(57)【要約】  本発明は、癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するための方法であって、当該患者のサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（配列番号２）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定することを含んでなる方法に関する。本発明はまた、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現、ならびにＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを測定するためのキットに関する。本発明はまた、前記ＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測された患者におけるＥＧＦＲ阻害剤の治療的使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、該患者のサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（配列番号２）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定することを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記患者がＫＲＡＳ野生型癌を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、膀胱癌および脳癌から選択される癌に罹患している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が結腸直腸癌、特に転移性結腸直腸癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体、特にセツキシマブまたはパニツムマブである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが腫瘍組織生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｍｉＲＮＡの発現レベルが、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが低いほど、患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する可能性が高い、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡの発現レベルに基づいて予後スコアを決定することをさらに含んでなり、該予後スコアは患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示すものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記予後スコアが式：
予後スコア＝ａ＊ｘ＋ｂ
であり、式中、
ｘは、患者のサンプルで測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルの対数であり、
ａおよびｂは、参照サンプルのプールに基づいて事前に決定されたパラメーターであり、かつ、
患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃよりも低ければまたはが閾値ｃと等しければＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測され、かつその患者の予後スコアが  閾値ｃよりも高ければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測され、ここで、該ｃの値は参照サンプルの同じプールに基づいて決定されたものである、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記a、ｂおよびｃは、好ましくは下記の範囲内である、請求項１０に記載の方法：
・ａ：［０．０９６］、好ましくは［０．００１；０．１２］；
・ｂ：［０．１４４］、好ましくは［０．０１；０．３］；および
・ｃ：［−０．１；０．１］、好ましくは［−０．０５５；０．０５５］。
【請求項１２】
ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定すること、およびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルと該他のパラメーターとを考慮した総合スコアを算出することをさらに含んでなり、該総合スコアは前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者が、患者のサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルの１つ以上の閾値との比較に基づきＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いか低いか予測される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのキットであって、
ａ）前記患者のサンプルにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（配列番号２）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬、および
ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定するための試薬
を含んでなる、またはからなる、キット。
【請求項１５】
癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤であって、該患者が請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により応答する可能性が高いと分類された患者である、ＥＧＦＲ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルの決定に基づき、癌治療の化学療法を個人に合わせるため、特に、１以上の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する患者の応答性をそのような薬剤による治療の前に評価するための方法を提供する。
【０００２】
背景技術
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路は、ヒト上皮癌の発生および進行において重要である。ＥＧＦＲ阻害剤との併用治療は、より効果的かつ持続的なＡｋｔ阻害を介して、機能的ＥＧＦＲに依存する自己分泌増殖経路を有する種々のヒト癌細胞において、相乗的な増殖阻害活性およびアポトーシス誘導活性を有する。
【０００３】
ＥＧＦＲ阻害剤は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部癌、結腸直腸癌、およびＨｅｒ２陽性乳癌を含む様々な癌の治療に対して承認済みであるか、または試験されており、標準療法に加えられつつある。ＥＧＦＲ標的の細胞内チロシンキナーゼドメインか細胞外ドメインのいずれかを標的とし得るＥＧＦＲ阻害剤は、一般に集団応答率の低さを悩みとし、多くの場合、効果のないまたは最適でない化学療法、ならびに不要な薬物毒性および出費をもたらす。例えば、セツキシマブ（ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的とするキメラモノクローナル抗体）による結腸直腸癌治療に関して報告されている臨床応答率は約１１％であり(Cunningham et al, N Engl Med 2004;351: 337-45)、エルロチニブによるＮＳＣＬＣ治療に関して報告されている臨床応答率は約８．９％である(Shepherd F A, et al, N Engl J Med 2005; 353:123-132)。
【０００４】
特に、ＫＲＡＳ突然変異の場合には耐性が認められている。
【０００５】
結腸直腸癌では、ＫＲＡＳ突然変異は抗ＥＧＦＲ抗体に対する耐性と明らかに関連があるので(Lievre et al, Cancer Res. 2006 66(8):3992-5)、非突然変異型ＫＲＡＳ患者において、この療法に対する応答の欠如を予測できる他のマーカーを同定することが大きな挑戦の１つである。中でも、癌遺伝子の増幅または活性化突然変異、および上記の腫瘍抑制遺伝子の不活性化突然変異は、例えば、ＥＧＦＲ下流リンタンパク質発現の測定により評価されるＥＧＦＲ下流シグナル伝達経路の活性化レベルなど、関連のある候補である。
【０００６】
肺癌では、３群の患者が明らかになっており、第１群は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ  ＴＫＩ）の使用が転帰を改善することが分かっている、ＥＧＦＲ変異型腫瘍を有する患者であり、第２群は、抗ＥＧＦＲ療法がおそらく良好な選択肢とはならない、ＫＲＡＳ変異型腫瘍を有する患者であり、第３群は、応答が予測できない非ＥＧＦＲ変異型かつＫＲＡＳ変異型腫瘍である。非変異型腫瘍群における薬物応答に関連するマーカーで、これまでに有益であることが分かっているものはない。
【０００７】
よって、特許療法のより良い個別化のためには、ＥＧＦＲ阻害剤に対する患者の応答性をそのような薬剤による治療の前に予測する必要がある。
【０００８】
従来技術において、種々の抗癌治療に対する感受性または耐性におけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の関与に関する多数の文献が存在する。しかしながら、ほとんどの場合、研究は部分的であり、不完全であり、実際には、治療に対する臨床応答または非応答の真の予測を可能とするものではない。事実、多くの場合で、研究は特定の治療に対して感受性もしくは耐性の細胞株におけるか、または患者腫瘍から単離された腫瘍細胞において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍｉＲＮＡの発現の分析に限定されている。さらに、多くの研究では、２つの細胞集団間または患者集団間での発現レベルの違いが示されるものの、新たな患者において応答または非応答の予測を実際に可能とする閾値またはスコアは示されていない。このことは、１つには、多くの研究が臨床現場で得られるデータを欠いているという第１の欠点に関連している。さらに、臨床現場で得られたデータをいくらか示している場合であっても、これらのデータはほとんどの場合で後向きでしかなく新しいコホートにおける予測法をバリデートするデータを欠いている場合が多い。
【０００９】
例として、ＷＯ２０１０／１２１２３８においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性または耐性な肺癌細胞株培養におけるｍｉＲＮＡ発現の分析が記載されている。臨床現場で得られたデータは提示されていない。
【００１０】
ＷＯ２００９／０８０４３７では抗癌治療に対する応答または非応答の予測方法が広く特許請求されている。しかしながら、ＷＯ２００９／０８０４３７において提示されたデータは種々の従来的化学療法治療に制限され、ＥＧＦＲ阻害剤に関する（同様に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体またはＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に関する）データは提供されていない。また、他の化学療法分子に提示されたデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された患者の腫瘍から単離させた腫瘍細胞におけるｍｉＲＮＡ中の発現に基づき得られた。臨床現場で得られたデータは提示されていない。
【００１１】
同様に、ＷＯ２０１１／１３５４５９においては抗癌治療に対する応答または非応答の予測方法が広く請求されている一方で、この文献にて示されたデータはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの種々の抗がん薬物に対する癌細胞株の感受性または耐性の予測に制限されている。ここでも同様に、臨床現場で得られたデータは提示されず、従ってｍｉＲＮＡ発現レベルと患者の臨床応答または生存率との相関は実証されていない。
【００１２】
Ragusa et al-2010 (Ragusa M. et al. Mol Cancer Ther. 2010 Dec;9(12): 3396-409)は、結腸直腸癌細胞株中のセツキシマブによる治療後の、セツキシマブ治療に対して感受性または耐性であると知られている、ｍｉＲＮＡの発現レベルを分析した。２つのｍｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ野生型とＫＲＡＳ変異の患者において異なって発現することが示された。しかしながら、ＫＲＡＳ野生型とＫＲＡＳ変異患者における異なった発現では、ＫＲＡＳ野生型患者のＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測することはできない。また、多くの他の研究におけるように、患者のＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を独立に予測するための、これらｍｉＲＮＡの発現レベルの能力を示す臨床現場で得られたデータが示されていない。
【００１３】
ＷＯ２０１３／０７６２８２には、癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性があるか否か予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、前記患者のサンプルにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（旧称ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊，UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU, http: //www.mirbase.orgにて受託番号  ＭＩＭＡＴ０００４５０４、本明細書において配列番号：１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定することを含んでなる方法が記載されている。より詳しくは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現が低ければ低いほど、患者はＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する可能性が高い。この出願に開示された方法は、癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性があるか否か予測する真の方法である一方で、このような療法がいくつかの選択肢のうちの１つとなる患者において、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測するためのさらなる真の、バリデートされた方法がなお必要である。本発明は、この必要に対する対応を提供する。
【００１４】
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、ＤＮＡから転写されるがタンパク質には翻訳されない遺伝子（非コードＲＮＡ）によりコードされている約２１〜２４、好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長の一本鎖分子であり、その代わりとして、それらはプリｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物から、プレｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステム−ループ構造へ、そして最終的には機能的ｍｉＲＮＡへとプロセシングする。成熟過程で、各プレｍｉＲＮＡは高い相補性を有する２つの異なるフラグメントを生じ、一方はプリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームに起源し、他方は３’アームに起源する。プリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームまたは３’アームから得られた２つの成熟ｍｉＲＮＡは、それぞれ「５ｐ」または「３ｐ」ｍｉＲＮＡと言われる。大体の場合、２つ（５ｐまたは３ｐ）のフラグメントのうちの１つは分解され、他方の（３ｐまたは５ｐ）フラグメントより少ない量で見つかる(Liu N et al. Cell Res. 2008 Oct;18(10):985-96; Okamura K et al. Nat Struct Mol Biol. 2008 Apr;15(4):354-63)。そうすると、最も豊富なフラグメントは、ｍｉＲ−Ｘ（Ｘは、特定の種におけるｍｉＲＮＡの配列に指定した独自の任意の番号である）と称してもよい一方で、豊富ではないフラグメントはｍｉＲ−Ｘ＊と称してもよい。
【００１５】
ＷＯ２０１３／０７６２８２において、癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性があるか否か予測するために用いるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊（配列番号：１）とも称される）である。共通のプレｍｉＲＮＡプレｍｉＲ−３１から発生した高い相補性を有する他のフラグメントは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１ (AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU、 http://www.mirbase.orgにて受託番号ＭＩＭＡＴ０００００８９、配列番号：２)とも称される）である。
【００１６】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルの変化は、種々の癌の診断／予後に関連すると知られているが、対立するデータが得られている(Wang S et al. Tumour Biol. 2014 Aug 20; Laurila EM et al. Genes Chromosomes Cancer. 2013 Dec;52(12):1103-13)。
【００１７】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルは、５−フルオロウラシル−５−ＦＵ、放射線療法、パクリタキセル、ドセタキセルおよびシスプラチンへの耐性に関連することも示された(Laurila EM et al. Genes Chromosomes Cancer. 2013 Dec;52(12):1103-13; Bhatnagar N et al. Cell Death Dis. 2010 Dec 9;1 :e105)。しかしながら、これら文献では、可能性のある、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルとＥＧＦＲ阻害剤治療に対する耐性または応答との相関の存在が分析されていない。
【００１８】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐは、共通のプレｍｉＲＮＡプレｍｉＲ−３１から発生した最も豊富なフラグメントであり（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐは豊富ではないフラグメントである）、ＷＯ２０１３／０７６２８２において、癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いか予測するために有用であることが示されている。
【００１９】
しかし、上記で説明したように、特定のプレｍｉＲＮＡについては、両方のフラグメントが同様の量で共通のプレｍｉＲＮＡから発生する一方で、成熟ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊比は定常状態で非対称であり、時として＞１００００：１の相違がある(Liu N et al. Cell Res. 2008 Oct;18(10):985-96; Okamura K et al. Nat Struct Mol Biol. 2008 Apr;15(4):354-63)。
【００２０】
また、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルおよびｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊比が大きくかつ一時的に変動し得ることは当技術分野において公知である(Liu N et al. Cell Res. 2008 Oct;18(10):985-96; Okamura K et al. Nat Struct Mol Biol. 2008 Apr;15(4):354-63; Guo L et al. PLoS One. 2010 Jun 30;5(6):e11387)。従って、共通のプレｍｉＲＮＡから発生したｍｉＲＮＡフラグメントのうちの１つの発現レベルが、特定の療法に対する応答／耐性に関連していることは、同一の共通プレｍｉＲＮＡから発生した高い相補性を有する他のフラグメントも同一の療法に対する応答／耐性に関連していることを意味しない。
【００２１】
例えば、ＷＯ２０１１／１３５４５９では、表１〜１２９において、Affymetrix miRNA 1.0アレイを用いた分析に基づき、過剰発現（表１〜６５）または過小発現（表６５〜１２９）が種々の薬剤の存在下での腫瘍細胞株の増殖に関連しているｍｉＲＮＡを開示し、そこには同一前駆体プレｍｉＲＮＡから得られた多くの一対のｍｉＲＮＡが含まれている。タモキシフェン治療については、過剰発現がタモキシフェンに対する応答に関連していると見出されたｍｉＲＮＡは表５３に列挙されている一方で、過小発現がタモキシフェンに対する応答に関連していると見出されたｍｉＲＮＡは表１１８に列挙されている。表５３および１１８の分析によって以下が示された。
・１０個の一対のｍｉＲＮＡ（同一プレｍｉＲＮＡ前駆体から得られた５ｐおよび３ｐフラグメント）はタモキシフェン応答での類似の正または負の相関を有する。即ち：
・過剰発現の相関：ｍｉＲ１０６ｂ／ｍｉＲ１０６ｂ＊，ｍｉＲ１７／ｍｉＲ１７＊，ｍｉＲ１８ａ／ｍｉＲ１８ａ＊およびｍｉＲ−９３／ｍｉＲ−９３＊；  
・過小発現の相関：ｍｉＲ１５１−３ｐ／ｍｉＲ１５１−５ｐ，ｍｉＲ１９３ｂ／ｍｉＲ１９３ｂ＊，ｍｉＲ２２／ｍｉＲ２２＊，ｍｉＲ２８−３ｐ／ｍｉＲ２８−５ｐ，ｍｉＲ３０ａ／ｍｉＲ３０ａ＊，ｍｉＲ９９ｂ／ｍｉＲ９９ｂ＊；
・１７個の一対のｍｉＲＮＡについては、２つのフラグメントのうち１つの過剰または過小発現しかタモキシフェンに対する応答に相関すると見出されず、同一のプレｍｉＲＮＡから得られた他方のフラグメントの発現レベルはタモキシフェンに対する応答に関連していなかった。即ち：
・１つのフラグメントの過剰発現で相関が見出され、他方のフラグメント発現は相関していなかったもの：ｍｉＲ１０６ａ，ｍｉＲ１２２８，ｍｉＲ１９５＊，ｍｉＲ２５＊，ｍｉＲ３４ｂ，ｍｉＲ６２９＊，ｍｉＲ６７１−５ｐ，ｍｉＲ７６９−５ｐ；  
・１つのフラグメントの過小発現で相関が見出され、他方のフラグメント発現は相関していなかったもの：ｍｉＲ１０ａ，ｍｉＲ１２５ａ−５ｐ，ｍｉＲ２１，ｍｉＲ２２１，ｍｉＲ２３ａ，ｍｉＲ２３ｂ，ｍｉＲ３０ｅ，ｍｉＲ３４ｃ−５ｐ，ｍｉＲ４２４＊；
・１つのｍｉＲＮＡについては、ｍｉＲ１４９＊過剰発現がタモキシフェン応答に相関している一方で、ｍｉＲ１４９過小発現がタモキシフェン応答に相関していた。即ち、同一のプレｍｉＲＮＡから得られた２つのフラグメントの発現レベルは、タモキシフェン応答へ逆相関していた。
【００２２】
上記の例は、いくつかのケースにおいて（ここでは２８ケース中１０ケース）同一のｍｉＲＮＡ前駆体から得られた両方のフラグメントの発現レベルは、薬物に対する応答に類似して相関しているが、多くのケースにおいて（ここでは２８ケース中１８ケース）はフラグメントの１つしか薬物に対する応答に相関していないか、ましてや２つのフラグメントが薬物に対する応答に逆相関しているかのいずれかであることを明白に例証している。従って、共通のプレｍｉＲＮＡから発生したｍｉＲＮＡフラグメントの１つの発現レベルが特定の療法に対する応答／耐性に相関しているということは、同一の共通プレｍｉＲＮＡから発生した高い相補性を有する他のフラグメントが、同一の療法に対する応答／耐性にも相関しているということを明白には意味しない。さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１とも言われる）およびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊とも言われる）の特定の場合において、Ｗ０２０１１／１３５４５９では、試験された薬物に従い、それらのうち１つのみか、または一方か、または両方が薬物応答に相関し得ると示されている。具体的には、表８９ではｈｓａ−ｍｉＲ−３１（即ち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ）およびｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊（即ち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ）の両方の過小発現がメルファランに対する応答に相関していることを示している。しかしながら、サイトキサン（表２８および９３を参照）およびフルベストラント（表６１および１２６を参照）に対する応答において、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１（即ち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ）の過小発現しか応答に相関していない。対照的に、ロムスチン（表４７および１１２）に対する応答において、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊（即ち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ）の過小発現しか応答へ相関していない。これはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐのうち１つしか薬物応答に相互に関連し得ず、ましてや両方のｍｉＲＮＡは同一の薬物応答に逆相関し得ることを明白に例証している。
【００２３】
また、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐにより標的にされると知られている遺伝子は異なっていて、このことはむしろ両方のｍｉＲＮＡが別個の経路に関与していることを示唆しているため、当業者はｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルが上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する応答の尤度に相関しているかもしれないことを考慮しなかったであろう。具体的には各ｍｉＲＮＡについて、このｍｉＲＮＡの標的遺伝子は実験的検証、配列情報も含めて、多様なデータベースに列挙されていて、いくつかの基準に基づき、最も可能性の高いものから最も可能性の低い遺伝子へ順位付けされている。miRNA.org データベースを２０１４年９月２２日に検索したところ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの１２個の最も可能性のある標的遺伝子は、下記であることが示された。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
上記で明らかに現れているように、１２個の最も可能性の高いｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子の中で両方のｍｉＲＮＡが主に別個の標的を有することを例証する共通の標的遺伝子はない。
【００２６】
また、Mosakhani N et al. Cancer Genet. 2012 Nov;205(1 1 ):545-51は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐを含む、AgilentのｍｉＲＮＡマイクロアレイSystem V2 (７２３のヒトおよび７６のヒトウイルス性ｍｉＲＮＡ、 Sangerデータベース v10.1、http: //microrna.sanger.ac.uk)を用いて、転移性結腸直腸癌患者において、抗ＥＧＦＲ抗体療法に対する応答の尤度を分析した。しかしながら、患者の抗ＥＧＦＲ療法に対する応答に相関しているのはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（本明細書においてはｍｉＲ−３１＊と称される）のみであり、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ  は相関していないと見出され、それ故にｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐが結腸直腸癌患者の抗ＥＧＦＲ療法に対する応答の尤度に相関していないであろうことが示唆される。
【発明の概要】
【００２７】
しかしながら、抗ＥＧＦＲ療法の治療を受けた結腸直腸癌患者腫瘍サンプルの定量的ＰＣＲ分析に基づいて、発明者らは、予期せずにｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルが実際には上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する応答の尤度にも相関していることを見出し、癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうか予測することに使用し得ることを見出した。
【００２８】
本発明者らによって得られた結果（実施例１参照）に基づき、本発明は、癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供し、その方法は、当該患者のサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（配列番号２）ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなる。
【００２９】
好ましくは、患者はＫＲＡＳ野生型癌を有する。
【００３０】
癌は好ましくは、結腸直腸癌、好ましくは、転移性結腸直腸癌である。
【００３１】
最も好ましい態様において、本発明は、転移性結腸直腸癌患者が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（具体的にはセツキシマブまたはパニツムマブ等の抗ＥＧＦＲ抗体）に応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供し、その方法は、当該患者の腫瘍サンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（配列番号２）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定することを含んでなる。
【００３２】
本発明はまた、癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのキットであって、当該患者のサンプルにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（配列番号２）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬、およびＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定するための試薬を含んでなる、またはからなるキットを提供する。
【００３３】
本発明はさらに、癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤に関し、ここで、当該患者は本発明による方法によって応答する可能性が高いと分類されている。
【００３４】
本発明はまた、本発明の方法によって「応答者」と分類されている患者の癌治療における使用を意図した薬物を製造するためのＥＧＦＲ阻害剤の使用に関する。
【００３５】
本発明はまた、癌に罹患している患者を治療するための方法であって、（ｉ）本発明の方法により、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定すること、および（ｉｉ）当該患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと決定された場合に、当該患者にＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルに従った患者における生存率曲線(Kaplan-Meier)。生存率（目的のグループの生存している患者対全患者の比で表したもの）は、時間（週）の関数で提示されている。各グループ（低／高ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ）における全患者数は、括弧内に記載されている。
【発明の具体的説明】
【００３７】
定義
「患者」は、年齢または性を問わず、任意の哺乳動物 、好ましくは、ヒトであり得る。患者は、癌に罹患している。患者は、任意の化学療法薬により治療をすでに受けていてもよいし、または未治療であってもよい。
【００３８】
癌は、好ましくは、ＥＧＦＲを介したシグナル伝達経路が関与する癌である。特に、癌は、例えば、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎臓癌、膵臓癌、膀胱癌、または脳癌であり得る(Ciardello F et al. N Engl J Med. 2008 Mar 13;358(11):1160-74; Wheeler DL et al. Nat Rev Clin Oncol. 2010 September; 7(9): 493-507; Zeineldin R et al. J Oncol. 2010;2010:414676; Albitar L et al. Mol Cancer 2010;9:166; Leslie KK et al. Gynecol Oncol. 2012 Nov;127(2):345-50; Mimeault M et al. PLoS One.2012;7(2):e31919; Liebner DA et al. Ther Adv Endocrinol Metab. 2011 Oct;2(5): 173-95; Leboulleux S et al. Lancet Oncol. 2012 Sep;13(9):897-905; Pan J et al. Head Neck. 2012 Sep 13; Chan SL et al. Expert OpinTher Targets. 2012 Mar;16 Suppl 1 :S63-8; Chu H et al. Mutagenesis.2012 Oct 15; Li Y et al. Oncol Rep. 2010 Oct;24(4): 1019-28; Thomasson M et al. Br J Cancer 2003, 89:1285-1289; Thomasson M et al. BMC Res Notes.2012 May 3;5:216)。特定の態様では、腫瘍は固形組織腫瘍および／または事実上、上皮のものである。例えば、患者は、結腸直腸癌患者、Ｈｅｒ２陽性またはＨｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ、すなわち、Ｈｅｒ２陰性、エストロゲン受容体陰性およびプロゲステロン受容体陰性）乳癌患者、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者、頭頸部癌患者（特に、頭頸部扁平上皮癌患者）、膵臓癌患者、または子宮内膜癌患者であり得る。より詳しくは、患者は、結腸直腸癌患者、Ｈｅｒ２陽性またはＨｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ）乳癌患者、肺癌（特に、ＮＳＣＬＣ）患者、頭頸部癌患者（特に、頭頸部扁平上皮癌患者）、または膵臓癌患者であり得る。
【００３９】
好ましい態様では、癌は結腸直腸癌であり、さらに好ましくは、癌は転移性結腸直腸癌である。実際に、実施例１に示したデータは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルが結腸直腸癌におけるＥＧＦＲ阻害剤（具体的には、セツキシマブおよびパニツムマブ等の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体）治療に対する応答の予測因子として使用可能であることを明らかに示している。
【００４０】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与することが知られている癌において得られたこれらの結果は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルが、肺癌、卵巣癌、子宮内膜、甲状腺癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎臓癌、膵臓癌、膀胱癌、または脳癌などの、ＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与することが知られている他のいずれの癌においても、ＥＧＦＲ阻害剤（具体的には、セツキシマブおよびパニツムマブ等の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体）に対する応答の予測因子として使用可能であることを明らかに示唆している。
【００４１】
従って、別の好ましい態様では、癌はＨｅｒ２陽性またはＨｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ）乳癌、好ましくは、Ｈｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ）乳癌である。
【００４２】
さらに別の好ましい態様では、癌は肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００４３】
さらに別の好ましい態様では、癌は膵臓癌である。
【００４４】
この予測はＥＧＦＲ阻害剤治療に関するものであるので、患者の腫瘍は好ましくはＥＧＦＲ陽性である。
【００４５】
好ましくは、患者は、ＫＲＡＳ野生型腫瘍を有し、すなわち、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子は、コドン１２、１３（エキソン１）、または６１（エキソン３）で変異していない。言い換えれば、ＫＲＡＳ遺伝子は、コドン１２、１３および６１において野生型である。
【００４６】
野生型、すなわち、非変異型のコドン１２、１３（エキソン１）、および６１（エキソン３）はそれぞれグリシン（Ｇｌｙ、コドン１２）、グリシン（Ｇｌｙ、コドン１３）、およびグルタミン（Ｇｌｎ、コドン６１）に相当する。野生型参照ＫＲＡＳアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４９７６．２（配列番号２４）に見出すことができる。
【００４７】
特に、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子は、以下の突然変異のいずれをも示さない(Bos. Cancer Res 1989;49:4682-4689; Edkins et al. Cancer Biol Ther. 2006 August; 5(8): 928-932; Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115)：
Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ（ＧＧＴ＞ＡＧＴ）
Ｇｌｙ１２Ａｒｇ（ＧＧＴ＞ＣＧＴ）
Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ（ＧＧＴ＞ＴＧＴ）
Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ＧＧＴ＞ＧＡＴ）
Ｇｌｙ１２Ａｌａ（ＧＧＴ＞ＧＣＴ）
Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）
Ｇｌｙ１３Ａｒｇ（ＧＧＣ＞ＣＧＣ）
Ｇｌｙ１３Ｃｙｓ（ＧＧＣ＞ＴＧＣ）
Ｇｌｙ１３Ａｓｐ（ＧＧＣ＞ＧＡＣ）
Ｇｌｙ１３Ａｌａ（ＧＧＣ＞ＧＣＣ）
Ｇｌｙ１３Ｖａｌ（ＧＧＣ＞ＧＴＣ）
【００４８】
好ましくは、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子はまた、以下の突然変異のいずれをも示さない(Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115)：
Ｇｌｙ１２Ｐｈｅ（ＧＧＴ＞ＴＴＴ）
Ｇｌｙ１３Ｓｅｒ（ＧＧＣ＞ＡＧＣ）
【００４９】
好ましくは、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子はまた、以下の突然変異のいずれをも示さない(Bos. Cancer Res 1989;49:4682-4689; Tarn et al. Clin Cancer Res 2006;12:1647-1653; Edkins et al. Cancer Biol Ther. 2006 August; 5(8): 928-932; Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115)：
Ｇｌｎ６１Ｈｉｓ（ＣＡＡ＞ＣＡＣ）
Ｇｌｎ６１Ｈｉｓ（ＣＡＡ＞ＣＡＴ）
Ｇｌｎ６１Ａｒｇ（ＣＡＡ＞ＣＧＡ）
Ｇｌｎ６１Ｌｅｕ（ＣＡＡ＞ＣＴＡ）
Ｇｌｎ６１Ｇｌｕ（ＣＡＡ＞ＧＡＡ）
Ｇｌｎ６１Ｌｙｓ（ＣＡＡ＞ＡＡＡ）
Ｇｌｎ６１Ｐｒｏ（ＣＡＡ＞ＣＣＡ）
【００５０】
患者のＫＲＡＳの状態を知るには、当技術分野で公知のいずれの方法を用いてもよい。
【００５１】
例えば、腫瘍組織を顕微解剖し、パラフィン包埋組織ブロックからＤＮＡを抽出する。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、１３、および６１を包含する領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅する。突然変異の状態は、ＰＣＲプローブを用いた対立遺伝子識別法(Laurent-Puig P, et al, J Clin Oncol. 2009, 27(35):5924-30)によるか、またはパイロシーケンス法(Ogino S, et al. J Mol Diagn 2008;7:413-21)などの他の任意の方法により判定する。
【００５２】
「サンプル」とは、患者に由来するいずれの生体サンプルであってもよく、核酸を含有する。このようなサンプルの例としては、体液（血液、血漿、唾液、尿、精液を含む）、組織、細胞サンプル、器官、生検などが挙げられる。好ましくは、サンプルは腫瘍サンプル、好ましくは、腫瘍組織生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部である。サンプルは、従来技術に従って採取してよく、そのまま診断に用いてもよいし、または保存してもよい。腫瘍サンプルは新鮮物、冷凍物またはパラフィン包埋物であってもよい。通常、利用可能な腫瘍サンプルは冷凍物またはパラフィン包埋物であり、ほとんどの場合、パラフィン包埋物である。
【００５３】
「参照サンプル」とは、ＥＧＦＲ阻害剤治療に対して陽性または陰性の応答が知られている患者の腫瘍サンプル（特に、腫瘍生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部）を意味する。好ましくは、参照サンプルのプールは、少なくとも１人（好ましくは数人、より好ましくは少なくとも５人、より好ましくは少なくとも６人、少なくとも７人、少なくとも８人、少なくとも９人、少なくとも１０人）の応答患者と、少なくとも１人（好ましくは数人、より好ましくは少なくとも６人、少なくとも７人、少なくとも８人、少なくとも９人、少なくとも１０人）の非応答患者を含んでなる。応答者（「陽性」とも称される）および非応答者（「陰性」とも称される）参照サンプルの数が多いほど、本発明による予測方法の信頼性が良好となる。
【００５４】
本発明の文脈において、「応答する可能性が高い」または「応答者」である患者は、ＥＧＦＲ阻害剤による治療に応答し得る、すなわち、その患者の症状の少なくとも１つが緩和されると期待される、またはその疾患の進展が停止される、もしくは緩徐化される患者を意味する。ＲＥＣＩＳＴ判定基準(Eisenhauer et al, European Journal of Cancer, 2009, 45:228-247)による完全応答者、部分応答者、または安定患者は、本発明の文脈における「応答する可能性が高い」または「応答者」とみなされる。
【００５５】
固形腫瘍では、ＲＥＣＩＳＴ判定基準は、少なくとも１つの測定可能な病巣の存在に基づく国際標準である。「完全応答」は、総ての標的病巣の消失を意味し、「部分応答」は、標的病巣の最大直径の合計における３０％の減少を意味し、「進行性疾患」は、標的病巣の最大直径の合計における２０％の増大を意味し、「安定疾患」は、上記の判定基準を満たさない変化を意味する。
【００５６】
用語「予測」または「予後」とは、患者がＥＧＦＲ阻害剤による治療に応答する確率または尤度を意味する。
【００５７】
本発明によれば、ＥＧＦＲ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性は、腫瘍細胞がｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐを発現するかどうかおよびそのレベルによって予測される。
【００５８】
用語「治療する」または「治療」とは、癌の進行を安定化させる、緩和する、治癒する、または軽減することを意味する。
【００５９】
「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、ＤＮＡから転写されるがタンパク質には翻訳されない遺伝子（非コードＲＮＡ）によりコードされている約２１〜２４、好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長の一本鎖分子であり、その代わりとして、それらはプリｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物から、プレｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステム−ループ構造へ、そして最終的には機能的ｍｉＲＮＡへとプロセシングする。成熟過程で、各プレｍｉＲＮＡは高い相補性を有する２つの異なるフラグメントを生じ、一方はプリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームに起源し、他方は３’アームに起源する。成熟ｍｉＲＮＡ分子は１以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と部分的に相補的であり、それらの主要な機能は遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。
【００６０】
ｍｉＲＮＡには国際命名法があり(Ambros V et al, RNA 2003 9(3):277-279; Griffiths-Jones S. NAR 2004 32(データベース公開):D109-D111; Griffiths-Jones S et al. NAR 2006 34(データベース公開):D140-D144; Griffiths-Jones S et al. NAR 2008 36(データベース公開):D154-D158;およびKozomara A et al. NAR 2011 39(データベース公開):D152-D157)、http://www.mirbase.org/においてmiRBaseから入手可能である。各ｍｉＲＮＡは、下記のように所定の形式で独自の名称が割り当てられる。
【００６１】
成熟ｍｉＲＮＡの場合には、ｓｓｓ−ｍｉＲ−Ｘ−Ｙ、ここで、
・「ｓｓｓ」はｍｉＲＮＡの種を示す３文字コードであり、「ｈｓａ」はヒトを表す。
・ｍｉＲの大文字「Ｒ」は、成熟ｍｉＲＮＡを表すことを示す。しかしながら、文献の著者によっては、成熟ｍｉＲＮＡに「ｍｉｒ」とも誤用している場合がある。この場合には、「−Ｙ」の存在により成熟ｍｉＲＮＡを表すと認識することができる。
・Ｘは、特定の種におけるｍｉＲＮＡの配列に割り当てられた独自の任意の数字であり、相同性の高いいくつかのｍｉＲＮＡが知られている場合には、この後に１文字が続き得る。例えば、「２０ａ」および「２０ｂ」は、相同性の高いｍｉＲＮＡを表す。
・Ｙは、プレｍｉＲＮＡの切断により得られた成熟ｍｉＲＮＡがプリｍＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームに相当するか（その場合、Ｙは「５ｐ」）または３’アームに相当するか（その場合、Ｙは「３ｐ」）を示す。ｍｉＲＮＡのこれまでの国際命名法においては、「−Ｙ」は存在していなかった。その後、プリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームまたは３’アームのいずれかから得られた２つの成熟ｍｉＲＮＡは、ｎのすぐ後に「＊」の印があるかないかによって識別された。「＊」の印があれば、その配列はあまり頻繁に検出されないｍｉＲＮＡに相当することを示した。このような分類が変化を受けたことから、「３ｐ」および「５ｐ」コードを用いた新たな分類が実施された。
【００６２】
プリｍｉＲＮＡの場合には、ｓｓｓ−ｍｉｒ−Ｘ、ここで、
・「ｓｓｓ」はｍｉＲＮＡの種を示す３文字コードであり、「ｈｓａ」はヒトを表す。
・ｍｉｒの小文字「ｒ」は、成熟ｍｉＲＮＡではなく（「−Ｙ」がないことで確認される）プリｍｉＲＮＡを表すことを示す。
・ｎは、特定の種におけるｍｉＲＮＡの配列に割り当てられた独自の任意の数字であり、相同性の高いいくつかのｍｉＲＮＡが知られている場合には、この後に１文字が続き得る。
【００６３】
各ｍｉＲＮＡにはまた、その配列に受託番号が割り当てられる。
【００６４】
本発明で検出されるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（旧称ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊）である。この名称において、「ｈｓａ」はヒトｍｉＲＮＡに関するものであることを意味し、「ｍｉＲ」は成熟ｍｉＲＮＡを意味し、「３１」はこの特定のｍｉＲＮＡに割り当てられた任意の数字を意味し、「５ｐ」はプリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームから得られた成熟ｍｉＲＮＡを意味する。
【００６５】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐは、AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU（配列番号２）である
（http://www.mirbase.orgにおいて受託番号ＭＩＭＡＴ０００００８９）。
【００６６】
サンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルの測定方法
当業者に公知のいずれの方法を用いてｍｉＲＮＡの発現レベルを決定してもよい（例えば、ｍｉＲＮＡの発現レベルを定量化してもよい）。
【００６７】
このような測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、患者のサンプル、特に、腫瘍サンプルから始めて行い、必ずサンプルの変換を含む。実際に、サンプルの何らかのタイプの変換なしに行うことのできる特定の遺伝子発現レベルの測定はない。
【００６８】
ほとんどの技術が目的のｍｉＲＮＡに特異的に結合する試薬の使用に頼るものであり、従って、検出試薬をさらに含む改変サンプルとなる。加えて、ほとんど技術が特定の試薬と結合する前に患者のサンプルからのＲＮＡの何らかの予備抽出も含む。従って、特許請求する方法もまた、患者のサンプルからＲＮＡを抽出する予備工程を含んでなり得る。
【００６９】
質量分析による検出は、特定の試薬との予備結合を必ずしも含まない。しかしながら、それはほとんどの場合抽出されたＲＮＡで行われる。備抽出工程無しでサンプルに直接行う場合であっても、それはレーザー光によるサンプルからの分子の多少の抽出を含み、次に、抽出された分子が分光計により分析される。
【００７０】
いずれにせよ、どの技術を用いる場合でも、ｍｉＲＮＡ発現レベルの測定後のサンプルの状態は患者から採取した最初のサンプルに比べて変換されている。
【００７１】
ｍｉＲＮＡの量は、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、次世代シーケンシングおよび標識プローブとのハイブリダイゼーションを含む、ナノストリング技術(Geiss GK et al. Nat Biotechnol. 2008 Mar;26(3):317-25参照)を含む、当業者に公知のいずれの技術によっても測定することができる。
【００７２】
特に、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が有用であり得る。いくつかの態様では、ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ標的の検出および定量の両方に使用することができる(Bustin et al., 2005, Clin. Sci., 109:365-379)。ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られた定量結果は定性データよりも情報量が多い場合があり、アッセイの標準化および品質管理を簡単にすることができる。よって、いくつかの態様では、ｑＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイが、細胞に基づくアッセイの際にｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルを測定するために有用であり得る。
【００７３】
ｑＲＴ−ＰＣＲ法はまた、患者の療法のモニタリングにも有用であり得る。ｑＲＴ−ＰＣＲは周知であり、当業者には容易に利用可能な技術であり、厳密な記載を必要としない。ｑＲＴ−ＰＣＲに基づく方法の例は、例えば、米国特許第７，１０１，６６３号に見出すことができる。市販のｑＲＴ−ＰＣＲに基づく方法（例えば、Ｔａｑｍａｎ(商標）アレイ）が例えば使用可能であり、プライマーおよび／またはプローブの設計は上記で開示されたｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの配列に基づいて容易になされる。
【００７４】
ｍｉＲＮＡアッセイまたはアレイもまた、サンプル中のｍｉＲＮＡレベルを評価するために使用可能である。
【００７５】
いくつかの態様では、ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドアレイは、作製または購入可能である。アレイは一般に、固相支持体とその支持体に接触した少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、このオリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡの少なくとも一部に対応する。
【００７６】
サンプル中のｍｉＲＮＡの存在を判定するために、いずれの好適なアッセイプラットフォームも使用可能である。例えば、アッセイは膜、チップ、ディスク、テストストリップ、フィルター、ミクロスフェア、マルチウェルプレートなどの形態であり得る。アッセイ系は、ｍｉＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチドが結合された固相支持体を備え得る。固相支持体は例えば、プラスチック、ケイ素、金属、樹脂またはガラスを含んでなり得る。アッセイ成分は、ｍｉＲＮＡを検出するためのキットとして一緒に調製および包装することができる。標的核酸サンプルの発現プロファイルを決定するために、前記サンプルを標識し、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させると、マイクロアレイ表面に結合されているプローブ配列と相補的な標的核酸間で複合体の形成が起こる。次に、標識されたハイブリダイズ複合体の存在を検出する。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が当業者に利用可能である。
【００７７】
別の態様では、ｍｉＲＮＡの定量化はGeiss GK et al. Nat Biotechnol. 2008 Mar;26(3):317-25)において記載されたようなナノストリング技術を用いて行うこともできる。  
【００７８】
別の態様では、ｍｉＲＮＡの定量化はシーケンシングによって行うこともできる。
【００７９】
患者の分類
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルに基づく分類
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現が低いほど、患者にとって良好である。従って、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルが低いほど、患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する可能性が高い。よって、好ましい態様では、患者のサンプル（具体的には上記の使用サンプル）中のｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルの１つ以上の閾値との比較に基づき、患者がＥＧＦＲ阻害剤（具体的には、セツキシマブまたはパニツムマブ等の抗ＥＧＦＲ抗体）に対して応答する可能性があるか否か予測される。
【００８０】
特定の態様において、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルが閾値よりも低い場合、患者は「応答者」、またはＥＧＦＲ阻害剤による治療に応答する可能性が高いとみなされる。このような閾値は、上記で定義したように、参照サンプルのプールに基づいて決定することができる。この態様において、患者は、発現レベルが当該閾値より低いか高いかに従い、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルに基づく２つのグループに分類される。閾値より低いｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルを有する患者は、応答する可能性が高い、即ち応答者、とみなされる。対照的に、閾値より高いまたは閾値に等しいｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルを有する患者は、応答する可能性が低い、即ち非応答者、とみなされる。
【００８１】
他の特定の態様において、本方法は、いくつかの閾値で行ってもよい。この場合、患者はｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルに基づく別個の応答可能性に関連した、少なくとも３つのグループに分類される。
【００８２】
３つのグループの場合、２つの閾値を使用し、患者をｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルが低いか（即ち、第一閾値より低い）、中間か（即ち、第一閾値より高いまたは第一閾値と同等、かつ第二閾値より低い）、または高いか（即ち、第二閾値より高いまたは第二閾値と同等）に従い、３つのグループに分類する。そのため、好ましい態様において、発現が低いグループの患者はよって応答する可能性が高い、即ち応答者（応答確率が高い）とみなし、発現が高いグループの患者は応答する可能性が低い、即ち非応答者（応答確率が低い小）とみなし、発現が中間の患者は中程度の応答確率を有するとみなす。あるいは、応答確率が高い、低いか中程度をＥＧＦＲ阻害剤治療を施すか否か決定する、臨床医に託すことができる。
【００８３】
別の態様においてこの方法は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルに基づく予後スコアまたは指数を決定することをさらに含んでなり、その予後スコアは、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示す。特に、前記予後スコアは、それが所定の閾値よりも高いか低いか（二分結果）によって、その患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示し得る。別の態様では、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答または非応答の離散確率は、予後スコアから導くことができる。
【００８４】
患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率は、ＥＧＦＲ阻害剤治療が患者に投与される場合に、この患者が病勢の進行を伴ってまたは伴わずに生存する確率と関係している。
【００８５】
結果として、予後スコアは、上記で定義したようにｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルと参照サンプルのプールの無進行生存率（ＰＦＳ）または全生存率（ＯＳ）の間の相関の分析に基づいて決定することができる。従って、ＰＦＳまたはＯＳをｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルと相関させる関数であるＰＦＳおよび／またはＯＳスコアは、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答の予測のための予後スコアとして使用することができる。好ましくは、病勢進行の不在はＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答の明らかな指標となるので、ＰＦＳスコアが使用される。
【００８６】
本発明者らによって得られた実験データは、患者のＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率がｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルの対数に直線的な負の相関があることを示す（図１参照）。好ましい態様では、前記予後スコアは、従って、下式で表される：
予後スコア＝ａ＊ｘ＋ｂ、式中、ｘは、患者のサンプルで測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルの対数（好ましくは、「ｌｏｇ２」と表される２を底とする対数）であり、かつ、ａおよびｂは、上記で定義されたように、参照サンプルのプールに基づいて事前に決定されたパラメーターである。
【００８７】
ａが正／負であるかによって、その患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃ以上／以下であればＥＧＦＲ阻害剤に応答する、その予後スコアが閾値ｃより小さければ／大きければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測することができ、ここで、ｃの値も同じ参照サンプルプールに基づいて決定されたものであり、ａが正であるとき、その患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃ以上であればＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測し、その患者の予後スコアが閾値ｃより小さければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測することができ、
あるいは、ａが負であるとき、その患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃ以下であればＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測し、その患者の予後スコアが閾値ｃより大きければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測することができる。
【００８８】
発明者が実行した実験に基づき、ａ、ｂおよびｃは、好ましくは下記の範囲で決定した。
・ａ：［０．０９６］、好ましくは［０．００１；０．１２］；  
・ｂ：［０．１４４］、好ましくは［０．０１；０．３］；および
・ｃ：［−０．１；０．１］、好ましくは［−０．０５５；０．０５５］。
【００８９】
別の態様では、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答または不応答の離散確率は、ａ＊ｘ＋ｂ予後スコアから導くことができる。予後スコアとＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答の確率の間の厳密な相関は、同じ参照サンプルセットに基づいて決定することができる。ａが正／負であるかによって、予後スコアが高い／低いほど、高いＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答確率を示す：
ａが正であれば、予後スコアが高いほどＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率が高く（すなわち、ＰＦＳスコアの場合には、疾患進行の確率が低く）、
あるいは、ａが負であれば、予後スコアが低いほどＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率が高い（すなわち、ＰＦＳスコアの場合には、疾患進行の確率が低い）。
【００９０】
癌患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかというこの予測はまた、ノモグラムを使用して行うこともできる。ノモグラムでは、対象とするスコアの各変数に対して点数スケールが設定される。ある患者について、各変数の点数スケールから対応する点数を選択することにより、それぞれの変数に点数を割り当てる。離散変数の場合（例えば、遺伝子発現レベル）、ある変数に帰属する点数は、その変数の値と直線的に相関させる。二分変数の場合（とり得る値が２つだけ）、とり得る２つの値または変数のそれぞれに異なる２つの値が帰属する。次に、各変数に割り当てられた点数を加算することで対象スコアを算出する（合計点数）。このスコアの値に基づき、次に、総合スコアが閾値（二分スコア）よりも劣っているか優れているかによって良好な応答予後か不良な応答予後かを、または治療に対する応答もしくは非応答の確率を患者に与えることができる。
【００９１】
ノモグラムは主としていくつかの異なる変数を合わせて総合スコアとする際に有用であることは明らかである（ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルとＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベル；ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルとｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベル；またはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルとＢＲＡＦの状態を合わせた総合スコアを使用する可能性については下記を参照）。しかしながら、ノモグラムはまた、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルなどの１つの変数だけに基づく予後スコアを表すために使用してもよい。この場合、合計点数は単一の変数に割り当てられた点数に相当する。
【００９２】
よって、本発明に従い、癌患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するための方法の一態様では、その方法は、参照サンプルのプールに基づいて較正されたノモグラムに基づき不応答リスクを決定することをさらに含んでなる。ノモグラムはＯＳまたはＰＦＳデータに基づいて較正することができる。ＯＳに基づいて較正された場合、不応答リスクは死亡リスクに相当する。ＰＦＳに基づいて較正された場合、不応答リスクは疾病進行リスクに相当する。
【００９３】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルとＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関があるさらなるパラメーターに基づく分類
ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルのみに基づいて予測することができ（実施例１参照）、本発明による方法はまた、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定することも含んでなり得る。
【００９４】
この場合、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルと他のパラメーターを組み合わせた総合スコアが特に、参照サンプルのプールに基づいて作成することができる。
【００９５】
点数スケールが総合スコアの各変数に対して設定されているノモグラムもまた、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルと他のパラメーターを組み合わせて総合スコアを得るために使用可能であり、次にこの総合スコアを不応答リスク（すなわち、ＰＦＳスコアについては、疾患進行リスク）と相関させることができる。ある患者について、各変数の点数スケールから対応する点数を選択することにより、それぞれの変数に点数を割り当てる。離散変数の場合（例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルまたは年齢）、ある変数に帰属する点数は、その変数の値と直線的に相関させる。二分変数の場合（ＢＲＡＦ突然変異の状態または性別など、とり得る値が２つだけ）、とり得る２つの値または変数のそれぞれに異なる２つの値が帰属する。
【００９６】
次に、各変数に割り当てられた点数を加算することで総合スコアを算出する（合計点数）。この総合スコアの値に基づき、次に、総合スコアが閾値（二分スコア）よりも劣っているか優れているかによって良好な応答予後か不良な応答予後かを、または治療に対する応答もしくは非応答の確率を患者に与えることができる。
【００９７】
各変数の点数スケールは、それを上回る／下回ると応答予後が良好または不良であるという閾値、または総合スコアと応答もしくは非応答の確率との間の相関と同様に、参照サンプルの同じプールに基づいて決定することができる。
【００９８】
このようなＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある他のパラメーターは特に以下のものから選択することができる：
・年齢；
・性別；
・ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルを測定するために上記で開示した任意の方法により測定され得る、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベル；および／または
・ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの突然変異の存在または不在。
【００９９】
このような突然変異は、当業者に公知のいずれの方法によって検出してもよく、特に下表１に記載のものを含む。
【０１００】
【表２】
2017529852.tif 000003
【０１０１】
ＥＧＦＲ阻害剤
本発明は、１以上の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する患者の応答性を、そのような薬剤による治療の前に予測することを可能とする。
【０１０２】
ＥＧＲＦ阻害剤はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であってよく、あるいはＥＧＦＲ標的の細胞外ドメインを標的とするものであってもよい。特定の態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、もしくはラパチニブ、またはＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブである。
【０１０３】
好ましくは、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、モノクローナル抗体、具体的には、セツキシマブまたはパニツムマブである。
【０１０４】
ＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子（抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブを含む）は、主として結腸直腸癌の治療または乳癌治療に使用される。結果として、患者の癌が結腸直腸癌（具体的には、転移性結腸直腸癌）または乳癌であれば、本発明による方法は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子、特に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブに対する応答を予測するために好ましく使用し得る。
【０１０５】
これに対して、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤は主として肺癌（具体的には、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）の治療に使用されるので、患者の癌が肺癌（具体的には、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）であれば、本発明による方法は、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブに対する応答を予測するために好ましく使用し得る。
【０１０６】
膵臓癌または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））では、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤および抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が療法として試験されているので、患者の癌が膵臓癌または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））であれば、本発明による方法は、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、もしくはラパチニブ）または抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブもしくはパニツムマブ）のいずれかに対する応答を予測するために使用し得る。
【０１０７】
セツキシマブおよびパニツムマブは、現在、臨床で主として使用されている抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である。しかしながら、ニモツズマブ（ＴｈｅｒａＣＩＭ−ｈ−Ｒ３）、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、ザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ）、ニモツズマブおよびＳｙｍ００４などのさらなる抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が開発中である。本発明による方法はまた、具体的に、患者が結腸直腸癌（特に、転移性結腸直腸癌）、乳癌、膵臓癌または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））に罹患している場合には、これらの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体またはさらに開発され得るであろう他の任意の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（フラグメントを含む）に対する応答を予測するために使用し得る。
【０１０８】
同様に、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブおよびレゴラフェニブは、現在、臨床で主として使用されているチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤である。しかしながら、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）、ダコミチニブ（ＰＦ２９９８０４，ＰＦ−００２９９８０４）、ＴＡＫ−２８５、ＡＳＴ−１３０６、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＧ−１４７８（チルホスチンＡＧ−１４７８）、ＡＶ−４１２、ＯＳＩ−４２０（デスメチルエルロチニブ）、ＡＺＤ８９３１、ＡＥＥ７８８（ＮＶＰ−ＡＥＥ７８８）、ペリチニブ（ＥＫＢ−５６９）、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＧ４９０、ＰＤ１５３０３５ＨＣｌ、ＸＬ６４７、ルキソリチニブおよびＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ４８０）などのさらなるチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤が開発中である。本発明による方法はまた、特に、患者が肺癌（特に、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））に罹患している場合には、これらのチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤またはさらに開発され得るであろう他の任意のチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測するために使用し得る。
【０１０９】
キット
本発明はまた、癌患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのキットであって、
ａ）前記患者のサンプル（好ましくは、腫瘍生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部などの腫瘍サンプル）においてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（配列番号２）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬、および
ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定するための試薬
（このような試薬は特に、
ｉ）前記患者のサンプル（好ましくは、腫瘍生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部などの腫瘍サンプル）において、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬、および／または
ｉｉ）上記表１に記載されたものなど、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの突然変異を検出するため
の試薬を含み得る）
を含んでなる、またはからなるキットに関する。
【０１１０】
前記患者のサンプルにおいて、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐもしくはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルを決定するための試薬は、特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐおよび／もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐに特異的なプライマー対（フォワードおよびリバースプライマー）および／もしくはプローブ（具体的には、標的配列に特異的な核酸およびそこに付着したラベル（具体的には蛍光ラベル）を含んでなるラベル化したプローブ）、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐおよび／もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐに特異的な配列を含んでなるマイクロアレイを含んでなり得るかまたはからなり得る。プライマーおよび／またはプローブの設計は、当業者ならば、上記のｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐおよび／もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの配列に基づいて容易に行うことができる。
【０１１１】
ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの突然変異を検出するための試薬としては、シーケンシング前に対象遺伝子の全体もしくは一部を増幅するための少なくとも１つのプライマー対、または例えば、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Applied Biosystems、フォスターシティ、ＣＡ）での対立遺伝子識別アッセイにおいて使用するための５’末端がリポーター色素で標識された特異的プローブのセット（ＢＲＡＦ突然変異Ｖ６００の検出に関しては、Laurent-Puig P, et al, J ClinOncol. 2009, 27(35):5924-30およびLievre et al. J ClinOncol. 2008 Jan 20;26(3):374-9を参照）を含み得る。
【０１１２】
本発明のキットは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルおよび他の供試パラメーターに基づいて、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するための説明書をさらに含んでなり得る。具体的には、総合スコアおよび総合スコア（合計点数）と予測（応答／非応答または応答もしくは非応答の確率）との間の相関に含まれる総ての変数の点数スケールを含んだノモグラムが含まれてよい。
【０１１３】
薬物、治療的使用および治療方法
本発明の方法は、ＥＧＦＲ阻害剤に関して報告されている臨床応答率に見合う率でＥＧＦＲ阻害剤に対する患者の応答性を予測する。
【０１１４】
よって、癌患者を治療するための方法がさらに提供され、その方法は、患者に少なくとも１種類のＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含んでなり、この場合、前記患者は上記のような方法によって「応答者」または「応答する可能性が高い」と分類されている。
【０１１５】
具体的には、本発明は、癌に罹患している患者を治療するための方法に関し、その方法は、（ｉ）本発明による方法によって、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定すること、および（ｉｉ）前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと決定された場合に、前記患者にＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含んでなる。
【０１１６】
本方法は、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が低いと決定された場合に、前記患者に別の抗癌治療を投与する工程（ｉｉｉ）をさらに含んでなり得る。このような別の抗癌治療は具体的な癌およびそれまでに試されている治療にもよるが、特に、放射線療法、他の化学療法分子、または他の抗原に対するモノクローナル抗体（抗Ｈｅｒ２、抗ＶＥＧＦ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＣＴＬＡ４など）などの他の生物工学製品から選択されてよい。
【０１１７】
具体的には、結腸直腸癌の場合、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が低いと決定された場合には、工程（ｉｉｉ）で投与される別の抗癌治療は、
・ＶＥＧＦ阻害剤、特に、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）、有利には、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン（フォリン酸）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、およびオキサリプラチンの合剤）等のオキサリプラチンに基づく化学療法、またはＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン（フォリン酸）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、およびイリノテカンの合剤）等のイリノテカンに基づく化学療法との併用から選択してよく、
・あるいは、患者がすでにＶＥＧＦ阻害剤により、場合により、オキサリプラチンまたはイリノテカンに基づく化学療法と併用して上手く治療できなかった場合には、５−ＦＵとともに、場合により、マイトマイシンＢも併用して投与することができる。特定の抗腫瘍薬投与計画なしで生活の質を最大化することを意図して投与される治療と定義されるベストサポーティブケア（すなわち、抗癌治療ではない）を患者にさらに投与してもよい。
【０１１８】
本発明のもう１つの目的は、上記で定義した方法によって患者が応答する可能性が高いと分類された場合に、癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤である。本発明はまた、癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤に関し、当該治療は、上記で定義した方法によって当該患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測する予備工程を含んでなり、当該ＥＧＦＲ阻害剤は、上記で定義した方法によって当該患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと予測された場合にのみ患者に投与される。当該患者は、結腸直腸癌、より詳しくは、転移性結腸直腸癌患者であり得る。あるいは、当該患者は、乳癌、特に、トリプルネガティブ乳癌患者であり得る。あるいは、当該患者は、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者であり得る。あるいは、当該患者は、頭頸部癌、特に、頭頸部扁平上皮癌患者であり得る。あるいは、当該患者は、膵臓癌患者であり得る。本発明はまた、上記のような本発明の方法によって「応答者」と分類された患者における癌の治療に使用することを意図した薬剤の製造のためのＥＧＦＲ阻害剤の使用に関する。
【０１１９】
好ましい態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブである。あるいは、ＥＧＦＲ阻害剤は、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、具体的には、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブであり得る。
【０１２０】
好ましい態様では、
・患者は結腸直腸癌、具体的には、転移性結腸直腸癌に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブであり；
・患者は乳癌、具体的には、トリプルネガティブ乳癌に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブであり；
・患者は肺癌、具体的には、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤はチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、具体的には、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブであり；
・患者は頭頸部癌、具体的には、頭頸部扁平上皮癌、または膵臓癌に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体（好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブ）またはチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤（具体的には、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブ）である。
【０１２１】
実施例および図面は本発明を例示するものであり、その範囲を限定しない。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：ＫＲＡＳ野生型結腸直腸癌におけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐレベルが抗ＥＧＦＲで治療した患者の生存率の差異を決定する。
患者および方法
患者のセット
患者セットは、２３名の進行性結腸直腸癌患者から構成され、全患者は少なくとも１系統の化学療法に基づく治療後に抗ＥＧＦＲ抗体の治療を受けた。患者８名はパニツムマブを受け、１４名はセツキシマブを受けた。患者１名はセツキシマブおよびパニツムマブを受けた。各患者においてホルマリンで固定し、パラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）初期腫瘍が入手可能であった。全患者はＫＲＡＳの野生型（ＷＴ）であった。
【０１２３】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現分析：
各腫瘍サンプルについて、５μｍＦＦＰＥスライドでの腫瘍エリアをスクラッチし、ＦＦＰＥmiRNeasy extraction kit (ドイツ、Hilden、Qiagen)を用いて全部のＲＮＡを製造会社の指示に従い抽出した。
【０１２４】
ｍｉＲＮＡｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐの発現レベルの特定の定量化は、逆転写されたＲＮＡでの特定のTaqManの事前設計されたアッセイおよびABI7900HT Real Time PCR Systemを用いて実行した。発現レベルは、ΔΔＣｔ法を介して基準に標準化された。
【０１２５】
生存モデル予測
生存リスクグループのmicroRNA発現に基づく予測因子をコックス比例ハザードモデル(Cox, D.R. (1972). Regression models and life-tables. Journal of the Royal Statistical Society, Series B 34 (2), 187-220)と管理主成分法(E Bair & Tibshirani, Sem-supervised methods to predict patient survival from gene expression data, PLOS Biology 2:511-522, 2004)を合わせることによって計算した。
【０１２６】
総合予後スコアを、その発現プロファイルが発現レベルの対数のベクトルｘで表される患者について、ｘの成分を各主成分値の計量した平均と合わせることによって計算した。高い値の予後スコアは、高い値の死亡の危険性に相当し、その結果、比較的低い予測生存率に相当する。予測値を評価するために、一個抜き交差検証を用いた。良好か不良な予後との間に最適な分離を発生させたスコア閾値は、Kaplan-Meier分析に用いた。
【０１２７】
結果
特定のTaqMan事前設計アッセイを用いたリアルタイムのｍｉＲＮＡ定量ＰＣＲ分析を２３個のサンプルについて実行し、ｍｉＲＮＡｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ発現レベルを定量化した。データセットからの主成分を用いて近似したコックスハザードモデルの共変量は、ＰＦＳ（無進行生存期間）について２．６であると予想された。サンプルは、その予後スコアが０（ＰＦＳ）より大きいか／小さいかまたは等しいかでリスクが高いか／低いかで予測した。高いレベルのｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐを有する患者は低いレベルのｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐを有する患者より顕著に短いＰＦＳを有し、平均ＰＦＳは、低いリスクの患者で５６．９週間、高いリスクの患者で１２．１週間（ｐ＝０．０６）（図１）であった。
【０１２８】
従って予後スコアは、下記の式によって算出することができる。
ＰＦＳスコア＝０．０９６＊ｘ＋０．１４４
（式中、ｘはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐのｌｏｇ２発現である。）
【０１２９】
Mosakhani et al (Mosakhani N et al. Cancer Genet. 2012 Nov; 205 (11): 545-51)は、研究において、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐを抗ＥＧＦＲ抗体に対する応答の予測マーカーとして同定しなかった。現在の研究において、予測マーカーとしてのｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ同定は、集団全体を考慮して、無進行生存期間を終着点として行われている。Mosakhani et alは、集団を異なって層化していた。彼らは、第一に集団を応答患者および安定疾患患者を含む疾患コントロールグループと進行グループの２つのグループに分割した。次いで、彼らはこの２つのグループを比較して分析を行った。
【０１３０】
参照文献
2017529852.tif 000004
2017529852.tif 000005
【図１】
2017529852.tif 000006
【配列表】
2017529852000001.app
【国際調査報告】
2017529852.tif 000007
2017529852.tif 000008
2017529852.tif 000009
2017529852.tif 000010