(57)【要約】  本発明は、ベータヘアピン構造を形成するために最適化された構造的に制約された合成ペプチドに関する。これらのペプチドは、デングウイルス（ＤＥＮＶ）によって生じる感染を阻害又は低減できる。本発明は、これらの合成ペプチドを含有する医薬組成物にも関し、前記医薬組成物は、ＤＥＮＶによって生じる感染を予防する及び／又は処置するために好適である。さらに本発明は、このウイルスによって生じる感染を処置するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から配列番号９又はそれらの類似配列(analogue sequence)で構成される群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、ベータヘアピンペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の１つ又は複数のペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とからなることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項３】
ヒト血清アルブミンを含有する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物の前記ペプチドが超分子凝集物を形成している、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
医薬品の製造のための請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項６】
前記薬物が、デングウイルス（ＤＥＮＶ）による感染、タンパク質アルファ２マクログロブリン（α２Ｍ）によって媒介される疾患又はタンパク質ＬＲＰ１によって媒介される疾患を阻害又は軽減するために使用される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
患者におけるＤＥＮＶ感染を阻害する又は軽減するための方法であって、請求項１に記載の１つ若しくは複数のペプチド又は請求項１に記載のペプチドの少なくとも１つを含む医薬組成物の該患者への投与からなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学及び製薬業界、具体的にはデングウイルス（ＤＥＮＶ）に対する抗ウイルス活性を示す合成ペプチドの設計及び取得に関する。これらのペプチドの一次構造はベータヘアピン構造の効率的な形成を促進し、ＤＥＮＶのエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩＥ）の機能性パッチを模倣するように設計された。本発明は、ＤＥＮＶ感染の予防及び／又は処置のために使用されるこれらの合成ペプチドを含有する医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＥＮＶは、そのゲノムがプラスセンス１本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含有するエンベロープウイルスで構成されるフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの一員である。フラビウイルス科ファミリーには３種の異なる属：フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）及びペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）がある。フラビウイルスは、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）及びデングウイルス（ＤＥＮＶ）などのその多くが臨床的に重要な疾患を引き起こす７０を超える周知のウイルスを包含している。ヒト疾患を引き起こすフラビウイルス属のウイルスは、通常節足動物媒介（マダニ及び蚊）であり、したがってこれらの疾患を根絶することは非常に困難な課題である（Ｍｏｎａｔｈ、Ｔ．Ｐ．、Ｆ．Ｘ．Ｈｅｉｎｚ．１９９６．Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ、ｐ．９６１〜１０３４．Ｉｎ：Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ（ｅｄ．）、Ｆｉｅｌｄｓ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３ｒｄ  ｅｄ．、ｖｏｌ．１．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）。
【０００３】
ＤＥＮＶ感染は、世界の熱帯地域においてパンデミック規模（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ）に達しており、それらの近年の再出現は影響を受けている国々の公衆衛生制度へのますます困難な課題になっている。年間約１億人のＤＥＮＶ感染者が生じていると推定され、ＤＥＮＶが流行している地域に２５億人が住んでいる（Ｇｕｂｌｅｒ、Ｄ．Ｊ．（１９９８）．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１１、４８０−４９６；Ｍｏｎａｔｈ、Ｔ．Ｐ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１、２３９５〜２４００）。１９９０〜１９９８年の間にＤＥＮＶ出血熱（ＤＨＦ）による平均５１４，１３９の症例及び１５，０００の死亡例が毎年世界保健機関（ＷＨＯ）に報告されたが、ＤＨＦの実際の発生は数倍多いと推定されている。商業的に入手できるＤＥＮＶに対するワクチンはなく、このウイルスに対して特異的な抗ウイルス処置はない。
【０００４】
用語ＤＥＮＶは、ＤＥＮＶ１からＤＥＮＶ４と命名される４種の抗原的に且つ遺伝的に関連するウイルス又は血清型から構成される複合体を指す。ＤＥＮＶは、少数の蚊種、主にネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）の咬刺を通じてヒトに伝播する。生じる感染の臨床的所見は、無症候性疾患又は軽度の発熱状態からさらに重度のＤＨＦ及び致死性である可能性があるデングショック症候群（ＤＳＳ）までさまざまな場合があり得る。最も重度の臨床所見は、ウイルスが初感染のものとは異なる血清型に属する場合の二次感染に伴う（Ｋｏｕｒｉ  ＧＰ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｔｒａｎｓ  Ｒｏｙ  Ｓｏｃ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ；７２：８２１〜８２３；  Ｈａｌｓｔｅａｄ、Ｓ．Ｂ（２００３）．  Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．６０：４２１〜６７）。この観察は、ウイルスの感染性が、感染するウイルスにＦｃ受容体を介する標的細胞への侵入のさらなるポートを提供する非中和性ウイルス抗体複合体の形成を通じて実際に増強され得ることを述べている、抗体依存性感染増強の理論によって説明されている（Ｈａｌｓｔｅａｄ  ＳＢ．（１９８８）．Ｓｃｉｅｎｃｅ；２３９：４７６〜４８１）。
【０００５】
ウイルスの複製周期の最初のステップは、それらの宿主細胞の表面へのビリオンの結合である。ＤＥＮＶビリオンは細胞表面グルコサミノグリカンに結合することが示されており、これらは標的細胞との感染ウイルスの最初の相互作用を媒介する分子として提案されている。結合することが示されている別のＤＥＮＶ分子は、樹状細胞特異的Ｃ型レクチンであるＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的細胞接着分子−３−結合ノンインテグリン）である。しかし、両分子は受動的役割を演じると考えられており、細胞表面にウイルスを蓄積するか、又は感染の二次部位へのそれらのｉｎ  ｖｉｖｏで伝播を静めている。増殖性のウイルス進入は、さらなる高親和性受容体又は共受容体との続く相互作用を介する受容体媒介エンドサイトーシスを必要とし、感染ビリオンの内部移行を生じる。後者が細胞内（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ）コンパートメントに達すると、結果としてのｐＨの低下がウイルス性融合タンパク質中の構造変化によって媒介されるウイルスエンベロープとエンドソーム膜との融合工程を引き起こす。この融合の最終結果は、ウイルスカプシドの細胞質への放出であり、これに続いて、それらのゲノムＲＮＡが放出される。次いで裸の細胞質性ウイルスＲＮＡはその５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を通じてリボソームと相互作用し、それが含有する単一の翻訳領域（ＯＲＦ）は前駆体ウイルス性ポリタンパク質に翻訳される。フラビウイルス属ではこのポリタンパク質前駆体は、ウイルス性及び宿主細胞プロテアーゼによる翻訳と同時に起きる及び翻訳後の修飾によって得られる３種の構造タンパク質（カプシド（Ｃ）膜（ｐｒＭ）及びエンベロープ（Ｅ））並びに５種の非構造タンパク質（ＮＳ１〜５）を含有する。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、次いでプラスセンス１本鎖ゲノムＲＮＡの合成のための鋳型として機能する１本鎖アンチセンスＲＮＡ複製物を産生する。そのＲＮＡ複製の工程に関与するウイルスタンパク質が、恐らく小胞体（ＥＲ）と関連する膜構造に物理的に会合することが示されている。
【０００６】
複製後、ＤＥＮＶゲノムＲＮＡは、カプシドタンパク質と会合し、生じたカプシドは、粗面ＥＲの膜を通じて、又はウイルスに誘発される膜構造において、ウイルスタンパク質を含有する脂質膜エンベロープで既に覆われたＥＲ内腔に出芽する。次いでこれらの未成熟ビリオンは、分泌経路に進入し、最終的に成熟ビリオンとして細胞外腔に放出される。
【０００７】
上述のとおりＤＥＮＶゲノムは、およそ１１ｋｂ長１本鎖プラスセンスＲＮＡ分子であり（Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．＆  Ｐｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．（１９９０）．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３、３７６〜３９６）、その正確な長さは異なるウイルス血清型間及び同じ血清型の株間においてさえも異なるＯＲＦを含有している（Ｙａｂａｒ  Ｖ，Ｃ．（２００３）．Ｒｅｖ．Ｐｅｒｕ．Ｍｅｄ．Ｅｘｐ．Ｓａｌｕｄ  Ｐｕｂｌｉｃａ  ２０、５１〜５７）。このＯＲＦの５’近位四分の一は構造タンパク質をコードし、残りは非構造ポリペプチドをコードしている（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．＆  Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（１９９９）．Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７３、４６１１〜４６２１）。
【０００８】
ＤＥＮＶ及び他のすべてのフラビウイルスのタンパク質Ｅは、成熟ビリオンの細胞性受容体への結合、ウイルス進入の際の膜融合及びビリオン集合において基本的役割を演じている。それによりこれは、宿主範囲、病原性及び防御免疫の誘導などの多数の基本的なウイルスの特徴に影響を与える（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、１２２３〜１２３１）。
【０００９】
タンパク質Ｅは、５３から５４ｋＤａの範囲の分子量を有する。それはすべてのＤＥＮＶ構造ポリペプチドでもっとも保存されており、６０〜７０％の血清型間類似性を呈する。Ｘ線結晶解析（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、（２００３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００、６９８６〜６９９１）及び電子低温顕微鏡研究（Ｋｕｈｎ，Ｒ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｃｅｌｌ  １０８、７１７〜７２５）を通じて、ＤＥＮＶでは他のフラビウイルスにおいてと同様にタンパク質Ｅが成熟ビリオンの表面で二量体を形成していることが示されている。
【００１０】
ＤＥＮＶビリオンをわずかに酸性のｐＨ（すなわち６．５より低い）に曝露することは、これらの二量体を解離させ、生じたモノマーの三量体への再会合を導く不可逆的立体構造シフトをタンパク質Ｅにおいて誘導する。この立体構造変化は、哺乳動物細胞での受容体媒介エンドサイトーシスによるＤＥＮＶビリオンの内部移行の後に生じるウイルスとエンドソーム膜との融合のために必要である（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｎａｔｕｒｅ  ４２７、３１３〜３１９）。
【００１１】
各タンパク質Ｅモノマーのおよそ５００アミノ酸残基の内、８０％はそのＮ末端外部ドメイン部分を形成し、残りはＥを脂質エンベロープに固着させる膜貫通ドメインを形成する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９０）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４、６４９〜６８８）。この膜貫通ドメインはおよそ５３残基のステムを通じて外部ドメインに連結されている（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｎａｔｕｒｅ  ４２７、３１３〜３１９）。Ｅ外部ドメインは、次いで３種の別々の構造ドメイン：中央ベータシートドメイン（ドメインＩ）、伸長二量体化ドメイン（ドメインＩＩ）及び免疫グロブリン様フォールドを有する第３のドメイン、ドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩＥ）にフォールドする（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．  Ｓ．Ａ  １００、６９８６〜６９９１）。
【００１２】
ＤＩＩＩＥは、そのポリペプチド鎖の継続的で、中断されていないセグメントによって形成された唯一のタンパク質Ｅドメインである。ＤＩＩＩＥは、タンパク質Ｅ外部ドメインのＣ末端、残基２９４と３９２との間に見出される。その構造は、免疫グロブリン定常領域の球状ドメインのものに非常に類似している（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７９、１２２３〜１２３１）。ＤＩＩＩＥの三次構造は、すべてのフラビウイルスの中で厳密に保存されている位置３０２及び３３３の２つのＣｙｓ残基間のジスルフィド結合を含む。
【００１３】
ＤＩＩＩＥは、ＤＩＩＩＥを残りのドメインに対して異なる配向をとらせる（Ｒｅｙ，Ｆ．Ａ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｎａｔｕｒｅ  ３７５、２９１〜２９８）伸びた可動性の１０残基リンカーを通じてドメインＩに繋がっている（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｎａｔｕｒｅ  ４２７、３１３〜３１９）。二量体から三量体への移行の際に、ＤＩＩＩＥは、それがおよそ７０°回転し、その重心がドメインＩＩの方向に３６Å移動する最も劇的な構造シフトを示すドメインである。ＤＥＮＶ及び他のフラビウイルスでは、病原性、細胞指向性及びウイルス宿主範囲を決定する残基の大部分は、ＤＩＩＩＥに位置する（Ｒｅｙ，Ｆ．Ａ．、ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｎａｔｕｒｅ  ３７５、２９１〜２９８）。同様に多数の中和エスケープ変異がこのドメインにマップされている（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、１２２３〜１２３１）。
【００１４】
ＤＩＩＩＥが推定ＤＥＮＶ細胞受容体と相互作用するタンパク質Ｅの領域の一部であるとの考えを支持する、タンパク質Ｅ及びＤＥＮＶビリオンの構造の分析、並びに実験的研究の両方から得られたたくさんの証拠がある。そのような役割に一致するこのドメインの構造的特徴のいくつかはＤＩＩＩＥがビリオン表面において最も突出しているドメインであり、それにより受容体部位との相互作用のために最も接近しやすいという事実である（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３、１３〜２２）。同様にそれが免疫グロブリン様フォールドをとるという事実は、類似のドメインが多種多様な細胞接着タンパク質において見出されることが以前から周知であることから、推定ＤＥＮＶ細胞受容体に関与する可能性があることを示唆している。受容体結合に関与している可能性と一致する、このドメインのさらに別の構造的特性は、残基２８４〜３１０及び３８６〜４１１から形成され、負に荷電したヘパリン硫酸分子へのこのドメインの結合に関与する可能性がある、正に荷電した親水性表面パッチの存在である（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、１２２３〜１２３１）。
【００１５】
組換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）技術を通じて得られたＤＩＩＩＥでの研究は、Ｃ６／３６及びＢＨＫ２１系の細胞の表面に直接結合し、ウイルス感染を遮断することができたことを示した（Ｈｕｎｇ，Ｊ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８、３７８〜３８８）。
【００１６】
以前の研究は、ＤＩＩＩＥが得られるフラビウイルス種に依存して、３０μＭ以下のみかけの解離定数（ＫＤ）を有してＤＩＩＩＥが宿主細胞への特異的結合を呈することを実証している（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．、ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３、８４９〜８５６）。一方、ＤＥＮＶのその標的細胞への結合を最も効率的に遮断するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、そのエピトープがＤＩＩＩＥに位置するモノクローナル抗体であることは周知であり、タンパク質Ｅとウイルス性細胞受容体との相互作用におけるこのドメインの関与についての間接的な証拠となっている（Ｔｈｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．、ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｊ．Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．８２、１８８５〜１８９２．）。
【００１７】
ＤＥＮＶのその宿主細胞への進入は、その前の細胞表面上の特異的受容体分子との相互作用に依存する。しかしＤＥＮＶ宿主細胞相互作用の研究の際に集められた証拠によると、ウイルスの進入のために使用されるその受容体は、細胞型及びさらにウイルス血清型に応じて変化する可能性がある。既存のデータは、ＤＥＮＶ進入が複数の分子複合体との相互作用を伴うことを示唆しており、ここでは、いくつかの分子が一次受容体の役割を演じ、ビリオンを細胞表面に結合及び濃縮して、その後に推定細胞内受容体と相互作用するようにする。
【００１８】
細胞へのウイルス進入を遮断することは、ウイルスの生活環のまさに最初の段階を標的化し、うまくいけばウイルス感染の他のすべての下流事象を遮断することから、抗ウイルス処置を開発するための魅力的な戦略である。Ｘ線結晶解析及び核磁気共鳴スペクトルによる分析は、フラビウイルス属（タンパク質Ｃ、タンパク質ｐｒＭ及びタンパク質Ｅ）の３種の構造タンパク質について原子分解能での構造情報を提供している。これらの研究は、エンベロープタンパク質の構造的移行の阻害などのウイルスの複製サイクルを阻害するための代替的手法を示唆している。同様にいくつかの構造研究は、受容体分子との相互作用及び抗体の中和に関与し、ＤＥＮＶに対する抗ウイルス薬の合理的な設計のための標的としての潜在的結合部位を構成するエンベロープタンパク質の具体的な領域に関与するデータを提供している。
【００１９】
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ１）と命名されたヒト膜タンパク質がＤＥＮＶ進入の際に使用される実際の細胞内受容体であることは以前から提唱されている（Ｈｕｅｒｔａ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ、ＷＯ２００７／１２４６９８）。したがってＬＲＰ１は、この分子が３０個を超える天然リガンドのエンドサイトーシスを効率的に媒介し、無関係のウイルス種、ヒトライノウイルスの小群への受容体として作用することが以前示されていることから、抗ウイルス薬の設計のための魅力的な標的となる。ＬＲＰ１は、直接並びに、ＬＲＰ１及びウイルスと同時に相互作用する橋渡し分子を通じての両方でＤＩＩＩＥに結合することが示されている。後者の場合の一例は、ＤＩＩＩＥに結合し、ＬＲＰ１リガンドでもあるヒトアルファ−２−マクログロブリン（α２Ｍ）である。
【００２０】
ＤＩＩＩＥの構造に基づいたベータヘアピンペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方でＤＥＮＶ感染を阻害するために使用され得ることが以前示されている（Ｈｕｅｒｔａ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ、ＷＯ２００７／１２４６９８）。これらのペプチドは、その正確な配列はそれが由来するウイルスの血清型に依存するが、ＤＩＩＩＥのＦＧベータヘアピンの部分を包含し、特定のヘアピン断片のＮ及びＣ末端に付加されたシステイン残基間のジスルフィド架橋を通じて繋ぎとめられている。この一連のペプチドの内、最も高い抗ウイルス活性を呈するメンバーはペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬであった。これはＤＥＮＶ３  ＤＩＩＩＥ由来であるが、４種すべてのＤＥＮＶ血清型に対し阻害活性を呈する。
【００２１】
これらの繋ぎとめられたベータヘアピンペプチドは、しかし比較的低い作用強度などの重大な短所を有する。例えばＶｅｒｏ細胞での感染阻害アッセイを通じて決定されたＨＤＩＩＩ３ＣＬの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、ＤＥＮＶ１について１５μＭであり、ＤＥＮＶ２及びＤＥＮＶ３について２０μＭであり、ＤＥＮＶ４について４０μＭである。この比較的乏しい作用強度は、優れた薬物が少なくともマイクロモル以下の範囲、好ましくはナノモル範囲又はより良い作用強度を有するべきであることから、臨床開発のためのこれらの分子の直接使用を排除する。
【００２２】
このペプチドシリーズの別の短所は、ループの鎖間部分が中和性の免疫優性Ｂ細胞エピトープを含有することである（Ｍａｔｓｕｉ  Ｋ、ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８４（１）：１６〜２０）。例えば文書Ｈｕｅｒｔａ  Ｖ．ら、ＷＯ２００７／１２４６９８は、中和ｍＡｂ  ３Ｈ５がこの鎖間ループを含有するペプチドに結合することを実証している。抗ＤＩＩＩＥ抗体応答の一部が異なる血清型内で交差反応性であることから、以前の感染によって誘導された既存の交差反応性抗ＤＩＩＩＥ抗体応答がこのペプチドに結合でき、その有効濃度を減少させている可能性があり、それによりペプチドの、それらの低い作用強度によって既に必要とされるものよりもさらに高い治療用量が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
上に示された事実は、好ましくはナノモル範囲のＩＣ５０を有する、ＤＥＮＶに対して高い効能を有する抗ウイルス薬がまだ入手できていないことを実証している。本発明は、このまだ満たされていない要求にまさに対処する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
発明の記載
本発明は、以前同定されたペプチドの作用強度を最適化することによって得られた新規ＤＥＮＶ阻害ベータヘアピンペプチドを提供することによって上に述べた問題を解決する。本発明のベータヘアピンペプチドは、配列番号１から配列番号９に示されるアミノ酸配列、又はこれらの配列への配列類似体の１つを有することによって特徴付けられる。
【００２５】
本発明の中心的課題は、少なくともマイクロモル以下の範囲、好ましくはナノモル範囲又はより良好な、比較的高い作用強度でＤＥＮＶ感染を阻害するペプチドを設計することである。高い効能は治療用量を可能な限り減少させるために必要である。他の病態に対して現在臨床使用にある治療用合成ペプチドは、典型的には非常に強力な化合物であり、その有効性（ＩＣ５０、５０％有効濃度（ＥＣ５０）など）はナノモル／ナノモル以下の範囲にあり、その特異性は非常に高く、したがって非常に低い毒性を呈する。低い作用強度のペプチドは、高い治療用量を必要とし、多数の重大な短所をもたらす。その１つは高用量が非特異的相互作用による副作用を薬物が示す可能性を増加させるという事実である。別に、製造及び製剤の際又はｉｎ  ｖｉｖｏでのその送達の際に（例えば血清タンパク質との非特異的相互作用による）凝集の問題を有する可能性が顕著に増加する。さらに別の短所は高用量が、抗ペプチド抗体応答の誘導が特に処置が反復される又は時間的に延長される場合に、その治療活性を無効化し、それによりこの損失を補うためにさらに高い用量を必要として、免疫原性／抗原的問題を有する可能性を増加させるという事実である。
【００２６】
対照的に低い有効量を有する高作用強度ペプチドの使用には、さらに低い製造経費及び患者によって支払われる低い価格の両方に由来する多数の経済的有利点がある。ペプチド合成技術は、低分子量化合物に基づく薬物の合成よりも通常さらに高価であり、経費の検討は、最終的にデングに対するペプチドに基づく抗ウイルス薬を利用する患者又はヒトの数を、特に治療用量が多い場合に、制限する可能性がある。
【００２７】
治療用ペプチドの作用強度を決定する基本的要因の１つは、その標的との相互作用の親和性である。しかし、高親和性タンパク質タンパク質相互作用に関与する機能性表面パッチを模倣する活性ペプチドを設計する課題は、自明からはほど遠い。ここで基本的問題は、球状タンパク質中の機能性表面パッチは通常位置特異的（すなわちポリペプチド鎖の１つより多い連続セグメントを含んでいる）及び立体構造的（すなわち相互作用を生じさせるために参加する残基の十分規定された空間的配置を必要とする）であることである。対照的に、短いタンパク質セグメント、典型的には１０〜２０残基長由来のペプチドは、溶液中で可動性であり、通常単一の十分規定された立体構造を取らない。ベータヘアピンペプチドは、例えばフォールドしたタンパク質中の十分に規定された構造モチーフ由来であるにも関わらず、溶液中で構造的に安定ではなく、代わりに平衡しているさまざまな立体構造の集合体として存在している。
【００２８】
具体的な立体構造を模倣することを意図された溶液中でのペプチドの立体構造状態は、２つの状態：フォールドされた状態（その三次元構造は、模倣しようとする天然のタンパク質構造に合致している）及びアンフォールド又は変性状態（溶液中のペプチドによって取られるすべて非天然立体構造の集合体）の間の平衡として通常分析される。天然タンパク質中のベータヘアピンと別のタンパク質標的との間の相互作用を模倣するベータヘアピンペプチドの場合では、ヘアピンが安定であるほど、天然タンパク質中の対応するセグメントのものにその構造は似ており、ペプチド受容体複合体の形成の際に立体構造のエントロピーの喪失が少ないほど生じた相互作用の親和性が高い。
【００２９】
言い換えると：溶液中でペプチドが無秩序な（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）構造を取ることを仮定して、その標的に結合する工程が立体構造的な選択機構を通じて進行すると仮定すると、それにより結合工程の自由エネルギーにおける変動は、ペプチドの好適な立体構造へのフォールディングに関連する自由エネルギーにおける変動、及び既にフォールドしたペプチドの受容体上のそのドッキング部位への結合に関連する自由エネルギーにおける変動の合計として表され得る。この場合結合工程、又は言い換えると相互作用の安定性によって放出される自由エネルギーの量は、ペプチドの配列を修飾することによって、元の配列のいくつかの残基をａ）溶液中のペプチドの立体構造の安定性を増強する（選択された残基が受容体部位の接触表面と直接相互作用しない場合に特に好都合）又はｂ）ペプチドとその受容体との間の分子間相互作用を最適化し、ドッキングステップの際に生じる自由エネルギーの低下を増加させる、のいずれかの他の残基によって置き換えることによって増加され得る。
【００３０】
ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ（配列番号１０、表１）の配列の分析は、そのベータヘアピンフォールドの安定性を改善するために利用できる可能性があるいくつかの特徴を明らかにする。これらは以下である：ａ）ベータ鎖Ｆ及びＧ上の−Ａｓｎ３及びＡｓｎ１６などの−アスパラギン残基の存在。アスパラギンはあまりベータシートを形成せず、内在性ベータシートを有する性向が非常に小さく、正のねじれ角によって特徴付けられるループ及び主鎖構造中に出現する傾向がある（Ｓｗｉｎｄｅｌｌｓ  ＭＢ、ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．；２（７）：５９６〜６０３）；ｂ）いくぶん大きなループの存在−鎖から鎖へ６残基、２個の最適なサイズよりさらに大きい（４残基まで）（Ｂｒａｎｄｅｎ  Ｃ．＆  Ｔｏｏｚｅ  Ｊ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９１）。ここで問題は、タンパク質ループへの新たな残基の挿入がループ閉鎖に関連するエントロピー消費を有することであり、それはループサイズと共に増大する；及びｃ）鎖間ループ中の２つのグリシン残基−Ｇｌｙ７及びＧｌｙ９−の存在。グリシンは、それが他の天然アミノ酸に伴う主鎖のねじれ角の制限を受けないことから、フォールディング工程の際に最も大きな立体構造的エントロピー損失を受ける残基である。
【００３１】
開示のベータヘアピンペプチドの立体構造的安定性を増加させる、本発明で示される配列変化の基礎は、修飾可能な位置の既存の残基を、ベータヘアピン型構造を形成する高い構造的性向を有する残基によって置き換えることである。具体的なアミノ酸がベータヘアピン中で特定の位置を占める構造的性向は、タンパク質構造データベースから実験的に決定されたベータヘアピン構造内の位置での前記アミノ酸の出現頻度から推定され得る。それは数学的には、その観察された出現頻度と予測されるものとの間の商の対数として算出され、後者はデータベース中の関連残基の相対存在量に由来する。
【００３２】
本発明において修飾可能であると定義される位置は以下である：
ａ）ＤＩＩＩＥの構造中の鎖Ｆの内側の面の残基に対応するベータヘアピンペプチドの第１のベータ鎖中の位置、すなわち天然構造で溶媒に曝露されていない残基。これらの残基は、ペプチドの第１の及び第２のベータ鎖（ＤＩＩＩＥの構造中の鎖Ｇに対応する）の主鎖中のドナー原子とアクセプター原子の間の水素結合が確立されている位置（ＨＢ位置）を占めている；
ｂ）鎖間ループに対応する位置；
ｃ）ペプチドの第２のベータ鎖（ＤＩＩＩＥの鎖Ｇに対応する）中のＨＢ位置、不変のままであるＤＩＩＩＥの残基Ｔｒｐ３９１（ＤＥＮＶ２残基番号）を除く。これらの「ｃ」位置の他に、疎水性特徴を有する残基は許容され、好ましい。
ｄ）ループに最も近い鎖Ｆの非ＨＢ（ＮＨＢ）位置；
ｅ）ペプチドの第２の鎖（ＤＩＩＩＥ中の鎖Ｇに対応する）の第１のＨＢ位置のための可能性がある修飾は、高い構造的性向を有する残基に加えて、４種すべての血清型のＤＩＩＩＥ内で組織分布的に保存されており、ＬＲＰ１／α２Ｍ＊（活性化α２Ｍ）複合体への結合の際に潜在的に関与する可能性があるリシン（Ｌｙｓ３８５、ＤＥＮＶ２残基番号）の役割を模倣するＬｙｓ残基によるその置換を含む。
【００３３】
ポイントａ）で定義される本発明の修飾可能残基は、ＤＩＩＩＥの構造において溶媒露出（ｓｏｌｖｅｎｔ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）されておらず、したがってドメインと、その受容体又はウイルスの生活環における任意の他の関連する受容体との間の接触界面の一部ではない。したがってそれらは、ペプチドのフォールディング安定性を増加させる残基によって置き換えられてよい。
【００３４】
ポイント（ｂ）で定義される鎖間ループの残基は、この領域の配列がＤＥＮＶ血清型の間で変動することから、修飾可能であると考えられ、これらの残基の厳密な保存がＤＩＩＩＥと推定ＤＥＮＶ受容体との相互作用を保存するために必要ではないことを示している。この根拠の方針は、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬが４種すべてのＤＥＮＶ血清型の感染を阻害し、一般にα２Ｍ＊／ＬＰＲ１受容体を遮断することは血清型非依存性抗ウイルス効果を有するという事実によって支持されている。本発明による好ましい鎖間ループ変種はベータターンの２つの中心的残基からなり、ターンの位置１及び４は隣接ベータ鎖の第１の連結残基に対応し、変種自体がペプチドの立体構造的安定性を増加させる。一般に天然のベータヘアピンは短い連結ループを有する傾向がある（Ｂｒａｎｄｅｎ  Ｃ．＆  Ｔｏｏｚｅ  Ｊ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９９１）。変性状態の立体構造のエントロピーは、ポリペプチド鎖のサイズに伴って増加するので、ループサイズの低減は同時にこのエントロピーを減少させる。
【００３５】
２残基ループ（本発明の鎖間ループについての好ましいサイズ）の２個の中心的残基の１つは、ＤＥＮＶ３由来のＤＩＩＩＥのＬｙｓ３８５を模倣することによって機能的役割をとり得る。本発明において開示されるペプチドのいくつかにおいてこの機能的役割は、ＩＩＰ型ベータターンの場合にはループの位置２のリシン残基（このＬｙｓ残基は次いでターンの中心的位置を占める）によって実施され、そのトポロジーはＤＩＩＩＥのＦＧヘアピンのものと同一であった。本発明によって開示される別のペプチドにおいてこの機能的役割は、ループの位置１（ＩＩＰ型ベータターンにおける位置２）に位置付するＤ−Ｌｙｓ残基（Ｌ−リシンのＤ立体異性体）によって、この場合ペプチドのトポロジーはＤＩＩＩＥ中のＦＧベータヘアピンのものと比較して逆になっているが、履行される。
【００３６】
ポイント（ｃ）で定義される修飾可能残基は、ポイントａ）のものと同様にヘアピンの同じ面に向けられており、したがってそれらは隣接していて、主鎖原子が関与する水素結合を形成している。ＤＩＩＩＥの構造中の対応する残基は、鎖Ｇがベータシートの縁を形成していることから部分的に溶媒に曝露されている。ＤＩＩＩＥにおけるＴｒｐ３９１（ＤＥＮＶ２残基番号）に対応するベータヘアピンペプチド中の位置は、この残基がすべてのＤＥＮＶ血清型にわたって厳密に保存されており、機能的である可能性が非常に高いことから、本発明において修飾不可能として定義される。実際に例２（表２）は、この残基がペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬの抗ウイルス活性に不可欠であり（ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ２のものも同様、表１を参照されたい）、アラニン残基による置き換えで失われることを実証している。リシン置換は、第２の鎖の第１の位置（ポイントｅ）で参照される修飾可能残基）でも許容され、置換自体がＤＥＮＶ３のＤＩＩＩＥの残基Ｌｙｓ３８５の構造的／機能的模倣物を構成する。Ｌｙｓ３８５は、ＤＩＩＩＥのα２Ｍ＊との相互作用に関与する陽イオン性残基であり、推定α２Ｍ＊／ＬＲＰ１細胞内受容体複合体の構成タンパク質の１つである。
【００３７】
ポイントｄ）で参照される修飾可能位置はＤＩＩＩＥの溶媒曝露表面中の残基に対応するが、ＤＥＮＶ血清型にわたって厳密に保存されてはいないことからこれらは修飾可能として定義される（図１Ｅ）。
【００３８】
ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ中の修飾可能位置のセットが定義されると、その配列は、各修飾可能位置について最も高い構造的性向指標を有する残基を選択することによって最適化された。上述のとおりこのパラメーターは、実験的に決定されたタンパク質構造のデータベースから取られた、中心２残基ループを有するベータヘアピン構造をとっている８残基断片（すなわち断片の残基４及び５がベータターンの中心的残基に対応する）中の各残基の観察された出現頻度に由来する。この場合に使用されたデータベースは、２．５Åより高い解像度を有する三次元タンパク質構造の非重複性セットである（ＷＨＡＴ  ＩＦ  ｄａｔａｂａｓｅ；Ｖｒｉｅｎｄ、Ｇ．（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．８、５２〜６）。構造的性向指標はヘアピン中の特定の位置での特定のアミノ酸の出現数とデータベース中の残基の相対存在量に基づく出現の予測される数との商の対数として定義され、ＩＰ型及びＩＩＰ型ベータターンを含有するベータヘアピンについて別々に算出された。最終的な選択は、最も一般的な側鎖回転異性体及び鎖間接触を考慮した提案されたベータヘアピンペプチドの三次元構造のモデルを築くことを必要とした。
【００３９】
本発明は、それらの化学的構造及び立体化学と構造的に合致するベータヘアピンの位置への非天然アミノ酸の導入も開示する。そのようなものとしては、主鎖が正のねじれ角をとっている位置に導入された天然アミノ酸のＤ−立体異性体の場合がある。例えばＤ−Ｐｒｏは、ＩＩＰ型ベータターンの第２の残基として好ましい（本発明における２残基鎖間ループの第１の残基に等価である）。別の例は、ＩＩＰ型ベータターンの第２の残基に対応する位置だが逆トポロジーを有するペプチドに同様に導入されたＤ−Ｌｙｓである。これらの場合Ｌ−Ｌｙｓは、この位置に立体的に好ましくなく（その構造的性向指標は高くなく、Ｌｙｓがラマチャンドランプロットの右下象限に位置するねじれ角をあまりとることがないことを反映している）。これは、この位置のＬｙｓ残基がＤＥＮＶ３由来のＤＩＩＩＥのＬｙｓ２８５を潜在的に模倣するという事実に鑑みると残念である。代わりにＤ−Ｌｙｓ残基を導入することは、ＩＩＰ型ベータターンの位置２に必要なねじれ角を容易にとれることからこの難問を解決する。
【００４０】
上の段落に記載の修飾可能残基の定義は、そのトポロジーがＤＩＩＩＥの構造中のベータヘアピンＦＧのものと同一（天然トポロジー）であるベータヘアピンターンに対応する。しかし本発明は、逆トポロジーを有するペプチドも開示する。これらのペプチドでは配列の第１の及び第２のベータ鎖は、機能的及び構造的にそれぞれＤＩＩＩＥの鎖Ｇ及びＦに対応し、ＮＨＢ位置を占める残基は天然トポロジーペプチドにおけるＨＢ位置に対応する（逆もまた同じ）。
【００４１】
ＤＩＩＩＥのＦＧベータヘアピンの天然のトポロジーを維持している本明細書で設計されるペプチドは、ベータヘアピン構造の立体構造的安定性を増加させるジスルフィド架橋をＮＨＢ位置に含む。これらのＣｙｓ残基によって占められている位置は：ａ）鎖Ｆの最初の残基及びｂ）鎖Ｇの最後の残基である（図１Ｅ）。
【００４２】
本発明において開示のペプチドのいくつかは、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬのものよりも長いベータ鎖を呈する。これらの長い鎖は、それらが２つのさらなる水素結合（鎖あたり１つのＨＢ残基）を導入することからペプチドの立体構造安定性を増加させる。
【００４３】
これらの立体構造を安定化することに加えて、開示のペプチドとそれらの標的との相互作用の親和性（それによりそれらの抗ウイルス活性）は、前記相互作用を直接最適化することによって増加され得る。これは、その相互作用のエネルギー変換への寄与が無視できるか又は実際にはマイナスであるかのいずれかである界面残基を修飾することによってなされ得る。
【００４４】
一般にタンパク質タンパク質結合のエネルギーが、残基のいくぶん少ないセットの相互作用によって支配されていることが見出されている。それによりほとんどの界面残基は、そうであるとしても、結合工程において比較的限定された役割を演じている。本発明において開示のペプチドとその標的との間の相互作用について、又はＤＩＩＩＥとその推定受容体との間の相互作用について構造的データは利用可能ではないが、最初の概算として、ＤＩＩＩＥのＦＧヘアピンのすべての溶媒曝露残基がペプチド受容体界面において機能的役割に関与している及び／又は演じていることが推定できる。
【００４５】
本発明の例２（表２）及び６は、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ２のＬｙｓ１４（ＤＥＮＶ３  ＤＩＩＩＥにおけるＬｙｓ３８８に対応する）又はＴｒｐ１７（ＤＩＩＩＥにおけるＴｒｐ３９１に対応する）をアラニン残基によって置き換えることが、いずれの場合でもＶｅｒｏ細胞でのこのペプチドの抗ウイルス活性を消失させ、ＬＲＰ１受容体へのその結合に影響を与えることを実証している。したがって両残基は、ＨＤＩＩＩ３ＣＬ２の生物学的活性に不可欠であり界面に位置する可能性が非常に高く、相互作用への不可欠な寄与をなす。したがって本発明ではこれらの残基は置換されない。残基Ｃｙｓ１及びＣｙｓ１８のアラニンによる二重置換も抗ウイルス活性及びＨＤＩＩＩＣＬ２のＬＲＰ１への結合を消失させるが、この場合効果は、好ましい分子間相互作用の喪失よりむしろベータヘアピンの溶液中での立体構造的安定性の喪失によって生じると考えられる。
【００４６】
本発明は、ベータヘアピンペプチドの潜在的な機能性表面を拡張することがそれらの作用強度を増加させるための追加的手段を構成することも開示する。この具体的な場合では４残基がヘアピンの構造に加えられ、その２個はＤＩＩＩＥ中のＦＧヘアピンの曝露表面に対応し、類似物ペプチドのＨＤＩＩＩ３ＣＬシリーズには以前含まれていなかった。具体的には２残基が各ベータ鎖に加えられ、ここでＮＨＢ位置はＤＥＮＶ３  ＤＩＩＩＥの残基３７５（Ｆ鎖）及び３９２（Ｇ鎖）に対応するアミノ酸によって占められている。ＤＩＩＩＥでは位置３７５の同一性は４種すべての血清型にわたって厳密には保存されていないが、Ａｓｐ又はＧｌｕのいずれかが異なる単離体において観察されていることから、これは保存的置換である。したがって、Ａｓｐはベータシートなどの伸長された立体構造の一部にある性向が低いためにＧｌｕが好ましい解決策であるが、両アミノ酸は本発明に開示のベータヘアピンペプチドの等価の位置のために適格である。ＤＩＩＩＥの残基３９２に等価であるペプチド位置の場合は、好ましいアミノ酸は、４種のＤＥＮＶ血清型でのこの位置に最も頻繁に観察される残基であるＰｈｅ又はＴｙｒである。そのため、ヘアピンのこれらの伸長された部分の修飾可能残基はＨＢ位置に対応し、高いベータシート形成性向を有する疎水性アミノ酸を優先的に含むことによって立体構造的安定性を最適化するために使用される。
【００４７】
例２において開示の必須残基（ＤＩＩＩＥ中のＬｙｓ３８８、Ｔｒｐ３９１及びＧｌｕ／Ａｓｐ３９２に対応するもの）を除いた、外側の面（ＮＨＢ位置）のすべての残りの残基が、ＤＩＩＩＥにおけるそれらの対応するアミノ酸がＤＥＮＶ血清型にわたってさらなる多様性を呈することから、本発明において修飾可能であると考えられる。
【００４８】
本発明のベータヘアピンペプチドの修飾可能な位置のために選択可能な残基の種類に関して、好ましい解決策は、ＤＥＮＶの４つの血清型の相同性配列の対応する位置に現れる残基の種類である。それは、ＤＩＩＩＥ中の位置３７７に対応する残基の場合であり、好ましい解決策はＡｓｎ（ＤＥＮＶ３由来ＤＩＩＩＥに出現）よりむしろＴｙｒ（ＤＥＮＶ１及びＤＥＮＶ４由来ＤＩＩＩＥに出現）である。Ｔｙｒ及びＡｓｎは両方とも極性及び水素結合ドナー／アクセプターであるが、Ｔｙｒはより大きな非極性表面を曝し、タンパク質タンパク質相互作用界面でさらに頻繁に出現し、伸長構造をとってベータ鎖の一部を形成するより高い性向を有し、ＤＩＩＩＥ由来Ｌｙｓ３８８に対応する残基とのより好ましい（ｐｉ−陽イオン）相互作用に寄与でき、それによりベータヘアピンの立体構造的安定性に寄与する。
【００４９】
必須ではないが潜在的に機能的な位置は、必須／構造的位置が固定されており、残りの位置が無作為化されているファージペプチドライブラリーの使用などのコンビナトリアル法を通じて通常同定され得る。この場合ライブラリーは、ＬＲＰ１及び／又はα２Ｍ＊などの特異的リガンドへのペプチドの高い結合を呈するファージを選択する結合アッセイの使用を通じて、最適配列に関してスクリーニングされる。最適配列は、合理的設計法の使用を通じても得ることができる。
【００５０】
本発明の目的のために開示されたベータヘアピンペプチドは、化学的に又は、それらの配列が天然アミノ酸だけを含有する場合は組換えＤＮＡ技術を通じて、単独で又は融合タンパク質としてのいずれかで合成され得る。組換えＤＮＡ技術が適用可能であれば、融合タンパク質の使用は、発現レベル及び宿主プロテアーゼに対する組換えペプチドの安定性を増加させ得る。ペプチドは、次いで関連プロテアーゼでの処置によってペプチドを放出するために使用され得るプロテアーゼ認識部位を通じてその融合パートナーに結合されてよい。
【００５１】
本発明の例１は、９個のベータヘアピンペプチド（配列番号１〜配列番号９）の設計を開示する。基本的にそれらの構造は４個のセグメントからなる：ベータターンによって分離され、３個のリシン残基を含有するＣ末端陽イオン性伸長が続く２個のベータ鎖セグメント（ＤＩＩＩＥのＦＧヘアピンの構造的類似体）。これらのペプチドは、それらの抗ウイルス作用強度及び細胞性受容体へのそれらの結合を最適化するために上で考察した構造的／機能的判定基準に従って設計された。
【００５２】
本発明の目的のためにペプチド配列は、ＰＨＢ１〜９ベータヘアピンペプチドの配列の少なくとも１つへの前記ペプチドの配列同一性が７０％、好ましくは８０％以上である場合に、本明細書で開示されるベータヘアピンペプチド（表１のペプチドＰＨＢ１〜９、配列番号１〜９）のものの類似体であると考えられる。前記類似体ペプチドの配列は、以下から選択される１つ又はいくつかの位置で互いに異なっている：１）上に記載の修飾可能な位置ａ）〜ｅ）であって、ＰＨＢ１〜９中の具体的な１つ又は複数の残基はベータヘアピン中のその位置を占める高い構造的性向も呈する残基によって置換されている位置ａ）〜ｅ）；２）上に記載の潜在的な機能的位置であって、ＰＨＢ１〜９中の関連位置（単数又は複数）は具体的なＤＥＮＶ血清型由来のＤＩＩＩＥのＦＧヘアピンの１つ又は複数の残基によって代わりに占められており、ここで前記残基（単数又は複数）はＰＨＢ１〜９ペプチドのベータヘアピン中の類似体位置を占めている機能的位置；３）Ｃ末端リシンタグの残基に対応する位置；この場合、タグは２個又は３個、好ましくは３個のリシン残基を含み得る；並びに４）ペプチドＰＨＢ１〜４及びＰＨＢ７〜９のジスルフィド結合を形成するシステインに対応する位置であって、ここで１つのＣｙｓ残基は対になるＣｙｓ残基がＬｙｓによって置き換えられる場合は、ペプチドが一方がＡｓｐ／Ｇｌｕ他方がＬｙｓである前記残基の側鎖間のアミド結合の形成を通じて繋ぎとめられるように、Ａｓｐ／Ｇｌｕによって置き換えられてよい位置。
【００５３】
ＰＨＢ１〜９ペプチドの活性は、Ｖｅｒｏ細胞でのプラーク阻害アッセイにおいて評価され、その結果は例２において示されている。それらすべてがこの実験モデルにおいて抗ウイルス活性を示し、その内６個はペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬより高いレベルであった。具体的にはペプチドＰＨＢ４は、４種すべてのＤＥＮＶ血清型に対して、非常に強力な抗ウイルス効果をナノモル範囲で呈し、選択性指標（具体的な血清型に応じて１２９０から６４５０）は非常に良好であった。したがってこのペプチドは、以前報告された抗ウイルス薬物候補よりも良い作用強度を有して、ＤＥＮＶに対する抗ウイルス薬の開発のための優れたリード分子を構成する。
【００５４】
したがって本発明は、配列番号１から配列番号９に示されるもの又はその類似体配列から選択されるアミノ酸配列を有する１つ又は複数のベータヘアピンペプチド及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物も開示する。
【００５５】
本発明の一実施形態では前記医薬組成物を含むペプチドは、超分子凝集物を形成している。ペプチドＰＨＢ４（及び一般に本発明で開示のベータヘアピンペプチド）が両親媒性ベータ鎖の構造に適合するように設計される分子であることから、それはペプチド濃度及び正確な溶媒組成に応じて超分子凝集物を形成できる。
【００５６】
例５は、そのサイズ及び形態がペプチド濃度、温度、溶媒、溶液の古さ(solution age)、さまざまな添加剤の存在などの実験条件に依存してペプチドがどのようにナノ構造に自己構築するかを示している。このペプチドの抗ウイルス活性はこれらの条件に応じて変化する場合がある。
【００５７】
本発明の内容では用語「超分子凝集物」は、いくつかの、好ましくは１０個を超えるペプチド分子によって形成された凝集物を示すことが意図される。
【００５８】
例８は、ペプチドＰＨＢ４が生理食塩水に溶解された後の特定の時点でのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加がどのように低ナノモル／ナモノル以下の範囲での作用強度を有する製剤を産生するかを示している。この結果は、ＨＳＡの存在下でペプチドを製剤することが可能であり、このタンパク質の存在が非常に高い抗ウイルス活性を呈するペプチド：ＨＳＡ複合体の形成を導くことを示している。これは、ペプチドが抗ウイルス化合物に開発される場合に、ＨＳＡの血清半減期が非常に長いだけでなく、ＨＳＡが血清プロテアーゼ及び他の血清構成要素との望まれない相互作用に対してペプチドを保護できることから、薬物動態の観点からの重要な発見である。したがって本発明の一実施形態において、開示のベータヘアピンペプチドを含む医薬組成物は、ＨＳＡも含有する。
【００５９】
ＨＳＡの存在とは無関係にナノ粒子へのペプチドＰＨＢ４自己構築は、薬物動態的及び薬力学的観点から望ましい特徴である。それらのサイズによりナノ粒子は、非常に短い期間で通常排除及び代謝されるモノマーペプチドよりも長い血清半減期を呈する傾向がある。加えてモノマーペプチドは、宿主プロテアーゼによるタンパク質分解性攻撃に非常に感受性であり、反対にナノ粒子へのそれらの集合はそれに対するいくらかの保護を提供する傾向がある。同様にナノ粒子は、単一の実体中に複数の結合部位がある構造的状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）を提供し、多価結合及びそれによるペプチド受容体相互作用に対するより高いみかけの親和性、言い換えるとより良い抗ウイルス作用強度に起因するアビジティー効果を生じる場合がある。
【００６０】
例３及び６は、本発明のベータヘアピンペプチドがα２Ｍ＊及びＬＲＰ１タンパク質に結合できることを実証している。α２Ｍ＊及びＬＲＰ１タンパク質は、ＤＥＮＶに対する推定細胞内受容体の構成要素であり、したがって、Ｈｕｅｒｔａ  Ｈ．ら、ＷＯ２００７／１２４６９８に報告されたとおり、抗ウイルス化合物の開発のための標的を構成する。
【００６１】
本発明の本質的な部分は、ナノモル範囲での開示のベータヘアピンペプチドの生物学的活性の分析である。例３に示すとおりペプチドＰＨＢ２、ＰＨＢ４、ＰＨＢ５、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９は、組換えＤＥＮＶ１  ＤＩＩＩＥ（Ｊａｍａｉｃａ株；ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔ）のビオチン化変種のタンパク質α２Ｍ＊への結合をナノモル／マイクロモル以下の範囲で阻害し、前記阻害能力は、それらの阻害百分率がＤＩＩＩＥ１Ｊのものよりも１．５から３倍高いことから非ビオチン化ＤＩＩＩＥ（ＤＩＩＩＥ１Ｊ）が呈するものよりも明らかに高い。対照的にこの濃度範囲でＨＤＩＩＩ３ＣＬが呈する阻害能力は、ＤＩＩＩＥ１Ｊと比較して非常に低い。例６は、本発明のベータヘアピンペプチドが高いアビジティーで受容体ＬＲＰ１に結合し、これに関してペプチドＰＨＢ４が最も高いアビジティーを表すことを実証している。この結果は、ＰＨＢ４が抗ウイルス活性アッセイでの最も強力なペプチドでもあった事実と一致している。
【００６２】
例８は、ベータヘアピンペプチドの抗ウイルス効果が受容体ＬＲＰ１及びタンパク質α２Ｍ＊に結合するそれらの能力と関連していることを実証しており、これは、これらのペプチドがＤＥＮＶのその標的細胞への進入を阻害することによってそれらの抗ウイルス効果を発揮するという知見を確実に支持している。この結果は、ベータヘアピンペプチドの抗ウイルス作用強度を最適化するための本発明において開示の戦略の合理性も強調している。
【００６３】
タンパク質α２Ｍ＊及び受容体ＬＲＰ１との結合に対する本発明で開示のベータヘアピンペプチドの能力は、これらのタンパク質によって媒介される疾患又は臨床状態の管理のための治療剤の開発のために利用され得る。本発明で開示のＤＥＮＶ感染のそれらの強力な阻害は、その可能性の一例を構成する。
【００６４】
ＤＥＮＶの推定細胞内受容体α２Ｍ＊／ＬＲＰ１への結合を遮断すること（言い換えるとタンパク質Ｅの結合を阻害すること）は、当技術分野において周知の他の受容体よりも、このウイルスに対する抗ウイルス薬を開発するためのより良い選択である。他の著者によって記載された受容体は接着受容体であり、すなわち、それらはウイルスの細胞質膜への結合を媒介するが、エンドサイトーシスによってウイルスを内部移行させない。本発明で開示のペプチドによって阻害される段階が、最初の接着段階より下流に位置することから、標的細胞に接着するためにウイルスがどの特異的受容体又は受容体を使用するかに非依存的にペプチドは有効である。
【００６５】
これらの発見を考慮して本発明は、薬物の製造のために記載されているベータヘアピンペプチドの使用も包含する。一実施形態では薬物は、ＤＥＮＶによる感染を阻害又は軽減するために使用される。別の実施形態では、本発明で開示のベータヘアピンペプチドを用いて製造される薬物は、タンパク質α２Ｍ＊又はＬＲＰ１によって媒介される臨床状態の処置のために用いられる。
【００６６】
本発明は、罹患した患者におけるＤＥＮＶによる感染を阻害する又は軽減するための方法であって、本発明で開示の１つ若しくは複数のベータヘアピンペプチド又は少なくとも１つのこれらのペプチドを含む医薬組成物の前記患者への投与によって特徴付けられる方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】デングウイルス（ＤＥＮＶ）に対するベータヘアピンペプチド阻害の設計を示す図である。Ａ）２０個の天然アミノ酸それぞれについての選好パラメーター（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）、ＩＰ型中心ベータターンを有する８残基ヘアピンの各位置について算出。選好パラメーターの値が高いほど、灰色の影が濃い。ＷＨＡＴＩＦデータベースの任意のベータヘアピンの特定の位置に出現する特定のアミノ酸の例が無い場合、前記アミノ酸はその位置で観察値０．５を指定され、次いで対応する選好パラメーターが算出される。Ｂ）２０個の天然アミノ酸それぞれについての選好パラメーター、ＩＩＰ型中心ベータターンを有する８残基ヘアピンの各位置について算出。着色スキーム及び選好パラメーターの算出は（Ａ）におけるものと同一。Ｃ〜Ｄ）ＩＰ型（Ｃ）又はＩＩＰ型（Ｄ）中心ベータターンのいずれかを有するベータヘアピンの配列比較由来の共通配列のロゴ形表示。文字サイズは、その位置のアミノ酸の観察された頻度とデータベースのアミノ酸組成に基づく予測頻度との比に比例している。Ｅ）４種それぞれのＤＥＮＶ血清型及びペプチドＰＨＢ４におけるヘアピンＦＧに対応するＤＩＩＩＥ断片の配列比較。ＭＰ：本発明において定義の修飾可能な位置（ａ〜ｅ）、＊機能的に関連する残基Ｌｙｓ３８５に対応する位置、ＳＳ：ペプチドＰＨＢ４について「設計された」二次構造、ＲＮ：ＰＨＢ４配列での残基番号、ＳＳＤＥＮ：ＤＩＩＩＥでの二次構造、ＲＮＤＥＮ：ＤＥＮＶ２由来のタンパク質Ｅの配列中の残基番号、鎖：ＤＩＩＩＥにおける鎖Ｆ及びＧに対応するベータ鎖。
【図２】ＤＥＮＶ阻害ベータヘアピンペプチドについての三次元構造モデルを示す図である。Ａ）ＨＤＩＩＩ３ＣＬベータヘアピンペプチド。示すセグメントは、陽イオン性Ｃ末端伸長を含まないヘアピンに対応し、いくつかの関連残基を強調している。ＤＩＩＩＥにおけるそれらの等価残基の残基番号は、括弧間に示される。Ｂ）ペプチドＰＨＢ４。カギ括弧は、ＨＤＩＩＩ３ＣＬと比較して伸長されたベータ鎖の部分を区切っている。Ｃ）両ペプチドの構造の重ね合わせ。
【図３】ＤＥＮＶ１（ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔ）由来のビオチン化ＤＩＩＩＥのタンパク質α２Ｍ＊への結合の阻害を示すグラフである。縦軸は、０．０５〜３μＭペプチド濃度範囲での本発明により開示のベータヘアピンペプチドについての阻害百分率を示す。ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ及び組換えＤＩＩＩＥ１Ｊの阻害活性も示されている。
【図４】ビオチン化ＤＥＮＶ１  ＤＩＩＩＥ（ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔ）のα２Ｍ＊への結合の阻害についての用量反応曲線を示すグラフである。チャートは、ベータターンペプチドＰＨＢ５、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ及び組換えＤＩＩＩＥ１Ｊに対応する阻害百分率を示す。
【図５】表示のベータヘアピンペプチドによるビオチン化ＤＥＮＶ１  ＤＩＩＩＥ（ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔ）のタンパク質α２Ｍ＊への結合の阻害及び抗ウイルス活性との関連を示すグラフである。縦軸は、ＤＩＩＩＥ１Ｊについて決定された結合阻害と比較した結合阻害百分率を示す。示したデータは、マイクロモル以下（５０〜２００ｎＭ）のペプチド濃度範囲に対応する。
【図６】プラスミドｐＥＴ−ＤＩＩＩ  ＤＥＮＶ１を示す図である。
【図７】タンパク質α２Ｍとの相互作用に不可欠なＤＩＩＩＥ残基のマッピングを示す図である。縦軸は、各アラニン置換変異についてのＩＣ５０値（横軸の各残基に対応する）と組換えＤＩＩＩＥ（ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ）についてのＩＣ５０値との間の比を示す。濃い色調で影を付けた楕円は一次相互作用部位の残基を示している。薄い色調で影を付けた楕円は二次相互作用部位を明示している。
【図８】タンパク質α２Ｍ＊とのその相互作用の際に関与する部位のＤＩＩＩＥの三次元構造内の位置を示す図である。詳細な棒状表示（ｓｔｉｃｋ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）及び、矢印及び円柱がベータシート及びループをそれぞれ表す二次構造の表示を含む、ＤＥＮＶ１  ＤＩＩＩの構造の２つの図が示される。関連残基は表示されている。それらは２つの部位にクラスター化されており、影付き楕円によって表されている：一次部位（Ａ）及び二次部位（Ｂ）。三次元構造は、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２ｒ３ｐｒｅ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ．）を使用して与えられた。
【図９】リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でのペプチドＰＨＢ４についての凝集動態を示すグラフである。Ａ〜Ｂ）：ＰＢＳ中１０μＭでのペプチドＰＨＢ４についての凝集動態。縦軸は、時間０（ペプチドがＰＢＳに溶解されるとき）での分散光の強度と比較した分散光の強度に対応する。Ａ：時間０から３００分についての凝集プロファイル。Ｂ：凝集工程の最初の３０分間。Ｃ〜Ｄ）：ＰＢＳ中５μＭでのペプチドＰＨＢ４の凝集動態。Ｃ：初期凝集、時間０〜４０分。Ｄ：後期凝集、時間３０〜２３０分。
【図１０】ペプチド濃度２ｍｇ／ｍＬ、水及びＰＢＳ中での透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるペプチドＰＨＢ４の凝集物の形態の研究を示す図である。実験条件：水（Ａ）又はＰＢＳ（Ｂ）への溶解直後に研究されたペプチド；水（Ｃ）又はＰＢＳ（Ｄ）のいずれかへの溶解及び１時間、５０℃での加熱後に研究されたペプチド；水（Ｅ）又はＰＢＳ（Ｆ）への溶解に続いて、１時間、５０℃で加熱及び室温、２時間のインキュベーション後に研究されたペプチド。Ａ、Ｂ、Ｅ及びＦにおけるバーは、長さ１００ｎｍを有し、Ｃ〜Ｄにおけるバーは長さ２００ｎｍを有する。
【図１１】ＬＲＰ１受容体とのＤＩＩＩＥの直接相互作用についてのアッセイにおいて使用されたタンパク質を示す図である。Ａ）ＬＲＰ１のドメインアーキテクチャの模式図。ＣＭ：細胞膜。リガンド結合クラスターに対応する領域が示される。Ｂ）キメラｓＬＲＰ１−ＣＩＶタンパク質の模式図。Ｆｃ：免疫グロブリン定常領域。Ｃ）組換えＤＩＩＩＥ１〜４タンパク質の模式図。Ｄ）最終ＤＩＩＩＥ調製物の変性電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析：１．ＤＩＩＩＥ１（詳細にはＤＩＩＩＥ１Ｊ）、２．ＤＩＩＩＥ２、３．ＤＩＩＩＥ３及び４．ＤＩＩＩＥ４。実験において使用された分子量ラダー中の１４ｋＤａマーカーに対応する位置は示される。
【図１２】ＥＬＩＳＡアッセイでのＬＲＰ１のリガンド結合クラスターとのＤＥＮＶ  ＤＩＩＩＥの相互作用を示すグラフである。プレートのウェルをコートするために使用されたタンパク質は各チャートの上に示されている。ｓＬＰＲ１−ＣＩＩ−ＩＶタンパク質の結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヒトＩｇＧのポリクローナル抗Ｆｃを使用して検出された。
【図１３】ＢｉａｃｏｒｅアッセイのためのｓＬＲＰ１−ＣＩＶ結合表面の特徴付けを示す図である。Ａ）α２Ｍ＊及び受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）の適用から得られたセンサーグラム（Ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）、両方とも１０ｎＭ。両チャネルから得られたシグナルを示す：Ｆｃ１、固定化ｓＬＲＰ１−ＣＩＶ及びＦｃ２、固定化組換えＨＳＡ。Ｂ）濃度データに対する最大レゾナンスユニット（ＲＵ）からのＲＡＰのｓＬＲＰ１との相互作用の親和性の決定。実線は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０３を使用して実施された２相互作用部位モデルへのフィットを表している。測定はＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ装置で実施された。
【図１４】ベータヘアピンペプチドのｓＬＲＰ１−ＣＩＶとの相互作用についてのＢｉａｃｏｒｅアッセイを示す図である。Ａ及びＢ）２０μＭでのペプチドの適用から得られたセンサーグラム、Ｃ）１６０ｓで観察されたＲＵ、及び（Ｄ）２７０ｓでのＲＵ。
【図１５】タンパク質ＬＲＰ１（ｓＬＲＰ１−ＣＩＶ断片）への結合とベータヘアピンペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性との間の関連を示すグラフである。Ｖｅｒｏ細胞でのＤＥＮＶ２に対する抗ウイルス活性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用強度データ［ｌｏｇ（ＩＣ５０，ｕＭ）］に、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ（天然トポロジー）と同じトポロジーを有するＰＨＢシリーズのペプチドに関するｔ＝４００ｓ（ＲＵｒｅｍ）でのＢｉａｃｏｒｅシグナルの大きさをフィットさせるために線形回帰が使用された。９５％信頼範囲（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｂａｎｄ）は破線で示される。挿入図はペプチドＰＨＢ４を除く同様の分析を表す。
【図１６】タンパク質α２Ｍ＊への結合とベータヘアピンペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性との間の関連を示すグラフである。線形回帰がタンパク質α２Ｍ＊へのＤＩＩＩＥの結合の阻害に関するデータをＤＥＮＶ２によるＶｅｒｏ細胞の感染の阻害についてのＩＣ５０値にフィットさせるために使用された。α２Ｍ＊への結合の阻害百分率は、ペプチドについて使用されたものと同じモル濃度で組換えＤＩＩＩＥ１Ｊについて決定された阻害百分率と比較して表される。示される値は、マイクロモル以下及びナノモルペプチド濃度（５０、１００、２００及び４００ｎＭ）で決定された平均及び標準偏差に対応する。
【図１７】ペプチドＰＨＢ４の抗ウイルス活性へのインキュベーション温度の影響を示すグラフである。抗ウイルス活性は、Ｖｅｒｏ細胞でのプラーク形成アッセイを使用して、ＤＥＮＶ２  １６８０３株を感染させたＶｅｒｏ細胞から感染後（ｐ．ｉ．）の２４時間上清を滴定することによって評価された。ＩＣ５０は、グラフＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０３を使用して概算された。実線はｌｏｇ１０（濃度）対応答曲線への非線形フィットを表す。
【図１８】ペプチドＰＨＢ４の抗ウイルス活性への凝集時間の影響を評価するために使用された実験設計を示す図である。
【図１９】インキュベーション時間及び温度のペプチドＰＨＢ４の抗ウイルス活性への影響を示す図である。抗ウイルス活性は、Ｖｅｒｏ細胞でのプラーク形成アッセイを使用して、ＤＥＮＶ２  １６８０３株を感染させたＶｅｒｏ細胞からのｐ．ｉ．２４時間の上清を滴定することによって評価された。未処置対照（ペプチド処置無し）でのウイルス力価は４ｌｏｇ１０であった。Ａ．１０℃でインキュベーション、Ｂ．３７℃でインキュベーション。
【図２０】凝集工程の際のペプチドＰＨＢ４の初期濃度のその抗ウイルス活性の作用強度への影響を評価するために使用された実験設計を示す図である。
【図２１】水中のペプチドの初期濃度のその抗ウイルス活性への影響を示すグラフである。抗ウイルス活性は、Ｖｅｒｏ細胞でのプラーク形成アッセイを使用して、ＤＥＮＶ２  １６８０３株を感染させたＶｅｒｏ細胞からのｐ．ｉ．２４時間の上清を滴定することによって評価された。
【図２２】ＰＨＢのＣ末端（上）又はＮ末端（下）ヒスチジンタグへの融合の設計を示す図である。
【図２３】金属イオン及びＥＧＴＡ（Ｍｅ２）スペーサーでの架橋によって安定化されたヒスチジンタグ化ペプチド凝集物／ナノ粒子を表すスキームである。
【図２４】ペプチドＨ５ＰＨＢ４及びＰＨＢ４Ｈ５の、単独又はＺｎ及びＥＧＴＡ（Ｚｎ２）との複合体での抗ウイルス活性を示すグラフである。
【実施例】
【００６８】
（例１）
デングウイルスの感染を阻害するベータヘアピンペプチドの設計及び合成
本発明で開示のベータヘアピンペプチドの配列の記載
その配列を配列番号１〜９に示す、表１においてＰＨＢ１〜９と命名した合計９種のベータヘアピンペプチドをそれらの抗ウイルス活性の作用強度及び細胞受容体へのそれらの結合強度をＨＤＩＩＩ３ＣＬと比較して増加させることを目的とした構造的／機能的判定基準に従って、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ（配列番号１０）から出発して設計した。これらのペプチドの構造は基本的に４個のセグメントからなる：ベータターンによって分離され、３個のリシン残基から構成されるＣ末端陽イオン性伸長が続く２個のベータ鎖セグメント（ＤＩＩＩＥのＦＧベータヘアピンのものの構造的類似体）。２つの異なるトポロジーが使用された：ペプチドＰＨＢ１〜４及びＰＨＢ７〜９において使用され、ポリペプチド主鎖はＤＩＩＩＥのＦＧベータヘアピンと同じ方向に進んでいる天然トポロジー、並びにペプチドＰＨＢ５及びＰＨＢ６において使用された逆トポロジー。天然トポロジーペプチドでは、第１のベータ鎖セグメント（表１のベータ１）はＦベータ鎖に構造的に対応し、第２のベータ鎖セグメント（ベータ２）はＧベータ鎖に対応する（図１Ｅ）。ペプチドＰＨＢ１、ＰＨＢ２及びＰＨＢ７での鎖の長さはペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ（６残基鎖）のものと同一であるが、ペプチドＰＨＢ５〜６では７残基に、並びにペプチドＰＨＢ３〜４及びＰＨＢ８〜９では８残基に伸長されている。より長い鎖は、ペプチドの立体構造的安定性を増加させる（Ｓｔａｎｇｅｒ、Ｈ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８、１２０１５〜１２０２０）。
【００６９】
ペプチドＰＨＢ１、ＰＨＢ２及びＰＨＢ７由来の残基Ｃｙｓ１、Ａｓｎ／Ｔｙｒ３及びＴｈｒ５は、ＤＩＩＩＥのＦＧベータヘアピン中の曝露されたＮＨＢ位置に対応する。ＤＥＮＶ３  ＤＩＩＩＥ中の残基Ａｓｎ３７７に相当するＡｓｎ残基をペプチドＰＨＢ１及びＰＨＢ７の位置３（Ａｓｎ３）について選び、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２及びＤＥＮＶ４由来のＤＩＩＩＥのＴｙｒ３７７に相当するＴｙｒ残基をペプチドＰＨＢ２の位置３（Ｔｙｒ３）について選んだ。Ｔｙｒ３は、それがＤＥＮＶ血清型にわたってより保存されており、ベータシート形成に対するより高い性向を有し、Ｌｙｓ１０に対角線上に配置されてそれらの対応する側鎖間の好ましいｐｉ−陽イオン相互作用を促進することから、Ａｓｎ３よりも好ましい（図２Ｂ）。Ｔｈｒ残基をＤＥＮＶ  ＤＩＩＩＥ配列において観察されるＶａｌ／Ｉｌｅ３７９の代わりに位置５（Ｔｈｒ５）について選んだ（図１Ｅ）。この選択の背後の論拠は、Ｔｈｒが、良好なベータシート形成性向を有するＶａｌ／Ｉｌｅに対する保存的置換であることだけでなく、それが他の２つの代替物よりもさらに親水性であり（したがって水へのペプチド溶解度に肯定的に貢献する）、構造的選好パラメーターについてより高い値を呈する（図１Ｅ中の８残基ベータヘアピンの位置２）ことであった。これらのペプチド中の残基Ｃｙｓ１４、Ａｓｎ１２及びＬｙｓ１０はベータヘアピンの同じ面でＣｙｓ１、Ｔｙｒ／Ａｓｎ３及びＴｈｒ５にそれぞれ隣接する位置を占めるが、これらの残基間に主鎖水素結合はない。残基Ｌｙｓ１０及びＡｓｎ１２は構造的及び機能的に残基Ｌｙｓ３８８（ＤＥＮＶ１〜３において保存）及びＡｓｎ３９０（ＤＥＮＶ２〜３において保存）に対応する。Ｔｒｐ残基は、ＤＩＩＩＥ（Ｔｒｐ３９１）中の等価残基がすべてのＤＥＮＶ血清型にわたって厳密に保存されていることから位置１３について選ばれた。システインＣｙｓ１及びＣｙｓ１４は、重要な構造的役割を満たすジスルフィド結合を形成する。それらは、ＮＨＢ位置を占め、この位置のジスルフィド結合はベータヘアピンの安定性に有利に貢献する（Ｓａｎｔｉｖｅｒｉ  Ｃ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、１４、４８８〜４９９）。本発明下記で、残基Ｌｙｓ１０、Ｔｒｐ１３、Ｃｙｓ１及びＣｙｓ１４がこれらのペプチドの抗ウイルス活性に不可欠であることが実験的に実証される。置換が１つの位置（Ｌｙｓ１４→Ａｌａ若しくはＴｒｐ１７→Ａｌａ、ＨＤＩＩＩ３ＣＬ中のＬｙｓ１４はＰＨＢ１、ＰＨＢ２及びＰＨＢ７の残基Ｌｙｓ１０に構造的に対応し；ＨＤＩＩＩ３ＣＬのＴｒｐ１７はＰＨＢ１、ＰＨＢ２及びＰＨＢ７の残基Ｔｒｐ１３に構造的に対応する）又は２つの位置（Ｃｙｓ１→Ｓｅｒ及びＣｙｓ１８→Ｓｅｒ、ＨＤＩＩＩ３ＣＬのＣｙｓ１８はＰＨＢ１、ＰＨＢ２及びＰＨＢ７の残基Ｃｙｓ１４に構造的に対応する）に生じているＨＤＩＩＩ３ＣＬに類似のペプチドは、アッセイした濃度範囲で検出可能な抗ウイルス効果を呈さなかった。同様に本明細書下記で、ペプチドＰＨＢ９がペプチドＰＨＢ８よりも高い抗ウイルス作用強度を呈し、それらの唯一の差異がＤＥＮＶ１〜２及びＤＥＮＶ４由来のＤＩＩＩＥのＴｙｒ３７５に対応する���置でどう置換されているのかであることから、Ｔｙｒ３がＡｓｎ３よりも良い選択であることが実験的に実証される。
【表１】
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【００７０】
残基Ｖａｌ２、Ｔｒｐ／Ｖａｌ４、Ｇｌｕ／Ａｒｇ／Ｉｌｅ６、Ｌｙｓ／Ｔｒｐ９、Ｖａｌ／Ｔｙｒ１１及びＴｒｐ１３は、ＨＢ位置を占めるヘアピンの反対の面の一部を形成する。位置２、４及び６は、位置１３、１１及び９にそれぞれ隣接しており、主鎖水素結合を形成する。位置１３は、先に説明のとおりＴｒｐによってだけ占められており、残りの位置は各残基についての選好パラメーターの値に従って選ぶ（図１Ａ及びＢ）。Ｇｌｕ６−Ｌｙｓ９（ＰＨＢ１）及びＡｒｇ６−Ｔｒｐ９（ＰＨＢ２）対は、それらが好ましい塩橋及びｐｉ−陽イオン相互作用をそれぞれ確立できることから、位置６及び９について選択した。Ｌｙｓ９（ＰＨＢ１及びＰＨＢ７）は、本発明下記に実証のとおりα２Ｍ＊との相互作用に不可欠であるＤＩＩＩＥの残基Ｌｙｓ３８５の役割を機能的に模倣できる。
【００７１】
ペプチドＰＨＢ１及びＰＨＢ２をＩＩＰ型ベータターンが残基６と９との間で形成されるように設計した。これらのペプチド中の位置７は、ＩＩＰ型ベータターンの第２の位置のための好ましいアミノ酸であるｄ−Ｐｒｏ残基（プロリンのＤ−立体異性体）によって占められている（Ｐａｎｔｏｊａ−Ｕｃｅｄａ  Ｄ、ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．；３４０：２７〜５１）。Ａｓｐは、この位置でこのアミノ酸についての選好パラメーターの高スコアによりペプチドＰＨＢ１中の位置８について選んだ。対照的にＬｙｓ残基は、ＤＩＩＩＥ由来のＬｙｓ３８６を模倣する目的でペプチドＰＨＢ２中の位置８の代わりに選択した。ペプチドＰＨＢ７について、ＩＰ型ベータターンを位置６と９との間に導入した。位置７及び８（Ａｓｎ７及びＧｌｙ８）についての残基の選択は、選好パラメーターの値によってなされた（図１Ａ及びＢ）。Ａｓｎ−ＧｌｙジペプチドはＩＰ型ベータターンにおいて非常に頻出する。
【００７２】
ペプチドＰＨＢ３及びＰＨＢ４のベータヘアピンの配列は、それぞれペプチドＰＨＢ１及びＰＨＢ２における対応するヘアピンの配列を含む（表１）。この場合前者における位置４〜１５は、後者での位置２〜１３と等価であり、それによりＰＨＢ３及びＰＨＢ４の位置４〜１５について選ばれた残基は、ペプチドＰＨＢ１及びＰＨＢ２について上に記載した同じ判定基準を使用した。
【００７３】
同様にペプチドＰＨＢ８及びＰＨＢ９は、ペプチドＰＨＢ７の配列を含み、位置４〜１５についての残基はＰＨＢ７中の位置２〜１３と同じ判定基準に従って選んだ。ＰＨＢ３、ＰＨＢ４、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９中の残基Ｇｌｕ３及びＰｈｅ１６は、ＤＩＩＩＥ由来のＧｌｕ３７５（ＤＥＮＶ１及びＤＥＮＶ３において保存されている、ＤＥＮＶ２及びＤＥＮＶ４におけるＡｓｐ）並びにＰｈｅ３９２（ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２  及びＤＥＮＶ４において保存されている、ＤＥＮＶ３においてＴｙｒ）を模倣する目的で選んだ（図１Ｅ）。ＰＨＢ３〜４及びＰＨＢ８〜９における残基Ｉｌｅ２及びＩｌｅ１７は、ベータ鎖構造を形成するそれらの性向によって選んだ。Ｃｙｓ１及びＣｙｓ１８はＮＨＢ位置を占め、ペプチドを繋ぎとめ、それによりベータヘアピン構造を安定化させるジスルフィド結合を形成するために導入される（図１Ｅ及び図２）。
【００７４】
ペプチドＰＨＢ５及びＰＨＢ６のトポロジーは、ＤＩＩＩＥ中の天然ＦＧヘアピンループのものの逆である。それらの場合、残基Ｐｈｅ１、Ａｓｎ３、Ｌｙｓ５、Ｔｈｒ１２、Ａｓｎ１４及びＧｌｕ１６は、ペプチドＰＨＢ３中のＰｈｅ１６、Ａｓｎ１４、Ｌｙｓ１２、Ｔｈｒ７、Ａｓｎ５及びＧｌｕ３に構造的に等価であるが、それらは水素結合を通じて共に相互作用するＨＢ位置を占めている。残基Ｔｒｐ４及びＴｒｐ６は、フォールドしたヘアピン中で残基Ｔｒｐ１１及びＴｒｐ１３に隣接しており、ＮＨＢ位置を占め、ベータヘアピンの立体構造的安定性を増加させるＴｒｐジッパーを形成するように選んだ。残基Ｔｒｐ２はＤＩＩＩＥの残基Ｔｒｐ３９１に構造的に対応し、先に説明の理由により選んだ。残基Ｇｌｕ７及びＬｙｓ１０は、選好パラメーターについての高スコア及びそれらがヘアピンにさらなる安定性を提供する塩橋を形成できるという事実に基づいて選んだ。Ａｓｎ９の選択は、選好パラメーターについての高スコアにも基づいていた。ＰＨＢ６中の残基ｄ−Ｐｒｏ８は、ＩＩＰ型ベータターンにおける位置２についてこれが好ましいアミノ酸であることから選択した。ＰＨＢ５（位置８）に導入されたｄ−Ｌｙｓ残基は、ＤＩＩＩＥのＬｙｓ３８５残基を模倣することを目的とし；付加的にｄ−ＬｙｓはＩＩＰ型ベータターンの位置２についてそのＬ立体異性体よりもさらにも好ましい。代替的に、ＰＨＢ５及びＰＨＢ６中のＬｙｓ１０は、ＤＩＩＩＥからのＬｙｓ３８５を模倣する。
【００７５】
ペプチドＰＨＢ１〜９に導入されたＣ末端伸長は、Ｌｙｓトリペプチドからなる。それらの目的は、開示のベータヘアピンペプチドの溶解度を増加させ、それらに陽イオン性特徴を付与することであり、それにより陰イオン性タンパク質である受容体ＬＲＰ１との静電力を通じたそれらの相互作用を支持する。ペプチドＰＨＢ５及びＰＨＢ６の場合、陽イオン性トリペプチドを両セグメント間にいくらかの可動性を提供し、鎖ベータ２の伸長されたベータ構造の延長を遮断する目的のためにジグリシンジペプチドスペーサーを通じてベータヘアピンに繋ぐ。
【００７６】
図１Ｃ及び１Ｄは（Ｊ．Ｇｏｒｏｄｋｉｎ、ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、Ｖｏｌ．１３、ｎｏ．６：５８３〜５８６；Ｔ．Ｄ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＆  Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ．（１９９０）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ  ２０、ｐ．６０９７〜６１００）８残基長ＩＰ及びＩＩＰ型ベータヘアピンをそれぞれ並べることによって作成した共通配列のロゴ型表示である。それらは、ウェブサーバーｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／〜ｇｏｒｏｄｋｉｎ／ａｐｐｌ／ｐｌｏｇｏ．ｈｔｍｌ．の「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｏｇｏｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｅｎｔｒｏｐｙ」を使用して得た。この表示は、図１Ａ及び１Ｂに示す選好パラメーターマトリクスの代替である。各アミノ酸を表す文字のサイズは、各位置でのアミノ酸の「重要性」に比例している；すなわち文字が大きいほど残基が構造的により好ましいことを示している。
【００７７】
ペプチドＰＨＢ１〜９に加えて表１は、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ（配列番号１０）及び、このペプチドの抗ウイルス活性に対する置換残基の重要性を調査するために使用した、選択した残基のアラニン残基への置換を保有している、それらのいくつかの変種の配列を示している。それにより設計されたペプチドはＨＤＩＩＩ３ＣＬ２であり、ここでペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬは、Ｃ末端が３個のリシン残基（配列番号１１）で伸長された；ＨＤＩＩＩ３ＣＬＷ−、ＨＤＩＩＩ３ＣＬ２（配列番号１２）のＴｒｐ１７→Ａｌａ変異体；ＨＤＩＩＩ３ＣＬＫ−、ＨＤＩＩＩ３ＣＬ２（配列番号１３）のＬｙｓ１４→Ａｌａ変異体；及びＨＤＩＩＩ３ＣＬＣ−、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ２（配列番号１４）のＣｙｓ１→Ａｌａ及びＣｙｓ１８→Ａｌａの二重変異体。
【００７８】
図２は、ベータヘアピンペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ（Ａ）及びＰＨＢ４（Ｂ）の構造の三次元モデルを示している。ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ（図２Ａ）の場合に図はヘアピン（陽イオン性のＣ末端伸長を除く）に対応するセグメントを示し、いくつかの重要な残基を強調している。括弧内の数は、ＤＩＩＩＥ中の対応する残基の残基番号に対応する。ペプチドＰＨＢ４（図２Ｂ）の場合、カギ括弧は鎖がＨＤＩＩＩ３ＣＬと比較して伸長されているところを示すために使用し、本発明で開示のペプチドの生物学的活性のために重要である次の側鎖を強調する：１）ＤＩＩＩＥのＬｙｓ３８５に対応する、ターン／ループに位置するＬｙｓ、２）ＤＩＩＩＥのＬｙｓ３８８に対応する、第２のベータ鎖に位置するＬｙｓ、３）ＤＩＩＩＥのＴｒｐ３９１に対応する、第２のベータ鎖に位置するＴｒｐ、４）ＤＩＩＩＥのＴｙｒ３７７に対応する、第１のベータ鎖に位置するＴｙｒ。図２Ｃは、両ペプチドの構造的の重ね合わせを示している。
【００７９】
本発明により開示されるペプチドＰＨＢ１〜９は、発明の記載のセクション及びこの例において明らかにされる一般原理に従って設計され得る、ＤＥＮＶに対する高い強力な抗ウイルス活性を有するベータヘアピンペプチドの具体的な例を表している。したがって本出願は、その配列同一性が７０％、及び好ましくは８０％以上であるように、ＰＨＢ１〜９セットのペプチドの内の少なくとも１つにその配列が類似している任意のベータヘアピンペプチドを網羅している。そのような類似体ペプチドは、以下の中から選択された１つ又はいくつかの位置での差異を保有している：１）発明の記載のセクションに記載の修飾可能な位置ａ〜ｅ）；この場合、ＰＨＢ１〜９中の残基（単数又は複数）はベータヘアピン中のその位置を占める高い構造的性向も呈する残基によって置き換えられている；２）発明の記載のセクションに記載の潜在的に機能的な位置；この場合、ＰＨＢ１〜９中の残基（単数又は複数）は特定のＤＥＮＶ血清型由来のＤＩＩＩＥのＦＧベータヘアピンの等価位置由来の残基によって置き換えられている、３）Ｃ末端Ｌｙｓ伸長に対応する位置；この場合、伸長は２個又は３個、好ましくは３個のリシン残基を含む、並びに４）ペプチドＰＨＢ１〜４及びＰＨＢ７〜９のジスルフィド結合を形成しているシステインに対応する位置；これらの場合Ｃｙｓ対の１つのメンバーはＡｓｐ／Ｇｌｕ又はＬｙｓによって、他はＬｙｓ又はＡｓｐ／Ｇｌｕによって、ペプチドがこれらの残基の側鎖間、すなわち１つの側のＡｓｐ／Ｇｌｕ及び他方のＬｙｓのアミド結合形成によって繋ぎとめられ得るように置き換えられ得る。
【００８０】
ＰＨＢ１〜９セットのペプチドに類似のベータヘアピンペプチドの配列は、一般論として次のとおり記載され得る：
ｉ．ＰＨＢ１及びＰＨＢ２に類似のペプチド：これらはＰＨＢ１又はＰＨＢ２と７０％以上（好ましくは８０％以上）の配列同一性を呈するペプチドであり、それらの配列は、以下からなる：
位置１（構造的、環化）：Ｃｙｓ又はＬｙｓ又はＡｓｐ又はＧｌｕ、Ｃｙｓの場合は位置１４のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成する、Ｇｌｕ／Ａｓｐ（Ｌｙｓ）の場合はその側鎖は位置１４のＬｙｓ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）側鎖とアミド結合を形成する。
位置２（修飾可能「ａ」）：Ｖａｌ又はＩｌｅ又はＴｒｐ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＭｅｔ
位置３（潜在的に機能的）：Ｔｙｒ又はＡｓｎ
位置４（修飾可能「ａ」）：Ｔｒｐ又はＶａｌ又はＰｈｅ又はＧｌｕ
位置５（修飾可能「ｄ」）：Ｔｈｒ又はＶａｌ又はＩｌｅ（後者２つは天然ＤＥＮＶ配列に出現する残基である）
位置６（修飾可能「ａ」）：Ａｒｇ又はＩｌｅ又はＶａｌ又はＧｌｕ又はＬｅｕ
位置７（修飾可能「ｂ」）：ｄ−Ｐｒｏ
位置８（修飾可能「ｂ」）：Ａｓｐ又はＬｙｓ又はＡｓｎ
位置９（修飾可能「ａ」及び「ｅ」）：Ｔｒｐ又はＬｙｓ又はＭｅｔ又はＴｈｒ又はＧｌｎ
位置１０（潜在的に機能的）：Ｌｙｓ
位置１１（修飾可能「ａ」）：Ｖａｌ又はＭｅｔ又はＨｉｓ又はＬｅｕ
位置１２（潜在的に機能的）：Ａｓｎ又はＡｓｐ又はＳｅｒ又はＨｉｓ
位置１３（必須位置）：Ｔｒｐ
位置１４（構造的、環化）：Ｃｙｓ又はＬｙｓ又はＡｓｐ又はＧｌｕ、Ｃｙｓの場合は位置１のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成する、Ｇｌｕ／Ａｓｐ（Ｌｙｓ）の場合はその側鎖は位置１のＬｙｓ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）側鎖とアミド結合を形成する。
位置１５〜１７又は１５〜１６（Ｃ末端伸長）：Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓトリペプチド又はＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド。
ｉｉ．ＰＨＢ３及びＰＨＢ４に類似のペプチド：これらは、ペプチドＰＨＢ３及びＰＨＢ４と比較して７０％以上（好ましくは８０％以上）の配列同一性を有するペプチドであり、前記類似体ペプチドは以下からなる配列を有する：
位置１（構造的、環化）：Ｃｙｓ又はＬｙｓ又はＡｓｐ又はＧｌｕ、Ｃｙｓの場合は位置１８のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成する、Ｇｌｕ／Ａｓｐ（Ｌｙｓ）の場合はその側鎖は位置１８のＬｙｓ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）側鎖とアミド結合を形成する。
位置２（修飾可能「ａ」）：Ｉｌｅ又はＶａｌ又はＴｒｐ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＭｅｔ
位置３（潜在的に機能的）：Ｇｌｕ又はＡｓｐ
位置４（修飾可能「ａ」）：Ｖａｌ又はＩｌｅ又はＴｒｐ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＭｅｔ
位置５（潜在的に機能的）：Ｔｙｒ又はＡｓｎ
位置６（修飾可能「ａ」）：Ｔｒｐ又はＶａｌ又はＰｈｅ又はＧｌｕ
位置７（修飾可能「ｄ」）：Ｔｈｒ又はＶａｌ又はＩｌｅ（後者２つは天然ＤＥＮＶ配列に出現する残基である）
位置８（修飾可能「ａ」）：Ａｒｇ又はＩｌｅ又はＶａｌ又はＧｌｕ又はＬｅｕ
位置９（修飾可能「ｂ」）：ｄ−Ｐｒｏ
位置１０（修飾可能「ｂ」）：Ａｓｐ又はＬｙｓ又はＡｓｎ
位置１１（修飾可能「ａ」及び「ｅ」）：Ｔｒｐ又はＬｙｓ又はＭｅｔ又はＴｈｒ又はＧｌｎ
位置１２（潜在的に機能的）：Ｌｙｓ
位置１３（修飾可能「ａ」）：Ｖａｌ又はＭｅｔ又はＨｉｓ又はＬｅｕ
位置１４（潜在的に機能的）：Ａｓｎ又はＡｓｐ又はＳｅｒ又はＨｉｓ
位置１５（必須位置）：Ｔｒｐ
位置１６（潜在的に機能的）：Ｐｈｅ又はＴｙｒ
位置１７（修飾可能「ａ」）：Ｉｌｅ又はＶａｌ又はＴｒｐ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＭｅｔ
位置１８（構造的、環化）：Ｃｙｓ又はＬｙｓ又はＡｓｐ又はＧｌｕ、Ｃｙｓの場合は位置１のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成する、Ｇｌｕ／Ａｓｐ（Ｌｙｓ）の場合はその側鎖は位置１のＬｙｓ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）側鎖とアミド結合を形成する。
位置１９〜２１又は１９〜２０（Ｃ末端伸長）：Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓトリペプチド又はＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド。
ｉｉｉ．ＰＨＢ７に類似のペプチド：これらは、ペプチドＰＨＢ７に７０％以上（好ましくは８０％以上）の配列同一性を有するペプチドであり、前記類似体ペプチドは、以下からなる配列を有する：
位置１（構造的、環化）：Ｃｙｓ又はＬｙｓ又はＡｓｐ又はＧｌｕ、Ｃｙｓの場合は位置１４のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成する、Ｇｌｕ／Ａｓｐ（Ｌｙｓ）の場合はその側鎖は位置１４のＬｙｓ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）側鎖とアミド結合を形成する。
位置２（修飾可能「ａ」）：Ｖａｌ又はＩｌｅ又はＴｒｐ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＭｅｔ
位置３（潜在的に機能的）：Ｔｙｒ又はＡｓｎ
位置４（修飾可能「ａ」）：Ｖａｌ又はＩｌｅ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＬｅｕ
位置５（修飾可能「ｄ」）：Ｔｈｒ又はＶａｌ又はＩｌｅ（後者２つは天然ＤＥＮＶ配列に出現する残基である）
位置６（修飾可能「ａ」）：Ｉｌｅ又はＶａｌ又はＴｙｒ、Ｈｉｓ又はＬｙｓ
位置７（修飾可能「ｂ」）：Ａｓｎ又はＡｓｐ
位置８（修飾可能「ｂ」）：Ｇｌｙ
位置９（修飾可能「ａ」及び「ｅ」）：Ｌｙｓ又はＨｉｓ又はＡｒｇ又はＶａｌ又はＴｙｒ又はＧｌｕ又はＭｅｔ
位置１０（潜在的に機能的）：Ｌｙｓ
位置１１（修飾可能「ａ」）：Ｔｙｒ又はＶａｌ又はＧｌｎ又はＴｒｐ、Ｐｈｅ
位置１２（潜在的に機能的）：Ａｓｎ又はＡｓｐ又はＳｅｒ又はＨｉｓ
位置１３（必須位置）：Ｔｒｐ
位置１４（構造的、環化）：Ｃｙｓ又はＬｙｓ又はＡｓｐ又はＧｌｕ、Ｃｙｓの場合は位置１のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成する、Ｇｌｕ／Ａｓｐ（Ｌｙｓ）の場合はその側鎖は位置１のＬｙｓ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）側鎖とアミド結合を形成する。
位置１５〜１７又は１５〜１６（Ｃ末端伸長）：Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓトリペプチド又はＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド。
ｉｖ．ＰＨＢ８及びＰＨＢ９に類似のペプチド：これらは、ペプチドＰＨＢ８及びＰＨＢ９と比較して７０％以上（好ましくは８０％以上）の配列同一性を有するペプチドであり、前記類似体ペプチドは、以下からなる配列を有する：
位置１（構造的、環化）：Ｃｙｓ又はＬｙｓ又はＡｓｐ又はＧｌｕ、Ｃｙｓの場合は位置１８のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成する、Ｇｌｕ／Ａｓｐ（Ｌｙｓ）の場合はその側鎖は位置１８のＬｙｓ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）側鎖とアミド結合を形成する。
位置２（修飾可能「ａ」）：Ｉｌｅ又はＶａｌ又はＴｒｐ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＭｅｔ
位置３（潜在的に機能的）：Ｇｌｕ又はＡｓｐ
位置４（修飾可能「ａ」）：Ｖａｌ又はＩｌｅ又はＴｒｐ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＭｅｔ
位置５（潜在的に機能的）：Ｔｙｒ又はＡｓｎ
位置６（修飾可能「ａ」）：Ｖａｌ又はＩｌｅ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＬｅｕ
位置７（修飾可能「ｄ」）：Ｔｈｒ又はＶａｌ又はＩｌｅ（後者２つは天然ＤＥＮＶ配列に出現する残基である）
位置８（修飾可能「ａ」）：Ｉｌｅ又はＶａｌ又はＴｙｒ又はＨｉｓ又はＬｙｓ
位置９（修飾可能「ｂ」）：Ａｓｎ又はＡｓｐ
位置１０（修飾可能「ｂ」）：Ｇｌｙ
位置１１（修飾可能「ａ」及び「ｅ」）：Ｌｙｓ又はＨｉｓ又はＡｒｇ又はＶａｌ又はＴｙｒ又はＧｌｕ又はＭｅｔ
位置１２（潜在的に機能的）：Ｌｙｓ
位置１３（修飾可能「ａ」）：Ｔｙｒ又はＶａｌ又はＧｌｎ又はＴｒｐ、Ｐｈｅ
位置１４（潜在的に機能的）：Ａｓｎ又はＡｓｐ又はＳｅｒ又はＨｉｓ
位置１５（必須位置）：Ｔｒｐ
位置１６（潜在的に機能的）：Ｐｈｅ又はＴｙｒ
位置１７（修飾可能「ａ」）：Ｉｌｅ又はＶａｌ又はＴｒｐ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＭｅｔ
位置１８（構造的、環化）：Ｃｙｓ又はＬｙｓ又はＡｓｐ又はＧｌｕ、Ｃｙｓの場合は位置１のＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成する、Ｇｌｕ／Ａｓｐ（Ｌｙｓ）の場合はその側鎖は位置１のＬｙｓ（Ｇｌｕ／Ａｓｐ）側鎖とアミド結合を形成する。
位置１９〜２１又は１９〜２０（Ｃ末端伸長）：Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓトリペプチド又はＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド。
ｖ．ＰＨＢ５及びＰＨＢ６に類似のペプチド：これらは、ペプチドＰＨＢ５及びＰＨＢ６と比較して７０％以上（好ましくは８０％以上）の配列同一性を有するペプチドであり、前記類似体ペプチドは、以下からなる配列を有する：
位置１（潜在的に機能的）：Ｐｈｅ又はＴｙｒ
位置１２（必須位置）：Ｔｒｐ
位置３（潜在的に機能的）：Ａｓｎ又はＡｓｐ又はＳｅｒ又はＨｉｓ
位置４（修飾可能「ａ」）：Ｔｒｐ
位置５（潜在的に機能的）：Ｌｙｓ
位置６（修飾可能「ａ」）：Ｔｒｐ
位置７（潜在的に機能的、修飾可能「ｂ」）：Ｇｌｕ又はＶａｌ又はＡｒｇ又はＩｌｅ又はＡｓｐ
位置８（修飾可能「ｂ」）：ｄ−Ｐｒｏ又はｄ−Ｌｙｓ
位置９（修飾可能「ｂ」）：Ａｓｎ又はＡｓｐ又はＬｙｓ
位置１０（潜在的に機能的、修飾可能「ｂ」）：Ｌｙｓ又はＭｅｔ又はＴｒｐ又はＧｌｎ又はＴｈｒ
位置１１（修飾可能「ａ」）：Ｔｒｐ
位置１２（修飾可能「ｄ」）：Ｔｈｒ又はＶａｌ又はＩｌｅ（後者２つは天然ＤＥＮＶ配列に出現している残基である）
位置１３（修飾可能「ａ」）：Ｔｒｐ
位置５（潜在的に機能的）：Ｔｙｒ又はＡｓｎ
位置１３（修飾可能「ａ」）：Ｉｌｅ又はＶａｌ又はＴｒｐ又はＰｈｅ又はＴｙｒ又はＭｅｔ
位置１４（潜在的に機能的）：Ｇｌｕ又はＡｓｐ
位置１５〜１９又は１５〜１８（Ｃ末端伸長）：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓペンタペプチド又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓテトラペプチド。
【００８１】
ペプチド合成
表１に列挙したペプチドを、Ｆｍｏｃ−ＡＭ−ＭＢＨＡレジン上での固相合成によって、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法（Ｂａｒａｎｙ、Ｇ．＆  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ．Ｂ．（１９７７）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．９９  ７３６３〜７３６５）に従い得た。工程を多孔性フリッターを装着した１０ｍＬシリンジで手作業で実施し、それによりすべての試薬及び溶媒は、真空下のろ過によって好都合に除去できた。アミノ酸をＤＩＣ／ＨＯＢｔ活性化法を使用してカップルさせ、カップリング反応の完了はニンヒドリン検査で検証した（Ｋａｉｓｅｒ、Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４  ５９５〜５９８）。合成したペプチドをトリフルオロ酢酸／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９４％／２．５％／２．５％／１％）溶液でレジンを処置することによって遊離させ、エーテルで沈殿させ、７２時間凍結乾燥させ、その後それらをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）での酸化を介してジスルフィド結合を形成することによって繋ぎとめた（Ａｎｄｒｅｕ、Ｄ．、ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９４、ｐｐ．９１〜１６９）。得られたペプチドを調製用ＲＰ−ＨＰＬＣによってＲＰ−Ｃ１８カラム中で精製し、回収した画分を分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって独立に分析し、最終ペプチド調製物を９９％より高い純度の画分をプールすることによって得た。質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を最終調製物の分子量を検証するために使用した。
【００８２】
質量スペクトルはＺ−スプレーエレクトロスプレーイオン化源を装着したｈｙｂｒｉｄ  ｏｃｔａｇｏｎａｌ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ＱＴＯＦ−２ＴＭ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、ＵＫ）で取得した。ソフトウエアパッケージＭａｓｓＬｙｎｘ、ｖｅｒ．３．５（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）をスペクトル取得及び処理のために使用した。
【００８３】
（例２）
Ｖｅｒｏ細胞でのＤＥＮＶ感染の阻害
本感染によって開示されたベータヘアピンペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＥＮＶ感染を阻害できることを実証するために、前記ペプチドをＶｅｒｏ細胞を使用するプラーク減少アッセイで評価した。
【００８４】
細胞を単層がおよそ９０％コンフルエンスに達するまで、２４ウェルプレートで増殖させ、その後ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含まないＭＥＭ培地で２回洗浄した。次いでペプチド希釈物を加え、細胞ペプチド混合物を典型的には１時間、３７℃でインキュベートし、ＤＥＮＶ血清型２調製物（ＮＩＢＳＣコードＳ１６８０３）の０．００１の感染効率（ｍ．ｏ．ｉ．）での添加が続いた。次いで細胞を１時間、３７℃でインキュベートし、ウイルス性接種物でのインキュベーション期間が終わったら未結合ビリオンを除去するために再度洗浄し、高密度培地（非必須アミノ酸、１％ＦＢＳ、１％カルボキシメチルセルロースを補充したＭＥＭ）中、３７℃で５日間ウイルス性プラークを形成させるためにインキュベートした。その後細胞を０．１５Ｍ酢酸ナトリウム中の０．１％ナフトールブルーブラックで染色した。各アッセイにおいて実験点あたり２回反復を行い、各試料について３回の独立した決定を実施した。
【００８５】
ベータヘアピンペプチドの毒性をＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）アッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．（１９８３）．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５、５５〜６３．）でＮｅｕｂａｕｅｒチャンバーを使用する手作業の細胞計数によって評価した。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）をＶｅｒｏ細胞１ｘ１０５個／ｍＬを含有する懸濁物２００μＬ／ウェルで播種し、単層がおよそ９０％コンフルエンスに達するまで、典型的には１８〜２４時間インキュベートした。細胞をＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）培地で２回洗浄後、評価されるペプチド又は添加物希釈物５０μＬ／ウェルを加え（ＰＢＳに溶解したＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）を陽性毒性対照として使用した）、プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２又は２４時間インキュベートした。次いで２つの異なる手順を毒性を測定するために用いた：
ａ）ＰＢＳ中のＭＴＴの２ｍｇ／ｍＬ溶液を加え（５０μＬ／ウェル）、プレートをさらに４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで培地を除去し、１００μＬ／ウェルのＤＭＳＯをホルマザン沈殿物を溶解するために加えた。最終的に波長５４０ｎｍでの上清の光学密度（ＯＤ）をプレートリーダー（Ｓｅｎｓｉｄｅｎｔ  Ｓｃａｎ（商標）、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。
ｂ）２００μＬ／ウェルのＤＭＥＭ培地でプレートを洗浄し、次いでトリプシン溶液（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を５０μＬ／ウェルで加えた。１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭを１５０μＬ／ウェルで加えることによってトリプシンを不活性化した後に、細胞をトリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）バイタルステインを使用して計数した。データを、それらをｌｏｇ１０（濃度）対応答曲線にフィットさせるために非線形回帰を使用する統計用ソフトウエアパッケージＰｒｉｓｍ  ｖ５．３  （ＧｒａｐｈＰａｄ、ＵＳＡ）を使用して処理した。
【００８６】
表２は、Ｖｅｒｏ細胞でのＤＥＮＶ２に対するベータヘアピンペプチドの抗ウイルス活性に対応する算出したＩＣ５０値並びにそれらの毒性及び選択性指標を示している。分析したすべてのペプチドは、この系において検出可能な抗ウイルス活性を呈した。ペプチドＰＨＢ２、ＰＨＢ３、ＰＨＢ４、ＰＨＢ５、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９は、ペプチドＰＨＢ３、ＰＨＢ５及びＰＨＢ８の場合は差異は小さかったが、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬよりも高い抗ウイルス作用強度を示した。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ系ではペプチドＰＨＢ１、ＰＨＢ６及びＰＨＢ７は実際にペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬよりも強力ではなかった。ペプチドＰＨＢ４は、ナノモル範囲で抗ウイルス活性を、及び４３３３の優れた選択性指標を呈した。したがってこのペプチドは、ＤＥＮＶに対する候補抗ウイルス薬物として優れた特性を有するリード分子を構成する。
【００８７】
結果は、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬの６残基鎖間ループが完全に不必要であることも実証している。このループが、本発明により開示のベータヘアピンペプチドの配列から欠失され、２つの中心的残基を含み、ＤＩＩＩＥループの元の配列の全体又は部分と類似性を有さないベータターンで置き換えられても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ウイルス活性に有害な効果がなかったからである。これは、ペプチドが二次ＤＥＮＶ感染の際に使用される場合に望ましい特徴である。ＤＥＮＶに対するヒト抗体応答の際にこのループが免疫優性であり（Ｓｕｋｕｐｏｌｖｉ−Ｐｅｔｔｙ  Ｓ、ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．；８１（２３）：１２８１６−２６）、したがって、ループが排除されていない場合、既存の抗体がＦＧベータヘアピンベースペプチドの抗ウイルス活性を中和する可能性があるからである。したがって、本発明で開示のペプチド中のループを欠失することは、この可能性を除外する。
【００８８】
データは、それらの抗ウイルス活性を増加させることにおいて重要な役割を恐らく演じている、最も強力なベータヘアピンペプチド内のいくつかの共通の特性も指している。その内の１つは、例えば、鎖間ベータターンの中央位置中のリシン（又はｄ−リシン）の存在である。ペプチドＰＨＢ５は、ＰＨＢ６よりも強力であり、それらの差異は、後者のベータターン上のリシン残基の欠如だけである（表１）。同様にＰＨＢ２及びＰＨＢ４は、それらの対応物ＰＨＢ１及びＰＨＢ３よりも強力であり、ＰＨＢ１もＰＨＢ３もループの中央位置にリシン残基を有さない（このリシンは、ＤＩＩＩＥのＬｙｓ３８６残基を機能的に模倣すると考えられている）。最も強力なペプチドの別の識別可能な特性は、ＤＩＩＩＥ中の残基３７７の等価位置でのチロシン残基の存在である。（ＤＥＮＶ３のＥタンパク質由来の残基番号）。例えばペプチドＰＨＢ９は、ＰＨＢ８よりも強力であり、それらのただ一つの差異は、Ｔｙｒ５が後者においてＡｓｎ５によって置き換えられていることである。同様にＰＨＢ２（Ｔｙｒ３を含有）及びＰＨＢ４（Ｔｙｒ５を含有）は、これらのチロシン残基がアスパラギン残基によって置き換えられているそれらのペプチド対応物ＰＨＢ１及びＰＨＢ３よりも強力である。
【００８９】
最終的にデータは、４個（鎖あたり２個）のさらなるアミノ酸を加えることによってベータ鎖を伸長することは、生じたペプチドの抗ウイルス活性に有利な効果を有したことを確認した。例えばペプチドＰＨＢ４の作用強度は、ＰＨＢ２のものより高く、ペプチドＰＨＢ８及びＰＨＢ９のものはＰＨＢ７のものより高かった。ペプチドＰＨＢ４は、シリーズ全体で最も強力であり、その配列は上で同定した強力なペプチドの３つの明確な特性すべてを含有する唯一のものである。それにより本例で得られた実験データを合わせると、本発明で開示のベータヘアピンペプチドを設計するために用いられる判定基準が賢明に選ばれたことが実証された。
【表２】
2017509619.tif 000003
【００９０】
次に、４種すべてのＤＥＮＶ血清型に対するペプチドＰＨＢ４及びＨＤＩＩＩ３ＣＬの抗ウイルス活性を、それらそれぞれのＩＣ５０値を比較する目的で比較することを決めた。この比較は、各血清型（ＤＥＮＶ１、ＮＩＢＳＣ  ｃｏｄｅ  Ｗｅｓｔ  Ｐａｃ  ７４、ＤＥＮＶ２、ＮＩＢＳＣ、ｃｏｄｅ  Ｓ１６８０３；ＤＥＮＶ３、ＮＩＢＳＣ、ｃｏｄｅ  ＣＨ５３４８９；ＤＥＮＶ  ４、ＮＩＢＳＣ  ｃｏｄｅ  ＴＶＰ３６０）についてのウイルス接種物を０．００１のｍ．ｏ．ｉ．で加えるＶｅｒｏ細胞上でプラーク減少アッセイで実施した。表３において観察され得るとおりペプチドＰＨＢ４は、４種の血清型に対して活性であり、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬよりもさらにであった（血清型に応じて４０００から７５００倍強力）。ＰＨＢ４が４種の血清型に対して阻害活性を呈する事実は、すべてのＤＥＮＶ血清型に対する細胞内受容体としてのα２Ｍ＊／ＬＲＰ１複合体の提案された役割及びこれらのタンパク質へのペプチドＰＨＢ４の結合を実証している実験的証拠と一致し、本出願下記に示される。
【表３】
2017509619.tif 000004
【００９１】
（例３）
ベータヘアピンペプチドによるＤＩＩＩＥのα２Ｍ＊への結合の阻害
ヒトα２Ｍの精製及び活性化
ヒトα２Ｍを３０から４０歳の健常者由来の血漿試料をプールすることによって得たヒト血漿３８０ｍＬから精製した。血漿を頻繁に交換した脱イオン水に対して、７２、４℃で透析した。得られた透析物から不溶性材料を１０，０００ｘｇ、３０分間での遠心分離によって除去し、上清をＰＢＳ、ｐＨ６．０に透析によって平衡化し、次いで予めＺｎ２＋をロードしＰＢＳ  ｐＨ６．０で平衡化したＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）６５ｍＬをパックしたＸＫ５０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）にロードした。試料をロードした後、溶出物の吸光度がベースラインに下がるまでカラムをＰＢＳ  ｐＨ６．０で洗浄し、結合タンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０緩衝液で溶出した。回収した溶出物を限外濾過で濃縮し、次いでＰＢＳ  ｐＨ７．８で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）ゲルろ過カラムにロードした。最も高い分子量画分中のα２Ｍの存在を抗ヒトα２Ｍポリクローナル抗体調製物（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）でのウエスタンブロットによって検証した。
【００９２】
精製α２Ｍを５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４中で２００ｍＭメチルアミンとインキュベートすることによって活性化した。得られたα２Ｍ＿ＭｅＮＨ２（α２Ｍ＊）調製物を５０ｍＭリン酸ナトリウム／０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．８に対して十分に透析した。
【００９３】
競合的アッセイ
組換えＤＩＩＩＥ１Ｊとα２Ｍ＊との相互作用を阻害するペプチドＰＨＢ１〜９及びＨＤＩＩＩ３ＣＬの能力を、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して分析した。プレートを精製α２Ｍ＊でコートし、予め精製及びビオチン化したＤＩＩＩＥ１Ｊ（ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔ）とさまざまな濃度の検査ペプチド及び／又は組換えＤＩＩＩＥ１Ｊの存在下でインキュベートし、α２Ｍ＊結合ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔをストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートで検出した。組換えＤＩＩＩＥ１Ｊ（配列番号１９）を得るために用いた実験手順の詳細を後に示すが、本質的には分子は、ＤＥＮＶ１  １６３６株のタンパク質Ｅの残基２８９〜４００（番号付けは配列ＰＩＲ：Ａ３２４０１による）からなり（Ｃｈｕ、Ｍ．Ｃ．、ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０（Ｐｔ７）、１７０１〜１７１２．）、Ｃ末端６−ヒスチジンタグが続くドメインＩＩＩに対応する。
【００９４】
低マイクロモルからマイクロモル以下／ナノモル範囲でのペプチド濃度で、ベータヘアピンペプチドＰＨＢ５、ＰＨＢ７、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９は、ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔのα２Ｍ＊への結合を部分的に阻害し（図３）、阻害百分率はペプチド濃度と共に単調に増加する。ペプチドＰＨＢ５、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９は、組換えＤＩＩＩＥ１Ｊのものに類似している２３から５０％の範囲の阻害百分率を呈し、この群の最も強力な阻害剤である。分析した濃度範囲ではこれら３個のペプチドは、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬよりも良いα２Ｍ＊へのＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔ結合の阻害剤（それらの正確な濃度に依存して２から１２倍）である。
【００９５】
これらのアッセイにおいてペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬによって示される最大阻害百分率は１８％だけであり；最も小さなベータヘアピンペプチドＰＨＢ７の阻害百分率よりさえ低い。実際にこれは、元の６残基長ループがペプチドＰＨＢ７において２個の中心的残基だけを有するＩＰ型ベータターンによって置き換えられていることから、ＤＩＩＩＥのＦＧヘアピンの鎖間ループの残基がタンパク質α２Ｍ＊との相互作用の目的のために不必要であることを示している。このベータターンの配列は、元のループの全体又は部分と類似性を保有しておらず、選ばれたその残基は構造判定基準に基づいている（高いＩＰ型ベータターン形成性向、ベータヘアピンコネクター）。ペプチドＰＨＢ７（及びＰＨＢ８及びＰＨＢ９も同様）中に残っている元のＨＤＩＩＩ３ＣＬループからのただ１つの残基はＬｙｓ１１（ＨＤＩＩＩ３ＣＬ番号付け）であり、その機能的役割はＰＨＢ７のＬｙｓ９によって模倣され、それは同様の（構造的に準等価）空間的位置を占めている。
【００９６】
Ｌｙｓ９（ＨＤＩＩＩ３ＣＬ由来Ｌｙｓ１１を模倣している）に加えて、ＨＤＩＩＩ３ＣＬ残基の役割を模倣する他のＰＨＢ７残基がある：ａ）ＰＨＢ７由来Ａｓｎ３、Ｌｙｓ１０及びＡｓｎ１２は、その側鎖がＤＩＩＩＥのＦＧヘアピンの曝露面に突き出していて、それにより潜在的に機能性であるＨＤＩＩＩ３ＣＬ由来残基のＡｓｎ３、Ｌｙｓ１４及びＡｓｎ１６を模倣している（これらは水素結合を形成しないベータヘアピン残基である）；ｂ）ＰＨＢ７由来Ｔｒｐ１３はＨＤＩＩＩ３ＣＬ由来Ｔｒｐ１７に等価であり、すべてのフラビウイルスにわたって厳密に保存されているＴｒｐ残基に対応する；ｃ）ＰＨＢ７由来Ｃｙｓ１及びＣｙｓ１４は、ＨＤＩＩＩ３ＣＬ由来のＣｙｓ１−Ｃｙ１８によって形成されるものに等価のジスルフィド架橋を形成する。
【００９７】
ＰＨＢ７がＨＤＩＩＩ３ＣＬのＤＥＮＶ阻害活性をまさに保持、実際には改善するという事実は、前者の設計の際に保持された特性が、本発明により開示されるペプチドの機能活性のために重要な役割を演じることを示唆している。
【００９８】
ペプチドＰＨＢ８及びＰＨＢ９は、ペプチドＰＨＢ７よりも良い阻害剤である。このことは、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９への４残基（鎖あたり２個）の付加が本発明により開示されるペプチドのＤＥＮＶ阻害活性に有利に寄与することを示している。
【００９９】
図４において観察できるとおり、ＰＨＢ５ベータヘアピンペプチドとα２Ｍ＊との間の相互作用のみかけの親和性は、アッセイされた各ＰＨＢ５濃度での阻害百分率がＤＩＩＩＥ１Ｊによって示されるものよりわずかに低いだけであることから、ＤＩＩＩＥとα２Ｍ＊との間の相互作用と同様である。これらの結果は、ＤＩＩＩＥの天然ＦＧベータヘアピンのものと比較してそのトポロジーが逆であり、ＤＩＩＩＥ−α２Ｍ＊相互作用をまだ阻害できるベータヘアピンペプチドを使用できることを実証している。同様の結論が、ＩＩＰ型ターンがＰＨＢ５において使用されている一方でペプチドＰＨＢ７〜９はＩＰ型ターンを使用していることを考慮して、ペプチドに設計されたベータターンの型に関して導かれ得る。重要なことは、相互作用に不可欠である残基の構造的同等性を保持することであり、つまり、構造的に異なるフレームワーク内に提示される場合でも、それらが類似の空間的様式で配置されていることである。同様にＰＨＢ５は、ペプチドＰＨＢ８及びＰＨＢ９の立体構造を安定化させることにおいてジスルフィド結合によって演じられる役割が、ＰＨＢ５において使用されるＴｒｐジッパーなどの他の構造的モチーフによって引き受けられてもよいことを実証している。
【０１００】
本発明の本質的要素は、開示のペプチドのナノモル範囲での生物学的活性の分析である。高作用強度ペプチドは、より低い治療用量の使用、並びにより低い経費並びに凝集、非特異的相互作用、抗原性及び免疫原性などの高用量に関連する多数の課題の出現の可能性がより低いことに関してそれらペプチドが有する有利点を可能にする。図５に示すとおり、ナノモル／マイクロモル以下の範囲でのペプチドＰＨＢ２、ＰＨＢ４、ＰＨＢ５、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９は、まだＤＩＩＩＥ１Ｊそれ自体よりもビオチン化ＤＩＩＩＥ１Ｊ（ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔ）のα２Ｍ＊への結合のより良い阻害剤であった（１．５から３倍良い百分率阻害）。一方その濃度範囲では、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬによって示される阻害はＤＩＩＩＥ１Ｊと比較して非常に低い。
（例４）
【０１０１】
ＤＩＩＩＥのα２Ｍ＊への結合のための必須残基のマッピング
ＤＩＩＩＥ（ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ）に対するアラニン変異体のライブラリーの調製
ＤＥＮＶ１由来のＤＩＩＩＥ中のどの残基が前記分子の多数の異なるリガンドとの相互作用において重要な役割を演じるのかを判定するために、単一残基変異体のライブラリーを、アラニン残基によって各溶媒曝露残基を体系的に置き換えて（技術はより一般的には「アラニンスキャニング」として周知である）、分析しようとするリガンドへの前記変異体変種の結合をその後に研究するために調製した。この種類の実験では、具体的な変種のリガンドへの結合に関するいかなる変動も野生型タンパク質と前記リガンドとの相互作用における変異残基の関与の証拠として解釈される。
【０１０２】
このライブラリーを調製するために、初期分析をＤＥＮＶ１、ＰＲＳ  ２８８６９０株のエンベロープタンパク質の残基２８９から３９５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＮ３２７７５．１による番号付け）に制限した（Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ，Ａ．Ｐ．、ｅｔ  ａｌ．（２００２）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０３（１）、１１０〜１１９．）。ＤＥＮＶ１  ＰＲＳ  ２８８６９０株由来のＤＩＩＩＥ（ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ）として本明細書で定義のウイルス性ポリタンパク質のこの断片に対応する配列を配列番号１５に示す。
【０１０３】
ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳにおいて変異される残基の選択
すべての残基がアラニン１種によって同時に置き換えられたブルートフォース（ｂｒｕｔｅ−ｆｏｒｃｅ）手法の代わりに、ＷＨＡＴ  ＩＦ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００５０９１９−１７１８  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｖｒｉｅｎｄ、Ｇ．、（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．８、５２〜６）を使用して概算される相対的溶媒到達性に基づいた、及び野生型タンパク質に関してすべての可能な変種のＦｏｌｄＸ  ｖｅｒｓｉｏｎ６．０（Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３、Ｗ３８２−Ｗ３８８）によって算出されたΔΔＧとして表される安定性における差異の概算に基づいた事前選択を行うことを決めた。両方の算出は、ＤＥＮＶ３由来タンパク質Ｅの結晶学座標（Ｍｏｄｉｓ、Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ１００、６９８６〜６９９１）から得たＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ（配列番号１５の残基１〜１０５）の相同性モデルに基づき、エネルギー最小化工程に出力した。
【０１０４】
Ａｌａに変異される残基を選択するために使用した判断基準は、１５％より高い相対的露出性及び４ｋｃａｌ／ｍｏｌより低いΔΔＧであった。この判断基準に合致する位置７９ヵ所及び、上に述べたパラメーターについての算出の結果を表４に示す。
【表４】
2017509619.tif 000005
【０１０５】
ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ及びその変異変種の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現のための組換えプラスミドのライブラリーの調製
アラニンスキャンのために使用するＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ残基を選択した後、組換えプラスミドを各Ａｌａ変異体変種のライブラリーの大腸菌における異種性発現のために調製した。これは、Ａｇａｒｗａｌらの方法（Ａｇａｒｗａｌ  ＫＬ、ｅｔ  ａｌ．（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７、２７〜３４）を使用して、ホスホラミド化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ（１９８１）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２、１８５９）を介して固相で合成されたオリゴヌクレオチドから出発して、ＤＥＮＶ１、ＰＲＳ  ２８８６９０株のタンパク質Ｅの残基２８９〜４００（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＮ３２７７５．１による番号付け）をコードする２本鎖ＤＮＡ分子（Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ，Ａ．Ｐ．、ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０３（１）、１１０〜１１９）に続くＣ末端６−ヒスチジンタグ；本明細書で組換えＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ（ｒＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ、配列番号１７）として定義の組換えタンパク質を合成することによって達成した。この２本鎖ＤＮＡ分子（配列番号１６）は、プラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）中に前記プラスミドによって提供される出発コドンと同じ読み取りフレームで断片を挿入できるように設計された、Ｎｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ制限酵素の認識部位を含有する。この２本鎖ＤＮＡ分子をＮｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ制限酵素でそれらの製造者によって指定された条件下で消化後、消化断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用してその製造者によって指定された条件下で、同じ手段で予め消化したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）にライゲートした。次いで得られたライゲーション混合物を大腸菌のＸＬ−１Ｂｌｕｅ株にＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載のとおり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９８９）形質転換し（Ｂｕｌｌｏｃｋ  ＷＯ、ｅｔ  ａｌ．（１９８７）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；５：３７６〜８）、選択培地で増殖させたコロニー由来のプラスミドを、その配列が予測する配列に対応しているプラスミドを得るためにスクリーニング、精製及び配列決定した。前記プラスミドはｐＥＴ−ＤＩＩＩ  ＤＥＮＶ１（配列番号１８）と命名され、図６で図表により示される。
【０１０６】
ＤＩＩＩ１ＰＲＳの７９個の予め選択したＡｌａ変異体を発現するための組換えプラスミドの作製をｐＥＴ−ＤＩＩＩ  ＤＥＮＶ１について上に記載のとおりだが、各場合において、変異される残基に対応するコドンが、アラニンコドンに対応するＧＣＧトリプレットによって置き換えられた異なる２本鎖ＤＮＡ分子を合成して実施した。各変種において置き換えられたコドンを、それがコードするアミノ酸と共に表５に示す。
【表５】
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【０１０７】
ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ変異体のライブラリーのプラスミドの大腸菌への形質転換及び得られたクローンの凍結保存
選択されたＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ変種の大腸菌での発現のためのプラスミドを含有する大腸菌細胞のクローンを得るために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換コンピテント細胞（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ．Ｗ．＆  Ｍｏｆｆａｔｔ、Ｂ．Ａ．（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９（１）、１１３〜１３０）を調製し、アリコートに分割し、そのそれぞれを当業者に周知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．１９８９．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を使用して変異体ライブラリーのプラスミドの１つに２０ｎｇで別々に形質転換した。形質転換したアリコートをアンピシリンを１００μｇ／ｍＬで含有するＬＢ−アガープレートに別々に蒔いた。細菌の増殖を可能にする１２時間、３７℃インキュベーション後、各プレートからの１つの十分単離されたコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬＢ  ｂｒｏｔｈ  ５ｍＬを含有する別々の試験管に接種し、３７℃、撹拌（２００ｒｐｍ）下で目に見える混濁が現れるまでインキュベートした。次いで培養物を無菌的に３０００ｘｇで２０分間、２５℃で遠心分離し、それぞれを新鮮ＬＢ  ｂｒｏｔｈ  ２５０μＬ＋４０％（ｖ／ｖ）グリセロール２５０μＬに再懸濁し、次に１００μＬアリコートに分割し、−７０℃で保存した。
【０１０８】
変異体ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ変種の精製
ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ変異体ライブラリーの各変種を発現している凍結保存大腸菌クローンのライブラリーを調製後、小規模工程を前記ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ変種を精製するために使用した。簡潔には、各変種について対応するプラスミドを含有する大腸菌クローンの単一の凍結保存アリコートを１Ｌ三角フラスコ中でアンピシリンを１００μｇ／ｍＬで補充したＺＹＭ５０５０２培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｆ．  Ｗ．（２００５）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４１（１）、２０７〜２３４）の５０ｍＬを接種するために使用し、次いで１２時間、３７℃、３００ｒ．ｐ．ｍでインキュベートした。その後、培養物を３０００ｘｇ、２５℃、２０分間で遠心分離し、上清を廃棄し、生じたバイオマスを６Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）を含有している１９ｍＬのＡＧ緩衝液（ＰＢＸ  １Ｘ、ＮａＣｌ  ０．３ｍｏｌ／Ｌ、イミダゾール２０ｍＭ）に再懸濁して溶解させ、適切なプローブでの３０の短い超音波処理によって破砕物の粘性を減らした。３０００ｘｇ、２５℃、４５分間の遠心分離によって破砕物を清明化した後に、上清を１時間、２５℃、遅いロータリー振とう機で０．３ｍＬのＮｉ２＋−ニトリロ三酢酸−アガロースレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートし、生じたスラリーを空のＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）に重力充填し、漸減する濃度のＧｕＨＣｌ（６Ｍから１．２）を含有するＡＧ緩衝液で、最終的に緩衝液Ａ（ＰＢＳ  １Ｘ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で継続的に洗浄した。次いでタンパク質を０．９ｍＬの緩衝液Ｅ（ＰＢＳ  １Ｘ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール）で溶出し、溶出物を直ちに、プレパックＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を使用するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５でのゲルろ過によるＰＢＳ  １Ｘへの緩衝液交換に供した。生じた調製物の総タンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）方法（Ｓｍｉｔｈ、Ｐ．Ｋ．（１９８５）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０（１）、７６−８５）によって決定し、純度を分解産生物が存在しないように還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．（１９７０）．Ｎａｔｕｒｅ  ２２７（２５９）、６８０〜６８５）によって評価した。精製ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ変種のライブラリーを使用まで−２０℃で保存した。
【０１０９】
競合的アッセイ
組換えＤＩＩＩＥとα２Ｍ＊との相互作用を阻害する各ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳアラニン変異体の能力を、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して分析した。プレートを精製α２Ｍ＊でコートし、ビオチン化ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳ（ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳｂｉｏｔ）と濃度を変化させた各ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳアラニン変異体の存在下でインキュベートし、次いでα２Ｍ＊結合ＤＩＩＩＥ１ＰＲＳｂｉｏｔをストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートで検出した。光学密度対濃度読み取り値を用量応答曲線にフィットさせ、各変異体のＩＣ５０及び野生型組換えＤＩＩＩＥ１ＰＲＳのＩＣ５０を算出するために使用した。
【０１１０】
図７において観察されるとおり、ドメインＩＩＩの５残基（Ｌｙｓ３６１、Ｇｌｕ２６２、Ｐｒｏ２６４、Ｖａｌ３６５及びＬｙｓ３８５）のいずれか１個のアラニンによる置き換えは、すべての場合において一桁を超えるＩＣ５０の増加（相互作用の親和性の減少）を生じた。ＩＣ５０における２倍増加を閾値とし、合計１３残基のアラニンへの変異が相互作用に影響を与える。１３個のこの群の残基は、上に述べた５残基に加えてＧｌｕ３４２、Ｔｈｒ３４、Ａｒｇ３５０、Ｌｙｓ３６３、Ａｓｎ３６６、Ｐｒｏ３７２、Ｇｌｙ３７４及びＧｌｕ３７５である。
【０１１１】
これらの結果は、ＤＩＩＩＥのα２Ｍ＊への結合がＤＩＩＩＥにおける２つの独立した表面パッチ（図７及び８）を必要とすることを意味している：１つはその上側表面に（Ｎ末端が見出される所）及びもう１つはその下側表面に（Ｃ末端近くに面している所）位置している。上のパッチは、相互作用に主に寄与する残基を含有し、そのアラニンによる置き換えが親和性における１０倍を超える減少を生じる５個の群を含んでいる。したがってこのパッチは、ＤＩＩＩＥとα２Ｍ＊との間の相互作用のための主な部位と考えられ得る。その必須残基は、Ｌｙｓ３６１〜Ａｓｎ３６６及び残基Ｌｙｓ３８５の近接直鎖状セグメントである。
【０１１２】
ＤＩＩＩＥの下の表面に位置する上に述べた第２のパッチ（図７及び８）は、残基Ｇｌｕ３４２、Ｔｈｒ３４６、Ａｒｇ３５０、Ｐｒｏ３７２、Ｇｌｙ３７４及びＧｌｕ３７５によって形成されている。これらの残基のいずれかのアラニンによる置き換えは、上のパッチの残基での同様の置き換えよりも親和性におけるより少ない減少をもたらす；したがってこの下のパッチは二次相互作用部位として考えることができる。
【０１１３】
α２Ｍ＊とのその相互作用に関与するＤＩＩＩＥの表面上の部位のマッピングを行ったこの実験において得られた結果は、本発明のベータヘアピンペプチドを設計するために用いられる原理の正当性を実証している。例えばＤＩＩＩＥのＬｙｓ３８５の構造的／機能的模倣物を構成するリシン残基を含むように注意を払い、これが相互作用に主に寄与している個々の残基であることが判明する（そのアラニンへの変異は相互作用の親和性を２２分の１より低減する）。この残基を模倣するペプチド残基は：ＰＨＢ２中のＬｙｓ８及びＰＨＢ５中のｄ−Ｌｙｓ８、ＰＨＢ１、ＰＨＢ６及びＰＨＢ７中のＬｙｓ９、ＰＨＢ４中のＬｙｓ１０並びにＰＨＢ３、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９中のＬｙｓ１１である。別の例では、ＤＩＩＩＥとα２Ｍ＊との相互作用を最も強く阻害するベータヘアピンペプチドの４個（ＰＨＢ４、ＰＨＢ５、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９、図５、例３）は、この例で決定された二次結合部位の最も重要な残基であるＤＩＩＩＥのＧｌｕ３７５を構造的／機能的に模倣する残基を有する。Ｇｌｕ３７５を模倣するベータヘアピンペプチド中の残基は、ＰＨＢ３、ＰＨＢ４、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９中のＧｌｕ３並びにＰＨＢ５及びＰＨＢ６中のＧｌｕ１６である。言い換えるとＤＩＩＩＥのα２Ｍ＊への結合を最も強く阻害する本発明で開示のベータヘアピンペプチドは、この例に記載の一次及び二次相互作用部位の２つの最も重要な残基を同時に含有するものである。
【０１１４】
（例５）
超分子構造の形成
ペプチドＰＨＢ４の凝集動態
光散乱をペプチドＰＨＢ４の凝集をモニターするために使用した。測定はＳｈｉｍａｄｚｕ（商標）ＲＦ−５３０１ＰＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）蛍光分光光度計で、装置製造者によって提供されたソフトウェアでデータを取得して実施した。５ｎｍの励起及び発光開口を使用して、入射光線（励起）及び検出（発光）の波長を３２０ｎｍに設定した。ペプチドによる光の散乱を、ペプチドによって分散された光の強度からペプチドを含まない溶液（ブランク）によって分散された光の強度を減算することによって算出した。ＰＢＳ中のペプチドの溶解による光散乱の多様性を経時モードで、１秒あたり１又は２回の測定頻度でのデータ取得によって研究した。ＰＢＳ中のＰＨＢ４溶液を水中のペプチド溶液１容量をＰＢＳ  ２Ｘ溶液の１容量と混合することによって調製した。
【０１１５】
この実験で取得されたデータは、ＰＢＳに溶解され、２分間より短い潜在期後にペプチドによって分散される光の強度は最初の３０〜４０分間に急速に増加し、次いで測定を終了した３００分間まで線形速度でゆっくり増加し続けることを明らかにした。図９は、５及び１０μＭのペプチド濃度でのゼロ時間での分散光と比較した分散光の比
【数１】
2017509619.tif 000007
の挙動を示している。５μＭでの
【数２】
2017509619.tif 000008
最大は１０μＭでのものより大きい（１１対７）が、両方の濃度についてのプロファイルは類似しており、より低いペプチド濃度で生じた凝集が元の平均サイズと比較してより大きい平均サイズの凝集物の形成をもたらしたことを示唆している。チャートはＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １０．０（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で作成した。
【０１１６】
ペプチドＰＨＢ４によって形成された超分子構造の形態の透過型電子顕微鏡による分析
ペプチドＰＨＢ４によって形成された凝集物の形態を分析するために、ペプチド溶液を温度、インキュベーション時間及び電解質の存在などの条件が凝集を促進するために操作されたさまざまな実験処置に供した（図１０）。この具体的な研究のために２種のペプチド溶液（２ｍｇ／ｍＬ、０．７３ｍＭ）を１つは水中にもう１つはＰＢＳ中に調製した。次いで試料をそれぞれから採取し、グリッドに直接固定し、顕微鏡下で観察した（Ｔ０試料）。残りを１時間、５０℃でインキュベートし、次いで試料を採取し、直ちに固定した（Ｔ１試料）。次いで残りをさらに２時間、室温でインキュベートし、次いで固定した（Ｔ２試料）。
【０１１７】
図１０Ａにおいて観察されるとおり、水に溶解した場合ペプチドは室温で５〜２０ｎｍの直径を有する粒子を形成する。粒子を含む５０℃処置は、５〜１０ｎｍのサイズを有するプロト原線維／原線維型線維構造の出現を誘導する（図１０Ｅ）。水中での原線維の形成には、それらが熱処置後のＴ２試料においてだけ検出されることから潜在期がある。原線維形成は、より長い（５〜２０ｎｍ）線維構造がＰＢＳ中でのペプチドの溶解直後に形成されることから、高イオン強度（ＰＢＳ）が好適であり（図１０Ｂ）、１時間、５０℃で試料を加熱した後に数での増加が継続している（図１０Ｄ及び１０Ｆ）。これらの結果は、より高い温度及びイオン強度がペプチドＰＨＢ４の凝集に好適であることを実証している。
【０１１８】
同様にこの研究は、ペプチドＰＨＢ４がその形態が正確な培地組成及び温度に依存する超分子凝集物を形成することを明らかに示している。観察された原線維性構造の大きさは、典型的には伸長されたベータシートの形成を通じて引き延ばされた線維として成長するアミロイド型構造のものと一致している。
【０１１９】
タンパク質凝集工程の結果は、タンパク質分子内の反発と誘引との間の正確なバランスに依存している（Ｊｕａｒｅｚ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９６［６］、２３５３〜２３７０）。タンパク質溶液に電解質を加えることが、前記電解質によるタンパク質分子間の静電的反発の遮蔽のためにしばしば原線維の形成速度を増加させ、それにより誘引性分子間相互作用に、そのため凝集物の形成に向けてバランスを傾けることは周知である（Ｊｕａｒｅｚ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９６［６］、２３５３〜２３７０；Ｓａｇｉｓ，Ｌ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２０、９２４〜９２７）。分子間相互作用の工程の動態は、タンパク質凝集の誘導で基本的役割を演じることが長く周知である温度によっても支持されている。
【０１２０】
（例６）
ＬＲＰ１受容体の断片を有するベータヘアピンペプチドの相互作用の研究
ＤＥＮＶ感染がＤＥＮＶビリオンと、ＬＲＰ１として周知の細胞受容体との間の相互作用を干渉する分子によって遮断され得ることは周知である（Ｈｕｅｒｔａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ、ＷＯ２００７／１２４６９８）。ＬＲＰ１は、８５ｋＤａのβ鎖に非共有結合的に会合したおよそ５００ｋＤａのα鎖によって形成された膜内在性タンパク質（図１１Ａ）である（Ａｎｎａ  Ｐ．Ｌｉｌｌｉｓ、ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８８：８８７〜９１８）。この受容体の細胞外領域は、受容体シグナル伝達及びエンドサイトーシスに関与している細胞内タンパク質との相互作用のための膜貫通セグメント及び２個のＮＰｘＹモチーフを含有している、α全体及びβ鎖の一部によって形成されている。ＬＲＰ１は、３０個を超えるさまざまなリガンドを内部移行でき、脂質の代謝、止血、ライソソーム酵素の活性化及び神経伝達を含む多数の重要な工程に関与することが示されている恒常的細胞内受容体である。
【０１２１】
細胞外ＬＲＰ１リガンドと相互作用するのはＬＲＰ１のα鎖である。この鎖は、ＬＲＰ１が属する低密度リポタンパク質受容体のファミリーメンバーの典型的ドメインアーキテクチャを呈する。詳細にはＬＲＰ１のα鎖は、補体カスケードのタンパク質のＣｙｓリッチ領域に構造的に関連する２個（クラスターＩ）、８個（クラスターＩＩ）、１０個（クラスターＩＩＩ）及び１１個（クラスターＩＶ）のリガンド結合部位を含有する４個のクラスターを含有する。各リガンド結合部位がクラスター化した後、Ｃｙｓリッチ領域及びＹＷＴＤドメインによって形成された上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインがある。
【０１２２】
ＬＲＰ１のリガンド結合ドメインがＤＥＮＶ由来ＤＩＩＩＥと相互作用するかどうかを判定するために、組換えＤＩＩＩＥタンパク質を、図１１Ｃに示すとおりＤＥＮＶ１  Ｊａｍａｉｃａ／ＣＶ１６３６／１９７７株由来タンパク質Ｅの残基２８９〜３９９（ＤＩＩＩＥ１Ｊ）；ＤＥＮＶ２  Ｊａｍａｉｃａ  １４０９株由来のタンパク質Ｅの残基２８９〜３９９（ＤＩＩＩＥ２）；ＤＥＮＶ３  Ｈ−８７株由来のタンパク質Ｅの残基２８７〜３９７（ＤＩＩＩＥ３）及びＤＥＮＶ４  Ｄｏｍｉｎｉｃａ  ８１４６６９株由来のタンパク質Ｅの残基２８９〜３９９（ＤＩＩＩＥ４）をＣ末端ヘキサヒスチジンタグに融合して（配列番号１９〜２２）調製した。タンパク質ＤＩＩＩＥ１Ｊ及びＤＩＩＩＥ２〜ＤＩＩＩＥ４を大腸菌での異種性発現によって得て、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって証明したとおり９０％を超える純度の調製物を得た（図１１Ｄ）。
【０１２３】
同様に実験は、それぞれｓＬＲＰ１−ＣＩＩ（配列番号２３）、ｓＬＲＰ１−ＣＩＩＩ（配列番号２４）及びｓＬＲＰ１−ＣＩＶ（配列番号２５）と命名され、ヒトＩｇＧ１分子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）の定常領域に融合されたＬＲＰ１由来のクラスターＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶを含有する３個の組換えタンパク質を使用した（図１１Ｂ）。
【０１２４】
ＤＩＩＩ／ＬＲＰ１相互作用の評価を９６ウェルプレートを１０μｇ／ｍｌでのタンパク質ＤＩＩＩＥ１Ｊ又はＤＩＩＩＥ２〜ＤＩＩＩＥ４でコートし、次いでウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の１０μｇ／ｍｌでのｓＬＲＰ１  ＣＩＩ、ｓＬＲＰ１  ＣＩＩＩ又はｓＬＲＰ１  ＣＩＶのいずれかと１時間、３７℃インキュベートしたＥＬＩＳＡアッセイで実施した。洗浄後プレートを１時間、３７℃で１：１０００希釈抗ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼコンジュゲートとインキュベートし、ｏ−フェニレンジアミン／Ｈ２Ｏ２で発色させた。得られたデータは、ｓＬＲＰ１−ＣＩＶが最も強い結合を呈し、ｓＬＲＰ１−ＣＩＩがこれに続き、一方ｓＬＲＰ１−ＣＩＩＩはいずれのＤＩＩＩＥ分子に対しても検出可能な結合を示さないという、４種すべての血清型由来のＤＩＩＩＥについて類似した相互作用のパターンを明らかにした（図１２）。
【０１２５】
ベータヘアピンペプチドとＬＲＰ１受容体の可溶性断片との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ装置を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって研究した。この技術では、研究する相互作用パートナーの１つをチップの表面に固定し、他方の相互作用パートナーを相互作用表面上の測定セルを通して制御流の条件で流す溶液に溶解する。相互作用パートナーの会合及び解離をレゾナンスユニット（ＲＵ）で測定し、時間の関数として「センサーグラム」として周知のチャート上にプロットする。それによりＳＰＲは実験者がいずれの相互作用パートナーも標識を有することなく相互作用に関する詳細な情報を得られるようにする。
【０１２６】
この例ではＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）の１個のチャネルをタンパク質ｓＬＲＰ１−ＣＩＶをその表面に高密度で固定するために使用し（表６を参照されたい）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を別のチャネルに固定した。各分子について達成されたＲＵ密度に基づいて、各ｓＬＲＰ１−ＣＩＶ分子について１１個の潜在的相互作用部位及び各ＨＳＡ分子について１個の潜在的相互作用部位があることを想定し、それにより両チャネルでの表面は、単位表面面積あたり同様の結合部位密度（ｐｍｏｌ／ｍｍ２）を呈する。
【表６】
2017509619.tif 000009
【０１２７】
固定化タンパク質の反応性を２個の周知のＬＲＰ１リガンド；すなわち、α２Ｍ及び受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）として周知のタンパク質を使用して評価した。両分子がＬＲＰ１受容体のクラスターＩＶと相互作用することは以前実証されている（Ｊａａｐ  Ｇ．Ｎｅｅｌｓ、ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７４、４４：３１３０５〜３１３１１）。図１３はこの検証の結果を示している。観察できるとおりα２Ｍ又はＲＡＰのいずれかをロードすることは、ｓＬＲＰ１−ＣＩＶチャネルで検出されるシグナル（ＲＵ）を増加させるが、ｒＨＳＡチャネルでのシグナル強度を増加させない。この結果は、固定化ｓＬＲＰ１−ＣＩＶが両リガンドとの特異的相互作用を確立できることを実証している。
【０１２８】
ｓＬＲＰ１−ＣＩＶを高密度で固定化することを、これらの条件が分子量が平均的タンパク質（この実験が研究する目的のペプチドなど）のものより低い化合物とのいかなる潜在的相互作用の検出も容易にすることから決めたが、高密度表面では、質量移動制限（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ）及び多価結合の可能性が速度定数の正確な決定を困難にしていることは強調されなければならない。したがってｓＬＲＰ１−ＣＩＶ結合表面をさらに詳細に特徴付けるために、さまざまなＲＡＰ希釈物（０．６〜２０μＭ）をロードし、ＲＵを相互作用平衡の条件下で記録した（２５０秒間、図１３Ｂを参照されたい）。生じた最大ＲＵ対濃度曲線によって示された挙動は、４．２ｎＭのＫｄでの高親和性相互作用及び１．１μＭのＫｄでの低親和性相互作用がある二重部位モデルのものに十分にフィットする。これらのデータは、ＲＡＰのＬＲＰ１への結合を分析した他の研究において得られた他の結果と一致し、ＲＡＰが６〜１８ｎＭの親和性を有するＬＲＰ１のクラスターＩＩ及びＩＶでの複数点相互作用を確立し、この相互作用での複数結合価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）の喪失がマイクロモル範囲の親和性定数をもたらしていることを示している。それによりこの実験では、親和性がマイクロモル範囲にある相互作用の存在がチップの表面での固定化ｓＬＲＰ１−ＣＩＶの高密度によって説明でき、高ＲＡＰ濃度での多価相互作用の喪失を促進する。データは、固定化ｓＬＲＰ１−ＣＩＶがＬＲＰ１−ＲＡＰ相互作用の以前報告された特徴を正確に再現することも示している。
【０１２９】
ベータヘアピンペプチドのｓＬＲＰ１−ＣＩＶへの結合をさまざまなペプチド変種のランニング緩衝液中２０μＭ希釈物を上で特徴付けしたｓＬＲＰ１−ＣＩＶチップにロードすることによって研究した。生じたシグナルの高い強度は、ペプチドのモノマー形態よりも凝集したものの結合と一致する。したがってさまざまなペプチドの間に観察された変動は、単位ペプチド相互作用の親和性における差異又は、多価様式で固定化ｓＬＲＰ１−ＣＩＶ分子を同時に会合できるペプチド単位の数における変動をもたらす、凝集数及び／若しくは幾何における差異のいずれかを反映している可能性がある。
【０１３０】
ＨＤＩＩＩ３ＣＬファミリーのペプチド（表１のペプチド１０〜１４）の場合は、変種ＨＤＩＩＩ３ＣＬ２は、最も強い結合を示す。変種ＨＤＩＩＩ３ＣＬＷ及びＨＤＩＩＩ３ＣＬＫの場合には検出可能な特異的結合もあるが、相互作用の強度は低く、残基Ｔｒｐ１７及びＬｙｓ１４の置き換えがｓＬＲＰ１−ＣＩＶへの結合に有害な効果を有することを示唆している。変種ＨＤＩＩＩ３ＣＬＣの場合は最大でも周辺の相互作用があるだけであり、残基Ｃ１及びＣ１８の置き換え（言い換えるとジスルフィド架橋の除去）は、ペプチドとｓＬＲＰ１−ＣＩＶとの相互作用の強度に劇的に影響を与えることを示している。ＨＤＩＩＩ３ＣＬＣ、ＨＤＩＩＩ３ＣＬＷ及びＨＤＩＩＩ３ＣＬＫは、ｓＬＲＰ１−ＣＩＶへのそれらの結合がＨＤＩＩＩ３ＣＬと比較して減少しており、Ｖｅｒｏ細胞においてＤＥＮＶ２に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性を呈さないことから、この結果は、ペプチドによって示される抗ウイルス活性の作用強度についての以前のデータと一致する（表２を参照されたい）。一方、ＨＤＩＩＩ３ＣＬ２が呈するｓＬＲＰ１−ＣＩＶへのより強い結合は、ＨＤＩＩＩ３ＣＬと比べてさらに強力な抗ウイルス活性には転換されず（表２を参照されたい）、受容体結合それ自体は必要であるが、抗ウイルス活性のために十分ではないことを示している。この発見に対する１つの可能性がある説明は、ウイルス受容体相互作用に関連する役割を演じないｓＬＲＰ１−ＣＩＶ中の部位に結合するＨＤＩＩＩ３ＣＬ２の画分があること、及び／又は非常に低い親和性での結合していること、である；これは、受容体ＬＲＰ１及びそのクラスターの多重ドメインアーキテクチャを考慮すれば合理的な想定である。ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬ２とＨＤＩＩＩ３ＣＬとの間の差異は、前者がさらなるＣ末端リシンを有し、それによりさらに強い陽イオン性特徴を有することであり、この陽イオン性特徴は、負に荷電したＬＲＰ１受容体とのさらなる静電相互作用を促進する場合がある。さらに、Ｌｙｓ２１が、（Ｈｕｅｒｔａ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ、ＷＯ２００７／１２４６９８）及び本発明において既に記載のＤＩＩＩＥ中の機能性パッチを模倣するトポロジー領域であるヘアピン部分を形成しないことは注目されるべきである。
【０１３１】
ベータヘアピンペプチドＰＨＢ１、ＰＨＢ２、ＰＨＢ３、ＰＨＢ４、ＰＨＢ５、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９とｓＬＲＰ１−ＣＩＶ表面との相互作用を評価するために同じ手順を用いた。図１４Ｂ及び１４Ｄに示すとおり、以前のアッセイではこのシリーズで最も強力な抗ウイルスペプチドであったペプチドＰＨＢ４が、ＳＰＲによってｓＬＲＰ１−ＣＩＶへの最も強い結合を示した。ペプチドＰＨＢ２、ＰＨＢ４及びＰＨＢ９もそれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性と関係があるペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬのものを超える最大の結合を示した（図１４Ａ及び１４Ｃ）。同じサイズ及びベータターン型のペプチド（ＰＨＢ１〜２、ＰＨＢ３〜４及びＰＨＢ８〜９）の最大結合の比較は、ペプチドＰＨＢ２、ＰＨＢ４及びＰＨＢ９が、それらの対応物（ＰＨＢ１、ＰＨＢ３及びＰＨＢ８）よりも良い結合剤であり、抗ウイルス活性アッセイにおけるそれらの挙動は匹敵していることを示している（例２を参照されたい）。
【０１３２】
（例７）
ベータヘアピンペプチドの抗ウイルス活性と受容体ＬＲＰ１及びタンパク質α２Ｍ＊へのそれらの結合との間の相関
受容体ＬＲＰ１は、ＤＥＮＶに対する推定細胞内受容体として以前提案されており、「架橋」又は「担体」の役割は、ウイルスの細胞への進入工程においてタンパク質α２Ｍ＊（ＬＲＰ１リガンド）に起因している（Ｈｕｅｒｔａ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ、ＷＯ２００７／１２４６９８）。
【０１３３】
以前の例（例６）は、本発明で開示のベータヘアピンペプチドが受容体ＬＲＰ１の断片に結合できることを実証した。次にこの例は、例２において観察された抗ウイルス活性が受容体ＬＲＰ１に結合するこれらのペプチドの能力に定量的に関連するかどうかを検討する。図１５において観察されるとおり、Ｖｅｒｏ細胞でのペプチドの抗ウイルス活性のＩＣ５０値の対数（−ｐＩＣ５０）は、４００秒の実行長（ＲＵｒｅｍ）で観察されたＢｉａｃｏｒｅシグナル値に線形依存性を示す。この場合、表１により同じトポロジーを共有しているＰＨＢペプチドだけが示される。ペプチドＰＨＢ４の抗ウイルス活性の作用強度が他よりもさらに高いだけでなく、ペプチドＰＨＢ４はＬＲＰ１結合に関しても他より相当に優れている。上で観察された関係の線形性は、線形回帰係数（Ｒ２）がＰＨＢ４データを含んで０．９９及びそれらを含まずに０．９７であることから、ＰＨＢ４データを排除した場合でも一定のままである（図１５の挿入図）。挿入図のデータを分析して、線形依存性がＰＨＢ４に関して維持され、Ｂｉａｃｏｒｅ結合値がナノモル範囲で抗ウイルス作用強度に対応し、例２で実験的に決定された作用強度と一致するという予測ができる。
【０１３４】
共通のトポロジーを有するペプチドの抗ウイルス活性についてのｐＩＣ５０データは、ＲＵｒｅｍ値に統計的に有意な相関（ｒ（ピアソン）＝−０．９９５７及びＰ＜０．０００１）を示す。ペプチドＰＨＢ４データを排除する場合、ピアソンの相関係数の値は同様のままである（ｒ（ピアソン）＝−０．９８６８、Ｐ＝０．００１８）。相関、線形回帰及びチャートの分析は、Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で行った。
【０１３５】
これらの結果は、ＰＨＢペプチドがビリオンとＬＲＰ１受容体との間の相互作用を妨害し、増殖性ウイルスの細胞への進入の阻害をもたらす抗ウイルス作用機序と一致している。
【０１３６】
同様の分析をマイクロモル以下／ナノモル範囲でのＤＩＩＩＥのタンパク質α２Ｍ＊への結合を阻害するＰＨＢペプチドの能力に関して実施した。例３に示すとおりその濃度範囲ではペプチドは、ペプチドＰＨＢ２、ＰＨＢ４、ＰＨＢ５、ＰＨＢ８及びＰＨＢ９がＤＩＩＩＥ１Ｊ単独よりも良い（１．５から３倍）阻害百分率を呈し、ビオチン化ＤＩＩＩＥ１Ｊ（ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔ）のα２Ｍ＊への結合を部分的に阻害した。この場合ペプチドの阻害能力（ＤＩＩＩＥ１Ｊｂｉｏｔのα２Ｍ＊への結合を阻害する組換えＤＩＩＩＥ１Ｊの能力と比較する）は、図１６に示すとおりＶｅｒｏ細胞でのＤＥＮＶ２に対するそれらの抗ウイルス活性と相関する。ＩＣ５０値とα２Ｍ＊阻害百分率（組換えＤＩＩＩＥ１Ｊの阻害百分率と比較）との間のスピアマンの相関係数はＲｓ＝−０．９７６２、Ｐ＝０．０００４であり；結果は、本発明で開示のベータヘアピンペプチドが、ウイルスの細胞への進入の際にタンパク質α２Ｍ＊によって演じられる役割に干渉する場合があることを示唆している。
【０１３７】
（例８）
ペプチドＰＨＢ４の抗ウイルス活性での凝集に影響を与える薬剤の効果
ペプチドＰＨＢ４の抗ウイルス活性を、ＤＥＮＶ２  Ｓ１６８０３株でのＨｕｈ７．５細胞の感染に対するこのペプチドの阻害活性へのそれらの効果を検討する目的で、その凝集を促進する処置後、又は凝集を調節するさまざまな薬剤の存在下で評価した。Ｈｕｈ７．５、ヒトヘパトーマ由来細胞系をＤＥＮＶ２に対して許容であることからだけでなく、ＤＥＮＶ病原性の観点から実験系としてのその関連性のために選択した（Ｌｉｎ  ＹＬ、ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．；６０（４）：４２５〜３１）。
【０１３８】
イオン強度における変化がペプチド凝集物のサイズ及び形態への変化を生じることを証明する例５に示す結果に基づいて、水中のＰＨＢ４の濃縮溶液から出発して、ペプチドを（ｉ）ＭＥＭ培地又は（ｉｉ）ＰＢＳ（それぞれ６．８ｇ／Ｌ及び８．０ｇ／ＬのＮａＣｌを含有し、ｐＨを７．４に調整）のいずれかに溶解し、評価しようとするさまざまな条件に供する実験を設計した。
【０１３９】
抗ウイルス活性をウイルス収量アッセイで評価した、８０〜９０％コンフルエントＨｕｈ７．５単層を非補充ＤＭＥＭで２回洗浄し、０．０１のｍ．ｏ．ｉで２時間、３７℃、５％ＣＯ２、さまざまなペプチド調製物の存在下で感染させ、その後ウイルス接種材料を非補充ＤＭＥＭでの洗浄によって除去し、細胞を２％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞上清をｐ．ｉ．２４時間で回収し、ウイルス収量をプラーク形成アッセイで上清を滴定することによって決定した（Ｍｏｒｅｎｓ  Ｄ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．（１９８５）．Ｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；２２：２５０〜２５４）。
【０１４０】
温度が凝集又はペプチドの超分子構造への自己集合に顕著に影響することは十分周知である（Ｓａｂａｔｅ  Ｒ、ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；１３（２）：４７４〜８３）。したがってアッセイの第１のシリーズは、水中のペプチドの２０μＭ溶液から出発して、希釈物を１０〜０．０１μＭ濃度範囲でＭＥＭ中に調製し、次いで平行して１０℃及び３７℃で２時間インキュベートし、次にウイルス阻害アッセイで使用するように設定した。インキュベートしていないペプチド希釈物（すなわち、ウイルス阻害アッセイ直前に調製した）を対照として使用した。
【０１４１】
結果は、ＭＥＭ培地に溶解し、インキュベートされていないペプチドが、用量依存的様式、０．１６μＭのＩＣ５０で及び１０μＭのＩＣ１００でウイルス感染を阻害したことを示している（図１７、表７）。しかしインキュベーション前のＭＥＭ中のペプチドはＩＣ５０が０．０３７μＭに降下して１０℃で作用強度における急な増加を生じ、一方３７℃でインキュベートすることは反対の効果を生じ、そのＩＣ５０は０．８９μＭに増加した。結果は、ペプチド凝集の工程において温度が決定的な役割を演じることを示しており、この予備実験においてのとおり温度は２４倍もの作用強度における変化をもたらす。
【表７】
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【０１４２】
第２の実験は、ペプチドＰＨＢ４の抗ウイルス作用強度への凝集時間の影響を決定するために設計した（図１８）。この実験ではペプチドをＰＢＳ中でさまざまな間隔でインキュベートし、次いで生じた混合物の抗ウイルス活性を評価する前に、凝集工程を停止する目的でＤＭＥＭ中８０ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡの１容量中に希釈した（ＨＳＡは、アミロイドβペプチド原線維の初期核形成及び成長の両方を阻害することが示されている強力な凝集調節因子であるＲｅｙｅｓ  Ａ．、ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３：５を参照されたい）。ＨＳＡとのこのインキュベーションは、１０℃又は３７℃のいずれかで平行して実施し（図１８）、さらにそれらの抗ウイルス活性を評価するためのこれらのペプチド試料の希釈をＤＭＥＭ中の４０ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡ溶液で実施した。
【０１４３】
図１９に示すとおり、アッセイの条件下で、ペプチドの抗ウイルス活性値は、その阻害活性のためのペプチド濃度の最適範囲の存在を示しているベル型用量依存応答曲線をもたらした。この種類の応答は、多数のさまざまな生物系の活性において一般に見られ、この挙動の根底に単一の作用機序はないが、すべての場合に共通する要素は、その場合の分子間の多価相互作用の存在である。
【０１４４】
結果は、ペプチドの阻害活性が、より高い作用強度の凝集物の形成について、ＰＢＳ中でのインキュベーション期間の長さに感受性であることを証明している。ここで、作用強度は、アッセイのための感染対照のウイルス収量の５０％まで減少させる最低ペプチド濃度として理解される。一方ＨＳＡ、１０℃でのインキュベーションは、３７℃でのインキュベーションによって得られた結果と比較して低作用強度変種の形成をもたらす。これから、ペプチド又は成長しているその凝集物とＨＳＡとの間に相互作用が恐らくあることが確認される。この相互作用においては、凝集工程の経過は変化して、ＰＢＳ中での４５〜６０分間のインキュベーションに次ぐ３７℃でのＨＳＡとのインキュベーションによって得られたものなどの高作用強度変種の形成をもたらし、この高作用強度変種は、このアッセイ形式において１ｎＭ〜１０ｐＭの低いペプチド濃度でＤＥＮＶによる感染の完全阻害をもたらすことができる。
【０１４５】
ペプチドの出発濃度は、凝集工程の動態及び最終結果に重要な様式で影響を与える場合がある別のパラメーターである。このパラメーターがペプチドＰＨＢ４の抗ウイルス活性にどのように影響を与えるかを精査するために、アッセイを設定し（図２０に図表で表した）、濃度範囲１００μＭから２μＭでの水中のペプチド溶液を１容量のＭＥＭ  ２Ｘで希釈して、２時間、２５℃でインキュベートし、その後非補充ＤＭＥＭ培地での希釈物を調製し、抗ウイルス活性のためにアッセイした。
【０１４６】
結果は、凝集物の成長工程を引き起こすより高いイオン強度の溶液へのその添加の前の、水中のペプチドＰＨＢ４の初期濃度と抗ウイルス活性との間に関連があることを実証する（図２１）。付加的にデータは、用量応答挙動が変化することも証明し、これから、水中のペプチドを溶解させる初期条件に応じて異なる凝集物構造に向けて進行することが確認される。、最も強力な形態は、ベル型用量応答曲線を再び示しており、このアッセイで評価された水中で最も高い初期希釈においてペプチドが見出された条件に関して得られる。
【０１４７】
全体として結果は、ペプチドＰＨＢ４が会合条件に応じてナノモル／ナノモル以下の範囲の抗ウイルス作用強度を有する凝集物形態を構築できることを証明している。これらの実験において使用された抗ウイルス活性アッセイは、評価下の分子が感染の初期段階の間だけ存在し、細胞単層の続く洗浄の際に除去されることからこの目的のための最もストリンジェントな検査の１つであることは強調されるべきである。したがって抗ウイルス活性がこの実験設定で検出可能であったという事実は、細胞へのウイルス進入の初期段階；すなわち細胞表面への結合、内部移行又は膜融合、のうちの１つを阻害するペプチドＰＨＢ４の作用機序と一致する。
【０１４８】
（例９）
動物モデルにおけるウイルス感染の防御
実験をペプチドＰＨＢ４のｉｎ  ｖｉｖｏ抗ウイルス活性を評価し、ペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬのものと比較するために設定した。この目的のためにＢａｌｂ／ｃマウス（平均体重２０ｇ）の成体１２匹の群をエーテル吸入によって麻酔し、頭蓋内にこのモデルの致死性容量中央値の１０倍及び評価されるペプチドを含有する２０μＬウイルス調製物を接種した。動物は処置後すぐに回復し、処置の５分後に既に覚醒し、その後２１日間モニターした。データをカプラン・マイヤー対数順位検定（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ  ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を使用して評価した。
【０１４９】
表８は、４種のＤＥＮＶ血清型で実施された実験の結果を含む。アッセイされた用量で、ペプチドＰＨＢ４はマウスに完全防御を提供し、したがってペプチドＨＤＩＩＩ３ＣＬよりさらに強力である。ＤＥＮＶ２株の場合実験は３回繰り返した。
【表８】
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【０１５０】
（例１０）
金属に基づくナノ粒子への会合のためのペプチドＰＨＢ４のポリヒスチジンタグへの融合
本発明者らは、本発明により開示のベータヘアピンペプチドが、化学合成又は組換えＤＮＡ技術を使用して、単独又は他のタンパク質／ペプチドに融合されて産生され得ることに以前注目した。同様に例５において、本発明により開示のベータヘアピンペプチドが、出発ペプチド濃度、溶媒種類並びに、温度、ｐＨ、イオン強度、超音波処理、添加物の存在、ＨＳＡなどのタンパク質への非共有結合などの実験条件に依存して凝集し、さまざまな四次構造をとり得ることを実証した。これらの超分子構造の形成は、恐らくペプチドに基づくナノ粒子とそれらの推定受容体との相互作用のアビジティーが多価結合（同じナノ粒子中のいくつかのモノマーと、受容体中のいくつかのリガンド結合ドメインとの又は細胞表面上の１つより多い受容体との同時相互作用）のためにさらに高いという事実により、ベータヘアピンペプチドの抗ウイルス活性を大きく増加させる（例８を参照されたい）。付加的にナノ粒子の形成は、その血清半減期を増加させ、血清プロテアーゼへの抵抗性を付与することによって、ペプチドの薬物動態的特性に正に寄与する場合がある。
【０１５１】
本発明により開示のベータヘアピンペプチドが形成することが示されているナノ粒子は、前記ペプチドを、「スペーサー」（Ｅ）分子又は原子に非共有結合的に結合できる「アクセプター」（Ａ）基に、各「Ｅ」基について２つ以上の「Ａ」基の化学量論で融合することによってさらに安定化され得る。そのような設計は、単一の「Ｅ」スペーサーを有する２つ以上ＰＨＢペプチドの会合を可能にする。本発明の一実施形態では本発明者らは、ヒスチジン残基５個からなるタグをペプチドＰＨＢ４に化学合成を介して付加する（図２２）。ポリヒスチジンタグはＺｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｓなどの多価金属イオンのための「Ａ」基として機能できる。この場合、ヒスチジン残基の側鎖を構成するイミダゾール基の原子は、金属イオンあたり４個までのイミダゾール基の化学量論で金属イオンに配位結合を確立する。したがって特定の濃度では、ポリヒスチジン結合金属イオンは「Ｅ」基として作用でき、ペプチド二量体化を促進する。
【０１５２】
図２３は、どのように金属イオンが、利用可能なイミダゾール基を保持しているさまざまなペプチド同士を、テトラ陰イオン（ｔｅｔｒａａｎｉｏｎｉｃ）化合物ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）及びＥＤＴＡ（２−（｛２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル｝（カルボキシメチル）アミノ）酢酸）などの補助キレート基に配位させる手段によって直接的及び間接的にの両方で連結するために使用できるかを図式で示している。これらの場合では、金属イオンはＥＧＴＡ（Ｍｅ）２及びＥＤＴＡ（Ｍｅ）２複合体を、ジアミンテトラカルボン酸の１分子あたり２個の金属原子の化学量論で形成し、前記金属イオンはさらなるイミダゾール基と配位結合をまだ形成でき、それによりペプチドとその凝集物との架橋を安定化できる「Ｅ」基として作用できる（図２３）。
【０１５３】
図２２は、本発明により開示の融合分子の２個を示す；１つでは、ポリヒスチジンタグがＣ末端アミド結合を介してペプチドＰＨＢ４に繋がっており（ＰＨＢ４Ｈ５）、もう１つではタグはペプチドに同様の様式でＮ末端で添付されている（Ｈ５ＰＨＢ４）。両融合ペプチドは、例１に既に記載の手順を用いて合成及び精製され、４ｍＭ  ＥＧＴＡの溶液に８ｍＭの最終濃度でＺｎＣｌ２を加えることによって予め得られた、２ｍＭ  ＺｎＣｌ２（金属イオンを提供する）又は２ｍＭ  ＥＧＴＡ（Ｚｎ２）複合体のいずれかを含有する１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．８〜７．５緩衝液中の各ペプチドの２００μＭ溶液を調製するために使用した。
【０１５４】
次いでこれらのペプチド調製物（ＰＨＢ４Ｈ５及びＨ５ＰＨＢ４、単独又はＺｎ若しくはＥＧＴＡ（Ｚｎ２）のいずれかとの複合体でのいずれかで）をＶｅｒｏ細胞でのＤＥＮＶ２（Ｍ２Ｃ株）に対する抗ウイルス活性についてアッセイした。簡潔には細胞を１時間、３７℃、ペプチド調製物の存在下でインキュベートし、次いでウイルス接種材料を０．００１のｍ．ｏ．ｉ．で加えた。２時間後、高密度培地層を加え、プレートを３日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ウイルスチャレンジの前に対応する濃度のＺｎＣｌ２及びＥＧＴＡ（Ｚｎ２）の溶液だけでインキュベートした細胞を陰性対照として使用した。ウイルスプラークをウイルスエンベロープに特異的なモノクローナル抗体で免疫フォーカス（ｉｍｍｕｎｏｆｏｃｉ）技術を使用して検出し、阻害百分率を次式：
Ｉ＝１００−１００ｘＮＰペプチド／ＮＰ陰性対照
に従って算出した。
【０１５５】
反復全体で平均化して、Ｉは阻害百分率を表し、ＮＰはウイルスプラークの数を表す。
【０１５６】
図２４において観察されるとおり、融合ペプチド（単独、金属添加物を含まない）は２０μＭの濃度で高度に阻害性である（１００％に近い阻害百分率）が、抗ウイルス活性は４又は０．１６μＭのいずれのペプチド濃度でも消失する。しかしこれらの濃度では、ペプチドとＥＧＴＡ（Ｚｎ２）スペーサーとの複合体は、５０〜７０％阻害百分率の範囲でまだ抗ウイルス活性を呈する。ペプチドＨ５ＰＨＢ４は、０．１６μＭで３３％の阻害百分率を呈する。
【０１５７】
これらの結果は、ポリヒスチジンタグへのペプチドＰＨＢ４の融合がスペーサー薬剤、特にＥＧＴＡ（Ｚｎ２）スペーサーに複合体化された場合にさらに強力な抗ウイルス活性を呈することを実証している。
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１２】
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【図１５】
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【図２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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