(57)【要約】  ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ、及び特にＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ＣＤ１９及びＣＤ３に同時に結合でき、血液悪性腫瘍の治療に使用される。【選択図】図２４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１９及びＣＤ３に特異的に結合できるＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであって、
前記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を備え、
前記ポリペプチド鎖は共有結合複合体を形成し：
Ｉ．前記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
Ａ．ドメインＩＡであって：
（１）ＣＤ１９（ＶＬCD19）又はＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できるＶＬドメインを備えるサブドメイン（ＩＡ１）；及び
（２）ＣＤ１９（ＶＨCD19）又はＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できるＶＨドメインを備えるサブドメイン（ＩＡ２）；
を備え、
前記サブドメインＩＡ１及びＩＡ２は、ポリペプチドリンカーによって互いから分離されており、また：
（ａ）ＶＬCD19及びＶＨCD3；又は
（ｂ）ＶＬCD3及びＶＨCD19
である、ドメインＩＡ；
Ｂ．ドメインＩＢであって、荷電ヘテロ二量体促進ドメインを備え、前記ドメインＩＢは、ポリペプチドリンカーによって前記ドメインＩＡから分離されている、ドメインＩＢ；
Ｃ．抗体のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備える、ドメインＩＣ；
を備え；
ＩＩ．前記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
Ａ．ドメインＩＩＡであって：
（１）ＣＤ１９（ＶＬCD19）又はＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できるＶＬドメインを備えるサブドメイン（ＩＩＡ１）；及び
（２）ＣＤ１９（ＶＨCD19）又はＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できるＶＨドメインを備えるサブドメイン（ＩＩＡ２）；
を備え、
前記サブドメインＩＩＡ１及びＩＩＡ２は、ポリペプチドリンカーによって互いから分離されており、また：
（ａ）前記サブドメインＩＡ１及びＩＡ２がＶＬCD3及びＶＨCD19である場合には、ＶＬCD19及びＶＨCD3；又は
（ｂ）前記サブドメインＩＡ１及びＩＡ２がＶＬCD19及びＶＨCD3である場合には、ＶＬCD3及びＶＨCD19
である、ドメインＩＩＡ；
Ｂ．ドメインＩＩＢであって、荷電ヘテロ二量体促進ドメインを備え、前記ドメインＩＩＢは、ポリペプチドリンカーによって前記ドメインＩＩＡから分離され、また前記ドメインＩＢの前記荷電ヘテロ二量体促進ドメイン及び前記ドメインＩＩＢの前記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは反対の電荷を有する、ドメインＩＩＢ；
を備え；
ＩＩＩ．前記第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、抗体のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備えるドメインＩＩＩＣを備え；
前記ＶＬCD19及び前記ＶＨCD19ドメインはＣＤ１９結合ドメインを形成し、前記ＶＬCD3及び前記ＶＨCD3ドメインはＣＤ３結合ドメインを形成し；
前記第１及び第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ受容体に結合することによって前記ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディを形成できる、Ｆｃドメインを形成する、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項２】
（Ａ）前記ドメインＩＢ及びＩＩＢは、それぞれジスルフィド結合を介して前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖とを共有結合させるシステイン残基を備え；
（Ｂ）前記ドメインＩＣ及びＩＩＩＣは、それぞれジスルフィド結合を介して前記第１のポリペプチド鎖と前記第３のポリペプチド鎖とを共有結合させるシステイン残基を備える、請求項１に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項３】
前記ＶＬCD19は、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、前記ＶＨCD19は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項４】
前記ＶＬCD3は、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、前記ＶＨCD3は、配列番号２９のアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項５】
前記ドメインＩＣの前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、前記ドメインＩＩＩＣの前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項６】
（Ａ）前記ドメインＩＢの前記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、前記ドメインＩＩＢの前記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し；又は
（Ｂ）前記ドメインＩＢの前記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、前記ドメインＩＩＢの前記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項７】
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列を有し；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号３７のアミノ酸配列を有し；
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項８】
ヒト及び霊長類両方のＣＤ１９及びＣＤ３と交差反応できる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項９】
医薬として使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項１０】
ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態の治療において使用するための、請求項８に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項１１】
前記ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態は、癌である、請求項１０に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項１２】
前記癌は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連するＡｂｅｌｓｏｎ癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；濾胞性リンパ腫；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター形質転換を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項１１に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ。
【請求項１３】
共有結合ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチド複合体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を備え：
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するヘテロ二量体促進ドメインに連結された、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを備え；
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するヘテロ二量体促進ドメインに連結された、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを備え；
前記第１のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメイン、及び前記第２のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは、ジスルフィド結合を介して互いと共有結合する、ポリペプチド複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディと、生理学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
前記ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態は、癌である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記癌は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連するＡｂｅｌｓｏｎ癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；濾胞性リンパ腫；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター形質転換を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／０５５，６９５号（２０１４年９月２６日出願；係属）に対する優先権を主張するものであり、上記出願はその全体が参照により本出願に援用される。
【０００２】
配列表に対する言及
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿１１６ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１５年９月１８日作成、サイズ：４７，３２９バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、２つのポリペプチド鎖を備え、ＣＤ１９のエピトープに対して特異的である１つの結合部位と、ＣＤ３のエピトープに対して特異的である１つの結合部位とを有する、二重特異性１価ダイアボディ（即ち「ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ」）を対象とする。最も好ましくは、このようなＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖からなり、ＣＤ１９のエピトープに対して特異的である１つの結合部位と、ＣＤ３のエピトープに対して特異的である１つの結合部位とを有し、更に免疫グロブリンＦｃドメインを備える（即ち「ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）。本発明の二重特異性１価ダイアボディ及び二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ＣＤ１９及びＣＤ３に同時に結合できる。本発明は、このような二重特異性１価ダイアボディ又はこのような二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含有する医薬組成物を対象とする。本発明は更に、疾患、特に血液悪性腫瘍の治療における、このようなダイアボディの使用のための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
Ａ．ＣＤ１９
ＣＤ１９（Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２８１７０）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの９５ｋＤａ  Ｉ型膜透過性糖タンパク質である。（非特許文献１〜３）。ＣＤ１９は、ＣＤ１９発現が下方制御されると、重鎖再編成時の初期Ｂ前駆細胞から形質細胞段階まで、濾胞性樹状細胞及び全てのＢ細胞上で発現する。ＣＤ１９は、造血幹細胞上又はプロＢ細胞段階前のＢ細胞上では発現しない（非特許文献４〜６）。
【０００５】
ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）複合体の構成要素であり、Ｂ細胞活性化及び体液性免疫の閾値を変調する、Ｂ細胞シグナリングの正のレギュレータである。ＣＤ１９は、２つの細胞外Ｃ２型Ｉｇ様ドメインを介して、ＣＤ２１（ＣＲ２、Ｃ３ｄ断片受容体）及びＣＤ８１と相互作用し、ＣＤ２２５と共にＢＣＲ複合体を形成する。ＣＤ１９の細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達カスケードに関与し、これは、限定するものではないが主にＢＣＲ及びＣＤ２２の下流のシグナルを調節する（非特許文献７、６、８）。
【０００６】
ＣＤ１９のいくつかの特性は、免疫療法の標的としてのＣＤ１９の潜在能力を示唆している。ＣＤ１９は、Ｂ細胞系統において最も普遍的に発現する抗原の１つであり、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含むＢ細胞悪性腫瘍の９５％超において発現する（非特許文献９〜１６）。ＣＤ１９は、他の細胞型上ではほとんど発現せず、また末梢分化した形質細胞上でも発現しないため、ＣＤ１９指向性治療は見逃されていた。ＣＤ１９は循環系に流出せず、迅速に内在化できる（非特許文献１７、１８）。特にＣＤ１９発現は、抗ＣＤ２０療法に耐性を有するようになったＢ細胞リンパ腫上で維持される（非特許文献１９）。ＣＤ１９はまた、自己免疫疾患を治療するための標的として示唆されている（非特許文献２０）。
【０００７】
Ｂ細胞悪性腫瘍は、広範に変化する特徴及び臨床挙動を有する障害の異種群を表す。歴史的には、症候性疾患を有するほとんどの患者は、永続的な寛解及び場合によっては治癒を達成する目的で、非交差反応性遺伝毒性剤の組み合わせを投与されてきた。多くの伝統的なレジメンもまた、効果的ではあるものの、相当な急性及び長期毒性と関連する（例えば非特許文献２１を参照）。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるリツキシマブは、多数のＢ細胞障害の治療のために使用され、これは、「標準治療（standard of care）」剤と組み合わせて採用してよく、又は単一の作用剤として採用してよい（非特許文献２２〜２４）。臨床結果の促進にもかかわらず、単一の作用剤リツキシマブを用いた無痛性リンパ腫の患者の再治療に関連する応答率は４０％しかなく、これは、リツキシマブへの長期曝露に対する応答として悪性Ｂ細胞において耐性が生じ得ることを示唆している。（非特許文献２５、１９、２６）。インビトロで生成されたリツキシマブ耐性細胞株は、多数の化学療法剤に対して交差耐性を示すことが報告されている（非特許文献２７、２８）。
【０００８】
治療用抗体によって標的とされる更なるＢ細胞リンパ腫表面抗原は、ＣＤ１９を含む（非特許文献２９、３０）。しかしながら、複合体の内在化及び遊離薬剤の細胞内放出に関連する潜在的な抗リンパ腫活性が、抗ＣＤ１９結合部分を有する様々な抗ＣＤ１９抗体二重特異性抗体、又は抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関して報告されているにもかかわらず、これらの抗ＣＤ１９抗体又はＡＤＣの抗腫瘍効果は可変であった。これは、エピトープ結合、ＣＤ１９のオリゴマー化を誘発する能力、又は細胞内シグナリングの差異といった抗体特異的特性が、上記抗ＣＤ１９抗体又はＡＤＣの有効性に影響を及ぼしていることを示唆している（非特許文献３１〜３４）。
【０００９】
従って、多くの人々の生存が改善されたにもかかわらず、Ｂ細胞悪性腫瘍に罹患している患者の大部分は、標準的な化学療法の後に再発し続けており、米国ではいまだに、Ｂ細胞癌によって毎年１５，０００人を超える患者が死亡する。従って、患者の生存を更に改善するために、交差耐性を有しない新規の化合物による治療が必要である。
【００１０】
Ｂ．ＣＤ３
ＩＩ．ＣＤ３
ＣＤ３は、４つの別個の鎖で構成されたＴ細胞補助受容体である（非特許文献３５〜３７）。
【００１１】
哺乳類において、この複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として公知である分子と連動して、Ｔリンパ球の活性化信号を生成する（非特許文献３８）。ＣＤ３が存在しない場合、ＴＣＲは適切に集合せず、劣化する（非特許文献３９）。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、実質的に他の細胞タイプには結合しない（非特許文献４０〜４２参照）。
【００１２】
Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の不変のＣＤ３εシグナリング成分は、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間の免疫学的シナプスの形成を強制するための標的として使用されている。ＣＤ３と腫瘍抗原との共役は、Ｔ細胞を活性化し、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の溶解を引き起こす（非特許文献４３）。このアプローチにより、二重特異性抗体は、腫瘍細胞に対する高い特異性を有するＴ細胞区画と全体的に相互作用することが可能になり、幅広い細胞表面腫瘍抗原に広く適用可能である。
【００１３】
Ｃ．抗体及び他の結合分子
抗体は、当該免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、この用語は、完全なポリクローナル又はモノクローナル抗体だけでなく、その突然変異体、自然に発生する変異体、必要な特異性の抗原認識部位を有する抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化抗体及びキメラ抗体、並びに必要な特異性の抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。
【００１４】
完全な未修飾抗体（例えばＩｇＧ）の、抗原のエピトープに結合する能力は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖上の可変ドメイン（即ちそれぞれＶＬ及びＶＨドメイン）の存在に左右される。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。対照的に、「ｓｃＦｖ」構造は、単一ポリペプチド鎖が含有する抗体のＶＬ及びＶＨドメインを備え、これらのドメインは、２つのドメインの機能性エピトープ結合部位への自己集合を可能とするのに十分な長さのフレキシブルリンカーによって隔てられる。ＶＬ及びＶＨドメインの自己集合が、不十分な長さ（約１２個未満のアミノ酸残基）のリンカーによって不可能となる場合、ｓｃＦｖ構造のうちの２つが互いに相互作用して、ダイアボディ分子を形成し、このダイアボディ分子内では、一方の鎖のＶＬが他方の鎖のＶＨと連結する（非特許文献４４において概説されている）。
【００１５】
抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（非特許文献４５）。２００近くの抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
【００１６】
天然の抗体は、１つのエピトープ種のみと結合できる（即ち単一特異性）が、これらは当該種の複数の複製にも結合できる（即ち２価性又は多価性を呈する）。幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば特許文献１〜４を参照）、その殆どは、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）を更なる結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ）に融合させるため、又は例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖを融合させるために、リンカーペプチドを使用する。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば特許文献５〜７は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（特許文献８、９）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。特許文献１０、１１は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを備える融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。特許文献１２〜１４は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。特許文献１５、１６は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。特許文献１７は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。特許文献１８〜２６は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。
【００１７】
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点で上記天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる能力に注目している（例えば非特許文献４６；Hollinger et al.による特許文献２７；Mertens et al.による特許文献２８；非特許文献４７、４８；Mertens et al.による特許文献２９；非特許文献４９〜５３参照）。
【００１８】
ダイアボディの設計は、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）に基づく。このような分子は、軽鎖及び／又は重鎖可変領域を、短い連鎖ペプチドを用いて連結することによって作製される。非特許文献５４は、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（非特許文献５４）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【００１９】
特許文献３０〜３１は、ＥｒｂＢ２に対して免疫特異的なｓｃＦｖ分子に関する。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（「ＢｉＴＥ」）、あるタイプのｓｃＦｖ分子が記載されている（特許文献３２；非特許文献５５、２３）。このような分子は、２つの抗原結合ドメインを有する単一のポリペプチド鎖分子からなり、上記２つの抗原結合ドメインは、一方がＣＤ３エピトープに免疫特異的に結合し、もう一方が標的細胞の表面上に存在する抗原に免疫特異的に結合する。
【００２０】
ＣＤ１９及びＣＤ３の両方を標的とする二重特異性分子について説明した。二重特異性ｓｃＦｖ‐ＣＤ１９×ＣＤ３  ＢｉＴＥであるブリナツモマブは、臨床試験中であり、ＣＤ３に対して〜１００ｎＭの親和性、及びＣＤ１９に対して〜１ｎＭの親和性を有することが報告されている。ブリナツモマブは、インビトロでの標的細胞溶解に関して〜１０‐１００ｐｇ／ｍｌのＥＣ50を呈する（非特許文献３４）。二重特異性ＣＤ１９×ＣＤ３二重親和性標的転換（dual affinity retargeting：ＤＡＲＴ）も開発されている（非特許文献５６）。二重特異性ｓｃＦｖ‐ＣＤ１９×ＣＤ３  ＢｉＴＥと比べて、この分子は同様の結合親和性を呈するものの、インビトロでの標的細胞溶解に関して〜０．５‐５ｐｇ／ｍｌという低いＥＣ50を有し、一貫して高い最大溶解レベルを示した。ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ＴａｎｄａｂであるＡＦＭ１１についても説明されている。ＡＦＭ１１は、インビトロでの標的細胞溶解に関して〜０．５‐５ｐｇ／ｍｌのＥＣ50を有することが報告されている（非特許文献５７）。これらの構造のいずれも、Ｆｃドメインを有しない。
【００２１】
このような成功にもかかわらず、安定した機能性ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディは、採用したポリペプチド鎖のうちの１つ又は複数中のシステイン残基に関する注意深い考察及びその配置によって、更に最適化できる。このように最適化されたダイアボディは、最適化されていないダイアボディよりも高い収率で、また高い活性を有して産生できる。従って本発明は、ヘテロ二量体性ダイアボディを形成するために特別に設計及び最適化されたポリペプチドを提供するという課題を対象としている。本発明は、例示的な最適化されたＣＤ１９×ＣＤ３ダイアボディを提供することによって、この課題を解決する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第2008/003116号
【特許文献２】国際公開第2009/132876号
【特許文献３】国際公開第2008/003103号
【特許文献４】国際公開第2007/146968号
【特許文献５】国際公開第2013/174873号
【特許文献６】国際公開第2011/133886号
【特許文献７】国際公開第2010/136172号
【特許文献８】国際公開第2008/027236号
【特許文献９】国際公開第2010/108127号
【特許文献１０】国際公開第2013/163427号
【特許文献１１】国際公開第2013/119903号
【特許文献１２】国際公開第2010/028797号
【特許文献１３】国際公開第2010/028796号
【特許文献１４】国際公開第2010/028795号
【特許文献１５】国際公開第2003/025018号
【特許文献１６】国際公開第2003/012069号
【特許文献１７】国際公開第2013/006544号
【特許文献１８】国際公開第2014/022540号
【特許文献１９】国際公開第2013/003652号
【特許文献２０】国際公開第2012/162583号
【特許文献２１】国際公開第2012/156430号
【特許文献２２】国際公開第2011/086091号
【特許文献２３】国際公開第2007/075270号
【特許文献２４】国際公開第1998/002463号
【特許文献２５】国際公開第1992/022583号
【特許文献２６】国際公開第1991/003493号
【特許文献２７】米国公開特許第2004/0058400号(Hollinger et al.)
【特許文献２８】米国公開特許第2004/0220388号(Mertens et al.)
【特許文献２９】国際公開第02/02781号(Mertens et al.)
【特許文献３０】米国特許第7,585,952号
【特許文献３１】米国公開特許第2010‐0173978号
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【非特許文献】
【００２３】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、２つのポリペプチド鎖を備え、ＣＤ１９のエピトープに対して特異的である１つの結合部位と、ＣＤ３のエピトープに対して特異的である１つの結合部位とを有する、二重特異性１価ダイアボディ（即ち「ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ」）を対象とする。最も好ましくは、このようなＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖からなり、ＣＤ１９のエピトープに対して特異的である１つの結合部位と、ＣＤ３のエピトープに対して特異的である１つの結合部位とを有し、更に免疫グロブリンＦｃドメインを備える（即ち「ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）。本発明の二重特異性１価ダイアボディ及び二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ＣＤ１９及びＣＤ３に同時に結合できる。本発明は、このような二重特異性１価ダイアボディ又はこのような二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含有する医薬組成物を対象とする。本発明は更に、疾患、特に血液悪性腫瘍の治療における、このようなダイアボディの使用のための方法を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
従って本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及び二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を備える。このようなダイアボディのポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体化するように互いに関連して、ＣＤ１９のエピトープに対して特異的である１つの結合部位と、ＣＤ３のエピトープに対して特異的である１つの結合部位とを形成する。従って本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又は二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ＣＤ１９のエピトープの１つの複製のみ、及びＣＤ３のエピトープの１つの複製のみとしか結合できないという点で１価であるが、単一のダイアボディがＣＤ１９のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに同時に結合できるという点で二重特異性である。上記ダイアボディの各ポリペプチド鎖は、上記ダイアボディの別のポリペプチド鎖と、例えば上記ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合によって、共有結合し、これにより共有結合複合体を形成する。特定の実施形態では、本発明のダイアボディは更に、免疫グロブリンＦｃドメイン及び／又はアルブミン結合ドメインを有し、これによりインビボ半減期が延長される。
【００２６】
詳細には、本発明は、ＣＤ１９及びＣＤ３に特異的に結合できるＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを提供し、上記ダイアボディは、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を備え、上記ポリペプチド鎖は共有結合複合体を形成し：
Ｉ．上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
Ａ．ドメインＩＡであって：
（１）ＣＤ１９（ＶＬCD19）又はＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できるＶＬドメインを備えるサブドメイン（ＩＡ１）；及び
（２）ＣＤ１９（ＶＨCD19）又はＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できるＶＨドメインを備えるサブドメイン（ＩＡ２）；
を備え、
上記サブドメインＩＡ１及びＩＡ２は、ポリペプチドリンカーによって互いから分離されており、また：
（ａ）ＶＬCD19及びＶＨCD3；又は
（ｂ）ＶＬCD3及びＶＨCD19
である、ドメインＩＡ；
Ｂ．ドメインＩＢであって、荷電ヘテロ二量体促進ドメインを備え、上記ドメインＩＢは、ポリペプチドリンカーによって上記ドメインＩＡから分離されている、ドメインＩＢ；
Ｃ．抗体のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備える、ドメインＩＣ；
を備え；
ＩＩ．上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
Ａ．ドメインＩＩＡであって：
（１）ＣＤ１９（ＶＬCD19）又はＣＤ３（ＶＬCD3）に結合できるＶＬドメインを備えるサブドメイン（ＩＩＡ１）；及び
（２）ＣＤ１９（ＶＨCD19）又はＣＤ３（ＶＨCD3）に結合できるＶＨドメインを備えるサブドメイン（ＩＩＡ２）；
を備え、
上記サブドメインＩＩＡ１及びＩＩＡ２は、ポリペプチドリンカーによって互いから分離されており、また：
（ａ）上記サブドメインＩＡ１及びＩＡ２がＶＬCD3及びＶＨCD19である場合には、ＶＬCD19及びＶＨCD3；又は
（ｂ）上記サブドメインＩＡ１及びＩＡ２がＶＬCD19及びＶＨCD3である場合には、ＶＬCD3及びＶＨCD19
である、ドメインＩＩＡ；
Ｂ．ドメインＩＩＢであって、荷電ヘテロ二量体促進ドメインを備え、上記ドメインＩＩＢは、ポリペプチドリンカーによって上記ドメインＩＩＡから分離され、また上記ドメインＩＢの上記荷電ヘテロ二量体促進ドメイン及び上記ドメインＩＩＢの上記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは反対の電荷を有する、ドメインＩＩＢ；
を備え；
ＩＩＩ．上記第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、抗体のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備えるドメインＩＩＩＣを備え；
上記ＶＬCD19及び上記ＶＨCD19ドメインはＣＤ１９結合ドメインを形成し、上記ＶＬCD3及び上記ＶＨCD3ドメインはＣＤ３結合ドメインを形成し；また上記第１及び第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ受容体に結合することによって上記ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディを形成できる、Ｆｃドメインを形成する。
【００２７】
本発明は更に、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの実施形態を提供し、ここで：
（Ａ）上記ドメインＩＢ及びＩＩＢは、それぞれジスルフィド結合を介して上記第１のポリペプチド鎖と上記第２のポリペプチド鎖とを共有結合させるシステイン残基を備え；
（Ｂ）上記ドメインＩＣ及びＩＩＩＣは、それぞれジスルフィド結合を介して上記第１のポリペプチド鎖と上記第３のポリペプチド鎖とを共有結合させるシステイン残基を備える。
【００２８】
本発明は更に、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれかの実施形態を提供し、ここで上記ＶＬCD19は、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨCD19は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する。
【００２９】
本発明は更に、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれかの実施形態を提供し、ここで上記ＶＬCD3は、配列番号２５のアミノ酸配列を有し、上記ＶＨCD3は、配列番号２９のアミノ酸配列を有する。
【００３０】
本発明は更に、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれかの実施形態を提供し、ここで上記ドメインＩＣの上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、上記ドメインＩＩＩＣの上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
【００３１】
本発明は更に、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれかの実施形態を提供し、ここで：
（Ａ）上記ドメインＩＢの上記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、上記ドメインＩＩＢの上記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し；又は
（Ｂ）上記ドメインＩＢの上記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、上記ドメインＩＩＢの上記荷電ヘテロ二量体促進ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。
【００３２】
本発明は更に、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれかの実施形態を提供し、ここで：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列を有し；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号３７のアミノ酸配列を有し；
（Ｃ）上記第３のポリペプチド鎖は、配列番号３９のアミノ酸配列を有する。
【００３３】
本発明は更に、ヒト及び霊長類両方のＣＤ１９及びＣＤ３と交差反応できる、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれかの実施形態を提供する。
【００３４】
本発明は更に、医薬として使用するための、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれを提供する。
【００３５】
本発明は更に、ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態の治療において使用するための、又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態を治療する方法において使用するための、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれを提供し、ここで詳細には、上記ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態は、癌であり、より詳細には、上記癌は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連するＡｂｅｌｓｏｎ癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；濾胞性リンパ腫；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター形質転換を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択される。
【００３６】
本発明は更に、共有結合ポリペプチド複合体を提供し、ここで上記ポリペプチド複合体は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を備え：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するヘテロ二量体促進ドメインに連結された、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを備え；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するヘテロ二量体促進ドメインに連結された、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを備え；
上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメイン、及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインは、ジスルフィド結合を介して互いと共有結合する。
【００３７】
本発明は更に、上述のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディのうちのいずれと、生理学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物を提供する。本発明は更に、ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、このような医薬組成物の使用に関し、ここで詳細には、上記ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態は、癌であり、より詳細には、上記癌は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連するＡｂｅｌｓｏｎ癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；濾胞性リンパ腫；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター形質転換を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択される。
【００３８】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは好ましくは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって分析した場合、又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞集団並びにＣＤ２０＋ゲートＢ細胞集団を用いたフローサイトメトリーによって分析した場合に対して、可溶性ヒト及びカニクイザルＣＤ３に対する同様の結合親和性、並びに１０倍異なるＣＤ１９への結合を示すことができる。
【００３９】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは好ましくは、３つの標的Ｂリンパ腫細胞株、Ｒａｊｉ／ＧＦ（バーキットリンパ腫）、ＨＢＬ‐２（マントル細胞リンパ腫）又はＪｅｋｏ‐１（マントル細胞リンパ腫）のうちのいずれを採用したアッセイにおいてヒトＴ細胞を用いて、及び精製したヒト初代Ｔ細胞をエフェクタ細胞として用いて、標的腫瘍細胞の標的転換殺滅を仲介できる。このようなアッセイにおいて、標的腫瘍細胞殺滅は、細胞死の際に細胞から放出されるＬＤＨの酵素活性を定量的に測定する、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイを用いて、又はルシフェラーゼ相対光単位（relative light unit：ＲＬＵ）が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方を発現するよう操作されたＲａｊｉ／ＧＦ標的細胞の相対生存能力を示す読み出し情報となる、ルシフェラーゼアッセイによって、測定される。このような標的転換殺滅の、観察されるＥＣ５０は、約５ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．３ｐＭ以下、約０．２ｐＭ以下、約０．１ｐＭ以下、約０．０５ｐＭ以下、約０．０４ｐＭ以下、約０．０３ｐＭ以下、約０．０２ｐＭ以下、又は約０．０１ｐＭ以下である。
【００４０】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは好ましくは、ヒト及びカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において細胞毒性を仲介でき、これにより、エフェクタ細胞：Ｔ細胞比が２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１又は９：１のこれら両方の細胞系において、用量依存性ＣＤ２０＋Ｂ細胞欠失を引き起こすことができる。ヒトＣＤ２０＋Ｂ細胞欠失の、観察されるＥＣ５０は、約７ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．３ｐＭ以下、約０．２ｐＭ以下、約０．１ｐＭ以下、約０．０５ｐＭ以下、約０．０４ｐＭ以下、約０．０３ｐＭ以下、約０．０２ｐＭ以下、又は約０．０１ｐＭ以下である。カニクイザルＣＤ２０＋Ｂ細胞欠失の、観察されるＥＣ５０は、約１０００ｐＭ以下、約９００ｐＭ以下、約８００ｐＭ以下、約５００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約２ｐＭ以下、又は約１ｐＭ以下であり、これにより、自己ヒトＢ細胞欠失：カニクイザルＢ細胞欠失の比が約５００：１以下、約３００：１以下、約１００：１以下、約５０：１以下、約２０：１以下、又は約１０：１以下となる。
【００４１】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは好ましくは、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣによるサイトカイン（例えばＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐６、及びＩＬ‐１０、並びに特にＩＦＮ‐γ及びＴＮＦ‐α）の放出を仲介できる。このような放出は、約５０００ｐｇ／ｍＬ以下、約４０００ｐｇ／ｍＬ以下、約３０００ｐｇ／ｍＬ以下、約２０００ｐｇ／ｍＬ以下、約１０００ｐｇ／ｍＬ以下、約５００ｐｇ／ｍＬ以下、約２００ｐｇ／ｍＬ以下、又は約１００ｐｇ／ｍＬ以下である。このようなヒトＰＢＭＣからのサイトカイン放出の平均ＥＣ５０は、約１００ｐＭ以下、約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、又は約５ｐＭ以下である。このようなカニクイザルＰＢＭＣからのサイトカイン放出の平均ＥＣ５０は、約３０００ｐＭ以下、約２０００ｐＭ以下、約１０００ｐＭ以下、約５００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、又は約５０ｐＭ以下である。
【００４２】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは好ましくは、上記分子が、１：５の比率のＨＢＬ‐２（ヒトマントル細胞リンパ腫）又はＲａｊｉ（バーキットリンパ腫）腫瘍細胞及び活性化ヒトＴ細胞と共にＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに導入される、共混合異種移植における、ヒトＢ細胞リンパ腫腫瘍成長の阻害を仲介できる。好ましくは、上記ダイアボディは、１００μｇ／ｍｌ超の濃度、約１００μｇ／ｋｇの濃度、約８０μｇ／ｋｇの濃度、約５０μｇ／ｋｇの濃度、約２０μｇ／ｋｇの濃度、約１０μｇ／ｋｇの濃度、約５μｇ／ｋｇの濃度、約２μｇ／ｋｇの濃度、約１μｇ／ｋｇの濃度、約０．５μｇ／ｋｇの濃度、約０．２μｇ／ｋｇの濃度、約０．１μｇ／ｋｇの濃度、約０．０５μｇ／ｋｇの濃度、約０．０２μｇ／ｋｇの濃度、約０．０１μｇ／ｋｇの濃度、又は約０．００５μｇ／ｋｇの濃度、又は０．００５μｇ／ｋｇ未満の濃度で提供された場合に、腫瘍成長を阻害できる。
【００４３】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは好ましくは、メスのＮＳＧＢ２ｍ‐／‐マウスのＨＢＬ‐２（ヒトマントル細胞リンパ腫）異種移植モデルにおいて、抗腫瘍活性を呈することができ、上記ＮＳＧＢ２ｍ‐／‐マウスは、０日目にＨＢＬ‐２腫瘍細胞を皮内（intradermally（ＩＤ））移植され、続いて４日目にＰＢＭＣを腹腔内（intraperitoneal（ＩＰ））注射され、１７日目にダイアボディを投与されることにより、約１０％、約２０％、約４０％、約６０％、約８０％、約９０％、又は９０％超の腫瘍体積の減少を引き起こす。
【００４４】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは好ましくは、レシピエントであるヒト又は非ヒト動物への導入時に、延長された半減期を呈することができる。このような半減期は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスに上記ダイアボディを導入することによって測定できる（米国特許第６，９９２，２３４号及び米国特許第７，３５８，４１６号；Haraya, K. (2014) “Application Of Human FcRn Transgenic Mice As A Pharmacokinetic Screening Tool Of Monoclonal Antibody,” Xenobiotica 2014 Jul 17:1-8; Proetzel, G. et al. (2014) “Humanized FcRn mouse models for evaluating pharmacokinetics of human IgG antibodies,” Methods 65(1):148-153; Stein, C. et al. (2012) “Clinical Chemistry Of Human FcRn Transgenic Mice,” Mamm. Genome 23(3-4):259-269; Roopenian, D.C. et al. (2010) “Human FcRn Transgenic Mice For Pharmacokinetic Evaluation Of Therapeutic Antibodies,” Methods Molec. Biol. 602:93-104）。上記測定は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  米国メーン州）から入手可能なＢ６．Ｃｇ‐Ｆｃｇｒｔtm1Dcr（ＣＡＧ‐ＦＣＧＲＴ）２７６Ｄｃｒ／ＤｃｒＪマウス（品番００４９１９）を用いて実施される。
【００４５】
念のため記載しておくと、本発明のダイアボディは、本明細書に記載の機能的属性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ以上又は全てを呈してよい。従って本発明のダイアボディは、本明細書に記載の機能的属性のいずれの組み合わせを呈してよい。
【００４６】
本発明のダイアボディは、医薬として使用するためのものであってよい。好ましくは、上記ダイアボディは、ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態において使用するためのものである。本発明はまた、好ましくは本明細書において更に定義されるようなＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態の治療のための、医薬組成物の製造における、本発明のダイアボディの使用にも関する。
【００４７】
ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態は、Ｂ細胞悪性腫瘍であってよい（Campo, E. et al. (2011) “The 2008 WHO Classification Of Lymphoid Neoplasms And Beyond: Evolving Concepts And Practical Applications,” Blood 117(19):5019‐5032）。例えば上記癌は：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連するＡｂｅｌｓｏｎ癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；濾胞性リンパ腫；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター形質転換を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択され得る。
【００４８】
本発明は更に、上述のダイアボディのうちのいずれ及び生理学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物を提供する。本発明は特に、治療される疾患及び状態が、リツキシマブを用いた治療に対して不応性である、このような医薬組成物に関係する。
【００４９】
本発明は更に、ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする疾患又は状態の治療における、上述の医薬組成物の使用を提供する。
【００５０】
本発明は特に、上記使用の実施形態を対象とし、ここでは、ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とする上記疾患又は状態は、Ｂ細胞悪性腫瘍（特に：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連するＡｂｅｌｓｏｎ癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；濾胞性リンパ腫；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター形質転換を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫からなる群から選択される癌）である。
【００５１】
「約（ａｂｏｕｔ）」のような用語は、文脈によって必然的にそうでない場合を除いて、明記されている値の１０％以内、より好ましくは５％以内として解釈されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、２つのポリペプチド鎖からなる、共有結合二重特異性１価ダイアボディの構造を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の３鎖ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１、第２及び第３のポリペプチド鎖の２つのバージョンの構造を示す（バージョン１、図２Ａ；バージョン２、図２Ｂ）。
【図３】図３は、ＤＡＲＴ‐Ａ（●）によるＣＤ１９及びＣＤ３両方への同時の係合を示す。対照ＤＡＲＴ１（■）も対照ＤＡＲＴ２（黒△）も、これら両方の標的に同時に結合できなかった。
【図４】図４Ａ‐４Ｂは、ヒト（図４Ａ）及びカニクイザル（図４Ｂ）ＣＤ２０＋Ｂ細胞への、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）の結合を示す。
【図５】図５Ａ‐５Ｂは、ヒト（図５Ａ）及びカニクイザル（図５Ｂ）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞への、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）の結合を示す。
【図６】図６Ａ‐６Ｆは、対照ＤＡＲＴ１に対する、標的細胞のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）仲介型標的転換殺滅を示す。標的細胞株：ＨＢＬ‐２（図６Ａ）、Ｒａｊｉ／ＧＦ（緑色蛍光）（図６Ｂ）、Ｊｅｋｏ‐１（図６Ｃ）、Ｍｏｌｍ‐１３（図６Ｄ）、及びＣｏｌｏ２０５／Ｌｕｃ（図６Ｆ）に関する、初代ヒトＴ細胞をエフェクタ細胞として用いた、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型細胞毒性の用量応答曲線。標的細胞殺滅はＬＤＨアッセイを用いて測定した。図６Ｅは、相対生存細胞を測定するためにルシフェラーゼアッセイ（ＲＬＵ）を用いて決定された、Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞の殺滅を示す。ＤＡＲＴ‐Ａに関するＥＣ５０値は、各グラフにおいて、１つの代表的な実験に関して示されている。ＤＡＲＴ‐Ａ：黒△；対照ＤＡＲＴ１：黒▽。
【図７】図７Ａ‐７Ｄは、変化するＥ：Ｔ細胞比率（１０：１（●）、５：１（■）、及び２．５：１（黒△））における、標的Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）仲介型標的転換殺滅を示す。２４時間のインキュベーション後（図７Ａ）及び４８時間のインキュベーション後（図７Ｂ）に決定した、ＣＤ１９＋標的Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞に関する、初代ヒトＴ細胞をエフェクタ細胞として用いた、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型細胞毒性（パーセント細胞毒性）の用量応答曲線。２４時間のインキュベーション後（図７Ｃ）及び４８時間のインキュベーション後（図７Ｄ）に決定した、ＣＤ１９陰性ＪＩＭＴ‐１細胞に関する、初代ヒトＴ細胞をエフェクタ細胞として用いた、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型細胞毒性（パーセント細胞毒性）の用量応答曲線を、対照として含めた。それぞれ別個のドナーからのＴ細胞を用いた３つの代表的な実験のうちの１つが示されている。
【図８】図８Ａ‐８Ｄは、２．５：１（●）、又は１：１（■）という比率より低いＥ：Ｔ細胞比率における、標的Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）‐仲介型標的転換殺滅を示す。７２時間のインキュベーション後（図８Ａ）及び９６時間のインキュベーション後（図８Ｂ）に決定した、ＣＤ１９＋標的Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞に関する、初代ヒトＴ細胞をエフェクタ細胞として用いた、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型細胞毒性（パーセント細胞毒性）の用量応答曲線。７２時間のインキュベーション後（図８Ｃ）及び９６時間のインキュベーション後（図８Ｄ）に決定した、ＣＤ１９陰性ＪＩＭＴ‐１細胞に関する、初代ヒトＴ細胞をエフェクタ細胞として用いた、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型細胞毒性（パーセント細胞毒性）の用量応答曲線を、対照として含めた。それぞれ別個のドナーからのＴ細胞を用いた３つの代表的な実験のうちの１つが示されている。
【図９】図９Ａ‐９Ｂは、ヒト又はカニクイザルＰＢＭＣにおけるＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）仲介型自己Ｂ細胞欠失を示す。ＤＡＲＴ（ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１）仲介型Ｂ細胞欠失に関して、用量応答曲線が提示されている。図９Ａ：様々な用量のＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１によるＰＢＭＣの処置後の、ヒトＣＤ２０＋細胞のパーセント。図９Ｂ：様々な用量のＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１によるＰＢＭＣの処置後の、カニクイザルＣＤ２０＋細胞のパーセント。ＤＡＲＴ‐Ａに関するＥＣ５０値が、各グラフにおいて示されている。ＣＤ３＋細胞のパーセントを並行して分析して、内部参照対照として使用し、試験したいずれの濃度において変化は観察されなかった。ＤＡＲＴ‐Ａ：黒△；対照ＤＡＲＴ１：黒▽。
【図１０】図１０は、Ｅ：Ｔ＝３０：１における、カニクイザルＰＢＭＣによる標的細胞のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）仲介型標的転換殺滅を示す。ＤＡＲＴ‐Ａ：黒△；対照ＤＡＲＴ１：黒▽。
【図１１】図１１Ａ‐１１Ｃは、標的細胞の存在下におけるヒトＴ細胞からのＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）仲介型サイトカイン放出を示す。ヒトＴ細胞を、Ｒａｊｉ／ＧＦ標的細胞の存在下において、約２４時間にわたってＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴで処置した。培養物上清を回収し、ＥＬＩＳＡベースのサイトカイン測定に供した。異なるドナーを用いた２つの実験のうちの１つの代表的な実験が示されている。図１１Ａ：γ‐インターフェロン（ＩＦＮγ）放出；図１１Ｂ：腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）放出；図１１Ｃ：インターロイキン２（ＩＬ‐２）放出。ＤＡＲＴ‐Ａ：黒△；対照ＤＡＲＴ１：黒▽。
【図１２】図１２Ａ‐１２Ｄは、対照ＤＡＲＴ１に対する、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）による標的転換細胞殺滅中のヒトＴ細胞活性化を示す。Ｒａｊｉ／ＧＦ標的細胞を用いた、ＣＤ８＋（図１２Ａ及び１２Ｃ）並びにＣＤ４＋（図１２Ｂ及び１２Ｄ）ヒトＴ細胞上での、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（図１２Ａ‐１２Ｂ）及びＣＤ６９（図１２Ｃ‐１２Ｄ）のＤＡＲＴ‐Ａ仲介型誘発の用量応答。それぞれ異なるドナーからのＴ細胞を用いた２つの実験のうちの１つの代表的な実験が示されている。ＤＡＲＴ‐Ａ：黒△；対照ＤＡＲＴ１：黒▽。
【図１３】図１３Ａ‐１３Ｄは、対照ＤＡＲＴ１に対する、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）による標的転換細胞殺滅中のカニクイザルＴ細胞活性化を示す。Ｒａｊｉ／ＧＦ標的細胞を用いた、ＣＤ８＋（図１３Ａ及び１３Ｃ）並びにＣＤ４＋（図１３Ｂ及び１３Ｄ）カニクイザルＴ細胞上での、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（図１３Ａ及び１３Ｂ）並びにＣＤ６９（図１３Ｃ及び１３Ｄ）のＤＡＲＴ‐Ａ仲介型誘発の用量応答。Ｔ細胞を用いた１つの代表的な実験が示されている。ＤＡＲＴ‐Ａ：黒△；対照ＤＡＲＴ１：黒▽。
【図１４】図１４Ａ‐１４Ｄは、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）及び対照ＤＡＲＴ１が、ＣＤ１９陰性ＪＩＭＴ１細胞の存在下において、ヒトＴ細胞活性化の仲介に失敗することを示す。提示されているのは、図１２Ａ‐１２Ｄと同一のドナーからのＣＤ８＋（図１４Ａ及び１４Ｃ）並びにＣＤ４＋（図１４Ｂ及び１４Ｄ）上での、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（図１４Ａ及び１４Ｂ）並びにＣＤ６９（図１４Ｃ及び１４Ｄ）のＤＡＲＴ‐Ａ仲介型誘発の用量応答である。ＤＡＲＴ‐Ａ：黒△；対照ＤＡＲＴ１：黒▽。
【図１５】図１５Ａ‐１５Ｂは、１０：１のＥ：Ｔ比における、２４時間にわたる、Ｒａｊｉ／ＧＦ標的細胞と、変化する濃度のＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１とを用いたインキュベーション後の、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ヒトＴ細胞におけるグランザイムＢ（図１５Ａ）及びパーフォリン（図１５Ｂ）染色の細胞内レベルを示す。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、２００ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１の存在下における、１０：１のＥ：Ｔ比における２４時間（図１６Ａ）又は７２時間（図１６Ｂ）にわたるＨＢＬ‐２標的細胞を用いた共培養後の、ＦＡＣＳ分析によるＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞の増殖を示す。ＤＡＲＴ‐Ａの存在下（黒色の線）又は対照ＤＡＲＴ１の存在下（灰色の塗り潰し部分）における、ＨＢＬ‐２細胞を用いた共培養後の染色プロファイルが示されている。
【図１７】図１７は、活性化ヒトＴ細胞の存在下における、ＨＢＬ‐２腫瘍細胞を移植したマウス中の、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）による細胞成長の阻害を示す。メスの非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（non‐obese diabetic/severe combined immunodeficient：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（ｎ＝８／グループ）に、ＨＢＬ‐２腫瘍細胞＋活性化ヒトＴ細胞を０日目に皮下（ＳＣ）移植し、その後、０‐３日目に、合計４用量のビヒクル対照、対照ＤＡＲＴ１、又はＤＡＲＴ‐ＡをＩＶ投与して処置した。ヒトＴ細胞及びＨＢＬ‐２細胞を、１：５の比（それぞれ１×１０6及び５×１０6細胞）でインキュベートした。腫瘍体積をグループ平均±ＳＥＭとして示す。
【図１８】図１８は、活性化ヒトＴ細胞の存在下における、Raji腫瘍細胞を移植したマウス中の、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性分子（ＤＡＲＴ‐Ａ）による細胞成長の阻害を示す。メスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８／グループ）に、Ｒａｊｉ腫瘍細胞＋活性化ヒトＴ細胞を０日目にＳＣ移植し、その後、０‐３日目に、合計４用量のビヒクル対照、対照ＤＡＲＴ１、又はＤＡＲＴ‐ＡをＩＶ投与して処置した。ヒトＴ細胞及びＲａｊｉ細胞を、１：５の比（それぞれ１×１０6及び５×１０6細胞）でインキュベートした。腫瘍体積をグループ平均±ＳＥＭとして示す。
【図１９】図１９Ａ‐１９Ｂは、ＨＢＬ‐２腫瘍細胞を移植したマウスにおける、腫瘍体積の経時的な変化を示す。図１９Ａ：メスのＮＳＧＢ２ｍ‐／‐マウス（ｎ＝８／グループ）に、ＨＢＬ‐２腫瘍細胞（５×１０6）を０日目に皮内（ＩＤ）移植した。４日目、マウスにＰＢＭＣ（５×１０7）を腹腔内（ＩＰ）移植した。次にこれらのマウスを、図示されているように（Ｒｘの矢印を参照）、ビヒクル、対照ＤＡＲＴ１、又はＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａを用いて血管内処置した。図１９Ｂ：メスのＮＳＧＢ２ｍ‐／‐マウス（ｎ＝８／グループ）に、ＨＢＬ‐２腫瘍細胞（５×１０6）を０日目に皮内（ＩＤ）移植した。４日目、マウスにＰＢＭＣ（５×１０7）を腹腔内（ＩＰ）移植した。次にこれらのマウスを、図示されているように（Ｒｘの矢印を参照）、ビヒクル、対照ＤＡＲＴ１、又はＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａを用いて血管内処置した。腫瘍体積をグループ平均±ＳＥＭとして示す。
【図２０】図２０Ａ‐２０Ｂは、１週間毎に用量を増加させる最高４回のサイクルのＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐ＡのＩＶ投与に続く、カニクイザルにおける循環Ｂ細胞レベルを経時的に示す。グループ１（ｎ＝４）のカニクイザルは、ビヒクル→０．５→５→５０→５０μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを１、８、１５、２２、及び２９日目（垂直な点線で示されている）にＩＶ投与して処置した（図２０Ａ）。グループ２（ｎ＝４）のカニクイザルは、ビヒクル→２→１０→１００→１００μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを１、８、１５、２２、及び２９日目（垂直な点線で示されている）にＩＶ投与して処置した（図２０Ｂ）。各カニクイザルに関するデータを示す。
【図２１】図２１Ａ‐２１Ｄは、１週間毎の固定用量の最高３回のサイクル、又は３日毎の固定用量の最高５回のサイクルの、ＤＡＲＴ‐ＡのＩＶ投与に続く、カニクイザルにおける循環Ｂ細胞レベルを経時的に示す。グループ３〜５（ｎ＝２／グループ）のカニクイザルは、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ＤＡＲＴ‐Ａを用いて処置した。グループ３（図２１Ａ）は、５ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投与され；グループ４（図２１Ｂ）は、５０ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投与され；グループ５（図２１Ｃ）は、５００ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投与された。ＤＡＲＴ‐Ａは、１、８及び１５日目（垂直な点線で示されている）にＩＶ投与された。グループ６（ｎ＝２）のカニクイザル（図２１Ｄ）は、５００ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを１、４、８、１１及び１５日目（垂直な点線で示されている）にＩＶ投与して処置した。各カニクイザルに関するデータを示す。
【図２２】図２２は、ＤＡＲＴ‐ＡヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスの薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ：ＰＫ）分析を示す。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３は、トランスジェニック動物における典型的な抗体半減期の決定を可能とするための対照として採用された、無関係のヒト化ＩｇＧ１抗体である。
【図２３】図２３は、５００μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａ（■）、５００μｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ１（黒△）又はビヒクル対照（●）を用いた処置に続く、ヒトＰＢＭＣ再構成マウスにおける播種性Ｒａｊｉ‐ｌｕｃ細胞白血病モデルの生存曲線を示す。
【図２４】図２４は、５００μｇ／ｋｇ（●）、１００μｇ／ｋｇ（■）、２０μｇ／ｋｇ（○）、４μｇ／ｋｇ（黒△）、０．８μｇ／ｋｇ（黒▽）若しくは０．１６μｇ／ｋｇ（□）のＤＡＲＴ‐Ａ、５００ｍｇ／ｋｇ（△）対照ＤＡＲＴ１又はビヒクル対照（◆）を用いた処置に続く、ヒトＰＢＭＣ再構成マウスにおける播種性Ｒａｊｉ‐ｌｕｃ細胞白血病モデルの生存曲線を示す。
【図２５】図２５は、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａ（黒△）、０．１ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａ（■）又はビヒクル対照（●）を用いた処置に続く、ヒトＰＢＭＣ再構成マウスにおける播種性Ｒａｊｉ‐ｌｕｃ細胞白血病モデルの生存曲線を示す。
【図２６】図２６は、５００μｇ／ｋｇ（■）、１００μｇ／ｋｇ（黒△）、２０μｇ／ｋｇ（黒▽）、４μｇ／ｋｇ（◆）、０．８μｇ／ｋｇ（□）若しくは０．１６μｇ／ｋｇ（△）のＤＡＲＴ‐Ａ、０．１ｍｇ／ｋｇ対照ＤＡＲＴ１（○）又はビヒクル対照（●）を用いた処置に続く、ヒトＰＢＭＣ再構成マウスにおける播種性Ｒａｊｉ‐ｌｕｃ細胞白血病モデルの生存曲線を示す。
【図２７】図２７は、１０μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投薬したカニクイザルにおける、ＤＡＲＴ‐Ａの血清濃度‐時間プロファイルを示す。
【図２８】図２８は、研究日数及びグループに関してフローサイトメトリーによって決定した、ＣＤ４５＋／ＣＤ２０＋細胞／μＬの平均±ＳＥＭ数を示す。８、１５、２２及び２９日目の垂直な点線は、グループ２‐５の動物に関する２時間のＩＶ注入による、ＤＡＲＴ‐Ａの各用量（dose：Ｄ）を示し；その一方でグループ１の動物は、ビヒクル対照を投与され続けた。研究日数を示すｘ軸は、‐７〜‐１日目、０〜６３日目及び６４‐１２１日目をカバーする３つのセグメントに分割されている。
【図２９】図２９Ａ‐２９Ｉは、無処置（図２９Ａ）、６日にわたるＤＡＲＴ‐Ａ（図２９Ｃ、２９Ｅ、２９Ｇ及び２９Ｉ）又は対照ＤＡＲＴ１（図２９Ｂ、２９Ｄ、２９Ｆ及び２９Ｈ）処置後の、ＣＬＬＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１：２３）における、悪性Ｂ細胞（ＣＤ２０＋／ＣＤ５＋）（図２９Ａ‐２９Ｃ）、Ｔ細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋）（図２９Ｄ‐２９Ｅ）及びＴ細胞活性化（ＣＤ４＋（図２９Ｆ‐２９Ｇ）又はＣＤ８＋（図２９Ｈ‐２９Ｉ）Ｔ細胞中のＣＤ２５）の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、２つのポリペプチド鎖を備え、ＣＤ１９のエピトープに対して特異的である１つの結合部位と、ＣＤ３のエピトープに対して特異的である１つの結合部位とを有する、二重特異性１価ダイアボディ（即ち「ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ」）を対象とする。最も好ましくは、このようなＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖からなり、ＣＤ１９のエピトープに対して特異的である１つの結合部位と、ＣＤ３のエピトープに対して特異的である１つの結合部位とを有し、更に免疫グロブリンＦｃドメインを備える（即ち「ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ」）。本発明の二重特異性１価ダイアボディ及び二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、ＣＤ１９及びＣＤ３に同時に結合できる。本発明は、このような二重特異性１価ダイアボディ又はこのような二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含有する医薬組成物を対象とする。本発明は更に、疾患、特に血液悪性腫瘍の治療における、このようなダイアボディの使用のための方法を対象とする。
【００５４】
Ａ．抗体及び他の結合分子
１．抗体
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」は、完全なポリクローナル又はモノクローナル抗体だけでなく、その突然変異体、自然に発生する変異体、必要な特異性の抗原認識部位を有する抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化抗体及びキメラ抗体、並びに必要な特異性の抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。本出願全体を通して、抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸残基の番号付与は、非特許文献１８中のもののようなＥＵインデックスに従ったものである。本明細書において使用される場合、「抗体の抗原結合性断片」は、少なくとも１つの抗原認識部位を有する抗体の一部分である。本明細書において使用される場合、この用語は、断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2Ｆｖ等）、及び単鎖（ｓｃＦｖ）を包含する。
【００５５】
用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の二重特異性分子及びキメラ抗体、ヒト化抗体又はイヌ化抗体を生成して、抗体の親和性若しくは他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の���原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第4,816,567号;米国特許第5,807,715号;米国特許第5,866,692号;及び米国特許第6,331,415号を参照。
【００５６】
Ｂ．二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ及びＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ
非単一特異性「ダイアボディ（diabody）の提供は、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（co‐ligate）して共存させることができる能力という、抗体に対する有意な利点を提供する。従って２価ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。２価性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び操作の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221）。特に重要なのは、異なる細胞の共連結、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋である（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305）。
【００５７】
ダイアボディエピトープ結合ドメインはまた、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０及びＣＤ７４といったＢ細胞の表面決定基を指向してよい（Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) “Newer monoclonal antibodies for hematological malignancies,” Exp. Hematol. 36(7):755-768）。多くの研究において、エフェクタ細胞決定基（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に対するダイアボディ結合は、エフェクタ細胞を活性化させることも発見された（Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916;国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、抗原に結合した抗体がＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によってエフェクタ細胞に結合することによってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、（例えば当該技術分野において公知の、又は本出願において例示されるいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）において分析されるように）Ｆｃドメインを備えるかどうかとは独立して、Ｉｇのような機能性を呈し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋することによって、ダイアボディはエフェクタ細胞を腫瘍細胞近傍にもたらすだけでなく、効果的な腫瘍の殺滅をもたらす（例えばCao et al. (2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197参照）。
【００５８】
しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止するような方法で（即ちホモ二量体化を防止するように）達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００５９】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００６０】
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（商標）と呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば米国公開特許第２０１３-０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０-０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９-００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号、欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；並びにMoore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを備え、１つ又は複数のシステイン残基を、採用した各ポリペプチド種中に組み込むステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。
【００６１】
最も単純なＤＡＲＴ（商標）の２つのポリペプチドはそれぞれ３つのドメインを備える（図１）。第１のポリペプチドは：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を備えるドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を備える、第２のドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記第２のポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する役割、及びダイアボディの第２のポリペプチドに対する第１のポリペプチドの共有結合を促進する役割を果たす、第３のドメインを備える。第２のポリペプチドは：相補的な第１のドメイン（ＶＬ２ドメイン）；相補的な第２のドメイン（ＶＨ１ドメイン）；並びに第１のポリペプチド鎖の第３のドメインと複合体化して、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進する、第３のドメインを含有する。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。これらの分子は、標的抗原を発現する細胞の標的転換Ｔ細胞仲介型殺滅を促進できる。
【００６２】
一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの第３のドメインはそれぞれ、システイン残基を含有し、このシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してポリペプチドを一体に結合させる役割を果たす。上記ポリペプチドのうちの一方又は両方の第３のドメインは更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、ダイアボディポリペプチドの複合体化によって、細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合できるＦｃドメインが形成される（図２Ａ‐２Ｂ）。このような分子の多数の変形例が記載されている（例えば米国特許公開第２０１３‐０２９５１２１号；米国特許公開第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国特許公開第２００９‐００６０９１０号；欧州特許公開第２７１４０７９号；欧州特許公開第２６０１２１６号；欧州特許公開第２３７６１０９号；欧州特許公開第２１５８２２１号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号参照）。これらのＦｃ担持ＤＡＲＴは、３つのポリペプチド鎖を備えてよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメイン；並びに（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（商標）の第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（商標）の第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を備える。従って、このようなＤＡＲＴ（商標）の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体として関連して、エピトープに結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメイン内のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して、互いに結合される。特に、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いと複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このようなダイアボディは、増強された強度を有する。このようなＦｃ担持ＤＡＲＴ（商標）は、２つの配向（表１）のうちのいずれを有してよい：
【００６３】
【表１】
2017533891.tif 000003
【００６４】
本発明は、ＣＤ１９及びＣＤ３に同時に結合できるＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ、並びに血液悪性腫瘍の治療におけるこのような分子の使用を対象とする。非最適化ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは十分に機能性であるが、コドン最適化によって遺伝子発現において得られる改善（例えばGrosjean, H. et al. (1982) “Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon‐Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes” Gene 18(3):199‐209参照）と同様に、配列を修飾又は改良することによって、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの安定性及び／又は機能を更に向上させることができる。
【００６５】
本発明の好ましいＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、３つの異なるポリペプチド鎖からなるＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディであり、上記３つの異なるポリペプチド鎖は互いに関連して、ＣＤ１９のエピトープに対して特異的な１つの結合部位、及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する（図２Ａ‐２Ｂ参照）ことにより、ＣＤ１９及びＣＤ３に同時に結合できる。従ってこれらのダイアボディは、ＣＤ３又はＣＤ１９であってよい「第１の抗原（first antigen）」と、上記第１の抗原がＣＤ３である場合はＣＤ１９、上記第１の抗原がＣＤ１９である場合はＣＤ３である、「第２の抗原（second antigen）とに結合する。
【００６６】
好ましくは、図２Ａに示すように、これら３つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、「第１の」抗原（ＣＤ３又はＣＤ１９）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の抗原結合ドメイン、第２の抗原（上記第１の抗原がＣＤ３であった場合はＣＤ１９、上記第１の抗原がＣＤ１９であった場合はＣＤ３）の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の抗原結合ドメイン、及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから分離する。好ましくは、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、介在リンカーペプチド（リンカー２）によってヘテロ二量体促進ドメインに連結される。ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの場合、ヘテロ二量体促進ドメインのＣ末端は、介在リンカーペプチド（リンカー３）によって、又は介在スペーサリンカーペプチド（スペーサリンカー３）によって、Ｆｃ領域（「Ｆｃドメイン」）のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに連結される。従って最も好ましくは、上記３つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において：ＶＬ第1の抗原‐リンカー１‐ＶＨ第2の抗原‐リンカー２‐ヘテロ二量体促進ドメイン‐スペーサリンカー３‐Ｆｃドメインを含有する。
【００６７】
あるいは図２Ｂに示すように、これら３つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、Ｎ末端、リンカー３、Ｆｃ領域（「Ｆｃドメイン」）のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、例えばアミノ酸配列：APSSS（配列番号４７）又はアミノ酸配列APSSSPME（配列番号４８）を有する介在スペーサペプチド（リンカー４）、第１の抗原（ＣＤ３又はＣＤ１９）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の抗原結合ドメイン、第２の抗原（第１の抗原がＣＤ３であった場合はＣＤ１９、第１の抗原がＣＤ１９であった場合はＣＤ３）の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体促進ドメイン、及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから隔てる。好ましくは、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、介在リンカーペプチド（リンカー２）によって、ヘテロ二量体促進ドメインに連結される。従って最も好ましくは、上記３つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において：リンカー３‐Ｆｃドメイン‐リンカー４‐ＶＬ第1の抗原‐リンカー１‐ＶＨ第2の抗原‐リンカー２‐ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。
【００６８】
好ましくは、これら３つのポリペプチド鎖のうちの第２のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、Ｎ末端、第２の抗原の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の抗原結合ドメイン、第１の抗原の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体促進ドメイン、及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから隔てる。好ましくは、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、介在リンカーペプチド（リンカー２）によって、ヘテロ二量体促進ドメインに連結される。従って最も好ましくは、上記３つのポリペプチド鎖のうちの第２のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において：ＶＬ第2の抗原‐リンカー１‐ＶＨ第1の抗原‐リンカー２-ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。
【００６９】
好ましくは、これら３つのポリペプチド鎖のうちの第３のものは、リンカーペプチド（リンカー３）及びＦｃ領域（「Ｆｃドメイン」）のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含有する。
【００７０】
第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＣＤ１９又はＣＤ３）に対して特異的な機能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第２の抗原（即ち第１の抗原の種別に応じてＣＤ３又はＣＤ１９）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。このように、第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が全体として、ＣＤ１９及びＣＤ３に結合できる軽鎖及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを含むように、整合される。
【００７１】
１．好ましいリンカー
最も好ましくは、ポリペプチド鎖の上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てるリンカー１の長さは、上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合するのを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１）：GGGSGGGGを有する。
【００７２】
リンカー２の目的は、ポリペプチド鎖のＶＨドメインを、上記ポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインから隔てることである。リンカー２の目的のために、多様なリンカーのうちのいずれを使用できる。このようなリンカー２に関する好ましい配列は、アミノ酸配列：ASTKG（配列番号２）を有し、これはＩｇＧ  ＣＨ１ドメイン又はGGCGGG（配列番号３）に由来し、これは、ジスルフィド結合を介して第１及び第２のポリペプチド鎖を互いに対して共有結合させるために使用できるシステイン残基を有する。リンカー２、ASTKG（配列番号２）はこのようなシステインを有しないため、このようなリンカー２の使用は好ましくは、配列番号１２のＥコイル又は配列番号１３のＫコイル等（以下を参照）のシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの使用に関連する。
【００７３】
リンカー３の目的は、ポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインを、上記ポリペプチド鎖のＦｃドメインから隔てることである。リンカー３の目的のために、多様なリンカーのうちのいずれを使用できる。このようなリンカー３に関する好ましい配列は、アミノ酸配列：DKTHTCPPCP（配列番号４）を有する。スペーサリンカー３に関する好ましい配列は、アミノ酸配列：GGGDKTHTCPPCP（配列番号５）を有する。
【００７４】
２．好ましいヘテロ二量体促進ドメイン
第１及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体の形成は、ヘテロ二量体促進ドメインを含むことによって開始させることができる。このようなドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号６）（又はVEPKSC；配列番号１７）、及び他方のポリペプチド鎖上にGFNRGEC（配列番号８）（又はFNRGEC；配列番号９）を含む（米国特許第２００７／０００４９０９号）。
【００７５】
しかしながらより好ましくは、本発明のヘテロ二量体促進ドメインは、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つの荷電アミノ酸残基を含む、反対の極の１つ、２つ、３つ又は４つのタンデム反復コイルドメインから形成される（Apostolovic, B. et al. (2008) “pH‐Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,” Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) “Helix‐stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled‐coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221‐228; Arndt, K.M. et al. (2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,” Structure 10:1235‐1248; Boucher, C. et al. (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,” Analytical Biochemistry 399:138‐140; Cachia, P.J. et al. (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross‐Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,” J. Mol. Recognit. 17:540‐557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) “Real‐Time Monitoring of the Interactions of Two‐Stranded de novo Designed Coiled‐Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754‐1763; Fernandez‐Rodriquez, J. et al. (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled‐Coil Tag,” Protein Science 21:511‐519; Ghosh, T.S. et al. (2009) “End‐To‐End And End‐To‐Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,” Acta Crystallographica D65:1032‐1041; Grigoryan, G. et al. (2008) “Structural Specificity In Coiled‐Coil Interactions,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477‐483; Litowski, J.R. et al. (2002) “Designing Heterodimeric Two‐Stranded α‐Helical Coiled‐Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α‐Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity,” J. Biol. Chem. 277:37272‐37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) “The d′‐‐d‐‐d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′‐‐a‐‐a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled‐coil Dimer Motif,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5):  2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) “Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled‐coil Interface,” J. Molec. Biol. 366:1232‐1242; Tripet, B. et al. (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C‐terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,” J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled‐Coil Structures And Assemblies,” Adv. Prot. Chem. 70:79‐112; Zeng, Y. et al. (2008) “A Ligand‐Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,” J. Gene Med. 10:355‐367）。
【００７６】
このような反復コイルドメインは、完全な反復であってよく、又は置換を有してよい。例えば、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、８つの負荷電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよく、第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、８つの正荷電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよい（又はその逆であってよい）。反対の電荷のコイルを他方のポリペプチド鎖に対して使用する場合、第１又は第２のポリペプチド鎖にどちらのコイルを設けるかは重要ではない。しかしながら、本発明の好ましいＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、負荷電コイルを有する第１のポリペプチド鎖を有する。正荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン等であってよく、及び／又は負荷電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよい。正荷電アミノ酸は好ましくはリジンであり、及び／又は負荷電アミノ酸は好ましくはグルタミン酸である。（このようなドメインはホモ二量体化を阻害し、これによってヘテロ二量体化を促進するため）単一のヘテロ二量体促進ドメインしか採用できないが、本発明のダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖両方が、ヘテロ二量体促進ドメインを含有することが好ましい。
【００７７】
好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインのうちの１つは、４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号１０：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）を備え、そのグルタミン酸残基は、ｐＨ７において負の電荷を形成し、またその一方で、ヘテロ二量体促進ドメインのうちのもう一方は、４つのタンデム「Ｋコイル」ドメイン（配列番号１１：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を備え、そのリジン残基は、ｐＨ７において正の電荷を形成する。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結が促進され、従ってヘテロ二量体化が促進される。特に好ましいのは、配列番号１０の上記４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号１２）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインである。同様に、特に好ましいのは、配列番号１１の上記４つのタンデム「Ｋコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号１３）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ドメインである。
【００７８】
３．ポリペプチド鎖の共有結合
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、その第１及び第２のポリペプチド鎖が、その長さに沿って位置決めされた１つ又は複数のシステイン残基を介して互いに対して共有結合するよう、操作されている。このようなシステイン残基は、上記ポリペプチドのＶＬ及びＶＨドメインを隔てる介在リンカーに導入され得る。あるいはリンカー２はシステイン残基を含有してよい。更に、又はあるいは、リンカー３が、配列番号４又は配列番号５のようなシステイン残基を含有してよい。最も好ましくは、ヘテロ二量体促進ドメインの１つ又は複数のコイルドメインは、配列番号１２又は配列番号１３のようなシステイン残基を含有するように置換される。
【００７９】
特定の実施形態では、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは更に、インビボでの半減期を延長するために、アルブミン結合ドメインを有してよい。
【００８０】
４．好ましいＦｃドメイン
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価FcダイアボディのＦｃドメインは、完全Ｆｃ領域（例えば完全ＩｇＧ  Ｆｃ領域）であってよく、又は完全Ｆｃ領域の断片でしかなくてもよい。本発明の二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよく、より好ましくは、上記Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃ領域が示す結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合の低下を引き起こし、又は上記Ｆｃドメインの、１つ若しくは複数の上記受容体に結合する能力を有意に低減する。本発明の二重特異性１価FcダイアボディのＦｃドメインは、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全Ｆｃ領域のＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を備えてよい。本発明の二重特異性１価FcダイアボディのＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を備えてよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃ領域の部分を備えてよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を備えてよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３領域、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【００８１】
好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖はそれぞれＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備え、これらは一体に複合体化して免疫グロブリン（ＩｇＧ）Ｆｃドメインを形成する。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は（配列番号１４）：
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGK
である。従って、上記第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインはいずれも、配列番号１４又はその変異型からなってよい。
【００８２】
特に、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに関して、（野生型Ｆｃドメイン（配列番号１４）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下する（又は結合を実質的に示さない）ことが好ましい。このような変化した結合を仲介できるＦｃ変異型及び突然変異型は当該技術分野において公知であり、２３４位及び２３５位におけるアミノ酸置換、２６５位における置換、又は２９７位におけるアミノ酸置換を含む（例えば米国特許第５，６２４，８２１号（これは参照により本出願に援用される）参照）。好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、２３４位におけるアラニンによる置換、及び２３５位におけるアラニンによる置換を含む。
【００８３】
第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の錯体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」とペアにすることができる。このような一連の変化は、二重特異性１価Ｆｃ二重特異性１価Ｆｃダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、また更に、上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs‐Into‐Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617‐621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26‐35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95‐101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましくは、「ノブ」は第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、「ホール」は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。従って「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たすことになる。第３のポリペプチド鎖は好ましくは「ホール」置換基を含有するため、第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、かつそれ自体とホモ二量体化する。好ましいノブは、天然ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、天然ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含む最終的な二重特異性１価Ｆｃダイアボディから精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。
【００８４】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、「ノブ担持」配列（配列番号１５）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGK
を有する。
【００８５】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましい配列は、「ホール担持」配列（配列番号１６）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGK
を有する。
【００８６】
上述のように、配列番号１５及び配列番号１６のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃ領域（配列番号１４）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃドメインを形成する。
【００８７】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号１５のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号１６）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号１５）は、第３のポリペプチド鎖中に採用される。
【００８８】
５．好ましいＣＤ１９可変ドメイン
いずれの抗ＣＤ１９抗体の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、本発明に従って使用してよい。ただし好ましくは、ＶＬCD19ドメインはアミノ酸配列（配列番号１７）：
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA
SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG
TKLEIK
を有し、下線を付した配列はそれぞれ、上記ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３である：
ＶＬCD19ＣＤＲ１：RASQSVSYMH（配列番号１８）
ＶＬCD19ＣＤＲ２：DASNRAS（配列番号１９）
ＶＬCD19ＣＤＲ３：FQGSVYPFT（配列番号２０）
【００８９】
同様に、いずれの抗ＣＤ１９抗体の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、本発明に従って使用してよい。ただし好ましくは、ＶＨCD19ドメインはアミノ酸配列（配列番号２１）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCARM
ELWSYYFDYW GQGTTVTVSS
を有し、下線を付した配列はそれぞれ、上記ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３である：
ＶＨCD19ＣＤＲ１：TSGMGVG（配列番号２２）
ＶＨCD19ＣＤＲ２：HIWWDDDKRYNPALKS（配列番号２３）
ＶＨCD19ＣＤＲ３：MELWSYYFDY（配列番号２４）
【００９０】
６．好ましいＣＤ３可変ドメイン
いずれの抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、本発明に従って使用してよい。ただし好ましくは、ＶＬCD3ドメインはアミノ酸配列（配列番号２５）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG
を有し、下線を付した配列はそれぞれ、上記ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３である：
ＶＬCD3ＣＤＲ１：RSSTGAVTTSNYAN（配列番号２６）
ＶＬCD3ＣＤＲ２：GTNKRAP（配列番号２７）
ＶＬCD3ＣＤＲ３：ALWYSNLWV（配列番号２８）
【００９１】
同様に、いずれの抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、本発明に従って使用してよい。ただし好ましくは、ＶＨCD3ドメインはアミノ酸配列（配列番号２９）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
を有し、下線を付した配列はそれぞれ、上記ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤ３である：
ＶＨCD3ＣＤＲ１：TYAMN（配列番号３０）
ＶＨCD3ＣＤＲ２：RIRSKYNNYATYYADSVKG（配列番号３１）
ＶＨCD3ＣＤＲ３：HGNFGNSYVSWFAY（配列番号３２）
【００９２】
７．任意のアルブミン結合ドメイン
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ及びＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディＦｃダイアボディのインビボ薬物動態特性を更に改善するために、上記ダイアボディを、上記ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数において血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのＣ末端に配置されることになる。この目的のために特に好ましい血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）である。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）が特に好ましい。
【００９３】
連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114‐8120）。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。
【００９４】
従って、アルブミン結合ドメインを有するこのようなＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又は二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、上記ポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）を上記アルブミン結合ドメインから隔てるリンカー（リンカー４）を含有する。このようなリンカー４に関する好ましい配列は、配列番号３３：ＧＧＧＳである。好ましいアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、配列（配列番号３４）：LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAALPを有する。
【００９５】
Ｃ．例示的なＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ「ＤＡＲＴ‐Ａ」
本発明は、ＣＤ１９及びＣＤ３に同時かつ特異的に結合できる例示的なＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを提供する。この例示的なダイアボディは、「ＤＡＲＴ‐Ａ」と呼ばれる。本発明のダイアボディは、他のＣＤ１９×ＣＤ３ダイアボディに対して増強された機能活性を呈することが分かった。
【００９６】
上述のように、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を備える。ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１９に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD19）（配列番号１７）、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）（配列番号２９）、介在リンカーペプチド（リンカー２；ASTKG（配列番号２））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号１２））、介在リンカーペプチド（スペーサリンカー３；GGGDKTHTCPPCP（配列番号５））、「ノブ担持（ｋｎｏｂ‐ｂｅａｒｉｎｇ）」ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド（Ｆｃドメイン配列、配列番号１５）、並びにＣ末端を備える。
【００９７】
従って、ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖は：配列番号１７‐配列番号１‐配列番号２９‐配列番号２‐配列番号１２‐配列番号５‐配列番号１５からなる。
【００９８】
ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号３５）：
ENVLTQSPATLSVTPGEKATITCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDASNRASGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLEAEDAATYYCFQGSVYPFTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGEVAACEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
である。
【００９９】
このようなポリペプチドをエンコードする好ましいポリヌクレオチドは、（配列番号３６）：
gagaatgtgctcacacagtcccctgcaactctgagcgtaactccaggggagaaggccaccatcacgtgtagagcctcccagagtgtgagctacatgcactggtatcagcagaaacctggacaagctcccaggttgctgatctatgacgcgagcaaccgggctagtggcgttccatcccggttttctggctcaggatctggcactgaccacaccctcaccatatccagccttgaagccgaagatgccgcaacctactactgctttcaggggagtgtgtatcccttcacattcggtcagggtacaaagctggagattaagggtggaggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtgaagggtagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccgcctccaccaagggcgaagtggccgcatgtgagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcggggacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
である。
【０１００】
ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）（配列番号２５）、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））、ＣＤ１９に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD19）（配列番号２１）、介在リンカーペプチド（リンカー２；ASTKG（配列番号２））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号１３））、及びＣ末端を備える。
【０１０１】
従って、ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖は：配列番号２５‐配列番号１‐配列番号２１‐配列番号２‐配列番号１３からなる。
【０１０２】
ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号３７）：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVFLTMTNMDPVDTATYYCARMELWSYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGKVAACKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
である。
【０１０３】
このようなポリペプチドをエンコードする好ましいポリヌクレオチドは、配列（配列番号３８）：
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctgacatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcagaagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacccctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggcacaggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttcgggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggaggtggacaggtgacactgagggaatctggtccagctctggtgaaacccactcagacgctcactctcacttgcacctttagtgggttctcactgtccacatctggcatgggagtaggctggattcgacagccacctgggaaagccttggagtggcttgcccacatctggtgggatgacgacaagcggtataatcccgcactgaagagcagactgaccatcagcaaggatacatccaagaaccaggtgtttctgaccatgaccaacatggaccctgtcgatacagccacctactattgtgctcgcatggagttgtggtcctactacttcgactattggggacaaggcacaaccgtgactgtctcatccgcctccaccaagggcaaagtggccgcatgtaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
を有する。
【０１０４】
ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ペプチド（リンカー３；DKTHTCPPCP（配列番号４））、「ホール担持（ｈｏｌｅ‐ｂｅａｒｉｎｇ）」ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド（Ｆｃドメイン配列、配列番号１６）、並びにＣ末端を備える。
【０１０５】
従って、ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖は：配列番号４‐配列番号１６からなる。
【０１０６】
ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号３９）：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
である。
【０１０７】
このようなポリペプチドをエンコードする好ましいポリヌクレオチドは、配列（配列番号４０）：
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgagttgcgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
を有する。
【０１０８】
Ｄ．対照ＤＡＲＴ
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの特性をより有意義に実証するために、２つの対照ＤＡＲＴを構築した。第１の対照ＤＡＲＴ（「対照ＤＡＲＴ１」）は、フルオレセイン及びＣＤ３に結合できる。第２の対照ＤＡＲＴ（「対照ＤＡＲＴ２」）は、フルオレセイン及びＣＤ１９に結合できる。
【０１０９】
対照ＤＡＲＴ１及び２を形成するために使用した抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０（Gruber, M. et al. (1994) “Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bi‐specific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,” J. Immunol. 152(11):5368‐5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti‐Fluorescein Idiotype Family,” J. Biol. Chem. 264(3): 1565‐1569）を、対照ダイアボディにおいて使用した。上記抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変軽鎖及び可変重鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである：
上記抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列（配列番号４１）：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK 
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP 
WTFGGGTKLE IK
上記抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変重鎖ドメインのアミノ酸配列（配列番号４２）：
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ 
IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG 
SYYGMDYWGQ GTSVTVSS
【０１１０】
１．対照ＤＡＲＴ１（フルオレセイン×ＣＤ３）
対照ＤＡＲＴ１の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、フルオレセインに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬ4‐4‐20）（配列番号４１）、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）（配列番号２９）、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号３））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号１０））、介在リンカーペプチド（スペーサリンカー３；GGGDKTHTCPPCP（配列番号５））、「ノブ担持（knob‐bearing）」ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド（Ｆｃドメイン配列、配列番号１５）、並びにＣ末端を備える。
【０１１１】
従って対照ＤＡＲＴ１の第１のポリペプチド鎖は：配列番号４１‐配列番号１‐配列番号２９‐配列番号３‐配列番号１０‐配列番号５‐配列番号１５からなる。
【０１１２】
対照ＤＡＲＴ１の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号４３）：
DVVMTQTPFSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGEVAACEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
である。
【０１１３】
対照ＤＡＲＴ１の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD3）（配列番号２５）、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））、フルオレセインに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨFluor）（配列番号４２）、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号３））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号１１））、及びＣ末端を備える。
【０１１４】
従って対照ＤＡＲＴ１の第２のポリペプチド鎖は：配列番号２５‐配列番号１‐配列番号４２‐配列番号３‐配列番号１１からなる。
【０１１５】
対照ＤＡＲＴ１の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号４４）：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGEVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGKVAACKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
である。
【０１１６】
対照ＤＡＲＴ１の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ペプチド（リンカー３；DKTHTCPPCP（配列番号４））、「ホール担持（hole‐bearing）」ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド（Ｆｃドメイン配列、配列番号１６）、並びにＣ末端を備える。
【０１１７】
従って、対照ＤＡＲＴ１の第３のポリペプチド鎖は：配列番号４‐配列番号１６からなる。
【０１１８】
対照ＤＡＲＴ１の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号３９）：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
である。
【０１１９】
２．対照ＤＡＲＴ２（フルオレセイン×ＣＤ１９）
対照ＤＡＲＴ２の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ＣＤ１９に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCD19）（配列番号１７）、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））、フルオレセインに結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨFluor）（配列番号４２）、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号３））、ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号１０））、介在リンカーペプチド（スペーサリンカー３；GGGDKTHTCPPCP（配列番号５））、「ノブ担持（knob‐bearing）」ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド（Ｆｃドメイン配列、配列番号１５）、並びにＣ末端を備える。
【０１２０】
従って対照ＤＡＲＴ２の第１のポリペプチド鎖は：配列番号１７‐配列番号１‐配列番号４２‐配列番号３‐配列番号１０‐配列番号５‐配列番号１５からなる。
【０１２１】
対照ＤＡＲＴ２の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号４５）：
ENVLTQSPATLSVTPGEKATITCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDASNRASGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLEAEDAATYYCFQGSVYPFTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGEVAACEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
である。
【０１２２】
対照ＤＡＲＴ２の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、フルオレセインに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬFluor）（配列番号４１）、介在リンカーペプチド（リンカー１；GGGSGGGG（配列番号１））、ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCD3）（配列番号２９）、介在リンカーペプチド（リンカー２；GGCGGG（配列番号３））、ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号１１））、及びＣ末端を備える。
【０１２３】
従って対照ＤＡＲＴ２の第２のポリペプチド鎖は：配列番号４１‐配列番号１‐配列番号２９‐配列番号３‐配列番号１１からなる。
【０１２４】
対照ＤＡＲＴ２の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号４６）：
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGEVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGKVAACKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
である。
【０１２５】
対照ＤＡＲＴ２の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、ペプチド（リンカー３；DKTHTCPPCP（配列番号４））、「ホール担持（hole‐bearing）」ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド（Ｆｃドメイン配列、配列番号１６）、並びにＣ末端を備える。
【０１２６】
従って、対照ＤＡＲＴ２の第３のポリペプチド鎖は：配列番号４‐配列番号１６からなる。
【０１２７】
対照ＤＡＲＴ２の第３のポリペプチドのアミノ酸配列は、（配列番号３９）：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
である。
【０１２８】
Ｅ．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。
【０１２９】
本発明はまた、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（及び特に、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ）、並びに特定の癌抗原に対して特異的である第２の治療用抗体（例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体）、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物も包含する。
【０１３０】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（pharmaceutically acceptable）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（carrier）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。
【０１３１】
一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を注入によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する注入ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０１３２】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐メチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明はまた、単独で又は上述の薬学的に許容可能なキャリアと併せて、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（及び特に、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ）で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０１３４】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ、及びより好ましくは、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ若しくは複数の他の予防剤及び／若しくは治療剤を、１つ若しくは複数のコンテナ内に含むことができ；並びに／又はこのキットは更に、癌に関連する１つ若しくは複数の癌抗原に結合する１つ若しくは複数の細胞毒性抗体を含むことができる。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。
【０１３５】
Ｆ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、齧歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０１３６】
例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor‐Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429‐4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。
【０１３７】
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；５，９８５，３２０号；５，９８５，３０９号；５，９３４，２７２号；５，８７４，０６４号；５，８５５，９１３号；５，２９０，５４０号；４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；９７／３２５７２号；９７／４４０１３号；９８／３１３４６号；９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本明細書に援用される）。
【０１３８】
本発明はまた、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（及び特に、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ）を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、少なくとも５μｇ、より好ましくは少なくとも１０μｇ、少なくとも１５μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ又は少なくとも２００μｇの単位剤形で、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０１３９】
凍結乾燥された本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、その元々のコンテナ内において２〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの液体形態は、少なくとも１μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ又は少なくとも１００μｇ／ｍｌの濃度でこの分子が存在する気密性コンテナ内に供給される。
【０１４０】
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０１４１】
本発明が包含するＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ又はＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディに関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、受容者である被験体の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。投与される投薬量は典型的には、少なくとも約０．３ｎｇ／ｋｇ／日〜約０．９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１ｎｇ／ｋｇ／日〜約３ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３ｎｇ／ｋｇ／日〜約９ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０ｎｇ／ｋｇ／日〜約３０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３０ｎｇ／ｋｇ／日〜約９０ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１００ｎｇ／ｋｇ／日〜約３００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２００ｎｇ／ｋｇ／日〜約６００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約３００ｎｇ／ｋｇ／日〜約９００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約４００ｎｇ／ｋｇ／日〜約８００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約６００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約７００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約８００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、少なくとも約９００ｎｇ／ｋｇ／日〜約１０００ｎｇ／ｋｇ／日、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｋｇ／日である。
【０１４２】
別の実施形態では、患者は、上述のような予防的又は治療的有効量の本発明が包含するＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（及び特に、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ）の１回又は複数回の用量を含む治療レジメンを投与され、この治療レジメンは、２日、３日、４日、５日、６日又は７日にわたって投与される。特定の実施形態では、治療レジメンは、予防的又は治療的有効量の本発明が包含するＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの用量を断続的に投与する（例えば所定の週の１日目、２日目、３日目及び４日目に投与し、同一の週の５日目、６日目及び７日目には、予防的又は治療的有効量の本発明が包含するＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（及び特に、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ）の用量を投与しない）ことを含む。典型的には、１、２、３、４、５つ又はそれを超えるコースが存在する。各コースは、同一のレジメン又は異なるレジメンであってよい。
【０１４３】
別の実施形態では、投与される用量は、本発明が包含するＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（及び特に、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ）の１日の予防的又は治療的有効量に到達するまで、１つ又は複数のレジメンの最初の１／４、最初の半分又は最初の２／３若しくは３／４にわたって（例えば４コース治療の第１、第２又は第３のレジメンにわたって）漸増する。
【０１４４】
表２は、典型的な治療コースに関する上述の様々な用量設定レジメンの５つの例を提供する。
【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの投与の投薬量及び頻度は、例えば脂質化等の修飾によって、上記ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディの取り込み及び組織貫通を増進することにより、低減又は変更してよい。
【０１４７】
患者に投与される本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの用量は、単一作用剤療法としての使用に関して計算してよい。あるいは、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、他の治療用組成物と併用され、患者に投与される用量は、上記分子を単一作用剤療法として使用する場合よりも低い。
【０１４８】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的注入によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０１４９】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527‐1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez‐Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353‐365(1989); Lopez‐Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【０１５０】
本発明の組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。１つ又は複数の本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディを含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；国際公開第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained‐Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179‐189;Song et al.(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‐Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‐397;Cleek et al.(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‐854;及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‐760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra; Sefton,(1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201‐240;Buchwald et al.(1980)“Long‐Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507‐516;及びSaudek et al.(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med.321:574‐579参照）。別の実施形態では、分子の放出制御を達成するためにポリマー材料を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);Levy et al.(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled‐Release Diphosphonate,” Science 228:190‐192;During et al.(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356;Howard et al.(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion‐Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105‐112；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（2‐ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。放出制御系は、治療標的（例えば肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115‐138(1984)参照）。放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．に従って使用できる（米国特許第５，９４５，１５５号参照）。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治療効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身体内のいずれの部位において実施できる。非ポリマー徐放系を使用でき、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。
【０１５１】
放出制御系については、Langer（1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527‐1533）による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained‐Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179‐189;Song et al.(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‐Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50:372‐397;Cleek et al.(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‐854;並びにLam et al.(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‐760参照（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１５２】
本発明の組成物が、本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディをエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードするＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ又はＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０１５３】
治療的又は予防的有効量の本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（及び特に、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ）を用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、このようなダイアボディを用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間にわたって週１回処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。あるいはこの医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間にわたって増減させてよいことも理解されるだろう。
【０１５４】
Ｇ．本発明の組成物の使用
本発明のＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディ（及び特に、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ）は、ＣＤ１９の発現に関連する又はＣＤ１９の発現を特徴とするいずれの疾患又は状態を治療する能力を有する。従ってこのような分子は、限定するものではないが：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ＣＭＬ及びＣＭＬに関連したアベルソン癌遺伝子の急性転化（Ｂｃｒ‐ＡＢＬ転座）を含む、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；濾胞性リンパ腫；リヒター症候群又はＣＬＬのリヒター転化を含む、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；有毛細胞白血病（ＨＣＬ）；芽形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；並びにバーキットリンパ腫；自己免疫性狼瘡（ＳＬＥ）；アレルギー；喘息並びに慢性関節リウマチの診断又は治療において採用してよい。本発明の二重特異性１価ダイアボディは更に、上述の状態の治療のための薬品の製造に使用してよい。
【実施例】
【０１５５】
ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。
【０１５６】
実施例１  ＣＤ１９細胞表面発現の定量化
好適な標的細胞株を識別して、ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの生物学的活性を評価するために、Ｎａｌｍ‐６（急性リンパ芽球性白血病）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）、ＨＢＬ‐２（マントル細胞リンパ腫）、ＭＥＣ‐１（慢性リンパ球性白血病）及びＪｅｋｏ‐１（マントル細胞リンパ腫）、ＭＯＬＭ‐１３（急性骨髄性白血病細胞株）、ＪＩＭＴ１（乳癌）及びＣｏｌｏ２０５（大腸癌）を含む、ヒトＢ細胞リンパ腫／白血病細胞株のパネル上での、定量的ＦＡＣＳ（ＱＦＡＣＳ）を用いて、ＣＤ１９細胞表面発現レベルを最初に確認した。上記表面上のＣＤ１９抗体結合部位の絶対数を、ＱＦＡＣＳキットを用いて算出した。表３に示すように、細胞株上のＣＤ１９結合部位の絶対数は、Ｒａｊｉ（高）＞Ｎａｌｍ‐６（中）＞Ｄａｕｄｉ（中）＞ＨＢＬ２（中）＞ＭＥＣ‐１（低）＞Ｊｅｋｏ‐１（低）の順序であった。予想された通り、ＭＯＬＭ‐３、ＪＩＭＴ‐１及びＣｏｌｏ２０５はＣＤ１９の発現が欠如しており、これはＣＤ１９がＢ細胞特異性抗原であることと矛盾しない。
【０１５７】
【表３】
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【０１５８】
実施例２  結合親和性
ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディとヒト又はカニクイザルＣＤ３との間の結合の程度を定量化するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析を、上記例示的なＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディ、ＤＡＲＴ‐Ａを用いて実施した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析は、解離オフ速度ｋｄを測定する。抗体と抗体の標的との間の結合親和性（ＫＤ）は、式ＫＤ＝［ｋｄ］／［ｋａ］に従って、連結（オン速度、ｋ）及び解離（オフ速度、ｋｄ）に関する動態定数の関数である。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析は、これらの動態パラメータを直接測定するために表面プラズモン共鳴を使用する。
【０１５９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって分析した、可溶性ヒト及びカニクイザルＣＤ３及びＣＤ１９へのＤＡＲＴ‐Ａ（０‐１００ｎＭ）の結合の結果を、表４に示す。
【０１６０】
ＤＡＲＴ‐Ａの結合親和性は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３に関して同様である（それぞれＫＤ＝２１．２ｎＭ及び２１．９ｎＭ）。しかしながら、ＤＡＲＴ‐Ａは、カニクイザルＣＤ１９からの解離速度定数（ｋｄ）の上昇により、カニクイザルＣＤ１９に関して、ヒトＣＤ１９に関してよりもおよそ１０倍低い親和性を有する（それぞれＫＤ＝２０．３ｎＭ及び２．０ｎＭ）。カニクイザルは、毒性評価のための妥当な種のままであるが、ＣＤ１９結合親和性の違いを考慮しなければならない。
【０１６１】
【表４】
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【０１６２】
実施例３  細胞結合特性
（全血から精製した）マウス、ラット、ウサギ、カニクイザル及びヒト血中白血球へのＤＡＲＴ‐Ａの結合を、フローサイトメトリーによってインビトロで評価した。白血球を、２５又は１００ｎＭの濃度のＤＡＲＴ‐Ａ並びに対照ＤＡＲＴ１及び対照ＤＡＲＴ２で、およそ１時間にわたって染色した。対照ＤＡＲＴ２はＤＡＲＴ‐Ａと同一のＣＤ１９結合成分を含有し、その一方で対照ＤＡＲＴ１はＤＡＲＴ‐Ａと同一のＣＤ３結合成分を含有する。インキュベーションに続いて、白血球に結合したＤＡＲＴタンパク質を、ＤＡＲＴタンパク質のＥＫコイルヘテロ二量体化領域を認識する抗Ｅコイル／Ｋコイル（ＥＫ）ｍＡｂを用いて検出した。マウス、ラット又はウサギ血中白血球に関して、ＤＡＲＴ‐Ａ結合は観察されなかった。同様に、いずれの対照ＤＡＲＴダイアボディも、マウス、ラット又はウサギ白血球に対する結合を全く示さなかった。予想された通り、試験した両方の濃度のＤＡＲＴ‐Ａは、ヒト及びカニクイザル血中白血球両方に対する特異的結合を示した。
【０１６３】
二官能性ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＤＡＲＴ‐Ａによる両方の標的抗原の同時結合を実証した。ＥＬＩＳＡプレートを可溶性ヒトＣＤ３ε／δヘテロ二量体でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした後、ＢＳＡでブロックした。様々な濃度のＤＡＲＴ‐Ａを添加した後、可溶性ヒトＣＤ１９ビオチンを添加した。これらのプレートを洗浄し、ストレプトアビジンとコンジュゲートした化学発光基質を用いて免疫複合体を検出した。図３に示すように、ＤＡＲＴ‐ＡはＣＤ１９及びＣＤ３の両方に同時に結合できる。
【０１６４】
（全血から精製した）カニクイザル及びヒト血中白血球両方において、ＤＡＲＴ‐Ａの二重特異性結合を、フローサイトメトリーによって更に評価した。白血球を、０．００５〜８０ｎＭの範囲の濃度のＤＡＲＴ‐Ａ、対照ＤＡＲＴ１又は対照ＤＡＲＴ２で、およそ１時間にわたって染色した。インキュベーションに続いて、白血球への結合を、ＤＡＲＴタンパク質のＥＫコイルヘテロ二量体化領域及びストレプトアビジン‐ＰＥを認識するビオチン化抗Ｅコイル／Ｋコイル（ＥＫ）ｍａｂを用いて検出した。ＤＡＲＴ‐ＡはＣＤ３に結合するため、ＣＤ４及びＣＤ８の組み合わせを用いてＴ細胞集団を画定した。同様に、ＣＤ２０をＣＤ１９の代わりにＢ細胞マーカーとして使用した。従ってこの研究では、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ゲートイベントはＴ細胞集団を表し、ＣＤ２０＋ゲートイベントはＢ細胞集団を表す。ＤＡＲＴ‐Ａは、ヒト及びカニクイザルＢ細胞及びＴ細胞両方に対する二重特異性結合を実証した。対照的に、上記対照ＤＡＲＴダイアボディは、これらの対照ＤＡＲＴダイアボディに対応する結合特異性と矛盾しない、Ｂ細胞（対照ＤＡＲＴ２）又はＴ細胞（対照ＤＡＲＴ１）への単一特異性結合しか示さなかった。ＤＡＲＴ‐Ａ及び対照ＤＡＲＴダイアボディの、ヒト及びカニクイザルＢ及びＴ細胞に関する結合滴定曲線を、図４Ａ‐４Ｂ及び図５Ａ‐５Ｂに提示する。
【０１６５】
実施例４  ヒトＴ細胞を用いた、標的腫瘍細胞のＤＡＲＴ‐Ａ仲介型標的転換殺滅
標的転換標的細胞殺滅を仲介するＤＡＲＴ‐Ａの能力を、ヒト初代Ｔ細胞をエフェクタ細胞として用いて、ある範囲のＣＤ１９発現を示す３つの標的Ｂリンパ腫細胞株、Ｒａｊｉ／ＧＦ（バーキットリンパ腫）、ＨＢＬ‐２（マントル細胞リンパ腫）、及びＪｅｋｏ‐１（マントル細胞リンパ腫）に対して評価した。Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞は、最も高いレベルのＣＤ１９発現を示し、ＨＢＬ‐２細胞における中程度のレベルのＣＤ１９発現、及びＪｅｋｏ‐１細胞における低いＣＤ１９発現がこれに続いた。標的腫瘍細胞殺滅は、細胞死の際に細胞から放出されるＬＤＨの酵素活性を定量的に測定する、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイを用いて、又はルシフェラーゼ相対光単位（ＲＬＵ）が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びルシフェラーゼレポーター遺伝子の療法を発現するよう操作されたＲａｊｉ／ＧＦ標的細胞の相対生存能力を示す読み出し情報となる、ルシフェラーゼアッセイによって、測定される。
【０１６６】
ＤＡＲＴ‐Ａは、複数の別個のヒトドナーからの精製Ｔ細胞を、エフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比１０：１で使用した場合、３つの細胞株全てにおいて強力な標的転換細胞殺滅を示した（図６Ａ‐６Ｃ）。最大活性の５０％における平均有効濃度（ＥＣ５０）の値は、ＨＢＬ‐２細胞に関して１．０５×１０‐1ｐＭ；Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞に関して３．０７×１０‐1ｐＭ；及びＪｅｋｏ‐１細胞に関して１．４６×１０‐1ｐＭであった（表５）。対照ＤＡＲＴ１は、標的細胞のＴ細胞標的転換殺滅を仲介しなかった。最も重要なことには、ＣＤ１９を発現しない細胞株（Ｍｏｌｍ‐１３及びＣｏｌｏ２０５）において細胞殺滅活性は観察されなかった（図６Ｄ‐６Ｆ）。
【０１６７】
【表５】
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【０１６８】
より少ない数のエフェクタ細胞の存在下におけるＤＡＲＴ‐Ａの活性を評価するために、ＤＡＲＴ‐Ａを用いた２４〜９６時間のインキュベーション後に、標的転換細胞殺滅を、Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞において、より低いＥ：Ｔ細胞比５：１、２．５：１及び１：１で試験した。５：１の比において観察された細胞毒性活性は、１０：１の比において観察された最大活性のおよそ半分であり；また２４及び４８時間の両方の時点において、Ｅ：Ｔ細胞比２．５：１においてより低い特異性活性が観察された（図７Ａ‐７Ｄ及び表５）。７２又は９６時間にわたるインキュベーションの後、Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞の細胞毒性は、２．５：１及び１：１の比において有意に上昇した（図８Ａ‐８Ｄ及び表６を参照）。より低いＥ：Ｔ細胞比における効率的な細胞溶解が、Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞において経時的に上昇することは、注目に値する。これはＤＡＲＴ‐Ａ活性化Ｔ細胞による連続的な標的細胞殺滅を示唆している。この動態は、Ｔ細胞の数が少ない場合に、時間が、より多数の標的細胞を効率的に排除するための制限因子となることを示唆している。結論として、異なる複数のドナーからのヒトＴ細胞を用いた複数の実験からのデータは、ＤＡＲＴ‐Ａ標的転換細胞殺滅活性が、Ｅ：Ｔ細胞比及び（特にＥ；Ｔ細胞比が小さい場合）時間の両方に左右されることを示している。
【０１６９】
【表６】
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【０１７０】
実施例５  ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣにおけるＤＡＲＴ‐Ａ仲介型自己Ｂ細胞欠失
正常なＢ細胞はＣＤ１９を発現するため、またＤＡＲＴ‐ＡはカニクイザルＣＤ１９及びＣＤ３と交差反応することが示された（実施例２、図４Ａ‐４Ｂ及び図５Ａ‐５Ｂ）ため、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型細胞毒性を、ヒト及びカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）両方において調査した。ＤＡＲＴ‐Ａによる処置後、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣの両方において、用量依存性ＣＤ２０＋Ｂ細胞欠失が観察された（図９Ａ‐９Ｂ）。予想された通り、対照ＤＡＲＴ１による処置後には、Ｂ細胞欠失は観察されなかった。
【０１７１】
ＰＢＭＣにおけるＤＡＲＴ‐Ａ活性を更に確認するために、Ｔ細胞（エフェクタ）：Ｂ細胞（標的）Ｅ：Ｔ細胞比が様々である複数の別個のヒト又はカニクイザルＰＢＭＣドナーを用いて、効能を評価した。要約すると（表７）、ヒトＢ細胞欠失に関するＥＣ５０値は１．８４〜６．２７ｐＭの範囲であり；一方でカニクイザルＢ細胞欠失に関するＥＣ５０値は１０６．８〜８５９．１ｐＭであった。自己ヒトＢ細胞欠失に関するＤＡＲＴ‐Ａの効力は、カニクイザルＢ細胞欠失に関してよりも高い（平均およそ１００倍高く、１９〜３１２倍の範囲）ようであった。しかしながら、カニクイザルＰＢＭＣにおけるＥ：Ｔ細胞比（平均約４：１）が、ヒトＰＢＭＣ（平均約８：１）よりも低かったことは、注目に値する。これはＤＡＲＴ‐Ａ標的転換殺滅活性がＥ：Ｔ細胞比に左右されることから、ＥＣ５０値の比較的大きな違いに寄与したと思われる。ヒトＢ細胞とカニクイザルＢ細胞との間のＣＤ１９発現レベルの潜在的な差異は、効力の見かけの差異に寄与する別の可変因子であり得る。
【０１７２】
【表７】
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【０１７３】
ＥＣ５０が１．３０×１０‐2ｐＭのカニクイザルＰＢＭＣをエフェクタ細胞として使用した場合の、Ｒａｊｉ／ＧＦ標的細胞に対するＤＡＲＴ‐Ａ仲介型の効率的な細胞毒性（図１０）は、ヒトＴ細胞をエフェクタ細胞として使用した場合（平均ＥＣ５０＝３．０７×１０‐1ｐＭ）に観察されるものと同様であることに留意することは重要であり、これは、ヒト及びカニクイザルＴ細胞が、同一の標的細胞株に対して同等の活性を有することを示している。これらのデータは更に、非臨床毒物学研究における、ＤＡＲＴ‐Ａの評価のための妥当な種としてのカニクイザルの使用をサポートする。
【０１７４】
実施例６  ヒト又はカニクイザルエフェクタ細胞を用いたＤＡＲＴ‐Ａ仲介型サイトカイン放出の評価
ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣにおけるＢ細胞集団のＤＡＲＴ‐Ａ仲介型欠失は、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣの両方におけるサイトカイン放出と関連していた。以下の表８にまとめられているように、サイトカイン放出に関するＥＣ５０値は、ヒト又はカニクイザル自己Ｂ細胞欠失に関してと同等であるかこれより高く、これは、ＤＡＲＴ‐Ａが、インビトロでサイトカイン放出を誘発するよりも、Ｂ細胞欠失を仲介するにあたって、より強力であることを示している。インビトロでのヒトとカニクイザルとの間のサイトカイン放出プロファイルは、ある程度の類似性及び差異を有する。ＩＦＮ‐γ及びＴＮＦ‐αは、ＤＡＲＴ‐Ａによる処置に続いて両方の種において放出される顕著なサイトカインであった。しかしながら、ＩＬ‐６は、Ｅｍａｘ値に基づいて、ヒトにおいて産生された３番目に顕著なサイトカインであった一方で、カニクイザルＰＢＭＣにおいてのみ、ＩＬ‐２が有意量で産生された。ＤＡＲＴ‐Ａを用いたインキュベーションに続いてＰＢＭＣにおいて産生された最も感受性の高いサイトカイン（ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、及びヒトにおいてはＩＬ‐６）に関する平均ＥＣ５０値を、自己Ｂ細胞欠失に関する平均ＥＣ５０値と比較することにより、ヒトにおけるＢ細胞欠失とサイトカイン産生との間の差異に反映されるように、少なくとも６倍の見かけの安全性マージンが存在することが明らかになった（表９）。
【０１７５】
【表８】
2017533891.tif 000010
【０１７６】
【表９】
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【０１７７】
標的細胞の存在下でのＴ細胞によるＤＡＲＴ‐Ａ仲介型サイトカイン放出についても調査した。ヒトＴ細胞からのＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ及びＩＬ‐２のＤＡＲＴ‐Ａ用量依存性サイトカイン産生は、標的細胞を用いたコインキュベーション後に、ＩＬ‐２（＞７００ｐｇ／ｍＬ）に関して観察された最高レベル（Ｅｍａｘ）で観察された（図１１Ａ‐１１Ｃ；表１０）。有意なレベルのＴＮＦ‐α及びＩＦＮ‐γ（〜２０００‐４０００ｐｇ／ｍＬ）も産生された。予想された通り、対照ＤＡＲＴダイアボディを用いたインキュベーションは、いずれの検出可能なサイトカイン産生ももたらさなかった（図１１Ａ‐１１Ｃ）。ＣＤ１９発現標的細胞（Ｒａｊｉ／ＧＦ）の存在下でのＤＡＲＴ‐Ａを用いたインキュベーション後に精製ヒトＴ細胞（ＴＮＦ‐α）が産生した最も感受性の高いサイトカインに関する平均ＥＣ５０値を、感受性が最低の標的細胞株（Ｒａｊｉ／ＧＦ）における標的細胞細胞毒性に関する平均ＥＣ５０値と比較して考えると、標的細胞殺滅とサイトカイン産生との間に少なくとも１２倍の見かけの安全性マージンが存在する（上の表９を参照）。
【０１７８】
【表１０】
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【０１７９】
実施例７  ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型ヒト及びカニクイザルＴ細胞活性化の評価
ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型標的転換標的細胞（Ｒａｊｉ／ＧＦ細胞）溶解中のＴ細胞に対する影響を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の発現を評価することによって特性決定した。ＣＤ２５及びＣＤ６９は両方とも、用量依存性の様式で、ヒト及びカニクイザルＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞において上方制御された（図１２Ａ‐１２Ｄ及び図１３Ａ‐１３Ｄ）、これは、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型標的転換細胞殺滅がＴ細胞の付随する活性化に関連していることを示している。Ｃ１９陰性ＪＩＭＴ‐１細胞の存在下では、Ｔ細胞活性化は観察されなかった（図１４Ａ‐１４Ｄ）。これらのデータは、Ｔ細胞活性化が標的細胞の共結合に左右されることを示唆している。この結論を更にサポートする事実として、対照ＤＡＲＴ１はＴ細胞活性化マーカーの誘発を仲介しなかった（図１２Ａ‐１２Ｄ及び図１３Ａ‐１３Ｄ）。
【０１８０】
実施例８  ＣＤ１９×ＣＤ３作用機序の評価
Ｔ細胞によるＣＤ１９×ＣＤ３仲介型標的転換細胞殺滅に関して予期される機序が、グランザイムＢ及びパーフォリンによって仲介されることを確認するために、ＣＴＬアッセイにおいて、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１への曝露後のＴ細胞の、グランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内レベルを測定した。Ｅ：Ｔ細胞比１０：１のＲａｊｉ／ＧＦ標的細胞の存在下でのＤＡＲＴ‐Ａを用いたヒトＴ細胞の２４時間のインキュベーション後に、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞両方におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの用量依存性上方制御が観察された（図１５Ａ‐１５Ｂ）。対照的に、Ｒａｊｉ／ＧＦ標的細胞及び対照ＤＡＲＴ１を用いてヒトＴ細胞をインキュベートした場合、グランザイムＢ又はパーフォリンの上方制御は観察されなかった。これらのデータは、ＤＡＲＴ‐Ａ仲介型標的細胞殺滅が、グランザイムＢ及びパーフォリン経路によって仲介され得ることをサポートする。留意するべきこととして、グランザイムＢ（図１５Ａ）及びパーフォリン（図１５Ｂ）の上方制御は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に比べてＣＤ８＋Ｔ細胞において高く、これはＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＴＬ効力が比較的高いと予想されることと矛盾しない。
【０１８１】
Ｔ細胞活性化に付随する増殖が過去に報告されていることから、ＣＤ１９×ＣＤ３によるエフェクタ：標的細胞共結合中のＴ細胞の膨張も評価した。ＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞を、濃度２００ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１の存在下で、ＨＢＬ‐２標的細胞と共にＥ：Ｔ細胞比１０：１で共培養した。ＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞の増殖を、ＦＡＣＳ分析により、ＣＦＳＥ希釈のレベルによって経時的に監視した（図１６Ａ‐１６Ｂ）。図１６Ａは、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１及び標的細胞の存在下でのＣＦＳＥ染色プロファイルを示す。ＤＡＲＴ‐Ａの添加は、７２時間のインキュベーション後に、細胞の約７５％が増殖する増殖（ＣＦＳＥ希釈）をもたらした（図１６Ｂ）。対照的に、対照ＤＡＲＴ１の存在下では、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖は観察されなかった。
【０１８２】
実施例９  共混合異種移植における効能
ＤＡＲＴ‐ＡによるヒトＢ細胞リンパ腫腫瘍成長の阻害を、活性化ヒトＴ細胞と共混合したＨＢＬ‐２（ヒトマントル細胞リンパ腫）又はＲａｊｉ（バーキットリンパ腫）腫瘍細胞を注射したメスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝８／グループ）において評価した。両方の研究において、ヒトＴ細胞及び腫瘍細胞（ＨＢＬ‐２又はＲａｊｉ）を１：５の比（それぞれ１×１０6個及び５×１０6個の細胞）で組み合わせ、０日目にマウスにＳＣ注射した。続いて、ビヒクル対照（腫瘍細胞のみ）、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１を、０、１、２及び３日目にＩＶ投与した。
【０１８３】
図１７に示すように、ＨＢＬ‐２腫瘍細胞の成長は、用量レベル≧０．２μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐ＡによるＩＶ処置後、完全に阻害された。０．０２μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａによる治療は、ＨＢＬ‐２腫瘍の成長を遅延させるように思われたが、応答は統計的に有意ではなかった。ビヒクル及び対照ＤＡＲＴグループにおけるＨＢＬ‐２腫瘍は、１３日目までに、およそ１０００ｍｍ3の平均腫瘍体積に達した。
【０１８４】
図１８に示すように、評価したあらゆる用量（０．８〜１００μｇ／ｋｇ）において、ＤＡＲＴ‐Ａで処置したマウスにおいて研究の終了（２８日目）まで、Ｒａｊｉ腫瘍細胞の有意な成長は観察されなかった。０．８μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａによる処置は、７／８のマウスにおいて完全な応答を引き起こした。ビヒクル及び対照ＤＡＲＴ１グループのＲａｊｉ腫瘍は、インビボでの腫瘍成長を示し、平均腫瘍体積は、研究の終了（２８日目）までに、それぞれ２４４９．４±４２１．１ｍｍ3及び２９６８．２±２００．０ｍｍ3に達した。
【０１８５】
実施例１０  確立された腫瘍モデルにおける効能
ＤＡＲＴ‐Ａの抗腫瘍活性を、メスのＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウス（ｎ＝８／グループ）において、ＨＢＬ‐２（ヒトマントル細胞リンパ腫）異種移植モデルにおいて評価した。マウスは、０日目にＨＢＬ‐２腫瘍細胞（５×１０6個の細胞）を皮内（ＩＤ）移植され、続いて４日目にＰＢＭＣ（５×１０7個の細胞）を腹腔内（ＩＰ）注射された。１７日目に、ビヒクル、対照ＤＡＲＴ１又はＤＡＲＴ‐Ａを投与されるグループに関して平均腫瘍体積がそれぞれ４３８．４±８０．２、４３３．７±６３．８及び５３１．７±１２２．５ｍｍ3となると、ビヒクル、対照ＤＡＲＴ１又はＤＡＲＴ‐ＡのＩＶ投与による処置が開始された。２１日目（第２の用量の投与時）には、平均腫瘍体積は、ビヒクル、対照ＤＡＲＴ１及びＤＡＲＴ‐Ａで処置したグループそれぞれにおいて、１３０６．１±２４０．４、１１８５．６±１３８．７及び９５８．５±２１６．１ｍｍ3まで増加した。２４日目（第３の用量の投与時）には、ビヒクル及び対照ＤＡＲＴ１グループの平均腫瘍体積は、それぞれ２４０１．３±３９７．４及び２６２３．７±３５１．５ｍｍ3まで増加した。対照的に、ＤＡＲＴ‐Ａを投与されたグループは、体積が４５％だけ、５２７．３±１４８．３ｍｍ3まで減少した。ＤＡＲＴ‐Ａ処置グループの腫瘍は、最終的に４２日目に最終体積１１１．４±３８．９ｍｍ3に達するまでサイズが減少し続け、これは記録された最大腫瘍体積から８８．３％の減少であった（図１９Ａ）。要約すると、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａによる処置は、大型の確立されたＨＢＬ‐２マントル細胞リンパ腫の腫瘍の縮小をもたらした。研究を終了した４２日目まで、再発は記録されなかった。
【０１８６】
研究１４日目において平均腫瘍サイズが５４１ｍｍ3の腫瘍を有するマウスの別のグループ（ｎ＝４体のマウス）を、５００μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａで処置するようスケジュールを立てた。１回目の投薬の時点（研究１７日目）において、腫瘍は平均体積２２７９±６１ｍｍ3に達した（図１９Ｂ）。しかしながら、３回目（研究２４日目）及び４回目（研究２８日目）の投薬の前、腫瘍体積はそれぞれ１４６９±１６２及び８４８±７４ｍｍ3であり、これらはそれぞれ、２１日目に記録されたピーク体積に対して３６％及び６３％の腫瘍体積の減少を表す（図１９Ｂ）。腫瘍は、４２日目において平均腫瘍体積が２４８±５２ｍｍ3となり、腫瘍体積が８９％減少するまで、サイズの減少を継続した（図１９Ｂ）。
【０１８７】
実施例１１  カニクイザルにおけるＤＡＲＴ‐Ａの毒物動態研究
非ＧＬＰ（Good Laboratory Practice：優良試験所基準）毒物動態研究をカニクイザルにおいて実施して、ＤＡＲＴ‐Ａの異なる複数の用量及びレジメンを評価した。段階Ａを最初に実施して、表１１（段階Ａ）にまとめられているように、４週間にわたり、連続する各週において動物内の用量が上昇するＤＡＲＴ‐Ａの、２時間のＩＶ注入を評価した。各グループの段階Ａのカニクイザルの半分（１Ｍ／１Ｆ）を、３６日目又は６４日目に屠殺した。続いてこの研究の段階Ｂを実施して、各グループにおいて固定用量として投与したＤＡＲＴ‐Ａの２時間のＩＶ注入を評価した（表１１、段階Ｂ）。グループ３、４及び５に関して、連続する各週において同一の用量（それぞれ５、５０又は５００ｎｇ／ｋｇ）を投与し、動物１体あたり合計３回の投薬を行った。グループ６に関しては、研究１、４、８、１１及び１５日目に２時間のＩＶ注入として５００ｎｇ／ｋｇを投与し、動物１体あたり合計５回の投薬を行った。全ての段階Ｂの動物を、１８日目に屠殺した。
【０１８８】
【表１１】
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【０１８９】
１．カニクイザルにおけるＤＡＲＴ‐Ａの毒物動態研究（段階Ａ）
ＤＡＲＴ‐Ａの非ＧＬＰ、パイロット、予備的用量上昇型研究を、カニクイザルにおいて実施した。この研究の段階Ａでは、カニクイザルの２つのグループ（ｎ＝４／グループ；２Ｍ／２Ｆ）に、ビヒクル（１日目）又は動物内の用量を上昇させたＤＡＲＴ‐Ａを、２時間のＩＶ注入として、１、８、１５、２２及び２９日目に投与した。グループ１のカニクイザルは、ビヒクル対照→５００→５０００→５０，０００→５０，０００ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投与された。グループ２のカニクイザルは、ビヒクル対照→２０００→１０，０００→１００，０００→１００，０００ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投与された。各グループの段階Ａのカニクイザルの半分（１Ｍ／１Ｆ）を、３６日目又は６４日目に屠殺した。
【０１９０】
本研究の段階Ａの間、ＤＡＲＴ‐Ａ関連の死亡は存在せず、またＤＡＲＴ‐Ａ関連の目に見える又は器官の重量変化は存在しなかった。しかしながら、以下に詳述するように、≧５００ｎｇ／ｋｇの用量レベルでは、ＤＡＲＴ‐Ａ関連の影響が存在した。これらの影響は、試験対象物の薬理学と矛盾せず、また毒物学的に有意であるとは見做されなかった。
【０１９１】
段階Ａでは、３６日目において、ＤＡＲＴ‐Ａ関連の微視的所見は、グループ１及び２の動物全てに関するリンパ節（鼠径、下顎及び腸間膜）、脾臓、並びに腸管関連リンパ組織（gut‐associated lymphoid tissue：ＧＡＬＴ）に限定され、微視的な所見の回復は６４日目まで存在しなかった。３６日目において、リンパ節及び脾臓の微視的所見は類似しており、識別されたリンパ濾胞性胚中心の数及びサイズの、中程度〜顕著な減少で構成されていた。ＧＡＬＴでは、リンパ濾胞性胚中心の数及びサイズの減少は最小限であった。６４日目までに、試験対象物関連の所見は依然としてリンパ節、脾臓及びＧＡＬＴに存在していた。リンパ節及び脾臓では、微視的所見はリンパ濾胞性胚中心の数及びサイズの軽度〜顕著な減少で構成され、ＧＡＬＴでは、リンパ濾胞性胚中心の数及びサイズの減少は最小限であった。
【０１９２】
免疫組織化学（immunohistochemistry：ＩＨＣ）による骨髄（胸骨）、リンパ節（鼠径部、下顎及び腸間膜）並びに脾臓の評価により、３６日目の段階Ａの動物におけるＣＤ２０陽性細胞の数の大幅な減少が明らかになり、６４日目までに、ＣＤ染色はごく部分的にしか発見されなかった。３６日目では、一般に、段階Ａの動物の骨髄又はリンパ節において、記録されたＣＤ２０陽性染色は、グループ１からの１体の動物を除いて存在せず、上記１体の動物では、極めて稀な、軽度〜中程度のＣＤ２０陽性染色が、鼠径リンパ節のみの胚中心及びリンパ球コロナそれぞれに存在した。脾臓においては、ＣＤ２０陽性細胞は、３体の動物（グループ１から１体、グループ２から２体）の赤脾髄のみにおいて識別され、ＣＤ２０陽性細胞の頻度は極めて稀であり、最小又は軽度〜中程度の強度であった。
【０１９３】
回復動物（６４日目）では、極めて稀に〜時折、中程度に染色されたＣＤ２０陽性細胞が、グループ１の動物の骨髄のみにおいて記録された。リンパ節（鼠径、下顎及び腸間膜）では、ＣＤ２０陽性染色はグループ１からの１体の動物においてのみ識別された。ＣＤ２０陽性細胞の頻度は、全リンパ節において一般に大きく減少したが、陽性細胞の染色強度は中程度〜顕著であった。グループ１及び２の全ての動物の脾臓において、ＣＤ２０陽性細胞が識別された。グループ１の動物では、１体の動物においてはリンパ濾胞、脈絡叢リンパ球鞘（ＰＡＬＳ）及び赤脾髄、もう１体の動物ではＰＡＬＳ及び赤脾髄において、ＣＤ２０陽性細胞が識別された。グループ２の動物では、極めて稀〜稀なＣＤ２０陽性細胞が、赤脾髄において、軽度の染色強度でのみ識別された。
【０１９４】
この研究の段階ＡにおけるＦＡＣＳベースのＢ細胞欠失、サイトカイン及びＡＤＡの評価を以下にまとめる。
【０１９５】
ａ．Ｂ、Ｔ、ＮＫ細胞及び単球に関するＦＡＣＳ評価
多様なリンパ球サブセット及び単球細胞集団のフローサイトメトリー評価のために、全血試料を採取した。段階Ａの動物を、‐１週目；１、８、１５、２２及び２９日目の投薬の前；２、９、１６、２３及び３０日目の注入開始（start of infusion：ＳＯＩ）２４時間後；４、１１、１８、２５及び３２日目のＳＯＩ７２時間後；並びに４３、５０、５７及び６３日目（各グループからの段階Ａのカニクイザルの半分のみに適用され、６４日目に回復後屠殺（recovery sacrifice）する）において評価した。
【０１９６】
Ｂリンパ球の絶対数の用量依存性減少は、両グループ（グループ１及び２）に関して９日目（ＳＯＩ２４時間後）に始まった。５００ｎｇ／ｋｇ／用量の動物（グループ１）に関するＢリンパ球集団は、１１及び１５日目には研究前のレベルへと向かったが、２０００ｎｇ／ｋｇ／用量の動物（グループ２）に関する値は減少したままであった。両方の投薬グループに関して、２回目のＤＡＲＴ‐Ａ用量投与後、Ｂリンパ球は１６日目（ＳＯＩ２４時間後）において実質的に欠失しており、その後のあらゆる時点に関して欠失したままであった（図２０Ａ‐２０Ｂ）。Ｂリンパ球欠失は、ＤＡＲＴ‐Ａの予期された薬理学的効果であった。
【０１９７】
単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞を含む他の免疫細胞集団も、フローサイトメトリーによって評価した。
【０１９８】
ＣＤ１４＋単球の一時的な用量依存性減少は、２０００ｎｇ／ｋｇで投薬された動物（グループ２）の大部分に関して、９日目、ＳＯＩ２４時間後において開始した。１６日目及び２３日目、ＳＯＩ２４時間後には、それぞれ５０００ｎｇ／ｋｇ及び５０，０００ｎｇ／ｋｇで投薬された動物（グループ１）の大部分、並びにそれぞれ１０，０００ｎｇ／ｋｇ及び１００，０００ｎｇ／ｋｇ投薬された動物（グループ２）の全てに関して、ＣＤ１４＋単球の数の減少が存在した。ＣＤ１４＋単球集団は、各注入の終了後すぐに回復し、次の投与前の時点までに研究前のベースライン値に概ね達したか、又はそれを超え、その後、後続の投薬後２４時間で再び減少した。投薬段階の終了時、ＣＤ１４＋単球は、研究前のレベルに向かう値で変動し、研究前のベースラインレベル以上の値を維持した。
【０１９９】
全Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｔ制御リンパ球（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋）、ＣＤ１５９ａ＋ＮＫ細胞、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞及びＣＤ１６＋／ＣＤ１５９ａ＋ＮＫ細胞に関しても、一時的な依存性減少が観察され、９日目（ＳＯＩ２４時間後）における２０００ｎｇ／ｋｇ／用量の動物（グループ２）に関して、及び１６日目（ＳＯＩ２４時間後）におけるグループ１の動物の５０００ｎｇ／ｋｇ／用量の後において、最大の減少が観察された。Ｔリンパ球及びＮＫ細胞サブセットは、各注入の終了後すぐに回復し、１５日目及び２２日目の次の投薬前に研究前のベースラインレベルに概ね達したか、又はそれを超え、その後、各投薬の後２４時間で再び減少した。２９日目に投与された用量に続いて、３０日目（ＳＯＩ２４時間後）のグループ１又はグループ２に関して更なる減少は存在しなかった。
【０２００】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球集団を、活性化マーカーＰＤ-１、ＴＩＭ-３、ＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御に関しても評価して、ＤＡＲＴ-Ａ用量投与後の細胞の活性化状態を決定した。ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＰＤ‐１＋、ＣＤ６９＋及びＣＤ２５＋の頻度、並びにＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＰＤ‐１＋及びＣＤ６９＋の頻度の変動が、投薬後に存在し、これは、投薬後の全血中の活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の頻度の増加を示す。ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＣＤ６９＋、ＰＤ‐１＋及びＣＤ２５＋（程度は低く、全てではないが一部の動物に発生する）の頻度、並びにＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＰＤ‐１＋及びＣＤ６９＋の頻度は、５００ｎｇ／ｋｇ（グループ１）及び２０００ｎｇ／ｋｇ（グループ２）の投薬を９日目（ＳＯＩ２４時間後）に開始した後で上昇した。これらの値は一般に、ベースラインレベルを上回ったままであり、その後のあらゆる時点において高い変動性を有していた。ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋、ＴＩＭ‐３＋、及びＰＤ‐１＋／ＴＩＭ３＋リンパ球集団の相対百分率は一般に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球集団全体の＜１％であり、これにより、いずれのＤＡＲＴ‐Ａ関連の変化の評価は困難であった。総括的に、これらのデータは、ＤＡＲＴ‐Ａ投与が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の両方におけるＰＤ‐１及びＣＤ６９の発現の上昇傾向を、全てではないが一部の動物のＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＣＤ２５＋のより緩やかな増加をもたらすことを示唆している。
【０２０１】
ｂ．サイトカイン評価
投与前並びに各注入の開始後４時間及び２４時間において、血清ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＴＮＦ‐α及びＩＦＮ‐γレベルを決定した（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅアッセイ）。最初の３回の投薬に関して、グループ１において５００〜５０，０００ｎｇ／ｋｇ、及びグループ２において２０００〜１００，０００ｎｇ／ｋｇの漸増用量を、２時間にわたるＩＶ注入によって、カニクイザルに投与した場合、一時的なＤＡＲＴ‐Ａ用量相関性のＩＬ‐１０レベルの上昇（１９１８ｐｇ／ｍＬまで）が、注入開始後４時間において観察され、レベルは注入開始後２４時間以内にベースラインへと概ね戻った。各グループにおける最後のＤＡＲＴ‐Ａの注入（グループ１において５０，０００ｎｇ／ｋｇ、又はグループ２において１００，０００ｎｇ／ｋｇ）の開始から４時間後、１体の例外（動物２５０２）を除いてＩＬ‐１０は概ね検出されなかった。動物２５０２は、最後の投薬（２９日目、１００，０００ｎｇ／ｋｇ）後に３３２ｐｇ／ｍＬまでの一時的なＩＬ‐１０の増加を経験したが、この増加は、２２日目の最初の１００μｇ／ｋｇの投薬後のＩＬ‐１０の増加（５７０ｐｇ／ｍＬ）よりも小さかった。最も高いＩＬ１０レベル（２２日目、１９１８ｐｇ／ｍＬ）を経験した５０，０００ｎｇ／ｋｇ用量レベルの１体のカニクイザル（動物１００１）はまた、ＩＬ‐２（３２ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ５（４５μｇ／ｍＬ）、及びＩＬ‐６（３５７μｇ／ｍＬ）の同時の一時的な増加も経験した。カニクイザルの大部分において、ＤＡＲＴ‐Ａの注入後４時間でＩＬ‐６レベルの一時的な上昇が観察された。しかしながらこの上昇は、１日目のビヒクル対照の注入（１９０ｐｇ／ｍＬまで）後に観察されたレベルと比較して、概ね同様であるか又はより小さいもの（上記の動物１００１を除く）であり、明白な用量応答性はなかった。サイトカインレベルの上昇に関連する明らかな臨床的観察は存在しなかった。
【０２０２】
ＤＡＲＴ‐Ａの注入後、ＩＬ‐５、ＩＬ‐４、ＩＬ‐２、ＩＦＮ‐γ、又はＴＮＦ‐αのレベルに一貫した変化はなかった。ＩＬ‐５のレベルは、各グループの動物の約半数において変動し、１５日目又は２２日目のＤＡＲＴ‐Ａ注入後に小さな一時的な上昇（〜１０〜２０ｐｇ／ｍＬ；上記の動物１００１を除く）を経験した。ＩＦＮ‐γのレベルもまた、研究を通して変動し、一部の動物での注入後、小さく（＜〜１０ｐｇ／ｍＬ）一時的に上昇した。
【０２０３】
２．カニクイザルにおけるＤＡＲＴ‐Ａの毒物動態研究（段階Ｂ）
この研究の段階Ｂでは、カニクイザルの４つのグループ（ｎ＝２／グループ；１Ｍ／１Ｆ）に、固定用量のＤＡＲＴ‐Ａを２時間のＩＶ注入として、グループ３（５ｎｇ／ｋｇ）、グループ４（５０ｎｇ／ｋｇ）及びグループ５（５００ｎｇ／ｋｇ）に関しては３用量を１、８及び１５日目に投与し；グループ６に関しては５用量を１、４、８、１１及び１５日目に投与した。全ての段階Ｂの動物を１８日目に安楽死させた。
【０２０４】
本研究の段階Ｂの間、ＤＡＲＴ‐Ａ関連の死亡は存在せず、またＤＡＲＴ‐Ａ関連の目に見える又は器官の重量変化は存在しなかった。
【０２０５】
１８日目において、ＤＡＲＴ‐Ａ関連の微視的所見は、グループ４、５及び６の動物のリンパ節（鼠径、下顎及び腸間膜）並びに脾臓に限定され、識別されたリンパ濾胞性胚中心の数及びサイズの、最小〜軽度の減少で構成されており、脾臓のＰＡＬＳを含むリンパ組織のサイズ及び／又は細胞密度には明らかな変化は存在しなかった。グループ３（５ｎｇ／ｋｇ）においては、微視的所見は特に報告されなかった。
【０２０６】
ＣＤ２０を発現する細胞集団に関して、ＩＨＣにより、骨髄（胸骨）、リンパ節（鼠径部、下顎及び腸間膜）並びに脾臓の更なるホルマリン固定パラフィン埋没切片を評価した（Mordenti, J. et al. (1991) “Interspecies Scaling Of Clearance And Volume Of Distribution Data For Five Therapeutic Proteins,” Pharm. Res. 8(11):1351‐1359）。グループ３、４、５又は６において、骨髄（胸骨）、リンパ節（鼠径部、下顎及び腸間膜）又は脾臓のＣＤ２０陽性細胞の分布及び／又は染色強度には、明らかな差異は存在しなかった。全ての組織において、陽性染色は細胞膜に関連していた。一般に、骨髄において偶発的なＣＤ２０陽性細胞は、骨髄間質全体にわたって位置し、陽性細胞の染色強度は中程度〜顕著であった。リンパ節においては、ＣＤ２０陽性細胞は主に胚中心及びリンパ球の濾胞のコロナに関連しており、傍皮質、髄索、並びに髄洞及び被膜洞内に位置するＣＤ２０陽性細胞は比較的少なかった。胚中心、リンパ球コロナ、髄索、並びに髄洞及び被膜洞内における染色強度は、中程度〜顕著であった。傍皮質における染色強度は軽度〜顕著であった。脾臓では、ＣＤ２０陽性細胞は主として胚中心、濾胞マントル、及びリンパ濾胞の辺縁領域に関連し、ＰＡＬＳ及び赤脾髄内のＣＤ２０陽性細胞は比較的少なく、染色は中程度の〜顕著な強度であった。
【０２０７】
この研究の段階Ｂ部分におけるＦＡＣＳベースのＢ細胞欠失、サイトカイン及びＡＤＡの評価を以下にまとめる。
【０２０８】
ａ．Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び単球に関するＦＡＣＳ評価
多様なリンパ球サブセット及び単球細胞集団のフローサイトメトリー評価のために、全血試料を採取した。段階Ｂの動物を、‐１週目；１、４（グループ６のみ）、８、１１（グループ６のみ）、及び１５日目の投薬の前；２、９及び１６日目のＳＯＩ２４時間後；並びに４及び１１日目（グループ３‐５のみ）のＳＯＩ７２時間後において評価した。
【０２０９】
Ｂリンパ球（ＣＤ２０＋）の総数の顕著な用量依存性減少は、１、８及び１５日目に投与した用量に関する注入の開始後２４時間において存在していた。５ｎｇ／ｋｇ（グループ３）、５０ｎｇ／ｋｇ（グループ４）並びに５００ｎｇ／ｋｇ（グループ５及び６）処置グループに関する最大の減少は、２日目（ＳＯＩ２４時間後）に存在していた。Ｂリンパ球集団は、グループ３及び４では各注入後すぐに回復し、他の全ての時点において、研究前ベースラインレベル付近で変動する値を示した。グループ５及び６は、投薬と投薬との間において最小の回復を示し、２日目以降の全ての時点において概ね減少する値を維持した（図２１Ａ〜２１Ｄ）。持続性のＢリンパ球欠失は、比較的高用量のＤＡＲＴ‐Ａの予期された薬理学的効果であった。
【０２１０】
単球、ＮＫ細胞及びＴ細胞を含む他の免疫細胞集団も、フローサイトメトリーによって評価した。
【０２１１】
ＣＤ１４＋単球に関して、一時的な用量依存性減少は、全ての用量グループ（グループ３‐６）のほとんどの動物に関して、２日目に始まった。ＣＤ１４＋単球の更なる変化も、全ての用量グループのほとんどの動物に関して９及び６日目に存在し、値は高い変動性を有していた。
【０２１２】
全Ｔリンパ球、Ｔ制御リンパ球（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋）、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、及びＮＫ細胞サブセットの数の一時的な用量依存性減少が存在し、全てのグループ（グループ３‐６）に関する最大の減少は概ね２日目（ＳＯＩ２４時間後）に存在していた。Ｔリンパ球サブセットは、各注入後すぐに回復し、全ての用量は、全てのグループにおいて次の注入の前に研究前のレベルに概ね達したか、又はそれを超えた。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＴ制御リンパ球に関する更なる減少も、５０ｎｇ／ｋｇ（グループ４）、５００ｎｇ／ｋｇ（グループ５）及び多投薬５００ｎｇ／ｋｇ（グループ６）の動物に関して９及び１６日目（ＳＯＩ２４時間後）において存在していたが、これらの時点において存在する減少は、１回目のＤＡＲＴ‐Ａ投薬後の２日目に存在していたものに比べて小さかった。ＮＫ細胞サブセットは一般に、注入１日目以降、回復に向かい、残りの全ての時点を通して可変値を示した。
【０２１３】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球集団を、活性化マーカーＰＤ-１、ＴＩＭ-３、ＣＤ２５及びＣＤ６９の上方制御に関して評価して、ＤＡＲＴ-Ａ用量投与後の細胞の活性化状態を決定した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球集団中のＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋（ＣＤ４＋Ｔリンパ球に関してのみ）、ＴＩＭ‐３＋及びＰＤ‐１／ＴＩＭ３＋の相対百分率は一般に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球集団全体の＜１％であり、これにより、いずれのＤＡＲＴ‐Ａ関連の変化の評価は困難であった。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＰＤ‐１＋及びＣＤ６９＋の頻度の増加は、２日目（ＳＯＩ２４時間後）に開始されるグループ５及び６の５００ｎｇ／ｋｇ／用量の動物に関して、複数の時点にわたって存在していた。更に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＣＤ２５＋の頻度のより緩やかな増加が、２日目（ＳＯＩ２４時間後）に開始される５００ｎｇ／ｋｇ／用量の動物（グループ５及び６）に関して存在し、またＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋の相対百分率の上昇が、多投薬５００ｎｇ／ｋｇ（グループ６）の動物に関して存在していた。２日目に存在したものに相当する大きさの増加が、後続の投薬に続く９及び１６日目（ＳＯＩ２４時間後）にも概ね存在していた。総括的に、これらのデータは、ＤＡＲＴ‐Ａ投与が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＰＤ‐１、ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現の上昇傾向をもたらすことを示唆している。
【０２１４】
ｂ．サイトカイン評価
‐７、８及び１５日目の投薬前；並びに１、８及び１５日目の注入の開始後４及び２４時間において、血清ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＴＮＦ‐α及びＩＦＮ‐γレベルを決定した（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅアッセイ）。５、５０又は５００ｎｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａ用量（グループ３‐６）をカニクイザルに投与した場合、一時的な用量相関性のＩＬ‐１０レベルの上昇（１７３ｐｇ／ｍＬまで）が、最初のＤＡＲＴ‐Ａ注入の開始後４時間において観察され、レベルは注入開始後２４時間以内にベースラインへと概ね戻った。ＩＬ‐１０の増加は、２回目及び３回目の投薬（以下に説明する動物５００１を除く全ての動物において＜２２ｐｇ／ｍＬ）に続くＩＬ‐１０の増加と比較して、ＤＡＲＴ‐Ａの１回目の投薬後、全てのグループにおいてより顕著であるように思われ、これは、サイトカイン放出の脱感作（desensitization）及び／又は標的細胞集団の迅速な減少／削減が、１回目の投薬後のＴ細胞活性化の原因となることを示唆している。ＩＬ‐６レベルの一時的な上昇（１６２ｐｇ／ｍＬまで）は、各ＤＡＲＴ‐Ａ注入の開始後４時間において、全ての用量グループにわたる一部の動物において様々に観察され、レベルは２４時間以内にベースラインレベル又はベースラインレベル付近に概ね戻った。しかしながら、１９０ｐｇ／ｍＬまでのＩＬ‐６レベルの上昇が観察された、段階Ａのビヒクル投与から生成されたデータに基づくと、段階ＢのＩＬ‐６のレベルの変動（≦１６２ｐｇ／ｍＬ）は、薬剤関連応答を必ずしも反映していなくてよい。研究全体を通して、ＩＬ‐５、ＩＬ‐４、ＩＬ‐２、ＩＦＮ‐γ、又はＴＮＦ‐αのレベルに一貫した変化は観察されなかった。
【０２１５】
１体のカニクイザル（動物５００１）は、２回目のＤＡＲＴ‐Ａ注入前の８日目においてＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ５、及びＩＬ‐１０のレベルの上昇を経験した。８日目の２回目の注入後４時間において、サイトカインレベルは更に上昇した（ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＩＦＮ‐γ、及びＴＮＦ‐α）か、又は安定したままであった（ＩＬ‐２）。２回目の投薬後２４時間までにサイトカインレベルは低下し始め、１５日目の３回目のＤＡＲＴ‐Ａ注入後、いくつかのサイトカインは様々に増加した。全てのサイトカインレベルがピーク値から低下したものの、このカニクイザルでは、評価した最終時点（１６日目）において、サイトカインレベルはベースラインレベルを超えて上昇したままであった。サイトカインレベルの上昇に関連する明らかな臨床的観察は存在しなかった。
【０２１６】
実施例１２  ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＩｇ様半減期
ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスの薬物動態（ＰＫ）研究を、Jackson Laboratories（Bar Harbor,  米国メーン州）から入手可能なヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウス株Ｂ６．Ｃｇ‐Ｆｃｇｒｔtm1Dcr（ＣＡＧ‐ＦＣＧＲＴ）２７６Ｄｃｒ／ＤｃｒＪマウス（品番００４９１９）を用いて実施して、ＤＡＲＴ‐Ａ及び対照ＤＡＲＴ１を評価した（図２２）。終末相半減期はそれぞれ８５．６及び９２．１時間であった。比較のために、同一の試験系において３つのヒトｍＡｂも評価し、これらは５８．７〜１０２．７時間の終末相半減期を有していた。
【０２１７】
実施例１３  ヒトＰＢＭＣ再構成マウスにおける、播種性Ｒａｊｉ細胞白血病／リンパ腫モデルの効能
ヒトＰＢＭＣで再構成したメスのＮＳＧ  Ｂ２ｍ‐／‐マウスのルシフェラーゼ形質導入Ｒａｊｉリンパ腫細胞を用いて、播種性腫瘍モデルを確立し、ここではマウスは、腫瘍細胞注射の１日後（「早期処置（early treatment）」若しくは白血病パラダイム）又はインビボにおける成長の少なくとも２週間後（「確立された腫瘍（established tumor）」又はリンパ腫モデル）に、ビヒクル、対照ＤＡＲＴ１又はＤＡＲＴ‐Ａで処置された。
【０２１８】
早期処置モデル
研究の‐１４日目におけるヒトＰＢＭＣ再構成後、研究０日目においてＲａｊｉ．ｌｕｃリンパ腫細胞を注射し、次の日（研究１日目）に処置を開始した。ビヒクル対照、０．５ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ１又は０．５ｍｇ／ｋｇ又はＤＡＲＴ‐Ａを、３〜４日毎に１回、合計１２回の用量をＩＶ注射した（即ち研究１、４、６、８、１１、１３、１５、１８、２０、２２、２５、及び２７日目）。研究５４日目又は研究５６日目まで、マウスを生存に関して追跡した。
【０２１９】
ビヒクル又は対照ＤＡＲＴ１を投与されたグループでは、びまん性播種性腫瘍細胞プロファイルは、２週目及び３週目までにマウスの大部分において急速に癒合して拡大した。これら２つの対照グループにおける動物の死亡は、腫瘍細胞移植後２週間もの早さで記録された。ビヒクル又は対照ＤＡＲＴ１グループの全てのマウスが、研究４０日目までに死亡したか、又は研究５３日目までに人道的に屠殺された（即ち動物が瀕死状態になったか、または体重が１５％を超えて失われた場合）。生存曲線を図２３に示す。対照的に、ＤＡＲＴ‐Ａで処置したグループは、いずれの時点においても腫瘍細胞増殖を示さず、研究の終了まで動物の死亡は観察されなかった。生存曲線を図２３に示す。
【０２２０】
０．１６μｇ／ｋｇ、０．８μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを、３〜４日毎に１回、合計１２回の用量をＩＶ注射した（即ち研究１、４、６、８、１１、１３、１５、１８、２０、２２、２５、及び２７日目）ことを除いて、上述のものと同一の実験条件下で、フォローアップ実験において用量範囲発見のための研究を行った。同一の研究日において、上述のようにビヒクル及び対照ＤＡＲＴ１を投与した。ビヒクル又は対照ＤＡＲＴ１で処置したマウスにおいて、Ｒａｊｉ．ｌｕｃ腫瘍成長の迅速な進行が観察された。ＤＡＲＴ‐Ａは試験した全ての用量において効能を示し、２０μｇ／ｋｇ程度の低い用量において、研究の終了時（５６日目）にマウスの大部分が生存しており（＞８％）、腫瘍を有しなかった（図２４）。
【０２２１】
確立された腫瘍モデル
処置が遅れた場合にＲａｊｉ．ｌｕｃ細胞腫瘍の負荷を制御するＣＤ１９×ＣＤ３の能力を、別個の実験のセットにおいて試験した。確立された腫瘍モデルでは、研究０日目（ＰＢＭＣ注射からおよそ１週間後）にヒトＰＢＭＣ再構成マウスにＲａｊｉ．ｌｕｃ細胞をＩＶ接種し、１４日間成長させた後で処置を開始した。
【０２２２】
研究１２日目に、腫瘍量に基づいてマウスを３つのグループに無作為化した後、研究１４日目に開始して（即ち研究１４、１５、１６、１９、２１、２３、３０、３３、３５及び３７日目）合計１０回の投薬にわたり、ビヒクル、０．１ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａ又は０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを用いて処置した。ビヒクル対照グループでは、最初の病巣は、処置の１週目の終わりまでにサイズが著しく増大し、５／７のマウスが処置開始の２週間以内に死亡した（図２５）。対照的に、両方のＤＡＲＴ‐Ａ治療グループにおける動物の大部分の腫瘍量は、治療の１週目に劇的に減少したか、又は消失した。無作為化の時点で比較的高い腫瘍量が存在した各ＤＡＲＴ-Ａ処置グループの１匹のみが、処置の１週目の間に死亡した（図２５）。研究５０日目までに、０．１ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａで処置したグループの２体のマウスのみが末梢腫瘍を残していた。
【０２２３】
上述の一般的な実験条件下で、遅延処置モデルにおいて用量範囲発見のための研究を行った。この実験では、研究０日目（ＰＢＭＣ注射後５日）にヒトＰＢＭＣ再構成マウスにＲａｊｉ．ｌｕｃ細胞をＩＶ接種し、研究１４日目まで成長させた後無作為化した。研究１５日目に処置を開始し、ビヒクル、０．１ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ１、又は０．１６μｇ／ｋｇ、０．８μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ若しくは０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを、合計９回（即ち研究１５、１７、２１、２３、２５、２８、３０、３２及び３５日目）投薬した。
【０２２４】
ビヒクル対照グループでは、腫瘍量は漸増し、処置の２週目の終了時までに全てのマウスが死亡したか、又は屠殺された（図２６）。０．１ｍｇ／ｋｇの対照ＤＡＲＴ１で処置されたマウスは、ビヒクル処置マウスに比べて腫瘍の進行のわずかな遅延を示した（図２６）。対照的に、ＤＡＲＴ‐Ａで処置した動物における腫瘍量は一般に、経時的な用量依存性低下を示した（図２６）。
【０２２５】
実施例１４  カニクイザルにおけるＤＡＲＴ‐Ａの薬物動態
カニクイザルは、前駆細胞ｍＡｂを用いた免疫組織化学的検査に基づき、この種において２つの標的抗原両方がヒトに比べて均等に分布していることに基づいて、ＤＡＲＴ‐Ａ分析のための適切な薬学的モデルとして選択された。
【０２２６】
本発明に従って、１グループにつき１０体（オス５体、メス５体）のカニクイザルからなる５つの処置グループを含む研究が実施された。これらのグループは、１日目の最初の注入のためにビヒクル対照を用いた２時間にわたるIV注入によって処置された後、週１回、４週間にわたるビヒクル対照（グループ１）又はＤＡＲＴ‐Ａ（グループ２‐５）を用いて処置された。グループ１の動物は後続の４回の注入全てに関してビヒクル対照を投与され続けたが、グループ２‐５の動物は、８、１５、２２及び２９日目の後続の注入全てに関して０．２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ又は１０μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投与された（表１２）。３７日目に３体のオス及び３体のメスを安楽死させて剖検し、残りの回復グループのサル（２体のオス及び２体のメス）を、１２週間の回復期間後、１２１日目に安楽死させて剖検した。
【０２２７】
【表１２】
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【０２２８】
様々な時点で採取した血清中のＤＡＲＴ-Ａの濃度分析を、ＥＬＩＳＡによって実施した。グループ５からの代表的な動物に関するＤＡＲＴ‐Ａ血清濃度‐時間プロファイルを図２７に示す。ＰＫパラメータ（２区画モデル）を、０．２、２、５及び１０μｇ／ｋｇの投薬後に推定した（表１３）。一般に、最大血清濃度（Ｃmax）及びＡＵＣinfの用量比例的上昇が、評価した用量範囲にわたって観察された。一次ＰＫパラメータのいくつかのペアワイズ用量比較では差異が存在したが、全体として、評価可能な用量にわたるＤＡＲＴ‐Ａのクリアランス（ＣＬ）、区画内クリアランス（ＣＬＤ2）並びに分布体積（Ｖ1及びＶ2）の変化には一貫した傾向は存在せず、これは線形ＰＫを示唆している。グループ２‐５の動物にわたるＣＬ値は、カニクイザルに関する糸球体濾過率（ＧＦＲ）（〜１２５ｍＬ／ｈ／ｋｇ）よりも低く、これは、この分子量（１０９．３ｋＤａ）のタンパク質について予想された通り、腎臓濾過による排除が実質的に発生しないことを示す。グループ２、３、４及び５の動物に関する平均初期分布容積（Ｖ1）は、カニクイザルの血漿体積（〜４５ｍＬ／ｋｇ）と同等であるか又はわずかに高く、これは標的細胞への結合によって中心区画においてＤＡＲＴ‐Ａの欠失がほとんど存在しないことを示唆している。平均ベータ相半減期及びＭＲＴは、用量の増加と共に増大する傾向を示し、平均ベータ半減期（ｔ１／２、β）が１６１時間（６．７日）、及び平均滞留時間（mean residence time：ＭＲＴ）が１９１時間（８日）となった。ＧＬＰ研究からの３体の動物（２μｇ／ｋｇ用量グループにおいてｎ＝１；５μｇ／ｋｇ用量グループにおいてｎ＝２）のみが、２回目以降のＤＡＲＴ‐Ａ注入（ｎ＝２）後、又は４回目のＤＡＲＴ‐Ａ注入（ｎ＝１）後に異常なＰＫプロファイルを有し、その後ＡＤＡに関して陽性であることが確認されたことに留意されたい。従って、影響を受けた注入サイクル後の血清濃度データは、これらの３体の動物関してはＰＫモデリングから除外された。
【０２２９】
【表１３】
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【０２３０】
ＤＡＲＴ‐Ａ処置カニクイザルにおけるサイトカイン放出
サイトカインレベルを評価するための血清試料を、注入前、並びに１、８、１５、２２及び２９日目の注入終了後２及び２２時間において、採取した。評価したサイトカインはＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６及びＩＬ‐１０であった。
【０２３１】
注入終了後２時間において発生したサイトカインレベルの最大の上昇に対して、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＩＦＮ‐γ及びＴＮＦ‐αのレベルの上昇が、１回目のＤＡＲＴ‐Ａ注入（８日目）の後に観察された。用量レベル＞２μｇ／ｋｇにおいて、ＩＬ‐１０及びＩＦＮ‐γに関してＤＡＲＴ‐Ａ用量依存性の増加が観察され、その一方でＩＬ‐６の増加は用量レベル≧５μｇ／ｋｇにおいて観察された。ＴＮＦ‐αレベルの変化は小さく、最高用量レベル（１０μｇ／ｋｇ）のみにおいて観察された。サイトカインレベルの変化は一時的なものであり、注入開始後２４時間以内にベースライン又はベースライン付近に戻り、これらの上昇したサイトカインレベルに関連する臨床的観察は存在しなかった。これに続く１５、２２及び２９日目のＤＡＲＴ‐Ａの注入は、比較的小さなサイトカインレベルの上昇をもたらし、これは対照物の注入後に観察されるものと同等であった。ＩＬ‐２，ＩＬ‐４及びＩＬ‐５の平均レベルは、個々の動物において様々な別個の変化を示したが、研究期間全体を通して全てのグループにわたって＜２０ｐｇ／ｍＬのままであり、毒物学的に有意であるとは考えられなかった。
【０２３２】
０．２μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａを投与された動物におけるサイトカインレベルは、対照物注入（グループ１）後に観察された変動と同等であった。
【０２３３】
カニクイザルにおける循環Ｂ細胞のＤＡＲＴ‐Ａ仲介型欠失
Ｂ細胞、Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４  ｖｓ  ＣＤ８）並びに活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＰＤ‐１及びＴＩＭ‐３）を含むＴ細胞、並びにＮＫ細胞の、循環絶対値を、薬力学的エンドポイントとして、研究全体を通して測定した。注入前、並びに３７日目の最終的な剖検の前の、１、８、２２及び２９日目の注入終了後２、２２及び７０時間において、並びにその後回復期間中に１週間に１回又は２週間に１回、３６、４３、５０、５７、６４、７８、９２、１０６及び１１９日目に、試料を採取した。
【０２３４】
図２８は、ＤＡＲＴ‐Ａ処置が、意図した標的集団であるＣＤ２０＋Ｂ細胞の用量依存性欠失をもたらしたことを示す。ＣＤ２０＋細胞の完全な又は略完全な欠失が、用量レベル≧２μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ‐Ａの１回目の注入開始後２４時間までに観察された。ＣＤ２０＋Ｂ細胞の欠失は、処置期間全体を通して持続し、最後の投薬後３‐５週間にわたって持続した。１２週間の回復期間の最後の数週間の間に、ＣＤ２０＋Ｂ細胞の投薬前レベルへの用量依存性の回復が発生した。
【０２３５】
実施例１５  ＣＬＬ一次患者試料における悪性Ｂ細胞の自己欠失
ＣＬＬ一次患者試料におけるＤＡＲＴ‐Ａ仲介型細胞溶解活性を評価するために、患者のＰＢＭＣを、ＤＡＲＴ‐Ａ又は対照ＤＡＲＴ１を用いてインキュベートした。患者試料の入手が限られていたため、２つの濃度（５０ｎｇ／ｍＬ及び２００ｎｇ／ｍＬ）のみを試験した。ＣＬＬ悪性Ｂ細胞（ＣＤ１９＋／ＣＤ５＋又はＣＤ２０＋／ＣＤ５＋）並びにＴ細胞（ＣＤ１９‐／ＣＤ５＋又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋）の百分率を、フローサイトメトリーによって、処置前並びに３及び６日間の処置後に測定した。試験した濃度のＤＡＲＴ‐Ａは、抗ＣＤ１９抗体の染色を部分的にブロックしたため、ＤＡＲＴ‐Ａによる処置後に悪性Ｂ細胞をゲートするためにＣＤ１９＋／ＣＤ５＋を使用するのは不適当であった。従って悪性Ｂ細胞欠失は、ＤＡＲＴ‐Ａ処置後にＣＤ２０＋／ＣＤ５＋上でゲートすることによって決定した。
【０２３６】
ＣＬＬ悪性Ｂ細胞及びＴ細胞の頻度から決定されるＥ：Ｔ比は、概ね≦１：１０であった。図示されている各ＣＬＬドナー実験では、全ＰＢＭＣの４％のみ及びＰＢＭＣの約９０％を構成するＣＤ１９‐／ＣＤ５＋Ｔ細胞をＣＤ１９＋／ＣＤ５＋悪性Ｂ細胞として識別することに基づく処置前において、Ｅ：Ｔ細胞比はおよそ１：２３であった。図２９Ａ‐２９Ｉ及び表１４は、ＣＬＬ患者試料と比較したＤＡＲＴ‐Ａ処置の効果を示す。ＣＬＬ  ＰＢＭＣを用いたＤＡＲＴ‐Ａのインキュベーションは、評価した両方のＤＡＲＴ‐Ａ濃度において、悪性Ｂ細胞の時間依存性欠失をもたらし、これは６日目に観察されるＴ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８）の付随する増加を伴った。更に、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５は、６日間のＤＡＲＴ‐Ａ処置後に上方制御され、これは、ＤＡＲＴ‐Ａが、悪性Ｂ細胞の標的転換殺滅のプロセスにおいてＴ細胞活性化を誘発することを示している。対照的に、６日目までに、対照ＤＡＲＴ１を用いてＢ細胞殺滅又はＣＤ２５の上方制御は観察されなかった。
【０２３７】
ＤＡＲＴ‐Ａは、評価した両方の濃度において同一レベルの殺滅を仲介したが、殺滅のレベルは経時的に上昇し、３日目及び６日目にはそれぞれ、悪性Ｂ細胞のおよそ４０％及び８５％が死滅し、これは、十分なＤＡＲＴ‐Ａが存在する場合、時間が、Ｔ細胞：標的の比が低い状態での標的細胞の効率的な排除のための重要な因子であることを示唆していることに留意されたい。
【０２３８】
【表１４】
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【０２３９】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【配列表フリーテキスト】
【０２４０】
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：介在スペーサペプチド（リンカー１）
配列番号２：リンカー２
配列番号３：システイン含有リンカー
配列番号４：ＩｇＧ１ヒンジドメイン
配列番号５：スペーサリンカー３
配列番号６：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号７：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号８：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号９：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１０：Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１１：Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１２：システイン含有Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１３：システイン含有Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１４：ヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号１５：「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号１６：「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号１７：抗ＣＤ１９抗体の可変軽鎖
配列番号１８：抗ＣＤ１９抗体の可変軽鎖のＣＤＲ１
配列番号１９：抗ＣＤ１９抗体の可変軽鎖のＣＤＲ２
配列番号２０：抗ＣＤ１９抗体の可変軽鎖のＣＤＲ３
配列番号２１：抗ＣＤ１９抗体の可変重鎖
配列番号２２：抗ＣＤ１９抗体の可変重鎖のＣＤＲ１
配列番号２３：抗ＣＤ１９抗体の可変重鎖のＣＤＲ２
配列番号２４：抗ＣＤ１９抗体の可変重鎖のＣＤＲ３
配列番号２５：抗ＣＤ３抗体の可変軽鎖
配列番号２６：抗ＣＤ３抗体の可変軽鎖のＣＤＲ１
配列番号２７：抗ＣＤ３抗体の可変軽鎖のＣＤＲ２
配列番号２８：抗ＣＤ３抗体の可変軽鎖のＣＤＲ３
配列番号２９：抗ＣＤ３抗体の可変重鎖
配列番号３０：抗ＣＤ３抗体の可変重鎖のＣＤＲ１
配列番号３１：抗ＣＤ３抗体の可変重鎖のＣＤＲ２
配列番号３２：抗ＣＤ３抗体の可変重鎖のＣＤＲ３
配列番号３３：リンカー４
配列番号３４：アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ３）
配列番号３５：ＤＡＲＴ‐Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号３６：ＤＡＲＴ‐Ａ（配列番号３５）をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３７：ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖
配列番号３８：ＤＡＲＴ‐Ａの第２のポリペプチド鎖（配列番号３５）をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３９：ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖
配列番号４０：ＤＡＲＴ‐Ａの第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号４１：抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変軽鎖ドメイン
配列番号４２：抗フルオレセイン抗体４‐４‐２０の可変重鎖ドメイン  配列番号４３：対照ＤＡＲＴ１の第１のポリペプチド鎖
配列番号４４：対照ＤＡＲＴ１の第２のポリペプチド鎖
配列番号４５：対照ＤＡＲＴ２の第１のポリペプチド鎖
配列番号４６：対照ＤＡＲＴ２の第２のポリペプチド鎖
配列番号４７：介在スペーサペプチド（リンカー４）
配列番号４８：介在スペーサペプチド（リンカー４）
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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