(57)【要約】  本発明において開示されているのは、特に、被検体中の癌を治療するための方法及び使用である。いくつかの実施形態において、１つの方法又は使用は、癌を有する候補被検体又は候補被検体から得た癌サンプルにおいて、核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現を測定し、前記サンプル又は癌を有する被検体においてＮＲＦ２の量を決定するステップと、前記決定されたＮＲＦ２又は前記決定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量をＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量と比較するステップを含む。前記サンプル又は前記癌を有する被検体におけるＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現が、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少なければ、配列番号１又は配列番号２等の本明細書に記載のペプチド又はペプチド模倣体を用いて前記癌を有する被検体を治療する。
2017519185.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体中の癌を治療するための方法であって、
ａ）癌を有する候補被検体又は候補被検体から得た癌サンプルにおいて、核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現を測定し、前記サンプル又は癌を有する被検体においてＮＲＦ２の量を決定するステップ、
ｂ）前記決定されたＮＲＦ２又は前記決定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量をＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量と比較し、それによって、前記サンプル又は前記癌を有する被検体におけるＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量が、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ないかどうかを決定するステップ、及び、
ｃ）前記サンプル又は前記癌を有する被検体におけるＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現が、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少なければ、ＣＢＰ５０１を用いて前記癌を有する被検体を治療するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
被検体中の癌を治療するための方法であって、
ａ）癌を有する候補被検体又は候補被検体から得た癌サンプルを、正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を求めてスクリーニングし、正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１の存在、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を決定するステップ、及び、
ｂ）被検体が正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１を発現している場合、又は、被検体がＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を有していない場合に、ＣＢＰ５０１を用いて癌を有する被検体を治療するステップを含む方法。
【請求項３】
ＣＢＰ５０１を用いて被検体の癌を治療するための方法であって、
ａ）（ｉ）被検体のＮＲＦ２発現若しくはＮＲＦ２標的遺伝子発現がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン若しくは参照量より少ない、又は、（ｉｉ）正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を有する、癌を有する被検体を同定及び／又は選択するステップ、及び、
ｂ）（ｉ）サンプル又は被検体においてＮＲＦ２若しくはＮＲＦ２標的遺伝子がＮＲＦ２若しくはＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン若しくは参照量より少ない場合に、又は、（ｉｉ）被検体が正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１を有しているか、若しくは、被検体がＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を有していない場合に、ＣＢＰ５０１を用いて被検体の癌を治療するステップを含む方法。
【請求項４】
ＣＢＰ５０１を用いた癌治療のための被検体を選択する方法であって、
ａ）癌を有する候補被検体又は候補被検体から得た癌サンプルにおいて核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現を測定し、前記被検体又は癌サンプルのＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量を決定するステップ、
ｂ）前記決定されたＮＲＦ２又は前記決定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量をＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量と比較し、それによって、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ないかどうかを決定するステップ、及び、
ｃ）前記サンプル又は被検体中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ない場合に、ＣＢＰ５０１を用いた癌治療のための被検体を選択するステップを含む方法。
【請求項５】
ＣＢＰ５０１を用いた癌治療のための被検体を選択する方法であって、
ａ）正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１又はＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を求めてスクリーニングするステップ、
ｂ）前記被検体が正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１を有しているか、又は、前記被検体がＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を有していない場合に、ＣＢＰ５０１を用いた癌治療のための被検体を選択するステップを含む方法。
【請求項６】
ＣＢＰ５０１を用いた癌治療のための候補被検体を同定する方法であって、
ａ）癌を有する候補被検体又は候補被検体から得た癌サンプルにおける核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現を測定し、前記被検体又は癌サンプル中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量を決定するステップ、
ｂ）ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ないかどうか決定するために、前記決定されたＮＲＦ２又は前記決定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量をＮＲＦ２のベースライン又は参照量と比較するステップ、及び、
ｃ）前記サンプル又は被検体中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ない場合に、前記被検体を、ＣＢＰ５０１を用いた癌治療のための候補であると同定するステップを含む方法。
【請求項７】
ＣＢＰ５０１を用いた癌治療のための候補被検体を同定する方法であって、
ａ）ＫＥＡＰ１の活性、機能又は発現を低下又は減少させる変異を求めてスクリーニングするステップと、
ｂ）被検体が正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１を有している場合、又は、被検体がＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を有していない場合に、前記被検体を、ＣＢＰ５０１を用いた癌治療のための候補であると同定するステップを含む方法。
【請求項８】
癌がＣＢＰ５０１を用いた治療に対して感受性がより強いか又はより弱いかを評価する方法であって、
ａ）癌の細胞の核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現を測定し、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現量を決定するステップ、及び、
ｂ）ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のための所定値より少ないかより多いかを決定するために、前記決定されたＮＲＦ２又は前記決定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量をＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のための所定値と比較するステップ、及び、
ｃ）ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のための所定値より少ないか又は多い場合に、癌がＣＢＰ５０１を用いた治療に対して感受性がより強いか又はより弱いと評価するステップを含む方法。
【請求項９】
ＣＢＰ５０１を用いた治療に対してより応答性であると癌を評価する方法であって、
ａ）正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を求めてスクリーニングするステップ、及び、
ｂ）正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１が存在するか、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異が不存在であるか若しくは存在しない場合に、ＣＢＰ５０１を用いた治療に対してより応答性であると癌を評価するステップを含む方法。
【請求項１０】
請求項１、３、４、６又は８のいずれかに記載の方法であって、
ＮＲＦ２標的遺伝子が、グルタチオン・レダクターゼ（ＧＳＲ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣメンバー２（ＡＢＣＣ２）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ１（ＡＫＲ１Ｃ１）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ３（ＡＫＲ１Ｃ３）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）、ＡＫＲ１Ｂ１０、γ−グルタミル・システイン・シンセターゼ・モディファイヤ・サブユニット（ｙＧＣＳｍ）、又は、グルタチオン・ペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）のいずれかである方法。
【請求項１１】
請求項１、３、４、６又は８のいずれかに記載の方法であって、
前記ベースライン、参照量又は所定値が、ＣＢＰ５０１処理に対して応答性が低い癌細胞と比較した、ＣＢＰ５０１処理に対して反応性の癌細胞における発現によって決定される方法。
【請求項１２】
前記サンプルが生体サンプルを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、細胞、組織、若しくは、器官バイオプシー、又は、血液サンプル若しくは血清サンプルを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが肺バイオプシーを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記被検体が哺乳動物である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記被検体がヒトである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
発現を定量的分析によって測定する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＮＲＦ２タンパク若しくはＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパクを検出する検体、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を検出する検体との接触によって、発現を測定又は検出する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＮＲＦ２の転写産物若しくはＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物を検出する検体との接触により、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を含む核酸を配列決定することにより、発現を測定又は検出する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
免疫学的測定法により発現を測定又は検出する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
抗体免疫学的測定法により発現を測定又は検出する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット、免疫組織化学法又は免疫細胞化学法により発現を測定又は検出する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ＮＲＦ２のｃＤＮＡ又はＮＲＦ２標的遺伝子のｃＤＮＡを決定することにより発現を測定又は検出する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＮＲＦ２のＲＮＡ若しくはＮＲＦ２標的遺伝子ＲＮＡの逆転写と、ＮＲＦ２のｃＤＮＡ若しくはＮＲＦ２標的遺伝子ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、又は、ＫＥＡＰ１のＲＮＡ若しくはＫＥＡＰ１遺伝子の逆転写と、ＫＥＡＰ１のｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、発現を測定又は検出する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＣＢＰ５０１がそのプロドラッグの塩を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ＣＢＰ５０１の塩が、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、硝酸塩、カリウム塩、リン酸塩、スルホン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、トリフルオロ酢酸塩、又は、酢酸塩を含む、請求項１〜９のうちのいずれかの方法。
【請求項２７】
Ｇ２チェックポイント阻害剤を投与するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
カルモジュリン結合剤を投与するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
核酸にダメージを与える薬剤を被検体に投与するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
核酸にダメージを与える薬剤が、ＤＮＡと結合する又はＤＮＡにインターカレートする分子を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
ＣＢＰ５０１、Ｇ２チェックポイント阻害剤、カルモジュリン結合剤又は核酸にダメージを与える薬剤を、単独で又は任意の組み合わせで、被検体に対して、１回、２回、３回、４回、５回又はそれ以上の回数、投与するステップを含む請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
癌が肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
癌細胞の集団であって、
前記細胞は基材に固定又は固着されており、
ＮＲＦ２タンパク、ＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパク、又は、ＥＡＰ１タンパクを検出し、前記細胞に結合した試薬を有する、癌細胞の集団。
【請求項３４】
被検体から得られる癌細胞の集団であって、
前記細胞は基材に固定又は固着されており、
ＮＲＦ２タンパク、ＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパク、又は、ＫＥＡＰ１タンパクを検出し、前記細胞に結合した試薬を有する、癌細胞の集団。
【請求項３５】
請求項３３又は３４のいずれかに記載の細胞の集団であって、
ＮＲＦ２タンパク、ＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパク、又は、ＫＥＡＰ１タンパクを検出する試薬が抗体を含む、細胞の集団。
【請求項３６】
癌細胞の集団であって、
前記細胞は基材に固定又は固着されており、
ＮＲＦ２の転写産物、ＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物、又は、ＫＥＡＰ１の転写産物に対して選択的に結合し、前記細胞に結合した試薬を前記細胞が有する、癌細胞の集団。
【請求項３７】
被検体から得られる癌細胞の集団であって、
前記細胞は基材に固定又は固着されており、
ＮＲＦ２転写産物、ＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物、又は、ＫＥＡＰ１の転写産物に対して選択的に結合し、前記細胞に結合した試薬を前記細胞が有する癌細胞の集団。
【請求項３８】
ＮＲＦ２転写産物又はＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物に対して選択的に結合する前記試薬がオリゴヌクレオチド又はプライマーを含む、請求項３６又は３７のいずれかに記載の細胞の集団。
【請求項３９】
請求項３３〜３８のいずれかに記載の細胞の集団であって、
ＮＲＦ２標的遺伝子が、グルタチオン・レダクターゼ（ＧＳＲ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣメンバー２（ＡＢＣＣ２）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ１（ＡＫＲ１Ｃ１）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ３（ＡＫＲ１Ｃ３）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）、ＡＫＲ１Ｂ１０、γ−グルタミル・システイン・シンセターゼ・モディファイヤ・サブユニット（ｙＧＣＳｍ）、又は、グルタチオン・ペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）のいずれかである、細胞の集団。
【請求項４０】
癌細胞の集団から分離、精製又は抽出された核酸を含む組成物であって、
前記核酸が、ＮＲＦ２遺伝子若しくはその転写産物に対して選択的に結合するか又はＫＥＡＰ１遺伝子若しくはその転写産物に対して選択的に結合する試薬に結合したＮＲＦ２遺伝子又はその転写産物を含む、組成物。
【請求項４１】
癌細胞の集団から分離、精製又は抽出された核酸を含む組成物であって、
前記核酸が、ＮＲＦ２遺伝子若しくはその転写産物に対して選択的に結合するか又はＫＥＡＰ１遺伝子若しくはその転写産物に対して選択的に結合する試薬に結合したＮＲＦ２標的遺伝子又はその転写産物を含む、組成物。
【請求項４２】
請求項４０又は４１のいずれかに記載の組成物であって、
ＮＲＦ２の転写産物又はＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物に対して選択的に結合する前記試薬がオリゴヌクレオチド又はプライマーを含む、組成物。
【請求項４３】
癌細胞の集団から分離、精製又は抽出されたタンパクを含む組成物であって、
前記タンパクが、ＮＲＦ２タンパクを選択的に検出する試薬に対して結合したＮＲＦ２タンパク、又は、ＫＥＡＰ１タンパクを選択的に検出する試薬に対して結合したＫＥＡＰ１タンパクを含む、組成物。
【請求項４４】
癌細胞の集団から分離、精製又は抽出されたタンパクを含む組成物であって、
前記タンパクが、ＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパクを選択的に検出する試薬に結合したＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパクを含む、組成物。
【請求項４５】
請求項４３又は４４のいずれかに記載の組成物であって、
ＮＲＦ２タンパク、ＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパク、又は、ＫＥＡＰ１タンパクを選択的に検出する前記試薬が抗体を含む、組成物。
【請求項４６】
請求項４０〜４５のいずれかに記載の組成物であって、
ＮＲＦ２標的遺伝子が、グルタチオン・レダクターゼ（ＧＳＲ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣメンバー２（ＡＢＣＣ２）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ１（ＡＫＲ１Ｃ１）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ３（ＡＫＲ１Ｃ３）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）、ＡＫＲ１Ｂ１０、γ−グルタミル・システイン・シンセターゼ・モディファイヤ・サブユニット（ｙＧＣＳｍ）、又は、グルタチオン・ペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）のいずれかである、組成物。
【請求項４７】
前記基材がガラス若しくはプラスチックの板、スライド、又は、小片で構成される、請求項３３〜３７のいずれか記載に細胞の集団。
【請求項４８】
前記組成物が溶媒を含む、請求項４０〜４６のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
前記癌細胞が肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む、請求項３３〜３９若しくは請求項４７のいずれかに記載の細胞の集団又は請求項４０〜４６若しくは４８のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願
この特許出願は、２０１４年５月２２日に提出された米国仮出願第６２／００２，０７６号および２０１４年８月１２日に提出された米国仮出願第６２／０３６，４７６号の利益を主張する。これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
イントロダクション
【０００２】
細胞周期はＳ期（ＤＮＡ複製）、Ｍ期（細胞分裂）、及び、Ｓ期とＭ期と間の２つのギャップ期（Ｇ１期及びＧ２期）を含む。ＤＮＡの完全性、ＤＮＡ複製、細胞サイズ及び周辺環境等の状態を監視すること等のように、細胞周期におけるチェックポイントは、正確な進行を保証している（Ｍａｉｌｅｒ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ３：２６  （１９９１））。ゲノムの完全性を維持することは多細胞生物にとって特に重要であり、ゲノムの状態を監視する多数のチェックポイントが存在する。Ｇ１チェックポイント及びＧ２チェックポイントは、ＤＮＡ複製と細胞分裂の前にそれぞれ存在する。一度損傷を受けたＤＮＡが複製されて変異が生じるので、Ｓ期に入る前にＤＮＡ損傷を修正することも重要である（Ｈａｒｔｗｅｌｌ，  Ｌ．  Ｃｅｌｌ，  ７１  ：  ５４３  （１９９２））。大規模なＤＮＡダメージが修正されることなくＧ１チェックポイント及びＧ２チェックポイントを通過して進行することは、アポトーシス及び／又は壊滅的な損傷を生じさせる。
【０００３】
ほとんどの癌細胞は、ｐ５３、Ｒｂ、ＭＤＭ−２、ｐ１６ＩＮＫ４及びｐｌ９ＡＲＦのようなＧ１のチェックポイント関連タンパクに異常を有している（Ｌｅｖｉｎｅ，  Ａ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ，  ８８：３２３  （１９９７））。あるいは、変異は、Ｇ１チェックポイントの厳密さを低下させる癌遺伝子産物（例えば、Ｒａｓ、ＭＤＭ−２及びサイクリンＤ）の過剰発現及び／又は過剰活性化を引き起こす場合がある。これらの変異に加えて、成長因子の過剰発現によって過剰な成長因子シグナリングが引き起こされる場合があり、過剰な成長因子シグナリングはＧ１チェックポイントの厳格さを低下させる場合がある。機能欠損型突然変異及び機能獲得型変異と共に、成長因子レセプター又は下流のシグナル変換分子の連続的な活性化は、Ｇ１チェックポイントを無効化することにより、細胞変化を引き起こす場合がある。Ｇ１チェックポイントの停止は、より高い変異率、及び、癌細胞中で観察される多くの変異に寄与する。その結果、ほとんどの癌細胞は、過剰なＤＮＡ損傷を乗り越えて生存することにおいて、Ｇ２チェックポイントに依存する（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ａｎｄ  Ｆａｎ，  Ｐｒｏｇ．  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅｓ．，  ２：  １６５  （１９９６））。
【０００４】
ＤＮＡ損傷後に細胞周期Ｇ２の進行停止を促進するメカニズムは、酵母から人間までの種間において保存されると考えられる。損傷を受けたＤＮＡが存在する状態において、Ｃｄｃ２キナーゼのトレオニン１４残基若しくはチロシン−１５残基抑制的リン酸化により又はサイクリンＢのタンパク発現量の減少により、Ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼが不活性に保たれる。細胞分裂の始めでは、二重リン酸化Ｃｄｃ２５が、これらの抑制的リン酸化を除去することによってＣｄｃ２／サイクリンＢキナーゼを活性化する。Ｃｄｃ２／サイクリンＢの活性化はＭ期の開始と等価である。
【０００５】
分裂酵母において、プロテインキナーゼＣｈｋ１は、損傷を受けたＤＮＡに反応して細胞周期を停止するのに必要とされている。Ｃｈｋ１キナーゼは、いくつかのｒａｄ遺伝子産物に下流に作用し、ＤＮＡ損傷時にリン酸化によって修飾される。出芽酵母のＲａｄ５３及び分裂酵母のＣｄｓ１キナーゼは、複製されていないＤＮＡからのシグナルを伝達することが知られている。損傷を受けたＤＮＡによって引き起こされるＧ２期進行停止の乱れにおいてＣｈｋ１及びｃｄｓ１の両方の排出が頂点に達するので、Ｃｈｋ１とＣｄｓ１の間に冗長性があると考えられる。興味深いことに、Ｃｈｋ１及びＣｄｓ１のいずれもが、Ｃｄｃ２５をリン酸化し、Ｃｄｃ２５に対してＲａｄ２４が結合することを促進する。これにより、細胞質ゾルにＣｄｃ２５を隔離し、Ｃｄｃ２／サイクリンＢの活性化を防ぐ。したがって、Ｃｄｃ２５がこれらのキナーゼの共通ターゲットであると考えられ、この分子がＧ２チェックポイントにおいて必要不可欠な要素であることを示唆している。
【０００６】
ヒトにおいては、ｈＣｈｋ１（分裂酵母Ｃｈｋ１のヒト相同体）及びＣｈｋ２／ＨｕＣｄｓ１（出芽酵母Ｒａｄ５３及び分裂酵母Ｃｄｓ１のヒト相同体）の両者が、ＤＮＡ損傷に反応してＣｄｃ２５Ｃのセリン−２１６（重大な制御部位）をリン酸化する。このリン酸化は、小さな酸性タンパク１４−３−３ｓ、分裂酵母のＲａｄ２４及びＲａｄ２５のヒト相同体、のための結合部位を作り出す。リン酸化のこの制御機能は、Ｃｄｃ２５Ｃのセリン−２１６をアラニンに置換することによってヒト細胞における細胞周期のＧ２期進行停止を破壊した、という事実によって明確に示されている。しかし、Ｇ２チェックポイントのメカニズムは完全には理解されていない。
【０００７】
種々の実施形態において、本明細書に開示されているのは、被検体の癌を治療する方法である。
ある実施形態において、１つの方法は、
ａ）癌を有する候補被検体又は候補被検体から得た癌サンプルにおいて、核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現を測定し、前記サンプル中又は前記癌を有する被検体中のＮＲＦ２の量を測定するステップと、
ｂ）測定されたＮＲＦ２又は測定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量を、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量と比較し、それにより、前記サンプル中の又は前記癌を有する被検体中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量が、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ないかどうかを測定するステップと、
ｃ）前記サンプル中の又は前記癌を有する被検体中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現が、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ない場合に、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：１）又はＰ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：２）（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いて被検体を治療するステップを含む。
別の実施例において、１つの方法は、
ａ）癌を有する候補被検体又は候補被検体から得た癌サンプルにおいて、正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能又は発現を低下若しくは減少させる変異を検査し、正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１又はＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下又は減少させる変異の存在を決定するステップと、
ｂ）被検体が正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１を有している場合又はＫＥＡＰ１の活性、機能又は発現を低下又は減少させる変異を有していない場合に、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：１）又はＰ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：２）（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いて癌を有する被検体を治療するステップを含む。
【０００８】
種々の実施形態において、本明細書に開示されているのは、被検体の癌を治療する方法である。ある実施形態において、１つの方法は、
ａ）被検体におけるＮＲＦ２発現若しくはＮＲＦ２標的遺伝子発現がＮＲＦ２若しくはＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン若しくは参照量より少ないか、又は、被検体が正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１を有しているか又はＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異がない場合に、癌を有する被検体を同定及び／又は選択するステップと、
ｂ）前記サンプル中の又は前記被検体中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子が、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ない場合、又は、被検体が正常な若しくは機能的なＫＥＡＰ１又はＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を有していない場合に、本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いて被検体の癌を治療するステップを含む。
別の実施形態において、１つの方法は、
ａ）癌を有する候補被検体又は候補被検体から得た癌サンプルにおいて、核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現を測定し、被検体又は癌サンプル中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量を決定するステップと、
ｂ）測定されたＮＲＦ２又は測定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量をＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量と比較し、それによって、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ない場合かどうかを測定するステップと、
ｃ）前記サンプル又は被検体中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子が、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ない場合に、本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いた癌治療のための被検体を選択するステップを含む。
【０００９】
さらに本明細書に開示されているのは、本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えばＣＢＰ５０１）を用いた癌治療のための被検体を選択及び／又は同定する方法である。
ある実施形態において、１つの方法は、
ａ）正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１又はＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を検査するステップと、
ｂ）正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１が存在する場合に、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異が非存在であるか若しくは存在しない場合に、ペプチド若しくはペプチド模倣体（例えばＣＢＰ５０１）を用いた癌治療のための被検体を選択するステップを含む。
別の実施形態において、１つの方法は、
ａ）癌を有する候補被検体又は候補被検体から得た癌サンプルにおいて、核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現を測定し、被検体又は癌サンプル中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量を決定するステップと、
ｂ）測定されたＮＲＦ２又は測定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ないかどうかを決定するために、測定されたＮＲＦ２又は測定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量をＮＲＦ２のベースライン又は参照量と比較するステップと、
ｃ）サンプル又は被検体中のＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子が、ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のベースライン又は参照量より少ない場合に、被検体を、本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いた癌治療のための候補であると同定するステップを含む。
【００１０】
本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いた癌治療のための候補被検体を選抜又は同定するための実施形態において、いくつかの実施形態は、時々、
ａ）正常な若しくは機能するＫＥＡＰ１又はＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下若しくは減少させる変異を検査するステップと、
ｂ）正常な又は機能するＫＥＡＰ１が存在する場合、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能又は発現を低下又は減少させる変異が非存在であるか存在しない場合に、被検体を、本明細に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いた癌治療に対する候補であると同定するステップを含む。
【００１１】
本明細書にさらに開示されているのは、癌が、本明細書に開示されているようなペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いた治療に対して反応性がより大きいか又は反応性がより小さいものであるかを評価する方法である。
ある実施形態において、１つの方法は、
ａ）癌細胞の核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現を測定し、発現されたＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量を決定するステップと、
ｂ）測定されたＮＲＦ２又は測定されたＮＲＦ２標的遺伝子の量がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のための所定値より少ないか又はより大きいかを決定するために、測定されたＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の量をＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のための所定値と比較するステップと、
ｃ）ＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子の発現がＮＲＦ２又はＮＲＦ２標的遺伝子のための所定値より小さいか又はより大きい場合に、癌を、本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えばＣＢＰ５０１）を用いた治療に対してより反応性が大きいか又はより反応性が小さいものであると評価するステップを含む。
別の実施形態において、１つの方法は、
ａ）正常な又は機能するＫＥＡＰ１又はＫＥＡＰ１の活性、機能又は発現を低下又は減少させる変異を検査するステップと、
ｂ）正常な又は機能するＫＥＡＰ１が存在するか又は不存在である場合に、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能又は発現を低下又は減少させる変異が不存在であるか又は存在する場合に、癌を、本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いた治療に対してより反応性が大きいか又はより反応性が小さいものであると評価するステップを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＮＲＦ２標的遺伝子は、グルタチオン・レダクターゼ（ＧＳＲ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣメンバー２（ＡＢＣＣ２）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ１（ＡＫＲ１Ｃ１）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ３（ＡＫＲ１Ｃ３）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン（ＮＱＯ１）、ＡＫＲ１Ｂ  １０、γ−グルタミル・システイン・シンセターゼ・モディファイヤ・サブユニット（ｙＧＣＳｍ）、及び／又は、グルタチオン・ペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）のいずれかである。
【００１３】
いくつかの実施例において、ベースライン又は参照レベル又は所定値は、本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いた治療に対してより反応性が小さい癌細胞と比較した、本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）を用いた治療に対して反応する癌細胞の発現によって決定される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、サンプルは生体サンプルを含む。ある態様において、サンプルは、細胞、組織若しくは器官（例えば、肺）バイオプシー、又は、血液若しくは血清のサンプルを含んでいてもよい。
【００１５】
ある態様において被検体は哺乳動物である。哺乳動物はヒトであってもよい。いくつかの態様において被検体はヒトである。
【００１６】
いくつかの実施態様において、発現は定量的分析によって測定される。いくつかの態様において、発現は、ＮＲＦ２タンパク若しくはＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパクを検出する又はＫＥＡＰ１タンパク若しくは標的遺伝子を検出する検体、又は、ＫＥＡＰ１の活性、機能若しくは発現を低下又は減少させる変異により測定され、又は、それらとの接触により検出される。いくつかの実施形態において、発現は、ＮＲＦ２転写産物若しくはＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物を検出する検体との接触により、又は、ＫＥＡＰ１を含む核酸若しくはＫＥＡＰ１の活性、機能又は発現を低下又は減少させる変異の配列を決定することによって、測定又は検出される。いくつかの実施形態において、発現は免疫学的測定によって測定又は検出される。いくつかの実施形態において、発現は、抗体免疫学的測定法によって測定又は検出される。いくつかの実施形態において、発現は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット、免疫組織化学的検査、又は、免疫細胞化学的検査によって測定又は検出される。ある実施形態において、発現は、ＮＲＦ２のｃＤＮＡ又はＮＲＦ２標的遺伝子のｃＤＮＡを測定することによって測定又は検出される。いくつかの態様において、発現は、ＮＲＦ２のＲＮＡ又はＮＲＦ２標的遺伝子のＲＮＡの逆転写及びＮＲＦ２のｃＤＮＡ又はＮＲＦ２標的遺伝子のｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、又は、ＫＥＡＰ１  ＲＮＡ又はＫＥＡＰ１遺伝子の逆転写及びＫＥＡＰ１  ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、測定又は検出される。
【００１７】
ある実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）は、それらの塩若しくはプロドラッグ、又は、それらのプロドラッグの塩を含む。いくつかの態様において、塩は、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、硝酸塩、カリウム塩、リン酸塩、スルホン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、トリフルオロ酢酸塩又は酢酸塩を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法は、Ｇ２チェックポイント阻害薬剤（例えば、ＣＢＰ５０１等のペプチド又はペプチド模倣体）を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法は、カルモジュリン結合剤を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法は、被検体に対して、核酸にダメージを与える薬剤（例えば、ＤＮＡに結合又はインターカレートする分子）を投与するステップを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法は、ペプチド若しくはペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）、Ｇ２チェックポイント阻害薬剤、カルモジュリン結合剤、又は、核酸にダメージを与える薬剤を、被検体に対して、１回、２回、３回、４回又は５回以上、単独又は任意の組み合わせで投与するステップを含む。
【００２０】
ある態様において、癌は肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む。
【００２１】
本明細書にさらに開示されているのは、癌細胞の集団であって、前記細胞は基材に固着又は固定されており、前記細胞は、ＮＲＦ２タンパク若しくはＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパク又はＫＥＡＰ１のタンパク又は遺伝子を検出する試薬であって、前記細胞に結合したものを有している。いくつかの実施形態において、被検体から得られる癌細胞の集団は、基材に固定又は固着され、ＮＲＦ２タンパク若しくはＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパク又はＫＥＡＰ１タンパク若しくはＫＥＡＰ１遺伝子を検出する試薬であって、前記細胞に結合したものを有している。ある態様において、ＮＲＦ２タンパク若しくはＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパク又はＫＥＡＰ１タンパクを検出する試薬は、抗体で構成される。
【００２２】
本明細書においてさらに開示されるのは、癌細胞の集団であって、前記細胞は、基材に固着又は固定されており、前記細胞は、ＮＲＦ２転写産物若しくはＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物又はＫＥＡＰ１の転写産物に対して選択的に結合する試薬であって、前記細胞に結合したものを有する。いくつかの実施例において、被検体から得られる癌細胞の集団は、基材に固定又は固着されており、前記細胞は、ＮＲＦ２転写産物若しくはＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物又はＫＥＡＰ１の転写産物に対して選択的に結合する試薬であって、前記細胞に結合したものを有する。いくつかの態様において、ＮＲＦ２転写産物又はＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物に対して選択的に結合するする試薬は、オリゴヌクレオチド又はプライマーを含む。
【００２３】
ＮＲＦ２標的遺伝子は、グルタチオン・レダクターゼ（ＧＳＲ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣメンバー２（ＡＢＣＣ２）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ１（ＡＫＲＩＣ、Ｉ）、アルド・ケト還元酵素家族１Ｃ３（ＡＫＲ１Ｃ３）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）、ＡＫＲ１Ｂ１０、γ−グルタミル・システイン・シンセターゼ・モディファイヤ・サブユニット（ｙＧＣＳｍ）、又は、グルタチオン・ペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）のいずれかを含む。いくつかの態様において、基材はガラス又はプラスチックの板、スライド又は小片で構成される。
【００２４】
本明細書においてさらに開示されるのは、癌細胞の集団から分離、精製又は抽出された核酸を含む組成物であり、前記核酸は、選択的に、ＮＲＦ２遺伝子若しくはその転写産物に対して結合する又はＫＥＡＰ１遺伝子若しくはその転写産物に対して結合する試薬に結合したＮＲＦ２遺伝子又はその転写産物を含む。組成物は、癌細胞の集団から分離、精製又は抽出された核酸を含み、前記核酸は、選択的に、ＮＲＦ２遺伝子若しくはその転写産物に対して結合する又はＫＥＡＰ１遺伝子若しくはその転写産物に対して結合する試薬に結合したＮＲＦ２標的遺伝子又はその転写産物を含む。いくつかの態様において、ＮＲＦ２転写産物又はＮＲＦ２標的遺伝子の転写産物に対して選択的に結合する試薬は、オリゴヌクレオチド又はプライマーで構成される。
【００２５】
本明細書においてさらに開示されるのは、癌細胞の集団から分離、精製又は抽出されたタンパクを含む組成物であり、前記タンパクは、ＮＲＦ２タンパクを選択的に検出する試薬に結合したＮＲＦ２タンパク、又は、ＫＥＡＰ１タンパクを選択的に検出する試薬に結合したＫＥＡＰ１タンパクを含む。組成物は、癌細胞の集団から分離、精製又は抽出されたタンパクを含み、前記タンパクは、ＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパクを選択的に検出する試薬に結合したＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパクを含む。いくつかの態様において、ＮＲＦ２タンパク、ＮＲＦ２標的遺伝子によってコードされるタンパク又はＫＥＡＰ１タンパクを選択的に検出する試薬は、抗体で構成される。
【００２６】
ＮＲＦ２標的遺伝子は、グルタチオン・レダクターゼ（ＧＳＲ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ＡＴＰ結合・カセット・サブファミリーＣメンバー２（ＡＢＣＣ２）、アルド・ケト還元酵素家族１Ｃ１（ＡＫＲ１Ｃ１）、アルド・ケト還元酵素ファミリー１Ｃ３（ＡＫＲ１Ｃ３）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）、ＡＫＲ１Ｂ１０、γ−グルタミル・システイン・シンセターゼ・モディファイヤ・サブユニット（ｙＧＣＳｍ）、又は、グルタチオン・ペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ  １）のいずれかを含む。いくつかの態様において、基材はガラス又はプラスチックの板、スライド又は小片で構成される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ−１Ｈは、Ｈ１７０３及びＨ１４３７ＮＳＣＬＣ細胞系の両方においてＣＤＤＰを用いた１時間の共投与により評価したＣＢＰ５０１感受性を示している。（図１Ａ−Ｄ）Ｈ１７０３を示している。（図１Ｅ−Ｈ）Ｈ１４３７を示している。（図Ａ、Ｅ）流動細胞計測法分析による亜Ｇ１集団の細胞周期分布変化（ｎ＝２）。（図１Ｂ、Ｆ）Ｇ１期を示している（ｎ＝２）。（図１Ｃ、Ｇ）Ｓ期を示している（ｎ＝２）。（図１Ｄ、Ｈ）Ｇ２−Ｍ期を示している（ｎ＝２）。カイ二乗検定は、各ＣＤＤＰ投与時点において、ＣＢＰ５０１（配列番号：８０）マイナスとプラスの間での細胞周期分布における変化を比較するために行なった。アスタリスクは統計的有意差（ｐ＜０．００１）を示している。「Ｎ．Ｓ」は、有意でない（ｐ＞０．０５）を示している。エラーバーは、二重の流動細胞計測法分析から得た標準偏差を示している。
【００２８】
【図２】図２Ａ−２Ｄは、ＣＢＰ５０１感受性細胞系におけるＮｒｆ２依存遺伝子発現の増加を示すマイクロアレイ遺伝子発現解析を示している。（図２Ａ）マイクロアレイ分析によって測定した単離遺伝子の発現の色分けマップ表示。左のパネルはＣＢＰ５０１非感受性細胞系を含む。右のパネルはＣＢＰ５０１感受性細胞系を含む。緑は低レベルの発現を示している。赤は高レベルの発現を示している。黒は、中間レベルの発現（値は約５０００）を示している。実験は３回繰り返して行なった。（図２Ｂ）ＮＳＣＬＣにおけるＮｒｆ２シグナリング成分に対するウエスタンブロット解析を示している。（図２Ｃ）ＮＳＣＬＣにおけるＮｒｆ２タンパクレベルの定量分析（ｎ＝３）を示している。（図２Ｄ）マイクロアレイ分析によって最初に同定された一連の遺伝子のためのウエスタンブロット解析を示している。
【００２９】
【図３】図３Ａ−３Ｃは、高度のＮｒｆ２の核局在化が高レベルのＮｒｆ２発現と関連していることを示している。（図３Ａ）ＮＳＣＬＣにおけるＮｒｆ２のための免疫細胞化学分析を示している。左のパネルは緑でＮｒｆ２を示している。中央のパネルは赤でヘキスト染料を示している。右のパネルは合体した画像を示している。スケールバーは１００μｍを示している。（図３Ｂ、Ｃ）図３Ａから得た５つの別の画像から得たＮｒｆ２強度の定量を示している（ｎ＝５）。（図３Ｂ）全細胞のＮｒｆ２強度を示している。（図３Ｃ）核におけるＮｒｆ２強度を示している。エラーバーは、５つの別の画像から測定したＮｒｆ２強度の標準偏差を示している。
【００３０】
【図４】図４Ａ−Ｄは、Ｎｒｆ２活性化剤スルフォラファン（ＳＦＮ）が、ＣＢＰ５０１の影響をなくすことを示している。Ｎｒｆ２のノックダウンはＳＦＮの効力を減ずる。（図４Ａ）ＮＳＣＬＣにおける一連のＮｒｆ２標的タンパクに対するウエスタンブロット解析を示している。（図４Ｂ）Ｎｒｆ２  ｓｈＲＮＡレンチウイルス・トランスフェクションによるノックダウンの効率の確認を示している。黒い矢印によって示されている上部バンドはＮｒｆ２タンパクレベルである。中央バンド及び下部バンドは、ＩＱＧＡＰ１とＡＴＭの内部標準をそれぞれ示している。（図４Ｃ、Ｄ）流動細胞計測法を用いた細胞周期分布変化の分析を示している（ｎ＝４）。ＳＦＮは、ＣＤＤＰ（２．５ｇ／ｍｌ）／ＣＢＰ５０１（１μΜ）の１時間の処置に先立って、Ｈ１７０３コントロール（Ｃｔｒｌ）−ｓｈ及びＮｒｆ２−ｓｈの亜系に対して２４時間供された。（図４Ｃ）全細胞周期分布を示している。（図４Ｄ）Ｇ２−Ｍ期を示している。アスタリスクは統計的有意差（Ｔテスト、ｐ＜０．００５）を示している。エラーバーは４回の流動細胞分析から測定された標準偏差を示している。
【００３１】
【図５】図５Ａ−Ｃは、ＣＢＰ５０１非感受性細胞系Ｈ１４３７におけるＮｒｆ２のノックダウンがＣＢＰ５０１感度を高めることを示している。（図５Ａ）Ｎｒｆ２  ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染によるノックダウン効率の確認を示している。上部バンドはＮｒｆ２タンパクレベルを示している。３つの中央バンドは、それぞれＮｒｆ２標的分子であるＡＫＲ１Ｃ３、Ｇ６ＰＤ及びＧＳＲである。２つの下部バンドは、ＩＱＧＡＰｌ及びＭＬＣ２アルファの内部標準をそれぞれ示している。（図５Ｂ）ＣＢＰ５０１を使用又は未使用とした１時間のＣＤＤＰによる処置を示している。細胞周期分布変化を流動細胞計測法によって検出した（ｎ＝４）。左のグラフは、コントロール（Ｃｔｒｌ）−ｓｈＲＮＡをＨ１４３７に導入することにより確立された亜系である。右のグラフは、Ｈ１４３７にＮｒｆ２−ｓｈＲＮＡを導入することによって確立された亜系から得たものである。上部グラフは亜Ｇ１集団を示している。グラフはＧ２−Ｍ集団を示している。アスタリスクは統計的有意差（Ｔテスト、ｐ＜０．００１）を示している。Ｎ．Ｓ．は有意でない（ｐ＞０．０１）ことを示している。（図５Ｃ）図５Ｂから得たデータのための差分解析のグラフを示している。青いバーは、ＣＢＰ５０１を用いたコントロール（Ｃｔｒｌ）−ｓｈＲＮＡからＣＢＰ５０１を用いていない細胞系を引いたものを示している。赤いバーは、ＣＢＰ５０１を用いたＮｒｆ２−ｓｈからＣＢＰ５０１を用いていない細胞系を引いたものを示している。グラフ（左）は、亜Ｇ１における細胞のパーセンテージを示している。グラフ（右）は、Ｇ２−Ｍにおけるパーセンテージを示している。アスタリスクは赤バーと青いバーと間で統計的有意差（Ｔテスト、ｐ＜０．００１）を示している。エラーバーは、４回の流動細胞計測法分析から判明した標準偏差を示している。
【００３２】
【図６】図６Ａ−Ｅは、Ｎｒｆ２標的遺伝子が、それらのタンパク又はｍＲＮＡ発現のレベルを使用してＣＢＰ５０１感受性を予測するためのマーカーとしての良い候補であることを示している。（図６Ａ）合計２８のＮＳＣＬＣ細胞系におけるマイクロアレイ分析によって決定した単離遺伝子発現レベルの色分け表示を示している。左のパネルはＣＢＰ５０１非感受性細胞系で構成されている。右のパネルはＣＢＰ５０１感受性細胞系で構成されている。緑は、低レベルの発現を示す値を示している。赤は高レベルの発現を示している。黒は、中程度レベルの発現を示している（値は約５０００）。実験は３回繰り返して行なった。ＣＢＰ５０１感受性と単離遺伝子発現値との間の相関関係のパーセンテージは、色分け表示図の右側に示されている。（図６Ｂ）オリジナルセットを越えて拡張されたＮＳＣＬＣ細胞系における一連のＮｒｆ２標的タンパクに対するウエスタンブロット解析を示している（表２）。（図６Ｃ）表１及び表２から得たＮＳＣＬＣにおけるＮｒｆ２及びＡＫＲ１Ｃ３のタンパクレベルの定量分析を示している（ｎ＝３）。（図６Ｄ）ＮＳＣＬＣにおけるＡＫＲ１Ｃ３に対する免疫細胞化学分析を示している。上部のパネルは緑でＡＰＣＲ１Ｃ３を示している。中央のパネルは赤でヘキスト染料を示している。下部のパネルは統合された画像を示している。スケールバーは１００μｍを示している。（図６Ｅ）Ｃから得たＡＫＲ１Ｃ３強度の定量を示している（ｎ＝５）。
【００３３】
【図７】図７は、図２から得たＣＢＰ５０１非感受性細胞系又はＣＢＰ５０１感受性細胞系における個々の遺伝子発現の比較分析を示している。黒いバーは、ＣＢＰ５０１非感受性細胞系における発現の平均値を示している。赤いバーは、ＣＢＰ５０１感受性細胞系における発現の平均値を示している。
【００３４】
【図８】図８Ａ−８Ｂ（図８Ａ）は、ＮＳＣＬＣにおけるＡＫＲ１Ｃ１に対する免疫細胞化学分析を示している。左のパネルは緑の擬似色でＡＫＲ１Ｃ１を示している。中央のパネルは赤の擬似色でヘキスト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）を示している。右のパネルは統合された画像を示している。スケールバーは１００ミクロンを示している。（図８Ｂ）図８ＡからのＡＫＲ１Ｃ１強度の定量化（ｎ＝５）を示している。
【００３５】
【図９】図９Ａ−９Ｂ（図９Ａ）は、ＮＳＣＬＣにおけるＡＫＲ１Ｂ１０の免疫細胞化学分析を示している。左のパネルは緑の擬似色でＡＫＲ１Ｂ１０を示している。中央のパネルは赤の擬似色でヘキスト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）を示している。右のパネルは統合された画像を示している。スケールバーは１００ミクロンを示している。（図９Ｂ）図９Ａから得たＡＫＲ１Ｂ１０強度の定量化を示している（ｎ＝５）。
【発明の概要】
【００３６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている方法に関して用いられるペプチド及びペプチド模倣体が提供される。ある実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：１）又はＰ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：２）の構造を含む。Ｐ１は、Ｃｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、同程度の側鎖空間を占めるアミノ酸（例えば、Ｔｙｒ若しくはＰｈｅ）、又は、芳香族基、ピペリジン基、ピラジン基、ピリミジン基、ピペラジン基、モルホリン基又はピリミジン基を１個若しくは２個、若しくは、インドール基、ペンタレン基、インデン基、ナフタレン基、ベンゾフラン基、ベンゾチオフェン基、キノリン基、インドリン基、クロマン基、キノキサリン基、キナゾリン基を１個側鎖中に有する任意のアミノ酸である。Ｐ２は、Ｃｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、同程度の側鎖空間を占めるアミノ酸（例えば、Ｔｙｒ又はＰｈｅ）、又は、芳香族、ピペリジン、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、モルホリン又はピリミジンの基を１個若しくは２個、若しくは、インドール基、ペンタレン基、インデン基、ナフタレン基、ベンゾフラン基、ベンゾチオフェン基、キノリン基、インドリン基、クロマン基、キノキサリン基、キナゾリン基を１個側鎖中に有する任意のアミノ酸である。Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５は、任意のアミノ酸（例えば、Ｐ４はＴｒｐである）であるか、又は、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５は、Ｐ２とＰ６との間の距離がＰ３、Ｐ４、Ｐ５のそれぞれがアミノ酸である場合とほぼ同じ距離となるような単純な炭素鎖（例えば、１１−アミノウンデカン酸、１０−アミノデカン酸、９−アミノノナン酸、８−アミノカプリル酸、７−アミノヘプタン酸、６−アミノカプロン酸、又は、１つ以上の不飽和炭素結合を有する類似構造）である。Ｐ６は、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、任意の１つのアミノ酸とＴｙｒ（例えば、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）、任意の１つのアミノ酸とＰｈｅ（例えば、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ）、任意のアミノ酸、又は、欠損である。
【００３７】
別の実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は以下の構造：Ｐ１，Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：３）；Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：４）；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：５）；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７（配列番号：６）；Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：７）；Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７（配列番号：８）；Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：９）；Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：１０）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：１１）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：１２）；Ｐ１２、Ｐ１、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：１３）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ４、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：１４）；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ６、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：１５）；又は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ４、Ｐ９、Ｐ６、Ｐ１０、Ｐ１１（Ｐ１２）（配列番号：１６）を含む。Ｐ１は、Ｃｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、同程度の側鎖空間を占めるアミノ酸（例えば、ｄ−又は１−Ｔｙｒ、ｄ−又は１−Ｐｈｅ）、又は、芳香族基、ピペリジン基、ピラジン基、ピリミジン基、ピペラジン基、モルホリン基又はピリミジン基を１個若しくは２個、若しくは、インドール基、ペンタレン基、インデン基、ナフタレン基、ベンゾフラン基、ベンゾチオフェン基、キノリン基、インドリン基、クロマン基、キノキサリン基、キナゾリン基を１個側鎖中に有する任意のアミノ酸である。Ｐ２は、Ｃｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、同程度の側鎖空間を占めるアミノ酸（例えば、Ｔｙｒ又はＰｈｅ）、又は、芳香族基、ピペリジン基、ピラジン基、ピリミジン基、ピペラジン基、モルホリン基又はピリミジン基を１個若しくは２個、若しくは、インドール基、ペンタレン基、インデン基、ナフタレン基、ベンゾフラン基、ベンゾチオフェン基、キノリン基、インドリン基、クロマン基、キノキサリン基、キナゾリン基を１個側鎖中に有する任意のアミノ酸である。Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５は、任意のアミノ酸である（例えば、Ｐ４はＴｒｐである）か、又は、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５の１つ以上は、Ｐ２とＰ６との間の距離がＰ３、Ｐ４、Ｐ５のそれぞれがアミノ酸である場合とほぼ同じ距離となるような単純な炭素鎖（例えば、１１−アミノウンデカン酸、１０−アミノデカン酸、９−アミノノナン酸、８−アミノカプリル酸、７−アミノヘプタン酸、６−アミノカプロン酸、又は、１個以上の不飽和炭素結合を有する類似構造）である。Ｐ６は、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、任意の１個のアミノ酸とＴｙｒ（例えば、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）、又は、任意の１個のアミノ酸とＰｈｅ（例えば、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ）である。Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２の少なくとも３つは塩基性アミノ酸であり、残りは任意のアミノ酸又は欠損である。
【００３８】
さらに別の実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、次の構造：Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：１７）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：１８）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ４、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：１９）；又は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ４、Ｐ９、Ｐ６、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：２０）を含む。Ｐ１は、Ｃｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、同程度の側鎖空間を占めるアミノ酸、又は、芳香族基、ピペリジン基、ピラジン基、ピリミジン基、ピペラジン基、モルホリン基又はピリミジン基を１個若しくは２個、若しくは、インドール基、ペンタレン基、インデン基、ナフタレン基、ベンゾフラン基、ベンゾチオフェン基、キノリン基、インドリン基、クロマン基、キノキサリン基、キナゾリン基を１個側鎖中に有する任意のアミノ酸である。Ｐ２は、Ｃｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、同程度の側鎖空間を占めるアミノ酸（例えば、Ｔｙｒ又はＰｈｅ）、又は、芳香族基、ピペリジン基、ピラジン基、ピリミジン基、ピペラジン基、モルホリン基又はピリミジン基を１個若しくは２個、若しくは、インドール基、ペンタレン基、インデン基、ナフタレン基、ベンゾフラン基、ベンゾチオフェン基、キノリン基、インドリン基、クロマン基、キノキサリン基、キナゾリン基を１個側鎖中に有する任意のアミノ酸である。Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５は任意のアミノ酸である（例えば、Ｐ４はＴｒｐである）か、又は、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５の１つ又はそれ以上は、Ｐ２とＰ６との間の距離がＰ３、Ｐ４、Ｐ５のそれぞれがアミノ酸である場合とほぼ同じ距離となるような単純な炭素鎖（例えば、アミノウンデカン酸又は８−アミノカプリル酸）である。Ｐ６は、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、任意の１個のアミノ酸とＴｙｒ（例えば、Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）、任意の１個のアミノ酸とＰｈe（例えば、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ）、任意のアミノ酸、又は、欠損である。Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２の少なくとも３個は塩基性アミノ酸であり、残りは任意のアミノ酸又は欠損である。
【００３９】
さらなる実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：２１）又はＰ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：２２）との構造を有している。
Ｐ１がＣｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、Ｔｙｒ、又は、Ｐｈｅであり、Ｐ２がＣｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、Ｔｙｒ又はＰｈｅであり、Ｐ３がＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ又はＡｓｎであり、Ｐ４がＴｒｐであり、Ｐ５はＳｅｒ、Ａｒｇ又はＡｓｎであるか、又は、
Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５が１個のアミノウンデカン酸又は１個の８−アミノカプリル酸であり、Ｐ６がＢｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、（Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）、又は、（Ｓｅｒ−Ｐｈｅ）である。
【００４０】
さらに別の実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、次の構造：Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：２３）；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７（配列番号：２４）；Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：２５）；Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７（配列番号：２６）；Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：２７）；Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：２８）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：２９）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：３０）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：３１）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ４、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：３２）；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ６、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：３３）；又は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ４、Ｐ９、Ｐ６、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：３４）を含む。
Ｐ１がＣｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、Ｔｙｒ、又は、Ｐｈｅであり、Ｐ２がＣｈａ、Ｎａｌ（２）、（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、Ｂｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、Ｔｙｒ、又はＰｈｅであり、Ｐ３がＳｅｒ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ又はＡｓｎであり、Ｐ４がＴｒｐであり、Ｐ５がＳｅｒ、Ａｒｇ又はＡｓｎであるか、又は、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５が１個のアミノウンデカン酸又は１個の８−アミノカプリル酸であり、Ｐ６がＢｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、（ｄ−Ｓｅｒ−ｄ−Ｔｙｒ）又は（ｄ−Ｓｅｒ−ｄ−Ｐｈｅ）であり、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２の少なくとも３個がＡｒｇ又はＬｙｓであり、残りが任意のアミノ酸又は欠損である。
【００４１】
さらに別の実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は次の構造：Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：３５）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：３６）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ４、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：３７）；又は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ４、Ｐ９、Ｐ６、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：３８）を含む。Ｐ１がＣｈａ又はＮａｌ（２）であり、Ｐ２が（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）であり、Ｐ３がＳｅｒであり、Ｐ４がＴｒｐであり、Ｐ５がＳｅｒ又はＡｓｎであり、Ｐ６がＢｐａ、Ｐｈｅ４ＮＯ２、（Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）又は（Ｓｅｒ−Ｐｈｅ）であり、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２の少なくとも３個がＡｒｇであり、残りが任意のアミノ酸又は欠損である。
【００４２】
さらに別の実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：３９）又はＰ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：４０）の構造を含む。
Ｐ１はＣｈａ又はＮａｌ（２）であり、Ｐ２が（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）又は（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）であり、Ｐ３がＳｅｒであり、Ｐ４がＴｒｐであり、Ｐ５がＳｅｒであり、Ｐ６がＢｐａ又は（Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）である。
【００４３】
さらに別の実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、次の構造：Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：４１）；Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：４２）；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：４３）；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７（配列番号：４４）；Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：４５）；Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７（配列番号：４６）；Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：４７）；Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：４８）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６（配列番号：４９）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：５０）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：５１）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ４、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：５２）；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ６、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：５３）；又は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ４、Ｐ９、Ｐ６、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：５４）を含む。
Ｐ１がＣｈａ又はＮａｌ（２）であり、Ｐ２が（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）、（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）又は（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）であり、Ｐ３が任意のアミノ酸（例えば、Ｓｅｒ又はＰｒｏ）であり、Ｐ４がｄ−又は１−Ｔｒｐであり、Ｐ５が任意のアミノ酸（例えば、Ｓｅｒ又はＰｒｏ）であり、Ｐ６がＢｐａ又は（Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）であり、Ｐ７がＡｒｇであり、Ｐ８がＡｒｇであり、Ｐ９がＡｒｇであり、Ｐ１０がＧｉｎ又はＡｒｇであり、Ｐ１１がＡｒｇであり、Ｐ１２がｄ−又は１−Ａｒｇである。
【００４４】
さらに別の実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、次の構造：Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：５５）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ９、Ｐ８、Ｐ７、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：５６）；Ｐ１２、Ｐ１１、Ｐ１０、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ４、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ１（配列番号：５７）；又は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ４、Ｐ９、Ｐ６、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２（配列番号：５８）を含む。
Ｐ１はＣｈａ又はＮａｌ（２）であり、Ｐ２が（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）であり、Ｐ３がＳｅｒであり、Ｐ４がＴｒｐであり、Ｐ５がＳｅｒであり、Ｐ６がＢｐａ又は（Ｓｅｒ−Ｔｙｒ）である、Ｐ７がＡｒｇであり、Ｐ８がＡｒｇであり、Ｐ９がＡｒｇであり、Ｐ１０がＧｉｎ又はＡｒｇであり、Ｐ１１がＡｒｇであり、Ｐ１２がＡｒｇである。
【００４５】
特別な態様において、ペプチド又はペプチド模倣体の配列は、次の構造：（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ＣＢＰ５０１、配列番号：８０）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（配列番号：１００）；（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：５９）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（配列番号：６０）；（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：６１）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｂｐａ）（配列番号：６２）；（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：６３）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｂｐａ）（配列番号：６４）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｂｐａ）（配列番号：６５）；（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：６６）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Τｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（配列番号：６７）；（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：６８）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３���４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（配列番号：６９）；（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：７０）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（配列番号：７１）；（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：７２）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（配列番号：７３）；（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：７４）；（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（配列番号：７５）；（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：７６）；又は、（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：７７）を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＣＢＰ５０１（配列番号：８０）の生理的に許容可能な塩、例えば、無機塩基の塩、有機塩基の塩、無機酸の塩、有機酸の塩、塩基性又は酸性のアミノ酸の塩等が提供される。そのような塩は既知の方法によって生産することができる（例えば、酢酸塩は、酢酸塩を含有する溶媒を用いた液体クロマトグラフィーの１ステップによって生産することができる）。
【００４７】
無機塩基との塩の例には、ナトリウム塩及びカリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、並びに、アルミニウム塩、及び、アンモニウム塩等が含まれる。
【００４８】
有機塩基との塩の例には、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンとの塩等が含まれる。
【００４９】
無機酸との塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩等が含まれる。
【００５０】
有機酸との塩の例には、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸との塩等が含まれる。
【００５１】
塩基性アミノ酸との塩の例には、アルギニン、リジン及び、オルニチン等との塩が含まれる。
【００５２】
酸性アミノ酸との塩の例には、アスパラギン酸及びグルタミン酸等のとの塩が含まれる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、酢酸等の有機酸との塩が提供される。本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）に付いている酢酸の数は、特に、例えば、本明細書に開示されているペプチド又はペプチド模倣体（例えば、ＣＢＰ５０１）１個当たり４個又は５個を含めて、変化し得る。あるいは、異なる数の酢酸が付いているペプチド又はペプチド模倣体（例えばＣＢＰ５０１）の酢酸塩の混合物（例えば、四酢酸塩と五酢酸塩との混合物等）を使用することもできる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ペプチド化合物ＣＢＰ５０１：（ｄ−Ｂｐａ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｔｒｐ）（ｄ−Ｓｅｒ）（ｄ−Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）（ｄ−Ｃｈａ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ｇｌｎ）（ｄ−Ａｒｇ）（ｄ−Ａｒｇ）（配列番号：８０）の酢酸塩が提供される。配列番号：８０によって示されるペプチド化合物の酢酸塩を生産する方法は、酢酸塩を含有する溶媒を使用した液体クロマトグラフィーを行う１ステップで構成されていてもよい。
【００５５】
さらなる態様において、ペプチド及びペプチド模倣体の配列は、Ｌ型又はＤ型の残基；Ｌ型の残基で置換されたＤ型残基；又は、Ｄ型の残基で置換されたＬ型残基を１つ以上含んでいてもよい。
【００５６】
ペプチド及びペプチド模倣配列は、：細胞の増殖を抑制する；細胞の細胞周期Ｇ２チェックポイントを停止する；細胞のアポプトーシスを促す；細胞の崩壊を促す、という活性の１つ以上を含んでいる。
【００５７】
ペプチド及びペプチド模倣体の配列は、約６〜約１２、１０〜約２０、１８〜約２５、２５〜約１００、２５〜約２００、又は、５０〜約３００個の残基の長さを有する配列を含む。
【００５８】
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書に開示されているペプチド配列及びペプチド模倣体配列を含む組成物である。ある実施形態において、１つの組成物は、ペプチド配列又はペプチド模倣配列と、核酸にダメージを与える薬剤とを含む。別の実施形態において、１つの組成物は、ペプチド配列又はペプチド模倣配列と、抗増殖剤とを含む。さらなる実施形態において、１つの組成物は、薬学的に許容できる担体又は賦形剤と、ペプチド配列又はペプチド模倣配列と、任意に、核酸にダメージを与える薬剤又は抗増殖剤とを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、いくつかの方法は、核酸にダメージを与える薬剤、核酸にダメージを与える処置、抗増殖剤、又は、抗増殖処置を被検体に対して施すステップを含む。特別な態様において、薬剤又は処置は、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、レベッカマイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）、ペプレオマイシン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）カルボプラチン等のシスプラチン誘導体、ピコプラチン、ネダプラチン、ミリプラチン、サトラプラチン、トリプラチン、リポプラチン、ミタプラチン、オキサリプラチン又はカンプトテシン（ＣＰＴ）等の化学療法剤、光線照射（例えば、ＵＶ照射、ＩＲ照射、又は、アルファ線、ベータ線若しくはγ線）、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１３Ｂｉ、又は、２１１Ａｔ）、環境的ショック（例えば、高熱）を含む。
【００６０】
本明細書で使用されているように、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク」という用語は、交換可能に用いられており、アミド結合又は非アミド相当物によって共有結合で連結された２個以上のアミノ酸を表す。ペプチドは任意の長さであってもよい。例えば、ペプチドは、５〜１２個、１２〜１５個、１５〜１８個、１８〜２５個、２５〜５０個、５０〜７５個、７５〜１００個又はそれ以上の長さのように、約５〜１００個又はより多くの残基を有していてもよい。ペプチドは、ｌ−異性体及びｄ−異性体、並びに、１−異性体とｄ−異性体との組み合わせを含んでいてもよい。ペプチドは、例えば、環化（例えば、ジスルフィド結合又はアミド結合）、リン酸化、グリコシル化、カルボキシル化、ユビキチン化、ミリスチル化、脂質付加等の、タンパクの翻訳後プロセシングに典型的に関連した修飾を含んでいてもよい。
【００６１】
本明細書に開示されているペプチドは、模倣体が１つ以上の機能又は活性を有している限り、アミノ酸構造的類似体及びアミノ酸機能的類似体を有する化合物、例えば、合成アミノ酸、非天然アミノ酸又はアミノ酸類似体を有するペプチド模倣体を含む。従って、本明細書に開示されている化合物は、「模倣体」形態及び「ペプチド模倣体」形態を含む。
【００６２】
本明細書において用いられているように、「模倣体」、「ペプチド模倣体」という用語は、ペプチドと実質的に同じ構造特性及び／又は機能特性を有する合成化学化合物を表す。模倣体は、すべてが合成の非天然アミノ酸類似体で構成されていてもよいし、又は、１個以上の天然ペプチドアミノ酸と１個以上の非天然アミノ酸類似体を含むキメラ分子であってもよい。そのような置換が模倣体の活性を破壊しない限り、模倣体は、任意の数の天然アミノ酸の保存的置換を包含していてもよい。保存的変異体であるポリペプチドと同様に、模倣体が必要とされる活性を有しているかどうか（例えば、細胞周期Ｇ２チェックポイントを停止する検出可能な活性を有していること）を判断するためにルーティーン試験を用いることができる。模倣体は、被検体に投与された場合又は細胞に接触した場合、Ｇ２細胞周期チェックポイントを検出可能に乱し、従って、Ｇ２チェックポイントを停止する活性を有するであろう。
【００６３】
ペプチド模倣体組成物は、非天然構造成分のいかなる組み合わせを含んでいてもよく、その組み合わせは、典型的には以下の３つの構造群：ａ）天然アミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結基；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基に代わる非天然残基；又は、ｃ）二次構造（例えば、βターン、γターン、ベータシート、アルファヘリックスコンフォメーション等）の模倣を生じさせる残基、すなわち、二次構造を誘導又は安定化する残基から組み合わせられる。例えば、残基の１個以上がアミド結合以外の化学的手段によって連結されている場合、そのポリペプチドは模倣体であるとみなすことができる。それぞれのペプチド模倣残基は、アミド結合、非天然及び非アミドの化学結合、他の化学結合又は結合手段（例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ν，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はΝ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を含む）により接合されていてもよい。アミド結合に代わる連結基は、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−対−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド又はエステルを含む（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｖｏｌ．７，第２６７−３５７頁，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。
【００６４】
検討したとおり、ペプチドは、天然アミノ酸残基に代えて１個以上の非天然残基を含んでいることにより、模倣体であるとみなすことができる。非天然残基は当業界において知られている。天然アミノ酸残基の模倣体として有用な非天然残基の特定の非制限的な例は、芳香族アミノ酸の模倣体、例えば、Ｄ−又はＬ−ナフィルアラニン；Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン；Ｄ−又はＬ−２チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−１，−２，３−，若しくは４−ピレニルアラニン；Ｄ−又はＬ−３チエニルアラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピリジニル）アラニン；Ｄ−又はＬ−（３−ピリジニル）アラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピラジニル）アラニン；Ｄ−又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ−又はＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；及び、Ｄ−又はＬ−アルキルアラニンを含み、ここで、アルキルは、置換されている又は置換されていない、メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル（ｓｅｃ−ｉｓｏｔｙｌ）、イソ−ペンチル又は非酸性アミノ酸である。天然芳香環に代えて使用することができる、非天然アミノ酸の芳香環は、例えば、チアゾリル芳香環、チオフェニル芳香環、ピラゾリル芳香環、ベンズイミダゾリル芳香環、ナフチル芳香環、フラニル芳香環、ピロリル芳香環、及び、ピリジン芳香環を含む。
【００６５】
酸性アミノ酸の模倣体は、負電荷を維持しながら、非カルボン酸塩アミノ酸を用いた置換によって生成することができる。（ホスホノ）アラニン及び硫酸化トレオニン。カルボキシル側鎖基（例えば、アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド化合物（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）（例えば、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリニル−（４−エチル））カルボジイミド又は１−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチルカルボジイミドを含む）との反応によって選択的に修飾することができる。アスパルチル基又はグルタミル基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル基及びグルタミニル基に変換してもよい。
【００６６】
塩基性アミノ酸の模倣体は、例えば、リジンとアルギニンに加えて、アミノ酸であるオルニチン、シトルリン、又は、（グアニジノ）酢酸若しくは（グアニジノ）アルキル酢酸を用いた置換によって生成することができ、ここで、前記アルキルは、置換されている又は置換されていない、メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル（ｓｅｃ−ｉｓｏｔｙｌ）、イソペンチル又は非酸性アミノ酸であってもよい。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの代わりにＣＮ部位を含む）は、アスパラギン又はグルタミンの代わりに用いることができる。アスパラギニル残基及びグルタミニル残基は、対応するアスパルチル残基又はグルタミル残基に脱アミノすることができる。
【００６７】
アルギニン模倣体は、任意にアルカリ条件下において、アルギニル基を、例えば、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン又はニンヒドリンを含む１つ以上の試薬と反応させることによって生成することができる。チロシン残基模倣体は、チロシル基を芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンと反応させることによって生成することができる。Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンは、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体をそれぞれ生成するために使用することができる。
【００６８】
リジン模倣体は、コハク酸無水物又は他のカルボン酸無水物とリジニル基を反応させることにより生成することができる（また、アミノ末端残基は変更することができる）。リジン及び他のαアミノを含む残基模倣体は、メチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４，−ペンタンジオン等のイミドエステルとの反応、及び、アミノ基転移酵素によって触媒されるグリオキシラートとの反応によって生成することができる。
【００６９】
メチオニン模倣体は、メチオニンスルフォキシドとの反応によって生成することができる。プロリン模倣体は、例えば、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３，４−ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、３−又は４−メチルプロリン、及び、３，３，−ジメチルプロリンを含む。ヒスチジン模倣体は、ジエチルプロカルボネート又はｐ−臭化ブロモフェナシルとヒスチジル基を反応させることにより生成することができる。他の模倣体は、例えば、プロリン及びリジンのヒドロキシル化によって生成されたもの；セリル残基又はトレオニル残基の水酸基のリン酸化；リジン、アルギニン及びヒスチジンのアルファアミノ基のメチル化；Ｎ末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化又は置換Ｎ−メチルアミノ酸による置換、；又は、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００７０】
１個又はそれ以上の残基が、反対のキラリティのアミノ酸（又は、ペプチド模倣残基）で置換されてもよい。従って、天然に存在するＬ配置（化学物質の構造に応じてＲ又はＳと呼ぶことができる）のあらゆるアミノ酸は、同じであるが反対のキラリティを有するアミノ酸又は模倣体、Ｄ−アミノ酸と呼ばれるものに置換されてもよい。これらはＲ型又はＳ型と呼ぶことができる。
【００７１】
ペプチド及びペプチド模倣体は、修飾されていないペプチド若しくは参照ペプチド又はペプチド模倣体の機能の少なくとも一部を保持しているという条件に限り、本出願に開示されている配列の修飾された態様をさらに含む。例えば、修飾ペプチド又はペプチド模倣体は、細胞増殖阻害活性又はＧ２停止活性の少なくとも一部を保持するが、参照ペプチド又はペプチド模倣体と比較して細胞増殖阻害活性又はＧ２停止活性が上昇又は低下していてもよい。
【００７２】
修飾ペプチド及びペプチド模倣体は、１つ以上のアミノ酸残基が別の残基に置換され、配列に追加され又は配列から除去されていてもよい。ある実施形態において、修飾ペプチド又はペプチド模倣体は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失（例えば、１〜３個、３〜５個、５〜１０個又はそれ以上）を有する。１つの態様において、置換は、参照アミノ酸又は模倣体（置換されることになるアミノ酸又は模倣体）と側鎖が同程度の空間を占領するアミノ酸又は模倣体によるものである。さらに別の態様において、置換は、ヒト残基に構造的に類似した非ヒトアミノ酸によるものである。特別な態様において、置換は保守的アミノ酸置換である。
【００７３】
本明細書において用いられているように、「同程度の空間」という用語は、参照部分にサイズにおいて類似している三次元空間を占める化学部分を意味する。典型的には、同程度の空間を占領する部分は、大きさにおいて参照部分と類似するであろう。「同程度の側鎖空間を占める」アミノ酸又は模倣体は、参照アミノ酸又は模倣体に大きさにおいて類似した三次元空間を占める側鎖を有する。ｄ−（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）、ｌ−（Ｐｈｅ−２，３，４，５，６−Ｆ）、ｄ−（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、ｌ−（Ｐｈｅ−３，４，５Ｆ）、ｄ−（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）、又は、  ｌ−（Ｐｈｅ−４ＣＦ３）に対する例は、（ｌ−又はｄ−Ｐｈｅ−２Ｒ１，３Ｒ２，４Ｒ３，５Ｒ４，６Ｒ５）であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、クロライド基、ブロマイド基、フッ化基、ヨウ化基、水素基、酸化水素基又は不存在であってもよい。小さい分子（例えば、大きさが約１オングストロームであるフッ化物）に対して同程度の空間は、部分の不存在であってもよい。
【００７４】
「保存的置換」という用語は、生物学的、化学的又は構造的に類似する１つの残基による１つのアミノ酸の置換を意味する。生物学的類似とは、置換が、生物学的活性（例えば、抗細胞増殖活性又はＧ２停止活性）に適合していることを意味する。構造的類似とは、アラニン、グリシン及びセリン等のように同程度の長さの側鎖を有するアミノ酸、又は、大きさが同程度のアミノ酸を意味する。化学的類似は、残基が、同じ帯電を有しているか、又は、両者が親水性若しくは疎水性であることを意味する。特別の例には、他の１つの残基に対する、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニン等の１つの疎水性残基の置換、又は、リジンに対するアルギニンの置換、アスパラギン酸に対するグルタミン酸の置換、アスパラギンに対するグルタミンの置換、若しくは、トレオニンに対するセリンの置換等のような、他の１つの残基に対する１つの極性残基の置換が含まれる。
【００７５】
従って、ペプチド及びペプチド模倣体は、表１に記載されているペプチド及びペプチド模倣体の配列と同一でない配列を有するペプチド及びペプチド模倣体を含む。ある実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体は、表１に記載されている配列と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はより高い同一性を有する配列を有する。１つの態様において、この同一性は、配列の定義領域、例えば、アミノ末端又はカルボキシ末端の３〜５個の残基に渡るものであってもよい。
【００７６】
ペプチド及びペプチド模倣体は、当業界において知られているあらゆる方法を使用して生産及び分離することができる。ペプチドは、全体又は一部を、当業界において知られている化学的手法を使用して合成することができる（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  （１９８０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ２１５−２２３；  Ｈｏｒｎ  （１９８０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ２２５−２３２；及び、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｋ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （１９９５）  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  Ｐａ．を参照されたい）。ペプチド合成は種々の固相法(例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ  （１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９９７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３−１３参照)を使用して行ってもよいし、例えば、製造業者のインストラクションに従ってＡＢＩ４３１ペプチド合成機（パーキン・エルマー）を使用して自動合成を行ってもよい。
【００７７】
個々の合成残基、及び、模倣体を包含する個々のポリペプチドは、当業界において知られている種々の手順及び方法を使用して合成することができる（例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  Ｖｏｌｕｍｅｓ，  Ｇｉｌｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹを参照されたい)。ペプチド及びペプチド模倣体は組み合わせの方法を用いて合成することができる。ペプチド及びペプチド模倣体のライブラリを生成するための技術は周知であり、例えば、マルチピン、ティーバッグ、及び、スプリット・カップル・ミックスの方法が含まれる（例えば、ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ  （１９９８）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９：２０５−２２３；  Ｈｒｕｂｙ  （１９９７）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １  ：１１４−１１９；  Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｄｉｖｅｒｓ．  ３：  １７−２７；  ａｎｄ  Ｏｓｔｒｅｓｈ（１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６７：２２０−２３４を参照されたい。）。修飾ペプチドは化学的修飾法によってさらに生産することができる。（例えば、Ｂｅｌｏｕｓｏｖ  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３４４０−３４４４；  Ｆｒｅｎｋｅｌ  （１９９５）  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９：３７３−３８０；  ａｎｄ  Ｂｌｏｍｍｅｒｓ  （１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６を参照されたい。）。
【００７８】
より免疫原性のペプチドを生産するために、組み換えにより合成されたペプチドをより容易に分離するために、又は、抗体若しくは抗体を発現するＢ細胞を同定及び分離するために、ペプチドは、１つ以上の追加ドメインが結合した融合タンパクとして合成及び発現されてもよい。検出と精製を促進するドメインには、例えば、固定化した金属に対する精製を可能にするポリヒスチジン・トラクト及びヒスチジン・トリプトファン・モジュール等のような金属キレートペプチド；固定化された免疫グロブリンに対する精製を可能にするプロテインＡ領域；ＦＬＡＧＳ（商標）エクステンション／アフィニティ精製システム（イミュネックス社、シアトル、ワシントン）にいて利用される領域が含まれる。ペプチド精製を促進するために、精製ドメインとペプチドとの間に、ファクタＸａ又はエンテロキナーゼ（Invitrogen、サンディエゴ・カリフォルニア）等の開裂可能なリンカー配列の組み込みを使用することができる。例えば、発現ベクターは、チオレドキシンとエンテロキナーゼの切断部位が後に続く６個のヒスチジン残基に連結されたペプチドコード核酸配列を含んでいてもよい（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  （１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：  １７８７−１７９７；  Ｄｏｂｅｌｉ  （１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  １２：４０４−１４を参照されたい）。ヒスチジン残基は、融合タンパクの検出及び精製を促進するが、その一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパクの残りからペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパクをコードするベクター及び融合タンパクの応用に関係する技術は、当業界において公知である（例えば、Ｋｒｏｌｌ  （１９９３）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １２：４４１−５３を参照）。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているペプチドをコードする核酸が提供される。特別な実施形態において、核酸は、おおよそ、８〜１２個、１２〜１５個、１５〜１８個、１５〜２０個、１８〜２５個、２０〜２５個、２５〜３５個、２５〜５０個、若しくは、５０〜１００個又はそれ以上の長さのアミノ酸を有するペプチド配列をコードする。
【００８０】
「核酸」との用語及び「ポリヌクレオチド」との用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、核酸のすべての形態を表すものとして相互に区別なく用いられる。核酸は、二重鎖、一本鎖、又は、三重鎖の核酸であってもよく、直線の又は環状の核酸であってもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスを含む。ＲＮＡ核酸は、接合された又は接合されていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又は、アンチセンス（例えば、ＲＮＡｉ）であってもよい。核酸は、天然及び合成のものだけでなく、ヌクレオチド類似体及び誘導体を含む。例えば、そのような変更された又は修飾されたポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性を提供する類似化合物を含む。核酸の長さは、例示されているペプチド配列より短くてもよい。例えば、ペプチド配列のうちのいずれかの配列は、抗増殖活性又はＧ２停止活性を有するペプチドをコードすることができる。
【００８１】
核酸は、種々の周知の標準クローニング方法及び化学合成方法のうちのあらゆるものを使用して生産することができ、部位特異的変異誘発法又は当業者に知られている他の組み換え技術によって意図的に変更することができる。ポリヌクレオチドの純度は、アミノ酸配列決定、ゲル電気泳動等によって決定することができる。
【００８２】
核酸は、「発現制御因子」によって核酸の発現が影響を受けるか又は制御される核酸構築物中に挿入されてもよい。この組み合わせは「発現カセット」と呼ばれる。「発現制御因子」という用語は、その因子が作用可能に連結した核酸配列の発現を制御し又は影響を与える１つ以上の配列因子を意味する。作用可能に核酸配列に連結された発現制御因子は、転写、及び、必要に応じて、核酸配列の翻訳を制御する。
【００８３】
作用可能に連結との用語は、機能的な並置であって、それらの構成部分が、意図される態様で機能することを可能にする関係にあることを表す。発現制御因子は、典型的には遺伝子の５’又は３’末端に並置されるが、イントロンであってもよい。プロモーターは、一般にコード配列の５’に位置する。「プロモーター」は、転写を指示するのに十分な最小の配列因子を意味する。
【００８４】
発現制御因子は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、遺伝子サイレンサー、タンパクをコードする遺伝子の前の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）を含む。発現制御因子は、構成的転写、誘導的転写（つまり、活性化のために外部シグナリングを必要とする。）を活性化するか、又は、転写を活性化（つまり、シグナルが転写をオフにする；シグナルの除去が転写を活性化する。）する。発現カセットは、特定の細胞種又は組織に対して遺伝子発現を制御可能にするのに十分な調節因子（つまり、組織特異的な調節因子）を含んでいてもよい。
【００８５】
核酸は、宿主細胞中への増殖のために及びその後の遺伝子操作のために、プラスミド中に挿入されてもよい。プラスミドは宿主細胞中で安定して増殖し得る核酸である。プラスミドは、宿主細胞においてペプチドをコードする核酸の発現を活性化するために任意に発現制御因子を含む。「ベクター」という用語は、本明細書においてプラスミドと同義的に使用されるものであり、宿主細胞における発現のための発現制御因子を含んでいてもよい。プラスミドとベクターは、一般に、細胞中での増殖のための複製開始点とプロモーターとを少なくとも含む。従って、例えば、プラスミド及びベクターは、ペプチドをコードする核酸の遺伝子操作のために、ペプチドの生産のために、及び、宿主細胞又は全組織におけるペプチドの発現のために有用である。
【００８６】
従って、ペプチドは、細菌系においてＴ７のような構成的プロモーターを用いて又はバクテリオファージπのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）のような誘導プロモータを用いて発現されてもよいし；酵母系においてＡＤＨ若しくはＬＥＵ２のような構成的プロモーター又はＧＡＬのような誘導プロモータを用いて発現されてもよいし(例えば、Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; 及び、Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II; R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol. 1 1, Ch. 3, ed. D. M. Glover, TRL Press, Wash., D. C, 1986を参照されたい)；昆虫細胞系においてエクジソンのような構成的誘導プロモータを使用して発現されてもよいし；哺乳類細胞系において、ＳＶ４０、ＲＳＶのような構成的プロモータ、又は、メタロチオネインＩＩＡプロモータ、熱ショックプロモータのような哺乳動物細胞のゲノムに由来する誘導プロモータ若しくはアデノウイルス後期プロモーター若しくは誘導性マウス乳腺腫瘍ウィルス末端反復配列のような哺乳類ウイルスに由来する誘導プロモータを使用して発現されてもよい。ペプチド発現系は、アデノウイルスベクター（米国特許５，７００，４７０及び５，７３１、１７２）、アデノ関連ベクター（米国特許５，６０４，０９０）、単純疱疹ウイルスベクター（米国特許５，５０１、９７９）、及び、レトロウイルス・ベクター（米国特許番号５，６２４，８２０、５，６９３，５０８、５，６７４，７０３、及びＷＩＰＯ公報ＷＯ９２／０５２６６及びＷＯ９２／１４８２９）を含む、ＩＮ  ＶＩＶＯ使用のために設計されたベクターをさらに含む。ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）が遺伝子治療において使用されてきた（米国特許５，７１９，０５４）。そのような遺伝子治療ベクターにはＣＭＶをベースとしたベクターも含まれる（米国特許５，５６１，０６３）。
【実施例】
【００８７】
ＣＢＰ５０１（配列番号：８０）は、非有棘非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の患者に対する２つの無作為化された第ＩＩ相試験において調査した抗癌剤候補である。ＣＢＰ５０１は、２つの作用機序、すなわち、カルモジュリン調節、Ｇ２チェックポイント停止を有していることが示されている。ＣＢＰ５０１に対する感受性を予測するバイオマーカーは本明細書に記載されている。ＣＤＤＰとＣＢＰ５０１に対する共暴露又はいずれか一方に対する短期（１時間）の処置を通じて、ＣＢＰ５０１のｃｉｓ−ジアミンジクロロ−白金（ＩＩ）（ＣＤＤＰ）強化活性を定量的に分析することによって、２８個のＮＳＣＬＣ細胞系をＣＢＰ５０１感受性及び非感受性の２つのサブグループに分類した。ＣＢＰ５０１感受性に関連する遺伝子発現パターンを確認するために、これらの細胞系に対してマイクロアレイ分析を行った。ＣＢＰ５０１非感受性細胞系において、多数の核因子赤血球系２関連因子２（Ｎｒｆ２）標的遺伝子が高い発現を示したことが分かった。ＮＳＣＬＣ細胞系中のＮｒｆ２に対するウエスタンブロット及び免疫細胞科学分析によっても、ＣＢＰ５０１非感受性細胞系におけるより高いタンパクレベルが示された。さらに、ＣＢＰ５０１感受性は、Ｎｒｆ２のサイレンシング又はスルフォラファン（ＳＦＮ）による過剰発現により調整される。これらの結果は、Ｎｒｆ２転写因子がＣＢＰ５０１に対する抵抗性のためのバイオマーカーとしての潜在的な候補であることを示している。この実施例は、ＮＳＣＬＣのためのＣＢＰ５０１とＣＤＤＰの組み合わせ治療に対してよく反応する患者のそれらの部分集団を同定する。
【００８８】
特定の薬剤に対する感受性を予測する定量化可能なマーカーを確立することがオーダーメード医療の目的である。いくつかの抗癌剤が既知の発癌突然変異に基づいて開発されており、変異の存在自体がそれらの医薬品の有用なバイオマーカーであることがわかっている。実施例は、いくつかのチロシンキナーゼ阻害剤を含み、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＮＳＣＬＣにおいて表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とし、それに対する効能が特定のＥＧＦＲ変異の存在に依存するゲフィチニブとエルロチニブ（１、２）と、ＮＳＣＬＣ細胞がＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を保護する場合に非常に有効であるクリゾチニブ（３）と、メラノーマ細胞がＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異を有する場合に非常に有効であるＢＲＡＦ阻害薬ベムラフェニブ（４）とを含む。
【００８９】
白金耐性卵巣癌及びＭＰＭの患者において、ＣＢＰ５０１とＣＤＤＰの組み合わせが臨床的活性の証拠を示したことが示されている（５）。効能に対する主要評価指標はＭＰＭで達成された（６）。Ｇ２チェックポイント停止は、ＣＢＰ５０１が、（ｉ）Ｓｅｒ２１６においてＣＤＣ２５Ｃをリン酸化する複数のキナーゼを阻害する、（ｉｉ）１４−３−３のタンパクに直接結合し、リン−ＣＤＣ２５Ｃと共に抑制的な複合体を形成する、（ｉｉｉ）Ｓｅｒ２１６におけるＣＤＣ２５Ｃのリン酸化を弱める、及び、（ｉｖ）ＣＤＤＰ又はブレオマイシン（ＢＬＭ）との長期の複合暴露におけるＧ２／Ｍの癌細胞の蓄積を低減する、という観察に基づいた作用機序（メカニズム・オブ・アクション、ＭＯＡ）として提案されている（７，８）。
【００９０】
ＣＢＰ５０１に対するさらなる作用機序が実証された。これはカルモジュリンとのＣＢＰ５０１の直接的作用を要し、Ｇ２チェックポイント停止のために必要とされる条件よりＣＢＰ５０１が低用量かつはるかに短い接触であっても癌細胞中へのＣＤＤＰの増加した取込に結びつく（９）ＣＤＤＰ取込は多数の輸送体及びチャネルに依存することが知られている（１０）。カルモジュリン−ＣＢＰ５０１相互作用は、癌細胞中へのＣＤＤＰ取込を増加させるように複合の輸送体に影響する可能性がある。
【００９１】
Ｎｒｆ２は、グルタチオン合成と関係するものを含む、多くの酸化防止剤遺伝子の発現を制御する転写因子である（１１）。腫瘍形成において、Ｋｒａｓ、ＢＲＡＦ及びＭｙｃの特定の腫瘍形成性のアレルの発現は、Ｎｒｆ２発現を引き起こすことにより細胞内抗酸化物質の量を増加させる（１２）。Ｎｒｆ２は、薬剤の解毒化及び輸送と関係する遺伝子の発現を制御する（１３）。
【００９２】
この実施例は、ＣＢＰ５０１とＣＤＤＰに対して短期暴露した場合のみに細胞を検査することによるＧ２チェックポイント停止ではなく、ＣＤＤＰ取込を促進することに対するＣＢＰ５０１の効果に注目する。２８個のＮＳＣＬＣ細胞系は、一方の薬剤と比較して、ＣＤＤＰとＣＢＰ５０１の短時間の（１ｈ）の共暴露に対する反応を分析することによって、ＣＢＰ５０１に対して感受性又は非感受性であることが定量的に定義された。ＣＢＰ５０１のこの作用機序のための感度マーカーを同定するために、これらの細胞系に対して、包括的遺伝子発現解析（マイクロアレイ）を行った。Ｎｒｆ２転写因子によって制御される多数の遺伝子は、ＣＢＰ５０１非感受性細胞系おいて高度に発現していることが確認された。さらに、Ｎｒｆ２  ｓｈ−ＲＮＡを用いたＮｒｆ２のノックダウンは、Ｎｒｆ２発現がＣＢＰ５０１に対する抵抗性に必要であることを明らかにした。
【００９３】
材料及び方法
【００９４】
細胞培養と試薬
１０％ウシ胎児血清（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）でそれぞれ補われた多様な培養液中においてヒトＮＳＣＬＣ細胞系を５％ＣＯ２／空気、３７℃で培養した。使用された培養液は、ＮＣＩ−Ｈ１７５５、ＮＣＩ−Ｈ２０３０、ＮＣＩ−Ｈ１４３７、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＮＣＩ−Ｈ２１７２、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＮＣＩ−Ｈ１５６３、ＮＣＩ−Ｈ１９４４、ＮＣＩ−Ｈ１９９３、ＮＣＩ−Ｈ１７３４、ＮＣＩ−Ｈ１５６８、ＮＣＩ−Ｈ２４４４、ＮＣＩ−Ｈ２２９１、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＮＣＩ−Ｈ１８３８、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＨＣＣ８２７、ＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＮＣＩ−Ｈ１１５５、ＮＣＩ−Ｈ５２２及びＮＣＩ−Ｈ１７０３に対してＲＰＭＩ１６４０（シグマ・オールドリッチ、セントルイス、ミズーリ）；ＮＣＩ−Ｈ７２７に対して、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補われたＲＰＭＩ１６４０；ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６４７及びＮＣＩ−Ｈ８３８に対して、４．５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース（シグマ・アルドリッチ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（シグマ・オールドリッチ）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（シグマ・アルドリッチ）が補われたＲＰＭＩ１６４０；Ａ５４９に対してハムズＦ１２Ｋ（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ）（シグマ・オールドリッチ）であった。ＣＤＤＰはシグマ・アルドリッチから購入した。スルフォラファン（ＳＦＮ）はシグマ・アルドリッチから購入した。すべてのＮＳＣＬＣ細胞系はＡＴＣＣから購入した。各細胞系の同一性を確かめるために、ＡＴＣＣによってＳＴＲ分析が実行された。すべての細胞系は解凍後に３か月以内に使用した。
【００９５】
細胞周期分析
細胞を２４ウェルプレートに被覆し、２４時間培養した。示されている回数にわたって示されている濃縮で、ＣＤＤＰを用いて又は用いずに、プラス又はマイナスのＣＤＤＰで、細胞を処理した。細胞を採取し、クリッシャー溶液（０．１％クエン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム、２０μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡ、０．５％ＮＰ−４０）で染色した。染色された細胞を、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（ベクトン・ディキンソン）を使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディキンソン、フランクリンレイクス、ニュージャージー）により分析した。
【００９６】
抗体
抗体は示されている出所：抗ＮＲ０Ｂ１、抗Ｇｒｘ、抗Ｐｒｘ、抗ｙＧＣＳｃ、抗ｙＧＣＳｍ、及び、Ｇｐｘｌ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ダラス、テキサス）；抗ＭＬＣ、抗Ｇ６ＰＤ、抗ＡＢＣＣ２、抗ＫＥＡＰｌ、抗ＢＡＣＨｌ、抗Ｔｒｘｌ、抗ＳＯＤｌ、抗ＨＯ１、抗ＮＱＯ１、抗ＩＱＧＡＰ１、及び、抗ＡＴＭ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ベヴァリー、マサチューセッツ）；抗ＧＳＲ及び抗ＡＫＲＩＣ１、抗ＡＫＲ１Ｃ３、抗ＡＫＲ１Ｂ１０、及び、抗Ｎｒｆ２（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、サンフランシスコ、カリフォルニア）から購入した。
【００９７】
マイクロアレイと遺伝子発現解析。
ＲＮＡ分離に先立ってＮＳＣＬＣ細胞系を単層中で培養した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、東京、日本）を使用してＲＮＡ全体を分離した。分離された全ＲＮＡサンプルのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ解析をタカラバイオ社、滋賀、日本）で行った。１つの細胞系のＲＮＡ全体の分析を各３回繰り返して行なった。タカラバイオ社が遺伝子発現データの予備統計処理（一元配置分散分析及びベンジャミーニ・ホッホベルク法：誤発見率＜０．０５）を行った。
【００９８】
レンチウイルス感染
Ｎｒｆ２  ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子及びコントロールｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子をＳａｎｔａＣｒｕｚから購入した。メーカーの指示書に従ってレンチウイルス感染を行なった。ウイルス感染に先立って、細胞（５０％コンフルエンス）を５μｇ／ｍｌポリブレン（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）で処理した。ウイルス添加の１日後に細胞を新しい培養液に移し、細胞をピューロマイシン（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）による処理で選択した。
【００９９】
免疫蛍光検査法
カバーガラス表面で成長する細胞を、４％のパラホルムアルデヒド（１５ｍｉｎ）で固定し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄（５分、３回）し、次に１％のブロックエース（ＤＳ  ｐｈａｒｍａ、大阪、日本）を含むＰＢＳ中でブロッキングした。その後、標準プロトコルを使用して、抗体と共にそれらをインキュベートした。一次抗体は、抗Ｎｒｆ２（１：１００）及び抗ＡＫＲ１Ｃ１（１：１００）、抗ＡＫＲ１Ｃ３（１：１００）、及び、抗ＡＫＲ１Ｂ１０（１：１００）を含んでいた。アレクサ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて二次抗体をラベルし、ＤＮＡを染色するためにヘキスト３３３４２（同仁堂、熊本、日本）を使用した。ＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ、東京、日本）を使用して共焦点顕微鏡を行った。
【０１００】
ウエスタンブロット解析
示された回数にわたって示された濃度で、ＳＦＮを用いて又はＳＦＮを用いずに、細胞（５０％コンフルエンス）を処理した。それらの細胞を回収し、溶解バッファ中に（氷上で３０分間）溶解した［５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１μΜミクロシスチン、プロティナーゼ阻害剤カクテル］（ロッシュ、マンハイム、ドイツ）。溶解物を遠心分離（２０６００ｇ、４℃）によって浄化し、その上澄みを、メーカーの指示書に従って洗剤適合性タンパク測定キット（バイオｒａｄ、ヘラクレス、カリフォルニア）を使用して、タンパク含有量について分析した。１０〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて全細胞溶解物（６０μｇ）を泳動した。各ゲルから得たタンパクをポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ−ｒａｄ）上に移した。この膜を、１％ブロック・エース（ＤＳファーマ）を含むＴＢＳＴ（１０ｍＭトリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．０５％トゥイーン２０）において１時間室温でブロッキングし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。この膜を、洗浄後に、抗ペルオキシダーゼ結合二次抗体（細胞シグナリング）と共に室温で１時間さらにインキュベートし、強化された化学発光検出システム（ＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してシグナルを検出した。照度計ＬＡＳ−４０００装置（富士フイルム、東京、日本）を使用して検出されたバンドを定量した。ＮＳＣＬＣ細胞系に対する変異探索。ＮＳＣＬＣ細胞系におけるＫｅａｐｌ変異の探索はオンラインデータベース、癌における体細胞変異のカタログ（ＣＯＳＭＩＣ）を使用して行った。（http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/）
【０１０１】
結果
【０１０２】
ＮＳＣＬＣ細胞系及びＣＢＰ５０１に対する感受性
【０１０３】
細胞周期分布の系統的変化を測定するコロニー形成法、インビトロ生存率測定、及び、流動細胞計測法分析を含む様々な方法によって示されるように、ＣＢＰ５０１は腫瘍細胞をＣＤＤＰに対して感受性にする。別々の複数の方法の間の結果は相互によく関連しており（８、９）、ＣＢＰ５０１に対する異なる感受性は異なる細胞系について一貫して変化した（９）。
【０１０４】
ここで、細胞周期分布の変化は、流動細胞計測法によって示されるように、ＣＢＰ５０１によって強化されるＣＤＤＰに対する細胞毒性に対するＮＳＣＬＣ細胞系の感受性を評価するために使用した。そのような変更は、ＣＢＰ５０１の存在下又は非存在下においてＣＤＤＰで処理された細胞においてモニターされた。抗癌治療の有効性を評価するためのこの分析の利用は、多くのタイプの癌細胞の細胞周期において、機能するＧ１／Ｓチェックポイント制御が非存在であることに基づいている（１４）。機能するＧ１／Ｓチェックポイントの欠如は、ＤＮＡ損傷性のある制癌剤に対するそれらの暴露時に、Ｇ２／Ｍ期における癌細胞の蓄積に至る（１４、１５）。
【０１０５】
ＣＢＰ５０１のＣＤＤＰ強化活性を評価するために、Ｘ軸がＣＤＤＰの量を示し、Ｙ軸がサブＧ１又はＧ２／Ｍの一方にある細胞の数を示す２つの用量応答曲線のいずれかを調べることができる。ＣＢＰ５０１感受性細胞に対してＣＢＰ５０１が存在する状態では、一方の用量応答曲線において推移及びピークが左に移動し、そのことはＣＤＤＰが細胞周期分布を変化させる能力が増強されたことを示す。ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞のそのような分析によって、ＣＢＰ５０１は、細胞周期分布を変化させるＣＤＤＰの有効性を約８倍に増加させた（図１Ａ〜Ｄ）。他方では、ＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞系は、ＣＢＰ５０１によって引き起こされるＣＤＤＰの用量応答曲線において、検出可能な変化を示さなかった（図１Ｅ〜Ｈ）。ＣＤＤＰによって生じるサブＧ１又はＧ２／Ｍ用量応答曲線を変化させるＣＢＰ５０１の能力に基づいたこの基準を使用して、１２個ＮＳＣＬＣ細胞系をＣＢＰ５０１感受性又はＣＢＰ５０１非感受性のいずれかであるとして分類した。２倍以上カーブが変化した細胞系をＣＢＰ５０１感受性細胞として分類し、カーブが２倍未満の変化を示したものをＣＢＰ５０１非感受性として分類した（表１）。
ＮＳＣＬＣ細胞系におけるＣＢＰ５０１感受性の分類
【表１】
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【０１０６】
包括的遺伝子発現解析は、いくつかのＮｒｆ２標的遺伝子がＣＢＰ５０１非感受性細胞系において発現がアップレギュレートされたかもしれないことを示す。
【０１０７】
表１に一覧されている１２個のＮＳＣＬＣ細胞系について包括的遺伝子発現（マイクロアレイ）分析を行った。発現レベルに対する閾値シグナル値を５０００に設定した場合、４０個の遺伝子が、ＣＢＰ５０１感受性との７０パーセント以上の相関関係を示した（図２Ａ）。これらの確認した遺伝子を、感受性細胞において高度に発現された遺伝子又は非感受性細胞系において高度に発現された遺伝子の２つのカテゴリに細分した。ＣＢＰ５０１感受性細胞系とＣＢＰ５０１非感受性細胞系とを比較した場合、感受性又は非感受性として個々に分類される遺伝子をグループ分けするための平均発現レベル値の検討は、いくつかの非感受性遺伝子が一貫して発現レベルの認識可能な差を示した（図７）。ストレス応答、薬剤抵抗性、代謝、分化及びアンチオキシダント応答（データは示されていない）を含む様々な生物学的プロセスにおいて作用する４０個超のタンパクについて、表１に一覧されている１２個のＮＳＣＬＣ細胞系に対してウエスタンブロット解析を行った。Ｎｒｆ２タンパクの発現レベルは、ＮＳＣＬＣ細胞系の同じセットにおけるＣＢＰ５０１感受性とよく相関することがわかった（図２Ｂ、Ｃ）。これらの分析に基づいて、図２Ａから、グルタチオン・レダクターゼ（ＧＳＲ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリＣメンバ２（ＡＢＣＣ２）、アルド・ケト還元酵素ファミリ１Ｃ１（ＡＫＲ１Ｃ１）及びＡＫＲ１Ｃ３のｍＲＮＡ発現レベルに着目した。これらの遺伝子の発現が共通の転写因子Ｎｒｆ２によって制御されることが知られているからである（１６−２０）。ウエスタンブロット解析によってタンパク発現のレベルがｍＲＮＡ発現と関連したことが確認された（図２Ｄ）。
【０１０８】
いくつかのＮＳＣＬＣ細胞系においてＮｒｆ２の細胞内局在性を調べるために免疫細胞化学分析を使用した。これらのテストは、ＣＢＰ５０１感受性細胞と比較して、ＣＢＰ５０１非感受性細胞系におけるＮｒｆ２の細胞全体の発現が有意に高いレベルであることのみならず、Ｎｒｆ２の高度に核局在化していることの両方を明らかにした（図３）。これらの結果は、ＣＢＰ５０１非感受性細胞系におけるＮｒｆ２タンパクの高いレベルの発現が、標的遺伝子の高いレベルでの発現に帰着することを示した。
【０１０９】
ＣＢＰ５０１感受性はＮｒｆ２の有効性によって影響を受ける。
【０１１０】
Ｎｒｆ２のさらなる既知の遺伝子ターゲットの発現レベルを調べるためにウエスタンブロット解析を行った（１６−２０）。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１）、Ｒ１Ｂ１０、γ−グルタミル・システイン・シンセターゼ・モディファイヤ・サブユニット（ｙＧＣＳｍ）及びグルタチオン・ペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）が、ＣＢＰ５０１非感受性細胞系においてそれぞれ高いレベルの発現を示した（図４Ａ）。これらの結果は、通常の培養条件下においてＣＢＰ５０１非感受性細胞系ではＮｒｆ２標的遺伝子の発現が増えることをサポートする。
【０１１１】
ＣＢＰ５０１感受性とＮｒｆ２発現との間の直接的な因果関係を示すために、ＣＢＰ５０１に対して感受性であるＨ１７０３の安定なＮｒｆ２ノックダウン細胞系を生産した（図４Ｂ）。ＣＢＰ５０１、ＣＤＤＰ、及び、既知のＮｒｆ２アクティベイタであるＳＦＮに対するこの細胞系の三重暴露を研究した（１７）。図４Ｂに示されているように、ＳＦＮは、コントロールｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞において用量依存的にＮｒｆ２タンパクレベルを増加させた。ＳＦＮは、Ｎｒｆ２ｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞においてはＮｒｆ２タンパク質のレベルの同様な増加を引き起こさなかった。ＳＦＮの添加は、コントロールｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞においてＣＢＰ５０１の効力を低下させた（図４Ｃ、Ｄ）。しかし、ＳＦＮの効果はＮｒｆ２ノックダウン株では無効化された（図４Ｂ〜Ｄ）。
【０１１２】
ＣＢＰ５０１非感受性細胞系Ｈ１４３７におけるＮｒｆ２ノックダウンの効果を調べた。Ｎｒｆ２ノックダウンは、ＡＫＲ１Ｃ３、Ｇ６ＰＤ及びＧＳＲについては低下した発現レベルを引き起こすことがわかった（図５Ａ）。このノックダウン細胞系については、ＣＢＰ５０１は、最初のＣＢＰ５０１非感受性を逆にして、サブＧ１及びＧ２Ｍの細胞周期分布の変化に対するＣＤＤＰの効果を増加させることがわかった。他方では、コントロールｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞系は、ＣＢＰ５０１があってもなくてもＣＤＤＰ活性の差を示さなかった（図５Ｂ、Ｃ）。これらの結果は、高いＮｒｆ２発現レベルがＣＢＰ５０１に対する抵抗を引き起こすかもしれないことを示している。
【０１１３】
Ｎｒｆ２タンパクの高発現はＣＢＰ５０１に対する抵抗を予測するためのマーカー候補である。Ｎｒｆ２ターゲットは、タンパク又はｍＲＮＡレベルのいずれかにおいて、さらなるマーカー候補である。
【０１１４】
Ｎｒｆ２又はそのいくつかの下流の転写ターゲットの発現はおそらくＣＢＰ５０１に対する抵抗性を予測するかもしれないが、ＣＢＰ５０１感受性に関するこれらの予測的マーカーの一般的な信頼度はまだ確立されていない。１６個のさらなるＮＳＣＬＣ細胞系におけるＣＢＰ５０１及びＣＤＤＰの組合せ効果を分析し、先の基準によってＣＢＰ５０１感受性又は非感受性であるとしてそれぞれを分類した（表２）。
さらなるＮＳＣＬＣ細胞系におけるＣＢＰ５０１感受性の分類
【表２】
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【０１１５】
その後、これらの細胞系統は、最初の１２個の細胞系と同じマイクロアレイ分析に供した。７０パーセントを超える正確さを有するＣＢＰ５０１感受性に対する予測マーカー候補を同定するために、２８個の細胞系の拡張されたセットに関する遺伝子発現色分け図を再び分析した。３つのＮｒｆ２標的遺伝子ＧＳＲ（８５．７％の予測確率）、ＡＫＲ１Ｃ３（７５％）及びＧ６ＰＤ（８５．７％）を含むそのような７つの遺伝子が同定された（図６Ａ）。これらの細胞系における対応タンパクの発現レベルをウェスタンブロッティングによって確認した（図６Ｂ）。特に、ＡＫＲ１Ｃ３とＧＳＲの高い発現レベルは、ＣＢＰ５０１に対する抵抗性及びＮｒｆ２発現と同じ程度に相関していた（図６Ｂ、Ｃ）。この観察の実用性を調査するために、免疫細胞科学法によるＡＫＲ１Ｃ３のタンパク発現の検出がＣＢＰ５０１感受性に関する可能な予測マーカーとして機能するかどうかを判断するために、いくつかのＮＳＣＬＣ細胞系を調べた。そのような方法論は、ＮＳＣＬＣ腫瘍バイオプシーから典型的に利用可能な小さな組織サンプルにおいてタンパクの発現レベルを検出するために充分な感度があるので、一般にマーカー検出に適用可能であるという見込みがある（２１）。これらのテストから、Ｎｒｆ２を用いた結果（図３及び図６Ｂ）と同様に、ＣＢＰ５０１感受性細胞系と比較して、ＣＢＰ５０１非感受性細胞系において高いレベルのＡＫＲＩＣ３が実際に検出され得ることが結論付けられた（図６Ｄ、Ｅ）。これらの結果は、少なくともインビトロにおいては、Ｎｒｆ２及び一連のＮｒｆ２遺伝子標的分子の免疫組織化学的検出が、ＣＢＰ５０１に対する抵抗性を予測するための非常に信頼できるマーカーになりえることを示している。
【０１１６】
ＣＢＰ５０１が抗癌剤候補として少なくとも２つの作用機序を持っていることが示されている（８、９）。これらの１つ、Ｇ２チェックポイント停止は、より長い時間かつより多い量の処理に対して生じる（８）。ＣＢＰ５０１の第２の抗癌活性、カルモジュリンへの結合によるＣＤＤＰ取込の増大は、より短い時間かつより低い量の処理に対して生じる（９）。この実施例において、焦点は後者の結果に置かれており、より低用量のＣＢＰ５０１でより短い時間で細胞を処理することにより、特性を明らかにした。ＣＢＰ５０１のこの第２の抗癌活性の詳細な分子メカニズムは、ＣＢＰ５０１−カルモジュリン相互作用がＣＤＤＰ取込に関与する多数のチャネル及び輸送体のいくつかに影響すると考えられるため、まだ解明されていない（１０）。ＣＤＤＰ取込に関するこれらの不明確さは、ＣＢＰ５０１によって最も一意的に影響される単一のＣＤＤＰ輸送経路の同定を複雑にした。マイクロアレイ分析によって決定されるように、ＣＢＰ５０１感受性は、ＣＢＰ５０１感受性細胞系とＣＢＰ５０１非感受性細胞系との間の遺伝子発現プロファイルにおける主要な差を確認することによって予測された。遺伝子発現のこの包括的解析は、ＣＢＰ５０１感受性に関する予測マーカーのいくつかの候補に最初に結びついた。Ｎｒｆ２によって制御される共通の転写経路からの遺伝子発現の増加は、ＣＢＰ５０１に対する非感受性の有力な指標であることが確認された。Ｎｒｆ２は、細胞保護機能に関係する遺伝子のための重要な転写因子であることが知られている（２２−２６）。恒常的条件下において、Ｎｒｆ２は、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ関連タンパク１（Ｋｅａｐ１）及びＣｕｌ３  Ｅ３リガーゼとの関連を通じて、プロテアソーム分解系によって非常に低い細胞内濃度で維持されている（２７−３０）。Ｎｒｆ２タンパク発現レベルは、ＣＢＰ５０１感受性細胞系より、ＣＢＰ５０１非感受性細胞系においてより高いことが分かった。しかし、Ｋｅａｐ１の発現レベルは、ＣＢＰ５０１に対する感度と同様には相関しなかった（図２Ｂ）。この結果は、Ｎｒｆ２タンパクが恒常的条件下で分解する能力が異なる細胞株において変化することを示すかもしれない。いくつかの報告は、ＮＳＣＬＣ細胞系及び腫瘍における、Ｋｅａｐ１変異と予後不良又は化学療法剤抵抗との関係を示している（３１−３３）。Ｋｅａｐ１変異は、この実施例において使用された一連のＮＳＣＬＣ細胞系に存在している（下記表３）。Ｋｅａｐ１変異はＣＢＰ５０１非感受性細胞系に存在する傾向があった。これは、Ｋｅａｐ１変異状態がＣＢＰ５０１に対する抵抗性の有用な指標であることを示している。各変異型の役割はさらに立証されるだろう。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
ＣＢＰ５０１非感受性を予測するマーカーのための候補を確認する手段として、ＲＮＡ又はタンパクのレベルのいくつかのＮｒｆ２標的遺伝子の特異的な発現を同定した。これらの最初の候補のうち、Ｇ６ＰＤ、ＧＳＲ及びＡＫＲ１Ｃ３は、ＣＢＰ５０１感受性細胞系とＣＢＰ５０１非感受性細胞系との間でｍＲＮＡ及びタンパク発現レベルの両方において有意差を示した。これらの同定された遺伝子の発現の制御は、ＡＲＥ（抗酸化反応エレメント）と呼ばれるＮｒｆ２結合因子の共通制御機構の下にあることが認められた（２３）。いくつかの既知の転写因子は、ＡＲＥにおける相互作用を競合することによりＮｒｆ２に拮抗することができる。これらは、小さなＭＡＦタンパク、ＢＡＣＨｌ、ｃ−ＦＯＳ及びＦＲＡ１（２３、３４、３５）を含む。これらの転写制御因子は、種々のＮｒｆ２標的遺伝子の特異的な発現の制御に関係しているかもしれない。実際、ＢＡＣＨ１タンパクは、ＮＳＣＬＣ細胞系における発現がＣＢＰ５０１感受性細胞系において増加するものである（図２Ｂ）。
【０１１９】
Ｎｒｆ２は、多数の遺伝子の発現を誘導することにより、代謝、生体異物反応、及び、アンチオキシダント応答を含む、種々の生物学的現象の広範な領域に関与している（２２〜２６）。例えば、Ｇ６ＰＤ及びＧＳＲの発現を誘導することは、グルタチオンレベルを上昇させ、これはアンチオキシダント応答に結びつく（３６、３７）。ＡＫＲ１Ｃ３は、テストステロンの合成及びプロスタグランジン生成に結びつく経路を媒介することができる（３８、３９）。Ｎｒｆ２がＣＢＰ５０１感受性を調整するかもしれないことをＮｒｆ２ノックダウン実験は示しているが、どのＮｒｆ２標的遺伝子又は現象が直接的にＣＢＰ５０１感受性に影響するかという決定的な答えはまだない。１つ又はいくつかのＮｒｆ２標的遺伝子は、ＣＤＤＰ取込に対するＣＢＰ５０１の効果に対する細胞感受性を決定することに関与しているかもしれない。そのような直接的効果は、従来のマイクロアレイ分析によって検出するのが難しいかもしれない。従来のマイクロアレイ分析は、個々のプローブの検出における感度が変化するという技術的な限界によって時々妨げられることがある。少なくとも７個の細胞系において、短時間暴露でのＣＢＰ５０１／ＣＤＤＰの組合せ効果がＣＤＤＰ取込とよく相関したことは示されたが（９）、ＮＳＣＬＣ細胞系における白金蓄積は証明されなかった。従って、ＣＢＰ５０１がＣＤＤＰ取込の増進にだけでなく、ＣＤＤＰに対するＮｒｆ２依存的細胞保護効果の抑制にも影響した可能性があった。例えば、Ｎｒｆ２によってアップレギュレートされ得る還元グルタチオン（ＧＳＨ）は、ＣＤＤＰに結合し、毒性を低下させることができる（４０）。しかし、ＮＳＣＬＣ細胞系における細胞内ＧＳＨの測定レベルの減少は、ＣＢＰ５０１感度と相関していない（データは示さず）。明らかに、Ｎｒｆ２がＣＢＰ５０１非感受性を制御する具体的なメカニズムを確立するためにさらなる調査が必要である。
【０１２０】
ＣＢＰ５０１感受性により恩恵を受ける可能性がある患者の実際の選択のためには、しかしながら、バイオプシーによって入手可能な小さな腫瘍サンプルから感度の明瞭な指標を得る可能性があるので、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）が選択の最良の方法である可能性がある。より小さなサンプルはウェスタンブロッティングよりもＩＨＣによって分析することができる（２１）。Ｎｒｆ２、ＡＫＲ１Ｃ１、ＡＫＲ１Ｂ１０及びＡＫＲ１Ｃ３に関する免疫細胞科学的測定に対する調査は、これらがウェスタンブロッティング試験において得られた結果を信用できるように再現することを示した（図３、図６Ｃ、図６Ｄ、図８及び図９）。腫瘍バイオプシーサンプルにおいてこれらのタンパクを発見するためのＩＨＣの使用の妥当性検証及びＣＢＰ５０１感受性との相関のさらなる妥当性検証は、ＣＤＤＰ＋ＣＢＰ５０１の組み合わせ療法に対する患者の増大した反応性を予測する有用なツールを提供することができる。
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【図１Ａ】
2017519185.tif 000006
【図１Ｂ】
2017519185.tif 000007
【図１Ｃ】
2017519185.tif 000008
【図１Ｄ】
2017519185.tif 000009
【図１Ｅ】
2017519185.tif 000010
【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2017519185.tif 000012
【図１Ｈ】
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【図２】
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【図３】
2017519185.tif 000015
【図４Ａ】
2017519185.tif 000016
【図４Ｂ】
2017519185.tif 000017
【図４Ｃ】
2017519185.tif 000018
【図４Ｄ】
2017519185.tif 000019
【図５Ａ】
2017519185.tif 000020
【図５Ｂ】
2017519185.tif 000021
【図５Ｃ】
2017519185.tif 000022
【図６】
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【図７】
2017519185.tif 000024
【図８】
2017519185.tif 000025
【図９】
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【国際調査報告】
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