(57)【要約】本開示の形態と実施態様は、ＨＳＣＴ移植後の患者における造血回復を改善するために有用な治療方法およびインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を含む組成物を提供する。特に、本開示が提供する、代表的な方法およびＩＬ−１２を含む組成物は、ＢＭＣＴと同様に有効に、致死的線量の放射線照射を浴びたマウスにおいて、造血を促進し、末梢血細胞の回復および生存率を増大させており、ｒＨｕＩＬ−１２療法は、ＨＳＣＴ後のＨＳＣ生着を増加させることができることを示している。発明者らは、可能性を有するＩＬ−１２の標的である、ＩＬ−１２Ｒβ２発現細胞を、放射線照射を浴びたマウス骨髄中から同定した。ｒＭｕＩＬ−１２の投与は、マウス骨髄中のＩＬ−１２Ｒβ２発現性Ｌｉｎ-細胞の数を増加させており、骨髄ＨＳＣおよびニッチ細胞がｒＭｕＩＬ−１２の直接的な標的であること、また、ｒＭｕＩＬ−１２の造血促進活性は、ＨＳＣ上のＩＬ−１２受容体によって仲介されることを示している。最終的に、発明者らは、ヒト骨髄のｌｉｎ−細胞およびＣＤ３４+細胞上でのＩＬ−１２Ｒβ２の発現を証明し、ヒトの移植における、ＩＬ−１２の可能性のある役割を示している。
2017533278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血作用を回復させる、ならびに、感染合併症を低減させるための医薬組成物であって、
（ａ）該医薬組成物は、ＩＬ−１２を含有しており、かつ
（ｂ）該医薬組成物を使用して、造血作用を回復させ、そして、感染合併症を低減させるための方法は、骨髄破壊的療法に引き続き、骨髄破壊的療法に先立ち、または骨髄破壊的療法に先立ちおよび引き続いて、該医薬組成物の有効用量を１回またはそれ以上投与する工程を含む、
ことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２】
造血作用を回復させるための医薬組成物であって、
（ａ）該医薬組成物は、ＩＬ−１２を含有しており、かつ
（ｂ）該医薬組成物を使用して、造血作用を回復させるための方法は、骨髄破壊的療法の前、後、または、前後のいずれかに、該医薬組成物の有効用量を１回またはそれ以上投与する工程を含み、
その際、骨髄中の造血細胞上のＩＬ−１２受容体の活性化を介して、造血作用が回復させられる、
ことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項３】
骨髄破壊的療法において、放射線療法が使用される
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
骨髄破壊的療法において、化学療法が使用される
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
骨髄破壊的療法は、放射線療法と化学療法の組み合わせである
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
骨髄中の前駆細胞の数の増加を介して、造血作用が回復させられる
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
末梢血において、造血が回復させられる
ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
末梢血球数が増加される
ことを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
血小板が増加される
ことを特徴とする、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
白血球が増加される
ことを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
網赤血球が増加される
ことを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
赤血球が増加される
ことを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
造血細胞は、ニッチ細胞および幹細胞を含んでいる
ことを特徴とする、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ニッチ細胞は、骨芽細胞を含む
ことを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
巨核球上のＩＬ−１２受容体の活性化に引き続いて、造血が回復される
ことを特徴とする、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記巨核球は、未成熟である
ことを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
骨髄中の骨芽細胞、巨核球細胞および造血幹細胞上のＩＬ−１２受容体の活性化に引き続き、造血が回復される
ことを特徴とする、請求項２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
骨髄破壊的療法に続いて、自家移植がなされる
ことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
骨髄破壊的療法に続いて、同種移植がなされる
ことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
骨髄破壊的療法に先立ち、造血幹細胞の動員および採取がなされる
ことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
造血幹細胞の動員および採取の結果、ＣＤ３４+細胞数の低下が引き起こされる
ことを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、低悪性度非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、中悪性度リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群およびホジキン病からなる群から選択される造血器悪性腫瘍を治療するために、骨髄破壊的療法が施されている
ことを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記療法は、骨髄非破壊的である
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、低悪性度非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、中悪性度リンパ腫、多発性骨髄腫およびホジキン病からなる群から選ばれる造血器悪性腫瘍を治療するために、前記骨髄非破壊的療法が施されている
ことを特徴とする、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
固形悪性腫瘍を治療するために、前記骨髄非破壊的療法が実施されている
ことを特徴とする、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記骨髄非破壊的療法は、ミニ移植を含む
ことを特徴とする、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記骨髄非破壊的療法は、強度軽減移植前治療（ＲＩＣ）を含む
ことを特徴とする、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ＩＬ−１２は、組換えヒトＩＬ−１２である
ことを特徴とする、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、参照によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる、２０１４年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第62/073,197号に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、一般に、移植のための新規方法および組成物に関し；特には、ＩＬ−１２を含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、幹細胞移植後の造血作用の回復を促進するための方法、ならびに、組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
本開示の多様な形態ならびに態様を理解する上で、有用でありうる情報が、以下に含まれている。本明細書中に提供されるいかなる情報は、ここに記載されている、もしくは権利請求されている発明に対して、従来技術、あるいは、関連していること、あるいは、具体的または暗示的に参照されている、いかなる刊行物または文献が、従来技術であることを、自認するものではない。
【０００４】
幹細胞移植は、特定の悪性腫瘍、血液、骨髄の疾患を有する人のために施すことができる、血液学および腫瘍学の分野における医療行為である。造血幹細胞移植は、いまだに、多くの可能性のある合併症を伴う、リスクの大きな外科的手術であり、そして、伝統的に、生死にかかる疾患を有する患者のためにのみ、残されてきた。重篤な機能障害性の自己免疫疾患および循環器疾患等の、非悪性および非造血系の適応症において、時折、実験的に使用されているものの、より広い承認を獲得するためには、致死的な合併症のリスクが高すぎると思われる。
【０００５】
Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎによって実施された、７１か国における１３２７の医療センターの世界的調査によれば、２００６年には、世界中では、合計５０，４１７例の初回造血幹細胞移植が施されたと報告された。このうち、２８，９０１例（５７％）は、自家移植であり、２１，５１６例（４３％）は、同種移植（家族ドナーからの１１，９２８例および非血縁ドナーからの９，５８８例）であった。移植の主要な適応症は、リンパ球増殖性障害（５４．５％）および白血病（３３．８％）であり、そして、大半は、ヨーロッパ（４８％）または南北アメリカ大陸（３６％）において施された。世界骨髄ドナー協会によれば、２００９年には、非血縁間移植のために提供された、幹細胞製品は、世界的には、１５，３９９例（３，４４５例の骨髄提供、８，１６２例の末梢血幹細胞提供および３，７９２単位の臍帯血ユニット）に増加した。
【０００６】
かつては、造血幹細胞は骨髄から直接採取された；しかし、現在では、骨髄から循環系中への幹細胞の移動を引き起こさせる、成長因子を、患者に投与した後、患者の血流から、これらの幹細胞を直接収集されることができる。幹細胞の採取に使用される機器は、アフェレーシス装置と呼ばれる。このタイプの移植は、高用量療法を施す前に、実際には、その幹細胞は、患者から収集されるため、自家移植と呼ばれる。移植の他の主要形態は、造血幹細胞は、ドナー（通常は、兄弟もしくは姉妹または適合ドナー）から収集される、同種移植と称される。同種移植は、患者は、本質的に新しい免疫系を獲得するという、付加的利益を有している。現在、科学者は、患者が高用量療法を受けた後でも残存する、腫瘍細胞をしばしば根絶することができるのは、この新しい免疫系であることを認識している。この現象は、移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果として知られている。
【０００７】
広く使用されているにもかかわらず、自家または同種いずれであろうと、造血細胞移植は、いまだに、リスクの大きな外科的手術のままである。よって、造血細胞移植の分野は、最近５〜１０年にわたって、変化を受けてきた。特に、同種移植後に再発した患者に、ドナー由来の免疫エフェクター細胞（Ｔリンパ球）を患者中に再注入した場合、その後、完全な鎮静に回復させ、そして、最終的には、その疾患から治癒することができたという現象が、特筆されている。この情報は、移植分野におけるパラダイムシフトをもたらし、そして、「ミニ−アロ（mini-allo）」移植、「トランスプラントライト（transplant lite）」、「ドライブ−スルー（drive-thru）」移植、「強度軽減（reduced intensity）」移植または「混合キメラ」移植等の、他の名前でも知られる、骨髄非破壊的な同種幹細胞移植の誕生をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、造血細胞移植のための、ミニ移植ならびに新しい手法の導入によってさえ、感染ならびに、他の合併症のリスクは、高いままである。主要な合併症は、静脈閉塞性疾患、粘膜炎、感染症（敗血症）、移植片対宿主病、ならびに新しい悪性腫瘍の発生である。よって、造血細胞移植手術を受けている患者における、その結果の改善を促進することのできる、新規薬剤が望まれている。そのような新規薬剤は、造血細胞移植引き続く、重篤な合併症の機会を低減させるとともに、造血回復の機会を増大させるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
したがって、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に引き続く、造血作用の回復のために有用な新規な方法ならびに、組成物が必要とされている。
【００１０】
本開示は、造血および自然免疫の複数の経路を標的とし、そして、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に引き続く造血作用の回復をはじめとする、広範囲の臨床的障害にたいして、治療目的で使用することが可能な方法および治療剤を提供する。いくつかの形態では、本開示は、ＨＳＣＴに引き続く、造血回復を改善することのできる方法および治療剤を提供する。
【００１１】
一形態では、本発明は、組換えヒトインターロイキン−１２（ｒＨｕＩＬ−１２）および／またはそのマウスホモログ、ＩＬ−１２（ｒＭｕＩＬ−１２）を含む組成物、ならびに、全身放射線照射（ＴＢＩ）の前または後のいずれかに投与される、単回の低用量を使用して、骨髄を再構築するために、それらの組成物を使用する方法に関する。驚くべきことに、例えば、組換えヒトインターロイキン−１２（ｒＨｕＩＬ−１２）ならびにそのマウスホモログ、ＩＬ−１２（ｒＭｕＩＬ−１２）が、全身放射線照射（ＴＢＩ）の前または後のいずれかに投与される単回の低用量を使用して、骨髄を再構成する、卓越した能力を有していることが証明された。
【００１２】
他の形態では、本発明は、例えば、ｒＨｕＩＬ−１２と、ＨＳＣおよびニッチ細胞上に発現されているＩＬ−１２受容体との相互作用を介して、作用することのできる、ｒＨｕＩＬ−１２を、造血を刺激するために投与する方法に関する。他の形態では、本発明は、補助剤として、ｒＨｕＩＬ−１２を用いて、造血細胞移植に対する治療を施す方法または移植に引き続く、ＨＳＣ移植ならびに骨髄回復を増進するための他の方法に関する。
【００１３】
一形態では、電離放射線への患者の曝露に引き続く、系統、器官、組織または細胞の損傷から患者を保護する方法は、骨髄破壊および骨髄非破壊に引き続き、患者に対して、実質的に単離されたＩＬ−１２を含む医薬組成物の治療有効量の用量を投与する工程を含んでいる。代表的な骨髄破壊的な方法には、例えば、放射線、化学療法および／または放射線と化学療法が含まれる。代表的な骨髄非破壊的は方法には、例えば、ミニ移植あるいは強度軽減移植前治療が含まれる。
【００１４】
一形態では、全身放射線照射として、骨髄破壊的な放射線照射を受ける。
【００１５】
一形態では、２つまたはそれ以上に分割された、分割線量として、放射線照射を受ける。別の形態では、多分割照射療法における、分割線量として、放射線照射を受ける。別の形態では、加速分画療法における、分割線量として、放射線照射を受ける。
【００１６】
一形態では、ＩＬ−１２の有効用量は、５０〜３００ｎｇ／Ｋｇの１回またはそれ以上の用量で投与される。ＩＬ−１２の他の有効用量は、１００〜２００ｎｇ／ｋｇの用量範囲にある。
【００１７】
一形態では、１またはそれ以上のＩＬ−１２の有効用量が、ＨＳＣＴの前に投与される。他の形態では、１またはそれ以上のＩＬ−１２の有効用量が、ＨＳＣＴの前後に、投与される。別の形態では、１またはそれ以上のＩＬ−１２の有効用量が、ＨＳＣＴの後に投与される。
【００１８】
一形態では、１またはそれ以上のＩＬ−１２の有効用量が、局所的に、皮下に、皮内に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、硬膜外に、腸管外に、鼻腔内におよび／または頭蓋内に投与される。
【００１９】
一形態では、例示的な方法および／または組成物として、本開示は、放射線照射を浴びたマウスにおいて、骨髄細胞移植（ＢＭＣＴ）とｒＭｕＩＬ−１２の造血促進活性のｉｎ  ｖｉｖｏでの比較を提供しており、そして、ｒＨｕＩＬ−１２の潜在的な細胞標的、ならびに、ヒトの造血における、ＩＬ−１２受容体の役割をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証した。
【００２０】
別の形態では、例示的な方法および／または組成物として、本開示は、致死的線量の放射線照射を浴びたマウスに対する、低用量（１０ｎｇ／マウス）の少なくとも１回のｒＭｕＩＬ−１２の投与が、ＢＭＣＴと同様に有効に、生存率および末梢血液細胞の回復を増大させることを実証した。一実施態様では、放射線照射の１２日後においては、ｒＭｕＩＬ−１２で治療されたマウスのマウス骨髄は、ＩＬ−１２受容体β２−サブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ２）を発現する骨髄前駆細胞、巨核球ならびに骨芽細胞の存在により、特徴付けられていた。
【００２１】
一形態では、例示的な方法および／または組成物として、ｒＭｕＩＬ−１２の投与は、マウス骨髄Ｌｉｎ細胞中における、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現する細胞の数も増大させていた。一実施態様では、ヒト骨髄細胞の分析が、多能性のＬｉｎ−細胞およびＣＤ３４+細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の他のマーカーとともに、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現していたことを示していた。
【００２２】
本明細書中に記載され、また、特許請求されている発明は、それには限定されないが、上述されたもの、あるいは、この概要中において、説明もしくは言及されたものをはじめとする、多くの性状ならびに実施態様を有する。該概要は、包括的なものであることを意図しておらず、そして、本明細書中に記載され、また、特許請求されている発明は、限定ではなく、単に例示の目的でのみ、含まれている、該概要中において見出された、特徴もしくは実施態様により、限定されず、またはそれにより制限もされない。さらなる実施態様は、以下の詳細な説明中において、開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１は、照射マウスにおける、生存率（ａ）および血液細胞回復（ｂ〜ｄ）の増加に対する、骨髄細胞移植（ＢＭＣＴ）と同程度の、ｒＭｕＩＬ−１２の有効性を示す図である。動物は、静脈内への、ビヒクル、ｒＭｕＩＬ−１２（１０ｎｇ／マウス）、またはＢＭＣＴ（１．１×１０6個の細胞）を受け、そして、３５日間、生存率および血球数について、モニターされた。ＴＢＩ=全身照射。
【図１Ｂ】図１は、照射マウスにおける、生存率（ａ）および血液細胞回復（ｂ〜ｄ）の増加に対する、骨髄細胞移植（ＢＭＣＴ）と同程度の、ｒＭｕＩＬ−１２の有効性を示す図である。動物は、静脈内への、ビヒクル、ｒＭｕＩＬ−１２（１０ｎｇ／マウス）、またはＢＭＣＴ（１．１×１０6個の細胞）を受け、そして、３５日間、生存率および血球数について、モニターされた。ＴＢＩ=全身照射。
【図１Ｃ】図１は、照射マウスにおける、生存率（ａ）および血液細胞回復（ｂ〜ｄ）の増加に対する、骨髄細胞移植（ＢＭＣＴ）と同程度の、ｒＭｕＩＬ−１２の有効性を示す図である。動物は、静脈内への、ビヒクル、ｒＭｕＩＬ−１２（１０ｎｇ／マウス）、またはＢＭＣＴ（１．１×１０6個の細胞）を受け、そして、３５日間、生存率および血球数について、モニターされた。ＴＢＩ=全身照射。
【図１Ｄ】図１は、照射マウスにおける、生存率（ａ）および血液細胞回復（ｂ〜ｄ）の増加に対する、骨髄細胞移植（ＢＭＣＴ）と同程度の、ｒＭｕＩＬ−１２の有効性を示す図である。動物は、静脈内への、ビヒクル、ｒＭｕＩＬ−１２（１０ｎｇ／マウス）、またはＢＭＣＴ（１．１×１０6個の細胞）を受け、そして、３５日間、生存率および血球数について、モニターされた。ＴＢＩ=全身照射。
【図２】図２：照射マウスにおける、ｒＭｕＩＬ−１２により増加された造血再構築。無照射、治療無しのマウスについて（Ａ）、ならびに、ＴＢＩの１２日後の、ビヒクルまたはｒＭｕＩＬ−１２（２０ｎｇ／マウス）の皮下注射を施した動物について、ＩＬ−１２Ｒβ２に対する染色を施した、大腿骨骨髄の切片を示している。ビヒクルによる治療が施されたマウスでは、ＩＬ−１２Ｒβ２発現細胞を欠き、そして、造血再生の兆候を示していない（Ｂ）が、ｒＭｕＩＬ−１２による治療が施されたマウスでは、造血再構築およびＩＬ−１２Ｒβ２−発現巨核球、骨髄系前駆細胞、および骨芽細胞の存在が示されている（Ｃ−Ｄ）。ｒＭｕＩＬ−１２治療後の、造血、ならびに、Ｌ−１２Ｒβ２発現幹細胞および非幹細胞に、記を付す。倍率＝１００×。
【図３】図３：海綿骨付近に観察される、巨核球の島。ＴＢＩの２４時間前ならびに３日後に、ｒＭｕＩＬ−１２（２０ｎｇ／マウス）の皮下注射を施されたマウスの、ＴＢＩの１２日後における、ＩＬ−１２Ｒβ２に対する染色（オレンジ色）を施した、大腿骨骨髄の切片。倍率＝１００×。
【図４】図４：Ｌ−１２Ｒβ２を発現している、マウス骨髄Ｌｉｎ−細胞。ＩＬ−１２Ｒβ２に対する抗体による標識に引き続き、マウス骨髄細胞中から、Ｌｉｎ−細胞を免疫磁気的に選択し、そして、フローサイトメトリーで解析した。ゲート領域（Ｒ６）は、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現しているサブセットを示しており、合計すると、Ｌｉｎ−細胞のおよそ５％である。
【図５Ａ】図５：ＩＬ−１２Ｒβ２を発現している、ヒト骨髄Ｌｉｎ−細胞ならびにＣＤ３４+細胞。ヒトＬｉｎ−細胞（Ａ）およびＣＤ３４+細胞（Ｂ、Ｃ）は、ＩＬ−１２Ｒβ２に対する抗体およびＣＤ３４に対する抗体で標識され、そして、フローサイトメトリー（ＡおよびＢ）または免疫細胞化学（Ｃ）で分析した。非染色およびアイソタイプ対照を使用して、四分象限を設定した。Ｒ２：ＩＬ−１２Ｒβ２+ＣＤ３４-、Ｒ３：ＩＬ−１２Ｒβ２+ＣＤ３４+、Ｒ５：ＩＬ−１２Ｒβ２-ＣＤ３４+。
【図５Ｂ】図５：ＩＬ−１２Ｒβ２を発現している、ヒト骨髄Ｌｉｎ−細胞ならびにＣＤ３４+細胞。ヒトＬｉｎ−細胞（Ａ）およびＣＤ３４+細胞（Ｂ、Ｃ）は、ＩＬ−１２Ｒβ２に対する抗体およびＣＤ３４に対する抗体で標識され、そして、フローサイトメトリー（ＡおよびＢ）または免疫細胞化学（Ｃ）で分析した。非染色およびアイソタイプ対照を使用して、四分象限を設定した。Ｒ２：ＩＬ−１２Ｒβ２+ＣＤ３４-、Ｒ３：ＩＬ−１２Ｒβ２+ＣＤ３４+、Ｒ５：ＩＬ−１２Ｒβ２-ＣＤ３４+。
【図５Ｃ】図５：ＩＬ−１２Ｒβ２を発現している、ヒト骨髄Ｌｉｎ−細胞ならびにＣＤ３４+細胞。ヒトＬｉｎ−細胞（Ａ）およびＣＤ３４+細胞（Ｂ、Ｃ）は、ＩＬ−１２Ｒβ２に対する抗体およびＣＤ３４に対する抗体で標識され、そして、フローサイトメトリー（ＡおよびＢ）または免疫細胞化学（Ｃ）で分析した。非染色およびアイソタイプ対照を使用して、四分象限を設定した。Ｒ２：ＩＬ−１２Ｒβ２+ＣＤ３４-、Ｒ３：ＩＬ−１２Ｒβ２+ＣＤ３４+、Ｒ５：ＩＬ−１２Ｒβ２-ＣＤ３４+。
【図６Ａ】図６は、他の幹細胞マーカーを共発現している、ヒトＬｉｎ−ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞およびＣＤ３４+ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞。Ｌｉｎ−細胞（Ａ）およびＣＤ３４+細胞（Ｂ）は、ＩＬ−１２Ｒβ２に対する抗体、ならびに、幹細胞の指標マーカーで共標識して、そして、フローサイトメトリーで分析した。なお、ＩＬ−１２Ｒβ２は、Ｌｉｎ−細胞の１〜４％およびＣＤ３４+細胞の６〜５０％上で発現していることに付記する。
【図６Ｂ】図６は、他の幹細胞マーカーを共発現している、ヒトＬｉｎ−ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞およびＣＤ３４+ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞。Ｌｉｎ−細胞（Ａ）およびＣＤ３４+細胞（Ｂ）は、ＩＬ−１２Ｒβ２に対する抗体、ならびに、幹細胞の指標マーカーで共標識して、そして、フローサイトメトリーで分析した。なお、ＩＬ−１２Ｒβ２は、Ｌｉｎ−細胞の１〜４％およびＣＤ３４+細胞の６〜５０％上で発現していることに付記する。
【図７】図７：ＴＢＩへの曝露、ならびに、ビヒクルまたはｒＨｕＩＬ−１２のいずれかによる、ＴＢＩの２４時間後の治療に引き続く、アカゲザルの生存率。
【００２４】
各治療群について、試験期間にわたる生存のカプラン−マイヤープロットを示す。各用量群は、１８匹の動物で構成されている。５０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ、２５０ｎｇ／ｋｇおよび５００ｎｇ／ｋｇ用量群の、ビヒクル治療対照群対する、ログ・ランク検定  ｐ−値は、それぞれ、０．０３０５、０．０３４４、０．０４０４、および０．０２６５であった。
【図８】図８：致死ＴＢＩへの曝露、ならびに、ビヒクルまたはｒＨｕＩＬ−１２のいずれかによる、ＴＢＩの２４時間後の治療が施された、アカゲザルの経時的な血球数（平均±ＳＥＭ）。
【００２５】
Ａ）血小板；Ｂ）平均血小板容積；Ｃ）好中球；Ｄ）リンパ球；Ｅ）網赤血球。正常な範囲は以下の通りである：リンパ球、１．８５〜８．７１×１０9／Ｌ；好中球、１．２１〜１０．２９×１０9／Ｌ；血小板、２５２〜６１２×１０9／Ｌ；平均血小板容積、６．３〜９．４  ｆＬ；網赤血球、２９．９〜１０３．９×１０9／Ｌ。
【図９−１】図９：骨髄再生島の同定。
【００２６】
（Ａ）：再生骨髄の病理組織学的な同定。別途切除された骨髄中に出現している、細胞のクラスターを、１つの再生島としてスコア化した。左パネル、切除された骨髄；中央パネル、再生している骨髄；右パネル、非照射骨髄。（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１  複合型顕微鏡；Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０、倍率：１０×）。
【００２７】
（Ｂ）：個々の治療群の再生島の数の定量（左パネル、５００ｎｇ／ｋｇ群対対照、Ｐ＜０．０１）、および、ビヒクル治療対照に対する、ｒＨｕＩＬ−１２治療群の組合せ（右パネル、ｐ＜０．０５）。
【００２８】
（Ｃ）個々の治療群の再生領域の定量（左パネル、５０および５００ｎｇ／ｋｇ群対対照、ｐ＜０．０５）、および、ビヒクル治療対照に対する、ｒＨｕＩＬ−１２治療群の組合せ（右パネル、ｐ＜０．０５）。
【００２９】
（Ｄ）個々の治療群の巨核球の定量（左パネル）および、ビヒクル治療対照に対する、ｒＨｕＩＬ−１２治療群の組合せ（右パネル）。
【図９−２】図９：骨髄再生島の同定。
【００３０】
（Ａ）：再生骨髄の病理組織学的な同定。別途切除された骨髄中に出現している、細胞のクラスターを、１つの再生島としてスコア化した。左パネル、切除された骨髄；中央パネル、再生している骨髄；右パネル、非照射骨髄。（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１  複合型顕微鏡；Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０、倍率：１０×）。
【００３１】
（Ｂ）：個々の治療群の再生島の数の定量（左パネル、５００ｎｇ／ｋｇ群対対照、Ｐ＜０．０１）、および、ビヒクル治療対照に対する、ｒＨｕＩＬ−１２治療群の組合せ（右パネル、ｐ＜０．０５）。
【００３２】
（Ｃ）個々の治療群の再生領域の定量（左パネル、５０および５００ｎｇ／ｋｇ群対対照、ｐ＜０．０５）、および、ビヒクル治療対照に対する、ｒＨｕＩＬ−１２治療群の組合せ（右パネル、ｐ＜０．０５）。
【００３３】
（Ｄ）個々の治療群の巨核球の定量（左パネル）および、ビヒクル治療対照に対する、ｒＨｕＩＬ−１２治療群の組合せ（右パネル）。
【図１０】図１０：致死的照射を受けたマウスにおける、ＢＭＴと同様に有効な、ｒＭｕＩＬ−１２により増大される生存率（percentage survival）。
【００３４】
マウスは、静脈内注射で、ビヒクル、ｒＭｕＩＬ−１２×１（ＴＢＩの２４時間前に１０ｎｇ投与）、ｒＭｕＩＬ−１２×２（ＴＢＩの２４時間前および３日後に１０ｎｇ投与）、またはＢＭＴ（ＴＢＩの２時間後に１．１×１０6個の細胞投与）による治療が施された。各群の生存曲線は、マンテル−コックス検定により統計的に比較された。
【図１１Ａ】図１１：ｒＭｕＩＬ−１２ならびにＢＭＴにより治療された、致死的照射がなされたマウスにおける血液細胞回復は同等であった。マウスは、ｒＭｕＩＬ−１２×１（ＴＢＩの２４時間前に１０ｎｇ投与）、ｒＭｕＩＬ−１２×２（ＴＢＩの２４時間前および３日後に１０ｎｇ投与）、あるいは、ＴＢＩの２時間後に投与されたＢＭＴ（１．１×１０6個の細胞）により治療された。Ａ）好中球；Ｂ）ＲＢＣ；Ｃ）血小板の血球数が、２１、２８、および３５日目に測定された。統計分析を、スチューデントのＴ検定を使用して実施した。パネルＡ、Ｂ、およびＣの破線は、マウスにおける正常レベルを示す。エラーバーは、平均±標準偏差を表す。
【図１１Ｂ】図１１：ｒＭｕＩＬ−１２ならびにＢＭＴにより治療された、致死的照射がなされたマウスにおける血液細胞回復は同等であった。マウスは、ｒＭｕＩＬ−１２×１（ＴＢＩの２４時間前に１０ｎｇ投与）、ｒＭｕＩＬ−１２×２（ＴＢＩの２４時間前および３日後に１０ｎｇ投与）、あるいは、ＴＢＩの２時間後に投与されたＢＭＴ（１．１×１０6個の細胞）により治療された。Ａ）好中球；Ｂ）ＲＢＣ；Ｃ）血小板の血球数が、２１、２８、および３５日目に測定された。統計分析を、スチューデントのＴ検定を使用して実施した。パネルＡ、Ｂ、およびＣの破線は、マウスにおける正常レベルを示す。エラーバーは、平均±標準偏差を表す。
【図１１Ｃ】図１１：ｒＭｕＩＬ−１２ならびにＢＭＴにより治療された、致死的照射がなされたマウスにおける血液細胞回復は同等であった。マウスは、ｒＭｕＩＬ−１２×１（ＴＢＩの２４時間前に１０ｎｇ投与）、ｒＭｕＩＬ−１２×２（ＴＢＩの２４時間前および３日後に１０ｎｇ投与）、あるいは、ＴＢＩの２時間後に投与されたＢＭＴ（１．１×１０6個の細胞）により治療された。Ａ）好中球；Ｂ）ＲＢＣ；Ｃ）血小板の血球数が、２１、２８、および３５日目に測定された。統計分析を、スチューデントのＴ検定を使用して実施した。パネルＡ、Ｂ、およびＣの破線は、マウスにおける正常レベルを示す。エラーバーは、平均±標準偏差を表す。
【図１２Ａ】図１２：ヒト骨髄ＣＤ３４+細胞がＩＬ−１２Ｒベータ２を発現する。
【００３５】
Ａ）ヒトＣＤ３４+細胞を、ＩＬ−１２Ｒベータ２に対する抗体で標識して、そして、免疫細胞化学を使用して分析した。分析は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１複合型顕微鏡上で、×２００（２０×対物および１０×対眼レンズ）で実施した。
【００３６】
Ｂ）ヒト骨髄ＣＤ３４+細胞上のＩＬ−１２Ｒベータ２発現を、フローサイトメトリーによって分析した（ドットプロットを示す）。各抗体について、そのアイソタイプ型一致  対照も、含めた。３回の独立した分析中の１つの代表的な画像を示している。
【図１２Ｂ】図１２：ヒト骨髄ＣＤ３４+細胞がＩＬ−１２Ｒベータ２を発現する。
【００３７】
Ａ）ヒトＣＤ３４+細胞を、ＩＬ−１２Ｒベータ２に対する抗体で標識して、そして、免疫細胞化学を使用して分析した。分析は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１複合型顕微鏡上で、×２００（２０×対物および１０×対眼レンズ）で実施した。
【００３８】
Ｂ）ヒト骨髄ＣＤ３４+細胞上のＩＬ−１２Ｒベータ２発現を、フローサイトメトリーによって分析した（ドットプロットを示す）。各抗体について、そのアイソタイプ型一致  対照も、含めた。３回の独立した分析中の１つの代表的な画像を示している。
【図１３Ａ】図１３：正常ヒト骨髄由来のＣＤ３４+細胞上における、ＩＬ−１２Ｒベータ２と、他の幹細胞マーカーと共発現。ＣＤ３４+細胞を、ＩＬ−１２Ｒ  ２に対する抗体ならびに、それぞれ、示された幹細胞マーカーで共標識して、フローサイトメトリーによって分析した。Ａ）ＣＤ１１７（ｃｋｉｔ）；Ｂ）ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）；Ｃ）ＣＤ１３３；Ｄ）ＣＤ３１８（ＣＤＣＰ１）。結果の各セットについて、左パネルは、それぞれ、アイソタイプ対照を示す。３回の独立した分析中の１つの代表的な画像を示している。
【図１３Ｂ】図１３：正常ヒト骨髄由来のＣＤ３４+細胞上における、ＩＬ−１２Ｒベータ２と、他の幹細胞マーカーと共発現。ＣＤ３４+細胞を、ＩＬ−１２Ｒ  ２に対する抗体ならびに、それぞれ、示された幹細胞マーカーで共標識して、フローサイトメトリーによって分析した。Ａ）ＣＤ１１７（ｃｋｉｔ）；Ｂ）ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）；Ｃ）ＣＤ１３３；Ｄ）ＣＤ３１８（ＣＤＣＰ１）。結果の各セットについて、左パネルは、それぞれ、アイソタイプ対照を示す。３回の独立した分析中の１つの代表的な画像を示している。
【図１３Ｃ】図１３：正常ヒト骨髄由来のＣＤ３４+細胞上における、ＩＬ−１２Ｒベータ２と、他の幹細胞マーカーと共発現。ＣＤ３４+細胞を、ＩＬ−１２Ｒ  ２に対する抗体ならびに、それぞれ、示された幹細胞マーカーで共標識して、フローサイトメトリーによって分析した。Ａ）ＣＤ１１７（ｃｋｉｔ）；Ｂ）ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）；Ｃ）ＣＤ１３３；Ｄ）ＣＤ３１８（ＣＤＣＰ１）。結果の各セットについて、左パネルは、それぞれ、アイソタイプ対照を示す。３回の独立した分析中の１つの代表的な画像を示している。
【図１３Ｄ】図１３：正常ヒト骨髄由来のＣＤ３４+細胞上における、ＩＬ−１２Ｒベータ２と、他の幹細胞マーカーと共発現。ＣＤ３４+細胞を、ＩＬ−１２Ｒ  ２に対する抗体ならびに、それぞれ、示された幹細胞マーカーで共標識して、フローサイトメトリーによって分析した。Ａ）ＣＤ１１７（ｃｋｉｔ）；Ｂ）ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）；Ｃ）ＣＤ１３３；Ｄ）ＣＤ３１８（ＣＤＣＰ１）。結果の各セットについて、左パネルは、それぞれ、アイソタイプ対照を示す。３回の独立した分析中の１つの代表的な画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を含む、移植に引き続く、造血回復のための方法および組成物が提供される。造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、骨髄、末梢血幹細胞または臍帯血に由来する複能性造血幹細胞の移植を含む。本明細書中で使用されるＨＳＣＴ骨髄破壊的な方法は、放射線、化学療法および／または放射線と化学療法の使用を含むことができる。方法および組成物は、ミニ移植または強度軽減前処置のような骨髄非破壊的な方法にも、有用であることができる。
【００４０】
本開示の形態および実施態様は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を含む移植後の造血回復のための、組換えヒトインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）調製物を含むＩＬ−１２を含む、治療用組成物およびその使用方法を提供する。
【００４１】
代表的な組成物および／または方法として、組換えヒトインターロイキン−１２（ｒＨｕＩＬ−１２）およびそのマウスホモログ、ＩＬ−１２（ｒＭｕＩＬ−１２）は、全身放射線照射（ＴＢＩ）の前または後のいずれかに投与される、単回の低用量を使用して、骨髄を再構成する卓越した能力を示す。これらの新規で驚くべきかつ予想外の知見は、ｒＨｕＩＬ−１２が、ＨＳＣおよびニッチ細胞上に発現されたＩＬ−１２受容体に直接作用して、造血を刺激するという証拠を提供した。さらなる臨床試験は、移植に引き続く、ＨＳＣ生着および骨髄回復を増進するための、造血細胞移植物の補助剤としてのｒＨｕＩＬ−１２の使用の有効性を裏付ける。
【００４２】
本開示は、ＨＳＣＴに引き続く、造血回復を向上することのできる方法および治療剤にも関する。例として、ＨＳＣＴの前に、ＩＬ−１２の有効用量を、投与することができる。他の例では、１回またはそれ以上のＩＬ−１２の有効用量を、ＨＳＣＴの前および後に、投与する。別の例では、１回またはそれ以上のＩＬ−１２の有効用量を、ＨＳＣＴの後に、投与する。
【００４３】
加えて、本開示は、実質的に単離されたＩＬ−１２を含む医薬組成物の治療有効量の用量を、骨髄破壊ならびに骨髄非破壊に引き続き、患者に投与する工程を含む；電離放射線への患者の曝露に引き続く、系統、器官、組織または細胞の損傷から、患者を保護する方法に関する。骨髄破壊的方法には、例えば、放射線、化学療法および／または放射線と化学療法が含まれる。代表的な骨髄非破壊的方法には、例えば、ミニ移植または強度軽減前処置が含まれる。
【００４４】
本開示は、例えば、全身放射線照射として、あるいは、体の一部の放射線照射を介して、施すことができる、骨髄破壊的放射線照射にも関する。放射線照射は、２つまたはそれ以上の画分の分割線量として、施すこともできる。別の実施態様では、放射線照射は、多分割照射療法においては、分割線量として、施される。別の形態では、放射線照射は、加速分割療法においては、分割線量として、施される。
【００４５】
一形態では、ＩＬ−１２の有効用量は、１回またはそれ以上の１００〜３００ｎｇ／Ｋｇの用量で投与される。
【００４６】
一形態では、１回またはそれ以上のＩＬ−１２の有効用量が、局所的に、皮下に、皮内に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、硬膜外に、腸管外に、鼻腔内におよび／または頭蓋内に投与される。
【００４７】
本発明は、放射線照射された患者における、組換えＩＬ−１２と骨髄細胞移植（ＢＭＣＴ）の造血促進活性をｉｎ  ｖｉｖｏで比較するための方法、ならびに、ｒＨｕＩＬ−１２の潜在的な細胞標的、およびヒトの造血における、ＩＬ−１２受容体の役割をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証する方法にも関する。
【００４８】
本発明は、ＢＭＣＴと同等に有効に、生存率および末梢血液細胞の回復を増大させた、致死的な放射線照射を受けたマウスに対する、少なくとも１回の低用量（１０ｎｇ／マウス）のｒＭｕＩＬ−１２の投与にも関する。一実施態様では、放射線照射の１２日後における、ｒＭｕＩＬ−１２で治療されたマウスのマウス骨髄は、ＩＬ−１２受容体β２−サブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ２）を発現する骨髄前駆細胞、巨核球および骨芽細胞の存在にとり、特徴付けられた。
【００４９】
本発明は、マウス骨髄Ｌｉｎ細胞中における、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現する細胞の数を増大させるためのｒＭｕＩＬ−１２の投与にも関する。一実施態様では、ヒト骨髄細胞の分析は、多能性Ｌｉｎ細胞およびＣＤ３４+細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の他のマーカーとともに、ＩＬ−１２Ｒβ２をも発現したことを示した。
【００５０】
本明細書中に記載され、また、特許請求されている発明は、それには限定されないが、上述されたもの、あるいは、この概要中において、説明もしくは言及されたものをはじめとする、多くの性状ならびに実施態様を有する。該概要は、包括的なものであることを意図しておらず、そして、本明細書中に記載され、また、特許請求されている発明は、限定ではなく、単に例示の目的でのみ、含まれている、該概要中において見出された、特徴もしくは実施態様により、限定されず、またはそれにより制限もされない。さらなる実施態様は、以下の詳細な説明中において、開示される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、ＩＬ−１２は、免疫におけるその役割に関して、周知である、ｐ４０およびｐ３５サブユニットを両方含む、ヘテロ二量体サイトカインである。約２０年間にわたる多数の報告中には、ＩＬ−１２は、炎症反応、感染に対する自然抵抗性および適応免疫を調節することによって、免疫性の自然免疫部分および適応免疫部分の間の相互作用において、重要な役割を有していることが解明されている。内因性のＩＬ−１２は、多くの病原体、ならびに、移植可能な腫瘍、および化学物質により誘発された腫瘍に対する抵抗性において、要求されている。免疫系における、ＩＬ−１２の特徴的な効果は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージおよびＴ細胞からのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）の産生を刺激する能力である。さらに、９０年代初期〜中期における、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究は、ＩＬ−１２が、他のサイトカインとともに、相乗的に造血を刺激することができると報告している。これらの研究では高度精製の前駆細胞または均一な単一細胞が使用されているので、ＩＬ−１２の造血促進活性は、骨髄幹細胞に対する直接作用に因っていると見做される。いくつかの研究が、造血の促進および抑制の両方を、ＩＦＮ−ガンマに結び付いているように、ＩＬ−１２の造血活性におけるＩＦＮ−ガンマの役割は、明らかではない。
【００５２】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、全身放射線照射への曝露の前、またはその直後に使用した場合、放射線防護機能を有することが示されている（Neta,et al.,(1994) "IL-12 protects bone marrow from and sensitizes intestinal tract to ionizing radiation."  J Immunol 153: 4230〜4237; Chen, et al., (2007) "IL-12 facilitates both the recovery of endogenous hematopoiesis and the engraftment of stem cells after ionizing radiation." Exp Hematol 35: 203〜213;さらに、US20110206635およびUS7939058の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。該研究においては、マウスは、致死的な全身放射線照射の有害作用から救済された。放射線照射防護効果は、骨髄中の未知の細胞集団の中、おそらくは、長期再増殖造血幹細胞に帰されると、報告されている。別の研究においては、ＩＬ−１２は、担腫瘍マウスへの亜致死的線量の放射線照射に引き続く、末梢血球数の早期回復を提供することが示されている。（Basile, et al., (2008); "Multilineage hematopoietic recovery with concomitant antitumor effects using low dose Interleukin-12 in myelosuppressed tumor-bearing mice."  J Transl Med 6: 26 ）。この後者の研究では、腫瘍体積の低減においては、ＩＬ−１２は、放射線照射と相乗的であったことが示された。特に、ＩＬ−１２は、放射線曝露の前または後のいずれかに投与された場合、腫瘍体積を増加させなかった。
【００５３】
よって、ＩＬ−１２は、全身放射線照射に引き続く、骨髄に対する放射線防護における可能性を有する。しかしながら、早期の研究は、ＩＬ−１２は、骨髄における、放射線防護効果を有するが、胃腸（ＧＩ）系は、放射線損傷に対して敏感になったと報告した（Neta,et al.）。その後の報告において、ＩＬ−１２のＧＩを敏感化する効果は、投与されたＩＬ−１２の用量に依存することがわかった（Chen, et al.）。骨髄以外の、他の組織または器官に対するＩＬ−１２の放射線防護効果についての報告はない。
【００５４】
本発明は、特定のマウス組換えＩＬ−１２（例えば、ｍ−ＨｅｍａＭａｘ）およびヒト組換えＩＬ−１２（例えば、ＨｅｍａＭａｘ）が、患者における、ＨＳＣＴ移植に引き続く、造血回復を向上させる能力を有しているという、驚くべき、予想外の発見に基づいている。
【００５５】
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、高用量の化学療法および／または放射線療法によって破壊された幹細胞を修復する手術である。幹細胞移植のために、全身放射線照射（ＴＢＩ）を施された患者は、血小板が低い個数である、延長された期間を有している。これらの低い血小板の個数は、出血および感染を引き起こす。これまで、血小板の回復を加速する用途に利用可能な薬物はなく、したがって、輸血がしばしば必要とされている。
【００５６】
ＨＳＣＴによって治療が可能な、疾患、障害および／または症状は、例えば、多発性骨髄腫；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；急性骨髄性白血病；神経芽細胞腫；胚細胞腫瘍；自己免疫障害；アミロイド−シスが含まれる。
【００５７】
自家ＨＳＣＴ：急性骨髄性白血病；急性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性リンパ球性白血病；骨髄増殖性障害；骨髄異形成症候群；多発性骨髄腫；非ホジキンリンパ腫；ホジキン病；再生不良性貧血；
同種ＨＳＣＴ；赤芽球ろう；発作性夜間ヘモグロビン尿症；ファンコーニ貧血；重症型サラセミア；鎌状赤血球貧血；重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）；ウィスコット・アルドリッチ症候群；血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）；先天性代謝異常
特定の実施態様では、従来のＢＭＴには適しているとは以前は考えられていなかった、患者のために、特別に開発されたＢＭＴ手技が、強度軽減移植前治療（「ＲＩＣ」）である。ＲＩＣ移植の着想は、患者にドナーの幹細胞を受け入れさせるためには、高用量療法は、必ずしも必要ではないということにある。この高用量療法の回避は、高齢あるいは、前から存在している健康上の問題を有する患者において、該手術をより安全なものとする。そのかわりに、患者に、比較的毒性の低い前処置療法を施す。軽減の程度に依って、時に、前処置療法は、患者を入院患者ユニットに収容するよりも、外来患者ユニットにおいて施される。強度軽減移植前治療は、患者の免疫系が十分に抑制され、その結果、ドナーの幹細胞を受け入れるように、設計される。
【００５８】
一形態では、骨髄は、全身放射線照射、または高用量化学療法および全身放射線照射の組み合わせによって完全に破壊される。そのような極端な処置の目的は、骨髄中に存在しうるすべての疾患細胞（例えば、白血病細胞または固形腫瘍に由来する転移した腫瘍細胞）を排除することである。この手技に引き続き、骨髄幹／前駆細胞の移植が施される。
【００５９】
一形態では、空の骨空洞に再生息するために使用される成人幹／前駆細胞は、骨髄から（例えば、後部腸骨稜から）直接に、または末梢血から取得することができる。後者の場合、ドナー（例えば、患者彼／彼女自身または近親者）は、骨髄細胞を動態化し、そして、末梢血前駆細胞の収率を高めるために、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦによって前処理することができる。幹／前駆細胞集団は、様々な方法、例えば、単球もしくはＴリンパ球を除去するための磁気細胞分離法（magnetic-activated cell sorting）またはＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心法を使用することによって、濃縮することができる。移植に先立ち、通常、幹／前駆細胞は、液体窒素の蒸気相中において、イスコフ改変ダルベッコ培地等の、５〜２０％のジメチルスルホキシド含有培地中にｆ貯蔵される。本分野で周知の幹／前駆細胞の単離、濃縮および貯蔵ための任意の標準化された手順を使用することもできる。
【００６０】
先行している造血支持療法（ＥＰＯ）は、腫瘍成長に対するそれらの効果に対して、ブラックボックス警告が通知された。造血幹細胞に対するＨｅｍａＭａｘの作用の直接的なメカニズムは、（Ｐｒｏｃｒｉｔ、ＡｒａｎｅｓｐおよびＥｐｏｇｅｎという商標を付けられた）ＥＰＯ、および（ＮｅｕｌａｓｔａおよびＮｅｕｐｏｇｅｎという商標を付けられた）Ｇ−ＣＳＦ、ならびに、（ＮｐｌａｔｅおよびＰｒｏｍａｃｔａという商標を付けられた）ＴＰＯ模倣体および（Ｎｅｕｍｅｇａという商標を付けられた）ＩＬ−１１等の、他の周知の造血成長因子とは、対比されることができる。ＥＰＯ様分子は、赤血球前駆細胞のレベルで作用して、赤血球の増加をもたらす。Ｇ−ＣＳＦ様分子は、好中球前駆細胞のレベルで作用して、好中球の増加をもたらす。ＴＰＯ模倣体およびＩＬ−１１は、巨核球のレベルで作用して、血小板の増加をもたらす。これらの造血成長因子の標的細胞集団は、すべて、ＨｅｍａＭａｘの標的細胞である造血幹細胞の下流にある。
【００６１】
ＨｅｍａＭａｘの作用メカニズムと、周知の造血成長因子のそれとの間には重複がない。ＨｅｍａＭａｘの作用メカニズムは、他の造血因子の作用の上流の造血幹細胞の活性化を伴っている。結論として、ＨｅｍａＭａｘは、除去した後に、造血系および免疫系を再充填し、そして、再生させることができるが、下流の作用因子は、前駆細胞を標的として、単一の血液細胞タイプをもたらすのみで、これらの下流の作用因子には、上流の造血幹細胞の活性化はできない。この早期に作用する（上流の）メカニズムを介して、ＨｅｍａＭａｘによる、原始造血幹細胞の活性化は、すべての主要血液細胞タイプを復元することができる。前臨床試験において、ＨｅｍａＭａｘは、その免疫療法の作用メカニズム（ＩＮＦ−γの増加ならびにＴおよびＮＫ細胞の上方制御）による、抗腫瘍効果を有している。
【００６２】
ＨｅｍａＭａｘに対するマウス対応物（ｒＭｕＩＬ−１２）は、亜致死性または致死的な全身放射線照射（ＴＢＩ）に曝露された、正常および担腫瘍マウス両方において、白血球および赤血球ならびに血小板をはじめとする、全系列血液細胞の回復を促進する。ＨｅｍａＭａｘの活性は、骨髄コンパートメント内に存在する原始細胞（造血および非造血幹細胞）のレベルで開始される。これらの原始細胞の活性化は、放射線照射または化学療法により引き起こされた骨髄破壊または骨髄機能抑制に引き続く、骨髄コンパートメントの再生をもたらす。
【００６３】
ＨｅｍａＭａｘは、ＨＳＣＴに先立つ、幹細胞移植の前／後における、現行方法の再定義、ならびに、ＨＳＣＴ後の造血幹細胞（ＨＳＣ）生着エンハンサーのアジュバントとして、特有の役割を有する。ＨＳＣＴは、白血病およびリンパ腫（また、神経芽細胞腫および多発性骨髄腫）の治療において、最も一般的に使用され、寛解期にある場合には、最も有効である。ＨｅｍａＭａｘは、早期の造血幹細胞（ＨＳＣ−移植前に動員し、移植後のＨＳＣ生着を助ける）の再生ならびに分化を刺激することによって、化学療法の処置により破壊された幹細胞／骨髄を回復することができた。
【００６４】
本開示の目的では、以下の定義は全体として、技術用語を定義するため、ならびに、請求の範囲において、権利保護が求められている、組成物の範囲を定義するために使用されるものとする。
【００６５】
本明細書中で使用する際、「患者」は、治療、観察または実験の対象である動物をさす。「動物」は、魚類、甲殻類、爬虫類および、特に哺乳動物等の、冷血および温血脊椎動物および無脊椎動物を含む。「哺乳動物」は、これらに限定されないが、マウス；ラット；ウサギ；モルモット；イヌ；ネコ；ヒツジ；ヤギ；雌牛；ウマ；サル、チンパンジー、類人猿ならびに、胎児期の、小児のおよび成人のヒトのような、霊長類を含む。
【００６６】
本明細書中で使用される際、「予防すること」または「保護すること」は、全体的にまたは部分的に防止すること、あるいは寛解させることまたは抑制することを意味する。
【００６７】
本明細書中で使用される際、用語「治療すること」は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方、あるいは治療的潜在力を有する疑いのある作用剤を投与することをさす。
【００６８】
本明細書中で使用される際、用語「薬学的有効量」は、治療されている疾患の症状の軽減または緩和を含む、研究者、獣医師、医師または他の臨床医によって求められている、組織、器官、動物またはヒトにおける生物学的または医学的応答を引出す、活性化合物または医薬品の量を意味する。
【００６９】
本明細書中で使用される際、本開示の医薬組成物に関して、「有効量」は、有用性を有し、所望の治療的な結果を提供するのに十分な量をさす。
【００７０】
本明細書中で使用される際、全身放射線照射（ＴＢＩ）に引き続く放射線誘発損傷は、以下の：骨髄、リンパ系、免疫系、粘膜組織、粘膜免疫系、胃腸管系、循環器系、神経系、生殖器官、前立腺、卵巣、肺、腎臓、皮膚および脳に付随している、器官、組織、系に悪影響を及ぼしえる。
【００７１】
本明細書中で使用される際、放射線曝露は、放射線誘発性の急性、慢性および全身性の損傷効果を伴っている。一形態では、本開示は、放射線誘発性の急性損傷効果を治療するための治療用組成物およびその使用方法を提供する。代表的な損傷効果は、必ずしも、放射線照射ビーム中の正常組織に限定されるわけではない。代表的な損傷効果には、処置部位を越えて拡がり、例えば、食道炎（嚥下困難）；肺内の肺炎（咳、発熱、肺液貯留）；小腸放射線照射誘導性の炎症（下痢、けいれん、腹部痛）；悪心および嘔吐；疲労、倦怠感、下痢、頭痛、組織膨満、皮膚の紅斑、咳および呼吸困難も含まれる。代表的な損傷効果は、皮膚の領域、例えば、紅斑、落屑；口腔粘膜、例えば、粘膜炎、鼻咽頭；中咽頭；声帯；扁桃；皮膚（扁平上皮または癌腫）に悪影響を及ぼしうる。特定の実施態様では、代表的な効果には、毛細血管拡張症、線維症、脊髄炎（spinal cord myelitis）および軟骨の線維症（cartilage fibrosis）も含まれる。
【００７２】
特定の実施態様では、代表的な放射線誘発損傷効果には、（骨髄、脾臓およびリンパ組織等の）最も早いペースで分裂する細胞への損傷が特徴である、造血器（骨髄）症候群も含まれる。代表的な症状には、内部出血、倦怠感、細菌感染および発熱が含まれる。
【００７３】
特定の実施態様では、代表的な放射線誘発損傷効果には、（胃および小腸の内壁等の）それほど急速に分裂しない細胞への損傷が特徴である、胃腸管症候群も含まれる。代表的な症状には、悪心、嘔吐、下痢、脱水、電解質不均衡、消化能力喪失、出血性潰瘍および造血器症候群の症状が含まれる。
【００７４】
特定の実施態様では、代表的な放射線誘発損傷効果には、粘膜炎も含まれる。一実施態様では、放射線誘発粘膜炎は、口腔粘膜炎である。
【００７５】
特定の実施態様では、代表的な放射線誘発損傷効果には、神経細胞のような再生されない細胞への損傷が特徴である、中枢神経系症候群も含まれる。代表的な症状は、協調運動障害、錯乱、昏睡、けいれん、ショックならびに造血器および胃腸管症候群の症状を含む。
【００７６】
特定の実施態様では、代表的な放射線誘発損傷効果には、胎児期の放射線曝露に因る、胎児に対する効果も含まれる。（胚／胎児細胞は急速に分裂している）、胚／胎児は、特に、妊娠の最初の２０週間において、放射線照射に対して特に敏感である。
【００７７】
特定の実施態様では、代表的な放射線誘発効果には、電離放射線照射と酸素および水の相互作用に由来する、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、酸化窒素および過酸化窒素をはじめとする、電離放射線照射誘発性のラジカル酸素種（ＲＯＳ）生成に因る損傷も含まれる。
【００７８】
一形態では、本開示は、放射線誘発性の慢性損傷効果を治療するための治療用組成物およびその使用方法を提供する。慢性の放射線照射効果は、すべての患者において非常に重要であるが、全身放射線照射（ＴＢＩ）を施されている者においては特別である。全身放射線照射は、いくつかのがん治療において、特に、骨髄移植を必要とする患者に対して、利用される。
【００７９】
代表的な放射線誘発性の慢性損傷効果は、例えば、白髪になること、皮膚の菲薄化および乾燥、白内障発生、早期心筋線維症、心筋梗塞、神経変性、骨減少症／骨軟化症（osteomalasia）および神経認知異常のような早期老化に共通する特徴を含むことができる。
【００８０】
特定の実施態様では、代表的な放射線誘発効果には、線維症（患部の制限された動きをもたらす、瘢痕組織による正常組織の置換）；下痢および出血を引き起こす、腸への損傷；記憶喪失；不妊および／または発癌／白血病誘発も含まれる。
【００８１】
特定の実施態様では、本開示の方法および組成物は、幹細胞移植に引き続く造血を改善するために有用である。代表的な骨髄破壊的な照射（delivery）のモダリティ／レジメンは、例えば、従来の分割照射療法、多分割照射法、少分割照射法および加速分割照射法を含むことができる。
【００８２】
一実施態様では、治療モダリティ／レジメンは、多分割照射法である。多分割照射法において、目標は、臨床的に許容される長期の組織損傷のレベルを維持しつつ、より高い腫瘍線量を照射することである。画分当たりの線量を減少させつつ、一日当たりの用量は、不変であるかまたは僅かに増加するのみで、そして、全体的な処置時間が一定のままである。
【００８３】
一実施態様では、治療モダリティ／レジメンは、加速分割照射療法である。加速分割照射療法においては、一日当たりの用量は増加する一方、画分当たりの線量は不変であり、そして、治療のための合計時間は減少する。
【００８４】
一実施態様では、治療モダリティ／レジメンは、持続的多分割加速放射線療法（ＣＨＡＲＴ）である。（ＣＨＲＡＴ）療法においては、短縮された期間内において、複数の日々画分が投与される、治療の集中スケジュールが施される。
【００８５】
一実施態様では、治療モダリティ／レジメンは、ＩＭＲＴ（強度変調放射線治療）である。
【００８６】
化学療法との組み合わせ
多数の化学療法剤が、放射線療法の効果を高めることができる。一形態では、本開示の形態および実施態様は、既存の化学療法モダリティとの併用療法として利用されることができる。（連続的または同時の）併用療法は、同時投与または共製剤とすることができる。
【００８７】
「インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）」は、天然のＩＬ−１２分子、ならびに、現在公知であるか、または将来的に開発され、本分野で現在公知のもしくは将来的に開発される任意の方法で生成される、変異型１１−１２分子および共有結合性に修飾されたＩＬ−１２分子をはじめとする、本明細書に開示された造血特性のうちの少なくとも１つをもたらす、ＩＬ−１２分子をさす。
【００８８】
ＩＬ−１２分子は、実質的に単離された形態で存在しうる。この生成物は、この生成物の意図された用途を妨害することのない、担体または希釈剤と混合することができ、そして、依然として、実質的に単離されているとみなされうることは理解されよう。本発明の生成物は、実質的に純粋な形態であることもでき、その場合、例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％をはじめとし、一般的に、調製物のペプチドまたは乾燥質量の約８０％、８５％または９０％を構成する。
【００８９】
一般に、本発明の実施態様において使用されるＩＬ−１２分子のアミノ酸配列は、本発明の方法によって治療される特定の哺乳動物に由来する。よって、一例としては、ヒトにおいては、一般に、ヒトＩＬ−１２または組換えヒトＩＬ−１２が本発明の方法においてヒトに投与され、また、同様に、ネコにおいては、例えば、ネコＩＬ−１２または組換えネコＩＬ−１２が、本発明の方法においてネコに投与される。
【００９０】
しかしながら、ＩＬ−１２分子のアミノ酸配列が本発明の治療方法の対象である哺乳動物に由来していない、特定の実施態様も本発明に含まれる。一例としては、ヒトＩＬ−１２または組換えヒトＩＬ−１２を、ネコ科の哺乳動物に対して利用することもできる。本発明のさらに他の実施態様は、ＩＬ−１２の天然のアミノ酸配列を、天然の配列から変更されているが、該ＩＬ−１２分子は本明細書中に開示された、ＩＬ−１２の造血特性をもたらすように機能しいる、ＩＬ−１２分子をも含む。ＩＬ−１２の天然の種特異的なアミノ酸配列からの変更は、ＩＬ−１２の一次配列中の変化を含み、また、変異型ＩＬ−１２分子をもたらすための、一次アミノ酸配列への欠失および付加をも包含する。高度に誘導体化がなされているＩＬ−１２分子の一例は、Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃにより製造される、再設計が施されたＩＬ−１２分子（Leong S Rら、Proc Nati Acad Sci USA. 2003 Feb. 4；100 (3)：1163-8ページ）であり、該変異型ＩＬ−１２分子は、ＤＮＡシャッフリング法によって生成されている。修飾ＩＬ−１２分子、例えば、保存可能期間、半減期、有効性、溶解度、送達性などを増加させる、ＩＬ−１２分子への共有結合的修飾、米国特許第4,640,835号；同第4,496,689号；同第4,301,144号；同第4,670,417号；同第4,791,192号または同第4,179,337号に示された手法でのポリレチレングリコール基、ポリプロピレングリコールなどの付加も、本発明の方法に含まれる。ＩＬ−１２分子への共有結合的修飾の１つのタイプは、ＩＬ−１２ポリペプチドの選択された側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端残基と反応することのできる有機誘導体化剤を用いて、ＩＬ−１２ポリペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることによって、分子内に導入される。天然配列ＩＬ−１２およびＩＬ−１２のアミノ酸配列変異体は、ともに、共有結合性に修飾することができる。本明細書中で言及される際、ＩＬ−１２分子は、組換え法をはじめとする、本分野で知られた多様な方法によって生成することができる．本開示に含まれる、他のＩＬ−１２変異体は、標準配列が翻訳後修飾、例えば、グリコシル化されるものである。特定の実施態様では、ＩＬ−１２は、哺乳動物発現系または細胞系において発現される。一実施態様では、ＩＬ−１２は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現によって産生される。
【００９１】
変異型ＩＬ−１２ポリペプチドの特徴を前もって予測することは困難なことが多いため、最適な変異体を選択するため、回収された変異体の何等かのスクリーニングが必要とされることは理解される。変異型ＩＬ−１２分子の血液学的な刺激または亢進特性における変化を評価する好ましい方法は、以下に開示される、致死的な放射線照射のレスキューのプロトコールによる。酸化還元もしくは温度安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、または担体と、もしくは多量体に凝集する傾向等の、タンパク質またはポリペプチドの特性の他の可能性のある修飾は、本分野で周知の方法を用いて、評価される。
【００９２】
ＩＬ−１２に関する、一般的記載に関しては、米国特許第5,573,764号、同第5,648,072号、同第5,648,467号、同第5,744,132号、同第5,756,085号、同第5,853,714号および同第6,683,046号を参照されたい。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、一般に、免疫反応に関与する細胞の活性を制御する炎症促進性サイトカインとして記述されている、ヘテロ二量体サイトカインである（Fitz K Mら、1989、J. Exp. Med. 170:827-45ページ）。一般に、ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生を刺激し（Lertmemongkolchai G, Caiら、2001、Journal of Immunology. 166:1097〜105ページ；Cui J, Shin Tら、1997、Science. 278:1623〜6ページ；Ohteki T, Fukao Tら、1999、J. Exp. Med. 189:1981〜6ページ；Airoldi I, Gri Gら、2000、Journal of Immunology. 165:6880〜8ページ）、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞の分化を助力し(Hsieh C Sら、1993、Science. 260：547〜9ページ；Manetti Rら、1993、J. Exp. Med. 177：1199〜1204ページ）、自然抵抗性と適応免疫の間の関連を形成する。
【００９３】
ＩＬ−１２は、その免疫調節および抗血管新生効果を介して、がん成長を阻害することも示されている（Brunda M Jら、1993、J. Exp. Med. 178：1223〜1230ページ；Noguchi Yら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93：11798〜11801ページ；Giordano P Nら、2001、J. Exp. Med. 194：1195〜1206ページ；Colombo M Pら、2002、Cytokine Growth factor rev. 13：155〜168ページ；Yao Lら、2000、Blood 96:1900〜1905ページ）。ＩＬ−１２は、主に樹状細胞（ＤＣ）および貪食細胞（マクロファージおよび好中球）が、遭遇した病原性細菌、真菌または細胞内寄生生物によって活性化されると、それらにより産生される（Reis Cら、1997、J. Exp. Med. 186： 1819〜1829 ページ； Gazzinelli R Tら、1994、J. Immunol. 153：2533〜2543 ページ；Dalod Mら、2002、J. Exp. Med. 195：517〜528ページ）。ＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）は、主に活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞によって発現される（Presky D Hら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93：14002〜14007 ページ； Wu C Yら、 1996、Eur J. Immunol. 26：345〜50 ページ）。
【００９４】
一般に、ＩＬ−１２の産生は、ＩＮＦ−γの産生を刺激し、これが、今度は、ＩＬ−１２の産生を高める、すなわち、ポジティブ・フィードバック・ループを形成する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系では、ＩＬ−１２は、他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−３およびＳＣＦ）と相乗して、初期造血前駆細胞の増殖および分化を刺激することができると報告されている。（Jacobsen S Eら、1993、J. Exp Med 2：413〜8ページ；Ploemacher R Eら、1993、Leukemia 7：1381〜8ページ；Hirao Aら、1995、Stem Cells 13：47〜53ページ）
ＩＬ−１２のｉｎ  ｖｉｖｏ投与では、末梢血球数および骨髄造血を減少させることが観察された（Robertson M Jら、1999、Clinical Cancer Research 5：9〜16ページ；Lenzi Rら、2002、Clinical Cancer Research 8：3686〜95ページ；Ryffel B. 1997、Clin Immunol Immunopathol. 83：18〜20ページ；Car B Dら、1999、The Toxicol Pathol. 27：58〜63ページ）。ＩＮＦ−γ受容体ノックアウトマウスを用いて、ＥｎｇらおよびＣａｒらは、高用量のＩＬ−１２が一般的にみられる毒性効果を誘発しない、すなわち、造血の阻害はなかったことを実証した、（Eng V Mら、1995、J. Exp Med. 181：1893〜8ページ；Car B Dら、1995、American Journal of Pathology 147：1693〜707ページ）。この観察結果は、先に報告されたとおり、一般的なＩＬ−１２の現象によって促進された分化した造血細胞の亢進は、支配的な骨髄抑制的方法において、作用する、ＩＮＦ−γの産生によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで釣り合いがとれることを示唆している。
【００９５】
最近の証拠は、代表的なＩＬ−１２調製物、組換えヒトＩＬ−１２（例えば、ＨｅｍａＭａｘ）が、体内で少なくとも４つのレベルで応答を引き起こすことを示唆している（図１４を参照されたい）。レベル１の応答においては、ＨｅｍａＭａｘは、現存の放射線感受性免疫細胞、すなわち、ＮＫ細胞、マクロファージおよび樹状細胞の増殖および活性化を促進する。ＨｅｍａＭａｘ誘発性のＩＬ−１５およびＩＬ−１８の血漿中上昇は、ＮＫ細胞の成熟も促進し、ＩＦＮ−γの放出をもたらし、これが次に、マクロファージおよび樹状細胞、およびおそらくＮＫ細胞からの内因性ＩＬ−１２の産生に良い影響を及ぼす。これらの事象は、ＨｅｍａＭａｘ投与に引き続き、早期に自然免疫能を高める。レベル２の応答においては、ＨｅｍａＭａｘは、生き残っている造血幹細胞、骨芽細胞および巨核球の、増殖および最適の造血を確実にする特定の細胞構成への分化を促進する。ＣＤ３４+、ＩＬ−１２Ｒβ２−陽性骨髄細胞からのＥＰＯのＨｅｍａＭａｘ誘発性の分泌も、骨髄における局所的なＩＦＮ−γの過剰産生を抑制し、こうして、造血細胞の拡大を促進する環境を提供する。骨髄における造血再生は、自然免疫能および適応免疫能を両方とも高める。レベル３の応答において、ＨｅｍａＭａｘは、ＧＩ幹細胞を維持し、病原体の漏出の低減、摂食量の増加および下痢の減少をもたらす。レベル４の応答において、恐らくは、ＨｅｍａＭａｘが、器官／組織の多様な集合において、細胞生育力を高める、細胞保護因子である、ＥＰＯの腎臓からの放出を直接的に増加させている。主に病原体および／またはＥＰＯによって活性化された、樹状細胞からの内因性ＩＬ−１２の継続した産生は、ポジティブ・フィードバック・ループとしての役目を果たし、おそらくは、放射線照射後何週間も、外因性ＨｅｍａＭａｘに対する初期応答を維持することにおける、重要な役割を演じる。
【００９６】
ＩＬ−１２の投与方法
本開示は、所望の治療効果を達成するために、ある期間、ＩＬ−１２の有効用量の１回またはそれより多くの、患者への投与による治療方法を提供する。患者は、好ましくは、雌ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物を含むが、それに限定されない哺乳動物であり、そして、最も好ましくは、ヒトである。
【００９７】
本発明の方法に従ってＩＬ−１２を投与するために、多様な送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、ＩＬ−１２を発現可能な組換え細胞、受容体媒介性のエンドサイトーシス（例えば、WuおよびWu、1987、J. Biol. Chem. 262：4429〜4432ページを参照されたい）、レトロウイルスもしくは他のベクター等の一部として、ＩＬ−１２遺伝子を含む核酸の構築等が知られており、また、使用可能である。導入方法は、それに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含む。
【００９８】
ＩＬ−１２は、任意の便利な経路により、例えば、点滴またはボーラス注入により、上皮もしくは粘膜皮膚裏層（例えば、口腔粘膜、直腸および小腸粘膜など）を経由する吸収により、投与することができ、また、他の生物学的活性剤と一緒に投与することができる。投与は、全身的または局所的であることができる。さらに、脳室内またはクモ膜下腔内注射を含む、任意の好適な経路により中枢神経系中へＩＬ−１２を含む医薬組成物を導入することが望ましい可能性があり；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーのようなリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易に施すことができる。肺内投与も、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を含む製剤の使用により、採用することができる。ＩＬ−１２を含む医薬組成物を、治療を必要とする領域へ局所的に投与することが好ましい可能性があり；これは、例えば、それに限定はされないが、局所投与により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラントにより、達成することができ、前記インプラントは、シラスティック（sialastic）膜のような膜、または繊維をはじめとする、多孔質の、無孔性の、またはゼラチン状の材料でできている。
【００９９】
ＩＬ−１２投与の他の様式は、ベシクル、特にリポソーム中での送達を含む（Langer、Science 249:1527〜1533ページ、(1990); Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer中、Lopez-Berestein および Fidler (編)、Liss, New York、353-365ページ、(1989)；Lopez-Berestein、同上所収、317〜327ページ; 一般に、同上を参照されたい）。
【０１００】
ＩＬ−１２投与のさらに他の様式は、制御放出システムにおける送達を含む。特定の実施態様では、ポンプが使用される（Langer、上記; Sefton、CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14：201ページ(1987); Buchwaldら、Surgery 88：507 (1980)；Saudekら、N. Engl. J. Med. 321：574ページ(1989)を参照されたい）。さらに、ポリマー材料も使用可能である（Medical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise (編), CRC Pres, Boca Raton, Fla. (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall(編)、Wiley、N.Y. (1984)；RangerおよびPeppas、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23：61ページを参照されたい(1983；Levyら, Science 228：190 (1985)；Duringら、Ann. Neurol. 25：351 (1989)；Howardら, J. Neurosurg. 71:105ページ(1989)も参照されたい））；あるいは、制御放出システムを、治療標的、すなわち、脳の近傍に設置することもでき、したがって、全身用量の一部のみが必要とされる（例えば、Goodson、Medical Applications of Controlled Release中、上記、vol. 2、115〜138ページ、(1984)を参照されたい）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ（Science 249:1527〜1533ページ、(1990)）による総説中に論じられている。
【０１０１】
ＩＬ−１２の形態および投薬量
本発明の実施態様での使用のためのＩＬ−１２の好適な剤形は、本質的に無毒性であり、非治療的である生理学的に許容される担体を包含する。そのような担体の例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または硫酸プロタミンのような電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質およびＰＥＧが挙げられる。ＩＬ−１２ポリペプチドの局所的またはゲル性の形態のための担体は、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ＰＥＧおよびウッドワックスアルコール（wood wax alcohol）などのポリサッカライドを含む。すべての投与のために、従来のデポー形態が好適に使用される。そのような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠および持続放出製剤を含む。
【０１０２】
持続放出製剤の好適な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、成形品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルである。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、上記のLangerらおよび上記のLangerにより記載されたポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Sidmanら、上記）、非分解性のエチレン−酢酸ビニル（Langerら、上記）、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）等の分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーが１００日間にわたる分子の放出を可能とする一方、特定のヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。封入されたＩＬ−１２ポリペプチドが長期間、体内に留まる場合、３７℃における水分への曝露の結果として、変性または凝集し、生物学的活性の喪失および免疫原性において可能性のある変化がもたらされる。関与するメカニズムに依存する、安定化のための合理的な対策を考案することができる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド相互変換による、分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることがわかった場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性の溶液から凍結乾燥すること、適切な添加剤を用いて水分含量を制御すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成されうる。
【０１０３】
また、持続放出ＩＬ−１２含有組成物には、リポソームに取り込まれたポリペプチドも含まれる。ＩＬ−１２ポリペプチドを含有するリポソームは、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：３６８８〜３６９２ページ（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７：  ４０３０ページ（１９８０）；および米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号に記載されたような、本分野で公知の方法によって調製される。通常は、リポソームは、その中で脂質含量が約３０モル％コレステロールを超え、選択された割合は最適のＷｎｔポリペプチド療法のために調整されている、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層タイプである。向上した循環時間を具える、リポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
【０１０４】
疾患の治療のために、ＩＬ−１２ポリペプチドの適切な投薬量は、上で定義した、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、先の治療、患者の臨床歴ならびに本明細書に開示されたＩＬ−１２治療法に対する応答性、ならびに担当医の裁量に依存する。本発明によれば、ＩＬ−１２は、１回または一連の治療にわたって、好適に患者に投与される。
【０１０５】
疾患のタイプおよび重症度に依存して、例えば、１回またはそれ以上の別個の投与による、あるいは、持続注入による、約１０ｎｇ／ｋｇ〜２０００ｎｇ／ｋｇのＩＬ−１２が患者への投与のための初回投薬量候補である。ヒトは、約５００ｎｇ／ｋｇの反復投薬量に安全に耐えることができる、但し、約２００ｎｇ／ｋｇまでの単回投薬量は毒性の副作用を生じてはならない。例えば、用量は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥＰＯのような他のサイトカインと同じであってもよい。数日以上にわたる反復投与のためには、症状に依存して、疾患症状の所望の抑制が起こるまで治療が持続される。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用である。この治療法の進行は、従来の技術およびアッセイ法によって容易にモニターすることができる。
【０１０６】
ＩＬ−１２は、直接同時投与または連続投与のいずれかによって、他のサイトカインとともに投与することができる。１つまたはそれ以上のサイトカインがＩＬ−１２と同時投与される場合、より低い用量のＩＬ−１２を採用することができる。他のサイトカイン、すなわち、ＩＬ−１２以外のサイトカインの好適な用量は、約１μｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇのサイトカインである。例えば、その用量は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥＰＯ等の他のサイトカインと同じであることができる。ＩＬ−１２の投与に先立ち、同時に、または、引き続いて、他のサイトカインを投与することができる。哺乳動物への同時投与のための医薬組成物を形成するために、該サイトカインおよびＩＬ−１２を、組み合わせることができる。特定の実施態様では、ＩＬ−１２およびサイトカインの量は、哺乳動物へのＩＬ−１２および他のサイトカインの投与に際して、哺乳動物において血液細胞の相乗的再増殖（または造血細胞の増殖および／または分化における相乗的増加）が起こるようなものである。言い換えれば、血液細胞の再増殖（または造血細胞の増殖および／または分化）に関する２つ以上の作用剤（すなわち、ＩＬ−１２および１つまたは複数のサイトカイン）の協調作用が、これらの分子の個々の効果の合計を超えている。
【０１０７】
貯蔵のために、ＩＬ−１２の治療用製剤は、所望の程度の純度を有するＩＬ−１２を、任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A.編、(1980)）と、混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態に調製される。許容される担体、賦形剤または安定化剤には、採用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して無毒性であり、そして、リン酸、クエン酸および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸をはじめとする抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンをはじめとするモノサッカライド、ジサッカライドおよび他の炭化水素；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成性対イオン；ならびに／あるいはＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１０８】
本明細書中で使用される際、用語「緩衝剤」は、医薬品のｐＨを安定化する、薬学的に許容される賦形剤を示す。好適な緩衝剤は、本分野で周知であり、文献中に見いだされることができる。薬学的に許容される緩衝剤には、それらに限定されないが、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、アルギニン緩衝剤、またはその混合物が含まれる。上記緩衝剤は、一般に、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、および約１０〜２０ｍＭの量で使用される。緩衝液のｐＨは、少なくとも４．０、少なくとも４．５、少なくとも５．０、少なくとも５．５または少なくとも６．０とすることができる。緩衝液のｐＨは、７．５未満、７．０未満または６．５未満とすることができる。緩衝液のｐＨは、本分野で公知の酸または塩基、例えば、塩酸、酢酸、リン酸、硫酸およびクエン酸、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムによって、約４．０〜約７．５、約５．５〜約７．５、約５．０〜約６．５、および約５．５〜約６．５とすることができる。本明細書中で使用される際、ｐＨを記載する場合、「約」は、プラスまたはマイナス０．２ｐＨ単位を意味する。
【０１０９】
本明細書中で使用される際、用語「界面活性剤」は、攪拌および剪断頭の機械的ストレスに対してタンパク質製剤を保護するために使用される、薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。薬学的に許容される界面活性剤の例には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。好適な界面活性剤には、（商標Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）のもとに販売される）ポリソルベート２０および（商標Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）のもとに販売される）ポリソルベート８０等の、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが含まれる。好適なポリエチレン−ポリプロピレンコポリマーは、名称Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８（登録商標）のもとに販売されるものである。好適なポリオキシエチレンアルキルエーテルは、商標Ｂｒｉｊ（登録商標）のもとに販売されるものである。好適なアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテル（esthers）は、商品名Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘのもとに販売されている。ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））が使用される場合、それらは、一般に、約０．００１〜約１％、約０．００５〜約０．２％、および約０．０１％〜約０．１％ｗ／ｖ（重量／体積）の濃度範囲内で使用される。
【０１１０】
本明細書中で使用される際、用語「安定化剤」は、製造、貯蔵および適用中、活性医薬成分および／または製剤を、化学的および／または物理的な劣化から保護する、薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。タンパク質医薬品の化学的および物理的な劣化経路は、Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ、７０（４）：３０７〜７７ページ（１９９３）；Ｗａｎｇ、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．、７Ｓ５（２）：１２９〜８８ページ（１９９９）；Ｗａｎｇ、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．、２０３（１−２）：１〜６０ページ（２０００）；およびＣｈｉら、Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．、２０（９）：１３２５〜３６ページ（２００３）中に、概説されている。安定化剤には、それらに限定されないが、糖、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、例えば、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−ベータ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、キレート剤、例えば、以下に定義されるＥＤＴＡが含まれる。上記のとおり、安定化剤は、製剤中に、約１０〜約５００ｍＭの量、約１０〜約３００ｍＭの量、または約１００ｍＭ〜約３００ｍＭの量で存在することができる。いくつかの実施態様では、代表的なＩＬ−１２を、その中では、それが安定である、適切な医薬製剤中に溶解させることができる。
【０１１１】
ＩＬ−１２を、例えば、コアセルベーション法あるいは界面重合法により調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中、あるいは、マクロエマルジョン中に、取り込ませることもできる。そのような技術は、上記の、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中に、開示されている。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用されるＩＬ−１２は、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成に先立ちまたは引き続いて、除菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。通常、ＩＬ−１２は、凍結乾燥形態または溶液中に貯蔵される。治療用ＩＬ−１２組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により突き刺し可能なストッパーを有する静脈注射用溶液のバッグまたはバイアル中に収納される。
【０１１３】
局所的に適用される場合、ＩＬ−１２は、担体および／または補助剤等の、他の成分と好適に組み合わせられる。生理学的に許容され、その意図される投与のために有効でなければならず、また、組成物の活性成分の活性を低下させる可能性がないことを除き、そのような他の成分の性質には制限がない。好適なビヒクルの例には、精製コラーゲンを含むかまたは含まない、軟膏、クリーム、ゲル、または懸濁液が含まれる。組成物は、経皮パッチ、プラスターおよび絆創膏にも、好ましくは、液体または半液体形態で含浸されることができる。
【０１１４】
ゲル製剤を得る目的で、局所な適用に適する粘度のゲルを形成するため、液体組成物に製剤化されたＩＬ−１２を、水溶性ポリサッカライドまたはＰＥＧのような合成ポリマーの有効量と混合することができる。使用することができる、ポリサッカライドには、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシアルキルセルロースをはじめとする、エーテル化セルロース誘導体等のセルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース；デンプンおよび分別デンプン（fractionated starch）；寒天；アルギン酸およびアルギン酸塩；アラブル ガム（gum arable）;プルラン（pullullan）；アガロース；カラギーナン；デキストラン；デキストリン；フルクタン；イヌリン；マンナン；キシラン；アラビナン；キトサン；グリコーゲン；グルカン；および合成バイオポリマー；ならびに,キサンタンガム；グアーガム；ローカストビーンガム；アラビアガム；トラガントガムおよびカラヤガム等のガム、ならびに、その誘導体および混合物が含まれる。その中でも好ましいゲル化剤は、生体系に対して不活性であり、無毒性で、調製が単純であり、そして、流れやす過ぎずまたは粘ちょう過ぎず、その中に閉じ込められているＩＬ−１２分子を不安定化することのないものである。
【０１１５】
好ましくは、ポリサッカライドは、エーテル化セルロース誘導体、より好ましくは、明確に定義され、精製され、ＵＳＰ（米国薬局方）に列挙されたもの、例えば、メチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース等のヒドロキシアルキルセルロース誘導体である。その中でも、最も好ましいのは、メチルセルロースである。
【０１１６】
ゲル化のために有用なポリエチレングリコールは、通常、適切な粘度を得るために、低分子量および高分子量ＰＥＧの混合物である。例えば、分子量４００〜６００のＰＥＧと分子量１５００のものとの混合物は、ペーストを得ために適する比率で混合されている場合、この目的のために有効となりうる。
【０１１７】
ポリサッカライドおよびＰＥＧに適用する際、用語「水溶性」は、コロイド状溶液および分散液を含むことを意図している。一般に、セルロース誘導体の溶解度は、エーテル基の置換度によって決定され、本明細書中で有用な、安定化させる誘導体は、セルロース鎖中のアンヒドログルコース単位当たり、該誘導体を水溶性とするために十分な量のエーテル基を有する必要がある。一般に、アンヒドログルコース単位当たり、少なくとも０．３５個のエーテル基のエーテル置換度で十分である。さらに、セルロース誘導体は、アルカリ金属塩、例えば、Ｌｉ、Ｎａ、ＫまたはＣｓ塩の形態であることができる。
【０１１８】
ゲル中に、メチルセルロースを採用する場合、それは、好ましくはゲルの約２〜５％、より好ましくは約３％を構成し、そして、ＩＬ−１２は、ゲル１ｍｌ当たり、約３００〜１０００ｍｇの量で存在する。
【０１１９】
治療的に採用される、ＩＬ−１２の有効量は、例えば、治療対象、投与経路、および患者の状態に依存する。したがって、最適な治療効果を得るために、必要に応じて、セラピストが投薬量を評定し、投与経路を修正することが必要である。通常、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで、ＩＬ−１２を投与する。全身的な処置のための、典型的な投薬量は、上述の要素に依存して、約１０ｎｇ／ｋｇから２０００ｎｇ／ｋｇまたはそれ以上までの範囲にわたることもある。いくつかの実施態様では、用量範囲は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９から、約２０まで；約３０まで；約５０まで；約１００まで；約２００まで；約３００まで；または約５００ｎｇ／ｋｇまでの範囲にわたることができる。一形態では、用量は、５００ｎｇ／ｋｇ未満である。別の形態では、用量は、３００ｎｇ／ｋｇ未満である。別の形態では、用量は、約２００ｎｇ／ｋｇ未満である。別の形態では、用量は、約１００ｎｇ／ｋｇ未満である。別の形態では、用量は、約５０ｎｇ／ｋｇ未満である。他の形態では、用量は、約１０〜３００ｎｇ／ｋｇまで、２０〜４０ｎｇ／ｋｇ、２５〜３５ｎｇ／ｋｇ、５０〜１００ｎｇ／ｋｇの範囲に及ぶことができる。
【０１２０】
一形態では、本明細書に記載される、代表的な治療用組成物を、分割照射療法と組み合わせて投与することができる。一実施態様では、各画分に先立ち、治療有効用量が投与される。一実施態様では、治療有効用量が、各画分の投与とおよそ同時に投与される。一実施態様では、治療有効用量が、各画分の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０もしくは６０分前から；または、各画分の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間前；あるいは、各画分の１、２、３、４、５、６、７日前にわたって、各画分の前に投与することができる。一実施態様では、治療有効用量が、各画分の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０もしくは６０分後；または、各画分の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間後；あるいは、各画分の１、２、３、４、５、６、７日後；または、放射線照射治療の間もしくはその後に、毎週、２週間ごとに、もしくは、２カ月に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回にわたって投与される。別の実施態様では、それぞれの放射線源を使用して、ＴＢＩまたは局所的に投与される、３０日間までの、１〜１０線量／日の分割レジメンにおける、各放射線照射の約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０分、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、前および後の両方において、1回またそれ以上の、ＩＬ−１２の代表的用量（１〜１００ｎｇ／ｋｇ）が投与される。
【０１２１】
代わりの一般的な提案として、ＩＬ−１２受容体を製剤化した上で、有効であるが過度に毒性でない最大用量までで、組織中において、約０．１ｎｇ／ｃｃより大きなＩＬ−１２レベルを確立することが可能な投薬量で、標的部位または組織に送達される。可能であれば、持続注入、徐放、局所適用または経験的に決定された頻度の注射によるものをはじめとする、投与レジームによって、この組織内濃度を、維持することが必要である。この治療法の進展は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。
【０１２２】
「処置投与の時間の近辺」は、約１カ月、約３週間、約２週間、約１週間、数日、約１２０時間、約９６時間、約７２時間、約４８時間、約２４時間、約２０時間、数時間、約１時間もしくは数分等の、処置投与の前および／または後のいずれかの、任意の合理的な時間における、ＩＬ−１２の投与をさす。処置投与の時間の近辺は、同時またはほぼ同時、すなわち、数分から１日以内の、いずれかの、処置およびＩＬ−１２の投与を指すこともできる。
【０１２３】
「化学療法」は、医学分野において、現在公知のまたは今後開発される、天然または合成の作用剤を含む、任意の療法をさす。化学療法の例には、現在利用可能な多数の制がん薬が含まれる。しかしながら、化学療法には、疾患状態を治療することを意図されている、任意の天然または合成の薬物をも含まれる。本発明の特定の実施態様では、化学療法には、疾患状態を治療することが意図されている、数種の最先端の薬物の投与も含まれる。例には、頭部の局所的に進行した扁平上皮癌腫を有する患者のための、ドセタキセル、シスプラチンおよび５−フルオロウラシルを用いる併用化学療法（Tsukuda, M.ら、Int J Clin Oncol. 2004 June；9 (3)：161〜6ページ）、ならびに難治性または再発した低悪性度リンパ腫における、フルダラビンおよびベンダムスチン（Konigsmann Mら、Leuk Lymphoma. 2004; 45 (9): 1821〜1827ページ）が含まれる。
【０１２４】
本明細書中で使用される際、代表的な治療用または偶発的な電離放射線源には、例えば、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、Ｘ線および中性子線源が含まれる。
【０１２５】
「放射線療法」は、疾患状態を治療するために、任意の形態の放射線照射が使用されている、任意の療法をさす。放射線療法のための放射線を発生させる機器は、現在利用可能であるか、または、将来利用可能となるいずれかの機器である。
【０１２６】
「高線量処置モダリティ」は、亜致死的またはほぼ致死的に高い処置をさす。高線量処置モダリティは、治療エンドポイントを達成するために、増大した能力を有することを意図しているが、一般に、増大した付随する毒性を有する。さらに、一般に、高線量処置モダリティは、従来の処置モダリティと比較して、増大した造血損傷を示す。高線量処置モダリティのためのプロトコールは、現在使用されているか、または、将来的に使用されるものである。
【０１２７】
本明細書中で使用される際、放射線療法「処置モダリティ」は、電離および非電離放射線源を両方含むことができる。代表的な電離放射線処置モダリティには、例えば、外部ビーム照射療法；強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）；画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）；Ｘ線照射（例えば、光子線療法）；電子ビーム（例えば、ベータ線照射）；プロトン照射；高形エネルギー付与（ＬＥＴ）粒子；定位放射線手術；ガンマナイフ；線形加速器媒介フレームレス定位放射線手術；ロボットアーム制御Ｘ線照射送達システム（robot arm controlled x irradiation delivery system）；臓器特異的またはがん細胞特異的取り込みのための放射性同位体放射線療法；腫瘍標的型放射線療法（または放射線免疫療法、ＲＩＴ）のためのモノクローナル抗体に結合した放射性同位体；密封小線源療法（組織内または腔内）；高線量率放射線源移植（high dose rate radiation source implantation）；臓器特異的線量送達のための永久放射性シード移植が含まれる。
【０１２８】
一般に、「ドーズデンス治療レジメン（dose dense treatment regimen）」は、それによって、従来の治療レジメンに比較して、治療が連続して加速的に繰り返されて、所望の治療アウトカムを達成する、治療レジメンである。本発明の方法は、処置に付随する造血毒性を低減し、または寛解させることによって、ドーズデンス治療レジメンの使用を容易化し、それによって、ドーズデンス治療レジメンが利用され、特定の疾患状態を治療することにおける成功率を増大させることを可能にする（一般に、Hudis C A、Schmits N、Semin Oncol. 2004 June; 31 (3 Suppl 8)：19〜26ページ; Keith Bら、J Clin Oncol. 2004 Feb. 15; 22 (4)：749ページ; author reply 751〜3ページ；Maurel Jら、Cancer. 2004 Apr. 1; 100 (7)：1498〜506ページ；Atkins C D、J Clin Oncol. 2004 Feb. 15；22 (4)；749〜50ページを参照されたい）。
【０１２９】
「化学防護または放射線防護」は、疾患状態を標的とすることを意図すた処置に付随する造血毒性からの防護またはその明らかな低減をさす。
【０１３０】
本明細書中で使用される際、「（放射線毒性または放射線障害としても知られる）急性放射線症候群（ＡＲＳ）」は、非常に短時間（例えば、ものの数分）、高線量の透過性放射線による、全身（または体のほとんど）の致死的または亜致死的な放射線照射を受容することによって引き起こされる、急性疾患により特徴付けられる。ＡＲＳを患う人の例は、広島および長崎原子爆弾の生存者、１９８６年のチェルノブイリ原子力発電所事故後に最初に対応した消防士、および滅菌放射線照射装置にうっかり曝露された人である。特定の実施態様では、急性放射線症候群に付随する放射線量は、通常、大きい（すなわち、０．７Ｇｒａｙ（Ｇｙ）または７０ｒａｄを超える）。特定の実施態様では、０．３Ｇｙまたは３０ｒａｄの低い線量でも、弱い症状が観察されうる。
【０１３１】
本明細書中で使用される際、「急性損傷効果」および「損傷効果」は、急性の致死的およびほぼ致死的な放射線量による放射線誘発損傷を含むことができる。
【０１３２】
「固形腫瘍」は、一般に、血液、骨髄またはリンパ系以外の体の組織のがんの存在をさす。
【０１３３】
「造血障害（がん）」は、一般に、造血系に起源を有するがん細胞の存在をさす。
【０１３４】
「欠損を寛解させる」は、造血欠損の低減、すなわち、欠損の改善または現在の臨床により定義された正常状態の部分的もしくは完全な回復をさす。よって、造血欠損の寛解は、全般的または特異的な造血の増大、刺激、亢進または促進をさす。造血欠損の寛解は、全般的、すなわち、２つ以上の造血細胞タイプもしくは系列を増加させること、または特異的、すなわち、１つの造血細胞タイプまたは系列を増加させることとして観察することができる。
【０１３５】
「骨髄細胞」は、一般に、哺乳動物の骨髄コンパートメント中に存在しおよび／または向かう細胞をさす。用語「骨髄細胞」に含まれるのは、それらに限定されないが、造血再増殖細胞、造血幹細胞および／または前駆細胞をはじめとする、造血系起源の細胞だけでなく、それに限定されないが、これらのおよび他の細胞タイプおよび系列に関連している幹細胞および／または前駆細胞をはじめとする、内皮細胞、間葉細胞、骨細胞、神経系細胞、支持細胞（間質細胞）等の、骨髄由来でありうる任意の細胞も含まれる。
【０１３６】
「造血細胞タイプ」は、一般に、多様なタイプの分化した造血細胞をさすが、幹細胞、前駆細胞、および、骨髄性細胞、リンパ球様細胞等の、多様な系列の細胞をはじめとする、血液細胞産生に関係する、すべての細胞タイプを指している、多様な芽細胞等の、特定の造血細胞タイプがそれに起源を有する、造血前駆細胞も含むことができる。
【０１３７】
「造血細胞系列」は、一般に、骨髄系またはリンパ系等の、分化した造血細胞の特定の系列をさすが、樹状細胞、赤血球等の、より分化した系列をもさしうる。
【０１３８】
細胞の「ＩＬ−１２により促進された増殖」は、一般に、造血前駆細胞および／または幹細胞等の、さらに、骨髄ニッチの微小環境を構成する他の細胞も含む、哺乳動物の骨髄に存在するかまたは向かう細胞の拡大または増加に、少なくとも部分的に貢献する造血の増大、刺激または促進をさす。
【０１３９】
「造血の刺激または促進」は、一般に、１つまたは複数の造血細胞タイプまたは系列の増加をさし、特に、哺乳動物が１つまたは複数の造血細胞タイプまたは系列の欠乏を有する場合に、１つまたは複数の造血細胞タイプまたは系列の刺激または亢進に関する。
【０１４０】
「長期再増殖造血細胞」は、一般に、骨髄中の最も原始的な血液細胞であり、多様な血液細胞タイプおよび系列の生涯にわたる産生を提供することに関与する血液幹細胞である。
【０１４１】
「造血幹細胞」は、一般に、血液幹細胞であって；上で定義される「長期再増殖」、および、短期間（哺乳動物に依って、数週間、数カ月または、時に数年）の間、「前駆細胞」を産生することのできる「短期再増殖」の２つのタイプがある。
【０１４２】
「造血前駆細胞」は、一般に、血液幹細胞から分化する（すなわち、成熟する）最初の細胞であり；その後、多様な血液細胞タイプおよび系列に分化（成熟）する。
【０１４３】
「造血支持細胞」は、骨髄の非血液細胞であり；これらの細胞は、血液細胞産生のための「支持体」を提供する。これらの細胞は、骨髄間質細胞とも呼ばれる。
【０１４４】
「骨髄維持」は、放射線、化学療法、疾患または毒素によって損傷された骨髄が、それによって、その正常または正常に近い状態を維持されるプロセスを意味し；「骨髄回復」は、放射線、化学療法、疾患または毒素によって損傷された骨髄が、それによって、その正常または正常に近い状態に回復するか、または、骨髄機能の何らかの測定可能な改善が得られるプロセスを意味し；骨髄機能は、適切なレベルの多様な血液細胞タイプまたは系列が、それによって、造血（血液）幹細胞から産生されるプロセスである。
【０１４５】
「骨髄機能不全」は、放射線、化学療法、疾患または毒素によって損傷された骨髄を、正常まで、修復することができず、したがって、哺乳動物中において、適切な造血を維持するための十分な血液細胞の産生ができなくなる、病理学的プロセスである。
【実施例】
【０１４６】
例
ここでは、以下の例を参照して、本発明を説明する。これらの例は、例示の目的のみのために、提供されており、そして、本発明は、これらの例に限定されないが、本明細書に提供されている、教示の結果として、明らかになっている、全てのバリエーションを包含する。
【０１４７】
本明細書に記載される、実験よりも前には、ＨＳＣＴに引き続く、造血回復を改善することを可能にする、組換えヒトインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）調製物をはじめとする、ＩＬ−１２を含む組成物および方法に対する、公開されたプロトコールはない。
【０１４８】
本開示の形態および実施態様は、ＨＳＣＴ移植に引き続き、患者に投与した場合、特定のＩＬ−１２製剤は、驚くべき且つ予期しない、有用性および有効性を有しているという予期しない発見に、由来している。
【０１４９】
一例として、治療上有効なＩＬ−１２製剤を調製する方法が開発された。
【０１５０】
例１：
材料および方法
ｒＭｕＩＬ−１２、マウスＢＭＣＴ、およびヒト骨髄ＣＤ３４+細胞
ｒＭｕＩＬ−１２（組換えマウスＩＬ−１２）は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（カタログ番号２１０−１２）、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）、または、Ｎｅｕｍｅｄｉｃｉｎｅｓ社に独占されている、ＳＢＨ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＬＳ＃４５（Ｑ４））（Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手した。マウスおよびマウス由来骨髄細胞における試験には、ｒＭｕＩＬ−１２を利用した。正常Ｃ５７／ＢＬ６マウスの大腿骨および脛骨から、２５Ｇ５／８針を使用して、ＰＢＳを用いて、骨髄細胞をフラッシング・アウトすることにより、ＢＭＣＴを調製した。細胞を、４０μｍのセルストレーナー（cell strainer）によって濾過し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩで洗浄し、そして、液体窒素中で凍結保存した。ＣＤ３４を発現するヒト骨髄細胞は、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ，（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。
【０１５１】
マウス
雌（ＢＭＣＴ試験）または雄（骨髄試験）Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ジャクソン研究所（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）から入手した。マウス試験は、ＢＡＴＴＳ研究所（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）で実施された。マウスは、試験の開始に先立ち、少なくとも一週間隔離して維持した。試験に使用されたマウスは、なんらの疾患の徴候を示していない、８週齢〜１０週齢、体重はおよそ２０ｇであった。全ての手順は、実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）およびアメリカ実験動物ケア学会によって公認されている、ＢＡＴＴＳ研究所動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって、審査および承認された。試験の間、動物のケアおよび使用は、米国国立衛生研究所によって公開された、実験動物のケアと使用に関する指針（公開番号：８５〜２３、１９９６年改訂）に概説された原理に従った。
【０１５２】
例２：
ｒＭｕＩＬ−１２およびＢＭＣＴで治療した照射マウスの生存試験
０日目、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４０）を、放射線照射の均等な分布のため、照射器の中央にマウスを保持するために特別に構築した「パイ・ボックス（pie-box）」中で、137Ｃｓ線源でＧａｍｍａｃｅｌｌ（登録商標）４０（Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、８．２Ｇｙの致死線量でＴＢＩを施した。マウスは、ＴＢＩの２４時間前（ｎ＝１０）、または、ＴＢＩの２４時間前および３日後（ｎ＝１０）のいずれかに、ビヒクル（ｎ＝１０）、または１０ｎｇ／マウスの用量のｒＭｕＩＬ−１２の静脈内注射を受けた。マウスの４つ目の群（ｎ＝１０）は、照射の２時間後、ＢＭＣＴ（１．１×１０6個の細胞）を施された。マウスは、３５日目まで生存をモニターした。この期間、マウスは、滅菌食および酸性化した水を自由に摂取できる。群間における生存の差違を、カプラン・マイヤー生存解析で、続いて、生存時間についてマンテル・コックス検定、および、生存率について、ピアソンのカイ二乗検定により評価した。血液試料を、２８日目に各群の動物の半分から、ならびに２１日目および３５日目に他の半分から採取し、自動血液分析装置（Ｈｅｍａｖｅｔ；Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ  ＣＴ）によって分析した。血球数の群間の差違を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。
【０１５３】
例３：
マウス骨髄の免疫組織化学
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たりｎ＝２）は、８．０ＧｙでＴＢＩを施され、そして、引き続き、照射の２４時間後の１回投与、あるいは、照射の２４時間および２日後の２回投与のいずれかで、皮下に、ビヒクル、またはｒＭｕＩＬ−１２（２０ｎｇ／マウス）を受けた。マウスを照射の１２日後に屠殺し、大腿骨を単離し、ホルマリン中で固定し、続いて、Ｃｙｔｏ−Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｄｕａｒｔｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、パラフィン包埋された組織切片に、調製された。
【０１５４】
キシレンを用いて、組織切片を脱パラフィンし、エタノールの濃度を減少させることにより再水和し、そして、加熱抗原賦活化法（ＨＩＥＲ）を施して、抗原を回復した。内在性のペルオキシダーゼを０．３％  Ｈ2Ｏ2で３０分間阻害し（ＶＷＲ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、そして、バックグラウンド染色を、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ；Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）を用いて、ブロッキングした。次いで、組織切片をウサギ抗マウスＩＬ−１２Ｒβ２（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とインキュベートした。組織切片を洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）とインキュベートした。ＡＥＣ基質（ＩｍｍＰＡＣＴ  ＡＥＣ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）とのインキュベーションに引き続き、ペルオキシダーゼ標識細胞はオレンジ色に発色した。ＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）を用いて、組織を対比染色した。Ｖｅｃｔａｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）中に、組織切片を含浸させ、カバーガラスで被覆し、透明のマニキュア液で密封し、そして、Ｏｌｙｍｐｕｓ複式顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．；Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を使用して、２０×〜１００×の倍率で、可視化した。
【０１５５】
例４：
ヒトＣＤ３４+細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２の免疫細胞化学分析
Ｌａｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ，（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手したヒト骨髄ＣＤ３４+細胞を、５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンで処置したスライド上に播種し、冷メタノール中、−２０℃で１０分間固定し、そして、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ；Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）で処置した後、ＩＬ−１２Ｒβ２に対するウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で標識し、引き続き、ホースラディッシュペルオキシダーゼとカップリングした抗ウサギＩｇＧ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）とインキュベーションした。スライドを、ＩｎｉｍＰＡＣＴ  ＡＥＣペルオキシダーゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と３０分間インキュベートし、そして、ＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ；Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）中で対比染色した。陰性対照は、固定され、そして、ウサギポリクローナル一次抗体を含まない、同じ試薬で処置された細胞を含んでおり。写真は、Ｏｌｙｍｐｕｓ複式顕微鏡を使用して撮った。
【０１５６】
例５：
マウス造血Ｌｉｎ-およびＬｉｎ-ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞ならびにヒト造血Ｌｉｎ−細胞の調製
マウス骨髄は、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ、ＮＹ）またはＢＡＴＴＳ研究所から入手した。細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）で希釈し、そして、７０μｍのセルストレーナー（ＶＷＲ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を通して、濾過した。次いで、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、そして、系統マーカー、すなわちＣＤ３ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ｂ、ＣＤ８ａ、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、ＧｒｌおよびＴｅｒ（８０）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）に特異的なビオチンコンジュゲート・モノクローナル抗体とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、そして、抗ビオチンマイクロビーズとインキュベートした。Ｌｉｎ+細胞は、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）の磁場中に配置される、ＭＡＣＳカラムに細胞を通すことによって、取り切った。未標識のＬｉｎ-細胞は、流出物として収集される間、磁気的に標識されたＬｉｎ+細胞は、該カラム上に保持された。選別試験において、マウス骨髄Ｌｉｎ-細胞を、ＭｏＦｌｏｗセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）のフローサイトメトリーによってソートして、マウスＩＬ−１２受容体複合体の特有のβ２サブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ２）と反応する、ＨＡＭ１０Ｂ９抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞集団が収穫された。
【０１５７】
ヒト骨髄細胞は、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ，（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）で希釈し、そして、７０μｍのセルストレーナー（ＶＷＲ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を通して、濾過した。骨髄単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、密度勾配遠心（４℃、４５５ｇで３５分間）により、分離した。２００ｇでの１０分間のさらなる遠心分離に引き続いて、単核細胞分画から、血小板を除去した。結果として得られる、細胞ペレットを、ＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、系統マーカーＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤＩ６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５ａ（Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ）に特異的なビオチンコンジュゲート・モノクローナル抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）とインキュベートした。先に記述したように、磁気ビーズによるＬｉｎ+細胞の除去に引き続いて、Ｌｉｎ-細胞を収集した。
【０１５８】
例６：
マウスおよびヒト造血細胞のサイトメトリー分析の方法
マウスおよびヒト骨髄Ｌｉｎ-細胞を、アロフィコシアニンコンジュゲート・抗ヒト／マウスＩＬ−１２Ｒβ２、クローン番号３０５７１９（ＡＰＣ−ＩＬ−１２Ｒβ２）抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と、室温で３０分間インキュベートした。未染色およびアイソタイプ対照が、含まれていた。選別試験において、ヒト骨髄Ｌｉｎ-細胞およびＣＤ３４+細胞を、ＡＰＣ−ＩＬ−１２Ｒβ２抗体およびコンジュゲートモノクローナルフィコエリスリン（ＰＥ）−ＣＤ３４抗体、クローン番号５６３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−ｃｋｉｔ、クローン番号１０４Ｄ２（Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＦＩＴＣ−ＫＤＲ、クローン番号８９１０６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、ＰＥ−ＣＤ１３３、クローン番号ＥＭＫ０８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＥ−Ｆｌｔ−３、クローン番号４Ｇ８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＰＥ−ＣＤＩ５０、クローン番号Ａ１２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＰＥ−ＣＤＣＰ１抗体、クローン番号３０９１２１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）でも、標識した。ヒト骨髄ＣＤ３４+細胞を、同様に、ＡＰＣ−ＩＬ−１２Ｒβ２およびＰＥ−ＣＤ３４抗体とインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＤＰＢＳ中に再懸濁し、ＭｏＦｌｏｗフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて、分析した。少なくとも、３匹の異なるドナーが、各分析において、評価された。
【０１５９】
例７：
結果
ｒＭｕＩＬ−１２は、致死的な照射マウスにおいて、ＢＭＣＴと同様に効果的に、生存を増加させ、そして、血液細胞回復を促進する：
臨床のＨＳＣ移植の状況における使用のための、ｒＨｕＩＬ−１２の能力の実証を始めるため、致死的な照射マウスにおいて、３５日間にわたり、静脈内に１回（ＴＢＩの２４時間前）または２回（ＴＢＩの２４時間前および３日後）投与された、ｒＭｕＩＬ−１２（１０ｎｇ／マウス）の生存および造血促進効果と、ＴＢＩの２時間後に投与された、ＢＭＣＴ（１．１×１０6個の全骨髄細胞）のものを、比較した。ＢＭＣＴ、ならびに、両方の投与スケジュールのｒＭｕＩＬ−１２は、照射による死亡を、本質的に同程度で低減させた（図１ａ）。全体的な生存比率は、ビヒクル群では０％、ＢＭＣＴ群では７０％、１回のｒＭｕＩＬ−１２群では６０％、および２回のｒＭｕＩＬ−１２群では９０％であった（図１ａ）。生存率の群間の差は、ビヒクル群と比較した場合、有意であった（Ｐ＜０．００５）。生存の群間の差は、ＢＭＣＴとｒＭｕＩＬ−１２群については、統計的に有意ではなかった。
【０１６０】
照射マウスにおける血球数の分析は、ＢＭＣＴおよび１回または２回のｒＭｕＩＬ−１２投与は、ともに、末梢血細胞数を同程度まで増加させたことを実証した（図１ｂ〜ｄ）。血球数の群間の差違は、ＢＭＣＴとｒＭｕＩＬ−１２群については、統計的に有意ではなかった。しかし、回復においては、ＢＭＣＴ、ｒＭｕＩＬ−１２の１回投与、およびｒＭｕＩＬ−１２の２回投与群でわずかな差があった。特に、ｒＭｕＩＬ−１２を２回投与した群における、血小板回復は、ＢＭＣＴ群よりも早く、正常な血小板レベルに達していた（図１ｄ）。
【０１６１】
例８：
ｒＭｕＩＬ−１２は照射マウスの骨髄中での造血を促進する
ＩＬ−１２の機能は、その受容体、ＩＬ−１２Ｒとのその相互作用によって駆動される；そのベータ２サブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ２）は、該受容体の特有の構成要素である。本発明者らは、致死的な照射マウスにおける、ｒＭｕＩＬ−１２の再生能力は、その受容体、造血幹細胞（ＨＳＣ）上のｍＩＬ−１２Ｒの発現によって、駆動されているという、仮設を立てた。本発明者らは、ｒＭｕＩＬ−１２で治療された、致死的な照射マウス由来のマウス大腿骨骨髄切片の表現型分析によって、ｒＭｕＩＬ−１２の造血促進活性をさらに評価した。致死的な放射線照射後、１２日目および３０日目の大腿骨骨髄を、ＴＢＩの２４時間後および３日後に、ｒＭｕＩＬ−１２（２０ｎｇ／マウス）またはビヒクルで皮下に処置したマウスについて、ＩＬ−１２Ｒβ２を染色した。照射され、ｒＭｕＩＬ−１２で治療されたマウス由来の骨髄は、ＩＬ−１２Ｒβ２発現骨芽細胞、前駆細胞、細胞質の細い縁で囲われた分葉核を有する未成熟巨核球、分葉核および豊富な細胞質（voluminous cytoplasm）を有する成熟巨核球の存在によって特徴付けられた（図２ａ）。対照的に、照射され、ビヒクルで処置したマウス由来の骨髄は、造血再生の最小限の兆候、および、照射に引き続く、１２日目における、ＩＬ−１２Ｒβ２発現細胞の完全な欠損によって特徴付けられた（図２ｂ）。骨髄系前駆細胞および骨芽細胞の細胞型は、それぞれ、Ｓｃａ−１およびオステオカルシンマーカーを使用する免疫組織化学分析によって分析した（データは示されていない）。骨芽細胞は、同種異系の状況において、マウス中での造血細胞の生着を促進し（EI-Badri NSら「Osteoblasts Promote Engraftment Of Allogeneic Hematopoietic Stem Cells」、Exp Hematol 1998; 26:110-116）、そして、巨核球のホーミングおよび増殖において、役割を果たす（Ahmed Nら、「Cytokine-Induced Expansion of Human CD34+ Stem/Progenitor and CD34+CD41+ Early Megakaryocytic Marrow Cells Cultured on Normal Osteoblasts」、Stem Cells 1999;17:92-99；Dominici Mら、「Restoration and Reversible Expansion of the Osteoblastic Hematopoietic Stem Cell Niche after Marrow Radioablation」、Blood 2009;I 14:2333-2343）ことが示されている。これと一致して、本発明者らは、放射線照射の２４時間後および３日後に、２回投与された、ｒＭｕＩＬ−１２で治療されたマウスの骨髄中、骨内膜性の表面の傍に、ＩＬ−１２Ｒβ２発現巨核球島を観察した（図３）。これは、巨核球が類洞周囲（parasinusoidal）部位を占める、正常、未治療マウスとは対照的である（Dominici Mら、上記を参照）。本発明者らの結果を支持する、形態学的に同定された、ＨＳＣ上のＩＬ−１２Ｒβ２の発現を確かめるため、マウスの骨髄細胞中から、Ｌｉｎ-細胞を免疫磁気的に選別した。系統枯渇細胞（Ｌｉｎ-）は、未分化幹細胞および成熟系統細胞マーカーを欠損する多能性前駆細胞から成る細胞の集団を表す。フローサイトメリー分析は、マウスＬｉｎ-細胞のおよそ０．５〜７％がＩＬ−１２Ｒβ２を発現していたことを実証した（図４）。
【０１６２】
例９：
ｒＭｕＩＬ−１２による、マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ治療は、放射線照射の不在下で、骨髄Ｌｉｎ-細胞から単離される、ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞の数を直接的に増加させる
マウスＨＳＣ、巨核球、および骨芽細胞上のｍＩＬ−１２Ｒβ２の発現、ならびに、致死的な照射マウスにおける、生存および造血回復をもたらす、ＢＭＣＴに匹敵する、その能力によって実証されたｒＭｕＩＬ−１２の再生能力は、ＩＬ−１２媒介性造血回復および再生が、ｍＩＬ−１２Ｒβ２発現細胞へのその直接作用によって引き起こされることを示唆している。次に、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、マウス骨髄中における、ＩＬ１２Ｒβ２発現細胞に対する、ｒＭｕＩＬ−１２の効果を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは尾静脈注射によってｒＭｕＩＬ−１２（１０ｎｇ／マウス）で治療する、または治療しないかのいずれかであった。骨髄は、第１の実験では、ｒＭｕＩＬ−１２での治療の２１時間後に、また、第２の実験では、ＩＬ−１２での治療の２５時間後に採取された。系統陰性細胞を各群から単離し、Ｌｉｎ-ＩＬ−１２Ｒβ２+を収穫する、フローサイトメトリーソーティングによってさらに分画した。治療または未治療群中に存在している、Ｌｉｎ-ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞の相対的割合を表１に示す。ｒＭｕＩＬ−１２での治療は、骨髄コンパートメントの系統陰性細胞中の、Ｌｉｎ-ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞の相対数の増加をもたらし、そして、２１時間後には、ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞の３．５倍増加、２５時間後には、ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞の５．４倍増加を引き起こしていた。
【０１６３】
例１０：
ヒト骨髄Ｌｉｎ-細胞およびＣＤ３４+細胞は、公知のＨＳＣマーカーと共に、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現している
ｒＭｕＩＬ−１２の造血再生機能、マウスＬｉｎ−細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２の発現、およびマウスＬｉｎ-ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞に対するｒＭｕＩＬ−１２の増殖効果は、ヒト骨髄の再生において、ｒＨｕＩＬ−１２の潜在的な効果を示唆している。ヒトの移植におけるｒＨｕＩＬ−１２の潜在的な役割を評価するため、本発明者らは、ヒト骨髄造血幹／前駆細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２の発現を明らかにした。本発明者らは、ＩＬ−１２Ｒβ２およびＣＤ３４に対する抗体で標識したＬｉｎ-細胞およびＣＤ３４+細胞のフローサイトメトリー分析によって、ヒト骨髄細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２の発現を評価した。臨床状況での移植のための、造血幹細胞の精製の選択における、長く認められたマーカーであることから、ＣＤ３４細胞を選択した。Ｌｉｎ-細胞中、ＣＤ３４発現状態にかかわらず、およそ０．５％〜４％（平均±ＳＤ：１．８９±１．２１）の細胞がＩＬ−１２Ｒβ２＋を発現していた（図５ａ）。しかし、ＣＤ３４+細胞中、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現は高度にドナー依存的であり、細胞の６％〜５７％（平均±ＳＤ：１９．５９±１７．５２）で検出された（図５ｂ）。フローサイトメトリー分析によって検出されたように、ＣＤ３４+細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２の存在を、ＩＬ−１２Ｒβ２に対する異なる抗体を使用するヒト骨髄ＣＤ３４+細胞の免疫細胞化学染色によってさらに実証した（図５ｃ）。同じ試薬で、ＩＬ−１２Ｒβ２に対する一次抗体とインキュベーションせずに調製された陰性対照は、染色を示さなかった（データは示さない）。
【０１６４】
ＩＬ−１２Ｒβ２とＨＳＣの他の細胞表面マーカーの共発現も、ヒト骨髄におけるフローサイトメトリー分析によって評価した。Ｌｉｎ-細胞およびＣＤ３４+細胞を、それぞれ、未分化骨髄細胞の別々の集団上に発現することが公知のＩＬ−１２Ｒβ２およびＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、Ｆｌｔ−３、ＣＤ１５０またはＣＤＣＰＩに対する抗体で共標識した。これらの分析は、およそ５０％のＬｉｎ-ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞が、ＣＤ３４（平均±ＳＤ：５３±５）またはｃ−Ｋｉｔ（平均±ＳＤ：５１±７）、３５％  ＫＤＲ（平均±ＳＤ：３５±６）、および２５％  ＣＤ１５０（平均±ＳＤ：２３±２１）を共発現しており（図６ａ）、Ｌｉｎ-細胞と同様に、およそ７０％のＣＤ３４+ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞が、ｃ−ｋｉｔ（平均±ＳＤ：６８±０．２）、８０％  ＣＤＣＰＩ、および１５％  ＫＤＲ（平均±ＳＤ：１３±９）を共発現していた（図６ｂ）ことを明らかにした。
【０１６５】
本明細書に提供する例は、例示的なＩＬ−１２調製物、ＨｅｍａＭａｘ  ＩＬ−１２がＨＳＣＴ移植に引き続く、造血回復を効果的に改善したことを明らかに実証した。
【０１６６】
考察
ＨＳＣＴは、骨髄破壊的化学療法および／または様々な血液系悪性腫瘍の放射線治療に引き続く、がん患者を治療するために使用されている。ＨＳＣＴ生着の成功に影響を及ぼす主な要因は、がんの種類およびステージ、移植用の調製レジメン、ＣＤ３４+細胞の質および量、ならびに増殖因子の移植後の使用である（Ninan MJら、「Posttransplant Thrombopoiesis Predicts Survival in Patients Undergoing Autologous Hematopoietic Progenitor Cell Transplantation」、Biol Blood Marrow Transplant 2007;13:895-904；Bensinger WIら「Peripheral Blood Stem Cells (PBSCs) Collected After Recombinant Granulocyte Colony Stimulating Factor (rhG-CSF): an Analysis of Factors Correlating with the Tempo of Engraftment After Transplantation」、Br J Haematol 1994; 87:825-831；Klumpp TRら「Phase II Study of High-Dose Cyclophosphamide, Etoposide, and Carboplatin (CEC) Followed by Autologous Hematopoietic Stem Cell Rescue In Women With Metastatic or High-Risk Non-Metastatic Breast Cancer: Multivariate Analysis of Factors Affecting Survival and Engraftment」、Bone Marrow Transplant 1997; 20:273-281）。ミエロイドおよびエリスロイド増殖因子の投与は、移植後の好中球減少症および貧血症を治療するために使用されている。（Held TKら「Pharmacodynamic Effects of Haematopoietic Cytokines: the View of a Clinical Oncologist」、Basic Clin Pharmacol Toxicol 2010; 106:210-214）しかし、その薬剤は血小板再生に影響しない。血小板減少症を克服するため、患者は、早期の移植後血小板輸血に頼っている。（Wandt Hら、「New Strategies for Prophylactic Platelet Transfusion in Patients with Hematologic Diseases」、Oncologist 2001; 6:446-450）。最初の回復後、がん患者の１７％もが、引き続き、二次的な移植後血小板減少症を経験しており、このことは、高い致死率と有意に関係している。（Ninan, MJら、上記を参照、895-904）突発性移植後血小板減少症および低い血小板数は、短期および長期の再増殖するＣＤ３４+細胞を伴う弱い生着を付随しており、そして、疾患の再発による死亡のリスクの増加を予示している。（同上）したがって、生着のためのＣＤ３４+細胞の数を改善し、そして、移植に引き続く、造血の回復を増加することが可能な薬物が必要である。現在、全体的な生存の減少の前兆となる、移植後血小板減少症を軽減するために利用可能な薬剤もない。
【０１６７】
非ヒト霊長類における、ｒＨｕＩＬ−１２、またはマウスにおける、ｒＭｕＩＬ−１２は、ＴＢＩのモデルにおいて、生存を増加させることが示されている。（Basile LAおよびEllefson Dら「HemaMaxTM, a Recombinant Human Interleukin-12, is a Potent Mitigator of Acute Radiation Injury in Mice and Non-Human Primates, PLoS ONE」、Submitted 2011；Basile LAおよびGallaher TKら「Multilineage Hematopoietic Recovery with Concomitant Antitumor Effects Using Low Dose Interleukin-12 in Myelosuppressed Tumor-Bearing Mice」、J Transl Med 2008; 6:26；Chen Tら、「IL-12 Facilitates Both the Recovery of Endogenous Hematopoiesis and the Engraftment of Stem Cells after Ionizing Radiation」、Exp Hematol 2007; 35:203-213）。いくつかの一連の証拠は骨髄造血の刺激が、ｒＨｕＩＬ−１２の生存促進性活性において重要な役割を果たし得ることを示している。（Basile LAおよびEllefson Dら、上記を参照）。ｉｎ  ｖｉｖｏで試験した場合、ＢＭＣＴと同様に、ｒＭｕＩＬ−１２は、致死的な照射マウスにおいて、末梢血液細胞回復、および生存を増加した。興味深いことに、ＢＭＣＴを投与されたマウスよりも、ＩＬ−１２で治療されたマウスにおいて、血小板の回復は、より早いと見えた。これらの知見は、それぞれ、マウスならびにアカゲザルにおける、ｒＭｕＩＬ−１２ならびにｒＨｕＩＬ−１２の造血促進および生存促進性活性を実証する本発明者らの先の報告と、矛盾していない。（Basile LAおよびEllefson Dら、上記を参照；Basile LAおよびGallaher TKら、上記を参照、Chen T.ら、上記を参照）。これらの造血回復効果は、担腫瘍マウスにおいても観察された。ルイス肺およびＥＬ４リンパ腫モデルの双方において、ｒＭｕＩＬ−１２は、亜致死性のＴＢＩに引き続く、好中球、赤血球、血小板の初期の回復をもたらした。さらに、リンパ腫および肺がんマウスモデルの双方において、放射線照射または化学療法と相乗的に、ＩＬ−１２は、腫瘍量を減少させた。（Basile LAおよびGallaher TKら、上記を参照）。本発明者らの知見と矛盾することなく、免疫療法として施されたｒＨｕＩＬ−１２の投与は、血液系悪性腫瘍を有する患者において、末梢造血幹細胞移植に引き続く、主なリンパ球サブセットのｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖を引き起こす。（Pelloso Dら「Immunological Consequences of Interleukin 12 Administration After Autologous Stem Cell Transplantation」、Clin Cancer Res 2004;10:1935-1942）。
【０１６８】
この試験において、注目すべきは、致死的な照射動物中での、血液細胞回復および生存の増加における、ｒＭｕＩＬ−１２およびＢＭＣＴの同様の有効性であった。さらに、いずれかの単独の治療では、致死的な照射動物を救うことはできないが、低用量のＢＭＣＴと、最適以下のｒＭｕＩＬ−１２用量との組合せは、相乗的に生存を増加さており、ｒＭｕＩＬ−１２の造血促進活性は、ＢＭＣＴの活性を補完しているように見える。（Chen T.ら、上記を参照）。この試験では、ＢＭＣＴと比較して、ｒＭｕＩＬ−１２治療マウスにおいて。血小板回復はより強固であった。ｒＭｕＩＬ−１２およびＢＭＣＴの、匹敵する有効性および相補的な活性は、ｒＨｕＩＬ−１２が、ＨＳＣの生着能および造血回復、特に、血小板数の回復を促進するための、ＨＳＣＴへの付加オプションとすることができることを示唆している。
【０１６９】
ｒＭｕＩＬ−１２のマウス骨髄造血を増加させる能力は、ＩＬ−１２と結合した際、骨髄再生を開始させる事象を誘発する、未分化な、残存している造血細胞上の機能的なＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）の存在を示している。この仮説の裏付けとして、本発明者らは、ｒＭｕＩＬ−１２治療マウスの骨髄は、ＩＬ−１２Ｒβ２−発現幹／前駆細胞、巨核球、および骨芽細胞の存在によって特徴付けられ、ＨＳＣおよびニッチ細胞の両方がｒＨｕＩＬ−１２の標的である可能性をしていることを、明らかにした。骨芽細胞の活性化は、造血幹細胞および巨核球の生存、増殖、ならびにホーミングに、極めて重要である。（Ahmed Nら、上記を参照、de Barros APら、「Osteoblasts and Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Control Hematopoietic Stem Cell Migration and Proliferation in 3D in vitro Model」、PLoS One 2010; 5:e9093；Hamada T、Mohle R、Hesselgesser Jら「Transendothelial Migration of Megakaryocytes in Response to Stromal Cell-Derived Factor 1 (SDF-1) Enhances Platelet Formation」、J Exp Med 1998; 188:539-548；Hodohara Kら「Stromal Cell-Derived Factor-1 (SDF-1) Acts Together with Thrombopoietin to Enhance the Development of Megakaryocytic Progenitor Cells」、(CFU-MK).  Blood 2000; 95:769-775；Kiel MJら、「Maintaining Hematopoietic Stem Cells in the Vascular Niche」、Immunity 2006; 25:862-864；Wang JFら、「The Alpha-chemokine Receptor CXCR4 is Expressed on the Megakaryocytic Lineage from Progenitor to Platelets and Modulates Migration and Adhesion」、Blood 1998; 92:756-764）。致死線量の放射線への曝露は、骨芽細胞系ニッチ増殖をもたらし、それによって、骨内膜骨領域付近に、放射線抵抗性骨芽前駆細胞の生存プールが増殖することが示されている。（Dominici M、Rasini Vら、上記を参照）。本試験においても、生存する巨核球は、それらの正常な類洞周囲部位中よりは、海綿骨骨内膜表面付近に観察されている。巨核球は、骨芽細胞性ニッチの増殖を刺激する因子を放出する。（同上）これらの知見と一致して、本発明者らの試験における免疫組織化学試験は、骨付近の骨芽細胞ニッチ、巨核球、および造血幹細胞から成る細胞の島を示す、マウス骨髄中の細胞配置を明らかにした。まとめると、これらの知見は、ｒＨｕＩＬ−１２がＩＬ−１２受容体を介して直接作用して、ＨＳＣおよびニッチ細胞の活性を調整し、そして、造血を刺激することができることを示唆している。この見解と一致して、ＩＬ−１２は、アクセサリーヒトＣＤ３４-細胞の存在下、５−フルオロウラシル治療ヒト末梢血ＣＤ３４+細胞のコロニー形成を促進することが報告されている。（Grafte Sら、IL-12 「Indirectly Enhances Proliferation of 5-FU-Treated Human Hematopoietic Peripheral Blood CD34+ Cells」Am J Hematol 1998; 58:183-188）。
【０１７０】
ｒＭｕＩＬ−１２で治療された照射マウス由来の骨髄中でのＩＬ−１２β２発現の存在は、未治療の照射マウス由来の骨髄中でのその不在とは対照的に、ｒＭｕＩＬ−１２は、骨髄中におけるＩＬ−１２受容体発現を増加させ、そして、直接、ＨＳＣおよびニッチ細胞上のＩＬ−１２受容体を介して、その造血促進活性を発揮することができることを示唆している。この仮説と矛盾することなく、放射線照射の不在下においては、外因性のｒＭｕＩＬ−１２による治療は、骨髄コンパートメントの系統陰性細胞中のＬｉｎ-ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞の相対数の増加をもたらし、そして、骨髄を採取した、２つの異なる時点において、ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞の平均４．５倍の増大が生じていた。これらのデータは、治療の２１時間後、未治療マウス（７．５％）と比較して、ＩＬ−１２治療マウスの全骨髄中のＢｒｄＵ陽性細胞の増加（１６．５％）を示した、放射線照射の不在下での、本発明者らのＢｒｄＵ取り込みアッセイとも矛盾していない（データは示さない）。これらのデータから、本発明者らは、ｒＭｕＩＬ−１２リガンドによるｉｎ  ｖｉｖｏでの治療に引き続く、骨髄から単離および選別されたｌｉｎ-ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞において観察された増加は、ＩＬ−１２受容体を持つ娘ＨＳＣの数の増加をもたらす、ＩＬ−１２リガンド／ＩＬ−１２受容体システムを介した、直接のＨＳＣ増殖に起因していると結論を出している。
【０１７１】
本開示は、ＩＬ−１２Ｒβ２が、造血幹および前駆細胞を包含する、骨髄細胞の２つのプール、マウスおよびヒトＬｉｎ-細胞ならびにヒトＣＤ３４+細胞上で発現していることを実証する初めての報告である。ヒトＣＤ３４+細胞上でのＩＬ−１２Ｒβ２の発現も、免疫細胞化学染色によって確認された。総合的に、これらの試験は、１〜４％のヒトＬｉｎ-細胞および６〜５０％のヒトＣＤ３４+細胞が、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現していたことを証明した。かなりの数のＬｉｎ-ＩＬ−１２Ｒβ２+細胞（２０％〜５０％）およびＣＤ３４+ＩＬ−１２Ｒβ２＋細胞（１５％〜８０％）は、ＨＳＣの他の潜在的なマーカー、主にｃ−ｋｉｔ、ＫＤＲ、ＣＤ１５０、またはＣＤＣＰ１も共発現していた（Hawley RGら、「Hematopoietic Stem Cells」、Methods Enzymol 2006; 419:149-179；Conze Tら「CDCP1 is a Novel Marker for Hematopoietic Stem Cells」、Ann N Y Acad Sci 2003; 996:222-226；Drake ACら「Human CD34+ CD133+ Hematopoietic Stem Cells Cultured with Growth Factors Including Angpt15 Efficiently Engraft Adult NOD-SCID I12rgamma-/- (NSG) Mice」、PLoS One 2011; 6:e18382；Ziegler BLら「KDR Receptor: a Key Marker Defining Hematopoietic Stem Cells」、Science 1999; 285:1553-1558）。注目すべきは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウス中では、ｒＭｕＩＬ−１２によって、その造血刺激活性が劇的に（７倍）増加された、幹細胞因子（ＳＣＦ）の受容体、ｃ−Ｋｉｔであった。（Jacobsen SEら、「Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor (Interleukin 12) is a Synergistic Growth Factor for Hematopoietic Stem Cells」、J Exp Med 1993; 178:413-418）。受容体ｃ−ｋｉｔは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、ＨＳＣの自己再生および維持に重要な役割を果たすことが示されている。（Porrata LFら、「Early Lymphocyte Recovery Predicts Superior Survival After Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Multiple Myeloma or Non-Hodgkin Lymphoma」、Blood 2001; 98:579-585）。ｃ−ｋｉｔ／ＳＣＦ複合体は、骨髄中における、その微小環境への幹細胞の接着およびＨＳＣホーミングにおいて、重要な役割を果たしている。ＩＬ−１２およびＳＣＦは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、リンパ球未分化造血前駆細胞の増殖を相乗的に支援していることが示されている。（Hirayama Fら、「Synergistic Interaction Between Interleukin-12 and Steel Factor in Support of Proliferation of Murine Lymphohematopoietic Progenitors in Culture」、Blood 1994; 83:92-98）。これらの予期しない、および驚くべき、ＩＬ−１２Ｒβ２とｃ−ｋｉｔとの相乗効果ならびに共発現は、造血再生および回復における、ＩＬ−１２の役割をさらに明らかにした。先の報告と一致して、ＣＤ１５０発現は、主にＬｉｎ-細胞に制限されるが、ＣＤＣＰ１発現は、主にＣＤ３４+細胞に限定される。（Conze T、Lammersら、上記を参照；Sintes Jら、「Differential Expression of CD150 (SLAM) Family Receptors by Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells」、Exp Hematol 2008; 36:1199-1204）。ＣＤ１５０発現Ｌｉｎ-細胞は、長期間再構築するＨＳＣのサブセットを代表していることが示されている。（Buhring HJら、「CDCP1 Identifies a Broad Spectrum of Normal and Malignant Stem/Progenitor Cell subsets of Hematopoietic and Nonhematopoietic Origin」、Stem Cells 2004; 22:334-343）。ＣＤＣＰ１反応性モノクローナル抗体による、ＣＤ３４+細胞の刺激は、赤血球コロニー形成単位の増加をもたらした。ＣＤＣＰ１発現は、間葉系細胞と類似する細胞型上でも観察された。（同上）Ｌｉｎ-細胞およびＣＤ３４+細胞の両方がＫＤＲを発現しており、先の報告と一致している。（Ziegler BLら、上記を参照）。ＨＳＣニッチは、ＣＤ３４-ＫＤＲ+表現型によって特徴付けられる、間葉系幹細胞から成ることが示されており、組織再生において、役割を果たしていることは公知であり、そして、続いて、ＫＤＲ+細胞は、再構築機能を保持していることが示されている。ＫＤＲとＩＬ−１２Ｒβ２との共発現は、さらに、ＨＳＣまたは骨髄ニッチ細胞上に発現される、ＩＬ−１２Ｒβ２が、造血回復において、重要な役割を果たす可能性を示唆している。まとめると、これらの知見は、ＩＬ−１２／ＩＬ−１２受容体経路は、ヒト骨髄造血に関与しており、そして、ＩＬ−１２Ｒβ２が
ｒＨｕＩＬ−１２によって外因的に刺激されて増殖し、そして、それにより、骨髄破壊に引き続き、造血組織を再構築することができる、造血幹および前駆細胞ならびに骨髄ニッチ細胞の新規のプールを描写しているマーカーを代表している可能性を示唆している。
【０１７２】
ＩＬ−１２の有効性は、がん患者におけるその抗腫瘍活性に関して、いくつかの研究の対象となってきた。強い関心にもかかわらず、ＩＬ−１２は、その中程度の臨床活性、ならびに、高用量（３００ｎｇ／Ｋｇ〜６００ｎｇ／Ｋｇ）、反復投与レジメン（反復レジメンでの１週間当たり５回投与）における、有意な毒性のため、薬として抜きんではなく、また、食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可も受けていない。（Atkins MBら、「Phase I Evaluation of Intravenous Recombinant Human Interleukin 12 in Patients with Advanced Malignancies」、Clin Cancer Res 1997; 3:409-417；Bajetta E、Del VM、Mortarini Rら、「Pilot Study of Subcutaneous Recombinant Human Interleukin 12 in Metastatic Melanoma」、Clin Cancer Res 1998;4:75-85；Gollob JAら、「Phase I Trial of Twice-Weekly Intravenous Interleukin 12 in Patients with Metastatic Renal Cell Cancer or Malignant Melanoma: Ability to Maintain IFN-Gamma Induction Is Associated With Clinical Response」、Clin Cancer Res 2000; 6:1678-1692；Gollob JAら、「Phase I Trial of Concurrent Twice-Weekly Recombinant Human Interleukin-12 Plus Low-Dose IL-2 in Patients with Melanoma or Renal Cell Carcinoma」、J Clin Oncol 2003; 21:2564-2573；Lenzi Rら、「Phase I Study of Intraperitoneal Recombinant Human Interleukin 12 in Patients with Mullerian Carcinoma, Gastrointestinal Primary Malignancies, and Mesothelioma」、Clin Cancer Res 2002; 8:3686-3695；Little RFら、「Phase 2 Study of Pegylated Liposomal Doxorubicin in Combination with Interleukin-12 for AIDS-Related Kaposi Sarcoma」、Blood 2007; 110:4165-4171；Motzer RJら、「Phase I Trial of Subcutaneous Recombinant Human Interleukin-12 in Patients with Advanced Renal Cell Carcinoma」、Clin Cancer Res 1998; 4:1183-1191；Ohno Rら、「A Dose-Escalation and Pharmacokinetic Study of Subcutaneously Administered Recombinant Human Interleukin 12 and its Biological Effects in Japanese Patients with Advanced Malignancies」、Clin Cancer Res 2000; 6:2661-2669；Portielje JEら、「Phase I Study of Subcutaneously Administered Recombinant Human Iinterleukin 12 in Patients with Advanced Renal Cell Cancer」、Clin Cancer Res 1999; 5:3983-3989；Robertson MJら、「Interleukin 12 immunotherapy After Autologous Stem Cell Transplantation for Hematological Malignancies」、Clin Cancer Res 2002; 8:3383-3393；van Herpen CMら、「Intratumoral Administration of Recombinant Human Interleukin 12 in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Patients Elicits a T-Helper 1 Profile in the Locoregional Lymph Nodes」、Clin Cancer Res 2004;10:2626-2635）。比較的少ない用量においては、外因性ＩＬ−１２による治療は、末梢血幹細胞移植のおよそ２カ月後に、１回、続いて、２週間後、反復レジメンにおける５日間毎日の投与で施される、３０ｎｇ／Ｋｇ〜２５０ｎｇ／Ｋｇの範囲の用量では、血液系悪性腫瘍を有する患者においては、十分に許容された。（Robertson MJら、上記を参照）。
【０１７３】
対照的に、本発明者らは、ｒＨｕＩＬ−１２が、本発明者らのマウスおよびアカゲザル試験の両方において、１回のみまたは２回投与された、ヒト用量の１００ｎｇ／Ｋｇ未満と等価である、動物にキログラム当たり少ないナノグラム用量において、その造血促進活性を発揮することを見出した。さらに、本発明者らの毒性試験において、本発明者らが占有している、ｒＨｕＩＬ−１２は、明白な毒性の兆候なく、約３００ｎｇ／Ｋｇのヒト用量と等価な、１０００ｎｇ／Ｋｇの最大７回投与後、アカゲザルにおいては、良好な耐容性であった（データは示さない）。これらの知見は、造血再生のためのｒＨｕＩＬ−１２用量は、がん患者においてこれまで使用された、ＩＬ−１２用量よりも実質的に少なくでき、ＨＳＣ移植患者における、ｒＨｕＩＬ−１２に対し、より好ましい安全性プロファイルを示唆している。
【０１７４】
本発明者らの知見は、ｒＨｕＩＬ−１２は、末梢血細胞数の多系列の回復を刺激することによって、さらなる治療効果を潜在的に提供することができることを実証する。ＩＬ−１２の抗腫瘍および免疫刺激効果は、がん患者におけるその治療効果にさらに加える。したがって、ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒは、外因性のＩＬ−１２の投与によって導入されて、ＨＳＣ移植を受けた患者の緩解を増加することができる、生存可能な経路を代表してい  結論
ＢＭＣＴと同様に効果的に、例示的な方法およびｒＭｕＩＬ−１２を含む組成物は、致死的な照射マウスにおいて、造血を促進し、そして、末梢血細胞の回復および生存を増加させており、ｒＨｕＩＬ−１２療法は、ＨＳＣＴに引き続く、ＨＳＣ生着を増加することができることを示している。本発明者らは、ＩＬ−１２の潜在的な標的である、照射マウス骨髄中の、ＩＬ−１２Ｒβ２発現細胞を同定した。ｒＭｕＩＬ−１２の投与は、マウス骨髄中の、ＩＬ−１２Ｒβ２発現Ｌｉｎ-細胞の数を増加させており、骨髄ＨＳＣおよびニッチ細胞がｒＭｕＩＬ−１２の直接的標的であり、そして、ｒＭｕＩＬ−１２の造血促進活性は、ＨＳＣ上のＩＬ−１２受容体によって媒介されることを示している。最後に、本発明者らは、ヒト骨髄ｌｉｎ-およびＣＤ３４+細胞上でのＩＬ−１２Ｒβ２の発現を明らかにし、ヒトの移植におけるＩＬ−１２の潜在的な役割を示している。
【０１７５】
例：
【０１７６】
【表１】
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【０１７７】
例１１
有効性の実証：単回、低用量ｒＨｕＩＬ−１２は、造血を回復し、そして、致死的な放射線に曝露されたアカゲザルの生存を増加させる
単一薬剤として、単回、低用量のｒＨｕＩＬ−１２は、致死的な放射線に曝露された非ヒト霊長類において、プラセボに比して、生存を著しく増加させており、支持療法を使用することなく、ｒＨｕＩＬ−１２は、敗血症および重症の好中球減少症／血小板減少症の比率を低減しており、そして、プラセボに比して、骨髄再生を増加させた。
【０１７８】
致死的な全身照射（ＴＢＩ）に曝露されたヒトにおいて、急性放射線症候群の造血症候群（ＨＳＡＲＳ）は、死へとつながる。組換えヒトインターロイキン−１２（ｒＨｕＩＬ−１２）は、有効性は、適切な動物モデル（例えば、非ヒト霊長類）において検証にされ、そして、安全性は、ヒトにおいて実証される、ＦＤＡのアニマル・ルールに基づいて、ＨＳＡＲＳの軽減のために開発されている。アカゲザル（９匹の動物／性別／投与群）が無作為化されて、ＴＢＩ（７００ｃＧｙ）の２４〜２５時間後に、抗生物質、輸液または輸血なしで、ｒＨｕＩＬ−１２（０［プラセボ］、５０、１００、２５０、または５００ｎｇ／ｋｇ）の単回の皮下注射を施した。６０日目の生存率は、プラセボ、５０、１００、２５０、および５００ｎｇ／ｋｇ  ｒＨｕＩＬ−１２投与群で、それぞれ１１％、３３％、３９％、および５０％であった（各投与対プラセボで、ログ・ランク検定  ｐ＜０．０５）。ｒＨｕＩＬ  １２は、重症好中球減少症、重症血小板減少症、および敗血症の発生率も著しく低減させた。さらに、ＴＢＩに引き続く、骨髄再生は、ｒＨｕＩＬ−１２で治療したサルにおいて、対照よりも著しく高かった。これらのデータは、ＴＢＩの１日後に投与されたｒＨｕＩＬ−１２の単回注射が、生存を著しく増加させ、そして、放射線誘導性造血毒性および感染症を著しく低減することができることを実証する。したがって、ｒＨｕＩＬ−１２は、放射線曝露の致死的な効果に対して効果のある、単品型の医学的対抗手段として、有効である。
【０１７９】
急性放射線症候群（ＡＲＳ）は、核事故または核攻撃の場合に起こるような、短期間に、＞１Ｇｙの放射線量への全身または重要な身体の一部の曝露によって引き起こされる生命を脅かす疾病である。ＡＲＳの病態生理学はよく理解されており、全ての哺乳動物にわたって類似しており、造血、胃腸、中枢神経、および皮膚系に対して有害な効果を伴っている。ＡＲＳの造血器官症候群（ＨＳＡＲＳ）において、毒性は急性骨髄消失に因っており、汎血球減少症をもたらす。ＨＳＡＲＳは、最終的には、放射線曝露のレベルに応じて、２週間〜２カ月の範囲にわたる、感染および／または出血に因って、死をもたらす。
【０１８０】
大規模な緊急被爆事故における、放射線被爆の医療対策（Ｒ−ＭＣＭ）の有効性は、生命を救うために重要であるが、現在、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可されている治療はない。ＨＳＡＲＳのための典型的な治療ガイドラインは、曝露レベルに応じて、短期または長期のサイトカイン投与が含まれている。入手可能なサイトカイン製品は、いくつかの個々の細胞型（好中球に対する、Ｇ−ＣＳＦなど）の成長を支援する1が、それらの使用の報告は、ＴＢＩ後の総合的な死亡率において、一貫した減少を示しておらず、そして、それらのサイトカインは、ＨＳＡＲＳへの適応については、ＦＤＡによって認可されていない。原子力災害または事故に起因する、ＨＳＡＲＳに対する最適なＲ−ＭＣＭは、骨髄コンパートメントの全ての系統を再生することができ、そして、予期されるロジスティック障害がある際には、好ましくは単一投与として、そして、集中的な支持療法がない状態で、曝露後数時間〜数日間のうちに投与した際、有効である必要がある。これらの要件は、顆粒球形成の系統にのみ影響を及ぼし、複数回の毎日の投与を必要とし、そして、集中的な支持療法と組み合わせることでのみ、生存を改善することが示されている、Ｇ−ＣＳＦでは、満たされない9。さらに、放射線曝露に関して、Ｇ−ＣＳＦは、長年にわたる単一性の血小板減少症10、ならびに、肺毒性18および繊維症（Aeolus referenceを参照）を伴う、遅延型の副作用とも関連すると、報告されている。
【０１８１】
本発明者らは、抗生物質、体液、または血液製剤の不在下、照射後２４〜２５時間で投与された、組換えヒトＩＬ−１２（ｒＨｕＩＬ−１２）の単回投与は、マウスＨＳＡＲＳモデル、ならびに、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の実証実験の、非盲検の、雄限定試験の双方において、生存を改善したことを以前に報告し8。これらの知見は、有効性は、適切な動物モデル（例えば、非ヒト霊長類）において検証し、そして、安全性は、ヒトにおいて実証される、ＦＤＡのアニマル・ルールに基づく、ＨＳＡＲＳのためのＲ−ＭＣＭとして、ｒＨｕＩＬ−１２のさらなる開発を支持している。以下に、本発明者らは、雄および雌のアカゲザルの大きな群における、ｒＨｕＩＬ−１２の放射線対策効果の、無作為化、盲検、極めて重要なフェーズ有効性試験の結果を記載する。このフェーズ２試験は、アニマル・ルールに基づく認可に向けて、ｒＨｕＩＬ−１２を前進させる。
【０１８２】
方法
動物
アカゲザル（Macaca mulatta）は、Ｙｏｎｇｆｕ  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｘｉｎｇｕｉ  Ｗｉｌｄ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｒａｉｓｉｎｇ  Ｌｔｄ．、Ｃｈｉｎａから入手した。サル（治療の開始時に、３〜５歳齢、３．０〜５．７ｋｇ）を、別々に飼育し、照射前５週間以上順化させた。Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｈｉ−Ｆｉｂｅｒ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｄｉｅｔ  ＃７１９５Ｃ（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を１日２回与えた。
【０１８３】
無作為化および盲検
主試験において、雄および雌の動物（各４５匹；投与群当たり、性別当たり、９匹）を無作為化し、体重によって層別化して、以下の用量のｒＨｕＩＬ−１２：ビヒクル；５０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ、２５０ｎｇ／ｋｇ、または５００ｎｇ／ｋｇを、ＳＣ注射により投与した（群１〜５）。試験チームリーダーおよび照射に関与する者以外の病理学者および研究スタッフには、知らされていない。１２日目の骨髄の評価は、ｒＨｕＩＬ−１２の同じ用量について無作為化されている、別々の動物を使用して、盲検法によって、実施した（群当たり、性別当たり、２匹）。
【０１８４】
全身照射
７００ｃＧｙの線量（Ｔｈｅｒａｔｒｏｎ  １０００  Ｃｏ６０  ｓｏｕｒｃｅ［Ｂｅｓｔ  Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ；Ｏｔｔａｗａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ］の６０ｃＧｙ／分）は、ＣｉＴｏｘＬＡＢ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａから入手可能な、稼働履歴データに基づいた。ＴＢＩを、先に記載したように、垂直位の動物に施した。均質な線量分布とするため、第１の半線量を体軸方向に施し、第２の半線量を前後方向に施した。各動物の前および後ろに配置してある、ナノドットチップ（Ｌａｎｄａｕｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｇｌｅｎｗｏｏｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）を使用して、線量測定値が、処方された線量の１０％以内に入っていることの確認を行った。
【０１８５】
ｒＨｕＩＬ−１２投与
医薬品グレードのｒＨｕＩＬ−１２またはビヒクルを、ＴＢＩに引き続き、およそ２４〜２５時間後に、ＳＣ注射によって、肩甲骨の間に投与した。各投与サンプル中の試験品目の濃度は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を使用して、ｉｎｔｅｒｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって検証された。
【０１８６】
アセスメント
臨床徴候を１日２回記録した。食欲（食物摂取に基づく）および身体活動の低下を毎日記録し、以下のようにスコア化した：１＝わずか；２＝中程度；および３＝重度。詳細な身体検査を、ｒＨｕＩＬ−１２投与前およびその後週２回実施した。体温（耳）を照射の前、ならびに３〜１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、３０日、４５日、および６０日目、あるいは、臨床的に正当化される場合に、測った。末梢血球数測定用の血液採取（０．５ｍＬ）を、照射の前、ならびに５日、１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、３０日、４５日、および６０日目に実施した。発熱性好中球減少症（直腸体温≧１０４°Ｆ／４０．０℃と共に、好中球絶対数＜０．０５  １０9／Ｌ）の場合と剖検の際、血液培養のために血液を採取した。
【０１８７】
終末手順
以下の基準のいずれかが観察された場合、６０日目の前に動物を安楽死させた：呼吸困難；３日間の完全な食欲不振；３日間で初期体重の＞２０％減少；活動レベルの重度の低下（全観察期間の間横たわるまたは触れても無反応）；推定血液量の＞２０％の急激な喪失；全身性の発作活動；異常な生命徴候に付随する、異常外観（姿勢、粗い被毛、低頭位、目および鼻の周りの滲出物、青白さ、しわの寄った腹部および臨床外観）：低体温を伴う重度の脱水症状（直腸温度が＜３４．６℃まで低下、および重度に低下した活動レベル）または高体温（温度＞４０．１℃および重度に低下した活動レベル）。安楽死の決定は、動物群の評価について知らされていない、技術者および獣医のチームによってなされた。生存する動物は、ＴＢＩに引き続く、６０日目に安楽死させた。
【０１８８】
剖検は、外側の肉眼検査、詳細な解剖、臓器重量および肉眼所見の評価、ならびに病理組織学のための組織の採取を含んでいる。出血の存在を、主な臓器に関して以下のようにスコア化した：０＝ない；１＝最少；２＝わずか；３＝中程度；４＝明らか；５＝重度。組織学的検査のため、組織をパラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン−フロキシン（Ｈ＆Ｅ）によって染色した。
【０１８９】
微生物学的分析を、脳、心臓、腎臓、肝臓、両肺、および脾臓で実施した。細菌増殖を各臓器についてスコア化した（０〜４）。各動物について、全スコアを合計した；平均スコアは、各治療群について算出されたスコアであった。
【０１９０】
骨髄病理組織学
骨髄評価群の動物は、ＴＢＩ後１２日目に安楽死させた。１匹の動物は、１１日目に予定外の安楽死術を受けた；全ての動物を、分析に含めた。各動物について、２つのＨ＆Ｅ切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１複式顕微鏡上で詳細に観察した。各大腿骨切片をその全体中に包含している、およそ４０°視野の画像を、１０×の倍率でＩｎｆｉｎｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０で得た。各切片における各視野内の、骨髄再生島の数は、視覚的定量化によって決定した。骨髄再生の延べ面積は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア、バージョン１．４６を使用して決定した。動物当たり２つの切片からの、再生島の平均数および再生の平均面積を、統計分析に使用した。各大腿骨切片内の、巨核球の数は、視覚的に決定した。
【０１９１】
統計分析
全ての統計比較は、性別の依存性について、ならびに、全試験集団について、実施した。生存機能は、１日ごとに適用される、カプラン・マイヤー法を使用して見積もった。対照群は、マンテルログ・ランク検定を使用して、他の治療群のそれぞれと比較された。ＧＬＰ分析は、ＣｉＴｏｘＬＡＢで実施された。
【０１９２】
重症好中球減少症（好中球数＜０．０５×１０9／Ｌとして定義される）、重症血小板減少症（血小板数＜１０×１０9／Ｌとして定義される）、および血液培養陽性の発生率について、群間の比較を、フィッシャーの正確確率検定を使用して実施した。総合比較が有意（Ｐ≦０．０５）である場合、対照群と各投与群との間のペアワイズ比較をフィッシャーの正確確率検定を使用して行った。
【０１９３】
骨髄再生データ（再生島の数および面積）の群平均は、統計ソフトウェアプログラムＰｒｉｓｍバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、片側ｔ検定によって比較した。ｐ＜０．０５である差違は、有意であると考えた。
【０１９４】
結果
生存
生存データを図１に示す。投与した放射線量は、この実験の条件下で（抗生物質、輸液、または輸血なし）、およそＬＤ90/60（未治療群において、２／１８匹生存）に相当した。５９匹中、５８匹の死亡は９日目と２４日目との間に起こり、アカゲザルにおいて先に観察されたＨＳＡＲＳによる死亡率および死亡時期と一致しており、そして、１匹の死亡は３３日目に起きた。最も高い死亡割合は、１１日目と２１日目との間に起こり、１４日目が、対照群およびｒＨｕＩＬ−１２治療群両方の死亡のピーク日（peak day）であった。死亡頻度は、雄と雌で同等であった。全ての死亡を、原因にかかわらず、有効性の統計分析に含めた。各ｒＨｕＩＬ−１２治療群は、ビヒクルよりも生存において統計的に有意な増加を示した（ログ・ランク検定ｐ＜０．０５）。ビヒクル群においては、１８匹中２匹が生存したが（１１％、両方とも雄）、ｒＨｕＩＬ−１２治療群２〜５では、それぞれ３３％（雄３匹および雌３匹）、３９％（雄４匹および雌３匹）、３９％（雄４匹および雌３匹）、ならびに５０％（雄５匹および雌４匹）が生存した。ｒＨｕＩＬ−１２治療群間のペアワイズ比較では、有意な差は示されなかった。
【０１９５】
６０日目より前の予定外の死亡の可能な原因は、主に感染であった。また、出血の巨視的および微視的証拠は、様々な臓器で観察された。
【０１９６】
血液学
血小板の平均容量、血小板、好中球、リンパ球、および網状赤血球の血球数を、それぞれ、図２Ａ〜Ｅに示す。血液学的測定は、基底レベルに相当する、放射線照射前の時点、ならびに、その後、ＨＳＡＲＳモデルにおいて見られる、重症血球減少症の期間に相当する、照射後５、１０、１２、１４、１６、および１８日の時点で行い、そして、生存する動物においては、基底レベルへの回復を評価するため、３０、４５、および６０日目にも行った。
【０１９７】
血小板
血小板最下点（nadir）は、投与群に依存して、１２日目または１４日目に生じた。明白な血小板減少症（＜５０×１０9／Ｌ）は、１０〜１５日間隔で現れた。対照群の最下点平均は、１０．１×１０9個の血小板／Ｌであり、ｒＨｕＩＬ−１２治療群２〜５においては、それぞれ、１２．１、１５．５、１２．７、および１８．６×１０9個の血小板／Ｌである、各治療群の最下点平均よりも低かった。全ての群の生存動物においては、３０日目の完全な回復ともなう、最初の回復が、１８日目までに、観察された。１０日目と１８日目との間の重症血小板減少症（血小板＜１０×１０9／Ｌ）を有する血液試料の割合は、対照群では３３％、そして、ｒＨｕＩＬ−１２治療群２〜５では、それぞれ３４％、２０％、２２％、および１２％であった。対照とのペアワイズ比較は、５００ｎｇ／ｋｇ群に関して有意であった（フィッシャーの正確確率検定  ｐ＝０．００７３）。平均血小板容量は、１４日目と１８日目との間で増加しており、回復する骨髄からの若い血小板の放出に相当する。平均ピーク値は、ｒＨｕＩＬ−１２治療群２〜５での、それぞれ９．２１、９．１３、９．５６、および９．１７ｆＬと比較して、対照群では、８．６４ｆＬであった。
【０１９８】
好中球
好中球最下点は、投与群に依存して、１０日目と１４日目との間に生じた。重症好中球減少症（＜５０×１０6／Ｌ）は、対照群では１００％の動物で生じ、そして、ｒＨｕＩＬ−１２治療群２〜５では、それぞれ、８８．９％、７７．８％、８３．３％、および７２．２％の動物で生じた。対照群の最下点平均は、２６×１０6／Ｌであり、５０、１００、２５０、および５００ｎｇ／ｋｇの用量でｒＨｕＩＬ−１２により治療した群においては、それぞれ、３４、５４、３９、および７８×１０6／Ｌである、各治療群の最下点平均よりも低かった。好中球の回復は、１８日目までに、開始され、そして、３０日目までに完了した。１０日目〜１８日目に重症好中球減少症を提示する血液試料の割合は、５０、１００、２５０、および５００ｎｇ／ｋｇの用量における、それぞれ、４６％、３５％、４６％、および３１％と比較して、対照群では、６７％であった（ｐ＝０．０１９６、０．０００５、０．０２７８、および＜．０００１、フィッシャーの正確確率検定）。
【０１９９】
リンパ球
リンパ球最下点は、投与群に依存して、１０日目と１６日目との間に生じた。全ての群は、放射線照射前のレベルの７〜１０％まで減少する重症リンパ球減少症を示した。対照群における、リンパ球の最下点平均は、０．１４３×１０9／Ｌであり、各治療群の最下点平均よりも低かった（５０、１００、２５０、および５００ｎｇ／ｋｇの用量において、それぞれｍ０．１６３、０．２１３、０．２２０、０．２３９×１０9／Ｌ）。１８日目に、全ての群において、最下点からの最初の回復が観察された。３０日目までは、群平均レベルは、放射線照射前のレベルの３０％〜ほぼ６０％の範囲であったが、４５および６０日目には、リンパ球数は正常な範囲であるが、依然として、ベースラインレベルよりもわずかに低かった。雄と雌を合わせると、統計的な有意さには達しなかったが、対照とｒＨｕＩＬ−１２で治療した動物との間のリンパ球最下点の差は、５０、２５０、および５００ｎｇ／ｋｇ用量レベルで治療した雌においては、統計的に有意であった（Ｓｉｄａｋ調製ｔ検定、それぞれ、ｐ＝０．０４４３、０．０１０３、および０．０２１１）。
【０２００】
赤血球および網状赤血球
赤血球最下点は、全ての群において１８日目に生じ、ベースラインから３７％の減少を示した。赤血球最下点は、全ての群で類似していた（データは示さない）。網状赤血球最下点は、対照群では、７．１×１０9／Ｌであり、５０、１００、２５０、および５００ｎｇ／ｋｇのｒＨｕＩＬ−１２群では、それぞれ、８．７×１０9／Ｌ、１２．１×１０9／Ｌ、９．１×１０9／Ｌ、および９．８×１０9／Ｌであり、赤血球生成に対する、ｒＨｕＩＬ−１２の刺激効果を示唆している。しかし、その差違は、統計的な有意さには達していなかった。
【０２０１】
発熱性好中球減少症
合計１５匹（雄８匹；雌７匹）が、発熱性好中球減少症を有すると報告され、そして、ほとんど（１０／１５）は、ｒＨｕＩＬ−１２の２つの最高用量レベルで治療されていた。１５匹のうち１０匹が、陽性血液培養を有しており、そして、最も一般的な細菌は大腸菌（Escherichia coli）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）であった。発熱性好中球減少症の期間は、全ての動物において、１日間であり、そして、１２匹では、同じまたは次の日に死亡した。１５匹のうち３匹は、６０日目まで生存した（１匹は、２５０ｎｇ／ｋｇ群、２匹は５００ｎｇ／ｋｇ群）。特に、３匹の生存する動物のうち、２匹は陰性血液培養を有した。
【０２０２】
骨髄
ＴＢＩに関連した、骨髄低細胞性が、３０日より前に死亡した全ての動物で観察された。これらの動物由来の骨髄塗抹標本は、全ての治療群において、類似の骨髄抑制効果を示した。上腕骨骨髄における明らかな造血低細胞性の痕跡を有していたが、他の骨髄部位では、正常である、１匹の動物（５００ｎｇ／ｋｇ群）を除き、生存した動物においては、低細胞性は、全てにおいて、６０日目までに完全に回復した。
【０２０３】
随伴試験においては、動物の別々のコホート（群当たり、性別当たり、２匹）を、生存試験と同様の放射線レベルに曝露し、同じ用量レベルのｒＨｕＩＬ−１２で治療した。全ての動物を、血球数の最下点のタイミングに基づき、最大の骨髄抑制が推定される日を代表している、１２日目に屠殺した。骨髄の組織学的分析は、再生の空洞を伴っている、重症低細胞性を示した（図３Ａ）。各動物における、再生島の数、再生島の延べ面積、ならびに巨核球の数の定量を、盲検分析で実施した。再生島の数および面積の両方とも、対照と比較して、ｒＨｕＩＬ−１２治療群で高く、全ての治療群が、増加した値は、類似の範囲を示した（図３Ｂ〜Ｃ）。両パラメーターに関して、差違は、５００ｎｇ／ｋｇ群、ならびに、プールした比較（全ての治療群対対照群）において、統計的な有意さに達した（再生の島の数および面積に関して、それぞれ、ｐ＝０．０２７２およびｐ＝０．０３１１）。重要なことに、巨核球数は、対照に対して、全てのｒＨｕＩＬ−１２治療群において高いが、その差違は、統計的に有意ではなかった（図３Ｄ）。
【０２０４】
微生物学および病理学
感染
ｒＨｕＩＬ−１２治療群２〜５における、それぞれ、６５％、６５％、４７％、および４４％と比較して、対照群では、血液培養陽性は８６％であった。該差違は、２つの最高用量については、統計的に有意であった（各群について、ｐ＝０．００７２）。感染の有病率の低下が、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方において、見られた。心臓、腎臓、肝臓、両肺、脳および脾臓の細菌学分析を、全ての動物の剖検において実施した。対照と比較して、ｒＨｕＩＬ−１２治療動物において、平均細菌増殖スコアの減少が見られた（表１）。
【０２０５】
大腸菌および黄色ブドウ球菌が、臓器および血液培養からの、最も頻度の高い培養菌であった。予定外に安楽死させた１６匹の対照動物のうち、１２匹（７５％）は、ｒＨｕＩＬ−１２治療群２〜５における、それぞれ、６６．７％、６３．６％、７２．７％、および５５．６％と比較して、臓器培養において、大腸菌について、陽性であった。予定外に安楽死させた１６匹の対照動物のうち、１０匹（６２．５％）は、ｒＨｕＩＬ−１２治療群２〜５における、それぞれ、５０．０％、５４．５％、５４．５％、および４４．４％と比較して、臓器培養において、黄色ブドウ球菌について、陽性であった。
【０２０６】
出血
全ての臓器における、群全体の平均出血スコア、ならびに、胃腸系における、別々のスコアを表１に示す。平均スコアは、全てのｒＨｕＩＬ−１２治療群よりも、対照群が高いが、その差違は、統計的有意性には達しておらず、臓器毎、ならびに、動物毎の相当の変動性に起因しているようである。特に、少なくとも１つの臓器において、≧４の出血スコアを有する動物の割合は、ｒＨｕＩＬ−１２で治療した群よりも対照群が高く、そして、脳出血は、対照群の動物（２匹の動物）のみで見出された。
【０２０７】
考察
この試験で使用したアカゲザルモデルにおける、ＴＢＩの血液学的効果、および、その結果生じる、感染および出血の発生は、ヒトに関して報告されたもの9、10と類似しているため、該試験で使用したアカゲザルモデルは、ヒトＨＳＡＲＳの確立されたモデルである。この無作為化、盲検、プラセボ対照試験からのデータは、ＨＳＡＲＳの該アカゲザルモデルにおける、致死的なＴＢＩ（７００ｃＧｙ；ＬＤ90/60）に引き続く、生存に対する、１０倍の用量範囲にわたる、単回のｒＨｕＩＬ−１２の皮下注射の陽性且つ有意な効果を実証している。特に、この効果は、支持療法を使用することなく、達成されている。これらの結果は、ＮＨＰにおける本発明者らの概念実証試験において見出された、生存に対するｒＨｕＩＬ−１２の有益な効果8と一致した。
【０２０８】
今回の試験では、通常、ＴＢＩから生じる臨床徴候（嘔吐、下痢、および体重）は、全ての治療群の間で、および性別間で類似していた（補足を参照）。血球数最下点、ならびに、感染、出血および死亡の最も高い割合の期間に生じる、活動および食欲の低下は、対照群で最も高く、そして、ｒＨｕＩＬ−１２で治療した群では、より低かった。
【０２０９】
放射線誘導骨髄抑制は、ｒＨｕＩＬ−１２によって軽減された：ｒＨｕＩＬ−１２で治療された動物群は、リンパ球、好中球、血小板、および網状赤血球に関する、弱まった最下点、ならびに、重症好中球減少症および重症血小板減少症の発生における、統計的に有意な低減を示した。平均血小板容量もまた、対照に対して、ｒＨｕＩＬ−１２で治療した動物において増加し、新しく形成された血小板の骨髄からの放出を示している。随伴試験における、骨髄再生ポケットの定量分析は、ｒＨｕＩＬ−１２のみが、骨髄の再生および主な血液細胞成分の回復を可能にする、造血に対する刺激効果を有するという結論を支持している。特に、巨核球数も、対照に対して、ｒＨｕＩＬ−１２治療群では高かった。この試験に示されるように、ｒＨｕＩＬ−１２によるｉｎ  ｖｉｖｏでの複数の造血系統の刺激は、ＩＬ−１２がｉｎ  ｖｉｔｒｏで造血幹細胞および前駆細胞の増殖を刺激するという先の報告（４〜６）、および担腫瘍マウスにおける本発明者らの先の試験11と一致している。
【０２１０】
重症好中球減少症の低減と一致して、感染に関する血液培養陽性の発生率は、対照群の８６％から、２５０または５００ｎｇ／ｋｇの用量でｒＨｕＩＬ−１２を投与された群では、それぞれ、４７％および４４％へと著しく減少している。これらのデータは、ＴＢＩの２４時間後に投与されたＨｕＩＬ−１２が、抗生物質がない場合、広範な細菌の感染性を低減したことを実証している。
【０２１１】
重症好中球減少症の低減、ならびに感染症および敗血症の減少の本発明者らの知見を支持して、ＩＬ−１２は、おそらくは感染の発生率の低減に寄与する、自然および獲得免疫に対する複数の刺激効果を有することが知られている。照射に引き続く初期の段階では、Ｔｈ１機能は、抗原提示細胞からの内在性ＩＬ−１２の分泌抑制によって低下する12、13。照射後に投与されたＩＬ−１２は、生存するＮＫ細胞、マクロファージ、および樹状細胞の増殖ならびに活性化を促進する14、15。ＮＫ、マクロファージ、および樹状細胞間の３方向のクロストークは、それらの成熟をさらに促進し、ＴＢＩに引き続く、Ｔｈ１機能の回復および初期免疫能の確立をもたらす。さらに、病原体活性化樹状細胞からの内在性ＩＬ−１２の継続的な産生は、ポジティブ・フィードバック・ループとして機能し、そして、外因性ＩＬ−１２への初期応答の維持に重要な役割を果たす17。総合すると、これらのＩＬ−１２が引き起こす、免疫媒介効果は、この試験において観察されたポジティブな生存利益に対して、主に関与することができ、それらは、恐らくは、ＩＬ−１２の抗感染性に由来している。
【０２１２】
重症血小板減少症の低減と一致して、この試験におけるｒＨｕＩＬ−１２治療は、予定期間前に死亡した、または安楽死させた動物の出血の低い重症度と関連していた。重症血小板減少症および出血の低減の本発明者らの知見を支持して、本発明者らは、近年、骨髄における、ＩＬ−１２シグナル伝達に最も特異的な、ＩＬ−１２受容体のβ２サブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ２）の発現が、造血幹細胞、巨核球、および骨芽細胞上で見出されたことを報告した。これらの重要な骨髄細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２受容体の存在は、その受容体を介して、ｒＨｕＩＬ−１２が、放射線曝露に引き続く、生存する幹細胞および巨核球の増殖および分化を促進し、血小板再生を増強し、重症血小板減少症を低減し得ることを示唆している。現状、がん患者において骨髄抑制療法後に血小板回復を促進することができる、入手可能な薬剤がないため、ｒＨｕＩＬ−１２の血小板再生を促進する能力は、ＨＳＡＲＳ軽減以外の適応において、臨床的に重要であることができる。
【０２１３】
白血球増殖因子は、放射線照射の犠牲者における使用が推奨されるが、この適応について、ＦＤＡによって認可はされていない。強力な、トリガーベースの医療管理（抗生物質、静脈内輸血、静脈内液置換）と組み合わせて、ｒＨｕＧ−ＣＳＦ−対対照ＮＨＰにおける生存の改善を実証する公開された研究が１つだけある9。本発明者らは、近年、支持療法がなされていない、ＮＨＰモデルにおいて、ｒＨｕＩＬ−１２またはビヒクルの単回注射と、ｒＨｕＧ−ＣＳＦの１８回の注射と比較する、無作為化盲検試験を完了した。予備解析は、ビヒクルおよび対Ｇ−ＣＳＦ治療群と比較して、ｒＨｕＩＬ−１２治療群における、優れた生存を確認しているが、Ｇ−ＣＳＦは、ビヒクルと比較して、生存を増加しなかった（投稿準備中）。動物有効性試験と並行して、ｒＨｕＩＬ−１２の安全性および耐容性を、アニマル・ルールにより、通常の健常な患者において、決定した。ファースト−イン−ヒューマン（ＦＩＨ）試験を実施して、用量の段階的増大（２〜２０μｇの範囲の用量で）を介して、ｒＨｕＩＬ−１２の安全で良好な耐容性の用量を決定し、１２μｇのＦＩＨ試験からの最も安全で良好な耐容性の用量において、フェーズ１ｂ拡大試験を続けた（Gokhaleら、準備中）。７０ｋｇの成人に対する１２μｇ単位のヒト用量は、体重ベースの変換を使用して、１７１ｎｇ／ｋｇのアカゲザル用量へと変換でき、そして、この用量は、本発明者らのアカゲザル試験において決定された有効な用量範囲内である。
【０２１４】
要約すると、この無作為化、プラセボ対照、盲検試験は、支持抗生物質、体液または血液製品を用いることなく、放射線曝露の２４時間後に、単回、低用量で投与された場合、ｒＨｕＩＬ−１２は、生存を増加し、造血系を再生する能力のため、理想的な最先端の放射線緩和剤となることを実証している。動物モデルからヒトへの有効で安全な用量の置き換えは、アニマル・ルールに基づく、任意の薬物開発プログラムのための重要な挑戦である。したがって、ＮＨＰモデルにおいて、生存の統計学的に有意な増加が、ｒＨｕＩＬ−１２の１０倍の有効な用量範囲にわたって、達成できるという、本発明者らの知見は、最適なヒト用量選択に、明解な利点を提供する。
【０２１５】
表
【０２１６】
【表２】
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【０２１７】
例１２：
マウスにおける致死的ま照射後の造血回復のための、組換えインターロイキン−１２対骨髄移植、ならびに潜在的な細胞性標的の評価
特徴がはっきりしている免疫調節効果に加えて、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、照射によって損傷した骨髄において、造血回復に役割を果たす。本発明者らは、支持療法を用いることなく、組換えマウスＩＬ−１２（ｒＭｕＩＬ−１２）が、単独で、致死的照射マウスの生存を増加させたことを、以前に報告した。本明細書において、本発明者らは、致死的照射に曝露されたマウスの救出のための、骨髄移植（ＢＭＴ）に対する、ｒＭｕＩＬ−１２の２つの投与スケジュールを比較した。群当たり１０匹が、以下の１つを投与された：ビヒクル；全身照射（ＴＢＩ）の２４時間前における、１０ｎｇのｒＭｕＩＬ−１２の投与；ＴＢＩの２４時間前および３日後における、１０ｎｇのｒＭｕＩＬ−１２の投与；あるいは、ＴＢＩの２時間後における、ドナー骨髄（１．１×１０6細胞）の注入。結果は、ｒＭｕＩＬ−１２で治療した動物における生存率は、ＢＭＴに匹敵することを示した。さらに、両治療における、好中球、赤血球、および血小板の造血回復も、また同等であった。マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ実験において、ビヒクルに対して、ｒＭｕＩＬ−１２は、骨髄由来の系統陰性（Ｌｉｎ-）細胞、造血幹／前駆細胞からなる細胞のサブセット上のＩＬ−１２受容体β２サブユニット（ＩＬ−１２β２）の発現を増加させた。本発明者らは、ヒト造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）のサブセット上のＩＬ−１２Ｒβ２の発現をさらに調査した。ヒト骨髄由来のＣＤ３４+ＨＳＣは、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現し、そして、ＩＬ−１２Ｒβ２は、ヒトＨＳＣの他のマーカーと共発現していた。これらの知見は、造血回復における、ＩＬ−１２の機能が、骨髄中のＩＬ−１２Ｒβ２発現幹細胞との相互作用により、駆動されることを示唆している。これらのデータは、様々な臨床現場における、骨髄除去に引き続く、造血回復を増強するためのアジュバント、組換えヒトＩＬ−１２の研究を動機づける。
【０２１８】
放射線誘導性造血症候群の緩和のための理想的な薬物は、放射線曝露の犠牲者の間おける、ＨＳＣ移植の効果（複数の骨髄細胞系統の増殖の促進、疾病率の減少、および生存率の改善）を模倣して、そして、健常な患者に投与した場合、安全であり、全ての犠牲者に単一の用量レベルで投与することができる。本発明者らは、候補として、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を以前に提案した［１］。免疫におけるそのよく確立された役割［２］に加え、ＩＬ−１２は、損傷した骨髄において、造血能力の保存にも基本的な役割を果たすようである。初期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、ＩＬ−１２がコロニー刺激因子（ＣＳＦ）［３］またはＩＬ−３のいずれか、および造血幹細胞因子（ＳＦ；幹細胞因子［ＳＣＦ］とも呼ぶ）［４、５、６］と共に、ミエロイド幹細胞および前駆細胞［６］、Ｌｉｎ-／Ｓｃａ−１+細胞［３］、リンパ球造血系の前駆細胞［５］、または混合、エリスロイド、ならびにミエロイドコロニー［４］の増殖を誘導できることを実証した。Netaら［７］によるｉｎ  ｖｉｖｏでの研究は、ＩＬ−１２のみ（１μｇ／マウス）が、マウスの骨髄を致死的な照射の効果から保護したが、しかし、胃腸系の放射線感受性を増加したことを実証した。続いて、Chenら［８］は、１００ｎｇ／マウスのＩＬ−１２用量が、胃腸系の放射線感受性を増加することなく、致死的な照射からの骨髄の保護に有効であったことを報告した。本発明者らは、近年、プラセボに対して、致死敵な照射の２４時間後にマウスに投与した１０〜４０ｎｇの用量の組換えマウスＩＬ−１２（ｒＭｕＩＬ−１２）が、骨髄細胞におけるＩＬ−１２受容体β２サブユニットの発現の誘導によって示されるように、生存を増加し、造血を促進したことを報告した［１］。さらに、致死的なＴＢＩに曝露した非ヒト霊長類において、組換えヒトＩＬ−１２（ｒＨｕＩＬ−１２）による治療は、プラセボ治療動物と比較すると、生存の有意な増加をもたらし、そして、リンパ球および血小板に関して最下点を減弱させた［１］。
【０２１９】
今回の試験では、本発明者らは、致死的照射マウスにおいて、造血回復および生存促進の誘導における、ｒＭｕＩＬ−１２の能力を、従来のＢＭＴのものと比較した。さらに、ＩＬ−１２の潜在的な細胞標的をさらにはっきりさせるために、本発明者らは、ヒト骨髄由来ＦＩＳＣにおけるＩＬ−１２受容体のβ２サブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ２）の発現を評価した。
【０２２０】
材料および方法
組換えＩＬ−１２
ｒＭｕＩＬ−１２は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（カタログ番号２１０−１２；Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）またはＳＢＨ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＬＳ＃４５［Ｑ４］；Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手した。各動物実験において報告されている用量は、ＥＬＩＳＡ（ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２  （ｐ７０）ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ（商標）Ｄｅｌｕｘｅ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））によって決定された用量である。
【０２２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ動物試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ジャクソン研究所（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）またはハーラン研究所（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手した。試験の開始時に、マウスは、８〜１０週齢、体重およそ２０ｇであり、疾患の徴候はなかった。全ての手順は、（実験動物ケア評価認証協会およびアメリカ実験動物ケア学会によって認証されている）ＢＡＬＩ’Ｓ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ  ＣＡ）研究所動物実験委員会によって審査および承認され、そして、国立衛生研究所の指針に従っっている。
【０２２２】
致死的な照射に曝露されたマウスの生存に対する、ｒＭｕＩＬ−１２およびＢＭＴの効果の比較
生存に対する、ｒＭｕＩＬ−１２およびＢＭＴの効果を、致死的なＴＢＩに曝露した４０匹の雌のマウスにおいて、比較した。それぞれ１０匹のマウスを、以下の静脈内治療の１つに割り当てた：ＴＢＩの２４時間前にビヒクル（リン酸緩衝液［ＰＢＳ］；１００μｌ）を投与した；ＴＢＩの２４時間前に１０ｎｇのｒＭｕＩＬ−１２を投与した（以降、単回投与ｒＭｕＩＬ−１２と呼ぶ）；ＴＢＩの２４時間前および３日後に１０ｎｇのｒＭｕＩＬ−１２を投与した（以降、反復投与ｒＭｕＩＬ−１２と呼ぶ）；またはＴＢＩの２時間後に投与したドナー骨髄（１．１×１０6細胞）。移植のためのドナー骨髄細胞は、大腿骨および脛骨を、２５ゲージ  ５／８インチ針を使用して、ＰＢＳでフラッシングすることにより、正常な雌のＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した。細胞を、４０μｍのセルストレーナーを通して、濾過し、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ培地で洗浄し、液体窒素中で凍結保存した。０日目、マウスを、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ（登録商標）４０（１３７Ｃｓ）（Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、８．２Ｇｙ（ＬＤ90を目標とした［１］）の線量でＴＢＩに曝露した。放射線量分布のため、「パイ・ボックス」を使用して、マウスを照射装置の中心に置いた。ＴＢＩ後、マウスは滅菌食および酸性化した水を自由に取れるようにし、３５日目まで生存をモニターした。血液を、各群の５匹から、２１日目、２８日目、および３５日目に採取した。血球数をＨｅｍａｖｅｔ（登録商標）８５０（Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．；Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ、ＣＴ）によって決定した。
【０２２３】
健常な雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、Ｌｉｎ-細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２受容体ベータ２サブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ２）発現に対する、ｒＭｕＩＬ−１２のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果のフローサイトメトリー分析
マウス（治療群当たり６匹）は、尾静脈注射により、ｒＭｕＩＬ−１２（１０ｎｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ）を投与された。骨髄を、ｒＭｕＩＬ  １２治療の２１時間後に回収した。大腿骨および脛骨からフラッシュした骨髄を、ＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）で希釈し、７０μｍのセルストレーナー（ＶＷＲ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）に通して、濾過した。細胞を洗浄し、以下のマウス系統マーカー（Ｌｉｎ+）：ＣＤ３ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ｂ、ＣＤ８ａ、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、ＧｒｌおよびＴｅｒ（８０）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）に対するビオチンコンジュゲート・モノクローナル抗体とインキュベートした。細胞を、抗ビオチン標識磁気ビーズとインキュベートし、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ分離機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）の磁場中に置いたＭＡＣＳカラムに通した。未標識のＬｉｎ-細胞を、流出物として回収し、そして、抗マウスＩＬ−１２Ｒβ２抗体（ＨＡＭ１０Ｂ９、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）と、室温で３０分間インキュベートした。細胞を、未染色およびアイソタイプ対照と共にＭｏＦｌｏｗセルサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で分析した。実験は、ｒＭｕＩＬ−１２の２５時間後に回収した骨髄で反復し、そして、先に述べたように、ＩＬ−１２Ｒ  ２の発現について、Ｌｉｎ-細胞を分析した。
【０２２４】
ヒト骨髄ＣＤ３４+細胞におけるＩＬ−１２Ｒβ２の免疫細胞化学検出
ヒト骨髄由来ＣＤ３４+細胞は、Ａｌｌ  Ｃｅｌｌ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）から購入した。細胞を５μｇ／ｍＬフィブロネクチン・スライド上に播種し、そして、冷メタノール中、２０℃で１０分間固定した。固定した細胞を０．３％Ｈ2Ｏ2で３０分間処理して、内在性ペルオキシダーゼ染色を排除し、次いで、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ；Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）で２０分処理して、非特異的な染色を排除した。処理した細胞を、ヒトＩＬ−１２Ｒβ２に対するウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で標識後、引き続き、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＩｍｍＰＲＥＳＳ試薬；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）とカップリングした抗ウサギＩｇＧとインキュベーションした。スライドをＩｍｍＰＡＣＴ  ＡＥＣペルオキシダーゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と３０分間インキュベートし、ＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ；Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）で対比染色した。陰性対照は、一次抗体を用いることなく、ホースラディッシュペルオキシダーゼとカップリングした抗ウサギＩｇＧで標識した細胞を含んていた。画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１複式顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ；Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＣＡ）およびＩｎｆｉｎｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０を使用して得た。分析は３匹の個々のドナー由来のＣＤ３４+細胞で３回実施した。
【０２２５】
ヒト骨髄由来幹／前駆細胞上のＩＬ−１２Ｒβ２の発現のフローサイトメトリー分析
ヒト骨髄由来ＣＤ３４+細胞は上記のように購入した。ＣＤ３４+細胞を洗浄し、室温で３０分間、生存マーカーであるＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  ｄｅａｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）とインキュベートした。細胞を洗浄し、以下の各造血幹細胞マーカーに対する抗体とインキュベートした：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲートｃＫｉｔ／ＣＤ１１７（クローン番号ＹＢ５．Ｂ８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、フィコエリスリン（ＰＥ）−コンジュゲートＣＤ１３３（クローン番号２９３Ｃ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−Ｆｌｔ−３／ＣＤ１３５（クローン番号４Ｇ８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−Ｓｌａｍ／ＣＤ１５０（クローン番号Ａｌ２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−ＶｅｇｆＲ２／ＫＤＲ（クローン番号８９１０６；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、ＰＥ−ＣＤＣＰ１／ＣＤ３１８（クローン番号３０９１２１；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＩＴＣ−ＣＤ３４（クローン番号ＡＣ１３６；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）。上に列挙した各抗体のアイソタイプ対応対照を並行して分析して、バックグラウンド蛍光を決定した。細胞を洗浄および固定し、そして、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ｆｉｘａｔｉｏｎ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｈｏｓｅ、ＣＡ）を使用して透過処理を施した。細胞内のＩＬ−１２Ｒ  ２は、ヒトＩＬ−１２Ｒ  ２（クローン番号３０５７１９；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に対するアロフィコシアニンコンジュゲート（ＡＰＣ）抗体を使用して決定した。ＩＬ−１２Ｒ  ２抗体のアイソタイプ対応対照を並行して分析した。細胞を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ−Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＣａｍｐｕｓのＢｒｏａｄ  ＣＩＲＭ  Ｃｅｎｔｅｒにある、３つの高出力固体レーザー（４８８ｎｍ、６３５ｎｍ、およびＵＶ付近の波長）を装備する、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｏｒｄｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔ（ＳＯＲＰ）ＢＤ（商標）ＬＳＲＩＩデジタルフローサイトメーター（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ；ライセンス番号  Ｈ４７３０００２２）を使用して分析した。このサイトメーターは、最大１０個の蛍光パラメーターによるデータの獲得用に特化されている。データを、Ｆｌｏｗ．Ｊｏ  バージョン９．５．２（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＵＳＡ）を使用して分析した。ゲーティング手順は以下の通りであった：ＣＤ３４細胞を選択するための前方対側方散乱のプロット、死細胞除外のための側方散乱対生／死細胞染色、対を除外するための高さ対面積散乱（データは示さない）、およびＩＬ−１２Ｒ  ２対幹細胞マーカー。各象限分画用ゲートを、アイソタイプ対応抗体対照に基づいて設定した。分析は３個体のドナー由来のＣＤ３４+細胞で３回行った。
【０２２６】
統計分析
全ての治療群の生存曲線を、コックス・マンテル検定を使用して統計的に比較した。全ての群の血液細胞回復をスチューデントＴ検定で分析した。適用可能な場合、標準偏差とともに平均を報告した。
【０２２７】
結果
ｒＭｕＩＬ−１２は、致死的な照射に曝露された健常なマウスにおいて、ＢＭＴと同程度に、効果的に、生存ならびに血液細胞回復を増加させる
ビヒクルと比較して、ＢＭＴならびにｒＭｕＩＬ−１２の単回または反復投与は、致死的なＴＢＩに曝露されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、生存を増加する同等の能力を示し（図Ｉ）、３５日目の全生存（ＯＳ）は、ビヒクル群では０％、ＢＭＴ群では７０％、単回投与ｒＭｕＩＬ−１２群では６０％、および反復投与ｒＭｕＩＬ−１２群では９０％であった。ｒＭｕＩＬ−１２によるＯＳは、ＢＭＴによるＯＳと同等であった。各ｒＭｕＩＬ−１２群およびＢＭＴ群におけるＯＳは、コックス−マンテル検定を使用して、ビヒクル群より優位に高かった（各比較について、Ｐ＜０．００５）。２１日目では、ＢＭＴ群における好中球レベルは、単回投与ｒＭｕＩＬ−１２よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）（図２Ａ）。反復投与ｒＭｕＩＬ−１２群における好中球レベルは、ＢＭＴ群と統計的には、差違はなかった。２８日目および３５日目においては、全ての治療群における好中球レベルは、統計的に同等であった。ＢＭＴ群におけるＲＢＣレベルは、２１日目の両ｒＭｕＩＬ−１２群よりも有意に高かった（ｐ＜０．００５）（図２Ｂ）。全ての治療群のＲＢＣレベルは、２８日目および３５日目においては、同等であった。血小板レベルは、２１日目においては、単回投与のｒＭｕＩＬ−１２（ｐ＜０．００５）およびＢＭＴ（ｐ＜０．０５）と比較して、反復投与ｒＭｕＩＬ−１２群で有意に高かった（図２Ｃ）。２８日目および３５日目においては、全ての治療群の血小板レベルは統計的に同等であった。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。総合的に、ｒＭｕＩＬ−１２による３５日目までの好中球、血小板、および赤血球（ＲＢＣ）の回復は、ＢＭＴと同等であった。
【０２２８】
ｒＭｕＩＬ−１２によるｉｎ  ｖｉｖｏでの治療は、骨髄由来系統枯渇（Ｌｉｎ-）細胞上でのＩＬ−１２受容体、ベータ−２サブユニット（ＩＬ−１２Ｒベータ２）の発現を増加する
マウス骨髄におけるＩＬ−１２Ｒベータ２の発現を評価するため、本発明者らは、健常な雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、尾静脈注射による、単回、静脈内、１０ｎｇ用量のｒＭｕＩＬ−１２（ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝６）によって治療し、骨髄から単離したＬｉｎ-細胞におけるＩＬ１２Ｒベータ２の発現を調べた。２つの実験からの結果は、ｒＭｕＩＬ−１２が、治療の２１〜２５時間後のＬｉｎ-細胞上でのＩＬ−１２Ｒｂ２の発現（表１）において、３．５倍〜５．４倍の増加を誘導することを示した（平均（±ＳＤ）−４．４５±１．３）。Ｌｉｎ-細胞は、造血幹／前駆細胞からなり、成熟造血細胞および関与する先駆細胞の枯渇した細胞集団を表す。本発明者らのデータは、ＩＬ−１２がマウス骨髄においてＬｉｎ-細胞上でのＩＬ−１２Ｒベータ２発現を増加することを示す。ＩＬ−１２の造血回復機能を含むこのデータは、ＩＬ−１２Ｒベータ２が、ＨＳＣ上で発現されることを示す。
【０２２９】
ヒト骨髄ＣＤ３４+細胞はＩＬ−１２Ｒβ２を発現する
次に、本発明者らは、ヒト骨髄ＣＤ３４発現ＨＳＣ上でのＩＬ−１２Ｒベータ２発現を明らかにした。第一に、免疫細胞化学染色を使用して、本発明者らは、市販のヒト骨髄ＣＤ３４+細胞上でのＩＬ−１２Ｒβ２の存在を実証した（図３Ａ）。第二に、本発明者らは、フローサイトメトリーによって、ヒトＣＤ３４+細胞上でのＩＬ−１２Ｒβ２の発現を定量した。試験した３個体のドナー由来のＣＤ３４+細胞中、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現する平均（±ＳＤ）割合は８９±２であった（図３Ｂ）。
【０２３０】
ヒト骨髄ＣＤ３４+細胞は、ＩＬ−１２Ｒβ２および他の公知の造血幹／前駆細胞（ＵＳＣ）マーカーを共発現する
次に、本発明者らは、ＩＬ−１２Ｒβ２のＨＳＣマーカー、ＣＤ１１７、ＣＤＩ３３、ＣＤ１３５、およびＣＤ３１８との共発現を調べて、ＣＤ３４+細胞上でのＩＬ−１２Ｒβ２の発現の本発明者らの観察をさらに裏付けることを考えた。これらのマーカーは、生着能力を有するＨＳＣ集団を表すことが示されているため選択した［１８、２３、２４、２５、２６、２７］。ＩＬ−１２Ｒβ２は、ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞上のＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、およびＣＤ３１８と共発現した。ＩＬ−１２Ｒβ２とＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、およびＣＤ３１８とを共発現するＣＤ３４+細胞の平均割合は、それぞれ、７０±１１％、６３±７％、５７±４％、および６１±９％であった（表２および図４Ａ〜４Ｄ）。特に、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、およびＣＤ３１８発現ＣＤ３４亜集団の大多数は、ＩＬ−１２Ｒβ２の発現を示した。これらの結果は、骨髄におけるＨＳＣ集団に因る、ＩＬ−１２媒介性の造血回復における、ＩＬ−１２Ｒβ２の潜在的な役割を示している。
【０２３１】
考察
今回の試験は、健常な照射マウスにおける、ｒＭｕＩＬ−１２またはＢＭＴを用いた治療によりもたらされる、ｉｎ  ｖｉｖｏでの造血活性および生存の利点を比較した。結果は、ビヒクル対照と比較して、ＢＭＴ、または、１回もしくは２回のいずれかの１０ｎｇ用量のｒＭｕＩＬ−１２で治療した照射マウスが、生存を有意に増加させていることを実証している。３つの有効な治療群の間では、生存曲線は互いに有意な差はなかった。好中球、ＲＢＣ、および血小板における同等の回復が、３５日目までに、３つの有効な治療群全てにおいて観察された。反復投与ｒＭｕＩＬ−１２における血小板レベルは、ＢＭＴと比較して、２１日目の早い時点では、有意に高く、血小板回復におけるＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒの役割を裏付けている。これらのデータは、本研究所［１］および他の研究者ら［７、８］の先のデータを確証し、そして、拡大する。本発明者らは、ルイス肺およびＥＬ４リンパ腫を保有する亜致死的照射マウスにおいて、血液細胞回復に対する、ｒＭｕＩＬ−１２の同様の効果も観察した［１０］。
【０２３２】
照射されたマウス骨髄において、生存および血液細胞回復を促進するｒＭｕＩＬ−１２の能力は、機能的なＩＬ−１２受容体（ＩＬ−１２Ｒ）が骨髄細胞上に存在することを示唆している。ＩＬ−１２受容体は、ＩＬ−２３受容体複合体［１１］およびＩＬ−１２受容体特異的ベータ２サブユニット（ＩＬ−１２Ｒベータ２）［２］と同じく、β１サブユニット（ＩＬ−１２Ｒβ１）から構成されるヘテロダイマー型の膜貫通タンパク質である。免疫組織化学分析を使用して、本発明者らは、ＩＬ−１２Ｒベータ２がマウスの骨髄細胞上で発現されていることを、以前に報告した［１］。マウスの骨髄免疫組織化学データは、ＩＬ−１２治療が造血骨髄細胞の増殖および分化を促進することを示したため、今回の論文では、本発明者らは正常なマウスにおけるｒＭｕＩＬ−１２治療が、造血幹／前駆細胞の集団を表す、Ｌｉｎ-集団におけるＩＬ−１２Ｒベータ２発現に影響するかどうかを調べた。結果は、対照のマウスと比較して、ｒＭｕＩＬ−１２で治療したものは、骨髄由来Ｌｉｎ-細胞上でのＩＬ−１２Ｒベータ２の発現は、３〜５倍の増加を示すことを、示している。
【０２３３】
本発明者らは、さらに、ＩＬ−１２Ｒベータ２がヒト骨髄で発現されているか、否かを決定しようと考えた。免疫細胞化学は、ヒト骨髄由来ＣＤ３４+細胞においてＩＬ−１２Ｒベータ２の存在を示し、フローサイトメトリー分析は、ＣＤ３４+細胞が１２Ｒベータ２を発現していることを解明した。今回の試験は、初めて、骨髄中における、造血幹および前駆細胞の混合集団を代表している、ヒトＣＤ３４+細胞上に、ＩＬ−１２Ｒベータ２が発現していることを示した。本発明者らは、長期間の再構築の可能性を保有する細胞の集団を代表し、そして、臨床現場において、骨髄移植のために使用される［１２、１３、１４］、正常なヒト骨髄由来ＣＤ３４+細胞の８７〜９０％でＩＬ−１２Ｒβ２の発現を同定した。さらに、マーカーＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）、およびＣＤ３１８（ＣＤＣＰ１）を発現している、ＣＤ３４細胞の亜集団の全てを、ＨＳＣ集団、共発現したＩＬ−１２Ｒ  ２を同定するために、使用された。ＣＤ１１７は、ＨＳＣの増殖に関与する、造血増殖因子として機能し［１５］、ＨＳＣの動員に関係することが示されたＳＣＦの受容体である［５、１５］。興味深いことに、ＩＬ−１２およびＳＣＦは、リンパ球造血系の増殖を相乗的に支援することが示されている［５］。ＣＤ１３３は、神経および造血幹／前駆細胞に発現することが報告されており［１６］、ＣＤ３４+／ＣＤ１３３+細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに生着することができる［１７］。受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーであるＣＤ１３５は、造血恒常性の維持に重要な役割を果たし、造血前駆細胞の拡大に関与する［１８］。Ｆｌｔ３−リガンドは、骨髄ＨＳＣの増殖において、ＩＬ−１２および他のサイトカインおよび増殖因子と協力することが示されている［１９］。ＣＤ３１８+細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに生着した場合、多系統分化能を保有することが示されている［２０］。総合すると、マウスおよびヒト骨髄からのＩＬ−１２Ｒβ２発現データは、ＩＬ−１２Ｒβ２発現ＨＳＣがＩＬ−１２の造血活性の潜在的な標的である可能性があることを示す。
【０２３４】
致死的な損傷骨髄を有する動物の造血を刺激し、生存を促進するＩＬ−１２の明らかな能力は、移植前レジメンの一部として、臨床的に誘導された、または、放射線事故もしくは災害の結果による、損傷した骨髄の状況において、ＩＬ−１２が有用な治療でありえることを示唆している。ＨｅｍａＭａｘ（商標）（Ｎｅｕｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ｉｎｃ．；Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）、組換えヒトインターロイキン−１２調製（ｒＨｕＩＬ−１２）は、ＦＤＡのアニマル・ルールに基づいて、急性放射線症候群の造血症候群（ＨＳＡＲＳ）の治療のために開発されている。本発明者らは、近年、致死的な照射への曝露の２４時間後に投与された、単回、低用量（１００ｎｇ／ｋｇまたは２５０ｎｇ／ｋｇ）のＨｅｍａＭａｘ（商標）が、骨髄を再構築し、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の生存を増加することを報告した［１］。さらに、本発明者らのデータは、ｒＨｕＩＬ−１２が致死的な照射ＮＨＰにおける白血球および血小板の最下点を減弱させることを示した。
【０２３５】
がん治療の現場における、ＢＭＴに関して、ＩＬ−１２の造血特性は、アジュバント治療として、応用可能である可能性がある。骨髄幹細胞動員における技術の改善、それらの回収のためのアフェレーシス手法の開発、ならびに、毒性を減少するための新しい方策の利用は、ＨＳＣ移植の治療効果を改善し、がん患者の幅広い集団へのその治療価値を拡大した［２１、２２、２３］。にもかかわらず、ＨＳＣ移植の成功は、造血系の長期の再構築に必要な細胞の数によって大きく制限される。従来の移植は、Ｇ−ＣＳＦなどの増殖因子を用いた動員によって単離される、ＣＤ３４+細胞の使用を採用しているが、十分な量のＣＤ３４+細胞を単離するための、Ｇ−ＣＳＦ治療の複数回の繰り返しの必要性は、免疫抑制性である可能性がある［２４、２５］。ミエロイドおよびエリスロイド増殖因子は、移植後の好中球減少症および貧血症の治療に使用されるが［２６］、血小板再生には影響を及ぼさない。したがって、がんを有する患者の１７％もの多くで生じ、そして、死亡のリスクを著しく増加しする可能性がある［２７］、移植後の血小板減少症を克服するため、患者は、移植後早期の血小板輸血に頼らなければならない［２８］。今回の試験、ならびに本発明者らの以前の研究において観察されたように［１、１０］、致死的な照射に曝露したマウスにおける、ＩＬ−１２治療後に観察された血小板のレベルの増加は、ＩＬ−１２が、ヒトにおいて、移植後の血小板回復を促進するのに有効である可能性があることを示唆している。
【０２３６】
多くの臨床試験が、がん患者における抗腫瘍剤としてＩＬ−１２を評価してきたが、該薬剤は、その中程度の臨床活性、ならびに、反復高用量（３００ｎｇ／ｋｇ〜６００ｎｇ／ｋｇ）レジメン（週当たり５回投与）で投与した際の著しい毒性のため、治療薬として前進していない［２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７］。対照的に、末梢血幹細胞移植のおよそ２カ月後、次いで２週間後の５連続日に単回投与として与えた３０〜２５０ｎｇ／ｋｇのＩＬ−１２用量は、ハイリスクな血液系悪性腫瘍を有する患者において許容可能な耐容性を示した［３７］。先に述べたように、ｒＨｕＩＬ−１２は、そのマウスの対応物と同様に、致死的なＴＢＩに曝露されたアカゲザルに１回だけまたは２回投与した場合、１００〜２５０ｎｇ／ｋｇの用量でその造血促進活性を発揮した［１］。これらの用量は、１００ｎｇ／ｋｇより少ないヒト用量と等価である。本発明者らの今回のフェーズ１ヒト安全性試験において、ｒＨｕＩＬ−１２は良好な耐容性であり、安全性の問題は同定されていない（Ｎｅｕｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，Ｉｎｃ．、未発表データ）。これらの知見は、造血再生に必要なｒＨｕＩＬ−１２の用量が、がん患者において先に使用したＩＬ−１２の用量よりも実質的に少ないことを示し、がんのためのＡＲＳおよびＨＳＣ移植両方の治療現場において、ｒＨｕＩＬ−１２のより好ましい安全性プロファイルをもたらすであろう。
【０２３７】
結論
本発明者らは、ｒＭｕＩＬ−１２が、致死的な放射線に曝露されたマウスにおいて造血回復および生存の促進に対して、ＢＭＴと等価であること、ならびに、ｒＭｕＩＬ−１２治療が、正常マウスから単離したＬｉｎ-細胞におけるＩＬ−１２Ｒβ２発現レベルを増加したことを実証した。さらに、正常ヒト骨髄由来のＣＤ３４+細胞は、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現することが見出された。ＩＬ−１２Ｒβ２は、他の公知のＨＳＣマーカーと共発現することも観察された。これらの知見は、幹細胞生物学および再生医療へのＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ系の重要性に光をあて始め、そして、この経路が、ＨＳＣ移植を受けた、または、原子力災害において、致死的な放射線曝露の効果を被った、患者の緩解および生存の増加のための治療標的を表すことを示唆している。したがって、臨床試験は、これらの状況における、アジュバントｒＨｕＩＬ−１２療法の安全性および有効性の評価を保証する。
【０２３８】
【表３】
2017533278.tif 000005
【０２３９】
【表４】
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【０２４０】
本発明は、特定の実施態様を参照して開示してきたが、他の実施態様および本発明のバリエーションは、本発明の目的および範囲を逸脱することなく当業者によって変更されうることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような実施態様および等価なバリエーションを含む。
本明細書において、参照および述べた、すべての特許、論文、科学記事、ウェブサイト、ならびに他の文献および資料は、本発明が属する技術分野の当業者の技術レベルを示しており、そして、そのような参照した文献および資料の夫々は、参照によりその全体を個別に組み込む、または、その全体を本明細書において明らかにするように同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。出願者は、任意のそのような特許、論文、科学記事、ウェブサイト、電子的に入手可能な情報、および他の参照した資料または文献からの任意のおよびすべての資料および情報を、本明細書に物理的に組み込む権利を保持している。
本明細書に記載の特定の方法および組成物は、好ましい実施態様の代表例であり、例示的であり、本発明の技術的範囲を制限することを意図していない。他の対象、形態、および実施態様は、本明細書を考慮する際、当業者には思い浮かべることができ、そして、請求の範囲によって規定される、本発明の技術思想内に包含される。本発明の技術的範囲および技術思想を逸脱することなく、本明細書に開示されている本発明に対して、様々な置換および変更を施すことができることは、当業者には容易に判るであろう。本明細書に例示的に記載されている発明は、必須であるとして本明細書中において具体的に開示されていない、任意の要素または要素群、または制限または制限群の不在下において、適宜、実施することもできる。したがって、例えば、本明細書内の事例中、本発明の実施態様または例示において、用語：「含む（comprising）」、「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」、および「〜からなる（consisting of）」は、本明細書における他の２つの用語のいずれかと置き換えることもできる。また、用語：「含む（comprising）」、「包含する（including）」、「含有する（containing）」等は、限定がなされてなく、開放的に読まれる。本明細書に例示的に記載されている方法およびプロセスは、異なるステップの順番において、適宜、実施することもでき、従って、それらは、本明細書または特許請求の範囲に記載されている、ステップの順番に、必ずしも限定されてはいない。本明細書において、および添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形「１つの（a）」「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が、明確に特段の規定をおこなっていない限り、複数の参照も含む。いかなる状況下でも、該特許は、本明細書中に具体的に開示されている、具体的な例または実施態様または方法に限定されていると解釈されることはない。いかなる状況下でも、該特許は、出願者による返答文書中において、具体的に、かつ、なんらの条件あるいは制限を付すことなく、明示的に、該記述を承認されていない限り、特許商標局の任意の審査官または任意の他の係官もしくは職員によってなされる任意の記述によって、限定がなされていると解釈されることはない。  採用されている用語および表現は、限定ではなく、記述の表現法として使用され、そして、そのような用語および表現の使用において、示されたおよび記載された特徴またはその一部の任意の等価物を除外する意図はなく、また、特許請求されている、本発明の技術的範囲内における、様々な改変が可能であると認識される。したがって、本発明は、好ましい実施態様および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている、概念の改変およびバリエーションは、当業者により講じられることができ、そして、そのような改変およびバリエーションは、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の技術的範囲内であると理解される。
【０２４１】
本発明は、本明細書において、概括的に、かつ属として、記載される。属の開示内に入る、各より狭い種ならびに下位概念の群類も、また、本発明の一部を形成している。これには、排除された事項が本明細書において具体的に記載されるか否かにかかわらず、条件付きで、または属の任意の対象事項を除く否定的な限定付きの、発明の属の記載も含まれる。
【０２４２】
他の実施態様は以下の特許請求の範囲内である。さらに、本発明の特徴または形態が、マーカッシュ・グループの表記法で記載されている場合、当業者は、本発明がそれによりマーカッシュ・グループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの表記法でも記載されることを認識するであろう。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【国際調査報告】
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