(57)【要約】本発明は、非コンジュゲート形と比較した場合に吸収、バイオアベイラビリティ、または循環半減期が増大された化合物をもたらす、治療用化合物にコンジュゲートされた非ホルモン性ビタミンＤを提供する。ビタミンＤ標的指向基は、ビタミンＤ骨格上の第３の炭素を介して治療用化合物にカップリングされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ホルモン性ビタミンＤ標的指向基の３位炭素で治療用化合物にコンジュゲートされた非ホルモン性ビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基を含む、担体−薬物コンジュゲート
【請求項２】
前記非ホルモン性ビタミンＤが、１位炭素ではヒドロキシル化されていない、請求項１に記載の担体−薬物コンジュゲート。
【請求項３】
前記標的指向基が、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含有する修飾基、水溶性ポリマー、低分子炭素鎖リンカー、および追加の治療用化合物からなる群から選択されるスカフォールドを介して前記治療用化合物にコンジュゲートされる、請求項１に記載の担体−薬物コンジュゲート。
【請求項４】
スカフォールドを介して非ホルモン性ビタミンＤ標的指向基の３位炭素で治療用化合物にコンジュゲートされた非ホルモン性ビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基を含む担体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項５】
前記担体が、循環中の前記治療用化合物の吸収、バイオアベイラビリティ、または半減期を増大させる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記非ホルモン性ビタミンＤが、１位炭素ではヒドロキシル化されていない、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含有する修飾基、水溶性ポリマー、低分子炭素鎖リンカー、および追加の治療用化合物からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記治療用化合物が、小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然に存在するタンパク質、天然に存在しないタンパク質、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、ステープルペプチド、モルホリノ、ホスホロジアミデートモルホリノ、アンチセンス薬、ＲＮＡに基づくサイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素をコンジュゲートさせた抗体、抗体−薬物コンジュゲート、代謝エフェクター、鎮痛薬、解熱薬、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌薬、筋骨格薬、心血管治療薬、腎薬物、肺薬物、消化器疾患薬、血液系作用薬、泌尿器薬物、代謝薬物、肝薬物、神経薬、抗糖尿病薬、抗癌薬、胃の状態を治療するための薬物、結腸の状態を治療するための薬物、皮膚の状態を治療するための薬物、およびリンパ状態を治療するための薬物からなる群から選択される、請求項４から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記治療用化合物が、配列番号１または１６との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アペリン活性を有するタンパク質である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記治療用化合物が、配列番号２、３、４、および５からなる群から選択されるタンパク質との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、グレリン活性を有するタンパク質である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記治療用化合物が、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記治療用化合物が、配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記治療用化合物が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記治療用化合物が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記治療用化合物が、配列番号１０または１７との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＰＴＨ活性を有するタンパク質である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記治療用化合物が、インスリン活性を有するタンパク質であって、配列番号１１または１２との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドの二量体を含むタンパク質である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記治療用化合物が、抗体である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記抗体が、配列番号１３との少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質に、高い親和性で結合する、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記治療用化合物が、ＲＮＡ分子である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
治療用化合物を必要としている患者を治療する方法であって、請求項４から７のいずれか一項に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３３】
前記治療用化合物が、小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然に存在するタンパク質、天然に存在しないタンパク質、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、ステープルペプチド、モルホリノ、ホスホロジアミデートオリゴヌクレオチド、アンチセンス薬、ＲＮＡに基づくサイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素をコンジュゲートさせた抗体、抗体−薬物コンジュゲート、代謝エフェクター、鎮痛薬、解熱薬、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌薬、筋骨格薬、心血管治療薬、腎薬物、肺薬物、消化器疾患薬、血液系作用薬、泌尿器薬物、代謝薬物、肝薬物、神経薬、抗糖尿病薬、抗癌薬、胃の状態を治療するための薬物、結腸の状態を治療するための薬物、皮膚の状態を治療するための薬物、およびリンパ状態を治療するための薬物からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療用化合物が、配列番号１または１６との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アペリン活性を有するタンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療用化合物が、配列番号２、３、４、および５からなる群から選択されるタンパク質との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、グレリン活性を有するタンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記治療用化合物が、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療用化合物が、配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療用化合物が、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記治療用化合物が、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療用化合物が、配列番号１０または１７との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＰＴＨ活性を有するタンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療用化合物が、配列番号１１との少なくとも９０％の配列同一性または配列番号１２との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、インスリン活性を有するタンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記治療用化合物が、抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、配列番号１３との少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質に、高い親和性で結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記治療用化合物が、ＲＮＡ分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的指向基が、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記スカフォールドが、ポリ（エチレングリコール）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記医薬組成物が、経皮、経口、非経口、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、頭蓋内注射、注入、吸入、眼、局所、直腸内、経鼻、頬側、舌下、膣内、または埋め込み式リザーバー様式によって前記患者に送達される、請求項１９に記載の方法。
【請求項５８】
前記医薬品を必要としている患者の治療のための前記医薬品の製造のための、請求項４から７のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５９】
請求項４から７のいずれか一項に記載の医薬組成物を製造する方法であって、前記標的指向基と前記治療用化合物とをコンジュゲートさせることを含み、前記コンジュゲートステップがカップリング基を利用する方法。
【請求項６０】
前記カップリング基が、アミン反応性の基、チオール反応性の基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、二官能性クロスリンカー、ＮＨＳ−マレイミド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物が、チオール結合、アミド結合、オキシム結合、ヒドラゾン結合、およびチアゾリジノン結合からなる群から選択される結合を含有する担体−薬物化合物を含む、請求項５９から得られる医薬組成物。
【請求項６２】
前記コンジュゲートステップが、付加環化反応によって実現される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
式Ｉ
【化１】
2017533906.tif 000064
（式中、
Ｂは、３位炭素でＬ１にコンジュゲートした非ホルモン性ビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基であり；
Ｓは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカー含有修飾基、ポリ乳酸、水溶性ポリマー、低分子炭素鎖リンカー、または追加の治療的部分を含むスカフォールド部分であり；
Ｃは、アミン反応性の基、チオール反応性の基、マレイミド基、チオール基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、４−ニトロフェニルエステル、アシルイミダゾール、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、および二官能性クロスリンカー（ＮＨＳ−マレイミドなど）、またはこれらの組み合わせであり；
Ｌ１およびＬ２は、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり；
Ｌ３は、−（ＣＨ２）ｏ−であり
ｎは、０〜３の整数であり；
ｏは、０〜３の整数である）
を含む医薬担体。
【請求項６４】
式Ｖ
【化２】
2017533906.tif 000065
を含む、請求項６３に記載の医薬担体。
【請求項６５】
式ＶＩ
【化３】
2017533906.tif 000066
を含む、請求項６３に記載の医薬担体。
【請求項６６】
式ＶＩＩ
【化４】
2017533906.tif 000067
を含む、請求項６３に記載の医薬担体。
【請求項６７】
以下：
ａ．治療用化合物、
ｂ．安定的に付着されたスカフォールド、
ｃ．３位炭素でコンジュゲートされた非ホルモン性ビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基
（ここでは、第１の試験対象への投与後に、前記治療用化合物は、複数の時点で採取された血液試料の前記ＥＬＩＳＡ分析によって測定される、前記安定的に付着されたスカフォールド部分および標的指向基を有しない、第２の試験対象に投与された前記治療用化合物の半減期よりも長い半減期（前記複数の時点で採取された血液試料のＥＬＩＳＡ分析によって測定される）を有する）
を含む医薬組成物。
【請求項６８】
前記第１および第２の対象への前記投与が、皮下注射によって実現される、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記スカフォールドおよび標的指向基に、安定的に付着された前記治療用化合物が、機能分析によって測定された場合に、前記スカフォールドおよび標的指向基に安定的に付着されていない前記治療用化合物と実質的に同じ活性を保持する、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
スカフォールド質量範囲が、１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．、２００Ｄａ．から１５，０００Ｄａ．、３００Ｄａ．から１０，０００Ｄａ．、４００Ｄａ．から９，０００Ｄａ．、５００Ｄａ．から５，０００Ｄａ．、６００Ｄａ．から２，０００Ｄａ．、１０００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、２０，００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、１００，０００から２００，０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．から１００，０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．から８０，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．から６０，０００Ｄａ．、および２０，０００Ｄａ．から４０，０００Ｄａからなる群から選択される、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記スカフォールドが、治療用化合物とほぼ同じ質量である、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
治療用化合物に非遊離可能にコンジュゲートされたビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基を含む、担体−薬物コンジュゲート。
【請求項７３】
前記ビタミンＤが、非ホルモンである、請求項７２に記載の担体−薬物コンジュゲート。
【請求項７４】
前記非ホルモン性ビタミンＤが、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである、請求項７３に記載の担体−薬物コンジュゲート。
【請求項７５】
前記治療用化合物が、前記非ホルモン性ビタミンＤ標的指向基の３位炭素でコンジュゲートされる、請求項７４に記載の担体−薬物コンジュゲート。
【請求項７６】
前記治療用化合物が、機能分析によって測定された場合に、前記標的指向基にコンジュゲートされていない前記治療用化合物と実質的に同じ活性を保持する、請求項７５に記載の担体−薬物コンジュゲート。
【請求項７７】
前記標的指向基が、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含有する修飾基、水溶性ポリマー、低分子炭素鎖リンカー、および追加の治療用化合物からなる群から選択されるスカフォールドを介して前記治療用ペプチドまたは前記治療用核酸にコンジュゲートされる、請求項７６に記載の担体−薬物コンジュゲート。
【請求項７８】
前記スカフォールドが、治療用化合物とほぼ同じ質量である、請求項７７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、どちらもその内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／０６７，３８８号明細書、および２０１５年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４４，１８１号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、非コンジュゲート形と比較した場合に吸収、バイオアベイラビリティ、または循環半減期が増大された化合物をもたらす、治療用化合物にコンジュゲートされた非ホルモン性ビタミンＤを提供する。ビタミンＤ標的指向基は、ビタミンＤ骨格上の第３の炭素を介して治療用化合物にカップリングされる。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、治療用化合物の効力、吸収、または薬物動態特性を向上させることに、また、ある種のビタミンＤ型に関する。ビタミンＤは、カルシウム、リン酸、および骨の恒常性における役割を担っている。ビタミンＤのホルモン活性は、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）への結合によって仲介される。ビタミンＤは、核に入り、その場所で、ホルモン性ビタミンＤに対して応答するある遺伝子サブセットのプロモーター内に存在するビタミンＤ受容体エレメント（ＶＤＲＥ）に結合する。
【０００４】
ビタミンＤは、脂溶性のセコステロイドの群である。いくつかの型（ビタマー）のビタミンＤが存在する。２つの主な型は、ビタミンＤ２すなわちエルゴカルシフェロール、およびビタミンＤ３すなわちコレカルシフェロールである。添え字のないビタミンＤは、ビタミンＤ２、Ｄ３、または当技術分野で知られている他の型を指す。ヒトでは、ビタミンＤは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）またはエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）として摂取することができる。大抵のヒトにとってのビタミンＤの主な源は、太陽光である。ビタミンＤがいったん皮膚内で作られるまたは摂取されると、一連のヒドロキシル化ステップによって、最初に肝臓内で２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ３）に、次いで腎臓内で１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３）に活性化される必要がある。１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、ＶＤＲに結合するので、活性な「ホルモン」型のビタミンＤである。２５（ＯＨ）Ｄ３は、「非ホルモン」型のビタミンＤであり、ヒト体内の主な循環形態である。これは、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）と結合する。これは、必要に応じた場合のみホルモン型に転換される。非ホルモンビタミンＤ型の例は、１α−ヒドロキシル基を欠くものである。非ホルモンビタミンＤ型は、ＶＤＲに対する大きく低下した親和性と、ＤＢＰに対する大きく増大した親和性を有する。
【０００５】
ＤＢＰは、ビタミンＤ代謝産物の主な輸送体である。血漿中のその濃度は、６〜７μＭであり、すべての体液区分において検出されている。ＤＢＰ濃度は、生理学的なビタミンＤ代謝産物濃度を上回る。ＤＢＰは、ビタミンＤの皮膚から循環への、また細胞膜を通過する細胞質（ここで、ビタミンＤが活性化されてホルモン型になる）への移動にとって重要である。ＤＢＰに対する非ホルモン性ビタミンＤの親和性は、ホルモン型の親和性よりも有意に高い。対照的に、ホルモン型のＶＤＲへの親和性は、非ホルモン型よりも有意に高い。
【０００６】
ビタミンＤおよびビタミンＤ類似体は、骨粗鬆症および二次性副甲状腺機能亢進症の治療のために認可されている。ビタミンＤはまた、正常細胞ならびに癌細胞における増殖を阻害するおよび分化を誘発することが示されている。この働きに必要とされるビタミンＤのレベルは、高カルシウム血症という形で深刻な毒性を引き起こす。ビタミンＤの類似体は、乾癬の治療のために認可されており、他のものは現在、癌治療のために試験中である。側鎖修飾を含有する類似体の多くは、血漿カルシウム上昇作用の低下を有することが明らかになっている。これらの修飾は、ＶＤＲ結合に大きくは影響を与えず、したがって、細胞に基づく増殖分析では、等しいまたは同等の有効性の増大を示す。しかし、これらの修飾の多くは、ＤＢＰへの結合を低下させ、それによって血流内での半減期を縮小することが示された。
【０００７】
本発明は、治療化合物の効力、吸収、又は薬物動態的性質を向上させることに関する。ポリ（エチレングリコール）すなわち（ＰＥＧ）の添加は、腎クリアランスの低下、凝集の低下、及び潜在的に望ましくない免疫認識の減少により、いくつかの化合物の半減期を増加させる公知の方法である（Ｊａｉｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２５：４０３−４４７（２００８））。ＰＥＧは、典型的には、循環中の半減期を最大にするため、かなり大きいサイズで使用される（２０〜４０ｋＤａ）。これは、単一の大きいＰＥＧの使用でも、化合物に結合した複数のより小さなＰＥＧの使用でも達成できる（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９−２１９７７（１９９６）；Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９７：４１６７−４１８３（２００８））。
【０００８】
医薬の効果が起こる前に薬物は吸収されなければならないため、吸収は、薬物の開発及び医薬の化学において主な焦点である。薬物の吸収プロファイルは、多くの因子に影響され得る。さらに、治療化合物の吸収性は、化合物によって著しく異なる。経口又は経皮投与後にあまり吸収されない治療化合物がいくつかある。ほとんどのペプチド系及びタンパク質系治療薬などの他の治療化合物は、経口投与できない。静脈内、皮下、又は筋肉内注射などの代替投与経路が、いくつかの化合物に日常的に利用されている。しかし、これらの経路は、遅い吸収及び分解を起こし得る酵素への治療化合物の曝露を起こすことが多く、そのため有効性を得るためにより高い投与量を必要とする。
【０００９】
いくつかのペプチドが、治療上期待が持てるものと特定されてきた。ペプチド及びタンパク質の化学的性質及び生物学的性質により、それらは、治療化合物として使用するための魅力的な候補である。ペプチド及びタンパク質は、アミノ酸でできた天然の分子であり、多くの生理学的プロセスに関与している。ペプチド及びタンパク質は、高度の選択性及び効力を示し、潜在的な有害薬物間相互作用も他の負の副作用も欠点として持たないことがある。そのため、ペプチド及びタンパク質は、多様性が高く、効き目が強く、選択性の高いクラスの低毒性の治療化合物として大いに有望なものである。しかし、ペプチド及びタンパク質は、短いインビボ半減期を有し得る。そのようなペプチドでは、これは数分になり得る。これによって、ペプチドは、その本来の形態（本明細書では「野生の」、「野生型」、または「ｗｔ」とも称される）では、治療的投与のためには一般に非実用的となる可能性がある。さらに、ペプチドは、作用の持続期間が短く、バイオアベイラビリティが不十分である可能性がある。
【００１０】
アペリンペプチド（配列番号１）は、ＡＰＬＮ遺伝子によってコードされる。アペリン遺伝子は、Ｎ−末端領域内にシグナルペプチドを有する７７アミノ酸のプレプロタンパク質をコードする。小胞体への移動およびシグナルペプチドの切断の後、５５アミノ酸のプロタンパク質は、いくつかの活性な断片：配列４２〜７７（アペリン３６）に対応する３６アミノ酸ペプチド、配列６１〜７７（アペリン１７）に対応する１７アミノ酸ペプチド、および配列６５〜７７（アペリン１３）に対応する１３アミノ酸ペプチドをもたらすことができる。この後者の断片はまた、そのＮ−末端グルタミン残基でのピログルタミル化（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｙｌａｔｉｏｎ）を受ける可能性がある。
【００１１】
アペリンは、いくつかの細胞型の表面で発現されるＧ−タンパク質共役ＡＰＪ受容体に対する内因性リガンドである。これは、心臓、肺、腎臓、肝臓、脂肪組織、消化管、脳、副腎、内皮、およびヒト血漿などの様々な器官において広く発現される。
【００１２】
アペリン受容体は、血圧の調節および新しい血管の形成（血管新生）に関与する。アペリンは、内皮細胞の表面上のその受容体の活性化により低血圧を引き起こす。これは、動脈壁の平滑筋細胞の弛緩を誘発する、ＮＯ、すなわち強力な血管拡張因子の放出を誘発する。血管形成活性は、アペリンが内皮細胞の増殖および遊走、および新しい血管の形成を促進することに起因する。アペリンの他の効果としては、体液恒常性の調節、食物および水の摂取の視床下部による調節、下垂体ホルモン放出、および脳における抗利尿ホルモンバソプレシンの下方調節が挙げられる。さらに、アペリンは、消化管において、また、膵臓において分泌される。
【００１３】
アペリンは、循環器および体液恒常性、食物摂取、細胞増殖、および血管新生を調節する。アペリンはまた、肥満および２型糖尿病などの代謝障害につながるアディポカインであると考えられている。したがって、アペリン療法は、これらの状態にとって有益な治療であり得る。例えば、Ｃａｓｔａｎ−Ｌａｕｒｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ４０（１）：１−９（２０１１）を参照されたい。実際、アペリンは、グルコースによって誘発されるインスリン分泌を阻害する。同様に、インスリンはアペリンを刺激し、インスリン産生に関するフィードバックループが明らかになっている。しかし、アペリンのインビボ半減期は、２０分以下である。例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６：１１５（２０１５）を参照されたい。
【００１４】
グレリンは、食欲および成長ホルモン（ＧＨ）の放出を刺激するために胃から循環に天然に分泌される哺乳類のペプチド（配列番号２）である。グレリンは、細胞受容体ＧＨＳ−Ｒを通して脳下垂体からの成長ホルモンの放出を刺激し、エネルギー恒常性における重要な役割を果たす。さらに、グレリンは、中枢神経系に直接的に作用して、交感神経活性を低下させる。ＧＨＳ−Ｒは、視床下部−下垂体軸に集中している。ＧＨＳ−Ｒは、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、胃、小腸および大腸、脂肪、および免疫細胞を含めた末梢組織に分布している。
【００１５】
グレリンは、悪液質を患う患者における体重および除脂肪体重、または癌（Ｈｉｕｒａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ、１１８：４７８５−９４（２０１２））などの慢性疾患に由来する意図的でない体重減少を増大させるために、治療的に使用されている。しかし、グレリンは、ヒトにおいて１１分という元々は短い半減期を有し（Ａｋａｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５０：４４７−５５（２００４））、したがって、多くの場合、治療効果をみるために投与されなければならない。
【００１６】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、パラトルモンまたはパラチリンは、副甲状腺の主細胞によって分泌される。これは、８４アミノ酸（配列番号１０）を含有するポリペプチドである。これは、血液中のカルシウム（Ｃａ２＋）の濃度を（カルシウム濃度を低下させるカルシトニンとは対照的に）増大させるように作用する。ＰＴＨは、副甲状腺ホルモン１受容体（骨および腎臓）および副甲状腺ホルモン２受容体（中枢神経系、膵臓、精巣、および胎盤）を活性化する。しかし、ＰＴＨは、およそ４分という非常に短い半減期を有する。
【００１７】
副甲状腺機能低下症は、最も一般的には甲状腺手術中の副甲状腺の損傷または除去、免疫系関連の損傷、遺伝、または他のまれな原因に起因する、血液中のＰＴＨの低レベルである。これは、血液中の低レベルのカルシウムをもたらし、しばしば筋肉のけいれんおよびれん縮、またはテタニー（不随意性筋収縮）、およびいくつかの他の症状を引き起こす可能性がある。カルシウム補充またはビタミンＤが、これらの症状を改善することができるが、腎臓結石および慢性腎疾患のリスクを増大させる可能性がある。例えば、Ｗｉｎｅｒ  ＫＫ，ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９７（２）：３９１−３９９（２０１２）を参照されたい。
【００１８】
インスリンは、炭水化物および脂肪の代謝を調節する、膵臓におけるβ細胞によって産生されるペプチドホルモンである（配列番号１１および１２）。ヒトインスリンタンパク質は、５１アミノ酸からなり、５８０８ダルトンの分子量を有する。これは、ジスルフィド結合によって連結されたＡ鎖とＢ鎖の二量体である。これは、血液から骨格筋および脂肪組織へのグルコースの吸収を促進し、脂肪をエネルギーとして使用させるのではなく貯蔵させる。
【００１９】
正常な生理的条件下では、インスリンは、血液から過剰なグルコースを除去するために一定の割合で産生される。しかし、インスリンレベルの調節ができなくなる場合、真性糖尿病が起こる可能性がある。したがって、糖尿病患者は、インスリン注射を受けることが多い。１型糖尿病を患う患者は、生存のために外因性インスリンに依存する。何故なら、このホルモンが、体内で、もはや十分には産生されないからである。インスリンは、最も一般的には、皮下に注射される。２型糖尿病を患う患者は、多くの場合、インスリン抵抗性であり、「見かけ上の」インスリン不足を患っている可能性がある。
【００２０】
線維芽細胞成長因子２１（配列番号２）は、ＦＧＦ２１遺伝子によってコードされる、血清中を循環するタンパク質である。これは、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２３を含む、非定型線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のファミリーのメンバーである。これは、通常のＦＧＦヘパリン結合ドメインを欠いている。ＦＧＦファミリーメンバーは、広い分裂促進および細胞生存活性を有し、胚発生、細胞成長、形態形成、組織修復、腫瘍成長および浸潤を含めた、様々な生物学的プロセスに関与する。ＦＧＦ２１は、ＨＭＧＣＳ２活性によって特異的に誘発される。ＦＧＦ２１は、脂肪細胞におけるグルコース取り込みを刺激するが、他の細胞型においては刺激しない。この効果は、インスリンの活性に対して相加的である。
【００２１】
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃ／ｂ−Ｋｌｏｔｈｏ受容体複合体への結合を、他のＦＧＦＲアイソタイプを含有するものよりも好む（Ｋｌｉｅｗｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．９１：２５４Ｓ−２５７Ｓ（２０１０））。糖尿病動物へのＦＧＦ２１の投与は、循環グルコースレベルを低下させるが、過剰なＦＧＦ２１は、過剰なインスリンの投与で見られるような低血糖を誘発しない（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ａｎｄ  Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇ  １０：３５９−３６４（２００９））。したがって、ＦＧＦ２１は、糖尿病の治療のための有望な治療用タンパク質である。しかし、天然状態のＦＧＦ２１は、血清における極度に短い半減期（約１．１時間）を有し、臨床的に実用的でない治療となっている（例えば、国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１６２７−１６３５（２００５）を参照されたい）。さらに、ＦＧＦ２１は、皮下に注射された場合に不十分なバイオアベイラビリティを呈する（Ｘｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２９７：Ｅ１１０５−Ｅ１１１４）。
【００２２】
インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，米国特許第５，９１９，４５２号明細書及び米国特許出願公開第２００２／０１４１９９６号明細書、引用によりその全体として本明細書に組み込まれる）は、自己免疫疾患の治療に使用される、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α、配列番号１３）に結合するモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、関節リウマチ、及び潰瘍性大腸炎の治療用に認可された。ＴＮＦ−αは、化学的メッセンジャー（サイトカイン）及び自己免疫反応の重要な部分である。インフリキシマブは、医療従事者により静脈内投与され、皮下投薬には認可されていない。
【００２３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、多くの場合特定のｍＲＮＡ分子を分解させることによって、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害するプロセスである。２つのタイプのＲＮＡ分子−マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）−が、ＲＮＡ干渉の中心となる。これらは、標的ｍＲＮＡ分子に結合し、その活性を増大または低下させる。ＲＮＡｉは、細胞を、ウイルスおよびトランスポゾン由来の核酸などの寄生的核酸から防御するのを助ける。ＲＮＡｉはまた、発生にも影響を与える。
【００２４】
ＲＮＡｉについての当初の医療適用は、黄斑変性症およびハンチントン病などの遺伝性疾患と関与する。追加的な適用には、ある種の癌、呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス２型、ＨＩＶ、Ａ型およびＢ型肝炎、インフルエンザ、および麻疹が含まれ得る。
【００２５】
ＲＮＡｉを標的組織、具体的には体の深部組織に送達することは難しいままである。ｓｉＲＮＡ分子は、内因性ヌクレアーゼが原因で、短いインビボ半減期を有する。また、特定の組織を標的にすることは、難易度が高い。ある手法は、確実に組織に到達させるための、高い投薬レベルのｓｉＲＮＡであった。しかし、これらの手法では、肝毒性が報告された。
【００２６】
治療用オリゴヌクレオチドは、有望でありながら、短い血漿半減期を、また、送達および細胞取り込みに関する問題を抱えている。これらの問題を克服するために、オリゴヌクレオチドの小分子へのコンジュゲーションが提案されているが、今のところ成功していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、３位炭素で治療用化合物に連結された非ホルモン性ビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基を含む、担体−薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、非ホルモン性ビタミンＤ分子は、１位炭素ではヒドロキシル化されていない。これらの担体は、治療用化合物の吸収、安定性、半減期、効果の持続期間、効力、またはバイオアベイラビリティを高める。担体は、任意選択で、本開示に記載される非遊離可能であるスカフォールディング部分、例えばＰＥＧなどをさらに含む。
【００２８】
したがって、本発明は、非ホルモン性ビタミンＤ標的指向基の３位炭素で治療用化合物にコンジュゲートされた非ホルモン性ビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基を含む、担体−薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、非ホルモン性ビタミンＤは、炭素１位置ではヒドロキシル化されていない。好ましい実施態様では、標的指向基は、約１００から２００，０００Ｄａであり、かつ、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含有する修飾基、水溶性ポリマー、低分子炭素鎖リンカー、および追加の治療用化合物からなる群から選択されるスカフォールドを介して、治療用化合物にコンジュゲートされる。
【００２９】
別の実施態様では、本発明は、スカフォールドを介して非ホルモン性ビタミンＤ標的指向基の３位炭素で治療用化合物にコンジュゲートされた非ホルモン性ビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基を含む担体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。好ましい実施態様では、担体は、循環中の前記治療用化合物の吸収、バイオアベイラビリティ、または半減期を増大する。別の好ましい実施態様では、非ホルモン性ビタミンＤは、１位炭素ではヒドロキシル化されていない。該医薬組成物の別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含有する修飾基、水溶性ポリマー、低分子炭素鎖リンカー、および追加の治療用化合物からなる群から選択される。
【００３０】
別の好ましい実施態様では、治療用化合物は、小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然に存在するタンパク質、天然に存在しないタンパク質、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、ステープルペプチド、モルホリノ、ホスホロジアミデートモルホリノ、オリゴヌクレオチド、アンチセンス薬、ＲＮＡに基づくサイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素をコンジュゲートさせた抗体、抗体−薬物コンジュゲート、代謝エフェクター、鎮痛薬、解熱薬、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌薬、筋骨格薬、心血管治療薬、腎薬物、肺薬物、消化器疾患薬、血液系作用薬、泌尿器薬物、代謝薬物、肝薬物、神経薬、抗糖尿病薬、抗癌薬、胃の状態を治療するための薬物、結腸の状態を治療するための薬物、皮膚の状態を治療するための薬物、およびリンパ状態を治療するための薬物からなる群から選択される。
【００３１】
より好ましい実施態様では、治療用化合物は、配列番号１または１６との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アペリン活性を有するタンパク質である。別のより好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別のより好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００３２】
本発明は、治療用化合物が、配列番号２、３、４、および５からなる群から選択されるタンパク質との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、グレリン活性を有するタンパク質であり得るということを提供する。より好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。他のより好ましい実施態様では、治療用化合物は、配列番号２、３、４、または５のアミノ酸配列を含むタンパク質である。別のより好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００３３】
本発明は、配列番号１０または１７との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＰＴＨ活性を有するタンパク質を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００３４】
本発明は、インスリン活性を有するタンパク質を含み、かつ配列番号１１または１２との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含む、医薬組成物を提供する。好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００３５】
本発明の一実施態様では、治療用化合物は、抗体である。好ましい実施態様では、該抗体は、配列番号１３との少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質に、高い親和性で結合する。別の好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００３６】
本発明は、治療用化合物がＲＮＡ分子であることを企図する。好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００３７】
本発明は、治療用化合物を必要としている患者を治療する方法であって、本発明に記載する有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、治療用化合物は、小分子、化学物質、核酸、核誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然に存在するタンパク質、天然に存在しないタンパク質、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、ステープルペプチド、モルホリノ、オリゴヌクレオチド、モルホリノ、アンチセンス薬、ＲＮＡに基づくサイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素をコンジュゲートさせた抗体、抗体−薬物コンジュゲート、代謝エフェクター、鎮痛薬、解熱薬、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌薬、筋骨格薬、心血管治療薬、腎薬物、肺薬物、消化器疾患薬、血液系作用薬、泌尿器薬物、代謝薬物、肝薬物、神経薬、抗糖尿病薬、抗癌薬、胃の状態を治療するための薬物、結腸の状態を治療するための薬物、皮膚の状態を治療するための薬物、およびリンパ状態を治療するための薬物からなる群から選択される。
【００３８】
前記方法の一実施態様では、治療用化合物は、配列番号１または１５との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アペリン活性を有するタンパク質である。好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００３９】
方法の別の実施態様では、治療用化合物は、配列番号２、３、４、および５からなる群から選択されるタンパク質との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、グレリン活性を有するタンパク質である。好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。他の好ましい実施態様では、治療用化合物は、配列番号２、３、４、または５のアミノ酸配列を含むタンパク質である。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００４０】
方法の別の実施態様では、治療用化合物は、配列番号１０または１６との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＰＴＨ活性を有するタンパク質である。好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００４１】
方法の別の実施態様では、治療用化合物は、配列番号１１との少なくとも９０％の配列同一性または配列番号１２との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、インスリン活性を有するタンパク質である。好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００４２】
方法の別の実施態様では、治療用化合物は、抗体である。好ましい実施態様では、該抗体は、配列番号１３との少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質に、高い親和性で結合する。別の好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００４３】
方法の別の実施態様では、治療用化合物は、ＲＮＡ分子である。好ましい実施態様では、標的指向基は、１位炭素ではヒドロキシル化されていないビタミンＤである。別の好ましい実施態様では、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）である。
【００４４】
本発明の方法は、医薬組成物が、経皮、経口、非経口、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、頭蓋内注射、注入、吸入、眼（ｏｃｕｌａｒ）、局所、直腸内、経鼻、頬側、舌下、膣内、または埋め込み式リザーバー様式によって患者に送達されるということを提供する。
【００４５】
本発明は、医薬品を必要としている患者の治療のための前記医薬品の製造のための医薬組成物を提供する。
【００４６】
本発明は、本明細書に開示した医薬組成物を製造する方法であって、標的指向基と治療用化合物とをコンジュゲートする（ここでは、コンジュゲートステップは、カップリング基を利用する）ことを含む方法を提供する。好ましい実施態様では、カップリング基は、アミン反応性の基、チオール反応性の基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、二官能性クロスリンカー、ＮＨＳ−マレイミド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。したがって、本発明は、方法から得られる医薬組成物を提供する。ここでは、医薬組成物は、チオール結合、アミド結合、オキシム結合、ヒドラゾン結合、およびチアゾリジノン結合からなる群から選択される結合を含有する担体−薬物化合物を含む。別の実施態様では、コンジュゲートステップは、付加環化反応によって実現される。
【００４７】
本発明は、式Ｉを含む医薬担体を提供する。
【化１】
2017533906.tif 000002
式中、
Ｂは、３位炭素でＬ１にコンジュゲートした非ホルモン性ビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基であり；
Ｓは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカー含有修飾基、ポリ乳酸、水溶性ポリマー、低分子炭素鎖リンカー、または追加の治療的部分を含むスカフォールド部分であり；
Ｃは、アミン反応性の基、チオール反応性の基、マレイミド基、チオール基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、４−ニトロフェニルエステル、アシルイミダゾール、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、および二官能性クロスリンカー（ＮＨＳ−マレイミドなど）、またはこれらの組み合わせであり；
（Ｌ）ａおよび（Ｍ）ｂは、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり；
ａは、０〜４の整数であり；
ｂは、０〜４の整数であり；
ｎは、０〜３の整数である。
【００４８】
本発明は、式Ｖ
【化２】
2017533906.tif 000003
を含む医薬担体を提供する。
【００４９】
本発明は、式ＶＩ
【化３】
2017533906.tif 000004
を含む医薬担体を提供する。
【００５０】
本発明は、式ＶＩＩ
【化４】
2017533906.tif 000005
を含む医薬担体を提供する。
【００５１】
本発明は、治療用化合物、安定的に付着されたスカフォールド、標的指向基（これは、３位炭素でコンジュゲートされた非ホルモン性ビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である）を含む、医薬組成物を提供する。ここでは、第１の試験対象への投与後に、治療用化合物は、複数の時点で採取された血液試料のＥＬＩＳＡ分析によって測定される、安定的に付着されたスカフォールド部分および標的指向基を有しない、第２の試験対象に投与された治療用化合物の半減期よりも長い半減期（複数の時点で採取された血液試料のＥＬＩＳＡ分析によって測定される）を有する。好ましい実施態様では、第１および第２の対象への投与は、皮下注射によって実現される。別の好ましい実施態様では、スカフォールドおよび標的指向基に、安定的に付着された治療用化合物は、機能分析によって測定された場合に、スカフォールドおよび標的指向基に安定的に付着されていない治療用化合物と実質的に同じ活性を保持する。
【００５２】
医薬組成物の別の好ましい実施態様では、スカフォールド質量範囲は、１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．、２００Ｄａ．から１５，０００Ｄａ．、３００Ｄａ．から１０，０００Ｄａ．、４００Ｄａ．から９，０００Ｄａ．、５００Ｄａ．から５，０００Ｄａ．、６００Ｄａ．から２，０００Ｄａ．、１０００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、２０，００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、１００，０００から２００，０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．から１００，０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．から８０，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．から６０，０００Ｄａ．、および２０，０００Ｄａ．から４０，０００Ｄａからなる群から選択される。より好ましい実施態様では、スカフォールドは、治療用化合物とほぼ同じ質量である。
【００５３】
本発明は、治療用化合物に非遊離可能にコンジュゲートされたビタミンＤ、類似体、またはその代謝産物である標的指向基を含む、担体−薬物コンジュゲートを提供する。好ましい実施態様では、ビタミンＤは、非ホルモンである。より好ましい実施態様では、非ホルモン性ビタミンＤは、１位炭素ではヒドロキシル化されていない。より好ましい実施態様では、治療用化合物は、非ホルモン性ビタミンＤ標的指向基の３位炭素でコンジュゲートされる。より好ましい実施態様では、治療用化合物は、機能分析によって測定された場合に、標的指向基にコンジュゲートされていない治療用化合物と実質的に同じ活性を保持する。より好ましい実施態様では、標的指向基は、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含有する修飾基、水溶性ポリマー、低分子炭素鎖リンカー、および追加の治療用化合物からなる群から選択されるスカフォールドを介して、治療用ペプチドまたは前記治療用核酸にコンジュゲートされる。より好ましい実施態様では、スカフォールドは、治療用化合物とほぼ同じ質量である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】担体、すなわちビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−アルデヒド付加物を作製するために使用される化学構造および合成を示す反応スキーム。担体は、１）ビタミンＤ類似体、２）ＰＥＧスカフォールド、および３）アルデヒドカップリング基をコンジュゲートすることによって作製される。
【図２】担体、すなわちビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド付加物を作製するために使用される化学構造および合成を示す反応スキーム。担体は、１）ビタミンＤ類似体、２）ＰＥＧスカフォールド、および３）マレイミドカップリング基をコンジュゲートすることによって作製される。
【図３】担体、すなわちビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ１．３ｋ−ＮＨＳ付加物を作製するために使用される化学構造および合成を示す反応スキーム。担体は、１）ビタミンＤ類似体、２）ＰＥＧスカフォールド、および３）ＮＨＳカップリング基をコンジュゲートすることによって作製される。
【図４】ＡＰＪ受容体を発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるフォルスコリン刺激性のｃＡＭＰ産生の阻害を測定する、アペリン機能分析。アペリン−１３、ビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−アペリン、およびビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アペリンを試験した。アペリンの機能活性（ＥＣ５０）は、曲線の４パラメータロジスティック関数適合から決定した。
【図５】アペリンおよびアペリンコンジュゲートの薬物動態。単独のまたはビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体若しくはビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−アルデヒド担体にコンジュゲートされたアペリンを、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、０．１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。血漿試料を、ＥＬＩＳＡによるアペリン濃度について、２連で分析し、３動物からの平均値を、片対数グラフにプロットした。
【図６】６Ａ−Ｂは、（Ａ）ビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体およびビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体にコンジュゲートされたグレリンの、非修飾グレリンと比較した場合の薬物動態の向上。全（実線）グレリンと活性な（破線）グレリンを、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットへの静脈内注射後に比較した。（Ｂ）ビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体にコンジュゲートされたグレリンを、非修飾グレリンと、皮下注射後のラットにおいて、ｔ＝０および４８時間で様々な用量で比較した。
【図７】皮下注射によって送達された、全（実線）グレリンおよび活性な（破線）グレリン、ならびにグレリンコンジュゲートの、薬物動態およびバイオアベイラビリティ。ビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体およびビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体へのコンジュゲーションは、コンジュゲートされていないグレリンに勝る有意な向上を示した。ただし、ビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体は、ビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体と比較して、優れたバイオアベイラビリティおよび薬物動態特性を示した。
【図８】単独のまたはビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体およびビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体を伴うＰＥＧ２ｋにコンジュゲートされたグレリンの静脈内（実線）および皮下（破線）注射の薬物動態プロファイル。
【図９】グレリン、およびビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体のグレリンコンジュゲート治療は、癌悪液質のモデルとしてＹｏｓｈｉｄａ  ＡＨ１３０腹水肝癌細胞を有するラットにおける体重減少を逆行させる。
【図１０】ビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−ＰＴＨおよびビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−ＰＴＨ薬物動態を、ラットにおける皮下注射時に、非修飾ＰＴＨ（１−３４）と比較した。
【図１１】ビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−ＦＧＦ２１およびビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−ＦＧＦ２１薬物動態を、ラットにおける皮下注射時に、非修飾ＦＧＦ２１と比較した。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、非ホルモン性ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体、またはビタミンＤ代謝産物である標的指向基を含む、担体−薬物コンジュゲートを提供する。例として、炭素１（Ｃ１）位置ではヒドロキシル化されていないビタミンＤに基づく分子が挙げられる。担体は、炭素３（Ｃ３）位で治療用化合物に連結される。本明細書に開示する通り、担体基は、非ホルモン性ビタミンＤ型が使用される、また、治療用化合物が３位炭素に連結される場合に、驚くほど有効である。理論に拘泥されることを望まないが、ホルモン形態のビタミンＤは、高カルシウム血症の誘発により有毒である可能性があるので、本明細書に記載する担体には適していないと考えられている。また、ホルモン型は、細胞におけるビタミンＤ受容体と結合するので、担体−薬物コンジュゲートを望ましくない細胞または組織に不適切に標的化する可能性がある。対照的に、非ホルモン性ビタミンＤ型は、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）と結合し、より長く循環を続ける。
【００５６】
担体分子は、本明細書に記載した化学、本明細書にその内容全体が組み込まれる国際公開第２０１３１７２９６７号パンフレットに記載された化学、または当技術分野で他に知られているものを使用して治療用化合物に付着される。担体は、治療用化合物の効力、吸収、バイオアベイラビリティ、循環半減期または薬物動態特性を向上させる。特定の実施態様では、担体は、特に、標的指向基と治療用化合物との間の非遊離可能「スペーサー」として作用する、「スカフォールド」として本明細書で記載することとなるものをさらに含む。他の実施態様では、担体は、スカフォールドを欠いている。
【００５７】
担体は、ヒトおよび動物における使用に適しているように設計される。担体は、担体にカップリングされた、コンジュゲートされた、または融合された生物または化学物質の薬物動態特性を向上させるという目的を果たす。これは、標的指向基とＤＢＰとの相互作用を通して生じる。ＤＢＰは、投与部位から循環血漿まで、分子を迅速かつ効果的に能動輸送することができ、それによって、分解酵素への薬物の曝露を低下させることができる。担体はまた、ＤＢＰに結合することによって、薬物の循環半減期を向上させる。これは、腎臓濾過および他の排出プロセスを妨げることによって、薬物の効力および治療有効性を増大させる。
【００５８】
この新しいクラスの治療法の、患者の健康に対する影響は、深刻であるだろう。癌悪液質のためのグレリン、肺動脈性肺高血圧症、糖尿病、および心臓病のためのアペリン、および副甲状腺機能低下症のためのＰＴＨなどの、重篤な状態については以前に使用不可能であった多くの治療法を、本発明の適用によって実現することができる。糖尿病を治療するためのインスリンおよびＧＬＰ１などの他の現在の治療法の改善は、患者の健康および便利さに大きな影響を与えることができた。多くの疾患が、ＲＮＡｉに基づく治療から恩恵を受けることができる。これらには、黄斑変性症およびハンチントン病などの疾患が含まれる。さらに、ある種の癌、肝疾患、および感染症（呼吸器多核体ウイルス、単純ヘルペスウイルス２型、ＨＩＶ、Ａ型およびＢ型肝炎、インフルエンザ、および麻疹を含めて）も、ＲＮＡｉに基づく治療から恩恵を受けることができる。
【００５９】
本発明の１以上の実施態様を説明および主張する際には、下に記載する定義に従って、次の専門用語が使用されることとなる。
【００６０】
用語「吸収」は、薬物の血流への移動である。薬物は、何らかの投与経路（例えば、経口、局所若しくは経皮、皮下、筋肉内、または静脈内）を介して、或いは、錠剤、貼付剤、カプセル剤、または液剤などの特定の剤形で、導入される必要がある。
【００６１】
用語「拮抗剤」は、リガンドの場合１つ以上の受容体に結合し、又は受容体の場合に１つ以上のリガンドに結合することを含む、特定又は指定されたタンパク質の活性を、中和し、遮断し、阻害し、無効にし、低減し、干渉できる分子を意味する。拮抗剤には、抗体及びその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチドミメティクス、薬理的薬剤（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ）及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などがある。拮抗剤には、タンパク質、ホルモン、又は他の生物活性分子の小分子阻害剤もある。拮抗剤は、融合タンパク質、受容体分子、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、又はタンパク質、ホルモン、若しくは他の生物活性分子に特異的に結合して標的へのその結合を封鎖する誘導体でもよい。
【００６２】
「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、類似の構造的特徴を有する糖タンパク質を意味する。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、全般的に抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低レベルで産生され、骨髄腫により増加したレベルで産生される。
【００６３】
「アプタマー」は、特定の標的に結合するように選択された核酸系化合物である。アプタマー系治療化合物の例は、引用により本明細書にその全体として組み込まれる国際公開第０７／０３５９２２号パンフレットに見ることができる。
【００６４】
用語「バイオアベイラビリティ」は、全身循環に到達する未変化の薬物の投与された投与量の分率であり、薬物の主要な薬物動態的性質の１つである。医薬が静脈内に投与される場合、そのバイオアベイラビリティは１００％である。医薬が他の経路により（経口など）投与される場合、そのバイオアベイラビリティは一般的に低下するか（不完全な吸収及び初回通過代謝により）、又は患者により様々になり得る。バイオアベイラビリティは、非静脈内投与経路の用量を計算する場合に考慮される、薬物動態において重要なパラメータである。
【００６５】
「担体」は、治療化合物にコンジュゲートされ、融合され、結合され、又は共に製剤されて、薬物の吸収、半減期、バイオアベイラビリティ、薬物動態的性質、又は薬力学的性質を向上させることができる化合物である。それらは、標的化基、結合基、及び任意選択的にスカフォールド部分を含む。いくつかの実施態様では、担体は、治療用化合物を皮下注射の部位から循環に運ぶ、また、治療用化合物を循環内で長期間運ぶことができる。
【００６６】
「有効量」は、必要な用量及び期間で、所望の治療的又は予防的な結果を得るのに効果的な治療化合物の量を意味する。治療化合物の「治療上有効な量」は、個人の病態、年齢、性別、及び体重などの因子により変わり得る。治療上有効な量は、例えば、向上した生存率、より迅速な回復若しくは寛解、症状の改善若しくは解消、又は他の許容できるバイオマーカー若しくは代用マーカーにより測定できる。治療上有効な量は、治療化合物の有毒又は有害な作用より、治療上利益のある効果が上回るものでもある。「予防上有効な量」は、必要な用量及び期間で、所望の予防的な結果を得るのに効果的な治療化合物の量を意味する。必ずではないが典型的には、予防的な投与量は対象において疾病の前又は初期に利用されるので、予防上有効な量は治療上有効な量より少ないだろう。
【００６７】
「半減期」は、被験分子の量の半分がもはや検出されない経過時間の量を意味する、当技術分野に公知である科学用語である。インビボ半減期は、被験分子の半分が、ヒト又は動物の循環している血清又は組織にもはや検出されない経過時間を意味する。
【００６８】
「ホルモン」は、ある細胞（又は細胞の群）と他の細胞の間で連絡を取り合う生物学的又は化学的メッセンジャーである。本明細書に記載される通り、本発明に使用するホルモンは、ペプチド、ステロイド、フェロモン、インターロイキン、リンフォカイン、サイトカイン、又は当技術分野に公知である他のホルモンクラスのメンバーであり得る。
【００６９】
「ホモログ」は、ヌクレオチド配列レベル、ペプチド配列レベル、機能的レベル、又は構造的レベルで基準分子に類似である生物活性分子である。ホモログは、基準配列と特定のパーセントの同一性を共有する配列誘導体を含み得る。そのため、一実施形態において、ホモログ配列又は誘導配列は、少なくとも７０パーセントの配列同一性を共有する。好ましい実施形態において、ホモログ配列又は誘導配列は、少なくとも８０又は８５パーセントの配列同一性を共有する。より好ましい実施形態において、ホモログ配列又は誘導配列は、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を共有する。ホモログ核酸配列又は誘導核酸配列は、ハイストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で基準核酸配列に結合したままでいる能力によっても定義できる。基準分子に構造的又は機能的類似性を有するホモログは、基準分子の化学的誘導体であり得る。構造的又は機能的なホモログ並びに誘導体を検出、発生、及びスクリーニングする方法は、当技術分野に公知である。
【００７０】
「ハイブリダイゼーション」は、一般的には、相補鎖が環境中にある場合、その融解温度未満で、変性したＤＮＡがリアニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列の間の望まれる相同性の程度が高いほど、利用可能な相対温度は高くなる。結果として、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向となり、より低い温度は、ストリンジェンシーを低くする傾向になることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明には、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照されたい。
【００７１】
「個人」、「対象」、又は「患者」は、脊椎動物である。特定の実施形態において、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、霊長類（ヒト及びヒト以外の霊長類を含む）及びげっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、モルモット、及びラット）があるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、哺乳動物はヒトである。「対照対象」は、個人、対象、又は患者に確認された疾病、機能不全、又は病態があると診断されていない健康な対象を意味する。対照対象には、疾病、機能不全、又は病態に関連する徴候又は症状が全くない。
【００７２】
「医薬品」は、疾病、障害、又は病態の治療のために製造された活性薬物である。
【００７３】
「モルホリノ」は、引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第８，０７６，４７６号明細書に記載されている、ホスホロジアミデート結合を利用する、天然の核酸の非天然バリアントである合成分子である。
【００７４】
「核酸」は、細胞機能を支配し得る遺伝情報を保持する高分子の群、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそのバリアントのいずれかである。核酸は、酵素様活性を持つことがあり（例えばリボザイム）、又は対象の遺伝子発現の阻害に使用されることもある（例えばＲＮＡｉ）。本明細書に記載される本発明に使用される核酸は、一本鎖でも、二本鎖でも、直鎖でも、環状でもよい。本発明は、アプタマー、ＰＮＡ、モルホリノ、又は核酸の他の非天然バリアントを含むがこれらに限定されない核酸バリアントの使用をさらに組み込む。例としては、本発明に有用な核酸は、引用によりその全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，０７６，４７６号明細書に記載されている。
【００７５】
「患者の反応」又は「反応」は、非限定的に下記を含む、患者にとっての利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価できる、（１）安定化、緩徐化及び完全な停止を含む、疾病の進行のある程度の阻害；（２）疾病エピソード及び／又は症状の数の低減；（３）隣接周辺臓器及び／又は組織への疾病細胞の浸潤の阻害（すなわち、低減、緩徐化、又は完全な停止）；（４）疾病の広がりの阻害（すなわち、低減、緩徐化、又は完全な停止）；（５）自己免疫状態の低下；（６）疾病に関連するバイオマーカーの発現の有利な変化；（７）疾病に関連する１つ以上の症状のある程度の緩和；（８）治療後の無病表示（ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の長さの増加；又は（９）治療後のある時点での死亡率低下。
【００７６】
本明細書では、用語「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドである。用語ペプチドは、短鎖ペプチドも（例えば、２〜１４個のアミノ酸を含むペプチド）、中鎖ペプチド（１５〜５０）も、長鎖ペプチド（例えば、タンパク質）も含む。用語ペプチド、中鎖ペプチド、及びタンパク質は本明細書では互換的に使用できる。本明細書では、用語「ペプチド」は、アミノ酸残基から構成されたポリマー、関連する天然の構造的バリアント、及びペプチド結合で結合した合成の非天然アナログ、関連する天然の構造的バリアント、及びその合成の非天然アナログを意味すると解釈される。合成ペプチドは、例えば、自動ペプチド合成機を使用して合成できる。ペプチドは、細胞、細菌、酵母、又は他の生物などの他の手段によっても合成できる。ペプチドは、遺伝子がコードした２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含むことがある。ペプチドは、プロセシング及び他の翻訳後修飾などの天然のプロセスにより修飾されたものも、化学修飾技術により修飾されたものも含む。そのような修飾は、基本的な教科書及びより詳述されたモノグラフに詳細に記載されており、当業者に周知である。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、ペプチド内のどこにでも起こる。
【００７７】
本明細書では、「薬学的に許容できる担体」又は「治療上有効な担体」は、水性又は非水性（固体）、例えばアルコール性又は油性、又はこれらの混合物であり、界面活性剤、軟化薬、潤滑剤、安定剤、染料、香料、保存剤、ｐＨ調整用の酸若しくは塩基、溶媒、乳化剤、ゲル化剤、保湿剤、安定剤、湿潤剤、時間放出剤（ｔｉｍｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）、保水剤、又は特定の形態の医薬組成物に通常含まれる他の成分を含み得る。薬学的に許容できる担体は当技術分野に周知であり、例えば、水又は生理学的に緩衝された塩水などの水溶液、又は他の溶媒若しくはビヒクル、例えばグリコール、グリセロール、及びオリーブ油又は注射用有機エステルなどの油類がある。薬学的に許容できる担体は、例えば、特定の阻害剤の吸収を安定化又は増加させるように働く生理的に許容できる化合物、例えば、グルコース、スクロース又はデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸又はグルタチオンなどの酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは賦形剤を含み得る。
【００７８】
用語「薬物動態」は、治療化合物の吸収、分布、代謝、及び排泄の時間経過であると定義されている。向上した「薬物動態的性質」は、特定の治療化合物に望まれる１つ以上の薬物動態的性質を向上させることと定義される。例には、代謝又は分泌による排出を低減すること、薬物吸収を増加させること、半減期を延ばすこと、及び／又はバイオアベイラビリティを増加させることがあるが、これらに限定されない。
【００７９】
「ＰＮＡ」は、ＤＮＡ又はＲＮＡに類似の化学構造を持つペプチド核酸を意味する。ペプチド結合は、ヌクレオチド又はヌクレオシドを結合するために利用される。
【００８０】
「スカフォールド」は、他の分子を共有結合によってまたは非共有結合によって付着または構築させることができる分子である。本発明のスカフォールドは、標的指向基と薬物との間の「スペーサー」として作用することができる。スペーサーは、２つの別の分子的実体間の物理的距離を提供する分子的実体である。スカフォールドはまた、反応性の「リンカー」を含有することもできるし、薬物に加えて有益な治療的特性を有することもできる。リンカーは、ある分子的実体から別の分子的実体までの付着の部位である。したがって、本発明のスカフォールドは、例えば、ＰＥＧ、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、反応性リンカーを含有する修飾基、水溶性ポリマー、または治療用化合物であり得る。本発明のスカフォールドおよびリンカーは、安定（すなわち非遊離可能）である。非遊離可能リンカーは、遊離可能リンカーよりも安定な化学結合を有し、付着された分子的実体をインビボで付着されたままにする。しかし、特定の実施態様では、これは、特定の条件下で「遊離可能」であり得る。遊離可能リンカーは、固有の不安定性を有し、時間と共に、ある種の条件下で、付着された分子を遊離させる。
【００８１】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定可能であり、プローブの長さ、洗浄温度、及び塩の濃度に依存する経験的計算である。一般に、プローブが長いほど適切なアニーリングに高温が必要であり、プローブが短いほど低温が必要である。
【００８２】
本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」又は「ハイストリンジェンシー条件」は、以下により定義され得る：（１）洗浄に、低イオン強度及び高温を利用するもの、例えば、５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーションの間に、ホルムアミドなどの変性剤を利用するもの、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ６．５）と、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム；又は（３）４２℃での、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｌ／ｍ１）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを利用する溶液中での一晩のハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃での１０分間の洗浄、それに続いて、５５℃のＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる１０分間のハイ−ストリンジェンシー洗浄。
【００８３】
本明細書に開示される「治療化合物」は、対象に投与されて疾病若しくは機能不全を治療するか、又は他の方法で個人の健康に影響を与える小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然のタンパク質、非天然のタンパク質、糖タンパク質、及びステロイドを意味する。治療化合物の非限定的な例には、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体断片、抗体誘導体などのポリペプチド、代謝機能に影響する薬物、並びに、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス化合物、抗真菌化合物、心臓血管薬、腎機能、電解質代謝に影響する薬物、中枢神経系に作用する薬物、化学療法化合物、受容体作動剤、及び受容体拮抗剤などの有機化合物がある。治療化合物には、例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質、若しくはトランスフェリンなどの血漿タンパク質、又は赤血球若しくはリンパ球の表面に存在するタンパク質があるがこれらに限定されない血清因子などの細胞外分子がある。そのため、例示的な治療化合物は、小分子、化学物質、核酸、核酸誘導体、ペプチド、ペプチド誘導体、天然のタンパク質、非天然のタンパク質、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ステープルドペプチド、オリゴヌクレオチド、モルホリノ、アンチセンス薬、ＲＮＡ系サイレンシング薬、アプタマー、糖タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、血液凝固因子、抗体、抗体断片、抗体誘導体、毒素結合抗体、抗体−薬結合体、代謝エフェクター、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症剤、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、筋骨格の薬、心臓血管の薬、腎臓の薬、肺の薬、消化器疾患の薬、血液作用薬、泌尿器の薬、代謝作用薬、肝臓の薬、神経作用薬、抗糖尿病薬、抗癌剤、胃の病気を治療する薬、結腸の病気を治療する薬、皮膚病を治療する薬、及びリンパの病気を治療する薬を含む。本明細書での用語「治療化合物」は、基本的に、用語「薬物」又は「治療剤」と同じ意味を有する。
【００８４】
本明細書では、「治療」は、治療される個人又は細胞の自然の経過を変えようとする臨床介入を意味し、臨床病理の過程の前又はその間に実施できる。治療の望ましい効果には、疾病又はその状態若しくは症状の発生又は再発の予防、疾病の状態又は症状の緩和、疾病の直接又は間接の病理的な結果の減少、疾病進行の速度の低減、疾病状態の寛解又は軽減、軽快又は改善された予後の達成がある。いくつかの実施形態において、本発明の方法及び組成物は、疾病又は疾患の発生を遅延する試みに有用である。
【００８５】
「ビタミン」は、当技術分野における認識された用語であり、体の正常な成長及び活動のために微量で欠くことのできない脂溶性又は水溶性有機物質であると定義され、植物性又は動物性の食品又はサプリメントから自然に得られる。
【００８６】
「ビタミンＤ」は、脂溶性のセコステロイドの群である。いくつかの型（ビタマー）のビタミンＤが存在する。２つの主な型は、ビタミンＤ２すなわちエルゴカルシフェロール、およびビタミンＤ３すなわちコレカルシフェロールである。添え字のないビタミンＤは、ビタミンＤ２、Ｄ３、または当技術分野で知られている他の型を指す。ヒトでは、ビタミンＤは、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）またはエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）として摂取することができる。さらに、ヒトは、ビタミンＤを、日光曝露が十分である場合に、コレステロールから合成することができる。コレカルシフェロールは、肝臓またはインビトロで修飾されて、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（「２５−ヒドロキシビタミンＤ」）となり得る。２５−ヒドロキシビタミンＤは、腎臓またはインビトロで修飾されて、別のホルモン型の１，２５−ヒドロキシビタミンＤとなり得る。
【００８７】
「ビタミンＤ結合タンパク質」又は「ＤＢＰ」は、いろいろな活性の中でも、ビタミンＤ及びそのアナログに結合して、ビタミンがその活性型に修飾される肝臓及び腎臓中の部位に輸送できる、全哺乳動物に見られる自然に循環している血清タンパク質であり、それは、ビタミンＤをその種々の形態で、ヒトで平均３０日間循環した状態に保つ。ＤＢＰタンパク質配列は、配列番号１４に開示されており、ＤＢＰタンパク質配列をコードする例示的な核酸配列は、配列番号１５に開示されている。ＤＢＰは、複数の天然のアイソフォームを有する。例示的なアイソフォームは、公共の配列データベースで利用できる（例えば、受託番号ＮＭ＿００１２０４３０６．１、ＮＭ＿００１２０４３０７．１、ＮＭ＿０００５８３．３、ＢＣ０３６００３．１、Ｍ１２６５４．１、Ｘ０３１７８．１、ＡＫ２２３４５８、Ｐ＿００１１９１２３５．１、ＮＰ＿０００５７４．２、ＡＡＡ６１７０４．１、ＡＡＤ１３８７２．１、ＮＰ＿００１１９１２３６．１、ＡＡＡ１９６６２．２、Ｉ５４２６９、Ｐ０２７７４．１、ＥＡＸ０５６４５．１、ＡＡＨ５７２２８．１、ＡＡＡ５２１７３．１、ＡＡＢ２９４２３．１、ＡＡＤ１４２４９．１、ＡＡＤ１４２５０．１、及びＢＡＤ９７１７８．１）。
【００８８】
本発明は、ＤＢＰまたは機能性ＤＢＰバリアント、および、ＤＢＰ活性を実質的に保持する保存的または非保存的アミノ酸置換を含有するホモログと結合する、非ホルモン性ビタミンＤコンジュゲートを企図する。ＤＢＰ結合分子または機能性ＤＢＰバリアントは、公知の技術を使用して特定する、および公知の方法を使用して特徴付けることができる（Ｂｏｕｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．６（１０）：１０５１−７（１９９１）、Ｔｅｅｇａｒｄｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９（２）：２９３−２９９（１９９１）、ＭｃＬｅｏｄ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６４（２）：１２６０−７（１９８９）、Ｒｅｖｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：４６９−４７４（１９８５））。先の参考文献の全体を、参照によって本明細書に組み込む。
【００８９】
用語「水溶性」は、水にいくらかの検出可能な程度の溶解度を有する部分を意味する。水溶性を検出及び／又は定量化する方法は、当技術分野に周知である。例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などがある。
【００９０】
本発明は、タンパク質、ペプチド、他の生物製剤、核酸、及び小分子薬物の投与のための効果的な経路を与える。本発明は、経皮、経口、非経口、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、頭蓋内注射、注入、吸入、眼、局所、直腸、鼻腔内、頬側、舌下、膣内、又は埋め込みリザーバー方式による、薬物投与の効果的な経路をさらに与える。
【００９１】
さらに、本明細書に記載される本発明は、治療化合物に、標的結合活性、すなわち薬力学（ＰＤ）を維持する組成物及び方法を与える。それは、本明細書に記載される治療化合物の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを向上させる組成物及び方法もさらに与える。本発明は、同じ投与経路又は異なる投与経路を利用するが本明細書に記載される担体のない薬物の薬物吸収プロファイルと比べて、向上した薬物吸収プロファイルのための組成物及び方法をさらに与える。本発明は、同じ投与経路又は異なる投与経路を利用するが本明細書に記載される本発明のない薬物の薬物バイオアベイラビリティプロファイルと比べて、向上した薬物バイオアベイラビリティプロファイルのための組成物及び方法をさらに与える。本発明は、同じ投与経路又は異なる投与経路を利用するが本明細書に記載される本発明のない薬物の薬物半減期プロファイルと比べて、向上した薬物半減期プロファイルのための組成物及び方法をさらに与える。
【００９２】
本発明は、本明細書に記載される本発明のない薬物と比べて、より経済的または患者に好都合な薬物投与の代替経路も与える。
【００９３】
本明細書に開示する非ホルモン性ビタミンＤ担体は、連結された治療用化合物の吸収、半減期、バイオアベイラビリティ、または薬物動態特性を向上させることができる。理論に拘泥されることを望まないが、この担体は、体内の天然のＤＢＰに結合する性質を有する。ＤＢＰは、投与部位から循環血清まで、担体−薬物複合体を輸送することができる。ビタミンＤ−ＤＢＰ相互作用は、治療用化合物を循環内に長期間保持することができる。これは、身体からの排出を妨げ、体内の治療用化合物の曝露を増大させて、より長く持続する治療効果を実現することができる。さらに、非修飾型と比較した場合、担体にコンジュゲートされる場合に、より少ない用量の薬物が必要となる可能性がある。
【００９４】
本発明の治療用化合物・担体コンジュゲートは、典型的には、治療用化合物にそれぞれ付着された約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の標的指向基を有する。治療用化合物に付着された標的指向基のそれぞれの構造は、同じでも異なってもよい。好ましい実施態様では、１以上の標的指向基が、Ｎ−末端、Ｃ−末端、または治療用タンパク質の他の部分に、治療用化合物に安定的または非遊離可能に付着される。例えば、治療化合物担体コンジュゲートは、Ｎ末端に結合した標的化基及び追加的にリジン残基に結合した標的化基を含み得る。他の実施形態において、治療化合物担体コンジュゲートは、グリコシル化部位の一部としての糖残基などの修飾により、又はペプチドのアシル化部位上で治療用タンパク質に結合した標的化基、又はリン酸化部位若しくは当業者に周知の他の天然若しくは非天然の修飾に結合した標的化基を有する。上述の部位の組み合わせを利用する結合部位も企図される。本発明のある好ましい実施形態は、治療化合物のある特異的な部位で治療化合物に結合している標的化基を含む。他の好ましい実施形態において、タンパク質上の結合部位は、システインでも、リジンでも、Ｎ末端でも、Ｃ末端でもよい。
【００９５】
他の実施形態において、スカフォールドは、薬学的に許容できる担体である。好ましい実施形態において、スカフォールドは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療部分である。
【００９６】
一実施形態において、水溶性スカフォールド部分は、水に対していくらかの検出可能な程度の溶解度を有する。水溶性を検出及び／又は定量化する方法は、当技術分野に周知である。例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などがある。
【００９７】
ペプチドは、混合された配列を有しても、単一のアミノ酸、例えば、ポリ（リジン）で構成されていてもよい。例示的な多糖類はポリ（シアル酸）である。例示的なポリ（エーテル）はポリ（エチレングリコール）、例えば、ｍ−ＰＥＧである。ポリ（エチレンイミン）は例示的なポリアミンであり、ポリ（アクリル）酸は代表的なポリ（カルボン酸）である。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）でよい。しかし、他の関連ポリマーも本発明の実施での使用に好適であり、用語ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）の使用がこの点で包括的であり、排他的でないものとすることを理解されたい。用語ＰＥＧは、その形態のいずれにあるポリ（エチレングリコール）も含み、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分岐鎖ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（すなわち、１つ以上の官能基がポリマー骨格に懸垂しているＰＥＧ又は関連ポリマー）、又は中に分解性結合を有するＰＥＧを含む。ポリマー骨格は、直鎖でも分岐鎖でもよい。
【００９８】
分岐鎖ポリマー骨格は、一般的に当技術分野に公知である。典型的には、分岐鎖ポリマーは、中心の分岐コア部分及び中心分岐コアに結合した複数の直鎖ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、通常、エチレンオキシドを種々のポリオールに、例えばグリセロール、ペンタエリスリトール、及びソルビトールに付加して調製できる分岐鎖形態で使用されている。中心の分岐部分は、リジンなどのいくつかのアミノ酸からも誘導できる。分岐鎖ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして一般形態で表すことができるが、Ｒはグリセロール又はペンタエリスリトールなどのコア部分を表し、ｍはアームの数を表す。引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第５，９３２，４６２号明細書に記載されるものなどのマルチアームＰＥＧ分子もポリマー骨格として使用できる。
【００９９】
多くの他のポリマーも本発明に好適である。非ペプチド性で水溶性であり、２から約３００の末端を持つポリマー骨格は、本発明に特に有用である。好適なポリマーの例には、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリビニルピロリドン）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載のものなどのポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、並びにこれらのコポリマー、ターポリマー、及び混合物があるが、これらに限定されない。ポリマー骨格の各鎖の分子量はさまざまになり得るが、典型的には約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの範囲である。
【０１００】
他の実施形態において、スカフォールド部分は、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカーを含む修飾基、水溶性ポリマー、小型炭素鎖リンカー、又は追加の治療化合物でよい。一実施形態において、スカフォールド部分はヒト及び動物にとって非毒性である。他の実施形態において、スカフォールドは内在性の血清タンパク質である。他の実施形態において、スカフォールド部分は水溶性ポリマーである。他の実施形態において、スカフォールドは非天然ポリマーである。他の実施形態において、スカフォールドは、追加の部分（例えば、ＰＥＧ、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（アスパルテート）、生体分子、治療用部分、又は診断用部分）への共有結合により修飾されている天然の部分である。本発明のスカフォールドおよびリンカーは、安定（すなわち非遊離可能）である。しかし、特定の実施態様では、これは、特定の条件下で「遊離可能」であり得る。
【０１０１】
ＰＥＧなどの親水性ポリマーのコンジュゲーションは当技術分野に公知である。その最も通常の形態では、ＰＥＧは、各末端がヒドロキシル基である直鎖ポリマーである：ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ、式中、ｎは、典型的には、約３から約４０００の範囲である。好ましい実施形態において、ＰＥＧは、基本的に単分散である分子量分布を有する。他の好ましい実施形態において、ＰＥＧは直鎖ポリマーである。他の好ましい実施形態において、ＰＥＧは分岐ポリマーである。
【０１０２】
多くの末端官能化誘導体又は分岐誘導体並びに種々のサイズが当技術分野に公知であり、市販されている。例としては、ＰＥＧ又はＰＥＯのコンジュゲーションは、本明細書に記載並びにそれぞれ引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第７，８０３，７７７号明細書（Ｄｅｆｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）及び同第４，１７９，３３７号明細書（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の組成物及び方法を利用して実施できる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、小さめの治療化合物は小さめのスカフォールド部分と組み合わされ、大きめの治療化合物は大きめのスカフォールド部分と組み合わされる。しかし、小さめの治療化合物を大きめのスカフォールド部分と組み合わせることができ、逆も同様であることが企図される。小さめの治療化合物は、１Ｄａから１０ｋＤａの分子量を持つものと定義される。大きめの治療化合物は、１０ｋＤａから１０００ｋＤａの分子量を持つものと定義される。
【０１０４】
いくつかの実施態様では、低分子治療用化合物の分子量とほぼ等しいスカフォールドは、効果的な担体−薬物コンジュゲートをもたらす。有効性の向上は、さらにスカフォールドサイズを経験的に調整することによって得ることができる。理論に拘泥されることを望まないが、コンジュゲートの薬物動態特性および有効性は、スカフォールド（必要に応じてリンカーと組み合わせて）が、ＤＢＰ結合による薬物の立体障害の可能性を除去するのに十分に大きい場合に高めることができる（逆も同様）。したがって、治療用化合物は、その活性な領域が曝露されて機能活性に利用可能であり、かつ担体がＤＢＰと結合できるようにコンジュゲートされる。追加の実施態様は、治療薬の循環を延長する非遊離可能な付着を提供する。グレリンなどのいくつかの低分子ペプチド実施態様では、スカフォールドは、治療薬の分子量とほぼ等しいように選択することができる。抗体などのいくつかの巨大タンパク質実施態様では、スカフォールドは、ビタミンＤ担体とＤＢＰとの間の結合を可能にするのに十分に長いものであり得る。
【０１０５】
好ましい実施態様では、治療用化合物のコンジュゲーションは、コンジュゲーション後に、その活性の実質的にすべてを保持する。所与の治療薬の活性な領域は、当技術分野で知られている、または実験によって決定することができる。他の実施態様では、コンジュゲートは、担体に連結されながら、治療的に活性である。この実施態様は、循環の時間ならびにその有効性を最大にすることができる。
【０１０６】
本発明のスカフォールドは、例えば、１００ダルトン（Ｄａ．）、５００Ｄａ．、１０００Ｄａ．、２０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．、１５，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．、３０，０００Ｄａ．、４０，０００Ｄａ．又は６０，０００Ｄａ．の分子量を有し得る。本発明の一実施形態において、「小さい」スカフォールドは、約１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．であり得る。他の実施形態において、「大きい」スカフォールドは、約２０，０００Ｄａ．を超え約２００，０００Ｄａ．になり得る。好ましい実施形態において、スカフォールド部分は、約１００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．である。より好ましい実施形態において、スカフォールドは、約１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．、２００Ｄａ．から１５，０００Ｄａ．、３００Ｄａ．から１０，０００Ｄａ．、４００Ｄａ．から９，０００Ｄａ．、５００Ｄａ．から５，０００Ｄａ．、６００Ｄａ．から２，０００Ｄａ．、１０００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、２０，００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、１００，０００から２００，０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．から１００，０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．から８０，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．から６０，０００Ｄａ．、又は２０，０００Ｄａ．から４０，０００Ｄａ．である。スカフォールドのサイズは、吸収、バイオアベイラビリティ、循環半減期、またはコンジュゲートされた治療用化合物の有効性を最大にするために変えることができる。
【０１０７】
担体分子の他の構成要素は、好ましくは、スカフォールド又は担体に薬物を共有結合するのに使用される結合基を含む。本発明の結合基には、アミン反応性基、チオール反応性基、マレイミド基、チオール基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、及びＮＨＳ−マレイミドなどの二官能性架橋剤、これらの組み合わせ、又は当業者に周知である他の結合基がある。本発明の結合基は、チオール結合、アミド結合、オキシム結合、ヒドラゾン結合、チアゾリジノン結合を促進することができ、クリックケミストリーとも呼ばれる環化付加反応を利用して担体を治療化合物に結合することもできる。他の実施形態において、組成物は、好ましくは、スカフォールド分子の結合基に結合した１つ以上の治療化合物の組み合わせを含む。本発明のリンカーは、約４０〜１００ダルトンであり得る。好ましい実施態様では、リンカーは、約４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ダルトンであり得る。リンカーはまた、担体と治療用化合物との間の連結の安定性または遊離可能性に影響を与えるために変えることができる。
【０１０８】
ＮＨＳ基は、結合の部位で操作する必要なく、天然のペプチド及びタンパク質にカップリングするのに有用であると、当業者に公知である。ＮＨＳ基は、リジン残基などのアミン基を有するアミノ酸を含むほとんどのタンパク質及びペプチドへの結合を可能にする。タンパク質構造及び反応時間が、結合部位及び治療化合物にコンジュゲートされる担体分子の数に影響を与え得るので、ＮＨＳ基を利用すると担体コンジュゲーションの部位に柔軟性ができる。例としては、ＮＨＳ−担体と治療化合物のモル比を制御することにより、当業者は、治療化合物に結合する担体分子の数をいくらか制御することができ、そのため、望まれる場合、２つ以上の担体が、ある治療化合物にコンジュゲートするのが可能となる。
【０１０９】
治療化合物への担体のコンジュゲーションは、分子の溶液を、特定のモル比で、適合性のある溶液、緩衝液、又は溶媒を使用して混合することにより達成される。例えば、担体と治療化合物の約１：１、２：１、４：１、５：１、１０：１、２０：１、２５：１、５０：１、１００：１、１０００：１、又は約１：２、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：２５、１：５０、１：１００、若しくは１：１０００のモル比を利用できる。比率を変えれば、治療化合物に結合する個別の担体の数を変えることができ、結合の特定の部位を選択するのを助けることができる。担体の結合は、ｐＨ、緩衝剤、塩、及び温度にも依存し、他のパラメータの中でもこれらのパラメータを変えると、結合部位、結合する担体の数、及び反応のスピードに影響を与えることができる。例えば、反応にｐＨ６以下のｐＨを選択すると、担体のアルデヒドバージョンが選択的に治療用タンパク質又はペプチドのＮ末端にコンジュゲートするのを助けることができる。
【０１１０】
さらに、治療用化合物の実質的に同じ活性を保持するために、担体へのコンジュゲーションは、治療的機能を妨げない分子上の部位でなされることとなる。タンパク質については、アミノ末端、カルボキシ末端、または内部の反応性の高いアミノ酸へのコンジュゲーションを必要とする可能性がある。核酸については、５’末端、３’末端、または内部ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはこれらの誘導体へのコンジュゲーションを必要とする可能性がある。一実施態様では、担体は、ポリヌクレオチド分子への組み込みの前にヌクレオチドまたはヌクレオシドにコンジュゲートされる。
【０１１１】
特定の実施態様では、本発明は、式Ｉのものを含む担体を提供する：
【化５】
2017533906.tif 000006
式中：
Ｂは、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ関連代謝産物、ビタミンＤ関連代謝産物の類似体、ＤＢＰと結合するペプチド、抗ＤＢＰ抗体、抗ＤＢＰ抗体誘導体、ＤＢＰと結合するヌクレオチドアプタマー、またはＤＢＰと結合する低分子炭素に基づく分子から選択される標的指向基であり；
Ｓは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、チオレドキシン、免疫グロブリン、アミノ酸、核酸、グリカン、反応性リンカー含有修飾基、ポリ乳酸、水溶性ポリマー、低分子炭素鎖リンカー、または追加の治療的化合物を含むスカフォールド部分であり；
Ｃは、アミン反応性の基、チオール反応性の基、マレイミド基、チオール基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、４−ニトロフェニルエステル、アシルイミダゾール、ハロアセチル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、ＳＭＣＣ基、スルホＳＭＣＣ基、カルボジイミド基、および二官能性クロスリンカー（ＮＨＳ−マレイミドなど）、またはこれらの組み合わせであり；
（Ｌ）ａおよび（Ｍ）ｂは、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり；
ａは、０〜４の整数であり；
ｂは、０〜４の整数であり；
ｎは、０〜３の整数である。
【０１１２】
好ましい実施態様では、本発明は、式Ｉのものを含む担体を提供する：
【化６】
2017533906.tif 000007
式中：
Ｂは、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体、ビタミンＤ関連代謝産物、ビタミンＤ関連代謝産物の類似体、またはＤＢＰと結合する低分子炭素に基づく分子から選択される標的指向基であり；
Ｓは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、ポリ（プロピレングリコール）、ペプチド、血清アルブミン、アミノ酸、核酸、グリカン、ポリ乳酸、水溶性ポリマー、または低分子炭素鎖リンカーを含むスカフォールド部分であり；
Ｃは、マレイミド基、チオール基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、ヨードアセチル基、またはブロモアセチル基であり；
（Ｌ）ａおよび（Ｍ）ｂは、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり；
ａは、０〜４の整数であり；
ｂは、０〜４の整数であり；
ｎは、０〜３の整数である。
【０１１３】
より好ましい実施態様では、本発明は、式Ｉのものを含む担体を提供する：
【化７】
2017533906.tif 000008
式中：
Ｂは、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体、またはビタミンＤ関連代謝産物から選択される標的指向基であり；
Ｓは、ポリ（エチレングリコール）、ポリリジン、またはポリ（プロピレングリコール）を含むスカフォールド部分であり；
Ｃは、マレイミド基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、またはヨードアセチル基であり；
（Ｌ）ａおよび（Ｍ）ｂは、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり；
ａは、０〜４の整数であり；
ｂは、０〜４の整数であり；
ｎは、０〜３の整数である。
【０１１４】
最も好ましい実施態様では、本発明は、式ＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩＩｃのものを含む担体を提供する：
【化８】
2017533906.tif 000009
式中：
Ｂは、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体、またはビタミンＤ関連代謝産物から選択される標的指向基であり；
Ｓは、ポリ（エチレングリコール）、またはポリ（プロピレングリコール）を含むスカフォールド部分であり；
Ｃは、マレイミド基、ジスルフィド基、アルデヒド基、ＮＨＳ−エステル基、またはヨードアセチル基であり；
Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ｌ３は、−（ＣＨ２）ｏ−であり；
（Ｍ）ｂは、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＨＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−ＮＨ−から独立に選択されるリンカーであり；
ｂは、０〜４の整数であり；
ｎは、３であり；
ｏは、１である。
【０１１５】
参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０３１７８８号明細書では、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３の炭素２５（Ｃ２５）位置でのコンジュゲーションが例示されている。本発明は、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３の炭素Ｃ３位置でのコンジュゲーションを組み込む。これは、Ｃ２５コンジュゲートと比較して向上した半減期延長およびバイオアベイラビリティを与える。
【０１１６】
式ＩＩａの特定の最も好ましい実施態様では、Ｂは、式ＩＩＩによって表され、Ｓは、ポリ（エチレングリコール）であり、（Ｍ）ｂ−Ｃは、式ＩＶａによって表される。
【化９】
2017533906.tif 000010
【０１１７】
式ＩＩｂの特定の最も好ましい実施態様では、Ｂは、式ＩＩＩによって表され、Ｓは、ポリ（エチレングリコール）であり、（Ｍ）ｂ−Ｃは、式ＩＶｂによって表される。
【化１０】
2017533906.tif 000011
【０１１８】
式ＩＩｃの特定の最も好ましい実施態様では、Ｂは、式ＩＩＩによって表され、Ｓは、ポリ（エチレングリコール）であり、（Ｍ）ｂ−Ｃは、式ＩＶｃによって表される。
【化１１】
2017533906.tif 000012
【０１１９】
特定の最も好ましい実施形態において、Ｓは、約１００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．である。他の最も好ましい実施形態において、スカフォールド部分は、約１００Ｄａ．から２０，０００Ｄａ．、２００Ｄａ．から１５，０００Ｄａ．、３００Ｄａ．から１０，０００Ｄａ．、４００Ｄａ．から９，０００Ｄａ．、５００Ｄａ．から５，０００Ｄａ．、６００Ｄａ．から２，０００Ｄａ．、１０００Ｄａ．から２００，０００Ｄａ．、５０００Ｄａ．から１００，０００Ｄａ．、１０，０００Ｄａ．から８０，０００Ｄａ．、２０，０００Ｄａ．から６０，０００Ｄａ．、又は２０，０００Ｄａ．から４０，０００Ｄａ．である。
【０１２０】
具体的な実施形態において、本発明は、式Ｖにより表される担体を与える。
【化１２】
2017533906.tif 000013
【０１２１】
別の具体的実施態様では、本発明は、式ＶＩによって表される担体を提供する。
【化１３】
2017533906.tif 000014
【０１２２】
別の具体的実施態様では、本発明は、式ＶＩＩによって表される担体を提供する。
【化１４】
2017533906.tif 000015
【０１２３】
特定の実施態様では、本発明は、式Ｉの担体：
【化１５】
2017533906.tif 000016
を生成するための方法であって、式Ｉａの化合物：
【化１６】
2017533906.tif 000017
を式Ｉｂの化合物：
【化１７】
2017533906.tif 000018
と、アミドカップリング剤の存在下で反応させるステップ
を含む方法を提供する。式中、Ｂ、Ｓ、Ｃ、およびＬ１、Ｌ３、および（Ｍ）ｂは、上で定義した通りであり、Ｌ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【０１２４】
当業者は、式Ｉａの化合物を、遊離塩基としても、好適な塩形態としても使用できることを認識するだろう。好適な塩形態には、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、及びＡｃＯＨがあるが、これらに限定されない。
【０１２５】
任意の好適なアミドカップリング剤を使用して、式Ｉの化合物を形成できる。好適なアミドカップリング剤には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は単独で使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬（ｃｏ−ｒｅａｇｅｎｔ）と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の両方と共に使用される。当業者は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰ以外の共試薬を使用できることを認識するだろう。さらに、当業者は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するだろう。
【０１２６】
当業者は、任意の好適な脱離基を、好適なカップリング剤の存在下で、式Ｉｂのカルボン酸とカップリングさせて、式Ｉｃの活性なエステルを形成することができることを認識するであろう：
【化１８】
2017533906.tif 000019
式中、Ｒは、限定はされないが、イミダゾール、ＨＯＢＴ、ＮＨＳ、および４−ニトロフェノールを含めた、好適な脱離基である。好適なカップリング試薬としては、限定はされないが、ヨウ化２−クロロメチルピリジニウム、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、およびＴ３Ｐが挙げられる。
いくつかの実施態様では、本発明は、式Ｉの担体：
【化１９】
2017533906.tif 000020
を生成するための方法であって、式Ｉａの化合物：
【化２０】
2017533906.tif 000021
を式Ｉｃの化合物：
【化２１】
2017533906.tif 000022
と反応させるステップを含む方法を提供する。式中、Ｂ、Ｓ、Ｃ、Ｒ、およびＬ１、Ｌ３、および（Ｍ）ｂは、上で定義した通りであり、Ｌ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【０１２７】
当業者は、式Ｉａの化合物を、遊離塩基として、または好適な塩の形態として使用できることを認識するであろう。好適な塩の形態としては、限定はされないが、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、およびＡｃＯＨが挙げられる。
【０１２８】
特定の実施態様では、アミドカップリングは、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの塩基を用いて実施される。当業者は、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するであろう。
【０１２９】
特定の他の実施態様では、本発明は、式ＩＩａの担体：
【化２２】
2017533906.tif 000023
を生成するための方法であって、式Ｉａの化合物：
【化２３】
2017533906.tif 000024
を式Ｉｄの化合物：
【化２４】
2017533906.tif 000025
と、アミドカップリング剤の存在下で反応させて、式Ｉｅの化合物
【化２５】
2017533906.tif 000026
を形成するステップと；
式Ｉｅの第一級アルコールの、式ＩＩａのアルデヒド
【化２６】
2017533906.tif 000027
への酸化を含む方法を提供する。式中、Ｂ、Ｓ、Ｌ１、Ｌ３、（Ｍ）ｂ、ｂ、ｎ、およびｏは、上で定義した通りであり、Ｌ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であり、Ｃは、アルデヒド基である。
【０１３０】
任意の好適な酸化剤を使用して、式ＩＩａの化合物を形成することができる。好適な酸化剤としては、限定はされないが、コリンズ試薬、ＰＤＣ、ＰＣＣ、塩化オキサリル／ＤＭＳＯ（スワーン酸化）、ＳＯ３−ピリジン／ＤＭＳＯ（パリック−デーリング酸化）、デス−マーチン・ペルヨージナン、ＴＰＡＰ／ＮＭＯ、およびＴＥＭＰＯ／ＮａＯＣｌが挙げられる。
【０１３１】
当業者は、式Ｉａの化合物を、遊離塩基として、または好適な塩の形態として使用できることを認識するであろう。好適な塩の形態としては、限定はされないが、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、およびＡｃＯＨが挙げられる。
【０１３２】
任意の好適なアミドカップリング剤を使用して、式Ｉｅの化合物を形成できる。好適なアミドカップリング剤には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は単独で使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の両方と共に使用される。当業者は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰ以外の共試薬を使用できることを認識するだろう。さらに、当業者は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するだろう。
【０１３３】
特定の実施態様では、任意の好適な脱離基を、好適なカップリング試薬の存在下で、式Ｉｄのカルボン酸とカップリングさせて、式Ｉｆの活性なエステルを形成することができる：
【化２７】
2017533906.tif 000028
式中、Ｒは、限定はされないが、イミダゾール、ＨＯＢＴ、ＮＨＳ、および４−ニトロフェノールを含めた好適な脱離基である。好適なカップリング試薬としては、限定はされないが、ヨウ化２−クロロメチルピリジニウム、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、およびＴ３Ｐが挙げられる。
【０１３４】
いくつかの実施態様では、本発明は、式Ｉｅの担体：
【化２８】
2017533906.tif 000029
を生成するための方法であって、式Ｉａの化合物
【化２９】
2017533906.tif 000030
を式Ｉｆの化合物
【化３０】
2017533906.tif 000031
と反応させるステップと；
式Ｉｅの第一級アルコールの、式ＩＩａのアルデヒド
【化３１】
2017533906.tif 000032
への酸化を含む方法を提供する。式中、Ｂ、Ｓ、Ｃ、Ｒ、およびＬ１、Ｌ３、および（Ｍ）ｂは、上で定義した通りであり、Ｌ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【０１３５】
当業者は、式Ｉａの化合物を、遊離塩基として、または好適な塩の形態として使用できることを認識するであろう。好適な塩の形態としては、限定はされないが、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、およびＡｃＯＨが挙げられる。
【０１３６】
特定の実施態様では、アミドカップリングは、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの塩基を用いて実施される。当業者は、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するであろう。
【０１３７】
任意の好適な酸化剤を使用して、式ＩＩａの化合物を形成することができる。好適な酸化剤としては、限定はされないが、コリンズ試薬、ＰＤＣ、ＰＣＣ、塩化オキサリル／ＤＭＳＯ（スワーン酸化）、ＳＯ３−ピリジン／ＤＭＳＯ（パリック−デーリング酸化）、デス−マーチン・ペルヨージナン、ＴＰＡＰ／ＮＭＯ、およびＴＥＭＰＯ／ＮａＯＣｌが挙げられる。
【０１３８】
特定の他の実施態様では、本発明は、式ＩＩｃの担体：
【化３２】
2017533906.tif 000033
を生成するための方法であって、式Ｉａの化合物：
【化３３】
2017533906.tif 000034
を式Ｉｇの化合物：
【化３４】
2017533906.tif 000035
と反応させて、式Ｉｈの化合物
【化３５】
2017533906.tif 000036
を形成するステップと；
式Ｉｈのカルボン酸を式ＩＩｃの活性なエステル
【化３６】
2017533906.tif 000037
に転換するステップとを含む方法を提供する。式中、Ｂ、Ｓ、Ｃ、Ｒ、Ｌ１、（Ｍ）ｂ、ｂ、ｎ、およびｏは、上で定義した通りであり、Ｌ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
【０１３９】
当業者は、式Ｉａの化合物を、遊離塩基として、または好適な塩の形態として使用できることを認識するであろう。好適な塩の形態としては、限定はされないが、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、およびＡｃＯＨが挙げられる。
【０１４０】
好適な脱離基を、好適なカップリング試薬の存在下で、式Ｉｈのカルボン酸とカップリングさせて、式ＩＩｃの活性なエステルを形成することができる。好適な脱離基には、イミダゾール、ＨＯＢＴ、ＮＨＳ、及び４−ニトロフェノールがあるが、これらに限定されない。好適なカップリング試薬には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、式ＩＩｃの活性エステルは、好適な脱離基とカップリング試薬の組み合わせを使用して、式Ｉｈのカルボン酸から形成される。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、式ＩＩｃの活性エステルは、脱離基を生成しカップリング反応も起こす単一の試薬を使用して、式Ｉｈのカルボン酸から形成される。そのような試薬には、１，１’−カルボニルジイミダゾール、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル、トリフルオロ酢酸４−ニトロフェニル、及びＨＢＴＵがあるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、単一の試薬が単独で使用される。他の実施形態において、単一の試薬は、アシル転移触媒と共に使用される。そのようなアシル転移触媒には、ＤＭＡＰ及びピリジンがあるが、これらに限定されない。当業者は、追加のアシル転移触媒を使用してよいことを認識するだろう。
【０１４３】
具体的な実施形態において、本発明は、式Ｖ
【化３７】
2017533906.tif 000038
により表される担体を生成するための方法であって、式Ｖａの化合物：
【化３８】
2017533906.tif 000039
を、式Ｖｂの化合物：
【化３９】
2017533906.tif 000040
と反応させて、式Ｖｃの化合物；
【化４０】
2017533906.tif 000041
を形成するステップと、
ニトリル基を還元して、式Ｖｄのアミン；
【化４１】
2017533906.tif 000042
を形成するステップと、
式Ｖｄの化合物を式Ｖｅの化合物；
【化４２】
2017533906.tif 000043
と反応させて、式Ｖｆの化合物
【化４３】
2017533906.tif 000044
を形成するステップと、
式Ｖｆの第一級アルコールを酸化させて、式Ｖのアルデヒド
を形成するステップと
【化４４】
2017533906.tif 000045
を含む方法を提供する。
【０１４４】
いくつかの実施態様では、式Ｖｂの化合物と式Ｖａの化合物との反応は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｂの添加によって促進される。当業者は、アクリロニトリルへの求核付加を促進するために、他の試薬も使用することができることを認識するであろう。
【０１４５】
いくつかの実施態様では、式Ｖｃのニトリルの、式Ｖｄのアミンへの還元は、ＡｌＣｌ３／ＬＡＨを使用して実施される。当業者は、ナトリウム、Ｈ２／Ｐｄ、Ｈ２／ラネーニッケル、およびジボランを含めた他の還元試薬も使用できることを認識するであろう。
【０１４６】
当業者は、式Ｖｄの化合物を、遊離塩基として、または好適な塩の形態として使用できることを認識するであろう。好適な塩の形態としては、限定はされないが、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、およびＡｃＯＨが挙げられる。
【０１４７】
特定の実施態様では、式ＶｅのＮＨＳ−エステルと式Ｖｄのアミンとのカップリングを促進するために、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの塩基が使用される。当業者は、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するであろう。
【０１４８】
任意の好適な酸化剤を使用して、式Ｖの化合物を形成することができる。好適な酸化剤としては、限定はされないが、コリンズ試薬、ＰＤＣ、ＰＣＣ、塩化オキサリル／ＤＭＳＯ（スワーン酸化）、ＳＯ３−ピリジン／ＤＭＳＯ（パリック−デーリング酸化）、デス−マーチン・ペルヨージナン、ＴＰＡＰ／ＮＭＯ、およびＴＥＭＰＯ／ＮａＯＣｌが挙げられる。
【０１４９】
別の具体的実施態様では、本発明は、式ＶＩによって表される担体：
【化４５】
2017533906.tif 000046
を生成するための方法であって、式Ｖｄの化合物：
【化４６】
2017533906.tif 000047
を、アミドカップリング剤の存在下で、式ＶＩａの化合物：
【化４７】
2017533906.tif 000048
と反応させるステップを含む方法を提供する。
【０１５０】
当業者は、式Ｖｄの化合物を、遊離塩基として、または好適な塩の形態として使用できることを認識するであろう。好適な塩の形態としては、限定はされないが、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、およびＡｃＯＨが挙げられる。
【０１５１】
任意の好適なアミドカップリング剤を使用して、式ＶＩの化合物を形成できる。好適なアミドカップリング剤には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、単独で使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基と共に使用される。特定の実施形態において、アミドカップリング剤は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰなどの共試薬と、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミンなどの塩基の両方と共に使用される。当業者は、ＨＯＢＴ又はＤＭＡＰ以外の共試薬を使用できることを認識するだろう。さらに、当業者は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するだろう。
【０１５２】
別の具体的実施態様では、本発明は、式ＶＩＩによって表される担体：
【化４８】
2017533906.tif 000049
を生成するための方法であって、式Ｖｄの化合物：
【化４９】
2017533906.tif 000050
を、式ＶＩＩａの化合物：
【化５０】
2017533906.tif 000051
と反応させて式ＶＩＩｂの化合物；
【化５１】
2017533906.tif 000052
を形成するステップと；
式ＶＩＩｂのカルボン酸を式ＶＩＩの活性なエステル；
【化５２】
2017533906.tif 000053
に転換するステップとを含む方法を提供する。
【０１５３】
当業者は、式Ｖｄの化合物を、遊離塩基として、または好適な塩の形態として使用できることを認識するであろう。好適な塩の形態としては、限定はされないが、ＴＦＡ、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＭｓＯＨ、ＴｆＯＨ、およびＡｃＯＨが挙げられる。
【０１５４】
特定の実施態様では、式ＶＩＩａのＮＨＳ−エステルと式Ｖａのアミンとのカップリングを促進するために、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの塩基が使用される。当業者は、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン以外の塩基を使用できることを認識するであろう。
【０１５５】
ＮＨＳは、好適なカップリング試薬の存在下で式ＶＩＩｂのカルボン酸とカップリングして、式ＶＩＩの活性エステルを形成できる。好適なカップリング試薬には、２−クロロメチルピリジニウムヨージド、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ、ＴＢＴＵ、及びＴ３Ｐがあるが、これらに限定されない。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、式ＶＩＩの活性エステルは、ＮＨＳとカップリング試薬の組み合わせを使用して、式ＶＩＩｂのカルボン酸から形成される。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、式ＶＩＩの活性エステルは、脱離基を生成しカップリング反応も起こす単一の試薬を使用して、式ＶＩＩｂのカルボン酸から形成される。そのような試薬には、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルがあるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、単一の試薬が単独で使用される。他の実施形態において、試薬はアシル転移触媒と共に使用される。そのようなアシル転移触媒には、ＤＭＡＰ及びピリジンがあるが、これらに限定されない。当業者は、追加のアシル転移触媒を使用してよいことを認識するだろう。
【０１５８】
当業者は、リンカーおよびスカフォールドを、ビタミンＤ誘導体および類似体のＣ３位置にコンジュゲートするための他の方法が存在することを認識するであろう。例えば、Ｃ３ヒドロキシ基は、Ｎ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．Ｕｅｄａ，Ｊ．Ｋｉｔａｈｏｒｉ，ａｎｄ  Ｋ．Ｓｈｉｍａｄａ、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，５７，４８８−４９３（１９９２）；Ｊ．Ｇ．Ｈａｄｄａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，７１７４−７１８１（１９９２）；Ａ．Ｋｕｔｎｅｒ，Ｒ．Ｐ．Ｌｉｎｋ、Ｈ．Ｋ．Ｓｃｈｎｏｅｓ，Ｈ．Ｆ．ＤｅＬｕｃａ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１４，１３４−１４７（１９８６）；ならびにＲ．Ｒａｙ，Ｓ．Ａ．Ｈｏｌｉｃｋ，Ｎ．Ｈａｎａｆｉｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｆ．Ｈｏｌｉｃｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５，４７２９−４７３３（１９８６）によって実施される通りの様々な基によって、アシル化することができる。先の参考文献の全体を、参照によって組み込む。当業者は、これらの化学を変更して、式Ｉの化合物：
【化５３】
2017533906.tif 000054
（式中、Ｂ、Ｓ、Ｃ、（Ｌ）ａ、および（Ｍ）ｂは、上で定義した通りである）
を合成できることを認識するであろう。
【０１５９】
望まれる場合、異なる分子量を有する治療化合物担体コンジュゲートを、ゲル濾過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを使用して単離できる。ゲル濾過クロマトグラフィーを利用して、異なる分子量に基づいて（差異は、基本的に標的化基の平均分子量に相当する）、異なる治療化合物担体コンジュゲートを分別することができる（例えば、１−マー、２−マー、３−マーなど、ここで、「１−マー」は、治療化合物あたり１つの標的化基分子を示し、「２−マー」は治療化合物に結合した２つの標的化基を示す、など）。
【０１６０】
この種の分離を実施するのに好適なゲル濾過カラムには、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から入手できるＳｕｐｅｒｄｅｘ及びＳｅｐｈａｄｅｘカラムがある。特定のカラムの選択は、所望の分別範囲によるだろう。溶離は、一般的に、リン酸塩、酢酸塩などの好適な緩衝剤を使用して実施される。回収された分画は、いくつかの異なる方法、例えば、（ｉ）タンパク質含量に関して２８０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質分析、及び（ｉｉｉ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）により分析することができる。
【０１６１】
治療化合物担体コンジュゲートの分離は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）Ｃ１８カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＶｙｄａｃ）を利用して逆相クロマトグラフィーによっても、イオン交換カラム、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＤＥＡＥ−又はＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換カラムを利用してイオン交換クロマトグラフィーによっても実施できる。生じた精製された組成物は、好ましくは、標的化基にコンジュゲートされていない治療化合物を実質的に含まない。さらに、組成物は、好ましくは、他の非共有結合した標的化基の全てを実質的に含まない。
【０１６２】
本明細書に記載する通り、本発明の担体は、３’炭素上にカップリング基を有する非ホルモン性２５−ヒドロキシビタミンＤまたはその類似体であり得る。本明細書で使用する場合の「２５−ヒドロキシビタミンＤ類似体」には、天然に存在するビタミンＤ代謝産物型と他の化学的に改変された型との両方が含まれる。本発明の担体には、活性な（すなわちホルモン）型のビタミンＤ（一般的に１炭素にヒドロキシル基を有する）は含まれない。これらの化合物は、ビタミンＤの構造をベースにしており、親和性は様々であるが、ビタミンＤの一部の機能を保持している（すなわち、これらは、ＤＢＰと相互作用する）。次のリストは、当技術分野で知られているビタミンＤ類似体の型を例示する。しかし、これらは、ホルモン性である可能性も、Ｃ１ヒドロキシル基を有する可能性もある。これらは、その機能上のホルモン性の性質についてではなく、ビタミンＤ類似体としてのその化学的性質についてのみ、ここに示す：ＯＣＴ、すなわち側鎖の２２位に酸素原子を有する化学的に合成された型の１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（Ａｂｅ  ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２６：５８−６２（１９８７））；ジェミニ（Ｇｅｍｉｎｉ）ビタミンＤ類似体、すなわち１α，２５−ジヒドロキシ−２０Ｒ−２１（３−ヒドロキシ−３−ジュウテロメチル−４，４，４−トリジュウテロブチル）−２３−イン−２６，２７−ヘキサフルオロ−コレカルシフェロール（ＢＸＬ０１２４）（Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７９（３）：３６０−７（２０１１））；パリカルシトール、すなわち、すべての天然のビタミンＤ代謝産物中に見られる炭素−１９メチレン基を欠くビタミンＤ２誘導ステロール（Ｓｌａｔｏｐｏｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．２６：８５２（１９９５））；ドキセルカルシフェロール（１α−ヒドロキシビタミンＤ２）は、アルファカルシドール（１α−ヒドロキシビタミンＤ３）と同様に、肝臓内で１α，２５（ＯＨ）２Ｄ２にヒドロキシル化されるプロドラッグであるが、アルファカルシドールとは異なり、ドキセルカルシフェロールはまた、２４−ヒドロキシル化されて、１α，２４（Ｓ）−（ＯＨ）２Ｄ２（Ｋｎｕｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５３：８２９（１９９７））を生じる；インビボでヒドロキシル化されて２５（ＯＨ）ＤＨＴ２，１，２５（ＯＨ）２ＤＨＴ２になるジヒドロタキステロール２（ＤＨＴ２）（ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５５：５００（１９９９））、ＥＤ−７１、およびエルデカルシトール。Ｅｒｂｅｎ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌ，Ｎｅｕｒｏｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２（１）：５９−６９（２００１）およびＳｔｅｄｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１６（１０）：１９６５−１９６７（２００１）も参照のこと。先の参考文献の全体を、参照によって組み込む。
【０１６３】
他の実施形態において、担体は、標的化基及び治療化合物に共有結合した薬学的に許容できるスカフォールド部分をさらに含む。本発明の担体のスカフォールド部分は、治療化合物の機能に必ずしも関与しないが、機能に貢献することがあり、治療化合物の薬物動態的性質を向上させることがある。本発明のスカフォールドは、標的化基のＤＢＰへの結合に実質的に干渉しない。同様に、本発明のスカフォールドは、治療化合物の構造又は機能に実質的に干渉しない。スカフォールド部分の長さは、標的化基及び治療化合物の性質による。当業者は、種々の結合間の公知の距離に基づいて、種々の原子の組み合わせが可変の長さの分子を与えることを認識するだろう（引用により本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ，ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ，Ａｌｌｙｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（１９７７））。本発明によって企図される他のスカフォールドとしては、ペプチドリンカー、タンパク質リンカー（ヒト血清アルブミン若しくは免疫グロブリンファミリータンパク質またはこれらの断片など）、核酸リンカー、低分子炭素鎖リンカー、酸素または窒素が散在している炭素リンカー、またはこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施態様では、リンカーは、非遊離可能または安定である。
【０１６４】
治療用ペプチドも本発明の範囲内にある。用語ペプチドは、ひとつなぎのアミノ酸を含むように意図される。本発明のペプチド中のアミノ酸は、天然でも、非天然でもよい。本発明のペプチドは、化学的に合成されても生物学的に合成されてもよく、システインリッチペプチド、環状ペプチド、ステープルドペプチド、Ｄ−又はＬ−アミノ酸及びこれらの混合物を含むペプチド、ペプチドミメティクス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、並びにこれらの組み合わせを含んでよい。例示的な実施形態には、ＡＩＤＳワクチン、アレルギーワクチン、抗炎症ペプチド、抗インテグリンペプチド、抗ＴＣＲワクチン、抗アレルギーペプチド、抗癌ペプチド、抗真菌性ペプチド、抗菌性ペプチド、抗リウマチペプチド、抗トロンビンペプチド、抗ウイルスペプチド、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）リガンド及び関連ペプチド（例えば、セクレチンファミリー）、ＣＧＲＰ、ＧＰＣＲ拮抗剤、ＣＭＶペプチド、カルパイン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、ＤＡＰ阻害剤、ディフェンシン、透析性オリゴペプチド（ｄｉａｌｙｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、エンハンシン、エンドルフィン、エンドセリン拮抗剤、フィブロネクチン阻害剤、ガストリン拮抗剤、グレリン、グルカゴン拮抗剤、ゴナドレリンアナログ、成長因子ペプチド、視床下部ホルモン、下垂体ホルモン、腸の機能及び食欲を制御するペプチド、炎症誘発性脂肪組織産生物、幹細胞増殖を刺激するペプチド、炎症性ペプチド、天然物、単純ヘルペスワクチン、ヘパリン結合ペプチド、Ｂ型肝炎ワクチン、免疫調節性ペプチド、インフルエンザワクチン、ＬＨＲＨ拮抗剤、オピオイドペプチド誘導体、ＭＭＰ阻害剤、ＭＵＣ−１ワクチン、マラリアワクチン、メラノーマワクチン、髄膜炎ワクチン、神経ペプチド、オピオイドペプチド、骨形成ペプチド、骨粗鬆症ペプチド（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、パピローマウイルスワクチン、前立腺ガンワクチン、ＲＧＤペプチド、ＲＳＶワクチン、Ｔ細胞受容体ペプチドなどがある。本発明は、本明細書に記載される方法によるさらなる修飾により臨床製品として改良されるだろう、その合成アナログも企図する。当業者は、増加した半減期、作用持続時間、吸収、及び／又はバイオアベイラビリティを与える本明細書に記載される修飾を受ける余地がある多くの追加の商業的に重要なペプチドを認識するだろう。
【０１６５】
本明細書に記載される実施形態の範囲内にやはり企図されるのは、分岐鎖又は分岐があるか若しくは分岐がない環状の治療用ペプチドである。環状、分岐鎖、及び分岐のある環状ペプチドは、翻訳後の自然のプロセスから生じ、好適な合成法によっても作られる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意のペプチド生成物は、先に記載されたペプチドアナログを含み、それが次いでアルキル−グリコシド界面活性剤部分に共有結合する。
【０１６６】
他の実施態様は、天然および非天然のアミノ酸または天然のアミノ酸の類似体から構成される治療用ペプチド鎖を含む。本明細書で使用する場合、ペプチドおよび／またはタンパク質「類似体」は、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、およびメタ置換チロシンを含むチロシン類似体などの、天然のアミノ酸に基づく非天然のアミノ酸を含む。ここでは、チロシン上の置換基は、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、メチル基、イソプロピル基、Ｃ２〜Ｃ２０直鎖または分枝炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ハロゲン、ニトロ基などを含む。
【０１６７】
追加の実施態様は、修飾されたアミノ酸を有する治療用ペプチド鎖を含む。リジンのε−位置のアシル化されたアミノ酸の例としては、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、３−フェニルプロパン酸などの脂肪酸を有する、または、飽和または不飽和アルキル鎖を有するアミノ酸が挙げられる。（Ｚｈａｎｇ、Ｌ．ａｎｄ  Ｂｕｌａｊ，Ｇ．（２０１２）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９：１６０２−１６１８、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）。
【０１６８】
本発明は、天然および非天然のアミノ酸または天然のアミノ酸の類似体を含む治療用ペプチド鎖をさらに企図する。いくつかの実施態様では、ペプチドまたはタンパク質「類似体」は、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、およびメタ置換チロシンを含むチロシン類似体などの、天然のアミノ酸に基づく非天然のアミノ酸を含む。ここでは、チロシン上の置換基は、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、メチル基、イソプロピル基、Ｃ２〜Ｃ２０直鎖または分枝炭化水素、飽和または不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ハロゲン、ニトロ基などを含む。具体例には、２，４，６−トリメチル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｔｍｐ）、Ｏ−メチル−チロシン、３−（２−ナフチル）アラニン（Ｎａｌ（２））、３−（１−ナフチル）アラニン（Ｎａｌ（１））、３−メチル−フェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−フェニルアラニン、ｐ−アジド−フェニルアラニン、ｐ−アシル−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−フェニルアラニンなどがあるが、これらに限定されない。
【０１６９】
実施形態の範囲内にやはり企図されるのは、当技術分野に公知である非標準的又は非天然のアミノ酸を含む治療用ペプチド鎖であり、例えば、ＡｉｂなどのＣ−α−二置換アミノ酸、Ｃａ−ジエチルグリシン（Ｄｅｇ）、アミノシクロペンタン−１−カルボン酸（Ａｃ４ｃ）、アミノシクロペンタン−１−カルボン酸（Ａｃ５ｃ）などである。そのようなアミノ酸は、しばしばアルファヘリックス構造に偏る制限された構造になることが多い（Ｋａｕｌ，Ｒ．ａｎｄ  Ｂａｌａｒａｍ，Ｐ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ７：１０５−１１７、引用により本明細書にその全体として組み込まれる）。アナログ設計に有用な、そのような非天然のアミノ酸の追加例は、ホモ−アルギニン（Ｈａｒ）などである。特定の例における還元アミド結合の置換は、酵素的破壊からの保護の向上につながるか、又は受容体結合を変える。例としては、還元アミド結合を持つＴｉｃ−Ｐｈｅジペプチドユニットの残基の間への組み込みは（Ｔｉｃ−Ｆ［ＣＨ２−ＮＨ］＾−Ｐｈｅとして設計）、酵素分解を低減する。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、本発明のペプチドまたはタンパク質に、アミノまたはカルボキシル末端での修飾を、任意選択で導入することができる（Ｎｅｓｔｏｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｊｒ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：４３９９−４４１８）。例えば、本発明のペプチドまたはタンパク質は、Ｎ−末端で切断またはアシル化することができる（Ｇｏｕｒｌｅｔ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３５４：１０５−１  １  １、Ｇｏｚｅｓ，Ｉ．ａｎｄ  Ｆｕｒｍａｎ，Ｓ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ９：４８３−４９４、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）。Ｄ−ＰｈｅなどのＤ−アミノ酸の欠損または組み込みなどの、ペプチドまたはタンパク質のＮ−末端に対する他の修飾は、長鎖アルキルグリコシドなどの本明細書に記載した修飾で置換された場合、強力なかつ長時間作用性のアゴニストまたはアンタゴニストをもたらす。
【０１７１】
したがって、本発明は、本来の治療用化合物が、アセチル化、アシル化、ＰＥＧ化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスフォチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、システインの共有結合架橋形成の形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、糖鎖付加、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖付加、脂質付着、硫酸化、γグルタミン酸残基のカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在性付加（アルギニル化など）、およびユビキチン化によって修飾された、治療用化合物類似体を提供する。例えば、（Ｎｅｓｔｏｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｊｒ．（２００７）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ  ２：５７３−６０１、Ｎｅｓｔｏｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｊｒ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：４３９９−４４１８、Ｕｙ，Ｒ．ａｎｄ  Ｗｏｌｄ，Ｆ．（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：８９０−６、Ｓｅｉｆｔｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｅｎｇｌａｒｄ，Ｓ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６、Ｒａｔｔａｎ，Ｓ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２）を参照のこと。先の参考文献の全体を、参照によって組み込む。
【０１７２】
グリコシル化された治療用ペプチドは、従来のＦｍｏｃ化学及び例えば樹脂上の固相ペプチド合成を利用して調製できるが、その場合、所望の保護された糖アミノ酸がペプチド合成の前に調製され、次いでペプチド合成の間に所望の部位でペプチド鎖に導入される。このように、治療用ペプチドポリマーコンジュゲートはインビトロでコンジュゲートされ得る。グリコシル化は脱保護の前に起こり得る。アミノ酸グリコシドの調製は、引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第５，７６７，２５４号明細書、国際公開第２００５／０９７１５８号パンフレット、及びＤｏｏｒｅｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４０１−１４０３，２００６に記載されている。例えば、セリン及びスレオニン残基のアルファ及びベータ選択的グリコシル化は、ケーニッヒ−クノール反応及びシッフ塩基中間体を伴うＬｅｍｉｅｕｘのインサイチューアノマー化方法を利用して実施される。次いで、シッフ塩基グリコシドの脱保護が、弱酸性条件又は加水素分解を利用して実施される。グリコシル化された治療用ペプチドコンジュゲートを含む組成物は、成長するペプチド鎖を、保護されたアミノ酸の少なくとも１つがグリコシル化されている保護されたアミノ酸と段階的に接触させ、それに続いて、水溶性ポリマーのコンジュゲーションを含む、段階的な固相ペプチド合成により作られる。そのような組成物は、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％のグリコシル化されコンジュゲートされた治療用ペプチドの単一の種の純度を有し得る。
【０１７３】
本明細書に定義及び／又は開示される治療用ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の導入に使用できる単糖類には、グルコース（デキストロース）、フルクトース、ガラクトース、及びリボースがある。使用に好適な追加の単糖類には、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、トレオース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、マンノース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、及びＮ−アセチルグルコサミンなどがある。本明細書に定義及び／又は開示される治療用ペプチド、治療用ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の修飾に使用される単糖類、二糖類、及び三糖類などのグリコシドには、とりわけ、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、メリビオース、及びセロビオースがある。三糖類には、アカルボース、ラフィノース、及びメレジトースがある。
【０１７４】
本発明のさらなる実施形態において、本明細書に定義及び／又は開示される治療化合物は、ビオチンに化学的に結合していてもよい。次いで、ビオチン／治療化合物がアビジンに結合できる。
【０１７５】
やはり本発明の範囲内にあるのは、抗体であるポリペプチドである。用語抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、毒素結合抗体、薬結合抗体（ＡＤＣ）、ヒト化抗体、抗体断片（例えば、Ｆｃドメイン）、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体、二重特異性又は多重特異性抗体、ラマ抗体、ナノボディ、ダイアボディ、アフィボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃなどを含むように意図される。用語の中にやはり含まれるのは、Ｉｇキメラなどの抗体融合タンパク質である。好ましい抗体には、ヒト化若しくは完全ヒトモノクローナル抗体又はその断片がある。
【０１７６】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は最も広い意味で互換的に使用され、モノクローナル抗体（例えば、完全長又はインタクトモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限り二重特異性抗体）を含み、特定の抗体断片（本明細書により詳細に記載されるとおり）も含み得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化、及び／又は親和性成熟であり得る。
【０１７７】
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「ホール抗体」は本明細書において互換的に使用され、以下に定義される抗体断片ではなく、実質的に無傷な形態にある抗体を意味する。その用語は、特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を持つ抗体を意味する。「抗体断片」は、好ましくは、抗原結合領域を含むインタクト抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体がある。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書では、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を意味し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性のある突然変異、例えば、自然発生突然変異以外は同一である。そのため、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物でないとして、抗体の特性を示す。
【０１７８】
特定の実施形態において、そのようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含むが、その場合、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスにより得られた。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又はリコンビナントＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列が、さらに変化されて、例えば、標的への親和性が改善されたり、標的結合配列がヒト化されたり、細胞培養物中でのその産生が向上されたり、インビボでのその免疫原性が低下したり、多重特異性抗体が作り出されたりし得ることなど、及び変化された標的結合配列を含む抗体が、やはり本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には、他の免疫グロブリンにより汚染されていないという点で有利である。
【０１７９】
ある抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原に対する高い親和性を有する。抗体親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって測定することができる。特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体の解離定数（Ｋｄ）は、約１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、または０．００１ｎＭ以下（例えば１０−７Ｍ以下、１０−７Ｍから１０−１３Ｍ、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、または１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
【０１８０】
一実施形態において、Ｋｄは、以下のアッセイにより記載されるとおり、対象としている抗体のＦａｂバージョン及びその抗原と共に、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識の抗原の漸増系列の存在下で、Ｆａｂを最低濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原と共に平衡化させ、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体−コートプレートにより捕捉して測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの抗Ｆａｂ捕捉抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）により一晩被覆され、その後ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンにより、２から５時間室温（およそ２３℃）でブロックされる。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ  ２６９６２０番）において、１００μＭ又は２６μＭ［１２５Ｉ］−抗原は、対象とするＦａｂの段階希釈物と混合される（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）中の、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次いで、対象とするＦａｂは一晩インキュベートされる。しかし、確実に平衡に達するように、インキュベーションをより長時間（例えば、約６５時間）続けてもよい。その後、混合物は捕捉プレートに移され、室温でインキュベートされる（例えば、１時間）。次いで、溶液は除かれ、プレートは、ＰＢＳ中０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄される。プレートが乾燥すると、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）が加えられ、プレートはＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計測される。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度が、競合結合アッセイのために選択される。
【０１８１】
他の実施形態によると、Ｋｄは、例えば、固定化された抗原ＣＭ５チップと共に、約１０の応答単位（ＲＵ）で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を２５℃で使用して、表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。簡単に述べると、製造業者の説明書に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化される。抗原は、ｐＨ４．８の１０ｍＭ酢酸ナトリウムで５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈されてから、流量５μｌ／分で注入されて、結合したタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を得る。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンが注入されて、未反応の基がブロックされる。反応速度測定のため、Ｆａｂの２倍の段階希釈物（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）が、２５℃の０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、流量およそ２５μｌ／分で注入される。会合速度（Ｋｏｎ）及び解離速度（Ｋｏｆｆ）が簡単な１対１ラングミュアーの結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を利用して、会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることにより計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。ｏｎ速度が上記表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、ｏｎ速度は、ストップフローを備えた分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は８０００−シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計中で測定して増加する濃度の抗原の存在下、撹拌しているキュベットで、２５℃で、ｐＨ７．２のＰＢＳ中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度の増加又は減少を測定する蛍光消光技法（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）を利用して測定できる。チップ表面への標的抗原の他のカップリング化学作用（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、疎水性相互作用、又はジスルフィド化学作用）も、当業者により理解されるとおり、上述のアミンカップリング方法（ＣＭ５チップ）の代りに容易に利用可能である。
【０１８２】
修飾語「モノクローナル」は、抗体の特性を、抗体の実質的に均質な集団から得られたものとして示し、特別な方法による抗体の製造が必要であると解釈されないものとする。例えば、本発明により使用すべきモノクローナル抗体は、種々の技法、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ｐｐ．５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）参照）、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全てを有する動物中でヒト又はヒト様抗体を製造する技術（例えば、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；同第９６／３４０９６号パンフレット；同第９６／３３７３５号パンフレット；同第９１／１０７４１号パンフレット；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）参照）により製造できる。上記特許、刊行物、及び引用文献は、引用によりその��体として組み込まれる。
【０１８３】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、ネズミ科の）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小限の配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基により代えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により代えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含むことがある。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために実施されることがある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含むだろうが、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列に対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むだろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。以下の総説記事及びそこに引用されている引用文献も参照されたい：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）。上記引用文献は、引用によりその全体として組み込まれる。
【０１８４】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含むか、且つ／又は本明細書に開示されるヒト抗体を製造する技術のいずれかを利用して作られたものである。そのような技術には、ファージディスプレイライブラリーなどのヒトから誘導されたコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）参照）；ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系の利用（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５５−９３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：８６（１９９１）参照）；及び内因性免疫グロブリン産生のない状態でヒト抗体の完全なレパートリーを産生できる遺伝子導入動物（例えばマウス）でのモノクローナル抗体の生成（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）参照）がある。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト動物由来の抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に排除する。
【０１８５】
公知の全種類のそのような抗体は本発明の範囲内にある。例示的な抗体には、成長因子、サイトカイン、リンフォカイン、細胞表面受容体、酵素、血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子に結合するもの及びそれらのそれぞれの受容体に対する抗体がある。他の例示的な抗体には、受容体−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質、及び糖タンパク質に対するモノクローナル抗体がある。先に列記されたポリペプチドのいずれの修飾された（例えば、突然変異した）任意のバージョンも、本発明の範囲内にある。本発明に使用すべき治療化合物は当技術分野に公知であり、例としては、引用により本明細書にその全体として組み込まれる米国特許第７，６０８，６８１号明細書に開示されている。さらに、本発明は、自己免疫疾患又は望ましくない炎症状態を起こす、対象中の天然又は非天然の抗体の阻害剤又は拮抗剤のコンジュゲートを企図する。
【０１８６】
一実施態様では、薬物は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、アプタマー（一本鎖または二本鎖）、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド、線状または環状であるより大きなＤＮＡ分子、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために使用されるオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子の置換などのＤＮＡの変化形、ＰＮＡまたは他の核酸誘導体分子などの合成のＤＮＡ様分子（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第０７／０３５９２２号パンフレットを参照のこと）である。別の実施態様では、治療用化合物は、ヌクレアーゼ耐性ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドからなる。好ましい実施態様では、ヌクレアーゼ耐性ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、モルホリノ（すなわち、配列特異的な方式で核酸に結合する、核酸のホスホロジアミデート類似体、Ｓａｒｅｐｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）である。
【０１８７】
他の実施態様では、本発明のビタミンＤ担体にコンジュゲートされたＲＮＡｉが、遺伝性疾患と感染症との両方を治療するために使用される。好ましい実施態様では、コンジュゲートが、例えば、血液状態、肝臓状態、心臓血管状態、肝炎、眼状態、代謝性の状態、移植片拒絶、癌、自己免疫状態、アミロイドーシス、および神経系状態を治療するために使用される。
【０１８８】
別の実施態様では、薬物は、小分子または化学物質である。別の実施態様では、薬物は、ペプチドまたはペプチドの誘導体（ＰＮＡなど）である。別の実施態様では、薬物は、完全長か断片か切断型かにかかわらず、ＰＥＧ化されているかグリコシル化されているか別な方式で共有結合的にまたは非共有結合的に修飾されているか修飾されないままかにかかわらず、ポリペプチドのすべてまたは一部から構成されるタンパク質である。
【０１８９】
担体のアセンブリーのいくつかの態様は、当技術分野に周知である化学的方法を利用する。例えば、ビタミンＥ−ＰＥＧはＥａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌにより製造され、ビオチン−ＰＥＧは、Ｅｎｚｏｎ、Ｎｅｋｔａｒ、及びＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなどの多くのＰＥＧ製造業者により製造されている。いくつかのビタミン及び他の治療化合物が連結しているＰＥＧ分子を製造する方法は、これらの方法及び当技術分野に公知である他の化学的方法に従う。例えば、５’アミン部分によりオリゴヌクレオチドに結合したＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなど、オリゴヌクレオチド又は関連する分子へのＰＥＧの結合が起こる。いくつかのカップリング法が企図され、例えば、ペプチド上のリジン残基などのアミン基へのＮＨＳカップリング、システイン残基上などのスルフヒドリル基へのマレイミドカップリング、スルフヒドリル基へのヨードアセチルカップリング、スルフヒドリル基へのピリジルジチオールカップリング、炭水化物基へカップリングするためのヒドラジド、Ｎ末端にカップリングするためのアルデヒド、又は一級若しくは二級アミンと反応することが知られているテトラフルオロフェニルエステルカップリングがある。他の可能な化学的カップリング法は当業者に知られており、代えることができる。例としては、本発明の結合基を使用するコンジュゲーションは、引用により本明細書にその全体として組み込まれる国際公開第９３／０１２１４５号パンフレット（Ａｔａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．）に記載の組成物及び方法を利用して実施できるが、第７，８０３，７７７号明細書（Ｄｅｆｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）も参照されたい。
【０１９０】
本発明の例示的な薬物製剤としては、水性の液剤、有機液剤、粉末製剤、固体製剤、および混合相製剤が挙げられる。
【０１９１】
本発明の医薬組成物は、本発明の化合物のいずれか及びその薬学的に許容できる塩を、任意の薬学的に許容できる担体、アジュバント、又はビヒクルと共に含む。本発明の医薬組成物に使用できる薬学的に許容できる担体、アジュバント、及びビヒクルには、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂があるが、これらに限定されない。
【０１９２】
薬学的に許容できる塩は、毒性の副作用なしに治療用組成物の望ましい生物学的活性を保持する。そのような塩の例は、（ａ）無機酸、例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩／及び有機酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タニン酸（ｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ）、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などにより形成される塩；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオンにより形成される；又はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン又はエスレンジアミン（ｅｔｈｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）から形成された有機カチオンにより形成される塩基付加塩若しくは錯体；又は（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、例えば、亜鉛のタンニン酸塩などである。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、皮下、経皮、経口、非経口、吸入、眼、局所、直腸、鼻腔内、頬側（舌下含む）、膣内、又は埋め込み式リザーバー方式により投与できる。本発明の医薬組成物は、従来の、非毒性で薬学的に許容できる担体、アジュバント、又はビヒクルを含み得る。本明細書での用語非経口は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容できる非毒性の成分との混合物中に有効成分として本明細書に記載される治療化合物又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物も企図される。上述の通り、そのような組成物は、非経口投与用に、特に、液体溶液又は懸濁液の形態で；経口又は頬側投与用に、特に錠剤又はカプセルの形態で；鼻腔内投与用に、特に、散剤、点鼻剤、蒸発する溶液、又はエアロゾルの形態で；吸入用に、特に、液体溶液又は広く定義された賦形剤を含む乾燥粉末の形態で；経皮投与用に、特に皮膚パッチ又はマイクロニードルパッチの形態で；及び直腸又は膣内投与用に、特に坐剤の形態で調製することができる。
【０１９５】
組成物は、簡便には単位剤形で投与でき、例えば、引用により本明細書にその全体として組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８５）に記載の通り、医薬分野に周知である方法のいずれによっても調製できる。非経口投与用の製剤は、賦形剤として、滅菌水又はプロピレングリコールなどの含塩アルキレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、糖類、植物由来の油、水素化ナプタレン（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓ）、血清アルブミン、又は他のナノ粒子（Ａｂｒａｘａｎｅ（商標）に使用されるとおり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）などを含んでよい。経口投与には、製剤は、胆汁酸塩又はアシルカルニチンの添加により強化され得る。鼻腔内投与用の製剤は、固体でも、ハイドロフルオロカーボンなどの蒸発する溶媒中の溶液でもよく、安定化のための賦形剤、例えば、糖類、界面活性剤、サブミクロン無水アルファ−ラクトース又はデキストランを含んでよく、点鼻剤又は定量スプレーの形態で使用するための水性又は油性の溶液でもよい。頬側投与には、典型的な賦形剤には、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどがある。
【０１９６】
本明細書に記載される修飾された治療化合物の、長時間にわたる、例えば１週間から１年にわたる対象への送達は、所望の放出期間のために充分な有効成分を含む制御放出系の単一投与により達成され得る。モノリシック又はリザーバータイプのマイクロカプセル、デポインプラント（ｄｅｐｏｔ  ｉｍｐｌａｎｔｓ）、ポリマー性ヒドロゲル、浸透圧ポンプ、ベシクル、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン導入装置、及び別な注射可能な剤形などの種々の制御放出系を、この目的に利用できる。有効成分の送達が望まれる部位での局在化は、いくつかの制御放出装置の追加の特徴であり、特定の疾患の治療において有益であると証明され得る。
【０１９７】
経皮投与用の特定の実施形態において、皮膚のバリアを越えた送達が、電極（例えば、イオン導入）、電気穿孔、又は短い高電圧の電気パルスの皮膚への印加、無線周波数、超音波（例えば、超音波導入）、マイクロプロジェクション（例えば、マイクロニードル）、ジェットインジェクター、熱アブレーション、磁気泳動、レーザー、速度、又はフォトメカニカル波を利用すると増強され得る。薬物は、単層薬物含有粘着剤、複層薬物含有粘着剤、リザーバー、マトリックス、又は蒸気型パッチ（ｖａｐｏｒ  ｓｔｙｌｅ  ｐａｔｃｈｅｓ）に含まれてよく、パッチレス技術（ｐａｔｃｈｌｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を利用できる。皮膚のバリアを越えた送達は、カプセル化、皮脂流動化剤（ｓｋｉｎ  ｌｉｐｉｄ  ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）、又は中空型若しくは中実型ミクロ構造経皮システム（ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＭＴＳ、３Ｍにより製造されるものなど）、ジェットインジェクターを利用しても増強できる。治療化合物が皮膚を通るのを助けるための製剤への添加剤には、プロドラッグ、化学物質、界面活性剤、細胞透過性ペプチド、透過促進剤、カプセル化技術、酵素、酵素阻害剤、ゲル、ナノ粒子、及びペプチド又はタンパク質シャペロンがある。
【０１９８】
制御放出製剤の一形態は、引用により本明細書に組み込まれるＫｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６７５，１８９号明細書の先駆的な研究に記載されている、コポリ（乳酸／グリコール酸）などのゆっくりと分解する非毒性で非抗原性ポリマーに分散されているか又はカプセル化されている治療化合物又はその塩を含む。化合物又はその塩は、コレステロール若しくは他の脂質マトリックスペレット、又はシラストマーマトリックスインプラント中に製剤されていてもよい。追加の徐放性デポインプラント又は注射用製剤は、当業者には明らかだろう。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＪＲ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８；及びＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ，ＲＷ  Ｂａｋｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７を参照されたい。上記は引用によりその全体として組み込まれる。
【０１９９】
追加の形態の制御放出製剤は、生体許容性（ｂｉｏａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）溶媒中のコポリ（乳酸／グリコール酸）又は乳酸とＰＥＧのブロックコポリマーなどの生分解性ポリマーの溶液を含み、それが皮下又は筋肉内に注射されて、デポ製剤が得られる。本明細書に記載される治療化合物をそのようなポリマー性製剤と混合すると、作用持続時間が非常に長い製剤を得るのに好適である。
【０２００】
鼻腔内投与用に製剤される場合、鼻腔内粘膜を越える吸収は、例えばグリココール酸、コール酸、タウロコール酸、エトコール酸（ｅｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デフドロコール酸（ｄｅｈｄｒｙｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、シクレデキストリン（ｃｙｃｌｅｄｅｘｔｒｉｎｓ）などの界面活性剤を、約０．１から１５重量パーセント、約０．５から４重量パーセント、又は約２重量パーセントの量で使用してさらに増強され得る。刺激が少なくより高い有効性を示すことが報告されている追加のクラスの吸収促進剤は、テトラデシルマルトシドなどのアルキルマルトシドのクラスである（全て引用により本明細書に組み込まれているＡｒｎｏｌｄ，ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：２２０５−１３；Ａｈｓａｎ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １８：１７４２−４６及びそこに引用されている引用文献）。
【０２０１】
医薬組成物は、例えば、滅菌注射用の水性又は油性懸濁剤としての滅菌注射用調合物の形態でよい。この懸濁剤は、好適な分散剤又は湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０など）及び懸濁化剤を使用して、当技術分野に公知である技術に従って製剤され得る。滅菌注射用調合物は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用液剤又は懸濁剤でもよい。利用され得る許容できるビヒクル及び溶媒の中に、マンニトール、水、リンゲル液、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌の不揮発油は、従来、溶媒又は懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の低刺激性不揮発油も利用できる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、特にポリオキシエチル化バージョンにおけるオリーブ油又はヒマシ油など、天然の薬学的に許容できる油であるので、注射剤の調製に有用である。これらの油液剤又は懸濁剤は、スイス薬局方又は類似のアルコールなどの長鎖アルコール希釈剤又は分散剤も含み得る。
【０２０２】
本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、並びに水性懸濁剤及び液剤を含むがこれらに限定されない経口的に許容できる任意の剤形で経口投与できる。経口使用のための錠剤の場合、通常使用される担体には、ラクトース及びコーンスターチがある。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的には加えられる。カプセル形態での経口投与のためには、有用な希釈剤には、ラクトース及び乾燥コーンスターチがある。水性懸濁剤が経口投与される場合、有効成分は、乳化剤及び懸濁化剤と組み合わされる。所望の場合、特定の甘味剤及び／又は着香剤及び／又は着色剤を加えてよい。
【０２０３】
本発明の医薬組成物は、直腸投与用の坐剤の形態でも投与できる。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温で固体であるが直腸の温度で液体であり、したがって直腸で融けて活性成分を放出する好適な非刺激性の賦形剤と混合して調製できる。そのような材料には、ココアバター、蜜蝋、及びポリエチレングリコールがあるが、これらに限定されない。
【０２０４】
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望の治療が、局所適用により容易にアクセスできる部分又は臓器を含む場合に特に有用である。皮膚に局所的に適用するために、医薬組成物は、担体に懸濁又は溶解している活性成分を含む好適な軟膏により製剤されなくてはならない。本発明の化合物の局所投与用の担体には、鉱油、液化石油（ｌｉｑｕｉｄ  ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ）、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋、及び水があるが、これらに限定されない。或いは、医薬組成物は、担体に懸濁又は溶解している活性化合物を含む好適なローション又はクリームにより製剤できる。好適な担体には、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水があるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、直腸坐剤製剤により、又は好適な浣腸製剤で、下部消化管に局所適用することもできる。局所経皮パッチも本発明に含まれる。
【０２０５】
本発明の医薬組成物は、鼻腔内エアゾールによっても、吸入よっても投与できる。そのような組成物は、医薬製剤の分野に周知である技法により調製され、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを高める吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は当技術分野に公知である他の可溶化剤若しくは分散剤を使用して、食塩水中の液剤として調製できる。
【０２０６】
吸入による送達のために製剤化される場合、いくつかの製剤が、利点をもたらす。ジケトピペラジン（例えば、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ粒子（Ｐｆｕｔｚｎｅｒ，Ａ  ａｎｄ  Ｆｏｒｓｔ，Ｔ、２００５、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ２：１０９７−１１０６）などの容易に分散する固体、または類似の構造に対する治療用化合物の吸着は、治療用化合物の迅速な初期取り込みをもたらす製剤を与える。治療用化合物と賦形剤とを含有する凍結乾燥粉末、特にガラス状粒子は、良好なバイオアベイラビリティを伴う肺への送達に有用であり、例えば、Ｅｘｕｂｅｒａ（登録商標）（吸入型インスリン、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．およびＡｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）およびＡｆｒｅｚｚａ（登録商標）（吸入型インスリン、Ｍａｎｎｋｉｎｄ，Ｃｏｒｐ．）を参照されたい。
【０２０７】
１日あたり約０．０１から約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり０．５１から約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の活性成分化合物の投薬レベルが、疾患の予防および治療に有用である。こうした投与は、慢性または急性的治療法として使用することができる。担体と組み合わせて単一の剤形を製造することができる薬物の量は、治療される宿主、および個々の投与様式に応じて変動することとなる。典型的な調製物は、約５％から約９５％の活性な化合物（ｗ／ｗ）を含有することとなる。好ましくは、こうした調製物は、約２０％から約８０％の活性な化合物を含有する。
【０２０８】
患者の状態が改善されると、本発明の化合物、組成物、又は組み合わせの維持量が、必要な場合投与され得る。その後、投与の用量若しくは頻度、又はその両方を、症状に応じて、改善された状態が保持されるレベルに低減することができ、症状が望ましいレベルに緩和した時、治療をやめなければならない。しかし、患者は、疾病の症状の再発時に、長期間の間欠的な治療を必要とすることがある。
【０２０９】
当業者が認識する通り、先に列挙したものより低い投与量又は高い投与量も必要になり得る。特定の患者のための具体的な用量及び治療レジメンは、種々の因子、例えば、利用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与の時間、排泄率、薬物の組み合わせ、感染の重症度及び経過、患者の感染に対する傾向、並びに治療する医師の判断に依存するだろう。
【０２１０】
本明細書に記載した担体−薬物コンジュゲートは、薬物製造者および患者に対して、非修飾薬物に勝る利点を提供する。具体的には、担体−薬物コンジュゲートまたは製剤は、より強力で、より長期間持続性であり、必要とされる投薬がより少なく、より低頻度であろう。これは、結果として、患者にとっての健康管理費用の低下、かつ、より便利な薬物投与スケジュールとなる。担体−薬物コンジュゲートはまた、静脈内注射の代替手段としての投与の皮下または経皮経路を提供する。これらの経路は、患者が自己投与することができるので、患者のコンプライアンスを向上させることができる。
【０２１１】
本発明のさらに他の態様において、ＤＢＰのレベルは、担体−薬物療法の一部として増加させることができる。エストロゲンがＤＢＰレベルを増加させ得ることが報告されている（Ｓｐｅｅｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３７１：３３）。担体−薬物コンジュゲートのより効果的な送達のためのエストロゲンの投与により、ＤＢＰのレベルが増加し得ることが、ここで企図される。
【０２１２】
本発明のさらに他の態様において、薬物を経皮送達するために担体が使用できることが企図される。ＤＢＰは、通常、皮膚の表面近くの位置でＵＶにより活性化されたビタミンＤを輸送するので、担体を持つ経皮送達系を使用することが実現可能になる。
【０２１３】
本明細書に記載される本発明がより完全に理解されるために、以下の実施例が述べられる。これらの実施例が説明目的のみのものであり、本発明をどのようにも限定すると解釈されるものでないことを理解されたい。具体的には、本明細書に開示した組成物および方法は、すべての非ホルモン型のビタミンＤ（そのホモログ、類似体、および代謝産物を含めて）と共に機能する。これには、以下の実施例で使用されるビタミンＤが含まれる。
【実施例】
【０２１４】
実施例１：治療用化合物をＣ２５位置で非ホルモンビタミンＤにカップリングさせるための例示的な担体の調製
ビタミンＤと２ｋＤａのＰＥＧスカフォールドとを含有する例示的な担体を調製した。ある例示的な担体は、チオール反応性であり、かつ、Ｃ２５位置にマレイミド反応性の基を有するビタミンＤ−ＰＥＧを含んでいた（ここではビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミドまたはＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミドと称する）。
【０２１５】
別の例示的な担体は、アミン反応性であり、かつ、ＮＨＳ反応性の基を有するビタミンＤ−ＰＥＧを含んでいた。これらの試薬を、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３１７２９６７号パンフレット（Ｓｏｌｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている通りに調製した。
【０２１６】
実施例２：治療用化合物をＣ３位置で非ホルモンビタミンＤにカップリングさせるための例示的なアミノ末端反応性の担体の調製
ビタミンＤのＣ３位置に接続されたアルデヒド反応性の基と２ｋＤａのＰＥＧスカフォールドとを含有する、例示的なアミノ末端反応性の担体（ここではビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−アルデヒドまたはＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミドと称する）を調製した。この実施例における担体上のアルデヒドを使用して、以下の実施例に開示するタンパク質およびペプチド上の遊離のアミノ末端にコンジュゲートした。この合成の概要を、図１に表す。
【０２１７】
簡単に言うと、（Ｓ，Ｚ）−３−（（Ｅ）−２−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ）−１−（（Ｒ）−６−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル）−７ａ−メチルヘキサヒドロ−１Ｈ−インデン−４（２Ｈ）−イリデン）エチリデン）−４−メチレンシクロヘキサノール（化合物Ｖａ、２０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、１当量、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入、カタログ番号Ｃ１２５７００、カルシフェジオールおよび２５−ヒドロキシビタミンＤとしても知られている）を、無水ｔｅｒｔ−ブタノールとアセトニトリル（１０：１、１ｍＬ）との混合物に溶解し、４℃に冷却した。これにアクリロニトリル（２６．６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、１０当量）、続いてＴｒｉｔｏｎ  Ｂ（４０％水溶液、１０μＬ）を添加した。混合物を４℃で２．５時間攪拌した。冷却した２％  ＨＣｌ（１０ｍＬ）を用いて反応を停止し、水相をエーテル（２×１０ｍＬ）で抽出し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、蒸発させて、未精製生成物を得た。この材料を、溶離液として５〜２０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィー（ＴＬＣ、シリカゲル、５０％酢酸エチル（ヘキサン中））によって精製して、所望の生成物３−（（（Ｓ，Ｚ）−３−（（Ｅ）−２−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ）−１−（（Ｒ）−６−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル）−７ａ−メチルヘキサヒドロ−１Ｈ−インデン−４（２Ｈ）−イリデン）エチリデン）−４−メチレンシクロヘキシル）オキシ）プロパンニトリル、化合物Ｖ（１５ｍｇ、６８％）を、白色固体として単離した（Ｒｆ  ０．２  シリカゲル、４０％  ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中））。ＮＭＲ分析は、少しの測定可能量の溶媒も示さなかった。
【０２１８】
塩化アルミニウム（６６ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ）の無水エーテル（２ｍＬ）溶液に、０℃でアルゴン下で、水素化アルミニウムリチウム（１Ｍ、エーテル中、１９ｍｇ、０．５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。混合物を５分間攪拌し、これに化合物Ｖｃ（１５ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）のエーテル（３ｍＬ）溶液を滴下し、反応混合物を０℃で５分間、次いで室温で１時間攪拌した。反応は、ＭＳおよびＴＬＣ（シリカゲル、１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３／０．１％  ＮＨ４ＯＨ）によってモニタリングした。反応混合物に、酢酸エチル（１ｍＬ）と水（１ｍＬ）、それに続いて５％  ＮａＯＨ（５ｍＬ）を添加した。有機相を分離し、水相を酢酸エチル（５ｍＬ）およびエーテル（５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、ロータリーエバポレーターで蒸発させて、所望のアミン、（Ｒ）−６−（（１Ｒ，３ａＳ，７ａＲ，Ｅ）−４−（（Ｚ）−２−（（Ｓ）−５−（３−アミノプロポキシ）−２−メチレンシクロヘキシリデン）エチリデン）−７ａ−メチルオクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）−２−メチルヘプタン−２−オール、化合物Ｖｄ（１２．５ｍｇ、８２％）を、淡黄色のオイルとして与えた。Ｒｆ  ０．２（シリカゲル、２０％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ／０．２％  ＮＨ４ＯＨ）。ＮＭＲ分析は、約８％の酢酸エチルの存在を明らかにした。
【０２１９】
化合物Ｖｄ（１２．５ｍｇ、０．０２７３ｍｍｏｌ、１当量）、化合物Ｖｅ（ヒドロキシルＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＭＷ  ２０００、ｎ≒４５（ここではｎはＣＨ２ＣＨ２Ｏ繰り返し単位の数である）、Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ  ＃Ａ−５０７６、４３ｍｇ、０．０２１６ｍｍｏｌ、０．８当量）を、無水ジクロロメタン（０．１ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（１２ｍｇ、１６μｌ、０．１１ｍｍｏｌ、４当量）を添加し、反応混合物を窒素下で室温で２０時間攪拌した。この試料を、窒素気流下で乾燥させて、未精製の化合物Ｖｆを与え、これを、溶離液として５〜１０％  ＭｅＯＨ／ジクロロメタンを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物Ｖｆを、白色の泡（３０ｍｇ、３８％）として単離した。Ｒｆ  ０．４（シリカゲル、１０％メタノール（ジクロロメタン中））。単離された材料の１Ｈ  ＮＭＲ分析によって、その同一性および純度が確認された。
【０２２０】
化合物Ｖｆ（３０ｍｇ、０．０１２３ｍｍｏｌ、１当量）と、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム（１．０ｍｇ、０．００２８４、０．２３当量）と、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（４．３ｍｇ、０．０３６９ｍｍｏｌ、３当量）とを、２ｍＬの乾燥ジクロロメタンに入れた溶液に、粉末状の４Å分子ふるい（５００ｍｇ）を添加し、反応混合物をＮ２でフラッシュ蒸発させた。光を避けるために反応フラスコをアルミニウムホイルで覆い、これを室温で３６時間攪拌した。出発材料も生成物も、ＴＬＣ（シリカゲル、１０％  ＭｅＯＨ／ジクロロメタン）でのＲｆが同じであるので、生成物の形成は、一定分量の１Ｈ  ＮＭＲを検査することによって確認した。反応混合物を、ジクロロメタン（１５ｍＬ）およびＮ２圧力を用いて、ピペット内で、セライトのパッドを通して濾過した。合わせた有機物を、Ｎ２気流下で濃縮し、高真空で２時間乾燥させて、３５ｍｇ（１００％）の未精製生成物ＴＬＣ（Ｒｆ：０．３、１０％  ＭｅＯＨ／ジクロロメタン、ＰＭＡで染色）を得た。厳密に同じ条件下での反応の２回目の実施によって、新たな３５ｍｇの生成物がもたらされた。どちらの回分からの生成物の１Ｈ  ＮＭＲも、同じであったので、これらを合わせて、７０ｍｇの化合物Ｖ、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−アルデヒドを得た。
【０２２１】
実施例３：治療用化合物をＣ３位置で非ホルモンビタミンＤにカップリングさせるための例示的なチオール反応性担体の調製
ビタミンＤのＣ３位置に接続されたマレイミド反応性の基を有するビタミンＤを含む、例示的なチオール反応性の担体（ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド）を調製した。この実施例における担体上のマレイミドを使用して、以下の実施例におけるタンパク質およびペプチド上の遊離のチオールにコンジュゲートした。この合成の概要を、図２に表す。
【０２２２】
簡単に言うと、実施例２と同様に調製した化合物Ｖｄ（２３ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１当量）、化合物ＶＩａ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｐｅｇｗｏｒｋｓ  ｃａｔ．＃  ＰＨＢ−９５６、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、２ｋ、ｎ≒４５（ここではｎはＣＨ２ＣＨ２Ｏ繰り返し単位の数である）、７９ｍｇ、０．０３９５ｍｍｏｌ、０．８当量）、およびヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウム（３２ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ、２．５当量）を、無水ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（２０．４ｍｇ、２８μｌ、０．２ｍｍｏｌ、４当量）を添加し、反応混合物を窒素下で室温で４時間攪拌した。この反応混合物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸水溶液（２０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２０ｍＬ）、およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、３０℃で濃縮した。試料をシリカゲル（１０ｇ）フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。カラムを１〜１０％  ＭｅＯＨ／ジクロロメタンで溶離した。純粋な生成物を含有する分画を合わせ、温度を３０℃に維持しながらロータリーエバポレーターで蒸発させた。この試料を、窒素気流下で乾燥させて、化合物ＶＩ、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミドを、褐色のゴムとして与えた（５８ｍｇ、４８％）（Ｒｆ  ０．２５、シリカゲル、１０％メタノール（ジクロロメタン中））。単離された材料の１Ｈ  ＮＭＲ分析によって、その同一性および純度が確認された。
【０２２３】
実施例４：治療用化合物をＣ３位置で非ホルモンビタミンＤにカップリングさせるための例示的なアミン反応性の担体の調製
ビタミンＤのＣ３位置に接続されたＮＨＳ反応性の基を有するビタミンＤを含む、例示的なアミン反応性の担体（ここではビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ１．３ｋ−ＮＨＳまたはＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ１．３ｋ−ＮＨＳと称する）を調製した。この実施例における担体上のＮＨＳを使用して、以下の実施例におけるタンパク質およびペプチド上の遊離のチオールにコンジュゲートした。この合成の概要を、図３に表す。
【０２２４】
簡単に言うと、化合物Ｖｄ（２０ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、１当量）および化合物ＶＩＩａ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  ｃａｔ．＃  １０１４０、ｎ＝２５（ここではｎはＣＨ２ＣＨ２Ｏ繰り返し単位の数である）、４４ｍｇ、０．０３４６ｍｍｏｌ、０．８当量）を、無水ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（２２．０ｍｇ、３１μｌ、０．２２ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、反応混合物を窒素下で室温で２４時間攪拌した。この反応混合物を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸水溶液（２０ｍＬ）、およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、３０℃の温度を維持しながら濃縮した。試料をシリカゲル（１０ｇ）フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。カラムを１〜１０％  ＭｅＯＨ／ジクロロメタンで溶離した。純粋な生成物を含有する分画を合わせ、温度を３０℃未満に維持しながらロータリーエバポレーターで蒸発させた。この試料を、窒素気流下で乾燥させて、化合物ＶＩＩｂを、褐色のゴムとして与えた（３３ｍｇ、５６％）（Ｒｆ  ０．２０、シリカゲル、１０％メタノール（ジクロロメタン中））。単離された材料の１Ｈ  ＮＭＲ分析によって、その同一性が確認された。
【０２２５】
化合物ＶＩＩｂ（３１ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、１当量）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（６．３ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ、３当量）と、ＥＤＣＩ（８．６ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ、２．５当量）とを、無水ＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（７．４ｍｇ、１０μＬ、０．０７３ｍｍｏｌ、４当量）を添加し、反応混合物を窒素下で室温で２４時間攪拌した。この反応混合物を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸水溶液（２０ｍＬ）、およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、３０℃の温度を維持しながら濃縮した。この試料を、窒素気流下で乾燥させて、化合物ＶＩＩ、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−ＮＨＳを、褐色のゴムとして与えた（３８．６ｍｇ、＞１００％）（Ｒｆ  ０．２５、シリカゲル、１０％メタノール（ジクロロメタン中））。単離された材料の１Ｈ  ＮＭＲ分析によって、その同一性および純度が確認された。
【０２２６】
実施例５：非ホルモン性ビタミンＤにコンジュゲートされたアペリンの調製および特徴付け
この実施例では、アペリンに対して実施例１で作製したＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド担体と実施例２で作製したＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アルデヒドにコンジュゲートされたアペリンは、アペリンに、有意に長い半減期を付与した。得られたコンジュゲートされた分子は、心疾患、肺高血圧症（例えば肺動脈性肺高血圧症または肺静脈性肺高血圧症）、他の心血管疾患、または糖尿病の治療に有用な治療薬であり得る。
【０２２７】
ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−アペリンの合成
Ｎ−末端システイン残基を有するアペリン−１３誘導体（Ｃ−アペリン）は、Ｂｉｏｐｅｐｔｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ、配列番号１６）によって合成された。担体とのコンジュゲーションは、５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解したチオール反応性部分［実施例１のＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド］を、５ｍｇ／ｍＬの濃度（１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液中）の遊離のシステインを含有するアペリンペプチドと、担体対ペプチドのモル比１．４：１で混合することによって実現した。反応は、室温で１時間、進行させた。コンジュゲートされたペプチド、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−アペリンを、イオン交換クロマトグラフィーによって、未反応成分から分離した。コンジュゲーションおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。次いで、コンジュゲートの緩衝液をＰＢＳに交換し、動物研究における使用のために、０．２２ミクロンフィルターを使用して濾過滅菌した。
【０２２８】
ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アペリンの合成：
アペリン−１３ペプチドは、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ、Ｃａｔ．ＮＯ．Ｈ−４５６６）から購入した。担体上のアルデヒドとペプチド上のアミン部分とのコンジュゲーションは、ペプチドのＮ−末端アミンとの反応に好都合であるように、低いｐＨで実施した。５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解させたアミン反応性の担体［実施例２のビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アルデヒド］を、５ｍｇ／ｍＬの濃度（ｄＨ２Ｏ中）の遊離のシステインを含有するアペリンペプチドと、担体対ペプチドのモル比３：１で混合した（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５）および２５ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３の最終濃度）。反応は、４℃で一晩、進行させた。コンジュゲートされたペプチド、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アペリンを、イオン交換クロマトグラフィーによって、未反応成分から分離した。コンジュゲーションおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０２２９】
細胞に基づくＡＰＪ受容体アッセイにおけるアペリン構築物の活性：
非修飾アペリン−１３、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−アペリン、およびＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アペリンは、生理活性の決定のために、Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）に提出した。Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ社のアペリン機能分析は、アペリンに対する受容体、ＡＰＪを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｍｕｌｔｉｓｐａｎカタログ＃：Ｃ１１９６）を使用する。この分析は、フォルスコリン刺激性のｃＡＭＰ産生のアペリン阻害を測定する。アペリンと２種の修飾されたペプチドとの機能活性比較を、図４に示す。ＥＣ５０値を決定するために、４パラメータロジスティック関数を用いて曲線を適合させた。アペリンについてのＥＣ５０値は、およそ６ｎＭであり、修飾されたアペリン誘導体は、３〜４倍高く、これは、この実験に関する観察される誤差の範囲内であった。したがって、非修飾アペリンと修飾されたアペリンは、実質的に同じ活性を有する。
【０２３０】
アペリンおよびアペリンコンジュゲートの薬物動態特性：
４グループの４種のラットそれぞれに、アペリン−１３、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−アペリン、またはビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アペリンを、０．１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。５分、および０．５、１、２、４、８、および２４時間の時点で、血漿試料を採取し、定量ＥＬＩＳＡ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＫ−０５７−２３）によって、アペリンの存在について分析した。アペリンコンジュゲートは、非修飾アペリンと比較した場合に劇的に向上した薬物動態プロファイルを示した（図５）。非修飾アペリンは、注射から５分以内にバックグラウンドレベル近くまで低下した。ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−アペリンは、非修飾アペリンと比較した場合に向上した薬物動態特性を示した。しかし、驚いたことに、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アペリンは、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−アペリンを含めた他のアペリン分子と比較した場合に著しく向上した薬物動態特性を示した。これは、ビタミンＤのＣ３位置に対する担体のコンジュゲーションが、Ｃ２５位置でのコンジュゲーションに対するさらなる向上を提供することを実証する。
【０２３１】
担体−コンジュゲートの崩壊速度は、複雑であり、おそらく、より遅い腎クリアランスと、プロテアーゼ分解からの防御との組み合わせに相当する。次いで、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（ＰｈａｒＳｉｇｈｔ）およびＧｒａｐｈＰａｄ（Ｐｒｉｓｍ）を使用して、データの薬物動態分析を実施した。重要なことに、本来のアペリン−１３ペプチドのＡＵＣは、０．４ｎｇ＊時間／ｍＬであり、ビタミンＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−アペリンは、８５ｎｇ＊時間／ｍＬであり、ビタミンＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋは、３２８ｎｇ＊時間／ｍＬであった。したがって、Ｃ２５およびＣ３担体のバイオアベイラビリティ向上は、それぞれ２１３倍および８２０倍であった。
【０２３２】
実施例６：非ホルモン性ビタミンＤにコンジュゲートされたグレリンの調製および特徴付け
合成のグレリンペプチドを、表１Ａに列挙する。野生型（ｗｔ）ペプチドは、Ｂａｃｈｅｍ［Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ，カタログ＃Ｈ−４８６４（ヒト）およびＨ−４８６２（ラット）］から購入し、カスタム配列は、Ｂｉｏｐｅｐｔｅｋ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）によって合成された。カスタム配列は、３位でのオクタノイル化セリン（Ｏｃｔ−Ｓ、Ｏ−オクタノイル−セリンとしても知られている）が、オクタノイル化２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｏｃｔ−Ｄａｐ、Ｎβ−オクタノイル−２，３−ジアミノプロピオン酸としても知られている）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）によって置き換えられた、ペプチドを含む。
【化５４】
2017533906.tif 000055
【０２３３】
Ｏｃｔ−Ｓは、エステラーゼによってインビボで急速に脱アシル化され；脱アシル化された型のグレリンは、ＧＨＳ−Ｒ受容体をもはや活性化しない。Ｏｃｔ−Ｄａｐ、トリプトファン、およびチロシン誘導体は、エステラーゼによる脱アセチル化を受けないので、その活性を維持するはずである。実施例１および３に記載した通りのビタミンＤ−ＰＥＧ−マレイミド担体を、コンジュゲーションが生理活性に有意に影響を与えないように、２〜３ｋＤａペプチドとサイズが比例するように選択した。担体とのコンジュゲーションは、５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解したチオール反応性部分［実施例１のＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド、または実施例３の化合物ＶＩ：ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃７３１７６５からのＰＥＧ２Ｋ−マレイミド（ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルマレイミドとしても知られている）
］を、５ｍｇ／ｍＬの濃度（１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液中）の遊離のシステインを含有するグレリンペプチドと、担体対ペプチドのモル比１．４：１で混合することによって実現した。反応は、室温で１時間、進行させた。コンジュゲートされたペプチドを、イオン交換クロマトグラフィーによって、未反応成分から分離した。コンジュゲーションおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。次いでラットグレリンペプチド（ｒグレリン）、ヒトグレリンペプチド（ｈグレリン）およびグレリン−担体コンジュゲートの緩衝液をＰＢＳに交換し、動物研究における使用のために、０．２２ミクロンフィルターを使用して濾過滅菌した。
【０２３４】
【表１】
2017533906.tif 000056
【０２３５】
グレリンコンジュゲートの薬物動態
グレリンコンジュゲートの薬物動態を、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいて検査した。コンジュゲートは、以下であった：ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミドにコンジュゲートされたｗｔ  Ｏｃｔ−ｈグレリンおよびＯｃｔ−ｈグレリン−Ｃ；ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミドまたは実施例３の化合物ＶＩ：ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミドのいずれかにコンジュゲートされたＤａｐ−ｈグレリン−Ｃ；およびＰＥＧ２Ｋ−マレイミド。簡単に言うと、０．１ｍｇ／ｋｇの各分子を、静脈内（ｉｖ）または皮下（ｓｃ）注射によって、ラットに別々に注射した。血漿の試料を、５分（ｉｖのみ）、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、および２４時間の時点で採取した。プロテアーゼ阻害剤とＨＣｌ（最終濃度０．０５Ｎ）を、血漿試料に添加し、次いでこれを直ちに凍結させた。ラット血漿（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．＃ＥＺＲＧＲＴ−９１Ｋおよび＃ＥＺＲＧＲＡ−９０Ｋ）からの全ｒグレリン（アシル化＋非アシル化）または活性なｒグレリン（アシル化のみ）のいずれかを分析するために検証された市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、試料を分析した。結果は、ｈグレリンとｈグレリン−担体コンジュゲートとの薬物動態プロファイルの有意差を示す（図６〜８）。
【０２３６】
図６Ａは、静脈内注射されたグレリンの薬物動態プロファイルが、Ｃ２５およびＣ３位置でビタミンＤにコンジュゲートされた場合に向上したことを示す。活性なグレリンと全グレリンのレベルを分析した。なぜなら、Ｏｃｔ−Ｄａｐ修飾が、タンパク質を脱アシル化から保護したのに対して、本来のＯｃｔ−Ｓｅｒを含有するペプチドは、急速に脱アシル化されたからである。単独のまたはＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体にコンジュゲートされたＷｔ−Ｏｃｔ−ｈグレリン、ならびにＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体またはＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体のいずれかにコンジュゲートされたＤａｐ−ｈグレリンを、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、０．１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。血漿試料中のグレリン濃度を、ＥＬＩＳＡによって、全グレリン（アシル化＋非アシル化）または活性なグレリン（アシル化のみ）のいずれかについて、２連で分析した。３動物からの平均値を、片対数グラフにプロットした。オクタノイル化Ｄａｐ残基は、分解に対して耐性であった。
【０２３７】
Ｃ２５コンジュゲートとＣ３コンジュゲートはどちらも、薬物動態プロファイルの有意な向上を示した。ただし、Ｃ３コンジュゲートが、最良の薬物動態プロファイルを示した。ＰＥＧ２Ｋ−（２５）−ＶｉｔＤ担体は、非修飾ｗｔ  Ｏｃｔ−ｈグレリンと比較して、Ｏｃｔ−ｈグレリン−ＣとＤａｐ−ｈグレリンとの両方に対して有意な半減期延長を提供したが、前者は、急速に脱アシル化されてその不活性形となる。ＰＥＧ２Ｋ−（３）−ＶｉｔＤ担体は、ＰＥＧ２Ｋ−（２５）−ＶｉｔＤ担体と比較した場合に、さらに長い半減期延長を提供した。
【０２３８】
図７は、ラットに皮下注射された活性なグレリンと全グレリンレベルを比較する。これは、ＰＥＧ２Ｋ−（２５）−ＶｉｔＤおよびＰＥＧ２Ｋ−（３）−ＶｉｔＤ担体が、有意な半減期延長およびバイオアベイラビリティの向上を提供したことを実証する。ビタミンＤのＣ３位置で修飾された担体の方が優れていた。Ｏｃｔ−Ｄａｐ修飾は、脱アシル化に対する耐性を提供したが、皮下注射後に、静脈内送達では観察されなかった、ある程度の脱アシル化が起こった。
【０２３９】
図８は、ＰＥＧ２ｋ−マレイミド、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド、およびＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２ｋ−マレイミド担体にコンジュゲートされた、Ｄａｐ−ｈグレリン−Ｃについての薬物動態プロファイルを比較する。これらの試料を、静脈内または皮下のいずれかに注射した。血漿試料を、ＥＬＩＳＡによって、全グレリン（アシル化＋非アシル化）レベルについて分析した。Ｃ２５コンジュゲートとＣ３コンジュゲートは両方とも、ＰＥＧ化されたグレリンに勝る有意な向上を示したが、Ｃ３コンジュゲートは、最も向上したバイオアベイラビリティおよび薬物動態特性を示した。２ｋＤａ  ＰＥＧスカフォールドは単独で、静脈内に注射されたグレリンに対して、いくらかの半減期を延長する性質を有していた。しかし、これは、皮下に注射されたグレリンの薬物動態特性を修飾することについては効果がなかった。対照的に、ＰＥＧ２Ｋ−（２５）−ＶｉｔＤまたはＰＥＧ２Ｋ−（３）−ＶｉｔＤ担体でのグレリンの修飾は、静脈内注射時に、有意に長い半減期をもたらした。さらに、バイオアベイラビリティは、皮下注射後に向上した。ビタミンＤのＣ３位置で修飾された担体は、Ｃ２５位置で修飾された担体よりも優れていた。
【０２４０】
グレリンペプチド−担体の受容体結合活性の評価
いくつかの実施態様では、グレリンペプチドの活性は、担体にコンジュゲートされる場合、非修飾ペプチドと実質的に同じである。グレリンとＶｉｔＤ−ＰＥＧ−グレリンを、細胞に基づく受容体アゴニスト分析を使用して、受容体結合およびグレリン受容体の活性化（アゴニスト活性）について比較した：ヒトグレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ、Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１１９７ｂ）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＦＬＩＰＲ  ３８４機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏｓ．ＦＬＩＰＲおよび０２００−６０７２）上でＳｃｒｅｅｎ  Ｑｕｅｓｔ（商標）Ｆｌｕｏ−８  Ｎｏ  Ｗａｓｈ  ｋｉｔ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３６３１５）を使用して、試験化合物への曝露時の細胞内カルシウムの上昇についてモニタリングした。コンジュゲートされていないグレリンとコンジュゲートされたグレリンについてのＥＣ５０値を決定し、比較した。ｒグレリンについてのＥＣ５０値は、１．９ｎＭであった。Ｄａｐ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤについてのＥＣ５０値は、２０．５ｎＭであった。ＧＳＷ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤについてのＥＣ５０値は、３．９ｎＭであった。したがって、グレリンのビタミンＤへのコンジュゲーションは、非修飾グレリンペプチドと実質的に同じ受容体活性をもたらした。
【０２４１】
反復投与を用いるグレリンコンジュゲートの薬物動態
２種のグレリンコンジュゲート、Ｄａｐ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤおよびＧＳＷ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤの長期の薬物動態プロファイルを、非修飾ｗｔ  Ｏｃｔ−ｒグレリンと、様々な用量で比較した。各用量を、次の通りの血液採取を伴う、４８時間によって隔てられる２回の皮下注射によって送達した：ｔ＝０（第１の投与前）、０．５、１、２、４、８、２４、３２、４８（第２の投与前）、４８．５、４９、５０、５２、５６、７２、８０、および９６時間。検査した用量は、５および０．５ｍｇ／ｋｇ（ｗｔ  Ｏｃｔ−ｒグレリン）、０．５および０．１ｍｇ／ｋｇ（Ｄａｐ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤ、ならびに０．５および０．１ｍｇ／ｋｇ（ＧＳＷ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤ）であった。採取した血漿試料に、Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ＃  ７６３０９）を、１ｍｇ／ｍｌで添加し、この血漿を、ラット／マウスグレリン（全）ＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．＃ＥＺＲＧＲＴ−９１Ｋ）を使用してグレリンのレベルが分析されるまで、直ちに凍結させた。どちらの担体で修飾されたグレリンコンジュゲートも、非修飾グレリンと比較して、大いに向上した薬物動態プロファイルを示す（図６Ｂ）。最大用量のグレリンコンジュゲート（０．５ｍｇ／ｋｇ）で、２回目の注射の７２時間後に、測定可能なレベルのコンジュゲートが認められたのに対して、同じ用量の非修飾グレリンは、６時間以内にベースラインレベルに戻った。０〜４８時間の関数としての濃度プロファイルを、血管外のノンコンパートメント分析を使用するＫｉｎｅｔｉｃａソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて分析した。台形（線形規則）方法を使用して、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。０．５ｍｇ／ｋｇ用量についての結果を、表１Ｂに与える。これらのコンジュゲートは、より高いピーク濃度（Ｃｍａｘ）を達成し、非修飾グレリンよりも遅い排出時間を有しており、算出されたＡＵＣの大幅な増大（３０〜５０倍）をもたらした。算出されたｔ１／２値は、０．６時間からおよそ１０時間まで増加した（ＶｉｔＤ−（３）担体では、１７倍の向上）。
【０２４２】
【表２】
2017533906.tif 000057
【０２４３】
悪液質および他の体重減少状態を治療するためのグレリンコンジュゲート
癌悪液質の動物モデルとして、ラットに、Ｙｏｓｈｉｄａ  ＡＨ１３０腹水肝癌細胞を移植した。腫瘍細胞の移植後、長寿命のグレリンコンジュゲート、Ｄａｐ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤを、様々な用量で、毎日または１日おきに送達した。非修飾グレリンは、皮下浸透圧ポンプを介する連続注入によって送達した。Ｄａｐ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤをまた、類似の皮下用量のグレリンおよびＯｃｔ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤ（長寿命だけでなく恒常的に活性なグレリン）と比較した。化合物投与の完全な一覧については、表１Ｃを参照されたい。ここでは、「グレリン」＝ｗｔ  Ｏｃｔ−ｒグレリン、「Ｄａｐ−ＶｉｔＤ」＝Ｄａｐ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤ、および「Ｏｃｔ−ＶｉｔＤ」＝Ｏｃｔ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤ。
【０２４４】
【表３】
2017533906.tif 000058
【０２４５】
第１日に体重（ＢＷ）範囲が１８５．１〜２６６．３ｇであった９週齢の雌のＷｉｓｔａｒラット（Ｃｒｌ：ＷＩ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ．）を使用した。Ｙｏｓｈｉｄａ  ＡＨ−１３０ラット肝癌細胞を、ラットにインビボで増殖させた。最初の接種の日に、肝癌細胞を解凍し、洗浄して凍結培地を除去し、ＰＢＳに再懸濁し、各ラットに腹腔内（ｉｐ）注射した。それに続くインビボ継代のために、対数期増殖中に肝癌細胞を腹水から採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、２×１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。第０日に、グループ３〜９（ｎ＝１０／グループ）の動物はそれぞれ、０．２ｍＬの細胞懸濁液のｉｐ注射を受けた。グループ１および２には接種しなかった。
【０２４６】
第１日に、ラットを１０匹の９つのグループに分け、表１Ｃのプロトコルに従って処置した。グループ１〜３および５〜８についての用量は、毎日（ｑｄ）皮下に（ｓｃ）送達した。グループ４についての用量は、皮下浸透圧ポンプ（Ｍｏｄｅｌ  ２００１、１μｌ／時間）を介して送達した。グループ９についての用量は、１日おきに（ｑｏｄ）送達した。グループ１および３には、ビヒクルを与え、グループ２および８には、Ｄａｐ−ＶｉｔＤを０．１ｍｇ／ｋｇで与え、グループ９には、Ｄａｐ−ＶｉｔＤを０．５ｍｇ／ｋｇで与えた。グループ４には、グレリンを、ｓ．ｃ．浸透圧ポンプを介して１．２５ｍｇ／ｋｇ／日で与え、グループ５および６には、グレリンを０．１および０．５ｍｇ／ｋｇで与えた。グループ７には、Ｏｃｔ−ＶｉｔＤを０．１ｍｇ／ｋｇで与えた。グループ１〜３および５〜９についてのすべての用量は、１ｍＬ／ｋｇの用量体積で送達し、それぞれの体重の各動物に投与した。各動物について、第１〜６日に体重（ＢＷ）を記録した。治療グループについての正規化された体重値の平均の間の差の有意性を、独立ｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して決定した。腫瘍接種グループでは、ある動物に見られる腹水が１．０ｍＬ未満であった場合には、生着失敗が想定され、その動物に関するデータは使用しなかった。
【０２４７】
治療の経過中の体重の変化を、図９に示す。これは、第１日を１００パーセントに正規化された、各グループ（ｎ＝７〜１０）についての平均体重のプロットを示す。移植された腫瘍で処置されていないグループ（グループ３）は、６日の間に体重が減った。対照的に、腫瘍で処置した群（グループ４〜９）はすべて、体重増加を示し、腫瘍を有しない健康な動物（グループ１および２）の体重増加に接近していた。第４日に、各グループの平均体重は、グループ３とは統計的に異なっていた（グループ３に対してｐ≦０．０５）。第４日に、腫瘍を有するすべてのグループのうち、グレリンの連続注入を受けたグループ（グループ４）が、体重が最も重く、そのすぐ後に、Ｄａｐ−ｒグレリン−Ｃ−ＰＥＧ２ｋ−（３）−ＶｉｔＤを１日おきに皮下注射によって受けたグループ（グループ９）が続いた。
【０２４８】
これらのデータは、ビタミンＤにコンジュゲートされたグレリンが、対象における体重を有効に増大させることを示す。これを使用して、悪液質の消耗性作用および他の体重減少障害を逆行させることができる。ビタミンＤ担体によって提供される優れた薬物動態プロファイルは、投薬時間および量におけるさらなる柔軟性を提供する。
【０２４９】
実施例７：Ｃ２５およびＣ３位置で非ホルモン性ビタミンＤにカップリングさせたインスリンの調製
この実施例では、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−ＮＨＳを、Ａ鎖（配列番号１１）とＢ鎖（配列番号１２）を含むヒトインスリンにコンジュゲートさせて、糖尿病を治療するための治療薬を調製した。インスリンＡ鎖は、ｃｙｓ６−ｃｙｓ１１鎖内ジスルフィド結合を含有する。Ａ鎖上のｃｙｓ７は、Ｂ鎖のｃｙｓ７に、鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。Ａ鎖上のｃｙｓ２０は、Ｂ鎖のｃｙｓ１９に、やはり鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。インスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ＃Ｉ２６４３）を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＤＭＳＯと１Ｍ  ＨＥＰＥＳ＋０．８５％  ＮａＣｌ（ｐＨ＝８）との１：１混合物に再懸濁した。５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解したＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−ＮＨＳ担体（インスリン４に対して１．４モル当量）を添加した。インスリンの最終濃度は、１ｍｇ／ｍｌ（ｄＨ２Ｏ中）となり、反応を、室温で１時間、進行させた。インスリンコンジュゲートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０２５０】
この実施例では、糖尿病を治療するための治療薬を調製するために、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ１．３ｋ−ＮＨＳが、ヒトインスリンにコンジュゲートされる。インスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ＃Ｉ２６４３）を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＤＭＳＯと１Ｍ  ＨＥＰＥＳ＋０．８５％  ＮａＣｌ（ｐＨ＝８）との１：１混合物に再懸濁する。５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解したＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ１．３ｋ−ＮＨＳ担体（インスリン４に対して１．４モル当量）を添加した。インスリンの最終濃度は、１ｍｇ／ｍｌ（ｄＨ２Ｏ中）にとなり、反応を、室温で１時間、進行させた。インスリンコンジュゲートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０２５１】
薬物動態実験、脂肪細胞によるグルコースの取り込みを測定するインビトロ生理活性分析、および糖尿病ラットモデルにおける血糖低下能力のインビボ評価を、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる欧州特許第２０８５４０６号明細書に記載されている通りに実施する。
【０２５２】
実施例８：Ｃ３位置およびＣ２５位置で非ホルモン性ビタミンＤにカップリングさせたＰＴＨの調製
ＰＴＨの半減期を延長し、それによって、コンジュゲートされた分子、すなわち副甲状腺機能低下症および骨粗鬆症の治療に潜在的に有用な治療薬を作製するために、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド担体（実施例３の化合物ＶＩ）、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アルデヒド（実施例２の化合物Ｖ）、およびＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド担体（実施例１より）を、ＰＴＨにコンジュゲートさせた。
【０２５３】
ＰＴＨ−Ｃ−ＰＥＧ２Ｋ−（３）−ＶｉｔＤの合成
Ｃ−末端システイン残基を有するＰＴＨ誘導体は、Ｂｉｏｐｅｐｔｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ、配列番号１７）によって合成された。担体とのコンジュゲーションは、ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍＬで溶解したチオール反応性ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド担体（実施例３の化合物ＶＩ）を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で遊離のシステインを含有するＰＴＨペプチドと、担体対ペプチドのモル比１．３：１で、混合することによって実現した。この反応は、室温で１００分間、進行させた。コンジュゲートされたペプチド、ＰＴＨ−Ｃ−ＰＥＧ２Ｋ−（３）−ＶｉｔＤを、未反応の成分から、イオン交換クロマトグラフィーによって分離した。コンジュゲーションおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。次いで、コンジュゲートの緩衝液をＰＢＳに交換し、動物研究における使用のために、０．２２ミクロンフィルターを使用して濾過滅菌した。
【０２５４】
ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−ＰＴＨの合成：
ヒトＰＴＨ（１−３４）ペプチドは、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ、カタログ＃Ｈ−４８３５、配列番号１０）から購入した。担体上のアルデヒドとペプチド上のアミン部分とのコンジュゲーションは、ペプチドのＮ−末端アミンとの反応に好都合であるように、低いｐＨで実施した。５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解させたアミン反応性のＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−アルデヒド担体（実施例２の化合物Ｖ）を、５ｍｇ／ｍＬの濃度（ｄＨ２Ｏ中）のＰＴＨ（１−３４）ペプチドと、担体対ペプチドのモル比３：１で混合した（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５）および２５ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３の最終濃度）。反応は、４℃で一晩、進行させた。コンジュゲートされたペプチド、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−ＰＴＨを、イオン交換クロマトグラフィーによって、未反応成分から分離した。コンジュゲーションおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０２５５】
細胞に基づくＰＴＨ１受容体アッセイにおけるＰＴＨ（１−３４）構築物の活性：
非修飾ＰＴＨ（１−３４）、ＰＴＨ−Ｃ−ＰＥＧ２Ｋ−（３）−ＶｉｔＤ、およびＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−ＰＴＨは、生理活性の決定のために、Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）に提出した。Ｍｕｌｔｉｓｐａｎ社のＰＴＨ機能分析は、ＰＴＨ１受容体を発現する哺乳類細胞（Ｍｕｌｔｉｓｐａｎカタログ＃Ｃ１３０１）を使用する。この分析は、カルシウム動員（Ｓｃｒｅｅｎ  Ｑｕｅｓｔ（商標）  Ｆｌｕｏ−８  Ｎｏ  Ｗａｓｈキット、ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔカタログ＃３６３１５）およびｃＡＭＰ分析（ＨＴＲＦ  ｃＡＭＰ  ＨｉＲａｎｇｅ  Ｋｉｔ、ＣｉｓＢｉｏカタログ＃６２ＡＭ６ＰＥＣ）を使用して、アゴニスト活性を測定する。ＰＴＨ（１−３４）と２種の修飾されたペプチドとの機能活性の比較を、表２に示す。ＥＣ５０値を決定するために、４パラメータロジスティック関数を用いて曲線を適合させた。ＰＴＨ（１−３４）とＰＴＨ−Ｃ−ＰＥＧ２Ｋ−（３）−ＶｉｔＤについてのＥＣ５０値が、非常に類似していたのに対して、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−ＰＴＨについてのＥＣ５０値は、およそ１０〜２０倍劣っていた。これは、Ｃ−末端へのＰＴＨのコンジュゲーションが、非修飾ＰＴＨ（１−３４）と実質的に同じ活性をもたらすことを示した。しかし、ＰＴＨのＮ−末端でのコンジュゲーションは、その活性を阻害する。
【０２５６】
【表４】
2017533906.tif 000059
【０２５７】
ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−ＰＴＨの合成
Ｎ−末端システイン残基を有するＰＴＨ誘導体は、Ｂｉｏｐｅｐｔｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ、配列番号１８）によって合成された。担体とのコンジュゲーションは、ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍＬで溶解した実施例１のチオール反応性ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド担体を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で遊離のシステインを含有するＰＴＨペプチドと、担体対ペプチドのモル比１．３：１で混合することによって実現した。この反応は、室温で７５分間、進行させた。コンジュゲートされたペプチド、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−ＰＴＨを、未反応の成分から、イオン交換クロマトグラフィーによって分離した。コンジュゲーションおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。次いで、コンジュゲートの緩衝液をＰＢＳに交換し、動物研究における使用のために、０．２２ミクロンフィルターを使用して濾過滅菌した。
【０２５８】
ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−ＰＴＨの合成
Ｎ−末端システイン残基を有するＰＴＨ誘導体は、Ｂｉｏｐｅｐｔｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ、配列番号１８）によって合成された。担体とのコンジュゲーションは、ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍＬで溶解したチオール反応性ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド担体（実施例３の化合物ＶＩ）を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で遊離のシステインを含有するＰＴＨペプチドと、担体対ペプチドのモル比１．３：１で、混合することによって実現した。この反応は、室温で７５分間、進行させた。コンジュゲートされたペプチド、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−ＰＴＨを、未反応の成分から、イオン交換クロマトグラフィーによって分離した。コンジュゲーションおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。次いで、コンジュゲートの緩衝液をＰＢＳに交換し、動物研究における使用のために、０．２２ミクロンフィルターを使用して濾過滅菌した。
【０２５９】
ＰＴＨコンジュゲートの薬物動態
ＰＴＨコンジュゲートは、遊離のＰＴＨと比較した場合に、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、薬物動態の向上を示す。非修飾ＰＴＨ（１−３４）、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−ＰＴＨ、およびＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−ＰＴＨを比較した。簡単に言うと、０．１ｍｇ／ｋｇの各分子を、皮下（ｓｃ）注射によって、ラット（ｎ＝４）に別々に注射した。血漿の試料を、０時間（投与前）、０．５、１、２、４、８、１２、２４、３２、４８、および５６時間の時点で採取し、次いで直ちに凍結させた。試料を、ＥＬＩＳＡ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃａｔ＃  ＥＫ−０５５−０８）によって、ヒトＰＴＨ（１−３４）について分析した。結果は、ＰＴＨとＰＴＨ−担体コンジュゲートとの薬物動態プロファイルの有意差を示す（図１０）。
【０２６０】
図１０は、皮下注射されたＰＴＨの薬物動態プロファイルが、Ｃ２５およびＣ３位置でビタミンＤにコンジュゲートされた場合に向上したことを示す。ただし、Ｃ３位置に対するコンジュゲーションを用いて、最良の薬物動態プロファイルが得られた。薬物動態パラメータは、Ｋｉｎｅｔｉｃａソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてデータを分析することによって得られた。非修飾ＰＴＨについての信頼できるパラメータは、野生型ペプチドの不十分なバイオアベイラビリティおよび内在性ラットＰＴＨからのバックグラウンドＰＴＨシグナルが原因で、得ることができなかった。しかし、ＰＴＨ（１−３４）の半減期は、ラットの皮下に投与された場合、１５から６０分であることが以前に報告されている（Ｆｒｏｌｉｃｋ、Ｂｏｎｅ  ３３：３７２−３７９（２００３）およびＳａｔｔｅｒｗｈｉｔｅ、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．８７：４８５−４９２（２０１０））。したがって、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−ＰＴＨの２．２時間およびＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−Ｃ−ＰＴＨの６．９時間という半減期は、非修飾ＰＴＨと比較して、少なくともそれぞれ２倍および７倍の向上に相当する。同様に、ビタミンＤ−コンジュゲートは、１０倍高いＣｍａｘ値によって示される通りのバイオアベイラビリティの向上およびそれぞれＣ２５およびＣ３コンジュゲートについての少なくとも５倍および１５倍のＡＵＣ値の向上を示す。
【０２６１】
実施例９：Ｃ３位置で非ホルモン性ビタミンＤにカップリングされた抗体の調製
この実施例では、抗体の半減期およびバイオアベイラビリティを延長するために、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−ＮＨＳ担体（国際公開第２０１３１７２９６７号パンフレットに記載されている通り）およびＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ１．３ｋ−ＮＨＳ担体（化合物ＶＩＩ）をインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））にコンジュゲートさせた。Ｒｅｍｉｃａｄｅを使用して、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および尋常性乾癬を治療する。
【０２６２】
適切な塩を伴って凍結乾燥粉末として販売されているインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））（Ｈａｎｎａｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、水で再懸濁して１０ｍｇ／ｍＬの濃度とした。ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−ＮＨＳまたはＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ１．３ｋ−ＮＨＳ担体を、ＤＭＳＯに、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁した。次いで、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ１．３ｋ−ＮＨＳとインフリキシマブを、担体とインフリキシマブのモル比５：１、１０：１、または３０：１で混合した。本発明の治療用化合物・担体コンジュゲートは典型的には、少なくとも１個の担体分子を有し、治療用化合物にそれぞれ付着された１〜１０個の担体分子であり得る。ＮＨＳ型の担体を使用することによって、２個以上の担体を、治療用タンパク質に付着させることができる。これは、反応における担体と標的治療薬のモル比を変えることによって制御することができる。この実施例では、１〜４担体の標的分配を使用した。これは、２つの異なるモル比を試験すること、および得られたコンジュゲートを質量分析によって検査することによって確認した。Ｃ２５担体は、約１〜２：１の比で、抗体にコンジュゲートした。Ｃ３担体は、約１：１の比で、抗体にコンジュゲートした。
【０２６３】
インフリキシマブおよびインフリキシマブＮＨＳ−担体コンジュゲートを、４０ｋＤａカットオフを有する脱塩カラム（Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用によって、コンジュゲートされていない担体から分離した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して、反応におけるインフリキシマブのインタクト質量を算出した。結果は、非修飾インフリキシマブが、大部分は１４９ｋＤａの質量を有していたことを示す。ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２ｋ−ＮＨＳ担体の１から３の平均付着部分が、抗体に付着し、ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ１．３ｋ−ＮＨＳ担体の１から２が、抗体に付着した。
【０２６４】
実施例１０：非ホルモン性ビタミンＤにコンジュゲートされたＧＬＰ−１の調製および特徴付け
合成のＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（配列番号１９、以下ではＧＬＰ−１と称する）は、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ、カタログ＃Ｈ−９５６０）から購入し、追加のＣ−末端システイン残基を有するＧＬＰ−１−Ｃ（配列番号２０）は、Ｂｉｏｐｅｐｔｅｋ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）によってカスタム合成された。これを、実施例１および３に記載した通りのビタミンＤ−ＰＥＧ−マレイミド担体にコンジュゲートした。コンジュゲーションは、ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬで溶解した、実施例１のチオール反応性部分（ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド）または実施例３の化合物ＶＩ（ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミド）を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液中に〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で遊離のシステインを含有するＧＬＰ−１−Ｃペプチドと、担体対ペプチドのモル比１．３：１で、混合することによって実現した。この反応は、室温で１時間、進行させた。コンジュゲートされたペプチドを、未反応の成分から、イオン交換クロマトグラフィーによって分離した。コンジュゲーションおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。次いで、ＧＬＰ−１ペプチドおよびＧＬＰ−１−担体コンジュゲートの緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０２６５】
ＧＬＰ−１ペプチド−担体の受容体結合活性の評価
いくつかの実施態様では、ＧＬＰ−１ペプチドの活性は、担体にコンジュゲートされる場合、非修飾ペプチドとほぼ同じであった。ＧＬＰ−１とＧＬＰ−１−Ｃ−ＰＥＧ２Ｋ−ＶｉｔＤを、細胞に基づく受容体アゴニスト分析を使用して、受容体結合、およびＧＬＰ１ＲすなわちＧＬＰ−１受容体の活性化（アゴニスト活性）について比較した：ヒトＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ１Ｒ、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を安定的に発現するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）細胞を、化学発光シグナル検出を用いるＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機器上でＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）検出試薬カクテルを使用して、試験化合物への曝露時のβ−アレスチンの動員についてモニタリングした。コンジュゲートされていないＧＬＰ−１についてのＥＣ５０値は、０．８２μＭであった。ＧＬＰ−１−Ｃ−ＰＥＧ２Ｋ−（２５）−ＶｉｔＤについてのＥＣ５０値は、０．５１μＭであった。ＧＬＰ−１−Ｃ−ＰＥＧ２Ｋ−（３）−ＶｉｔＤについてのＥＣ５０値は、０．５２μＭであった。したがって、ＧＬＰ−１のビタミンＤへのコンジュゲーションは、非修飾ＧＬＰ−１ペプチドとほぼ同じまたはより優れた受容体活性をもたらした。
【０２６６】
実施例１１：Ｃ３およびＣ２５位置で非ホルモン性ビタミンＤにコンジュゲートされたＦＧＦ２１の調製および特徴付け
修飾されたＦＧＦ２１を、実施例１および３に記載した通りにビタミンＤ−ＰＥＧ−マレイミド担体にコンジュゲートした。以下に示す通り、ＦＧＦ２１−担体組成物は、非修飾ＦＧＦ２１と比較した場合に、有意に向上した薬物動態特性を提供した。どちらのコンジュゲートも、非修飾ＦＧＦ２１に勝る有意な向上を示したが、Ｃ３位置でのコンジュゲーションは、Ｃ２５位置でのコンジュゲーションに勝る有意な向上を示した。まとめると、この実施例は、ＦＧＦ２１−ＶｉｔＤコンジュゲートが、糖尿病を含めた、ＦＧＦ２１治療の恩恵を受けるであろう疾患の治療のための重要な治療用化合物であることを示す。
【０２６７】
ＦＧＦ２１は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、精製し、次の通りに担体にコンジュゲートした。ＦＧＦ２１のアミノ末端の近くに遊離のシステイン残基を有する修飾されたＦＧＦ２１は、担体への部位特異的なカップリングを可能にする。精製しやすくするために６−Ｈｉｓタグを添加した。修飾されたＦＧＦ２１コード配列（配列番号２１）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために計算上最適化されたコドンであった。遺伝子は、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって化学的に合成し、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ５プロモーターとカナマイシン耐性遺伝子とを含有するＩＰ−Ｆｒｅｅ発現ベクターｐＤ４４１−ＳＲにクローン化した。プラスミドを、Ｓｈｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｃ３０２８Ｈ）に形質転換した。細胞を、対数期半ばまで３０℃で培養し、次いで、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて２５℃で４時間誘導させた。細胞を回収し、溶解させ、上清を収集した。ＦＧＦ２１タンパク質（配列番号２２）を、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して精製し、アニオン交換クロマトグラフィーによって最終精製した。
【０２６８】
担体とのコンジュゲーションは、実施例１のチオール反応性部分ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミドまたは実施例３の化合物ＶＩ：ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−マレイミドを混合することによって実現した。簡単に言うと、担体を、遊離のシステインを含有する精製されたＦＧＦ２１タンパク質と共に、担体対ＦＧＦ２１のモル比３：１で、ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬで溶解した。この反応は、室温で１時間、進行させた。コンジュゲートされたペプチドを、未反応の成分から、製造業者のプロトコルに従ってＺｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム、７Ｋ  ＭＷＣＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．８９８８２）を使用することによって分離した。コンジュゲーションおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。次いで、ＦＧＦ２１、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−ＦＧＦ２１、およびＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−ＦＧＦ２１の緩衝液をＰＢＳに交換し、動物研究における使用のために、０．２２ミクロンフィルターを使用して濾過滅菌した。
【０２６９】
ＦＧＦ２１−担体コンジュゲートの受容体結合活性の評価
いくつかの実施態様では、ＦＧ２１の活性は、担体にコンジュゲートされる場合、非修飾タンパク質と実質的に同じであった。ＦＧＦ２１とＶｉｔＤ−ＰＥＧ２Ｋ−ＦＧＦ２１コンジュゲートを、細胞に基づく受容体アゴニスト分析（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｕ２ＯＳ  ＦＧＦＲ１−β−Ｋｌｏｔｈｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓａｙ、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．９３−０９４３Ｃ３）を使用して、受容体結合およびＦＧＦＲ１の活性化について比較した。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）細胞は、ヒトＦＧＦ２１受容体（ＦＧＦＲ１）を安定的に発現する。これらを、化学発光シグナル検出を用いるＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機器上でＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）検出試薬カクテルを使用して、試験化合物への曝露後のｃｏ−受容体、β−Ｋｌｏｔｈｏの動員についてモニタリングした。コンジュゲートされていないＦＧＦ２１についてのＥＣ５０値は、０．１６μｇ／ｍｌであった。ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−ＦＧＦ２１についてのＥＣ５０値は、０．１３μｇ／ｍｌであった。ＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−ＦＧＦ２１についてのＥＣ５０値は、０．４０μｇ／ｍｌであった。したがって、ＦＧＦ２１コンジュゲートは、非修飾ＦＧＦ２１タンパク質とほぼ同じ、またはそれ以上の受容体活性を保持していた。
【０２７０】
ＦＧＦ２１コンジュゲートの薬物動態
Ｓｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるＦＧＦ２１コンジュゲートの薬物動態を決定した。非修飾ＦＧＦ２１、ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−ＦＧＦ２１、およびＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−ＦＧＦ２１を比較した。簡単に言うと、０．１ｍｇ／ｋｇの各分子を、皮下（ｓｃ）注射によって、ラット（ｎ＝３）に別々に注射した。血漿の試料を、０時間（投与前）、０．５、１、２、４、８、２４、３２、４８、および５６時間の時点で採取し、直ちに凍結させた。試料を、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ヒトＦＧＦ２１について分析した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＺＨＦＧＦ２１−１９Ｋ）。結果は、コンジュゲートされていないＦＧＦ２１とＦＧＦ２１−担体コンジュゲートとの薬物動態プロファイルの有意差を示す（図１１）。皮下注射されたＦＧＦ２１の薬物動態プロファイルは、Ｃ２５およびＣ３位置でビタミンＤにコンジュゲートされた場合に向上した。ただし、Ｃ３位置に対するコンジュゲーションを用いて、最良の薬物動態プロファイルが得られた。薬物動態パラメータは、Ｋｉｎｅｔｉｃａソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてデータを分析することによって得られ、これを表３に列挙する。ＶｉｔＤ−（２５）−ＰＥＧ２Ｋ−ＦＧＦ２１の５．３時間およびＶｉｔＤ−（３）−ＰＥＧ２Ｋ−ＦＧＦ２１の１１．５時間という半減期（ｔ１／２）は、非修飾ＦＧＦ２１と比較して、それぞれ４．１倍および８．８倍の向上に相当する。同様に、ビタミンＤコンジュゲートは、およそ２倍高いＣｍａｘ値によって示される通りのバイオアベイラビリティの向上およびそれぞれＣ２５およびＣ３コンジュゲートについての７．２倍および１２．０倍のＡＵＣ値の向上を示す。平均滞留時間（ＭＲＴ）および終末相の速度定数（Ｌｚ）値の向上も観察された。
【０２７１】
【表５】
2017533906.tif 000060
【０２７２】
例示的な配列
配列番号１（アペリン）
ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ
配列番号２（ヒトｗｔ  Ｏｃｔ−ｈグレリン）
ＧＳ（Ｏｃｔ−Ｓ）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
配列番号３（ヒトＯｃｔ−ｈグレリン−Ｃ）
ＧＳ（Ｏｃｔ−Ｓ）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
配列番号４（ヒトＤａｐ−ｈグレリン）
ＧＳＳ（Ｏｃｔ−Ｄａｐ）ＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
配列番号５（ヒトＧＳＹ−ｈグレリン）
ＧＳＹＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
配列番号６（ラットｗｔ  Ｏｃｔ−ｒグレリン）
ＧＳ（Ｏｃｔ−Ｓ）ＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＰＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ
配列番号７（ラットＯｃｔ−ｒグレリン）
ＧＳ（Ｏｃｔ−Ｓ）ＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＰＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
配列番号８（ラットＤａｐ−ｒグレリン）
ＧＳ（Ｏｃｔ−Ｄａｐ）ＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＰＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
配列番号９（ラットＧＳＷ−ｒグレリン）
ＧＳＷＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＰＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲＣ
配列番号１０（ＰＴＨ（１−３４））
ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ
配列番号１１（ヒトインスリンＡ鎖）
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
配列番号１２：（ヒトインスリンＢ鎖）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
【化５５】
2017533906.tif 000061
【化５６】
2017533906.tif 000062
配列番号１６（Ｃ−アペリン）  
ＣＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ
配列番号１７（ＰＴＨ−Ｃ）  
ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦＣ
配列番号１８（Ｃ−ＰＴＨ）  
ＣＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ
配列番号１９（ＧＬＰ−１（７−３７））  
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ  Ｇ
配列番号２０（ＧＬＰ−１−Ｃ）  
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＣ
【化５７】
2017533906.tif 000063
【０２７３】
本明細書に開示したまたは言及したすべての刊行物および特許文献の全体を、参照によって組み込む。先の記載は、例示および説明の目的でのみ提供されている。この記載は、本発明を、開示された厳密な形態に限定することを意図していない。本発明の範囲は、本明細書に添付された特許請求の範囲によって定義されるものとする。
【図１】
2017533906.tif 000068
【図２】
2017533906.tif 000069
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2017533906.tif 000081
2017533906.tif 000082
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