(57)【要約】本発明は、特にタンパク質およびオリゴ糖が富化された可溶性画分を回収するような方法におけるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属微細藻バイオマスの熱透過処理方法において、次の工程：微細藻バイオマスを提供する工程と、６０〜１３０℃、好ましくは６０〜９０℃の温度で段階的に１〜５分間熱処理する工程と、０〜１０℃の温度まで冷却する工程と、微細藻細胞が除去された可溶性画分の回収、濃縮、および富化を行う工程とを含むことを特徴とする、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特にタンパク質およびオリゴ糖が富化された可溶性画分を回収するような方法におけるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属微細藻バイオマスの熱透過処理プロセスにおいて、次の工程：
−  微細藻バイオマスを提供する工程と、
−  ６０〜１３０℃、好ましくは６０〜９０℃の温度で段階的に１〜５分間熱処理する工程と、
−  ０〜１０℃の温度まで冷却する工程と、
−  微細藻細胞が除去された前記可溶性画分の回収、濃縮、および富化を行う工程と
を含むことを特徴とする、プロセス。
【請求項２】
以下の工程：
１）従属栄養条件下かつ光の非存在下で、発酵により微細藻を培養する工程と、
２）前記バイオマスを回収する工程と、
３）任意選択で、前記発酵から生じる間質液の残渣を除去するために前記バイオマスを洗浄する工程と、
４）６０〜１３０℃、好ましくは６０〜９０℃の温度で段階的に１〜５分間熱処理する工程と、
５）任意選択で、細胞内成分を反応培地中に拡散させるために周囲温度まで冷却し、前記温度に３０分間〜３時間維持する工程と、
６）０〜１０℃の温度、好ましくは約４℃の温度まで冷却する工程と、
７）固液分離技術によって残留バイオマスを除去する工程と、
８）前記微細藻細胞が除去された前記可溶性画分の回収、濃縮、および富化を行う工程と
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の熱透過処理プロセス。
【請求項３】
前記クロレラ属微細藻が、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択され、より特定的にはクロレラ・プロトセコイデスであることを特徴とする、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記バイオマスが、固液分離により、前面ろ過もしくはタンジェントろ過により、または遠心分離により回収されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記熱処理が、温度を上昇させるいくつかの工程と、次いで任意選択で温度を低下させるいくつかの工程とを含み、各工程が１０〜４０℃であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記熱処理が、前記バイオマスを約６０〜７０℃の温度にすることを可能にする第１工程と、約９０〜１３０℃の適用最高温度に到達させることを可能にする１つ以上の工程と、任意選択で温度を低下させることを可能にする１つ以上の工程とを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記熱処理が、以下の段階：
−  ３０秒で周囲温度から６０℃まで温度を上昇させる段階と、
−  さらに３０秒間にわたり６０℃から９０℃まで温度を上昇させる段階と、
−  ３分間にわたり９０℃に前記温度を維持する段階と
を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記熱処理が、以下の段階：
・３０秒間にわたり２８℃から６０℃まで前記温度を上昇させる段階と、
・３０秒間にわたり６０℃から９０℃まで前記温度を上昇させる段階と、
・１分間にわたり９０℃に前記温度を維持する段階と、
・３０秒間にわたり９０℃から６０℃に冷却する段階と、
・好ましくは１分間にわたり６０℃から４℃に冷却する段階と
を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記クロレラ属微細藻から可溶性のペプチドおよびポリペプチドならびにオリゴ糖が富化された組成物を調製するプロセスにおいて、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセスを行うことにより得られた前記可溶性画分が、単独でまたは組み合わせて、精密ろ過、限外ろ過、ナノろ過、および透析ろ過からなる群から選択される膜分離システムでろ過されることを特徴とする、プロセス。
【請求項１０】
請求項９に記載されるように得られた可溶性のペプチドおよびポリペプチドならびにオリゴ糖が富化された組成物を分画するプロセスにおいて、逆浸透型の膜が使用されることを特徴とする、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻バイオマスの熱透過処理プロセスに関する。この処理は、可溶性細胞内容物、特にペプチドおよびポリペプチドをそれから放出させることを可能にする。
【０００２】
この熱透過処理プロセスは細胞崩壊を伴わず、それにより、さらに当業者にそれ自体公知の任意の固液分離方法により、たとえば、前面ろ過もしくはタンジェントろ過、遠心分離、および／またはフロキュレーションにより、こうして放出された細胞内容物を残留バイオマスから容易に分離することも可能にする。
【０００３】
より詳細には、選択された微細藻が脂質に富む場合には、本発明のプロセスは、対象の脂質画分を残留バイオマス中に保持することを可能にする。
【０００４】
最後に、本発明は、水溶液中で微細藻の細胞内容物を回収および分画することに関する。前記細胞内容物は、可溶性のペプチドおよびポリペプチド、色素、遊離脂肪酸、オリゴ糖および多糖などで構成される。
【背景技術】
【０００５】
タンパク質および他の必須栄養素に富むことから、クロレラが有望な食品源であることは当業者に周知である。
【０００６】
クロレラは、４５％のタンパク質と、２０％の脂肪と、２０％の炭水化物と、５％の繊維と、１０％のミネラルおよびビタミンとを含有すると言われている。
【０００７】
クロレラバイオマスの油画分は、一価不飽和油で本質的に構成されているため、従来の食品製品に多く見られる飽和油、水素化油、および多価不飽和油と比較して栄養上および健康上の利点を提供する。
【０００８】
一方、タンパク質画分は、起泡性、乳化性などがあるため、食品産業、化粧品産業、さらには医薬品産業で機能剤として活用可能である。
【０００９】
したがって、クロレラは、クロレラバイオマスの乾燥により得られるホールバイオマスの形態または粉体の形態のいずれかで、ヒトまたは動物が摂取するための食品に慣例的に利用され、その細胞壁は、特に機械的手段により破壊されている。
【００１０】
微細藻粉はまた、微量栄養素、食物繊維（可溶性および不溶性の炭水化物）、リン脂質、糖タンパク質、フィトステロール、トコフェロール、トコトリエノール、セレンなどの他の有益物を提供する。
【００１１】
食品組成物に組み込まれるバイオマスを調製するために、バイオマスは培養培地から濃縮または回収される（フォトバイオリアクター内での光独立栄養による培養、または暗所でのかつクロレラにより同化可能な炭素源の存在下での従属栄養による培養。）。
【００１２】
本発明が関連する技術分野では、クロレラの従属栄養培養が好ましい（発酵経路として知られるもの）。
【００１３】
発酵培地からの微細藻バイオマスの回収時には、バイオマスは、水性培地中に主に懸濁された状態の無傷細胞を含む。
【００１４】
次いで、バイオマスを濃縮するために、前面ろ過および／もしくはタンジェントろ過により、遠心分離により、またはさらに当業者に公知の任意の手段により、固液分離工程が行われる。
【００１５】
濃縮後、真空パックケーク、微細藻フレーク、微細藻ホモジネート、無傷微細藻粉末、粉砕された微細藻粉、または微細藻油を生産するために、微細藻バイオマスを直接処理することが可能である。
【００１６】
微細藻バイオマスはまた、後続処理を容易にするために、またはその種々の用途、特に食品用途でバイオマスを使用するために乾燥される。
【００１７】
しかしながら、現在まで、微細藻は、高い付加価値を有する製品の生産に主に使用されたが、少量であった。この状況を説明する理由として挙げられるのは、微細藻の大量生産のコストが極端に高いこと、特に前記製品の精製プロセス（「ＤＳＰ」（下流処理））に困難が伴うことである。
【００１８】
以上に述べたように、高い付加価値を有する多くの産物は、微細藻の細胞内区画に保持され、これらの産物の抽出処理は、慣例的に細胞崩壊工程を必要とする。
【００１９】
しかしながら、効率的な細胞崩壊処理は、抽出された製品の収率だけでなく品質も最大化する責務を有する。換言すれば、この最適化された崩壊処理は、対象製品の化学的な汚染または分解を回避しなければならない。
【００２０】
さらに、大規模生産のために、選択された処理はこの規模に移行可能であることが重要である。
【００２１】
最後に、ＤＳＰへのこの細胞崩壊工程の導入は容易でなければならず、しかも後続の処理／処理工程に悪影響を及ぼしてはならない。
【００２２】
これらの制限は全て、崩壊処理の効率および同様にそのエネルギー消費量に影響を及ぼす。
【００２３】
微細藻の種々の崩壊手順、たとえば、化学的手順、機械的手順、酵素的手順、さらには電気的（パルスフィールド）手順が研究されてきた。
【００２４】
しかしながら、微細藻細胞は非常に堅固な膜壁を有するため、細胞崩壊および対象の製品の抽出が非常に困難であり、しかもエネルギーの点で非常にコストがかかる。
【００２５】
たとえば、細胞を溶解するために圧力破砕機を用いて、細胞を含有する懸濁液を制限オリフィスにポンプ注入することが可能である。高圧（最低でも１５００ｂａｒ）を印加した後、ノズルを介して瞬時膨脹を実施する。細胞を破裂させる３つの異なる機構、すなわち、バルブ中への流入、オリフィス中の液体の高剪断、および出口での突然の圧力低下により、細胞を破壊することが可能である。この方法では、細胞残屑と混合された細胞内分子が放出される。
【００２６】
Ｎｉｒｏホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉまたは任意の他の高圧ホモジナイザー）は、主に０．２〜５ミクロンのサイズを有する細胞を処理するために使用される。高圧下で藻類バイオマスを処理すると、一般に細胞の９０％超が溶解されて、サイズが５ミクロン未満に低減される。
【００２７】
他の選択肢として、ボールミルを使用してもよい。ボールミルでは、細胞は小さい球状粒子と共に、懸濁状態で攪拌される。細胞の破壊は、剪断力、ボール間でのミリング、およびボールとの衝突により引き起こされる。適切なボールミルの説明は、たとえば米国特許第５３３０９１３号明細書に記載されている。これらのボールは、細胞を破壊してそれから細胞内容物を放出させる。次いで、元の細胞よりも小さいサイズの粒子の懸濁液が、「水中油型」エマルジョンの形態で得られる。次いで、このエマルジョンが霧化されて水が除去され、残存乾燥粉末は、細胞残屑と間質可溶性化合物と油とで構成された不均一混合物を含有する。
【００２８】
これらの細胞崩壊技術の使用時に解決すべき難題は、細胞内容物のみの単離（細胞膜残屑および脂肪を除去して）、特にタンパク質負荷の品質の維持である。
【００２９】
微細藻の剛性の破壊に使用されるエネルギーは、実際には対象の細胞内分子の不可逆的な分解または変性を引き起こす可能性がある。
【００３０】
パルスフィールド電気処理などの代替策が提案されてきた。高強度パルス電界に生体細胞を暴露すると、実際には細胞膜の構造が改変される可能性がある。外部場は膜の充電を引き起こす。十分な膜貫通電圧（０．５〜１Ｖ）では、リン脂質の分子配列が変化し、その結果、膜がそのバリアの役割を失って透過性になる。使用条件に応じて、この膜透過性は可逆的または不可逆的であってもよい。
【００３１】
しかしながら、細胞内化合物の効率的抽出のために、当業者は依然として、膜の不可逆的な透過性を引き起こすことにより、その崩壊をもたらすように推奨している。
【００３２】
その場合、この膜の破壊により細胞内容物の放出が容易になると共に、補助的な溶媒抽出技術を使用する場合、細胞内への溶媒の浸透もまた容易になる。
【００３３】
この技術は有望であるが、残念ながら、１〜２００ｍ３の反応器で生産されたバイオマスを処理するように工業規模を移行することができない。
【００３４】
さらに、それはまた汚染膜残屑も生成するため、細胞内区画の対象の分子から分離することが必要であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
結果として、細胞を破壊したりその成分の品質を損ねたりすることなく、細胞内容物を放出可能な微細藻壁を弱化するための技術を提供する必要性が満たされないまま存在する。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本出願人企業は、微細藻細胞の熱透過処理プロセスにより、この必要性を満たすことが可能であることを見いだした。
【００３７】
したがって、本出願人企業は、熱的細胞破砕方法が機械的崩壊により引き起こされる剪断力と同様に微細藻からの製品の分解または変性のために代替的に使用される技術であるという技術的偏見を克服する（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，１９８６，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  Ｍａｓｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ−Ｍｏｌｉｎａ  Ｇｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ  ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｐ
ｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２０：４９１−５１５）。
【００３８】
さらに、本出願人企業により開発された熱処理が細胞壁の崩壊をもたらさないことを考慮すると、一旦細胞内区画から放出されれば、当業者に公知の任意の固液分離技術により分子の回収を簡単に行うことが可能である。
【００３９】
最後に、この可溶性画分の回収は、たとえば当業者に公知の膜分離技術によるその内容物の分画への道を開く。
【００４０】
本発明は、特にペプチドおよびポリペプチドならびにオリゴ糖が富化された可溶性画分を回収するような方法におけるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属微細藻バイオマスの熱透過処理プロセスに関する。
【００４１】
このプロセスは、以下の工程：
−  微細藻バイオマスを提供する工程と、
−  ６０〜１３０℃、好ましくは６０〜９０℃の温度で段階的に１〜５分間熱処理する工程と、
−  ０〜１０℃の温度まで冷却する工程と、
−  微細藻細胞が除去された可溶性画分の回収、濃縮、および富化を行う工程と
を含む。
【００４２】
このプロセスは、好ましくは、以下の工程：
１）従属栄養条件下かつ光の非存在下で発酵により微細藻を培養する工程と、
２）バイオマスを回収する工程と、
３）任意選択で、発酵から生じる間質液の残渣を除去するためにバイオマスを洗浄する工程と、
４）６０〜１３０℃、好ましくは６０〜９０℃の温度で段階的に１〜５分間熱処理する工程と、
５）任意選択で、細胞内成分を反応培地中に拡散させるために周囲温度まで冷却し、およびこの温度に３０分間〜３時間維持する工程と、
６）０〜１０℃の温度、好ましくは約４℃の温度まで冷却する工程と、
７）固液分離技術によって残留バイオマスを除去する工程と、
８）微細藻細胞が除去された可溶性画分の回収、濃縮、および富化を行う工程と
を含む。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
好ましくは、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属微細藻は、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、およびクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択され、およびより特定的にはクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）である。特定の一実施形態では、株はクロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）（ＵＴＥＸ２５０株  −  米国テキサス大学オースティン校藻類カルチャーコレクション（Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ  −  ＵＳＡ）である。他の特定の実施形態では、株はクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）（ＵＴＥＸ１６６３株  −  米国テキサス大学オースティン校藻類カルチャーコレクション（Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａ
ｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ  −  ＵＳＡ）である。
【００４４】
従属栄養条件下かつ光の非存在下で培養すると、慣例的には乾燥細胞の４５〜７０重量％のタンパク質含有率（窒素含有率Ｎ×６．２５を測定することにより評価される）を有するクロレラバイオマスが生産される。
【００４５】
これ以降で例示されるように、この培養は、２つの工程：
−  グルコースと酵母抽出物とを含有する培地中で、振盪しながら２８℃で７２時間前培養する工程と、
−  振盪しながら、かつ水性アンモニアでｐＨ６．５に調整して、３６時間超にわたり２８℃でバイオマスの生産のためにグルコースおよび酵母抽出物中で培養する工程と
で行われ、これにより乾燥細胞の約５２重量％のタンパク質含有率（Ｎ６．２５により評価される）を有する約８０ｇ／ｌのバイオマスが得られる。
【００４６】
次いで、固液分離により、前面ろ過もしくはタンジェントろ過により、遠心分離により、またはさらに当業者に公知の任意の手段により、バイオマスが回収される。
【００４７】
次いで、有利には、本出願人企業は、バイオマスの一連の濃縮（遠心分離による）／希釈により間質可溶性化合物を除去するようにバイオマスを洗浄することを推奨する。
【００４８】
本発明の目的では、「間質可溶性化合物」という用語は、発酵培地のすべての可溶性有機汚染物質、たとえば、塩、残留グルコース、２または３の重合度（またはＤＰ）のオリゴ糖、ペプチドなどの水溶性化合物を意味することが意図される。
【００４９】
次いで、こうして間質可溶性物質から精製されたこのバイオマスは、脱塩水を用いて好ましくは５〜３５％の乾物重量、好ましくは１０％〜２０％の乾物重量に調整される。
【００５０】
次いで、６０〜１３０℃、好ましくは６０〜９０℃の温度で段階的に１〜５分間熱処理が行われる。この処理は２〜６つの温度工程を含むことができる。たとえば、温度を上昇させるいくつかの工程と、次いで任意選択で温度を低下させるいくつかの工程を含むことができる。温度工程は、１０〜４０℃、たとえば、約１０、２０、３０、または４０℃であってもよい。第１工程は、バイオマスを約６０〜７０℃の温度にすることを可能にする。「約」という用語は、±１０％、好ましくは±５％を意味することが意図される。中間工程は、６０℃〜適用最高温度、たとえば約９０〜１３０℃で行うことが可能である。各工程は、約１０秒間〜４分間、好ましくは３０秒間〜３分間継続可能である。
【００５１】
したがって、この処理は、バイオマスを約６０〜７０℃の温度にすることを可能にする第１工程と、約９０〜１３０℃の適用最高温度に到達させることを可能にする１つ以上の工程と、任意選択で温度を低下させることを可能にする１つ以上の工程とを含むことができる。
【００５２】
これ以降で例示されるように、この処理は、３つの段階：
−  ３０秒間で周囲温度から６０℃まで温度を上昇させる段階と、
−  さらに３０秒間にわたり６０℃から９０℃まで温度を上昇させる段階と、
−  ３分間にわたり９０℃に温度を維持する段階と
で行うことが可能である。
【００５３】
特定の一実施形態では、このプロセスは、以下の工程：
・３０秒間にわたり２８℃から６０℃まで前記温度を上昇させる工程と、
・３０秒間にわたり６０℃から９０℃まで前記温度を上昇させる工程と、
・１分間にわたり９０℃に温度を維持する工程と、
・３０秒間にわたり９０℃から６０℃に冷却する工程と、
・好ましくは１分間にわたり６０℃から４℃に冷却する工程と
を含む。
【００５４】
この処理は、反応培地中への細胞内成分の拡散を可能にする。
【００５５】
この自由拡散現象を増幅するように温度を周囲温度まで冷却して３０分間〜３時間にわたりこの温度に維持することが可能である。
【００５６】
最後に、これらの工程の終了時、温度を０〜１０℃の最終温度、好ましくは約４℃の温度まで冷却する。
【００５７】
本出願人企業は、これらの操作条件下で行われる熱処理が、細胞内区画の可溶性成分の自然放出を可能にする膜の弱化プロセスとして機能することをこうして見いだした。
【００５８】
イオン性物質の他に、炭水化物（主にＤＰ１およびＤＰ２）、ペプチド、ポリペプチドなどの有機物質が細胞から排出される。
【００５９】
反対に、脂質および疎水性有機化合物は細胞内に残留するため、細胞は透過処理され、かつ溶解／破壊されないことが明確に実証される。
【００６０】
したがって、本発明に係るプロセスでは、エマルジョンが形成されることはなく、実際には水性懸濁液が得られる。
【００６１】
透過性膜を通過するこれら全ての可溶性物質の放出は、透析型の自由拡散のプロセスに類似している。
【００６２】
したがって、膜を透過処理する熱処理の後に十分な拡散を可能にするために、遅延時間を必要とすることもある。
【００６３】
文献によると、タンパク質を抽出するための酵母の細胞膜のパルスフィールド透過処理プロセスは、４〜６時間を必要とする（Ｇａｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１５，７７−８４）。
【００６４】
本発明によれば、１〜５分間というかなり短い反応時間が使用される。
【００６５】
有利には、細胞区画の可溶性化合物の拡散を最適化するために、さらに３０分間〜３時間の反応時間を使用してもよい。
【００６６】
次いで、前面ろ過もしくはタンジェントろ過による、フロキュレーションによる、遠心分離による、またはさらに当業者に公知の任意の手段による固液分離の技術により、残留バイオマスが除去されるため、微細藻細胞が除去された可溶性画分を容易に回収することが可能になる。
【００６７】
この可溶性画分は、タンパク質（５０〜８０％ｗ／ｗ）と炭水化物（５〜１５％ｗ／ｗ）とで本質的に構成される。
【００６８】
可溶性タンパク質を回収する従来のプロセスは、一般に、トリクロロ酢酸（１０％重量／体積）を用いて、または硫酸アンモニウムを用いて、前記タンパク質を沈殿させる工程
に基づく。
【００６９】
しかしながら、沈殿によるこれらの単離は、非常に破壊的な細胞破壊処理（通常は超音波処理またはホモジナイズ処理による）の後に行われるため、実際に抽出収率を増加させる一方で、特に変性された低溶解性のタンパク質が得られる。
【００７０】
次いで、化学的手段（水酸化ナトリウムによる溶解）、物理的手段（高温処理）、または酵素的手段（タンパク質分解酵素）により（ペプチドまでの）加水分解物を利用してその再機能化を行うことが想定される。
【００７１】
本発明に係るプロセスは、それとは対照的に、全ての機能を依然として発現可能な無傷の天然ペプチドおよび天然ポリペプチドの放出を可能にする。
【００７２】
さらに、本出願人企業は、放出される可溶性のペプチドおよびポリペプチドのサイズが使用処理温度に比例して変化することを見いだした。また、処理時間も影響すると考えられる。
【００７３】
さらに、対象のタンパク質またはオリゴ糖を単離するための分画プロセスが本出願人企業により提案され、前記分画プロセスは主に膜分画プロセスである。
【００７４】
したがって、本出願人企業は、２つの工程：
−  単独でまたは組み合わせて、精密ろ過、限外ろ過、ナノろ過、および透析ろ過からなる群から選択される膜システムでろ過された可溶性画分（熱処理された微細藻が除去されたもの）から可溶性のタンパク質およびオリゴ糖が富化された組成物を調製する工程と、
−  一方ではペプチドおよびポリペプチドを分離するために、他方ではオリゴ糖を分離するために、前記組成物を逆浸透型の追加の膜分画処理に付す工程と
においてプロセスを実施することを推奨する。
【００７５】
本発明は以下の実施例からより明確に理解されよう。これらの実施例は例示を意図した一価であり、限定を意図したものではない。
【実施例】
【００７６】
実施例１：フェドバッチ発酵によるクロレラ・プロトセコイデスの生産
使用した株はクロレラ・プロトセコイデスＵＴＥＸ２５０である。
【００７７】
前培養：
−  ２ｌのエルレンマイヤーフラスコ中の５００ｍｌの培地、
−  培地の組成（ｇ／ｌ単位）。
【００７８】
【表１】
2017507662.tif 000002
【００７９】
インキュベーションは次の条件下で行われる。継続時間：７２時間、温度：２８℃、振盪：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター）。
【００８０】
次いで、前培養物を３０ｌザルトリウス型発酵槽に移す。
【００８１】
バイオマス生産のための培養：
培地は以下のとおりである。
【００８２】
【表２】
2017507662.tif 000003
【００８３】
発酵槽の初期体積（Ｖｉ）は、接種後に１７ｌに調整する。それを約２０〜２５ｌの最終体積にする。
【００８４】
発酵を実施するためのパラメーターは以下のとおりである。
【００８５】
【表３】
2017507662.tif 000004
【００８６】
残留グルコース濃度が１０ｇ／ｌ未満に低下した場合、発酵槽内のグルコース含有量を０〜２０ｇ／ｌに維持するように、約８００ｇ／ｌの濃縮液の形態でグルコースを導入する。
【００８７】
結果
４０時間で、５２％のタンパク質を含有する８０ｇ／ｌのバイオマスが得られる。
【００８８】
実施例２．クロレラ・プロトセコイデスバイオマスの熱透過処理および可溶性画分の回収
実施例１に従って得られたバイオマスは：
−  １５０ｇ／ｌの乾物含有量かつ９０％超の純度（バイオマスの乾物の全乾物に対する割合により定義される純度）になるように遠心分離および洗浄が行われ、次いで、
−  以下のように熱処理される：
・３０秒間にわたり２８℃から６０℃まで温度を上昇させ、
・３０秒間にわたり６０℃から９０℃まで温度を上昇させ、
・１分間にわたり９０℃に温度を維持し、
・３０秒間にわたり９０℃から６０℃に冷却し、
・好ましくは１分間にわたり６０℃から４℃に冷却する。
【００８９】
こうして得られたバイオマスを遠心分離により可溶性画分から分離する。次いで、前記可溶性画分を６０℃で０．１４μｍセラミック膜により精密ろ過する。
【００９０】
膜間差圧を０．２〜０．６ｂａｒの値に固定し、２．５の体積濃縮係数が得られるように精密ろ過を行う（したがって、１００ｌの可溶性画分をこうして精密ろ過することにより、４０リットルの濃縮液「Ｒ１」と６０リットルの透過物「Ｐ１」とが生成される）。
【００９１】
この精密ろ過透過物「Ｐ１」は、４％の乾物含有量と、Ｎ×６．２５で表したときに６０％〜８０％の価の可溶性タンパク質とを有する。
【００９２】
実施例３．透過処理したクロレラ・プロトセコイデスバイオマスの細胞内容物のタンパク質成分および糖成分の分画
可溶性のタンパク質および糖に富む画分を得るために、
・５ｋＤａ以上の分子量を有するペプチドと、高ＤＰを有するオリゴ糖とを含有する１０％の乾物含有量の濃縮液「Ｒ２」と、
・５ｋＤａ未満の分子量を有するペプチドと、２以下のＤＰを有するオリゴ糖とを含有する１％の乾物含有量の透過物「Ｐ２」と
が得られるように、４％の乾物含有量を有する実施例２の終了時に得られた精密ろ過透過物「Ｐ１」を、特に１０ｋＤａのカットオフ閾値の膜により限外ろ過する。
【００９３】
次いで、
・５ｋＤａ未満の分子量を有するペプチドとＤＰ２のオリゴ糖、たとえばスクロースとを含有する１０％の乾物含有量の濃縮液「Ｒ３」と、
・ＤＰ１のオリゴ糖と塩と遊離アミノ酸と有機酸とを含有する０．１％の乾物含有量の透過物「Ｒ３」と
が得られるように、この透過物「Ｐ２」を特に逆浸透膜（９３％のＮａＣｌ排除率を有する）によりろ過することが可能である。
【国際調査報告】
2017507662.tif 000005
2017507662.tif 000006
2017507662.tif 000007
2017507662.tif 000008
2017507662.tif 000009
2017507662.tif 000010