(57)【要約】  非常に少量の血液サンプルに適合性のあるバイオチップが、ヘモグロビン障害を検出し、臨床的に意味のある方法で疾患の重症度、今後の疼痛発作、治療反応、及び治療の有効性を含む、異常な血液細胞の変形能並びに接着に関連する障害を監視するために使用される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン障害を検出するための電気泳動バイオチップであって、
ハウジングの第１の端部から第２の端部へ広がり、アルカリ緩衝液で少なくとも部分的に飽和された酢酸セルロース紙を含むマイクロチャネルを含むハウジング；
それぞれ前記ハウジングの前記第１の端部及び第２の端部を通って、前記マイクロチャネル及び酢酸セルロース紙に広がり、前記酢酸セルロース紙を少なくとも部分的に飽和する前記アルカリ緩衝液を受容することが可能である第１のバッファーポート並びに第２のバッファーポート；
血液サンプルを受容し、前記ハウジングの第１の端部を通って前記マイクロチャネル及び酢酸セルロース紙へ広がるサンプルローディングポート；並びに
前記酢酸セルロース紙の全域に電界を発生させ、それぞれ前記第１のバッファーポート及び前記第２のバッファーポートを通って前記酢酸セルロース紙へ広がる第１の電極及び第２の電極、
を含む電気泳動バイオチップ。
【請求項２】
さらに、前記サンプルローディングポートに導入される血液サンプルについて、前記酢酸セルロース紙に沿ったヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するための撮像システムを含む、請求項１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項３】
前記ハウジングが、前記酢酸セルロース紙及びヘモグロビン変異体の移動を可視化するための表示領域を含む、請求項１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項４】
前記第１の電極及び前記第２の電極が、約１Ｖ〜約４００Ｖの電界を発生させる電源に接続される、請求項１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項５】
前記電極によって前記バイオチップに印加される電圧が２５０Ｖを超えない、請求項４に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項６】
前記サンプルローディングポートに導入される血液サンプルが１０マイクロリットル未満である、請求項１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項７】
前記緩衝液が、アルカリ性トリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液を含む、請求項１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項８】
前記第１の電極及び前記第２の電極がグラファイト電極を含む、請求項１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項９】
前記ハウジングが、上部キャップ、底部キャップ、及び上部キャップと底部キャップとの間に介在し、前記ハウジング内で前記チャネルを画定するチャネルスペーサーを含む、請求項１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１０】
前記上部キャップ、底部キャップ、及びチャネルスペーサーが、ガラス又はプラスチックのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１１】
前記撮像システムが、ヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するための携帯電話撮像システムを含む、請求項２に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１２】
前記携帯電話撮像システムが、ヘモグロビン変異体の移動を撮像するために使用される携帯電話、並びに診断決定を行うために前記ヘモグロビンバンドの種類及び厚さを認識並びに定量化するソフトウェアアプリケーションを含む、請求項１１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１３】
前記ヘモグロビンバンドの種類が、ヘモグロビンの種類Ｃ／Ａ、Ｓ、Ｆ、及びＡ０を含む、請求項１２に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１４】
前記対象が、ヘモグロビン遺伝子型ＨｂＳＳ、ＨｂＳＡ、及びＨｂＳＣ、又はＨｂＡ２を有するかどうかを診断するための、請求項１１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１５】
前記対象が鎌状赤血球症を有するかどうかを診断するための、請求項１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１６】
対象における鎌状赤血球症を診断するための電気泳動バイオチップシステムであって、
ハウジングの第１の端部から第２の端部へ広がり、アルカリ緩衝液で少なくとも部分的に飽和された酢酸セルロース紙を含むマイクロチャネルを含むハウジング；
それぞれ前記ハウジングの前記第１の端部及び第２の端部を通って、前記マイクロチャネル及び酢酸セルロース紙に広がり、前記酢酸セルロース紙を少なくとも部分的に飽和するアルカリ緩衝液を受容することが可能である第１のバッファーポート並びに第２のバッファーポート；
血液サンプルを受容し、前記ハウジングの第１の端部を通って前記マイクロチャネル及び酢酸セルロース紙へ広がるサンプルローディングポート；
前記酢酸セルロース紙の全域に電界を発生させ、それぞれ前記第１のバッファーポート及び前記第２のバッファーポートを通って前記酢酸セルロース紙へ広がる第１の電極及び第２の電極；並びに
前記サンプルローディングポートに導入される血液サンプルについて、酢酸セルロース紙に沿ったヘモグロビン変異体の移動を可視化し、定量化し、前記対象が鎌状赤血球症を有するかどうかを決定するための撮像システム、
を含む電気泳動バイオチップシステム。
【請求項１７】
前記ハウジングが、前記酢酸セルロース紙及びヘモグロビン変異体の移動を可視化するための表示領域を含む、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップシステム。
【請求項１８】
前記第１の電極及び前記第２の電極が、約１Ｖ〜約４００Ｖの電界を発生させる電源に接続される、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップシステム。
【請求項１９】
前記電極によって前記バイオチップに印加される電圧が２５０Ｖを超えない、請求項１８に記載の電気泳動バイオチップシステム。
【請求項２０】
前記サンプルローディングポートに導入される血液サンプルが１０マイクロリットル未満である、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップシステム。
【請求項２１】
前記緩衝液が、アルカリ性トリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液を含む、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップシステム。
【請求項２２】
前記第１の電極及び前記第２の電極がグラファイト電極を含む、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップシステム。
【請求項２３】
前記ハウジングが、上部キャップ、底部キャップ、及び上部キャップと底部キャップとの間に介在し、前記ハウジング内で前記チャネルを画定するチャネルスペーサーを含む、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップシステム。
【請求項２４】
前記上部キャップ、底部キャップ、及びチャネルスペーサーが、ガラス又はプラスチックのうちの少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップシステム。
【請求項２５】
撮像システムが、ヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するための携帯電話撮像システムを含む、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項２６】
前記携帯電話撮像システムが、ヘモグロビン変異体の移動を撮像するために使用される携帯電話、並びに診断決定を行うために前記ヘモグロビンバンドの種類及び厚さを認識並びに定量化するソフトウェアアプリケーションを含む、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項２７】
前記ヘモグロビンバンドの種類が、ヘモグロビンの種類Ｃ／Ａ、Ｓ、Ｆ、及びＡ０を含む、請求項１６に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項２８】
方法であって、
ハウジングの第１の端部から第２の端部へ広がり、アルカリ緩衝液で少なくとも部分的に飽和された酢酸セルロース紙を含むマイクロチャネルを含むハウジング；
それぞれ前記ハウジングの前記第１の端部及び第２の端部を通って、前記マイクロチャネル及び酢酸セルロース紙に広がり、前記酢酸セルロース紙を少なくとも部分的に飽和するアルカリ緩衝液を受容することが可能である第１のバッファーポート並びに第２のバッファーポート；
血液サンプルを受容し、前記ハウジングの第１の端部を通って前記マイクロチャネル及び酢酸セルロース紙へ広がるサンプルローディングポート；
前記酢酸セルロース紙の全域に電界を発生させ、それぞれ前記第１のバッファーポート及び前記第２のバッファーポートを通って前記酢酸セルロース紙へ広がる第１の電極及び第２の電極；並びに
前記サンプルローディングポートに導入される血液サンプルについて、前記酢酸セルロース紙に沿ったヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するための撮像システム、
を含む電気泳動バイオチップシステムを提供すること、
少なくとも１つの血液細胞を含む対象からの血液サンプルを前記サンプルローディングポートに導入すること；かつ
前記対象についてヘモグロビンの表現型を決定するために、前記撮像システムを用いて前記酢酸セルロース紙上に形成されるヘモグロビンバンドを撮像すること、
を含む方法。
【請求項２９】
前記ヘモグロビン表現型が、ＨｂＡＡ、ＨｂＳＡ、ＨｂＳＳ、ＨｂＳＣ、及びＨｂＡ２からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＨｂＡＡヘモグロビン表現型が前記対象は正常であると診断する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＨｂＳＡヘモグロビン表現型が前記対象は鎌状赤血球形質を有していると診断する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＨｂＳＳヘモグロビン表現型が前記対象は鎌状赤血球症を有していると診断する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＨｂＳＣヘモグロビン表現型が前記対象はヘモグロビンＳＣ疾患を有していると診断する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＨｂＡ２ヘモグロビン表現型が前記対象はサラセミアを有していると診断する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ハウジングが、前記酢酸セルロース紙及びヘモグロビン変異体の移動を可視化するための表示領域を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の電極及び前記第２の電極が、約１Ｖ〜約４００Ｖの電界を発生させる電源に接続される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記電極によって前記バイオチップに印加される電圧が２５０Ｖを超えない、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルローディングポートに導入される血液サンプルが１０マイクロリットル未満である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記緩衝液が、アルカリ性トリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の電極及び前記第２の電極がグラファイト電極を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記撮像システムが、ヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するための携帯電話撮像システムを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記携帯電話撮像システムが、ヘモグロビン変異体の移動を撮像するために使用される携帯電話、並びに診断決定を行うために前記ヘモグロビンバンドの種類及び厚さを認識並びに定量化するソフトウェアアプリケーションを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヘモグロビンバンドの種類が、ヘモグロビンの種類Ｃ／Ａ、Ｓ、Ｆ、及びＡ０を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
マイクロ流体バイオチップ装置であって、
少なくとも１つの細胞接着領域を画定する少なくとも１つのマイクロチャネルを含むハウジングであって、前記少なくとも１つの細胞接着領域は、細胞を含有する流体が前記少なくとも１つのマイクロチャネルを通過する際に、目的の細胞を接着する少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドでコーティングされているハウジング、及び流体が前記チャネルを通過する際に前記少なくとも１つのマイクロチャネル内の前記少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドに接着する細胞の量を測定する撮像システムであって、前記少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドは、フィブロネクチン、ラミニン、セレクチン、フォン・ヴィルブランド因子、トロンボモジュリン又はＣ１４６抗体のうちの少なくとも１つを含む撮像システム、を含むマイクロ流体バイオチップ装置。
【請求項４５】
前記撮像システムがレンズレス撮像システムを含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項４６】
前記レンズレス撮像システムが電荷結合素子センサ及び発光ダイオードを含む、請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
前記細胞が、前記対象から得られた血液細胞である、請求項４４に記載の装置。
【請求項４８】
前記撮像システムが、前記細胞が取得される対象の健康を監視するために、それぞれのチャネル内の前記接着細胞を定量化する、請求項４４に記載の装置。
【請求項４９】
前記撮像システムが、前記細胞が取得される対象の疾患の進行を監視するために、それぞれのチャネル内の前記接着細胞を定量化する、請求項４４に記載の装置。
【請求項５０】
前記疾患が鎌状赤血球症である、請求項４９に記載の装置。
【請求項５１】
前記撮像システムが、前記細胞が取得される対象に施される治療処置の有効性を測定するために、それぞれのチャネル内の前記接着細胞を定量化する、請求項４４に記載の装置。
【請求項５２】
前記ハウジングが、少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドでコーティングされた別個の細胞接着領域をそれぞれ含む複数のマイクロチャネルを含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項５３】
少なくとも２つのマイクロチャネルが異なるバイオアフィニティーリガンドを含む、請求項５２に記載の装置。
【請求項５４】
少なくとも３つのマイクロチャネルが異なるバイオアフィニティーリガンドを含む、請求項５２に記載の装置。
【請求項５５】
複数のマイクロチャネルが同一のバイオアフィニティーリガンドを含む、請求項５２に記載の装置。
【請求項５６】
少なくとも１つのマイクロチャネルが、前記マイクロチャネルの細胞接着領域上にコーティングされた少なくとも２つの異なるバイオアフィニティーリガンドを含む、請求項５２に記載の装置。
【請求項５７】
異なるバイオアフィニティーリガンドが、少なくとも１つのマイクロチャネルの前記細胞接着領域内の異なる位置に位置付けられる、請求項５２に記載の装置。
【請求項５８】
前記ハウジングが、ベース層、中間層、及びカバー層で形成された多層構造であり、前記少なくとも１つのマイクロチャネルが前記中間層に形成される、請求項４４に記載の装置。
【請求項５９】
前記ハウジングが、各マイクロチャネルの第１の端部及び第２の端部にそれぞれ流体連通する入口ポート並びに出口ポートを含む、請求項４４に記載の装置。
【請求項６０】
前記少なくとも１つのマイクロチャネルが、マイクロリットルもしくはミリリットル体積の血液又は接着する細胞を含有する溶液を受け入れるようにサイズ調整される、請求項４４に記載の装置。
【請求項６１】
ラミニン、セレクチン、フォン・ヴィルブランド因子、トロンボモジュリン及びＣ１４６抗体のうちの少なくとも１つが、前記少なくとも１つのマイクロチャネルに沿って異なる位置に配置される、請求項４４に記載の装置。
【請求項６２】
少なくとも１つの細胞接着領域を画定する少なくとも１つのマイクロチャネルを含むハウジングであって、前記少なくとも１つの細胞接着領域は、細胞を含有する流体が前記少なくとも１つのマイクロチャネルを通過する際に、目的の細胞を接着する少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドでコーティングされているハウジング、及び前記流体が前記チャネルを通過する際に前記少なくとも１つのマイクロチャネル内の前記少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドに接着する前記細胞の量を測定する撮像システムであって、前記少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドは、フィブロネクチン、ラミニン、セレクチン、フォン・ヴィルブランド因子、トロンボモジュリン又はＣ１４６抗体のうちの少なくとも１つを含む撮像システム、を含むマイクロ流体バイオチップ装置を提供すること；
少なくとも１つの血液細胞を含む対象由来の血液サンプルを前記マイクロチャネル内に導入すること；並びに
前記少なくとも１つのマイクロチャネル内の前記少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドに接着した前記細胞の量を撮像すること、
を含む方法。
【請求項６３】
前記撮像システムが、レンズレス撮像システムを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記レンズレス撮像システムが、電荷結合素子センサ及び発光ダイオードを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
それぞれのチャネル内の前記接着細胞の量が、前記細胞が取得される前記対象の健康の指標となる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
それぞれのチャネル内の前記接着細胞の量が、前記細胞が取得される対象の疾患の進行の指標となる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患が鎌状赤血球症である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
それぞれのチャネル内の前記接着細胞の量が、前記細胞が取得される対象に施される治療処置の有効性の指標となる、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１４年７月３０日出願の米国仮出願第６２／０３０，９６４号の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、バイオチップに関し、特に、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症（ＳＣＤ））などのヘモグロビン障害を迅速かつ容易に診断又は識別するバイオチップ、並びに血液細胞分析に基づいて患者の健康及び病気の進行を監視するバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００３】
米国疾病管理予防センターによると、全世界、主にアフリカ、インド及び中東で約３百万人が鎌状赤血球症（ＳＣＤ）に罹患しており、米国では推定１００，０００人が罹患している。ＳＣＤは、米国で生まれた３７５人に１人のアフリカ系アメリカ人の新生児を苦しめている。「米国予防サービスタスクフォース、異常ヘモグロビン症のためのスクリーニング（Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）」：臨床予防サービスへのガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、第２版、第２版（編）：国際医療出版（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）；４８５〜４９４（１９９６）。
【０００４】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、公衆衛生上の優先事項としてＳＣＤを宣言した［１〜３］。ＳＣＤの負担を最も負っているのは低所得国、特にアフリカである。ＳＣＤを有するアフリカ生まれの赤ちゃんの推定５０〜８０％は、診断されないことにより５歳前に死亡する（すなわち、６００人以上の赤ちゃんが毎日死ぬ）［２、４］。従来の試験を実行するには高いコスト及びスキルのレベルが必要であるため、アフリカでは乳児がほとんどスクリーニングされていない［５］。現在の方法はあまりにも高価であり、命を救うために公平かつタイムリーな診断を可能にするには時間がかかり過ぎる（２〜６週間）［５］。ＳＣＤ関連死の７０％が、新生児スクリーニングによる早期のポイントオブケア（ＰＯＣ）診断、その後の治療及びケアなどの簡単で、コスト効率の高い介入によって予防可能であることが、ＷＨＯによって推定されている［６］。診断の障壁は、出生直後の早期検出を容易にする低コストのＰＯＣツールで打ち破ることができる［５］。
【０００５】
８００人以上の子供たちがアフリカで毎日ＳＣＤを有して生まれ、彼らの半分以上が診断及び早期治療を受けないことにより小児期に死亡する。Ｍｏｄｅｌｌら、「ヘモグロビン障害と派生サービス指標のグローバル疫学（Ｇｌｏｂａｌ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｅｒｖｉｃｅ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ）、世界保健機関の紀要（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）８６：４８０〜４８７（２００８）；Ｍａｋａｎｉら、「アフリカにおける鎌状赤血球貧血での死亡：タンザニアでの前向きコホート研究（Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａ：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ｔａｎｚａｎｉａ）、ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ６：ｅｌ４６９９（２０１１）；及びＭｃＧａｎｎら、「アンゴラのルアンダにおける鎌状赤血球貧血のための前向き新生児スクリーニング及び治療プログラム（Ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ  ｉｎ  Ｌｕａｎｄａ，  Ａｎｇｏｌａ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ８８：９８４〜９８９（２０１３）。アメリカの全５０州、及びコロンビア特別区では、監視及び治療が直ちに開始できるように、早期にＳＣＤを診断するために新生児のヘモグロビンスクリーニングが義務付けられている（米国立衛生研究所、鎌状赤血球症の管理（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ．Ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｉｃｋｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、第４版、ＮＩＨ公開番号０２−２１１７、心臓、肺及び血液のＮＩＨ国立研究所（２００２））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新生児スクリーニング、その後の簡単な介入を経る早期診断は、米国におけるＳＣＤ関連死亡数を劇的に減少させた。しかしながら、これらの戦略は、限られたリソースのために、アフリカ及び他の第３世界の国々で広く利用されていない。必要とされるのは、ポイントオブケアバイオチップベースのヘモグロビンスクリーニング法である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載の実施形態は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）などのヘモグロビン障害を検出するための電気泳動バイオチップ及びシステムに関する。該バイオチップは、ハウジング、第１及び第２のバッファーポート、サンプルローディングポート、並びに第１及び第２の電極を含む。該ハウジングはまた、該ハウジングの第１の端部から第２の端部へ広がるマイクロチャネルを含む。該マイクロチャネルは、アルカリ緩衝液で少なくとも部分的に飽和された酢酸セルロース紙を含む。第１のバッファーポート及び第２のバッファーポートは、それぞれ該ハウジングの第１の端部及び第２の端部を通ってマイクロチャネル並びに酢酸セルロース紙に広がっている。第１のバッファーポート及び第２のバッファーポートは、酢酸セルロース紙を少なくとも部分的に飽和するアルカリ緩衝液を受容することが可能である。該サンプルローディングポートは、血液サンプルを受容することができ、該ハウジングの第１の端部を通って該マイクロチャネル及び酢酸セルロース紙へ広がる。第１の電極及び第２の電極は、酢酸セルロース紙に沿った血液サンプル中のヘモグロビン変異体の移動を促進するのに効果的な電界を酢酸セルロース紙の全域に発生させることができる。第１の電極及び第２の電極は、それぞれ第１のバッファーポート及び第２のバッファーポートを通って、酢酸セルロース紙へ広がることができる。
【発明の効果】
【０００８】
いくつかの実施形態において、該ハウジングは、酢酸セルロース紙及びヘモグロビン変異体の移動を可視化するための表示領域を含むことができる。該電気泳動バイオチップは、さらに、サンプルローディングポートに導入される血液サンプルについて、酢酸セルロース紙に沿ったヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するための撮像システムを含むことができる。
【０００９】
第１の電極及び第２の電極は、電源に接続することができる。該電源は、約１Ｖ〜約４００Ｖの電界を発生させることができる。いくつかの実施形態において、電極によってバイオチップに印加される電圧は２５０Ｖを超えない。
【００１０】
他の実施形態において、該サンプルローディングポートに導入される血液サンプルは、約１０マイクロリットル未満であり得る。いくつかの実施形態において、緩衝液はアルカリ性トリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液を含むことができる。第１の電極及び第２の電極は、グラファイト又はカーボン電極を含むことができる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、該ハウジングは、上部キャップ、底部キャップ、及び上部キャップと底部キャップとの間に介在するチャネルスペーサーを含むことができる。該チャネルスペーサーは、該ハウジング内でチャネルを画定することができる。上部キャップ、底部キャップ、及びチャネルスペーサーは、ガラス又はプラスチックのうちの少なくとも１つから形成することができる。
【００１２】
他の実施形態において、該撮像システムは、ヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するために、携帯電話撮像システムを含むことができる。携帯電話撮像システムは、ヘモグロビン変異体の移動を撮像するために使用される携帯電話、並びに診断決定を行うためにヘモグロビンバンドの種類及び厚さを認識並びに定量化するソフトウェアアプリケーションを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヘモグロビンバンドの種類は、ヘモグロビンの種類Ｃ／Ａ、Ｓ、Ｆ、及びＡ０を含むことができる。
【００１３】
他の実施形態において、該電気泳動バイオチップは、対象がヘモグロビン遺伝子型ＨｂＡＡ、ＨｂＳＳ、ＨｂＳＡ、及びＨｂＳＣ、又はＨｂＡ２を有するかどうかを診断するために使用することができる。他の実施形態において、該電気泳動バイオチップは、対象がＳＣＤを有するか又はＳＣＤのリスクが高いかどうかを診断するために使用することができる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、該電気泳動バイオチップは、対象からの血液サンプルをサンプルローディングポートに導入する方法で使用することができる。血液サンプルは、少なくとも１つの血液細胞を含む。電界は酢酸セルロース紙に適用することができ、その後、酢酸セルロース紙内に形成されたヘモグロビンバンドが、対象のヘモグロビン表現型を決定するために撮像システムで撮像される。ヘモグロビン表現型は、ＨｂＡＡ、ＨｂＳＡ、ＨｂＳＳ、ＨｂＳＣ、又はＨｂＡ２を含むことができる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＨｂＡＡヘモグロビン表現型は、対象が正常であると診断し、ＨｂＳＡヘモグロビン表現型は、対象が鎌状赤血球形質を有していると診断し、ＨｂＳＳヘモグロビン表現型は、対象が鎌状赤血球症を有していると診断し、ＨｂＳＣヘモグロビン表現型は、対象がヘモグロビンＳＣ疾患を有していると診断し、ＨｂＡ２ヘモグロビン表現型は、対象がサラセミアを有していると診断する。
【００１６】
本明細書に記載の他の実施形態は、ハウジングを含むマイクロ流体バイオチップ装置に関する。該ハウジングは、少なくとも１つの細胞接着領域を画定する少なくとも１つのマイクロチャネルを含む。少なくとも１つの細胞接着領域は、細胞を含有する流体が少なくとも１つのマイクロチャネルを通過する際に、目的の細胞を接着する少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドでコーティングされている。該バイオアフィニティーリガンドは、フィブロネクチン、ラミニン、セレクチン、フォン・ヴィルブランド因子、トロンボモジュリン又はＣ１４６抗体のうちの少なくとも１つを含むことができる。該装置はまた、流体が該チャネルを通過する際に、少なくとも１つのマイクロチャネル内で少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドに接着した細胞の量を測定する撮像システムを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、該バイオチップ装置は、対象の赤血球及び白血球の膜特性、細胞特性並びに接着特性を定量化して、臨床的に意味のある方法で疾患の重症度、今後の疼痛発作、治療反応、及び治療の有効性を監視することができる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、該ハウジングは、複数のマイクロチャネルを含むことができる。各マイクロチャネルは、少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドでコーティングされた別個の細胞接着領域を含むことができる。他の実施形態において、該マイクロチャネルの少なくとも２つ又は少なくとも３つは、異なるバイオアフィニティーリガンドを含むことができる。さらに他の実施形態において、複数のマイクロチャネルは、同一のバイオアフィニティーリガンドを含むことができる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのマイクロチャネルは、該マイクロチャネルの細胞接着領域上にコーティングされた少なくとも２つの異なるバイオアフィニティーリガンドを含むことができる。この異なるバイオアフィニティーリガンドは、少なくとも１つのマイクロチャネルの細胞接着領域内の異なる位置に位置付けることができる。例えば、ラミニン、セレクチン、フォン・ヴィルブランド因子、トロンボモジュリン及びＣ１４６抗体のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのマイクロチャネルに沿って異なる位置に位置付けられる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、該ハウジングは、ベース層、中間層、及びカバー層で形成された多層構造であり、少なくとも１つのマイクロチャネルは、中間層に形成することができる。該ハウジングは、各マイクロチャネルの第１の端部及び第２の端部にそれぞれ流体連通する入口ポート並びに出口ポートを含むことができる。少なくとも１つのマイクロチャネルは、マイクロリットルもしくはミリリットル体積の血液又は接着する細胞を含有する溶液を受け入れるようにサイズ調整することができる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、該撮像システムは、レンズレス撮像システムである。例えば、該レンズレス撮像システムは、電荷結合素子センサ及び発光ダイオードであり得る。
【００２２】
他の実施形態において、細胞は、対象から得られた血液細胞であり、該撮像システムは、細胞が取得される対象の健康を監視するためにそれぞれのチャネル内の接着細胞を定量化することができる。他の実施形態において、該撮像システムは、細胞が取得される対象の鎌状赤血球症などの疾患の進行を監視するために、それぞれのチャネル内の接着細胞を定量化することができる。さらに他の実施形態において、該撮像システムは、細胞が取得される対象に施される治療処置の有効性を測定するために、それぞれのチャネル内の接着細胞を定量化することができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、該マイクロ流体バイオチップ装置は、対象からの少なくとも１つの血液細胞を含む血液サンプルをマイクロチャネルに導入して、少なくとも１つのマイクロチャネル内の少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドに接着した細胞の量を撮像する方法において使用することができる。該バイオチップ装置は、対象の赤血球及び白血球の膜特性、細胞特性並びに接着特性を定量化し、臨床的に意味のある方法で疾患の重症度、今後の疼痛発作、治療反応、及び治療有効性を監視することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ａ〜Ｅ。鎌状赤血球症及びサラセミアを含むヘモグロビン障害の診断のためのＨｅｍｅＣｈｉｐを示す。（Ａ）ＨｅｍｅＣｈｉｐは、酢酸セルロース紙の単一のストリップを包含するＰＭＭＡ（１〜３、５〜６）の複数の層を積層して製造される（４）。（Ｂ）ＨｅｍｅＣｈｉｐは、コンパクトに設計されており（５ｃｍ×２ｃｍ×０．６ｃｍ）、ポケットに入れて持ち運ぶことができる。（Ｃ）全てのあり得るヘモグロビンの種類の分離が示されている：正常ヘモグロビン（Ｈｂ  Ａ０）、胎児ヘモグロビン（Ｈｂ  Ｆ）、鎌状ヘモグロビン（Ｈｂ  Ｓ）、及びヘモグロビンＣ（Ｈｂ  Ｃ）又はＡ２。（Ｄ）ヘモグロビンの分離は、陽極（＋）と陰極（−）との間で黒鉛電極を通して生成される印加電界を介してＨｅｍｅＣｈｉｐで起こる。（Ｅ）ＨｅｍｅＣｈｉｐの原型が、ヘモグロビンバンドに分離された微小量の血液サンプルとともに示されている。
【図２】Ａ〜Ｂ。マイクロ流体ゲル電気泳動試験の時間経過を示す画像を示す。（Ａ）行ったＨｅｍｅＣｈｉｐ試験のタイムラプス画像。ｉ）血液は添加されたが、電流がまだ印加されていない試験の開始。ｉｉ）電流が印加された４分後の血液サンプル。ｉｉｉ）電流が印加された８分後の血液サンプル。電流が停止し、サンプルが最終位置にある。（Ｂ）Ａのプロセスの側面図。ｉ）血液は添加されたが、電流がまだ印加されていない試験の開始。ｉｉ）電流が印加された４分後の血液サンプル。ｉｉｉ）電流が印加された８分後の血液サンプル。電流が停止し、サンプルが最終位置にある。
【図３】Ａ〜Ｂ。ＨｅｍｅＣｈｉｐを用いて異なるヘモグロビン組成を有する血液サンプル中のヘモグロビンの種類の識別及び定量化を示す。（Ａ）ＳＳサンプル、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）を有するＳＣＤ、及び（Ｂ）ＳＡサンプル、鎌状赤血球形質（ＳＣＴ）が示されている。（ｉ）ＨｅｍｅＣｈｉｐに形成されたヘモグロビンバンド（ポンソーＳで染色されている）は、Ｃ／Ａ２、Ｓ、Ｆ、及びＡ０ヘモグロビンの識別を可能にする。（ｉｉ）測定され、ＨｅｍｅＣｈｉｐ長を通して平均化された各ピクセルの輝度は、ヘモグロビンの種類のＡ０及びＳを識別する強度ピークを明らかにする。Ｈｂ量は、各ヘモグロビンの種類の強度ピーク下の面積を計算することによって定量化される（ＡＵは任意の単位を表す）。（ｉｉｉ）画像処理により得られたヘモグロビンバンドピクセル強度の３次元表面プロファイル。（ｉｖ）ＨｅｍｅＣｈｉｐ、ＨＰＬＣ、及びベンチトップ電気泳動を用いて測定されたヘモグロビンの割合が比較されている。
【図４】Ａ〜Ｆ。ＨＰＬＣ標準でのＨｅｍｅＣｈｉｐヘモグロビン定量化の比較を示す。（Ａ〜Ｅ）ＨｅｍｅＣｈｉｐヘモグロビン定量効率に対するＨＰＬＣの比較についての相関プロットは、個々のヘモグロビンの種類Ｈｂ  Ｃ／Ａ２、Ｈｂ  Ｓ、ＨｂＦ、及びＨｂ  Ａ０についても全てのヘモグロビンの種類についても高い正の相関（ＰＣＣ＞０．９６、ｐ＜０．００１）を示す。（Ｅ）データセットは、１２の異なる患者の血液サンプル（２×ＳＳ、１×ＳＳ  ＨＰＦＨ、１×臍帯血、３×ＳＣ、５×ＳＡ）及び４３の個々の実験の合計からなる。（Ｆ）ブランドアルトマンプロットは、推定％ＨｂＳと実際の％ＨｂＳとの間に強い一致（ＳＤ差＝７％ＨｂＳ）を示す（実線＝平均値の差；破線＝２ＳＤ差）。実際の％ＨｂＳと推定の％ＨｂＳとの差の大部分（９５．５％）は、差の平均の２標準偏差の範囲内にある。ヘモグロビンの種類は、ドットの色で示されている。
【図５】Ａ〜Ｂ。各ヘモグロビンバンドの移動距離を示す。（Ａ）設定条件下（２５０Ｖ、１〜２ｍＡ、８分間）での、各ヘモグロビンバンドの適用点からのｍｍでの移動距離。これらの距離は、ＨｅｍｅＣｈｉｐをマークするために使用され、全体的な診断のための各ヘモグロビンの種類の分離及び存在を識別するために使用される。このデータセットは、１１の異なる患者の血液サンプル（３×ＳＳ、２×ＳＳ  ＨＰＦＨ、２×臍帯血、２×ＳＣ、２×ＳＡ）及び複数のヘモグロビンバンド（２０×Ｈｂ  Ｃ／Ａ２、２８×Ｈｂ  Ｓ、１１×Ｈｂ  Ｆ、及び７×Ｈｂ  Ａ０）をもたらした３２の実験からなる。各ヘモグロビングループの個々の水平な線は、このデータセットの平均を表す。ヘモグロビンのグループ間の水平な線は、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定（ｐ＜０．００１）に基づく統計的に有意な差を表す。（Ｂ）受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、サンプル適用点からの移動距離に基づいて、隣接するヘモグロビンバンドを区別するための感度及び特異性を示す。定義されたバンドの移動距離の閾値が示されている（ｏ＝７．５ｍｍ、Δ＝１０．０ｍｍ、及び□＝１２．５ｍｍ）。定義された閾値について、ＲＯＣ曲線は、ヘモグロビンの種類の識別のために０．８９を超える感度及び０．８６を超える特異性を示した。
【図６Ａ】追加のサンプルの分析及び標準的な方法との比較を示す。プロットプロファイル（ｉｉ）の網掛け赤領域は、ヘモグロビン定量化のために選択した領域を表す。（Ａ）ヘモグロビンＳＣ病（ＨｂＳＣ）を有するサンプル。（Ｂ）高いＨｂＦレベルを有する臍帯血。（Ｃ）ＨｂＳが低レベルでＨｂＡ０が高レベルであるＳＣＴ（ＨｂＳＡ）を有するサンプル。
【図６Ｂ】追加のサンプルの分析及び標準的な方法との比較を示す。プロットプロファイル（ｉｉ）の網掛け赤領域は、ヘモグロビン定量化のために選択した領域を表す。（Ａ）ヘモグロビンＳＣ病（ＨｂＳＣ）を有するサンプル。（Ｂ）高いＨｂＦレベルを有する臍帯血。（Ｃ）ＨｂＳが低レベルでＨｂＡ０が高レベルであるＳＣＴ（ＨｂＳＡ）を有するサンプル。
【図６Ｃ】追加のサンプルの分析及び標準的な方法との比較を示す。プロットプロファイル（ｉｉ）の網掛け赤領域は、ヘモグロビン定量化のために選択した領域を表す。（Ａ）ヘモグロビンＳＣ病（ＨｂＳＣ）を有するサンプル。（Ｂ）高いＨｂＦレベルを有する臍帯血。（Ｃ）ＨｂＳが低レベルでＨｂＡ０が高レベルであるＳＣＴ（ＨｂＳＡ）を有するサンプル。
【図７】ウェブベースの画像処理データフロー及び結果の比較を示す。
【図８】Ａ〜Ｂ。細胞、膜及び接着（ＣＭＡ）の相互作用を評価するマイクロ流体バイオチップを示す。（Ａ）ＳＣＤにおける細胞構成成分と細胞内構成成分との間の潜在的な相互作用のサブセットが示されている。異常な相互作用が、ｉ）ＲＢＣを含有する酸化ＨｂＳ；ｉｉ）可溶性架橋タンパク質（すなわち、例えば、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）及び／又はフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）；サイトカイン及び／又は白血球（例えば、ＣＤ１１ｂ＋単球）；ｉｖ）インテグリン、インテグリン受容体、接着分子、及びセレクチンを含むがこれらに限定されない分子を含む活性化内皮細胞；ｉｖ）ＴＳＰ、ｖＷＦ、フィブロネクチン、及びラミニンを含むがこれらに限定されない内皮下層マトリックス成分；並びにｉｖ）内皮にも直接接着する活性化ＷＢＣ（ＭＡＣ−１＋、ＬＦＡ−１＋、ＶＬＡ−４＋好中球）の間で発生し得る。（Ｂ）ＳＣＤマイクロ流体バイオチップのための一実施形態の概略図。挿入図：分析のための末梢血サンプルを充填したマイクロ流体チャネルを含むバイオチップの写真。
【図９−１】Ａ〜Ｂ。生理学的な流動条件における赤血球（ＲＢＣ）の接着及び変形能の評価のためのＳＣＤマイクロ流体バイオチップシステムの概要を示す。（Ａ）未処理の全血を調べることができる、５０μｍの高さのチャネルを含むマイクロ流体バイオチップ。該マイクロ流体バイオチップは、単一ＲＢＣの高解像度の画像記録及び分析用の自動化顕微鏡ステージ上に配置される。（Ｂ）該マイクロ流体バイオチップ内の３Ｄ層流速度プロファイルの存在下で、フィブロネクチン官能化表面上の、流動しているＲＢＣ及び接着しているＲＢＣの図。（Ｃ）マイクロ流体チャネル内で観察されるように、接着している鎌状ＲＢＣ形態の不均一性を示す代表的なデータ。異なるレベルの鎌状化の影響を有する同じ血液サンプルからのＲＢＣが示されている：（ｉ）軽度の影響を受けたＲＢＣ、（ｉｉ）適度に影響を受けたＲＢＣ、及び（ｉｉｉ）非常に影響を受けたＲＢＣ。スケールバーは５μｍ長を表す。
【図９Ｃ】生理学的な流動条件における赤血球（ＲＢＣ）の接着及び変形能の評価のためのＳＣＤマイクロ流体バイオチップシステムの概要を示す。（Ａ）未処理の全血を調べることができる、５０μｍの高さのチャネルを含むマイクロ流体バイオチップ。該マイクロ流体バイオチップは、単一ＲＢＣの高解像度の画像記録及び分析用の自動化顕微鏡ステージ上に配置される。（Ｂ）該マイクロ流体バイオチップ内の３Ｄ層流速度プロファイルの存在下で、フィブロネクチン官能化表面上の、流動しているＲＢＣ及び接着しているＲＢＣの図。（Ｃ）マイクロ流体チャネル内で観察されるように、接着している鎌状ＲＢＣ形態の不均一性を示す代表的なデータ。異なるレベルの鎌状化の影響を有する同じ血液サンプルからのＲＢＣが示されている：（ｉ）軽度の影響を受けたＲＢＣ、（ｉｉ）適度に影響を受けたＲＢＣ、及び（ｉｉｉ）非常に影響を受けたＲＢＣ。スケールバーは５μｍ長を表す。
【図１０Ａ】非流動条件下、流動条件下及び剥離条件下で示される健常ＲＢＣ（ＨｂＡ含有）並びに鎌状ＲＢＣ（ＨｂＳ含有、変形可能及び変形不能）のアスペクト比（ＡＲ）並びに変形能の例示的なデータを示す。（Ａ）非流動条件下、流動条件下及び剥離条件下での健常ＲＢＣ及び鎌状ＲＢＣが示されている。異なる実験群におけるＲＢＣの剥離が生じる流速は、各列の下に記載されている。白の点線は、非流動条件下でのＲＢＣの初期位置を示す。流動方向は矢印で示されている。スケールバーは５μｍ長を表す。各フレーム内の細胞のアスペクト比（ＡＲ）は、画像の左下に設けられている。（Ｂ）異なるＲＢＣグループの細胞のＡＲは、非流動条件下、流動条件下及び剥離条件下で測定される。ＨｂＡ細胞は、非流動条件から剥離条件のＡＲで連続的減少を示すが、ＨｂＳ変形不能細胞は、剥離を介して全ての状態でそれらの初期のＡＲを保っている。（Ｃ）健常ＲＢＣ及び鎌状ＲＢＣの変形能（例えば、非流動条件下に関する細胞ＡＲ変化率）。ＨｂＡ及びＨｂＳ変形可能ＲＢＣの変形能は、流動条件から剥離条件で有意に増加するが、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣは同じままである。
【図１０Ｂ】非流動条件下、流動条件下及び剥離条件下で示される健常ＲＢＣ（ＨｂＡ含有）並びに鎌状ＲＢＣ（ＨｂＳ含有、変形可能及び変形不能）のアスペクト比（ＡＲ）並びに変形能の例示的なデータを示す。（Ａ）非流動条件下、流動条件下及び剥離条件下での健常ＲＢＣ及び鎌状ＲＢＣが示されている。異なる実験群におけるＲＢＣの剥離が生じる流速は、各列の下に記載されている。白の点線は、非流動条件下でのＲＢＣの初期位置を示す。流動方向は矢印で示されている。スケールバーは５μｍ長を表す。各フレーム内の細胞のアスペクト比（ＡＲ）は、画像の左下に設けられている。（Ｂ）異なるＲＢＣグループの細胞のＡＲは、非流動条件下、流動条件下及び剥離条件下で測定される。ＨｂＡ細胞は、非流動条件から剥離条件のＡＲで連続的減少を示すが、ＨｂＳ変形不能細胞は、剥離を介して全ての状態でそれらの初期のＡＲを保っている。（Ｃ）健常ＲＢＣ及び鎌状ＲＢＣの変形能（例えば、非流動条件下に関する細胞ＡＲ変化率）。ＨｂＡ及びＨｂＳ変形可能ＲＢＣの変形能は、流動条件から剥離条件で有意に増加するが、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣは同じままである。
【図１０Ｃ】非流動条件下、流動条件下及び剥離条件下で示される健常ＲＢＣ（ＨｂＡ含有）並びに鎌状ＲＢＣ（ＨｂＳ含有、変形可能及び変形不能）のアスペクト比（ＡＲ）並びに変形能の例示的なデータを示す。（Ａ）非流動条件下、流動条件下及び剥離条件下での健常ＲＢＣ及び鎌状ＲＢＣが示されている。異なる実験群におけるＲＢＣの剥離が生じる流速は、各列の下に記載されている。白の点線は、非流動条件下でのＲＢＣの初期位置を示す。流動方向は矢印で示されている。スケールバーは５μｍ長を表す。各フレーム内の細胞のアスペクト比（ＡＲ）は、画像の左下に設けられている。（Ｂ）異なるＲＢＣグループの細胞のＡＲは、非流動条件下、流動条件下及び剥離条件下で測定される。ＨｂＡ細胞は、非流動条件から剥離条件のＡＲで連続的減少を示すが、ＨｂＳ変形不能細胞は、剥離を介して全ての状態でそれらの初期のＡＲを保っている。（Ｃ）健常ＲＢＣ及び鎌状ＲＢＣの変形能（例えば、非流動条件下に関する細胞ＡＲ変化率）。ＨｂＡ及びＨｂＳ変形可能ＲＢＣの変形能は、流動条件から剥離条件で有意に増加するが、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣは同じままである。
【図１１−１】Ａ〜Ｂ。ＨｂＡ及びＨｂＳ含有変形可能ＲＢＣと比較した、相対的により高い流速、剪断応力、及び抗力でのＨｂＳ含有変形不能ＲＢＣの剥離の例示的なデータを示す。（Ａ）流動中のＲＢＣの連続画像は、位相コントラストモードでは倒立顕微鏡を用いて記録される。接着ＲＢＣと自由流動ＲＢＣの両方が画像解析で示されている。（Ｂ）マイクロチャネル内で局所的に測定された流速と計算された平均流速との相関が示されている（ピアソン相関係数０．９４、ｐ＜０．００１）。（Ｃ）剥離瞬間のチャネル幅（ｘ軸）及び平均局所流速（点線）に対する、マイクロチャネル内の接着ＨｂＡ、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣ及びＨｂＳ変形可能ＲＢＣの相対的な位置。ＨｂＳ変形不能ＲＢＣは、流速の面でＨｂＡ及びＨｂＳ変形可能ＲＢＣよりも有意に異なっている。（Ｄ）剥離時のＨｂＡ  ＲＢＣと、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣとＨｂＳ変形可能ＲＢＣの間の剪断応力の相対的な違い。（Ｅ）剥離時のＨｂＡ  ＲＢＣと、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣとＨｂＳ変形可能ＲＢＣの間の抗力の相対的な違い。
【図１１−２】Ｃ〜Ｅ。ＨｂＡ及びＨｂＳ含有変形可能ＲＢＣと比較した、相対的により高い流速、剪断応力、及び抗力でのＨｂＳ含有変形不能ＲＢＣの剥離の例示的なデータを示す。（Ａ）流動中のＲＢＣの連続画像は、位相コントラストモードでは倒立顕微鏡を用いて記録される。接着ＲＢＣと自由流動ＲＢＣの両方が画像解析で示されている。（Ｂ）マイクロチャネル内で局所的に測定された流速と計算された平均流速との相関が示されている（ピアソン相関係数０．９４、ｐ＜０．００１）。（Ｃ）剥離瞬間のチャネル幅（ｘ軸）及び平均局所流速（点線）に対する、マイクロチャネル内の接着ＨｂＡ、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣ及びＨｂＳ変形可能ＲＢＣの相対的な位置。ＨｂＳ変形不能ＲＢＣは、流速の面でＨｂＡ及びＨｂＳ変形可能ＲＢＣよりも有意に異なっている。（Ｄ）剥離時のＨｂＡ  ＲＢＣと、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣとＨｂＳ変形可能ＲＢＣの間の剪断応力の相対的な違い。（Ｅ）剥離時のＨｂＡ  ＲＢＣと、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣとＨｂＳ変形可能ＲＢＣの間の抗力の相対的な違い。
【図１２】Ａ〜Ｌ。ＨｂＡ含有ＲＢＣ及びＨｂＳ含有ＲＢＣについての流動開始時の投影された細胞輪郭の分析に基づいて、細胞接着部位の決定を示す例示的データを示す。（Ａ〜Ｄ）ＨｂＡ含有ＲＢＣ；（Ｅ〜Ｈ）ＨｂＳ含有変形可能ＲＢＣ；及び（Ｉ〜Ｌ）ＨｂＳ含有変形不能ＲＢＣについての、０．２８秒かけて撮影した３つの連続フレーム内の個々のＲＢＣの輪郭が、流体の流動開始に応答した細胞の動きを反映するように投影されている。
【図１３】Ａ〜Ｄ。ＳＣＤ−バイオチップの開発手順の概要を示す。（Ａ）免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ＢＣＡＭ／ＬＵ及びインテグリンファミリー（α４β１）からの接着受容体は、内皮及び内皮下結合タンパク質のＦＮ及びＬＮへの接着を標的としている。（Ｂ）ＦＮ及びＬＮは、架橋剤（ＧＭＢＳ）及び自己組織化シラン単分子層コーティング（ＡＰＴＥＳ）を介してガラススライドに共有結合している。（Ｃ）微細加工された入口及び出口を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）カバー、チャネルの形状及び高さを画定する両面接着（ＤＳＡ）層、並びにガラススライドベースで構成されたＳＣＤバイオチップのアセンブリ。（Ｄ）生細胞の撮像のための顕微鏡ステージ上に配置されたＳＣＤバイオチップ。
【図１４】Ａ〜Ｆ。ＳＣＤヘモグロビン表現型の中でのＦＮ及びＬＮ官能化マイクロチャネルにおけるＲＢＣ接着の変化の例示的なデータを示す。（Ａ〜Ｂ）ＦＮ又はＬＮにおけるマイクロチャネルの高解像度画像。（Ｃ〜Ｄ）接着したＲＢＣの数は、ＦＮ及びＬＮ固定マイクロチャネルの両方においてＨｂＳＳ＞ＨｂＳＣ／Ｓβ＋＞ＨｂＡＡの順で、対象からのサンプルにおいて有意に高かった。個々のグループ間の水平な線は、一方向ＡＮＯＶＡ検定に基づいて、統計的に有意な差を表す（Ｐ＜０．０５）。データポイントのクロスバーは平均を表す。「Ｎ」は対象の数を表す。（Ｅ〜Ｆ）受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、ＦＮ及びＬＮ上のＲＢＣの接着に基づいて、ＳＳ−ＡＡ、ＳＣ−ＡＡ、及びＳＳ−ＳＣのヘモグロビン表現型の間の区別のための真陽性率（感度）及び偽陽性率（１−特異性）を表す。ＲＯＣ上の接着ＲＢＣ数について定義された閾値が示されている（ＦＮについて◇＝９、□＝９、及び〇＝３０；ＬＮについて◇＝１６、□＝１６、及び〇＝１７０）。ＲＯＣは、ＳＳとＳＣ間の区別と比較して、ＡＡとＳＳ間又はＡＡとＳＣ間の区別において最も強かった。
【図１５】Ａ〜Ｂ。高い（＞８％）ＨｂＦと比較して、低い（＜％８）ＨｂＦを有するＨｂＳＳ対象においてより多いＲＢＣのＲＢＣ接着の例示的なデータを示す。（Ａ〜Ｂ）ＲＢＣ接着を、高いＨｂＦレベル及び低いＨｂＦレベルを有するＨｂＳＳ患者の血液サンプルにおいて定量化した。接着ＲＢＣ数は、ＦＮ及びＬＮ固定マイクロチャネルの両方で、高いＨｂＦレベルを有する対象からの血液サンプルと比較して、低いＨｂＦレベルを有する対象からの血液サンプルにおいて有意に高かった。個々のグループ間の水平な線は、一方向ＡＮＯＶＡ検定に基づいて、統計的に有意な差を表す（Ｐ＜０．０５）。データポイントのクロスバーは平均値を表す。「ｎ」は対象の数を表す。
【図１６】Ａ〜Ｄ。ＨｂＳＳにおけるＲＢＣ接着と乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＲＢＣ接着と血小板数（ｐｌｔ）、及びＲＢＣ接着と網状赤血球数（ｒｅｔｉｃｓ）との間の関連付けの例示的なデータを示す。（Ａ〜Ｂ）ＦＮマイクロチャネル内の接着ＲＢＣ数は、それぞれ（Ａ）高ＬＤＨ（＞５００  Ｕ／Ｌ）及び（Ｂ）高ｐｌｔ（＞３２０  １０９／Ｌ）を有する血液サンプルで有意に高かった。（Ｃ〜Ｄ）（Ｃ）高ＬＤＨ（＞５００  ｕ／Ｌ）及び（Ｄ）ｒｅｔｉｃｓ（＞３２０  １０９／Ｌ）を有する血液サンプル中のＲＢＣは、それぞれ低ＬＤＨ（＜５００Ｕ／Ｌ）及び低ｒｅｔｉｃｓ（＜３２０  １０９／Ｌ）と比較して、ＬＮ固定マイクロチャネルへの顕著により高い接着を示した。個々のグループ間の水平な線は、一方向ＡＮＯＶＡ検定に基づいて、統計的に有意な差を表す（Ｐ＜０．０５）。データポイントのクロスバーは平均値を表す。「ｎ」は対象の数を表す。
【図１７】Ａ〜Ｇ。ＦＮ官能化マイクロチャネル内の接着ＲＢＣ及び血清ＬＤＨ値との関連における不均一性の例示的なデータを示す。（Ａ〜Ｃ）ＨｂＳＳ血液サンプル中の接着ＲＢＣ数及び形態を、段階的に増加させた流速；（Ａ）０．８ｍｍ／ｓ、（Ｂ）３．３ｍｍ／ｓ、及び（Ｃ）４１．７ｍｍ／ｓで分析した。（Ｄ〜Ｅ）変形可能ＲＢＣ（特徴的な両凹形状）及び変形不能ＲＢＣ（特徴的な両凹形状なし）を、形態学的特徴に基づいて決定した。スケールバーは５μｍの長さを表す。（Ｆ）０．８ｍｍ／ｓの流速で、接着した全ＲＢＣにおける変形可能ＲＢＣ及び変形不能ＲＢＣの割合を計算した。０．８ｍｍ／ｓの流速では、変形可能ＲＢＣと変形不能ＲＢＣの割合の間に有意差はなかった（Ｐ＝０．２６６）が、変形不能ＲＢＣの割合は、４１．７ｍｍ／ｓの流速で変形可能ＲＢＣの割合より有意に高かった。個々のグループ間の水平な線は、一方向ＡＮＯＶＡ検定に基づいて、統計的に有意な差を表す（Ｐ＜０．０５）。エラーバーは平均の標準誤差を表す。「ｎ」は対象の数を表す。（Ｇ）０．８ｍｍ／ｓでの、接着した変形不能ＲＢＣとＬＤＨの割合間に統計的に有意な相関が観察された（ピアソン相関係数０．７９、ｎ＝２１サンプル）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書で定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。「ａ」、「ａｎ」及び「その」などの用語は、単数の実体だけでなく複数の実体も指すことを意図し、特定の実施例が説明のために使用することができる一般的なクラスも含む。この用語は、本明細書では、本発明の特定の実施形態を記載するために使用されるが、その用法は、特許請求の範囲で概説される場合を除き、本発明を限定するものではない。
【００２６】
本明細書で使用する用語「マイクロチャネル」は、液体及び気体の移動を可能にする媒体（例えば、シリコン）を通る経路を指す。したがって、マイクロチャネルは、他の構成要素を連結する、すなわち、構成要素を「流体連通」した状態にすることができる。本発明は、チャネルの正確な寸法によって制限されることを意図しないが、チャネルの例示的な範囲は以下の通りである：これらのチャネルは、深さが０．３５〜１００μｍ（好ましくは５０μｍ）であり、幅が５０〜１０００μｍ（好ましくは４００μｍ）であり得る。チャネル長は、４ｍｍ〜１００ｍｍ、又は約２７ｍｍであり得る。「電気泳動チャネル」は、生物学的物質（例えば、全部の細胞、タンパク質、脂質、核酸）の差動移動に役立つ材料（例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、酢酸セルロース紙）で実質的に満たされたチャネルである。特に、電気泳動チャネルは、それぞれのヘモグロビン含有量中の変異に基づいて血液細胞の差動移動に役立ち得る。
【００２７】
本明細書で使用する用語「微細加工」、「微細機械加工」及び／又は「微細製造」は、小規模（例えば、構成要素がミクロンサイズの寸法を有する場合）もしくはマイクロスケールで装置を組み立てる、構築する、アセンブルする、又は作製することを意味する。一実施形態において、電気泳動装置は、約ミリメートルからセンチメートルのサイズ範囲で微細加工されている（「微細加工電気泳動装置」）。
【００２８】
用語「アガロースゲル」、「ポリアクリルアミドゲル」、及び「酢酸セルロース」は、それを通して電気泳動が行われ、分子ふるいに貢献する流体相の対流混合を抑制する媒体を意味すると当技者が理解する用語である。例えば、ポリアクリルアミドゲルは、架橋されていても又は架橋されていなくてもよい。用語「架橋」は、ポリマーがネットワークとして、溶解により強く、より耐性となり、電気泳動に用いた場合、サンプル成分のより良好な分離を可能にするようなポリマー（例えば、ポリアクリルアミド）の鎖の相互結合を意味する。ビスアクリルアミドは、アクリルアミド電気泳動で使用される架橋剤の例である。
【００２９】
用語「ポリマー」は、同じ物質の２つ以上の分子から形成された物質を指す。ポリマーの例としては、ゲル、架橋ゲル及びポリアクリルアミドゲルが挙げられる。ポリマーはまた、線状ポリマーであってもよい。線状ポリマー中で分子は、互いに平行又はほぼ平行な鎖で主に整列している。非線状ポリマー中では、分子の平行整列は必要とされない。
【００３０】
本明細書で使用する用語「マイクロ電気泳動装置」は、電気泳動を行うために小規模（例えば、ミクロンサイズの成分）装置を指す。一実施形態において、該マイクロ電気泳動装置は、幅約４０００μｍ以下で深さ２０００μｍ以下の電気泳動チャネルを含むことが企図される。
【００３１】
本明細書で使用する用語「電極」は、それを通じで電流が、例えば、電気泳動ゲル又は他の媒体に侵入するか又は離れる導電体を指す。
【００３２】
本明細書で使用する用語「チャネルスペーサー」は、リソグラフィエッチングを支持できる固体基板を指す。チャネルスペーサーは、１つ又はそれ以上のマイクロチャネルを含んでもよく、それぞれ上部キャップと底部キャップとの間で二重の接着フィルムを用いて外部環境から密封されている。
【００３３】
本明細書で使用する用語「レンズレス撮像システム」は、光の波とは対照的に、電気信号に基づいて画像を収集する光学構成を指す。例えば、レンズレス画像は、発光ダイオードからの放出により電荷結合素子センサ（ＣＣＤ）の励起によって形成され得る。
【００３４】
本明細書で使用する用語「電荷結合素子（ＣＣＤ）」は、通常、装置内から電荷を操作するできる領域への電荷の移動、例えば、デジタル値への変換のための装置を指す。ピクセルがｐドープされたＭＯＳキャパシタによって表されるＣＣＤイメージセンサを使用する場合に、ＣＣＤはデジタル画像を提供する。
【００３５】
本明細書で使用する用語「有することが疑われる」は、鑑別診断を提供するには不十分である、患者が示す医学的状態又は医学的状態のセット（例えば、予備症状）を指す。それにもかかわらず、示される状態（複数可）は、診断の基礎となるさらなる情報を得るために、さらなる試験（例えば、自己抗体検査）を正当化する。
【００３６】
本明細書で使用する用語「危険性がある」は、患者を特定の疾患又は苦痛にかかりやすくし得る、患者が示す医学的状態又は医学的状態のセットを指す。例えば、これらの状態は、行動的、感情的、化学的、生化学的、又は環境の影響を含むが、これらに限定されない影響から生じ得る。
【００３７】
本明細書で使用する用語「症状」は、患者によって観察される疾患もしくは物理的な障害の任意の主観的又は客観的証拠を指す。例えば、主観的な証拠は、通常、患者の自己申告に基づいており、疼痛、頭痛、視覚障害、悪心及び／又は嘔吐を含み得るが、これらに限定されない。あるいは、客観的証拠は、通常、体温、全血球数、脂質パネル、甲状腺パネル、血圧、心拍数、心電図、組織及び／又は身体の撮像スキャンを含むが、これらに限定されない医療検査の結果である。
【００３８】
本明細書で使用する用語「疾患」又は「医学的状態」は、生命機能の能力を妨害又は変更する、生きている動物もしくは植物の体又はその部分の１部の正常な状態のなんらかの機能障害を指す。典型的には、徴候及び症状を区別することによって明らかにされるが、疾患又は医学的状態は、通常、ｉ）環境要因（栄養失調、産業上の危険、又は気候など）；ｉｉ）特定の感染性因子（線虫、細菌、又はウイルスなど）；ｉｉｉ）生物の固有の欠陥（遺伝子異常など）；及び／又はｉｖ）これらの因子の組み合わせに応答する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「患者」又は「対象」は、ヒト又は動物であり、入院する必要はない。例えば、外来患者、老人ホームの人々は「患者」である。患者は、ヒト又は非ヒト動物の全ての年齢を含むことができ、したがって、成人及び青少年（すなわち、子供）の両方を含む。用語「患者」は、医学的処置の必要性を暗示することを意図するものではなく、したがって、患者は、臨床研究であろうと又は基礎科学研究の支援であろうと、実験の一部に自発的に又は非自発的になり得る。
【００４０】
本明細書で使用する用語「親和性」は、物質又は粒子を化学結合に加わらせ、化学結合させた状態にする物質又は粒子間の任意の引力を指す。例えば、受容体に対して高い親和性を有する阻害剤化合物は、低い親和性を有する阻害剤よりも、受容体とその天然リガンドとの相互作用の阻止においてより高い有効性を提供するであろう。
【００４１】
本明細書で使用する用語「由来する」は、化合物又はサンプルの供給源を指す。一態様において、化合物又はサンプルは、生物又は特定の種に由来し得る。
【００４２】
用語「抗体」は、免疫原（抗原）により動物において誘発される免疫グロブリンを指す。抗体は、免疫原に含まれるエピトープに特異性を示すことが望ましい。用語「ポリクローナル抗体」は、プラズマ細胞の複数のクローンから産生される免疫グロブリンを指し、対照的に、「モノクローナル抗体」は、血漿細胞の単一クローンから産生される免疫グロブリンを指す。
【００４３】
用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、抗体とタンパク質又はペプチドの相互作用に関して使用される場合、相互作用は、タンパク質上の特定の構造（すなわち、例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味し；言い換えれば、抗体は、タンパク質全般ではなく特定のタンパク質構造を認識し、結合している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」及び抗体を含有する反応におけるエピトープＡ（又は遊離の非標識Ａ）含有タンパク質の存在は、抗体に結合した標識Ａの量を減少させる。
【００４４】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられ、環境的及び生物学的サンプルを含む。環境サンプルは、土壌及び水などの環境からの材料を含む。生物学的サンプルは、ヒトを含む動物、流体（例えば、血液、血漿及び血清）、固体（例えば、糞便）、組織、液体食品（例えば、ミルク）、並びに固形食品（例えば、野菜）であり得る。生物学的サンプルは、細胞、組織抽出物、体液、染色体又は細胞から単離された染色体外要素、（溶液中の又はサザンブロット分析用などの固体支持体に結合した）ゲノムＤＮＡ、（溶液中の又はノーザンブロット分析用などの固体支持体に結合した）ＲＮＡ、（溶液中の又は固体支持体に結合した）ｃＤＮＡなどを含み得る。
【００４５】
本明細書で使用する用語「バイオアフィニティーリガンド」、「結合成分」、「目的の分子」、「目的の薬剤」、「リガンド」又は「受容体」は、多数の異なる分子、生物学的細胞又は凝集体のいずれかであり得、これらの用語は互換的に使用される。各結合成分は、固体基板上に固定化することができ、検出される検体に結合する。タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド）、抗体、リガンド、糖類、多糖類、細菌、真菌及びウイルスなどの微生物、受容体、抗生物質、試験化合物（特に、コンビナトリアルケミストリーによって生成されるもの）、植物、及び動物細胞、それぞれの及び他の生物学的実体のオーガンジー又は画分は各々、結合成分であり得る。ひいては、各々がマイクロ流体バイオチップ上の結合成分に結合する場合に、検体とみなされ得る。
【００４６】
本明細書で使用する用語「結合」又は「接着」は、永続的又は一時的であってよい任意の物理的接着又は強い結合を含む。一般に、水素結合、疎水性力、ファンデルワールス力、共有結合及びイオン結合などの相互作用は、目的の分子と測定される検体との間の物理的な接着を容易にする。「結合」の相互作用は、結合が化学反応を発生させる状況のように短くて良い。それは、結合成分が酵素であり、検体が酵素の基質である場合に典型的である。結合剤と検体との間の接触から生じる反応も、本発明の目的のための結合の定義内である。
【００４７】
本明細書で使用する用語「基盤」は、マイクロチャネルを含み得る表面及び固相を指す。場合によって、基盤は固体であり、ＰＤＭＳを含み得る。基盤は、ガラス、シリコン、石英、プラスチック、又はフォトリソグラフィーを支持することができる任意の他の組成物を含むが、これらに限定されない成分も含み得る。
【００４８】
本明細書で使用する用語「フォトリソグラフィー」、「光リソグラフィー」又は「ＵＶリソグラフィー」は、薄膜又は基板のバルクの部分にパターン形成するための微細加工で使用されるプロセスを指す。これは、フォトマスクから基板上の感光性化学物質「フォトレジスト」、又は単に「レジスト」に幾何学的なパターンを転写するために光を使用する。その後に、一連の化学処理によって、フォトレジストの下の材料に露光パターンが彫り込まれるか、又はその上に所望のパターンの新材料の堆積が可能になる。例えば、複雑な集積回路では、近代的なＣＭＯＳウェハは、５０回までのフォトリソグラフィサイクルを受ける。
【００４９】
本明細書に記載の実施形態は、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症（ＳＣＤ））などのヘモグロビン障害を迅速かつ容易に診断し、臨床的に意味のある方法で疾患の重症度、今後の疼痛発作、治療反応、及び治療効果を監視するために対象の赤血球及び白血球などの血液細胞の膜特性、細胞特性及び接着特性を定量化するためのバイオチップ並びにバイオチップの使用に関する。
【００５０】
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）
ＳＣＤは、ヘモグロビン遺伝子中の単一変異に起因し得る遺伝性の血液障害であると考えられている。「鎌状」ヘモグロビンに起因する貧血は、１９１０年に米国で最初に臨床的に記載され、変異した遺伝性鎌状ヘモグロビン分子が１９４９年に特定された。Ｈｅｒｒｉｃｋ  Ｊ．、「重度の貧血の場合の特有の細長い鎌状赤血球小体（Ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｅｌｏｎｇａｔｅｄ  ａｎｄ  ｓｉｃｋｌｅ−ｓｈａｐｅｄ  ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  Ｃｏｒｐｕｓｃｌｅｓ  ｉｎ  ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｎｅｍｉａ）」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９１０；及びＰａｕｌｉｎｇら、「鎌状赤血球貧血、分子病（Ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ，  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０９：４４３  １９４９。
【００５１】
ヘモグロビンは、酸素を運ぶ赤血球中のタンパク質である。ＳＣＤの病態生理は、赤血球の膜特性、形状、密度、及び／又は完全性に影響を与える脱酸素鎌状ヘモグロビンの異常な重合の結果であると考えられている。さらに、これらの影響は、炎症細胞及び内皮細胞機能の変化につながると考えられている。ＳＣＤのいくつかの臨床結果は、疼痛を伴う発作、広範な臓器障害、及び早期死亡を含み得るが、これらに限定されない。
【００５２】
正常なヘモグロビン（ＨｂＡ）は、通常、α鎖及びβ鎖で構成されている。鎌状変異したβ鎖の１コピーと、正常なβ鎖の１コピーを継承する個人は、鎌状赤血球形質（ＨｂＡＳ）を有する。これらの人々は健康であるが、無意識のうちに自分の子供にＳＣＤを伝播する可能性がある。鎌状変異したβ鎖（ＨｂＳＳ）の２コピーを継承する個人は、ＳＣＤを発症する。鎌状鎖の１コピー及び異常β鎖Ｃの１コピーを保有する個人は、複合ヘテロ接合性ＨｂＳＣを有する。ＨｂＳＣは、より軽度ではあるが、なお衰弱性ＳＣＤ型をもたらす。Ｎａｇｅｌら、「ヘモグロビンＳＣ病のパラドックス（ｔｈｅ  ｐａｒａｄｏｘ  ｏｆ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ＳＣ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７：１６７−１７８（２００３）。現在診断されたＳＣＤ集団の約２／３が、ホモ接合性ＨｂＳＳであると考えられており、１／４が複合ヘテロ接合性ＨｂＳＣ形質を有する。残りのＳＣＤ集団はＨｂＳベータサラセミアの患者で構成されており、その中でＨｂＳ及び少量のＨｂＡが作られる（又はＨｂＡが全く作られない）。
【００５３】
ＳＣＤは、認識されている分子疾患であり、ヘモグロビン中のベータグロビン遺伝子の変異によって引き起こされる。Ｐａｕｌｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１０（２８６５）：５４３−５４８（１９４９）。β−グロビン鎖の６番目の位置での疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸の置換は、細胞内ＨｂＳの重合及び細胞内の堅いヘモグロビンポリマー構造の形成につながる。Ｂａｒａｂｉｎｏら、医用生体工学の年次レビュー（Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）１２：３４５−３６７（２０１０）。この変異は、世界中の何百万人もの人々を苦しめており、かなりの罹患率及び死亡率と関連付けられている。Ｐｉａｔｔら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０（２３）：１６３９−１６４４（１９９４）。
【００５４】
ＳＣＤの病態生理は、異常ヘモグロビン重合及びＲＢＣの膜、形状、密度、接着、及び変形能に対する有害な影響の結果である。Ｈｉｌｌｅｒｙら、Ｂｌｏｏｄ  ８７（１１）：４８７９−４８８６（１９９６）；Ｋａｕｌら、Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １６（１）：９７−１１１（２００９）；Ｋａｕｌら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８６（９）：３３５６−３３６０（１９８９）；Ｈｅｂｂｅｌら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３０２（１８）：９９２−９９５（１９８０）；Ｓｔｕａｒｔら、３６４（９４４２）：１３４３−１３６０（２００４）；及びＨｏｏｖｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ５４（４）：８７２−８７６（１９７９）。正常なＲＢＣは、細胞を容易に変形させ、体内の微小血管及び毛細血管を通過することを可能にする特徴的な両凹形状を有している。しかしながら、鎌状ＲＢＣは、変形能の減少、剛性の増加、及び血管閉塞として知られている血管の封鎖を引き起こす異常な接着につながるラジカルな形態転換を受ける。この血管封鎖の結果は、疼痛を伴う発作、広範囲の臓器損傷、及び早期死亡を含む。Ａｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １４１（３）：３６７−３７５（２００８）；Ｍｏｈａｎｄａｓら、Ｂｌｏｏｄ  １１２（１０）：３９３９−３９４８（２００８）；Ｌｉｐｏｗｓｋｙ，Ｈ．Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２（１）：５−１５（２００５）；及びＨｏｆｒｉｃｈｔｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ７１（１２）：４８６４−４８６８（１９７４）。
【００５５】
赤血球（ＲＢＣ）の変形能、接着、溶血、及び流動の変化は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の病態生理学的症状であると考えられている。Ｂａｒａｂｉｎｏら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２：３４５−３６７（２０１０）；及びＡｌｅｘｙら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４６（６）：９１２−９１８（２００６）。ヘモグロビン重合、細胞変形能、接着、血行動態の変化、及び／又は臨床異質性を含む鎌状ＲＢＣの多くの面が調べられている。Ｈｅｂｂｅｌ  Ｒ．Ｐ．，Ｂｌｏｏｄ  ７７（２）：２１４−２３７（１９９１）；Ｆｅｒｒｏｎｅ，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１（２）：１１５−２８（２００４）；Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４：２３９−２６３（１９８５）；Ｎａｓｈら、Ｂｌｏｏｄ  ６３（１）：７３−８２（１９８４）；Ｂｒａｎｄａｏら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ７０（４）：２０７−２１１（２００３）；Ｍｏｈａｎｄａｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ７６（４）：１６０５−１６１２（１９８５）；Ｍｏｎｔｅｓら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ７０（３）：２１６−２２７（２００２）；Ｈｉｌｌｅｒｙら、Ｂｌｏｏｄ  ８７（１１）：４８７９−４８８６（１９９６）；Ｋａｓｓｃｈａｕら、Ｂｌｏｏｄ  ８７（２）：７７１−７８０（１９９６）；Ｂａｒｔｏｌｕｃｃｉら、Ｂｌｏｏｄ  １２０（１５）：３１３６−３１４１（２０１２）；Ｋａｕｌら、Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １６（１）：９７−１１１（２０１２）；Ｋａｕｌら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ７２（１）：２２−３１（１９８３）；Ｌｅｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１０（２８）：１１３２６−１１３３０（２０１３）；Ｂｕｎｎら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３７（１１）：７６２−７６９（１９９７）；Ｂａｌｌａｓら、Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１（２）：２０９−２２５（２００４）；及びＫａｕｌら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８６（９）：３３５６−３３６０（１９８９）。
【００５６】
具体的には、鎌状ＲＢＣの接着（すなわち、例えば、粘着性）及び変形能は、血管閉塞に関与する生物物理学的因子として特定されており、ＳＣＤの重症度と相関することが示されている。Ｈｅｂｂｅｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １００（１１）：Ｓ８３−Ｓ８６（１９９７）；Ｈｅｂｂｅｌら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３０２（１８）：９９２−９９５（１９８０）；及びＢａｌｌａｓら、Ｂｌｏｏｄ  ７９（８）：２１５４−２１６３（１９９２）。これらの要因は、多様な臨床表現型からの血液サンプルを直接分析する際に直面する重要な技術的障壁が原因で個別に研究されていない。この課題は、ＳＣＤなどの異種の多面的な病態の理解への複雑な生物物理学的現象の説得力のある統合に大きな制約を提起している。
【００５７】
ＲＢＣの形態学的、物理的、及び血行力学的特性の劇的な変化は、ＨｂＳ重合によって引き起こされる。Ｂａｒａｂｉｎｏら、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２：３４５−３６７（２０１０）。以前の研究は、ＳＣＤ患者におけるＲＢＣが密度、形態及び機能において不均一であることを示している。Ｋａｕｌら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ７２（１）：２２−３１（１９８３）、Ｆａｂｒｙら、Ｂｌｏｏｄ  ６０（６）：１３７０−１３７７（１９８２）；Ｋａｕｌら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６（２）：１７０−１８１（１９８３）；Ｌｉｐｏｗｓｋｙら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ８０（１）：１１７−１２７（１９８７）；及びＫａｕｌら、Ｂｌｏｏｄ  ６８（５）：１１６２−１１６６（１９８６）。本明細書に提示されたデータは、ＨｂＳ含有ＲＢＣも変形能、接着強度、及び接着部位の数において変化することを示す。加えて、変形可能なＨｂＳ含有ＲＢＣはあまり接着性がないが、変形不能細胞はフィブロネクチン（ＦＮ）により接着性がある。最近の研究では、パーコールで分離した鎌状ＲＢＣのエクタサイトメトリー（ｅｋｔａｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）及びレーザー後方散乱を用いて測定される変形能の減少及びＲＢＣ凝集が、溶血と相関することが示された。Ｃｏｎｎｅｓら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １６５（４）：５６４−５７２（２０１４）。したがって、ＲＢＣの接着及び変形能がＳＣＤを有する対象における血管閉塞及び溶血の構成要素であると考えられている。
【００５８】
アルファサラセミアなどの非ベータ鎖の異常ヘモグロビン症は、特にアジアの子どもたちにおいて主要な世界的健康問題でもある。いくつかの実施形態において、ＨｂＳＳ及びＨｂＳＣなどのベータ鎖異常の電気泳動診断が確立されると、本発明はこの集団を試験するために使用することができることが期待される。この技術は、アルファサラセミアで上昇しているヘモグロビンＢａｒｔ（４つの胎児ベータ型ガンマ鎖）又はＨｂＨ（４つの成人ベータ型鎖）などの追加の変異体ヘモグロビンを検出する必要性に適応可能である可能性もある。
【００５９】
ＳＣＤの病態生理学的変化は、鎌状赤血球（ＲＢＣ）間での接着の変化、活性化白血球（ＷＢＣ）、活性化内皮細胞、循環内皮細胞の異常な数及び循環造血前駆細胞の異常な数を含むが、これらに限定されない（図８Ａ）。しかしながら、観察された病態生理学的相関は、技術的な制限及び限られた専門知識により、広く試験されていない。
【００６０】
ＳＣＤの鎌状ＲＢＣ及びＷＢＣによる内皮への異常な接着が、炎症及び異常な細胞接着によって媒介される疼痛並びに血管障害の原因となり得ることが報告されている。Ｈｅｂｂｅｌら、「鎌状赤血球貧血における内皮への赤血球接着。疾患の重症度の可能性のある決定要因（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ．Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ）」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３０２：９９２−９９５（１９８０）；Ｈｅｂｂｅｌら、「鎌状赤血球症の赤血球／内皮相互作用及び血管閉塞性の重症度（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ／ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｖａｓｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ５５：１４５−１６２（１９８１）；Ｂａｒａｂｉｎｏら、「制御された流動の下での鎌状赤血球と内皮細胞の相互作用、鎌状の特質、機械的に損傷した赤血球、及び正常な赤血球（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ，ｓｉｃｋｌｅ  ｔｒａｉｔ，ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ  ｉｎｊｕｒｅｄ，ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｆｌｏｗ）」、Ｂｌｏｏｄ  ７０：１５２−１５７（１９８７）；及びＢａｒａｂｉｎｏら、「鎌状赤血球症における赤血球と内皮細胞の相互作用のレオロジー研究（Ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２４０：１１３−１２７（１９８７）。ＨｂＳ含有ＲＢＣ、活性化ＷＢＣ、及び活性化内皮細胞の間で相互に結合する無数の異常な相互作用が想定され、ＳＣＤにおいて疼痛及び荒廃をもたらし得る（図８Ａ）。異常な単球、好中球、血小板、並びに内皮細胞の活性化及び接着がＳＣＤに存在し得、血管閉塞発作の補完的モデルから、最初に活性化内皮及び／又は内皮下層マトリックス（すなわち、例えば、ＬＮ、ＦＮ、ｖＷＦを含む）に網状赤血球及び好中球が接着し、その後、高密度（不可逆的鎌状）赤血球の捕捉及び血管閉塞が続くと説明される。Ｓｅｔｔｙら、「鎌状赤血球内皮接着における赤血球のホスファチジルセリンの役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ）」、Ｂｌｏｏｄ  ９９：１５６４−１５７１（２００２）；Ｋａｕｌら、「鎌状赤血球−内皮相互作用（Ｓｉｃｋｌｅ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」、Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １６：９７−１１１（２００９）；及びＦｒｅｎｅｔｔｅら、「鎌状赤血球症：古い発見、新しい概念、及び将来的見込み（Ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｏｌｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ，ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ）」、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７：８５０−８５８（２００７）。
【００６１】
あるいは、エクソビボ及びインビボ実験は、内皮が、鎌状ＲＢＣ由来因子によって活性化されるサイトカイン及び白血球、主に単球によって活性化されることを示唆している。Ｂｅｌｃｈｅｒら、「鎌状赤血球症における活性化単球：血管内皮の活性化及び脈管閉塞における潜在的な役割（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ａｎｄ  ｖａｓｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）」、Ｂｌｏｏｄ  ９６：２４５１−２４５９（２０００）；Ｎａｔａｒａｊａｎら、「インビトロでの流動の下での鎌状赤血球の接着及びインターロイキン−１ベータで刺激された内皮細胞への損傷（Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−  １  ｂｅｔａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒ  ｆｌｏｗ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」Ｂｌｏｏｄ  ８７：４８４５−４８５２（１９９６）；Ｐｅｒｅｌｍａｎら、「胎盤成長因子は、単球を活性化し、鎌状赤血球症の重症度と相関する（Ｐｌａｃｅｎｔａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ）」、Ｂｌｏｏｄ  １０２：１５０６−１５１４（２００３）；及びＺｅｎｎａｄｉら、「鎌状赤血球は内皮へのリンパ球及び単球の接着を誘導する（Ｓｉｃｋｌｅ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」、Ｂｌｏｏｄ  １１２：３４７４−３４８３（２００８）。これらの要因が組み合わさって、互いへの並びに内皮及び内皮下層へのＲＢＣ及び白血球、主に好中球の接着を増加させる。水溶性の架橋因子（すなわち、例えば、ＴＳＰ、ＦＮ、及びｖＷＦ）も関与し得るが、これらの相互作用は定量化されていない。Ｓｔｏｎｅら、「培養内皮細胞への接着に対する鎌状赤血球の密度及び脱水の影響（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｆ  ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」、Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ５２：１３５−１４３（１９９６）；Ｋａｕｌら、「微小循環における鎌状赤血球−内皮相互作用：血管閉塞についてのフォン・ヴィルブランド因子の役割と意味（Ｓｉｃｋｌｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｆｏｒ  ｖａｓｏｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）」、Ｂｌｏｏｄ  ８１：２４２９−２４３８（１９９３）：Ｗｉｃｋら、「異常に大きなフォン・ヴィルブランド因子のマルチマーが、制御された流動の下でのヒト内皮細胞への鎌状赤血球接着を増加させる（Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ  ｌａｒｇｅ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃ���ｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｆｌｏｗ）」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８０：９０５−９１０（１９８７）；Ｂｒｉｔｔａｉｎら、「活性化された血小板からのトロンボスポンジンは、生理学的な流動の下でヒト微小血管内皮への鎌状赤血球接着を促進する：鎌状赤血球血管閉塞における血小板活性化の潜在的な役割（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｆｒｏｍ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｉｃｋｌｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｕｎｄｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｆｌｏｗ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｖａｓｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）」、Ｂｌｏｏｄ  ８１：２１３７−２１４３（１９９３）；Ｓｕｇｉｈａｒａら、「トロンボスポンジンは、内皮細胞へのＣＤ３６＋鎌状網赤血球の接着を媒介する（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ３６＋  ｓｉｃｋｌｅ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｂｌｏｏｄ  ８０：２６３４−２６４２（１９９２）；Ｂａｒａｂｉｎｏら、「動的流動条件下でのフォン・ヴィルブランド因子によって固定化されたトロンボスポンジンへの鎌状赤血球接着の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｂｙ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｕｎｄｅｒ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、Ｂｌｏｏｄ  ８９：２５６０−２５６７（１９９７）；Ｆｉｎｎｅｇａｎら、「接着白血球は、血管閉塞のインビトロ流動モデルにおける鎌状赤血球を捕捉する（Ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｓｉｃｋｌｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｌｏｗ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｖａｓｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）」、Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８２：２６６−２７５（２００７）；Ｔｕｒｈａｎら、「鎌状赤血球血管閉塞における接着白血球の主な役割：新しいパラダイム（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ：ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ）」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９：３０４７−３０５１（２００２）。さらに、活性化された内皮細胞及び造血前駆細胞は、ＳＣＤにおいて異常に高いレベルで循環しており、末端器官障害と相関する。血管閉塞発作中の膜／細胞相互作用が、ある程度研究されている、又は動物モデルにおいて説得力のある証明がなされているが、広い臨床的相関の研究は存在しない。Ｈｅｂｂｅｌら、「鎌状赤血球貧血における内皮への赤血球の接着（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌ���−ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ）」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３０２：９９２−９９５（１９８０）；Ｓｏｌｏｖｅｙら、「鎌状赤血球貧血において循環している活性化内皮細胞」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３７：１５８４−１５９０（１９９７）；Ｓｔｒｉｊｂｏｓら、「循環内皮細胞：鎌状赤血球貧血における臓器障害の潜在的なパラメータ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｏｆ  ｏｒｇａｎ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ）」、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ  ４３：６３−６７（２００９）；ｖａｎ  Ｂｅｅｍら、「疼痛を伴う鎌状赤血球発作中の内皮前駆細胞の上昇（Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐａｉｎｆｕｌ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｒｉｓｉｓ）」、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３７：１０５４−１０５９（２００９）；並びにＪａｎｇら、「ＣＸＣＬ１及びその受容体のＣＸＣＲ２は、溶血性輸血反応の際にマウスの鎌状赤血球血管閉塞を媒介する（ＣＸＣＬ１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＸＣＲ２，ｍｅｄｉａｔｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｖａｓｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１：１３９７−１４０１。
【００６２】
赤血球接着
全ての脊椎動物では、白い血液の魚（コオリウオ科）を除いて、酸素は、ＲＢＣによって肺から組織に運ばれているため、この細胞はほぼ全ての生理学的プロセスに不可欠なプレーヤーである。心血管系が血液の流通を担当していているが、組織及び臓器への酸素並びに栄養の供給を保証するのは微小毛細血管ネットワークであるため、毛細血管におけるＲＢＣ輸送の研究は特に重要である。全身循環における全体的な圧力降下の約８０％が、微小循環で起こる。微小循環の血流は、内因性のＲＢＣ生体力学的特性、すなわち変形能及び接着に依存している。狭い毛細血管を通過するので、ＲＢＣの圧搾により、この細胞の全周が血管壁接着分子に暴露され、これにより、太い血管に比べて、微小血管はＲＢＣ接着の有害な影響をより受けやすくなる。多くの疾患状態でＲＢＣの変形能及び接着が損なわれ、微小毛細血管ネットワークにおける血流の閉塞を生じさせている。
【００６３】
ＲＢＣの変形能の低下、接着の増加、及びＰＳ暴露は、貧血、敗血症、マラリア、狼瘡、重金属暴露、輸血合併症、糖尿病、癌、腎疾患、心血管疾患、肥満、及び神経障害を含む多くの疾患において微小循環障害と関連している。これらの疾患は、世界的に毎年数千億ドルの社会経済的負担により何億人もの人々に影響を与えている。例えば、鎌状赤血球貧血において、ＲＢＣ接着は、血流の閉塞、疾患の重症度、及び臓器損傷と関連している。ＲＢＣは、水銀の重要な標的であり、低レベルの水銀であっても、循環中のＰＳ暴露及び接着を誘導することができる。鉛暴露は、ＲＢＣ膜を損傷させ、変形能の低下、及び膜の弾力性の低下をもたらすことが示されている。貯血は、臓器不全と関連している酸化ストレス、浸透圧ストレス、ＰＳ暴露、及びＲＢＣの変形能の低下を誘導することが示されている。ＲＢＣの接着親和性、変形能、及びＰＳ暴露の基本的かつ統合された理解は、何百万人もの人々の生活を向上させることができる微小循環障害のための新規の監視及び治療戦略に潜在的につながる。
【００６４】
ヘモグロビンバイオチップ（ＨｅｍｅＣｈｉｐ）
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、対象からのヘモグロビンタンパク質を正確に識別し、定量化する電気泳動バイオチップ及びシステムに関する。該電気泳動バイオチップは、異常ヘモグロビン症、サラセミア、鎌状赤血球症、鎌状赤血球貧血、先天性赤血球形成異常性貧血、及び軽度の慢性貧血などのヘモグロビン障害を検出するためのシステムで使用することができる。
【００６５】
図１及び図２を参照すると、該電気泳動バイオチップは、第１及び第２のバッファーポートを有するハウジング、サンプルローディングポート、並びに第１及び第２の電極を含むことができる。該ハウジングは、該ハウジングの第１の端部から第２の端部に広がるマイクロチャネルも含む。該マイクロチャネルは、アルカリ緩衝液で少なくとも部分的に飽和された酢酸セルロース紙を含む。第１のバッファーポート及び第２のバッファーポートは、それぞれ、該ハウジングの第１の端部及び第２の端部を通じて、該マイクロチャネル及び酢酸セルロース紙に広がっている。第１のバッファーポート及び第２のバッファーポートは、酢酸セルロース紙を少なくとも部分的に飽和するアルカリ緩衝液を受容することが可能である。該サンプルローディングポートは、血液サンプルを受容することができ、該ハウジングの第１の端部を通って該マイクロチャネル及び酢酸セルロース紙に広がる。第１の電極及び第２の電極は、酢酸セルロース紙に沿った血液サンプル中のヘモグロビン変異体の移動を促進するのに効果的な電界を酢酸セルロース紙の全域で発生させることができる。第１の電極及び第２の電極は、それぞれ第１のバッファーポート及び第２のバッファーポートを通って、酢酸セルロース紙へ広がることができる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、該ハウジングは、上部キャップ、底部キャップ、及び上部キャップと底部キャップとの間に介在するチャネルスペーサーを含むことができる。該チャネルスペーサーは、該ハウジング内のチャネルを画定することができる。上部キャップ、底部キャップ、及びチャネルスペーサーは、ガラス又はプラスチックのうちの少なくとも１つから形成することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、該電気泳動バイオチップは、さらにサンプルローディングポートに導入される血液サンプルについて、酢酸セルロース紙に沿ったヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するための撮像システムを含むことができる。該ハウジングは、酢酸セルロース紙及びヘモグロビン変異体の移動を可視化するための表示領域を含むことができる。
【００６８】
第１の電極及び第２の電極は、電源に接続することができる。電源は、約１Ｖ〜約４００Ｖの電界を発生させることができる。いくつかの実施形態において、電極によって該バイオチップに印加される電圧は２５０Ｖを超えない。
【００６９】
該バイオチップは、微細加工することができ、少量（例えば、指穿刺量又は踵穿刺量）の血液を処理できる。
【００７０】
他の実施形態において、サンプルローディングポートに導入される血液サンプルは、１０マイクロリットル未満であり得る。緩衝溶液は、アルカリトリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液を含むことができる。第１の電極及び第２の電極は、グラファイト又はカーボン電極を含むことができる。
【００７１】
他の実施形態において、該撮像システムは、ヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するための携帯電話撮像システムを含むことができる。例えば、図７に示すように、携帯電話撮像システムは、ヘモグロビン変異体の移動を撮像するために使用される携帯電話、並びに診断の決定を行うためにヘモグロビンバンドの種類及び厚さを認識並びに定量化するソフトウェアアプリケーションを含むことができる。ヘモグロビンバンドの種類は、ヘモグロビンの種類Ｃ／Ａ、Ｓ、Ｆ、及びＡ０を含むことができる。
【００７２】
他の実施形態において、モバイルイメージング及び定量化のアルゴリズムは、該バイオチップ装置に統合することができる。このアルゴリズムにより、該バイオチップ装置の全てのリソース設定で収集されたデータについて信頼性及び再現性のある試験結果を得ることができる。
【００７３】
電気泳動バイオチップ及びデータ分析の撮像は、血液分析の信頼性及び再現性を高めるために、モバイルアプリケーションを使用して実行されてよい。Ｗａｎｇら、「ポイントオブケアでの迅速なＣＤ４細胞計数のためのマイクロ流体工学ＥＬＩＳＡ（Ｍｉｃｒｏ−ａ−ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ＣＤ４  ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４：３７９６（２０１４）。簡単に説明すると、画像処理アルゴリズムは、位置マーカーとして典型的なサンプルポートを使用することによってマイクロ流体バイオチップチャネルを最初に認識することができる。次いで、赤（Ｒ）ピクセル値は、カラー画像から抽出され、バックグラウンドに対して正規化され得る。赤のピクセル強度のヒストグラムは、チャネルに沿って自動的にプロットされ、それによって最高強度の位置を決定し得る（図７）。該アプリケーションは、該ＨｅｍｅＣｈｉｐ上の異なるＨｂの種類、それゆえに異なるＨｂの障害に対応するバンドを分割し、計数し、定量化する。例えば、ＨｂＡ及び／又はＨｂＳの位置は、ヒストグラムプロットを使用して、各サンプルについて決定することができ、その結果が画面に表示される。グラフィカルユーザインタフェースは、カメラの視野を適切に位置合わせするようにユーザーを導く位置合わせマーカーを含む、基本的な特徴を含む。該アプリケーションは、日付、場所、及び固有の患者識別子を入力することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、該電気泳動バイオチップは、対象がヘモグロビン遺伝子型ＨｂＡＡ、ＨｂＳＳ、ＨｂＳＡ、ＨｂＳＣ、又はＨｂＡ２を有するかどうかを診断するために使用することができる。他の実施形態において、該電気泳動バイオチップを用いて、対象が鎌状赤血球症を有するか、又はそのリスクが増加しているかどうかを診断することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、該電気泳動バイオチップは、対象からの血液サンプルがサンプルローディングポートに導入される方法で使用することができる。血液サンプルは、少なくとも１つの血液細胞を含む。次いで、酢酸セルロース紙に形成されたヘモグロビンバンドは、対象のヘモグロビン表現型を決定するために、撮像システムで撮像される。ヘモグロビン表現型は、ＨｂＡＡ、ＨｂＳＡ、ＨｂＳＳ、ＨｂＳＣ、及びＨｂＡ２からなる群から選択することができる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＨｂＡＡヘモグロビン表現型は、対象が正常であると診断し、ＨｂＳＡヘモグロビン表現型は、対象が鎌状赤血球形質を有していると診断し、ＨｂＳＳヘモグロビン表現型は、対象が鎌状赤血球症を有していると診断し、ＨｂＳＣヘモグロビン表現型は、対象がヘモグロビンＳＣ疾患を有していると診断し、ＨｂＡ２ヘモグロビン表現型は、対象がサラセミアを有していると診断する。
【００７７】
他の実施形態において、該電気泳動バイオチップは、早期ＳＣＤ診断を識別することが可能なヘモグロビンスクリーニング方法で使用することができる。一実施形態において、早期診断は、新生児に対して行われる。別の実施形態において、早期診断は、成人に対して行われる。さらに他の実施形態において、本方法は、健康な個人と、鎌状赤血球形質のキャリア、及びＳＣＤ患者とを区別する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、該電気泳動バイオチップは、生物医学用途及び臨床用途において生体適合性で、非細胞毒性であることが示されている生物医学グレードのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ）基板及び両面接着フィルム（ＤＳＡ）（３Ｍ社）を含む。バイオチップは、入口ポート、出口ポート、サンプルポート、マイクロ流体チャネル、反応チャンバー、及び／又は電気泳動チャネルを含むが、これらに限定されない様々な構造を作成するために微細加工プラットフォーム（例えば、Ｘ−６６０レーザー、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して製造され得る（図１Ａ）。マイクロ流体チャネルの寸法は、１０マイクロメートルの範囲内で制御され得る。他の実施形態において、該マイクロ流体バイオチップシステムは、迅速な手動組み立てを可能にし、患者間の起こり得る交差汚染を防ぐために使い捨て（例えば、単回使用バイオチップ）である。
【００７９】
電気泳動バイオチップ設計の１つの利点は、ポイントオブケア技術に効率をもたらす大量生産に適していることである。該電気泳動バイオチップは、実行するのに１０分かかるＳＣＤ（及び他のヘモグロビン障害）のための低コストのスクリーン試験を提供することができる。これは持ち運びでき、使いやすく；短い（３０分）研修後に誰でも行うことができる。本明細書に記載の電気泳動バイオチップは、客観的かつ定量的な結果をもたらすために、モバイル装置（例えば、ＩＰｈｏｎｅ、ＩＰｏｄ）と統合することができる。必要であれば、バイオチップ及び／又はそれらの構成要素は、（例えば、ＵＶ光によって）滅菌し、無菌の層流フード内で組み立てられ得る。無菌の生物医学グレードのシリコンチューブ（Ｔｙｇｏｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｐｌｕｓ）を該バイオチップに統合してもよく、バイオチップは、いかなる漏れを防ぐために密封されてよい。さらに、必要に応じて、チューブは、追加の分析のためのインビトロ培養系などの他のプラットフォームに簡単に接続できる。
【００８０】
マイクロ流体バイオチップ
本明細書に記載の他の実施形態は、血液細胞の変形能及び単一細胞レベルでの微小血管模倣表面への接着の同時調査のためのマイクロ流体バイオチップシステム並びに分析方法に関する。いくつかの実施形態において、該マイクロ流体バイオチップ装置又はシステムは、臨床的に意味のある方法で疾患の重症度、今後の疼痛発作、治療反応、及び治療有効性を監視するために対象の赤血球及び白血球の膜特性、細胞特性並びに接着特性を定量化することができる。一実施形態において、血液細胞は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の進行についてスクリーニング及び／又は監視されている患者の全血に由来する。
【００８１】
該マイクロ流体バイオチップ装置は、ハウジング及び該ハウジング内に少なくとも１つの細胞接着領域を画定する少なくとも１つのマイクロチャネルを含む。少なくとも１つの細胞接着領域は、細胞を含む流体が少なくとも１つのマイクロチャネルを通過する際に、目的の細胞を接着する少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドでコーティングされている。該バイオアフィニティーリガンドは、フィブロネクチン、ラミニン、セレクチン、フォン・ヴィルブランド因子、トロンボモジュリン又はＣ１４６抗体のうちの少なくとも１つを含むことができる。該装置はまた、流体がチャネルを通過する際に、少なくとも１つのマイクロチャネル内の少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドに接着した細胞の量を測定する撮像システムを含む。
【００８２】
図８及び図９は、一実施形態によるマイクロ流体バイオチップを示す。該マイクロ流体バイオチップは、細胞接着領域を含む複数のチャネルを画定するハウジングを含む。それぞれのチャネルは、一端にある入口ポート及び他端にある出口ポートに接続する。図８は３つだけのチャネルを示すが、該マイクロ流体装置は、３より多い又は少ないチャネルを含むことができる。チャネルの直径は、血液がチャネルを通過する際のチャネルの目詰まりを防止するのに十分な大きさであるべきである。
【００８３】
図１３は、マイクロ流体バイオチップがベース層、中間層、及びカバー層で形成された積層構造を含むことができることを示す。該チャネルは中間層に形成されており、入口ポート及び出口ポートがカバー内に形成される。それぞれのチャネルの第１の端部を対応する入口ポートと整列させ、それぞれのチャネルの第２の端部を対応する出口ポートと整列させると、入口ポートからチャネルを介して対応する出口ポートに流路が作製される。いくつかの実施形態において、該チャネルは、それぞれの入口ポート及び出口ポートをわずかに越えて広がる。該チャネルは、例えば、接着又は捕捉される細胞を含有するマイクロリットル又はミリリットル量の血液又は溶液を受け入れるようにサイズ調整される。該チャネルはまた、細胞の接着又は捕捉に影響を与えるようにさらにサイズ調整され、形作られてよい。
【００８４】
ベース層は、細胞接着領域に構造的支持を提供し、製造及び組み立ての制限によって決定される約０．１ｍｍ〜約２ｍｍ、例えば、約１．６ｍｍなどの適切な厚さでポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）又はガラスなどの十分に剛性の材料で形成されている。カバー層は、チャネルの中／外に血液を供給するために使用される入口ポート及び出口ポートを含む。カバー層の厚さは、約１ｍｍ〜約１０ｍｍ、例えば、約３．６ｍｍであり得、統合及び組み立ての要件によって決定される。入口ポート及び出口ポートの直径は、約０．３ｍｍ〜約３ｍｍ、例えば、約１ｍｍであり得、その下限は製造上の制約によって決定され、上限は血液の流動条件によって決定される。
【００８５】
いくつかの実施形態において、必要に応じて、レーザーカッターを用いて、マイクロ流体チップのための所望の大きさに大きなピースのＰＭＭＡを切断し、入口ポート及び出口ポート用の穴を切断することができる。
【００８６】
中間層は、ベース層とカバー層の両方に接着する材料で形成することができる。該チャネルは、例えば、所望のサイズ（例えば、ベース層の大きさ）にレーザー切断される中間層の中の矩形断面などのポリゴンをレーザー切断することにより形成することができる。チャネルの高さは、以下により詳細に説明されている中間層の厚さによって決定することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、該装置の幾何学的形状及び寸法は、捕捉効率及び流速を決定する血液の均一な層流条件に適応するように決定される。チャネル幅は、約１ｍｍ〜約１５ｍｍ、例えば、約３．５ｍｍであり得、最小幅は入口ポート及び出口ポートの直径によって決定され、チャネル幅の上限は、限局されたチャネル内の血液の流動特性によって決定される。チャネル長は、約４ｍｍ〜約１００ｍｍ、例えば、約２７ｍｍであり得る。下部チャネルの長さ寸法は、限局されたチャネル内の血液の流動特性によって決定され、上限は、細胞捕捉効率によって決定される。チャネルの高さは、約１０μｍ〜約５００μｍ、例えば、約５０μｍであり得、限局されたチャネル内の流体力学の法則及び制約並びに血液の流動特性によって決定される。
【００８８】
チャネルが中間層で切断された後に、中間層は基材層に接着される。カバー層は、ベース層及び中間層と同一の横方向寸法を有することができ、中間層の露出面上に接着し、それによってチャネルを囲むことができる。図１３に示される実施形態において、該マイクロ流体バイオチップ装置は、カバー層が上部にあるように配向される。他の実施形態において、該細胞分離装置は、カバー層が底部にあるように配向されてよい。
【００８９】
該マイクロ流体バイオチップ装置の細胞接着領域は、少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドの層又はコーティングが設けられた表面を含むことができる。該バイオアフィニティーリガンドは、フィブロネクチン、ラミニン、セレクチン、フォン・ヴィルブランド因子、トロンボモジュリン又はＣ１４６抗体のうちの少なくとも１つを含むことができる。該バイオアフィニティーリガンドは、それぞれのチャネルの細胞接着領域に接着するか、官能化されるか、又は化学的に官能化され得る。
【００９０】
本明細書で使用する用語「官能化される」又は「化学的に官能化される」は、化学反応（複数可）によって材料の表面上への官能基の付加を意味する。当業者によって容易に理解されるように、官能化は、生体適合性、及び水和性などの所望の表面特性を達成するために、材料の表面改質に使用することができる。同様に、本明細書で使用する用語「生体機能化」、又は「生体機能化される」などは、生物工学などの当業者によって容易に理解されるように、所望の生物学的機能を有するように材料の表面の改質を意味する。
【００９１】
該バイオアフィニティーリガンドは、共有結合又は非共有結合で細胞接着領域に官能化されてよい。リンカーは、細胞接着領域にバイオアフィニティーリガンドの共有結合を提供するために使用することができる。リンカーは、様々な実体を結合するために使用することができるリンカーであり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態において、該リンカーは、コンジュゲートされる分子の性質に応じて、ホモ二官能性リンカー又はヘテロ二官能性リンカーであってもよい。ホモ二官能性リンカーは、２つの同一の反応基を有する。ヘテロ二官能性リンカーは、２つの異なる反応基を有する。商業的に入手可能な様々な種類のリンカーは、以下の基：第１級アミン、第２級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル及び炭水化物のうちの１以上と反応性がある。アミン特異的リンカーの例としては、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、ジスクシンイミジルスベレート、ジスクシンイミジルタルトレート、ジメチルアジピメート２ＨＣｌ、ジメチルピメリミデート２ＨＣｌ、ジメチルスベリミデートＨＣｌ、エチレングリコールビス−［スクシンイミジル−［スクシネート］、ジチオールビス（スクシンイミジルプロピオネート）、及び３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）が挙げられる。スルフヒドリル基と反応するリンカーには、ビスマレイミドヘキサン、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）］ブタン、１−［ｐ−アジドサリチルアミド］−４−［ヨードアセトアミド］ブタン、及びＮ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミドが含まれる。炭水化物と優先的に反応するリンカーには、アジドベンゾイルヒドラジンが含まれる。カルボキシル基と優先的に反応するリンカーには、４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミンが含まれる。
【００９３】
アミン及びスルフヒドリルと反応するヘテロ二官能性リンカーには、Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノ安息香酸、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド］ヘキサノエート、及びスルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレートが含まれる。カルボキシル基及びアミン基と反応するヘテロ二官能性リンカーには、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩が含まれる。炭水化物及びスルフヒドリルと反応するヘテロ二官能性リンカーには、４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジドＨＣｌ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド２ＨＣｌ、及び３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジドが含まれる。
【００９４】
あるいは、該バイオアフィニティーリガンドは、細胞接着領域上に非共有結合でコーティングされてもよい。細胞接着領域へのバイオアフィニティーリガンドの非共有結合蒸着は、ポリマーマトリックスの使用を含んでよい。該ポリマーは、天然のもの又は非天然のものであってよく、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、及びＬＮＡなど、又は模倣体、誘導体、又はこれらの組合せ）、アミノ酸（例えば、ペプチド、及びタンパク質（天然又は変性）など、又は模倣体、誘導体、又はこれらの組み合わせ）、脂質、ポリサッカライド、並びに官能化ブロック共重合体を含むが、これらに限定されない任意の種類であってよい。受容体は、ポリマーマトリックス上に吸着されるか、かつ／又はポリマーマトリックス内に封入されてよい。
【００９５】
あるいは、該バイオアフィニティーリガンドは、ポリマーに共有結合又は架橋されてよい（例えば、それは、機能性ポリマー上に「グラフト」されてよい）。
【００９６】
適切なペプチドポリマーの例としては、ポリ−リジン（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）が挙げられる。他のポリマーの例としては、ブロックコポリマーが挙げられ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸とメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、セルロースプロピオネート、酢酸セルロースブチレート、酢酸セルロースフタレート、カルボキシエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、及びポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ無水物、ポリ（スチレン−ｂ−イソブチレン−ｂ−スチレン）（ＳＩＢＳ）ブロックコポリマー、エチレンビニルアセテート、ポリ（メタ）アクリル酸、乳酸及びグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、及びポリ（ラクチド−コカプロラクトン）、並びにアルギネートとデキストラン及びセルロースを含む他の多糖類などの天然ポリマー類、コラーゲン、アルブミン及び他の親水性タンパク質、ゼイン及び他のプロラミン類及び疎水性タンパク質、コポリマー類及びそれらの混合物、並びに化学基、例えば、アルキル、アルキレンの置換及び／又は付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者によって日常的に行われる他の修飾を含むそれらの化学誘導体が含まれる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、各マイクロチャネルは、少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドでコーティングされた別個の細胞接着性領域を含むことができる。該マイクロチャネルの少なくとも２種又は少なくとも３種は、異なるバイオアフィニティーリガンドを含むことができる。他の実施形態において、複数のマイクロチャネルは、同一のバイオアフィニティーリガンドを含むことができる。
【００９８】
さらに他の実施形態において、少なくとも１つのマイクロチャネルは、マイクロチャネルの細胞接着領域上にコーティングされた少なくとも２つの異なるバイオアフィニティーリガンドを含むことができる。異なるバイオアフィニティーリガンドは、少なくとも１つのマイクロチャネルの細胞接着領域内の異なる位置に位置付けることができる。例えば、ラミニン、セレクチン、フォン・ヴィルブランド因子、トロンボモジュリン及びＣ１４６抗体のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つのマイクロチャネルに沿って異なる位置に位置付けられる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、該撮像システムは、レンズベースの撮像システム又はレンズレス撮像システムであり得る。例えば、レンズレス撮像システムは、電荷結合素子センサ及び発光ダイオードであり得る。いくつかの実施形態において、モバイルイメージング及び定量化アルゴリズムを、該バイオチップ装置に統合することができる。該アルゴリズムは、該バイオチップ装置の全てのリソース設定で収集されたデータについて信頼性及び再現性のある試験結果を得ることができる。
【０１００】
他の実施形態において、細胞は、対象から取得される血液細胞であり得、該撮像システムは、細胞が取得される対象の健康を監視するために、それぞれのチャネル内の接着細胞を定量化することができる。他の実施形態において、該撮像システムは、細胞が取得される対象の鎌状赤血球症などの疾患の進行を監視するために、それぞれのチャネル内の接着細胞を定量化することができる。さらに他の実施形態において、該撮像システムは、細胞が取得される対象に施される治療処置の有効性を測定するために、それぞれのチャネル内の接着細胞を定量化することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、該マイクロ流体バイオチップ装置は、対象からの少なくとも１つの血液細胞を含む血液サンプルをマイクロチャネルに導入して、少なくとも１つのマイクロチャネル内の少なくとも１つのバイオアフィニティーリガンドに接着した多数の細胞が撮像される。該バイオチップ装置は、臨床的に意味のある方法で、疾患の重症度、今後の疼痛発作、治療反応、及び治療有効性を監視するために、対象の赤血球及び白血球の膜特性、細胞特性及び接着特性を定量化することができる。
【０１０２】
本明細書に開示されるマイクロ流体バイオチッププラットフォームは、より大きな、臨床的に多様な集団の対象内の接着細胞の単一細胞異質の研究に適用可能であり、ＳＣＤ以外の複合疾患の表現型に重要な洞察を提供し得ることが期待できる。例えば、微小血管の表面への異常なＲＢＣ接着は、βサラセミア、糖尿病、遺伝性球状赤血球症、真性赤血球増加症、及びマラリアなどの他の多系統疾患に関与している。Ｃｏｎｎｅｓら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １６５（４）：５６４−５７２（２０１４）；Ｃｏｌｉｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２１（３）：１８６−１９２（２０１４）；及びＣｏｏｋｅら、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １０７：３５９−３６８（１９９３）。
【０１０３】
血管壁への鎌状ＲＢＣ接着は、後毛細血管細静脈で起こることが示されている。一実施形態において、本発明は、後毛細血管細静脈について報告されている、幅が約６０μｍで、流体流速が約１〜１０ｍｍ／秒の範囲内にある少なくとも１つのマイクロチャネルを含むマイクロ流体ＳＣＤバイオチップを企図する。Ｋａｕｌら、Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １６（１）：９７−１１１（２００９）；Ｋａｕｌら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８６（９）：３３５６−３３６０（１９８９）；Ｌｉｐｏｗｓｋｙ，Ｈ．Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２（１）：５−１５（２００５）；及びＴｕｒｉｔｔｏ，Ｖ．Ｔ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ６：  １３９−１７７（１９８２）。
【０１０４】
ＳＣＤにおける生理学的状態からの推定に基づいて同様の流動条件を用いた研究が文献で報告されている。Ｍｏｎｔｅｓら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ７０（３）：２１６−２２７（２００２）；Ｋａｓｓｃｈａｕら、Ｂｌｏｏｄ  ８７（２）：７７１−７８０（１９９６）；Ｌｅｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１０（２８）：１１３２６−１１３３０（２０１３）。しかしながら、約６０μｍの微小血管スケールで全血を使用して、ＨｂＳ含有ＲＢＣの接着及び変形能を分析している研究はない。本明細書に提示されるデータは、微小血管系を模倣するマイクロ流体チャネルで調べたＳＣＤ血液サンプル中の、単一細胞レベルで測定したＨｂＳ含有ＲＢＣの接着及び変形能の不均一性を示す。
【０１０５】
一実施形態において、該マイクロ流体バイオチップは、ベースライン時及び血管閉塞発作時に治療した、末端器官損傷の存在下でのＨｂＳＳ及びＨｂＳＣにおける接着特性及び膜特性の分析を含むが、これらに限定されない病態生理学的相関を利用するＳＣＤ試験方法で使用することができる。ＳＣＤ試験方法は、１０分未満で完了することができる。いくつかの実施形態において、ＳＣＤ試験方法は、ＲＢＣ、ＷＢＣ、循環造血前駆細胞及び循環内皮細胞中のＣＭＡ特性の高度に特異的な分析を提供する。一実施形態において、ＳＣＤ試験方法は、持ち運びできる高効率のマイクロ流体バイオチップ及び微小血液サンプル（＜１５μｌ）を用いて行われる。ＳＣＤ試験方法は、患者の血液サンプルをＳＣＤ疾患進行中に細胞／膜／接着特性について連続して試験することができる洗練された、臨床的に関連する戦略を提供することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、該バイオチップは、一滴の血を使用して、細胞間相互作用及び膜特性を正確に定量化することができる。該バイオチップ及び方法は、ＳＣＤにおける疾患のメカニズムについての洞察を検証することができ、疾患の不均一性と急性及び／又は慢性のＳＣＤ合併症との相関を明らかにすることができる。
【０１０７】
該マイクロ流体バイオチップは、臨床表現型の範囲で認識された異常の数を調べることによって、膜及び細胞異常を評価することもできる。現在までに、これらの表現型は、臨床報告、試験結果、介入、及び／又はチャートのレビューとの間の範囲の様々な相関ＳＣＤ研究で議論されている。Ｌｏｒｃｈら、「測定するたびの、推定される肺動脈収縮期圧の上昇は鎌状赤血球症を有する成人における超過死亡と関連している（Ａｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ，  ｗｈｅｎｅｖｅｒ  ｍｅａｓｕｒｅｄ，ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｅｓｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １２５：２２５−２２９（２０１１）；Ｐｏｗａｒｓら、「鎌状赤血球貧血の結果：１０５６人の患者の４０年の観察研究（Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ：ａ  ４−ｄｅｃａｄｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  １０５６  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）８４：３６３−３７６（２００５）；Ｎｏｕｒａｉｅら、「米国と欧州の鎌状赤血球貧血を有する４１５人の患者における溶血の重症度と、臨床症状と死亡リスクの関係（Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ４１５  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＵＳ  ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅ）」、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９８：４６４−４７２（２０１３）；Ｐｉａｔｔ  ら、「鎌状赤血球症における死亡率。平均余命と早期死亡のリスク要因（Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌｉｆｅ  ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒＳ、Ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｄｅａｔｈ）」、Ｎ  ＥｎｇＬ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３０：１６３９−１６４４（１９９４）；Ｏｈｅｎｅ−Ｆｒｅｍｐｏｎｇら、「鎌状赤血球症における脳血管事故：割合とリスク要因（Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｃｃｉｄｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ）」、Ｂｌｏｏｄ  ９１：２８８−２９４（１９９８）；Ｗｅｓｔら、「鎌状赤血球症の研究室プロファイル：断面解析。鎌状赤血球症の共同研究（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ａ  ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｓｉｃｋｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ４５：８９３−９０９（１９９２）；Ｃｈａｒａｃｈｅら、「鎌状赤血球貧血で疼痛を伴う発作の頻度に対するヒドロキシ尿素の効果。鎌状赤血球貧血におけるヒドロキシ尿素の多施設研究の研究者（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐａｉｎｆｕｌ  ｃｒｉｓｅｓ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ  ｉｎ  Ｓｉｃｋｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｅｍｉａ）」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３２：１３１７−１３２２（１９９５）；Ｌｅｔｔｒｅら、「鎌状赤血球症における胎児ヘモグロビンレベルと疼痛発作を伴うＢＣＬ１１Ａ、ＨＢＳ１Ｌ−ＭＹＢ、及びβ−グロビンの遺伝子座でのＤＮＡ多型（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ＢＣＬ１１Ａ，ＨＢＳ１１−ＭＹＢ，ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｌｏｃｉ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｆｅｔａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｐａｉｎ  ｃｒｉｓｅｓ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：１１８６９−１１８７４（２００８）；Ｍｉｌｔｏｎら、「鎌状赤血球貧血における溶血の遺伝的決定因子（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎａｅｍｉａ）」、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １６１：２７０−２７８（２０１３）；Ｂａｅら、「２０４０人の鎌状赤血球貧血患者のメタ分析：ＢＣＬ１１Ａ及びＨＢＳ１Ｌ−ＭＹＢは、アフリカ系アメリカ人のＨｂＦの主要な修飾子である（Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ２０４０  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ＢＣＬ１１Ａ  ａｎｄ  ＨＢＳ１Ｌ−ＭＹＢ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ｏｆ  ＨｂＦ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ）」、Ｂｌｏｏｄ  １２０：１９６１−１９６２（２０１２）；及びＭｉｌｔｏｎら、「鎌状赤血球貧血における総ビリルビンと胆石症リスクのゲノムワイド関連解析（Ａ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｅｌｉｔｈｉａｓｉｓ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ）」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  Ｔ：ｅ３４７４１（２０１２））」。
【０１０８】
共通の血液疾患のうち、ＳＣＤは、細胞膜特性及び細胞活性化の検査により著しく検出可能であることが一般に知られている。例えば、ＳＣＤにおける膜及び細胞の異常、並びに臨床的合併症とのそれらの関係についての多くの観察が、１９８０年代から行われてきた。しかしながら、ほとんどの病態生理学的研究は、単一の施設で単一の時点で適度な数の対象に行われてきた。さらに、複数の分析、例えば、膜特性、炎症性細胞活性化、及び循環内皮細胞の数の同時評価を１人の患者のサンプルに対して実行することは実現可能ではなかった。多くの場合、有望な「最先端の」又は生物学的に明らかにする相関試験は、あまりにも高価で、複雑で、又は他のセンターへの「輸送」が困難である。本方法のこれらの欠点は、ＲＢＣ、ＷＢＣ、及び内皮（及び内皮下層）の細胞間接着などの病態生理学的エンドポイントの縦断試験への広範囲なアクセスを妨げてきた。
【０１０９】
さらに、第３世界の国々は、ＳＣＤの負担を負っている。したがって、疾患活動性の判別及び診断を提供するために、安価で簡単なポイントオブケア装置は、世界的に非常に貴重なツールとなり得る。Ｙａｎｇら、「鎌状赤血球症の簡単で、迅速、低コストの診断試験（Ａ  ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ｌｏｗ−ｃｏｓｔ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ  １３：１４６４−１４６７（２０１３）。Ｙａｎｇらは、ペーパークロマトグラフィーを用いた鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の診断試験を説明している。現在開示されているＳＣＤの監視及び試験の改善は、マイクロ流体ＳＣＤバイオチップ技術による病態生理学的エンドポイントの利用可能性を広げる。一実施形態において、該マイクロ流体ＳＣＤバイオチップは、細胞接着を測定する試験方法を実施する。一実施形態において、該ＳＣＤバイオチップは、赤血球（ＲＢＣ）のラミニン（ＬＮ）への結合を測定する。一実施形態において、該ＳＣＤバイオチップは、白血球のセレクチンへの結合を測定する。一実施形態において、該ＳＣＤバイオチップは、白血球活性化、内皮細胞活性化及び／又は造血前駆細胞活性化を含むが、これらに限定されない細胞活性化を測定する。
【０１１０】
既存の従来の方法はＣＭＡ特性との縦断的で、大規模なＳＣＤ臨床相関を評価することはできないので、本発明の実施形態は利点を有する。一実施形態において、本発明は、細胞の特性及び相互作用を調べるためのＳＣＤバイオチップを使用する方法を企図する。一実施形態において、これらの細胞の特性及び相互作用は、赤血球（ＲＢＣ）の細胞特性及び接着特性、白血球（ＷＢＣ）の細胞特性及び接着特性、循環内皮細胞の特徴及び造血前駆細胞の特徴を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明は、様々な年齢層にわたる、ＨｂＳＳ及びＨｂＳＣを含むが、これらに限定されない不均一なＳＣＤ集団において、並びに急性及び慢性の合併症を有する集団において、正常なＨｂＡＡ対照と比較して、ＳＣＤバイオチップ機能を相関させる方法を企図する。
【０１１１】
本データはＳＣＤ細胞特性の集束パネルを検証するが、当業者は、この技術がＳＣＤにおけるさらなる病理学的細胞相互作用により広く適用することができる可能性があることを認識する。図８。その結果、ＳＣＤバイオチップは、これまで実現可能ではなかった病態生理学的疾患の相関の広範な臨床応用を可能にする。このアプローチは、さらに、ＳＣＤの病因（例えば、内皮細胞及び炎症性細胞）に関係付けられている正確に分離された細胞集団などの独特の貴重な研究材料をもたらし得る。さらに、ＳＣＤバイオチップのいくつかの実施形態は、米国内並びに南米及びアフリカなどのＳＣＤが最も蔓延している世界中のリソース制限された状況で利用可能な将来の治療臨床試験において使用するためのエンドポイントを探索することができる。
【０１１２】
本明細書に記載のマイクロ流体バイオチップ技術は、典型的には、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学、又は顕微鏡撮像法などの従来の技術を用いて測定される表面特性を調べることができる。ＦＡＣＳでは、目的の細胞を、単離し、詳細に処理し、細胞タンパク質（例えば、インテグリン、受容体、接着分子）に対して作製された蛍光標識抗体とインキュベートし、光学的認識によって選別する。一実施形態において、本発明は、調べる抗体を含むマイクロ流体バイオチップ（例えば、マイクロ流体ＳＣＤバイオチップ）を企図する。一実施形態において、抗体は、マイクロチャネル表面にコーティングされる。一実施形態において、抗体は、前処理も、インキュベーションも、又はインビトロ操作も行うことなく目的の細胞集団を捕捉する。
【０１１３】
一実施形態において、該マイクロ流体バイオチップは、リグニン、接着分子、又はセレクチンを含むが、これらに限定されない細胞内の構成要素への細胞集団の接着を定量化する。いくつかの実施形態において、該マイクロ流体バイオチップは、膜特性及び接着に基づいてＲＢＣ、ＷＢＣ、及び循環内皮細胞並びに造血前駆細胞を捕捉し、定量化することができる。例えば、マイクロ流体バイオチップは、ＢＣＭＡ／ＬＵ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３４及び／又はＣＤ１４６にリグニン、セレクチン、アビジン及び／又はビオチン化抗体で官能化された複数のマイクロチャネルを含む。
【０１１４】
接着についての簡単な試験は、発作の間に加えて、ＳＣＤ中の慢性合併症におけるその役割の探査を可能にする。セレクチンは、培養内皮細胞の代わりに、接着面としてマイクロ流体バイオチップを用いて試験することができる。内皮セレクチンは、白血球の接着を媒介し、内皮表面上を転がっていると考えられている。例えば、ＳＣＤの実験モデルにおいて、Ｐ−セレクチンは血管内皮上で広く発現しており、内皮Ｅ−セレクチンは、血管閉塞に重要である。Ｗｏｏｄら、「鎌状赤血球トランスジェニックマウスの微小血管系におけるＥ−及びＰ−セレクチンの差次的発現（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ−  ａｎｄ  Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）」、Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１：３７７−３８５（２００４）；Ｗｏｏｄら、「内皮細胞のＰ−セレクチンは、鎌状赤血球トランスジェニックマウスの脳細静脈において炎症誘発性のプロトロンビン表現型を媒介する（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｖｅｎｕｌｅｓ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｈｅａｒｔ  Ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２８６：Ｈ１６０８−１６１４（２００４）；及びＨｉｄａｌｇｏら、「局在化した好中球マイクロドメインによってもたらされるヘテロ型相互作用は、血栓性炎症による損傷を媒介する（Ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｉｎｊｕｒｙ）」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５：３８４−３９１（２００９）。ＳＣＤにおける好中球は、有効な治療法で変更することができる好中球ＭＡＣ−１、ＬＦＡ−１、及びＳＣＤに固有のＶＬＡ−４９０を介して、内皮への接着性がより高いことを示す。Ａｌｍｅｉｄａら、「ヒドロキシ尿素及びｃＧＭＰ増幅剤は、鎌状赤血球症マウスにおける急性脈管閉塞事象に対して直接的な利点を有する（Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ  ａｎｄ  ａ  ｃＧＭＰ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｈａｖｅ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｎ  ａｃｕｔｅ  ｖａｓｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｉｃｅ  ）」、Ｂｌｏｏｄ  １２０：２８７９−２８８８（２０１２）。
【０１１５】
一実施形態において本発明は、少なくとも１つの固定化されたＰ−セレクチン及び／又はＥ−セレクチン接着分子を有する少なくとも１つのマイクロチャネルを含むマイクロ流体ＳＣＤバイオチップを企図する。ＳＣＤサンプルは、ＨｂＡＡ対照と比較して、セレクチンへのＷＢＣ接着性がより高いことを示すことが期待される。ベースライン時及び発作時のＳＣＤサンプルの検査は、疾患活動性と共に変化を評価することができる。例えば、ＭＡＣ−１、ＬＦＡ−１、及びＶＬＡ−４の発現は、ＳＣＢマイクロ流体バイオチップ上の同じサンプルからの未処理のＷＢＣと比較して、セレクチン捕捉した血液ＷＢＣ上でＦＡＣＳによって測定することができる。
【０１１６】
固定化したセレクチンはＲＢＣと相互作用できる可能性がある。これがＷＢＣの相互作用の分析を妨害する場合、ＲＢＣは、分析の前に溶解され得る。Ｍａｔｓｕｉら、「Ｐ−セレクチンが内皮への鎌状赤血球の接着を媒介する（Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」、Ｂｌｏｏｄ  ９８：１９５５−１９６２（２００１）。ＲＢＣの接着は、患者間で変動し得るため、有益であり、そうであれば定量化することができる。注目すべきことに、ＷＢＣ接着の従来のインビトロ測定は、マイクロ流体バイオチップシステムの使用によって回避される内皮細胞培養物を必要とする。
【０１１７】
単球は、ＳＣＤにおける内皮活性化の主要な炎症性メディエーターとして認識されている。Ｂｅｌｃｈｅｒら、「鎌状赤血球症における活性化単球：血管内皮及び血管閉塞の活性化における潜在的な役割（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ａｎｄ  ｖａｓｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）」、Ｂｌｏｏｄ  ９６：２４５１−２４５９（２０００）；及びＰｅｒｅｌｍａｎら、「胎盤成長因子は、単球を活性化し、鎌状赤血球症の重症度と相関する（Ｐｌａｃｅｎｔａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ）」、Ｂｌｏｏｄ  １０２：１５０６−１５１４（２００３）。一実施形態において、ＣＤ１１ｂを含むＳＣＤマイクロ流体バイオチップは、活性化ＷＢＣを分離する。一実施形態において、活性化ＷＢＣは単球である。
【０１１８】
他の実施形態において、該マイクロ流体バイオチップは、成熟循環内皮細胞を定量化するためにＣＤ１４６抗体でコーティングされたマイクロチャネルを含むことができる。別の実施形態において、本発明は、画像解析によってＣＥＣを定量化するために、ｖＷＦ又はトロンボモジュリンを含むマイクロ流体ＳＣＤバイオチップを企図する。Ｌｉｎら、「循環内皮細胞の起源及び血液からの内皮成長（Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ）」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０５：７１−７７（２０００）。希少のＣＥＣの単離は技術的に困難であるが、これらの細胞は、ＣＤ１４６マーカーを使用して未処理の血液中でＦＡＣＳによって特定されている。Ｓａｍｓｅｌら、「希少な循環内皮細胞の形態学的特徴及び表現型の特徴についてのイメージングフローサイトメトリー（Ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（２０１３）。
【０１１９】
本明細書に記載のマイクロ流体バイオチップ内の個々の細胞の生物物理探査は、正確な制御、計測、及び接着細胞近傍における流速の推定を必要とする。これらの測定値及び推定値は、該マイクロ流体チャネル内の流動に関する理論計算を可能にする。測定された局所流速と比較して、これらの予測される流速の精度の検証は、接着細胞の周りを追跡する粒子像を介して、かつ局所流速を測定するための自由流動性粒子として非接着流動性細胞を用いて行ってよい（図１１Ａ）。細胞などの自由流動性粒子は、比較的長いカメラ露光時間で撮像されている場合、線条としても知られる動きぼけに起因して直線として現れる。これらの線条の長さは、流動粒子の速度に比例する（図１１Ａ）。流動性細胞の局所流速（Ｖｐ）は、式１を使用して、ストリーキングライン長（ＬＰ）−平均細胞サイズ（ｄＰ）をカメラ露光時間（ＴＰ）で割ることにより決定される：
【数１】
2017530337.tif 000003
【０１２０】
次いで、式２を用いて、測定された局所流速と、マイクロチャネルの体積流量（Ｑ）及び寸法（幅：Ｗｃ、及び高さ：ｈｃ）によって決定される予測平均流速（Ｖｍ）との相関が分析される：
【数２】
2017530337.tif 000004
【０１２１】
このデータにより、測定される局所流速が予測流速と有意な相関を示すことが示される（ピアソン相関係数０．９４、ｐ＜０．００１、ｎ＝９、Ｒ２＝０．８８）（図１１Ｂ）。したがって、理論的な平均流速を、ＨｂＡ及びＨｂＳ含有ＲＢＣの剥離のための剪断応力並びに抗力のレベルを決定する際に使用した（図１１Ｃ、１１Ｄ及び１１Ｅ）。
【０１２２】
接着ＲＢＣ、並びに剥離時に細胞に作用する剪断応力及び抗力について、接着ＲＢＣの相対的な位置及び流速を決定した。接着ＲＢＣを、流速がチャネル全域で均一であるマイクロチャネルの中間領域に配置した。このデータにより、ｉ）最高で４．３倍速い流速（図１１Ｃ）；ｉｉ）４．３倍高い剪断応力（図１１Ｄ）；及びｉｉｉ）４．１倍高い抗力（図１１Ｅ）のいずれかが、変形可能なＨｂＳ含有ＲＢＣと比較して、変形不能ＨｂＳ含有ＲＢＣを剥離するのに必要であったことが示される（ｐ＜０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）。これとは対照的に、ＨｂＡ含有ＲＢＣ及び変形可能ＨｂＳ含有ＲＢＣは、剥離時の流速、剪断応力、及び抗力の点で異なっていなかった（ｐ＞０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）。これらの結果は、ＨｂＳ含有ＲＢＣがＦＮへの接着強度の点で異質であることを確証する。
【０１２３】
フロー開始時の接着ＲＢＣの動きは、ＨｂＡ、ＨｂＳ変形可能、及びＨｂＳ変形不能のＲＢＣにおける接着部位を分析するために、０．２８秒かけて撮影した高解像度の連続顕微鏡画像を用いて評価した。（図１２Ａ〜Ｌ）。このデータは、ＨｂＡ及びＨｂＳ変形可能細胞が流体の流動方向に応じて回転運動を示し、接着ピボット点が単一であることを示している（図１２Ｄ及び１２Ｈ）。一方、ＨｂＳ変形不能細胞は流体の流動方向に応じて回転運動を示さず、接着部位が複数あることを意味する（図１２Ｌ）。重要なことに、これらの観察は、ＨｂＳ変形不能細胞のより高い接着強度が多数の接着部位に起因し得ることを示唆している。
【０１２４】
実施例
実施例１
該ＨｅｍｅＣｈｉｐ技術は、ＳＣＤの診断において臨床施設が直面する課題に、新規かつ革新的なソリューションを提供する。わずか１０分で、該ＨｅｍｅＣｈｉｐは酢酸セルロース電気泳動を使用して、ヘモグロビンの基本的な種類：Ａ、Ａ２、Ｓ、Ｃ及びＦを示すバンドに５マイクロリットル未満の血液を分離する。実行し、各チップを作るコストは、＄２．００未満であり、該ＨｅｍｅＣｈｉｐシステムは、使いやすく、輸送が簡単である。さらに、チップのシンプルなデザインは、大量生産に容易である。該ＨｅｍｅＣｈｉｐ技術は、ＳＣＤを診断するために、正確で、効率的で、迅速かつ安価な方法を提供する。
【０１２５】
材料及び方法
ＨｅｍｅＣｈｉｐの材料
厚さ１．５ｍｍのポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）シートを、ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ（Ｅｌｍｈｕｒｓｔ，ＩＬ）から購入し、１／３２”厚のＰＭＭＡシートをｅＰｌａｓｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。３Ｍの光学的に透明な両面接着（ＤＳＡ）（タイプ８１４２）を、ｉＴａｐｅＳｔｏｒｅ（Ｓｃｏｔｃｈ  Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）から購入した。１×トリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液（ｐＨ８．３）を、脱イオン水（ＭｉｌｌｉＱ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で希釈した１０×ＴＢＥ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から作製した。酢酸セルロース膜を、Ａｐａｃｏｒから購入し、ＶＷＲインターナショナルＬＬＣ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）によって分配した。３００Ｖの電源を、ＶＷＲインターナショナルＬＬＣ（モデル３０２、Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）から購入した。ポンソーＳ染色、ヘモグロビンＡＦＳＣ対照、及びスーパーＺマイクロアプリケーターを、Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅａｕｍｏｎｔ，ＴＸ）から購入した。氷酢酸を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。黒鉛電極（０．９ｍｍ）をＡｍａｚｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から購入した。ブラック１／８”直径ドットをＭａｒｋ−Ｉｔ（Ｔｏｎａｗａｎｄａ，ＮＹ）から購入した。
【０１２６】
ＨｅｍｅＣｈｉｐの作製及び構築
該ＨｅｍｅＣｈｉｐを、１．５ｍｍ及び１／３２”厚のＰＭＭＡシートを用いて製造する。５層のＰＭＭＡ（５０ｍｍ×２５ｍｍ）があり、これらの層を、ＤＳＡを使用して組み立てる（図１Ａ）。発明者らは、個々のＰＭＭＡ層及びこれらの層を接着するためのＤＳＡ層を作製するために、ＶｅｒｓａＬＡＳＥＲシステム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）、レーザー微細加工システムを用いた。該ＨｅｍｅＣｈｉｐの上部層及び底部層は、１／３２”厚のＰＭＭＡシートで作られており、層の残りの部分は、厚さ１．５ｍｍのＰＭＭＡシートで作られている。ＤＳＡは、５０μｍの厚さを有している。実験用の酢酸セルロース紙も、ＶｅｒｓａＬＡＳＥＲシステムを用いて切断する（３９ｍｍ×９ｍｍ）。発明者らはまた、ＰＭＭＡと類似の製造方法を用いて、該ＨｅｍｅＣｈｉｐためのサンプルローディングユニットを作製した。このユニットを、血液サンプルアプリケーションの断面積及び再現性の分析を介して、手による手動スタンプと比較した。
【０１２７】
該ＨｅｍｅＣｈｉｐのためのＣＡＤ設計は、ＣｏｒｅｌＤＲＡＷ  ＳｕｉｔｅＸ６（Ｃｏｒｅｌ社，Ｏｔｔａｗａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）及びＳｏｌｉＤＷｏｒｋｓ  ３Ｄ  ＣＡＤ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して描いた（図１Ｂ）。この設計を、それらの層を作るためのＶｅｒｓａＬＡＳＥＲシステム用のインタフェースにエクスポートした。ＶｅｒｓａＬＡＳＥＲシステム用の切断パワーは、レーザーのための強度調整から「ベクター切断」を設定することによって準備した。ＰＭＭＡシート及びＤＳＡを、「ベクター切断」のために４５％（最低：５０％、最大：５０％）の設定で切断した。発明者らは、酢酸セルロース紙を切断するために約４０％の設定を使用した。紙を曲げるために、セルロース紙のプラスチックバックの両端で貫通しないように切り込みを入れた（図１Ｃ）。曲げは、電気泳動用緩衝液及び紙の接触を容易にする。レーザーの強度調整で「ラスター」設定の５０％（最低：−５０％、最大：５０％）の設定を使用して、両端から３．０ｍｍに位置で貫通しないように切り込みを入れた。
【０１２８】
血液の調製
施設内倫理委員会（ＩＲＢ）の承認の下で、廃棄され、非特定化された患者の血液サンプルを、大学病院の血液学及び腫瘍学部門（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から入手した。血液サンプルを、ＥＤＴＡ抗凝固剤（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を含有するバキュテイナー管に収集した。全血サンプルを、１０℃で静置保存し、重力により血漿及びヘマトクリットに分離させた。各サンプルのヘマトクリットを１：５の比率で脱イオン水と混合し、赤血球を溶解するために１５分間氷のブロックの上に置いた。調製したサンプルを、１０℃で個々の密封したマイクロチューブ内に保存し、使用前に穏やかに混合した。サンプルを使用し、受け取った日から２週間まで保存した。もう１つの方法として、全血サンプルは、１％サポニン＋ＴＢＥ緩衝液を用いてチップ上で溶解することができる。
【０１２９】
ＨｅｍｅＣｈｉｐ分析
毛細管現象によって完全に飽和するまで、該ＨｅｍｅＣｈｉｐのサンプルローディングポートを介してピペットを用いて４０μＬの１×ＴＢＥバッファーに酢酸セルロース紙を浸した。過剰な緩衝液を放置して乾燥させるか、又は紙全体に５分間再分布させた。１μＬ未満の調整した血液サンプルを、サンプルローディングポートを介してマイクロアプリケーターを用いてこの紙の上にスタンプした。約２００μＬの１×ＴＢＥバッファーを各バッファーポートにピペットで移した。グラファイト電極（長さ１インチ）は、バッファーポートに垂直に配置した。該ＨｅｍｅＣｈｉｐを、コンパクトな電源を使用して、８分間、２５０Ｖの定電圧及び５ｍＡの最大電流で運転した。必要に応じて、ポンソーＳ染色（２５μＬ）を、この紙の上にピペットで移し、５分間浸した。５％酢酸洗浄液を用いて、ヘモグロビンバンドが見え、この紙が元の白色に戻るまで染色を除去した。４つのブラック１／８”直径ドットを、モバイル及びＷｅｂベースの画像処理ソフトウェアと共に使用するために各コーナーに配置した。
【０１３０】
画像処理
４０ｍｍのｆ／２．８Ｇ  ＡＦ−Ｓ  ＤＸ  Ｍｉｃｒｏ  ＮＩＫＫＯＲレンズ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）搭載のＮｉｋｏｎ  Ｄ３２００カメラを用いて、各ＨｅｍｅＣｈｉｐのクローズアップ写真を撮影した。追加のプラグインを使用することなく、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＩｍａｇｅｊバージョン１．４８を使用して画像を処理した。各画像には、紙のみをトリミングし、分析のために使用した。減算バックグラウンド機能を用いて、この紙から滑らかで連続的なバックグラウンドノイズを除去するために、半径２５ピクセルの「ローリングボール」アルゴリズムを適用した。プロットプロファイル、表面プロット、及びゲルプロットツールを用いて、ヘモグロビンバンドを可視化し、定量化した。プロットプロファイルツールは、紙に沿って相対的なピクセル強度を提供し、各種類のヘモグロビンバンドに対応するピークを識別するために使用した。各ピークの下の面積を、ゲルプロットツールを使用して計算し、相対的なヘモグロビンの割合を表した。各ピークの領域を、ガスクロマトグラフィーで一般に使用されているバリー・ツー・バリー法（ｖａｌｌｅｙ−ｔｏ−ｖａｌｌｅｙ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて輪郭を描いた。ヘモグロビンバンドの３Ｄ表面プロファイルを、表面プロットツールを用いて取得した。バンド距離を、プロファイルプロット上の各頂点の座標を識別するために、ＭＡＴＬＡＢで計算した。これらは、Ｉｍａｇｅ  Ｊから得られたＨｅｍｅＣｈｉｐの長さ対ピクセル比を用いてピクセルからｍｍに変換した。同じ手順を用いて、標準的なベンチトップ電気泳動セットアップからのヘモグロビンの結果を定量化した。
【０１３１】
データ分析
該ＨｅｍｅＣｈｉｐ、ＨＰＬＣ、及びベンチトップ電気泳動から得られたヘモグロビンの割合を分析し、バー及び相関プロットを用いて比較した。該ＨｅｍｅＣｈｉｐ実験に用いたのと同じ血液サンプルのＨｂＣ／Ａ２、ＨｂＦ、ＨｂＳ、及びＨｂＡ０のヘモグロビンの識別をＢｉｏ−Ｒａｄ社のバリアントＩＩ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、大学病院ケース医療センターコア研究所の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって実施した。サンプルを、発明者らの研究室の伝統的なベンチトップ型電気泳動セットアップ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｇ４０６３０００，Ｂｅａｕｍｏｎｔ，ＴＸ）も用いて分析した。
【０１３２】
Ｗｅｂベースの画像処理及び定量化
画像処理アルゴリズム：この実施例では、画像処理アルゴリズムを、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアを使用して開発する。簡単に説明すると、このアルゴリズムは、最初にカラー画像を読み取り、基準点を検出し、チップ及びチャネルの画像の大きさを較正する。次いで、このアルゴリズムは、チャネルの中央に配置された基準線に沿ってピクセルごとに赤、青、及び緑の値の変化を識別する。この識別は、チャネル内の赤みを帯びた領域に対応するピーク値の検出をもたらす。赤みを帯びた領域が決定すると、各領域の面積及び開始点からの変位を計算する。この面積及び距離を用いて、ヘモグロビン疾患の種類を決定する。
【０１３３】
モバイルオペレーティングシステムから独立した画像解析システムを有するために、発明者らは、クラウド・コンピューティング・リソースと互換性のある画像処理モジュールを設計した。その結果、ウェブブラウザ及びインターネット接続を有する任意のモバイル装置を用いて、該ＨｅｍｅＣｈｉｐから画像を取得し、分析のためのクラウド計算サーバに画像を転送し、Ｗｅｂブラウザ上で結果を受け取り／表示することができる。
【０１３４】
発明者らは、．ＮＥＴフレームワークで処理するために、ＭＡＴＬＡＢコードから．ｄｌｌファイルを生成するためのＭＡＴＬＡＢ  Ｃｏｍｐｉｌｅｒ  ＳＤＫ（商標）（ソフトウェア開発キット）を使用した。生成された．ｄｌｌファイル及びブートストラップフレームワークを用いて、Ａｓｐ．ＮＥＴプロジェクトを開発した。最初に、ウェブページが、該ＨｅｍｅＣｈｉｐの画像をｍｗアレイオブジェクトに変換し、バックグラウンドでＭＡＴＬＡＢコードを実行する．ＮＥＴライブラリに転送する。次いで、関数の出力が、別のｍｗアレイオブジェクトを生成し、表示用のウェブページに戻す。発明者らは、ＡＳＰ．ＮＥＴ層を除去し、完全にスケーラブルなクラウド・コンピューティング・システムを統合することにより、画像解析の時間効率を高める計画をしている。この設計では、画像処理要求がキューイングサービスに転送される。キューイングサービスは、リクエストを実行するためにＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｗｏｒｋｅｒｓに処理要求を分配し、スケーラビリティがリクエストの量に基づいて自動的に実行される。Ｗｅｂブラウザ上で解析ツールを実行するかわりに、モバイル装置アプリケーションを開発することも可能である。モバイル装置上でアプリケーションを有すると、カメラの特徴を制御し、較正されたＨｅｍｅＣｈｉｐ画像を取得できる。
【０１３５】
統計分析
異なるヘモグロビンの種類のバンドの移動距離を、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を用いて（Ｍｉｎｉｔａｂ  １６ソフトウェア、Ｍｉｎｉｔａｂ社、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）を統計的に評価した。該ＨｅｍｅＣｈｉｐとＨＰＬＣで測定したヘモグロビン濃度間の相関及び一致を、ピアソン・プロダクトモーメント相関係数及びブランドアルトマン分析を用いて評価した。ブランドアルトマン分析における一致の限界を、平均値の差±１．９６倍の差の標準偏差として定義した。統計的有意性は、全検定について９５％の信頼レベル（ｐ＜０．０５）に設定した。受信者動作特性曲線を利用して、該ＨｅｍｅＣｈｉｐでの移動距離に基づいて、異なるヘモグロビン表現型の差別化を評価した。感度を＃真陽性／（＃真陽性＋＃偽陰性）として計算し、特異性を＃真陰性／（＃真陰性＋＃偽陽性）として計算した。本研究で得られたＨｅｍｅＣｈｉｐデータは、平均値±標準偏差として報告する。図中のエラーバーは標準偏差を表す。
【０１３６】
結果
ＨｅｍｅＣｈｉｐの設計及び運用
この技術の基礎は、ヘモグロビン電気泳動であり、簡単に説明する。ヘモグロビンの種類のＣ、Ａ２、Ｓ、Ｆ、及びＡ０は、６．５〜９．０の範囲のｐＨを有する緩衝液中で正味の負電荷を有する。発明者らは、１×トリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液を使用して、８．３のｐＨで電気伝導度に必要なイオンを提供する。ヘモグロビンの全体的な負の正味電荷は、電界に置かれたときに、ヘモグロビンを正電極に向かって移動させる。ヘモグロビンの移動度の違いは、図１Ｃに示すように、ふるい媒体である酢酸セルロース内で生じる分離を可能にする。ＨｂＡ０は、最高の移動度を有しており、最も遠くに移動する。対照的に、ＨｂＣ／Ａ２は、最も低い移動度を有し、最小距離を移動する。本論文では、発明者らは、類似の移動度によりＨｂＣ及びＨｂＡ２を一緒のグループにする。
【０１３７】
発明者らは、マイクロ工学設計及びＨｅｍｅＣｈｉｐの開発に複数の層積層アプローチを利用した。該ＨｅｍｅＣｈｉｐは、電極、バッファーポート、及びヘモグロビンの分離が行われる酢酸セルロース紙を包含するポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）基板で構成されている（図１Ａ）。該マイクロチップシステムは、迅速な手動の組み立てを可能にし、微小量の血液で動作する（図１Ｄ）。フィンガースティック又はヒールスティック量の血液サンプル（２０μＬ）を、細胞溶解用の脱イオン水と混合し、１μＬ未満をＨｅｍｅＣｈｉｐの酢酸セルロース紙上にスタンプした。
【０１３８】
グラファイト鉛筆の芯を、電源（ＶＷＲ、モデル３０２）によって生成された定電圧を印加するための電極として利用した。サンプルの分析は、最大５ｍＡで一定の２５０Ｖで８分かかる。図２は、これらの条件下でＨｅｍｅＣｈｉｐ上の鎌状赤血球形質（ＳＣＴ）を有する患者のサンプルのヘモグロビン分離の時間経過を示す。ＨｂＳ及びＨｂＡ０バンド間の分離が肉眼で見えた（図２Ａ、ｉｉｉ）。ポンソーＳでの染色は、低ヘマトクリットレベルの結果として、よりかすかなバンドを有するサンプルの場合はオプションである。このプロセスはＨｅｍｅＣｈｉｐ上で行うことができる。
【０１３９】
ＨｅｍｅＣｈｉｐの定量
得られたヘモグロビンバンドを、デジタルカメラを用いて撮影した。次いで、それらを可視化し、ＩｍａｇｅＪで様々なツールを用いて定量化した。発明者らは、酢酸セルロース紙の長さに沿ってヘモグロビンバンドの強度プロファイルをプロットした（図３、ｉｉ）。各プロットの原点は、サンプル適用点の中心に対応する。各ピークは、ヘモグロビンバンドを示し、各ピークの下の面積は、そのバンドのヘモグロビンの相対量を表す。発明者らは、サンプル中の他のヘモグロビンバンドの量に対する割合としてヘモグロビンの量を表した（図３、ｉｖ）。３Ｄ表面プロットも用いて、酢酸セルロース紙全体でヘモグロビンバンドを可視化した（図３、ｉｉｉ）。発明者らは、この方法を用いて、合計４３回の実験で１２の血液サンプルを分析した。これらのサンプルには、以下のものを含めた：２×ＨｂＳＳ、１×ＨｂＳＳ  ＨＰＦＨ、１×臍帯血（高ＨｂＦ）、３×ＨｂＳＣ、及び５×ＨｂＳＡ。該ＨｅｍｅＣｈｉｐの結果を、ＨＰＬＣ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社ＶＡＲＩＡＮＴ（商標）ＩＩヘモグロビン試験システム）及び従来のベンチトップ電気泳動（Ｈｅｌｅｎａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓモデルＧ４０６３０００，Ｂｅａｕｍｏｎｔ，ＴＸ）に対して評価した。
【０１４０】
図３Ａは、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）を有するホモ接合ＨｂＳＳのＳＣＤ患者の分析を示す。該ＨｅｍｅＣｈｉｐ分析は、高レベルのＨｂＳ並びに低レベルのＨｂＣ／Ａ２及びＨｂＦを示す。これらの結果は、ＨＰＬＣ及びベンチトップ電気泳動を介して得られたものと一致している（図３Ａ、ｉｖ）。同様に、図３Ｂは、鎌状赤血球形質（ＳＣＴ）のヘテロ接合ＨｂＳＡを有する患者の分析を示す。該ＨｅｍｅＣｈｉｐ結果は、高レベルのＨｂＳ及び多少のＨｂＡ０を示し、標準的な臨床的方法と一致する。これとは対照的に、該ＨｅｍｅＣｈｉｐは、低ＨｂＳ及び高ＨｂＡ０を有するサンプルのＳＣＴを検出することができ、これも標準的な方法と合意した（図６Ｃ）。ヘモグロビンの種類のＣ／Ａ２、Ｓ、Ｆ及びＡ０は、視覚的にも定量的にも正常に識別された。ヘモグロビンＳＣ病のＨｂＳＣについての類似の分析を図６に示す。全体的に、該ＨｅｍｅＣｈｉｐは、ホモ接合ＨｂＳＳ（ＳＣＤ）、ヘテロ接合ＨｂＳＡ（ＳＣＴ）、及びＨｂＳＣ（ヘモグロビンＳＣ疾患）を含む異なる種類のヘモグロビン障害を区別することができた。
【０１４１】
ＨｅｍｅＣｈｉｐ診断の有効性
該ＨｅｍｅＣｈｉｐの診断有効性を評価するために、発明者らは、合計４３の実験により、１２の血液サンプルについてＨＰＬＣから得られた割合とヘモグロビンの割合を比較した。これらのサンプルには、以下のものを含めた：２×ＨｂＳＳ、１×ＨｂＳＳ  ＨＰＦＨ、１×臍帯血（高ＨｂＦ）、３×ＨｂＳＣ、及び５×ＨｂＳＡ。図４Ａ〜Ｅは、該ＨｅｍｅＣｈｉｐ対ＨＰＬＣヘモグロビンパーセントの相関プロットを示す。各データポイントは、単一のサンプルからの平均ヘモグロビンの割合を表す。実線の対角線は、各データセットの傾向線を表す。発明者らは、２つの方法の一致を評価するために、ピアソン積率相関係数（ＰＣＣ）を使用した。ヘモグロビンの種類のＣ／Ａ２、Ｓ、Ｆ、及びＡ０は、ｐ＜０．００１（ＰＣＣＨｂＣ／Ａ２−０．９９、ＰＣＣＨｂＳ−０．９９、ＰＣＣＨｂＦ−０．９９、ＰＣＣＨｂＡ０−０．９６）と高い正の相関を示した。組み合わせたヘモグロビンの種類の全てについて高い正の相関も観察された（ｐ＜０．００１、ＰＣＣ＝０．９９）（図４Ｅ）。
【０１４２】
発明者らはまた、ブランドアルトマンプロットを使用して、該ＨｅｍｅＣｈｉｐとＨＰＬＣの結果の一致を評価した。図４Ｆは、推定（ＨｅｍｅＣｈｉｐ）の％ＨｂＳと実際（ＨＰＬＣ）の％ＨｂＳの強い一致（ＳＤ差＝７％ＨｂＳ）を示す。実線は平均値の差を表し、破線は２つの標準偏差の差を表す。実際の％ＨｂＳと推定の％ＨｂＳとの差の大部分（９５．５％）は、差の平均の２標準偏差内である。ヘモグロビンの種類は着色ドットで示されている。
【０１４３】
ヘモグロビンバンドの識別を、設定条件（２５０Ｖ、＜５ｍＡ、８分）の下での適用点からの各バンドの移動距離（ｍｍ）を分析することによって達成した。図５Ａは、各ヘモグロビンの種類の移動距離を比較している。このデータセットは、１１人の異なる患者の血液サンプル（３×ＳＳ、２×ＳＳ  ＨＰＦＨ、２×臍帯血（高ＨｂＦ）、２×ＳＣ、２×ＳＡ）と複数のヘモグロビンバンドを生成した３２の実験（２０×ＨｂＣ／Ａ２、２８×ＨｂＳ、１１×ＨｂＦ、及び７×ＨｂＡ０）からなる。各ヘモグロビングループの個々の水平な線は、データセット（ＨｂＣ／Ａ２＝６．３±０．９ｍｍ、ＨｂＳ＝９±１ｍｍ、ＨｂＦ＝１０．９±０．７ｍｍ、及びＨｂＡ０＝１３±１ｍｍ）の平均を表す。ヘモグロビングループ間の水平な線は、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定（ｐ＜０．００１）に基づいて、統計的に有意な差を表す。受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を利用して、該ＨｅｍｅＣｈｉｐでの移動距離に基づいて、異なるヘモグロビン表現型の差別化を評価した（図５Ｂ）。ＨｂＣ／Ａ２とＨｂＳの比較から、感度−０．９０及び特異性−０．８９が得られた。ＨｂＳとＨｂＦの比較から、感度＝０．８９及び特異性＝０．９２が得られた。ＨｂＦとＨｂＡ０の比較から、感度＝１．００及び特異性＝０．８６が得られた。
【０１４４】
新規ＨｅｍｅＣｈｉｐを使用して、発明者らは、ヘモグロビンの種類Ｃ／Ａ２、Ｓ、Ｆ、及びＡ０の識別及び定量化に成功することができた。発明者らは、該ＨｅｍｅＣｈｉｐがホモ接合ＨｂＳＳ（ＳＣＤ）、ヘテロ接合ＨｂＳＡ（ＳＣＴ）、及びＨｂＳＣ（ヘモグロビンＳＣ疾患）を含む異なる種類のヘモグロビン障害を区別することができることを示した。ヘモグロビンバンド間の分離が肉眼で見えた。定量分析により、該ＨｅｍｅＣｈｉｐヘモグロビンのパーセントがＨＰＬＣ及びベンチトップ電気泳動結果と同等であることが示された。
【０１４５】
該ＨｅｍｅＣｈｉｐは、ＳＣＤを診断する現在の方法に比べていくつかの利点を提供する。第１の利点は、該ＨｅｍｅＣｈｉｐのコストの低さである。＄２．００未満で、発明者らはその必要な試薬の全てを有するＨｅｍｅＣｈｉｐを製造することができる。対照的に、発明者らの研究室は現在、大学病院ケース医療センター（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）のコア研究所でＨＰＬＣ分析用サンプルあたり＄１９．２５を支払う。同様に、発明者らの研究室の標準的なベンチトップ電気泳動のセットアップは、該ＨｅｍｅＣｈｉｐよりも酢酸セルロース紙及び試薬に約１５倍多くの材料を必要とする。該ＨｅｍｅＣｈｉｐと比較した場合、これらの標準的なシステムの初期投資を含めると、大幅にコストの差が増大する。
【０１４６】
第２の利点は、ＰＯＣ診断のためのＨｅｍｅＣｈｉｐの携帯性及び使いやすさである。該ＨｅｍｅＣｈｉｐは現在、電源、カメラ、及びコンピュータを必要とする。これは、該ＨｅｍｅＣｈｉｐが電源コンセントのある場所ではどこでも使用することができ、専用のラボ環境を必要としないことを意味する。該ＨｅｍｅＣｈｉｐ上のサンプル処理は、簡単で、サンプルの調製、バッファーの添加、及び電源のオンを伴う。本論文では、サンプルを主にＩｍａｇｅＪで分析したが、発明者らは、モバイル装置で使用するための予備的なＷｅｂベースの画像解析ソフトウェアを開発した。図７で原型を説明し、手動画像処理と比較している。結果の分析は、単に該ＨｅｍｅＣｈｉｐの写真撮影及び自動化されたアプリケーションへのそのアップロードのみを伴う。このソフトウェアは、さらに該ＨｅｍｅＣｈｉｐの携帯性及び使いやすさを向上させる。該ＨｅｍｅＣｈｉｐの全体的なシンプルさは、ＨＰＬＣ及びベンチトップ電気泳動と比較して、基本的な実験スキルを有する全てのユーザーが安価かつ正確にＳＣＤ、ＳＣＴ、及びヘモグロビンＳＣ疾患を検出するのを可能にする。
【０１４７】
該ＨｅｍｅＣｈｉｐの第３の利点は、その短いランタイムである。２０分以内に、該ＨｅｍｅＣｈｉｐ技術は、処理し、分析し、かつ結果をユーザーに表示することができる（染色を含まない）。診断時間のこの大幅な減少は、臨床技術者の数が限られている環境で、患者のより高いスループットを可能にする。該ＨｅｍｅＣｈｉｐは個々のサンプル用に設計されるので、患者は試験が終了するとすぐに、その結果を受け取ることができる。対照的に、標準的なベンチトップ電気泳動はバッチで実行される場合が多く、患者に結果を伝えるのが遅れる。これは、患者がＰＯＣを去った後に、患者に接触するためのシステムを欠くエリアで重大である。
【０１４８】
臍帯血サンプルを使用すると、発明者らはさらに、新生児患者における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の高発現を認めることができた。胎児ヘモグロビンの発現は、健常な赤ちゃんで５０〜９５％であり、６ヶ月間にわたって低下する。成人では、総ヘモグロビンの１％未満がＨｂＦである。ＨｂＦ発現はまた、ＳＣＤ及びβ−サラセミアなどの個人のＲＢＣ障害で増加する。この高発現のヘモグロビンは、６ヶ月後に症状が現れる多くの新生児の古典的なＳＣＤ表現型を隠す。該ＨｅｍｅＣｈｉｐは、ＨｂＦを検出し、ＨｂＡとＨｂＳの両方を区別することができる。該ＨｅｍｅＣｈｉｐ装置の診断精度を向上させるために、発明者らは、血液サンプル中のＨｂＦ発現を低減することができる方法を探した。
【０１４９】
クエン酸リン酸を用いて、ＲＢＣからのＨｂＡ及びＨｂＳを沈殿させる新しいプロトコルが開発中である。溶出後、成人ヘモグロビンは、チューブの底で胎児ヘモグロビン含有細胞を超えて上昇する。次いで、成人ヘモグロビンを含有する上清を用いて、ＨｅｍｅＣｈｉｐ実験を実行する。この新しいプロトコルにより、ＲＢＣの溶解ステップがバイパスされ、胎児ヘモグロビンのタンパク質濃度が低減する。今日までに、発明者らは、クエン酸リン酸の曝露により、遠心分離していないサンプルにおいてＨｂＦタンパク質濃度を５０％減少させることを見出した。
【０１５０】
実施例２
マイクロ流体バイオチップの作製
ＰＭＭＡトップ部分は、ＶｅｒｓａＬＡＳＥＲシステム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）を用いて、入口及び出口（直径０．６１ｍｍで２６メートル離れている）を切断することにより調製する。両面接着（ＤＳＡ）フィルム（ｉＴａｐｅｓｔｏｒｅ，Ｓｃｏｔｃｈ  Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）を、ＰＭＭＡ部分及び２８×４ｍｍのチャネルのサイズに合わせてカットする。次いで、ＤＳＡを、ＤＳＡ膜の輪郭の間に入口及び出口を含むようにＰＭＭＡ上部に接着させる。次いで、金シールガラススライドを、マイクロ流体チャネルを形成するために、ＰＭＭＡ−ＤＳＡ構造で組み立てる。
【０１５１】
界面化学
ＧＭＢＳストック溶液を、０．２５ｍＬのＤＭＳＯに２５ｍｇのＧＭＢＳを溶解することによって調製し、ストック溶液をエタノールで希釈して、０．２８％のｖ／ｖのＧＭＢＳ作業溶液を取得した。ＦＮをＰＢＳで希釈し、（１：１０）ＦＮ作業溶液を作製する。ＢＳＡ溶液を、１ｍＬのＰＢＳに３ｍｇの凍結乾燥ＢＳＡを溶解することによって調製する。
【０１５２】
これらのチャネルを、組み立て後に３０μＬのＰＢＳ及びエタノールで洗浄する。次に、２０μＬの架橋剤ＧＭＢＳ作業溶液を、これらのチャネルに２回注入し、室温で１５分間インキュベートする。ＧＭＢＳインキュベーション後に、チャネルを３０μＬのエタノール及びＰＢＳで２回洗浄する。次に、２０μＬのＦＮ溶液をこれらのチャネルに注入し、室温で１．５時間インキュベートする。
【０１５３】
次いで、３０μＬのＢＳＡ溶液を注入し、４℃で一晩インキュベーションすることによって表面を不動態化する。血液サンプルを処理する前に、チャネルをＰＢＳで洗浄する。
【０１５４】
血液処理
廃棄され、非特定化された患者の血液サンプルを、治験審査委員会（ＩＲＢ）の承認の下で大学病院の血液学及び腫瘍学部門から取得した。血液サンプルを、ＥＤＴＡを含有する紫色のキャップバキュテイナー管に収集した。実験に使用する前に、血液サンプルを、周囲の空気への暴露を最小限にするために密封したマイクロチューブ及び密封した注射器に等分した。チャネルを通して血液を流し、以後のＦＣＳＢフロー手順を、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  ＮＥ−３００シリンジポンプシステム（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を使用して適用する。血液サンプルを、マイクロチャネルへの注入前及びその間に１ｍＬの使い捨て注射器に密封して、直立させる。次に、チャネルが血液で満たされるまで、血液をマイクロチャネルに２８．５μＬ／分で導入し、次いで、１５μＬの血液サンプルを２．８５μＬ／分の流速で注入する。次に、注射器を変更し、１０μＬ／分の流速で１２０μＬのＦＣＳＢをチャネルに導入し、非接着細胞を除去する。チャネル内の接着ＲＢＣを、倒立蛍光顕微鏡（オリンパスＩΧ８３）及び蛍光顕微鏡カメラ（ＥＸｉ  Ｂｌｕｅ  ＥＸＩ−ＢＬＵ−Ｒ―Ｆ−Ｍ―１４−Ｃ）を用いて可視化する。リアルタイム顕微鏡撮影及び高解像度ビデオを７ｆｐｓレートで記録している間に、ＲＢＣの剥離がマイクロチャネル表面から観察されるまで、段階的に増加する制御された流体流動を適用する。
【０１５５】
マイクロ流体チャネルの可視化及び画像処理
この研究で、オリンパスセルセンス生細胞撮像及び解析ソフトウェア搭載のオリンパスＩＸ８３倒立電動顕微鏡を用いて、リアルタイム顕微鏡記録を取得する。オリンパス（２０×／０．４５  ｐｈ２及び４０×／０．７５  ｐｈ３）長作動距離対物レンズを、マイクロチャネル内の単一ＲＢＣの位相コントラスト撮像のために利用する（図９Ａ）。ビデオを７ｆｐｓで記録し、さらなる処理及び分析のための単一フレーム画像に変換する。細胞の寸法は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いることによって分析する。
【０１５６】
接着ＲＢＣを、記録画像内のフローの生物物理学的特性の観点から分析し、発明者らは局所流速を決定するために（カメラの露光時間１．５ｍｓでぼんやりした線として見える）自由流動性細胞を利用する（図１０Ａ）。加えて、細胞接着、流動中の細胞変形、及び細胞剥離を、毎秒７コマで撮影した連続記録画像で再解析した。
【０１５７】
データ解析
接着ＲＢＣ上の流速を、矩形チャネル内の圧力駆動流を説明する式３及び式４を用いて計算する：
【数３】
2017530337.tif 000005
式中、ｘ、ｙ及びｚは主軸であり、ｈ及びｗはチャネルの高さ及び幅であり、ｎは流体の粘度であり、ｄｐ／ｄｘはｘ軸に沿った圧力変化であり、Ｑは体積流量である。表１を参照されたい。
【０１５８】
【表１】
2017530337.tif 000006
【０１５９】
接着ＲＢＣに適用した抗力を、抗力式（式５）を用いて計算する：
【数４】
2017530337.tif 000007
Ｆｄは抗力であり、ｐは流体密度であり、Ｃｄは抗力係数であり、Ａは基準領域である。Ｃｄは、１３．６／Ｒｅとして低いレイノルズ数の流動での細胞の流動仮定に平行な円板に基づいて計算され、Ｒｅは、レイノルズ数である。Ｍｕｎｓｏｎら、流体力学の基礎（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）、７版；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｃａｎａｄａ：Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ，Ｃａｎａｄａ，２０１２；ｐ７９２．Ａの基準領域は、典型的なＲＢＣの厚さ及び剥離時に測定されたＲＢＣ幅を用いて計算する。接着面上の剪断応力（Ｔ）を、式６を使用して計算する：
【数５】
2017530337.tif 000008
【０１６０】
統計分析
本研究で得られたデータを、平均±平均の標準誤差として報告する。細胞のアスペクト比、アスペクト比の変化（変形能）、流速、剪断応力、及び抗力を、多重比較のためのフィッシャーのポストホック検定と共に分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して統計的に評価する（１グループ当たりｎ＝３〜６の血液サンプル）（Ｍｉｎｉｔａｂ  １６ソフトウェア、Ｍｉｎｉｔａｂ社、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）。統計的有意性を、全ての試験について９５％の信頼レベル（ｐ＜０．０５）に設定する。図中のエラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【０１６１】
データクラスタリング：全血球数の個々の構成要素と接着ＲＢＣの数の関係を、Ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングを用いて解析した。ＨｂＳＳを有する患者は、Ｋ−ｍｅａｎｓ法を用いて２つの群にクラスター化し、得られたグループを、疾患の重症度の違いについて評価した。全血球数の単一構成要素並びに複数の成分を、Ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングで使用し、２つのサブグループを識別した。サブグループを識別したら、これらのグループ間の接着ＲＢＣの数の差を、一方向ＡＮＯＶＡ検定を用いて統計的有意性について試験した。試験のレベル（アルファ）を０．０５（両側）として設定した。接着ＲＢＣの数の間の差異の観点で重要なサブグループをもたらす１つの又は複数の構成要素を、この論文で報告した。Ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングを、Ｍａｔｌａｂ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社、Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いて行った。
【０１６２】
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線：受信者動作特性曲線を用いて、ＳＣＤ−バイオチップのヘモグロビン表現型の差別化の精度を決定した。曲線を、Ｍａｔｌａｂ（登録商標）（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ社、Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いて作成した。曲線下面積に加えて、感度、特異性、陽性及び陰性の尤度比、並びに陽性及び陰性の予測値を以下のように計算した：感度を＃真陽性／（＃真陽性＋＃偽陰性）として計算し、特異性を＃真陰性／（＃真陰性＋＃偽陽性）として計算した。陽性の尤度比を感度／（１−特異性）と定義した。陰性の尤度比を（１−感度）／特異性であった。陽性予測値は、＃真陽性／（＃真陽性＋＃偽陽性）であり、陰性の予測値は＃真陰性／（＃真陰性＋＃偽陰性）であった。
【０１６３】
実施例３
この実施例では、フィブロネクチン（ＦＮ）官能化ガラス表面を含む少なくとも１つのエッチングされたマイクロチャネルを含むマイクロ流体バイオチップについて説明する。該バイオチップは、さらに、エッチングされた入口ポート及びエッチングされた出口ポートを有するポリ（メチルメタクリレート）プラスチックトップを含む。さらに上部には、マイクロチャネルの輪郭及び幅（例えば、約５０μｍ）を画定する両面接着フィルムを真ん中に含む（図９Ａ及び１３Ｃ）。さらに、該マイクロ流体システムは、高解像度生単細胞の画像記録及び分析のためのオリンパスＩΧ８３倒立電動顕微鏡ステージ上に配置してもよい。
【０１６４】
ＦＮは、血漿中を循環し、内皮細胞の膜に存在する。ＦＮは、内皮壁へのＨｂＳ  ＲＢＣ接着において役割を果たすことが示されている接着性糖タンパク質であると考えられている。Ｋａｓｓｃｈａｕら、Ｂｌｏｏｄ  ８７（２）：７７１−７８０（１９９６）；Ｗｉｃｋら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ３（２）：１１８−１２４（１９９６）；Ｍｏｓｈｅｒ，Ｄ．Ｆ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５：５６１−５７５（１９８４）；及びＫｕｍａｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８８（１１）：４３４８−４３５８（１９９６）。ＦＮを、部分的に内皮細胞壁の特性を模倣するように、マイクロ流体チャネルの表面上に固定化した。該マイクロ流体の設計は、微小血管系における生理的条件に類似した流速の正確な制御を可能にし、表面上の直線的で平行な流線の層流条件をもたらす。Ｌｉｐｏｗｓｋｙ，Ｈ．Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２（１）：５−１（２００５）。該マイクロ流体チャネル内の層流プロファイルは、ＦＮ固定表面を有する循環ＲＢＣの相互作用を可能にし、増加した接着特性を有するＲＢＣの接着を可能にする（図９Ｂ）。得られたデータは、ＨｂＳを有する対象からの血液サンプル中の形態学的に異種のＲＢＣ集団の接着を示す（図９Ｃ）。この接着は、ＨｂＡの血液サンプルを試験する場合に観察されない（データ示さず）。接着ＲＢＣは、単一ＨｂＳ含有血液サンプルからの同じフィールド内に、軽度の鎌状（図９Ｃ（ｉ））、中程度の鎌状（図９Ｃ（ｉｉ））及び高度な鎌状（図９Ｃ（ｉｉｉ））の細胞形態を含んでいた。
【０１６５】
これらのデータは、３つの条件：（１）非流動条件、（２）流動条件、及び（３）剥離条件における単一ＨｂＡ含有ＲＢＣ又は単一ＨｂＳ含有ＲＢＣのアスペクト比（ＡＲ）並びに変形能について分析した。このデータは、変形能：ＨｂＳ変形可能及びＨｂＳ変形不能の面で、ＨｂＳ含有ＲＢＣの２つのサブグループを示した（図１０Ａ）。非流動条件に関する細胞のアスペクト比の変化を変形能の尺度として使用し、細胞のアスペクト比がより大きく変化すると、より高い変形能、ひいては、より低い剛性につながる。流速は、段階的に増加する。各ＲＢＣについての細胞変形能を、タイムラプス実験での剥離直前に最大流速で評価する。この分析は、接着細胞の最大変形の推定をもたらす（図１０Ｂ及び１０Ｃ）。
【０１６６】
ＨｂＡ含有ＲＢＣは、非流動時にＨｂＳ含有ＲＢＣよりも有意に高い細胞アスペクト比（すなわち、例えば、円形度）を示す（ｐ＜０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）。ＨｂＡ  ＲＢＣのアスペクト比は流動条件下で有意に減少し（ｐ＜０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）、より高い変形能を暗示する。ＨｂＳ含有変形可能ＲＢＣは、非流動条件と比較して、剥離瞬間のみにアスペクト比の有意な減少を提示する（ｐ＜０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）。確かに、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣのアスペクト比は、いかなる流動条件においても変化しない（ｐ＞０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）（図１０Ｂ）。
【０１６７】
ＨｂＳ変形可能ＲＢＣは、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣと比較して、非流動時に有意に大きい細胞のアスペクト比及び剥離時に有意に大きい変形能を示す（ｐ＜０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）（図１０Ｂ及び１０Ｃ）。ＨｂＡ含有ＲＢＣの変形能は、全ての流動条件においてＨｂＳ含有ＲＢＣよりも有意に大きい（ｐ＜０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）。ＨｂＡ含有変形可能ＲＢＣとＨｂＳ含有変形可能ＲＢＣの両方の変形能は、流動中に測定した場合及び剥離時に測定した場合に有意に異なる（ｐ＜０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）。しかしながら、これらの同じ条件下で、ＨｂＳ変形不能ＲＢＣは、この区間中の変形能に有意差は示さない（ｐ＞０．０５、フィッシャーのポストホック検定と一方向ＡＮＯＶＡ）。ＳＣＤ（すなわち、例えば、ＦＮ官能化表面）における通常の血流の特徴を模倣する表面に接着するが、ＨｂＳ含有ＲＢＣはアスペクト比及び変形能において不均質である。（図１０Ｃ）。
【０１６８】
別の実施例では、マイクロ流体チャネルは、ＦＮ又はＬＮ、ポリ（メチルメタクリレート）プラスチックトップ（入口及び出口を包含する）で官能化され、該マイクロチャネルの高さ及び形状を画定する５０μｍ厚の両面接着テープを挟むガラス表面で構成されていた（図１３）。ＦＮは、血漿中を循環し、内皮細胞の膜に存在する糖タンパク質である。ＦＮは、内皮壁とのＲＢＣインテグリンα４β１相互作用を介して、ＳＣＤ  ＲＢＣ接着において役割を果たしている。ＬＮは、内皮下細胞であり、ベータアドレナリン刺激中にリン酸化される免疫グロブリンスーパーファミリーのＢＣＡＭ／ＬＵからの重要なＲＢＣ表面タンパク質に結合する。
【０１６９】
接着ＲＢＣの数を、ＦＮ又はＬＮ固定マイクロ流体チャネル内で定量化した。発明者らは、ＳＣＤを有する対象からの血液サンプルにおいてＲＢＣの異常な接着を観察した。一方、正常な対象からの血液サンプル中のＲＢＣの接着はほとんどなかった（図示せず）。ＳＣＤバイオチップ内部のＦＮ及びＬＮコーティングマイクロチャネル表面の高解像度位相コントラスト画像は、接着ＲＢＣの不均質な鎌状形態を明らかにした。ＲＢＣの接着の範囲は、様々な臨床的表現型を有する患者において観察された。
【０１７０】
発明者らは、マイクロ流体チャネルの高解像度画像を使用して、ＨｂＡＡ、複合ヘテロ接合ＨｂＳＣ又はＨｂＳβ＋サラセミア（ＨｂＳＣ／Ｓβ＋）、又はホモ接合ＨｂＳＳを有する対象からの血液サンプル中のＦＮ及びＬＮ官能化マイクロチャネルにおける単位面積（３２ｍｍ２）あたりの接着ＲＢＣの数を分析した（図１４）。異なるヘモグロビン表現型を有する血液サンプル中で、接着ＲＢＣの数は、ＦＮ（Ｐ＝０．０２３及びＰ＝０．００２、それぞれ）及びＬＮ（Ｐ＝０．０２４及びＰ＝０．０１１、それぞれ図１４Ｃ及び１４Ｄ）中のＨｂＳＳ＞ＨｂＳＣ／Ｓβ＋＞ＨｂＡＡ血液サンプルにおいて有意に高かった。さらに、ＨｂＳＣ／Ｓβ＋血液サンプルは、ＦＮ（Ｐ＝０．００２）及びＬＮ（Ｐ＝０．０２７）官能化マイクロチャネルの両方でＨｂＡＡ血液サンプルよりも有意に高い数の接着ＲＢＣを示した（図１４Ｃ及び１４Ｄ）。
【０１７１】
次に、発明者らは、接着を介して、ヘモグロビンの表現型を正確に決定するＳＣＤ−バイオチップの能力を評価するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットした（図１４Ｅ及び１４Ｆ）。接着ＲＢＣ数の選択された閾値について（図１０Ｅ及び１０Ｆ）、発明者らは、ＨｂＳＳとＨｂＡＡの表現型を区別するために、０．９３真陽性率及び０．００偽陽性率を観察した。ＨｂＳＳ及びＨｂＡＡを区別するための曲線下面積は、ＦＮ及びＬＮについて両方とも０．８５より高かった。これらの結果は、細胞接着を介してヘモグロビン表現型間で区別するＳＣＤバイオチップの能力を実証する。これらのデータは、さらに、ＨｂＳＳの溶血性がより高く、ＨｂＳＣの溶血性が低いＳＣＤの表現型を説明することにおいて、異常な細胞接着が果たす役割を支持し得る。
【０１７２】
ＳＣＤにおけるＨｂＦの改善的な役割のために、発明者らは、低い（＜％８）ＨｂＦレベル及び高い（＞８％）ＨｂＦレベルを有するＨｂＳＳの血液サンプル中のＲＢＣ接着を調べた（図１５）。比較すると、接着ＲＢＣの数は、ＦＮ（Ｐ＝０．０１５、図１５Ａ）及びＬＮ（Ｐ＝０．０２２、図１５Ｂ）官能化マイクロチャネルの両方において高いＨｂＦレベルよりも低いＨｂＦを有する対象からの血液サンプルで有意に高かった。これらの知見は、ＳＣＤの機能的表現型についてのインビトロ接着アッセイ、及び新規治療法のこれらの表現型に対する影響としてＳＣＤ−バイオチップのベースグラウンドを確立する。
【０１７３】
発明者らは、ケア血液検査結果及びヘモグロビン試験結果の標準の単一構成要素に基づいて、ＨｂＳＳ患者の中でサブグループを識別するためにＫ−ｍｅａｎｓクラスタリング分析を利用した。発明者らは、高乳酸脱水素酵素及び低乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、血小板数（ｐｌｔ）、及び網状赤血球数（ｒｅｔｉｃｓ）を含む様々な臨床表現型を有する患者からのＨｂＳＳ血液サンプルにおけるＦＮ及びＬＮマイクロチャネルへのＲＢＣ接着を分析した（図１６）。発明者らは、低ＬＤＨレベル（＜５００ｕ／ｌ）を有する患者と比較して、高ＬＤＨレベル（＞５００ｕ／Ｌ）を有する患者からの血液サンプルにおけるＦＮ（Ｐ＝０．０００３）及びＬＮ（Ｐ＝０．００３）固定マイクロチャネルの両方への有意に高い数の接着ＲＢＣを観察した（図１６Ａ及び１６Ｃ）。また、高ｐｌｔ患者からの血液サンプル中のＲＢＣ（＞３２０  １０９／Ｌ）は、低ｐｌｔ患者（＜３２０  １０９／Ｌ）よりもＦＮ固定マイクロチャネルへの有意に高い接着（Ｐ＝０．０４６）を示した（図１６Ｂ）。さらに、発明者らは、低ｒｅｔｉｃｓ患者（＜３２０  １０９／Ｌ）と比較して、高ｒｅｔｉｃｓ患者（＞３２０  １０９／Ｌ）の血液サンプル中のＬＮ官能化マイクロチャネル（Ｐ＝０．０１４）への有意に高いＲＢＣ接着を観察した（図１６Ｄ）。
【０１７４】
次いで、発明者らは、ＦＮ官能化マイクロチャネル中の接着ＲＢＣの不均一性を分析した（図１７）。ＨｂＳＳ血液サンプル中の接着ＲＢＣの形態及び数を、０．８ｍｍ／ｓ、３．３ｍｍ／ｓ、及び４１．７ｍｍ／ｓの段階的に増加した流速での制御された細胞の剥離後に定量化した（図１７Ａ〜Ｃ）。形態学的特徴に基づき、接着ＲＢＣを、変形可能（図１７Ｄ）及び変形不能（図１３Ｅ）ＲＢＣとして分類した。０．８ｍｍ／ｓの流速での接着ＲＢＣの合計のうちの変形可能ＲＢＣ及び変形不能ＲＢＣの割合を計算した（図１７Ｆ）。変形可能ＲＢＣ及び変形不能ＲＢＣの割合は、０．８ｍｍ／ｓで有意差はなかった（Ｐ＝０．２６６）。一方、変形不能ＲＢＣの割合は、４１．７ｍｍ／ｓでの変形不能ＲＢＣの割合よりも有意に高かった（Ｐ＝０．０４７、図１７Ｆ）。さらに、変形可能ＲＢＣの割合は、０．８ｍｍ／ｓと比較して、３．３ｍｍ／ｓ及び４１．７ｍｍ／ｓで有意に低かった（それぞれＰ＝０．００１及びＰ＜０．００１）。また、変形可能ＲＢＣの割合は、３．３ｍｍ／ｓよりも４１．７ｍｍ／ｓで有意に低かった（Ｐ＜０．００１）。しかしながら、変形不能ＲＢＣの割合における唯一の有意差が、０．８ｍｍ／ｓと４１．７ｍｍ／ｓ（Ｐ＝０．００３、図１７Ｆ）との間で観察された。さらに、発明者らは、発明者らの対象において変形不能接着ＲＢＣ（％）と血清ＬＤＨレベルとの間に有意な関連が観察された（図１３Ｇ、ピアソン相関係数０．７９、ｐ＜０．００５）。これらの結果は、接着ＲＢＣにおける形態学的及び質的異質性並びに溶血と変形不能接着ＲＢＣとの間の関連を示す。
【０１７５】
本発明の上記の説明から、当業者は、改善、変更及び修正を認識するであろう。このような改善、変更、及び修正は、当業者の範囲内であり、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本明細書で特定する全ての特許及び刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月31日(2017.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハウジングの一部を通って広がり、電気泳動篩媒体を含むマイクロチャネルを含むハウジング；
前記マイクロチャネル及び篩媒体にサンプルを導入するための手段；
前記篩媒体の長さに沿って電界を発生させるための第１の電極及び第２の電極、
を含む電気泳動チップであって、
前記発生した電界が前記開口部に導入される前記サンプルの構成成分の移動及び分離を誘導し、前記ハウジングの一部が前記移動及び分離されたサンプルを可視化するために必要に応じて透明である電気泳動チップ。
【請求項２】
さらに、前記篩媒体に沿ったサンプル移動を可視化及び定量化するための携帯可能なコンピューターインターフェース撮像システムを含む、請求項１に記載の電気泳動チップ。
【請求項３】
前記携帯可能なコンピューターインターフェース撮像システムが、サンプルの移動を撮像するために使用されるカメラ、並びにサンプルの移動を認識及び定量化するソフトウェアアプリケーションを含む、請求項２に記載の電気泳動チップ。
【請求項４】
前記ハウジングが、前記篩媒体及びサンプル移動を可視化するための必要に応じて透明な領域を含む、請求項３に記載の電気泳動チップ。
【請求項５】
前記上部キャップ又は底部キャップのうちの少なくとも１つが、必要に応じて透明なガラス又はプラスチックを含む、請求項４に記載の電気泳動チップ。
【請求項６】
前記サンプルが血液サンプルであり、前記第１の電極及び第２の電極が、前記血液サンプル中のヘモグロビン変異体の移動及び分離を促進するのに有効な電界を発生させる、請求項５に記載の電気泳動チップ。
【請求項７】
前記カメラが、ヘモグロビン変異体の移動を撮像するために使用され、前記ソフトウェアアプリケーションが、スクリーニング決定もしくは診断を支援するために前記ヘモグロビンバンドの種類及び／又は密度を認識並びに定量化する、請求項６に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項８】
前記第１の電極及び第２の電極によって印加される電圧が、約１Ｖ〜約４００Ｖの範囲内である、請求項１に記載の電気泳動チップ。
【請求項９】
前記篩媒体に導入されるサンプルが１０マイクロリットル未満である、請求項１に記載の電気泳動チップ。
【請求項１０】
前記ハウジングが、上部キャップ、底部キャップ、及び前記上部キャップと底部キャップとの間に介在する空洞を含み、前記空洞が前記ハウジング内で前記マイクロチャネルを画定する、請求項１に記載の電気泳動チップ。
【請求項１１】
ヘモグロビン変異体を検出するのに使用するための電気泳動バイオチップであって、
ハウジングの一部を通って広がり、篩媒体を含むマイクロチャネルを含むハウジング；
前記マイクロチャネル及び篩媒体に血液サンプルを導入するための手段；
前記篩媒体の長さに沿って電界を発生させるための第１の電極及び第２の電極、
を含み、前記発生した電界が前記開口部に導入される血液サンプル中のヘモグロビン変異体の移動及び分離を誘導し、前記ハウジングの一部が前記移動及び分離されたヘモグロビン変異体を可視化するために必要に応じて透明である電気泳動バイオチップ。
【請求項１２】
さらに、前記篩媒体に沿ったヘモグロビン変異体の移動を可視化及び定量化するための携帯可能なコンピューターインターフェース撮像システムを含む、請求項１１に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１３】
前記携帯可能なコンピューターインターフェース撮像システムが、ヘモグロビン変異体の移動を撮像するために使用されるカメラ、並びにスクリーニング決定もしくは診断を行うためにヘモグロビンバンドの種類及び／又は密度を認識並びに定量化するソフトウェアアプリケーションを含む、請求項１２に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１４】
前記ハウジングが、前記篩媒体及びヘモグロビン変異体の移動を可視化するための、必要に応じて透明な領域を含む、請求項１３に記載の電気泳動バイオチップ。
【請求項１５】
前記篩媒体が、アルカリ緩衝液で飽和された酢酸セルロース紙を含む、請求項１１に記載の電気泳動バイオチップ。
【国際調査報告】
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