(57)【要約】  髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｂ（ＭｅｎＢ）由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を含む、ワクチン組成物が挙げられる組成物が提供される。また、そのような組成物を製造する方法であって、培養でＭｅｎＢを増殖させることと、産生されるＯＭＶを単離することとを含む方法、および対象における髄膜炎の予防のためのＭｅｎＢワクチン組成物の使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも６つの異なる髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｂ（ＭｅｎＢ）株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を含む組成物であって、前記ＭｅｎＢ株は併せて
配列番号６に記載される配列を有するＰｏｒＡ可変領域２（ＶＲ２）、配列番号１０に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ２、配列番号７に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ２、配列番号８に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ２、配列番号９に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ２、および配列番号１１に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ２；ならびに
配列番号１２に記載される配列を有するＦｒｐＢ  ＶＲ、配列番号１４に記載される配列を有するＦｒｐＢ  ＶＲ、配列番号１３に記載される配列を有するＦｒｐＢ  ＶＲ、配列番号１６に記載される配列を有するＦｒｐＢ  ＶＲ、配列番号１５に記載される配列を有するＦｒｐＢ  ＶＲ、および配列番号１７に記載される配列を有するＦｒｐＢ  ＶＲ
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＭｅｎＢ株は：
配列番号２に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ１、配列番号３に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ１、配列番号４に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ１、または配列番号５に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ１
の１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＭｅｎＢ株は、配列番号１に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ１をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
各ＭｅｎＢ株が、正確に１つのＰｏｒＡ  ＶＲ１、１つのＰｏｒＡ  ＶＲ２、および１つのＦｒｐＢ  ＶＲを発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも６つのＭｅｎＢ株は：
配列番号６に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列および配列番号１２に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、
配列番号７に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列および配列番号１３に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、
配列番号８に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列および配列番号１４に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、
配列番号９に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列および配列番号１５に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、
配列番号１０に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列および配列番号１６に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、ならびに
配列番号１１に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列および配列番号１７に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも６つのＭｅｎＢ株は：
配列番号１に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１配列、配列番号６に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列、および配列番号１２に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、
配列番号２に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１配列、配列番号７に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列、および配列番号１３に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、
配列番号３に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１配列、配列番号８に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列、および配列番号１４に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、
配列番号４に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１配列、配列番号９に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列、および配列番号１５に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、
配列番号２に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１配列、配列番号１０に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列、および配列番号１６に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株、
配列番号５に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１配列、配列番号１１に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２配列、および配列番号１７に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ配列を有する株
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＭｅｎＢ株は、ｌｐｘＬ１突然変異および／またはｌｐｘＬ２突然変異を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＭｅｎＢ株は、ｒｍｐＭ突然変異またはｇｎａ３３突然変異を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＭｅｎＢ株は、ｌｐｘＬ１突然変異およびｒｍｐＭ突然変異を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＭｅｎＢ株は、ｓｉａＤ突然変異およびｇａｌＥ突然変異を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＭｅｎＢ株は、野生型株と比較して、ファミリＡの１つの因子Ｈ結合タンパク質（ｆＨｐｂ）メンバ、およびファミリＢの１つのｆＨｐｂメンバを過剰発現する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＭｅｎＢ株はそれぞれ、異なるｆＨｐｂファミリＡまたはファミリＢのメンバを過剰発現する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、６〜１０の異なるＭｅｎＢ株由来のＯＭＶを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＯＭＶは、固有のＯＭＶ（ｎＯＭＶ）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物中のＰｏｒＡタンパク質の、ＦｒｐＢタンパク質に対する比率は、３：１から１：３、任意に２：１から１：２、任意に１．５：１から１：１．５である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含むワクチン。
【請求項１７】
アジュバントをさらに含む、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
対象における髄膜炎の予防に用いる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１６もしくは１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）感染に対して対象を免疫化する方法であって、請求項１６または１７に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の髄膜炎菌（N. meningitidis）Ｂ（ＭｅｎＢ）外膜小胞組成物を生産する方法であって、前記少なくとも６つのＭｅｎＢ株を増殖させることと、前記株によって産生される前記外膜小胞を単離することとを含む方法。
【請求項２１】
前記ＭｅｎＢ株を、ＦｒｐＢ発現を誘導するために鉄含有量が制限されている、化学的に定義された培地中で増殖させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記鉄含有量は、０〜２２μＭ、好ましくは、鉄補給ＦｅＣｌ３およびクエン酸鉄アンモニウムについて、それぞれ５〜２０μＭまたは０〜２μＭである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記培地は、前記ＭｅｎＢ株の増殖中、鉄キレート化剤を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法によって生産される組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、髄膜炎菌（Neisseria meningitis）莢膜群Ｂ（ＭｅｎＢ）細菌由来の外膜小胞を含む組成物、およびその、ワクチンとしての使用に関する。本発明はまた、そのような組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
Neisseria meningitidis（髄膜炎菌）は、世界的に髄膜炎および敗血症の主な原因である。このグラム陰性双球菌は、あらゆる年齢の人々に感染することができるが、進行中の髄膜炎菌性疾患（ＭＤ）のリスクは、幼児期の間、および１０代において最も大きい。莢膜群Ｂ（ＭｅｎＢ）株は、疾患の発病率が最も高い年齢群である＜１歳の乳児において、相当な数の症例を引き起こしている。ヘルスケアおよび抗生物質処置の進歩にも拘らず、致死率は、先進国においてでさえ、高い（１０％）ままである。さらに、生存者の３０％に、破壊的な、長期の後遺症、例えば癲癇、永続的な脳損傷、難聴、および／または四肢切断が残る。
【０００３】
髄膜炎菌は、莢膜の免疫化学に基づいて、１２の莢膜群に分類されている。１２の血清群：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９−Ｅ、Ｗ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、およびＬが知られている。しかしながら、１２の血清群のうちの６つ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｗ、およびＹ）が、全疾患の９０％超を占めている。血清群Ｂ、Ｃ、Ｗ、およびＹが、先進国における症例の大多数を占めているが、血清群Ａ、および最近出現している血清群Ｘが、「髄膜炎ベルト」とも呼ばれるアフリカのサハラ以南の一部において主な負担となっている。
【０００４】
全てのうち、ＭｅｎＢ株が特に懸念されており、これは、殆どの先進国において、全髄膜炎菌性疾患のおおよそ８０％を担っている。細菌性髄膜炎の迅速な発症および重篤度が、この疾患に対する一般市民の恐怖心を主に煽っている。
【０００５】
現在、血清群ＢおよびＸを除く多糖類ワクチンまたは多糖類結合型ワクチンが広範に用いられている。血清群Ｂの多糖類ベースのワクチンの開発は、その莢膜抗原の不十分な免疫原性によって、およびグリコシル化ヒト抗原との抗体交差反応の潜在的リスクによって、遅れている。ゆえに、群Ｂ単離体からの保護を実現する潜在性がある包括的な髄膜炎菌ワクチンの開発は、サブ莢膜（sub-capsular）抗原、例えばリポオリゴ糖（ＬＯＳ）および表面タンパク質に集中してきた。また、当該サブ莢膜の細菌成分によって示される遺伝的多様性および抗原多様性のレベルが高いために、タンパク質／ＬＯＳベースの髄膜炎菌ワクチンの設計は複雑である。
【０００６】
難題にもかかわらず、例えば、１９８０年代にキューバおよびノルウェーで、そしてより最近では、ニュージーランド（１９９０年代）およびフランス（２０００年代）で起こった、長期にわたる流行病に対して、いくつかの株特異的ＭｅｎＢワクチンが開発されている。これらのワクチンは全て、髄膜炎菌によって本来産生される、野生型の外膜小胞（ＯＭＶ）に基づいていた。ＯＭＶは、平均直径が５０〜２５０ｎｍである脂質二重層の「ブレブ」であり、増殖しているグラム陰性菌の外膜から構成的に押し出されたものである。ＯＭＶは一般に、組成が、生きた細菌の外膜に類似しており、リポオリゴ糖（ＬＯＳ；主な髄膜炎菌エンドトキシン）および表面タンパク質を含んでいる。これらのワクチンは一般に、免疫原性であり、かつ保護的であることが示されている。しかしながら、ＯＭＶに対して誘導される免疫応答は、主に免疫優性であり、かつ可変的なポーリンＡ（ＰｏｒＡ）に向けられ、異種株からの保護を付与する能力は非常に限られることが示されている。それ故に、ＯＭＶベースのものは全て、局地的なＭｅｎＢ大発生に対してのみ有効であった（表１参照）。
【０００７】
【表１】
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【０００８】
HexaMenおよびNonaMenと呼ばれるワクチンを開発する際、株カバー範囲を広げる目的で、ＯＭＶに基づく更なるアプローチが、Netherlands Vaccine Institute（ＮＶＩ）によって採用された。HexaMenについて臨床治験中に生じたデータ［１］は、生後２年目における投与を含む、４回の免疫化後に初めて、複数のＭｅｎＢ株に対して良好な殺菌活性を実証した一方で、生後１年目における可能な限り早い時期に保護が必要とされている。NonaMenは、それぞれがＰｏｒＡの３つのサブタイプを発現する、３つの遺伝子操作された株からのＯＭＶの調製に基づいている。当該株はさらに、ペンタアセチル化脂質Ａを発現するように、ｌｐｘＬ１突然変異によって遺伝子改変されており、このペンタアセチル化脂質Ａは、野生型ＬＯＳよりも反応原性が大幅に低いことが報告されている［２］。しかしながら、ワクチンの主成分はＰｏｒＡタンパク質であるので、他のマイナー抗原の限られた交差保護が、NonaMenによって得られる。複数のＰｏｒＡ抗原が同じ株の表面上で発現されたという事実はおそらく、Nonamenによって得られる免疫応答が一様でない原因となっている［２２］。
【０００９】
免疫優性ＰｏｒＡよりもかなり保存されているマイナー抗原もまた、その抗原潜在性について研究されている。残念なことに、H44/76株で得たデータは、ＰｏｒＡの不在下で、マイナーな外膜タンパク質（ＯＭＰ）が過剰発現されていたとしても、弱い免疫応答しか引き起こさないことを示した［２３］。
【００１０】
「ユニバーサル」抗原の使用に基づいた、株カバー範囲が広いＭｅｎＢワクチンを生じさせるための異なるアプローチが、リバースワクチノロジ（reverse vaccinology）を利用することによるものであった［１６］。このアプローチに関する課題は、同定された抗原の可変性である。リバースワクチノロジ（「Bexsero」）後にNovartisによって調製されるＭｅｎＢワクチンは、３つの組換えタンパク質（２つの融合タンパク質を含む）、および洗浄剤で抽出された外膜小胞（ｄＯＭＶ）で構成される。
【００１１】
ＮａｄＡ（ナイセリア（Neisseria）属アドヘジンＡ）は、コロニー形成中および浸潤中の重要なアドヘジンおよびインバシンとして作用する。しかしながら、これは、限られた数の病原性髄膜炎菌においてしか生じないので、ワクチンへの寄与は制限されるかもしれないことが示唆される。ＮａｄＡとは異なり、ナイセリア属ヘパリン結合タンパク質（ＮＨＢＰ）は、病原性髄膜炎菌の殆どの単離体中に存在している。ＮＨＢＰは、粘膜分泌液中に存在する、高度に硫酸化されたグリコシル化物（glycosylates）に結合することができ、ＭｅｎＢ血清抵抗性を増大させることが示された。これまで得られたデータは複雑であるので、ワクチンによって高められる抗ＮＨＢＰ抗体の、保護全体への寄与は、まだわかっていない。Bexseroは、因子Ｈ結合タンパク質（ｆＨｂｐ）からも構成され、これはヒトｆＨと結合して、別の相補体経路の負のレギュレータとして作用する。ｆＨの動員は、病原体表面上でのＣ３分解を低下させて、補体媒介溶解を低下させる。ｆＨｂｐの存在量は、その有効性にとって重要である。したがって、ｆＨｂｐを欠く株、およびその発現を下方制御する株の出現は、大きな懸念である。
【００１２】
このワクチンは有効であるように思われるが、株カバー範囲が疑わしく、ＬＯＳの存在の結果としてのワクチンの反応原性が懸念されている。今までのところ、Bexseroは、Quebec（カナダ）においてしか、ルーチンの乳児免疫化スケジュールに実施されていない。
【００１３】
「ユニバーサル」抗原の着想は、Pfizerによっても探究されており、その二価「rLP2086」ＭｅｎＢワクチンは、因子Ｈ結合タンパク質（ｆＨｂｐ）に基づいている；このワクチンは、青年期の人および若年成人において有効であると思われている。幼児において行われた研究は、概して低いＳＢＡ応答、およびｆＨｂｐ異種株に対する交差反応性の低下を示した（４４．４％未満、ｈＳＢＡ≧１：４）。そして、小児および乳児（ＭｅｎＢワクチンにとって重要な標的集団）におけるこのワクチンのさらなる開発は、ストップしているように思われる。また、二価rLP2086は、青年期の人および若年成人において、穏やかな局所反応原性を誘導し、対象の最大１０％において発熱が報告されている。
【００１４】
以前に、Oxfordの研究者ら［３］、［１７］は、世界的な髄膜炎菌過剰侵襲性系統の多様性を代表すると主張される、７８株のパネルを分析して、組換えワクチンにおけるＭｅｎＢに対する広いカバー範囲を潜在的に実現するであろうＰｏｒＡおよびＦｅｔＡ（ＦｒｐＢ）の精製抗原の組合せを提唱した。僅か６セットのＰｏｒＡエピトープ（Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．５−２，１６；Ｐ１．５，１０；Ｐ１．７，１３−１；Ｐ１．７−２，４；およびＰ１．２０，９）および５つのＦｅｔＡエピトープ（Ｆ１−５、Ｆ３−１、Ｆ５−１、Ｆ３−９、およびＦ５−５）による「標準的な」配合が、潜在的に、髄膜炎菌単離体から広く保護的であろうと示唆された。さらに、研究者らは、髄膜炎菌単離体からの保護がよりいっそう広い、第７のセットのＰｏｒＡエピトープ（Ｐ１．１９，１５）による「増強された」配合を示した。ワクチン組成物は、これらの研究において、実際に調製されてもいなければ、機能的な抗体誘導について試験されてもいなかった。また、自然環境以外で組換えにより発現される場合、タンパク質の生来の折畳みは損なわれるかもしれず、これは、提唱されるタンパク質の実際の免疫原性を引き下げる虞がある。
【００１５】
現在、欧州（２０１３年１月）、オーストラリア（２０１３年７月）、およびカナダ（２０１３年１２月）において認可されている、血清群Ｂに対するワクチンがたった１つ存在する。コスト効率の問題のために、ワクチンは未だルーチン免疫化スケジュールに実施されていない。それ故に、ＭｅｎＢは、重大な健康負担として残っており、広い保護を与える良好なワクチンが、医学的に強く必要とされている。非莢膜抗原に基づくワクチンが設計されているが、そのような抗原の可変性に直面して、当該ワクチンのカバー範囲が、限られた数の株に制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、ＭｅｎＢに対する広く保護的なワクチンが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の要約
本発明は、外膜小胞組成物として提供される場合に、ＰｏｒＡ抗原およびＦｒｐＢ抗原の特定のサブセットが、広い範囲の様々なＭｅｎＢ株からの保護を実現することができる一方で、既存のＭｅｎＢワクチンと比較して反応原性が低いという発見に基づくものである。
【００１８】
第１の態様において、本発明は、少なくとも６つの異なる髄膜炎菌Ｂ（ＭｅｎＢ）株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を含む組成物であって、少なくとも６つのＭｅｎＢ株は、配列番号６から１１に記載される配列を有するＰｏｒＡ可変領域２（ＶＲ２）と、配列番号１２から１７に記載される配列を有するＦｒｐＢ  ＶＲとを含む組成物を提供する。
【００１９】
ＦｒｐＢ（ＦｅｔＡ）可変領域およびＰｏｒＡ可変領域の何百もの変異体およびサブ変異体が同定されているが、本発明者らは、特定の、最適な、ＰｏｒＡ可変領域２（ＶＲ２）およびＦｒｐＢ  ＶＲの変異体のサブセットを有する少なくとも６つの異なるＭｅｎＢ株由来の外膜小胞を含む組成物が、既知の病原性ＭｅｎＢ株に対する広いカバー範囲を提供することができることを見出した。
【００２０】
さらに、組換えタンパク質と比較して、本発明者らは、本来の膜環境内にあるＦｒｐＢ（ＦｅｔＡ）抗原およびＰｏｒＡ抗原が投与されると、これらがＯＭＶ内に存在するので、組成物は、免疫原性が予想外に高いことを見出した。理論に拘束されることを望むものではないが、ＯＭＶ中に示される抗原は、正確に折り畳まれており、そしてさらに、ＯＭＶ中に存在するマイナー膜抗原が、予防効果にさらに寄与し得ることとなると考えられる。
【００２１】
ＭｅｎＢ株はさらに、配列番号２から５に記載される配列を有するＰｏｒＡ可変領域１（ＶＲ１）変異体の１つ、複数、または全てを含んでよい。これらの可変領域に含まれるエピトープもまた、予防効果に寄与することが示された。
【００２２】
ＭｅｎＢ株はまた、配列番号１に記載される配列を有するＰｏｒＡ  ＶＲ１変異体を含んでもよい［２１］。
【００２３】
組成物中の異なるＭｅｎＢ株はそれぞれ、正確に１つのＰｏｒＡ  ＶＲ１、１つのＰｏｒＡ  ＶＲ２、および１つのＦｒｐＢ  ＶＲを発現し得る。ＭｅｎＢ株が正確にＰｏｒＡ  ＶＲ１、ＰｏｒＡ  ＶＲ２、およびＦｒｐＢ  ＶＲのそれぞれ１つを発現する場合、これは、同じ株によって、発現されるそのような可変領域中の他のエピトープに対する、そのような可変領域中のあらゆるエピトープの免疫優性の課題を回避する。この課題は、他のＯＭＶワクチンにおいて以前に観察されている。その代わりとして、本ワクチンにおいて、好ましくは単一のＰｏｒＡ  ＶＲ１変異体、ＰｏｒＡ  ＶＲ２変異体、およびＦｒｐＢ  ＶＲ変異体は、ＯＭＶが調製された異なるＭｅｎＢ株のそれぞれにおいて発現される。すなわち、単一の株が好ましくは、単一のＰｏｒＡ  ＶＲ１、単一のＰｏｒＡ  ＶＲ２、および単一のＦｒｐＢ  ＶＲを発現し、ワクチンは、そのような単一の株のうちの少なくとも６つに由来するＯＭＶを含む。
【００２４】
ある実施形態において、少なくとも６つのＭｅｎＢ株は、
（ｉ）配列番号６に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．４配列および配列番号１２に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ１−５配列を有する株、ならびに／または
（ｉｉ）配列番号７に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１４配列および配列番号１３に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ５−５配列を有する株、ならびに／または
（ｉｉｉ）配列番号８に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１５配列および配列番号１４に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ５−１配列を有する株、ならびに／または
（ｉｖ）配列番号９に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１６配列および配列番号１５に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ３−３配列を有する株、ならびに／または
（ｖ）配列番号１０に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．９配列および配列番号１６に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ５−１２配列を有する株、ならびに／または
（ｖｉ）配列番号１１に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．２配列および配列番号１７に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ４−１配列を有する株を含んでよい。
【００２５】
ある好ましい実施形態において、組成物は、（ｉ）から（ｖｉ）に記載される６つの株由来のＯＭＶを含む。可変領域変異体のこの組合せを有するＭｅｎＢ株は、侵襲性髄膜炎菌性疾患の患者において最も一般的に観察される株の最適な組合せを提供して、完全なＭｅｎＢ型株のループ５におけるＰｏｒＡ可変領域２（ＶＲ２）（図１）およびＦｒｐＢ可変領域（ＶＲ）の最大カバー範囲を提供する。
【００２６】
ある実施形態において、少なくとも６つのＭｅｎＢ株は：
（ｖｉｉ）ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．７−２（配列番号１）、ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．４（配列番号６）、およびＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ１−５（配列番号１２）を有する株、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．２２（配列番号２）、ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１４（配列番号７）、およびＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ５−５（配列番号１３）を有する株、ならびに／または
（ｉｘ）ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．１９（配列番号３）、ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１５（配列番号８）、およびＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ５−１（配列番号１４）を有する株、ならびに／または
（ｘ）ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．７（配列番号４）、ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１６（配列番号９）、およびＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ３−３（配列番号１５）を有する株、ならびに／または
（ｘｉ）ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．２２（配列番号２）、ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．９（配列番号１０）、およびＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ５−１２（配列番号１６）を有する株、ならびに／または
（ｘｉｉ）ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．５（配列番号５）、ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．２（配列番号１１）、およびＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ４−１（配列番号１７）を有する株を含んでよい。
【００２７】
好ましくは、組成物は、（ｖｉｉ）から（ｘｉｉ）に記載される６つ全ての株由来のＯＭＶを含む。
【００２８】
（ｖｉｉ）から（ｘｉｉ）に記載される株のＰｏｒＡ／ＦｒｐＢレパートリによる免疫化は、オランダ、英国、およびポーランドの三カ国のデータベースに提出された３５５３のＭｅｎＢ型株において、約８９％のカバー範囲に達するであろう（「The National Databases」参照）。同ＰｏｒＡ／ＦｒｐＢレパートリは、国際PubMLSTデータベースに提出された４２９３の株パネルＭｅｎＢ型株において、約８４％のカバー範囲に達するであろう。
【００２９】
同ＰｏｒＡ／ＦｒｐＢの組合せはまた、オランダおよび英国由来の３８７３のＭｅｎＢ  ＣＷＹ型株の約８７％のカバー範囲に達するであろう（「The National Databases」参照）。そしてまた、国際PubMLSTデータベースに提出された６６５６のＭｅｎＢ  ＣＷＹ型株の約８０％のカバー範囲に達するであろう。
【００３０】
同ＰｏｒＡ／ＦｒｐＢの組合せはまた、オランダおよび英国由来の１４２のＭｅｎＷ型株の約８５％のカバー範囲に達するであろう（「The National Databases」参照）。そしてまた、国際ＰｕｂＭＬＳＴデータベースに提出された６９０のＭｅｎＷ型株の約９１％のカバー範囲に達するであろう。
【００３１】
本発明のＯＭＶを調製するのに用いられるＭｅｎＢ株は、好ましい実施形態において、ｌｐｘＬ１突然変異およびｒｍｐＭ突然変異をさらに含んでよい。ｌｐｘＬ１における突然変異は、外膜小胞のＬＯＳ反応原性を引き下げる一方で、ｒｍｐＭ突然変異は、外膜小胞の放出を増強する。
【００３２】
本発明のＯＭＶを調製するのに用いられるＭｅｎＢ株は、好ましい実施形態において、ｓｉａＤ突然変異およびｇａｌＥ突然変異をさらに含んでよい。ｓｉａＤ欠失およびｇａｌＥ欠失はそれぞれ、ＭｅｎＢ莢膜の発現の不在およびＬＯＳ  ｌａｃｔｏ−Ｎ−ネオテトラオース構造の変化を引き起こす。
【００３３】
組成物におけるＰｏｒＡタンパク質の、ＦｒｐＢタンパク質に対する比率は３：１から１：３、好ましくは２：１から１：２、より好ましくは１．５：１から１：１．５であってよい。
【００３４】
本発明はまた、本明細書中に記載される組成物を含むワクチンを提供する。
【００３５】
ワクチン組成物は、ある実施形態において、場合によっては水中油エマルジョン、リポソーム、サポニン、リポ多糖、またはアルミニウム塩から選択される、アジュバントをさらに含んでよい。他の適切なアジュバントが、当該技術分野において知られている。
【００３６】
本明細書中に開示される組成物を含むワクチンは、対象におけるナイセリア属細菌による感染、特に髄膜炎菌血清群Ｂ（ＭｅｎＢ）細菌による感染を処置または予防する方法に用いられ得る。本発明のワクチンはまた、Ａ莢膜、Ｃ莢膜、Ｗ莢膜、およびＹ莢膜を発現する侵襲性髄膜炎菌株に対して有効であり得る。ワクチンは、例えば有効量のワクチン組成物による対象の免疫化による、対象における細菌性髄膜炎の予防に用いられ得る。
【００３７】
更なる態様において、本発明は、対象における髄膜炎の処置または予防のための医薬の製造に用いるための、本明細書中に記載される組成物を提供する。
【００３８】
更なる態様において、本発明は、髄膜炎菌Ｂ（ＭｅｎＢ）外膜小胞組成物を生産する方法であって、少なくとも６つの異なるＭｅｎＢ株を増殖させることと、前記株によって産生される外膜小胞を単離することとを含む方法を提供し、少なくとも６つのＭｅｎＢ株は、ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．４、Ｐ１．９、Ｐ１．１４、Ｐ１．１５、Ｐ１．１６、およびＰ１．２、ならびにＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ１−５、Ｆ５−１、Ｆ５−５、Ｆ５−１２、Ｆ３−３、およびＦ４−１を併せて含む。増殖工程は典型的に、６つの株のそれぞれについて別個の培養でなされる。ＭｅｎＢ株が別々に増殖する場合、単離されたＯＭＶは一緒に混合されて、ＯＭＶ組成物が得られることとなる。
【００３９】
化学的に定義された培地は好ましくは、鉄含有量が、ＦｒｐＢタンパク質発現レベルを誘導するほど低く、このレベルは、ＰｏｒＡタンパク質発現レベルに近いものである。有効濃度は、用いられる鉄源よって決まり、例えば、塩化鉄（ＩＩＩ）について０〜２２μＭ、好ましくは５〜２０μＭである。場合によっては、鉄キレート化剤、例えばデフェロキサミンメシラート（デスフェラール）またはエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシフェニル）酢酸（ＥＤＤＨＡ）が培地に加えられる。好ましくは、鉄キレート化剤は、ＭｅｎＢ株の増殖中に加えられる。特に、鉄キレート化剤は、ＭｅｎＢ株の指数増殖期、好ましくは初期の指数増殖期の間に加えられてよい。キレータを用いる場合には、キレータの付加前の培地の有効鉄含有量は、ＦｒｐＢタンパク質発現を誘導するのに必要とされるレベルを超えていてよい。
【００４０】
化学的に定義された培地は、ある実施形態において、ｐＨ６．６〜７．６に、場合によってはｐＨ約７．２に緩衝されてよい。バッファは、例えば、水酸化ナトリウムにより所望のｐＨにセットされてよい。
【００４１】
ＭｅｎＢ外膜小胞組成物は、本明細書中に記載されるあらゆる組成物であってよい。
【００４２】
図の要約
本発明は次に、以下の図を参照して、一例として記載されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】可変領域（ＶＲ）１および２がループＩおよびＩＶ上に表されているＰｏｒＡトポロジモデルを示す。
【図２】可変領域（ＶＲ）がＬ５上に表されているＦｒｐＢトポロジモデルを示す。
【図３】６つのＭｅｎＢ株と共に、広いカバー範囲を提供することが予測されるＰｏｒＡ  ＶＲ１配列、ＶＲ２配列、およびＦｒｐＢ  ＶＲ配列を示す表を示す。
【図４】ＦｒｐＢおよびＰｏｒＡのタンパク質含有量が等しい固有のＯＭＶ（ｎＯＭＶ）の生産に、化学的に定義された培地を使用することができる。３００μＭのＦｅＣｌ３を補った１５０ｍｌの培地を有するシェーカーフラスコ内で（レーン１）、ｐＨを７．２±０．０５にセットした、１２μＭのＦｅＣｌ３を補った３Ｌの培地を有する５Ｌのバイオリアクタ内で（レーン２）、または初期の対数期に５０μＭデスフェラールを加えた、１６μＭのＦｅＣｌ３を補った１５０ｍｌの培地を有するシェーカーフラスコ内で（レーン３）増殖した髄膜炎菌H44/76 RLG突然変異株から、ｎＯＭＶを単離した。ｎＯＭＶタンパク質プロファイルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得た。主なｎＯＭＶタンパク質ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、およびＦｒｐＢの位置を、ゲルの右側の矢印で示し、分子量マーカーの位置を、ゲルの左側に示している。ポーリンＢ（ＰｏｒＢ）は、最も豊富な外膜タンパク質の１つであり、アジュバントとして作用することが見出されており、ＴＬＲ２に結合して、樹枝状細胞を活性化する［３３、３４］。
【図５】より高い、または低いＦｒｐＢ発現を含むプロトタイプH44/76-RLG株由来のｎＯＭＶによる免疫化後にマウスで達成されるＳＢＡ力価を示す。点は、H44/76の同系突然変異体に対して試験した個々のマウス由来のデータを示す。ｎＯＭＶは、シェーカーフラスコ内の増殖体から単離した。
【図６】ＯＭＶ配合による、HEK-293細胞におけるヒトＴＬＲ４の活性化を示す。Ｘ軸は、細胞を刺激するのに用いた、総タンパク質によるＯＭＶの濃度を示す。Ｙ軸は、吸光度による比色読出しを示す。ｎＯＭＶを、完全抽出精製法により、６０Ｌの発酵槽内の増殖体から単離した。
【図７】ＯＭＶ配合による、HEK-293細胞におけるヒトＴＬＲ２の活性化を示す。Ｘ軸は、細胞を刺激するのに用いた、総タンパク質によるＯＭＶの濃度を示す。Ｙ軸は、吸光度による比色読出しを示す。ｎＯＭＶを、完全抽出精製法により、６０Ｌの発酵槽内の増殖体から単離した。
【図８】六価ｎＯＭＶまたは認可されているワクチンによる、HEK-293細胞におけるヒトＴＬＲ４の活性化を示す。Ｘ軸は、細胞を刺激するのに用いた濃度を示す（ここで用いたｎＯＭＶの１×ヒト用量＝３００μｇの総タンパク質）。Ｙ軸は、吸光度による比色読出しを示す。
【図９】六価ｎＯＭＶまたは認可されているワクチンによる、HEK-293細胞におけるヒトＴＬＲ２の活性化を示す。Ｘ軸は、細胞を刺激するのに用いた濃度を示す（ここで用いたｎＯＭＶの１×ヒト用量＝３００μｇの総タンパク質）。Ｙ軸は、吸光度による比色読出しを示す。
【図１０】ＯＭＶ配合による刺激後のヒトＰＢＭＣによる炎症性サイトカインＩＬ−６の発現を示す。Ｘ軸は、細胞を刺激するのに用いた、総タンパク質によるＯＭＶの濃度を示す。Ｙ軸は、１６時間後にＥＬＩＳＡによって測定したＩＬ−６の濃度を示す。ｎＯＭＶを、完全抽出精製法により、６０Ｌの発酵槽内の増殖体から単離した。
【図１１】培地のみ（ＲＰＭＩ）；H44/76-RLG  ｎＯＭＶ（アジュバントなし）；H44/76-RG  ｄＯＭＶ（アジュバントなし）；H44/76-RLG  ｄＯＭＶ（アジュバントなし）；または認可されている小児ワクチン：Bexsero（登録商標）（ｒＭｅｎＢ＋ｄＯＭＶ）、Prevnar 13（登録商標）（１３の肺炎球菌血清型をカバーする結合型ワクチン）、EasyFive（登録商標）（ＤＴｗＰ、ＨｅｐＢ、ＨｉＢ）、PedvaxHib（登録商標）（ＨｉＢ−ＯＭＰ）による刺激後のヒト全血（成人の血液または臍帯血）による炎症性サイトカインＩＬ−１βの発現を示す。Ｘ軸は、全血を刺激するのに用いた物質を示す（Ｎ＝２、全ての刺激物はヒトの１／１０用量）。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡによって測定したＩＬ−１βの濃度を示す。ｎＯＭＶを、完全抽出精製法により、６０Ｌの発酵槽内の増殖体から単離した。
【図１２】培地のみ（ＲＰＭＩ）；H44/76-RLG  ｎＯＭＶ（アジュバントなし）；H44/76-RG  ｄＯＭＶ（アジュバントなし）；H44/76-RLG  ｄＯＭＶ（アジュバントなし）；または認可されている小児ワクチン：Bexsero（登録商標）（ｒＭｅｎＢ＋ｄＯＭＶ）、Prevnar 13（登録商標）（１３の肺炎球菌血清型をカバーする結合型ワクチン）、EasyFive（登録商標）（ＤＴｗＰ、ＨｅｐＢ、ＨｉＢ）、PedvaxHib（登録商標）（ＨｉＢ−ＯＭＰ）による刺激後のヒト全血（成人の血液または臍帯血）による炎症性サイトカインＴＮＦαの発現を示す。Ｘ軸は、全血を刺激するのに用いた物質を示す（Ｎ＝２、全ての刺激物はヒトの１／１０用量）。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡによって測定したＴＮＦαの濃度を示す。ｎＯＭＶを、完全抽出精製法により、６０Ｌの発酵槽内の増殖体から単離した。
【図１３】六価ｎＯＭＶ配合または認可されているワクチンによる刺激後のヒトＰＢＭＣによる炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦαの発現を示す。Ｘ軸は、細胞を刺激するのに用いた濃度を示す（ここで用いたｎＯＭＶの１×ヒト用量＝３０μｇの総タンパク質）。Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡによって測定した各サイトカインの濃度を示す。
【図１４】六価ｎＯＭＶ配合（３０μｇの総タンパク質／用量）、六価ｄＯＭＶ配合（Ａｌ（ＯＨ）３アジュバントを有する３０μｇの総タンパク質／用量）、Bexsero（登録商標）（ヒトの１／５用量）、またはバッファコントロールのそれぞれ２用量によるマウスの免疫化後のＰ１．７−２，４；Ｆ１−５；ｃｃ４１／４４標的株に対するＳＢＡ力価を示す。ｎＯＭＶおよびｄＯＭＶを、２つの別々の研究において試験し、Bexseroを、各研究においてコンパレータとして用いた。グラフは、各群について、個々のマウスの力価を、幾何平均力価と共に示す。
【図１５】六価ｎＯＭＶ配合（３０μｇの総タンパク質／用量）、Bexsero（登録商標）（ヒトの１／５用量）、またはバッファコントロールのそれぞれ２用量によるマウスの免疫化後の標的株のパネルに対するＳＢＡ力価を示す。グラフは、各群について、個々のマウスの力価を、幾何平均力価と共に示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
詳細な説明
本開示は、特定のＰｏｒＡ変異体およびＦｒｐＢ変異体を含む、ワクチン組成物が挙げられる免疫原性ＭｅｎＢ組成物を提供する。そのような組成物を生産する方法もまた提供される。
【００４５】
タンパク質可変領域およびエピトープ
髄膜炎菌のＰｏｒＡおよびＦｒｐＢ（ＦｅｔＡとも呼ばれる）外膜タンパク質（ＯＭＰ）は、以前に特徴付けられており、エピトープが、これらのタンパク質の可変領域（ＶＲ）内に記載されている［４〜６］。
【００４６】
可変領域は一般に、記載される全てのＶＲがモノクローナル抗体と反応すると実証されているわけではないけれども、単一のエピトープと合致するとみなされている。
【００４７】
ＰｏｒＡタンパク質中の殆どの可変性は、８つの推定の露出表面ループのうちの２つに生じる。これらの可変ループ（ＩおよびＩＶ）はそれぞれ、可変領域１および可変領域２（ＶＲ１およびＶＲ２）と称されている。これらの可変領域の何百もの変異体が記載されている。例えば［５および６］参照。示されるＶＲ１およびＶＲ２を有するＰｏｒＡトポロジモデルが、図１に示されている。
【００４８】
ＦｒｐＢ中の殆どの可変性は、単一の可変領域（ＶＲ）にて生じることが見出されており、これには殺菌エピトープが含まれている［１８、２０］。この領域の何百もの変異体が記載されている。例えば［４］参照。
【００４９】
ＦｒｐＢトポロジモデルが、図２に示されている。可変領域は、細胞外ループ５（Ｌ５）中に位置決めされている。この可変領域は、ＦｒｐＢの示唆される鉄輸送機能に関与せず、トランスポータの保存機能部を、免疫認識から保護すると考えられている［３５］。
【００５０】
ＰｏｒＡ  ＶＲ１変異体およびＶＲ２変異体は一般に、数字と共に示されている。例えば：Ｐ１．７−２，４では、７−２がＰｏｒＡ  ＶＲ１であり、４がＰｏｒＡ  ＶＲ２である。１つのＶＲのみが指定され、これがＶＲ１かＶＲ２であるかが示されることとなる。ＦｒｐＢにおいては１つの可変領域しか存在しないので、このタイプの詳細を指定する必要はない。
【００５１】
単一の数字（例えば４）が示される可変領域が、所与のモノクローナル抗体によって認識される、実証されたエピトープである。サブ変異体（例えば７−２または１０−１５）は、メインファミリの数字の後ろのダッシュによって認識可能であり、多くの場合、ファミリのヘッドを認識したｍＡｂによって認識されない（例えば、サブ変異体７−２は、１．７を認識したｍＡｂによって認識され得ない）。これらのサブ変異体は、ファミリのヘッドとは、僅か１つのアミノ酸によって異なり得る。便宜のために、用語「変異体」は、実証されたエピトープおよびサブ変異体に言及するために用いられることとなる。
【００５２】
髄膜炎菌外膜タンパク質（ＯＭＰ）をコードする遺伝子は一般に、免疫系に曝されるタンパク質の一部をコードする領域に及ぶ強い選択圧のために、非常に可変的である。その結果、これらのタンパク質によって高められる免疫応答は主に、同種の髄膜炎菌株に限られる。
【００５３】
ＯＭＰの高い可変性にも拘らず、本発明者らは、ＰｏｒＡ変異体およびＦｒｐＢ変異体の限られたサブセットが、現在広まっている大部分の様々なＭｅｎＢ株からの保護を提供し得ることを発見した。ＰｏｒＡタンパク質およびＦｒｐＢタンパク質の多様性は、超侵襲性の系統間で高度に構築されることが示された［１７］。したがって、選択されたＰｏｒＡ／ＦｒｐＢ変異体組合せを示す株から抽出された、ＯＭＶを含むワクチンが、第２の抗原に応答した、殺菌抗体のロバストな産生によって、一抗原に対する免疫応答の不足を補完することができる。
【００５４】
本発明に従う、関連するエピトープを包含する可変領域は、図３に示される表中に記載されている。これらの可変領域のそれぞれに対応する配列は、配列リストに含まれており、以下で言及される。
【００５５】
本明細書中に記載されるＭｅｎＢ株は、Ｐ１．４（配列番号６）；Ｐ１．９（配列番号１０）；Ｐ１．１４（配列番号７）；Ｐ１．１５（配列番号８）；Ｐ１．１６（配列番号９）、およびＰ１．２（配列番号１１）から選択されるＶＲ２を有するＰｏｒＡ抗原を含む。これらのＰｏｒＡ  ＶＲ２変異体は、既知のいずれかのＰｏｒＡ  ＶＲ１変異体、好ましくは本明細書中に開示されるいずれかのＰｏｒＡ  ＶＲ１変異体と組み合わせて見出され得る。
【００５６】
また、本明細書中に記載されるＭｅｎＢ株は、Ｆ１−５（配列番号１２）；Ｆ５−１（配列番号１４）；Ｆ５−５（配列番号１３）；Ｆ５−１２（配列番号１６）；Ｆ３−３（配列番号１５）、およびＦ４−１（配列番号１７）から選択されるＦｒｐＢ  ＶＲを含む。
【００５７】
また、ＰｏｒＡ抗原は、Ｐ１．７（配列番号４）；Ｐ１．１９（配列番号３）；Ｐ１．７−２（配列番号１）；Ｐ１．２２（配列番号２）；またはＰ１．５（配列番号５）から選択されるＶＲ１を有してよい。
【００５８】
本明細書中に記載されるＭｅｎＢ株は、例えば、配列番号１および６に記載される配列を有するＰ１．７−２，４；配列番号２および７に記載される配列を有するＰ１．２２，１４；配列番号３および８に記載される配列を有するＰ１．１９，１５；配列番号４および９に記載される配列を有するＰ１．７，１６；配列番号２および１０に記載される配列を有するＰ１．２２，９；ならびに配列番号５および１１に記載される配列を有するＰ１．５，２から選択されるＰｏｒＡ（ＶＲ１，ＶＲ２）抗原を含んでよい。
【００５９】
好ましくは、本明細書中に記載されるＭｅｎＢ株は、先に記載される配列を有するＰ１．７−２，４、Ｐ１．２２，１４、Ｐ１．１９，１５、Ｐ１．７，１６、Ｐ１．２２，９、およびＰ１．５，２から選択されるＰｏｒＡ、ならびに配列番号１２に記載される配列を有するＦ１−５、配列番号１４に記載される配列を有するＦ５−１、配列番号１３に記載される配列を有するＦ５−５、配列番号１６に記載される配列を有するＦ５−１２、配列番号１５に記載される配列を有するＦ３−３、および配列番号１７に記載される配列を有するＦ４−１から選択されるＦｒｐＢ  ＶＲを含む。
【００６０】
本明細書中に記載されるＭｅｎＢ株は、以下の株（ｉ）から（ｖｉ）のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ、またはそれらのＰｏｒＡ  ＶＲ２変異体およびＦｒｐＢ  ＶＲ変異体のあらゆる組合せを含んでよい：
（ｉ）配列番号６に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．４配列、および配列番号１２に記載されるＦｒｐＢ  Ｆ１−５  ＶＲ配列を有する株、
（ｉｉ）配列番号７に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１４配列、および配列番号１３に記載されるＦｒｐＢ  Ｆ５−５  ＶＲ配列を有する株、
（ｉｉｉ）配列番号８に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１５配列、および配列番号１４に記載されるＦｒｐＢ  Ｆ５−１  ＶＲ配列を有する株、
（ｉｖ）配列番号９に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１６配列、および配列番号１５に記載されるＦｒｐＢ  Ｆ３−３  ＶＲ配列を有する株、
（ｖ）配列番号１０に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．９配列、および配列番号１６に記載されるＦｒｐＢ  Ｆ５−１２  ＶＲ配列を有する株、
（ｖｉ）配列番号１１に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．２配列、および配列番号１７に記載されるＦｒｐＢ  Ｆ４−１  ＶＲ配列を有する株。
【００６１】
好ましくは、組成物は、（ｉ）から（ｖｉ）に記載される６つの株のそれぞれに由来するＯＭＶを含む。
【００６２】
本明細書中に記載される少なくとも６つのＭｅｎＢ株は、以下の株（ｖｉｉ）から（ｘｉｉ）のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つ、またはそれらのＰｏｒＡ  ＶＲ１変異体、ＶＲ２変異体、およびＦｒｐＢ  ＶＲ変異体のあらゆる組合せを含んでよい：
（ｖｉｉ）配列番号１に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．７−２配列、配列番号６に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．４配列、および配列番号１２に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ１−５配列を有する株、
（ｖｉｉｉ）配列番号２に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．２２配列、配列番号７に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１４配列、および配列番号１３に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ５−５配列を有する株、
（ｉｘ）配列番号３に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．１９配列、配列番号８に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１５配列、および配列番号１４に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ５−１配列を有する株、
（ｘ）配列番号４に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．７配列、配列番号９に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１６配列、および配列番号１５に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ３−３配列を有する株、
（ｘｉ）配列番号２に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．２２配列、配列番号１０に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．９配列、および配列番号１６に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ５−１２配列を有する株、
（ｘｉｉ）配列番号５に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．５配列、配列番号１１に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．２配列、および配列番号１７に記載されるＦｒｐＢ  ＶＲ  Ｆ４−１配列を有する株。
【００６３】
好ましくは、組成物は、（ｖｉｉ）から（ｘｉｉ）に記載される６つの株のそれぞれ由来のＯＭＶを含む。
【００６４】
ＭｅｎＢ株の数
本明細書中に記載される組成物は、本明細書中に記載されるＰｏｒＡ  ＶＲ２変異体およびＦｒｐＢ変異体を有する、少なくとも６つの異なるＭｅｎＢ株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を含む。
【００６５】
組成物は、１つまたは複数の更なるＭｅｎＢ株由来のＯＭＶをさらに含んでよい。例えば、組成物は、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０のＭｅｎＢ株由来のＯＭＶを含んでよい。組成物は、合計６、７、８、９、または１０の異なるＭｅｎＢ株由来のＯＭＶ、またはこれらの値から選択されるあらゆる範囲（例えば、組成物は、６〜１０、６〜８その他のＭｅｎＢ株由来のＯＭＶを含んでよい）のＭｅｎＢ株由来のＯＭＶを含んでよい。
【００６６】
１つまたは複数の更なるＭｅｎＢ株は、図３に開示されるＰｏｒＡ  ＶＲ１変異体、ＰｏｒＡ  ＶＲ２変異体、および／またはＦｒｐＢ変異体を、図３に開示されていない１つまたは複数のＰｏｒＡ  ＶＲ１変異体、ＶＲ２変異体、および／またはＦｒｐＢ変異体と併せて有する株を含んでよい。例えば、ＭｅｎＢ株は、ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．７−２変異体（図３に開示されている）を、図３に開示されていないＰｏｒＡ  ＶＲ２変異体およびＦｒｐＢ変異体と併せて有してよい。また、１つまたは複数の更なるＭｅｎＢ株が、図３に開示されていないＰｏｒＡ  ＶＲ１変異体、ＶＲ２変異体、およびＦｒｐＢ変異体を含んでよいことが想定される。
【００６７】
更なるＭｅｎＢ株を含むことで、組成物は、図３のものとは異なる可変領域を有する更なるＭｅｎＢ株を含むことによって、特定の必要性（例えば特定の大発生）に合わせて調整され得る。すると、これにより、組成物によって提供される保護の広がりがさらに増大することとなる。
【００６８】
各ＭｅｎＢ株は好ましくは、正確に１つのＰｏｒＡタンパク質および正確に１つのＦｒｐＢタンパク質を発現する。これは、野生型（すなわち、組換え型でない）ＭｅｎＢ株において見出されるものと同じである。ゆえに、各ＭｅｎＢ株は好ましくは、正確に１つのＰｏｒＡ  ＶＲ１、１つのＰｏｒＡ  ＶＲ２、および１つのＦｒｐＢ  ＶＲを発現することとなる。
【００６９】
ＭｅｎＢ株が複数のＰｏｒＡタンパク質および／または複数のＦｒｐＢタンパク質を発現するように操作されることも可能でもある。正確に１つのＰｏｒＡタンパク質および正確に１つのＦｒｐＢタンパク質を発現するＭｅｎＢ株を用いる利点は、単一の株における異なるＰｏｒＡ変異体タンパク質またはＦｒｐＢ変異体のタンパク質間の表面曝露または免疫原性のアンバランスについてリスクがなく、それ故に、同じタンパク質の変異体に対する免疫応答の不均一性を激化させるリスクがないことである。
【００７０】
鉄調節タンパク質
各ＭｅｎＢ株がＦｒｐＢを発現する。殆どの増殖条件において発現されるＰｏｒＡとは異なり、ＦｒｐＢは、殆どの増殖条件において十分に発現されない。
【００７１】
ＦｒｐＢは、鉄誘導可能な（鉄調節とも呼ばれる）タンパク質である。鉄調節タンパク質は、鉄制限増殖条件の間に発現される外膜タンパク質の、比較的よく研究されているクラスである。鉄調節タンパク質として、源、例えばシデロホア、トランスフェリン、およびヘモグロビンからの鉄の吸収に関与する受容体が挙げられる。宿主組織中の可溶性遊離鉄の濃度は、微生物の増殖を支持するほど十分でない。したがって、これらのような入手可能な源から鉄を利用する能力は、ヒト体での髄膜炎菌のコロニー形成の伝播に重要な役割を果たすと考えられている。
【００７２】
以前に、鉄キレータが加えられた複合液体培地中で、高レベルのＦｒｐＢ発現に至った［２２］。これ以外にも、化学的に定義された増殖培地中で、高レベルのＦｒｐＢ発現が達成され得る。これ以外にも、遺伝子改変を細菌ゲノム中に導入することによって、高いＦｒｐＢ発現が達成され得、これは、細菌の増殖特性および抗原性プロファイルに重大な影響を及ぼし得る［１９］。ＦｒｐＢの過剰発現は、誘導可能なプラスミドを用いなければ困難であると以前に示されているが［１８］、ワクチン産生株中の自己複製高コピー発現ベクターの安定性は困難であると証明され得る。
【００７３】
極端な鉄制限条件において、細菌株は、増殖するために奮闘して、細菌培養体のバイオマスが引き下げられ得る。したがって、一般に、鉄調節タンパク質の発現を増大させるための増殖培地の鉄含有量の引下げと、増殖培地からの細菌の良好な収率の維持とのバランスを達成することが好ましい。
【００７４】
本明細書中に記載される、化学的に定義された培地中でのＭｅｎＢ株の増殖は、ＦｒｐＢ発現を誘導すると同時に、細菌増殖および良好なＰｏｒＡ発現を支持することが示された。
【００７５】
ある好ましい実施形態において、ＦｒｐＢは、ＭｅｎＢ株によって発現される総タンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０％を占める。
【００７６】
ある好ましい実施形態において、ＰｏｒＡは、ＭｅｎＢ株によって発現される総タンパク質の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５％を占める。
【００７７】
総タンパク質と比較した、所与のタンパク質の量は、例えば、タンパク質ゲル上のバンドの濃度測定分析によって、または他の既知の方法によって判定することができる。
【００７８】
ＭｅｎＢ株によって発現されるＰｏｒＡタンパク質およびＦｒｐＢタンパク質の量の増大は、ＯＭＶ中のこれらのタンパク質（その結果、免疫原性ＰｏｒＡ変異体およびＦｒｐＢ変異体）の量の対応する増大の原因となる。
【００７９】
好ましい実施形態において、組成物中のＰｏｒＡタンパク質の、ＦｒｐＢタンパク質に対する比率は、３：１から１：３、好ましくは２：１から１：２、より好ましくは１．５：１から１：１．５であってよい。当該比率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＰｏｒＡおよびＦｒｐＢの総タンパク質の、「クーマシー」トリフェニルメタン色素による染色、および組成物中に含まれる異なるＭｅｎＢ株由来のＯＭＶの４０〜４４ｋＤのＰｏｒＡバンドおよび約７０ｋＤａのＦｒｐＢバンドの定量化により（例えば［３１］参照）総タンパク質を測定することによって、そしてこれらのタンパク質間の比率を算出することによって、算出される。
【００８０】
組成物中のＰｏｒＡタンパク質の、ＦｒｐＢタンパク質に対する比率は、ＦｒｐＢ発現を誘導することによって（例えば鉄の制限による）変更することができる。ＰｏｒＡは鉄の制限によって誘導されないので、ＦｒｐＢの発現は増大し、このようにしてＰｏｒＡの、ＦｒｐＢに対する比率は引き下げられることとなる。
【００８１】
ＦｒｐＢは、主な鉄調節外膜タンパク質である。しかしながら、マイナーな鉄調節タンパク質の多くの他の例が記載されており、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、ＬｂｐＡ、およびＨｍｂＲが挙げられる。
【００８２】
いくつかの鉄調節タンパク質が免疫原性であることが示されているが、これは一般に、限られた数のＭｅｎＢ株に対してのものである。例えば、ＬｂｐＢ（ラクトフェリン結合タンパク質Ｂ）は、殺菌抗体の標的であることが示されているが、交差反応性が限られている［１４］。ＦｒｐＢ発現を最適化することが示されている、本明細書中に記載される、化学的に定義された培地中の増殖ＭｅｎＢ株はまた、組成物の全体的な保護効果を増強し得るマイナーな鉄調節タンパク質の発現を増大させると予想される。
【００８３】
ＯＭＶ
組成物は、様々なＭｅｎＢ株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を含む。外膜小胞は、髄膜炎菌外膜から放出され、その生来の構造および膜環境中に、外膜タンパク質（ＯＭＰ）およびリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を含有する。
【００８４】
ＯＭＶは、ＯＭＶブレブ形成を誘導して、ＯＭＶを髄膜炎菌懸濁液および増殖培地から単離することによって、調製される。ＯＭＶを調製する方法は、当該技術分野において周知の技術である［１１］。従来のＯＭＶワクチン調製において、濃縮細菌バイオマス懸濁液が、洗浄剤で処理される（ｄＯＭＶ）。このプロセスにおいて、一般的に用いられる洗浄剤デオキシコレート（ＤＯＣ）は、細菌外膜からの小胞形成と共に、（毒性の）ＬＰＳ、リン脂質、および（免疫原性）リポタンパク質のストリッピングを誘導する。これらの膜構成要素の除去により、サイズ異質性が大きく、かつマイナー抗原の交差保護がさらに引き下げられたＯＭＶ凝集体が生じることが示されている。
【００８５】
好ましくは、ＯＭＶは、洗浄剤抽出なしで調製される。洗浄剤抽出工程を必要としないＯＭＶ調製法が記載されている［１１］。洗浄剤フリープロセスによるＯＭＶの調製により、固有の小胞構造が保存されて、膜免疫原性プロファイルが保持された、均質な、より単分散されたＯＭＶ懸濁液が生じる。２つの洗浄剤フリーＯＭＶ回収プロセスが記載されている。固有の（ｎＯＭＶ）プロセスは、ｄＯＭＶプロセスに類似しているが、両親媒性洗浄剤を、膜安定化マグネシウムイオンの除去によって小胞形成を促進する金属キレート化剤に代えることを除く［３１］。自然的ＯＭＶ（ｓＯＭＶ）プロセスでは、小胞形成が、細菌増殖中に、細胞の代謝コンディショニングによって誘導される。小胞は、遠心分離法［１１］または濾過法［３２］によって、発酵ブロスの上澄みから直接回収される。ｎＯＭＶ一次回収法に拘りなく、ＯＭＶ精製プロトコルは典型的に、宿主細胞タンパク質、脂質、低分子量の核酸、および非結合ＬＰＳからＯＭＶを濃縮して精製する、１つまたは複数のサイズ分離法を含む。ＤＮＡサイズは、エンドヌクレアーゼ工程の使用によって引き下げられ得る。完全なｎＯＭＶワクチン製造プロトコルの例が、例えば［３１］に記載されている。固有の（ｎＯＭＶ）プロセスは、本組成物および本方法に関して用いられるのが好ましい。ゆえに、好ましくは、組成物に含まれるＭｅｎＢ  ＯＭＶは、ｎＯＭＶである。
【００８６】
ＯＭＶは、異なるＭｅｎＢ株から別々に抽出されてから、単一の組成物に統合されてよい。
【００８７】
好ましくは、ＭｅｎＢ株は、本明細書中に記載されるように、ＯＭＶ中での外膜タンパク質の発現を最大にする条件下で培養される。
【００８８】
突然変異
ＭｅｎＢ株は、ｒｍｐＭ、ｌｐｘＬ１、ｓｉａＤ−ｇａｌＥ遺伝子の１つまたは複数に突然変異を含むように遺伝子操作されてよい。好ましくは、組成物中の全ＭｅｎＢ株は、ｒｍｐＭ、ｌｐｘＬ１、ｓｉａＤ−ｇａｌＥ遺伝子の全てにおいて突然変異を有する。これらの突然変異を有する株は、「ＲＬＧ」株と呼ばれ得る。
【００８９】
ｒｍｐＭ、ｌｐｘＬ１、および／またはｓｉａＤ−ｇａｌＥ突然変異は、ノックアウト（ＫＯ）突然変異である。標的遺伝子のノックアウト突然変異は、遺伝子発現が検出不可能であるように、もしくは重要でないように、かつ／または遺伝子産物が機能しないように、もしくはあまり機能的でないと考えられるように、遺伝子の配列を変更する突然変異である。例えば、ｌｐｘＬ１遺伝子のノックアウトは、遺伝子の発現が検出可能でないように、もしくは重要でないレベルでしか存在しないように、かつ／または遺伝子産物の生物学的活性が、改変の前と比較して有意に引き下げられるように、もしくは検出可能でないように、遺伝子の機能がかなり低下していることを意味する。
【００９０】
これらの遺伝子を突然変異させる方法、および「ＲＬＧ」株を生産する方法が、ナイセリア属細菌で以前に記載されている。例えば、ｒｍｐＭ遺伝子（例えば［１０］）（すなわちＲ突然変異）、ｌｐｘＬ１遺伝子（すなわちＬ突然変異）（例えば［７］）、およびｓｉａＤ−ｇａｌＥ遺伝子座（すなわちＧ突然変異）（例えば［８］、［９］）。
【００９１】
ｒｍｐＭ遺伝子中のＫＯ突然変異は、ＯＭＶの放出を増大させる［１１］。
【００９２】
ｌｐｘＬ１遺伝子中のＫＯ突然変異は、野生型ＬＯＳ中に存在するヘキサアシル化脂質Ａの代わりに、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）のペンタアシル化脂質Ａ形態を発現させる。ペンタアシル化ＬＯＳの反応原性の引下げにより、ＯＭＶからのＬＯＳ除去の必要が回避される［７］。
【００９３】
ｓｉａＤ遺伝子およびｇａｌＥ遺伝子のＫＯ突然変異はそれぞれ、カプセルＢ莢膜多糖類の不在に、そして切断型（truncated）オリゴ糖類の産生に至る。これらの改変は、ワクチン株を非病原性にし、かつヒト抗原との交差反応の潜在性を全くなくする［９］。
【００９４】
ｒｍｐＭ突然変異に代わるものとしての、ワクチン株に含まれるゲノム改変は、ＧＮＡ３３タンパク質をコードする遺伝子中のＫＯ突然変異であってよい。このタンパク質は、細菌の細胞構造の維持に関与する溶解トランスグリコシラーゼである。ｒｍｐＭ突然変異体のように、ｇｎａ３３遺伝子についてノックアウトした髄膜炎菌株は自発的に、更なる化学的／物理的処理を何ら必要とせずとも、ＯＭＶ小胞を増量させて放出する［２９］。
【００９５】
ｌｐｘＬ２中のＫＯ突然変異は（ｌｐｘＬ１の代わりに、またはｌｐｘＬ１に加えて、ｌｐｘＬ２を不活化する利益は証明されていないにしても）、ｌｐｘＬ１突然変異の代替物として、またはｌｐｘＬ１突然変異に加えて、用いられてよい［７］。
【００９６】
ＭｅｎＢ株は、ｒｍｐＭ、ｌｐｘＬ１、ｓｉａＤ−ｇａｌＥ遺伝子中に突然変異を含んでよいことから、固有の（または野生型）株ではないけれども、髄膜炎菌において典型的に見出されるので、固有の（自然に存在する）ｐｏｒＡ配列およびｆｒｐＢ配列を保持していると理解されるべきである。好ましくは、固有のｐｏｒＡプロモータ配列およびｆｒｐＢプロモータ配列も含む。ある好ましい実施形態において、ＭｅｎＢ株はさらに、ｒｍｐＭ、ｌｐｘＬ１、および／またはｓｉａＤ−ｇａｌＥの突然変異を有すること以外、自然に存在するＭｅｎＢ株と同じであることとなる。
【００９７】
一部の実施形態において、ＭｅｎＢ株は、野生型株と比較してＦｒｐＢ発現を増大させるように遺伝子操作されてよい。これは例えば、固有のｆｒｐＢプロモータを、より強いプロモータに代えることによって（例えば［２３］）、ｆｒｐＢ遺伝子を、細菌染色体中の様々な遺伝子座上（例えば［３６］、［１９］）、またはプラスミド（例えば［１８］）、コスミドもしくは他の可動性因子上に配置することによって、達成され得る。遺伝子操作された全株においてｆｒｐＢ遺伝子の前に配置され得る代わりのプロモータの例として、異なる髄膜炎菌株由来のｆｒｐＢプロモータ、遺伝子改変された固有のｆｒｐＢプロモータ［１９］、タンパク質発現レベルが高い他の髄膜炎菌遺伝子由来のプロモータ、例えばｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ、ｒｍｐＭ、およびｏｐａ、髄膜炎菌において活性であるように操作された他の種由来のプロモータまたは人工プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
また、ある実施形態において、一部または全てのＭｅｎＢ株がさらに、野生型株と比較して、因子Ｈ結合タンパク質（ｆＨｐｂ；タンパク質７４１、ＮＭＢ  １８７０、ＧＮＡ１８７０、Ｐ２０８６、ＬＰ２０８６、またはＯＲＦ２０８６としても知られている）を過剰発現するように操作される。ＭｅｎＢ株においてｆＨｐｂを過剰発現すると、当該株由来のＯＭＶ中のｆＨｐｂの量が増大することとなる。ｆＨｐｂの発現は、組成物を調製するのに用いられる１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のＭｅｎＢ株において、増大してよい。本発明の組成物のＯＭＶを調製するのに用いられる一部または全ての株において、証明された免疫原性ｆＨｂｐタンパク質［３０］の発現をさらに増大させることによって、ワクチン組成物に対する免疫応答は、より一層増強され、かつ／または広げられ得る。因子Ｈ結合タンパク質変異体は、２つのファミリ、ＡおよびＢにカテゴリ化されている。ある態様において、ファミリＡの少なくとも１つの代表的なｆＨｂｐメンバ、およびファミリＢのメンバは、ＭｅｎＢ株において過剰発現されて、当該株由来のＯＭＶにおけるｆＨｐｂの対応する増大に至り得る。［３０］参照。ある態様において、これらの少なくとも２つのｆＨｂｐとして、変異体Ａ０５および変異体Ｂ０１が挙げられる［３９、４０］。ｆＨｂｐの更なる変異体が挙げられてもよい。特に、本発明の組成物中のＯＭＶは、ｆＨｂｐタンパク質の少なくとも６つの変異体について（ＭｅｎＢ  １株あたり１つ）、ＯＭＶの形態で、過剰発現および強い抗原提示を示す可能性を提供する。株におけるｆＨｂｐの過剰発現は、ルーチンの遺伝子工学によって、例えば、異種プロモータ、例えば鉄調節プロモータの制御下に、ｆＨｐｂをコードする遺伝子を配置することによって、またはＦｒｐＢについて先に述べた他の方法によって、なされ得る。
【００９９】
ワクチン組成物
本発明はまた、本明細書中に記載される、治療に有効な量の組成物を含むワクチン組成物を提供する。
【０１００】
組成物は、予防的であってよい（すなわち、ナイセリア属細菌による感染を予防するものである）。
【０１０１】
ナイセリア属細菌に起因する疾患は、髄膜炎菌による感染において存在するあらゆる臨床的徴候または徴候の組合せを包含する。これらの徴候として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：髄膜炎菌の病原株による上気道（例えば扁桃腺および鼻咽頭の粘膜）のコロニー形成、粘膜および粘膜下血管床中への細菌の侵入、敗血症、感染性ショック、炎症、出血性皮膚病変、線維素溶解の、そして血液凝固の活性化、臓器機能障害（例えば腎不全、肺不全および心不全）、副腎出血、筋梗塞、毛細血管漏出、浮腫、四肢末梢性虚血、呼吸障害症候群、心膜炎、ならびに髄膜炎。
【０１０２】
組成物は、ヒト医療においてヒトに用いてよい。好ましくは、組成物は、対象への投与用である。好ましくは、対象はヒトである。
【０１０３】
本明細書中に記載される組成物は、医薬的に許容可能なキャリア、賦形剤、バッファ、安定化剤、もしくは希釈剤、または当業者に周知である他の材料で配合されてよい。医薬的に許容可能な適切なキャリア、賦形剤、または希釈剤が、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000];およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]に記載されている。キャリアまたは他の材料の正確な性質は、投与の経路によって決まることとなる。
【０１０４】
本明細書中に記載される組成物はさらに、アジュバントを含んでよい。アジュバントは、例えば、水中油エマルジョン、リポソーム、サポニン、リポ多糖、またはアルミニウム塩から選択されてよい。適切なアジュバントは、当該技術分野において周知である。
【０１０５】
「治療的に有効な量」は、対象への利益を示すのに十分な組成物の量を意味し、対象においてナイセリア属細菌に対して免疫応答を誘導して／増大させて、対象において重篤度または髄膜炎疾患の期間を引き下げることが挙げられるが、これに限定されない。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処理されることになる対象の性質および重篤度によって決まることとなる。処方、例えば投薬量その他についての決定は、一般的な実務者および他の医師の責任の範囲内でなされ、そして処置されることになる疾患の徴候の重篤度および／または進行によって決まることとなる。
【０１０６】
特定の組成物の投与の前後に測定される免疫学的応答指標の検出可能な差異が存在するならば、免疫応答が誘導または増大されている。免疫応答指標として以下が挙げられるが、これらに限定されない：アッセイ、例えば酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、殺菌アッセイ、フローサイトメトリ、免疫沈降、Ouchter-Lowny免疫拡散法；例えばスポットの、結合検出アッセイ、ウェスタンブロット、または抗原アレイ；細胞毒性アッセイその他によって検出されるような抗体価または特異度。
【０１０７】
本発明はまた、髄膜炎菌感染に対して対象を免疫化する方法であって、前記対象に、本明細書中に記載されるワクチン組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１０８】
投与
ワクチン組成物が挙げられる、本明細書中に記載される組成物は、あらゆる適切な経路、例えば、非経口（注射可能な形態で）、粘膜、例えば鼻腔内もしくは経口（例えばスプレー、タブレット、またはカプセルとして）、または局所（例えばクリームまたはローションとして）を介して投与されてよい。
【０１０９】
本発明のワクチンの非経口投与の一部の好ましい経路が、筋肉内、皮下、または皮内への注入であり、筋肉内が特に好ましい。本発明のワクチンの投与の好ましい粘膜経路が、鼻腔内投与である。投与の代わりの経路が、皮膚を介したものであってよい。乳児にとって、筋肉内投与が特に好ましい。青年期の人には、筋肉内投与が可能であるが、鼻腔内投与、または経皮投与等の代わりの送達経路も可能である。
【０１１０】
投与の他の適切な経路が、当該技術分野において周知である。
【０１１１】
組成物は、意図される投与モードに適切である形態で配合されてよい。例えば、場合によっては適切なキャリア、賦形剤、または希釈剤と合わせた、粉末、スプレー、タブレット、溶液、または懸濁液（またはそれらの組合せ）としてである。非経口投与について、組成物は、滅菌水溶液の形態であってよく、場合によっては他の物質、例えば塩またはバッファを含有してよい。当業者は、例えば、等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液を用いて、適切な溶液を調製することが十分にできる。
【０１１２】
防腐剤、安定化剤、バッファ、抗酸化剤、および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれてよく、これらとして、バッファ、例えばリン酸バッファ、クエン酸バッファ、および他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメソニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンが挙げられる単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；ならびに／または非イオン界面活性剤、例えばトゥイーン（商標）、プルロニック（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１１３】
本明細書中に記載される組成物は、単独で、または他の処置と組み合わせて、同時に、または連続して投与されてよい。
【０１１４】
投与は、毎日、週２回、毎週、または毎月の間隔で繰り返されてよい。個々の対象についての処置スケジュールは、投与の経路および処置されることになる症状の重篤度等の因子に依存してよい。
【０１１５】
組成物は、１用量または複数用量が投与されてから、数日後、数週後、または数年後に、１回または複数回の更なる「ブースター」用量が投与されてよい。例えば、小児に組成物を投与する場合、第１の用量が１１〜１２歳にて、そしてブースター用量が１６歳にて与えられてよい。１３〜１５歳にて第１の用量を受ける青年期の人について、ブースター用量が、１６〜１８歳にて与えられてよい。注射は、同じ用量の活性成分を含有してもよいし、異なる用量を含有してもよい。好ましくは、用量は、注射によって投与されることとなる。
【０１１６】
組成物は、小児に、青年期の人に、または大人に投与されてもよい。「小児」は、一般に２歳までの乳児を含む。乳児は一般に、２用量が投与されて、生後２年目に第３の「ブースター」用量が投与されることとなる。
【０１１７】
特定のいずれかの患者についての具体的な用量レベルおよび投薬頻度は、変動してよく、処置を受ける個体の年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与モードが挙げられる種々の因子によって決まることとなる。典型的に、適切な投薬量は、医師が決定してよい。
【０１１８】
組成物は、０．００００１μｇ／体重Ｋｇから５ｍｇ／体重Ｋｇ、好ましくは０．０００１μｇ／体重Ｋｇから５ｍｇ／体重Ｋｇ、好ましくは０．００１μｇ／体重Ｋｇから１ｍｇ／体重Ｋｇ、好ましくは０．０１μｇ／体重Ｋｇから５００μｇ／体重Ｋｇ、好ましくは０．０２μｇ／体重Ｋｇから３００μｇ／体重Ｋｇの用量として投与されてよい。
【０１１９】
本明細書中に記載される組成物は、キットの形態で提供されてよく、例えば、外部環境からその内容物を保護する適切なコンテナ内に封入される。そのようなキットは、使用説明書を含んでよい。
【０１２０】
ＭｅｎＢ株を増殖させる方法。
ＰｏｒＡ変異体およびＦｒｐＢ変異体の双方が、広範囲のＭｅｎＢ株に対する免疫原性反応を生じさせるのに重要であると確認されているので、これらのタンパク質の発現を最適化することが所望される。
【０１２１】
本発明者らは、細菌株によって産生される外膜小胞におけるＰｏｒＡおよびＦｒｐＢの発現を増大させるための増殖条件の実施例を与えている。好都合にも、これらの増殖条件はまた、ＦｒｐＢに加えて、他の鉄調節タンパク質の発現を増大させ、これが組成物の免疫原性をさらに増大させると予想される（例えば［２３］）。
【０１２２】
したがって、本発明は、ワクチン組成物であってよい、ＭｅｎＢ外膜小胞組成物を生産する方法を提供し、これは、本明細書中に開示される少なくとも６つのＭｅｎＢ株を増殖させることと、ＯＭＶ組成物を得るために、株によって産生される外膜小胞を単離することとを含む。
【０１２３】
ＭｅｎＢ株はそれぞれ典型的に、別個の培養で増殖されることとなる。ＭｅｎＢ株が別個に増殖されてから、単離されたＯＭＶが一緒に混合されて、ＯＭＶ組成物が得られることとなる。
【０１２４】
ＭｅｎＢの増殖を支持するのに適した培地は、当該技術分野において周知であり、化学的に定義された培地および化学的に定義されていない培地が挙げられる。化学的に定義されていない培地は、未知の割合の複数の化学種の混合物からなるいくつかの複雑な成分、例えば酵母抽出物を有するものである。化学的に定義されていない適切な培地が当該技術分野において知られており、例えばFrantz完全培地が挙げられる。化学的に定義された培地は、髄膜炎菌の増殖を支持するための、いくつかの定義された栄養分および成分を含有するものである。化学的に定義された適切な培地が当該技術分野において知られている。例えば［１３、１４、１５］。好ましくは、ＭｅｎＢ株は、化学的に定義された培地中で増殖する。
【０１２５】
好ましくは、培地は、鉄（ＩＩＩ）含有量が低いと、鉄調節タンパク質の発現を誘導することになる。そのような条件は時折、「鉄制限」条件、または、「増殖制限」条件と呼ばれ、鉄調節タンパク質、例えばＦｒｐＢの発現を増大させると以前に記載されているので、当業者に知られている（とりわけ、鉄キレータを用いる複合培地において。例えば、［１８、２２］。しかし、そのようなキレータは、化学的に定義された培地においても用いられ得、かつ／または鉄の濃度は、そのような定義された培地において鉄源の量を変更することによって、容易に操作され得る）。「低い」鉄含有量は概して、おおよそ２２μＭ以下である。したがって、培地の鉄含有量は、０から２２μＭ、好ましくは５〜２０μＭであってよい。例えば、化学的に定義された培地のＦｅＣｌ３含有量は、５から２２μＭ、例えば１２μＭであってよい。他の鉄源が使用可能であり、発現に最適な鉄（ＩＩＩ）濃度は、他の鉄（ＩＩＩ）源では異なり得る。
【０１２６】
方法はさらに、鉄キレータ（鉄キレート化剤）を培地に加えることを含んでよい。鉄キレート化剤は、利用可能な鉄の量を引き下げることで鉄調節タンパク質の発現を増大させるために、培地に加えられてよい。方法に用いるのに適した鉄キレータが、当該技術分野において知られており、例えば、デスフェラール（デスフェリオキサミン）またはＥＤＤＨＡ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシフェニル酢酸）が挙げられる。
【０１２７】
鉄キレータは、細菌培養体の増殖中に、例えば細菌培養体の指数増殖期の間に、培地に加えられてよい。好ましくは、鉄キレータは、初期の指数増殖期の間に加えられる。初期の指数増殖は典型的に、細菌培養体の植菌後０から４時間で達成され、不十分な細菌増殖の初期の遅滞期の後、培養体の光学密度の増大の促進によって認識される。
【０１２８】
培地のｐＨは、当該技術分野において周知であるバッファ、塩基、および／または酸を用いることによって、増殖中の特定の範囲内で維持され得る。ある実施形態において、ｐＨ範囲は、比較的狭く維持される。例えば、培地のｐＨを水酸化ナトリウムおよびリン酸によりｐＨ７．２±０．０５にて一定に維持すると、ＦｒｐＢの発現レベルは高くなる。
【０１２９】
ＯＭＶは、好ましくは培養体が後期の指数増殖期または定常増殖期に達したときに、ＭｅｎＢ株から抽出される。外的ストレス刺激、例えばシステイン枯渇が、場合によっては、ＯＭＶ放出を増強するのに用いられ得る［４１］。
【０１３０】
ＯＭＶをＭｅｎＢ細菌から抽出する方法が、当該技術分野において知られている。好ましくは、ＯＭＶは、本明細書中で記載されるように、洗浄剤なしで抽出される。適切な生産プロセスが、［３１］に記載されている。
【０１３１】
先に記載される実施形態の適合可能ないずれの組合せも、個々に、そして明示的に列挙されているかのように、本明細書中で明示的に開示されている。
【０１３２】
本発明の種々の更なる態様および実施形態が、本開示を考慮して当業者に明らかとなろう。
【０１３３】
本明細書中で用いられる場合の「および／または」は、２つの具体的な特徴または構成要素のそれぞれの、他方と併せた、または他方と併せない、具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢがそれぞれ本明細書中で個々に定められているかのように、それぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。
【０１３４】
文脈上別の意味を記載しない限り、先に定める特徴の記載および定義は、本発明の特定のいずれかの態様または実施形態に限定されずに、記載される全ての態様および実施形態に等しく当てはまる。
【０１３５】
定義されていない用語はいずれも、当該技術分野において認識されている意味を有する。
【実施例】
【０１３６】
実験
本発明のある態様および実施形態を、一例として、先に記載される図を参照して次に示すこととする。
【０１３７】
材料および方法
MenB H44/76’RLG’突然変異体を遺伝子操作して、先に記載される［７〜１０］、ｒｍｐＭ遺伝子（すなわちＲ突然変異）、ｌｐｘＬ１遺伝子（すなわちＬ突然変異）、およびｓｉａＤ−ｇａｌＥ遺伝子座（すなわちＧ突然変異）の機能的破壊を含有させた。
【０１３８】
タンパク質発現レベルを、「クーマシー」染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定分析によって判定した。抗原のパーセンテージは、サンプル中のタンパク質の総質量に関するものである。ＳＤＳタンパク質バンドの濃度測定を、例えば、［３１］に記載されるルーチンの方法によって実行した。
【０１３９】
例えば［３８］に記載される、（タンパク質バンドを同定するための）質量分析、切り取ったタンパク質バンドのゲル内トリプシン消化、および抽出したペプチドのNanoLC-MS/MS分析を実行した。
【０１４０】
髄膜炎菌の増殖用の、化学的に定義された培地は、以前に、例えば［１３および１４］に記載されている。細菌培養を、記載されるように（例えば［３１］）、１５０ｍＬの培地を有する５００ｍＬのバッフル付シェーカーフラスコ内で、または３Ｌの培地を有する５Ｌのバイオリアクタ内で実行した。
【０１４１】
ｎＯＭＶの代表である外膜小胞を、公開されている方法（例えば［３１］）に従って、ＥＤＴＡ抽出および超遠心分離によって、細菌培養体の細胞ペレットから単離した。ｄＯＭＶもまた、ｎＯＭＶ抽出に用いたのと同じ条件下で増殖させた、またはＲＰＭＩ培地において増殖させた野生型、ＲＧ株またはＲＬＧ株から、調製した。ｄＯＭＶは、［１２］によって記載されるように抽出した。
【０１４２】
H44/76-RLG  ｎＯＭＶ、H44/76-RG  ｄＯＭＶ、またはBexsero（登録商標）（4CMenB髄膜炎菌Ｂワクチン、Novartis Vaccines）の２用量（１用量あたり５μｇの総タンパク質または１用量あたり２．５μｇの総タンパク質）（ヒトの１／１０用量）でそれぞれ、メスのBalb/cマウス（１０頭／群）を０日目および２８日目に免疫化した。末期の血液（Terminal bleed）を４２日目に採った。第２の実験では、同じスケジュールを用いて、５つのＲＬＧ  ｎＯＭＶ（１用量あたり１２．５μｇまたは２５μｇの総タンパク質）またはBexsero（登録商標）（4CMenB髄膜炎菌Ｂワクチン、Novartis Vaccines）の組合せの２用量（ヒトの１／１０用量）で、メスのBalb/cマウス（１０頭／群）を免疫化した。第３の研究では、先に記載する同じスケジュールを用いて、６つのＲＬＧ  ｎＯＭＶ（１用量あたり３０μｇの総タンパク質）、６つの野生型ｄＯＭＶの、Ａｌ（ＯＨ）３アジュバント（１用量あたり３０μｇの総タンパク質）またはBexsero（登録商標）（4CMenB髄膜炎菌Ｂワクチン、Novartis Vaccines）との組合せの２用量（ヒトの１／５用量）で、メスのBalb/cマウス（２０頭／群）を免疫化した。殺菌活性の評価を、以前に記載されるように［２４］、個々のマウス由来の血清により実行した。
【０１４３】
ｈＴＬＲ４およびｈＴＬＲ２を発現するHEK-293細胞（Invivogen、San Diego、米国）を、メーカーの説明書（［２４］も参照）に従って増殖させて、維持して、刺激した。刺激のために、細胞を２４時間、ワクチンサンプルとインキュベートした。HEK-Blue Detection（Invivogen）を用いて、ＳＥＡＰ活性のレベルを測定した。ｎＯＭＶを、Bexsero（登録商標）（Novartis）およびPedvaxHIB（登録商標）（ヘモフィラス（Haemophilus）属ｂ髄膜炎菌タンパク質結合型ワクチン、Merck Vaccines）と比較した。
【０１４４】
末梢血単核細胞（Sanquin Blood Supply、Amsterdam、オランダから得たＰＢＭＣ）の刺激を、以前に記載される［２６］ように実行した。細胞培養体上澄み中でのサイトカイン誘導を、Meso Scale Discovery（Rockville、米国）由来の10-plex Human Proinflammatory Panel 1（V-PLEX）ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ｎＯＭＶを、ＲＧ株およびＲＬＧ株由来のｄＯＭＶと、そしてBexsero（登録商標）（Novartis）およびPedvaxHIB（登録商標）（ヘモフィラス属ｂ髄膜炎菌タンパク質結合型ワクチン、Merck Vaccines）と比較した。
【０１４５】
成人の血液または臍帯血のいずれか一方による全血アッセイを、以前に記載される［２７］ように実行した。血液サンプルを、ヒトの１／１０用量のワクチンサンプルで刺激した。
【０１４６】
実施例１．本発明に従うＯＭＶ中のＰｏｒＡ変異体およびＦｒｐＢ変異体の組合せによる広いＭｅｎＢ株カバー範囲。
図３に表す可変領域を有する６つのＭｅｎＢ株由来のＯＭＶから併せて構成されるワクチンの予測されるＭｅｎＢカバー範囲を判定するために、３つのEuropean National Neisseria Reference Laboratories、すなわちオランダ（２００２〜２０１２年）、英国（２０１０〜２０１４年）、およびポーランド（２００７〜２０１１年）、ならびに国際PubMLSTデータベース（２０００〜２０１４年）で入手可能な髄膜炎菌Molecular Epidemiologyデータベースを用いた。三カ国のデータベースを組み合わせて、３５５３株の単一のデータベースを与え、国際的な４２９３株のＰｕｂＭＬＳＴデータベースを独立して用いた。完全に純粋なタイプの（fine-typed）ＭｅｎＢ株のみを含めた。
【０１４７】
ＰｏｒＡ  ＶＲ１、ＰｏｒＡ  ＶＲ２、およびＦｒｐＢ  ＶＲのタイピングに基づくと、図３に表す株に対する殺菌免疫応答は、国のデータベース由来の３５５３株、およびPubMLSTデータベース由来の４２９３株のそれぞれ約８９％および８４％のカバー範囲に達したであろう。全ての場合において、ＰｏｒＡ  ＶＲ１型Ｐ１．７−２を、累積カバー範囲の計算から除外した。というのも、このＰｏｒＡ  ＶＲ１型は、保護を提供しないことが知られているからである。これらのカバー範囲の推定値は、他の研究者らが提唱した［３］、［１７］６つの精製ＰｏｒＡタンパク質および５つの精製ＦｒｐＢタンパク質の組合せ（［３］において「標準的な」組合せと呼ばれる）が達した、国のデータベース由来の単離体の８５％およびPubMLSTの単離体の８１％をカバーしたであろう推定値と比較して、より高い。この研究者らが提唱した［３］７つの精製ＰｏｒＡ抗原および５つの精製ＦｒｐＢ抗原の「増強された」組合せについて、カバー範囲は、国のデータベースについて８６％、およびPubMLSTについて８４％であろう。このことは、より高い、または類似したカバー範囲保護が、本発明のＯＭＶ組成物で達成される一方で、より少ないＰｏｒＡ抗原（［３］における、「標準的な」組合せよりも１つ少ないＰｏｒＡ抗原、および「増強された」組合せよりも２つ少ないＰｏｒＡ抗原）を必要とするであろうことを意味する。さらに、精製組換えタンパク質と比較して、本発明のＯＭＶワクチンは、自然環境において本来折り畳まれているタンパク質を含む更なる利点があり、これは、さらに増強された免疫原性および保護に寄与し得る。さらに、ＯＭＶ中に存在する他の成分、例えば鉄調節抗原が挙げられるマイナー抗原は、本発明のワクチンによって、保護の広がりをより一層増強することができる。
【０１４８】
実施例２．本発明に従うＯＭＶ中のＰｏｒＡ変異体およびＦｒｐＢ変異体の組合せによるＭｅｎＷ株のカバー範囲。
図３に表す可変領域を有する６つのＭｅｎＢ株由来のＯＭＶから構成されるワクチンの予測されるＭｅｎＷカバー範囲を判定するために、２つのEuropean National Neisseria Reference Laboratories、すなわちオランダ（２００２〜２０１２年）および英国（２０１０〜２０１４年）、ならびに国際PubMLSTデータベース（２０００〜２０１４年）で入手可能な髄膜炎菌Molecular Epidemiologyデータベースを用いた。二カ国のデータベースを組み合わせて、１４２株の単一のデータベースを与え、国際的な６９０株のPubMLSTデータベースを独立して用いた。完全に純粋なタイプのＭｅｎＷ株のみを含めた。
【０１４９】
ＰｏｒＡ  ＶＲ１、ＰｏｒＡ  ＶＲ２、およびＦｒｐＢ  ＶＲのタイピングに基づくと、図３に表す株に対する殺菌免疫応答は、国のデータベース由来の１４２株、およびPubMLSTデータベース由来の６９０株のそれぞれ約８５％および９１％のカバー範囲に達したであろう。全ての場合において、ＰｏｒＡ  ＶＲ１型Ｐ１．７−２を、累積カバー範囲の計算から除外した。というのも、このＰｏｒＡ  ＶＲ１型は、保護を提供しないことが知られているからである。これらのカバー範囲の推定値は、他の研究者らが提唱した［３］、［１７］６つの精製ＰｏｒＡタンパク質および５つの精製ＦｒｐＢタンパク質の組合せ（［３］において「標準的な」組合せと呼ばれる）が達した、国のデータベースおよびPubMLSTデータベース由来の単離体のそれぞれ７１％および８８％をカバーしたであろう推定値と比較して、より高い。この研究者らが提唱した［３］７つの精製ＰｏｒＡ抗原および５つの精製ＦｒｐＢ抗原の「増強された」組合せについて、カバー範囲はまた、国のデータベースおよびPubMLSTデータベースについて、それぞれ７１％および８８％であろう。このことは、他者によって記載されるカバー範囲よりも高いカバー範囲が、本発明の組合せで得られることを意味する。また、精製組換えタンパク質と比較して、本発明のＯＭＶワクチンは、自然環境において本来折り畳まれているタンパク質を含む更なる利点があり、これは、さらに増強された免疫原性および保護に寄与し得る。さらに、ＯＭＶ中に存在する他の成分、例えば鉄調節抗原が挙げられるマイナー抗原は、本発明のワクチンによって、保護の広がりをより一層増強することができる。
【０１５０】
実施例３．ＯＭＶにおけるＰｏｒＡおよびＦｒｐＢの過剰発現。
３００μＭのＦｅＣｌ３を補った１５０ｍｌの培地を有するシェーカーフラスコ内で髄膜炎菌H44/76 RLG突然変異株を増殖させた場合、単離したｎＯＭＶは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でいかなる可視ＦｒｐＢも示さなかった（図４、レーン１）。
【０１５１】
ＦｒｐＢタンパク質およびＰｏｒＡタンパク質のレベルが大体等しいｎＯＭＶを得るために、１２μＭのＦｅＣｌ３を補った３Ｌの培地を有し、かつｐＨを７．２±０．０５にセットした５Ｌのバイオリアクタ内で、髄膜炎菌H44/76 RLG突然変異株を培養した（図４、レーン２）。この実験のｎＯＭＶは、ｎＯＭＷのＦｒｐＢタンパク質およびＰｏｒＡタンパク質の含有量が、ｎＯＭＶタンパク質の総量のそれぞれ２０％および２０％であることを示した。
【０１５２】
ＦｒｐＢタンパク質およびＰｏｒＡタンパク質のレベルが大体等しいｎＯＭＶを得る別の方法が、鉄キレータ、デスフェラールの使用であった。１６μＭのＦｅＣｌ３を補った１５０ｍｌの培地を有するシェーカーフラスコ内の髄膜炎菌H44/76 RLG突然変異株の初期の対数培養体に、合計５０μＭの鉄キレータ、デスフェラールを加えると、ＦｒｐＢ発現の強い誘導が観察された（図４、レーン３）。この実験のｎＯＭＶは、ｎＯＭＷのＦｒｐＢタンパク質およびＰｏｒＡタンパク質の含有量が、ｎＯＭＶタンパク質の総量のそれぞれ１８％および１８％であることを示した。デスフェラールを有する、および有していないシェーカーフラスコ内の細胞培養体が、５９０ｎｍ（ＯＤ５９０）にておよそ１０の光学密度に達し、１２μＭのＦｅＣｌ３を有するバイオリアクタ培養体が、ほぼ８のＯＤ５９０に達した。
【０１５３】
これらの結果は、鉄濃度および／または鉄キレータの使用を引き下げることによって、培地中の鉄濃度を調整して、ＦｒｐＢタンパク質およびＰｏｒＡタンパク質の含有量が大体等しいｎＯＭＶを得る一方で、培養体の増殖を依然として支持して、ワクチン生産に十分なバイオマスを得ることが可能であることを示している。
【０１５４】
最後に、鉄濃度の引下げにより、サイズが７０から１００ｋＤａであるいくつかのマイナー外膜タンパク質の発現もまた誘導されたことが観察された。ＭＳ分析は、これらのタンパク質が、鉄調節外膜タンパク質ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、ＬｂｐＡ、およびＨｍｂＲであることを確認した。
【０１５５】
実施例４．ＯＭＶにおけるＦｒｐＢ発現の増大が、殺菌力価を向上させる。
ＯＭＶの免疫原性に及ぼす、高いＦｒｐＢ発現の効果を実証するために、高濃度のＦｒｐＢもしくは低濃度のＦｒｐＢ、またはバッファコントロールを含有した、プロトタイプ株H44/76-RLG由来の２用量のｎＯＭＶ（５μｇの総タンパク質／用量）で、マウスを免疫化した。
【０１５６】
個々のマウス由来の血清を、野生型H44/76（ＲＬＧでない）および同系突然変異体：ＰｏｒＡ−ネガティブ；ＦｒｐＢ−ネガティブ、およびＰｏｒＡ＋ＦｒｐＢ−ダブルネガティブに対する血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）によって分析した（図５）。
【０１５７】
ｎＯＭＶを受けた全マウスの力価は、文献に公開されている力価と比較して、非常に高かった（例えば、［２８］は、その中で記載されるｎＯＭＶワクチンによる免疫化の後、マウスにおいて最大力価が２９であった）。発明者らの実験では、野生型H44/76に対する幾何平均力価（ＧＭＴ）が、高ＦｒｐＢ−ｎＯＭＶによる免疫化後で２１６であり、低ＦｒｐＢ−ｎＯＭＶによる免疫化後で２１３であった。この差異は、Mann-Whitneyの２サンプル検定によって統計的に有意であり、ｎＯＭＶにおけるＦｒｐＢレベルの増大は、免疫原性を向上させることを示した。バッファコントロール群のＧＭＴは低く（２３）、測定した殺菌力価が、ｎＯＭＶ調製物による免疫化に起因することが示された。
【０１５８】
低ＦｒｐＢ−ｎＯＭＶを用いた場合、ＰｏｒＡネガティブ株に対するＧＭＴは、野生型に対する力価（２１３）と比較して低かった（２７）一方で、ＦｒｐＢネガティブ株に対するＧＭＴもまた、２１３であった。これらのデータは、ｎＯＭＶが低いレベルのＦｒｐＢしか含有しない場合、生じた殺菌応答が、ＰｏｒＡに特異的な抗体によって占められ、ＦｒｐＢに対する殺菌抗体が存在していないことを示している。
【０１５９】
対照的に、高ＦｒｐＢ−ｎＯＭＶを用いた場合、ＰｏｒＡネガティブ標的株に対するＧＭＴ（２１３）、およびＦｒｐＢネガティブ株に対するＧＭＴ（２１４）は、野生型H44/76に対するよりも有意に低かった（それぞれＰ＜０．００１およびＰ＝０．０１０）。ＰｏｒＡ／ＦｒｐＢダブルネガティブ株に対する力価は、双方の群において低かった（＜２５）。これらのデータは、高いレベルのＦｒｐＢがｎＯＭＶ中に存在する場合、ＰｏｒＡおよびＦｒｐＢの双方に対する抗体が、殺菌に寄与すること、ならびにＰｏｒＡまたはＦｒｐＢに対する抗体が、高い殺菌に必要とされることを示している。したがって、ｎＯＭＶワクチンにおける主抗原としてのＰｏｒＡおよびＦｒｐＢ双方の組合せは、これらの抗原の１つのみを含有する、またはいずれも含有しないワクチンと比較して、殺菌力価、従って潜在的な予防効果を増大させるのに重要な役割を果たし得る。
【０１６０】
実施例５．ｎＯＭＶ調製物の反応原性およびアジュバント活性。
ワクチン製剤の低い反応原性を実証するために、ｎＯＭＶの固有のアジュバント活性を維持しながら、いくつかの方法を用いた。
【０１６１】
ＯＭＶは、いくつかの固有のアジュバント特性を有する；特に、小胞中に存在する脂質Ａは、免疫細胞上のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４を活性化することが知られている。小胞中のリポタンパク質およびポーリンもまた、ＴＬＲ２を活性化する。これらの受容体の活性化は、ＮＦ−κＢの活性化を介して、有効な免疫応答に必要とされるサイトカイン放出をトリガーする。しかしながら、ｎＯＭＶ中のＬＰＳによるＴＬＲ４の活性化はまた、反応原性と関連する、炎症誘発性サイトカインの放出を伴う。
【０１６２】
先に記載される［２５］インビトロリポータ系を用いて、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の刺激を介した、ｎＯＭＶのアジュバント活性を試験した。ヒトＴＬＲ２（＋ＣＤ１４）またはＴＬＲ４（＋ＭＤ２、＋ＣＤ１４）のいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞を、ｌｐｘＬ１  ＬＰＳ（すなわち、ｌｐｘＬ１突然変異体由来のＬＰＳ）を含有するｎＯＭＶで、または野生型ＬＰＳ（ｄＯＭＶ−ＲＧ）もしくはｌｐｘＬ１  ＬＰＳ（ｄＯＭＶ−ＲＬＧ）を含有する洗浄剤抽出ＯＭＶ（ｄＯＭＶ）で、それぞれ４つの異なる濃度にて刺激した。ＴＬＲ活性化に由来するＮＦ−κＢの活性化を、比色シグナルとして測定する。結果は、ｎＯＭＶが、野生型ＬＰＳを含有するｄＯＭＶよりも低いＴＬＲ４活性化能を有することを示している。ｌｐｘＬ１  ＬＰＳを（洗浄剤抽出中のＬＰＳの除去により、低いレベルにて）含有するｄＯＭＶは、最も低いＴＬＲ４活性化をもたらす。ｄＯＭＶ−ＲＧと比較してより低い、ｄＯＭＶ−ＲＬＧによるＴＬＲ４刺激は、ｌｐｘＬ１  ＬＰＳのＴＬＲ４刺激活性が、野生型ＬＰＳよりも低いことを示している（図６）。ｎＯＭＶによる一部のＴＬＲ４活性化が、依然として存在する。ＲＬＧ−ｎＯＭＶにより見られるＴＬＲ４刺激は、ＲＬＧ−ｄＯＭＶにより見られるＴＬＲ４刺激よりも高い。これは、ｄＯＭＶが、多くのＬＰＳを除去する洗浄剤抽出を経ている一方で、ｎＯＭＶはより高い濃度のＬＰＳを含有するからである。対照的に、洗浄剤抽出小胞（野生型ＬＰＳおよびｌｐｘＬ１  ＬＰＳの双方、図７）と同じレベルのＴＬＲ２活性化に必要とされるのは、より低い濃度のｎＯＭＶである。これは、ＴＬＲ２を活性化することが知られている、ｄＯＭＶの洗浄剤抽出中に除去される固有の小胞中のリポタンパク質の存在に起因する可能性がある。このデータから、ＲＬＧ−ｎＯＭＶは、野生型ＬＰＳを含有するｄＯＭＶよりも効力が劣るＴＬＲ４の刺激因子であるが、より効力があるＴＬＲ２の刺激因子であると結論することができる。ＴＬＲ４は特に、炎症性サイトカインの誘導を伴うので、このＴＬＲ４刺激の引下げにより、反応原性は引き下げられ得る一方で、ＴＬＲ２刺激は、免疫の誘導に必須のサイトカイン誘導を依然として可能にする。
【０１６３】
続いて、６つのＲＬＧ  ｎＯＭＶの組合せ（１ｍｌあたりの試験した最も高い濃度は３００μｇの総タンパク質）によるｈＴＬＲ２およびｈＴＬＲ４の刺激を、認可されているワクチンBexsero（登録商標）（Novartis Vaccines）およびPedvaxHIB（登録商標）（Merck Vaccines）と比較した。Bexsero（登録商標）およびPedvaxHIB（登録商標）について、試験した最も高い濃度は、ヒト１用量であった。全ワクチンを、５つの異なる濃度で試験した。結果は、組合せｎＯＭＶのＴＬＲ４刺激活性が、野生型ＬＰＳを有するｄＯＭＶを含有するBexsero（登録商標）よりも有意に低い（一般線形モデル、ＧＬＭによってＰ＜０．０３）ことを示している（図８）。組合せｎＯＭＶはまた、Bexsero（登録商標）およびPedvaxHIB（登録商標）の双方と比較して有意に高いＴＬＲ２刺激活性（ＧＬＭによってＰ＜０．００１）を示した（図９）。PedvaxHIB（登録商標）は、洗浄剤抽出髄膜炎菌外膜タンパク質を含有し、最適な免疫原性のためのＴＬＲ２の活性化を必要とすることが報告されている［４２］。
【０１６４】
これらのデータは、ｌｐｘＬ１  ＬＰＳに起因して、ｎＯＭＶのＴＬＲ４活性化が、認可されているワクチンよりも低いけれども、小胞のアジュバント活性が、ＴＬＲ２の活性化の増大よって維持されることを示唆している。また、ＴＬＲ４の活性化を引き下げると、小胞の反応原性をより低くする可能性がある。ＯＭＶの反応原性、特にワクチン接種後の発熱の誘導は、血流中の単核細胞によるいくつかの炎症性サイトカインの放出と関連している。反応原性の指標として、凍結ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ｌｐｘＬ１  ＬＰＳを含有するｎＯＭＶで、野生型ＬＰＳもしくはｌｐｘＬ１  ＬＰＳを含有する洗浄剤抽出ＯＭＶで、またはBexsero（登録商標）で刺激した。ＩＬ−６の誘導を、１６時間後に測定した。結果（図１０）は、ＲＬＧ  ｎＯＭＶ（ＲＬＧ株由来のｎＯＭＶ）が、ｄＯＭＶまたはBexsero（登録商標）よりも低い濃度の炎症性サイトカインＩＬ−６を刺激し、このことは、ｎＯＭＶ（ＲＬＧ株由来）が、以前に、または現在用いられているｄＯＭＶ  ＭｅｎＢワクチンよりもインビボ反応原性が低い可能性があることを示している。
【０１６５】
また、成人の血液および臍帯血の双方を用いた全血アッセイにおいて、一価のｎＯＭＶの反応原性を、認可されている小児ワクチン製剤と比較した。炎症性サイトカインＩＬ−１β（図１１）およびＴＮＦα（図１２）のレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、成人の血液および臍帯血の双方において、ＲＬＧ−ｎＯＭＶ製剤が、試験した全ての認可されているワクチンよりも低いレベルの、これらの２つのサイトカインを誘導することを示している。比較として、Bexsero（登録商標）によって、および同じ株由来のＲＧ−ｄＯＭＶ（すなわち、ＲＧ株由来のｄＯＭＶ。ゆえにｗｔ  ＬｐｘＬ１を有する）によって誘導されたＩＬ−１βおよびＴＮＦαのレベルは高かった。
【０１６６】
続いて、６つのＲＬＧ  ｎＯＭＶの組合せを、先に記載するヒトＰＭＢＣにおけるサイトカイン誘導について、認可されているワクチンBexsero（登録商標）（Novartis Vaccines）およびPedvaxHIB（登録商標）（Merck Vaccines）と比較した。Bexsero（登録商標）およびPedvaxHIB（登録商標）について、試験した最も高い濃度は、ヒト１用量であった一方で、ｎＯＭＶについて、試験した最も高い濃度は、１ｍｌあたり３００μｇの総タンパク質であった。結果（図１３）は、ｎＯＭＶが、Bexsero（登録商標）と比較して有意に低いレベルの炎症誘発性サイトカインＩＬ−１βおよびＩＬ−６を（ＧＬＭによってＰ＜０．０２）、そしてBexsero（登録商標）およびPedvaxHIB（登録商標）の双方と比較して有意に低いレベルのＴＮＦαを（ＧＬＭによってＰ＜０．０２）誘導することを示している。
【０１６７】
これらの結果は、まとめると、ｎＯＭＶは、以前に、または現在用いられているｄＯＭＶ  ＭｅｎＢワクチンよりもインビボ反応原性が低い可能性があることを示している。
【０１６８】
実施例６．特定の遺伝子型について、ＲＬＧ  ｎＯＭＶは、対応する野生型ｄＯＭＶよりも高い免疫原性を与えることができる。
ＯＭＶの組合せの潜在的カバー範囲を実証するために、マウスを、同じＰｏｒＡ変異体およびＦｒｐＢ変異体を含有する、等濃度の６つのＲＬＧ  ｎＯＭＶまたは６つの野生型ｄＯＭＶで免疫化した。双方のＯＭＶ調製物を、３０μｇの総タンパク質／用量にて与えた。ｄＯＭＶおよびｎＯＭＶを異なる研究において試験したので、双方の研究において、Bexsero（登録商標）をコンパレータとして用いた（ヒトの１／５用量）。
【０１６９】
結果は、Ｐ１．７−２，４；Ｆ１−５標的株について、ｎＯＭＶの組合せの使用は、ｄＯＭＶの組合せの使用よりも有意に高いＳＢＡ力価を与えたことを示している（図１４、ＧＬＭによってＰ＜０．０００１）。Bexsero（登録商標）で得たＳＢＡ力価は、２つの研究間で有意に異ならなかった（ＧＬＭによってＰ＝０．３９２）。この遺伝子型（Ｐ１．７−２，４）に存在するＰｏｒＡ変異体は、他のＰｏｒＡ変異体と比較して、免疫原性が比較的不十分であることが知られている［４３］；したがって、これらの結果は、一部の遺伝子型について、ｎＯＭＶが、同系ｄＯＭＶよりも高い免疫原性であり得ることを示唆している。
【０１７０】
実施例７．ＰｏｒＡおよびＦｒｐＢを発現するＲＬＧ  ｎＯＭＶの組合せは、Bexsero（登録商標）よりも広いカバー範囲を提供することができる。
５つのＲＬＧ  ｎＯＭＶの組合せの潜在的カバー範囲を実証するために、マウスを、等濃度の５つのＲＬＧ  ｎＯＭＶ（各ｎＯＭＶについて２．５μｇまたは各ｎＯＭＶについて５μｇ）で免疫化した。Bexsero（登録商標）をコンパレータとして用いた（ヒトの１／１０用量）。世界的にＭｅｎＢ疾患の主な原因である５つの遺伝子型を代表する５つのＭｅｎＢ標的株のパネルに対するＳＢＡによって、個々のマウス由来の血清を試験した。
【０１７１】
これらの５つの遺伝子型に対して、ＲＬＧ  ｎＯＭＶの組合せを与えたマウス由来の血清は、４／５株に対してポジティブな殺菌力価を示した。Bexsero（登録商標）を与えたマウス由来の血清は、３／５株のみに対してポジティブな殺菌力価を示した。この実験において、Bexsero（登録商標）によってカバーされる標的株は、ワクチンに存在するＰｏｒＡ抗原およびｆＨｂｐ抗原との相同性が知られている。
【０１７２】
６つのＲＬＧ  ｎＯＭＶの組合せの潜在的カバー範囲を実証するために、マウスを、等濃度の６つのＲＬＧ  ｎＯＭＶ（用量あたり３０μｇの総タンパク質）で免疫化した。Bexsero（登録商標）をコンパレータとして用いた（ヒトの１／５用量）。世界的に髄膜炎菌性疾患の主な原因である５つの遺伝子型を代表する、５つのＭｅｎＢ単離体および１つのＭｅｎＷ単離体を含む６つの髄膜炎菌標的株のパネルに対するＳＢＡによって、個々のマウス由来の血清を試験した。
【０１７３】
これらの６つの遺伝子型に対して、ＲＬＧ  ｎＯＭＶの組合せを与えたマウス由来の血清は、５／６株に対してポジティブな殺菌力価を示した（図１５）。Bexsero（登録商標）を与えたマウス由来の血清は、３／６株のみに対してポジティブな殺菌力価を示した。これには、Bexsero（登録商標）（Ｐ１．７−２，４）に存在するＰｏｒＡ変異体との相同性を共有することが知られている１株、およびBexsero（登録商標）（ｖ１．１）に存在する因子Ｈ結合タンパク質（ｆＨｂｐ）変異体を発現する２株が含まれる。
【０１７４】
１つの標的株（Ｂ：Ｐ１．２２，１４；Ｆ５−５）について、試験した全製剤により、低い殺菌力価しか達成されなかった。ＲＬＧ  ｎＯＭＶの組合せによる免疫化後、ポジティブな抗原特異的ＩｇＧが血清中に存在した（ＥＬＩＳＡによって測定した）が、これは、当該株に対するポジティブな殺菌活性をもたらさなかった。この遺伝子型由来の標的株による以前の研究はまた、ＳＢＡにおいてカバー範囲を示さず、または低いカバー範囲を示した［４４、４５］。このことは、この遺伝子型が、補体媒介殺傷作用にかなり抵抗性である可能性があることを示している。ｎＯＭＶの用量または配合を増大させることによって誘導され得る、より高いレベルの抗ＰｏｒＡおよび抗ＦｒｐＢ  ＩｇＧが、この遺伝子型に対するカバー範囲を向上させ得る。
【０１７５】
全体的に、六価ＲＬＧ−ｎＯＭＶの配合によるマウスの免疫化は、試験した標的株に対するカバー範囲が、Bexsero（登録商標）による免疫化よりも広かった（５／６株対３／６株のカバー範囲）。
【０１７６】
参考文献
本発明、および本発明が属する技術の状態をより完全に説明かつ開示するために、いくつかの刊行物を先で引用している。これらの参考文献の全引用を以下に提供する。本明細書において言及した文書は全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１．  Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７（１９９９），ｐｐ２６１２−２６１９
２．  米国特許第６，４８２，８０７号
３．  国際公開第２００５／１１７９５６号
４．  ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ／ＦｅｔＡ／ｖｒ．ｓｈｔｍｌ
５．  ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ／ＰｏｒＡ／ｖｒ２．ｓｈｔｍｌ
６．  ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ／ＰｏｒＡ／ｖｒ１．ｓｈｔｍｌ
７．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙ  ａｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（Ｏｃｔ，２００１），６９：５９８１−５９９０（ＰＭＩＤ：１１５５３５３４）
８．  Ｂｏｓ  ａｎｄ  Ｔｏｍｍａｓｓｅｎ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（Ｓｅｐ，２００５），ｐｐ６１９４−６１９７  Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．９（ＰＭＩＤ：１６１１３３４８）
９．  Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９３，１０：３６１−３６９（ＰＭＩＤ：７９３４８２７）
１０．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｏｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（Ｊｕｌｙ  １９９６），６４：２７４５−２７５１（ＰＭＩＤ：８６９８５０４）．
１１．  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１０，２８：４８１０−４８１６（ＰＭＩＤ：２０４８３１９７）
１２．  Ｎｏｒｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：２１７１−２１８０
１３．  国際公開第２０１３／００６０５５号
１４．  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ（２００６）２４：３５４５−３５５７  
１５．  米国特許第６５５８６７７号
１６．  Ｒａｐｐｕｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．（２００１）２１；１９（１７−１９）：２６８８−９１．
１７．  Ｕｎｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（２００４）．Ｐ５９５５−５９６２  Ｖｏｌ  ７２  Ｎｏ．１０．
１８．  Ｋｏｒｔｅｋａａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｖａｃｃｉｎｅ．（Ｊａｎ，２００７）２；２５（１）：７２−８４（ＰＭＩＤ：１６９１４２３６）
１９．  Ｄｅｌａｎｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００６  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（Ａｐｒ；１８８），（７）：２４８３−９２
２０．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．（１９９６），１４２，ｐｐ３２６９−３２７４
２１．  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，（２００６），１３（４）：４８６−９１
２２．  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８（９）：３０３６−４１（ＰＭＩＤ  １６９６９３９）
２３．  Ｗｅｙｎａｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，（２００７）ｐ．５４３４−５４４２，Ｖｏｌ．７５
２４．  Ｍａｓｌａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９７）４（２）：１５６−１６７
２５．  Ｓａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１７：５５２３−５５３１
２６．  Ｋｉｋｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３６：４５−５５
２７．  Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：１９５６−１９６６
２８．  Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１０），Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：５０５７−５０６７
２９．  Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ６：１８５６−１８６６．
３０．  Ｋｏｅｂｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｍａｙ，２０１１）；１８（５）：７３６−４２（ＰＭＩＤ：２１３６７９８１）
３１．  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  Ｍａｙ  ３１，２０１３，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６５１５７（ＰＭＩＤ：２３７４１４７８）
３２．  欧州特許第２４８２８４７Ｂ１号．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  
３３．  Ｍａｓｓａｒｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６（４）：２３７３−２３８０．
３４．  Ａｌ−Ｂａｄｅｒ  Ｔ，Ｊｏｌｌｅｙ  ＫＡ，Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ＨＥ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６（７）：６５１−６６２．
３５．  Ｓａｌｅｅｍ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．，（２０１３）８（２）：ｅ５６７４６（ＰＭＩＤ  ２３４５７６１０）
３６．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５），１３：４０１−４０７
３７．  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  ［２０００］；ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  ［２０００］
３８．  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ  ｅｔ  ａｌ，（２０１３）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  １２：１８９８−１９０８（ＰＭＩＤ：２３４１０２２４）
３９．  ＭｃＮｅｉｌ  ＬＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２０１３），７７（２）：２３４−２５２．
４０．  Ｊｉａｎｇ  ＨＱ，ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：６０８６−６０９３．
４１．  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２３，２０１３，ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５４３１４
４２．  Ｌａｔｚ  Ａ，ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００４）１７２：２４３１−２４３８．
４３．  Ｌｕｉｊｋ  ＴＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）１５（１０）：１５９８−１６０５．
４４．  Ｆｉｎｄｌｏｗ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）ＣＩＤ  ５１：１１２７−１１３７
４５．  Ｐｉｎｔｏ，Ｖ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９：７７５２−７７５８
【０１７７】
非公式の配列表
配列番号１（ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．７−２）  ＡＱＡＡＮＧＧＡＳＧＱＶＫＶＴＫＡ
配列番号２（ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．２２）    ＱＰＳＫＡＱＧＱＴＮＮＱＶＫＶＴＫＡ
配列番号３（ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．１９）    ＰＰＳＫＳＱＰＱＶＫＶＴＫＡ
配列番号４（ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．７）      ＡＱＡＡＮＧＧＡＳＧＱＶＫＶＴＫＶＴＫＡ
配列番号５（ＰｏｒＡ  ＶＲ１  Ｐ１．５）      ＰＬＱＮＩＱＰＱＶＴＫＲ
配列番号６（ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．４）      ＨＶＶＶＮＮＫＶＡＴＨＶＰ
配列番号７（ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１４）    ＹＶＤＥＫＫＭＶＨＡ
配列番号８（ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１５）    ＨＹＴＲＱＮＮＡＤＶＦＶＰ
配列番号９（ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．１６）    ＹＹＴＫＤＴＮＮＮＬＴＬＶＰ
配列番号１０（ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．９）    ＹＶＤＥＱＳＫＹＨＡ
配列番号１１（ＰｏｒＡ  ＶＲ２  Ｐ１．２）    ＨＦＶＱＱＴＰＫＳＱＰＴＬＶＰ
配列番号１２（ＦｒｐＢ  Ｆ１−５）            ＳＱＦＫＩＥＤＫＥＫＡＴＤＥＥＫＮＫＮＲＥＮＥＫＩＡＫＡＹＲＬＴ
配列番号１３（ＦｒｐＢ  Ｆ５−５）            ＧＫＦＫＩＳＤＫＫＰＤＰＮＤＰＴＫＥＩＤＫＤＡＡＥＫＡＫＤＫＫＤＭＤＬＶＨＳＹＫＬＳ
配列番号１４（ＦｒｐＢ  Ｆ５−１）            ＧＥＦＥＩＳＧＫＫＫＤＰＫＤＰＫＫＥＩＤＫＴＤＥＥＫＡＫＤＫＫＤＭＤＬＶＨＳＹＫＬＳ
配列番号１５（ＦｒｐＢ  Ｆ３−３）            ＳＫＦＳＩＰＴＴＥＥＫＮＧＱＫＶＤＫＰＭＥＱＱＭＫＤＲＡＤＥＤＴＶＨＡＹＫＬＳ
配列番号１６（ＦｒｐＢ  Ｆ５−１２）          ＧＥＦＫＩＳＤＫＫＰＤＰＴＤＰＫＫＥＩＡＫＴＤＥＥＫＡＫＤＫＩＤＭＤＬＶＨＳＹＫＬＳ
配列番号１７（ＦｒｐＢ  Ｆ４−１）            ＳＫＦＥＩＳＤＫＫＫＧＡＤＧＫＥＶＤＶＤＤＡＱＫＥＫＮＲＡＮＥＫＩＶＨＡＹＫＬＳ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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