(57)【要約】  病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強する方法である。前記方法は、処置対象の物体に抗菌銀材料を供給するステップと、抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記部位に供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含む。前記方法は、創傷に対して抗菌銀材料を供給し、で大気中の濃度より高い濃度の酸素を局級することを含む。前記方法を実施するためのデバイス及び組成物、並びにそのようなデバイス及び組成物を製造するための方法も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強するための創傷治療デバイスであって、
ａ）独立気泡及び壁を含む、成形された生体適合性ポリマーのマトリクスと、
ｂ）前記独立気泡に含められた気体酸素と、
ｃ）前記マトリクスの少なくとも皮膚接触部分上に存在する抗菌銀材料とを含み、
前記抗菌銀材料の存在下で前記独立気泡から酸素が送達されるように構成され、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮することを特徴とするデバイス。
【請求項２】
請求項１に記載のデバイスであって、
前記抗菌銀材料は、銀塩、銀錯体、元素銀、またはそれらの組み合わせを含み、
好ましくは、前記抗菌銀材料は、約０．０１重量％〜約２重量％の濃度で存在することを特徴とするデバイス。
【請求項３】
請求項２に記載のデバイスであって、
前記元素銀は、銀ナノ粒子、銀粉末、またはそれらの組み合わせから選択されることを特徴とするデバイス。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイスであって、
生体適合性ポリマーの前記マトリクスは、ポリマーと触媒とを含み、
気体酸素は、溶解酸素が前記壁のなかの水分中に存在するように過酸化物が触媒と反応した場合に生成されることを特徴とするデバイス。
【請求項５】
請求項４に記載のデバイスであって、
前記触媒は、炭酸ナトリウム、塩化第二銅、塩化第二鉄、酸化マンガン、ヨウ化ナトリウム、ラクトペルオキシダーゼ、カタラーゼ、またはそれらの組み合わせを含み、
前記過酸化物は、過酸化水素、過酸化アンモニウム、過酸化ナトリウム、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とするデバイス。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイスであって、
前記マトリクスは、ストランドの形態を更に有することを特徴とするデバイス。
【請求項７】
病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強するための創傷治療デバイスであって、
ａ）ポリマー及び触媒を含み、かつ独立気泡及び壁を含む、成形された生体適合性ポリマーのマトリクスと、
ｂ）前記独立気泡に含められた気体酸素と、
ｃ）前記マトリクスの皮膚接触部分上に存在する抗菌銀材料と、
ｄ）前記壁のなかの水分中に存在する溶解酸素とを含み、
過酸化物が触媒と反応したときに前記気体酸素及び前記溶解酸素が生成されるように構成され、前記デバイスは、前記抗菌銀材料の存在下で前記独立気泡から酸素が送達されるように使用されるべく構成され、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮することを特徴とするデバイス。
【請求項８】
請求項７に記載のデバイスであって、
前記抗菌銀材料は、銀塩、銀錯体、元素銀、またはそれらの組み合わせを含み、
好ましくは、前記抗菌銀材料は、約０．０１重量％〜約２重量％の濃度で存在することを特徴とするデバイス。
【請求項９】
請求項８に記載のデバイスであって、
前記元素銀は、銀粉末及び銀ナノ粒子から選択されることを特徴とするデバイス。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか一項に記載のデバイスであって、
前記触媒は、炭酸ナトリウム、塩化第二銅、塩化第二鉄、酸化マンガン、ヨウ化ナトリウム、ラクトペルオキシダーゼ、カタラーゼ、またはそれらの組み合わせを含み、
前記過酸化物は、過酸化水素、過酸化アンモニウム、過酸化ナトリウム、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とするデバイス。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか一項に記載のデバイスであって、
前記マトリクスは、ストランドの形態を更に有することを特徴とするデバイス。
【請求項１２】
病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強する方法であって、
抗菌銀材料のナノ粒子を処理対象の表面または物品に提供するステップと、
前記抗菌銀材料の存在下で酸素を供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
独立気泡及び壁を含む、成形された生体適合性ポリマーのマトリクスを提供することによって前記酸素が提供され、
気体酸素は大気中の濃度よりも高い濃度で前記独立気泡に含まれていることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法であって、
前記抗菌銀材料のナノ粒子が、前記マトリクスの一部分上に存在することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法であって、
酸素の存在下での前記抗菌銀材料は、前記抗菌銀材料単独の場合と比較して大きい微生物殺滅能力を提供することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法であって、
前記抗菌銀材料を提供し、大気中の濃度より高い濃度の酸素を創傷に供給するステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記処理対象の表面または物品は、無生物の物品または表面であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強する方法であって、
抗菌銀材料のナノ粒子を処理対象の表面または物品に提供するステップであって、前記抗菌銀材料は０．５重量％未満の濃度で提供される、該ステップと、
前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度で酸素を物品に供給するステップであって、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記処理対象の表面または物品は、無生物の物品または表面であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
創傷被覆材であって、
酸素送達成分及び抗菌銀材料を含み、
前記創傷被覆材が創傷を治療するために使用される場合、前記抗菌銀材料の存在下で酸素が送達され、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅を提供することを特徴とする創傷被覆材。
【請求項２１】
請求項２０に記載の創傷被覆材であって、
前記抗菌銀材料は抗菌銀ナノ粒子であることを特徴とする創傷被覆材。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の創傷被覆材であって、
前記抗菌銀材料が、０．５重量％未満の濃度で存在することを特徴とする創傷被覆材。
【請求項２３】
哺乳動物における微生物感染を治療または予防する方法であって、
処置対象の部位に抗菌銀材料を投与するステップと、
前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記部位に供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、
前記抗菌銀材料は抗菌銀ナノ粒子であることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の方法であって、
前記抗菌銀材料が、０．５重量％未満の濃度で存在することを特徴とする方法。
【請求項２６】
創傷治癒を促進する方法であって、
抗菌銀材料を創傷に投与するステップと、
前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記創傷に供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
前記抗菌銀材料は抗菌銀ナノ粒子であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の方法であって、
前記抗菌銀材料が、０．５重量％未満の濃度で存在することを特徴とする方法。
【請求項２９】
細菌感染を治療するための方法であって、
処置対象の部位に抗菌銀材料を投与するステップと、
前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記部位に供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、
前記抗菌銀材料は抗菌銀ナノ粒子であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載の方法であって、
前記抗菌銀材料が、０．５重量％未満の濃度で存在することを特徴とする方法。
【請求項３２】
微生物感染の治療または予防、創傷治癒の促進、または細菌感染の治療において大気の濃度より高濃度の酸素とともに使用するための抗菌銀材料。
【請求項３３】
請求項３２に記載の抗菌銀材料であって、
前記抗菌銀材料は抗菌銀ナノ粒子であることを特徴とする抗菌銀材料。
【請求項３４】
微生物感染の治療または予防、創傷治癒の促進、または細菌感染の治療において大気の濃度より高濃度の酸素とともに使用するための医薬の製造における抗菌銀材料の使用。
【請求項３５】
請求項３４に記載の使用であって、
前記抗菌銀材料は抗菌銀ナノ粒子であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第６２／０１７，３５０号を基礎とする優先権を主張するものである。
本発明は、一般に損傷した組織への気体及び他の薬剤の送達のための創傷処置デバイスの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
銀は、一般的に慢性及び急性の創傷のための局所抗菌剤として使用されている。これは、軟膏、ヒドロゲル、及びポリマーのような様々な製剤に配合され、次いで創傷に局所的に適用される。銀は様々な創傷治療デバイスにも使用されている。銀を使用することの欠点の１つは、高濃度では、健康な哺乳動物細胞に対して細胞毒性であり、創傷治癒を阻害する炎症を引き起こすことである。
【０００３】
イオン銀は、１ｐｐｍの濃度でヒト線維芽細胞に対して細胞毒性であることが見いだされた。非特許文献１を参照されたい。非特許文献２においても類似の結果が見いだされており、ここでは、０．７ｐｐｍまで硝酸銀が細胞毒性であることが発見された。これらの数値よりはるかに高いレベルの銀を放出する可能性のある銀含有創傷ケア製品が数多く存在する。この細胞毒性は、創傷治癒過程を遅らせる可能性がある。
【０００４】
銀は消費者及び創傷ケアの分野でますます使用されているため、慢性的な曝露により、ある種の生物において低濃度での耐性を発生させる可能性がある。このような生物には、特に、グラム陰性バクテリアが含まれ、グラム陰性菌では、外側膜及び能動排出系によって殺生物剤が細胞内の標的に到達することが防止される。非特許文献３を参照されたい。この文献は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）及びセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）といった銀に対する耐性を示す傾向がある種々の例が示されている。非特許文献４を参照されたい。
【０００５】
銀が抗菌特性を有するためには、イオン化（Ａｇ＋）型でなければならないことが実証されている。銀塩及び他の銀含有化合物は、少量の銀イオンを放出することによって作用し、一般的にはこれらのイオンは、銀塩の解離により放出される。銀ナノ粒子は、わずかに異なるメカニズムを有する。即ち、ナノ粒子はそれらのコアにおいて、水に不溶性のゼロ価の銀金属でできており、これらの粒子の表面は最初に酸化してＡｇ２Ｏを形成し、次いで解離して銀イオンを放出しなければならない。非特許文献５を参照されたい。また、非特許文献６も参照されたい。
【０００６】
非常に低い解離定数を有する銀含有化合物は、銀イオンの解離がそのように低いので、抗菌活性があるとしてもごく低い活性である傾向がある。これは、ヨウ素のような特定のハロゲンと錯体を形成する場合、またはチオールまたはジスルフィドのような硫黄を含む官能基を有する分子と錯体を形成する場合の銀に特に当てはまる。銀が抗菌性をどのように発揮するかについての理論の１つは、それが細菌の細胞壁及び内部細胞小器官からのタンパク質に見られるチオールと結合し、タンパク質の三次構造を破壊し、機能しなくさせる、というものである。
【０００７】
創傷床は、一般的にはタンパク質が豊富な環境である。これらのタンパク質は、患者自身の創傷滲出液及び／または微生物バイオフィルムから得られ、一般的には多数のチオール基及びジスルフィド基を含むことができる。これらのチオールまたはジスルフィドが銀イオンと相互作用して硫化銀錯体を形成すると、銀イオンは標的細菌に到達する前に高度に不溶性になり、抗菌剤としてはあまり効果的でなくなる。
【０００８】
一般的には、銀を従来の局所創傷被覆材を用いて創傷に適用すると、その銀は、ほとんどの場合ではないにしても、タンパク質によって不溶性にされる、ひいては効果を発揮できないようにされる可能性が非常に高い。多くの銀の創傷用製品は、塩化銀のようなわずかに可溶な銀塩の形態またはコロイドまたはナノ粒子のような元素銀の形態の、ある種の銀「リザーバ」を使用する。銀イオンは、長期間にわたって抗菌効果を発揮するようにゆっくりと制御された形で放出されると考えられている。実際には、これらの低レベルのイオン銀は、それぞれが多数の不活性化チオール及びジスルフィド基を含む豊富なタンパク質によって単に抑制されてしまう可能性がある。
【０００９】
活性酸素種が銀の抗菌活性にある役割を果たすことが示唆されているが、その役割は十分に理解されていない。例えば、ある研究により、好気性条件下で、嫌気性条件下より銀イオンが大腸菌及び黄色ブドウ球菌に対してより良好な殺菌活性を示すことが実証された。この活性は、スーパーオキシド・ラジカルの細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）生成に起因するものであった。そのメカニズムは、銀と細胞酵素との間のチオール相互作用を含むことが示唆された。非特許文献７を参照されたい。別の研究では、細胞を様々な大きさの銀ナノ粒子に曝露した。ナノ粒子が小さいほど細胞毒性が高いことが判明した。細胞は、ＲＯＳメカニズムを示唆する酸化ストレスに関連する典型的なマーカーについて高いレベルを有することが見いだされた。非特許文献８を参照されたい。
【００１０】
逆に、ＲＯＳが、銀に抗菌活性を発揮させる唯一のメカニズムではないことが示されている。非特許文献９には、水中で完全に解離して高レベルの銀イオンを与える硝酸銀は、嫌気性及び大気好気性の両方の環境において同じ殺滅率を示したことが実証されている。分子酸素はＲＯＳを生成するために必要であるため、この同等の殺傷率は、ＲＯＳが機構に関与していないことを示唆している。この論文は、銀ナノ粒子が嫌気性条件下で大腸菌に対する効力を示すことを示している。粒子を周囲空気に暴露すると、粒子の表面が酸化されることによっておそらく殺傷率が増加し、これは前述のように銀イオン放出を増加させるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第８６７９５２３号明細書
【特許文献２】米国特許第７１６０５５３号明細書
【特許文献３】米国特許第８０７５５３７号明細書
【特許文献４】米国特許第４２２４９４１号明細書
【特許文献５】米国特許第４２２４９４１号明細書
【特許文献６】米国特許第５９２８１７４号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Kvitek, A, et al, Antibacterial activity and toxicity of silver - nanosilver versus ionic silver. Journal of Physics: Conference Series 304 (2011) 012029
【非特許文献２】Hidalgo E., et. al.（1998, Silver Nitrate: antimicrobial activity related to cytotoxicity in cultured human fibroblasts. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol）
【非特許文献３】Poole, K. J., Antimicrob. Chemother. (July 2005) 56 (1): 20-51
【非特許文献４】Lansdown, A., Williams, A., (2007) Bacterial resistance to silver-based antibiotics. Nursing Times; 103: 9, 48-49
【非特許文献５】S.L. Percivala, P.G. Bowlera, D. Russell, Bacterial resistance to silver in wound care. Journal of Hospital Infection (2005) 60, 1-7
【非特許文献６】Zong-Ming Xiu, Jie Ma, and Pedro J. J. Alvarez, Differential Effect of Common Ligands and Molecular Oxygen on Antimicrobial Activity of Silver Nanoparticles versus Silver Ions; Environ. Sci. Technol. 2011, 45, 9003-9008
【非特許文献７】Hee-Jin Park, Jee Yeon Kim, Jaeeun Kim, Joon-Hee Lee, Ji-Sook Hahn, Man Bock Gu, Jeyong Yoon., Silver-ion-mediated reactive oxygen species generation affecting bactericidal activity. Water Research 43 (2009) 1027-1032
【非特許文献８】C. Carson, et. al. Unique Cellular Interaction of Silver Nanoparticles: Size Dependent Generation of Reactive Oxygen Species. J. Phys. Chem. B 2008, 112, 13608-13619
【非特許文献９】Differential Effect of Common Ligands and Molecular Oxygen on Antimicrobial Activity of Silver Nanoparticles versus Silver Ions; Environ. Sci. Technol. 2011, 45, 9003-9008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、健康な哺乳動物細胞に対して細胞毒性を示さず、かつ創傷治癒を阻害する炎症を引き起こさずに、抗菌銀材料を利用して創傷を治療するための方法、組成物またはデバイスが必要とされている。ある種の生物が低濃度の銀に対する耐性を容易に発現することをより困難にしつつ、低濃度で抗菌銀材料を利用して創傷を治療するための方法、組成物またはデバイスも必要である。銀に対する微生物の耐性が生ずる可能性を減少させるために、抗菌銀材料の殺傷率を速める創傷を治療するための方法、組成物またはデバイスも必要とされている。
【００１４】
これらのニーズは、満足できるレベルの微生物殺滅を確実かつ効果的に提供しながら、創傷床などのタンパク質に富んだ環境において抗菌銀材料を利用する方法、デバイス及び組成物にまで及んでいる。また、病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強する方法のニーズも満たされていない。例えば、抗菌性銀が従来の方法、デバイス及び組成物よりも効果的に使用される、哺乳動物における微生物感染を治療または予防するため、及び／または創傷治癒を促進することについて未だ満たされていないニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書で論じる困難性及び問題に対応して、本発明は、病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強するための方法、デバイス及び組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強するための創傷治療デバイスであって、ａ）独立気泡及び壁を含む、成形された生体適合性ポリマーのマトリクスと、ｂ）前記独立気泡に含められた気体酸素と、ｃ）前記マトリクスの少なくとも皮膚接触部分上に存在する抗菌銀材料とを含み、デバイスを包含する。本発明によれば、デバイスが創傷を治療するために使用される場合、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺傷能力を発揮するように、前記抗菌銀材料の存在下で前記独立気泡から酸素が送達される。例えば、前記抗菌銀材料は、抗微生物チャレンジアッセイによって測定された微生物殺滅について前記抗菌銀材料単独よりも少なくとも３ｌｏｇの増加を提供することができる。一般的に言えば、前記抗菌銀材料は、抗微生物チャレンジアッセイによって測定されたグラム陰性菌に対する微生物殺滅について処置の３時間以内に単なる前記抗菌銀材料単独よりも少なくとも１ｌｏｇの増加を提供し得る。
【００１７】
前記抗菌銀材料は、銀塩、銀錯体、元素銀、またはそれらの組み合わせであってもよい。例えば、抗菌性銀は銀塩及び銀錯体であってもよい。別の例として、抗菌性銀は、それ自体で、または銀塩及び／または銀錯体と組み合わせて、元素銀であってもよい。前記元素銀は、銀ナノ粒子、銀粉末、またはそれらの組み合わせから選択される元素銀材料であってもよい。
【００１８】
前記抗菌銀材料は、約０．００１重量％〜約２重量％の濃度で存在し得る。例えば、前記抗菌銀材料は、約０．００２５重量％〜約１重量％の濃度で存在し得る。別の例として、前記抗菌銀材料は、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度で存在し得る。更に別の例として、前記抗菌銀材料は、約０．００７５重量％〜約０．２５重量％の濃度で存在し得る。望ましくは、前記抗菌銀材料は、約０．０５重量％〜約０．００２５重量％の濃度で存在し得る。前記抗菌銀材料は、０．００２５重量％未満のレベルで存在し得ると考えられる。例えば、ある場合には、前記抗菌銀物質は、約０．０００００１〜約０．００１重量％のレベルで存在し得る。
【００１９】
本発明の一態様によれば、生体適合性ポリマーの前記マトリクスは、ポリマーと触媒とを含み、気体酸素は、溶解酸素が前記壁のなかの水分中に存在するように過酸化物が触媒と反応した場合に生成される。前記創傷治療デバイスに使用される触媒は、炭酸ナトリウムであってもよい。しかし、他の触媒、例えば、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の塩も、それらが生体適合性である製品と適合するならば使用され得る。更に、２種以上の触媒を使用してもよい。例えば、１つの触媒は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の塩からなる群から誘導されたものでよく、第２の触媒としては、有機化学物質及び無機化学物質（例えば、塩化第二銅、塩化第二鉄、酸化マンガン、ヨウ化ナトリウム及びそれらの均等物等）が挙げられるが、これらに限定されない。他の触媒としては、ラクトペルオキシダーゼ及びカタラーゼなどの酵素またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
前記創傷治療デバイスに使用される前記過酸化物は望ましくは過酸化水素である。  しかし、例えば限定しないが過酸化アンモニウム、過酸化尿素、過酸化ナトリウム、及び他のペルオキシ化合物またはそれらの組み合わせを含む他の過酸化物も、それらが生体適合性及び／または生体吸収性に矛盾する残留物を残さない限り使用することができる。本発明は、マトリクス内に気体元素を生成することができ、かつ安全で有効な成分の使用を想定している。例えば、マトリクス中に酸性触媒を導入し、その後マトリクス中に炭酸ガスを発生させるために炭酸塩でマトリクスを灌流することができる。このような材料は、溶液または環境をバッファリングするために使用される。
【００２１】
本発明のデバイスは、デバイスの用途に応じて、多くの物理的形態をとることができる。好ましい形状は、任意の２次元形状に切断または成形することができるゲルシートである。他の好ましい実施形態は、創傷床または身体の空洞内に配置するのに適したマトリクスの薄いストランド（線材）で主に構成されている。デバイスの生体適合性マトリクスは、生体吸収性マトリクスであってもよいと考えられる。
【００２２】
本発明は更に、病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強する方法を包含する。この方法は、抗菌銀材料のナノ粒子を処理対象の表面または物品に提供するステップと、前記抗菌銀材料の存在下で酸素を供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含む。前記処理対象の表面または物品は、無生物の物品または表面であり得ることが理解されるべきである。前記方法は、前記抗菌銀材料を提供し、大気中の濃度より高い濃度の酸素を創傷に供給するステップを更に含み得る。
【００２３】
前記抗菌銀材料は銀ナノ粒子のような元素状銀であってもよい。代わりに及び／または更に、前記抗菌銀材料は、銀塩及び／または銀錯体などであってもよい。望ましくは、これらの銀塩及び／または銀錯体は、約０．００１重量％〜約２重量％の濃度で存在する。より望ましくは、前記抗菌銀材料は、約０．０１重量％〜約０．５重量％の濃度で存在する。例えば、前記抗菌銀材料は、約０．０１重量％〜約０．２５重量％の濃度で存在する。本発明によれば、前記抗菌銀材料の一部は、非常に低い解離定数を有する銀錯体として創傷内に存在し得る。低い解離定数は、高濃度の銀によって引き起こされる細胞毒性の問題を軽減するために使用され、抗菌剤として十分な銀イオンを提供する。
【００２４】
本発明の一態様によれば、酸素は、独立気泡及び壁を含む形成されたマトリクスから提供されることができ、気体酸素は前記独立気泡中に含められることができ、溶解酸素は壁内の水分中に存在することができ、抗菌銀材料はマトリクスの一部に存在する抗菌銀材料から提供することができる。
【００２５】
本発明は、創傷被覆材であって、酸素送達成分及び抗菌銀材料を含み、前記創傷被覆材が創傷を治療するために使用される場合、前記抗菌銀材料の存在下で酸素が送達され、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅を提供する、創傷被覆材を包含する。
【００２６】
本発明はまた、哺乳動物における微生物感染を治療または予防する方法であって、処置対象の部位に抗菌銀材料を投与するステップと、前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記部位に供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含む、方法を包含する。
【００２７】
本発明は更に、創傷治癒を促進する方法であって、抗菌銀材料を創傷に投与するステップと、前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記創傷に供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含む、方法を包含する。
【００２８】
本発明はまた、細菌感染を治療するための方法であって、抗菌銀材料を投与するステップと、前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記部位に供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含む、方法を包含する。
【００２９】
本発明は、病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強するための創傷治療デバイスの製造方法を包含する。この方法は、一般に、少なくとも１つの架橋可能な生体適合性ポリマーと触媒とのゲル化混合物を提供するステップと、前記ゲル化混合物の前記生体適合性ポリマーを架橋して、水膨潤性架橋生体適合性ポリマーネットワークを形成するステップと、前記ゲル化混合物をゲルシートに乾燥させるステップと、前記ゲルシートに第２の反応物を添加するステップと、前記触媒と前記第２の反応物とを反応させることにより、前記ゲルシートに酸素を含む複数の独立気泡を生成するステップとを含む。前記菌性銀材料は、調合（コンパウンディング）の間に混合物に添加されてもよく（例えば、前記ゲル化混合物に添加され得る）、または前記抗菌銀材料は、前記ゲルシートが形成された後に、または前記ゲルシートに酸素を含む複数の独立気泡が形成された後に塗布してもよい。前記菌性銀材料は、浸漬、コーティング、噴霧または類似のプロセスによって前記ゲルシートに添加され得る。
【００３０】
本発明の前記方法において、前記第２の反応物は過酸化水素のような過酸化物であってもよく、前記触媒は炭酸ナトリウムのような炭酸化合物であってもよい。
【００３１】
本発明はまた、微生物感染の治療または予防、創傷治癒の促進、または細菌感染の治療において大気の濃度より高濃度の酸素とともに使用するための抗菌銀材料を包含する。前記抗菌銀材料は抗菌銀ナノ粒子であり得る。
【００３２】
微生物感染の治療または予防、創傷治癒の促進、または細菌感染の治療において大気の濃度より高濃度の酸素とともに使用するための医薬の製造における抗菌銀材料の使用も、本発明に包含される。前記抗菌銀材料は抗菌銀ナノ粒子であり得る。
【００３３】
本開示の他の目的、利点及び用途は、以下の詳細な説明によって明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、例示的な創傷治療デバイスの断面図である。
【図２】図２は、本発明の実施例を含む様々なサンプルについて、ｘ軸に時間（時）をとり、ｙ軸に緑膿菌ＣＦＵの対数減少をとったグラフを示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施例を含む様々なサンプルについて、ｘ軸に時間（時）をとり、ｙ軸にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＣＦＵの対数減少をとったグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、図面に示された実施例、１以上の実施形態の詳細に参照する。１つの実施形態の一部として図示または記載された特徴は、別の実施形態とともに用いられて、さらに別の実施形態を作り出せることを理解されたい。特許請求の範囲に定める技術範囲には、本開示の範囲及び精神の範囲内に含まれるこれら及び他の変更及び変形形態が含まれることが想定されている。
【００３６】
本明細書で使用される「抗微生物チャレンジアッセイ（または抗微生物チャレンジ試験）」という用語は、従来の抗微生物有効性試験を指し、ＡＳＴＭ  Ｅ−２３１５「Guide for Assessment of Antimicrobial Activity Using a Time-Kill Procedure」に基づく試験を含む。
【００３７】
本明細書において、用語「抗菌銀」、「抗菌銀材料」、「銀」及び「銀材料」は交換可能に使用され、適切な形態で銀イオンを溶出させ、抗微生物チャレンジアッセイによって決定される測定可能な微生物殺滅能力を有する物質を指す。例えば、これらの材料は、銀塩、銀錯体、銀ナノ粒子または銀粉末の形態の元素銀であってもよい。
【００３８】
本明細書において、用語「グラム陰性菌」は、紫色素が適用され、続いて脱色剤、次いで赤色色素が適用されるグラム染色法（「グラム法」とも呼ばれる）を利用して特定された細菌を指す。グラム陰性細菌は最初の色素を失って赤く見える。
【００３９】
本明細書において、用語「グラム陽性菌」は、紫色素が適用され、続いて脱色剤、次いで赤色色素が適用されるグラム染色法（「グラム法」とも呼ばれる）を利用して特定された細菌を指す。グラム陽性細菌は第１の色素を保持し、紫色に見える。
【００４０】
本明細書において、用語「増強する」及び「増強」は、１つの薬剤の作用効果を別の薬剤によって増強し、組み合わせた作用効果をそれぞれ単独の作用効果の合計よりも大きくすることを意味する。
【００４１】
本発明は、病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強するための方法、デバイス及び組成物を提供する。一態様では、本発明は、病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強するための創傷治療デバイスを包含する。図１を参照すると、例示的な創傷治療デバイス１０の一部分（必ずしも一定の縮尺ではない）の断面図が示されている。デバイスは、成形された生体適合性ポリマーのマトリクス１２を含む。生体適合性ポリマーのマトリクス１２は、酸素の送達のために使用される。マトリクスは、水膨潤性で架橋された生体適合性ポリマーネットワークを含むことができる。例示的な生体適合性マトリクス及びそれを形成する技術は、Ｇｉｂｂｉｎｓらに２０１４年３月２５日に付与された米国特許第８６７９５２３号明細書（「Oxygen-Delivery Closed Cell Foam Matrix for Wound Treatment」）（特許文献１）及びＧｉｂｂｉｎｓらに２００７年１月９日に付与された米国特許第７１６０５５３号明細書（「Matrix for Oxygen Delivery to Compromised Tissues」）（特許文献２）に開示されており、これらの特許文献の内容は引用により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
マトリクス１２は、独立気泡１４及び壁１６を含む。即ち、複数の気体透過性で弾性の独立気泡が、架橋された生体適合性ポリマーネットワークによって画定される。本発明の一態様によれば、生体適合性マトリクスは、ポリマーと触媒とを含む生体適合性ポリマーのマトリクスであり、独立気泡は、触媒と第２の反応物（例えば、過酸化物）との反応から生成され得る。デバイスが創傷を治療するために使用されるとき、酸素が独立気泡から送達されるように、送達可能な酸素が弾性独立気泡内に含められる。一般に、気体酸素「ＧＯ」が独立気泡１４に含まれ、溶解酸素「ＤＯ」は壁１６内の水分中に存在する。
【００４３】
生体適合性ポリマーネットワークは、水膨潤性ポリマーネットワークに架橋され得る生体適合性ポリマーから形成される。架橋ポリマーネットワークは、気体透過性である弾性のある独立気泡を画定することができるように可撓性でなければならない。天然に由来するかまたは合成された様々なポリマーを使用して、ポリマーネットワークを作成することができる。架橋可能で生体適合性であるポリマーが好ましい。例示的なポリマーには、限定しないが、ヒアルロン酸及びその誘導体、アルギン酸及びその誘導体、コラーゲン、キトサン、キチン、デンプン誘導体、グアーガム、キサンタンガム等のガム、クエン酸系のポリマー、乳酸及びグリコール酸系ポリマー、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（無水物）、ポリ（ホスホエステル）及びポリアルキレングリコール系ポリマー等が挙げられる。他の例としては、限定しないが、ポリリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリアクリレート、ポリブテラート、ポリウレタン発泡材、ポリエーテル、シラスティック（シリコーンゴム）、シリコーンエラストマー、ゴム、ナイロン、ビニルまたは架橋デキストランが挙げられる。架橋デキストランを使用する場合、デキストランポリマーの分子量は５０，０００〜５００，０００であることが好ましい。更にマトリクス材料は、天然及び合成ポリマーの組み合わせ、または合成ポリマーの混合物または天然ポリマーの混合物から作製することができる。
【００４４】
第２の反応物は望ましくは過酸化水素である。しかし、限定しないが、尿素過酸化物、過酸化ナトリウム及び他の過酸化化合物を含む過酸化物も、生体適合性及び／または生体吸収性を損なう残留物を残さない限り使用することができる。本発明は、マトリクス内に気体元素を生成することができ、かつ安全で有効な成分の使用を想定している。例えば、マトリクス中に酸性触媒を導入し、その後炭酸塩でマトリクスを灌流し、マトリクス中に炭酸ガスを発生させることができる。このような材料は、次いで溶液または環境をバッファリングするために使用される。
【００４５】
触媒は、炭酸ナトリウムであってもよい。しかし、他の触媒、例えば、他のアルカリ及びアルカリ土類化合物も、それらが生体適合性である製品と適合する場合には使用することができる。更に、２種以上の触媒を使用してもよい。例えば、１つの触媒は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の塩からなる群から誘導されたものでよく、第２の触媒としては、有機化学物質及び無機化学物質（例えば、塩化第二銅、塩化第二鉄、酸化マンガン、ヨウ化ナトリウム及びそれらの均等物等）が挙げられるが、これらに限定されない。他の触媒としては、ラクトペルオキシダーゼ及びカタラーゼなどの酵素を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４６】
生体適合性マトリクスは、非ゲル化性多糖類を含むことができる。適切な非ゲル化性多糖類の例には、グアーガム、グアーガム、ルツェルン、フェヌグリーク、ハニーローカスビーンガム、ホワイトクローバービーンゴム、またはイナゴマメガムが含まれる。生体適合性マトリクスはさらに可塑剤を含むことができる。可塑剤は、グリセロール及び／または水であってもよいが、プロピレングリコール及び／またはブタノール及びそれらの組み合わせも使用され得る。グリセロールが使用される場合、約０．２５〜２５％ｗ／ｗ、好ましくは０．５〜１２％ｗ／ｗの範囲である。生体適合性マトリクスは、水和制御剤を更に含み得る。水和制御剤は、イソプロピルアルコールであってもよい。しかし、エタノール、グリセロール、ブタノール、及び／またはプロピレングリコール及びそれらの組み合わせもまた使用され得る。イソプロピルアルコールは、約０．０５〜５％ｗ／ｗ、好ましくは約０．１〜２．５％ｗ／ｗ、最も好ましくは約０．２５〜１％ｗ／ｗの範囲が一般に十分である。例えば、架橋された生体適合性ポリマーネットワークが形成される場合、グアーガムのような非ゲル化性多糖類を添加することによって、かつグリセロールのような水和制御剤を添加することによって、水膨潤度を増加させることができる。架橋した生体適合性ポリマーネットワークを十分に水膨潤性にすることにより、第２の反応物（例えば、過酸化水素）を架橋生体適合性ポリマーネットワークに吸収させることができる。水性流体により生体適合性マトリクスの膨潤性を評価するためには、３〜４時間の蒸留水中での浸漬時間即ち浸した時間の後に２５℃での「吸水容量」として表される水和容量を測定することが重要である。水分吸収能の有用なレベルは、生体適合性ポリマーネットワーク１ｇ当たり水約２ｇ〜約８ｇの範囲であり得る。例えば、水吸収能力のレベルは、生体適合性ポリマーネットワーク１ｇ当たり水約３ｇ〜約７ｇの範囲であり得る。別の例として、水吸収能力のレベルは、生体適合性ポリマーネットワーク１ｇ当たり約４ｇ〜約６ｇの水の範囲であり得る。
【００４７】
生体適合性マトリクスは、水分喪失制御剤を更に含み得ることが想定されている。マトリクスの透水性を減少させるために、水分喪失制御剤をデバイスの表面に適用することができる。水分損失制御剤の適用は、デバイスの透水性の低下が流体の損失を制御することになるので、有用であり得る。適切な水分喪失制御剤としては、糖脂質、セラミド、遊離脂肪酸、コレステロール、トリグリセリド、ステリルエステル、コレステリル硫酸、リノール酸エチルエステル、及びシリコーンオイルが挙げられる。更に組成物及びデバイスは、水分の制御を助けるために、１つ以上の表面を覆う不透水性シートを有してもよい。
【００４８】
代わりに及び／または更に、生体適合性ポリマーのマトリクスは、Ｆｒａｎｋｌｉｎらに２０１１年１２月１３日に付与された米国特許第８０７５５３７号明細書（「Multiple Cell Therapeutic Diffusion Device」）（特許文献３）に概略が記載されているような１種以上の気体を含む１以上の気体リザーバの形態であってもよく、この特許文献の内容は引用により本明細書に組み込まれる。気体リザーバは、気体透過性の高分子フィルムから作製されてもよく、またはそのような材料から作製される部分を組み込んでいてもよい。気体リザーバはまた、個々の気泡の少なくとも一部が酸素ガスに対して透過性の、酸素ガスを含む「バブルラップ」型の材料の形態であってもよい。別の例として、気体リザーバは、１９８０年９月３０日にＳｔｉｖａｌａに付与された米国特許第４２２４９４１号明細書（「Hyperbaric Treatment Apparatus」）（特許文献４）に記載されているように、高圧の治療用ガスを皮膚の領域に投与するために使用されるチャンバまたはバッグの形態であってもよく、この特許文献の内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
１以上の抗菌銀材料１８が、マトリクス１２の少なくとも皮膚接触部分２０上に存在する。例えば、抗菌銀材料１８は、調合（コンパウンディング）の間にマトリクス１２に含まれる結果として、マトリクス１２全体に組み込まれ得る。代わりに及び／または更に、抗菌銀材料１８が、浸漬、コーティング、堆積プロセス、噴霧プロセスまたは類似の技術を利用してマトリクス１２に適用されてもよい。
【００５０】
１以上の抗菌銀材料１８は、銀塩、銀錯体、元素銀、またはそれらの組み合わせであり得る。例えば、抗菌性銀は銀塩及び銀錯体であってもよい。別の例として、抗菌性銀は、単独での、または銀塩及び／または銀錯体と組み合わせた元素銀であってもよい。元素銀は、銀粉末及び銀ナノ粒子から選択される元素銀材料であり得る。例示的な抗菌銀ナノ粒子材料は、Ｋａｒａｎｄｉｋａｒらに２０１３年１月２９日に付与された米国特許第８３６１５５３号明細書（「Methods and Compositions for Metal Nanoparticle Treated Surfaces」）（特許文献５）に開示されておりこの特許文献の内容は、引用により本明細書に組み込まれる。抗菌銀材料１８は、必ずしも縮尺通りに図示されておらず、銀塩または銀錯体のゾルまたは溶液の残渣である薄膜コーティング及び／またはナノスケール粒子（即ちナノ粒子）を含む粒子であってもよい。
【００５１】
抗菌銀材料は、約０．００１重量％〜約２重量％の濃度で存在してもよい。例えば、抗菌銀材料は、約０．００２５重量％〜約１重量％の濃度で存在してもよい。別の例として、抗菌銀材料は、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度で存在してもよい。更に別の例として、抗菌銀材料は、約０．００７５重量％〜約０．２５重量％の濃度で存在してもよい。一般的に創傷治療デバイスの場合、抗菌銀物質は、約０．０２５重量％〜約０．０５重量％程度の比較的低い濃度で存在してもよい。本発明は、そのような抗菌銀物質が０．００２５重量％または更に低い０．００１重量％のレベルで存在する場合に抗菌銀物質の作用を増強すると考えられる。例えば、抗菌銀材料は、約０．０００００１重量％〜約０．００１重量％のレベルで存在してもよい。
【００５２】
本発明のデバイスは、デバイスの用途に応じて、多くの物理的形態をとることができる。これらのデバイスはまず配置したままにしておき、次に取り除いてもよい。デバイスが生体吸収性である場合、それらは除去されずに身体によって再吸収され得る。好ましい形状は、任意の２次元形状に切断または成形することができるゲルシートである。他の好ましい実施形態は、創傷床または身体の空洞内に配置するのに適したマトリクスの薄いストランドで主に構成されている。デバイスは、創傷内に全体が配置されるか、同じ設計のさらなる束と組み合わせて創傷内に配置されるか、または創傷内に存在するストランドのサイズまたは数を低減するためにストランド間のブリッジを通して切断され得る。例示的な構造としては、Ｇｉｂｂｉｎｓに１９９９年７月２７日に付与された米国特許第５９２８１７４号明細書（「Wound Dressing Device」）（特許文献６）に記載されているものが挙げられるが、これに限定されない。
【００５３】
本発明によれば、デバイスが創傷を治療するために使用される場合、抗菌銀材料が、抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅を提供するように、前記抗菌銀材料の存在下で独立気泡から酸素が送達される。例えば、抗菌銀材料は、抗微生物チャレンジアッセイによって測定された微生物殺滅について抗菌銀材料単独よりも少なくとも３ｌｏｇの増加を提供することができる。例えば、抗菌銀材料は、抗微生物チャレンジアッセイによって測定されたグラム陽性細菌の微生物殺傷について単なる抗菌銀材料よりも３時間以内に、少なくとも３ｌｏｇの増加を提供し得る。一般的に言えば、抗菌銀材料は、抗微生物チャレンジアッセイによって測定されたグラム陰性菌に対する微生物殺滅について処置の３時間以内に単なる前記抗菌銀材料単独よりも少なくとも１ｌｏｇの増加を提供し得る。
【００５４】
一般に、酸素が創傷治癒の目的で供給される場合、創傷治癒の間に酸素に依存するいくつかの代謝過程が助けられることが知られている。しかし、ある種の嫌気性細菌（偏性嫌気性菌）の場合を除いて、酸素そのものが抗菌性であることは知られておらず、通常、創傷における生物負荷を低下させるものとして理解されていない。
【００５５】
例を参照すると、Ｇｉｂｂｉｎｓらに２００７年１月９日に付与された米国特許第７１６０５５３号明細書（「Matrix for Oxygen Delivery to Compromised Tissues」）（特許文献２）及びＧｉｂｂｉｎｓらに２０１４年３月２５日に付与された米国特許第８６７９５２３号明細書（「Oxygen-Delivery Closed Cell Foam Matrix for Wound Treatment」）（特許文献１）は、酸素を創傷に送達するために使用される特定のタイプのデバイスに種々の活性剤（銀塩及び元素銀を含む）を添加または組み込むことを提案しているが、これらの文献では、溶解酸素の存在下での銀が、銀単独よりも強力な病原体に対する抑制作用を有することは認識されていない。
【００５６】
本発明によれば、銀及び分子酸素は、好気性（緑膿菌）及び嫌気性（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌：ＭＲＳＡ）の両方の細菌に対する抑制作用について相乗効果をもたらす。酸素と銀が銀単独よりも偏性嫌気性菌に対する抑制作用についてより有効であることが観察されるのは完全に予想外で驚くべきことではないが、酸素と銀の組み合わせによって提供される、酸素を代謝する通性嫌気性菌（例えば、ＭＲＳＡ）に対する抑制作用の向上は、驚くべき予想外の知見であると本発明者らは考えている。同様に、緑膿菌のような完全に好気性の生物に対して、酸素及び銀によってもたらされる同じ効力の増加が観察されることは、驚くべき予想外のことである。更に、銀だけではなく、溶解酸素の存在下で銀がより低濃度でより効果的であることも示すことができる。
【００５７】
銀が抗菌性を有するためには、イオン化（Ａｇ＋）型でなければならない。非常に低い解離定数を有する銀含有化合物は、そのような銀イオンの解離が低いので、抗菌活性があるとしても、ごくわずかなものである傾向がある。これは、チオールまたはジスルフィドのような硫黄を含む官能基を有する分子と複合体を形成する場合の銀に特に当てはまる。銀の抗菌効果は、細菌細胞壁及び内部の細胞小器官由来のタンパク質に見られるチオールとの銀結合に関連していると考えられている。これは、タンパク質の三次構造を破壊し、それらを機能できなくすると考えられている。創傷内に見いだされる多くのタンパク質は、患者自身の創傷滲出液及び／または微生物の生物薄膜由来である。これらはチオールまたはジスルフィドを含有し、チオールまたはジスルフィドは、銀イオンがそれらの標的細菌に到達する前に不溶性銀スルフィド複合体を形成することによって銀の抗菌効力を減少させる。酸素の存在は、銀がその抗菌効果をもたらすことができる細菌に進入することができるまで、タンパク質の存在下で酸化された＋１状態に保つことによって銀の効力を維持するのを助けることが可能である。別の考えられる理論は、微生物自体が酸素の存在下で銀チオール錯体を代謝することができる、というものである。いかなる特定の理論にも縛られることないが、本発明者らは、創傷環境において抗菌銀材料と組み合わせて酸素（例えば、創傷または組織表面で局所的に利用可能である酸素）が存在することが、この効果を緩和し、創傷環境における銀の抗菌効果を高めることを見いだした。創傷環境における銀の抗菌効果のこの増加は、銀イオン濃度の低下にもかかわらず起こると考えられる。
【００５８】
本発明は更に、病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強する方法を包含する。この方法は、抗菌銀材料を処理対象の表面または物品に提供するステップと、前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度よりも高い濃度で酸素を供給するステップであって、それにより前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮する、該ステップとを含む。いくつかの実施形態では、表面は皮膚または創傷であり得る。更なる実施形態では、物品または表面は、無生物表面（すなわち、ヒトまたは動物の体の表面ではない表面）であり得る。任意の適切な無生物または表面、例えば医療用デバイス；医療用デバイスの一部；カウンターの上面、棚等の工業用または家庭用物品の表面；消費者製品；等が処理対象となり得る。この方法は、抗菌銀材料を提供するステップ、及び大気圧よりも高い濃度の酸素を創傷に提供するステップを更に含み得る。一般に、抗菌銀材料は、銀ナノ粒子または銀粉末であってもよい。代わりに及び／または更に、抗菌銀材料は、銀塩または銀錯体であってもよい。
【００５９】
本発明の方法を実施する際に、これらの抗菌銀材料は、約０．００１重量％〜約２重量％の濃度で存在し得るが、望ましくは０．５重量％未満の濃度で存在する。例えば、抗菌銀材料は、約０．００２５重量％〜約１重量％の濃度で存在し得る。別の例として、抗菌銀材料は、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度で存在し得る。更に別の例として、抗菌銀材料は、約０．００７５重量％〜約０．２５重量％の濃度で存在し得る。一般に、創傷に関連して本発明の方法を実施する場合、抗菌銀材料は、約０．０２５重量％〜約０．０５重量％のような比較的低濃度で存在し得る。本発明は、そのような抗菌銀材料が０．００２５重量％または、更には０．００１重量％のレベルで存在する場合、抗菌銀材料の作用を増強すると考えられる。例えば、抗菌銀物質は、約０．０００００１〜約０．００１重量％のレベルで存在し得る。
【００６０】
本発明のある態様によれば、酸素は、独立気泡及び壁を含む成形されたマトリクスから提供され得、気体酸素は独立気泡中に含まれ、溶解酸素は壁内の水分中に存在し、かつ抗菌銀材料はマトリクスの一部に存在する抗菌銀材料から提供され得る。
【００６１】
創傷被覆材であって、酸素送達成分及び抗菌銀材料を含み、前記創傷被覆材が創傷を治療するために使用される場合、前記抗菌銀材料の存在下で酸素が送達され、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅を提供することを特徴とする創傷被覆材を提供する。抗菌銀材料は銀ナノ粒子及び／または銀粉末であり得る。代わりに及び／または更に、抗菌銀材料は銀塩及び／または銀錯体であり得る。抗菌銀材料のより高い濃度（例えば、最大２重量％、最大１重量％、最大０．５重量％）を利用することができるが、増強機能を発揮する酸素の存在により、抗菌銀材料が存在することが可能となり、かつ例えば約０．０２５重量％〜約０．０５重量％の比較的低濃度で効果的であることが可能となると考えられる。本発明は、そのような抗菌銀材料が０．００２５重量％未満、または更に０．００１重量％未満のレベルで存在する場合に、抗菌銀物質の作用を増強すると考えられる。例えば、抗菌銀材料は、約０．０００００１重量％〜約０．００１重量％のレベルで存在してもよい。
【００６２】
本発明は、処置対象の部位に抗菌銀材料を投与し、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮するように前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記部位に供給することによって、哺乳動物における微生物感染を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、処置対象の部位に抗菌銀材料を投与し、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮するように、前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記部位に供給することによって、細菌感染を治療するための方法を包含する。本発明は更に、抗菌銀材料を投与し、前記抗菌銀材料が前記抗菌銀材料単独よりも大きな微生物殺滅能力を発揮するように、前記抗菌銀材料の存在下で大気中の濃度より高い濃度の酸素を前記部位に供給することによって、創傷治癒を促進する方法を包含する。
【００６３】
本発明の方法の実施において、抗菌銀材料は銀ナノ粒子及び／または銀粉末であり得る。代わりに及び／または更に、抗菌銀材料は銀塩及び／または銀錯体であり得る。抗菌銀材料のより高い濃度（例えば、最大２重量％、最大１重量％、最大０．５重量％）を利用することができるが、増強機能を発揮する酸素の存在により、抗菌銀材料が存在することが可能となり、かつ例えば約０．０２５重量％〜約０．０５重量％の比較的低濃度で効果的であることが可能となると考えられる。本発明は、そのような抗菌銀材料が０．００２５重量％未満、または更に０．００１重量％未満のレベルで存在する場合に、抗菌銀物質の作用を増強すると考えられる。例えば、抗菌銀材料は、約０．０００００１重量％〜約０．００１重量％のレベルで存在してもよい。
【００６４】
本発明の方法の実施において、上記のマトリクス構造及び／または組成物を利用して、抗菌銀及び酸素を提供することができる。
【００６５】
本発明は、病原体に対する抗菌銀材料の抗菌作用を増強するための創傷治療デバイスの製造方法を包含する。この方法は、一般に、少なくとも１つの架橋可能な生体適合性ポリマーと触媒とのゲル化混合物を提供するステップと、前記ゲル化混合物の前記生体適合性ポリマーを架橋して、水膨潤性架橋生体適合性ポリマーネットワークを形成するステップと、前記ゲル化混合物をゲルシートに乾燥させるステップと、前記ゲルシートに第２の反応物を添加するステップと、前記触媒と前記第２の反応物とを反応させることにより、前記ゲルシートに酸素を含む複数の独立気泡（即ち独立気泡及び壁）を生成するステップとを含む。前記菌性銀材料は、調合（コンパウンディング）の間に混合物に添加されてもよく（例えば、前記ゲル化混合物に添加され得る）、または前記抗菌銀材料は、前記ゲルシートが形成された後に、または前記ゲルシートに酸素を含む複数の独立気泡が形成された後に塗布してもよい。前記菌性銀材料は、浸漬、コーティング、噴霧または類似のプロセスによって前記ゲルシートに添加され得る。代わりに及び／または更に、抗菌銀材料は、スプレーまたはコーティングによって、或いはマトリクス重合中に組み込むことによって、創傷治療デバイスの形成されたマトリクスの小空洞に直接組み込むことができる。抗菌銀イオンの放出は、抗菌銀濃度の操作、マトリクスを通しての水の移動、及びマトリクス中の架橋の程度によって制御され得ると考えられる。いくつかの例では、抗菌銀イオンの放出は、インビボでのマトリクスの崩壊速度によって制御され得る。
【００６６】
一般的に言えば、本発明の例示的な創傷治療デバイスの製造方法は、酸素を送達し、抗菌銀を提供するための生体適合性マトリクスを生成する。生体適合性マトリクスの特徴は、気体を閉じ込める気泡または気泡のアレイの形成である。気泡または泡は、反応物を含む形成されたマトリクスに添加された第２の反応物の浸透によって形成される。２つの反応物が相互作用すると、マトリクス内に閉じ込められたガスを遊離させる反応が起こる。例えば、マトリクスは、その中に組み込まれた炭酸塩触媒（反応物）を有する。次いで、形成されたマトリクスを第２の反応物（例えば、過酸化水素のような過酸化化合物）の存在下に置く。過酸化水素の触媒分解が起こり、酸素ガスが放出され、その場で形成された気泡として閉じ込められる。過酸化水素反応物は、マトリクスの調合の一部ではないが、マトリクスのストック形成後の処理のなかで用いられる。
【００６７】
この方法によれば、少なくとも１種の架橋可能な生体適合性ポリマーのゲル化混合物が調製される。これは、架橋可能な生体適合性ポリマーの溶液または架橋可能な生体適合性ポリマーの混合物からなる溶液を作製することによって達成され得る。溶液は、水溶液か、または水成分が主要成分である溶液であることが望ましい。この方法によれば、抗菌銀材料をゲル化混合物に添加することができる。例えば、銀塩、銀錯体、銀ナノ粒子及び／または銀粉末をゲル化混合物に添加することができる。
【００６８】
ゲル化混合物中に触媒を導入することができる。例えば、触媒は炭酸ナトリウムであり得る。しかし、他の触媒、例えば、他のアルカリ金属及びアルカリ土類金属化合物は、それらが生体適合性である製品と適合するのであれば使用することができる。更に、２種以上の触媒を使用してもよい。例えば、１つの触媒は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の塩からなる群から誘導されたものでよく、第２の触媒としては、有機化学物質及び無機化学物質（例えば、塩化第二銅、塩化第二鉄、酸化マンガン、ヨウ化ナトリウム及びそれらの均等物等）が挙げられるが、これらに限定されない。他の触媒としては、ラクトペルオキシダーゼ及びカタラーゼなどの酵素またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。望ましくは、触媒は第２の反応物と相互作用する物質である。
【００６９】
非ゲル化性多糖類、可塑剤及び／または水和制御剤をゲル化混合物に添加してもよい。望ましくは、非ゲル化性多糖類は、グアーガムのような非ゲル化性ガラクトマンナン高分子である。グアーガムの濃度範囲は、約０．００５〜５３％ｗ／ｗ、好ましくは約０．０５〜５％ｗ／ｗ、最も好ましくは約０．２５〜１％ｗ／ｗが一般に十分である。他の好適な非ゲル化性多糖類の例としては、ルツェルン、フェヌグリーク、ハニーローカスビーンガム、ホワイトクローバービーンガム、またはイナゴマメガムが挙げられる。
【００７０】
可塑剤は、グリセロール及び／または水であってもよいが、プロピレングリコール及び／またはブタノール及びそれらの組み合わせも使用することができる。グリセロールが使用される場合、約０．２５〜２５％ｗ／ｗ、好ましくは０．５〜１２％ｗ／ｗの範囲が一般に十分である。生体適合性マトリクスは、水和制御剤を更に含み得る。
【００７１】
水和制御剤は、イソプロピルアルコールであってもよい。しかし、エタノール、グリセロール、ブタノール、及び／またはプロピレングリコール及びそれらの組み合わせもまた使用され得る。イソプロピルアルコールは、約０．０５〜５％ｗ／ｗ、好ましくは約０．１〜２．５％ｗ／ｗ、最も好ましくは約０．２５〜１％ｗ／ｗの範囲が一般に十分である。
【００７２】
次いで、ゲル化混合物の架橋可能な生体適合性ポリマーを架橋させて、水膨潤性の架橋生体適合性ポリマーネットワークを形成する。これは、ゲル化混合物中に既に存在する架橋剤を活性化し、ゲル化混合物に架橋剤を添加または適用し、ゲル化混合物から溶媒を脱水または除去し、及び／またはそうでなければゲル化混合物中に、架橋を引き起こす条件を作り出す（例えば、ｐＨ、熱、電磁放射線及びＸ線を含む様々な形態の放射線、超音波エネルギー、マイクロ波エネルギー等）ことによって達成される。
【００７３】
例えば、ゲル化混合物は、架橋剤を活性化し、かつゲル化混合物を容易に取り扱うことができる可撓性基材（即ち、ゲルシート）に脱水することによって架橋され得る。ゲルシートの厚さは、２〜３ｍｍから２０ｍｍ以上の厚さの範囲であり得る。別の例として、ゲル化混合物は、表面積を最大化するために平らな開放容器に注ぎ、高温（例えば、４５〜６５℃）で通常のオーブン中にその開放容器を配置し、かつシートが「フルーツレザー」または「フルーツロールアップ」と同様の堅さに達するまで２〜６時間脱水することによって架橋することもできる。フルーツレザーまたはフルーツロールアップは、約１０％〜約２０％の重量水分含有量即ち重量に基づく水分含有量を有する。望ましくは、マトリクスは可撓性でかつ弾性であり、水性流体、銀塩、及び酸素を含む溶解した気体物質のような物質に対して透過性である半固体の足場材であり得る。特定の理論に縛られることは望まないが、その物質は架橋ポリマーの間の分子間空間を通してマトリクスを透過すると考えられる。プロセスのこの時点で、抗菌銀材料をゲルシートに添加することができる。例えば、銀塩、銀錯体、銀ナノ粒子及び／または銀粉末は、スプレー、浸漬またはコーティングによって添加することができる。
【００７４】
次いで、第２の反応物をゲルシートに加える。これは、第２の反応物にゲルシートを浸漬することによって、または第２の反応物をスプレー、ブラッシング、コーティングまたは塗布することによって達成され得る。望ましくは、第２反応物は過酸化水素である。過酸化水素は、５重量％〜２０重量％またはそれ以上であり得る。他の過酸化物、例えば、過酸化尿素、過酸化ナトリウムまたはアルカリ金属またはアルカリ土類金属の他の過酸化化合物が挙げられるが、これらに限定されない。第２の反応物は、水溶液または水が主成分である溶液中に存在することが好ましい。
【００７５】
第２の反応物は、ゲルシートに吸収され、膨潤性（例えば、水膨潤性）架橋生体適合性ポリマーのマトリクスに浸透する。膨潤度は、グアーガムなどの非ゲル化性多糖類を添加することによって、かつグリセロールなどの水和制御剤を添加することによって増加させることができる。架橋した生体適合性ポリマーネットワークを十分に水膨潤性にすることにより、第２の反応物（例えば、過酸化水素）を架橋生体適合性ポリマーネットワークに十分に吸収させることができる。
【００７６】
本発明の方法によれば、第２の反応物が吸収されて架橋した生体適合性ポリマーのマトリクスに浸透すると、触媒（即ち、第１の反応物）が第２の反応物と反応したときガスが発生する。得られるガスは、望ましくは酸素ガスである。本発明のマトリクスは、ガスを閉じ込める気泡または泡のアレイを形成する。即ち、触媒（第１の反応物）と第２の反応物との反応により、ゲルシートに酸素を含む複数の独立気泡が生成される。
【００７７】
例えば、架橋された生体適合性ポリマーのマトリクスは、そのなかに組み込まれた炭酸塩触媒（即ち、第１の反応物）を有し得る。次いで、架橋した生体適合性ポリマーのマトリクスを、第２の反応物である過酸化水素の存在下に置く。過酸化水素の触媒分解が起こり、酸素ガスが放出され、その場で形成された気泡として閉じ込められる。過酸化水素反応物は、マトリクスの調合の一部ではないが、マトリクスのストックの形成後に添加される。
【００７８】
完成した形態では、ゲルシートは発泡材シートに変換されている。この時点で、抗菌銀材料をゲルシートに添加することができる。例えば、銀塩、銀錯体、銀ナノ粒子及び／または銀粉末は、スプレー、浸漬またはコーティングによって添加することができる。
【００７９】
本発明の方法は、反応を促進するため、または抗菌銀材料の組み入れを高めるために、ゲルシート及び第２の反応物に加熱またはエネルギーを添加するステップを更に含み得ると考えられる。上記のように、この方法の任意の適切な段階で、１以上の抗菌銀材料（例えば、銀塩、銀錯体、銀ナノ粒子及び／または銀粉末）を組み込むことができる。例えば、抗菌銀材料を架橋前にゲル化混合物に添加してもよく、脱水前または脱水後に抗菌銀材料を架橋ポリマーマトリクスに添加してもよく、及び／または独立気泡が形成された後に抗菌銀材料を架橋ポリマーマトリクスに加えてもよい。
【００８０】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。しかしながら、そのような実施例は、本発明の精神または範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８１】
以下に記載する実施例において使用される全ての化学物質は、特にことわらない限り、試薬等級のものであった。
【００８２】
実施例１−銀ナノ粒子でコーティングされた酸素含有発泡材
【００８３】
酸素及び抗菌銀材料を送達するための例示的創傷治療デバイスとして、酸素ガスを含有するポリマーマトリクスを作製した。このデバイスは、発泡材の気泡に酸素ガスを含む独立気泡発泡材シートであった。独立気泡発泡材シートは、上記の発明の詳細な説明、並びにＧｉｂｂｉｎｓらに２００７年１月９日に付与された米国特許第７１６０５５３号明細書（「Matrix for Oxygen Delivery to Compromised Tissues」）（特許文献２）及びＧｉｂｂｉｎｓらに２０１４年３月２５日に付与された米国特許第８６７９５２３号明細書（「Oxygen-Delivery Closed Cell Foam Matrix for Wound Treatment」）（特許文献１）に記載された方法によって作製した。成分及びそれらの濃度を下記の表１に列記する。
【００８４】
形成後、独立気泡発泡材シートを、非極性有機溶媒のなかの銀ナノ粒子溶液でスプレーコーティングまたは浸漬コーティングして、シートの表面に銀ナノ粒子のコーティングを付与した。使用時には、創傷治療デバイスは創傷上に配置され、そこで創傷流体中に酸素を放出する。銀はまた、銀と酸素の組み合わせが前節で説明した相乗効果をもたらすように放出される。
【００８５】
2017529113.tif 000003
【００８６】
銀ナノ粒子コーティングは、約２０００ｐｐｍ（約０．２重量％）の全体の銀濃度をもたらした。コーティングは、銀ナノ粒子を含有する有機溶媒中に発泡被覆材を浸漬することによって適用した。この例では、銀ナノ粒子溶媒はヘプタンであり、ヘプタンには、容易に蒸発して銀ナノ粒子のみを残すような高い蒸気圧を有するという利点がある。
【００８７】
実施例２−発泡材マトリクスに組み込まれた塩化銀を含む酸素含有発泡材
【００８８】
酸素及び抗菌銀材料を送達するための例示的創傷治療デバイスとして、酸素ガスを含有するポリマーマトリクスを作製した。このデバイスは、発泡材の気泡に酸素ガスを含む独立気泡発泡材シートであった。独立気泡発泡材シートは、上記の発明の詳細な説明、並びにＧｉｂｂｉｎｓらに２００７年１月９日に付与された米国特許第７１６０５５３号明細書（「Matrix for Oxygen Delivery to Compromised Tissues」）（特許文献２）及びＧｉｂｂｉｎｓらに２０１４年３月２５日に付与された米国特許第８６７９５２３号明細書（「Oxygen-Delivery Closed Cell Foam Matrix for Wound Treatment」）（特許文献１）に記載された方法によって作製した。成分及びそれらの濃度を下記の表２に列記する。
【００８９】
使用時には、創傷治療デバイスは創傷上に配置され、そこで創傷流体中に酸素を放出する。銀はまた、銀と酸素の組み合わせが前節で説明した相乗効果をもたらすように放出される。
【００９０】
2017529113.tif 000004
【００９１】
予備重合された混合物に塩化ナトリウム及び硝酸銀を溶液として添加することにより、塩化銀をゲルシートに組み込んだ。これら２つが組み合わされると、塩化銀が沈殿して、独立気泡発泡材シートの概ね全体に存在する。ポリマー混合溶液への塩化銀の添加は、約１０００ｐｐｍ（約０．１重量％）の全体の銀濃度をもたらした。原材料は、塩化銀による変色のためにごく僅かに暗色化していた。独立気泡発泡材シートは、脱イオン水に一晩浸漬した後も崩壊しなかったことが観察された。残留ＨＯＯＨは検出されなかった。
【００９２】
実施例３−酸素で増強された銀の作用
【００９３】
この実験では、硝酸銀を含有する試料を、抗微生物チャレンジ試験において硝酸銀と酸素ガスの両方を含有する試料と比較して、酸素と銀の間の相乗効果を実証した。第１の試料では、約１０５ＣＦＵの緑膿菌（ＡＴＣＣ９０２７）を５％トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）に１０ｍｌ接種し、最終濃度が０．０３ｐｐｍの銀（約０．０００００３重量％）になるまで硝酸銀に混ぜた。第２の試料は、試験管のヘッドスペースを１００％酸素ガス（Ｏ２）で一杯にした後に密封したこと以外は、硝酸銀を用いた試料１と同様に調製した。ヘッドスペース内の酸素は、実施例１及び２に記載された酸素送達創傷被覆材の効果をシミュレートするためにＴＳＢ内に拡散した。次に、各試験試料を３７℃でインキュベートした。生存している生物のレベルを、それぞれ３時間後及び６時間後に試験した。銀のみを含む試料１は、３時間後のＣＦＵ数の２ｌｏｇの減少を示し、６時間後のＣＦＵ数の３ｌｏｇの減少を示した。試料２（銀と酸素の試料）は、３時間後のＣＦＵ数の３．２ｌｏｇの減少及び６時間後のＣＦＵ数の４．５ｌｏｇの減少を示した。
【００９４】
これらの結果を図２に示す。図２は、ｘ軸に時間（時）をとり、ｙ軸にＣＦＵの対数減少をとったグラフを示す図である。これらの結果は、銀が酸素と共に使用される場合の、緑膿菌の対数減少の明らかな改善を示している。例えば、３時間では、銀＋酸素試料は、銀単独に対してＣＦＵ数で１以上の完全対数減少（即ち、１０倍以上減少）したことを示す。６時間で、銀＋酸素試料は、銀単独よりもＣＦＵ数が１．５ｌｏｇ以上減少した（即ち、３０倍減少した）ことを示す。
【００９５】
重要な点として、この実施例は、比較的低濃度の抗菌銀に対するガス状酸素の増強効果を実証している。即ち、抗菌銀は０．０３ｐｐｍ（約０．０００００３重量％）の銀で存在していた。
【００９６】
希釈媒質及び銀濃度の試験手順
１．チャレンジ生物（緑膿菌ＡＴＣＣ９０２７）は、大豆カゼイン消化ブロス（ＴＳＢ）において３５℃で１８〜２４時間培養し、約１．８×１０８ＣＦＵ／ｍｌの濃度になるように調製した。
２．チャレンジ試験について：０．０１ｍｌのストック培養液を５０ｍｌのねじ口試験管に加え、次いで５％ＴＳＢ液で１０ｍｌに希釈して最終濃度を１．８×１０５ＣＦＵ／ｍｌとした。
３．チャレンジ試料の調製：
（ａ）銀チャレンジ試験：ステップ２からの上記のように調製した試験管に、１００μｌの３ｐｐｍのＡｇＮＯ３を添加し、ボルテックスして最終濃度が０．０３ｐｐｍのＡｇＮＯ３となるように混合した。
（ｂ）銀＋Ｏ２チャレンジ試験：ステップ２からの上記のように調製した試験管に、１００μｌの３ｐｐｍのＡｇ＋（ＡｇＮＯ３からの）溶液を添加し、ボルテックスして最終濃度が０．０３ｐｐｍのＡｇＮＯ３となるように混合した。次いで、試験管のヘッドスペースを１００％ＵＳＰ酸素ガスで２分間パージした。
（ｃ）その後、試料を３７℃で３時間のインキュベート及び６時間インキュベートを行った。
（ｄ）３時間の時点及び６時間の時点で、試料を異なる希釈度（１０−１、１０−３及び１０−５）でプレーティングして、生存コロニーを数えた。
（ｉ）３時間の試料をＯ２ガスで再度パージし、インキュベーションオーブンに更に３時間戻した。
（ｉｉ）プレーティングに使用した培地はトリプチカーゼ大豆寒天（ＴＳＡ）であった。
（ｅ）プレートをカウントする前に２〜３日間インキュベートした。
（ｆ）対数減少は、時間がゼロのときのプレートカウント数に基づくものとした。
【００９７】
実施例４−酸素で増強された銀の作用
【００９８】
一連の実験において、酸素と銀の間の相乗作用を実証するために４つの実験試料を調製した。第１の試料では、約１０５ＣＦＵのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌−ＭＲＳＡ（臨床分離株）を９５％トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）１０ｍｌに接種した。第２の試料は、同じ１０５ＣＦＵに接種したが、最終濃度が３０００ｐｐｍの銀（約０．３重量％）になるまで硝酸銀を混ぜた、別の１０ｍｌの９５％ＴＳＢを用いて同様に調製した。第３の試料は、試験管のヘッドスペースを１００％酸素ガス（Ｏ２）で一杯にした後に封止した以外は試料２と同様に、硝酸銀を用いて調製した。第４の試料は、試験管のヘッドスペースを１００％酸素ガス（Ｏ２）で一般にした後に密封した以外は試料１と同様に調製した。ヘッドスペース内の酸素は、実施例１及び２に記載された酸素送達創傷被覆材の効果をシミュレートするためにＴＳＢ内に拡散した。次に、各試験試料を３７℃でインキュベートした。生存している生物のレベルを、それぞれ３時間後及び６時間後に試験した。
【００９９】
これらの結果を図３に示す。図３は、ｘ軸に時間（時）をとり、ｙ軸にＣＦＵの対数減少をとったグラフを示す図である。これらの結果は、銀が酸素と共に使用される場合の、緑膿菌の対数減少の明らかな改善を示している（試料３）。３時間で銀試料は２．１２ｌｏｇの減少を示し、銀＋酸素試料は５．３２ｌｏｇの減少を示す。僅か３時間後、銀＋酸素試料は、銀単独に対してＣＦＵ数の３．２ｌｏｇ以上の減少（すなわち、１５００倍の減少）をもたらす。
【０１００】
６時間で、銀単独（試料２）の２．５ｌｏｇの減少に対して、銀＋酸素（試料３）試料は６．２６ｌｏｇの完全対数減少を示す。６時間後、銀＋酸素試料は、銀単独に対してＣＦＵ数の３．７６ｌｏｇの減少（即ち、５７００倍の減少）をもたらす。酸素ガスのみの（銀なし−試料４）及び媒質のみの（銀またはＯ２なし−試料１）対照の試験を行った。これらは、グラフの負のバーで表され、試験期間中、コロニー形成単位の量が（予想どおり）増加したことを示している。
【０１０１】
濃縮された媒質及び銀試料の試験手順
１．チャレンジ生物（ＭＲＳＡ）は、大豆カゼイン消化ブロス（ＴＳＢ）において３５℃で１８〜２４時間培養し、約１．８×１０９ＣＦＵ／ｍＬの濃度になるように調製した。
２．チャレンジ試験について：０．０１ｍｌのストック培養液を５０ｍｌのねじ口試験管に加え、次いで５％ＴＳＢ液で１０ｍｌに希釈して最終濃度を１．８×１０６ＣＦＵ／ｍｌとした。
３．チャレンジ試料の調製：
（ａ）銀チャレンジ試験：ステップ２からの上記のように調製した試験管に、１００μｌの３０％ｗ／ｗのＡｇＮＯ３を添加し、ボルテックスして最終濃度が０．３％のＡｇＮＯ３となるように混合した。
（ｂ）銀＋Ｏ２チャレンジ試験：ステップ２からの上記のように調製した試験管に、１００μｌの３０％ｗ／ｗのＡｇＮＯ３溶液を添加し、ボルテックスして最終濃度が０．３％のＡｇＮＯ３となるように混合した。次いで、試験管のヘッドスペースを１００％ＵＳＰ酸素ガスで２分間パージした。
（ｃ）その後、試料を３７℃で３時間のインキュベート及び６時間インキュベートを行った。
（ｄ）３時間の時点及び６時間の時点で、試料を異なる希釈度（１０−１、１０−３及び１０−５）でプレーティングして、生存コロニーを数えた。
（ｉ）３時間の試料をＯ２ガスで再度パージし、インキュベーションオーブンに更に３時間戻した。
（ｉｉ）プレーティングに使用した培地はトリプチカーゼ大豆寒天（ＴＳＡ）であった。
（ｅ）プレートをカウントする前に２〜３日間インキュベートした。
（ｆ）対数減少は、時間がゼロのときのプレートカウント数に基づくものとした。
【０１０２】
本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、本発明はそれらの特定の実施形態に限定さないことを理解されたい。むしろ、本発明は、特許請求の範囲の請求項の技術範囲及び精神に含まれ得るすべての代替形態、修正形態、及び均等物を含むことが想定されている。
【図１】
2017529113.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2017529113.tif 000009