(57)【要約】  本発明は、薬物、特に炎症性および不適免疫応答を治療するための薬物に関する。本発明はまた、移植片対宿主病を治療するための薬物にも関する。すなわち、本発明は、詳細には、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ３１、ＣＣＲ５、およびＣＤ１０５を発現する細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、およびＣＣＲ５を発現することを特徴とする、細胞。
【請求項２】
ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ、ＣＣＲ７、およびＰＤＬ１を含む群から選択される１種または複数の分子を発現しないことを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ＣＣＬ２およびＩＬ−６を含む群から選択される１種または複数の分子を発現することを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
医薬品として使用するための、請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
移植片対宿主病、自己炎症性疾患、巨細胞性動脈炎（ホートン病）、リウマチ様関節炎、自己免疫疾患、および移植片拒絶を治療するための、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
ＣＤ８調節性Ｔ細胞の増加を誘導するための、請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
エフェクターＴリンパ球の増殖の阻害を誘導するための、請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞、および薬学上許容されるビヒクルを含む、組成物。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞の製造方法であって、以下からなる工程：
−（ｉ）ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で単球を培養する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞の製造方法であって、以下からなる工程、
−（ｉ）ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で単球を培養する工程、
−（ｉｉ）該先行工程に従って得られた該細胞を単離する工程、該細胞はＣＤ３３を発現する、
を含む、方法。
【請求項１１】
少なくとも１種の増血細胞に由来する前記細胞は、ＰＢＭＣであることを特徴とする、請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
ＣＤ３３を発現する前記細胞を単離する前記工程は、細胞選別機を介して行われることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
ＣＤ３３を発現する前記細胞を単離する前記工程は、磁気ビーズを介して行われることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）で前記培地に存在する前記ＩＬ−６は、５〜１５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
工程（ｉ）で前記培地に存在する前記ＧＭ−ＣＳＦは、５〜１５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）は、４〜１０日間の期間行われることを特徴とする、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
工程（ｉ）は３７℃で行われることを特徴とする、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、特に免疫および炎症性反応を阻害または減少させるための医薬品に関する。本発明はまた、移植片対宿主病、自己免疫疾患、および自己炎症性疾患などの、患者にとって免疫または炎症性反応が有害である疾患を治療するための医薬品にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系および炎症の制御は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を防ぐために、また自己免疫性および自己炎症性疾患を治療するために達成すべき治療目的の１つである。ＧｖＨＤは、同種異系間造血細胞移植により引き起こされる移植片合併症である。現在のところ、ＧｖＨＤの発症と戦うための、または自己免疫性および自己炎症性疾患を治療するための主要な戦略は、免疫抑制剤（コルチコステロイド、化学療法）を使用して患者に全身性免疫抑制を誘導することからなる。しかしながら、こうした免疫抑制剤治療では、患者は、感染の可能性および患者の血液疾患の再発にさらされる。新規戦略は、現在、研究途中であるが、注目すべきは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの抑制因子細胞の使用である。しかしながら、今のところ、この治療法の効力は、第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験で実証できていない。頭字語ＭＤＳＣ（「骨髄性抑制性細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ）」より）で知られるさらなる細胞型も、免疫系の負の調節に関与している。このサブタイプの細胞は、健康な対象には稀であるまたは存在しないが、病態時、特に癌の場合に検出される。これらの細胞を注射すると、動物において、移植後の移植免疫寛容を促進することが可能であったが、これらの細胞は、その希少性ゆえに臨床で使用するのは困難である。本発明は、患者の血液から単離された循環性細胞より生成される、自己免疫性および自己炎症性疾患ならびに移植片対宿主病の治療用途に適した、新規サブタイプの骨髄系抑制性細胞を提案する。本発明はまた、この免疫抑制性細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで製造する方法にも関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明は、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、およびＣＣＲ５を発現する細胞に特に関係する。
【０００４】
本出願人らは、これらの細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで生成させ、上記の分子の発現を調べることにより同一であると特性決定することができた。本出願人らはまた、治療しようとする患者の免疫系の中和が指示される特定疾患の治療の範囲内においてこれらの細胞の薬効を実証することができた。
【０００５】
本発明の範囲内において、「細胞」という用語は、天然または組換えの真核生物細胞を示す。優先的には、この細胞はヒト細胞であり、さらにより優先的には、この細胞は造血幹細胞に由来する。「由来する」という用語は、この細胞が、直接または間接的に、造血幹細胞の分裂から得られることを示すものとする。本発明の範囲内で記載される様々なマーカーは、当業者に周知のものである。好ましくは、これらのマーカーは、これらのマーカーのヒトアイソフォームのうちの任意の１種である。ＣＤの（分化表面抗原分類のための）命名法は、特に本出願の範囲内で使用されるものは、１９８２年にパリで開催されたヒト白血球抗原に関する第一回国際ワークショップおよび会議により提案および確立されたものである。問題の命名法は、ＨＣＤＭにより維持されており、特に協会のウェブサイトで見ることができる（ｗｗｗ．ｈｃｄｍ．ｏｒｇ）。
【０００６】
本発明の範囲内において、「発現する」という用語は、本発明による細胞が、言及のタンパク質を産生することを示すものとする。より詳細には、このタンパク質が膜タンパク質である場合、「発現する」という用語は、このタンパク質がこの細胞の細胞膜で発現することを表す。このタンパク質が溶解性タンパク質である場合、「発現する」という用語は、このタンパク質がこの細胞の細胞外ドメインに向かって発現することを表す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの特に好適な実施形態に従って、本発明による細胞は、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、およびＣＣＲ５を発現する。１つの好適な実施形態に従って、本発明による細胞は、以下の分子を発現しない：ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ６６ｂ、ＣＣＲ７、およびＰＤＬ１。
【０００８】
１つの好適な実施形態に従って、本発明による細胞は、ＣＣＬ２、およびＩＬ−６を発現する。１つの好適な実施形態に従って、本発明による細胞は、以下を発現しない：ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＣＣＬ２０、ＩＦＮγ、グランザイムＢ、可溶性ＦａｓＬ、ＴＧＦ−β。
【０００９】
本発明はまた、医薬品として使用するための、本発明による細胞にも関する。本発明による細胞の医薬品としての使用可能性は、移植片対宿主病の実験モデルで特に実証され、免疫系の一時的な中和が求められる可能性がある疾患全てに拡大適用できる可能性がある。したがって、本発明はまた、移植片対宿主病、自己炎症性疾患、例えば巨細胞性動脈炎（ホートン病）、リウマチ様関節炎、自己免疫疾患、および移植片拒絶を治療するための本発明による細胞の使用にも関する。本発明はまた、本発明による細胞および薬学上許容されるビヒクルを含む組成物にも関する。薬学上許容されるキャリアとして、生理食塩水、ＰＢＳ、５％グルコース、ＲＰＭＩを挙げることができる。
【００１０】
本発明はまた、ＣＤ８調節性Ｔ細胞の増加を誘導するための、本発明による細胞にも関する。
【００１１】
本発明の範囲内において、「増加する」という用語は、増殖の増加を示す。
【００１２】
本発明はまた、エフェクターＴリンパ球の増殖の阻害を誘導するための、本発明による細胞にも関する。
【００１３】
本発明による組成物は、目論んでいる治療の範囲内で必要とされる任意の薬物をさらに含むことができる。優先的には、この組成物は、１回の注射あたり１×１０７〜１×１０８個の細胞を含み、注射の回数は、許容度および反応に応じて、１〜２０回である。
【００１４】
本発明による細胞は、当業者に既知である任意の経路により患者に注射することができる。それらの経路のうち、静脈内経路が好適である。
【００１５】
本発明はまた、本発明による細胞を製造する方法にも関し、本方法は以下からなる工程を含む：
−（ｉ）単球を、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養する工程。
−（ｉｉ）先の工程に従って得られた細胞から、ＣＤ３３を発現する細胞を単離する工程。
【００１６】
本発明の１つの代替実施形態に従って、工程（ｉｉ）は省略することができる。
【００１７】
本発明の１つの好適な実施形態に従って、工程（ｉ）は、他のどのケモカイン、サイトカイン、およびヒト増殖因子も存在しない状態で行われる。
【００１８】
本発明の１つの好適な実施形態に従って、単球は、工程（ｉ）において、ＩＬ−４の不在下で培養される。
【００１９】
本発明のさらにより好適な実施形態に従って、単球は、工程（ｉ）において、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＴＮＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、およびＩＦＮ−ｇの不在下で培養される。
【００２０】
本発明のさらにより好適な実施形態に従って、単球は、工程（ｉ）において、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ならびにＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ８、およびＣＸＣＬ１０の中から選択されるケモカインまたはケモカインの組み合わせの不在下で培養される。
【００２１】
本発明の１つの好適な実施形態に従って、本発明による方法は、追加の工程を含まない。
【００２２】
単球は、優先的には、治療しようとする患者の末梢血、または健常な献血者の同種異系間血液から得られる。
【００２３】
単球は、優先的には、２つの技法、ＣＤ１４発現細胞の磁気分離後に、または磁気ソーティングにより末梢血から単離し、「ＣＤ３４発現培地」の存在下で培養して増殖させ、次いでＭ−ＣＳＦの存在下で培養して単球に分化させたＣＤ３４＋細胞から、のいずれかを用いて得られてもよい。
【００２４】
−（ｉｉ）７日間培養後、先の工程に従って得られた細胞から、磁気ソーティングによりＣＤ３３発現細胞を単離する工程。
【００２５】
当業者なら、細胞をその表現型に従って単離する技法を周知している。こうした技法は、通常、その表現型に対する特異的な、随意に標識化された、抗体を使用し、続いてこの抗体と結合した細胞を他の細胞から分離する技法を使用する。
【００２６】
本発明の１つの好適な実施形態に従って、本発明による製造方法は、ＣＤ３３発現細胞の単離からなる工程（ｉｉ）が、細胞選別機を介して行われることを特徴とする。
【００２７】
本発明の１つの好適な実施形態に従って、本発明による製造方法は、ＣＤ３３発現細胞の単離からなる工程（ｉｉ）が、磁気ビーズを介して行われることを特徴とする。
【００２８】
単球をＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養することからなる工程（ｉ）は、この種の細胞に通常使用される培養条件下で実行されてもよい。優先的には、細胞は、適切な培地中、３７℃および５％ＣＯ２に維持される。優先的には、この培地は、ＲＰＭＩ  １６４０である。本発明の１つの好適な実施形態に従って、本発明による製造方法は、工程（ｉ）で培地に存在するＩＬ−６が５〜１５ｎｇ／ｍｌであり、特に優先的には、８〜１２ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする。本発明の１つの好適な実施形態に従って、本発明による製造方法は、工程（ｉ）で培地に存在すＧＭ−ＣＳＦが５〜１５ｎｇ／ｍｌであり、特に優先的には、８〜１２ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする。示されるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−６の濃度は、培地と細胞が接触する時点での培地中の初期濃度である。有利なことに、この培地は、２または３日ごとに定期的に交換される。本発明の１つの好適な実施形態に従って、本発明による製造方法は、工程（ｉ）が４〜１０日間の期間、特に優先的には、７日間の期間で行われることを特徴とする。本発明の１つの好適な実施形態に従って、本発明による製造方法は、工程（ｉ）が３７℃で行われることを特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
材料および方法
−本発明による細胞の製造
２つの技法を使用して、末梢血単核球を、健康なドナーから、または治療しようとする患者から単離した。第一の技法は、フィコール比重液で末梢血を遠心し、ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を回収し、そして磁気ビーズと結合した抗ＣＤ１４抗体を用いた磁気ソーティングにより単球を単離することからなる。第二の技法は、末梢血から、磁気ソーティングによりＣＤ３４発現細胞を単離し、それらの細胞の増殖を促進する培地（ＣＤ３４増大培地）の存在下でそれらの細胞を培養し、そしてＭ−ＣＳＦの存在下でそれらを培養することによりそれらを分化させることからなる。
【００３０】
次いで、単球を、１０％牛胎仔血清、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を補充したＲＰＭＩ１６４０中、５．１０６細胞／ｍｌの濃度で７日間培養し、培地は３日ごとに交換した。次いで、特異的ＣＤ３３マーカーで標識化してから、本発明による細胞を、細胞選別機で精製した。
【００３１】
−細胞増殖試験
Ｔリンパ球、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔリンパ球、およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔリンパ球を、「Ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット」（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で標識化した。標識された細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）でコーティングされたビーズの存在下、本発明による細胞とともにまたは細胞なしで、培養した。Ｔリンパ球の増殖は、フローサイトメトリーで検出した。
【００３２】
−形態学的解析
ライト・ギムザ標識化を行ってから、本発明による細胞の形態学的解析を行った。
【００３３】
−サイトカインアッセイ
培養した細胞の培養上清で、ＥＬＩＳＡ法を用いて、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、およびＴＧＦ−βの濃度を求めた。
【００３４】
−移植片対宿主病の動物モデル
８〜１２週齢の、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｃ−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、本発明による細胞とともに（マウス１匹あたり５．１０６細胞）または細胞なしで、末梢血単核球を静脈内投与した（マウス１匹あたり２０．１０６細胞）。細胞は、注射する直前に混合する。移植片対宿主病の兆候を３日ごとに盲検で検出した。
【００３５】
−移植片対宿主病の病変の組織学的解析
処置したマウスから取り出した臓器を、ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。５μｍの切片を調製して、エオシンおよびヘマトキシリンで染色する。
【００３６】
結果
このようにして得られた細胞は、ＨｕＭｏＳＣと称することにするが、これらの細胞は、以下に記載されるとおりの物性、表現型、および機能の特性を有している。
【００３７】
−本発明による細胞の物性
ライト・ギムザ染色で染色すると、ＨｕＭｏＳＣ細胞は、好塩基球性細胞質を持つ大単核球の均一な集団であるように見える。
【００３８】
−本発明による細胞の表現型
本発明による細胞は、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋ＣＤ１６３＋ＣＤ２０６＋  ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ４４＋ＣＤ３１＋ＣＤ１０５＋  ＣＣＲ５＋表現型を有し、ＣＣＲ６を弱く発現する。
【００３９】
本発明による細胞は、ＣＤ１α、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＣＲ７を発現しない。
【００４０】
−Ｔリンパ球増殖に対する本発明による細胞の効果
刺激した自己Ｔリンパ球を、本発明による細胞とともに、２／１のＴリンパ球／本発明による細胞の比で、共培養した。刺激して本発明による細胞と共培養したＴリンパ球は、Ｔリンパ球単独で培養したものほど増殖しないことが観測された。Ｔリンパ球の個別分析から、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖もまた、本発明による細胞により阻害されたことが実証された。その上、本発明による細胞の抗増殖性効果も、自己Ｔリンパ球で、および同種異系間Ｔリンパ球で観測された。本発明による細胞と共培養したＴリンパ球は、Ｔリンパ球単独で培養したものとは異なり、ＣＤ２５＋マーカーを発現しない。種々な試料の培養上清の分析から、本発明による細胞は、Ｔリンパ球による炎症性サイトカイン（ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α）の産生を阻害することを実証することができた。したがって、本発明による細胞は、自己性および同種異系間ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の細胞活性化および細胞増殖ならびにそれらのサイトカイン分泌を阻害することを特徴とする。
【００４１】
−本発明による細胞が持つ抑制効果はＳＴＡＴ３−依存性である
本発明による細胞が持つ抑制効果は、直接の細胞対細胞接触に依存するのではなく、１種または複数の可溶性因子に依存する。本発明による細胞をホスホリル化型ＳＴＡＴ３の阻害剤で前処理すると、本発明による細胞の生存度には干渉することなく、抑制効果の低下、ＣＣＬ２およびＩＬ−６分泌の減少が誘導される。
【００４２】
−本発明による細胞は、移植片対宿主病の発症を防ぐ
ヒト末梢血細胞を投与されたマウスは、注射後２０〜３０日のうちに、移植片対宿主病の臨床兆候を発現し、注射の５０日後を迎える前に死亡する。それに対して、ヒト末梢血細胞を本発明による細胞と同時投与されたマウスは、移植片対宿主病の臨床兆候をほとんど示さず、この注射から生き延びる。詳細には、肝臓におけるＧｖＨＤの組織病変が、本発明による細胞を投与された群で顕著に減少する。
【００４３】
−調節性Ｔリンパ球に対する本発明による細胞の効果。
調節性Ｔリンパ球は、特定の同種異系抗原耐性を促進することができる抑制因子細胞の集団を表す。
【００４４】
本発明による細胞を投与されたマウスは、対照マウスと比較して、より大量のＣＤ８＋Ｔリンパ球発現ＦｏｘＰ３を示す。
【００４５】
同じ結果が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、全Ｔリンパ球集団を本発明による細胞と同時培養した後に観測された。
【国際調査報告】
2017509343.tif 000002
2017509343.tif 000003
2017509343.tif 000004
2017509343.tif 000005
2017509343.tif 000006
2017509343.tif 000007
2017509343.tif 000008
2017509343.tif 000009