(57)【要約】本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原を発現する腫瘍に対して治療およびワクチン接種をし、これに対する免疫応答を被験者の中に誘発するための組成物および方法を提供する。一態様では、本明細書に提供される発明は、融合ポリペプチを含む免疫原性組成物に関し、前記融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、かつＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を有する被験者に融合タンパク質を投与することは腫瘍による変異回避を避ける。【選択図】図１４
2017507943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、前記方法が組み換え型ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを含む組成物を投与する工程を含み、前記組み換え型ポリペプチドが追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、前記核酸分子が前記組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記核酸分子が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、かつ前記代謝酵素が前記組み換え型リステリア株の前記染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補する、方法。
【請求項２】
前記組成物がリステリア約３．３×１０９個のリステリア投与量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験者がヒトまたはイヌの被験者である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒトの被験者が子ども、青年、または大人である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドを前記被験者に投与することが前記腫瘍の中のエスケープ変異を防止する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が前記マッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むヒトキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕがキメラ型イヌＨＥＲ２／ｎｅｕである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸分子が前記組み換え型リステリアワクチン株の中のプラスミドの中にあり、かつ抗生物質選択がないとき、前記プラスミドは前記組み換え型リステリアワクチン株の中に安定して維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組み換え型リステリアが前記ａｃｔＡ病毒性遺伝子内に突然変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記追加的なポリペプチドが、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされた前記代謝酵素がアラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
独立したアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍がＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍であり、かつ前記ガンがＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するガンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ガンが骨肉腫、卵巣ガン、胃ガン、中枢神経系（ＣＮＳ）のガン、またはユーイング肉腫（ＥＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記骨肉腫ガンがイヌの骨肉腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記骨肉腫が小児骨肉腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法であって、前記方法が組み換え型ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を含む組成物を投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドが追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、前記核酸分子が前記組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記核酸分子が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、かつ前記代謝酵素が前記組み換え型リステリア株の前記染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補する、方法。
【請求項２０】
前記組成物がリステリア約３．３×１０９個のリステリア投与量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験者がヒトまたはイヌの被験者である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒトの被験者が子ども、青年、または大人である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記融合ポリペプチドをＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を有する前記被験者に投与することが前記腫瘍の中のエスケープ変異を防止する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が前記マッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むヒトキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕがキメラ型イヌＨＥＲ２／ｎｅｕである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸分子が前記リステリアゲノムに組み込まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
核酸分子が、前記組み換え型リステリアワクチン株の中のプラスミド内にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
抗生物質選択が無いときに前記プラスミドが前記組み換え型リステリアワクチン株内で安定して維持される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記組み換え型リステリアが前記ａｃｔＡ病毒性遺伝子内に突然変異を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記追加的なポリペプチドが、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされた前記代謝酵素がアラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
独立したアジュバントをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍がＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍であり、かつ前記ガンがＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するガンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ガンが骨肉腫、卵巣ガン、胃ガン、中枢神経系（ＣＮＳ）のガン、またはユーイング肉腫（ＥＳ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記骨肉腫ガンがイヌの骨肉腫である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記骨肉腫が小児骨肉腫である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍またはガンに対する前記免疫応答が、前記ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の準優占エピトープへの免疫応答を含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原を発現する腫瘍に対して免疫応答を誘発するための、ならびにヒトおよびイヌの被験者において、これを治療し、またこれに対してワクチン接種するための、組成物および方法を提供する。別の実施形態では、ヒトの被験者は、子どもまたは青年である。
【背景技術】
【０００２】
リステリア・モノサイトゲネスは、主として抗原提示細胞に感染し、またこれらの細胞の細胞質内に死ぬまで適合する細胞内病原体である。マクロファージなどの宿主細胞は、Ｌ．モノサイトゲネスを活発に貪食し、その大半の細菌がファゴリソソーム内で分解される。一部の細菌は、溶血素、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の活動を通してファゴソーム膜に穿孔することによって宿主サイトゾルの中へとエスケープする。一旦サイトゾル内に入ると、Ｌ．モノサイトゲネスは宿主アクチンを重合して、細胞間を直接通り抜けて、宿主の免疫系をさらに逃れることができ、結果としてＬ．モノサイトゲネスに対する抗体応答がごくわずかになる。
【０００３】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ（本明細書では「Ｈｅｒ−２」とも称する）は、チロシンキナーゼの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである１８５  ｋＤａの糖タンパク質であり、かつ細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達に関与することが知られている細胞内領域からなる。ヒトでは、Ｈｅｒ２抗原はすべての乳ガンの２５〜４０％で過剰発現され、また骨（骨肉腫−ＯＳＡ）、卵巣、肺、膵臓、脳、および消化管といった数多くのガンで過剰発現される。Ｈｅｒ−２の過剰発現は制御されていない細胞増殖およびシグナル伝達と関連付けられ、その両方が腫瘍の発生に寄与する。Ｈｅｒ−２を過剰発現するガンを有する患者は、Ｈｅｒ−２に対して向けられた検出可能な体液性のＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答にさえも耐性を示す。
【０００４】
大型の飼育犬は、組織学的不均質性、侵攻性局所疾病、および早期の転移を含む小児科のＯＳＡの数多くの態様を反復するＯＳＡを自発的に発生する。イヌでは、ＯＳＡはいかなる骨にも生じる可能性があるが、影響を受けたすべての骨の７５％〜８５％を体肢が占めており、これは「四肢骨肉腫」と呼ばれている。残りのＯＳＡは、上顎骨、下顎骨、脊椎、頭蓋、肋骨、鼻腔、副鼻腔、および骨盤を含む中軸骨格に影響を与える。診断では、微小転移性病態を有するイヌの９５％は、切断術および化学療法を受けたにもかかわらず、進行性転移性疾患のためにほとんどのイヌは安楽死させられるので、生存期間中央値は１０か月である。肺の転移性疾患は両方の種で罹患率および死亡率の主たる原因である。
【０００５】
小児科ないし若年成人母集団での原発性悪性骨腫瘍は比較的珍しく、２０歳未満の者のすべてのガンの約６％を数え、また、１５〜２９歳の年齢範囲内の青年および若年成人（ＡＹＡ）ではすべてのガンの３％である。骨肉腫は、米国では毎年約４００人の子どもおよび１０代を襲っていて、数十年にわたって治癒的な改善があまり見られなかった小さい必要性の高い領域を示している。骨肉腫（ＯＳ）は稀な悪性腫瘍であるが、小児科の年齢群でのガン関連死の主要な原因の中でも上位になっている。最近の多剤併用用量強化化学療法を外科手術と併せて用いることで、極端に局所的な非転移性疾患で６０〜７０％の５年間のイベントフリー生存率を達成した。しかしながら、まだ解決されていない主要な問題は、転移の再燃または再発に対する、また中軸疾患を有する患者に対する予後の不良である。さらに、米国では骨肉腫に対して認可された製品が無く、この疾患に対処する新規の療法の高い必要性を提示している。
【０００６】
本発明は、ＬｍｄｄＡワクチンベクターを使用して生成した組み換え型リステリア−ＨＥＲ２／ｎｅｕワクチン株を提供することによってこの必要性を満たすものであり、これは良好に画定された弱毒化機構を有し、かつ抗生物質選択マーカーを欠いており、これはイヌの骨肉腫を治療するうえで効果的であることが見出されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本明細書に提供される発明は、融合ポリペプチを含む免疫原性組成物に関し、前記融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、かつＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を有する被験者に融合タンパク質を投与することは腫瘍による変異回避を避ける。別の実施形態では、変異回避を避けることはエピトープ拡大に起因する。さらに別の実施形態では、変異回避を避けることは抗原のキメラ的な性質に起因する。
【０００８】
別の実施形態では、本明細書に提供される発明は核酸分子を含む組み換え型リステリアワクチン株に関し、この実施形態および別の実施形態では、核酸分子はポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、ポリペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、また代謝酵素は組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補する。
【０００９】
一実施形態では、本明細書に提供される発明は被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法に関し、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドが追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、前記核酸分子が前記融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記核酸分子が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、かつ前記代謝酵素が前記組み換え型リステリアワクチン株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、被験者はヒトである。別の実施形態では、ヒトの被験者は大人であってもよく、または子どもであってもよい。別の実施形態では、被験者はイヌである。別の実施形態では、キメラのＨＥＲ２はイヌのキメラのＨＥＲ２である。別の実施形態では、キメラのＨＥＲ２はヒトのキメラのＨＥＲ２である。別の実施形態では、前記融合ポリペプチドを前記被験者に投与することは前記腫瘍内のエスケープ変異を防止する。別の実施形態では、前記ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原はマッピングしたヒトのＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含む。
【００１０】
別の実施形態では、本明細書に提供される発明はＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを防止する方法に関する。
【００１１】
一実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法は、結果として前記被験者の全生存の増加をもたらす。別の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法は結果として被験者内の転移性疾患の遅延をもたらす。別の実施形態では、治療は結果としてＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答の増加をもたらす。
【００１２】
一実施形態では、本発明は被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法を提供し、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドが追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、前記核酸分子が前記融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記核酸分子が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、かつ前記代謝酵素が前記組み換え型リステリアワクチン株の染色体内で欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、前記強化した免疫応答を引き出す方法は結果として前記被験者の全生存の増加をもたらす。別の実施形態では、前記強化した免疫応答を引き出す方法は結果として被験者内の転移性疾患の遅延をもたらす。別の実施形態では、前記強化免疫応答を引き出す方法は結果としてＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答の増加をもたらす。
【００１３】
一実施形態では、本発明はＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験者の生存を延長させる方法を提供し、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドが追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、前記核酸分子が前記融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記核酸分子が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、かつ前記代謝酵素が前記組み換え型リステリアワクチン株の染色体内で欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、被験者はヒトである。別の実施形態では、ヒトの被験者は大人であってもよく、または子どもであってもよい。別の実施形態では、被験者はイヌである。一実施形態では、前記方法は前記被験者内での再燃または転移に続いて前記組み換え型弱毒化リステリアを投与することをさらに含む。
【００１４】
一実施形態では、本明細書に提供される発明はＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験者内の転移性疾患を遅延する方法に関し、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドが追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、前記核酸分子が前記融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記核酸分子が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、かつ前記代謝酵素が前記組み換え型リステリアワクチン株の染色体内で欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、被験者はヒトである。別の実施形態では、ヒトの被験者は大人であってもよく、または子どもであってもよい。別の実施形態では、被験者はイヌである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本発明の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点とともに、添付図面とともに読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解され得る。
【００１６】
【図１】ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。（Ａ）構造性のリステリアｐ６０プロモーターの制御下で、ＬｍｄｄＡ株内の染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失の相補のために、バシラスサチリスｄａｌ遺伝子を寄生するｐＡｄｖ１６４のプラスミドマップ。これは、ＨＥＲ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ  ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ  ３５９−５１８）およびＩＣＩ（ａａ  ６７９−８０８）の直接融合によって構造化された、切断ＬＬＯ（１−４４１）のキメラ型ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する。右側のベクターの概略図は、切断ＬＬＯに融合したヒトＨＥＲ２／ｎｅｕの２つの細胞外領域および１つの細胞内領域から構成されるキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ融合タンパク質を発現するｐＡｄｖ１６４の詳細を示す。プラスミドはｄａｌ遺伝子の栄養要求性相補によって組み換え型ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ−リステリア株（ＬｍｄｄＡ）内に維持される（実施例参照）。（Ｂ）抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿した細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内でｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。〜１０４  ＫＤの差を示す帯はｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性のＬＬＯは、５８  ＫＤ帯として検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。
【図２】ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性（Ａ）ＮＴ−２細胞を刺激薬として使用し、かつ３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として使用して、免疫化マウスからの脾細胞内でＨＥＲ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンによって引き出された細胞毒性Ｔ細胞応答を試験した。Ｌｍ−対照は、すべてのやり方で同一であるが、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）が発現される、ＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づく。（Ｂ）脾細胞によって免疫化ＦＶＢ／Ｎマウスから細胞培地の中へと分泌されたＩＦＮ−γが、ＮＴ−２細胞によって治療されたマイトマイシンＣを用いたインビトロの刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。（Ｃ）インビトロでのタンパク質の異なる領域からのペプチドを用いたインキュベーションに応答する、キメラワクチンを用いて免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群が負の対照を構成要素とした。コインキュベーションの７２時間後に採取した細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各々のデータ点は、３倍のデータ＋／−標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【図３】リステリア−ＣｈＨＥＲ２／ｎｅｕワクチンのための腫瘍防止研究ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに各々組み換え型リステリア−ＣｈＨｅｒ２または対照リステリアワクチンを６回注射した。生後６週で免疫化を開始し、２１週目まで３週ごとに継続した。腫瘍の外観を毎週観察して、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージで表現した。＊ｐ＜０．０５、グループ当たりＮ＝９。
【図４】脾臓中のＴｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。第２の免疫化の７日後、脾臓を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のためにこれらを抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によって染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図５】ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。第２の免疫化の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。（Ａ）代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロット。（Ｂ）異なる投与群にわたって全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（左のパネル）、および腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）に対するパーセンテージとして表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度。データは、２つの独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示される。
【図６】ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡＤＸＳ３１−１６４または対照リステリアワクチンを用いて３回免疫化した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００）を麻酔をかけたマウスの頭蓋内に注射した。（Ａ）示された日にＸｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００  ＣＣＤカメラを使用してマウスのエクスビボ撮像を遂行した。（Ｂ）ピクセルの輝度は、１秒当たり表面積１平方ｃｍ当たりの光子数としてグラフ表示され、平均放射輝度として提示される。（Ｃ）ウエスタンブロットによって、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を使用して、ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−Ｌｕｃ、およびＮＴ−２細胞株によるＨＥＲ２／ｎｅｕの発現が検出された。Ｊ７７４．Ａ２細胞、マウスのマクロファージ様細胞株を負の対照として使用した。
【図７】ＡＤＸＳ３１−１６４を用いてワクチン接種した最初の１８人の患者を示す。
【図８】ＡＤＸＳ３１−１６４の投与が早期または遅発の心臓障害を生じないことを示す。Ａ）正常に見える心臓を示す心臓の心エコー図。Ｂ）レベルが正常であることを示す、研究期間全体にわたって評価された連続的な心筋トロポニンＩレベル（図２６Ｄも参照のこと）。
【図９】ＡＤＸＳ３１−１６４に関連する、Ａ）体温および、Ｂ）収縮期血圧の変化を示す。ベースラインおよびＡＤＸＳ３１−１６４投与後２時間ごとの体温および収縮期血圧を記録した。各々のイヌに対する各々のワクチン接種でのパラメータが表示される。水平のバーは各々の時点における各々の投与群でのすべてのイヌの中央値を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５
【図１０】原発性疾患におけるＡＤＸＳ３１−１６４と緩和的放射線療法（ＲＴ）との組み合わせの治療スケジュールを示す。
【図１１】上腕骨近位端骨折後のイヌで転移性疾患の証拠がないことを示す放射線写真であり、また骨折の治癒を示す骨カルスの存在も示す。
【図１２】四肢骨肉腫を有するイヌで治療的に効果的な抗腫瘍免疫性を引き出すためにＡＤＸＳ３１−１６４を発現するＬ．モノサイトゲネス組み換え型の安全性および有効性を評価するための試験段階Ｉ臨床試験のタイムライン。
【図１３】ＡＤＸＳ−３１−１６４投与に続く、治療に関連する有害事象および生存曲線。Ａ）治療に関連する有害事象。Ｂ）試験に登録した時点で転移性疾患を有していないすべてのイヌ。四肢の切断術を受け、それに続いてカルボプラチン単独またはカルボプラチンに加えてアドリアマイシンを受けた対照群のイヌ。２匹のイヌは関係のない原因で死んだため（１匹のイヌは誤嚥性肺炎で死に、もう一匹は腎芽細胞腫で死んだ）、ワクチン群から打ち切りにされた。ワクチン接種した群  赤い線、対照群  黒い線。
【図１４】ヒト（Ａ）およびイヌ（Ｂ）の患者での原発性および転移性骨肉腫（ＯＳＡ）の放射線写真の画像。両方の種で、原発病巣は骨幹端でのマーキングした増殖および溶解の区域（Ａの中の矢印）によって特徴付けられる。
【図１５】フェーズＩの、ＨＥＲ２＋骨肉腫（ＯＳＡ）を有するイヌでのＡＤＸＳ３１−１６４の安全性および有効性を評価するための３＋３臨床試験の概略図である。自発性ＨＥＲ２＋四肢ＯＳＡを有する個人所有のイヌが標準的である治療切断、およびフォローアップのカルボプラチン化学療法を受けた。最後のカルボプラチン投与の３週間後、２×１０８、５×１０８、１×１０９、または３×１０９ＣＦＵのいずれかのＡＤＸＳ３１−１６４を用いてイヌに静脈内でワクチン接種した（３週間おきに３回のワクチン接種）。転移性疾患を防止するうえでのワクチンの有効性を決定するために、死ぬまで２か月ごとにイヌを再ステージングした。
【図１６】イヌの原発性骨肉腫におけるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現。（Ａ）悪性骨芽細胞および類骨沈着の病巣を示すイヌからの原発性ＯＳＡのＨ＆Ｅ染色。（Ｂ）イヌの原発性ＯＳＡの免疫組織化学的評価は悪性骨芽細胞内のＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を示す。（Ｃ）ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現のばらつきを示す、５匹の個人所有のイヌからの原発性ＯＳＡサンプルのウエスタンブロット。正の対照は：ヒトの乳ガン細胞株ＭＣＦ−７、およびイヌの乳ガン細胞株ＣＡＭＡＣ２。
【図１７】ベースラインおよびＡＤＸＳ３１−１６４投与後２４時間の時点での血液学的数値。各々の投与群内のすべてのイヌからの各々のワクチン接種前および後の値を平均した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。白血球および好中球の計数（Ａ〜Ｂ）では、ＡＤＸＳ３１−１６４投与の２４時間後に生じた一時的だが統計的に有意な増加を示し、また血小板およびリンパ球の一時的な減少が付随して起きた（Ｃ〜Ｄ）。
【図１８】ＡＤＸＳ３１−１６４は、生存と相関する白血球（ＷＢＣ）、好中球、および単球の計数の増加を誘発した。ＷＢＣ、好中球、および単球の数をベースラインおよびワクチン接種の２４時間後に測定した。各々のワクチン接種に引き続いてパーセント増加を計算し、各々のイヌについて平均した。（Ａ）生存（死または生）によって結果を表示した。（Ｂ）受容したＡＤＸＳ３１−１６４投与量によって結果を表示した。水平のバーは群の中央値を表す。
【図１９】ＡＤＸＳ３１−１６４によって誘発されるＨｅｒ−２に特異的なＴ細胞応答のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによる評価の結果を示す。
【図２０】Ｈｅｒ−２に特異的な免疫性を刺激する繰返し「ブースター」ワクチン接種を示す。（Ａ）患者２８９−００３に対する結果を示す。（Ｂ）患者２８９−００４に対する結果を示す。ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１はＨＥＲ２／ｎｅｕポリペプチドのペプチド断片を表す。
【図２１】（Ａ）転移までの時間（ＴＴＭ）および（Ｂ）ＯＳＡ特異的な生存についてのカプラン・マイヤー推定値。
【図２２】ＡＤＸＳ３１−１６４が転移性疾患の発生を防止することを示す。（ＡおよびＢ）カルボプラチン療法の３週間後（Ａ）、および第３のＡＤＸＳ３１−１６４ワクチンの３週間後（Ｂ）に撮った胸部放射線写真。右肺中葉内の前から存在する転移性結節のサイズの増加を示すが、残りの肺葉内ではさらなる転移性疾患の発生を欠いている。（ＣおよびＤ）ＩＣＧの投与に引き続いて近赤外光の下で蛍光を発する、胸腔鏡検査で識別される肺結節（Ｃ）。近赤外光の下で蛍光を示す転移巣切除のときに取り出した大幅な正常な外見の肺組織（差し込み図）（Ｄ）。（ＥおよびＦ）Ｈ＆Ｅ染色した肺結節（Ｅ）および蛍光を発する正常な肺組織（Ｆ）の病理組織。封入された肺結節（Ｅ）および大幅に正常な外見の肺組織内の炎症の巣状地域（Ｆ）の著しい出血および壊死を示す。（ＧおよびＨ）組織内の最小限のＣＤ３＋Ｔ細胞で肺結節を取り囲むＣＤ３＋Ｔ細胞を示す低倍率（Ｇ）および高倍率（Ｈ）の肺結節の免疫組織化学。（ＩおよびＪ）ＣＤ３＋Ｔ細胞の巣状滞留を示す、正常な外見の肺組織の低倍率（Ｇ）および高倍率（Ｈ）の免疫組織化学。（Ｋ）リンパ球によって包囲された有糸分裂像を有する大きい異常細胞を示す巣状肺炎の高倍率のＨ＆Ｅ染色。（Ｌ）単核細胞によって取り囲まれた有糸分裂像を有する大きい細胞を示す肺炎の領域のビメンチン染色。
【図２３】ＡＤＸＳ３１−１６４は転移性疾患を遅延／防止し、自発性ＨＥＲ２＋骨肉腫を有するイヌの全生存を長持ちさせる。ワクチン接種したイヌのカプラン−マイヤー生存率曲線を歴史的な対照群と比較して示す。対照群は、切断術を用いて治療され、フォローアップ化学療法を受けたがＡＤＸＳ３１−１６４を受けていない、ＨＥＲ２＋四肢ＯＳＡを有するイヌから成る。Ｐ＜０．０００１。ワクチン接種した群  赤い線、対照群  黒い線。
【図２４】ＡＤＸＳ３１−１６４がＨＥＲ２／ｎｅｕに対する耐性を破壊することを示す。第３のワクチンの３週間後（９週目）および２か月後（１７週目）にＰＢＭＣをベースライン収集し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによってＨＥＲ２／ｎｅｕの高度に保存されたＩＣ１領域に対する応答について解析した。結果は、応答の早いもの、応答の遅いもの、および明らかな応答の無いものにイヌを分けて示した。適用外はこれらのイヌに対する１７週目のサンプルがまだ評価されていないことを示す。
【図２５Ａ】ＡＤＸＳ３１−１６４が心臓の機能に有害な影響を及ぼすことが無いことを示す。心臓のパラメータＬＶＩＤ（拡張期）（図２５Ａ）、ＬＶＩＤ（収縮期）（図２５Ｂ）、および短縮率（図２５Ｃ）を各々のイヌについてベースライン、ワクチン接種時、およびその後２か月ごとに評価した。心筋トロポニンＩレベルを同じ時点で評価した（図２５Ｄ）。
【図２５Ｂ】ＡＤＸＳ３１−１６４が心臓の機能に有害な影響を及ぼすことが無いことを示す。心臓のパラメータＬＶＩＤ（拡張期）（図２５Ａ）、ＬＶＩＤ（収縮期）（図２５Ｂ）、および短縮率（図２５Ｃ）を各々のイヌについてベースライン、ワクチン接種時、およびその後２か月ごとに評価した。心筋トロポニンＩレベルを同じ時点で評価した（図２５Ｄ）。
【図２５Ｃ】ＡＤＸＳ３１−１６４が心臓の機能に有害な影響を及ぼすことが無いことを示す。心臓のパラメータＬＶＩＤ（拡張期）（図２５Ａ）、ＬＶＩＤ（収縮期）（図２５Ｂ）、および短縮率（図２５Ｃ）を各々のイヌについてベースライン、ワクチン接種時、およびその後２か月ごとに評価した。心筋トロポニンＩレベルを同じ時点で評価した（図２５Ｄ）。
【図２５Ｄ】ＡＤＸＳ３１−１６４が心臓の機能に有害な影響を及ぼすことが無いことを示す。心臓のパラメータＬＶＩＤ（拡張期）（図２５Ａ）、ＬＶＩＤ（収縮期）（図２５Ｂ）、および短縮率（図２５Ｃ）を各々のイヌについてベースライン、ワクチン接種時、およびその後２か月ごとに評価した。心筋トロポニンＩレベルを同じ時点で評価した（図２５Ｄ）。
【図２６】ＡＤＸＳ３１−１６４がＨＥＲ２／ｎｅｕの高度に保存された細胞内領域への免疫寛容を破壊することを示す。
【００１７】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下の発明を実施するための形態では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本発明はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者によって理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【００１９】
一実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ抗原を発現する腫瘍に対して防止、治療、およびワクチン接種し、かつＨｅｒ２−ｎｅｕ抗原の準優占エピトープに対する免疫応答を誘発し、一方で変異回避を避けるための組成物および方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、変異回避を避けることはエピトープ拡大に起因する。さらに別の実施形態では、変異回避を避けることは抗原のキメラ的な性質に起因する。
【００２０】
別の実施形態では、融合ポリペプチを含む免疫原性組成物が本明細書に提供され、前記融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、またＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を有する被験者に融合タンパク質を投与することは前記腫瘍内のエスケープ変異を防止する。別の実施形態では、免疫原性組成物を含む組み換え型リステリアワクチン株が本明細書に提供される。
【００２１】
一実施形態では、被験者はヒトの被験者である。別の実施形態では、ヒトの被験者は大人または子どもである。別の実施形態では、ヒトの被験者は子どもである。別の実施形態では、被験者はイヌの被験者である。別の実施形態では、イヌは犬である。
【００２２】
一実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法が本明細書に提供され、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。
【００２３】
一実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを防止する方法が本明細書に提供され、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。
【００２４】
別の実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法が本明細書に提供され、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。
【００２５】
一実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを有する被験者の生存を長持ちさせる方法が本明細書に提供され、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。一実施形態では、被験者はヒトである。別の実施形態では、被験者はイヌである。
【００２６】
一実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを有する被験者内の転移性疾患を遅延する方法が本明細書に提供され、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。一実施形態では、被験者はヒトである。別の実施形態では、被験者はイヌである。
【００２７】
一実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法が本明細書に提供され、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与する工程を含み、前記融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、前記核酸分子は前記融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、かつ前記代謝酵素は前記組み換え型リステリアワクチン株の染色体内で突然変異した内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では被験者はヒトである。別の実施形態では、ヒトの被験者は大人であってもよく、または子どもであってもよい。別の実施形態では、被験者はイヌである。別の実施形態では、キメラのＨＥＲ２はイヌのキメラのＨＥＲ２である。別の実施形態では、キメラのＨＥＲ２はヒトのキメラのＨＥＲ２である。別の実施形態では、前記融合ポリペプチドを前記被験者に投与することは前記腫瘍内のエスケープ変異を防止する。別の実施形態では、前記ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原はマッピングしたヒトのＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含む。
【００２８】
一実施形態では、核酸分子を含む組み換え型リステリアワクチン株が本明細書に提供され、核酸分子はポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、ポリペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素は組み換え型リステリア株の染色体内で欠いている内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、組み換え型リステリアワクチン株は、代謝酵素をコードする第３のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、代謝酵素は組み換え型リステリア株の染色体内で欠いている内因性遺伝子を相補する。
【００２９】
一実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子は組み換え型リステリアワクチン株内のプラスミドの中にある。さらに別の実施形態では、抗生物質選択が無いときにプラスミドは組み換え型リステリアワクチン株内で安定して維持される。別の実施形態では、プラスミドは組み換え型リステリア上に抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、弱毒化されている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。別の実施形態では、外来抗原の発現が本発明のうちの１つなどの細菌上に行使する高い代謝負担も、弱毒化の重要な機構である。
【００３０】
一実施形態では、弱毒化株はＬｍｄｄＡである。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的特性である強いアジュバント効果を発揮する。このアジュバント効果の１つの兆候は、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ以外の抗原を発現するリステリア、またはＡＤＸＳ−３１−１６４（キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する）ワクチンのいずれかによって生じた腫瘍内のＴｒｅｇの数の５分の１への減少である（本明細書内の図５参照）。別の実施形態では、恐らく免疫性応答の結果と同様に、異なる抗原（ＨＰＶ１６  Ｅ７）を発現するＬｍｄｄＡベクターは腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の著しい減少とも関連付けられる。
【００３１】
一実施形態では、本明細書に提供される弱毒化した栄養要求性リステリアワクチン株はＡＤＸＳ−３１−１６４株である。ＡＤＸＳ−３１−１６４は、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病毒性遺伝子ＡｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでのＨＥＲ２／ｎｅｕ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。一実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４はリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の最初の４４１のアミノ酸を融合したキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現および分泌し、別の実施形態では、これは切断ＬＬＯおよび非溶血性ＬＬＯである。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、耐性を破壊する能力を有する強くかつ抗原特異的な抗腫瘍応答をトランスジェニック動物内のＨＥＲ２／ｎｅｕに対して行使する（図２４の実施例参照）。別の実施形態では、免疫化したマウスの脾臓からより迅速に除去されるので、ＡＤＸＳ３１−１６４株は高度に弱毒化され、以前のリステリアワクチン世代より良好な安全性プロファイルを有する。別の実施形態では、トランスジェニック動物で、このワクチンの抗生剤耐性でかつより病毒性のバージョンであるＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも長い腫瘍発症の遅延を、ＡＤＸＳ３１−１６４はもたらす（図３参照）。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４株は高度に免疫原性であり、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニック動物内でＨＥＲ２／ｎｅｕ自己抗原に対する耐性を破壊し、腫瘍形成を防止することができる。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の著しい減少を生じる。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡワクチンで処理した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。別の実施形態では、このキメラ抗原の使用は、腫瘍が突然変異してこの新規な抗原を用いた治療に対する治療的に有効な応答から離れることを示すエスケープ変異をもたさない（実施例６参照）。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた末梢の免疫化は脳内の転移性乳ガン細胞株の増殖を遅延する（実施例７参照）。別の実施形態では、骨肉腫を患い、かつ切断術、化学療法、およびＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を含む治療を提供されたイヌの被験者は、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を受けていない対照被験者と比較して生存を延長させた。（実施例９および１０参照）。別の実施形態では、骨肉腫を患い、かつ切断術、化学療法、およびＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を含む治療を提供されたイヌの被験者は、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を受けていない対照被験者と比較して転移の減少を示した。（実施例１０参照）。別の実施形態では、骨肉腫を患い、かつ切断術、化学療法、およびＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を含む治療を提供されたイヌの被験者は、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を受けていない対照被験者と比較して誘発された特異的なＴ細胞応答の増加を示した。（実施例１０参照）。
【００３２】
一実施形態では、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８であり、抗生物質抵抗性遺伝子およびプラスミドから発現されるｐｒｆＡ遺伝子を含む。
【００３３】
一実施形態では、本明細書に例示したように、組み換え型の弱毒化した、抗生物質を含まないリステリアを発現するキメラ抗原はガンまたは固形腫瘍を防止および治療するために有用である。別の実施形態では、腫瘍はＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍である。別の実施形態では、このガンはＨＥＲ２を発現するガンである。別の実施形態では、このガンは乳ガン、中枢神経系（ＣＮＳ）のガン、頭頸部ガン、骨肉腫（ＯＳＡ）、イヌの骨肉腫、ユーイング肉腫（ＥＳ）、または当該技術分野で既知のいずれかのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するガンである。別の実施形態では、イヌの骨肉腫は四肢骨肉腫である。別の実施形態では、腫瘍は骨肉腫腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、または当該技術分野で既知の任意の他の抗原を発現する腫瘍である。別の実施形態では、本明細書に記述されるガンまたは固形腫瘍は、再燃または転移性疾患の結果である。
【００３４】
別の実施形態では、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する組み換え型リステリアはＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する固形腫瘍に対する治療のための治療ワクチンとして有用である。別の実施形態では、本明細書に提供されるＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を治療するため、およびそのエスケープ変異を防止するに有用である。別の実施形態では、「エスケープ変異」という用語は、治療に対する治療的に有効な応答から変異して離れる腫瘍を指す。
【００３５】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を本明細書に提供し、核分子は組み換え型リステリアワクチン株の中に常在する。別の実施形態では、本明細書に提供される核酸分子は組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するように使用される。別の実施形態では本明細書に提供される核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、リステリアゲノムの中へと組み込まれた核酸分子は非機能性病毒性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリアのゲノム内で突然変異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内因性の遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態では、病毒性遺伝子はａｃｔＡ遺伝子。別の実施形態では、病毒性遺伝子はｐｒｆＡ遺伝子である。当業者であれば理解するとおり、病毒性遺伝子は、組み換え型リステリア内で病毒性と関連付けられる、当該技術分野で既知の任意の遺伝子とすることができる。
【００３６】
一実施形態では、本明細書に提供される代謝遺伝子、病毒性遺伝子などはリステリア株の染色体内で欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供される代謝遺伝子、病毒性遺伝子などはリステリア株の染色体内でおよびいずれかのエピソーム性の遺伝要素中で欠いている。「エピソーム」、「エピソーム性の」などの用語が、本明細書に提供されるリステリアの染色体の中に組み込まれないプラスミドベクターまたはその使用を指すことを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、この用語は本明細書に提供されるリステリアの染色体の中に組み込まれるプラスミドベクターを指す。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などは、病毒性株のゲノムを欠いている。一実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は染色体から欠失される。
【００３７】
別の実施形態では、本明細書に提供される核酸およびプラスミドは、本明細書に提供される組み換え型リステリアに抗生物質抵抗性を与えない。
【００３８】
一実施形態では、本明細書に提供される核酸分子はプラスミドを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される核酸分子はプラスミドである。別の実施形態では、本明細書に提供されるプラスミドは組込み型ベクターである。別の実施形態では、プラスミドは非組込み型ベクターである。別の実施形態では、プラスミドは組込み型ベクターを含む。別の実施形態では、組込み型ベクターは部位特異的な組込み型ベクターである。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、当該技術分野で既知の任意のタイプのヌクレオチドで成り立っている。
【００３９】
「代謝酵素］という用語が宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００４０】
「安定して維持される」という用語が、１０世代の間検出可能な損失無しで、選択（例えば、抗生物質選択）が無い場合に宿主細胞または細菌内の核酸分子またはプラスミドの維持を包含する場合があることを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、期間は１５世代である。別の実施形態では、期間は２０世代である。別の実施形態では、期間は２５世代である。別の実施形態では、期間は３０世代である。別の実施形態では、期間は４０世代である。別の実施形態では、期間は５０世代である。別の実施形態では、期間は６０世代である。別の実施形態では、期間は８０世代である。別の実施形態では、期間は１００世代である。別の実施形態では、期間は１５０世代である。別の実施形態では、期間は２００世代である。別の実施形態では、期間は３００世代である。別の実施形態では、期間は５００世代である。別の実施形態では、期間は世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。
【００４１】
一実施形態では、本発明は抗原を発現する組み換え型リステリア株を提供する。本発明は、ＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片に融合したリステリオリシン（ＬＬＯ）タンパク質断片を含む組み換え型ポリペプチド、ワクチンおよびこれを含む免疫原性組成物、ならびに抗ＨＥＲ２免疫応答を誘発する方法およびこれを含むＨＥＲ２を発現する腫瘍に対して治療およびワクチン接種する方法も提供する。
【００４２】
別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリア株は動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系の有病率を減少する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって継代を遂行する。
【００４３】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドは本明細書に提供される融合タンパク質を含む。別の実施形態では、組み換え型ポリペプチドは融合タンパク質である。別の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質はキメラ型ＨＥＲ２抗原、ならびにａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片から成る群から選択される追加的なポリペプチドを含み、さらに前記追加的なポリペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原に融合している。別の実施形態では、追加的なポリペプチドは機能性である。別の実施形態では、追加的なポリペプチドの断片は免疫原性である。別の実施形態では、追加的なポリペプチドは免疫原性である。
【００４４】
別の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は非溶血性ＬＬＯタンパク質または本明細書に提供されるＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原に融合したＮ末端断片を含む。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質はリステリア生物体からのＡｃｔＡ配列を含む。ＡｃｔＡタンパク質およびその断片は抗原発現および免疫性をＬＬＯと類似の様式で増強する。
【００４５】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質はリステリア生物体からの切断ＡｃｔＡ配列を含む。別の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許シリアル番号第７，６５５，２３８号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０のアミノ酸から成る。別の実施形態では、米国特許公開番号第２０１４／０１８６３８７号に記述されるように、切断ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり、この中でＰＥＳＴモチーフを欠失しており、非保存的なＱＤＮＫＲ置換を含有する。ＡｃｔＡタンパク質およびその断片は抗原発現および免疫性をＬＬＯと類似の様式で増強する。
【００４６】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質はＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原および追加的なポリペプチドを含む。一実施形態では、追加的なポリペプチドは非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片である（実施例が本明細書に含まれる）。別の実施形態では、追加的なポリペプチドはＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、追加的なポリペプチドはＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。ＡｃｔＡタンパク質およびその断片は抗原発現および免疫性をＬＬＯと類似の様式で増強する。
【００４７】
本発明の方法および組成物の追加的なポリペプチドは、別の実施形態ではリステリオリシン（ＬＬＯ）ペプチドである。別の実施形態では、追加的なポリペプチドはＡｃｔＡペプチドである。別の実施形態では、追加的なポリペプチドはＰＥＳＴ配列ペプチドである。別の実施形態では、追加的なポリペプチドは抗原ペプチドの免疫原性を強化する能力を有する任意の他のペプチドである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００４８】
ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合タンパク質を、例えば、クローニングおよび適切な配列の制限、または以下に考察する方法による直接的な化学合成を含む任意の好適な方法で調製してもよい。あるいは、部分配列をクローニングし、適切な部分配列を適切な制限酵素を使用して分割してもよい。次いで断片を連結し、望ましいＤＮＡ配列を生産してもよい。一実施形態では、本明細書に提供される抗原コードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産することができる。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’端もペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５’端は第２の断片の３’端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第３のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。別の実施形態では、抗原はプラスミドの中へと連結される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【００４９】
本発明の結果は、本発明の組成物の投与が腫瘍細胞を識別しかつ殺す抗原特異的なＴ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）の形成を誘発するために有用性を有することを実証する（実施例が本明細書に含まれる）。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片から構成される組み換え型ポリペプチドを提供する。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質はヒトＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質はマウスのＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質はラットのＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質は霊長類のＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質はイヌのＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は当該技術分野で既知のヒトもしくは任意の他の動物種のＨＥＲ２キメラタンパク質またはその組み合わせである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００５２】
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、「ＨＥＲ２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、または「ｃＮｅｕ」と称されるタンパク質である。別の実施形態では、本明細書では、ＨＥＲ２／ｎｅｕは、「Ｈｅｒ−２」、「Ｈｅｒ−２タンパク質」、「ＨＥＲ２タンパク質」、「ＨＥＲ２」）とも称される。
【００５３】
一実施形態では、本明細書に提供されるＨｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、ガン遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外および１つの細胞内の断片を寄生し、一方別の実施形態では、キメラタンパク質は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２Ｄｑおよび少なくとも１７のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１）を寄生する（図１Ａ参照）。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも１３のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ２およびＩＣ１）を寄生する。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも１４のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ１）を寄生する。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも９のマッピングしたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ２）を寄生する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は非溶血性リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）に融合する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は切断リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）に融合する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質はリステリア−モノサイトゲネスリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１のアミノ酸に融合し、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化栄養要求性株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌される。別の実施形態では、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原／ＬＬＯ融合タンパク質を発現する本明細書に提供される弱毒化栄養要求性株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖した後ＴＣＡ沈殿させた細胞培養上清内のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のものと同等である（図１Ｂ参照）。
【００５４】
一実施形態では、無処置の動物、または無関連のリステリアワクチンを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図２Ａ）。一方で別の実施形態では、本明細書に提供される弱毒化栄養要求性株（ＡＤＸＳ３１−１６４）は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することができる（図２Ｂ）。
【００５５】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物の代謝酵素はアミノ酸代謝酵素であり、一方で別の実施形態では、代謝酵素はアラニン・ラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は組み換え型リステリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成に触媒作用を及ぼし、一方で別の実施形態では、代謝酵素はアラニン・ラセマーゼ酵素である。
【００５６】
別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下で発現する。別の実施形態では、ｉｎｌＡ（インターナリンをコードする）プロモーターが使用される。別の実施形態では、ｈｌｙプロモーターが使用される。別の実施形態では、ａｃｔＡプロモーターが使用される。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子は任意の他のグラム陽性プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリア内で機能する任意の他のプロモーターの制御下で発現する。遺伝子の発現を駆動するために他のプロモーターまたはポリシストロニック発現カセットが使用されてもよいことを当業者は理解するであろう。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００５７】
別の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラタンパク質は、配列番号：１に示される以下の核酸配列によってコードされる。
ｇａｇａｃｃｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｇｃｔｃｃｇｃｃａｃｃｔｃｔａｃｃａｇｇｇｃｔｇｃｃａｇｇｔｇｇｔｇｃａｇｇｇａａａｃｃｔｇｇａａｃｔｃａｃｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃａａｔｇｃｃａｇｃｃｔｇｔｃｃｔｔｃｃｔｇｃａｇｇａｔａｔｃｃａｇｇａｇｇｔｇｃａｇｇｇｃｔａｃｇｔｇｃｔｃａｔｃｇｃｔｃａｃａａｃｃａａｇｔｇａｇｇｃａｇｇｔｃｃｃａｃｔｇｃａｇａｇｇｃｔｇｃｇｇａｔｔｇｔｇｃｇａｇｇｃａｃｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｇａｇｇａｃａａｃｔａｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｇｔｇｃｔａｇａｃａａｔｇｇａｇａｃｃｃｇｃｔｇａａｃａａｔａｃｃａｃｃｃｃｔｇｔｃａｃａｇｇｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｇａｇｇｃｃｔｇｃｇｇｇａｇｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｇａａｇｃｃｔｃａｃａｇａｇａｔｃｔｔｇａａａｇｇａｇｇｇｇｔｃｔｔｇａｔｃｃａｇｃｇｇａａｃｃｃｃｃａｇｃｔｃｔｇｃｔａｃｃａｇｇａｃａｃｇａｔｔｔｔｇｔｇｇａａｇａａｔａｔｃｃａｇｇａｇｔｔｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃａａｇａａｇａｔｃｔｔｔｇｇｇａｇｃｃｔｇｇｃａｔｔｔｃｔｇｃｃｇｇａｇａｇｃｔｔｔｇａｔｇｇｇｇａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃａａｃａｃｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃａｇｃｃａｇａｇｃａｇｃｔｃｃａａｇｔｇｔｔｔｇａｇａｃｔｃｔｇｇａａｇａｇａｔｃａｃａｇｇｔｔａｃｃｔａｔａｃａｔｃｔｃａｇｃａｔｇｇｃｃｇｇａｃａｇｃｃｔｇｃｃｔｇａｃｃｔｃａｇｃｇｔｃｔｔｃｃａｇａａｃｃｔｇｃａａｇｔａａｔｃｃｇｇｇｇａｃｇａａｔｔｃｔｇｃａｃａａｔｇｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｃｃｃｔｇｃａａｇｇｇｃｔｇｇｇｃａｔｃａｇｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇｃｔｇｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｇａａｃｔｇｇｇｃａｇｔｇｇａｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃａｃｃａｔａａｃａｃｃｃａｃｃｔｃｔｇｃｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇｇｇａｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｃｇｇａａｃｃｃｇｃａｃｃａａｇｃｔｃｔｇｃｔｃｃａｃａｃｔｇｃｃａａｃｃｇｇｃｃａｇａｇｇａｃｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａｇｃｔｇｔｇｃｇｃｃｃｇａｇｇｇｃａｇｃａｇａａｇａｔｃｃｇｇａａｇｔａｃａｃｇａｔｇｃｇｇａｇａｃｔｇｃｔｇｃａｇｇａａａｃｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｃｃｇｃｔｇａｃａｃｃｔａｇｃｇｇａｇｃｇａｔｇｃｃｃａａｃｃａｇｇｃｇｃａｇａｔｇｃｇｇａｔｃｃｔｇａａａｇａｇａｃｇｇａｇｃｔｇａｇｇａａｇｇｔｇａａｇｇｔｇｃｔｔｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｃａｃａｇｔｃｔａｃａａｇｇｇｃａｔｃｔｇｇａｔｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｇａｇａａｔｇｔｇａａａａｔｔｃｃａｇｔｇｇｃｃａｔｃａａａｇｔｇｔｔｇａｇｇｇａａａａｃａｃａｔｃｃｃｃｃａａａｇｃｃａａｃａａａｇａａａｔｃｔｔａｇａｃｇａａｇｃａｔａｃｇｔｇａｔｇｇｃｔｇｇｔｇｔｇｇｇｃｔｃｃｃｃａｔａｔｇｔｃｔｃｃｃｇｃｃｔｔｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｇｃｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇａｃａｃａｇｃｔｔａｔｇｃｃｃｔａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｃｔｔａｇａｃｔａａ（配列番号：１）。
【００５８】
別の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラタンパク質は配列番号：２に示される配列を含む。
Ｅ    Ｔ    Ｈ    Ｌ    Ｄ    Ｍ    Ｌ    Ｒ    Ｈ    Ｌ    Ｙ    Ｑ    Ｇ    Ｃ    Ｑ    Ｖ    Ｖ    Ｑ    Ｇ    Ｎ    Ｌ    Ｅ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｌ    Ｐ    Ｔ    Ｎ    Ａ    Ｓ    Ｌ    Ｓ    Ｆ    Ｌ    Ｑ    Ｄ    Ｉ    Ｑ    Ｅ    Ｖ    Ｑ    Ｇ    Ｙ    Ｖ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｈ    Ｎ    Ｑ    Ｖ    Ｒ    Ｑ    Ｖ    Ｐ    Ｌ    Ｑ    Ｒ    Ｌ    Ｒ    Ｉ    Ｖ    Ｒ    Ｇ    Ｔ    Ｑ    Ｌ    Ｆ    Ｅ    Ｄ    Ｎ    Ｙ    Ａ    Ｌ    Ａ    Ｖ    Ｌ    Ｄ    Ｎ    Ｇ    Ｄ    Ｐ    Ｌ    Ｎ    Ｎ    Ｔ    Ｔ    Ｐ    Ｖ    Ｔ    Ｇ    Ａ    Ｓ    Ｐ    Ｇ    Ｇ    Ｌ    Ｒ    Ｅ    Ｌ    Ｑ    Ｌ    Ｒ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｅ    Ｉ    Ｌ    Ｋ    Ｇ    Ｇ  Ｖ    Ｌ    Ｉ    Ｑ  Ｒ    Ｎ    Ｐ    Ｑ    Ｌ    Ｃ    Ｙ    Ｑ    Ｄ    Ｔ    Ｉ    Ｌ    Ｗ    Ｋ    Ｎ    Ｉ    Ｑ    Ｅ    Ｆ    Ａ    Ｇ    Ｃ    Ｋ  Ｋ    Ｉ    Ｆ    Ｇ    Ｓ    Ｌ    Ａ    Ｆ    Ｌ    Ｐ    Ｅ    Ｓ    Ｆ    Ｄ    Ｇ    Ｄ    Ｐ    Ａ    Ｓ    Ｎ    Ｔ    Ａ    Ｐ    Ｌ    Ｑ    Ｐ    Ｅ    Ｑ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｆ    Ｅ    Ｔ    Ｌ    Ｅ    Ｅ    Ｉ    Ｔ    Ｇ    Ｙ    Ｌ    Ｙ    Ｉ    Ｓ    Ａ    Ｗ    Ｐ    Ｄ    Ｓ    Ｌ    Ｐ    Ｄ    Ｌ    Ｓ    Ｖ    Ｆ    Ｑ  Ｎ    Ｌ    Ｑ    Ｖ    Ｉ    Ｒ    Ｇ    Ｒ    Ｉ    Ｌ    Ｈ    Ｎ    Ｇ    Ａ    Ｙ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｌ    Ｑ    Ｇ    Ｌ    Ｇ    Ｉ    Ｓ    Ｗ    Ｌ    Ｇ    Ｌ    Ｒ    Ｓ    Ｌ    Ｒ    Ｅ  Ｌ    Ｇ    Ｓ    Ｇ    Ｌ    Ａ    Ｌ    Ｉ    Ｈ    Ｈ    Ｎ    Ｔ    Ｈ    Ｌ    Ｃ    Ｆ    Ｖ    Ｈ    Ｔ    Ｖ    Ｐ    Ｗ    Ｄ    Ｑ    Ｌ    Ｆ    Ｒ    Ｎ    Ｐ    Ｈ    Ｑ    Ａ    Ｌ    Ｌ    Ｈ    Ｔ    Ａ    Ｎ    Ｒ    Ｐ    Ｅ    Ｄ    Ｅ    Ｃ    Ｖ    Ｇ    Ｅ    Ｇ    Ｌ    Ａ    Ｃ    Ｈ    Ｑ    Ｌ    Ｃ    Ａ    Ｒ    Ｇ    Ｑ    Ｑ    Ｋ    Ｉ    Ｒ    Ｋ    Ｙ    Ｔ    Ｍ    Ｒ    Ｒ    Ｌ    Ｌ    Ｑ    Ｅ    Ｔ    Ｅ    Ｌ    Ｖ    Ｅ    Ｐ    Ｌ    Ｔ    Ｐ    Ｓ    Ｇ    Ａ    Ｍ    Ｐ    Ｎ    Ｑ    Ａ    Ｑ    Ｍ    Ｒ    Ｉ    Ｌ    Ｋ    Ｅ    Ｔ    Ｅ    Ｌ    Ｒ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ｖ    Ｌ    Ｇ    Ｓ    Ｇ    Ａ    Ｆ    Ｇ    Ｔ    Ｖ    Ｙ    Ｋ    Ｇ    Ｉ    Ｗ    Ｉ    Ｐ    Ｄ    Ｇ    Ｅ    Ｎ    Ｖ    Ｋ    Ｉ    Ｐ    Ｖ    Ａ    Ｉ    Ｋ  Ｖ    Ｌ    Ｒ    Ｅ    Ｎ    Ｔ    Ｓ    Ｐ    Ｋ    Ａ    Ｎ  Ｋ  Ｅ  Ｉ    Ｌ  Ｄ  Ｅ    Ａ    Ｙ  Ｖ    Ｍ    Ａ    Ｇ    Ｖ    Ｇ    Ｓ  Ｐ  Ｙ    Ｖ    Ｓ    Ｒ    Ｌ  Ｌ  Ｇ    Ｉ    Ｃ    Ｌ    Ｔ    Ｓ    Ｔ    Ｖ    Ｑ    Ｌ    Ｖ    Ｔ    Ｑ    Ｌ    Ｍ    Ｐ    Ｙ    Ｇ    Ｃ    Ｌ    Ｌ    Ｄ（配列番号：２）。
【００５９】
以下の表１は、ヒトとイヌとのそれぞれＨｅｒ−２  ＥＣおよびＩＣ断片アミノ酸配列の間の同一性パーセント（％）を示す。
【表１−１】
2017507943.tif 000003
【００６０】
別の実施形態では、ヒトＨＥＲ２／ＥＣ１断片をコードするアミノ酸配列は（配列番号：６９）で示される：  ＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫ（配列番号：６９）。
【００６１】
別の実施形態では、イヌのｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７０）で示される：
【００６２】
ＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＳＱＶＲＱＩＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＥＧＧＩＰＡＰＧＡＡＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＳＰＱＬＣＨＱＤＴＩＬＷＫＤＶＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＰＰＣＳＰＡＣＫ（配列番号：７０）。
【００６３】
別の実施形態では、ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７１）で示される：
【００６４】
ＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳ（配列番号：７１）。
【００６５】
別の実施形態では、イヌのｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７２）で示される：
【００６６】
ＴＡＰＬＱＰＥＱＬＲＶＦＥＡＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＮＬＳＶＦＱＮＬＲＶＩＲＧＲＶＬＨＤＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳ（配列番号：７２）。
【００６７】
別の実施形態では、ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７３）で示される：
【００６８】
ＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤＨＶＲＥＮＲＧＲＬＧＳＱＤＬＬＮＷＣＭＱＩＡＫＧＭＳＹＬＥＤ（配列番号：７３）。
【００６９】
別の実施形態では、イヌのｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７４）で示される：
【００７０】
ＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤＨＶＲＥＮＲＧＲＬＧＳＱＤＬＬＮＷＣＭＱＩＡＫＧＭＳＹＬＥＤ（配列番号：７４）。一実施形態では、ヒトのＨＥＲ２  ＥＣ１断片のアミノ酸配列（配列番号：６９）はイヌのＨＥＲ２  ＥＣ１断片のアミノ酸配列（配列番号：７０）と８９％の同一性を有する。別の実施形態では、ヒトのＨＥＲ２  ＥＣ２断片のアミノ酸配列（配列番号：７１）はイヌのＨＥＲ２  ＥＣ２断片のアミノ酸配列（配列番号：７２）と９３％の同一性を有する。別の実施形態では、ヒトのＨＥＲ２  ＩＣ１断片のアミノ酸配列（配列番号：７３）はイヌのＨＥＲ２  ＩＣ１断片のアミノ酸配列（配列番号：７４）と９８％の同一性を有する。
【００７１】
一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片はそのシグナル配列を含まない。別の実施形態では、シグナル配列の高い疎水性により、シグナル配列の削除はＨＥＲ２断片がリステリア内で順調に発現できるようにする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００７２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質の断片はその膜貫通領域（ＴＭ）を含まない。一実施形態では、ＴＭの高い疎水性により、ＴＭの削除はＨＥＲ２断片がリステリア内で順調に発現できるようにする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００７３】
一実施形態では、ラットのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子をコードする核酸配列は配列番号：４５を含む：  ＣＣＧＧＡＡＴＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＡＣＣＴＡＣＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＴＣＧＴＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＴＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣ���ＣＡＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＣＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＧＴＡＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧＡＴＧＣＧＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＴＴＡＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴ���ＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＴＡＧＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＧＡＣＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＴＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧＡＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＡ（配列番号：４５）。
【００７４】
一実施形態では、ラットのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードする核酸配列は配列番号：４６を含む：  ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＴＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ（配列番号：４６）。
【００７５】
別の実施形態では、ラットのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードする核酸配列は配列番号：４７を含む：  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡ（配列番号：４７）。
【００７６】
別の実施形態では、ラットのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列は配列番号：４８を含む：
【００７７】
ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡ（配列番号：４８）。
【００７８】
一実施形態では、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の核酸配列は配列番号：４９を含む：
ＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＴＡＡＧＧＡＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＧＴＣＣＡＴＣＧＴＣＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＧＣＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＧＴＣＧＴＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＧＧＧＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡ（配列番号：４９）。
【００７９】
別の実施形態では、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードする核酸配列は、ヒトのＥＣ１領域の１２０〜５１０ｂｐにわたるキメラの中へと実装され、以下の配列番号：５０を含む：
ＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧ（配列番号：５０）。
【００８０】
一実施形態では、完全なＥＣ１ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ断片は（ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の５８〜９７９ｂｐ）にわたり、以下の配列番号：５４を含む核酸配列によってコードされる：
ＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号：５４）。
【００８１】
別の実施形態では、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードする核酸配列は、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片の１０７７〜１５５４ｂｐにわたるキメラの中へと実装されかつ５０ｂｐの延長部を含み、以下の配列番号：５１を含む：
ＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧ（配列番号：５１）。
【００８２】
一実施形態では、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の９０７〜１５０４ｂｐにわたる完全なＥＣ２ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ断片は、以下の配列番号：５５を含む核酸配列によってコードされる）：
ＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧ（配列番号：５５）。
【００８３】
別の実施形態では、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列は以下の配列番号：５２を含むキメラの中へと実装される：
ＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＴ（配列番号：５２）。
【００８４】
別の実施形態では、完全なヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列はヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の２０３４〜３２４３にわたり、配列番号：５６を含む）：
ＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＧＣＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号：５６）。
【００８５】
一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物で利用されるＬＬＯはリステリアＬＬＯである。一実施形態では、ＬＬＯが由来するリステリアはリステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）である。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・シーリゲリである。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、非リステリア系ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、合成ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、これは組み換え型ＬＬＯタンパク質である。
【００８６】
一実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、以下の配列番号：３を含む核酸配列によってコードされる：
ａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔ（配列番号：３）。
【００８７】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号：４の配列を含む：
Ｍ    Ｋ    Ｋ    Ｉ    Ｍ    Ｌ    Ｖ    Ｆ    Ｉ    Ｔ    Ｌ    Ｉ    Ｌ    Ｖ    Ｓ    Ｌ    Ｐ    Ｉ    Ａ    Ｑ    Ｑ    Ｔ    Ｅ    Ａ    Ｋ    Ｄ    Ａ    Ｓ    Ａ    Ｆ    Ｎ    Ｋ    Ｅ    Ｎ    Ｓ    Ｉ    Ｓ    Ｓ    Ｍ    Ａ    Ｐ    Ｐ    Ａ    Ｓ    Ｐ    Ｐ    Ａ    Ｓ    Ｐ    Ｋ    Ｔ    Ｐ    Ｉ    Ｅ    Ｋ    Ｋ    Ｈ    Ａ    Ｄ    Ｅ    Ｉ    Ｄ    Ｋ    Ｙ    Ｉ    Ｑ    Ｇ    Ｌ    Ｄ    Ｙ    Ｎ    Ｋ    Ｎ    Ｎ    Ｖ    Ｌ    Ｖ    Ｙ    Ｈ    Ｇ    Ｄ    Ａ    Ｖ    Ｔ    Ｎ    Ｖ    Ｐ    Ｐ    Ｒ    Ｋ    Ｇ    Ｙ    Ｋ    Ｄ    Ｇ    Ｎ    Ｅ    Ｙ    Ｉ    Ｖ    Ｖ    Ｅ    Ｋ    Ｋ    Ｋ    Ｋ    Ｓ    Ｉ    Ｎ    Ｑ    Ｎ    Ｎ    Ａ    Ｄ    Ｉ    Ｑ    Ｖ    Ｖ    Ｎ    Ａ    Ｉ    Ｓ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｙ    Ｐ    Ｇ    Ａ    Ｌ    Ｖ    Ｋ    Ａ    Ｎ    Ｓ    Ｅ    Ｌ    Ｖ    Ｅ    Ｎ    Ｑ    Ｐ    Ｄ    Ｖ    Ｌ    Ｐ    Ｖ    Ｋ    Ｒ    Ｄ    Ｓ    Ｌ    Ｔ    Ｌ    Ｓ    Ｉ    Ｄ    Ｌ    Ｐ    Ｇ    Ｍ    Ｔ    Ｎ    Ｑ    Ｄ    Ｎ    Ｋ    Ｉ    Ｖ    Ｖ    Ｋ    Ｎ    Ａ    Ｔ    Ｋ    Ｓ    Ｎ    Ｖ    Ｎ    Ｎ    Ａ    Ｖ    Ｎ    Ｔ    Ｌ    Ｖ    Ｅ    Ｒ    Ｗ    Ｎ    Ｅ    Ｋ    Ｙ    Ａ    Ｑ    Ａ    Ｙ    Ｐ    Ｎ    Ｖ    Ｓ    Ａ    Ｋ    Ｉ    Ｄ    Ｙ    Ｄ    Ｄ    Ｅ    Ｍ    Ａ    Ｙ    Ｓ    Ｅ    Ｓ    Ｑ    Ｌ    Ｉ    Ａ    Ｋ    Ｆ    Ｇ    Ｔ    Ａ    Ｆ    Ｋ    Ａ    Ｖ    Ｎ    Ｎ    Ｓ    Ｌ    Ｎ    Ｖ    Ｎ    Ｆ    Ｇ    Ａ    Ｉ    Ｓ    Ｅ    Ｇ    Ｋ    Ｍ    Ｑ    Ｅ    Ｅ    Ｖ    Ｉ    Ｓ    Ｆ    Ｋ    Ｑ    Ｉ    Ｙ    Ｙ    Ｎ    Ｖ    Ｎ    Ｖ    Ｎ    Ｅ    Ｐ    Ｔ    Ｒ    Ｐ    Ｓ    Ｒ    Ｆ    Ｆ    Ｇ    Ｋ    Ａ    Ｖ    Ｔ    Ｋ    Ｅ    Ｑ    Ｌ    Ｑ    Ａ    Ｌ    Ｇ    Ｖ    Ｎ    Ａ    Ｅ    Ｎ    Ｐ    Ｐ    Ａ    Ｙ    Ｉ    Ｓ    Ｓ    Ｖ    Ａ    Ｙ    Ｇ    Ｒ    Ｑ    Ｖ    Ｙ    Ｌ    Ｋ    Ｌ    Ｓ    Ｔ    Ｎ    Ｓ    Ｈ    Ｓ    Ｔ    Ｋ    Ｖ    Ｋ    Ａ    Ａ    Ｆ    Ｄ    Ａ    Ａ    Ｖ    Ｓ    Ｇ    Ｋ    Ｓ    Ｖ    Ｓ    Ｇ    Ｄ    Ｖ    Ｅ    Ｌ    Ｔ    Ｎ    Ｉ    Ｉ    Ｋ    Ｎ    Ｓ    Ｓ    Ｆ    Ｋ    Ａ    Ｖ    Ｉ    Ｙ    Ｇ    Ｇ    Ｓ    Ａ    Ｋ    Ｄ    Ｅ    Ｖ    Ｑ    Ｉ    Ｉ    Ｄ    Ｇ    Ｎ    Ｌ    Ｇ    Ｄ    Ｌ    Ｒ    Ｄ    Ｉ    Ｌ    Ｋ    Ｋ    Ｇ    Ａ    Ｔ    Ｆ    Ｎ    Ｒ    Ｅ    Ｔ    Ｐ    Ｇ    Ｖ    Ｐ    Ｉ    Ａ    Ｙ    Ｔ    Ｔ    Ｎ    Ｆ    Ｌ    Ｋ    Ｄ    Ｎ    Ｅ    Ｌ    Ａ    Ｖ    Ｉ    Ｋ    Ｎ    Ｎ    Ｓ    Ｅ    Ｙ    Ｉ    Ｅ    Ｔ    Ｔ    Ｓ    Ｋ    Ａ    Ｙ    Ｔ    Ｄ    Ｇ    Ｋ    Ｉ    Ｎ    Ｉ    Ｄ    Ｈ    Ｓ    Ｇ    Ｇ    Ｙ    Ｖ    Ａ    Ｑ    Ｆ    Ｎ    Ｉ    Ｓ    Ｗ    Ｄ    Ｅ    Ｖ    Ｎ    Ｙ    Ｄ（配列番号：４）
【００８８】
この配列に対応するタンパク質の最初の２５個のアミノ酸はシグナル配列であり、また細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、遺伝子銀行受入番号ＤＱ０５４５８８、ＤＱ０５４５８９、ＡＹ８７８６４９、Ｕ２５４５２、またはＵ２５４５２で示される配列を有する。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の相同体である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００８９】
別の実施形態では、「切断ＬＬＯ」または「ｔＬＬＯ」はＰＥＳＴドメインを含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、この用語はアミノ末端において活性化ドメインを含有せず、シスチン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は５２９アミノ酸全長ＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４００〜４４１アミノ酸から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
【００９０】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸配列によってコードされた組み換え型ポリペプチドは、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原および追加的なポリペプチドを含む融合タンパク質であり、一方で別の実施形態では、融合タンパク質は、とりわけ一実施形態ではＬＭ非溶血性ＬＬＯタンパク質であり、または別の実施形態では切断ＬＬＯであるＬＬＯ断片を含む（実施例が本明細書に含まれる）。
【００９１】
一実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質は、ＬＬＯタンパク質由来または別の生物体（例えば、原核生物生命体など）由来のいずれかの、ＰＥＳＴ配列を含む。
【００９３】
別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸（ＡＡ）配列は配列番号：５〜９から選択される配列を含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）ＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：７）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：８）を含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３５〜５１においてＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：９）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３８〜５４においてＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：１０）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ  ＡＡ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知の任意の他のＰＥＳＴ配列である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９４】
ＬｍのＰＥＳＴ配列への抗原の融合は媒介した細胞および抗原の抗腫瘍免疫性を強化した。したがって、他の原核生物に由来する他のＰＥＳＴ配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も強化する。他の原核生物のＰＥＳＴ配列を、例えば、ＬＭについてＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）に記述されているものなどの方法に従って同定することができる。あるいは、この方法に基づいて原核生物由来のＰＥＳＴ  ＡＡ配列を同定することもできる。ＰＥＳＴ  ＡＡ配列が期待されることになる他の原核生物には、他のリステリア種が含まれるが限定されない。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は抗原タンパク質の中に埋め込まれる。したがって、別の実施形態では、「融合」は、抗原の一方の端部にリンクしているかまたは抗原の中に埋め込まれるかのどちらかで、抗原とＰＥＳＴアミノ酸配列との両方を含む抗原タンパク質を指す。
【００９５】
別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドを含むワクチンが本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドを含む組成物が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドから構成されるワクチンが本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドから構成される組成物が本明細書に提供される。別の実施形態では、組成物は免疫原性組成物である。
【００９６】
別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドをコードするヌクレオチド分子が本明細書に提供される。別の実施形態では、ヌクレオチド分子を含むワクチンが本明細書に提供される。別の実施形態では、ヌクレオチド分子を含む組成物が本明細書に提供される。
【００９７】
別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドをコードするヌクレオチド分子が本明細書に提供される。
【００９８】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子によってコードされる組み換え型ポリペプチドが本明細書に提供される。
【００９９】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含むワクチンが本明細書に提供される。
【０１００】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含む免疫原性組成物が本明細書に提供される。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含むベクターが本明細書に提供される。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子を含むリステリアの組み換え型形態が本明細書に提供される。
【０１０３】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型の形態を含むワクチンが本明細書に提供される。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型を含む免疫原性組成物が本明細書に提供される。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型形態のカルチャーが本明細書に提供される。
【０１０６】
一実施形態では、本発明の方法で使用するためのワクチンまたは組成物は組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを、本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で含む。一実施形態では、本発明で使用するためのワクチンまたは組成物は本発明の組み換え型リステリア・モノサイトゲネスから、本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で構成される。別の実施形態では、本発明の方法で使用するためのワクチンまたは組成物は本発明の組み換え型リステリア・モノサイトゲネスから、本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で本質的に構成される。
【０１０７】
一実施形態では、「含む」という用語は組み換え型リステリア・モノサイトゲネスをワクチンまたは組成物の中に含むこと、ならびに当該技術分野で既知である場合がある他のワクチン、組成物、または処置を含むことを指す。別の実施形態では、「本質的に含む」という用語は、機能的な構成成分は組み換え型リステリア・モノサイトゲネスであるが、しかしながらワクチンまたは組成物の他の構成成分が含まれる場合があるワクチンを指し、他の構成成分はワクチンの治療的な効果に直接的に関与せず、例えば、組み換え型リステリア・モノサイトゲネスの効果を促進する（例えば、安定する、保存する、等々）構成成分を指す場合がある。別の実施形態では、「含む」という用語は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを含有するワクチンを指す。
【０１０８】
別の実施形態では、本発明の方法は組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で投与する工程を含む。一実施形態では、本発明の方法は本発明の組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明の方法は本発明の組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で投与する工程を本質的に含む。一実施形態では、「含む」という用語は方法の中に組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを投与する工程を含むこと、ならびに当該技術分野で既知である場合がある他の方法または処置を含むことを指す。別の実施形態では、「本質的に〜からなる」という用語は、その機能的な構成要素が組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを投与することであるが、しかしながらこの方法の他の工程を含んでもよく、その工程は、方法の治療的な効果に直接的に関与せず、例えば、組み換え型リステリア・モノサイトゲネスの投与の効果を促進する工程を指す場合がある、方法を指す。一実施形態では、「〜からなる」という用語は、追加的な工程を含まずに組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを投与する方法を指す。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリアはリステリア・モノサイトゲネスである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・シーリゲリである。各々のタイプのリステリアは本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１０】
一実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリア株はＡＤＸＳ３１−１６４株である。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によってＩＦＮ−γの分泌を刺激する。さらに、本明細書に提示されたデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープへと引き出すことができることを示す。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明はＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド分子を含むリステリアの組み換え型形態を提供する。
【０１１２】
一実施形態では、本発明は被験者内に抗ＨＥＲ２免疫応答を誘発する方法であって、ＨＥＲ２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを被験者に投与することを含む方法を提供し、これによって抗ＨＥＲ２免疫応答を被験者内に誘発する。
【０１１３】
一実施形態では、融合タンパク質の２つの分子（ＬＬＯ、ＡｃｔＡ断片、またはＰＥＳＴ配列、および抗原）は直接的に結合する。別の実施形態では、２つの分子は１つ以上のアミノ酸から構成される短いスペーサーペプチドによって結合される。一実施形態では、スペーサーは、タンパク質を結合すること、またはこれらの間の何らかの最低限の距離もしくは他の空間的関係を保持すること以外には特異的な生物活性を有しない。別の実施形態では、スペーサーの構成アミノ酸は、フォールディング、正味荷電、または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を与えるように選択される。別の実施形態では、タンパク質の２つの分子（ＬＬＯ断片および抗原）は別個に合成される、または非融合される。別の実施形態では、タンパク質の２つの分子は同じ核酸から別個に合成される。さらに別の実施形態では、２つの分子は別個の核酸から個別に合成される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１１４】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドをコードする核酸は、シグナルペプチドまたは配列もコードする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質はＬＬＯからのＬＬＯシグナル配列を含む。一実施形態では、異種抗原は、リステルアシグナル配列（例えば、溶血素シグナル配列またはＡｃｔＡシグナル配列）などのシグナル配列の使用を通して発現される場合がある。代替的には、例えば、融合タンパク質を作り出すことなく外来遺伝子をＬ．モノサイトゲネスプロモーターから下流で発現することができる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌性（リステリア性または非リステリア性）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対してネイティブである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対して外来である。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ｓｅｃＡ１シグナルペプチドなどのリステリア・モノサイトゲネスからのシグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ラクトコッカス・ラクティスからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはバチルス・アントラシスからの保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ｐ６０シグナルペプチドなどの、リステリア・モノサイトゲネスからのｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。さらに、組み換え型核酸分子は、任意選択的にｐ６０またはその断片をコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、シグナルペプチドは、バシラスサチリスＴａｔシグナルペプチドなどのＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、組み換え型ポリペプチドをコードする同一の翻訳リーディングフレームである。
【０１１５】
別の実施形態では、被験者内に抗ＨＥＲ２免疫応答を誘発する方法であって、ＨＥＲ２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型ヌクレオチドを被験者に投与することを含む方法が本明細書に提供され、これによって抗ＨＥＲ２免疫応答を被験者内に誘発する。
【０１１６】
一実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に強化した免疫応答を引き出す方法が本明細書に提供され、一方で別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与することを含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質に対する準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質のいくつかの準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質の少なくとも１〜５個の準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質の少なくとも１〜１０個の準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質の少なくとも１〜１７個の準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質の少なくとも１７個の準優占エピトープに対する免疫応答を含む。
【０１１７】
小さい断片リステリアベースのワクチンまたはトラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の細胞外領域に位置するエピトープに対するモノクローナル抗体）によってこれらの腫瘍が標的化されたとき、ガン遺伝子タンパク質ＨＥＲ２／ｎｅｕ内での点突然変異またはアミノ酸欠失が耐性腫瘍細胞の処置を媒介することが報告されている．ガン遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片および１つの細胞内断片を寄生するキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕベースの組成物が本明細書に記述される。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の３個のＨ２Ｄｑおよび少なくとも１７個のマッピングしたヒトのＭＨＣクラスＩエピトープを寄生する、このキメラタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスリステリオリシンＯタンパク質の最初の４４１のアミノ酸に融合し、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌した。
【０１１８】
以前の報告は、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の小さい断片（その各々がＨＥＲ２／ｎｅｕガン遺伝子の１つのＨ２Ｄｑエピトープのみを寄生する）を発現し、分離して分泌するリステリアベースのワクチンを用いて免疫化したとき、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍は各々のワクチンによって標的化されたＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原のこれらのエピトープでの突然変異に起因してエスケープする可能性があることを示している（Ｓｉｎｇｈ  Ｒ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ｙ．Ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｃｕｌｐｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：１８８７−９２参照）。キメラ型ワクチン内にＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の３つ以上のエピトープが組み込まれたとき、これらの腫瘍の選択を除去し、エスケープ変異によってエスケープすることができるという予期しない結果が本明細書で実証された。新規のＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ型リステリアワクチンを用いた免疫化は、点突然変異またはアミノ酸欠失と関連付けられる可能性があるいかなるエスケープ変異もＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原内にもたらさない（本明細書の実施例４参照）。
【０１１９】
一実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質またはキメラタンパク質を発現する組み換え型ポリペプチドを発現するためにリステリアワクチン株を改変する方法が本明細書に提供され、この方法は核酸分子を用いたリステリア株の形質転換を含む。別の実施形態では、核酸分子はポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、ポリペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。別の実施形態では、核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、前記代謝酵素は組み換え型リステリア株の染色体内で欠いている内因性遺伝子を相補し、それによってＨＥＲ２キメラタンパク質を発現するためにリステリアワクチン株を改変する。
【０１２０】
一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物はさらにアジュバントを含み、一方で別の実施形態では、アジュバントは、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、メチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、または当該技術分野で既知の任意のアジュバントを含む。
【０１２１】
一実施形態では、本発明では、ＬＭ  ｄｅｌｔａ−ａｃｔＡ  ｍｕｔａｎｔ（Ｂｒｕｎｄａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ、９０：１１８９０−１１８９４）、Ｌ．モノサイトゲネスｄｅｌｔａ−ｐｌｃＡ（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １７３：７５１−７５４）、またはｄｅｌｔａ−ＡｃｔＡ、ｄｅｌｔａ  ＩＮＬ−ｂ（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ５  ａｌ、２００４、ＰＮＡＳ、１０１：１３８３２−１３８３７）などの弱毒化リステリア株が使用される。別の実施形態では、弱毒化リステリア株は、本明細書の開示を装備するとき当業者であれば理解するとおり、１つ以上の弱毒化突然変異を導入することによって構築される。かかる株の例としては、芳香族アミノ酸に対する栄養要求性のリステリア株（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０  ６１：２２４５−２２４８）およびリポタイコ酸の形成のための突然変異体（Ａｂａｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ、２００２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１−１４）、および病毒性遺伝子を欠くことによって弱毒化されるもの（本明細書に含まれる実施例を参照）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第１のオープンリーディングフレームは、プロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、核酸分子は、プロモーター／調節配列に動作可能にリンクする第２のオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、オープンリーディングフレームの各々はプロモーター／調節配列に動作可能にリンクする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１２３】
本開示および本明細書に提供される方法が装備されたとき、異なる転写プロモーター、停止剤、キャリアベクター、または特異的な遺伝子配列（例えば、市販のクローニングベクター内のもの）を本発明の方法および組成物内で順調に使用することができることを当業者は容易に理解するであろう。本発明で意図されるように、これらの機能性は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られる市販のベクターで提供される。別の実施形態では、非必須ＤＮＡ配列（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）は除去される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。別の実施形態では、本発明で市販のプラスミドが使用される。かかるプラスミドは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）などの様々な供給元から入手可能であり、または当該技術分野で周知の方法を使用して構築することができる。
【０１２４】
別の実施形態は、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）などのプラスミドであり、これは原核生物の複製起点および原核生物内での発現を容易にするプロモーター／調節要素を有する原核生物発現ベクターである。別の実施形態では、外来ヌクレオチド配列は、プラスミドのサイズを減少しかつその中に定置することができるカセットのサイズを増加するために除去される。
【０１２５】
かかる方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記述されている。
【０１２６】
抗生物質抵抗性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製で一般的に採用される従来の選択およびクローニングプロセスで使用される。本発明で企図される抗生物質抵抗性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシンおよび当該技術分野で周知の他のものに抵抗を与える遺伝子産物が挙げられるがこれらに限定されない。各々の遺伝子は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２７】
細菌を形質転換するための方法は当該技術分野で周知であり、またこの方法としては塩化カルシウム適格細胞ベースの方法、電気穿孔法、バクテリオファージ媒介性形質導入、化学的および物理的形質転換技法が挙げられる（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  ９：１９０−１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。別の実施形態では、本発明のリステリアワクチン株は電気穿孔によって形質転換される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２８】
別の実施形態では、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へと導入するために結合が使用される。結合のための方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）および  Ａｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記述される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２９】
一実施形態では「形質転換」という用語は「形質移入」いう用語と同じ意味で使用され、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り上げるために細菌細胞を改変することを指す。別の実施形態では、「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変することを指す。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１３０】
本発明で有用なプラスミドおよび他の発現ベクターは、本明細書のいずれかに記述され、プロモーター／調節配列、グラム陰性およびグラム陽性細菌に対する複製の起点、融合タンパク質をコードする孤立核酸、および分離されたアミノ酸代謝遺伝子をコードする核酸などの特徴を含むことができる。さらに、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする孤立核酸は、かかる孤立核酸の発現を駆動するのに好適なプロモーターを有する。細菌系で発現を駆動するために有用であるプロモーターは当該技術分野で周知であり、またバクテリオファージλ、ｐＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを含む。原核生物プロモーターのさらなる実施例としては、５つのバクテリオファージλのメジャーライトおよびレフトプロモーター（ＰＬおよびＰＲ）と、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ、およびｇａｌプロモーター、αアミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ、１９８５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７６−１８２）およびＳ２８特異的な枯草菌のプロモーター（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４  Ｇｅｎｅ  ３２：１１−２０）と、桿菌のバクテリオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ、１９８２、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）と、ストレプトマイシンプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ、１９８６、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８）と、が挙げられる。本発明で企図される追加的な原核生物のプロモーターは、例えば、Ｇｌｉｃｋ（１９８７，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２）、Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ、（１９８６、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、６８：５０５−５１６）、およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ、（１９８４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２）で検討される。本発明で企図されるプロモーター／調節要素のさらなる実施例としては、リステリアのｐｒｆＡプロモーター、リステリアのｈｌｙプロモーター、リステリアのｐ６０プロモーター、およびリステリアのａｃｔＡプロモーター（遺伝子銀行受入番号ＮＣ＿００３２１０）、またはその断片が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３１】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のプラスミドは融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。別の実施形態では、次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。別の実施形態では、抗原をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産される。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’端もペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５’端は第２の断片の３’端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第３のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。抗原はプラスミドへと連結される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明は臨床用途のためのファージベースの染色体組込系をさらに含む。ｄ−アラニンラセマーゼ（しかしこれに限定されない）を含む必須酵素のための栄養要求性宿主株は、例えばＬｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）を使用されることになる。別の実施形態では、「ファージ治癒工程」を避けるためにＰＳＡベースのファージ組込系を使用した（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，  ２００２  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８４：４１７７−４１８６）。別の実施形態では、これは組込まれた遺伝子を維持するための抗生物質による継続的な選択を要求する。したがって、別の実施形態では、本発明は、抗生物質を用いた選択を要求しないファージベースの染色体組込系の確立を可能にする。別の方法で、栄養要求性宿主株を相補することになる。
【０１３３】
別の実施形態では、組み換え型ＤＮＡ法を使用して本発明の組み換え型タンパク質を合成した。一実施形態では、これは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作り出すことと、特定のプロモーター／調節要素の制御下で本発明のプラスミドなどの発現カセット内にＤＮＡを定置することと、タンパク質を発現することと、に関与する。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質（例えば、非溶血性ＬＬＯ／抗原）をコードするＤＮＡは、任意の好適な方法によって調製され、この方法としては、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、またはＮａｒａｎｇらのホスホトリエステル法（１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９）、Ｂｒｏｗｎらのホスホジエステル法（１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：１０９−１５１）、Ｂｅａｕｃａｇｅらのジエチルホスホラミダイト法（１９８１、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，  ２２：１５  １８５９−１８６２）、および米国特許第４，４５８，０６６号の固定法などの方法による直接化学合成が挙げられる。
【０１３４】
別の実施形態では、一本鎖のオリゴヌクレオチドを生産するために化学合成が使用される。様々な実施形態では、一本鎖をテンプレートとして使用して、相補的な配列を用いたハイブリダイゼーションによって、またはＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、この一本鎖のオリゴヌクレオチドを二本鎖のＤＮＡへと変換する。ＤＮＡの化学合成が約１００個の塩基の配列に限られ一方で、より短い配列の連結によってより長い配列を得ることができることを当業者は認識するであろう。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。
【０１３５】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質または組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用してクローニングされる。したがって、非溶血性ＬＬＯに対する遺伝子は、クローニングを容易にするために、好適な制限部位を含むセンスプライマーと、例えば、同一でない制限部位などの別の制限部位を含むアンチセンスプライマーとを使用して増幅されたＰＣＲである。抗原をコードする孤立核酸に対しても同じことを繰り返す。非溶血性ＬＬＯおよび抗原配列の連結、ならびにプラスミドまたはベクターの中への挿入は抗原の末端に結合する非溶血性ＬＬＯをコードするベクターを生産する。２つの分子は、直接的か、または制限部位によって導入された短いスペーサーによってかのいずれかで結合する。
【０１３６】
別の実施形態では、分子は１つ以上のアミノ酸から構成されるペプチドスペーサーによって分離され、一般的にスペーサーはタンパク質を結合することまたはこれらの間のなんらかの最少距離もしくは他の空間関係を保持すること以外には特定の生物活性を有しない。別の実施形態では、スペーサーの構成ＡＡは、フォールディング、正味荷電、または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を与えるように選択される。別の実施形態では、融合タンパク質または組み換え型タンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌、リステリアなどの他の細菌宿主、酵母、および様々なより高度な真核生物細胞（ＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞株、ならびに骨髄腫細胞株などの）を含む様々な宿主細胞へと形質転換される組み換え型融合タンパク質遺伝子は、各々の宿主に対して適切な発現対照配列に動作可能にリンクする。プロモーター／調節配列は、本明細書のいずれかに詳細に記述される。別の実施形態では、プラスミドは、追加的なプロモーター調節要素、ならびにリボソーム結合部位および転写終結シグナルをさらに含む。真核生物細胞については、対照配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、等々に由来するプロモーターおよびエンハンサー、およびポリアデニレーション配列を含む。別の実施形態では、配列はスプライスドナーおよびアクセプター配列を含む。
【０１３７】
一実施形態では、「動作可能にリンクする」という用語は並置を指し、そのように記述される構成成分はそれらの意図される様式で機能することができるようにする関係にある。コード配列に「動作可能にリンクする」対照配列は、コード配列の発現が対照配列に対応する条件の下で達成されるようなやり方で連結される。
【０１３８】
別の実施形態では、プラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子の発現を選択する培地上で増殖する。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、また栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸無しで増殖することになり、一方でＤ−グルタミン酸合成のためにプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、増殖しないことになる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする孤立核酸を含む場合、本発明のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときＤ−アラニン無しで増殖することになる。必要な増殖因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、また市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一旦選択されると、この細菌は適切な培地上で選択的な圧力の存在の中で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の増殖を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドの複製を確保し、したがって継続的にプラスミドが規制する細菌を選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
【０１４０】
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本発明の使用に適合されことを当業者は理解するであろう。
【０１４１】
一実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍の増殖を妨げる方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に記述される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１４２】
一実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍からの転移性疾患の起因を妨げるまたは遅延する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に記述される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１４３】
別の実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に強化した免疫応答を引き出す方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に記述される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応答を含む。
【０１４４】
一実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍の治療でのエスケープ変異を防止する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を前記被験者に投与する工程を含む。
【０１４５】
別の実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原を発現する腫瘍の発症を防止する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１４６】
一実施形態では、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の頻度を減少する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１４７】
別の実施形態では、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の頻度を減少する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１４８】
一実施形態では、腫瘍内の骨髄系由来抑制細胞の頻度を減少する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１４９】
別の実施形態では、骨髄系由来抑制細胞の頻度を減少する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１５０】
一実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍の形成を防止する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍から起因する転移性疾患の形成を防止する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。一実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を治療する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、被験者内のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍から来る転移性疾患を治療する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。一実施形態では、本発明の組成物を投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明のワクチンを投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドまたは組み換え型ヌクレオチドを投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の組成物、ワクチン、組み換え型ポリペプチド、または組み換え型ヌクレオチドを投与する工程を、弱毒化組み換え型形態のリステリアを含む組成物、ワクチン、組み換え型ヌクレオチド、またはこれを発現する組み換え型ポリペプチドを用いて、各々その独自の個別の実施形態の中で遂行する。別の実施形態では、異なる弱毒化細菌ベクターを用いて投与を遂行する。別の実施形態では、ＤＮＡワクチン（例えば、ネイキッドＤＮＡワクチン）を用いて投与を遂行する。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドの投与は、タンパク質を遺伝子組み換えによって生産し、次いで組み換え型タンパク質を被験者に投与することによって遂行される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１５１】
一実施形態では、腫瘍退行を達成するために、第１の処置の過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、本発明の組成物の繰返し投与（ブースター投与量）を行ってもよい。別の実施形態では、腫瘍増殖の抑制を達成するために、第１の処置の過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、繰返し投与を行ってもよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの解析、生検、または腫瘍に伴う症状の存在、不在、または寛解などの診断方法を含む当該技術分野で既知の任意の技法によって評価を決定してもよい。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって引き出される免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答である。
【０１５３】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物によって引き出される免疫応答はＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答である。別の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は抗原に対する測定可能な抗体応答に付随して起こる。別の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は抗原に対する測定可能な抗体応答に付随しない。
【０１５４】
別の実施形態では、本発明は被験者内に抗原の準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対してＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は（ａ）Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラ抗原またはその断片をコードするヌクレオチド分子をＬＬＯタンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド分子に融合してこれによってＬＬＯ−抗原融合タンパク質をコードする組み換え型ヌクレオチドを生成する工程と、（ｂ）組み換え型ヌクレオチドまたはＬＬＯ−抗原融合を被験者に投与する工程とを含み、これによってＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を抗原の準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して誘発する。
【０１５５】
一実施形態では、腫瘍内のＣＤ８＋／調節性Ｔ細胞の比を増加する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本発明の組み換え型ポリペプチド、組み換え型リステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１５６】
一実施形態では、腫瘍内のＣＤ８＋／調節性Ｔ細胞の比を増加する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本発明の組み換え型ポリペプチド、組み換え型リステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１５７】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物によって引き出された免疫応答は少なくとも１つの抗原の準優占エピトープへの免疫応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は準優占エピトープへの免疫応答を含まない。別の実施形態では、免疫応答は少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応答から構成される。別の実施形態では、ただ１つの測定可能な免疫応答の構成成分は少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応答である。各々のタイプの免疫応答は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５８】
一実施形態では、本発明の方法は被験者内のＨＥＲ２／発現腫瘍またはガンに対する前記被験者内の耐性を破壊し、また別の実施形態では、この方法は本明細書に記述される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【０１５９】
免疫応答を測定する方法は当該技術分野で周知であり、例えば、腫瘍増殖の抑制の測定、フローサイトメトリー、標的細胞溶解アッセイ（例えば、クロム遊離アッセイ）、四量体の使用、および他のものが挙げられる。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１６０】
別の実施形態では、本発明は被験者内でＨｅｒ−２を発現する腫瘍から発する転移性疾患を遅延または阻害する方法を提供し、また別の実施形態では、方法は被験者にＨＥＲ２キメラタンパク質もしくはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチド、または組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型ヌクレオチドを投与することを含み、被験者はＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、これによって被験者内でＨＥＲ２を発現する腫瘍から発する転移性疾患を遅延または阻害する。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明はＨＥＲ２キメラタンパク質抗原性を改善する方法を提供し、また別の実施形態では、方法はＬＬＯタンパク質のＮ末端断片をＨｅｒ−２タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチドにコードするヌクレオチドを融合して組み換え型ポリペプチドを作り出す工程を含み、これによってＨＥＲ２キメラタンパク質の抗原性を改善する。
【０１６２】
別の実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質の抗原性を改善する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、方法は組み換え型ヌクレオチドを発現するためにリステリア株を改変することを含む。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドを発現するために異なる細菌ベクターが使用される。別の実施形態では、細菌ベクターは弱毒化される。別の実施形態では、ＤＮＡワクチン（例えば、ネイキッドＤＮＡワクチン）は組み換え型ヌクレオチドを発現するために使用される。別の実施形態では、ヌクレオチドによってコードされたＬＬＯ−ＨＥＲ２キメラ融合ペプチドの投与は、タンパク質を遺伝子組み換えによって生産し、次いで組み換え型タンパク質を被験者に投与することによって遂行される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１６３】
一実施形態では、本発明は腫瘍の「エピトープ拡大」のための方法を提供する。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法を使用する免疫化は、本発明のワクチン内で搬送される抗原以外の抗原を持つ他の腫瘍の上へのエピトープ拡大を誘発する。
【０１６４】
別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される被験者内でそれぞれ優占または準優占である。別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される母集団内でそれぞれ優占または準優占である。
【０１６５】
一実施形態では、エピトープ拡大によって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療する、抑制する、または阻害する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、前記ガンは本発明の組成物内に含まれる抗原またはその断片の発現と関連付けられる。別の実施形態では、方法は前記被験者に本発明の組み換え型ポリペプチド、組み換え型リステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態では、被験者は抗原を発現するガンまたは抗原を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、これによって被験者内のガンまたは腫瘍増殖を治療、抑制、または阻害する。
【０１６６】
一実施形態では、「優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、ワクチン接種、タンパク質もしくは病原体による感染または悪性増殖、またはタンパク質を含有するガン細胞によって引き出される、３０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、これによって引き出される３５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、５０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、５５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、７０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、７５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、８０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、８５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９６％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９７％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。
【０１６７】
一実施形態では、「準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、ワクチン接種、タンパク質もしくは病原体による感染または悪性増殖、またはタンパク質を含有するガン細胞によって引き出される、３０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２８％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２６％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２４％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２２％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１６％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１４％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１２％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、５％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、３％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、０．５％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。
【０１６８】
各々のタイプの優占エピトープおよび準優占エピトープは、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１６９】
一実施形態では、本発明の方法および組成物での抗原は被験者の非腫瘍細胞上で検出可能なレベルで発現される。別の実施形態では、抗原は被験者の非腫瘍細胞の少なくともある特定のパーセンテージ（例えば、０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％、１％、２％、３％、または５％）の検出可能なレベルで発現される。一実施形態では、「非腫瘍細胞」は腫瘍の本体の外側の細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は非悪性細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は形質転換されていない細胞を指す。別の実施形態では、非腫瘍細胞は体細胞である。別の実施形態では、非腫瘍細胞は生殖細胞である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１７０】
一実施形態では、「検出可能なレベル」は標準的なアッセイ使用するときに検出可能なレベルを指す。一実施形態では、アッセイは免疫学的アッセイである。一実施形態では、アッセイは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。別の実施形態では、アッセイはウエスタンブロットである。別の実施形態では、アッセイはＦＡＣＳである。当該技術分野において利用可能である任意の他のアッセイを本明細書に提供される方法において使用することができることが当業者によって理解されるべきである。別の実施形態では、検出可能なレベルは特定のアッセイのバックグラウンドレベルに対して決定される。これらの技法の各々を遂行するための方法は当業者に周知であり、各々の技法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１７１】
一実施形態では、組み換え型の抗原を発現するＬＭを用いたワクチン接種はエピトープ拡大を誘発する。別の実施形態では、ＬＬＯ−抗原融合を用いたワクチン接種は、Ｈｅｒ２の状況の外側でさえも、エピトープ拡大を同様に誘発する。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１７２】
別の実施形態では、本発明は被験者内でＨＥＲ２を発現する腫瘍の増殖を妨げる方法を提供し、被験者にＨＥＲ２キメラ抗原に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを投与することを含み、抗原は１つ以上の準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、被験者は抗原を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、これによって被験者内でＨＥＲ２を発現する腫瘍の増殖を妨げる。別の実施形態では、抗原は優占Ｄ８＋Ｔ細胞エピトープのうちのいずれも含有しない。別の実施形態では、被験者内でのＨＥＲ２を発現する腫瘍の増殖を妨げる方法が本明細書に提供され、この方法は本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型ヌクレオチドを含むリステリアの組み換え型形態を被験者に投与することを含む。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明はガンを有する宿主内に細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘発するための方法を提供し、この方法は宿主に本発明の組成物を投与することを含み、これによってガンを有する宿主内の細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘発する。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明は、ガンの発生率を減少する方法を提供し、この方法は本発明の組成物を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、ガンを軽快する方法を提供し、この方法は本発明の組成物を投与することを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１７５】
一実施形態では、組成物を被験者の細胞にエクスビボで投与し、別の実施形態では、組成物をドナーの細胞にエクスビボで投与し、別の実施形態では、組成物をドナーの細胞にインビボで投与し、次いで被験者に移入した。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１７６】
一実施形態では、本発明の方法で治療されるガンは乳ガンである。別の実施形態では、このガンはＨｅｒ２を含有するガンである。別の実施形態では、このガンはメラノーマである。別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、このガンは結腸直腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞性肺ガンである。別の実施形態では、このガンはＣＮＳガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは中皮腫である。別の実施形態では、このガンは悪性中皮腫（ＭＭ）である。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。別の実施形態では、このガンは骨肉腫である。別の実施形態では、このガンはＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する骨肉腫である。別の実施形態では、この骨肉腫はイヌの骨肉腫である。別の実施形態では、この骨肉腫は限局性骨肉腫である。別の実施形態では、この骨肉腫は転移性骨肉腫である。別の実施形態では、この骨肉腫は高悪性度骨肉腫である。別の実施形態では、この骨肉腫はイヌの四肢骨肉腫である。
【０１７７】
本発明の方法の別の実施形態では、被験者は抗原を発現する腫瘍または標的抗原に対して免疫応答を搭載し、これによって抗腫瘍効果を媒介する。
【０１７８】
別の実施形態では、本発明はガンを治療するために免疫原性組成物を提供し、この組成物はＨＥＲ２キメラタンパク質への切断ＬＬＯの融合を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は融合を発現するリステリア株をさらに含む。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明はガンを治療するために免疫原性組成物を提供し、この組成物はＨＥＲ２キメラタンパク質を発現するリステリア株を含む。
【０１８０】
一実施形態では、本発明の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、本発明のワクチンまたは組成物は、家族性の遺伝子または人々がこれらのタイプの病気にかかりやすくする他の状況の原因で、乳ガンまたは他のタイプのＨＥＲ２含有腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、ワクチンは、外科手術による腫瘍増殖の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用される。かかる治療に続いて、本発明のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、ワクチンは、外科手術、従来の化学療法、または放射線治療と組み合わせてガン免疫療法として使用される。別の実施形態では、切断術を受けることができない被験者にかかる併用療法が使用される。別の実施形態では、切断術を受けることができない原発性骨肉腫を有する被験者にかかる併用療法が使用される。別の実施形態では、本発明のワクチンは、それまでに定着した腫瘍の増殖に効果を持ち、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。
【０１８１】
一実施形態では、「腫瘍抗原またはその断片」、「腫瘍関連抗原またはその断片」、「異種抗原またはその断片」、または「抗原ペプチドまたはその断片」は本明細書では交換可能に使用され、腫瘍抗原、血管形成抗原、または感染性疾患抗原を含む当該技術分野で既知の任意の抗原を含む。別の実施形態では、抗原は自己抗原である。
【０１８２】
一実施形態では、本明細書に提供される抗原は腫瘍関連抗原に由来し、一実施形態では、これは以下の腫瘍抗原、サバイビン、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ  １６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、結腸直腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原のうちの１つである。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組合せである。当該技術分野で既知の他の腫瘍関連抗原は本発明でも企図される。
【０１８３】
別の実施形態では、抗原またはその断片は、ＨＰＶ−Ｅ７（ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８株のいずれかから）、ＨＰＶ−Ｅ６（ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８株のいずれかから）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ、ＳＣＣＥ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、ＰＳＡ（前立腺に特異的な抗原）、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、アポトーシスのバキュロウイルス阻害剤繰返し含有５（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ５）（ＢＩＲＣ５）、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺に特異的な抗原）、またはこれらの組合せから選択される抗原に由来する。
【０１８４】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法は腫瘍またはガンに対してワクチン接種するために使用される。
【０１８５】
一実施形態では、本発明の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、本発明のワクチンまたは組成物は、家族性の遺伝子または人々がこれらのタイプの病気にかかりやすくする他の状況の原因で、乳ガンまたは他のタイプのＨＥＲ２含有腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、ワクチンは、外科手術による腫瘍増殖の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用される。かかる治療に続いて、本発明のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、外科手術または従来の化学療法と組み合わせてガン免疫療法としてワクチンが使用される。別の実施形態では、切断術を受けることができない被験者にかかる併用療法が使用される。別の実施形態では、切断術を受けることができない原発性骨肉腫を有する被験者にかかる併用療法が使用される。別の実施形態では、本発明のワクチンは、それまでに定着した腫瘍の増殖に効果を持ち、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。
【０１８６】
別の実施形態では、上述の方法のいずれかで利用されるワクチンおよび免疫原性組成物は、本発明のワクチンおよび免疫原性組成物の特徴のいずれかを有する。各々の特徴は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１８７】
本発明によって投与範囲の様々な実施形態が企図される。一実施形態では、ワクチンベクターの場合は、投与量は０．４ＬＤ５０／回の範囲である。別の実施形態では、投与量は約０．４〜４．９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．５〜０．５９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．６〜０．６９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．７〜０．７９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．８ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は０．４ＬＤ５０／回〜０．８のＬＤ５０／回である。
【０１８８】
別の実施形態では、投与量は細菌数１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数４×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数４×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５．０×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３．３×１０９個／回である。別の実施形態では、本明細書に提供される方法で使用するための組成物の投与量はリステリア３．３×１０９個／回を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１８９】
一実施形態では、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を被験者に単独で投与する。別の実施形態では、別のガン療法と一緒にワクチンまたは免疫原性組成物を投与する。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１９０】
一実施形態では、本発明の方法および組成物の組み換え型リステリアは、ＨＥＲ２キメラ抗原またはＬＬＯ−ＨＥＲ２キメラ抗原融合をコードする構築体を用いて安定して形質転換される。一実施形態では、構築体はさらなるサブクローニングを容易にするためにポリリンカーを含有する。組み換え型リステリアを生産するためのいくつかの技法が既知である。
【０１９１】
一実施形態では、構築体または核酸分子は相同的組み換えを使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる。相同的組み換えのための技法は周知であり、また例えば以下の文献に記述されている。Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭ、ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５、１０９（１−２）：１１−７）、およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，  Ｓｏｎｇ  ＨＨ，  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００５、３７（１）：１９−２４）。別の実施形態では、相同的組み換えを米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施した。この場合、Ｅ７を発現する組み換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下で、また遺伝子生成物の分泌を確保するためにｈｌｙシグナル配列を含むことによって、Ｅ７遺伝子の染色体組込によって作成され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組み換え型を得る。別の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。各々の技法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１９２】
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、とりわけ以下のＳｕｎらの文献（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：３７７０−３７７８）にＤＰ−Ｌ９６７の構築について記述されている。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという有利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されるゲノム内の位置が未知であるという不利点を有する。
【０１９３】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，  Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子のｃ端）の中へとインサートするために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体または異種遺伝子組込の前に利用された付着部位から回復した。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１９４】
別の実施形態では、様々なプロモーターのうちの１つが、これを含有する抗原または融合タンパク質を発現するために使用される。一実施形態では、Ｌｍプロモーターが使用され、例えば、プロモーターはリステリアのタンパク質溶血素、ａｃｔＡ、ホスホチジルイノシトールに特異的なホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＣ、およびメタロプロテアーゼそれぞれをコードするための遺伝子ｈｌｙ、ａｃｔＡ、ｐｌｃａ、ｐｌｃＢ、およびｍｐｌのためのプロモーターである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１９５】
本発明の別の実施形態では、本発明の方法および組成物は、本発明のＨＥＲ２キメラタンパク質またはＬＬＯ配列の相同体を利用する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物はヒト以外の哺乳類のＨＥＲ２キメラタンパク質を利用する。「相同性」、「相同の」等々という用語は、いずれかのタンパク質またはペプチドに関するとき、一実施形態では、最大パーセントの相同性を達成するため、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮せずに、必要に応じて配列をアラインしギャップを導入した後の対応する未変性ポリペプチドの残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは当該技術分野で周知である。
【０１９６】
別の実施形態では、「相同性」という用語は、いずれかの核酸配列を参照するとき、対応する未変性核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを同様に示す。
【０１９７】
別の実施形態では、本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする孤立核酸を本発明は提供する。一実施形態では、孤立核酸は少なくとも６５％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも７５％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも８５％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９０％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９５％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９７％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９９％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。
【０１９８】
一実施形態では、当該技術分野において適切に記述される方法によって、相同性は配列アライメントに対してコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム解析は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ強化アラインメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどの利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含む場合がある。
【０１９９】
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列（核酸またはアミノ酸配列）から選択された配列との同一性が６５％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は７５％より大きい。別の実施形態では、同一性は７８％より大きい。別の実施形態では、同一性は８０％より大きい。別の実施形態では、同一性は８２％より大きい。別の実施形態では、同一性は８３％より大きい。別の実施形態では、同一性は８５％より大きい。別の実施形態では、同一性は８７％より大きい。別の実施形態では、同一性は８８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９０％より大きい。別の実施形態では、同一性は９２％より大きい。別の実施形態では、同一性は９３％より大きい。別の実施形態では、同一性は９５％より大きい。別の実施形態では、同一性は９６％より大きい。別の実施形態では、同一性は９７％より大きい。別の実施形態では、同一性は９８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９９％より大きい。別の実施形態では、同一性は１００％である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２００】
別の実施形態では、相同性は候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介して決定され、その方法は当該技術分野において適切に記述される（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，  Ｅｄｓ．（１９８５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙを参照のこと）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、未変性カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【０２０１】
本発明の一実施形態では、「核酸」は少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組合せのストリングを指す。一実施形態では、この用語はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一実施形態では、「ヌクレオチド」は核酸高分子の単量体単位を指す。一実施形態では、ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態をとる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述される（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびその中で引用される参考文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態、またはこれらの群の誘導体であってもよい。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、または４本鎖であってもよい。別の実施形態では、この用語は他の種類のバックボーンであるが同一の塩基を含有する人工核酸も含む。一実施形態では、この人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチドバックボーンおよびヌクレオチド塩基を含有し、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に結合することができる。別の実施形態では、このヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は当該技術分野で既知の未変性の核酸のリン酸バックボーンの任意の他の変異体を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に既知であり、また例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記述される。核酸の生産および使用は、当業者には既知であり、また例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記述される。各々の核酸誘導体は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２０２】
本明細書に列挙された任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において適切に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージを含んでもよく、また例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用してもよい。各々の相同性を決定する方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２０３】
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法を遂行するうえで利用される試薬を含むキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、ツール、または器具を含むキットを提供する。
【０２０４】
一実施形態では、「接触する」または「投与する」という用語は本発明の組成物を用いてガン細胞または腫瘍に直接的に接触することを指す。別の実施形態では、この用語は、本発明の組成物を用いてガン細胞または腫瘍に間接的に接触することを指す。別の実施形態では、本発明の方法は、これによって化合物が体内を循環する当該技術分野で既知の拡散または任意の他の能動輸送もしくは受動輸送プロセスによって、被験者に本発明の組成物を接触し、その後組成物がガン細胞または腫瘍と接触する方法を含む。別の実施形態では、本発明の方法は本発明の組成物の少なくとも単一の投与を含んでもよく、別の実施形態では、本発明の方法は本発明の組成物の複数の投与を含んでもよい。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２０５】
別の実施形態では、「遺伝子」および「組み換え型遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。かかる自然の対立遺伝子変異は、典型的には所与の遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を生じる。数多くの異なる個体または生物体の中の対象となる遺伝子を配列決定することによって、代替的な対立遺伝子を同定することができる。これはハイブリダイゼーションプローブを使用して、様々な個体または生物体中の同一の遺伝子座を識別するために、容易に実行することができる。自然の対立遺伝子変異の結果であり、また機能活性を変更しない、ありとあらゆるかかるヌクレオチドの変種および結果として得られるアミノ酸多型もしくは変種が本発明の範囲内であることが意図される。
【０２０６】
医薬組成物
別の実施形態では、非経口的に、癌近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内になどの当業者に既知の任意の方法によって、本発明のワクチンおよび組成物を含有する医薬組成物を被験者に投与する。
【０２０７】
本明細書に提供される方法および組成物の別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は経口で投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬いゼラチンカプセルを含む。
【０２０８】
別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、液状調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０２０９】
一実施形態では、「治療する」という用語は疾患を治癒することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患を防止することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の発生率を減少することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の症状を軽快することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは患者のパフォーマンスのない生存率または全体的な生存率が増加することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を安定させることを指す。別の実施形態では、「治療する」とは寛解を誘発することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を減速することを指す。別の実施形態では、「減少する」、「抑制する」、および「阻害する」という用語は、より少なくすることまたは減らすことを指す。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２１０】
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスもしくはマイナス５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％を意味し、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％を意味する。
【０２１１】
「被験者」という用語は、症状もしくはその後遺症に対するまたはその症状になりやすいことに対する療法を必要とする、成人のヒト、またはヒトの子ども、ティーンエージャー、もしくは青年を含むことができ、これはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類を包含してもよいことを当業者は理解するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解されるであろう。「被験者」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０２１２】
一実施形態では、「被験者」という用語は切断術を行うことができない愛玩用のイヌおよびネコも包含する。別の実施形態では、「被験者」という用語は外科手術を行うことができないヒトも包含する。別の実施形態では、「被験者」という用語は切断術を行うことができないヒトも包含する。別の実施形態では、「被験者」という用語はヒトの子どもも包含する。
【０２１３】
治療の目的については、［哺乳類」という用語は哺乳類と分類されたあらゆる動物を指し、ヒト、飼育動物および家畜物、ならびに動物園の動物、スポーツ用の動物、または愛玩用動物（犬を含むイヌ科の動物、およびウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ等々など）を含むがこれに限定されないことを当業者は理解するであろう。
【０２１４】
腫瘍の治療に関して「治療的に有効な量」とは、以下の効果のうちの１つ以上を引き起こす能力を有する量を指す。（１）増殖の減速および完全な増殖停止を含むある程度の腫瘍増殖の阻害、（２）腫瘍細胞の数の減少、（３）腫瘍サイズの減少、（４）周辺器官への腫瘍細胞の浸潤の阻害（すなわち、減少、減速、または完全な停止）、（５）転移の阻害（すなわち、減少、減速、または完全な停止）、（６）腫瘍の退行もしくは拒絶をもたらす場合があるが、必ずしもそうでなくてもよい、抗腫瘍免疫応答の強化、および／または（７）障害に関連した１つ以上の症状のある程度の軽減。腫瘍の治療の目的については、本明細書に提供されるワクチンの「治療的に有効な量」は、経験的におよび習慣的な様式で決定される場合がある。
【０２１５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
【実施例】
【０２１６】
材料および方法
オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）によって合成され、またＤＮＡ配列決定はＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ（米国ニュージャージー州Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ）によって行われた。フローサイトメトリー試薬はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から購入した。細胞培養培地、補助剤および他のすべての試薬は、示されない限りＳｉｇｍａ（米国ミズーリ州Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓｅ）から入手した。ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２ペプチドはＥＺｂｉｏｌａｂｓ（米国インディアナ州Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ）によって合成された。完全なＲＰＭＩ  １６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含有した。多クローン性の抗ＬＬＯ抗体が以前に記述され、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入した。
【０２１７】
マウスおよび細胞株
すべての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａまたはＲｕｔｇｅｒｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいてＩＡＣＵＣによって認可されたプロトコルに従って実施した。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。ラットＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの実験動物コア施設で収容および飼育された。ＮＴ−２腫瘍細胞株は高いレベルのラットＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、以前記述したように増殖した。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから得られ、ＡＴＣＣの推奨に従って増殖した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株は、Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、米国ミネソタ州）からの寛大な供与物であり、また完全なＣ−ＲＰＭＩ培地中で増殖した。生物発光の作業は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（米国ペンシルバニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）のＳｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＳＡＩＦ）によるガイダンスに従って実行された。
【０２１８】
リステリア構築体および抗原発現
ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは、親切にもＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＭａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅ博士によって提供され、これはｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）へとクローニングされた全長のヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。このプラスミドは、ＰＣＲによってｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表１に示されるオリゴを使用して、ｈＨＥＲ２／ｎｅｕの３つの区分、すなわちＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を増幅するためのテンプレートとして使用された。
【表１−２】
2017507943.tif 000004
【０２１９】
ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ構築体はＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法およびテンプレートとしての各々の別個のｈＨＥＲ２／ｎｅｕ区分による直接融合によって生成された。プライマーを表２に示す。
【０２２０】
異なる区分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列
【表１Ａ】
2017507943.tif 000005
【０２２１】
ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切り離され、Ｌｍｄｄシャトルベクター、ｐＡｄｖ１３４で、ＬＬＯの切断非溶血性断片を用いてインフレームでクローニングされた。インサート、ＬＬＯ、およびｈｌｙプロモーターの配列はＤＮＡシークエンシング解析によって確認された。このプラスミドは電子コンピテントＡｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、ＬｍｄｄＡへと電気穿孔され、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）寒天培養基プレート上で陽性クローンが選択された。いくつかの実験では、ｈＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨＥＲ２）断片を発現する類似のリステリア株が比較の目的で使用された。これらは以前に記述した。すべての研究で、無関連リステリア構築体（Ｌｍ対照）が、免疫系でリステリアの抗原と無関係な効果を説明するために含まれる。Ｌｍ対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４と同一のリステリアプラットフォームに基づくが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現および分泌が試験された。各々の構築体はインビボで２回継代された。
【０２２２】
細胞毒性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスの群が、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２  ＩＣＩ、またはＬｍ対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。ＮＴ−２細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り出し、マイトマイシンＣ（血清を含まないＣ−ＲＰＭＩ媒体中２５０μｇ／ｍＬ）で３７℃にて４５分間処置した。５回洗浄した後、これらを免疫化した動物または無処置の動物から採取した脾細胞を用いて１：５の比（刺激薬：レスポンダー）で５日間、３７℃にて、５％ＣＯ２で共インキュベートした。標的として３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞のラベルが付いているユーロピウムを使用して、前述した方法により、標準的な細胞毒性アッセイを実施した。４時間のインキュベーションの後、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ２）を５９０ｎｍにて使用して、死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。特異的な溶解のパーセントが（実験群での溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）として定義された。
【０２２３】
免疫化マウスからの脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの群が、１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、陰性リステリア対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。最後の免疫化の一週間後、ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞が分離され、５×１０６細胞／ウェルにて２４ウェルプレートでマイトマイシンＣで処置したＮＴ−２細胞の存在下でＣ−ＲＰＭＩ培地中で共培養された。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞は、１μＭのＨＬＡ−Ａ２に特異的なペプチドまたは１μｇ／ｍＬの組み換え型Ｈｉｓタグ付きＣｈＨｅｒ２タンパク質（大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された）の存在下でインキュベートされた。上清からのサンプルが２４時間または７２時間後に得られ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在について、製造業者の推奨に従ってマウスＩＦＮ−γ酵素にリンクした免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して試験した。
【０２２４】
ＩＮＦ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
各々の表示された時点での凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、３７℃で一晩置き、次いで計数した。キメラ型ワクチン、および組み換え型ヒトＩＬ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国メリーランド州Ｆｒｅｄｒｉｃｋ）の中に存在するＨＥＲ２／ＮｅｕのＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１ドメインを代表する重複ヒトＨＥＲ２／Ｎｅｕペプチド（５アミノ酸によって１１ｍｅｒが重複する）の２．５μＭのプールを用いて細胞を５日間の間刺激した。細胞を採取し、１×のＰＢＳ中で２回洗浄し、計数した。製造業者のプロトコルに従って市販のイヌのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を使用して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを遂行した。簡潔に述べると、０．８−２×１０５の刺激された細胞を２．５μＭのＥＣ１、ＥＣ２、またはＩＣ１ペプチドプールプラスＩＬ−２を用いて、またはＩＬ−２を単独で用いてインキュベートした（バックグラウンド計数を決定するため）。すべてのアッセイを２回ずつ遂行した。製造業者の取扱い説明書に従ってプレートを発色させた。ＣＴＬ−Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアナライザー（Ｃ．Ｔ．Ｌ、米国オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）を使用してスポットを計数した。刺激していないウェルで計数したスポットの数を２回差し引くことによってスポットの数を正規化した。
【０２２５】
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究
生後６週間のＦＶＢ／ＮラットＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４／群）に５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、またはＬｍ対照を６回免疫化した。これらを、自然発生的な乳腺腫瘍の出現について週に２回観察し、これらは最高５２週間まで電子カリパスを使用して測定された。平均直径が１ｃｍ２のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を切り離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ内で−２０℃にて保存した。これらの腫瘍のエスケープ上のＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質内の突然変異の効果を決定するために、ゲノムＤＮＡ分離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定した。
【０２２６】
脾臓および腫瘍内の調節性Ｔ細胞へのＡＤＸＳ３１−１６４の効果
マウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）で移植した。７日目、１４日目、および２１日目に、これらに１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ対照で免疫化、または無処置のままにした。２８日目に腫瘍および脾臓を抽出し、ＦＡＣＳ解析によってＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在について試験した。簡潔に述べると、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で２枚のガラススライドの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を分離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、ＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍＬ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有するバッファーを用いて消化した。室温にて撹拌しながら６０分間インキュベーションした後で、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解バッファーによって溶解し、続いて１０％ＦＢＳを含有する完全なＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通した濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中で再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体を用いて染色し、続いて抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥを用いて透過処理および染色した。４色ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー解析を実施し、ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを解析した。
【０２２７】
統計的解析
生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用し、ＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイに対してスチューデントのｔ検定を使用し、これらを３回行った。これらの解析では、０．０５未満（＊印をつけた）のｐ値は統計的に有意であると考えられる。Ｐｒｉｓｍソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）のいずれかを用いてすべての統計的な解析が行われた。別段の記載がない限り、すべてのＦＶＢ／ＮラットＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニック研究のために、群あたり８〜１４匹のマウスを使用し、すべての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために、群あたり少なくとも８匹のマウスを使用した。ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍研究を除いて、すべての研究を少なくとも１回は繰り返した。
（実施例１）
【０２２８】
Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の発生：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。
【０２２９】
キメラＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築については前述した。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法によって、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ  ４０〜１７０およびａａ  ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ  ６７８〜８０８）との直接融合によって生成された。キメラタンパク質は、タンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープのほとんどを有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、プラスミド、ｐＡｄｖ１３８（これは構築体Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に使用される）から切り離され、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドへとクローニングされ、結果としてプラスミドｐＡｄｖ１６４が得られる（図１Ａ）。これらの２つのプラスミドバックボーンの間には２つの大きい違いがある。１）組み換え型細菌のインビトロでの選択のためにｐＡｄｖ１３８はクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用しているが、ｐＡｄｖ１６４はバシラスサチリスからのＤ−アラニン・ラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を寄生し、これはｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠いているＬｍｄｄＡ株内でインビトロでの選択のためおよびインビボでのプラスミド保持のために代謝相補経路を使用する。このワクチンプラットフォームは、ＦＤＡによる改変リステリアワクチン株の抗生物質抵抗性についての憂慮に対処するために設計および開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、これはインビボでのＬｍｄｄ株の相補に必要ないので、プラスミド（以下の配列および図１Ａを参照）中でｐＡｄｖ１６４はｐｒｆＡ遺伝子のコピーを寄生しない。ＬｍｄｄＡワクチン株も、ａｃｔＡ遺伝子（リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する）を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるＬｍｄｄに由来するものより病毒性が１００倍少ない。ＬｍｄｄＡベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのＬｍｄｄベースのワクチンよりもずっと速く（４８時間未満の間に）除去される。この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖したＴＣＡ沈殿した細胞培養上清の中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のもの（図１Ｂ）と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用して約１０４ＫＤの帯域として抗ＬＬＯ抗体によって検出される。負の対照としてｔＬＬＯのみを発現するリステリアバックボーン株が使用される。
【０２３０】
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図１参照）：
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（実施例２）
【０２３１】
ＡＤＸＳ３１−１６４は、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原性である。
【０２３２】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な細胞毒性Ｔ細胞を発生するうえでのＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性の特性が、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に対して強いが同等の細胞毒性Ｔ細胞応答を引き出す。したがって、ＬＬＯに対してＨｅｒ２に融合された細胞内断片のみを発現するリステリアを用いて免疫化されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラより低い溶解活性を示す。無処置の動物、または無関連リステリアワクチンを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図２Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によってＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできる（図２Ｂ）。これはマイトマイシンＣで処理されたＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞のカルチャー上清の中で検出され、これらは高いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原（図５Ｃ）を発現する。
【０２３３】
ヒトＭＨＣクラスＩエピトープのＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化後の適切な処置および提示は、ＨＬＡ−Ａ２マウスで試験された。免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックからの脾細胞は、マッピングしたＨＬＡ−Ａ２で制限されたエピトープに対応するペプチドと７２時間の間、共インキュベートされ、このペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕ分子の細胞外（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ配列番号：１１もしくはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ配列番号：１２）、または細胞内（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ配列番号：１３）領域に位置する（図２Ｃ）。組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質は、正の対照、および無関連ペプチド、または負の対照としてペプチドなしで使用された。この実験からのデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープへと引き出すことができることを示す。
（実施例３）
【０２３４】
ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２より有効である。
【０２３５】
ＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果が、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２とＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニック動物において比較され、この動物は生後２０〜２５週間で増殖の遅い自然発生的な乳腺腫瘍を発生した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、２１〜２５週の間に乳房の腫瘍を発生し、３３週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−ＨＥＲ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。４５週には、５０％を超えるＡＤＸＳ３１−１６４をワクチン接種したマウス（９匹のうち５匹）は、まだ腫瘍がなく、これはＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を用いて免疫化したマウスの２５％と比較される。５２週には、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化した８匹のうち２匹のマウスは、まだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験的な群からのマウスはすべて、すでにこれらの疾患に屈服していた（図３）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４はより弱毒化しているにもかかわらず、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止ではＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２より有効であることを示す。
（実施例４）
【０２３６】
ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の際のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子での突然変異。
【０２３７】
ＨＥＲ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ（ハーセプチン）（ＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外領域でエピトープを標的化するモノクローナル抗体）を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。いかなるワクチン接種した腫瘍サンプルのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の中にも突然変異が観察されなかったことは、代替的なエスケープ機構を示唆するの（データ示さず）。
（実施例５）
【０２３８】
ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の著しい減少を生じる。
【０２３９】
脾臓および腫瘍内での調節性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫化の後、脾細胞および腫瘍内のリンパ球が分離され、Ｔｒｅｇのために染色した。これらは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞と定義されたが、別個に解析したとき、ＦｏｘＰ３マーカーまたはＣＤ２５マーカーのいずれかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、無関連リステリアワクチンまたは無処置の動物と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化は、脾臓内のＴｒｅｇの頻度については効果を有しないことを示した（図４参照）。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のＴｒｅｇの存在に少なからぬ影響を生じた（図５Ａ）。処理されていない腫瘍ではすべてのＣＤ３＋Ｔ細胞の平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は無関連ワクチンについては４．２％に減少し、ＡＤＸＳ３１−１６４ついては３．４％と腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が５分の１に減少した（図５Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化したマウスからの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６．７１±０．４３、ｎ＝５）は、未処置マウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）、または無関連ワクチン（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら２つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
（実施例６）
【０２４０】
ＨＥＲ−２キメラを発現するリステリアワクチンによってエスケープ変異が導入されない
【０２４１】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８、ＬｍｄｄＡ１６４、および無関連ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹなどの異なるワクチンを用いて免疫化したマウスの腫瘍サンプルを採取した。これらのサンプルからＤＮＡを精製し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ領域に対応するＤＮＡ断片、ＩＣ１、ＥＣ１、およびＥＣ２を増幅し、何らかの免疫エスケープ変異があるかどうかを決定するために配列決定した。ＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して各々のＤＮＡからの配列のアラインメントを遂行した。解析の結果腫瘍から採取したＤＮＡ配列内には突然変異がないことを示した。これらの配列の詳細な解析を以下に示す。
ＥＣ２のアラインメント（９７５−１０２９ｂｐのＨＥＲ２／ｎｅｕ）
【０２４２】
参照    ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ（配列番号：１４）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
【０２４３】
参照    ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ（配列番号：１５）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
【０２４４】
参照    ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ（配列番号：１６）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
【０２４５】
参照    ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ（配列番号：１７）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
ｔＬｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
【０２４６】
参照    ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号：１８）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＮＡＣＡＧＴＣＴＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴ
【０２４７】
参照    ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ  （配列番号：１９）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−２    ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６    ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
【０２４８】
参照    ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ（配列番号：２０）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
【０２４９】
参照    ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ（配列番号：２１）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
【０２５０】
参照    ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ（配列番号：２２）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＮＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
【０２５１】
参照    ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ  （配列番号：２３）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
【０２５２】
参照    ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ  （配列番号：２４）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−３    ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＩＣ１のアラインメント（２１１４−３０４２ｂｐのＨＥＲ２／ｎｅｕ）
【０２５３】
参照    ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ  （配列番号：２５）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
【０２５４】
参照    ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ  （配列番号：２６）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
【０２５５】
参照    ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ（配列番号：２７）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
【０２５６】
参照    ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ  （配列番号：２８）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
【０２５７】
参照    ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ  （配列番号：２９）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
【０２５８】
参照    ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ（配列番号：３０）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
【０２５９】
参照    ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ（配列番号：３１）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
【０２６０】
参照    ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ（配列番号：３２）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
【０２６１】
参照    ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ（配列番号：３３）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
【０２６２】
参照    ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ（配列番号：３４）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
【０２６３】
参照    ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号：３５）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
【０２６４】
参照    ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ（配列番号：３６）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＮＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
【０２６５】
参照    ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ（配列番号：３７）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
【０２６６】
参照    ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ（配列番号：３８）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＣＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４  ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６    ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
【０２６７】
参照    ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ（配列番号：３９）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１    ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２    ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６  ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
ＥＣ１のアラインメント（３９９−７５８ｂｐのＨＥＲ２／ｎｅｕ）
【０２６８】
参照    ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ（配列番号：４０）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
【０２６９】
参照    ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ（配列番号：４１）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
【０２７０】
参照    ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ（配列番号：４２）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
【０２７１】
参照    ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ（配列番号：４３）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
【０２７２】
参照    ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ（配列番号：４４）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１  ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２  ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１  ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２    ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３    ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡ
ＬｍｄｄＡ１６４−４    ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡ
（実施例７）
【０２７３】
ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた末梢の免疫化は転移性乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる
【０２７４】
ＡＤＸＳ３１−１６４または無関連Ｌｍ対照ワクチンを用いてマウスに腹腔内で免疫化し、次いでルシフェラーゼおよび低いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞を５，０００頭蓋内に移植した（図６Ｃ）。麻酔をかけたマウスのエクスビボでの撮像によって接種後の異なる時点で腫瘍をモニターした。腫瘍接種後８日目に、すべての対照動物で腫瘍が検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスではいかなる検出可能な腫瘍を示すものもなかった（図６Ａおよび図６Ｂ）。ＡＤＸＳ３１−１６４はこれらの腫瘍の発症を明らかに遅延することができ、腫瘍接種後１１日目には負の対照群のマウスはすべてその腫瘍によって死んだが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスはすべてまだ生存しており、腫瘍増殖の小さい兆候を示すのみであった。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与を用いて得られた免疫応答が中枢神経系に到達することができる可能性があり、かつＬｍｄｄＡベースのワクチンがＣＮＳ腫瘍の治療のための使用の可能性を有する場合があることを強く示唆する。
（実施例８）
【０２７５】
ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化によるイヌの骨肉腫の治療。
【０２７６】
イヌの骨肉腫は長骨（下肢骨）のガンであり、１０歳を超える大型犬の主要な死亡原因である。標準的な治療は診断直後の切断術と、後に続く化学療法である。しかしながら、常にガンは肺に転移する。化学療法を用いて、イヌは約１８か月生存し、治療しない場合の６〜１２か月と比較される。骨肉腫の最高５０％までではＨＥＲ２抗原が存在すると考えられる。ＡＤＸＳ３１−１６４はこの抗原を発現する細胞を攻撃する免疫を作り出し、ヒトの乳ガンを治療するために開発されてきた。
【０２７７】
骨肉腫の組織学的な診断、および悪性細胞によるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現の証拠を有するイヌは、登録する資格がある。
【０２７８】
イヌの骨肉腫の試験
第１のレジメンでは、四肢を切断し、化学療法治療のラウンドがその後に続いた。３投与のＨｅｒ−２ワクチンをこれに続いて投与し、６か月間隔でブースターする、またはブースターなしとした。
【０２７９】
すべてのイヌは４週間のカルボプラチン療法を受けた。最後のカルボプラチン投与の４週間後、イヌはＡＤＸＳ−ＨＥＲ２を３週間に１回、合計３回の投与を受けた。群１（３匹のイヌ）は投与当たり１×１０８ＣＦＵを受け、群２（３匹のイヌ）は各々投与当たり５×１０８ＣＦＵを受け、群３（３匹のイヌ）は投与当たり１×１０９ＣＦＵを受けた。潜在的用量制限毒性の場合、さらに多くのデータを収集するために追加的なイヌが群に追加される。したがって初期の研究では９〜１８匹のイヌが治療される場合がある。
【０２８０】
第２のレジメンでは、化学療法の前（１か月前）にワクチンを１投与しかせず合計４投与であることを除いて、第１のレジメンと同様のものを繰り返した。
【０２８１】
さらに、両方のレジメンで、化学療法の１か月後に１投与のみを投与した。
（実施例９）
【０２８２】
ＨＥＲ２／ＮＥＵを過剰発現するイヌの骨肉腫を有する愛玩犬でのＡＤＸＳ−ｃＨＥＲ２の安全性を評価するフェーズ１投与量エスカレーション研究
【０２８３】
骨肉腫を有するイヌで腫瘍特異的な免疫性を安全かつ効果的に刺激することができる、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンを発現するＬ．モノサイトゲネス投与を決定するために試験段階Ｉ投与量エスカレーション研究を遂行した。ＯＳＡの疑いまたは確認されたＯＳＡに起因する四肢の切断術のためにＰｅｎｎＶｅｔに提示されたすべてのイヌの腫瘍を、定期的に採取し、ＯＳＡの診断を確認するために病理組織的に評価した。加えて、すべてのイヌからの腫瘍の断面を、腫瘍がＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するかどうかを決定するためにＩＨＣおよびウエスタンブロット解析によって評価した。ＯＳＡの組織学的な診断、および悪性細胞によるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現の証拠を有するイヌのみが登録する資格がある。外科手術で取った腫瘍組織の単一細胞懸濁液を凍結保存し、抗腫瘍免疫性を決定するためにクロム遊離アッセイで自己腫瘍標的として使用した。
【０２８４】
四肢ＯＳＡを有し、かつＨｅｒ２−ｎｅｕの発現を確認した最高１８匹の個人所有のイヌが登録された（図７）。登録時（最後のカルボプラチン処置後３週間）に、すべてのイヌは全血算定（ＣＢＣ）、化学スクリーニング（ＣＳ）、および尿検査（ＵＡ）を含む基本的な臨床検査、ならびに心エコー図および心臓に特異的なトロポニンＩ（ｃＴｎＩ）レベルの測定による心臓機能のベースライン評価を受けた。胸部放射線写真を取って、肺の転移が存在するかどうかを決定した。肺の転移の兆候が見られないイヌのみにこの研究に含まれる資格がある。登録時に、抗腫瘍免疫性のベースラインレベルを評価するために末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集した（抗腫瘍免疫性の評価を参照）。さらに、これらがすでにカルボプラチンによって免疫抑制されていないことを確認する目的で、ベースライン免疫機能性を評価するために血液を取った。機能的に無傷な免疫系を有するイヌのみにリステリアワクチンを受ける資格がある。
【０２８５】
Ｌｍ組み換え型投与およびデータ取得
すべてのイヌに単一のＡＤＸＳ３１−１６４ＡＤＸＳ３１−１６４組み換え型ワクチンを使用してワクチン接種した。第１のＬｍ−ｈｕＨｅｒ２−ｎｅｕワクチンを最後のカルボプラチン投与の３週間後に与え、この後３週間に１度、合計３投与だけ与えた（図７）。
【０２８６】
群１（３匹のイヌ）はＡＤＸＳ３１−１６４（Ｌｍ−ヒトキメラＨＥＲ２／ｎｅｕ）ワクチンを投与当たり１×１０８ＣＦＵで受け、群２（３匹のイヌ）は各々投与当たり５×１０８ＣＦＵで受け、群３（３匹のイヌ）は投与当たり１×１０９ＣＦＵで受け、投与当たり３．３×１０９ＣＦＵで受けた（１匹のイヌ）。組み換え型Ｌｍは３０分間にわたる遅い静脈内点滴で投与された。群１のために選択された投与量は、マウスでキメラ型ＡＤＸＳ３１−１６４組み換え型に対して確立された安全な投与量である。ヒトではＬｏｖａｘｉｎ  Ｃに対する非毒性投与量はマウスで確率されたものより１ログ高いだけであり、この投与量はこのパイロット試験の群３で評価された投与量である。
【０２８７】
Ｌｍ投与の時点で、全身的な悪影響の兆候についてイヌをモニターした。点滴の間の、ＥＣＧによって心拍数および心リズムをモニターし、呼吸数を記録した。さらに、超音波の使用およびトロポニンＩレベルの測定によって心臓障害をモニターした（図８）。点滴の後４８時間の間、イヌを注意深くモニターした。ＭｉｎｉＭｉｔｔｅｒ  ＲｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓのＶｉｔａｌ  Ｓｅｎｓｅ連続体温監視システム（発明者らの獣医臨床試験センター（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）、ＶＣＩＣで日常的に使用される）を使用して中核体温を点滴後１２時間未満の間連続的にモニターした。脈拍の数、リズム、および質、ならびに呼吸数および呼吸努力をモニターし、最初の６時間の間は１時間ごとに記録し、次いでそれ以後は４時間ごとに記録し、血圧および体温も同様にした（図９）。免疫刺激と一致したすべての症状に留意され、必要に応じて激しい反応を制御するために液体、鎮痛薬、制吐薬、および抗ヒスタミン薬を使用した。すべてのイヌを１日に６回観察し、不快症状、昏睡、吐き気、嘔吐、および下痢を含む組み換え型剤の毒性的な影響のあらゆる兆候を記録した。全身的投与後のＬｍの除去を評価する培養のために、最初のＡＤＸＳ３１−１６４ワクチンの２４、４８、および７２時間後に血液サンプルを取った。
【０２８８】
抗腫瘍免疫性の評価
最後のカルボプラチン投与に続く３週間、イヌは定期的な臨床検査ならびにＣＢＣ、ＣＳ、ＵＡ、およびｃＴｎＩレベルを含むベースライン血液検査を受けた。抗腫瘍免疫性のベースライン評価のためにこの時点でＰＢＭＣを取った。各々のワクチン接種の時点および最後のワクチン接種の３週間後に繰返し免疫評価を遂行した。以下に概要を示すように、ＣＦＳＥ増殖、サイトカイン産生（ＥＬＩＳｐｏｔおよびｑＲＴ−ＰＣＲ）、およびＣＴＬアッセイによって、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答についてＰＢＭＣを自己腫瘍標的に対して解析した（図１２）。
【０２８９】
結果
今日までに、発明者らは１６匹のイヌで合計４１件のＡＤＸＳ３１−１６４の点滴を遂行した。
【表１Ｂ】
2017507943.tif 000006
【０２９０】
ＡＤＸＳ３１−１６４投与量は、１×１０８、５×１０８、１×１０９、および３．３×１０９ＣＦＵからの範囲であった。
【表１Ｃ】
2017507943.tif 000007
【０２９１】
ワクチン投与のための標準作業手順
ＡＤＸＳ３１−１６４の投与のための標準作業手順を開発した。ワクチン接種の１時間前に患者は筋肉内注射を介しての２ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンと、ゆっくりとした静注として０．２ｍｇ／ｋｇのオンダンセトロンとを受けた。ワクチンを−８０℃に保持し、患者の傍で解凍した。これを２００ｍＬの０．９％ＮａＣｌ中で３０分間にわたって投与した。次いで点滴ラインを３０ｍＬのプラズマライト（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）でフラッシングした。アモキシシリンの３日間の過程（ワクチン接種後７２時間に開始）、および細胞の増殖および修復を助ける肝臓補助剤（Ｓ−アデノシル−メチオニン）の７日間の過程付きでイヌを家庭に帰した。
【０２９２】
研究の一次的な終了点は、ＡＤＸＳ３１−１６４の最大許容投与量を決定することであった。
【０２９３】
最大３．３×１０９までの投与量は体重が２５ｋｇ〜６７ｋｇの範囲のイヌでは良好に許容された。報告されたすべての副作用は、グレードＩの毒性で、最大耐量にはまだ達していなかった。副作用はワクチン投与の２〜４時間以内に常套的に生じた。高熱は等張液を維持速度（４ｍＬ／ｋｇ／時間）で２〜４時間の間静脈内に送達することによって通常解消された。体温が１０４．７°Ｆ以上に達した２つの事例では、カルプロフェンの単一の皮下注射が１〜２時間の間に正常体温を誘発した。吐き気および嘔吐は通常自己限定的であったが、場合によってはいくつかのエピソードが注記され、１ｍｇ／ｋｇのセレニアを投与し、これはさらなる吐き気および嘔吐の防止に大変効果的であった。合計５匹のイヌがワクチン投与の４８時間以内に中程度の肝臓酵素のグレードＩ上昇を発生し、これはワクチン接種の１週間後までに解消された。
【０２９４】
リステリアの除去
ワクチン接種した１６匹のイヌすべてに対して血液培養を遂行した後、今日までワクチン接種後２４時間の時点でいずれのイヌの末梢循環内でも検出可能なリステリアは無かった。ワクチン接種したイヌの尿および排泄物内へのリステリアの排出は評価しなかった。
【０２９５】
研究の二次的な終了点は、無増悪生存および全生存である。四肢の切断術およびカルボプラチンの４投与後ＡＤＸＳ３１−１６４を投与したとき、骨肉腫を有するイヌでの統計的に有意な全生存優位性が観察された。所有者が試験に参加しないが生存について追跡することを選択した６匹のイヌと比較すると、第１の２回投与群（６匹のイヌ）からの早期の結果はＡＤＸＳ３１−１６４を受けたイヌにおける有意な生存優位性を示す（ｐ＝０．００３）（図１３）。ワクチン接種していないイヌの平均生存時間は２３９．５日である。ワクチン接種したイヌに対する平均生存時間にはまだ達していない。治療を意図する群の中のすべてのイヌが解析に含まれる場合、これは真実となる。
【０２９６】
結論として、心臓血管系、造血系、肝臓系、または腎臓系で有意な短期または長期の副作用の証拠はない。さらに、最小限の残余疾患の存在下でのＡＤＸＳ３１−１６４の投与は転移性疾患を遅延／防止することができ、ＨＥＲ２／ｎｅｕが陽性の骨肉腫を有するイヌの全生存を長くすることができる。
（実施例１０）
【０２９７】
自然発生的なイヌの骨肉腫（ＯＳＡ）のモデルでＡＤＸＳ３１−１６４を評価するフェーズ１臨床試験
材料および方法
【０２９８】
ワクチン製造業者
ＡＤＸＳ３１−１６４の設計および生成。簡潔に述べると、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）のｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ突然変異体株を、キメラ型ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ構築体を担持するｐＡＤＶプラスミドを用いて形質移入する。この構築体はヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ分子の２つの細胞外領域（ＥＣ１およびＥＣ２）と１つの細胞内領域（ＩＣ１）とを含有し、この分子はＨＬＡ−Ａ２で制限された免疫優性エピトープの大部分を含有し、切断リステリオリシンＯ構築体と融合した。伝達プラスミドは、桿菌ｐ６０ｄａｌ遺伝子およびも含有し、これは栄養要求性相補を介して突然変異体Ｌｍの中に維持される。細菌耐性カセットはない。ワクチンはＶｉｂａｌｏｇｉｃｓ  ＧｍｂＨ（ドイツ、Ｃｕｘｈａｖｅｎ）によって製造され、使用前は−８０℃で保存された。
【０２９９】
病理組織学、病期分類、および免疫組織化学
すべての原発性四肢骨肉腫腫瘍の病理組織学的評価が有資格獣医病理学者（Ｊ．Ｅ．）によって遂行された。腫瘍は組織学的な特徴に基づいて、骨芽細胞性、軟骨芽細胞性、線維芽細胞性、および毛細血管拡張性として記述された。原発性腫瘍は、有糸分裂指数、核多形性、ならびにマトリクスおよび壊死が存在する量に基づいてスコアリングされた。組織学的スコアはグレード（Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ）へと変換された。
【０３００】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ染色については、ホルマリン固定し、脱灰し、パラフィン包埋した組織の５マイクロメートルの厚さの連続切片を負電荷を帯びたガラススライド上に搭載した。切片を２０分間８０℃で加熱し、Ｐｒｏ  Ｐａｒ（透明剤）内に浸し、エタノール中で再水和した。切片のクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨが９．０付近）内での煮沸によって抗原の回収を遂行した。３％の過酸化水素を使用して内因性ペルオキシダーゼを閉鎖した。ウサギの抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（Ｎｅｕ（ｃ−１８）：ｓｃ−２８４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ）またはウサギのＩｇＧアイソタイプを用いて染色を遂行した（ユニバーサル負の対照血清、ＮＣ４９８、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ２  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ／ＬＳＡＢ２、ＨＲＰ）を使用して結合抗体を検出した。組織を３，３’−ジアミノベンジジン溶液（ＤＡＫＯ）を用いて染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅ６００無限遠補正正立顕微鏡を使用してスライドを見た。画像解析のためにＮｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｈｔ  ＤＳ−Ｆｉ１カラーカメラおよびＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔ  ＢＲ３を使用して明るい視野画像が得られた。有資格獣医病理学者（Ｊ．Ｅ．）によって、ＨＥＲ２／ｎｅｕを染色している新生細胞のパーセンテージ（＜１０％＝１、１０％〜５０％＝２、＞５０％＝３）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ染色の強度（弱＝１、中＝２、強＝３）に基づいて組織切片を評価し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ正陽性のためにスコアリングした。スコアは各々の組織切片に対して１０ｈｐｆ以内で解析された細胞に基づいた。組み合わせられたＨＥＲ２／ｎｅｕスコアは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ染色およびＨＥＲ２／ｎｅｕ染色強度に対して陽性の腫瘍細胞のパーセンテージに対して与えられた２つの別個のスコアを掛け算することによって得られる。その腫瘍細胞の１０％より多くがＨＥＲ２／ｎｅｕに対して陽性に染色するイヌのみに試験の登録資格がある。
【０３０１】
資格の基準および臨床試験設計
ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性ＯＳＡの病理組織学的および免疫組織化学的診断を有し、四肢の切断術または四肢の温存のいずれかの手術によって原発性腫瘍の除去を受けたイヌで、アジュバント化学療法として３週間毎に１度（または骨髄抑制が生じた場合は４週間毎に１度）の３００ｍｇ／ｍ２のカルボプラチンの４回の投与を受けたイヌはスクリーニングのために資格を有する。最後のカルボプラチン治療の３週間後イヌをスクリーニングした。詳細な身体検査、全血算定（ＣＢＣ）、化学スクリーニング（ＣＳ）、および尿検査（ＵＡ）を遂行して、全体的な健康状態を決定した。フローサイトメトリーの好中球酸化バーストアッセイおよびマイトジェン誘発性のリンパ球増殖アッセイをそれぞれ使用して、基本的に先天的および適応性の免疫機能を試験した。ベースラインの心臓の状態を心電図記録法、心エコー図、および血清心筋トロポニンＩレベルによって評価した。肺の転移性疾患の存在を決定するために胸部放射線写真を遂行した（図１４Ｂ参照）。先天的および適応性免疫が無傷であり、心臓の疾患を受けている兆候のない、かつ肺の転移性疾患の兆候のない、全身的に健康であることが見いだされたイヌのみが、登録の資格を有する。研究の過程の間に死んだイヌは検視を受けた。転移性疾患の存在および場所を記録し、転移性病巣内でのＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を評価するために病理組織的および免疫組織化学的検査を遂行した。
【０３０２】
免疫解析
好中球酸化バーストアッセイ。ナトリウムヘパリン抗凝固剤処置血液中の赤血球を０．８３％ＮＨ４Ｃｌを使用して溶解し、残った白血球を１×ＰＢＳ中で２回洗浄した。１５μｇ／ｍＬのジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ−１２３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）を用いて血球を標識し、３ｎＭの１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて３７℃にて３０分間活性化した。フローサイトメトリー解析の前に、血球を氷上に１５分間定置した。血球をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ血球計算器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）の上に取得し、ＦｌｏＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ）を使用して解析した。
【０３０３】
リンパ球増殖アッセイ。密度遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をナトリウムヘパリン抗凝固剤処置全血から分離した。ＰＢＭＣを、１×ＰＢＳ中で２回洗浄され、計数した。血球を５μＭのＣＦＳＥを用いて標識し、１．２５μＭのコンカナバリンＡを用いて３７℃にて５日間刺激した。細胞を採取し、ＦＡＣＳバッファー内で２回洗浄し、ＡＰＣ結合ラット抗イヌＣＤ４およびＰＥ結合ラット抗イヌＣＤ８抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、米国ノースカロライナ州Ｒａｌｅｉｇｈ）を用いて標識し、フローサイトメトリーによって解析した。免疫機能の解析のために、正の対照として健康なコロニー犬（ＩＡＣＵＣ  ＃８０４１９７）から取った末梢血液を使用した。
【０３０４】
Ｔ細胞サブセット解析。各々のワクチン接種の前にベースラインにおいて、再ステージングにおいて、およびその後２か月毎に取ったＰＢＭＣをＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞サブセットについて解析した。簡潔に述べると、凍結保存した細胞を解凍し、ＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ、０．２％のＢＳＡ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、および４ｍＭのアジ化ナトリウム）内で２回洗浄し、その後マウス抗イヌＣＤ３、ＰＥ標識したラット抗イヌＣＤ８、またはＡｌｅｘａ標識した抗イヌＣＤ４（Ｓｅｒｏｔｅｃ、米国ノースカロライナ州Ｒａｌｅｉｇｈ）を用いて表面染色した。フローサイトメトリーの取得の直前に細胞を生体染色色素７−ＡＤＤとともにインキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞数およびＣＤ８＋Ｔ細胞数の合計をフローサイトメトリーのパーセンテージから計算し、Ｃｅｌｌ  Ｄｙｎ  ３７００ＣＳ血液分析器を使用してリンパ球計数の合計を決定した。
【０３０５】
ワクチン投与
ワクチン接種の前に、イヌは５ＨＴ３拮抗薬オンダンセトロン（０．２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内で、Ｈ１受容体遮断薬、ジフェンヒドラミン（２ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内で受容して、吐き気およびアナフィラキシーをそれぞれ防止する。標準的な３＋３臨床試験設計が採用された。ＡＤＸＳ３１−１６４を以下の投与で投与した。群１（２×１０８ＣＦＵ）、群２（５×１０８ＣＦＵ）、群３（１×１０９ＣＦＵ）および群４（３．３×１０９ＣＦＵ）。ＡＤＸＳ３１−１６４を１００ｍＬの０．９％のＮａＣｌ（群１および群２）、ならびに２００ｍＬの０．９％のＮａＣｌ（群３および群４）内に希釈し、３０分にわたり静脈内で投与した。点滴後一時間ごとに体温、脈拍、呼吸数、心拍数および心リズム（ＥＫＧによる）ならびに血圧をモニターした。体温が１０３°Ｆを超えた場合、イヌに静脈内でプラズマライトを４ｍＬ／ｋｇ／時間で体温が１０３°Ｆより低くなるまで与えた。イヌを１時間ごとに昏睡、吐き気、または嘔吐の兆候についてモニターした。血液学的パラメータまたは生化学的パラメータに何らかの変化がないかを評価するためにワクチン接種の２４時間後および１週間後に血液サンプルを抜き出し、ワクチン接種の２４時間後に血液培養を遂行して血流中の生細菌の持続性を決定した。すべてのイヌはワクチン接種後７２時間にアモキシシリンおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）の短い過程を受け、残っているリステリアをすべて殺し、肝臓に抗酸化剤酸サポートを提供した。
【０３０６】
初期の一連で最後にワクチンを受けた後少なくとも５か月転移性疾患を有しないイヌの所有者は１×１０９ＣＦＵの標準的な投与量でブースターワクチンを受けるオプションの提案を受けた。ブースターワクチンを記述されているように投与し、点滴後イヌを上述のようにモニターした。
【０３０７】
毒性
毒性を、獣医がん臨床研究グループの有害事象に対する共通分類用語（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃｏ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  −  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ）（ＶＣＯＧ−ＣＴＣＡＥ）に従ってグレード付けした。各々のワクチン接種のとき、最後のワクチン接種後３週間、およびその後死ぬまで２か月毎に、連続心電図、心エコー図、およびベースラインにおける血清心筋トロポニンＩレベルを通して心毒性の評価を遂行した。評価したパラメータとしては左室内径短縮率（ＬＶＦＳ）、ならびに左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）および左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）が挙げられる。イヌの間でからだの大きさの範囲が幅広いことを考慮してＬＶＩＤｄおよびＬＶＩＤｓを体重で正規化した。
【０３０８】
ＥＬＩＳｐｏｔ解析
各々の表示された時点での凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、３７℃で一晩置き、次いで計数した。キメラ型ワクチン、および組み換え型ヒトＩＬ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国メリーランド州Ｆｒｅｄｒｉｃｋ）の中に存在するＨＥＲ２／ＮｅｕのＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１ドメインを代表する重複ヒトＨＥＲ２／Ｎｅｕペプチド（５アミノ酸によって１１ｍｅｒが重複する）の２．５μＭのプールを用いて細胞を５日間の間刺激した。細胞を採取し、１×のＰＢＳ中で２回洗浄し、計数した。製造業者のプロトコルに従って市販のイヌのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を使用して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを遂行した。簡潔に述べると、０．８−２×１０５の刺激された細胞を２．５μＭのＥＣ１、ＥＣ２、またはＩＣ１ペプチドプールプラスＩＬ−２を用いて、またはＩＬ−２を単独で用いてインキュベートした（バックグラウンド計数を決定するため）。すべてのアッセイを２回ずつ遂行した。製造業者の取扱い説明書に従ってプレートを発色させた。ＣＴＬ−Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアナライザー（Ｃ．Ｔ．Ｌ、米国オハイオ州Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）を使用してスポットを計数した。
【０３０９】
一次および二次転帰の測定
転移の時期（ＴＴＭ）は切断術と転移性疾患発生との間の時間として計算される。切断術と死との間の時間としてＯＳＡに特異的な生存を計算した。無関係な原因で死んだ患者は、その死の時点で打ち切った。
【０３１０】
結果
資格種特異の基準を満たした１８匹のイヌをこのフェーズＩ臨床試験に登録した。年齢、品種、性別、腫瘍の場所、サブタイプ、グレード、およびＨＥＲ２／ｎｅｕの状態を記録した（表４）。標準的な３＋３臨床試験設計が採用された。ＡＤＸＳ３１−１６４を以下の投与量で投与した。群１：２×１０８ＣＦＵ（ｎ＝３）、群２：５×１０８ＣＦＵ（ｎ＝３）、群３：１×１０９ＣＦＵ（ｎ＝９）、および群４：３×１０９ＣＦＵ（ｎ＝３）。スクリーニングの時点で識別された既存の肺の転移性疾患を有する５匹の追加的なイヌも、思いやりのあるケアとしてＡＤＸＳ３１−１６４を受容した（表４）。これらのイヌのうち４匹はその原発性腫瘍からの新生細胞の＞５０％で強いＨＥＲ２／ｎｅｕ染色を有した。スクリーニングの際にこれらのイヌのうち３匹は複数の肺の転移性結節を有し、２匹のイヌは単一の転移性結節を有した。複数の肺結節を有するイヌは、疾患の進行の前に各々１つのワクチンを受容し、代替的な治療のために研究から離脱した。単一の結節を有する２匹のイヌは、各々３つのワクチンの全過程を受容した。既存の転移性疾患を有するイヌは１×１０９ＣＦＵ（ｎ＝３）または３×１０９ＣＦＵ（ｎ＝２）のいずれかのＡＤＸＳ３１−１６４を受容した（表５）。
【０３１１】
図１５はフェーズ１臨床試験のタイムラインの概略図を示し、切断およびフォローアップの化学療法に続いて３つのワクチン接種を投与した。
【表４】
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【表５】
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結果
【０３１２】
安全性および毒性＝２３匹のワクチン接種したイヌすべてに対して安全性が評価された。すべてのイヌはＡＤＸＳ３１−１６４投与に対して十分な耐性があり、ワクチン接種の日に一時的な低グレードの毒性のみが観察された（表６）。投与量に関わらずすべての群で、ＡＤＸＳ３１−１６４の投与の４時間後に体温の統計的に有意な増加が生じた（図９Ａ）。低血圧はいかなる時点でもまたはいずれの投与量でも観察されなかった（図９Ｂ）。８匹／１８匹のイヌ（既存の転移性疾患のない）、および３匹／５匹のイヌ（既存の転移性疾患を有する）は、ワクチン接種の４時間以内に＞１０３°Ｆの熱を発生し、その時点で静脈内に液体を与えられた。３匹のイヌは体温を下げるために単一投与の非ステロイド抗炎症薬を受容した。すべての事例で、さらなる介入なしに発熱は解消した。投与量に関わらず、ワクチン接種の４時間以内に、治療的な介入を必要としない一時的な昏睡、吐き気、ならびに嘔吐が発生した。２匹のイヌでは、ワクチン接種のすぐ後で一時的な単一のまたは二段の心室性期外収縮が識別された。既存の転移性疾患を有する１匹のイヌは、ワクチン接種の２時間以内に心室頻拍を発生した。リドカイン、プロカインアミド、ソタロール、および副腎皮質ステロイドを用いた治療はあまり効果が無かったが、しかしながら不整脈は７２時間以内に解消された。ＡＤＸＳ３１−１６４の２４時間後に、一時的ではあったが、白血球および好中球の計数の統計的に有意な増加が生じ、血小板およびリンパ球の一時的減少が付随して起きた（図１７）。ＡＤＸＳ３１−１６４投与量と血液学的変化の程度との間に相関はなかったが、生存したイヌと死亡したイヌとの白血球、好中球、および単球の程度の応答の間には有意な差があった（図１８Ａ〜図１８Ｆ）。肝臓酵素の血清濃度の中程度の一時的な増加がおよそ半分のイヌで、肝臓指向性リステリアによって発生した中程度の炎症と一致して生じた（表６）。末梢血液で識別されたすべての変化は無症候性であり、一週間以内のＡＤＸＳ３１−１６４投与で解消された。いずれのイヌでも腎臓の機能では有意な変更は記載されなかった。１９匹／２３匹のイヌはＡＤＸＳ３１−１６４投与の２４時間後に血液培養を遂行し、高度に弱毒化したＬｍｄｄＡ株の急速な除去と一致してすべて陰性であった。
【０３１３】
ＨＥＲ２／ｎｅｕを標的化したモノクローナル抗体が心臓毒性を生じると仮定して、心筋トロポニンＩ、短縮率（％）、ベースラインにおけるＬＶＩＤｄおよびＬＶＩＤｓを含む、心臓障害のバイオマーカーおよび機能障害の心エコー測定を、各々のワクチン接種の前およびその後２か月ごとに評価した。いずれかのワクチン接種したイヌで、心筋トロポニンＩ、短縮率、ＬＶＩＤｄまたはＬＶＩＤｓの有意でない、持続的な変化が識別された（図２６Ａ〜図２６Ｄ）。群３の中の１匹のイヌは各々のワクチン接種の時点で血清心筋トロポニンＩの段階的な増加を示したが、これは心エコーの機能障害の兆候に付随して起きたものではなかった。値は最後のワクチン接種に続いてベースラインに戻り、繰り返し評価では上昇しなかった。
【０３１４】
図２５（Ａ〜Ｄ）に示すように、臨床試験を通して、短縮率、左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）、および拡張期のＬＶＩＤ（ＬＶＩＤｄ）とともに心筋トロポニンＩのレベルを測定し、ＡＤＸＳ３１−１６４の投与に続く長期または短期の心臓毒性の兆候はなかった。
【０３１５】
最低限の治療に関連する有害事象を示すデータを提供する下記の表６が臨床試験の間に報告された。
【表６】
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【０３１６】
結論：ＡＤＳＸ３１−１６４の毒性のグレードは低く、かつ一時的であった。
【０３１７】
ＡＤＸＳ３１−１６４への免疫応答
図１８に提示する結果は、イヌの生存が予測されるワクチンを受容したイヌでのＡＤＸＳ３１−１６４への早期の免疫応答を実証する。図１８は、ＡＤＸＳ３１−１６４が生存と相関するＷＢＣ、好中球、および単球の計数の増加を誘発したことを示し、これは血小板およびリンパ球の一時的な減少に付随して起こる（図１７）。
【０３１８】
ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫応答を誘発および維持する能力、および特にＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞免疫性を誘発する能力を臨床試験の間に評価した。免疫応答を評価し、ＡＤＸＳ３１−１６４によってＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答が誘発されるかどうかを決定するために、ＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞数をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。ベースライン（カルボプラチンの３週間後）において、各ワクチン接種ごと、およびその後２か月に一度サンプルを取った。図１９はＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。
【０３１９】
ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な免疫応答。ＨＥＲ２／ｎｅｕのヒトＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１ドメインに対する免疫学的応答（それぞれ８９％、９３％、および９８％の同一性をイヌのＨＥＲ２／ｎｅｕと共有する）をそれぞれ４／１８、６／１８、および１／１８のイヌでベースラインにおいて検出した。１つ以上のＨＥＲ２／ｎｅｕドメインに対する誘発されたＩＦＮ−γ応答が７匹のイヌで第３のＡＤＸＳ３１−１６４ワクチン接種の３週間後に検出された（表７）。これらのイヌのうちの５匹は高度に保存されたＩＣ１ドメインに対して免疫応答を発生した。５匹の追加的なイヌは２か月後ＩＣ１ドメインに対してＩＦＮ−γ応答を発生した。３匹の追加的なイヌは、再燃の時点でＥＣ２単独、ＥＣ２およびＩＣ１、またはＥＣ１、ＥＣ２、およびＥＣ３の何れかに対してＩＦＮ−γ応答を発生した（イヌ００１、００２、および０１７）。初期のワクチン接種の一連の間にＨＥＲ２／ｎｅｕに対して免疫学的応答を発生した３匹のイヌは、１５〜１７か月にわたってＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。ＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＩＦＮ−γ応答は維持されなかったが、イヌはこの期間の間、転移性疾患がないままだった。１０匹のイヌが追加的なブースターワクチン接種を受け、６匹の評価可能なもののうち、２匹のイヌは、ブースターワクチン接種の２か月後、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＩＦＮ−γ応答の検出可能な増加を有した。再発した８匹のイヌのうち、５匹はＡＤＸＳ３１−１６４後３週間、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＩＦＮ−γ応答の増加がなかった。
【表７】
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【０３２０】
ブースターワクチン接種。登録時に転移性疾患を有しない１８匹のイヌのうちの１０匹に、初期の一連のワクチンの後５〜１０か月の間に単一のブースターワクチンを投与した。これらのイヌのうちの４匹は、第１のブースターワクチンの後４〜１５か月の間に与えられる追加的なブースターワクチンを受容した。初期の一連のワクチン接種と類似のグレードの低い一時的な副作用がブースターワクチン接種の時点で留意された。
【０３２１】
図２０（ＡおよびＢ）は、繰返しブースターワクチン接種もＨＥＲ２に特異的な免疫を刺激することを示している。動物２８９−００３に対しては６か月および１０か月に、動物２８９−００４に対しては８か月に繰返しブースターワクチン接種を投与した。臨床的転帰。ワクチン接種した群の中の８匹／１８匹のイヌが再発し、４匹は肺の転移性疾患を有し、４匹は骨転移を有した。骨転移を有する２匹のイヌは肺の転移へと進行した。仙骨に骨病巣を有する１匹のイヌは、誤嚥性肺炎で死に、孤立性肺結節を有する１匹のイヌは腎芽細胞腫で死んだが、骨および肺の病巣からのそれぞれの検視標本を転移性骨肉腫の病理組織学的な確認のために利用することができなかった。これらの２匹のイヌはＯＳＡに特異的な生存解析から打ち切られた。再発したイヌは主任臨床医の自由裁量で異なる救援化学療法および放射線療法を受けた。骨転移を有する４匹のイヌは鎮痛薬のみを用いて（１匹のイヌ）、緩和放射線単独で（１匹のイヌ）、または化学療法と組み合わせて（２匹のイヌ）処置された。２匹のイヌはアドリアマイシンを受容し、１匹のイヌは肺の転移性疾患の治療のためにパラディアを受容した。ワクチン接種したイヌに対するＯＳＡに特異的な平均生存期間にはまだ到達していない。ＴＴＭおよびＯＳＡに特異的な生存に対するカプラン−マイヤー生存率曲線を図２１に示す。ワクチン接種したイヌに対する１年および２年の全生存率は、それぞれ７１．４％および５７％である。ワクチン接種の２か月以内にＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＩＦＮ−γ応答を発生した１２匹のイヌのうち、９匹がまだ生存している（３匹のイヌ＞９００日、１匹のイヌ＞７００日、３匹のイヌ＞４００日、および２匹のイヌ＞３００日、７匹は今日まで腫瘍が無いままである（表７））。図２４に提示される結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４がＨＥＲ２／Ｎｅｕへの耐性を破壊することを実証する。これはＯＳＡの治療ならびに他のＨＥＲ２／Ｎｅｕ腫瘍および／またはガンに対して有意である場合がある。
【０３２２】
剖検所見。６匹／１８匹のイヌは研究期間の間に死に、これらのイヌのうち４匹で剖検を遂行した。３匹のイヌは、肺（３匹のイヌ）、骨（２匹のイヌ）、縦隔（１匹のイヌ）、および腎臓（１匹のイヌ）が関与するグレードＩＩおよびグレードＩＩＩの多巣性転移性骨肉腫を有することが見出された。大きい進行性の腎腫瘤のために安楽死させた１匹のイヌは、腎芽細胞腫を有することが見出された。このイヌは単一の肺結節も有したが、これは残念ながら病理組織検査による評価はされなかった。
【０３２３】
ＡＤＸＳ３１−１６４の投与に続く生存、生存の延長、腫瘍進行
スクリーニング時に複数の転移性肺結節を有し、思いやりのあるケアとして治療された３匹のイヌは、疾患の進行の前に各々１つのワクチンを受容し、研究から除外された。スクリーニング時に孤立性転移性肺結節を提示した２匹のイヌは３つのワクチンすべてを受容した（表徴および腫瘍特徴については表５を参照）。ワクチン接種にもかかわらずこれらのイヌのうちの１匹で進行性の肺転移性疾患が発生した。既存の肺結節の大きさが３週間ごとに倍になっていたのにもかかわらず、第２のイヌではいかなる追加的な肺の病巣も発生しなかった（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。最後のワクチン接種の１週間後、ＣＴスキャンは追加的な転移性病巣が無いことを確認し、そのイヌは転移巣切除術を受けた。外科手術の前に、腫瘍境界および炎症の区域を検出するために使用される染料であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を静脈内投与し、外科手術では近赤外光の下で肺結節および孤立性結節の近くの健康に見える肺実質のいくつかの他の区域で蛍光が見られた（図２２Ｃおよび図２２Ｄ）。肺結節の病理組織検査では、出血および壊死の大きい区域を有し、厚い線維性被膜によって取り囲まれた転移性ＯＳＡを明らかにした（図２２Ｅ）。ＩＨＣは、結節自体の中にごくわずかなＴ細胞を有する線維性被膜の周りのＣＤ３＋Ｔ細胞の蓄積を示した（図２２Ｇおよび図２２Ｈ）。近赤外光蛍光によって識別される他の区域はＴ細胞浸潤の焦点地域を示す（図２２Ｆ、図２２Ｉ、および図２２Ｊ）。Ｔ細胞は、異常に大きいビメンチン陽性細胞を包囲して目立つ有糸分裂像を用いて示される（図２２Ｋおよび図２２Ｌ）。これらの所見は単一の転移性肉腫細胞が肺の中の腫瘍に特異的なＴ細胞によって効果的に標的化される場合があり、ＡＤＸＳ３１−１６４がこれによって肺の転移性疾患を防止する、可能な機構を提供する場合があることを示唆する。このイヌは外科手術から良好に回復し、広い範囲に及ぶ侵攻性のＨＥＲ２／ｎｅｕ＋転移性疾患が皮下組織（骨芽細胞性、グレードＩＩおよび軟骨芽細胞性、グレードＩＩＩ）、縦隔（骨芽細胞、グレードＩＩ）、および横隔膜（骨芽細胞、グレードＩＩＩ）に発生する前５か月間の間肺の転移性疾患が無いままであった。結果は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答の誘導にもかかわらず、腫瘍外での副作用が識別されず、したがってＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞の誘導はＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性の転移性細胞の除去および疾患の再発からの長期の保護を担当することを示す。これはＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞増幅のタイミングによってサポートされ、これは数多くのイヌが転移性疾患を発生するとき、また巣状Ｔ細胞の病理組織学的所見によってワクチン接種および転移巣切除術に続いて１匹のイヌの肺実質の中で応答するとき、５匹のイヌでは診断のおよそ８か月後に発生した。
【０３２４】
図２２および図２３に提示される結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の投与が自然発生的なＨＥＲ２＋骨肉腫を有するイヌの転移性疾患を遅延および／または防止し、かつ全生存を長くすることを実証する。両方の図で見ることができるように、ワクチンを受容しているイヌは、有意に延長された生存時間を有し、一方でこれらのワクチンを受容しているイヌに対する平均生存期間にはまだ達していない。
【０３２５】
発明者らの研究は転移性疾患を防止するうえでのこのアプローチの有効性を実証するが、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は、思いやりのあるケアに基づき治療を受けた５匹のイヌでは既存の大きい肺の転移性疾患の退行を誘発することができなかった。１匹のイヌでは、これはＴ細胞が転移性病巣を包囲する線維性被膜に浸透することができないこと、またはこれらの細胞が定着した腫瘍微小環境内で生存することと関連付けられると思われた（図２２Ｃ）。しかしながら、この同じイヌで、周囲の大きい活動的に分割している間葉細胞を浸潤し、転移性ＯＳＡ細胞となると言われているＴ細胞の焦点地域は大幅に正常な肺実質内で識別され、また予想に反してこのイヌの転移巣切除術の後はさらなる肺の転移性疾患は発生しなかった。これらを考え合わせると、これらのデータは、転移性ＯＳＡ細胞をＦＡＳ／ＦＡＳＬ媒介アポトーシスに敏感にする場合があるその有能な先天的な免疫応答、および微小転移性肺疾患を除去するＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞の形態の適応性免疫応答を誘発する能力を通してＡＤＸＳ３１−１６４が肺の転移性疾患を防止していることを示唆する。
【０３２６】
結論：
この適用を登録した時点では、１２匹／１８匹のイヌは肺の転移性疾患を発生しておらず、最低限の残留疾患の設定で投与するときＡＤＸＳ３１−１６４が自然発生ＨＥＲ２＋骨肉腫を患う被験者内の転移性疾患を防止することを実証していた。ワクチン接種したイヌは、履歴的なＨＥＲ２／Ｎｅｕ＋対照群と比較して、全生存の統計的に有意な増加を示した。ＨＥＲ２／Ｎｅｕ＋対照のイヌ（ｎ＝１１）での平均生存期間は、３１６日（ｐ＝０．０３２）であり、ＡＤＳＸ３１−１６４治療されたイヌでの平均生存期間はまだ達していない。さらに、結果はＡＤＸＳ３１−１６４がＨＥＲ２／Ｎｅｕの高度に保存されたＩＣ１ドメインに対する末梢耐性を破壊することを示している（図２６）。ＡＤＸＳ３１−１６４投与の２４時間以内の白血球の増加の程度は（図１８）は、生存と相関し、ワクチンに応答するため転帰がイヌの免疫系の能力に部分的に依存することを示唆する。重要なことに、この研究は自発性ＯＳＡを有するイヌに最高３×１０９ＣＦＵまでのＡＤＸＳ３１−１６４の投与が安全であり、投与時に単に一時的な低いグレードの副作用のみを発生することを示している。さらに、肺の転移性疾患の防止は、部分的にＣＤ３＋Ｔ細胞が媒介する肺内の顕微鏡的な転移性疾患の除去と関連付けられる場合がある。この研究は小児科のＯＳＡおよびＨＥＲ２／Ｎｅｕを発現する他のヒトのガンのために重要な意味合いを有する。
【０３２７】
さらに、ここで発明者らはイヌでの最高３．３×１０＾９  ＣＦＵまでの投与量でのＡＤＸＳ３１−１６４の投与が安全であること、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な免疫性を誘発するにもかかわらず、短期または長期の心毒性につながらないことを示した。標的上で、心毒性を含む腫瘍外での副作用は、多数のＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞の投与と、またはトラスツズマブがアントラサイクリンとの同時使用時とに関連付けられてきた。発明者らは、あらゆる潜在的な心毒性のリスクを減少するためにドキソルビシンを用いない標準的な化学療法プロトコルを採用した。
【０３２８】
発明者らの研究は、ＯＳＡを有するイヌでＡＤＸＳ３１−１６４が肺の転移性疾患を防止することができることを実証した。これらの結果は安全性およびかつてないほどの生存時間をＯＳＡを有するイヌで実証し、小児骨肉腫および乳ガンを含むＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を有する患者内の転移性疾患を防止する、ＡＤＸＳ３１−１６４の能力を調査する道筋を固めるものである。
【０３２９】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、今では当業者には数多くの修正、置換、変更、および均等物が生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨に含まれるかかるすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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