(57)【要約】  本発明は、増大された培養能および／若しくは形質転換能を有するトウモロコシ植物の同定方法に関する。該方法は、増大された培養能および／若しくは形質転換能をもつ植物を同定および選択するため、または減少された培養能および／若しくは形質転換能をもつ植物を同定および選択解除するために分子マーカーを使用する。本発明の方法により生成されるトウモロコシ植物もまた本発明の１特徴である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増大された培養能および／若しくは形質転換能を表すトウモロコシ植物の同定方法であって、該方法が：
ａ）トウモロコシ植物の生殖質中で最低９個のマーカー遺伝子座を検出することであって、最低１個のマーカー遺伝子座が各染色体間隔（ｉ）−（ｉｘ）：
（ｉ）ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｉｉ）ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｉｉ）ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｖ）ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖ）ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉ）ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｖｉｉ）ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉｉｉ）ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接され；ならびに
（ｉｘ）ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接され
内に配置され；ならびに
ｂ）最低１個の対立遺伝子が、増大された培養能および／若しくは形質転換能と関連する、
ことを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
最低１個のマーカー遺伝子座が：
（ｉ）ＰＺＡ０１２１６．１、ＤＡＳ−ＰＺ−７１４６、ＤＡＳ−ＰＺ−１２６８５およびｍａｇｉ１７７６１；
（ｉｉ）Ｍｏ１７−１００１７７；
（ｉｉｉ）ＤＡＳ−ＰＺ−５６１７、ＤＡＳ−ＰＺ−２３４３、ＰＺＡ０３２０３−２、Ｍｏ１７−１００２９１、ＰＺＡ０３４０９およびＤＡＳ−ＰＺ−１９１８８；
（ｉｖ）ＤＡＳ−ＰＺ−２０４３；
（ｖ）ＤＡＳ−ＰＺ−２０５７０；
（ｖｉ）ＰＺＡ０２９６５；
（ｖｉｉ）Ｍｏ１７−１４５１９およびＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６；
（ｖｉｉｉ）ｍａｇｉ５２１７８；ならびに、
（ｉｘ）ＤＡＳ−ＰＺ−３６６
よりなる群（ｉ）−（ｉｘ）のそれぞれから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トウモロコシ植物がＳｔｉｆｆ  Ｓｔａｌｋヘテロ強勢群に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１の方法により同定されるトウモロコシ植物。
【請求項５】
増大された培養能および／若しくは形質転換能を表すトウモロコシ植物の同定方法であって、該方法が、トウモロコシ植物の生殖質中で１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを検出することを含んでなり、ここで：
ａ）１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座が各染色体間隔（ｉ）−（ｉｘ）：
（ｉ）ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｉｉ）ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｉｉ）ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｉｖ）ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖ）ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉ）ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｖｉｉ）ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉｉｉ）ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接され；ならびに
（ｉｘ）ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接され
内に配置され；ならびに
ｂ）該ハプロタイプが増大された培養能および／若しくは形質転換能と関連する、
上記方法。
【請求項６】
該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座が、各染色体間隔（ｉ）−（ｉｘ）：
（ｉ）ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｉｉ）ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｉｉ）ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｖ）ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖ）ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉ）ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｖｉｉ）ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉｉｉ）ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接され；ならびに
（ｉｘ）ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接され
内に配置される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
トウモロコシ植物がＳｔｉｆｆ  Ｓｔａｌｋヘテロ強勢群に属する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
請求項５の方法により同定されるトウモロコシ植物であって、該トウモロコシ植物が、その生殖質内に増大された培養能および／若しくは形質転換能と関連するハプロタイプを含んでなり、該ハプロタイプが、各染色体間隔（ｉ）−（ｉｘ）：
（ｉ）ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｉｉ）ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｉｉ）ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｖ）ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖ）ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉ）ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｖｉｉ）ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉｉｉ）ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接され；ならびに
（ｉｘ）ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接され
内に配置される１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなる、上記
植物。
【請求項９】
ａ）最低９個のマーカー遺伝子座を有する第一のトウモロコシ植物を得ることであって、最低１マーカー遺伝子座が各染色体間隔（ｉ）−（ｉｘ）：
（ｉ）ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｉｉ）ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｉｉ）ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｖ）ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖ）ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉ）ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｖｉｉ）ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉｉｉ）ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接され；ならびに
（ｉｘ）ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接され
内に配置され；かつ、該マーカー遺伝子座の対立遺伝子が増大された培養能および／若しくは形質転換能と関連し；
ｂ）第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配すること；
ｃ）子孫を最低１個の対立遺伝子について評価すること；ならびに
ｄ）該最低１個の対立遺伝子を所有する子孫植物を選択すること
を含んでなる、マーカー支援選抜方法。
【請求項１０】
最低１個のマーカー遺伝子座が：
（ｉ）ＰＺＡ０１２１６．１、ＤＡＳ−ＰＺ−７１４６、ＤＡＳ−ＰＺ−１２６８５およびｍａｇｉ１７７６１；
（ｉｉ）Ｍｏ１７−１００１７７；
（ｉｉｉ）ＤＡＳ−ＰＺ−５６１７、ＤＡＳ−ＰＺ−２３４３、ＰＺＡ０３２０３−２、Ｍｏ１７−１００２９１、ＰＺＡ０３４０およびＤＡＳ−ＰＺ−１９１８８；
（ｉｖ）ＤＡＳ−ＰＺ−２０４３；
（ｖ）ＤＡＳ−ＰＺ−２０５７０；
（ｖｉ）ＰＺＡ０２９６５；
（ｖｉｉ）Ｍｏ１７−１４５１９およびＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６；
（ｖｉｉｉ）ｍａｇｉ５２１７８；ならびに、
（ｉｘ）ＤＡＳ−ＰＺ−３６６
よりなる群（ｉ）−（ｉｘ）のそれぞれから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
トウモロコシ植物がＳｔｉｆｆ  Ｓｔａｌｋヘテロ強勢群に属する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法により選択されるトウモロコシ子孫植物であって、該植物が１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、最低１個のマーカー遺伝子座が各染色体間隔（ｉ）−（ｉｘ）：
（ｉ）ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｉｉ）ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｉｉ）ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｉｖ）ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖ）ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接され
；
（ｖｉ）ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接され；（ｖｉｉ）ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接され；
（ｖｉｉｉ）ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接され；ならびに
（ｉｘ）ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接され
内に配置される、上記植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年１０月１０日に米国特許商標庁に出願された仮出願第６２／０６２，５２０号（その完全な開示は引用することによりここに組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明はトウモロコシ植物における培養能（ｃｕｌｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ）および形質転換能の改良において有用な方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
トウモロコシの形質転換は、歴史的に、組織培養および遺伝子送達技術の影響を受けやすい遺伝子型を使用して実践されてきた。しかしながら、製品開発の観点から、これら遺伝子型を使用する遺伝子導入事象の創成は、それらがしばしば農学的に不十分であるため望ましくない。多くの場合、しかしながら、有望系統のような優れた農学的形質をもつ植物は、乏しい培養および形質転換能の特徴を表す傾向がある。従って、トウモロコシ形質転換における慣例の使用に適する効率で、培養かつ形質転換され得る有望系統を開発する機会が存在する。こうした系統を有することの利点は、より迅速かつより正確な事象および形質評価、高められた形質、収量、ならびに規制の試験、ならびにより迅速な製品開発を包含する。
【０００４】
有望な形質転換可能な近交系を開発するための一方法論は、ドナー物質から所望の有望系統への培養能および形質転換能の形質の遺伝子浸透（ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を必要とする。これらの形質の遺伝子マーカーを有することはこの遺伝子浸透を補助するために貴重であるとみられる。Ｈｉ−ＩＩおよびＡ１８８生殖質における培養能および形質転換能の形質は十分に研究されており、そしてこれらの形質に連鎖されるいくつかの分子マーカーが同定されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。改良された培養能および形質転換能をもつ新規系統Ｈｉ−ＩＩはＡ１８８とＢ７３の間の初期交配（ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｒｏｓｓ）から開発され（非特許文献５）、ここでＡ１８８は培養能および形質転換能の形質のドナーであった。
【０００５】
本発明は、より培養可能かつ形質転換可能な有望系統に対する必要性に対処し、そして、高められた培養能および形質転換能をもつ新たな農学的に優れたトウモロコシ系統の開発の改良された助長方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら  １９９２
【非特許文献２】ＬｏｗｅとＣｈｏｍｅｔ  ２００４
【非特許文献３】Ｌｏｗｅら  ２００６
【非特許文献４】Ｚｈａｏら  ２００８
【非特許文献５】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら  １９９１
【発明の概要】
【０００７】
［発明の要約］
一態様において、トウモロコシ植物の生殖質中で１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を検出することを含んでなる、増大された培養能および形質転換能を表すトウモロコシ植物の同定方法が提供される。該マーカー遺伝子座はｉｄｐ８５１６およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接される染色体間隔（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ
ｌ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）内に配置され（Ｂｉｎ  １．０７）；そして最低１個の対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連付けられる。該マーカー遺伝子座は、以下のマーカー遺伝子座ＰＺＡ０１２１６．１、ＤＡＳ−ＰＺ−７１４６、ＤＡＳ−ＰＺ−１２６８５およびｍａｇｉ１７７６１のいずれか、ならびにこれらマーカーに連鎖される（ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ）いずれかの他のマーカーから選択し得る。該マーカー遺伝子座は、第１染色体上、ＰＺＡ０１２１６．１およびｍａｇｉ１７７６１を含んでなりかつこれらにより隣接される間隔内に見出され得、そして増大された培養能および形質転換能と関連する最低１個の対立遺伝子を含んでなる。
【０００８】
本発明の他の態様において、マーカー遺伝子座は、ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接される染色体間隔内に配置され（Ｂｉｎ  ４．０４）；そして最低１個の対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する。該マーカー遺伝子座は、Ｍｏ１７−１００１７７、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーであり得、そして増大された培養能および形質転換能と関連する最低１個の対立遺伝子を含んでなる。
【０００９】
本発明の他の態様において、マーカー遺伝子座は、ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接される染色体間隔内に配置され（Ｂｉｎ  ４．０５）；そして最低１個の対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する。該マーカー遺伝子座は、以下のマーカー遺伝子座ＤＡＳ−ＰＺ−５６１７、ＤＡＳ−ＰＺ−２３４３、ＰＺＡ０３２０３−２、Ｍｏ１７−１００２９１、ＰＺＡ０３４０９およびＤＡＳ−ＰＺ−１９１８８、ならびにこれらマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーから選択され得る。該マーカー遺伝子座は、第４染色体上、ＤＡＳ−ＰＺ−５６１７およびＤＡＳ−ＰＺ−１９１８８を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出され得、そして増大された培養能および形質転換能と関連する最低１個の対立遺伝子を含んでなる。
【００１０】
本発明の他の態様において、マーカー遺伝子座は、ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接される染色体間隔内に配置され（Ｂｉｎ  ４．０６）；そして最低１個の対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する。該マーカー遺伝子座は、ＤＡＳ−ＰＺ−２０４３、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーであり得、そして増大された培養能および形質転換能と関連する最低１個の対立遺伝子を含んでなる。
【００１１】
本発明の他の態様において、マーカー遺伝子座は、ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接される染色体間隔内に配置され（Ｂｉｎ  ４．１０）；そして最低１個の対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する。該マーカー遺伝子座は、ＤＡＳ−ＰＺ−２０５７０、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーであり得、そして増大された培養能および形質転換能と関連する最低１個の対立遺伝子を含んでなる。
【００１２】
本発明の他の態様において、マーカー遺伝子座は、ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接される染色体間隔内に配置され（Ｂｉｎ  ５．０４）；そして最低１個の対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する。該マーカー遺伝子座は、ＰＺＡ０２９６５、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーであり得、そして増大された培養能および形質転換能と関連する最低１個の対立遺伝子を含んでなる。
【００１３】
本発明の他の態様において、マーカー遺伝子座は、ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接される染色体間隔内に配置され（Ｂｉｎ  ５．０６
）；そして最低１個の対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する。該マーカー遺伝子座は、以下のマーカー遺伝子座Ｍｏ１７−１４５１９およびＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６、ならびにこれらマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーから選択され得る。該マーカー遺伝子座は、第５染色体上、Ｍｏ１７−１４５１９およびＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出され得、そして増大された培養能および形質転換能と関連する最低１個の対立遺伝子を含んでなる。
【００１４】
本発明の他の態様において、マーカー遺伝子座は、ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接される染色体間隔内に配置され（Ｂｉｎ  ８．０２）；そして最低１個の対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する。該マーカー遺伝子座は、ｍａｇｉ５２１７８、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーであり得、そして増大された培養能および形質転換能と関連する最低１個の対立遺伝子を含んでなる。
【００１５】
本発明の他の態様において、マーカー遺伝子座は、ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接される染色体間隔内に配置され（Ｂｉｎ  ９．０３）；そして最低１個の対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する。該マーカー遺伝子座は、ＤＡＳ−ＰＺ−３６６、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーであり得、そして増大された培養能および形質転換能と関連する最低１個の対立遺伝子を含んでなる。
【００１６】
いくつかの態様において、該トウモロコシ植物はＳｔｉｆｆ  Ｓｔａｌｋヘテロ強勢群（Ｓｔｉｆｆ  Ｓｔａｌｋ  ｈｅｔｅｒｏｔｉｃ  ｇｒｏｕｐ）に属する。本方法により同定されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００１７】
別の態様において、トウモロコシ植物の生殖質中のハプロタイプを検出することによる、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定方法が提供される。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は、ｉｄｐ８５１６およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内の第１染色体上に見出される（Ｂｉｎ  １．０７）。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は第１染色体上に見出され、かつ、ＰＺＡ０１２１６．１、ＤＡＳ−ＰＺ−７１４６、ＤＡＳ−ＰＺ−１２６８５およびｍａｇｉ１７７６１、ならびにこれらマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーよりなる群から選択される。該ハプロタイプは増大された培養能および形質転換能と関連する。
【００１８】
別の態様において、トウモロコシ植物の生殖質中のハプロタイプを検出することによる、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定方法が提供される。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は、第４染色体上でｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出される（Ｂｉｎ  ４．０４）。該ハプロタイプは、１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は第４染色体上に見出され、かつ、Ｍｏ１７−１００１７７ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーよりなる群から選択される。該ハプロタイプは増大された培養能および形質転換能と関連する。
【００１９】
別の態様において、トウモロコシ植物の生殖質中のハプロタイプを検出することによる、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定方法が提供される。
該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は、第４染色体上でａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出される（Ｂｉｎ  ４．０５）。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は第４染色体上に見出され、かつ、ＤＡＳ−ＰＺ−５６１７、ＤＡＳ−ＰＺ−２３４３、ＰＺＡ０３２０３−２、Ｍｏ１７−１００２９１、ＰＺＡ０３４０９およびＤＡＳ−ＰＺ−１９１８８、ならびにこれらマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーよりなる群から選択される。該ハプロタイプは増大された培養能および形質転換能と関連する。
【００２０】
別の態様において、トウモロコシ植物の生殖質中のハプロタイプを検出することによる、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定方法が提供される。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は、第４染色体上でｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出される（Ｂｉｎ  ４．０６）。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は第４染色体上に見出され、かつ、ＤＡＳ−ＰＺ−２０４３、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーから選択される。該ハプロタイプは増大された培養能および形質転換能と関連する。
【００２１】
別の態様において、トウモロコシ植物の生殖質中のハプロタイプを検出することによる、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定方法が提供される。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は、第４染色体上でｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出される（Ｂｉｎ  ４．１０）。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は第４染色体上に見出され、かつ、ＤＡＳ−ＰＺ−２０５７０、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーから選択される。該ハプロタイプは増大された培養能および形質転換能と関連する。
【００２２】
別の態様において、トウモロコシ植物の生殖質中のハプロタイプを検出することによる、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定方法が提供される。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は、第５染色体上でｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出される（Ｂｉｎ  ５．０４）。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は第５染色体上に見出され、かつ、ＰＺＡ０２９６５、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーから選択される。該ハプロタイプは増大された培養能および形質転換能と関連する。
【００２３】
別の態様において、トウモロコシ植物の生殖質中のハプロタイプを検出することによる、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定方法が提供される。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は、第５染色体上でｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出される（Ｂｉｎ  ５．０６）。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は第５染色体上に見出され、かつ、Ｍｏ１７−１４５１９およびＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６、ならびにこれらマーカー
に連鎖されるいずれかの他のマーカーから選択される。該ハプロタイプは増大された培養能および形質転換能と関連する。
【００２４】
別の態様において、トウモロコシ植物の生殖質中のハプロタイプを検出することによる、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定方法が提供される。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は、第８染色体上でｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出される（Ｂｉｎ
８．０２）。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は第８染色体上に見出され、かつ、ｍａｇｉ５２１７８、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーから選択される。該ハプロタイプは増大された培養能および形質転換能と関連する。
【００２５】
別の態様において、トウモロコシ植物の生殖質中のハプロタイプを検出することによる、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定方法が提供される。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は、第９染色体上でｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出される（Ｂｉｎ  ９．０３）。該ハプロタイプは１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなり、ここで該１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座は第９染色体上に見出され、かつ、ＤＡＳ−ＰＺ−３６６、ならびにこのマーカーに連鎖されるいずれかの他のマーカーから選択される。該ハプロタイプは増大された培養能および形質転換能と関連する。
【００２６】
さらなる一態様において、増大された培養能および形質転換能をもつ植物の選択方法が提供される。一局面において、１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、該対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する第一のトウモロコシ植物を得る。該マーカー遺伝子座は、第１染色体上、ｉｄｐ８５１６およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出し得る（Ｂｉｎ  １．０７）。該第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配し得、そして該交配から生じる子孫を第一のトウモロコシ植物の対立遺伝子について評価し得る。第一のトウモロコシ植物からの対立遺伝子を所有する子孫植物を、増大された培養能および形質転換能を有するとして選択し得る。本方法により選択されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００２７】
さらなる一態様において、増大された培養能および形質転換能をもつ植物の選択方法が提供される。一局面において、１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、該対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する第一のトウモロコシ植物を得る。該マーカー遺伝子座は、第４染色体上、ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出し得る（Ｂｉｎ  ４．０４）。該第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配し得、そして該交配から生じる子孫を第一のトウモロコシ植物の対立遺伝子について評価し得る。第一のトウモロコシ植物からの対立遺伝子を所有する子孫植物を、増大された培養能および形質転換能を有するとして選択し得る。本方法により選択されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００２８】
さらなる一態様において、増大された培養能および形質転換能をもつ植物の選択方法が提供される。一局面において、１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、該対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する第一のトウモロコシ植物を得る。該マーカー遺伝子座は、第４染色体上、ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出し得る（Ｂｉｎ  ４．０５）。該第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配し得、そして該交配から生じる子孫を第一のトウモロコシ植物の対立遺伝子について評価し得る。第一のトウモロコシ植物からの対
立遺伝子を所有する子孫植物を、増大された培養能および形質転換能を有するとして選択し得る。本方法により選択されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００２９】
さらなる一態様において、増大された培養能および形質転換能をもつ植物の選択方法が提供される。一局面において、１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、該対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する第一のトウモロコシ植物を得る。該マーカー遺伝子座は、第４染色体上、ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出し得る（Ｂｉｎ  ４．０６）。該第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配し得、そして該交配から生じる子孫を第一のトウモロコシ植物の対立遺伝子について評価し得る。第一のトウモロコシ植物からの対立遺伝子を所有する子孫植物を、増大された培養能および形質転換能を有するとして選択し得る。本方法により選択されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００３０】
さらなる一態様において、増大された培養能および形質転換能をもつ植物の選択方法が提供される。一局面において、１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、該対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する第一のトウモロコシ植物を得る。該マーカー遺伝子座は、第４染色体上、ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出し得る（Ｂｉｎ  ４．１０）。第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配し得、そして該交配から生じる子孫を第一のトウモロコシ植物の対立遺伝子について評価し得る。第一のトウモロコシ植物からの対立遺伝子を所有する子孫植物を、増大された培養能および形質転換能を有するとして選択し得る。本方法により選択されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００３１】
さらなる一態様において、増大された培養能および形質転換能をもつ植物の選択方法が提供される。一局面において、１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、該対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する第一のトウモロコシ植物を得る。該マーカー遺伝子座は、第５染色体上、ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出し得る（Ｂｉｎ  ５．０４）。第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配し得、そして該交配から生じる子孫を第一のトウモロコシ植物の対立遺伝子について評価し得る。第一のトウモロコシ植物からの対立遺伝子を所有する子孫植物を、増大された培養能および形質転換能を有するとして選択し得る。本方法により選択されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００３２】
さらなる一態様において、増大された培養能および形質転換能をもつ植物の選択方法が提供される。一局面において、１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、該対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する第一のトウモロコシ植物を得る。該マーカー遺伝子座は、第５染色体上、ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出し得る（Ｂｉｎ  ５．０６）。第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配し得、そして該交配から生じる子孫を第一のトウモロコシ植物の対立遺伝子について評価し得る。第一のトウモロコシ植物からの対立遺伝子を所有する子孫植物を、増大された培養能および形質転換能を有するとして選択し得る。本方法により選択されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００３３】
さらなる一態様において、増大された培養能および形質転換能をもつ植物の選択方法が提供される。一局面において、１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、該対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する第一のトウモロコシ植物を得る。該マーカー遺伝子座は、第８染色体上、ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出し得る（Ｂｉｎ  ８．０２）。第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配し得、そして該交配から生じる子孫を第一のトウモロコシ植物の対立遺伝子について評価し得る。第一のトウモロコシ植物からの
対立遺伝子を所有する子孫植物を、増大された培養能および形質転換能を有するとして選択し得る。本方法により選択されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００３４】
さらなる一態様において、増大された培養能および形質転換能をもつ植物の選択方法が提供される。一局面において、１マーカー遺伝子座の最低１個の対立遺伝子を有し、該対立遺伝子が増大された培養能および形質転換能と関連する第一のトウモロコシ植物を得る。該マーカー遺伝子座は、第９染色体上、ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接される区間内に見出し得る（ＢＩｎ  ９．０３）。第一のトウモロコシ植物を第二のトウモロコシ植物に交配し得、そして該交配から生じる子孫を第一のトウモロコシ植物の対立遺伝子について評価し得る。第一のトウモロコシ植物からの対立遺伝子を所有する子孫植物を、増大された培養能および形質転換能を有するとして選択し得る。本方法により選択されるトウモロコシ植物もまた興味深い。
【００３５】
［図面および配列表の簡単な説明］
本発明は、以下の詳細な記述、および本出願の一部を形成する付随する図面および配列表からより完全に理解され得る。配列表は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１−３０３０（１９８５）およびｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ標準に従って定義されるところのヌクレオチド配列の特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒ）についての１文字記号およびアミノ酸の３文字記号を含有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００３６】
配列番号１はＤＡＳ−ＰＺ−７１４６のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００３７】
配列番号２はＤＡＳ−ＰＺ−１２６８５のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００３８】
配列番号３はＭｏ１７−１００１７７のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００３９】
配列番号４はＤＡＳ−ＰＺ−５６１７のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００４０】
配列番号５はＤＡＳ−ＰＺ−２３４３のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００４１】
配列番号６はＭｏ１７−１００２９１のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００４２】
配列番号７はＤＡＳ−ＰＺ−１９１８８のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００４３】
配列番号８はＤＡＳ−ＰＺ−２０４３のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００４４】
配列番号９はＤＡＳ−ＰＺ−２０５７０のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００４５】
配列番号１０はＭｏ１７−１４５１９のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００４６】
配列番号１１はＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００４７】
配列番号１２はＤＡＳ−ＰＺ−３６６のＳＮＰおよび隣接配列を含有する。
【００４８】
配列番号１３はＰＺＡ０１２１６．１の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００４９】
配列番号１４はＰＺＡ０１２１６．１の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００５０】
配列番号１５はＰＺＡ０１２１６．１の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００５１】
配列番号１６は配列番号１の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００５２】
配列番号１７は配列番号１の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００５３】
配列番号１８は配列番号１の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００５４】
配列番号１９は配列番号２の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００５５】
配列番号２０は配列番号２の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００５６】
配列番号２１は配列番号２の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００５７】
配列番号２２はｍａｇｉ１７７６１の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００５８】
配列番号２３はｍａｇｉ１７７６１の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００５９】
配列番号２４はｍａｇｉ１７７６１の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００６０】
配列番号２５は配列番号３の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００６１】
配列番号２６は配列番号３の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００６２】
配列番号２７は配列番号３の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００６３】
配列番号２８は配列番号４の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００６４】
配列番号２９は配列番号４の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００６５】
配列番号３０は配列番号４の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００６６】
配列番号３１は配列番号５の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００６７】
配列番号３２は配列番号５の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００６８】
配列番号３３は配列番号５の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００６９】
配列番号３４はＰＺＡ０３２０３−２の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００７０】
配列番号３５はＰＺＡ０３２０３−２の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００７１】
配列番号３６はＰＺＡ０３２０３−２の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００７２】
配列番号３７は配列番号６の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００７３】
配列番号３８は配列番号６の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００７４】
配列番号３９は配列番号６の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００７５】
配列番号４０はＰＺＡ０３４０９の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００７６】
配列番号４１はＰＺＡ０３４０９の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００７７】
配列番号４２はＰＺＡ０３４０９の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００７８】
配列番号４３は配列番号７の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００７９】
配列番号４４は配列番号７の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００８０】
配列番号４５は配列番号７の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００８１】
配列番号４６は配列番号８の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００８２】
配列番号４７は配列番号８の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００８３】
配列番号４８は配列番号８の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００８４】
配列番号４９は配列番号９の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００８５】
配列番号５０は配列番号９の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００８６】
配列番号５１は配列番号９の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００８７】
配列番号５２はＰＺＡ０２９６５の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００８８】
配列番号５３はＰＺＡ０２９６５の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００８９】
配列番号５４はＰＺＡ０２９６５の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００９０】
配列番号５５は配列番号１０の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００９１】
配列番号５６は配列番号１０の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００９２】
配列番号５７は配列番号１０の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００９３】
配列番号５８は配列番号１１の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００９４】
配列番号５９は配列番号１１の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００９５】
配列番号６０は配列番号１１の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００９６】
配列番号６１はｍａｇｉ５２１７８の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００９７】
配列番号６２はｍａｇｉ５２１７８の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【００９８】
配列番号６３はｍａｇｉ５２１７８の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【００９９】
配列番号６４は配列番号１２の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【０１００】
配列番号６５は配列番号１２の増幅のためのフォワードＰＣＲプライマーである。
【０１０１】
配列番号６６は配列番号１２の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーである。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
［発明の詳細な記述］
本発明は、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物の同定および選択方法を提供する。以下の定義は本発明を理解するための補助として提供される。
【０１０３】
「対立遺伝子」という用語は、特定の１遺伝子座に存在する２種若しくはそれ以上の異なるヌクレオチド配列の１つを指す。
【０１０４】
「アンプリコン」は、増幅された核酸、例えば、いずれかの利用可能な増幅方法（例えばＰＣＲ、ＬＣＲ、転写など）によりテンプレート核酸を増幅することにより製造される核酸である。
【０１０５】
核酸増幅の状況における「増幅すること」という用語は、選択された核酸（若しくはその転写された形態）の付加的なコピーがそれにより製造されるいずれかの過程である。典型的な増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のようなリガーゼに媒介される方法、およびＲＮＡポリメラーゼに基づく増幅（例えば転写による）方法を包含する多様なポリメラーゼに基づく複製方法を包含する。
【０１０６】
「集合する」という用語は、ＢＡＣ、および一緒になってＤＮＡの隣接範囲（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｓｔｒｅｔｃｈ）を形成するそれらの性向に当てはまる。ＢＡＣは、該ＢＡＣがシークエンシングされる場合は配列アライメントに基づき、若しくは他のＢＡＣのフィンガープリントへのそのＢＡＣフィンガープリントのアライメントを介して、コンティグに「集合する」。該アセンブリは、インターネット上で公的に利用可能であるトウモロコシゲノムブラウザ（Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ）を使用して見出し得る。
【０１０７】
ある対立遺伝子は、それがある形質に連鎖する場合、および、該対立遺伝子の存在が、所望の形質若しくは形質形態（ｔｒａｉｔ  ｆｏｒｍ）が該対立遺伝子を含んでなる植物中に存在することができることの指標である場合に、それ「と関連する」。
【０１０８】
「ＢＡＣ」すなわちバクテリア人工染色体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の天然に存在するＦ因子に由来するクローニングベクターである。ＢＡＣはＤＮＡ配列の大型挿入物を受容し得る。トウモロコシにおいて、それぞれトウモロコシゲノムＤＮＡの大型挿入物を含有する多数のＢＡＣすなわちバクテリア人工染色体が、コンティグ
（オーバーラップ隣接遺伝子フラグメント若しくは「隣接ＤＮＡ」）に集合されている。
【０１０９】
「戻し交配（すること）」は、それによりハイブリッド子孫が親の一方に反復して戻し交配される過程を指す。戻し交配スキームにおいて、「ドナー」親は、遺伝子浸透されるべき所望の遺伝子若しくは遺伝子座をもつ親植物を指す。「レシピエント」親（１回若しくはそれ以上使用される）または「反復」親（２回若しくはそれ以上使用される）は、該遺伝子若しくは遺伝子座がそれに遺伝子浸透されている親植物を指す。例えば、Ｒａｇｏｔ，Ｍ．ら（１９９５）Ｍａｒｋｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｂａｃｋｃｒｏｓｓｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｅｘａｍｐｌｅ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｅｔ  Ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎｓ  ｄｅｓ  Ｍａｒｑｕｅｕｒｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｓ  Ｌｅｓ  Ｃｏｌｌｏｑｕｅｓ、Ｖｏｌ．７２、ｐｐ．４５−５６中、およびＯｐｅｎｓｈａｗら、（１９９４）Ｍａｒｋｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｋｃｒｏｓｓ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｒｋｅｒ
Ｄａｔａ、ｐｐ．４１−４３を参照されたい。初期交配はＦ１世代を生じさせ：「ＢＣ１」という用語はその場合反復親の第二の使用を指し、「ＢＣ２」は反復親の第三の使用を指し、などである。
【０１１０】
「Ｂｉｎ」は染色体セグメントを指す。遺伝子地図は、２個の固定されたコアマーカーの間のおよそ２０センチモルガンのｂｉｎと呼ばれる１００セグメントに分割される（Ｇａｒｄｉｎｅｒら  １９９３  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４：９１７−９３０）。該セグメントは、染色体番号次いで小数点以下２桁の数字（例えば１．００、１．０１、１．０２など）を用いて示される。ｂｉｎは最も左のすなわち最上位のコアマーカーから次のコアマーカーまでの全部の遺伝子座を包含する間隔である。あるｂｉｎへの１遺伝子座の配置はマッピングデータの精度に依存し、そしてマーカーの数が増大する若しくは集団が増大するにつれて確実性が増大する。配置が統計学的に不確実である場合はいつも、「Ｂｉｎ１」は範囲の始まりを指し、そして「Ｂｉｎ２」は範囲の終わりを指す。
【０１１１】
センチモルガン（「ｃＭ」）は組換え頻度の尺度の単位である。１ｃＭは、１遺伝子座のあるマーカーが単一世代での乗換えにより第二の遺伝子座のあるマーカーから分離されることができる１％の可能性に等しい。
【０１１２】
「染色体間隔」は、単一染色体上の、ある植物に存するゲノムＤＮＡの隣接した直線状の距離（ｓｐａｎ）を示す。単一染色体間隔に配置される遺伝要素すなわち遺伝子は物理的に連結されている。染色体間隔の大きさはとくに制限されない。いくつかの局面において、単一染色体間隔内に配置される遺伝要素は、典型的には例えば２０ｃＭ未満若しくはそれに等しい、または、あるいは１０ｃＭ未満若しくはそれに等しい遺伝子組換え距離で遺伝子的に連鎖される。すなわち、単一染色体間隔内の２遺伝要素は、２０％若しくは１０％未満若しくはそれに等しい頻度で組換えを受ける。「染色体間隔」という用語は、本発明に示されるマーカーのいずれかにより定義されるいかなるおよび全部の区間も示す。増大された培養能および形質転換能と相関する染色体間隔が提供される。
【０１１３】
「相補物」という用語は、所定のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を指す。すなわち、該配列は塩基対形成規則により関係づけられる。
【０１１４】
「隣接ＤＮＡ」という用語はオーバーラップ隣接遺伝子フラグメントを指す。
【０１１５】
「コアＢｉｎマーカー（ＣＢＭ）」という用語は染色体ｂｉｎの境界を規定する固定されたコアマーカーを指す。
【０１１６】
「交配された」若しくは「交配（する）」という用語は、子孫（例えば細胞、種子若し
くは植物）を生じるための受粉を介する配偶子の融合を意味している。該用語は性的交配（１植物の別のものによる受粉）ならびに自家受粉（ｓｅｌｆｉｎｇ）（自家受粉（ｓｅｌｆ−ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ）、例えば花粉および胚珠が同一植物からである場合）双方を包含する。「交配（すること）」という用語は、子孫を生じるため受粉を介して配偶子を融合する行為を指す。
【０１１７】
「好都合な対立遺伝子」は、所望の表現型例えば増大された培養能および形質転換能を付与する若しくはそれらに寄与する特定の１遺伝子座の対立遺伝子であるか、または、あるいは、育種プログラム若しくは植付けから除去し得る（「対抗選択」）低下された培養能および形質転換能をもつ植物の同定を可能にする対立遺伝子である。あるマーカーの好都合な対立遺伝子は、好都合な表現型とともに分離する、若しくは、あるいは、不都合な植物表現型とともに分離して従って植物を同定するという利益を提供するマーカー対立遺伝子である。
【０１１８】
「フラグメント」はヌクレオチド配列の一部分を意味することを意図している。フラグメントは、本明細書に開示される方法を使用してハイブリダイゼーションプローブ若しくはＰＣＲプライマーとして使用し得る。
【０１１９】
「遺伝子地図」は、一般に図面若しくは表の形態で描かれる、所定の１種内の１若しくはそれ以上の染色体（１若しくは複数）上の遺伝子座間の遺伝子連鎖関係の記述である。各遺伝子地図について、遺伝子座間の距離はそれらの間の組換え頻度により測定され、また、遺伝子座間の組換えは多様な分子遺伝子マーカー（分子マーカーともまた呼ばれる）を使用して検出し得る。遺伝子地図は、マッピング集団、使用されるマーカーの種類、および多様な集団間の各マーカーの多形の可能性の帰結である。遺伝子座の順序および遺伝子座間の遺伝的距離は１つの遺伝子地図から別のもので異なり得る。しかしながら、情報は、普遍的マーカーの一般的枠組みを使用して１地図から別のものへ相関され得る。当業者は、普遍的マーカーの枠組みを使用して、各個々の遺伝子地図上のマーカーの位置および目的の他の遺伝子座を同定し得る。
【０１２０】
「遺伝子マーカー」という用語は、限定されるものでないが制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、単純反復配列（ＳＳＲ）ランダム増幅多形ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、切断後増幅多形配列（ＣＡＰＳ）（ＲａｆａｌｓｋｉとＴｉｎｇｅｙ、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：２７５−２８０）、増幅断片長多形（ＡＦＬＰ）（Ｖｏｓら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：４４０７−４４１４）、一塩基多形（ＳＮＰ）（Ｂｒｏｏｋｅｓ、１９９９、Ｇｅｎｅ  ２３４：１７７−１８６）、ＳＣＡＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ）（ＰｅｃａｎとＭｉｃｈｅｌｍｏｒｅ、１９９３、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ、８５：９８５−９９３）、配列タグ部位（ＳＴＳ）（Ｏｎｏｚａｋｉら  ２００４、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １３８：２５５−２６２）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）（Ｏｒｉｔａら、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃｅｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：２７６６−２７７０）。ＩＳＲ（Ｉｎｔｅｒ−Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔ）（Ｂｌａｉｒら  １９９９、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９８：７８０−７９２）、ＩＲＡＰ（Ｉｎｔｅｒ−Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、レトロトランスポゾン−マイクロサテライト増幅多形（ＲＥＭＡＰ）（Ｋａｌｅｎｄａｒら、１９９９、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ  ９８：７０４−７１１）、ＲＮＡ切断生成物（Ｌｙｎｘタグのような）などを挙げることができる、いかなる種類の核酸に基づくマーカーも指すものとする。
【０１２１】
「遺伝子組換え頻度」は２遺伝子座間の乗換え事象（組換え）の頻度である。組換え頻度は、減数分裂後のマーカーおよび／若しくは形質の分離を追跡することにより観察し得
る。
【０１２２】
「ゲノム」は、１染色体若しくは染色体組により運搬される全ＤＮＡすなわち遺伝子の組全体を指す。
【０１２３】
「遺伝子型」という用語は、観察可能な形質（表現型）と対比されるところの１若しくはそれ以上の遺伝子座での１個体（若しくは個体の群）の遺伝子構成である。遺伝子型は、該個体がその親から受け継いだ１若しくはそれ以上の既知の遺伝子座の対立遺伝子（１若しくは複数）により定義される。遺伝子型という用語は、単一遺伝子座での、複数の遺伝子座での、１個体の遺伝子構成を指すのに使用し得るか、若しくは、より一般的には、遺伝子型という用語は、そのゲノム中の全遺伝子についての１個体の遺伝子構成を指すのに使用し得る。
【０１２４】
「生殖質」は、１個体（例えば１植物）、個体の１群（例えば植物の１系列、変種若しくは系統群）、または１系列、変種、種若しくは培養物に由来する１クローンの若しくはそれらからの遺伝物質を指す。生殖質は生物体若しくは細胞の一部であり得るか、または生物体若しくは細胞から離れていることができる。一般に、生殖質は、１生物体若しくは細胞培養物の遺伝の質のいくつか若しくは全部の物理的基礎を提供する特定の分子構成をもつ遺伝物質を提供する。本明細書で使用されるところの生殖質は、それから新たな植物が成長されうる細胞、種子若しくは組織、または植物全体に培養し得る葉、茎、花粉若しくは細胞のような植物部分を包含する。
【０１２５】
「ハプロタイプ」は、多数の遺伝子座の１個体の遺伝子型、すなわち対立遺伝子の組合せである。典型的に、１ハプロタイプにより記述される遺伝子座は物理的かつ遺伝的に連鎖されて、すなわち同一染色体セグメント上にある。「ハプロタイプ」という用語は、単一マーカー遺伝子座のような特定の１遺伝子座の配列、多形、若しくは所定の１ゲノム中の１染色体セグメントに沿った複数の遺伝子座の配列多形を指すことができる。前者は「マーカーハプロタイプ」若しくは「マーカー対立遺伝子」ともまた称され得る一方、後者は「ＬＲＨ（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）」ともまた称され得る。
【０１２６】
「ヘテロ強勢群」は、異なるヘテロ強勢群からの遺伝子型と交配される場合に良好に機能する１組の遺伝子型を含んでなる（Ｈａｌｌａｕｅｒら（１９９８）Ｃｏｒｎ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ、ｐ．４６３−５６４。Ｇ．Ｆ．ＳｐｒａｇｕｅとＪ．Ｗ．Ｄｕｄｌｅｙ（編）Ｃｏｒｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ中）。近交系はヘテロ強勢群に分類され、そして、系統、分子マーカーに基づく会合、およびハイブリッド組合せにおける性能のようないくつかの基準に基づき、１ヘテロ強勢群内で系統群にさらに細分される（Ｓｍｉｔｈら（１９９０）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．８０：８３３−８４０）。米国における２種の最も広範に使用されるヘテロ強勢群は「Ｉｏｗａ  Ｓｔｉｆｆ  Ｓｔａｌｋ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ」（ＢＳＳＳ）および「Ｌａｎｃａｓｔｅｒ」若しくは「Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｕｒｅ  Ｃｒｏｐ」（ときにＮＳＳ若しくはｉｒｏｎ−Ｓｔｉｆｆ
Ｓｔａｌｋと称される）と称される。
【０１２７】
「ヘテロ接合の」という用語は、多様な対立遺伝子が相同染色体上の対応する遺伝子座に存する遺伝子状態を意味している。
【０１２８】
「ホモ接合の」という用語は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の対応する遺伝子座に存する遺伝子状態を意味している。
【０１２９】
「ハイブリダイゼーション」若しくは「核酸ハイブリダイゼーション」は、相補ＲＮＡおよびＤＮＡ鎖の対形成ならびに相補ＤＮＡ一本鎖の対形成を指す。
【０１３０】
「ハイブリダイズする」という用語は、核酸鎖の相補領域間で塩基対を形成することを意味している。
【０１３１】
「ＩＢＭ遺伝子地図」は、以下の地図：ＩＢＭ、ＩＢＭ２、ＩＢＭ２  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ、ＩＢＭ２  ＦＰＣ０５０７、ＩＢＭ２  ２００４  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ、ＩＢＭ２
２００５  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ、ＩＢＭ２  ２００５  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ  ｆｒａｍｅ若しくはＩＢＭ２  ２００８  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓのいずれかを指す。ＩＢＭ遺伝子地図は、初期交配からの子孫が、マッピングのため組換え近交系を構築することの前に複数世代についてランダム率（ｒａｎｄｏｍ  ｒａｔｅ）であった、Ｂ７３×Ｍｏ１７集団に基づく。より新しいバージョンは、遺伝子およびＢＡＣのマッピングされたクローンの追加、ならびに他の遺伝子地図から得られる情報の取り込みによる強化された地図改良を反映する。
【０１３２】
「インデル」という用語は、その中で１系統が第二の系統に関して挿入を有すると称されうる、若しくは第二の系統が第一の系統に関して欠失を有すると称されうる、挿入若しくは欠失を指す。
【０１３３】
「遺伝子浸透」若しくは「遺伝子浸透すること」という用語は、１遺伝子背景（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）から別のものへの１遺伝子座の所望の１対立遺伝子の伝達を指す。例えば、指定される１遺伝子座での所望の１対立遺伝子の遺伝子浸透は、同一種の２親間の性的交配を介して最低１子孫に伝達され得、ここで親の少なくとも一方がそのゲノム中に該所望の対立遺伝子を有する。あるいは、例えば、１対立遺伝子の伝達は例えば融合プロトプラスト中の２種のドナーゲノム間の組換えにより発生し得、ここで該ドナープロトプラストの少なくとも一方がそのゲノム中に該所望の対立遺伝子を有する。該所望の対立遺伝子は、例えば、マーカー、ＱＴＬ、導入遺伝子などの選択された１対立遺伝子であり得る。いずれの場合においても、該所望の対立遺伝子を含んでなる子孫を、所望の遺伝的背景を有する系統に繰り返し戻し交配しかつ該所望の対立遺伝子について選択して、選択された遺伝的背景で固定されたようになる対立遺伝子をもたらし得る。例えば、本明細書に記述される第１染色体の遺伝子座を、問題の多いグリーンスナップ（ｇｒｅｅｎ  ｓｎａｐ）を有する反復親に遺伝子浸透しうる。遺伝子浸透された遺伝子若しくは遺伝子座をもつ該反復親系統はその場合、増大された培養能および形質転換能を有する。
【０１３４】
本明細書で使用されるところの「連鎖（ｌｉｎｋａｇｅ）」という用語は、１マーカー遺伝子座が別のマーカー遺伝子座若しくはいくつかの他の遺伝子座（例えば培養能および形質転換能の遺伝子座）と関連する程度を記述するのに使用される。分子マーカーと表現型の間の連鎖の関係は「確率」若しくは「補正確率」として示される。連鎖は所望の限度若しくは範囲として表現し得る。例えば、いくつかの態様において、いずれのマーカーも、該マーカーが５０、４０、３０、２５、２０若しくは１５地図単位（すなわちｃＭ）未満分離されている場合に、いずれかの他のマーカーに（遺伝子的かつ物理的に）連鎖される。いくつかの局面において、連鎖の挟まれる範囲、例えば１０と２０ｃＭの間、１０と３０ｃＭの間若しくは１０と４０ｃＭの間を定義することが有利である。あるマーカーが第二の遺伝子座により緊密に連鎖されるほど、そのマーカーは該第二の遺伝子座のより良好な指標となる。従って、あるマーカー遺伝子座および第二の遺伝子座のような「密接に連鎖される遺伝子座」は、１０％若しくはより小さい、好ましくは約９％若しくはより小さい、さらにより好ましくは約８％若しくはより小さい、なおまたより好ましくは約７％若しくはより小さい、さらにより好ましくは約６％若しくはより小さい、なおまたより好ましくは約５％若しくはより小さい、さらにより好ましくは約４％若しくはより小さい、なおまたより好ましくは約３％若しくはより小さい、およびさらにより好ましくは約２％
若しくはより小さい遺伝子座間の組換え頻度を表す。高度に好ましい態様において、関連する遺伝子座は、約１％若しくはより小さい、例えば約０．７５％若しくはより小さい、より好ましくは約０．５％若しくはより小さい、またはなおまたより好ましくは約０．２５％若しくはより小さい組換え頻度を表す。同一染色体に、かつ該２遺伝子座間の組換えが１０未満（例えば約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％若しくはより小さい）の頻度で起こるような距離に、局在化される（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）２遺伝子座もまた、相互「に近接」であると言われる。１ｃＭは１％の組換え頻度を示す２マーカー間の距離であるため、いずれのマーカーも、緊密に接近して、例えば１０ｃＭ距離若しくはそれ未満にあるいずれかの他のマーカーに緊密に連鎖（遺伝子的かつ物理的に）される。同一染色体上の２個の緊密に連鎖されるマーカーは、相互から９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５若しくは０．２５ｃＭまたはより小さく配置され得る。
【０１３５】
「連鎖不平衡」という用語は、遺伝子座若しくは形質（または双方）の非ランダム分離を指す。いずれの場合も、連鎖不平衡は、関連する遺伝子座が、それらがランダムより大きい（すなわち非ランダム）頻度で一緒に分離するように染色体の長さに粗って十分な物理的近接内にある（同時分離する形質の場合、該形質の根底にある遺伝子座が相互に十分に近接している）ことを意味している。連鎖不平衡を示すマーカーは連鎖されているとみなされる。連鎖される遺伝子座は、時間の５０％以上、例えば時間の約５１％から約１００％まで同時分離する。言い換えれば、同時分離する２マーカーは５０％未満の組換え頻度を有する（かつ、定義上、同一染色体上で５０ｃＭ未満分離されている）。本明細書で使用されるところの連鎖は、２マーカー間、若しくは、あるいは１マーカーと１表現型の間であり得る。あるマーカー遺伝子座はある形質例えば低下されたグリーンスナップ「と関連し」（に連鎖され）得る。表現型の形質への分子マーカーの連鎖の程度は、例えば該表現型とのその分子マーカーの同時分離の統計学的確率として測定される。
【０１３６】
連鎖不平衡は、最も普遍的には、Ｈｉｌｌ，Ｗ．Ｇ．とＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ａ、Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ  ３８：２２６−２３１（１９８８）により記述される式を使用して計算される量ｒ2を使用して評価される。ｒ2＝１の場合、完全なＬＤが該２マーカー遺伝子座間に存在し、該マーカーが組換えにより分離されておらずかつ同一の対立遺伝子頻度を有することを意味している。１／３より上のｒ2の値は、マッピングに有用であるべき十分に強力なＬＤを示す（Ａｒｄｌｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２９９−３０９（２００２））。これゆえに、対立遺伝子は、対のマーカー遺伝子座間のｒ2値が０．３３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９若しくは１．０より大きい若しくはこれに等しい場合に連鎖不平衡にある。
【０１３７】
本明細書で使用されるところの「連鎖平衡」は、２マーカーが独立に分離するすなわち子孫間でランダムに選別する状況を記述する。連鎖平衡を示すマーカーは連鎖されない（それらが同一染色体上にあろうとなかろうと）とみなされる。
【０１３８】
「ロッド（ＬＯＤ）値」若しくは「ＬＯＤスコア」（Ｒｉｓｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：８０３−８０４（１９９２））は、２マーカー遺伝子座間の連鎖の程度を記述するために区間マッピングで使用され、２マーカー間の３のＬＯＤスコアは連鎖が連鎖なしより１０００倍よりありそうであることを示す一方、２のＬＯＤスコアは連鎖が連鎖なしより１００倍よりありそうであることを示す。２より大きい若しくはこれに等しいＬＯＤスコアを、連鎖を検出するのに使用しうる。
【０１３９】
「遺伝子座」は遺伝子若しくはマーカーが配置されている染色体上の位置である。
【０１４０】
「トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）」は、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ｓｓｐ．
ｍａｙｓ）の１植物を指し、そして「トウモロコシ（ｃｏｒｎ）」としてもまた知られる。
【０１４１】
「トウモロコシ植物」という用語は：トウモロコシ植物全体、トウモロコシ植物細胞、トウモロコシ植物のプロトプラスト、それからトウモロコシ植物を再生し得るトウモロコシ植物細胞若しくはトウモロコシ組織培養物、トウモロコシ植物カルス、および、トウモロコシ植物、若しくはトウモロコシ種子、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ花、トウモロコシ子葉、トウモロコシ葉、トウモロコシ茎、トウモロコシ芽体、トウモロコシ根、トウモロコシ根端などのようなトウモロコシ植物の部分中で無傷であるトウモロコシ植物細胞を包含する。
【０１４２】
「マーカー」は参照点として使用されるヌクレオチド配列若しくはそのコードされる産物（例えばタンパク質）である。マーカーが組換えを検出することで有用であるために、それらは監視されている集団内で差違すなわち多形を検出することが必要である。分子マーカーについて、これは、ポリヌクレオチド配列の差違（例えばＳＳＲ、ＲＦＬＰ、ＦＬＰ、ＳＮＰ）によるＤＮＡレベルでの差違を意味している。ゲノムの変動性はいかなる起源、例えば挿入、欠失、重複、反復要素、点突然変異、組換え事象、若しくは転位因子の存在および配列のものでもあり得る。分子マーカーはゲノム若しくは発現された核酸（例えばＥＳＴ）由来であり得、かつまたＰＣＲに基づく方法の使用を介して配列フラグメントを増幅することが可能なプローブ若しくはプライマー対として使用される核酸も指すことができる。多数のトウモロコシ分子マーカーが当該技術分野で既知であり、そして、Ｍａｉｚｅ  ＧＤＢインターネットリソース、およびアリゾナ大学により運営されるアリゾナゲノミクス研究所（Ａｒｉｚｏｎａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）インターネットリソースのような多様な供給源から公表され若しくは利用可能である。
【０１４３】
１集団のメンバー間の遺伝子多形に対応するマーカーは当該技術分野で確立した方法により検出し得る。これらは、例えば、ＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲに基づく配列特異的増幅法、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）の検出、イソ酵素マーカーの検出、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）によるポリヌクレオチド多形の検出、植物ゲノムの増幅された可変配列の検出、自家持続配列複製の検出、単純反復配列（ＳＳＲ）の検出、一塩基多形（ＳＮＰ）の検出、若しくは増幅断片長多形（ＡＦＬＰ）の検出を包含する。確立した方法は、発現配列タグ（ＥＳＴ）ならびにＥＳＴ配列およびランダム増幅多形ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）由来のＳＳＲマーカーの検出についてもまた既知である。
【０１４４】
「マーカー対立遺伝子」あるいは「マーカー遺伝子座の対立遺伝子」は、あるマーカー遺伝子座について多形である１集団中で該マーカー遺伝子座で見出される多数の多形ヌクレオチド配列の１つを指すことができる。
【０１４５】
「マーカー支援選抜（Ｍａｒｋｅｒ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）（ＭＡＳ）」は、表現型がマーカーの遺伝子型に基づいて選択される方法である。
【０１４６】
「マーカー支援対抗選抜（Ｍａｒｋｅｒ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」は、選択されないことができる植物を同定するのにマーカー表現型を使用してそれらが育種プログラム若しくは植付けから除外されることを可能にする方法である。
【０１４７】
「マーカーハプロタイプ」は、１マーカー遺伝子座例えばＰＺＡ０１２１６対立遺伝子１の対立遺伝子の組合せを指す。
【０１４８】
「マーカー遺伝子座」は、特定の１マーカーを見出し得る場合のある種のゲノム中の特
定の染色体位置である。マーカー遺伝子座を、第二の連鎖される遺伝子座、例えばある表現型の形質の発現をコードする若しくはそれに寄与する連鎖される遺伝子座の存在を追跡するのに使用し得る。例えば、あるマーカー遺伝子座を、該マーカー遺伝子座に遺伝子的若しくは物理的に連鎖されるＱＴＬ若しくは単一遺伝子のようなある遺伝子座の対立遺伝子の分離を監視するのに使用し得る。
【０１４９】
「マーカープローブ」は、核酸ハイブリダイゼーションにより、マーカー遺伝子座の存在を同定するのに使用し得る核酸配列若しくは分子、例えばあるマーカー遺伝子座配列に相補的である核酸プローブであり、該マーカー遺伝子座の３０若しくはそれ以上の隣接ヌクレオチド（該マーカー遺伝子座配列の「全部若しくは一部分」）を含んでなるマーカープローブを核酸ハイブリダイゼーションに使用しうる。あるいは、いくつかの局面において、マーカープローブは、あるマーカー遺伝子座に存在する特定の対立遺伝子を識別（すなわち遺伝子型同定）することが可能であるいずれかの種類のプローブを指す。
【０１５０】
「分子マーカー」という用語は、連鎖される１遺伝子座を同定する場合に参照点として使用される、上で定義されたところの遺伝子マーカー若しくはそのコードされる産物（例えばタンパク質）を指すのに使用しうる。マーカーは、ゲノムヌクレオチド配列若しくは発現されたヌクレオチド配列（例えばスプライスされたＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）、またはコードされるポリペプチドに由来し得る。該用語は、マーカー配列を増幅することが可能なプローブ若しくはプライマー対として使用される核酸のような、マーカー配列に相補的若しくはそれに隣接する核酸配列もまた指す。
【０１５１】
「分子マーカープローブ」は、マーカー遺伝子座の存在を同定するのに使用し得る核酸配列若しくは分子、例えばあるマーカー遺伝子座配列に相補的である核酸プローブである。あるいは、いくつかの局面において、マーカープローブは、あるマーカー遺伝子座に存在する特定の対立遺伝子を識別（すなわち遺伝子型同定）することが可能であるいかなる種類のプローブも指す。核酸は、それらが例えばワトソン−クリックの塩基対形成規則に従って溶液中で特異的にハイブリダイズする場合に「相補的」である。本明細書に記述されるマーカーのいくつかは、本明細書に記述される非同一線上（ｎｏｎ−ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）領域のようなインデル領域上に配置される場合にハイブリダイゼーションマーカーともまた称される。これは、該挿入領域が、定義上、該挿入を伴わない植物に相対して多形であるためである。従って、該マーカーは、該インデル領域が存在若しくは非存在であるかどうかを示すことのみが必要である。いかなる適するマーカー検出技術もこうしたハイブリダイゼーションマーカーを同定するのに使用することができ、例えばＳＮＰ技術を本明細書に提供される実施例で使用する。
【０１５２】
「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」および「核酸フラグメント」は互換性に使用され、そして、合成、非天然若しくは変えられたヌクレオチド塩基を場合によっては含有する一若しくは二本鎖であるＲＮＡ若しくはＤＮＡのポリマーを指す。「ヌクレオチド」は、それからＤＮＡ若しくはＲＮＡポリマーが構築されかつプリン若しくはピリミジン塩基、五炭糖およびリン酸基よりなる単量体単位である。ヌクレオチド（通常それらの５’−一リン酸の形態で見出される）は、以下のとおりそれらの一文字呼称により称される：アデニル酸若しくはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡ若しくはＤＮＡについて）に対し「Ａ」、シチジル酸若しくはデオキシシチル酸に対し「Ｃ」。グアニル酸若しくはデオキシグアニル酸に対し「Ｇ」。ウリジル酸に対し「Ｕ」、デオキシチミジル酸に対し「Ｔ」、プリン（Ａ若しくはＧ）に対し「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ若しくはＴ）に対し「Ｙ」、Ｇ若しくはＴに対し「Ｋ」、Ａ若しくはＣ若しくはＴに対し「Ｈ」、イノシンに対し「Ｉ」およびいずれかのヌクレオチドに対し「Ｎ」。
【０１５３】
「表現型」または「表現型の形質」若しくは「形質」という用語は、ある生物体の１種
若しくはそれ以上の形質を指す。表現型は、裸眼に、または当該技術分野で既知のいずれかの他の評価手段、例えば顕微鏡検査、生化学的分析若しくは電気機械アッセイにより観察可能であり得る。いくつかの場合において、１表現型は単一の遺伝子若しくは遺伝子座により直接制御され、すなわち「単一遺伝子形質」。他の場合において、１表現型は数種の遺伝子の結果である。
【０１５４】
ゲノムの「物理的地図」は染色体ＤＮＡ上の同定可能な目印（遺伝子、マーカーなどを包含する）の直線的順序を示す地図である。しかしながら、遺伝子地図と対照的に、目印間の距離は絶対であり（例えば塩基対若しくは単離されかつ重なる隣接遺伝子フラグメント中で測定される）そして遺伝子組換えに基づかない。
【０１５５】
「植物」は、植物全体、そのいずれかの部分、またはある植物由来の細胞若しくは組織培養物であり得る。従って、「植物」という用語は：植物全体、植物の構成要素若しくは器官（例えば葉、茎、根など）、植物組織、種子、植物細胞、および／若しくはその子孫のいずれも指すことができる。植物細胞は、植物の、植物から採られた、若しくは植物から採られた細胞から培養により派生される細胞である。
【０１５６】
「植物組織培養」は、既知組成の栄養培地上で無菌条件下に植物の細胞、組織若しくは器官を維持若しくは成長させるのに使用される技術の集合体を指す。植物組織培養は、多くの植物細胞が植物全体を再生する能力を有するという事実に頼る。植物組織培養における多様な技術は伝統的な繁殖方法を上回るある種の利点を提供しうる。
【０１５７】
「多形」は、単に新たな突然変異によるには普遍的すぎるＤＮＡ中の変動である。多形は１集団において最低１％の頻度を有しなければならない。多形は、一塩基多形すなわちＳＮＰ、若しくは「インデル」ともまた本明細書で称される挿入／欠失多形であり得る。
【０１５８】
「確率値」若しくは「ｐ値」は、表現型および特定の１マーカー対立遺伝子の存在若しくは非存在の特定の組合せがランダムであるという統計学的尤度である。従って、確率スコアが低いほど表現型および特定の１マーカーが同時分離することができる尤度が大きくなる。いくつかの局面において、確率スコアは「有意」若しくは「有意でない」とみなされる。いくつかの態様において、任意組合せの０．０５という確率スコア（ｐ＝０．０５、若しくは５％確率）は同時分離の有意の指示とみなされる。しかしながら、許容できる確率は５０％（ｐ＝０．５）未満のいずれの確率でもあり得る。例えば、有意の確率は、０．２５未満、０．２０未満、０．１５未満、０．１未満、０．０５未満、０．０１未満若しくは０．００１未満であり得る。
【０１５９】
「子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）」という用語は交配から発生される子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）を指す。
【０１６０】
「子孫植物」は２植物間の交配から発生される。
【０１６１】
「参照配列」は配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、該遺伝子座で多数の系統の遺伝子型を同定すること、該ヌクレオチド配列を配列アライメントプログラム（例えばＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）で整列させること、およびその後該アライメントのコンセンサス配列を得ることにより得られる。
【０１６２】
「再生」は植物細胞（例えば植物のプロトプラスト、カルス若しくは外植体）から植物を成長させる過程である。
【０１６３】
「Ｓｔｉｆｆ  Ｓｔａｌｋ」ヘテロ強勢群は北部米国およびカナダのトウモロコシ栽培
地域における主要ヘテロ強勢群を表す。それはまたＩｏｗａ  Ｓｔｉｆｆ  Ｓｔａｌｋ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ（すなわちＢＳＳＳ）ヘテロ強勢群とも称することができる。
【０１６４】
「形質転換」という用語は、その中で外来性ＤＮＡが染色体中に組み込まれる若しくは自己複製が可能である細胞若しくはプロトプラスト中に、ＤＮＡ配列若しくは構築物（例えばベクター若しくは発現カセット）を導入する過程を指す。
【０１６５】
「ストリンジェントな条件下」という句は、プローブ若しくはポリヌクレオチドが、典型的には核酸の複雑な混合物中で特定の１核酸配列にハイブリダイズすることができるが、しかし本質的に他の配列にしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして異なる環境で異なることができる。
【０１６６】
より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されるイオン強度ｐＨで特定の配列について熱的融点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）より約５〜１０℃より低くなるよう選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されるイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）であり（標的配列がＴｍで過剰に存在する際に、プローブの５０が平衡で占有される）、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０ないし８．３で塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍナトリウムイオン濃度（若しくは他の塩）であるものであることができ、ならびに、温度は短いプローブ（例えば１０ないし５０ヌクレオチド）について最低約３０℃、および長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド以上）について最低約６０℃である。ストリンジェントな条件はホルムアミドのような不安定化剤の添加でもまた達成しうる。選択的すなわち特異的ハイブリダイゼーションについて、正の信号はバックグラウンドの最低２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、しばしば：６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴う、４２℃でインキュベートする５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、若しくは６５℃でインキュベートする５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳである。ＰＣＲについて、約３６℃の温度は低ストリンジェンシー増幅に典型的であるとは言え、アニーリング温度はプライマー長さに依存して約３２℃と４８℃の間で変動しうる。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するための付加的な指針が多数の参考文献に提供されている。
【０１６７】
配列アライメントおよび同一性パーセント計算は、限定されるものでないがＬＡＳＥＲＧＥＮＥ．ＲＴＭ．バイオインフォーマティクスコンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ．ＲＴＭ．Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マディソン）のＭＥＧＡＬＩＧＮ．ＲＴＭプログラムを挙げることができる、相同的配列を検出するよう設計された多様な比較方法を使用して決定しうる。別の方法で述べられない限り、本明細書に提供される配列の複数のアライメントは、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）を用いてＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９））を使用して実施し、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用するタンパク質配列の対のアライメントおよび同一性パーセントの計算のためのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸について、これらパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用する配列のアライメント後に、同一プログラム上の「配列距離」表を見ることにより「同一性パーセント」および「相違」を得ることが可能であり；別の方法で述べられない限り、本明細書で提供かつ特許請求される同一性パーセントおよび相違はこの様式で計算した。
【０１６８】
「ベクター」は、宿主細胞中で複製が可能でありかつ／若しくは付属されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントがそれに効果的に連結され得るＤＮＡ分子である。プラスミドは１例示的ベクターである。
【０１６９】
本発明を詳細に記述する前に、本発明は特定の態様に制限されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は特定の態様を記述する目的上でありかつ制限することを意図していないこともまた理解されるべきである。本明細書および付録として追加される請求の範囲で使用されるところの、単数および単数形例えば「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「該（ｔｈｅ）」の用語は、文脈が別の方法で明確に指図しない限り複数の指示対象を包含する。従って、例えば、「植物（ｐｌａｎｔ）」、「該植物（ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ）」若しくは「ある植物（ａ  ｐｌａｎｔ）」への言及は複数の植物もまた包含する。文脈に依存して、「植物」という用語の使用はその植物の遺伝子的に類似若しくは同一の子孫もまた包含し得る。「ある核酸（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」という用語の使用は、場合によってはその核酸分子の多くのコピーを包含する。
【０１７０】
遺伝子マッピング
増大された培養能および形質転換能のような特定の表現型と相関する特定の遺伝子座が１生物体のゲノム中でマッピングされ得ることが、かなり長い間認識されている。植物育種家は、連鎖不平衡として明示される所望の表現型を伴う同時分離の統計学的に有意の確率を示すマーカー対立遺伝子を検出することにより所望の個体を同定するために、分子マーカーを有利に使用し得る。目的の形質と同時分離する１分子マーカー若しくは分子マーカーのクラスターを同定することにより、育種家は、適正な分子マーカー対立遺伝子について選択することにより所望の表現型を迅速に選択することが可能である（マーカー支援選抜若しくはＭＡＳと呼ばれる方法）。
【０１７１】
当該技術分野で公知の多様な方法が、増大された培養能および形質転換能のような目的の形質と同時分離する分子マーカー若しくは分子マーカーのクラスターを検出するために利用可能である。これらの方法の根底にある基本概念は、それについて代替の遺伝子型（若しくは対立遺伝子）が大きく異なる平均的表現型を有するマーカーの検出である。従って、代替遺伝子型（若しくは対立遺伝子）間の差違の大きさまたはその差違の有意性のレベルのマーカー遺伝子座間の比較を行う。形質遺伝子は、最大の関連する遺伝子型の差違を有するマーカー（１若しくは複数）の最も近くに配置されていることが推論される。
【０１７２】
目的の形質遺伝子座を検出するのに使用される２つのこうした方法は：１）集団に基づく連関分析および２）伝統的な連鎖分析である。集団に基づく連関分析において、系統を、複数の始祖例えば有望育種系統をもつ既存集団から得る。集団に基づく連関分析は、連鎖不平衡（ＬＤ）の消滅、および、非構造化集団において、目的の形質を制御する遺伝子とそれらの遺伝子に緊密に連鎖されるマーカーの間の相関のみが非常に多くの世代の任意交配後に留まることができるという概念に頼る。現実には、ほとんどの既存集団は集団下部構造を有する。従って、構造化関連アプローチの使用は、ゲノム全体にランダムに分布されているマーカーから得られるデータを使用して個体を集団に割り当てることにより集団構造を制御するのを助け、それにより個別の集団（亜集団ともまた呼ばれる）内の集団構造による不平衡を最小化する。表現型値を、亜集団中の各系統のそれぞれのマーカー遺伝子座で遺伝子型（対立遺伝子）と比較する。重大なマーカーと形質の関連は、マーカー遺伝子座と、その形質の発現に関与する１若しくはそれ以上の遺伝子座の間の近い近接を示す。
【０１７３】
同一の原理が伝統的連鎖分析の根底にあるが；しかしながら、ＬＤは少数の始祖から１集団を創成することにより生成される。該始祖は構築された集団内の多形のレベルを最大
化するよう選択され、そして多形の部位を、所定の１表現型を伴う同時分離のそれらのレベルについて評価する。多数の統計学的方法が重大なマーカーと形質の関連を同定するのに使用されている。１つのこうした方法は区間マッピングのアプローチ（ＬａｎｄｅｒとＢｏｔｓｔｅｉｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２１：１８５−１９９（１９８９）であり、ここで遺伝子地図に沿った多くの位置のそれぞれ（１ｃＭ区間で言う）を、目的の形質を制御する遺伝子がその位置に配置される尤度について試験する。遺伝子型／表現型データを使用してＬＯＤスコア（尤度比の対数）を各試験位置について計算する。ＬＯＤスコアが閾値を超える場合、遺伝子地図上のその位置に、目的の形質を制御する遺伝子の場所（特定の２マーカー遺伝子座間に入ることができる）についての重大な証拠が存在する。
【０１７４】
上述されたとおり、当該技術分野で公知の方法が、増大された培養能および形質転換能のような目的の形質と同時分離する分子マーカー若しくは分子マーカーのクラスターを検出するために利用可能である。しかしながら、培養、形質転換および再生の行為のようなある種の実験的処置は、目的の形質の遺伝子領域を含有する植物のみが生存しかつＢＣ1植物になることが可能であるように、植物の遺伝子的に分離する集団に選択圧を適用する。その後、ある遺伝子座が目的の形質に重要である場合には、親の一方により運搬される１対立遺伝子が選択されるであろう。従って、選択圧を適用した後にゲノムを走査する場合、目的の形質に重要である対立遺伝子は５０％以上の頻度で存在する。５０％以上への大きな逸脱を示すマーカーは選択の正の効果を示す遺伝子座を表し、そしてχ2検定（ｐ＜０．０５）を使用して同定し得る。こうした分子マーカー検出方法を内に記述する。
【０１７５】
増大された培養能および形質転換能と関連するマーカー。
【０１７６】
増大された培養能および形質転換能と関連するマーカーが本明細書で同定される。該方法は、トウモロコシ植物の生殖質の強化と関連する最低１種のマーカー対立遺伝子の存在を検出することを必要とする。該マーカー遺伝子座は、ＰＺＡ０１２１６．１、ＤＡＳ＿ＰＺ−７１４６、ＤＡＳ−ＰＺ−１２６８５、ｍａｇｉ１７７６１、Ｍｏ１７−１００１７７、ＤＡＳ−ＰＺ−５６１７、ＤＡＳ−ＰＺ−２３４３、ＰＺＡ０３２０３−２、Ｍｏ１７−１００２９１、ＰＺＡ０３4０９、ＤＡＳ−ＰZ−１９１８８、ＤＡＳ−ＰＺ−２０４３、ＤＡＳ−ＰＺ−２０５７０、ＰＺＡ０２９６５、Ｍｏ１７−１４５１９、ＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６、ｍａｇｉ５２１７８およびＤＡＳ−ＰＺ−３６６、ならびにこれらマーカーに連鎖されるいかなる他のマーカー（連鎖されるマーカーはＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースから決定し得る）も包含する、表１に提供されるマーカー遺伝子座のいずれからも選択し得る。
【０１７７】
単一染色体上のゲノムＤＮＡの隣接した直線状の区間上に配置される遺伝要素すなわち遺伝子は物理的に連結されている。双方が培養能および形質転換能と高度に関連するマーカーａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５が、培養能および形質転換能のＱＴＬの輪郭を描く。ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきａｓｇ６２に９５％同一であるヌクレオチド配列、ならびにｍａｇｉ８７５３５若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｍａｇｉ８７５３５に９５％同一であるヌクレオチド配列の間かつこれらを包含する隣接ＤＮＡに集合するいかなるポリヌクレオチドも、培養能および形質転換能と関連するマーカー遺伝子座を収容し得る。公的に利用可能なマーカーの配列はＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースを使用して見出し得る。
【０１７８】
さらに、双方が培養能および形質転換能と高度に関連するｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂが、培養能および形質転換能のＱＴＬの輪郭を描く。ｎｐｉ３８６ａ若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｎｐｉ３８６ａに９５％同一であるヌクレオチド配列、およびｇｐｍ１７４ｂ若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｇｐｍ１７４ｂに９５％同一であるヌクレオチド配列の間かつこれらを包含する隣接ＤＮＡに
集合するいかなるポリヌクレオチドも、培養能および形質転換能と関連するマーカー遺伝子座を収容し得る。公的に利用可能なマーカーの配列はＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースを使用して見出し得る。
【０１７９】
さらに、双方が培養能および形質転換能と高度に関連するａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４が、培養能および形質転換能のＱＴＬの輪郭を描く。ａｇｒｒ３７ｂ若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきａｇｒｒ３７ｂに９５％同一であるヌクレオチド配列、およびｎｆａ１０４若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｎｆａ１０４に９５％同一であるヌクレオチド配列の間かつこれらを包含する隣接ＤＮＡに集合するいかなるポリヌクレオチドも、培養能および形質転換能と関連するマーカー遺伝子座を収容し得る。公的に利用可能なマーカーの配列はＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースを使用して見出し得る。
【０１８０】
さらに、双方が培養能および形質転換能と高度に関連するｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８が、培養能および形質転換能のＱＴＬの輪郭を描く。ｕｍｃ１５６ａ若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｕｍｃ１５６ａに９５％同一であるヌクレオチド配列、およびｐｃｏ０６１５７８若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｐｃｏ０６１５７８に９５％同一であるヌクレオチド配列の間かつこれらを包含する隣接ＤＮＡに集合するいかなるポリヌクレオチドも、培養能および形質転換能と関連するマーカー遺伝子座を収容し得る。公的に利用可能なマーカーの配列はＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースを使用して見出し得る。
【０１８１】
さらに、双方が培養能および形質転換能と高度に関連するｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８が、培養能および形質転換能のＱＴＬの輪郭を描く。ｐｈｐ２０６０８ａ若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｐｈｐ２０６０８ａに９５％同一であるヌクレオチド配列、およびｉｄｐ６６３８若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｉｄｐ６６３８に９５％同一であるヌクレオチド配列の間かつこれらを包含する隣接ＤＮＡに集合するいかなるポリヌクレオチドも、培養能および形質転換能と関連するマーカー遺伝子座を収容し得る。公的に利用可能なマーカーの配列はＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースを使用して見出し得る。
【０１８２】
さらに、双方が培養能および形質転換能と高度に関連するｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２が、培養能および形質転換能のＱＴＬの輪郭を描く。ｂｎｌ４．３６若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｂｎｌ４．３６に９５％同一であるヌクレオチド配列、およびｕｍｃ１４８２若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｕｍｃ１４８２に９５％同一であるヌクレオチド配列の間かつこれらを包含する隣接ＤＮＡに集合するいかなるポリヌクレオチドも、培養能および形質転換能と関連するマーカー遺伝子座を収容し得る。公的に利用可能なマーカーの配列はＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースを使用して見出し得る。
【０１８３】
さらに、双方が培養能および形質転換能と高度に関連するｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２が、培養能および形質転換能のＱＴＬの輪郭を描く。ｕｍｃ１２６ａ若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｕｍｃ１２６ａに９５％同一であるヌクレオチド配列、およびｉｄｐ８３１２若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｉｄｐ８３１２に９５％同一であるヌクレオチド配列の間かつこれらを包含する隣接ＤＮＡに集合するいかなるポリヌクレオチドも、培養能および形質転換能と関連するマーカー遺伝子座を収容し得る。公的に利用可能なマーカーの配列はＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースを使用して見出し得る。
【０１８４】
さらに、双方が培養能および形質転換能と高度に関連するｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐ
ｍ６０９ａが、培養能および形質転換能のＱＴＬの輪郭を描く。ｂｎｌ９．１１ａ若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｂｎｌ９．１１ａに９５％同一であるヌクレオチド配列、およびｇｐｍ６０９ａ若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｇｐｍ６０９ａに９５％同一であるヌクレオチド配列の間かつこれらを包含する隣接ＤＮＡに集合するいかなるポリヌクレオチドも、培養能および形質転換能と関連するマーカー遺伝子座を収容し得る。公的に利用可能なマーカーの配列はＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースを使用して見出し得る。
【０１８５】
さらに、双方が培養能および形質転換能と高度に関連するｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９が、培養能および形質転換能のＱＴＬの輪郭を描く。ｗｘ１若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｗｘ１に９５％同一であるヌクレオチド配列、およびｂｎｌｇ１２０９若しくはＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアライメント法に基づきｂｎｌｇ１２０９に９５％同一であるヌクレオチド配列の間かつこれらを包含する隣接ＤＮＡに集合するいかなるポリヌクレオチドも、培養能および形質転換能と関連するマーカー遺伝子座を収容し得る。公的に利用可能なマーカーの配列はＭａｉｚｅ  ＧＤＢリソースを使用して見出し得る。
【０１８６】
連鎖の１普遍的尺度は形質が同時分離する頻度である。これは同時分離のパーセンテージ（組換え頻度）として、若しくはセンチモルガン（ｃＭ）で表現し得る。ｃＭは遺伝子組換え頻度の尺度の単位である。１ｃＭは１遺伝子座の１形質が単一世代において乗換えにより別の遺伝子座の形質から切り離されることができる１％の可能性に等しい（該形質が９９％の確率で一緒に分離することを意味している）。染色体距離は形質間の乗換え事象の頻度にほぼ比例するため、組換え頻度と相関する近似の物理的距離が存在する。
【０１８７】
マーカー遺伝子座はそれら自体形質であり、そして分離中のマーカー遺伝子座を追跡することにより標準的連鎖分析に従って評価し得る。従って、１ｃＭは、あるマーカー遺伝子座が単一世代において乗換えにより別の遺伝子座から分離されることができる１％の可能性に等しい。
【０１８８】
表２に列挙されるマーカーに連鎖される他のマーカーを、トウモロコシ植物における培養能および形質転換能を予測するのに使用し得る。これは、ＰＺＡ０１２１６．１、ＤＡＳ−ＰＺ−７１４６、ＤＡＳ−ＰＺ−１２６８５、ｍａｇｉ１７７６１、Ｍｏ１７−１００１７７、ＤＡＳ−ＰＺ−５６１７、ＤＡＳ−ＰＺ−２３４３、ＰＺＡ０３２０３−２、Ｍｏ１７−１００２９１、ＰＺＡ０３４０９、ＤＡＳ−ＰＺ−１９１８８、ＤＡＳ−ＰＺ−２０４３、ＤＡＳ−ＰＺ−２０５７０、ＰＺＡ０２９６５、Ｍｏ１７−１４５１９、ＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６、ｍａｇｉ５２１７８およびＤＡＳ−ＰＺ−３６６の５０ｃＭ以内のいかなるマーカーも包含し、該マーカーは培養能および形質転換能を関連させる。あるマーカーが目的の形質を制御する遺伝子に近いほど、そのマーカーは所望の形質の指標としてより効果的かつ有利になる。緊密に連鎖された遺伝子座は、約１０％若しくはより小さい、好ましくは約９％若しくはより小さい、さらにより好ましくは約８％若しくはより小さい、なおまたより好ましくは約７％若しくはより小さい、さらにより好ましくは約６％若しくはより小さい、なおまたより好ましくは約５％若しくはより小さい、さらにより好ましくは約４％若しくはより小さい、なおまたより好ましくは約３％若しくはより小さい、そしてさらにより好ましくは約２％若しくはより小さい、遺伝子座間の乗換え頻度を表す。高度に好ましい態様において、関連する遺伝子座（例えばマーカー遺伝子座と標的遺伝子座）は、約１％若しくはより小さい、例えば約０．７５％若しくはより小さい、より好ましくは約０．５％若しくはより小さい、またはなおまたより好ましくは約０．２５％若しくはより小さい組換え頻度を表す。従って、該遺伝子座は、約１０ｃＭ、９ｃＭ、８ｃＭ、７ｃＭ、６ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ、０．７５ｃＭ、０．５ｃＭ若しくは０．２５ｃＭまたはより少なく離れている  言い換えれば、同一染色体に、かつ、２遺伝子座間の組換えが１０％未満（例えば約９％、８％、７％、６％、５
％、４％、３％、２％  １％、０．７５％、０．５％、０．２５．度若しくはより小さい）の頻度で発生するような距離に局在化される２遺伝子座は、相互「に近接して」いると言われる。
【０１８９】
特定のマーカー対立遺伝子は増大された培養能および形質転換能を伴う同時分離を示し得るとは言え、該マーカー遺伝子座は必ずしも培養能および形質転換能の表現型の発現の原因ではないことに注目することが重要である。例えば、マーカーポリヌクレオチド配列が増大された培養能および形質転換能を付与する１遺伝子の一部である（例えば遺伝子読み取り枠の一部である）ことは要件ではない。特定の１マーカー対立遺伝子と増大された培養能および形質転換能の表現型の間の関連は、該マーカー対立遺伝子と、該対立遺伝子が発した祖先のトウモロコシ系統中の該対立遺伝子の間の元の「カップリング」連鎖相による。最終的に、反復する組換えで、マーカーと遺伝子座の間の乗換え事象がこの方向を変え得る。この理由上、好都合なマーカー対立遺伝子は、分離する集団を創成するのに使用される抵抗性の親内に存在する連鎖相に依存して変化しうる。これは、該マーカーを該表現型の分離を監視するのに使用し得るという事実を変えない。それは、どのマーカー対立遺伝子を所定の分離する集団中で好都合とみなすかを変えるのみである。
【０１９０】
「染色体間隔」という用語は、本発明に示されるマーカーのいずれかにより定義されるいかなるおよび全部の区間も指示する。培養能および形質転換能と相関する染色体間隔が提供される。第１染色体に配置される１区間は、ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５を含んでなりかつこれらにより隣接される。染色体間隔ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５の１下位区間がＰＺＡ０１２１６．１およびｍａｇｉ１７７６１である。第４染色体上に配置される別の区間は、ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂを含んでなりかつこれらにより隣接され、そしてＭｏ１７−１００１７７を包含する。第４染色体上に配置される別の区間は、ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４を含んでなりかつこれらにより隣接される。ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４の１下位区間がＤＡＳ−ＰＺ−５６１７およびＤＡＳ−ＰＺ−１９１８８である。第４染色体上に配置される別の区間は、ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８を含んでなりかつこれらにより隣接され、そしてＤＡＳ−ＰＺ−２０４３を包含する。第４染色体上に配置される別の区間は、ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８を含んでなりかつこれらにより隣接され、そしてＤＡＳ−ＰＺ−２０５７０を包含する。第５染色体上に配置される別の区間は、ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２を含んでなりかつこれらにより隣接され、そしてＰＺＡ０２９６５を包含する。第５染色体上に配置される別の区間は、ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２を含んでなりかつこれらにより隣接される。染色体間隔ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２の１下位区間がＭｏ１７−１４５１９およびＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６である。第８染色体上に配置される別の区間は、ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａを含んでなりかつこれらにより隣接され、そしてｍａｇｉ５２１７８を包含する。第９染色体上に配置される別の区間は、ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９を含んでなりかつこれらにより隣接され、そしてＤＡＳ−ＰＺ−３６６を包含する。
【０１９１】
当該技術分野で公知の多様な方法が染色体間隔を同定するために利用可能である。こうした染色体間隔の境界は、目的の形質を制御する遺伝子に連鎖されることができるマーカーを包含するよう引かれる。言い換えれば、その区間（該区間の境界を定義する末端マーカーを包含する）内にあるいかなるマーカーも培養能および形質転換能のマーカーとして使用し得るような染色体間隔が区分される。上述される区間は培養能および形質転換能と同時分離するマーカーの１クラスターを包含する。マーカーの該クラスター形成は該染色体上の比較的小さいドメイン中で発生し、それら染色体領域中の目的の形質を制御する遺伝子の存在を示す。該区間は培養能および形質転換能と同時分離するマーカーを包含するように区分された。該区間は、該区間内に位置するマーカーならびに該末端を定義するマーカーを包含する。例えば、ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５は、Ｓｔｉｆｆ  Ｓｔ
ａｌｋ亜集団中で培養能および形質転換能と同時分離するマーカーのクラスターを包含する１染色体間隔を定義する。第二の１例は下位区間ＰＺＡ０１２１６．１およびｍａｇｉ１７７６１を包含し、これらはＳｔｉｆｆ  Ｓｔａｌｋ亜集団中で培養能および形質転換能と同時分離するマーカーの１クラスターを包含する１染色体間隔を定義する。該区間の終点を定義する末端マーカーにより記述される区間は、末端マーカー、および、それらマーカーが現在既知であろうと未知であろうとその染色体ドメイン内に集中するいかなるマーカーも包含することができる。
【０１９２】
染色体間隔は、目的の１マーカー（と連鎖不平衡を示すよう）に連鎖されるマーカーによってもまた定義され得、そして関連研究の状況で連鎖不平衡（ＬＤ）の普遍的尺度である。ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５の区間、ＰＺＡ０１２１６．１およびｍａｇｉ１７７６１の下位区間、若しくはａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５のいずれかの他の下位区間内にあるいずれかの第１染色体マーカー遺伝子座と、増大された培養能および形質転換能と関連する１対立遺伝子を有するその区間内の同定された１マーカーとの間のＬＤのｒ2値が１／３以上である（Ａｒｄｌｉｅら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２９９−３０９（２００２））場合、該遺伝子座は連鎖されている。同様に、それは本明細書に記述されるいずかなる区間内のいかなるマーカーにも適用される。
【０１９３】
本発明のマーカーはまた、そうでなければハプロタイプとして知られるマーカー遺伝子座の対立遺伝子の組合せでもあり得る。当業者は、本明細書で同定される第１、４、５、８および９染色体のマーカー中およびその周囲のマーカー遺伝子座に追加の多形部位が存在しうることを期待するとみられ、ここで１若しくはそれ以上の多形部位が、増大された培養能および形質転換能と関連する１対立遺伝子と連鎖不平衡（ＬＤ）にある。異なる多形部位の特定の２対立遺伝子は、該部位の一方での該対立遺伝子の存在が同一染色体上の他の部位の該対立遺伝子の存在を予測する傾向がある場合に、ＬＤにあると言われる（Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｍｏｌ．Ｄｉａｇ．４：３０９−１７（１９９９））。
【０１９４】
マーカー支援選抜
分子マーカーは多様な植物育種応用で使用し得る（例えば、Ｓｔａｕｂら（１９９６）Ｈｏｒｔｓｃｉｅｎｃｅ  ７２９−７４１；Ｔａｎｋｓｌｅｙ（１９８３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １：３−８を参照されたい）。目的の主領域の１つは、マーカー支援選抜（ＭＡＳ）を使用して遺伝子を戻し交配および遺伝子浸透する効率を増大させることである。所望の表現型の形質に影響を及ぼす１遺伝子座との連鎖を示す１分子マーカーは、ある植物集団での該形質の選択のための有用なツールを提供する。これは、該表現型がアッセイすることが困難である、例えば多くの疾患抵抗性の形質、若しくは植物発達の後の段階で発生する、例えば穀粒の特徴の場合にとりわけ真実である。ＤＮＡマーカーアッセイはより少なく労力を要しかつ圃場若しくは温室の表現型決定より少ない物理的空間を占めるため、はるかにより大きな集団をアッセイし得、レシピエント系統に移動されるドナー系統からの標的セグメントをもつ組換え体を見出す可能性を増大させる。連鎖が緊密になるほど、該マーカーはより有用になる。組換えは該マーカーと該形質を引き起こす遺伝子の間で発生することがより少なくありそうであり、これが偽陽性をもたらし得るためである。隣接するマーカーを有することは、二重組換え事象が必要とされるであろうため、偽陽性選択が発生することができる可能性を低下させる。理想的な状況は、該遺伝子それ自体中に１マーカーを有することであり、その結果、組換えは該マーカーと該遺伝子の間で発生し得ない。こうしたマーカーは「完全マーカー」と呼ばれる。
【０１９５】
ある遺伝子がＭＡＳにより遺伝子浸透される場合、導入されるのは該遺伝子のみならずしかしまた隣接領域もである（Ｇｅｐｔｓ．（２００２）．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ；４２：１
７８０−１７９０）。これは「リンケージドラッグ」と称され、ドナー植物がレシピエント植物に高度に無関係である場合、これら隣接領域は農学的に望ましくない形質をコードしうる追加の遺伝子を運搬する。この「リンケージドラッグ」は、有望トウモロコシ系統への複数サイクルの戻し交配後でさえ、低下された収量若しくは他の負の農学的特徴もまたもたらしうる。これはまたときに「収量低下」とも称される。隣接領域の大きさは追加の戻し交配により低下され得るとは言え、育種家は該領域の大きさ若しくは組換えブレイクポイントに対する制御を有しないため、これは常に成功裏でない（Ｙｏｕｎｇら、（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０：５７９−５８５）。古典的育種において、ドナーセグメントの大きさの低減に寄与する組換えが選択されることは通常偶然にのみである（Ｔａｎｋｓｌｅｙら（１９８９）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：２５７−２６４）。この種類の戻し交配における２０回の戻し交配後でさえ、選択されている遺伝子になお連鎖されるドナー染色体の相当な大きさの片を見出すことを期待しうる。しかしながらマーカーを用いて、目的の遺伝子近くの組換えを経験したまれな個体を選択することが可能である。１５０の戻し交配植物において、最低１植物が単一減数分裂地図距離に基づき該遺伝子の１ｃＭ以内の乗換えを経験していることができる９５％の可能性が存在する。マーカーはそれら個体の決定的な同定を明言することができる。３００植物の追加の１戻し交配で、該遺伝子の他の側の１ｃＭの単一減数分裂地図距離内の１個の乗換えの９５％の可能性が存在するとみられ、単一減数分裂地図距離に基づき２ｃＭ未満の標的遺伝子周囲のセグメントを生成する。これはマーカーを用いて２世代で達成され得る一方、それはマーカーなしで平均１００世代を必要としたとみられる（Ｔａｎｋｓｌｅｙら、上記を参照されたい）。ある遺伝子の正確な場所が既知である場合、該遺伝子の周囲の隣接するマーカーを、多様な集団の大きさでの組換えについて選択するのに利用し得る。例えば、より小さい集団の大きさにおいて、組換えは該遺伝子からさらに離れて期待されることができ、従ってより遠位の隣接するマーカーが該組換えを検出するのに必要とされるとみられる。
【０１９６】
増大する密度の公的トウモロコシマーカーを含有するトウモロコシゲノムの統合された連鎖地図の利用可能性が、トウモロコシの遺伝子マッピングおよびＭＡＳを助長した。例えば、Ｍａｉｚｅ  ＧＤＢウェブサイト上でオンラインで利用可能であるＩＢＭ２  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ地図を参照されたい。
【０１９７】
ＭＡＳの実施の重要な要素は：（ｉ）分離する集団すなわちランダム若しくは構造化集団であり得る、それ内でマーカーと形質の関連を決定することができる集団を定義すること：（ｉｉ）該形質に関する多形マーカーの分離若しくは関連を監視すること、および統計学的方法を使用して連鎖若しくは関連を決定すること：（ｉｉｉ）統計学的解析の結果に基づき１組の所望のマーカーを定義すること、ならびに（ｉｖ）マーカーに基づく選択の決定が下されることを可能にするための育種生殖質の現在の組へのこの情報の使用および／若しくは外挿である。本開示に記述されるマーカーならびにＳＳＲおよびＦＬＰのような他のマーカーの種類を、マーカー支援選抜プロトコルで使用し得る。
【０１９８】
ＳＳＲは、６ｂｐ若しくはより小さい長さをもつ縦列反復ＤＮＡの比較的短いひと続き（ｒｕｎ）と定義し得る（Ｔａｕｔｚ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：６４６３−６４７１；Ｗａｎｇら（１９９４）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ
ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８８：１−６）多形は、おそらくＤＮＡ複製中の翻訳スリップにより引き起こされる反復単位の数の変動により生じる（ＬｅｖｉｎｓｏｎとＧｕｔｍａｎ（１９８７）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ４：２０３−２２１）。反復長さの変動は、保存された反復しない隣接領域に対しＰＣＲプライマーを設計することにより検出することができ（ＷｅｂｅｒとＭａｙ（１９８９）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．４４：３８８−３９６）、ＳＳＲは、それらが複対立、共優性、再現可能でありかつハイスループット自動化の影響を受けやすいため、マッピングおよびＭＡＳに高度に適する（Ｒａｆａｌｓｋｉら（１９９６）Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎ
ｇ  ＤＮＡ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｎｏｎ−ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ中、ｐｐ  ７５−１３５）。
【０１９９】
多様な種類のＳＳＲマーカーを生成し得、そして抵抗性系統からのＳＳＲプロファイルを増幅産物のゲル得電気泳動により得ることができる。マーカーの遺伝子型のスコアリングは増幅されたフラグメントの大きさに基づく。トウモロコシのＳＳＲサービスが、カナダ国ケベック州サン・ジャン・シュル・リシュリューのＤＮＡ  Ｌａｎｄｍａｒｋｓにより契約に基づいて公衆に利用可能である。
【０２００】
多様な種類のＦＬＰマーカーもまた生成し得る。最も普遍的には、増幅プライマーを使用して断片長多形を生成する。こうしたＦＬＰマーカーは、該プライマーにより増幅される領域が典型的には高度に反復する領域でないことを除き、多くの点でＳＳＲマーカーに類似している。それでもなお、該増幅された領域すなわちアンプリコンは、しばしば挿入若しくは欠失により生殖質間で十分な変動性を有することができ、その結果該増幅プライマーにより生成されるフラグメントが多形の個体間で識別され得、そしてこうしたインデルはトウモロコシで頻繁に発生することが知られている（Ｂｈａｔｔｒａｍａｋｋｉら（２００２）．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８、５３９−５４７；Ｒａｆａｌｓｋｉ（２００２ｂ）、上記）。
【０２０１】
ＳＮＰマーカーは単一塩基対ヌクレオチド置換を検出する。全部の分子マーカーの種類のうち、ＳＮＰは最も豊富であり、従って最高の遺伝子地図分解能を提供する可能性を有する（Ｂｈａｔｔｒａｍａｋｋｉら  ２００２  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８：５３９−５４７）。ＳＮＰはいわゆる「超ハイスループット」様式でＳＳＲよりなおより高レベルのスループットでアッセイされ得る。それらが大量のＤＮＡを必要とせずかつ該アッセイの自動化が簡単でありうるからである。ＳＮＰは比較的低コストシステムであるという見込みもまた有する。これら３因子が一緒になって、ＳＮＰをＭＡＳでの使用について高度に魅力的にする。限定されるものでないがハイブリダイゼーション、プライマー伸長、オリゴヌクレオチドライゲーション、ヌクレアーゼ切断、ミニシークエンシングおよびコード化領域（ｃｏｄｅｄ  ｓｐｈｅｒｅ）を挙げることができるいくつかの方法が、ＳＮＰ遺伝子型同定に利用可能である。こうした方法は：Ｇｕｔ（２００１）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  １７  ｐｐ，４７５−４９２：Ｓｈｉ（２００１）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４７、ｐｐ．１６４−１７２；Ｋｗｏｋ（２０００）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １、ｐｐ．９５−１００：ＢｈａｔｔｒａｍａｋｋｉとＲａｆａｌｓｋｉ（２００１）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｒ，Ｊ  Ｈｅｎｒｙ、編、Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：Ｔｈｅ  ＤＮＡ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、ＣＡＢＩ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ウォーリングフォード中で総説されている。広範な商業的に利用可能な技術は、これら、およびＭａｓｓｃｏｄｅTM（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｎａｐＳｈｏｔ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＢｅａｄａｒｒａｙｓTM（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を包含するＳＮＰを調べる他の方法を利用する。
【０２０２】
１配列内若しくは連結された配列にわたる一緒の多数のＳＮＰを、いずれか特定の遺伝子型についてハプロタイプを記述するのに使用し得る（Ｃｈｉｎｇら（２００２）、ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔ．３：１９  ｐｐ  Ｇｕｐｔａら  ２００１、Ｒａｆａｌｓｋｉ（２００２ｂ）、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６２：３２９−３３３）。ハプロタイプは単一ＳＮＰよりもより情報を提供し得、そしていずれか特定の遺伝子型をより記述し得る。例
えば、単一ＳＮＰは増大された培養能および形質転換能をもつ特定の１系統若しくは変種について対立遺伝子「Ｔ」でありうるが、しかし、該対立遺伝子「Ｔ」は反復親について利用されているトウモロコシ育種集団でもまた存在しうる。この場合、あるハプロタイプ、例えば連鎖されたＳＮＰマーカーの対立遺伝子のある組合せがより情報を提供しうる。ある独特のハプロタイプがあるドナー染色体領域に一旦割り当てられれば、そのハプロタイプを、ある個体が特定の１遺伝子を有するかどうかを決定するためにその集団若しくはそのいずれかのサブセットで使用し得る。例えば第ＷＯ２００３０５４２２９号明細書を参照されたい。当業者に既知の自動化ハイスループットマーカー検出プラットフォームを使用することが、この過程を高度に効率的かつ効果的にする。
【０２０３】
表２に列挙される配列を、本開示に列挙されるＱＴＬ区間内の追加の多形ＳＮＰ（および他のマーカー）を得るために容易に使用し得る。記述される地図領域内のマーカーを、記述されるマーカーと同一の近接した場所で新たな配列を見出すために、ＢＡＣ若しくは他のゲノムライブラリーにハイブリダイズ、またはゲノム配列と電子的に整列し得る。
【０２０４】
上述されたところのＳＳＲ、ＦＬＰおよびＳＮＰに加え、限定されるものでないが発現配列タグ（ＥＳＴ）から開発されるマーカー、ＥＳＴ配列由来のＳＳＲマーカー、ランダム増幅多形ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、および他の核酸に基づくマーカーを挙げることができる他の種類の分子マーカーもまた広範に使用される。
【０２０５】
イソ酵素プロファイルおよび連鎖される形態学的特徴を、いくつかの場合においてマーカーとして間接的にもまた使用し得る。それらはＤＮＡの差違を直接検出しないにしても、それらはしばしば、特定の遺伝子の差違により影響される。しかしながら、ＤＮＡの変動を検出するマーカーは、イソ酵素若しくは形態学的マーカーよりはるかにより多数かつ多形である（Ｔａｎｋｓｌｅｙ（１９８３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １：３−８）。
【０２０６】
配列アライメント若しくはコンティグもまた、本明細書に列挙される特定のマーカーの上流若しくは下流の配列を見出すのに使用しうる。本明細書に記述されるマーカーに近いこれら新たな配列が、その場合、機能的に同等のマーカーを発見および開発するのに使用される。例えば、異なる物理的および／若しくは遺伝子地図を整列して、本開示内に記述されないがしかし類似の領域内にある同等のマーカーの位置を決定する。これら地図は、トウモロコシ種内に、またはコメ、コムギ、オオムギ若しくはモロコシのようなトウモロコシと遺伝子的若しくは物理的に整列されている他の種にわたってさえありうる。
【０２０７】
一般に、ＭＡＳは培養能および形質転換能との同時分離の大きな尤度を有すると同定された多形マーカーを使用する。こうしたマーカーは、該植物にその培養能および形質転換能の表現型を与える遺伝子（１若しくは複数）近くに位置付けられると推定され、かつ、所望の形質若しくはマーカーの指標とみなされる。植物を該マーカー中の所望の１対立遺伝子の存在について試験し、そして１若しくはそれ以上の遺伝子座に所望の遺伝子型を含有する植物は、所望の遺伝子型を所望の表現型と一緒にそれらの子孫に移すことが期待される。指定される１対立遺伝子を、ＰＺＡ０１２１６．１、ＤＡＳ−ＰＺ−７１４６、ＤＡＳ−ＰＺ−１２６８５、ｍａｇｉ１７７６１、Ｍｏ１７−１００１７７、ＤＡＳ−ＰＺ−５６１７、ＤＡＳ−ＰＺ−２３４３、ＰＺＡ０３２０３−２、Ｍｏ１７−１００２９１、ＰＺＡ０３４０９、ＤＡＳ−ＰＺ−１９１８８、ＤＡＳ−ＰＺ−２０４３、ＤＡＳ−ＰＺ−２０５７０、ＰＺＡ０２９６５、Ｍｏ１７−１４５１９、ＤＡＳ−ＰＺ−１２２３６、ｍａｇｉ５２１７８およびＤＡＳ−ＰＺ−３６６を包含する、本明細書に記述されるマーカー遺伝子座のいずれか１つに有する植物を同定することにより、増大された培養能および形質転換能を有するトウモロコシ植物を同定するための手段が、本明細書に提示される。
【０２０８】
本明細書に提示される区間は、増大された培養能および形質転換能を示す植物を選択するためのＭＡＳにおける使用を見出す。ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５により定義されかつこれらを包含する第１染色体の区間内に位置するいかなるマーカーも本目的上使用し得る。加えて、ａｓｇ６２およびｍａｇｉ８７５３５により定義されかつこれらを包含する第１染色体の区間内の１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを、増大された培養能および形質転換能をトウモロコシ系統若しくは変種に導入するのに使用し得る。
【０２０９】
ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂにより定義されかつこれらを包含する第４染色体の区間内に位置するいかなるマーカーも本目的上使用し得る。加えて、ｎｐｉ３８６ａおよびｇｐｍ１７４ｂにより定義されかつこれらを包含する第４染色体の区間内の１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを、増大された培養能および形質転換能をトウモロコシ系統若しくは変種に導入するのに使用し得る。
【０２１０】
ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４により定義されかつこれらを包含する第４染色体の区間内に位置するいかなるマーカーも本目的上使用し得る。加えて、ａｇｒｒ３７ｂおよびｎｆａ１０４により定義されかつこれらを包含する第４染色体の区間内の１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを、増大された培養能および形質転換能をトウモロコシ系統若しくは変種に導入するのに使用し得る。
【０２１１】
ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８により定義されかつこれらを包含する第４染色体の区間内に位置するいかなるマーカーも本目的上使用し得る。加えて、ｕｍｃ１５６ａおよびｐｃｏ０６１５７８により定義されかつこれらを包含する第４染色体の区間内の１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを、増大された培養能および形質転換能をトウモロコシ系統若しくは変種に導入するのに使用し得る。
【０２１２】
ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８により定義されかつこれらを包含する第４染色体の区間内に位置するいかなるマーカーも本目的上使用し得る。加えて、ｐｈｐ２０６０８ａおよびｉｄｐ６６３８により定義されかつこれらを包含する第４染色体の区間内の１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを、増大された培養能および形質転換能をトウモロコシ系統若しくは変種に導入するのに使用し得る。
【０２１３】
ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２により定義されかつこれらを包含する第５染色体の区間内に位置するいかなるマーカーも本目的上使用し得る。加えて、ｂｎｌ４．３６およびｕｍｃ１４８２により定義されかつこれらを包含する第５染色体の区間内の１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを、増大された培養能および形質転換能をトウモロコシ系統若しくは変種に導入するのに使用し得る。
【０２１４】
ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２により定義されかつこれらを包含する第５染色体の区間内に位置するいかなるマーカーも本目的上使用し得る。加えて、ｕｍｃ１２６ａおよびｉｄｐ８３１２により定義されかつこれらを包含する第５染色体の区間内の１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを、増大された培養能および形質転換能をトウモロコシ系統若しくは変種に導入するのに使用し得る。
【０２１５】
ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａにより定義されかつこれらを包含する第８染色体の区間内に位置するいかなるマーカーも本目的上使用し得る。加えて、ｂｎｌ９．１１ａおよびｇｐｍ６０９ａにより定義されかつこれらを包含する第８染色体の区間内の１若
しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを、増大された培養能および形質転換能をトウモロコシ系統若しくは変種に導入するのに使用し得る。
【０２１６】
ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９により定義されかつこれらを包含する第９染色体の区間内に位置するいかなるマーカーも本目的上使用し得る。加えて、ｗｘ１およびｂｎｌｇ１２０９により定義されかつこれらを包含する第９染色体の区間内の１若しくはそれ以上のマーカー遺伝子座に対立遺伝子を含んでなるハプロタイプを、増大された培養能および形質転換能をトウモロコシ系統若しくは変種に導入するのに使用し得る。
【０２１７】
増大された培養能および形質転換能と関連する対立遺伝子と連鎖不平衡にあるいかなる対立遺伝子若しくはハプロタイプも、増大された培養能および形質転換能をもつ植物を選択するためＭＡＳで使用し得る。
【実施例】
【０２１８】
以下の実施例は具体的に説明するために提供されるがしかし付録として追加される請求の範囲を制限するためでない。本明細書に記述される実施例および態様は具体的説明の目的上のみであること、ならびに、当業者は、本発明の技術思想若しくは付録として追加される請求の範囲の範囲から離れることなく変えられ得る多様な試薬若しくはパラメータを認識することができることが理解される。
【実施例１】
【０２１９】
植物材料
初期交配を、高度に形質転換可能な系統Ａ１８８とダウ  アグロサイエンシィズ（ＤＡＳ）有望近交系Ｄ０４６３５８およびＳＬＢ２４の間で行った。これら集団からのＦ1植物をその後有望系統に戻し交配し、そして未熟なＢＣ1（戻し交配１）胚を収集し、培養しかつＢＣ1植物に再生した。再生された植物からの葉組織を収集し、そして、ＤＮＡを、Ｂｉｏｃｅｌ  １８００ロボットプラットフォーム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）およびＱｉａｇｅｎ  ＭａｇＡｔｔｒａｃｔプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して抽出した。
【実施例２】
【０２２０】
胚の収集
Ｄ０４６３５８およびＳＬＢ２４集団からの穂を、次亜塩素酸ナトリウム（５％）および２滴のＴｗｅｅｎ  ２０の２０％溶液中の２０〜３０分間の浸漬により表面滅菌し、次いで滅菌水で３回すすいだ。未熟接合胚（１．０〜２．０ｍｍ）を各穂から無菌的に切開し、そしてアグロバクテリウム属（Ａｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染のため微小遠心管にランダムに分配した。胚は、複数の穂が同一系統から入手可能であった場合にプールした。
【実施例３】
【０２２１】
再生能力についてのスクリーニング
異なる系統および交配からの胚を、培養で再生するそれらの能力についてスクリーニングした。形質転換に使用された穂のそれぞれからの少数の胚（５〜３０）を、選択剤を欠く２種類の培地（ＺＭ００００２２３４若しくはＺＭ００００１３４１、表１．５若しくは１．４）上でプレーティングした。培養物を暗所で２８℃で１４日間インキュベートした。増殖された胚を同一種類の培地上で継代し、そして暗所で２８℃で別の１４日間インキュベートした。胚形成カルスを再生培地（ＺＭ００００２３８８、表１．８）に移し、そして、平方メートルあたり秒あたり８０〜１００マイクロモル（μｍｏｌ  ｍ-2ｓ-1）の光強度を伴う１６／８時間（ｈ）の明／暗下２８℃で１０〜１４日間インキュベートした。若芽（ｓｈｏｏｔ）が開始されたカルスを第二の種類の再生培地（ＺＭ００００２２
４２、表１．１０）に移し、そして８０〜１００μｍｏｌ  ｍ-2ｓ-1の光強度を伴う１６／８ｈの明／暗下２８℃で１０〜１４日間インキュベートした。再生頻度を、プレーティングされた胚の数により除算される、最低１個の若芽を再生した胚の数として推定した。
【実施例４】
【０２２２】
形質転換
実施例４．１：アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株および構築物
スーパーバイナリーベクターｐＤＡＢ１４０５を運搬するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４を全部の形質転換実験に使用した。ｐＤＡＢ１４０５構築物は、ＺｍＵｂｉ１プロモーターおよびそのイントロンの制御下のＧＦＰ遺伝子ｖ．２、ならびにＯｓＡｃｔｉｎ１プロモーターおよびそのイントロンの制御下のＰＡＴ遺伝子ｖ．３を含有する。該２遺伝子およびプロモーターはＲＢ７  ＭＡＲ配列により隣接された（図１）。
2017529861.tif 000002
【０２２３】
実施例４．２：アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養の開始
宿主アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４中のスーパーバイナリーベクターｐＤＡＢ１４０５のグリセロールストックをＤＡＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。ストリーキングされたプレートを、１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、２５０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンおよび１０ｍｇ／Ｌテトラサイクリンを含有するＡＢ最少培地（ＡＴ００００２１７２、表１．１３）を使用して作成し、そして２０℃で３〜４日間増殖させた。１個の単一コロニーをその後拾い、そして同一抗生物質を含有するＹＥＰプレート（ＡＴ０００２１７０、表１．１４）上にストリーキングし、そして２８℃で１〜２日間インキュベートした。
【０２２４】
実施例４．３：アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）共培養
実験日に、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のコロニーをＹＥＰプレートから採取し、５０ｍｌチューブ中で７〜１０ｍｌの感染培地（ＺＭ００００２２
３１、表１．１）に懸濁し、そして細胞密度を分光光度計を使用してＯＤ550＝１．２〜１．４に調節した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物を、胚切開を実施した間、分あたり１００回転（ｒｐｍ）の回転振とう器上に置いた。大きさが１．５〜２．０ｍｍの間の未熟接合胚を滅菌されたトウモロコシ穀粒から単離し、そして１ｍｌの感染培地中に置き（２．０ｍｌエッペンドルフチューブ中約３０〜１３０胚）、次いで同一培地で１回洗浄した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液（１．０ｍｌ）を各チューブに添加し；チューブを２０分間反転し、そしてその後室温で５分間静置させた。胚をその後共培養培地（ＺＭ００００２２３２若しくはＺＭ００００１３５８、表１．２若しくは１．３）上に移した。胚をその後、顕微鏡を使用して胚盤を上に向けた。２０℃で３日の共培養後に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子の一過性発現を観察してアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染を検証した。
【０２２５】
実施例４．４：カルス選択および遺伝子導入事象の再生
共培養期間後に、胚を、抗生物質セフォタキシムを含有する休止培地（ＺＭ００００２２３４若しくはＺＭ０００１３４１、表１．５若しくは１．４）に移し、そして暗所で２８℃で７日間インキュベートした。胚をその後、導入されたｐａｔ遺伝子の選択剤として３ｍｇ／Ｌビアラホスを含有する選択１培地（ＺＭ００００２２４０若しくはＺＭ００００２１８０、表１．６若しくは１．７）上に移し、そして暗所で２８℃で１４日間インキュベートした。ＧＦＰを発現する増殖する胚形成カルスを立体顕微鏡下により小さい片（２〜３ｍｍ）に切断し、３ｍｇ／Ｌビアラホスを含有する選択培地上に移し、そして暗所で２８℃で別の１０〜１４日間インキュベートした。１個の胚から切断された全部の片を黒色マーカーで丸で囲みそして１事象とみなした。この選択段階が、カルスがさらに増殖することを可能にしかつ安定なＧＦＰ発現の均一性を強化した。カルス選択期間はおよそ４ないし６週間持続した。ＧＦＰを発現する増殖する胚形成カルスを、３ｍｇ／Ｌビアラホスを含有する再生１培地（ＺＭ００００２２５４、表１．９）上に移し、そして暗所で２８℃で７〜１０日間培養した。この期間は胚形成カルスの成熟に不可欠であった。
【０２２６】
若芽が開始された胚形成カルスを、ビアラホスを含まない再生２培地（ＺＭ００００２２４２若しくはＺＭ００００２２５５、表１．１０若しくは１．１１）上に移した。該培養物を、８０〜１００μｍｏｌ  ｍ-2ｓ-1の光強度を伴う１６／８ｈの明／暗下２８℃で１０〜１４日間インキュベートした。一次根を伴う小さい若芽をその後、マジェンタボックス中の若芽伸長および発根培地（ＺＭ００００２２３８、表１．１２）に移し、そして１６／８ｈの明／暗下２８℃で７〜１０日間インキュベートした。推定上の小植物をＧＦＰ発現について確認し、そしてその後遺伝子導入事象として評価した。
【０２２７】
【表１−１】
2017529861.tif 000003
【０２２８】
【表１−２】
2017529861.tif 000004
【０２２９】
【表１−３】
2017529861.tif 000005
【０２３０】
【表１−４】
2017529861.tif 000006
【０２３１】
【表１−５】
2017529861.tif 000007
【実施例５】
【０２３２】
ＢＣ1植物の遺伝子型を同定すること
ＳＬＢ２４集団について、１７３のＢＣ1植物を独立の培養物から再生した一方、１１７のＢＣ1植物をＤ０４６３５８集団について再生した。ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ競争的対立遺伝子特異的ＰＣＲ系、若しくはＫＡＳＰａｒTM（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国ハートフォードシャー）を使用して、ＳＬＢ２４およびＤ０４６３５８集団についてそれぞれ２５６および２３５の多形マーカーを使用して、再生された植物からの葉組織からのＤＮＡの遺伝子型を同定した。ＫＡＳＰａｒTM系は、２成分（１）ＳＮＰ特異的アッセイ（３種の未標識プライマーの組合せ）ならびに（２）普遍的蛍光レポーティング系および特別に開発されたＴａｑポリメラーゼを包含する全部の他の必要とされる成分を含有する普遍的反応混合物から構成される。３種のプライマーすなわち対立遺伝子特異的１（Ａ１）、対立遺伝子特異的２（Ａ２）および共通（Ｃ１）若しくはリバースを、ワークフローマネージャー、Ｋｒａｋｅｎ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国ハートフォードシャー）のアッセイ設計アルゴリズムを使用して設計した。
【０２３３】
１２μＭのＡ１およびＡ２のそれぞれならびに３０μＭのＣ１よりなる該３種のプライマーのアッセイ混合物を作成した。普遍的１５３６反応混合物を１×に希釈した。２．０μｌの容量のＭａｇＡｔｔｒａｃｔ抽出されたＤＮＡから１：２０希釈されたＤＮＡを、液体取り扱いロボットを使用してＰＣＲプレート中に分注し、そして６５℃で２時間乾燥した。次に、１．３μｌの１×ＫＡＳＰ  １５３６反応混合物を該ＰＣＲプレートに添加した。プレートをＦｕｓｉｏｎヒートシーラー（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国ハートフォードシャー）を使用して封止した。サーマルサイクリングは、以下の条件：９４℃で１５分間の初期変性およびホットスタート酵素活性化、次いで１０サイクルの９４℃で２０秒間の変性、および６５〜５７℃にわたり６０秒間タッチダウン（サイクルあたり０．８℃下落する）を用いるＨｙｄｒｏｃｙｃｌｅｒ水浴サーマルサイクラー（Ｋｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国ハートフォードシャー）中で完了した。これに２９サイクルの９４℃で２０秒間の変性および６０秒間の５７℃アニーリングが続いた。
【０２３４】
ＫＡＳＰａｒTMは、遺伝子型を識別するためにフルオロフォアＦＡＭおよびＶＩＣを使用する。受動的参照色素ＲＯＸもまた、ウェルごとの液体容量の差違により引き起こされる信号の変動の正規化を可能にするため使用する。Ｋｒａｋｅｎで、ＦＡＭおよびＶＩＣデータをそれぞれｘおよびｙ軸上にプロットする。遺伝子型をその後、試料クラスターに従って決定し得る。
【実施例６】
【０２３５】
統計学的解析
培養、形質転換および再生の行為は、組織培養、形質転換および再生に重要な遺伝子領
域を含有する胚のみが生存しかつＢＣ1植物になることが可能であったように、胚の遺伝子的に分離する集団に選択圧を適用した。その後、ある遺伝子座が培養、形質転換若しくは再生に重要である場合には、親の一方により運搬されるある対立遺伝子が選択されるとみられる。従って、該ゲノムを培養および植物再生後に走査する場合、培養能および形質転換能に重要である対立遺伝子は５０％より大きい頻度で存在する。５０％以上への重大な逸脱を示すマーカーは選択の正の効果を示す遺伝子座を表し、そしてχ2検定（ｐ＜０．０５）を使用して同定された。
【０２３６】
χ2解析結果は増大された培養能および形質転換能と関連する９遺伝子領域を示した（表２）。これら遺伝子領域は第１、４、５、８および９染色体上に配置され、そして培養能および形質転換能と関連するとして以前に報告されなかった新規領域を表す。Ｂｉｎの境界はＭａｉｚｅ  ＧＤＢウェブサイト上のＩＢＭ２  ２００８  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ地図を使用して決定された。
【０２３７】
【表２】
2017529861.tif 000008
【実施例７】
【０２３８】
マーカーの枠組みおよびマーカー支援選抜のための使用
１組の共通のマーカーを、染色体間隔中のマーカーを同定するための枠組みを確立するのに使用し得る。表３は、Ｂ７３参照ゲノム、バージョン２上で相互に関して一致する位置にあるマーカーを示す。ＤＡＳ専有マーカーの物理的場所はＤＡＳ専有のＧＢｒｏｗｓｅｒを使用して決定した。公的マーカーの物理的場所を、公的に利用可能なＭａｉｚｅ  ＧＤＢウェブサイト上でＢ７３参照ゲノム、バージョン２を使用して決定した。
【０２３９】
その遺伝子座の好都合な１対立遺伝子と連鎖不均衡にある対立遺伝子を有する、目的の形質と関連する緊密に連鎖されるマーカーを、増大された培養能および形質転換能をもつ子孫植物について選択するために効果的に使用しうる。従って、表３に列挙されるもののような本明細書の中に記述されるマーカー、ならびに同一染色体間隔に遺伝子的若しくは物理的に位置付けられる他のマーカーを、増大された培養能および形質転換能をもつトウモロコシ植物について選択するのに使用しうる。典型的に、１組のこれらマーカーを、目的の形質と関連する領域中で使用することができる（例えば２若しくはそれ以上、３若しくはそれ以上、４若しくはそれ以上、５若しくはそれ以上）。場合によっては、実際の遺伝子および／若しくは遺伝子座内の１マーカーを使用しうる。増大された培養能および形
質転換能と関連するゲノム領域を増幅かつ検出するための例示的プライマーを表４に示す。
【０２４０】
【表３】
2017529861.tif 000009
【０２４１】
【表４】
2017529861.tif 000010
【０２４２】
参考文献
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＣＬ，Ｒｏｍｅｒｏ−Ｓｅｖｅｒｓｏｎ  Ｊ，Ｈｏｄｇｅｓ  ＴＫ．１９９２．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｌｉｔｅ  ｍａｉｚｅ  ｉｎｂｒｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂａｃｋｃｒｏｓｓ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ，ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＦＬＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８４：７５５−７６２。
Ｌｏｗｅ  ＢＡとＣｈｏｍｅｔ  ＰＳ．２０１０．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ｌｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  ＵＳ  ７７５９５４５  Ｂ２。
Ｚｈａｏ  ＺＹ，Ｓｍｉｔｈ  ＯＳ，Ｌｉ  Ｂ，Ｂｈａｔｔｒａｍａｋｋｉ  Ｄ，Ｓｈｕ
ＧＧ．２００８．Ｍａｒｋｅｒ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＵＳ  ２００８／００７８００３  Ａ１。
【配列表】
2017529861000001.app
【国際調査報告】
2017529861.tif 000011
2017529861.tif 000012
2017529861.tif 000013