(57)【要約】  本発明は、植物における２ｎ配偶子の産生をもたらす、ＴＤＭ遺伝子の優性突然変異、前記突然変異を含む植物、及び植物育種におけるそれらの使用に関する。本発明は、ＴＤＭ遺伝子の優性突然変異と、植物における減数分裂組換えに関与する遺伝子及び減数分裂の間の動原体の単極配向に関与する遺伝子の不活性化が組み合わさった植物にも関する。アポマイオシス性配偶子を産生するこれらの植物は、植物育種においても有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する植物を得るための方法であって、
ランダム突然変異誘発若しくは標的化突然変異誘発によって、又は遺伝子形質転換によって、本明細書ではＴＤＭタンパク質と称されるタンパク質をコードする、本明細書ではＴＤＭ遺伝子と称される遺伝子に優性突然変異を含む植物をもたらすステップを含み、
該タンパク質が、該植物がアブラナ属の種（ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ）である場合には配列番号１のＴＤＭタンパク質のアミノ酸残基１〜２８６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか、又は該植物がアブラナ属の種（ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ）とは異なる場合には該残基に対して少なくとも３０％の同一性を有し、該タンパク質の最初の６０アミノ酸が、本明細書ではＴＰＰ／Ｑモチーフと称されるモチーフＸ１Ｘ２Ｘ３（Ｘ１は、トレオニン（Ｔ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）であり、Ｘ３はプロリン（Ｐ）又はグルタミン（Ｑ）である）を含み、
該優性突然変異が、該ＴＤＭタンパク質のモチーフＸ１Ｘ２Ｘ３の少なくとも１つの残基の突然変異を含み、第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する能力を該植物にもたらす方法。
【請求項２】
前記モチーフが、配列番号１の１６〜１８位に位置付けられる、前記タンパク質の領域内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記残基が、Ｔ残基又はその隣のＰ残基である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記突然変異が、前記Ｔ残基及び／又はＰ残基の異なる残基による置換、並びに前記Ｔ残基及び／又はＰ残基の、単独で又は前記Ｔ残基及び／若しくはＰ残基に隣接する１若しくは２残基を伴う欠失からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記突然変異により、前記モチーフの前記Ｔ残基におけるリン酸化が抑止される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ランダム突然変異誘発若しくは標的化突然変異誘発によって、ＴＤＭ遺伝子の対立遺伝子に前記優性突然変異を有する植物であって、この突然変異についてヘテロ接合性である植物をもたらすステップを含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物がトランスジェニック植物であり、
ａ）少なくとも１つの植物細胞を、前記優性突然変異を有するＴＤＭ遺伝子を含むＤＮＡ構築物を含有するベクターを用いて形質転換するステップと、
ｂ）該形質転換された植物細胞を培養して、ゲノム内に該ＤＮＡ構築物を含有する導入遺伝子を有する植物を再生する、ステップと
を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アポマイオシス性配偶子を産生する植物を得るための方法であって、
ａ）請求項１から７までのいずれか一項に記載のＴＤＭ遺伝子に前記優性突然変異を含む植物をもたらすステップと、
ｂ）該植物において植物における減数分裂組換えの開始に関与する第１のタンパク質を阻害するステップであって、該タンパク質が、
−  ＳＰＯ１１−１タンパク質と称されるタンパク質であって、配列番号２９のＳＰＯ１１−１タンパク質に対して、少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも６０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＳＰＯ１１−２タンパク質と称されるタンパク質であって、配列番号３０のＳＰＯ１１−２タンパク質に対して、少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも６０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＰＲＤ１タンパク質と称されるタンパク質であって、配列番号３１のＰＲＤ１タンパク質に対して、少なくとも２５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも３５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＰＲＤ２タンパク質と称されるタンパク質であって、配列番号３２のＰＲＤ２タンパク質に対して、少なくとも２５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも３５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＰＡＩＲ１タンパク質と称されるタンパク質であって、配列番号３３のＰＡＩＲ１タンパク質に対して少なくとも３０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＤＦＯタンパク質と称されるタンパク質であって、配列番号３４のＤＦＯタンパク質に対して少なくとも３０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３５、４０、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質
の中から選択される該ステップと、
ｃ）該植物においてＲＥＣ８タンパク質と称される第２のタンパク質を阻害するステップであって、該タンパク質が、配列番号３５のＲＥＣ８タンパク質に対して少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも４５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有する該ステップと
を含む方法。
【請求項９】
ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ、ＰＡＩＲ１、又はＲＥＣ８タンパク質のうちの少なくとも１つの阻害が、前記タンパク質をコードする遺伝子又はそのプロモーターの突然変異誘発、及び、前記タンパク質の活性を部分的に又は完全に失った突然変異体の選択によって得られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ、ＰＡＩＲ１又はＲＥＣ８タンパク質のうちの少なくとも１つの阻害が、前記植物において、前記タンパク質をコードする遺伝子を標的とするサイレンシングＲＮＡを発現させることによって得られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の優性突然変異を有するＴＤＭ遺伝子を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する植物であって、第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する能力を該植物にもたらす前記優性突然変異を、ＴＤＭタンパク質のモチーフΧ１Χ２Χ３に含む植物。
【請求項１３】
請求項１１に記載のＤＮＡ構築物を含む導入遺伝子を含有するトランスジェニック植物である、第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する植物。
【請求項１４】
請求項８から１０までのいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、アポマイオシス性配偶子を産生する植物であって、第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する能力を該植物にもたらす前記優性突然変異を、ＴＤＭタンパク質のモチーフＸ１Ｘ２Ｘ３に含む植物。
【請求項１５】
第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生させるための方法であって、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法によって得ることができる植物を培養するステップであって、該植物が、第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する能力を該植物にもたらす前記優性突然変異を、ＴＤＭタンパク質のモチーフＸ１Ｘ２Ｘ３に含む該ステップと、該植物によって産生される配偶子を回収するステップとを含む方法。
【請求項１６】
アポマイオシス性配偶子を産生させるための方法であって、請求項８から１０までのいずれか一項に記載の方法によって得ることができる植物を培養するステップであって、該植物が、第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する能力を該植物にもたらす前記優性突然変異を、ＴＤＭタンパク質のモチーフＸ１Ｘ２Ｘ３に含む該ステップと、該植物によって産生される配偶子を回収するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物における２ｎ配偶子の産生をもたらす、ＴＤＭ遺伝子の優性突然変異、前記突然変異を含む植物、及び植物育種におけるそれらの使用に関する。本発明は、ＴＤＭ遺伝子の優性突然変異と、植物における減数分裂組換えに関与する遺伝子及び減数分裂の間の動原体の単極配向に関与する遺伝子の不活性化が組み合わさった植物にも関する。アポマイオシス性（ａｐｏｍｅｉｏｔｉｃ）配偶子を産生するこれらの植物は、植物育種においても有用である。
【背景技術】
【０００２】
減数分裂は、大多数の開花植物などの有性再生する真核生物の生活環における重要なステップである。
【０００３】
正常な減数分裂では、染色体がまず複製され、その結果、姉妹染色分体の対が生じる。この複製のラウンドの後に、第一減数分裂及び第二減数分裂として公知の２ラウンドの分裂が続く。第一減数分裂の間に、相同染色体が組み換えられ、２つの細胞区画に分離され、そのそれぞれが染色体の一倍体内容物全体を１つ含む。第二減数分裂では、第一減数分裂によって生じる２セットの染色体がさらに分裂し、姉妹染色分体が分離する。したがって、この分裂によって生じる４つの胞子は一倍体（ｎ）であり、組み換えられた遺伝情報を有する。
【０００４】
これと比較すると、二倍体細胞における有糸分裂の間には、染色体が複製され、姉妹染色分体が分離して、二倍体（２ｎ）であり始原細胞と遺伝的に同一である娘細胞が生成する。
【０００５】
減数分裂の間の例外によって生じる異常な配偶子が、作物を含めたいくつかの目的の植物の遺伝学的改善に有用であることが示されている（総説については、例えば、ＲＡＭＡＮＮＡ＆ＪＡＣＯＢＳＥＮ、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ２００３年、１３３巻、３〜１８頁を参照されたい）。特に、２ｎ及びアポマイオシス性配偶子は、それらの遺伝的多様性を植物育種プログラムにおいて使用するために、倍数体植物の作製、又は倍数性レベルが異なる植物、例えば、四倍体作物植物とそれらの二倍体近縁野生種の交配に有用である。２ｎ及びアポマイオシス性配偶子は、遺伝子マッピングの方法においても使用することができる。アポマイオシス性配偶子はまた、アポミクシス植物、すなわち、胚珠の母系組織から種子を形成し、その結果、母系親の遺伝子クローンである後代をもたらすことができる植物の作製のためにも関心が持たれる。
【０００６】
２ｎ配偶子（二倍体配偶子としても公知）は、配偶体染色体数ではなく体細胞染色体数を有する配偶子である。２ｎ配偶子形成をもたらす異常としては、特に、異常な細胞質分裂、第一減数分裂若しくは第二減数分裂のスキップ、又は異常な紡錘幾何学的形状が挙げられる（総説については、Ｖｅｉｌｌｅｕｘ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９８５年、３巻、２５２〜２８８頁、又はＢｒｅｔａｇｎｏｌｌｅ＆Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ、１９９５年、１２９巻、１〜２２頁を参照されたい）。これらの異常により、異なるクラスの減少していない配偶子が生じる。例えば、第一減数分裂のスキップにより、第一分裂復旧（Ｆｉｒｓｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）（ＦＤＲ）配偶子が生じ、第二減数分裂が起こらないことにより、第二分裂復旧（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）（ＳＤＲ）配偶子が生じる。２ｎ配偶子を産生することができる多数の突然変異体が種々の植物種において報告されている。しかし、これらの植物において二倍体配偶子の形成に関与する突然変異は特徴付けられていない。
【０００７】
アポマイオシス性配偶子は、始原細胞と遺伝的に同一であり、親の遺伝情報を全て保持する配偶子である。アポマイオシス性配偶子産生は、アポミクシスの重要な構成要素の１つである（Ｂｉｃｋｎｅｌｌ＆Ｋｏｌｔｕｎｏｗ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２００４年、１６巻、Ｓ２２８〜４５頁）。４００種を超える植物がアポミクシス性であるが、それらに含まれる作物種はわずかである。さらに、交配によってこの形質を導入するための試みは上手く行っていない（「アポミクシスの開花：機構から遺伝子工学まで（Ｔｈｅ  Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｐｏｍｉｘｉｓ：Ｆｒｏｍ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、２００１年；Ｅｄｉｔｏｒ：Ｓａｖｉｄａｎら；Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：ＣＩＭＭＹＴ、ＩＲＤ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ＤＧ  ＶＩ（ＦＡＩＲ）、ＭＥＸＩＣＯ、２００１年。Ｓｐｉｌｌａｎｅら、Ｓｅｘｕａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、２００１年、１４巻、１７９〜１８７頁）。
【０００８】
現在まで、２ｎ又はアポマイオシス性の花粉の形成に関係づけられる遺伝子はほんの数種しか同定されていない。
【０００９】
ＡｔＰＳ１（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）  ＰＡＲＡＬＬＥＬ  ＳＰＩＮＤＬＥＳ）の不活性化により、二倍体雄性胞子が生成し、それにより、遺伝情報が組み換えられた生存可能な二倍体花粉粒及び後代に自生三倍体植物が生じる（ＷＯ２０１０／００４４３１；ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、２００８年、４巻、ｅ１０００２７４頁）。
【００１０】
ＴＡＭ（遅発性同期性減数分裂（ＴＡＲＤＹ  ＡＳＹＮＣＨＲＯＮＯＵＳ  ＭＥＩＯＳＩＳ）、ＣＹＣＡ１；２としても公知）の不活性化又はＯＳＤ１（第二分裂の省略（ＯＭＭＩＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＳＥＣＯＮＤ  ＤＩＶＩＳＩＯＮ））の不活性化により、第一減数分裂後に減数分裂の早期終了がもたらされ、したがって、遺伝情報が組み換えられた二倍体胞子及びＳＤＲ配偶子が産生される（ｄ’Ｅｒｆｕｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、２０１０年、６巻、ｅ１０００９８９頁；ｄ’Ｅｒｆｕｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、２００９年、７巻、ｅ１０００１２４頁；ＷＯ２０１０／０７９４３２）。
【００１１】
ＳＰＯ１１−１は、植物における効率的な減数分裂組換えに必要なタンパク質をコードし、その阻害により、組換え及び対形成が排除され（Ｇｒｅｌｏｎら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．、２００１年、２０巻、５８９〜６００頁）、ＲＥＣ８（Ａｔ２ｇ４７９８０）は、減数分裂の間の動原体の単極配向に必要なタンパク質をコードし（Ｃｈｅｌｙｓｈｅｖａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、２００５年、１１８巻、４６２１〜３２頁）、その阻害により、染色分体の分離が改変される。Ａｔｓｐｏ１１−１突然変異体は、不均衡な第一分裂、及びその後に第二分裂を受け、それにより、不均衡な胞子及び不稔性が生じる。Ａｔｓｐｏ１１−１／Ａｔｒｅｃ８二重突然変異体は、正常な第一減数分裂の代わりに有糸分裂様分裂、その後に不均衡な第二分裂を受け、それにより、不均衡な胞子及び不稔性が生じる（Ｃｈｅｌｙｓｈｅｖａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、２００５年、１１８巻、４６２１〜３２頁）。
【００１２】
三重ｏｓｄ１／ｓｐｏ１１−１／ｒｅｃ８突然変異体では、ｓｐｏ１１−１突然変異及びｒｅｃ８突然変異が存在することにより有糸分裂様の第一減数分裂が生じ、ｏｓｄ１突然変異が存在することにより第二減数分裂の発生が妨げられる。したがって、減数分裂は、その後の有性プロセスに影響を及ぼすことなく有糸分裂で完全に置き換えられる。したがって、ｏｓｄ１／ｓｐｏ１１−１／ｒｅｃ８突然変異体は、減数分裂の代わりに有糸分裂（Ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｎｓｔｅａｄ  ｏｆ  Ｍｅｉｏｓｉｓ）の意味で、ＭｉＭｅと称される（ｄ’Ｅｒｆｕｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、２００９、７、ｅ１０００１２４頁及びＷＯ２０１０／０７９４３２）。ＭｉＭｅ突然変異体から得られる胞子及び配偶子は始原細胞と遺伝的に同一である。
【００１３】
したがって、現在まで、２ｎ又はアポマイオシス性配偶子を産生することができる植物の工学的作製は限られた数の遺伝子に制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、２ｎ又はアポマイオシス性配偶子を高頻度で産生するように改変することができる遺伝子の数を増加させるために、植物におけるこれらの配偶子の形成に関係づけられる他の遺伝子が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ＴＤＭ（３分裂突然変異体（ＴＨＲＥＥ−ＤＩＶＩＳＯＩＮ  ＭＵＴＡＮＴ））遺伝子は、ＴＤＭ１、ＭＳ５（タンパク質雄性不稔性５（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＭＡＬＥ  ＳＴＥＲＩＬＥ  ５））又はＰＯＬＬＥＮＬＥＳＳ３とも称され、植物において保存されている小さなタンパク質ファミリーに属するタンパク質をコードする。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＴＤＭ遺伝子の配列は、ＴＡＩＲデータベースにおいて受託番号Ａｔ４ｇ２０９００の下で、又はＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて受託番号ＮＣ＿００３０７５．７の下で入手可能である。これは、配列が添付の配列表において配列番号１として表されている４３４アミノ酸（ａａ）のタンパク質をコードする。
【００１６】
ＴＤＭ遺伝子は、減数分裂の最後に第二減数分裂を終了させるために必要であるといわれている。ＴＤＭ突然変異により、正常な第一減数分裂及び第二減数分裂後の異常な第三減数分裂の開始によって引き起こされる、多分胞子の形成及び雄性不稔性がもたらされる。ｔｄｍ突然変異体は、Ｃ末端の３０５アミノ酸又は１１２アミノ酸を欠く切断型ＴＤＭタンパク質をコードする遺伝子をもたらす突然変異を有することが示された（Ｂｕｌａｎｋｏｖａら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２０１０年、２２巻、３７９１〜３８０３頁；Ｃｒｏｍｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、２０１２年、８巻、ｅ１００２８６５２０１２頁；Ｇｌｏｖｅｒら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９８年、１５巻、３４５〜３５６頁；Ｒｏｓｓら、Ｃｈｒｏｍ．Ｒｅｓ．、１９９７年、５巻、５５１〜５５９頁；ＷＯ／９７３０５８１）。
【００１７】
対照的に、本明細書で示されているように、本発明者らは、減数分裂の第二減数分裂前の早期終了、したがって、遺伝情報が組み換えられた二倍体の雄性及び雌性ＳＤＲ配偶子並びに二倍体胞子の産生がもたらされる、ＴＤＭ遺伝子の優性突然変異を同定した。さらに、ＴＤＭ遺伝子の優性突然変異をｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８二重突然変異体に導入することによりＭｉＭｅ突然変異体が生じることも示した。
【００１８】
したがって、本発明者らは、植物における２ｎ及びアポマイオシス性配偶子の形成に関係づけられる別の遺伝子を同定した。
【００１９】
劣性であり、したがって、一次突然変異体（突然変異についてヘテロ接合性である）を自家受精させて突然変異についてホモ接合性の植物を得る追加的なステップを必要とする、二倍体配偶子産生に関与する他の突然変異と比較して、優性であるＴＤＭ遺伝子の突然変異には、このステップは必要ない。ＴＤＭ遺伝子の優性突然変異を有する一次突然変異体は、２ｎ配偶子を産生することができる。
【００２０】
したがって、本発明は、第二分裂復旧（ＳＤＲ）２ｎ配偶子を産生する植物を得るための方法であって、
本明細書ではＴＤＭタンパク質と称されるタンパク質をコードする、本明細書ではＴＤＭ遺伝子と称される遺伝子に優性突然変異を含む植物をもたらすステップを含み、
該タンパク質が、該植物がアブラナ属の種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ）である場合には配列番号１のＴＤＭタンパク質のアミノ酸残基１〜２８６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか、又は該植物がアブラナ属の種とは異なる場合には該残基に対して少なくとも３０％の配列同一性を有し、該タンパク質の最初の６０アミノ酸が、本明細書ではＴＰＰ／Ｑモチーフと称されるモチーフＸ１Ｘ２Ｘ３（Ｘ１はトレオニン（Ｔ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐ）であり、Ｘ３はプロリン（Ｐ）又はグルタミン（Ｑ）である）を含み、
該優性突然変異が、ＳＤＲ  ２ｎ配偶子を産生する能力を植物にもたらす方法を提供する。
【００２１】
以下の説明では、標準の１文字アミノ酸コードを使用する。
【００２２】
ＴＤＭ遺伝子及びタンパク質配列は、例えば、限定することなく、Ｐｌａｚａデータバンク（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｐｌａｚａ／）及びｐｈｙｔｏｚｏｍｅ  ｗｅｂ  ｐｏｒｔａｌ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／（ｐｈｙｔｏｓｏｍｅ  ｖ９．１）などの公共のデータベースにおいて入手可能である。
【００２３】
ＴＤＭタンパク質についてのタンパク質配列同一性は、初期パラメータを用いたＴ−Ｃｏｆｆｅｅ（ｖ６．８５）（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｋｉｔ．ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｔ＿ｃｏｆｆｅｅ）を使用した配列アラインメント後に配列番号１の残基１〜２８６に対して算出し、百分率同一性は、このアラインメントから、Ｂｉｏｅｄｉｔ  ７．２．５（Ｈａｌｌ、Ｔ．Ａ．、１９９９年、ＢｉｏＥｄｉｔ：ウィンドウズ（登録商標）９５／９８／ＮＴ用の使用者が操作しやすい生物学的配列アラインメントエディター及び分析プログラム（ａ  ｕｓｅｒ−  ｆｒｉｅｎｄｌｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｅｄｉｔｏｒ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ９５／９８／ＮＴ．）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１巻：９５〜９８頁）を使用して得られる。
【００２４】
種のそれぞれがＴＤＭ遺伝子を１つ又は２つ、通常は１つ有する（図１及び２及び表Ｉ）。ＴＤＭタンパク質は、種に応じて、約４００〜約８５０アミノ酸からなる（図１）。ＴＤＭタンパク質の最初の半分は、図１に示されている種々の被子植物種由来のＴＤＭタンパク質のアラインメントで示される通り、保存されている。具体的には、全てのＴＤＭタンパク質の最初の６０アミノ酸が保存されたＴＰＰ／Ｑモチーフを含む（図１）。
【００２５】
種々の被子植物種由来のＴＤＭタンパク質と配列番号１のＴＤＭタンパク質の残基１〜２８６の百分率配列同一性を、初期パラメータを用いたＴ−Ｃｏｆｆｅｅ（ｖ６．８５）（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｋｉｔ．ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｔ＿ｃｏｆｆｅｅ）を使用した多数の配列アラインメント後に算出した。このアラインメントから、Ｂｉｏｅｄｉｔ  ７．２．５（Ｈａｌｌ、Ｔ．Ａ．、１９９９年、ＢｉｏＥｄｉｔ：ウィンドウズ（登録商標）９５／９８／ＮＴ用の使用者が操作しやすい生物学的配列アラインメントエディター及び分析プログラム（ａ  ｕｓｅｒ−  ｆｒｉｅｎｄｌｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｅｄｉｔｏｒ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ９５／９８／ＮＴ．）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１巻：９５〜９８頁）を使用して同一性行列を得た。結果を以下の表Ｉに示す。
【００２６】
【表１】
2017520240.tif 000003
【００２７】
配列番号１のＴＤＭタンパク質のアミノ酸残基１〜２８６に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する配列は、配列番号１のＴＤＭタンパク質のアミノ酸残基１〜２８６に対して少なくとも５０％の配列類似性(sequence similarity)を有する。したがって、アブラナ属の種以外の植物のＴＤＭタンパク質は、その代わりに、配列番号１のＴＤＭタンパク質のアミノ酸残基１〜２８６に対して少なくとも５０％の配列類似性を有し、該タンパク質の最初の６０アミノ酸にＴＰＰ／Ｑモチーフを含むものとして定義される。
【００２８】
本発明に従って産生されるＳＤＲ  ２ｎ配偶子は、例えば、倍数体植物を作製するため、又は倍数性レベルが異なる植物の２ｎ配偶子間の交配を可能にするための通常の適用の全てにおいて有用である。本発明に従って産生されるＳＤＲ  ２ｎ配偶子は、遺伝子マッピングの方法、例えば、ＷＯ２００６／０９４７７４に開示されている「逆後代マッピング（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｇｅｎｙ  ｍａｐｐｉｎｇ）」の方法においても有用である。
【００２９】
第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する植物を得るための方法の好ましい実施形態によると、前記タンパク質は、該植物がアブラナ属の種とは異なる場合には、配列番号１のＴＤＭタンパク質に対して少なくとも３５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）配列同一性を有するか、又は該植物がアブラナ属の種である場合には、配列番号１のＴＤＭタンパク質に対して少なくとも８０％及び好ましさが増す順で、少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有する。第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する植物を得るための方法の別の好ましい実施形態によると、前記ＴＰＰ／Ｑモチーフは、配列番号１の１６〜１８位により位置付けられる、前記タンパク質の領域内にある。
【００３０】
本発明によると、前記優性突然変異はＴＤＭ遺伝子の対立遺伝子又はＴＤＭ導入遺伝子にあり、ＴＤＭ遺伝子又は導入遺伝子は、例えば、表Ｉに記載のものなどの任意の植物種に由来する。したがって、ＳＤＲ  ２ｎ配偶子を産生することが可能な植物は、ＴＤＭ遺伝子の標的化突然変異誘発若しくはランダム突然変異誘発によって、又は遺伝子形質転換によって得られる。
【００３１】
ＳＤＲ  ２ｎ配偶子を産生することが可能な植物を得るための本発明の方法の好ましい実施形態によると、該方法は、
−  ＴＤＭ遺伝子の対立遺伝子に前記優性突然変異を有する植物であって、この突然変異についてヘテロ接合性又はホモ接合性である植物をもたらすステップ
を含む。
【００３２】
ＴＤＭ遺伝子の突然変異誘発は、標的化突然変異誘発であってもランダム突然変異誘発であってもよい。例えばＥＭＳ突然変異誘発によるランダム突然変異誘発の後には、所望の遺伝子の突然変異体のスクリーニングを行う。ハイスループットな突然変異誘発及びスクリーニングの方法が当技術分野で利用可能である。例として、ＴＩＬＬＩＮＧ（ＭｃＣａｌｌｕｍらによる「ゲノム内への誘導局所変異のターゲティング（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０００年、１２３巻、４３９〜４４２頁）を挙げることができる。標的化突然変異誘発は当技術分野で公知の標準の技法を使用して実施され、好ましくは、例えばＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲなどのヌクレアーゼと組み合わせて、相同組換えを使用する。
【００３３】
ＳＤＲ  ２ｎ配偶子を産生することが可能な植物をもたらすための本発明の方法の別の好ましい実施形態によると、該植物は、トランスジェニック植物であり、該方法は、
ａ）少なくとも１つの植物細胞を、前記優性突然変異を有するＴＤＭ遺伝子を含むＤＮＡ構築物を含有するベクターを用いて形質転換するステップと、
ｂ）ゲノム内に該ＤＮＡ構築物を含有する導入遺伝子を有する植物を再生するために、該形質転換された植物細胞を培養するステップと
を含む。
【００３４】
ＤＮＡ構築物は、それが導入される植物と同じ種又は異なる種のいずれかに由来するＴＤＭ遺伝子を含む。
【００３５】
ＴＤＭ遺伝子の突然変異の中で、ＳＤＲ  ２ｎ配偶子を産生する能力をもたらすものは、この突然変異についてヘテロ接合性である植物の表現型特性に基づいて同定することができる：これらの植物は、減数分裂の産物として、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、及び最大１００％の二分胞子を形成し得る。
【００３６】
或いは、ＳＤＲ  ２ｎ配偶子を産生する能力を突然変異体又はトランスジェニック植物にもたらすＴＤＭ遺伝子の優性突然変異は、シロイヌナズナ（Ａ．Ｔｈａｌｉａｎａ）ｓｐｏ１１／ｒｅｃ８二重突然変異体の稔性を回復させるそれらの能力によって同定することができ、ここで、稔性ｓｐｏ１１／ｒｅｃ８／ｔｄｍ三重突然変異体は、シロイヌナズナｓｐｏ１１／ｒｅｃ８二重突然変異体を優性突然変異のスクリーニングのために使用し、次いで、優性突然変異を目的の植物に導入する本出願の実施例において実証されている通り、ＴＤＭ突然変異についてヘテロ接合性である。
【００３７】
第二分裂復旧２ｎ配偶子を産生する植物を得るための本発明の方法の別の好ましい実施形態によると、前記優性突然変異は、保存されたＴＰＰ／Ｑモチーフの少なくとも１つの残基の突然変異を含む又はそれからなる。
【００３８】
突然変異は、置換、挿入又は欠失、好ましくは置換又は欠失であってよい。
【００３９】
より好ましい実施形態では、前記優性突然変異は、Ｔ残基及び／又はその隣のＰ残基の突然変異を含む又はそれからなる。ＴＰは、潜在的なリン酸化部位である。本出願の実施例により、Ｔ１６残基又はＰ１７残基の突然変異によって早期減数分裂終了を優性に付与すること可能であることが実証される。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、これらの結果を考慮して、ＴＤＭがリン酸化によって調節されて、第一減数分裂から第二減数分裂への移行が確実になると考える。
【００４０】
したがって、突然変異は、前記モチーフのＴ残基のリン酸化を抑止する突然変異、すなわち、ＴＰリン酸化部位を破壊する突然変異であることが有利である。
【００４１】
前記突然変異は、例えば、ＴがＡで置換され、ＰがＬで置換されるなど、前記Ｔ残基及び／又はＰ残基（単数又は複数）の異なる残基による置換が有利である。或いは、前記突然変異は、Ｔ残基及びＰ残基、最終的には前記Ｔ残基及び／又はＰ残基に隣接する追加的な残基の欠失、例えば、１〜１０残基、好ましくは１〜５残基、なおより好ましくは１又は２残基の欠失などである。
【００４２】
本発明の別の態様は、上で定義された通り、ＳＤＲ  ２ｎ配偶子を産生する能力を突然変異体／トランスジェニック植物にもたらす前記優性突然変異を有するＴＤＭ遺伝子を含むＤＮＡ構築物に関する。ＴＤＭ遺伝子は、それが導入される植物と同じ種に由来するものであっても異なる種に由来するものであってもよい。ＤＮＡ構築物は、ＴＤＭ遺伝子を発現可能な形態で含む。ＴＤＭ遺伝子は、植物細胞において機能的なプロモーターの転写制御下に置くことが好ましい。プロモーターは、前記ＴＤＭ遺伝子の内在性プロモーターなどのＴＤＭ遺伝子プロモーターであっても、植物において機能的な別のプロモーターであってもよい。
【００４３】
植物において異種遺伝子を発現させるために適したプロモーターの広範な選択が当技術分野において利用可能である。
【００４４】
プロモーターは、例えば、植物、植物ウイルス、又はアグロバクテリウムなどの細菌から得ることができる。プロモーターとしては、構成的プロモーター、すなわち、大多数の組織及び細胞において、及び大多数の環境条件下で活性であるプロモーター、及び、ある特定の組織若しくはある特定の細胞型においてのみ、又は主にある特定の組織若しくはある特定の細胞型において活性である組織特異的又は細胞特異的プロモーター、並びに、線形動物感染によって生じるものなどの、物理的又は化学的刺激によって活性化される誘導性プロモーターが挙げられる。プロモーターは、減数母細胞において機能的であるように選択する。
【００４５】
植物細胞において一般に使用される構成的プロモーターの非限定的な例は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｎｏｓプロモーター、ルビスコプロモーター、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーターである。
【００４６】
本発明において使用することができる器官又は組織特異的プロモーターとしては、特に、減数分裂に関連する発現を付与することが可能なプロモーター、例えばＤＭＣ１プロモーター（ＫＬＩＭＹＵＫ＆ＪＯＮＥＳ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１９９７年、１１巻、１〜１４頁）などが挙げられる。
【００４７】
一般に、本発明のＤＮＡ構築物として、転写ターミネーター（例えば、３５Ｓ転写ターミネーター、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）転写ターミネーター又はＴＤＭ遺伝子ターミネーター）も挙げられる。
【００４８】
本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含有する組換えベクターも含む。古典的には、前記組換えベクターとして、形質転換された宿主の選択を可能にする１つ又は複数のマーカー遺伝子も挙げられる。
【００４９】
適切なベクター及びそれにＤＮＡ構築物を挿入するための方法の選択は、当業者には周知である。ベクターの選択は、意図された宿主及び該宿主の意図された形質転換方法に依存する。多くの植物種、双子葉植物又は単子葉植物に関して、植物細胞又は植物体を遺伝子形質転換するための種々の方法が当技術分野において利用可能である。非限定的な例として、ウイルス媒介性形質転換、微量注射による形質転換、電気穿孔による形質転換、微粒子銃媒介性形質転換、アグロバクテリウム媒介性形質転換などを挙げることができる。
【００５０】
本発明は、本発明の組換えＤＮＡ構築物を含む宿主細胞も提供する。前記宿主細胞は、原核細胞、例えば、アグロバクテリウム細胞であってもよく、真核細胞、例えば、本発明のＤＮＡ構築物によって遺伝的に形質転換された植物細胞であってもよい。構築物は、一過性に発現させることができ、安定な染色体外レプリコンに組み入れることも、染色体に組み込むこともできる。
【００５１】
本発明者らは、さらに、ＴＤＭ突然変異における優性突然変異と、一方は減数分裂組換えの開始に必須な遺伝子であって、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２（ＡＴ５Ｇ５７８８０）、ＰＲＤ３／ＰＡＩＲ１及びＤＦＯ（ＡＴ１Ｇ０７０６０）の中から選択される遺伝子であり、他方はＲＥＣ８である２つの遺伝子の不活性化とを組み合わせることにより、アポマイオシス性配偶子を産生するＭｉＭｅ突然変異体がもたらされることを見いだした。
【００５２】
ＭｉＭｅ突然変異体によって産生されるアポマイオシス性配偶子は、ＳＤＲ  ２ｎ配偶子と同様に、倍数体植物の作製、又は倍数性レベルが異なる植物の交配に使用することができる。これらはまた、アポミクシス植物、すなわち、胚珠の母系組織から種子を形成し、その結果、母系親の遺伝子クローンである後代をもたらすことができる植物の作製のためにも関心が持たれる。
【００５３】
したがって、本発明の別の目的は、アポマイオシス性配偶子を産生する植物を得るための方法であり、該方法は、
ａ）上で定義されたＴＤＭ遺伝子の優性突然変異を含む植物をもたらすステップと、
ｂ）該植物において植物における減数分裂組換えの開始に関与する第１のタンパク質を阻害するステップであって、該タンパク質が、
−  ＳＰＯ１１−１タンパク質と称されるタンパク質であって、添付の配列表における配列番号２９に対応する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおける配列受託番号Ｑ９Ｍ４Ａ２を有するＳＰＯ１１−１タンパク質に対して、少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも６０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＳＰＯ１１−２タンパク質と称されるタンパク質であって、添付の配列表における配列番号３０に対応する、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおける配列受託番号Ｑ９Ｍ４Ａ２を有するＳＰＯ１１−２タンパク質に対して、少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも６０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＰＲＤ１タンパク質と称されるタンパク質であって、添付の配列表における配列番号３１に対応する、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて配列受託番号ＡＢＱ１２６４２を有するＰＲＤ１タンパク質に対して、少なくとも２５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも３５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＰＲＤ２タンパク質と称されるタンパク質であって、添付の配列表における配列番号３２に対応する、Ｐｌａｚａデータバンクにおいて配列受託番号ＡＴ５Ｇ５７８８０を有するＰＲＤ２タンパク質に対して、少なくとも２５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも３５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＰＡＩＲ１タンパク質と称されるタンパク質であって、添付の配列表の配列番号３３に対応する、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて配列受託番号ＮＰ＿１７１６７５を有するＰＡＩＲ１タンパク質に対して少なくとも３０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質、
−  ＤＦＯタンパク質と称されるタンパク質であって、添付の配列表における配列番号３４に対応する、Ｐｌａｚａデータバンクにおいて配列受託番号ＡＴ１Ｇ０７０６０を有するＤＦＯタンパク質に対して、少なくとも３０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するタンパク質
の中から選択される該ステップと、
ｃ）該植物においてＲＥＣ８タンパク質と称される第２のタンパク質を阻害するステップであって、該タンパク質が、添付の配列表における配列番号３５に対応する、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて配列受託番号ＮＰ＿１９６１６８を有するＲＥＣ８タンパク質に対して、少なくとも４０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性、又は少なくとも４５％、及び好ましさが増す順で、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％配列同一性を有する該ステップと
を含む。
【００５４】
ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ、ＰＡＩＲ１、又はＲＥＣ８タンパク質に関して本明細書において提供されるタンパク質配列同一性及び類似性の値は、ＢＬＡＳＴＰプログラムを初期パラメータの下で使用して算出する。類似性の算出は、スコアリング行列ＢＬＯＳＵＭ６２を使用して実施する。
【００５５】
上記のＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＰＡＩＲ１、ＤＦＯ又はＲｅｃ８タンパク質の阻害は、それらの機能を消滅させること、遮断すること、若しくは減少させることによって、又は有利に、対応する遺伝子の発現を妨げること若しくは下方制御することによってのいずれかで得ることができる。ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ、ＰＡＩＲ１、及びＲｅｃ８タンパク質、並びに該タンパク質の阻害は、出願ＷＯ２０１０／００４３１において詳細に開示されている。
【００５６】
例として、前記タンパク質の阻害は、対応する遺伝子又はそのプロモーターの突然変異誘発、及び前記タンパク質の活性を部分的に又は完全に失った突然変異体の選択によって得ることができる。前記阻害は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／００４３１の５頁の最後の段落の最初から６頁の４段落目の最後まで、及び６頁の最後の段落に開示されている。
【００５７】
或いは、標的タンパク質の阻害は、対応する遺伝子のサイレンシングによって得られる。そのような阻害は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／００４３１の７頁の４段落目の始めから９頁の最後の前の段落の最後まで、及び１０頁の最初の３つの段落に開示されている。
【００５８】
アポマイオシス性配偶子を産生することが可能な植物を得るための本発明の方法の好ましい実施形態によると、該方法は、
ａ）ＳＤＲ  ２ｎ配偶子を産生する能力をもたらす優性突然変異を、ＴＤＭ遺伝子の対立遺伝子に有する植物であって、この突然変異についてヘテロ接合性である植物をもたらすステップと、
ｂ）ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ、又はＰＡＩＲ１遺伝子の中から選択される遺伝子の対立遺伝子に、該対立遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害をもたらす突然変異を有する植物であって、この突然変異についてヘテロ接合性である植物をもたらすステップと、
ｃ）ＲＥＣ８遺伝子の対立遺伝子に、該対立遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害をもたらす突然変異を有する植物であって、この突然変異についてヘテロ接合性である植物をもたらすステップと、
ｅ）ＴＤＭ遺伝子の対立遺伝子に優性突然変異、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ又はＰＡＩＲ１遺伝子の中から選択される遺伝子の対立遺伝子の突然変異、及びＲＥＣ８遺伝子の対立遺伝子の突然変異を有する植物であって、各突然変異についてヘテロ接合性である植物を得るために、ステップａ）、ｂ）及びｃ）の植物を交配させるステップと、
ｆ）ＴＤＭ遺伝子の突然変異について、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ又はＰＡＩＲ１遺伝子の中から選択される遺伝子の突然変異について、及びＲＥＣ８遺伝子の突然変異についてホモ接合性の植物を得るために、ステップｅ）の植物を自家受精させるステップと
を含む。
【００５９】
アポマイオシス性配偶子を産生することが可能な植物を得るための本発明の方法の別の好ましい実施形態によると、該植物は、トランスジェニック植物であり、該方法は、
ａ）少なくとも１つの植物細胞を、上で定義されたＴＤＭ遺伝子の優性突然変異を含む本発明のＤＮＡ構築物を含有するベクター、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ及びＰＡＩＲ１の中から選択される遺伝子を標的とするＤＮＡ構築物を含有するベクター、並びにＲＥＣ８遺伝子を標的とするＤＮＡ構築物を含有するベクターを用いて形質転換するステップと、
ｂ）ゲノム内に該ＤＮＡ構築物を含有する導入遺伝子を有する植物を再生するために、該形質転換された植物細胞を培養するステップと
を含む。
【００６０】
ＴＤＭ遺伝子の優性突然変異を含むＤＮＡ構築物の発現により、前記トランスジェニック植物に２ｎ  ＳＤＲ配偶子を産生する能力がもたらされる。ＴＤＭ遺伝子の優性突然変異を含むＤＮＡ構築物遺伝子、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ及びＰＡＩＲ１の中から選択される遺伝子を標的とするＤＮＡ構築物、並びにＲＥＣ８遺伝子を標的とするＤＮＡ構築物の同時発現により、これらの３つの遺伝子によりコードされるタンパク質の下方制御がもたらされ、前記トランスジェニック植物にアポマイオシス性配偶子を産生する能力がもたらされる。
【００６１】
本発明は、本発明の方法によって得ることができる、ＳＤＲ  ２ｎ又はアポマイオシス性配偶子を産生することが可能な植物も包含する。
【００６２】
これは、具体的には、上で定義されたＴＤＭ遺伝子に優性突然変異を含む植物、並びに、ＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ又はＰＡＩＲ１遺伝子の中から選択される遺伝子の第１の突然変異であって、この突然変異の結果として該遺伝子によりコードされるＳＰＯ１１−１、ＳＰＯ１１−２、ＰＲＤ１、ＰＲＤ２、ＤＦＯ又はＰＡＩＲ１タンパク質が阻害される第１の突然変異と、ＲＥＣ８遺伝子の第２の突然変異であって、この突然変異の結果としてＲＥＣ８タンパク質が阻害される第２の突然変異とをさらに含む植物を含む。
【００６３】
これは、本発明のＤＮＡ構築物の少なくとも１つによって遺伝的に形質転換された植物も含む。前記植物がトランスジェニック植物であり、該構築物が植物ゲノム内に組み込まれた導入遺伝子に含有されており、したがって連続的な植物世代に伝わることが好ましい。
【００６４】
本発明は、ＳＤＲ  ２ｎ配偶子を産生させるための方法であって、本発明の方法によって得ることができる植物を培養するステップと、該植物によって産生される配偶子を回収するステップとを含む方法も包含する。前記配偶子が少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の生存可能な２ｎ配偶子を含むことが好ましい。
【００６５】
本発明は、アポマイオシス性配偶子を産生させるための方法であって、本発明の方法によって得ることができる植物を培養するステップと、該植物によって産生される配偶子を回収するステップとを含む方法も包含する。前記配偶子が少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、及び好ましさが増す順で、少なくとも３０％、４０％、５０％、又は６０％、７０％、８０％、又は９０％の生存可能なアポマイオシス性配偶子を含むことが好ましい。
【００６６】
本発明は、農学的に興味深い広範囲の単子葉植物又は双子葉植物に適合している。非限定的な例として、ジャガイモ、イネ、コムギ、トウモロコシ、トマト、キュウリ、アルファルファ、サトウキビ、サツマイモ、キャッサバ、クローバー、ダイズ、ホソムギ、バナナ、メロン、スイカ、綿又はバラ、ユリ、チューリップ、及びスイセンなどの観葉植物を挙げることができる。
【００６７】
本発明の実施には、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内に入る従来の技法を使用する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。
【００６８】
上記の取り合わせに加えて、本発明はまた、添付図を参照して、本発明の主題の例示的な実施形態に従う、それを参照する説明から現れる他の取り合わせも含む。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】種々の被子植物種由来のＴＤＭタンパク質のアラインメントを表す図である。初期パラメータを用いたＴ−Ｃｏｆｆｅｅ（ｖ６．８５）（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｋｉｔ．ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｔ＿ｃｏｆｆｅｅ）を用いて配列をアラインメントした。ＢｉｏＥｄｉｔを用いて配列アラインメントを編集した。ＴＤＭタンパク質において保存されている配列の最初の半分のみが示されている。アラインメントされるＴＤＭタンパク質内の、８０％超の同一性を示す残基に濃淡が付けられている。ＴＰＰ／Ｑモチーフを含む保存された領域が枠で囲まれている。
【図２】種々の被子植物に由来するＴＤＭタンパク質、アブラナ目（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）由来のＴＤＭ＿ｌｉｋｅ１タンパク質並びにシロイヌナズナ由来のＴＤＭ様タンパク質及びミナトカモジグサ由来のＴＤＭ様タンパク質の系統樹である。Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｆｒプラットフォームで分析を実施し、以下のステップが含まれた。Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ（ｖ６．８５）を用い、以下のペアワイズアラインメント方法を使用して配列をアラインメントした：１０最良局所アラインメント（１０  ｂｅｓｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（Ｌａｌｉｇｎ＿ｐａｉｒ）、正確なグローバルアラインメント（ａｃｃｕｒａｔｅ  ｇｌｏｂａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（ｓｌｏｗ＿ｐａｉｒ）。アラインメント後、ギャップを伴う位置をアラインメントから除去した。ＰｈｙＭＬプログラム（ｖ３．０  ａＬＲＴ）で実行される最大尤度法を使用して系統樹を再構築した。全ての種についてＴＤＭクレードのタンパク質が示されている（アブラナ目におけるＴＤＭ様１を含む）。より遠いＴＤＭパラログはシロイヌナズナ及びミナトカモジグサについてのみ示されている。Ａｔ：シロイヌナズナ、Ａｌ：ミヤマハタザオ。Ｂｒａ：ブラッシカ・ラパ。Ｓｌｙ：トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）。Ｓｔ：ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）。Ｃｓａ  ：キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）。Ｅｕｃｇｒ：ユーカリプタス・グランディス。Ｃｐ：パパイヤ。ＭＥ：キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）。ＴＣ：カカオ。Ｇｏｒａｉｉ：ゴシピウム・ライモンディ。ＦＶ：エゾヘビイチゴ。Ｐｐ：モモ。ＬＪ：ミヤコグサ。ＭＴ：タルウマゴヤシ。ＧＭ：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ．）。Ｐｖ：インゲンマメ。ＶＶ：ブドウ。Ａｑ：アクイレギア・カエルレア。ＯＳ：ジャポニカ米。ＯＳＩＮＤＩＣＡ：インディカ米。ＢＤ：ミナトカモジグサ。ＳＢ：モロコシ。ＺＭ：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）。Ｓｉ：アワ。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８（ｓ）−４０突然変異体が二分胞子を産生し、四倍体であることを示す図である。        図３Ａは、野生型が四分胞子を産生することを示す図である。トルイジンブルーによって染色された雄性減数分裂産物を示す。        図３Ｂは、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８が不均衡な多分胞子を産生することを示す図である。トルイジンブルーによって染色された雄性減数分裂産物を示す。        図３Ｃは、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８（ｓ）−４０が二分胞子を産生することを示す図である。トルイジンブルーによって染色された雄性減数分裂産物を示す。スケールバー＝１０μＭ。        図３Ｄは、野生型が二倍体であり、有糸分裂の中期プレートに整列した１０個の染色体を有することを示す図である。有糸分裂の核型を示す。        図３Ｅは、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８が二倍体であることを示す図である。有糸分裂の核型を示す。        図３Ｆは、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８（ｓ）−４０が四倍体であり、有糸分裂中期プレートに整列した２０個の染色体を有することを示す図である。有糸分裂の核型を示す。スケールバー＝１０μＭ。
【図４】図４Ａは、ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ減数分裂産物を例示する図である。ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌを用いて形質転換したｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８突然変異体。野生型における四分胞子（図３Ａ）及びｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８における多分胞子（図３Ｂ）と比較して、二分胞子が観察される。        図４Ｂは、ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ数分裂産物を例示する図である。ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌによって形質転換した野生型植物。野生型における四分胞子（図３Ａ）及びｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８における多分胞子（図３Ｂ）と比較して、二分胞子が観察される。        図４Ｃは、ＴＤＭ−Ｔ１６Ａ減数分裂産物を例示する図である。ＴＤＭ−Ｔ１６Ａによって形質転換した野生型植物。野生型における四分胞子（図３Ａ）及びｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８における多分胞子（図３Ｂ）と比較して、二分胞子が観察される。        図４Ｄは、ＴＤＭ−Δ１４−１９減数分裂産物を例示する図である。ＴＤＭ−Δ１４−１９によって形質転換した野生型植物。野生型における四分胞子（図３Ａ）及びｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８における多分胞子（図３Ｂ）と比較して、二分胞子が観察される。
【図５】図５Ａは、野生型植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。５つの二価染色体が中期Ｉにおいて整列している。        図５Ｂは、野生型植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。野生型における減数分裂。相同染色体の対が終期Ｉにおいて２つの核に分布している。        図５Ｃは、野生型植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。野生型における減数分裂。５つの姉妹染色分体の対が２つの中期プレートに整列している。        図５Ｄは、野生型植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。野生型における減数分裂。４つの平衡した核が終期ＩＩおいて形成される。        図５Ｅは、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８における減数分裂。第一分裂は有糸分裂と類似している。１０対の染色分体が中期プレートに整列している。        図５Ｆは、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８における減数分裂。第一分裂は有糸分裂と類似している。１０個の染色分体が２つの群に分離している。        図５Ｇは、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８における減数分裂。第一分裂は有糸分裂と類似している。単一の染色分体が中期ＩＩに適正に整列できていない。        図５Ｈは、ＴＤＭ−Ｐ１７植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８における減数分裂。第一分裂は有糸分裂と類似している。単一の染色分体が中期ＩＩに適正に整列できていないことにより、終期ＩＩにおいて変動数の不均衡な核がある。        図５Ｉは、ＴＤＭ−Ｐ１７植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。ＴＤＭ−Ｐ１７を用いて形質転換した野生型植物における減数分裂。単一の第一減数分裂様分裂が観察される。        図５Ｊは、ＴＤＭ−Ｐ１７植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。ＴＤＭ−Ｐ１７を用いて形質転換した野生型植物における減数分裂。単一の第一減数分裂様分裂が観察される。        図５Ｋは、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８  ＴＤＭ−Ｐ１７植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。ＴＤＭ−Ｐ１７を用いて形質転換したｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８植物における減数分裂。単一の有糸分裂様分裂が観察される。        図５Ｌは、ＴＤＭ−Ｐ１７植物及びｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８  ＴＤＭ−Ｐ１７植物における減数分裂による染色体スプレッドを例示する図である。ＴＤＭ−Ｐ１７を用いて形質転換したｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８植物における減数分裂。単一の有糸分裂様分裂が観察される。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７０】
実験手順
１．成長条件及び遺伝子型決定
シロイヌナズナ属の植物を、温室内で、以前に記載されている通り（Ｖｉｇｎａｒｄら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、２００７年、３巻、１８９４〜１９０６頁）、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてシロイヌナズナ属培地で、以前に記載されている通り（Ｅｓｔｅｌｌｅ及びＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８７年、２０６巻、２００〜２０６頁）、２１℃、１６時間〜１８時間の光周期及び７０％相対湿度の下で培養した。
【００７１】
ｓｐｏ１１−１−３  ｒｅｃ８−２植物を、以前に記載されている通り遺伝子型決定した（ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、２００９年、７巻、ｅ１０００１２４頁）。ｔｄｍ−３植物を、Ｃｒｏｍｅｒら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、２０１２年、８巻、ｅ１００２８６５頁に記載の通り遺伝子型決定した。
【００７２】
２．ＥＭＳ突然変異誘発及び突然変異同定
ＥＭＳ突然変異誘発を以前に記載されている通り実施した（Ｃｒｉｓｍａｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、３３６巻、１５８８〜１５９０頁）。全ゲノム配列決定をＨｉｇＳｅｑ（商標）２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって行った。シロイヌナズナＴＡＩＲ１０（栽培品種Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の参照ゲノムと比較してＳＮＰの一覧を作成した。
【００７３】
３．細胞診及び倍数性分析
雄性減数分裂産物の観察、染色体スプレッド、及び倍数性測定を、ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら（ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、２００８年、４巻、ｅ１０００２７４頁）に記載されている技法を使用して行った。
【００７４】
４．定方向突然変異誘発構築物及び植物形質転換
ＴＤＭゲノムの断片を、ＴＤＭ  Ｕ（５’−ＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＡＧＡＧ−３’；配列番号３６）及びＴＤＭ  Ｌ（５’−ＧＣＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴ−３’；配列番号３７）を使用したＰＣＲによって増幅した。増幅は、ＡＴＧの前９８６ヌクレオチド及び終止コドンの後５３７ヌクレオチドにわたるものであった。ＰＣＲ産物を、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｐＤＯＮＲ２０７（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしてｐＥＮＴＲ−ＴＤＭを創出し、それに対して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用して定方向突然変異誘発を実施した。ＴＤＭの突然変異型を生成するために使用した変異原性プライマーは、配列番号３８〜４１：
−  ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ：５’−ＧＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＣ−３’；
−  ＴＤＭ−Ｔ１６Ａ：５’−ＣＴＣＣ  ＡＣＣＴＧＧＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡ−３’；
−  ＴＤＭ−Ｙ１４Ａ：５’−ＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＴＧＣＧＴＡＴＡＣＴＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧ−３’；
−  ＴＤＭ−Δ１４−１９：５’−ＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＴＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＧＧＣ−３’；及び
それらのそれぞれの逆相補プライマーであった。植物を形質転換するためのバイナリーベクターを生成するために、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）システム用のバイナリーベクター、ｐＧＷＢ１（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２００７年、１０４巻、３４〜４１頁）を用いてＬＲ組換え反応を実施した。得られたバイナリーベクター、ｐＴＤＭ、ｐＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ、ｐＴ１６Ａ、及びｐＴＤＭ−Ｙ１４Ａを用いて、アグロバクテリウム媒介性フローラル・ディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ，ＳＪ．及びＢｅｎｔ  Ａ．Ｆ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１９９８年、１６巻、７３５〜７４３頁）を使用して、野生型植物、及びｓｐｏ１１−１突然変異又はｒｅｃ８突然変異又はｔｄｍ−３突然変異について分離される植物集団を形質転換した。２０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含有する寒天プレートにおいて、形質転換された植物を選択した。
【００７５】
（例１）
ＴＤＭの優性突然変異により早期減数分裂終了がもたらされる
減数分裂の進行を制御する新しい遺伝子を同定するために、ｏｓｄ１及びｃｙｃａ１；２／ｔａｍなどの、第二減数分裂のスキップをもたらす突然変異により、第二減数分裂においてのみ不均衡な染色体分離欠陥を有する突然変異体の稔性が回復するという考え（ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、２００９年、７巻、ｅ１０００１２４頁；ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、２０１０年、６巻、ｅ１０００９８９頁及びＷＯ２０１０／０７９４３２）に基づいて遺伝子スクリーニングを設計した。これは、第一減数分裂は有糸分裂と類似している（姉妹染色分体が反対側の極に平衡して分離する）が、第二分裂は不均衡であり、異数性の配偶子、したがって、非常に限定された稔性がもたらされるｓｐｏ１１  ｒｅｃ８二重突然変異体に当てはまる（図５）（Ｃｈｅｌｙｓｈｅｖａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、２００５年、１１８巻、４６２１〜３２頁）。減数分裂の第二減数分裂の前での終了をもたらす、ＯＳＤ１における突然変異（ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、２００９年、７巻、ｅ１０００１２４頁  ２００９年）又はＣＹＣＡ１；２／ＴＡＭにおける突然変異（ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、２０１０年、６巻、ｅ１０００９８９頁）により、実際に、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８の稔性を回復させることができる。したがって、ｏｓｄ１又はｔａｍと同様の欠陥を付与する突然変異体を同定することを目的として、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８の稔性の回復に基づいて遺伝子スクリーニングを実行した。減数分裂による分離欠陥にもかかわらず、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８植物は、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を用いて突然変異誘発された残存種子を十分に産生した。ＥＭＳ突然変異についておそらくヘテロ接合性であるＭ１植物を自家受精させ、約５のバルクで回収してＭ２ファミリーを生じさせた。約２０００のＭ２ファミリー（４００バルク）を、稔性の増大についてｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８非突然変異誘発対照と比較してスクリーニングした。
【００７６】
３バルクにより稔性が増大した植物が分離された。遺伝子型決定により、これらがｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８突然変異体であることが確認され、これにより、真性の抑制因子であることが示された。トルイジンブルーによって染色された雄性減数分裂産物の分析から、３つの場合全てにおいて、稔性植物が、野生型において観察される四分胞子の代わりに、ｏｓｄ１又はｃｙｃａ１；２／ｔａｍにおいて観察される二分胞子を産生したことが示され、これにより、これらの植物において第二減数分裂が起こらなかったことが示唆される（図３）。候補遺伝子（ＣＹＣＡ１；２／ＴＡＭ及びＯＳＤ１）の配列決定により、３つのファミリーのうち２つにおいてＣＹＣＡ１；−２／ＴＡＭにおける劣性の突然変異が同定された。同定された突然変異は、エクソン７におけるスプライシング部位（ＴＡＩＲ１０  ｃｈｒｌ：２９０８２５２２  Ｃ＞Ｔ）、及び、上流のアウトオブフレーム開始コドンが導入される５’ＵＴＲ領域における突然変異（ＴＡＩＲ１０  ｃｈｒｌ：２９０８４１７４  Ｇ＞Ａ）であった。相補性試験から、これらが対立遺伝子であることが示され、これにより、ＣＹＣＡ１；２における突然変異により二分胞子表現型及び稔性の回復が引き起こされることが確認される。第３のファミリー（ｓｐｏ１１  ｒｅｃ８（ｓ）−４０）はＯＳＤ１にもＣＹＣＡ１；２にも突然変異を有さず、本研究はこれに注目する。
【００７７】
予想外に、染色体スプレッドから、４つの植物が四倍体であることが示された（図３）。このことにより、原因突然変異が優性であり、Ｍ１植物の雄性器官と雌性器官のどちらにおいても二倍体配偶子の産生を引き起こすことが示唆された。約１００×カバレッジを有する２つの姉妹植物のバルクの全ゲノム配列決定により、野生型と比較して１１４４のＳＮＰが存在することが明らかになった。しかし、１５のＳＮＰのみがホモ接合体であることが明らかになった。これらの少数のホモ接合体ＳＮＰはゲノム内に分散しており、これにより、これらが、ＥＭＳ誘導性突然変異の固定によって生じたのではなく、突然変異誘発前にｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８株に存在していたことが示唆される。検出された突然変異のほとんど全てがヘテロ接合体であるという事実から、原因突然変異が優性であることがさらに示唆された。この突然変異は、Ｍ１植物において表現型的に発現しており、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８突然変異と組み合わさって、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８  ｏｓｄ１三重突然変異体において観察される二倍体クローン配偶子の産生をもたらし（ＭｉＭｅ、ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、２００９年、７巻、ｅ１０００１２４頁及びＷＯ２０１０／０７９４３２）、したがって、Ｍ１植物からのＥＭＳ誘導性突然変異のヘテロ接合性が四倍体Ｍ２植物において維持される。
【００７８】
次いで、原因突然変異の候補をヘテロ接合体ＳＮＰの中で探した。これらの１１２９の突然変異の中で、３４１が、コード配列に影響を及ぼすと予測された（ナンセンス、ミスセンス又はスプライシング部位）。それらの中で、アミノ酸の変化をもたらすＴＤＭの突然変異（ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ）が潜在的な原因優性突然変異として良好な候補であると思われた。ＴＤＭは、第二減数分裂の最後に減数分裂終了のために必須であることが以前に示されている。ｔｄｍノックアウト突然変異体（余分のラウンドの分裂）において観察される減数分裂欠陥が（ｓｐｏ１１  ｒｅｃ８（ｓ）−４０）欠陥とは全く違うものであっても、ＴＤＭの優性突然変異は（ｓｐｏ１１  ｒｅｃ８（ｓ）−４０）における原因突然変異の潜在的な候補であると思われた。
【００７９】
この仮説を検証するために、ｔｄｍ−３突然変異体（ｎ＝８の形質転換体、１００％四分胞子）を補完することが可能な、ＴＤＭ遺伝子（プロモーター及びターミネーターを含める）を含有するゲノムクローンを作製し、突然変異させて、スクリーニングにおいて同定された突然変異（ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ）を再度創出した。ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８植物に導入すると、ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌクローンでは一次形質転換体の稔性が回復し（ｎ＝２／３、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８：果実当たり種子０．１個（ｎ＝１９７）、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８  ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ＃１５：果実当たり種子２５個（ｎ＝１５）、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８  ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ＃６７：果実当たり種子４８個（ｎ＝１０））、二分胞子の産生がもたらされた（図４、表ＩＩ）。これにより、ＴＤＭにおける突然変異が実際にｓｐｏ１１  ｒｅｃ８（ｓ）−４０における原因優性突然変異であることが実証される。ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８  ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ形質転換体における減数分裂による染色体スプレッドの分析により、有糸分裂様の第一分裂が示され、１０個の一価が中期Ｉにおいて整列し、後期Ｉにおいて姉妹染色分体が分離し、第二分裂が起こらなかった（図５）。次に、ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８  ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ子孫の倍数性レベルを探究した。自殖後代の中では、四倍体（４ｎ）のみが見いだされた（表ＩＩＩ）。ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８  ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ花粉を使用して野生型植物を受精させた場合、得られた後代は全て三倍体であった（表ＩＩＩ）。ｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８  ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ胚珠を野生型花粉粒と受精させた場合、三倍体植物のみが見いだされた（表ＩＩＩ）。これにより、ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌによって形質転換されたｓｐｏ１１−１  ｒｅｃ８突然変異体では、高レベルの雄性及び雌性（１００％）有糸分裂様由来胞子が産生され、それにより、機能的な二倍体配偶子がもたらされることが実証された。
【００８０】
野生型植物及びｔｄｍ−３突然変異体に導入したところ、ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌゲノムクローンは、二分胞子を産生することにより、どちらの遺伝子型の減数分裂表現型も改変した（図４、表ＩＩ）。
【００８１】
【表２】
2017520240.tif 000004
【００８２】
二分胞子を産生したＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ植物では野生型第一分裂及び第二減数分裂が起きないことが示され（図５）、これにより、ｏｓｄ１及びｃｙｃａ１；２／ｔａｍによるものとよく類似した表現型である２ｎ配偶子の形成が引き起こされた（ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．、２００９年、７巻、ｅ１０００１２４頁及びＷＯ２０１０／０７９４３２；ｄ’Ｅｒｆｕｒｔｈら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．、２０１０年、６巻、ｅ１０００９８９頁）。ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ植物の子孫の中で倍数性レベルを測定した（表ＩＩＩ）。自殖後代の中では、四倍体及び三倍体が見いだされた。ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ胚珠を野生型花粉粒と受精させると、二倍体植物及び三倍体植物が単離された（表ＩＩＩ）。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
要約すると、ｔｄｍ−ｐ１７Ｌ優性突然変異により、劣性ｏｓｄ１又はｔａｍ突然変異と同様の減数分裂欠陥が付与され、それにより、第二分裂の前での減数分裂の早期終了、したがって、二倍体雄性及び雌性配偶子の産生がもたらされる。
【００８５】
ＴＤＭは、植物において保存されているタンパク質の小さなファミリーに属する。例えば、シロイヌナズナ属ゲノムは、ＴＤＭに対して有意な配列類似性を示す他の遺伝子を５つ含有する（図２）。これらのＴＤＭ様遺伝子の機能は分かっていない。タンパク質配列の分析から、原因突然変異が、一般には植物種当たり１つ又は２つの遺伝子を含有するＴＤＭタンパク質サブファミリーにのみ保存されている小さなドメインであることが示された（図１）。Ｐｒｏ１７アミノ酸は、隣のＴｈｒ１６アミノ酸と同様に絶対的に保存されている（図１）。これにより、Ｔ１６上の最小のコンセンサスリン酸化部位が定義される。これを検証するために、このゲノムＴＤＭ遺伝子の２つの他の潜在的なリン酸化喪失型を、リン酸化可能なアミノ酸をリン酸化可能でないアミノ酸で置換することによって（ＴＤＭ−Ｔ１６Ａ）、及び保存されたドメイン全体を欠失させることによって（ＴＤＭ−Δ１４＿１９）その部位において創出した。ＴＤＭ−Ｔ１６Ａ及びＴＤＭ−Δ１４＿１９のどちらでも、野生型植物に導入したところ、二分胞子表現型が優性に得られ、これにより、ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌの効果が再現される（表ＩＩ；図４）。さらに、ｔｄｍ−３突然変異体に導入したところ、ＴＤＭ−Δ１４＿１９では同様に二分胞子表現型が示された（表ＩＩ）。しかし、このドメインの、保存の程度がわずかに低いアミノ酸であるＴＤＭチロシン１４の突然変異（ＴＤＭ−Ｙ１４Ａ）では、野生型に導入した場合には二分胞子表現型を付与することができず、ｔｄｍ−３突然変異を補完することはできた（表ＩＩ）。要約すると、ＴＤＭ−Ｐ１７Ｌ突然変異、ＴＤＭ−Ｔ１６Ａ突然変異及びＴＤＭ−Δ１４−１９突然変異の発現は、同等に、早期減数分裂終了を優性に付与することができる。ＴＰは潜在的なリン酸化部位であるので、この結果により、ＴＤＭがリン酸化によって調節されて第一減数分裂から第二減数分裂への移行が確実になる可能性があることが示唆される。
【図１−１】
2017520240.tif 000006
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
2017520240.tif 000014
【配列表】
2017520240000001.app
【国際調査報告】
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2017520240.tif 000016
2017520240.tif 000017