(57)【要約】  本明細書には、細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの生成を増加させるための方法および組成物が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させて被験体を処置する方法であって、該細胞は、保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ（ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）を有し、該ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードし、該方法は、被験体の細胞を、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡから構成的に切り出され、それにより、被験体の細胞において、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる、方法。
【請求項２】
保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ（ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）を有している細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる方法であって、該ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードし、該方法は、細胞を、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡから構成的に切り出され、それにより、細胞内で標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる、方法。
【請求項３】
被験体が、標的タンパク質の量または活性の不足または機能ＲＮＡの量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的タンパク質または機能ＲＮＡが、被験体において量または活性が不足している標的タンパク質または機能ＲＮＡを機能的に増強または交換する、補償タンパク質または補償機能ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、標的タンパク質の量または活性の不足または機能ＲＮＡの量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体内にあるか又は被験体に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
標的タンパク質の量の不足が、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで、被験体は、機能的な標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子、標的タンパク質が生成されない第２の対立遺伝子、または非機能性の標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に結合する、請求項３乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
被験体が、標的タンパク質の量または機能の不足から結果として生じる常染色体劣性遺伝疾患によって引き起こされた疾病を有し、ここで被験体は、
ａ．第１の変異対立遺伝子であって、そこから、
ｉ）標的タンパク質が、野生型対立遺伝子からの生成と比較して、低下したレベルで生成される、
ｉｉ）標的タンパク質が、等価な野生型タンパク質と比較して、低下した機能を有する形態で生成される、または
ｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、第１の変異対立遺伝子および
ｂ．第２の変異対立遺伝子であって、そこから、
ｉ）標的タンパク質が、野生型対立遺伝子からの生成と比較して、低下したレベルで生成される、
ｉｉ）標的タンパク質が、等価な野生型タンパク質と比較して、低下した機能を有する形態で生成される、または
ｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、第２の変異対立遺伝子を含み、および
ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、第１の対立遺伝子及び／又は第２の対立遺伝子から転写される、請求項３乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
標的タンパク質が、等価な野生型タンパク質と比較して低下した機能を有する形態で生成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標的タンパク質が、等価な野生型タンパク質と比較して完全に機能的である形態で生成される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分が、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６内の保持されたイントロンにある、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分が、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から＋１００内；または
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６から−１００内の保持されたイントロンにある、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分が、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける領域＋２ｅから−４ｅ内；または
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける領域＋２ｅから−４ｅ内にある、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
アンチセンスオリゴマーが、機能ＲＮＡまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能ＲＮＡの量を増加させない、請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
アンチセンスオリゴマーが、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子の変異から結果として生じる異常スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能ＲＮＡの量を増加させない、請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＲＩＣ プレｍＲＮＡが、全長プレｍＲＮＡの部分的スプライシングまたは野生型プレｍＲＮＡの部分的スプライシングによって生成された、請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡが、全長成熟ｍＲＮＡまたは野生型成熟ｍＲＮＡである、請求項１乃至１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
生成される標的タンパク質が、全長タンパク質または野生型タンパク質である、請求項１乃至１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
アンチセンスオリゴマーと接触された細胞において生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの合計量が、対照細胞において生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの合計量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、 約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、 約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、増加される、請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
アンチセンスオリゴマーと接触された細胞によって生成された標的タンパク質の合計量が、対照細胞によって生成された標的タンパク質の合計量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、 約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、増加される、請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、請求項１乃至１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、または２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む、請求項１乃至２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
アンチセンスオリゴマーが、少なくとも１つの修飾された糖部を含む、請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
各糖部が、修飾された糖部である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アンチセンスオリゴマーが、８〜５０の核酸塩基、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、 １０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５核酸塩基、１１〜３０核酸塩基、１１〜２５核酸塩基、１１〜２０核酸塩基、１１〜１５核酸塩基、１２〜５０核酸塩基、１２〜４０核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、または１２〜１５の核酸塩基から成る、請求項１乃至２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
アンチセンスオリゴマーが、タンパク質をコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である、請求項１乃至２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団を含み、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団は、２つ以上の保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団において最も豊富な保持されたイントロンに結合する、請求項１乃至２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
最も豊富な保持されたイントロンへのアンチセンスオリゴマーの結合が、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するために、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングを誘発する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団を含み、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団は、２つ以上の保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団において２番目に豊富な保持されたイントロンに結合する、請求項１乃至２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
２番目に豊富な保持されたイントロンへのアンチセンスオリゴマーの結合が、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するために、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングを誘発する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
疾病が、疾患また障害である、請求項３乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
疾患または障害が、血栓性血小板減少性紫斑病、結節性硬化症、腎多嚢胞病、家族性自律神経不全、Ｘ型網膜色素変性症、ＸＩ型網膜色素変性症、嚢胞性線維症、網膜芽細胞腫、家族性大腸腺腫症、プロテインＳ欠乏症、βサラセミア、および鎌型赤血球症から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
標的タンパク質およびＲＩＣ プレｍＲＮＡが、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＴＳＣ１、ＰＫＤ１、ＩＫＢＫＡＰ、ＩＭＰＤＨ１、ＰＲＰＦ３１、ＣＦＴＲ、ＲＢ１、ＡＰＣ、ＰＲＯＳ１、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、およびＨＢＢから選択される遺伝子によってコードされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
方法が、タンパク質発現を評価する工程をさらに含む、請求項１乃至３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
アンチセンスオリゴマーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０２から選択されるＲＩＣ プレｍＲＮＡの一部に結合する、請求項１乃至３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
被験体がヒトである、請求項１乃至３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
被験体がヒト以外の動物である、請求項１乃至３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
細胞がエスクビボにある、請求項１乃至３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
アンチセンスオリゴマーが、被験体の硝子体内注射、髄腔内注射、腹膜腔内注射、皮下注射、または静脈内注射によって投与される、請求項１乃至３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
５’スプライス部位に隣接しているエクソンの−３ｅから−１ｅおよび保持されたイントロンの＋１から＋６での９つのヌクレオチドが、対応する野生型配列と同一である、請求項１乃至３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
保持されたイントロンの−１５から−１および３’スプライス部位に隣接しているエクソンの＋１ｅでの１６のヌクレオチドは、対応する野生型配列と同一である、請求項１乃至３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
請求項１乃至３９のいずれかの方法において使用されるアンチセンスオリゴマー。
【請求項４２】
請求項４１のアンチセンスオリゴマーおよび賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４３】
不足したタンパク質または不足した機能ＲＮＡに関係する被験体の疾病を処置するために細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる方法に使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、不足したタンパク質または不足した機能ＲＮＡは、被験体において量または活性が不足しており、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ（ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）の構成的スプライシングを増強させ、ここで標的タンパク質は、
（ａ）不足したタンパク質；または
（ｂ）被験体において不足したタンパク質を機能的に増強または交換する、補償タンパク質であり、
および、機能ＲＮＡは、
（ａ）不足したＲＮＡ；または
（ｂ）被験体において不足した機能ＲＮＡを機能的に増強または交換する、補償機能ＲＮＡであり、
ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡから切り出され、それによって、被験体において標的タンパク質または機能ＲＮＡの生成または活性を増加させる、組成物。
【請求項４４】
被験体において標的タンパク質または機能ＲＮＡに関係する疾患または障害を処置する方法に使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、該方法は、被験体の細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる工程を含み、ここで細胞は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含む、保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ（ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）を有し、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードし、該方法はまた、細胞をアンチセンスオリゴマーと接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡ転写物から構成的に切り出され、それにより、被験体の細胞において、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる、組成物。
【請求項４５】
標的タンパク質または機能ＲＮＡの量または活性の不足から結果として生じる被験体の疾病を処置する方法における使用ための、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
疾病が、疾患また障害である、請求項４３または４５に記載の組成物。
【請求項４７】
疾患または障害が、血栓性血小板減少性紫斑病、結節性硬化症、腎多嚢胞病、家族性自律神経不全、Ｘ型網膜色素変性症、ＸＩ型網膜色素変性症、嚢胞性線維症、網膜芽細胞腫、家族性大腸腺腫症、プロテインＳ欠乏症、βサラセミア、および鎌型赤血球症から選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
標的タンパク質およびＲＩＣ プレｍＲＮＡが、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＴＳＣ１、ＰＫＤ１、ＩＫＢＫＡＰ、ＩＭＰＤＨ１、ＰＲＰＦ３１、ＣＦＴＲ、ＲＢ１、ＡＰＣ、ＰＲＯＳ１、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、およびＨＢＢから選択される遺伝子によってコードされる、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
アンチセンスオリゴマーが、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６内の保持されたイントロンにある、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの一部を標的とする、請求項４３乃至４８のいずれかに記載の組成物。
【請求項５０】
アンチセンスオリゴマーが、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から＋１００内；または
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６から−１００内の保持されたイントロンにある、請求項４３乃至４９のいずれかに記載の組成物。
【請求項５１】
アンチセンスオリゴマーが、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の下流にある約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流にある約１００のヌクレオチドの領域内にある、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの一部を標的とする、請求項４３乃至４８のいずれかに記載の組成物。
【請求項５２】
ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分が、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける領域＋２ｅから−４ｅ内；または
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける領域＋２ｅから−４ｅ内にある、請求項４３乃至４８のいずれかに記載の組成物。
【請求項５３】
アンチセンスオリゴマーが、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能ＲＮＡの量を増加させない、請求項４３乃至５２のいずれかに記載の組成物。
【請求項５４】
アンチセンスオリゴマーが、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子の変異から結果として生じる異常スプライシングを調節することにより機能ＲＮＡまたは機能タンパク質の量を増加させない、請求項４３乃至５３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５５】
ＲＩＣ プレｍＲＮＡが、全長プレｍＲＮＡまたは野生型プレｍＲＮＡから部分的スプライシングによって生成される、請求項４３乃至５４のいずれかに記載の組成物。
【請求項５６】
標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡが、全長成熟ｍＲＮＡまたは野生型成熟ｍＲＮＡである、請求項４３乃至５５のいずれかに記載の組成物。
【請求項５７】
生成される標的タンパク質が、全長タンパク質または野生型タンパク質である、請求項４３乃至５６のいずれかに記載の組成物。
【請求項５８】
保持されたイントロンが、律速のイントロンである、請求項４３乃至５７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５９】
保持されたイントロンが、ＲＩＣ プレｍＲＮＡにおいて最も豊富なイントロンである、請求項４３乃至５８のいずれかに記載の組成物。
【請求項６０】
保持されたイントロンが、ＲＩＣ プレｍＲＮＡにおいて２番目に豊富なイントロンである、請求項４３乃至５８のいずれかに記載の組成物。
【請求項６１】
アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、請求項４３乃至６０のいずれかに記載の組成物。
【請求項６２】
アンチセンスオリゴマーが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４３乃至６１のいずれかに記載の組成物。
【請求項６３】
アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、または２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む、請求項４３乃至６２のいずれかに記載の組成物。
【請求項６４】
アンチセンスオリゴマーが、少なくとも１つの修飾された糖部を含む、請求項４３乃至６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６５】
各糖部が、修飾された糖部である、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
アンチセンスオリゴマーが、８〜５０の核酸塩基、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、 １０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５核酸塩基、１１〜３０核酸塩基、１１〜２５核酸塩基、１１〜２０核酸塩基、１１〜１５核酸塩基、１２〜５０核酸塩基、１２〜４０核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、または１２〜１５の核酸塩基から成る、請求項４３乃至６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６７】
アンチセンスオリゴマーが、タンパク質をコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である、請求項４３乃至６６のいずれかに記載の組成物。
【請求項６８】
アンチセンスオリゴマーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０２から選択されるＲＩＣ プレｍＲＮＡの一部に結合する、請求項４３乃至６７のいずれかに記載の組成物。
【請求項６９】
請求項４１乃至６８の組成物のいずれかのアンチセンスオリゴマー、および賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項７０】
各々がＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的部位にハイブリダイズする１セットのアンチセンスオリゴマーの中から、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーを同定する方法であって、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、少なくとも１つの保持されたイントロンを含み、該セットのアンチセンスオリゴマーは、１〜５のヌクレオチドごとに敷き詰められ、ここで、該セットのアンチセンスオリゴマーは、
少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の上流の約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の下流の約１００のヌクレオチド；または、
少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流の約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の下流の約１００のヌクレオチドである、配列内のＲＩＣ プレｍＲＮＡにハイブリダイズし、
該方法は、
ａ）該セットの第１のアンチセンスオリゴマーをＲＩＣ プレｍＲＮＡを含む細胞に送達する工程；
ｂ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量を測定し、第１のアンチセンスオリゴマーが送達された細胞中で標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；
ｃ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量を測定し、対照細胞中で標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；および
ｄ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡと、工程ｂ）およびｃ）で測定された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量とを比較する工程、を含み、
ここで、第１のアンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量の観察された減少、および対照細胞と比較した第１のアンチセンスオリゴマーが送達された細胞における標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量の観察された増加に基づいて、ＲＩＣ プレｍＲＮＡから少なくとも１つの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーとして同定され、該方法はまた、
ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって細胞中の遺伝子からｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーを同定するために必要に応じて、該セットのアンチセンスオリゴマーにおいて追加のアンチセンスオリゴマーを用いて、工程ａ）からｄ）を繰り返す工程を含む、方法。
【請求項７１】
疾病を処置するためのアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を同定する方法であって、該疾病は遺伝子産物の不十分な生成から結果として生じ、該方法は、
該疾病を有する被験体から細胞の核内の少なくとも１つのＲＩＣ プレｍＲＮＡの存在を同定する工程を含み、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、少なくとも１つの保持されたイントロンを含み、遺伝子産物をコードする遺伝子から転写され、および成熟ｍＲＮＡに完全に切り出されたときの同定されたＲＩＣ プレｍＲＮＡは、完全に機能的または部分的に機能的である形態で遺伝子産物をコードし、該方法はまた、
ａ）各々が少なくとも１つのＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的部位にハイブリダイズする１セットのＡＳＯを調製する工程であって、該セットのアンチセンスオリゴマーが、１〜５のヌクレオチドごとに敷き詰められ、該セットのＡＳＯが、
少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の上流の約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の下流の約１００のヌクレオチド；または、
少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流の約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の下流の約１００のヌクレオチドである、配列内の少なくとも１つのＲＩＣ プレｍＲＮＡにハイブリダイズする、工程；
ｂ）該セットのＡＳＯにおける第１のＡＳＯを少なくとも１つのＲＩＣ プレｍＲＮＡを含む細胞に送達する工程；
ｃ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量を測定し、第１のアンチセンスオリゴマーが送達された細胞における遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；
ｄ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量を測定し、対照細胞における遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；および
ｅ）工程ｃ）およびｄ）で得られた値を比較する工程、を含み、
ここで、第１のアンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量の観察された減少、および対照細胞と比較した第１のアンチセンスオリゴマーが送達された細胞における遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量の観察された増加に基づいて、ＲＩＣ プレｍＲＮＡから少なくとも１つの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって、遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーとして同定され、該方法はまた、
ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって細胞中の遺伝子から遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーを同定するために必要に応じて、該セットのアンチセンスオリゴマーにおいて追加のアンチセンスオリゴマーを用いて、工程ａ）からｅ）を繰り返す工程；
さらに、細胞によって生成された遺伝子産物の量を増加させる能力に関して、ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって、細胞における遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を増加させる、そのようなアンチセンスオリゴマーを試験する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜相互参照＞
本発明は、２０１４年１０月３日に出願の、米国仮特許出願第６２／０５９，８４７号の利益を主張し、これは引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
幾つかの遺伝子疾患は、ハプロ不全によって引き起こされ、該ハプロ不全では、１つのみの機能的な遺伝子のコピーがあり、単一のコピーが十分な遺伝子産物を生成しない。例えば、これは、遺伝子の１つのコピーが失われる、ヘミ接合体欠失によって引き起こされ得る。他の遺伝子疾患は、遺伝子産物を変更する変異によって引き起こされ、その結果、遺伝子産物は部分的な機能のみを有する。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書で記載されるように、アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）は、イントロン含有遺伝子のイントロン・スプライス部位で（野生型配列を利用する）構成的スプライシングを促進して、遺伝子産物の発現を増加させることによって、タンパク質の生成、または非タンパク質コード遺伝子の場合には機能ＲＮＡを増加させるために使用され得る。これらの方法を使用するために記載されているＡＳＯは、構成的スプライシングを促進して、変異から結果的に生じる異常スプライシングを訂正しない、あるいは構成的スプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を促進して、選択的スプライシングを調節しない。それ故、本明細書に記載される方法は、遺伝子産物の減少された発現または不十分な活性から結果として生じる疾病を処置するために使用され得る。
【０００４】
本明細書には、少なくとも１つの保持されたイントロンを含むプレｍＲＮＡ（ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）によってコードされた標的タンパク質の細胞における発現を増加させる方法が記載され、保持されたイントロンは、他のイントロンの１つ以上が切り出された（ｓｐｌｉｃｅｄ ｏｕｔ）（除去された）ときに存在したままであるイントロンである。標的タンパク質の発現は、細胞質に続けて輸出され、標的タンパク質へと翻訳される成熟ｍＲＮＡを生成するために、核内のプレｍＲＮＡにおけるすべてのイントロンの完全なスプライシング（除去）に依存する。イントロンの非効率的なスプライシング（除去）は、主として核内に蓄積する、および細胞質に輸出された場合に、標的タンパク質に翻訳されないように分解される、保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）プレｍＲＮＡを結果としてもたらす。本明細書の方法による記載されるアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）での処置は、プレｍＲＮＡ転写物（１つ以上のイントロンを含むプレｍＲＮＡ種）からの保持されたイントロンのスプライシングを促進し、ｍＲＮＡの増加を結果としてもたらすことができ、これは、より高いレベルの標的タンパク質を提供するために翻訳される。
【０００５】
実施形態では、該方法は、保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ（ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）を有している細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる方法であり、該ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここでＲＩＣ プレｍＲＮＡは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする。実施形態では、該方法は、細胞を、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的なＡＳＯと接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡから構成的に切り出され、それにより、細胞内で標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる。実施形態では、細胞は、被験体内にあるか又は被験体に由来し、該方法は、被験体の細胞内の標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させて被験体を処置する方法である。実施形態では、細胞は、標的タンパク質の量または活性の不足または機能ＲＮＡの量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体内にあるか又は被験体に由来する。実施形態では、標的タンパク質または機能ＲＮＡは、被験体において量または活性が不足している標的タンパク質または機能ＲＮＡを機能的に増強または交換する、補償（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）タンパク質または補償機能ＲＮＡである。
【０００６】
実施形態では、標的タンパク質の量または活性の不足または機能ＲＮＡの量または活性の不足によって引き起こされた疾病は、ＡＳＯが標的とされる保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングによって引き起こされた疾病ではない。
実施形態では、標的タンパク質の量または活性の不足または機能ＲＮＡの量または活性の不足によって引き起こされた疾病は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの中の任意の保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングによって引き起こされる疾病ではない。
【０００７】
実施形態では、標的タンパク質の量の不足は、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで、被験体は、機能的な標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子、標的タンパク質が生成されない第２の対立遺伝子、または非機能性の標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に結合する。
【０００８】
他の実施形態では、被験体は、標的タンパク質の量または機能の不足から結果として生じる常染色体劣性遺伝疾患によって引き起こされた疾病を有し、ここで被験体は、ａ）第１の変異対立遺伝子であって、そこから、ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して低下したレベルで生成される、ｉｉ）標的タンパク質が等価な野生型タンパク質と比較して低下した機能を有する形態で生成される、またはｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、第１の変異対立遺伝子、および第２の変異対立遺伝子であって、そこから、ｂ）ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して低下したレベルで生成される、ｉｉ）標的タンパク質が等価な野生型タンパク質と比較して低下した機能を有する形態で生成される。またはｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、第２の変異対立遺伝子を含み、ここでＲＩＣ プレｍＲＮＡは、第１の対立遺伝子及び／又は第２の対立遺伝子から転写される。実施形態では、標的タンパク質は、低下したレベル、および等価な野生型タンパク質と比較して低下した機能を有する形態の両方で生成される。
【０００９】
実施形態では、標的タンパク質は、等価な野生型タンパク質と比較して低下した機能を有する形態で生成される。他の実施形態では、標的タンパク質は、等価な野生型タンパク質と比較して完全に機能的である形態で生成される。
【００１０】
実施形態では、機能ＲＮＡの量の不足は、機能ＲＮＡのハプロ不全によって引き起こされ、ここで被験体は、機能的である機能ＲＮＡをコードする第１の対立遺伝子、機能ＲＮＡが生成されない第２の対立遺伝子、または非機能性である機能ＲＮＡをコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に結合する。
【００１１】
他の実施形態では、被験体は、機能ＲＮＡの量または機能の不足から結果として生じる常染色体劣性遺伝疾患によって引き起こされた疾病を有し、ここで被験体は、ａ）ｉ）機能ＲＮＡが野生型対立遺伝子からの生成と比較して低下したレベルで生成される、ｉｉ）機能ＲＮＡが等価な野生型タンパク質と比較して低下した機能を有する形態で生成される。またはｉｉｉ）機能ＲＮＡが生成されない、第１の変異対立遺伝子、およびｂ）ｉ）機能ＲＮＡが野生型対立遺伝子からの生成と比較して低下したレベルで生成される、ｉｉ）機能ＲＮＡが等価な野生型タンパク質と比較して低下した機能を有する形態で生成される。またはｉｉｉ）機能ＲＮＡが生成されない、第２の変異対立遺伝子を含み、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、第１の対立遺伝子及び／又は第２の対立遺伝子から転写される。実施形態では、機能ＲＮＡは、低下したレベル、および等価な野生型機能ＲＮＡと比較して、低下した機能を有する形態の両方で生成される。
【００１２】
実施形態では、機能ＲＮＡは、等価な野生型タンパク質と比較して低下した機能を有する形態で生成される。他の実施形態では、機能ＲＮＡは、等価な野生型タンパク質と比較し、完全に機能的である形態で生成される。
【００１３】
実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６内の保持されたイントロンにある。実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６かた＋１００内の保持されたイントロン内；または保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６から−１００内の保持されたイントロンにある。実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける領域＋２ｅから−４ｅ内；または保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける領域＋２ｅから−４ｅ内にある。
【００１４】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、機能ＲＮＡまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能ＲＮＡの量を増加させない。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子の変異から結果として生じる異常スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能ＲＮＡの量を増加させない。
【００１５】
実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、全長プレｍＲＮＡの部分的スプライシングまたは野生型プレｍＲＮＡの部分的スプライシングによって生成された。実施形態では、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長成熟ｍＲＮＡまたは野生型成熟ｍＲＮＡである。実施形態では、生成された標的タンパク質は、全長タンパク質または野生型タンパク質である。実施形態では、生成された機能ＲＮＡは、全長機能ＲＮＡまたは野生型機能ＲＮＡである。
【００１６】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触された細胞において生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする、ｍＲＮＡの合計量または成熟ｍＲＮＡの合計量は、対照細胞において生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする、ｍＲＮＡの合計量または成熟ｍＲＮＡの合計量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、増加される。
【００１７】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触された細胞において生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの合計量は、対照細胞において生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの合計量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、増加される。
【００１８】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触された細胞において生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする成熟ｍＲＮＡの合計量は、対照細胞において生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする成熟ｍＲＮＡの合計量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、４倍から約７倍、約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、増加される。
【００１９】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーと接触された細胞によって生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡの合計量は、対照細胞によって生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡの量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、４倍から約７倍、約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、増加される。
【００２０】
実施形態では、該方法は、ＲＩＣ プレｍＲＮＡを有する細胞を、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むアンチセンスオリゴマーと接触させる工程を含む。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、または２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの修飾された糖部を含む。関連する実施形態では、各糖部は、修飾された糖部である。
【００２１】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、８〜５０の核酸塩基から成る。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、１０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５核酸塩基、１１〜３０核酸塩基、１１〜２５核酸塩基、１１〜２０核酸塩基、１１〜１５核酸塩基、１２〜５０核酸塩基、１２〜４０核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、または１２〜１５の核酸塩基から成る。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である。
【００２２】
前の方法のいずれかにおいて、細胞は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団を含むことができ、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団は、２つ以上の保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団において最も豊富な保持されたイントロンに結合する。これらの実施形態では、最も豊富な保持されたイントロンへのアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するために、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングを誘発することができる。
【００２３】
他の実施形態では、細胞は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団を含み、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団は、２つ以上の保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団において２番目に豊富な保持されたイントロンに結合する。これらの実施形態では、２番目に豊富な保持されたイントロンへのアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するために、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングを誘発することができる。
【００２４】
前の方法では、疾病は疾患または障害であり得る。これらの実施形態では、疾患または障害は、以下から選択され得る：血栓性血小板減少性紫斑病、結節性硬化症、腎多嚢胞病、家族性自律神経不全、Ｘ型網膜色素変性症、ＸＩ型網膜色素変性症、嚢胞性線維症、網膜芽細胞腫、家族性大腸腺腫症、プロテインＳ欠乏症、βサラセミア、および鎌型赤血球症。関連する実施形態では、標的タンパク質およびＲＩＣ プレｍＲＮＡは、以下から選択される遺伝子によってコードされる：ＡＤＡＭＴＳ１３、ＴＳＣ１、ＰＫＤ１、ＩＫＢＫＡＰ、ＩＭＰＤＨ１、ＰＲＰＦ３１、ＣＦＴＲ、ＲＢ１、ＡＰＣ、ＰＲＯＳ１、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、およびＨＢＢ。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０２から選択されるＲＩＣ プレｍＲＮＡの一部に結合することができる。
【００２５】
実施形態では、前の方法はいずれも、タンパク質発現を評価する工程をさらに含む。
【００２６】
幾つかの実施形態では、被験体はヒトである。他の実施形態では、被験体はヒト以外の動物である。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、被験体の硝子体内注射、髄腔内注射、腹膜腔内注射、皮下注射、または静脈内注射によって投与される。実施形態では、細胞はエスクビボにある。
【００２７】
実施形態では、５’スプライス部位に隣接しているエクソンの−３ｅから−１ｅおよび保持されたイントロンの＋１から＋６での９つのヌクレオチドは、対応する野生型配列と同一である。実施形態では、保持されたイントロンの−１５から−１および３’スプライス部位に隣接しているエクソンの＋１ｅでの１６のヌクレオチドは、対応する野生型配列と同一である。
【００２８】
本明細書には、本明細書で記載されるような方法に使用されるアンチセンスオリゴマーを含む組成物が記載される。また、アンチセンスオリゴマーおよび賦形剤を含む医薬組成物が記載される。実施形態では、アンチセンスオリゴマーを含む組成物は、不足したタンパク質または不足した機能ＲＮＡに関係する被験体の疾病を処置するために、細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる方法における使用を意図しており、ここで、不足したタンパク質または不足した機能ＲＮＡは、被験体において量または活性が不足しており、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ（ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）の構成的スプライシングを増強させ、ここで標的タンパク質は、（ａ）不足したタンパク質；または（ｂ）被験体において不足したタンパク質を機能的に増強または交換する、補償タンパク質を含み、および機能ＲＮＡは、（ａ）不足したＲＮＡ；または（ｂ）被験体において不足した機能ＲＮＡを機能的に増強または交換する、補償機能ＲＮＡであり、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここで、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡから切り出され、それによって、被験体において標的タンパク質または機能ＲＮＡの生成または活性を増加させる。
【００２９】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーを含む組成物は、被験体において標的タンパク質または機能ＲＮＡに関係する疾患または障害を処置する方法における使用を意図しており、該方法は、被験体の細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる工程を含み、ここで細胞は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含む、保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ（ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）を有し、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードし、該方法はまた、細胞をアンチセンスオリゴマーと接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡ転写物から構成的に切り出され、それにより、被験体の細胞において、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる。
【００３０】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーを含む組成物は、標的タンパク質または機能ＲＮＡの量または活性の不足から結果として生じる被験体の疾病を処置する方法における使用を意図している。実施形態では、疾病は、疾患また障害である。実施形態では、疾患または障害は、以下から選択される：血栓性血小板減少性紫斑病、結節性硬化症、腎多嚢胞病、家族性自律神経不全、Ｘ型網膜色素変性症、ＸＩ型網膜色素変性症、嚢胞性線維症、網膜芽細胞腫、家族性大腸腺腫症、プロテインＳ欠乏症、βサラセミア、および鎌型赤血球症。実施形態では、組成物は、標的タンパク質およびＲＩＣ プレｍＲＮＡが以下から選択される遺伝子によってコードされる方法における使用を意図している。ＡＤＡＭＴＳ１３、ＴＳＣ１、ＰＫＤ１、ＩＫＢＫＡＰ、ＩＭＰＤＨ１、ＰＲＰＦ３１、ＣＦＴＲ、ＲＢ１、ＡＰＣ、ＰＲＯＳ１、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、およびＨＢＢ。
【００３１】
実施形態では、組成物のアンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６内の保持されたイントロンにある、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの一部を標的とする。実施形態では、組成物のアンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から＋１００、または保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６から−１００内の保持されたイントロンにある、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの一部を標的とする。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の下流にある約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流にある約１００のヌクレオチドの領域内にある、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの一部を標的とする。実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから−４ｅの領域、または保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから−４ｅの領域内にある。
【００３２】
実施形態では、組成物のアンチセンスオリゴマーまたは本明細書に記載される方法に使用されるようなアンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能ＲＮＡの量を増加させない。実施形態では、組成物のアンチセンスオリゴマーまたは本明細書に記載される方法に使用されるようなアンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子の変異から結果として生じる異常スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能ＲＮＡの量を増加させない。
【００３３】
実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、全長プレｍＲＮＡまたは野生型プレｍＲＮＡから部分的スプライシングによって生成された。実施形態では、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長成熟ｍＲＮＡまたは野生型成熟ｍＲＮＡである。実施形態では、生成される標的タンパク質は、全長タンパク質または野生型タンパク質である。実施形態では、生成される機能ＲＮＡは、全長機能ＲＮＡまたは野生型機能ＲＮＡである。
【００３４】
実施形態では、保持されたイントロンは、律速の（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）イントロンである。実施形態では、保持されたイントロンは、前記ＲＩＣ プレｍＲＮＡにおいて最も豊富なイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンは、前記ＲＩＣ プレｍＲＮＡにおいて２番目に豊富なイントロンである。
【００３５】
実施形態では、組成物のアンチセンスオリゴマーまたは本明細書に記載される方法に使用されるようなアンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３６】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、または２’−Ｏ−メトキシエチル部分を含む。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの修飾された糖部を含む。関連する実施形態では、各糖部は、修飾された糖部である。
【００３７】
アンチセンスオリゴマーは、８〜５０の核酸塩基から成り得る。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、１０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５核酸塩基、１１〜３０核酸塩基、１１〜２５核酸塩基、１１〜２０核酸塩基、１１〜１５核酸塩基、１２〜５０核酸塩基、１２〜４０核酸塩基、１２〜３５の核酸塩基、１２〜３０の核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、または１２〜１５の核酸塩基から成る。
【００３８】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である。実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０２から選択されるＲＩＣ プレｍＲＮＡの一部に結合する。
【００３９】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、賦形剤を含む医薬組成物に含まれる。
【００４０】
本明細書には、各々がＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的部位にハイブリダイズする１セットのアンチセンスオリゴマーの中から、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーを同定する方法が記載され、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、少なくとも１つの保持されたイントロンを含み、該セットのアンチセンスオリゴマーは、１〜５のヌクレオチドごとに敷き詰められ（ｔｉｌｅｄ）、および該セットのアンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の上流の約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の下流の約１００のヌクレオチド、または少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流の約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の下流の約１００のヌクレオチドである、配列内のＲＩＣ プレｍＲＮＡにハイブリダイズし、該方法は、ａ）該セットの第１のアンチセンスオリゴマーをＲＩＣ プレｍＲＮＡを含む細胞に送達する工程；ｂ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量を測定し、第１のアンチセンスオリゴマーが送達された細胞中で標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；ｃ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量を測定し、対照細胞中で標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；およびｄ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡと、工程ｂ）およびｃ）で測定された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量とを比較する工程、を含み、ここで、第１のアンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量の観察された減少、および対照細胞と比較した第１のアンチセンスオリゴマーが送達された細胞における標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量の観察された増加に基づいて、ＲＩＣ プレｍＲＮＡから少なくとも１つの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーとして同定され、該方法はまた、ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって細胞中の遺伝子からｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーを同定するために必要に応じて、該セットのアンチセンスオリゴマーにおいて追加のアンチセンスオリゴマーを用いて、工程ａ）からｄ）を繰り返す工程を含む。
【００４１】
本明細書にはまた、疾病を処置するためのアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を同定する方法が記載され、ここで該疾病は遺伝子産物の不十分な生成から結果として生じ、該方法は、該疾病を有する被験体から細胞の核内の少なくとも１つのＲＩＣ プレｍＲＮＡの存在を同定する工程を含み、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、少なくとも１つの保持されたイントロンを含み、遺伝子産物をコードする遺伝子から転写され、および成熟ｍＲＮＡに完全に切り出されたときの同定されたＲＩＣ プレｍＲＮＡは、完全に機能的または部分的に機能的である形態で遺伝子産物をコードし、該方法はまた、ａ）各々が少なくとも１つのＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的部位にハイブリダイズする１セットのＡＳＯを調製する工程であって、該セットのアンチセンスオリゴマーが、１〜５のヌクレオチドごとに敷き詰められ、該セットのＡＳＯが、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の上流の約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の下流の約１００のヌクレオチド、または少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流の約１００のヌクレオチドから、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の下流の約１００のヌクレオチドである、少なくとも１つの配列内のＲＩＣ プレｍＲＮＡにハイブリダイズする、工程；ｂ）該セットのＡＳＯにおける第１のＡＳＯを少なくとも１つのＲＩＣ プレｍＲＮＡを含む細胞に送達する工程；ｃ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量を測定し、第１のアンチセンスオリゴマーが送達された細胞における遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；ｄ）ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量を測定し、対照細胞における遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を測定する工程；およびｅ）工程ｃ）およびｄ）で得られた値を比較する工程、を含み；ここで、第１のアンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの量の観察された減少、および対照細胞と比較した第１のアンチセンスオリゴマーが送達された細胞における遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量の観察された増加に基づいて、ＲＩＣ プレｍＲＮＡから少なくとも１つの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって、遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーとして同定され、該方法はまた、ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって細胞中の遺伝子から遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を増加させるアンチセンスオリゴマーを同定するために必要に応じて、該セットのアンチセンスオリゴマーにおいて追加のアンチセンスオリゴマーを用いて、工程ａ）からｅ）を繰り返す工程；さらに、細胞によって生成された遺伝子産物の量を増加させる能力に関して、ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発することによって、細胞における遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を増加させる、そのようなアンチセンスオリゴマーを試験する工程を含む。
【００４２】
＜参照による組み込み＞
本明細書で挙げられるすべての出願、特許、特許出願は、個々の出願、特許、特許出願がそれぞれ引用によって組み込まれるように具体的且つ個別に示される程度まで、引用によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
添付の図面は、一定の比率の縮尺で描かれるようには意図されていない。図面は、単に例示であり、本開示の実施には必要とされない。明瞭さの目的で、すべての図面において、すべての構成要素が標識付けされてはいない。
【００４４】
【図１】図１は、典型的な保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）プレｍＲＮＡ転写物の略図を示す。５’スプライス部位コンセンサス配列は、−３ｅから−１ｅおよび＋１から＋６（「ｅ」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである）まで下線を引かれた文字（文字はヌクレオチドである；大文字：エクソン部分、および小文字：イントロン部分）で示されている。３’スプライス部位コンセンサス配列は、−１５から−１および＋１ｅ（「ｅ」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである）まで下線を引かれた文字（文字はヌクレオチドである；大文字：エクソン部分、および小文字：イントロン部分）で示されている。ＡＳＯスクリーニングのためのイントロン標的部位は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋６（左の矢印）から、保持されたイントロンの３’スプライス部位対する−１６（右の矢印）までのヌクレオチドを含む。実施形態では、ＡＳＯスクリーニングのためのイントロン標的部位は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋６から＋１００のヌクレオチド、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する−１６から−１００のヌクレオチドを含む。エクソン標的部位は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから−４ｅのヌクレオチド、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから−４ｅのヌクレオチドを含む。「ｎ」または「Ｎ」は、あらゆるヌクレオチドを示し、「ｙ」はピリミジンを示す。示される配列は、哺乳動物のスプライス部位のためのコンセンサス配列を表わし、個々のイントロンおよびエクソンは、あらゆる位置でコンセンサス配列と一致する必要はない。
【図２Ａ】図２Ａは、核内遺伝子出力の標的とされた増強（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅ Ｏｕｔｐｕｔ）（ＴＡＮＧＯ）のアプローチの略図を示す。図２Ａは、核と細胞質の区画に分割された細胞を示す。核内では、エクソン（長方形）およびイントロン（接続線）から成る標的遺伝子のプレｍＲＮＡ転写は、ｍＲＮＡを生成するためにスプライシングを受け、このｍＲＮＡは、細胞質に輸出され、標的タンパク質へと翻訳される。この標的遺伝子に関して、イントロン１のスプライシングは非効率的であり、保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）プレｍＲＮＡは、主として核に蓄積し、細胞質に輸出されない場合、分解されて、標的タンパク質は生成されない。
【図２Ｂ】図２Ｂは、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）のアプローチの略図を示す。図２Ｂは、核と細胞質の区画に分割された同じ細胞の例を示す。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）による処置は、イントロン１のスプライシングを促進し、ｍＲＮＡの増加を結果としてもたらし、ｍＲＮＡは、順に、より高いレベルの標的タンパク質へと翻訳される。
【図３】図３は、７−エクソン／６−イントロン遺伝子の、実施例１に記載されるような、ＲＴ−ＰＣＲを使用する、イントロン保持のためのスクリーニングの例の略図を示す。番号が付けられた長方形は、イントロンを示す線によって接続されたエクソンを示す。アーチ形の矢印はスプライシング事象を示す。短い横棒は、イントロン保持を評価するために使用されるプライマー対を示す。フォワードプライマーは「Ｆ」で示され、リバースプライマーは「Ｒ」で示され、つまりＦ１とＲ１、Ｆ２とＲ２、Ｆ３とＲ３、Ｆ４とＲ４、Ｆ５とＲ５、およびＦ６とＲ６が対である。イントロンは、そのようなイントロンが存在し、隣接したイントロンが切り出される（除去される）ことが観察されるときに、保持されたイントロンとして同定される。
【図４】図４は、７−エクソン／６−イントロン遺伝子の、実施例２に記載されるように、ＲＴ−ＰＣＲを使用してイントロン保持を確認するためのスクリーニングの例の略図を示す。番号が付けられた長方形は、イントロンを示す線によって接続されたエクソンを示す。アーチ形の矢印はスプライシング事象を示す。短い横棒は、イントロン保持を評価するために使用されるプライマー対を示す。フォワードプライマーは「Ｆ」で示され、リバースプライマーは、「Ｒ１」、「Ｒ２」、または「Ｒ３」で標識される。イントロンは、そのようなイントロンが存在し、１つ以上の隣接したイントロンが切り出される（除去される）ことが観察されるときに、保持されたイントロンとして確認される。
【図５】図５は、イントロン除去効率を判定するための典型的なＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）の略図を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例１に記載されるような、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１の遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。図６Ａは、ＰＲＰＦ３１遺伝子の略図を示し、番号が付けられた長方形はエクソンを示し、イントロンは介在線（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｌｉｎｅｓ）を示す。フォワード（「Ｆ」）また、リバース（「Ｒ」）プライマーは、短線によって示されている。下記は、ＰＲＰＦ３１におけるイントロン保持事象に対応するＲＴ−ＰＣＲ産物を示す代表的なゲルである。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１．５％のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル中で分離された。上のゲルはＨｅＬａ細胞の核画分からの産物に対応し、下のゲルは２９３Ｔ細胞からの核画分からの産物に対応する。アスタリスクは、イントロン保持事象のための正しい産物（サイズによる）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例１に記載されるような、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１の遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。図６Ｂは、ＲＢ１遺伝子の略図を示し、番号が付けられた長方形はエクソンを示し、イントロンは介在線を示す。下記は、ＲＢ１におけるイントロン保持事象に対応するＨｅＬａ核抽出物からのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す代表的なゲルである。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１．５％のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル中で分離された。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例１に記載されるような、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１の遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。図６Ｃは、ＲＢ１におけるイントロン保持事象に対応する２９３Ｔ細胞核抽出物からのＲＴ−ＰＣＲ産物の代表的なゲルを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、実施例１に記載されるような、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１の遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。図６Ｄは、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１におけるイントロン保持事象に対応するＡＲＰＥ−１９細胞核抽出物からのＲＴ−ＰＣＲ産物の代表的なゲルを示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１．５％のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル中で分離された。
【図６Ｅ】図６Ｅは、実施例１に記載されるような、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１の遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。図６Ｅは、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１におけるイントロン保持事象に対応するＡＲＰＥ−１９細胞の細胞性抽出物からのＲＴ−ＰＣＲ産物の代表的なゲルを示す。ＩＶＳ：介在配列（イントロン）。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例２に記載されるような、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１の遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。図７Ａは、ＰＲＰＦ３１におけるイントロン保持事象に対応するＲＴ−ＰＣＲ産物の代表的なゲルを示す。Ａｒｐｅ−１９細胞核抽出物からのＲＴ−ＰＣＲ産物は、１．５％のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル中で分離された。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例２に記載されるような、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１の遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。図７Ｂは、ＲＢ１におけるイントロン保持事象に対応するＲＴ−ＰＣＲ産物の代表的なゲルを示す。Ａｒｐｅ−１９細胞核抽出物からのＲＴ−ＰＣＲ産物は、１．５％のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル中で分離された。アスタリスクは、示されたプライマー対を使用する、イントロン保持事象のための正しい産物（サイズによる）を示す。ＩＶＳ：介在配列（イントロン）。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例３に記載されるような、スプライス部位の変異誘発を介してスプライシング効率を促進することによる遺伝子発現の増加を示す。図８Ａは、エクソンを示す番号が付けられた長方形を含む、ＨＢＢレポーター遺伝子の略図を示す。実際のＨＢＢスプライス部位配列は、イントロン−エクソンの境界を印して示される。アスタリスクで示されるスプライス部位配列内のヌクレオチドは、スプライス部位配列をコンセンサス配列（ＨＢＢスプライス部位の直下の配列）にもたらすための部位特異的変異誘発によって誘導されたヌクレオチド置換の場所を示す。Ａ：ＩＶＳ１ ５’スプライス部位変異体、Ｂ：ＩＶＳ１ ３’スプライス部位変異体、Ｃ：ＩＶＳ２ ５’スプライス部位変異体、Ｄ：ＩＶＳ２ ３’スプライス部位変異体。ＡＢ、ＣＤ、ＡＣおよびＢＤ：変異体の組み合わせ。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例３に記載されるような、スプライス部位の変異誘発を介してスプライシング効率を促進することによる遺伝子発現の増加を示す。図８Ｂは、野生型（ＷＴ）および変異体のＨＢＢレポーターの放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物の代表的なゲルを示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、５％のポリアクリルアミドゲル中で分離された。
【図８Ｃ】図８Ｃは、実施例３に記載されるような、スプライス部位の変異誘発を介してスプライシング効率を促進することによる遺伝子発現の増加を示す。図８Ｃは、ＧＦＰに正規化されたＨＢＢ転写物に対応するバンドの強度の棒グラフを示す。倍率変化は、ＷＴ ＨＢＢ産物に対してプロットされた。黒線は１の比率を示し、変化はない。
【図９Ａ】図９Ａは、実施例３に記載されるように、ＨＢＢ ＩＶＳ１’５スプライス部位のすぐ下流のＡＳＯを標的とする配列がＨＢＢ ｍＲＮＡを増加させることを示している。図９Ａは、ＨＢＢレポーター遺伝子の略図を示す。番号が付けられた長方形はエクソンを示し、介在線はイントロンを示す。オレンジ色の線はＩＶＳ１＋６ ＡＳＯ（「＋６」）を示し、灰色の線はＩＶＳ１＋７ ＡＳＯ（「＋７」）を示す。黒色の線は、ＨＢＢ転写物のＰＣＲ増幅に使用されるフォワード（「Ｆ」）またリバース（「Ｒ」）プライマーを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例３に記載されるように、ＨＢＢ ＩＶＳ１’５スプライス部位のすぐ下流のＡＳＯを標的とする配列がＨＢＢ ｍＲＮＡを増加させることを示している。図９Ｂは、示された濃度での、未処理（−）、模擬処理された（ＲｉＭ、ＲＮＡｉＭＡＸまたはＥＰ、ＥｎｄｏＰｏｒｔｅｒ）、非標的（ＮＴ）、またはＩＶＳ１＋７ ２’−Ｏ−Ｍｅ（ゲルの左の部分）またはＰＭＯ（ゲルの右の部分）のＡＳＯで処理された、野生型ＨＢＢレポーターの放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物の代表的なゲルを示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、５％のポリアクリルアミドゲル中で分離された。
【図９Ｃ】図９Ｃは、実施例３に記載されるように、ＨＢＢ ＩＶＳ１’５スプライス部位のすぐ下流のＡＳＯを標的とする配列がＨＢＢ ｍＲＮＡを増加させることを示している。図９Ｃは、ＧＦＰに正規化されたＨＢＢ転写物に対応するバンドの強度の棒グラフを示す。倍率変化は、模擬処理された細胞からの産物に対してプロットされた。緑色のバーは、ＩＶＳ＋７ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯによる処置に対応し、オレンジ色のバーは、ＩＶＳ＋７ ＰＭＯ ＡＳＯによる処置に対応する。黒線は１の比率を示し、変化はない。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例４に記載されるように、ＨＢＢ ＩＶＳ１’５スプライス部位のすぐ下流のＩＶＳ１＋７ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯを標的とする配列がＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７タンパク質レベルを増加させることを示している。図１０Ａは、Ｕ２ＯＳ細胞のゲノムに統合されたＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７レポーター遺伝子の略図を示す。「ＧＦＰ」と標識された長方形はＧＦＰのオープンリーディングフレームを示し、番号が付けられた長方形はＨＢＢエクソンを示し、介在線はイントロンを示し、および「Ｔ７」と標識された長方形はＴ７タグをコード化する配列を示す。「＋７」と標識された線は、ＩＶＳ１＋７ ＡＳＯを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例４に記載されるように、ＨＢＢ ＩＶＳ１’５スプライス部位のすぐ下流の配列を標的とするＩＶＳ１＋７ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯがＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７タンパク質レベルを増加させることを示している。図１０Ｂは、５０ｎＭの濃度での、模擬処理された（ＲｉＭ、ＲＮＡｉＭＡＸ）またはＩＶＳ１＋７ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯで処理された、野生型ＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７レポーターのタンパク質生成物の代表的なゲルを示す。タンパク質生成物は、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離された。ＧＦＰおよびβチューブリンに対する抗体は、タンパク質生成物を検出するために使用された。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、実施例４に記載されるように、ＨＢＢ ＩＶＳ１’５スプライス部位のすぐ下流の配列を標的とするＩＶＳ１＋７ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯがＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７タンパク質レベルを増加させることを示している。図１０Ｃは、２つの生物学的複製物からβチューブリンに正規化されたＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７タンパク質に対応するバンドの強度の棒グラフを示す。倍率変化は、模擬処理された細胞からの産物に対してプロットされた。黒線は１の比率を示し、変化はない。
【図１１】図１１は、実施例５に記載されるように、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーにおいて視覚化された、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を使用するＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。上のパネルは、ＴＨＬＥ−３（ヒトの肝臓上皮）細胞において発現され、細胞質（上）または核分画（下）のいずれかにおいて局在化された、ＡＤＡＭＴＳ１３転写物に対応する読取密度を示す。このパネルの下部に、ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子のすべてのｒｅｆｓｅｑ．アイソフォームのグラフ表示が、一定の縮尺で示される。読取密度はピークとして示される。最も高い読取密度はエクソン（ブラックボックス）に対応し、一方で、細胞画分のいずれにおいてもイントロンのほとんどにおいて読み取り（ｒｅａｄｓ）は観察されていない（矢印の先端を有する線）。イントロン２５および２７のスプライシング効率が低いことを示す細胞質画分と比較して、核画分におけるイントロン２５および２７（矢印によって示される）に対して、より高い読取密度が検出され、これはイントロン保持を結果としてもたらす。保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ転写物は、核内に保持され、細胞質に輸出されない。ＴＨＬＥ−３細胞におけるイントロン２５に対する読取密度は、下の写真に詳細に示される。
【図１２】図１２は、実施例６に記載されるような、放射性ＲＴ−ＰＣＲを介する生物情報学的解析の確証を示す。図１１に示される生物情報学的予測を確証するための放射性ＲＴ−ＰＣＲアッセイの略図は、図１２に描写される。番号が付けられた長方形はエクソンを示し、介在線はイントロンを示す。黒色の線は、２つの産物、イントロン−２５保持された（６５２ｂｐ）産物および正しく切り出された（１８７ｂｐ）産物を結果としてもたらすＡＤＡＭＴＳ−１３転写物のＰＣＲ増幅に使用される、フォワード（「Ｆ１」）およびリバース（「Ｒ１」）プライマーを示す。下記は、５％のポリアクリルアミドゲル中で分離されたＡ１７２（膠芽腫、左）およびＨｅｐＧ２（肝細胞癌、右）細胞の核および細胞質の画分からの放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す代表的なゲルである。アスタリスクは、正しい産物（サイズによる）を示す。結果は、両方の細胞質画分には存在しない、両方の細胞株の核画分におけるイントロン−２５保持された産物に対応するバンドを示す。放射性ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡｓｅｑの実験からのパーセントのイントロン保持（ＰＩＲ）として計算されたＡＤＡＭＴＳ１３イントロン−２５保持に関する定量化の概要は、右の表に示される。
【図１３】図１３は、実施例７に記載されるように、２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用する、５’スプライス部位のすぐ下流または３’スプライス部位の上流にあるＡＤＡＭＴＳ１３ ＩＶＳ ２５を標的とする配列のために実行されたＡＳＯ ｗａｌｋのグラフ表示を示す。ＡＳＯは、一度に５つのヌクレオチドをシフトすることによってこれらの領域をカバーするように設計された。エクソン２４から２９およびイントロン配列は、一定の比率の縮尺で描かれている。
【図１４】図１４は、実施例８に記載されるような、イントロン２５を標的とするＡＳＯ−ｗａｌｋの結果を描写する。上の図では、代表的なゲルは、ＨｅｐＧ２細胞における６０ｎＭの濃度での、図１３に記載されるような、模擬処理された（−、ＲＮＡｉＭＡＸのみ）、ＳＭＮ対照のＡＳＯ処理された、または２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ標的のイントロン２５で処理された、ＡＤＡＭＴＳ１３の放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。３つの独立した実験からβアクチンに正規化されたＡＤＡＭＴＳ１３産物に対応するバンドの定量化は、ＳＭＮ対照のＡＳＯ処理された生成物に対する倍率変化として下に棒グラフでプロットされている。黒線は１の比率を示し、変化はない。アスタリスクは、ｍＲＮＡのレベルの最も高い増加につながるＡＳＯを示す。
【図１５】図１５は、実施例９に記載されるように、２つの最も優れた標的ＡＳＯである、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２１、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２６、およびＡＤＡＭＴＳ１３転写物の減少を結果としてもたらすＡＳＯである、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ−４６に対する用量−応答曲線を示す。上のパネルでは、代表的なゲルは、示された濃度での、模擬処理された、ＳＭＮ対照処理された、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２１処理された、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２６処理された、またはＡＤＡＭ−ＩＶＳ−４６処理された、ＨｅｐＧ２細胞からの放射性ＲＴ−ＰＣＲ ＡＤＡＭＴＳ１３産物を示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、５％のポリアクリルアミドゲル中で分離された。βアクチンに正規化されたＡＤＡＭＴＳ１３産物に対応するバンドの定量化は、模擬処理された産物に対する倍率変化として下に棒グラフでプロットされている。黒線は１の比率を示し、変化はない。
【図１６】図１６は、実施例１０に記載されるような、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２１およびＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２６ ＡＳＯによるＨｅｐＧ２細胞の処置から結果として生じるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の増加を示す。上のパネルでは、代表的なゲルは、示された濃度での、模擬処理された、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２１処理された、またはＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２６処理された、ＨｅｐＧ２細胞からのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質生成物を示す。タンパク質生成物は、８％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離された。ＡＤＡＭＴＳ−１３およびαチューブリンに対する抗体は、タンパク質生成物を検出するために使用された。下記の棒グラフは、αチューブリンに正規化された、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋の２１処理された細胞からのＡＤＡＭＴＳ−１３タンパク質レベルに対応するバンドの強度の定量化を示す。倍率変化は、模擬処理された細胞からの産物に対してプロットされた。黒線は１の比率を示し、変化はない。ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２１は、用量依存的様式でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質生成物を増加させる。
【図１７】図１７は、実施例１１に記載されるような、２’−Ｏ−Ｍｅおよび５’−Ｍｅ−Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ＡＳＯを使用して、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２１およびＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２６ ＡＳＯの領域においてＡＤＡＭＴＳ１３ ＩＶＳ ２５を標的とする配列のために実行された、ＡＳＯ ｍｉｃｒｏｗａｌｋのグラフ表示を示す。ＡＳＯは、一度に１つのヌクレオチドをシフトすることによって領域をカバーするように設計された。エクソン２４から２９およびイントロン配列は、一定の比率の縮尺で描かれている。
【図１８】図１８は、実施例１２に記載されるような、イントロン２５におけるＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２１およびＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２６の領域を標的とするＡＳＯ−ｍｉｃｒｏｗａｌｋの結果を描写する。上の図では、代表的なゲルは、ＨｅｐＧ２中の６０ｎＭの濃度での（図１７に記載されている）、模擬処理された（−）、ＳＭＮ対照のＡＳＯ処理された、または２’−Ｏ−Ｍｅ、５’−Ｍｅ−Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ＡＳＯ処理された、ＡＤＡＭＴＳ１３の放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。２つの独立した実験からのβアクチンに正規化されたＡＤＡＭＴＳ１３産物に対応するバンドの定量化は、模擬処理された生成物に対する倍率変化として下に棒グラフでプロットされている。黒線は１の比率を示し、変化はない。２本の薄灰色のバーは、図１４および図１５に記載される、ＩＶＳ２５ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２１およびＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５＋２６を示す。
【図１９】図１９は、実施例１３に記載されるような、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーにおいて視覚化された、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を使用する、ＴＳＣ１遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。上のパネルは、ＨＣＮ（主要なヒトの皮質ニューロン）細胞において発現され、細胞質（上）または核画分（下）のいずれかにおいて局在化されたＴＳＣ１転写物に対応する読取密度を示す。このパネルの下部に、ＴＳＣ１遺伝子のすべてのｒｅｆｓｅｑ．アイソフォームのグラフ表示が、一定の縮尺で示される。読取密度はピークとして示される。最も高い読取密度はエクソン（ブラックボックス）に対応し、一方で、細胞画分のいずれにおいてもイントロンのほとんどにおいて読み取りは観察されていない（矢印の先端を有する線）。イントロン５、１０および１１のスプライシング効率が低いことを示す細胞質画分と比較して、核画分におけるイントロン５、１０および１１（矢印によって示される）に対して、より高い読取密度が検出され、これはイントロン保持を結果としてもたらす。保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ転写物は、核内に保持され、細胞質に輸出されない。イントロン１０に対する読取密度は、ＨＣＮ細胞およびＡＳＴＭ（主要なヒト星状細胞）細胞に対する下の写真に詳細に示される。
【図２０】図２０は、実施例１４に記載されるような、図１９に示される生物情報学的予測を確証するための放射性ＲＴ−ＰＣＲアッセイの略図を示す。番号が付けられた長方形はエクソンを示し、介在線はイントロンを示す。黒色の線は、２つの産物、イントロン−１０保持された（６１７ｂｐ）産物および正しく切り出された（２７８ｂｐ）産物を結果としてもたらすＴＳＣ１転写物のＰＣＲ増幅に使用される、フォワード（「Ｆ１」）およびリバース（「Ｒ１」）プライマーを示す。下記は、５％のポリアクリルアミドゲル中で分離されたＡ１７２（膠芽腫）細胞の核および細胞質の画分からの放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す代表的なゲル剤である。結果は、細胞質画分において著しく減少される、Ａ１７２細胞の核画分中のイントロン−１０保持された産物に対応するバンドを示す。バンドの定量化は、ＴＳＣ１転写物のおよそ３６％がイントロン１０を含有し、この産物が核内で保持されることを示した。さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３に対して示されるように、放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は生物情報学的予測を確証した。放射性ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡｓｅｑの実験からのパーセントのイントロン保持（ＰＩＲ）として計算されたＴＳＣ１イントロン−１０保持に関する定量化の概要は、右の表に示される。
【図２１】図２１は、実施例１５に記載されるように、２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用する、５’スプライス部位のすぐ下流または３’スプライス部位の上流にあるＴＳＣ１ ＶＳ １０を標的とする配列のために実行されたＡＳＯ ｗａｌｋのグラフ表示を示す。ＡＳＯは、一度に５つのヌクレオチドをシフトすることによってこれらの領域をカバーするように設計された。ＴＳＣ１エクソンイントロン構造は、一定の比率の縮尺で描かれている。
【図２２】図２２は、実施例１６に記載されるような、イントロン１０を標的とするＡＳＯ−ｗａｌｋの結果を描写する。上の図では、代表的なゲルは、Ａ１７２細胞中の６０ｎＭの濃度での、図２１に記載されている、模擬処理された（−）、ＳＭＮ対照のＡＳＯ処理された、または１０２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ標的のイントロンで処理された、ＴＳＣ１の放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。２つの独立した実験からのβアクチンに正規化されたＴＳＣ１産物に対応するバンドの定量化は、模擬処理された生成物に対する倍率変化として下に棒グラフでプロットされている。黒線は１の比率を示し、変化はない。アスタリスクは、ＴＳＣ１ ｍＲＮＡのレベルの増加につながるＡＳＯを示す。
【図２３】図２３は、実施例１７に記載されるような、ＴＳＣ１−ＩＶＳ１０＋３１ ＡＳＯに対する用量−応答曲線を示す。上のパネルはでは、代表的なゲルは、示された濃度での、模擬処理された、ＳＭＮ対照処理された、またはＴＳＣ１−ＩＶＳ１０＋３１処理された、Ａ１７２細胞からの放射性ＲＴ−ＰＣＲ ＴＳＣ１産物を示す。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、５％のポリアクリルアミドゲル中で分離された。βアクチンに正規化されたＴＳＣ１産物に対応するバンドの定量化は、模擬処理された生成物に対する倍率変化として左下に棒グラフでプロットされている。同じ実験のＲＴ−ｑＰＣＲの結果は、放射性ＲＴ−ＰＣＲ結果を確証する右の棒グラフ上で、模擬処理された生成物に対してプロットされている。黒線は１の比率を示し、変化はない。
【図２４】図２４は、実施例１８に記載されるような、ＴＳＣ１−ＩＶＳ１０＋３１ ＡＳＯによるＡ１７２細胞の処置から結果として生じるＴＳＣ１タンパク質の増加を示す。上のパネルはでは、代表的なゲルは、示された濃度での、模擬処理された、ＳＭＮ対照処理された、またはＴＳＣ１−ＩＶＳ１０＋３１ ＡＳＯ処理された、Ａ１７２細胞からのＴＳＣ１タンパク質生成物を示す。タンパク質生成物は、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離された。ＴＳＣ１およびαチューブリンに対する抗体は、タンパク質生成物を検出するために使用された。下の棒グラフは、αチューブリンに正規化された、ＴＳＣ１−ＩＶＳ１０＋の３１処理された細胞からのＴＳＣ１タンパク質レベルに対応するバンドの強度の定量化を示す。倍率変化は、模擬処理された細胞からの産物に対してプロットされた。黒線は１の比率を示し、変化はない。ＴＳＣ１−ＩＶＳ１０＋３１は、ＴＳＣ１タンパク質生成物を増加させる。
【図２５】図２５は、実施例１９に記載されるような、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーにおいて視覚化された、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を使用するＩＭＰＤＨ１遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。上のパネルは、ＡＲＰＥ１９（ヒトの網膜上皮）細胞において発現され、細胞質（上）または核画分（下）のいずれかにおいて局在化されたＩＭＰＤＨ１転写物に対応する読取密度を示す。このパネルの下部に、ＩＭＰＤＨ１遺伝子のすべてのｒｅｆｓｅｑ．アイソフォームのグラフ表示が、一定の縮尺で示される。読取密度はピークとして示される。最も高い読取密度はエクソン（ブラックボックス）に対応し、一方で、細胞画分のいずれにおいてもイントロンのほとんどにおいて読み取りは観察されていない（矢印の先端を有する線）。イントロン１４のスプライシング効率が低いことを示す細胞質画分と比較して、核画分におけるイントロン１４（矢印によって示される）に対して、より高い読取密度が検出され、これはイントロン保持を結果としてもたらす。保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ転写物は、核内に保持され、細胞質に輸出されない。イントロン１４に対する読取密度は、ＡＲＰＥ１９細胞に対する下の写真に詳細に示される。
【図２６】図２６は、実施例２０に記載されるように、２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用する、５’スプライス部位のすぐ下流または３’スプライス部位の上流にあるＩＭＰＤＨ１ ＩＶＳ １４を標的とする配列のために実行されたＡＳＯ ｗａｌｋのグラフ表示を示す。ＡＳＯは、一続きの（ａ ｓｔｒｅｔｃｈ ｏｆ）４つのグアニンがＡＳＯ中に存在しない限り、一度に５つのヌクレオチドをシフトすることによってこれらの領域をカバーするように設計された。ＩＭＰＤＨ１エクソンイントロン構造は、一定の比率の縮尺で描かれている。
【図２７】図２７は、実施例２１に記載されるような、イントロン１４を標的とするＡＳＯ−ｗａｌｋの結果を描写する。上の図では、代表的なゲルは、ＡＲＰＥ１９細胞における６０ｎＭの濃度での、図２１に記載されている、模擬処理された（−）、ＳＭＮ対照のＡＳＯ処理された、または２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ標的のイントロン１４で処理された、ＩＭＰＤＨ１の放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。２つの独立した実験からのβアクチンに正規化されたＩＭＰＤＨ１産物に対応するバンドの定量化は、模擬処理された生成物に対する倍率変化として下に棒グラフでプロットされている。黒線は１の比率を示し、変化はない。アスタリスクは、ＩＭＰＤＨ１ ｍＲＮＡレベルの最も高い増加につながるＡＳＯを示す。
【図２８】図２８は、実施例２２に記載されるような、示された濃度での、ＩＭＰ−ＩＶＳ１４＋４８ ＡＳＯによるＡＲＰＥ１９細胞の処置から結果として生じる用量依存的様式でのＩＭＰＤＨ１遺伝子発現レベルの増加を示す。ＡＲＰＥ−１９細胞からのＩＭＰＤＨ１（保持され正しく切り出されたイントロン−１４）およびβアクチンの放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物は、５％のポリアクリルアミドゲル上で分離された。左の棒グラフは、模擬処理された細胞と比較したＩＭＰ−ＩＶＳ１４＋４８ ＡＳＯ処理された細胞からの合計の転写物（保持され正しく切り出されたイントロン−１４）に対して計算された、パーセントのイントロン保持（ＰＩＲ）の用量依存的低下を実証している（２つの独立した実験）。２つの独立した実験からの正しく切り出された転写物レベルの倍率変化は、ＩＭＰＤＨ１転写物レベルの用量依存的増加を示す中央のグラフにおいて模擬処理された細胞に対してプロットされた、ＲＴ−ｑＰＣＲ（右の棒グラフ）が実行され、結果として生じる値はβアクチンに正規化された。４つの生物学的複製物の倍率変化は、相対的な模擬処理されたＩＭＰＤＨ１産物とともにプロットされ、これは放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果を確証している。
【図２９】図２９は、実施例２３に記載されるような、ＡＲＰＥ１９細胞における示された濃度でのＩＭＰ−ＩＶＳ１４＋４８ ＡＳＯ標的を介して達成されたＩＭＰＤＨ１タンパク質レベルの増加を示す。ＡＲＰＥ−１９細胞からのタンパク質溶解物は、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離された。ＩＭＰＤＨ１、βアクチンおよびβカテニンに対する抗体は、タンパク質生成物を検出するために使用された。ＩＭＰＤＨ１タンパク質バンドの強度は、βアクチンバンドの強度に正規化され、倍率変化は、４つの生物学的複製物からの模擬処理された生成物に対して計算され、下に棒グラフでプロットされた。
【図３０】図３０は、実施例２４に記載されるように、２’−Ｏ−Ｍｅ、５’−Ｍｅ−Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ＡＳＯを使用して、ＩＭＰ−ＩＶＳ１４＋４８ ＡＳＯの領域におけるＩＭＰＤＨ１ ＩＶＳ１４を標的とする配列のために実行されたＡＳＯ ｍｉｃｒｏｗａｌｋのグラフ表示を示す。ＡＳＯは、一度に１つのヌクレオチドをシフトすることによって領域をカバーするように設計された。ＩＭＰＤＨ１エクソンイントロン構造は、一定の比率の縮尺で描かれている。
【図３１】図３１は、実施例２５に記載されるように、図３０に示されるようなｍｉｃｒｏｗａｌｋから結果として生じるＭＰＤＨ１発現レベルの増加を示す。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＡＲＰＥ−１９細胞から抽出された全ＲＮＡ上で実行され、ＡＲＰＥ−１９細胞は６０ｎＭのＡＳＯ濃度で処理された。ＩＭＰＤＨ１遺伝子のＣｔ値は、ｃｔ値のβアクチン（左）およびＲＰＬ３２（右）のハウスキーピング遺伝子に正規化され、倍率変化は、棒グラフにおいて模擬処理された細胞からの産物に対してプロットされた。ｍｉｃｒｏｗａｌｋは、ＩＭＰＤＨ１転写物レベルをさらに増加させる２つの追加のＡＳＯを同定した。
【図３２】図３２は、実施例２６に記載されるような、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーにおいて視覚化された、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を使用するＰＫＤ１遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。上のパネルは、主要なヒト腎上皮細胞（ＲＥＮ）において発現され、細胞質（上）または核画分（下）のいずれかにおいて局在化されたＰＫＤ１転写物に対応する読取密度を示す。このパネルの下部に、ＰＫＤ１遺伝子のｒｅｆｓｅｑ．アイソフォームのグラフ表示が、一定の縮尺で示される。読取密度はピークとして示される。最も高い読取密度はエクソン（ブラックボックス）に対応し、一方で、細胞画分のいずれにおいてもイントロンのほとんどにおいて読み取りは観察されていない（矢印の先端を有する線）。イントロン３２、３３、３７および３８のスプライシング効率が低いことを示す細胞質画分と比較して、核画分におけるこれらのイントロン（矢印によって示される）に対して、より高い読取密度が検出され、これはイントロン保持を結果としてもたらす。保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ転写物は、核内に保持され、細胞質に輸出されない。イントロン３７に対する読取密度は、ＲＥＮの細胞に対する下の写真に詳細に示される。
【図３３】図３３は、実施例２７に記載されるように、２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用する、５’スプライス部位のすぐ下流または３’スプライス部位の上流にあるＰＫＤ１ ＩＶ ３７を標的とする配列のために実行されたＡＳＯ ｗａｌｋのグラフ表示を示す。ＡＳＯは、一続きの４つのグアニンがＡＳＯ中に存在しない限り、一度に５つのヌクレオチドをシフトすることによってこれらの領域をカバーするように設計された。ＰＫＤ１エクソンイントロン構造は、一定の比率の縮尺で描かれている。
【図３４】図３４は、実施例２８に記載されるような、イントロン３７を標的とするＡＳＯ−ｗａｌｋの結果を描写する。上の図では、代表的なゲルは、ＨＥＫ２９３（ヒトの胚腎上皮）細胞における６０ｎＭの濃度での、図３３に記載されている、模擬処理された（Ｃ）、ＳＭＮ対照のＡＳＯ処理された、または２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ標的のイントロン３７で処理された、ＰＫＤ１の放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。２つの独立した実験からのβアクチンに正規化されたＰＫＤ１産物に対応するバンドの定量化は、模擬処理された生成物に対する倍率変化として下に棒グラフでプロットされている。黒線は１の比率を示し、変化はない。アスタリスクは、ＰＫＤ１ ｍＲＮＡレベルの最も高い増加につながるＡＳＯを示す。
【図３５】図３５は、実施例２９に記載されるような、示された濃度での、ＰＫＤ１−ＩＶＳ３７＋２９ ＡＳＯによるＨＥＫ２９３細胞の処置から結果として生じる用量依存的様式でのＰＫＤ１遺伝子発現レベルの増加を示す。ＨＥＫ２９３細胞からのＰＫＤ１（保持され正しく切り出されたイントロン−３７）およびβアクチンの放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物は、５％のポリアクリルアミドゲル上で分離された。左の棒グラフは、模擬処理された細胞（２つの独立した実験）と比較したＰＫＤ１−ＩＶＳ３７＋２９ ＡＳＯ処理された細胞からの合計の転写物（保持され正しく切り出されたイントロン−３７）に対して計算された、パーセントのイントロン保持（ＰＩＲ）の用量依存的低下を実証している。２つの独立した実験からの正しく切り出された転写物レベルの倍率変化は、ＰＫＤ１転写物レベルの増加を示す中央のグラフにおいて模擬処理された細胞に対してプロットされた。ＲＴ−ｑＰＣＲ（右の棒グラフ）が実行され、結果として生じる値はβアクチンに正規化された。４つの生物学的複製物の倍率変化は、相対的な模擬処理されたＰＫＤ１産物とともにプロットされ、これは、放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果を確証し、ＰＫＤ１転写物レベルの用量依存的増加を示していた。
【図３６】図３６は、実施例３０に記載されるような、ＨＥＫ２９３細胞における示された濃度でのＰＫＤ１−ＩＶＳ３７＋２９ ＡＳＯ標的を介して達成されたＰＫＤ１タンパク質レベルの増加を示す。ＨＥＫ２９３は、ＰＫＤ１に対する抗体、またはＩｇＧアイソタイプ対照を用いて、固定され、透過処理され、および処理された。各疾病における１０，０００個の処理された細胞に対してフローサイトメトリー分析が実行され、蛍光強度がプロットされた。倍率変化は、模擬処理された（形質導入されなかった）産物に対して計算され、ＰＫＤ１−ＩＶＳ３７＋２９ ＡＳＯによる処置後にＰＫＤ１レベルの増加を示す下の棒グラフにおいてプロットされた。
【図３７】図３７は、実施例３１に記載されるような、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーにおいて視覚化された、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を使用するＩＫＢＫＡＰ遺伝子におけるイントロン保持事象の同定を示す。上のパネルは、ＡＲＰＥ１９、ＡＳＴ、主要なヒト気管支上皮細胞（ＢＲＯＮ）、ＨＣＮ、ＲＥＮ、およびＴＨＬＥ３細胞において発現され、細胞質（各細胞株に対して上）または核画分（各細胞株に対して下）のいずれかにおいて局在化されたＰＫＤ１転写物に対応する読取密度を示す。このパネルの下部に、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子のｒｅｆｓｅｑ．アイソフォームのグラフ表示が、一定の縮尺で示される。読取密度はピークとして示される。最も高い読取密度はエクソン（ブラックボックス）に対応し、一方で、細胞画分のいずれにおいてもイントロンのほとんどにおいて読み取りは観察されていない（矢印の先端を有する線）。イントロン７および８のスプライシング効率が低いことを示す細胞質画分と比較して、核画分におけるこれらのイントロン（矢印によって示される）に対して、より高い読取密度が検出され、これはイントロン保持を結果としてもたらす。保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ転写物は、核内に保持され、細胞質に輸出されない。イントロン７および８に対する読取密度は、すべての分析された細胞に対する下の写真に詳細に示される。
【図３８】図３８は、実施例３２に記載されるような、ＡＲＰＥ−１９、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳの細胞株における、それぞれのＩＫＢＫＡＰイントロン７の保持レベルを示す。核および細胞質のＲＮＡ画分は、ＡＲＰＥ−１９、ＨｅｌａおよびＵ２ＯＳの細胞から抽出され、それらの対応する放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物は、５％のポリアクリルアミドゲル上で分離された。番号が付けられた長方形はエクソンを示し、介在線はイントロンを示す。結果は、対応する細胞質画分には存在しない、３つの細胞株の核画分中のイントロン７保持された産物に対応するバンドを示す。バンドの定量化は、ＩＫＢＫＡＰ転写物のおよそ３５％がイントロン７を含有し、この産物が核内に保持されることを示した。再び、放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は生物情報学的予測を確証した。放射性ＲＴ−ＰＣＲに加えて、ＲＮＡｓｅｑの実験結果からの合計の転写物（保持され正しく切り出されたイントロン−７）に対するパーセントのイントロン保持（ＰＩＲ）として計算された、ＩＫＢＫＡＰイントロン７保持の定量化の概要が、右の表に示される。
【図３９】図３９は、実施例３３に記載されるように、２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用する、５’スプライス部位のすぐ下流または３’スプライス部位の上流にあるＩＫＢＫＡＰ ＩＶＳ７（上）およびＩＶＳ８（下）を標的とする配列のために実行されたＡＳＯ ｗａｌｋのグラフ表示を示す。ＡＳＯは、一度に５つのヌクレオチドをシフトすることによってこれらの領域をカバーするように設計された。ＩＫＢＫＡＰエクソンイントロン構造は、一定の比率の縮尺で描かれている。
【図４０】図４０は、実施例３４に記載されるように、図３９に示されるようなイントロン７（上）および８（下）の同定のＡＳＯ標的を介して達成されたＩＫＢＫＡＰ遺伝子発現レベルの増加を実証している。細胞質ＲＮＡは、６０ｎＭの濃度で、模擬処理された、ＳＭＮ対照のＡＳＯ処理された、または各ＡＳＯで処理されたＡＲＰＥ−１９細胞から抽出された。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＩＫＢＫＡＰ発現レベルを測定するために実行され、ＩＫＢＫＡＰからのｃｔ値は、βアクチン産物の対応するｃｔ値に正規化された。倍率変化は、模擬処理された生成物に対してプロットされた。
【図４１】図４１は、実施例３５に記載されるように、示された濃度でＩＫＢ−ＩＶＳ７＋２６またはＩＫＢ−ＩＶＳ８−１６ ＡＳＯ、あるいは各々４５ｎＭ（合計９０ｎＭ）で両方のＡＳＯの組み合わせにより処理された細胞における用量依存的様式でのＩＫＢＫＡＰ転写物レベルの増加を示す。ＡＲＰＥ−１９細胞からの細胞質ＲＮＡを使用する、エクソン６−８（ＩＫＢ−ＩＶＳ７＋２６、上）またはエクソン８−１０（ＩＫＢ−ＩＶＳ８−１６、下）に対応する放射性ＲＴ−ＰＣＲ産物は、５％のポリアクリルアミドゲル上で分離された。ＩＫＢＫＡＰの発現が、バンド強度を測定することによって定量され、その値はβアクチンの値に正規化された。２つの生物学的複製物からの倍率変化は、模擬処理された細胞の産物に対してプロットされ、各々の代表的なゲルの右の棒グラフにおいて示された。
【図４２】図４２は、実施例３６に記載されるように、示された濃度でＩＫＢ−ＩＶＳ７＋２６またはＩＫＢ−ＩＶＳ８−１６ ＡＳＯ、あるいは各々４５ｎＭ（合計９０ｎＭ）で両方のＡＳＯの組み合わせにより処理されたＡＲＰＥ１９細胞におけるＩＫＡＰタンパク質レベルの用量依存的増加を示す。ＡＲＰＥ−１９細胞からのタンパク質溶解物は、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で抽出され、分離された。ＩＫＡＰおよびβカテニンに対する抗体は、分離されたタンパク質生成物を検出するために使用された。ＩＫＡＰタンパク質バンドの強度は、βカテニンバンドの強度に正規化され、２つの生物学的複製物のための倍率変化は、模擬処理された細胞に対して計算され、下の棒グラフでプロットされた。
【００４５】
＜配列＞
本出願は、ヌクレオチド配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３７４を含み、これらのヌクレオチド配列は、請求項の前に表２〜８および表１１〜２０にリストされる。表１１〜２０にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０２として明記されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載される方法によってアンチセンスオリゴマーにより標的とされ得る配列の例である。表２−８にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３−３７４として明記されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載される方法に有用なアンチセンスオリゴマーの例である。すべての表において、大文字はエクソン配列を表わし、小文字はイントロン配列を表わす。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
ヒトのタンパク質をコード化する遺伝子の８５パーセント（８５％）は、少なくとも１つのイントロンを有し、８は、１遺伝子当たりのイントロンの平均数であり、イントロンの数は１〜３１６の範囲に及び得る。個々のイントロンは、異なる効率で一次転写物から切り出され、ほとんどの場合、完全に切り出されたｍＲＮＡだけが、細胞質中の続く翻訳のために核膜孔を通って輸出される。切り出されていない転写物および部分的に切り出された転写物は、核内で検出可能である。完全には切り出されていない転写物の核保持は、タンパク質に翻訳され得る細胞質中の潜在的に有害なｍＲＮＡの蓄積を防ぐための機構であると一般に考えられる。幾つかの遺伝子に関して、最も効率的でないイントロンのスプライシングは、細胞質中の翻訳の前の遺伝子発現における律速的な転写後の工程である。遺伝子発現の核段階に対して律速的であるイントロンのスプライシングが、より効率的になされる場合、完全に切り出された成熟ｍＲＮＡの定常状態の生成および対応するタンパク質の翻訳が増強される。そのような方法はまた、標的遺伝子の発現をアップレギュレートすること助けとなり、これには無数の臨床的および研究的に応用がある。遺伝子（正常な対立遺伝子及び／又は変異対立遺伝子）の出力の増加は、その遺伝子産物（例えば、タンパク質または機能ＲＮＡ）の活性の量を減少させる変異を補うのに有用であり得る。多くの遺伝子疾患および障害は、減少されたタンパク質生成または単に部分的に機能的であるタンパク質の生成の結果である。
【００４７】
本明細書で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、列挙された特徴（例えば、アンチセンスオリゴマーの場合、定義された核酸塩基配列）を包含することを示すが、他の特徴を除外するように示してはいないと解釈されるべきである。
したがって、本明細書で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包含的であり、追加の列挙されていない特徴（例えば、アンチセンスオリゴマーの場合に、追加の列挙されていない核酸塩基の存在）を除外しない。
【００４８】
本明細書で提供される組成物および方法のいずれかの実施形態では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と交換され得る。句「〜から本質的に成る」は、指定された特徴（例えば核酸塩基配列）の他に、本発明の性質または機能に実質的に影響しない特徴も必要とするために本明細書で使用される。本明細書で使用されるように、用語「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、列挙された特徴（例えば核酸塩基配列）単独の存在を示すために使用される（その結果、指定された核酸塩基配列から成るアンチセンスオリゴマーの場合には、追加の列挙されていない核酸塩基の存在は除外される）。
【００４９】
＜核内遺伝子出力の標的とされた増強＞
本明細書には、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）と呼ばれる標的タンパク質の発現を増加させる方法が記載される。該方法は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含む、および標的タンパク質をコードする、保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ（ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）を有している（含む）細胞を、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含む。ＲＩＣ プレｍＲＮＡの部分へのＡＳＯのハイブリダイゼーションは、保持されたイントロンのスプライス部位（５’スプライス部位または３’スプライス部位）でスプライシングの増強を結果としてもたらし、続いて、標的タンパク質の生成を増加させる。
【００５０】
用語「プレｍＲＮＡ」および「プレｍＲＮＡ転写物」は、交換可能に使用されてもよく、少なくとも１つのイントロンを含有するプレｍＲＮＡ種を指し得る。プレｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ転写物は、５’−７−メチルグアノシンキャップ及び／又はポリＡテールを含んでよい。幾つかの実施形態では、プレｍＲＮＡ転写物は、５’−７−メチルグアノシンキャップ及び／又はポリＡテールを含まない。プレｍＲＮＡ転写物は、タンパク質に翻訳されない（または核からの細胞質へと輸送される）場合、非生産的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子である。
【００５１】
本明細書で使用されるように、「保持されたイントロン含有プレｍＲＮＡ」（「ＲＩＣ プレｍＲＮＡ」）は、少なくとも１つの保持されたイントロンを含有するプレｍＲＮＡ転写物である。ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含有し、標的タンパク質をコードする。「標的タンパク質をコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡ」は、完全に切り出されたときに標的タンパク質をコードすると理解される。「保持されたイントロン」は、同じ遺伝子によってコードされた、隣接したイントロンなどの１つ以上の他のイントロンが、同じプレｍＲＮＡ転写物から切り出されたときにプレｍＲＮＡ転写物中に存在するイントロンである。幾つかの実施形態では、保持されたイントロンは、標的タンパク質をコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡにおける最も豊富なイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンは、細胞において標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団における最も豊富なイントロンであり、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団は、２つ以上の保持されたイントロンを含む。実施形態では、標的タンパク質をコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団における最も豊富なイントロンに標的とされたアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的とされるか又は結合する、保持されたイントロンを含む、集団における２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングを誘発する。それによって、実施形態では、標的タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡが生成される。用語「成熟ｍＲＮＡ」および「完全に切り出されたｍＲＮＡ」は、標的タンパク質をコードする完全に処理されたｍＲＮＡ（例えば、核から細胞質へと輸出され、標的タンパク質へと翻訳される、ｍＲＮＡ）または完全に処理された機能ＲＮＡについて記載するために本明細書で交換可能に使用される。用語「生産的ｍＲＮＡ（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｍＲＮＡ）」も、標的タンパク質をコードする完全に処理されたｍＲＮＡについて記載するために使用され得る。
【００５２】
幾つかの実施形態では、標的とされた領域は、標的タンパク質をコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡにおける２番目に豊富なイントロンである保持されたイントロン中にある。例えば、２番目に豊富な保持されたイントロンは、２番目に豊富な保持されたイントロンのヌクレオチド配列の独自性、特定のヌクレオチドＡＳＯを標的とする配列設計の容易さ、及び／又はＡＳＯによりイントロンを標的とすることから結果として生じるタンパク質生成の量の増加が原因で、最も豊富な保持されたイントロンよりも標的とされ得る。実施形態では、保持されたイントロンは、細胞において標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団における２番目に豊富なイントロンであり、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団は、２つ以上の保持されたイントロンを含む。実施形態では、標的タンパク質をコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの集団における２番目に豊富なイントロンに標的とされたアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的とされるか又は結合する、保持されたイントロンを含む、集団おける２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングを誘発する。それによって、実施形態では、標的タンパク質をコードする完全に切り出された（成熟）ＲＮＡが生成される。
【００５３】
実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡにおいて保持されていないイントロン内にある標的とされた領域に相補的である。実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分は、保持されていないイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から＋１００；または保持されていないイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６から−１００内にある。実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分は、保持されていないイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋１００から、保持されていないイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１００内にある。領域または配列の場所を同定するために使用されるように、「内（ｗｉｔｈｉｎ）」は、列挙される位置で残基を含むように理解される。例えば、領域＋６から＋１００は、位置＋６および＋１００で残基を含む。それによって、実施形態では、標的タンパク質をコードする完全に切り出された（成熟）ＲＮＡが生成される。
【００５４】
幾つかの実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの保持されたイントロンは、非効率的に切り出されたイントロンである。本明細書で使用されるように、「非効率的に切り出された」は、ＲＩＣ プレｍＲＮＡにおける別のスプライス部位でのスプライシングの頻度と比較した、保持されたイントロンに隣接しているスプライス部位（５’スプライス部位または３’スプライス部位）でのスプライシングの比較的低い頻度を指し得る。用語「非効率的に切り出された」はまた、スプライス部位でのスプライシングの相対速度または動態を指し得、ここで、「非効率的に切り出された」イントロンは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡにおける別のイントロンと比較して、より遅い速度で切り出され得るか又は除去され得る。
【００５５】
幾つかの実施形態では、５’スプライス部位に隣接しているエクソンの−３ｅから−１ｅおよび保持されたイントロンの＋１から＋６での９つのヌクレオチド配列は、対応する野生型配列と同一である。幾つかの実施形態では、保持されたイントロンの−１５から−１および３’スプライス部位に隣接しているエクソンの＋１ｅでの１６のヌクレオチド配列は、対応する野生型配列と同一である。本明細書で使用されるように、「野生型配列」は、生物学的および科学的情報のＮＣＢＩリポジトリ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ８６００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｐｉｋｅ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ＵＳＡ ２０８９４によって運営される）に寄託された公開された参考文献のゲノム中の標的遺伝子に対するヌクレオチド配列を指す。また本明細書で使用されるように、「ｅ」で示されたヌクレオチド位置は、ヌクレオチドがエクソン（例えば、５’スプライス部位に隣接しているエクソンまたは３’スプライス部位に隣接しているエクソン）の配列中に存在することを示す。
【００５６】
該方法は、細胞を、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするプレｍＲＮＡの一部に相補的であるＡＳＯと接触させる工程を含み、これによって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を結果的に増加させる。本明細書で使用されるように、「接触させる工程」または細胞に投与する工程は、ＡＳＯと細胞が相互作用するように、ＡＳＯを細胞に近接させる方法を指す。ＡＳＯで接触させられる細胞は、ＡＳＯを細胞へと取り込む又は輸送する。該方法は、疾病または疾患に関係する又は疾病または疾患に関連する細胞を、本明細書に記載されるＡＳＯのいずれかと接触させる工程を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、ＡＳＯを細胞型に対して標的とする、ＡＳＯと疾病または疾患に関係する又は疾病または疾患に関連する細胞との間の接触を増強する、またはＡＳＯの取り込みを増強するために、さらに修飾され得るか又は別の分子に結合され得る（例えば、共有結合される）。
【００５７】
図２Ａにおいて実証されるように、細胞の核内では、エクソンおよびイントロンから成るプレｍＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡを生成するためにスプライシングを受け、ここでｍＲＮＡは、核からｍＲＮＡがタンパク質へと翻訳される細胞の細胞質へと輸出され得る。少なくとも１つの非効率的に切り出されたイントロン（保持されたイントロン）を含有するプレｍＲＮＡ転写物の例において、ＲＩＣ プレｍＲＮＡが生じて、これが核内で維持され、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、細胞質に輸出される場合には、タンパク質へと翻訳されないが、分解される。特定の理論に縛られることなく、プレｍＲＮＡ転写物の標的とされた部分に相補的であるＡＳＯの存在下において、保持されたイントロンのスプライシングは増強されて、それ故、タンパク質へと輸出され翻訳され得るｍＲＮＡの量が増加される（図２Ｂ）。
【００５８】
本明細書で使用されるように、用語「タンパク質生成を増加させる」または「標的タンパク質の発現を増加させる」は、細胞においてｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質（例えば標的タンパク質）の量を増加させることを意味する。「標的タンパク質」は、発現／生成の増加が望まれるタンパク質であり得る。幾つかの実施形態では、標的タンパク質は、表１に示されるタンパク質のいずれかなどの疾患に関係するタンパク質である。例えば、ＲＩＣ プレｍＲＮＡを発現する細胞をＲＩＣ プレｍＲＮＡ転写物の標的とされた部分に相補的であるＡＳＯと接触させる工程は、結果として、プレｍＲＮＡによってコードされたタンパク質（例えば標的タンパク質）の量の測定可能な増加をもたらす。タンパク質の生成を測定または検出する方法は、当業者に明白であり、例えば、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡを含む。
【００５９】
幾つかの実施形態では、細胞をＲＩＣ プレｍＲＮＡ転写物の標的とされた部分に相補的であるＡＳＯと接触させる工程は、結果として、ＡＳＯの欠如／処置の欠如下における細胞によって生成されたタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００％の生成されたタンパク質（例えば標的タンパク質）の量の増加をもたらす。実施形態では、アンチセンスオリゴマーが接触させられた細胞によって生成された標的タンパク質の合計量は、対照化合物によって生成された標的タンパク質の量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍からから約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも５倍、または少なくとも約１０倍増加される。対照化合物は、例えば、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。
【００６０】
幾つかの実施形態では、細胞をＲＩＣ プレｍＲＮＡ転写物の標的とされた部分に相補的であるＡＳＯと接触させる工程は、結果として、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする成熟ｍＲＮＡを含む、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量の増加をもたらす。幾つかの実施形態では、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡ、または標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする成熟ｍＲＮＡの量は、ＡＳＯの欠如／処置の欠如下における細胞によって生成されたタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００％増加される。実施形態では、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴマーが接触させられた細胞において生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする成熟ｍＲＮＡの合計量は、未処理の細胞、例えば、未処理の細胞または対照化合物で処理された細胞における生成された成熟したＲＮＡの量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍増加される。対照化合物は、例えば、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。
【００６１】
実施形態では、細胞をＲＩＣ プレｍＲＮＡ転写物の標的とされた部分に相補的であるＡＳＯと接触させる工程は、結果として、機能ＲＮＡの量の増加をもたらす。幾つかの実施形態では、機能ＲＮＡの量は、ＡＳＯの欠如／処置の欠如下における細胞によって生成された機能ＲＮＡの量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００％増加される。実施形態では、アンチセンスオリゴマーが接触させられた細胞において生成された機能ＲＮＡの合計量は、未処理の細胞、例えば、未処理の細胞または対照化合物で処理された細胞における生成された機能ＲＮＡの量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍からから約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも５倍、または少なくとも約１０倍増加される。対照化合物は、例えば、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。本明細書で提供される方法のいずれかが、機能ＲＮＡ、例えば、非タンパク質コード化ＲＮＡなどの、タンパク質をコードしないｍＲＮＡの生成を増加させるために使用され得る。幾つかの実施形態では、機能ＲＮＡまたは非タンパク質コード化ＲＮＡは、疾病、例えば疾患または障害に関係している。
【００６２】
＜ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシング＞
本明細書で提供される方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡ、または標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする成熟ｍＲＮＡのレベルを増加させることによって、例えば、標的タンパク質または機能ＲＮＡの量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体における細胞において、標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させるのに有用である。特に、本明細書で記載されるような方法および組成物は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡ転写物からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、それによって、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡ、または標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする成熟ｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる。
【００６３】
ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングは、保持されたイントロンをＲＩＣ プレｍＲＮＡから正しく除去し、ここで、保持されたイントロンは野生型スプライス配列を有する。構成的スプライシングは、本明細書で使用されるように、遺伝子または対立遺伝子から転写されたプレｍＲＮＡの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす変異を有する遺伝子または対立遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンのスプライシングを包含しない。例えば、本明細書で提供される方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して誘発された、保持されたイントロンの構成的スプライシングは、プレｍＲＮＡにける異常スプライシングを訂正しないか、またはプレｍＲＮＡの選択的スプライシングに影響せず、結果的に標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現が増加される。
【００６４】
実施形態では、構成的スプライシングは、保持されたイントロンをＲＩＣ プレｍＲＮＡから正しく除去し、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、完全に機能的な標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする、野生型遺伝子または対立遺伝子または多形性遺伝子または対立遺伝子から転写され、遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす変異を有さない。
【００６５】
幾つかの実施形態では、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングは、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンを正しく除去し、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、遺伝子または対立遺伝子から転写され、そこから、標的遺伝子または機能ＲＮＡが野生型対立遺伝子からの生成と比較して低下したレベルで生成され、および遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす変異を有さない。これらの実施形態では、構成的に切り出された保持されたイントロンの正しい除去は、結果として、等価な野生型タンパク質または機能ＲＮＡと比較したときに機能的である標的タンパク質または機能ＲＮＡの生成をもたらす。
【００６６】
他の実施形態では、構成的スプライシングは、保持されたイントロンをＲＩＣ プレｍＲＮＡから正しく除去し、ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、等価な野生型タンパク質または機能ＲＮＡと比較して低下した機能を有する形態で生成された標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードする、遺伝子または対立遺伝子から転写され、遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす変異を有さない。これらの実施形態では、構成的に切り出された保持されたイントロンの正しい除去は、結果として、部分的に機能的な標的タンパク質、または等価な野生型タンパク質または機能ＲＮＡと比較したときに部分的に機能的である機能ＲＮＡの生成をもたらす。
【００６７】
構成的スプライシングによる保持されたイントロンの「正しい除去」は、エクソンの部分の除去がない、全イントロンの除去を指す。
【００６８】
実施形態では、本明細書に記載される又は本明細書に記載される方法において使用されるようなアンチセンスオリゴマーは、機能ＲＮＡまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたプレｍＲＮＡの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの量、標的タンパク質の量、または機能ＲＮＡの量を増加させない。選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節は、ＲＮＡ種の配列および長さを分析する既知の方法を使用して、例えば、ＲＴ−ＰＣＲによって、および本明細書および文献中で別記される方法を使用して測定することができる。実施形態では、選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節は、少なくとも１０％または１．１倍の対象の切り出された種の量の増加または減少に基づいて判定される。実施形態では、調節は、本発明の方法において標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの増加の判定に関して本明細書に記載されるように、少なくとも１０％から１００％または１．１倍から１０倍であるレベルでの増加または減少に基づいて判定される。
【００６９】
実施形態では、該方法は、ＲＩＣ プレｍＲＮＡが、野生型プレｍＲＮＡの部分的スプライシングによって生成された方法である。実施形態では、該方法は、ＲＩＣ プレｍＲＮＡが、野生型プレｍＲＮＡの部分的スプライシングによって生成された方法である。実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、全長プレｍＲＮＡの部分的スプライシングによって生成された。これらの実施形態では、全長プレｍＲＮＡは、野生型スプライス部位配列を有する保持されたイントロンのスプライシングと比較して、保持されたイントロンの正しいスプライシングを損なわない保持されたイントロンのスプライス部位に多型性を有し得る。
【００７０】
実施形態では、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長成熟ｍＲＮＡまたは野生型成熟ｍＲＮＡである。これらの実施形態では、全長成熟ｍＲＮＡは、野生型成熟ｍＲＮＡによってコードされた標的タンパク質または機能ＲＮＡの活性と比較して、成熟ｍＲＮＡによってコードされた標的タンパク質または機能ＲＮＡの活性に影響しない多型性を有し得る。
【００７１】
＜アンチセンスオリゴマー＞
本開示の一態様は、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に結合することによってスプライシングを増強する、アンチセンスオリゴマーを含む組成物である。本明細書で使用されるように、用語「ＡＳＯ」および「アンチセンスオリゴマー」は、交換可能に使用され、ワトソン・クリック塩基対またはゆらぎ塩基対（Ｇ−Ｕ）によって標的核酸（例えば、ＲＩＣ プレｍＲＮＡ）配列にハイブリダイズする、核酸塩基を含む、ポリヌクレオチドなどのオリゴマーを指す。ＡＳＯは、標的配列に相補的な又はほぼ相補性的である（例えば、標的配列に結合し、スプライス部位でスプライシングを増強させるのに十分な相補性）正確な配列を有し得る。ＡＳＯは、標的核酸（例えば、プレｍＲＮＡ転写物の標的とされた部分）に結合し（ハイブリダイズし）、生理学的条件下でハイブリダイズされたままであるように設計されている。典型的に、ＡＳＯは、意図した（標的とされた）核酸配列以外の部位にハイブリダイズする場合、標的核酸でない限られた数の配列に（標的核酸以外の少数の部位に）ハイブリダイズする。ＡＳＯの設計は、プレｍＲＮＡ転写物の標的とされた部分の核酸配列、またはゲノまたはか細胞プレｍＲＮＡまたはトランスクリプトームにおける他の場所での十分類似した核酸配列の発生を考慮に入れることができ、その結果、ＡＳＯが他の部位に結合し「オフターゲット」効果を引き起こす可能性は、限定されている。例えば、発明の名称「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｎｏｎｓｅｎｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｃａｙ」のＷＯ ２０１５／０３５０９１として公開されたＰＣＴ国際出願番号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５４１５１におけるものなどの、当業者に既知のアンチセンスオリゴマーは、本明細書に記載される方法を実施するために使用され得る。
【００７２】
幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、標的核酸またはＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に「特異的にハイブリダイズする」または「特異的である」。典型的に、そのようなハイブリダイゼーションは、３７℃より実質的に高い融解温度（Ｔｍ）で、好ましくは少なくとも５０℃で、および典型的に６０℃からおよそ９０℃の間で生じる。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、厳格なハイブリダイゼーション条件に対応している。与えられたイオン強度およびｐＨで、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。
【００７３】
オリゴヌクレオチドなどのオリゴマーは、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行構成において生じるときに、互いに「相補的」である。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの鎖の１つと第２のポリヌクレオチドの鎖の１つとの間に生じる場合に、別のポリヌクレオチドに「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に容認された塩基対合則に従って、互いに水素結合を形成すると予期される対向する鎖における塩基の割合（例えばパーセンテージ）の点から数量化できる。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）の配列は、ハイブリダイズするその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はない。特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的とされる標的核酸配列内の標的部位に対する、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相補性を含むことができる。例えば、オリゴマー化合物の２０の核酸塩基のうちの１８が標的部位に相補的であり、それ故、特異的にハイブリダイズするＡＳＯは、９０パーセントの相補性を表わす。この例において、残りの相補的でない核酸塩基は、ともにクラスター化され得るか、または相補的な核酸塩基と分散され（ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ）、互いに又は相補的な核酸塩基に隣接している必要はない。ＡＳＯの標的核酸の領域とのパーセント相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム（基礎的なローカルアライメント検索ツール）および当該技術分野で既知のＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９０， ２１５， ４０３−４１０； Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， １９９７， ７， ６４９−６５６）を慣例的に使用して判定され得る。
【００７４】
ＡＳＯは、標的配列におけるすべての核酸塩基にハイブリダイズする必要はなく、それがハイブリダイズする核酸塩基は、隣接しているか又は隣接していないかもしれない。ＡＳＯは、プレｍＲＮＡ転写物の１つ以上の断片にわたってハイブリダイズし得、その結果、介在する又は隣接する断片は、ハイブリダイゼーション事象に関係しない（例えば、ループ構造またはヘアピン構造が形成され得る）。特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的プレｍＲＮＡ転写物において隣接していない核酸塩基にハイブリダイズする。例えば、ＡＳＯは、ＡＳＯがハイブリダイズしない１つ以上の核酸塩基によって分離される、プレｍＲＮＡ転写物における核酸塩基にハイブリダイズすることができる。
【００７５】
本明細書に記載されるＡＳＯは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的部分に存在する核酸塩基に相補的である核酸塩基を含む。用語「ＡＳＯ」は、オリゴヌクレオチド、および標的ｍＲＮＡ上の相補的な核酸塩基にハイブリダイズすることができる核酸塩基を含むが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの糖部を含まない、他のオリゴマー分子を具体化する。ＡＳＯは、自然発生のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾されたヌクレオチド、またはそれらの２つ又は３つの任意の組み合わせを含み得る。用語「自然発生のヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾された又は置換された糖類及び／又は修飾された骨格を有するヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯのヌクレオチドのすべてが、修飾されたヌクレオチドである。本明細書に記載される方法および組成物と適合するＡＳＯの化学修飾およびのＡＳＯの成分は、当業者に明白であり、例えば、米国特許第８，２５８，１０９号 Ｂ２、米国特許第５，６５６，６１２号、米国特許公開番号２０１２／０１９０７２８、およびＤｉａｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２００２， １ ， ３４７−３５５で見られ得、それら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【００７６】
ＡＳＯの核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルなどの自然発生の未修飾の核酸塩基、または標的プレｍＲＮＡの上に存在する核酸塩基との水素結合が可能であるように未修飾の核酸塩基に十分類似している合成または修飾された核酸塩基であってもよい。修飾された核酸塩基の例は、限定されないが、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、および５−ヒドロキシメチルシトシンを含む。
【００７７】
本明細書に記載されるＡＳＯはまた、オリゴマーの成分に結合する骨格構造を含む。用語「骨格構造」および「オリゴマー結合」は、交換可能に使用され、ＡＳＯのモノマー間の結合を指し得る。自然発生のオリゴヌクレオチドでは、骨格は、オリゴマーの糖部を結合する３’−５’ホスホジエステル結合を含む。本明細書に記載されるＡＳＯの骨格構造またはオリゴマー結合は、（限定されないが）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）などを含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：９０８１ （１９８６）； Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０６：６０７７ （１９８４）， Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９ （１９８８）， Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９ （１９９１）； Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｐｐ． ８７−１０８ （Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ （１９９１））； Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，１５１，５１０； Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３ （１９９０）、を参照。幾つかの実施形態では、ＡＳＯの骨格構造は、亜リン酸を含有していないが、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはカルバミン酸塩、アミド、および直鎖および環式の炭化水素基を含む結合基において、ペプチド結合を含有している。幾つかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホチオエート結合である。幾つかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホラミデート結合である。
【００７８】
本明細書に記載されるＡＳＯのいずれかは、自然発生のヌクレオチド中に存在するリボースまたはデオキシリボースを含む糖部、またはモルホリン環を含む、修飾された糖部または糖アナログを含有し得る。修飾された糖部の限定しない例は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノエチル、２’Ｆ；Ｎ３’＞−Ｐ５’ホスホラミデート、２’ジメチルアミノオキシエトキシ、２’ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’−グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｄｉｕｍ）、２’−Ｏ−グアニジニウムエチル、カルバミン酸塩修飾した糖、および二環式修飾した糖などの、２’置換基を含む。幾つかの実施形態では、糖部修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’Ｆ、および２’ＭＯＥから選択される。幾つかの実施形態では、糖部修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）におけるような追加の架橋結合である。幾つかの実施形態では、糖アナログは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）などのモルホリン環を含有している。幾つかの実施形態では、糖部は、リボフラノシルまたは２’デオキシリボフラノシルの修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、２’４’抑制された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）２’Ｏ−メチルオキシエチル（ｃＭＯＥ）修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、ｃＥｔ ２’，４抑制された２’−ＯエチルＢＮＡ修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、エチレン核酸（ＥＮＡ）修飾を含む。幾つかの実施形態では、糖部は、ＭＣＥ修飾を含む。修飾は当該技術分野で既知であり、文献、例えば、Ｊａｒｖｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２０１４，”Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖｉｅｗ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２４（１）： ３７−４７に記載され、この目的のための引用によって本明細書に組み込まれる。
【００７９】
幾つかの例において、ＡＳＯの各モノマーは、同じ方法で修飾され、例えば、ＡＳＯの骨格の各結合はホスホロチオエート結合を含む、または各リボース糖部は２’Ｏ−メチル修飾を含む。ＡＳＯのモノマー成分の各々の上に存在する、そのような修飾は、「均一な修飾」と呼ばれる。幾つかの例において、異なる修飾の組み合わせが望まれ得、例えば、ＡＳＯは、ホスホロジアミデート結合とモルホリン環を含む糖部（モルホリノ）との組み合わせを含み得る。ＡＳＯへの異なる修飾の組み合わせは、「混合修飾」または「混合化学作用」と呼ばれる。
【００８０】
幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の糖部修飾を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾および１つ以上の糖部修飾を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、２’ＭＯＥ修飾およびホスホロチオエート骨格を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）を含む。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。本明細書に記載されるＡＳＯのいずれか又はＡＳＯの成分（例えば、核酸塩基、糖部、骨格）は、ＡＳＯの望ましい特性または活性を達成するために又はＡＳＯの望ましくない特性または活性を減少させるために修飾され得る。例えば、ＡＳＯまたは任意のＡＳＯの１つ以上の成分は、プレｍＲＮＡ転写物上の標的配列への結合親和性を増強する；非標的配列への結合を減少させる；細胞のヌクレアーゼ（つまり、ＲＮａｓｅ Ｈ）による分解を減少させる；細胞及び／又は細胞の核へのＡＳＯの取り込みを改善する；ＡＳＯの薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）または薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）を変更する；およびＡＳＯの半減期を調節する、ために修飾され得る。
【００８１】
幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）のホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドで構成される。そのようなヌクレオチドで構成されたＡＳＯは、特に、本明細書で開示される方法によく適しており、そのような修飾を有しているオリゴマーは、ヌクレアーゼ分解に対する著しく増強された耐性および増加したバイオアベイラビリティを有すると示されており、これによって、例えば、本明細書に記載される幾つかの実施形態における経口送達に適している。例えば、Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００１； ２９６（３）：８９０−７； Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００１； ２９６（３）：８９８−９０４を参照。
【００８２】
ＡＳＯを合成する方法は当業者に既知である。代替的に又はさらに、ＡＳＯは商用源から得られ得る。
【００８３】
他に明記されない限り、一本鎖核酸（例えば、プレｍＲＮＡ転写物、オリゴヌクレオチド、ＡＳＯなど）配列の左側端は、５’末端であり、一本鎖または二本鎖の核酸配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。同様に、核酸配列（一本鎖または二本鎖）の右側端または右側方向は、３’末端または方向である。一般に、核酸中の基準点に対する５’にある領域または配列は、「上流」として言及され、核酸中の基準点に対する３’にある領域または配列は、「下流」として言及される。一般に、ｍＲＮＡの５’方向または末端は、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）が位置する場所であり、一方で、３’末端または方向は、終止コドンが位置する場所である。幾つかの態様では、核酸中の基準点の上流にあるヌクレオチドは、負数によって指定され得、基準点の下流にあるヌクレオチドは、正数によって指定され得る。例えば、基準点（例えば、ｍＲＮＡ中のエクソンエクソン連結）は「ゼロ」部位として指定され得、基準点に直接隣接しその上流にあるヌクレオチドは、「マイナス１」例えば「−１」と指定され、一方で、基準点に直接隣接しその下流にあるヌクレオチドは、「プラス１」例えば「＋１」と指定される。
【００８４】
他の実施形態では、ＡＳＯは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡにおける保持されたイントロンの５’スプライス部位の（３’方向における）下流（例えば、５’スプライス部位に対する正数で指定された方向）にあるＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的である（および結合する）（図１）。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から＋１００内にあるＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋１から＋５（５’スプライス部位の下流に位置する第１の５つのヌクレオチド）に相補的ではない。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋６と＋５０の間の領域内にあるＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的であり得る。幾つかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋６から＋９０、＋６から＋８０、＋６から＋７０、＋６から＋６０、＋６から＋５０、＋６から＋４０、＋６から＋３０、または＋６から＋２０内にある標的とされた部分に相補的である。
【００８５】
幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、ＲＩＣ プレｍＲＮＡにおいて保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流（５’相対（ｒｅｌａｔｉｖｅ））にある（例えば、負数で指定された方向における）ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた領域に相補的である（図１）。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６から−１００内にあるＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、３’スプライス部位に対するヌクレオチド−１から−１５（３’スプライス部位の上流に位置する第１の１５のヌクレオチド）に相補的ではない。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６から−５０内にあるＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的である。幾つかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１６から−９０、−１６から−８０、−１６から−７０、−１６から−６０、−１６から−５０、−１６から−４０、または−１６から−３０内にある、標的とされた部分に相補的である。
【００８６】
実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域＋１００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域−１００内にある。
【００８７】
幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン内（上流）にあるＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的である（図１）。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける領域＋２ｅから−４ｅ内にあるＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド−１ｅから−３ｅに相補的ではない。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する領域−４ｅから−１００ｅ、−４ｅから−９０ｅ、−４ｅから−８０ｅ、−４ｅから−７０ｅ、−４ｅから−６０ｅ、−４ｅから−５０ｅ、−４ｅから−４０ｅ、−４ｅから−３０ｅ、または−４ｅから−２０ｅ内にある、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的である。
【００８８】
幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソン内（下流）にあるＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的である（図１）。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける領域＋２ｅから−４ｅ内にあるＲＩＣ プレｍＲＮＡへの標的とされた部分に相補的である。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対するヌクレオチド＋１ｅに相補的ではない。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する領域＋２ｅから＋１００ｅ、＋２ｅから＋９０ｅ、＋２ｅから＋８０ｅ、＋２ｅから＋７０ｅ、＋２ｅから＋６０ｅ、＋２ｅから＋５０ｅ、＋２ｅから＋４０ｅ、＋２ｅから＋３０ｅ、または＋２ｅから＋２０ｅ内にある、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に相補的である。ＡＳＯは、スプライシングの特異的結合および有効な増強に適した長さであり得る。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは８〜５０の核酸塩基から成る。例えば、ＡＳＯは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、または５０の核酸塩基の長さである。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは５０を超える核酸塩基から成る。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、８〜５０の核酸塩基、８〜４０の核酸塩基、８〜３５の核酸塩基、８〜３０の核酸塩基、８〜２５の核酸塩基、８〜２０の核酸塩基、８〜１５の核酸塩基、９〜５０の核酸塩基、９〜４０の核酸塩基、９〜３５の核酸塩基、９〜３０の核酸塩基、９〜２５の核酸塩基、９〜２０の核酸塩基、９〜１５の核酸塩基、１０〜５０の核酸塩基、１０〜４０の核酸塩基、１０〜３５の核酸塩基、１０〜３０の核酸塩基、１０〜２５の核酸塩基、１０〜２０の核酸塩基、１０〜１５の核酸塩基、１１〜５０の核酸塩基、１１〜４０の核酸塩基、１１〜３５の核酸塩基、１１〜３０の核酸塩基、１１〜２５の核酸塩基、１１〜２０の核酸塩基、１１〜１５の核酸塩基、１２〜５０の核酸塩基、１２〜４０の核酸塩基、１２〜３５核酸塩基、１２〜３０核酸塩基、１２〜２５の核酸塩基、１２〜２０の核酸塩基、１２〜１５の核酸塩基、１３〜５０の核酸塩基、１３〜４０の核酸塩基、１３〜３５の核酸塩基、１３〜３０の核酸塩基、１３〜２５の核酸塩基、１３〜２０の核酸塩基、１４〜５０の核酸塩基、１４〜４０の核酸塩基、１４〜３５の核酸塩基、１４〜３０の核酸塩基、１４〜２５の核酸塩基、１４〜２０の核酸塩基、１５〜５０の核酸塩基、１５〜４０核酸塩基、１５〜３５核酸塩基、１５〜３０核酸塩基、１５〜２５核酸塩基、１５〜２０核酸塩基、２０〜５０の核酸塩基、２０〜４０の核酸塩基、２０〜３５の核酸塩基、２０〜３０の核酸塩基、２０〜２５の核酸塩基、２５〜５０の核酸塩基、２５〜４０の核酸塩基、２５〜３５の核酸塩基、または２５〜３０の核酸塩基の長さである。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、１８のヌクレオチドの長さである。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、１５のヌクレオチドの長さである。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、２５のヌクレオチドの長さである。
【００８９】
幾つかの実施形態では、異なる化学作用を有するがＲＩＣ プレｍＲＮＡの同じ標的とされた部分に相補的である２つ以上のＡＳＯが使用される。幾つかの実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡの異なる標的とされた部分に相補的である２つ以上のＡＳＯが使用される。
【００９０】
実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の部分または抱合体、例えば、標的とする部分、またはオリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する他の抱合体に化学的に結合される。そのような部分は、限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、ポリアミン、またはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸を含む。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開された文献に記載されている。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−Ａｃ−グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（例えば、マンノース−６−リン酸、脂質、あるいはポリ炭化水素化合物を含む、部分と結合する。当該芸術分野で理解される及び文献に記載されるように、例えば、リンカーを使用して、抱合体は、糖、塩基またはリン酸基上の幾つかの位置のいずれかでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、ヌクレオチドの１つ以上に結合され得る。リンカーは、二価または三価の分枝リンカーを含むことができる。実施形態では、抱合体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合される。オリゴヌクレオチドを調製する方法は、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。
【００９１】
幾つかの実施形態では、ＡＳＯによって標的とされる核酸は、真核細胞などの細胞において発現されたＲＩＣ プレｍＲＮＡである。幾つかの実施形態では、用語「細胞」は、細胞の集団を指し得る。幾つかの実施形態では、細胞は、被験体中にある。幾つかの実施形態では、細胞は、被験体から分離される。幾つかの実施形態では、細胞は、エスクビボにある。幾つかの実施形態では、細胞は、疾病または疾患関連の細胞または細胞株である。幾つかの実施形態では、細胞は、（例えば、細胞培養において）インビトロにある。
【００９２】
＜医薬組成物＞
記載された組成物の及び記載された方法のいずれかにおいて使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物または医薬製剤は、製薬産業において周知の及び公開された文献に記載された従来の技術に従って調製され得る。実施形態では、被験体を処置するための医薬組成物または医薬製剤は、上に記載されるような有効な量のアンチセンスオリゴマー、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、またはエステル、および薬学的に許容可能な希釈剤を含む。医薬製剤のアンチセンスオリゴマーはさらに、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含み得る。
【００９３】
薬学的に許容可能な塩は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがない、ヒトおよび下等動物の組織と接触させる使用に適しており、合理的なベネフィット・リスク比に相応しており（例えば、Ｓ． Ｍ． Ｂｅｒｇｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６６： １−１９ （１９７７）を参照）、この目的のための参照によって本明細書に組み込まれる。塩は、化合物の最終的な分離および精製中にインサイチュで、または遊離基機能を適切な有機酸と反応させることによって別々に調製され得る。薬学的に許容可能な無毒の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの、無機酸、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、またはマロン酸などの、有機酸で、あるいはイオン交換などの他の文書化された方法論を用いることによって形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容可能な塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコビル酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩の塩などを含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらに、薬学的に許容可能な塩は、適切な場合、無毒のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの、対イオンを使用して形成されたアミンカチオンを含む。
【００９４】
実施形態では、組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸剤などの多くの考えられる剤形のいずれかへと製剤される。実施形態では、組成物は、水性、非水性、または混合した培地中の懸濁液として製剤される。水性懸濁液は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質さらに含有し得る。懸濁液はまた、安定剤を含有し得る。実施形態では、本発明の医薬製剤または医薬組成物は、限定されないが、溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、泡、リポソーム含有製剤（例えば、カチオンまたは非カチオンのリポソーム）を含む。
【００９５】
本発明の医薬組成物または医薬製剤は、必要に応じた及び当業者に周知の又は公開された 文献に記載された、１つ以上の浸透促進剤、担体、賦形剤、または他の活性または不活性の成分を含み得る。実施形態では、リポソームはまた、立体的に安定したリポソーム、例えば、１つ以上の特定化された脂質を含むリポソームを含む。これらの特定化された脂質は、結果として、循環寿命が増強されたリポソームをもたらす。実施形態では、立体的に安定したリポソームは、１つ以上の糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化される。実施形態では、界面活性剤は、医薬製剤または医薬組成物に含まれる。医薬品、製剤およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、当該技術分野で周知である。実施形態では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な送達を達成する、例えば、細胞膜にわたる拡散を助ける及び／又は脂溶性薬物の浸透性を増強するために、浸透促進剤を利用する。実施形態では、浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、または非キレート性の非界面活性剤である。
【００９６】
実施形態では、医薬製剤は、複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の薬物または治療薬と組み合わせて投与される。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の方法によって、血液脳関門にわたって主題のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を促進することができる１つ以上の薬剤とともに投与される。例えば、筋組織における運動性ニューロンへのアデノウイルスベクターの投与による薬剤の送達は、米国特許第６，６３２，４２７号「Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ−ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ」に記載され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。脳、例えば、線条体、視床、海馬、または黒質への直接のベクターの送達は、例えば、米国特許第６，７５６，５２３号「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎ ｂｒａｉｎ」に記載され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。
【００９７】
実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましい薬剤的特性または薬力学的特性を提供する薬剤と連結または結合される。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血液脳関門にわたる浸透または輸送を促進すると当該技術分野で知られている物質、例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体にカップリングされる。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス化合物をより効果的にする又は血液脳関門にわたる輸送を増加させるために、ウイルスベクターと結合される。実施形態では、浸透性の血液脳関門の破壊は、糖、例えば、メソ−エリトリトール、キシリトール、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｄ（＋）ラクトース、Ｄ（＋）キシロース、ズルシトール、ミオイノシトール、Ｌ（−）フルクトース、Ｄ（−）マンニトール、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）アラビノース、Ｄ（−）アラビノース、セロビオース、Ｄ（＋）マルトース、Ｄ（＋）ラフィノース、Ｌ（＋）ラムノース、Ｄ（＋）メリビオース、Ｄ（−）リボース、アドニトール、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（−）アラビトール、Ｄ（＋）フコース、Ｌ（−）フコース、Ｄ（−）リキソース、Ｌ（＋）リキソース、およびＬ（−）リキソース、あるいはアミノ酸、例えば、グルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、およびタウリンの注入によって助けられる。血液脳関門の浸透を増強するための方法および物質は、例えば、米国特許第４，８６６，０４２号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、米国特許第６，２９４，５２０号「Ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｐａｓｓａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、および米国特許第６，９３６，５８９号「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。
【００９８】
実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の部分または抱合体、例えば、オリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する標的とする部分または他の抱合体に化学的に結合される。そのような部分は、限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、ポリアミン、またはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸を含む。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開された文献に記載されている。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−Ａｃ−グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、またはマンノース（例えば、マンノース−６−リン酸、脂質、あるいはポリ炭化水素化合物を含む、部分と結合する。当該芸術分野で理解される及び文献に記載されるように、例えば、リンカーを使用して、抱合体は、糖、塩基またはリン酸基上の幾つかの位置のいずれかでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、ヌクレオチドの１つ以上に結合され得る。リンカーは、二価または三価の分枝リンカーを含むことができる。実施形態では、抱合体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合される。オリゴヌクレオチドを調製する方法は、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。
【００９９】
＜疾患および障害＞
少なくとも１つのイントロン（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のイントロン）を含むプレｍＲＮＡによってコードされたタンパク質または機能ＲＮＡ生成または活性の減少に関係する疾病、例えば、疾患または障害は、本明細書で提供される方法および組成物によって処置され得る。処置される疾患または障害は、遺伝子の１つの対立遺伝子が機能的（野生型）タンパク質をコードする及び遺伝子の１つの対立遺伝子が変異させられ非機能性タンパク質または減少した／部分的な機能を有するタンパク質をコードする、ハプロ不全の結果であり得る。他の疾患または障害は、遺伝子の１つの対立遺伝子が失われる及び遺伝子の他の対立遺伝子によって生成されたタンパク質の量が十分でない、ヘミ接合体欠失が原因であり得る。さらに他の疾患または障害は、タンパク質をコードする遺伝子が、変異させられて、結果的に部分的な機能を有するタンパク質の生成をもたらす低形質変異（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）が原因であり得る。
【０１００】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、機能タンパク質の生成を増加させるために使用される。本明細書で使用されるように、用語「機能的な（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」は、疾患の１つ以上の疾病を除去するのに必要とされるタンパク質の活性または機能の量に言及している。幾つかの実施形態では、該方法は、部分的に機能的なタンパク質またはＲＮＡの生成を増加させるために使用される。本明細書で使用されるように、用語「部分的に機能的な（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」は、疾患の１つ以上の疾病を除去する又は防ぐのに必要とされる活性または機能の量未満である、タンパク質かＲＮＡの活性または機能の量に言及している。幾つかの実施形態では、部分的に機能的なタンパク質またはＲＮＡは、完全に機能的なタンパク質またはＲＮＡに対して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％少ない活性を有する。
【０１０１】
実施形態では、該方法は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡを有する被験体の細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる方法であり、ここで、被験体は、標的タンパク質または機能ＲＮＡの活性の量の不足によって引き起こされた疾病を有し、標的タンパク質または機能ＲＮＡの活性の量の不足は、標的タンパク質または機能ＲＮＡのハプロ不全によって引き起こされる。そのような実施形態では、被験体は、機能的な標的タンパク質または機能的な機能ＲＮＡをコードする第１の対立遺伝子、および標的タンパク質または機能ＲＮＡが生成されない第２の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的な標的タンパク質または機能的な機能ＲＮＡをコードする第１の対立遺伝子、および非機能性の標的タンパク質または非機能性の機能ＲＮＡをコードする第２の対立遺伝子を有する。これらの実施形態のいずれにおいても、アンチセンスオリゴマーは、（機能的な標的タンパク質をコードする）第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に結合し、それによって、ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、被験体の細胞において、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルの増加、および標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現の増加を引き起こす。
【０１０２】
関連する実施形態では、該方法は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡを有する被験体の細胞によって標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現を増加させる方法であり、ここで、被験体は、標的タンパク質または機能ＲＮＡの量または機能の不足から結果として生じる常染色体劣性遺伝疾患によって引き起こされた疾病を有する。これらの実施形態では、被験体は、
ａ．第１の変異対立遺伝子であって、そこから、
ｉ）標的タンパク質または機能ＲＮＡが、野生型対立遺伝子からの生成と比較して、低下したレベルで生成される、
ｉｉ）標的タンパク質または機能ＲＮＡが、等価な野生型タンパク質と比較して、低下した機能を有する形態で生成される、または
ｉｉｉ）標的タンパク質または機能ＲＮＡが生成されない、第１の変異対立遺伝子および
ｂ．第２の変異対立遺伝子であって、そこから、
ｉ）標的タンパク質または機能ＲＮＡが、野生型対立遺伝子からの生成と比較して、低下したレベルで生成される、
ｉｉ）標的タンパク質または機能ＲＮＡが、等価な野生型タンパク質と比較して、低下した機能を有する形態で生成される、または
ｉｉｉ）標的タンパク質または機能ＲＮＡが生成されない、第２の変異対立遺伝子を含み、
ここで、ＲＩＣ プレｍＲＮＡは、第１の対立遺伝子及び／又は第２の対立遺伝子から転写される。これらの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子または第２の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に結合し、それによって、ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、被験体の細胞内において、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルの増加、および標的タンパク質または機能ＲＮＡの発現の増加を引き起こす。これらの実施形態では、ＲＩＣ プレｍＲＮＡからの保持されたイントロンの構成的スプライシングから結果として生じる発現レベルの増加を有している標的タンパク質または機能ＲＮＡは、等価な野生型タンパク質と比較して低下した機能を有している（部分的に機能的）、または等価な野生型タンパク質と比較して完全な機能を有している（完全に機能的）形態のいずれかである。
【０１０３】
実施形態では、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ、標的タンパク質または機能ＲＮＡのレベルは、対照細胞、例えば、アンチセンスオリゴマーで処理されていない対照細胞またはＲＩＣ プレｍＲＮＡの標的とされた部分に結合しないアンチセンスオリゴマーで処理されている対照細胞において生成された標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ、標的タンパク質または機能ＲＮＡの量と比較したときに、本明細書で別記されるように、１．１倍から１０倍増加した。
【０１０４】
実施形態では、標的タンパク質の量または活性の不足または機能ＲＮＡの量または活性の不足によって引き起こされた疾病は、ＡＳＯが標的とされる保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングによって引き起こされた疾病ではない。実施形態では、標的タンパク質の量または活性の不足または機能ＲＮＡの量または活性の不足によって引き起こされた疾病は、標的タンパク質または機能ＲＮＡをコードするＲＩＣ プレｍＲＮＡの中の任意の保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングによって引き起こされる疾病ではない。
【０１０５】
表１は、疾患および本明細書で提供される方法および組成物を使用して処置可能であり得る各疾患に関係する標的遺伝子の例を提供する。
【０１０６】
【表１】
2017536338.tif 000003
【０１０７】
幾つかの実施形態では、疾患の原因となるタンパク質をコードするプレｍＲＮＡ転写物は、本明細書に記載されるＡＳＯによって標的とされる。幾つかの実施形態では、疾患の原因とならないタンパク質をコードするプレｍＲＮＡ転写物は、ＡＳＯによって標的とされる。例えば、特定の経路において第１のタンパク質の変異または不足の結果である疾患は、第２のタンパク質をコードするプレｍＲＮＡを標的とすることによって改善され得、それによって、第２のタンパク質の生成が増加される。幾つかの実施形態では、第２のタンパク質の機能は、第１のタンパク質の変異または不足を補うことができる。
【０１０８】
本明細書で提供される組成物のいずれかが、個体に投与され得る。「個体」は、「被験体」または「患者」と交換可能に使用されてもよい。個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、またはヒト以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ロバ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、またはヒツジなどの動物であってもよい。幾つかの実施形態では、個体はヒトである。他の実施形態では、個体は、植物などの別の真核生物であってもよい。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、エクスビボで細胞に投与される。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、疾患または障害を処置する方法として個体に投与される。幾つかの実施形態では、個体は、本明細書に記載される疾患のいずれかなどの遺伝子疾患を有している。幾つかの実施形態では、個体は、本明細書に記載される疾患のいずれかなどの疾患を有するリスクがある。幾つかの実施形態では、個体は、タンパク質の量の不足またはタンパク質の活性の不足によって引き起こされた疾患または障害を有するリスクが増加している。個体が、タンパク質の量の不足またはタンパク質の活性の不足によって引き起こされた疾患または障害を有するリスクが増加している場合、該方法は予防処置（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｏｒ ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を含む。例えば、個体は、疾患の家族歴によるそのような疾患または障害を有するリスクが増加し得る。典型的に、そのような疾患または障害を有するリスクが増加している個体は、（例えば、疾患または障害の発症または進行を防ぐ又は遅らせることによる）予防処置から恩恵を得る。
【０１１０】
表２は、ＨＢＢ遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの領域を標的とすることによって、ＨＢＢ遺伝子によってコードされたタンパク質の生成を増加させるための、ＡＳＯの配列の限定しないリストを提供する。
【０１１１】
【表２】
2017536338.tif 000004
【０１１２】
表３は、ＰＲＰＦ３１遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの領域を標的とすることによって、ＰＲＰＦ３１遺伝子によってコードされたタンパク質の生成を増加させるための、ＡＳＯの配列の限定しないリストを提供する。
【０１１３】
【表３】
2017536338.tif 000005
【０１１４】
表４は、ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの領域を標的とすることによって、ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子によってコードされたタンパク質の生成を増加させるための、ＡＳＯの配列の限定しないリストを提供する。
【０１１５】
【表４−１】
2017536338.tif 000006
【０１１６】
【表４−２】
2017536338.tif 000007
【０１１７】
表５は、ＴＳＣ１遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの領域を標的とすることによって、ＴＳＣ１遺伝子によってコードされたタンパク質の生成を増加させるための、ＡＳＯの配列の限定しないリストを提供する。
【０１１８】
【表５−１】
2017536338.tif 000008
【０１１９】
【表５−２】
2017536338.tif 000009
【０１２０】
表６は、ＩＭＰＤＨ１遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの領域を標的とすることによって、ＩＭＰＤＨ１遺伝子によってコードされたタンパク質の生成を増加させるための、ＡＳＯの配列の限定しないリストを提供する。
【０１２１】
【表６−１】
2017536338.tif 000010
【０１２２】
【表６−２】
2017536338.tif 000011
【０１２３】
表７は、ＰＫＤ１遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの領域を標的とすることによって、ＰＫＤ１遺伝子によってコードされたタンパク質の生成を増加させるための、ＡＳＯの配列の限定しないリストを提供する。
【０１２４】
【表７−１】
2017536338.tif 000012
【０１２５】
【表７−２】
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【０１２６】
【表７−３】
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【０１２７】
表８は、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子から転写されたＲＩＣ プレｍＲＮＡの領域を標的とすることによって、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子によってコードされたタンパク質の生成を増加させるための、ＡＳＯの配列の限定しないリストを提供する。
【０１２８】
【表８−１】
2017536338.tif 000015
【０１２９】
【表８−２】
2017536338.tif 000016
【０１３０】
＜保持されたイントロンを同定する方法＞
本開示の範囲内にはまた、隣接した（上流または下流の）イントロンが細胞におけるプレｍＲＮＡから切り出されているなかで、プレｍＲＮＡ転写物における保持されたイントロンを同定する（判定する）方法がある。一例では、標的遺伝子からのエクソンのスプライシングおよび接合および各イントロンの除去の程度は、以下の方法によって測定することができる。イントロンが、プレｍＲＮＡ転写物から切り出されている隣接したイントロンに対するプレｍＲＮＡ転写物において保持されるかどうか、および標的イントロンが、同じ遺伝子によってコードされたプレｍＲＮＡ内の１つ以上の他のイントロンに対してより大きな程度まで保持されるかどうかを判定するために、あらゆる方法が使用され得ることは、当業者によって理解される。
【０１３１】
Ｉ．保持されたイントロンのためのスクリーニング
イントロン保持のために第１ラウンドのスクリーニングは、細胞または組織（例えば、疾患関連の細胞）から分離された核ＲＮＡを使用して実行され、例えば、標的遺伝子によってコードされたプレＲＮＡを調査する逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析され得る。標的遺伝子は、少なくとも１つのイントロンを含有し、疾患または障害を関係する、または疾患または障害に関係する又はその原因となる疑いのあるタンパク質または機能ＲＮＡをコードする遺伝子であり得る。ＲＴ−ＰＣＲ分析に関して、各イントロンは、対のプライマーの１つが標的プレｍＲＮＡのイントロンの領域に特異的である、および対のもう１つのプライマーが、イントロンの２つのエクソン分上流または下流のであるエクソンの領域に特異的である、一連のプライマー対を設計することによって、遺伝子によってコードされたプレｍＲＮＡにおける保持のために評価される（図３）。幾つかの実施形態では、上流またはフォワードプライマーは、相補的であり得、イントロン、例えば、図３におけるエクソン１と２の間のイントロン内の領域にハイブリダイズし得、および下流またはリバースプライマーは、相補的であり得、評価されているイントロンから２つのエクソン分離れた位置にあるエクソン内、例えば、図３に示されるようなエクソン３内の領域にハイブリダイズし得る。代替的に、上流またはフォワードプライマーは、相補的であり得、エクソン、例えば、図３におけるエクソン２内の領域にハイブリダイズし得、および下流またはリバースプライマーは、相補的であり得、フォワードプライマーから２つのエクソン分離れているイントロン内、例えば、図３に示されるようなエクソン３と４の間のイントロン内の領域にハイブリダイズし得る。プライマー対の設計は、遺伝子によってコードされたイントロンの各々に対して繰り返され得る。
【０１３２】
プライマー対の各々を使用するＲＴ−ＰＣＲ後に、ＲＴ−ＰＣＲ産物が、当該技術分野で既知の方法、例えば、アガロースゲル中の分離および視覚化によって分析される。標的イントロンが存在する場合に予期されるＲＴ−ＰＣＲ産物のおよそのサイズが、遺伝子及び／又はプレｍＲＮＡの核酸配列に基づいて推定され得る。ＲＴ−ＰＣＲ分析からの産物の欠如は、標的イントロンが、存在しなかった、およびプレｍＲＮＡから除去／切り出された、並びにそれ故、試験される条件下では、保持されたイントロンではないことを示している。推定されたおよそのサイズであるＲＴ−ＰＣＲ反応からの産物の存在は、標的イントロンが、プレｍＲＮＡ中に存在し、試験される条件下でプレｍＲＮＡから除去／切り出されなかったことを示しており、そのようなイントロンは「保持されたイントロン」と呼ばれる。
【０１３３】
多くのプレＲＮＡに対して又はトランスクリプトーム全体のレベルで分析が望まれる例において、イントロン保持のためのスクリーニングは、ＲＮＡ−ｓｅｑまたは他の高スループットの転写分析法によって分析することができる。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析は、全トランスクリプトームにわたってイントロン保持事象を判定するために、ディープシークエンシングの読み取りおよび統計方法の適切なマッピングを使用して行われる。
【０１３４】
ＩＩ．イントロン保持事象の確認
プレｍＲＮＡ内のイントロンの第２ラウンドのスクリーニングは、ＲＴ−ＰＣＲなどの方法を使用してイントロン保持事象を確認するために実行され得る。上に記載された第１ラウンドのスクリーニング上で保持されたイントロンであると同定されたイントロンの各々は、再び評価することができる。ＲＴ−ＰＣＲ分析に関して、保持された各イントロンは、対のプライマーの１つが標的プレｍＲＮＡのイントロンの領域に特異的であり、対のもう１つのプライマーがイントロンの３、４または５つのエクソン分上流または下流にあるエクソンの領域に特異的であるプライマー対を設計することによって、遺伝子によってコードされたプレｍＲＮＡにおける保持のために評価される（図４）。図４に示された略図において、評価される保持されたイントロンは、エクソン１と２の間に位置する。上流またはフォワードプライマーは、領域に特異的であり、保持されたイントロン内でハイブリダイズし、下流またはリバースプライマーは、保持されたイントロンから３、４、および５つのエクソン分離れているエクソンである、それぞれ、エクソン４、エクソン５、およびエクソン６における領域にハイブリダイズするように設計されている。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの各々を使用して実行される。
【０１３５】
ＲＴ−ＰＣＲ後に、ＲＴ−ＰＣＲ産物が、当該技術分野で既知の方法、例えば、アガロースゲル中の分離および視覚化によって分析される。各反応からのＲＴ−ＰＣＲ産物の分子サイズに基づいて、イントロンの各々（例えば、エクソン２と３、３と４、４と５との間のイントロン）が、試験されているイントロン（上で同定された保持されたイントロン）に加えて保持されるかどうかを判定することができる。１つ以上の隣接したイントロンが除去／切り出されたときに保持されると分かった保持されたイントロンは、「非効率的に切り出されたイントロン」と呼ばれ得る。
【０１３６】
ＩＩＩ．イントロンのスプライシング効率の判定
除去される／切り出される同じプレｍＲＮＡにおける他のイントロンに対する持続性の（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ）イントロンまたは非効率的に切り出されたイントロンとして同定される標的遺伝子によってコードされたプレｍＲＮＡにおけるイントロンは、イントロン保持の割合または効率を判定するためにさらに評価され得る。
【０１３７】
イントロンは、ＲＮａｓｅ保護アッセイなどのアッセイを実行することによって、イントロン保持の効率を判定するために評価され得る（図５）。１対のＲＮＡプローブ（例えば、放射標識されたＲＮＡプローブ）は、プローブの各々が、保持されたイントロンおよび隣接したエクソンの末端に及ぶ領域に特異的であるように設計されている。例えば、ＲＮＡプローブは、保持されたイントロンの５’末端および保持されたイントロンの上流にあるエクソンの３’末端に及ぶ領域にハイブリダイズするように設計され；および第２のＲＮＡプローブは、保持されたイントロンの３’末端および保持されたイントロンの下流にあるエクソンの５’末端に及ぶ領域にハイブリダイズするように設計されている。幾つかの実施形態では、イントロンにハイブリダイズするプローブの部分は、少なくとも１００のヌクレオチドの長さであり、エクソンにハイブリダイズするプローブの部分は、少なくとも５０のヌクレオチドの長さである（図５）。疾患関連の細胞、組織または細胞株から抽出された核ＲＮＡは、プローブが二本鎖ＲＮＡの領域を形成するプレｍＲＮＡの領域にハイブリダイズする条件下で、対のＲＮＡプローブでインキュベートされる。プレｍＲＮＡとＲＮＡプローブの混合物は、ＲＮａｓｅＡ及び／又はＲＮａｓｅＴ１などの、一本鎖ＲＮＡを分解するＲＮａｓｅで消化した。二本鎖ＲＮＡは分解から保護されている。
【０１３８】
ＲＮａｓｅの消化反応は、当該技術分野で既知の方法、例えば、アガロースゲル中の分離および視覚化によって分析される。ＲＮＡプローブの全長（例えば、１５０のヌクレオチド）に対応するＲＮＡ分子の量は、プレｍＲＮＡ中に存在する保持されたイントロンのその量を示す。消化されたＲＮＡプローブに対応するＲＮＡ分子（例えば、およそ５０のヌクレオチドの長さのＲＮＡ分子）の量は、ＲＮＡプローブがハイブリダイズするイントロンがプレｍＲＮＡ中に存在しない（例えば、切り出された）ために、切り出されたＲＮＡの量を表わした。切り出されたＲＮＡ（分解されたＲＮＡプローブの量、例えば、５０のヌクレオチドＲＮＡ分子）に対するイントロン保持（全長ＲＮＡプローブの量、例えば、１００のヌクレオチドＲＮＡ分子）の比率は、イントロンのスプライシングの効率を示している。同じプレｍＲＮＡの他のイントロンに対して最も高い比率を有しているプレｍＲＮＡのイントロンは、イントロンが、標的遺伝子によってコードされたプレｍＲＮＡの最も非効率的に切り出されたイントロンまたは最も高度に保持されたイントロンであることを示している。
【０１３９】
＜スプライシングを増強するＡＳＯを同定する方法＞
本発明の範囲内にはまた、標的プレｍＲＮＡ、特に標的イントロンのスプライシングを増強するＡＳＯを同定する（判定する）方法がある。プレｍＲＮＡの標的部位内の異なるヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするＡＳＯは、標的イントロンのスプライシングの速度及び／又は程度を改善するＡＳＯを同定する（判定する）ためにスクリーニングされ得る。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、スプライシング抑制因子／サイレンサーの結合部位をブロックまたは妨害し得る。イントロンの標的部位にハイブリダイズされたときに望ましい効果（例えば、増強されたスプライシング、タンパク質または機能ＲＮＡの生成）をもたらすＡＳＯを同定する（判定する）ために、当該技術分野で既知の方法が使用され得る。これらの方法はまた、保持されたイントロンに隣接しているエクソンまたは保持されていないイントロンにおける標的とされた領域への結合によって、保持されたイントロンのスプライシングを増強するＡＳＯを同定するために使用され得る。使用され得る方法の一例は以下に提供される。
【０１４０】
ＡＳＯ「ｗａｌｋ」と呼ばれる、１ラウンドのスクリーニングは、プレｍＲＮＡの標的部位にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを使用して実行され得る。例えば、ＡＳＯ ｗａｌｋに使用されるＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位の上流のおよそ１００のヌクレオチド（例えば、標的とされた／保持されたイントロンの上流に位置するエクソンの配列の一部）から標的とされた／保持されたイントロン５の’スプライス部位に下流のおよそ１００のヌクレオチドまで、及び／又は保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流のおよそ１００のヌクレオチドから標的とされた／保持されたイントロンの３’スプライス部位の下流のおよそ１００ヌクレオチド（例えば、標的とされた／保持されたイントロンの下流に位置するエクソンの配列の一部）までで、５つのヌクレオチドごとに敷き詰められ得る。例えば、１５のヌクレオチドの長さの第１のＡＳＯは、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋６から＋２０まで特異的にハイブリダイズするように設計され得る。第２のＡＳＯは、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋１１から＋２５まで特異的にハイブリダイズするように設計されている。ＡＳＯは、プレｍＲＮＡの標的部位に及ぶように設計されている。実施形態では、ＡＳＯは、より密に、例えば、１、２、３、または４つのヌクレオチドごとに敷き詰められ得る。さらに、ＡＳＯは、５’スプライス部位の下流の１００のヌクレオチドから３’スプライス部位の上流の１００のヌクレオチドまで敷き詰められ得る。
【０１４１】
１つ以上のＡＳＯ、または１つの対照ＡＳＯ（標的部位にハイブリダイズするとは予期されていない配列である、スクランブル配列を有するＡＳＯ）は、例えばトランスフェクションによって、標的プレｍＲＮＡ（例えば、本明細書で別記されるＲＩＣ プレｍＲＮＡ）を発現する疾患関連の細胞株へと送達される。ＡＳＯの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲによって評価され得る（「イントロン保持事象の同定」を参照）。対照ＡＳＯ処理された細胞と比較したＡＳＯ処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して生成されたＲＴ−ＰＣＲ産物の減少または欠如は、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。幾つかの実施形態では、スプライシング効率、比率、切り出されていないプレｍＲＮＡに対する切り出されたプレｍＲＮＡの割合、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載されるＡＳＯを使用して改善され得る。標的プレｍＲＮＡによってコードされるタンパク質または機能ＲＮＡの量も、各ＡＳＯが望ましい効果（例えば、タンパク質生成の増強）を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡなどの、タンパク質生成を評価及び／又は定量するための当該技術分野で既知の方法も使用することができる。
【０１４２】
ＡＳＯ「ｍｉｃｒｏ−ｗａｌｋ」と呼ばれる第２ラウンドのスクリーニングは、プレｍＲＮＡの標的部位にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを使用して実行され得る。ＡＳＯ ｍｉｃｒｏ−ｗａｌｋに使用されるＡＳＯは、ＡＳＯでハイブリダイズされたときに結果的にスプライシングを増強させるプレｍＲＮＡのヌクレオチド酸配列をさらに改良する（ｒｅｆｉｎｅ）ために、１つのヌクレオチドごとに敷き詰められる。
【０１４３】
標的イントロンのスプライシングを促進するＡＳＯによって定義された領域は、１−ｎｔ工程（１−ｎｔ ｓｔｅｐｓ）で間隔を置かれたＡＳＯの他に、典型的に１８−２５ｎｔである、より長いＡＳＯを含む、ＡＳＯ「ｍｉｃｒｏ−ｗａｌｋ」によって、より詳細に調査される。
【０１４４】
上にＡＳＯ ｗａｌｋに関して記載されたように、ＡＳＯ ｍｉｃｒｏ−ｗａｌｋは、１つ以上のＡＳＯ、または対照ＡＳＯ（標的部位にハイブリダイズすると予期されていない配列である、スクランブル配列を有するＡＳＯ）を、例えば、トランスフェクションによって、標的プレｍＲＮＡを発現する疾患関連お細胞株へと送達することにより実行される。ＡＳＯの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲによって評価され得る（「イントロン保持事象の同定」を参照）。対照ＡＳＯ処理された細胞と比較したＡＳＯ処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して生成されたＲＴ−ＰＣＲ産物の減少または欠如は、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。幾つかの実施形態では、スプライシング効率、比率、切り出されていないプレｍＲＮＡに対する切り出されたプレｍＲＮＡの割合、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載されるＡＳＯを使用して改善され得る。標的プレｍＲＮＡによってコードされるタンパク質または機能ＲＮＡの量も、各ＡＳＯが望ましい効果（例えば、タンパク質生成の増強）を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡなどの、タンパク質生成を評価及び／又は定量するための当該技術分野で既知の方法も使用することができる。
【０１４５】
プレｍＲＮＡの領域にハイブリダイズされたときに、結果的にスプライシングを増強させ、タンパク質生成を増加させるＡＳＯは、動物モデル、例えば、全長ヒト遺伝子がノックインされたトランスジェニックマウスモデルまたは疾患のヒト化マウスモデルを使用して、インビボで試験され得る。ＡＳＯの投与に適した経路は、ＡＳＯの送達が望まれる疾患及び／又は細胞型に依存して変化し得る。ＡＳＯは、例えば、硝子体内注射、髄腔内注射、腹膜腔内注射、皮下注射、または静脈内注射によって投与され得る。投与後に、モデルの動物の細胞、組織、及び／又は臓器は、当該技術分野に既知の及び本明細書に記載される方法によって、例えば、スプライシング（効率、速度、程度）およびタンパク質生成を評価することにより、ＡＳＯ処置の効果を判定するために評価され得る。動物モデルはまた、疾患または疾患重症度の表現型または行動の徴候であり得る。
【実施例】
【０１４６】
本発明は、以下の実施例によってより具体的に例証される。しかしながら、本発明がいかなる方法においてもこれらの実施例によって限定されないことが理解されるべきである。
【０１４７】
実施例１：イントロン保持事象は、遺伝子に固有であり、非生産的である。
本明細書に記載された方法を使用して、ＰＲＰＦ３１（ＸＩ型網膜色素変性症）およびＲＢ１（網膜芽細胞腫）遺伝子におけるイントロン保持事象のために、第１ラウンドスクリーニングを実行した（図３）。簡潔には、ＲＮＡ抽出物を、ＨｅＬａ（ヒトの上皮子宮頸部腺癌）および２９３Ｔ（ヒトの胚腎上皮）細胞の核画分およびＡＲＰＥ−１９（ヒトの網膜）細胞の核および細胞質の画分から分離した。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を、細胞型の各々からのＲＮＡ抽出物を使用して実行した。要するに、ポリ−Ａ ＲＮＡ（完全に転写されたＲＮＡ）のＤＮＡコピーのみを生成するために、ｃＤＮＡ合成をオリゴｄＴとともに実行し、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１の転写物におけるイントロン保持に関する評価を行うために、ＰＣＲを実行した。ＰＣＲ産物を、１．５％のエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル上で分離した（図６Ａ−６Ｄ）。結果は、試験される３つの細胞株の各々の核内の両方の遺伝子（ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１）に関する（黒のアスタリスクによって印された）幾つかのイントロン保持事象を示している（図６Ａ−６Ｄ）。
【０１４８】
表９および１０は、それぞれ、ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１に関して試験された３つの細胞株に生じる、すべてのイントロン保持事象をリストしている。３つの細胞株すべてにわたって生じる事象（イントロン保持の存在または欠如）は、アスタリスクで示されている。表は、３つの細胞株にわたって非常に高い一致があることを示し、これは、イントロン保持事象が、遺伝子に固有であり、異なる細胞環境によって影響されないことを示唆している。これらの事象が非生産的である（つまり、結果的にタンパク質生成をもたらすことができる）かどうかを検討するために、ＡＲＰＥ−１９細胞の細胞質画分を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実行した（図６Ｅ）。結果は、観察されたイントロン保持事象の大多数が、ＡＲＰＥ−１９細胞の細胞質中に存在しないことを示し（図６Ｅ、アスタリスクはバンドがあるべき場所を印している）、これは、予測した通り、イントロン保持事象によって、結果的として、転写物が、核内に保持されるか、または細胞質中のナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構によって分解され、それ故、非生産的な転写物であることを示唆している。
【０１４９】
【表９】
2017536338.tif 000017
【０１５０】
【表１０−１】
2017536338.tif 000018
【０１５１】
【表１０−２】
2017536338.tif 000019
【０１５２】
実施例２：イントロン保持事象の確認
本明細書に記載された方法を使用して、ＰＲＰＦ３１（ＸＩ型網膜色素変性症）およびＲＢ１（網膜芽細胞腫）遺伝子におけるイントロン保持事象のために、第２ラウンドスクリーニングを実行した（図４）。簡潔には、実施例１に記載されるように逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実行するために、ＡＲＰＥ−１９（ヒトの網膜）細胞からの核ＲＮＡ抽出物を使用した。本実施例において、１つを超えるイントロンがプレｍＲＮＡから切り出された（除去された）シナリオで、イントロン保持を評価した。結果は、候補イントロン保持事象の数の範囲を限定する図６Ａ−Ｄの結果と比較して、両方の遺伝子（ＰＲＰＦ３１およびＲＢ１）に関する（黒のアスタリスクによって印された）より少ないイントロン保持事象を示す（図７Ａ−７Ｂ）。
【０１５３】
実施例３：変異誘発またはイントロン領域のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、遺伝子発現を増加させる
βサラセミアに関係する、ＨＢＢ（ヒトのβグロビン）遺伝子の２つのイントロンの各々のスプライシング効率を改善し、これが結果として転写レベルの増加をもたらすかどうかを評価することを目的とした。ＨＢＢオープンリーディングフレーム全体を、ミニ遺伝子レポーターにおいてクローン化した。変異を、完全なコンセンサス配列にもたらすために、両方のイントロンの５’および３’スプライス部位へと導入した図８Ａは、スプライス部位で導入されたＨＢＢ遺伝子および変異の略図を示す。各スプライス部位における変異に加えて、これらの変異の組み合わせを運ぶミニ遺伝子レポーターを、Ｆｕｇｅｎｅのトランスフェクション試薬を使用して２４時間、独立して、ＨＥＫ２９３（ヒトの胚腎上皮）細胞へとトランスフェクトした。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、イントロン１（ＩＶＳ１）の５’スプライス部位のみを改善する変異が、ＨＢＢ転写物レベルを増加させることを示している（図８Ｂ）。変異ミニ遺伝子のＨＢＢ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度の定量化を、ＧＦＰの強度に正規化し、野生型ＨＢＢに関連してプロットした。バーは、イントロン１のスプライシング効率が改善されたときのＨＢＢの発現レベルの２倍を超える増加を示している（図８Ｃ）。我々は、ＨＢＢイントロン１が、非効率的に切り出され、遺伝子（示されないデータ）中の律速のイントロンであることを以前に観察した。ここでは、非効率的に切り出されたイントロンのスプライシング効率を改善することによって、遺伝子発現の著しい増加が達成され得ることを示す。
【０１５４】
ＡＳＯを使用してＨＢＢイントロン１のスプライシング効率を改善することによって、ＨＢＢレポーター遺伝子（ミニ遺伝子）発現の増加も達成することができるかどうかを判定した。この目的のために、１８−ｍｅｒ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯを生成し、位置＋７で開始してイントロン１を標的とし、および２つの１８−ｍｅｒ ＰＭＯ−ＡＳＯを生成し、５’スプライスジャンクションに対して、それぞれ、位置＋６および＋７で開始してイントロン１を標的とした（図９Ａ；表２、それぞれ、配列番号：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４および１０５）。ＨＥＫ２９３細胞を、最初に、Ｆｕｇｅｎｅのトランスフェクション試薬を使用して、野生型ＨＢＢミニ遺伝子レポーターおよびＧＦＰ（トランスフェクション対照として）で同時導入した。４時間後、細胞を、トランスフェクトしなかったか、模擬トランスフェクトしたか、またはＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＥｎｄｏＰｏｒｔｅｒ（ＥＰ）（ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ）の送達試薬を使用して、独立して、標的ＡＳＯまたは非標的ＡＳＯ対照の各々でトランスフェクトした。４８時間、図９Ｂに示されるように増加したＡＳＯの濃度を使用して、実験を行った。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、両方の化学作用による＋７標的のＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＨＢＢ転写物レベルを増加させることを示している（図９Ｂ）。＋６ ＰＭＯ−ＡＳＯに対しても同様の結果が得られた（データは示されず）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＨＢＢ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、ＧＦＰに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＨＢＢ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋６および＋７）の両方が、ＨＢＢ転写物レベルをおよそ５０％増加させることを示している（図９Ｃ）。これらの結果は、ＡＳＯを使用するＨＢＢ遺伝子中の律速のイントロンのスプライシング効率の改善が、遺伝子発現の増加につながることを示している。
【０１５５】
実施例４：イントロン領域のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善がタンパク質生成を増加させる
＋７ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯによるＨＢＢイントロン１の標的後のタンパク質生成の増加を検出するために、ＧＦＰオープンリーディングフレームにより上流およびＴ７タグをコードする配列により下流に隣接しているＨＢＢミニ遺伝子から成るレポーター構築物を生成した（図１０Ａ）。このレポーターを、内因性遺伝子を模倣するＵ２ＯＳ細胞のゲノムに統合した。ＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７レポーターを発現するＵ２ＯＳ細胞を、模擬トランスフェクトしたか、または＋７ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯでトランスフェクし、タンパク質抽出物をウェスタンブロットによって分析した。簡潔には、２つの独立した生物学的複製物からのタンパク質抽出物を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に流し（ｒｕｎ）、ニトロセルロース膜に移した。タンパク質生成の増加を証拠づけるために、抗ＧＦＰ抗体を、ＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７レポーターからタンパク質生成物を検出するために使用し、抗βチューブリン抗体を、ローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）としてβチューブリンを検出するために使用された。図１０Ｂは、ＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７タンパク質（下のバンド）が、＋７ ２’−Ｏ−Ｍｅ ＡＳＯによる処置で増加されることを示すウェスタンブロット結果を示している。標的ＡＳＯで−トランスフェクトされた細胞からのＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７タンパク質に対応するバンドの強度を、内因性βチューブリンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７タンパク質バンドに対してプロットした。
【０１５６】
この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋７）が、ＧＦＰ−ＨＢＢ−Ｔ７タンパク質レベルを２．５倍を超えて増加させることを示している（図１０Ｃ）。これらの結果は、律速のイントロンの５’スプライス部位の領域の下流に標的とされたＡＳＯを使用することによってスプライシング効率を促進することが、図２に描写されるような標的タンパク質生成の増加につながることを実証している。
【０１５７】
実施例５：次世代配列を使用するＲＮＡｓｅｑによるＡＤＡＭＴＳ１３転写物におけるイントロン保持事象の同定
イントロン保持事象を同定するためにＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子によって生成された転写物のスナップショットを明らかにするために、次世代シークエンシングを使用して、全トランスクリプトームのショットガンシークエンシングを実行した。この目的のために、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡをＴＨＬＥ−３（ヒトの肝臓上皮）細胞の核および細胞質の画分から分離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ'ｓ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーに対して、対末端配列決定を行い（ｐａｉｒ−ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）、結果として、ヒトゲノム（２００９年２月、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ）にマッピングされた１００のヌクレオチドの読み取りをもたらした。ＡＤＡＭＴＳ１３に対する配列決定の結果を、図１１に示す。簡潔には、図１１は、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ （Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， １１５６ Ｈｉｇｈ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ ９５０６４）によって操作され、例えば、Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ， ｅｔ ａｌ．， ２０１５，”Ｔｈｅ ＵＣＳＣのゲノムブラウザーのデータベース： ２０１５年アップデート，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３， Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ （ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ１１７７）に記載された、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーを使用して視覚化されたマッピングされた読み取りを示し、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論され得る。ピークの高さは、特定の領域における読み取りの密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークがＡＤＡＭＴＳ１３のエクソンおよびイントロンの領域に合わせられ得るように、（読込み信号の下の）ＵＣＳＣのゲノムブラウザーによって、（一定の比率の縮尺で描かれた）すべてのＡＤＡＭＴＳ１３アイソフォームの略図が提供される。このディスプレイに基づいて、ＴＨＬＥ−３細胞の核画分において高い読取密度を有しているが、（図１１の下のチャートにおけるイントロン２５に関して示されるように）これらの細胞の細胞質画分においては非常に低い読取密度を有しているか又は読取密度を有していない、２つのイントロン（矢印によって示された、２５および２７）を同定した。これは、両方のイントロンが保持されること、およびイントロン−２５およびイントロン−２７を含有している転写物が、核内に残ることを示している。これは、これらの保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ＡＤＡＭＴＳ１３プレｍＲＮＡが、細胞質に輸出されないために非生産的であることを示唆している。
【０１５８】
実施例６：ＡＤＡＭＴＳ１３のＲＮＡｓｅｑ分析によって同定されたイントロン保持事象の確証
ＡＤＡＭＴＳ１３（血栓性血小板減少性紫斑病）遺伝子におけるイントロン２５の保持事象の確証を、本明細書に記載された方法を使用して実行した（図１２）。簡潔には、Ａ１７２（ヒトの膠芽腫）およびＨｅｐＧ２（ヒトの肝細胞癌）細胞からの核および細胞質のＲＮＡ抽出物を、実施例１に記載されるような放射性の逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実行するために使用した。本実施例において、エクソン２５およびエクソン２７に位置付けられたプライマーを使用して、イントロン保持を評価し、これは、イントロン−２５を含有している転写物および正しく切り出された転写物の両方の増幅につながった。産物を、５％のポリアクリルアミドゲルに流し、ホスホルイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）によって視覚化した。イントロン２５の保持レベルを、合計の転写物（イントロン含有の転写物＋正しく切り出された転写物）に対する、イントロン−２５を含有している産物に対応するバンドの強度のパーセントのイントロン保持（ＰＩＲ）として計算した。バンドの定量化は、ＡＤＡＭＴＳ１３転写物のおよそ８０％がイントロン２５を含有していること、およびこの産物が核内で保持されることを示した。さらに、放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＲＮＡｓｅｑ結果の生物情報学的解析がイントロン保持事象を同定する強力なツールであることを実証している生物情報学的予測を確証した。
【０１５９】
実施例７：ＡＤＡＭＴＳ１３のイントロン２５を標的とするＡＳＯ−ｗａｌｋの設計
ＡＳＯ ｗａｌｋを、本明細書に記載される方法を使用してイントロン２５を標的とするように設計した（図１３）。ヌクレオチド＋６から＋５８に及ぶ５’スプライス部位のイントロン２５のすぐ下流の領域およびイントロンのヌクレオチド−１６から−７９に及ぶ３’スプライス部位のイントロン２５のすぐ上流の領域を、（一続きの４つのグアニンを回避するために、１ ＡＳＯ、ＡＤＡＭ−ＩＶＳ２５−４７を例外として）５つのヌクレオチド間隔でシフトされた２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、１８−ｍｅｒ ＡＳＯを用いて標的とした（図１３；表４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０〜１６７）。イントロン調節エレメントがスプライス部位に隣接している配列に集中する（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）という知識に基づいて、これらの標的部位を選択した。
【０１６０】
実施例８：ＡＤＡＭＴＳ１３イントロン２５のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、転写レベルを増加させる
ＡＳＯを使用してＡＤＡＭＴＳ１３イントロン２５のスプライシング効率を改善することによって、ＡＤＡＭＴＳ１３発現の増加を達成することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図１４）。この目的のために、ＨｅｐＧ２細胞を、模擬トランスフェクトしたか、またはＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、図１３および表４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０〜１６７に記載される標的ＡＳＯ、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。４８時間（図１４に示されるように）６０ｎＭのＡＳＯを使用して、実験を行った。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、＋２１および＋２６を標的とするＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３転写物レベルを増加させることを示している（図１４）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＡＤＡＭＴＳ１３ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、対照ＡＳＯ処理された細胞からの正規化されたＡＤＡＭＴＳ１３ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋２１および＋２６）の両方が、ＡＤＡＭＴＳ１３転写物レベルをおよそ２．５倍増加させることを示している（図１４）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを示している。
【０１６１】
実施例９：ＡＤＡＭＴＳ１３イントロン２５を標的とするＡＳＯの用量反応効果
＋２１および＋２６のＡＳＯの他に、逆効果を示した（図１４）−４６ ＡＳＯの用量反応効果を判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図１５）。ＨｅｐＧ２細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは４８時間、図１５に示されるような増加する濃度で、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、３つのＡＳＯの各々、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、＋２１および＋２６を標的とするＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３転写物レベルを増加させ、一方で、−４６ ＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３転写物レベルを減少させることを示している（図１５）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＡＤＡＭＴＳ１３ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、対照ＡＳＯ処理された細胞からの正規化されたＡＤＡＭＴＳ１３ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋２１および＋２６）の両方が、ＡＤＡＭＴＳ１３転写物レベルをおよそ２．５倍増加させることを示している（図１５）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを示している。
【０１６２】
実施例１０：ＡＤＡＭＴＳ１３イントロン２５のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、タンパク質レベルを増加させる
＋２１または＋２６のＡＳＯによるＡＤＡＭＴＳ１３イントロン２５の標的後のタンパク質生成の増加を検出するために、本明細書に記載される方法を使用した（図１６）。ＨｅｐＧ２細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは４８時間、図１６に示されるような増加する濃度で、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、３つのＡＳＯの各々、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。簡潔には、ＨｅｐＧ２に処理された細胞からのタンパク質抽出物を、８％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に流し、ニトロセルロース膜に移した。タンパク質生成の増加を証拠づけるために、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体または抗αチューブリン抗体を、それぞれ、ローディングコントロールとしてＡＤＡＭＴＳ１３およびαチューブリンを検出するために使用した。図１６は、ＡＤＡＭＴＳ１３（上のパネルは）が、＋２１または＋２６のＡＳＯによる処置により用量依存的様式で増加されることを示すウェスタンブロットの結果を示している。標的ＡＳＯで−トランスフェクトされた細胞からのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質に対応するバンドの強度を、内因性αチューブリンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質バンドに対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋２１および＋２６）が、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質レベルを３倍を超えて増加させることを示している（図１６）。これらの結果は、律速のイントロンである、ＡＤＡＭＴＳ１３イントロン２５の５’スプライス部位の下流の領域に標的とされたＡＳＯを使用することによってスプライシング効率を促進することが、図２に描写されるような標的タンパク質生成の増加につながることを実証している。
【０１６３】
実施例１１：ＡＤＡＭＴＳ１３イントロン２５の＋２１〜＋２６の領域を標的とするＡＳＯ−ｍｉｃｒｏｗａｌｋの設計
ＡＳＯ ｍｉｃｒｏｗａｌｋを、本明細書に記載される方法を使用して、イントロン２５＋２１から＋２６の領域を標的とするように設計した（図１７）。＋１７から＋４６に及ぶ５’スプライス部位のイントロン２５の下流の領域を、１つのヌクレオチド間隔でシフトされた、２’−Ｏ−Ｍｅ、 ５’−Ｍｅ−Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、１８−ｍｅｒ ＡＳＯを用いて標的とした（図１７；表４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４〜１９７）。ＡＳＯ＋２１および＋２６の観察された効果に基づいて、この標的部位を選択した（図１６）。
【０１６４】
実施例１２：ＡＤＡＭＴＳ１３イントロン２５の＋２１から＋２６の領域のＡＳＯ ｍｉｃｒｏｗａｌｋ標的を介するスプライシング効率の改善は、転写レベルを増加させる
ｍｉｃｒｏｗａｌｋ ＡＳＯを使用してＡＤＡＭＴＳ１３イントロン２５のスプライシング効率を改善することによって、ＡＤＡＭＴＳ１３発現の増加を達成することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図１８）。この目的のために、ＨｅｐＧ２細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいはＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、図１７および表４のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４〜１９７に記載される標的ＡＳＯの各々、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。４８時間（図１８に示されるように）６０ｎＭのＡＳＯを使用して、実験を行った。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、５’−Ｍｅ−Ｃｙｔｏｓｉｎｅでの＋２１およびＡＳＯ標的の＋２５が、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯの他に、２つの元の＋２１および＋２６のＡＳＯと比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３転写物レベルをさらに増加させることを示している（薄灰色のバー、図１８）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＡＤＡＭＴＳ１３ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、対照ＡＳＯ処理された細胞からの正規化されたＡＤＡＭＴＳ１３ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋２１および＋２５）の両方が、ＡＤＡＭＴＳ１３転写物レベルをおよそ２．０倍増加させることを示している（図１８）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながり、ｍｉｃｒｏｗａｌｋによる標的部位の改良（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）が、より効率的なＡＳＯの同定につながることを示している。
【０１６５】
実施例１３：次世代シークエンシングを使用するＲＮＡｓｅｑによるＴＳＣ１転写物におけるイントロン保持事象の同定
イントロン保持事象を同定するためにＴＳＣ１遺伝子によって生成された転写物のスナップショットを明らかにするために、次世代シークエンシングを使用して、全トランスクリプトームのショットガンシークエンシングを実行した。この目的のために、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを主要なヒトの星状細胞（ＡＳＴＭ）および主要なヒトの皮質ニューロン（ＨＣＮ）細胞の核および細胞質の画分から分離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ'ｓ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーに対して、対末端配列決定を行い、結果として、ヒトゲノム（２００９年２月、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ）にマッピングされた１００のヌクレオチドの読み取りをもたらした。ＴＳＣ１に対する配列決定の結果を、図１９に示す。簡潔には、図１９は、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーを使用して視覚化されたマッピングされた読み取りを示し、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論され得る。
ピークの高さは、特定の領域における読み取りの密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークがＴＳＣ１のエクソンおよびイントロンの領域に合わせられ得るように、（読込み信号の下の）ＵＣＳＣのゲノムブラウザーによって、（一定の比率の縮尺で描かれた）すべてのＴＳＣ１アイソフォームの略図が提供される。このディスプレイに基づいて、ＡＳＴＭおよびＨＣＮの細胞の核画分において高い読取密度を有しているが、（図１９の下のチャートにおけるイントロン１０に関して示されるように）これらの細胞の細胞質画分においては非常に低い読取密度を有しているか又は読取密度を有していない、３つのイントロン（矢印によって示された、５、１０および１１）を同定した。これは、両方のイントロンが保持されること、およびイントロン−５、イントロン−１０およびイントロン−１１を含有している転写物が、核内に残ることを示している。これは、これらの保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ＴＳＣ１プレｍＲＮＡが、細胞質に輸出されないために非生産的であることを示唆している。
【０１６６】
実施例１４：ＴＳＣ１のＲＮＡｓｅｑ分析によって同定されたイントロン保持事象の確証
ＴＳＣ１（Ｉ型結節性硬化症）遺伝子におけるイントロン１０の保持事象の確証を、本明細書に記載される方法を使用して実行した（図２０）。簡潔には、実施例１に記載されるような放射性逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実行するために、Ａ１７２（ヒトの膠芽腫）細胞からの核および細胞質のＲＮＡ抽出物を使用した。本実施例において、エクソン９およびエクソン１１に位置付けられたプライマーを使用して、イントロン保持を評価し、これは、イントロン−１０を含有している転写物および正しく切り出された転写物の両方の増幅につながった。産物を、５％のポリアクリルアミドゲルに流し、ホスホルイメージングによって視覚化した。イントロン１０の保持レベルを、合計の転写物（イントロン含有の転写物＋正しく切り出された転写物）に対する、イントロン−１０を含有している産物に対応するバンドの強度のパーセントのイントロン保持（ＰＩＲ）として計算した。バンドの定量化は、ＴＳＣ１転写物のおよそ３６％がイントロン１０を含有していること、およびこの産物が核内で保持されることを示した。さらに、放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＲＮＡｓｅｑ結果の生物情報学的解析がイントロン保持事象を同定する強力なツールであることを実証している生物情報学的予測を確証した。
【０１６７】
実施例１５：ＴＳＣ１のイントロン１０を標的とするＡＳＯ−ｗａｌｋの設計
ＡＳＯ ｗａｌｋを、本明細書に記載される方法を使用してイントロン１０を標的とするように設計した（図２１）。ヌクレオチド＋６から＋５８に及ぶ５’スプライス部位のイントロン１０のすぐ下流の領域およびイントロンのヌクレオチド−１６から−６８に及ぶ３’スプライス部位のイントロン１０のすぐ上流の領域を、５つのヌクレオチド間隔でシフトされた２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、１８−ｍｅｒ ＡＳＯを用いて標的とした（図２１；表５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４〜２２９）。イントロン調節エレメントがスプライス部位に隣接している配列に集中するという知識に基づいて、これらの標的部位を選択した。
【０１６８】
実施例１６：ＴＳＣ１イントロン１０の標的ＡＳＯを介するスプライシング効率の改善は、転写レベルを増加させる
ＡＳＯを使用してＴＳＣ１イントロン１０のスプライシング効率を改善することによって、ＴＳＣ１発現の増加を達成することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図２２）。この目的のために、Ａ１７２細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいはＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、図２１および表５のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４〜２２９に記載される標的ＡＳＯの各々、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。４８時間（図２２に示されるように）６０ｎＭのＡＳＯを使用して、実験を行った。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、＋３１を標的とするＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＴＳＣ１転写物レベルを増加させることを示している（図２２）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＴＳＣ１ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＴＳＣ１ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、幾つかのＡＳＯ（＋３１を含む）が、ＴＳＣ１転写物レベルをおよそ１．５倍増加させることを示している（図２２）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＴＳＣ１遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを示している。
【０１６９】
実施例１７：ＴＳＣ１イントロン１０を標的とするＡＳＯの用量応答効果
＋３１ ＡＳＯの用量反応効果を判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図２３）。Ａ１７２細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは７２時間、図２３に示されるような増加する濃度で、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、＋３１ ＡＳＯ、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、＋３１を標的とするＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＴＳＣ１転写物レベルを増加させることを示している（図２３）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＴＳＣ１ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＴＳＣ１ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、＋３１を標的とするＡＳＯが、用量依存的様式でＴＳＣ１転写物レベルをおよそ２．０倍増加させることを示している（図２３）。これらの結果は、ＴＳＣ１転写物におけるどこかのプライマーを使用するＲＴｑＰＣＲによって確証され、３倍の増加、およびＡＳＯ処置に対する用量依存反応を示している。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＴＳＣ１遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを確認している。
【０１７０】
実施例１８：ＴＳＣ１イントロン１０のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、タンパク質レベルを増加させる
＋３１ ＡＳＯによるＴＳＣ１イントロン１０の標的後のタンパク質生成の増加を検出するために、本明細書に記載される方法を使用した（図２４）。Ａ１７２細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは７２時間、図２４に示されるような増加する濃度で、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、＋３１ ＡＳＯ、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。簡潔には、Ａ１７２に処理された細胞からのタンパク質抽出物を、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に流し、ニトロセルロース膜に移した。タンパク質生成の増加を証拠づけるために、抗ＴＳＣ１抗体または抗αチューブリン抗体を、それぞれ、ローディングコントロールとしてＴＳＣ１およびαチューブリンを検出するために使用した。図２４は、ＴＳＣ１（上のパネルは）が、３０ｎＭおよび６０ｎＭで＋３１ ＡＳＯによる処置により用量依存的様式で増加されることを示すウェスタンブロットの結果を示している。標的ＡＳＯで−トランスフェクトされた細胞からのＴＳＣ１タンパク質に対応するバンドの強度を、内因性αチューブリンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＴＳＣ１タンパク質バンドに対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋３１）が、ＴＳＣ１タンパク質レベルを２倍を超えて増加させることを示している（図２４）。これらの結果は、律速のイントロンである、ＴＳＣ１イントロン１０の５’スプライス部位の下流の領域に標的とされたＡＳＯを使用することによってスプライシング効率を促進することが、図２に描写されるような標的タンパク質生成の増加につながることを実証している。
【０１７１】
実施例１９：次世代シークエンシングを使用するＲＮＡｓｅｑによるＩＭＰＤＨ１転写物におけるイントロン保持事象の同定
イントロン保持事象を同定するためにＩＭＰＤＨ１遺伝子（Ｘ型網膜色素変性症）によって生成された転写物のスナップショットを明らかにするために、次世代シークエンシングを使用して、全トランスクリプトームのショットガンシークエンシングを実行した。この目的のために、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡをＡＲＰＥ−１９（ヒトの網膜上皮）細胞の核および細胞質の画分から分離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ'ｓ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーに対して、対末端配列決定を行い、結果として、ヒトゲノム（２００９年２月、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ）にマッピングされた１００のヌクレオチドの読み取りをもたらした。ＩＭＰＤＨ１に対する配列決定の結果を、図２５に示す。簡潔には、図２５は、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーを使用して視覚化されたマッピングされた読み取りを示し、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論され得る。ピークの高さは、特定の領域における読み取りの密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークがＩＭＰＤＨ１のエクソンおよびイントロンの領域に合わせられ得るように、（読込み信号の下の）ＵＣＳＣのゲノムブラウザーによって、（一定の比率の縮尺で描かれた）すべてのＩＭＰＤＨ１アイソフォームの略図が提供される。このディスプレイに基づいて、ＡＲＰＥ−１９細胞の核画分において高い読取密度を有しているが、（図２５の下のチャートにおけるイントロン１４に関して示されるように）これらの細胞の細胞質画分においては読取密度を有していない、１つのイントロン（矢印によって示された、１４）を同定した。これは、イントロン１４が保持されること、およびイントロン−１４を含有している転写物が、核内に残ることを示している。これは、保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ＩＭＰＤＨ１プレｍＲＮＡが、細胞質に輸出されないために非生産的であることを示唆している。
【０１７２】
実施例２０：ＩＭＰＤＨ１のイントロン１４を標的とするＡＳＯ−ｗａｌｋの設計
ＡＳＯ ｗａｌｋを、本明細書に記載される方法を使用してイントロン１４を標的とするように設計した（図２６）。ヌクレオチド＋６から＋６５に及ぶ５’スプライス部位のイントロン１４のすぐ下流の領域およびイントロンのヌクレオチド−１６から−６８に及ぶ３’スプライス部位のイントロン１４のすぐ上流の領域を、（一続きの４つのグアニンを回避するために、１ ＡＳＯ、ＩＭＰ−ＩＶＳ１４＋１８を例外として）５つのヌクレオチド間隔でシフトされた２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、１８−ｍｅｒ ＡＳＯを用いて標的とした（図２６；表６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６〜２６１）。イントロン調節エレメントがスプライス部位に隣接している配列に集中するという知識に基づいて、これらの標的部位を選択した。
【０１７３】
実施例２１：ＩＭＰＤＨ１イントロン１４のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、転写レベルを増加させる
ＡＳＯを使用してＩＭＰＤＨ１イントロン１４のスプライシング効率を改善することによって、ＩＭＰＤＨ１発現の増加を達成することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図２７）。この目的のために、ＡＲＰＥ−１９細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいはＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、図２６および表６のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６〜２６１に記載される標的ＡＳＯの各々、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。４８時間（図２７に示されるように）６０ｎＭのＡＳＯを使用して、実験を行った。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、＋４８を標的とするＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＩＭＰＤＨ１転写物レベルを増加させることを示している（図２７）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＩＭＰＤＨ１ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、対照ＡＳＯ処理された細胞からの正規化されたＩＭＰＤＨ１ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋４８）が、ＩＭＰＤＨ１転写物レベルを４倍増加させることを示している（図２７）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＩＭＰＤＨ１遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを示している。
【０１７４】
実施例２２：ＩＭＰＤＨ１イントロン１４を標的とするＡＳＯ＋４８の用量応答効果
＋４８ ＡＳＯの用量反応効果を判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図２８）。ＡＲＰＥ−１９細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは７２時間、図２８に示されるような増加する濃度で、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、＋３１ ＡＳＯ、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、＋４８を標的とするＡＳＯが、用量依存的様式で、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＩＭＰＤＨ１転写物レベルを増加させることを示している（図２８）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＩＭＰＤＨ１ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＩＭＰＤＨ１ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋４８）が、ＩＭＰＤＨ１転写物レベルをおよそ１．５倍増加させることを示している（図２８、中央のグラフ）。これらの結果は、ＩＭＰＤＨ１転写物におけるどこかのプライマーを使用するＲＴｑＰＣＲによって確証され、２．５倍の増加、およびＡＳＯ処置に対する用量依存反応を示している（図２８、右のグラフ）。さらに、ＰＩＲを（実施例６に記載されるように）イントロン１４保持に対して計算し、ＡＳＯ濃度および正しく切り出された転写物が増加すると、イントロン１４保持の低下が観察されることを示す値をプロットした（図２８、左のグラフ）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＩＭＰＤＨ１遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを確認している。
【０１７５】
実施例２３：ＩＭＰＤＨ１イントロン１４のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、タンパク質レベルを増加させる
＋４８ ＡＳＯによるＩＭＰＤＨ１イントロン１４の標的後のタンパク質生成の増加を検出するために、本明細書に記載される方法を使用した（図２９）。ＡＲＰＥ−１９細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは７２時間、図２９に示されるような増加する濃度で、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、＋４８ ＡＳＯ、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。簡潔には、ＡＲＰＥ−１９に処理された細胞からのタンパク質抽出物を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に流し、ニトロセルロース膜に移した。タンパク質生成の増加を証拠づけるために、抗ＩＭＰＤＨ１抗体、抗βカテニン抗体、またはβアクチンを、それぞれ、ローディングコントロールとしてＩＭＰＤＨ１、βカテニンまたはβアクチンを検出するために使用した。図２９は、ＩＭＰＤＨ１が、＋４８ ＡＳＯによる処置により用量依存的様式で増加されることを示すウェスタンブロットの結果を示している。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＩＭＰＤＨ１タンパク質に対応するバンドの強度を、内因性βアクチンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＩＭＰＤＨ１タンパク質バンドに対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋４８）が、ＩＭＰＤＨ１タンパク質レベルをおよそ２．５倍増加させることを示している（図２９）。これらの結果は、律速のイントロンである、ＩＭＰＤＨ１イントロン１４の５’スプライス部位の下流の領域に標的とされたＡＳＯを使用することによってスプライシング効率を促進することが、図２に描写されるような標的タンパク質生成の増加につながることを実証している。
【０１７６】
実施例２４：ＩＭＰＤＨ１イントロン１４の＋４８の領域を標的とするＡＳＯ−ｍｉｃｒｏｗａｌｋの設計
ＡＳＯ ｍｉｃｒｏｗａｌｋを、本明細書に記載される方法を使用して、イントロン１４＋４４から＋７０の領域を標的とするように設計した（図３０）。＋４４から＋７０に及ぶ５’スプライス部位のイントロン１４の下流の領域を、１つのヌクレオチド間隔でシフトされた、２’−Ｏ−Ｍｅ、 ５’−Ｍｅ−Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、１８−ｍｅｒ ＡＳＯを用いて標的とした（図３０；表６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２〜２７１）。ＡＳＯ＋４８の観察された効果に基づいて、この標的部位を選択した（図２９）。
【０１７７】
実施例２５：ＩＭＰＤＨ１イントロン１４の＋４８領域のＡＳＯ ｍｉｃｒｏｗａｌｋ標的を介するスプライシング効率の改善は、転写レベルを増加させる
ＡＳＯを使用してＩＭＰＤＨ１イントロン１４のスプライシング効率を改善することによって、ＩＭＰＤＨ１発現の増加を達成することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図３１）。この目的のために、ＡＲＰＥ−１９細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいはＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、図３０および表６のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２〜２７１に記載される標的ＡＳＯの各々、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。４８時間（図３１に示されるように）６０ｎＭのＡＳＯを使用して、実験を行った。ＲＴ−ｑＰＣＲの結果は、ＡＳＯ標的の＋４６および＋４７が、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯの他に、元の＋４８ ＡＳＯと比較して、ＩＭＰＤＨ１転写物レベルをさらに増加させることを示している（図３１）。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋４６および＋４７）の両方が、ＩＭＰＤＨ１転写物レベルを３．０倍を超えて増加させることを示している（図３１）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＩＭＰＤＨ１遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながり、ｍｉｃｒｏｗａｌｋによる標的部位の改良が、より効率的なＡＳＯの同定につながることを示している。
【０１７８】
実施例２６：次世代シークエンシングを使用するＲＮＡｓｅｑによるＰＫＤ１転写物におけるイントロン保持事象の同定
イントロン保持事象を同定するためにＰＫＤ１遺伝子（腎多嚢胞病）によって生成された転写物のスナップショットを明らかにするために、次世代シークエンシングを使用して、全トランスクリプトームのショットガンシークエンシングを実行した。この目的のために、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを主要なヒトの星状細胞（ＡＳＴＭ）および主要なヒト腎上皮細胞（ＲＥＮ）細胞の核および細胞質の画分から分離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ'ｓ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーに対して、対末端配列決定を行い、結果として、ヒトゲノム（２００９年２月、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ）にマッピングされた１００のヌクレオチドの読み取りをもたらした。ＰＫＤ１に対する配列決定の結果を、図３２に示す。簡潔には、図３２は、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーを使用して視覚化されたマッピングされた読み取りを示し、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論され得る。ピークの高さは、特定の領域における読み取りの密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークがＰＫＤ１のエクソンおよびイントロンの領域に合わせられ得るように、（読込み信号の下の）ＵＣＳＣのゲノムブラウザーによって、（一定の比率の縮尺で描かれた）すべてのＰＫＤ１アイソフォームの略図が提供される。このディスプレイに基づいて、ＲＥＮ細胞の核画分において高い読取密度を有しているが、（図３２の下のチャートにおけるイントロン３７に関して示されるように）これらの細胞の細胞質画分においては非常に低い読取密度を有しているか又は読取密度を有していない、４つのイントロン（矢印によって示された、３２、３３、３７および３８）を同定した。これは、４つのイントロンが保持されること、およびイントロン−３２、イントロン−３３、イントロン−３７、およびイントロン−３８を含有している転写物が、核内に残ることを示している。これは、これらの保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ＰＫＤ１プレｍＲＮＡが、細胞質に輸出されないために非生産的であることを示唆している。
【０１７９】
実施例２７：ＰＫＤ１のイントロン３７を標的とするＡＳＯ−ｗａｌｋの設計
ＡＳＯ ｗａｌｋを、本明細書に記載される方法を使用してイントロン３７を標的とするように設計した（図３３）。ヌクレオチド＋６から＋６６に及ぶ５’スプライス部位のイントロン３７のすぐ下流の領域およびイントロンのヌクレオチド−１６から−５１に及ぶ３’スプライス部位のイントロン３７のすぐ上流の領域を、（一続きの４つのグアニンを回避するために、２ ＡＳＯ、ＰＫＤ１−ＩＶＳ３７＋８および＋２４を例外として）５つのヌクレオチド間隔でシフトされた２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、１８−ｍｅｒ ＡＳＯを用いて標的とした（図３３；表７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９７〜３１２）。イントロン調節エレメントがスプライス部位に隣接している配列に集中するという知識に基づいて、これらの標的部位を選択した。
【０１８０】
実施例２８：ＰＫＤ１イントロン３７のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、転写レベルを増加させる
ＡＳＯを使用してＰＫＤ１イントロン３７のスプライシング効率を改善することによって、ＰＫＤ１発現の増加を達成することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図３４）。この目的のために、ＨＥＫ２９３細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいはＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、図３３および表７のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９７〜３１２に記載される標的ＡＳＯの各々、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。４８時間（図３４に示されるように）６０ｎＭのＡＳＯを使用して、実験を行った。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、＋２９を標的とするＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＰＫＤ１転写物レベルを増加させることを示している（図３４）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＰＫＤ１ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＰＫＤ１ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、＋２９ ＡＳＯが、ＰＫＤ１転写物レベルを１．８倍増加させることを示している（図３４）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＰＫＤ１遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを示している。
【０１８１】
実施例２９：ＰＫＤ１イントロン３７を標的とするＡＳＯの用量応答効果
＋２９ ＡＳＯの用量反応効果を判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図３５）。ＨＥＫ２９３細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは４８時間、図３５に示されるような増加する濃度で、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、＋２９ ＡＳＯ、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、＋２９を標的とするＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＰＫＤ１転写物レベルを増加させることを示している（図３５）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＰＫＤ１ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＰＫＤ１ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、＋２９を標的とするＡＳＯが、用量依存的様式でＰＫＤ１転写物レベルを２．０倍を超えて増加させることを示している（図３５、中央のグラフ）。これらの結果は、ＰＫＤ１転写物におけるどこかのプライマーを使用するＲＴｑＰＣＲによって確証され、２倍を超える増加、およびＡＳＯ処置に対する用量依存反応を示している（図３５、右のグラフ）。さらに、ＰＩＲを（実施例６に記載されるように）イントロン３７保持に対して計算し、ＡＳＯ濃度および正しく切り出された転写物が増加すると、イントロン３７保持の低下が観察されることを示す値をプロットした（図３５、左のグラフ）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＰＫＤ１遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを確認している。
【０１８２】
実施例３０：ＰＫＤ１イントロン３７のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、タンパク質レベルを増加させる
＋２９ ＡＳＯによるＰＫＤ１イントロン３７の標的後のタンパク質生成の増加を検出するために、本明細書に記載される方法を使用した（図３６）。ＨＥＫ２９３細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは７２時間、図３６に示されるような増加する濃度で、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、＋２９ ＡＳＯ、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。簡潔には、細胞を、抗ＰＫＤ１抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体を用いて、固定し、透過処理し、および処理した。１０，０００個の細胞を数えることによって、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。図３６は、より高いＡＳＯ濃度の細胞が、模擬処理された（未処理の）細胞と比較して、より強いＰＫＤ１シグナルを有することを示唆している、細胞数当たりの蛍光強度のプロットを示す。模擬処理された細胞に対応する蛍光強度に対する、＋２９ ＡＳＯ処理された細胞に対応する蛍光強度の倍率変化をプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ（＋２９）が、ＰＫＤ１タンパク質レベルをおよそ１．５倍増加させることを示している（図３６）。これらの結果は、律速のイントロンである、ＰＫＤ１イントロン３７の５’スプライス部位の下流の領域に標的とされたＡＳＯを使用することによってスプライシング効率を促進することが、図２に描写されるような標的タンパク質生成の増加につながることを実証している。
【０１８３】
実施例３１：次世代シークエンシングを使用するＲＮＡｓｅｑによるＩＫＢＫＡＰ転写物におけるイントロン保持事象の同定
イントロン保持事象を同定するためにＩＫＢＫＡＰ遺伝子によって生成された転写物のスナップショットを明らかにするために、次世代シークエンシングを使用して、全トランスクリプトームのショットガンシークエンシングを実行した。この目的のために、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡをＡＲＰＥ−１９、ＡＳＴＭ、ヒト気管支上皮（ＢＲＯＮ）、ＨＣＮ、ＲＥＮ、およびＴＨＬＥ−３細胞の核および細胞質の画分から分離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ'ｓ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーに対して、対末端配列決定を行い、結果として、ヒトゲノム（２００９年２月、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ）にマッピングされた１００のヌクレオチドの読み取りをもたらした。ＩＫＢＫＡＰに対する配列決定の結果を、図３７に示す。簡潔には、図３７は、ＵＣＳＣのゲノムブラウザーを使用して視覚化されたマッピングされた読み取りを示し、読み取りの範囲および数はピーク信号によって推論され得る。ピークの高さは、特定の領域における読み取りの密度によって与えられた発現のレベルを示している。ピークがＩＫＢＫＡＰのエクソンおよびイントロンの領域に合わせられ得るように、（読込み信号の下の）ＵＣＳＣのゲノムブラウザーによって、（一定の比率の縮尺で描かれた）すべてのＩＫＢＫＡＰアイソフォームの略図が提供される。このディスプレイに基づいて、配列決定されるすべての細胞の核画分において高い読取密度を有しているが、（図３７の下のチャートにおける両方のイントロンに関して示されるように）これらの細胞の細胞質画分においては読取密度を有していない、２つのイントロン（矢印によって示された、７および８）を同定した。これは、イントロン７および８が保持されること、およびイントロン７および８を含有している転写物が、核内に残ることを示している。これは、保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ＩＫＢＫＡＰプレｍＲＮＡが、細胞質に輸出されないために非生産的であることを示唆している。
【０１８４】
実施例３２：ＩＫＢＫＡＰのＲＮＡｓｅｑ分析によって同定されたイントロン保持事象の確証
ＩＫＢＫＡＰ（家族性自律神経不全）遺伝子中のイントロン７−保持事象の確証を、本明細書に記載される方法を使用して実行した（図３８）。簡潔には、実施例１に記載されるような放射性逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実行するために、ＡＲＰＥ−１９、ＨｅＬａ、およびＵ２ＯＳからの核および細胞質のＲＮＡ抽出物を使用した。本実施例において、エクソン６およびエクソン８に位置付けられたプライマーを使用して、イントロン保持を評価し、これは、イントロン−７を含有している転写物および正しく切り出された転写物の両方の増幅につながった。産物を、５％のポリアクリルアミドゲルに流し、ホスホルイメージングによって視覚化した。イントロン７の保持レベルを、合計の転写物（イントロン含有の転写物＋正しく切り出された転写物）に対する、イントロン−７を含有している産物に対応するバンドの強度のパーセントのイントロン保持（ＰＩＲ）として計算した。バンドの定量化は、ＩＫＢＫＡＰ転写物のおよそ３５％がイントロン７を含有していること、およびこの産物が核内で保持されることを示した。さらに、放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＲＮＡｓｅｑ結果の生物情報学的解析がイントロン保持事象を同定する強力なツールであることを実証している生物情報学的予測を確証した。
【０１８５】
実施例３３：ＩＫＢＫＡＰのイントロン７および８を標的とするＡＳＯ−ｗａｌｋの設計
ＡＳＯ ｗａｌｋを、本明細書に記載される方法を使用してイントロン７（上のパネル）またはイントロン８（下のパネル）を標的とするように設計した（図３９）。ヌクレオチド＋６から＋５８に及ぶ５’スプライス部位のイントロン７または８のすぐ下流の領域およびイントロンのヌクレオチド−１６から−６８に及ぶ３’スプライス部位のイントロン７または８のすぐ上流の領域を、５つのヌクレオチド間隔でシフトされた２’−Ｏ−Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格、１８−ｍｅｒ ＡＳＯを用いて標的とした（図３９；表８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２９〜３６０）。イントロン調節エレメントがスプライス部位に隣接している配列に集中するという知識に基づいて、これらの標的部位を選択した。
【０１８６】
実施例３４：ＩＫＢＫＡＰイントロン７および８のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、転写レベルを増加させる
ＡＳＯを使用してＩＫＢＫＡＰイントロン７または８のスプライシング効率を改善することによって、ＩＫＢＫＡＰ発現の増加を達成することができるかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図４０）。この目的のために、ＡＲＰＥ−１９細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいはＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、独立して、図３９および表８のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２９〜３６０に記載される標的ＡＳＯの各々、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照でトランスフェクトした。４８時間（図４０に示されるように）６０ｎＭのＡＳＯを使用して、実験を行った。ＲＴ−ｑＰＣＲの結果は、ＩＶＳ７＋２６を標的とするＡＳＯ（上のグラフ）およびＩＶＳ８＋２６および−１６（下のグラフ）を標的とするＡＳＯが、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＩＫＢＫＡＰ転写物レベルを増加させることを示している（図４０）。この分析は、これらのＡＳＯが、ＩＫＢＫＡＰ転写物レベルをおよそ１．２−１．６倍増加させることを示している（図４０）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＩＫＢＫＡＰ遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを示している。
【０１８７】
実施例３５：ＩＫＢＫＡＰイントロン７および８を標的とするＡＳＯの用量応答効果
ＩＶＳ７＋２６およびＩＶＳ８−１６のＡＳＯの用量反応効果を判定するために、本明細書に記載される方法を使用した（図４１）。ＡＲＰＥ−１９細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは７２時間、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、増加する濃度で、独立して、ＩＶＳ７＋２６またはＩＶＳ８−１６のＡＳＯ、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照で、あるいは各々４５ｎＭ（合計９０ｎＭ）で両方のＡＳＯの組み合わせでトランスフェクトした（図４１）。放射性ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＩＶＳ７＋２６またはＩＶＳ８−１６を標的とするＡＳＯが、用量依存的様式で、模擬トランスフェクトされた又は非標的のＡＳＯと比較して、ＩＫＢＫＡＰ転写物レベルを増加させることを示している（図４１）。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＩＫＢＫＡＰ ＰＣＲ産物に対応するバンドの強度を、βアクチンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＩＫＢＫＡＰ ＰＣＲ産物に対してプロットした。この分析の結果は、ＩＶＳ７＋２６およびＩＶＳ８−１６を標的とするＡＳＯ、およびそれらの組み合わせが、ＩＫＢＫＡＰ転写物レベルを用量依存的様式で２．０−２．５倍増加させることを示している（図４０）。これらの結果は、ＡＳＯを使用してＩＫＢＫＡＰ遺伝子における律速のイントロンのスプライシング効率を改善することが、遺伝子発現の増加につながることを確認している。
【０１８８】
実施例３６：ＩＫＢＫＡＰイントロン７または８のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、タンパク質レベルを増加させる
ＩＶＳ７＋２６ ＡＳＯまたはＩＶＳ８−１６ ＡＳＯによる、それぞれ、ＩＫＢＫＡＰイントロン７または８の標的後のタンパク質生成の増加を検出するために、本明細書に記載される方法を使用した（図４２）。ＡＲＰＥ−１９細胞を、模擬トランスフェクトしたか、あるいは７２時間、ＲＮＡｉＭＡＸ（ＲｉＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の送達試薬を使用して、増加する濃度で、独立して、ＩＶＳ７＋２６またはＩＶＳ８−１６のＡＳＯ、または非標的ＳＭＮ−ＡＳＯ対照で、あるいは各々４５ｎＭ（合計９０ｎＭ）で両方のＡＳＯの組み合わせでトランスフェクトした（図４２）。簡潔には、ＡＲＰＥ−１９に処理された細胞からのタンパク質抽出物を、４−２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に流し、ニトロセルロース膜に移した。タンパク質生成の増加を証拠づけるために、抗ＩＫＡＰ抗体または抗βカテニン抗体を、それぞれ、ローディングコントロールとしてＩＫＡＰおよびβカテニンを検出するために使用した。図４２は、ＩＫＡＰが、ＩＶＳ７＋２６ ＡＳＯまたはＩＶＳ８−１６ ＡＳＯ、または両方のＡＳＯの組み合わせによる処置により用量依存的様式で増加されることを示すウェスタンブロットの結果を示している。標的ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞からのＩＫＡＰタンパク質に対応するバンドの強度を、内因性βカテニンに正規化し、模擬処理された細胞からの正規化されたＩＫＡＰタンパク質バンドに対してプロットした。この分析の結果は、標的ＡＳＯ ＩＶＳ７＋２６およびＩＶＳ８−１６が、ＩＫＡＰタンパク質レベルをおよそ３倍増加させることを示している（図４２）。これらの結果は、ＩＫＢＫＡＰイントロン７の５’スプライス部位の下流の領域またはＩＫＢＫＡＰイントロン８の３’スプライス部位の上流の領域に標的とされたＡＳＯを使用することによってスプライシング効率を促進することが、図２に描写されるような標的タンパク質生成の増加につながることを実証している。
【０１８９】
【表１１】
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【０１９０】
【表１２−１】
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【０１９１】
【表１２−２】
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【０１９２】
【表１２−３】
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【０１９３】
【表１３】
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【０１９４】
【表１４−１】
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【０１９５】
【表１４−２】
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【０１９６】
【表１５−１】
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【０１９７】
【表１５−２】
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【０１９８】
【表１５−３】
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【０１９９】
【表１５−４】
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【０２００】
【表１５−５】
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【０２０１】
【表１５−６】
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【０２０２】
【表１５−７】
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【０２０３】
【表１５−８】
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【０２０４】
【表１５−９】
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【０２０５】
【表１５−１０】
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【０２０６】
【表１５−１１】
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【０２０７】
【表１５−１２】
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【０２０８】
【表１５−１３】
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【０２０９】
【表１５−１４】
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【０２１０】
【表１５−１５】
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【０２１１】
【表１５−１６】
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【０２１２】
【表１５−１７】
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【０２１３】
【表１５−１８】
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【０２１４】
【表１５−１９】
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【０２１５】
【表１５−２０】
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【０２１６】
【表１５−２１】
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【０２１７】
【表１５−２２】
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【０２１８】
【表１５−２３】
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【０２１９】
【表１５−２４】
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【０２２０】
【表１５−２５】
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【０２２１】
【表１５−２６】
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【０２２２】
【表１５−２７】
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【０２２３】
【表１５−２８】
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【０２２４】
【表１５−２９】
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【０２２５】
【表１５−３０】
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【０２２６】
【表１５−３１】
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【０２２７】
【表１５−３２】
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【０２２８】
【表１５−３３】
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【０２２９】
【表１５−３４】
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【０２３０】
【表１５−３５】
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【０２３１】
【表１５−３６】
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【０２３２】
【表１５−３７】
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【０２３３】
【表１５−３８】
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【０２３４】
【表１５−３９】
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【０２３５】
【表１５−４０】
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【０２３６】
【表１５−４１】
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【０２３７】
【表１５−４２】
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【０２３８】
【表１５−４３】
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【０２３９】
【表１５−４４】
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【０２４０】
【表１５−４５】
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【０２４１】
【表１５−４６】
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【０２４２】
【表１５−４７】
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【０２４３】
【表１６−１】
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【０２４４】
【表１６−２】
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【０２４５】
【表１６−３】
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【０２４６】
【表１７−１】
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【０２４７】
【表１７−２】
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【０２４８】
【表１７−３】
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【０２４９】
【表１８】
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【０２５０】
【表１９−１】
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【０２５１】
【表１９−２】
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【０２５２】
【表２０−１】
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【０２５３】
【表２０−２】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９−１】
2017536338.tif 000136
【図３９−２】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2017536338.tif 000141
2017536338.tif 000142
2017536338.tif 000143