(57)【要約】本開示は、ミクロトームデバイスおよびその使用方法の実施形態に関する。いくつかの実施形態では、ミクロトームを、走査電子顕微鏡のビルトインステージに取り付けて、連続ブロック面走査電子顕微鏡法を行うために使用することができる。いくつかの場合には、走査電子顕微鏡に設置されたミクロトームは、走査電子顕微鏡の電子ビーム軸から外れた位置でサンプルを切断することができる。場合によっては、ミクロトームは、ミクロトームのブレードの位置を測定することができる容量センサを含み、また、該ミクロトームは、MATLABで実行されるプログラムによってコンピュータ制御され得る。2017519200.tif 000003
2017519200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの最上部の薄い部分を除去するためのミクロトームであって、
ベースプレート；
撮像位置から切断位置に移動することができるようにベースプレートに連結され、かつサンプルを取り付けることができる露出面を有する、ペデスタル；
ブレードとベースプレートとの間の距離を選択的に変化させるために、ペデスタルが撮像位置にあるときにペデスタルの露出面に垂直な方向にブレードを移動させることによって、ベースプレートに対するブレードの位置を調整することができるようにベースプレートに連結されたブレード；
を含んでなり、切断位置が撮像位置よりもブレードの近くにある、ミクロトーム。
【請求項２】
カメラを用いてサンプルの表面を画像化するように構成された蛍光顕微鏡に取り付けられている、請求項1記載のミクロトーム。
【請求項３】
カメラを用いてサンプルの表面を画像化するように構成されたカソードルミネッセンス顕微鏡に取り付けられている、請求項1記載のミクロトーム。
【請求項４】
カメラを用いてサンプルの表面を画像化するように構成された光電子顕微鏡に取り付けられている、請求項1記載のミクロトーム。
【請求項５】
前記ブレードが、ベースプレートに連結された第1のコンピュータ制御リニアアクチュエータに取り付けられている、請求項1〜4のいずれか一項記載のミクロトーム。
【請求項６】
前記ペデスタルが、ピボットベアリングによってベースプレートに連結されたレバーに取り付けられている、請求項5記載のミクロトーム。
【請求項７】
前記ペデスタルが、ベースプレートに連結された第2のコンピュータ制御リニアアクチュエータの作動によって、ピボットベアリングの周りを回転することができる、請求項6記載のミクロトーム。
【請求項８】
前記第1のアクチュエータが、ブレードの移動を指示する制御信号を受信するように構成されており、前記ミクロトームが、
第1のアクチュエータに連結され、かつベースプレートに対するブレードの位置を示す出力信号を生成するように構成されたセンサ；および
センサからの出力信号を受信し、センサからの出力信号に少なくとも部分的に基づいて制御信号を生成して、その制御信号を第1のアクチュエータに送信するように構成されたコンピュータプログラム；
をさらに含んでなる、請求項7記載のミクロトーム。
【請求項９】
ペデスタル上に配置されたサンプルをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載のミクロトーム。
【請求項１０】
サンプルと走査電子顕微鏡の磁極片との間の作動距離が、利用可能な作動距離の範囲から選択され得る、請求項9記載のミクロトーム。
【請求項１１】
電圧がサンプルに印加される、請求項9または10記載のミクロトーム。
【請求項１２】
サンプルがミクロトームから電気的に絶縁されている、請求項11記載のミクロトーム。
【請求項１３】
前記ブレードが圧電制御振動ダイヤモンドブレードである、請求項1〜12のいずれか一項記載のミクロトーム。
【請求項１４】
プロセッサおよびメモリを含むコンピューティング装置をさらに含んでなり、該メモリが、サンプルの複数の画像を組み合わせて該サンプルの3次元描写を作成するためのコンピュータ読み取り可能命令を格納している、請求項1〜13のいずれか一項記載のミクロトーム。
【請求項１５】
ベースプレートに対してブレードの位置を変えることなく容量センサをリセットするように構成されたリニアピエゾステージをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項記載のミクロトーム。
【請求項１６】
ペデスタルに連結され、かつファラデーカップを保持するように構成されたポリマーマウントをさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項記載のミクロトーム。
【請求項１７】
ペデスタルとベースプレートに連結され、かつサンプルがペデスタルに取り付けられている間ベースプレートに対してペデスタルを静止状態に保持するように構成されたクランプをさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載のミクロトーム。
【請求項１８】
アクチュエータに連結されたブレードであって、ここで、アクチュエータは、走査電子顕微鏡のビーム軸に平行な方向にステージに対してブレードを移動させることができるように走査電子顕微鏡のステージに連結され、かつアクチュエータは、ブレードの移動を指示する制御信号を受信するように構成されている、ブレード；
アクチュエータに連結され、かつベースプレートに対するブレードの位置を示す出力信号を生成するように構成されたセンサ；および
センサからの出力信号を受信し、センサからの出力信号に少なくとも部分的に基づいて制御信号を生成して、その制御信号をアクチュエータに送信するように構成されたコンピュータプログラム；
を含んでなる、走査電子顕微鏡内に設置されるように構成されたミクロトーム。
【請求項１９】
ビーム軸上の撮像位置からビーム軸を外れた切断位置まで移動することができるようにステージに連結されたペデスタルをさらに含み、該切断位置が撮像位置よりもブレードの近くにある、請求項18記載のミクロトーム。
【請求項２０】
以下の工程：
走査電子顕微鏡内のミクロトーム上の撮像位置にサンプルを配置する工程であって、ここで、撮像位置は走査電子顕微鏡のビーム軸上にある、工程；
サンプルの第1の露出表面を画像化する工程；
ミクロトームのブレードの高さを設定する工程；
サンプルを撮像位置から切断位置に移動させる工程であって、ここで、切断位置は撮像位置よりもブレードの近くにあり、かつビーム軸上にはない、工程；
ブレードを横切ってサンプルを移動させてサンプルの一部を除去し、サンプルの第2の露出表面を出現させる工程；
サンプルを撮像位置に移動させる工程；および
サンプルの第2の露出表面を画像化する工程；
を含んでなる方法。
【請求項２１】
ブレードの高さを設定した後、フィードバック制御下でブレードの高さを維持する工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
第2の露出表面を画像化する前に、走査電子顕微鏡の電子ビームを第2の露出表面で集束させる工程をさらに含む、請求項20または21記載の方法。
【請求項２３】
第2の露出表面を画像化する前に、ビーム軸に沿ってサンプルを調整する工程をさらに含む、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
ビーム軸に沿ってサンプルを調整した後、走査電子顕微鏡の電子ビームを第2の露出表面で集束させる工程をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
サンプルの第1の露出表面を画像化する動作が、
走査電子顕微鏡を使用して、第1の露出表面の複数の構成画像を取り込むこと；および
複数の構成画像を互いにつなぎ合わせて、第1の露出表面の合成画像を形成すること；
を含む、請求項20〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
ビーム軸がサンプルの露出表面に垂直でないようにミクロトームを傾斜させる工程をさらに含む、請求項20〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
ミクロトームを回転させる工程をさらに含む、請求項20〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
スタイロフォームクリーニングロッドでブレードをクリーニングする工程をさらに含む、請求項20〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記ミクロトームが、走査電子顕微鏡のビルトインステージに取り付けられている中間ステージに取り付けられている、請求項20〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
サンプルに対してナイフの位置を変えることなく容量センサをリセットする工程をさらに含む、請求項20〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
ペデスタルに連結されたポリマーマウントにファラデーカップを取り付ける工程をさらに含む、請求項20〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
サンプルがペデスタルに取り付けられている間ベースプレートに対してペデスタルを静止状態に保持するために、ペデスタルとベースプレートの間にクランプを固定する工程をさらに含む、請求項20〜31のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年5月12日に出願された米国仮出願第61/991,929号の恩典を主張するものであり、これを参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
分野
本開示は、ミクロトームデバイスおよびその使用方法に関し、特に、光学または電子ベースのイメージングを含むブロック面イメージングの用途で使用するために設計されたミクロトームデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ブロック面イメージング技術の1つの用途は、連続ブロック面走査電子顕微鏡法(SBEM、SBSEMおよび/またはSBFSEMと呼ばれることもある)であり、これは、第3次元に沿って連続する平面でサンプルの複数の2次元画像を作成し、それによって該サンプルの3次元構造に関するデータを生み出すプロセスを指す。SBSEM技術は、多くの異なるタイプの生物試料を研究するために使用することができ、多くの場合は脳組織の研究に使用されている。それは、例えば脳および神経回路の接続性における軸索をマッピングする場合に、高解像度の解剖学的データを収集するために特に有用である。1つのSBSEMプロセスは、二次電子および後方散乱電子を収集することによって2次元画像を得るための走査電子顕微鏡(SEM)と、連続する画像間でサンプルの最上部のごく薄い(例えば、数十ナノメートルの範囲の)部分を除去するためのミクロトーム(「超ミクロトーム」と呼ばれることもある)の使用を含む。ミクロトームを走査電子顕微鏡の真空チャンバに取り付けることによって、このプロセスはより効率的に行うことができる。以前のミクロトームは、本明細書でさらに説明するように、さまざまな欠点を有している。したがって、ミクロトーム技術の改良が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
概要
いくつかの実施形態において、サンプルの最上部の薄い部分を除去するためのミクロトームは、ベースプレート；ペデスタルが撮像位置から切断位置に移動することができるようにベースプレートに連結されたペデスタル、ここで、該ペデスタルはサンプルを取り付けることができる露出面を有する；ブレードとベースプレートとの間の距離を選択的に変化させるために、ペデスタルが撮像位置にあるときペデスタルの露出面に垂直な方向にブレードを移動させることによって、ベースプレートに対するブレードの位置を調整することができるように、ベースプレートに連結されたブレード；を含んでなり、この場合、切断位置は撮像位置よりもブレードの近くにある。
【０００５】
いくつかの例では、前記ミクロトームは、カメラを用いてサンプルの表面を画像化するように構成された蛍光顕微鏡に取り付けられる。いくつかの例では、前記ミクロトームは、カメラを用いてサンプルの表面を画像化するように構成されたカソードルミネッセンス顕微鏡に取り付けられる。いくつかの例では、前記ミクロトームは、カメラを用いてサンプルの表面を画像化するように構成された光電子顕微鏡に取り付けられる。いくつかの例では、ブレードは、ベースプレートに連結された第1のコンピュータ制御リニアアクチュエータに取り付けられる。いくつかの例では、ペデスタルは、ピボットベアリングによってベースプレートに連結されたレバーに取り付けられる。いくつかの例では、ペデスタルは、ベースプレートに連結された第2のコンピュータ制御リニアアクチュエータの作動によって、ピボットベアリングの周りを回転することができる。
【０００６】
いくつかの例では、第1のアクチュエータは、ブレードの移動を指示する制御信号を受信するように構成されており、前記ミクロトームは、第1のアクチュエータに連結されかつベースプレートに対するブレードの位置を示す出力信号を生成するように構成されたセンサ；およびセンサからの出力信号を受信し、センサからの出力信号に少なくとも部分的に基づいて制御信号を生成して、その制御信号を第1のアクチュエータに送信するように構成されたコンピュータプログラム；をさらに含んでなる。
【０００７】
いくつかの例では、前記ミクロトームは、ペデスタル上に配置されたサンプルをさらに含む。いくつかの例では、サンプルと走査電子顕微鏡の磁極片との間の作動距離は、利用可能な作動距離の範囲から選択することができる。いくつかの例では、電圧がサンプルに印加される。いくつかの例では、サンプルはミクロトームから電気的に絶縁される。いくつかの例では、ブレードは圧電制御振動ダイヤモンドブレードである。いくつかの例では、前記ミクロトームは、プロセッサおよびメモリを含むコンピューティング装置をさらに含み、該メモリは、サンプルの複数の画像を組み合わせて該サンプルの3次元描写を作成するためのコンピュータ読み取り可能命令を格納する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、走査電子顕微鏡内に設置されるように構成されたミクロトームは、アクチュエータに連結されたブレード、ここで、アクチュエータは、走査電子顕微鏡のビーム軸に平行な方向にステージに対してブレードを移動させることができるように走査電子顕微鏡のステージに連結され、かつアクチュエータは、ブレードの移動を指示する制御信号を受信するように構成される；アクチュエータに連結され、かつベースプレートに対するブレードの位置を示す出力信号を生成するように構成されたセンサ；およびセンサからの出力信号を受信し、センサからの出力信号に少なくとも部分的に基づいて制御信号を生成して、その制御信号をアクチュエータに送信するように構成されたコンピュータプログラム；を含んでなる。
【０００９】
いくつかの例では、ミクロトームは、ペデスタルがビーム軸上の撮像位置からビーム軸を外れた切断位置まで移動することができるように、ステージに連結されたペデスタルをさらに含み、この場合、切断位置は撮像位置よりもブレードの近くにある。
【００１０】
いくつかの実施形態において、方法は、以下の工程を含んでなる：走査電子顕微鏡内のミクロトーム上の撮像位置にサンプルを配置する工程、ここで、撮像位置は走査電子顕微鏡のビーム軸上にある；サンプルの第1の露出表面を画像化する工程；ミクロトームのブレードの高さを設定する工程；サンプルを撮像位置から切断位置に移動させる工程、ここで、切断位置は撮像位置よりもブレードの近くにあり、かつビーム軸上にはない；ブレードを横切ってサンプルを移動させてサンプルの一部を除去し、サンプルの第2の露出表面を出現させる工程；サンプルを撮像位置に移動させる工程；およびサンプルの第2の露出表面を画像化する工程。
【００１１】
いくつかの例では、前記方法は、ブレードの高さを設定した後、フィードバック制御下でブレードの高さを維持する工程をさらに含んでなる。いくつかの例では、前記方法は、第2の露出表面を画像化する前に、走査電子顕微鏡の電子ビームを第2の露出表面で集束させる工程をさらに含んでなる。いくつかの例では、前記方法は、第2の露出表面を画像化する前に、ビーム軸に沿ってサンプルを調整する工程をさらに含んでなる。いくつかの例では、前記方法は、ビーム軸に沿ってサンプルを調整した後、走査電子顕微鏡の電子ビームを第2の露出表面で集束させる工程をさらに含んでなる。
【００１２】
いくつかの例では、サンプルの第1の露出表面を画像化する動作は、走査電子顕微鏡を使用して、第1の露出表面の複数の構成画像を取り込むこと；および複数の構成画像を互いにつなぎ合わせて、第1の露出表面の合成画像を形成すること；を含む。いくつかの例では、前記方法は、ビーム軸がサンプルの露出表面に垂直でないようにミクロトームを傾斜させる工程をさらに含む。いくつかの例では、前記方法は、ミクロトームを回転させる工程をさらに含む。いくつかの例では、前記方法は、スタイロフォーム(Styrofoam)クリーニングロッドでブレードをクリーニングする工程をさらに含む。いくつかの例では、前記ミクロトームは中間ステージに取り付けられ、中間ステージは走査電子顕微鏡のビルトインステージに取り付けられる。
【００１３】
開示された技術の上記のおよび他の特徴ならびに利点は、添付図面を参照して進められる、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、例示的なミクロトームの上面斜視図である。
【図２Ａ】図2A〜2Cは、図1のミクロトームの部分をより大きいスケールで示す。
【図２Ｂ】図2A〜2Cは、図1のミクロトームの部分をより大きいスケールで示す。
【図２Ｃ】図2A〜2Cは、図1のミクロトームの部分をより大きいスケールで示す。
【図２Ｄ】図2Dは、図1のミクロトームを使用する方法を示す。
【図３Ａ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異(computed difference)を示す画像である。
【図３Ｂ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｃ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｄ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｅ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｆ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｇ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｈ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｉ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｊ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｋ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｌ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｍ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｎ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図３Ｏ】図3A〜3Oは、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルのいくつかの連続的な走査電子顕微鏡画像と、該組織サンプルの連続的な走査電子顕微鏡画像間の計算された差異を示す画像である。
【図４】図4Aは、組織サンプルがナイフブレードを横切って数回移動されるときに、ミクロトームのナイフブレードの垂直位置を測定する容量センサからの出力を示すグラフである。図4Bは、互いに重なり合う図4Aのデータ系列を示すグラフである。
【図５】図5は、複数の構成走査電子顕微鏡画像の位置を示す図である。
【図６Ａ】図6A〜6Cは、異なる作動距離で同じサンプルを撮影した走査電子顕微鏡画像である。
【図６Ｂ】図6A〜6Cは、異なる作動距離で同じサンプルを撮影した走査電子顕微鏡画像である。
【図６Ｃ】図6A〜6Cは、異なる作動距離で同じサンプルを撮影した走査電子顕微鏡画像である。
【図７】図7は、電気的に絶縁されたサンプルに電圧が印加されているミクロトームの側面図である。
【図８】図8A〜8Cは、走査電子顕微鏡内のミクロトーム、例えば図1のミクロトームを用いて、サンプルの傾きを制御する能力を示す。
【図９Ａ】図9A〜9Eは、別の例示的なミクロトームの異なる図である。
【図９Ｂ】図9A〜9Eは、別の例示的なミクロトームの異なる図である。
【図９Ｃ】図9A〜9Eは、別の例示的なミクロトームの異なる図である。
【図９Ｄ】図9A〜9Eは、別の例示的なミクロトームの異なる図である。
【図９Ｅ】図9A〜9Eは、別の例示的なミクロトームの異なる図である。
【図１０】図10Aおよび10Bは、開示されたミクロトームを用いて切断された組織の15ナノメートル薄片の、それぞれ、XY図およびXZ図を示す。
【図１１】図11は、さらに別の例示的なミクロトームの斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本明細書に記載のミクロトームは、走査電子顕微鏡法、光ベース(光学、例えば蛍光)顕微鏡法、カソードルミネッセンス顕微鏡法などにおいて、またはこれらの技術を組み合わせて、顕微鏡分析のためのさまざまな技術に使用することができる。例えば、サンプルは、通常の光ベース(光学)(例えば、蛍光)顕微鏡の対物レンズの下に直接取り付けることができる、以下に記載するようなミクロトーム上に載置され得る。このような実施形態は、大気条件で、かつ走査電子顕微鏡の不在下で操作することができる。こうした技術は、当技術分野で知られている種々の蛍光顕微鏡技術(例えば、多光子顕微鏡法、超解像顕微鏡法など)をうまく利用することができる。
【００１６】
いくつかの例では、本明細書に記載のミクロトームは、光学および/またはカソードルミネッセンス顕微鏡法と走査電子顕微鏡法の両方で使用でき、連続的な露出表面の画像が取り込まれて保存され得る。また、その画像をデジタル解析し、再結合して、高い顕微鏡解像度で組織の3次元画像または描写を提供することもでき、例えば、被検者の神経回路を確定またはマッピングすることができる。これは、いくつかの実施形態では、例えば蛍光検出器、カメラ、またはCMOSセンサを使用して、走査電子顕微鏡の内部真空チャンバ内のビューポートを通してサンプルを画像化することによって達成することができる。いくつかの場合には、SBEMプロセス中にサンプルの各露出表面について蛍光透視画像および/またはカソードルミネッセンス画像を撮ることができ、その結果、どの走査電子顕微鏡画像も対応する蛍光透視画像および/またはカソードルミネッセンス画像を有する。以下の説明部分は、SBEMプロセスにおけるミクロトームの使用に関連して進行するが、本開示は、一般的に、あらゆる用途でのミクロトームの使用に応用することが可能である。
【００１７】
本明細書に記載のミクロトームは、細胞生物学、癌生物学および/または免疫学の研究のための組織標本の検査を含めて、各種のサンプル材料を研究するために、さまざまな目的で使用することができる。ミクロトームは、特に、プラスチック包埋脳組織のような、プラスチックに埋め込まれた生物学的組織サンプルと共に使用するのに都合よくできている。
【００１８】
走査電子顕微鏡法は、きわめて高解像度のサンプルの画像化を可能にし、広範囲の分野でのその使用につながっている。多くの商業用走査電子顕微鏡には、アクセス可能な内部真空チャンバがあり、このチャンバ内に顕微鏡による画像化のためにサンプルが配置される。顕微鏡の横にあるドアを介して内部チャンバにアクセスし、該チャンバに気密シールを提供するためにドアが閉じられる。次いで、内部チャンバは、画像化プロセスの妨害(例えば、気体分子による電子ビームの散乱による妨害)を低減するために排気される。
【００１９】
また、多くの走査電子顕微鏡は、画像化されるサンプルを配置するためのステージを含み、該ステージは、3つの軸(例えば、顕微鏡の電子ビームと整列したz軸およびそのz軸に垂直なx軸とy軸)に沿って、または3つの軸に対して直線的に平行移動する。該ステージはまた、z軸の周りを回転し、かつx軸とy軸の少なくとも1つの周りで傾斜することができ、その結果、該ステージの面は電子ビームに対して回転および傾斜することができる。いくつかの電子顕微鏡では、ステージをz軸の周りに360°回転させ、かつx軸とy軸のうちの1つの周りに90°の範囲にわたって傾斜させることができる。ミクロトームをz軸の周りに回転させることによって、サンプルを電子ビームの下に整列させることができる。
【００２０】
材料の研究、特に生物学的組織の研究では、サンプルの3次元構造を記述するデータは非常に望ましいことがある。3次元データを得るために、走査電子顕微鏡の真空チャンバ内に設置することが可能なミクロトームが開発されている。サンプルはミクロトーム上に取り付けられ、顕微鏡によって画像化されるように位置づけられる。サンプルの露出表面が画像化されたら、ミクロトームを用いてサンプルの最上部のごく薄い部分を除去し、画像化される新しい表面を露出させる。このプロセスは、所望の枚数の画像が撮影されるまで、またはサンプルの所望の厚さが画像化されるまで、繰り返すことができる。こうして得られた一連の画像は、サンプルの3次元構造を示すことができる。
【００２１】
既知のミクロトームデバイスにはいろいろな欠点がある。一例として、既知のミクロトームは、サンプルの最上部の薄い部分を除去するために、サンプルを横切ってブレードを移動させる。サンプルは検出器と顕微鏡の磁極片の直下に配置されるため、サンプルのスライシングからのデブリが検出器および/または電子カラムの磁極片に接触するかまたは付着して、顕微鏡の操作を妨害する可能性がある。場合によっては、電子顕微鏡の磁極片の入口に圧力差が存在し、デブリが電子カラムに入る機会を高めて、この問題を悪化させている。さらに、ブレードがサンプルの最上部を横切って移動するためのスペースを確保するために、サンプルと検出器との間に十分なスペースを設ける必要があり、それによって利用可能な作動距離(working distance)の範囲が減少する。特に、これは、作動距離を短くすることができる範囲を制限し、ひいては、得られるデータの質を制限する可能性がある。例えば、サンプルと検出器との間の作動距離を短くすると、得られるデータの信号対ノイズ比が改善され得る。
【００２２】
別の例として、ペンシルベニア州ウォーレンデール(Warrendale)のGatan社から入手可能な既知のミクロトームは、特注のスチール製ドアに取り付けられている。このミクロトームを走査電子顕微鏡に設置するには、顕微鏡の元のステージとドアを取り外して、特注のスチール製ドアを元の場所にはめ込む必要がある。これにより、ミクロトームは比較的重くなり、取り付けが困難になる。さらに、このミクロトームは、x軸、y軸およびz軸に沿ってサンプルの平行移動を可能にするにすぎず、ビルトインステージが可能にするような、サンプルを傾けたり回転させたりすることはできない。さらに、この装置がx軸およびy軸に沿って提供する平行移動は、真に直線的ではない。むしろ、Gatan社のミクロトームは、平行移動が接近するように、大きな放物線の弧に沿って平行移動し、あまり直線的ではないことが理解される。既知のミクロトームには他にも欠点があり、これらについては以下で詳しく説明する。
【００２３】
本明細書に記載のミクロトームデバイスは、電子ビーム軸から外れた位置でサンプルを切断することができ、したがって、デブリによる妨害の機会を少なくして、より広い作動距離範囲でのイメージングを可能にする。これは、既知のデバイスよりも作動距離をさらに短縮できることによって、かつより広い作動距離範囲を提供してそこから選択できることによって、有利であり得る。本明細書に記載のミクロトームデバイスはまた、比較的軽量であり、したがって、取り付けが容易であり、いくつかの実施形態では、さまざまな走査電子顕微鏡のビルトインステージ上に設置されるように設計されている。その結果、サンプルの位置および方向は、真の直線的平行移動(数センチメートルの範囲にわたる)の3つの軸に沿って、かつ回転の2つの軸の周りで微調整することができる。本明細書に記載のミクロトームは、サンプルの最上部から極薄切片を再現性よく切断することが可能である。本明細書に記載のミクロトームはさらなる利点を有しており、これらについては以下で詳しく説明する。
【００２４】
図1および図2A〜2Cは、走査電子顕微鏡で使用するのに適した例示的なミクロトーム100を示す。ミクロトーム100は、走査電子顕微鏡で使用する場合、ミクロトーム100の平行移動と回転を調整するために、顕微鏡のステージ上に取り付けられる。ミクロトーム100は、顕微鏡のステージと同一平面に取り付けられるか、または複数のポストによってステージに連結されて、ステージから離間される。ミクロトーム100は、該ミクロトームを取り付けるのに十分な大きさの内部チャンバを有する、さまざまな市販の走査電子顕微鏡のいずれとも接続して使用することができる(ミクロトーム100の例示的な全体寸法は以下に提供される)。例えば、ミクロトーム100は、オハイオ州ヒルズボロ(Hillsboro)のFEI社から市販されているNOVA NANOSEM 50シリーズ走査電子顕微鏡に使用することができる。適切な走査電子顕微鏡の1つは、FEI NanoSEM 450装置である。
【００２５】
ミクロトーム100は、ステージに連結されたベースプレート102を含む。ブラケット106はベースプレート102に連結され、リニアアクチュエータ110が取り付けられる垂直面108を含む。適切な各種リニアアクチュエータのどれを使用してもよい。例として、Physik Instrumente社から以前に市販されている、NEXACT Driveを備えたN-661 Miniature Linear Stage、およびPhysik Instrumente社から現在市販されている、その代替製品Linear Piezo Stage LPS-45は、それらの関連するコントローラユニットと組み合わせて、好適なリニアアクチュエータである。リニアアクチュエータ110は、その本体110Aに対してそのプラットフォーム110Bの平行移動をもたらすことができる。
【００２６】
2つの垂直ポスト112Aと中央クロスバー112Bを有するH字型の取り付け要素112は、プラットフォーム110Bの露出面に取り付けられる。中央クロスバー112Bには、垂直部分114Aと2つの水平に突出したアーム114Bとを含むブレード支持部114が取り付けられる。アーム114Bは互いから離間しており、かつ互いに平行に垂直部分114Aから延びており、その結果、ブレード116をそれらの終端部の間に取り付けることができる。適切なブレードは当技術分野で公知である。ミクロトーム100で使用するのに特に適したブレードには、圧電制御振動ダイヤモンドブレード、例えば、Studer, et al., Minimal Compression of Ultrathin Sections with use of an Oscillating Diamond Knife, Journal of Microscopy, Vol. 197, Pt. 1, 94-100ページ(2000年1月)に記載されるものが含まれる。種々の特に適した市販のブレードは、米国DiATOME社によって提供される。
【００２７】
図2Bおよび2Cに詳細に示されるように、ブレード116は、アーム114Bの終端部の間にはめ込み、アーム114Bにネジ144を通して、ブレード116がアーム114Bの間に挟まれるようにネジ144を締め付ける。ピエゾアクチュエータ146は、ネジ148でブレード支持部114の垂直部分114Aに連結され、ネジ148はピエゾアクチュエータ146とは反対側のネジ148の端部にナットでブレード支持部114に固定される。ブレード支持部114は、ミクロトーム100の残りの部分にブレード支持部114を連結する撓み要素150に連結することができる。撓み要素は、十分な柔軟性を有する狭くしなやかな金属要素であり得、その結果、ピエゾアクチュエータ146の作動は、撓み要素150が曲がるとき、ブレード支持部114を前後に振動させる。撓み要素150は1mmの幅を持つことができる。ピエゾアクチュエータ146は、撓み要素150上のブレード支持部114の共振周波数で振動するように構成することができる。1つの適切なピエゾアクチュエータは、PI Ceramic社から入手可能な、高真空対応のPD080.31スルーホールピエゾアクチュエータ、およびPhysik Instrumente社から入手可能な、関連する信号増幅調整装置である。
【００２８】
ミクロトーム100はまた、センサアセンブリ118(図1)を含み、センサアセンブリ118は、センサを所定の位置に保持するためのセンサクランプ120、シャフト122と容量センサモジュール124を含む容量センサ(capacitive sensor)、およびベースプレート102に連結されたターゲットプレート126を含む。種々の適切な容量センサが市販されており、一例は、ナノメートル分解能での測定が可能な、Physik Instrumente社から入手可能なD-510 PISECA容量センサおよび関連する信号調整装置である。容量センサは、容量センサモジュール124の露出底面とターゲットプレート126の露出上面との間の距離を示す出力信号を提供することができる。センサアセンブリ118は、取り付け要素112の垂直ポスト112Aに連結され、したがって、ミクロトーム100のさまざまな構成要素の寸法についての知識があれば、出力信号はサンプル136に対するブレード116の高さを示すことができる。
【００２９】
容量センサからの出力信号は、National Instruments社から市販されている18ビット、625kS/sのNI USB-6289 MシリーズマルチファンクションDAQシステムなどの、データ調整および/または取得システムを介して、Mathworks社から市販されているMATLABにより実行されるプログラムなどの、ソフトウェアプログラムに入力することができる。該プログラムは、容量センサからの出力信号を受信し、ユーザからの入力(例えば、ブレード116の所望の高さ)を受け取り、かつプラットフォーム110Bの移動を制御するためにアクチュエータ110に出力信号を供給するように構成され得る。ブレード116が所望の高さに移動すべきことを示す入力を受信すると、該プログラムは、ブレード116を所望の高さに位置決めするプラットフォーム110Bの特定の高さを計算することができる。次いで、該プログラムは、指定された高さに移動せよという命令(command)を含む信号をアクチュエータ110に送ることができる。該プログラムはさらに、ブレードが指定された高さに実際に移動して保持されているかどうかを判断するために、容量センサからの信号をモニターすることができる。
【００３０】
実際のブレードの高さが所望のブレードの高さよりも低いことを容量センサからの信号が示す場合、該プログラムは、指定された高さよりも高い新しい高さに移動せよという命令を含む新しい信号をアクチュエータ110に送ることができる。実際のブレード高さが所望のブレード高さよりも高いことを容量センサからの信号が示す場合には、該プログラムは、指定された高さよりも低い新しい高さに移動せよという命令を含む新しい信号をアクチュエータ110に送ることができる。このプロセスを連続的に実行して、容量センサからの信号に基づいてブレード116を所望の高さに維持する閉制御ループ(またはフィードバックループ)を(例えば、PID制御ループフィードバック機構を用いて)作成することができる。これは、ミクロトームシステムがサンプル136の最上部から材料を除去する際の精度および均一性を含めて、ミクロトームシステムの精度を向上させるのに役立ち得る。
【００３１】
ミクロトームはまた、互いに離間しかつベースプレート102に連結された2つのピボット支持要素128、ピボット支持要素128に取り付けられかつそれらの間にまたがるピボットベアリング130、およびピボットベアリングの軸の周りを回転するようピボットベアリング130に取り付けられた回転可能なレバー132を含む。ピボットベアリング130は、ピボット支持要素128に堅く連結されて支持された静止部分と、レバー132に堅く連結されてこれを支持する、静止部分に対して自由に回転可能な回転部分とを含む。さまざまな市販の適切なピボットベアリングを使用することができ、例えば、Riverhawk社から市販されている6016-800ピボットベアリングが使用される。回転可能なレバー132の頂部に、ミクロトーム100は、被検サンプル136を取り付けることができるペデスタル134を含む。適切なペデスタルには、Electron Microscopy Sciences社から市販されているEMSアルミニウム試料台(Aluminum Specimen Stub)75638-10のような、走査電子顕微鏡用の試料台が含まれる。
【００３２】
ミクロトーム100はまた、ベースプレート102に連結されたクランプ138と、クランプ138内に固定されたリニアアクチュエータ140とを含む。さまざまな市販のリニアアクチュエータのどれも使用することができるが、1つの特に適したアクチュエータは、Physik Instrumente社から入手可能な、N-381 NEXACTリニアアクチュエータ、マニピュレータ、ピエゾステッパ製品および関連コントローラである。リニアアクチュエータ140は回動可能なレバー132に連結され、結果的に、アクチュエータ140は、ピボットベアリング130の周りのレバー132の回転を制御することができる。より具体的には、アクチュエータ140は、レバー132の内側に位置するサファイアパッドと係合しているボールベアリングで終端する。サファイアパッドは、アクチュエータ140と係合するための非常に平坦で耐久性のある表面を提供することができる。適切なサファイアパッドには、Thorlabs社からモデル番号P25SK2-Polaris-K1で販売されているものが含まれる。
【００３３】
いくつかの場合において、レバー132は、ブレード116から離れてピボットベアリング130の周りを回転するように付勢(bias)され得る(例えば、レバー132は重み付けされ得る)。アクチュエータ140は、レバー132を作動させてサンプル136をブレード116の方に移動させるために、サファイアパッドを押し付けることができる。特定の一実施形態では、レバー132は重み付けされ、結果的に、それは走査電子顕微鏡の電子ビームよりもブレード116から遠くピボットベアリング130の周りに約1度の回転で止まるように付勢される。アクチュエータ140は、サンプル136が走査電子顕微鏡の電子ビーム内に配置されるように、サファイアパッドと係合してレバー132をブレード116の方へ1度だけ回転させることができる。アクチュエータ140は、サンプル136がブレード116の領域内に配置されるように、サファイアパッドと係合してレバー132を約10度だけ回転させることができる。
【００３４】
アクチュエータ140がブレード116とアクチュエータ110の方向にあまりにも遠くへサンプル136を回転させるのを防ぐために、ミクロトームはまた、ピボット支持要素128に連結されかつレバー132とアクチュエータ110との間に延びるピボットストッパ142を含む。ミクロトーム100はまた、サンプル136がブレード116を横切って平行移動されるとき、アクチュエータ110に追加の重みを加えてブレード116を安定化させかつブレード116の位置を維持するために、鋼鉄のブロックなどの重り152を含むことができる。
【００３５】
アクチュエータ140は、例えばサンプル136の露出表面の一部を除去するために、ブレード116を横切ってサンプル136を移動させるために使用することができる。例えば、上述したMATLABプログラムは、サンプル136の所望の動きに関するユーザからの入力を受信し、かつレバー132、それゆえにサンプル136、の動きを制御するための出力信号をアクチュエータ140に供給するように構成することができる。サンプル136を所望の位置に移動すべきことを示す入力を受信すると、該プログラムは、サンプルを所望の場所に位置付けると予想されるアクチュエータ140の特定の位置を計算することができる。その後、該プログラムは、指定された位置に移動せよという命令を含む信号をアクチュエータ140に送ることができる。
【００３６】
場合によっては、サンプルの正確な切断および画像化を容易にするために、被検サンプルをプラスチック(例えば、エポキシ樹脂)に埋め込むことができる。連続ブロック面走査電子顕微鏡法のためのミクロトームで使用するサンプルを調製する方法は、当技術分野で公知である。このような方法の一例として、被検組織サンプルを適当なサイズに切断し、次いで金型内の液状エポキシ樹脂に包埋し、その後エポキシ樹脂をオーブン内で硬化させることができる。サンプルおよびそれが埋め込まれているエポキシは、金型から切り取って、マウントまたはペデスタル(その上でサンプルはミクロトームに支えられる)に接着することができる。例えば、サンプルは、該サンプルが埋め込まれたのと同じエポキシを用いて、ペデスタルに接着することができる。
【００３７】
サンプルがペデスタルに接着されたら、市販の超ミクロトームを用いてサンプルの不要な部分を除去することができ、その結果、組織の側面が露出した切頭ピラミッド形または台形プリズム形のサンプルが得られる。このような形状は、他の形状のサンプルよりも正確かつ首尾一貫して切断することができる、比較的固く安定したサンプルを提供する。次いで、サンプルの側面をペデスタルに接地して、サンプルからの電子の散逸を可能にし、かつイメージング中の静電気の蓄積を防止するために、サンプルを金などの導電性材料でコーティングすることができる。その後、コーティングをサンプルの最上部から除去して、走査電子顕微鏡で画像化するためにサンプルの上面を露出させることができる。
【００３８】
図2Aは、ミクロトーム100の部分の拡大図を示し、ここでは、サンプル136が走査電子顕微鏡の磁極片の下で、ビーム軸上に置かれている。図2Bは、MATLABプログラムがアクチュエータ140に命令を送り、アクチュエータ140が、サンプル136を、走査電子顕微鏡の磁極片の下から出て、ビーム軸から離れて、ブレード116の方へ移動させるようにレバー132を作動させることによって、その命令に応答した後の、図2Aのミクロトームの部分の拡大図を示す。
【００３９】
本明細書に記載のミクロトームは、サンプルの最上部から極薄の切片を再現性よく切断することが可能である。ミクロトームは、容量センサの分解能に等しい厚さを有する切片を切り取ることができ、それは10ナノメートル未満であり得る。ミクロトームを走査電子顕微鏡において使用する場合、切片の厚さは、サンプルおよびサンプルのプラスチック包埋材料に与えられる電子線量によって制限され、その電子線量は、上述したように、(例えば、プラスチックポリマー中の結合を破壊することによって)プラスチック包埋材料の材料特性を変化させ、したがって、サンプルのスライシング(slicing)をより困難にし、チャッター(chatter)および/またはあまり一貫性のない切片の厚さをもたらすことがある。この影響を少なくするためには、30ナノメートルが適切な切片の厚さであることが判明した。したがって、SBEMの用途において、本明細書に記載のミクロトームは十分に精密であり、それらが切片の厚みの減少を制限する要因ではない。ミクロトームを光学顕微鏡で使用する場合には、容量センサの分解能と同じくらい薄い切片の厚さを使用することができる。
【００４０】
上述したミクロトームの構成要素は、アルミニウム、チタン、および/またはステンレス鋼を含む種々の適切な材料のいずれかから製造することができる。ミクロトームは、必要に応じて熱的影響を軽減するために、構成要素の温度をモニターする熱電対を含むことができる。上記のミクロトームは、1kg未満の重量、235mmの全幅、73mmの深さ、および75mmの高さをもつことができ、既知の市販のミクロトームよりも大幅に少ない費用で構築できることが見出された。ミクロトームの寸法を調整するために、例えば、特定のSEM真空チャンバに対応するために、ミクロトームの要素のわずかな再配列を行うことができる。その重量に基づいて、このミクロトームは、他の既知のミクロトームよりも走査電子顕微鏡に取り付けるのが容易である。その全体的な寸法に基づいて、このミクロトームは、走査電子顕微鏡の30cmの真空チャンバ内に容易に収めることができる。それはまた、光学顕微鏡にも対応しており、油浸レンズ操作モードでのSEMの磁場との干渉を防止または低減するように非磁性材料(例えば、アルミニウム、白金)から製造することができる。
【００４１】
図2Dは、ミクロトーム100を使用する例示的な方法250を示す。252において、ミクロトーム100を走査電子顕微鏡の真空チャンバ内に取り付ける。254において、サンプルを研究のために調製し、ミクロトーム100上に設置する。256において、走査電子顕微鏡を用いてサンプルの露出表面を画像化する。258において、ブレードの高さを設定してフィードバック制御下で維持し、ピエゾアクチュエータ146を作動させてブレードを振動させる。260において、ブレードを横切ってサンプルを平行移動させてサンプルの薄い部分を除去し、ピエゾアクチュエータ146の作動を中断してブレードの振動を一時的に止める。262において、ナイフブレードをサンプルから離して上方に引き戻す。264において、サンプルを走査電子顕微鏡の電子カラムの下の元の撮像位置に平行移動させて戻す。
【００４２】
ひとたびサンプルが撮像位置に戻されたら、サンプルの露出表面は、ブレードによるサンプルの最上部の除去のために、ステップ256の画像化の場合よりもわずかに低い位置にある。したがって、264でサンプルを撮像位置に戻した後、この変化を補償するためにシステムを調整することができる。この調整は、266Aで、走査電子顕微鏡の電子ビームを新たな露出表面に再集束することによって達成することができる。代替的に(または追加的に)、この調整は、266Bで、走査電子顕微鏡のビルトインステージを平行移動させて、サンプルの露出表面がステップ256の画像化の場合と同じ位置にくるようにサンプルを上方に移動させることによって達成することができる。268において、サンプルの露出表面を走査電子顕微鏡で画像化し、十分なデータが収集されるまでこのプロセスを繰り返すことができる。
【００４３】
場合によっては、サンプルがブレードを横切って平行移動するとき、ブレード上にデブリが堆積して、その精度と一貫性を低減させることがあり、かつ/またはデブリがサンプルの露出表面に残存して、その表面の撮影画像にエラーを導入する可能性がある。ブレード116上のデブリの堆積を防止するために、一片のスタイロフォーム(STYROFOAM：発泡スチレン)または他の適切な材料をサンプル136の後方でペデスタル134に取り付けることができ、すなわち、サンプルが撮像位置にあるとき、サンプル136がその材料とブレード116の間にあるようにする。したがって、サンプル136が切断されるようにレバー132をアクチュエータ110に向かって移動させることができ、また、該材料がブレード116に接触してその上に残っているデブリを除去するようにレバー132をさらに移動させることができる。
【００４４】
露出表面の走査電子顕微鏡画像がその表面上のデブリの存在を明らかにした場合、その表面からデブリを除去するためのステップを取ることができ、そうすることで、その後により完全な画像を得ることができる。サンプル136の露出表面上に残っているデブリを除去するために、サンプル136は、例えば、ブレード116を横切って再度移動させることができ、その結果、ブレード116はサンプル116の表面からデブリを掃き取ることができる。これは、ブレード116を最初の切断のときと同じ高さに維持することによって、またはサンプル136の追加の部分が不用意に除去されることのないように、サンプル136の露出表面から少し離してブレード116を最初に移動させることによって、行うことができる。
【００４５】
図3Aおよび3Bは、組織サンプルの最上部から厚さ40ナノメートルのスライスを除去するために上述のミクロトームを使用して、連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された、組織サンプルの連続的な露出表面の走査電子顕微鏡画像である。特定の実施形態を用いて、より薄いスライス、例えば図10Aおよび10Bに示されるような15ナノメートルまでの薄片、を除去することもできる。図3Cは、図3Aと図3Bの連続画像間の計算された差異を示す画像である。図3Cにおいて、より暗い領域は連続画像間の差異が小さいことを示し、明るい領域は連続画像間の差異が大きいことを示す。図3Cに示されるように、連続した画像は大部分が似ており、このことは、組織サンプルの構造がミクロトームによってサンプルの最上部から除去されたスライスの厚さにわたってほんのわずかにしか変化していないことを示しており、サンプルのごく一部を取り除くミクロトームの能力を反映している。さらに図3Cに示されるように、連続画像間の差異は、画像の全範囲にわたって比較的一貫しており、このことは、サンプルから除去された部分の厚さが同様にサンプルの表面にわたって一貫していたことを示している。これらの結果は、例えばサンプルの表面を横切るナイフブレードのスキッピング(「チャッター」(chatter)と呼ばれることもある)なしに、サンプルのごく薄い部分を大きな一貫性でもって除去する本明細書に記載のミクロトームの能力を示す。
【００４６】
図3Dは、図3Bと同じ顕微鏡写真画像である。図3Dと図3Eは、上述のように作成されたサンプルの連続的な露出表面の走査電子顕微鏡画像である。図3Fは、図3Dと図3Eの連続画像間の計算された差を示す画像である。図3Gは、図3Eと同じ顕微鏡写真画像である。図3Gと図3Hは、上述のように作成されたサンプルの連続的な露出表面の走査電子顕微鏡画像である。図3Iは、図3Gと図3Hの連続画像間の計算された差を示す画像である。図3Jは、図3Hと同じ顕微鏡写真画像である。図3Jと図3Kは、上述のように作成されたサンプルの連続的な露出表面の走査電子顕微鏡画像である。図3Lは、図3Jと図3Kの連続画像間の計算された差異を示す画像である。図3Mは、図3Kと同じ顕微鏡写真画像である。図3Mと図3Nは、上述のように作成されたサンプルの連続的な露出表面の走査電子顕微鏡画像である。図3Oは、図3Mと図3Nの連続画像間の計算された差異を示す画像である。図3F、3I、3Lおよび3Oに示された結果は、図3Cにおいて示された上述の結果に匹敵する。
【００４７】
図4Aは、組織サンプルがブレードを14回横切って移動するときのミクロトームブレードの垂直位置を測定する、上述の容量センサからの複数のデータ系列での出力を示すグラフである。図4Bは、互いに重なり合う図4Aのデータ系列を示すグラフである。図4Aおよび4Bに示されるように、グラフのy軸はブレードの高さを示し、グラフのx軸はサンプルがブレードを横切って移動するときの時間の増分を示す。図4Aのデータ系列402を参照すると、440において、ブレードが最初に所望の位置まで下がっていることが分かる。ひとたびブレードが所望の位置に配置されると、サンプルはブレードを横切って移動することができる。図4Aに示すデータは、データ系列402、404、406、408、410および412に示されるように、最初の6回でサンプルはブレードを横切って移動したが、サンプルはブレードに接触しなかったことを明らかにしている。
【００４８】
図4Aのデータ系列414を参照すると、サンプルが横切って移動したときブレードに接触したことが450で見て取れる。サンプルとブレードとの接触が開始すると、ブレードが押し上げられるという結果になり、その後フィードバックループはブレードを修正して所望の位置まで下方に戻す機会を有する。図4Aのデータ系列414をさらに参照すると、サンプルは460でブレードと接触することをやめることが分かる。サンプルとブレードとの接触が停止すると、ブレードがサンプルの端部から降下するという結果になり、その後フィードバックループはブレードを修正して所望の位置まで上方に戻す機会を有する。接触の開始時にブレードが押し上げられ、フィードバックループがブレードを下方に移動させるように修正し、接触の停止時にブレードが降下し、フィードバックループがブレードを上方に移動させるように修正するという特徴的なパターンは、残りのデータ系列416、418、420、422、424、426および428全体を通して見ることができる。
【００４９】
このデータは、以前のミクロトームで得られたものとは異なる明確な利点を提供する。例えば、既知のミクロトームでは、サンプルに対するブレードの位置を正確に決定するための簡単な方法がない。したがって、多くの場合、SBEMの用途で使用するためのミクロトームの調整は、研究者がサンプルの表面を画像化し、サンプルを横切ってブレードを移動させ、再びサンプルの表面を画像化し、2つの画像を比較してサンプルの一部が除去されたかどうかを判定することを必要とする。除去された部分がない場合には、ブレードをサンプルにより近いわずかな距離だけ移動させて、このプロセスを繰り返す。このプロセスは、連続画像を比較することによって、サンプルの一部が除去されたと判定されるまで反復される。このプロセスは、非常に時間がかかり、効率が悪く、さらにはエラーが発生しやすく、また、ミクロトームの不使用期間が長くなると、ブレードとサンプルの正確な相対位置が不明確になる可能性があるため、このプロセスを頻繁に行う必要がある。さらに、このプロセスはサンプルに大きな電子線量を導入し、これは、プラスチックコーティングの材料特性を(例えば、プラスチックポリマー中の結合を破壊することによって)変えることがあり、したがって、サンプルのスライシングをより困難にし、かつチャッターおよび/またはあまり一貫性のない切片の厚さをもたらす。したがって、本明細書に記載のミクロトームは、較正および中断回復のより効率的かつ効果的な方法を提供する。
【００５０】
図4Bは、互いに重なり合う図4Aのデータ系列を示すグラフであって、ミクロトームがサンプルの表面から一連の部分を除去する際のデータ系列の一貫性、それゆえにミクロトームの性能の一貫性を示している。
【００５１】
場合によっては、走査電子顕微鏡は、50ミクロン×50ミクロン以下の表面の領域を画像化することが可能である。しかしながら、SBEM技術を用いて研究されるサンプルは、500ミクロン×500ミクロンの範囲のサイズを有することが多い。したがって、ある場合には、同一平面上で撮影された複数の走査電子顕微鏡画像を互いにつなぎ合わせて、サンプルの表面のより大きな合成画像を作成する。例えば、図5に示すように、走査電子顕微鏡を用いて、サンプルの露出表面の第1の領域501の第1の画像を第1の位置で撮影する。次いで、走査電子顕微鏡のビルトインステージを使用して、サンプルを第1の位置から第2の位置に平行移動させ、走査電子顕微鏡を用いて第2の領域502の第2の画像を取得する。その後、例えば後処理ソフトウェアを用いて、2つの画像を互いにつなぎ合わせることができる。ある場合には、第1の画像に示されるサンプルの領域は、第2の画像に示されるサンプルの領域と重複する領域を有し、重複領域503は、2つの画像を互いにつなぎ合わせて合成画像を形成する後処理ソフトウェアによって使用され得る。
【００５２】
2つの画像が撮影されたら、上述のようにサンプルの最上部を除去して、サンプルをその第1の位置に戻すことができ、このプロセスは、重複領域506を有する第1の領域504および第2の領域505を画像化することによって新たな露出表面について繰り返すことができる。このプロセスは、第3の露出表面の第1の領域507、第2の領域508、および重複領域509について、ならびに第4の露出表面の第1の領域510、第2の領域511、および重複領域512について繰り返すことができる。
【００５３】
このような技術をSBEMプロセスと効果的に組み合わせるために、ステージは、サンプルが連続的な各露出表面のイメージングのために同じ位置で静止することを確実にするのに十分な精度を有することが好ましい。さらに、第1の領域501と第2の領域502との間の重複領域503は、ミクロトームの平行移動における何らかのエラーを仮定して、第1の画像と第2の画像とを互いにつなぎ合わせることができるように、少なくともいくらかの重複領域が存在することを確実にするのに十分な大きさであることが好ましい。したがって、より精密なステージは、より小さい重複領域、それゆえにより大きな合成画像、を可能にすることができる。典型的な走査電子顕微鏡のビルトインステージに基づくと、多くの場合、約1マイクロメートルの重複領域で十分であることが判明した。
【００５４】
FEI NanoSEM 450走査電子顕微鏡のビルトインステージは、これらの目的のために十分な精度を有することが見出された。しかし、走査電子顕微鏡のビルトインステージの精度が不十分であると分かった場合は、中間の線型並進(linear translation)ステージをビルトインステージに取り付けて、ミクロトームをその中間ステージに取り付けることができる。1つの適切な中間ステージは、Physik Instrument社から市販されているP-625.2 XYピエゾステージである。この場合、ビルトインステージは粗調整を提供し、中間ステージは微調整を提供することができる。
【００５５】
図6Aは、3.1mmの作動距離で撮影された、組織サンプルの走査電子顕微鏡画像である。図6Bは、4.0mmの作動距離で撮影された、同じ組織サンプルの走査電子顕微鏡画像である。図6Cは、4.9mmの作動距離で撮影された、同じ組織サンプルの走査電子顕微鏡画像である。まとめると、図6A〜6Cに示した画像は、作動距離を短くすることによって、組織サンプルのより高い信号対ノイズ比の画像が得られることを示している。これは、以前のミクロトームよりも短い作動距離で走査電子顕微鏡画像を撮ることができるという点で、上述のミクロトームの1つの利点を示している。
【００５６】
典型的な走査電子顕微鏡では、電子ビームに2kVの加速電圧が供給され、サンプルは上述したように接地される。この場合、検出器によって収集される電子は、ほぼ2kV、場合によっては約1.9kVを有する。図7は代替ミクロトーム700を示し、ここでは、サンプル702に電圧が印加される。これは、例えばサンプルに適用された金コーティングを介して、サンプル702をペデスタル704から電気的に絶縁し、サンプル702に電圧を印加することによって達成することができる。これはまた、絶縁体706を設けてペデスタル704を電気的に絶縁し、例えば708で電圧をかけることにより、ペデスタル704に電圧を印加することによっても達成することができる。この場合、ペデスタル704への電圧の印加は、電場線710を生じさせる。
【００５７】
図7は、走査電子顕微鏡の磁極片から出て、走査電子顕微鏡のビーム軸に沿って荷電サンプル702に向けられた電子ビーム712と、サンプル702からの二次電子および後方散乱電子を収集する検出器714を示す。特定の一実施形態では、電子ビーム712に6kVの加速電圧を供給して、サンプル702に-4kVの電圧を供給することが可能である。このシナリオでは、電子ビーム712は、ビーム減速のために、上述の接地されたサンプルの場合と同じエネルギー(2kV)でサンプル702と衝突するが、検出器714によって収集された電子は、ビーム加速のために、6kVに近いエネルギー、場合によっては約5.9kVを有し、より多くの電子が検出器714に戻される。したがって、図7に示した実施形態によって収集されたデータは、より高品質であり、改善された信号対ノイズ比をもつことができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、結果を改善するために電子断層撮影(electron tomography)を使用することができる。電子断層撮影は、電子ビームがサンプルの中心の周りのさまざまな回転度でサンプルに向けられる技術である。図8A〜8Cは、電子断層撮影の用途で使用するのに適した走査電子顕微鏡のミクロトーム800および検出器802の異なる配置を示す。図8Aは、0°の傾斜でのミクロトーム800と、サンプル804の上に配置された検出器802を示す。図8Bは、20°の傾斜でのミクロトーム800と、サンプル804の上に配置された検出器802を示す。図8Cは、20°の傾斜でのミクロトーム800と、電子検出効率を高めるためにサンプル804の側面に配置された検出器802を示す。例示的な傾斜角として20°が示されており、実際には、その角度は広範囲の適切な角度にわたって変化し得る。
【００５９】
得られた電子の収集は、サンプル804の詳細な3次元構造の再構成を可能にする。この技術の1つの利点は、それがサンプル804の3次元構造のより詳細な研究を可能にすること、または(サンプル804の表面から除去された材料のスライスを薄くする必要がないために)精度の低いミクロトームで同様に詳細な研究を可能にすることである。この技術は、サンプル804を回転させる能力を必要とするので、サンプル804の回転を可能にしない既知のミクロトームと組み合わせて用いることはできない。本明細書に記載のミクロトームに関して、サンプル804の回転は、走査電子顕微鏡のステージ(ひいてはミクロトーム800全体)の回転によって、またはピボットベアリングの周りのペデスタルの回転によって行うことができる。
【００６０】
図9A〜9Eは、別の例示的なミクロトーム900を示す。ミクロトーム900は、ミクロトーム100に関して上述した構成要素の多くを含む。ミクロトーム900は、ブレード支持部904をリニアアクチュエータ906に連結する垂直たわみ要素902を含む。垂直たわみ要素902は、ブレード908が前後に振動するときのブレード908の垂直方向の動きを最小限に抑えるので、有利である。ミクロトーム900はまた、サンプル914を電気的に絶縁するための絶縁体910を含む。絶縁体910はポリエーテルエーテルケトン(PEEK)または他の真空対応の材料から製造することができる。ミクロトーム900はまた、サンプル914を切断した後にブレード908をクリーニングすることができるように、スタイロフォームクリーニングロッド(図示せず)が配置されるスロット912を含む。また、ミクロトーム900はヒートシンク916をも含む。ヒートシンク916は、リニアアクチュエータ140が真空チャンバ内で使用されるとき、リニアアクチュエータ140からのさらなる熱放散をもたらす。
【００６１】
図9Bは、別の角度からのミクロトーム900を示す。図9Cは、サンプルが走査電子顕微鏡の電子ビームの下に配置されている撮像構成でのミクロトーム900を示す。図9Dは、ブレード908がサンプル914を切断している切断構成でのミクロトーム900を示す。図9Eは、ブレード908がスロット912内のスタイロフォームクリーニングロッドでクリーニングされ得るクリーニング構成でのミクロトーム900を示す。
【００６２】
図10Aおよび10Bは、サンプルから厚さ15ナノメートルのスライスを除去するために本明細書に記載のミクロトームを用いた連続ブロック面走査電子顕微鏡法の間に作成された組織サンプルの露出表面の走査電子顕微鏡画像である。図10Aは、多くのデータを通してのXY図を示し、一方図10Bは、多くのデータを通してのXZ図を示す。
【００６３】
図11は、別の例示的なミクロトーム1000を示す。ミクロトーム1000は、ミクロトーム900に関して上述した構成要素の多くを含む。ミクロトーム1000は、ブレード支持部1004をリニアアクチュエータ1006に連結する垂直たわみ要素1002を含む。垂直たわみ要素1002は、ブレード1008が前後に振動するときのブレード1008の垂直方向の動きを最小限に抑えるので、有利である。ミクロトーム1000はまた、サンプル1014を電気的に絶縁するための絶縁体1010を含む。絶縁体1010はポリエーテルエーテルケトン(PEEK)または他の真空対応の材料から製造することができる。ミクロトーム1000はまた、サンプル1014を切断した後にブレード1008をクリーニングすることができるように、スタイロフォームクリーニングロッド(図示せず)を配置することができるスロット1012を含む。また、ミクロトーム1000はヒートシンク1016をも含む。ヒートシンク1016は、リニアアクチュエータが真空チャンバ内で使用されるとき、リニアアクチュエータからのさらなる熱放散をもたらす。
【００６４】
ミクロトーム1000はまた、容量センサをその範囲の上端にリセットするためのリニアステージまたはピエゾステージ1020を含むことができる。容量センサは約600ミクロンの範囲を有することができる。600ミクロンの組織にわたって切断した後、リニアステージ1020は、サンプル1014に対してナイフ1008の位置を変えることなく、容量センサ範囲の上端に該センサを上げることができる。これは、Z軸に沿った切断範囲を、600ミクロンからリニアステージ1020の範囲(例えば、約25mm)まで効果的に増大させる。
【００６５】
ミクロトーム1000はまた、ファラデーカップ(Faraday cup)を設置または保持することができる、サンプル1014の隣に配置されたポリマーマウント1022を含むことができる。マウント1022を追加することにより、SEMステージを用いて電子ビームの下でファラデーカップを時々平行移動させることによって電子ビーム電流をモニターすることが可能である。
【００６６】
ミクロトーム1000はまた、(例えば、サンプルを取り付けている間ペデスタルが意図せず旋回しないように)サンプルを取り付けている間ペデスタルを静止状態に保持するためのクランプ1024を含むことができる。クランプ1024は、データ収集が始まったら、取り外すことができる。
【００６７】
この説明のために、本開示の実施形態の特定の態様、利点、および新規な特徴が本明細書に記載されている。開示された方法、装置、およびシステムは、いかなる場合にも限定的であると解釈されるべきではない。むしろ、本開示は、さまざまな開示された実施形態の全ての新規かつ自明でない特徴および態様へと、単独で、または互いとの種々の組み合わせおよび部分的組み合わせで、向けられている。本方法、装置、およびシステムは、いずれかの特定の態様もしくは特徴またはそれらの組み合わせに限定されず、開示された実施形態は、いずれか1つ以上の特定の利点が存在したり、問題が解決されたりすることを必要としない。
【００６８】
本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物、化学的部分または基は、それと両立できない場合を除き、本明細書に記載の他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書(添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む)に開示された特徴の全て、および/または開示された方法もしくはプロセスのステップの全ては、そのような特徴および/またはステップの少なくとも一部が互いに排他的である場合の組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、前述のどの実施形態の詳細にも限定されない。本発明は、本明細書(添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む)に開示された特徴のいずれかの新規なものもしくは新規な組み合わせ、または開示された方法もしくはプロセスのステップのいずれかの新規なものもしくは新規な組み合わせにまで及んでいる。
【００６９】
開示された方法のいくつかの動作は、簡便な提案説明のために特定の連続的な順序で記載されているが、特定の順序付けが特定の言語によって要求されない限り、この記述方法は再配列を包含することを理解すべきである。例えば、連続的に記載された動作は、場合によっては、同時に再配列または実行されてもよい。さらに、簡略化のために、添付の図面は、開示された方法を他の方法と共に使用することができる種々の方法を示しているわけではない。本明細書で使用する用語「1つ」(a, an)および「少なくとも1つ」は、指定された要素の1つ以上を包含する。すなわち、特定の要素が2つ存在する場合、これらの要素の1つもまた存在し、したがって「1つ」の要素が存在する。用語「複数の」(a plurality ofおよびplural)は、指定された要素の2つ以上を意味する。
【００７０】
本明細書で使用する場合、要素のリストの最後の2つの間に使用される「および/または」という用語は、列挙された要素のいずれか1つ以上を意味する。例えば、語句「A、Bおよび/またはC」は、「A」、「B」、「C」、「AとB」、「AとC」、「BとC」、または「AとBとC」を意味する。
【００７１】
本明細書で使用する用語「連結された」は、一般的に、物理的、磁気的、化学的、電気的に、もしくは他の方法で結合または連結されたことを意味し、特定の反対の言語がない限り、連結された要素間の中間要素の存在を排除するものではない。
【００７２】
本明細書に開示された原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、示された実施形態は単なる例であり、本開示の範囲を限定するものではないと認識すべきである。むしろ、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される本発明と少なくとも同じである。したがって、本発明者は、特許請求の範囲に入る全てのものを自分の発明であると主張する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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