(57)【要約】本発明は気圧測定に基づく定量分析方法を提供し、無機イオン、小分子、タンパク質やＤＮＡを例とする生体高分子、ないしウイルス、細菌、細胞などの多種の標的の高感度定量分析に使われる。本発明は酵素又はナノ粒子などで、オキシドールが大量の気体を生成することを触媒し、測定標的分子の信号をガスの圧力信号に転換させることで、信号の増幅を実現し、最後は気圧計を通して圧力を電子信号に転換させて読み取り、高感度の定量測定を実現する。本発明では、気圧計を使用して三つの異なった測定体系、其々ＥＬＩＳＡ体系、ＤＮＡハイドロゲル、機能化ＤＮＡセンサーで、本発明の実行性、広い適用性及び信頼性を証明する。【代表図面】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法であって、
密閉した体系の中に、分子識別で信号増幅分子又は粒子を導入し、信号増幅分子又は粒子を通して基質からガス分子を放出させることを触媒し、密閉した体系の圧力を増強させ、反応測定体系の圧力変化を測定することで標的の濃度を測定することを特徴とする気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項２】
前記分子識別は、特異性識別機能を備える分子を利用し、前記標的を識別又はマークし、且つ前記識別分子で信号増幅分子又は粒子を測定体系に導入することを含むことを特徴とする請求項１に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項３】
分子識別技術を利用して前記標的を識別又はマークし、前記標的はタンパク質、核酸、ペプチド鎖、糖類、脂肪類、有機小分子、無機イオン、細胞、細菌又はウイルスの中の少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項２に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項４】
前記信号増幅分子は基質を触媒してガスを発生させる触媒又は酵素を含み、触媒基質は触媒された後にガス分子を発生する物質であり、ガス分子は基質が触媒された後の産物であることを特徴とする請求項１に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項５】
前記信号増幅分子はカタラーゼ、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、金−白金ナノ粒子、マンガン酸化物ナノ粒子又は基質を触媒してガスを発生させる他の触媒又は酵素であることを特徴とする請求項４に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項６】
前記密閉した体系の中に、それの反応測定体系は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）体系、ＤＮＡハイドロゲル体系、機能化ＤＮＡセンサー体系の中の少なくとも一種であることを特徴とする請求項１に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項７】
前記酵素結合免疫吸着法体系において、気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法は、
測定必要性のある抗原に基づき、対応する捕捉抗体及び測定抗体を選択し、
信号増幅分子を修飾し、測定抗体とカップリング結合させ、又は測定抗体と特異的に結合させ、
多孔板又は磁気ビーズ又はミクロスフェア又は他の酵素結合免疫吸着法に使われる固相の表面を包み、捕捉抗体を入れて包まれた固相の表面と結合させた後に、密閉液で密閉させ、測定待ち抗原を入れてから測定抗体を入れてサンドイッチ構造を形成し、余計な測定抗体を洗い除き、
信号増幅分子を導入し、
多孔板に基質を入れ、反応キャビティを密閉し、信号増幅分子で基質分子を触媒して大量のガス分子を生成させ、気圧計に読み取ることのできる圧力変化信号を発生し、
気圧計で示す圧力変化値に基づき、標的分子の定量測定を実現する、
というステップを含むことを特徴とする請求項６に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡハイドロゲル体系において、気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法は、
二つのアクリルアミド／ＤＮＡ高重合鎖、一つの核酸アプタマー分子を信号増幅分子と混合し、信号増幅分子を包む核酸アプタマーの架橋ハイドロゲルを製造し、
異なる既知濃度の分析物を含む溶液を前記のハイドロゲルに入れて反応させ、信号増幅分子を放出し、
反応が終わった後に、反応上澄み液を取って反応試験管に置き、信号増幅分子を基質と触媒反応させ、
密閉した体系に発生する大量のガスで体系中の圧力が高くなり、気圧計で読み取り、且つデータを記録し、それによって標準曲線を作り、未知サンプル中の標的含有量を測定する、
という工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項９】
前記機能化ＤＮＡセンサー体系において、気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法は、
標的分子に対して適合する核酸アプタマーを選び、核酸アプタマーに捕捉プローブと相補する序列を添加し、
核酸アプタマーの序列に基づき、適合する検出プローブの序列を設計し、標的分子は存在していない時に、検出プローブを塩基同士間の相互作用で、核酸アプタマー鎖と結合させ、標的分子は存在する時に、検出プローブより競合性があり、
脱炭酸反応又はビオチン−親和素の相互作用を含む生物又は化学的カップリング方法を利用し、捕捉プローブを磁気ビーズの表面につけ、測定ＤＮＡ及び核酸アプタマーを入れて磁気ビーズの表面に機能化ＤＮＡのサンドイッチ交雑構造を形成させ、
ＤＮＡのサンドイッチ交雑構造に標的を入れ、標的は核酸アプタマーと結合して三鎖構造上の検出プローブを置換し、
磁石で磁気ビーズを集め、上澄みを取って反応試験管の中に入れ、同時に溶液相の基質を入れ、信号増幅分子が溶液相基質に作用して気圧計に読み取られる信号分子を発生させ、
気圧計に示す数字に基づき、測定結果を記録する、
という工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項１０】
前記検出プローブに、基質を触媒して大量のガスを放出させる信号増幅分子がカップリングされていることを特徴とする請求項７に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【請求項１１】
核酸アプタマーと標的分子との結合を利用し、標的分子は存在している時に、信号増幅分子がカップリングされている検出プローブより競合性があり、且つ後続の信号増幅を実現することを特徴とする請求項９に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法に関し、無機イオン、小分子、生体高分子、特にタンパク質、ＤＮＡ、ないしウイルス、細菌、細胞などの多種の標的の高感度定量に使われる。
【背景技術】
【０００２】
斬新、高感度、高選択性で、安価、便利な定量測定分析方法を開発することは常に科学研究活動の中で、最も人気のある課題である。従来の定量測定分析方法は通常、各種の大型精密設備、例えば、分光器、質量分析装置、クロマトグラフ装置、電気泳動などに依存している。これらの定量分析方法は長年の開発を経て、成熟した測定方法や技術を確立しており、生物、化学、医学、食品等の多分野のサンプル測定や分析、例えば、各種の有機小分子、生体高分子乃至細菌、ウイルス、細胞などに広く運用されている。しかし、質量分析、クロマトグラフや電気泳動であれ、分光器であれ、高感度の定量測定や分析を実現するためには、設備の精密程度や測定部品の感度に対する要求が高いので、測定装置や測定試験のコストを下げることは困難である。
【０００３】
光学に基づく定量分析装置を例にすると、よくみられるのは紫外−可視分光光度計、紫外線分光計、蛍光分析計等である。高感度の精確的な定量測定分析を実現するためには、これらの装置には複雑且つ精密な光路部品、例えば、ライトカーテン、フィルター、レンズ組が必要であることに加え、十分に訓練された操作員によって設備を精確に操作する必要もある。それ以外に、設備の感度を向上するために、高出力の光源を提供して光学信号を集中させ増加させる必要がある。同時に、光学に基づく測定方法は測定体系に対する要求が極めて高い。一方で、測定体系の成分をあまりにも複雑にすることはできない。標的以外の分子又は物質が測定標的分子と類似な光学特性を持っている時に、測定の正確性を深く影響するので、光学測定体系においては、複雑な前処理を実施してこの問題を避けることが一般的である。他方で、全ての分子には良好な光学特性があるわけではないので、通常は、分子識別技術を用いて分子の標識や信号増幅を行い、例えば、酵素結合免疫法は免疫学的方法を利用し、蛍光特性又は光学吸収特異性のある産生物を触媒・発生させ、標的抗原の測定を実現する（１、Ｅｎｇｖａｌｌ  Ｅ、Ｐｅｒｌｍａｎｎ  Ｐ．Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｊ］、１９７１、８（９）：８７１−８７４．）。前記の問題いずれによっても、光学定量測定方法のコストを下げることが一層難しくなる。そのため、安価で実行でき且つ感度の良い定量測定方法の開発が日々研究者の関心を引き起こしている。
【０００４】
同時に、技術の発展、及び科学や生命への意識が高くなるとともに、人間は実験室の費用と手間がかかる実験測定に満足できなくなり、技術を生活運用と結合し、「科学技術は生活を変える」を確実に実現する希望は差し迫っている。例えば、「即時診断」という概念は日々注目されている（２、Ｒ．Ｊ．Ｄａｖｉｅｓ、Ｓ．Ｓ．Ｅ．、Ｓ．Ｊ．Ｃａｒｌｉｓｌｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｉｐｓ、Ｗｉｌｅｙ、Ｈｏｂｏｋｅｎ［Ｍ］．２００８．；３、Ｌｉｕ、Ｈ．、Ｘｉａｎｇ、Ｙ．、Ｌｕ、Ｙ．、Ｃｒｏｏｋｓ、Ｒ．Ｍ．、Ａｐｔａｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｏｒｉｇａｍｉ  ｐａｐｅｒ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ［Ｊ］．２０１２、５１．６９２５−８．；４、Ｌｉｕ、Ｊ．Ｗ．、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ａｓ  ｓｔｉｍｕｌｉ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ［Ｊ］．２０１１、７．６７５７−６７６７．）。いわゆる「即時診断」（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔ、ＰＯＣ  Ｔｅｓｔ）とは、発病又は事件が発生した場所で、即時に測定、診断し、それにより、迅速な監視制御や治療を実現する。現代のＰＯＣ測定方法は通常免疫分析技術を利用し、つまり、特異性抗体は抗原と結合して目標物を捕捉して分析する。病気特異性目標蛋白の標識物を測定の目標として、病気の診断を実現する。例として、妊娠測定試薬キットは妊娠ホルモンのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を標的とする。しかし、精密装置のサポートを失うと、ＰＯＣ測定の感度は必ず影響される。現有のＰＯＣ測定は通常定性又は半定量測定しか実現できないので、病気又は身体状況の精確な診断が実現できない。そのため、ＰＯＣ測定は即時診断や緊急状況対応に対してある程度の情報を提供できるにもかかわらず、もっと高速に臨床治療にもっと精確な根拠を提供することはできない。小型、同時に高感度の高速・安価な測定方法の構築が目前に迫っている。
【０００５】
以上のようにして、将来の科学研究では、実験方法の高感度、高選択性、高正確性などのメリットを影響しないと同時に測定装置や実験コストを顕著に下げ、又は、実験室の高感度、高選択性、高正確性等の実験要求を実現し、小型、携帯、低エネルギー消耗などのメリットを有する、即時診断に応用できる定量測定分析方法の開発は急迫に解決すべき問題になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は現有高感度定量測定分析方法及び装置の値段が高い、実験方法コストが高いなどの欠点に対し、気圧測定に基づく高感度、高選択性、高正確性と同時に、安価で携帯的な定量測定分析方法を提供し、この方法は実験室の高感度、高選択性の無機イオン、小分子、生体高分子のタンパク質、ＤＮＡ、乃至ウイルス、細菌、細胞などの多種標的の高感度定量に使われる以外、高速な高感度ＰＯＣ定量測定分析にも使える。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の技術案は以下である。
気圧に基づいて標的を測定する高感度、通用する定量測定方法は、密閉した体系の中に、分子識別で信号増幅分子、例えば酵素、又はナノ粒子を導入し、信号増幅分子又は粒子を通して基質から大量のガス分子を放出することを触媒し、体系の圧力を増強させ、体系の圧力変化を通して標的濃度の高感度定量測定を実現する。
【０００８】
その中、前記分子識別技術は、抗体、核酸アプタマー、核酸プローブなど特異性識別機能を備える分子を利用し、標的を識別又はマークし、且つ前記識別分子で信号増幅分子又は粒子を測定体系に導入することである。
【０００９】
その中、分子識別技術を利用して標的を識別又はマークし、標的はタンパク質、核酸、ペプチド鎖、糖類、脂肪類、有機小分子、無機イオン、細胞、細菌、ウイルスを含むが、それらに限らない。
【００１０】
その中、信号増幅分子はカタラーゼ、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、金−白金ナノ粒子、マンガン酸化物ナノ粒子又は基質を触媒してガスを発生する他の触媒又は酵素であり、触媒基質は触媒された後にガス分子を発生する物質（例えばＨ２Ｏ２）であり、ガス分子は基質が触媒された後の産物（例えばＯ２）である。
【００１１】
その中、密閉した体系の中に、その反応測定体系は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）体系、ＤＮＡハイドロゲル体系、機能化ＤＮＡセンサー体系の中の少なくとも一種である。
【００１２】
酵素結合免疫吸着法体系において、気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法は好ましくは以下のステップを含み、
測定必要性のある抗原に基づき、対応の捕捉抗体及び測定抗体を選択し、
信号増幅分子を修飾して測定抗体分子とカップリング結合させ、又は測定抗体と特異的に結合させ、
多孔板（例えば９６ウェルプレート）又は磁気ビーズ又はミクロスフェア等の酵素結合免疫吸着法に使われる固相の表面に包み、捕捉抗体を入れて包まれた固相の表面と結合させた後に、密閉液で密閉し、測定待ちの抗原を入れてから測定抗体を入れてサンドイッチ構造を形成し、余計な測定抗体を洗い除き、
信号増幅分子を導入し、
多孔板に基質を入れ、反応キャビティを密閉し、信号増幅分子で基質分子を触媒して大量のガス分子を生成させ、気圧計に読取れる圧力信号を発生させ、
気圧計に示す圧力変化値に基づき、標的分子の定量測定を実現する。
【００１３】
その中、多孔板の表面を捕捉抗体が吸着する固相表面として、標的分子の捕捉に使うことができる。磁気ビーズ又はミクロスフェアを捕捉抗体が吸着する固相の表面として、磁場又は遠心などの方法で、標的分子の捕捉を実現することもできる。
【００１４】
その中、信号増幅分子又はナノ粒子を導入する方法として、測定抗体を直接カップリング標記してもよい、又は、特異性識別測定抗体の分子を信号増幅分子又はナノ粒子の修飾に使うこともよい、測定抗体が標的分子と結合した後、信号増幅分子又はナノ粒子を測定抗体と結合させ、信号増幅分子又はナノ粒子にもっとよい通用性や適用性を備わらせる。
【００１５】
ＤＮＡハイドロゲル体系において、気圧測定に基づく多種の標的の即時可視化した定量測定方法は好ましくは以下の工程を含み、
二つのアクリルアミド／ＤＮＡ高重合鎖、一つの核酸アプタマー分子を酵素分子又はナノ粒子と混合し、架橋ハイドロゲルを製造し、
異なる既知濃度の分析物を含む溶液を前記のハイドロゲルに入れて反応させ、酵素又はナノ粒子を放出し、
（３）反応が終わった後に、反応上澄み液を取って反応試験管に置き、信号増幅分子を基質と触媒反応させ、密閉した体系に発生した大量のガスで、体系中の圧力が高くなり、気圧計で読み取り、データを記録し、さらに標準曲線を作り、未知サンプル中の標的含有量を測定する。
【００１６】
その中、二つのアクリルアミド／ＤＮＡ高重合鎖、一つの両端がそれぞれ二つの高重合鎖の上のＤＮＡ序列と相補・対合できる核酸アプタマーを利用し、ＤＮＡハイドロゲルを形成する。
【００１７】
その中、酵素分子又はナノイオンを形成したＤＮＡハイドロゲル中のＤＮＡ三鎖構造で形成したキャビティの中に包み、分子間の立体障害を利用し、自由拡散できないように、酵素分子又はナノイオンを制限する。標的が存在している時に、核酸アプタマーに構造変化が発生し、ＤＮＡハイドロゲルが瓦解し、中の酵素分子又はナノ粒子を放出する。
【００１８】
機能化ＤＮＡセンサー体系において、気圧測定に基づく多種の標的の即時可視化した定量測定方法は好ましくは以下の工程を含み、
標的分子に対して適合する核酸アプタマーを選び、核酸アプタマーに捕捉プローブと相補する序列を添加し、
核酸アプタマーの序列に基づき、適合する検出プローブの序列を設計し、標的分子は存在していない時に、検出プローブを塩基同士間の相互作用で、核酸アプタマー鎖と結合させ、標的分子は存在する時に、検出プローブより競合性があり、
生物又は化学的カップリング方法、例えば、脱炭酸反応又はビオチン−親和素の相互作用を利用し、捕捉プローブを磁気ビーズの表面につけ、検出ＤＮＡ及び核酸アプタマーを入れて磁気ビーズの表面に機能化ＤＮＡのサンドイッチ交雑構造を形成させ、
ＤＮＡのサンドイッチ交雑構造に標的を入れ、標的は核酸アプタマーと結合して三鎖構造上の検出プローブを置換し、
磁石で磁気ビーズを集め、且つ上澄みを取って反応試験管の中に入れ、同時に溶液相の基質を入れ、信号増幅分子は溶液相基質に作用して気圧計に読み取ることのできる信号分子を産生し、
（６）気圧計に示す数字に基づき、測定結果を記録する。
【００１９】
その中、検出プローブに、基質を触媒して大量のガスを放出する信号増幅分子がカップリングされて、例えば、酵素又はナノ粒子である。
【００２０】
その中、核酸アプタマーと標的分子との結合を利用し、標的分子は存在している時に、信号増幅分子がカップリングされている検出プローブより競合性があり、且つ後続の信号増幅を実現することができる。
【００２１】
その中、ステップ（３）に使われる磁気ビーズをミクロスフェア又は多孔板で取り替えることができ、それに対応して、とり替えられない検出プローブを除く方法として、遠心（ミクロスフェア）又は直接上澄みを吸い取る（多孔板）方法を使用してもよい。
【００２２】
その中、使用している検出プローブは化学又は生物のカップリング方法で、信号増幅分子（酵素又はナノ粒子）とカップリングし、検出プローブの特異性で酵素又はナノ粒子を導入する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のメリットは、まず、この方法は設計の面で、ＡＳＳＵＲＥＤ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ａ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｓ．、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ  Ｇ．、ｅｔ．ａｌ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｗｏｒｌｄ：Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｐａｐｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｊ］．２０１０、８２．３−１０．）という国際標準に符合すると同時に、感度が高い、選択性がよい、測定結果が信頼できる。その中、Ａｕ＠ＰｔＮＰｓには長時間触媒、保存しやすいなどのメリットがある。Ａｕ＠ＰｔＮＰｓがＨ２Ｏ２との反応時間を延長することで、超低標的の測定が実現でき、発生したＯ２の体積量を圧力に転化させた上で、標的濃度と気圧計表現値の定量関係を築いた。また、ＳＥＬＥＸ技術の高速な発展により、現在にはたくさんの使用できる核酸アプタマーがある以外、ＳＥＬＥＸを通してもっと広い標的の核酸アプタマーを選別することもでき、ハイドロゲル及び機能化ＤＮＡセンサー体系の中に、特異性核酸アプタマー序列を簡単に取替えて、我々の発展方法をもっと多い他の標的の高速、定量分析に使うことができる。その以外、ＥＬＩＳＡ体系においで、伝統のＥＬＩＳＡは、標識したＨＲＰ酵素又は他の酵素の顕色反応を利用して抗体又は抗原の定量測定を実現するので、それは大型装置に依存する必要があることは、実験室又は病院に使用する必要があることを指し、即時診断が実現できない。本発明では、簡単な気圧計だけで、定量測定が実現でき、且つ、抗体抗原を簡単に交換するだけで、異なる抗原の測定が実現できる。コストが安価で、測定が速く、使用が便利、及び気圧計の広い運用で、気圧測定に基づく可視化した定量測定方法は公衆に広く使われる標的の定量測定工具に発展できる。
【００２４】
本発明の測定方法は感度が高く、且つ、操作が簡単で、値段が安く、反応が速く、サンプルへの複雑な前処理が要らないなどのメリットがあり、且つ、通用性が良いので、複雑体系にも使え、生体小分子、重金属イオン、タンパク質などを含む各種物質の高速、高感度の定量測定に使われる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】は室温で、違う濃度のカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）が９．７９ＭのＨ２Ｏ２での触媒効率である。
【図２】は室温で、違うＨ２Ｏ２濃度で、５ｎＭカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）の触媒効率である。
【図３】は室温で、違うＨ２Ｏ２濃度で、０．００５ｎＭ  Ａｕ＠ＰｔＮＰｓの触媒効率である。
【図４】は室温で、カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）、ＡｕＮＰｓ、Ａｕ＠ＰｔＮＰｓの触媒効率比較である。
【図５】は室温で、気圧を輸出方式として、Ｈ２Ｏ２濃度が９．７９Ｍである時の、違う濃度のＡｕ＠ＰｔＮＰｓが１時間以内の触媒効率である。
【図６】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、信号方法分子がＢｉｏｔｉｎ化されたカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）が１時間以内に、ＥＬＩＳＡ  Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白測定に使い、カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）の触媒活性を考察する。
【図７】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、通常ＥＬＩＳＡ標的の人の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の蛋白体系組替の実行性の検証である。
【図８】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、ナノ粒子を使って異なる濃度の標的蛋白、標的の人の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の蛋白組替の実行性の検証である。
【図９】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、人の血清蛋白（ＨＡＳ）、ヤギ抗マウス二次抗体（ＩｇＧ）、基質金属蛋白酵素（ＭＭＰ）、トロンビン（Ｔｈｒ）をネガティブコントロールとして、この体系の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の選択性を考察し、図は１２０μＭ  ＨＳＡ、ＩｇＧ、ＭＭＰ、Ｔｈｒ、ＰＳＡに対する反応で、反応時間は１時間である。
【図１０】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、通常ＥＬＩＳＡを標準方法として、ナノ粒子を使って異なる濃度の標的蛋白、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を測定する正確性の考察である。
【図１１】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、通常ＥＬＩＳＡ  Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白体系の実行性の検証である。
【図１２】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、ナノ粒子を使って、異なる濃度の標的蛋白、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白の測定である。
【図１３】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、ヤギ抗マウス二次抗体（ＩｇＧ）、人の血清蛋白（ＨＡＳ）、甲型Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ）をネガティブコントロールとして、この体系のＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白の選択性を考察し、図は１２０μＭ  Ｈ５Ｎ１、ＩｇＧ、ＨＳＡ、Ｈ３Ｎ２、ＳＡＲＳへの反応で、反応時間は１時間である。
【図１４】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、血清環境で、ナノ粒子を使って異なる濃度の標的蛋白、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白の測定である。
【図１５】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、通常ＥＬＩＳＡの人の基質金属蛋白酵素（ＭＭＰ９）の蛋白組替体系の実行性の測定である。
【図１６】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、ナノ粒子を使い、異なる濃度の標的蛋白、人の基質金属蛋白酵素（ＭＭＰ９）の蛋白組替体系の実行性の測定である。
【図１７】は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、トロンビン（Ｔｈｒ）、リゾチーム（Ｌｙｓ）、ヤギ抗マウス二次抗体（ＩｇＧ）、人の血清蛋白（ＨＳＡ）をネガティブコントロールとして、この体系の人の基質金属蛋白酵素（ＭＭＰ９）の選択性を考察し、図は１２０μＭ  ＭＭＰ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ＩｇＧ、ＨＳＡへの反応で、反応時間は１時間である。
【図１８】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のコカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）の測定に使い、反応時間は５分間である。
【図１９】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のコカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）の測定に使い、反応時間は１５分間である。
【図２０】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、実際のサンプル尿液体系の中に、異なる濃度のコカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）の測定に使い、反応時間は５分間である。
【図２１】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、コカインの代謝産物ベンゾイルエクゴニンとアンヒドロエクゴニンメチルをネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は２５０μＭコカインと２．５ｍＭベンゾイルエクゴニンとアンヒドロエクゴニンメチルへの反応で、反応時間は５分間である。
【図２２】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、ＬＣ／ＭＳを標準方法として、ナノ粒子を使い、気圧を輸出方式として異なる濃度の標的コカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）を測定する正確性への考察である。
【図２３】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）測定に使い、反応時間は５分間である。
【図２４】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、シチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）をネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は１ｍＭアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）と１０ｍＭシチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）への反応で、反応時間は５分間である。
【図２５】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のＰｂ２＋測定に使い、反応時間は５分間である。
【図２６】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｈｇ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋をネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は１ｍＭ  のＮｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｈｇ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋と４００ｎＭ  Ｐｂ２＋への反応で、反応時間は５分間である。
【図２７】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のオクラトキシンＡ（ＯＴＡ）測定に使い、反応時間は５分間である。
【図２８】は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、アフラトキシンＭ１（ＡＦＭ１）、ゼアラレノン（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ、ＺＥＮ）、Ｔ−２毒素（Ｔ−２）、パツリン（ｐａｔｕｌｉｎ、ＰＡＴ）、シトリニン（ｃｉｔｒｉｎｉｎ、ＣＩＴ）、オクラトキシンＢ（ＯＴＢ）、ステリグマトシスチン（ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ、ＳＴＣ）をネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は１ｍＭ  ＡＦＭ１、ＺＥＮ、Ｔ−２、ＰＡＴ、ＣＩＴ、ＯＴＢ、ＳＴＣと２５μＭオクラトキシンＡ（ＯＴＡ）への反応で、反応時間は５分間である。
【図２９】は室温で、機能化ＤＮＡセンサー体系において、ナノ粒子上の異なるＤＮＡの修飾条数が気圧計感度への影響実験であり、アデノシン体系を例として、反応時間は１．５時間である。
【図３０】は室温で、機能化ＤＮＡセンサー体系において、異なる濃度のアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）測定に使い、反応時間は１．５時間である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
実施例１、アクリル酸ホスホラミダイト単体の合成
【００２７】
アクリル酸ホスホラミダイト単体の合成は三つのステップに分けられ、１）６−アミノ−１−ヘキサノール（１ｇ、８．５３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．３６ｍＬ、１７ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのジクロロメタンの中に入れて氷浴し、無水無酸素条件の下で、メタクリロイルクロリド（２．６７ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）を一滴一滴に入れ、その後、体系全体を室温の条件で２時間攪拌反応させた。２）溶剤を回転して蒸発させ、産物に１０ｍＬのヘキサノールと１５％ＮａＯＨ（４ｍＬ）を入れ、産物を選択的にＮ−（６−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅに加水分解させた。Ｎ−（６−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅを酢酸エチルでシリカゲルコラムに分離した後、次の反応を行った。３）純化後のＮ−（６−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（０．５０ｇ、２．７０ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの無水ジクロロメタンの中に溶かし、０℃の条件で、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、０．９８ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を一滴、一滴入れた後に、クロロ（ジイソプロピルアミノ）亜ホスフィン酸２−シアノエチル（０．８７ｍＬ、３．２５ｍｍｏｌ）を一滴、一滴入れ、室温で２時間反応させた。溶剤を回転蒸発させた後に、酢酸エチル：石油エーテル：トリエチルアミンが４０：６０：３の溶離液でシリカゲルコラムに産物を溶離した。得た最終産物は無色の油状の液体であった。最終産物の核磁気分析のデータは、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ５．９２（ｂｒ、１Ｈ）、５．６３（ｍ、１Ｈ）、５．２７（ｍ．１Ｈ）、３．８６−３．７２（ｍ、２Ｈ）、３．６６−３．４９（ｍ、４Ｈ）、３．３０−３．２３（ｍ、２Ｈ）、２．６１（ｔ、２Ｈ）、１．９２（ｍ、３Ｈ）、１．５８−１．５０（ｍ、４Ｈ）１．３７−１．３２（ｍ、４Ｈ）１．１７−１．１３（ｍ、１２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１６８．６、１４０．４、１１９．３、１１８．０、６３．８、６３．６、５８．６、５８．３、４３．２、４３．１、３９．８、３１．３、２９．７、２６．８、２５．８、２４．９、２４．８、２４．７、１９．０．３１Ｐ（ＣＤＣｌ３）：δ１４８である。
【００２８】
実施例２、メチルプロペングループ、ｂｉｏｔｉｎグループ及びスルフィドリルグループで修飾した核酸分子の合成と純化
【００２９】
通常のＣＰＧを固相担体とし、ＤＮＡ担体塩基を原料とし、ＤＮＡ合成装置で、３′端から５′端に、鎖Ａ、鎖Ｂ、ｌｉｎｋｅｒ核酸アプタマー、検出ＤＮＡ、ＥＬＩＳＡ  ＤＮＡを合成し、最後は鎖ＡとＢの５′端で実施例１に合成したアクリル酸ホスホラミダイト単体を修飾（合成装置で修飾する）し、ＤＮＡ上の修飾スルフィドリルを検出した。具体的な合成序列を表１、表２、表３に示す。ｂｉｏｔｉｎで修飾されるＣＰＧを固相担体として、ＤＮＡ単体塩基を原料として、ＤＮＡ合成装置で３′端から５′端に捕捉ＤＮＡを合成し、具体的な合成序列を表２に示す。合成が終わった後に、前記ＣＰＧを２ｍＬ洗浄滅菌されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、０．５ｍＬメチルアミン：アンモニア＝１：１の溶液を入れ、６５℃で３０分間加安分解し、ＤＮＡをＣＰＧから切断した。加安分解の後に、上澄みを取り、少量の超純水でＣＰＧを洗い、上澄みと合わせた。体系に体積が２．５倍の冷凍無水アルコールと体積が０．１倍の３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを入れ、−２０℃の冷蔵庫で３０分間アルコールの沈積を行った。アルコール沈積終わった後に、１４、０００ｒｐｍの回転速度で１０分間遠心処理して、上澄みを捨てた。得た粗産物をｐＨ  ８の０．１ｍｏｌ／Ｌの酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）に溶かし、高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣで純化した。高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣで純化された製品を真空乾燥した。スルフィドリル修飾ＤＮＡ以外、他のＤＮＡを８０％の酢酸に溶かしてＤＭＴを脱し、３０分間反応した後に、汲み上げて超純水に溶かし、ゲル濾過柱で脱塩処理した。紫外−可視分光光度計で２６０ｎｍのところの核酸の光吸収度を測定し、ＤＮＡの消光係数に基づき、対応物質の量や濃度値を計算した。定量後真空濃縮した。５’スルフィドリル修飾ＤＮＡがＨＰＬＣで純化した後に、ｐＨ  ６．５の０．１Ｍ  ＴＥＡＡを入れてＤＮＡを溶かし、Ａ２６０を測定し、Ａ２６０＝１００まで希釈し、総体積はＶであることを記録した。その後は０．１５Ｖの１Ｍ  ＡｇＮＯ３を入れ、均一に混合し、室温で３０分間反応した。さらに、０．２０Ｖの１Ｍ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を入れて均一に混合し、室温で５分間反応した。遠心して上澄み（ＤＴＴ配合物）を取り、沈積は１Ｖ  ０．１Ｍ  ＴＥＡＡで洗浄し、洗浄液を合弁した。ゲル濾過柱で脱塩処理を行った。紫外−可視分光光度計で２６０ｎｍところの核酸の光吸収度を測定し、ＤＮＡの消光係数に基づき、対応物質の量や濃度値を計算した。定量後真空濃縮した。
【００３０】
表１  実施例２に使用したＤＮＡ序列
2017519983.tif 000002
【００３１】
表２  実施例２に使用したＤＮＡ序列
2017519983.tif 000003
【００３２】
表３  実施例２に使用したＤＮＡ序列
2017519983.tif 000004
【００３３】
実施例３、サンドイッチ構造の製造
【００３４】
Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白を例として、９６ウェルプレートで捕捉抗体を包み、濃度は２．０μｇ／ｍＬであり、体積は１００μＬであり、板を密閉し、４度で夜を過ごした。その後はＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで三回洗浄した。３００μＬの密閉液を入れて、室温で少なくとも１時間密閉した。１００μＬの違う濃度の測定待ち抗原を入れ、室温で２ｈｒインキュベートし、三回洗浄した後に、１００μＬ、１．５μｇ／ｍＬの測定抗体を入れ、室温で１時間インキュベートしてサンドイッチ構造を形成した。
【００３５】
実施例４、通常ＥＬＩＳＡ蛋白体系の実行性検証
【００３６】
通常ＥＬＩＳＡの反応過程はまず、ｃａｐｔｕｒｅ抗体を包み、タンパク質とポリスチレン固相担体は疎水作用力を通して結合した。その後それぞれ抗原、ｂｉｏｔｉｎ化のｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体、ＳＡ−ＨＲＰ複合物及び基質を入れ、基質の反応で、吸収の測定を通して標的を測定した。結果を図７、図１０、図１５に示す。
【００３７】
実施例５、Ｂｉｏｔｉｎ化のカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）の製造
【００３８】
Ｂｉｏｔｉｎ化に使用された緩衝液は、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムであり、ｐＨが８．４であった。１ｍｇ／ｍｌのＢＮＨＳをゆっくりと１０ｍｇ／ｍｌのカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）に滴落し、それの反応最終体比を８：１に制御した。均一に揺れて混合し、室温で４ｈｒ反応した。遠心式限外ろ過で遊離のＢＮＨＳを除き、Ｂｉｏｔｉｎのカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）を得た。
【００３９】
実施例６、ＥＬＩＳＡ体系測定−信号増幅分子はカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）である。
【００４０】
作りあがったサンドイッチ構造の９６ウェルプレート微細キャビティの中に１００μＬ、１μｇ／ｍＬＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、それを測定抗体上のｂｉｏｔｉｎと結合させた。１００μＬ、２０ｎＭ  Ｃａｔａｌａｓｅ−ｂｉｏｔｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、余計なカタラーゼ除いた。９６ウェルプレートに溶液層基質をいれ、反応蓋を閉めて密閉させた。信号増幅分子カタラーゼ（は溶液相の基質に作用し、気圧計に読み取ることのできる信号を産生した。気圧計の表現値に基づき、測定結果を記録した。結果を図６に示す。
【００４１】
図６は室温で、ＥＬＩＳＡ体系においで、カタラーゼを使い、異なる濃度の標的蛋白、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白を測定した。９６ウェルプレートに捕捉抗体を包み、濃度は２μｇ／ｍＬ、体積は１００μＬであり、板を密閉して４度で夜を過ごした。その後はＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで三回洗浄した。３００μＬ密閉液を入れて室温で少なくとも１時間密閉した。１００μＬの異なる濃度の測定抗原をいれ、室温で２ｈｒインキュベートし、三回洗浄した後に、１００μＬ、１．５μｇ／ｍＬの測定抗体を入れ、室温で１時間インキュベートし、サンドイッチ構造を形成し、測定抗体を洗い除いた。１００μＬ、１μｇ／ｍＬＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、それを測定抗体上のｂｉｏｔｉｎ相と結合させた。１００μＬ、２０ｎＭ  Ｃａｔａｌａｓｅ−ｂｉｏｔｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、余計なカタラーゼを除いた。９６ウェルプレートに溶液相基質（０．３１Ｍ  Ｈ２Ｏ２）を入れ、反応蓋を閉めて密閉した。信号増幅分子カタラーゼは溶液相基質に作用し、気圧計が読み取る信号分子を産生した。反応時間を１時間に制御した。気圧計に示す数字に基づき、測定結果を記録した。
【００４２】
実施例７、ＥＬＩＳＡ体系測定−信号増幅分子はＡｕ＠ＰｔＮＰｓであった。
【００４３】
サンドイッチ構造が作り上げた９６ウェルプレートの微細キャビティに１００μＬ、１μｇ／ｍＬＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを入れ、且つ室温で１時間インキュベートし、測定抗体上のｂｉｏｔｉｎと結合させた。１００μＬ、２．５ｎＭ  Ａｕ＠ＰｔＮＰｓ−ＤＮＡ−ｂｉｏｔｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、余計なナノ粒子を洗い除いた。９６ウェルプレートに溶液相基質を入れて反応蓋を閉めて密閉した。信号増幅分子Ａｕ＠ＰｔＮＰｓは溶液相基質に作用して気圧計が読み取る信号分子を産生した。気圧計に示す表現値に基づき、測定結果を記録した。結果を図８、図９、図１１、図１２、図１３、図１４、図１６、図１７に示す。
【００４４】
図８は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、ナノ粒子を使い、異なる濃度の標的蛋白、人のＰＳＡ組替蛋白を測定した。９６ウェルプレートに捕捉抗体を包み、その濃度は２．０μｇ／ｍＬで、体積は１００μＬであり、板を密閉し、４度で夜を過ごした。その後はＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで三回洗浄した。３００μＬの密閉液を入れ、室温で少なくとも１時間を密閉した。１００μＬの異なる濃度の測定抗原を入れ、室温で２ｈｒインキュベートし、三回洗浄した後に、１００μＬ、０．２μｇ／ｍＬの測定抗体を入れ、室温で１時間インキュベートし、サンドイッチ構造を形成し、測定抗体を洗い除いた。１００μＬ、１μｇ／ｍＬＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、測定抗体上のｂｉｏｔｉｎと結合させた。１００μＬ、０．６２５ｎＭ  Ａｕ＠ＰｔＮＰｓ−ＤＮＡ−ｂｉｏｔｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、余計なナノ粒子を洗い除いた。９６ウェルプレートに溶液相基質を入れ、反応蓋を閉めて密閉させた。信号増幅分子Ａｕ＠ＰｔＮＰｓは溶液相基質に作用し、気圧を読み取る信号分子を産生した。反応時間を１時間に制御した。気圧計に示す表現値に基づき、測定結果を記録した。
【００４５】
図９は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、ＨＳＡ、ＩｇＧ、ＭＭＰ、Ｔｈｒをネガティブコントロールとして、前記体系ＰＳＡの選択性を考察し、図は１２０μＭ  ＨＳＡ、ＩｇＧ、ＭＭＰ、Ｔｈｒ、ＰＳＡに対する反応で、反応時間は１時間であった。
【００４６】
図１１は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、ナノ粒子を使って異なる濃度の標的蛋白、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白体系を測定した。９６ウェルプレートに捕捉抗体を包み、その濃度は２．０μｇ／ｍＬで、体積は１００μＬであり、板を密閉し、４度で夜を過ごした。その後はＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで三回洗浄した。３００μＬの密閉液を入れ、室温で少なくとも１時間密閉した。１００μＬの異なる濃度の測定抗原を入れ、室温で２ｈｒインキュベートし、三回洗浄した後に、１００μＬ、１．５μｇ／ｍＬの測定抗体を入れ、室温で１時間インキュベートし、サンドイッチ構造を形成し、測定抗体を洗い除いた。１００μＬ、１μｇ／ｍＬＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、測定抗体上のｂｉｏｔｉｎと結合させた。１００μＬ、２．５ｎＭＡｕ＠ＰｔＡｕＮＰｓ−ＤＮＡ−ｂｉｏｔｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、余計なナノ粒子を洗い除いた。９６ウェルプレートに溶液相基質を入れ、反応蓋を閉めて密閉させた。信号増幅分子Ａｕ＠ＰｔＡｕＮＰｓは溶液相基質に作用し、気圧が読み取る信号分子を産生した。反応時間を１時間に制御した。気圧計に示す表現値に基づき、測定結果を記録した。
【００４７】
図１２は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、ＩｇＧ、ＨＳＡ、Ｈ３Ｎ２、ＳＡＲＳをネガティブコントロールとして、この体系のＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白の選択性を考察し、図は１２０μＭ  Ｈ５Ｎ１、ＩｇＧ、ＨＳＡ、Ｈ３Ｎ２、ＳＡＲＳへの反応で、反応時間は１時間であった。
【００４８】
図１３は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、血清環境で、異なる濃度のＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡを入れ、ナノ粒子を信号増幅分子として、異なる濃度の標的蛋白、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白を測定した。
【００４９】
図１４は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、異なる濃度の標的蛋白、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白を測定した。異なる濃度のＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白サンプルを一式二部に分け、一部を標準方法の通常ＥＬＩＳＡで測定し、もう一部はナノ粒子を信号増幅方法として、異なる濃度の標的蛋白、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスＨＡ蛋白を測定し、本発明の前記方法の正確性を考察した。
【００５０】
図１６は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、ナノ粒子を使って、異なる濃度の標的蛋白、人のＭＭＰ９組替蛋白を測定した。９６ウェルプレートにおいて捕捉抗体を包み、その濃度は２．０μｇ／ｍＬで、体積は１００μＬであり、板を密閉し、４度で夜を過ごした。その後はＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで三回洗浄した。３００μＬの密閉液（２％ＢＳＡ）を入れ、室温で少なくとも１時間を密閉した。１００μＬの異なる濃度の測定抗原を入れ、室温で２ｈｒインキュベートし、三回洗浄した後に、１００μＬ、０．２５μｇ／ｍＬの測定抗体を入れ、室温で１時間インキュベートし、サンドイッチ構造を形成し、測定抗体を洗い除いた。（４）１００μＬ、１μｇ／ｍＬＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、測定抗体上のｂｉｏｔｉｎと結合させた。（５）１００μＬ、０．６２５ｎＭ  Ａｕ＠ＰｔＮＰｓ−ＤＮＡ−ｂｉｏｔｉｎを入れ、室温で１時間インキュベートし、余計なナノ粒子を洗い除いた。（６）９６ウェルプレートに溶液相基質を入れ、反応蓋を閉めて密閉させた。信号増幅分子Ａｕ＠ＰｔＮＰｓは溶液相基質に作用し、気圧が読み取る信号分子を産生した。反応時間を１時間に制御した。気圧計に示す表現値に基づき、測定結果を記録した。
【００５１】
図１７は室温で、ＥＬＩＳＡ体系において、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ＩｇＧ、ＨＳＡをネガティブコントロールとして、前記体系ＭＭＰの選択性を考察し、図は１２０μＭ  ＭＭＰ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、ＩｇＧ、ＨＳＡに対する反応で、反応時間は１時間であった。
【００５２】
実施例８、ハイドロゲルの製造
【００５３】
鎖Ａと鎖Ｂをそれぞれ超純水に溶かして高濃度ＤＮＡ保存液を作った。１０％の過硫酸アンモンと５％のＴＥＭＥＤ（Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）をそれぞれ配合し、つまり、０．０５ｇの過硫酸アンモンが０．５ｍＬの超純水に、２５μｌ  ＴＥＭＥＤが０．５ｍＬの超純水に溶けていた。ＤＮＡを最終濃度が４％のアクリルアミドと混合液に配合させ、真空乾燥器の中に入れて１０分間真空引き、ガスを除いた。最終濃度が１．４％の作りあがった開始剤（過硫酸アンモン）と加速剤（ＴＥＭＥＤ）を入れて、均一に混合した後に反応体系を真空乾燥器の中に入れ、３０℃で１５分間真空引き、鎖Ａと鎖Ｂの線状高分子重合物ＰＳ−Ａ、ＰＳ−Ｂを得た。ＰＳ−ＡとＰＳ−Ｂは１：１の比例で混合した後に、１０×反応緩衝液を１μＬ入れ、（コカインはＰＢ緩衝液を使い、７７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２３ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ  ７．３であり、アデノシンはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使い、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ  ８．０であり、Ｐｂ２＋はＴｒｉｓ−ＣＨ３ＣＯＯＨ緩衝液を使い、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０であり、オクラトキシンＡはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使い、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ８．５である）、その後２３ｎＭ  Ａｕ＠ＰｔＮＰｓ  ２μＬを入れ、振動して均一に混合したら、ＰＳ−Ａ、ＰＳ−Ｂと濃度比が１：１：０．６のｌｉｎｋｅｒ  ａｐｔａｍｅｒを入れた。Ａｕ＠ＰｔＮＰｓを包む三次元架橋ハイドロゲルを得るまで、振動、加熱のステップを繰り返して行った。前記反応は乾浴器の中で実施し、過熱ステップは６５℃で５分間キープし、その後は室温まで自然冷却した。
【００５４】
実施例９、ＤＮＡハイドロゲル可視化定量測定ステップ
【００５５】
使用する前に、対応の１×Ｂｕｆｆｅｒ緩衝液で製造されたハイドロゲルを三回洗浄し、遠心管の管壁及びハイドロゲルの表面に残した信号増幅分子を除き、且つ、純水を除いた。測定する時に、緩衝液を使って標的溶液を配合し、且つハイドロゲルが入れた遠心管に入れた。遠心管をシェーキングテーブルに移し、３０℃、１５０ｒｐｍの回転速度で充分反応させた。反応が終わったら、反応上澄み液を収集し、２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬＨ２Ｏ２を入れ、反応時間を制御し、気圧変化に基づき、データを読み取って記録した。結果を図１８、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３、図２４、図２５、図２６、図２７、図２８に示す。
【００５６】
図１８は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のコカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）の測定に使った。ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＰＢ緩衝液（７７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ２、ｐＨ  ７．３である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで１時間反応した。反応上澄み液を収集し、２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬＨ２Ｏ２を入れ、５分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。０μＭ実験グループとの差値を求め、図を作った。
【００５７】
図１９は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のコカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）の測定である。ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＰＢ緩衝液（７７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ２、ｐＨ  ７．３である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで１時間反応した。反応上澄み液を収集し、在２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬＨ２Ｏ２を入れ、１５分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。０μＭ実験グループとの差値を求め、図を作った。反応時間を延長することで、体系の検出限界を一層低下した。
【００５８】
図２０は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、実際のサンプル尿液体系の中に、異なる濃度のコカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）の測定である。ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＰＢ緩衝液（７７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ  ７．３である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで１時間反応した。反応上澄み液を収集し、在２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬＨ２Ｏ２を入れ、５分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。０μＭ実験グループとの差値を求め、図を作った。
【００５９】
図２１は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、コカインの代謝産物ベンゾイルエクゴニンとアンヒドロエクゴニンメチルをネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は２５０μＭコカインと２．５ｍＭベンゾイルエクゴニンとアンヒドロエクゴニンメチルへの反応で、ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＰＢ緩衝液（７７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ  ７．３である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで１時間反応した。反応上澄み液を収集し、在２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬ  Ｈ２Ｏ２を入れ、５分間反応した。
【００６０】
図２２は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、実際のサンプル尿液体系の中に、異なる濃度のコカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）の測定である。サンプルを二部に分け、一部は標準方法のＬＣ／ＭＳで測定し、もう一部は本発明の前記方法を使い、気圧を輸出方式として、違う濃度の標的コカイン（ｃｏｃａｉｎｅ）を測定し、前記方法の正確性を考察した。
【００６１】
図２３は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）測定であり、反応時間は５分間であった。標的に基づき、ハイドロゲル中のＤＮＡ序列を変わることを通し、対応標的の測定が実現できた。ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ  ８．０である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで２ｈｒ反応した。反応上澄み液を収集し、在２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬ  Ｈ２Ｏ２を入れ、５分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。０μＭ実験グループとの差値を求め、図を作った。
【００６２】
図２４は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、シチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）をネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は１ｍＭアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）と１０ｍＭシチジン（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）への反応で、反応時間は５分間であった。ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ  ８．０である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで２ｈｒ反応した。反応上澄み液を収集し、在２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬ  Ｈ２Ｏ２を入れ、５分反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。０μＭ実験グループとの差値を求め、図を作った。
【００６３】
図２５は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のＰｂ２＋測定に使い、反応時間は５分間であった。ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＨ３ＣＯＯＨ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ  ８．０である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで２．５時間反応した。反応上澄み液を収集し、在２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬ  Ｈ２Ｏ２を入れ、５分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録する。０μＭ実験グループとの差値を求め、図を作った。
【００６４】
図２６は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｈｇ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋をネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は１ｍＭ  のＮｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｈｇ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２と４００ｎＭ  Ｐｂ２＋への反応で、反応時間は５分間であった。ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＣＨ３ＣＯＯＨ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで２．５時間反応した。反応上澄み液を収集し、在２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬのＨ２Ｏ２を入れ、５分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。０μＭ実験グループとの差値を求め、図を作った。
【００６５】
図２７は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、異なる濃度のオクラトキシンＡ（ＯＴＡ）測定に使い、反応時間は５分間であった。ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ８．５である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで１．５時間反応した。反応上澄み液を収集し、在２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬ  Ｈ２Ｏ２を入れ、５分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。０μＭ実験グループとの差値を求め、図を作った。
【００６６】
図２８は室温で、ＤＮＡハイドロゲル体系において、アフラトキシンＭ１（ＡＦＭ１）、ゼアラレノン（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ、ＺＥＮ）、Ｔ−２毒素（Ｔ−２）、パツリン（ｐａｔｕｌｉｎ、ＰＡＴ）、シトリニン（ｃｉｔｒｉｎｉｎ、ＣＩＴ）、オクラトキシンＢ（ＯＴＢ）、ステリグマトシスチン（ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ、ＳＴＣ）をネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は１ｍＭ  ＡＦＭ１、ＺＥＮ、Ｔ−２、ＰＡＴ、ＣＩＴ、ＯＴＢ、ＳＴＣと２５μＭオクラトキシンＡ（ＯＴＡ）への反応で、反応時間は５分間であった。ＤＮＡハイドロゲルの除去実験はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ８．５である）の中で、３０℃、１５０ｒｐｍで１．５時間反応した。反応上澄み液を収集し、在２００μＬの自制反応試験管に、それぞれ５０μＬ反応上澄み液と５０μＬＨ２Ｏ２を入れ、５分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。０μＭ実験グループとの差値を求め、図を作った。
【００６７】
実施例１０、ＤＮＡ製造の測定
【００６８】
１ｍＬ  １３ｎＭ  Ａｕ＠Ｐｔ−Ａｕ溶液を取り、１４０００ｒｐｍ遠心処理で上澄みを除き、１ｍＬ  Ｂｕｆｆｅｒを入れて再懸濁させた。三回繰り返して行った。１００μＬの体積濃度が１０％のＦ１２７を入れて、均一に混合した。８μＬのＤＮＡ−ＳＨを入れて、均一に混合した。５０μＬの０．２Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を入れて、均一に混合した。３７℃回転で１ｈ反応した。１４０００ｒｐｍ遠心処理で上澄みを除き、１ｍＬ  Ｂｕｆｆｅｒを入れて再懸濁させた。三回繰り返して行った。入れたＤＮＡ−ＳＨの濃度を制御し、異なるＤＮＡ条数出修飾されているＡｕ＠ＰｔＮＰｓを製造することができ、結果を図２９に示す。
【００６９】
図２９は室温で、機能化ＤＮＡセンサー体系において、ナノ粒子上の異なるＤＮＡの修飾条数が気圧計感度への影響実験であり、アデノシン体系を例として、反応時間は１．５時間であった。１５０μＬの  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを取って磁気ビーズを修飾し、１ｍＬ  ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒで一回洗浄した。９５０μＬ  ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、２５μＬ  ４μＭ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＤＮＡと２５μＬ  ４μＭ  Ａｄｅ−Ａｐｔを入れ、２００ｒｐｍ、２５℃で３０分間振動した。ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒで三回洗浄し、毎回１ｍＬであった。Ａｐｔで修飾した磁気ビーズを含む懸濁液６００μＬを取り、２００μＬの異なるＤＮＡ条数の２５ｎＭ  Ｐｔ−ＤＮＡと３００μＬ  ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（反応面積を増大すると、ビーズの均一混合に有利である）を入れ、２５℃で３０分間混合した。ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒで６回洗浄し、毎回１ｍＬであった。３００μＬ  ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒの中に再懸濁し、それぞれ二つの遠心管に入れ、各遠心管５０μＬであり、上澄みを除き、各実験組に最終濃度が１００ｎＭのアデノシンを入れ、対照組にＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒを入れ、最終体系は５０μＬであり、２５℃で３０分間混合した。１０μＬの上澄み＋４０μＬのＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒ＋５０μＬのＨ２Ｏ２を気圧計反応管に入れ、ピペットで十回吸い打ち、均一に混合し、反応蓋をきつく締めた。１．５時間反応した後に、体系中の圧力を測定した。各サンプルには４つの平行実験があった。実験組みの圧力差で対照組の圧力差を割ってＳＢ比を得た。
【００７０】
実施例１１、機能化ＤＮＡサンドイッチ構造の製造
【００７１】
１５μＬ  のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ストレプトアビジン）を取って磁気ビーズを修飾し、１００μＬのＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒで一回洗浄した。９８μＬのＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、２μＬ  ４μＭのＢｉｏｔｉｎ−ＤＮＡを入れ、２００ｒｐｍで２５℃で３０分間振動した。ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、毎回１００μＬであった。８０μＬのＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、２０μＬ  ３３０ｎＭ  Ａｐｔａｍｅｒを入れ、２００ｒｐｍ、２５℃で３０分間振動した。ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、毎回１００μＬであった。２４０μＬ  ２．５ｎＭ  ＤＮＡ−Ｐｔを入れ、２００ｒｐｍ、２５℃で３０分間振動すると、機能化ＤＮＡサンドイッチ構造を形成した。
【００７２】
実施例１２、機能化ＤＮＡ可視化定量測定
【００７３】
作りあがった機能化ＤＮＡサンドイッチ構造を１００μＬ  ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒの中に再懸濁し、異なる濃度の標的溶液を入れて、シェーキングテーブルに置き、２００ｒｐｍ、２５℃で３０分間振動した。反応終わった後に、反応上澄み液を取り、反応試験管の中に入れ、Ａｕ＠ＰｔＮＰｓをＨ２Ｏ２と触媒反応させた。密閉した体系の中に発生したＯ２は圧力に転化され、気圧計で読み取り、データを記録した。結果を図３０に示した。
【００７４】
図３０は２５℃で、機能化ＤＮＡセンサー体系において、異なる濃度のアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）測定に使い、反応時間は１．５時間であった。１５０μＬ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを取って磁気ビーズを修飾し、１ｍＬ  ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒで一回洗浄した。９５０μＬ  ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、２５μＬ  ４μＭ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＤＮＡと２５μＬ  ４μＭ  Ａｄｅ−Ａｐｔを入れ、２００ｒｐｍで２５℃で３０分間振動した。ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、毎回１ｍＬであった。Ａｐｔで修飾した磁気ビーズを含む懸濁液６００μＬを取り、２００μＬ  ２５ｎＭ  Ｐｔ−ＤＮＡと３００μＬ  ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（反応面積を増大すると、ビーズの均一混合に有利である）を入れ、２５℃で３０分間混合する。ＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒで６回洗浄し、毎回１ｍＬであった。３００μＬＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒｒの中に再懸濁し、それぞれ六つの遠心管に入れ、各遠心管５０μＬであり、上澄みを捨て、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの中にそれぞれＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬ、４９．５μＬ、４７．５μＬ、４９．５μＬ、４９μＬ、４８．５μＬをいれ、ａ、ｂ、ｃの中にそれぞれ０．１μＭ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ０μＬ、０．５μＬ、２．５μＬを入れ、ｄ、ｅ、ｆ管にそれぞれ１μＭ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ０．５μＬ、１μＬ、１．５μＬを入れて、最終体積を５０μＬにならせて、２５℃で３０分間混合した。１０μＬ上澄み＋４０μＬＰＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒ＋５０μＬ  Ｈ２Ｏ２を気圧計反応管に入れ、ピペットで十回吸い打ち、均一に混合し、反応蓋をきつく締めた。１．５時間反応した後に、体系中の圧力を測定した。各サンプルには４つの平行実験があった。
【００７５】
前記実施例は本発明の好ましい実施例であり、本発明は実施例に限定されるものではなく、当業者が、本発明の技術実質に基づき、前記実施例に対するいかなる簡単な修正、類似変化及び修飾も本発明技術案の保護範囲に属する。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は酵素又はナノ粒子などで、オキシドールが大量の気体を生成することを触媒し、標的分子の信号をガスの圧力信号に転換させることで、信号の増幅を実現し、最後は気圧計を通して圧力を電子信号に転換させて読み取り、高感度の定量測定を実現する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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