(57)【要約】本発明は、試料中に存在するＩｇＧ凝集物の量を決定するための、免疫グロブリンの試料を分析する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ免疫グロブリン分子の試料中のＩｇＧ抗体凝集物の量を定量する方法であって、
（ａ）凝集していないＩｇＧ抗体の切断を可能にする条件下で、前記試料をＩｄｅＳポリペプチドと接触させるステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で生じた切断産物を定量するステップ、および
（ｃ）ステップ（ｂ）の結果を使用して、前記試料中の抗体凝集の量を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＩｄｅＳポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸、またはその変異体もしくはフラグメントを含むか、またはそれらからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号１の前記変異体が、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であり、配列番号１のフラグメントが、配列番号１の最大３００個の連続するアミノ酸を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が治療用抗体製剤である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩｇＧ分子が、ヒトまたはヒト化されたＩｇＧ分子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、前記試料からＦｃおよび／またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを単離するステップ、ならびにその量を定量するステップを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記定量するステップが、混合物からＦｃフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを分離するための、ゲル電気泳動などのサイズ分離技術を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）が、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとＦｃフラグメントとの比を決定するステップ、およびその比を使用して前記試料中の凝集の量を決定するステップを含む、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料をＩｄｅＳと接触させるステップの前に、前記試料中の抗体の濃度が決定される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫グロブリンの試料を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
構造特性評価および生理化学分析などで抗体を特性評価することが、抗体ベースの治療法の開発者および製造者に必要とされている。治療用途のために生産された抗体に品質管理を受けさせることによって、生産されたその抗体が必要な結合特性および安定性を有することが保証される。評価されるべき重要な品質の１つは、もしある場合には、治療用途のための抗体の凝集（aggregation）の程度である。このような凝集は、抗体の全体的な品質および有効性にとって有害である。以前は、抗体製剤中の凝集物（aggregate）の量を評価するため、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が使用されていた。これはロースループット法である。抗体製剤中の凝集物を定量するため、改良された方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のシステインプロテアーゼ酵素である、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）の免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＳ）は、ＩｇＧ抗体を切断してＦｃおよびＦａｂフラグメントを生じる活性を有することが報告されている。本発明者らは、凝集した抗体が、ＩｄｅＳ消化に抵抗することができ、試料中の凝集したＩｇＧの量と、ＩｄｅＳにより消化されやすいＩｇＧの量との間に直接の関係があることを確認した。したがって、本発明は、試料中に存在する凝集した抗体の量を定量するための、ＩｄｅＳポリペプチドの使用を対象としている。ＩｄｅＳの使用により、ハイスループット法を使用して、試料を分析しそこでの凝集物の量を定量する機会が得られる。
【０００４】
本発明によれば、ＩｇＧ免疫グロブリン分子の試料中のＩｇＧ抗体凝集物の量を定量する方法であって、
（ａ）凝集していないＩｇＧ抗体の切断を可能にする条件下で、試料をＩｄｅＳポリペプチドと接触させるステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で生じた切断産物を定量するステップ、および
（ｃ）ステップ（ｂ）の結果を使用して、試料中の抗体凝集の量を決定するステップ
を含む、方法が存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、ＩｄｅＳによる３０分間の消化後の、３つの異なる凝集物濃度での、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２】図２は、線形回帰を用いた、凝集物濃度を増加させたＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの消化産物ピーク面積を示すグラフである。ａ）Ｆ（ａｂ’）２ピーク面積（Ｒ２＝０．９９８９）、ｂ）Ｆｃピーク面積（Ｒ２＝０．９８８５）、ならびにｃ）Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃピーク面積の合計（Ｒ２＝０．９９７９）。データは、酵素による消化時間３０分での３回の試行に由来する。
【図３】図３は、線形回帰を用いた、凝集物濃度を増加させたＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムの、Ｆ（ａｂ’）２ピーク面積をＦｃピーク面積で割ったものを示すグラフである（Ｒ２＝０．９７５８）。データは、酵素による消化時間３０分での３回の試行、および消化時間１５分での１回の試行に由来する。
【０００６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）ＡＰ１から単離されたＩｄｅＳをコードするアミノ酸配列である。
配列番号２は、推定シグナル配列を含む、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）ＡＰ１から単離されたＩｄｅＳをコードするアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
開示される方法および産物の様々な適用を、当技術分野における特定の必要性に合わせることが可能であることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は本発明の特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定的であることを意図されないことも理解されるべきである。さらに、この明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に指示されない限り、複数形の対象を含む。したがって、例えば「ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ」への言及は２つ以上のそのような免疫グロブリンなどを含む。これ以前であれ以降であれ、本明細書で引用される全ての出版物、特許および特許出願は、その全体にわたって、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００８】
本発明は、免疫グロブリン分子の試料を分析する方法であって、試料をＩｄｅＳポリペプチドと接触させるステップを含む、方法を提供する。試料は典型的には少なくとも１つのＩｇＧ分子を含み、方法は典型的にはエクスビボで、好ましくはインビトロで実施される。ＩｄｅＳポリペプチドは、試料中の抗体を切断するために使用される。ＩｄｅＳは、より大きい凝集物の切断に対しては低下した活性を有するため、切断産物の量は、凝集形態となっていない製剤中の抗体の量により決定され、これと関連している。したがって、この方法によれば、生じた切断産物の量を使用して、凝集した抗体の量との相関関係を得て、それにより試料中の凝集物のレベルが決定可能である。
【０００９】
ＩｄｅＳポリペプチドは、ＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧを重鎖のヒンジ領域において切断する酵素、具体的にはシステインプロテアーゼ酵素である。
【００１０】
ＩｄｅＳポリペプチドは、好ましくは化膿レンサ球菌（S. pyogenes）由来のＩｄｅＳポリペプチドである。ＩｄｅＳポリペプチドは、別の生物、例えば別のレンサ球菌属（Streptococcus）の細菌由来であってもよい。レンサ球菌属（Streptococcus）は、好ましくは群Ａレンサ球菌属（Streptococcus）、群Ｃレンサ球菌属（Streptococcus）、または群Ｇレンサ球菌属（Streptococcus）である。具体的には、ＩｄｅＳポリペプチドは、群Ｃレンサ球菌属（Streptococcus）、例えばＳ・エクイ（S. equii）またはＳ・ズーエピデミクス（S. zooepidemicus）由来であってもよい。代わりに、ＩｄｅＳポリペプチドはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来であってもよい。ＩｄｅＳポリペプチドは、好ましくは配列番号１または２に示すアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【００１１】
ＩｄｅＳポリペプチドは、ＩｇＧのヒンジ領域をＫａｂａｔナンバリングシステムによる２４９および２５０位（ＥＵナンバリングシステムによる２３６および２３７位）の間で切断する。ＩｄｅＳポリペプチドは任意の好適な手段により得られる。例えば、それを発現する任意の好適な生物、例えば化膿レンサ球菌（S. pyogenes）細菌などからそれを単離するか、組換え手段によりそれを生産することができる。ＩｄｅＳポリペプチドは市販されている。
【００１２】
本発明の方法のために、ＩｄｅＳポリペプチドは、それらの変異体（バリアント（variant））またはフラグメントが元のポリペプチドの機能特性を維持しているという条件で、前記変異体またはフラグメントで置き換えることができる。具体的には、変異体またはフラグメントはＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を維持し、ＩｇＧを切断しなければならない。
【００１３】
任意のポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は、好適なアッセイを用いて決定可能である。例えば、試験ポリペプチドを好適な温度、例えば３７℃でＩｇＧとともにインキュベートすることが可能である。次いで出発物質および反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、望ましいＩｇＧ切断産物が存在するかどうかを決定することが可能である。切断産物にＮ−末端シークエンシングを行い、切断がＩｇＧのヒンジ領域において起こったことを検証することが可能である。ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は、阻害研究によりさらに特性評価することが可能である。好ましくは、活性は、ともにプロテアーゼ阻害剤である、ペプチド誘導体Ｚ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２および／またはヨード酢酸により阻害される。しかし、ＩｄｅＳポリペプチド（またはその変異体もしくはフラグメント）は、一般的にＥ６４により阻害されない。
【００１４】
ＩｄｅＳポリペプチドの変異体は、配列番号１または２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含んでいてよい。配列番号１または２の変異体の同一性を、配列番号１もしくは２に示す配列の少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００個以上の連続するアミノ酸の領域、またはより好ましくは配列番号１もしくは２の全長にかけて測定することが可能である。
【００１５】
アミノ酸の同一性は、任意の好適なアルゴリズムを使用して算出可能である。例えば、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、同一性を算出するまたは配列を並べる（例えば（典型的にはそれらのデフォルト設定で）同等のまたは対応する配列を同定する）ために使用可能である。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さの文字列とアラインメントさせた場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致または満たす、検索配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは隣接文字列スコア閾値とも称される（Altschul et al、上記を参照）。これらの最初の隣接文字列ヒットは、ＨＳＰを含む文字列を探し出すための探査を開始するためのシーズとして作用する。文字列ヒットは、累積アラインメントスコアが増加しうる限り、各配列に沿って両方向に伸長する。各方向への文字列ヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量Ｘ減少した場合、１つもしくは複数の負のスコアの残基のアラインメントが蓄積することにより、累積スコアが０もしくはそれ未満となった場合、またはいずれかの配列の端に到達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは文字列長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照のこと）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両ストランドの比較をデフォルトとして使用する。
【００１６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性について統計的分析を行う。例えばKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりもたらされる類似性の１つの基準が、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第１の配列を第２の配列と比較した際に、最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列は他の配列と類似していると考えられる。代わりに、ＵＷＧＣＧパッケージは、（例えば、そのデフォルト設定で使用される）、同一性を算出するために使用可能なＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395）。
【００１７】
変異体は、対立遺伝子変異体、およびタンパク質配列内の単一のアミノ酸またはアミノ酸群の置換、欠失または挿入を含みうる。変異体配列は、元の配列と比較した場合に少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、５０以上の（アミノ酸の置換、欠失または挿入でありうる）変異において異なっていてよい。例えば、１〜５０、２〜３０、３〜２０、または５〜１０のアミノ酸置換、欠失または挿入がなされてよい。置換変異体は、好ましくは１つまたは複数のアミノ酸を同一数のアミノ酸で置き換え、保存されたアミノ酸置換を作り出すことを含む。例えば、アミノ酸は、類似の特性を有する代替のアミノ酸、例えば他の塩基性アミノ酸、他の酸性アミノ酸、他の中性アミノ酸、他の荷電アミノ酸、他の親水性アミノ酸、他の疎水性アミノ酸、他の極性アミノ酸、他の芳香族アミノ酸、または他の脂肪族アミノ酸などで置換することが可能である。好適な置換体を選択するために使用可能な、２０個の主要アミノ酸の一部の特性は以下の通りである。
【００１８】
【表１】
2017529846.tif 000002
【００１９】
ＩｄｅＳポリペプチドのフラグメントは、典型的には配列番号１または２の１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個または３５０個を超えない連続するアミノ酸からなる。
【００２０】
本明細書に記載される任意のポリペプチド、変異体またはフラグメントのアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むように、および／または化合物の安定性を増大させるように改変されうる。ポリペプチドが合成手段によって生産される場合、このようなアミノ酸は生産中に導入されうる。ポリペプチドは合成または組換え生産後にも改変されうる。本明細書に記載されるポリペプチド、変異体またはフラグメントはＤ−アミノ酸を使用して生産されうる。このような場合、アミノ酸はＣからＮの向きに逆の配列に連結するであろう。これは、このようなポリペプチドを生産するための、当技術分野における慣行である。いくつかの側鎖改変が当技術分野において知られており、ポリペプチド、変異体またはフラグメントの側鎖になされてよく、それらが、本明細書に記述されうる、任意のさらに求められる活性または特性を維持しやすくなる。
【００２１】
ポリペプチド、変異体またはフラグメントが化学的に改変、例えば翻訳後に改変されうることも理解されるであろう。例えば、それらはグリコシル化、リン酸化されているか、または改変されたアミノ酸残基を含みうる。
【００２２】
本発明の方法において使用される、免疫グロブリンを含む試料は、少なくとも１つのＩｇＧ分子を含むという条件で、例えばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、および／またはＩｇＷなどの免疫グロブリン分子を含みうる。前記ＩｇＧは任意の種、例えばヒト、サル、ウサギ、ヒツジ、またはマウス由来であってよいが、好ましくはヒト由来である。前記ＩｇＧはヒト化されていてもキメラでもよい。ＩｇＧは、マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ３であってよい。好ましくは、ＩｇＧは、ヒトまたはヒト化されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。
【００２３】
免疫グロブリン分子を含む任意の好適な試料が、本発明の方法において使用可能である。例えば、試料は抗体クローンであってよく、これを評価して、特定のクローンの凝集する能力、または凝集していない形態のままである能力を決定する。特定の製剤が抗体の凝集特性に及ぼす効果を評価するために、試料は抗体製剤であってもよい。代わりに、試料が、このような試料の品質管理の一部として、凝集の程度が評価される、患者に投与するために医薬担体または賦形剤とともに製剤化する前または後に、合成的に生産された免疫グロブリンまたはＩｇＧのバッチから取られてもよい。試料中のＩｇＧ抗体は、治療用モノクローナル抗体などのモノクローナル抗体；抗体薬物コンジュゲートまたは二重特異性抗体の形態であってよい。
【００２４】
本発明の方法は以下のステップを含みうる：
（ａ）ＩｇＧ免疫グロブリンを含む試料を、ＩｄｅＳポリペプチドと接触させるステップ；
（ｂ）試料中の１つまたは複数のＩｇＧ免疫グロブリン切断フラグメントを定量するステップ；および
（ｃ）それにより、試料中のＩｇＧ免疫グロブリン凝集を決定するステップ。
【００２５】
ステップ（ａ）は、ＩｄｅＳポリペプチドによる、試料中のＩｇＧ免疫グロブリン分子の切断を可能にする任意の条件下で行われうる。好適な条件は実施例に記載される。典型的には、任意の標準緩衝液はｐＨ５．０〜８．０、例えば５．５〜７．５、典型的には６．０〜７．５で使用される。標準緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス、炭酸水素アンモニウム、ＭＥＳ、ＨＥＰＥｓ、および酢酸ナトリウムを含む。典型的には、試料は少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、好ましくは少なくとも６０分間、第１のポリペプチドとともにインキュベートされる。インキュベーションは、好ましくは室温で、より好ましくは約２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、または４５℃で、最も好ましくは約３７℃で行われる。典型的には、酵素：抗体比は約１：５０（ｗ：ｖ）である。典型的には、還元剤は使用されない。
【００２６】
切断の定量は、任意の好適な方法を使用して、試料中のＦｃフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメントまたはその両方の量を決定することにより確認することができる。例えば、ＦｃまたはＦ（ａｂ）２フラグメントは、アフィニティ分離、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、または透析により、生じた混合物から分離されうる。典型的には、混合物は、好適なＦｃ結合剤と接触されうる。ステップ（ａ）から生じた混合物は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ結合樹脂にアプライされてよく、樹脂に結合しないＦｃフラグメント以外の成分（例えば、Ｆａｂフラグメント、還元剤、およびＩｄｅＳポリペプチドなど）は溶出されうる。Ｆｃ結合剤、例えばヒトＩｇＧ  Ｆｃ結合樹脂などは市販されている。代わりに、Ｆａｂ結合剤を使用してＦａｂフラグメントを結合させ、その他の成分を溶出させる。
【００２７】
本発明の好ましい態様においては、ハイスループット法を使用して、切断産物、例えばＦｃおよび／またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを分離し、その量を定量する。典型的には、この分析は、試料中に存在する成分がそのサイズに基づき分離される、ハイスループットゲル電気泳動法を含む。これにより、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃフラグメントが互いに分離され、これらのフラグメントの量が定量されうる。
【００２８】
切断産物の量は、凝集の増加につれて減少するため、ＦｃまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの量を使用して、研究中の試料中の凝集の量を決定することができる。具体的には、本発明者らは、線形回帰モデルを使用して、凝集物が形成された場合の、ＩｄｅＳが抗体を消化する能力の低下について説明することができることを決定した。ＦｃまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントのみが定量される本発明の方法においては、最初の試料中の抗体の濃度も任意の好適な技術により決定されるか、または既知である。本発明の好ましい態様においては、ＦｃおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントの両方が検出され、ＦｃおよびＦ（ａｂ’）２のピーク面積間の比を使用して、試料中の凝集物の濃度を決定する。本発明のこの態様においては、限界抗体濃度（critical antibody concentration）を別々に決定する必要はない。
【００２９】
典型的には、本発明の方法は、例えば抗体の生産用の生産ラインから取られた抗体の試料に対して実施され、それにより試料が、抗体の凝集のレベルが許容されるレベルに留まっていることを確認するための品質管理目的で試験される。代わりに、この方法は、治療、診断もしくは研究用途のための新規の抗体を確認するための、または、抗体の製剤化において、特定のクローンもしくは製剤が凝集に対し抵抗性である能力を評価し、それによってより長期的な安定性を有する抗体もしくは製剤を特定するための評価の一部として使用可能である。
【００３０】
以下の実施例では、本発明を説明する：
本発明者らは、臨床的に承認されたモノクローナル抗体に対して強制的な凝集を適用し、生じた凝集物および凝集していない遊離した抗体の混合物をＩｄｅＳ消化に曝露した。驚くべきことに、本発明者らは、凝集した抗体がＩｄｅＳ消化に大幅に抵抗することを見出した。本発明者らは、凝集したＩｇＧおよびＩｄｅＳにより消化されやすいＩｇＧの量の間の直接的関係を見出した。
【００３１】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析後、未処理（インタクト（intact））のＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）のピークが保持時間１１．４分後に、ならびにＦ（ａｂ’）２およびＦｃセグメントのピークがそれぞれ１２．１および１３．２分後に見られた、図１を参照のこと。
【００３２】
図１において、様々な凝集物濃度を有する消化された抗体溶液中の、様々なフラグメントのＳＥＣ−ＨＰＬＣピーク面積がプロットされている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも確認された通り、遊離Ｆ（ａｂ’）２および遊離Ｆｃの濃度の両方が、凝集の増加につれて減少し、このことは、ＩｄｅＳが大きい凝集物をあまり切断できないことを示している。
【００３３】
線形回帰モデルを、Ｆ（ａｂ’）２の減少（図２ａ）、Ｆｃの減少（図２ｂ）、または産物減少の合計（図２ｃ）のいずれかに当てはめると、線形回帰モデルはよく当てはまり、決定係数０．９８超を与える。このことは、線形回帰モデルを使用して、抗体が大きい凝集物を形成した場合の、ＩｄｅＳが抗体を消化する能力の低下について説明することができることを示している。
【００３４】
ＩｄｅＳを使用した、凝集の程度についてのハイスループット分析
ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびキャピラリー電気泳動、またはそれらの組合せなどの技術を使用し、発見された上記ＩｄｅＳ活性の特性を使用して凝集の程度を定量することができた。
【００３５】
Ｃａｌｉｐｅｒ’ｓ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したプロトコル
抗体消化
・９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに、粗抗体試料５５μｇを添加し、ＰＢＳ緩衝液と混合する。
・ＩｄｅＳを、酵素：抗体比１：５０でウェルに添加する（各ウェルの最終抗体濃度は１．１ｍｇ／ｍｌとなるべきである）。
・プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。
【００３６】
ＨＴ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＫｉｔ分析
・キットのプロトコルに従って、新たなマイクロタイタープレートのウェルに、キットの変性溶液７μｌを添加する。
・キットのプロトコルに従って、新たなマイクロタイタープレートに各ウェルの内容物２μｌを移す。
・次いで、キットのプロトコルに従う（試料を水３５μｌで５０ｎｇ／μｌに希釈することを含む）。
【００３７】
次いで、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃピーク面積間の比を算出することにより、凝集の程度を測定する。
【００３８】
機器の検出限界は５ｎｇ／μｌであるため、総抗体濃度の１０％までの遊離Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ濃度を検出するために、総抗体濃度は１０ｘ超でなければならない。
【００３９】
ＨＴ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＫｉｔによる各試料の分析時間には４１秒を要するため（ａｒｔｉｋｅｌｎ）、９６ウェルプレート全体の分析には、１時間をわずかに上回る時間を要するはずである。このことは、この手順の分析時間には全体として、試料９６個に対して２時間未満を要するはずであることを意味する。
【００４０】
消化体積が５０μｌである場合、ＨＴ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＫｉｔでは抗体５５μｇが検出限界である。
【００４１】
キットのタンパク質調製をこの手順に最適化させる場合は、このプロセスを、１つのマイクロタイタープレートにさらに簡素化し、より少ない抗体量で行うことができる。例えば、変性溶液２μｌを添加しさえすれば、より高い変性溶液濃度により、試料の希釈を減少させ、それにより望ましい抗体量を４９μｇに減少させることになる。
【００４２】
ｃｅＰＲＯ  ９６００  ９６−キャピラリー電気泳動装置（ＣｏｍｂｉＳｅｐ、Ａｍｅｓ、ＩＡ、ＵＳＡ）を使用したプロトコル
抗体消化
・９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに、抗体試料２．７μｇを添加し、トリス−ＨＣｌ緩衝液と混合する。
・Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒを、酵素：抗体比１：５０でウェルに添加する（各ウェルの最終抗体濃度は５４μｇ／ｍｌとなるべきである）。
・プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。
【００４３】
ｃｅＰＲＯ  ９６００  ９６−キャピラリー電気泳動分析
・１３０ｍＭ  ＤＴＴ溶液２μｌを各ウェルに添加し、最終濃度５ｍＭにする。
・２．７％  ＳＤＳ溶液２μｌを各ウェルに添加し、最終濃度０．５％にする。
・試料注入前に、タイタープレートを９５℃で２０分間加熱することにより、タンパク質試料を変性させる。
・Luo, S., J. Feng, H. Pang, 2004, High-throughput protein analysis by multiplexed sodium dodecyl sulfate capillary gel electrophoresis with UV absorption detection, Journal of Chromatography A, 1051 p. 131-134のプロトコルに従う。
【００４４】
次いで、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃピーク面積間の比を算出することにより、凝集の程度を測定する。
【００４５】
機器の検出限界は５ｎｇ／μｌであるため、総抗体濃度の１０％までの遊離Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ濃度を検出するために、総抗体濃度は１０ｘ超でなければならない。
【００４６】
ｃｅＰＲＯ  ９６００  ９６−キャピラリー電気泳動装置により、試料９６個を３０分以内に同時に分析することができる。このことは、この手順の分析時間には全体として、試料９６個に対して約１時間を要するはずであることを意味する。
【００４７】
消化体積が５０μｌである場合、ＨＴ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＫｉｔでは抗体２．７μｇが検出限界である。
【００４８】
配列表
【表２】
2017529846.tif 000003
【図１】
2017529846.tif 000004
【図２】
2017529846.tif 000005
【図３】
2017529846.tif 000006
【配列表】
2017529846000001.app
【国際調査報告】
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