(57)【要約】  本発明は主として、ラクト-N-テトラオース(LNT)およびラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)ならびにそれらのフコシル化誘導体のin vivo合成のための遺伝子改変微生物と、該微生物のラクト-N-テトラオースおよびラクト-N-ネオテトラオースならびにそれらのフコシル化誘導体を産生させる方法における使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクト-N-テトロースまたはラクト-N-ネオテトロースのin vivo合成のための遺伝子改変微生物であって、
(i)β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする第1導入遺伝子、
および
(ii)β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼまたはβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする第2導入遺伝子
を含む、上記遺伝子改変微生物。
【請求項２】
前記微生物がLacZおよびLacAの発現を抑制するためにさらに遺伝的に改変されている、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３】
前記の(i)第1導入遺伝子がLacZYA遺伝子座に組み込まれており、かつ前記微生物がLacYをコードするさらなる導入遺伝子を含む、請求項２に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４】
前記のLacYをコードする導入遺伝子がFucIK遺伝子座に組み込まれている、請求項３に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５】
前記微生物がUDP-糖ピロホスホリラーゼをコードするさらなる導入遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６】
前記微生物が、UDP-グルコース4-エピメラーゼの発現を抑制するためにさらに遺伝的に改変されている、請求項１〜５のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項７】
1つもしくは両方の、または1つ、複数もしくは全ての導入遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜６のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項８】
前記微生物が、L-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素をコードするさらなる導入遺伝子、ならびにα1,2-フコシル化、α1,3-フコシル化またはα1,4-フコシル化の能力がある酵素をコードする少なくとも1つの導入遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項９】
前記のL-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素をコードする導入遺伝子が染色体に組み込まれており、かつ前記のα1,2-フコシル化、α1,3-フコシル化またはα1,4-フコシル化の能力がある酵素をコードする少なくとも1つの導入遺伝子がプラスミドベクターで発現される、請求項８に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１０】
前記のL-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素をコードする導入遺伝子と、前記のα1,2-フコシル化、α1,3-フコシル化またはα1,4-フコシル化の能力がある酵素をコードする少なくとも1つの導入遺伝子の両方が染色体に組み込まれている、請求項８に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１１】
ラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体のin vivo合成のための、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物の使用。
【請求項１２】
ラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体を調製する方法であって、以下のステップ：
(a)請求項１〜１０のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物を用意するステップ、
(b)前記遺伝子改変微生物を、ラクト-N-テトロースおよびラクト-N-ネオテトロースの合成を可能にする条件下で培養するステップ、
(c)場合により、フコースを添加するステップ、
(d)場合により、合成されたラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体を単離するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１３】
ステップ(b)が、
−ガラクトースを前記微生物用の炭素源として使用すること、
または
−グリセロールおよびガラクトースを前記微生物用の炭素源として使用すること
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ(b)が、好ましくはラクトース、グルコース、グリセロール、ガラクトース、およびそのいずれかの混合物からなる群より選択される1つまたは複数の炭素源を、連続的に、または数回に分けて添加することを含む、請求項１２および１３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、2〜30 L、好ましくは3〜20 L、特に好ましくは5〜15 Lの範囲のバッチ量を用いる流加法により実施される、請求項１２〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子改変微生物が、細菌、真菌、および植物、好ましくはコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バシラス属、サッカロミセス属およびエシェリキア属の微生物からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物、または請求項１１記載の使用、または請求項１２〜１５のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクト-N-テトロース(LNT)およびラクト-N-ネオテトロース(LNnT)、ならびにそれらのフコシル化誘導体のin vivo合成のための遺伝子改変微生物と、かかる微生物のラクト-N-テトロースおよびラクト-N-ネオテトロース、ならびにそれらのフコシル化誘導体を産生させる方法における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト母乳は健全な乳幼児発達において重要な役割を有すると考えられている。ヒト母乳中に存在するオリゴ糖(ヒトミルクオリゴ糖(HMO))は母乳の主要な構成成分の1つであり、またそのコア構造は還元末端にラクトース単位を有し、かつこれにN-アセチルラクトサミン単位が分岐または鎖状の様式で続く。構造の可変性は、末端位のフコシルまたはシアリル修飾によりさらに高められる。
【０００３】
ラクト-N-テトロース(LNT)は、下記構造：
【０００４】
【化１】
2017520267.tif 000002
【０００５】
を有する、化学式N-[(2S,3R,4R,5S,6R)-2-{[(2R,3S,4S,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)-6-{[(2R,3S,4R,5R)-4,5,6-トリヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)オキサン-3-イル]オキシ}オキサン-4-イル]オキシ}-5-ヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)-4-{[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]オキシ}オキサン-3-イル]アセトアミドの四糖である。
【０００６】
ラクト-N-ネオテトラオース(LNnT)は、化学式N-[(2S,3R,4R,5S,6R)-2-{[(2R,3S,4S,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)-6-{[(2R,3R,4R,5R)-1,2,4,5-テトラヒドロキシ-6-オキソヘキサン-3-イル]オキシ}オキサン-4-イル]オキシ}-4-ヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)-5-{[(2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-トリヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-2-イル]オキシ}オキサン-3-イル]アセトアミドおよび下記構造：
【０００７】
【化２】
2017520267.tif 000003
【０００８】
を有する。
【０００９】
健康および発育増進作用に関しては、十分な量での純粋化合物の回収を必要とするものの、HMOの生物学的機能が数多くの研究の主題となっている。現在、最も一般的に用いられている方法は、母乳からのかなり複雑な抽出である。HMOを産生させる生物工学的方法についての記述はあるが(Hanら、Biotechnol. Adv. 2012, 30, 1268-1278を参照されたい)、例えば、最も一般的なHMOの1つであるラクト-N-テトロースは、現在、適正価格では研究に利用できない。LNTに関しては、化学的および酵素的合成が共に文献から公知である(Alyら、Carbohydr. Res. 1999, 316, 121-132；Murataら、Glycoconj. J. 1999, 16, 189-195を参照されたい)。しかし、化学的合成は反応基の保護および脱保護の複数工程を必要とし、また酵素的合成は好ましくない平衡生成物分布および位置選択性という問題があるため、これらの方法では満足のいく結果を得られない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hanら、Biotechnol. Adv. 2012, 30, 1268-1278
【非特許文献２】Alyら、Carbohydr. Res. 1999, 316, 121-132
【非特許文献３】Murataら、Glycoconj. J. 1999, 16, 189-195
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の第一の目的は、高収率のLNTおよびLNnTならびにそれらのフコシル化誘導体を産生できる系、好ましくは微生物を特定することであった。
【００１２】
本発明のもう１つの目的は、LNTおよびLNnTならびにそれらのフコシル化誘導体を効率的かつ安価な形で生物工学的に産生させることを可能にする対応方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の第一の目的は、本発明によれば、ラクト-N-テトロースまたはラクト-N-ネオテトロースのin vivo合成のための遺伝子改変微生物であって、
(i)β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする第1導入遺伝子
および
(ii)（ラクト-N-テトロースの合成の場合にあっては）β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼまたは（ラクト-N-ネオテトロースの合成の場合にあっては）β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする第2導入遺伝子
を含む上記微生物により達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、ラクト-N-テトロースを与えるラクトースの細胞内反応の図である。
【図２】図2は、コア構造としてLNTを有するフコシル化HMOの細胞内合成の図である。FucTはフコシルトランスフェラーゼであり、またLNFXはそこから得られた生成物である。
【図３】図3は、振盪フラスコ培養における培養上清中の特定のオリゴ糖が、誘導の24時間後に該オリゴ糖の総量に占める割合を、炭素源に応じて示したものである。0.5 mMのIPTGによる誘導と2 g L-1のラクトースおよび2番目に記載した2 g L-1の炭素源の添加を各場合に行ない、かつ30℃および90rpmでインキュベートした。
【図４】図4は、誘導の24時間後の振盪フラスコ培養におけるLNT濃度を炭素源に応じて示したものである。0.5 mMのIPTGによる誘導と2 g L-1のラクトースおよび2番目に記載した2 g L-1の炭素源の添加を各場合に行ない、かつ30℃および90rpmでインキュベートした。
【図５】図5は、誘導の24時間後の振盪フラスコ培養におけるLNT II濃度を炭素源に応じて示したものである。0.5 mMのIPTGによる誘導と2 g L-1のラクトースおよび2番目に記載した2 g L-1の炭素源の添加を各場合に行ない、かつ30℃および90rpmでインキュベートした。
【図６】図6は、LNF Iの構造(非-還元末端部のガラクトシル残基上にα1,2-結合フコシル残基を有するLNT)を示したものである。
【図７】図7は、LND IIの構造(N-アセチルグルコサミニル残基上にα1,4-結合フコシル残基を有し、かつ還元末端部のグリコシル残基上にα1,3-結合フコシル残基を有するLNT)を示したものである。
【図８】図8は、種々の炭素源に対するシェーカーボトル実験における、誘導の24時間後のラクトース消費と生成物形成との比較を示したものである。a)はラクトース(白色)、LNT II(灰色)およびLNT(黒色)の濃度を示している。b)はバイオマス当たりの生成物の収率を示している。c)は培養上清中の生成物の割合(％)を示している。
【図９】図9は、種々の炭素源に関して指数増殖中のUDP-糖の細胞内濃度を示したものである：UDP-グルコース(灰色)、UDP-ガラクトース(黒色)、UDP-アセチルグルコサミン(白色)。値は2回以上の独立した実験の平均値およびSEとして与えられる。
【図１０】図10は、LNTの流加培養による産生を示したものである。縦の破線(12.6時間)は、タンパク質発現を誘導するためのIPTG添加および最初のラクトース添加を表している。縦の点線(20.5時間)は、バッチ期の終了ならびにガラクトースおよび窒素添加の開始を表している。a)は系に添加した総炭素源のプロフィールを示している：ガラクトース(実線)、窒素源：リン酸アンモニウム(点線)およびラクトース(破線)；b)は細胞乾燥重量濃度(CDW)を示している；c)はLNT II(白三角)およびLNT(黒丸)の濃度を示している。
【図１１】図11は、フコシル化ラクト-N-トリオースIIの構造を示したものである。
【図１２】図12は、ジフコシル化ラクト-N-ペントースの構造を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
遺伝子改変微生物とは、本文脈においては、生物工学的方法を利用し特定の様式で、個々の遺伝子がスイッチオフされている、および／または内因性もしくは外来性の遺伝子が組み込まれている(導入遺伝子)微生物を意味する。本発明と一致する導入遺伝子は、ゲノム内の異なる部位に遺伝子工学により組み込まれており、またその結果として、例えば、天然プロモーターとは異なるプロモーターの下で発現される、異なる生物から移入された遺伝子、または関心のある微生物に本来存在する遺伝子でありうる。
【００１６】
驚いたことに、本発明の過程において、遺伝子導入によりβ1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼまたはβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼを発現する、遺伝子工学に日常的に用いられる微生物を、それぞれLNTおよびLNnTの合成に上手く用いうることが見出された。その際、例えば、まず始めにグリコシル化の基質としてのラクトースと反応することでラクト-N-トリオースII(LNT II)を中間体として与え、その後ヌクレオチド-活性化糖に依存する段階においてLNT IIを伸長してLNTを与えるLeloirグリコシルトランスフェラーゼ(LgtAまたはLgtB)を使用することが可能である(図1およびFreyら、FASEB J. 1996, 10, 461-70を参照されたい)。本発明の範囲内にある、適合性が証明された導入遺伝子の具体例は、β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする髄膜炎菌(Neisseria meningitides)IgtA遺伝子およびβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする大腸菌(E. coli)wbgO遺伝子である。組換えグリコシルトランスフェラーゼであるLgtAの供与体基質(UDP-N-アセチルグルコサミン)およびWbgOの供与体基質(UDP-ガラクトース)は大腸菌(E.coli)K12代謝の中間体であり、増殖中に連続的に合成される(Raetzら、Annu. Rev. Biochem., 2002, 71, 635-700を参照されたい)。UDP-N-アセチルグルコサミンは、ペプチドグリカン、リポ多糖および腸内細菌共通抗原の生合成の前駆体である(Neidhardtら、Cellular and Molecular Biology, 第2版、1996を参照されたい)。UDP-N-アセチルグルコサミンはGlmS、GlmM、およびGlmU生合成酵素によりフルクトース6-リン酸から産生される(Barreteauら、FEMS Microbiol. Rev., 2008, 32, 168-207を参照されたい)。UDP-ガラクトースは大腸菌(E.coli)におけるリポ多糖生合成およびコラン酸生合成の前駆体基質であり、Pgm、GalU、およびGalEにより触媒される3つの酵素段階を経てグルコース6-リン酸から形成される(Frey, FASEB J., 1996, 10, 461-70を参照されたい)。細胞増殖および前記のヌクレオチド-活性化糖の細胞内供給のためには、グリセロールまたはグルコースなどの安価な基質を用いると有利であろう。
【００１７】
本発明の好適な実施形態によれば、前記微生物は、LacZおよびLacAの発現を抑制するためにさらに遺伝的に改変されている。特に好適な実施形態では、(i)第1導入遺伝子はこの際LacZYA遺伝子座に組み込まれており、かつ前記微生物はLacYをコードするさらなる導入遺伝子を含む。
【００１８】
LacZおよびLacAによるラクトースの代謝と生じうるアセチル化を阻害するため、これらの遺伝子の発現を本発明の微生物において抑制してもよい。これは好ましくは、第1導入遺伝子(i)をLacZYA遺伝子座に組み込むことにより実施する。しかし、前記微生物がラクトースを依然として取り込むようにするため、LacYを、好適な実施形態では、遺伝子導入によりゲノム内の異なる部位で、例えば異なるプロモーター下、好ましくはPtacプロモーター下で発現させる。特に好ましくは、lacYを、フコース代謝遺伝子をコードするfucIK遺伝子座に組み込む。
【００１９】
LNTおよびLNnTの収率が可能な限り高くなるようにするためには、LNT IIのLNTへの変換を効率的に進められるように多くのヌクレオチド-活性化糖、特にUDP-ガラクトースを細胞内に提供すると有利である。
【００２０】
従って、本発明のさらなる好適な実施形態では、前記微生物はUDP-糖ピロホスホリラーゼ(USP)をコードするさらなる導入遺伝子を含む。
【００２１】
かかるUSPは、例えば、森林型熱帯リーシュマニア(Leishmania major)においてLmjF17.1160オープンリーディングフレームによりコードされている(Damerowら、J.Biol. Chem. 2010, 285, 878-887を参照されたい)。該USPは、ガラクトース-1-リン酸を利用してUDP-ガラクトースの生成を触媒する。有利なことに、この反応は、細胞毒性を示しうるガラクトース-1-リン酸の蓄積を阻害する場合もある。
【００２２】
本発明のさらなる好適な実施形態では、前記微生物は、UDP-グルコース4-エピメラーゼの発現を抑制するためにさらに遺伝的に改変されている。
【００２３】
この種の抑制は、例えば、好ましくはオペロンの下流遺伝子の連続発現のためにT5プロモーターと置き換えられるgalE-遺伝子を欠失させることにより達成してもよい。有利なことに、細胞内UDP-ガラクトース濃度が結果として同様に上昇する。特に好ましいのは、この実施形態とUDP-糖ピロホスホリラーゼ(USP)をコードする導入遺伝子を含む微生物(先に記載した通り)との組み合わせである。
【００２４】
さらに、本発明によれば、特に好ましいのは先に記載した実施形態のいずれかの微生物であり、該微生物では1つもしくは両方、または1つ、複数、もしくは全ての導入遺伝子が染色体に組み込まれている。
【００２５】
プラスミド不含菌株を使用することは、生産性の維持に選択圧(抗生物質耐性)を一切必要としないため特に有利である。さらに、食品関連の、または製薬上適用しうる生産過程における抗生物質の使用は望ましくない。
【００２６】
本発明の微生物のもう1つの好適な実施形態によれば、前記微生物は、L-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素をコードするさらなる導入遺伝子、ならびにα(アルファ)1,2-フコシル化、α(アルファ)1,3-フコシル化またはα(アルファ)1,4-フコシル化の能力がある酵素をコードする少なくとも1つの導入遺伝子を含む。
【００２７】
かかる微生物は、LNTまたはLNnTの合成後の反応を介して、これら2つの化合物のフコシル化誘導体を産生し、その結果、天然に存在するHMOの構造可変性に関して本発明の微生物の考えうる用途を拡大することができる(図2を参照されたい)。例えば、FKPを、L-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素として用いてもよい。フコシル化に適しているのは、例えば、futC(α1,2-フコシル化)、fucT14(α1,4-フコシル化)またはfutA(α1,3-フコシル化)遺伝子によりコードされている酵素の発現である。
【００２８】
本発明の微生物の好適な実施形態(先に記載した通り)では、前記のL-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素をコードする導入遺伝子が染色体に組み込まれており、かつα1,2-フコシル化、α1,3-フコシル化またはα1,4-フコシル化の能力がある酵素をコードする少なくとも1つの導入遺伝子がプラスミドベクターで発現される。
【００２９】
本発明の微生物の特に好適な実施形態(先に記載した通り)では、前記のL-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素をコードする導入遺伝子と、前記のα1,2-フコシル化、α1,3-フコシル化またはα1,4-フコシル化の能力がある酵素をコードする少なくとも1つの導入遺伝子の両方が染色体に組み込まれている。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、本明細書中に記載した、好ましくは先に記載した実施形態のいずれかにより本明細書中で好適であると記載した、ラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体のin vivo合成のための遺伝子改変微生物の使用に関する。
【００３１】
かかる遺伝子改変微生物の使用により、ラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体を、意図した用途に適合させうる規模で効率的かつ安価に産生させることが可能となる。
【００３２】
さらなる態様によれば、本発明は、ラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体を調製する方法であって、以下のステップ：
(a)先に記載した、好ましくは先に好適なものとして記載した、遺伝子改変微生物を提供するステップ、
(b)前記遺伝子改変微生物を、ラクト-N-テトロースおよびラクト-N-ネオテトロースの合成を可能にする条件下で培養するステップ、
(c)場合により、フコースを添加するステップ、
(d)場合により、合成されたラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体を単離するステップ
を含む上記方法に関する。
【００３３】
本発明の方法は、第一に、先に記載した遺伝子改変微生物を提供すること、ならびに該遺伝子改変微生物を例えば振盪フラスコ中、ラクト-N-テトロースおよびラクト-N-ネオテトロースの合成を可能にする条件下で培養することを含む。この際、細胞増殖は主として用いる微生物に依存する。好ましくは、用いる微生物は、最大生産性のために最適化された生物工学的用途に日常的に使用される微生物である。必須であるラクトースに加えて、例えば、グルコース、グリセロール、ガラクトース、およびその任意の混合物からなる群より選択される安価な(さらなる)炭素源を使用すると有利な場合がある。LNTまたはLNnTの合成を可能にするためには、ラクトースが基質として存在していなければならず、かつ導入遺伝子(i)および(ii)(先に記載した通り)の発現が、場合によってはそれらを発現させるプロモーターに応じて、誘導されなければならない。生成物のフコシル化を確実なものとするためには、フコースも添加されていなければならない。フコースは、好ましくはLNTまたはLNnTの合成に関わる遺伝子の誘導後にのみ、理想的には十分な量の適当な基質が存在しかつラクトースだけがフコシル化されることのないように、添加される。あるいは、フコースはステップ(b)の開始時に既に存在していてもよく、また発現はLNTまたはLNnTの合成に関する遺伝子の発現を調節するプロモーターとは異なるプロモーターの下に置かれていてもよい。フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、その後、適当な誘導物質を所望の時点で添加することにより誘導される。好ましい展開では、LNTまたはLNnTの合成に関わる遺伝子はIPTG-誘導性プロモーター下で発現され、またこの場合、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子はラムノース誘導性プロモーター下で発現される。
【００３４】
場合により、産生された生成物をその後単離する。このため、細胞を遠心分離により採集する、例えば、水に再懸濁してから溶解する。産生された糖は、その後、標準法を利用して上清から精製してもよい。
【００３５】
本発明の方法の好適な実施形態では、ステップ(b)は、
−ガラクトースを前記微生物用の炭素源として使用すること、
または
−グリセロールおよびガラクトースを前記微生物用の炭素源として使用すること
を含む。
【００３６】
本発明の過程において、LNT II中間体に関連するLNTの収率は、供給する炭素源を介して制御できることが見出された(図3を参照されたい)。従って、特に高い収率は、例えば、ガラクトースが存在する主要炭素源である場合に生じる。好ましくは、合成に必要とされるラクトースおよび存在しうる他の炭素源(例えばグリセロールまたはグルコースなど)の総重量に対するガラクトースの(重量)割合は、少なくとも50％、好ましくは70％、特に好ましくは少なくとも90％である。同様に、特に高い収率は、使用する主要炭素源がグリセロールであり、かつガラクトースをLNTまたはLNnTの合成に関わる遺伝子の誘導の開始時に添加する場合に達成される。この場合もまた、合成に必要とされるラクトースおよび存在しうる他の炭素源(例えばグルコースなど)の総重量に対するグリセロールの(重量)割合は、少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも90％である。
【００３７】
さらには、ステップ(b)が、好ましくはラクトース、グルコース、グリセロール、ガラクトース、およびそのいずれかの混合物からなる群より選択される1つまたは複数の炭素源、好ましくは少なくともラクトース、特に好ましくはラクトースおよびガラクトースまたはラクトース、ガラクトースおよびグリセロールを、連続的に、または数回に分けて添加することを含む本発明の方法(先に記載した通り)も好ましい。
【００３８】
有利なことに、細胞毒性を示しうる蓄積または望ましくない阻害は、特定の炭素源(複数の場合あり)を完全に、またはある一定の程度まで使い切る場合、それらを連続的に、または数回に分けて添加することにより回避することができる。
【００３９】
好ましくは、前記遺伝子改変微生物(先に記載した通り)または本明細書中に記載したいずれかの用途に従って用いるかもしくは本明細書中に記載したいずれかの方法で用いる微生物は、本発明によれば、細菌、真菌、および植物、好ましくはコリネバクテリウム属の微生物、特にコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、ブレビバクテリウム属の微生物、特にブレビバクテリウム・フラバム(Bevibacterium flavum)、バシラス属の微生物、サッカロミセス属の微生物、およびエシェリキア属の微生物、特に大腸菌(E.coli)からなる群より選択される。
【００４０】
遺伝子工学において日常的に用いられる微生物の使用は、それらの微生物が高い生産性および導入遺伝子を導入するための遺伝子工学方法に関して最適化されており、また導入遺伝子の誘導は公知であることから、本発明を実行する上で特に有利である。
【００４１】
本発明の過程において、本発明の方法はリットルスケールでも流加法という形で効率的に実施できることが証明された(実施例3を参照されたい)。従って、好ましいのは先に記載した方法であり、該方法は、2〜30 L、好ましくは3〜20 L、特に好ましくは5〜15 Lの範囲のバッチ量を用いる流加法により実施する。
【００４２】
本発明を、図面および実施例に基づき、以下に具体例を挙げてより詳細に説明する。
【実施例１】
【００４３】
実施例1：本発明の遺伝子改変微生物の調製
この調製のための出発菌株は大腸菌(E.coli)K-12株LJ110とした。このプラスミド不含菌株を、相同組換えを利用して対応する発現カセット内の糖分解遺伝子座をノックアウトすることにより改変した。β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子を除去してから、この菌株に髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするlgtA遺伝子を提供することにより、LNT IIの合成を可能とした。最後に、該菌株に、WbgO β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするwbgO遺伝子を供給した。これらの遺伝子は染色体に組み込んだ。
【００４４】
これはまず始めにIPTG-誘導性Ptacプロモーターを有する発現ベクターへのlgtA遺伝子のクローニングを必要とし、該発現ベクターにはその後、該lgtA遺伝子の下流にFRT隣接クロラムフェニコール耐性遺伝子を供給した。Ptacプロモーター、リボソーム結合部位(シャイン-ダルガルノ配列)、lgtA、FRT-cat-FRT耐性マーカー、およびrrnB 転写終結配列を含むこの発現カセットを、PCRを利用して増幅した。該カセットをその後LacZYA遺伝子座に染色体的に組み込んだ。
【００４５】
前記菌株にさらに、ラクトースの取込みを確実にするために、Ptacプロモーターの制御下にある大腸菌(E.coli)K12 lacY遺伝子を提供した。この目的のため、lacYを発現ベクターにクローニングし、続いてFRT-kan-FRT耐性カセットの下流クローニングにより適切に耐性標識した発現カセットを作製した。増幅後、該発現カセットをfucIK遺伝子座に染色体的に組み込んだ。
【００４６】
LNT IIのLNTへの細胞内変換のために、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする大腸菌(E.coli)O55：H7菌株由来のwbgO遺伝子を、lgtAについて記載したようにxylAB遺伝子座に染色体的に組み込んだ。
【実施例２】
【００４７】
実施例2：種々の炭素源を利用したLNTおよびLNT IIの形成の研究
文献に記載されている、ガラクトースに対するグルコースによるカタボライト抑制(McGinnisら、J. Bacteriol. 1969, 100, 902-913を参照されたい)にも関わらず、この実験では、生成物の形成について分析するために、ガラクトースをグルコースまたはグリセロールとの混合物両方の形で、および最少培地において唯一利用可能な炭素源として用いた。実施例1で調製した菌株を本実験のために使用した。培養物は各場合50 mLの量とした。主な炭素源であるグルコース、グリセロールおよびガラクトースは、各々10 g L-1の最終濃度で使用したが、ラクトースは2 g L-1の最終濃度で使用し、混合するガラクトースも同様に2 g L-1で使用し、いずれもOD600＝0.4〜0.6での誘導時に添加した(最終濃度0.5 mMのIPTGを使用)。
【００４８】
LNTの形成は、培養上清および培養ペレットの両方において、誘導の24時間後、アントラニル酸による誘導体化後(Ruhaakら、Proteomics 2010, 10, 2330-2336を参照されたい)にHPLCを利用して蛍光定量的に測定した。その結果、例えば、グリセロールからグルコースに切り替えた場合に改善されたLNT収率が観察された。予想通り、グルコースを含有する培養物へのガラクトースの添加は、カタボライト抑制のため、増殖に対する影響も生成物形成に対する影響も示さなかった。ラクトースの他はガラクトースが使用した唯一の炭素源であった場合、または誘導時にグリセロールを含有する培養物にガラクトースを添加した場合、LNT濃度は誘導の24時間後に該培養物において著しく上昇した。グリセロールを含有する培養物にガラクトースを添加すると、LNT濃度が2.7倍上昇して434.3 mg L-1となり、結果としてグルコースを使用した場合の値の約2倍の生成物形成速度を示した。培地に10 g L-1のガラクトースをグルコースまたはグリセロール抜きで用いた場合、798.1 mg L-1というLNT濃度が達成された。従って、以前にグルコースを用いて達成された最高値が3.6倍上昇した(図4を参照されたい)。
【００４９】
三糖であるLNT IIの産生から判断すると、比較により、LNT II合成は炭素源としてグリセロールを用いると最高となり、一方グルコースおよびガラクトースは約16.4％低いLNT II合成をもたらすことが分かる。グルコースとガラクトースを一緒に用いる場合、誘導の24時間後のLNT II濃度はわずか769 mg L-1と明らかに低い(図5を参照されたい)。このことは、培養物のより低い細胞密度により説明できるかもしれない。しかし、グルコース取込みによる誘導物質の取込み阻害(inducer exclusion)(Nelsonら、EMBO J. 1983, 2, 715-720を参照されたい)と存在するガラクトースによるLacパーミアーゼの阻害(Olsenら、J. Biol. Chem. 1989, 264, 15982-15987を参照されたい)との相互作用もまた考えられ、結果的にLacパーミアーゼの1種類の阻害だけを有する系よりも少量のラクトースが取り込まれる。この阻害は、ペレット中のLNT IIおよびラクトースに対するLNTの比が他の炭素源を含有する培養物における比より著しく高いという事実によっても裏付けられる。
【００５０】
培養上清中のLNTの割合(図3を参照されたい)から判断すると、ガラクトース上の菌株は著しく多いLNTを合成するだけでなく、その培養上清中のLNTの割合も、約93.3％と、グルコース培養物の培養上清中の割合(約54.6％)より有意に高いことが明らかとなる。培養上清からのLNTの単離は培養ペレットからの単離と比較して有利であり、また炭素源としてガラクトースを用いるとより多くの生成物が形成されるため、ガラクトースを使用したLNTの合成は恐らく、より高い基質コストにもかかわらず、特に有利であり、またそれ故に好ましい。
【００５１】
四糖であるLNTの形成には、N-アセチルグルコサミニル由来のグリコシル単位およびガラクトシル単位の、受容体基質であるラクトースへの転移が必要である。それぞれの供与体基質であるUDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)およびUDP-ガラクトース(UDP-Gal)は細胞質型グリコシルトランスフェラーゼ反応に必要であり、既に最初に言及したように、大腸菌(E.coli)代謝により提供される。しかし、ラクトースのLNTへの不完全な変換は、供与体基質、特にUDP-ガラクトースの限られた供給を示している。
【００５２】
UDP-ガラクトースの細胞内入手可能性を改善するため、ひいては増大したLNT収率を達成できるようにするため、種々の炭素源を含有する最少培地を、ラクトースの変換および生成物形成ならびに生成物の培地への放出に関してさらに詳細に調べた。これもまた、実施例1に従って調製した、1％グルコース、1％グリセロールおよび1％ガラクトースのうちの1つ、または各場合0.2％ガラクトースを追加した1％グルコースもしくは1％グリセロールを含有する最少培地で培養した菌株を使用することを必要とした。組換え遺伝子の発現およびLNTの合成は、各培養において、IPTG(最終濃度2 g L-1)を初期指数増殖期の細胞に添加することにより開始させた。ラクトース、LNT IIおよびLNTの濃度を誘導の24時間後に各培養物において測定した。
【００５３】
前記菌株は、50 μg mL-1のクロラムフェニコール(コンタミネーション防止用)を含有するLB培地において37℃で培養した。95％超の純度を有するラクト-N-テトロース標準品をIsoSep (Tullinge, Sweden)から入手した。UDP-グルコース二ナトリウム塩水和物(≧98％)およびUDP-N-アセチルグルコサミンナトリウム塩(≧98％)の標準品はSigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)から入手し、またUDP-ガラクトース二ナトリウム塩(≧95％)はCalbiochem (Merck, Darmstadt, Germany)から入手した。ラクトース一水和物(欧州薬局方グレード)、グルコース一水和物(≧99.5％)、グリセロール(≧98％)およびガラクトース(≧98％)はCarl Roth(Karlsruhe, Germany)から入手した。入手可能な最高純度を有する他の全ての化学物質および試薬は、Carl Roth(Karlsruhe, Germany)またはSigma Aldrich(Taufkirchen, Germany)から入手した。
【００５４】
LNT IIおよびLNTの合成は、1％の主要炭素源(グリセロール、グルコースまたはガラクトース)およびクロラムフェニコール(50μg ml-1、コンタミネーション防止用)を含む50 mLの最少培地を含有する500 mLシェーカーボトル中で各場合2回に分けて30℃および90 rpmで実施した。この培地は以下の組成を有していた：2.68 g L-1の(NH4)2SO4、1 g L-1の(NH4)2-Hクエン酸塩、10 g L-1の主要炭素源(グリセロール、グルコースまたはガラクトース)、14.6 g L-1のK2HPO4、0.241 g L-1のMgSO4、10 mg L-1のMnSO4・H2O、2 g L-1のNa2SO4、4 g L-1のNaH2PO4・H2O、0.5 g L-1のNH4Cl、10 mg L-1のチアミン塩酸塩、ならびに微量溶液(3 mL L-1：0.5 g L-1のCaCl2・2H2O、16.7 g L-1のFeCl3・6H2O、20.1 g L-1のNa2-EDTA、0.18 g L-1のZnSO4・7H2O、0.1 g L-1のMnSO4・H2O、0.16 g L-1のCuSO4・5H2O、および0.18 g L-1のCoCl2・6H2O)。この培養物に、1％の対応する炭素源を含有する最少培地寒天プレート上で増殖させた単一コロニーを接種した。600 nmでの光学密度(OD600)が0.4〜0.6に達した後、該培養物を0.5 mMのIPTG(最終濃度)で誘導し、2 g L-1のラクトースを誘導時に添加した。ガラクトース、ラクトース、LNT IIおよびLNTのレベルを測定するために、2 mLの試料を誘導の24時間後に遠心分離した(15300 g、2分)。遠心分離後、上清を誘導体化まで-20℃で保存した；ペレットは1 mLの氷冷生理食塩水で洗浄し、前述の通りに遠心分離した後、同様に-20℃で保存した。
【００５５】
1種の主要炭素源(グリセロール、グルコースまたはガラクトース)を含有する培養物の細胞乾燥重量(CDW)を、各場合において誘導の24時間後に、10 mLの培養物の遠心分離(5869 g、4℃、20分)およびその細胞ペレットの恒量(2回のうちの最小値)までの120℃での乾燥により分析した。CDW [g L-1]とOD600 [-]の相関関係をシェーカーボトルにおいて調べた(グリセロールを主要炭素源とした場合0.3、グルコースを主要炭素源とした場合0.37、およびガラクトースを主要炭素源とした場合0.39)。
【００５６】
図8aおよび8bに示すように、提供した炭素源はラクトースの変換に有意な影響を与え、その結果は使用した炭素源がより多くのUDP-活性化糖およびラクトース取込みへの変移の両方に影響を及ぼすことを示している。グリセロール上で増殖させた培養物は、先に記載したように、最も低いLNT収率(0.152±0.002 g L-1)をもたらしたが、グリセロールとガラクトースの混合物を使用すると今度はLNT収率がほぼ3倍増大した。これに対し、グルコースまたはグルコース／ガラクトース混合物上で増殖させた培養物の比較によりほぼ同じLNT収率が示されたが、ラクトースのLNT IIへの変換は混合物の場合に有意に少なかった。ラクトースの最大変換、ならびに最高LNT収率(0.810±0.013 g L-1)は、ガラクトースのみで増殖させた培養物において観察された。
【００５７】
ラクトースのLNT IIおよびLNTへの変換に影響を与えるだけでなく、使用した炭素源は、生成物であるLNTの放出に対する効果も示した(図8cを参照されたい)。グルコースまたはグルコース／ガラクトース混合物を含有する培地では産生されたLNTの約50％が放出されたが、ガラクトースまたはグリセロール／ガラクトースを含む培養における培地では形成されたLNTの90％超が見出された。
【００５８】
前記のシェーカーボトル実験により、前記炭素源がLNTの形成に明らかに影響を与えうることが示された。使用する炭素源が供与体基質の細胞内利用可能性、ひいては生成物形成を制御できるかどうかを判定するために、UDP-N-アセチルグルコサミン、UDP-グルコースおよびUDP-ガラクトースの濃度を定量化した。これには、実施例1に従って調製した菌株をグリセロール、グルコースおよびガラクトースのうちの1種を含む最少培地で培養し、後期指数増殖期の細胞を採取し、さらに細胞内代謝物をHPLCにより分析することが必要であった。
【００５９】
前記菌株を、先に記載したように、グリセロール、グルコースまたはガラクトースを含有する最少培地100 mLを入れた1 Lシェーカーボトル中で30℃および90rpmにて培養した。OD600が0.4〜0.6の時点で、発現を0.5 mMのIPTGにより誘導してから、培養物を30℃および90rpmでさらにインキュベートした。誘導の12時間後、25 mLの試料を遠心分離した(2876 rpm、4℃、15分)。ペレットをその後クエンチングバッファー(アセトニトリル：メタノール：H2O 4：4：2および0.1 Mのギ酸(Bennettら、Nat. Chem. Biol., 2009, 5, 593-599))に再懸濁してから、氷上で10分間のインキュベーション中、3分間隔でボルテックスミキサーにて4℃で激しく混合し、さらにこの懸濁物をその後1 MのNH4OHで中和した。この試料をその後再び遠心分離した(22410 g、4℃、10分)。上清をSpeedvac CON-1000(Frobel, Lindau, Germany)で乾燥させてから、HPLC分析に先立って抽出量の5％としてH2Oに溶解した。UDP-糖は、Chromeleonソフトウェア、Ginaオートサンプラー、P580ポンプ、UVDダイオードアレイ検出器およびLuna C18(2)逆相カラム(250 mm x 4.5 mm、5μm、Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)を備えたDionex HPLC装置(Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Germany)を使用して分析した。PayneおよびAmes(Anal. Biochem., 1982, 123, 151-161)を改変した以下の勾配を1 mL分-1の流速で適用した：0〜30分は100％溶媒A／0％溶媒B〜80％溶媒A／20％溶媒Bの直線勾配、30〜30.5分は80％溶媒A／20％溶媒B〜100％溶媒A／0％溶媒Bの直線勾配、30.5〜35分は次の試料のためにカラムを平衡化するための100％溶媒Aを用いるアイソクラチック条件。同定および定量化は、262 nmにて、保持時間、スペクトルおよびシグナル面積を7つの異なる濃度で市販標準品と比較することにより分析した。
【００６０】
結果から、UDP-ヘキソースの濃度は使用する炭素源に実際に有意に依存することが明らかとなった。ガラクトースのみでの増殖は最高細胞内量のUDP-ガラクトース(145.63±20.52 nmol L-1OD-1)をもたらし、グルコース上での増殖の際に観察されたUDP-ガラクトース(65.73±5.63 nmol L-1 OD-1)またはグリセロール上での増殖の際に観察されたUDP-ガラクトース(45.87±17.42 nmol L-1OD-1)よりおよそ3倍高かった。最高量のUDP-N-アセチルグルコサミンはグルコース上での増殖中に観察された(334.03±3.41 nmol L-1 OD-1)(図9を参照されたい)。
【実施例３】
【００６１】
実施例3：ガラクトースに対するLNT合成のスケーラビリティの実証
LNTの全細胞合成用の炭素源としてのガラクトースの使用は、そのより高い細胞内UDP-ガラクトース濃度のため、グルコースまたはグリセロールなどの通常使用する大腸菌(E.coli)炭素源と比較して利点がある。ガラクトースに対するLNT合成のスケーラビリティを実証するため、流加培養(流加法)を高細胞密度用のバイオリアクター中、10リットルスケールで実施した。この方法は8.45-リットルのバッチを使用して開始し、最初に存在していたガラクトースが利用された後に約13 g L-1 CDWのバイオマス濃度に達した。その後の流加期の間、一定の増殖速度(μ＝0.054)が維持されるようにガラクトースの供給を設定したところ、47時間後に55.7 g L-1 CDWの最終バイオマスが得られた(図10a、bを参照されたい)。
【００６２】
実施例1で調製した菌株の流加培養は、開始量を8.45 L、および最終量を13.63 Lとして、30℃で30 L撹拌槽型反応器(Bioengineering, Wald, Switzerland)中、無機塩培地および主要炭素源としてのガラクトースを使用して実施した。この培地はWilmsら(Biotechnol. Bioeng., 2001, 73, 95-103)を改変したものであり、以下の組成を有していた：2.68 g L-1の(NH4)2SO4、1 g L-1の(NH4)2-Hクエン酸塩、25 g L-1のガラクトース、3.9 g L-1の(NH4)2HPO4、14.6 g L-1のK2HPO4、0.241 g L-1のMgSO4、10 mg L-1のMnSO4・H2O、2 g L-1のNa2SO4、4 g L-1のNaH2PO4・H2O、0.5 g L-1のNH4Cl、10 mg L-1のチアミン塩酸塩、および微量溶液(3 mL L-1、先に記載した組成)からなる8リットルのバッチ培地。バッチ期および流加期の間に、アンモニア(25％)を用いた滴定によりpHを7.0に調整した。相対溶存酸素(pO2)は、反応器の圧力を大気圧より500 hPa高くし、通気および撹拌により40％超に維持した。前記バッチ培地に0.45 Lの一晩予備培養物を接種することにより0.096 g L-1の細胞乾燥重量濃度とし、シェーカーボトルに関して先に記載した通りに、前記の10 g L-1のガラクトースを含有する無機塩培地で30℃および90rpmにて培養した。組換え遺伝子の発現は、接種の12.6時間後に、約2.4 g L-1の細胞乾燥重量濃度で、IPTG(最終濃度0.5 mM)を添加することにより誘導した。ラクトース(16.9 g)を同時に添加することにより生成物を形成させた。最初に提供したガラクトースが利用された後(pO2の増大により示される)、3種の添加物を用いて流加期を開始した：添加物1は514.76 g L-1のガラクトース、15.21 g L-1のMgSO4・7H2O、0.65 g L-1のチアミン塩酸塩、および100.89 mL L-1の微量元素溶液(先に記載した組成)からなり、一方で添加物2は335.59 g L-1の(NH4)2HPO4からなり、また添加物3は生成物形成のための150 g L-1のラクトースからなるものであった。添加物1および2は81：19の比率で添加し、ガラクトース-制限増殖速度は式(1)
【００６３】
【数１】
2017520267.tif 000004
【００６４】
〔式中、F[L h-1]は添加の速度であり、t[h]は流加期の期間であり、μset[h-1]は所望の増殖速度(この式では0.1に固定)であり、Yx/s[g g-1]は基質に基づくバイオマスの比収率係数(以前のシェーカーボトル実験から0.36とみなす)であり、m[g g-1h-1]は特定の維持係数(0.04とみなす)であり、cx0[g L-1]は流加期の開始時のバイオマス濃度(この方法では12.0)であり、V0[L]は流加期の開始時の培養物量(8.25に固定)であり、かつcso[g L-1]は添加物1のガラクトース濃度(514.76に固定)である(Wenzelら、Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77, 6419-6425)〕に従うものとした。ラクトース添加は利用に基づいて手動で調整し、合計200.4 gのラクトースを系に添加した。細胞増殖は、40 OD単位の培養密度まで、OD600を測定しかつ0.47 g L-1の相関係数(発酵中に測定)によりCDW濃度を算出することにより判定した。CDW濃度をその後、10 mLの培養物を遠心分離し、続いて細胞ペレットをガラス管内で恒量まで乾燥させることにより2回ずつ直接測定した。
【００６５】
添加したラクトースの全てが培養中に利用され、かつ反応してLNT IIおよびLNTを与えた。LNT IIおよびLNTの濃度は共にこの過程で上昇し、最終的な収率は、それぞれ12.72±0.21 g L-1(LNT)および13.70±0.10 g L-1(LNT II)に達した。最も高いLNT II濃度は44時間後に得られ(15.78±0.29 g L-1)、またその後はラクトースの利用とガラクトースの添加による希釈を理由に低下した(図10a、cを参照されたい)。この発酵過程の終了時のラクトースの完全利用を確実なものとするために、ラクトースの供給を接種の44時間後に停止した。LNT形成の経時的収率は0.37 g L-1 h-1であり、またこの流加法で産生されたLNTの最終量は173.37±2.86 gであって、生成物の大部分(LNT IIの88.91±0.06％およびLNTの64.86±0.12％)が培養物の上清中に見出された。
【実施例４】
【００６６】
実施例4：LNTまたはLNnTのコア構造を有するフコシル化オリゴ糖の合成
LNTまたはLNnTのコア構造を保有するフコシル化オリゴ糖を合成するため、実施例1で調製した菌株に組換え手法でGDP-L-フコース合成のための適当なフコシルトランスフェラーゼを供給した。三糖である2'-フコシルラクトースの合成には、サルベージ合成経路でのフコースの付加(Baumgartnerら、Microb. Cell Fact. 2013, 12, 40を参照されたい)は不経済であるため、依然としてGDP-L-フコースのde novo合成経路が好ましいが、該サルベージ合成経路はより大きいオリゴ糖の合成に好適である。その理由は、五-および六糖を最終的に目標としているので、追加費用はもはやそれほど大きな問題ではないということと、サルベージ合成経路はフコースの添加無しではGDP-L-フコースを一切生成できず、そのため培養中のフコシル化反応の開始をより上手く制御することが可能になるということである。これは、組換えにより導入する全遺伝子に対して同一プロモーターを使用する場合に、誘導後間もなく早くもフコシル化が開始されるのを防止することを意図しており、その結果、主にフコシル化ラクトースが産生される。このために、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)由来のL-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性FKP酵素を使用した(Coyneら、Science (80-. ). 2005, 307, 1778-1781；国際公開第2010070104(A1)号を参照されたい)。発現プラスミド上のfkp遺伝子は機能することが以前に確認されているので、該fkp遺伝子を既存菌株のaraBADアラビノース分解遺伝子座に組み入れた。
【００６７】
フコシル化LNTを合成するため、前記菌株を、futC遺伝子(α1,2-フコシル化用、Albermannら、Carbohydr. Res. 2001, 334, 97-103を参照されたい)およびfucT14遺伝子(α1,4-フコシル化用、Rabbaniら、Glycobiology, 2005, 15, 1076-83；Rabbaniら、Biometals, 2009, 22, 1011-7を参照のこと、大腸菌(E.coli)へのin vivo適用に関してはこれまで記載されていない)をそれぞれ含有するプラスミド、または対応する空プラスミドを用いて形質転換した。フコシル化LNnTを合成するためには、使用する菌株を、futC遺伝子およびfutA遺伝子(α1,3-フコシル化用、Geら、J. Biol. Chem. 1997, 272, 21357-63を参照されたい)をそれぞれ含むプラスミドを用いて同様に形質転換した。生成物の形成を確認するため、これらの菌株を、各場合において、振盪フラスコ中グルコース(10 g L-1)およびカザミノ酸(最終濃度1 g L-1、Difco、より確実な増殖用)を含有する最少培地で培養した。これには、各場合において、OD600＝0.4〜0.6でIPTG(最終濃度0.5 mM)によりタンパク質発現を誘導すること、およびラクトース(最終濃度2 g L-1)を同時に添加することが必要であった。フコース(最終濃度2 g L-1)を、IPTGによる誘導の26時間後、ならびに事前の試料採取および0.5培養物量のグルコース(10 g L-1)含有最少培地の添加の後に添加することにより、十分な炭素の連続的供給および十分な量のLNTまたはLNnTの前合成を確保した。この培養物をその後30℃および90rpmでさらにインキュベートし、2回目の試料採取を最初の誘導の65時間後に実施した。65時間後に空プラスミドを用いた対照と比較すると、菌株は、各場合において、コア構造のフコシル化の成功によるものでありうる生成物を示した。
【実施例５】
【００６８】
実施例5：フコシルトランスフェラーゼ遺伝子がラムノース誘導性プロモーターの制御下に配置されている菌株を使用したフコシル化LNTまたはLNnTコア構造の合成
前記と同一の実験を、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子がIPTG-誘導性tacプロモーターを有するベクター上ではなく、該フコシルトランスフェラーゼ遺伝子(futC)がラムノース誘導性プロモーターの制御下に配置されているプラスミド中にある菌株を使用して再度実施した(Wiese, A. Molekulargenetische und funktionelle Charakterisierung des Hydantoin-Operons aus Arthrobacter aurescens DSM 3747 [Molecular genetic and functional characterization of the hydantoin operon from Arthrobacter aurescens DSM 3747]. (2000)を参照されたい)。これには、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を最初にL-ラムノース(2 g L-1)を用いて誘導すること、ならびにLgtAおよびLgtB／WbgOグリコシルトランスフェラーゼのためのより多くのタンパク質形成資源を提供するためにL-フコースを添加することが必要であった。以前の実験と類似した方法で別に実施した振盪フラスコ培養では、誘導の65時間後の時点で試料中のフコシルトランスフェラーゼに関してより強いシグナルが示された。これらの構造を抗生物質を使用せずに合成するため、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子もrhaBADラムノースオペロンに染色体的に組み込んだ。組み込んだフコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、この際、いずれの場合もtacプロモーターの制御下にある。振盪フラスコ実験における全菌株がフコシル化されたLNTまたはLNnTを合成する能力を有することが、HPLCおよび質量分析法により示された。
【実施例６】
【００６９】
実施例6：より大きなフコシル化オリゴ糖の合成および単離
上述の実験によりLNnTについてもフコシル化が機能することが実証されたため、またLNnTに基づくα1,3-およびα1,2-フコシル化化合物が既に産生されているため(Drouillardら、Angew Chem Int Ed Engl 2006, 45, 1778-1780；Dumonら、Glycoconj. J. 2001, 18, 465-474を参照されたい)、産生されたフコシル化化合物を単離し、さらには特徴付けることにした。この目的のために、L-ラムノース誘導性プラスミドを含む上記の培養を、750 mLスケールでバッフル付きの3-リットル振盪フラスコ中、その他の点では前記と同一の条件下で繰り返した。生成物をその後H2Oへの再懸濁、100℃で20分間のインキュベーション、および遠心分離により細胞ペレットから回収し、続いて分取活性炭／Celite545クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーより単離した。これには、Bio-Radから得たBio-Gel P2に加えて、より狭い粒度分布とより大きいカットオフを有するBio-Gel P4(極微細)も用いることが必要であったが、これは後者が既により大きな中性オリゴ糖を分画するために首尾良く使用されているからである(Priemら、Glycobiology  2002, 12, 235-240を参照されたい)。これらの単離ステップにより、前記の培養物から合計で59.4 mgのLNFIを単離することができた(構造については図6を参照されたい)。その一部を、構造を完全に解明するために、質量分析法およびNMRにより調べた。生成物の質量スペクトルはこの際、多少のコンタミネーションを除けば、特にLNFIのプロトン付加物、ナトリウム付加物および二ナトリウム付加物のシグナルを示す。
【００７０】
FucT14を与えた菌株からのオリゴ糖単離により、合計で133.7 mgのLNDIIが得られた(構造については図7を参照されたい)。さらに、71.5 mgのフコシル化ラクト-N-トリオースIIが単離された。その質量スペクトルはここで同様に予想された付加物の質量を示し、またコンタミネーションは殆ど示されなかった。これらの物質はコア構造としてLNTを有するフコシル化またはジフコシル化化合物であり、大腸菌(E.coli)においてin vivoで合成される化合物としてはこれまで記載されていない(同様の量の生成物を伴う他の合成経路も知られていない)。単離過程で出現するもう1つの化合物は2つのフコシル残基を有するラクト-N-ペントースであり、これは恐らく、もう1つのN-アセチルグルコサミニル基によるLNTの伸長の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月24日(2017.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
前記の第一の目的は、本発明によれば、ラクト-N-テトロースのin vivo合成のための遺伝子改変微生物であって、
(i)β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする第1導入遺伝子
および
(ii)β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする第2導入遺伝子
を含む上記微生物により達成される。 
さらなる実施形態によれば、本発明は、ラクト-N-ネオテトロースのin vivo合成のための遺伝子改変微生物であって、
(i)β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする第1導入遺伝子、
および
(ii)β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする第2導入遺伝子
を含む上記遺伝子改変微生物に関する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクト-N-テトロースのin vivo合成のための遺伝子改変微生物であって、
(i)β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする第1導入遺伝子、
および
(ii)β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする第2導入遺伝子
を含む、上記遺伝子改変微生物。
【請求項２】
ラクト-N-ネオテトロースのin vivo合成のための遺伝子改変微生物であって、
(i)β1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする第1導入遺伝子、
および
(ii)β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする第2導入遺伝子
を含む、上記遺伝子改変微生物。
【請求項３】
前記微生物がLacZおよびLacAの発現を抑制するためにさらに遺伝的に改変されている、請求項1または2記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４】
前記の(i)第1導入遺伝子がLacZYA遺伝子座に組み込まれており、かつ前記微生物がLacYをコードするさらなる導入遺伝子を含む、請求項3記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５】
前記のLacYをコードする導入遺伝子がFucIK遺伝子座に組み込まれている、請求項4記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６】
前記微生物がUDP-糖ピロホスホリラーゼをコードするさらなる導入遺伝子を含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項７】
前記微生物が、UDP-グルコース4-エピメラーゼの発現を抑制するためにさらに遺伝的に改変されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項８】
1つもしくは両方の、または1つ、複数もしくは全ての導入遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項９】
前記微生物が、L-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素をコードするさらなる導入遺伝子、ならびにα1,2-フコシル化、α1,3-フコシル化またはα1,4-フコシル化の能力がある酵素をコードする少なくとも1つの導入遺伝子を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１０】
前記のL-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素をコードする導入遺伝子が染色体に組み込まれており、かつ前記のα1,2-フコシル化、α1,3-フコシル化またはα1,4-フコシル化の能力がある酵素をコードする少なくとも1つの導入遺伝子がプラスミドベクターで発現される、請求項9記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１１】
前記のL-フコキナーゼ活性およびL-フコース-1-リン酸グアニリルトランスフェラーゼ活性を有する二機能性酵素をコードする導入遺伝子と、前記のα1,2-フコシル化、α1,3-フコシル化またはα1,4-フコシル化の能力がある酵素をコードする少なくとも1つの導入遺伝子の両方が染色体に組み込まれている、請求項9記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１２】
ラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体のin vivo合成のための、請求項1〜11のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物の使用。
【請求項１３】
ラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体を調製する方法であって、以下のステップ：
(a)請求項1〜11のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物を提供するステップ、
(b)前記遺伝子改変微生物を、ラクト-N-テトロースおよびラクト-N-ネオテトロースの合成を可能にする条件下で培養するステップ、
(c)場合により、フコースを添加するステップ、
(d)場合により、合成されたラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースまたはラクト-N-テトロースもしくはラクト-N-ネオテトロースのフコシル化誘導体を単離するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１４】
ステップ(b)が、
−ガラクトースを前記微生物用の炭素源として使用すること、
または
−グリセロールおよびガラクトースを前記微生物用の炭素源として使用すること
を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
ステップ(b)が、1つまたは複数の炭素源を、連続的に、または数回に分けて添加することを含む、請求項13および14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、2〜30 Lの範囲のバッチ量を用いる流加法により実施される、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子改変微生物が、細菌、真菌、および植物、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バシラス属、サッカロミセス属およびエシェリキア属の微生物からなる群より選択される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項１８】
前記遺伝子改変微生物が、細菌、真菌、および植物、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バシラス属、サッカロミセス属およびエシェリキア属の微生物からなる群より選択される、請求項12記載の使用、または請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
【国際調査報告】
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2017520267.tif 000018
2017520267.tif 000019
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