(57)【要約】調製品が得られる試料のクロマチンレベルから実質的に減少したクロマチンレベルを有する形態の調製品を提供するステップと、調製品を、選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも５０％を保持するが選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過は許す多孔性を有する電気陽性の膜と接触させるステップであって、選択されたサイズが、約１０ｎｍから約１５ｎｍの間であり、接触させるステップの少なくとも一部の間に調製品が、（１）５０ｍＭ未満の濃度で存在する場合、ｐＨ値が、約３から調製品におけるＩｇＧ抗体の最もアルカリ性のグリコフォームの等電点の０．５ｐＨ単位以内までの範囲であるか、または（２）５０ｍＭより高い濃度で存在する場合、調製品のｐＨ値が、３から９の範囲であるような、塩を含むステップと、操作条件を、５％より多い膜に結合している抗体を生じない最高ｐＨおよび最低塩濃度に調整するステップとを含む調製品からＩｇＧ抗体を精製する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ抗体および汚染物質を含有する調製品から前記抗体を精製する方法であって、
前記調製品が得られる原料源試料に内在するクロマチンの５％未満を有する形態の前記調製品を提供するステップと、
前記調製品を、選択されたサイズよりも大きいが前記選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過を許す流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも５０％を保持する多孔性を有する電気陽性の膜と接触させるステップであって、前記選択されたサイズが、約１０ｎｍから約１５ｎｍの間から選択され、さらには前記接触させるステップの少なくとも一部の間に前記調製品が、（１）塩が約５０ｍＭ未満の濃度で存在する場合、前記調製品のｐＨ値が、約３から前記調製品における前記ＩｇＧ抗体の最もアルカリ性のグリコフォームの等電点の約０．５ｐＨ単位以内までの範囲である、または（２）塩が約５０ｍＭより高い濃度で存在する場合、前記調製品のｐＨ値が、約３から約９の範囲であるような塩を含むステップと
を含み、
前記接触させるステップの最終操作条件が、前記調製品中に過剰塩が無いことまたは前記調製品中の２０ｍＭ以下の非ゼロ塩濃度のいずれか、および約５から前記ＩｇＧ抗体の最もアルカリ性のグリコフォームの等電点の約０．５ｐＨ単位以内までの範囲のｐＨ値によって定義される、方法。
【請求項２】
前記選択されたサイズが、約１１ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択されたサイズが、約１２ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択されたサイズが、約１３ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選択されたサイズが、約１４ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記電気陽性の膜が、選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも６０％を保持するが前記選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過は許す多孔性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記電気陽性の膜が、選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも７０％を保持するが前記選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過は許す多孔性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記電気陽性の膜が、選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも８０％を保持するが前記選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過は許す多孔性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記電気陽性の膜が、選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも９０％を保持するが前記選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過は許す多孔性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記電気陽性の膜が、選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも９５％を保持するが前記選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過は許す多孔性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記電気陽性の膜が、選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも９９％を保持するが前記選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過は許す多孔性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記最終操作条件が当てはまる場合以外の前記接触させるステップの一部の間に、前記調製品の条件が、塩が無いことまたは飽和までの非ゼロ濃度での塩の存在のいずれかによって特徴付けられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記原料源試料に内在する前記クロマチンの少なくとも９５％から前記調製品を分離することによって前記原料源試料から前記調製品を取得するステップを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記原料源試料が、細胞培養採取物、体液、または組織抽出物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記原料源試料が、細胞培養採取物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記調製品が、分別を含むプロセスによって前記原料源試料から取得される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記分別が、前記原料源試料または前記原料源試料から得られた試料と、アラントインおよびカプリル酸とのインキュベーションの後に続く、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記調製品が、前記分別プロセスからの再可溶化されたＩｇＧを含む、請求項１７〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記調製品が、ウイルスを不活性化する１種または複数の薬剤を含有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスを不活性化する１種または複数の薬剤が、エタクリジン、メチレンブルー、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、リン酸トリ（ｎ−ブチル）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスを不活性化する１種または複数の薬剤が、それぞれ約０．１％以下の濃度で存在する、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記電気陽性の膜が、前記膜の表面に接触している前記調製品上に位置するように膜材料の構造にまたは内部に共有結合で固定化された複数の正に帯電した窒素を含有する部分を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記正に帯電した窒素を含有する部分が、（１）第一級アミン、（２）第二級アミン、（３）第三級アミン、（４）第四級アミン（５）ポリアミン、（６）イミン、（７）Ｎ−複素環、（８）アミノ酸、（９）Ｎ−ヒドロキシアミド、（１０）アリールアミン、それらのポリマー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記正に帯電した窒素を含有する部分が、金属イオンにさらに結合する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記正に帯電した窒素を含有する部分が、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、デフェロキサミン（デスフェリオキサミン）、アルギニン、ヒスチジン、ヒスタミン、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記正に帯電した窒素を含有する部分が、それぞれ式Ｉ
【化１】
2017507938.tif 000005
（式中、Ｒのそれぞれの出現は、少なくとも１つのＲが、場合によってはリンカーを介する、前記電気陽性の膜への付着物の部位であるという条件で、独立に水素あるいはＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはヒドロキシル、アミノ、もしくはハロ部分で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、かつ
Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立に（ＣＨ２）ｎであり（式中、ｎは２から８の整数である）、ＣＨ２基は、場合によってはＯ、またはＮＨによって置き換えられる）
の式を有する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのＲが、場合によってはリンカーを介する、前記電気陽性の膜への付着物の部位であるという条件で、Ｒのそれぞれの出現が、独立に水素またはＣ３〜Ｃ８アルキルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
それぞれのｎが、２から６の整数である、請求項２７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記正に帯電した窒素を含有するトリス（２−アミノエチル）アミンである、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記正に帯電した窒素を含有する部分が、二価または三価の第一級アミノ化合物を前記膜の表面上に固定化すること、次いで遊離アミノ基を活性化することおよび二価または三価のアミノ化合物の別の層を付加すること、ならびに場合によっては前記プロセスを繰り返すことによって調製されたグラフト化されたデンドリマーの形態で存在する、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記正に帯電した窒素を含有する部分が、アルキルまたはアリール組成物の１つまたは複数の疎水性の部分を含んでいてよい、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記電気陽性の膜が、タンジェンシャルフローろ過を支持するためにデバイス内に収納される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項３５】
前記調製品を取得するために前記原料源試料を浄化するための成分をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記浄化するための成分が、クロマチン含有量を減少させるために選択される、請求項３５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年２月１９日出願の米国仮特許出願第６１／９４１，９１１号の優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書において開示された実施形態は、抗体、具体的にはＩｇＧ抗体を精製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＩｇＧには弱く結合する、結合しない、または陰イオン交換表面からはじかれる一方で、酸性の汚染物質には選択的に結合するので、ＩｇＧ抗体の精製のために用いられてきた。これは、抗体から酸性の汚染物質を除去する都合のよい有効な手段を提供する。陰イオン交換クロマトグラフィーの一般的に実施されている例には、ＩｇＧを含有する試料への正に帯電したポリマーまたは粒子の大量添加、フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）または空隙排除（ｖｏｉｄ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）モードの陰イオン交換粒子で充填されたカラムを通る試料の通過、あるいは膜細孔を通る抗体の通過が、膜の表面上の正に帯電した基からのそれらの静電反発力によって非常に低塩濃度において排他的に妨げられる高性能タンジェンシャルフローろ過（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の技術が含まれる。空隙排除モードで動作した粒子充填カラム上の陰イオン交換（非特許文献１）を除いて、全ての陰イオン交換法は、最初に汚染物質の結合に適した化学条件に試料を平衡させる必要がある。これは、先行の分別ステップから来た試料が、その技術を実行するために条件が適切になるように陰イオン交換体に適用される前に緩衝液交換されなければならないことを意味するので、陰イオン交換の適用性を制限する。さらにより制限的な選択肢は、先行の分別ステップ自体が、その分別ステップの完了時に陰イオン交換体への適用に適した条件下で処理されたＩｇＧがすでに提供されているように選択されなければならないことである。これらの制限は、後続の陽イオン交換クロマトグラフィーステップ、またはマルチモード（陽イオン交換−疎水性相互作用、またはヒドロキシアパタイトステップ）、または塩沈殿ステップ、または何らかの理由のために塩が試料に加えられた場合などの、ＩｇＧ抗体が高塩条件に内在する場合に特に精製プロセス順序の負担になる。
【０００４】
具体的にはクロマチン異化産物を除去するＩｇＭを含有する細胞培養採取物を処理するための方法が記述されている（非特許文献２）。これらの方法は、具体的には概ね生理学的条件下で、ＩｇＧを含有する細胞培養採取物を浄化するためのＤＮＡ挿入化合物エタクリジンの使用を記述している。
【０００５】
カプリル酸（オクタン酸）での汚染物質共沈によるモノクローナルＩｇＧ抗体の部分精製が開示されている（非特許文献３）。脂肪酸は、全てのタンパク質に結合するが非ＩｇＧ汚染物質を選択的に沈澱させる（非特許文献４、非特許文献５）。無細胞培養採取物の適用のためのプロセス開発ガイドラインが示されている（非特許文献４）。細胞を含有する細胞培養採取物へのカプリル酸の適用が記述されている（非特許文献６）。その技術は、さらなる精製に干渉する混濁した、粘着性の、電気陰性の曇りを併産することの不首尾な特徴を有する（非特許文献４、非特許文献６）。
【０００６】
アラントインは、処方箋無しで買える医療製品において広く用いられているＦＤＡ認可の抗炎症剤である。ＩｇＧの溶液からを含めた、タンパク質溶液からのエンドトキシンを除去することで知られている（非特許文献７、非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒ．Ｎｉａｎら著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １２８２（２０１３年）１２７〜１３２」
【非特許文献２】Ｇａｎら著、「Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ、１２９１（２０１３年）３３〜４０」
【非特許文献３】Ｃｈａｎｔｕｉｎ，Ａ．ら著、「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９（１９６０年）２１８〜２２０」
【非特許文献４】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．著、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１９９６年」、Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ出版
【非特許文献５】Ｍｏｒａｉｓ，Ｖ．ら著、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９（２０１２年）５０〜５４」
【非特許文献６】Ｂｒｏｄｓｋｙら著、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０９（２０１２年）２５８９〜２５９８」
【非特許文献７】Ｖ．Ｖａｇｅｎｅｎｄｅら著、「ＡＣＳ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、２２（２０１３年）４４７２〜４４７８」
【非特許文献８】Ｖ．Ｖａｇｅｎｅｎｄｅら著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １３１０（２０１３年）１５〜２０」
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
特定の態様において、本発明は、好ましくは調製品が、それが由来する元の産生培地中に存在するクロマチンの少なくとも９５％を除去するように処理されている、抗体および汚染物質を含有する調製品からＩｇＧ抗体を精製する方法を提供する。方法には、調製品を選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも５０％を保持するが選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過を許しかつ選択されたサイズが約１０ｎｍから約１５ｎｍの間の任意の量であってよい多孔性を有する電気陽性の膜と接触させるステップが含まれる。接触させるステップの少なくとも一部の間に調製品は、（１）塩が約５０ｍＭ未満の濃度で存在する場合、調製品のｐＨ値が、約３から調製品におけるＩｇＧ抗体の最もアルカリ性のグリコフォームの等電点の約０．５ｐＨ単位以内の範囲であるか、または（２）塩が約５０ｍＭより高い濃度で存在する場合、調製品のｐＨ値が、約３から約９の範囲であるような塩を含む。接触させるステップの最終操作条件は、調製品中に過剰塩が無いことまたは調製品中の２０ｍＭ以下の非ゼロ塩濃度のいずれか、および約５からＩｇＧ抗体の最もアルカリ性のグリコフォームの等電点の約０．５ｐＨ単位以内の範囲のｐＨ値によって定義される。
【０００９】
特定の実施形態において、調製品は、調製品におけるクロマチンの量が、調製品が得られる原料源試料中に存在していたクロマチンの量の約５％未満であるように減少したレベルのクロマチンを有する形態の方法のために提供される。特定の態様において、原料源試料は、存在するクロマチンの実質的な量を有する細胞培養採取物、組織試料、または体液でありかつ原料源試料は、本発明の方法において使用するための原料源試料のクロマチンの約５％未満を有する調製を取得するために浄化、精製または分別するための１つまたは複数のプロセスを受ける。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の特定の態様に関してＩｇＧ抗体を含有する調製品の精製のレベルにおける驚くべき改善が、クロマチンを対象とする浄化後の抗体を保持するのに十分な多孔性を有する荷電膜を用いる分別プロセスの性能で達成可能であることが発見されている。したがって特定の態様において本発明の精製方法は、調製品が、その元の原料源と比較するとクロマチンのレベルにおいて実質的な減少をもたらした１つのプロセスまたは複数のプロセスによって得られたものであるＩｇＧ抗体を含有する調整品を対象とする。例えば、特定の実施形態において所望のＩｇＧ抗体を提供する元の原料源試料は、細胞培養採取物、体液または組織試料でありかつ元の原料源試料は、クロマチンレベルの実質的な減少のためのステップを受け、特定のこうした実施形態において元の原料源試料のクロマチンレベルは、本発明の方法のために提供された調製品が、原料源試料中に元々存在するクロマチンの５％未満であるように９５％を超えて減少する。クロマチン減少のレベルは、元の原料源試料および本発明の方法において提供された調製品におけるレベルを参照して評価してよい。クロマチン減少のレベルは、ヒストンタンパク質のレベルおよび／またはＤＮＡのレベルを参照して評価してよい。特定の実施形態において、調製品中のクロマチンレベルは、元の原料源試料またはそれから調製品が最終的に導かれた培地におけるクロマチンのレベルより少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％減少する。調製品を調製することにおいて複数ステップが行われる特定の実施形態においてクロマチンレベルの減少の測定は、調製品を取得する直前に最後から２番目の試料との比較とは対照的に調製または精製の全てのステップに先立って元の試料における量に関して行われる。
【００１１】
特定の態様において、本発明は、抗体および汚染物質を含有する調製品からＩｇＧ抗体を精製する方法を提供する。方法には、調製品を選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも５０％を保持するが選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質の通過を許しかつ選択されたサイズが約１０ｎｍから約１５ｎｍの間の任意の量であってよい多孔性を有する電気陽性の膜と接触させるステップが含まれる。接触させるステップの少なくとも一部の間に調製品は、（１）塩が約５０ｍＭ未満の濃度で存在する場合、調製品のｐＨ値が、約３から調製品におけるＩｇＧ抗体の最もアルカリ性のグリコフォームの等電点の約０．５ｐＨ単位以内の範囲であるか、または（２）塩が約５０ｍＭより高い濃度で存在する場合、調製品のｐＨ値が、約３から約９の範囲であるような塩を含む。接触させるステップの最終操作条件は、調製品中に過剰塩が無いことまたは調製品中の２０ｍＭ以下の非ゼロ塩濃度のいずれか、および約５からＩｇＧ抗体の最もアルカリ性のグリコフォームの等電点の約０．５ｐＨ単位以内の範囲のｐＨ値によって定義される。
【００１２】
特定の実施形態において、調製品は、調製品におけるクロマチンの量が、調製品が得られる原料源試料中に存在していたクロマチンの量の約５％未満であるように減少したレベルのクロマチンを有する形態の方法のために提供される。特定の態様において、原料源試料は、存在するクロマチンの実質的な量を有する細胞培養採取物、組織試料、または体液でありかつ原料源試料は、本発明の方法において使用するための原料源試料のクロマチンの約５％未満を有する調製品を取得するために浄化、精製または分別の１つまたは複数のプロセスを受ける。
【００１３】
特定の態様において、本明細書において開示された実施形態は、選択されたサイズより大きい流体力学直径を有する非吸着溶質の少なくとも最低限の割合が、サイズに基づいて保持されるが、選択されたサイズ未満の流体力学直径を有する非吸着溶質は、膜を通り抜けることを許されるように選択された多孔性を有する電気陽性の膜を提供する。特定の実施形態において、最低限の割合は、５０％から１００％の間の任意の量であってよく、特定のこうした実施形態において最低限の割合は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％である。これらの実施形態のいずれかにおいて、選択されたサイズは、約１０ｎｍから１５ｎｍの間の任意の量であってよく、特定のこうした実施形態において選択されたサイズは、約１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、または１５ｎｍであってよい。特定の実施形態において、電気陽性の膜の多孔性は、調製品から精製される所望のＩｇＧ抗体の全てまたは実質的に全てが保持されるように選択してよい。
【００１４】
一部の態様において、本発明の実施形態は、電気陽性の膜が、約３ｎｍから約６ｎｍの平均細孔径を有すると特徴付けられる多孔性を有する本明細書に述べられるような方法を提供する。特定のこうした実施形態において電気陽性の膜の平均細孔径は、約６ｎｍ、または約５ｎｍ、または約４ｎｍ、または約３ｎｍであろう。一部の態様において、本発明の実施形態は、電気陽性の膜が、約９ｎｍ以下、または約８ｎｍ以下、または約７ｎｍ以下、または約６ｎｍ以下、または約５ｎｍ以下の最大細孔径を有すると特徴付けられる多孔性を有する本明細書に述べられるような方法を提供する。それらの最長寸法に従って測定されるような、ＩｇＧ抗体の流体力学直径は、局所条件に応じた一部のばらつきを伴って約１０〜１５ｎｍである傾向がある。抗体の柔軟性およびそれらのサイズのばらつきを考慮すれば、抗体を保持するための細孔径の選択は典型的には、当該の抗体の流体力学直径よりもはっきりと感知できるほど小さい細孔径を必要とする。例えば、約９ｎｍの最大細孔径は、より大きいＩｇＧの実質的に全てを保持する可能性があるのに対して一部のより小さいまたはより柔軟なＩｇＧは、約５ｎｍなどのより小さい最大細孔径を必要とし得る。さらに、膜における細孔径は、平均細孔径が最大細孔径よりもはっきりと感知できるほど小さいような分布を有することが期待され得る。例えば、約９ｎｍの最大細孔径を有する膜は、６ｎｍの平均細孔径を有してよく、同様に、約５ｎｍの最大細孔径を有する膜は、３ｎｍの平均細孔径を有してよい。
【００１５】
一部の態様において、本発明の実施形態は、最終操作条件が当てはまる場合以外の接触させるステップの一部の間、調製の条件が、塩がないことまたは飽和までの非ゼロ濃度の塩の存在のいずれかによって特徴付けられる方法を提供する。こうした実施形態の幾つかにおいて、塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、およびそれらの組み合わせである。特定の実施形態において、接触させるステップの一部の間またはこれに先立って、調製品は、本明細書においてさらに述べられるようなある種の塩濃度にさらされる。
【００１６】
特定の実施形態において、緩衝液交換は、電気陽性の膜と接触させるステップの一部の間に実行される。特定のこうした実施形態において電気陽性の膜は、タンジェンシャルフローろ過装置内に収納されかつＩｇＧ抗体は、接触させるステップの少なくとも一部の間にタンジェンシャルフローろ過装置の濃縮水中に濃縮される。
【００１７】
一部の態様において、本発明の実施形態は、原料源試料中に存在するクロマチンの少なくとも９５％から調製品を分離することによって元の原料源試料から調製品を取得する追加のステップを含む方法を提供する。こうした実施形態の幾つかにおいて、原料源試料は、細胞培養採取物、体液、または組織抽出物あるいは幾つかの精製または処理にかけられたこうした材料である。特定の実施形態において、調製品は、分別を含めたプロセスによって原料源試料から取得される。特定のこうした実施形態において、分別は、原料源試料またはそこから導かれた試料のアラントインおよびカプリル酸とのインキュベーションの後に続く。特定のこうした実施形態において、調製品は、分別プロセスからの再可溶化されたＩｇＧを含む。
【００１８】
一部の態様において、本発明の実施形態は、調製品がウイルスを不活性化する１種または複数の薬剤を含有する方法を提供する。特定のこうした実施形態において、ウイルス不活性化剤は、エタクリジン、メチレンブルー、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、リン酸トリ（ｎ−ブチル）、およびそれらの組み合わせのいずれかであってよい。特定のこうした実施形態において、ウイルス不活性化剤は、それぞれ約０．１％以下の濃度で存在する。
【００１９】
一部の態様において、本発明の実施形態は、電気陽性の膜が、調製品に接触する膜の表面にそれらが位置できるように膜の構造にまたは内部に共有結合で固定化された複数の正に帯電した窒素を含有する部分を有する方法を提供する。特定のこうした実施形態において、正に帯電した窒素を含有する部分は、（１）第一級アミン、（２）第二級アミン、（３）第三級アミン、（４）第四級アミン、（５）ポリアミン、（６）イミン、（７）Ｎ−複素環、（８）アミノ酸、（９）Ｎ−ヒドロキシアミド、（１０）アリールアミン、それらのポリマーおよびそれらの組み合わせのいずれかである。特定のこうした実施形態において、正に帯電した窒素を含有する部分は、金属イオンにも結合する。特定のこうした実施形態において、正に帯電した窒素を含有する部分は、アルキルまたはアリール組成物の１つまたは複数の疎水性の部分も含んでいてよい。
【００２０】
一部の態様において、本発明の実施形態は、正に帯電した窒素を含有する部分が、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、デフェロキサミン（デスフェリオキサミン（ｄｅｓｆｅｒｉｏｘａｍｉｎｅ））、アルギニン、ヒスチジン、ヒスタミン、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
【００２１】
一部の態様において、本発明の実施形態は、正に帯電した窒素を含有する部分が、それぞれ式Ｉ：
【化１】
2017507938.tif 000002
に記載の通りである方法を提供する（式中、Ｒ基のうちの少なくとも１つが、場合によってはリンカーを介する、電気陽性の膜への付着物の部位であり、かつＸ、Ｙ、およびＺのそれぞれが、独立に（ＣＨ２）ｎであり（式中、ｎは２から８の整数である）かつＣＨ２基が、場合によってはＯ、またはＮＨによって置き換えられていてよいという条件で、Ｒのそれぞれの出現は、独立に水素またはＣ１〜Ｃ１０アルキルあるいはヒドロキシル、アミノ、もしくはハロ部分で置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキルである）。特定のこうした実施形態において、Ｒ基のうちの少なくとも１つが、場合によってはリンカーを介する、電気陽性の膜への付着物の部位であるという条件で、Ｒのそれぞれの出現は、独立に水素またはＣ３〜Ｃ８アルキルである。特定のこうした実施形態において、それぞれのｎは、２から６の整数である。特定のこうした実施形態において、正に帯電した窒素を含有するトリス（２−アミノエチル）アミンである。
【００２２】
一部の態様において、本発明の実施形態は、膜表面上に二価または三価の第一級アミノ化合物を固定化すること、次いで遊離アミノ基を活性化することおよび二価または三価のアミノ化合物の別の層を付加すること、ならびに場合によってはプロセスを繰り返すことにより調製されたグラフト化されたデンドリマーの形態（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍ）で存在する正に帯電した窒素を含有する部分を含む方法を提供する。
【００２３】
一部の態様において、本発明の実施形態は、電気陽性の膜が、タンジェンシャルフローろ過を支持するためにデバイス内に収納されかつ接触させるステップの少なくとも一部が、タンジェンシャルフローろ過モードで行われる方法を提供する。特定のこうした実施形態において、接触させるステップは、電気陽性の膜を用いてＴＦＦによって実行される。
【００２４】
一部の態様において、本発明の実施形態は、本明細書において開示された方法のいずれかを実施するキットを提供する。特定のこうした実施形態において、キットは、クロマチン含有量を減少するために選択された浄化成分などの、調製品を取得するために原料源試料を浄化するための成分も含む。
【００２５】
本発明の特定の態様に関して、陰イオン交換クロマトグラフィーの機能性を妨げる緩衝液に内在する試料に陰イオン交換クロマトグラフィーを試みることは、１０〜５０ｋＤａの球状タンパク質に対応するサイズの細孔を備えた正に帯電した膜を採用すること、膜を高濃度の塩に内在する抗体を含有する溶液と接触させること、次いで元の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーの実行に適した第２の溶液で置き換えることによって有用になり得ることが発見されている。いかなる特定の理論にも帰するものではないが、プロセスは、１ＭのＮａＣｌ中のＩｇＧなどの、高塩濃度試料が膜に導入される場合、ＩｇＧは保持されるが細孔より小さい塩および汚染種は膜を通って流れる、という様式で働くと考えられている。これらには、高塩濃度が、正に帯電した膜からの静電反発力によってアルカリ性の汚染物質の保持力を妨げること、および酸性の汚染物質の正に帯電した膜への静電結合を妨げることの特定の効果を有する、小さい電気的中性、アルカリ性、および酸性の汚染物質が含まれる。これは、そうしないと陰イオン交換法の一般的な問題である、酸性の汚染物質の大部分が正に帯電した表面を汚染することを妨げる。さらなる清浄な高塩濃度緩衝液は、細孔を通る小さい汚染物質を完全に洗浄する。高塩濃度緩衝液は、次いで中性から弱アルカリ性のｐＨの低塩または無塩緩衝液で置き換えられ、かつ存在する場合はウイルス粒子などの、細孔によって保持されるのに十分大きい残留しているいかなる酸性の汚染物質も膜上の荷電基に結合する。ウイルスが結合部位のために酸性のタンパク質と競合しなければならず、その結合および除去がより効率的ではない結果を伴う、従来の陰イオン交換クロマトグラフィー法と対照的に、小さい酸性の汚染物質の結合が高塩濃度によって最初に妨げられかつ小さい汚染物質が細孔によって排除されたので、膜の全電荷容量が、ウイルス結合のために利用可能である。小さいアルカリ性の汚染物質の保持力が、それらの膜表面からの静電反発力を妨げる高塩濃度によって妨げられたので、この汚染物質の部分集団も除去される。この性能の特色の組み合わせを提供する陰イオン交換法は他に無い。
【００２６】
有利には、本明細書において開示された方法は、高い塩濃度を含有する試料の容量制限を受けない。従来型の陰イオン交換法が非常に大容量を許容し得る一方で、これらは塩濃度が低からゼロの場合にのみ実行可能である。したがって、例えば、一部の実施形態では本明細書において開示された方法における試料容量は、高い塩濃度においてさえ膜の示された容量より実質的に大きくてよい。
【００２７】
開示された方法は、静電相互作用および水素結合などの非特異的な化学力によって抗体または膜のいずれかに最初に結合し得る汚染物質を解離させるために特別に設計された中間緩衝液配合物で試料を洗ってよく、膜細孔を通る解離した汚染物質を除去することを可能にする、他の陰イオン交換法とは関連しない追加の有利な条件も提供する。以下の実施形態は、方法の特有の能力に重点を置く。ＩｇＧが、２Ｍの硫酸アンモニウム沈殿における沈殿によって最初に分別される。抗体が沈殿し、大部分の汚染物質が上清と共に除去される。ＩｇＧが、例えば水の追加によって、アンモニウム濃度を１Ｍに減少することによって再可溶化される。この場合ＩｇＧにはさらなる精製が必要であるが、ＩｇＧはこうした高塩濃度緩衝液内にあるので、通常の選択であろう、陰イオン交換クロマトグラフィーとは折り合いが悪い。１つの選択肢は、別々の緩衝液交換ステップを行うことであろうが、これは費用が掛かりかつ産生物が損失する原因となる。開示された方法では、高塩濃度試料は、５０ｋＤａの推定球状タンパク質に対応する平均細孔径を有する電気陽性の膜を備えたタンジェンシャルフローろ過装置に導入される。ＩｇＧは保持されたままであるが、高塩濃度は上記で述べた通りの静電相互作用を大部分停止させかつ電荷にかかわりなく小さい汚染物質の除去を可能にする。高塩濃度緩衝液は、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．２などの低塩濃度緩衝液で置き換えられる。いかなる残留している酸性の汚染物質も電気陽性の膜表面に結合するが、ＩｇＧは結合しない。ＩｇＧは、必要に応じて、濃縮してよく、かつ必要に応じて、さらなる処理のために回収してよい。
【００２８】
一部の態様において、本明細書において開示された実施形態は、後続の陰イオン交換クロマトグラフィーの従来の技術による精製のためには高すぎる塩濃度および／またはｐＨ値を有する溶液に内在するＩｇＧ抗体を精製する方法に関する。これは、溶液を約１０〜５０ｋＤａの球状タンパク質に対応するサイズの細孔を有する正に帯電した（陰イオン交換）膜と接触させること、次いで緩衝液を陰イオン交換クロマトグラフィーの方法を実施するのに適した物に交換することにより達成され、その結果残留している酸性の汚染物質が膜上の正に帯電した部分に結合し、後続のスタンドアロンの陰イオン交換クロマトグラフィーステップを不要にする効果がある。一部の実施形態において、中間ステップは、試料が酸性の汚染物質が膜上の正電荷に結合することを可能にするのに適した条件に緩衝液交換される前に、元の溶液が、ＩｇＧ汚染物質間、または汚染物質と膜との間の非特異的な相互作用を解離することを意図した成分を含有する緩衝液に緩衝液交換される場合に実行してよい。一部の実施形態において、元の抗体を含有する試料は、塩沈殿の技術によって前に分別されている、またはクロマトグラフィーステップから高塩濃度で溶離されている、または塩が加えられている結果として高濃度の塩に内在し得る。
【００２９】
一部の態様において、本明細書において開示された実施形態は、例えば一実施形態において混合物を形成するための８から１０個の炭素原子を有する少なくとも１種の脂肪酸との接触、混合物を、１種または複数の固体であって、カチオン性官能基ならびに金属結合官能基が（１）ポリアミン、（２）イミン、（３）Ｎ−複素環、（４）アミノ酸、（５）Ｎ−ヒドロキシアミド、（６）、アリールアミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される窒素を含有する部分を含む、金属結合官能基を含む１種または複数の固体と接触させて混合物を形成すること、ならびに混合物を１種または複数の固体と接触させた後に固形物を分離してＩｇＧ抗体を含む溶液を提供することによって、特にクロマチンを除去する方法によって浄化されたＩｇＧを含有する細胞培養採取物に関する。
【００３０】
一部の態様において、本明細書において開示された実施形態は、具体的にはクロマチンを除去し、その後にＩｇＧを含有する溶液を約５０ｋＤａの推定球状タンパク質に対応するサイズの細孔を有する正に帯電した膜と接触させること、および場合によっては緩衝液を非特異的な化学相互作用を弱めるまたは停止するように設計された配合物に交換すること、次いで緩衝液を、その後に精製された抗体が回収される、フロースルーモードの陰イオン交換クロマトグラフィーの方法を実行するために適すると一般的に考えられている配合物に交換することが続く浄化法を含むＩｇＧ抗体を精製するための方法に関する。抗体は、必要に応じて他の方法によってさらに精製してよい。
【００３１】
一部の態様において、本明細書において開示された実施形態は、具体的にはクロマチンを除去し、その後に塩沈殿ステップが続き、その後に高塩濃度のＩｇＧを含有する溶液を約５０ｋＤａの推定球状タンパク質に対応するサイズの細孔を有する正に帯電した膜と接触させること、および次いで緩衝液を、その後に精製された抗体が回収される、フロースルーモードの陰イオン交換クロマトグラフィーの方法を実行するために適した配合物に交換することが続く浄化法を含むＩｇＧ抗体を精製するための方法に関する。
【００３２】
一部の実施形態において、開示された方法は、驚いたことに具体的にはクロマチンを除去し、その後試料が正に帯電した膜と接触する前に塩が試料に加えられるか、または緩衝液が陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するために適した緩衝液に最終的に交換されるより前の中間ステップの間に元の試料が高塩濃度に緩衝液交換される開示された方法が続く浄化法からなるプロセスから治療用グレードの抗体の精製を可能にする。開示された方法の完了後、必要な場合は、所望の精製度を得るために、試料を他の方法によって処理してよい。
【００３３】
一部の実施形態において、開示された方法は驚いたことに、具体的にはクロマチンを除去し、その後に高塩濃度を含有する再可溶化された上清が開示された方法に直接適用される、塩媒介ＩｇＧ沈殿の方法が続く浄化法からなるプロセスから治療グレードの抗体の精製を可能にする。この中核は、任意のカラムクロマトグラフィーステップの必要が無い、および具体的には固定化されたプロテインＡでのバイオアフィニティークロマトグラフィーからなるカラムクロマトグラフィーステップが無い全体プロセスを提供するために最終配合物へのウイルス不活化、ウイルスろ過、および限外ろ過と組み合わせてよい。
【００３４】
一部の実施形態において、開示された方法は驚いたことに、具体的にはクロマチンを除去し、その後に高塩濃度を含有するＩｇＧが開示された方法に直接適用される、陽イオン交換クロマトグラフィー、または疎水性の陽イオン交換体を用いるマルチモードクロマトグラフィー、または陽イオン交換および金属アフィニティー官能性を併用するマルチモードクロマトグラフィーなどの、溶離されたＩｇＧ画分が高塩濃度において存在するクロマトグラフィー法が続く浄化法からなるプロセスから治療グレードの抗体の精製を可能にする。この中核は、固定化されたプロテインＡでのバイオアフィニティークロマトグラフィーからなるカラムクロマトグラフィーステップの必要が無い全体プロセスを提供するために最終配合物へのウイルス不活化、ウイルスろ過、および限外ろ過と組み合わせてよい。
【００３５】
一部の実施形態において、開示された方法は、全体として精製プロセスの有効性を増加するために補助的な電気陽性のデバイスと組み合わせてよい。例えば、モノリスにおける質量移行は、より制御されかつ膜よりも高度の汚染物質除去効率を支持し得るので、方法の完了時に抗体を単に回収する代わりに、抗体を補助的な陰イオン交換モノリスを通してポンプ送出してよい。モノリスは、全体的な結果を向上させ得るデバイスの任意の他の種類、例えば異なる固定化された電気陽性の種、または正に帯電した粒子で充填されたカラムを備えた膜デバイスと交換してよい。
【００３６】
一部の実施形態において、膜上の正に帯電した基には、少なくとも１種の窒素を含有する化合物が含まれていてよい。一部のこうした実施形態において、少なくとも１種の窒素を含有する化合物は、金属イオンに結合する能力を具体化し得る。一部のこうした実施形態において、少なくとも１種の窒素を含有する化合物は、正に帯電していてよくかつ特に、ＴＲＥＮ、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン（デスフェリオキサミン）、アルギニン、ヒスチジン、ヒスタミン、およびイミダゾールを含む群からの１種または複数の化合物が含まれ得る。
【００３７】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、膜上の正に帯電した基は、式Ｉ
【化２】
2017507938.tif 000003
の化合物である（式中、Ｒのそれぞれの出現は、少なくとも１つのＲが、場合によってはリンカーを介する、固体担体への付着物の部位であるという条件で、独立に水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、かつＸ、Ｙ、およびＺのそれぞれが、独立に（ＣＨ２）ｎであり（式中、ｎは、２から６の整数である）、ＣＨ２基は、場合によってはＯ、またはＮＨによって置き換えられる））。１つのこうした実施形態において、金属結合官能基は、トリス（２−アミノエチル）アミン、ＴＲＥＮであるカチオン性キレート剤である。他の実施形態において、式Ｉに従って、任意の近いＴＲＥＮ類似体は、本明細書において開示された方法において用いてよい。非常に多くの市販されている化合物が式Ｉに含まれかつ他の合成設計された化合物が当業者によって日常的に用いられている方法により容易に調製され得る。例えば、式Ｉの第三級アミンは、逐次還元的アミノ化反応によって第一級アミンから調製され得る。
【００３８】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、正電荷のデンドリマーの層は、例えば還元的アミノ化によって、既存の層を連続的に活性化すること、次いで多価のアミノ種を導入すること、非結合過剰分を洗い流すこと、次いでその表面を再び活性化することなどによって膜表面上に構成される。例えばＴＲＥＮの場合は、ＴＲＥＮの最初の層は、膜に共有結合で付着して過剰分が洗い流される。結合したＴＲＥＮは、次いで活性化され、活性化剤が除去されて、新しいＴＲＥＮが導入され、最初に固定化されたＴＲＥＮの末端における反応性のアミノ基へＴＲＥＮ分子を付加する効果、電荷電場の深度を本質的に倍加する効果、および正に帯電した基の数を３倍化する効果を伴う。非結合ＴＲＥＮを洗い流した後、追加の層を加えてよい。
【００３９】
ＴＲＥＮで官能化された膜を用いる１つの例示的な実施形態において、ＴＲＥＮは、１つの末端基によって共有結合で膜に付着し、２個の第一級アミン窒素原子、１個の第二級アミン窒素原子、１個の第三級アミン窒素、５個の末端水素原子、および３個の疎水性エチル基を有する種を生成する。別のこうした実施形態において、ＴＲＥＮは、２つの末端基によって共有結合で固体に付着し、１個の第一級アミン窒素原子、２個の第二級アミン窒素原子、１個の第三級アミン窒素原子、４個の末端水素原子、および３個のエチル基を有する種を生成する。別のこうした実施形態において、ＴＲＥＮは、３つの末端基によって共有結合で固体に付着し、３個の第二級アミン窒素原子、１個の第三級アミン窒素原子、３個の末端水素原子、および３個のエチル基を有する種を生成する。一実施形態において、共有結合で固定化されたＴＲＥＮは、これらのまたは他の形態の任意の組み合わせまたは部分セットにおいて存在してよい。
【００４０】
電気陽性の種が膜上に固定化される１つまたは複数の先行の実施形態において、ＴＲＥＮ以外の種は、これに限らないが１，３−ジアミノ−２−プロパノール、２−アミノ−１，３−プロパンジオール、エタノールアミン、１−アミノ−４−グアニドブタン（１−Ａｍｉｎｏ−４−ｇｕａｎｉｄｏｂｕｔａｎｅ）、アンモニア、１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、ビス（トリス）ペンタン、１，２−ジアミノエタン、トリメチルアミン、ビス（３−アミノプロピル）アミン、４−アミノ−４−（３−ヒドキシプロピル）−１，７−ヘプタンジオール、１，３−ジアミノプロパン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、１，２−ジアミノエタン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ−（３−アミノプロピル）ジエタノールアミン、エタノールアミン、Ｎ−ブチルアミン、１，３−ジアミノペンタン、２−（２−アミノエトキシ）エタノール、ポリエチレンイミン（ＭＷ：２０００）、ポリアリルアミン、ポリベンザリルアミン、ポリリジン、ポリアルギニン、１−アミノ−１−デオキシ−ｄ−ソルビトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、ペンタエチレンヘキサアミン、トリエタノールアミン、１，３−ジアミノ−２，２−ジメチルプロパン、３−メチルアミノ−１，２−プロパンジオール、２−アミノ−エタンチオール、ジアリルアミン、ジエチレントリアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、１，５−ジアミノペンタン、４−アミノ−４−（３−ヒドキシプロピル）−１，７−ヘプタンジオール、１，４−ジアミノブタン、トリメチルアミン、ジエチルトリアミン、６−アミノ−１−ヘキサノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、２−（メチルアミノ）エタノール、メチオニノール、４−アミノ−１−ブタノール、およびヒドラジン、またはそれらの組み合わせを含めた幾つかの特定の例を伴う、１種または複数の第一級アミン、１種または複数の第二級アミン、１種または複数の第三級アミン、あるいは１種または複数の第四級アミンを含んでいてよい。
【００４１】
１つまたは複数の実施形態において、膜上に固定化された正に帯電した種は、これに限定されないがトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、ＴＲＥＮデンドリマー、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア）、デフェロキサミン、アルギニン、ヒスチジン、ヒスタミン、イミダゾール、リン酸アミノエチル、リン酸アミノフェニル、またはそれらの組み合わせが含まれ得る高程度の金属アフィニティーを特に具体化し得る。
【００４２】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、正に帯電した種のうちの２種以上の種が、膜上に固定化されていてよい。先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、正に帯電した種は、正に帯電していない種と組み合わせて膜上に固定化されていてよい。１つのこうした実施形態において、追加の種は、水素結合、疎水性相互作用、金属アフィニティー相互作用、ファンデルワールス相互作用、または試料成分の正に帯電した特色による静電相互作用において連結する強化された能力を与え得る。正に帯電した種以外の種の包含は、膜の電気陽性度を中性化する正味の効果は有さず、膜は固定化された異なる化学的性質の種の存在にかかわらず選択された適用条件下で電気陽性に留まるであろう。一般的に、非電気陽性の種は、開示された方法を実施することによって除去され得る汚染物質成分の質量または多様性を増加する目的のために膜上に固定化してよい。
【００４３】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、膜の細孔径分布は、かなりの割合のＩｇＧの通過を物理的に妨げるが、５０ｋＤａの質量、または１０ｋＤａ以下までの、それより低い質量を有する推定球状タンパク質に対応するサイズの溶解した種の通過は許す。
【００４４】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、膜の基本材料は、セルロースなどの天然ポリマー、あるいはポリエーテルスルホン、ポリアミド、または膜を合成するために適する他の材料などの合成材料である。
【００４５】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、膜の物理的構成は、平面状シート、または渦巻きシート、または中空繊維、または他の物理的構成の形態である。
【００４６】
先行の実施形態の全てにおいて、条件は、ＩｇＧを含有する溶液の正に帯電した膜との接触の間のある時点における陰イオン交換クロマトグラフィーの実行のためには不適切である。陰イオン交換のために適した条件は、一般には汚染物質の大部分が結合しかつＩｇＧの大部分が結合しない条件を指すと理解される。ヒト、ヒト化、またはキメラのＩｇＧ１に関して、陰イオン交換を実施するために適すると考えられている条件には、低伝導率およびｐＨの弱酸性から弱アルカリ性の範囲が含まれるであろう。陰イオン交換を実施するために不適切と考えられている条件には、酸性の汚染物質の結合を不必要に妨げる、またはＩｇＧの結合を不必要に生じさせる条件が含まれると理解される。ヒト、ヒト化、またはキメラのＩｇＧ１に関して、陰イオン交換を実施するために不適切と考えられている塩濃度は、任意の中間値を含み、かつ上限値が無く、１ｍＳ／ｃｍより高いおよび潜在的に１００ｍＳ／ｃｍより高い伝導率を有するであろう。こうした抗体に関して、陰イオン交換を実施するために不適切と考えられているｐＨは、その等電点の約０．５ｐＨ単位下よりも高いｐＨ、またはその等電点の１単位下よりも低いｐＨであろう。開示された方法の特定の利益のうちの１つは、方法が陰イオン交換のために適切な条件に非常に近い条件を許容するのと同じくらい効果的に陰イオン交換のための通常の制限をはるかに超える条件を許容するので適用される試料の塩濃度もｐＨも慎重に選択される必要も高度に定義される必要さえも無いことである。開示された方法の驚くべき特色の１つは、方法が添加剤の包含が静電相互作用、非特異的な相互作用、またはウイルスの不活化を増強する添加剤の包含さえ妨げることを許すので陰イオン交換クロマトグラフィーの典型的な範囲をはるかにを越える条件から利益を受け得ることである。
【００４７】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、正に帯電した膜と接触した元の試料の条件は、結合溶離、フロースルー、またはＨＰＴＦＦのその従来のモードで陰イオン交換クロマトグラフィーの方法を実施するためには不適切である。
【００４８】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、正に帯電した膜と接触した元の試料の条件は、結合溶離、フロースルー、またはＨＰＴＦＦのその従来のモードで陰イオン交換クロマトグラフィーの方法を実施するのに適するが、条件は、その従来のモードで陰イオン交換クロマトグラフィーの方法を実施するためには不適切な塩濃度および／またはｐＨ値を含めるために開示された方法の間に変更される。
【００４９】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、正に帯電した膜と接触した元の試料の条件は、結合溶離、フロースルー、またはＨＰＴＦＦのその従来のモードで陰イオン交換クロマトグラフィーの方法を実施するのには不適切であり、かつ条件は、その従来のモードで陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するために適した配合物への緩衝液交換によって開示された方法の性能を完了する前に、その従来のモードで陰イオン交換クロマトグラフィーの方法を実施するためには不適切な別の塩濃度および／またはｐＨ値を含めるために開示された方法の間に変更される。
【００５０】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、陰イオン交換の方法の実施するために不適切な条件を作るのに用いられた塩は、塩化ナトリウムまたはカリウムなどのいわゆる中性の塩である。
【００５１】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、陰イオン交換の方法の実施するために不適切な条件を作るのに用いられた塩は、チオシアン酸ナトリウムまたはカリウム、あるいはグアニジン塩酸塩または酢酸塩などのいわゆるカオトロピック塩である。
【００５２】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、陰イオン交換の方法の実施するために不適切な条件を作るのに用いられた塩は、硫酸ナトリウムまたはカリウム、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウムまたはカリウムなどのいわゆるコスモトロピック塩である。
【００５３】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、他の添加剤は、汚染物質と抗体との間および／または汚染物質と正に帯電した膜との間の非特異的な相互作用を解離する明確な目的ために、元の試料緩衝液、または中間緩衝液のいずれかに含まれていてよい。こうした添加剤には、ウレイドなどの非イオン性カオトロープ、例えば尿素またはアラントイン、あるいはアルコールまたはグリコールなどの有機溶媒、あるいは糖、あるいは非イオン性、双性イオン性、またはカチオン性洗浄剤などの界面活性剤が含まれ得る。
【００５４】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、リン酸トリ（ｎ−ブチル）、エタクリジン、塩化ベンザルコニウム、メチレンブルー、またはクロルヘキシジンなどの非イオン性、双性イオン性、またはカチオン性抗ウイルス剤、尿素またはグアニジン、中性塩またはカオトロピック塩などの他の添加剤は、ウイルス含有量を減少する明確な目的ために、元の試料緩衝液、または中間緩衝液のいずれかに含まれていてよい。
【００５５】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、ｐＨを下げること、あるいは抗ウイルス化合物を加えることと共に、またはそれら自体は主要な抗ウイルス剤とはみなされていないがそれにもかかわらずｐＨ処理を強化する能力がある化合物であって、塩化ナトリウム、アルギニン、もしくはアルギニル化合物、もしくはアラントインを含めたこうした化合物を加えることと共にｐＨを下げることなどの条件は、ウイルスを減少する明確な目的ために中間ステップの間に変更されてよい。
【００５６】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、方法は、タンジェンシャルフローろ過を支持するために用いられるデバイスにおいて実行してよい。これは、膜を通り抜ける材料は除去可能でありながら、膜を通り抜けない材料の保持力および再利用を可能にするシステムである。このタイプのシステムは、タンパク質が内在する緩衝液の交換を必然的に伴う、緩衝液交換の技術も支持する。１つのこうした実施形態において、ＴＦＦユニットは、完全に自動化されていてよい。こうした実施形態の幾つかにおいて、プロセスは、任意の規模で、手動で実行してよい。
【００５７】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、方法は、元の高塩濃度試料の体積が最低限にまで引き下げられ、新たな低塩濃度緩衝液で再膨張され、次いで緩衝液が十分に低塩濃度配合物に交換されたと判断されるまで、再び引き下げられるなど、いわゆる閉管膜（ｄｅａｄ−ｅｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）で実施してよい。このプロセスは、任意の規模で実行してよい。
【００５８】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、ＩｇＧを含有する元の試料は、体液、あるいは哺乳類の細胞、酵母、細菌、昆虫細胞、または他の生物産生培地などの細胞培養プロセスからの採取物である。
【００５９】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、ＩｇＧは、モノクローナル、またはポリクローナル、または組み換え、または合成、または酵素由来のいずれかの約１５０から１７０ｋＤａの分子量を有する完全な状態のＩｇＧである。１つまたは複数のこうした実施形態において、抗体は、異なる抗原に対して免疫特異性であるそのそれぞれの抗原結合部位の能力を指す、二官能性であってよい。１つまたは複数のこうした実施形態において、抗体は、通常は抗体と結合しない抗体に官能性を与える化合物と結合し得る。こうした実施形態のうちの１つまたは複数において、追加された官能性は、疾患状態の療法に関連して生物学的プロセスを仲介し得る、あるいは追加された化合物が、蛍光性もしくは有色である、または抗体が結合することが意図され得る抗原担持基質の検出を助ける信号を発生し得る。
【００６０】
先行の実施形態のうちの１つまたは複数において、正に帯電した膜と接触した試料は、具体的には採取物のクロマチン含有量を減少させる処理の適用を通して浄化されているＩｇＧを含有する細胞培養採取物からなる。１つのこうした実施形態において、クロマチン減少処理は、採取物を正に帯電した粒子と接触させることからなる。１つのこうした実施形態において、クロマチン減少処理は、採取物を正に帯電した膜と接触させることからなる。１つのこうした実施形態において、クロマチン減少処理は、採取物を正に帯電した疎水性化合物と接触させることからなり、かつその処理は、試料を正に帯電した膜または正に帯電した粒子と接触させることと組み合わせてよい。１つのこうした実施形態において、クロマチン減少処理は、採取物を脂肪酸の種と接触させることからなってよくかつその処理は、試料を正に帯電した膜または正に帯電した粒子と接触させることと組み合わせてよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、過飽和させる量のアラントインを、元の採取物に加えてよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、固体は、遠心分離、膜ろ過法、あるいは膜またはデプスフィルターが共有結合で固定化された正電荷を含有する場合を含めた、深層ろ過によって除去してよい。
【００６１】
一部の実施形態において、調製品をＩｇＧ抗体の少なくとも５０％を保持するのに十分な多孔性を有する電気陽性の膜と接触させることを含む調製品からＩｇＧ抗体を精製する方法であって、接触させるステップの間に調製品が飽和までの濃度の中性の塩を含み、かつ（１）中性の塩が約５０ｍＭより高い濃度で存在する場合、調製品のｐＨ値が、約３から約９の範囲であるか、または（２）中性の塩が約５０ｍＭ未満の濃度で存在する場合、ｐＨ値が、約３からＩｇＧ抗体の平均等電点の約０．５ｐＨ単位以内の範囲である方法が提供される。
【００６２】
理論に拘束されるものではないが、最初の接触溶液の高塩濃度は、静電相互作用を抑制しかつ膜における細孔の通過によって代わりに排除される、最初の接触溶液における場合によっては大量の酸性の汚染物質による膜の汚染を防止し得る。
【００６３】
接触させるステップにおいて適用された調製品の相対体積は、膜の示された体積等量の約５０％より大きくてよい。本明細書において開示された方法において、相対体積は、理論上無制限に、５０％、１００％、２００％、５００％、１０００％より大きくてもよく、または電気陽性の膜の示された体積等量より大きくてもよい。開示された方法は、膜の示された体積等量の５０％未満の調製品体積にも対応可能であり、かつまだなおより大きい体積の試料を提供する利益の全てを有する。したがって、試料体積は、膜の示された体積等量の約２５％、または１０％、または５％、または１％、またはより少ない非ゼロ体積であってもよい。
【００６４】
最後に、本明細書において開示された方法は、操作条件を、ＩｇＧ抗体の５％より多くが電気陽性の膜に結合する結果をもたらさない最高ｐＨおよび最低塩濃度に調節することをさらに含む。このステップの間に膜細孔を通して排除されていない酸性の汚染物質は、正電荷に結合しかつしたがってＩｇＧ溶液から除去される。塩濃度およびｐＨは、それぞれの抗体に関して異なるので、特定できない。切り捨ては、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％以下またはそれより小さく、さらにゼロに近づいてよい。
【００６５】
一部の実施形態において、方法は、接触させるステップに先立って電気陽性の膜を任意の対象の塩濃度またはｐＨに平衡化させることをさらに含む。一部の実施形態において方法は、接触させるステップに先立って膜を平衡化させないことをさらに含む。
【００６６】
一部の実施形態において、方法は、接触させるステップの後に電気陽性の膜を約５０ｍＭから飽和までの範囲の濃度の中性の塩で洗うことをさらに含む。このステップは、膜の細孔を通る小さい酸性の汚染物質を、それらが膜上の正電荷を汚損する（または能力を消費する）代わりに排除するための方法の能力を向上させ得る。最初の接触溶液が高濃度の塩を含有しない状況において、このステップは、正電荷に結合していてよいこうした汚染物質を遊離させかつ膜における細孔によってそれらを排除し、調製品内にとどまり得る比較的少数の酸性の汚染物質により多くの能力を残す機会を提供する。
【００６７】
一部の実施形態において、方法は、接触させるステップの後の方法の任意のステップにおいて調製品を濃縮することをさらに含んでいてよい。
【００６８】
一部の実施形態において、中性の塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００６９】
一部の実施形態において、接触させるステップより前にＩｇＧ調製品は、汚染物質と、電気陽性の膜と、または両方とのＩｇＧ抗体の非特異的な相互作用を中断させる能力がある１種または複数の薬剤を含む。
【００７０】
一部の実施形態において、洗浄するステップの間の溶液は、汚染物質と、電気陽性の膜と、または両方とのＩｇＧ抗体の非特異的な相互作用を中断させる能力がある１種または複数の薬剤を含む。
【００７１】
一部の実施形態において、１種または複数の薬剤は、グアニジン塩酸塩、グアニジン酢酸塩、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるカオトロピック塩であって、約１Ｍまでの非ゼロ濃度で存在するカオトロピック塩を含む。
【００７２】
一部の実施形態において、１種または複数の薬剤は、非イオン性カオトロープを含む。
【００７３】
一部の実施形態において、非イオン性カオトロープは、約６Ｍまでの非ゼロ濃度で存在する尿素である。
【００７４】
一部の実施形態において、１種または複数の薬剤は、非イオン性、双性イオン性、またはカチオン性の界面活性剤を含む。
【００７５】
一部の実施形態において、１種または複数の薬剤は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される有機溶媒であって、約１０％までの非ゼロ濃度で存在する有機溶媒を含む。
【００７６】
一部の実施形態において、１種または複数の薬剤は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される有機溶媒であって、約２５％までの非ゼロ濃度で存在する有機溶媒を含む。
【００７７】
一部の実施形態において、１種または複数の薬剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＴＲＥＮ、デフェロキサミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるキレート剤であって、５０ｍＭまでの非ゼロ濃度で存在するキレート剤を含む。
【００７８】
一部の実施形態において、１種または複数の薬剤は、非イオン性、双性イオン性、またはカチオン性疎水性の化合物を含む。
【００７９】
一部の実施形態において、１種または複数の薬剤は、エタクリジン、メチレンブルー、クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、リン酸トリ（ｎ−ブチル）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤であって、約０．１％までの非ゼロ濃度で存在する１種または複数の薬剤を含む。
【００８０】
一部の実施形態において、１種または複数の薬剤は、還元剤を含む。
【００８１】
一部の実施形態において、還元剤は、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｉｔｏｌ）、グルタチオン、システイン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、還元剤が約２０ｍＭまでの非ゼロ濃度で存在する。
【００８２】
一部の実施形態において、調製品は、細胞および細片を除去する方法によって浄化された細胞培養採取物である。
【００８３】
一部の実施形態において、調製品は、体液である。
【００８４】
一部の実施形態において、体液は、血清である。
【００８５】
一部の実施形態において、調製品は、クロマトグラフィーカラムからの溶出物である。
【００８６】
一部の実施形態において、調製品は、沈殿プロセスからの再可溶化されたＩｇＧを含む。
【００８７】
一部の実施形態において、電気陽性の膜は、膜材料の表面に共有結合で固定化された正に帯電した窒素を含有する化合物を含む。
【００８８】
一部の実施形態において、正に帯電した窒素を含有する化合物は、（１）第一級アミン、（２）第二級アミン、（３）第三級アミン、（４）第四級アミン（５）ポリアミン、（６）イミン、（７）Ｎ−複素環、（８）アミノ酸、（９）Ｎ−ヒドロキシアミド、（１０）アリールアミン、それらのポリマー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される部分を含む。
【００８９】
一部の実施形態において、正に帯電した窒素を含有する化合物は、金属イオンにさらに結合する。
【００９０】
一部の実施形態において、正に帯電した窒素を含有する化合物は、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、デフェロキサミン（デスフェリオキサミン）、アルギニン、ヒスチジン、ヒスタミン、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００９１】
一部の実施形態において、正に帯電した窒素を含有する化合物は、式Ｉ
【化３】
2017507938.tif 000004
の化合物である
（式中、Ｒのそれぞれの出現は、少なくとも１つのＲが、場合によってはリンカーを介する、固体担体への付着物の部位であるという条件で、独立に水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、かつ
Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立に（ＣＨ２）ｎであり（式中、ｎは２から６の整数である）、ＣＨ２基は、場合によってはＯ、またはＮＨによって置き換えられる）。
【００９２】
一部の実施形態において、正に帯電した窒素を含有する化合物は、トリス（２−アミノエチル）アミンである。
【００９３】
一部の実施形態において、正に帯電した窒素を含有する化合物は、二価または三価の第一級アミノ化合物を膜表面上に固定化すること、次いで遊離アミノ基を活性化することおよび二価または三価のアミノ化合物の別の層を付加すること、ならびに場合によってはプロセスを繰り返すことによって調製されたグラフト化されたデンドリマーの形態で存在する。
【００９４】
一部の実施形態において、正に帯電した窒素を含有する化合物は、アルキルまたはアリール組成物の１つまたは複数の疎水性の部分を含んでいてよい。
【００９５】
一部の実施形態において、電気陽性の膜は、タンジェンシャルフローろ過を支持するためのデバイス内に収納される。
【００９６】
一部の実施形態において、本明細書において開示された方法を実施するためのキットが提供される。こうしたキットは、小規模の精製を実行するため、または大規模の精製に関する仕様を決定するための小規模の実験を行うために適し得る。本明細書において開示された方法の実施形態を実行するための他の物理的形式がある。１つは、遠心分離が、流体に膜を通らせる力を提供する、５０ｍＬ（またはより小さい）遠心管内の垂直に（または少なくとも斜めに）取り付けられたタンジェンシャルフロー（電気陽性）膜を用いるであろう。別の物は、排出口に接続された真空ラインを使用し得る。別の物は、ユニットがクロマトグラフに取り付け可能であるようにそれぞれの端部に圧力取り付け具（ねじ状またはルアーロック）を備えた密閉ユニットであってよい。
【００９７】
一部の実施形態において、キットは、調製品を浄化するための成分をさらに含む。一部のこうした実施形態において、浄化成分は、クロマチン含有量を減少させるために選択される。
【００９８】
以下の語は、本明細書において開示された方法がより容易に理解され得るように定義される。さらなる定義は、発明を実施するための形態の全体を通して記述される。
【００９９】
「ＴＲＥＮ」は、トリス（２−アミノエチル）アミンを指す。この電気陽性の化合物は、金属イオンに対する強い親和力を具体化することが特に知られている。これは、種々の材料に化学的に付加されてＴＲＥＮによって仲介された化学的特性をそれらの材料に与え得る。
【０１００】
「細胞培養」は、本文脈において、ＩｇＧモノクローナル抗体を産生する目的のための、液体培地における細胞の培養法を指す。この目的のために用いられた細胞には、一般にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれるが、他の哺乳類、ならびに非哺乳類の動物細胞、植物、および微生物からの細胞型が含まれ得る。全ての場合において、液体培地は、細胞増殖を助けるために栄養素を含有する。
【０１０１】
「採取物」または「細胞培養採取物」は、一般には細胞培養プロセスの終了時のバイオリアクターの内容物を指す。産生されたＩｇＧに加えて、採取物は当初、細胞、細胞分泌物、および死細胞の放出された内容物、ならびに細胞が当初その中で増殖した栄養培地の内容物を含有する。これらの非抗体成分は、抗体から除去される汚染物質を構成する。具体的には宿主タンパク質およびＤＮＡが含まれるが、ウイルスおよびエンドトキシンも含まれ得る。細胞培養採取物は、抗体の誤って構築された形態または損傷した形態を断片形態で頻繁に含有する。
【０１０２】
「浄化された細胞培養採取物」は、細胞が除去されている採取物を指す。種々の添加剤の使用によって、浄化プロセスは、ある場合にはクロマチンを除去するための特定の能力を有する、細胞以外の汚染物質のかなりの部分セットを除去する能力も有し得る。
【０１０３】
「クロマチン」は、ＤＮＡが、ヌクレオソームの配置の形態のヒストンタンパク質、個別のヌクレオソーム、劣化したヌクレオソーム、ならびに遊離ＤＮＡおよびヒストンとの関連を存続し、ＤＮＡの全てが抗体および他の細胞培養採取物成分との安定した結合においても存在し得る、細胞死時の細胞核から排出されたゲノムＤＮＡを指す。
【０１０４】
「タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）」は、液体が１つまたは複数の多孔質の膜によって閉ざされた空間を通って押し出され、細孔を通り抜けるのに十分小さい分子はろ液内に排除され、かつ細孔によってはじかれるのに十分大きい分子は濃縮水中に留まる膜ろ過の方法を指す。タンジェンシャルフローという名前は具体的には、流れが膜に概ね直交するいわゆる閉管ろ過とは対照的に、液体流の方向が概ね膜に平行であるという事実を指す。
【０１０５】
「透析ろ過」は、細孔は当該の産生物を保持するのに十分小さいがより小さい材料が通り抜けることを許すＴＦＦの方法を指す。元の試料とは異なる組成物の溶液の連続的な導入は、時に緩衝液交換と呼ばれるプロセスにおいて、組成物が入ってくる溶液の組成物に徐々に変わることを可能にする。
【０１０６】
「タンパク質」は、炭素、水素、酸素、窒素、および通常は硫黄を含有しかつ主としてペプチド結合によって連結された１つまたは複数のアミノ酸の鎖から構成される複雑な有機巨大分子の群のいずれかを指す。タンパク質は、天然または組み換え由来であってよい。タンパク質は、グリコシル化、ペグ化、または他の化学的部分と共役などによって非アミノ酸部分で修飾されていてよい。タンパク質の例には、これに限定されないが抗体、凝固因子、酵素、およびペプチドホルモンが含まれる。
【０１０７】
「宿主汚染物質」または「宿主細胞汚染物質」は、その中で当該の産生物が増殖する細胞によって産生された生体分子を指す。この語は、宿主タンパク質および宿主ＤＮＡなどの、宿主汚染物質の種々のクラスを含んでいてよい。
【０１０８】
「宿主タンパク質」または「宿主細胞タンパク質」または「ＨＣＰ」は、その中で当該の産生物が増殖する細胞によって産生されたタンパク質を指す。こうしたタンパク質は、当該の産生物から除去される汚染物質の１つのクラスを表す。
【０１０９】
「抗体」は、ヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組み換え、雑種、突然変異、グラフト化、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生された抗体などの天然または遺伝子改変の形態を含めた、ヒトまたは他の哺乳類の細胞株由来のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ種の免疫グロブリンを指す。抗体は、単一のクローンによって産生されてもよく、この場合それらはモノクローナルと呼ばれ、または２種以上のクローンから産生されてもよく、この場合それらはポリクローナルと呼ばれる。ＩｇＧ抗体は、具体的には免疫グロブリンＧと呼ばれる抗体のクラスを指し、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４としてヒトにおいて、あるいはＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、またはＩｇＧ３としてマウスにおいて、あるいはＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃとしてラットにおいて、サブクラスの１種または混合物としても存在しうる。真核生物宿主において天然にまたは組み換えで産生された抗体は、種々のグリコシル化された形態で存在し得る一方で、非真核生物宿主において産生された抗体は、種々のグリコシル化された形態および非グリコシル化形態で存在し得る。
【０１１０】
「エンドトキシン」は、溶解時に細胞から放出されるグラム陰性細菌の外膜に存在する毒性の熱安定性リポ多糖物質を指す。エンドトキシンは、それらのリン酸およびカルボキシル残基の高い含有量が原因で一般には酸性であってよく、かつリピドＡ領域の脂肪酸含有量が原因で高度に疎水性で有り得る。エンドトキシンは、水素結合の幅広い機会を提供し得る。
【０１１１】
「示された体積等量」は、陰イオン交換等量の表現を指す。この表現は、多くの膜の機能表面が一般には２次元として近似されるのである点において任意であると理解される。しかしながら、それらの容量はそれでもなお、粒子の本体内の内部的にアクセス可能な空間を作り出す細孔の存在に起因して典型的には陰イオン交換相互作用が３次元で起こり得る多孔質粒子陰イオン交換体との比較に基づき、体積等量と関連し得る。これも、３次元性の程度が１つの粒子構造から別の粒子構造まで変化するので任意である。一部の膜も、ある程度の３次元のアクセスを許す形式で存在してよい。陰イオン交換の分野における慣例は、単位体積当たりの容量を表すことであるので、その不正確さにもかかわらず、概念は引き継がれかつ膜に適用されている。実験室規模の膜では、電気陽性の膜の示された体積等量は、膜培地の１ｍＬ当りの選択されたタンパク質またはＤＮＡのｍｇとして与えてよい。工業規模において、示された体積等量は、膜培地の１リットル当たりのｍｇまたはｇで表わしてよい。
【０１１２】
「ポリヌクレオチド」は、鎖内の共有結合した複数のヌクレオチドモノマーから構成されるバイオポリマーを指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。ポリヌクレオチドは、水素結合の形成の高い傾向を有し得る。
【０１１３】
「タンパク質調製品」は、細胞を含有する細胞培養採取物、（実質的に）細胞を含まない細胞培養上清、または精製の段階からの当該のタンパク質を含有する溶液などの、当該のタンパク質を含有する任意の水溶液または主として水溶液を指す。
【０１１４】
「ウイルス」または「ビリオン」は、超顕微鏡的な（概ね直径２０から３００ｎｍ）、代謝的に不活性な、生きている宿主、主に細菌、植物、および動物の細胞内でのみ複製する感染因子を指し、ＲＮＡまたはＤＮＡコア、タンパク膜、および、より複雑な種類では、周囲膜から構成される。
【０１１５】
その操作するステップおよび選択肢、ならびにそれらが生み出すことが期待される効果の認識を持って開示された方法の実施に取り組むことは有用であろう。これらは、以下の仮説の実施例によって例示される。精製されるＩｇＧモノクローナル抗体を含有する哺乳類の細胞培養採取物は、具体的には採取物におけるクロマチンの含有量を減少させる方法によって浄化される。こうした浄化法は、具体的には採取物における大きい汚染種の含有量を減少させる。浄化された採取物は、開示された方法を実施するのに適した正に帯電した膜を備えたタンジェンシャルフローろ過デバイスに導入される。細孔を通り抜けるのに十分小さいサイズの汚染物質は、それによって排除され、一方で抗体は保持される。本ステップの汚染物質除去は、負に帯電した汚染物質と膜上の正電荷との間の引力相互作用を抑制し、かつ正に帯電した汚染物質と膜上の正電荷との間の斥力相互作用も抑制する高塩濃度緩衝液へ試料を緩衝液交換することによって強化され得る。こうした相互作用を抑制することの１つの利益は、膜の電荷容量が粗製試料中のかなり高濃度の酸性の汚染物質によって消費されることを防ぎ、かつそれによって方法の最終段階にまで残り得る、ウイルスまたはＤＮＡなどの、少量の大きい酸性の汚染物質に結合するための膜の容量を維持することである。こうした相互作用を抑制することの別の利益は、高度に電気陽性の汚染物質が、細孔を通り抜けるのに十分小さくあり得るにもかかわらず、膜からの電荷斥力によって保持されることを防ぐことである。高塩濃度を含有することに加えて、緩衝液は、場合によってはＩｇＧと汚染物質との間の非特異的な相互作用、または膜と汚染物質との間の非特異的な相互作用を解離する傾向がある塩の種を含有していてよい。他の添加剤は緩衝液の解離能力の範囲を広げるために含まれていてよく、および／または一連の異なる解離緩衝液を適用してもよい。抗体は、膜の多孔性によって本プロセス全体を通して保持される。方法の高塩濃度許容度は、空隙排除陰イオン交換クロマトグラフィーのカラム技術を除く陰イオン交換クロマトグラフィーの全ての他の形態と比較して開示された方法の有益な相違を際立たせる。方法の膜多孔性および高塩濃度許容度は、高性能タンジェンシャルフローろ過（ＨＰＴＦＦ）として知られる膜陰イオン交換法と比較してその利益および相違を特に際立たせる。ＨＰＴＦＦは、本質的に細孔からの抗体の静電反発力に依存する。ＨＰＴＦＦ供給流は、したがって供給流が導入される前に適切に低伝導率および高ｐＨ条件に平衡させる必要があり、かつプロセスの継続時間の範囲内は維持する必要がある。方法の最終段階は、ＩｇＧを、抗体が実質的に膜上の正電荷に結合することにならない最低伝導率および最高ｐＨを表す所定の終点条件に緩衝液交換することである。この時点で、大きいまたは小さい、但し特にＤＮＡまたはウイルスなどの大きい汚染物質を含めた任意の酸性の汚染物質は、膜上の正電荷に結合するであろう。膜細孔を通り抜けるのに十分小さい酸性の汚染物質を排除するより早期のステップは、大きい酸性の汚染物質を除去することができる最大化された容量を有するであろうことが認識されるであろう。これは、大きい酸性の汚染物質の除去が、固相上の同一正電荷について競合するより小さい酸性の汚染物質による不利益を被り得る、従来の陰イオン交換法と比較した開示された方法の別の利益および相違を際立たせる。精製されたＩｇＧは、次いでユニットから取り出される。
【０１１６】
適切な細孔径分布の正に帯電した膜が市販されるようになるまでの、方法を実施するために必要なステップは、不可欠な多孔性を有するが正電荷が無い市販の培地から膜を調製することになろう。表面の化学的修正は、種々の処理、本明細書で例示の目的のために簡単に説明されているうちの１つによって好都合に達成してよい。ヒドロキシル化された膜は、タンジェンシャルフローろ過カセット内に置かれて１ＭのＮａＯＨで流下で平衡化される。１ＭのＮａＯＨ、１ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム、１００ｍＭのトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、および１００ｍＭのエピクロロヒドリンが次いで導入され膜を通って連続的に再循環している緩衝液と共に５０℃で４時間反応させる。反応溶液を、次いでデバイスから追い出してよく、このとき膜は、開示された方法を実施するために用いてよいＴＲＥＮ残基を担持している。あるいは、必要に応じて、存在するＴＲＥＮ基は、表面上の正電荷の量を増加するためにさらに修飾してもよい。これは、まだＴＦＦユニット内で、５０ｍＭのリン酸ナトリウム中の８％のグルタルアルデヒド、ｐＨ６．４で、膜を洗うことによって達成してよい。グルタルアルデヒド溶液は、次いで５０ｍＭリン酸塩ｐＨ、６．４、すぐ後に５０ｍＭのホウ酸中の１００ｍＭのＴＲＥＮ、ｐＨ９．１ですすがれる。混合物は、２時間インキュベートされ次いで５０ｍＭのリン酸塩、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４で、次いで２０％エタノールですすがれる。本プロセスは、膜表面上の電荷の総量を約２倍にしかつ膜表面から離れるにつれて電荷の総量を２倍に拡大する、第１発生固定化ＴＲＥＮ分子の遊離アミノ末端上に固定化された第２発生ＴＲＥＮ分子を有することが理解される。荷電層の深度およびしたがって膜の単位表面積当りの電荷の総数を増加させるためにグルタルアルデヒド−ＴＲＥＮの並びが複数回繰り返されてよいことは明らかであろう。本明細書において開示された方法を実施するのに適した膜を調製するために、必要に応じて、疎水性、水素結合、金属親和力、パイ−パイ、またはその他などの二次的な相互作用に参加する可能性も具体化する正に帯電した材料を含めた、多くの代替材料および化学的修正の取り組みを用いてよいことは当業者に明らかであろう。
【０１１７】
細胞培養採取物によって例示されたものなどの、本明細書において開示された方法の特定のモノクローナル抗体調製品へのカスタマイズにおける有用な出発点は、クロマチンのＤＮＡ成分、ヌクレオソームなどのクロマチン基礎構造、およびヒストンを含有するヌクレオソーム基礎構造と共に安定な会合を形成する、固体または可溶性いずれかの、具体的には正に帯電した材料を含む処理によって供給流を浄化することである。１つのこうした処理は、採取物を、正に帯電した表面を担持する固体と単に組み合わせることからなり得る。別のこうした処理は、採取物を、正に帯電したポリマーと組み合わせることからなり得る。Ｇａｎら（上述）によって記述された処理は、採取物を、アラントインおよびエタクリジンと組み合わせ、次いで正に帯電した粒子および負に帯電した粒子を加えて可溶性の非抗体存在物を捕捉することに関与する。その取り組みの未発表の変形は、エタクリジンの代わりにメチレンブルーを加えることである。別の未発表の変形は、エタクリジンまたはメチレンブルーのいずれかの代わりに脂肪酸の追加に関与する。これらの場合の全てにおいて、固体は、遠心分離および／または膜もしくは深層形式のいずれかの、ろ過媒体が正電荷を担持し得る、ろ過技術によって除去してよい。前述の例の全てにおいて、処理された試料は、クロマチンが高度に欠乏することになり、これは試料組成物を開示された方法を実施するために特に適した物にするであろう。
【０１１８】
一部の実施形態において、抗体の膜上の正電荷への有意の結合を生じさせない最低伝導率および最高ｐＨを最初に定義することは得策であろう。都合のよい出発点は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０であろう。それに続く実験は、ＩｇＧの正電荷への結合を妨げるためにより低いおよびより高いｐＨ値、ならびにより低い緩衝液濃度、またはさらに、必要に応じて、ＮａＣｌなどの、塩の追加を評価してよい。最大の有用性のｐＨおよび伝導率範囲が特定されたら、最も効果的な汚染物質除去を支持する組み合わせ条件を定義するためにそれらのパラメータの両方が変化する２次元の実験を実行することは一般に得策であろう。最も効果的な条件は、特定された場合、開示された方法の最終ステップのための対象の緩衝液交換終点緩衝液を表すであろう。
【０１１９】
一部の実施形態において、１Ｍの濃度を生成するのに十分なＮａＣｌがＩｇＧを含有する試料に加えられ、次いで試料が、正に帯電した膜を用いて、所望の終点緩衝液まで、タンジェンシャルフロー緩衝液交換によって処理され、その後抗体回収率が測定される簡潔な検定実験を実行することは得策であろう。一般に、元の膜の多孔性が適切であった場合、抗体損失は、５％未満になるはずである。
【０１２０】
一部の実施形態において、試料に内在する汚染物質によって汚損される可能性から膜を保護するために高濃度の塩を正に帯電した膜を収納するＴＦＦデバイスに導入する前の試料中に含めることは得策であろう。
【０１２１】
一部の実施形態において、汚染する物質と抗体との間、または汚染する物質と膜との間、あるいは両方の解離さもなければ安定した解離の明確な目的のために中間緩衝液を適用することは得策であろう。こうした中間緩衝液配合物には、具体的には塩化グアニジニウムもしくは硫酸グアニジニウム、またはチオシアン酸ナトリウムもしくはカリウムなどのいわゆるカオトロピック塩を含めた高濃度の塩、尿素、糖類、界面活性剤、キレート剤、ヒスチジンまたはアルギニンなどのアミノ酸、あるいは必要に応じて他の化合物が含まれ得る。本ステップの潜在的有用性の簡易評価を実行するために都合のよい配合物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのヒスチジン、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０である。
【０１２２】
一部の実施形態において、方法をプロセスにおける早期に高濃度の産生物、および一般にはクロマチンを対象とした方法によって浄化された細胞培養採取物または部分的に精製された材料に方法を実施することによるであろう汚染物質減少のレベルではないが、それでもなお汚染物質含有量の実質的な減少を作り出すために用いてもよい場合に、遠心分離および／または膜ろ過などの、物理的手段のみによって浄化された細胞培養採取物に方法を実施することは適切であり得る。
【０１２３】
流速、膜表面積、膜間差圧、体積、および他の基本的操作パラメータの問題は、タンジェンシャルフローろ過の分野から良く知られておりかつその実践的知識は、変更無しで直接適用してよい。
【０１２４】
一部の実施形態において、全体としての系内の個々の要素によって明らかになる影響の程度はそれらの独立した挙動によって予見できないので、開示された要素の全てが存在する本明細書において開示された方法を実行することは、有利で有り得る。本明細書において開示された方法の実施において、方法の単一の要素は、任意の特定の対象とするＩｇＧ抗体のための最新式の取り組みを提供するために連続的に除外してよい。一部の実施形態において、当技術分野において既知のような、実験計画法（ＤｏＥ）などの統計的技術は、特定のＩｇＧ精製のために設計された、本明細書において開示された方法の実施形態の減少した数の選択を特定する手段を提供し得る。
【０１２５】
方法は、特定のプロセス設計または設計者の必要にしたがって、複数ステップの精製プロセスにおける任意の好都合な点に位置してよいことは当業者に明らかであろう。したがって、方法は、細胞培養浄化の直後に続いてよく、プロセスにおける最終分別ステップとして適用してよく、またはプロセスにおける任意の中間点において適用してよい。
【０１２６】
以下の実施例は、一般的であり、例示のみのためと理解され、かつ任意のやり方に限定するものとして解釈すべきでない。
【実施例】
【０１２７】
実施例１。開示された方法を実施するための電気陽性の膜の調製。電気陽性の膜を、国際特許国際公開第２００１８７９２（Ａ２）号、図２Ａに記載のようにｖａｎ  Ｒｅｉｓの方法に従って調製した。簡単に言えば、３０ｋＤａのセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  １４４５９−７６−Ｄ）を、２Ｍの３−ブロモプロピルトリメチル臭化アンモニウムと室温で一晩反応させた。ｖａｎ  Ｒｅｉｓと異なり、膜を、次いで１ＭのＮａＣｌ、次いで水で洗い、残余反応物および反応副生物を除去した。第四級アミノ基の固型化を、アニオン性染料メチルブルーの結合によって確認した。
【０１２８】
実施例２。開示された方法の実施形態の適用。約２．５ｇ／Ｌの濃度でＩｇＧモノクローナル抗体を含有する哺乳類の細胞培養採取物を、ｐＨ５．２への調製、１％のアラントイン、その後４％のカプリル酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｐｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）の追加によって浄化し、次いで２時間撹拌しながらインキュベートした。固体を、精密ろ過によって除去して上清を、ＴＲＥＮ（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ４０  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈ、ＢｉｏＷｏｒｋｓ、ウプサラ）で置換したアガロースビーズを含有するカラムを流し通し、ここでＴＲＥＮカラムの体積は、細胞培養採取物の元の体積の５％であった。これは、宿主タンパク質汚染物質を元の４６３，８０４ｐｐｍから８２９２ｐｐｍへ減少させた。試料を、３０ｋＤａの第四級アミン置換フィルターに直接適用して５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝液交換した。宿主タンパク質汚染物質は、概ね７０％の減少を表す、２４１４ｐｐｍに減少した。比較すると、フロースルーモードのＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜吸着装置（細孔径２〜５ミクロン）を通る試料の通過は、宿主タンパク質含有量を２９．５％しか減少しなかった。これは、開示された方法の有効性が、フロースルーモードの電気陽性の固相（陰イオン交換体）を用いる業界標準の慣例より実質的に大きいことを示す。
【０１２９】
実施例３。開示された方法の実施形態の適用。約０．６ｇ／Ｌの濃度でＩｇＧモノクローナル抗体を含有する哺乳類の細胞培養採取物を、ｐＨ５．４への調製、１％のアラントイン、その後４％のカプリル酸ナトリウムの追加によって浄化し、２時間インキュベートした。固体を、精密ろ過によって除去して上清を、ＴＲＥＮ（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ４０  ＴＲＥＮ  ｈｉｇｈ、ＢｉｏＷｏｒｋｓ、ウプサラ）で置換したアガロースビーズを含有するカラムを流し通しここでＴＲＥＮカラムの体積は細胞培養採取物の元の体積の５％であり、次いでその後Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１深層ろ過を通した。これは、宿主タンパク質汚染物質を元の３，８４１，３９７ｐｐｍから１９８ｐｐｍへ減少させた。試料を、３０ｋＤａの第四級アミン置換フィルターに直接適用して５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝液交換した。宿主タンパク質汚染物質は、１８ｐｐｍに減少した。本実施例は、注射可能な治療抗体に関して規制当局によって推薦されるレベル（１００ｐｐｍ）より低い宿主汚染物質レベルを達成するために開示された膜技術の実施形態のみが後に続くクロマチンを対象とする浄化の能力を例示する。これは典型的にはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで達成されるよりも良好な結果を得るために膜分別法と組み合わされたクロマチンを対象とする浄化の予想外の能力も際立たせる。プロテインＡは、一般に利用可能な最も強力な抗体精製法と考えられているので適切な参照標準である。プロテインＡカラムから溶出したＩｇＧは、典型的には５００〜２０００ｐｐｍの宿主細胞タンパク質を含有する。
【０１３０】
実施例４。開示された方法の実施形態の適用。約１．５ｇ／Ｌの濃度でＩｇＧモノクローナル抗体を含有する哺乳類の細胞培養採取物を、ｐＨ５．４への調製、１％のアラントイン、その後４％のカプリル酸ナトリウムの追加によって浄化し、２時間撹拌しながらインキュベートした。固体を、精密ろ過によって除去して上清を、ＴＲＥＮ（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ４０  ＴＲＥＮ  Ｈｉｇｈ、ＢｉｏＷｏｒｋｓ、ウプサラ）で置換したアガロースビーズを含有するカラムを流し通し、ここでＴＲＥＮカラムの体積は、細胞培養採取物の元の体積の５％であった。これは、宿主タンパク質汚染物質を元の２１９，５７０ｐｐｍから４４４１ｐｐｍへ減少させた。試料を、３０ｋＤａの第四級アミン置換フィルターに直接適用して５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝液交換した。宿主タンパク質汚染物質は、６７９ｐｐｍに減少した。本実施例は、プロテインＡでのアフィニティークロマトグラフィーによって生じるレベルと一致する宿主汚染物を達成するために開示されたろ過技術のみが後に続くクロマチンを対象とする浄化の能力を例示する。
【０１３１】
実施例５。開示された方法の追加の分別方法との統合。ＮａＣｌを、実施例４からの処理したＩｇＧに１Ｍの最終濃度まで加え、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０に平衡化させたＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムに適用した。Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅカラムを、５０ｍＭのＭＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０までのステップで溶離した。溶離したＩｇＧのＨＣＰ含有量は、１ｐｐｍ未満であり、かつ１ｐｐｍ未満のＤＮＡ、および０．１％未満の凝集物を含有した。これは、３つ全ての基準で治療用ＩｇＧのための品質標準を達成するまたは超えるための開示された方法および単一のポリッシングステップの能力を例示する。
【０１３２】
実施例６。荷電膜対無荷電膜の性能の比較。正に帯電した基を含有するために修飾されていない３０ｋＤａのセルロース膜を用いることを除いて実施例４の方法を繰り返した。荷電膜が宿主タンパク質汚染物質を６７９ｐｐｍまで減少させたのに対して、無荷電膜はそれらを２２８０ｐｐｍまでしか減少しなかった。しかしながら、汚染物質負荷の約５０％の減少は、荷電膜の細孔を通る汚染物質減少がかなりの割合の汚染物質を除去するという点を強調し、かつなぜ開示された方法がフロースルーモードで電気陽性の固相を用いる標準の慣例よりも効果的に働くか（実施例２）をある程度説明する。無荷電膜からの試料を、実施例５の方法によってさらに分別した。荷電膜の後のＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅが宿主タンパク質を１ｐｐｍ未満まで減少させたのに対して、無荷電膜で処理後のＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅは、宿主タンパク質を８６ｐｐｍまで減少させた。
【０１３３】
実施例７。開示された方法の追加の分別方法との統合。約２．５ｇ／Ｌの濃度でＩｇＧモノクローナル抗体を含有する哺乳類の細胞培養採取物を、ｐＨ５．２への調製、１％のアラントイン、その後４％のカプリル酸ナトリウムの追加によって浄化し、次いで２時間撹拌しながらインキュベートした。ＴＲＥＮ担持粒子（ＷｏｒｋＢｅａｄｓ  ４０  ＴＲＥＮ  Ｈｉｇｈ、ＢｉｏＷｏｒｋｓ、ウプサラ）を、５％（ｖ：ｖ）の比で加えて撹拌しながら４時間インキュベートし、次いで遠心分離して固体を除去した。これは、宿主タンパク質汚染物質を元の２４３，９９７ｐｐｍから３５５１ｐｐｍへ減少させた。試料を、ｐＨ６．０まで滴定し水で１：１で希釈して伝導率を低下させ、次いでカラム内のＰＯＲＯＳ  ＸＳ陽イオン交換クロマトグラフィー媒体に適用し、ｐＨ８．０で洗い、次いで５０ｍＭのＮａＣｌまでのステップで溶離した。宿主タンパク質は、１５５ｐｐｍに減少した。試料を、平衡化せずに約３０ｋＤａの多孔性を有する第四級アミン膜に適用した。試料を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．２に緩衝液交換し、次いで系から除去した。宿主タンパク質は、２４ｐｐｍであった。実施例５が開示された方法の後続のポリッシング法との統合を記述しているのに対して、本実施例は、開示された方法の先行の抗体捕捉法との統合を記述する。
【０１３４】
実施例８。開示された方法を実施するための電気陽性の膜の調製。方法を実施するために適切な膜を利用できないので、それらを調製する必要がある。３０ｋＤａの推定球状タンパク質に対応する平均細孔径を有する再生したセルロース膜を、１ＭのＮａＯＨ、１ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム、１００ｍＭのトリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）、および１００ｍＭのエピクロロヒドリンで平衡化し、次いで膜を通して緩衝液を連続的に再循環させた状態で５０℃で４時間反応させた。緩衝液を、１ＭのＮａＣｌ、次いで水で置き換えて、残余反応物および反応副生物を洗い流した。ＴＲＥＮの固定化を、アニオン性染料メチルブルーの結合によって確認した。
【０１３５】
実施例９。クロマチンと対象とする細胞培養採取物の浄化の後の開示された方法の実施形態の適用。約２．５ｇ／Ｌの濃度でＩｇＧモノクローナル抗体を含有する哺乳類の細胞培養採取物を、ｐＨ５．２への調整、１％のアラントイン、その後０．４％のカプリル酸ナトリウム酸（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｐｒｙｌａｔｅ  ａｃｉｄ）の追加によって浄化し、２時間インキュベートし、５％のＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮを追加し、４時間のインキュベーション、遠心分離して固体を除去し、次いでデプスフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＰＣ１）を通過させた。これは、宿主タンパク質汚染物質を元の２４３，９９７ｐｐｍから２３６ｐｐｍへ減少させた。調製品を、３０ｋＤａの質量を有する球状タンパク質に対応する定格の細孔径を有するＴＲＥＮ担持セルロース膜に直接適用した。調製品を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのヒスチジン、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０に緩衝液交換して非特異的な相互作用を解離させ、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．２に緩衝液交換し、次いで系から除去した。ＩｇＧの宿主タンパク質含有量は、１０ｐｐｍに減少した。
【０１３６】
実施例１０。クロマチンを対象とする細胞培養採取物の浄化の後の開示された方法の実施形態の適用および硫酸アンモニウムでのＩｇＧ沈殿。約２．５ｇ／Ｌの濃度でＩｇＧモノクローナル抗体を含有する哺乳類の細胞培養採取物を、ｐＨ５．２への調整、１％のアラントイン、その後０．４％のカプリル酸ナトリウム酸の追加によって浄化し、２時間インキュベートし、５％のＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮを追加、４時間のインキュベーション、次いで遠心分離で固体を除去した。これは、宿主タンパク質汚染物質を元の２４３，９９７ｐｐｍから３５５１ｐｐｍへ減少させた。ＩｇＧを、２Ｍの硫酸アンモニウムで沈殿させ、次いで精密ろ過して上清を除去した。ＩｇＧを、１試料体積の水を追加することによって再可溶化し、ＩｇＧを１Ｍの硫酸アンモニウム中に残留させた。宿主タンパク質汚染物は、１４２３ｐｐｍに減少した。試料を、実施例８および１０に記載のようにＴＲＥＮ膜に直接適用し、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのヒスチジン、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０に緩衝液交換して非特異的な相互作用を解離させ、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．２に緩衝液交換し、次いで系から除去した。ＩｇＧの宿主タンパク質含有量は、１２ｐｐｍに減少した。
【０１３７】
実施例１１。クロマチンを対象とする細胞培養採取物の浄化の後の開示された方法の実施形態の適用および陽イオン交換クロマトグラフィー。約２．５ｇ／Ｌの濃度でＩｇＧモノクローナル抗体を含有する哺乳類の細胞培養採取物を、ｐＨ５．２への調整、１％のアラントイン、その後０．４％のカプリル酸ナトリウム酸の追加によって浄化し、２時間インキュベートし、５％のＢｉｏＷｏｒｋｓ  ＴＲＥＮを追加、４時間のインキュベーション、次いで遠心分離で固体を除去した。これは、宿主タンパク質汚染物質を元の２４３，９９７ｐｐｍから３５５１ｐｐｍへ減少させた。試料を、ｐＨ６．０まで滴定して水で１：１で希釈して伝導率を低下させ、次いでカラム内のＰＯＲＯＳ  ＸＳ陽イオン交換クロマトグラフィー媒体に適用し、ｐＨ８．０で洗い、次いで５０ｍＭのＮａＣｌまでのステップで溶離した。宿主タンパク質は、５ｐｐｍに減少した。試料を、実施例８に記載のようにＴＲＥＮ膜に直接適用し、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのヒスチジン、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０に透析ろ過して非特異的な相互作用を解離させ、次いで５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．２内に透析ろ過し、次いで系から除去した。宿主タンパク質は、検出能のレベルより下まで減少した。
【０１３８】
実施例１２。ＴＲＥＮ−デンドリマー膜の生成。実施例８に記載のように調製した膜を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．４中の８％のグルタルアルデヒドで１時間洗った。グルタルアルデヒド溶液を、５０ｍＭリン酸塩ｐＨ、６．４、すぐ後に５０ｍＭホウ酸中の１００ｍＭのＴＲＥＮ、ｐＨ９．１ですすいだ。混合物を、２時間インキュベートし次いで５０ｍＭのリン酸塩、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４で、次いで２０％エタノールですすいだ。本プロセスは、膜表面上の電荷の総量を倍加しかつ膜表面から離れるにつれて電荷の総量を２倍に拡大する、第１発生固定化ＴＲＥＮ分子の遊離アミノ末端上に固定化された第２発生ＴＲＥＮ分子を有することが理解される。効果をさらに増加させるためにグルタルアルデヒド−ＴＲＥＮの並びが複数回繰り返されてよいことは明らかであろう。
【０１３９】
本明細書において引用されるすべての参照は、あたかもそれぞれの個別の刊行物または特許または特許出願が、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれると具体的にかつ個々に示されたのと同程度にそれら全体がかつ全ての目的のために参照により組み込まれる。参照により組み込まれた刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する範囲では、本明細書が、任意のこうした矛盾材料に取って代わるおよび／または優先されることが意図される。
【０１４０】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる原料の分量、クロマトグラフィー条件などを表す全ての数値は、「約」という語によって全ての実例において修正されることが理解される。したがって、それとは反対の指示がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記述されている数字によるパラメータは、本明細書において開示された方法によって得られることが求められる所望の性能に応じて変化し得る概算値である。
【０１４１】
当業者には明らかになるように、本明細書において開示された方法の多くの修正形態および変形形態が、それらの精神および範囲から逸脱すること無くなされ得る。本明細書に述べる特定の実施形態は、例のみの目的で提供されかついかなる方法においても限定することを意味しない。本明細書および実施例は、下記の特許請求の範囲によって示されている本明細書において開示された方法の真の範囲および精神と共に、例示のみと見なされることが意図される。
【国際調査報告】
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