(57)【要約】本発明は、免疫療法の分野のものである。より具体的には、本発明は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）と抗原とを含む組成物を提供する。また、抗原特異的寛容を誘導するために患者に皮下、皮内、又は局所的に投与することによって本発明の組成物を投与する方法を本明細書に提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要としている患者において抗原特異的寛容を誘導する方法において使用するための、（ｉ）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と（ii）病態に関与している少なくとも１つの病原性抗原とを含むか又はからなる組成物であって、前記病態に罹患しているか又は前記病態のリスクを有する患者の皮膚に局所的に又は皮内に投与される組成物。
【請求項２】
（ｉ）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と（ii）少なくとも１つの病原性抗原とを含む組成物であって、該病原性抗原が、インスリンからなるものではない組成物。
【請求項３】
前記ＨＯ−１誘導因子が、ラパマイシンからなるものではない、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記ＨＯ−１誘導因子が、コバルトプロトポルフィリン（CoPP）、塩化物配位子を有する（ヘミン）第二鉄イオンを含有する（ヘムＢ）プロトポルフィリンIX、ヘマチン、鉄プロトポルフィリン、又はヘム分解産物である、請求項２又は３記載の組成物。
【請求項５】
前記病原性抗原が、自己抗原、同種抗原、又はアレルゲンである、請求項２〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
前記自己抗原が、ミエリン関連抗原（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（例えば、MBP83-102ペプチド）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）（例えば、MOG35-55ペプチド）、及びプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）（例えば、PLP139-151ペプチド）からなる群から選択される、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記自己抗原が、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（GAD65）、グリア線維酸性タンパク質（GFAP）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（IGRP）、インスリノーマ関連抗原−２（IA-2）、及び亜鉛トランスポータ８（ZnT8）からなる群から選択される、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
前記自己抗原が、II型コラーゲン（CTII）である、請求項５記載の組成物。
【請求項９】
前記同種抗原が、同種移植片によって発現される抗原、遺伝子療法の過程で発現するタンパク質、及び処置用タンパク質からなる群から選択される、請求項５記載の組成物。
【請求項１０】
皮下、皮内、又は局所への投与用に製剤化される、請求項２〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
それを必要としている患者において免疫寛容を誘導する方法であって、請求項２〜１０のいずれか一項記載の組成物を前記患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１２】
それを必要としている患者において抗原特異的寛容を誘導する方法であって、請求項２〜１０のいずれか一項記載の組成物を前記患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１３】
それを必要としている患者において移植拒絶反応を予防又は低減する方法であって、請求項２〜１０のいずれか一項記載の組成物を前記患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
それを必要としている患者における自己免疫疾患、遺伝子療法の過程で発現するタンパク質又は処置用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、及びアレルギーを予防又は治療する方法であって、請求項２〜１０のいずれか一項記載の組成物を前記患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、若年性少関節炎、コラーゲン誘発関節炎、アジュバント誘発関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、自己免疫性胃萎縮症、尋常性天疱瘡、乾癬、白斑、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、後天性血友病、及び血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）からなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
それを必要としている患者における抗原特異的寛容を誘導する方法であって、病態に罹患しているか又は前記病態のリスクを有する患者の皮膚に、（ｉ）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と（ii）前記病態に関与している少なくとも１つの病原性抗原とを含むか又はからなる組成物を局所的に又は皮内に投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
抗原特異的寛容原性ＡＰＣの集団を生成するインビトロ又はエクスビボにおける方法であって、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と、関心がある前記抗原とを含む培養培地を用いてＡＰＣの集団を培養する工程を含む方法。
【請求項１８】
抗原特異的寛容原性ＡＰＣの集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法の分野のものである。
【０００２】
より具体的には、本発明は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と特異的抗原とを含む組成物を提供する。また抗原特異的寛容を誘導するため、患者に皮下、皮内、又は局所投与によって本発明の組成物を投与する方法を本明細書で提供する。
【０００３】
発明の背景：
自己免疫疾患、移植臓器拒絶、アレルギー／喘息、免疫原性処置用タンパク質及び遺伝子療法は、共通の免疫応答が組織を破壊するか又は所与の分子を排除する免疫介在性病態生理学的状況である。前記病態生理学的状況における免疫応答は、制御／抑制機構の減少と共に、免疫原性樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋系列のＴエフェクタ／メモリ細胞、並びに抗体の産生の全体的な増加を含む。したがって、これらは、歴史的には免疫抑制因子、そして、より最近では生物学的調節因子等、処置アプローチを共有している。望ましくない免疫応答に関連する障害（例えば、自己免疫疾患、移植片拒絶反応）における免疫抑制のための従来の臨床ストラテジーは、広範囲作用型免疫抑制薬、例えば、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６（タクロリムス）、又はコルチコステロイドの長期間投与に基づいている。高用量のこれら薬物の長期使用は、毒性の副作用を有する場合もある。更に、これら薬物に対して耐容性を示すことができる患者でさえも、生涯にわたる免疫抑制薬療法の必要性は、腫瘍、重篤な感染症、腎毒性、及び代謝性障害を含む重篤な副作用の著しいリスクを有する。したがって、これら病状に関与する抗原に対する寛容は、その処置を大きく改善するであろう。
【０００４】
例えば、Ｉ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、インスリン分泌β細胞の自己免疫破壊に起因する。ヒト及び非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス（Ｔ１Ｄの有用な実験モデル）における所見は、診断の直後でさえも、疾患の発症中にＣＤ８＋Ｔ細胞が病因に関する不可欠な役割を果たしていることを証明した（Tsaiら（１）によって概説されている）。更に、最近、発症したばかりのＴ１Ｄと自己反応性β細胞特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在との間の強固な相関関係が、本発明者らのグループ（２）及び他のグループ（３〜６）によって報告された。
【０００５】
Ｔ１Ｄの処置における１つの重大な課題は、診断時には、抗原特異的Ｔ細胞の攻撃後に膵β細胞のうちの７０〜９０％が既に失われており、狭い処置濃度域しか残されていないことである（７）。全身免疫抑制は、治癒的なＴ１Ｄ処置へ向けた重要な工程を表すが、その理由は、残りのβ細胞を増殖させるか又は非β細胞を分化転換させることによって疾患を改善する可能性が最も高いためである。しかし、現在の免疫抑制は、特異性を有していないという固有の問題を有しており、このことによって、日和見感染症のリスク増大等の望ましくない副作用が生じる（８）。したがって、自己反応性Ｔ細胞の選択的ターゲティングのための処置ストラテジーが緊急に必要とされている。抗原特異的ナイーブＴ細胞を寛容化しようとする試みは、多少は成功しているが、臨床的に関連する活性化された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞における寛容は、アジュバントに乳化した大量の合成ペプチドを投与した場合にしか得られておらず（９〜１１）、これは、臨床的使用に不適合である。
【０００６】
別の免疫介在性病態生理学的状況は、ニューロンの脱髄及び中枢神経系（ＣＮＳ）に対する進行性損傷を引き起こす自己免疫疾患である多発性硬化症（ＭＳ）である。脱髄は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、そして、炎症プロセスを誘発する自己反応性のＴ細胞及びＢ細胞によって媒介されると考えられる。この炎症は、複数の分離した脱髄斑を引き起し、該斑は、主に白質に位置する。前記斑内で軸索離断へと進行する緩徐進行性軸索損傷は、進行ＭＳ患者において最終的にみられる不可逆的損傷の一因となる（Tabansky et al., 2015）。
【０００７】
したがって、それを必要としている患者において抗原特異的寛容を誘導することができる組成物が依然として必要とされている。
【０００８】
ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）は、一酸化炭素（ＣＯ）、ビリベルジン、及び鉄中の遊離ヘムの分解を触媒し、そして、これら分子は全て、抗炎症活性及び寛容原性活性を有する。ＨＯ−１の薬理学的誘導因子（例えば、Normosang（登録商標））は、ヒトにおける急性ポルフィリン症の処置について臨床的に承認されている（１２）。ＨＯ−１の誘導又は遺伝子の過剰発現は、げっ歯類モデルにおいて強力な抗炎症効果を有し（Blancouらによって概説されている（１３）、そして、自己免疫疾患に対する保護を付与する（１４〜１６）。ＨＯ−１が作用する正確な機序は、未だ完全には解明されていないが、幾つかの研究によって、これら機序が少なくとも部分的に抗原提示細胞（ＡＰＣ）に依存していることが示唆されている（１７、１８）。それにもかかわらず、これら結果は、関心がある特定の抗原を同時投与していないＨＯ−１誘導因子による長期間の全身処置に基づいていた。この種の処置は、前記抗原に特異的なものだけではなく、全ての免疫応答を減弱するリスクを有している。
【０００９】
発明の概要：
第１の態様では、本発明は、（ｉ）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と、（ii）少なくとも１つの病原性抗原とを含む組成物に関する。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、それを必要としている患者において免疫寛容を誘導する方法において使用するための本発明の組成物に関する。
【００１１】
第３の態様では、本発明は、それを必要としている患者において抗原特異的寛容を誘導する方法において使用するための本発明の組成物に関する。
【００１２】
第４の態様では、本発明は、それを必要としている患者において移植拒絶反応を予防又は低減する方法において使用するための本発明の組成物に関する。
【００１３】
第５の態様では、本発明は、その患者において自己免疫疾患、遺伝子療法の過程で発現するタンパク質又は処置用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、及びアレルギーを予防又は治療する方法において使用するための本発明の組成物に関する。
【００１４】
第６の態様では、本発明は、抗原特異的寛容原性ＡＰＣの集団を生成するインビトロ又はエクスビボにおける方法であって、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と、関心がある前記抗原とを含む培養培地を用いてＡＰＣの集団を培養する工程を含む方法に関する。
【００１５】
第７の態様では、本発明は、抗原特異的免疫原性ＡＰＣの集団に関する。
【００１６】
発明の詳細な説明：
本発明は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と抗原とを含む組成物の皮内注射による投与が、それを必要としている患者において抗原特異的寛容を誘導するのに有効であるという発見に関する。この処置後、ＨＯ−１を過剰発現している単球由来ＤＣ（MoDC）集団等、ＨＯ−１を過剰発現している寛容原性抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団（ＨＯ−１＋ＡＰＣ）が、マウス及び非ヒト霊長類における流入領域リンパ節に動員される。これらＨＯ−１＋ＡＰＣは、病原性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクタ機能並びにＢ細胞による抗体の産生を阻害する。ヒトＨＯ−１＋ＡＰＣでもインビトロにおいて同じ結果が得られた。
【００１７】
本発明の組成物
したがって、本発明の第１の態様は、（ｉ）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と、（ii）少なくとも１つの病原性抗原とを含むか又はからなる組成物に関する。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）」とは、ヘム群を一酸化炭素、鉄、及びビリルビンに触媒する誘導性律速酵素を指す。より具体的には、ＨＯ−１は、酸化によってヘムＢ分子のα−メソ炭素橋を切断して、等モル量のビリベルジンIXa、一酸化炭素（ＣＯ）、及び遊離鉄を生成する。本明細書で使用するとき、用語「ヘム」とは、メチン橋によって結合している４つのピロール基で構成されている、ポリフィリンと呼ばれる大きな複素環式有機環の中心に含有されているＦｅ２＋（第一鉄）イオンからなる補欠分子族として知られている種類の化学化合物を指す。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「誘導因子」とは、タンパク質、例えば、ＨＯ−１をコードしている患者自身の内因性（例えば、非組み換え）遺伝子を用いて、該患者の体内における該タンパク質の産生を増加させることができる物質を指す。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「ＨＯ−１誘導因子」とは、患者においてＨＯ−１を誘導することができる物質、例えば、本明細書に記載する剤のいずれか、例えば、ヘミン、ヘマチン、プロトポルフィリン鉄、及び／又はコバルトプロトポルフィリンを指すが、例えば、ヘム分解産物（例えば、ビリルビン、ビリベルジン、フェリチン、デスフェロキサミン、サリチルアルデヒドイソニコチノイルヒドラゾン、デキストラン鉄、及びアポフェリチン）等のＨＯ−１誘導体も包含する。
【００２１】
特定の実施態様では、本発明は、（ｉ）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と（ii）少なくとも１つの病原性抗原とを含むか又はからなる組成物であって、該ＨＯ−１誘導因子が、ラパマイシンからなるものではない組成物に関する。
【００２２】
ＨＯ−１は、当技術分野において公知の任意の方法によって患者において誘導され得る。例えば、ＨＯ−１の産生は、ヘミンによって、ヘマチンによって、プロトポルフィリン鉄によって、又はコバルトプロトポルフィリンによって誘導され得る。重金属、サイトカイン、ホルモン、一酸化窒素、ＣｏＣｌ２、エンドトキシン、及び熱ショックを含む様々な非ヘム剤も、ＨＯ−１発現の強力な誘導因子である（Otterbein et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1029-L1037, 2000；Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:9-19, 1996；Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997；及びTenhunen et al., J. Lab. Clin. Med. 75:410-421, 1970）。また、ＨＯ−１は、過酸化水素、グルタチオン枯渇剤、ＵＶ照射、及び酸素過剰を含む酸化的ストレスを生じさせる様々な剤及び条件によって高度に誘導される（Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15: 9-19, 1996；Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:517-554, 1997；及びKeyse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:99-103, 1989）。
【００２３】
１つの実施態様では、ＨＯ−１誘導因子は、コバルトプロトポルフィリン（CoPP）又は塩化物配位子を有する（ヘミン）第二鉄イオンを含有する（ヘムＢ）プロトポルフィリンIXである。
【００２４】
１つの実施態様では、ＨＯ−１誘導因子は、ヘマチン（商品名Panhematin（登録商標））又はアルギン酸ヘム（商品名NormoSang（登録商標））である。
【００２５】
あるいは、それを必要としている患者に外因性ＨＯ−１を直接投与することによって、ＨＯ−１を該患者に提供してもよい。例えば、当技術分野において公知の任意の方法によって患者に外因性ＨＯ−１タンパク質を直接投与してよい。本明細書に記載する通り、患者においてＨＯ−１を誘導することに加えて、又はその代わりに、外因性ＨＯ−１を直接投与してよい。ＨＯ−１は、例えば、リポソーム中で、及び／又は融合タンパク質として、例えば、ＴＡＴ−融合タンパク質として、及び／又は遺伝子療法、例えば、アデノウイルスベクターによって患者に送達することができる。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「抗原」とは、免疫グロブリン分子（又は抗体）の抗原結合領域又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合することができる物質を指す。したがって、用語「抗原」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、低分子（オリゴペプチド模倣体（すなわち、抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物））、炭水化物、例えば、多糖類、脂質、核酸、又はこれらの組み合わせであってよい抗原決定基、ハプテン、及び免疫原を含むが、これらに限定されない。更に、本発明に係る抗原は、組み換えＤＮＡ技術又は異なる組織若しくは細胞源からの精製によって得ることができるタンパク質であってよいことに留意すべきである。このようなタンパク質は、天然タンパク質に限定されるものではなく、例えば、選択されたアミノ酸配列を変化させることによって又は異なるタンパク質の一部を融合させることによって得られる改変タンパク質又はキメラ構造物も含む。あるいは、前記抗原は、Ｆｍｏｃ生化学手順、大規模マルチピンペプチド合成、組み換えＤＮＡ技術、又は他の好適な手順によって得られる合成ペプチドであってもよい。
【００２７】
本発明の状況において、本発明の組成物は、例えば、自己免疫疾患、処置用タンパク質に対する免疫反応、移植片拒絶反応、及びアレルギーに関与しているもの等、望ましくない免疫応答の予防又は治療において有用である。
【００２８】
したがって、本発明の状況において有用な抗原は、予防又は治療すべき疾患／病態に関連及び／又は関与している抗原である（「病原性抗原」とも呼ばれる）。したがって、関心がある抗原は、自己抗原（セルフ抗原）、同種抗原、処置用タンパク質、及びアレルゲンからなる群から選択される。
【００２９】
例えば、自己免疫疾患が多発性硬化症であるとき、前記自己抗原は、ミエリン関連抗原（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（例えば、MBP83-102ペプチド）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）（例えば、MOG35-55ペプチド）、及びプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）（例えば、PLP139-151ペプチド）からなる群から選択される。
【００３０】
自己免疫疾患がＩ型糖尿病（Ｔ１Ｄ）であるとき、前記自己抗原は、インスリン、インスリン前駆体プロインスリン（ProIns）、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（GAD65）、グリア線維酸性タンパク質（GFAP）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（IGRP）、インスリノーマ関連抗原−２（ＩＡ−２）、及び亜鉛トランスポータ８（ZnT8）からなる群から選択される。
【００３１】
特定の実施態様では、本発明は、（ｉ）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と（ii）少なくとも１つの病原性抗原とを含むか又はからなる組成物であって、前記病原性抗原がインスリンからなるものではない組成物に関する。
【００３２】
自己免疫疾患が関節リウマチであるとき、前記自己抗原は、II型コラーゲン（CTII）である。
【００３３】
他の例は、アレルゲンと呼ばれる外因性抗原に対して身体が過剰反応するアレルギーである。これらアレルゲンの中でも、一部は食品中にみられ（例えば、甲殻類、種子、果実、野菜、乳、卵、魚類のタンパク質）、一部は非食品に関連し（例えば、花粉、ラテックス、セメント、クロム）、そして、一部は、薬物に対する（例えば、ペニシリン、アスピリン、クラーレ、モルヒネ、バンコマイシン）。
【００３４】
また、前記同種抗原は、同種移植片、遺伝子療法の過程で発現するタンパク質（そして、用いられるウイルスベクター由来のウイルス抗原も）、及び処置用タンパク質を含むが、これらに限定されないことを意図する。
【００３５】
このように、「同種移植片」は、２つの遺伝的に異なるＭＨＣハプロタイプを有する同じ種の２個体間の移植片である。
【００３６】
用語「処置用タンパク質」とは、タンパク質又はペプチド、及び任意の所与の病態又は病気の療法におけるこれらの投与を指す。処置用タンパク質とは、患者に投与される任意のタンパク質又はペプチド、例えば、処置用の抗体、サイトカイン、酵素、又は任意の他のタンパク質を指す。タンパク質療法の例は、プラスミド由来の若しくは組み換えの凝固因子濃縮物（例えば、第VIII因子又は第IX因子）の投与を介した血友病の処置、モノクローナル抗体を用いる癌若しくは心血管疾患の処置、又は酵素補充療法による代謝性疾患若しくはリソソーム病の処置に関する。
【００３７】
本発明の１つの実施態様では、前記組成物は、皮下、皮内、又は局所への投与用に製剤化される。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「皮内投与」とは、皮膚の真皮の領域への前記組成物の送達を指すが、必ずしも真皮だけに位置している必要はなく、該真皮とは、ヒトの皮膚における表面から約１．０〜約２．５mmに位置する皮膚の層である。個体間及び身体の異なる部分間で特定の量のばらつきが存在し得る。一般的に、皮膚の表面下約１．５mmで真皮に達し、それぞれ、表面及び下方の皮下層における角質層と表皮との間である。投与後、前記組成物は、真皮だけに位置していてもよく、又は表皮、皮下組織、又は流入領域リンパ節に存在していてもよい。
【００３９】
皮内投与は、長針の使用を回避する組成物の投与方法であり、そして、該組成物は、信頼性がありかつ使用が容易な装置を用いて投与してよい。更に、皮膚は、優れた免疫器官であるが、その理由は、特殊な樹状細胞である高密度のランゲルハンス細胞が存在するためである。一般的に、組成物の皮内投与は、抗原のより効率的な取り込みを提供するものとされる。
【００４０】
例えば、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５．１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号に記載されているもの等の短針装置等の任意の好適な装置を皮内送達に用いてよい。また、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第９９／３４８５０号及び欧州特許第１０９２４４４号に記載されているもの等、針の皮膚への有効貫通長さを制限する装置及びその機能的等価物によって組成物を投与してもよい。また、液体ジェット式注射器を介して、又は角質層を貫通し、そして、真皮に達するジェットを生成する針を介して、真皮に液体ワクチンを送達するジェット式注射装置も好適である。ジェット式注射装置は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、国際公開公報第９７／３７７０５号、及び国際公開公報第９７／１３５３７号に記載されている。また、皮膚の外層を通じて真皮に達する粉末形態の組成物を加速するために圧縮ガスを使用する弾道粉末／粒子送達装置も好適である。更に、皮内投与の古典的なマントー法において従来の注射器を用いてもよい。
【００４１】
別の好適な投与経路は、皮下経路である。皮下送達用の任意の好適な装置、例えば、古典的な針を用いてよい。好ましくは、例えば、国際公開公報第０１／０５４５３号、国際公開公報第０１／０５４５２号、国際公開公報第０１／０５４５１号、国際公開公報第０１／３２２４３号、国際公開公報第０１／４１８４０号、国際公開公報第０１／４１８３９号、国際公開公報第０１／４７５８５号、国際公開公報第０１／５６６３７号、国際公開公報第０１／５８５１２号、国際公開公報第０１／６４２６９号、国際公開公報第０１／７８８１０号、国際公開公報第０１／９１８３５号、国際公開公報第０１／９７８８４号、国際公開公報第０２／０９７９６号、国際公開公報第０２／３４３１７に公開されているような無針ジェット式注射器サービスを用いる。より好ましくは、前記装置には、液体組成物製剤が予め充填されている。
【００４２】
別の好適な投与経路は、局所投与（皮膚上経路とも呼ばれる）である。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「局所投与」及び「皮膚上経路」とは、皮膚（又は呼吸器、泌尿生殖器、及び消化管等の外部と連通している全ての身体通路の内側を覆い、そして、粘液を分泌する細胞及び関連する腺を有する、粘性膜とも呼ばれる粘膜）にこの組成物を塗布することによる該組成物の送達を指す。局所投与は、針、注射器、又は表皮の表層を穿孔するか若しくは完全性を変化させる任意の他の手段の使用を必要としない。活性物質は、該活性物質を表皮の角質層に浸透させるのに十分な期間及び条件下で皮膚と接触した状態で維持される。
【００４４】
例えば、皮膚パッチ装置、ゲル、又は軟膏等の任意の好適な装置を用いてよい。
【００４５】
本明細書で使用するとき、用語「皮膚パッチ装置」（「皮膚パッチ」とも呼ばれる）とは、皮膚に医薬を送達するために該皮膚上に配置される薬用貼付剤を指す。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「ゲル」とは、溶液よりも固体形態であるコロイドを指す。また、ゲルは、コロイド状液体の凝固によって形成されるゼリー様物質でもある。多くのゲルは、繊維性マトリクス及び流体が充填された間隙を有する。ゲルは、単なる粘性ではなく粘弾性であり、そして、変形することなく多少の機械的ストレスに耐えることができる。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語「軟膏」とは、半固体の油系局所製剤を意味する。軟膏の例は、水素添加されているか又は他の方法で化学的に修飾されている、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、植物油又は動物油の本質的に非水性の混合物を含む。また、軟膏は、活性剤が完全に又は部分的に溶解している溶媒も含有していてよい。
【００４８】
前記組成物は、例えば、交互に連続する部位に繰り返し皮下、皮内、又は局所投与するために製剤化してよい。前記組成物は、例えば、少なくとも２週間、２ヶ月間、６ヶ月間、１、２、３、４、若しくは５年間、又はそれ以上の投与期間にわたって、例えば、１時間〜１ヶ月間の投与間隔で与えられる逐次用量で、投与部位に、例えば、皮下、皮内、又は局所注射することによって投与してよい。
【００４９】
また、本発明は、本発明に係る組成物の組み合わせ、及び該組み合わせを皮下、皮内、又は局所的に送達する送達装置に関する。したがって、本発明は、また、本発明に係る組成物と、該組成物の皮下、皮内、又は局所送達に好適な送達装置とを含むキットに関する。更により好ましいのは、前記組成物が前記送達装置内部に既に存在しているキットであり、これによって、医療従事者が患者に該組成物を容易に投与することが可能になる。
【００５０】
本発明の全ての組成物と同様に、抗原の免疫学的に有効な量は、経験的に決定されるなければならない。考慮すべき要因は、寛容、抗原が担体タンパク質又は他の担体と複合体化又は共有結合するかどうか、及び投与される寛容化投薬の回数を含む。このような要因は、当技術分野において公知であり、そして、過度の実験を行うことなくこのような決定を行うことは、十分に免疫学者の技能の範囲内である。
【００５１】
抗原及びＨＯ−１誘導因子は、本発明の組成物中に異なる濃度で存在してよい。典型的には、前記物質の最低濃度は、その意図する使用を達成するのに必要な量であり、一方、最高濃度は、溶液中に留まるか又は初期混合物内に均質に懸濁する最大量である。例えば、処置剤の最小量は、単回処置上有効な投与量を与える量である。生物活性物質の場合、最低濃度は、再構成時に生物活性に必要な量であり、そして、最高濃度は、均質な懸濁を維持することができない点である。単回投与ユニットの場合、該量は、単回処置適用の量である。一般的に、各用量は、１〜１００μg/kg、例えば、２５又は５０μg/kg 抗原を含むと予測される。更に、各用量は、１〜８mg/kg、例えば、３又は４mg/kg ＨＯ−１誘導因子（すなわち、全身投与される用量１２mg/kgよりも少ない用量）を含むと予測される。前記物質の好ましい量は、物質によって変動するが、当業者が容易に決定可能である。
【００５２】
本発明の別の態様は、病態に罹患しているか又は該病態のリスクを有する患者への皮下、皮内、又は局所投与に好適な組成物であって、（ｉ）ＨＯ−１誘導因子と（ii）該病態に関与している少なくとも１つの抗原とを含む組成物に関する。
【００５３】
本発明の別の態様は、皮下、皮内、又は局所投与に好適な組成物であって、（ｉ）ＨＯ−１誘導因子と（ii）少なくとも１つの病原性抗原とを含む組成物に関する。
【００５４】
本発明の別の態様は、病態に罹患しているか又は該病態のリスクを有する患者の皮膚の皮下又は皮内の分画に投与するための組成物であって、（ｉ）ＨＯ−１誘導因子と（ii）該病態に関与している少なくとも１つの病原性抗原とを含み、その結果、該皮下又は皮内の分画に送達されたとき、該患者において抗原特異的寛容を誘導する組成物に関する。
【００５５】
本発明の別の態様は、病態に罹患しているか又は前記病態のリスクを有する患者において抗原特異的寛容を誘導するのに好適な組成物であって、（ｉ）ＨＯ−１誘導因子と（ii）該病態に関与している少なくとも１つの抗原とを含む組成物に関する。
【００５６】
１つの実施態様では、本発明は、それを必要としている患者において抗原特異的寛容を誘導する方法において使用するための（ｉ）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と（ii）病態に関与している少なくとも１つの病原性抗原とを含むか又はからなる組成物であって、前記病態に罹患しているか又は前記病態のリスクを有する患者の皮膚に局所的に又は皮内に投与される組成物に関する。
【００５７】
更なる態様では、本発明の組成物は、ベクター、例えば、膜又は脂質小胞（例えば、リポソーム）に含有されていてもよく、例えば、国際公開公報第２０１２／１４９２６５号に記載されている通り、ナノ担体、例えば、合成ナノ担体、脂質ナノ粒子、金属ナノ粒子、例えば、金ナノ粒子、ポリマーナノ粒子（例えば、非メトキシ終端プルロニックポリマーであるポリマーを含むポリマーナノ粒子、ポリエステル（例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、又はポリカプロラクトン）、ポリエーテルにカップリングしているポリエステル（例えば、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール）、ポリアミノ酸、ポリカーボナート、ポリアセタール、ポリケタール、多糖、ポリエチルオキサゾリン、又はポリエチレンイミン）、界面活性剤系エマルション、デンドリマー、バッキーボール、ナノワイヤ、ウイルス様粒子、又はペプチド若しくはタンパク質粒子に含有されていてもよい。
【００５８】
抗原特異的寛容原性ＡＰＣの集団を得る方法
別の態様では、抗原特異的寛容原性ＡＰＣの集団を生成するインビトロ又はエクスビボにおける方法であって、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と、関心がある前記抗原とを含む培養培地を用いてＡＰＣの集団を培養する工程を含む方法に関する。
【００５９】
本明細書で使用するとき、用語「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）とは、抗原を内部に取り入れ、そして、プロセシングすることができ、その結果、免疫系によって認識され得るように抗原決定基がＭＨＣ結合複合体（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球に制限されるＭＨＣクラスＩ及び／又はヘルパーＴリンパ球に制限されるＭＨＣクラスII）として該細胞の表面上に提示される免疫細胞の分類を指す。細胞をＡＰＣとして機能させる２つの不可欠な特性は、エンドサイトーシスされた抗原をプロセシングする能力及びＭＨＣ遺伝子産物の発現である。ＡＰＣの例は、皮膚の樹状細胞（ＤＣ）、単核食細胞（例えば、マクロファージ）、Ｂリンパ球、ランゲルハンス細胞、そして、ヒトでは、内皮細胞を含む。
【００６０】
本明細書で使用するとき、用語「培養培地」とは、ＡＰＣの成長及び寛容原性ＡＰＣへの分化を支援することができる任意の培地を指す。典型的には、栄養素（炭素、アミノ酸の源）、ｐＨバッファ、及び塩類を含有する基本培地からなり、これには、成長因子及び／又は抗生物質が添加されていてもよい。典型的には、該基本培地は、RPMI 1640培地、DMEM培地、IMDM培地、X-VIVO培地、又はAIM-V培地であってよく、これらは全て市販されている標準的な培地である。
【００６１】
ＡＰＣの成長及び寛容原性ＡＰＣへの分化を支援する好ましい培地の処方は、既知組成培地（ＣＤＭ）を含む。本明細書で使用するとき、用語「既知組成培地」（ＣＤＭ）とは、指定の成分、好ましくは、公知の化学構造の成分のみを含有する、細胞を培養するための栄養溶液を指す。既知組成培地は、無血清かつフィーダーフリー培地である。
【００６２】
ＨＯ−１誘導因子と、少なくとも１つの関心がある抗原とを含む培養培地を用いてＡＰＣの集団を培養する工程は、該ＨＯ−１誘導因子及び該抗原を該ＡＰＣ内部に取り入れ、そして、該ＡＰＣが該抗原を提示するのに必要な時間実施すべきである。典型的には、培養培地を用いるＡＰＣの集団の培養は、３、６、１２時間から１日間又はそれ以上実施すべきである。
【００６３】
関心がある抗原は、既に記載した通り、自己抗原（セルフ抗原）、同種抗原、処置用タンパク質、及びアレルゲンからなる群から選択される。
【００６４】
ＨＯ−１誘導因子は、既に記載した通り、患者においてＨＯ−１を誘導することができる物質である。
【００６５】
１つの実施態様では、ＨＯ−１誘導因子は、コバルトプロトポルフィリン（CoPP）又は塩化物配位子を有する（ヘミン）第二鉄イオンを含有する（ヘムＢ）プロトポルフィリンIXである。
【００６６】
１つの実施態様では、ＨＯ−１誘導因子は、ヘマチン（商品名Panhematin（登録商標））又はアルギン酸ヘム（商品名NormoSang（登録商標））である。
【００６７】
あるいは、ＨＯ−１は、外因性ＨＯ−１を投与することによってＡＰＣに提供されてもよい。遺伝子を運ぶベクターを細胞に導入することができる手段は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、形質導入、又はＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウム、若しくは当業者に公知の他の手段を用いるトランスフェクションを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
１つの実施形態では、ＡＰＣは、樹状細胞である。
【００６９】
１つの特定の実施態様では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ヒトの樹状細胞又は単球（特に、処置される患者から得られたもの）である。
【００７０】
処置される疾患に関連する抗原（病原性抗原）に特異的な寛容原性ＡＰＣの集団を得なければならない。したがって、関心がある抗原は、自己抗原、同種抗原、及びアレルゲンからなる群から選択される。
【００７１】
樹状細胞（ＤＣ）を用いる場合、ＡＰＣは、以下の通り調製することができる。Ficoll法によって末梢血からリンパ球を単離し；接着細胞を非接着細胞から分離し；次いで、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で該接着細胞を培養してＤＣを誘導し；そして該ＤＣをＨＯ−１誘導因子と、関心がある抗原と共に培養して、抗原特異的寛容原性ＤＣを得る。次いで、得られたＤＣを、処置される患者に再投与してよい。このような方法は、国際公開公報第９３／２０８１８５号及び欧州特許第０５６３４８５号に記載されており、これらは参照することによって本明細書に組み入れられる。
【００７２】
本発明の別の態様は、抗原特異的免疫原性ＡＰＣの集団に関する。
【００７３】
１つの実施態様では、抗原特異的寛容原性ＡＰＣは、上記本発明の方法によって得られる。
【００７４】
１つの実施態様では、抗原特異的寛容原性ＡＰＣは、MHC-II+CD14+CD11c+細胞である。
【００７５】
また、本発明は、薬物として用いるための、抗原特異的寛容原性ＡＰＣの集団かそれを含む医薬組成物かに加えて、抗原特異的寛容原性ＡＰＣの集団を含む医薬組成物に関する。
【００７６】
抗原特異的寛容原性ＡＰＣの集団を用いることによって、抗原特異的制御性Ｔ細胞の集団を得る方法
本発明の別の態様は、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞の集団を得る方法であって、制御性Ｔ細胞の集団を該抗原に特異的な寛容原性ＡＰＣの集団と共に培養する工程を含む方法に関する。
【００７７】
また、本発明は、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞の集団を得る方法であって、
−  該抗原に特異的な寛容原性ＡＰＣの集団を得るために、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と該抗原とを含む培養培地を用いてＡＰＣの集団を培養する工程と、
−  場合により、該抗原に特異的な寛容原性ＡＰＣの集団を単離する工程と、
−  制御性Ｔ細胞の集団を該抗原特異的寛容原性ＡＰＣの集団と共に培養する工程と
を含む方法に関する。
【００７８】
１つの実施態様では、前記制御性Ｔ細胞の集団は、CD4+CD25+制御性細胞の集団である。
【００７９】
特定の実施態様では、前記制御性Ｔ細胞の集団は、ナイーブCD4+CD25+CD45RA+制御性Ｔ細胞の集団である。
【００８０】
１つの実施態様では、前記制御性Ｔ細胞の集団は、CD8+CD45RClow又は-制御性Ｔ細胞の集団である。
【００８１】
本願の状況において、用語「制御性Ｔ細胞の集団」とは、エフェクタＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞等のエフェクタＴ細胞によって媒介される免疫反応を抑制又はダウンレギュレートする能力を特徴とするＴ細胞の集団を指す。
【００８２】
１つの実施態様では、前記制御性Ｔ細胞は、ヒト制御性Ｔ細胞（特に、処置される患者から得られたもの）である。
【００８３】
出発物質として機能する制御性Ｔ細胞の集団は、当技術分野において公知の任意の技術に従って単離してよい。例えば、制御性Ｔ細胞の集団は、リンパ球を含有する様々な生物学的サンプルから得ることができる。典型的には、該制御性Ｔ細胞は、末梢血から単離される。該制御性Ｔ細胞は、様々なリガンド（例えば、ＣＤ４及びＣＤ２５）で標識したビーズを用いる負の選択と正の選択との組み合わせによって単離することができる。次いで、細胞選別等の様々な技術によってこのような標識された細胞を分離してよい。次いで、得られた制御性Ｔ細胞を、処置される患者に再投与してよい。
【００８４】
本発明の別の態様は、抗原特異的制御性Ｔ細胞の集団に関する。
【００８５】
１つの実施態様では、抗原特異的制御性Ｔ細胞は、上記本発明の方法によって得られる。
【００８６】
また、本発明は、薬物として用いるための、抗原特異的制御性Ｔ細胞の集団かそれを含む医薬組成物かに加えて、抗原特異的制御性Ｔ細胞の集団を含む医薬組成物に関する。
【００８７】
処置方法及び使用：
本発明は、それを必要としている患者における、免疫寛容、そして、より具体的には、抗原特異的寛容を誘導する方法において使用するための方法及び組成物（例えば、本発明の組成物又は細胞の集団）を提供する。
【００８８】
また、本発明は、それを必要としている患者において移植拒絶反応を予防又は低減する方法において用いるための方法及び組成物を提供する。
【００８９】
本発明は、更に、それを必要としている患者において自己免疫疾患、処置用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、及びアレルギーを予防又は治療する方法において用いるための方法及び組成物を提供する。
【００９０】
第１の態様では、本発明は、それを必要としている患者において免疫寛容を誘導する方法において使用するための本発明の組成物に関する。
【００９１】
本明細書で使用するとき、用語「免疫寛容」又は「寛容原性免疫応答」とは、免疫応答を誘発する能力を有する抗原に対する、免疫系によって誘導される発病過程が存在しないことを指す。寛容原性免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＢ細胞の増殖及び／又は活性（アネルギー）及び／又は標的組織への遊走の任意の低減、遅延、又は阻害を含む。また、寛容原性免疫応答は、制御性細胞、例えば、寛容原性樹状細胞、CD4+Treg細胞、CD8+Treg細胞、Breg細胞等の刺激、誘導、産生、又は動員につながる任意の応答を含んでいてよい。幾つかの実施態様では、寛容原性免疫応答は、細胞の産生、誘導、刺激、又は動員を特徴とする制御性表現型への変換をもたらすものである。また、寛容原性免疫応答は、抗体産生の低減を含んでいてもよい。
【００９２】
本明細書で使用するとき、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞介在性及び／又はＢ細胞介在性の免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞の細胞毒性を含み、更に、免疫応答という用語は、Ｔ細胞の活性化によって間接的に生じる免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。免疫応答に関与する免疫細胞は、リンパ球、例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、Ｔｈ１細胞、及びＴｈ２細胞）；抗原提示細胞（例えば、樹状細胞（ＤＣ）等のプロフェッショナル抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えば、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。
【００９３】
本明細書で使用するとき、用語「抗原特異的免疫寛容」とは、所与の抗原に対する特異的免疫寛容を指す。それは、抗原に応答する能動的抗原依存性プロセスである。免疫応答と同様に、寛容は特異的であり、そして、免疫記憶と同様に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又は両方に存在し得る。
【００９４】
１つの実施態様では、本発明の組成物は、ＨＯ−１誘導因子無しで投与される抗原及び／又は抗原無しで局所的に投与されるＨＯ−１誘導因子を用いて得られるものと比べて、免疫応答によって誘導される発病過程を阻害又は低減することができ、そして、特に、抗原特異的Ｔ細胞、例えば、抗原特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋メモリＴ細胞、並びに活性化抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）及び所与の抗原に対する抗体の抗原特異的Ｂ細胞プロデューサの寛容化を誘導することができる。具体的には、前記抗原特異的Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋メモリＴ細胞の寛容化又は活性化ＣＴＬは、更に、他の抗原に対する免疫応答に影響を与えることなく、前記抗原に対する免疫寛容を誘導することができる。具体的には、前記抗原特異的Ｔ細胞の寛容化は、ＨＯ−１＋寛容原性ＡＰＣ、例えば、流入領域リンパ節（ＤＬＮ）細胞におけるMoDC（マウスにおけるMHC-II+CD11b+Ly6+F4/80+CD11clowCD64+FcεR1+細胞、そして、ヒヒ及びヒトにおけるMHC-II+CD14+CD11c+）の誘導を含む。
【００９５】
「それを必要としている患者」とは、処置すべき移植拒絶反応、自己免疫疾患、同種免疫応答、又はアレルギーに罹患しているか又は罹患しやすい個体を意味する。処置される個体は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。
【００９６】
第２の態様では、本発明は、それを必要としている患者において移植拒絶反応を予防又は低減する方法において使用するための本発明の組成物に関する。
【００９７】
本明細書で使用するとき、用語「移植拒絶反応を予防又は低減する」とは、免疫移植拒絶反応の予防又は阻害、及び免疫移植拒絶反応の発生又は進行の遅延を包含することを意味する。また、この用語は、患者における移植片の生存延長、又は患者における移植片の不全の逆行を包含することも意味する。更に、この用語は、例えば、免疫拒絶に関連する免疫学的合併症、例えば、間質性線維症、慢性移植片動脈硬化症、又は脈管炎等の寛解を含む、免疫移植拒絶反応の症状の寛解を包含することも意味する。
【００９８】
本明細書で使用するとき、用語「移植拒絶反応」は、急性及び慢性の移植拒絶反応を包含する。「急性拒絶反応」は、移植された組織が免疫学的に異質である場合の組織移植のレシピエントの免疫系による拒絶反応である。急性拒絶反応は、レシピエントの免疫細胞による移植組織の浸潤を特徴とし、該免疫細胞は、そのエフェクタ機能を遂行し、そして、移植組織を破壊する。急性拒絶反応の発生は急速であり、そして、一般的に、ヒトでは移植手術後数週間以内に生じる。一般的に、急性拒絶反応は、ラパマイシン、シクロスポリン、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体等の免疫抑制薬を用いて阻害又は抑制することができる。「慢性拒絶反応」は、一般的に、ヒトでは、急性拒絶反応の免疫抑制が成功している場合でさえも、生着後数カ月間〜数年間以内に生じる。線維症は、全ての種類の臓器移植の慢性拒絶反応における共通の要因である。
【００９９】
用語「移植」及びその変形は、移植が同系（ドナー及びレシピエントが遺伝的に同一である）であろうと、同種（ドナー及びレシピエントが異なる遺伝的起源であるが同じ種である）であろうと、異種（ドナー及びレシピエントが異なる種由来である）であろうと、移植片（グラフトとも呼ばれる）をレシピエントに挿入することを指す。したがって、典型的なシナリオでは、ホストはヒトであり、そして、グラフトは、同じ又は異なる遺伝的起源のヒトに由来する同種同系移植片である。別のシナリオでは、グラフトは、系統学的に遠く離れている種に由来する動物を含む、移植される種とは異なる種に由来し、例えば、ヒヒの心臓をヒトホストに移植する等である。
【０１００】
１つの実施態様では、移植のドナーは、ヒトである。移植のドナーは、生体ドナー又は死亡したドナー、すなわち、死体ドナーであってよい。
【０１０１】
１つの実施態様では、移植片は、臓器、組織、又は細胞である。
【０１０２】
本明細書で使用するとき、用語「臓器」とは、生物内の特定の機能又は機能群を果たす固形血管新生化臓器を指す。臓器という用語は、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、子宮、骨、軟骨、小腸又は大腸、膀胱、脳、乳房、血管、食道、卵管、胆嚢、卵巣、膵臓、前立腺、胎盤、脊髄、上肢及び下肢を含む肢、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、子宮を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用するとき、用語「組織」とは、ヒト又は動物における任意の種類の組織を指し、そして、血管組織、皮膚組織、肝組織、膵組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、骨及び軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱及び靭帯を含む結合組織、羊膜組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔組織、眼組織を含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
本発明の特定の実施態様では、移植片は、心臓の同種移植片である。
【０１０４】
本明細書で使用するとき、用語「細胞」とは、関心がある細胞を多く含む組成物、好ましくは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６５％の該細胞を含む組成物を指す。
【０１０５】
特定の実施態様では、前記細胞は、骨髄、末梢血、若しくは臍帯血に由来する多分化能造血幹細胞；又は心筋細胞、ベータ膵細胞、肝細胞、神経細胞等の異なる細胞系列の多能性（すなわち、胚幹細胞（ＥＳ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ））若しくは多分化能幹細胞由来の分化細胞からなる群から選択される。
【０１０６】
１つの実施態様では、細胞組成物は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）のために用いられるので、通常、骨髄、末梢血、又は臍帯血に由来する、多分化能造血幹細胞を含む。
【０１０７】
ＨＳＣＴは、白血病及びリンパ腫の患者に治癒をもたらすことができる。しかし、同種ＨＣＴの重大な制約は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発現であり、これは、この療法を受けたヒトのうちの約３０〜５０％において重篤な形態で生じる。
【０１０８】
本発明の組成物は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防又は低減する方法において有用である。
【０１０９】
したがって、１つの実施態様では、それを必要としている患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖性症候群、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫等のリンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される疾患に罹患している。
【０１１０】
第３の態様では、本発明は、その患者において自己免疫疾患、遺伝子療法の過程で発現するタンパク質又は処置用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、及びアレルギーを予防又は治療する方法において使用するための本発明の組成物に関する。
【０１１１】
本明細書で使用するとき、用語「予防する」、「予防している」、及び「予防」とは、疾患、障害、又は病態の少なくとも１つの症状が最終的に顕在化する可能性があるが、未だそうなっていない個体に対して、所与の期間、該個体が該疾患、障害、又は病態の症状を発現する機会を低減するために、療法を投与することを指す。このような低減は、例えば、患者における該疾患、障害、又は病態の少なくとも１つの症状の発生の遅延に反映され得る。
【０１１２】
本明細書で使用するとき、用語「治療する」、「治療している」、又は「治療」とは、患者の疾患、異常、障害、又は有害な病態の症状の頻度及び／又は重篤度を低減する試みにおいて、個体に療法を投与することを指す。
【０１１３】
本明細書で使用するとき、用語「自己免疫疾患」とは、免疫系が、正常ホストの一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対する免疫応答（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞の応答）を生じさせる疾患を指す。自己免疫疾患では、ホストの免疫系は、特定の抗原を「自己」として認識することができず、そして、抗原を発現しているホストの組織に対する免疫反応を開始する。
【０１１４】
ヒトで発症する例示的な自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性少関節炎、コラーゲン誘発関節炎、アジュバント誘発関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、自己免疫性胃萎縮症、尋常性天疱瘡、乾癬、白斑、Ｉ型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、後天性血友病、血栓性血小板減少性紫斑病等を含む。
【０１１５】
本明細書で使用するとき、用語「処置用タンパク質に対する望ましくない免疫応答」とは、遺伝子療法の過程で発現するタンパク質及び／又は処置用タンパク質、例えば、第VIII因子（血友病Ａ）及び他の凝固因子、酵素補充療法、モノクローナル抗体（例えば、ナタリズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ）、ポリクローナル抗体（ＡＴＧ）、ホルモン（インスリン）、又はサイトカイン（例えば、ＩＦＮβ）に対する任意の望ましくない免疫反応を指す。
【０１１６】
例えば、このアプローチは、実際に、対応する遺伝的欠損を有する個体においてその発現が遺伝子療法によって回復するとき、免疫応答を抑制するため、特に、特定のタンパク質に対する免疫反応を予防するために適用することができる。したがって、本発明に係る免疫原性組成物を用いて、遺伝子療法によってその再構成を達成すると同時に、突然変異に起因する患者において通常存在しないタンパク質に対する免疫反応性を予防することができる。
【０１１７】
更に、タンパク質療法は、より普及しつつある医学的革新の領域であり、そして、処置用製品として患者に直接タンパク質、例えば、酵素、抗体、又はサイトカインを適用することを含む。このような医薬の送達における主な障害の１つは、処置用タンパク質自体に対する免疫応答を含む。タンパク質に基づく処置の投与は、多くの場合、免疫抑制剤の投与を伴い、該免疫抑制剤は、タンパク質の寿命延長を容易にするために用いられ、したがって、生物の細胞及び組織へのタンパク質の取り込みを増加させるものである。しかし、一般的な免疫抑制剤は、実施される免疫抑制の非特異的性質に起因して、患者において望ましくない副作用が生じるので、不都合な場合がある。したがって、このアプローチは、患者に投与される処置用タンパク質及びペプチド、例えば、処置用の抗体、サイトカイン、酵素、又は任意の他のタンパク質に対する免疫応答を抑制するために適用することができる。
【０１１８】
本明細書で使用するとき、用語「アレルギー」とは、免疫系の障害（又は不適切な反応）を指す。アレルギー反応は、アレルゲンとして知られている通常は無害の環境物質に対して生じ、これら反応は、後天性であり、予測可能であり、かつ急速である。厳密には、アレルギーは、過敏症の４つの形態のうちの１つであり、そして、Ｉ型（又は即時型）過敏症と呼ばれる。アレルギーは、極度の炎症応答を生じさせる、ＩｇＥとして知られている抗体の種類によるマスト細胞及び好塩基球と呼ばれる特定の白血球の過剰活性化を特徴とする。一般的なアレルギー反応は、湿疹、蕁麻疹、花粉症、喘息、食物アレルギー、並びにスズメバチ及びミツバチ等の刺咬昆虫の毒に対する反応を含む。
【０１１９】
本発明の別の態様は、それを必要としている患者において免疫寛容を誘導する方法であって、有効量の上記本発明の組成物を該患者に皮下、皮内、又は局所的に投与する工程を含む方法に関する。
【０１２０】
本発明の別の態様は、それを必要としている患者において抗原特異的寛容を誘導する方法であって、有効量の上記本発明の組成物を該患者に皮下、皮内、又は局所的に投与する工程を含む方法に関する。
【０１２１】
本発明の別の態様は、それを必要としている患者において移植拒絶反応を予防又は低減する方法であって、有効量の上記本発明の組成物を該患者に皮下、皮内、又は局所的に投与する工程を含む方法に関する。
【０１２２】
本発明の別の態様は、その患者における自己免疫疾患、遺伝子療法の過程で発現するタンパク質又は処置用タンパク質に対する望ましくない免疫応答、及びアレルギーを予防又は治療する方法であって、有効量の上記本発明の組成物を該患者に皮下、皮内、又は局所的に投与する工程を含む方法に関する。
【０１２３】
１つの実施態様では、本発明は、それを必要としている患者における抗原特異的寛容を誘導する方法であって、病態に罹患しているか又は前記病態のリスクを有する患者の皮膚に、（ｉ）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）誘導因子と（ii）前記病態に関与している少なくとも１つの病原性抗原とを含むか又はからなる組成物を局所的に又は皮内に投与する工程を含む方法に関する。
【０１２４】
以下の図面及び実施例によって本発明を更に説明する。しかし、これら実施例及び図面は、いかなる手段によっても、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１Ａ】CoPP及び自己抗原の皮内注射は、流入領域ＬＮのMHC-II+細胞においてＨＯ−１を誘導し、そして、ＣＴＬを寛容化する。（Ａ、Ｂ）オボアルブミンのみ又はＨＯ−１誘導因子（CoPP）と共に皮内注射した２４時間後、ＦＡＣＳによって脾細胞及び流入領域ＬＮにおけるMHC-II+細胞のうちのＨＯ−１＋細胞の比率を求めた。データを、代表的な密度プロットとして（Ａ）示す。
【図１Ｂ】CoPP及び自己抗原の皮内注射は、流入領域ＬＮのMHC-II+細胞においてＨＯ−１を誘導し、そして、ＣＴＬを寛容化する。（Ａ、Ｂ）オボアルブミンのみ又はＨＯ−１誘導因子（CoPP）と共に皮内注射した２４時間後、ＦＡＣＳによって脾細胞及び流入領域ＬＮにおけるMHC-II+細胞のうちのＨＯ−１＋細胞の比率を求めた。データを、３つの独立した実験の平均頻度±s.e.m.（ｎ≧３マウス／群）として（Ｂ）示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｃ】CoPP及び自己抗原の皮内注射は、流入領域ＬＮのMHC-II+細胞においてＨＯ−１を誘導し、そして、ＣＴＬを寛容化する。（Ｃ、Ｄ）指定の条件で皮内処理した次の日、Rip-OVAhighマウスに０．５×１０５個の自己反応性ＣＴＬを移植した。マウスを糖尿病の発現についてモニタリングした。ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン。少なくとも２つの独立した実験からプールした指定の数のマウスから得られたデータを示す（Ｃ）。
【図１Ｄ】CoPP及び自己抗原の皮内注射は、流入領域ＬＮのMHC-II+細胞においてＨＯ−１を誘導し、そして、ＣＴＬを寛容化する。（Ｃ、Ｄ）指定の条件で皮内処理した次の日、Rip-OVAhighマウスに０．５×１０５個の自己反応性ＣＴＬを移植した。マウスを糖尿病の発現についてモニタリングした。ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン。処理の６〜８日間後、組織学的分析を用いて２つの独立した実験（ｎ＝５〜６マウス／群）でインスリンの程度を求め、両群について＞１５０個の膵島を分析した（Ｄ）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２】CoPP及び自己抗原の皮内注射は、ＨＯ−１＋血液−MoDCを誘導する。C57/B6マウスにおいて、オボアルブミン（ＯＶＡ）のみ又はＨＯ−１誘導因子（CoPP）と共に皮内注射した２４時間後に流入領域ＬＮにおける細胞集団を分析した。流入領域ＬＮ（ｎ＝４マウス／群）におけるMHC-II+F4/80+CD11b+Ly6C+細胞の数を報告する。
【図３】HO-1+moDCは、自己反応性ＣＴＬを寛容化する。Rip-OVAhighマウスに０．５×１０５個の自己反応性ＣＴＬを移植し、そして、ＯＶＡ又はCoPP-OVAで皮内免疫したマウスの流入領域ＬＮから単離したMHC-II+細胞又はCD11b+ CD11clowLy6ChighF4/80+細胞と共に４時間共培養した（Ａ）。マウスを糖尿病の発現についてモニタリングした。示したデータは、３つの独立した実験からプールした指定の数のマウスから得られたものである。（Ｂ）指定の条件で皮内処理した２４時間後、流入領域ＬＮ由来のF4/80選別細胞をＬＰＳで２４時間刺激した。ELISAによって上清をＩＬ−１２及びＩＬ−１０の含有量について分析した。データは、３つの実験の平均±s.e.m.を示す。
【図４】CoPP＋自己抗原の皮内注射は、ＣＴＬの速度を低下させる。Rip-OVAhighマウスをＯＶＡ又はCoPP-OVAで皮内免疫した。２４時間後、マウスに０．５×１０５個の自己反応性CD45.1+ CTLを移植した（Ａ〜Ｂ）か、又はインビトロ実験のためにMHC-II+細胞を流入領域ＬＮから単離した（Ｃ、Ｄ）。（Ａ）２又は６日目に、インビボＣＴＬアッセイを実施し、そして、標的細胞を移植した１２時間後に特異的溶解を求めた；データは、３つの実験の平均±s.e.m.を示す（ｎ≧６マウス／群）。（Ｂ）CD45.1+ CTLを移植した２日間後、脾臓、流入領域ＬＮ、及びＰＬＮにおいてCD8+CD45.1+細胞の絶対数を求めた；データは、３つの実験の平均±s.e.m.を示す（ｎ＝９マウス／群）。速度測定（Ｃ）及びトランスウェル遊走アッセイ（Ｄ）については、データは、３つの独立した実験の平均±s.e.m.を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５】ＨＯ−１誘導因子処理後のヒト単球の表現型。（Ａ）インビトロヘミン処理の４時間後、ヒトＰＢＭＣをＨＯ−１発現について分析した。データは、５人のドナーの平均頻度±s.e.m.を示す。インビトロにおけるCoPP処理（Ｂ）又は臨床的に関連するヘミン処理（Ｃ）の１６時間後、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞をＨＯ−１発現について分析した。データは、３つの独立した実験の平均±s.e.m.として示す（Ａ、Ｂ、Ｃ）。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ａ】CoPP及び自己抗原の皮内注射は、病原性Ｔ細胞のＣＮＳへの遊走を阻害することによってＥＡＥから保護する。マウスのＥＡＥを誘導し、そして、３日間間隔で３回、ＥＡＥ誘導時から始める（「発症前処理」）又は最初の臨床徴候の出現後に始める（「発症後処理」）処理を行ったか又は行わなかった。臨床スコアを毎日測定し、そして、平均±ＳＥＭとして示す。
【図６Ｂ】代表的なヘマトキシリン及びエオシン脊髄染色を示す。浸潤の定量を、クリッピング後の面積を手動測定することによって計算した。
【図６Ｃ】浸潤の定量を、クリッピング後の面積を手動測定することによって計算した。マトリクスを用いると、各浸潤細胞を１つの黒色ピクセルと同様に検出可能である。２回のうちの１回の代表的な実験を提示する（ｎ＝４マウス／群）。発症前及び後の処理は、それぞれ、３回及び７つの実験のプールである。
【図６Ｄ】６×１０６個のＣＦＳＥを負荷した２Ｄ２抗MOG CD45.2/2 CD4+細胞を投与したMOG35-55ペプチドで免疫されたC57/B6 CD45.1/1マウスにおいて、Ｔ細胞増殖に対するCoPP処理の影響（０及び３日目）を評価した。データは、代表的なドットプロットとして提示する。
【図６Ｅ】６×１０６個のＣＦＳＥを負荷した２Ｄ２抗MOG CD45.2/2 CD4+細胞を投与したMOG35-55ペプチドで免疫されたC57/B6 CD45.1/1マウスにおいて、Ｔ細胞増殖に対するCoPP処理の影響（０及び３日目）を評価した。データは、増殖細胞の割合±s.e.m.として（ｎ＝７〜８マウス／群）提示する。
【図６Ｆ】ＣＮＳ又はＤＬＮ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を収集し、そして、MOG38-49-APCテトラマーで染色した。データは、代表的なドットプロットとして提示する。
【図６Ｇ】ＣＮＳ又はＤＬＮ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を収集し、そして、MOG38-49-APCテトラマーで染色した。データは、臓器当たりの細胞数±s.e.m.として（ｎ＝７〜８マウス／群）提示する。
【図７Ａ】非ヒト霊長類における臨床ヘミンによる処理は、流入領域ＬＮのMHC-II+細胞においてＨＯ−１を誘導し、そして、ＤＴＨ反応を失わせる。Normosang（登録商標）によるＨＯ−１の誘導を、ヒヒにおける皮内免疫後にインビボで評価した。臨床等級のヘミン（Normosang（登録商標））を皮内注射した２４時間後、処理した又は未処理のヒヒのＤＬＮ及び非ＤＬＮ（ｎＤＬＮ）における細胞内染色によって、MHC-II+細胞中のＨＯ−１＋の比率を求めた。データは、１頭のヒヒ／条件の代表的なＦＡＣＳプロファイルを示す。
【図７Ｂ】非ヒト霊長類における臨床ヘミンによる処理は、流入領域ＬＮのMHC-II+細胞においてＨＯ−１を誘導し、そして、ＤＴＨ反応を失わせる。Normosang（登録商標）によるＨＯ−１の誘導を、ヒヒにおける皮内免疫後にインビボで評価した。臨床等級のヘミン（Normosang（登録商標））を皮内注射した２４時間後、処理した又は未処理のヒヒのＤＬＮ及び非ＤＬＮ（ｎＤＬＮ）における細胞内染色によって、MHC-II+細胞中のCD14+CD11c+の比率を求めた。データは、１頭のヒヒ／条件の代表的なＦＡＣＳプロファイルを示す。（
【図７Ｃ】データは、１頭のヒヒ／条件の代表的なＦＡＣＳ頻度を示す。
【図７Ｄ】MHC-II+CD11c+CD14+又はCD14-細胞においてＨＯ−１の発現を評価した。
【図７Ｅ】４頭のヒヒをＢＣＧで免疫し、そして、Normosang（ヘミン）処理前後にＤＴＨ評価のためにツベルクリンに曝露した。
【図７Ｆ】全ての動物においてツベルクリンの皮内注射後毎日紅斑を測定した。
【図８】CoPP及び自己抗原の静脈内注射は、誘導された糖尿病から保護しない。CoPP及び自己抗原（「CoPP OVA IV」）又は自己抗原のみ（「OVA IV」）を静脈内注射した次の日、Rip-OVAhighマウスに０．５×１０５個の自己反応性ＣＴＬを移植した。マウスを糖尿病の発現についてモニタリングした。結果は、２つの独立した実験からプールする。曲線は、統計的に異なっていない。
【０１２６】
実施例：
実施例１：ヘムオキシゲナーゼ−１誘導因子の皮内注射によって誘導された単球由来樹状細胞による１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）における進行中のＣＴＬ応答の寛容化。
材料及び方法
細胞：
自己反応性ＣＴＬの生成：自己反応性ＣＴＬを、既に記載されている通り生成した（３４）。簡潔に述べると、ＯＶＡ特異的クラスＩ制限Ｔ細胞（ＯＴ−１）マウス（３５）の脾臓及びリンパ節の単一細胞懸濁液から磁気選別（Miltenyi Biotech）によってＣＤ８＋細胞を単離した。５ng/mL ＩＬ−２（Roche Applied Science）及び２０ng/mL ＩＬ−１２（R&D Systems）を含有する１０％ ＦＣＳ（Eurobio）を添加した安定なグルタミン（ＰＡＡ）を含む完全DMEM高グルコース ２mL中、５×１０６個のマイトマイシン処理し、そして、オボアルブミン（２５７〜２６４）ペプチドを負荷した同系脾細胞で１×１０６個の精製OT-I CD8+Ｔ細胞を刺激した。３日目、培養物を４つのアリコートに分け、そして、ＩＬ−２を含有する新鮮培地に供給した。６日目、細胞を回収し、そして、培養培地で３回洗浄した。
【０１２７】
マウスＡＰＣの単離及び自己反応性ＣＴＬとの共培養：MHC-II+細胞及びF4/80+細胞を単離するために、背中又は耳に皮内注射した２４時間後に皮膚流入領域ＬＮを除去した。コラゲナーゼＤ（Sigma-Aldricht）を用いて酵素的にリンパ節を解離させることによって単一細胞懸濁液を調製した。一次標識試薬として抗MHC-II-FITC（クローンAF6-120.1、BD pharmingen）モノクローナル抗体又は抗F4/80-PE（クローンBM8、eBioscience）モノクローナル抗体、そして、それぞれ、二次試薬として抗FITCマイクロビーズ又は抗ＰＥマイクロビーズ（Miltenyi）を用いて細胞を染色した。磁気分離後、CoPP-OVA免疫マウスにおいてCD11b+CD11clowLy6ChighF4/80+細胞の純度が＞８２％であることを確認した。これらの細胞を、速度測定及びトランスウェル遊走アッセイのために、自己反応性ＣＴＬ（それぞれ、ＡＰＣのＣＴＬに対する比１：１及び１：５）と共に一晩共培養した。
【０１２８】
ヒトＴＨＰ−１単球細胞株及びＣＤ８＋Ｔ細胞クローンとの共培養：既に記載されている（３６）通りの標準的な条件下で、１０％ ウシ胎仔血清（Eurobio）、１％ グルタミン（Gibco）、５０IU/mL ペニシリン、５０IU/mL ストレプトマイシン（Gibco）、及び２００nM ＰＭＡ（Sigma-Aldrich）を添加したRPMI 1640（Gibco）中にてＴＨＰ−１細胞を培養した。
【０１２９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンとの共培養実験のために、ＴＨＰ−１をヘミン（２５μM又は５０μM）又はCoPP（１２．５μM又は２５μM）で一晩処理し、培養培地中５μM MUC1（９５０〜９５８）又はNYESO-1（１５６〜１６５）を用いて３７℃で３０分間パルス処理し、十分に洗浄し、そして、速度測定のために、それぞれ、１：１の比のHLA-A*0201/MUC1(950-958)特異的Ｔ細胞クローン（N5.14）（３７）又はHLA-A*0201/NYESO-1 156-165)特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン（M117.167）（３８）と共に一晩共培養した。
【０１３０】
ヒト及び非ヒト霊長類のＰＢＭＣ：ヒトＰＢＭＣは、NantesのEtablissement Francais du Sangにおいて、健常ドナーの血液から得た。Ficoll-Paque密度勾配遠心分離（GE Healthcare）後、４時間の間CoPP又はヘミンの存在下又は非存在下で、１０％ ウシ胎仔血清（Eurobio）、１％ グルタミン（Gibco）、５０IU/mL ペニシリン、５０IU/mL ストレプトマイシン（Gibco）を添加したRPMI 1640（Gibco）中にてＰＢＭＣを培養した。
【０１３１】
動物：
非ヒト霊長類：ヒヒ（Papio anubis、CNRS Primatology Center, Rousset, Franceから入手）は、全ての検疫試験について陰性であった。動物は、Institutional Ethical Guidelines of the Institut National de la Sante Et de la Recherche Medicale, Franceの推奨に従って本発明者らの研究室の大型動物施設で飼育した。全ての実験は、Zoletil（Virbac, Carron, France）による全身麻酔下で実施した。それぞれ、臨床ヘミン（Normosang（登録商標）） ６．２５mg（５００μL）、１２．５mg（５００μL）、又は２５mg（１mL）を、３頭のヒヒの鼠径襞に皮内注射した。未処理ヒヒは、コントロールとして機能した。皮内注射の２４時間後に鼠径リンパ節を外科的に除去した。コラゲナーゼＤ（Sigma-Aldricht）を用いて酵素的にリンパ節を解離させることによってフローサイトメトリー分析用の単一細胞懸濁液を調製した。
【０１３２】
pIi-TTA-TetO-HO-1トランスジェニックＮＯＤマウスの生成：pIi-TTAマウスは、Christophe Benoistから供与された（２１）。TetO-HO-1マウスの生成については、ヒトＨＯ−１ｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡ配列の上流に位置するヒトβグロビンイントロン、及び該ｃＤＮＡの下流に位置するウシ成長ホルモンpolyAを、ミニマルＣＭＶプロモータの下流のＴｅｔ応答配列（ＴＲＥ）に続いて、ヒトβ−グロビンイントロン、及びウシ成長ホルモンpolyAを含有するpBluKSM-tet-O-CMVベクターのNot-I/Xho-I部位にクローニングした。記載したベクターのXhoI-NotI断片をCBA/C57BL6の卵に前核マイクロインジェクションすることによって、トランスジェニックマウスを生成した。１７頭の異なるファウンダーが、ＰＣＲ及びサザンブロットによって試験したとき、トランスジーンを保有していた。１７系統のうち、３頭のファウンダーは、高コピーのｈＨＯ−１ｃＤＮＡを含有していた。アクチンｒｔＴＡマウスと交配することによって、これらのうちの１頭を更に分析した。ウエスタンブロットによってｈＨＯ−１の発現を確認した。最後に、少なくとも１２世代、pIi-TTA及びTetO-HO-1の両系統をNOD/LtJマウス（Charles River, France）に戻し交配した。雌のみを実験で用いた。
【０１３３】
他のマウス：Rip-OVAhighトランスジェニックマウス（３９）は、膵島でＯＶＡを発現し、そして、OT-I CD45.1+トランスジェニックマウスは、ＯＶＡのH2Kb制限エピトープ及びCD45.1コンジェニックマーカーに特異的なＴＣＲを発現する。Rip-OVAhighマウス及びOT-I CD45.1+マウス及びC57/BL6マウスは、それぞれ、Jackson Laboratory、Charles River、及びJanvierから入手した。全ての動物の飼育及び実験は、Inserm and European Union Guidelinesに従った条件下で実施した。
【０１３４】
ドキシサイクリン処理：ドキシサイクリン塩酸塩粉末（Sigma-Aldricht）を、飲料水で様々な濃度（２００μg/mLから８００μg/mLまで）に希釈し、そして、光から保護した。ＨＯ−１トランスジェニックマウスを、ＨＯ−１発現分析のために３日間、そして、糖尿病発症実験のために最長２００日間処理した。
【０１３５】
マウスの皮内免疫及び糖尿病の誘導：１０μL中、上記の通り調製したCoPP（Livchem） ７０μg及びエンドフリーオボアルブミン（Hyglos） ２０μgを、８〜１０週齢のRip-OVAhighマウスの背中に２回皮内注射した。ＨＯ−１阻害実験のために、上記の通り（１８）調製したMnPP（Livchem） １４０μgを調製品に添加した。食作用アッセイのためにAlexa Fluor（登録商標）488オボアルブミン（Molecular Probes） ４０μgを用いた。糖尿病を誘導するために、４日間MHC-II+細胞又はF4/80+細胞と予め共培養しておいた又はしていない０．５×１０５個の自己反応性細胞傷害性OT-I CD8+Ｔ細胞（純度＞９５％）を、次の日、マウスに静脈内注射した。
【０１３６】
糖尿病のフォローアップ：尿中糖尿分析によって糖尿病のモニタリングを実施し、そして、血中血糖測定によって陽性マウス（５．５mmol/L）において確認した。ＨＯ−１トランスジェニックＮＯＤモデルについては連続して２週間又はRip-OVAhighモデルについては連続して２日間血中血糖が１８０mg/dLを超えたとき、マウスを糖尿病であるとみなした。
【０１３７】
フローサイトメトリー：脾臓及びリンパ節の単一細胞懸濁液を、抗CD8抗体（クローン53-6.7）、抗CD45.1抗体（クローンA20）、抗CD49b/α2抗体（クローンDX5）、抗CD49d/α4抗体（クローンR1-2）、抗ITGAE/αE抗体（クローンM290）、抗CD29/β1−インテグリン抗体（クローンHa2/5）、抗CD18/β2−インテグリン抗体（クローンC71/16）、抗CD61/β3−インテグリン抗体（クローン2C9.G2）、抗CD62E抗体（クローン10E9.6）、抗CD62L抗体（クローンMel14）、抗PSGL1抗体（クローン2PH1）、抗ICAM-1抗体（クローン3E2）、抗VCAM-1抗体（クローン429）、抗CD183/CXCR3抗体（クローンCXCR3-173）、抗CD195/CCR5抗体（クローンC34-3448）、抗GITR抗体（クローンDTA-1）、抗PD-1抗体（クローンJ43）、抗CD28抗体（クローン37.51）、抗CD38抗体（クローン90）、抗CD69抗体（クローンH1.2F3）、抗CD44抗体（クローンIM7）、抗CD107b抗体（クローンABL-93)で染色した。全ての抗体は、BD Biosciencesから入手した。製造業者の推奨に従ってBD cytofix/cytopermキットを用いるＨＯ−１の細胞内染色を、一次標識試薬として抗ＨＯ−１抗体（クローンＨＯ−１−２、abcam）を用い、そして、二次標識抗体として蛍光色素にコンジュゲートしている抗抗ＩｇＧ１（クローンMOPC-21）モノクローナル抗体を用いて実施した。
【０１３８】
アイソタイプ抗体（Immunotech）をネガティブコントロールとして用いた。FACScantoフローサイトメータ及びDiva 6.1ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて染色を評価した。
【０１３９】
インビボ細胞毒性アッセイ：C57/B16マウス由来の脾細胞を３７℃で３０分間５μM H2-Kbオボアルブミン（２５７〜２６４）ペプチドを用いてパルス処理したか又はパルス処理せず、そして、それぞれ、５及び０．５μM CFSEを含有するＰＢＳ中室温で５分間インキュベートした。インビボ細胞毒性アッセイについては、ＯＶＡ（２５７〜２６４）ペプチド及びパルス処理していない脾細胞３×１０６個をレシピエントマウスに同時に静脈内注射した。１２時間後にマウスを殺処分し、そして、フローサイトメトリーによって脾細胞を分析した。以下の式を用いて特異的溶解の割合を計算することによって、細胞溶解活性を求めた。１００−（［自己反応性ＣＴＬ有りの（オボアルブミン（２５７〜２６４）でパルス処理した脾細胞％／パルス処理していない脾細胞％）／自己反応性ＣＴＬ無しの（オボアルブミン（２５７〜２６４）でパルス処理した脾細胞％／パルス処理していない脾細胞％）］×１００）。
【０１４０】
組織学的分析：膵島炎の評価のために、膵臓を急速冷凍し、そして、凍結切片（厚さ８μm）をアセトンで固定した。切片をH&E（Thermo Electron Corp.）で染色し、そして、膵島炎の程度を顕微鏡で評価した。
【０１４１】
光シートに基づく蛍光顕微鏡分析：動物を４％ ＰＦＡで灌流し、そして、ＰＢＳで洗浄した。摘出した膵臓を、3Disco法を用いて浄化した（４０、４１）。簡潔に述べると、５０％ 無水テトラヒドロフラン（ＴＨＥ、Sigma, Saint Quentin Falavier, France）（vol/vol）浴に一晩、８０％ ＴＨＥ（vol/vol）浴に２時間、そして、１００％ ＴＨＥ浴に１時間を２回、逐次室温で膵臓を脱水した。次いで、該臓器を１００％ ジクロロメタン（ＤＣＭ、Sigma, Saint Quentin Falavier, France）溶液中で４５分間インキュベートし、そして、清浄媒体１００％ ジベンジルエーテル９８％（ＤＢＥ、Sigma, Saint Quentin Falavier, France）に一晩移す。成体マウスの膵臓全体を画像化するために、自家製の光シート限外顕微鏡を用いる（４０）。ベンチのＺステージ上に置かれた、ＤＢＥが充填された立方体キュベットに試料を入れた。それに、シリンダレンズによって形成される光の平面シートを照射した。多波長（４０５、４８８、５６１、６３５nm）レーザーベンチ（LBX-4C, Oxxius, Lannion, France）から照射された光を、２本の単一モード光ファイバーを介してセットアップにカップリングして、片面又は両面からの照射を可能にした。４８８nm レーザ励起を用いた照度は、光シート１枚当たり１０〜４０mWであった。本発明者らは、両面照射を用いた。４８８nm 光シートに対して垂直に配向されたPlanApo 1X/0.25 NA又は2X/0.5 NA対物レンズ（Olympus, Rungis, France）を通してMVX10マクロスコープを用いて上方から試料を撮影した。ＧＦＰ蛍光イメージングについては、タレット上の５２５／５０バンドパスフィルタを用いた。光シートを通してサンプルを移動させるｚステージと同期したＣＣＤカメラ（ORCA AG, Hamamatsu, France）を用いて画像を捕捉した。自家製の限外顕微鏡をMicro-managerソフトウェアによって管理し、そして、サンプル及び倍率に応じて２０、１０、又は５ミクロン毎にｚスタックの画像を撮影した。ImageJソフトウェア（Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012）を用いて画像スタックを分析する。
【０１４２】
速度アッセイ：自己反応性ＣＴＬを、ＯＶＡ又はCoPP-OVAで免疫したマウスのＤＬＮから単離したMHC-II+細胞と共に一晩共培養した。MHC-II+細胞の磁気枯渇後、再単離したＣＴＬを、ibidi μスライド上に播種したコンフルエントなSVEC細胞単層上に定着させた。倍率２０倍でDMI 6000 B顕微鏡（Leica Microsystems, Nanterre, France）を用いて３７℃でライブセルイメージングを実施した。Cool Snap HQ2カメラ（Roper, Tucson, AZ）を用いて３０分間１５秒間毎に画像を取得し、そして、Metafluor 7.1イメージングソフトウェア（Universal Imaging, Downington, PA）で解析した。画像をImageJソフトウェアプログラムにインポートし、そして、MTrackJプラグイン（University Medical Center Rotterdam, Rotterdam, The NetherlandsのErik Meijeringによって開発、http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/）を用いてマニュアルセルトラッキングを実施した。最後の１０分間に移動した総距離を細胞で除することによって、各細胞の平均速度を計算した。
【０１４３】
トランスウェル遊走アッセイ：自己反応性ＣＴＬを、ＯＶＡ又はCoPP-OVAで免疫したマウスのＤＬＮから単離したMHC-II+細胞と共に共培養した。MHC-II+細胞の磁気枯渇後、再単離したＣＴＬを、ポリカーボナートトランスウェルメンブレンフィルタ（孔径５μm；Corning）を含有する上方チャンバに付着させた。下方チャンバは、DMEM完全培地中に１００ng/mL CXCL12、１００ng/mL CCL19、又は８０ng/mL CCL17を含有していた。３７℃で２時間後、回収した細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１４４】
サイトカイン測定：MHC-II+マウス細胞又はＰＭＡ活性化ＴＨＰ−１細胞を、マウスについて記載した通りCoPP又はヘミンで処理し、そして、１μg/mL ＬＰＳと共に２４時間培養した。上清を連続希釈し、そして、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）によってデュープリケートでサイトカイン濃度を評価した。ＩＬ−１２及びＩＬ−１０についてのマウスELISAキット、及びヒトＩＬ−１β  ELISAキット（ＢＤ）を用いた。
【０１４５】
統計値：糖尿病の発症については、ログランク検定を用いて有意性を計算した。全ての他のパラメータについては、Prismソフトウェアを用いて対応のあるｔ検定、マンホイットニーノンパラメトリックｔ検定、又は片側分散分析によって有意性を計算した；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０１４６】
結果
ＨＯ−１の発現の遺伝的及び薬理学的な操作は、Ｔ１Ｄを予防する：ＤＣは、Ｔ１Ｄの発症において重要な役割を果たし（１９）、そして、ＨＯ−１は、主にＡＰＣを介してその免疫抑制効果を発揮する（１７、１８）ので、ここで、本発明者らは、ＨＯ−１の発現がＮＯＤマウス由来のＤＣを障害するかどうかについて調べた。実際、本発明者らは、非糖尿病対照（ＮＯＲマウス）（２０）に比べて、雌ＮＯＤマウスは、脾臓におけるCD11c+細胞のうちのＨＯ−１発現細胞の割合が低いことを見出した。
【０１４７】
ＡＰＣにおけるＨＯ−１発現が糖尿病に影響を与え得るかどうかについて更に調べるために、本発明者らは、Tet ONシステムがMHC-IIインバリアント鎖（Ｅα−Ｉｉ）プロモータの制御下にある（２１）系統であるpIi-TTAマウスを用いた。pIi-TTAマウスを、ＨＯ遺伝子がハイブリッドCMV-Tetオペレータの制御下にあるTetO-HO-1トランスジェニックＮＯＤマウスと交配した。得られたpIi-TTA/TetO-HO-1ダブルトランスジェニックマウスでは、ドキシサイクリン投与によって、骨髄由来樹状細胞（BMDC）及び脾臓ＤＣの両方においてＨＯ−１発現の用量依存的増加が誘導された。雌ＮＯＤマウスでは、ドキシサイクリンによって誘導されるＨＯ−１発現は、主にＤＣで観察され、そして、ＮＯＲマウスのレベルまでＨＯ−１レベルを回復した。
【０１４８】
４週齢から飲料水中でドキシサイクリンを与えた場合、ドキシサイクリン処理されたpIi-TTA/Tet-O-HO-1雌マウスは、処理されたシングルトランスジェニック同腹仔又は未処理同腹仔と比べてＴ１Ｄの発症率が低かった。ドキシサイクリン処理動物の中でも、pIi-TTA/Tet-O-HO-1マウスは、Tet-O-HO-1マウスと比べて白血球の浸潤が低減されていた。この現象は、用量依存的であった。全体的に見て、本発明者らによるデータは、MHC-II+ APCにおけるＨＯ−１の過剰発現が、雌ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄの発症を低減することを証明した。
【０１４９】
ＨＯ−１誘導因子は、自己反応性ＣＴＬ介在性損傷を阻害する：本発明者らは、次に、コバルトプロトポルフィリン（CoPP）等のＨＯ−１誘導因子によってＴ１Ｄを予防できるかどうかについて調べた。これら実験のために、本発明者らは、ＯＶＡが膵β細胞において選択的に発現しているRIP-OVAhighトランスジェニックマウス（２２）を用いた。CoPPの皮内注射は、流入領域リンパ節（ＬＮ）のMHC-II+細胞においてＨＯ−１発現を増加させた（５．８倍±１．８）（図１Ａ及びＢ）。この誘導は、流入領域ＬＮに制限されており、CoPP注射の２４時間後には早くも観察され、そして、少なくとも７２時間続いた。
【０１５０】
活性化されたＯＶＡ特異的ＣＴＬを養子移植したとき、RIP-OVAhighトランスジェニックマウスは、既に報告されている通り、Ｔ１Ｄを急速に発現させた（２２）。しかし、ＣＴＬ移植の１日前にＯＶＡ及びCoPPを同時に注射したRIP-OVAhighトランスジェニックマウスは、６〜８日目に免疫組織学によって（図１Ｄ）、そして、１８時間目に光シートに基づく蛍光顕微鏡法によって分析したとき、糖尿病（図１Ｃ）及び膵島炎の両方を低減した。このような保護は、ＯＶＡ又はCoPPのみを注射したマウスでも、CoPP及びヒトアルブミンを注射したマウスでも観察されず（図１Ｃ）、これは、抗原特異的免疫応答に干渉することによってCoPPがこの保護を媒介していることを示唆する。ＨＯ−１の酵素阻害剤であるMnPPの投与も、保護を無効にし、これは、更に、この保護がＨＯ−１の酵素活性の増大に依拠していることを示す（図１Ｃ）。興味深いことに、CoPP及びＯＶＡを静脈内注射したとき、保護は得られなかった（図８）。全体的に見て、これら結果は、活性化抗原特異的ＣＴＬが、CoPPと共にその同種抗原を皮内注射した際にインビボで寛容化され得ることを証明した。
【０１５１】
MoDCは、ＨＯ−１誘導因子で処理されたマウスにおいてＣＴＬを寛容化する：CoPP及びＯＶＡの同時注射は、流入領域ＬＮにおけるHO-1+MHC-II+細胞の数を劇的に増加させたので（図１Ａ及びＢ）、本発明者らは、更に、これら細胞の表面分子の発現と、既に活性化しているＣＴＬを寛容化する能力とについて特性評価した。これを通して、本発明者らは、CoPP/OVAで処理したマウスにおいてＣＴＬが寛容化される機序を解明することを目的とする。CoPP及びＯＶＡの皮内注射の２４時間後、流入領域ＬＮに動員されたMHC-II+HO-1+細胞の大部分は、CD11b+CD11clowF4/80+CD64+Ly6C+FcεRI+表面表現型を示し、これは、単球由来のＤＣ（MoDC）特有の特徴である（２３）。CoPP/OVAによる免疫後、これら細胞は、ＯＶＡ免疫とは対照的に、流入領域ＬＮに大量に動員された（図２）。以前の研究で、CCR2欠損マウスではMoDCを動員することができず、したがって、CoPP/OVAで免疫したマウスのＬＮにおけるHO-1+ MoDCの数は、ＷＴ動物（２．１５×１０５細胞／ＬＮ、ｎ＝３）と比べてCCR2欠損マウス（１．５×１０３細胞／ＬＮ、ｎ＝３）において劇的に減少することが証明されており、これによって、CoPP/OVAで免疫したマウスにおけるHO-1+APCの単球源が確認された。
【０１５２】
MoDCは、血液又は真皮中に存在する循環単球から流入領域ＬＮに動員され得る（２４）。皮膚遊走阻害剤としてのＤ２プロスタグランジン受容体アゴニストBW245cの投与は、MoDCの動員に影響を与えず、これは、MoDCが血液から直接動員されたことを示唆する。この結果は、CoPP注射の１時間後、CoPPを注射した部位を切除した後のMoDCの動員の程度によって確認され、これは、MoDCの皮膚源とは不適合であった。
【０１５３】
HO-1+ MoDCSがCoPPを注射したマウスにおけるＴ細胞寛容化に関与しているかどうかについて更に調べるために、CoPP及びＯＶＡで免疫したマウスの流入領域ＬＮからMHC-II+細胞を精製し、そして、既に活性化しているＯＶＡ特異的ＣＴＬと共に４時間インキュベートした。次に、これら細胞をRIP-OVAhighマウスに養子移植し、次いで、これをＴ１Ｄについてモニタリングした。CoPP/OVAで免疫した動物由来のMHC-II+細胞と共にインキュベートしたＣＴＬは、Ｔ１Ｄを誘導する能力の低下を示した（図３Ａ）。
【０１５４】
CoPP/OVAで処理したマウスの流入領域ＬＮから単離したCD11b+CD11clowLy6ChighF4/80+細胞と共にインキュベートしたＣＴＬでも同様の結果が得られ、これは、更に、CoPP及びＯＶＡを同時に注射したマウスにおいて観察されたＯＶＡ特異的ＣＴＬの寛容化にHO-1+MoDCが関与していたことを示唆する。この仮説を裏付けるように、本発明者らは、CoPP及びＯＶＡを同時に注射したマウスの流入領域ＬＮ由来のF4/80+細胞が、ＬＰＳに応答してより低いレベルのＩＬ−１２と、より高いレベルのＩＬ−１０とを分泌し（図３Ｂ）、そして、ＯＶＡのみを注射したマウスから精製した細胞と比べて、より低い表面レベルの同時刺激分子を発現することも見出した。更に、HO-1+ MoDCは、これら細胞に割り当てられる抗原特異的寛容特性に従ってＯＶＡを効率的にエンドサイトーシスした。
【０１５５】
HO-1+ MoDCは、ＣＴＬ速度を損なわせ、そして、ケモカインに応答する：本発明者らは、次に、ＭｏＤによるＣＴＬの寛容化の機序について調べ、この目的のために、本発明者らは、CoPP/OVA又はＯＶＡのみで免疫したマウスにおけるＯＶＡ特異的ＣＴＬの細胞毒性活性及び分布を比較した。インビボ細胞溶解アッセイを用いてＣＴＬ活性を測定したところ、両群において類似していた（図４Ａ）。更に、両群は、注射の２日間後（図４Ｂ）及び６日間後に、脾臓並びに流入領域及び膵ＬＮにおいて類似の数のＯＶＡ特異的ＣＴＬを示した。著しく対照的に、Ｔ細胞注射の１８時間後に実施したイメージング実験は、ＯＶＡで免疫したコントロール動物に比べてCoPP/OVAで免疫したマウスの方が膵島におけるＯＶＡ特異的ＣＴＬが少ないことを示したので、これは、HO-1+ MoDCが、非リンパ組織に遊走するＣＴＬの能力を変化させたことを示唆する。
【０１５６】
この問題について更に調べるために、本発明者らは、トランスウェル遊走アッセイにおいてこれら細胞の速度及びケモカイン勾配に応答する能力を測定するインビトロ実験を実施した。非寛容化コントロール細胞と比べて、寛容化ＣＴＬは、細胞速度の低下を示し（図４Ｃ）、そして、ケモカイン勾配に沿って遊走する能力の低下を示した（図４Ｄ）。
【０１５７】
ケモカイン受容体及び接着分子を含むＣＤ８＋Ｔ細胞の炎症組織への遊走に関与している２０個の表面マーカーの発現をモニタリングすることによって、CoPP/OVA及びＯＶＡで免疫したマウスにおいて異なる発現を示すものは存在しないことが明らかになった。
【０１５８】
ＨＯ−１誘導因子は、種をまたいで選択的にMoDCを動員する：本発明者らは、次に、同様の現象がヒトでも生じるかどうかについて調べた。この目的のために、本発明者らは、健常ヒトボランティア由来のＰＢＭＣをヘミンと共にインキュベートした。４時間後、これら細胞をＨＯ−１の発現について分析した。ヒヒで観察された通り、ヘミンは、ヒトMHC-II+CD11clowCD14+細胞において最高のＨＯ−１発現を誘導した（図５Ａ）。したがって、ヒト単球細胞株由来の細胞ＴＨＰ−１は、CoPP（図５Ｂ）又はヘミン（図５Ｃ）と共にインキュベートした際、用量依存的にＨＯ−１を発現した。ＴＨＰ−１細胞は、刺激時にＩＬ−１０及びＩＬ−１２を発現しないので、本発明者らは、これらの発現を比較することができなかった。しかし、未処理ＴＨＰ−１細胞と比べて、HO-1+ THP-1細胞は、より低いレベルの炎症サイトカインＩＬ−１βを分泌し、そして、より低い表面レベルの共刺激マーカーＣＤ４０及びＣＤ８６を発現した。更に、HO-1+ THP-1細胞は、ヒトＣＴＬの速度を低下させた。全体的に見て、これら結果は、臨床的に承認されているＨＯ−１誘導因子が種をまたいでMoDCを選択的に標的とすることを示し、そして、これら細胞がマウス及びヒトの両方においてＣＴＬを寛容化できることを示唆した。
【０１５９】
考察
化学物質（CoPP）及びヘム分解産物（例えば、ＣＯ）によって誘導されるＨＯ−１は、疾患の発症前に全身投与したとき、ＮＯＤマウスにおいてＴ１Ｄを阻害することが示されている（１４、１６）。しかし、これら処理の作用機序は、未だ完全には解明されていない。更に、これら全身処理は、副次的効果を有し得る。本文献では、本発明者らは、４週齢のマウスのＭＨＣクラスII陽性細胞におけるＨＯ−１の選択的誘導が、ＮＯＤマウスにおいてＴ１Ｄを阻害するのに十分であることを示した。この知見は、ＨＯ−１に基づく処置の効果についての機構的説明を提供する。また、ＮＯＤマウス由来の脾臓ＣＤ１１ｃ＋細胞が、非糖尿病対照であるＮＯＲマウス由来のものよりも低い基本レベルのＨＯ−１を発現したことも注目に値する。これは、ＨＯ−１、又はより可能性が高いのはその上流制御因子のうちの１つが、ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄ発現に関与している多くの遺伝子のうちの１つであり得ることを示唆する。ＨＯ−１を過剰発現している樹状細胞（１７、１８）又はマクロファージ（２５）によるＩＬ−１２サイトカイン分泌の阻害及びＩＬ−１０分泌の増加又は維持が、これら結果の主な原因であり得る（２６、２７）可能性がある。また、説明は、ＨＯ−１によって生成される一酸化炭素に曝露したとき、インテグリン発現の減少を通して、ナイーブ抗β膵島ＣＤ８＋Ｔ細胞を寛容化する樹状細胞の能力を含み得る（２８）。
【０１６０】
本発明者らは、限局性であって全身性ではないＨＯ−１の誘導をＴ１Ｄ処置の寛容原性ストラテジーとして用いることができると結論付けた。非経口又は鼻腔内のワクチン接種及び自己抗原の経口経路投与は、β細胞抗原に対する特異的寛容を誘導するために用いられている（２９）。これら処置は、時に、疾患の発症（３０）又はＣペプチドレベルの低下（３１）の遅延を誘導することが報告されているが、全体的に、これら結果は期待外れであった。特に、このような研究の結果は、抗原及びアジュバントの選択がこのストラテジーを確実に成功させるための最重要事項で有り得ることを示唆している。ＨＯ−１の誘導は、本発明者らのグループ（１８）及び他のグループ（１４）によって既に証明されている通り、病原性Ｔ細胞のプライミングを阻害する古典的なＤＣに寛容原性特性を付与する。
【０１６１】
本研究における最も顕著な結果のうちの１つは、ＨＯ−１を発現するように誘導したMoDCが、インビトロ及びインビボにおいて既に活性化しているＣＴＬを阻害できたことであった。また、MoDCは、炎症性マクロファージと並行して動員されるので炎症性ＤＣとも呼ばれる（２３）が、マクロファージとは対照的に、MoDCは、マウス及びヒトの両方においてＣＤ８＋細胞に抗原を効率的に交差提示することが示されている。この報告は、MoDCが活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して寛容原性特性を示し得ることの最初の証拠を提供する。この現象に関与する分子機序は、未知のままであるが、本結果において幾つかの糸口が提供される。本発明者らは、HO-1+ MoDCが高いレベルのＩＬ−１０を分泌し、そして、より低いレベルの共刺激分子を発現することを見出した。HO-1+ MoDCのこの表現型は、「寛容原性」機能に適合する。実際、MoDCによるアポトーシス性赤血球系細胞貪食の天然プロセス（血球貪食と呼ばれるプロセス）では、ＨＯ−１の発現増加（３２）及び抗ウイルスＣＴＬ活性を緩和するＩＬ−１０分泌（３３）の両方につながる。ＣＴＬ寛容化の機序に関して、本発明者らは、その増殖又は溶解活性が、インビボにおけるHO-1+ MoDCへの曝露後も損なわれないことを見出した。著しく対照的に、寛容化ＣＴＬは、RIP-OVAhighマウスの膵島中に存在しないことによって証明されている通り、非リンパ組織に遊走する能力が障害された。また、この欠陥は、速度の低下、及びインビトロにおいてケモカイン勾配に対して応答する能力の低下の両方に関連していた。この知見は、寛容化ＣＴＬの表現型についての有望な機構的説明を提供する。
【０１６２】
自己免疫疾患を治癒させるために寛容原性剤としてＨＯ−１又はその誘導体を用いる、以前のストラテジーの結果に対して改善を示すので（１４、１６）、ＨＯ−１誘導因子の皮内注射後に観察された寛容は、臨床的に関連しており、そして、抗原特異的であった。マウスで観察された通り、本発明者らは、非ヒト霊長類におけるＨＯ−１誘導因子の皮内注射によって、流入領域ＬＮにHO-1+ MoDCが出現することを見出した。最も重要なことに、ＨＯ−１誘導因子と共にインキュベートした際にＨＯ−１を発現するように誘導されたヒト単球細胞株由来の細胞は、２つの異なるヒトＣＴＬクローンの速度低下を示し、これは、更に、種をまたいで同じ寛容化機序が生じることを示唆している。本発明者らは、これは重要な知見であると考えているが、その理由は、Normosang（登録商標）及びPanhematin（登録商標）等のＨＯ−１誘導因子がヒトの急性ポルフィリン症の処置について既に承認されている（１２）ので、ヒトにおいてＴ１Ｄの発現を防ぐためにこの分子を使用することへの道筋をつけるためである。
【０１６３】
実施例２：実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における進行中のＣＴＬ応答の寛容化
材料及び方法
動物：C57BL/6マウスは、Inserm and European Union Guidelinesによって承認されている安全な条件下で維持した。６〜１０週齢のマウスを用いた。
【０１６４】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘導：簡潔に述べると、結核菌（mycobacterium tuberculosis）（４００μg、ＢＤ）及びＭＯＧ３５−５５ペプチド（２００μg、genecust）を補完した乳化完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ、sigma aldrich）を皮下注射することによってC57BL/6を免疫した。免疫時及び２日間後に百日咳毒素を注射する（２００ng、静脈内、ＶＷＲ）。ＥＡＥの臨床徴候を毎日評価し、そして、以下の通り採点した：０、正常；１、跛行尾；２、後肢の部分的麻痺；３、後肢の完全な麻痺；４、後肢の麻痺及び前肢の脱力；５、瀕死又は死亡。
【０１６５】
処置：予防的処置については、免疫時に、CoPPのみ（７０μg）、又はCoPP（７０μg）及びＭＯＧペプチド（２０μg）、又はＭＯＧペプチドのみ（２０μg）、又は無関係のクラスIIペプチドＯＶＡ（２０μg）と共にCoPP（７０μg）を各耳に１回注射することによりマウスを処理した。同じ注射を３日間隔で２回繰り返した。治癒的処置については、ＥＡＥの発症（すなわち、平均臨床スコア、０．７２±０．１）時に、予防的処置と同じ量を各耳に１回注射することによりマウスを処理した。ＥＡＥ発症後、同じ注射を３日間隔で２回繰り返した。
【０１６６】
結果
ＨＯ−１の誘導がＥＡＥモデルのＣＤ４＋Ｔ細胞について多少の抗炎症特性を示した（１４）ことを考慮して、本発明者らは、ＨＯ−１の発現及び抗原提示が同じＡＰＣにおいて同時に生じた場合、ＨＯ−１によって媒介される保護が抗原特異的作用を発揮し得るという仮説を立てた。低用量のCoPP（０．２mg/マウス）を用いたとき、本発明者らは、CoPPのみの皮内注射では、予防的（ＭＯＧ免疫後０、３、及び６日目にCoPP処理を投与）又は治癒的（ＥＡＥの最初の臨床徴候が出現した後、３日間隔で３回CoPPを投与）設定においてＥＡＥに対する寛容化に不十分であることを見出した（図６Ａ）。しかし、低用量のCoPPを同種抗原（MOG35-55クラスIIペプチド）と同時に皮内投与したとき、ミエリン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の寛容化が予防的又は治癒的に生じる（図６Ａ）。このような保護は、MOG35-55のみ又はCoPP及び無関係のペプチドを注射したマウスでは観察されず、これは、CoPPによって誘導される保護が抗原特異的であることを証明する（図６Ａ）。CoPPによって誘導されるＣＴＬの寛容化と同様に、ＭＯＧ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、CoPPを注射したマウス及び未処理マウスにおいて同じ増殖能を有する（図６Ｂ、Ｃ）。この保護は、CoPP MOGで処理したマウスのＣＮＳにおける浸潤の阻害と関連していた（図６Ｄ、Ｅ）。本発明者らは、予防的設定及び治癒的設定について、コントロールと比べてCoPP MOGで処理したマウスのＣＮＳにおいてＭＯＧ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数が有意に減少することを観察した（図６Ｆ、Ｇ）。興味深いことに、末梢分画（脾臓及びリンパ節）では、ＭＯＧ特異的Ｔ細胞の数は変化しておらず、これは、ＣＮＳにおけるＭＯＧ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の遊走が障害されたことを示唆する。
【０１６７】
全体的に見て、これら結果は、進行中の自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答が、その同種自己抗原及びCoPPを皮内注射した際、インビボで寛容化されることを証明する。
【０１６８】
実施例３：非ヒト霊長類の遅延型過敏（ＤＴＨ）における進行中のＴｈ１応答の寛容化
材料及び方法
【０１６９】
動物：非ヒト霊長類：ヒヒ（Papio anubis、CNRS Primatology Center, Rousset, Franceから入手）は、全ての検疫試験について陰性であった。動物は、Institutional Ethical Guidelines of the Institut National de la Sante Et de la Recherche Medicale, Franceの推奨に従って本発明者らの研究室の大型動物施設で飼育した。
【０１７０】
Normosang（登録商標）による皮内免疫：３頭のヒヒの鼠径襞に、それぞれ、臨床ヘミン（Normosang（登録商標）） ６．２５mg（５００μL）、１２．５mg（５００μL）、又は２５mg（１mL）を皮内注射した。未処理ヒヒは、コントロールとして機能した。皮内注射の２４時間後に鼠径リンパ節を外科的に除去した。コラゲナーゼＤ（Sigma-Aldricht）を用いて酵素的にリンパ節を解離させることによってフローサイトメトリー分析用の単一細胞懸濁液を調製した。全ての実験は、Zoletil（Virbac, Carron, France）による全身麻酔下で実施した。
【０１７１】
ＤＴＨアッセイについては、４頭のヒヒの２つの鼠径襞に、１．２mL中ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ；Symbiotics Corporation, San Diego, CA, USA） ２５mg＋２０００UIを皮内注射した。
【０１７２】
ＢＣＧワクチン接種及びＤＴＨアッセイ：ＤＴＨ皮膚試験の４及び２週間前、脚の上方領域にカルメット−ゲラン杆菌ワクチン（ＢＣＧ）ワクチン（０・１mL；２〜８×１０  ５UFS；Sanofi Pasteur MSD, Lyon, France）で２回ヒヒを皮内（i.d.）免疫した。動物の背中の右側の皮膚に０．１mL中ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ；Symbiotics Corporation, San Diego, CA, USA） ２用量（２０００UI又は４０UI）をデュープリケートで皮内注射することによって、背中で皮内反応（ＩＤＲ）を実施した。生理食塩水（０・１mL）をネガティブコントロールとして用いた。ノギスを用いて注射部位における皮膚応答を測定した。３〜８日目に２人の観察者によって各硬化性紅斑の直径を測定し、そして、直径が＞４mmのとき、陽性であるとみなした。読み取り値の平均を記録した。ヘミン（Normosang（登録商標））及びツベルクリン精製タンパク質誘導体 ２０００IUを１回動物に皮内注射した４日間、１、２、及び３ヶ月間後に他のＩＤＲを実施した。
【０１７３】
結果
ＨＯ−１誘導因子が霊長類においてHO-1+MoDCを誘導することができるかどうかについて調べるために、本発明者らは、ヒトにおいて急性ポルフィリン症の処置について承認されているＨＯ−１誘導因子である臨床等級のヘミン（Normosang（登録商標））をヒヒに皮内注射した１０。ヘミンの注射は、流入領域ＬＮにおけるＨＯ−１＋細胞の頻度を用量依存的に増加させたが、対側ＬＮでは増加させなかった（図７Ａ、Ｃ）。これらＨＯ−１＋細胞は、MHC-II+、CD11c+、及びCD14陰性細胞（図７Ｄ）とは対照的に、MHC-II、CD11c、及びCD14（図７Ｂ、Ｃ）を発現し、これは、これらがMoDCであることを更に示唆する。
【０１７４】
霊長類において抗原特異的寛容を誘導するためにＨＯ−１誘導因子を用いることができるかどうかについて調べるための最初の工程として、本発明者らは、ヒヒにおける遅延型過敏（ＤＴＨ）モデルを用いた。動物をＢＣＧワクチンで免疫し、そして、ツベルクリン皮内反応（ＩＤＲ）で５ヶ月間にわたって３回連続曝露した（図７Ｅ）。これら動物は、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）の注射後３〜７日間持続する、測定可能かつ再現可能な紅斑（最小サイズ４mm）を示した（図７Ｆ）。最後のＩＤＲの６ヶ月間後、Normosang及びツベルクリンを皮内注射することによって動物を寛容化した。寛容化の４日間、１、２、及び３ヶ月間後、ＩＤＲを評価した。寛容化プロトコール後ＩＤＲの大きな低減が観察され、３ヶ月目に進行性再発した（図７Ｆ）。
【０１７５】
結論として、ＢＣＧワクチン接種したヒヒにおける臨床ヘミン及びツベルクリンの皮内投与によって、少なくとも２ヶ月間、ツベルクリンに対するＴ細胞メモリ応答が抑制された。
【０１７６】
参照文献：
本願全体を通して、本発明が関連する技術分野の状況について様々な参照文献に説明されている。これら参照文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【０１７７】
【表１】
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2017533238.tif 000003
2017533238.tif 000004
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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