(57)【要約】  本発明は、粘膜接着特性及びバリア効果特性を有するムギワラギク属の抽出物の画分、前記画分を含む組成物、それらの使用及び前記画分及び前記組成物の調製のための方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムギワラギク属（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）の抽出物より優れた粘膜接着活性、及び前記抽出物以上のバリア効果によって特徴付けられる、ムギワラギク属の抽出物の画分。
【請求項２】
前記粘膜接着活性が、細胞上での粘膜接着アッセイにおける粘膜接着パーセンテージとして測定される、請求項１に記載のムギワラギク属の抽出物の画分。
【請求項３】
前記粘膜接着パーセンテージが、６０％超、又は６５％超、又は７０％超である、請求項３に記載のムギワラギク属の抽出物の画分。
【請求項４】
前記画分はまた、前記抽出物以上のバリア効果により特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のムギワラギク属の抽出物の画分。
【請求項５】
炎症又は刺激性薬剤に対する応答において細胞マーカー放出阻害アッセイによって測定されるバリア効果パーセンテージが３０％以上又は３２％以上であることによって前記画分が特徴付けられる、請求項４に記載のムギワラギク属の抽出物の画分。
【請求項６】
細胞上での粘膜接着アッセイによって測定される粘膜接着パーセンテージが６５％超であること、及び炎症又は刺激性薬剤に対する応答において細胞マーカー放出阻害アッセイによって測定されるバリア効果パーセンテージが４５％超であることによって前記画分が特徴付けられる、請求項５に記載のムギワラギク属の抽出物の画分。
【請求項７】
細胞上での粘膜接着アッセイによって測定される粘膜接着パーセンテージが７０％超であること、及び炎症又は刺激性薬剤に対する応答において細胞マーカー放出阻害アッセイによって測定されるバリア効果パーセンテージが３０％以上又は３２％以上であることによって前記画分が特徴付けられる、請求項５に記載のムギワラギク属の抽出物の画分。
【請求項８】
前記抽出物はムギワラギク属の花頂の抽出物でありそれは任意に乾燥又は凍結乾燥形態である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のムギワラギク属の抽出物の画分。
【請求項９】
前記抽出物は含水アルコール抽出物である、請求項８に記載のムギワラギク属の抽出物の画分。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に係るムギワラギク属の抽出物の１つ以上の画分を含み、ムギワラギク属の未分画抽出物を含まない組成物。
【請求項１１】
細胞上での粘膜接着アッセイにおける粘膜接着パーセンテージが６０％超、６５％超、又は７０％超であり、及び炎症又は刺激性薬剤に対する応答において細胞マーカー放出阻害アッセイによって測定されるバリア効果パーセンテージが３０％以上又は３２％以上のであることによって特徴付けられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のムギワラギク属の抽出物の１つ以上の画分を含む医薬組成物又は薬草組成物のための担体。
【請求項１２】
以下のステップ：
ａ．ムギワラギク属の花頂の含水アルコール抽出物を調製し、前記抽出物を遠心分離及び／又はデカンテーションに付し、それにより析出画分と清澄アルコール画分を得るステップ；
ｂ．ａ．で調製される清澄アルコール画分から濃縮水性画分Ｂを得るステップ
により特徴付けられるムギワラギク属の抽出物の画分の調製方法であって、
前記画分Ｂは、前記抽出物より優れた粘膜接着活性及び、前記抽出物より大きいバリアにより特徴付けられる、上記方法。
【請求項１３】
前記画分Ｂは、細胞上での粘膜接着アッセイによって測定される粘膜接着パーセンテージが６５％超であり、及び炎症又は刺激性薬剤に対する応答において細胞マーカー放出阻害アッセイによって測定されるバリアのパーセンテージが４５％超であることによって特徴付けられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下のステップ：
ｃ．前記画分Ｂをデカンテーション及び／又は遠心分離及びろ過し、それによって水溶性画分を集めるステップ；
ｄ．ｃ．で得られた水溶性画分を膜限外ろ過又はナノろ過に付し、前記限外ろ過又はナノろ過から得られる透過液に相当する画分Ｄを収集するステップ、
をさらに含む、請求項１２又は１３に記載の方法であって、
前記画分Ｄは、前記抽出物よりも優れた粘膜接着活性、及び前記抽出物以上のバリア効果によって特徴付けられる、上記方法。
【請求項１５】
前記画分Ｄは、細胞上での粘膜接着アッセイによって測定される粘膜接着パーセンテージが７０％超であり、及び炎症又は刺激性薬剤に対する応答において細胞マーカー放出阻害アッセイによって測定されるバリア効果パーセンテージが３０％以上又は３２％以上であることによって特徴付けられる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜接着特性を有し、及びバリア効果を有する有効成分が枯渇しているムギワラギク属の抽出物の画分、該画分を含む組成物、それらの使用、及び該画分及び該組成物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムギワラギク属（ｓｙｎ．Ｈｅｌｙｃｈｒｉｓｕｍ  ｉｔａｌｉｃｕｍ）は、交互にグレーと白っぽい色の高さ３０〜４０ｃｍの低木の習性を有し、２０〜４０ｍｍの長さ及び１ｍｍの幅、微細な白っぽい軟毛により覆われ、柔らかく、巻き込まれた線形の葉を有する、シオン属（Ａｓｔｅｒｓ）に属する多年生植物である。
【０００３】
花序は、黄金色の管状花で、茎の頂に設置される、多数の花頂から構成される散房花序である。
【０００４】
化学的観点から、ムギワラギク属の有効成分は、主にフラボノイドによって表され、有効成分中で特に豊富なムギワラギク属の抽出物を得るための方法は、文献、例えば、同じ出願人の特許ＥＰ１８８３４１５に記載されている。
【０００５】
周知のように、ムギワラギク属は、上記のように、主に、植物の花頂から抽出される、とりわけ親油性部分に存在するフラボノイドによって、その皮膚軟化（柔軟化化粧水）性特性のために使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の著者らはまた、ムギワラギク属の抽出物の非親油性部分を利用するとことを試み、ムギワラギク属の含水アルコール抽出物の特性を分析することによって、該抽出物はいくらかの程度のバリア効果を有する一方、それは、実質的な粘膜接着特性を有していないようであることを発見した。これは、一般的に、ムギワラギク属の頂部の抽出物は、特に検出可能な機械的（粘膜接着及びバリア）活性を有さないことを意味する。
【０００７】
本発明の著者らは、次に、興味深い、主に機械的活性を有するだろうこの植物の一般廃棄成分を使用することができるように、より良い機械的活性及び少ない薬理学的活性を有するムギワラギク属の抽出物の画分を単離することが可能かどうかを理解することを試みた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の著者らは、ムギワラギク属の抽出物の様々な画分を単離し、粘膜接着及びバリア効果の機械的特性において強化されることを明らかにした、出発抽出物に比べて薬理学的有効成分（フラボノイド）が枯渇しているそれらの画分を選択した。
【０００９】
ムギワラギク属の含水アルコール抽出物の様々な画分を分析することにより、驚くべきことに、いくつかの画分が、出発抽出物にない効果である強い粘膜接着効果を示すことがわかった。また、これらの選択される画分の間で、いくつかは、開始抽出物のバリア効果よりもずっと大きいバリア効果を示すことがわかった。
【００１０】
実際には、著者らによって得られ、以下の詳細なセクションで報告される比較データは、ムギワラギク属の含水アルコール抽出物のいくつかの画分（開始抽出物との比較において選択される画分のみが報告される）は、開始抽出物（粘膜接着は、使用される２つの異なるアッセイにおいて０に等しかった）よりもずっと優れた粘膜接着パーセンテージを有し、これらの画分のいくつかはまた、開始抽出物中で測定されるバリア効果以上のバリア効果を有することを示す。
【００１１】
したがって、本発明は、ムギワラギク属の抽出物（これは使用される２つの異なる方法で測定可能でないことがわかった）よりも優れた粘膜接着活性、及び該抽出物以上のバリア効果を有することによって特徴付けられるムギワラギク属の抽出物の画分、該抽出物を含む組成物、そのような画分及びそのような組成物の使用、及びそのような画分の調製方法に関する。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、ムギワラギク属の抽出物より優れた粘膜活性、及び該抽出物以上又は同様のバリア効果バリア効果を有することによって特徴付けられるムギワラギク属の抽出物の画分、該画分を含む組成物、そのような画分及びそのような組成物の使用、及びそのような画分の調製方法である。
【００１３】
さらに、本発明の目的は、本明細書中に記載され、特許請求の範囲で定義されるようなムギワラギク属の抽出物の１つ以上の画分を含み、ムギワラギク属の未分画抽出物及び／又は本明細書中に記載されるものと異なる画分を含まない組成物である。
【００１４】
本発明の目的はまた、細胞上の粘膜接着アッセイにおいて、粘膜接着パーセンテージが６０％超であることにより特徴づけられる、本明細書中に記載され、特許請求の範囲で定義されるようなムギワラギク属の抽出物の１つ以上の画分を含む医薬品又は薬草組成物のための担体である。
【００１５】
この場合も、担体は、ムギワラギク属の未分画抽出物及び／又は本明細書中で記載されるそれらと異なる画分を含まない。
【００１６】
最後に、本発明の目的は、粘膜接着特性及びバリア効果を有するムギワラギク属の抽出物の画分の調製方法であって、以下のステップ：
ａ．ムギワラギク属の含水アルコール抽出物を調製し、該抽出物を遠心分離及び／又はデカンテーションに供し、それにより析出画分と清澄アルコール画分を得るステップ；
ｂ．ａ．で調製された清澄アルコール画分から濃縮された水性画分Ｂを得るステップ
により特徴付けられ、
該画分Ｂは、該抽出物より優れた粘膜接着活性、及び該抽出物以上のバリア効果によって特徴付けられる。
【００１７】
用語解説
本発明の終わりまで「ムギワラギク属の抽出物」とは、ムギワラギク属の頂部の含水アルコール抽出物を意味する。
ＮＭＷＣＯ＝公称分子量カットオフ
透過液：半透過性限外ろ過又はナノろ過技術を通した抽出物
残留物：限外ろ過又はナノろ過膜又は樹脂上に吸収された材料を通らなかった抽出物。
溶出液：樹脂上を吸着通過後に樹脂上に吸着されない材料
限外ろ過：１０，０００ダルトン（０．０１μｍ）から５００ダルトン（約０．００５μｍ）のサイズを有する細孔によって特徴付けられる半透膜上のろ過技術。
ナノろ過：５００〜１５０ダルトンのサイズを有する細孔によって特徴付けられる半透膜上のろ過技術。
「頂部」又は「花頂」による頂部又は花頂とは、一般的に薬草医薬（ｈｅｒｂａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）及び植物療法（ｂｏｔａｎｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｉｅｓ）で使用される用語を意味し、したがって、葉、茎（ｓｔｅｍ）（枝（ｂｒａｎｃｈｅｓ）として意味され、植物の主な茎（ｍａｉｎ  ｓｔａｌｋ）としてではない）及び花を含む植物の大気中の（空中の）末端である。
「粘膜接着活性」とは、本発明において、粘膜表面に付着する化合物又は物質の能力を意味する。
「バリア効果」（ＢＥ）とは、例えば、粘膜又は皮膚のような細胞表面上で保護フィルムを作成するための化合物又は物質の能力を意味する。
「細胞上での粘膜接着アッセイ」とは、本明細書において、発明の詳細な説明及び実施例で記載されるような粘膜接着活性を測定するためのアッセイを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の画分の調製方法を示すブロック図である。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
上記要約で記載されるように、本明細書は、未分画開始抽出物に関して改善される、粘膜接着性能力及びバリア効果のような、機械的特徴を有するムギワラギク属の抽出物の画分に関する。
【００２０】
本発明の著者らは、例えば、ムギワラギク属の花頂のアルコール抽出物のような、ムギワラギク属の全体の（未分画）抽出物の粘膜接着効果及びバリア効果能力を実際に調べ、それは、例えば、この説明の実験のセクションにおいて報告される単純なアッセイによって、正味のバリア効果を存在させ、測定可能とさせたのに対し、そのような抽出物は、傾斜板上での粘膜接着アッセイ又は細胞上での粘膜接着アッセイのような粘膜接着測定のための標準的な実験で測定可能な粘膜付着性能力を有さなかったことがわかった。
【００２１】
様々な技術でムギワラギク属の抽出物を分画し、得られた画分を分析することによって、本発明の著者らは、驚くべきことに、開始抽出物よりも非常に大きな粘膜接着性、及び開始抽出物のバリア効果に対して、大きいか又は等しいバリア効果を示すいくつかの画分を単離した。
【００２２】
第１の態様において、本発明は、開始抽出物よりも優れた粘膜接着性又は粘膜接着活性、すなわち、前記画分が分離される抽出物の粘膜接着性又は粘膜接着活性より優れる、及び開始抽出物のバリア効果に対して、大きいか又は等しいバリア効果によって特徴付けられるムギワラギク属の抽出物の画分に関する。
【００２３】
本発明において、粘膜接着活性は、当該分野の技術者に公知の任意の方法に従って測定されることができた。特に、それは、本発明の画分を用いて実施される単純な細胞接着（ｃｙｔｏａｄｈｅｓｉｏｎ）アッセイ（また、本明細書中で、細胞上での粘膜接着アッセイとして定義される）による粘膜接着パーセンテージとして測定されることができ、これは、そのような製品が粘膜に付着し、その結果保護作用を発揮する能力を有するかどうかを確認するために、試験下で製品の粘膜接着性を評価することを目的とする。
【００２４】
この粘膜接着活性は、例えば、本出願で記載され、請求される画分の１つ又は両方を有する分析される細胞の前処理によって導入されるレクチン−糖タンパク質結合の阻害のパーセンテージの評価によって、粘膜細胞上で測定されることができる。
【００２５】
要するに、粘膜接着性は、試験下でサンプルで前処理される口腔、胃、腸又は膣の粘膜細胞を使用して分析されるサンプルによって誘導されるレクチン−糖タンパク質結合の阻害のパーセンテージの評価によって決定される。細胞は、試験下でサンプルで可変時間（例えば、１５〜３０分）の間、最初に前処理され、続いて、ビオチン化レクチン（Ｃｏｎ−Ａ）で処理され、これにストレプトアビジンペルオキシダーゼを続いて加え、タンパク質−グルコース−レクチン−ビオチン−ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体を形成することを可能にする。この時点で、細胞を洗浄し、タンパク質−グルコース−レクチン−ビオチン−ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体を、ペルオキシダーゼの存在のおかげで、オルト−フェニレンジアミンの酸化の反応の方法によって定量する。
【００２６】
タンパク質／グルコース／レクチン／ビオチン／ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体は、重合反応：
【化１】
2017509695.tif 000003
を触媒する。
【００２７】
（λ＝４５０ｎｍを有する分光高度計を用いて測定される）溶液の黄色／オレンジ色の着色の強度は、糖タンパク質／レクチン結合の量に比例し、したがって、粘膜接着のために利用可能な部位（糖タンパク質）の量に比例する。こうして決定される吸光度は、「対照」を構成する。
【００２８】
以下に報告される細胞上での粘膜接着アッセイにおいて、粘膜細胞は、レクチンを用いる処理前に、試験下の製品により、３０℃で約１５分間処理される。粘膜接着製品の存在下において、前記製品は、上記のように、対照と比較して、サンプル中でのそれらの粘膜接着性能力、信号の強さに比例して、レクチンの結合を阻害し、減少させるだろう。
【００２９】
生成物の粘膜接着のパーセンテージ（％ＭＡ）は、以下のように決定される。
％ＭＡ＝（１−サンプル吸光度／対照吸光度）×１００
【００３０】
特定の態様において、本発明の画分の粘膜接着パーセンテージは、上記及び実施例において詳細に記載されるように、細胞上での粘膜接着アッセイにおいて、６０％超、６５％超、又は７０％超である。
【００３１】
同じアッセイで算出して、０に等しい粘膜接着パーセンテージを出発抽出物が有することに留意することが重要である。
【００３２】
本明細書中で記載されるムギワラギク属の抽出物の画分はまた、出発抽出物のバリア効果以上のバリア効果を示す。
【００３３】
本発明の著者は、実際に、所望の粘膜接着性能力に基づいて選択される画分のうちいくつかの画分はまた、出発抽出物以上のバリア効果を示したことを見出している。
【００３４】
粘膜又は皮膚上の化合物のバリア効果は、当該分野の技術者に利用可能な任意の方法で測定され得る。例えば、バリア効果は、以下の実験のセクションで詳細に記載されるように、炎症又は刺激性薬剤に応答する細胞マーカー放出阻害アッセイによって測定されうる。
【００３５】
しかしながら、要するに、細胞培養上でのムギワラギク属の抽出物の画分のバリア効果の評価のためのインビトロ方法は、以下のステップ：
ａ）細胞培養を準備するステップ；
ｂ）該培養物からそれを分離する半透膜上に関心のあるサンプル（例えば、ムギワラギク属の抽出物の画分）を置き、続いて又は同時に、該サンプルに、該培養物と接触する場合、該培養物からマーカー（例えば、ヒスタミン又はβ−グルクロニダーゼ又はＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ１α、ＴＮＦα、ＴＮＦβのようなサイトカイン）の放出を誘導することができる物質（例えば、細菌リポ多糖ＬＰＳ又はインターフェロンのような炎症性薬剤；オボアルブミン、ジニトロクロロベンゼン、オキサゾロン、オイゲノール、ペニシリンＧ、硫酸ニッケルのような刺激性又はアレルギー性薬剤）を加えるステップ；
ｃ）ａ）及びｂ）で調製される実験において該マーカーの濃度を１つ以上の連続した時間の瞬時に検出し、１つ以上の基準値に対して得られる測定値を比較するステップ
で要約されることができ、
ステップｃ．における該マーカーの経時の増加の欠如（又は、対照に関してより長い時間をかけてのみ測定可能なマーカーの増加）は、サンプルのバリア効果を示しており、試験下のサンプルが半透膜上に置かれていない。
【００３６】
特に、ステップｃ）は、以下を含む：
ａ）及びｂ）において、並びに並列対照実験において調製される実験において該マーカーの濃度を１つ以上の連続した時間の瞬時に検出し、ムギワラギク属の抽出物の画分が、ｂ）において、透過膜上に加えられず、同じ時間の瞬時に２つの実験から得られる測定値を比較するステップ。
【００３７】
ステップｃ）はまた、以下を含む：
１つ以上の連続した時間の瞬時に、ステップｂ）の前の同じ実験において測定される該マーカーの量に関連して、ステップａ）及びｂ）において調製される実験における該マーカーの濃度を検出するステップ。
【００３８】
１つの態様において、本発明の方法はさらに、内部対照を調製するステップを含み、このステップでは培養細胞がマーカー放出を誘導するために適した物質で前処理され、ムギワラギク属の抽出物の画分が、該物質の存在しない半透膜上に設置され、該物質が該画分の前に沈む（定在する）べきである場合、試験下で画分に後で追加されることができた。
【００３９】
１つの態様にしたがって、バリア効果（ＢＥ）は、ＬＰＳのような薬剤に対する応答でのＩＬ−６阻害アッセイによって測定される。
ＢＥ＝サイトカインＩＬ−６の放出における低下％＝１００−［（サンプルから放出されるサイトカイン（ｐｇ／μＬ）／Ｃ＋から放出されるサイトカイン（ｐｇ／μＬ））×１００］
【００４０】
興味深い態様において、本発明のムギワラギク属の抽出物画分は、バリア効果パーセンテージのような、炎症性又は刺激性薬剤に対する応答において（例えば、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−８のようなサイトカインの阻害、ＬＰＳに対する応答の場合の放出）、細胞マーカー放出阻害アッセイにけるバリア効果パーセンテージが３０％以上、又は３２％以上、例えば、約３４％又は約４９％である。
【００４１】
特定の態様において、本発明に係るムギワラギク属の抽出物の画分は、該出発抽出物よりも優れた粘膜接着活性、及び、炎症性又は刺激性薬剤に対する応答において（例えば、サイトカイン放出阻害、例えば、ＬＰＳに対する応答におけるＩＬ−６及び／又はＩＬ−８など）細胞マーカー放出阻害アッセイにおけるバリア効果パーセンテージが約４９％であることにより特徴付けられる。
【００４２】
粘膜接着が、細胞上での粘膜接着アッセイによって測定される場合、上記に示される画分は、６５と７０％の間に含まれる粘膜接着パーセンテージ、すなわち、６５％超、例えば、約６８％の粘膜接着パーセテージを有する。
【００４３】
別の態様において、本発明に係るムギワラギク属の抽出物の画分は、該出発抽出物より優れた粘膜接着活性、及び、炎症性又は刺激性薬剤に対する応答（例えば、サイトカイン放出阻害、例えば、ＬＰＳに対する応答におけるＩＬ−６及び／又はＩＬ−８など）における細胞マーカー放出阻害アッセイでのバリア効果パーセンテージが３０％超、例えば、約３４％であること、によって特徴付けられる。
【００４４】
粘膜接着が細胞上での粘膜接着アッセイによって測定される場合、上記に示される画分は、７０％超の粘膜接着パーセンテージ、例えば、約７４％の粘膜接着パーセンテージを有する。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、ムギワラギク属の開始抽出物は、それから本発明の画分が分離されるものであり、上記で定義されるようなムギワラギク属の花頂の含水アルコール抽出物であり、これは任意に乾燥又は凍結乾燥されることができた。
【００４６】
次に、その画分は、任意に乾燥又は凍結乾燥されることができた。
【００４７】
本発明の目的はまた、本発明の抽出物の画分又はその混合物を含む組成物である。本発明に係る組成物は、ムギワラギク属の未分画抽出物、例えば、ムギワラギク属の未分画の含水アルコール抽出物及び／又は本明細書中に記載されるそれらと異なるムギワラギク属の抽出物の画分を含まない。したがって、組成物においてムギワラギク属から来る唯一の化合物は、本明細書中で記載され、請求されるような画分に存在するそれらである。
【００４８】
上記のような、そのような画分又は混合物を含む本発明の画分、それらの混合物、又は組成物は、医薬品又は薬草組成物として粘膜接着性担体として使用されることができる。
【００４９】
したがって、本発明の画分は、粘膜及び皮膚の保護及び／又は修復のために有用な植物起源の材料の新規なソース、及び／又は粘膜上での所望の物質をより長い時間の間保持するこができる賦形剤／担体としてまた提供し、有効成分として既知の成分に寄与する薬理学的効果は、実質的に低減され、又は削除さえされる。
【００５０】
天然の材料又は植物源が、主に機械的なタイプの作用として使用される場合（すなわち、例えば、受容体、免疫経路又は代謝過程の活性化に対する直接の影響を有する薬理学的作用としてではない）、前記条件が、特に望ましい。例えば、バリア効果又は粘膜接着効果を有する物質のような、主に機械的効果を有する物質の使用は、例えば、薬物療法と協働するように、望ましい。本発明のように、植物又は天然由来の材料中で薬理学的活性を有する物質（すなわち、フラボノイド）の存在を最小にすることによって、薬物と組み合わせて使用されることができる主に機械的効果を有する材料が得られ、薬物と起こり得る望ましくない相互反応を最小にし、同時に、一般的に使用される薬理学的に活性な成分（この場合、実質的に排除される）の他に、皮膚及び粘膜上の保護効果を発揮することができる、機械的効果を有する膨大な数の成分を有する植物由来の物質の典型的な特徴を利用している。
【００５１】
「粘膜の保護」とは、本発明の画分又はその混合物の粘膜接着性能力やバリア能力によって与えられる、機械的保護を意味し、それは、本発明の画分と混合されている、ムギワラギク属の有効成分と異なる有効成分に関する薬理学的保護と関連づけることができた。包帯が物理学的に傷を保護し、そのさらなる悪化を防ぎ、それによって、その治癒を促進するように、本発明の画分のバリア効果は、病状及び炎症を引き起こしうる、そして易感染性の皮膚又は粘膜の治癒を遅くすることがあり得る成分の攻撃から皮膚及び粘膜を保護する。本明細書において、前記粘膜は、口腔粘膜、胃粘膜、腸粘膜、鼻粘膜、膣粘膜、子宮粘膜、直腸粘膜であることができる。
【００５２】
上記のように、得られた混合物の機械的活性を強化するために、本発明の画分は、他の植物又は他の天然生成物の有効成分として、単独又は互いに混合されて使用することができ、他の植物及び／又は他の起源の天然有効成分の抽出物（すなわち、ムギワラギク属から抽出されない）と一緒に、（単独又は組み合わせて）任意にさらに混合されることができた。
【００５３】
本発明に係る抽出物の画分を含む可能な処方を続いてより詳細に記載する。
【００５４】
現在、上記の要件に合うムギワラギク属の抽出物の画分を単離することを当業者に可能にするプロセスが提供されるだろう。
【００５５】
明らかに、これらの記載から開始すると、当該分野の技術者は、追加の発明活動の必要性なしに、上記の基準を満たす画分を得ることが可能な他のプロセスを開発することができるであろう。実際、一度、特有の粘膜接着特性及びバリア効果特性を示すムギワラギク属の抽出物の画分が存在することが知られると、そして一度、それらを単離することができるプロセスを知れば、当該分野の技術者は、これらのプロセスに変更をもたらすことができ、発明活動の特定の使用なしに類似の画分を得ることができるであろう。
【００５６】
したがって、本明細書中に記載されるプロセスは、決して本発明を限定する教示としてではなく、むしろ当該分野の技術者の利益に資する実施例として、理解されるべきである。
【００５７】
したがって、本発明はまた、ムギワラギク属の抽出物の画分の調製のための方法に関し、以下のステップ：
ａ．ムギワラギク属の含水アルコール抽出物を調製し、該抽出物を遠心分離及び／又はデカンテーションに供し、それにより析出画分と清澄アルコール画分を得るステップ；
ｂ．ａ．で調製された清澄アルコール画分から画分Ｂとして言及される濃縮された水性画分（極性又は水溶性画分）を得るステップ
によって特徴付けられ、
該画分Ｂは、該抽出物の粘膜接着パーセンテージより大きく、該抽出物以上のバリア効果によって特徴付けられる。
【００５８】
特に、前記画分Ｂは、細胞上での粘膜接着アッセイを用いて測定される粘膜接着パーセンテージが６０％超（６５％超、約６８％）であること、及び炎症性又は刺激性薬剤に対する応答（例えば、サイトカイン放出阻害、例えば、ＬＰＳに対する応答においてＩＬ−６及び／又はＩＬ−８など）において細胞マーカー放出阻害アッセイにおけるバリア効果が４５％超（約４９％）であることによって特徴づけられる。
【００５９】
さらなる態様に従って、本発明の方法はまた、以下のステップ： 
ｃ．前記画分Ｂをデカンテーション及び／又は遠心分離及びろ過し、それによって水溶性画分を集めるステップ；
ｄ．ｃ．で得られた水溶性画分を膜限外ろ過又はナノろ過に供し、該限外ろ過又はナノろ過から得られる透過液に相当する画分Ｄを収集するステップ
を含むことができ、
該画分Ｄは、該抽出物の粘膜接着活性よりも優れた粘膜接着活性、及び該抽出物のバリア効果に匹敵するバリア効果によって特徴付けられる。
【００６０】
特に、前記画分Ｄは、細胞上でのアッセイにおける粘膜接着パーセンテージが７０％超であること、及びバリア効果が３０％以上又は３２％以上であることによって特徴付けられる。
【００６１】
ａ．で調製される含水アルコール抽出物は、本発明の態様において、ムギワラギク属の花頂のアルコール抽出物である。
【００６２】
上記方法で得られる画分の特性を以下の表１にまとめる：
【表１】
2017509695.tif 000004
【００６３】
物質又は化合物のＢＥは、本明細書中ではＬＰＤに曝露される細胞によって、ＩＬ−６サイトカインの放出の減少％として表され、サンプルは、陽性対照（Ｃ＋又はＣｌ）について分析され（ＴＢ）、細胞は、ＬＰＳに対してのみ曝露されたことがわかる。
【００６４】
ムギワラギク属の抽出物の画分Ｂは、イソクエルシトリンとして滴定される総フラボノイドのパーセンテージが約０．３％に等しく、画分Ｄは、イソクエルシトリンとして滴定される総フラボノイドのパーセンテージが約０．２％に等しい。一方、ムギワラギク属の抽出物の初期の画分は、イソクエルシトリンとして滴定される総フラボノイドのパーセンテージが約０．８２％に等しい。
【００６５】
本明細書中に記載される方法は、新鮮な、及び乾燥された両方のムギワラギク属の頂部から出発して実施され、又は、代わりに、流体（例えば、含水アルコール抽出物のような）又は乾燥されたムギワラギク属の抽出物から直接開始して実施され得る。
【００６６】
乾燥抽出物は、例えば、４〜８時間の範囲の時間の間、塊の撹拌下に置きながら、１：５、又は１：７又は１：８又は１：１０の固体／溶媒比を使用することによって、含水アルコール溶液によって、再懸濁／再溶解され得る。
【００６７】
本発明の方法のステップａ：
ａ．ムギワラギク属の頂部の含水アルコール抽出物を調製又は使用し、該抽出物を遠心分離及び／又はデカンテーションに付し、清澄アルコール画分を得る工程
【００６８】
本発明に従って、上記の方法は、濃度減少でエタノール中で、ステップａ．で少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのステップで実施することによって実施されることができ、エタノールの減少濃度は、約９６％エタノール〜約０％エタノールである。
【００６９】
例えば、本発明の方法のステップａ．は、約９６％エタノール中でのステップ、及び約５％エタノール中でのステップを行うことによって、実施されることができる。
【００７０】
又は、本発明の方法のステップａ．は、約９６％エタノール中でのステップ、約５０％エタノール中でのステップ、及び約２０％エタノール中でのステップを行うことによって、実施され得る。
【００７１】
又は、本発明の方法のステップａ．は、約９６％エタノール中でのステップ、約５０％エタノール中でのステップ、及び／又は約２０％エタノール中でのステップ、及び約５％エタノール中でのステップを行うことによって、実施され得る。
【００７２】
上記のように得られる抽出物は、含水アルコール抽出物を形成するために集められる。これらは、例えば、エタノール中の２つのステップの場合において５０：５０、又はエタノール中での３つのステップの場合３３．３：３３．３：３３．３、又はエタノール中での４つのステップの場合２５：２５：２５：２５のような等しい同等の割合で、集められることができる。明らかに、上記のエタノール中での様々なステップを行うことによって得られる抽出物は、当該分野における技術者の一般的な知識に従って異なる比率に収集され得る。
【００７３】
すでに上記に示されるように、ステップａ．で得られる清澄アルコール画分は、濃縮水性画分（画分Ｂ）を調製するために次のステップｂ．で使用される。
【００７４】
そのような濃縮水性画分又は画分Ｂは、アルコール蒸発によって、ステップａ．において得られる含水アルコール画分を濃縮することによって調製されることができ、次に、それは、デカンテーション及び／又は遠心分離及び／又はろ過され、得られる濃縮水性画分が集められる。例えば、デカンテーション及び／又は遠心分離の場合、水性上清は集められ、一方、ろ過の場合、ろ液は回収される。あるいは、アルコール蒸発は、遠心分離及び／又はデカンテーション及び／又はろ過ステップの後、実施され得る。
【００７５】
デカンテーションは、例えば、１〜７２時間、実施されることができ、１と１０分の間の期間の間、たとえば５分間、約３０００〜４０００（例えば、約３５００）ｒｐｍで１回以上の遠心分離をその後に行うか、又はそれで置き換えることができる。ろ過について、当該分野の技術者に公知の適切なフィルタは、例えば、約２５マイクロメートルのカットオフを有するパネルフィルターのようなものを使用することができる。いくつかの場合、抽出物のさらなる連続するろ過は、２００マイクロメートルから０．１マイクロメートルまで次第に減少するカットオフを有するフィルタ上で実施されることができる。
【００７６】
次に、このステップ（単数又は複数）の後に得られる上清又はろ液は、回収され、これが以前にすでに実施されていない場合には、例えば、当該分野の技術者によって一般的に使用される標準プロトコルに従って、薄膜蒸留装置、又はバッチ式濃縮装置の使用によって、標準技術によるアルコール蒸発に付される。
【００７７】
この蒸発の結果は、本明細書緒中で画分Ｂとして記載される、濃縮水性画分である。
【００７８】
したがって、得られる画分Ｂは、開始抽出物よりも優れた（より大きい）粘膜接着性能力、及び開始抽出物よりも大きいバリア効果を有する。特に、細胞上での粘膜接着アッセイによって測定される画分Ｂの粘膜接着パーセンテージは、６０％超、又は６５％超、例えば約６８％に等しく、及び炎症性又は刺激性薬剤に対する応答において細胞マーカー放出阻害アッセイによって測定される、バリア効果は、４５％超、例えば、約４９％に等しい。
【００７９】
画分Ｂはさらに、限外ろ過又はナノろ過による物質枯渇のさらなるプロセスにさらに付されることができる。
【００８０】
画分Ｂは、１時間と７２時間、デカンテーションに付されることができ、次に上清が回収され、それによって、清澄又は透明溶液を得る。
【００８１】
デカンテーションは、１分と１０分の間、例えば、約５分間、約３０００〜４０００（例えば、約３５００）ｒｐｍで１回以上の遠心分離をその後に行うか、又はそれで置き換え得る。
【００８２】
代わりに、画分Ｂがろ過され、それによって、透明溶液を得る。いくつかの場合、抽出物のさらなる連続するろ過は、２００マイクロメートルから出発し、０．１マイクロメートルに到達するまで、徐々に減少するカットオフを有するフィルタ上で実施されることができる。ろ過は、例えば、２５マイクロメートルのカットオフを有するパネルフィルター上で実施することができる。
【００８３】
さらなる態様において、画分Ｂを、上記のようにデカントすることができ、次に得られた上清を、上記のようにろ過することができる。
【００８４】
上記のように得られる上清又はろ液は回収され、限外ろ過（又はナノろ過）又は吸着樹脂上を通すことにより、薬理学的に活性な芳香族物質の枯渇のさらなるステップに付される。
【００８５】
したがって、本発明の方法は、所望の抽出物の回収前に、上記ステップｃ．において得られる上清又はろ液から望ましくない物質の枯渇の、ｄ．として下記に記載されるさらなるステップを含むことができ、前記上清又はろ液は、有効成分の枯渇の１つ以上のさらなるステップに供される。
【００８６】
このステップは、ｃ．で得られる上清又はろ液の限外ろ過又はナノろ過によって実施されることができた（ステップｄ）。
【００８７】
ｃ．で得られる上清又はろ液は、限外ろ過又はナノろ過の１つ以上のステップに供され、そのろ液は、画分Ｄとして回収され、開始抽出物、すなわち、ａ．での抽出物よりも優れた粘膜接着活性、及び開始抽出物よりも優れたバリア効果によって特徴付けられる（上記画分Ｄの記載参照）。
【００８８】
このさらなるステップにおいて、画分Ｂは、５００から１５，０００ダルトン、例えば、１０，０００ダルトン、５，０００ダルトン、２，５００ダルトン、１，０００ダルトンの分子量のカットオフ（ＮＭＣＷＯ）を有する膜上での限外ろ過の、又は５００ダルトンより低いカットオフを有する膜上でのナノろ過の１つ以上のステップに供される。したがって、得られるろ液（画分Ｄ）は、そのまま使用されるか、又は内部使用及び／又は外部使用のための治療的使用を有する製剤に有用な凍結乾燥された抽出物を提供するための凍結乾燥プロセスに供されることができる。
【００８９】
したがって、本発明に従って、前記１つ以上の限外ろ過のステップは、約５００〜１５，０００ダルトン、例えば、約１０，０００ダルトン、５，０００ダルトン、２，５００ダルトン、１，０００ダルトンのカットオフを有する膜上で実施されることができ、一方、ナノろ過のものは、５００ダルトンより低いカットオフを有する膜上で実施され得る。
【００９０】
したがって、本発明は高い粘膜接着力を有するムギワラギク属の抽出物の画分の調製方法に関し、以下のステップ：
ａ．ムギワラギク属の花頂の含水アルコール抽出物を調製し、該抽出物を遠心分離及び／又はデカンテーションに供し、それにより析出画分と清澄アルコール画分を得るステップ；
ｂ．ａ．で調製された清澄アルコール画分から画分Ｂとして記載される濃縮された水性画分を得るステップ；
ｃ．前記画分Ｂをデカンテーション及び／又は遠心分離及びろ過し、それによって水溶性画分を集めるステップ；
ｄ．ｃ．で得られた水溶性画分を膜限外ろ過又はナノろ過に供し、該限外ろ過又はナノろ過から得られる透過液に相当する画分Ｄを収集するステップ
を含み、
該画分Ｄは、該抽出物の粘膜接着活性よりも優れた粘膜接着活性、及び該抽出物のバリア効果に匹敵するバリア効果によって特徴付けられる。
【００９１】
特に、ステップｄ．で得られる画分Ｄは、細胞上での粘膜接着アッセイにより測定される粘膜接着パーセンテージが７０％超であり、及び炎症性又は刺激性薬剤に対する応答において細胞マーカー放出阻害アッセイによって測定されるバリア効果が３０％以上、又は３２％以上、例えば約３４％であることによって特徴付けられる。
【００９２】
すでに上記に記載のように、本明細書中に記載されるようなムギワラギク属の初期の抽出物の粘膜接着性能力は、細胞に対する粘膜接着のアッセイにより検出可能ではなく；これは、ムギワラギク属の抽出物が、以下に記載のアッセイで分析されるサンプルとして使用される場合、サンプルを用いて得られる結果は、レクチン処理前に細胞といかなる物質とも接触されない「ブランク」又は陰性対照で得られる結果に等しい。
【００９３】
したがって、本発明に係る方法は、有効成分中が枯渇している、及び保護作用を有する物質に驚くほど富む、上記のようなムギワラギク属の抽出物の画分を得ることができる。
【００９４】
本発明はまた、皮膚又は粘膜の保護に有用なムギワラギク属の抽出物の１つ以上の画分を含む組成物に関し、前記画分は、実質的に有効成分が枯渇しており、粘膜接着特性、また任意に開始抽出物中で最初は低いか、又は存在しないバリア効果特性を示す。
【００９５】
もちろん、画分自体又は互いに混合される画分と組成物の両方を参照して、そのような保護は、すでに上記のように、部分的に易感染性の皮膚又は粘膜の予防的保護又は保護であることができる。本発明の組成物は、ムギワラギク属に関して、本発明の画分のみを含む。
【００９６】
抽出物の組成物又は画分は、それらのバリア効果及び粘膜接着効果により、健康かつ弾力性の皮膚又は粘膜の復元に伴って、損傷した粘膜又は皮膚組織の修復を促進することができる。
【００９７】
本発明に係る皮膚の病変は、瘢痕性及び／又は抗菌性有効物質が本発明の画分に伴わない場合、皮膚下層の組織も含みうる、開放創が存在しない病変であることもある。
【００９８】
開放創の存在を意味しない皮膚の病変とは、本明細書において、皮膚の上層及び下層が、損傷されていないが（ｎｏｔ  ｂｅｉｎｇ  ｗｏｕｎｄｅｄ）、特にもろく、刺激され、損傷される（ｄａｍａｇｅｄ）病変を意味する。
【００９９】
このタイプの病変の非限定的な例は、第一度の熱傷、第一度の蓐瘡、圧力病変、新たな瘢痕ができて治る発疹、創傷又は火傷、炎症、紅斑によって表される。
【０１００】
開放創を有する皮膚の病変の治療に適する有効成分に関して、本発明の画分は、それらの粘膜接着効果又はバリア効果のおかげで、そのような治療のアジュバントとして適し得る。
【０１０１】
次に、本発明の組成物又は画分（又はその混合物）は、開放創の存在を暗示しない皮膚の病変の治療又は予防のために、又はその悪化の予防又は減速に、又はムギワラギク属と異なる植物の適切な有効成分と伴って、開放傷を有する皮膚又は粘膜の病変の治療に使用され得る。
【０１０２】
本発明に係る組成物は、有利には、例えば、ムギワラギク属と異なる植物の天然由来の有効成分の他に、例えば、皮膚軟化剤、消化剤、運動促進剤、胆汁分泌促進剤、駆風薬、プレバイオティクス、リラックス剤、賦形剤、保存剤、湿潤性の性質を有する、例えば、植物起源の更なる成分を含む。
【０１０３】
本発明の組成物又は１つ以上の画分は、皮膚の保護のために使用される場合、その適用は、局所的であろう。局所使用のための組成物の態様は、本明細書中で以下に報告される。
【０１０４】
本発明に係る組成物は、例えば、水中油型エマルション、油中水型エマルション、ゲル中油エマルション又は油中ゲルエマルション、多重エマルション、スプレー、及び無水製剤（ポマード、ゲル、ペースト、クリーム、軟膏）にすることができ、所望の最終形の作成に適した１つ以上の賦形剤を含むだろう。
【０１０５】
そのような賦形剤は、例えば、乳化剤（セテアリルアルコール、セテアリルグルコシド、水素化ヒマシ油）、レオロジー添加剤、抗酸化剤（例えば、ビタミン、トコフェロール又は当該分野で公知の他の抗酸化剤など）であり得る。
【０１０６】
乳化剤は、界面活性剤であることができ、界面張力を低下させることによって、系の自由エネルギーを減少させ；あるいは、またアラビアゴム、ゼラチン、親水コロイド又は微細細分化粉末（例えば、タルク）のような非界面活性剤を使用することができる。１つの態様において、賦形剤は、当該分野の技術者が発明活動を加えることなく準備しようとする態様に従って必要な賦形剤の濃度を適用する方法をとにかく知っているだろうということを考慮に入れて、３と８％の間に含まれる全体的な濃度で存在することができる。
【０１０７】
また、組成物は、香料剤及び／又は着色剤を含むことができ、それに快適な匂いを与え、例えば、１つ以上のエッセンシャルオイル、例えば、ラベンダーのエッセンシャルオイル、メラレウカのエッセンシャルオイル、レモン、ミント、オレンジ、及び／又は着色剤であり、これらは、例えば、容易に、組成物の適用範囲を認識させることができ、着色は、例えば、一時的であるので、それは、組成物の他の後の適用を妨げない。
【０１０８】
１つの態様において、前記着色剤及び／又は香料剤は、０．００１〜３％の全体的な重量での濃度で含まれる。
【０１０９】
「全体的な重量での濃度」とは、様々な賦形剤の合計の組成物中の重量での濃度、又は組成物中に存在する様々な香料剤及び／又は着色剤の合計の組成物中の重量での濃度を意味する。
【０１１０】
皮膚の保護における組成物の使用に関して、本発明はまた、医療デバイス、例えば、薬用パッチ、薬用ガーゼ、薬用包帯、薬用タオル、薬用パッド、薬用おむつ、すなわち、最も適切な型において本発明の記載される組成物を含むか、又はそれにより少なくとも部分的に覆われ、又はそれで少なくとも部分的に染色されるパッチ、ガーゼ、包帯、タオル、パッド又はおむつに関する。
【０１１１】
ガーゼは、脂肪性ガーゼとして作られることができ、そのため、包帯パッチは、例えば、軟膏、ペースト又はクリームの形態で作られる組成物を使用する。タオルは、水又はゲルと油のエマルションの形態で組成物で染色することができ、おむつ又は吸収性パッドは、保護又は抗刺激組成物の挿入のために当該分野で公知の関連する層において、組成物を挿入することによって作ることができる。
【０１１２】
そのような製品、例えば、幼児用おむつ、女性のための吸収性パッド（通常「生理用ナプキン」と呼ばれる）及び成人用失禁パッドは、通常、例えば、幼児用、女性用、及び老年用の関連分野で使用され、当該分野の技術者は、本明細書中に記載される組成物をどこに挿入すべきか、どのような態様が、特定の技術の必要性なしに、唯一、当該分野の従来技術に基づいて、最も適切なものであるかを知っているであろう。
【０１１３】
そのようなデバイスは、予防目的のために治療及び／又は保護される部分に適用可能であろう。
【０１１４】
すでに上記に示されるように、本発明の組成物は、当該分野で通常使用される技術にしたがって、水中油型エマルション、油中水型エマルション、多重エマルション、スプレー、及び無水製剤（ポマード、軟膏、ゲル、ペースト、クリーム、スプレー）の形態で実現され得る局所使用のための組成物であってもよい。本明細書中で「スプレー」として記載される製剤は、無水製剤、又はエマルション中での製剤であることができ、噴霧器を有する形態はまた、到達しにくいゾーン（例えば、背中のような）でも自己適用を可能にし、製剤が、例えば、日発疹、紅斑、又は様々な種類の皮膚の炎症を軽減するために使用される全ての場合で有用である。
【０１１５】
別の態様にしたがって、本発明の画分の１つ以上又は本発明の組成物は、それらの粘膜接着効果及びバリア効果のおかげで、粘膜の保護のために、使用され得る。
【０１１６】
この場合も同様に、前記保護は、例えば、粘膜を攻撃するという副作用を有する薬剤の投与を想定する全ての場合、又は粘膜の刺激を繰り返す条件を示す患者の場合、予防的な保護であることができる。他の場合、保護は、代わりに、治療の目的のために、又は炎症を起こした、若しくは部分的に易感染性の粘膜の悪化を避けるための保護であることができる。
【０１１７】
これらの場合、組成物の画分Ｂ又はＣの１つ以上の投与は、局所投与（例えば、経口（頬）、直腸、膣、鼻粘膜）が可能な全ての粘膜に対して局所的であることができ、あるいは前記膜が、例えば、腸又は胃粘膜である場合には経口であることができる。
【０１１８】
したがって、粘膜の保護のための組成物は、カプセル、錠剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、硬ゼラチン、軟ゼラチン、懸濁液、乳濁液、溶液、坐剤、クリーム、ゲル、スプレー、軟膏、ポマード、ペースト、水中油型エマルション、油中水型エマルション、ゲル中油型エマルション、油中ゲル型エマルションの形態で作られることができる。
【０１１９】
局所使用のための製剤の場合、皮膚の保護のための組成物に関連する上記指示は、従うことができ、又はシロップ、リンス、スプレーが、例えば、口、喉、鼻の粘膜の保護のためになされることができる。
【０１２０】
直腸粘膜への適用については、坐剤又は浣腸剤又はミクロ浣腸剤は、そのような組成物を作るための当該分野の技術者に公知の賦形剤と一緒に、使用され得る。
【０１２１】
すでに記載のように、本発明の組成物は、カプセル、錠剤、トローチ剤、硬ゼラチン、軟ゼラチン、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルションの形態であることができた。経口投与について、組成物は、毎日の単位量又は毎日の単位量の画分の形態で作られ（例えば、治療する医師の判断に従って、２、３、４、５、６つ又はそれ以上のカプセル剤、錠剤、トローチ剤、顆粒剤又は粉末単回用量、又はゼラチンは、一日にわたって接種されることができる）、及び、例えば、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、及び／又はポリビニルピロリドンのような結合剤；ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、コメデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール及び／又はグリシンのような充填剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール及び／又はシリカのような錠剤潤滑剤；ジャガイモデンプンのような崩壊剤；及びラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤を含む従来の賦形剤を含んでもよい。錠剤は、標準の薬務において周知の方法に従って覆われることができる。
【０１２２】
組成物はまた、経口投与用の懸濁液、エマルション、溶液として、液体又は半液体の形態で作られることができ、任意に、口当たりのいい味を与える天然芳香剤を含むことができる。
【０１２３】
粉末又は顆粒の形態の組成物は、適切な容器に予め計量され、そのまま摂取することにより、又は水、お茶等のような適切な液体で再懸濁されて摂取することのいずれかによって、使用のために準備することができる。この場合においても同様に、組成物は口当たりのよい味を与える天然芳香剤を含むことができる。
【０１２４】
明らかに、上記賦形剤の全ては、薬学的に許容可能なグレードで使用されることができる。
【０１２５】
１つの態様において、本明細書中に記載されるような組成物は、上記態様のいずれか１つにおいて、医薬組成物の形態であることができ、すなわち、医薬品グレードの成分を含み、又はそれは、特定目的食品（医学的食品）中に又は医療デバイス中に存在させることができ、又は導入することができる。
【０１２６】
本明細書に記載の組成物は、医療デバイスに対する指令９３／４２／ＥＥＣ（条項の機械的な意味での「デバイス」だけではなく、物質も含む）に記載されるクラスのいずれか１つに従う医薬組成物又は医療デバイスの形態で、又は、医療食品、食品サプリメントの形態で、又は組成物が製造される国の規制条項に従ういずれかの態様で作成されることができる。
【０１２７】
医療デバイス又は医療食品はまた、成分として他の製品を含むことができ、その他の成分とは、例えば、ビタミン、ミネラル塩及びダイエットサプリメントで指示される他の物質の組み合わせを含む。
【０１２８】
したがって、本発明の画分の１つ以上又は本発明の組成物は、それらのバリア効果の性質のために有用であり、存在する場合、粘膜接着特性は、皮膚又は粘膜の保護が必要であり又は望ましい全てのそれらの場合において、それらは、粘膜又は皮膚を攻撃する薬剤が投与されなければならない場合であってもよく、したがって、薬剤の有害な作用を防止又は制限するために、又はそのより良好な、及びより迅速な治癒を可能にして、さらなる侵害からそれを守るために、部分的に易感染性の皮膚又は粘膜の保護が好ましく又は望ましい場合において、又は個体が皮膚又は粘膜が炎症又は変更を被る慢性疾患を有する場合において、それゆえ、バリア効果は、皮膚又は粘膜上での損傷を予防又は制限することができる。
【０１２９】
本発明はまた、開放創の存在を含まない皮膚病変の発現又は悪化の治療又は予防のための方法、又は開放創の治療のための方法に関し、そのような方法は、本発明の組成物の１つ以上の適用又は関連する部分上で１日当たり１回以上それを含む医療デバイスの１つ以上の適用を含む。
【０１３０】
例えば、組成物の適用は、必要なときはいつでも（例えば、失禁関連の発疹の予防の場合は、パッドを取り替えるごとに）、又は一般的に１日当たり１回、２回、３回、４回又はそれ以上、繰り返されることができる。
【０１３１】
本発明はまた、上記の態様のいずれか１つに係る組成物の調製のための方法に関し、有効成分が枯渇している、そして本明細書中に記載されるような粘膜接着特性及びバリア効果特性を与える成分に富むムギワラギク属の抽出物の画分（画分Ｂ、Ｄ）又はそれらの混合物は、上記のような皮膚軟化剤、消化剤、運動促進剤、胆汁分泌促進剤、駆風薬、プレバイオティクス、リラックス剤、賦形剤、保存剤、保湿性の性質を有する少なくとも１つの賦形剤及び／又は天然の物質及び／又はムギワラギク属と異なる植物の植物起源の物質と一緒に混合される。
【０１３２】
これらの中で、例えば、次の１つ以上が使用されることができる：ゲンチアナ根エキス、ボルド葉エキス、オオアザミ果実エキス、チョウセンアザミ葉エキス、タンポポ根エキス、アニス果実エキス、ローズマリー葉エキス、ミント葉エキス、マジョラム葉エキス、クミン果実エキス、コリアンダー果実エキス、生姜根エキス、ウイキョウ果実エキス、キャラウェー果実エキス、カモミール花エキス、アルテア根エキス、亜麻仁エキス、大麦エキス、炭、イヌリン。
【０１３３】
本発明の目的はまた、本発明の画分の１つ以上又は本発明の組成物の投与をそれを必要とする患者に提供する皮膚又は粘膜の保護的（予防的又は治癒的）治療のための方法である。そのような投与はまた、他の薬剤の投与に併用とすることもできる。
【０１３４】
本発明の画分において、又は組成物において、薬理学的有効成分の低減及び粘膜接着及びバリア特性の増大は、本発明の抽出物又は組成物と、共に投与される又は併用して投与される薬剤との間の相互作用の副作用が著しく起こりえないので、そのような製品を他の薬剤と併用の投与に特に適するものとする。
【０１３５】
皮膚又は粘膜の治療及び／又は予防の方法の非限定的な例は、治療する医師の判断に従って、１週間と６週間の間の期間、例えば３週間と６週間の間、又は６週間より長い時間、本明細書にしたがって混合物又は組成物の記載される、単回投与量又は複数投与量に細分される、毎日の投与量の投与を含むことができる。
【０１３６】
そのような投与は、治療される皮膚又は粘膜の健康状態を最適化するために、長い期間の間でさえ薬物の投与に先行することができる。
【０１３７】
治療する医師は、患者の健康状態、体重、性別及び年齢に基づいて最も適切な投与量と投与の時間の両方を確立する方法を知っているだろう。
【０１３８】
皮膚の構造と粘膜の構造の間の実質的な違いの１つは、粘膜における角質層などの選択的バリアの不存在によって表される。したがって、環境（汚染物質、病原微生物等）に存在する有害又は刺激性物質との口腔粘膜接触は、炎症性及び／又はアレルギー性の病態を引き起こす粘膜の内側と関連する気道（気管支、肺など）での両方の前記物質の高い浸透を引き起こすことができる。
【０１３９】
本発明の抽出物の画分の保護作用は、粘膜接着アッセイ及びバリア効果アッセイによって評価された。
【０１４０】
前者は、そのような製品が粘膜に付着する能力を有し、その結果、保護作用を発揮するかどうかを確立するために、試験下で、製品の粘膜接着性を評価することを目的とする。
本発明の画分で実施される細胞接着アッセイは、そのような製品が粘膜に付着する能力を有し、その結果、保護作用を発揮するかどうかを確立するために、試験下で、製品の粘膜接着性を評価することを目的とする。
【０１４１】
レシチン／糖タンパク質結合の阻害のパーセンテージの評価による、粘膜細胞に対する本発明の抽出物の粘膜接着性能力の評価
粘膜接着性は、レシチン／糖タンパク質結合の阻害のパーセンテージの評価によって決定される。このモデルにおいて、例えば、口腔、胃、腸又は膣細胞が使用され得る。細胞は、最初に膜糖タンパク質に存在するグルコシド及びマンノシド残基に対する高い親和性を有する、ビオチン化レクチン（Ｃｏｎ−Ａ）で処理された。したがって、粘膜の糖タンパク質の部位は、ビオチン化レクチンで占有されるだろう。レクチン中のビオチン（ビタミンＨ）の存在は、次の段階のために不可欠である。既にビオチン化レクチンで処理された細胞は、ストレプトアビジンを加えられ、ビオチンとトレプトアビジンの間の高い親和性のおかげで、タンパク質−グルコース−レクチン−ビオチン−ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体を形成することを可能にする。この点で、細胞は洗浄され、ペルオキシダーゼの存在のおかげで、オルト−フェニレンジアミンの酸化の反応によって、タンパク質−グルコース−レクチン−ビオチン−ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体が定量される。
【０１４２】
タンパク質／グルコース／レクチン／ビオチン／ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体は、重合反応：
【化２】
2017509695.tif 000005
を触媒する
【０１４３】
（λ＝４５０ｎｍを有する分光高度計を用いて測定される）溶液の黄色／オレンジ色の着色の強度は、糖タンパク質／レクチン結合の量に比例し、したがって、粘膜接着のために利用可能な部位（糖タンパク質）の量に比例する。このようにして求めた吸光度は、「対照」を構成する。
【０１４４】
以下に報告される粘膜接着アッセイにおいて、胃腸細胞は、レクチンを用いる処理前に、試験下の製品で、３０℃で約１５分間処理される。粘膜接着製品の存在下において、前記製品は、上記のように、対照と比較して、それらの粘膜接着性能力、サンプル中での信号の強さに比例して、レクチンの結合を阻害し、減少させるだろう。
【０１４５】
生成物の粘膜接着のパーセンテージ（％ＭＡ）は、以下のように決定される。
％ＭＡ＝（１−サンプル吸光度／対照吸光度）×１００
【０１４６】
バリア効果アッセイ
バリア効果アッセイは、環境汚染物質（ほこり、花粉、微生物等）との接触から薄い「絶縁」層、粘膜及び皮膚の形成を通じて、保護する最終製品及び／又は原料の能力を評価するために採用される生物学的タイプのインビトロアッセイである。
【０１４７】
アッセイは、外部侵略に対して保護膜を作成する目的で、皮膚及び／又は粘膜上に適用される製品によって発揮されるインビトロ作用を刺激するために開発された。
【０１４８】
そのモデルは、炎症剤との接触を受けた細胞が、引き起こされる炎症の程度に関係する量で、細胞外環境において予備炎症性のメディエータ（サイトカイン）を生成し、分泌するという原理を利用する；特定の範囲内で、正比例関係が、炎症剤への曝露の回数と濃度、及び放出されるサイトカインの量の間に存在する。
【０１４９】
採用される実験モデルは、半透膜（０．４μｍ細孔）によって物理的に分離される２つのチャンバを提供する。上部のチャンバが炎症剤を収容する一方、細胞は、下部チャンバで播種される；２つのチャンバを分離する半透膜上で、分析下のサンプルの薄膜は、存在する場合、炎症剤の自由な通過に対するバリア効果を強調するために階層化される。
【０１５０】
半透膜は、下部チャンバにおいて炎症剤の通過を可能にし、分析されるべきサンプルが階層化される担体を構成される。サンプルの「絶縁」能力に応じて、上部チャンバから底部チャンバのＬＰＳ移動の減少（したがって、サイトカイン生成に対する細胞のより小さい刺激）が持たれるだろう。
【実施例】
【０１５１】
例１
画分Ｂ及びＤの調製
低減する濃度でのエタノール中へのムギワラギク属の頂部からの２つの抽出ステップが実行される。すなわち、９６％エタノール中でのステップ、及び５％エタノール中でのステップを実施する。
【０１５２】
記載されるように得られたアルコール抽出物は、５０：５０の比率で集められ、３，５００ｒｐｍに等しい回転速度で１〜５分の間、遠心分離に供された；清澄アルコール画分を構成する析出物及び上清を得た。清澄アルコール画分は、標準プロトコルにしたがって、薄膜蒸留装置の使用で、エタノール蒸発によって濃縮され、約５００Ｌ／時の速度で、濃縮される抽出物の供給を提供した；操作は、０．６〜０．８バールの残留真空を設定することによるものであり、蒸留壁を加熱する流体は、１４０℃に設定され、それにより、エタノール除去後、濃縮された水性画分（画分Ｂ）及び析出物を得た。画分Ｂは、細胞上での粘膜接着アッセイによって測定される場合、６８％の値に等しい、高い粘膜接着力、及び約４９％に等しい本明細書中で記載されるアッセイによって測定されるバリア効果を有する。
【０１５３】
画分Ｂは、２５マイクロメートルのカットオフを有するパネルフィルター上でろ過された。
【０１５４】
したがって、得られたろ液は、２５００ダルトンのカットオフを有する膜上での限外ろ過／ナノろ過のステップに供され、及び／
それによって得られる限外ろ過／ナノろ過のろ液（画分Ｄ）は、細胞上での粘膜接着アッセイによって測定される場合、７４％の値に等しい高い粘膜接着力、及び開始抽出物のバリア効果に等しい本明細書中に記載のアッセイによって測定されるバリア効果を有する。
【０１５５】
例２
画分における総フラボノイドの測定
イソクエルシトリンとして表される総フラボノイドの決定
サンプル抽出：
０．３０ｇのサンプルを１００ｍｌのフラスコに正確に秤量した。１ｍｌのヘキサメチレンテトラアミン（５ｇ／ｌ）、５０ｍｌのアセトン及び２ｍｌの希釈ＨＣｌ（１００ｍｌの水中７０ｇ）を加え、それらを還流下で３０分加熱した。同じ抽出は、最初の抽出の残留物に他の２回繰り返し、３つの抽出物が、１００ｍｌのメスフラスコ中で一緒に集められた。
【０１５６】
そのように得られた２０ｍｌの溶液が分液漏斗に集められ、２０ｍｌの超純水を加え、続いて、まず１５ｍｌで、次に１０ｍｌの酢酸エチルでさらに３回、抽出を実施した。各抽出後、相を分離し、有機相を１００ｍｌの三角フラスコに回収した。集められた有機抽出物を第２の分離漏斗に導入した。他の２つの抽出は、（各５０ｍｌの）超純水の連続した部分で実施された。
【０１５７】
各抽出後、相が分離され、綿及び無水硫酸ナトリウムでろ過され、抽出物を５０ｍｌのフラスコ中にデカントし、次に酢酸エチルで容量にした。
【０１５８】
分析溶液：上記のように得られた１０ｍｌの溶液を２５ｍｌのメスフラスコに入れた。メタノール中酢酸溶液中の１ｍｌの塩化アルミニウム（５％ｖ／ｖメタノール中酢酸溶液中の２％ＡｌＣｌ３）が加えられ、それは、５％（ｖ／ｖ）メタノール中酢酸溶液を用いて体積にした。
【０１５９】
標準液。１０ｍｌのこの溶液を第２の２５ｍｌのメスフラスコ中に入れ、全体をＡｌＣｌ３の添加なしに５％ｖ／ｖメタノール中酢酸溶液を用いて容量にした。
【０１６０】
分光光度読み取り：
ＡｌＣｌ３との反応の３０分後、分析溶液の吸光度が、標準溶液をブランクとして用いて、４２５ｎｍで測定された。
【０１６１】
計算：
総フラボノイドの含有率は、以下の式を用いてイソクエルシトリンのモル吸光計数に基づいて計算された：
％＝（Ａ＊１．２５）／ｐ
Ａ＝分析溶液中で４２５ｎｍで測定された吸光度
Ｐ＝グラムで表されるサンプル重量
【０１６２】
例３
レクチン／糖タンパク質結合の阻害のパーセンテージの評価によって、粘膜細胞に対する本発明の画分Ｂ及びＤの粘膜接着性能力の評価
粘膜接着性は、腸粘膜細胞上のレクチン／糖タンパク質結合の阻害パーセンテージの評価によって決定された。
【０１６３】
１００万個の腸粘膜細胞（ＨＴ−２９  ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３８（登録商標））を含む２ｍｌの細胞懸濁液が調製され、次に本明細書中に記載されるような５ｍｌの画分Ｂ又はＤ及び対照として使用された非前処理細胞を用いた類似するサンプルで前処理された。細胞は、恒温槽中で３０℃でゆっくり撹拌しながら、１５分間インキュベートさせた。次に、それらを２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を捨て、それらをＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）緩衝液で３回洗浄した。
【０１６４】
次に、細胞（サンプル及び対照）をゆっくりと撹拌しながら、３０℃で３０分間５ｍｌのビオチン化レクチン（Ｃｏｎ−Ａ）１０ｍｇ／ｌで処理した。次に、それらを２０００ｒｐｍで５分、遠心分離し、その上清を捨て、それらをＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）緩衝液で３回洗浄した。ビオチン化レクチンですでに処理された細胞を、ゆっくり撹拌しながら３０℃で６０分間、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（５ｍｌのストレプトアビジンペルオキシダーゼ、５ｍｇ／Ｌ）で充填した。次に、それらを２０００ｒｐｍで５分、遠心分離し、その上清を捨て、それらをＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）緩衝液で３回洗浄した。
【０１６５】
各サンプル（各サンプルについて２５０，０００細胞）に、０．０５Ｍクエン酸リン酸及びＨ２Ｏ２中で２．５ｍｌのＯ−フェニレンジアミン（ｏ−ｐｄ）を、０．０４％に等しい最終濃度にまで添加した。２分後、反応を１ＮのＨ２ＳＯ４で停止した。タンパク質−グルコース−レクチン−ビオチン−ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体は、その後、ペルオキシダーゼの存在のおかげで、オルト−フェニレンジアミンの酸化の反応によって、分光光度計読み取り（λ＝４５０ｎｍ）によって定量された。
【０１６６】
タンパク質／グルコース／レクチン／ビオチン／ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体は、重合反応：
【化３】
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を触媒する
【０１６７】
溶液の黄色／オレンジ色の着色の強度は、糖タンパク質／レクチン結合の量に比例し、したがって、粘膜接着のために利用可能な部位（糖タンパク質）の量に比例する。したがって、決定される吸光度の値は、「対照」を構成する。上述したように、粘膜接着性製品の存在下で、粘膜細胞へのレクチン結合の阻害があり、これは上記に記載されるように、対照と比較して、サンプルにおける信号強度の、分析されるサンプルの粘膜接着性能力に比例した減少につながる。粘膜接着性能力は、次の式にしたがって、糖タンパク質／レクチン結合の阻害のパーセンテージとして、又は製品の粘膜接着のパーセンテージとしてより良く表される：
％ＭＡ＝（１−サンプル吸光度／対照吸光度）×１００
【０１６８】
例４
参照抽出物について、画分Ｂ及びＤのそれぞれに対して実施されるバリア効果アッセイ
バリア効果アッセイについて、半透膜（０．４μｍ細孔）によって物理的に分離された２つのチャンバが使用された。ヒト線維芽細胞は、下部チャンバで播種され、一方、炎症剤ＬＰＳ（精製された大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）リポ多糖）が上部チャンバに導入され、２つのチャンバを分離する半透膜上で、本発明で記載されるような抽出物の画分の薄膜が階層化された。
【０１６９】
誘導された炎症反応は、下部チャンバの培地中に放出されるインターロイキン６（ＩＬ６）サイトカインの半定量的な用量によって評価された：バリア効果の評価が、陽性対照との比較によって得られ、ここで２つのチャンバは、いかなるバリアのない、同じタイプの半透膜によって分離された。
【０１７０】
物質の階層化された膜によって及ぼされるバリア効果が大きければ大きいほど、上方チャンバにおける炎症性薬剤が、半透過性チャンバを横切るために大きな困難性を有するであろうから、下方のチャンバに存在する細胞で観察される炎症作用は小さくなる。
【０１７１】
物質が本明細書中で報告されるアッセイにおいてバリア効果を引き起こすと言われるだろう上記閾値に関して、バリア効果を有することが公知の物質で実施されたアッセイに基づいて、アッセイのセットアップの間、対照と比較して１５％に等しい阻害の値が、発明者によって確認された。
【０１７２】
次に、本明細書中に記載されるような抽出物の画分のバリア効果が評価された。
【０１７３】
以下に報告されるデータは、参照抽出物と比較して、明細書に記載の抽出物の画分が、いかに顕著なバリア効果を有するかを示す。
【０１７４】
インビボで皮膚及び粘膜に適用した場合、評価分析は、環境要因に対して「絶縁」膜を形成する物質及び製剤の保護作用をインビトロで刺激するために開発された方法により、以下のように実施された。
【０１７５】
モデルは、炎症性薬剤との接触に供される細胞が、引き起こされる炎症の程度に関連する量で、細胞外環境中に前炎症メディエータ（サイトカイン）を生成し、分泌する原理を活用している。細胞に到達する炎症剤の量が大きいほど、放出されるサイトカインの量は大きくなる。
【０１７６】
モデルは、半透膜によって物理的に分離される２つのチャンバの配置を想定し、これは十分に小型の溶質の通過を可能にする。
【０１７７】
細胞培養のためのプレートを含むウェルからなる下部のチャンバにおいて、ＨｕＤｅ細胞（番号ＢＳ  ＰＲＣ  ４１、イタリアのＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  ｄｉ  Ｂｒｅｓｃｉａから購入した）を増殖させ、一方、複雑な細胞培養のためのインサート（トランスウェル）からなる上部チャンバは、炎症剤を収容する。
【０１７８】
２つのチャンバを分離するインサートの半透膜の表面上で、上部チャンバにおける炎症剤の導入前に、試験されるサンプルの薄膜が、炎症剤の自由な通過の際に、任意のＢＥを評価するために階層化される。
【０１７９】
サンプルの絶縁能力の関数として、上部チャンバから炎症剤の移行の減少が生じることがあり、結果として、サイトカインを生成する細胞の刺激がより少なくなる。炎症反応の程度は、下部チャンバの培地に放出されるサイトカイン、特にインターロイキン６（ＩＬ−６）の半定量的な用量によって推定される。
【０１８０】
対照として、サンプルが膜上に階層化されず、したがって、半透膜に加え、何らバリアなしに、炎症剤の効果を測定することを可能にする類似する実験が使用される。
【０１８１】
さらに培養細胞が、マーカーの放出を誘導するために適用される物質で前処理され、サンプルが、前記物質の非存在下で半透膜上に設置され、したがって、時間内に１つ以上の測定が、前記内部コントロールの培地において、マーカーの定量について実施をされる内部コントロールが使用さる。したがって、内部コントロールでは、細胞が誘導物質で最初に刺激され、次に膜を通過し、上記培地によって押されて細胞に入ることができるサンプルが、バリア効果に関連しないマーカーの放出を減少させることに効果を有するかどうかが評価されなければならない。例えば、炎症剤が誘導物質として使用される場合、内部コントロールによって、培地においてサイトカインの濃度の減少が、バリア効果によるものであるかどうか、又は上記培地によって押されて細胞中に入ることができるサンプルが、バリア効果とは独立に炎症反応を減少させる効果を有するかどうかを理解することができる。
【０１８２】
バリア効果（ＢＥ）は、ＩＬ−６の放出の減少のパーセンテージとして表され、陽性対照との比較によって計算され、２つのチャンバは、サンプルによって作成されるバリアなしに、同じタイプの半透膜によって分離される。
【０１８３】
４．１  細胞培養の準備
各分析されるサンプルについて、ＨｕＤｅ系細胞が、バリアアッセイ（ＢＡ）のためのもの、及び１０％ウシ血清（ＦＢＳ）で補われたＭＥＭ培地中で、４０，０００細胞／ｍｌの密度での内部対照としての別のものである、細胞培養プレートのウェルに播種された；ウェル当たり１ｍｌの細胞懸濁液。
【０１８４】
細胞がサンプル（ＣＡＭ）、陽性対照（Ｃ＋）（サンプルなしの炎症剤）及び陰性対照（Ｃ−）（培地のみ）で処理され、各アッセイが３重で実施された。
【０１８５】
プレートを３７℃で一晩（２２〜２４時間）、インキュベートした。
【０１８６】
４．２  複雑な細胞培養のためのインサートの準備
複雑な細胞培養のための細胞培養インサート（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）が、他のプレート上に置かれ、それらの各々の上で、０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンの固定量が供給された。プレートを３７℃で、一晩（２２〜２４時間）、インキュベートした。
【０１８７】
４．３  細胞の密集度の状態及びレベルの確認
実験を進めるためには、９５％以上の密集度が要求される。
【０１８８】
４．４  コラーゲン層乾燥
インサートを有する２つのプレート（ＢＡ及びＩＣ）から、コラーゲンが除去され、インサートは、それらを完全に乾燥させるために必要な時間、フードの流れの下で、放置された（１０〜１５分）。
【０１８９】
４．５  バリアアッセイ（ＢＡ）
以下に記載されるステップが、ＢＡに対する培養プレートで実施された。
【０１９０】
ＢＡのサンプル層の設定：
サンプルの半透膜上で、本発明で記載される抽出物（２％）の画分のそれぞれ（アッセイがそれぞれの画分について実施された）に基づく１００μｌの組成物が、インキュベートされ、２０分間、階層化することができた、一方、Ｃ＋及びＣ−インサートにおいて、何も添加されなかった。２０分が経過すると、プロトコルに記載される手順にしたがって、過剰なサンプルを除去し、膜をＰＢＳで洗浄した。
【０１９１】
ＢＡインサートに対するＬＰＳ（炎症剤）の添加
サンプル層を乾燥させたら、最初に３つのＣＡＭインサート及び３つのＣ＋のＣＡＭインサートにおいて、３００μｌのＬＰＳ（膜リポ多糖）溶液が１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートされ、一方、残りの３つのＣ−において、５％ＦＢＳを有するＭＥＭ培地の３００μｌが添加された。インサートは、細胞を有するそれらのそれぞれのウェルにおいて挿入され、プレートは、１時間、３７℃で、５％ＣＯ２に富む雰囲気下で、一晩（２２〜２４時間）、インキュベートされた。
【０１９２】
１時間のインキュベーションが完了すると、インサートを除去し、廃棄し、プレートを再び一晩（２２〜２４時間）、インキュベートした。
【０１９３】
４．６  内部対照（ＩＣ）アッセイ：
内部対照アッセイが、ＢＡと同時に実施された。
【０１９４】
ＬＰＳへのＩＣ細胞の曝露：
乾燥されると、ＩＣの最初の６つのインサート、すなわち、分析されるべきサンプルＣＡＭについて３つ、及びＣ＋について３つにおいて、３００μｌのＬＰＳ溶液がインキュベートされ、一方、残り３つのＣ−において、培地の３００μｌが加えられた。
【０１９５】
次に、ＬＰＳ及びＭＥＭを有するインサートは、ＩＣ細胞を有するウェルに挿入され、すべてを１時間、インキュベートした。
【０１９６】
ＬＰＳ除去及びＩＣ膜乾燥：
１時間のインキュベーションが完了すると、インサートを細胞を有するウェルから除去し、空のプレートに移し、一方、細胞を有するプレートをインキュベーターに入れた。
【０１９７】
まだ存在するＬＰＳ溶液をインサートから除去し、後者を超純滅菌水で急速洗浄にかけ、乾燥させた。
【０１９８】
ＩＣにおけるサンプル層の配置：
サンプルのための３つのインサートの半透膜上で、本発明に係る抽出物（２％）の画分のそれぞれに基づく１００μｌの組成物がインキュベートされ、２０分間、階層化させたが、一方、Ｃ＋及びＣ−インサートにおいて、何も添加されなかった。２０分が経過すると、プロトコルに記載の手順に従って、過剰なサンプルが除去され、膜をＰＢＳで洗浄した。
【０１９９】
ＩＣインサートに対するＬＰＳの添加
サンプルでのインサートが準備されると、３００μｌの培地が全てのインサート（ＣＡＭ、Ｃ＋、Ｃ−）に添加された。インサートは、細胞を有するそれらのそれぞれのウェルに挿入され、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。
【０２００】
１時間のインキュベートが完了すると、インサートを除去し、廃棄し、プレートを再び、一晩（２２〜２４時間）、インキュベートした。
【０２０１】
４．７  上清回収及び酵素免疫測定法
２２〜２４時間が経過すると、上清をＥＬＩＳＡアッセイ及びＩＬ−６の半定量的な投薬を実施するために、ＢＡ及びＩＣプレートから回収した。
【０２０２】
バリア効果（ＢＥ）の評価
物質又は化合物のＢＥは、ＬＰＳに曝露された細胞によって、ＩＬ−６サイトカインの放出の低減％として表され、サンプルは、陽性対照（Ｃ＋）と比較して分析され、細胞は、ＬＰＳに曝露しておくだけとする。
ＢＥ＝ＩＬ−６サイトカインの放出の低減％＝１００−［（サンプルから放出されるサイトカインｐｇ／μＬ／Ｃ＋から放出されるサイトカインｐｇ／μＬ）×１００］
【０２０３】
上記で報告される表１は、試験されるムギワラギク属の初期の抽出物が、検出可能な粘膜接着効果を有しないことを示すが、一方、画分Ｂ及びＤは、開始抽出物に関する画分のバリア効果特性の維持又はその増加に関連する開始抽出物（測定不能なＢＥ抽出物、測定可能な前記ＢＥ抽出物の画分Ｂ及びＤ）より非常に優れた粘膜接着効果を有する。
【０２０４】
得られたデータは、本発明の画分が、記載され、請求される使用に適することを示す。
【図１】
2017509695.tif 000007
【国際調査報告】
2017509695.tif 000008