(57)【要約】  クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィー媒体を含むデバイスが開示される。クロマトグラフィーデバイスを作製する方法及びクロマトグラフィー媒体を含むクロマトグラフィーデバイスを使用する方法も開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１超〜約３個のリンカー分子を含む、官能化表面とを有する、クロマトグラフィー媒体。
【請求項２】
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有する、クロマトグラフィー媒体。
【請求項３】
前記タンパク質が、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を介して、前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合している、請求項２に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項４】
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約２０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積と、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面と、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質とを有する、クロマトグラフィー媒体。
【請求項５】
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約０．９の細孔径分布相対スパンを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項６】
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約０．９９の細孔径分布相対スパンを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項７】
前記多孔質無機粒子が、約１．０〜約１．３の細孔径分布相対スパンを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項８】
全細孔容積の少なくとも４０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項９】
全細孔容積の約４０％〜約９０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にある、請求項８に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１０】
全細孔容積の少なくとも２０％が、約１０００Å〜約１６００Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１１】
全細孔容積の約２０％〜約６０％が、約１０００Å〜約１６００Åの直径の細孔を有する、請求項１０に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１２】
全細孔容積の少なくとも１５％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１３】
全細孔容積の約１５％〜約３０％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項１２に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１４】
前記多孔質無機粒子が、約１０ｍ２／ｇを超える平均ＢＥＴ表面積を有する、請求項１〜３及び５〜１３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１５】
前記多孔質無機粒子が、約２０ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積を有する、請求項１４に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１６】
前記多孔質無機粒子が、約２５ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積を有する、請求項１５に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１７】
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積を有する、請求項１〜３及び５〜１５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１８】
前記多孔質無機粒子が、約３０μｍ〜約１２０μｍの平均粒子寸法を有する、請求項１７に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１９】
前記多孔質無機粒子が、約５０μｍ〜約９０μｍの平均粒子寸法を有する、請求項１８に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２０】
前記多孔質無機粒子が、約７０μｍの平均粒子寸法を有する、請求項１９に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２１】
前記多孔質無機粒子が、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２２】
前記多孔質無機粒子が、シリカを含む、請求項２１に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２３】
前記多孔質無機粒子が、前記多孔質無機粒子の総重量に基づいて少なくとも９７重量％のＳｉＯ２を有するシリカを含む、請求項２２に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２４】
前記官能化表面が、（ｉ）前記多孔質無機粒子上のヒドロキシル基と（ｉｉ）シランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２５】
前記官能化表面が、前記粒子上のヒドロキシル基とエポキシシランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、請求項２４に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２６】
前記官能化表面が、前記粒子上のヒドロキシル基と（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、請求項２５に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２７】
前記リンカー分子のそれぞれが、ジオールを含む、請求項１に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２８】
前記官能化表面が、（ｉ）ジオール基と、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項１又は２７に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項２９】
前記ジオールが、約３０〜約１５０μｍｏｌ／ｇの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、請求項２７又は２８に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３０】
前記ジオールが、約５０〜約１００μｍｏｌ／ｇの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３１】
前記リンカー分子のそれぞれが、アルデヒドを含む、請求項１に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３２】
前記官能化表面が、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかを介して前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質を含む、請求項１及び５〜３１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３３】
前記官能化表面が、（ｉ）前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合した前記タンパク質と、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項２〜３２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３４】
前記タンパク質が、プロテインＡを含む、請求項２〜２６及び３２又は３３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３５】
前記前記プロテンが、組み換えプロテインＡ（ｒＰｒｏＡ）である、請求項２〜２６及び３２〜３４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３６】
前記タンパク質が、約４．０〜約１６ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、請求項２〜２９及び３２〜３５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３７】
前記タンパク質が、約５．０〜約１２ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、請求項２〜２６及び３２〜３６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３８】
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約２０．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３９】
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約５．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項４０】
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項４１】
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を作製するための方法であって、
前記多孔質無機粒子を形成することと、
前記官能化表面を形成するように、前記多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることと、を含む、方法。
【請求項４３】
前記形成工程が、ゲル化、沈降、凝集、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される粒子形成プロセスを介して、多孔質無機粒子を形成することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記形成工程が、ゲル化プロセスを介して多孔質無機粒子を形成することを含む、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの反応物質が、シランを含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの反応物質が、エポキシシランを含む、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記エポキシシランが、（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシランを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項４８】
ジオールを形成するように、
前記シラン上の少なくとも１つの官能基をヒドロキシル基に変換することを更に含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記官能化表面が、（ｉ）ジオールと、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ジオールが、前記多孔質無機粒子中約３０〜約１５０μｍｏｌ／ｇの範囲の量で前記表面上に存在する、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ジオールが、約５０〜約１００μｍｏｌ／ｇの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１つのジオールを
アルデヒド基に変換することを更に含む、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
少なくとも１つのアルデヒド基を所望のタンパク質上の少なくとも１つの遊離アミノ基と反応させて、イミン基を形成することと、任意選択で、前記イミン基をアミンに還元することと、を更に含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
イミノ又はアミノ基を介して、タンパク質を前記官能化表面に共有結合することを更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記官能化表面が、前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質を含む、請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記官能化表面が、（ｉ）前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質と、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項４２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記官能化表面が、前記多孔質無機粒子の表面に共有結合した組み換えプロテインＡ（ｒＰｒｏＡ）を含む、請求項４２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記タンパク質が、約４．０〜約１６ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記タンパク質が、約５．０〜約１２ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
クロマトグラフィーデバイスであって、
デバイス筐体と、
前記デバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体であって、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を含む、前記クロマトグラフィー媒体と、を含む、クロマトグラフィーデバイス。
【請求項６１】
前記デバイス筐体が、管状筐体部材と、少なくとも１つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを備える、請求項６０に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項６２】
前記デバイス筐体が、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含む、請求項６０又は６１に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項６３】
前記デバイス筐体が、生分解性ポリマー材料を含む、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項６４】
前記デバイス筐体が、金属材料を含む、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項６５】
前記デバイス筐体が、ステンレス鋼を含む、請求項６０〜６２又は６４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項６６】
前記クロマトグラフィーデバイスが、充填済み使い捨てカラムを含む、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項６７】
前記クロマトグラフィー媒体が、約２０．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、請求項６０〜６６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項６８】
前記クロマトグラフィー媒体が、約５．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、請求項６０〜６７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項６９】
前記クロマトグラフィー媒体が、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する、請求項６０〜６８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項７０】
前記クロマトグラフィー媒体が、約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する、請求項６０〜６９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項７１】
前記クロマトグラフィーデバイスが、親和性カラムを含む、請求項６０〜７０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項７２】
前記クロマトグラフィー媒体が、約１０００ｃｍ／時の線速度で運転されるとき、前記クロマトグラフィーデバイスが、０．０３４ＭＰａ（５．０バール）未満のデバイス背圧を有する、請求項６０〜７１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項７３】
請求項６０〜７２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイスを作製する方法であって、
請求項１〜４１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を、前記デバイス筐体に組み込む工程を含む、方法。
【請求項７４】
熱形成工程を介して、
前記デバイス筐体を形成することを更に含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記熱形成工程が、管状筐体部材と、少なくとも１つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを熱形成することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
１つ又は２つ以上の検証試験によって、
前記クロマトグラフィーデバイスを検証することを更に含む、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を使用する方法であって、
前記クロマトグラフィー媒体を親和性カラムに組み込む工程を含む、方法。
【請求項７８】
請求項６０〜７２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を使用する方法であって、
前記クロマトグラフィーデバイスを、クロマトグラフィーシステムの操作位置内に位置付ける工程を含む、方法。
【請求項７９】
前記親和性カラム
又は前記クロマトグラフィーデバイスを通じて流体を処理することを更に含む、請求項７７又は７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記流体が、１つ又は２つ以上の生体分子を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記流体が、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体、ウイルス、ワクチン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７９又は８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記流体が、モノクローナル抗体を含む、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記方法が、前記クロマトグラフィーシステム内での定置洗浄工程を含まない、請求項７７〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記方法が、
前記親和性カラム又は前記クロマトグラフィーデバイスをユーザに提供することを含み、前記提供工程が、充填済み及び検証済み親和性カラム又はクロマトグラフィーデバイスを前記ユーザに提供することを含む、請求項７７〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、全細孔容積の少なくとも約２０％が、約１０００Å〜約１６００Åの範囲の直径の細孔を有するような細孔径分布とを有する、クロマトグラフィー媒体。
【請求項８６】
前記多孔質無機粒子が、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面を有する、請求項８５に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項８７】
全細孔容積の少なくとも４０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にある、請求項８５又は８６に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項８８】
全細孔容積の約４０％〜約９０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にある、請求項８５〜８７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項８９】
全細孔容積の少なくとも２０％〜約６０％が、約１０００Å〜約１６００Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項８５〜８８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項９０】
全細孔容積の少なくとも１５％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項８５〜８９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項９１】
全細孔容積の約１５％〜約３０％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項８５〜９０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]
本発明は、クロマトグラフィー媒体、及びクロマトグラフィー媒体を含むクロマトグラフィーデバイス、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法、並びにクロマトグラフィーデバイスを使用する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
[0002]
親和性クロマトグラフィー媒体は、一般に、１つ又は複数の標的分子と相互作用することができる結合リガンドを有する固体支持体を含む。親和性クロマトグラフィーは、固体支持体上で展開されるリガンド、例えばビーズが、典型的に標的分子に対して選択的であるため有用である。この選択性は、良好な収率、並びに標的分子の高速かつ経済的な精製を可能にする。
【０００３】
[0003]
黄色ブドウ球菌のプロテインＡ、又は免疫グロブリンに対する特異的親和性を有する組み換えプロテインＡは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）のほとんどのサブクラスに結合する、選択的親和性リガンドである。Ｂｏｙｌｅ，Ｍ，Ｄ．Ｐ．ａｎｄ  Ｒｅｉｓ，Ｋ．Ｊ．，１９８７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：６９７。一旦、樹脂などの多孔質クロマトグラフィー支持体、膜、又は他の媒体の上に固定化されると、プロテインＡは、ｍＡｂ又はポリクローナルＩｇＧの精製及び商業生産に有用である。
【０００４】
[0004]
親和性クロマトグラフィー媒体の性能は、選択性、有効物質移動、結合能、及び支持体の充填床浸透性選択性などの因子によって決定することがある。かかる性能特徴の最適化は、ベースマトリックス特性、リガンド付着に使用される化学修飾の種類、及びリガンド特性の組み合わせ及び相互作用によって決定される。
【０００５】
[0005]
最も一般的に使用される媒体支持体は、ビーズ状アガロースなどの炭水化物のポリマーである。これらの材料は、低い非特異的タンパク質結合を呈するが、それらは軟質かつ圧縮性であり、したがって大規模での使用が制限される。シリカ系固体支持体は、アガロース又は他の種類のポリマー支持体と関連した短所の多くを被らない。
【０００６】
[0006]
多孔質シリカに基づく親和性媒体、例えば、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）は、それらの高い能力及び好適な背圧流特徴に起因して、いくらかの商業的実用性を見出した。ＭｃＣｕｅらの２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，９８９（１）：１３９では、２つの異なる細孔径７００Å及び１０００Åの制御細孔ガラスビーズ（５６〜１００μｍ粒径）が、プロテインＡ親和性媒体固体支持体に使用された。彼らは、より小さい７００Å細孔径材料を用いて、より大きな静的及び動的容量が達成されたことを見出し、これは、より大きな表面積及び関連した表面上の高いリガンド濃度の結果として合理化された。特に、多孔質シリカ系支持体が、狭い細孔径分布にわたって均一な細孔径を必要とすることは通説であった。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（国際公開第１９９００９２３７号）は、均一な細孔径を有する（すなわち、細孔径分布が狭い範囲内に含まれ、全細孔の９０％が平均から±１０％の直径を有する）多孔質ガラスが、親和性支持媒体に好ましいと主張した。Ｃｏｐａｎ（欧州特許第０２６３９３４号）もまた、その材料の狭い細孔径範囲を定義した。未定義の広い細孔径分布を有するシリカゲルは、一般に、親和性媒体の支持体として不十分であると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]
当該技術分野において、バイオポリマーの精製及び生成のための親和性クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィー操作における生産性及びプロセス効率を増加させる必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]
ここで予想外に、特定の細孔径分布及び帯域を有する多孔質無機酸化物支持体を含む、プロテインＡ系親和性クロマトグラフィー媒体が、特定のリンカー密度と共に、モノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ１）に対する強化されたタンパク質Ａ動的結合能、及び良好な選択性、すなわち望ましくにタンパク質に対する低い非特異的タンパク質結合を有することが発見された。具体的に、広い細孔径分布にわたって不均一な細孔径を有するシリカ系支持体が、より小さい粒径及び狭い細孔径分布を有する制御細孔ガラス支持体を含む既知のプロテインＡ親和性媒体に対して同等のプロテインＡ動的結合能性能を有する親和性媒体をもたらすことが見出された。有利に、本発明の親和性媒体は、クロマトグラフィーカラム内で使用されるとき、背圧と関連した問題を最小限に抑える一方で、低い非特異的タンパク質結合を有するモノクローナル抗体に高い結合能をもたらす。
【０００９】
[0009]
したがって、本発明は、改良されたシリカ系クロマトグラフィー媒体、及びかかるクロマトグラフィー媒体を含むクロマトグラフィーデバイスを提供する。開示されたクロマトグラフィーデバイスは、従来のクロマトグラフィー操作を超える以下の利点、すなわち、ユーザによるデバイス充填工程の排除、定置洗浄（ＣＩＰ）工程の排除、水酸化ナトリウム溶液を用いる定置洗浄（ＣＩＰ）の排除、ユーザによる任意の検証工程の排除、及び生分解性材料を含むクロマトグラフィーデバイスの使用のうちの１つ又は２つ以上に起因して、より効率的、生産的、及び／又は環境に優しいクロマトグラフィー操作を可能にする。
【００１０】
[0010]
例示的な一実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約６００オングストローム（Å）〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１．０超〜約３．０個のリンカー分子を含む官能化表面とを有する。
【００１１】
[0011]
別の例示的な実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００ダルトン（Ｄ）の範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有する。
【００１２】
[0012]
別の例示的な実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約２０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積と、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１．０超〜約３．０個のリンカー分子を含む官能化表面と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質とを有する。
【００１３】
[0013]
本発明は、クロマトグラフィー媒体又は支持体を作製する方法も対象とする。例示的な一方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることとを含む。別の例示的な方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることとを含む。別の例示的な方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約２０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積と、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１超〜約３個のリンカー分子と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質とを含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることとを含む。
【００１４】
[0014]
本発明は、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備える、クロマトグラフィーデバイスを更に対象とする。一実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備え、クロマトグラフィー媒体が、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を含む、官能化表面とを有する。
【００１５】
[0015]
別の例示的な実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備え、クロマトグラフィー媒体が、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有する。
【００１６】
[0016]
更に別の例示的な実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備え、クロマトグラフィー媒体が、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約２０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積と、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質とを有する。
【００１７】
[0017]
本発明は、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法を尚も更に対象とする。例示的な一方法では、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体のうちのいずれかをデバイス筐体に組み込むことを含む。クロマトグラフィーデバイスを作製するいくつかの方法では、この方法は、クロマトグラフィー媒体を、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料、及びいくつかの実施形態では、生分解性ポリマー材料から形成されたカラム筐体に組み込むことを含む。
【００１８】
[0018]
本発明は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスのうちのいずれかを使用する方法を尚も更に対象とする。クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスを使用する例示的な一方法では、この方法は、本発明のクロマトグラフィー媒体及び／又はクロマトグラフィーデバイスをクロマトグラフィーシステムの操作位置内に位置付けることと、クロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーデバイスを通じて流体を処理することとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、クロマトグラフィーシステムの操作位置内にあるとき、１つ又は２つ以上の生体分子を含有する流体を、クロマトグラフィー媒体又はクロマトグラフィーデバイスを通じて処理することを含む。例えば、流体は、タンパク質、抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００１９】
[0019]
本発明のこれら及び他の特徴及び利点は、開示される実施形態及び添付の特許請求の範囲の以下の詳細な説明を再検討することで明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
[0020]
本発明は、添付の図面の参照しながら更に記載される。
【図１】[0021]  本発明の例示的なクロマトグラフィーデバイスの図を表す。
【図２】[0022]  図１に示されるクロマトグラフィーカラムを備える例示的なクロマトグラフィーシステムの図を表す。
【図３】[0023]  本発明のクロマトグラフィー媒体の例示的な実施形態の反応スキームを表す。
【図４】[0024]  本発明のクロマトグラフィー媒体の例示的な実施形態の細孔径分布のグラフを表す。
【図５Ａ】[0025]  実施例１〜８で使用される本発明のクロマトグラフィー媒体の例示的な実施形態の非特異的結合対リンカー密度のグラフを表す。
【図５Ｂ】[0026]  実施例１〜８で使用される本発明のクロマトグラフィー媒体の例示的な実施形態の動的結合能対結合密度のグラフを表す。
【図５Ｃ】[0027]  実施例１〜８で使用される表面リンカー密度に関して、非特異的結合及び動的結合能の変化を明示する。
【図６】[0028]  実施例９〜１２で使用されるシリカの細孔径分布の比較を表す。
【図７】[0029]  実施例１０及び比較例４で使用されるシリカの細孔径分布の比較を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0030]
本発明の原理の理解を促進するために、本発明の特定の実施形態の説明が続き、特定の専門用語が特定の実施形態を記載するために使用されるが、特定の専門用語の使用によって、本発明の範囲を制限するとは意図されないことが理解されるだろう。変更、更なる修正、及び考察されるそのような本発明の原理の更なる用途は、通常、本発明が関係する当業者が想到し得るものとして企図される。
【００２２】
[0031]
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他の意味を示す場合を除き、複数の指示物を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「１つの酸化物」に関する言及は、複数のかかる酸化物を含み、「酸化物」に関する言及は、１つ又は２つ以上の酸化物、及び当業者に既知のその同等物などを含む。
【００２３】
[0032]
例えば、本開示の実施形態を説明する際に用いられる組成物中の成分の量、濃度、容積、プロセス温度、プロセス時間、回収率又は収率、流量、並びにそれらの同様の値及び範囲を修飾する「約」は、例えば、典型的な測定及び取り扱い手順を通じて、これらの手順における不慮のエラーを通じて、これらの方法を実行するために使用される成分の差を通じて、並びに同様の近似した考慮事項を通じて起こり得る数量の変化を指す。「約」という用語はまた、特定の初期濃度又は混合物を有する製剤の経時変化によって異なる量、並びに特定の初期濃度又は混合物を有する製剤の混合又は処理によって異なる量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかに関わらず、これらの量の同等量を含む。
【００２４】
[0033]
本明細書で使用される場合、「生体分子」という用語は、生存生物によって生成される任意の分子を意味し、タンパク質、多糖類、脂質、及び核酸などの大分子、並びに一次代謝物、二次代謝物、及び天然生成物などの小分子が挙げられる。生体分子の例としては、細胞及び細胞残屑、抗体、タンパク質及びペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸、内毒素、ウイルス、ワクチンなどが挙げられる。生体分子の他の例としては、国際公開第２００２／０７４７９１号及び米国特許第５，５４１，６６０号に列挙されるものが挙げられる。
【００２５】
[0034]
本明細書で使用される場合、「無機酸化物」は、無機成分がカチオンであり、酸化物がアニオンである、二元酸素化合物として定義される。無機材料は、金属を含み、またメタロイドも含み得る。金属は、周期表上でホウ素からポロニウムまで引かれた斜線の左側の元素を含む。メタロイド又は半金属は、この線の右側の元素を含む。無機酸化物の例としては、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア等、及びそれらの混合物が挙げられる。
【００２６】
[0035]
本明細書で使用される場合、「多孔質無機粒子」は、無機材料（例えば、金属、半金属、及びそれらの合金、無機酸化物を含むセラミックなど）、並びに性質的に異種又は同種の組成物材料などの有機材料（例えば、有機ポリマー）からなる粒子を含む。例えば、異種組成物材料としては、材料の単なる混合物、層状材料、コアシェルなどが挙げられる。同種組成物材料の例としては、合金、有機−無機ポリマーハイブリッド材料などが挙げられる。粒子は、鎖、ロッド、又はラス形状を含む、様々な異なる対称、非対称、又は不規則な形状であり得る。粒子は、非晶質又は結晶質等を含む異なる構造を有し得る。粒子は、異なる組成、大きさ、形状、若しくは物理構造を含むか、又は異なる表面処理以外は同じものであり得る粒子の混合物を含み得る。より小さい粒子が凝集し、より大きい粒子を形成する場合、粒子の有孔率は粒子内又は粒子間であり得る。例示的な一実施形態では、粒子は、無機酸化物、硫化物、水酸化物、炭酸塩、ケイ酸塩、リン酸塩などの無機材料から構成されるが、好ましくは、例えばコロイド粒子を形成するための溶液重合、例えば溶融粒子を形成するための連続火炎加水分解、例えばゲル状粒子を形成するためのゲル化、沈降、噴霧、テンプレート法、ゾル−ゲルなどを含むが、これらに限定されない任意の既知のプロセスを介して形成され得る無機酸化物である。
【００２７】
[0036]
本明細書で使用される場合、「秩序多孔質材料」という用語は、細孔径分布が、本明細書で定義されるとおり、０．５未満の相対スパンを有するように、非常に狭い細孔径分布を持つ構造秩序を有する多孔質粒子を指す。
【００２８】
[0037]
本明細書で使用される場合、「無秩序多孔質材料」という用語は、細孔径分布が、本明細書で定義されるとおり、０．５を超える相対スパンを有するように、均一でない細孔径分布（すなわち、性質的に多様な非常に広い細孔径分布）を有する多孔質粒子を指す。
【００２９】
[0038]
本明細書で使用される場合、「官能化表面」という用語は、粒子の外側部分上、及び／又は内部細孔の表面積上の表面積を含む、粒子表面の少なくとも一部分の湿潤性又は選択性を改変するために、少なくとも１つの官能化合物との反応によって表面修飾された無機粒子を意味する。官能化表面を使用して、結合相（共役的又はイオン的）、被覆表面（例えば、逆相Ｃ１８結合された）、クラッド表面（例えば、ＥＰ６と同様に炭素クラッド）、重合表面（例えば、イオン交換）、固有表面（例えば、無機／有機ハイブリッド材料）、又は同様のものを形成することができる。例えば、無機粒子をオクタデシルトリクロロシランと反応させることは、シランを無機表面に共有結合することによって「逆相」を形成する。別の実施例では、無機粒子のアミノプロピルトリメトキシシランとの反応に続いて、アミノ基の４級化によって「アニオン交換相」を形成する。第３の実施例では、結合相は、無機粒子のアミノプロピルトリメトキシシランとの反応に続いて、酸塩化物によるアミドの形成よって形成されてもよい。他の結合相としては、ジオール、シアノ、カチオン、親和性、キラル、アミノ、Ｃ４、Ｃ８、親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）、混合モード、サイズ排除などが挙げられる。結合相又は官能化表面の一部として、リガンドを使用して、標的分子又は生体分子との特異的相互作用（例えば、結紮）、例えば米国特許第４，８９５，８０６号に記載されるものを示すことができる。
【００３０】
[0039]
本明細書で使用される場合、「リンカー分子」又は「リンカー」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、多孔質無機粒子の表面に付着した分子を定義し、この分子は、生体分子などの他の分子の、多孔質無機粒子の表面へのリンカー分子を介した付着を可能にする。
【００３１】
[0040]
本明細書で使用される場合、「分子量」という用語は、特定の化合物又はポリマーの単一分子のモル量を意味するものとして定義される。
【００３２】
[0041]
本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、移動相中に溶解した混合物を、混合物中の他の分子から標的分子を分離し、それを単離させる、カラム若しくはカートリッジ又は他の容器内に収容された固定相（すなわち、クロマトグラフィー媒体）に通すプロセスを意味する。使用されるクロマトグラフィーの種類に応じて、標的分子は、固定相の上に吸着されてもよいが、望ましくない成分は、デバイスを通過するか、又は逆も同様である。「液体クロマトグラフィー」という用語は、液体が移動相として使用され、固体又は固体支持体上の液体が固定相として使用される、クロマトグラフィーの形態である。「フラッシュクロマトグラフィー」という用語は、正圧下（例えば、最大２ＭＰａ（３００ｐｓｉ））で行われる液体クロマトグラフィーを意味する。「高性能液体クロマトグラフィー」（ＨＰＬＣ）という用語は、高い正圧下（例えば、最大約３５ＭＰａ（５０００ｐｓｉ））で行われる液体クロマトグラフィーを意味する。「分取クロマトグラフィー」という用語は、標的化合物又は分子の単離及び精製のためのＨＰＬＣを意味する。「高速タンパク質液体クロマトグラフィー」（ＦＰＬＣ）という用語は、生体分子の分離に有用なＨＰＬＣの形態である。
【００３３】
[0042]
本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、その無機物以外の無機粒子中に存在する材料を意味する。
【００３４】
[0043]
本明細書で使用される場合、「不規則な」という用語は、それが無機粒子に適用するとき、粒子間の粒子形状が、均一でなく（すなわち、ランダムな粒子形状）、１．０を超えるアスペクト比を有することを意味する。
【００３５】
[0044]
本明細書で使用される場合、「筐体」という用語は、クロマトグラフィーにおける使用のために固定相を保持するための導管又は容器を意味し、カートリッジ、カラム、管、デバイス、床、袋などが挙げられる。
【００３６】
[0045]
本明細書で使用される場合、「固定相」又は「クロマトグラフィー媒体」又は「クロマトグラフィー支持体」という用語は、試料混合物中の異なる成分に対して異なる親和性を示す、官能化表面（例えば、いくつかの官能基を介して無機粒子の表面に付着したリガンド）を含む材料を意味し、クロマトグラフィーにおいて、標的分子（例えば、結紮）を１つ又は２つ以上の他の分子の混合物から分離するために使用される。固定相は、有機及び無機材料、又はそれらのハイブリッドを含み、粒子、モノリス、膜、被覆などの形態であってもよい。
【００３７】
[0046]
本明細書で使用される場合、「細孔径分布」という用語は、代表的な容積の多孔質無機粒子中の各細孔径の相対豊富度を意味する。
【００３８】
[0047]
本明細書で使用される場合、「メジアン細孔径」（ｄ５０）という用語は、細孔径の中間点を意味するように使用され、ここで細孔容積の５０％が、中間点直径よりも小さい細孔径を有する細孔から寄与され、５０％が中間点直径よりも大きい直径を有する細孔から寄与される。
【００３９】
[0048]
本明細書で使用される場合、「細孔容積」という用語は、飽和蒸気圧で試料の細孔構造に吸着される液体の容積として定義され、吸着された液体は、液体のバルク密度と同じ密度を有すると仮定する。本発明における細孔容積の水銀測定及び多孔質無機粒子の細孔径分布は、約２８ＭＰａ（４１００バール）までの大気圧の圧力範囲で可能な任意の好適な水銀ポロシメータを使用して得ることができ、接触角θ＝１４０°、及び２５．２℃で４８５ダイン／ｃｍの水銀表面張力を有する（かかる温度でのＨｇ密度は１３．５３３５ｇ／ｍＬである）。
【００４０】
[0049]
本明細書で使用される場合、「相対スパン」という用語は、細孔径分布の帯域の尺度として定義される。「スパン」は、水銀ポロシメトリによって測定される、ｄ１０細孔径（すなわち、その下に細孔容積の１０％が存在する細孔径／直径）を、ｄ９０細孔径（すなわち、その下に細孔容積の９０％が存在する細孔径／直径）から差し引くことによって測定される。「相対スパン」という用語は、（ｄ９０−ｄ１０）／ｄ５０の比率として定義される。
【００４１】
[0050]
本明細書で使用される場合、「表面積」という用語は、ＢＥＴ表面積分析によって決定される。表面積を測定するＢＥＴ方法は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６０（１９３８）３０９〜３１９においてＢｒｕｎａｕｅｒ、Ｅｍｍｅｔｔ、及びＴｅｌｌｅｒにより詳細に説明されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
[0051]
本明細書で使用される場合、「動的結合能」という用語は、それがクロマトグラフィー媒体に関するとき、本明細書において、未結合のタンパク質の著しい破過が起こる前に、媒体が流動条件下で結合するであろう標的タンパク質の量を示すために使用される。実際に、このクロマトグラフィー媒体は、カラム又はカートリッジに充填され、低イオン強度緩衝液中の標的タンパク質の溶液が、カラムを通り抜ける。未結合のタンパク質は、媒体上へのタンパク質の結合がその最大能力に達すると、カラムから出始める。破過曲線が生成され、同じ条件下で、タンパク質が破過し始めるまでの時間が長いほど、媒体が有する結合能が高い。
【００４３】
[0052]
本明細書で使用される場合、「非特異的タンパク質結合」という用語は、本明細書において、非特異的相互作用に起因して、不純物タンパク質が親和性媒体上に結合することを示すように使用され、この結合は望ましくなく、プロテインＡクロマトグラフィーの場合にＩｇＧなどの所望のタンパク質の結合能を低減し、全てのタンパク質が溶出工程において溶出された後、クロマトグラフィー生成物のより多量の不純物の存在にもつながるであろう。非特異的結合の一般的原因のうちの１つは、タンパク質の、媒体（例えば、シリカ表面上の未反応の曝露したシラノール基）上の他の種類の官能基との相互作用である。
【００４４】
[0053]
本発明は、クロマトグラフィー媒体、及びクロマトグラフィーカラムなどのクロマトグラフィーデバイスを対象とする。本発明は、クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーカラムを作製する方法、並びにクロマトグラフィーカラムを使用する方法を更に対象とする。例示的なクロマトグラフィー媒体、例示的なクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーカラムを作製する方法、並びにクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーカラムを使用する方法に関する説明が下に提供される。
【００４５】
[0054]
図１は、本発明の例示的なクロマトグラフィーカラム１００の図を提供する。図１に示されるように、例示的なクロマトグラフィーカラム１００は、カラム筐体１５０、及びカラム筐体１５０内に位置付けられる媒体床空間１５１を備える。いくつかの実施形態では、媒体１５１は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１超〜約３個のリンカー分子を含む、官能化表面とを有する。いくつかの実施形態では、媒体１５１は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有する。いくつかの実施形態では、媒体１５１は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約２０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積と、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質とを有する。
【００４６】
[0055]
図１に更に示されるように、カラム筐体１５０は、典型的に、管状筐体部材１５６、第１の管状筐体部材エンドキャップ１５２、第２の管状筐体部材エンドキャップ１５３の反対側エンドキャップ１５２、カラム入口１５４、及びカラム出口１５５を備える。カラム１００は、カラム入口１５４を通るスラリーの形態の多孔質無機粒子で充填されてもよく、このカラム入口は、その中に通路を有する中心ボア１５７、及びノズル１５８を備える。床空間内のスラリーの分布及び均一な充填を促進する様々なノズルを使用することができる。フィルター１５９はそれぞれ、エンドキャップ１５２、１５３の内面上に位置付けられ、管状部材１５６と作用して、床空間１５１を定義し、また床空間１５１からの粒子媒体の漏出を防止する。分布チャネル１６０は、第１のエンドキャップ１５２及び／又は第２のエンドキャップ１５３の面にわたって横方向に位置し、フィルター１５９と流体連通している。流体分布チャネル１６０は、液体の放射状分布を促進するように作用する。単純な形態の分布チャネル１６０は、第１及び／又は第２のエンドキャップ１５２及び１５３の面に少なくとも１つの円周方向及び／又は放射状の溝を備える。この溝は、それが入口１５４のノズル１５８から出る液体の円周方向及び／又は放射状の分布をもたらすように位置付けられる。カラムを使い捨てカラムとして使用するとき、典型的に０．１〜２０００リットル、及び０．１〜１００リットルの範囲の広範囲のカラム容量が可能であることが理解されるであろう。米国特許出願公開第２００８／００１７５７９号も参照されたい（その主題全体が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４７】
[0056]
カラム筐体１５０は、様々な材料から形成することができる。典型的に、カラム筐体１５０は、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含み、いくつかの所望の実施形態では、生分解性ポリマー材料を含む。カラム筐体１５０を形成するための好適なポリマー材料としては、ポリオレフィンを含む成形性のプラスチックなどの任意の合成又は半合成有機固体が挙げられるが、これらに限定されない。カラム筐体１５０を形成するための好適な金属材料としては、ステンレス鋼が挙げられるが、これに限定されない。
【００４８】
[0057]
カラム筐体１５０は、従来の熱形成技法を使用して形成することができる。例えば、カラム筐体１５０の管状筐体部材１５６、第１の管状筐体部材エンドキャップ１５２、及び第２の管状筐体部材エンドキャップ１５３は、成形工程を介してそれぞれ独立して形成されてもよい。いくつかの実施形態では、管状筐体部材１５６と、（ｉ）カラム筐体１５０の第１の管状筐体部材エンドキャップ１５２及び（ｉｉ）第２の管状筐体部材エンドキャップ１５３のうちの１つとは、単一成形工程を介して形成される（すなわち、エンドキャップのうちの１つは、管状筐体部材１５６の一端上に一体形成される）。
【００４９】
[0058]
上述されるように、カラム筐体１５０内に位置付けられる媒体１５１は、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径を有する多孔質無機粒子を含むことができる。いくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、約８００Å〜約１５００Å（又はその間の、１０００Å及び１３００Åを含む、１．０Åの増分での任意の値（例えば、１２８０Å））のメジアン細孔径を有する。更にいくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、約１０００Å〜約１３００Å、又は１０００Å〜約１３００Åを含むその間の値の任意の範囲（例えば、約１０８０Å〜約１２６０Å）のメジアン細孔径を有する。
【００５０】
[0059]
多孔質無機粒子は、典型的に、Ｈｇポロシメトリによって測定して、少なくとも約０．９ｍＬ／ｇ又は少なくとも１．０ｍＬ／ｇの細孔容積を有する。本発明の例示的な一実施形態では、多孔質無機粒子は、窒素ポロシメトリによって測定して、約１．０ｍＬ／ｇ〜約３．０ｍＬ／ｇの細孔容積を有する。本発明の別の例示的な実施形態では、多孔質無機粒子は、Ｈｇポロシメトリによって測定して、約１．０ｍＬ／ｇ〜約２．０ｍＬ／ｇの細孔容積を有する。
【００５１】
[0060]
多孔質無機粒子は、一般に全細孔容積の少なくとも４０％が約６００Å〜約１６００Åの直径の細孔を有するように、細孔径分布を有することができる。一実施形態では、全細孔容積の約４０％〜約９０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径の細孔を有する。
【００５２】
[0061]
好ましい実施形態では、全細孔容積の少なくとも２０％が、約１０００Å〜約１６００Åの直径の細孔を有する。別の実施形態では、全細孔容積の約２０％〜約６０％が、約１０００Å〜約１６００Åの直径の細孔を有する。
【００５３】
[0062]
別の実施形態では、全細孔容積の少なくとも１５％が、約１２００Å〜約１５００Åの直径の細孔を有する。他の実施形態では、全細孔容積の約１５％〜約３０％が、約１２００Å〜約１５００Åの直径の細孔を有する。
【００５４】
[0063]
多孔質無機粒子は、少なくとも約０．８、又は少なくとも約０．９、又は少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１、又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．３、又は少なくとも約１．４、又は少なくとも約１．５の細孔径分布に関して相対スパンを有することができる。いくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、少なくとも約０．８、又は少なくとも約０．９、又は少なくとも約１．０、又は少なくとも約１．１、又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．３、又は少なくとも約１．４、又は少なくとも約１．５から最大約２．０まで全ての細孔径分布に関して相対スパンを有する。
【００５５】
[0064]
多孔質無機粒子は、典型的に、約１ミクロン（μｍ）〜約１５０μｍの範囲の光散乱測定によって測定される粒径を有する。多孔質無機粒子は、典型的に、少なくとも約１μｍ、より典型的には約１２０μｍ未満のメジアン粒径を有する。いくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、約１０〜約１２０μｍ、より望ましくは約３０〜約１２０μｍの平均粒子寸法を有する。他の実施形態では、多孔質無機粒子は、約５０〜約９０μｍの平均粒子寸法を有する。望ましい一実施形態では、多孔質無機粒子は、約７０μｍの平均粒子寸法を有する。
【００５６】
[0065]
多孔質無機粒子は、典型的に、不規則な形状を有するが、任意の形状（例えば、球形、楕円形など）を有してもよい。形状に関わらず、多孔質無機粒子は、典型的に、本明細書に論じられる平均粒子寸法を有する。
【００５７】
[0066]
多孔質無機粒子は、典型的に、例えば透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）技法を使用して測定して、少なくとも約１．０のアスペクト比を有する。本明細書で使用される場合、「アスペクト比」という用語は、（ｉ）多孔質無機粒子の平均粒子寸法と（ｉｉ）多孔質無機粒子の平均断面粒子寸法との間の比率を説明するために使用され、この断面粒子寸法は、多孔質無機粒子の最大粒子寸法に対して実質的に垂直である。本発明のいくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、少なくとも約１．１（又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．３、又は少なくとも約１．４）から最大約５．０のアスペクト比を有する。典型的に、多孔質無機粒子は、約１．０〜約１．５のアスペクト比を有する。
【００５８】
[0067]
多孔質無機粒子は、ＢＥＴ窒素吸着方法（すなわち、Ｂｒｕｎａｕｅｒ  Ｅｍｍｅｔ  Ｔｅｌｌｅｒ法）によって測定して、少なくとも約１０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２０ｍ２／ｇ、又は少なくとも約２５ｍ２／ｇ、又は少なくとも約３０ｍ２／ｇの表面積を有することもできる。本発明の例示的な一実施形態では、多孔質無機酸化物粒子は、約２０ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇ、又は２５ｍ２／ｇ〜約１５０ｍ２／ｇ、又は約３０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する。本発明の更なる例示的な実施形態では、多孔質無機酸化物粒子は、約２０ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇ、又は約２０ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇ、又は約２０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有する。
【００５９】
[0068]
多孔質無機粒子は、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない様々な無機材料を含んでもよい。望ましい一実施形態では、多孔質無機粒子は、シリカを含む。多孔質無機粒子がシリカを含む場合、粒子は、望ましくは粒子の総重量に基づいて少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９３重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９４重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９５重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９６重量％のＳｉＯ２、少なくとも約９７重量％のＳｉＯ２、又は少なくとも約９８重量％のＳｉＯ２から最大１００重量％のＳｉＯ２の純度を有するシリカを含む。
【００６０】
[0069]
本発明は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を作製する方法も対象とする。例示的な一方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、多孔質無機粒子を含み、該多孔質無機粒子が、約６００オングストローム（Å）〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンとを有し、多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることを含む。別の例示的な方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、該多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることとを含む。更に別の例示的な方法では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、約２０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積と、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンとを有する、多孔質無機粒子を形成することと、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子と、該リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質とを含む官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることとを含む。
【００６１】
[0070]
多孔質無機粒子は、様々な多孔質無機材料から調製されてもよい。いくつかの実施形態では、多孔質無機粒子は、多孔質沈降無機酸化物、無機酸化物ゲル、及びヒュームド酸化物を含む。
【００６２】
[0071]
ゲルを含む実施形態では、本粒子は、ＳｉＯ２を含むゲルなどであるが、これらに限定されない多孔質無機酸化物ゲルから誘導される。ゲルは、ハイドロゲル、エアロゲル、又はキセロゲルであってもよい。ハイドロゲルは、水中で形成され、結果としてその細孔が水で充填される、アクアゲルとしても知られる。キセロゲルは、水を除去したハイドロゲルである。エアロゲルは、水が除去されたときにゲルの構造中の任意の崩壊又は変化を最小限に抑えるような方法で液体が除去されたキセロゲルの一種である。
【００６３】
[0072]
ゲルは、当該技術分野において周知である。Ｉｌｌｅｒの「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ」，ｐ．４６２（１９７９）を参照されたい。ゲル、例えばシリカゲルの粒子は、コロイダルシリカ又は沈降シリカ粒子と区別できる。例えば、コロイドシリカは、濃密な非多孔質シリカ粒子のスラリーとして調製される。コロイドシリカ粒子は、典型的に２００ｎｍ（０．２ミクロン）よりも小さい。前述のように、これらの粒子は、内部多孔性を有しない。一方で典型的な分散沈降粒子は、いくらかの内部多孔性を有する。しかしながら、場合によって、典型的に沈降した粒子中の内部多孔性は、乾燥中に水が蒸発するにつれて、水のメニスカスを後退させることによってもたらされる毛管圧下で大幅に降下する。コロイドシリカ及び沈降シリカを作製するための条件は周知である。
【００６４】
[0073]
一方、ゲルは、一次粒子（典型的に、透過型電子顕微鏡、すなわちＴＥＭ下で測定して、約１〜約１０ｎｍのメジアン粒径を有する）の癒合を促進する条件下で調製され、比較的剛性の３次元ネットワークを形成する。ゲルの癒合は、無機酸化物、例えばシリカの分散体が、構造統合性を有する「ゲル」又は「ゲル状」塊に硬化するとき、マクロ量で呈される。
【００６５】
[0074]
無機酸化物ゲルを調製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、シリカゲルは、アルカリ金属ケイ酸塩（例えば、ケイ酸ナトリウム）の水性溶液を、硝酸又は硫酸などの強酸と混合することによって調製され、この混合は、約３０分未満でハイドロゲル、すなわちマクロゲルに固化する透明なシリカゾルを形成するために好適な撹拌条件下で行われる。その後、得られるゲルを洗浄する。ハイドロゲル中に形成される無機酸化物、すなわちＳｉＯ２の濃度は、通常、約１０〜約５０重量％の範囲内、好ましくは約２０〜約３５重量％、最も好ましくは約３０〜約３５重量％の範囲内であり、そのゲルのｐＨは約１〜約９、好ましくは１〜約４である。広範囲の混合温度を用いることができ、この範囲は、典型的に約２０〜約５０℃である。
【００６６】
[0075]
新たに形成されたハイドロゲルは、単に連続的に動く水流に浸すことによって洗浄され、望ましくない塩を浸出し、約９９．５重量％以上の純粋な無機酸化物を残す。
【００６７】
[0076]
洗浄水のｐＨ、温度、及び期間は、表面積（ＳＡ）及び細孔容積（ＰＶ）などのシリカの物理特性に影響を及ぼす。６５〜９０℃、ｐＨ８〜９で約１５〜約３６時間洗浄されたシリカゲルは、通常、約２５０〜約４００ｍ２／ｇのＳＡを有し、約１．４〜約１．７ｍＬ／ｇのＰＶを有するエアロゲルを形成する。ｐＨ３〜５、約５０〜約６５℃で約１５〜約２５時間洗浄したシリカゲルは、約７００〜約８５０ｍ２／ｇのＳＡを有し、約０．６〜約１．３ｍＬ／ｇのＰＶを有するエアロゲルを形成する。これらの測定値は、周知のＮ２多孔性方法によって生成される。ハイドロゲルは、ゲル中の水分が約２０％未満、好ましくは約１０％未満、及びより好ましくは約５重量％未満になるまで、ハイドロゲル床を通じて１００〜１８０℃の範囲の温度で空気を吹き込むことによって乾燥させる。キセロゲルを作製するためのプロセスは、米国特許第６，５６５，９０５号及び同第５，６２２，７４３号に見出すことができる。
【００６８】
[0077]
米国特許第４，１５７，９２０号に記載されるものなどの強化沈降シリカを使用して、本発明のクロマトグラフィー媒体を調製することもできる。その特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、強化沈降シリカは、まず、アルカリ無機ケイ酸塩を酸性にし、初期沈降物を創出することによって、調製することができる。次いで、生じた沈降物は、更なるケイ酸塩及び酸によって、強化されるか、又は「事後調整される」。ケイ酸塩及び酸の第２の添加から生じた沈降物は、最初に調製された沈降物の１０〜７０重量％を含む。この沈降物の強化構造は、第２の沈降の結果として、従来の沈降物よりも剛性であると考えられる。粉砕、遠心分離、及び後続の乾燥後であっても、強化ケイ酸塩は、そのネットワーク剛性及び多孔性を実質的に維持すると考えられる。これは、米国特許第５，０３０，２８６号に開示されるものなどの他の沈降シリカとは対照的である。
【００６９】
[0078]
別の実施形態では、無機酸化物は、ヒュームドシリカを含む。ヒュームドシリカは、ドイツ特許第７６２７２３号に記載されるプロセスを使用して製造されてもよい。ヒュームドシリカの生成は、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．Ａ２３，１９９３．Ｃｈａｐｔｅｒ  ６にも論じられている。
【００７０】
[0079]
一旦、多孔質粒子が形成されると、その後、それらは粉砕される。一般的な粉砕条件は、供給材料、滞留時間、インペラ速度、及び粉砕媒体粒径に応じて異なり得る。これらの条件は、約１〜約１２０ミクロンの範囲内の所望のサイズを得るように変えることができる。所望の粒径を得るようにこれらの条件を選択及び修正するための技法は、当業者に既知である。多孔質無機酸化物粒子を粉砕するために使用される粉砕装置は、材料を激しく粉砕し、例えば機械的作用を通じて約１〜約１２０ミクロンのサイズを有する粒子に低減することができる種類であるべきである。かかるミルは、この目的に特に好適なハンマーミル及びサンドミルと共に市販されている。ハンマーミルは、高速金属刃を通じて必要な機械的作用を付与し、サンドミルは、ジルコニア又はサンドビーズなどの急速撹拌媒体を通じて作用を付与し、インパクトミルを使用することもできる。インパクトミル及びハンマーミルの両方は、金属刃を用いる無機酸化物のインパクトによって粒径を低減する。本発明における使用のための他の好適な粉砕器としては、空気分級ミル（ＡＣＭ）又は流体エネルギーミル（ＦＥＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。粉砕された無機酸化物粒子は、粉砕プロセス中に行われない場合、空気分級器を使用して分級されてもよい。
【００７１】
[0080]
本発明の一実施形態では、その後、粉砕された多孔質無機粒子を約１００〜約４００℃で約２〜約２０時間、約８〜約１０のｐＨで熱水処理される。代替として、熱水処理は、米国特許第５，９７６，４７９号、同第４，７３２，８８７号、及び同第４，１０４，３６３号に記載されるように行われてもよい。熱水処理の条件は、粒子の細孔容積、表面積、細孔径、及び構造統合性に影響を及ぼす。
【００７２】
[0081]
多孔質無機酸化物粒子は、所望の材料への無機酸化物粒子表面の結合を選択的に強化するように、表面修飾（すなわち、官能化）されてもよい。例えば、多孔質無機酸化物粒子は、例えば、クロマトグラフィーカラムを通じて処理される所与の流体内の１つ又は２つ以上の材料に選択的に結合するように、それに結合される１つ又は２つ以上の化学部分の形態で表面化学を更に含むことができ、本明細書では官能化表面と称される。二官能性リガンドなどの化学部分は、例えば、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．−Ｃｏｎｎ．に帰する米国特許第７，１６６，２１３号に記載されるように、粒子表面に結合されてもよく、この主題は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、この固定／結合相、又はクロマトグラフィー媒体は、粒子の官能化表面の一部として活性基又はリガンドを含み、典型的にいくつかの結合を介して粒子に共有結合している。リガンドは、別の分子成分、この場合は標的生体分子との特異的な相互作用を示す任意の化学種であってもよい。既知のリガンドとしては、荷電基（スルホン酸、第４級アンモニウム、ジエチルアミノエチル、カルボキシルメチルなど）、合成染料、アルキル及びアリール化合物（ホウ酸フェニル、オクチルなど）、タンパク質、レクチン、抗体、抗原、酵素などが挙げられるが、これらに限定されない。クロマトグラフィー技法によって分離され得る化合物である結紮としては、タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、抗原、レクチン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗生物質などの様々な生体分子が挙げられる。
【００７３】
[0082]
本発明の一実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることを含む。一実施形態では、無機酸化物粒子の表面部分は、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を提供するように、（ｉ）多孔質無機粒子上のヒドロキシル基（例えば、シラノール基）と（ｉｉ）シランとの反応から生じる反応生成物を含む官能化表面を提供するようにシランで処理される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることを含み、少なくとも１つの反応物質は、エポキシシランを含む。例えば、図３を参照されたい。得られた官能化表面は、多孔質無機粒子上のヒドロキシル基とエポキシシランとの間の反応から生じる反応を含む。所望の一実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、官能化表面を形成するように、多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることを含み、少なくとも１つの反応物質は、（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシランを含むエポキシシランを含む。この実施形態では、得られる官能化表面は、多孔質無機粒子上のヒドロキシル基と（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシランとの間の反応から生じる反応生成物を含む。
【００７４】
[0083]
本発明の別の実施形態では、多孔質無機粒子の官能化表面は、ジオールを含む。この実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、ジオールを形成するように、シラン上の少なくとも１つの官能基（エポキシ環）を２つのヒドロキシル基に変換することを含むことができる。例えば、図３を参照されたい。この実施形態では、得られる官能化表面は、望ましくは、（ｉ）ジオールと、（ｉｉ）多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む。例えば、いくつかの実施形態では、表面ジオール基は、約３０〜約１５０μｍｏｌ／ｇの範囲の量（又はその間の、３０及び１５０μｍｏｌ／ｇを含む、１．０μｍｏｌ／ｇの増分での任意の量、又はその間の、３０及び１５０μｍｏｌ／ｇを含む任意の量の範囲、例えば、約３２〜約４５μｍｏｌ／ｇ）で多孔質無機粒子中に存在する。いくつかの実施形態では、表面ジオール基は、約５０〜約１００μｍｏｌ／ｇの範囲の量で多孔質無機粒子中に存在する。
【００７５】
[0084]
本発明の別の実施形態では、多孔質無機粒子の官能化表面は、アルデヒドを含む。この実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、本明細書で上述される方法を使用するシリカの表面上の少なくとも１つのジオール基を形成することと、少なくとも１つのジオールをアルデヒド基に変換することと、少なくとも１つのアルデヒド基を所望のタンパク質上の少なくとも１つの遊離アミノ基と反応させてイミン基を形成することと、そのイミン基をアミンに還元することとを含む。例えば、図３を参照されたい。
【００７６】
[0085]
本発明の更に別の実施形態では、多孔質無機粒子の官能化表面は、該多孔質無機粒子の表面に（例えば、リンカー分子のうちの少なくともいくつかを介して）共有結合したタンパク質を含む。これらの実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、タンパク質を、アミン基を介して官能化表面に共有結合することを更に含むことができる。例えば、図３を参照されたい。得られる官能化表面は、望ましくは、（ｉ）多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質と、（ｉｉ）多孔質無機粒子の未反応のヒドロキシル基とを含む。望ましい一実施形態では、クロマトグラフィー媒体を作製する方法は、組み換えプロテインＡ（ｒＰｒｏＡ）を、アミン基を介して官能化表面に共有結合することを含む。得られる官能化表面は、多孔質無機粒子の表面に共有結合した組み換えプロテインＡ（ｒＰｒｏＡ）を含む。存在する場合、タンパク質は、典型的に、約４．０〜約１６ｍｇ／ｍＬの範囲の量で多孔質無機粒子中に存在する。望ましい一実施形態では、タンパク質は、約５．０〜約１２ｍｇ／ｍＬの範囲の量で多孔質無機粒子中に存在する。
【００７７】
[0086]
一般に、本発明の上記クロマトグラフィー媒体は、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面を有する。いくつかの実施形態では、媒体は、該多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１．１〜約２．５個のリンカー分子を含む、官能化表面を含む。他の実施形態では、媒体は、該多孔質無機粒子の１平方ナノメートル当たり平均約１．３〜約２．０個のリンカー分子を含む官能化表面を含む。
【００７８】
[0087]
親和性カラム内で使用されるとき、いくつかの所望の実施形態では、本発明の上記クロマトグラフィー媒体は、図５Ａに示されるように、約２０．０ｎｇ／ｍＬ未満（又はその下の、２０．０ｎｇ／ｍＬを含み、０．１ｎｇ／ｍＬの増分での任意の値、例えば、４．８ｎｇ／ｍＬ、又はその下の、２０．０ｎｇ／ｍＬを含む任意の範囲、例えば、０超〜約１０ｎｇ／ｍＬ）の非特異的タンパク質結合レベルを有する。一実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、親和性カラム内で使用されるとき、約５．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する。
【００７９】
[0088]
いくつかの所望の実施形態では、本発明の上記のクロマトグラフィー媒体は、親和性カラム内で使用されるとき、図５Ｂに示されるように、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ（又はその上の、３０ｍｇ／ｍＬを含み、０．１ｍｇ／ｍＬの増分での任意の値、例えば、６０．８ｍｇ／ｍＬ、又はその上の、３０ｍｇ／ｍＬを含む任意の範囲、例えば、約４１．２〜約８５．２ｍｇ／ｍＬ）の動的結合能も有する。一実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、親和性カラム内で使用されるとき、約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する。
【００８０】
[0089]
上述されるように、本発明は、図１〜２に示されるクロマトグラフィーカラム１００などのクロマトグラフィーデバイスを更に対象とする。一実施形態では、本発明のクロマトグラフィーデバイスは、デバイス筐体と、そのデバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体とを備え、クロマトグラフィー媒体は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を含む。クロマトグラフィーデバイスのデバイス筐体は、管状筐体部材と、少なくとも１つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを備える。デバイス筐体は、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含むことができる。一実施形態では、デバイス筐体は、生分解性ポリマー材料を含む。別の実施形態では、デバイス筐体は、ステンレス鋼などの金属材料を含む。
【００８１】
[0090]
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、充填済みの使い捨てカラムを備える。
【００８２】
[0091]
本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、約２０．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有するクロマトグラフィー媒体を含む。本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、約５．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有するクロマトグラフィー媒体を含む。本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有するクロマトグラフィー媒体を含む。本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有するクロマトグラフィー媒体を含む。
【００８３】
[0092]
本発明のいくつかの所望の実施形態では、クロマトグラフィーデバイスは、親和性カラムを備える。望ましくは、クロマトグラフィー媒体が約１０００ｃｍ／時の線速度で運転されるとき、クロマトグラフィーデバイスは、０．０３４ＭＰａ（５．０バール）のデバイス背圧を有する。
【００８４】
[0093]
本発明のクロマトグラフィーカラム、例えば、例示的なクロマトグラフィーカラム１００は、所与の適用における使用のために調整されてもよい。適用に関わらず、本発明のクロマトグラフィーカラム、例えば例示的なクロマトグラフィーカラム１００は、様々なクロマトグラフィーシステムに挿入できるように寸法決定することができる。図２は、図１に示されるクロマトグラフィーカラムを備える例示的なクロマトグラフィーシステム２００の図を表す。
【００８５】
[0094]
図２に示されるように、例示的なクロマトグラフィーシステム２００は、以下の構成要素、すなわち、クロマトグラフィーカラム１００、溶剤溜まり２０１、ポンプ２０２、プレカラム２０３、注入ポート２０４、検出器２０６、レコーダー／モニター２０７、及び排出物回収器２０８を備える。図２に示されていないが、クロマトグラフィーカラム１００は、クロマトグラフィーシステム、例えば例示的なクロマトグラフィーシステム２００における使用に適した他のシステム構成要素と併せて使用されてもよく、他のシステム構成要素としては、複数の溶剤溜まり２０１、真空ポンプ、フロースプリッター、圧力ゲージ、脱気器、分画回収器などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
[0095]
本発明は、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法も対象とする。一実施形態では、クロマトグラフィーデバイスを作製する方法は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体をデバイス（例えば、カラム）筐体に組み込むことを含む。クロマトグラフィーデバイスを作製する方法は、１つ又は２つ以上の追加の工程を更に含んでもよい。好適な追加の工程としては、熱形成工程（例えば、任意の成形工程、例えば、射出成形）を介してデバイス筐体を形成することと、多孔質無機酸化物粒子を非ＮａＯＨ溶液に曝露することによって、カラム筐体内に位置付けられた多孔質無機酸化物粒子を洗浄することと、１つ又は２つ以上の検証試験を介してクロマトグラフィーカラムを検証することと、洗浄、検証されたクロマトグラフィーカラムを出荷可能な容器に包装することとを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
[0096]
開示される方法では、熱形成工程を介してデバイス筐体を形成する工程は、管状筐体部材と、少なくとも１つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを熱形成する工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、熱形成工程は、（ｉ）第１の開端及び反対の閉端を有する管状筐体部材（すなわち、カラム筐体出口を中に有する一体形成されたエンドキャップ）と、（ｉｉ）別個かつ管状筐体部材の開端に取り付け可能な第１の管状筐体部材エンドキャップとを熱形成することを含む。他の実施形態では、熱形成工程は、（ｉ）反対開端を有する管状筐体部材、（ｉｉ）別個かつ管状筐体部材の第１の開端に取り付け可能な第１の管状筐体部材エンドキャップ、及び（ｉｉｉ）別個かつ管状筐体部材の第２の開端に取り付け可能な第２の管状筐体部材を熱形成することを含み、第２の管状筐体部材エンドキャップが、第１の管状筐体部材エンドキャップの反対の管状筐体部材エンドキャップに取り付け可能である。
【００８８】
[0097]
本発明は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスを使用する方法を対象とする。一実施形態では、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を使用する方法は、クロマトグラフィー媒体を親和性カラムに組み込む工程を含む。一実施形態では、本明細書に記載されるクロマトグラフィーデバイスを使用する方法は、クロマトグラフィーデバイスをクロマトグラフィーシステム、例えば、図２に示されるようなシステムの操作位置内に位置付ける工程を含む。本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスを使用する方法は、親和性カラム又はクロマトグラフィーデバイスを通じて流体を処理することを更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体及びクロマトグラフィーデバイスを使用する方法は、１つ又は２つ以上の生体分子を含有する流体を、親和性カラム又はクロマトグラフィーデバイスを通じて処理することを含む。例えば、流体は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、ウイルス、ワクチン、又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【００８９】
[0098]
一実施形態では、カラム１００上の分離のための１つ若しくは２つ以上の検体（標的分子）又は物質は、カラム入口１５４を介して添加される。出口１５８から出て床空間１５１に入る移動相は、分布チャネル１６０にわたって均等に分布し、フィルター１５９を通過した後、粒子媒体１５１の床を通じて均一に溶出される。移動相は、カラム出口１５５を通ってカラムから出る。
【００９０】
[0099]
本発明のクロマトグラフィーデバイスを使用する開示される方法、例えば例示的なクロマトグラフィーカラム１００は、有利に、クロマトグラフィーシステム（例えば、図２に示される例示的なクロマトグラフィーシステム２００）内の定置洗浄工程を含まない。換言すれば、所与のクロマトグラフィーシステム、例えば図２に示される例示的なクロマトグラフィーシステム２００上で、定置洗浄を有する必要なく、複数回の運転を行うことができる。代わりに、所与のクロマトグラフィーカラムが使用され、洗浄する必要があるとき、使用されるクロマトグラフィーカラムは、置換クロマトグラフィーカラムと置換され、クロマトグラフィーシステムは、定置洗浄工程と関連した遅延なしに操作し続ける。
【００９１】
[0100]
本発明の開示されるクロマトグラフィーデバイスを使用する開示される方法は、クロマトグラフィーデバイスをユーザに提供する工程を含んでもよく、この提供工程は、充填済み及び検証済みのクロマトグラフィーカラムをユーザに提供することを含む。この工程は、ユーザが１つ又は２つ以上のカラム調製工程を行う必要性を排除し、更にユーザの時間及び処理能力の効率的使用を可能にする。
【００９２】
[0101]
使い捨てクロマトグラフィーカラムを使用する方法は、１つ又は２つ以上の生体分子を試料から分離するために好適であり得る。任意の特定の適用に限定されないが、本発明の使い捨てクロマトグラフィーカラムを使用する方法を使用して、１つ又は２つ以上の生体分子を試料から分離することができ、この１つ又は２つ以上の生体分子は、少なくとも１つのタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、多糖類、脂質、核酸、代謝物、ウイルス、ワクチン、又は任意のそれらの組み合わせから選択される。
【００９３】
[0102]
例示的な実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、本明細書で述べられる結合相の全てを含む様々な適用、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除などにおいて使用することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、免疫グロブリンの単離のためのプロトコルにおいて頻繁に使用される。アニオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの負電荷アミノ酸側鎖は、クロマトグラフィーマトリックスの正電荷リガンドと相互作用する。一方でカチオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの正電荷アミノ酸側鎖は、クロマトグラフィーマトリックスの負電荷リガンドと相互作用する。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、記載される別の方法であり、免疫グロブリンの単離のためのプロトコルにおいて使用され、高純度の免疫グロブリンが対象である場合、ＨＩＣを１つ又は２つ以上の更なる工程と組み合わせることが一般に推奨される。ＨＩＣにおいて、免疫グロブリンをＨＩＣマトリックスに対して効率的に結合させるために、リオトロピック塩の移動相への添加が必要である。結合された免疫グロブリンは、リオトロピック塩の濃度を低下させることによってマトリックスからその後放出される。親和性クロマトグラフィーは、ロックキー認識の原理において、標的生体分子と生体特異的リガンドとの間の特異的相互作用に基づく。したがって、標的及びリガンドは、親和性の対、例えば抗原／抗体、酵素／受容体などを構成する。プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬ親和性クロマトグラフィーなどのタンパク質系親和性リガンドは周知であり、いずれも抗体の単離及び精製のための普及した方法である。プロテインＡクロマトグラフィーが、特にモノクローナル抗体に対して顕著な特異性を提供し、結果として高い純度が得られることは周知である。イオン交換、疎水性相互作用、ハイドロキシアパタイト、及び／又はゲルろ過工程と併せて使用されるとき、プロテインＡに基づく方法は、多くの生物製剤会社が選択する抗体精製方法となった。例えば、国際特許公開第８４００７７３号、及び米国特許第５，１５１，３５０号を参照されたい。
【００９４】
[0103]
例示的な実施形態では、本発明のクロマトグラフィー媒体は、混合モード又はマルチモード分離マトリックス又は媒体などの様々な適用において使用されてもよい。「マルチモード」分離媒体という用語は、結合される化合物と相互作用する、少なくとも２つの異なるが協働する部位を提供することができるマトリックスを指す。例えば、これらの部位のうちの１つは、リガンドと対象の物質との間の電荷−電荷相互作用の魅力的な種類を付与することができる。他の部位は、電子受容体−供与体相互作用並びに／又は疎水性及び／若しくは親水性相互作用を付与することができる。例えば、米国特許第７，７１４，１１２号を参照されたい。加えて、本発明の多孔質粒子は、拡張された床吸着において（例えば、米国特許第６，６２０，３２６号を参照）、精製性能を向上させるための膜の一部として（例えば、米国特許出願公開第２０１１／００４９０４２号を参照）使用されてもよく、流動化床吸着を伴う適用において（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２６９２５７号を参照）、及び広い細孔材料を使用する精製又は吸着に適した任意の他の適用において使用されてもよい。
【００９５】
[0104]
本発明は、以下の実施例によって更に説明されるが、これらはいかなる方法においても、その範囲に制限を課するものとして解釈されるものではない。反対に、様々な他の実施形態、修正、及びそれらの同等物に依ることができることは明らかに理解されるものであり、これは本明細書の説明を読めば、本発明の趣旨及び／又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、それら自体が当業者に示唆され得る。
【実施例】
【００９６】
[0105]
以下の実施例は、（ｉ）官能化表面を有するクロマトグラフィー媒体、つまりプロテインＡを付着させたシリカを調製するための本発明によるプロセス、並びに（ｉｉ）カラム充填物を含む材料の評価及びカラムの使用を説明する。これらの実施例に示される本発明の一実施形態は、以下の工程、すなわち、大きな細孔シリカを（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシランと結合させ、続いて硫酸加水分解を行って初期結合ジオールシラン中間物を形成すること、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化によってジオール基をアルデヒド基に変換すること、プロテインＡを官能化シリカでインキュベートすること、及び最後に還元アミン化からなるプロセスによって調製されたシリカ粒子を官能化することに関する。かかるプロセスは、図３と同様に示される。
【００９７】
[0106]
実施例において報告されるメジアン粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．からＡＳＴＭ  Ｂ８２２−１０として入手可能なＭａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００を使用して光散乱により決定された。メジアン細孔径分布は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐから入手可能なＡｕｔｏｐｏｒｅ  ＩＶ  ９５２０を使用して水銀圧入によって測定された。本明細書で言及される細孔容積は、１００〜１０，０００Åサイズの細孔への水銀圧入を表す。ＢＥＴ表面積は、窒素吸収分析から得られた。
【００９８】
[0107]
粒径（ＰＳ）は、容積分布によってメジアン粒径として定義される。ＰＳ５０は、中間点粒径を表し、粒子の５０％が中間点粒径よりも小さく、５０％が中間点粒径よりも大きい。同様に、ＰＳ９０は、粒子の９０％が粒径点よりも小さく、１０％がそれよりも大きい粒径点を表す。いくつかの実施例では、約７０μｍのメジアン粒径（ＰＳ５０）を有するシリカゲルを用いた。メジアン細孔径（ＰＤ５０）は、細孔容積の５０％がより小さい細孔から寄与され、５０％がより大きい細孔から寄与される中間点として定義される。「相対スパン」という用語は、細孔径分布の帯域の尺度を意味するものとして定義される。「スパン」は、水銀ポロシメトリによって測定される、ＰＤ１０（すなわち、細孔容積の１０％が存在する細孔径）をＰＤ９０細孔径（すなわち、その下に細孔容積の９０％が存在する細孔径）を差し引くことによって測定される。「相対スパン」という用語は、（ＰＤ９０−ＰＤ１０）／ＰＤ５０の比率として定義される（図４）。
【００９９】
[0108]
シリカゲルは、以下の手順を使用して調製された。１９０ｇの１９％硫酸溶液を、オーバーヘッド撹拌器を備える反応器内に置き、５℃に冷却した。別個に、２６３ｇのケイ酸ナトリウムの溶液（２２．９重量％のＳｉＯ２）も５℃に冷却した。その後、ケイ酸ナトリウム溶液を、ケイ酸塩の全量を１５分で添加するような速度でポンプを介して硫酸溶液に添加した。添加中、温度は５℃で維持した。添加が完了した後、反応器を室温に温め、内容物を撹拌せずにゲル化させた。ゲル化時に、ゲル塊を小片に切断し、反応中に形成された硫酸ナトリウムを除去するために水に沈めた。洗浄水を排出し、新鮮な水をゲルに添加しながら、材料中に残留する硫酸ナトリウムのレベルを定期的にチェックした。レベルが１％より下に低下したとき、ゲルを水中に懸濁し、液体のｐＨをｐＨ＝９．７に調整し、溶液を６７℃に加熱した。この温度を２０時間２０分間維持した。加熱期間の最後に、ゲルをろ過によって回収し、ゲルの含水量が約５重量％未満になるまで１６０℃のオーブンで乾燥させた。
【０１００】
[0109]
したがって、得られたシリカゲルは、３２５ｍ２／ｇの窒素ＢＥＴ表面積及び１．２４ｍＬ／ｇの窒素細孔容積を有した。円筒形細孔を想定し、細孔径（オングストローム）＝４００００×ＰＶ／ＳＡという等式を使用すると、この材料は、上述されるような細孔径を呈した。その後、ＡＣＭを使用してゲルを所望の粒径（７０ミクロン）に粉砕し、その後所望の細孔径が達成されるまで３００℃のオートクレーブ内で熱水処理する。
【０１０１】
[0110]
ＬＥＣＯ  Ｃｏｒｐから入手可能なＬＥＣＯ炭素分析器ＳＣ−６３２を使用して、炭素含有量の元素分析を行った。シリカの純度は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐ．から入手可能なＩＣＰＥ−９０００を使用し、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）によって測定した。
【０１０２】
[0111]
本発明のシリカゲル粒子の細孔径分布は、本明細書に記載される方法によって調べた。
[0112]
動的結合能は、クロマトグラフィー媒体（１００ｍＭのＮａＣｌ溶液中でスラリー化）を０．６６ｃｍ径のＯｍｎｉｆｉｔカラム（Ｋｉｎｅｓｉｓ  ＵＳＡ）に最終床高１０ｃｍまで充填することによって決定した。１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（ｐＨ  ７．４）中の２．０ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ（ｈＩｇＧ）溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販）を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥＨＣ）からのＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣシステムを使用して、２００ｃｍ／時の線流速度でカラム上に負荷した。ｈＩｇＧの破過は、ＵＶ９００（ＧＥＨＣ）を使用し、２８０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓシグナルによって測定し、ＧＥＨＣからのＵｎｉｃｏｍソフトウェアを用いてクロマトグラムを記録してプロットした。動的能力は、未結合のＩｇＧ３フロースルー分画及びシステムホールドアップ体積に対して訂正した後、５％破過で決定した。
【０１０３】
[0113]
大きいカラム（２．２×２０ｃｍ２又は２０ｍＬ）を使用して、修飾された多孔質無機材料で充填されたカラムの圧力低下（背圧）を評価した。典型的に、圧力は、ＡＫＴＡシステムを用いて、脱イオン化水中１００ｍＭのＮａＣｌ溶液の１０００ｃｍ／時の線速度で得られた。
【０１０４】
[0114]
プロテインＡリガンド相互作用に非特異的な表面タンパク質結合の量は、プロテインＡ誘導体化シリカを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販）に共役されたストレプトアビジンタンパク質と相互作用させることによって決定した。１００μＬのプロテインＡシリカを、ｐＨ７．５のリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）中８３ｎｇのストレプトアビジン−ＨＲＰと周囲温度で３０分間混合した。試料をＰＢＳで繰り返し洗浄して、残留ストレプトアビジン−ＨＲＰを溶液から除去した。ストレプトアビジン−ＨＲＰの希釈液を、標準として使用するために調製した。テトラメチルベンジジンＨＲＰ基質（ＴＭＢ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）を添加して、試料及び標準を調製し、周囲温度で４分間、混合しながらインキュベートした。１Ｎのリン酸の添加によって反応を停止させた。各試料中に残留するストレプトアビジン−ＨＲＰの量は、作成された標準曲線を使用する分子デバイスＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍの波長で酸化形態への基質変換を測定することによって決定した。初期結合（プロテインＡ結合前）材料も、記載されるものと同様の手順によって、ＨＲＰタンパク質の非特異的タンパク質結合についてチェックした。
【０１０５】
シリカを結合するための一般的なプロセス説明
[0115]
リンカー結合（初期結合）：官能化多孔質シリカ粒子の試料は、シリカ粒子を（３−グリシドオキシプロピル）トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ又はＧｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．から市販）で処理することによって調製した。丸底フラスコに多孔質シリカを充填し、（３−グリシドオキシプロピル）−トリメトキシシランの量をフラスコに添加した。混合物を室温で終夜回転させた。その後、シリカを１Ｍの硫酸に３０分間浸し、ろ過した。その後、ＤＩ水で５回洗浄し、ろ過して、７０℃で終夜乾燥させた。得られる試料を、それぞれシリカ上の炭素のパーセンテージについての元素分析（ＬＥＣＯ）に供した。リンカー分子を含む官能化表面のケイ酸は、下の式によるＣ％に基づいた。
【０１０６】
【数１】
2017505921.tif 000003
【０１０７】
[0116]
プロテインＡを、アルデヒドを産生するためのＮａｌＯ４による表面ジオール基の酸化に続いて、表面アルデヒド基によるプロテインＡ鎖上の遊離アミン基のシフ塩基形成を必要とする、周知の化学反応（例えば、国際公開第１９９００２３７号）を使用して官能化シリカ粒子に固定化した（プロテインＡは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇから商品名ｒＳＰＡとして入手される組み換えプロテインＡであった）。水素化ホウ素ナトリウムを添加して、シフ塩基（イミン）中間物（還元アミン化）を安定した二次アミン結合及びアルコール基に対する未反応のアルデヒドに還元した。（図３）。
【０１０８】
[0117]
固定化したプロテインＡの量は、未反応のプロテインＡの量を、反応に使用されるプロテインＡの総量から差し引くことによって決定した。プロテインＡの濃度は、分光光度計を用いてＵＶ−Ｖｉｓによって２８０ｎｍで測定した。
【０１０９】
[0118]
［実施例１〜８］
実施例１〜８は、異なる量の表面リンカー基、及びＩｇＧ結合能及び非特異的タンパク質結合に対するその影響を明示する（図５）。これらの実施例では、同じバッチのシリカゲルを使用し、他のプロセス条件を全て同様に保持した。シリカゲルのメジアン粒子分布（ＰＳ５０）は７０μｍであり、シリカのメジアン細孔径（ＰＤ５０）は、約１１５０Åであり、同じ量のプロテインＡが各試料に組み込まれる。
【０１１０】
[0119]
これらの試料の結果を下の表１に記録した。
【０１１１】
【表１】
2017505921.tif 000004
【０１１２】
[0120]
表１及び図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃから、リンカー集団が１．８を超えると、ＤＢＣが減少し始めたことがわかる。一方、リンカー結合材料に対する非特異的タンパク質結合は、少量のリンカー分子密度を用いる場合よりもはるかに高い。
【０１１３】
比較例１
[0121]
実施例１〜８において使用される未修飾のシリカゲルをカラムに充填し、非特異的タンパク質結合を測定した。試料は、約７６ｎｇ／ｍＬの高い非特異的タンパク質結合を示した。
【０１１４】
実施例９〜１２
[0122]
メジアン細孔径及び細孔径分布の、ＩｇＧ結合能に対する効果を比較するため、メジアン粒径（約７０μｍ）のシリカゲル粒子を、上記の手順を使用して修飾した。実施例９〜１２の結果を下の表２に示す。
【０１１５】
【表２】
2017505921.tif 000005
【０１１６】
[0123]
図６は、実施例９〜１２のそれぞれにおいて使用されるシリカの細孔分布を示す。表２及び図６から、７０％、４０％、１９％それぞれの％ＰＶ１、％ＰＶ２、及び％ＰＶ３を有する官能化多孔質シリカ粒子（図１０に示される）は、４１ｍｇ／ｍＬの最高結合能を付与すると結論することができる。
【０１１７】
実施例１３〜１６
[0124]
メジアン粒径の、ＩｇＧ結合能及びカラム背圧に及ぼす効果を比較するために、異なるメジアン粒径であるが、実施例１０と同じメジアン細孔径及び分布を有するシリカゲル粒子は、上記の一般手順を使用して修飾した。実施例１３〜１６の結果を下の表３に示す。
【０１１８】
【表３】
2017505921.tif 000006
【０１１９】
[0125]
上の表３に示されるように、６９μｍのメジアン粒径を用いる実施例１５は、４０ｍｇ／ｍＬを超えるＤＢＣ、及び１０００ｃｍ／時の線速度で０．０２８ＭＰａ（４．０バール）未満の背圧を提供した。
【０１２０】
［比較例２〜４］
[0126]
異なるメジアン細孔径、細孔容積、相対スパン、細孔径分布のシリカを比較するために、市販のシリカゲル又は制御細孔ガラス粒子を、シリカを結合し、プロテインＡを固定化するための上記の手順で処理した。これらのシリカの特性を表４に列挙し、結果を下の表５にまとめる。
【０１２１】
【表４】
2017505921.tif 000007
【０１２２】
[0127]
表４では、シリカＡは、現在Ｄａｉｓｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．によって製造され、商品名Ｄａｉｓｏｇｅｌ（商標）ＳＰ−２０００−４０／６０として販売されているシリカゲルである。このシリカは、４０〜６０μｍの粒径範囲を有する。
【０１２３】
[0128]
シリカＢは、現在Ｆｕｊｉ  Ｓｉｌｙｓｉａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｔｄ．によって製造され、商品名Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ（登録商標）ＭＢ８００−４０／７５として販売されているシリカゲルである。このシリカは、４０〜７５μｍの粒径範囲を有する。
【０１２４】
[0129]
シリカＣは、現在Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．によって製造及び販売されている、制御細孔ガラス（ＣＰＧ（登録商標））１０００粒子である。このシリカは、約６０μｍの平均粒径を有する。図７は、実施例１０及び比較例４の細孔径分布の差を明示する。
【０１２５】
【表５】
2017505921.tif 000008
【０１２６】
[0130]
本発明は、限定数の実施形態を用いて説明されたが、これらの特定の実施形態は、本明細書の他の箇所で説明及び請求されるように、本発明の範囲を制限することを意図しない。更なる修正、同等物、及び変型が可能であることは、本明細書における例示的な実施形態を検討するとき、当業者には明らかとなり得る。実施例並びに残りの本明細書におけるすべての部及び割合は、別途指定がない限り、重量で示される。更に、属性の特定のセット、計測の単位、条件、物理的状態、又はパーセンテージを表すような、明細書又は請求項において引用される数字の任意の範囲は、そのような範囲内にあるいかなる数をも、そのように引用されるいかなる範囲内の、いかなる数字のサブセットも含めて、明確に言及されている場合には文字通りに含有するように、そうでない場合には含有しないように意図されている。例えば、下限ＲＬ及び上限Ｒｕを有する数値範囲が開示されるときはいつも、その範囲内に入る任意の数Ｒが具体的に開示される。特に、範囲内の以下の数が具体的に開示される。Ｒ＝Ｒ１＋ｋ（Ｒｕ−Ｒ１）、式中、ｋは、１％増分の１％〜１００％の範囲の変数であり、例えば、ｋは、１％、２％、３％、４％、５％．．．５０％、５１％、５２％．．．９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。更に、上で計算されるＲの任意の２つの値によって表される任意の数値範囲も具体的に開示される。本明細書に図示及び説明されるものに加えて、本発明の任意の修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。本明細書に引用される全ての刊行物は、参照によりそれら全体が組み込まれる。
【図１】
2017505921.tif 000009
【図２】
2017505921.tif 000010
【図３】
2017505921.tif 000011
【図４】
2017505921.tif 000012
2017505921.tif 000013
【図５Ａ】
2017505921.tif 000014
【図５Ｂ】
2017505921.tif 000015
【図５Ｃ】
2017505921.tif 000016
【図６】
2017505921.tif 000017
【図７】
2017505921.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成28年9月21日(2016.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１超〜約３個のリンカー分子を含む、官能化表面とを有する、クロマトグラフィー媒体。
【請求項２】
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有する、タンパク質を含む官能化表面とを有する、クロマトグラフィー媒体。
【請求項３】
前記タンパク質が、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を介して、前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合している、請求項２に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項４】
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約２０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積と、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面と、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有する、タンパク質とを有する、クロマトグラフィー媒体。
【請求項５】
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約０．９、好ましくは少なくとも約０．９９、より好ましくは約１．０〜約１．３の細孔径分布相対スパンを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項６】
全細孔容積の少なくとも４０％、好ましくは全細孔容積の約４０％〜約９０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にあり、かつ／又は全細孔容積の少なくとも２０％、好ましくは全細孔容積の約２０％〜約６０％が、約１０００Å〜約１６００Åの範囲の直径の細孔を有し、かつ／又は全細孔容積の少なくとも１５％、好ましくは全細孔容積の約１５％〜約３０％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項７】
前記多孔質無機粒子が、約１０ｍ２／ｇ超、好ましくは約２０ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇ、より好ましくは約２５ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積を有する、請求項１〜３及び５又は６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項８】
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積を有する、請求項１〜３及び５〜７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項９】
前記多孔質無機粒子が、約３０μｍ〜約１２０μｍ、好ましくは約５０μｍ〜約９０μｍ、より好ましくは約７０μｍの平均粒径を有する、請求項８に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１０】
前記多孔質無機粒子が、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含み、好ましくはシリカを含み、より好ましくは、前記多孔質無機粒子の総重量に基づいて少なくとも９７重量％のＳｉＯ２を有するシリカを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１１】
前記官能化表面が、（ｉ）前記多孔質無機粒子上のヒドロキシル基と、（ｉｉ）シラン、好ましくはエポキシシラン、より好ましくは（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１２】
前記リンカー分子のそれぞれが、ジオールを含み、かつ／又は前記官能化表面が、（ｉ）ジオール基と、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項１に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１３】
前記ジオールが、前記多孔質無機粒子中約３０〜約１５０μｍｏｌ／ｇ、好ましくは前記多孔質無機粒子中約５０〜約１００μｍｏｌ／ｇの範囲の量で存在する、請求項１２に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１４】
前記リンカー分子のそれぞれが、アルデヒドを含む、請求項１に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１５】
前記官能化表面が、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかを介して前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質を含む、請求項１及び５〜１４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１６】
前記官能化表面が、（ｉ）前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合した前記タンパク質と、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項２〜１５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１７】
前記タンパク質が、プロテインＡ、好ましくは組み換えプロテインＡ（ｒＰｒｏＡ）を含み、前記タンパク質が、好ましくは前記多孔質無機粒子中約４．０〜約１６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは前記多孔質無機粒子中約５．０〜約１２ｍｇ／ｍＬの範囲の量で存在する、請求項２〜１１及び１５又は１６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１８】
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約２０．０ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは約５．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有し、かつ／又は少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を作製するための方法であって、
前記多孔質無機粒子を形成することと、
前記官能化表面を形成するように、前記多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることと、を含む、方法。
【請求項２０】
前記形成工程が、ゲル化、沈降、凝集、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される粒子形成プロセスを介して、好ましくはゲル化プロセスを介して、多孔質無機粒子を形成することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの反応物質が、シラン、好ましくはエポキシシラン、より好ましくは（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシランを含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
ジオールを形成するように、
前記シラン上の少なくとも１つの官能基をヒドロキシル基に変換することを更に含み、好ましくは前記官能化表面が、（ｉ）ジオールと、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２３】
前記ジオールが、前記多孔質無機粒子中約３０〜約１５０μｍｏｌ／ｇ、好ましくは前記多孔質無機粒子中約５０〜約１００μｍｏｌ／ｇの範囲の量で前記表面上に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つのジオールを
アルデヒド基に変換することを更に含み、好ましくは少なくともアルデヒド基を所望のタンパク質上の少なくとも１つの遊離アミノ基と反応させて、イミン基を形成することと、任意選択で、前記イミン基をアミンに還元することとを更に含み、より好ましくは、タンパク質をイミノ又はアミノ基を介して前記官能化表面に共有結合することを更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記官能化表面が、前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質を含み、好ましくは前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基も含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
クロマトグラフィーデバイスであって、
デバイス筐体と、
前記デバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体であって、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を含む、クロマトグラフィー媒体と、を備える、クロマトグラフィーデバイス。
【請求項２７】
前記デバイス筐体が、管状筐体部材と、少なくとも１つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを備える、請求項２６に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項２８】
前記デバイス筐体が、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料、好ましくは生分解性ポリマー材料、又は金属材料、好ましくはステンレス鋼を含む、請求項２６又は２７に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項２９】
前記クロマトグラフィーデバイスが、親和性カラムを備え、かつ／又は前記クロマトグラフィー媒体が、約１０００ｃｍ／時の線速度で運転されるとき、前記クロマトグラフィーデバイスが、０．０３４ＭＰａ（５．０バール）未満のデバイス背圧を有する、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
【請求項３０】
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、全細孔容積の少なくとも約２０％が、約１０００Å〜約１６００Åの範囲の直径の細孔を有するような細孔径分布とを有する、クロマトグラフィー媒体。
【請求項３１】
前記多孔質無機粒子が、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面を有する、請求項３０に記載のクロマトグラフィー媒体。
【請求項３２】
全細孔容積の少なくとも４０％、好ましくは全細孔容積の約４０％〜約９０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にあり、かつ／又は全細孔容積の少なくとも２０％〜６０％が、約１０００Å〜約１６００Åの範囲の直径の細孔を有し、かつ／又は全細孔容積の少なくとも１５％、好ましくは全細孔容積の約１５％〜約３０％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、請求項３０又は３１に記載のクロマトグラフィー媒体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
[0130]
本発明は、限定数の実施形態を用いて説明されたが、これらの特定の実施形態は、本明細書の他の箇所で説明及び請求されるように、本発明の範囲を制限することを意図しない。更なる修正、同等物、及び変型が可能であることは、本明細書における例示的な実施形態を検討するとき、当業者には明らかとなり得る。実施例並びに残りの本明細書におけるすべての部及び割合は、別途指定がない限り、重量で示される。更に、属性の特定のセット、計測の単位、条件、物理的状態、又はパーセンテージを表すような、明細書又は請求項において引用される数字の任意の範囲は、そのような範囲内にあるいかなる数をも、そのように引用されるいかなる範囲内の、いかなる数字のサブセットも含めて、明確に言及されている場合には文字通りに含有するように、そうでない場合には含有しないように意図されている。例えば、下限ＲＬ及び上限Ｒｕを有する数値範囲が開示されるときはいつも、その範囲内に入る任意の数Ｒが具体的に開示される。特に、範囲内の以下の数が具体的に開示される。Ｒ＝Ｒ１＋ｋ（Ｒｕ−Ｒ１）、式中、ｋは、１％増分の１％〜１００％の範囲の変数であり、例えば、ｋは、１％、２％、３％、４％、５％．．．５０％、５１％、５２％．．．９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。更に、上で計算されるＲの任意の２つの値によって表される任意の数値範囲も具体的に開示される。本明細書に図示及び説明されるものに加えて、本発明の任意の修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。本明細書に引用される全ての刊行物は、参照によりそれら全体が組み込まれる。
［発明の態様］
［１］
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１超〜約３個のリンカー分子を含む、官能化表面とを有する、クロマトグラフィー媒体。
［２］
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質を含む官能化表面とを有する、クロマトグラフィー媒体。
［３］
前記タンパク質が、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を介して、前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合している、２に記載のクロマトグラフィー媒体。
［４］
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約２０ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積と、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均約１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面と、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかに共有結合したタンパク質であって、約１０，０００〜約１００，０００Ｄの範囲の分子量を有するタンパク質とを有する、クロマトグラフィー媒体。
［５］
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約０．９の細孔径分布相対スパンを有する、１〜４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［６］
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約０．９９の細孔径分布相対スパンを有する、１〜５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［７］
前記多孔質無機粒子が、約１．０〜約１．３の細孔径分布相対スパンを有する、１〜６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［８］
全細孔容積の少なくとも４０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にある、１〜７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［９］
全細孔容積の約４０％〜約９０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にある、８に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１０］
全細孔容積の少なくとも２０％が、約１０００Å〜約１６００Åの範囲の直径の細孔を有する、１〜９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１１］
全細孔容積の約２０％〜約６０％が、約１０００Å〜約１６００Åの直径の細孔を有する、１０に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１２］
全細孔容積の少なくとも１５％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、１〜１１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１３］
全細孔容積の約１５％〜約３０％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、１２に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１４］
前記多孔質無機粒子が、約１０ｍ２／ｇを超える平均ＢＥＴ表面積を有する、１〜３及び５〜１３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１５］
前記多孔質無機粒子が、約２０ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積を有する、１４に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１６］
前記多孔質無機粒子が、約２５ｍ２／ｇ〜約１００ｍ２／ｇの平均ＢＥＴ表面積を有する、１５に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１７］
前記多孔質無機粒子が、少なくとも約１ｍＬ／ｇの平均細孔容積を有する、１〜３及び５〜１５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１８］
前記多孔質無機粒子が、約３０μｍ〜約１２０μｍの平均粒子寸法を有する、１７に記載のクロマトグラフィー媒体。
［１９］
前記多孔質無機粒子が、約５０μｍ〜約９０μｍの平均粒子寸法を有する、１８に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２０］
前記多孔質無機粒子が、約７０μｍの平均粒子寸法を有する、１９に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２１］
前記多孔質無機粒子が、シリカ、アルミナ、ジルコニア、又はそれらの混合物を含む、１〜２０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２２］
前記多孔質無機粒子が、シリカを含む、２１に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２３］
前記多孔質無機粒子が、前記多孔質無機粒子の総重量に基づいて少なくとも９７重量％のＳｉＯ２を有するシリカを含む、２２に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２４］
前記官能化表面が、（ｉ）前記多孔質無機粒子上のヒドロキシル基と（ｉｉ）シランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、１〜２３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２５］
前記官能化表面が、前記粒子上のヒドロキシル基とエポキシシランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、２４に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２６］
前記官能化表面が、前記粒子上のヒドロキシル基と（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシランとの間の反応から生じる反応生成物を含む、２５に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２７］
前記リンカー分子のそれぞれが、ジオールを含む、１に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２８］
前記官能化表面が、（ｉ）ジオール基と、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、１又は２７に記載のクロマトグラフィー媒体。
［２９］
前記ジオールが、約３０〜約１５０μｍｏｌ／ｇの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、２７又は２８に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３０］
前記ジオールが、約５０〜約１００μｍｏｌ／ｇの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、２７〜２９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３１］
前記リンカー分子のそれぞれが、アルデヒドを含む、１に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３２］
前記官能化表面が、前記リンカー分子のうちの少なくともいくつかを介して前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質を含む、１及び５〜３１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３３］
前記官能化表面が、（ｉ）前記多孔質無機粒子の表面部分に共有結合した前記タンパク質と、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、２〜３２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３４］
前記タンパク質が、プロテインＡを含む、２〜２６及び３２又は３３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３５］
前記前記プロテンが、組み換えプロテインＡ（ｒＰｒｏＡ）である、２〜２６及び３２〜３４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３６］
前記タンパク質が、約４．０〜約１６ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、２〜２９及び３２〜３５のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３７］
前記タンパク質が、約５．０〜約１２ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、２〜２６及び３２〜３６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３８］
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約２０．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、１〜３７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［３９］
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約５．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、１〜３８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［４０］
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する、１〜３９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［４１］
前記クロマトグラフィー媒体が、親和性カラム内で使用されるとき、約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する、１〜４０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［４２］
１〜４１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を作製するための方法であって、
前記多孔質無機粒子を形成することと、
前記官能化表面を形成するように、前記多孔質無機粒子の表面部分を少なくとも１つの反応物質と反応させることと、を含む、方法。
［４３］
前記形成工程が、ゲル化、沈降、凝集、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される粒子形成プロセスを介して、多孔質無機粒子を形成することを含む、４２に記載の方法。
［４４］
前記形成工程が、ゲル化プロセスを介して多孔質無機粒子を形成することを含む、４２又は４３に記載の方法。
［４５］
前記少なくとも１つの反応物質が、シランを含む、４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
［４６］
前記少なくとも１つの反応物質が、エポキシシランを含む、４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
［４７］
前記エポキシシランが、（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシランを含む、４８に記載の方法。
［４８］
ジオールを形成するように、
前記シラン上の少なくとも１つの官能基をヒドロキシル基に変換することを更に含む、４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
［４９］
前記官能化表面が、（ｉ）ジオールと、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
［５０］
前記ジオールが、前記多孔質無機粒子中約３０〜約１５０μｍｏｌ／ｇの範囲の量で前記表面上に存在する、４８又は４９に記載の方法。
［５１］
前記ジオールが、約５０〜約１００μｍｏｌ／ｇの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
［５２］
少なくとも１つのジオールを
アルデヒド基に変換することを更に含む、４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
［５３］
少なくとも１つのアルデヒド基を所望のタンパク質上の少なくとも１つの遊離アミノ基と反応させて、イミン基を形成することと、任意選択で、前記イミン基をアミンに還元することと、を更に含む、５２に記載の方法。
［５４］
イミノ又はアミノ基を介して、タンパク質を前記官能化表面に共有結合することを更に含む、５３に記載の方法。
［５５］
前記官能化表面が、前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質を含む、４２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
［５６］
前記官能化表面が、（ｉ）前記多孔質無機粒子の表面に共有結合したタンパク質と、（ｉｉ）前記多孔質無機粒子上の未反応のヒドロキシル基とを含む、４２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
［５７］
前記官能化表面が、前記多孔質無機粒子の表面に共有結合した組み換えプロテインＡ（ｒＰｒｏＡ）を含む、４２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
［５８］
前記タンパク質が、約４．０〜約１６ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
［５９］
前記タンパク質が、約５．０〜約１２ｍｇ／ｍＬの範囲の量で前記多孔質無機粒子中に存在する、５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
［６０］
クロマトグラフィーデバイスであって、
デバイス筐体と、
前記デバイス筐体内に位置付けられるクロマトグラフィー媒体であって、１〜４１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を含む、前記クロマトグラフィー媒体と、を含む、クロマトグラフィーデバイス。
［６１］
前記デバイス筐体が、管状筐体部材と、少なくとも１つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを備える、６０に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［６２］
前記デバイス筐体が、ポリマー材料、金属材料、ガラス材料、セラミック材料、又はそれらの複合材料を含む、６０又は６１に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［６３］
前記デバイス筐体が、生分解性ポリマー材料を含む、６０〜６２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［６４］
前記デバイス筐体が、金属材料を含む、６０〜６３のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［６５］
前記デバイス筐体が、ステンレス鋼を含む、６０〜６２又は６４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［６６］
前記クロマトグラフィーデバイスが、充填済み使い捨てカラムを含む、６０〜６４のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［６７］
前記クロマトグラフィー媒体が、約２０．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、６０〜６６のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［６８］
前記クロマトグラフィー媒体が、約５．０ｎｇ／ｍＬ未満の非特異的タンパク質結合レベルを有する、６０〜６７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［６９］
前記クロマトグラフィー媒体が、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する、６０〜６８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［７０］
前記クロマトグラフィー媒体が、約３０〜約９０ｍｇ／ｍＬの動的結合能を有する、６０〜６９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［７１］
前記クロマトグラフィーデバイスが、親和性カラムを含む、６０〜７０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［７２］
前記クロマトグラフィー媒体が、約１０００ｃｍ／時の線速度で運転されるとき、前記クロマトグラフィーデバイスが、０．０３４ＭＰａ（５．０バール）未満のデバイス背圧を有する、６０〜７１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイス。
［７３］
６０〜７２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィーデバイスを作製する方法であって、
１〜４１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を、前記デバイス筐体に組み込む工程を含む、方法。
［７４］
熱形成工程を介して、
前記デバイス筐体を形成することを更に含む、７３に記載の方法。
［７５］
前記熱形成工程が、管状筐体部材と、少なくとも１つの別個かつ取り付け可能な管状筐体部材エンドキャップとを熱形成することを含む、７４に記載の方法。
［７６］
１つ又は２つ以上の検証試験によって、
前記クロマトグラフィーデバイスを検証することを更に含む、７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
［７７］
１〜４１のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を使用する方法であって、
前記クロマトグラフィー媒体を親和性カラムに組み込む工程を含む、方法。
［７８］
６０〜７２のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体を使用する方法であって、
前記クロマトグラフィーデバイスを、クロマトグラフィーシステムの操作位置内に位置付ける工程を含む、方法。
［７９］
前記親和性カラム
又は前記クロマトグラフィーデバイスを通じて流体を処理することを更に含む、７７又は７８に記載の方法。
［８０］
前記流体が、１つ又は２つ以上の生体分子を含む、７９に記載の方法。
［８１］
前記流体が、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗体、ウイルス、ワクチン、又はそれらの任意の組み合わせを含む、７９又は８０に記載の方法。
［８２］
前記流体が、モノクローナル抗体を含む、７９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
［８３］
前記方法が、前記クロマトグラフィーシステム内での定置洗浄工程を含まない、７７〜８２のいずれか一項に記載の方法。
［８４］
前記方法が、
前記親和性カラム又は前記クロマトグラフィーデバイスをユーザに提供することを含み、前記提供工程が、充填済み及び検証済み親和性カラム又はクロマトグラフィーデバイスを前記ユーザに提供することを含む、７７〜８３のいずれか一項に記載の方法。
［８５］
クロマトグラフィー媒体であって、
多孔質無機粒子を含み、前記多孔質無機粒子が、約６００Å〜約１６００Åのメジアン細孔径と、少なくとも約０．７５の細孔径分布相対スパンと、全細孔容積の少なくとも約２０％が、約１０００Å〜約１６００Åの範囲の直径の細孔を有するような細孔径分布とを有する、クロマトグラフィー媒体。
［８６］
前記多孔質無機粒子が、前記多孔質無機粒子の表面積の１平方ナノメートル当たり平均１超〜約３個のリンカー分子を含む官能化表面を有する、８５に記載のクロマトグラフィー媒体。
［８７］
全細孔容積の少なくとも４０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にある、８５又は８６に記載のクロマトグラフィー媒体。
［８８］
全細孔容積の約４０％〜約９０％が、約６００Å〜約１６００Åの直径を有する細孔内にある、８５〜８７のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［８９］
全細孔容積の少なくとも２０％〜約６０％が、約１０００Å〜約１６００Åの範囲の直径の細孔を有する、８５〜８８のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［９０］
全細孔容積の少なくとも１５％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、８５〜８９のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
［９１］
全細孔容積の約１５％〜約３０％が、約１２００Å〜約１５００Åの範囲の直径の細孔を有する、８５〜９０のいずれか一項に記載のクロマトグラフィー媒体。
【国際調査報告】
2017505921.tif 000019
2017505921.tif 000020