(57)【要約】本発明は、ポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法に関し、方法はポリアルコキシル化核酸分子を核酸分子の混合物から分離することを含み、核酸分子の混合物はポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含み、ポリアルコキシル化核酸分子は非ポリアルコキシル化核酸分子から、ポリアルコキシル化核酸分子を混合物から沈殿させることにより分離される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法であって、前記方法は前記ポリアルコキシル化核酸分子を核酸分子の混合物から分離することを含み、核酸分子の前記混合物は前記ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含み、前記ポリアルコキシル化核酸分子は前記非ポリアルコキシル化核酸分子から、前記ポリアルコキシル化核酸分子を前記混合物から沈殿させることにより分離される、方法。
【請求項２】
前記ポリアルコキシル化核酸分子は核酸部分および少なくとも１つのポリアルコキシレート部分を含み、前記非ポリアルコキシル化核酸分子は１つの核酸部分を含み、ポリアルコキシレート部分を欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリアルコキシル化核酸分子は、ポリアルコキシル化核酸分子の複数の異なる種である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記非ポリアルコキシル化核酸分子は非ポリアルコキシル化核酸分子の複数の異なる種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ポリアルコキシル化核酸分子の前記異なる種はそれらの核酸部分の観点で異なり、好ましくはポリアルコキシル化核酸分子の前記異なる種は、前記核酸部分のヌクレオチド配列の観点で異なる、請求項３〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
非ポリアルコキシル化核酸分子の前記異なる種はそれらの核酸部分の観点で異なり、好ましくは非ポリアルコキシル化核酸分子の前記異なる種は、前記核酸部分のヌクレオチド配列の観点で異なる、請求項４〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記非ポリアルコキシル化核酸分子の前記核酸部分の分子量は、前記ポリアルコキシル化核酸分子の前記核酸部分の分子量より低い、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記非ポリアルコキシル化核酸分子の前記核酸部分は、前記ポリアルコキシル化核酸分子の前記核酸部分より少ないヌクレオチドを含む、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の前記混合物は溶液であり、前記溶液は１つの溶媒または１を超える溶媒を含む溶媒の混合物から構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒は、水を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒は、１つ以上の水混和性有機溶媒（複数可）を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記水混和性有機溶媒（複数可）は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、ホルムアミド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、エチルホルムアミド、エチルメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドン、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、ジエチルケトン、メチルイソプロピルケトン、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、酢酸メチル、酢酸エチル、プロパン酸メチル、テトラヒドロフラン、ジオキサンを含む群から選択される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記水混和性有機溶媒（複数可）は前記溶液の５％〜９５％の体積分率を提供する、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリアルコキシル化核酸分子を前記混合物から沈殿させる前記工程は、−５０℃〜３０℃の温度で、好ましくは−２５℃〜２５℃の温度で、より好ましくは−２０℃〜４℃の温度で、最も好ましくは−２０℃の温度でまたは４℃の温度で実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記沈殿させる工程は、−２０℃〜４℃の温度で３０分〜１６時間の間実施され、その後、前記ポリアルコキシル化核酸分子の沈殿で前記ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の前記混合物により形成された上清から、沈殿したポリアルコキシル化核酸分子が分離される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記沈殿させる工程は、−２０℃の温度で３０分〜１６時間の間実施され、その後、前記ポリアルコキシル化核酸分子の沈殿で前記ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の前記混合物により形成された上清から、沈殿したポリアルコキシル化核酸分子が分離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記沈殿させる工程は、４℃の温度で１６時間実施され、その後、前記ポリアルコキシル化核酸分子の沈殿で前記ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の前記混合物により形成された上清から、沈殿したポリアルコキシル化核酸分子が分離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリアルコキシル化核酸分子を前記ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の前記混合物から沈殿させる工程は、４〜１１のｐＨ範囲で、好ましくは６〜１０のｐＨ範囲で、より好ましくは７〜９．５のｐＨ範囲で実施される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリアルコキシル化核酸分子を、前記ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の前記混合物から沈殿させる工程は、前記ポリアルコキシル化核酸分子の７５％〜１００％が沈殿されるまで、好ましくはポリアルコキシル化核酸分子の９０％〜１００％が沈殿されるまで実施される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記沈殿したポリアルコキシル化核酸分子は、前記非ポリアルコキシル化核酸分子から、液体を固体から分離するための分離法により分離される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
液体を固体から分離するための前記分離法は、濾過、遠心分離、およびデカンテーションを含む群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリアルコキシレート部分は直鎖または分枝ポリアルコキシレート部分である、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリアルコキシレート部分は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリグリセロールを含む群から選択される、請求項２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリアルコキシレート部分はポリエチレングリコールである、請求項２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリアルコキシレート部分は、５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００Ｄａ〜８０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリアルコキシル化核酸分子および／または前記非ポリアルコキシル化核酸分子の前記核酸部分はそれぞれ、３００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、好ましくは３，０００Ｄａ〜３５，０００Ｄａ、より好ましくは３，０００Ｄａ〜１６，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリアルコキシル化核酸分子および／または前記非ポリアルコキシル化核酸分子の前記核酸部分はアプタマーまたはスピーゲルマーである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
核酸部分およびポリアルコキシレート部分を含むポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法であって、前記方法は核酸分子をポリアルコキシレートと反応させ、よってポリアルコキシル化核酸分子を形成させることを含み、前記反応は、四級アンモニウム化合物の存在下で実施され、前記核酸分子は前記ポリアルコキシル化核酸部分の前記核酸部分を形成し、前記ポリアルコキシレートは、前記ポリアルコキシル化核酸分子の前記ポリアルコキシレート部分を形成する、方法。
【請求項２９】
前記四級アンモニウム化合物は、テトラアルキルアンモニウムクロリド、テトラアルキルアンモニウムブロミド、テトラアルキルアンモニウムテトラフルオロボラート、テトラアルキルヘキサフルオロホスフェート、テトラアルキル硫酸水素塩、テトラアルキルリン酸水素塩を含む群から選択され、アルキルは、１〜１８個のＣ原子からなるアルキル鎖であり、好ましくは前記四級アンモニウム化合物はテトラブチルアンモニウムブロミドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記四級アンモニウム化合物は、水または水混和性有機溶媒または、その組み合わせに溶解される、請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記水混和性有機溶媒は、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、エチルホルムアミド、エチルメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドン、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、ジエチルケトン、メチルイソプロピルケトン、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、酢酸メチル、酢酸エチル、プロパン酸メチル、テトラヒドロフラン、ジオキサンを含む群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記四級アンモニウム化合物は、ジメチルホルムアミドに溶解され、好ましくは前記四級アンモニウム化合物はテトラブチルアンモニウムブロミドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記反応は、前記核酸分子のヌクレオチド当たり１〜２０モル当量の前記四級アンモニウム化合物、好ましくは前記核酸分子のヌクレオチド当たり２〜１０モル当量の存在下で実施される、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記反応は、１０℃〜５０℃の温度、好ましくは２０℃〜４０℃の温度で実施される、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記反応は、４〜１１のｐＨ範囲、好ましくは６〜１０のｐＨ範囲で実施される、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリアルコキシル化核酸分子の前記ポリアルコキシレート部分は、１つのポリアルコキシレート部分または１を超えるポリアルコキシレート部分から構成される、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリアルコキシレート部分は直鎖または分枝ポリアルコキシレート部分である、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリアルコキシレート部分は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールおよびポリグリセロールを含む群から選択される、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリアルコキシレート部分はポリエチレングリコールである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸分子は少なくとも１つの反応基、好ましくは１を超える反応基を含み、前記１を超える反応基は異なる反応基であり、前記ポリアルコキシレートは、前記ポリアルコキシル化核酸分子を形成する前記核酸分子の前記少なくとも１つの反応基と反応することができる反応基を含む、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸分子の前記反応基は、アミン、チオール、アジド、アルキン、カルボキシレート、カルボン酸エステル、アルデヒド、ヨードアルキルおよびマレイミドを含む群から選択され、好ましくは、前記核酸分子の前記反応基はアミンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリアルコキシレートの前記反応基は、アミン、チオール、アジド、アルキン、カルボキシレート、カルボン酸エステル、アルデヒド、ヨードアルキルおよびマレイミドを含む群から選択され、好ましくは、前記ポリアルコキシレートの前記反応基は、カルボン酸エステルであり、より好ましくは、前記ポリアルコキシレートの前記反応基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項４０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸分子の前記反応基は、アミンであり、前記ポリアルコキシレートの前記反応基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリアルコキシレート部分および／または前記ポリアルコキシレートは、５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００Ｄａ〜８０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項２８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸分子部分および／または前記核酸部分は、３００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、好ましくは３，０００Ｄａ〜３５，０００Ｄａ、より好ましくは３，０００Ｄａ〜１６，０００Ｄａの分子量を有する、請求項２８〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸分子はアプタマーまたはスピーゲルマーである、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ａ）ポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法であって、前記方法は、核酸分子をポリアルコキシレートと反応させ、よって前記ポリアルコキシル化核酸分子を形成することを含む、方法、ならびに
ｂ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法
を含む、ポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法。
【請求項４８】
ポリアルコキシル化核酸分子の調製のための前記方法は、請求項２８〜４６のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項４７に記載のポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法。
【請求項４９】
ａ）固体支持体上で非ポリアルコキシル化核酸分子を合成すること、
ｂ）前記非ポリアルコキシル化核酸分子を前記固体支持体から切断し、前記非ポリアルコキシル化核酸分子を脱保護すること、
ｃ）限外濾過を用いて前記非ポリアルコキシル化核酸分子を脱塩すること、
ｄ）前記非ポリアルコキシル化核酸分子をポリアルコキシル化して、ポリアルコキシル化核酸分子を生成すること、
ｅ）前記ポリアルコキシル化核酸分子の沈殿により、前記ポリアルコキシル化核酸分子を非ポリアルコキシル化核酸分子から分離すること、
ｆ）前記ポリアルコキシル化核酸分子をＨＰＬＣにより精製すること、
ｇ）限外濾過を用いて、前記ポリアルコキシル化核酸分子を脱塩すること
を含む、ポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法。
【請求項５０】
さらに、最終生成物を凍結乾燥する工程ｈ）を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
工程ｄ）は、請求項２８〜４６のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項４９〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
工程ｅ）は、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
請求項２８〜４６のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、ポリアルコキシル化核酸分子。
【請求項５４】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、ポリアルコキシル化核酸分子。
【請求項５５】
請求項４７〜４８のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、ポリアルコキシル化核酸分子。
【請求項５６】
請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、ポリアルコキシル化核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法およびそのような方法により得ることができるポリアルコキシル化核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアルキレングリコールなどのポリアルコキシレートの、小分子、核酸分子、ペプチド、タンパク質およびナノ粒子などの薬物への結合は、治療用途のためのそのような薬物のバイオアベイラビリティ、安定性、安全性、および効力を増加させるために広く使用されている。核酸系薬物の分野内では、アプタマーおよび鏡像アプタマーとも呼ばれるスピーゲルマーは典型的にはポリアルコキシル化される。ポリエチレングリコール（略語ＰＥＧ）は、典型的に使用されるポリアルコキシレートであり、これは食品医薬品局により、静脈内に、経口的におよび経皮的に投与される薬物の一部として認可されている。
【０００３】
一般に、ポリアルコキシル化核酸分子は、最初に、固相上で反応基を含む核酸分子を構築するプロセスにより調製される。そのようなプロセスは、例えば、Ｈｏｆｆｍａｎｎら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ．  ａｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１，  ４：４．４６．１−４．４６．３０）において記載され、本明細書における図１Ａで示される。固相から切断させた後、粗合成生成物は、様々なプロセス、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー（略語ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（略語ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）および限外濾過またはそれらの任意の組み合わせにより精製することができる。典型的には、そのようなプロセスはＲＰ−ＨＰＬＣまたはＩＥＸ−ＨＰＬＣと限外濾過との組み合わせから構成され、所望のヌクレオチド配列およびポリアルコキシレートのその後の結合付着のための反応基を含む核酸分子が得られる。この反応基はその後、核酸分子およびそのような核酸分子により提供される反応基との共有結合を形成することができる好適な反応基を含むポリアルコキシレートと、反応させることができる。コンジュゲーション反応後、このように得られた粗生成物は再び、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＩＥＸ−ＨＰＬＣまたは限外濾過またはそれらの任意の組み合わせなどのプロセスにより精製される。
【０００４】
ポリアルコキシル化反応の収率はポリアルコキシル化される核酸分子の純度および反応条件自体に依存する。そのために、典型的には、ポリアルコキシル化される核酸分子は、ポリアルコキシル化反応前にＨＰＬＣおよび／または限外濾過により精製される。ポリアルコキシル化反応のための標準条件は下記の通りである：アミノ修飾核酸分子が水溶液中で調製され、塩基が添加される。典型的には、塩基は１００ｍＭホウ酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウムである。最後に、ポリアルコキシレート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（略語ポリアルコキシレート−ＮＨＳ）がＤＭＦまたはＤＭＳＯなどの水混和性有機溶媒に溶解されて、添加される。ポリアルコキシル化核酸分子に対する収率は、７５〜９５％であり、主に使用されるポリアルコキシレート−ＮＨＳの当量に依存する。収率はポリアルコキシレート−ＮＨＳの競合加水切断の影響を受ける。そのため、通常、数当量のポリアルコキシレート−ＮＨＳが経時的に数回に分けて添加され、ターンオーバーが分析方法によりモニターされる。
【０００５】
典型的には、治療アプタマーおよびスピーゲルマーは約３０〜５０のヌクレオチドから構成される（Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２０１０，  ９，  ５３７；  Ｊａｍｅｓ，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０００，  ４８４８）。平均段階的カップリング効率は９９％に近いが、非常に多くの、様々な長さのトランケート型失敗配列の核酸分子が固相合成中に蓄積される。これらのトランケート型失敗配列を所望の全長核酸種から分離するために、最終的に結合されたヌクレオチド、それぞれ、ポリアルコキシレートの核酸分子およびヌクレオチドへの結合において使用されるリンカーまたは修飾因子、または修飾因子へのその後に生成されるコンジュゲートの特性が活用され、というのも、キャッピングされたトランケート配列を有する核酸種はこのビルディングブロックを有さないからである。例えば、３’〜５’方向合成では、Ｃ６−アミノ−またはＣ６−ジスルフィド修飾因子の５’ＭＭＴ−または５’ＤＭＴ−基は、修飾を欠く、トランケート型失敗種を有する種と比べ、ＩＥＸ−ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ−樹脂とのより強い相互作用を達成するために使用することができ、核酸の全長種のより遅い溶離が得られる。同様の親和性効果はポリアルコキシル化反応の未反応のトランケート型失敗配列を所望のポリアルコキシル化全長核酸分子から分離するために使用することができるが、最終ＨＰＬＣ−精製前に失敗配列を除去することが有利であり、というのも、クロマトグラフィー精製の分解能および効率は不純物により影響されるからである。しかしながら、ポリアルコキシル化核酸、例えば、例として、アプタマーおよびスピーゲルマーのＨＰＬＣによる精製は時間がかかり、骨が折れ、高価な樹脂が関与する。
【０００６】
以上を考慮すると、ポリアルコキシル化核酸の生成は合成および精製の多くの工程を含み、それらは時間およびお金がかかる。したがって、ポリアルコキシル化核酸の生成を最適化することが強く要求される。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の根底にあるこれらのおよび他の問題は、本発明および、特に、添付の独立クレームの対象物により解決される。好ましい実施形態は、添付の従属クレームから得られ得る。
【０００８】
より特定的には、本発明の根底にある問題は、第１の態様ではポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法により解決され、ここで、方法は、ポリアルコキシル化核酸分子を核酸分子の混合物から分離することを含み、ここで、核酸分子の混合物はポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含み、ポリアルコキシル化核酸分子は非ポリアルコキシル化核酸分子から、ポリアルコキシル化核酸分子を混合物から沈殿させることにより分離される。
【０００９】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子は、核酸部分および少なくとも１つのポリアルコキシレート部分を含み、非ポリアルコキシル化核酸分子は１つの核酸部分を含み、ポリアルコキシレート部分を欠いている。
【００１０】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子はポリアルコキシル化核酸分子の複数の異なる種である。
【００１１】
第１の態様の一実施形態では、非ポリアルコキシル化核酸分子は非ポリアルコキシル化核酸分子の複数の異なる種である。
【００１２】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子の異なる種はそれらの核酸部分の観点で異なり、好ましくは、ポリアルコキシル化核酸分子の異なる種は、核酸部分のヌクレオチド配列の観点で異なる。
【００１３】
第１の態様の一実施形態では、非ポリアルコキシル化核酸分子の異なる種は、それらの核酸部分の観点で異なり、好ましくは、非ポリアルコキシル化核酸分子の異なる種は、核酸部分のヌクレオチド配列の観点で異なる。
【００１４】
第１の態様の一実施形態では、非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分の分子量は、ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分の分子量より低い。
【００１５】
第１の態様の一実施形態では、非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分は、ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分より少ないヌクレオチドを含む。
【００１６】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の混合物は溶液であり、溶液は１つの溶媒または１を超える溶媒を含む溶媒の混合物から構成される。
【００１７】
第１の態様の一実施形態では、溶媒は、水を含む。
【００１８】
第１の態様の一実施形態では、溶媒は、１つ以上の水混和性有機溶媒（複数可）を含む。
【００１９】
第１の態様の一実施形態では、水混和性有機溶媒（複数可）は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、ホルムアミド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、エチルホルムアミド、エチルメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドン、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、ジエチルケトン、メチルイソプロピルケトン、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、酢酸メチル、酢酸エチル、プロパン酸メチル、テトラヒドロフラン、ジオキサンを含む群から選択される。
【００２０】
第１の態様の一実施形態では、水混和性有機溶媒（複数可）は、溶液の５％〜９５％の体積分率を提供する。
【００２１】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子を混合物から沈殿させる工程は−５０℃〜３０℃の温度で、好ましくは−２５℃〜２５℃の温度で、より好ましくは−２０℃〜４℃の温度で、最も好ましくは−２０℃の温度で、または４℃の温度で実施される。
【００２２】
第１の態様の一実施形態では、沈殿させる工程は、−２０℃〜４℃の温度で３０分〜１６時間の間実施され、その後、ポリアルコキシル化核酸分子の沈殿でポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の混合物により形成された上清から、沈殿したポリアルコキシル化核酸分子が分離される。
【００２３】
第１の態様の一実施形態では、沈殿させる工程は、−２０℃の温度で３０分〜１６時間の間実施され、その後、ポリアルコキシル化核酸分子の沈殿でポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の混合物により形成された上清から、沈殿したポリアルコキシル化核酸分子が分離される。
【００２４】
第１の態様の一実施形態では、沈殿させる工程は、４℃の温度で１６時間実施され、その後、ポリアルコキシル化核酸分子の沈殿でポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の混合物により形成された上清から、沈殿したポリアルコキシル化核酸分子が分離される。
【００２５】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子を、ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の混合物から沈殿させる工程は、４〜１１のｐＨ範囲で、好ましくは６〜１０のｐＨ範囲で、より好ましくは７〜９．５のｐＨ範囲で実施される。
【００２６】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子を、ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の混合物から沈殿させる工程は、ポリアルコキシル化核酸分子の７５％〜１００％が沈殿されるまで、好ましくはポリアルコキシル化核酸分子の９０％〜１００％が沈殿されるまで実施される。
【００２７】
第１の態様の一実施形態では、沈殿したポリアルコキシル化核酸分子は非ポリアルコキシル化核酸分子から、液体を固体から分離するための分離法により分離される。
【００２８】
第１の態様の一実施形態では、液体を固体から分離するための分離法は、濾過、遠心分離、およびデカンテーションを含む群から選択される。
【００２９】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシレート部分は直鎖または分枝ポリアルコキシレート部分である。
【００３０】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシレート部分はポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリグリセロールを含む群から選択される。
【００３１】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシレート部分はポリエチレングリコールである。
【００３２】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシレート部分は、５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００Ｄａ〜８０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００Ｄａの分子量を有する。
【００３３】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子および／または非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はそれぞれ、３００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、好ましくは３，０００Ｄａ〜３５，０００Ｄａ、より好ましくは３，０００Ｄａ〜１６，０００Ｄａの分子量を有する。
【００３４】
第１の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子および／または非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はアプタマーまたはスピーゲルマーである。
【００３５】
より特定的には、本発明の根底にある問題は、第２の態様では、核酸部分およびポリアルコキシレート部分を含むポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法により解決され、ここで、方法は核酸分子をポリアルコキシレートと反応させ、よってポリアルコキシル化核酸分子を形成させることを含み、ここで、反応は、四級アンモニウム化合物の存在下で実施され、ここで、核酸分子はポリアルコキシル化核酸部分の核酸部分を形成し、ポリアルコキシレートは、ポリアルコキシル化核酸分子のポリアルコキシレート部分を形成する。
【００３６】
第２の態様の一実施形態では、四級アンモニウム化合物は、テトラアルキルアンモニウムクロリド、テトラアルキルアンモニウムブロミド、テトラアルキルアンモニウムテトラフルオロボラート、テトラアルキルヘキサフルオロホスフェート、テトラアルキル硫酸水素塩、テトラアルキルリン酸水素塩を含む群から選択され、ここで、アルキルは１〜１８個のＣ原子からなるアルキル鎖であり、好ましくは、四級アンモニウム化合物はテトラブチルアンモニウムブロミドである。
【００３７】
第２の態様の一実施形態では、四級アンモニウム化合物は水または水混和性有機溶媒またはそれらの組み合わせに溶解される。
【００３８】
第２の態様の一実施形態では、水混和性有機溶媒はジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、エチルホルムアミド、エチルメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、２−ピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドン、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、ジエチルケトン、メチルイソプロピルケトン、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、酢酸メチル、酢酸エチル、プロパン酸メチル、テトラヒドロフラン、ジオキサンを含む群から選択される。
【００３９】
第２の態様の一実施形態では、四級アンモニウム化合物は、ジメチルホルムアミドに溶解され、ここで、好ましくは四級アンモニウム化合物はテトラブチルアンモニウムブロミドである。
【００４０】
第２の態様の一実施形態では、反応は、核酸分子のヌクレオチド当たり１〜２０モル当量の四級アンモニウム化合物、好ましくは核酸分子のヌクレオチド当たり２〜１０モル当量の存在下で実施される。
【００４１】
第２の態様の一実施形態では、反応は、１０℃〜５０℃の温度で、好ましくは２０℃〜４０℃の温度で実施される。
【００４２】
第２の態様の一実施形態では、反応は、４〜１１のｐＨ範囲で、好ましくは６〜１０のｐＨ範囲で実施される。
【００４３】
第２の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子のポリアルコキシレート部分は、１つのポリアルコキシレート部分または１を超えるポリアルコキシレート部分から構成される。
【００４４】
第２の態様の一実施形態では、ポリアルコキシレート部分は直鎖または分枝ポリアルコキシレート部分である。
【００４５】
第２の態様の一実施形態では、ポリアルコキシレート部分は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールおよびポリグリセロールを含む群から選択される。
【００４６】
第２の態様の一実施形態では、ポリアルコキシレート部分はポリエチレングリコールである。
【００４７】
第２の態様の一実施形態では、核酸分子は少なくとも１つの反応基、好ましくは１を超える反応基を含み、ここで１を超える反応基は異なる反応基であり、ポリアルコキシレートは、ポリアルコキシル化核酸分子を形成する核酸分子の少なくとも１つの反応基と反応することができる反応基を含む。
【００４８】
第２の態様の一実施形態では、核酸分子の反応基は、アミン、チオール、アジド、アルキン、カルボキシレート、カルボン酸エステル、アルデヒド、ヨードアルキルおよびマレイミドを含む群から選択され、ここで、好ましくは、核酸分子の反応基はアミンである。
【００４９】
第２の態様の一実施形態では、ポリアルコキシレートの反応基は、アミン、チオール、アジド、アルキン、カルボキシレート、カルボン酸エステル、アルデヒド、ヨードアルキルおよびマレイミドを含む群から選択され、ここで、好ましくは、ポリアルコキシレートの反応基は、カルボン酸エステルであり、ここで、より好ましくは、ポリアルコキシレートの反応基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００５０】
第２の態様の一実施形態では、核酸分子の反応基は、アミンであり、ポリアルコキシレートの反応基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【００５１】
第２の態様の一実施形態では、ポリアルコキシレート部分および／またはポリアルコキシレートは、５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００Ｄａ〜８０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００Ｄａの分子量を有する。
【００５２】
第２の態様の一実施形態では、核酸分子部分および／または核酸部分は、３００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、好ましくは３，０００Ｄａ〜３５，０００Ｄａ、より好ましくは３，０００Ｄａ〜１６，０００Ｄａの分子量を有する。
【００５３】
第２の態様の一実施形態では、核酸分子はアプタマーまたはスピーゲルマーである。
【００５４】
より特定的には、本発明の根底にある問題は、第３の態様では、下記を含むポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法により解決される：
ａ）ポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法であって、方法は、核酸分子をポリアルコキシレートと反応させ、よってポリアルコキシル化核酸分子を形成することを含む、方法、ならびに
ｂ）第１の態様による方法。
【００５５】
第３の態様の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法は、第２の態様による方法を含む。
【００５６】
より特定的には、本発明の根底にある問題は、第４の態様では、下記を含むポリアルコキシル化核酸分子の調製のための方法により解決される：
ａ）固体支持体上で非ポリアルコキシル化核酸分子を合成すること、
ｂ）非ポリアルコキシル化核酸分子を固体支持体から切断し、非ポリアルコキシル化核酸分子を脱保護すること、
ｃ）限外濾過を用いて非ポリアルコキシル化核酸分子を脱塩すること、
ｄ）非ポリアルコキシル化核酸分子をポリアルコキシル化して、ポリアルコキシル化核酸分子を生成すること、
ｅ）ポリアルコキシル化核酸分子の沈殿により、ポリアルコキシル化核酸分子を非ポリアルコキシル化核酸分子から分離すること、
ｆ）ポリアルコキシル化核酸分子をＨＰＬＣにより精製すること、
ｇ）限外濾過を用いて、ポリアルコキシル化核酸分子を脱塩すること。
【００５７】
第４の態様の一実施形態では、方法はさらに、最終生成物を凍結乾燥する工程ｈ）を含む。
【００５８】
第４の態様の一実施形態では、工程ｄ）は、第２の態様による方法を含む。
【００５９】
第４の態様の一実施形態では、工程ｅ）は、第１の態様による方法を含む。
【００６０】
より特定的には、本発明の根底にある問題は、第５の態様では、第２の態様による方法により得ることができるポリアルコキシル化核酸分子により解決される。
【００６１】
より特定的には、本発明の根底にある問題は、第６の態様では、第１の態様による方法により得ることができるポリアルコキシル化核酸分子により解決される。
【００６２】
より特定的には、本発明の根底にある問題は、第７の態様では、第３の態様による方法により得ることができるポリアルコキシル化核酸分子により解決される。
【００６３】
より特定的には、本発明の根底にある問題は、第８の態様では、第４の態様による方法により得ることができるポリアルコキシル化核酸分子により解決される。
【００６４】
本発明はまた、未反応失敗配列をポリアルコキシル化核酸から除去するための方法を提供する。
【００６５】
本発明はまた、ポリアルコキシル化前にクロマトグラフィープロセスにより精製されていない核酸出発材料からポリアルコキシル化核酸を調製するための方法を提供する。
【００６６】
発明者らは、驚いたことに、ポリアルコキシル化核酸分子は非ポリアルコキシル化核酸分子から沈殿により分離することができることを見出した。そのようなプロセスにより、とりわけ、粗核酸の第１のクロマトグラフィー精製は省略することができ、ポリアルコキシレートにコンジュゲートされた核酸の第２のクロマトグラフィー精製の効率は改善することができる。
【００６７】
加えて、本発明者らは、核酸分子をポリアルコキシレートと反応させ、これにより、ポリアルコキシル化核酸分子を形成させことを含むポリアルコキシル化核酸分子を調製するためのプロセスを見出し、ここで、核酸はポリアルコキシル化前にクロマトグラフィープロセスにより精製されておらず、ポリアルコキシル化核酸分子は非ポリアルコキシル化核酸分子から、沈殿により分離され、ここで、非ポリアルコキシル化核酸分子は、核酸合成の望ましくない不純物、例えばトランケート配列である。図１Ｂは本発明によるプロセスの概略図を示す。
【００６８】
発明者らはこのように驚いたことに、最先端から知られている、ポリアルコキシル化核酸のより効率的な生成を可能にする核酸分子のポリアルコキシル化のためのプロトコルを見出した。
【００６９】
最後に、発明者らは、ポリアルコキシル化核酸は、本発明のポリアルコキシル化法により生成させることができ、その実施において、ポリアルコキシル化核酸分子は非ポリアルコキシル化核酸分子から沈殿により分離されることを見出した。
【００７０】
下記は、本発明の各々および任意の態様に適用可能であり、より特定的には本発明によるポリアルコキシル化核酸分子の調製のための各方法およびそのような方法により得ることができる任意のポリアルコキシル化核酸分子に適用可能である。
【００７１】
ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の混合物は溶液であり、または溶液に含まれることは、本発明の範囲内にあり、ここで、溶液はポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む。これによれば、ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の混合物からポリアルコキシル化核酸分子を沈殿させると、ポリアルコキシル化核酸分子は沈殿物として存在し、一方、非ポリアルコキシル化核酸分子は溶液内に溶解したままであることは、その様々な実施形態における発明の方法の範囲内にある。
【００７２】
好ましくは本明細書で使用されるように、ポリアルコキシル化核酸分子は、少なくとも核酸部分および少なくとも１つのポリアルコキシレート部分を含む核酸分子である。核酸部分はヌクレオチド配列を含む。ポリアルコキシル化核酸分子は１つまたは複数のポリアルコキシレート部分を含み得る。好ましい実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子はリンカーを含み；好ましくはそのようなリンカーは１つのまたはそのポリアルコキシレート部分を核酸部分に連結させる。ポリアルコキシル化核酸分子が２つ以上のポリアルコキシレート部分を含む本発明の一実施形態では、２つ以上のポリアルコキシレート部分の各々は、核酸部分に、リンカーにより結合され；そのようなリンカーは個々のポリアルコキシレート部分に対し同じか、または異なり得る。
【００７３】
リンカーは本明細書では修飾因子とも呼ばれることが認められるべきである。
【００７４】
ポリアルコキシル化核酸分子が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のポリアルコキシレート部分を含むことは、本発明の範囲内にある。ポリアルコキシル化核酸分子が２つ以上のポリアルコキシレート部分を含む場合、２つ以上のポリアルコキシレート部分は、ポリアルコキシル化核酸分子の核酸配列部分の同じ位置または異なる位置で結合されることは、本発明の範囲内にある。
【００７５】
好ましい実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子は１つのポリアルコキシレート部分を含む。
【００７６】
別の好ましい実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子は２つのポリアルコキシレート部分を含む。２つのポリアルコキシレート部分を含むポリアルコキシル化核酸分子の一実施形態では、２つのポリアルコキシレート部分は、核酸部分の同じ位置で結合される。好ましくは、そのような２つの部分は、核酸部分の５’末端ヌクレオチドに結合される。第１の代替案では、そのような２つの部分は、核酸部分の３’末端ヌクレオチドに結合される。第２の代替案では、そのような２つの部分は、核酸部分のヌクレオチド配列内の核酸部分の一ヌクレオチドに結合され、これにより、そのようなヌクレオチドは、核酸部分の５’末端ヌクレオチドおよび核酸部分の３’末端ヌクレオチドとは異なる。２つのポリアルコキシレート部分を含むポリアルコキシル化核酸分子の他の実施形態では、２つのポリアルコキシレート部分は、核酸部分の異なる位置で結合される。これによれば、第１のポリアルコキシレート部分は、核酸部分の５’末端ヌクレオチドに結合され、第２のポリアルコキシレート部分は、核酸部分の３’末端ヌクレオチドに結合され；あるいは第１のポリアルコキシレート部分は、核酸部分の５’末端ヌクレオチドに結合され、第２のポリアルコキシレート部分は、核酸部分のヌクレオチド配列内の核酸部分の一ヌクレオチドに結合され、これにより、そのようなヌクレオチドは、核酸部分の５’末端ヌクレオチドおよび核酸部分の３’末端ヌクレオチドとは異なり；あるいは第１のポリアルコキシレート部分は、核酸部分の３’末端ヌクレオチドに結合され、第２のポリアルコキシレート部分は、核酸部分のヌクレオチド配列内の核酸部分の一ヌクレオチドに結合され、これにより、そのようなヌクレオチドは、核酸部分の５’末端ヌクレオチドおよび核酸部分の３’末端ヌクレオチドとは異なり；あるいは、第１のポリアルコキシレート部分は、核酸部分のヌクレオチド配列内の核酸部分の一ヌクレオチドに結合され、これにより、そのようなヌクレオチドは、核酸部分の５’末端ヌクレオチドおよび核酸部分の３’末端ヌクレオチドとは異なり、ここで、第２のポリアルコキシレート部分は、核酸部分のヌクレオチド配列内の核酸配列部分の一ヌクレオチドに結合され、これにより、そのようなヌクレオチドは、核酸部分の５’末端ヌクレオチド、核酸部分の３’末端ヌクレオチドおよび第１のポリアルコキシレート部分が結合されるヌクレオチドとは異なる。
【００７７】
好ましくは本明細書で使用されるように、非ポリアルコキシル化核酸分子は核酸部分を含むが、一ポリアルコキシレート部分を欠き、または全てのポリアルコキシレート部分を欠いている核酸分子であり、各々が、好ましくは本明細書で規定される通りである。しかしながら、非ポリアルコキシル化核酸分子はリンカーを含み、これは、ポリアルコキシレート部分を、本明細書で規定されるように核酸部分に連結させるために使用されることは本発明の範囲内にある。非ポリアルコキシル化核酸分子は前記リンカーを欠いていることもまた、本発明の範囲内にある。最後に、非ポリアルコキシル化核酸分子はリンカーを含む非ポリアルコキシル化核酸分子および前記リンカーを欠いている非ポリアルコキシル化核酸分子の混合物であることもまた、本発明の範囲内にある。
【００７８】
本発明の様々な態様の一実施形態では、「ポリアルコキシル化核酸分子」という用語は、ポリアルコキシル化核酸分子の複数の種を指す。好ましくは、そのような複数の個々の種は、互いに、核酸部分のヌクレオチド配列に関して異なる。ヌクレオチド配列のそのような違いは、例えば、核酸部分の合成に起因し得る。しかしながら、そのような複数の個々の種が同じヌクレオチド配列を有することもまた本発明の範囲内にある。その代わりにまたは加えて、そのような複数の個々の種は、互いに、それぞれ、１つまたは複数のポリアルコキシレート部分に関して異なることもまた、本発明の範囲内にある。
【００７９】
本発明の様々な態様の一実施形態では、「非ポリアルコキシル化核酸分子」という用語は、非ポリアルコキシル化核酸分子の複数の種を指す。好ましくは、そのような複数の個々の種は、互いに、核酸部分のヌクレオチド配列に関して異なる。ヌクレオチド配列のそのような違いは、例えば、核酸部分の合成に起因し得る。しかしながら、そのような複数の個々の種が同じヌクレオチド配列を有することもまた本発明の範囲内にある。
【００８０】
例えば、混合物または溶液中に存在する、またはこれに含まれるポリアルコキシル化核酸分子に言及される場合、単一分子のみではなく、複数のそのようなポリアルコキシル化核酸分子が存在することもまた、本発明の範囲内にある。言い換えれば、好ましくはポリアルコキシル化核酸分子という用語は、その数ではなく、分子の属を示す。
【００８１】
例えば、混合物または溶液中に存在する、またはこれに含まれる非ポリアルコキシル化核酸分子に言及される場合、単一分子のみではなく、複数のそのような非ポリアルコキシル化核酸分子が存在することもまた、本発明の範囲内にある。言い換えれば、好ましくは、非ポリアルコキシル化核酸分子という用語は、その数ではなく、分子の属を示す。
【００８２】
本発明の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はアプタマーである。本発明の一実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はスピーゲルマーである。本発明のさらなる実施形態では、非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はアプタマーである。本発明の一実施形態では、非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はスピーゲルマーである。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はアプタマーであり、非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はアプタマーである。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はアプタマーであり、非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分は、アプタマーとは異なり、好ましくは非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分は、アプタマーとして活性ではなく、より好ましくはポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分のアプタマー特性を有さない。好ましくは本明細書で使用されるように、アプタマー特性は、例えば、ＫＤ値として表されるアプタマーのその標的分子への結合特性を指す。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はスピーゲルマーであり、非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はスピーゲルマーである。
【００８６】
本発明のさらなる実施形態では、ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分はスピーゲルマーであり、非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分は、スピーゲルマーとは異なり、好ましくは非ポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分は、スピーゲルマーとして活性ではなく、より好ましくはポリアルコキシル化核酸分子の核酸部分のスピーゲルマー特性を有さない。好ましくは本明細書で使用されるように、スピーゲルマー特性は、例えば、ＫＤ値として表されるスピーゲルマーのその標的分子への結合特性を指す。
【００８７】
好ましくは本明細書で使用されるように、アプタマーは、その標的分子にＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成とは異なる結合を介して結合する核酸分子であり、これにより、核酸分子はＤ−ヌクレオチドから構成される。アプタマーの生成は、例えば、ＥＰ０５３３８３８号で記載される。
【００８８】
好ましくは本明細書で使用されるように、スピーゲルマーは、その標的分子にＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成とは異なる結合を介して結合する核酸分子であり、これにより、核酸分子は本質的にＬ−ヌクレオチドから構成される。スピーゲルマーの生成は、例えば、ＷＯ９８／０８８５６号で記載される。
【００８９】
本発明の方法は、ポリアルコキシル化された、天然糖部分を含む核酸、例えば２’−デオキシリボ核酸（以下「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（以下「ＲＮＡ」）ならびに修飾された糖部分、修飾されリン酸部分、修飾された核酸塩基を含む核酸に適用することができる。本発明による方法は、ＲＮＡおよびＤＮＡの天然立体異性体に制限されない。また、鏡像ＤＮＡ（Ｌ−ＤＮＡ）またはＲＮＡ（Ｌ−ＲＮＡ）ならびに糖−、リン酸−またはヌクレオチド修飾されたＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡならびにＤ／Ｌ−ハイブリッド核酸分子およびその修飾物を含むポリアルコキシル化核酸は、本発明による方法により調製することができる。糖部分の修飾としては環サイズの変更（例えばフラノース、ヘキソース）、置換、単一環原子の導入もしくは除去（例えばカルバ糖、アザ糖）、置換、側鎖基または原子（例えば２’−Ｆ、２’ＯＭｅ）の導入もしくは除去、環の非環状または多環状誘導体（例えばアンロックド核酸、アミノ酸核酸、ロックド核酸、三環核酸）による置換、核酸塩基の配向または位置（α−アノマー配向、ヘキシトール核酸）が挙げられる。核酸分子は１つ以上の天然または非天然脱塩基部分（例えばテトラヒドロフラン、エチレングリコール）から構成され得る。修飾されたリン酸部分としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスフェート、ホスホラミデートおよびホスホロチオアミダートが挙げられる。核酸塩基の修飾は、天然起源、例えばイソニン（ｉｓｏｎｉｎｅ）、キサンチン、５，６−ジヒドロウラシルまたは５−メチルシトシンまたは人工修飾例えばＣ５−アルキニルピリミジン、Ｎ−アルキル化プリンおよびピリミジン、ピリミジンおよびプリンのＣ６−誘導体などとすることができる。核酸分子はまた、上記修飾の１つ以上を含む、またはこれから構成されてもよい。
【００９０】
核酸分子の構築および合成のための方法は当技術分野でよく知られており、その各々が本発明の方法に供せられる核酸分子の調製において使用され得る。多くの実施形態では、核酸分子は固体支持体上での保護されたビルディングブロックの新生核酸分子への段階的カップリングを使用するホスホラミダイト法により構築される（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９２，  ４８（１２），  ２２２３−２３１１）。好ましい実施形態では、合成方向は３’〜５’方向であるが、５’〜３’方向の逆合成もまた使用され得る（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ．ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ２００８，５２，１０３−１０４）。所望の核酸配列が構築され、下流プロセシングのための全ての必要な修飾が導入されるとすぐに、核酸分子は固体支持体から切断され、脱保護される。核酸分子はその後、これまで当技術分野で知られている任意の手段により精製され得る。
【００９１】
一般に、切断および脱保護工程は、アンモニアおよび／またはアルキルアミンまたはアンモニア塩の使用を含む。例えば、ＲＮＡは、ＮＨ３／ＭｅＮＨ２により、続いてＮＥｔ３・ＨＦまたはＢｕ４ＮＦにより切断される。ＮＨＳ−エステル媒介ポリアルコキシル化を使用する場合、これらのアミンおよびアンモニア塩は、ポリアルコキシル化前に除去されなければならず、というのも、それらにより望まれない副反応が引き起こされ、ポリアルコキシル化中のカップリング効率が低下するからである。アミン種の除去は、大量のナトリウム塩を添加し、続いて沈殿または限外濾過を実施することにより行うことができる塩交換、または溶離のためにナトリウム塩勾配を使用するＩＥＸ−ＨＰＬＣ中に達成することができる。ＩＥＸ−ＨＰＬＣ精製後、過剰の塩の除去がまた、必要である。他の型のコンジュゲーション反応はアミンの存在に対して感応性があってもよく、なくてもよい。複数の異なる技術は、そのような目的のために、必要に応じて使用することができる。好ましい実施形態では、塩交換、続いて限外濾過が使用される。本発明を説明するための実施例で使用されるアミノ修飾核酸分子は実施例１−１１に従い、合成および精製された。
【００９２】
ポリアルコキシル化のための方法は当技術分野でよく知られている。本発明の方法の実施において使用することができるポリアルコキシレートとしてはポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）および混合ポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）化合物が挙げられるが、それらに限定されない。ポリアルコキシレートは好ましくは下記式を有し：
（化１）
ＰｒＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｘ−（ＣＨ２ＣＨＲＯ−）ｙ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｚＱ、
式中、ｘ、ｙおよびｚは独立して０または正の整数であり、ただし、ｘ、ｙおよびｚの少なくとも１つは０でないことを条件とし；ＲはＨまたはアルキル、例えばＣ１−４アルキル、特にメチル基であり、Ｐｒはキャッピング基または標識基であり、Ｑはオリゴヌクレオチドとのカップリングを可能にする基である。ｘ、ｙまたはｚが０ではない場合、それらは典型的には１０００までである。いくつかの実施形態では、ｘは３〜１０００、好ましくは１００〜５００であり、ｙおよびｚはどちらも０である。他の実施形態では、ｘおよびｙはそれぞれ、独立して３〜１０００、好ましくは１００〜５００であり、ｚは０である。さらに他の実施形態では、ｘおよびｚはそれぞれ、独立して３〜５００、好ましくは１００〜３００であり、ｙは３〜１０００、好ましくは１００〜５００である。好ましくは、ポリアルキレンオキシドは、例えばＣ１−４アルキル基、好ましくはメチル基によりキャッピングされる。Ｐｒにより表され得る標識基としては、フルオレセインおよびビオチン、または、他の反応基、例えばアミン、チオール、マレイミド、アジドまたはアルキンが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の実施において使用されるポリアルコキシレート化合物は、典型的にはそれらのおよその平均分子量および省略された化学名により同定される（例えばＰＥＧ＝ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ＝ポリ（プロピレングリコール）。ポリアルキレンオキシドは直鎖または分枝であってもよく、典型的には、０．２ｋＤ〜６０ｋＤ、好ましくは２ｋＤ〜４０ｋＤの平均分子量を有する。ポリアルキレンオキシドが分枝である場合、核酸分子とのカップリングを可能にするＱ基は、２つ以上のポリアルキレンオキシド鎖もしくは部分を有し得る。例えば、Ｑはリジンまたは２つのポリアルキレンオキシド鎖もしくは部分および反応基をを有する等価な部分を表してもよい。好ましくは、ポリアルコキシレートはＰＥＧである。
【００９３】
幅広い好適なコンジュゲーション反応を、核酸分子をポリアルコキシレートにカップリングさせるために使用することができる。典型的には、アミノ、チオ、アジドまたはアルキン修飾を有する核酸分子が、好適な反応基、例えばカルボン酸、カルボン酸エステル、アルデヒド、ヨードアルキル基、マレイミド、アジドまたはアルキンで修飾されたポリアルコキシレートと反応させられる。本発明の方法は、任意のポリアルコキシル化法に限定されない。むしろ、本発明の方法は任意のポリアルキル化法の反応生成物を使用し得る。好ましくは、アミノ修飾されたオリゴヌクレオチドが、反応基としてのポリアルコキシレート−ＮＨＳ−エステルと反応させられる。核酸分子におけるアミノ−修飾の位置は３’端および／または５’端および／または内部、すなわち、５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドとは異なる任意のヌクレオチドとすることができる。図２は非限定的な意味で、そのような反応性アミノ基を核酸分子に導入するために使用することができる一組の試薬を示す。アミノ修飾された核酸分子のポリアルコキシレートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ポリアルコキシレートＮＨＳエステル）との反応は、典型的には、水および水混和性有機溶媒を含む水性有機溶媒中で実施される。好ましい有機溶媒は非プロトン性、極性であり、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＮＭＰおよびアセトニトリルが挙げられる。有機溶媒の濃度は１０％〜５０％、好ましくは重量％で変動し得る。核酸分子は好ましくは水溶液、例えば緩衝液、例えば、例として、重炭酸ナトリウムまたはホウ酸ナトリウム中で使用され、しかしながら、三級アミン、例えばＮＥｔ３またはＤＩＰＥＡを含む水溶液もまた使用することができる。好ましくは、核酸含有溶液のｐＨは、８．５〜９．５に調整される。ポリアルコキシレートが、水混和性有機溶媒中の溶液として使用され、それぞれ、水混和性有機溶媒中の溶液で提供され、水性オリゴヌクレオチドに添加された時には、溶液中に存在したままである。ポリアルコキシレートのオリゴヌクレオチドに対するモル比は、当業者により認識されるように、規模および反応性によって１：１〜５：１／反応性アミノ基で変動し得る。ポリアルコキシレートの添加は好ましくは、反応が完了するまで続けられる。反応に続いて当業者が利用できる任意の手段が取られ得る。多くの実施形態では、ポリアルコキシル化反応をモニターするためにＲＰ−ＨＰＬＣが使用される。最良の変換を達成するために、周囲温度、例えば２０℃、２１℃または２２℃から４５℃まで変動する温度を使用することができる。
【００９４】
本発明の１つの態様は、ポリアルコキシル化核酸分子を形成するための、アミノ修飾された核酸分子のポリアルコキシレート−ＮＨＳエステルとのポリアルコキシル化反応に関する。ＮＨＳエステルは核酸分子のアミノ基と反応して所望の生成物を形成するだけでなく、水と反応する反応基である。そのため、そのような反応において存在する水の量を低減させることが、好ましい。しかしながら、水は速く、完全な反応を達成するために、核酸分子を溶解させ、高い濃度の核酸を提供するのに必要である。他方、ポリアルコキシレートはＤＭＦなどの極性溶媒中よりも水中で溶解性が低い。驚いたことに、Ｂｕ４ＮＢｒなどの四級アンモニウム化合物を、ポリアルコキシレートをＤＭＦ中に添加する前に核酸分子に添加すると、そのような反応における水量は著しく低減させることができることが見出されている。ＤＭＦの総含量は、７６％（好ましくは重量で）に等しく、一方、高い核酸濃度が維持される。このように、アルコキシレートＮＨＳエステルの加水分解などの副反応が低減され、生成物変換が実施例１２−２２により説明されるように増強される。
【００９５】
ポリアルコキシレートおよび核酸分子を反応させて、コンジュゲートポリアルコキシル化核酸分子を形成させた後、生成物は好ましくは全ての未反応オリゴヌクレオチドから分離される。
【００９６】
本発明によれば、驚いたことに、ポリアルコキシル化核酸は、粗ポリアルコキシル化反応混合物を沈殿工程に供することにより、ポリアルコキシル化核酸分子および非ポリアルコキシル化核酸分子を含む核酸分子の混合物から非常に効率的に、かつ高い生成物回収率で分離することができることが見出されている。一実施形態では、沈殿は、沈殿剤の添加により達成され、アモルファスまたは微結晶固体および母液からなる懸濁液が形成される。一実施形態では、オリゴヌクレオチドのための沈殿剤は水混和性有機溶媒、塩またはオリゴヌクレオチド溶液のｐＨを変化させる作用物質とすることができる。他の実施形態では、沈殿は、本発明の方法に供せられた核酸分子の混合物などのオリゴヌクレオチド溶液の冷却により達成される。沈殿剤の組み合わせ、ならびに冷却および１つまたは複数の沈殿剤の添加の組み合わせが使用され得る。好ましい実施形態では、粗ポリアルコキシル化反応物への少なくとも１つの沈殿剤の添加および／または粗ポリアルコキシル化反応物の冷却により、ポリアルコキシル化核酸分子が沈殿し、一方、未反応オリゴヌクレオチド、すなわち非ポリアルコキシル化核酸分子は、上清中に存在し、または溶解したままである。その後の生成物収集は、当技術分野で知られている任意の固体−流体分離技術により容易に達成することができる。そのような分離技術は、好ましくは物質混合物の密度の違いを活用する。例えば、沈殿物は、重力または２００−２０，０００ｇでの遠心分離により沈降させることができる。沈降または遠心分離後、上清をデカントすることができ、沈殿物を回収することができる。その後の生成物収集もまた、活用することができ、このように、固体−流体混合物中に含まれる固体の粒子サイズに基づくことができる。例えば、沈殿物は濾過により収集することができる。濾過は、流体のみが通過することができる媒体を挿入することにより達成される。濾紙の使用ありまたはなしの表面フィルタ、例えばガラスディスクフィルタ、ブフナー漏斗、ベルトフィルタまたは回転真空ドラムフィルタを使用することができる。ある一定の濾過助剤が濾過を助けるために使用され得る。そのような濾過助剤はしばしば、非圧縮性珪藻土、キーゼルガー（ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）またはパーライトである。木材セルロースもまた使用され得る。流体はフィルタの高圧側から低圧側までフィルタを通って流れる。これを達成するための最も簡単な方法は重力による。好ましい実施形態では、供給側の圧縮空気またはガスの形態の圧力（または、濾液側の真空）が適用され、濾過プロセスがより迅速になる。あるいは、液体は、ポンプにより与えられる力によりフィルタを通って流れてもよい。
【００９７】
精製プロセス、すなわち本発明による沈殿工程を利用して、ポリアルコキシル化核酸分子を調製するための方法は非常に有益であり、というのも、それは分離プロセスであり、これは、ポリアルコキシル化前のＲＰ−またはＩＥＸ−精製と同じくらい強力であるが、安価な試薬を用いて迅速に実施され、当技術分野、例えばＷＯ２００７／０６６０６９号において記載される他の方法の不利点が回避されるからである。ＷＯ２００７／０６６０６９号は、限外濾過による非ポリアルコキシル化核酸分子からのポリアルコキシル化核酸分子の分離を促進するために、ポリアルコキシル化による分子量の増加を活用する方法を記載する。しかしながら、内部塩基対形成により安定化される３次元構造を有するオリゴヌクレオチド、例えばアプタマーおよびスピーゲルマーは、未反応およびポリアルコキシル化核酸分子の凝集物を形成する傾向がある。そのため、ＷＯ２００７／０６６０６９号は変性条件を適用することを示唆する。より特定的には、１Ｍ  ＮａＣｌＯ４が生成物に添加され、熱が適用され、ストランド分離が促進される。過剰のポリアルコキシレートはその後、ＩＥＸ−ＨＰＬＣポリッシング工程により除去される。しかしながら、過塩素酸ナトリウムは強い酸化試薬である。加熱と一緒にすると、ポリアルコキシル化核酸分子が酸化的分解を受けるリスクが増加し、これは、典型的にはその治療的使用に影響する。これとは対照的に、本発明は、攻撃的な試薬が反応物に添加されず、これに熱も適用されないので、優れていることが証明される。収集された生成物は、その後のＩＥＸ−ＨＰＬＣポリッシングおよび過剰のポリアルコキシレートの除去の準備ができている。
【００９８】
これまでのことろ、図３Ａについて特定的に言及すると、これはペグ化前の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６の典型的な粗合成生成物のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（１  ｐｒｅＰＥＧ、実施例３４を参照されたい）。クロマトグラムによれば、粗生成物は５８％全長生成物を含んだ。１−ｐｒｅＰＥＧのペグ化により、ＩＥＸ−ＨＰＬＣ−分析により示されるように、ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）への変換が導かれた（図３Ｂ）。ＹＰＥＧは４０ｋＤａのＹ字型分枝ＰＥＧである。１０倍過剰のＭｅＯＨの添加、およびその後の−２０℃への冷却により、沈殿物が形成した（実施例２３）。沈殿物を、遠心分離、続いてデカンテーションにより収集し、沈殿物および上清をＩＥＸ−およびＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ペグ化生成物ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）はほぼ沈殿物においてのみ見出されることが示された（図３Ｃ）。上清では１は非常に少量だけ見出される（図３Ｄ）。沈殿物のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析は、生成物の６８％純度を示す（図３Ｅ）が、上清のみが多種多様な非コンジュゲートオリゴヌクレオチド関連不純物を含んだ（図３Ｆ）。その後のＩＥＸポリッシングおよびＰＥＧ除去は、高い生成物回収率および高い生成物純度で実施した。
【００９９】
本発明による精製方法、すなわち沈殿工程を使用してポリアルコキシル化核酸分子を調製するための本発明の方法はまた、非常に不十分な粗固相合成生成物から調製されたポリアルコキシル化核酸分子の精製を可能にする。合成動作を不十分な量のホスホラミダイトを用いて計画的に実施し、２７％ＦＬＰの純度を有する粗５’ＮＨ２’ＮＯＸ−Ｅ３６を得た（実施例５）。この合成生成物であっても、ペグ化し（実施例１４）および、効率的に精製することができるであろう（実施例２４）。
【０１００】
本発明による沈殿は、ＭｅＯＨの添加および−２０℃までのその後の冷却（実施例２３、２４および３７）により開始されるだけでなく、前の共溶媒添加なしの４℃（実施例３８および３９）または−２０℃までの冷却のみ（実施例４０）によっても開始され得る。
【０１０１】
本発明による精製方法は、４０ｋＤａＹＰＥＧへのオリゴヌクレオチドコンジュゲートに制限されない。幅広い核酸が異なる長さのＰＥＧ種およびＰＥＧ負荷（１０ｋＤａ−２×４０ｋＤａ）で修飾され、全ての得られたコンジュゲートは沈殿により容易に精製された（実施例２３−２８）。加えて、精製プロセスは、オリゴヌクレオチドの性質に制限されない。異なる長さのＤＮＡならびにＲＮＡの精製は、実施例２９−３３で説明される。
【０１０２】
核酸が核酸分子であることは、本発明の範囲内にある。これまでのことろ、核酸および核酸分子という用語は、本明細書では、反対のことが示されない限り、同義で使用される。その上、そのような核酸（複数可）は、好ましくは本明細書では本発明による核酸分子（複数可）、本発明による核酸（複数可）、発明の核酸（複数可）または発明の核酸分子（複数可）とも呼ばれる。加えて、核酸はオリゴヌクレオチドであることは本発明の範囲内にある。
【０１０３】
発明による核酸は好ましくは、共有結合により、好ましくはリン酸ジエステル結合または連結を介して、互いに連結されたヌクレオチドから構成されることは、当業者に認識されるであろう。
【０１０４】
本発明はさらに下記表、図および実施例により説明され、これらから、さらなる特徴、実施形態および利点が理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】ポリアルコキシル化核酸の生成のための典型的に適用されるプロセスの概略図を示す。
【図１Ｂ】本発明によるプロセスの概略図を示す。
【図２】反応性アミノ基を核酸中に導入することを可能にする試薬を示す。
【図３Ａ】ペグ化前の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６の典型的な粗合成生成物のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例４）。
【図３Ｂ】ペグ化後の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６の典型的な粗合成生成物のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例１３）。
【図３Ｃ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例２３）。
【図３Ｄ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例２３）。
【図３Ｅ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例２３）。
【図３Ｆ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例２３）。
【図４Ａ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３７）。
【図４Ｂ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３７）。
【図４Ｃ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３７）。
【図４Ｄ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３７）。
【図５Ａ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３８）。
【図５Ｂ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３８）。
【図５Ｃ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３８）。
【図５Ｄ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３８）。
【図６Ａ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３９）。
【図６Ｂ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３９）。
【図６Ｃ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３９）。
【図６Ｄ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例３９）。
【図７Ａ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例４０）。
【図７Ｂ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例４０）。
【図７Ｃ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の沈殿物のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例４０）。
【図７Ｄ】５’−ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６および４０ｋＤａＹＰＥＧの典型的なコンジュゲーション反応物の沈殿後の上清のＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析を示す（実施例４０）。
【図８】本発明によるプロセスを示すために使用される核酸の配列を示す表１を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
実施例１：ＲＮＡ合成
スピーゲルマーを固相合成により、ＡｋｔａＰｉｌｏｔ１００シンセサイザー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を用いて、６．３ｍＬ固定容積カラムにおいて、２’ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡホスホラミダイト反応（Ｄａｍｈａ  ａｎｄ  Ｏｇｉｌｖｉｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，  ８１−１１４，  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して生成させた。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｒＣ（Ａｃ）−、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびＬ−ｒＵ−ホスホラミダイトを、Ｐｒｏｌｉｇｏ−ＳＡＦＣ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｄ）から購入した。５’−アミノ−修飾因子を、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。アミノ修飾されたスピーゲルマーの合成をＬ−ｒｉｂｏＧ、またはＬ−ｒｉｂｏＣ修飾ＣＰＧ細孔サイズ６００Å（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）、またはあるいは３’アミノ（ＴＦＡ）修飾ＣＰＧ細孔サイズ１０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）上で開始した。カップリングのために（１２分／サイクル）、０．６Ｍエチルチオテトラゾール（Ａｚｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ、Ａｎｚｈｅｎ、Ｗｕｘｉ、ＣＮ）を含むアセトニトリル、およびそれぞれ１．５−４当量の０．２Ｍホスホラミダイトのアセトニトリル溶液を使用した。酸化−キャッピング−酸化サイクルを使用した。オリゴヌクレオチド合成のための標準溶媒および試薬を、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ、ＮＬ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｄ）、ＶＷＲ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｄ）またはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｄ）から購入した。スピーゲルマーを５’−ＭＭＴ−ＯＮで合成した。切断および脱保護を、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗｉｎｃｏｔｔ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９５，  ２３（１４），  ２６７７−２６８４）に従い、少しの手直しを加えて達成した。詳細には、自動化合成が完了すると、ＣＰＧ結合オリゴヌクレオチド（５０−１５０μｍｏｌ）を短時間乾燥させ、ガラス瓶中に移した。８０ｍＬのＭｅＮＨ２水溶液（４０％）を添加し、懸濁液を室温で穏やかに撹拌させた。９０分後、スラリーを濾過し、残留ＣＰＧを数回、ＥｔＯＨ水溶液（５０％）で洗浄した。濾液を合わせ、濃縮し、最後に凍結乾燥させた。２’ＴＢＤＭＳ基の除去のために、乾燥粗生成物を、１５ｍＬのＤＭＳＯ、続いて７．５ｍＬのＮＥｔ３および１０ｍＬのＮＥｔ３・３ＨＦに溶解した。この混合物を６５℃で２時間、穏やかに撹拌させた。室温まで冷却した後、１２０ｍＬのｎ−ＢｕＯＨを添加し、得られた沈殿物を収集し、アセトンで洗浄した。５’ＭＭＴ基の切断のために、得られた粗生成物を水に溶解し、２０ｍＬの酢酸を添加した。４０℃で３０分後、ＲＰ−ＨＰＬＣは完全なＭＭＴ除去を示し、６５ｍＬの５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を撹拌しながら中和のために添加した。その後、スピーゲルマーはタンジェンシャルフロー濾過により５Ｋ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して脱塩した。その後、０．４Ｌの０．２５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を添加し、溶液をタンジェンシャルフロー濾過により再び脱塩した。最後に、生成物を収集し、凍結乾燥により乾燥させた。
【０１０７】
実施例２：ＲＮＡ合成：
スピーゲルマーはまた、固相合成により、４８ｍＬの固定容積カラムにおいて、実施例１と同様に、下記の変更を用いて生成させた。切断および脱保護のために、２００ｍＬのＭｅＮＨ２（４０％）、１２０ｍＬのＤＭＳＯ、６０ｍＬのＮＥｔ３および８０ｍＬのＮＥｔ３・３ＨＦを使用した。２’ＴＢＤＭＳ基の切断後、反応を１Ｌの氷水の添加により停止させ、ＭＭＴの除去を、酢酸（２５ｍＬ）の添加により支援した。その後、スピーゲルマーをタンジェンシャルフロー濾過により、２Ｋ再生セルロース膜（Ｓａｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｄ）を使用して脱塩し、３Ｌの０．２５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を塩交換のために添加し、その後再び、溶液をタンジェンシャルフロー濾過により脱塩した。
【０１０８】
実施例３：ＤＮＡ合成
ＤＮＡ−アプタマーおよびＤＮＡ−スピーゲルマーを、実施例１と同様に下記の変更を用いて合成した。使用されるＤ−ｄＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｄ−ｄＣ（Ａｃ）−、Ｄ−ｄＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびＤ−ｄＴ−ホスホラミダイトを、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｄ）から購入し、対応するＬ−アミダイトおよびＣＰＧ（Ｄ−ｄＧおよびＬ−ｄＴ、１０００Å）を、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。カップリングのために（８分／サイクル）、０．６Ｍエチルチオテトラゾール（Ａｚｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ、
【０１０９】
実施例４：５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６の合成（１  ｐｒｅＰＥＧ）
実施例１で記載される手順を適用して、１．１１ｇのＬ−ｒＧ  ＣＰＧ（６００Å、７０μｍｏｌ／ｇ、７８μｍｏｌ）を使用して、３当量のアミダイト／ヌクレオチドカップリングサイクルを用い、５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６（１  ｐｒｅＰＥＧ）を構築した。収率：７０７７ＯＤ、純度：５４％、質量：１２９６６、（計算：１２９９６）。
【０１１０】
実施例５：５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６の合成（１  ｐｒｅＰＥＧ）
実施例２で記載される手順を適用して、９．４３ｇのＬ−ｒＧ  ＣＰＧ（６００Å、７０μｍｏｌ／ｇ、６６０μｍｏｌ）を使用して、ヌクレオチドカップリングサイクル当たり１．６６当量のアミダイトを用い、５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６（１  ｐｒｅＰＥＧ）を構築した。収率：６８６００ＯＤ、純度：２７％、質量：１２９６７、（計算：１２９９６）。
【０１１１】
実施例６：５’（ＮＨ２）２−ＮＯＸ−Ｅ３６の合成（４  ｐｒｅＰＥＧ）
実施例１で記載される手順を適用して、１．１１ｇのＬ−ｒＧ  ＣＰＧ（６００Å、７０μｍｏｌ／ｇ、７８μｍｏｌ）を使用して、ヌクレオチドカップリングサイクル当たり３当量のアミダイトを用い、５’（ＮＨ２）２−ＮＯＸ−Ｅ３６（４  ｐｒｅＰＥＧ）を構築した。収率：１０６５２ＯＤ、純度：３８％ＦＬＰ、質量：１３１４８、（計算：１３１４９）。
【０１１２】
実施例７：５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ａ１２の合成（５  ｐｒｅＰＥＧ）
実施例１で記載される手順を適用して、１．９７ｇのＬ−ｒＣ  ＣＰＧ（６００Å、７２μｍｏｌ／ｇ、１４２μｍｏｌ）を使用して、ヌクレオチドカップリングサイクル当たり２．５当量のアミダイトを用い、５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ａ１２（５  ｐｒｅＰＥＧ）を構築した。収率：２２０１２ＯＤ、純度：４３％ＦＬＰ、質量：１４６５６、（計算：１４６５７）。
【０１１３】
実施例８：５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｈ９４の合成（６  ｐｒｅＰＥＧ）
実施例１で記載される手順を適用して、１．９０ｇのＬ−ｒＣ  ＣＰＧ（６００Å、７２μｍｏｌ／ｇ、１３７μｍｏｌ）を使用して、ヌクレオチドカップリングサイクル当たり２．５当量のアミダイトを用い、５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｈ９４（６  ｐｒｅＰＥＧ）を構築した。収率：２６８８０ＯＤ、純度：３３％ＦＬＰ、質量：１４６０５、（計算：１４６０２）。
【０１１４】
実施例９：５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ａ１４の合成（７  ｐｒｅＰＥＧ）
実施例１で記載される手順を適用して、１．９６ｇのＬ−ｒＣ  ＣＰＧ（６００Å、７２μｍｏｌ／ｇ、１４１μｍｏｌ）を使用して、ヌクレオチドカップリングサイクル当たり２．５当量のアミダイトを用い、５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ａ１４（７  ｐｒｅＰＥＧ）を構築した。収率：１７０２８ＯＤ（６８１ｍｇ）、純度：６０％ＦＬＰ  ＩＥＸ、質量：９６２８、（計算：９６２８）。
【０１１５】
実施例１０：５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｇ１２の合成（８  ｐｒｅＰＥＧ）
実施例３で記載される手順を適用して、１．８０ｇのＬ−ｄＴ  ＣＰＧ（１０００Å、３６μｍｏｌ／ｇ、６４．５μｍｏｌ）を使用して、ヌクレオチドカップリングサイクル当たり３当量のアミダイトを用い、５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｇ１２（８  ｐｒｅＰＥＧ）を構築した。収率：１２１４１ＯＤ（４０１ｍｇ）、純度：６６％ＦＬＰ  ＩＥＸ、質量：１４５３３、（計算：１４５２９）。
【０１１６】
実施例１１：５’ＮＨ２−ＴＢＡの合成（９  ｐｒｅＰＥＧ）
実施例３で記載される手順を適用して、１．７３ｇのＤ−ｄＧ  ＣＰＧ（１０００Å、３７μｍｏｌ／ｇ、６４．０μｍｏｌ）を使用して、ヌクレオチドカップリングサイクル当たり２．５当量のアミダイトを用い、５’ＮＨ２−ＴＢＡ（９  ｐｒｅＰＥＧ）を構築した。収率：６０００ＯＤ（１９８ｍｇ）、純度：７７％ＦＬＰ  ＩＥＸ、質量：４９０４、（計算：４９０５）。
【０１１７】
実施例１２：ペグ化反応
反応させるアミノ修飾された（デオキシ−）オリゴヌクレオチドを、水（１０００ＯＤ／ｍＬ）に溶解した。ＤＭＦに溶解したＴＢＡＢｒ（ＤＭＦ中の総オリゴヌクレオチドのリン酸当たり３当量、０．８ｍＬ／ｍＬのオリゴヌクレオチド溶液）、ＤＩＰＥＡ（７５μＬ／ｍＬのオリゴヌクレオチド溶液）およびＤＭＦに溶解したＰＥＧ−ＮＨＳ（ＪｅｎＫｅｍＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）（ＤＭＦ中の全長生成物に対し１．５当量、２．４ｍＬ／ｍＬのオリゴヌクレオチド溶液）を、オリゴヌクレオチド溶液に連続して添加した。反応混合物を３０分間激しく撹拌させ、反応をＲＰ−ＨＰＬＣにより追跡した。必要に応じて、追加のＰＥＧ−ＮＨＳをそのまま添加し、反応を完了させた。完全な変換後、ＡｃＯＨ（８０％、３７．５μＬ／ｍＬのオリゴヌクレオチド溶液）の添加により反応を中止させた。
【０１１８】
実施例１３：ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＰＥＧ（１）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、７０７７ＯＤ（２８３ｍｇ、５４％ＦＬＰ、１１．８μｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６（１  ｐｒｅＰＥＧ）を合計１．１１ｇ（２７．７μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳと、６８７ｍｇ（２．１３ｍｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、５３１μＬ（３．１２ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む３０．１ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、６４％変換を示した。
【０１１９】
実施例１４：ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＰＥＧ（１）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、１００ＯＤ（４ｍｇ、２７％ＦＬＰ、８３．１ｎｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６（１  ｐｒｅＰＥＧ）を合計５．６ｍｇ（０．１４１μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳと１０．７ｍｇ（３３．１μｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、７．５μＬ（４３．１μｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む４２５μＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、３２％変換を示した。
【０１２０】
実施例１５：ＮＯＸ−Ｅ３６−２０ｋＤａＰＥＧ（２）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、１０００ＯＤ（４０ｍｇ、５６％ＦＬＰ、１．７２μｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６（１−ｐｒｅＰＥＧ）を合計５１．７ｍｇ（２．５９μｍｏｌ）の２０ｋＤａＰＥＧ−ＮＨＳと１０７ｍｇ（３３１μｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、７５μＬ（４３１μｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む４．２５ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、６４％変換を示した。
【０１２１】
実施例１６：ＮＯＸ−Ｅ３６−１０ｋＤａＰＥＧ（３）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、１０００ＯＤ（４０ｍｇ、５６％ＦＬＰ、１．７２μｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６（１−ｐｒｅＰＥＧ）を合計７５．９ｍｇ（７．５９μｍｏｌ）の１０ｋＤａＰＥＧ−ＮＨＳと１０７ｍｇ（３３１μｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、７５μＬ（４３１μｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む４．２５ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、６１％変換を示した。
【０１２２】
実施例１７：ＮＯＸ−Ｅ３６−２×４０ｋＤａＰＥＧ（４）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、１０６４２ＯＤ（４２５ｍｇ、３８％ＦＬＰ、１２．３μｍｏｌ）の５’（ＮＨ２）２−ＮＯＸ−Ｅ３６（４−ｐｒｅＰＥＧ）を合計１．２３ｇ（８６．０μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳと、７６１ｍｇ（２．３６ｍｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、７９８μＬ（４．６９ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む４５．２ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、４４％変換を示した。
【０１２３】
実施例１８：ＮＯＸ−Ａ１２−４０ｋＤａＹＰＥＧ（５）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、２１０１４ＯＤ（８４０ｍｇ、４３％ＦＬＰ、２４．６μｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ａ１２（５−ｐｒｅＰＥＧ）を合計３．４４ｇ（８６．０μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳと、３．９９ｍｇ（１２．４ｍｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、１．５８ｍＬの（９．０４ｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む８９．３ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、６８％変換を示した。
【０１２４】
実施例１９：ＮＯＸ−Ｈ９４−４０ｋＤａＹＰＥＧ（６）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、２５８８０ＯＤ（８４０ｍｇ、３３％ＦＬＰ、２３．４μｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｈ９４（６−ｐｒｅＰＥＧ）を合計１．４０ｇ（３５．１μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳと、１．５９ｇ（４．９４ｍｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、１．９１ｍＬの（１１．１ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む１１０ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、３０％変換を示した。
【０１２５】
実施例２０：ＮＯＸ−Ａ１４−４０ｋＤａＹＰＥＧ（７）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、１６０３０ＯＤ（６４１ｍｇ、６０％ＦＬＰ、４０．０μｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ａ１４（７−ｐｒｅＰＥＧ）を合計４．００ｇ（１００μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳと、２．９９ｇ（９．２７ｍｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、１．２０ｍＬの（６．９０ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む６８．１ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、８０％変換を示した。
【０１２６】
実施例２１：ＮＯＸ−Ｇ１２−４０ｋＤａＹＰＥＧ（８）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、１１１５６ＯＤ（４４６ｍｇ、６６％ＦＬＰ、２０．３μｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｇ１２（８−ｐｒｅＰＥＧ）を合計１．８４ｇ（４６．０μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳと、２．１９ｇ（６．７８ｍｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、８３７μＬ（４．９２ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む４７．４ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、６４％変換を示した。
【０１２７】
実施例２２：ＴＢＡ−４０ｋＤａＹＰＥＧ（９）の合成
実施例１２で記載される手順を適用して、５０００ＯＤ（２００ｍｇ、７３％ＦＬＰ、２９．８μｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＴＢＡ（９−ｐｒｅＰＥＧ）を合計２．４５ｇ（６１．２μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳと、９４６ｍｇ（２．９４ｍｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、３７５μＬ（２．２１ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む２１．３ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、８４％変換を示した。
【０１２８】
実施例２３：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）の精製
１００ＯＤ（４２５μＬ）の実施例１３で生成された材料の試料をファルコンチューブに移し、４ｍＬのＭｅＯＨを添加した。混合物を完全にボルテックスし、−２０°で３０分間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：６５ＯＤ、９２％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、６５％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：２２ＯＤ、９％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１２９】
実施例２４：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）の精製
１０００ＯＤ（４．２５ｍＬ）の実施例１３で生成された材料の試料をファルコンチューブに移し、４０ｍＬのＭｅＯＨを添加した。混合物を完全にボルテックスし、−２０°で３０分間貯蔵した。得られた沈殿物を、ガラスフィルタ漏斗（細孔サイズ１６−４０μｍを使用して濾過した。濾液を濃縮して乾燥させた。回収沈殿物：６８２ＯＤ、９２％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、６３％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：２４３ＯＤ、２％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１３０】
実施例２５：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）の精製
１００ＯＤ（４２５μＬ）の実施例１４で生成された材料の試料をファルコンチューブに移し、４ｍＬのＭｅＯＨを添加した。混合物を完全にボルテックスし、−２０°で３０分間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：３４ＯＤ、８１％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、５８％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：５１ＯＤ、０％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１３１】
実施例２６：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−２０ｋＤａＹＰＥＧ（２）の精製
１００ＯＤ（４２５μＬ）の実施例１５で生成された材料の試料をファルコンチューブに移し、４ｍＬのＭｅＯＨを添加した。混合物を完全にボルテックスし、−２０°で３０分間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：６２ＯＤ、９２％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、６９％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：３３ＯＤ、０％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１３２】
実施例２７：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−１０ｋＤａＹＰＥＧ（３）の精製
１００ＯＤ（４２５μＬ）の実施例１６で生成された材料の試料をファルコンチューブに移し、４ｍＬのＭｅＯＨを添加した。混合物を完全にボルテックスし、−２０°で３０分間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：６８ＯＤ、９６％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、７０％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：３６ＯＤ、０％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１３３】
実施例２８：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−２×４０ｋＤａＰＥＧ（４）の精製
実施例１７で生成された材料（１０６４２ＯＤ、３８％ＦＬＰペグ化前）の２つの２２．５ｍＬのアリコートを２つの７５０ｍＬ遠心ボトル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｄ）に移し、２２５ｍＬのＭｅＯＨを各々に添加した。混合物を完全に混合し、−２０°で２時間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：４２３０ＯＤ、９５％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、５３％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：６５００ＯＤ、４％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１３４】
実施例２９：沈殿による粗ＮＯＸ−Ａ１２−４０ｋＤａＹＰＥＧ（５）の精製
実施例１８で生成された材料の２つの２９．７ｍＬのアリコートを２つの７５０ｍＬの遠心ボトル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｄ）に移し、４５０ｍＬのＭｅＯＨを各々に添加した。混合物を完全に混合し、−２０°で２時間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：１０６０４ＯＤ、９５％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、５８％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：４９００ＯＤ、１３％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１３５】
実施例３０：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｈ９４−４０ｋＤａＹＰＥＧ（６）の精製
実施例１９で生成された材料の２つの５５ｍＬのアリコートを２つの７５０ｍＬの遠心ボトル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｄ）に移し、５５０ｍＬのＭｅＯＨを各々に添加した。混合物を完全に混合し、−２０°で２時間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：９０４８ＯＤ、７７％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、４５％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：１５２５０ＯＤ、２％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布、７％ＦＬＰ（ＩＥＸ）。
【０１３６】
実施例３１：沈殿による粗ＮＯＸ−Ａ１４−４０ｋＤａＹＰＥＧ（７）の精製
実施例２０で生成された材料の２つの３４ｍＬのアリコートを２つの７５０ｍＬの遠心ボトル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｄ）に移し、３５０ｍＬのＭｅＯＨを各々に添加した。混合物を完全に混合し、−２０°で２時間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：１１７９１ＯＤ、９２％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、５１％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：２３５０ＯＤ、２４％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布、１２％ＦＬＰ（ＩＥＸ）。
【０１３７】
実施例３２：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｇ１２−４０ｋＤａＹＰＥＧ（８）の精製
実施例２１で生成された材料の２つの２４ｍＬのアリコートを２つの７５０ｍＬの遠心ボトル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｄ）に移し、２４０ｍＬのＭｅＯＨを各々に添加した。混合物を完全に混合し、−２０°で２時間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：５３００ＯＤ、９０％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、５７％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：４０００ＯＤ、９％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１３８】
実施例３３：沈殿による粗ＴＢＡ−４０ｋＤａＹＰＥＧ（９）の精製
実施例２２で生成された材料（２１ｍＬ）を７５０ｍＬの遠心ボトル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｄ）に移し、２５０ｍＬのＭｅＯＨを添加した。混合物を完全に混合し、−２０°で２時間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：４４１０ＯＤ、９６％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、８７％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：８３０ＯＤ、９％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布、１３％ＦＬＰ（ＩＥＸ）。
【０１３９】
実施例３４：ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）の合成（併用プロセス）
実施例２で記載される手順を適用して、１１．３ｇのＬ−ｒＧ  ＣＰＧ（６００Å、７０μｍｏｌ／ｇ、７９３μｍｏｌ）を使用して、ヌクレオチドカップリングサイクル当たり２当量のアミダイトを用い、５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６（１  ｐｒｅＰＥＧ）を構築した。収率：１６４０００ＯＤ、純度：５３％、質量：１２９６６、（計算：１２９９６）。次に、１６４ｋＯＤの５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６（６．５５ｇ、５８％ＦＬＰ、２６７μｍｏｌ）を合計２３．３ｇ（５８３μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳ−エステル（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）と、１８．１ｇ（５６．１ｍｍｏｌ）のＢｕ４ＮＢｒ、１２．３ｍＬの（７０．６ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む６９６ｍＬのＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３．２５／１、ｖ／ｖ）の存在下で、実施例１２で記載される手順を適用して反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは、７０％変換を示した。ＩＥＸ分析はペグ化生成物の４３％ＦＬＰを示した。３２ｍＬ（１５０００ＯＤ、４３％ＦＬＰ）の２つのアリコートを２つの７５０ｍＬの遠心ボトル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｈａｎａｕ、Ｄ）に移し、３２０ｍＬのＭｅＯＨを各々に添加した。溶液を完全に混合し、−２０°で２時間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。残渣を、１５０ｍＬのＨ２Ｏに溶解した。回収：９２３７ＯＤ、６８％ＦＬＰ（ＩＥＸ）、９７％ＦＬＰｘＯＤ回収。この溶液の８９００ＯＤ試料を８９ｍＬのＳｏｕｒｃｅＱ  ＩＥＸカラム（１００ＯＤ／ｍＬの樹脂、５０℃、２０ｍＬ／分）上に入れ、下記緩衝液系の勾配を適用することにより溶離させた（緩衝液Ａ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０％ＡＣＮ；緩衝液Ｂ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、１０％ＡＣＮ；勾配：３０分で５％Ｂ〜２５％Ｂ、３０ｍＬ／分）。ロード中、１４５０ＯＤのブレークスルー（６８％ＦＬＰ、１６％ＦＬＰｘＯＤ回収）を検出した。全ての生成物を含む画分（ＦＬＰ≧８０％ＦＬＰ）を合わせ（６０８０ＯＤ）、ＵＦにより５Ｋ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して脱塩し、最後に凍結乾燥させた。収率：５０１３ＯＤ、８３％ＦＬＰ、６９％ＦＬＰｘＯＤ回収）。
【０１４０】
実施例３５：ペグ化反応
反応させるアミノ修飾された（デオキシ−）オリゴヌクレオチドを、水に溶解した（１０００ＯＤ／ｍＬ）。ＤＭＳＯ（２ｍＬ）、ＤＩＰＥＡ（７５μＬ／ｍＬオリゴヌクレオチド溶液）およびＡＣＮに溶解したＰＥＧ−ＮＨＳ（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）（ＡＣＮ中の全長生成物に対し１．５当量、４．５ｍＬ／ｇ）を、オリゴヌクレオチド溶液に連続して添加した。反応混合物を３０分間激しく撹拌させ、反応をＲＰ−ＨＰＬＣにより追跡した。必要に応じて、ＡＣＮに溶解した追加のＰＥＧ−ＮＨＳを添加し、反応を完了させた。完全な変換後、ＡｃＯＨ（８０％、３７．５μＬ／ｍＬオリゴヌクレオチド溶液）の添加により反応を中止させた。
【０１４１】
実施例３６：ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＰＥＧ（１）の合成
実施例３５で記載される手順を適用して、６０００ＯＤ（２４０ｍｇ、５４％ＦＬＰ、９．２３μｍｏｌ）の５’ＮＨ２−ＮＯＸ−Ｅ３６（１  ｐｒｅＰＥＧ）を、３．５ｍＬＡＣＮに溶解させた合計７３８ｍｇ（１８．５μｍｏｌ）の４０ｋＤａＹＰＥＧ−ＮＨＳと、４６６μＬ（２．６６ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを含む１８ｍＬのＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ（２／１、ｖ／ｖ）の存在下で反応させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングは６３％変換を示した
【０１４２】
実施例３７：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）の精製
実施例３６で生成された材料の１０００ＯＤ（３．５ｍＬ）試料をファルコンチューブに移し、１０．５ｍＬのＭｅＯＨを添加した。混合物を完全にボルテックスし、−２０°で３０分間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：６９５ＯＤ、９５％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、６５％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：２７７ＯＤ、０％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１４３】
実施例３８：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）の精製
実施例３６で生成された材料の１０００ＯＤ（３．５ｍＬ）試料をファルコンチューブに移し、４°で１６時間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：６１８ＯＤ、８６％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、６５％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：３３０ＯＤ、０％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１４４】
実施例３９：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）の精製
実施例３６で生成された材料の１０００ＯＤ（３．５ｍＬ）試料をファルコンチューブに移し、４°で１６時間貯蔵した。沈殿させるために、１７ｍＬのＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ（２／１、ｖ／ｖ、４℃）を添加し、完全に混合した。得られた混合物を遠心分離し（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：５４０ＯＤ、９５％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、６６％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：３７１ＯＤ、１％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１４５】
実施例４０：沈殿による粗ＮＯＸ−Ｅ３６−４０ｋＤａＹＰＥＧ（１）の精製
実施例３６で生成された材料の１０００ＯＤ（３．５ｍＬ）試料をファルコンチューブに移し、−２０°で１６時間貯蔵した。得られた沈殿物を遠沈させ（４０００ｇ）、上清をデカントした。有機相を合わせ、濃縮し、乾燥させた。回収沈殿物：６０１ＯＤ、８６％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、５０％ＦＬＰ（ＩＥＸ）；回収上清：３４１ＯＤ、２％ペグ化種（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、微小ピークの分布（ＩＥＸ）。
【０１４６】
明細書、特許請求の範囲および／または図面において開示される本発明の特徴は、別個に、またはそれらの任意の組み合わせで、発明をその様々な形態において実現するための材料となり得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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