(57)【要約】  リポソーム脂質二重層内に組み込まれたリン脂質-PEG複合体、及びキトサン若しくはキトサン誘導体と共にリポソーム脂質二重層を形成する脂質を含むリポソーム組成物が記載され、特許請求される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム脂質二重層を形成する脂質、リポソーム脂質二重層内に組み込まれたリン脂質-PEG複合体又はポロキサマー、及びキトサン又はキトサン誘導体を含むリポソーム組成物。
【請求項２】
アミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)及びアミノアルカンスルホン酸緩衝剤をさらに含む請求項1に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
リポソームの脂質がDOPCである、請求項1又は2に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
リポソーム組成物がコレステロールをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
リポソーム脂質二重層を形成する脂質、リポソーム脂質二重層内に組み込まれたポロキサマーなどのPEGコポリマー/界面活性剤、AGP及びアミノアルカンスルホン酸緩衝剤を含むリポソーム組成物。
【請求項６】
リポソームの脂質がコレステロールの非存在下でのDOPCである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項７】
リン脂質-PEG複合体がポロキサマー407(Pluronic(登録商標)F127)、ポロキサマー184(Pluronic(登録商標)L64)、ポロキサマー188(Pluronic(登録商標)L68)からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項８】
リン脂質-PEG複合体がMPEG-2000-DSPE N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はMPEG-5000-DPPE N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000)-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項９】
リポソーム組成物がキトサンをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１０】
アミノアルカンスルホン酸緩衝剤が、HEPES、HEPPS/EPPS、MOPS、MOBS及びPIPESからなる群から選択される、請求項2〜9のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１１】
AGPがCRX-601、CRX602、CRX527、CRX547、CRX526、CRX529又はCRX524からなる群から選択される、請求項2〜10のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１２】
キトサンオリゴサッカリドラクテート、トリメチルキトサングリコールキトサン、及びメチルグリコールキトサンからなる群から選択されるキトサンを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１３】
粘膜送達用のリポソーム組成物の改善された製造方法であって、
a.ジオレオイルホスファチジルコリン、リン脂質-PEGb.複合体及びAGPなどの脂質を有機溶媒に溶解するステップ、
c.溶媒を除去してリン脂質膜を得るステップ、
d.膜をHEPES緩衝液又は生理食塩水中のHEPES緩衝液に添加するステップ、
e.膜を溶液内に分散させるステップ、及び
f.ポリカーボネートフィルターから連続的に溶液を押し出して単層リポソームを形成するステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
AGPがCRX-601である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
AGPがCRX-601であり、10mg未満、9mg未満、8mg未満、7mg未満、6mg未満、5mg未満、4mg未満、3mg未満、2mg未満又は1mg未満の量で存在する、請求項2〜15のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１６】
AGPがCRX-601であり、30μg/mL〜6mg/mLの量で存在する、請求項15に記載のリポソーム組成物。
【請求項１７】
リポソームが多重膜である、請求項1〜16のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１８】
リポソームが2、3、4、5、6、7、8、9、又は10層である、請求項1〜17のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１９】
リポソームが単層である、請求項1〜18のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項２０】
リポソーム径が50nm〜500nm、さらなる実施形態で50nm〜200nmの範囲である、請求項1〜19のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項２１】
リポソーム径が約80nm〜120nmの範囲である、請求項1〜20のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項２２】
リポソーム構造が水性内容物を封入する、請求項1〜21のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項２３】
リピドAのミメティック、TLR4リガンド又はAGPをさらに含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項２４】
AGP 約30モル%以下のMPEG2000又はMPEG5000リポソームを含み、約20mg/mL以下のキトサン又はキトサン誘導体をさらに含む、リポソーム組成物。
【請求項２５】
キトサン又はキトサン誘導体が20mg/mL未満、19mg/mL未満、18mg/mL未満、17mg/mL未満、16mg/mL未満、15mg/mL未満、14mg/mL未満、13mg/mL未満、12mg/mL未満、11mg/mL未満、10mg/mL未満、9mg/mL未満、8mg/mL未満、7mg/mL未満、6mg/mL未満、5mg/mL未満、4mg/mL未満、3mg/mL未満、2mg/mL未満又は1mg/mL未満の量で存在する、請求項1〜24のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項２６】
MPEGがMPEG250〜MPEG10000である、請求項1〜25のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項２７】
リン脂質PEGがMPEG約30モル%未満、約25モル%未満、約20モル%未満、約15モル%未満、約10モル%未満、約5モル%未満、約1モル%未満で存在する、請求項1〜26のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項２８】
脂質がDPPE、DSCPE及びDOPCからなる群から選択される、請求項1〜27のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項２９】
AGPが式I:
【化１】
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[b.式中、
c.mは0〜6であり、
d.nは0〜4であり、
e.XはO又はS、好ましくは、Oであり、
f.YはO又はNHであり、
g.ZはO又はHであり、
h.R1、R2、R3はそれぞれ独立にC1〜20アシル及びC1〜20アルキルからなる群から選択され、
i.R4はH又はMeであり、
j.R5は独立に-H、-OH、-(C1〜C4)アルコキシ、-P03R8R9、-OP03R8R9、-S03R8、-OS03R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-N02、-CHO、-C02R8、及びCONR8R9からなる群から選択され、ここで、R8及びR9はそれぞれ独立にH及び(C1〜C4)アルキルから選択され、
k.R6及びR7はそれぞれ独立にH又はPO3H2である]
に示された構造を有する化合物である、請求項1〜28のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明の態様は、NIH契約番号HHSN272200900008Cに基づく合衆国政府の援助によって実施されたものであり、合衆国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
ヒト粘膜からのナノ粒子の迅速輸送が、最近、短鎖ポリエチレングリコール(PEG、通常5000単位未満)又はある種のPluronicポリマーで十分にコーティングされたナノ粒子について報告されている(Cu Y,SaLtzman WM.MoL PHarm.2009;6(1):173〜181;Hanes Jら.Nanomedicine.2011;6(2):365〜375)。著者らによって粘膜浸透と命名されたこの手法は、粘膜接着の低減(粘膜接着の増進ではなくて)に基づき、粘膜からのナノ粒子の迅速浸透を可能にすると考えられている。
【０００３】
Toll様受容体4(TLR4)調節剤は、医薬組成物で、詳細にはヒトワクチンでのアジュバントとして使用される免疫原性化合物である。TLR-4アゴニストは、ワクチン注射を介する送達のためにリポソーム中で配合される。アミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)は、TLR4調節剤であり、その一部は、特に強力であり、潜在的に反応原性である。一般には改良されたリポソーム組成物、詳細には、医薬組成物を投与するためのTLR4調節剤の改良されたリポソーム組成物が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Cu Y,SaLtzman WM.MoL PHarm.2009;6(1):173〜181
【非特許文献２】Hanes Jら.Nanomedicine.2011;6(2):365〜375
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
粘膜送達のためのリポソーム製剤のための方法及び組成物が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、本発明は、リポソーム脂質二重層を形成する脂質を含み、リポソーム脂質二重層内に組み込まれるリン脂質-PEG複合体をさらに含むリポソーム組成物を提供する。加えて、リポソーム組成物は、TLR4アゴニスト(例えば、AGP)を含み、適切には、HEPES緩衝剤を含む。
【０００７】
一実施形態では、リポソームの脂質は、コレステロール存在下のDOPCである。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、リポソーム脂質二重層を形成する脂質を含み、リポソーム脂質二重層内に組み込まれるポロキサマーなどのPEGコポリマー/界面活性剤をさらに含むリポソーム組成物を提供する。加えて、リポソーム組成物は、TLR4アゴニスト(例えば、AGP)を含み、適切には、HEPES緩衝剤を含む。一実施形態では、リポソームの脂質は、コレステロール非存在下のDOPCである。
【０００９】
一つの適切な実施形態では、リポソーム組成物は、キトサン又はキトサン誘導体を含む。
【００１０】
一つの適切な実施形態では、本発明は、ステロール非存在下のDOPCリポソーム、DOPCリポソーム二重層内に組み込まれたポロキサマー、HEPES緩衝液中のAGP,及び任意選択でキトサン又はキトサン誘導体を含むリポソーム製剤を提供する。
【００１１】
一つの適切な実施形態では、本発明は、ステロール、適切には、コレステロール存在下のDOPCリポソーム、DOPC-ステロールリポソーム二重層内に組み込まれるリン脂質-PEG複合体、HEPES緩衝液中のTLR4アゴニスト(例えば、AGP)、及び任意選択でキトサン又はキトサン誘導体を含むリポソーム製剤を提供する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、リン脂質、リン脂質-PEG複合体又はポロキサマー、及びHEPES、HEPPS/EPPS、MOPS、MOBS及びPIPESなどのアミノアルカンスルホン酸緩衝剤を含むリポソーム組成物を提供する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、リン脂質、リン脂質-PEG複合体又はポロキサマー、及びアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、適切には、CRX-601、CRX602、CRX527、CRX547、CRX526、CRX529又はCRX524を含むリポソーム組成物を提供する。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、リン脂質、リン脂質-PEG複合体又はポロキサマー、AGP、アミノアルカンスルホン酸緩衝剤及びキトサン又はキトサン誘導体、適切には、キトサンオリゴサッカリドラクテート、グリコールキトサン、トリメチルキトサン又はメチルグリコールキトサン含むリポソーム組成物を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、舌下送達用のリポソーム組成物の改善された製造方法であって、ジオレオイルホスファチジルコリン(「DOPC」)などの脂質、リン脂質-PEG複合体(又はコレステロール非存在下のポロキサマー)及びAGPを有機溶媒に溶解するステップ、溶媒を除去してリン脂質膜を得るステップ、膜をHEPES緩衝液又は生理食塩水中のHEPES緩衝液に添加するステップ、膜を溶液内に分散させるステップ、及びポリカーボナートフィルターから連続的に溶液を押し出して単層リポソームを形成するステップを含む、方法を提供する。リポソーム組成物は、無菌でさらにろ過することもできる。
【００１６】
一つの適切な実施形態では、リポソームがコレステロールを用いて形成される場合、リポソーム組成物は、TLR4アゴニスト(例えば、AGP)の高組み込みを示す。
【００１７】
別の実施形態では、リポソームがコレステロールなどのステロールなしで形成される場合、リポソーム組成物は、特定のAGP、CRX601の高組み込みを示し、ポロキサマーを含むリポソーム組成物を含めたそのようなリポソーム組成物の製造及び製剤に対して利点を提供する。
【００１８】
本発明のリポソームは、医薬組成物の製造と使用の両方で有利である。
【００１９】
さらなる実施形態は、本明細書で提供される説明、図及び特許請求の範囲で開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】メチルグリコールキトサン(MGC)存在下のアジュバント-リポソームの安定性を示す。(A)及び(C)では、アジュバント充填非改変、PE-PEG2K改変及びPE-PEG5K改変リポソーム、並びに(B)及び(D)では、Pluronic L64、F68及びF127改変リポソームに対するMGCの濃度増加に伴う径/PDI及びζ-電位値。(A)及び(B)で、径は、棒として、PDI値は、点プロットとしてプロットされる。データは、平均±SD(n=3)として表される。径がμmの範囲の粒子は、経時的に沈殿する傾向があった。
【図２】メチルグリコールキトサン(MGC)存在下アジュバント充填リン脂質-PEGリポソームのキャラクタリゼーションを示す。アジュバント充填1%(上行)及び25%(下行)のPE-PEG2K改変及びPE-PEG5K改変リポソームに対するMGCの濃度増加に伴う径/PDI及びζ-電位値。径は、棒として、PDI値は、点プロットとしてプロットされる。データは、平均±SDとして表され、1モル%改変(上行)に対して(n=2)、25モル%改変(下行)に対してn=1である。径がμmの範囲の粒子は、経時的に沈殿する傾向があった。
【図３】メチルグリコールキトサン(MGC)存在下アジュバント充填Pluronicリポソームのキャラクタリゼーションを示す。アジュバント充填15%(上行)及び25%(下行)のPluronic L64、F68及びF127改変リポソームに対するMGCの濃度増加に伴う径/PDI及びζ-電位値。径は、棒として、PDI値は、点プロットとしてプロットされる。データは、平均±SDとして表され、1モル%改変(上行)に対して(n=2)、25モル%改変(下行)に対してn=1である。径がμmの範囲の粒子は、時間の経過で沈殿する傾向があった。
【図４】リン脂質-PEG改変リポソーム調査によるポスト二次血清IgG滴定濃度(上)、ポスト三次血清IgG滴定濃度(中)及びポスト三次HI滴定濃度並びに気管/膣洗浄液IgA滴定濃度(下)を示す。1、5、及び25モル%MPEG-2000-DSPE又はMPEG-5000-DPPE置換されたリポソームを5μgCRX-601/動物/ワクチン接種の投与量で評価した。IM対照におけるCRX-601投与量は、1μg/動物/ワクチン接種である。
【図５】リン脂質-PEG改変リポソーム調査によるポスト三次HI滴定濃度(A)及び気管/膣洗浄液IgA滴定濃度(B)を示す。
【図６】ポロキサマー407改変リポソーム調査によるポスト二次血清IgG滴定濃度(上)、ポスト三次血清IgG滴定濃度(中)及びポスト三次気管/膣洗浄液IgA滴定濃度(下)を示すグラフである。5、10及び15モル%ポロキサマー407で置換されたリポソームを1又は5μgCRX-601/動物/ワクチン接種投与の投与量で評価した。
【図７】ポロキサマー407、188、及び184改変リポソーム調査によるポスト二次血清IgG滴定濃度(上)、ポスト三次血清IgG滴定濃度(中)及びポスト三次気管/膣洗浄液IgA滴定濃度(下)。15及び25モル%ポロキサマー407、188、又は184で置換されたリポソームを5μgCRX-601/動物/ワクチン接種投与の投与量で評価した。
【図８】ポロキサマー407、188、及び184改変リポソーム調査によるポスト三次HI滴定濃度(A)及び気管/膣洗浄液IgA滴定濃度(B)を示す。パネル中で図の標識は、ポロキサマー407(F127)、ポロキサマー188(F68)及びポロキサマー184(F64)を表す。
【図９】ポロキサマー407(図の凡例でF127として示される)改変リポソーム+メチルグリコールキトサン調査によるポスト二次血清IgG滴定濃度(上)、ポスト三次血清IgG滴定濃度(中)及びポスト三次気管/膣洗浄液IgA滴定濃度(下)を示す。メチルグリコールキトサンと組み合わせて5、15又は15モル%ポロキサマー407を添加したリポソームを5μgCRX-601/動物/ワクチン接種の投与量で評価した。IM対照におけるCRX-601投与量は、1.5μg/動物/ワクチン接種である。
【図１０−１】リン脂質-PEG改変リポソーム+メチルグリコールキトサン又はキトサンオリゴサッカリドラクテート調査によるポスト二次血清IgG滴定濃度(A)、ポスト三次血清IgG滴定濃度(B)及びポスト三次HI滴定濃度(C)及び気管/膣洗浄液IgA滴定濃度(D)。メチルグリコールキトサン又はキトサンオリゴサッカリドラクテートと組み合わせて5モル%MPEG-2000-DSPE又はMPEG-5000-DPPEで置換されたリポソームを5μgCRX-601/動物/ワクチン接種の投与量で評価した。IM対照におけるCRX-601投与量は、1.5μg/動物/ワクチン接種である。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１１】ポロキサマー407(図の凡例でF127として示される)改変リポソーム+メチルグリコールキトサン調査によるポスト二次血清IgG滴定濃度(上)、ポスト三次血清IgG滴定濃度(中)及びポスト三次気管/膣洗浄液IgA滴定濃度(下)。メチルグリコールキトサンと組み合わせて5、15又は15モル%ポロキサマー407を添加したリポソームを5μgCRX-601/動物/ワクチン接種の投与量で評価した。IM対照におけるCRX-601投与量は、1.5μg/動物/ワクチン接種である。
【図１２−１】ポロキサマー407(図の凡例でF127として示される)改変リポソーム+メチルグリコールキトサン調査によるポスト二次血清IgG滴定濃度(A)、ポスト三次血清IgG滴定濃度(B)及びポスト三次HI滴定濃度(C)ポスト三次気管/膣洗浄液IgA滴定濃度(D)。メチルグリコールキトサンと組み合わせて5、15又は15モル%ポロキサマー407を添加したリポソームを5μgCRX-601/動物/ワクチン接種の投与量で評価した。IM対照におけるCRX-601投与量は、1.5μg/動物/ワクチン接種である。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
リポソーム
「リポソーム」という用語は、一般に、水性内容物を封入する単層膜又は多重膜の(詳細には、形成される脂質膜の数に応じて2、3、4、5、6、7、8、9、又は10層)脂質構造体である。リポソーム及びリポソーム製剤は、当技術分野で周知である。リポソームを形成できる脂質として、脂肪又は脂肪様特性を有する物質すべてが挙げられる。リポソーム中の脂質を構成し得る脂質は、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノリピド、グリセロホスホノリピド、スルホリピド、スフィンゴリピド、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、アルケオリピド、合成カチオン性脂質及び炭水化物含有脂質（carbohydrate containing lipid）を含む群から選択することができる。
【００２２】
本発明の特定の実施形態では、リポソームは、リン脂質を含む。適切なリン脂質として(限定されないが)ホスファチジルコリンの合成における中間体であるホスホコリン(PC);天然リン脂質誘導体:卵ホスホコリン、卵ホスホコリン、大豆ホスホコリン、水素化大豆ホスホコリン、天然リン脂質としてのスフィンゴミエリン;及び合成リン脂質誘導体:ホスホコリン(ジデカノイル-L-α-ホスファチジルコリン[DDPC]、ジラウロイルホスファチジルコリン[DLPC]、ジミリストイルホスファチジルコリン[DMPC]、ジパルミトイルホスファチジルコリン[DPPC]、ジステアロイルホスファチジルコリン[DSPC]、ジオレオイルホスファチジルコリン[DOPC]、1-パルミトイル、2-オレオイルホスファチジルコリン[POPC]、ジエライドイルホスファチジルコリン[DEPC])、ホスホグリセロール(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセリン[DMPG]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセリン[DPPG]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセリン[DSPG]、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセリン[POPG])、ホスファチジン酸(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸[DMPA]、ジパルミトイルホスファチジン酸[DPPA]、ジステアロイル-ホスファチジン酸[DSPA])、ホスホエタノールアミン(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DMPE]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DPPE]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDSPE、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DOPE])、ホスホセリン、ポリエチレングリコール[PEG]リン脂質(mPEG-リン脂質、ポリグリセリン−リン脂質、官能化リン脂質、末端活性化リン脂質)、1,2-ジオレオイル-3-(トリメチルアンモニウム)プロパン(DOTAP)及びスフィンゴミエリン(SPNG)が挙げられる。一実施形態では、リポソームは、1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンを含む。一実施形態では、高度に精製されたホスファチジルコリンが使用され、それは、ホスファチジルコリン(卵由来)、水素化ホスファチジルコリン(卵由来)、ホスファチジルコリン(大豆由来)及び水素化ホスファチジルコリン(大豆由来)を含む群から選択することができる。さらなる実施形態では、リポソームは、ホスファチジルエタノールアミン[POPE]又はその誘導体を含む。
【００２３】
リポソーム径は、リン脂質組成及びそれを調製するために使用される方法に応じて30nm〜約5μmで変動することができる。本発明の特定の実施形態では、リポソーム径は、30nm〜500nmの範囲であり、さらなる実施形態では、50nm〜200nm、適切には、200nm未満である。動的レーザー光散乱法は、当業者に周知のリポソーム径を測定するのに使用される方法である。
【００２４】
適切なリポソーム製剤では、脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン[DOPC](2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)及びステロール、詳細には、任意選択でステロール非存在下で、コレステロールを含む。
【００２５】
リポソーム組成物
「リポソーム組成物」は、リポソーム及びリポソーム内の含有物を含む調製された組成物であり、限定されないが、特に、
a)リポソーム二重層を形成する脂質、
b)リポソーム二重層内の脂質以外の化合物、
c)リポソームの水性内容物内の及びそれに付随する化合物、及び
d)リポソームの外層に結合した又は付随する化合物が挙げられる。
【００２６】
したがって、本発明のリポソーム組成物は、適切には、限定されないが、リポソームの脂質に加えて、薬学的な活性成分、ワクチン抗原及びアジュバント、賦形剤、粘膜接着剤用担体、粘膜浸透剤並びに緩衝剤を含むことができる。好ましい実施形態では、そのような化合物は、リポソーム組成物の安定性又はAGP組込み効率に相補的であり及び/又は顕著に有害ではない。
【００２７】
「リポソーム製剤」とは、本明細書に記載されたように、貯蔵用及び/又は被験体への投与用の他の化合物と共に適切に製剤化されたリポソーム組成物を意味する。
【００２８】
したがって、本発明の「リポソーム製剤」は、本明細書に規定されたリポソーム組成物を含み、さらに、限定されないが、本発明の範囲外のリポソーム組成物、並びに薬学的な活性成分、ワクチン抗原及びアジュバント、賦形剤、担体及び緩衝剤を含むことができる。好ましい実施形態では、そのような化合物は、本発明のリポソーム組成物の安定性又はAGP組込み効率に相補的であり及び/又は顕著に有害ではない。
【００２９】
アミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物
AGPは、Toll様受容体4(TLR4)調節剤である。Toll様受容体4は、バクテリアLPS(リポポリサッカリド)を認識し、活性化された場合自然免疫応答を開始する。AGPは、バクテリアLPSのリピドAタンパクのモノサッカリドミメティックであり、化合物の「アシル鎖」上のエーテル及びエステル結合によって開発された。こうした化合物を作製するための方法は、公知であり、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開第2006/016997号、米国特許第7,288,640号及び第6,113,918号、及び国際公開第01/90129号で開示されている。他のAGP及び関連の方法は、米国特許第7,129,219号、米国特許第6,525,028号及び米国特許第6,911,434号に開示されている。本発明の組成物中で用いられたアシル鎖上のエーテル結合を有するAGPは公知であり、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる国際公開第2006/016997号に開示されている。特に重要であるのは、国際公開第2006/016997号中のパラグラフ[0019]〜[0021]の式(III)に記載され、説明されたアミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物である。
【００３０】
本発明で用いられたアミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物は、下記式1
【００３１】
【化１】
2017507968.tif 000003
[式中、
mは0〜6であり、
nは0〜4であり、
XはO又はS、好ましくは、Oであり、
YはO又はNHであり、
ZはO又はHであり、
R1、R2、R3はそれぞれ独立にC1〜20アシル及びC1〜20アルキルからなる群から選択され、
R4はH又はMeであり、
R5は独立に-H、-OH、-(C1〜C4)アルコキシ、-P03R8R9、-OPO3R8R9、-SO3R8、-OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8、及びCONR8R9からなる群から選択され、ここでR8及びR9はそれぞれ独立にH及び(C1〜C4)アルキルから選択され、
R6及びR7がそれぞれ独立にH又はPO3H2である]
に記載された構造を有する。
【００３２】
式1では、ノルマル脂肪族アシル残基(即ち、第2級アシルオキシ又はアルコキシ残基、例えば、R1O、R2O、及びR3O)が結合している3'立体中心の配置は、R又はS,好ましくは、R(Cahn-IngoLd-PreLog優先則による命名)である。R4及びR5が結合しているアグリコン立体中心の配置は、R又はSであってよい。すべての立体異性体、即ちエナンチオマーとジアステレオマーの両方及びその混合物は、本発明の範囲内に入ると考えられる。
【００３３】
ヘテロ原子Xとアグリコン窒素原子の間の炭素原子数は、変数「n」によって決定され、これは0〜4の整数、好ましくは、0〜2の整数であってよい。
【００３４】
ノルマル脂肪酸R1、R2及びR3の鎖長は、約6〜約16の炭素、好ましくは、約9〜約14の炭素であってよい。鎖長は、同じであっても異なっていてもよい。一部の好ましい実施形態には、R1、R2及びR3が6又は10又は12又は14である鎖長が含まれる。
【００３５】
式1は、L/D-セリル、-トレオニル、-システイニルエーテル及びエステル脂質AGP、即ちアゴニストとアンタゴニストの両方及びその同族体(n=1〜4)並びに多様なカルボン酸生物学的等価体(即ち、R5は塩形成可能な酸性基であり、ホスフェートは、グルコサミン単位の4-位上であっても6-位上であってもよく、好ましくは、4位である)を包含する。
【００３６】
式1のAGP化合物を用いる本発明の好ましい実施形態では、nは0であり、R5はCO2Hであり、R6はPO3H2であり、R7はHである。この好ましいAGP化合物は、下記式1a
【００３７】
【化２】
2017507968.tif 000004
[式中、XはO又はSであり、YはO又はNHであり、ZはO又はHであり、R1、R2、R3はそれぞれ独立にC1〜20アシル及びC1〜20アルキルからなる群から選択され、R4はH又はメチルである]
の構造として記載される。
【００３８】
式1aでは、ノルマル脂肪族アシル残基(即ち、第2級アシルオキシ又はアルコキシ残基、例えば、R1O、R2O、及びR3O)が結合している3'立体中心の配置は、R又はS,好ましくは、R(Cahn-IngoLd-PreLog優先則による命名)である。R4及びCO2Hが結合しているアグリコン立体中心の配置は、R又はSであってよい。すべての立体異性体、即ちエナンチオマーとジアステレオマーの両方及びその混合物は、本発明の範囲内に入ると考えられる。
【００３９】
式1aは、L/D-セリル、-トレオニル、-システイニルエーテル又はエステル脂質AGP、即ちアゴニストとアンタゴニストの両方を包含する。
【００４０】
式1と式1aの両方では、Zは、二重結合又はそれぞれ単結合によって結合している2つの水素原子によって結合されたOである。つまり、この化合物は、Z=Y=Oである場合エステル結合であり、Z=O及びY=NHである場合アミド結合であり、Z=H/H及びY=Oである場合エーテル結合である。
【００４１】
式1の特に好ましい化合物は、CRX-601及びCRX-527と呼ばれる。その構造は、以下のように記載される:
【００４２】
【化３】
2017507968.tif 000005
【化４】
2017507968.tif 000006
【００４３】
加えて、別の好ましい実施形態は、示される構造を有するCRX547を用いる。
【００４４】
【化５】
2017507968.tif 000007
【００４５】
さらに他の実施形態は、CRX602又はCRX526などのAGPを含み、これは、より短い第2級アシル又はアルキル鎖を有するAGPに対しての増加した安定性をもたらす。
【００４６】
【化６】
2017507968.tif 000008
【化７】
2017507968.tif 000009
【００４７】
本発明で使用するのに適した他のAGPには、CRX524及びCRX529が含まれる。
【００４８】
緩衝剤
本発明の一実施形態では、リポソーム組成物は、両性イオン緩衝剤を使用して緩衝される。適切には、両性イオン緩衝剤は、アミノアルカンスルホン酸又は適切な塩である。アミノアルカンスルホン酸緩衝剤の例として、限定されないが、HEPES、HEPPS/EPPS、MOPS、MOBS及びPIPESが挙げられる。好ましくは、緩衝剤は、市販の注射製品で使用するなど、ヒトでの使用に適切な薬学的に許容される緩衝剤である。最も好ましくは、緩衝剤はHEPESである。リポソーム組成物は、適切には、AGPを含むことができる。
【００４９】
本発明の適切な実施形態では、リポソームは、
i)約7のpHを有するHEPES、
ii)約5のpHを有するシトレート(例えば、クエン酸ナトリウム)及び
iii)約5のpHを有するアセテート(例えば、クエン酸アンモニウム)
からなる群から選択される緩衝剤を使用して緩衝される。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態では、AGP CRX-601、CRX-527及びCRX-547は、約7のpHを有するHEPESを使用して緩衝されたリポソーム組成物中に含まれる。緩衝剤は、適切な量の生理食塩水又は他の賦形剤と一緒に使用して所望の等張性を実現することができる。一つの好ましい実施形態では、0.9%生理食塩水が使用される。
【００５１】
HEPES:CAS登録番号:7365-45-9 C8H18N2O4S
1-ピペラジンエタンスルホン酸,4-(2-ヒドロキシエチル)-
HEPESは、約6〜約8(例えば、6.15〜8.35)の生理的pH範囲、より具体的には、約6.8〜約8.2のより有用な範囲、本発明の場合、約7〜約8、又は7〜8、好ましくは、約7から8未満で緩衝されるように設計された両性イオン緩衝剤である。HEPESは、通常、白色結晶性粉末であり、以下の構造の分子式C8H18N2O4Sを有する:
【００５２】
【化８】
2017507968.tif 000010
【００５３】
HEPESは、周知であり、市販されている(例えば、Goodら、Biochemistry1966を参照されたい)。
【００５４】
PEG
ポリエチレンオキシド(PEO)又はポリオキシエチレン(POE)としても知られるポリエチレングリコール(PEG)は、工業的な製造から医薬までの範囲の多数の用途を有する親水性ポリマー(ポリエーテル)である。このポリマーは、安価であり、生体適合性が良好であり、ヒトの内部への適用について規制当局から承認されている。1〜15kDaの範囲の分子量を有するPEG鎖は、多様なコロイド系で立体的保護剤として広く用いられている。水に対する溶解度が大きく、可動性が大きく、排除体積が大きいので、水和PEGは、外側に延伸し、粒子表面を覆うポリマー鎖の密なブラシを形成する。これによって粒子表面の界面自由エネルギーが最小化され、他の粒子との相互作用が妨害され、系に対してコロイド安定性が提供される。PEGコーティングが血液中のタンパク及び他の生体分子並びに細胞との相互作用を防止する能力を広く利用して血液中の薬物担体の循環時間が延長され、粒子のオプソニン化が低減され、肝臓及び脾臓中の細網内皮系(RES)による認識が低減されてきた。詳細には、粘膜経路を介する送達の場合に、PEGは、その鎖長に応じて、粘膜接着性(長鎖)と粘膜不活性(短鎖)両方の特性を有することが示されている。
【００５５】
PEGを用いたコロイド薬物担体、詳細には、リポソームの表面改変は、幾つかの方法によって:即ち1)両親媒性PEG-脂質複合体であるポロキサマーなどのPEGコポリマー、又は他のそのようなPEG-疎水性物質複合体を使用して、ベシクル表面上にそれを物理吸着させることによってか又はリポソーム調製中にそれを組み込むことによってのいずれかによって、2)事前に作製したリポソームの表面上で反応性基に末端官能基を有するPEG鎖を共有結合的にグラフトすることによって実施することができる。
【００５６】
リン脂質-PEG複合体
PEGとリン脂質の複合体は、PEGをリポソーム上に組み込むために広く用いられている。リン脂質部分は、二重層の疎水性内容物への包埋によってアンカーとして働き、PEG鎖をリポソーム水性表面にグラフトさせる。こうした複合体は、生体適合性が優れている。数種の異なる複合体が、PEG鎖長及び使用されたリン脂質の型に応じて利用可能である。Doxil、即ち、臨床的に承認されたリポソームドキソルビシン製剤及び後期臨床試験における多数の他のリポソーム製剤(LipopLatin、SPI-77、LipoxaLなどの)は、PEG-リン脂質を組み込むというこの概念に基づいている。
【００５７】
多数のリン脂質-PEG複合体が当技術分野で公知であり、多数のリン脂質-PEG複合体、例えば、
MPEG-2000-DSPE:N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩、
MPEG-5000-DPPE:N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000)-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩
が市販されている。
【００５８】
他の関連したリン脂質-PEG複合体として、限定されないが、
DPPE-mPEG(1000):1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-1000](アンモニウム塩)、
DSPE-mPEG(1000):1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-1000](アンモニウム塩)、
DOPE-mPEG(1000):1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-1000](アンモニウム塩)、
DPPE-mPEG(2000):1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)、
DOPE-mPEG(2000):1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩)、
DSPE-mPEG(5000):1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000](アンモニウム塩)、及び
DOPE-mPEG(5000):1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000](アンモニウム塩)
が挙げられる。
【００５９】
ポロキサマー
ポロキサマーは、2つの親水性PEG鎖が隣接するポリオキシプロピレン(ポリ(プロピレンオキシド))の中心疎水性鎖で構成される両親媒性の非イオン性3ブロックコポリマーである。ポロキサマーはまた、商標名Synperonic、Pluronics及びKolliphorsによって公知である。ポリマーブロックの長さは、カスタマイズすることができ、したがって、その特性が多様である多数の異なるポロキサマーが存在し、液体、ペースト又は固体として存在することができる。その両親媒性構造のために、こうしたポリマーは、界面活性特性を有し、それを使用して、水不溶性物質を乳化し、多様な化合物を捕捉できる又はリポソームなどの他のコロイド粒子内に組み込みできる超分子会合体(ミセル又はベシクル)を水溶液中に形成することができる。こうした合成ポリマーの特徴は、比較的低い毒性及び生体適合性である。この理由のために、こうしたポリマーは、工業用途、化粧品、及び医薬で普通に使用される。これらはまた、火傷及び傷の治療、凍結保護剤（cryoprotectant）、薬物乳化剤、ワクチンアジュバント、医用画像、血管疾患の管理で利用され、抗薬物性ガンを化学療法に感作させることが示されている。中心の疎水性ブロックは、ポロキサマーをリポソーム二重層内及び他のコロイド薬物送達粒子内に組み込むために必須である。
【００６０】
薬学的に許容されるポロキサマーとして、限定されないが、
ポロキサマー407(Pluronic(登録商標)F127)、
ポロキサマー184(Pluronic(登録商標)L64)及び
ポロキサマー188(Pluronic(登録商標)L68)
が挙げられる。Pluronicは、BASFの登録商標である。多数の他のポロキサマーが市販されている。
【００６１】
キトサン
キトサンは、強力なアルカリ性溶液下でアセトアミド基を部分的に脱アセチル化することによってキチンから誘導される天然カチオン性ポリサッカリドである。この20年間にわたり、キトサンは、その低毒性、良好な生体適合性及び優れた粘膜接着特性のために生物医学用途及び薬物送達用途で広く使用されている(van der Lubben、IM.,VerhoeF、J.C.,Borchard、G.&Junginger、H.E.Chitosan For mucosaL vaccination.Adv.Drug DeLiv.Rev.52、139〜144、2001)。キトサンの粘膜接着性は、水素結合及び疎水性効果もまた重要な役割を果たしていると考えられているが、複雑な機構を含み、粘膜表面上のカチオン性キトサンとアニオン性ムチンコーティングの間の静電気性相互作用が、主要な因子であると考えられている。
【００６２】
非誘導体化(「無誘導体化」)キトサンは、溶解度が限定されており(約1mg/mL)、酸性条件(pH6.5未満)下でのみ可溶性である。しかし、グリコールキトサン、メチルグリコールキトサン、及びキトサンオリゴサッカリドラクテートなどのキトサン誘導体は、生理学的pHで溶解度が顕著に改善されている(約10mg/mL)。
【００６３】
市販のキトサン誘導体として、限定されないが、キトサンオリゴサッカリドラクテート、グリコールキトサン、又はメチルグリコールキトサン(MGC)が挙げられる。こうした誘導体は、キトサンと異なる多様な物理特性を有するので、抗原、アジュバント、リポソームなどと一緒に使用するのにより適したものになる場合がある。キトサン又はキトサン誘導体は、20mg/mL未満、19mg/mL未満、18mg/mL未満、17mg/mL未満、16mg/mL未満、15mg/mL未満、14mg/mL未満、13mg/mL未満、12mg/mL未満、10mg/mL未満、9mg/mL未満、8mg/mL未満、7mg/mL未満、6mg/mL未満、5mg/mL未満、4mg/mL未満、3mg/mL未満、2mg/mL未満又は1mg/mL未満の量で存在する。
【００６４】
リポソームの調製
リポソームを作製するための標準的な方法として、限定されないが、Liposomes:A Practical Approach、V.P.TorchiLin,Volkmar Weissig Oxford University Press、2003で報告された方法が挙げられ、当技術分野で周知である。
【００６５】
本発明のリポソーム組成物を作製するための一つの適切な方法では、AGP(例えば、CRX-601(0.2%w/v))及びDOPC(具体的には、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、3〜4%w/v))及び任意選択でステロール(例えば、コレステロール(1%w/v))が、丸底フラスコ中でクロロホルム又はテトラヒドロフランの有機相中に溶解される。有機溶媒は、ロータリー式エバポレーターでの蒸発によって及びさらに12時間の高圧真空によって除去される。こうして得られた混合リン脂質膜にpH7.2の10mM HEPES緩衝液又は10mM HEPES-生理食塩緩衝液などのアミノアルカンスルホン酸緩衝液10mLが添加される。フラスコ壁に沿ったすべての膜が溶液内に分散するまで(30分〜1.5時間)、混合物は、断続的にボルテックスしながら水浴(20〜30°C)上で超音波処理される。次いで、溶液は、Lipid押出器(Northern Lipids Inc.、Canada)を用いてポリカーボネートメンブレンフィルターから連続的に押し出されて単層リポソームが形成される。次いで、リポソーム組成物は、0.22μmフィルターを使用して、無菌ろ過され、滅菌脱パイロジェン容器に入れられる。動的光散乱によって測定された得られた製剤の平均粒径は、80〜120nmであり、正味の負のζ電位を有していた。製剤は、CRX-601 2mg/mL、コレステロール10mg/mL、及び全リン脂質40mg/mLという最終の目標濃度を示す。
【００６６】
適切には、方法の最初に、PEG-リン脂質(例えば、MPEG-2000-DSPE(0.1〜3%w/v)又はMPEG-5000-DPPE(0.3〜6%w/v))又はポロキサマー(例えば、ポロキサマー407(1〜16%w/v))が、AGP及びDOPC脂質と一緒に溶解される。適切には、リポソーム組成物は、HEPESに溶解されたキトサン(例えば、MGC200mg)の無菌溶液と混合することができる製剤である。
【００６７】
この作業で使用されるアミノアルキルグルコサミニド4-ホスフェート(AGP)CRX-601は、既に記載されたように(Bazin、2008 32447/id)合成することができ、クロマトグラフィーによって精製することができる(純度95%超まで)。出発材料中か又は最終製品中いずれかのCRX-601は、標準逆相HPLC分析方法によって定量することができる。
【００６８】
一実施形態では、リポソームの調製中、HEPES緩衝液(pH=7.0)中で製剤化されたCRX-601は、リポソーム水和緩衝液(ホスフェートをベースとする「LHB」、pH=6.1)に比較して、5倍速やかに所望の粒径低減が得られる。HEPES緩衝液中のCRX-601脂質膜の再水和には、LHBホスフェート緩衝液に比較して、リポソームを製剤化するのに4倍少ない全圧力及び時間しか必要でない。エネルギーと時間両方を節約し、リポソームの加工中にAGPに対してはるかに小さいストレスしか与えないため、これは顕著な改良である。
【００６９】
リポソーム組成物の成分の適切な範囲(w/v)は、約3〜4%w/vの範囲の脂質、1%w/vのステロール、0.1〜1%w/vの範囲のAGPなどの活性成分及び10mMのアミノアルカンスルホン酸緩衝液を含む一実施形態を含む。一実施形態では、ステロールは、適切には、0.5〜4%w/vの範囲で存在する。さらに、一実施形態では、脂質:ステロール:活性成分比は、約3〜4:1:0.1〜1である。
【実施例】
【００７０】
CRX-601を用いた改変DOPCリポソームの調製
[実施例1：1モル%のMPEG-2000-DSPEで置換されたリポソーム]
本実施例のモル%置換は、全リン脂質含量に対するMPEG-2000-DSPEの量を指す。CRX-601(20mg)、DOPCと略称される1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(396mg)、コレステロール(100mg)及びMPEG-2000-DSPEと略称されるPEGリン脂質[N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩](15mg)を丸底フラスコ中のテトラヒドロフラン有機相に溶解した。有機溶媒ロータリー式エバポレーターで蒸発によって及びさらに12時間の高圧真空によって除去した。このようにして得られた混合リン脂質膜にpH7.2の10mM HEPES又は10mM HEPES-生理食塩緩衝液10mLを添加した。フラスコ壁に沿ったすべての膜が溶液内に分散するまで(30分〜1.5時間)、混合物を、断続的にボルテックスにしながら水浴(20〜30°C)上で超音波処理した。次いで、溶液を、脂質ミニ押出器(Lipex(登録商標)押出器(Northern Lipids Inc.、Canada))を用いて孔径600nm(1パス)、400nm(1パス)、及び200nm(2〜4パス)を有するポリカーボネートメンブレンフィルターから連続的に押し出して単層リポソームを形成した。次いで、リポソーム組成物を、0.22μmフィルターを使用して無菌ろ過し、滅菌脱パイロジェン容器に入れた。動的光散乱法によって測定された得られた製剤の平均粒径は、80〜120nmであり、正味負のζ電位を有していた。製剤は、CRX-601 2mg/mL、コレステロール10mg/mL、及び全リン脂質40mg/mLという最終の目標濃度を示す。
【００７１】
この作業で使用されたアミノアルキルグルコサミニド4-ホスフェート(AGP)CRX-601を、既に記載されたように(Bazin、2008 32447/id)合成し、クロマトグラフィーによって精製した(純度95%超まで)。出発材料中か又は最終製品中いずれかのCRX-601を、標準逆相HPLC分析方法によって定量した。
【００７２】
[実施例2：より高いモル%のMPEG-2000-DSPEで置換したリポソーム]
リポソーム製剤を、実施例1と同様であるが、但し、多様なDOPC及びMPEG-2000-DSPEを用いて調製して所望のモル%置換を得た。5、10、15、及び25モル%という目標置換を有する製剤を調製した。動的光散乱法によって測定された代表的な平均粒径及びζ電位を表1に示す。25モル%超置換された製剤は、成分の溶解度の限界に近づくにつれて、超音波処理中の脂質膜の緩衝液中への溶解が制限されるので、調製が困難である。高い置換では、PEGリン脂質は、リポソーム二重層を飽和することが予想され、過剰分は、ミセル又はユニマーとして溶液中に存在する。
【００７３】
【表１】
2017507968.tif 000011
【００７４】
[実施例3：1モル%のMPEG-5000-DPPEで置換されたリポソーム]
リポソーム製剤を実施例1と同様に調製したが、但し、MPEG-2000-DSPEの代わりにMPEG-5000-DPPEと略称されるPEGリン脂質N-(カルボニル-メトキシポリエチレングリコール-5000)-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンナトリウム塩を使用した。動的光散乱法で測定した得られた製剤の平均粒径は、80〜120nmであった。
【００７５】
[実施例4：より高いモル%のMPEG-5000-DPPEで置換されたリポソーム]
リポソーム製剤を、実施例3と同様であるが、但し、多様なDOPC及びMPEG-5000-DPPE量を用いて所望のモル%置換を得た。5、10、15、及び25モル%という目標置換を有する製剤を調製した。動的光散乱法によって測定された代表的な平均粒径及びζ電位を表2に示す。25モル%超置換された製剤は、成分の溶解度の限界に近づくにつれて、超音波処理中の脂質膜の緩衝液中への溶解が制限されるので、調製が困難である。高い置換では、PEGリン脂質は、リポソーム二重層を飽和することが予想され、過剰分は、ミセル又はユニマーとして溶液中に存在する。
【００７６】
【表２】
2017507968.tif 000012
【００７７】
[実施例5：1モル%のポロキサマー407を添加したリポソームの調製]
この実施例の添加モル%は、全リン脂質含量に対するポロキサマーの量を指す。CRX-601(20mg)、DOPC(400mg)、及びポロキサマー407(64mg)を丸底フラスコ中のテトラヒドロフラン有機相に溶解し、実施例1で議論したのと同様に処理した。コレステロールがリン脂質二重層内へのポロキサマーの組込みを低減することが報告されているので、この調製では、コレステロールを含ませなかった。動的光散乱法で測定した得られた製剤の平均粒径は、120〜180nmであった。製剤は、2mg/mL CRX-601、40mg/mL DOPC、及び1モル%(DOPCに関して)のポロキサマー407という最終目標濃度を示す。
【００７８】
[実施例6：より高いモル%のポロキサマー407を添加したリポソームの調製]
リポソーム製剤を実施例5と同様に調製したが、但し、ポロキサマー407の量を増加させた。5、10、15、及び25モル%の置換を目標とした製剤を調製した。動的光散乱法によって測定した代表的な平均粒径及びζ電位を表3に示す。25モル%超添加される製剤は、成分の溶解度の限界に近づくにつれて、超音波処理中の脂質ポロキサマー膜の緩衝液中への溶解が制限されるので、調製が困難である。高い置換では、ポロキサマー407は、リポソーム二重層を飽和することが予想され、過剰分は、ミセル又はユニマーとして溶液中に存在する。
【００７９】
【表３】
2017507968.tif 000013
【００８０】
[実施例7：ポロキサマー188を添加したリポソームの調製]
リポソーム製剤を実施例6と同様に調製したが、但し、ポロキサマー407の代わりにポロキサマー188を使用した。15及び25モル%の目標の置換を有する製剤を調製した。動的光散乱法によって測定した代表的な平均粒径及びζ電位を表4に示す。
【００８１】
[実施例8：ポロキサマー184を添加したリポソームの調製]
リポソーム製剤を実施例6と同様に調製したが、但し、ポロキサマー407の代わりにポロキサマー184を使用した。15及び25モル%の目標の置換を有する製剤を調製した。動的光散乱法によって測定した代表的な平均粒径及びζ電位を表4に示す。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
[実施例9：キトサンを用いたリポソーム製剤の調製]
メチルグリコールキトサン(キトサングリコールトリメチルアンモニウムイオディド、200mg)をpH7.2の10mM HEPES-生理食塩緩衝液10mLに溶解して濃度20mg/mLを得た。溶液を、0.22μmフィルターを使用して無菌ろ過して滅菌脱パイロゲン化容器に入れた。実施例1〜4由来の製剤を多様な体積のメチルグリコールキトサン溶液と無菌混合して1〜10mg/mLの範囲の濃度を得た。従来のDOPC-コレステロールリポソーム製剤は、キトサン又はメチルグリコールキトサンを含めたその誘導体との混合時に凝集する(表5)が、本明細書で報告した改変リポソーム(実施例1〜4)は、懸濁液中で安定のままである(表6)。表6に示した、動的光散乱法によって測定した代表的な平均粒径及びζ電位は、メチルグリコールキトサン約1mg/mLを超えると、粒径のいくらかの増加及びζ電位の逆転(正味負の電位から正味正の電位)を示し、これはメチルグリコールキトサンによる表面コーティングと一致する。ある種の閾値を超えた濃度で、メチルグリコールキトサンは、リポソーム二重層を飽和させると予想され、過剰分は溶液中に存在する。
【００８４】
【表５】
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【００８５】
【表６】
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【００８６】
キトサンオリゴサッカリドラクテート
キトサンオリゴサッカリドラクテートをメチルグリコールキトサンの代わりに使用する点を除いて、上のメチルグリコールキトサン(MGC)の場合と同じ方法で調査を実施した。実施例1由来のリポソームを用いた試験組成物はすべて、凝集した。他の製剤はすべて懸濁液中で安定のままであった。
【００８７】
グリコールキトサン
グリコールキトサンをメチルグリコールキトサンの代わりに使用する点を除いて、上のメチルグリコールキトサン(MGC)の場合と同じ方法で調査を実施した。実施例1及び2由来のリポソームを用いた試験組成物はすべて、凝集した。実施例3及び4由来のリポソームは懸濁液中で安定のままであった。
【００８８】
キトサンコーティングリポソーム
非改変、リン脂質-PEG改変、又はPluronic改変CRX-601リポソームをキトサン誘導体と混合することによってキトサンコーティングリポソーム製剤を調製し、径及びζ電位の変化を評価した。MGCと組合わせると、非改変リポソームは、0.4〜2mg/mLのMGCで凝集を示し、沈殿がもたらされ、μm範囲の径を示す粒子として図1Aに示される。2mg/mLを超えるMGC濃度で、製剤は、最初はコロイドとして安定であるようだったが、1〜4日で凝集の傾向を示した。5モル%改変されたPE-PEG2K及びPE-PEG5K改変リポソームは、MGCの存在下でコロイドとして安定であり、試験された濃度のいずれでも径の大きな変化は存在しなかった(図1A)。負電位から正へのζ電位の逆転は、非改変リポソームではMGC約0.5mg/mLで、5%のPE-PEG2K又はPE-PEG5K改変では1mg/mLで生じた。わずか1モル%のPE-PEG2K又はPE-PEG5Kによる改変は、大部分の濃度でMGCによる凝集を十分に防止することが示された(図2A)。1%改変では、PE-PEG5Kリポソームは、PE-PEG2K改変リポソームよりもMGCによる凝集に対して耐性があった。0.4〜0.6mg/mLのMGCでは、1%PE-PEG5K改変で粒径又はPDIの大きな変化は観察されなかったが、μm範囲への径の増加が、1%PE-PEG2K改変で観察された。25%までの改変は、MGCの存在下でいかなる不安定化/凝集ももたらされなかった(図2B)。
【００８９】
Pluronic改変リポソームの中でも、F127改変リポソームは、最も安定であり、評価されたMGC濃度のあらゆる範囲にわたり目に見える凝集も多分散性の増加も存在しなかった(図1B)。粒径の増加は、約10〜30nm、正味の負電位から正電位へのζ電位の逆転は、0.4mg/mL以上のMGC濃度で生じた。15及び25%改変されたF127改変リポソームは、MGCの存在下で同様に安定であったが(図3A)、1%改変では凝集を示した(データは示さず)。5モル%のL64で改変されたリポソームは、MGCと組合わされた場合、0.2〜0.8mg/mLのMGCで径及び多分散性の増加を示し(図1B)、リポソーム表面荷電の完全な中和に対応した。1mg/mL以上のMGCでは、非改変リポソームと同様に、L64改変リポソームは、最初は安定であるようだったが、時間の経過とともに凝集し、沈殿する傾向があった(図1B)。F68改変リポソームは、最も安定性が低く、試験濃度のすべてでMGCによって即座に沈殿が引き起こされた。同様な傾向は、15及び25%というより高いPluronic改変を受けたリポソームで観察された(図3)。したがって、MGC存在下のPluronic改変リポソーム安定性の順序は、F127>L64>F68であった。
【００９０】
キトサン誘導体、MGC、GC及びCO存在下のこうしたリポソーム製剤の安定性評価の要約を表7に示す。全体として、試験されたキトサン誘導体すべての中で、最も低い凝集は、MGCで観察された。リン脂質-PEG改変リポソームは、キトサンによる凝集に対してPluronicリポソームより安定であった。荷電の顕著な低減を示した製剤(リン脂質-PEG又はPluronic F127改変リポソーム)のみがキトサンによる凝集に対して耐性であった。PE-PEG5Kリポソームは、PE-PEG2Kリポソームより安定であったが、これは、1%改変でのMGC存在下の径/PDIの変化が全くなく、GC及びCO存在下の安定性の改善から明らかである。
【００９１】
【表７】
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【００９２】
[実施例10：ウサギパイロジェン試験]
パイロジェン試験は、実施例1〜6由来の改変リポソームへのCRX-601組込みの代理評価基準として及び生理環境におけるその安定性の評価基準として本明細書で使用される。試験を、SOP 16E-02当りPacific Biolabs(HercuLes、CA)で実施したが、これはUSP<151>に概要を示した手順に従う。実施例7由来の製剤(ポロキサマー188改変リポソーム)及び実施例8由来の製剤(ポロキサマー184改変リポソーム)を除いて、実施例1〜6由来の製剤のすべては、少なくとも250ng CRX-601/kg動物体重の濃度まで発熱作用はなかった。250ng/kgまでこの発熱作用のないことは、無CRX-601に対して100倍の改善に対応し(2.5ng/kgの最大非発熱作用投与量)、CRX-601のリポソーム二重層内への99%超の組込みを示す。試験当り3羽のウサギからの個別温度上昇を表8に示す。
【００９３】
【表８】
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【００９４】
[実施例11：マウス舌下ワクチン接種及び特異抗体応答の測定]
Charles River Laboratories (WiLmington、MA)から取得したメスBALB/cマウス(6〜8週齢)をこれらの調査に使用した。ケタミン(100mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)の腹腔内(i.p)投与によって麻酔したマウスに舌下投与でワクチン接種した(5〜6μL)。インフルエンザ抗原A/Victoria/210/2009 H3N2を使用して1又は1.5μgHA/マウスと混合されたリポソーム製剤中の5μgCRX-601を0、21及び42日にマウスすべてにワクチン接種した。麻酔下で血清を36日に採取し(14dp2)、56日目(14dp3)のマウスを犠牲にして、膣洗浄液、気管洗浄液及び血清の最終採取液を集めた。動物のすべてをU.S.Department of Health and Human Services Office of Laboratory Animal Welfare and the Institutional Animal Care and Use Committee at GSK Biologicals、Hamilton、Montanaのガイドラインに従って使用した。
【００９５】
特異抗体応答を、2つの独立した免疫測定法、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)及びインフルエンザ血球凝集素阻害(HI)アッセイによって測定した。
【００９６】
分割インフルエンザコーティング96ウエルプレート(Nunc Maxisorp)を使用し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG、IgG1、IgG2a又はIgAを使用して添加された血清又は気管洗浄液又は膣洗浄液試料からの結合免疫グロブリンを検出することによってELISAを実施した。この後に酵素特異的クロモゲンを添加したが、これによって、血清中に含まれた特異的抗インフルエンザIgGs/IgAsの量に直接比例する色強度がもたらされた。光学密度を450nmで読み取った。
【００９７】
マウス血清の存在下でインフルエンザウイルスに暴露した場合のチキン又はおんどりRBCの阻害を評価することによってHIアッセイを実施した。RBCの完全な又は部分的な凝集をもたらすインフルエンザウイルスの最終稀釈の逆数を使用してHI滴定濃度を計算し、HI単位/血清50μLとして表した。
【００９８】
[実施例12：MPEG-2000-DSPE又はMPEG-5000-DPPEで改変されたリポソームを用いたマウス舌下ワクチン接種(NIH#162)]
実施例1〜4由来の1、5、及び25モル%MPEG-2000-DSPE又はMPEG-5000-DPPE改変リポソームによって実施例11で概略された手順を使用してマウスにワクチン接種した。二次及び三次ワクチン接種後14日の血清IgG滴定濃度を図4(及びまた図5のHI滴定濃度)に示す。舌下治療群の中でも、25%MPEG-5000-DPPEリポソーム処理群中CRX-601を受けたマウスで滴定濃度が最高であり、これは、CRX-601水性又はCRX-601非改変リポソーム処理群より顕著に高い。
【００９９】
[実施例13：ポロキサマー407で改変されたリポソームを用いたマウス舌下ワクチン接種(NIH#158)]
実施例5〜6由来の5、10及び15モル%ポロキサマー407改変リポソームによって実施例11で概略された手順を使用してマウスにワクチン接種した。二次及び三次ワクチン接種後14日の血清IgG滴定濃度を図6に示す。舌下治療群の中でも、15%ポロキサマー407改変リポソーム処理群中(二次ワクチン接種後)CRX-601を受けたマウスで滴定濃度が最高であり、これは、CRX-601水性又はCRX-601非改変リポソーム処理群より顕著に高い。
【０１００】
[実施例14：ポロキサマー407、188、及び184で改変されたリポソームを用いたマウス舌下ワクチン接種(NIH#167)］
実施例5〜8由来の15及び25モル%ポロキサマー407又は188又は184改変リポソームによって実施例11で概略された手順を使用してマウスにワクチン接種した。二次及び三次ワクチン接種後14日の血清IgG滴定濃度を図7(及びまた図8のHI滴定濃度)に示す。舌下治療群の中でも、15%ポロキサマー188リポソーム処理群中CRX-601を受けたマウスで滴定濃度が最高であった。CRX-601/ポロキサマー改変リポソーム処理群の滴定濃度は、一般に、CRX-601水性又はCRX-601非改変リポソーム処理群より良好であった。
【０１０１】
[実施例15：MPEG-2000-DSPE又はMPEG-5000-DPPE及びメチルグリコールキトサン又はキトサンオリゴサッカリドラクテートで改変されたリポソームを用いたマウス舌下ワクチン接種(NIH#163)]
実施例9で記載されたのと同様にメチルグリコールキトサン又はキトサンオリゴサッカリドラクテートを用いて製剤された実施例2及び4由来の5モル%MPEG-2000-DSPE又はMPEG-5000-DPPE改変リポソームによって実施例11で概略された手順を使用してマウスにワクチン接種した。二次及び三次ワクチン接種後14日の血清IgG滴定濃度を図9(及びまた図10のHI滴定濃度)に示す。舌下治療群の中でも、リポソーム+メチルグリコールキトサン処理群の滴定濃度は、一般に、CRX-601非改変リポソーム処理群より良好であった。
【０１０２】
[実施例16：ポロキサマー及びメチルグリコールキトサンで改変されたリポソームを用いたマウス舌下ワクチン接種(NIH#164)]
実施例5〜8由来の5、15及び25モル%ポロキサマー407(図11及び12でF127とラベルした)改変リポソーム並びに実施例9で記載されたのと同様にメチルグリコールキトサンを用いて製剤された15又は25モル%ポロキサマー407リポソームによって実施例11で概略された手順を使用してマウスにワクチン接種した。二次及び三次ワクチン接種後14日の血清IgG滴定濃度を図11(及びまた図12のHI滴定濃度)に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【国際調査報告】
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