthritis & Rheumatology 2014 66 1153-1164）が含まれる。
【０００９】
二重特異性抗体は次世代のバイオ薬物治療において大きな役割を果たすと広く予想されている（D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798）。二重特異性抗体は、さらに大きな割合の患者において優れた長期にわたる広い効力をもたらす潜在力がある。これは、一般疾患経路内で異なる抗原に同時に共結合し、それによって多重度を減少させることにより、又は独立した経路由来の抗原を標的として相加的な若しくは相乗的な効果を提供することにより達成することが可能である。
【００１０】
現在まで、Ｂ細胞を除去することなくＢ細胞の機能を阻害する戦略はＣＤ３２ｂ（ＦｃｇＲＩＩＢ）による天然の制御機構を利用することに焦点を合わせてきた。これらの戦略には、ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３２ｂ（Arthritis & Rheumatism 2010 62 1933-1943）、ＣＤ１９／ＣＤ３２ｂ（J.Immunol 2014 192 1430-1490）に対する二重特異性抗体、及びＣＤ３２ｂ結合が増強されているＦｃを有するＣＤ１９に対する抗体（Arthritis & Rheumatology 2014 66 1153-1164）が含まれる。
【００１１】
特に抗原が小さな免疫複合体中の抗体と結合しているときには、Ｆｃガンマ受容体ＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）とＢ細胞受容体のコライゲーションが起きてシグナル伝達を自然に調節する。次に、ＣＤ３２ｂは、ＢｃＲ活性化と拮抗するホスファターゼＳＨＰ−１及びＳＨＩＰ−１を動員する。この天然の制御機構はＢ細胞機能を制御することが可能であるが、ＣＤ３２ｂのタンパク質配列の変動により引き起こされるＣＤ３２ｂ機能の破壊のせいで自己免疫疾患になることがあり、この受容体は自己免疫疾患では、例えば、ＳＬＥの症例では下方調節されることがある。したがって、Ｂ細胞活性を遮断する代わりの方法は、ＢｃＲ機能を調節する代わりの非天然の方法を提供してくれるので、望ましい。これらの代わりの機構は、天然の機構が所与の疾患では機能不全であるときには特に重要になる可能性がある。
【００１２】
二重特異性抗体は、
１）適切な場合には、細胞上の受容体を架橋結合する、
２）細胞媒介効果を誘導する、
３）サイトカインを細胞に局在化してシグナル伝達を調節する又はサイトカイン機能を局所的に遮断する、
４）複数のエピトープに同時に結合して、単一のモノクローナル抗体も、実際、異なる抗原に対する混合物を含む、連結していない抗体の混合物（「ポリ−モノクローナル」）も示すことができない「新しい活性」を生み出し、機能又は特異性を増加させる、
などの新規の生物学の利用を促進する。
【００１３】
正常な生理的条件下では、抗原結合するとＣＤ４５はＢｃＲ複合体から排除される。本発明者らは驚くべきことに、二重特異性抗体を使用してＢｃＲ（ＣＤ７９）を分子ＣＤ４５に結合させると、ＢＣＲシグナル伝達を阻害できることを見出した。したがって、二重特異性抗体の使用を通じてＢｃＲをＣＤ４５に物理的に連結させることにより、発明者らは、Ｂ細胞での活性化を阻害できることを見出した。
【００１４】
したがって、本発明者らは、ＣＤ４５及びＣＤ７９に対して少なくとも二重特異性である分子についての相乗的機能を同定した。この機能は、単に、例えば、モノクローナル抗体又はその結合断片の混合物として提供されるのと対照的に、主に、特異性の組合せを有する結合領域が二重特異性（多特異性）フォーマットで提供されるときに検出可能になると思われる。
【００１５】
したがって、本発明の多特異性分子は、自己免疫及びがんなどのある種の疾患と関連する異常なＢ細胞機能を制御するのに有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメイン並びに抗原ＣＤ７９に特異的な結合ドメインを含む多特異性分子が提供される。
【００１７】
二重特異性フォーマットでの本開示に従った組合せは、機能ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて興味深い生物活性、例えば、以下の、Ｂ細胞上でのＣＤ８６、ＣＤ７１及び／又はＣＤ４０の発現の阻害に加えて、Ａｋｔ  Ｓ４７３のリン酸化の阻害、Ｐ３８のリン酸化の阻害及びＩｋＢのＰＬＣγ２  Ｙ７５９阻害のうちのいずれか１つにより測定した場合のＢ細胞シグナル伝達の阻害を示す。個々の成分単独又は混合物で提供される成分では同じレベルの活性は明らかではない。しかし、ＣＤ４５及びＣＤ７９に対する特異性を有する二重特異性構築物が提供されるときには活性は明白である。
【００１８】
これらのアッセイにおいて観察されるある種のＢ細胞機能の阻害は、ＣＤ４５に特異的な結合ドメイン及びＣＤ７９に特異的な結合ドメインを含む本発明の多特異性分子を使用すればＢ細胞機能を変化させる、及び、例えば、Ｂ細胞の枯渇に代わる治療法を提供することができることを示している。
【００１９】
Ｂ細胞受容体シグナル伝達はＢ細胞の極めて重要な機能であり、Ｂ細胞の抗原特異的活性化の必要条件である。ＢｃＲシグナル伝達は、Ｂ細胞発生の初期段階から記憶Ｂ細胞応答の活性化及び発生までずっと極めて重要である。Ｂ細胞受容体は、ＣＤ７９ａとＣＤ７９ｂのヘテロ二量体複合体と会合する表面免疫グロブリン（Ｉｇ）分子で構成されている。表面Ｉｇが抗原を認識すると、これによってＣＤ７９ａ／ｂ複合体がクラスター化し、これにより、Ｓｒｃファミリーキナーゼ並びにＳｙｋ及びＢｔｋチロシンキナーゼが含まれるすぐ隣のシグナル伝達カスケードが下流で活性化されると考えられている。次に、このシグナル伝達複合体はＣＤ１９及びＢＬＮＫなどのアダプタータンパク質を動員することが可能であり、ＰＬＣγ２とＰＩ３Ｋが活性化されて、これが今度は、Ｂ細胞成長、生存及び分化を制御する経路などのさらに下流の経路を活性化することが可能である。このシグナル伝達複合体は、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＩＬ−２１Ｒ及びＣＤ４０を経るシグナル伝達を介して他の２番目のシグナルによってさらに調節することも可能であり、とりわけＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ８３、ＣＤ２２、ＣＤ３２ｂ及びＣＤ４５などの他のシグナル伝達分子によって調節することも可能である。ＢｃＲによって抗原が認識されると、活性化された第１の応答のうちの１つは共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６などの表面受容体の上方調節である。これらの分子はＴ細胞上の対応する受容体に結合し、この受容体は、ＭＨＣクラスＩＩの文脈で抗原を認識するＴ細胞の生存及び増殖を可能にする生存及び活性化シグナルをさらに送る。この応答は、ＭＨＣクラスＩＩの文脈で抗原をＴ細胞に提示し戻すＢ細胞の能力によりさらに増幅され、これによってＩＬ−２及びＩＬ−２１などの因子が放出される。これらのサイトカインは、今度はＢ細胞数を大いに増やす。
【００２０】
さらに、Ｂ細胞受容体シグナル伝達を阻害すれば下流の機能を阻害することが可能である。１つのそのような結果は、Ｔ細胞機能、生存及び分化を阻害することになるＣＤ８６などの共刺激分子の阻害（又は同じ分子の発現の減少）になると考えられる。
【００２１】
したがって、Ｂ細胞受容体シグナル伝達を阻害すれば、自己免疫及びがんと関連のある異常なＢ細胞機能を制御するのに有益になることが可能である。Ｂ細胞受容体シグナル伝達は、Ｂ細胞増殖、分化、抗原提示及び自己免疫疾患におけるサイトカイン放出に必要である。このように、ＢｃＲ活性を阻害すれば、免疫グロブリン分泌、Ｔ細胞活性化などのＢ細胞機能を調節し、例えば、自己免疫状態と関連のある不適切なＢ細胞活性を制御することが可能である。さらに、生存及び成長にＢ細胞受容体シグナル伝達を必要とするＢ細胞白血病及びリンパ腫がいくつかあるが、そのシグナル伝達をＢ細胞受容体活性化の阻害物質により制御することができる。
【００２２】
一実施形態では、本発明の多特異性分子の結合ドメイン（単数又は複数）はそれぞれが独立して、関連抗原（ＣＤ４５若しくはＣＤ７９などの又は分子が少なくとも三重特異的である場合はさらなる抗原）に特異的な１つ又は２つ（２つなど）の抗体可変ドメインを含む。
【００２３】
本明細書で使用されるＣＤ７９とは、ＣＤ７９ａとＣＤ７９ｂで構成された複合体のことである。したがって、ＣＤ７９に結合する抗体はＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに結合することができる。本明細書で用いられるＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂへの結合とは、ＣＤ７９ａに特異的である、ＣＤ７９ｂに特異的である、ＣＤ７９ａとｂの両方に特異的である（すなわち、ＣＤ７９ａ上のエピトープを認識し、ＣＤ７９ｂ上のエピトープも認識する、すなわち、汎特異的である）又はＣＤ７９ａとＣＤ７９ｂの複合体に特異的である（すなわち、複合体形態のＣＤ７９ａとＣＤ７９ｂの相互作用から形成されるエピトープを認識する）ことである。
【００２４】
一実施形態では、本開示の分子中で用いられる抗体又はその結合断片はＣＤ７９ａに特異的である。
【００２５】
一実施形態では、本開示の分子中で用いられる抗体又はその結合断片はＣＤ７９ｂに特異的である。
【００２６】
一実施形態では、本開示の分子中で用いられる抗体又はその結合断片はＣＤ７９複合体に特異的である、すなわち、抗体又はその結合断片は複合体に存在するエピトープを認識し、それに、例えば、ＣＤ７９ａとＣＤ７９ｂの間の相互作用を含むエピトープに特異的である。
【００２７】
一実施形態では、結合ドメインがＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂに特異的である場合でも、複合体形態のときにそれでも結合ドメインはＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂに結合することになることは認識されるであろう。
【００２８】
結合ドメインに又はそれぞれの結合ドメインに２つの可変領域が存在する場合、前記２つの可変領域は一般に協同的に働いて関連する抗原に対する特異性を提供する、例えば、前記２つの可変領域は同族対である又はドメインが特定の抗原に特異的であるように、親和性成熟して十分な親和性を提供する。典型的には前記２つの可変領域は重及び軽鎖可変領域対（ＶＨ／ＶＬ対）である。
【００２９】
一実施形態では、本開示の分子は二重特異性である。
【００３０】
一実施形態では、例えば、第３の結合ドメインが血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンに特異的である場合、本開示の分子は三重特異的である。
【００３１】
一実施形態では、本開示の分子はＣＤ７９及びＣＤ４５に対して単一特異性である、すなわち、分子はＣＤ７９に結合する１つの結合ドメインとＣＤ４５に結合する１つの結合ドメインのみを含む。
【００３２】
一実施形態では、本開示の多特異性分子は一本鎖である。
【００３３】
一実施形態では、本開示の多特異性分子は重鎖及び軽鎖も含む。一例では、本明細書で用いられるように、特に、一実施形態では、本開示の分子が、抗体の二量体などの多量体、ユニット／断片又は成分を含まない場合は、重及び軽鎖対合は二量体とは呼ばれない。
【００３４】
一態様では、
ａ）式（Ｉ）：
ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−（Ｖ１）ｐのポリペプチド鎖、
ｂ）式（ＩＩ）：
ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−（Ｖ２）ｑのポリペプチド鎖
であって、
ＶＨは重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し、
Ｘは結合又はリンカー、例えば、アミノ酸リンカーを表し、
Ｙは結合又はリンカー、例えば、アミノ酸リンカーを表し、
Ｖ１はｄａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表し、
ＶＬは可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは定常領域由来のドメイン、例えば、カッパなどの軽鎖定常領域ドメインを表し、
Ｖ２はｄａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表し、
ｐは０又は１であり、
ｑは０又は１であり、
ｐが１のときｑは０又は１であり、ｑが１のときｐは０又は１であり、すなわち、ｐとｑの両方が０を表すことはない、
を含む又はからなる多特異性抗体分子が提供される。
【００３５】
一実施形態では、分子は、ＣＤ４５に対する結合部位を１つ以下及びＣＤ７９に対する結合部位を１つ以下含む。
【００３６】
上記フォーマットは、例えば、比較的長期のアッセイにおいて及び治療上の使用のために、可変領域の組合せをスクリーニングするのに特に有用である。
【００３７】
一実施形態では、ｑは０でありｐは１である。
【００３８】
一実施形態では、ｑは１でありｐは１である。
【００３９】
一実施形態では、Ｖ１はｄａｂでありＶ２はｄａｂであり、合わせると、Ｖ１とＶ２は、同族ＶＨ／ＶＬ対などの可変領域の協同的対の単一結合ドメインを形成する。
【００４０】
一実施形態では、ＶＨとＶＬはＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂに特異的である。
【００４１】
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ａに特異的である。
【００４２】
一実施形態では、Ｖ２はＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ａに特異的である。
【００４３】
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ｂに特異的である。
【００４４】
一実施形態では、Ｖ２はＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ｂに特異的である。
【００４５】
一実施形態では、Ｖ１とＶ２は合わせて（例えば、１つの結合ドメインとして）ＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂに特異的である。
【００４６】
一実施形態では、ＶＨとＶＬはＣＤ４５に特異的である。
【００４７】
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ４５に特異的である。
【００４８】
一実施形態では、Ｖ２はＣＤ４５に特異的である。
【００４９】
一実施形態では、Ｖ１とＶ２は合わせて（例えば、１つの結合ドメインとして）ＣＤ４５に特異的である。
【００５０】
一実施形態では、本開示の分子は融合タンパク質である又は融合タンパク質を含む。
【００５１】
一実施形態では、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂであって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
ＡはＣＤ４５、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又は複合体型のＣＤ７９ａとｂに特異的な第１の結合ドメインを含み、
ＢはＣＤ４５、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又は複合体型のＣＤ７９ａとｂに特異的な第２の結合ドメインを含み、
Ｘは結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは結合対の第２の結合パートナーであり、
：はＸとＹの間の相互作用（結合相互作用などの）であり、
Ａ又はＢのうちの少なくとも１つはＣＤ４５に特異的であり、もう一方はＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はその複合体型に特異的である、
前記式を有する二重特異性タンパク質複合体である、本開示に従った多特異性分子が提供される。
【００５２】
上記フォーマットは、例えば、機能アッセイにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を受けさせることが可能である二重特異性フォーマットを組み立てる迅速で効率的なやり方を提供するので都合がよい。これにより可変領域の好ましい対の選択が促進され、それに続いて前記好ましい対は代わりの治療多特異性抗体フォーマットに組み込むことができる。
【００５３】
理論に縛られたくはないが、ＣＤ７９に特異的な可変領域の範囲と組み合わせてＣＤ４５に特異的な可変領域の異なる並べ替えをすれば生物機能の異なる微妙な違いを提供できる。
【００５４】
本発明は、例えば、本発明の多特異性分子で使用するための、又は他の任意の適切な抗体フォーマットに組み込むための新規のＣＤ４５抗体も提供する。
【００５５】
本発明は、例えば、本発明の多特異的分子で使用するための、又は他の任意の適切な抗体フォーマットに組み込むための新規のＣＤ７９抗体も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＣＤ４５及びＣＤ７９ｂに対する特異性を有する抗体の二重特異性及び二価組合せについてのリン酸化されたＡｋｔの相対的阻害効力を示す棒グラフである。
【図２】ＣＤ４５及びＣＤ７９ｂに対する特異性を有する抗体の二重特異性及び二価組合せについてのリン酸化されたＰＬＣｇ２の相対的阻害効力を示す棒グラフである。
【図３】抗ＩｇＭ刺激を受けたＢ細胞上でのＣＤ８６発現に対するＣＤ４５とＣＤ７９ｂの二重特異性組合せの効果の滴定を示すグラフである。
【図４】異なるＶ領域を有するＣＤ４５及びＣＤ７９ｂに対する特異性を有する二重特異性タンパク質についてのリン酸化されたＰＬＣｇ２の阻害を示すグラフである。
【図５】ある種の抗体フォーマットを示すChan and Carter Nature Reviews Immunology vol 10, May 2010, 301からの抜粋である。
【図６】抗原格子にわたる特異性についてのデータを示す表である。抗原２＝ＣＤ７９ｂ及び抗原４＝ＣＤ４５。値はＳｙｋのリン酸化のパーセンテージ阻害（活性化では負の値）であり、評価された複数のＶ領域組合せの平均を表す。
【図７】抗原格子にわたる特異性についてのデータを示す表である。抗原２＝ＣＤ７９ｂ及び抗原４＝ＣＤ４５。値はＰＬＣγ２のパーセンテージ阻害（活性化では負の値）であり、評価された複数のＶ領域組合せの平均を表す。
【図８】抗原格子にわたる特異性についてのデータを示す表である。抗原２＝ＣＤ７９ｂ及び抗原４＝ＣＤ４５。値はＡＫＴのパーセンテージ阻害（活性化では負の値）であり、評価された複数のＶ領域組合せの平均を表す。
【図９】Ｆａｂ−ＹにおけるＣＤ４５特異性と組み合わせたＦａｂ−ＸにおけるＣＤ７９ｂ特異性についてのＶ領域組合せごとのＳｙｋ、ＰＬＣγ２及びＡＫＴのリン酸化のパーセンテージ阻害を示すグラフである。
【図１０】Ｆａｂ−ＸにおけるＣＤ４５特異性と組み合わせたＦａｂ−ＹにおけるＣＤ７９ｂ特異性についてのＶ領域組合せごとのＳｙｋ、ＰＬＣγ２及びＡＫＴのリン酸化のパーセンテージ阻害を示すグラフである。
【図１１】ドナー１２９及び１３０由来のＩｇＭ刺激されたＢ細胞上（で一過性に発現された）精製ＣＤ７９ｂ−ＣＤ４５によるＰＬＣγ２（＋／−ＳＤ）の阻害を示すグラフである。
【図１２】ドナー１２９及び１３０由来のＩｇＭ刺激されたＢ細胞上（で一過性に発現された）精製ＣＤ７９ｂ−ＣＤ４５によるＰＬＣγ２（＋／−ＳＤ）の阻害を示すグラフである。
【図１３】ドナー１２９及び１３０由来のＩｇＭ刺激されたＢ細胞上（で一過性に発現された）精製ＣＤ７９ｂ−ＣＤ４５によるｐ３８（＋／−ＳＤ）の阻害を示すグラフである。
【図１４】ドナー１２９及び１３０由来のＩｇＭ刺激されたＢ細胞上（で一過性に発現された）精製ＣＤ７９ｂ−ＣＤ４５によるｐ３８（＋／−ＳＤ）の阻害を示すグラフである。
【図１５】ドナー１２９及び１３０由来のＩｇＭ刺激されたＢ細胞上（で一過性に発現された）精製ＣＤ７９ｂ−ＣＤ４５によるＡｋｔ（＋／−ＳＤ）の阻害を示すグラフである。
【図１６】ドナー１２９及び１３０由来のＩｇＭ刺激されたＢ細胞上（で一過性に発現された）精製ＣＤ７９ｂ−ＣＤ４５によるＡｋｔ（＋／−ＳＤ）の阻害を示すグラフである。
【図１７】異なる多特異性分子と一緒に培養されたＰＢＭＣからの破傷風トキソイドＩｇＧ産生の阻害を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本明細書で用いられる「多特異性分子」とは、少なくとも２つの別個の抗原、例えば、異なる抗原に特異的に結合する能力を備えた分子のことである。一実施形態では、多特異性分子は二重特異性、三重特異性又は四重特異性分子、特に、二重特異性分子又は三重特異性分子である。
【００５８】
したがって、一態様では、本開示は、少なくともＣＤ４５及びＣＤ７９ａに特異的な適切なフォーマットの分子にまで、並びに二重特異性フォーマット又は三重特異性フォーマットなどの多特異性分子でのＣＤ４５及びＣＤ７９ａに特異的な抗体／断片又はその組合せの使用にまで及ぶ。
【００５９】
したがって、一態様では、本開示は、少なくともＣＤ４５及びＣＤ７９ｂに特異的な適切なフォーマットの分子にまで、並びに二重特異性フォーマット又は三重特異性フォーマットなどの多特異性分子でのＣＤ４５及びＣＤ７９ｂに特異的な抗体／断片又はその組合せの使用にまで及ぶ。
【００６０】
したがって、一態様では、本開示は、少なくともＣＤ４５及びＣＤ７９ａ／ｂ複合体に特異的な適切なフォーマットの分子にまで、並びに二重特異性フォーマット又は三重特異性フォーマットなどの多特異性分子でのＣＤ４５及びＣＤ７９ａ／ｂ複合体に特異的な抗体／断片又はその組合せの使用にまで及ぶ。
【００６１】
一実施形態では、例えば、第３の結合ドメインが、例えば、血清担体タンパク質に結合することによって分子の半減期を延ばすことができる場合、本開示の分子は三重特異性である。
【００６２】
血漿中には種々のタンパク質が存在し、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン及びアルブミン、又はそのいずれかの断片が含まれる（Bartalena & Robbins, 1993, Clinics in Lab. Med. 13:583-598; Bree et al., 1986, Clin. Pharmacokin. 11:336-342; Gitlin et al. 1964, J. Clin. Invest. 10:1938-1951; Peters, 1985, Adv Protein Chem. 37:161-245; Waldeman & Strober, 1969, Progr. Allergy, 13:1-110）。一例では、第３の結合ドメインは血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンに特異的である。
【００６３】
多特異性分子フォーマット
適切な多特異性分子の例は、例えば、概説“The coming of Age of Engineered Multivalent Antibodies, Nunez-Prado et al Drug Discovery Today Vol 20 Number 5 Mar 2015, page 588-594,  D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798, Chan and Carter, Nature Reviews Immunology vol 10, May 2010, 301に開示されている通りに当技術分野では公知であり、前記文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
一実施形態では、多特異性フォーマットには、当技術分野で公知の多特異性フォーマット並びに分子フォーマットが、
・直列型ｓｄＡｂ、直列型ｓｄＡｂ−ｓｄＡｂ（３つのｓｄＡｂ）；
・（ｓｃＦｖ）２（直列型ｓｃＦｖとも呼ばれる）、ｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ）２；
・ダイアボディ、ｄｓダイアボディ、ｄｉｄｓダイアボディ、
・ｓｃダイアボディ、ｄｓｓｃダイアボディ、ｄｉｄｓｓｃダイアボディ；
・Ｄａｒｔ抗体、すなわち、ＶＨ１とＶＨ２のＣ終端がジスルフィド結合により結合されているＶＬ１リンカーＶＨ２リンカー及びＶＨ１リンカーＶＬ２；
・ＢｉＴＥ（登録商標）、ｄｓＢｉＴＥ、ｄｉｄｓＢｉＴＥ；
・Ｄｉ−ダイアボディ（Nunez-Prado et al in particular molecule number 25 in Fig 1 therein参照）、ｄｓｄｉ−ダイアボディ、ｄｉｄｓｄｉ−ダイアボディ；
・トリアボディ、ｄｓトリアボディ、ｄｉｄｓトリアボディ、ｔｒｉｄｓトリアボディ；
・テトラボディ、ｄｓテトラボディ、ｄｉｄｓテトラボディ、ｔｒｉｄｓテトラボディ、ｔｅｔｒａｄｓテトラボディ；
・タンダブ（Nunez-Prado et al in particular molecule number 22 in Fig 1 therein参照）；ｄｓタンダブ、ｄｉｄｓタンダブ、ｔｒｉｄｓタンダブ、ｔｅｔｒａｄｓタンダブ；
・［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、（Nunez-Prado et al in particular molecule number 22 in Fig 1 therein参照）、ｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ｄｉｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ｔｒｉｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ｔｅｔｒａｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２；
・ペンタボディ（Nunez-Prado et al in particular molecule number 27 in Fig 1 therein参照）；
・Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（ｂｉｂｏｄｙとも呼ばれる）、Ｆａｂ’ｓｃＦｖ、ＦａｂｄｓｓｃＦｖ（又はＢＹｂｅ）、Ｆａｂ’ｄｓｓｃＦｖ；
・トリボディ、ｄｓトリボディ、ｄｉｄｓトリボディ（ＦａｂｄｉｄｓｓｃＦｖ又はＴｒＹｂｅ又はＦａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）、Ｆａｂ’ｄｉｄｓｓｃＦｖ；
・・Ｆａｂｄａｂ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’ｄａｂ、Ｆａｂ’Ｆｖ；
・Ｆａｂ単一リンカーＦｖ（本明細書ではＷＯ２０１４／０９６３９０に開示されている通りにＦａｂｄｓＦｖとも呼ばれる）、Ｆａｂ’単一リンカーＦｖ（本明細書ではＦａｂ’ｄｓＦｖとも呼ばれる）；
・ＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ；
・ＦａｂｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ；
・ＦｖＦａｂＦｖ、ＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ｄｓＦｖＦａｂＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ、
・ＦａｂＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖＦｖ、ＦａｂＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖｄｓＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖｄｓＦｖ、
・ｄｉＦａｂ、化学的にコンジュゲートされたｄｉＦａｂ’を含むｄｉＦａｂ’、
・（ＦａｂｓｃＦｖ）２、（Ｆａｂ）２ｓｃＦｖｄｓＦｖ、（Ｆａｂ）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖ、（ＦａｂｄｓｃＦｖ）２、
・（Ｆａｂ’ｓｃＦｖ）２、（Ｆａｂ’）２ｓｃＦｖｄｓＦｖ、（Ｆａｂ’）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖ、（Ｆａｂ’ｄｓｃＦｖ）２、
・ＶＨＨＣＫ（Nunez-Prado et al in particular molecule number 6 in Fig 1 therein参照）；
・ミニボディ、ｄｓミニボディ、ｄｉｄｓミニボディ、
・ミニ抗体（ＺＩＰ）[Nunez-Prado et al in particular molecule number 7 in Fig 1 therein参照]、ｄｓミニ抗体（ＺＩＰ）及びｄｉｄｓミニ抗体（ＺＩＰ）；
・ｔｒｉｂｉ−ミニボディ[Nunez-Prado et al in particular molecule number 15 in Fig 1 therein参照]ｄｓｔｒｉｂｉ−ミニボディ、ｄｉｄｓｔｒｉｂｉ−ミニボディ、ｔｒｉｄｓｔｒｉｂｉ−ミニボディ；
・ダイアボディ−ＣＨ３、ｄｓダイアボディ−ＣＨ３、ｄｉｄｓダイアボディ−ＣＨ３、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ｄｓｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ｄｉｄｓｓｃダイアボディ−ＣＨ３、
・直列型ｓｃＦｖ−ＣＨ３、直列型ｄｓｓｃＦｖ−ＣＨ３、直列型ｄｉｄｓｓｃＦｖ−ＣＨ３、直列型ｔｒｉｄｓｓｃＦｖ−ＣＨ３、直列型ｔｅｔｒａｄｓｓｃＦｖ−ＣＨ３、
・ＷＯ２００８／０１２５４３に記載されているｓｃＦｖ−Ｆｃ（本明細書では（ｓｃＦｖＣＨ２ＣＨ３）２とも呼ばれる）及びその一本鎖バージョン、ｄｓｓｃＦｖｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｄｓｓｃＦｖ−Ｆｃ（本明細書では（ｄｓｓｃＦｖＣＨ２ＣＨ３）２とも呼ばれる）、ｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ−Ｆｃ、ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ−Ｆｃ、ｄｓＦｖ−Ｆｃ（本明細書では（ｄｓＦｖＣＨ２ＣＨ３）２とも呼ばれる）、
・スコーピオン分子（Ｔｒｕｂｉｏｎ）すなわち、米国特許第８，４０９，５７７号に記載されている結合ドメイン、リンカー−ＣＨ２ＣＨ３結合ドメイン；
・ＳＭＩＰ（Ｔｒｕｂｉｏｎ）すなわち、（ｓｃＦｖ−ＣＨ２ＣＨ３）２；
・（ｄｓＦｖＣＨ２ＣＨ３）２、直列型ｓｃＦｖ−Ｆｃ、直列型ｄｓｓｃＦｖｓｃＦｖ−Ｆｃ、直列型ｄｓｓｃＦｖ−Ｆｃ，
・ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｄｓｓｃＦｖ、
・ダイアボディ−Ｆｃ、ｄｓダイアボディ−Ｆｃ、ｄｉｄｓダイアボディ−Ｆｃ、トリアボディ−Ｆｃ、ｄｓトリアボディ−Ｆｃ、ｄｉｄｓトリアボディ−Ｆｃ、ｔｒｉｄｓトリアボディ−Ｆｃ、テトラボディ−Ｆｃ、ｄｓテトラボディ−Ｆｃ、ｄｉｄｓテトラボディ−Ｆｃ、ｔｒｉｄｓテトラボディ−Ｆｃ、ｔｅｔｒａｄｓテトラボディ−Ｆｃ、ｄｓテトラボディ−Ｆｃ、ｄｉｄｓテトラボディ−Ｆｃ、ｔｒｉｄｓテトラボディ−Ｆｃ、ｔｅｔｒａｄｓテトラボディ−Ｆｃ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ｄｓｓｃダイアボディ、ｄｉｄｓｓｃダイアボディ；
・例えば、異なる重鎖可変領域と共通の軽鎖を有する二又は三機能抗体、例えば、固定された配列の共通軽鎖と異なる重鎖（異なるＣＤＲを含む）と異なる重鎖の二量体化を推進するよう工学的に操作されたＣＨ３ドメインを有するＭｅｒｕｓ二重特異性抗体フォーマット（Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標））
・Ｄｕｏｂｏｄｙ（すなわち、抗体中の１つの完全長鎖が抗体中のもう１つの完全長鎖に対し異なる特異性を有する）；
・二重特異性フォーマットを作り出すためにＦａｂアーム交換が用いられている完全長抗体；
・完全長抗体が共通の重鎖及び異なる軽鎖を有するカッパ／ラムダボディ又はκ／λボディとも呼ばれる二又は三機能抗体で、例えば、ＷＯ２０１２／０２３０５３参照。前記特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。
・重又は軽鎖のＣ終端からのＩｇ−ｓｃＦｖ１、２、３又は４、重又は軽鎖のＮ終端からのｓｃＦｖ−Ｉｇ１、２、３又は４、単一リンカーＩｇ−Ｆｖ、重又は軽鎖のＣ終端からのＩｇ−ｄｓｓｃＦｖ１、２、３又は４（１つ、２つ、３つ又は４つのジスルフィド結合を有する）；
・重又は軽鎖のＮ終端からのＩｇ−ｄｓｓｃＦｖ１、２、３又は４（１つ、２つ、３つ又は４つのジスルフィド結合を有する）；
・Ｉｇ単一リンカーＦｖ（ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６４４５０参照）、
・Ｉｇ−ｄａｂ、ｄａｂ−Ｉｇ、ｓｃＦｖ−Ｉｇ、Ｖ−Ｉｇ、Ｉｇ−Ｖ、
・ｓｃＦａｂＦｖＦｃ、ｓｃＦａｂｄｓＦｖＦｃ（単一リンカーバージョン  ｓｃＦａｖＦｖ）、（ＦａｂＦｖＦｃ）２、（ＦａｂｄｓＦｖＦｃ）２、ｓｃＦａｂ’ＦｖＦｃ、ｓｃＦａｂ’ｄｓＦｖＦｃ、（Ｆａｂ’ＦｖＦｃ）２、（Ｆａｂ’ｄｓＦｖＦｃ）２並びに
・ＤＶＤＩｇ、下でさらに詳細に考察される。
を含む又はからなる群から選択されるなどの、本明細書に記載される多特異性フォーマットが含まれる。
【００６５】
一実施形態では、多特異性分子フォーマットには、当技術分野で公知の多特異性分子フォーマット並びに分子フォーマットが、ダイアボディ、ｓｃダイアボディ、トリアボディ、トリボディ、テトラボディ、直列型ｓｃＦｖ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、直列型ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、Ｉｇ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｉｇ、Ｖ−Ｉｇ、Ｉｇ−Ｖ、Ｄｕｏｂｏｄｙ及びＤＶＤＩｇを含む又はからなる群から選択されるなどの、本明細書に記載される多特異性分子フォーマットが含まれ、これらのフォーマットは下でさらに詳細に考察される。
【００６６】
一実施形態では、本開示の多特異性抗体分子はＦｃドメインを含まない、すなわち、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含まず、例えば、分子は直列型ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ  ｄｉｄｓＦｖ、ダイアボディ、ｄｓダイアボディ、ｄｉｄｓダイアボディ、ｓｃダイアボディ（（ｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）、ｄｓｓｃダイアボディ、トリアボディ、ｄｓトリアボディ、ｄｉｄｓトリアボディ、ｔｒｉｄｓトリアボディ、テトラボディ、ｄｓテトラボディ、ｄｉｄｓテトラボディ、ｔｒｉｄｓテトラボディ、ｔｅｔｒａｄｓテトラボディ、トリボディ、ｄｓトリボディ、ｄｉｄｓトリボディ、Ｆａｂｄａｂ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’ｄａｂ、Ｆａｂ’Ｆｖ、Ｆａｂ単一リンカーＦｖ（ＷＯ第２０１４／０９６３９０号に開示されている）、Ｆａｂ’単一リンカーＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（バイボディとも呼ばれる）、Ｆａｂ’ｓｃＦｖ、ＦａｂｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓｓｃＦｖ、ＦａｂｄｉｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ’ｄｉｄｓｓｃＦｖ、ＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、ＦａｂｄｓｓｃＦｖｓ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、ＦｖＦａｂＦｖ、ＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ｄｓＦｖＦａｂＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ、ＦａｂＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖＦｖ、ＦａｂＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖｄｓＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖｄｓＦｖ、ｄｉＦａｂ、化学的にコンジュゲートされたｄｉＦａｂ’を含むｄｉＦａｂ’、（ＦａｂｓｃＦｖ）２、（Ｆａｂ）２ｓｃＦｖｄｓＦｖ、（Ｆａｂ）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖ、（ＦａｂｄｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ｄｓミニボディ、ｄｉｄｓミニボディ、ダイアボディ−ＣＨ３、ｄｓダイアボディ−ＣＨ３、ｄｉｄｓダイアボディ−ＣＨ３、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ｄｓｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ｄｉｄｓｓｃダイアボディ−ＣＨ３、直列型ｓｃＦｖ−ＣＨ３、直列型ｄｓｓｃＦｖ−ＣＨ３、直列型ｄｉｄｓｓｃＦｖ−ＣＨ３、直列型ｔｒｉｄｓｓｃＦｖ−ＣＨ３及び直列型ｔｅｔｒａｄｓｓｃＦｖ−ＣＨ３を含む群から選択される。
【００６７】
一実施形態では、本開示の分子はＦｃドメインを含まない。
【００６８】
一実施形態では、本開示の分子は、本明細書の下に記載されている改変Ｆｃドメインを含む。
【００６９】
文脈が他の方法で明確に示していなければ、本明細書で用いられるＦｃドメインとは一般に−（ＣＨ２ＣＨ３）２のことである。
【００７０】
一実施形態では、本開示の分子は−ＣＨ２ＣＨ３断片を含まない。
【００７１】
一実施形態では、本開示の分子はＣＨ２ドメインを含まない。
【００７２】
一実施形態では、本開示の分子はＣＨ３ドメインを含まない。
【００７３】
本明細書で用いられる分子は、有機物の、特にタンパク質性の塊を形成する原子の集団を指すために生化学的な意味で使用され、この塊には、複合体が形成された後は適切な条件下で単一の実体として取り扱うのに適している複合体、例えば、２つ又はそれよりも多いポリペプチド鎖により形成される複合体が含まれる。
【００７４】
文脈が他の方法で示していなければ、分子と構築物は本明細書では互換的に使用される。しかし、構築物のほうがポリヌクレオチド分子を指すのに用いられることが多く、分子のほうが主にアミノ酸配列を含む実体を指すのに用いられることが多い。
【００７５】
本明細書で用いられる特異性（又は特異性の）とは、相互作用のパートナーが互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、バックグランドの結合レベル若しくは別の無関係なタンパク質への結合の、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【００７６】
本明細書で用いられる「結合ドメイン」とは、例えば、ドメインを抗原に対して特異的であると特徴付けられるほどの親和性で標的抗原に結合することができる結合領域、典型的にはポリペプチドのことである。
【００７７】
いかなる適切な結合ドメインも本発明の多特異性分子において使用することができる。これらのドメインはいかなる適切な供給源に由来するものでもよい。
【００７８】
一実施形態では、生体適合性フレームワーク構造が本開示の分子の結合ドメインにおいて使用され、そのような構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スキャフォールド又は骨格を基盤にしている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノステイン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｉｎ）、チトクロムｂ、ＣＰ１亜鉛フィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメイン及びテンドラミサト（ｔｅｎｄｒａｍｉｓａｔ）ドメインを基盤とする構造を使用することができる（例えば、Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469参照）。
【００７９】
本明細書で使用される用語「多特異性分子」には、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ダルピン（Ｄａｒｐｉｎｓ）、フィロマー（Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）、アプタマー、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎｓ）、ミクロボディ、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ）及びクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを含む生物学的スキャフォールドを基盤とする結合剤も含むことができる。
【００８０】
本発明の多特異性分子は典型的には多特異性抗体分子である、すなわち、多特異性分子の結合ドメインのうちの少なくとも１つ又は複数は抗体又はその断片に由来する。
【００８１】
結合ドメインが抗体に由来する場合、本明細書で用いられる「結合ドメイン又は部位」は、抗体のうち抗原と接触する部分である。一実施形態では、結合ドメインは少なくとも１つの可変ドメイン又はその誘導体、例えば、可変ドメイン又はその誘導体の同族対などの可変ドメイン又はその誘導体の対を含有する。典型的には、これはＶＨ／ＶＬ対である。
【００８２】
可変領域（本明細書では可変ドメインとも呼ばれる）は一般に、３つのＣＤＲ及び適切なフレームワークを含む。一実施形態では、結合ドメインは２つの可変領域、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、合わせてこれらのエレメントが抗体又は結合断片の結合相互作用の特異性に寄与する。
【００８３】
本明細書で用いられる「同族対」とは、予め形成されたカップルとして宿主から単離された可変ドメインの重と軽鎖対（又はそのヒト化バージョンなどのその誘導体）のことである。この定義は、宿主由来の初めの対合が保持されていないライブラリーから単離される可変ドメインを含まない。同族対は、宿主において親和性成熟していることが多いので有利であることがあり、したがって、ファージライブラリーなどのライブラリーから選択される可変ドメイン対の組合せよりも、その同族対が特異的である抗原に対する親和性が高いことがある。
【００８４】
本明細書で用いられる「天然に存在するドメインの誘導体」は、例えば、望ましくない特性を取り除くことによりなどのドメインの特性を最適化するために、天然に存在する配列中の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が置き換えられている又は欠失しているが、ドメインの特徴的な特色（単数又は複数）は保持されていることを指すことを意図している。改変の例は、グリコシル化部位、ＧＰＩアンカー、又は溶媒曝露リシンを取り除く改変である。これらの改変は、関連するアミノ酸残基を保存的アミノ酸置換で置き換えることにより達成することが可能である。
【００８５】
ＣＤＲにおける他の改変には、例えば、１つ又は複数のシステインを、例えば、セリン残基で置き換えることを含むことができる。Ａｓｎは脱アミノ化の基質になることが可能であり、この傾向はＡｓｎ及び／又は隣接するアミノ酸を保存的置換などの代わりのアミノ酸で置き換えることにより減少させることが可能である。ＣＤＲにおけるアミノ酸Ａｓｐは異性化を受けることができる。後者はＡｓｐ及び／又は隣接するアミノ酸を、代わりのアミノ酸、例えば、保存的置換で置き換えることにより最小化することが可能である。
【００８６】
可変領域のヒト化バージョンは、本明細書の文脈では、その誘導体でもある。ヒト化には、非ヒトフレームワークをヒトフレームワークに置き換えること、及び場合によって１つ又は複数の残基の「ドナー残基」への逆突然変異が含まれ得る。本明細書で用いられるドナー残基とは、宿主から単離された元の可変領域に見られる残基のことであり、特に、ヒトフレームワーク内の所与のアミノ酸をドナーフレームワークにおける対応する位置のアミノ酸に置き換える。
【００８７】
一実施形態では、結合ドメイン又はそれぞれの結合ドメインは抗体の（抗体に含まれる又は組み込まれている）一部又は抗体断片である。
【００８８】
一実施形態では、本開示の分子中の結合ドメインは免疫グロブリン／抗体分子中にある。
【００８９】
本明細書で使用されるように、「抗体分子」には抗体及びその結合断片が含まれる。
【００９０】
一実施形態では、本明細書で使用される用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位（本明細書では結合部位又は結合ドメインとも呼ばれる）を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチド等などの標的抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子のことである。
【００９１】
本明細書で用いられる「抗体断片」とは、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれらに限定されない抗体結合断片のことである（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217参照）。
【００９２】
本明細書で用いられる「結合断片」とは、断片をペプチド又は抗原に対して特異的であると特徴付けることができるほどの十分な親和性で標的ペプチド又は抗原に結合することができる断片のことである。
【００９３】
これらの抗体断片を作製し製造するための方法は当技術分野では周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181参照）。本開示で使用するための他の抗体断片には、ＷＯ０５／００３１６９、ＷＯ０５／００３１７０及びＷＯ０５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は複数の特異性体、例えば、二重特異性体を含んでいてもよく又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２、及びＷＯ２０１０／０３５０１２参照）。
【００９４】
本明細書で使用される用語「Ｆａｂ断片」とは、軽鎖（ＣＬ）のＶＬ（可変軽）ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片並びに重鎖のＶＨ（可変重）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片のことである。
【００９５】
Ｆｖとは、２つの可変ドメイン、例えば、同族対又は親和性成熟可変ドメイン、すなわち、ＶＨとＶＬ対などの協同的可変ドメインのことである。
【００９６】
本明細書で用いられる協同的可変ドメインは、互いに補完しあい及び／又は両方がＦｖ（ＶＨ／ＶＬ対）を問題の抗原に対して特異的にする抗原結合に寄与する可変ドメインである。
【００９７】
本明細書で使用される「単一ドメイン抗原」（本明細書ではｄａｂ及びｓｄＡｂとも呼ばれる）とは、単一単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片のことである。単一ドメイン抗体の例には、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが含まれる。
【００９８】
本明細書で用いられる直列型ｓｄＡｂとは、特に、ドメイン抗体が異なる抗原に対する特異性を有し、リンカー、例えば、ペプチドリンカーにより連結された２つのドメイン抗体のことである。
【００９９】
本明細書で用いられる直列型ｓｄＡｂ−ｓｄＡｂとは、特に、ドメイン抗体が異なる抗原に対する特異性を有し、２つのリンカー、例えば、ペプチドリンカーにより連続して連結された３つのドメイン抗体のことである。
【０１００】
本明細書で用いられるｄｓＦｖとは、可変内ジスルフィド結合を有するＦｖのことである。ｄｓＦｖはもっと大きな分子の成分であってよく、例えば、可変ドメインの１つは、例えば、アミノ酸リンカーを介して別の抗体断片／成分に連結され得る。
【０１０１】
本明細書で用いられる（ｄｓＦｖ）２とは、１つのドメインが、例えば、ペプチドリンカー又はジスルフィド結合を介して（例えば、２つのＶＨのＣ終端の間で）第２のｄｓＦｖ中のドメインに連結されているｄｓＦｖのことであり、フォーマットは下に記載される（ｓｃＦｖ）２に似ているが、可変領域のそれぞれの対は可変領域内ジスルフィド結合を含む。
【０１０２】
本明細書で用いられる成分とは、本開示の多特異性分子の構成要素又は部分のことであり、特に成分は、特に本明細書に記載されるｓｃＦｖ、Ｆａｂ又は他の断片などの抗体断片である。
【０１０３】
本明細書で使用される一本鎖Ｆｖ、又は「ｓｃＦｖ」として略記されるこれはとは、連結されて（例えば、ペプチドリンカーにより）単一ポリペプチド鎖を形成するＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片のことである。重及び軽鎖の定常領域はこのフォーマットでは省略されている。
【０１０４】
本明細書で用いられるｄｓｓｃＦｖとは、可変領域内ジスルフィド結合を有するｓｃＦｖのことである。
【０１０５】
本明細書で用いられる直列型ｓｃＦｖ（本明細書ではｄｉｓｃＦｖ又は（ｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）とは、例えば、図５ｂで示されるように、単一Ｆｖ間リンカーが存在するように単一リンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖのことである。
【０１０６】
本明細書で用いられる直列型ｄｓｓｃＦｖ（本明細書ではｓｃＦｖｄｓｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖｓｃＦＶとも呼ばれる）とは、例えば、図５ｂで示されるように、単一Ｆｖ間リンカーが存在するように単一リンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖのことであり、ｓｃＦｖのうちの１つは可変領域内ジスルフィド結合を有する。
【０１０７】
本明細書で用いられる直列型ｄｉｄｓｓｃＦｖ（本明細書ではｄｉｄｓｓｃＦｖとも呼ばれる）とは、例えば、図５ｂで示されるように、単一Ｆｖ間リンカーが存在するように単一リンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖのことであり、それぞれのｓｃＦｖは可変領域内ジスルフィド結合を含む。
【０１０８】
本明細書で用いられるｓｃＦｖ−ｄｓＦｖは、ジスルフィド結合を介して連結されてｄｓＦｖを形成する２つの可変ドメインを含むＦｖドメインに、例えば、ペプチドリンカーにより連結されているｓｃＦＶである。このフォーマットでは、ｓｃＦｖのＶＨ又はＶＬがｄｓＦｖのＶＨ又はＶＬに連結され得る。
【０１０９】
本明細書で用いられるｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖは、ジスルフィド結合を介して連結されてｄｓＦｖを形成する２つの可変ドメインを含むＦｖドメインに、例えば、ペプチドリンカーにより連結されているｄｓｓｃＦＶである。このフォーマットでは、ｄｓｓｃＦｖのＶＨ又はＶＬがｄｓＦｖのＶＨ又はＶＬに連結され得る。
【０１１０】
本明細書で用いられるダイアボディとは、第１のＦｖのＶＨが第２のＦｖのＶＬに連結され、第１のＦｖのＶＬが第２のＦｖのＶＨに連結されるように２つのＦｖ内リンカーを有する、２つのＦｖ対ＶＨ／ＶＬと追加のＶＨ／ＶＬ対のことである。
【０１１１】
本明細書で用いられるｄｓダイアボディとは、可変領域内ジスルフィド結合を含むダイアボディのことである。
【０１１２】
本明細書で用いられるｄｉｄｓダイアボディとは、２つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、可変領域のそれぞれの対間に１つのｄｓを含むダイアボディのことである。
【０１１３】
本明細書で用いられるＳｃ−ダイアボディとは、分子が３つのリンカーを含み、２つの正常なｓｃＦｖを形成するように、Ｆｖ内リンカー、例えば、ＶＨ１リンカーＶＬ１リンカーＶＨ２リンカーＶＬ２を含むダイアボディのことである。
【０１１４】
本明細書で用いられるｄｓｓｃ−ダイアボディとは、可変領域内ジスルフィド結合を有するｓｃ−ダイアボディのことである。
【０１１５】
本明細書で用いられるｄｉｄｓｓｃ−ダイアボディとは、可変領域のそれぞれの対間に可変領域内ジスルフィド結合を有するｓｃ−ダイアボディのことである。
【０１１６】
本明細書で用いられるＤａｒｔとは、ＶＨ１とＶＨ２のＣ終端がジスルフィド結合で連結されているＶＬ１リンカーＶＨ２リンカーとＶＨ１リンカーＶＬ２のことである。Paul A. Moore et al Blood, 2011; 117(17):4542-4551。
【０１１７】
本明細書で用いられるＢｉｔｅ（登録商標）とは、以下のフォーマット；対１由来のドメイン（例えば、ＶＨ１）がリンカーを介して対２由来のドメイン（例えば、ＶＨ２又はＶＬ２）に連結され前記第２のドメインがリンカーを介して対１由来のさらなるドメイン（例えば、ＶＬ１）に連結され、今度は対２由来の残りのドメイン（すなわち、ＶＬ２又はＶＨ２）に連結されている、で可変ドメインの２つの対を含む分子のことである。
【０１１８】
Ｄｉ−ダイアボディは、Nunez-Prado et al in particular molecule number 25 in Fig 1 thereinを参照されたい。
【０１１９】
本明細書で用いられるＤｓｄｉ−ダイアボディは、可変領域内ジスルフィド結合を有するｄｉ−ダイアボディである。
【０１２０】
本明細書で用いられるＤｉｄｓｄｉ−ダイアボディは、可変領域のそれぞれの対間に可変領域内ジスルフィド結合を有するｄｉ−ダイアボディである。
【０１２１】
本明細書で用いられるトリアボディとは、３つのＦｖと３つのＦｖ内リンカーを含むダイアボディに類似するフォーマットのことである。
【０１２２】
本明細書で用いられるｄｓトリアボディとは、可変ドメイン対のうちの１つ間に可変領域内ジスルフィド結合を含むトリアボディのことである。
【０１２３】
本明細書で用いられるＤｉｄｓトリアボディとは、２つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、２つの可変ドメイン対のそれぞれの間に１つのｄｓを含むトリアボディのことである。
【０１２４】
本明細書で用いられるＴｒｉｄｓトリアボディとは、３つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、可変領域のそれぞれの対間に１つのｄｓを含むトリアボディのことである。
【０１２５】
本明細書で用いられるテトラボディとは、４つのＦｖと４つのＦｖ内リンカーを含むダイアボディに類似するフォーマットのことである。
【０１２６】
本明細書で用いられるｄｓテトラボディとは、可変ドメイン対のうちの１つの間に可変領域内ジスルフィド結合を含むテトラボディのことである。
【０１２７】
本明細書で用いられるＤｉｄｓテトラボディとは、２つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、２つの可変ドメイン対のそれぞれの間に１つのｄｓを含むテトラボディのことである。
【０１２８】
本明細書で用いられるＴｒｉｄｓテトラボディとは、３つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、可変領域の３つの対のそれぞれの間に１つのｄｓを含むテトラボディのことである。
【０１２９】
本明細書で用いられるＴｅｔｒａｄｓテトラボディとは、４つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、それぞれの可変ドメイン間に１つのｄｓを含むテトラボディのことである。
【０１３０】
本明細書で用いられるトリボディ（Ｆａｂ（ｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）とは、第１のｓｃＦｖが軽鎖のＣ終端に付加されており第２のｓｃＦｖが重鎖のＣ終端に付加されているＦａｂ断片のことである。
【０１３１】
本明細書で用いられるｄｓトリボディとは、２つの位置のうちの１つにｄｓｓｃＦｖを含むトリボディのことである。
【０１３２】
本明細書で用いられるｄｉｄｓトリボディ又はＴｒＹｂｅとは、２つのｄｓｓＦｖを含むトリボディのことである。
【０１３３】
本明細書で用いられるｄｓＦａｂとは、可変領域内ジスルフィド結合を有するＦａｂのことである。
【０１３４】
本明細書で用いられるｄｓＦａｂ’とは、可変領域内ジスルフィド結合を有するＦａｂ’のことである。
【０１３５】
ｓｃＦａｂは一本鎖Ｆａｂ断片である。
【０１３６】
ｓｃＦａｂ’は一本鎖Ｆａｂ’断片である。
【０１３７】
ｄｓｓｃＦａｂは一本鎖としてのｄｓＦａｂである。
【０１３８】
ｄｓｓｃＦａｂ’は一本鎖としてのｄｓＦａｂ’である。
【０１３９】
本明細書で用いられるＦａｂｄａｂとは、ドメイン抗体が、場合によってリンカーを介して、その重又は軽鎖に付加されているＦａｂ断片のことである。
【０１４０】
本明細書で用いられるＦａｂ’ｄａｂとは、ドメイン抗体が、場合によってリンカーを介して、その重又は軽鎖に付加されているＦａｂ’断片のことである。
【０１４１】
本明細書で用いられるＦａｂＦｖとは、追加の可変領域が以下の重鎖のＣＨ１及び軽鎖のＣＬのそれぞれのＣ末端に付加されているＦａｂ断片のことである。例えば、ＷＯ２００９／０４０５６２を参照されたい。フォーマットはそのペグ化バージョンとして提供することができる。例えば、ＷＯ２０１１／０６１４９２を参照されたい。
【０１４２】
本明細書で用いられるＦａｂ’ＦｖはＦａｂＦｖに類似しており、Ｆａｂ部分がＦａｂ’で置き換えられている。フォーマットはそのペグ化バージョンとして提供することができる。
【０１４３】
本明細書で用いられるＦａｂｄｓＦｖとは、Ｆｖ内ジスルフィド結合が付加されたＣ末端可変領域を安定化しているＦａｂＦｖのことである。例えば、ＷＯ２０１０／０３５０１２を参照されたい。フォーマットはそのペグ化バージョンとして提供することができる。
【０１４４】
本明細書で用いられるＦａｂ単一リンカーＦｖとＦａｂ’単一リンカーとは、例えば、ペプチドリンカーによって可変ドメインに連結されているＦａｂ又はＦａｂ’断片のことであり、前記可変ドメインは可変ドメイン内ジスルフィド結合を介して第２の可変ドメインに連結されており、それによってｄｓＦｖを形成する。例えば、ＷＯ２０１４／０９６３９０を参照されたい。
【０１４５】
本明細書で用いられるＦａｂ−ｓｃＦｖ（バイボディとも呼ばれる）はｓｃＦｖが、場合によってリンカーを介して、軽又は重鎖のＣ終端上に付加されているＦａｂ分子である。
【０１４６】
本明細書で用いられるＦａｂ’−ｓｃＦｖはｓｃＦｖが、場合によってリンカーを介して、軽又は重鎖のＣ終端上に付加されているＦａｂ’分子である。
【０１４７】
本明細書で用いられるＦａｂｄｓｓｃＦｖ又はＢＹｂｅは一本鎖Ｆｖの可変領域間にジスルフィド結合を有するＦａｂｓｃＦｖである。
【０１４８】
本明細書で用いられるＦａｂ’ｄｓｓｃＦｖ又はＢＹｂｅは一本鎖Ｆｖの可変領域間にジスルフィド結合を有するＦａｂ’ｓｃＦｖである。
【０１４９】
本明細書で用いられるＦａｂｓｃＦｖ−ｄａｂとは、ｓｃＦｖが１つの鎖のＣ終端に付加されておりドメイン抗体がもう一方の鎖のＣ終端に付加されているＦａｂのことである。
【０１５０】
本明細書で用いられるＦａｂ’ｓｃＦｖ−ｄａｂとは、ｓｃＦｖが１つの鎖のＣ終端に付加されておりドメイン抗体がもう一方の鎖のＣ終端に付加されているＦａｂ’のことである。
【０１５１】
本明細書で用いられるＦａｂｄｓｓｃＦｖ−ｄａｂとは、ｄｓｓｃＦｖが１つの鎖のＣ終端に付加されておりドメイン抗体がもう一方の鎖のＣ終端に付加されているＦａｂのことである。
【０１５２】
本明細書で用いられるＦａｂ’ｄｓｓｃＦｖ−ｄａｂとは、ｄｓｓｃＦｖが１つの鎖のＣ終端に付加されておりドメイン抗体がもう一方の鎖のＣ終端に付加されているＦａｂ’のことである。
【０１５３】
本明細書で用いられるＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖとは、ＦｖのドメインがＦａｂの重又は軽鎖に連結され、ｓｃＦｖがもう一方のＦａｂ鎖に連結され、Ｆｖのドメインが可変領域内ジスルフィドにより連結されているＦａｂ単一リンカーＦｖのことである。
【０１５４】
本明細書で用いられるＦａｂｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖとは、ｓｃＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含むＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖのことである。
【０１５５】
本明細書で用いられるＦａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖとは、ＦｖのドメインがＦａｂの重又は軽鎖に連結され、ｓｃＦｖがもう一方のＦａｂ鎖に連結され、Ｆｖのドメインが可変領域内ジスルフィドにより連結されているＦａｂ’単一リンカーＦｖのことである。
【０１５６】
本明細書で用いられるＦａｂ’ｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖとは、ｓｃＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含むＦａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖのことである。
【０１５７】
本明細書で用いられるＦｖＦａｂＦｖとは、第１のＦｖのドメインがＦａｂの重及び軽鎖のＮ終端に付加されており第２のＦｖのドメインが重及び軽鎖のＣ終端に付加されているＦａｂのことである。
【０１５８】
本明細書で用いられるＦｖＦａｂ’Ｆｖとは、第１のＦｖのドメインがＦａｂ’の重及び軽鎖のＮ終端に付加されており第２のＦｖのドメインが重及び軽鎖のＣ終端に付加されているＦａｂ’のことである。
【０１５９】
本明細書で用いられるｄｓＦｖＦａｂＦｖとは、第１のＦｖのドメインがＦａｂの重及び軽鎖のＮ終端に付加されていて第１のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含み、第２のＦｖのドメインが重及び軽鎖のＣ終端に付加されているＦａｂのことである。
【０１６０】
本明細書で用いられるＦｖＦａｂｄｓＦｖとは、第１のＦｖのドメインがＦａｂの重及び軽鎖のＮ終端に付加されており、第２のＦｖのドメインが重及び軽鎖のＣ終端に付加されていて第２のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含むＦａｂのことである。
【０１６１】
本明細書で用いられるｄｓＦｖＦａｂ’Ｆｖとは、第１のＦｖのドメインがＦａｂ’の重及び軽鎖のＮ終端に付加されていて第１のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含み、第２のＦｖのドメインが重及び軽鎖のＣ終端に付加されているＦａｂ’のことである。
【０１６２】
本明細書で用いられるＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖとは、第１のＦｖのドメインがＦａｂ’の重及び軽鎖のＮ終端に付加されており、第２のＦｖのドメインが重及び軽鎖のＣ終端に付加されていて第２のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含むＦａｂ’のことである。
【０１６３】
本明細書で用いられるｄｓＦｖＦａｂｄｓＦｖとは、第１のＦｖのドメインがＦａｂの重及び軽鎖のＮ終端に付加されていて第１のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含み、第２のＦｖのドメインが重及び軽鎖のＣ終端に付加されていて第２のＦｖも可変領域内ジスルフィド結合を含むＦａｂのことである。
【０１６４】
本明細書で用いられるｄｓＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖとは、第１のＦｖのドメインがＦａｂ’の重及び軽鎖のＮ終端に付加されていて第１のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含み、第２のＦｖのドメインが重及び軽鎖のＣ終端に付加されていて第２のＦｖも可変領域内ジスルフィド結合を含むＦａｂ’のことである。
【０１６５】
本明細書で用いられるＦａｂＦｖＦｖとは、２対のＦｖが重及び軽鎖のＣ終端に連続して付加されているＦａｂ断片のことである。例えば、ＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい。
【０１６６】
本明細書で用いられるＦａｂ’ＦｖＦｖとは、２対のＦｖが重及び軽鎖のＣ終端に連続して付加されているＦａｂ’断片のことである。例えば、ＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい。
【０１６７】
本明細書で用いられるＦａｂｄｓＦｖＦｖとは、２対のＦｖが重及び軽鎖のＣ終端に連続して付加されているＦａｂ断片のことである。例えば、ＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい。ここで、Ｃ終端に直接付加している第１のＦｖ対は可変領域内ジスルフィド結合を含む
【０１６８】
本明細書で用いられるＦａｂ’ｄｓＦｖＦｖとは、２対のＦｖが重及び軽鎖のＣ終端に連続して付加されているＦａｂ’断片のことである。例えば、ＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたいここで、終端に直接付加している第１のＦｖ対は可変領域内ジスルフィド結合を含む。
【０１６９】
本明細書で用いられるＦａｂＦｖｄｓＦｖとは、２対のＦｖが重及び軽鎖のＣ終端に連続して付加されており、分子の「Ｃ」終端の第２のＦｖ対が可変領域内ジスルフィド結合を含む、Ｆａｂ断片のことである。
【０１７０】
本明細書で用いられるＦａｂ’ＦｖｄｓＦｖとは、２対のＦｖが重及び軽鎖のＣ終端に連続して付加されており、分子の「Ｃ」終端の第２のＦｖ対が可変領域内ジスルフィド結合を含む、Ｆａｂ’断片のことである。
【０１７１】
本明細書で用いられるＦａｂｄｓＦｖｄｓＦｖとは、２対のＦｖが重及び軽鎖のＣ終端に連続して付加されており、第１と第２のＦｖ対が可変領域内ジスルフィド結合を含む、Ｆａｂ断片のことである。
【０１７２】
本明細書で用いられるＦａｂ’ｄｓＦｖｄｓＦｖとは、２対のＦｖが重及び軽鎖のＣ終端に連続して付加されており、第１と第２のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含む、Ｆａｂ’断片のことである。
【０１７３】
本明細書で用いられるＤｉＦａｂとは、重鎖のＣ末端を介して連結されている２つのＦａｂ分子のことである。
【０１７４】
本明細書で用いられるＤｉＦａｂ’とは、そのヒンジ領域において１つ又は複数のジスルフィド結合を介して連結されている２つのＦａｂ’分子のことである。
【０１７５】
ＤｉＦａｂ及びＤｉＦａｂ’分子はその化学的にコンジュゲートされた形態を含む。
【０１７６】
本明細書で用いられる（ＦａｂｓｃＦｖ）２とは、２つのｓｃＦｖがそこに付加されている、例えば、重鎖などの重又は軽鎖のＣ末端に付加されているｄｉＦａｂ分子のことである。
【０１７７】
本明細書で用いられる（Ｆａｂ’ｓｃＦｖ）２とは、２つのｓｃＦｖがそこに付加されている、例えば、重鎖などの重又は軽鎖のＣ末端に付加されているｄｉＦａｂ’分子のことである。
【０１７８】
本明細書で用いられる（Ｆａｂ）２ｓｃＦｖｄｓＦｖとは、例えば、重鎖Ｃ終端のそれぞれから１つ、ｓｃＦｖとｄｓＦｖが付加されているｄｉＦａｂのことである。
【０１７９】
本明細書で用いられる（Ｆａｂ’）２ｓｃＦｖｄｓＦｖとは、例えば、重鎖Ｃ終端のそれぞれから１つ、ｓｃＦｖとｄｓＦｖが付加されているｄｉＦａｂ’のことである。
【０１８０】
本明細書で用いられる（Ｆａｂ）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖとは、例えば、重鎖Ｃ終端から、ｄｓｓｃＦｖとｄｓＦｖが付加されているｄｉＦａｂのことである。
【０１８１】
本明細書で用いられる（Ｆａｂ’）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖとは、例えば、重鎖Ｃ終端から、ｄｓｓｃＦｖとｄｓＦｖが付加されているｄｉＦａｂ’のことである。
【０１８２】
本明細書で用いられるミニボディとは（ＶＬ／ＶＨ−ＣＨ３）２のことである。
【０１８３】
本明細書で用いられるｄｓミニボディとは、１つのＶＬ／ＶＨが可変領域内ジスルフィド結合を含む（ＶＬ／ＶＨ−ＣＨ３）２のことである。
【０１８４】
本明細書で用いられるｄｉｄｓミニボディとは（ｄｓＦｖ−ＣＨ３）２のことである。
【０１８５】
本明細書で用いられるｓｃＦｖ−Ｆｃとは、分子が２つの結合ドメインを有するように、定常領域断片−（ＣＨ２ＣＨ３）のＣＨ２ドメインのＮ終端に、例えば、ヒンジを介して付加されているｓｃＦｖのことである。
【０１８６】
本明細書で用いられるｄｓｓｃＦｖ−Ｆｃとは、分子が２つの結合ドメインを有するように、例えば、ヒンジを介して、定常領域断片−（ＣＨ２ＣＨ３）２のＣＨ２ドメインのＮ終端に付加されたｄｓｓｃＦｖと第２のＣＨ２ドメインのＮ終端に付加されているｓｃＦｖのことである。
【０１８７】
本明細書で用いられるｄｉｄｓｓｃＦｖ−Ｆｃとは、分子が２つの結合ドメインを有するように、定常領域断片−（ＣＨ２ＣＨ３）２のＣＨ２ドメインのＮ終端に、例えば、ヒンジを介して付加されているｓｃＦｖのことである。
【０１８８】
本明細書で用いられる直列型ｓｃＦｖ−Ｆｃとは、分子が４つの結合ドメインを有するように、それぞれ１つが定常領域断片−（ＣＨ２ＣＨ３）のＣＨ２ドメインのＮ終端に、例えば、ヒンジを介して連続して付加されている２つの直列型ｓｃＦｖのことである。
【０１８９】
本明細書で用いられるｓｃダイアボディ−Ｆｃは、それぞれ１つが定常領域断片−ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に、例えば、ヒンジを介して付加されている２つのｓｃダイアボディである。
【０１９０】
本明細書で用いられるＳｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖとは、それぞれのうちの１つが−ＣＨ２ＣＨ３断片の重鎖と軽鎖の両方のＮ末端とＣ末端に付加されている４つのｓｃＦｖのことである。
【０１９１】
本明細書で用いられるｓｃダイアボディ−ＣＨ３とは、例えば、ヒンジを介してＣＨ３ドメインにそれぞれが連結されている２つのｓｃダイアボディ分子のことである。
【０１９２】
カッパ／ラムダボディ又はκ／λボディは、２つの重鎖と２つの軽鎖を有する正常なＩｇＧのフォーマットであり、２つの軽鎖は互いに異なっており、１つはラムダ軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）でありもう１つはカッパ軽鎖（ＶＫ−ＣＫ）である。重鎖はＷＯ２０１２／０２３０５３に記載されるＣＤＲにおいてさえ、同一である。
【０１９３】
本明細書で用いられるＩｇＧ−ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＣ末端にある完全長抗体である。
【０１９４】
本明細書で用いられるｓｃＦｖ−ＩｇＧは、ｓｃＦｖが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＮ末端にある完全長抗体である。
【０１９５】
本明細書で用いられるＶ−ＩｇＧは、可変ドメインが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＮ末端にある完全長抗体である。
【０１９６】
本明細書で用いられるＩｇＧ−Ｖは、可変ドメインが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＣ末端にある完全長抗体である。
【０１９７】
ＤＶＤ−Ｉｇ（デュアルＶドメインＩｇＧとしても知られる）は、それぞれの重鎖及びそれぞれの軽鎖のＮ末端に１つ、４つの付加的可変領域を有する完全長抗体である。
【０１９８】
本明細書で用いられるＤｕｏｂｏｄｙ又は「Ｆａｂ−ａｒｍ交換」は、２つの異なるモノクローナル抗体の定常領域（典型的にはＣＨ３）においてマッチドした相補的な工学的に操作されたアミノ酸変化が、混合するとヘテロ二量体の形成をもたらす二重特異性ＩｇＧフォーマット抗体である。第１の抗体由来の重：軽鎖対は、残基の工学的操作の結果、第２の抗体の重：軽鎖対と会合するほうを好む。例えば、ＷＯ２００８／１１９３５３、ＷＯ２０１１／１３１７４６、及びＷＯ２０１３／０６０８６７を参照されたい。
【０１９９】
本発明の多特異性分子中の１つ又は複数対の可変領域がＶＨとＶＬの間にジスルフィド結合を含む場合、これは、下に収載されている残基のうちの２つの間などの任意の適切な位置にあり得る（文脈が他の方法で示していない限り、Ｋａｂａｔ番号付けが下の一覧表では用いられている）。Ｋａｂａｔ番号付けを参照する場合はどこでも、関連文献はKabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USAである。
【０２００】
一実施形態では、ジスルフィド結合は、
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ、例えば、Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)参照；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００、例えば、Biochemistry 33 5451-5459 Reiter et al (1994);又はJournal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 pp.18327-18331 Reiter et al (1994);又はProtein Engineering, vol.10 no.12 pp.1453-1459 Rajagopal et al (1997)参照；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、例えば、J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995)参照；
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７、例えば、Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)参照；
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、例えば、FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)参照；
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０、例えば、Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990)参照；
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６、例えば、Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)参照；
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６；
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993);又はProteins 19, 35-47 Jung et al (1994)参照,
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、例えば、FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)参照
及び分子中に位置している可変領域対においてそれに対応する位置、
を含む群から選択される位置にある。
【０２０１】
一実施形態では、ジスルフィド結合はＶＨ４４位とＶＬ１００位の間で形成される。
【０２０２】
本明細書で用いられる「単一特異性の」とは、標的抗原に１度だけ結合する能力のことである。したがって、一実施形態では、本発明の多特異性分子は抗原ごとに単一特異性である。
【０２０３】
したがって、一実施形態では、本開示に従った多特異性分子の結合ドメインは単一特異性である。これはいくつかの治療応用では有利である。なぜならば、本開示の分子は１度よりも多く標的抗原に結合することにより抗原に架橋結合することができないからである。したがって、一実施形態では、本開示の二重特異性又は多特異性分子は、例えば、同じ細胞上で又は２つの異なる細胞上で、２つの異なる位置で同じ標的に２度結合することにより架橋結合することはできない。
【０２０４】
特に、同じ細胞又は異なる細胞上のＣＤ７９ｂとの関連での架橋結合は、例えば、標的抗原の活性を刺激するシグナルをｉｎ  ｖｉｖｏで発生させることが可能である。
【０２０５】
別の実施形態では、例えば、本開示の分子が少なくとも３つの結合ドメインを含む場合、２つ又は３つの結合ドメイン（例えば、抗体、断片又は抗体と断片の組合せ）は、例えば、２つ又は３つの異なる標的抗原に結合する異なる抗原特異性を有することができる。
【０２０６】
一例では、本発明の多特異性分子は、ＣＤ２２に対する結合ドメインを１つ以下及びＣＤ７９に対する結合ドメインを１以下だけ含有する。それぞれの結合ドメインは単一特異性である。
【０２０７】
一実施形態では、本開示の多特異性分子中で用いられるそれぞれの抗体又は抗体断片は一価である。
【０２０８】
したがって、一実施形態では、本開示の多特異性分子の結合ドメインは一価である。
【０２０９】
したがって、一実施形態では、本開示の多特異性分子の結合ドメインは一価であり単一特異性である。
【０２１０】
一実施形態では、本開示の多特異性分子は、例えば、本明細書の上に記載されるように、多特異性分子を構築するのに適したいかなる方法でも組み合わされる又は連結される、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆｖ、ｄｓＦｖなどの２つ又はそれよりも多い単一特異性、一価結合ドメインを含む。
【０２１１】
定常領域
本開示の多特異性分子の抗体定常領域ドメインは、存在するとすれば、多特異性抗体分子の提唱される機能、及び、特に、必要とされる場合があるエフェクター機能を考慮して選択することができる。例えば、定常領域ドメインはヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療的使用を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされるときは、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。代わりに、抗体分子が治療目的を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされないときは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。
【０２１２】
これらの定常領域ドメインの配列変異体も使用できることは認識されるであろう。例えば、Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108に記載されている２４１位のセリンがプロリンに交換されているＩｇＧ４分子を使用することができる。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態では、抗体は変異Ｓ２４１Ｐを含むことができる。
【０２１３】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン、カッパ又はラムダのいずれかを含む。
【０２１４】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン、カッパ又はラムダのいずれかを含む。
【０２１５】
４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化させるＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、及び異なる親和性を有する補体（Ｃ１ｑ）の第１の成分に結合し、非常に異なったエフェクター機能を生じる（Bruhns P. et al., 2009.  Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses. Blood. 113(16):3716-25）。Jeffrey B. Stavenhagen, et al. Cancer Research 2007 Sep 15; 67(18):8882-90も参照されたい。
【０２１６】
ＦｃγＲ又はＣ１ｑへのＩｇＧの結合はヒンジ領域及びＣＨ２ドメインに位置する残基に依拠する。ＣＨ２ドメインの２つの領域はＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合に極めて重要であり、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４に独特の配列を有する。ＩｇＧ２残基を２３３位〜２３６位で、並びにＩｇＧ４残基を３２７位、３３０位及び３３１位でヒトＩｇＧ１に代入するとＡＤＣＣ及びＣＤＣを大いに減少させることが明らかにされている（Armour KL. et al., 1999.  Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 29(8):2613-24 and Shields RL. et al., 2001.  High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 276(9):6591-604）。さらに、Idusogieらは、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換は補体活性化を著しく低下させることを実証した（Idusogie EE. et al., 2000. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc. J Immunol. 164(8):4178-84）。同様に、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ２ドメインでの突然変異はＦｃγＲＩ及びＣ１ｑへの結合を減少させることが明らかにされた（Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J Immunol. 155(3):1165- 74）。
【０２１７】
一実施形態では、用いられるＦｃ領域は突然変異されており、特に本明細書に記載される突然変異である。一実施形態では、突然変異は結合及び／又はエフェクター機能を取り除くことである。
【０２１８】
一実施形態では、Ｆｃ突然変異は、Ｆｃ領域の結合を取り除くための突然変異、エフェクター機能を増加させる又は取り除くための突然変異、半減期を増やすための突然変異及びそれらの組合せを含む群から選択される。
【０２１９】
ｐＨ７．４ではなくｐＨ６．０でＦｃＲｎに選択的に結合する一部の抗体は、種々の動物モデルにおいてより高い半減期を示す。Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279(8):6213-6）及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nat Biotechnol. 23(10):1283-8）などのＣＨ２とＣＨ３ドメインの間のインターフェイスに位置するいくつかの突然変異は、ＦｃＲｎへの結合親和性及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＩｇＧ１の半減期を増加させることが明らかにされている。
【０２２０】
しかし、いつもＦｃＲｎ結合の増加と半減期の改善の間に直接的関係があるわけではない（Datta-Mannan A. et al., 2007. Humanized IgG1 Variants with Differential Binding Properties to the Neonatal Fc Receptor: Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates. Drug Metab. Dispos. 35: 86 - 94）。
【０２２１】
ＩｇＧ４サブクラスはＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合の減少を示し、他のＩｇＧサブクラスの抗体は一般に強い結合を示す。これら他のＩｇＧサブタイプにおける受容体結合の減少は、変える、例えば、Ｐｒｏ２３８、Ａｐｓ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２７０（Ｆｃ炭水化物の消失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５を含む群から選択される１つ又は複数のアミノ酸を置き換えることにより成し遂げられる。
【０２２２】
一実施形態では、本開示に従った分子は、ＩｇＧサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３のＦｃを有しており、Ｆｃは１つ、２つ又はすべての以下のＳ２２８位、Ｌ２３４位及び／又はＤ２６５位で突然変異している。
【０２２３】
一実施形態では、Ｆｃ領域の突然変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ及びその組合せから独立して選択される。
【０２２４】
Ｆｃ領域のエフェクター機能を減少させる又は増加させるのが望ましいことがある。エフェクター機能を抑制する細胞表面分子、特に免疫細胞上の分子を標的とする抗体が必要とされる。いくつかの実施形態では、例えば、自己免疫の処置のために、負のＦｃ受容体結合（ＦｃｇＲＩＩｂ又はＣＤ３２ｂ）を増加させることによる免疫細胞上へのＦｃ結合の増強が望ましいことがある。Stavenhagen JB, et al Advances in Enzyme Regulation 2007 December 3 and Veri MC, et al. Arthritis Rheum, 2010 Mar 30;62(7):1933-43を参照されたい。逆に、腫瘍学使用を意図した抗体では、エフェクター機能を増加させると治療活性を改善することができる。
【０２２５】
ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインでは数多くの突然変異が作られＡＤＣＣ及びＣＤＣに対するその効果がｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験された（Idusogie EE. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J Immunol. 166(4):2571-5）。とりわけ、３３３位でのアラニン置換はＡＤＣＣとＣＤＣの両方を増加させることが報告された。Lazarらは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性が高まりＦｃγＲＩＩｂに対する親和性が低下してＡＤＣＣを増強する三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）を記載した（Lazar GA. et al., 2006. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. PNAS 103(11): 4005-4010）。同じ突然変異を使用してＡＤＣＣが増加する抗体が産生された（Ryan MC. et al., 2007. Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasma cells. Mol. Cancer Ther., 6: 3009 - 3018）。Richardsらは、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ親和性及びマクロファージによる標的細胞の増強された食作用を媒介するＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比を有するわずかに異なる三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ）を研究した（Richards JO et al 2008. Optimization of antibody binding to Fcgamma RIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther. 7(8):2517-27）。
【０２２６】
エフェクター機能が欠如しているせいで、ＩｇＧ４抗体は細胞枯渇なしの受容体遮断に適したＩｇＧサブクラスを表す。ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂアーム交換と名付けられた動的過程で半分子を交換することが可能である。この現象は治療抗体と内在性ＩｇＧ４の間で起こることが可能である。Ｓ２２８Ｐ突然変異は、この組換え過程を妨げて予測不可能性が少ない治療ＩｇＧ４抗体の設計を可能にすることが明らかにされている（Labrijn AF. et al., 2009. Therapeutic IgG4 antibodies engage in Fab-arm exchange with endogenous human IgG4 in vivo. Nat Biotechnol. 27(8):767-71）。この技術を用いれば二重特異性抗体分子を作製することができる。
【０２２７】
抗体は種々の翻訳後修飾を受けることができることも当業者であれば理解するであろう。これらの修飾の種類及び程度は多くの場合、抗体を発現するのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に依拠する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化の変動が含まれる場合がある。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基残基（リシン又はアルギニンなどの）の喪失である（Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に記載されている）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リシンは非存在でもよい。
【０２２８】
親和性
本発明の多特異性分子は抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメイン並びに抗原ＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメインを含む。
【０２２９】
一実施形態では、本開示の分子中で用いられる結合ドメインはＣＤ４５に特異的である。
【０２３０】
一実施形態では、本開示の分子中で用いられる結合ドメインはＣＤ７９ａに特異的である。
【０２３１】
一実施形態では、本開示の分子中で用いられる結合ドメインはＣＤ７９ｂに特異的である。
【０２３２】
一実施形態では、本開示の分子中で用いられる結合ドメインはＣＤ７９複合体に特異的である、すなわち、結合ドメインは複合体中に存在しそれに特異的なエピトープ、例えば、ＣＤ７９ａとＣＤ７９ｂの間の相互作用を含むエピトープを認識する。
【０２３３】
ＣＤ４５（ＰＴＰＲＣとしても知られる）は既知のタンパク質である。ＣＤ４５はタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーである。ＰＴＰは、細胞成長、分化、有糸分裂周期、及び癌化を含む種々の細胞過程を調節するシグナル伝達分子であることが知られている。このＰＴＰは細胞外ドメイン、単一膜貫通セグメント及び２つの直列型細胞質内触媒領域を含有し、したがって受容体型ＰＴＰに属する。ＣＤ４５の種々のアイソフォーム；ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）が存在する。ＣＤ４５ＲＡはナイーブＴ細胞上に位置しておりＣＤ４５ＲＯは記憶Ｔ細胞上に位置している。ＣＤ４５スプライスバリアントアイソフォームＡ、Ｂ及びＣはヒトＢ細胞上で差次的に発現される。ＣＤ４５はタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーであり、その細胞内（ＣＯＯＨ−終端）領域は２つのＰＴＰ触媒ドメインを含有し、細胞外領域はエキソン４、５、及び６（それぞれＡ、Ｂ、及びＣと命名されている）の選択的スプライシング及び異なるレベルのグリコシル化のせいで極めて可変性である。検出されるＣＤ４５アイソフォームは、細胞型−、成熟、及び活性化状態−特異性である。一般に、長い形態のタンパク質（Ａ、Ｂ又はＣ）はナイーブ又は不活性化Ｂ細胞上で発現され成熟又は切断型のＣＤ４５（ＲＯ）は活性化された又は成熟／記憶Ｂ細胞上で発現される。
【０２３４】
ヒト配列はＵｎｉＰｒｏｔエントリーナンバーＰ０８５７５で入手可能であり、本明細書では配列番号１４３、又はシグナルペプチドを欠く配列番号１４３のアミノ酸２４〜１３０４で提供される。マウスバージョンはＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ０６８００である。本開示は、任意の種由来のあらゆる形態のＣＤ４５に関する。一実施形態では、ＣＤ４５とはヒト型のタンパク質並びにその天然の変異体及びアイソフォームのことである。
【０２３５】
一実施形態では、本開示の分子中の結合ドメインのＣＤ４５に対する親和性は約１００ｎＭ、又は約５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ又はそれよりも強いなどのそれよりも強い、特に５０ｐＭ又はそれよりも強い結合親和性である。
【０２３６】
ＣＤ７９に対する結合ドメインはＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに結合することができる。
【０２３７】
ＣＤ７９ａ（免疫グロブリンアルファ及びＢ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖としても知られる）は既知のタンパク質である。ＣＤ７９ａの発現はＢリンパ球に限定されている。ヒト配列はＵｎｉＰｒｏｔにおいてエントリーＰ１１９１２下で入手可能である（配列番号及びシグナル配列なしでは配列番号１４１のアミノ酸３３〜２２６）。マウスバージョンはＵｎｉＰｒｏｔにおいてエントリーＰ１１９１１下で入手可能である。本開示は、任意の種由来のあらゆる形態のＣＤ７９ａ、特にそのヒト及び任意の天然の変異体に関する。一実施形態では、ＣＤ７９ａとはヒト型のタンパク質のことである。
【０２３８】
ＣＤ７９ｂ（免疫グロブリン関連ベータ及びクラスター分化７９Ｂとしても知られる）は既知のタンパク質である。ＣＤ７９ｂの発現はＢリンパ球に限定されている。ヒト配列はＵｎｉＰｒｏｔにおいてエントリーＰ４０２５９下で入手可能である（配列番号１４２及びシグナル配列なしでは配列番号１４２のアミノ酸２９〜２２９）。マウスバージョンはＵｎｉＰｒｏｔにおいてエントリーＰ１５５３０下である。本開示は、任意の種由来のあらゆる形態のＣＤ７９ｂ、特にそのヒト及び任意の天然の変異体に関する。一実施形態では、ＣＤ７９ｂとはヒト型のタンパク質のことである。
【０２３９】
一実施形態では、ＣＤ７９に特異的な結合ドメインはＣＤ７９ａに結合する。
【０２４０】
一実施形態では、ＣＤ７９に特異的な結合ドメインはＣＤ７９ｂに結合する。
【０２４１】
一実施形態では、ＣＤ７９に特異的な結合ドメインはＣＤ７９ａとＣＤ７９ｂの複合体に結合する。
【０２４２】
一実施形態では、本開示の分子中の結合ドメインのＣＤ７９に対する親和性は約１００ｎＭ、又は約５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ又はそれよりも強いなどのそれよりも強い、特に５０ｐＭ又はそれよりも強い結合親和性である。
【０２４３】
一実施形態では、本開示の分子中の結合ドメインのＣＤ７９ａに対する親和性は約１００ｎＭ、又は約５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ又はそれよりも強いなどのそれよりも強い、特に５０ｐＭ又はそれよりも強い結合親和性である。
【０２４４】
一実施形態では、本開示の分子中の結合ドメインのＣＤ７９ｂに対する親和性は約１００ｎＭ、又は約５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ又はそれよりも強いなどのそれよりも強い、特に５０ｐＭ又はそれよりも強い結合親和性である。
【０２４５】
ＣＤ４５に対する結合ドメインの親和性はＣＤ７９に対する結合ドメインの親和性と同じである又は異なっていることもあることは認識されるであろう。
【０２４６】
一実施形態では、本開示の多特異性抗体分子又はその抗体／断片成分は処理されて、標的抗原（単数又は複数）に対する改善された親和性を提供する。そのような変異体は、ＣＤＲを突然変異する（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発菌種の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャフリング（Patten et al Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）及び性的ＰＣＲ（Crameri et al Nature, 391, 288-291, 1998）を含むいくつかの親和性成熟プロトコルにより得ることが可能である。Vaughanら（上記）は親和性成熟のこれらの方法を考察している。
【０２４７】
抗体及び抗体の産生
本発明において使用するための結合ドメインは、当技術分野で公知の任意の適切な方法により産生することができる。例えば、ＣＤＲは市販の抗体を含む非ヒト抗体から採取し、ヒトフレームワークに移植することができる又は代わりにキメラ抗体を非ヒト可変領域とヒト定常領域等を用いて調製することが可能である。
【０２４８】
典型的には、本発明において使用するための結合ドメインは、ＣＤ４５、ＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに結合する抗体などの選択された抗原に結合する抗体由来の結合ドメインである。
【０２４９】
ＣＤ４５及びＣＤ７９抗体の例は当技術分野では公知であり、これらの抗体は本発明の分子中に直接用いる又は本明細書に記載される方法を使用して適合性についてスクリーニングし、それに続いて、必要な場合には本明細書に記載される方法を使用して改変する、例えば、ヒト化することができる。治療抗ＣＤ４５及び抗ＣＤ７９抗体は当技術分野で記載されており、例えば、抗ＣＤ４５抗体は米国特許出願公開第２０１１／００７６２７０号に開示され、抗ＣＤ７９ｂ抗体はＷＯ２０１４／０１１５２１及びＷＯ２０１５／０２１０８９に開示されている。
【０２５０】
ＣＤ４５抗体の例には、ラットモノクローナルＹＴＨ５４、ＹＴＨ２５．４、Ｍｉｌｔｅｎｙｉクローン５Ｂ１及びクローン３０Ｆ１１由来のマウスモノクローナル、ラットモノクローナルＹＡＭＬ５６８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製マウスモノクローナルクローン２Ｄ１カタログ番号３４７４６０、Ｎｏｖｕｓ社製マウスモノクローナル抗体５Ｄ３Ａ３カタログ番号ＮＢＰ２−３７２９３、マウスモノクローナルＨＩ３０カタログ番号ＮＢＰ１−７９１２７、マウスモノクローナル４Ａ８Ａ４Ｃ７Ａ２カタログ番号ＮＢＰ１−４７４２８、マウスモノクローナル２Ｂ１１カタログ番号ＮＢＰ２−３２９３４、ラットモノクローナルＹＴＨ２４．５カタログ番号ＮＢ１００−６３８２８、ウサギモノクローナルＹ３２１カタログ番号ＮＢ１１０−５５７０１、マウスモノクローナルＰＤ７／２６／１６カタログ番号ＮＢ１２０−８７５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製クローンＢ８由来マウスモノクローナルカタログ番号ｓｃ−２８３６９、クローンＦ１０−８９−４由来マウスモノクローナルカタログ番号ｓｃ−５２４９０、クローンＨ−２３０由来ウサギモノクローナルカタログ番号ｓｃ−２５５９０、クローンＮ−１９由来ヤギモノクローナルカタログ番号ｓｃ−１１２３、クローンＯＸ１由来マウスモノクローナルカタログ番号ｓｃ−５３０４５、ラットモノクローナル（Ｔ２９／３３）カタログ番号ｓｃ−１８９０１、ラットモノクローナル（ＹＡＭＬ  ５０１．４）カタログ番号ｓｃ６５３４４、ラットモノクローナル（ＹＴＨ８０．１０３）カタログ番号ｓｃ−５９０７１、マウスモノクローナル（３５１Ｃ５）カタログ番号ｓｃ−５３２０１、マウスモノクローナル（３５−Ｚ６）カタログ番号ｓｃ−１１７８、マウスモノクローナル（１５８−４Ｄ３）カタログ番号ｓｃ−５２３８６、マウスモノクローナルＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨ−Ｌ１）カタログ番号ｓｃ−１１８３、マウスモノクローナルＣＤ４５ＲＯ（２Ｑ１３９２）カタログ番号ｓｃ−７０７１２が含まれる。
【０２５１】
ＣＤ４５抗体はＷＯ２００５／０２６２１０、ＷＯ０２／０７２８３２及びＷＯ２００３／０４８３２７にも開示されており、これら特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５２】
市販の抗ＣＤ７９ａ抗体には、クローンＨＭ５７由来のマウスモノクローナルＬＳ−Ｂ４５０４（ＬＳＢｉｏ）、マウスモノクローナルＬＳ−Ｂ８３３０、マウスモノクローナルＬＳ−Ｃ４４９５４、ウサギモノクローナルＬＳ−Ｂ９０９３、クローンＪＣＢ１１７由来のマウスモノクローナルＬＳ−Ｂ８５１３、クローンＳＰ１８由来のウサギモノクローナルＬＳ−Ｃ２１０６０７、クローン５Ｅ２由来のマウスモノクローナルＬＳ−Ｃ１７５４４１、クローン３Ｄ３由来のマウスモノクローナルＬＳ−Ｃ３３８６７０、クローンＨＭ４７／Ａ９由来のマウスモノクローナルＬＳ−Ｃ８８１２０、マウスモノクローナルＬＳ−Ｃ１９１７１４、マウスモノクローナルＬＳ−Ｃ８７５９２、マウスモノクローナルＬＳ−Ｃ４４９５５、マウスモノクローナルＬＳ−Ｃ９５９３４、マウスモノクローナルＬＳ−Ｃ１２１５８４、マウスモノクローナルＬＳ−Ｃ１２１５８５、マウスモノクローナルＬＳ−Ｃ２０４３４７、マウスモノクローナルＬＳ−Ｃ８８１２２、Ａｂｃａｍマウスモノクローナルａｂ３１２１［ＨＭ４７／Ａ９］、ウサギモノクローナルａｂ７９４１４、及びウサギモノクローナルａｂ１３３４８３が含まれる。
【０２５３】
市販のＣＤ７９ｂ抗体には、マウスモノクローナルＡｂｃａｍ抗体ａｂ３３２９５、ラットモノクローナルａｂ２３８２６、マウスモノクローナルａｂ１０３４２２、ウサギモノクローナルａｂ１３４１０３、ウサギモノクローナルａｂ１３４１４７、及びウサギモノクローナルａｂ１８３３４３が含まれる。
【０２５４】
そのような市販の抗体は治療抗体の発見に有用なツールになり得る。
【０２５５】
当業者であれば、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して本発明の多特異性分子で使用するための抗体を産生することができる。
【０２５６】
抗体産生で使用するための、例えば、宿主を免疫化するのに使用するための、又はファージディスプレイにおいてなどのパニングにおいて使用するための抗原ポリペプチドは、当技術分野では周知の工程により発現系を含む遺伝的に操作された宿主細胞から調製してもよいし、又は抗原ポリペプチドは天然の生物供給源から回収してもよい。本出願では、用語「ポリペプチド」には、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が含まれる。これらの用語は他の方法で明示されていなければ互換的に使用される。抗原ポリペプチドはいくつかの例では、例えば、アフィニティータグ又は類似のものに融合された融合タンパク質などのもっと大きなタンパク質の一部であってもよい。一実施形態では、宿主は、関連タンパク質又はポリペプチドをトランスフェクトされた、例えば、ＣＤ７９ａとＣＤ７９ｂを共トランスフェクトされた細胞を用いて免疫化することができる。
【０２５７】
抗原ポリペプチドに対して産生された抗体は、動物の免疫化が必要な場合には、周知でルーチンなプロトコルを使用して動物、好ましくは非ヒト動物にポリペプチドを投与することにより得ることができる。例えば、Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタなどの多くの温血動物を免疫化することができる。しかし、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが一般には非常に適している。
【０２５８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法（Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor et al 1983, Immunology Today, 4:72）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985）などの当技術分野で公知の任意の方法により調製することができる。
【０２５９】
抗体は、例えば、Babcook, J. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l; ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７により記載されている方法により特定の抗体の産生のために選択された単一リンパ球から得た免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし発現させることにより、単一リンパ球抗体法を使用して産生することもできる。
【０２６０】
本開示において使用するための抗体は当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して産生することも可能であり、Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280)並びにＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及び米国特許第５，６９８，４２６号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，７５０，７５３号；米国特許第５，８２１，０４７号；米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，５１６，６３７号；米国特許第５，７８０，２２５号；米国特許第５，６５８，７２７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第５，９６９，１０８号、及びＷＯ２００１１／３０３０５により開示された抗体が含まれる。
【０２６１】
一例では、本開示の多特異性分子は完全にヒトであり、特に可変ドメインのうちの１つ又は複数は完全にヒトである。
【０２６２】
完全にヒト分子は、重と軽鎖の両方の可変領域と定常領域（存在する場合には）がすべてヒト起源である、又は必ずしも同じ抗体由来ではないヒト起源の配列に実質的に同一である分子である。完全にヒト抗体の例には、例えば、上記のファージディスプレイ法により産生される抗体並びに、例えば、欧州特許第０５４６０７３号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、欧州特許第０４３８４７４号及び欧州特許第０４６３１５１号において一般用語で記載されているように、マウス免疫グロブリン可変及び場合によっては定常領域遺伝子がそのヒト相当物により置き換えられているマウスにより産生される抗体が含まれ得る。
【０２６３】
一例では、本開示に従った多特異性分子の結合ドメインはヒト化される。
【０２６４】
本明細書で用いられるヒト化（ＣＤＲグラフト抗体を含む）とは、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する分子のことである（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；ＷＯ９１／０９９６７参照）。全ＣＤＲよりむしろＣＤＲの特異性決定残基を移すだけでよいことは認識されるであろう（例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34参照）。ヒト化抗体は、場合によって、ＣＤＲが由来する非ヒト種由来の１つ又は複数のフレームワーク残基をさらに含んでいてもよい。
【０２６５】
本明細書で使用されるように、用語「ヒト化抗体分子」とは、重及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重及び／又は軽鎖可変領域フレームワークに移植されたドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の１つ又は複数のＣＤＲ（必要に応じて１つ又は複数の改変ＣＤＲを含む）を含有する抗体分子のことである。概説は、Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998を参照されたい。一実施形態では、全ＣＤＲを移すよりむしろ、本明細書の上に記載されるＣＤＲのうちのいずれか１つ由来の特異性決定残基のうちの１つ又は複数のみがヒト抗体フレームワークに移される（例えば、Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34参照）。一実施形態では、本明細書の上に記載されるＣＤＲのうちの１つ又は複数由来の特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移される。別の実施形態では、本明細書の上に記載されるＣＤＲのそれぞれ由来の特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移される。
【０２６６】
ＣＤＲ又は特異性決定残基が移植されると、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含むＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／種類を考慮していかなる適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列でも使用することができる。適切には、本発明に従ったヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域並びに本明細書で提供されるＣＤＲのうちの１つ又は複数を含む可変ドメインを有する。
【０２６７】
本開示において使用することが可能なヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Kabat et al上記）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に使用することが可能であり、ＲＥＩは軽鎖に使用することが可能であり、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖と軽鎖の両方に使用することが可能である。代わりに、ヒト生殖系列配列を使用してもよい。これらの配列はhttp://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.phpで入手可能である。
【０２６８】
本開示のヒト化抗体分子では、アクセプター重及び軽鎖は必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、必要に応じて、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含むことができる。
【０２６９】
フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と全く同じ配列を有する必要はない。例えば、普通でない残基は、そのアクセプター鎖クラス又は種類ではもっと頻繁に存在する残基に交換することができる。代わりに、アクセプターフレームワーク領域における選択された残基は、ドナー抗体における同じ位置に見出される残基と一致するように変えることができる（Reichmann et al 1998, Nature, 332, 323-324参照）。そのような変化はドナー抗体の親和性を回復するのに必要最小限にとどめるべきである。変える必要があるアクセプターフレームワーク領域における残基を選択するためのプロトコルはＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
【０２７０】
フレームワークの誘導体は、１、２、３又は４つのアミノ酸が代わりのアミノ酸で、例えば、ドナー残基で置き換えられていてもよい。
【０２７１】
ドナー残基はドナー抗体、すなわち、ＣＤＲの初めの由来となった抗体由来の残基であり、特にドナー配列由来の対応する位置の残基が採り入れられる。ドナー残基はヒト受容体フレームワーク由来の適切な残基（アクセプター残基）で置き換えることができる。
【０２７２】
抗体可変ドメインにおける残基はＫａｂａｔらが考案した方式に従って便利に番号付けされる。この方式はKabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA（今後は「Kabat et al（上記）」）に記載されている。この番号付け方式は、他の方法で示される場合を除いて本明細書において使用される。
【０２７３】
Ｋａｂａｔ残基命名は必ずしもアミノ酸残基の線形番号付けと直接一致するわけではない。基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであれ相補性決定領域（ＣＤＲ）であれ、実際の線形アミノ酸配列は、構造成分の短縮又は構造成分への挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも含有するアミノ酸が少ない又は追加のアミノ酸を含有してもよい。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、「標準」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列と抗体の配列中の相同な残基を整列させることにより所与の抗体について決定することができる。
【０２７４】
Ｋａｂａｔ番号付け方式に従えば、重鎖可変ドメインのＣＤＲは残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置している。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)）に従えば、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループは残基２６から残基３２まで伸びている。したがって、他の方法で示されていなければ、本明細書で用いられる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付け方式とＣｈｏｔｈｉａの位相ループ定義の組合せにより記述される残基２６から３５を指すことが意図されている。
【０２７５】
Ｋａｂａｔ番号付け方式に従えば、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置している。
【０２７６】
一例では、ＣＤＲ  Ｈ１が配列番号７８で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２が配列番号７９で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３が配列番号８０で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＣＤ７９に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２７７】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号８８、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号８９、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号９０の３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＣＤ７９に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２７８】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７５、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号７６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号７７の３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含むＣＤ７９に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２７９】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号８５、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号８７の３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含むＣＤ７９に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２８０】
一例では、ＣＤＲ  Ｈ１が配列番号７８で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２が配列番号７９で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３が配列番号８０で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＣＤＲ  Ｌ１が配列番号７５で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２が配列番号７６で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３が配列番号７７で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＣＤ７９に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２８１】
一例では、ＣＤＲ  Ｈ１が配列番号８８で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２が配列番号８９で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３が配列番号９０で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＣＤＲ  Ｌ１が配列番号８５で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２が配列番号８６で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３が配列番号８７で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＣＤ７９に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２８２】
一実施形態では、本開示に従った多特異性分子は、配列番号９８、９９、１００、１０８、１０９、１１０、１１８、１１９、１２０、１２８、１２９及び１３０を含む群から選択される３つの重鎖ＣＤＲを含むＣＤ４５に特異的な結合ドメインを含む。
【０２８３】
一実施形態では、本開示に従った多特異性分子は、配列番号９５、９７、９７、１０５、１０６、１０７、１１５、１１６、１１７、１２５、１２６及び１２７を含む群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲを含むＣＤ４５に特異的な結合ドメインを含む。
【０２８４】
一実施形態では、本開示に従った多特異性分子は、配列番号９８、９９、１００、１０８、１０９、１１０、１１８、１１９、１２０、１２８、１２９及び１３０を含む群から選択される３つの重鎖ＣＤＲ並びに配列番号９５、９７、９７、１０５、１０６、１０７、１１５、１１６、１１７、１２５、１２６及び１２７を含む群から選択される３つの軽鎖ＣＤＲを含むＣＤ４５に特異的な結合ドメインを含む。
【０２８５】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号９８、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号９９、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１００の３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２８６】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１０８、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１０９、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１１０の３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２８７】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１８、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１１９、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１２０の３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２８８】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１２８、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２９、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３０の３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２８９】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号９５、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号９６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９７の３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含むＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２９０】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号１０５、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１０６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１０７の３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含むＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２９１】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号１１５、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１１７の３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含むＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２９２】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号１２５、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１２６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１２７の３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含むＣＤ４５に対して特異的な結合ドメインが提供される。
【０２９３】
一例では、ＣＤＲ  Ｈ１が配列番号９８で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２が配列番号９９で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３が配列番号１００で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＣＤＲ  Ｌ１が配列番号９５で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２が配列番号９６で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３が配列番号９７で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＣＤ４５に特異的な結合ドメインが提供される。
【０２９４】
一例では、ＣＤＲ  Ｈ１が配列番号１０８で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２が配列番号１０９で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３が配列番号１１０で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＣＤＲ  Ｌ１が配列番号１０５で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２が配列番号１０６で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３が配列番号１０７で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＣＤ４５に特異的な結合ドメインが提供される。
【０２９５】
一例では、ＣＤＲ  Ｈ１が配列番号１１８で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２が配列番号１１９で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３が配列番号１２０で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＣＤＲ  Ｌ１が配列番号１１５で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２が配列番号１１６で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３が配列番号１１７で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＣＤ４５に特異的な結合ドメインが提供される。
【０２９６】
一例では、ＣＤＲ  Ｈ１が配列番号１２８で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２が配列番号１２９で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３が配列番号１３０で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＣＤＲ  Ｌ１が配列番号１２５で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２が配列番号１２６で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３が配列番号１２７で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むＣＤ４５に特異的な結合ドメインが提供される。
【０２９７】
一例では、本発明は、抗原ＣＤ７９に特異的な結合ドメイン及び抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメインであって、結合ドメインのこれらの対がそれぞれ、例えば、以下の対抗体；４４４７と４１２２、４４４７と４１２９、４４４７と４１３１、４４４７と４１３３、４４５０と４１２２、４４５０と４１２９、４４５０と４１３１及び４４４７と４１３３から選択されるＣＤ７９とＣＤ４５抗体の対由来の６つのＣＤＲを含む結合ドメインを含む多特異性分子を提供する。
【０２９８】
ＶＨ、ＶＬ及びＣＤＲ配列を含む、これらのＣＤ７９抗体（抗体４４４７及び抗体４４５０）の配列は本明細書の下に提供されている。ＶＨ、ＶＬ及びＣＤＲ配列を含む、これらのＣＤ４５抗体（抗体４１２２、４１２９、４１３１及び４１３３）の配列は本明細書の下に提供されており、本発明の分子において結合ドメインとして組み合わせることができる。
【０２９９】
一実施形態では、本開示は本明細書に開示される抗体配列に及ぶ。
【０３００】
一例では、ＣＤＲ  Ｈ１が配列番号１３１で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ２が配列番号１３２で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｈ３が配列番号１３３で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＣＤＲ  Ｌ１が配列番号１３４で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ２が配列番号１３５で与えられる配列を有し、ＣＤＲ  Ｌ３が配列番号１３６で与えられる配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むアルブミンに特異的な結合ドメインが提供される。
【０３０１】
一例では、配列番号１３７で与えられる配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１３９で与えられる配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むアルブミンに特異的な結合ドメインが提供される。
【０３０２】
一例では、配列番号１３８で与えられる配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１４０で与えられる配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むアルブミンに特異的な結合ドメインが提供される。
【０３０３】
一例では、結合ドメインはヒト化されている。
【０３０４】
一例では、本明細書で提供される１つ又は複数のＣＤＲは、システイン残基又はアスパラギン酸（Ｄ）異性化部位又はアスパラギン（Ｎ）脱アミド部位などの望ましくない残基又は部位を取り除くように改変することができる。一例では、アスパラギン脱アミド部位は、アスパラギン残基（Ｎ）及び／又は隣接する残基を他の任意の適切なアミノ酸に突然変異することにより１つ又は複数のＣＤＲから取り除くことができる。一例では、ＮＧ又はＮＳなどのアスパラギン脱アミド部位は、例えば、ＮＡ又はＮＴに突然変異することができる。
【０３０５】
一例では、アスパラギン酸異性化部位は、アスパラギン酸残基（Ｄ）及び／又は隣接する残基を他の任意の適切なアミノ酸に突然変異することにより１つ又は複数のＣＤＲから取り除くことができる。一例では、ＤＧ又はＤＳなどのアスパラギン酸異性化部位は、例えば、ＥＧ、ＤＡ又はＤＴに突然変異することができる。
【０３０６】
例えば、ＣＤＲのうちのいずれか１つにおける１つ又は複数のシステイン残基は、セリンなどの別のアミノ酸で置換することができる。
【０３０７】
一例では、ＮＬＳなどのＮグリコシル化部位は、アスパラギン残基（Ｎ）を他の任意の適切なアミノ酸に、例えば、ＳＬＳ又はＱＬＳに突然変異することにより取り除くことができる。一例では、ＮＬＳなどのＮグリコシル化部位は、セリン残基（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）を除く他の任意の残基に突然変異することにより取り除くことができる。
【０３０８】
当業者であれば、活性が維持されていることを確かめるために、本明細書に記載されるアッセイなどの任意の適切なアッセイにおいてＣＤＲの変異体又はヒト化配列を試験することができる。
【０３０９】
抗原への特異的結合は、例えば、抗原（ＣＤ４５及び／又はＣＤ７９）への結合を測定することができるＥＬＩＳＡ法又はＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴法を含む任意の適切なアッセイを使用して試験することができる。そのようなアッセイは、単離された天然の又は組換えＣＤ４５若しくはＣＤ７９（ａ又はｂ）又は適切な融合タンパク質／ポリペプチドを使用することができる。一例では、結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴により、組換えＣＤ４５（配列番号１４３又は配列番号１４３のアミノ酸２３〜１３０４）又は配列番号１４１及び配列番号１４２並びに配列番号１４１のアミノ酸３３〜２２６及び配列番号１４２のアミノ酸２９〜２２９で与えられる配列などのＣＤ７９を使用して測定される。代わりに、タンパク質はＨＥＫ細胞などの細胞上で発現され、親和性はフローサイトメトリーベースの親和性決定を用いて測定することができる。
【０３１０】
本発明により提供される抗体配列を使用すれば、さらなる抗体、したがって、本発明の多特異性分子において使用するのに適した結合ドメインを同定することができる。本発明に従った抗体分子のＣＤ７９への結合をクロスブロックする抗体、特に、配列番号７３で与えられる重鎖配列及び配列番号７１で与えられる軽鎖配列を含む抗体分子又は配列番号８３で与えられる重鎖配列及び配列番号８１で与えられる軽鎖配列を含む抗体分子は、ＣＤ７９への結合において同様に有用であり、したがって、本発明の多特異性分子において同様に有用であり得る。したがって、本発明は、抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメインと抗原ＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメインを含み、ＣＤ７９ｂに対する結合ドメインが本明細書の上に記載される抗体分子のうちのいずれか１つのＣＤ７９への結合をクロスブロックする及び／又はそれらの抗体のうちのいずれか１つによりＣＤ７９への結合をクロスブロックされる多特異性分子も提供する。一実施形態では、そのような抗体は本明細書の上に記載される抗体と同じエピトープに結合する。
【０３１１】
同様に、本発明に従った抗体分子のＣＤ４５への結合をクロスブロックする抗体、特に、配列番号９３で与えられる重鎖配列及び配列番号９１で与えられる軽鎖配列を含む抗体分子、又は配列番号１０３で与えられる重鎖配列及び配列番号１０１で与えられる軽鎖配列を含む抗体分子、又は配列番号１１３で与えられる重鎖配列及び配列番号１１１で与えられる軽鎖配列を含む抗体分子、又は配列番号１２３で与えられる重鎖配列及び配列番号１２１で与えられる軽鎖配列を含む抗体分子、又は配列番号１３３で与えられる重鎖配列及び配列番号１３１で与えられる軽鎖配列を含む抗体分子は、ＣＤ４５への結合において同様に有用であり、したがって、本発明の多特異性分子において同様に有用であり得る。したがって、本発明は、抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメインと抗原ＣＤ７９に特異的な結合ドメインを含み、ＣＤ４５に対する結合ドメインが本明細書の上に記載される抗体分子のうちのいずれか１つのＣＤ４５への結合をクロスブロックする及び／又はそれらの抗体のうちのいずれか１つによりＣＤ４５への結合をクロスブロックされる多特異性分子も提供する。一実施形態では、そのような抗体は本明細書の上に記載される抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態では、クロスブロック抗体は、本明細書の上に記載される抗体が結合しているエピトープに隣接している及び／又は重なっているエピトープに結合する。
【０３１２】
別の実施形態では、クロスブロック中和抗体は、本明細書の上に記載される抗体が結合しているエピトープに隣接している及び／又は重なっているエピトープに結合する。
【０３１３】
クロスブロック抗体は当技術分野の任意の適切な方法を使用して、例えば、クロスブロック抗体が抗原（ＣＤ４５及び／又はＣＤ７９）に結合すると本発明の抗体の結合が妨げられる又は逆もまた同じである競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用することにより、同定することが可能である。そのようなクロスブロックアッセイは、単離された天然の又は組換えＣＤ４５若しくはＣＤ７９（ａ及び／又はｂ）又は適切な融合タンパク質／ポリペプチドを使用することができる。一例では、結合及びクロスブロックは組換えＣＤ４５（配列番号１４３）又はＣＤ７９を使用し測定される。
【０３１４】
代わりに又はさらに、本発明のこの態様に従った抗体は、例えば、配列番号７１と７３、８１と８３、９１と９３、１０１と１０３、１１１と１１３、及び１２１と１２３で与えられる重鎖可変配列と軽鎖配列由来のＣＤＲを含む本明細書で開示される結合ドメインにより抗原（ＣＤ４５又はＣＤ７９）への結合がクロスブロックされ得る。したがって、抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメインと抗原ＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメインを含む多特異性分子であって、８０％よりも多く、例えば、９０％よりも多くなどの８５％よりも多く、特に９５％よりも多く、ＣＤ７９ｂに対する結合ドメインが本明細書の上に記載される抗体分子のいずれか１つのＣＤ７９ｂへの結合をクロスブロックする及び／又はそれらの抗体のいずれか１つによりＣＤ７９への結合をクロスブロックされ、場合によって、８０％よりも多く、例えば、９０％よりも多くなどの８５％よりも多く、特に９５％よりも多く、ＣＤ４５に対する結合ドメインが本明細書の上に記載される抗体分子のうちのいずれか１つのＣＤ４５への結合をクロスブロックする及び／又はそれらの抗体のうちのいずれか１つによりＣＤ４５への結合をクロスブロックされる多特異性分子も提供される。
【０３１５】
一態様では、
ａ）式（Ｉ）：
ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−（Ｖ１）ｐのポリペプチド鎖、
ｂ）式（ＩＩ）：
ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−（Ｖ２）ｑのポリペプチド鎖
であって、
ＶＨは重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し、
Ｘは結合又はリンカー、例えば、アミノ酸リンカーを表し、
Ｙは結合又はリンカー、例えば、アミノ酸リンカーを表し、
Ｖ１はｄａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表し、
ＶＬは可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは定常領域由来のドメイン、例えば、カッパなどの軽鎖定常領域ドメインを表し、
Ｖ２はｄａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表し、
ｐは０又は１であり、
ｑは０又は１であり、
ｐが１のときｑは０又は１であり、ｑが１のときｐは０又は１、すなわち、ｐとｑの両方が０を表すことはない、
を含む又はからなる多特異性抗体分子が提供される。
【０３１６】
一実施形態では、多特異性抗体分子はＣＤ４５に対する結合部位を１つ以下及びＣＤ７９に対する結合部位を１以下含む。
【０３１７】
一実施形態では、ｑは０でありｐは１である。
【０３１８】
一実施形態では、ｑは１でありｐは１である。
【０３１９】
一実施形態では、Ｖ１はｄａｂでありＶ２はｄａｂであり、合わせると、Ｖ１とＶ２は、場合によって、ジスルフィド結合により連結されている、同族ＶＨ／ＶＬ対などの可変領域の協同的対の単一結合ドメインを形成する。
【０３２０】
一実施形態では、ＶＨとＶＬはＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂに特異的である。
【０３２１】
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂに特異的である。
【０３２２】
一実施形態では、Ｖ２はＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂに特異的である。
【０３２３】
一実施形態では、Ｖ１とＶ２は合わせて（例えば、結合ドメインとして）ＣＤ７９、例えば、ＣＤ７９ａ又はＣＤ７９ｂに特異的であり、ＶＨとＶＬはＣＤ４５に特異的である。
【０３２４】
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ４５に特異的である。
【０３２５】
一実施形態では、Ｖ２はＣＤ４５に特異的である。
【０３２６】
一実施形態では、Ｖ１とＶ２は合わせて（例えば、１つの結合ドメインとして）ＣＤ４５に特異的であり、ＶＨとＶＬはＣＤ７９に特異的である。
【０３２７】
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ４５に特異的であり、Ｖ２はアルブミンに特異的であり、ＶＨとＶＬはＣＤ７９に特異的である。
【０３２８】
一実施形態では、Ｖ１はアルブミンに特異的であり、Ｖ２はＣＤ４５に特異的であり、ＶＨとＶＬはＣＤ７９に特異的である。
【０３２９】
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ７９に特異的であり、Ｖ２はアルブミンに特異的であり、ＶＨとＶＬはＣＤ４５に特異的である。
【０３３０】
一実施形態では、Ｖ１はアルブミンに特異的であり、Ｖ２はＣＤ７９に特異的であり、ＶＨとＶＬはＣＤ４５に特異的である。
【０３３１】
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ４５に特異的なｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はアルブミンに特異的なｄｓｓｃＦｖであり、ＶＨとＶＬはＣＤ７９に特異的である。
【０３３２】
一実施形態では、Ｖ１はアルブミンに特異的なｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はＣＤ４５に特異的なｄｓｃＦｖであり、ＶＨとＶＬはＣＤ７９に特異的である。
【０３３３】
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ７９に特異的なｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はアルブミンに特異的なｄｓｓｃＦｖであり、ＶＨとＶＬはＣＤ４５に特異的である。
【０３３４】
一実施形態では、Ｖ１はアルブミンに特異的なｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はＣＤ７９に特異的なｄｓｓｃＦｖであり、ＶＨとＶＬはＣＤ４５に特異的である。
【０３３５】
上記構築物中のＶ１、Ｖ２、ＶＨ及びＶＬはそれぞれ結合ドメインを表し、本明細書で提出される配列のいずれかを組み込むことができる。
【０３３６】
ＸとＹは任意の適切なリンカーを表し、例えば、ＸとＹはＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）であり得る。
【０３３７】
一実施形態では、Ｖ１及び／又はＶ２がｄａｂ、ｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１及び／又はＶ２の可変ドメインＶＨとＶＬの間のジスルフィド結合はＶＨ４４位とＶＬ１００位の間で形成される。
【０３３８】
本開示は、本明細書で開示される新規のポリペプチド配列、それに少なくとも８０％類似する又は同一の、例えば、９０％又はそれよりも大きいなどの、８５％又はそれよりも大きい、特に９５％又はそれよりも大きい類似性又は同一性の配列にまでも及ぶ。
【０３３９】
「同一性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で同一であることを示している。「類似性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で類似する種類であることを示している。例えば、ロイシンはイソロイシン又はバリンの代わりに用いることができる。多くの場合互いに代わりに用いることが可能な他のアミノ酸には、
−  フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
−  リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
−  システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれるがこれらに限定されない。
【０３４０】
同一性及び類似性の程度は容易に計算することが可能である（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLASTTM software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656）。
【０３４１】
特に一態様では、本発明は、本明細書に任意の適切な抗体フォーマットで記載されるＣＤ４５及びＣＤ７９抗体を提供する。
【０３４２】
したがって、一態様では、本発明は、本明細書に並びに配列番号９５、９６、９７、９８、９９及び１００（抗体４１２２）又は１０５、１０６、１０７、１０８、１０９及び１１０（抗体４１２９）又は１１５、１１６、１１７、１１８、１１９及び１２０（抗体４１３１）又は１２５、１２６、１２７、１２８、１２９及び１３０（抗体４１３３）に提供されるＣＤＲを含む本明細書で上に記載される結合ドメインのうちの１つ又は複数を含有する抗ＣＤ４５抗体又はその断片を提供する。本明細書に並びに配列番号７５、７６、７７、７８、７９及び８０（抗体４４４７）又は配列番号８５、８６、８７、８８、８９及び９０（抗体４４５０）に提供されるＣＤＲを含む本明細書で上に記載される結合ドメインのうちの１つ又は複数を含有する抗ＣＤ７９抗体又はその断片も提供される。
【０３４３】
前記ＣＤＲは任意の適切な抗体フレームワークに及び任意の適切な抗体フォーマットに組み込むことができる。そのような抗体には、モノクローナル、ヒト化、完全ヒト又はキメラ抗体であってよいがこれらに限定されない全抗体及びその機能的に活性な断片若しくは誘導体が含まれる。したがって、そのような抗体は、完全長の重及び軽鎖を有する完全抗体分子又はその断片を含んでいてもよく、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二、三又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片でもよいがこれらに限定されない（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217参照）。これらの抗体断片を作製し製造するための方法は当技術分野では周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181参照）。多価抗体は複数の特異性を含んでいてもよく、又は単一特異性でもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５参照）。本発明のこの態様は、本明細書で上に記載されている１つ又は複数の異性化、脱アミド、グリコシル化部位又はシステイン残基を取り除くためにＣＤＲにおいてアミノ酸が突然変異されている抗体を含む、ヒト化バージョン及び改変バージョンを含む、これら抗ＣＤ４５及びＣＤ７９抗体の変異体にも及ぶことが認識されるであろう。
【０３４４】
リンカー
一文脈におけるリンカーの本明細書での教唆は、本発明の任意の多特異性分子においてなどの、リンカーが用いられている異なる文脈におけるリンカーに等しく適用することが可能である。
【０３４５】
一実施形態では、本開示の分子中で用いられるリンカーは５０残基又はそれよりも少ない長さのアミノ酸リンカーであり、例えば、配列５〜７０で示される配列から選択される。
【表１】
2017529061.tif 000003
【表２−１】
2017529061.tif 000004
【表２−２】
2017529061.tif 000005
【０３４６】
（Ｓ）は配列１７から２０では自由選択である。
【０３４７】
強固なリンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号６９）、ＰＰＰＰ（配列番号７０）及びＰＰＰが含まれる。
【０３４８】
他のリンカーは表３に示されている。
【表３】
2017529061.tif 000006
【０３４９】
エフェクター分子
必要に応じて、本発明において使用するための多特異性分子は１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートすることができる。エフェクター分子は、単一エフェクター分子又は本発明の多特異性分子に付加させることが可能な単一実体を形成するように連結されている２つ若しくはそれよりも多いそのような分子を含み得ることは認識されるであろう。エフェクター分子に連結された本開示に従った抗体又は多特異性分子を得るのが望ましい場合、これは、抗体断片がエフェクター分子に直接又はカップリング剤を介して連結される標準化学的又は組換えＤＮＡ手法により調製することができる。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技法は当技術分野では周知である（Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123参照）。特定の化学的手法には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１に記載される手法が含まれる。代わりに、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及び欧州特許第０３９２７４５号に記載される組換えＤＮＡ手法を使用して達成することができる。
【０３５０】
一実施形態では、本開示の多特異性分子はエフェクター分子を含むことができる。
【０３５１】
本明細書で使用される用語エフェクター分子には、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、合成の若しくは天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレート金属、ナノ粒子並びに蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法により検出することができる化合物などのレポーター基が含まれる。
【０３５２】
エフェクター分子の例には、細胞に有害である（例えば、死滅させる）任意の薬剤を含む細胞毒又は細胞傷害性薬を含み得る。例には、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎｓ）、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン（１−ｄｅｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにその類似物又は相同物が含まれる。
【０３５３】
エフェクター分子には、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシン又はデュオカルマイシン）、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も含まれるがこれらに限定されない。
【０３５４】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カルホルニウム２５２、イリジウム１９２並びにタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート放射性核種；又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどのしかしこれらに限定されない薬物が含まれ得る。
【０３５５】
他のエフェクター分子にはタンパク質、ペプチド及び酵素が含まれる。対象の酵素には、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるがこれらに限定されない。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓症薬若しくは抗血管新生薬、例えば、アンジオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキンー１（ＩＬ−１）、インターロイキンー２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）又は他の成長因子及び免疫グロブリンなどの生体応答修飾物質が含まれるがこれらに限定されない。
【０３５６】
他のエフェクター分子には、例えば、診断に有用な検出可能物質が含まれ得る。検出可能物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン放出断層撮影で使用するために）、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。診断として使用するための抗体にコンジュゲートすることが可能な金属イオンについては一般的には米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ；適切な蛍光物質には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが含まれ；適切な発光物質にはルミノールが含まれ；適切な生物発光物質にはルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ；並びに適切な放射性核種には１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが含まれる。
【０３５７】
別の例では、エフェクター分子はｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期を増加させる及び／又は抗体の免疫原性を減少させる及び／又は上皮性関門を横切って免疫系までの抗体の送達を増強することができる。この種の適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はＷＯ０５／１１７９８４に記載される化合物などのアルブミン結合化合物が含まれる。
【０３５８】
エフェクター分子は、ポリマーである場合、一般に、合成でも天然に存在するポリマー、例えば、随意に置換された直鎖又は分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー又は分岐若しくは非分岐ポリサッカライド、例えば、ホモ−若しくはヘテロ−ポリサッカライドでもよい。
【０３５９】
上記の合成ポリマー上に存在することができる特定の随意の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が含まれる。
【０３６０】
合成ポリマーの特定の例には、随意に置換されている直鎖又は分岐鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）、又はその誘導体、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体などの随意に置換されているポリ（エチレングリコール）が含まれる。
【０３６１】
機能アッセイ及びスクリーニングフォーマット
典型的には、本発明において使用するための適切な結合ドメインは、機能アッセイにおいて１つ又は複数の結合ドメイン対を試験することにより同定することが可能である。例えば、抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメイン並びに抗原ＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメインを含む多特異性分子は１つ又は複数の機能アッセイにおいて試験することができる。
【０３６２】
本明細書で使用される「機能アッセイ」は、アッセイ条件に曝されるタンパク質複合体、抗体複合体又は抗体の混合物の１つ又は複数の所望の特性又は活性を決定するために使用することが可能なアッセイである。適切な機能アッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ、細胞成長又は増殖の阻害（細胞静止効果）アッセイ、細胞殺傷（細胞傷害効果）アッセイ、細胞シグナル伝達アッセイ、サイトカイン産生アッセイ、抗体産生及びアイソタイプスイッチ、及び細胞分化アッセイでもよい。
【０３６３】
本開示に従った多特異性抗体の効力は、当業者に一般的に知られている方法によってそのようなモデルにおいて個々の抗体又は抗体（又は断片）の混合物と比較することが可能である。
【０３６４】
機能アッセイは、結果の信頼性を高めるために必要に応じて何回か繰り返すことができる。当業者には公知の種々の統計検定を用いて統計的に有意な結果を同定し、このようにして、生物学的機能を有する多特異性分子を同定することが可能である。
【０３６５】
適切な機能アッセイの例は本明細書の実施例に記載されており、リン酸化Ａｋｔ発現、リン酸化Ｐ３８発現、ＰＬＣγシグナル伝達、ＣＤ４０発現、ＣＤ７１発現及び／又はＣＤ８６発現などのＢ細胞活性化のマーカーの阻害を検出することにより測定した場合の、抗ＩｇＭでの刺激に続くＢ細胞活性化を妨げる本発明の多特異性分子の能力を測定することを含む。
【０３６６】
スクリーニングのための機能アッセイを確立すると、当業者であれば、それを超えると同定された活性が「ヒット」だと見なされる適切な閾値を設定することが可能である。１つよりも多い機能アッセイが使用されるところでは、管理しやすいヒット率を確立するためにアッセイごとの閾値を適切なレベルで設定することができる。一例では、ヒット率は３〜５％でもよい。一例では、Ｂ細胞機能を阻害する結合ドメインの対を探索するときに設定される基準はＢ細胞活性化アッセイにおける少なくとも２つのリン読み取りの少なくとも３０％阻害であり得る。
【０３６７】
一例では、本発明の多特異性分子は、抗ＩｇＭ刺激されたＢ細胞におけるＣＤ８６発現の阻害について５ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
【０３６８】
一実施形態では、マウス腫瘍モデル、自己免疫疾患のモデル、ウイルス感染又は細菌感染齧歯類又は霊長類モデル及び同類のものを含む動物モデルなどのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて本開示の分子を試験することができる。
【０３６９】
結合ドメインのスクリーニング及び発見に適したフォーマットの例は本明細書で下に記載されている。
【０３７０】
本発明において使用するための結合ドメインを同定するためのスクリーニングでは二重特異性タンパク質複合体を用いることができる。
【０３７１】
本明細書で使用される「二重特異性タンパク質複合体」とは、ヘテロ二量体繋により一つに保持されている２つのタンパク質（本明細書では二重特異性成分と呼ばれるＡとＢ）を含む分子のことである。一実施形態では、タンパク質のうちの１つ又は両方は結合ドメインを有する、例えば、タンパク質のうちの１つ又は両方は抗体又はその断片である。
【０３７２】
典型的には、二重特異性タンパク質複合体は、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂであって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
Ａは第１の結合ドメインを含み、
Ｂは第２の結合ドメインを含み、
Ｘは結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは結合対の第２の結合パートナーであり、
：はＸとＹの間の相互作用（結合相互作用などの）である、
上記式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを有する。
【０３７３】
本明細書で用いられる「融合タンパク質」は、タンパク質成分、例えば、別の実体に融合されたＡ又はＢ、例えば、結合パートナーＸ又はＹ（必要に応じて）を含む。実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子構築物から組換え技法により発現される、例えば、ＤＮＡ構築物から宿主において発現される翻訳タンパク質である。
【０３７４】
繋Ｘ：Ｙの機能は、ＡとＢの相乗的機能を実現することができるように、タンパク質ＡとＢを互いの近傍に保持することである。
【０３７５】
本明細書で使用される「ヘテロ二量体繋」とは、２つの結合パートナーを一緒に保持するのに十分である全体的親和性を有する互いの間の相互作用（結合などの）を形成する２つの異なる結合パートナーＸとＹを含む繋のことである。一実施形態では、Ｘ及び／又はＹはホモ二量体を形成するには不適切である。
【０３７６】
ヘテロ二量体的に繋がれたヘテロ二量体繋は本明細書では互換的に使用される。
【０３７７】
一実施形態では、本明細書で用いられる「ホモ二量体を形成するのに不適切な」とは、ヘテロ二量体のＸ−Ｙの形成のほうが好ましい、例えば、形成された後は熱力学的に安定している及び／又は物理的に安定している（例えば、凝集がないことにより証明される）などの安定していることである。
【０３７８】
一実施形態では、Ｘ−Ｙ相互作用はＸ−Ｘ又はＹ−Ｙ相互作用よりも都合がよい。このせいで、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙが混合されると、ホモ二量体Ｘ−Ｘ又はＹ−Ｙの形成は減少する。このせいでホモ二量体を取り除くのも比較的簡単であり、例えば、カラムクロマトグラフィーなどの一精製ステップで本開示に従った実質的に純粋な融合タンパク質及び／又は二重特異性タンパク質複合体が得られる。
【０３７９】
一実施形態では、精製ステップはそれぞれの融合タンパク質の発現後に提供される。したがって、一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合に先立って、融合タンパク質（単数又は複数）は実質的に純粋な形態で提供される。本明細書で用いられる実質的に純粋な形態とは、融合タンパク質が８５〜１００％の範囲にあり、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％単量体のことである。
【０３８０】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体形成後には精製は必要ではない。
【０３８１】
一実施形態では、本方法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられる融合タンパク質の比は、１．５対１又は２対１などのＡ−Ｘ対Ｂ−Ｙで０．８対１から３対１である。
【０３８２】
一実施形態では、本方法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられる融合タンパク質の比は、１．５対１又は２対１などのＢ−Ｙ対Ａ−Ｘで０．８対１から３対１である。
【０３８３】
一実施形態では、その比は１対１である。
【０３８４】
一実施形態では、結合パートナーのうちの１つ（又は少なくとも１つ）はホモ二量体を形成することができず、例えば、結合パートナーのアミノ酸配列が突然変異してホモ二量体の形成を排除する又は最小化する。
【０３８５】
一実施形態では、結合パートナーの両方がホモ二量体を形成することができず、例えば、結合パートナーの１つはペプチドでもう一方の結合パートナーは前記ペプチドに特異的なＶＨＨである。
【０３８６】
一実施形態では、本開示の分子中で用いられるｓｃＦｖはホモ二量体を形成することができない。
【０３８７】
本明細書で用いられるホモ二量体を形成することができないとは、ホモ二量体を形成する傾向が低い又はないことである。本明細書で用いられる低いとは、４、３、２、１、０．５％若しくはそれ未満の凝集体などの、５％又はそれ未満のことである。
【０３８８】
融合タンパク質中の少量の凝集体又はヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体中に残存するものは一般に本開示の方法に最小限の効果を及ぼす。
【０３８９】
一実施形態では、：は、水素結合及び静電気相互作用などの、例えば、ファンデルワールス力などの引力に基づく、例えば、ペプチドなどの抗原に対する抗体特異性に基づく結合相互作用である。
【０３９０】
一実施形態では、：は、クリックケミストリーなどの特定の化学的相互作用から形成される共有結合である。
【０３９１】
一実施形態では、：は共有結合ではない。
【０３９２】
本明細書で用いられる「複合体を形成する」とは、結合相互作用又は化学反応を含む相互作用のことであり、この相互作用は複合体が会合し融合タンパク質が一緒に保持される適切な条件下で融合タンパク質成分Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙが接触するときには十分に特異的で強力である。
【０３９３】
本明細書で用いられる「一緒に保持される」とは、結合後、複合体を１つの分子であるかのように取り扱うことができ、多くの場合に単一分子のように振る舞い機能するようにその成分（融合タンパク質）を互いに近傍に保持することである。一実施形態では、保持によって複合体は本明細書で開示される方法において使用するのに適したものになる、すなわち、少なくとも１つの機能スクリーニングにおいて使用するのに適したものになる。
【０３９４】
一実施形態では、結合相互作用は可逆的である。
【０３９５】
本明細書で用いられるＸとＹに関するときの特異性とは、相互作用にある結合パートナーＸとＹが互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【０３９６】
一実施形態では、ＸとＹの間の結合相互作用は低い解離定数を有する。低い解離定数の例には、１〜９×１０−２ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１〜９×１０−３ｓ−１、１〜９×１０−４ｓ−１、１〜９×１０−５ｓ−１、１〜９×１０−６ｓ−１、１〜９×１０−７ｓ−１が含まれる。特に適した解離定数には、１×１０−４ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１×１０−５ｓ−１、１×１０−６ｓ−１又は１×１０−７ｓ−１が含まれる。
【０３９７】
理論に縛られたくはないが、低い解離定数（オフレートとも呼ばれる）であれば分子は、二重特異性タンパク質複合体が特に機能スクリーニングアッセイにおいて有用になるほど安定していることができると考えられる。
【０３９８】
一実施形態では、互いに対するＸとＹの親和性は５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ又はそれよりも強い。
【０３９９】
一実施形態では、互いに対するＸとＹの親和性は９００ｐＭ又はそれよりも強く、例えば、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００若しくは５０ｐＭ又はそれよりも強い。
【０４００】
別の実施形態では、互いに対するＸとＹの親和性は１０ｐＭ又はそれよりも強く、例えば、９、８、７、６、又は５ｐＭである。
【０４０１】
親和性は相互作用のオン及びオフレートから計算される値である。本明細書で使用される用語「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、ペプチド）の間の非共有結合的相互作用の総計の強さのことである。その結合パートナーに対する分子の親和性は一般に平衡解離定数（ＫＤ）により表すことが可能である。親和性は、表面プラズモン共鳴法、特にＢＩＡコアなどの本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的方法により測定することが可能である。
【０４０２】
一実施形態では、本開示に従った複数の二重特異性タンパク質複合体は平行して又は基本的に同時に試験される。
【０４０３】
本明細書で用いられる同時にとは、試料／分子／複合体が同じ分析で、例えば、同じ「ラン」で分析されることである。
【０４０４】
一実施形態では、同時にとは、シグナル出力が基本的に同時刻に機器により分析される共存分析のことである。このシグナルは得られた結果を解釈するのにデコンボリューションが必要になる場合がある。
【０４０５】
有利なことに、複数の二重特異性タンパク質複合体を試験すれば、多数の二重特異性タンパク質複合体のより効率的なスクリーニング及び新たな興味深い関係の同定が可能になる。対象の標的抗原であるＣＤ４５及びＣＤ７９にとって明らかに異なる可変領域により生物学的機能の微妙な違いが得られる。
【０４０６】
一実施形態では、複数の二重特異性タンパク質複合体は、上記のマルチプレックスを使用し同じものを１つ又は複数の機能アッセイに供することにより試験する。
【０４０７】
本明細書で使用される用語「生物学的機能」とは、試験されている生物学的実体にとっては天然の又は目的とする活性、例えば、細胞、タンパク質若しくは類似のものの天然の活性のことである。理想的には、機能の存在は、哺乳動物の生細胞を利用するアッセイを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイを使用して試験することが可能である。本明細書で用いられる天然の機能には、がんに関連する機能などの異常な機能が含まれる。
【０４０８】
本明細書で用いられる関連する「生物学的コンパレーター」とは、ある変化又は新規の活性若しくは機能が存在するかどうかを確証するために二重特異性タンパク質複合体について用いられるのと同じアッセイにおいて活性を評価するのに適した実体のことである。Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂに適したコンパレーターには、天然の形態の又は二重特異性体と同じフォーマットで示される精製されたタンパク質（組換えタンパク質を含む）、すなわち、ＡとＢがＡ−Ｘ：Ｙ−Ａ若しくはＢ−Ｘ：Ｙ−Ｂなどの同じ実体である場合が含まれることがある。代わりに、複合体化されていない形態の融合タンパク質Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、コンパレーターとして用いることができる。代わりに、異なるフォーマットの複数のコンパレーター（特に本明細書に記載される）を用いることができる。当業者であれば、共通の一般的知識又は文献に見出される情報に基づいて適切な対照／コンパレーターを同定し含むことができる。
【０４０９】
本明細書で使用される用語「相乗的機能」とは、観測されない生物活性、又は本開示の二重特異性タンパク質複合体の第１と第２のタンパク質が一緒に用いられないときに観察されるより高い、例えば、二重特異性形態でしか観察されない活性のことである。したがって、「相乗的」は新規の生物学的機能を含む。
【０４１０】
本開示は、ＣＤ４５及びＣＤ７９に対する少なくとも特異性を有する分子に新規の生物学的機能を提供する。
【０４１１】
本明細書で用いられる新規の生物学的機能とは、２つ若しくはそれよりも多い相乗的実体［タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂ］が１つにまとめられる（二重特異性体として又は他の方法で）まで明らかではない若しくは存在しない機能又はこれまで同定されていない機能のことである。
【０４１２】
本明細書で用いられるより高いとは、ゼロからの増加を含む活性の増加、すなわち、個々の複合体化されていない二重特異性成分（単数又は複数）が関連する機能アッセイにおいて活性がない二重特異性体におけるある活性のことであり、本明細書では、新たな活性又は新規の生物学的機能とも呼ばれる。本明細書で用いられるより高いには、個々の複合体化されていない二重特異性成分又は二価結合ドメインと比べて関連する機能アッセイにおいて二重特異性体の加法関数よりも大きい、例えば、関連する活性の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００％又はそれよりも多い増加も含まれる。
【０４１３】
一実施形態では、新規の相乗的機能はより高い阻害活性である。
【０４１４】
一実施形態では、本発明の多特異性抗体分子は、単独で又は混合して与えられるＣＤ４５への二価結合ドメインとＣＤ７９ａへの二価結合ドメインの活性の合計よりも高い阻害活性を有する。
【０４１５】
一実施形態では、結合対の第１の結合パートナーＸと第２の結合パートナーＹのうちの少なくとも１つは、独立してペプチド及びタンパク質から選択され、例えば、第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーはペプチドである。
【０４１６】
適切なペプチドには、ＧＣＮ４、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（ヒト及びマウスＦｏｓはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１１００及びＰ０１１０１を有し、ヒト及びマウスｊｕｎはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０５４１２及びＰ０５６２７を有する）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＦＬＡＧを含む群が含まれる。他のペプチドも本開示において使用するのに適切と予想されており、特に適切なペプチドはタンパク質精製のためのアフィニティータグである。なぜならば、そのようなペプチドはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０４１７】
本明細書で使用される用語「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の短いポリマーのことであり、ペプチドは２〜１００の範囲で、例えば、６から９８、７から９７又は８から９６などの５から９９のアミノ酸を含有する。一実施形態では、本開示で用いられるペプチドは５０アミノ酸残基又はそれよりも少ない、例えば、４０、３０、１０又はそれよりも少ないアミノ酸配列である。本開示で使用されるペプチドは目的に適合するのに十分な長さであり、例えば、ペプチドがリンカーである場合、ペプチドはそれが連結する断片がその生物学的機能を果たすことを可能にするのに適した長さである必要があり、代わりに、ペプチドが結合パートナーである場合、ペプチドは抗体などの別の実体に特異的に結合することができなければならない。
【０４１８】
一実施形態では、結合対のもう一方の結合パートナー（別の第１又は第２の結合パートナー）はタンパク質である。
【０４１９】
本明細書で用いられるタンパク質とは、１００アミノ酸又はそれよりも多いアミノ酸配列のことである。一実施形態では、本明細書で用いられる「タンパク質」とは、二次又は三次構造を持つアミノ酸配列のことである。
【０４２０】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質Ａ及び／又は第２のタンパク質Ｂは抗体又は抗体断片である。そのような二重特異性タンパク質複合体は二重特異性抗体複合体と呼ぶことができる。
【０４２１】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体に用いられるそれぞれの抗体又は断片は１つの結合部位を含む。
【０４２２】
融合タンパク質（Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙ）で用いられる完全長抗体又は抗体断片は単一特異性、多価又は二重特異性でもよい。
【０４２３】
有利には、２つの二重特異性抗体又は抗体断片を使用すれば、本明細書に記載される二重特異性抗体複合体などの本開示の分子は最大４つの異なる抗原に対して潜在的に特異的であることが可能である（すなわち、複合体は四重特異性であり得る）。これにより結合活性タイプ効果を調べることが可能になる。
【０４２４】
一実施形態では、第１の融合タンパク質Ａ−Ｘなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ又は類似のものであり、特にＣＤ４５に特異的である。
【０４２５】
一実施形態では、第２の融合タンパク質Ｂ−Ｙなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ又は類似のものであり、特にＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに特異的である。
【０４２６】
一実施形態では、第２の融合タンパク質Ｂ−Ｙなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、すなわち、２つ又はそれよりも多い結合ドメインを有する。
【０４２７】
一実施形態では、第１の融合タンパク質Ａ−Ｘなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質Ｂ−Ｘなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０４２８】
したがって、一実施形態では、本開示の多特異性分子の結合ドメインは一価である。
【０４２９】
したがって、一実施形態では、本開示の多特異性分子の結合ドメインは一価であり単一特異性である。
【０４３０】
一実施形態では、第１の融合タンパク質Ａ−Ｘなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質Ｂ−Ｙなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０４３１】
一実施形態では、第１の融合タンパク質Ａ−Ｘなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質Ｂ−Ｙなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０４３２】
一実施形態では、第１の融合タンパク質Ａ−Ｘなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質Ｂ−Ｙなどの本開示の分子又はその成分で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０４３３】
一実施形態では、二重特異性抗体複合体などの、本開示の分子又はその成分の第１の抗体、第２の抗体又は第１と第２の抗体の両方は、ＩｇＧフォーマットでもよく、例えば、抗ＣＤ４５及び／又は抗ＣＤ７９抗体はＩｇＧフォーマットで提供されてもよい。
【０４３４】
一実施形態では、抗体断片は、断片抗原（Ｆａｂ）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及びｓｃＦｖなどの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択され、第１（Ａ−Ｘ）又は第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる。有利には、小サイズのｓｃＦｖであれば二重特異性抗体複合体の正確な折り畳みを促進することができる。
【０４３５】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はＦａｂであってよい。
【０４３６】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１、第２の抗体／断片又は第１と第２の抗体／断片の両方はＶＨＨである。
【０４３７】
本開示の二重特異性複合体の文脈で用いられる「融合タンパク質」とは、タンパク質、例えば、結合パートナーに付加している抗体又は抗体断片のことである。
【０４３８】
便宜上、本開示の二重特異性タンパク質複合体は本明細書ではＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂと呼ばれる。しかし、この命名法は、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙがどのように設計されるのかを限定することを意図してはいない。なぜならば、本発明者らの実験は結合パートナーＸとＹをその方法に不利な影響を与えることなく逆にすることが可能であること、すなわち、Ａ−Ｙ及びＢ−Ｘを示しているからである。したがって、Ａ及びＢ並びにＸ及びＹは本技術の説明を支援するために言及される名目ラベルである。
【０４３９】
本明細書で用いられる「付加されている（attached）」とは、その例が下で考察されるペプチドリンカーなどのリンカーを介して直接的に又は間接的に連結している又は結合していることである。直接的に連結しているには、一つに融合している（例えば、ペプチド結合）又は化学的にコンジュゲートしているが含まれる。
【０４４０】
本明細書で用いられる「結合パートナー」とは、結合対の１つの成分部分のことである。
【０４４１】
一実施形態では、結合パートナーの親和性は高く、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００ｐＭ又はそれよりも強いなどの５ｎＭ又はそれよりも強い。
【０４４２】
本明細書で用いられる「結合対」とは、互いに特異的に結合する二つの結合パートナーのことである。結合対の例には、ペプチドとそれに特異的な抗体若しくは結合断片、又は酵素とリガンド、又は酵素とその酵素の阻害剤が含まれる。
【０４４３】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ペプチド及びｓｄＡｂを含む群から選択され、ｓｄＡｂの例にはＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが含まれる。
【０４４４】
一実施形態では、第２のパートナー（Ｙ）は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ペプチド及びｓｄＡｂを含む群から選択され、ｓｄＡｂの例にはＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが含まれる。
【０４４５】
一実施形態では、Ａが抗体又はその断片である場合、第１の結合パートナー（Ｘ）は第１の抗体又は抗体断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、第１の結合パートナーは第１の抗体又は抗体断片の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０４４６】
別の実施形態では、Ｂが抗体又はその断片である場合、第２の結合パートナー（Ｙ）は第２の抗体又は抗体断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、第２の結合パートナーは第２の抗体又は抗体断片の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０４４７】
一実施形態では、Ｘは抗体又は断片（タンパク質Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されており、Ｙは抗体又は断片（タンパク質Ｂ）のＣ末端に付加されている。
【０４４８】
一実施形態では、Ｘはリンカー（ＡＳＧＧＧＧ又はＡＳＧＧＧＧＳＧなどの）を介して、抗体又は断片（タンパク質Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されており、Ｙはリンカー（ＡＳＧＧＧＧ又はＡＳＧＧＧＧＳＧなどの）を介して、抗体又は断片（タンパク質Ｂ）のＣ末端に付加されている。
【０４４９】
一実施形態では、第１の又は第２の結合パートナー（Ｘ又はＹ）はペプチドである。
【０４５０】
適切な結合対の例には、ＧＣＮ４（配列番号１）又はその変異体、及びＧＣＮ４に対して特異的なｓｃＦｖである５２ＳＲ４（配列番号３）又はその変異体を含むことができる。
【０４５１】
一実施形態では、第１の結合パートナー（名目上Ｘ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１で示される）又はその変異体（例えば、Ｈｉｓタグなし）であり、第２の結合パートナー（名目上Ｙ）はＧＣＮ４に対して特異的なｓｃＦｖ（例えば、配列番号３に示される）又はその変異体である。
【０４５２】
一実施形態では、第１の結合パートナー（名目上Ｘ）はＧＣＮ４に対して特異的なｓＦｖ（例えば、配列番号３に示される）又はその変異体であり、第２の結合パートナー（名目上Ｙ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１で示される）又は変異体である。
【０４５３】
ＧＣＮ４変異体には、配列番号１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％、又は９９％同一性のアミノ酸配列が含まれる。ＧＣＮ４変異体には、ヌクレオチド配列番号２によりコードされる配列に、又は厳密な条件下で配列番号２にハイブリダイズするヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０４５４】
ＧＣＮ４に特異的な適切なｓｃＦｖは５２ＳＲ４（配列番号３）又はその変異体である。５２ＳＲ４の変異体には配列番号３に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。５２ＳＲ４の変異体には、ヌクレオチド配列番号４によりコードされる配列に、又は厳密な条件下で配列番号２にハイブリダイズするヌクレオチド配列に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０４５５】
本発明者らは、単鎖抗体５２ＳＲ４及びペプチドＧＣＮ４は本開示の二重特異性タンパク質複合体において使用するのに適した結合対であることを見出していた。
【０４５６】
代わりに、いかなる適切な抗体／断片及び抗原（ペプチドなどの）でもＸ及びＹとして用いることができる。
【０４５７】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）及び第２の結合パートナー（Ｙ）はタンパク質である。
【０４５８】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はリガンドである又はその逆もまた同じである。
【０４５９】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はその酵素の阻害剤である又はその逆もまた同じである。
【０４６０】
本明細書で用いられる「活性断片」とは、アミノ酸断片のことであり、これは実体では全アミノ酸配列よりも少なく、基本的に同じ生物活性又は関連する生物活性、例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％などの５０％を超える活性を保持している。
【０４６１】
別の実施形態では、第１の結合パートナーＸはグルタチオン（ＧＳＨ）であり第２の結合パートナーＹはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である又はその逆もまた同じである。
【０４６２】
別の実施形態では、ＸはＦｏｓでありＹはＪｕｎである又はその逆もまた同じである。
【０４６３】
別の実施形態では、ＸはＨｉｓでありＹは抗Ｈｉｓである又はその逆もまた同じである。
【０４６４】
別の実施形態では、結合対はカルモジュリン結合ペプチドでありＹはカルモジュリンである又はその逆もまた同じである。
【０４６５】
別の実施形態では、Ｘはマルトース結合タンパク質でありＹは抗マルトース結合タンパク質若しくはその断片である又はその逆もまた同じである。
【０４６６】
他の酵素−リガンド組合せも結合パートナーにおいて使用するために想定している。タンパク質精製のための当技術分野で公知の親和性タグも適切である。なぜならば、これらのタグはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０４６７】
同一性及び類似性の程度は容易に計算することが可能である（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLASTTM software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656）。
【０４６８】
一実施形態では、第１又は第２の結合パートナー（Ｘ又はＹ）はタンパク質又はペプチドである。
【０４６９】
一実施形態では、第１及び第２の融合タンパク質は１つ又は複数のペプチドリンカーを含む。リンカーは融合タンパク質中の種々の位置に取り込むことができる。例えば、リンカーは結合パートナーとそれに付加されているタンパク質の間に導入することができる。
【０４７０】
一実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。
【０４７１】
本明細書で使用される用語「ペプチドリンカー」とは、アミノ酸配列を有するペプチドのことである。一定範囲の適切なペプチドリンカーは当業者には公知であろう。
【０４７２】
一実施形態では、ペプチドリンカーは合成起源である、すなわち、合成化学技法により調製されていてもよい。
【０４７３】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体の結合パートナーはペプチドリンカーを介してそのそれぞれのタンパク質に結合されている。
【０４７４】
一実施形態では、融合タンパク質は翻訳融合であり、すなわち、融合タンパク質が発現されるもとの遺伝子構築物を含む宿主細胞において発現される融合タンパク質である。
【０４７５】
一実施形態では、融合タンパク質は、場合によってペプチドリンカーを介してＡをＸに又はＢをＹにコンジュゲートすることにより調製される。
【０４７６】
一実施形態では、ペプチドリンカーは５０アミノ酸長又はそれよりも少なく、例えば、２０アミノ酸又はそれよりも少ない。
【０４７７】
一般に、融合タンパク質を組換え的に発現させるほうが効率的であり、したがって、宿主細胞において発現させることが可能な直接ペプチド結合又はペプチドリンカーが有利である可能性がある。
【０４７８】
一態様では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を産生する方法であって、
（ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加した、ＣＤ４５又はＣＤ７９ａ及び／若しくはＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメイン（Ａ）を含む第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）を作製するステップと、
（ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加した、ＣＤ４５又はＣＤ７９ａ及び／若しくはＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメイン（Ｂ）を含む第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を作製するステップと、
少なくとも第１の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質がＣＤ４５に特異的な結合ドメインを含み、残りの融合タンパク質がＣＤ７９ａ及び／若しくはＣＤ７９ｂに特異的な結合ドメインを含み、
（ｃ）ステップａ）とｂ）で調製された第１（Ａ−Ｘ）と第２融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を一緒に混合するステップと
を含む前記方法が提供される。
【０４７９】
特に、ヘテロ二量体的に繋がれた二重特異性タンパク質複合体は、Ａ−ＸとＢ−Ｙをｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合することにより調製される。したがって、一実施形態では、方法はＡ−ＸとＢ−Ｙを接触させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップを含む。
【０４８０】
したがって、一般的に、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは同じ細胞で同時発現されることはない。これは、例えば１００のＡ−Ｘ融合タンパク質と１００のＡ−Ｙ融合タンパク質を別々に発現させ、場合によって精製することができ、それに続いて２００の融合タンパク質を様々な並べ替えで混合することにより、１０，０００のヘテロ二量体的に繋がれた二重特異性タンパク質複合体を提供することが可能であるので有利である。
【０４８１】
これとは対照的に、先行技術の方法では二重特異性の同時発現が必要であり、したがって、１０，０００の複合体では、１０，０００のトランスフェクション、発現及び精製が必要になる。
【０４８２】
結合パートナーＸ及びＹは互いに対して親和性を有し、ベルクロ（登録商標）の生物学的等価物又はバーと磁石として機能し、複合体を１つに保持する。有利なことに、これは、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＹ−ＹＢは、その融合タンパク質を互いに混ぜ合わせるだけで容易に会合して二重特異性タンパク質複合体になることが可能であることを意味する。したがって、本開示の二重特異性タンパク質複合体はモジュラー構造体を有し、これのおかげで２つの異なるタンパク質を、例えば、格子状の様式で抗原特異性の異なる組合せを用いた二重特異性タンパク質複合体の並べ替えの大きなパネルを作製するために容易に会合させることが可能になる。これのおかげで、相加的、相乗的又は新規の生物学的機能を検出するための多数の二重特異性タンパク質複合体の効率的で系統的なスクリーニングが可能になる。
【０４８３】
ＸとＹが互いに対して特異的であることを考慮すると、このせいで、ホモ二量体を形成する能力が著しく減少する。本明細書ではＸとＹは合わせて結合対又は結合パートナーと呼ばれる。一実施形態では、Ｘは他のＸに対して高い親和性を持たない。一実施形態では、Ｙは他のＹに対して高い親和性を持たない。有利なことに、ＸとＹがホモ二量体を形成しないとき、このことが望ましくない単一特異性タンパク質複合体の形成を妨げ、所望の二重特異性タンパク質複合体の収量を増やし、単一特異性タンパク質複合体を除去するための面倒な精製ステップの必要性をなくす。
【０４８４】
二重特異性タンパク質複合体のこの急速な組立て、収量及び／又は純度のレベルは先行技術の方法により効率的に獲得することはできない、特に先行技術の方法は一般に大規模な精製ステップを必要とする。
【０４８５】
有利なことに、Ｘ及びＹ成分のせいで、融合タンパク質の異なる並べ替えから構成される二重特異性タンパク質複合体を含むマルチプレックスを迅速に容易に会合させることができる。
【０４８６】
一実施形態では、タンパク質Ａ及びＢは抗体又は抗体断片である。抗体又は抗体断はＸとＹを介して複合体として１つに保持されているとき、これは二重特異性抗体複合体を形成する。
【０４８７】
混合は、一般的に、ＸとＹが相互作用できる条件で成し遂げられる。一実施形態では、融合タンパク質は、細胞培養条件下で細胞培養培地においてインキュベートされ、例えば、融合タンパク質は３７℃／５％ＣＯ２環境において９０分間インキュベートされる。
【０４８８】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質は水性環境で混合され、例えば、１つの融合タンパク質はビーズ又はプレートなどの固体表面に結合させることができ、もう一方の融合タンパク質は水溶液／懸濁液中でそれに対して導入することが可能である。固相であれば過剰な成分及び試薬は容易に洗い流すことができる。一実施形態では、どちらの融合物も固相に付加しておらず、単に液体／溶液／培養液中に混合しているだけである。
【０４８９】
有利なことに、本開示の方法を用いれば、異種対間（すなわち、第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］と第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］の間）で形成され、同種対間（すなわち、２つの第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］間又は２つの第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］間）の相互作用が最小化されている複合体を調製することが可能である。したがって、本方法により、ホモ二量体複合体の混入を最小限にして又はなしで、多数の二重特異性タンパク質複合体を調製することが可能になる。この純度及び収量のレベルは先行技術の方法を使用するのでは実現可能ではない。
【０４９０】
一実施形態では、形成された複合体はさらなる精製ステップを必要としない。
【０４９１】
一実施形態では、形成された複合体は１回の精製ステップ、例えば、カラムクロマトグラフィーを必要とする。
【０４９２】
一実施形態では、方法は、例えば、本開示に従った融合タンパク質の発現後に、少なくとも１回の精製ステップをさらに含む。
【０４９３】
本明細書で使用される「機能アッセイ」は、アッセイ条件を受けやすいタンパク質複合体、抗体複合体又は抗体の混合物の１つ又は複数の所望の特性又は活性を決定するのに使用することが可能なアッセイである。適切な機能アッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ、細胞成長又は増殖の阻害（細胞分裂停止効果）アッセイ、細胞死滅（細胞毒性効果）アッセイ、細胞シグナル伝達アッセイ、サイトカイン産生アッセイ、抗体産生とアイソタイプスイッチ及び細胞分化アッセイであり得る。一実施形態では、マウス腫瘍モデル、自己免疫疾患のモデル、ウイルス感染又は細菌感染齧歯類又は霊長類モデル及び同類のものを含む動物モデルなどのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて本開示の分子を試験することができる。
【０４９４】
二重特異性抗体複合体の文脈では、本開示に従った二重特異性抗体複合体の効力は、当業者に一般的に知られている方法によってそのようなモデルにおいて個々の抗体又は抗体（又は断片）の混合物と比べることが可能である。
【０４９５】
機能アッセイは、結果の信頼性を高めるため、特定の二重特異性抗体複合体の異なる試料を用いて又はなしで、必要に応じて数回繰り返すことができる。当業者に公知の種々の統計検定を用いれば、統計的に有意な結果を確認し、したがって、生物学的機能を有する二重特異性抗体複合体を同定し、特に、本発明の多特異性分子において使用するための最適の可変領域対を同定することができる。
【０４９６】
組成物及び医学的利用
一態様では、融合タンパク質、ヘテロ二量体的に繋がれた二重特異性タンパク質複合体などの本開示に従った分子又は成分、融合タンパク質又は前記二重特異性タンパク質複合体を含む本発明の分子を含む組成物、本明細書で定義されるマルチプレックス、アレイ、ライブラリーが提供される。
【０４９７】
一実施形態では、本開示の分子、例えば、本明細書に記載される抗体、多特異性分子及び／又は二重特異性タンパク質複合体は治療応用に適しており、疾患の処置に新規の療法を提供することができる。したがって、さらなる態様では、治療において使用するために、本開示の分子、例えば、上記の二重特異性タンパク質複合体が提供される。本明細書に記載される多特異性分子及び二重特異性タンパク質複合体を含む本開示の分子は、がんなどの一定範囲の疾患の処置に適している。
【０４９８】
本明細書に記載される多特異性分子及び二重特異性タンパク質複合体を含む本開示の分子は、種々の自己免疫疾患における免疫及び自己免疫反応を制御するためにＢ細胞機能を阻害するのにも特に適している。
【０４９９】
したがって、本開示は、治療的有効量の本開示の分子、例えば、本開示の多特異性分子又は二重特異性タンパク質複合体の投与を含む、患者において疾患を処置する方法にまで及ぶ。
【０５００】
一態様では、本開示の１つ又は複数の分子、例えば、本開示の多特異性分子を含む医薬組成物が提供される。
【０５０１】
薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む、種々の異なる成分を組成物に含めることが可能である。組成物は、場合により、本発明の多特異性分子の集団の特徴を変え、それによって、例えば、抗体の機能を低下させる、安定化させる、遅延させる、調節する及び／又は活性化することができるさらなる分子を含むことができる。組成物は、固体又は液体形態でもよく、なかんずく、粉末、錠剤、溶液又はエアロゾルの形態でもよい。
【０５０２】
本発明は、本発明の抗体分子又は多特異性分子を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、処置における使用のため及び病態又は障害の処置用の薬物の製造のための本発明の多特異性分子の使用が提供される。
【０５０３】
ＴＧ２２７
病態又は障害は、例えば、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性及び寄生性）、感染に関連するエンドトキシンショック、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病（Pilonidal disease）、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着（surgical adhesions）、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫ブドウ膜炎；多発性硬化症、ループス（全身性エリトマトーデスなどの）及びギラン・バレー症候群などの中枢及び末梢神経系の免疫媒介炎症性疾患；アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植片拒絶、心筋梗塞並びに粥状動脈硬化などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周炎、低酸症（hypochlorhydia）並びに乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵がん、食道がん、頭頸部がん、腎がんなどのがん、特に、腎細胞癌、前立腺がん、肝がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、及び甲状腺がん、並びにその転移型からなる群から選択することができる。
【０５０４】
一実施形態では、障害はがん、例えば、急性リンパ芽球性白血病若しくは慢性リンパ性白血病などのリンパ性白血病、又は急性骨髄性白血病若しくは慢性髄性白血病などの髄性白血病を含む、白血病である。
【０５０５】
一実施形態では、自己免疫疾患には、急性散在性脳脊髄炎（ａｄｅｍ）、急性壊死性出血性白脳炎、アディソン病、副腎不全、腎上腺皮質機能不足（ｈｙｐｏｃｏｒｔｉｓｏｌｉｓｍ）、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、脊椎関節炎、シュトリュンペル・マリー病、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ａｐｓ）、自己免疫血管浮腫、自己免疫再生不良性貧血、自己免疫自律神経障害、自己免疫肝炎、自己免疫高脂血症、自己免疫免疫不全、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、カナール・スミス症候群、自己免疫心筋炎、自己免疫卵巣炎、自己免疫膵炎（ＡＩＰ）、自己免疫多腺性症候群（Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型）、自己免疫網膜症（ＡＲ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫甲状腺疾患、自己免疫蕁麻疹、軸索型／神経型ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多病巣性骨脊髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡（ＣＰ）、クローン病、炎症性腸疾患、結腸炎、小腸炎、回腸炎、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト病（crest disease）、クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、デューリング病、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、円板上エリテマトーデス（ＤＬＥ）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、表皮水疱症（ＥＢ）及び後天性表皮水疱症（ｅｂ  ａｃｑｕｉｓｉｔａ）（ＥＢＡ）、好酸球性胃腸炎、食道炎、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維症肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎（非増殖性：巣状分節性糸球体硬化症及び膜性糸球体腎炎  増殖性：ＩｇＡ腎炎）、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパシー、急性運動感覚性軸索型ニューロパシー、急性全自律（ｐａｎａｕｔｏｎｏｍｉｃ）ニューロパシー、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症（ＩＧＡＮ）、ベルガー症候群、シンファリンジティック（ｓｙｎｐｈａｒｙｎｇｉｔｉｃ）糸球体腎炎、ＩｇＡ天疱瘡、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性不妊症（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病、間質性膀胱炎、アイザック症候群、神経性筋強直症、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線形ＩｇＡ皮膚症（ＬＡＤ）、類天疱瘡、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、単クローン性γグロブリン血症（ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、神経性筋強直症、アイザックス症候群（後天性、腫瘍随伴、遺伝性）、好中球減少症、眼球瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、卵巣炎、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、精巣炎、回帰性リウマチ、パンダス（ｐａｎｄａｓ）（連鎖球菌関連小児自己免疫神経精神病学的障害）、腫瘍随伴自己免疫多臓器症候群（ＰＡＭＳ）、傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴性天疱瘡（ＰＮＰ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、落葉状天疱瘡（ＰＦ）、末梢神経障害、周囲静脈脳脊髄炎（ｐｅｒｉｖｅｎｏｕｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、悪性貧血、ポエムス（Ｐｏｅｍｓ）症候群、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、黄体ホルモン皮膚炎原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、アノー症候群、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、慢性焦点性脳炎（ＣＦＥ）、レイノー現象、反応性関節炎、ライター症候群、リカバリン関連網膜症（ＲＡＲ）、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、全身性硬化症、シェーグレン症候群、精液精巣自己免疫（ｓｐｅｒｍ  ＆  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）、全身硬直／スティフ・マン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎、バージャー病、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、リウマチ性多発筋痛症、高安動脈炎、側頭動脈炎、バージャー病、皮膚血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグ・ストラウス症候群、皮膚血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ゴルファーの脈管炎、水疱性皮膚炎、白斑ウェゲナー肉芽腫症（Ｖｉｔｉｌｉｇｏｗｅｇｅｎｅｒ’ｓ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）（現在では多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と名付けられている）が含まれる。
【０５０６】
一実施形態では、自己免疫疾患は、ＡＮＣＡ血管炎、ＩｇＡ腎症（ベルジェ病）、尋常性天疱瘡／水疱性類天疱瘡、ＩＴＰ、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性甲状腺炎（グレーブス病）、橋本病、ループス腎炎、膜性糸球体腎症（又は膜様ネフロパシー）、ＡＰＳ、重症筋無力症、視神経脊髄炎、原発性シェーグレン、自己免疫好中球減少症、自己免疫膵炎、皮膚筋炎、自己免疫ブドウ膜炎、自己免疫網膜症、ベーチェット病、ＩＰＦ、全身性硬化症、肝線維症、自己免疫肝炎、原発性硬化性胆管炎、白斑、グッドパスチャー症候群、肺胞蛋白症、慢性自己免疫蕁麻疹（ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｕｒｔｉｃａｒｉａｌ）、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、軸性脊椎関節炎（ａｘｉａｌ  ｓｐｏｄｙｌｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、移植（ＧｖＨＤを含む）、喘息、ＣＯＰＤ、巨細胞性動脈炎、難治性自己免疫血球減少症、エヴァンス症候群（自己免疫溶血性貧血）、Ｉ型糖尿病、サルコイドーシス、多発性筋炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、巣状分節性糸球体硬化症、慢性ライム病（ライムボレリア症）、扁平苔癬、全身硬直症候群、拡張型心筋症、自己免疫（リンパ球性）卵巣炎、後天性表皮水疱症、自己免疫萎縮性胃炎、悪性貧血、アトピー性皮膚炎、粥状動脈硬化、多発性硬化症、ラスムッセン脳炎、ギラン・バレー症候群及び後天性神経性筋強直症、脳卒中を含む又はからなる群から選択される。
【０５０７】
一実施形態では、障害はがん、例えば、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病若しくは慢性リンパ性白血病などのリンパ性白血病；又は急性骨髄性白血病若しくは慢性骨髄性白血病などの骨髄性白血病；或いはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫又はホジキン若しくは非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫である。
【０５０８】
本発明は、本明細書に記載される多特異性分子などの本開示の分子を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、処置において及び薬物の製造において使用するための、本明細書に記載される多特異性分子などの本開示の分子の使用が提供される。
【０５０９】
組成物は、通常薬学的に許容される担体を含むことになる無菌の医薬組成物の一部として普通、供給されることになる。本発明の医薬組成物は薬学的に許容されるアジュバントをさらに含むことができる。
【０５１０】
本発明は、本発明の多特異性分子を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と一緒に添加して混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製のための工程も提供する。
【０５１１】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される賦形剤」とは、本発明の組成物の所望の特徴を増強する薬学的に許容される製剤担体、溶液又は添加物のことである。賦形剤は当技術分野では周知であり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤及び炭酸水素緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁液はリポソーム又は生分解性マイクロスフェアに被包することが可能である。製剤は、一般に、無菌の製造工程を用いて実質的に無菌の形態で提供されることになる。
【０５１２】
これには、製剤のために使用される緩衝溶媒溶液の濾過による生産及び無菌化、無菌緩衝溶媒溶液中での抗体の無菌懸濁、並びに当業者によく知られている方法による製剤の無菌容器中への分注が含まれることがある。
【０５１３】
薬学的に許容される担体はそれ自体が、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導するべきではないし、毒性を持つべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子などの大きなゆっくり代謝される巨大分子であってよい。
【０５１４】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸、プロピオン酸、マロン酸及び安息香酸などの有機酸の塩を使用することが可能である。
【０５１５】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有することができる。そのような担体であれば、患者による摂取のために、医薬組成物を、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ジェル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方することができる。
【０５１６】
本明細書に記載される多特異性分子などの本開示の分子は、溶媒に分散させて、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達することが可能である。本発明の二重特異性タンパク質複合体は、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水、薬学的に許容される溶媒又は緩衝液に懸濁することが可能である。当技術分野で公知の緩衝液は、約４．０から５．０のｐＨを達成するために１ｍｌの水当たり０．０５ｍｇから０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇから９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇから０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇから０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇから０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有することができる。上記のように、懸濁液は、例えば、凍結乾燥した抗体から作ることが可能である。
【０５１７】
薬学的に許容される担体の徹底的な検討はRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)で入手可能である。
【０５１８】
本明細書で使用される用語「治療的有効量」とは、標的とされた疾患若しくは状態を処置する、寛解する若しくは予防する、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示すのに必要な治療剤の量のことである。任意の抗体では、治療的有効量は、最初は細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデルにおいて、通常、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類においてのどちらかで推定することが可能である。動物モデルを使用して適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次に、そのような情報を使用すればヒトにおける有用な用量及び投与のための経路を決定することが可能である。
【０５１９】
ヒト対象についての正確な治療的有効量は、疾病状態の重症度、対象の全般的健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び回数、薬物組合せ（単数又は複数）、反応感受性及び治療に対するトレランス／応答に依拠することになる。この量はルーチンな実験方法により決定することが可能であり、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療的有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇになる。代わりに、用量は１日当たり１０から１００、２００、３００又は４００ｍｇなどの１日当たり１から５００ｍｇであってよい。医薬組成物は、所定量の本発明の活性剤を含有する単位用量形態で都合よく提示することができる。
【０５２０】
組成物は患者に独立して投与してもよいし、又は他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次又は別々に）投与してもよい。
【０５２１】
本開示の多特異性分子が投与される用量は、処置される状態の性質、存在する炎症の程度及び抗体分子が予防的に使用されているのか又は既存の状態を処置するために使用されているのかどうかに依拠する。
【０５２２】
投与回数は多特異性分子の半減期及びその効果の持続時間に依拠することになる。多特異性分子の半減期が短い（例えば、２から１０時間）場合、１日当たり１又は複数用量を与える必要がある場合もある。代わりに、多特異性分子の半減期が長い（例えば、２から１５日）場合、１日当たり１回、１週間当たり１回又は１若しくは２か月ごとに１回でも用量を与えるだけでよい場合もある。
【０５２３】
本開示では、最終製剤のｐＨは多特異性分子の等電点の値に類似してはいない。なぜならば、製剤のｐＨが７である場合、８〜９又はそれよりも上のｐｌが適切である場合があるからである。理論に縛られたくはないが、これは最終的に最終製剤に改善された安定性をもたらすことができる、例えば、抗体又は断片は溶液のままであると考えられる。
【０５２４】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内又は直腸経路を含むがこれらに限定されないいかなる数の経路によっても投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。
【０５２５】
組成物の直接送達は、一般的には、皮下に、腹腔内に、静脈内に若しくは筋肉内に注射により実現される、又は組織の間質腔に送達されることになる。組成物は対象の特定の組織にも投与することが可能である。投薬処置は単回服用予定でも複数回服用予定でもよい。
【０５２６】
生成物が注射又は注入目的である場合、油性又は水性溶媒中の懸濁液、水溶液又は乳化液の形態を帯びることができ、生成物は懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。代わりに、多特異性分子は、適切な無菌液体と一緒に使用する前の復元のために乾燥形態でもよい。消化管を使用する経路により組成物を投与するつもりであれば、組成物は抗体を分解から保護ししかし消化管から吸収された後は二重特異性タンパク質複合体を放出する薬剤を含有する必要があることになる。
【０５２７】
本開示に従った噴霧可能な製剤は、例えば、ホイル包みに充填された単回用量単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。それぞれのバイアルは、容積が、例えば、２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中に単位用量を含有する。
【０５２８】
本明細書で使用される用語「変異体」とは、対応する野生型ペプチド又はタンパク質のアミノ酸又はヌクレオチド配列と比べた場合、少なくとも１つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列変化を含有するペプチド又はタンパク質のことである。変異体は対応する野生型ペプチド又はタンパク質に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％配列同一性を含むことができる。しかし、変異体は、対応する野生型ペプチド又はタンパク質に実質的に類似する機能を示すのであれば、８０％未満の配列同一性を含むことが可能である。
【０５２９】
一実施形態では、本開示の構築物は少なくとも三重特異性である。この状況では、さらなる特異性は、対象の任意の抗原、例えば、アルブミン若しくはＦｃ新生児受容体（ＦｃＲｎ）などの半減期を延ばす抗原；Ｆｃ受容体若しくは共刺激分子を活性化する若しくは阻害するなどのエフェクター機能のための抗原；組織若しくは細胞ターゲティング抗原；又はトランスフェリン受容体若しくはＬＲＰ１などの血液／脳関門（ＢＢＢ）移行を支援する抗原に対するものとすることができる。
【０５３０】
本開示は、特定の抗原特異性を備えた前記新規のフォーマットを含む医薬組成物などの組成物までも及ぶ。
【０５３１】
追加の態様では、本開示は処置におけるフォーマット及び組成物の使用を含む。
【０５３２】
本発明は、本発明の抗体分子を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と一緒に添加して混合することを含む医薬又は診断組成物の調製のための工程も提供する。
【０５３３】
抗体分子は医薬又は診断組成物中の唯一の活性成分であってもよく、或いは他の抗体成分又はステロイド若しくは他の薬物分子などの非抗体成分を含む他の活性成分を伴っていてもよい。
【０５３４】
医薬組成物は治療的有効量の本発明の抗体を適切に含む。本明細書で使用される用語「治療的有効量」とは、標的とする疾患若しくは状態を処置する、寛解する若しくは予防する、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示すのに必要な治療剤の量のことである。任意の抗体では、治療的有効量は、最初に細胞培養アッセイにおいて又は動物モデルにおいて、通常は齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類において見積もることが可能である。動物モデルを使用して適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次に、そのような情報を使用すれば、ヒトにおける有用な用量及び投与のための経路を決定することが可能である。
【０５３５】
ヒト対象のための正確な治療的有効量は、疾患状態の重症度、対象の一般的健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与時間と頻度、薬物組合せ（単数又は複数）、反応感受性並びに治療に対する寛容度／応答に依拠することになる。この量は決まりきった実験によって決定することが可能であり、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療的有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００ｍｇ／ｋｇなどの０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇになる。
【０５３６】
医薬組成物は、用量当たり所定量の本発明の活性剤を含有する単位用量形態で都合よく提供できる。
【０５３７】
組成物は患者に独立して投与してもよいし、又は他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次に又は別々に）投与してもよい。
【０５３８】
本明細書で用いられる薬剤とは、投与されると生理的影響を及ぼす実体のことである。
【０５３９】
本明細書で用いられる薬物とは、治療用量で適切な生理的影響を及ぼす化学的実体のことである。
【０５４０】
一実施形態では、本開示に従った抗体又は断片は、ステロイド、特にプレドニゾンなどの免疫抑制剤治療と一緒に用いられる。
【０５４１】
一実施形態では、本開示に従った抗体又は断片は、リツキシマブ又は他のＢ細胞療法と一緒に用いられる。
【０５４２】
一実施形態では、本開示に従った抗体又は断片は、任意のＢ細胞又はＴ細胞調節剤又は免疫調節剤と一緒に用いられる。例には、メトトレキサート、ミコフェノール酸（ｍｉｃｒｏｐｈｅｎｙｏｌａｔｅ）及びアザチオプリンが含まれる。
【０５４３】
本発明の抗体分子が投与される用量は処置する状態の性質、存在する炎症の程度及び抗体分子が予防的に使用されているのか又は既存の状態を処置するために使用されているのかに依拠する。
【０５４４】
投与の頻度は抗体分子の半減期及びその効果の持続期間に依拠することになる。抗体分子の半減期が短い（例えば、２〜１０時間）場合、１日当たり１回又は複数回の用量を与える必要があることがある。代わりに、抗体分子の半減期が長く（例えば、２〜１５日間）及び／又は持続性の薬力学（ＰＤ）プロファイルを有する場合、１日当たり１回、週当たり１回又は１か月若しくは２か月ごとに１回でも用量を与えればよいことがある。
【０５４５】
一実施形態では、用量は隔週に、すなわち、１月に２回送達される。
【０５４６】
一実施形態では、用量は追加の用量を投与する前に抗薬物（この場合は、抗抗体）応答をウェイン（ｗａｉｎｅ）させるように間隔をあけられる。
【０５４７】
本明細書で用いられる半減期は、循環中の、例えば、血清／血漿中の分子の持続期間を指すことが意図されている。
【０５４８】
本明細書で用いられる薬力学とは、本開示に従った分子のプロファイル及び特に生物学的作用の持続期間のことである。
【０５４９】
薬学的に許容される担体はそれ自体が、組成物を受ける患者に有害な抗体の産生を誘導するべきではなく、有毒であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子などの大きくゆっくり代謝される巨大分子であってよい。
【０５５０】
薬学的に許容される塩、例えば、塩化水素、臭化水素、リン酸及び硫酸などの鉱酸塩、又は酢酸、プロピオン酸、マロン酸及び安息香酸などの有機酸の塩を使用することが可能である。
【０５５１】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有することができる。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような組成物中に存在していてもよい。そのような担体があれば、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方することが可能になる。
【０５５２】
投与のための適切な形態には、例えば、注射又は注入による、例えば、ボーラス注射又は連続注入による非経口投与に適した形態が含まれる。製品が注射又は注入用である場合、油性又は水性溶媒中の懸濁液、溶液又は乳濁液の形態を取ることができ、懸濁、保存、安定化及び／若しくは分散剤などの調合剤を含有できる。代わりに、抗体分子は、適切な無菌液と一緒に使用する前の復元のために、乾燥形態でもよい。
【０５５３】
処方された後は、本発明の組成物は対象に直接投与することが可能である。処置される対象は動物であることが可能である。しかし、１つ又は複数の実施形態では、組成物はヒト対象への投与に適応される。
【０５５４】
適切には、本開示に従った製剤では、最終製剤のｐＨは抗体又は断片の等電点の値に類似してはおらず、例えば、タンパク質のｐＩが８〜９又はそれよりも上の範囲の場合では、製剤ｐＨ７が適切であり得る。理論に縛られたくはないが、最終的にこれは最終製剤に改善された安定性を与えることができる、例えば、抗体又は断片は溶液のままであると考えられる。
【０５５５】
一例では、範囲が４．０〜７．０のｐＨの医薬製剤は、１〜２００ｍｇ／ｍＬの本開示に従った抗体分子、１〜１００ｍＭの緩衝液、０．００１〜１％の界面活性剤、ａ）１０〜５００ｍＭの安定化剤、ｂ）１０〜５００ｍＭの安定化剤及び５〜５００ｍＭの等張化剤、又はｃ）５〜５００ｍＭの等張化剤を含む。
【０５５６】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内又は直腸経路を含むがこれらに限定されないいかなる数の経路によっても投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療組成物は、注射剤として、液体溶液又は懸濁液として調製できる。注射に先立つ液体溶媒での溶液、又は懸濁液に適した固体形態も調製することができる。
【０５５７】
組成物の直接送達は一般には、皮下に、腹腔内に、静脈内に若しくは筋肉内に、注射により達成される、又は組織の間質腔に送達されることになる。組成物は病変内に投与することも可能である。投薬処置は単回投与計画又は複数回投与計画でもよい。
【０５５８】
組成物中の活性成分は抗体分子になることは認識されるであろう。したがって、活性成分は消化管では分解を受けやすくなる。したがって、消化管を使用する経路により組成物を投与するつもりであれば、組成物は、抗体を分解から保護するが消化管から吸収された後は抗体を放出する薬剤を含有する必要がある。
【０５５９】
薬学的に許容される担体についての徹底的な考察はRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)で入手可能である。
【０５６０】
一実施形態では、製剤は吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０５６１】
適切な吸入可能な調製物には、吸入可能粉末、推進用ガスを含有する計量エアロゾル又は推進用ガスのない吸入可能溶液が含まれる。活性物質を含有する本開示に従った吸入可能な粉末は上記の活性物質だけからなっていてもよく、又は上記の活性物質と生理的に許容される賦形剤の混合物からなっていてもよい。
【０５６２】
これらの吸入可能な粉末には、単糖（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、ショ糖、マルトース）、オリゴ−及び多糖（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いの混合物が含まれ得る。単糖又は二糖を使用するのが、特にしかし排他的ではなくその水和物の形態でのラクトース又はグルコースの使用が適切である。
【０５６３】
肺での沈着のための粒子は、１〜９ミクロン、例えば、１〜５μｍなどの１０ミクロン未満の粒子サイズが必要である。活性成分（抗体又は断片などの）の粒子サイズは極めて重要である。
【０５６４】
吸入可能エアロゾルを調製するのに使用することが可能な推進用ガスは当技術分野では公知である。適切な推進用ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素、並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素の間から選択される。上記の推進用ガスは単独で又はその混合物で使用することができる。
【０５６５】
特に適した推進用ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の間から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにその混合物が特に適している。
【０５６６】
推進用ガス含有吸入可能なエアロゾルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤及びｐＨを調整するための手段などの他の成分も含有することができる。これらの成分はすべて当技術分野では公知である。
【０５６７】
本発明に従った推進用ガス含有吸入可能なエアロゾルは、５重量％までの活性物質を含有することができる。本発明に従ったエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０５６８】
代わりに、肺への局所投与は、例えば、ネブライザー、例えば、圧縮機に接続されたネブライザー（例えば、Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.製造のＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）圧縮機に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネブライザー）などの装置を用いる液体溶液又は懸濁製剤の投与によることもできる。
【０５６９】
本発明の抗体又は多特異性分子は、溶媒に分散させて、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達することが可能である。本発明の抗体又は多特異性分子は、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水又は他の薬理学的に許容される溶媒又は緩衝液に懸濁させることが可能である。当技術分野で公知の緩衝液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように１ｍｌの水当たり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有し得る。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された抗体を用いることが可能である。
【０５７０】
治療懸濁液又は溶液製剤は１つ又は複数の賦形剤も含有することが可能である。賦形剤は当技術分野では周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び炭酸水素塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁液はリポソーム又は生分解性マイクロスフェアにカプセル化することが可能である。製剤は一般に、無菌製造工程を用いて実質的に無菌形態で提供されることになる。
【０５７１】
これには、生産並びに処方のために使用される緩衝溶媒／溶液の濾過による無菌化、無菌緩衝溶媒液での抗体の無菌懸濁、及び当業者にはよく知られている方法による無菌容器内への製剤の分注が含まれ得る。
【０５７２】
本開示に従った噴霧可能な製剤は、例えば、ホイル薬袋に詰めた単回用量単位（例えば、密封プラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。それぞれのバイアルには体積で、例えば、２ｍＬの溶媒／溶液緩衝液の単位用量が含有される。
【０５７３】
本明細書に開示される抗体は吸入投与を介した送達に適していることもある。
【０５７４】
本発明の抗体は遺伝子治療の使用によって投与し得ることも想定されている。これを達成するために、適切なＤＮＡ成分の制御下にある抗体分子の重及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現されｉｎ  ｓｉｔｕで組み立てられるように、患者内に導入される。
【０５７５】
一実施形態では、本明細書に記載される二重特異性タンパク質複合体などの本開示の分子を使用すれば、対象の抗原（単数又は複数）の活性を機能的に変えることができる。例えば、二重特異性タンパク質複合体は前記抗原（単数又は複数）の活性を直接的に又は間接的に中和する、拮抗する又は刺激することができる。
【０５７６】
本開示は、本開示の分子又はその成分を含むキットにも及ぶ。一実施形態では、キットは、
ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加したＣＤ４５又はＣＤ７９ａ及び／若しくはＣＤ７９ｂに特異的な第１の抗体又は抗体断片（Ａ）を含む１つ又は複数の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）；並びに
ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加したＣＤ４５又はＣＤ７９ａ及び／若しくはＣＤ７９ｂに特異的な第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）を含む１つ又は複数の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を含み、後者は第１の結合パートナーに対して特異的であり、例えば、第１の結合パートナー（Ｘ）がペプチド又はポリペプチドであり、第２の結合パートナー（Ｙ）がそれに特異的な抗体又は抗体断片であり、
Ｙである第２の結合パートナーが第１の結合パートナーＸに特異的であり、第２の結合パートナーが、例えば、それに特異的な抗体又は抗体断片であり、２つの結合パートナーの特異的相互作用（結合相互作用などの）がヘテロ二量体繋を形成してａ）及びｂ）から２つの融合タンパク質を物理的に互いに近づけて二重特異性タンパク質複合体を形成し、
Ａ又はＢのうちの少なくとも１つがＣＤ４５に特異的であり、もう一方がＣＤ７９ａ及び／又はＣＤ７９ｂに特異的であり、
融合タンパク質（単数又は複数）が複合体化されている又は複合体化されていない形態である。
【０５７７】
有利なことに、キットは本開示の二重特異性タンパク質複合体を含んでいてもよいし、又は複合体化された若しくは非複合体形態である融合タンパク質を含んでいてもよい。前者の場合では、二重特異性タンパク質複合体は便利さと使用のしやすさを提供する「枠を超える」使用の準備が整っており、後者の場合では、二重特異性タンパク質複合体は異なる融合タンパク質を組み合わせて使用することにより使用者の要件に従って会合させることが可能である。
【０５７８】
別の実施形態では、キットは使用のための説明書をさらに含む。
【０５７９】
さらに別の実施形態では、キットは１つ又は複数の機能アッセイを実施するための１つ又は複数の試薬をさらに含む。
【０５８０】
一実施形態では、融合タンパク質、二重特異性タンパク質複合体又はそれらを含む組成物を含む本開示の分子は、実験室試薬として使用するために提供される。
【０５８１】
さらなる態様
さらなる態様では、ヌクレオチド配列、例えば、上記の多特異性分子又は融合タンパク質を含む本明細書に記載される構築物をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０５８２】
一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば、本開示に従った多特異性分子又は二重特異性タンパク質複合体又は抗体を含む本明細書に記載される構築物をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０５８３】
本明細書の開示は上で定義されるヌクレオチド配列を含むベクターにも及ぶ。
【０５８４】
本明細書で使用される用語「ベクター」とは、それがすでに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子のことである。ベクターの例は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントをそこにライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループである。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。ある種のベクターは、それが導入されている宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞のゲノムに組み込むことが可能であり、そこではベクターはそれに続いて宿主ゲノムと一緒に複製される。プラスミドはもっとも一般的に使用されている形態のベクターであるので、本明細書では、用語「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用することができる。
【０５８５】
ベクターを構築することができる一般的な方法、すなわち、トランスフェクション法及び培養法は当業者には周知である。これに関しては、"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishingを参照する。
【０５８６】
本明細書で使用される用語「選択可能なマーカー」とは、その発現によってマーカー遺伝子を含有するベクターを形質転換されている又はトランスフェクトされている細胞を同定することができるようになるタンパク質のことである。広範囲の選択マーカーが当技術分野では公知である。例えば、典型的には選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。選択可能マーカーは、例えば、蛍光マーカーなどの視覚的に同定可能なマーカーでも可能である。蛍光マーカーの例には、ローダミン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ及びその種々のコンジュゲートが含まれる。
【０５８７】
本開示の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本開示の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のためにはいかなる適切な宿主細胞／ベクター系でも使用することができる。細菌、例えば、大腸菌及び他の微生物系を使用してもよいし、又は真核生物、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０５８８】
本開示は、本開示に従った分子又はその成分の生産のための工程であって、本開示の分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現させるのに適した条件下で本開示のベクターを含有する宿主細胞を培養し、前記分子を単離することを含む前記工程も提供する。
【０５８９】
本明細書に記載される二重特異性タンパク質複合体を含む本開示の分子は診断／検出キットにおいて使用することができる。キットは、例えば、その両方が同じ細胞型上に存在している２つの抗原に対して特異的である二重特異性抗体複合体を含み、両方の抗原が首尾よく検出された場合には陽性の診断のみを行うことが可能である。複合体化されていない形態の２つの別々の抗体又は抗体断片よりもむしろ本明細書に記載される二重特異性抗体複合体などの本開示の分子を使用することにより、検出の特異性を大いに増強することが可能である。
【０５９０】
一実施形態では、二重特異性抗体複合体などの本開示の分子は固体表面に固定される。固体表面は例えば、チップ又はＥＬＩＳＡプレートであってもよい。
【０５９１】
試料中で第１と第２のペプチドの存在を検出するための本開示に従った分子、例えば、本明細書に記載される二重特異性タンパク質複合体の使用がさらに提供され、それによって前記分子は検出剤として使用される。
【０５９２】
本明細書に記載される二重特異性抗体複合体などの本開示の分子は、例えば、結合した抗体−抗原複合体の検出を促進する蛍光マーカーにコンジュゲートさせることができる。そのような二重特異性抗体複合体は免疫蛍光顕微鏡のために使用することが可能である。代わりに、二重特異性抗体複合体はウェスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡのためにも使用することができる。
【０５９３】
一実施形態では、本開示に従った分子又はその成分を精製するための工程が提供される。
【０５９４】
一実施形態では、本開示に従った分子又はその成分を精製するための工程であって、不純物がカラム上に保持され抗体が非結合画分中に維持されるように陰イオン交換クロマトグラフィーを非結合モードで実施するステップを含む前記工程が提供される。ステップは、例えば、ｐＨ約６〜８で実施することができる。
【０５９５】
工程は、例えば、ｐＨ約４〜５で実施される、カチオン交換クロマトグラフィーを用いる最初の捕捉ステップをさらに含むことができる。
【０５９６】
工程は、生成物及び工程関連不純物が生成物ストリームから適切に分離されることを確実にする追加のクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）をさらに含むことができる。
【０５９７】
精製工程は、濃縮及びダイアフィルトレーションステップなどの１つ又は複数の限外濾過ステップも含むことができる。
【０５９８】
上で使用される「精製された形態」は、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれよりも多い純度などの少なくとも９０％純度を指すことを意図されている。
【０５９９】
本明細書の文脈では、「含む（comprising）」は「含む（including）」と解釈するべきである。
【０６００】
ある種の要素を含む開示の態様は、関連する要素「からなる」又は「基本的にからなる」別の実施形態に及ぶことも意図されている。
【０６０１】
肯定的に列挙される実施形態は本明細書では放棄の根拠として用いられることがある。
【０６０２】
本明細書で参照されるすべての参考文献は、参照により具体的に組み込まれる。
【０６０３】
本明細書の小見出しは明細書を構築するのを支援するのに用いられ、本明細書の専門用語の意味を構成するために使用されることを意図していない。
【０６０４】
本開示の配列は本明細書の下に提供される。
【０６０５】
GCN4(7P14P) 配列
2017529061.tif 000007
ボールドのアミノ酸は任意である。
GCTAGCGGAGGCGGAAGAATGAAACAACTTGAACCCAAGGTTGAAGAATTGCTTCCGAAAAATTATCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCCATCACCATCACCATCAC 配列番号２
52SR4 ds scFv配列
DAVVTQESALTSSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYASWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSDHWVFGCGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQSPGKCLEWLGVIWGDGITDYNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLTVSSAAAHHHHHHEQKLISEEDL−配列番号３
GATGCGGTGGTGACCCAGGAAAGCGCGCTGACCAGCAGCCCGGGCGAAACCGTGACCCTGACCTGCCGCAGCAGCACCGGCGCGGTGACCACCAGCAACTATGCGAGCTGGGTGCAGGAAAAACCGGATCATCTGTTTACCGGCCTGATTGGCGGCACCAACAACCGCGCGCCGGGCGTGCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCCTGATTGGCGATAAAGCGGCGCTGACCATTACCGGCGCGCAGACCGAAGATGAAGCGATTTATTTTTGCGTGCTGTGGTATAGCGACCATTGGGTGTTTGGCTGCGGCACCAAACTGACCGTGCTGGGTGGAGGCGGTGGCTCAGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGCGGGTCTGGCGGCGGCGGCAGCGATGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTCTCCTGACCGATTATGGCGTGAACTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAATGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCGATGGCATTACCGATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGAGCGTGACCAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGAGCGGCGATAGCGCGCGCTATTATTGCGTGACCGGCCTGTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGCGGCCGCCCATCACCATCACCATCACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGTAATAG
配列番号４
【０６０６】
ＣＤ７９ｂ抗体
Ａｂ４４４７
ウサギＡｂ４４４７ＶＬ領域  配列番号７１
AQVLTQTPSP VSAPVGGTVT INCQASQSVV SGNYLAWLQQ KPGQPPKQLI HSASTLASGV SSRFSGSGSG TQFTLTISGV QCEDAATYYC LGEFSCSSHD
CNAFGGGTEV VVK
ウサギＡｂ４４４７ＶＬ領域  配列番号７２
gcccaagtgc tgacccagac tccgtcccct gtgtctgcac ctgtgggagg cacagtcacc atcaattgcc aggccagtca gagtgttgtt agtggcaatt acctagcctg gcttcagcag aaaccagggc agcctcccaa gcaactgatc cattctgcat ccactctggc atctggggtc tcatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acacaattca ctctcaccat cagcggcgtg cagtgtgaag atgctgccac ttactactgt ctaggcgaat ttagttgtag tagtcatgat tgtaatgctt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaa
ウサギＡｂ４４４７ＶＨ領域  配列番号７３
QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSN YAVSWVRQAP GEGLEWIGII YIETGTTWYA NWAKGRFTIS KTSTTVDLTI TSPSTEDTAT YFCAREPYEP YDDSNIYYGM DPWGPGTLVT VSS
ウサギＡｂ４４４７ＶＨ領域  配列番号７４
cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc tgcaccgtct ctggattctc cctcagtaac tatgcagtaa gctgggtccg ccaggctcca ggggagggac tggaatggat cgggatcatt tatattgaaa ctggtaccac atggtacgcg aactgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga tctgacaatc accagtccgt caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagagaacc ttatgaacct tatgatgata gtaatattta ctacggcatg gacccctggg gcccaggcac cctcgtcacc gtctcgagt
2017529061.tif 000008
【０６０７】
本開示は、１つの又は両方のシステインが別のアミノ酸、例えば、セリンで置き換えられており、特に、第１のｃｙｓがセリンで置き換えられていて第２のｃｙｓは変化しないままである、又は第１のシステインが変化しないままで第２のシステインがセリンで置き換えられている、又は両方のシステインがセリンで置き換えられている配列番号７７の誘導体にも及ぶ。
【０６０８】
Ａｂ４４５０
ウサギＡｂ４４５０ＶＬ領域  配列番号８１
AIDMTQTPSP VSAAVGGTVT INCQSSQSIY NNNDLAWYQQ KPGQPPKLLI YEASKLASGV PSRFKGSGSG TQFTLTISGV QCDDAATYYC QGGGSGGDGI AFGGGTKVVV E
ウサギＡｂ４４５０ＶＬ領域  配列番号８２
gccattgata tgacccagac tccatccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc atcaattgcc agtccagtca gagtatttat aataataatg acttagcctg gtatcagcag aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacgaagcat ccaaactggc atctggggtc ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagtggcgtg cagtgtgatg atgctgccac ttactactgt cagggcggtg gtagtggtgg tgatggcatt gctttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc gaa
ウサギＡｂ４４５０ＶＨ領域  配列番号８３
QSVEESGGRL VTPGAPLTLT CTVSGFSLNN YVMVWVRQAP GKGLEWIGII YVSGNAYYAS WAKGRFTISR TSTTVDLKVT SLTTEDTATY FCARDAGHSD VDVLDIWGPG TLVTVSS
ウサギＡｂ４４５０ＶＨ領域  配列番号８４
cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg gggcacccct gacactcacc tgcacagtct ctggattctc cctcaataac tatgtaatgg tctgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggaatggat cggaatcatt tatgttagtg gtaatgcata ctacgcgagc tgggcaaaag gccgattcac catctccaga acctcgacca cggtggatct gaaagtgacc agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gagatgctgg tcatagtgat gtcgatgttt tggatatttg gggcccgggc accctcgtca ccgtctcgag t
2017529061.tif 000009
【０６０９】
本開示は、モチーフＤＧのアミノ酸のうちの少なくとも１つが別のアミノ酸で置き換えられている、例えば、モチーフはＥＧ、ＤＡ又はＤＳに突然変異されている配列番号８７の誘導体にも及ぶ。
【０６１０】
ＣＤ４５抗体
Ａｂ４１２２
ウサギＡｂ４１２２ＶＬ領域  配列番号９１
DIVMTQTPAS VSEPVGGTVT IMCQASQSIS NWLAWYQQKP GQPPKLLIYQ ASKLASGVPS RFKGSGSGTE YTLTISDLEC ADAATYYCQS YYDSGSNVFF AFGGGTKVVV E
ウサギＡｂ４１２２ＶＬ領域  配列番号９２
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc atcatgtgcc aggccagtca gagcattagc aattggttag cctggtatca acagaaacca gggcagcctc ccaagctcct gatctaccag gcatccaaac tggcatctgg ggtcccatcg cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcga cctggagtgt gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattatgata gtggtagtaa tgtttttttt gctttcggcg gagggaccaa ggtggtggtc gaa
ウサギＡｂ４１２２ＶＨ領域  配列番号９３
LSLEESGGDL VKPGASLTLT CTASGFSFSA GYWICWVRQA PGKGLEWIAC TYAGRSGSTY YANWVNGRFT IPKTSSTTVT LQMTSLSGAD TASYFCARGN AGVAVGALWG PGTLVTVSS
ウサギＡｂ４１２２ＶＨ領域  配列番号９４
ctgtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc tgcacagcct ctggattctc cttcagtgcc ggctattgga tatgttgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc acttatgctg gtcgtagtgg tagcacttac tacgcgaact gggtgaatgg ccgattcacc atccccaaaa cctcgtcgac cacggtgact ctgcaaatga ccagtctgtc aggcgcggac acggccagct atttctgtgc gagaggtaat gctggtgttg ctgttggtgc cttgtggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcgagt
2017529061.tif 000010
【０６１１】
本開示は、モチーフＤＳのアミノ酸のうちの少なくとも１つが別のアミノ酸で置き換えられている、例えば、モチーフはＤＡ又はＤＴに突然変異されている配列番号９７の誘導体にも及ぶ。
【０６１２】
本開示は、システインが別のアミノ酸、例えば、セリンで置き換えられている配列番号９８の誘導体にも及ぶ。
【０６１３】
本開示は、システインが別のアミノ酸、例えば、セリンで置き換えられている配列番号９９の誘導体にも及ぶ。
【０６１４】
本開示は、モチーフＮＧのアミノ酸のうちの少なくとも１つが別のアミノ酸で置き換えられている、例えば、モチーフはＮＡ、ＮＳ又はＮＴに突然変異されている配列番号９９の誘導体にも及ぶ。
【０６１５】
Ａｂ４１２９
ウサギＡｂ４１２９ＶＬ領域  配列番号１０１
DIVMTQTPAS VEAAVGGTVT INCQASQSIS SWLSWYQQKP GQPPKLLIYG ASNLASGVPS RFSGSGSGTQ FSLTISDLEC ADAATYYCQS YYDSGSSVFF NFGGGTKVVV K
ウサギＡｂ４１２９ＶＬ領域  配列番号１０２
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc atcaattgcc aagccagtca gagcattagc agttggttat cctggtatca gcagaaacca gggcagcctc ccaagctcct gatctatggt gcatccaatc tggcatctgg ggtcccatca cggttcagcg gcagtggatc tgggacacag ttcagtctca ccatcagcga cctggagtgt gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattatgata gtggtagtag tgtttttttt aatttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc aaa
ウサギＡｂ４１２９ＶＨ領域  配列番号１０３
QSLEESGGDL VKPGASLTLT CTASGFSFSA GYWICWVRQA PGKGLEWIAC IYAGSSGSTY YASWAKGRFT IPKTSSTTVT LQMTSLTGAD TATYFCARGN AGVAVGALWG PGTLVTVSS
ウサギＡｂ４１２９ＶＨ領域  配列番号１０４
cagtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gttaagcctg gggcatccct gacactcacc tgcacagcct ctggattctc cttcagtgcc ggctattgga tatgttgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatgctg gtagtagtgg tagcacttac tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atccccaaaa cctcgtcgac cacggtgact ctgcaaatga ccagtctgac aggcgcggac acggccacct atttctgtgc gagaggtaat gctggtgttg ctgttggtgc cttgtggggc ccaggcaccc tcgtcaccgt ctcgagt
2017529061.tif 000011
【０６１６】
本開示は、モチーフＤＳのアミノ酸のうちの少なくとも１つが別のアミノ酸で置き換えられている、例えば、モチーフはＤＡ又はＤＴに突然変異されている配列番号１０７の誘導体にも及ぶ。
【０６１７】
本開示は、システインが別のアミノ酸、例えば、セリンで置き換えられている配列番号１０８の誘導体にも及ぶ。
【０６１８】
本開示は、システインが別のアミノ酸、例えば、セリンで置き換えられている配列番号１０９の誘導体にも及ぶ。
【０６１９】
Ａｂ４１３１
ウサギＡｂ４１３１ＶＬ領域  配列番号１１１
DIVMTQTPAS VSEPVGGSVT IKCQASQSFY NLLAWYQQKP GQPPKLLIYD ASDLASGVPS RFKGSGSGTD FTLTISDLEC ADAAAYYCQS ADGSSYAFGG GTEVVVK
ウサギＡｂ４１３１ＶＬ領域  配列番号１１２
gacattgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg ctcagtcacc atcaagtgcc aggccagtca gagcttttac aacctcttag cctggtatca gcagaaacca gggcagcctc ccaaactcct gatctatgat gcatccgatc tggcatctgg ggtcccatcg cggttcaaag gcagtggatc tgggactgat ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt gccgatgctg ccgcttacta ctgtcaaagt gctgatggta gtagttacgc tttcggcgga gggaccgagg tggtcgtcaa a
ウサギＡｂ４１３１ＶＨ領域  配列番号１１３
QEQLEESGGG LVKPEGSLTL TCTASGVSFS SSYWIYWVRQ APGKGLEWIA CIYTGSSGST YYASWAKGRF TVSETSSTTV TLQMTSLTAA DTATYFCARA SAWTYGMDLW GPGTLVTVSS
ウサギＡｂ４１３１ＶＨ領域  配列番号１１４
caggagcaat tggaggagtc cgggggaggc ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc acctgcacag cctctggagt ctccttcagt agcagctatt ggatatactg ggtccgccag gctccaggga aggggctgga gtggatcgca tgcatttata ctggtagtag tggtagcact tactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accgtctccg aaacctcgtc gaccacggtg actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagca agcgcttgga cctacggcat ggacctctgg ggcccgggca ccctcgtcac cgtctcgagt
2017529061.tif 000012
【０６２０】
本開示は、モチーフＤＳのアミノ酸のうちの少なくとも１つが別のアミノ酸で置き換えられている、例えば、モチーフはＤＡ又はＤＴに突然変異されている配列番号１１７の誘導体にも及ぶ。
【０６２１】
本開示は、システインが別のアミノ酸、例えば、セリンで置き換えられている配列番号１１９の誘導体にも及ぶ。
【０６２２】
Ａｂ４１３３
ウサギＡｂ４１３３ＶＬ領域  配列番号１２１
AQVLTQTPSP VSAVVGGTVS ISCQASQSVY NNNNLSWYQQ KPGQPPKLLI YDASKLASGV PSRFKGSGSG TQFTLTISGV QCDDAATYYC LGGYYSSGWY FAFGGGTKVV VK
ウサギＡｂ４１３３ＶＬ領域  配列番号１２２
gcgcaagtgc tgacccagac tccatctccc gtgtctgcag ttgtgggagg cacagtcagc atcagttgcc aggccagtca gagtgtttat aataacaaca acttatcctg gtatcagcag aaaccagggc agcctcccaa gctcttgatc tacgatgcat ccaaattggc atctggggtc ccatcccggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt ctaggcggtt attatagtag tggttggtat tttgctttcg gcggagggac caaggtggtg gtcaaa
ウサギＡｂ４１３３ＶＨ領域  配列番号１２３
QEQLVESGGG LVQPEGSLTL TCTASGFSFS GNYYMCWVRQ APGKGLEWIG CLYTGSSGST YYASWAKGRF TISKTSSTTV TLQMTSLTAA DTATYFCARD LGYEIDGYGG LWGQGTLVTV SS
ウサギＡｂ４１３３ＶＨ領域  配列番号１２４
caggagcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtccagc ctgagggatc cctgacacta acctgcacag cttctggatt ctccttcagt ggcaactact acatgtgctg ggtccgccag gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tgcctttata ctggtagtag tggtagcaca tattacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagat ctaggttatg aaattgatgg ttatgggggc ttgtggggcc agggcaccct cgtcaccgtc tcgagt
2017529061.tif 000013
【０６２３】
本開示は、グリコシル化部位ＮＬＳが取り除かれ、例えば、ＳＬＳ又はＱＬＳに突然変異されている配列番号１２５の誘導体にも及ぶ。
【０６２４】
本開示は、システインが別のアミノ酸、例えば、セリンで置き換えられている配列番号１２８の誘導体にも及ぶ。
【０６２５】
本開示は、モチーフＤＧのアミノ酸のうちの少なくとも１つが別のアミノ酸で置き換えられている、例えば、モチーフはＥＧ、ＤＡ又はＤＳに突然変異されている配列番号１３０の誘導体にも及ぶ。
【０６２６】
血清アルブミン結合抗体
ＣＤＲＨ１  ｄＡｂＨ１  配列番号１３１  Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn
ＣＤＲＨ２  ｄＡｂＨ１  配列番号１３２  Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
ＣＤＲＨ３  ｄＡｂＨ１  配列番号１３３  Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu
ＣＤＲＬ１  ｄＡｂＬ１  配列番号１３４  Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
ＣＤＲＬ２  ｄＡｂＬ１  配列番号１３５  Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser
ＣＤＲＬ３  ｄＡｂＬ１  配列番号１３６  Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr
抗アルブミン抗体の重鎖可変ドメイン（ｄｓなし）  配列番号１３７
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
抗アルブミン抗体の重鎖可変ドメイン（ｄｓ）  配列番号１３８
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
抗アルブミン抗体の軽鎖可変ドメイン（ｄｓなし）  配列番号１３９
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
抗アルブミン抗体の軽鎖可変ドメイン（ｄｓ）  配列番号１４０
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
ヒトＣＤ７９ａ  配列番号１４１
MPGGPGVLQA LPATIFLLFL LSAVYLGPGC QALWMHKVPA SLMVSLGEDA HFQCPHNSSN NANVTWWRVL HGNYTWPPEF LGPGEDPNGT LIIQNVNKSH  GGIYVCRVQE GNESYQQSCG TYLRVRQPPP RPFLDMGEGT KNRIITAEGI ILLFCAVVPG TLLLFRKRWQ NEKLGLDAGD EYEDENLYEG LNLDDCSMYE DISRGLQGTY QDVGSLNIGD VQLEKP
ヒトＣＤ７９ｂ  配列番号１４２
MARLALSPVP SHWMVALLLL LSAEPVPAAR SEDRYRNPKG SACSRIWQSP RFIARKRGFT VKMHCYMNSA SGNVSWLWKQ EMDENPQQLK LEKGRMEESQ NESLATLTIQ GIRFEDNGIY FCQQKCNNTS EVYQGCGTEL RVMGFSTLAQ LKQRNTLKDG IIMIQTLLII LFIIVPIFLL LDKDDSKAGM EEDHTYEGLD IDQTATYEDI VTLRTGEVKW SVGEHPGQE
ヒトＣＤ４５  配列番号１４３
MYLWLKLLAF GFAFLDTEVF VTGQSPTPSP TGLTTAKMPS VPLSSDPLPT HTTAFSPAST FERENDFSET TTSLSPDNTS TQVSPDSLDN ASAFNTTGVS SVQTPHLPTH ADSQTPSAGT DTQTFSGSAA NAKLNPTPGS NAISDVPGER STASTFPTDP VSPLTTTLSL AHHSSAALPA RTSNTTITAN TSDAYLNASE TTTLSPSGSA VISTTTIATT PSKPTCDEKY ANITVDYLYN KETKLFTAKL NVNENVECGN NTCTNNEVHN LTECKNASVS ISHNSCTAPD KTLILDVPPG VEKFQLHDCT QVEKADTTIC LKWKNIETFT CDTQNITYRF QCGNMIFDNK EIKLENLEPE HEYKCDSEIL YNNHKFTNAS KIIKTDFGSP GEPQIIFCRS EAAHQGVITW NPPQRSFHNF TLCYIKETEK DCLNLDKNLI KYDLQNLKPY TKYVLSLHAY IIAKVQRNGS AAMCHFTTKS APPSQVWNMT VSMTSDNSMH VKCRPPRDRN GPHERYHLEV EAGNTLVRNE SHKNCDFRVK DLQYSTDYTF KAYFHNGDYP GEPFILHHST SYNSKALIAF LAFLIIVTSI ALLVVLYKIY DLHKKRSCNL DEQQELVERD DEKQLMNVEP IHADILLETY KRKIADEGRL FLAEFQSIPR VFSKFPIKEA RKPFNQNKNR YVDILPYDYN RVELSEINGD AGSNYINASY IDGFKEPRKY IAAQGPRDET VDDFWRMIWE QKATVIVMVT RCEEGNRNKC AEYWPSMEEG TRAFGDVVVK INQHKRCPDY IIQKLNIVNK KEKATGREVT HIQFTSWPDH GVPEDPHLLL KLRRRVNAFS NFFSGPIVVH CSAGVGRTGT YIGIDAMLEG LEAENKVDVY GYVVKLRRQR CLMVQVEAQY ILIHQALVEY NQFGETEVNL SELHPYLHNM KKRDPPSEPS PLEAEFQRLP SYRSWRTQHI GNQEENKSKN RNSNVIPYDY NRVPLKHELE MSKESEHDSD ESSDDDSDSE EPSKYINASF IMSYWKPEVM IAAQGPLKET IGDFWQMIFQ RKVKVIVMLT ELKHGDQEIC AQYWGEGKQT YGDIEVDLKD TDKSSTYTLR VFELRHSKRK DSRTVYQYQY TNWSVEQLPA EPKELISMIQ VVKQKLPQKN SSEGNKHHKS TPLLIHCRDG SQQTGIFCAL LNLLESAETE EVVDIFQVVK ALRKARPGMV STFEQYQFLY DVIASTYPAQ NGQVKKNNHQ EDKIEFDNEV DKVKQDANCV NPLGAPEKLP EAKEQAEGSE PTSGTEGPEH SVNGPASPAL NQGS
【０６２７】
参考文献
1.Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard HR, Pluckthun A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14130-14135
2.Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain Antibody Fragment (scFv) with Low Picomolar Affinity. Zhand C, Spinelli S, Luginbuhl B, Amstutz P, Cambillau C, Pluckthun A. (2004) J. Biol. Chem. 279, 18870-18877
3.Antigen recognition by conformational selection. Berger C,  Weber-Bornhauser S,  Eggenberger Y, Hanes J,  Pluckthun A, Bosshard H. R. (1999) F.E.B.S. Letters 450, 149-153
【実施例】
【０６２８】
実施例で使用される用語Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂは、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂであって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
ＡはＣＤ４５又はＣＤ７９などの抗原に特異的なＦａｂ断片を含み、
ＢはＣＤ４５又はＣＤ７９などの抗原に特異的なＦａｂ断片を含み、
ＸはｓｃＦｖなどの結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙはペプチドなどの結合対の第２の結合パートナーであり、
：はＸとＹの間の相互作用（結合相互作用などの）である
前記式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを有する二重特異性タンパク質複合体を記述する。
【０６２９】
（例１）
機能アッセイのためのＦａｂ−Ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ「Ａ−Ｘ」）及びＦａｂ−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド［Ｂ−Ｙ］）の作製
クローニング戦略
抗体可変領域ＤＮＡはＰＣＲ又は遺伝子合成隣接制限酵素部位ＤＮＡ配列により作製した。これらの部位は可変重鎖ではＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏｌであり、可変軽鎖ではＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩであった。これらは相補的な制限部位なので、重鎖可変領域を、２つの重鎖ベクター（ＦａｂＢ−Ｙを有するｐＮＡＦＨ及びＦａｂＡ−Ｘｄｓ［安定化されたジスルフィド］を有するｐＮＡＦＨ）にライゲートしやすくなる。これにより、可変領域はマウス定常領域及びペプチドＹ（ＧＣＮ４）又はｓｃＦｖ  Ｘ（５２ＳＲ４）の上流（又は５’）にライゲートされ、全リーディングフレームが作製される。軽鎖は、再び同じ相補的制限部位を使用する標準社内マウス定常カッパベクター（ｐＭｍＣＫ又はｐＭｍＣＫ  Ｓ１７１Ｃ）にクローニングした。ｐＭｍＣＫ  Ｓ１７１Ｃベクターは可変領域がウサギから単離された場合に使用する。クローニング事象は、全オープンリーディングフレームに隣接するプライマーを使用する配列決定により確認した。
【０６３０】
ＣＨＯＳを培養する
浮遊ＣＨＯＳ細胞を、２ｍＭ（１００×）ｇｌｕｔａｍｘを補充したＣＤＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に前順応させた。細胞は、振盪インキュベーター器（Ｋｕｎｅｒ  ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上、１４０ｒｐｍで撹拌して対数増殖期に維持し、８％ＣＯ２を補充して３７℃で培養した。
【０６３１】
電気穿孔トランスフェクション
トランスフェクションに先立って、細胞数及び生存率をＣＥＤＥＸ細胞計数器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ．Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定し、必要量の細胞（２×１０８細胞／ｍｌ）を遠心コニカルチューブに移して１４００ｒｐｍで１０分間回転させた。ペレット状細胞は無菌Ｅａｒｌｓ平衡塩類溶液に再懸濁させ、１４００ｒｐｍでさらに１０分間回転させた。上澄みは捨てペレットは所望の細胞密度まで再懸濁した。
【０６３２】
最終濃度２×１０８細胞／ｍｌ混合で４００μｇ及び８００μｌのベクターＤＮＡはキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）にピペットを使って入れ、社内電気穿孔システムを使用して電気穿孔した。
【０６３３】
トランスフェクトされた細胞は、２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｘ及び抗生物質有糸分裂阻害剤（１００×）溶液（５００中１）で強化したＰｒｏＣＨＯ５培養液を含有する１×３Ｌエルレンマイヤーフラスコに直接移し、細胞は３７℃、５％ＣＯ２及び１４０ｒｐｍに設定したＫｕｈｎｅｒ振盪インキュベーター器で振盪しながら培養した。栄養補助剤２ｇ／ＬのＡＳＦ（味の素）をトランスフェクションの２４時間後に添加し、さらに１３日間の培養のために温度を３２℃まで下げた。４日目、３ｍＭの酪酸ナトリウム（ｎ−ＢＵＴＲＩＣ  ＡＣＩＤナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ  Ｂ−５８８７）を培養物に添加した。
【０６３４】
１４日目、培養物はチューブに移し、４０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離後上澄みを細胞から分離した。保持した上澄みは０．２２μｍのＳＡＲＴＯ  ＢＲＡＮ  Ｐ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍのガンマゴールド濾過器を通してさらに濾過した。最終発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０６３５】
大規模（１．０Ｌ）精製
Ｆａｂ−Ａ及びＦａｂ−Ｂは、ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓシステム及びＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌ前充填ニッケルカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して親和性捕捉により精製した。培養上澄みは０．２２μｍの無菌濾過を行い、ｐＨは必要な場合にはカラムに充填する前に弱酸又は弱塩基で中性に調整した。１５〜２５ｍＭイミダゾールを含有する二次洗浄ステップを使用して、弱い結合の宿主細胞タンパク質／非特異的Ｈｉｓ結合物をいずれもニッケル樹脂から移動させた。溶出は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋１Ｍ  ＮａＣｌ＋２５０ｍＭイミダゾールを用いて実施し、２ｍｌの画分を収集した。１カラム容積を溶出に入れ、系は１０分間休止させて、溶出ピークを締め、したがって、全溶出量は減少する。一番きれいな画分をプールし、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４に緩衝液交換し０．２２μｍの濾過を行った。最終プールはＡ２８０  Ｓｃａｎ、ＳＥ−ＨＰＬＣ（Ｇ３０００法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元された及び非還元の）により、内毒素についてはＰＴＳ  Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してアッセイした。
【０６３６】
（例２）
ＣＤ４５Ｆａｂ／ＣＤ７９Ｆａｂ二重特異性複合体はＡｋｔシグナル伝達を阻害するが、ＣＤ４５とＣＤ７９Ｆａｂの混合物又は二価ＣＤ７９Ｆａｂ複合体は阻害しない
血小板アファレーシス錐体由来のヒトＰＢＭＣを凍結アリコートとして預けた。アッセイを実施するのに先立って、細胞を解凍し、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、３７℃／５％ＣＯ２環境に順応させた。この期間中、二重特異性又は二価抗体の格子は、細胞表面タンパク質ＣＤ４５及びＣＤ７９ｂに対する抗原特異性を有する等モル（２００ｎＭ）量のＦａｂ’−Ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）とＦａｂ−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド）又はＦａｂ−Ａ（Ｆａｂ−ペプチド）とＦａｂ−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド）を１０％仔ウシ血清及び２ｍＭのグルタミンを含有するＤＭＥＭに希釈することにより作製した。この格子は表４に示されている。
【表４】
2017529061.tif 000014
【０６３７】
ＦａｂＡ−ＸとＦａｂＢ−Ｙ又はＦａｂ−Ａ−ＹとＦａｂ−Ｂ−Ｙは９０分間一緒にインキュベートし（３７℃／５％ＣＯ２環境において）、その後Ｖ字型底９６ウェルプレートにおいて２．５×１０５ＰＢＭＣと混合させた。次に、ＰＢＭＣプラス二重特異性又は二価組合せはさらに９０分間一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は、２００ｎＭのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の添加により３７℃で８分間活性化した。次に、シグナル伝達反応は等体積のＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加することにより停止させた。次に、プレートは室温で１５分間放置し、その後５００ｇで５分間遠心分離した。過剰な上澄みは細胞ペレットから廃棄し、このペレットはフロー緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０１％ＮａＮ３）に再懸濁させてもう１回洗浄した。次に、細胞は氷冷Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に３０分間再懸濁し、その後フロー緩衝液で２回洗浄した。
【０６３８】
次に、細胞は、蛍光的に標識された抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びタンパク質上の４７３位の改変されたセリン残基を認識する蛍光的に標識された抗リン酸Ａｋｔ抗体で染色した。次にプレートは再懸濁し、暗室において室温で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２回洗浄し２５μｌのフロー緩衝液に再懸濁した。ＣＤ２０及びＡｋｔの細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（商標）フローサイトメトリーを使用して測定した。
【０６３９】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、Ａｋｔレベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。ＣＤ４５及びＣＤ７９ｂの組合せの相対的効果は表５に示されている（↓＝阻害、↑＝刺激及び⇔＝総合効果なし）。
【表５】
2017529061.tif 000015
【０６４０】
このデータは棒グラフの形態でも示され（図１）、データは平均値を表しエラーバーは９５％信頼区間である。データは、ＣＤ４５とＣＤ７９ｂの二重特異性組合せが抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞においてリン−Ａｋｔ発現を阻害することが可能であり、二重特異性体を形成することができない混合物であるＣＤ７９ｂ−ＹとＣＤ７９ｂ−Ｙを組み合わせても阻害しないことを示している。
【０６４１】
（例３）
ＣＤ４５Ｆａｂ／ＣＤ７９Ｆａｂ二重特異性複合体はＰＬＣγ２シグナル伝達を阻害するが、ＣＤ４５とＣＤ７９Ｆａｂの混合物又は二価ＣＤ７９Ｆａｂ’複合体は阻害しない
血小板アファレーシス錐体由来のヒトＰＢＭＣを凍結アリコートとして預けた。アッセイを実施するのに先立って、細胞を解凍し、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、３７℃／５％ＣＯ２環境に順応させた。この期間中、二重特異性又は二価抗体の格子は、細胞表面タンパク質ＣＤ４５及びＣＤ７９ｂに対する抗原特異性を有する等モル（２００ｎＭ）量のＦａｂ−ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ［Ａ−Ｘ］）とＦａｂ’−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド［Ｂ−Ｙ］）又はＦａｂ−Ａ（Ｆａｂ−ペプチド）とＦａｂ−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド）を１０％仔ウシ血清及び２ｍＭのグルタミンを含有するＤＭＥＭに希釈することにより作製した。この格子は表４に示されている。
【０６４２】
Ｆａｂ’Ａ−ＸとＦａｂ’Ｂ−Ｙ又はＦａｂ−Ａ−ＹとＦａｂ−Ｂ−Ｙは９０分間一緒にインキュベートし（３７℃／５％ＣＯ２環境において）、その後Ｖ字型底９６ウェルプレートにおいて２．５×１０５ＰＢＭＣと混合させた。次に、ＰＢＭＣプラス二重特異性又は二価組合せはさらに９０分間一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は、２００ｎＭのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の添加により３７℃で８分間活性化した。次に、シグナル伝達反応は等体積のＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加することにより停止させた。次に、プレートは室温で１５分間放置し、その後５００ｇで５分間遠心分離した。過剰な上澄みは細胞ペレットから廃棄し、このペレットはフロー緩衝液に再懸濁させてもう１回洗浄した。次に、細胞は氷冷Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に３０分間再懸濁し、その後フロー緩衝液で２回洗浄した。
【０６４３】
次に、細胞は、蛍光的に標識された抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びタンパク質上の７５９位の改変されたチロシン残基を認識する蛍光的に標識された抗リン酸ＰＬＣγ２抗体で染色した。次にプレートは再懸濁し、暗室において室温で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２回洗浄し、２５μｌのフロー緩衝液に再懸濁させた。ＣＤ２０及びＰＬＣｇ２の細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（商標）フローサイトメトリーを使用して測定した。
【０６４４】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、ＰＬＣγ２レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。ＣＤ４５とＣＤ７９ｂの組合せの相対的効果は表６に示されている（↓＝阻害、↑＝刺激、及び⇔＝全体的効果なし）。
【表６】
2017529061.tif 000016
【０６４５】
このデータは棒グラフとしても表すことが可能であり（図２）、データは平均値を表しエラーバーは９５％信頼区間である。データは、ＣＤ４５とＣＤ７９ｂの二重特異性組合せが抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞においてリン−ＰＬＣγ２発現を阻害し、二重特異性体を形成することができない混合物であるＣＤ７９ｂ−ＹとＣＤ７９ｂ−Ｙを組み合わせても阻害しないことを示している。
【０６４６】
（例４）
二重特異性ＣＤ４５とＣＤ７９ｂ複合体はＢ細胞上でのＣＤ８６の発現を強力に阻害することが可能である
血小板アファレーシス錐体由来のヒトＰＢＭＣを凍結アリコートとして預けた。アッセイを実施するのに先立って、細胞を解凍し、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、３７℃／５％ＣＯ２環境に順応させた。この期間中、二重特異性組合せは、細胞表面タンパク質ＣＤ４５及びＣＤ７９ｂに対する抗原特異性を有する等モル（５００ｎＭ）量のＦａｂ−Ｘ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）とＦａｂ−Ｙ（Ｆａｂ−ペプチド）を１０％仔ウシ血清及び２ｍＭのグルタミンを含有するＤＭＥＭに希釈することにより作製した。次に、これらの組合せは８段階の１／２．５希釈度で希釈し、この組合せについての用量系列を作製した。
【０６４７】
Ｆａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙは９０分間一緒にインキュベートし（３７℃／５％ＣＯ２環境において）、その後２．５×１０５ＰＢＭＣをＶ字型底９６ウェルプレートに添加した。次に、ＰＢＭＣをＦａｂ’−ＸとＦａｂ’−Ｙ組合せに添加し、さらに９０分間一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は、２００ｎＭのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の添加により３７℃で２４時間活性化した。細胞表面活性化マーカーの検出を可能にするために、プレートは氷上に置いて氷冷フロー緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０１％ＮａＮ３）で１回洗浄した。次に、細胞は蛍光標識された抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び蛍光標識された抗ＣＤ８６抗体で染色し、暗所において１時間氷上でインキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２回洗浄し２５μｌのフロー緩衝液に再懸濁した。ＣＤ１９及びＣＤ８６の細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（商標）フローサイトメーターを使用して測定した。データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なるとして同定し、ＣＤ８６レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて、最大応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。図３に見ることができるように、ＣＤ４５−Ｘ／ＣＤ７９ｂ−Ｙの組合せの滴定は、２４時間後Ｂ細胞上での抗ＩｇＭ誘導ＣＤ８６発現を阻害することができた。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を使用する４パラメータロジスティック曲線フィットを使用して外挿したＩＣ５０は４．７ｎＭであった（データは平均値を表しエラーバーは標準偏差である）。
【０６４８】
（例５）
ＣＤ４５及びＣＤ７９ｂ二重特異性タンパク質の阻害効果は異なる抗体Ｖ領域を用いて再現することが可能である
免疫化：抗原ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂ並びにＣＤ４５をコードするＤＮＡは遺伝子合成又は商業的供給源から入手し、強力な構成的プロモーターを有する発現ベクターにクローニングした。次に、社内電気穿孔装置を使用して、プラスミドＤＮＡをＲａｂ−９ウサギ線維芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４１４（商標））にトランスフェクトした。ＣＤ７９免疫化では、ＣＤ７９ａとＣＤ７９ｂの両方を同時トランスフェクトした。２４時間後、細胞はフローサイトメトリーにより抗原発現について調べ、使用するまで液体窒素にアリコートで凍結させた。ウサギ当たり６抗原までは同じ細胞上での同時発現により又は単独で若しくは複数のトランスフェクト細胞の混合物を作製することにより免疫化した。ウサギは３用量の細胞で免疫化した。
【０６４９】
抗体発見：Zubler et al. (1985)により記載されている方法に類似する方法を使用してＢ細胞培養物を調製した。手短に言えば、免疫化ウサギからの脾臓又はＰＢＭＣ由来Ｂ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｔｄ．）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％βメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、３％活性化脾細胞培養上澄み及びガンマ線照射突然変異体ＥＬ４マウス胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェルＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を備えたバーコード化９６ウェル組織培養プレートにおいてウェル当たりおおよそ２０００〜５０００細胞の密度で５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で７日間培養した。
【０６５０】
Ｂ細胞培養上澄み中の抗原特異的抗体の存在は、ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂ又はＣＤ４５で同時トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用する均一蛍光ベースの結合アッセイを使用して判定した。スクリーニングは、バーコード化９６ウェル組織培養プレートからの１０μｌの上澄みを、Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｌａｔｅｍａｔｅリキッドハンドラを使用して、標的抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を含有するバーコード化３８４ウェルブラック壁アッセイプレート（おおよそ３０００細胞／ウェル）に移した。結合はヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＦＣγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて明らかにした。プレートはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出装置上で読み取った。
【０６５１】
一次スクリーニングに続いて、陽性上澄みはＡｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘヒットピッキングロボットを使用して９６ウェルバーコード化マスタープレー上に固定し、細胞培養プレート中のＢ細胞は−８０℃で凍結させた。次に、マスタープレートは、ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂ又はＣＤ４５抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞又は抗原の供給源として組換えＣＤ４５タンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上での均一蛍光ベースの結合アッセイでスクリーニングした。これはウェルごとに抗原特異性を判定するために実行した。
【０６５２】
対象のウェルの選択からの抗体可変領域遺伝子の回収を可能にするために、デコンボリューションステップを実施して、Ｂ細胞の不均一集団を含有する所与のウェル中の抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にした。これは蛍光焦点法（Clargo et al., 2014.Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159; ＥＰ１５７０２６７Ｂ１）を使用して達成した。手短に言えば、陽性ウェルからの免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、標的抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞と又はビオチン化標的抗原で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及び１対１２００最終希釈度のヤギ抗ウサギＦｃγ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）と混ぜ合わせた。３７℃、１時間の静止インキュベーション後、抗原特異的Ｂ細胞はそのＢ細胞を取り囲む蛍光ハローの存在により同定することができた。次に、いくつかのこれらの個々のＢ細胞クローンは、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して同定されたが、エッペンドルフマイクロマニピュレーターで選び取り、ＰＣＲチューブに沈殿させた。蛍光焦点法も使用して、免疫化されたウサギの骨髄に直接由来するＢ細胞の不均一集団から抗原特異的Ｂ細胞を同定した。
【０６５３】
抗体可変領域遺伝子は、重及び軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲにより単細胞から回収した。可変領域をマウスＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターにクローニングするのを可能にする制限部位を３’及び５’末端に組み込んでいるネステッド二次ＰＣＲを用いて、２ラウンドのＰＣＲを実施した。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ発現ベクター用の重及び軽鎖構築物は、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ−２９３細胞に、又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトし、組換え抗体は容積５ｍｌの６ウェル組織培養プレートで発現させた。５〜７日の発現後、上澄みを収穫した。上澄みは、抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び組換えタンパク質又は抗原トランスフェクトＨＥＫ細胞で被覆されたＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上で、均一蛍光ベースの結合アッセイにおいて試験した。これはクローン化抗体の特異性を確認するために実行した。
【０６５４】
ＦａｂＡ−Ｘ及びＦａｂＢ−Ｙの小規模産生（小規模（５０ｍＬ）Ｅｘｐｉ２９３トランスフェクション）
Ｅｘｐｉ２９３細胞はＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地において最終濃度０．５×１０６生細胞／ｍＬまでルーチン的に継代し、オービタルシェイキングインキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
【０６５５】
トランスフェクションの日、細胞生存率及び濃度は自動細胞計測器（Ｖｉ−ＣＥＬＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定した。最終細胞濃度２．５×１０６生細胞／ｍＬを達成するため、適切な体積の細胞懸濁液を無菌２５０ｍＬ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコに添加し、５０ｍＬトランスフェクションごとに新鮮な予熱されたＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地を添加することにより体積を４２．５ｍＬまでにした。
【０６５６】
トランスフェクションごとに脂質−ＤＮＡ複合体を調製するため、合計で５０μｇの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で全体積２．５ｍＬまで希釈し、１３５μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地で全体積２．５ｍＬまで希釈した。すべての希釈液を穏やかに混合し室温で長くても５分間インキュベートし、その後それぞれのＤＮＡ溶液をそれぞれの希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬に添加して、全体積５ｍＬを得た。ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬混合物を穏やかに混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートし、ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体を形成させた。
【０６５７】
ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体インキュベーションが終了後、５ｍＬのＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体をそれぞれの振盪フラスコに添加した。振盪フラスコはオービタルシェイキングインキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
【０６５８】
トランスフェクションのおおよそ１６〜１８時間後、２５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれの振盪フラスコに添加した。
【０６５９】
細胞培養物はトランスフェクション７日後に収穫した。細胞は５０ｍＬの回転チューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、４０００ｒｐｍで３０分間遠心沈殿させ、続いて０．２２μｍのＳｔｅｒｉｃｕｐ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して無菌濾過した。浄化し無菌濾過した上澄みは４℃で保存した。最終発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０６６０】
小規模（５０ｍｌ）精製：Ｆａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙの両方は、小規模減圧ベースの精製装置を使用して親和性捕捉により別々に精製した。手短に言えば、５０ｍｌの培養上澄みを０．２２μｍ無菌濾過して、その後５００μＬのＮｉセファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加した。次に、上澄みビーズ混合物は約１時間引っくり返し、その後減圧させることにより上澄みを取り除いた。次に、ビーズはＷａｓｈ１（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．２）及びＷａｓｈ２（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。溶出は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０＋１Ｍ  ＮａＣｌを用いて実施した。溶出画分はＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４にバッファー交換し、０．２２μｍ濾過した。最終プールはＡ２８０スキャン、ＳＥ−ＵＰＬＣ（ＢＥＨ２００法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元＆非還元）によりアッセイし、内毒素についてはＰＴＳ  Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してアッセイした。
【０６６１】
血小板アファレーシス錐体由来のヒトＰＢＭＣを凍結アリコートとして預けた。アッセイを実施するのに先立って、細胞を解凍し、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、３７℃／５％ＣＯ２環境に順応させた。この期間中、二重特異性、二価又は抗体の混合物の組合せは、細胞表面タンパク質ＣＤ４５及びＣＤ７９ｂに対する抗原特異性を有する等モル（２００ｎＭ）量のＦａｂ’−Ｘ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）とＦａｂ’−Ｙ（Ｆａｂ−ペプチド）を１０％ウシ胎仔血清、５０ユニット／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ  １６４０に希釈することにより作製した。３つの異なるＣＤ７９ｂ  Ｆａｂ−Ｙ及び２つの異なるＣＤ４５  Ｆａｂ−Ｘのこれらの組合せは表７に示されている。
【表７】
2017529061.tif 000017
【０６６２】
ＦａｂＡ−ＸとＦａｂＢ−Ｙは６０分間一緒にインキュベートし（３７℃／５％ＣＯ２環境において）、その後Ｖ字型底９６ウェルプレートにおいて２．５×１０５ＰＢＭＣと混合した。次に、ＰＢＭＣプラスＦａｂＡ−Ｘ及び／又はＦａｂＢ−Ｙ組合せをさらに９０分間一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は、１２．５μｇ／ｍＬのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の添加により３７℃で１０分間活性化した。次に、シグナル伝達反応は等体積のＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加によって停止させた。次に、プレートは室温で１５分間放置し、その後５００×ｇで５分間遠心分離した。過剰な上澄みは細胞ペレットから廃棄し、このペレットはフロー緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁しもう１回洗浄した。次に、細胞は氷冷Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に３０分間再懸濁して、その後フロー緩衝液で２回洗浄した。
【０６６３】
次に、細胞は蛍光標識された抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び７５９位で改変チロシン残基を認識する抗リンＰＬＣγ２抗体で染色した。次に、プレートは再懸濁し、暗所、室温で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２回洗浄し４０μｌのフロー緩衝液に再懸濁した。ＣＤ２０及びＰＬＣγ２の細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（商標）フローサイトメーターを使用して測定した。
【０６６４】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、ＰＬＣγ２レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて、最大応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。
【０６６５】
図４に見ることができるように、データは、ＣＤ４５と異なる抗体Ｖ領域を有するＣＤ７９ｂの組合せが、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞においてリン酸化ＰＬＣγ２発現を阻害することが可能であることを示している。
【０６６６】
（例６）
新規の二重特異性抗体標的を同定するためのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたタンパク質複合体の大きなパネルの格子スクリーニング
序論：前の例における二重特異性フォーマット及びスクリーニング法が首尾よく確証されたことを受けて、スクリーニングを多数の抗原対にまで広げた。Ｂ細胞上で発現される２３の異なる抗原に対する抗体可変（Ｖ）領域対のパネルを作製した。Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ［すなわち、Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂ  Ａ及びＢはＦａｂ断片］フォーマットを使用して、３１５の異なる抗原対組合せのそれぞれの複数のＶ領域組合せを表すヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたタンパク質複合体の格子を形成した。これらの組合せは、二重特異性抗体を用いた介入治療のための新規の標的対を選択するため、ハイスループットフローサイトメトリーアッセイにおいてＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）シグナル伝達を調節するその能力についてスクリーニングした。
【０６６７】
免疫化：選択された抗原をコードするＤＮＡは、遺伝子合成又は商業的供給源により入手し、強力な構成的プロモーターを備えた発現ベクター中にクローニングした。次に、社内電気穿孔システムを使用して、プラスミドＤＮＡをＲａｂ−９ウサギ線維芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４１４（商標））にトランスフェクトした。２４時間後、細胞はフローサイトメトリーにより抗原発現について調べ、使用するまで液体窒素中にアリコートで凍結した。同じ細胞上での同時発現、又は単一若しくは複数をトランスフェクトされた細胞の混合物を作ることによりウサギ当たり最大６抗原を免疫化した。ウサギは３用量の細胞で免疫化した。
【０６６８】
抗体発見：Ｂ細胞培養物はZublerら(1985)により記載された方法に類似する方法を使用して調製した。手短に言えば、免疫化ウサギからの脾臓又はＰＢＭＣ由来Ｂ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｔｄ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％βメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、３％活性化脾細胞培養上澄み及びガンマ線照射突然変異ＥＬ４マウス胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェル  ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を備えたバーコード化９６ウェル組織培養プレートにおいてウェル当たりおおよそ２０００〜５０００細胞の密度で、５％ＣＯ２環境において３７℃で７日間培養した。
【０６６９】
Ｂ細胞培養上澄み中の抗原特異的抗体の存在は、ウサギを免疫化するのに用いた抗原を同時トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用する均一蛍光ベースの結合アッセイを使用して判定した。スクリーニングは、バーコード化９６ウェル組織培養プレート由来の１０μｌの上澄みを、標的抗原をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を含有する（おおよそ３０００細胞／ウェル）バーコード化３８４ウェル黒壁アッセイプレートにＭａｔｒｉｘ  Ｐｌａｔｅｍａｔｅリキッドハンドラを使用して移すことを含んでいた。結合はヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて明らかにした。プレートはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム上で読み取った。
【０６７０】
一次スクリーニングに続いて、陽性上澄みはＡｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘ  ｈｉｔ−ｐｉｃｋｉｎｇ  ｒｏｂｏｔを使用して９６ウェルバーコード化マスタープレート上にまとめ、細胞培養プレート中のＢ細胞は−８０℃で凍結した。次に、マスタープレートは、抗原で別々にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び抗原供給源として組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいてスクリーニングした。これはウェルごとの抗原特異性を判定することが目的であった。
【０６７１】
対象のウェルの選択からの抗体可変領域遺伝子の回収を可能にするために、デコンボリューションを実施してＢ細胞の不均一集団を含有する所与のウェルにおいて抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にした。これは蛍光フォーカス法（Clargo et al., 2014.Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159; EP1570267B1）を使用して達成した。手短に言えば、陽性ウェル由来の免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、標的抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞又はビオチン化標的抗原及びヤギ抗ウサギＦｃγ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）の１対１２００最終希釈で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のいずれかと混合した。３７℃での１時間の静置インキュベーション後、抗原特異的Ｂ細胞はそのＢ細胞を取り囲んでいる蛍光ハローの存在のために同定することができた。いくつかのこれらの個々のＢ細胞クローンは、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して同定されたが、次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロマニュピレーターを用いて選び取り、ＰＣＲチューブ内に蓄積した。蛍光フォーカス法を使用して、直接免疫化ウサギの骨髄由来のＢ細胞の不均一集団からも抗原特異的Ｂ細胞を同定した。
【０６７２】
抗体可変領域遺伝子は、重及び軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにより単細胞から回収した。２ラウンドのＰＣＲを実施し、３’及び５’末端に制限部位を組み込んでいるネステッド二次ＰＣＲにより可変領域をマウスＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターにクローニングすることができた。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ発現ベクターのための重及び軽鎖構築物は、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトし、組換え抗体が容積５ｍｌの６ウェル組織培養プレートで発現された。発現の５〜７日後、上澄みを収穫した。上澄みは、抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又は抗原トランスフェクトＨＥＫ細胞上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいて試験した。これはクローン化された抗体の特異性を確認するために実行した。
【０６７３】
小規模ＦａｂＡ−Ｘ及びＦａｂＢ−Ｙの作製（小規模（５０ｍＬ）Ｅｘｐｉ２９３トランスフェクション）
Ｅｘｐｉ２９３細胞はＥｘｐｉ２９３（商標）発現培養液において、最終濃度０．５×１０６生細胞／ｍＬまでルーチン的に継代し、軌道振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍで８％ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。
【０６７４】
トランスフェクションの日、自動細胞計測器（Ｖｉ−ＣＥＬＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞生存率及び濃度を測定した。最終細胞濃度２．５×１０６生細胞／ｍＬを達成するため、適切な容積の細胞懸濁系を無菌２５０ｍＬエルレンマイヤー振盪フラスコに添加し、５０ｍＬトランスフェクションごとに新鮮な予熱したＥｘｐｉ２９３（商標）発現培養液を添加することにより４２．５ｍＬの容積まで養育した。
【０６７５】
トランスフェクションごとに脂質ＤＮＡ複合体を調製するため、全体で５０μｇの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡを全容積２．５ｍＬまでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培養液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈し、１３５μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を全容積２．５ｍＬまでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培養液に希釈した。すべての希釈物を穏やかに混合し室温で長くても５分間インキュベートし、その後それぞれのＤＮＡ溶液をそれぞれの希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬に添加して、全容積５ｍＬを得た。ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬混合物は穏やかに混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートしてＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体を形成させた。
【０６７６】
ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体インキュベーションを終わらせた後、５ｍＬのＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体をそれぞれの振盪フラスコに添加した。振盪フラスコは軌道振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍで８％ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。
【０６７７】
トランスフェクションのおおよそ１６〜１８時間後、２５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれの振盪フラスコに添加した。
【０６７８】
細胞培養物はトランスフェクション７日後に収穫した。細胞は５０ｍＬ回転チューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、４０００ｒｐｍで３０分間回転させ、その後０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して無菌濾過した。浄化し無菌濾過した上澄みは４℃で保存した。最終発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより判定した。
【０６７９】
小規模（５０ｍｌ）精製：Ｆａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙの両方を、小規模真空ベースの精製システムを使用する親和性捕捉により別々に精製した。手短に言えば、５０ｍｌの培養上澄みを０．２２μｍ無菌濾過し、その後５００μＬのＮｉセファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加した。次に、上澄みビーズ混合物は約１時間転がし、その後上澄みは吸引を適用して取り除いた。次に、ビーズはＷａｓｈ１（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．２）及びＷａｓｈ２（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。溶出は５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０＋１Ｍ  ＮａＣｌを用いて実施した。溶出画分はＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４に緩衝液交換し０．２２μｍ濾過した。最終プールはＡ２８０スキャン、ＳＥ−ＵＰＬＣ（ＢＥＨ２００法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）により、内毒素ではＰＴＳ  Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してアッセイした。
【０６８０】
スクリーニングアッセイ
ドナーＰＢＭＣを３７℃に設定した水浴を使用して急速解凍し、５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブに慎重に移した。次に、ＰＢＭＣは、浸透圧ショックを最小化するためアッセイ培養液で５ｍｌまで液滴で希釈した。次に、細胞は２０ｍｌまで慎重に希釈し、その後最終培養液希釈液を添加して、容積を５０ｍｌにした。次に、細胞は５００ｇで５分間回転させ、その後上澄みを取り除いて細胞を１ｍｌ培養液に再懸濁した。次に、細胞は計数し１．６６×１０６細胞／ｍｌまで希釈し、その後ウェル当たり３０μｌをＶ字型底ＴＣプレートに分注し、最終アッセイ濃度５．０×１０４細胞／ウェルを与える。次に、細胞プレートは必要になるまで３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中にカバーして保存し、最小限１時間休ませる。
【０６８１】
Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ試薬はアッセイ培養液において、等モル比、最終アッセイ濃度の５倍で混合し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした。試料は９６ウェルＵ字型底ポリプロピレンプレートにおいて調製し、インキュベーション中はカバーした。
【０６８２】
１０μｌの５×Ｆａｂ−ＫＤ−Ｆａｂ混合物を、細胞を含有する適切な試験ウェルに添加し、１０００ｒｐｍで３０秒間振盪することにより混合し、その後３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした。
【０６８３】
次に、細胞は１０μｌの抗ヒトＩｇＭで刺激した。刺激の最終アッセイ濃度は、アッセイパネル読み出し情報により変動し、３つの抗体カクテルＡ、Ｂ及びＣ（下で詳述）は、５０μｇ／ｍｌ（カクテルＡ及びＣ）又は２５μｇ／ｍｌ（カクテルＢ）のいずれかの最終アッセイ濃度で刺激した。次に、アッセイプレートは１０００ｒｐｍで３０秒間穏やかに混合し、その後３７℃、５％ＣＯ２で５分間（抗体カクテルＡ及びＣ）又は２分間（抗体カクテルＢ）インキュベートした。アッセイは、１５０μｌの氷冷ＢＤ  ＣｙｔｏＦｉｘをすべてのウェルの添加することにより停止し、室温で１５分間インキュベートした。次に、固定された細胞は５００ｇで５分間回転させて細胞をペレット状にし、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５プレート洗浄機を使用して上澄みを除去させた。ペレットはプレートを２４００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスすることにより再懸濁した。次に、細胞は、１００μｌの氷冷ＢＤ細胞透過処理緩衝液ＩＩＩを３０分間添加することにより４℃で透過処理した。次に、細胞は１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し５００ｇで５分間回転させた。上澄みはＥＬｘ４０５により再び取り除き、その後それを使用して残っている透過処理緩衝剤はいずれも洗い流すために２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を迅速に分注した。細胞は５００ｇで再び回転させ、上澄みは反転により取り除いた。先行する回転ステップ中、抗体カクテルはＦＡＣＳ緩衝液で調製し、光を遮断したままにした。次に、細胞はボルテックスする（２４００ｒｐｍ、３０秒間）ことにより再懸濁し、その後２０μｌの抗体カクテルをすべてのウェルの添加し、プレートは１０００ｒｐｍで３０秒間振盪させた。次に、細胞は暗所において室温で６０分間インキュベートした。
【０６８４】
次に、細胞は５００ｇの回転をかけて２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、それぞれのステップ後に上澄みを取り除いた。最後に、細胞は２４００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスすることにより再懸濁し、その後最終２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。次に、プレート（単数又は複数）はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ／ｉＱｕｅ装置上で読み取った。
ＦＡＣＳ緩衝液＝ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ＋０．０５％  ＮａＮ３＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ
抗体カクテルＡ＝１対２  ＣＤ２０  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１対５  ＰＬＣｇａｎｍａ２  ＡＦ８８＋１対１０  Ａｋｔ  ＡＦ６４７＋１対５０  ＥＲＫ１／２  ＰＥ（ＦＡＣＳ緩衝液で希釈）。
抗体カクテルＢ＝１対２  ＣＤ２０  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１対５  Ｓｙｋ  ＰＥ＋１対５  ＢＬＮＫ  ＡＦ６４７（ＦＡＣＳ緩衝液で希釈）
抗体カクテルＣ＝１対５  ＣＤ２０  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）＋１対５  ＰＬＣｇａｎｍａ２  ＡＦ４８８＋１対１０  Ａｋｔ  ＡＦ６４７＋１対５  Ｓｙｋ  ＰＥ（ＦＡＣＳ緩衝液で希釈）
【表８】
2017529061.tif 000018
Fab-X+Fab-Y組合せは、抗体カクテルA及びB又はC単独のいずれかを用いてスクリーニングされた。スクリーニングはすべて2つの異なる血液ドナー由来の錐体細胞上で行った。データは市販のソフトウェアツールを使用して取得し評価した。総数で2500のFab-X+Fab-Y組合せは315の異なる抗原組合せまでスクリーニングした。
【０６８５】
結果
それぞれのＦａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ［すなわち、Ａ−Ｘ：Ｙ−ＢでＡ及びＢはＦａｂ断片］組合せによるＢＣＲシグナル伝達カスケードタンパク質のリン酸化の誘導のパーセンテージ阻害を計算し、この例では、Ｂ細胞機能を阻害する抗原の新たな組合せを探して、陽性組合せの基準を、Ｖ領域の少なくとも１つの組合せによる少なくとも２つのリン酸読み取りの少なくとも３０％阻害として設定した。この閾値に従えば、試験した３１５から１１の新たな抗原対組合せが必要とされる基準を満たした。これは３．５％のヒット率を表し、所望の活性の組合せを見つけるためには多数の組合せをスクリーニングすることが重要であり、ＣＤ７９ｂとＣＤ４５の組合せの活性がいかにまれであるかを示している。
【０６８６】
図６〜８は抗原格子クロス特異性についてのデータを示している。値はそれぞれＳｙｋ、ＰＬＣγ２及びＡｋｔのリン酸化のパーセント阻害（活性化に対してマイナスの値）であり、評価された複数のＶ領域組合せの平均を表している。３１５の異なる抗原組合せを試験し、図に示すように、抗体の異なる組合せによるＢＣＲシグナル伝達に対する効果は強い阻害、例えば、Ｆａｂ−Ｙ上の抗原４（ＣＤ４５）と組み合わせたＦａｂ−Ｘ上の抗原２（ＣＤ７９ｂ）（リン酸Ｓｙｋの７０．４％阻害、図６）から活性化、例えば、Ｘ上の抗原６とＹ上の抗原１１（マイナス１１８．１０％リン酸Ｓｙｋ、図６）まで著しく変化した。
【０６８７】
図６〜８に表される平均％値を表すそれぞれのデータポイントは、図９ではＦａｂ−Ｘ上の抗原組合せ２（ＣＤ７９ｂ）とＦａｂ−Ｙ上の抗原４（ＣＤ４５）について示されている。この場合、異なる抗体Ｖ領域の１０の異なる組合せを評価した。同じ抗原組合せであるが配向が別である、すなわち、Ｆａｂ−Ｙ上の抗原２（ＣＤ７９ｂ）とＦａｂ−Ｘ上の抗原４（ＣＤ４５）は図１０に示されている。この場合では、異なる抗体Ｖ領域の６つの異なる組合せを評価した。再度、すべてのＶ領域が阻害を示すが、前記方法を使用して最適Ｖ領域組合せを同定し選択することが可能である。
【０６８８】
（例７）
最適抗ＣＤ４５抗体Ｖ領域を選択するための、ヘテロ二量体的に繋がったタンパク質複合体での精製抗ＣＤ７９ｂ  Ｆａｂ−ＹとのＦａｂ−Ｘとしての抗原ＣＤ４５に対する一過性に発現されたＶ領域のスクリーニング
導入：ＣＤ７９ｂと組み合わせた二重特異性抗体としてＢ細胞シグナル伝達を阻害するＣＤ４５に対する新しいＶ領域が、ヘテロ二量体的に繋がれたタンパク質複合体の格子スクリーニングを使用して同定された。ＣＤ４５Ｖ領域はＦａｂ−Ｘとして及び精製抗ＣＤ７９ｂ  Ｆａｂ−Ｙと組み合わせて一過性に発現された。Ｂ細胞シグナル伝達の活性化の阻害を測定して、もっとも強力な抗ＣＤ４５及び抗ＣＤ７９ｂＶ領域を選択した。
【０６８９】
抗原発現細胞の調製及びウサギの免疫化は例６に記載されるのと同じように実行した。
【０６９０】
抗体発見：Ｂ細胞培養物は例６に記載されるのと同じように調製した。
【０６９１】
Ｂ細胞培養上澄み中の抗原特異的抗体のスクリーニング及び抗原特異的Ｂ細胞の同定のためのデコンボリューションステップは例６と同じように決定した。
【０６９２】
抗体可変領域遺伝子は、重及び軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにより単細胞から回収した。２ラウンドのＰＣＲを実施し、３’及び５’末端に制限部位を組み込んでいるネステッド二次ＰＣＲにより可変領域をマウスＦａｂ−Ｘ及びマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターにクローニングすることができた。次に、これらのベクターは、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトし、６日間発現させておいた。上澄みは、抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又は抗原トランスフェクトＨＥＫ細胞上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいて試験した。これはクローン化された抗体の特異性を確認するために実行した。
【０６９３】
Ｆａｂ−Ｘ一過性上澄みに加えて、陰性対照ニセ上澄みを無関係な対照ＤＮＡを使用して同じように調製した。
【０６９４】
Ｆａｂ−Ｘの発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０６９５】
精製されたＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙの作製：精製されたＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙは例６に記載されるのと同じ方法を使用して調製した。
【０６９６】
ＰｈｏｓＦｌｏｗアッセイ：ＣＤ７９ｂ特異的Ｆａｂ−Ｙ及びＣＤ４５特異的Ｆａｂ−Ｘは、精製されている又は一時的に上澄みにあるが、２００ｎＭ及び９０ｎＭの等モル濃度で６０分間一緒にインキュベートした（３７℃及び５％ＣＯ２環境において）。適切にもニセ上澄みも含まれた。Ｖ字型底９６ウェルプレートでは、５．０×１０４ＰＢＭＣがウェルに添加され、これに滴定したＦａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙ組合せ又はニセ上澄みを添加した。次に、組合せと細胞をさらに９０分間一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は２５μｇ／ｍＬのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の添加により３７℃で１５分間プラス５％ＣＯ２で活性化した。次に、シグナル伝達反応は等体積のＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加によって停止させた。次に、プレートは室温で１５分間放置し、その後５００×ｇで５分間遠心分離した。過剰な上澄みは細胞ペレットから廃棄し、このペレットはＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０１％ＮａＮ３＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁しもう１回洗浄した。次に、細胞は氷冷Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に３０分間再懸濁して、その後フロー緩衝液で２回洗浄した。
【０６９７】
次に、３つの異なる抗体カクテルの代わりに、例６の抗体カクテルＡについて記載されているのと同じアッセイ濃度及びインキュベーション条件でカクテルを１つだけ使用すること以外は、細胞は例６に記載される通りに染色した。
抗体カクテル＝１対３  ＣＤ２０  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５＋１対５  ＰＬＣｇａｎｍａ２  ＡＦ８８＋１対１０  Ａｋｔ  ＡＦ６４７＋１対５  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ＰＥ（ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した）
【０６９８】
結果
図１１〜１６に見ることができるように、データは、Ｆａｂ−Ｘにおける異なる一過性に発現された抗原ＣＤ４５Ｖ領域とＦａｂ−Ｙにおける２つの異なる精製抗原ＣＤ７９ｂＶ領域（ＶＲ４４７とＶＲ４４５０）の組合せはＢ細胞活性化を異なるレベルにまで阻害することができ（ＰＬＣγ２、ｐ３８及びＡｋｔの阻害により測定した場合）、したがって二重特異性フォーマットにおけるスクリーニングは最適Ｖ領域組合せの選択を促進することを示している。一過性Ｆａｂ−Ｘとの組合せは、精製されたＣＤ４５Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１２２）との基準組合せと比べた。
【０６９９】
（例８）
抗アルブミンさらに付加して又はなしで分子的に連結された二重特異性Ｂｙｂｅを使用する記憶Ｂ細胞機能に対する抗原ＣＤ７９ｂプラス抗原ＣＤ４５の同時ターゲティングの効果
導入：ＣＤ７９ｂ／ＣＤ４５をターゲティングすることが長期培養中のＢ細胞に対して機能的効果を及ぼすことを調べるため、混合したＰＢＭＣ培養でのＢ細胞からのＩｇＧ産生を測定した。リコール抗原破傷風トキソイドに特異的な抗体の測定は、記憶Ｂ細胞機能の読み出しを提供する。
【０７００】
抗原ＣＤ７９ｂ特異性（ＶＲ４４４７）及び抗原ＣＤ４５特異性（ＶＲ４２４８及びＶＲ４１３３）を、抗アルブミン断片（ＶＲ０６４５）を付加した又はなしのＢＹｂｅフォーマットで作製した。抗アルブミン抗体断片は、例８に記載される通りにＢＹｂｅフォーマットの抗原ＣＤ４５Ｆａｂの軽鎖に融合させた。
【表９】
2017529061.tif 000019
【０７０１】
方法
抗アルブミン付加の特異性を有する／なしのＢＹｂｅの精製
ＢＹｂｅ（Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ［Ｆａｂ重鎖のＣ終端からのｓｃＦｖ］）及び抗アルブミンを有するＢＹｂｅ（Ｆａｂ−２×ｄｓｓｃＦｖ［Ｆａｂ重鎖と軽鎖のＣ終端からのｓｃＦｖ］）フォーマットを以下の通りに精製した。標準ｅｘｐｉＨＥＫ又はＣＨＯ発現由来の澄んだ細胞培養上澄みを０．２２μｍ無菌濾過した。濾過した上澄みは、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で平衡化した５０ｍｌのＧａｍｍａｂｉｎｄＰｌｕｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＫ２６カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に２ｍｌ／分で充填した。充填後、カラムはＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、次に０．１Ｍ  グリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．７で溶出させた。溶出に続いて２８０ｎｍで吸光度を測り、溶出ピークを収集し、次に１／２５容積の２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５で中和した。中和された試料はＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して濃縮し、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａいずれかの分子量は膜から切り離し、スイングアウトルーターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。濃縮した試料は、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で平衡にしたＸＫ１６／６０又はＸＫ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかに適用した。カラムは、それぞれ１ｍｌ／分又は２．６ｍｌ／分のいずれかで均一濃度勾配のＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて展開させた。画分を収集し、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出した。選択された単量体画分はプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して＞１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａ分子量は膜から切り離し、スイングアウトルーターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。最終試料は、Ａ２８０Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ＵＶ−可視光分光光度計（Ｃａｒｙ  ５０Ｂｉｏ）により濃度について；ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより％単量体について；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出；５０ｍＡ（ゲル当たり）で５３分間４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン１．５ｍｍゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で実行される還元性及び非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより；並びにカブトガニアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験カートリッジを用いるＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ’ｓ  ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）携帯型試験システムにより内毒素についてアッセイした。
【０７０２】
Ｂ細胞の活性化及び破傷風トキソイド特異的ＩｇＧの測定
ヒトＰＢＭＣは、１６４０培地プラス１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｒ１０培地）において６日間、５００ｎｇ／ｍｌ  ＣＤ４０Ｌ、１μｇ／ｍｌ  ＣｐＧ及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２１を用いて刺激した。精製されたタンパク質の構築物は０日目に最終濃度１００ｎＭで添加され、アッセイ期間中は培養培地中にとどまった。６日後、上澄みを収穫し破傷風トキソイド特異的ＩｇＧの量はＥＬＩＳＡにより検出した。
【０７０３】
手短に言えば、ＭａｘｉｓｏｒｐハーフウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）にＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ破傷風トキソイドを４℃で一晩被覆させた。次に、プレートは０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中５％Ｍｉｌｋにおいて２時間ブロックした。上澄みを希釈し、次に室温で２時間添加した。プレートはＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、破傷風結合抗体は、５％Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０中１μｇ／ｍｌまで希釈したペルオキシダーゼ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を使用して検出した。プレートはＴＭＢ基質溶液（ＫＰＬ）を使用して発色し、吸光度はＳｙｎｅｒｇｙ２マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して４５０ｎＭで測定した。データはＥｘｃｅｌにエクスポートしパーセンテージ阻害は試験抗体なしで培養した細胞と比べて計算した。次に、データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）にインポートし、棒グラフとしてプロットした。
【０７０４】
図１７は、ＶＲ４４４７／ＶＲ４２４８  ＢＹｂｅ、ＶＲ４４４７／ＶＲ４１３３  ＢＹｂｅ、ＶＲ４４４７／ＶＲ４２４８／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミン及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１３３／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンと一緒に培養されたＰＢＭＣからの破傷風トキソイドＩｇＧ産生の阻害を示している。示されデータは単一ドナー由来である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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