(57)【要約】マイクロバイオームに含まれる細菌の増殖動態を評価する方法が開示される。【選択図】２Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロバイオームに含まれる細菌の増殖動態を評価する方法であって、
（ａ）マイクロバイオームのＤＮＡ断片をシーケンシングして、複数の核酸配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ）を取得すること、
（ｂ）前記複数の核酸配列データを、前記細菌のゲノムの配列である少なくとも１つの参照配列に対してアラインさせること、ならびに
（ｃ）少なくとも１つのヌクレオチドが前記ゲノムの複製起点に位置する頻度および少なくとも１つのヌクレオチドが前記ゲノムの末端に位置する頻度を解析することを有し、前記２つの頻度の間の比率は前記細菌の増殖動態を示す、方法。
【請求項２】
前記マイクロバイオームのＤＮＡを断片化して、前記マイクロバイオームの前記ＤＮＡ断片を得ることをさらに有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）は、前記細菌の前記ゲノムの全体において前記ヌクレオチドの各々が出現する頻度を解析することを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記シーケンシングは並列ハイスループットシーケンシングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ハイスループットシーケンシングはディープシーケンシングを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチドの前記頻度をゲノム上の位置と相関させて図表で表示することをさらに有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロバイオームは皮膚マイクロバイオーム、消化管マイクロバイオーム、腸マイクロバイオーム、口マイクロバイオーム、および膣マイクロバイオームからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロバイオームはヒトマイクロバイオームである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロバイオームは消化管マイクロバイオームを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（前記ヌクレオチドが前記ゲノムの複製起点にある頻度）：（前記ヌクレオチドが前記ゲノムの末端にある頻度）の比率が約２：１またはそれ以上である場合、この比率は前記細菌が指数増殖を呈することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ヌクレオチドが前記ゲノムの複製起点にある頻度）：（ヌクレオチドが前記ゲノムの末端にある頻度）の比率が約１：１である場合、この比率は前記細菌が静止増殖を呈することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
複製中の細菌の複製起点を決定する方法であって、
（ａ）前記細菌のゲノムのＤＮＡ断片をシーケンシングして、複数の核酸配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ）を取得すること、
（ｂ）前記複数の核酸配列データを、前記細菌のゲノムの配列である参照配列に対してアラインさせること、ならびに
（ｃ）前記細菌の前記ゲノムの全体においてヌクレオチドが出現する頻度を解析することを有し、
リード数が最大であるゲノム上の位置は前記細菌の複製起点である、方法。
【請求項１３】
前記マイクロバイオームのＤＮＡを断片化して、前記マイクロバイオームの前記ＤＮＡ断片を得ることをさらに有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオチドの前記頻度をゲノム上の位置と相関させて図表で表示することをさらに有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記シーケンシングはハイスループットシーケンシングを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハイスループットシーケンシングはディープシーケンシングを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌は混合細菌集団中に含まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記混合細菌集団はマイクロバイオームを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロバイオームは消化管マイクロバイオームを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試験するマイクロバイオームの健康状態を解析する方法であって、
（ａ）前記試験するマイクロバイオームに含まれる少なくとも１種の細菌の増殖動態を解析すること、
（ｂ）前記試験するマイクロバイオームに含まれる前記少なくとも１種の細菌の前記増殖動態を、病的なマイクロバイオームに含まれる前記少なくとも１種の細菌の増殖動態と比較することを有し、
前記試験するマイクロバイオームに含まれる前記少なくとも１種の細菌の前記増殖動態が、前記病的なマイクロバイオームに含まれる前記少なくとも１種の細菌の前記増殖動態と、統計的有意に類似している場合、前記マイクロバイオームは健康でないことが示される、方法。
【請求項２１】
増殖動態の前記解析は請求項１に記載の方法によって実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌は図４に記載の細菌からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記病的なマイクロバイオームは代謝異常の対象の消化管に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記代謝異常は糖尿病、肥満、潰瘍性大腸炎、およびクローン病からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試験するマイクロバイオームおよび前記病的なマイクロバイオームは消化管マイクロバイオームである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
対象の健康状態を決定する方法であって、
（ａ）前記対象のマイクロバイオーム試料に含まれる少なくとも１種の細菌の増殖動態を解析すること、
（ｂ）前記対象の前記マイクロバイオーム試料に含まれる前記少なくとも１種の細菌の前記増殖動態を、少なくとも１つの病的なマイクロバイオームの中の前記少なくとも１種の細菌の増殖動態と比較することを有し、
前記マイクロバイオーム試料に含まれる前記少なくとも１種の細菌の前記増殖動態が、前記病的なマイクロバイオームに含まれる前記少なくとも１種の細菌の前記増殖動態と、統計的有意に類似している場合、前記対象は健康でないことが示される、方法。
【請求項２７】
増殖動態の前記解析は請求項１に記載の方法によって実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１種の細菌は図４に記載の細菌からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロバイオーム試料は消化管マイクロバイオーム試料を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記病的なマイクロバイオームは代謝異常の対象の消化管に由来する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記代謝異常は糖尿病、肥満、潰瘍性大腸炎、およびクローン病からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、いくつかの実施形態において、マイクロバイオームのメタゲノムデータを解析することにより上記マイクロバイオームに含まれる微生物の増殖動態に関する情報を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸内には、種の進化と共に進化してきた非常に多様な微生物生態系が存在し、ヒトが健康でいるために欠かせない。哺乳類の腸内には、数１００万個の微生物遺伝子からなる「長いゲノム」がある。これがマイクロバイオームである。宿主であるヒトの体内には、このように多くのゲノムが共生する状態がプロテオミクスレベルおよび代謝レベルでみられる。このことから、ヒトは非常に複雑な生物学的「超個体」を代表するものであり、ヒト宿主の代謝調節の一部は共生微生物が担っている、といわれている。今日の消化管マイクロバイオームについての解釈は、ハイスループットゲノムスクリーニング技術により提供される腸の培養非依存的な分子レベルでの観察に基づいている。また、消化管マイクロバイオームは、肥満、循環器疾患、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ）および自閉症など広範囲にわたる多くの病的状態の疾病原因に直接関連するとされている。また、消化管内の微生物相は、薬物の代謝および毒性、食餌により発生する熱の生物学的利用能、免疫系の調節および応答、ならびに外科手術後の回復にも影響を及ぼす。ここでいう関連とは、すなわち消化管マイクロバイオームとその活性の定量解析が将来の個別化医療戦略を生み出すのに不可欠であり、消化管マイクロバイオームは次世代の治療薬標的を開発するうえでの肥沃な土壌となるということを指す。また、消化管マイクロバイオームを宿主生物に有利になるよう直接調節できるかもしれないということも示唆される。
【０００３】
従来、ヒトの皮膚、便、または血液から採取した微生物試料を対象とした研究は、生物個体を増殖させ単離して表現型または遺伝子型を解析するという、時間と人手を要する微生物学的技術により行われてきた。こうした方法では、単一試料中に存在する微生物コミュニティをプロファイリングすることは不可能であった。
【０００４】
次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）の出現により、ヒトマイクロバイオーム解析やヒト腸内細菌叢のメタゲノム解析（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｒａｃｔ：ＭｅｔａＨＩＴ）といったいくつかの著名な共同研究が可能となった。こうした研究では、ＮＧＳを基本ツールとして用いたヒトマイクロバイオームに関する広範囲のデータが発表されている。
【０００５】
マイクロバイオーム研究においてマイクロバイオームの特徴を決定する際には、通常、そのマイクロバイオーム中に存在する微生物の同定およびその遺伝子構成の同定を行う。
【０００６】
背景技術としては、Ｘｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１３，Ｒ２７（２０１２）およびＳｋｏｖｇａａｒｄ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２１，１３８８−９３（２０１１）が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｘｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．１３，Ｒ２７（２０１２）
【非特許文献２】Ｓｋｏｖｇａａｒｄ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２１，１３８８−９３（２０１１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、マイクロバイオームに含まれる細菌の増殖動態を評価する方法であって、（ａ）マイクロバイオームのＤＮＡ断片をシーケンシングして、複数の核酸配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ）を取得すること、（ｂ）上記複数の核酸配列データを、上記細菌のゲノムの配列である少なくとも１つの参照配列に対してアラインさせること、ならびに（ｃ）少なくとも１つのヌクレオチドが上記ゲノムの複製起点に位置する頻度および少なくとも１つのヌクレオチドが上記ゲノムの末端に位置する頻度を解析することを有し、上記２つの頻度の間の比率は上記細菌の増殖動態を示す方法が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、複製中の細菌の複製起点を決定する方法であって、
（ａ）上記細菌のゲノムのＤＮＡ断片をシーケンシングして、複数の核酸配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ）を取得すること、
（ｂ）上記複数の核酸配列データを、上記細菌のゲノムの配列である参照配列に対してアラインさせること、ならびに
（ｃ）上記細菌の上記ゲノムの全体においてヌクレオチドが出現する頻度を解析することを有し、
リード数が最大であるゲノム上の位置は上記細菌の複製起点である方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、試験するマイクロバイオームの健康状態を解析する方法であって、
（ａ）上記試験するマイクロバイオームに含まれる少なくとも１種の細菌の増殖動態を解析すること、
（ｂ）上記試験するマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態を、病的なマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の増殖動態と比較することを有し、
上記試験するマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態が、上記病的なマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態と、統計的有意に類似している場合、上記マイクロバイオームは健康でないことが示される方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、対象の健康状態を決定する方法であって、
（ａ）上記対象のマイクロバイオーム試料に含まれる少なくとも１種の細菌の増殖動態を解析すること、
（ｂ）上記対象の上記マイクロバイオーム試料に含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態を、少なくとも１つの病的なマイクロバイオームの中の上記少なくとも１種の細菌の増殖動態と比較することを有し、
上記マイクロバイオーム試料に含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態が、上記病的なマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態と、統計的有意に類似している場合、上記対象は健康でないことが示される方法が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法は、上記マイクロバイオームのＤＮＡを断片化して、上記マイクロバイオームの上記ＤＮＡ断片を得ることをさらに有する。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、工程（ｃ）は、上記細菌の上記ゲノムの全体において上記ヌクレオチドの各々が出現する頻度を解析することを有する。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記シーケンシングは並列ハイスループットシーケンシングを含む。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ハイスループットシーケンシングはディープシーケンシングを含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法は、上記ヌクレオチドの上記頻度をゲノム上の位置と相関させて図表で表示することをさらに有する。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記マイクロバイオームは皮膚マイクロバイオーム、消化管マイクロバイオーム、腸マイクロバイオーム、口マイクロバイオーム、および膣マイクロバイオームからなる群より選択される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記マイクロバイオームはヒトマイクロバイオームである。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記マイクロバイオームは消化管マイクロバイオームを含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（上記ヌクレオチドが上記ゲノムの複製起点にある頻度）：（上記ヌクレオチドが上記ゲノムの末端にある頻度）の比率が約２：１またはそれ以上である場合、この比率は上記細菌が指数増殖を呈することを示す。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、（ヌクレオチドが上記ゲノムの複製起点にある頻度）：（ヌクレオチドが上記ゲノムの末端にある頻度）の比率が約１：１である場合、この比率は上記細菌が静止増殖を呈することを示す。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法は、上記マイクロバイオームのＤＮＡを断片化して、上記マイクロバイオームの上記ＤＮＡ断片を得ることをさらに有する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法は、上記ヌクレオチドの上記頻度をゲノム上の位置と相関させて図表で表示することをさらに有する。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記シーケンシングはハイスループットシーケンシングを含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ハイスループットシーケンシングはディープシーケンシングを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細菌は混合細菌集団中に含まれる。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記混合細菌集団はマイクロバイオームを含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記マイクロバイオームは消化管マイクロバイオームを含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、増殖動態の上記解析は本明細書中に記載の方法によって実施される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細菌は図４に記載の細菌からなる群より選択される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記病的なマイクロバイオームは代謝異常の対象の消化管に由来する。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記代謝異常は糖尿病、肥満、潰瘍性大腸炎、およびクローン病からなる群より選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記試験するマイクロバイオームおよび上記病的なマイクロバイオームは消化管マイクロバイオームである。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、増殖動態の上記解析は本明細書中に記載の方法によって実施される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１種の細菌は図４に記載の細菌からなる群より選択される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記マイクロバイオーム試料は消化管マイクロバイオーム試料を含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記病的なマイクロバイオームは代謝異常の対象の消化管に由来する。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記代謝異常は糖尿病、肥満、潰瘍性大腸炎、およびクローン病からなる群より選択される。
【００３９】
特に記載がない場合、本明細書中に記載の技術および／または科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味で記載される。本明細書中に記載のものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験において使用できるが、以下に、具体的な方法および／または材料を記載する。両者が異なる場合には、定義を含む、本特許明細書が優先される。また、材料、方法、および具体例は例として記載されるのみであり、必ずしも限定を意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態が、本明細書中において、添付の図面を参照しつつ、例示目的のみにおいて記載される。尚、詳細な図面が個々に参照されるが、これらの図面に示される詳細は本発明の実施形態を説明するために例として記載されるものである。したがって、こうした説明と図面とから、当業者には、本発明の実施形態をどのように実施できるかが明白となる。
【図１Ａ−１Ｃ】メタゲノム試料１つから得られた大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の増殖動態のシグニチャを示す図である。（図１Ａ）メタゲノム試料１つをシーケンシングカバレッジ解析にかけることにより細菌の増殖動態を推論する本発明の方法を説明する。１つのメタゲノム試料に由来するシーケンスリードを、入手可能な細菌ゲノムにマッピングし、次いで、各細菌ゲノムの全長にわたって、各ゲノム上の位置におけるシーケンシングカバレッジ（マッピングされたメタゲノムリード数）をプロットする（グラフ）。増殖している細菌集団（上）の個々の細菌はそれぞれ異なるＤＮＡ複製段階にあることが分かり、既知の複製起点（グラフ中の緑色の垂直線）の近くにピークがあるカバレッジパターンと、ピーク１つおよびトラフ１つを有する原型のシーケンシングカバレッジパターンとが作成される。分裂中でない集団（下）の細菌は、それぞれゲノムコピー数が１であり、ゲノム全体にわたって平らなシーケンシングカバレッジパターンが作成される。（図１Ｂ）単離した大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ、指数増殖期（左）または静止期（右）に採取した培養物について、そのシーケンシングカバレッジを示す。点は、重なっていない１０Ｋｂｐのウィンドウ内における各ゲノム上の位置でのリード数を表す。青線は、ピーク位置とトラフ位置の間の点に区分的にフィットさせた直線である。ピーク対トラフ比率が示されているが、これは、複製起点におけるシーケンシングカバレッジをトラフにおけるシーケンシングカバレッジで割って計算されたものである（「方法」）。（図１Ｃ）異なるヒト消化管メタゲノム試料５２２個７、９に含まれる大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のシーケンシングカバレッジを示す。図は、ピーク対トラフ比率（ｘ軸）とメタゲノム試料の数（ｙ軸）の相関を示すヒストグラムと、図１Ｂと同様の方法でプロットし、上記ヒストグラムのピーク対トラフ比率の異なる範囲からとってきたシーケンシングカバレッジパターンの例３つとを示す。Ｐ／Ｔ−ピーク対トラフ比率。
【図２Ａ−２Ｆ】カバレッジ解析による複製起点の正確な特定を示す。（図２Ａ）メタゲノム試料１つに由来するパラバクテロイデス  ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）のカバレッジ解析を示す。（図２Ｂ）異なるヒト消化管メタゲノム試料８５個に由来するＰ．ディスタソニス（Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）についてフィッティング後のシーケンシングカバレッジ線（青）を示す。既知の複製起点の位置を緑色の垂直線で示す。また、本発明者らのカバレッジ解析により、全試料のピークをフィットさせて円周中央値（ｃｉｒｃｕｌａｒ−ｍｅｄｉａｎ）をとることで予測した起点位置を、赤色の垂直線で示す（「方法」）。（図２Ｃ、図２Ｄ）図２Ａおよび図２Ｂと同様であるが、バクテロイデス  ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ）について示す。（図２Ｅ）公けに入手できるメタゲノム便試料３４６個９に由来し、本発明者らがピーク−トラフ原型パターンを特定した細菌１６８種（「方法」）のうち起点が報告されている細菌１１３種について、文献３０から得た複製起点の位置（ｙ軸）または本発明者らのシーケンシングカバレッジ解析で予測した複製起点の位置（ｘ軸）を示す。各点は細菌１種についてそれぞれ表し、文献中の位置と予測位置との間の距離に従って着色されている（細菌ゲノム画分中で測定、凡例参照）。ピアソン相関関係（Ｒ２）がみられる。（図２Ｆ）既知の複製起点の位置と予測された複製起点の位置の一致の程度に基づいて細菌を異なるカテゴリに分けた際の、各カテゴリにおける細菌数を示す円グラフである（緑色の濃さが３通りあるが、これは、上記距離が各細菌のゲノム長の＜５％、５〜１０％、または＞１０％であることを示す）。複製起点の位置が間違っている可能性のある細菌（図５Ａ〜図５Ｆ）、および複製起点の位置は未知だが本発明者らのカバレッジ解析により新規の複製起点が予測された細菌（図６Ａ〜図６Ｉ）について示す。
【図３Ａ−３Ｆ】細菌の動態が日内周期的変動を呈し、その位相が量的割合における周期的変動の位相とずれていることを示す。（図３Ａ）ヒト対象１人から連続４日間にわたって約６時間毎にメタゲノム試料を採取し、その試料中におけるルミノコッカス  オベウム（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ）の相対量的割合（赤）およびピーク対トラフ比率（青）を調べたものを示す。ピーク対トラフ比率はカバレッジ解析方法（「方法」）によって計算し、対数スケールで示す。時間はツァイトゲーバー時間（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ  ｔｉｍｅ：ＺＴ、ｘ軸）で表す。ピーク対トラフ比率は、相対量的割合が上昇する６時間前に最高値に到達することに注意する。（図３Ｂ〜図３Ｄ）図３Ａと同様であるが、ユーバクテリウム  シラエウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ）（図３Ｂ）、パラバクテロイデス  ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）（図３Ｃ）、およびヘモフィルス  パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（図３Ｄ）について示す。
【図４】細菌の動態がいくつかの疾患および代謝異常と相関関係にあることを示す。  中国コホート（Ｎ＝３６３、Ｑ）および欧州コホート（Ｎ＝３９６、Ｍ）に由来する細菌種についてのピーク対トラフ（Ｐｅａｋ  ｔｏ  ｔｒｏｕｇｈ：ＰＴＲ）比率である（箱ひげ図、左、赤−中央値境界２５〜７５パーセンタイル）。これは、相対量またはＰＴＲが臨床パラメータに有意に関連するかどうかを調べたものである。門構成員；ＰＴＲを計算した試料数；臨床パラメータとＰＴＲ（左カラム区画）の間、または臨床パラメータと相対量（右カラム区画）の間に統計的に有意な関連（ＦＤＲ補正、Ｐは０．５未満）がある場合に着色したエントリーを伴う列を示す。バイナリ臨床パラメータおよび連続的臨床パラメータをそれぞれ、マン・ホイットニーＵ検定およびスピアマンの相関関係を用いて求めた。上区画はＰＴＲと臨床パラメータとの間に有意な関連がみられる細菌種を示し、下区画は相対量と臨床パラメータの間にのみ有意な関連がみられる細菌種を示す。  各細菌の門は、ＡがＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＢがＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、ＦがＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、ＰがＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＶがＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａである。
【図５Ａ−５Ｆ】間違っている複製起点の位置を特定するシーケンシングカバレッジ解析を示す。図は、既知の複製起点が間違っていることが解析により示唆される細菌６種について、ピーク位置をフィットさせた試料の数（ｙ軸）と７０Ｋｂｐのビンにおけるゲノム上の位置（ｘ軸）の相関を示すヒストグラムである。既知（緑）および予測（赤）複製起点を、図２Ａ〜図２Ｆと同様に示す。図示したすべてのケースについて、異なるヒト消化管メタゲノム試料においてピーク位置は互いによく一致するが、文献で報告された複製起点とは一致せず、この結果から、後者の位置が間違っていると示唆されることに注意する。
【図６Ａ−６Ｉ】シーケンシングカバレッジ解析による新規の複製起点の位置の特定を示す。図は、複製起点の位置が解析では予測されたが文献中では既知ではない細菌５５種のうち９種についての、図５Ａ〜図５Ｆと同様のヒストグラムである。図示したすべてのケースについて、異なるヒト消化管メタゲノム試料においてピーク位置は互いによく一致し、この結果から、これらが確かに新規の複製起点を表すことが示唆されることに注意する。
【図７】細菌増殖動態が相対量的割合とは独立していることを示す。図はドットプロットであり、各ドットは、メタゲノム試料１つに含まれる細菌１種についてのピーク対トラフ比率（ｙ軸）および相対量（ｘ軸）を表す。カバレッジ解析を実行したメタゲノム試料７０９個すべてについて、カバレッジ解析した細菌２０７種すべての解析結果を示す。ピーク対トラフ比率と相対量的割合との相関関係が比較的小さく、この結果から、ピーク対トラフ比率より得られる情報と細菌相対量より得られる情報とが主として独立していることが示されることに注意する。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、いくつかの実施形態において、マイクロバイオームのメタゲノムデータを解析することにより上記マイクロバイオームに含まれる微生物の増殖動態に関する情報を取得する方法に関する。
【００４２】
本発明の少なくとも１つの実施形態について詳細に説明するにあたり、本発明の用途は、以下の記載または実施例中に例示される詳細に必ずしも限定されないことが理解される。本発明は他の実施形態においても実施でき、また、種々の様式において実施または実行できる。
【００４３】
マイクロバイオームの組成および機能の特徴がショットガンシーケンシングにより決定され、マイクロバイオームが健康状態や疾患において果す複雑な役割について多くの見識が得られた。この研究には、ジーンコーリング（ｇｅｎｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）、機能／経路解析、全メタゲノム関連研究、ゲノムアセンブリ、およびメタゲノム一塩基多型（ＳＮＰ）検出などの解析技術が使用された。こうした方法は、マイクロバイオームの構成と、肥満、成人発症型糖尿病、自己炎症性障害、代謝性疾患、さらにはがんといった疾患感受性との関連を確立するうえで非常に有用であった。ただ、こうした方法には根本的な限界があった。微生物相の生態系を採取時の静的な事象として扱っているため、マイクロバイオーム中に存在する微生物の多くが実は非常に動的であり活性状態がそれぞれ異なるということが考慮されていないのである。
【００４４】
このたび本発明者らは、メタゲノム試料１つから、細菌ゲノム全体のシーケンスリードカバレッジ（深度）のパターン、すなわち、異なるゲノム領域にマッピングされたメタゲノムのリード数のばらつきを調べることによって、微生物相の動態を深く究明することが可能かどうかを問うた。ほとんどの細菌は環状染色体を１つ有し、この環状染色体が、１つの決まった起点から１つの末端へと双方向に複製される。その結果、細菌のＤＮＡ複製において、未複製領域はコピー数が１であるのに対し、複製フォークが既に通過した領域はコピー数が２となる。この考えは、個々の細胞が異なる複製段階にある可能性のある非同期的な細菌集団についてもあてはまる。というのは、あるＤＮＡ領域のコピー数を細菌集団全体で合計すると、その領域が複製起点に近いほどコピー数が多く、その領域が末端に近いほどコピー数が少ないからである。また、ＤＮＡ複製率は概して一定であるため、複製起点付近のＤＮＡコピー数と末端付近のＤＮＡコピー数の量的比率はその細菌集団の増殖速度を反映しているといえよう。その理由は、世代時間が短く増殖の速い集団ではＤＮＡ複製に関わる微生物細胞の数が多く、したがってより多くの活性複製点が各細胞中に存在し、その結果、起点付近のＤＮＡと末端付近のＤＮＡとの比率が１：１を超えるためである。世代時間がＤＮＡ複製時間より短い場合には、複製フォークが複数存在することになるために、起点と末端との比率はさらに大きくなって、２：１を超える可能性がある。
【００４５】
注目に値するのは、本発明者らが、ヒト消化管メタゲノム試料から採取した異なる非同期マイクロバイオーム集団７０９個について別々にカバレッジを解析したところ、異なる細菌および試料の間に明確な原型パターンが保持されていることが分かった、ということである。この原型パターンは、カバレッジピーク１つおよびトラフ１つを有するものであり、カバレッジピークとトラフの間隔は細菌ゲノムの長さの半分ほどであった（図１Ｃおよび図２Ａ〜図２Ｄ）。既知の複製起点の位置はシーケンシングカバレッジ（細菌１１３種）のピークとよく一致していたが、それ以外の、複製起点が未知である細菌５５種については、複数の試料間で強いカバレッジピークを有する箇所が起点であることが新たに予測された（図２Ｅおよび図２Ｆ）。異なるヒト個体から採取した消化管メタゲノム試料間で、ピーク対トラフカバレッジ比率は大きく変動している。比率の高値および低値は、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養で増殖させた細菌集団の指数増殖期および静止期にみられる高値および低値とそれぞれよく似ていた。同一個体の場合には、一部の細菌の比率が日内周期的変動を呈し、この日内周期的変動の位相は、同じ細菌の量的割合の周期的変動の位相とずれていた。これらのことから、上記比率が確かに細菌の増殖動態を反映していることが示唆される（図３Ａ〜図３Ｆ）。最後に、ピーク対トラフ比率は、ヘモグロビンＡ１ｃ％（ＨｂＡ１Ｃ％）、空腹時血糖値、ならびに成人発症型糖尿病およびクローン病の罹患率といったいくつかの宿主パラメータと有意な相関関係を呈する（図４）。
【００４６】
上記のことより、本発明が提供する例から、細菌のシーケンスカバレッジパターンの解析によりメタゲノム試料１つから細菌の増殖動態についての新たな知見が提供される。この知見は臨床関連性を有し得る。
【００４７】
したがって、本発明の一態様によれば、マイクロバイオームに含まれる細菌の増殖動態を評価する方法であって、
（ａ）マイクロバイオームのＤＮＡ断片をシーケンシングして、複数の核酸配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ）を取得すること、
（ｂ）上記複数の核酸配列データを、上記細菌のゲノムの配列である少なくとも１つの参照配列に対してアラインさせること、ならびに
（ｃ）少なくとも１つのヌクレオチドが上記ゲノムの複製起点に位置する頻度および少なくとも１つのヌクレオチドが上記ゲノムの末端に位置する頻度を解析することを有し、
上記２つの頻度の間の比率は上記細菌の増殖動態を示すものである、方法が提供される。
【００４８】
用語「増殖動態」は、細菌の増殖相（例えば、誘導期、静止期、指数増殖、死滅期）および増殖速度そのものを指す。
【００４９】
誘導期は、細菌が増殖条件に適応する相である。この相では、個々の細菌は成熟はするが、まだ分裂はできない。細菌増殖サイクルの誘導期においては、ＲＮＡ、酵素、およびそれ以外の分子が合成される。
【００５０】
対数期（対数的期または指数期ともよばれる）は、細胞数が二倍に増える期間である。単位時間あたりに出現する新しい細菌の数は、元の細胞数に比例する。増殖が制限されない場合には、二倍増加が一定速度で継続して、細胞数および細胞数増加速度はともに一定時間ごとに二倍になり、これが連続する。この種の指数増殖においては、細胞数の自然対数を時間に対してプロットすると直線になる。この直線の傾斜がその生物の比増殖速度であり、細胞１個が単位時間あたりに分裂する回数の指標である。この増殖の実際の速度は増殖条件に依存し、増殖条件は、細胞分裂事象の頻度と、娘細胞２個がそれぞれ生存する確率とに影響を及ぼす。ただ、すぐに培地中の栄養が欠乏し老廃物が蓄積してくるため、指数増殖が無限に継続することはできない。
【００５１】
静止期は、多くの場合、必須栄養素の欠乏といった増殖制限要因および／または有機酸などの阻害物質の生成によって生じる。静止期は、増殖速度と死滅速度が等しくなる状況により生じる。生成する新しい細胞の数は増殖因子により制限され、その結果、細胞増殖速度と細胞死滅速度とが等しくなるのである。
【００５２】
死滅期（衰退期）は、細菌が死滅する相である。この現象は、栄養の欠如、過度の高温もしくは低温、または不適切な生存条件により生じ得る。
【００５３】
本明細書中において、用語「マイクロバイオーム」は、ある環境における微生物（細菌、真菌、原生生物）とその遺伝因子（ゲノム）を全体として指す。
【００５４】
マイクロバイオームの由来は限定されず、例えば、消化管マイクロバイオーム、口腔マイクロバイオーム、腸マイクロバイオーム、気管支マイクロバイオーム、皮膚マイクロバイオーム、または膣マイクロバイオームであってよい。
【００５５】
特定の実施形態によれば、上記マイクロバイオームは消化管マイクロバイオームである。
【００５６】
上記マイクロバイオームの解析には、対象から試料を採取する。
【００５７】
上記対象は、典型的には哺乳類対象、例えばヒト対象である。
【００５８】
したがって、例えば、便試料を採取して消化管マイクロバイオームを解析でき、気管支試料を採取して気管支マイクロバイオームを解析でき、唾液試料を採取して口腔マイクロバイオームを解析できるなど。特定の実施形態によれば、ある対象の上記マイクロバイオームはその対象の便試料に由来する。
【００５９】
本発明者らは、摂食パターンの変化（例えば、２４時間周期の乱れ）がマイクロバイオームの組成に影響を及ぼすことを示した。したがって、試料は一日のうち決まった時間に採取されることが好ましい。
【００６０】
増殖動態を解析する細菌は、グラム陽性細菌であってもグラム陰性細菌であってもよい。
【００６１】
本明細書中において、用語「グラム陽性細菌」は、細胞壁構造の一部がペプチドグリカンならびに多糖類および／またはタイコ酸であり、かつグラム染色手順で青紫色反応を呈する細菌を指す。代表的なグラム陽性細菌として、アクチノミセス属細菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、バチルス  アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ビフィドバクテリウム属細菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム  ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム  パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム属細菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、クロストリジウム  テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム  ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム  ジェイケイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍ）、エンテロコッカス  フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス  フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エリジペロトリックス  ルジオパシアエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ユーバクテリウム属細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ガードネレラ  バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ゲメラ  モルビロルム（Ｇｅｍｅｌｌａ  ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍ）、ロイコノストック属細菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム  アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｃｅｓｓｕｓ）、マイコバクテリウム  アビウムコンプレックス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、マイコバクテリウム  ケロネー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム  フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム  ヘモフィルム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｍ）、マイコバクテリウム  カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム  レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム  マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム  スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム  スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム  テラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｅｒｒａｅ）、マイコバクテリウム  ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム  ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ノカルジア属細菌（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、ペプトコッカス  ニガー（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペプトストレプトコッカス属細菌（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、プロプリオニバクテリウム属細菌（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス  アウリクラーリス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、スタフィロコッカス  キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）、スタフィロコッカス  コーニイ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ）、スタフィロコッカス  エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス  ヘモリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス  ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス  ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄａｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス  サッカロリティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス  サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス  シュライフェリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）、スタフィロコッカス  シミュランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｉｌａｎｓ）、スタフィロコッカス  ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカス  キシローサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス  アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス  アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス  ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス  カニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｎｉｓ）、ストレプトコッカス  エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス  ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｌｌｅｒｉ）、ストレプトコッカス  ミティオ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス  ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス  ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス  ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス  サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、およびストレプトコッカス  サンギス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）が挙げられる。
【００６２】
本明細書中において、用語「グラム陰性細菌」は、細菌細胞ひとつひとつが二重膜で囲まれている細菌を指す。代表的なグラム陰性細菌として、アシネトバクター  カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アクチノバチルス  アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、エロモナス  ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アルカリゲネス  キシロソキシダンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、バクテロイデス属細菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バクテロイデス  フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バルトネラ  バシリホルミス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ボレリア  ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブランハメラ  カタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、クラミジア  ニューモニエ（Ｃｈａｌｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア  シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミジア  トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クロモバクテリウム  ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、エイケネラ  コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム  メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ヘモフィルス  インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、モラクセラ  カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、モルガネラ  モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、マイコプラズマ  ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア  ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア  メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、パスツレラ  マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、プレジオモナス  シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、プロビデンシア  レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、シュードモナス  エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、リケッチア  ロワゼキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア  リケッチ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ  チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、セラチア  マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、トレポネーマ  カラテウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｃａｒａｔｅｕｍ）、トレポネーマ  パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ  パリダム亜種エンデミカム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｅｎｄｅｍｉｃｕｍ）、トレポネーマ  ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ  コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ  バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、エルシニア  エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、およびエルシニア  ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）が挙げられる。
【００６３】
典型的には、増殖動態を解析する細菌のゲノム配列は既知である（または、少なくともその一部分が既知である）。上記既知の配列を本明細書中では参照配列と称し、以下にさらに説明する。
【００６４】
マイクロバイオームからの染色体（ゲノム）ＤＮＡの取得は、例えば上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ中に開示されるような、従来の技術によって実施できる。とりわけ、特定の工程で少量のＤＮＡを使用する際など、試料ＤＮＡが少量しかないために容器壁などに非特異的に結合してなくなってしまう恐れがある場合には、関係のない合成環状二本鎖ＤＮＡなどの担体ＤＮＡを試料ＤＮＡと混合して使用するのが有利な場合もある。
【００６５】
一実施形態において、染色体ＤＮＡを長い断片として得る。細胞を溶解し、穏やかに遠心分離することによって、核を完全な状態でペレット状に沈殿させることができる。次いで、そのゲノムＤＮＡを遊離させる（例えば、プロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅ消化により、数時間（例えば１〜５時間）かけて）。得られたものは、残留している細胞ごみの濃度を下げるために、一定期間（すなわち、２〜１６時間）の透析、および／または希釈などによる、処理にかけてもよい。こうした方法では破壊処理（エタノール沈殿、遠心分離、およびボルテックスなど）を多く実施する必要がないので、ゲノムの核酸がほぼ完全な状態で残り、得られる断片の大部分は長さが１５０キロベースを超える。いくつかの実施形態において、得られる断片の長さは約５〜約７５０キロベースである。さらなる実施形態において、得られる断片の長さは約１５０〜約６００キロベース、約２００〜約５００キロベース、約２５０〜約４００キロベース、および約３００〜約３５０キロベースである。
【００６６】
次いで、任意に、酵素消化、剪断、または超音波処理といった従来の技術により標的ゲノムＤＮＡを分別または断片化して所望のサイズとしてもよい。特に、後者の２つの技術を、本発明において使用する。
【００６７】
標的核酸断片のサイズは、元にした標的核酸および使用したライブラリ構築方法によって異なり得るが、標準的な全ゲノムシーケンシングにおいては、こうした断片の長さは５０〜６００ヌクレオチドの範囲であってよい。別の実施形態において、断片の長さは３００〜６００ヌクレオチドまたは２００〜２０００ヌクレオチドである。更に別の実施形態において、断片の長さは１０〜１００ヌクレオチド、５０〜１００ヌクレオチド、５０〜３００ヌクレオチド、１００〜２００ヌクレオチド、２００〜３００ヌクレオチド、５０〜４００ヌクレオチド、１００〜４００ヌクレオチド、２００〜４００ヌクレオチド、３００〜４００ヌクレオチド、４００〜５００ヌクレオチド、４００〜６００ヌクレオチド、５００〜６００ヌクレオチド、５０〜１０００ヌクレオチド、１００〜１０００ヌクレオチド、２００〜１０００ヌクレオチド、３００〜１０００ヌクレオチド、４００〜１０００ヌクレオチド、５００〜１０００ヌクレオチド、６００〜１０００ヌクレオチド、７００〜１０００ヌクレオチド、７００〜９００ヌクレオチド、７００〜８００ヌクレオチド、８００〜１０００ヌクレオチド、９００〜１０００ヌクレオチド、１５００〜２０００ヌクレオチド、１７５０〜２０００ヌクレオチド、および５０〜２０００ヌクレオチドである。断片の長さはさらに長くてもよい。
【００６８】
さらなる実施形態において、特定のサイズの、または特定のサイズ範囲にある断片を単離する。かかる単離は、当技術分野において公知の方法によって実施する。例えば、ゲルを用いて分別することによって、例えば５００塩基対＋５０塩基対といった、ある塩基対範囲内における特定サイズを有する断片からなる集団を得ることができる。
【００６９】
多くの場合、抽出したＤＮＡは酵素消化する必要がない。というのは、溶解および抽出の過程で生じた剪断力によって断片のサイズが所望範囲になるからである。さらなる実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いて断片化し、より短い断片（１〜５ｋｂ）を得ることができる。
【００７０】
配列決定は一般的に、当業者に既知の方法によって実施する。好ましいシーケンシング法は次世代シーケンシング法または並列ハイスループットシーケンシング法である。例えば、細菌ゲノム配列を、大規模並列処理特徴配列シーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＭＰＳＳ）によって得ることができる。想定されるシーケンシング法として、例えば、パイロシーケンシング、特にロシュ（Ｒｏｃｈｅ）４５４ゲノムシーケンサーなどを用いた４５４パイロシーケンシングがある。この方法では、油性溶液中の水滴の中に含まれるＤＮＡを増幅する。個々の水滴は、プライマー被覆ビーズ１つと、それに付着したＤＮＡ鋳型１つを含有している。増幅されたＤＮＡはクローンコロニーを形成する。パイロシーケンシングでは、ルシフェラーゼを使用して発光させることにより、生じてきたＤＮＡに付加するヌクレオチドの１つ１つを検出でき、得られたデータを組み合わせて配列を読み取る。想定されるシーケンシング法としてはさらに、例えばイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）ゲノムアナライザ技術を用いた、イルミナまたはソレキサ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシングがある。この方法には可逆的色素ターミネータを用いる。典型的には、ＤＮＡ分子をスライドガラス上のプライマーに付着させ、増幅させて、局所的にクローンコロニーを形成させる。続いてヌクレオチドを１種ずつ添加し得、組み込まれなかったヌクレオチドは洗浄により除去する。続いて、蛍光標識ヌクレオチドの画像を取得し得、化学処理によってＤＮＡから色素を除去して、次のサイクルに移る。さらに別のシーケンシング法としては、ライゲーションによりシーケンシングを行うアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＳＯＬｉＤ技術がある。この方法は、可能性のあるオリゴヌクレオチドすべてを決まった長さで含むオリゴヌクレオチドプールを使用するものであり、使用するオリゴヌクレオチドはシーケンシングされる位置に応じて標識されている。このオリゴヌクレオチドをアニールしてライゲーションさせる。続いて、対応する配列をＤＮＡリガーゼを用いて選択的にライゲーションさせることにより、典型的には、その位置のヌクレオチドについての情報を与えるシグナルが得られる。このＤＮＡは典型的にはエマルジョンＰＣＲで増幅されるため、得られるビーズ（同一ＤＮＡ分子のコピーのみを含有）をスライドガラスに付着させることによって、イルミナシーケンシングと同等の数および長さの配列を得ることができる。さらに別のシーケンシング法としては、アレイに繋いだポリＴオリゴマーによって断片を捕獲するヘリコス（Ｈｅｌｉｃｏｓ）のＨｅｌｉｓｃｏｐｅ技術がある。各シーケンシングサイクルにつきポリメラーゼおよび蛍光標識ヌクレオチド１種を添加し、アレイを画像化する。続いて蛍光タグを除去し、サイクルを繰り返す。本発明の方法に包含されるさらに別のシーケンシング法としては、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアを使用するシーケンシング、顕微鏡によるシーケンシング技術、微小流体サンガーシーケンシング、またはマイクロチップによるシーケンシング法がある。本発明はまた���これらの技術をさらに発展させたものも想定している。例えば、配列決定精度のさらなる改善、または生物のゲノム配列決定に要する時間のさらなる改善などを想定している。
【００７１】
一実施形態によれば、上記シーケンシング法はディープシーケンシングを含む。
【００７２】
本明細書中において、用語「ディープシーケンシング」は、一回の試験において標的配列を複数回にわたって読み取るシーケンシング法を指す。一回のディープシーケンシングは、同一の標的配列についてシーケンシング反応を複数回実施することからなり、各回のシーケンシング反応において独立して配列を読み取る。
【００７３】
本明細書中に記載されるいずれの解析方法も多くの形態で組み込まれ得ることが理解されよう。例えば、各方法の操作を実行するコンピュータなどの有形の媒体に組み込まれていてもよい。あるいは、各方法の操作を実行するコンピュータ読取可能命令を含むコンピュータ読取可能媒体に組み込まれていてもよい。あるいは、上記有形の媒体上のコンピュータプログラムを実行する、またはコンピュータ読取可能媒体上の上記命令を実行するデジタルコンピュータ機能を備えた電子装置に組み込まれていてもよい。
【００７４】
本実施形態の解析方法を実行するコンピュータプログラムは、ＣＤ−ＲＯＭまたはフラッシュメモリ媒体など（これらに限定されない）の配布媒体により使用者に一般に配布できる。上記配布媒体から、上記コンピュータプログラムをハードディスクまたはこれに類似する中間記憶媒体にコピーできる。本発明のいくつかの実施形態において、本実施形態の方法を実行するコンピュータプログラムは、使用者がインターネットなどの通信ネットワークを介して遠隔地からプログラムをダウンロードできるようにすることによって、使用者に配布できる。上記コンピュータプログラムは、上記配布媒体または上記中間記憶媒体からのコンピュータ命令をコンピュータの実行メモリに読み込み、コンピュータが本発明の方法に従って作動するよう構成することよって実行できる。こうした操作はすべて、コンピュータシステム分野の当業者に既知である。
【００７５】
シーケンシング工程の実施によって、複数の核酸配列データが得られる。このデータには、取得したすべての核酸断片リードからの情報が含まれる。
【００７６】
本明細書中において「核酸断片リード」は、連続的な短い情報１つまたは一続きの配列データを指す。リード１つの長さは限定されず、適切な長さであってよく、好ましくは約３０ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチドであってよい。この長さは、一般的に、リード取得に用いたシーケンシング技術によって異なる。特定の実施形態において、リードはさらに長くてもよく、例えば２〜１０ｋｂまたはそれ以上であってもよい。本発明では概して、任意のリードまたはリード長を想定している。リード長は、現時点で可能なリード長に限定されず、この技術分野がさらに発展して例えば現在よりも長いリードをシーケンシングする方法などが開発された場合、こうした方法も本発明に含まれる。
【００７７】
上記配列データは、シーケンシング機器、取得日の日付、リード長、シーケンシング方向、シーケンシング対象の由来、隣接する配列もしくはリード、反復配列の有無、またはこれら以外で当業者に既知の適切なパラメータについての情報をさらに含んでもよい。上記配列データは、当業者に既知の任意の適切な形式、アーカイブ、コード、またはドキュメントにて提示されてよい。上記データは、例えばＦＡＳＴＱ、Ｑｓｅｑ、ＣＳＦＡＳＴＡ、ＢＥＤ、ＷＩＧ、ＥＭＢＬ、Ｐｈｒｅｄ、ＧＦＦ、ＳＡＭ、ＳＲＦ、ＳＦＦ、またはＡＢＩ−ＡＢＩＦ形式のものであってよい。
【００７８】
好ましくは、上記データまたはデータセットは１つのデータ形式、より好ましくは統一データ形式、例えばｆａｓｔｑ形式であり、塩基品質はＰｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ形式またはその改変形式である。さらに好ましくは、上記データ形式は、配列リードおよびこれに関連する塩基品質に少なくとも対応したものである。
【００７９】
本発明の特に好ましい実施形態において、上記複数の配列データは、統一形式に変換されていてもよい。このような変換は、当業者に既知の任意の適切な変換ツール（例えばイルミナ形式をサンガー形式に変換できる標準変換ツール）（いくつかのアライメントアルゴリズムによって使用可能）、またはそれ以外で当業者に既知の、ある形式から別の形式に変換できる同等の任意のツールで実施できる。このような変換は、必須のデータが少なくとも最小量維持されるように行うことができる。上記データ最小量は、例えば、配列そのもの、実行情報、ペアエンドライブラリ情報、メイトペアライブラリ情報、シングルエンドライブラリ情報、および塩基ＱＣ値を含んでいてよい。上記配列データを変換し得る先の好ましい形式は適切な形式であれば特に限定されず、その形式は参照配列アライメントアルゴリズムおよび新規のアセンブリアルゴリズムで認識される。好ましい形式はｆａｓｔｑ形式である。あるいは、上記配列データは、ｃｆａｓｔａ／ＳＣＡＲＦ形式に変換されてもよい。本発明はさらに、上記以外の任意の形式をも想定しており、例えば、新たに設定または開発され、参照配列アライメントおよび新規のアセンブリ方法の両方により使用され得る形式をも想定する。
【００８０】
上記データは、データセット１つの中に１つまたは複数のエントリを含んでもよい。上記データは、データセットを１つ以上または複数含んでもよい。したがって、用語「複数」はここで、１つ以上の由来または出所からの１つ以上のデータセットを指す。上記データセットまたはデータは、例えば、形式が同じであってもよく、および／または由来が同じ、すなわち、使用したシーケンシング機器、使用したマイクロバイオーム、または使用したシーケンシング技術などが同じであってもよい。あるいは、上記データセットまたはデータは、形式が異なっていてもよく、および／または由来、すなわち、使用したシーケンシング機器、採取元の患者もしくは対象、または使用したシーケンシング技術などが異なっていてもよい。
【００８１】
上記複数の配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ）が得られたら、次の工程は、上記複数の核酸配列データを、解析する細菌のゲノムの配列である少なくとも１つの参照配列に対してアラインさせることを有する。
【００８２】
本明細書中において、用語「参照配列に対してアラインさせる」は、核酸断片リードの情報を比較し、既存のゲノム配列またはサブゲノム配列の横に並べ、好ましくは続いて、上記既存のゲノム配列またはサブゲノム配列に基づくスキャフォルド内に上記配列リードを配置することを指す。
【００８３】
本明細書中において「参照配列」は、既存の、十分な長さの任意の適切な配列であってよく、新たに得る配列データまたは核酸断片リードと同じまたは類似するものであってよい。
【００８４】
細菌ゲノム配列（参照配列）は、ＮＣＢＩの微生物ゲノムプロジェクトのデータベースや、他にも、Ｑｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９０，５５−６０（２０１２）（参考として本明細書に組み込む）およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２９３９（参考として本明細書に組み込む）中に開示されるデータベースなどから入手できる。さらなる詳細は、ＭｃＮｅｉｌ  Ｌ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＮＭＰＤＲ）：ａ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｕｂｓｙｓｔｅｍ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００７；３５（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ３４７−５３（その全体を参考として本明細書に組み込む）から入手できる。
【００８５】
上記参照配列は、以下に定義するように、本質的に完全な配列であるか、または本質的に完全な細菌ゲノムの一部分を含むものであってよい。
【００８６】
本明細書中において、用語「本質的に完全」は、天然に存在するゲノムの全部分の配列情報を含むことを指す。例えば、上記ゲノム配列は、重複配列、反復配列、テロメア配列などを含んでいてもよい。例えば、上記ゲノム配列の約９９％、約９８％、約９７％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、または約７５％が、本質的に完全なゲノム中に含まれていてもよい。さらなる実施形態において、上記参照配列は、反復配列、テロメア配列、トランスポゾン配列、重複配列などの特定の配列エレメントを含んでいなくてもよい。
【００８７】
本質的に完全なゲノムの「一部分」は、例えば、ゲノム配列全体の任意の割合を占めていてよく、その割合は、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、６５％、７０％、７５％など、またはこれら数値の間の任意の数値であってよい。本質的に完全なゲノムの「一部分」はまた、染色体配列１つ、染色体アーム、複数の染色体の組合せ、ハプロイド染色体などであってもよい。
【００８８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記参照配列は、核酸データをアセンブルする対象である生物に系統学的に関連のある群または分類群から選択されてもよい。一般的に、系統学的に関連のある生物は、ゲノム全体の同一性が少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％であり得る。系統学的に関連のある生物は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の配列リードを解析する際にはＣ．グルタムチカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｔｉｃｕｍ）であってよく、逆の場合も同様である。さらなる実施形態において、系統学的に関連のある生物に由来する参照配列は、全ゲノム配列の一部分を含んでいてよく、例えば上記に定義したように、特定の染色体、染色体組合せ、染色体アーム、そのゲノムの切片などを含んでいてよい。
【００８９】
本発明の方法の工程（ｂ）による参照配列のアライメントは、好ましい実施形態において、適切な参照アライメントアルゴリズムによって、または適切な参照アライメントアルゴリズムに基づいて実施できる。このようなアルゴリズムの好ましい例としては、ＢＦＡＳＴ、ＥＬＡＮＤ、ＧｅｎｏｍｅＭａｐｐｅｒ、ＧＭＡＰ、ＭＡＱ、ＭＯＳＡＩＫ、ＰＡＳＳ、ＳｅｑＭａｐ、ＳＨＲｉＭＰ、ＳＯＡＰ、ＳＳＡＨＡ、またはＣＬＤといったアルゴリズムが挙げられる。特に好ましくは、アルゴリズムＢｏｗｔｉｅまたはＢＷＡを使用する。さらに、これらのアルゴリズムの１種以上の組合せも想定される。例えば、参照とのアライメントを、まず上記アルゴリズムのうち１種で実施し、続いて上記アルゴリズムのうち別の１種で反復してもよい。二回のアライメントの結果を比較してもよく、また、必要に応じて組み合わせてもよい。一般的に、一致しないリードまたはアライメントされないリードの数が最も少ない連続ヌクレオチド配列を使用することが好ましい。
【００９０】
こうしたアルゴリズムを実行する際の詳細および方法は当業者に既知であるか、あるいは適切な文献、例えばＢａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２８  Ａｐｒ．２０１１，ｐ．１−９（その全体を参考として本明細書に組み込む）から入手できる。本発明はさらに、本明細書中に記載される参照配列アライメントの原則目的が達成される限り、こうしたアルゴリズムを最適化もしくはさらに発展させて使用すること、または異なるスキームもしくはアルゴリズム論理（現時点ではまだ入手不可能なアルゴリズムを含む）に従って参照アライメントアルゴリズムを使用することも想定する。
【００９１】
アライメントに続き、本方法は、少なくとも１つのヌクレオチドが上記ゲノムの複製起点に位置する頻度および少なくとも１つのヌクレオチドが上記ゲノムの末端に位置する頻度を解析する。上記２つの頻度の間の比率は上記細菌の増殖動態を示す。
【００９２】
本明細書中において、「複製起点」は、ゲノム中、複製が開始される特定の配列を指す。複製起点の具体的な構造は種によっていくらか異なるが、高ＡＴ含量（アデニンおよびチミン）など、どの種にもみられる共通の特徴がいくつかある。複製起点は、複製前複合体に結合する。複製前複合体とは、ＤＮＡを認識し、巻き戻し、コピーを開始するタンパク質複合体である。
【００９３】
ほとんどの細菌は環状ＤＮＡ分子１つを有し、典型的には、環状染色体１つにつき複製起点は１つのみである。
【００９４】
ゲノムの末端は、典型的には、環状細菌ゲノムの複製起点のほぼ反対の位置にある。
【００９５】
末端領域は、いくつかのＤＮＡ複製終結点、別名「Ｔｅｒ」部位を有する。
【００９６】
少なくとも１つのヌクレオチドが複製起点に位置する頻度および少なくとも１つのヌクレオチドが上記ゲノムの末端に位置する頻度の解析は、これらの位置におけるリードのカバレッジパターンを解析することによって実施できる。
【００９７】
別の実施形態において、上記ヌクレオチドの２０％が上記細菌の全ゲノムにおいて出現する頻度を解析する。この際、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは複製起点に位置し、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは末端に位置する。
【００９８】
別の実施形態において、上記ヌクレオチドの３０％が上記細菌の全ゲノムにおいて出現する頻度を解析する。この際、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは複製起点に位置し、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは末端に位置する。
【００９９】
別の実施形態において、上記ヌクレオチドの４０％が上記細菌の全ゲノムにおいて出現する頻度を解析する。この際、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは複製起点に位置し、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは末端に位置する。
【０１００】
別の実施形態において、上記ヌクレオチドの５０％が上記細菌の全ゲノムにおいて出現する頻度を解析する。この際、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは複製起点に位置し、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは末端に位置する。
【０１０１】
別の実施形態において、上記ヌクレオチドの６０％が上記細菌の全ゲノムにおいて出現する頻度を解析する。この際、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは複製起点に位置し、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは末端に位置する。
【０１０２】
別の実施形態において、上記ヌクレオチドの７０％が上記細菌の全ゲノムにおいて出現する頻度を解析する。この際、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは複製起点に位置し、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは末端に位置する。
【０１０３】
別の実施形態において、上記ヌクレオチドの８０％が上記細菌の全ゲノムにおいて出現する頻度を解析する。この際、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは複製起点に位置し、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは末端に位置する。
【０１０４】
別の実施形態において、上記ヌクレオチドの９０％が上記細菌の全ゲノムにおいて出現する頻度を解析する。この際、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは複製起点に位置し、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは末端に位置する。
【０１０５】
別の実施形態において、上記ヌクレオチドの９５％が上記細菌の全ゲノムにおいて出現する頻度を解析する。この際、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは複製起点に位置し、解析する上記ヌクレオチドのうち少なくとも１つは末端に位置する。
【０１０６】
複製起点および末端の位置が既知であれば、本発明のこの態様の方法は、これらの位置のみにおけるカバレッジ（または頻度）を解析すればよいことが理解されよう。しかし、複製起点および末端の位置が未知の場合には、全ゲノム中の本質的にすべての（またはほとんどの）ヌクレオチドを解析することが好ましい。以下にさらに記載するとおり、このようにして複製起点および末端の位置を決定することができる。
【０１０７】
任意に、ヌクレオチドの頻度は、ゲノム上の位置と相関させて図表で表示できる。図表表示の一例を図２Ａおよび図２Ｃ中に示す。これらのグラフ中、ピークは複製起点と、トラフは末端と一致する。
【０１０８】
本発明者らは、（ヌクレオチドが上記ゲノムの複製起点にある頻度）：（上記ヌクレオチドが上記ゲノムの末端にある頻度）の比率が約２：１またはそれ以上である場合、この比率は上記細菌が指数増殖を呈することを示すことを明らかにした。
【０１０９】
また、（ヌクレオチドが上記ゲノムの複製起点にある頻度）：（ヌクレオチドが上記ゲノムの末端にある頻度）の比率が約１：１である場合、この比率は上記細菌が静止増殖を呈することを示す。
【０１１０】
上述の通り、上述の方法は、複製細菌の複製起点を決定するために実施されてよい。この方法は、
（ａ）上記細菌のゲノムのＤＮＡ断片をシーケンシングして、複数の核酸配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ）を取得すること、
（ｂ）上記複数の核酸配列データを、上記細菌のゲノムの配列である参照配列に対してアラインさせること、ならびに
（ｃ）上記細菌の上記ゲノムの全体においてヌクレオチドが出現する頻度を解析することを有し、
リード数が最大であるゲノム上の位置は上記細菌の複製起点である。
【０１１１】
工程（ａ）および（ｂ）については既に上述した。この場合、ヌクレオチドの頻度の解析は全ゲノムにわたって実施する。リード数が最大であるゲノム上の位置は上記細菌の複製起点であると推定できる。
【０１１２】
上述の通り、上記頻度解析の結果は図表で表すことができる（例えば、図２Ａおよび図２Ｃ参照）。この場合、グラフのピークは複製起点に対応し、グラフのトラフは末端に対応すると推定できる。
【０１１３】
本発明のこの態様の一実施形態によれば、上記細菌は、細菌および／または他の微生物の混合集団中に含まれる。上記混合細菌集団は、１種、２種、３種、４種、５種、１０種、２０種、５０種、１００種、またはそれ以上の微生物を含んでいてよい。特定の実施形態によれば、上記細菌は、マイクロバイオーム試料（例えば、消化管マイクロバイオーム）または本明細書中に開示される任意の他のマイクロバイオーム中に含まれる。
【０１１４】
さらに上述したように、本方法は、細菌の複製起点の位置を決定することに加えて、それと同時に増殖動態を解析することも可能にすることが理解されよう。
【０１１５】
本発明者らは、マイクロバイオームの細菌の増殖動態を利用してそのマイクロバイオームの健康状態を評価できることを明らかにした。
【０１１６】
したがって、本発明のさらなる態様によれば、
試験するマイクロバイオームの健康状態を解析する方法であって、
（ａ）上記試験するマイクロバイオームに含まれる少なくとも１種の細菌の増殖動態を解析すること、
（ｂ）上記試験するマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態を、病的なマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の増殖動態と比較することを有し、
上記試験するマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態が、上記病的なマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態と、統計的有意に類似している場合、上記マイクロバイオームは健康でないことが示される方法が提供される。
【０１１７】
本明細書中において、用語「病的なマイクロバイオーム」は、疾患（例えば、糖尿病もしくは前糖尿病などの代謝性疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、がん、または肥満）に罹っていることが既知である対象に由来するマイクロバイオームを指す。
【０１１８】
出所が同一であるマイクロバイオーム同士を比較することが理解されよう（すなわち、上記試験するマイクロバイオームが消化管マイクロバイオームである場合には、上記病的なマイクロバイオームも典型的には消化管マイクロバイオームである）。
【０１１９】
上記に開示されるものなど、あらゆる出所のマイクロバイオームが想定される。
【０１２０】
２種の細菌について、２種共が静止増殖に分類される場合または２種共が指数増殖に分類される場合に、これら２種の細菌は増殖動態が統計的有意に類似するとされる。
【０１２１】
一実施形態によれば、増殖動態の解析は本明細書中に記載される上記シーケンシング法によって実施される。したがって、例えば、（上記試験するマイクロバイオームに由来する上記細菌のゲノムの複製起点に上記ヌクレオチドがある頻度）：（上記試験するマイクロバイオームに由来する上記細菌のゲノムの末端に上記ヌクレオチドがある頻度）の比率が約２：１またはそれ以上であり、（上記病的なマイクロバイオームに由来する上記細菌のゲノムの複製起点に上記ヌクレオチドがある頻度）：（上記病的なマイクロバイオームに由来する上記細菌の末端に上記ヌクレオチドがある頻度）の比率が約２：１またはそれ以上である場合、これら２種の細菌はその増殖動態が統計的に有意に類似するとされてよい。
【０１２２】
また、（上記試験するマイクロバイオームに由来する上記細菌のゲノムの複製起点に上記ヌクレオチドがある頻度）：（上記試験するマイクロバイオームに由来する上記細菌のゲノムの末端に上記ヌクレオチドがある頻度）の比率が約１：１であり、（上記病的なマイクロバイオームに由来する上記細菌のゲノムの複製起点に上記ヌクレオチドがある頻度）：（上記病的なマイクロバイオームに由来する上記細菌の末端に上記ヌクレオチドがある頻度）の比率が約１：１である場合、これら２種の細菌はその増殖動態が統計的に有意に類似するとされてよい。
【０１２３】
上記以外にも、細菌の増殖動態を解析する方法が当技術分野において公知であり、例えば、接種細菌の光学濃度を一定期間にわたって解析することが挙げられる。
【０１２４】
試験するマイクロバイオームが「病的」であるとされるのは、典型的には、そのマイクロバイオームに含まれる細菌のうち少なくとも１種、より好ましくは少なくとも５種、より好ましくは少なくとも１０種、より好ましくは少なくとも２０種、より好ましくは少なくとも３０種、より好ましくは少なくとも４０種、より好ましくは少なくとも５０種、より好ましくは少なくとも１００種、より好ましくは少なくとも２００種、より好ましくは少なくとも３００種、より好ましくは少なくとも４００種、より好ましくは少なくとも５００種の増殖動態が、「病的なマイクロバイオーム」に由来する同じ細菌の増殖動態と類似する場合である。
【０１２５】
特定の実施形態によれば、以下の細菌のうち少なくとも１種の増殖動態を解析して、マイクロバイオームの健康状態を評価する。
シゲラ  ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、門Ｐ
シゲラ  ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、門Ｐ
クロストリジウム  サッカロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、門Ｆ
バクテロイデス  ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｅｓ）、門Ｂ
バクテロイデス  テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、門Ｂ
ビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、門Ａ
ストレプトコッカス  インファンタリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ）、門Ｆ
アシダミノコッカス  インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、門Ｆ
ストレプトコッカス  アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、門Ｆ
パラバクテロイデス  ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、門Ｂ
オドリバクター  スプランクニカス（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、門Ｂ
ルミノコッカス  オベウム（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ）、門Ｆ
ストレプトコッカス  パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、門Ｆ
ストレプトコッカス属Ｉ−Ｐ１６（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｉ−Ｐ１６）、門Ｆ、
ストレプトコッカス  ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、門Ｆ、
ストレプトコッカス属Ｉ−Ｇ２（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｉ−Ｇ２）、門Ｆ、
酪酸産生菌ＳＭ４／１、門Ｆ、
シゲラ  フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、門Ｐ、
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、門Ｐ、
ヘモフィルス  パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、門Ｐ、
酪酸産生菌ＳＳ３／４、門Ｆ、
ビフィドバクテリウム  アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、門Ａ、
アッカーマンシア  ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、門Ｖ、
ルミノコッカス  ブロミイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒｏｍｉｉ）、門Ｆ、
コプロコッカス  カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ）、門Ｆ、
酪酸産生菌ＳＳＣ／２、門Ｆ、
ユーバクテリウム  レクタール（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌ）、門Ｆ、
フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、門Ｆ、
ロゼブリア  インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、門Ｆ、
コプロコッカス属ＡＲＴ５５／１（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＡＲＴ５５／１）、門Ｆ、
ロゼブリア  ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、門Ｆ、
ルミノコッカス  トルキース（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ）、門Ｆ、
ビフィドバクテリウム  アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、門Ａ、
ユーバクテリウム  シリンドロイデス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ）、門Ｆ、
アリスティペス  シャヒィ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｓｈａｈｉｉ）、門Ｂ、
ユーバクテリウム  シラエウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ）、門Ｆ、
ユーバクテリウム  エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、門Ｆ、
ラクトバチルス  サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）、門Ｆ、
ラクトバチルス  ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、門Ｆ、
ルミノコッカス  シャンパネレンシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）、門Ｆ、
アドレクラウチア  エクオーリファシエンス（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ  ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、門Ａ、または
ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、門Ａ。
【０１２６】
特定の実施形態によれば、上記細菌のうち少なくとも５種が解析される。特定の実施形態によれば、上記細菌のうち少なくとも１０種が解析される。特定の実施形態によれば、上記細菌のうち少なくとも２０種が解析される。特定の実施形態によれば、上記細菌のうち少なくとも３０種が解析される。特定の実施形態によれば、上記細菌の全種が解析される。
【０１２７】
特定の実施形態によれば、ビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、シゲラ  ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、シゲラ  ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、バクテロイデス  ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｅｓ）、バクテロイデス  テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、アシダミノコッカス  インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、およびパラバクテロイデス  ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）のうち少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、または全種について増殖動態を解析し、マイクロバイオームの健康状態を評価する。
【０１２８】
さらなる別の実施形態によれば、上記試験するマイクロバイオームに含まれる細菌全種の増殖動態の平均を、上記病的なマイクロバイオームに含まれる細菌全種の増殖動態の平均と比較する。
【０１２９】
さらなる別の実施形態によれば、上記試験するマイクロバイオームに含まれる細菌全種の増殖動態の中央値を、上記病的なマイクロバイオームに含まれる細菌全種の増殖動態の中央値と比較する。
【０１３０】
上記マイクロバイオームに含まれる上記細菌の増殖動態を試験することに加え、特定の遺伝子配列の量およびその有無など、細菌関連の他のパラメータも解析できることが理解されよう。
【０１３１】
種々の微生物の濃度を定量する方法が以下に記載される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、１種以上の微生物またはその構成要素またはその生成物の濃度を決定することは、１種以上のＤＮＡ配列の濃度を決定することを含む。いくつかの実施形態において、１種以上のＤＮＡ配列は、異なる種類の微生物を区別するために使用できる任意のＤＮＡ配列を含む。ある実施形態において、１種以上のＤＮＡ配列は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。ある実施形態において、１種以上のＤＮＡ配列は１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個、１，０００個、５，０００個、またはそれ以上の配列が増幅される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、微生物相試料（例えば糞便試料）を直接アッセイし、１種以上のＤＮＡ配列の濃度を調べる。いくつかの実施形態において、微生物相試料からＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡをアッセイして１種以上のＤＮＡ配列の濃度を調べる。微生物のＤＮＡを単離する方法は当技術分野において公知である。例として、フェノール−クロロホルム抽出、およびＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア）などの種々の市販キットが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、１種以上のＤＮＡ配列の濃度の決定は、ＰＣＲ（例えば、標準ＰＣＲ、半定量ＰＣＲ、または定量ＰＣＲ）を用いてＤＮＡ配列を増幅することにより実施する。いくつかの実施形態において、１種以上のＤＮＡ配列の濃度の決定は、定量ＰＣＲを用いてＤＮＡ配列を増幅することにより実施する。こうしたＤＮＡ増幅手順やそれ以外の基本的なＤＮＡ増幅手順は当技術分野の技術者にとって既知であり、Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ  Ｍ，Ｂｒｅｎｔ  Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  Ｒ  Ｅ，Ｍｏｏｒｅ  Ｄ  Ｄ，Ｓｅｉｄｍａｎ  Ｊ  Ｇ，Ｓｍｉｔｈ  Ｊ  Ａ，Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ（ｅｄｓ）．１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中に記載される。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列の増幅には、個々の微生物種を他の異なる微生物種と区別する１種以上の配列に対して特異的なプライマーを使用する。いくつかの実施形態において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列またはその断片を、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対して特異的なプライマーを使用して増幅する。いくつかの実施形態において、１８Ｓ  ＤＮＡ配列を、１８Ｓ  ＤＮＡ配列に対して特異的なプライマーを使用して増幅する。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、１種以上の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の濃度の決定は、ファイロチップ（ｐｈｙｌｏｃｈｉｐ）技術により実施する。ファイロチップの使用は当技術分野において公知であり、Ｈａｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｄｅｅｐ−ｓｅａ  ｏｉｌ  ｐｌｕｍｅ  ｅｎｒｉｃｈｅｓ  ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ  ｏｉｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０，２０４−２０８，２０１０）（その全体を参考として本明細書に組み込む）中に記載される。簡潔には、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅し、微生物相試料から抽出されたＤＮＡで標識する。次いで、増幅したＤＮＡを、微生物１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のプローブを含むアレイにハイブリダイズさせる。次いで、各プローブへの結合レベルを定量して、プローブした１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対応する微生物種の試料濃度を提供する。いくつかの実施形態において、ファイロチップ解析は業者が実施する。例として、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ社（カリフォルニア州サンフランシスコ）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、１種以上の微生物またはその構成要素またはその生成物の濃度の決定は、１種以上の微生物ＲＮＡ分子（例えば転写物）の濃度を決定することを含む。ＲＮＡ転写物の濃度を定量する方法は、当技術分野において公知であり、ノーザン解析、半定量的逆転写酵素ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、およびマイクロアレイ解析が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、１種以上の微生物またはその構成要素またはその生成物の濃度の決定は、１種以上の微生物ポリペプチドの濃度を決定することを含む。ポリペプチド濃度を定量する方法は、当技術分野において公知であり、ウェスタン解析および質量解析が挙げられるが、これらに限定されない。こうしたポリペプチド検出手順やそれ以外の基本的なポリペプチド検出手順は、Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ中に記載される。いくつかの実施形態において、１種以上の微生物またはその構成要素またはその生成物の濃度の決定は、１種以上の微生物代謝産物の濃度を決定することを含む。いくつかの実施形態において、代謝産物の濃度は質量解析により決定される。いくつかの実施形態において、代謝産物の濃度は核磁気共鳴分光法により決定される。いくつかの実施形態において、代謝産物の濃度は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）により決定される。いくつかの実施形態において、代謝産物の濃度は比色解析により決定される。いくつかの実施形態において、代謝産物の濃度は分光光度法により決定される。
【０１３９】
上述の方法を、マイクロバイオームの健康状態を解析することに加えて、疾患を有する対象を診断するために使用してもよいことが理解されよう。
【０１４０】
したがって、本発明のさらなる別の態様によれば、対象の健康状態を決定する方法であって、
（ａ）上記対象のマイクロバイオーム試料に含まれる少なくとも１種の細菌の増殖動態を解析すること、
（ｂ）上記対象の上記マイクロバイオーム試料に含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態を、少なくとも１つの病的なマイクロバイオームの中の上記少なくとも１種の細菌の増殖動態と比較することを有し、
上記マイクロバイオーム試料に含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態が、上記病的なマイクロバイオームに含まれる上記少なくとも１種の細菌の上記増殖動態と、統計的有意に類似している場合、上記対象は健康でないことが示される方法が提供される。
【０１４１】
本発明のこの態様によれば、上記試験するマイクロバイオームの採取元である上記対象を、上記対象のマイクロバイオームの状態にしたがって診断できる。上記試験するマイクロバイオームに含まれる細菌の増殖動態が、上記病的なマイクロバイオームに含まれる対応する細菌の増殖動態と類似する場合、上記対象が疾患を有していることが示される。
【０１４２】
あるいは、またはそれに加えて、上記試験するマイクロバイオームに含まれる細菌の増殖動態が、健康なマイクロバイオームに含まれる対応する細菌の増殖動態と類似する場合、上記対象が疾患を有していないことが示される。
【０１４３】
対象が疾患を有すると診断されるのは、典型的には、含まれる細菌のうち少なくとも１種、より好ましくは少なくとも５種、より好ましくは少なくとも１０種、より好ましくは少なくとも２０種、より好ましくは少なくとも３０種、より好ましくは少なくとも４０種、より好ましくは少なくとも５０種、より好ましくは少なくとも１００種、より好ましくは少なくとも２００種、より好ましくは少なくとも３００種、より好ましくは少なくとも４００種、より好ましくは少なくとも５００種の増殖動態が、その疾患を有する病的なマイクロバイオームに由来する細菌の増殖動態と類似する場合である。
【０１４４】
例えば、試験対象の消化管マイクロバイオームに含まれるユーバクテリウム  レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ）の増殖動態が、潰瘍性大腸炎患者の消化管マイクロバイオームに含まれるユーバクテリウム  レクターレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ）の増殖動態と類似する場合、上記試験対象が潰瘍性大腸炎を有することが示される。
【０１４５】
例えば、試験対象の消化管マイクロバイオームに含まれる酪酸産生菌ＳＳ３／４の増殖動態が、クローン病患者の消化管マイクロバイオームに含まれる酪酸産生菌ＳＳ３／４の増殖動態と類似する場合、上記試験対象がクローン病を有することが示される。
【０１４６】
例えば、試験対象の消化管マイクロバイオームに含まれる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  Ｃｏｌｉ）の増殖動態が、クローン病患者の消化管マイクロバイオームに含まれる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  Ｃｏｌｉ）の増殖動態と類似する場合、上記試験対象がクローン病を有することが示される。
【０１４７】
例えば、試験対象の消化管マイクロバイオームに含まれるビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）の増殖動態が、クローン病患者または潰瘍性大腸炎の消化管マイクロバイオームに含まれるビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）の増殖動態と類似する場合、上記試験対象がクローン病または潰瘍性大腸炎を有することが示される。
【０１４８】
例えば、試験対象の消化管マイクロバイオームに含まれるエガセラ  レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）の増殖動態を解析することにより、対象のクローン病が活性型であるか寛解状態にあるかについての情報を取得できる。
【０１４９】
試験対象の消化管マイクロバイオームに含まれるクレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｅｎｅｕｏｉａｅ）、エレセラ  レンタ（Ｅｒｒｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酪酸産生菌ＳＳ３／４、シゲラ  ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、シゲラ  ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、バクテロイデス  ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｅｓ）、バクテロイデス  テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、アシダミノコッカス  インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、ビフィドバクテリウム  アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｓｃｅｎｔｉｓ）、ベイロネラ  パルブラ（Ｂｅｉｏｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ）、オドリバクター  スプランクニカス（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、バクテロイデス  キシラシソルベンス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｓｉｓｏｌｖｅｎｓ）、アリスティペス  シャヒィ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｓｈａｈｉｉ）、およびパラバクテロイデス  ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）のうち少なくとも１種の増殖動態が、糖尿病患者の消化管マイクロバイオームに含まれる同じ細菌の増殖動態と類似する場合、上記試験対象が糖尿病を有することが示される。
【０１５０】
特定の実施形態によれば、対象を診断するために、以下の細菌のうち少なくとも１種の増殖動態が解析される。
シゲラ  ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、門Ｐ、
シゲラ  ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、門Ｐ、
クロストリジウム  サッカロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、門Ｆ、
バクテロイデス  ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｅｓ）、門Ｂ、
バクテロイデス  テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、門Ｂ、
ビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、門Ａ、
ストレプトコッカス  インファンタリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ）、門Ｆ、
アシダミノコッカス  インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、門Ｆ、
ストレプトコッカス  アンギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、門Ｆ、
パラバクテロイデス  ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、門Ｂ、
オドリバクター  スプランクニカス（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、門Ｂ、
ルミノコッカス  オベウム（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ）、門Ｆ、
ストレプトコッカス  パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、門Ｆ、
ストレプトコッカス属Ｉ−Ｐ１６（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｉ−Ｐ１６）、門Ｆ、
ストレプトコッカス  ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、門Ｆ、
ストレプトコッカス属Ｉ−Ｇ２（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｉ−Ｇ２）、門Ｆ、
酪酸産生菌ＳＭ４／１、門Ｆ、
シゲラ  フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、門Ｐ、
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、門Ｐ、
ヘモフィルス  パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、門Ｐ、
酪酸産生菌ＳＳ３／４、門Ｆ、
ビフィドバクテリウム  アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、門Ａ、
アッカーマンシア  ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、門Ｖ、
ルミノコッカス  ブロミイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒｏｍｉｉ）、門Ｆ、
コプロコッカス  カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ）、門Ｆ、
酪酸産生菌ＳＳＣ／２、門Ｆ、
ユーバクテリウム  レクタール（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌ）、門Ｆ、
フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、門Ｆ、
ロゼブリア  インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、門Ｆ、
コプロコッカス属ＡＲＴ５５／１（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＡＲＴ５５／１）、門Ｆ、
ロゼブリア  ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、門Ｆ、
ルミノコッカス  トルキース（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ）、門Ｆ、
ビフィドバクテリウム  アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、門Ａ、
ユーバクテリウム  シリンドロイデス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ）、門Ｆ、
アリスティペス  シャヒィ（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ  ｓｈａｈｉｉ）、門Ｂ、
ユーバクテリウム  シラエウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ）、門Ｆ、
ユーバクテリウム  エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ）、門Ｆ、
ラクトバチルス  サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）、門Ｆ、
ラクトバチルス  ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、門Ｆ、
ルミノコッカス  シャンパネレンシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）、門Ｆ、
アドレクラウチア  エクオーリファシエンス（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ  ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、門Ａ、または
ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、門Ａ。
【０１５１】
別の実施形態によれば、対象を診断するために、図４中の以下の細菌のうち少なくとも１種の増殖動態が解析される。特定の実施形態によれば、上記細菌のうち少なくとも５種が解析される。特定の実施形態によれば、上記細菌のうち少なくとも１０種が解析される。特定の実施形態によれば、上記細菌のうち少なくとも２０種が解析される。特定の実施形態によれば、上記細菌のうち少なくとも３０種が解析される。特定の実施形態によれば、上記細菌の全種が解析される。
【０１５２】
特定の実施形態によれば、ビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、シゲラ  ボイディ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、シゲラ  ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、バクテロイデス  ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｅｓ）、バクテロイデス  テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、アシダミノコッカス  インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、およびパラバクテロイデス  ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）のうち少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、または全種について増殖動態を解析し、対象の健康状態を評価する。
【０１５３】
さらなる別の実施形態によれば、上記試験対象の上記マイクロバイオームに含まれる細菌全種の増殖動態の平均を、上記病的なマイクロバイオームに含まれる細菌全種の増殖動態の平均と比較する。
【０１５４】
さらなる別の実施形態によれば、上記試験対象の上記マイクロバイオームに含まれる細菌全種の増殖動態の中央値を、上記病的なマイクロバイオームに含まれる細菌全種の増殖動態の中央値と比較する。
【０１５５】
本出願から特許となった際、その特許の存続期間中に、本出願に関連するシーケンシング技術が多数開発されることが予期される。用語「シーケンシング」の範囲は、予期されるそうした新技術も全て含むものとする。
【０１５６】
本明細書中において、用語「約」は±１０％を指す。
【０１５７】
用語「含む」、「有する」、「備える」、およびそれらの組合せは、「〜を含むがそれに限定されない」ことを意味する。
【０１５８】
用語「からなる」は、「〜を含み、それに限定される」ことを意味する。
【０１５９】
用語「本質的に〜からなる」は、組成、方法、または構造が、更なる成分、工程、および／または部分を含んでもよく、そうした更なる成分、工程、および／または部分は請求項に記載の組成、方法、または構造の基本的かつ新規の特徴を実質的に変更するものではないことを意味する。
【０１６０】
本明細書中において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明瞭に記載がない限り、複数の意味も含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、複数の化合物を含んでもよく、それらの混合物を含んでもよい。
【０１６１】
本出願の全体にわたって、本発明の種々の実施形態は範囲形式で記載されている場合がある。範囲形式での記載は、単に便利かつ簡潔にするものであり、本発明の範囲を不変に限定するものではないことが理解されよう。したがって、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲、およびその範囲に含まれる個々の数値を具体的に開示しているものとして解釈される。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、ならびにその範囲に含まれる個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示しているものとして解釈される。このことは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【０１６２】
本明細書中において用語「方法」は、所与の作業を遂行するための手法、手段、技術、および手順を指す。そうした手法、手段、技術、および手順は、既知の手法、手段、技術、および手順、ならびに化学、薬理学、生物学、生化学、および医学分野の技術者が既知の手法、手段、技術、および手順を基にして容易に開発できる手法、手段、技術、および手順を含むが、これらに限定されない。
【０１６３】
明確さを期して別個の実施形態に記載された本発明の特定の特徴は、これらを組み合わせて１つの実施形態において提供してもよいことが理解されよう。逆に、簡潔さを期して１つの実施形態に記載された本発明の種々の特徴を、別個に、または任意の適切な副次組合せで、または記載された本発明の他の任意の実施形態において適切に提供してもよいことが理解されよう。種々の実施形態に記載された特定の特徴は、それらの要素なしでは当該実施形態を実施できない場合を除いて、当該実施形態の必須の特徴とみなされることはない。
【０１６４】
上記に詳述され請求項に記載された本発明の種々の実施形態および態様に関し、実験による裏付けとして、以下に実施例を記載する。
実施例
【０１６５】
以下の実施例を参照する。以下の実施例と上記の記載とにより本発明のいくつかの実施形態を例示するが、本発明はこれらに限定されない。
【０１６６】
一般的に、本明細書中で使用される学術用語および本発明で使用される実験手順は、分子学的技術、生化学的技術、微生物学的技術、および組換えＤＮＡ技術を含む。こうした技術については文献中に十分に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号明細書、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、米国特許第４，８０１，５３１号明細書、米国特許第５，１９２，６５９号明細書、および米国特許第５，２７２，０５７号明細書に記載の方法、“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照。使用可能なイムノアッセイは特許文献および科学文献中に広く記載される。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、米国特許第３，８３９，１５３号明細書、米国特許第３，８５０，７５２号明細書、米国特許第３，８５０，５７８号明細書、米国特許第３，８５３，９８７号明細書、米国特許第３，８６７，５１７号明細書、米国特許第３，８７９，２６２号明細書、米国特許第３，９０１，６５４号明細書、米国特許第３，９３５，０７４号明細書、米国特許第３，９８４，５３３号明細書、米���特許第３，９９６，３４５号明細書、米国特許第４，０３４，０７４号明細書、米国特許第４，０９８，８７６号明細書、米国特許第４，８７９，２１９号明細書、米国特許第５，０１１，７７１号明細書、および米国特許第５，２８１，５２１号明細書、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）、“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）参照。これらはすべて参考として本明細書に組み込み、本明細書中に十分に説明されているものとみなす。上記以外の一般的な参照文献を、本明細書の全体にわたって記載する。こうした文献中の手順は、当技術分野において公知であると考え、読者の利便のために提供される。こうした文献中に含まれる情報はすべて、参考として本明細書に組み込む。
【０１６７】
材料および方法
ｅｘ  ｖｉｖｏ大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）培養およびシーケンシング
凍結ストックしてあった大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞（Ｋ−１２株）のバッチ培養物を、ＬＢ培地中で増殖させた。２００ｒｐｍにおいて振とうしながら上記培養物を３７℃で培養して、吸光度６００ｎｍの分光度が９になった２４時間後に細胞を回収し、静止培養物からＤＮＡを精製した。指数増殖期の培養物からＤＮＡを得るために、一晩培養したスタータ培養物を６００倍に希釈して３時間増殖させ、吸光度６００ｎｍの分光度が０．２になった時点で細胞を回収した。ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。ショットガンシーケンシングのために、精製ゲノムＤＮＡ１μｇをＣｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０超音波処理器で剪断した。次いで、イルミナ互換ライブラリ（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）を文献（Ｓｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の通りに調製して、ＨｉＳｅｑ  ２５００機でシーケンシングした。
【０１６８】
データ
複製起点の位置は、Ｇａｏ，Ｆ．，Ｌｕｏ，Ｈ．＆Ｚｈａｎｇ，Ｃ．−Ｔ．ＤｏｒｉＣ  ５．０：ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｏｒｉＣ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１，Ｄ９０−３（２０１３）より入手した。完全な細菌ゲノムは以下のようにして得た。まず、完全なゲノムをＲｅｆＳｅｑ３６およびＥｎｓｅｍｂｌ３７からダウンロードした（２０１４年３月）。不完全なゲノム（断片、スーパーコンティグなど）またはプラスミドをフィルターにかけ、重複するゲノムを除去した。メタゲノムデータセットは参照文献７（試料３６３個）および参照文献９（試料３４６個、完全なメタデータを有する試料のみ）から得た。
【０１６９】
シーケンシングカバレッジ解析
ＧＥＭ  ｍａｐｐｅｒ３８を使用してペアエンド様式により、特定のパラメータ（−ｑ  ｏｆｆｓｅｔ−３３−ｇｅｍ−ｑｕａｌｉｔｙ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ２６）で、全細菌ゲノムを含むデータベースに試料をマッピングした。複数種にマッピングされたリードを、Ｐａｔｈｏｓｃｏｐｅ３９から取り入れた期待値最大化（Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ−Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ：ＥＭ）アルゴリズムを必要に応じて使用することにより、正しく割り当てた、かつ／または正しく分けた。同一種の異なる株にリードがマッピングされることがよくあるが、その場合、各試料について量が最も多い株を選択し、これを代表的な株とした。各細菌にマッピングされたシーケンスリードの総数を合計し、表示のために、重複のない各１０Ｋｂｐのビンとした。次いで、本発明者らは、ウィンドウサイズ１０Ｋｂｐの移動和および１００ｂｐのスライドを、続いてウィンドウサイズ１０Ｋのビンの移動中央値および１００ビンのスライドを有する平滑化フィルターを用いた。細菌ゲノム全体において、中央値ビンカバレッジを対称的に囲む８倍の範囲に入っていないビンを除去し、４０％を超えるビンが除去された細菌や、残存するビンが１０未満である細菌も除去した。
【０１７０】
複製起点の位置の予測
ｌｍｆｉｔ４０により、非線形最小二乗極小化に用いるレーベンバーグ・マーカート・アルゴリズムを実行して、各試料中における各細菌の平滑化済のカバレッジビンに、原型のカバレッジ関数をフィットさせた。上記カバレッジ関数は、ピーク位置とピークカバレッジおよびトラフ位置とトラフカバレッジの関数である（ＯＲＩｌｏｃ，ＯＲＩｃｏｖ）および（ＴＥＲｌｏｃ，ＴＥＲｃｏｖ）が、各セグメント間において直線である。
2017533723.tif 000002
式中、
2017533723.tif 000003
ＯＲＩｌｏｃおよびＴＥＲｌｏｃは限定され、細菌ゲノムの長さの４５〜５５％で分離されていた。カバレッジビンを置き換えることによってｐ値を割り当て、ｐ＜０．０５でありかつピーク対トラフ比率（ＯＲＩｃｏｖ／ＴＥＲｃｏｖ）が１．１を超えるフィットのみを保持した。
【０１７１】
少なくとも３つの異なる試料について、カバレッジフィットが成功した細菌についてのみ、複製起点の位置の予測を実施した。いずれの試料についても、各細菌のＯＲＩｌｏｃの円周中央値が複製起点位置であるとして予測した。円周中央値（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉａｎ）は、複製起点が所定のゲノム配列の端に位置する場合に対処するためのものである。こうした場合、由来試料を問わずその細菌のカバレッジピークがゲノムの両端にある可能性があり、したがって、通常の中央値では、配列の中央に複製起点があると誤って判断されるからである。円周中央値（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉａｎ）は以下のように定義される。
2017533723.tif 000004
式中、
2017533723.tif 000005
式中、ｇはゲノム長であり、
2017533723.tif 000006
は異なる試料のカバレッジピークのベクトルである。複製終結点の位置の予測も類似の方法によって実施した。
【０１７２】
ピーク対トラフ比率
各試料において、予測ピーク位置における平滑化済のシーケンシングカバレッジ（シーケンシングカバレッジ解析については上記を参照）を予測トラフ位置における平滑化済のシーケンシングカバレッジで割ることにより、各細菌のピーク対トラフ比率を計算した。比率の計算においては、２つの条件が満たされる必要がある。（１）個々の細菌について複製起点の位置および複製終結点の位置を予測すること（すなわち、カバレッジ関数をフィットさせｐ＜０．０５かつフィット後ピーク対トラフ比率＞１．１である試料が少なくとも３つあること）、（２）個々の試料において細菌が十分なカバレッジを有し、かつ、シーケンシングカバレッジ解析の一部として平滑化フィルターが使用された後に上記細菌が保持されること。
【０１７３】
ピーク対トラフ比率と臨床パラメータの相関関係
各データセット７、９について別個に相関関係を計算した。ピーク対トラフ比率、相対量、および相対量について線形補正した後のピーク対トラフ比率と、異なる宿主変数と、の間のスピアマン相関関係をそれぞれ独立して計算した。ピーク対トラフ比率を計算した試料数が２０個を超える細菌のみを、この解析において考察した。欠損している微生物データは隠し、相関関係には含めなかった。含めた宿主変数は、Ｑｉｎ  ｅｔ．ａｌ７についてはＢＭＩ（Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ）、ＩＩ型糖尿病罹患率、空腹時血中グルコース、遊離インスリン、ＨｂＡ１Ｃ％、および体重、ＭｅｔａＨＩＴ９についてはＢＭＩ、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＤ）罹患率、および潰瘍性大腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ：ＵＣ）罹患率とした。後者について、ＵＣ罹患率またはＣＤ罹患率との相関関係は、罹患者がスペイン人サブセットのみであったため、スペイン人から採取した試料についてのみ解析した。加えて、ＢＭＩとの相関関係は、両国（デンマーク、スペイン）の国籍をもつ被験者について別個に計算した。得られた相関関係はいずれも、多重仮説検定のためにＦＤＲ補正に供した。
【０１７４】
文献情報と予測された起点の位置との相関関係
図２Ｅ中の相関関係はピアソン相関関係である。特定の細菌について、予測された複製起点の位置と文献にみられる複製起点の位置とを比較した際、誤差がゲノム長の５０％を超える場合にゲノム長を最も小さい位置に加えて、その細菌ゲノムが環状であることの根拠とした。
【実施例１】
【０１７５】
カバレッジ解析より、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養物およびｉｎ  ｖｉｖｏメタゲノム試料のいずれにおいても大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）に原型パターンがみられる。
シーケンシングカバレッジ解析によりＤＮＡの複製および増殖動態についての情報が取得できるという着想を実証するため、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（Ｋ−１２株）のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物を増殖させた。上記培養物は指数増殖期または静止増殖期のいずれかにおいて採取した（「方法」参照）。各試料からＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡプールをそれぞれ次世代シーケンシングに供して、リードを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ゲノムにマッピングした後、カバレッジパターンを解析した。その結果、培養物中の細胞のほとんどが増殖しておらずゲノムのコピー数が１つである静止期において、ゲノム全体にわたりカバレッジは均一であった（図１Ａ、図１Ｂ）。その一方、多くの細菌細胞がＤＮＡ複製の異なる段階にある可能性が高い指数増殖期に採取した試料のカバレッジパターンは、トラフ１つおよびピーク１つを呈し、そのピークは既知の３０大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の複製起点と一致した（図１Ｂ）。このことから、カバレッジパターンは、集団中の各細菌のゲノムにおける種々の部分のコピー数が異なるために生じており、ＤＮＡ複製段階を反映していることが示唆される。さらに、ピークにおけるカバレッジとトラフにおけるカバレッジの比率が、静止期の試料では約１：１であるのに対し、指数増殖期の試料では約３：１であることも注目され、このことから、この比率がこれら２種の培養物の増殖動態を示していることが示唆された。
【０１７６】
注目に値するのは、十分量の細菌を含むヒト便由来の、公けに入手できるｉｎ  ｖｉｖｏメタゲノム試料５２２個７、９において、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ゲノムのカバレッジ解析を同様に実施したところ、同一の原型パターンがみられ、そのカバレッジピーク位置とカバレッジトラフ位置がｅｘ  ｖｉｖｏ培養物におけるその位置と一致した（図１Ｃ）ということである。また、ピーク対トラフ比率は０．９７〜３．５５の範囲で大きく変動し、この変動は、培養中の静止期増殖（比率＝１．１）から指数期増殖にわたる大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の増殖動態の変動範囲と非常によく一致している（比率＝３．３、図１Ｃ）。
【０１７７】
総合すると、これらの結果から、ＤＮＡ複製の過程によって原型のシグニチャが生じ、このシグニチャをシーケンスリードのカバレッジ解析によって検出できることが示唆される。また、異なる培養条件および異なるヒトマイクロバイオーム試料において、細菌ゲノム全体にわたるピークカバレッジとトラフカバレッジの比率が大きく変動し、高い比率は、解析した細菌集団の複製速度が高いこと、したがって増殖が速いことを示している可能性が高い。
【実施例２】
【０１７８】
カバレッジ解析は複製起点を正確に同定する
この方法を混合微生物集団全般に用いて、カバレッジパターン解析を大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）以外の種にも適用できるかどうかを試験するため、本発明者らは、この解析方法を完全なゲノム（「方法」）が入手可能であり、公けに入手できるメタゲノム便試料９３４６個における全ての細菌について適用した。注目に値するのは、本発明者らが、異なる細菌１６８種について、原型のカバレッジパターンが大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の原型のカバレッジパターンと類似しており、各細菌におけるパターンがピーク１つおよびトラフ１つからなることを見い出した（図２Ａ、図２Ｃ）ということである。また、異なるヒトマイクロバイオーム試料に含まれる各細菌について、カバレッジパターンのピーク位置およびトラフ位置は異なる試料間でよく一致した（図２Ｂ、図２Ｄ）。
【０１７９】
大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）でのように、各細菌におけるピークカバレッジの位置がその複製起点の位置に対応するかどうかを試験するため、本発明者らは、異なる試料中の上記細菌１６８種の各々についてピーク位置の中央値（円周中央値、「方法」参照）を計算した。その結果、本発明の細菌カバレッジパターンの解析のみに基づいて計算された前記の中央値の位置は、起点が既知３０である種々の細菌１１３種の複製起点とよく一致した（ピアソン−Ｒ２＝０．９８、ｐ＜１０−９８、図２Ｅ）。例えばパラバクテロイデス  ディスタソニス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）の場合、予測された起点位置は既知の起点から約１８０ｋｂ離れており、この距離はこの細菌のゲノム長のわずか約３．７％の差異に対応していた。中央値ピーク位置と既知の起点との差が上記より大きかったケースは少なかったが、そうしたケースについて、より詳しく調べたところ、恐らく、６種の細菌において既知の起点の位置が間違っており、本明細書中では正しい位置が示されている（図５Ａ〜図５Ｆ）。例えばオドリバクター  スプランクニカス（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｌａｎｃｈｉｕｓ）の場合、既知の起点はゲノムの始点に位置しているが、ヒトマイクロバイオーム試料７２個に基づく本発明者らの解析では原型のピークおよびトラフパターンが３．３Ｍｂｐの位置にあることを特定している。注目に値するのは、本発明者らがカバレッジ解析を実施した細菌１６８種のうち５５種については、起点位置は未知であり、したがって本発明者らの解析が新たな起点位置を提示したことになる（図２Ｆ、図６Ａ〜図６Ｉ）ということである。
【０１８０】
本発明者らがこのようにカバレッジ解析をメタゲノム試料に適用することのみで計算して明らかとしたように、ほとんどの細菌において既知の複製起点とピーク位置とがよく一致していたことから、ここで得られた原型のカバレッジパターンが、対象細菌がその宿主中で受けるＤＮＡ複製プロセスに関する情報を確かに示す、ということを裏付けるさらなる証拠を与えることになる。また、このカバレッジ解析により、複製起点が未知の細菌についてその複製起点を新たに推定し、場合によっては間違った起点の位置を正しく特定することによって、細菌ゲノムの構造特性を明らかにできるということも示される。
【実施例３】
【０１８１】
ピーク対トラフ比率が呈する日内周期的変動と量の周期的変動との位相がずれている
次に、本発明者らは、マイクロバイオーム構造内における個々の種の挙動パターンを評価する目的で、カバレッジ解析の生理的関連性を調べることにした。近年の研究から、腸内の微生物相に含まれる微生物構成員の約１５％は日内周期的変動を呈し、この日内周期的変動は１日を通じ、量において、また「ドライバ」細菌の機能において周期的変化を示す、ということが分かっている。さらに、こうした微生物の周期的変化は宿主とマイクロバイオームの間の相互作用にとって根本的に重要であり、マイクロバイオームの周期的変化における日内の乱れは肥満および耐糖能障害に対する宿主の感受性を駆り立てる、ということも示されている。
【０１８２】
細菌量におけるこうした日内の周期的変動は増殖速度の日内変化によって生じている可能性が高いため、本発明者らは、これらのデータにカバレッジ解析法を適用し、細菌増殖の周期的変化は一日の異なる時間でのピーク対トラフカバレッジ比率の変化に表れる、と仮説を立てた。この研究において、本発明者らは、ヒト対象２人から連続４日間または連続５日間にわたって約６時間毎にメタゲノム便試料を採取し、これを解析した。一般的に使用されるＪＴＫサイクル３２アルゴリズムを適用した結果、量的割合が２４時間周期で変化し、かつ由来試料を問わず量的割合が十分であり本発明者らのピーク対トラフカバレッジ解析を実行できる細菌６種を特定した。注目に値するのは、上記細菌６種のいずれもが、由来試料を問わずピーク対トラフ比率が周期的パターンを呈し、細菌３種においてはこの周期的変動が２４時間周期で統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５、図３Ａ〜図３Ｆ）ということである。また、上記細菌６種のうち５種の周期的変動の位相は、相対量的割合の周期的変動の位相とずれていた（図３Ａ〜図３Ｆ）。例えばルミノコッカス  オベウム（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ）の場合、ピーク対トラフ比率は毎日ツァイトゲーバー時間（ＺＴ）１２時間に最高値となったが、その細菌の量は６時間後、つまり毎日ＺＴの１８時間には最高値となった（図３Ａ）。このように一方の指標が低値のときもう一方が高値となるような、細菌量とピーク対トラフ比率との非相関関係は、これら２つの指標の特性として些細なものではない。というのは、異なるヒト試料を調べたところ、これら２つの指標には相関がないからである（図７）。
【０１８３】
注目に値するのは、上記細菌６種のうち２種（Ｒ．オベウム（Ｒ．ｏｂｅｕｍ）およびユーバクテリウム  シラエウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｒａｅｕｍ））について、文献３０中には既知の複製起点の記載がないが本解析により新たな起点が予測され、これをカバレッジ解析において使用すると、サイクリング（ｃｙｃｌｉｎｇ）ピーク対トラフ比率が得られた（図３Ａ、図３Ｂ）ということである。このことは、本発明者らが推定した起点が正確であることと本発明者らの方法が有用であることを、上記とは独立して、さらに裏付けるものである。これ以外の場合でも、例えばＰ．ディスタソニス（Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）およびヘモフィルス  パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）において、カバレッジ解析で特定した起点は文献中の起点と一致し、ピーク対トラフ比率は日内周期的変動を呈した（図３Ｃ、図３Ｄ）。
【０１８４】
これらの結果は、ピーク対トラフ比率が細菌の増殖動態を反映しているという着想をさらに裏付けるものであり、一部の細菌の細菌量日内変化がその細菌の増殖速度日内変化に起因することを示唆する。より包括的に、本発明者らによる結果は、微生物相の生態系に含まれる細菌の量の増加はその細菌のピーク対トラフ比率が増加した後に起こるため、ピーク対トラフ比率の増加から予測できることを示唆する。
【実施例４】
【０１８５】
細菌のピーク対トラフ比率は複数の宿主臨床パラメータと相関関係にある
細菌のＰＴＲが疾患および種々の臨床パラメータに関連するかどうかを試験するため、欧州コホート（Ｎ＝３９６）および中国コホート（Ｎ＝３６３）に由来する試料に含まれる細菌種すべてについてＰＴＲを作成した。両データセットにおいて、異なる試料から作成したＰＴＲには大きな違いがみられた（図４）。注目に値するのは、細菌２０種のＰＲＴと複数の臨床パラメータとの間に統計的に有意な相関関係がみられた、ということである。例えば、図４に示すように、欧州コホートのスペイン国籍をもつ被験者においてビフィドバクテリウム  ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）のＰＴＲとクローン病の発生との間に有意な相関関係がみられ（ＦＤＲ補正したマン・ホイットニー検定、Ｐは０．００５未満）、また、中国コホートにおいて細菌１２種のＰＴＲとＩＩ型糖尿病の発生との間に統計的に有意な相関関係がみられた。他にも、ＰＴＲと、潰瘍性大腸炎の発生、体格指数（ＢＭＩ）、糖化ヘモグロビン画分、空腹時血清インスリン、および空腹時血中グルコース濃度との間に有意な相関関係がみられた。
【０１８６】
これらの関連は細菌量の検査とは独立したものであり、細菌量の検査をしても分からない。（１）ＰＴＲと臨床パラメータとの関連を調べた際、検査対象の細菌が存在する試料のみを使用したため、その細菌が存在するか否かについての情報は控えた。（２）統計的に有意な相関関係がみられた３８種のうち５種のみにおいて、量的割合と同臨床パラメータとの相関をとり、３８種のうち３６種において、相対的量的割合について相関をとった後でＰＴＲの関連が有意なまま保持された。一部の細菌種については、ユーバクテリウム  レクタール（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌ）を含む細菌の相対量とクローン病発生との相関（ＦＤＲ補正したマン・ホイットニー検定、Ｐは１０−４未満）をとった後で初めて、ＰＴＲと臨床パラメータとの相関をとった。
【０１８７】
微生物相全体の増殖動態の包括的指標として、各試料につき、存在する上記細菌すべてについてのＰＴＲの平均値および中央値の両方を計算した。この包括的指標は、空腹時血糖およびＨｂＡ１ｃ％濃度ならびにクローン病およびＩＩ型糖尿病の発生と相関関係にあり、これより、マイクロバイオームの包括的な増殖動態も疾患と関連していることが示される（図４）。
【０１８８】
マサチューセッツ総合病院（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ；ＭＧＨ）におけるＩＢＤ研究の前向きレジストリ（Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ＩＢＤ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＭＧＨ；ＰＲＩＳＭ）のコホートに由来する試料４０個について予備的に解析したところ、全試料のうち半分を超える試料について、ＰＴＲ計算を目的とした本発明のストリンジェントなパイプラインフィルターを通過した細菌は４種のみであった。にもかかわらず、エガセラ  レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）のＰＴＲは活性型クローン病患者と寛解クローン病患者の間で有意に異なっていた（ＦＤＲ補正したマン・ホイットニー検定、Ｐは０．１未満）。Ｅ．レンタ（Ｅ．ｌｅｎｔａ）の量も他の３種の細菌の量も異なっていなかった。
【０１８９】
活性型クローン病患者と非活性型クローン病患者との間で、マイクロバイオームが宿主に及ぼす効果の独立した特徴をＰＴＲが反映していることが強調される。
【０１９０】
これらの結果を総合すると、ピーク対トラフカバレッジ比率が臨床的関連のある情報を含むことが示され、また、この情報は細菌の量的割合に含まれる情報とは独立していることが示される。したがって、一部の細菌については、生態系におけるその増殖動態の方が、相対的量的割合よりも関連性が大きい可能性があることが示唆される。
【０１９１】
結論および考察
以上のことを要約すると、上記の実施例から、メタゲノム試料に含まれる細菌のリードカバレッジのパターンを、マイクロバイオームに含まれる細菌の増殖カイネティック挙動を静的メタゲノム試料１つから推論して解明するための新しい手法として使用できることが示される。カバレッジ解析をヒト消化管メタゲノム試料７０９個７、９に適用するにあたり、本発明者らは、ほとんどの細菌はゲノム全体にわたってピーク１つおよびトラフ１つからなる原型のカバレッジパターンを呈することを示す。これらのカバレッジパターンが微生物相の生態系における別個の細菌の増殖動態を反映している可能性があることを示す複数の証拠が、本明細書中に提示される。第一に、複製起点が既知であるほとんどの細菌について、カバレッジパターンのピークが起点に非常に近く、細菌の増殖および複製のシグニチャから予期できるものと一致する。第二に、異なるヒトマイクロバイオーム試料についてのピーク対トラフ比率の値の範囲は、増殖期にない細菌集団（つまり、静止期の細菌集団）で観察された比率と指数増殖期にある細菌集団について観察された比率との間にある。第三に、細菌量が経時変化する状況において、対応するピーク対トラフカバレッジ比率の変化の位相が、量の変化の位相とずれて観察され、この変化は、細菌量の増加よりも先に表れるピーク対トラフ比率の増加を反映している。
【０１９２】
本発明の結果から、メタゲノムデータから簡便な解析によって得られるこの新規の特徴により、微生物相の構造および機能についての新たな洞察が提供され得ることが示される。第一に、複製起点が未知の細菌について、カバレッジ解析によって、推定起点位置を示唆し（本発明者らが細菌５５種について示したように）、他の細菌については、間違った起点位置の修正を示唆する助けとなり得る（本明細書中で細菌６種について示したように）。第二に、ピーク対トラフ比率の変化は量の変化よりも先に表れるという知見から、将来的な微生物相の組成変化の予測にカバレッジ解析が有用であり得ることが示唆される。最後に、細菌のピーク対トラフ比率と疾患（例えば、クローン病およびＩＩ型糖尿病）の罹患率などいくつかの重要な臨床パラメータとの間に多くの関連がみられた。注目に値するのは、これらの細菌の量がこれらの臨床パラメータに関連していないことから、一部の細菌の増殖動態は、生態系中における相対量よりも臨床的に関連の大きな指標であることが強く示唆される、ということである。
【０１９３】
注目に値するのは、これらの知見が非常に複雑な生態学的微小環境をもつ便のメタゲノム試料から得られた、ということである。便の生態学的微小環境は、細菌コミュニティが同時発生しているわけではなく、多くの細菌のゲノムが現在入手可能な文献中の細菌ゲノムと異なっており、その異なる度合いも多様であるという事実ゆえに、さらに複雑となっている。
【０１９４】
複雑なマイクロバイオーム集団に含まれる個々の微生物のカイネティック挙動をリードカバレッジ解析によって解明することは、複数の臨床的意味をもつ可能性がある。宿主と微生物相との相互作用は現在は静的な視点から理解されているが、こうした解明により、微生物相が順応性のある機能的単位とみなされ得、環境シグナルに高度に応答できるといったような動的な視点へと、理解が広がるかもしれない。したがって、非常に複雑な生態系における個々の細菌の増殖パターンを明らかにすることにより、何千もの傍観者型の共生種の中から、環境条件の変化に最もよく対応した活性型の「ドライバ」種や「モジュレータ」種を特定できるかもしれない。また、固有の増殖活性が量の変化に隠れている可能性のある、多因子疾患の一因となる病原微生物または疾患調節微生物を特定できるかもしれない。さらに、本発明の方法は、生態系中に導入された病原体または病原性共生生物であって、病原状態での増殖性が高いと予期されるものの、よく似た非病原性共生細菌種と区別し難い可能性のあるようなものについて、その治療応答性を検出、追従、かつ評価することができるかもしれない。
【０１９５】
総じて、微生物相の増殖動態を一時的な試料１つからみることができる新しい型のメタゲノムデータ解析が提示される。この解析方法は臨床的関連性をもつ可能性がある。したがって、カバレッジ解析は、ショットガンメタゲノム解析により得られる膨大なデータを活用して微生物の機能的特性を推論できるという新しい特徴を、切望されている「機能ツールキット」に導入する。こうして推論できる機能的特性により、宿主と微生物相との相互作用がホメオスタシスおよび疾患感受性の形成において果たす役割を機構的に解明できる可能性がある。
【０１９６】
本発明は特定の実施形態に関連させて記載されるが、当業者には、多くの代案、改変、および変更があることが明らかである。したがって、本発明は、付属の請求項の思想に含まれかつ付属の請求項の広い範囲に含まれるこうした代案、改変、および変更のすべてを包含することが意図される。
【０１９７】
本明細書中に言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、その全体が、本明細書の参考として本明細書中に組み込まれ、個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個々に参考として本明細書に組み込まれるよう記載されているのと同等とする。また、本出願中における任意の参考資料の引用または特定は、こうした参考資料が本発明の先行技術として入手可能であると認めるものとは解釈されない。各項の見出しについては、必ずしも限定とは解釈されない。
【０１９８】
引用文献
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2017533723.tif 000008
2017533723.tif 000009
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ−２Ｄ】
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【図２Ｅ−２Ｆ】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｆ】
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【図６Ａ−６Ｉ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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