(57)【要約】  骨髄異形成症候群および他の血液悪性腫瘍を処置、管理、診断、および監視するための方法が提供される。これらの方法は、末梢血血漿または血清由来の無細胞ＤＮＡに対して行われる次世代シーケンシング分析を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、白血病、リンパ腫、および骨髄腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍を診断および監視する方法であって、
患者の末梢血血漿または血清から無細胞ＤＮＡサンプルを得る工程と；
前記無細胞ＤＮＡサンプルに対して突然変異分析を実行する工程であって、前記突然変異分析は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリッドキャプチャ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される手順を含む、工程と；
前記突然変異分析が前記無細胞ＤＮＡサンプル中に１つまたは複数のＤＮＡ突然変異を検出する場合に、前記血液悪性腫瘍が発症していると判定する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記突然変異分析は、ＮＧＳを用いて、前記無細胞ＤＮＡサンプル中のＭＤＳ関連遺伝子のパネルにおいて行われ、ＭＤＳ関連遺伝子の前記パネルの１つまたは複数における１つまたは複数のＤＮＡ突然変異の前記検出は、前記血液悪性腫瘍の存在を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記突然変異分析は、ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＺＲＳＲ２、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＭＤＳ関連遺伝子に対して実行される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記患者は、血球減少を表すが、明らかな核型異常を有していない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記血液悪性腫瘍は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記突然変異分析は、前記患者の経過を監視するために周期的に繰り返される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１つまたは複数の突然変異が前記無細胞ＤＮＡサンプル中で誘導される場合に、疾患管理計画を策定する工程を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患管理計画は、成長因子、輸血、デフェロキサミン、エリトロポイエチン、化学療法剤、幹細胞移植、およびそれらの任意の組合せを施すことから選択される手順を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化学療法剤は、シタラビン、イダルビシン、トポテカン、およびフルダラビンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＤＳの進行を診断および管理するための、ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、およびＺＲＳＲ２を含むＭＤＳ関連遺伝子のパネルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月１１日出願の米国特許出願第１４／９３７，９３７号明細書、２０１４年１１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／０８３，４３２号明細書、および２０１４年１１月１２日出願の米国仮特許出願第６２／０７８，９２１号明細書の優先権の利益を主張し、これらの開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、骨髄異形成症候群および他の血液悪性腫瘍の患者を診断、監視、処置、および管理するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、無効造血および形成異常によって特徴付けられるクローン性血液疾患の異質な群である。ＭＤＳにおいて、ゲノム異常が造血幹細胞中に蓄積して、多系列分化障害の結果としての様々な重篤度の末梢血球減少、および初期相では骨髄（ＢＭ）アポトーシスの原因となる。疾患の罹患率および死亡率は、血球減少または急性脊髄性白血病への転化に由来し、これらは両方とも、機能障害および血球の減少に起因する重篤な感染症、貧血、または出血の原因となるおそれがある。
【０００４】
血球減少（低血球数）は、骨髄環境内の高い割合のアポトーシス、および結果として生じる末梢血循環流中への細胞放出の欠如に由来する（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，２０１４；Ｋｅｒｂａｕｙ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ＭＤＳの診断は、患者の徴候として芽球が増大しない血球減少が挙げられる初期ステージ中において、とりわけ難しくなり得る。血球減少を引き起こす多数の反応プロセスがあり、薬物反応、栄養欠乏症またはホルモン欠乏症、および自己免疫疾患または慢性の感染症が挙げられる。
【０００５】
ＭＤＳを診断するための主な基準は、末梢血球減少および形成異常の存在である。しかしながら、形成異常の評価は主観的であり、かつ骨髄生検なしでは困難となり得る。それでも、適切かつ早期の診断は、ＭＤＳの進行を処置および管理するのに非常に重要である。なぜなら、ＭＤＳが進行して白血病のステージになる前に検出されれば、寛解の見込みがかなり高いからである。
【０００６】
血球減少を呈する患者では、ＭＤＳが考えられるべきであるが、診断の確認には、骨髄生検ならびに形態学的評価および細胞遺伝学的評価が必要となる。ＭＤＳの診断は、現在、血液学的分析、形態学的分析、および細胞遺伝学的分析を含む多くの専門的アプローチを必要とする。また、この診断は、約半分の患者のみが細胞遺伝学的異常を示すという事実により、宣告するのが困難となり得る。ＭＤＳを処置するのに用いられる療法の選択は、疾患の重篤度、およびより一層進行した疾患への進行のリスクに非常に依存する。したがって、予後を正確に策定する能力が患者治療の必須の構成要素となる。
【０００７】
現在の予後スコアリングシステムは、ＭＤＳ患者をリスク群に階層化するのに核型異常および特定の臨床的特徴を考慮する。一部の核型異常は、予後を確立する一助となる。また、これは、特定の臨床的表現型と関連し得る。しかしながら、ＭＤＳ患者の半数超は正常な核型を有し、同一の染色体異常を有する患者は臨床的に異質なままである。核型が正常であり、かつ芽球が増大しない場合、ＭＤＳの診断を確認するために主観的な形態学的特徴に依拠するのは極めて困難である。
【０００８】
分子評価は、異常な突然変異クローンの実証およびＭＤＳの診断の確認のための客観的な手段を提供する一助となり得る（Ｉｔｚｙｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１３；Ｂｅｊａｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｈａｆｅｒｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１４；Ｔｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｍａｌｃｏｖａｔｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。末梢血中の血球減少により、末梢血球から抽出されるＤＮＡの分子研究は、異常なクローンを十分な感度で同定できないおそれがある。そのため、分子異常を検出し、かつＭＤＳの診断を確認するうえで、骨髄から得られるサンプルはより信頼性が高いと考えられる。
【０００９】
検出された異常は、予後および療法決定に臨床的な影響を及ぼす。また、予後全体を決定し得るサブクローンの存在を検出することができる感度の高い方法を用いて、患者を試験することが重要である（Ｂｅｊａｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。ＭＤＳは、骨髄中のアポトーシスが過剰となる疾患であり、このアポトーシスに由来するＤＮＡは、造血細胞が血中に浸されているため、循環流中で豊富である。これらの細胞は、アポトーシスまたはネクローシスの間、アポトーシス体、エキソソーム、微小血管、またはＤＮＡ−タンパク質複合体の形態で内容物を血液中に流し込む（Ｇｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
とりわけ初期のステージにおいて、ＭＤＳを診断するための信頼性の高い正確な方法が要求されている。そのような方法は、ＭＤＳの処置から利益を得ることとなる患者を同定する一助になるであろう。更に、現在の方法は、非常に侵襲性であり、かつ痛みを伴う手順である骨髄生検に依拠しているため、骨髄からサンプルを得ることを必要としない手順によれば、処置および診断法の大きい進歩が達成され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一実施形態において、本発明は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）について患者を処置する方法であって、患者の末梢血血漿または血清由来の無細胞ＤＮＡに対し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を含む突然変異分析を実行することにより、ＭＤＳ患者として患者を同定する工程を含む方法を提供する。この方法は、患者から骨髄サンプルを得ることなく実行され得る。
【００１２】
一実施形態は、患者を診断および管理する方法を提供する。この方法は、患者の末梢血血漿または血清から無細胞ＤＮＡサンプルを得る工程と；無細胞ＤＮＡサンプルに対して突然変異分析を実行する工程であって、突然変異分析は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリッドキャプチャ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される手順を含む、工程と；突然変異分析が無細胞ＤＮＡサンプル中にＤＮＡ突然変異を検出する場合に、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、白血病、リンパ腫、および骨髄腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍の管理のための処置を患者に施す工程とを含む。
【００１３】
一実施形態は、ＭＤＳ患者を診断および管理する方法を提供する。この方法は、患者の末梢血血漿または血清から無細胞ＤＮＡサンプルを得る工程と；無細胞ＤＮＡサンプルに対して突然変異分析を実行する工程であって、突然変異分析は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリッドキャプチャ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される手順を含む、工程と；突然変異分析が無細胞ＤＮＡサンプル中にＤＮＡ突然変異を検出する場合に、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、白血病、リンパ腫、および骨髄腫の管理のための処置を患者に施す工程とを含む。
【００１４】
方法は、骨髄芽球の増大が健常なコントロールと比較して５％未満である患者が挙げられる、疾患の非常に初期のステージの患者を診断および管理する一助となり得る。方法はまた、血球減少を呈するが、明らかな核型異常を呈さない患者に適している。
【００１５】
一部の実施形態において、突然変異分析は、ＭＤＳ関連遺伝子、例えばＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＺＲＳＲ２、およびそれらの遺伝子の任意の組合せが挙げられる遺伝子に対して実行される。ＭＤＳの処置は、無細胞ＤＮＡサンプルが、以下の遺伝子の少なくとも１つにおいて突然変異を表す患者に施される：ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、およびＺＲＳＲ２。成長因子、輸血、デフェロキサミン、エリトロポイエチン、化学療法剤、幹細胞移植、およびそれらの任意の組合せが挙げられる種々の処置が用いられ得る。
【００１６】
更なる実施形態は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を管理および監視する方法を提供する。この方法は、少なくとも以下の工程：血球減少を呈する患者の群から患者を選択する工程と；患者の血漿または血清から無細胞ＤＮＡサンプルを得る工程と；ＭＤＳ関連遺伝子について、無細胞ＤＮＡサンプルに対して突然変異分析を行う工程と；無細胞ＤＮＡサンプルがＭＤＳ関連遺伝子中に１つまたは複数の突然変異を含む患者に対し、ＭＤＳの管理のための処置を施す工程とを含む。ＭＤＳ関連遺伝子は、ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＺＲＳＲ２、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されてよい。
【００１７】
一部の実施形態において、患者の末梢血血漿から無細胞ＤＮＡサンプルを得る工程、およびＭＤＳ関連遺伝子について、無細胞ＤＮＡサンプルに対して突然変異分析を行う工程は、処置が始まった後に繰り返され、ＭＤＳ関連遺伝子中に追加の突然変異が検出される場合に処置が変更される。
【００１８】
更なる実施形態は、患者において、ＭＤＳ、白血病、リンパ腫、骨髄腫、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される血液悪性腫瘍を診断および監視する方法を提供する。この方法は、以下の工程：無細胞ＤＮＡを患者の末梢血血漿サンプルまたは血清から抽出する工程と；次世代シーケンシングを用いて、無細胞ＤＮＡ中のＭＤＳ関連遺伝子のパネルにおいて突然変異分析を行う工程であって、ＭＤＳ関連遺伝子のパネルの１つまたは複数における１つまたは複数の突然変異の検出は、血液悪性腫瘍の存在を示す、工程と；１つまたは複数の突然変異の検出に基づいて、患者のための処置プロトコルを決定する工程とを含む。方法の一部の実施形態において、ＭＤＳ関連遺伝子は、ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＺＲＳＲ２、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００１９】
更なる実施形態は、ＭＤＳを診断するために、患者の末梢血血漿または血清由来の無細胞ＤＮＡのディープシーケンシングを利用する。
【００２０】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて、突然変異について末梢血血漿中の無細胞ＤＮＡを分析することにより、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）について患者を診断および監視する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】患者におけるＭＤＳ関連遺伝子の突然変異分析である。分析された遺伝子は、左側の列に記載されている。各患者は、第１行目における番号１〜１６によって同定される。サンガー配列決定法およびＮＧＳ分析の両方によって同定された点突然変異が黒色で示されている。ＮＧＳ分析によって同定されたが、サンガー配列決定法において見落とされた点突然変異は太字であり、かつ下線を引かれている。
【図２】末梢血血漿由来の無細胞ＤＮＡサンプルおよび末梢血血漿由来の細胞ベースのＤＮＡサンプルについて、対立遺伝子頻度を比較するプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の患者を含む患者が、ＭＤＳについて非常に初期のステージにおいて診断され得る方法を提供する。試験は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて、末梢血血漿または血清由来の無細胞ＤＮＡサンプルを検出および分析するものであり、骨髄生検を得る必要なく実行される。更なる実施形態において、ＮＧＳは、他の感度の高い試験、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）およびハイブリッドキャプチャと併用されてよい。更なる実施形態において、以下の試験の少なくとも１つが用いられてよい：ＮＧＳ、ＰＣＲ、およびハイブリッドキャプチャ。
【００２３】
本発明はまた、他の血液悪性腫瘍、例えば白血病、リンパ腫、および骨髄腫の患者が診断され得る方法を提供する。用語「血液悪性腫瘍」は、用語「血液癌」と互換的に用いられる。この方法は、非常に初期のステージにおいて患者を診断することができる。試験は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて、末梢血血漿または血清由来の無細胞ＤＮＡサンプルを検出および分析するものであり、骨髄生検を得る必要なく実行される。
【００２４】
更なる実施形態において、ＮＧＳは、他の感度の高い試験、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）およびハイブリッドキャプチャと併用されてよい。更なる実施形態において、以下の試験の少なくとも１つが用いられてよい：ＮＧＳ、ＰＣＲ、およびハイブリッドキャプチャ。
【００２５】
更なる実施形態は、ＭＤＳおよび他の血液悪性腫瘍の管理方法または処置方法であって、末梢血血漿または血清由来の無細胞ＤＮＡサンプルの突然変異分析を実行する工程を含む方法を提供する。この方法において、突然変異分析は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を含み、これは、一部の実施形態において、ＰＣＲおよびハイブリッドキャプチャと組み合わせて実行されてよい。
【００２６】
当業者にとって、用語「処置」は、本開示において広く理解されて、ＭＤＳまたは他の血液悪性腫瘍からの全治を必要としないことは明らかであろう。用語「処置」は、用語「管理」と互換的に用いられてよい。患者の症状のあらゆる改善または患者の症状のあらゆる安定化が処置または管理であると考えられる。安定化および／または改善に加えて、処置または管理はまた、たとえ疾患を寛解させるに至らないとしても、ＭＤＳまたは他の血液悪性腫瘍の進行の遅延、改善、または制御を含み得る。
【００２７】
一部の実施形態において、処置または管理は、ＭＤＳまたは他のいくつかの血液悪性腫瘍の患者として診断された患者に対し、成長因子、輸血、デフェロキサミン、エリトロポイエチン、化学療法剤、および幹細胞移植片から選択される少なくとも１つの治療剤を投与することを含んでよい。適切な成長因子として、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−１１、およびアンドロゲンが挙げられるが、これらに限定されない。適切な化学療法剤として、シタラビンが挙げられるが、これに限定されない。他の適切な化学療法剤として、イダルビシン、トポテカン、およびフルダラビンが挙げられるが、これらに限定されない。適切な幹細胞として、造血幹細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００２８】
一実施形態において、本方法は、ＭＤＳおよび他の血液悪性腫瘍と関連する、遺伝子中の突然変異についてのスクリーニングを含む。そのような遺伝子として、以下の遺伝子の少なくとも１つが挙げられ得る：ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、およびＺＲＳＲ２。一部の実施形態において、他の遺伝子が、ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、およびＺＲＳＲ２のいずれかに加えて分析されてよい。
【００２９】
用語「ＭＤＳ関連遺伝子」は、広く理解されて、ＭＤＳ患者において突然変異していることが知られているあらゆる遺伝子が挙げられ、その突然変異がＭＤＳの発症、進行、および／または予後と相関することが示されている遺伝子が挙げられることが理解される。
【００３０】
用語「血液癌関連遺伝子」は、広く理解されて、血液悪性腫瘍の患者において突然変異していることが知られているあらゆる遺伝子が挙げられ、その突然変異があらゆる血液癌の発症、進行、および／または予後と相関することが示されている遺伝子が挙げられることが理解される。そのような遺伝子として、ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、およびＺＲＳＲ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
更に、用語「ＭＤＳの初期ステージ」は、広く理解されるべきであり、患者が血球減少を呈するが、骨髄芽球の有意な増大が検出されないことを含むことが理解される。そのような患者として、健常なコントロールと比較して、芽球数の増大が５％未満である患者が挙げられる。
【００３２】
用語「突然変異」は、広く理解されて、ＤＮＡの点突然変異、欠失、挿入、および転座が挙げられる。用語「突然変異分析」は、広く理解されるべきであり、ＤＮＡ中の以下の突然変異の少なくとも１つを同定することを含む：健常なコントロールと比較したＤＮＡ点突然変異、ＤＮＡ欠失、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ転座。
【００３３】
一部の好ましい実施形態において、突然変異分析は、点突然変異について行われるため、本方法は、核型分析手順が用いられる他の方法を上回る技術的利点を有する。なぜなら、核型分析は、点突然変異を検出する見込みがないからである。そのため、本方法は、核型が明らかな異常を示さないが、疾患が点突然変異と関連する患者を診断できる利点を提供する。
【００３４】
一部の実施形態において、以下のＭＤＳ関連遺伝子の少なくとも１つが点突然変異について分析される：ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、およびＺＲＳＲ２。これらの遺伝子は、以下の表１中のジーンバンクの登録番号および記載によって同定される。
【００３５】
【表１】
2017533714.tif 000003
【００３６】
更なる実施形態において、以下のＭＤＳ関連遺伝子の少なくとも２つ以上が点突然変異について分析される：ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、およびＺＲＳＲ２。更なる実施形態において、以下のＭＤＳ関連遺伝子のセットが点突然変異について分析される：ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、およびＺＲＳＲ２。一部の実施形態において、ＭＤＳ関連遺伝子のセットは、ＭＤＳを示す他の遺伝子および／または他の異常、例えば血球減少、低ヘモグロビン、疲労、および／または発熱と組み合わせて分析される。
【００３７】
表１中の各ＭＤＳ関連遺伝子は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）から入手可能なＴｒｕＳｉｇｈｔ（商標）Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ上に含まれている。配列表を含む、表１のＭＤＳ関連遺伝子に関する追加情報が国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から一般公開されている。
【００３８】
表１のＭＤＳ関連遺伝子は、Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ中の５４標的遺伝子から選択された。当業者であれば、追加の遺伝子、または遺伝子の異なる組合せが選択されてよいことを認識するであろう。また、当業者であれば、同様のパネルが、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣｌｅａｒＳｅｑ  ＡＭＬ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｘＧｅｎ（登録商標）ＡＭＬ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｎｅｌ）、ＡＲＵＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびその他が挙げられる他のいくつかの供給会社から入手可能であることも知っているであろう。
【００３９】
種々の方法がＭＳＤ関連遺伝子中の突然変異を検出するのに適している。一部の特に好ましい実施形態において、適切な方法は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）と略される、非サンガーベースの高スループットＤＮＡ配列決定技術から選択される。ＮＧＳ突然変異分析の一実施形態において、インプットＤＮＡサンプルは、短い断片に切断されて、アダプターを用いてスライドにアニールされる。ＰＣＲ反応が実行されて、ＤＮＡコピー数が増幅される。その後、スライドは、蛍光標識されたヌクレオチド、ターミネータ、およびＤＮＡポリメラーゼと反応する。重合の１サイクルが完了すると、スライドの画像が撮られる。その後、スライドは、ターミネータを除去することによって次のサイクルのために調製されてから、次の塩基がＤＮＡ重合プロセス中に加えられる。プロセスは繰り返されて、各サイクル中に１ヌクレオチドが加えられて、各サイクル後の画像が記録される。その後、コンピュータが用いられて、キャプチャされた画像が処理されて、ＤＮＡ配列が作成される。
【００４０】
当業者にとって、ＮＧＳ分析の他の多くの変更が実行されてよいことは明らかであろう。更に、用語「ＮＧＳ分析」は、広く理解されて、ＤＮＡサンプルを固体の担体に付着させることによって実行され、その長さに従ってＤＮＡ分子を電気泳動ゲルによって分離させることのない、あらゆるＤＮＡ配列決定法を含むことが理解される。少なくとも一部の実施形態において、ＮＧＳ分析は、以下のキットの少なくとも１つにより実行されてよい：Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．から入手可能なＩＬＬＵＭＩＮＡ（ＳＯＬＥＸＡ）ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ（商標）Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．から入手可能なＲＯＣＨＥ  ４５４  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能なＩＯＮ  ＴＯＲＲＥＮＴ：ＰＲＯＴＯＮ／ＰＧＭ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ（商標）、およびＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能なＳＯＬＩＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ（商標）。
【００４１】
ＮＧＳプロトコルの追加の記載が、Ｒ．Ｌｕｔｈｒａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｕｓｉｎｇ  ＭｉＳｅｑ：ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ”，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２０１４；９９（３）：４６５−４７３；およびＭ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｅｒｃａｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ２５  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｄｅｌ（５ｑ）ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ”，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２０１３；９８（１２）：１８５６−１８６４において見出され得る。ＮＧＳの詳細なレビューが、Ａ．Ｍｏｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｎｅｗ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ”，Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｓ．，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１３；４８（４）：２４２−２４９に提供されている。
【００４２】
患者由来の種々のサンプルがＭＤＳ関連遺伝子の突然変異分析を実行するのに用いられ得る。そのようなサンプルとして、末梢血血漿由来の細胞、および末梢血血漿または血清から得られる無細胞ＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡと略される）が挙げられ得る。一部の好ましい実施形態において、ＭＤＳ関連遺伝子の点突然変異分析が、末梢血血漿または血清から得られる無細胞ＤＮＡで実行される。そのため、本方法は、血球減少患者に診断、処置、管理、および監視を提供する大きい技術的利点を提供する。なぜなら、本方法は、感度が高く、骨髄サンプルを得ることを必要としないからである。
【００４３】
図１に示されるように、予想外にも、末梢血血漿または血清から得られる無細胞ＤＮＡ上のＭＤＳ関連遺伝子のＮＧＳ突然変異分析は、ＭＤＳ処置が必要な患者を同定するためのより正確かつ感度の高い方法であることが発見された。分析されたＭＤＳ関連遺伝子が図１の左側の列に示されており、表１に記載されるＭＤＳ遺伝子を含む。
【００４４】
図１は、１６人の患者についてのＮＧＳ突然変異分析の結果を報告しており、各患者は、図１における表の第１行目において、番号１〜１６により同定される。ＮＧＳ配列決定法およびサンガー配列決定法の両方が、ＮＲＡＳエキソン３、ＴＥＴ２エキソン４および１３〜１６、ＥＺＨ２エキソン１０および１１、ならびにＴＰ５３エキソン４について実行された。アンプリコンは、各サンプルについて、アガロースゲル上でランさせることによって確認された。サンプルがプールされて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｍａｎａｇｅｒを用いてデータシートが作成された。ＭｉＳｅｑ（商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒが分析に用いられ、Ｖａｒｉａｎｔ  Ｓｔｕｄｉｏがコーリングに用いられた。バリアントコーリングの確認のために、ＮｅｘｔＧｅｎｅ（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）ソフトウェアが用いられた。コード領域の全体にわたる平均配列カバー率（Ｘ）は、配列決定されたアンプリコンの９４％で４０００であった。これによると、突然変異は、ＤＮＡの３％に存在する場合に確実に検出することができる。
【００４５】
１６人の初期ステージのＭＤＳ患者由来の末梢血血漿中の無細胞ＤＮＡのＮＧＳ配列決定は、ＭＤＳの診断を確かめる少なくとも１つまたは複数の突然変異遺伝子を示した。正常なコントロール由来の末梢血血漿中の無細胞ＤＮＡは、突然変異の証拠を示さなかった。サンガー配列決定法が用いられて、全血から抽出されたＤＮＡが分析された場合に検出されなかった８（５０％）サンプルにおいて、追加の突然変異が検出された（図１）。これらの追加の突然変異は、太字のかつ下線を引かれた数字で示され、サンガー配列決定法およびＮＧＳ配列決定法の両方によって検出された突然変異は、通常のフォントで示されている。数字は、ＤＮＡサンプル中の突然変異対立遺伝子頻度をパーセントで表している。図１から分かるように、遺伝子ＡＳＸＬ１についての患者１における突然変異対立遺伝子頻度は、５パーセントである。
【００４６】
１６人の患者のうちの５人（３１％）は、全血ＤＮＡにおいて全く異常を示さなかった。これらのサンプルは、サンガー配列決定法が全血に実行された場合、正常であると偽同定される可能性が高い。ＮＧＳ突然変異分析によって末梢血血漿中に検出された突然変異は、＜１５％の頻度であった。これは、一般に、たとえ全血ＤＮＡ中に同じ頻度で存在するとしても、サンガー配列決定法の検出レベルを下回っている。しかしながら、殆どの場合において、全血ＤＮＡ中の突然変異ＤＮＡの頻度レベルは、ＮＧＳ突然変異分析によって試験されたサンプルにおいて確認されたように有意に低くなる。
【００４７】
図２に更に示されるように、予想外にも、末梢血血漿無細胞ＤＮＡに対して突然変異分析を行うことは、末梢全血由来のＤＮＡに対して突然変異分析を行うことと比較して、かなり感度の高い方法であることも発見された。
【００４８】
図２に示されるように、ＮＧＳ突然変異分析は、末梢全血から抽出された５つのＤＮＡサンプルに対して実行された。５つのサンプルのうちの４つは、末梢血血漿無細胞ＤＮＡから検出された結果と同一の結果を示した。しかしながら、１つのサンプルは、ＲＵＮＸ１中の突然変異が無細胞末梢血血漿ＤＮＡにおいて７％検出され、ＮＧＳによる全血ＤＮＡでは示されなかった。
【００４９】
より重要なことに、ＮＧＳ分析によって検出されたように、検出された突然変異の頻度、血漿中の対立遺伝子頻度は、末梢血血漿由来の無細胞ＤＮＡにおいて有意に（Ｐ＝０．００８）高かったことから、腫瘍性ＤＮＡによるより高い感度および血漿の富化が示唆される（図２）。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、ＭＤＳ患者を管理する方法であって、あまり複雑でなく、侵襲が最小限であり、かつ感度が増した、ＭＤＳのスクリーニング試験を含む方法を提供する。また、試験を実行するのに必要な時間は、従来の試験と比較して短くなる。
【００５１】
更なる実施形態において、本発明は、ＭＤＳの患者を監視する方法であって、あまり複雑でなく、侵襲が最小限であり、かつ感度が増した、ＭＤＳのスクリーニング試験を含む方法を提供する。また、試験を実行するのに必要な時間は、従来の試験と比較して短くなる。用語「監視」は、広く理解されるべきであり、患者の疾患の状態を判定するための処置と同時に、または処置の完了後に試験を行うことを含む。監視方法により、医者は、処置プロトコルが機能しているか、および追加のまたは異なる処置が必要とされ得るかを判定することができる。
【００５２】
更なる実施形態によれば、徴候を和らげ、疾患の進行を遅らせ、かつ／または疾患を潜在的に治療するのに有効な治療を提供するのに適切な処置プロトコルを、より迅速に同定しかつ開始することが可能となる。
【００５３】
ＮＧＳ突然変異分析によって診断された患者に施され得る既知の処置として、輸血療法、赤血球生成促進剤、抗生物質、薬物療法、幹細胞療法の有無に拘らない化学療法、臨床試験へのエントリ、またはそれらの組合せが挙げられる（Ａ．Ｍ．Ｚｅｉｄａｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ”，Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．２０１３  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；２７（５）：２４３−２５９）。
【００５４】
本発明の方法は、患者が追加の骨髄穿刺手順を経験する必要なく、処置中かつ／または処置の変更中の患者の進行の正確かつより高頻度の監視を容易にする。処置の完了後のフォローアップ試験も本発明の方法によって大いに向上する。
【００５５】
いくつかのＭＤＳ関連遺伝子を用いた末梢血血漿または血清中の無細胞ＤＮＡのＮＧＳ分析は、ＭＤＳ患者として患者を同定または確認するための客観的な試験を提示する。末梢血血漿がＭＤＳ患者において腫瘍特異的ＤＮＡで富化されていることが発見された。更に、血漿中の無細胞ＤＮＡの突然変異分析は、突然変異を有するサブクローンを検出することができ、かつ新しいクローンの出現を予測することができる。ＮＧＳを用いた末梢血血漿中の無細胞ＤＮＡの分析は、腫瘍量に関する重要なデータを提供する。これは、療法を監視し、かつ進行を予測するために用いられ得、かつまた骨髄生検を実行する必要性を減らすものである。
【００５６】
末梢血血漿または血清由来の無細胞ＤＮＡの突然変異分析に基づく本方法の以前には、ＭＤＳが疑われる患者における分子異常の検出は、骨髄生検を実行することなく達成することが困難であった。骨髄中の芽球数が正常範囲内である場合、診断は主観的となり、細胞遺伝学的研究または分子研究によって分子異常が実証されることはない。
【００５７】
末梢血中の血球減少により、末梢血球中の分子異常の検出は、非常に感度の高い方法が用いられる場合ですら、とりわけ初期の疾患において困難となり得る。本発明の方法の評価は、ＮＧＳ突然変異分析が用いられる場合ですら、末梢血球中の突然変異の検出を見落とす可能性があることを示している。対照的に、ＮＧＳ突然変異分析において末梢血血漿由来の無細胞ＤＮＡを用いると、突然変異がより確実に検出される。
【００５８】
末梢血血漿または血清は、容易にアクセス可能であり、ＭＤＳを診断または確認するのにこれを用いることができるため、骨髄生検の必要性は大いに低減され得る。
【００５９】
理論に拘束されることを望むものではないが、末梢血血漿が腫瘍性ＤＮＡで富化されているという事実は、ＭＤＳにおける腫瘍細胞の比較的高いアポトーシスによると考えられる。これらの腫瘍細胞は、骨髄中で死んで、ＤＮＡを血流中に放出する。殆どの場合において、このＤＮＡは、アポトーシス体、微小血管、またはタンパク質−ＤＮＡ複合体の形態である。
【００６０】
ＭＤＳを示し得る徴候のある患者における分子異常の実証は、診断、予後、および治療アプローチの選択の確認のために非常に重要である。これは特に、初期のＭＤＳ患者（骨髄中の芽球＜５％）に関して重要である。患者のこの群において、骨髄穿刺および生検を実行した後ですら、しばしば診断は疑わしいままである。形態学的変化は微妙であり得、細胞遺伝学的異常は存在しないことがあり得る。
【００６１】
ＭＤＳの分子特性評価における最近の進歩により、ＭＤＳの診断は、異常なクローンの存在を検出する際に、分子試験により一層依拠するようになっている。更に、検出された分子異常のタイプは、予後を予測し、かつ臨床経過および療法を判断するための重要な情報を提供し得る。
【００６２】
他方では、ＭＤＳ診断を疑う主な徴候である血球減少がいくつかの反応プロセスにおいて見られ得、かつ骨髄生検が必要とされるか否かを判定する際の診断ジレンマを表す。
【００６３】
末梢血球を用いた分子分析の実行は、ＭＤＳの存在を確認することが可能なアプローチである。しかしながら、末梢血における血球減少により、末梢血球における分子異常の検出は、感度の高い試験を必要とし、ＮＧＳ突然変異分析は、サンガー配列決定法よりもかなり良好な感度を提供する。陰性結果が、ＭＤＳの存在を常に除外するわけではない。
【００６４】
芽球数が５％未満であるＭＤＳ患者から同意により得られたサンプルにおいて、本ＮＧＳ突然変異分析は、全ての症例において異常を検出することから、本ＮＧＳ突然変異分析は、疾患のより早期のステージにおいてすら、ＭＤＳ患者として患者を同定するための非常に正確なかつ感度の高い方法であるという結論が支持される。
【００６５】
無細胞ＤＮＡを用いて実行される場合のＮＧＳ突然変異分析は、末梢血細胞ＤＮＡのサンガー配列決定法と比較して、より正確かつ高感度である。また、血漿の無細胞ＤＮＡによるＮＧＳ突然変異分析が、分子異常を検出し、かつＭＤＳ診断を確認する際に、細胞ＤＮＡに実行されるＮＧＳ突然変異分析と比較して、より正確かつ高感度であると判定された。また、予想外にも、無細胞ＤＮＡは、正常な細胞ＤＮＡによってあまり薄められず、かつＭＤＳ特異的ＤＮＡによってより富化されていることが見出された。この発見は、図２に示されるように、ＮＧＳ突然変異分析を用いた細胞ＤＮＡと比較して、無細胞ＤＮＡにおいて検出される有意に高い突然変異対立遺伝子によって支持される（Ｐ＝０．００８）。
【００６６】
以前の研究（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ，２００９；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，２００４；Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｊｉｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００３）は、より進行したＭＤＳ患者がより循環する無細胞ＤＮＡを有することを示しているため、ＭＤＳの診断を確認する分子異常の検出は、この場合、より容易なはずである。
【００６７】
芽球数が５％未満である場合であっても、ＭＤＳ患者において分子異常を検出する際に、末梢血細胞ＤＮＡよりも無細胞ＤＮＡが信頼できると判定された。更に、ＮＧＳ突然変異分析は、サンガー配列決定法よりも正確であり、およびＭＤＳ患者として患者を同定しかつＭＤＳ処置を施す際の、無細胞ＤＮＡを分析するための選択方法として考えられるべきである。
【実施例】
【００６８】
実施例１．患者およびサンプル
骨髄評価によってＭＤＳに罹患していることを確認した１６人の患者、および年齢を合わせた正常な４人のコントロールから、末梢血（ＰＢ）サンプルを収集した。全ての患者は、芽球が＜５％であった。
【００６９】
末梢血血漿から無細胞ＤＮＡを、およびＰＢ細胞から細胞ＤＮＡを抽出した。患者の特性を表２に記載する。
【００７０】
【表２】
2017533714.tif 000004
【００７１】
実施例２．ＤＮＡの単離
ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ抽出キット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を用いて、メーカーの説明書に従って血漿から全核酸を単離した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、メーカーの説明書に従ってＰＢ細胞からＤＮＡを単離した。
【００７２】
実施例３．遺伝子の配列決定
サンガー配列決定法およびＮＧＳを用いて、以下の遺伝子中の突然変異を分析した：ＡＳＸＬ１、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、およびＺＲＳＲ２。サンガー配列決定法は、標準的なプロトコルを用いて実行した。これらの遺伝子中の報告されている突然変異の＞９０％を包含するように、プライマー対を設計した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物を精製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３０ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、フォワード方向およびリバース方向の両方に配列を決定した。配列決定分析ソフトウェアを用いて、配列決定データをベースコールし、およびＳｅｑＳｃａｐｅソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりアセンブルして分析した。
【００７３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシステム（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてＮＧＳを実行した。メーカーによって推奨されるように、ＮＧＳ、増幅、およびインデクシングを実行した。各サンプルについて、アンプリコンをアガロースゲルでのランによって確認した。サンプルをプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｍａｎａｇｅｒを用いて実験シートを作成した。分析にＭｉＳｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒを用い、コーリングにＶａｒｉａｎｔ  Ｓｔｕｄｉｏを用いた。バリアントコーリングの確認のために、ＮｅｘｔＧｅｎｅソフトウェア（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）を用いた。コード領域の全体にわたる平均配列カバー率は、配列決定したアンプリコンの９４％で４，０００であった。これによると、突然変異は、突然変異ＤＮＡの少なくとも３％に存在する場合に確実に検出することができる。
【００７４】
実施例４．無細胞ＤＮＡを用いた腫瘍性の異常ＭＤＳクローンの存在の確認
骨髄サンプルの調査、ならびに徹底した細胞遺伝学的評価および分子評価を通して、１６人の患者がＭＤＳに罹患していることを確認した。患者の特性を表２に記載する。
【００７５】
１６人の患者のうちの１人は、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）に罹患しており、残りは不応性貧血に罹患していた。９人の患者（５６％）が男性であった。１６人の患者は全て、不応性貧血に罹患しており、２人は輪状鉄芽球を有した。骨髄の細胞遺伝学的データは、１人の患者が複合異常、１人がトリソミー８、および１人が第６染色体の長腕に欠失を有することを示した。血漿無細胞ＤＮＡのＮＤＳ突然変異分析と同時に、１６人の患者は全て、少なくとも１つの突然変異遺伝子を示し、ＭＤＳと整合する異常クローンの存在が確認された。正常なコントロール個体由来の４つのサンプルのいずれにおいても、異常は検出されなかった。
【００７６】
８人の患者（５０％）は、１つの遺伝子において突然変異を示し、残りの８人の患者（５０％）は、２つ以上の遺伝子において突然変異を示した（図１）。
【００７７】
実施例５．無細胞ＤＮＡのＮＧＳは、末梢血細胞ＤＮＡのサンガー配列決定よりも感度が高い
１６人の患者のうちの５人（３１％）は、無細胞ＤＮＡのＮＧＳによって突然変異が検出されたが、末梢血細胞ＤＮＡのサンガー配列決定は、突然変異の証拠を示さなかった。これらの患者は、細胞ＤＮＡのサンガー配列決定法が用いられた場合、ＭＤＳについて陰性であると考えられたであろう。残りの１１人の患者のうちの３人（２７％）は、サンガー配列決定法によって検出されない追加の突然変異を示した。全体として、１６人の患者のうちの８人（５０％）は、サンガー配列決定法によって全血ＤＮＡ中に検出されなかった血漿無細胞ＤＮＡ中の突然変異をＮＧＳによって示した。
【００７８】
細胞ＤＮＡにおいてサンガー配列決定法によって検出されずにＮＧＳによって無細胞ＤＮＡ中で検出された全突然変異は、対立遺伝子頻度が＜２０％であった（図１）。これは、サンガー配列決定法による検出の不全を説明し得る。一般に、サンガー配列決定法の検出レベルは、１５〜２０％であるが、ＮＧＳ配列決定法はおおよそ５％である（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ、２０１５）。
【００７９】
実施例６．ＮＧＳは、細胞ＤＮＡの使用と比較して、無細胞ＤＮＡを使用するとより感度が高い
ＮＧＳの検出レベルは、サンガー配列決定法よりもかなり良好であるため、ＮＧＳを用いて末梢血細胞ＤＮＡを試験して、５つのサンプルにおける無細胞ＤＮＡで得られた結果と比較した。５つの対のうちの４つ（８０％）は同一の結果を示し、１つのサンプルは、無細胞ＤＮＡにおけるＲＵＮＸ１中に７％の突然変異を示し、これは、細胞ＤＮＡ由来のＤＮＡにおいて検出されなかった。
【００８０】
殆どの場合において、これは、腫瘍特異的ＤＮＡによる血漿の相対的な富化を反映している。これを確認するために、無細胞ＤＮＡにおいて検出した突然変異対立遺伝子頻度を、末梢血細胞ＤＮＡにおいて検出した頻度と比較した。図２に示されるように、無細胞ＤＮＡ中の突然変異対立遺伝子のレベルは、末梢血球由来の細胞ＤＮＡ中のレベルよりも有意に高い（Ｐ＝０．００８）。これは、血漿中の腫瘍性ＤＮＡのより高い感度および富化を示唆している（図２）。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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2017533714.tif 000008