(57)【要約】皮質組織と間質組織を含む卵巣組織サンプルを提供するステップと、卵巣組織サンプルから、あれば損傷組織を取り除くステップと、卵巣組織サンプルから、あれば余分な間質組織を取り除くステップと、次に、卵巣組織サンプルを該卵巣組織サンプルの少なくとも一つの次元に沿って機械的に引き伸ばし、その結果、少なくとも１つの次元に沿った卵巣組織サンプルのサイズを少なくとも１０％拡大するステップとを含む、原始卵胞の成長のための卵巣組織を調製する方法を提示する。生育可能な卵母細胞をインビトロで成長させる方法および個々の成長用卵巣卵胞を調製する方法も提示する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮質組織と間質組織を含む卵巣組織サンプルを提供するステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば損傷組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば余分な間質組織を取り除くステップと、次に、
前記卵巣組織サンプルを該卵巣組織サンプルの少なくとも一つの次元に沿って機械的に引き伸ばし、その結果、前記少なくとも１つの次元に沿った卵巣組織サンプルのサイズを少なくとも１０％拡大するステップとを含む、原始卵胞の成長のための卵巣組織を調製する方法。
【請求項２】
前記卵巣組織サンプルは、前記卵巣組織サンプルの多数の次元に沿って機械的に引き伸ばされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記卵巣組織サンプルサイズの最も大きな拡大は、前記卵巣組織サンプルを、前記卵巣組織サンプルの最も長く連結した繊維の次元に対して平行な卵巣組織サンプルの次元に沿って機械的に引き伸ばす場合に実現される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
間質組織の層の厚さは、余分な間質組織を前記卵巣組織サンプルから取り除くステップの後、１〜５ｍｍまで薄くされる、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
間質組織の層の厚さは、余分な間質組織を前記卵巣組織サンプルから取り除くステップの後、約３ｍｍまで薄くされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記卵巣組織サンプルは、前記卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、複数のより小さい卵巣組織断片に切断される、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記卵巣組織サンプル内の皮質組織は、前記卵巣組織サンプルの第１の辺に皮質表面を形成し、前記間質組織は、前記第１の辺に対向して、前記卵巣組織の第２の辺に間質表面を形成する、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記皮質表面の表面積は、前記卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、前記間質表面の表面積の少なくとも１〜２倍になり得る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記皮質表面の表面積は、前記卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、前記間質表面の表面積の約１．５倍になる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記皮質組織は内在性の卵巣卵胞の集合を含み、前記内在性の卵巣卵胞の成長は、前記卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの間に促進され得る、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記内在性の卵巣卵胞の集合内の直径８０μｍ超の内在性の卵巣卵胞は、前記卵巣組織から機械的に取り出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、卵巣幹細胞の集合が前記卵巣組織サンプルに導入される、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記卵巣幹細胞の集合の部分集合は前記皮質組織内で外生卵巣卵胞に分化する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記外生卵巣卵胞はマーカでラベル付けされ、前記外生卵巣卵胞を前記内在性の卵巣卵胞と区別できるようにする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカは蛍光マーカである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記卵巣組織サンプルは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む無血清培地において少なくとも２４時間培養される、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記無血清培地は、０．５ｎｇ／ｍＬ〜２．５ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含み得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
単離した卵巣支持体細胞の集合が、少なくとも２４時間培養した後で、前記卵巣組織サンプルの皮質組織に導入される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記単離支持体細胞はＤＤＸ４陰性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記単離卵巣支持体細胞の集合を導入するステップの後、前記卵巣組織サンプルは追加で少なくとも４日間培養される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れか一項に記載の方法を介して調製された卵巣組織サンプルを提供するステップと、
前記卵巣組織サンプルから個々の卵巣卵胞を選択し、機械的に抽出するステップと、
抽出した個々の卵巣卵胞を別個の培養培地にそれぞれ置くステップとを含む、個々の卵巣卵胞を調製する方法。
【請求項２２】
前記卵巣組織サンプルから機械的に抽出された前記個々の卵巣卵胞は、直径が少なくとも７０μｍである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
個々の抽出卵巣卵胞はそれぞれ、別個の容器の別個の培養培地に置かれる、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
分離させられた抽出卵巣卵胞が置かれる前記培養培地は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む、請求項２１〜２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養培地はアクチビンＡを含む、請求項２１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＦＳＨの濃度は培養期間の間で上昇させられる、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
皮質組織と間質組織を含む卵巣組織サンプルを提供するステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば損傷組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば余分な間質組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルを該卵巣組織サンプルの少なくとも一つの次元に沿って機械的に引き伸ばし、その結果、前記少なくとも１つの次元に沿った卵巣組織サンプルのサイズを少なくとも１０％拡大するステップと
前記卵巣組織サンプルを、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む無血清培地において少なくとも２４時間培養するステップと、
単離した卵巣支持体細胞の集合を前記卵巣組織サンプルに加えるステップと、
前記卵巣組織サンプルを追加で少なくとも４日間培養するステップと、
前記卵巣組織サンプルから個々の成長卵胞を機械的に取り出すステップとを含む、個々の成長用卵巣卵胞を調製する方法。
【請求項２８】
前記卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップと、前記卵巣組織サンプルを少なくとも２４時間培養するステップの間で、卵巣幹細胞の集合を前記皮質組織に導入し、その結果、前記卵巣幹細胞の集合の少なくとも部分集合を前記皮質組織内で外生卵巣卵胞の集合に分化させるステップを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後かつ前記卵巣組織サンプルを少なくとも２４時間培養するステップの前に、前記卵巣組織サンプルは複数の卵巣組織断片に切断される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記機械的に取り出された個々の成長卵胞を、それぞれさらに別個に成長させる、請求項２７〜２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
培地内に、卵母細胞−卵丘複合体と基底膜とを含む卵巣卵胞を提供するステップと、
前記卵巣卵胞の基底膜を機械的に破るステップと、
前記卵母細胞−卵丘複合体を前記卵巣卵胞から放出させるステップとを含む、卵母細胞−卵丘複合体を卵巣卵胞から放出させる方法。
【請求項３２】
前記卵巣卵胞は、請求項２１〜３０の何れか一項に記載の方法により提供される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記卵巣卵胞は胞状卵巣卵胞である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記卵巣卵胞の直径は少なくとも１５０μｍである、請求項３１〜３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記卵母細胞−卵丘複合体を保持膜に移し、その結果、前記卵母細胞−卵丘複合体が前記保持膜にサポートされるようにする、請求項３１〜３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
内在性の卵巣卵胞の集合を含む皮質組織と、間質組織とを含む卵巣組織サンプルを提供するステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば損傷組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば余分な間質組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルを該卵巣組織サンプルの少なくとも一つの次元に沿って機械的に引き伸ばし、その結果、前記少なくとも１つの次元に沿った卵巣組織サンプルのサイズを少なくとも１０％拡大するステップと、
前記卵巣組織サンプルを、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む無血清培地において少なくとも２４時間培養するステップと、
単離した卵巣支持体細胞の集合を前記卵巣組織サンプルに加えるステップと、
前記卵巣組織サンプルを追加で少なくとも４日間培養するステップと、
直径が少なくとも８０μｍの個々の成長卵胞を、前記卵巣組織サンプルの内在性の成長卵胞の集合から機械的に抽出するステップと、
個々の抽出卵巣卵胞をそれぞれ、ＦＳＨとアクチビンＡを含む培養培地に置き、前記個々の卵巣卵胞を少なくとも６日間培養して、その結果、前記個々の卵巣卵胞が卵母細胞−卵丘複合体と基底膜とを含むようにするステップと、
前記卵巣卵胞の基底膜を機械的に破ることにより、前記卵母細胞−卵丘複合体を前記卵巣卵胞から放出させるステップと、
前記卵母細胞−卵丘複合体を保持膜に移し、その結果、前記卵母細胞−卵丘複合体が前記保持膜にサポートされるようにするステップと、
前記保持膜上の卵母細胞−卵丘複合体を、前記卵母細胞−卵丘複合体内の卵母細胞の直径が少なくとも１００μｍに成長するまで培養培地において培養するステップと、
前記保持膜上の卵母細胞を培養培地で培養し、第１極体が前記卵母細胞から放出されるまで前記培養培地から空気を遮断するステップとを含む、生育可能な卵母細胞をインビトロで成長させる方法。
【請求項３７】
卵巣幹細胞の集合を前記皮質組織に導入し、その結果、前記卵巣幹細胞の集合の少なくとも部分集合を、前記卵巣組織サンプルを引き延ばすステップの後、外生卵巣卵胞の集合に分化させるステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３６のステップを含む、生育可能な卵母細胞をインビトロで成長させる方法であって、前記卵巣組織サンプルの皮質組織は内在性の卵巣卵胞の集合を含まず、前記卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後かつ前記卵巣組織サンプルを少なくとも２４時間培養するステップの前に、卵巣幹細胞の集合を前記卵巣組織サンプルの皮質組織に導入し、その結果、前記幹細胞の集合の少なくとも部分集合を、前記卵巣組織サンプルを引き延ばすステップの後、外生卵巣卵胞の集合に分化させるステップを含む、方法。
【請求項３９】
請求項１〜３８の何れか一項に記載の卵巣組織サンプルを調製する方法で用いるための単離卵巣支持体細胞の集合であって、インビトロで単独で培養される場合はシート状の構造を形成する、単離卵巣支持体細胞の集合。
【請求項４０】
ＤＤＸ４陰性細胞であると特定される、請求項３９に記載の単離卵巣支持体細胞の集合。
【請求項４１】
前記単離卵巣支持体細胞が処理卵巣間質組織に由来する、請求項３９または４０に記載の単離卵巣支持体細胞の集合。
【請求項４２】
無血清であり、０．５ｎｇ／ｍＬ〜２．５ｎｇ／ｍＬの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）含む、請求項１〜２０の何れか一項に記載の卵巣組織を培養する方法で用いるための培養培地。
【請求項４３】
０．５〜１．５ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含む、請求項３１〜３８の何れか一項に記載の単離卵巣卵胞を成長させる方法で用いるための培養培地。
【請求項４４】
５０〜１５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項４３に記載の培養培地。
【請求項４５】
前記ＦＳＨの濃度は、単離卵巣卵胞の培養が進行するに従って調整される、請求項４３または４４に記載の培養培地。
【請求項４６】
エストラジオールが、最初の培養期間の後に前記培養培地に加えられる、請求項４３〜４５の何れか一項に記載の培養培地。
【請求項４７】
追加のエストラジオールが、追加の培養期間の後に前記培養培地に加えられる、請求項４６に記載の培養培地。
【請求項４８】
５０〜１５０ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含む、請求項３１〜３８の何れか一項に記載の卵母細胞を成長させる方法で用いるための培養培地。
【請求項４９】
ピルビン酸ナトリウム、カナマイシン硫酸塩、トランスフェリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、エストラジオール、および上皮成長因子（ＥＧＦ）のうち１つまたは複数をさらに含む、請求項４８に記載の培養培地。
【請求項５０】
請求項３９〜４１の何れか一項に記載の単離支持体細胞の集合と適切な培地とを含むパーツキット。
【請求項５１】
前記単離支持体細胞の集合は前記適切な培地に懸濁している、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
請求項１〜３８の何れか一項に記載の方法で用いられる、請求項５０または５１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵母細胞とインビトロでの卵母細胞発育方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
大型哺乳類の卵母細胞を、卵胞期の最も初期の段階から成熟および受精へとインビトロで成長させる機能は、これらの種における卵母細胞の発育プロセスを研究するためのモデル系を提供するだけでなく、ヒトおよび例えばウシといった動物の産生系における妊孕性温存手法を革命的に変化させる可能性がある。原始段階からインビトロで成長させた卵母細胞から生きた子孫を産生することは、マウスで達成されたのみである（Eppig and O'Brien 1996; O'Brien et al., 2003）。この実証は、ヒトおよび家畜における同様の培養系の逐次展開へとつながった。これらの系はそれぞれ、卵母細胞発育の異なる段階をサポートする。
【０００３】
原則としては、原始卵胞を皮質組織（しばしば生検を介して採取される）から単離し、卵母細胞に成長させ、次に受精させることができる。しかしながら、当技術分野での異なる系は、必ずしも一緒に機能するように設計されているわけではなく、そのため、このような系は両立し得ない、または、後で受精させ、最終的には生きた子孫をもたらす生育可能で健全な卵母細胞をインビトロで産生する、有効もしくは効率的な方法を提供することができない。
【０００４】
加えて、例えばヒト、ウシ、またはヒツジなどのより大型の哺乳動物の原始卵胞を卵母細胞へ発育させるためのインビトロ成熟系を開発することは、げっ歯類とより大きい哺乳動物の間のタイミングとサイズの尺度の違いにより達成することがより困難だった（Telfer and McLaughlin, 2012）。これらの違いは、これらの系からの生育可能で健全な卵母細胞の収率の低さにつながった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そのため、より大型な哺乳類の、生育可能で健全な卵母細胞を原始卵胞から発育させる、成立可能かつ実現可能な方法を提供することが本発明の少なくとも１つの態様の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１態様により、
皮質組織と間質組織を含む卵巣組織サンプルを提供するステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば損傷組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば余分な間質組織を取り除くステップと、次に、
前記卵巣組織サンプルを該卵巣組織サンプルの少なくとも一つの次元に沿って機械的に引き伸ばし、その結果、前記少なくとも１つの次元に沿った卵巣組織サンプルのサイズを少なくとも１０％拡大するステップとを含む、原始卵胞の成長のための卵巣組織を調製する方法を提供する。
【０００７】
典型的には、卵巣組織サンプルは、より大型の哺乳動物から採取する。例えば、卵巣組織サンプルは、ブタ、ウシ、ヒツジ、またはヒトの卵巣から採取した生検サンプルの形であってよい。卵巣組織サンプルはヒトの組織サンプルであってよい。
【０００８】
本発明の本態様の方法で用いる卵巣組織サンプルは、元の卵巣組織サンプル全体またはその一部であってよい。例えば、卵巣組織サンプルが生検サンプルの形をしている実施形態では、本発明の本態様の方法で用いる卵巣組織サンプルは、生検サンプル全体またはその断片もしくは切片であってよい。
【０００９】
卵巣組織サンプルを生検を介して取得した場合、該卵巣組織サンプルは損傷組織を含み得る。用語「損傷組織」は、卵巣組織サンプルを親組織から切り離した際に、出血し得る、または、生検中に穴が開いたもしくは破れた、組織、血管、および／または管を指す。
【００１０】
損傷組織は、原始卵胞の成長を抑制し得る酵素、ホルモン、または他の因子を放出し得る。そのため、卵巣組織サンプルから損傷組織を取り除くステップは、原始卵胞の成長の抑制を招き得る因子を抑制することにより、非損傷組織の汚染を防ぐ、または限定する。
【００１１】
「機械的に引き伸ばすこと」は、卵巣組織サンプルに対し、該卵巣組織サンプルの少なくとも１つの次元に沿って固定点から離れる方向に物理的な力を適用することによって、組織を引き延ばすことを指す。例えば、卵巣組織サンプルは、概して、少なくとも１つの次元に平行に走る繊維を含み得、少なくとも１つの次元に対し平行な方向に物理的な力を適用した際、前記繊維同士が少なくとも１つの次元に対し平行な方向に互いに移動することによって、少なくとも１つの次元に沿って卵巣組織サンプルのサイズを拡大することができる。
【００１２】
用語「原始卵胞」は、活性化して成長するまでには至っていない未成熟の卵胞を指す。このような卵胞を、一般的に当技術分野では、「原始段階」または「原始状態」にあるという。
【００１３】
当技術分野で既知の、インビトロで卵巣卵胞を成長させるための方法は、典型的には、最小の卵胞の活性化でつまずくため、成長卵巣卵胞の数が少なく、成長中の少数の卵巣卵胞の成長速度は遅く、結果として生じる卵母細胞の生育能力および健全性は限定される。したがって、これらの方法は、生育可能で健全な卵母細胞を産生するには非効率で限られた効果しかない。
【００１４】
驚くべきことに、発明者らは、卵巣組織サンプルを機械的に引き延ばすステップが、皮質組織内での成長が後から観察できる、生育可能で健全な卵胞の数を増加させることを発見した。
【００１５】
典型的には、卵巣組織は高密度の繊維を含み、卵巣組織サンプルを引き伸ばす行為により、これらの繊維の密度を緩めるまたは低減させることができる。卵巣組織繊維の密度を緩めるまたは低減させることは繊維間の相互作用を弱め、それにより繊維間の距離を拡大させることができる。したがって、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップは、培地、タンパク質、酵素、または細胞などの外生的な種が、卵巣組織の繊維間に容易に浸透することを可能にし得る。
【００１６】
加えて、卵巣組織サンプルの皮質組織は、しばしば原始卵胞を含み、これらの皮質組織内の原始卵胞は、皮質組織内に密集している場合がある。例えば、原始卵胞の密度はｍｍ３当たり最大で４００個の場合がある。
【００１７】
発明者らは、皮質組織内の原始卵胞の密集が、原始卵胞の活性化とその後の成長を抑制し得ると推測する。そのため、原始卵胞が皮質組織に密集している実施形態では、卵巣組織サンプルを機械的に引き延ばすステップが、皮質組織内の原始卵胞間の分離を拡大し得る。このような分離の拡大は、例えば、卵巣組織サンプルの皮質組織内の原始卵胞の位置にある抗ミュラー管ホルモンなどの抑制因子の濃度を減少させることにより、近くの原始卵胞に対する所与の原始卵胞の抑制効果を低減させることができる。
【００１８】
任意の事象において、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップには、卵巣組織サンプルの皮質組織内に存在し得る任意の原始卵胞の活性化を促進する効果があり得る。
【００１９】
卵巣組織サンプルは、該卵巣組織サンプルの多数の次元に沿って機械的に引き伸ばすことができる。
【００２０】
卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップは、該卵巣組織サンプルのサイズを少なくとも１つの次元に沿って、少なくとも１０％拡大することができる。
【００２１】
卵巣組織サンプルサイズの最も大きな拡大は、卵巣組織サンプルを、卵巣組織サンプルの最も長く連結した繊維の次元に対して平行な卵巣組織サンプルの次元に沿って機械的に引き伸ばす場合に実現することができる。
【００２２】
卵巣組織は、機械的に引き伸ばした後、弛緩してほぼ元のサイズに戻り得る。卵巣組織サンプルは、機械的に引き伸ばすステップの後、拡大したサイズまたは実質的に拡大したサイズのままにすることができる。
【００２３】
好適には、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップは、組織の破断および／または細胞の破裂、ならびに、それに続くその内容物の放出を引き起こさない。
【００２４】
間質組織は、皮質組織の上に層を形成し得る。間質組織の層の厚さは、必要以上に厚いため、余分な間質組織を取り除くことにより間質組織の層の厚さを薄くすることができる。間質組織の層の厚さは、余分な間質組織を卵巣組織サンプルから取り除くステップの後、１〜５ｍｍまで薄くすることができる。間質組織の層の厚さは、余分な間質組織を卵巣組織サンプルから取り除くステップの後、２〜４ｍｍまで薄くすることができる。好適には、間質組織の層の厚さは、余分な間質組織を卵巣組織サンプルから取り除くステップの後、約３ｍｍまで薄くすることができる。したがって、「余分な間質組織」とは、１〜５ｍｍ、２〜４ｍｍ、または好適には約３ｍｍを超えて皮質組織から伸長している間質組織である。
【００２５】
卵巣組織サンプル内の皮質組織は、卵巣組織サンプルの第１の辺に皮質表面を形成し得る。間質組織は、第１の辺に対向して、卵巣組織の第２の辺に間質表面を形成し得る。
【００２６】
皮質表面の表面積は、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、間質表面の表面積の少なくとも１〜２倍になり得る。皮質表面の表面積は、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、間質表面の表面積の少なくとも１．３〜１．７倍になり得る。好適には、皮質表面の表面積は、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、間質表面の表面積の約１．５倍である。したがって、卵巣組織サンプルの皮質表面積対間質表面積の比率は１：１〜２：１になり得る。好適には、皮質表面積対間質表面積の比率は３：２である。
【００２７】
卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、卵巣組織サンプルを複数のより小さい卵巣組織断片に切断することができる。卵巣組織サンプルは、皮質表面の表面積が間質表面の表面積より大きくなるような角度で切断することができる。卵巣組織サンプルは、皮質表面の平面に対し３０°〜６０°の角度で切断することができる。好適には、卵巣組織サンプルは、皮質表面の平面に対し約４５°の角度で切断する。
【００２８】
卵巣組織サンプルを対向端部で切断する実施形態では、結果として生じる組織断片は直角プリズムであり得る。卵巣組織サンプルを、結果として生じる皮質表面が長方形になるように２組の対向辺で切断する実施形態では、組織断片は裁頭ピラミッド型（frusto-pyramidal）であり得る。このように、本発明は、原始卵胞の成長のための卵巣組織および／または卵巣組織断片を調製する方法であり得る。
【００２９】
皮質組織は内在性の卵巣卵胞の集合を含み得、内在性の卵巣卵胞の成長は、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの間に促進され得る。
【００３０】
用語「内在性の卵巣卵胞」（内生卵巣細胞）は、卵巣組織サンプルを取得した際、卵巣組織サンプルに元々あった卵巣卵胞を指す。
【００３１】
内在性の卵巣卵胞集合内の直径８０μｍ超の内在性の卵巣卵胞は、卵巣組織から機械的に取り出すことができる。好適には、内在性の卵巣卵胞集合内の直径１００μｍ超の内在性の卵巣卵胞は、卵巣組織から機械的に取り出すことができる。内在性の卵巣卵胞集合内の直径８０μｍ超または１００μｍ超の内在性の卵巣卵胞は、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、卵巣組織から機械的に取り出すことができる。
【００３２】
約８０μｍ以上の内在性の卵巣卵胞には、原始卵胞の活性化およびそれに続く成長を抑制する効果があることが観察されているため、これらのより大きな内在性の卵巣卵胞を取り出すことはこの抑制効果を最小にし、それにより、後で成長が活性化される内在性の卵巣卵胞の潜在的数が増える。
【００３３】
本発明の一実施形態では、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、卵巣幹細胞の集合を卵巣組織サンプルに導入する。卵巣幹細胞の集合は、内在性の卵巣卵胞を含む卵巣組織サンプルに導入することができる。卵巣幹細胞の集合は、内在性の卵巣卵胞を含まない卵巣組織サンプルに導入することができる。
【００３４】
典型的には、卵巣幹細胞の集合には、１００〜１００００個の卵巣幹細胞が含まれる。
【００３５】
卵巣幹細胞の集合の部分集合は、皮質組織内で外生卵巣卵胞に分化することができる。好適には、卵巣幹細胞集合内の卵巣幹細胞の大部分が、皮質組織内で外生卵巣卵胞に分化することができる。
【００３６】
例えば、卵巣組織サンプルは、１〜１００個の外生卵巣卵胞を含み得る。
【００３７】
用語「外生卵巣卵胞」は、卵巣組織サンプルを取得した際には卵巣組織サンプル内に元々存在せず、それ以降に卵巣組織サンプルに加えられた卵巣卵胞を指す。例えば、卵巣組織サンプルに加えられた卵巣幹細胞は、外生卵巣卵胞に分化することができる。
【００３８】
卵巣組織サンプルが内在性の卵巣卵胞を含み、外生卵巣卵胞に分化する卵巣幹細胞の集合が卵巣組織サンプルに導入される本発明の実施形態では、外生卵巣細胞は、卵巣組織サンプル内で内在性の卵巣卵胞と一緒に成長することができる。外生卵巣卵胞はマーカでラベル付けし、外生卵巣卵胞を内在性の卵巣卵胞と区別できるようにする。マーカは蛍光マーカでよい。蛍光マーカは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはＧＦＰの誘導体などの蛍光タンパク質を含むか、または、例えば蛍光デキストランなどの代わりの蛍光色素部分を含むことができる。したがって、卵巣組織サンプルに、蛍光マーカの蛍光を引き起こす波長の光を当てた際に、外生卵巣卵胞を視覚的に内在性の卵巣卵胞と区別することができる。
【００３９】
典型的には、所与の卵巣組織サンプルの皮質組織内の原始内在性の卵巣卵胞の分布および密度は均一ではなく、卵巣組織ごとに典型的にはｍｍ３あたり０〜４００卵胞と非常に異なる可能性があり、前記分布および密度は卵巣組織サンプルを取得した対象の種、齢、ホルモン周期性、および薬物治療／病気といったいくつかの因子に関係し得る。
【００４０】
そのため、所与の卵巣組織サンプルの皮質組織は、内在性の卵巣卵胞を含まない場合がある。したがって、卵巣幹細胞の集合が皮質組織に導入され、該皮質組織が原始内在性の卵巣卵胞を含まない実施形態では、本方法は、外生卵巣卵胞の成長のための卵巣組織を調製する方法であり得る。
【００４１】
好適には、卵巣組織サンプルを、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む無血清培地において少なくとも２４時間培養する。卵巣組織サンプルは、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、ＦＳＨを含む無血清培地において少なくとも２４時間培養することができる。卵巣幹細胞の集合を卵巣組織サンプルに加える実施形態では、卵巣組織サンプルは、卵巣幹細胞の集合を卵巣組織サンプルに加えるステップの後、ＦＳＨを含む無血清培地において少なくとも２４時間培養することができる。
【００４２】
無血清培地は、０．５ｎｇ／ｍＬ〜２．５ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含み得る。好適には、無血清培地は、少なくとも１ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含む。好適には、無血清培地は、２．５ｎｇ／ｍＬ未満を含む。
【００４３】
卵巣組織サンプルがウシ卵巣組織サンプルである実施形態では、ウシ血清、アクチビンＡ、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、７４０−ＹＰ、ＧＤＦ−９、またはＢＭＰ１５それぞれが、またはその組み合わせが、卵巣組織培養において禁忌である場合がある。つまり、好適には、無血清培地はウシ血清、アクチビンＡ、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、７４０−ＹＰ、ＧＤＦ−９、およびＢＭＰ１５を含まない。
【００４４】
卵巣組織サンプルがヒト卵巣組織サンプルである実施形態では、ヒト血清、アクチビンＡ、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、７４０−ＹＰ、ＧＤＦ−９、またはＢＭＰ１５それぞれが、またはその組み合わせが、卵巣組織培養において禁忌である場合がある。つまり、好適には、無血清培地はヒト血清、アクチビンＡ、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、７４０−ＹＰ、ＧＤＦ−９、およびＢＭＰ１５を含まない。
【００４５】
さらに、組織の生育能力は、ＦＳＨ濃度を上記の範囲外に変更することにより悪影響を受ける場合がある。加えて、無血清培地は、抗菌インスリン合剤を含まないことが好ましい。
【００４６】
卵巣幹細胞の集合を卵巣組織に加える実施形態では、続いて卵巣組織を培養することにより、卵巣組織サンプルの皮質組織内の卵巣幹細胞を外生卵巣細胞に分化させることができる。典型的には、卵巣組織サンプルを少なくとも２４時間培養することは、内在性および／または外生の卵巣卵胞の成長を活性化させ得る。
【００４７】
好適には、単離した卵巣支持体細胞（ovarian somatic support cell）の集合を、少なくとも２４時間培養した後で、卵巣組織サンプルの皮質組織に導入する。単離卵巣支持体細胞の集合は、単離卵巣間質細胞であり得る。単離卵巣支持体細胞の集合は、大部分が卵巣間質細胞であり得る。単離卵巣支持体細胞の集合は、５μＬ当たり２０００〜４０００細胞の濃度で導入することができる。適切には、２００００〜４００００細胞を皮質組織に導入することができる。
【００４８】
好適には、単離卵巣支持体細胞の集合を、５μＬ当たり少なくとも２０００細胞の濃度で導入する。
【００４９】
用語「単離卵巣支持体細胞」は、酵素的に処理された卵巣組織の産物である、卵巣支持体細胞を指す。
【００５０】
用語「単離卵巣間質細胞」は、酵素的に処理された卵巣組織の産物である、卵巣間質細胞を指す。
【００５１】
単離卵巣支持体細胞は、間質細胞型の混合集合であり得る。単離卵巣支持体細胞内の間質細胞型には、例えば、紡錘状細胞、楕円形細胞、および円形細胞が含まれ得る。単離卵巣支持体細胞の直径は、典型的には、１〜１５μｍ、好適には５〜１０μｍであり得る。単離卵巣支持体細胞は、マーカを含む、または発現し得る。単離卵巣支持体細胞は、それらが含む、または発現するマーカにより特定することができる。単離卵巣支持体細胞は、複数のマーカを含む、または発現することができる。複数のマーカには、例えば、ＦｏｘＬ２、ＣｏｕｐＴＦＩＩ、ｂＦＧＦが含まれ得る。あるいは、単離支持体細胞は、１つまたは複数のマーカを欠く、または発現しない場合がある。該１つまたは複数のマーカには、例えばＤＤＸ４が含まれ得、単離支持体細胞はそのためＤＤＸ４陰性であり得る。
【００５２】
出願人は、皮質組織内に存在する卵巣卵胞の成長がいったん活性化されれば、単離卵巣支持体細胞を皮質組織に導入することが、後で皮質組織から抽出されて卵母細胞を形成し得る、生育可能で健全な卵胞の数を増やすことにつながることを発見した。
【００５３】
理論に縛られることを望まず、内生および／または外生の卵巣卵胞が活性化された後に卵巣支持体細胞を導入することには、卵巣組織サンプルを高密度化し、活性化卵巣卵胞が成長することが可能な環境を改善する効果があり得、成長卵巣卵胞の健全性の改善および単離可能な成長卵巣卵胞の数を増やすことにつながる。
【００５４】
単離卵巣支持体細胞の集合を皮質組織に導入するステップの後、卵巣組織サンプルを追加で少なくとも４日間培養することができる。好適には、追加期間は少なくとも５日、より好適には少なくとも６日である。好適には追加期間は４〜８日の間である。典型的には、追加期間の終わりまでに、成長卵胞を卵巣組織の表面に観察することができる。
【００５５】
典型的には、卵巣組織サンプルを追加期間に培養する間、卵巣組織の皮質組織内の卵巣卵胞は成長する。
【００５６】
本発明を、第２態様において、
本発明の第１態様の方法を介して調製される卵巣組織サンプルを提供するステップと、
前期卵巣組織サンプルから個々の卵巣卵胞を選択し、機械的に抽出するステップと、
抽出した個々の卵巣卵胞を別個の培養培地にそれぞれ置くステップとを含む、個々の卵巣卵胞を調製する方法へ拡張する。
【００５７】
卵巣組織サンプルから機械的に抽出した個々の卵巣卵胞は、直径が少なくとも７０μｍ、好適には少なくとも８０μｍであり得る。
【００５８】
卵巣卵胞の成長は、いったん卵巣卵胞が定義された段階を超えて成長したら、追加の卵巣卵胞の存在により抑制されるという証拠がある。例えば、卵巣卵胞の成長は、いったん卵巣卵胞の直径が少なくとも７０μｍ、８０μｍ、または１００μｍとなったら、追加の卵巣卵胞の存在により抑制され得る。
【００５９】
そのため、卵巣卵胞を卵巣皮質組織から抽出し分離するステップには、各分離卵巣卵胞の成長を促進し、それにより、健全な卵母細胞を抽出できる、生育可能で健全な卵巣卵胞の最終的な数を増加させる効果があり得る。
【００６０】
したがって、本発明の本態様の方法は、所与の数の原始卵巣卵胞から、当技術分野で既知の他の方法よりも多くの生育可能な成長卵巣卵胞の集合をもたらし得る。
【００６１】
酵素の使用など、非機械的手段を用いて卵巣組織サンプルから個々の卵巣卵胞を抽出することは、個々の卵巣卵胞と結果として生じる卵母細胞の生育能力に悪影響があることが発明者らにより観察された。そのため、卵巣組織サンプルから個々の卵胞を機械的に抽出することは、酵素などの非機械的手段を用いるより、個々の卵巣卵胞および結果として生じる卵母細胞の生育能力を改善する。
【００６２】
個々の抽出卵巣卵胞をそれぞれ、別個の容器の別個の培養培地に置くことができる。例えば、容器はプレート内のウェルであってよく、抽出された１つの卵巣卵胞でプレート内の１ウェルを占有することができる。
【００６３】
分離させた抽出卵巣卵胞を置く培養培地は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含み得る。培養培地は、少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬのＦＳＨ、または少なくとも１．０ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含み得る。培養培地は、アクチビンＡを含み得る。培養培地は、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡまたは少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含み得る。
【００６４】
抽出卵巣卵胞は、培養期間の間、培養培地において培養することができる。ＦＳＨの濃度は培養期間の間で変動し得る。ＦＳＨの濃度は、培養期間中に上昇させることができる。例えば、ＦＳＨの濃度は最初の４８時間は１ｎｇ／ｍＬのＦＳＨで、次の９６時間は１０ｎｇ／ｍＬまで上昇させることができる。
【００６５】
典型的には、卵巣組織サンプルから抽出される卵巣卵胞には、直径が少なくとも７０μｍの任意の卵巣卵胞が含まれる。そのため、卵巣組織が内生卵巣卵胞および／または外生卵巣卵胞を含む実施形態では、抽出卵巣卵胞は、内生卵巣卵胞または外生卵巣卵胞であり得る。
【００６６】
本発明の第３の態様により、
皮質組織と間質組織を含む卵巣組織サンプルを提供するステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば損傷組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば余分な間質組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルを該卵巣組織サンプルの少なくとも一つの次元に沿って機械的に引き伸ばし、その結果、前記少なくとも１つの次元に沿った卵巣組織サンプルのサイズを少なくとも１０％拡大するステップと
前記卵巣組織サンプルを、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む無血清培地において少なくとも２４時間培養するステップと、
単離した卵巣支持体細胞の集合を前記卵巣組織サンプルに加えるステップと、
前記卵巣組織サンプルを追加で少なくとも４日間培養するステップと、
前記卵巣組織サンプルから個々の成長卵胞を機械的に取り出すステップとを含む、個々の成長用卵巣卵胞を調製する方法を提供する。
【００６７】
好適には、皮質組織は内生卵巣卵胞の集合を含み、内生卵巣卵胞の集合に由来する個々の成長卵胞は、皮質組織から機械的に取り出される。
【００６８】
したがって、本方法は、生育可能で健全な卵母細胞に成長し得る個々の内生卵巣卵胞を調製する方法とすることができる。
【００６９】
本方法は、卵巣幹細胞の集合を、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップと、卵巣組織サンプルを少なくとも２４時間培養するステップの間で皮質組織に導入し、その結果、卵巣幹細胞の集合の少なくとも部分集合を皮質組織内で外生卵巣卵胞の集合に分化させるステップを含み得る。そのため、皮質組織が内生卵巣卵胞の集合を含む実施形態では、本方法は、個々の外生卵巣卵胞と内生卵巣卵胞を調製するステップであり得る。
【００７０】
典型的には、所与の卵巣組織サンプルの皮質組織内の内生卵巣卵胞の分布は均一ではなく、分布は卵巣組織サンプルごとに非常に異なり得る。そのため、所与の卵巣組織サンプルの皮質組織は、内生卵巣卵胞を全く含まない場合がある。したがって、卵巣幹細胞の集合が皮質組織に導入され、皮質組織が内生卵巣卵胞を含まない実施形態では、本方法は、個々の外生卵巣卵胞のみを調製する方法であり得る。
【００７１】
卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後かつ卵巣組織サンプルを少なくとも２４時間培養するステップの前に、卵巣組織サンプルを複数の卵巣組織断片に切断することができる。卵巣組織サンプルは、皮質表面の表面積が間質表面の表面積より大きくなるような角度で切断することができる。卵巣組織サンプルは、皮質表面の平面に対し３０°〜６０°の角度で切断することができる。好適には、卵巣組織サンプルは、皮質表面の平面に対し約４５°の角度で切断する。
【００７２】
皮質表面の表面積は、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、間質表面の表面積の少なくとも１〜２倍になり得る。皮質表面の表面積は、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、間質表面の表面積の少なくとも１．３〜１．７倍になり得る。好適には、皮質表面の表面積は、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後、間質表面の表面積の約１．５倍である。したがって、卵巣組織サンプルの皮質表面積対間質表面積の比率は１：１〜２：１になり得る。好適には、皮質表面積対間質表面積の比率は３：２である。
【００７３】
卵巣組織サンプルを対向端部で切断する実施形態では、結果として生じる組織断片は直角プリズムであり得る。卵巣組織サンプルを、結果として生じる皮質表面が長方形になるように２組の対向辺で切断する実施形態では、組織断片は裁頭ピラミッド型（frusto-pyramidal）であり得る。このように、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後で培養される卵巣組織は、卵巣組織断片または元の卵巣組織サンプルであってよい。
【００７４】
機械的に取り出された個々の成長卵胞は、それぞれさらに別個に成長させることができる。例えば、各成長卵胞を卵巣組織から機械的に取り出した後、適切な培養培地を含有する別個のウェルに置くことができる。
【００７５】
典型的には、個々の成長卵胞の直径は、卵巣組織サンプルを少なくとも追加で４日間培養するステップの後、約７０μｍ〜１００μｍに到達し、この時点でそれらは近くの卵胞の成長に対し抑制効果を持ち始め得る。そのため、成長卵胞を分離し、それぞれ個別に培養して抑制を最小にすることが重要である。
【００７６】
卵巣組織サンプルを培養する追加期間は、少なくとも５日または少なくとも６日とし得る。典型的には、成長卵胞が卵巣組織表面に観察され得るまで、卵巣組織サンプルを追加期間の間培養する。
【００７７】
第１態様と第２態様の好適でオプション的な特徴は、第３態様の好適でオプション的な特徴である。
【００７８】
本発明の第４態様により、
培地内に、卵母細胞−卵丘複合体と基底膜とを含む卵巣卵胞を提供するステップと、
前記卵巣卵胞の基底膜を機械的に破るステップと、
前記卵母細胞−卵丘複合体を前記卵巣卵胞から放出させるステップとを含む、卵母細胞−卵丘複合体を卵巣卵胞から放出させる方法を提供する。
【００７９】
好適には、卵巣卵胞は、本発明の第２態様または本発明の第３態様の方法により提供される。
【００８０】
卵巣卵胞は、胞状卵巣卵胞であってよい。つまり、卵巣卵胞は卵胞腔を含むほど十分に成熟していてよく、卵母細胞−卵丘複合体は卵胞腔内にあってよい。卵巣卵胞は前胞状卵巣卵胞であってよい。つまり、卵巣卵胞は、卵胞腔を含むほど十分に成熟していなくてよい。
【００８１】
典型的には、卵巣卵胞の直径は少なくとも１５０μｍである。好適には、卵巣卵胞の直径は少なくとも２００μｍである。
【００８２】
出願人は、卵巣卵胞の基底膜を破るステップを機械的に実行して、卵母細胞−卵丘複合体を卵巣卵胞から放出させるプロセス中に、該卵母細胞−卵丘複合体を確実に傷つけないようにしなければならないことを発見した。例えば、酵素を用いて卵巣卵胞の基底膜を破ることは、卵母細胞−卵丘複合体の劣化、または、卵母細胞−卵丘複合体の破壊につながり得る。
【００８３】
いったん卵母細胞−卵丘複合体を卵巣卵胞から放出させたら、卵母細胞−卵丘複合体を保持膜に移し、その結果、卵母細胞−卵丘複合体が該保持膜にサポートされるようにすることができる。
【００８４】
多数の卵母細胞−卵丘複合体を単一の保持膜に保管することができる。例えば、単一の保持膜は、最大６個の卵母細胞−卵丘複合体を保管し、サポートすることができる。
【００８５】
保持膜が多数の卵母細胞−卵丘複合体を保管しサポートする実施形態では、単一保持膜に保管される各卵母細胞−卵丘複合体の直径は、好適にはほぼ同じである。したがって、保持膜上の各卵母細胞−卵丘複合体は、ほぼ同じ成長段階にあり、栄養所要量がほぼ同じであるため、これらの所要量は、膜上の各複合体に対し、同時に、容易に満たすことが可能である。
【００８６】
保持膜は、直径が１〜２０μｍの孔を含み得る。保持膜は、直径が５〜１５μｍの孔を含み得る。好適には、保持膜は、直径が５〜１０μｍの孔を含む。したがって、保持膜は、培養培地から保持膜上に保管された卵母細胞−卵丘複合体へ栄養を流すことを可能にし得る。例えば、保持膜は、トラックエッチング（track-etched）ヌクレオポア膜、または、直径約８μｍの孔を有するニトロセルロース膜であってよい。保持膜は、卵母細胞−卵丘複合体内の卵母細胞と周りの細胞の間の物理的な接触を維持することができる。保持膜は、正確な複合体の構造を維持し、複合体内で卵母細胞が成長することを可能にし得る。
【００８７】
保持膜上の卵母細胞−卵丘複合体は、培養培地で培養することができる。保持膜上の卵母細胞−卵丘複合体は、卵母細胞−卵丘複合体内の卵母細胞の直径が少なくとも１００μｍに成長するまで、培養培地で培養することができる。保持膜上の卵母細胞−卵丘複合体内の卵母細胞は、培養培地で培養することができる。培養培地は、第１極体が卵母細胞から放出されるまで覆って、培養培地から空気を遮断し、培養培地の蒸発または希釈化を防ぐことができる。培養培地は、培養培地と混ざり合わない液体で覆うことができる。好適には、培養培地は、第１極体が卵母細胞から放出されるまで、鉱物油で覆うことができる。
【００８８】
そのため、本発明を、第５態様において、
内生卵巣卵胞の集合を含む皮質組織と、間質組織とを含む卵巣組織サンプルを提供するステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば損傷組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルから、あれば余分な間質組織を取り除くステップと、
前記卵巣組織サンプルを該卵巣組織サンプルの少なくとも一つの次元に沿って機械的に引き伸ばし、その結果、前記少なくとも１つの次元に沿った卵巣組織サンプルのサイズを少なくとも１０％拡大するステップと、
前記卵巣組織サンプルを、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む無血清培地において少なくとも２４時間培養するステップと、
単離された卵巣支持体細胞の集合を前記卵巣組織サンプルに加えるステップと、
前記卵巣組織サンプルを追加で少なくとも４日間培養するステップと、
直径が少なくとも８０μｍの個々の成長卵胞を、前記卵巣組織サンプルの内生成長卵胞の集合から機械的に抽出するステップと、
個々の抽出卵巣卵胞をそれぞれ、ＦＳＨとアクチビンＡを含む培養培地に置き、前記個々の卵巣卵胞を少なくとも６日間培養して、その結果、前記個々の卵巣卵胞が卵母細胞−卵丘複合体と基底膜とを含むようにするステップと、
前記卵巣卵胞の基底膜を機械的に破ることにより、前記卵母細胞−卵丘複合体を前記卵巣卵胞から放出させるステップと、
前記卵母細胞−卵丘複合体を保持膜に移し、その結果、前記卵母細胞−卵丘複合体が前記保持膜にサポートされるようにするステップと、
前記保持膜上の卵母細胞−卵丘複合体を、前記卵母細胞−卵丘複合体内の卵母細胞の直径が少なくとも１００μｍに成長するまで培養培地において培養するステップと、
前記保持膜上の卵母細胞を培養培地で培養し、第１極体が前記卵母細胞から放出されるまで前記培養培地から空気を遮断するステップとを含む、生育可能な卵母細胞を体外で成長させる方法まで拡張する。
【００８９】
前記方法は、卵巣幹細胞の集合を皮質組織に導入し、その結果、卵巣組織サンプルを引き延ばすステップの後、卵巣幹細胞の集合の少なくとも部分集合を外生卵巣卵胞の集合に分化させるステップを含み得る。したがって、前記方法は、内生卵巣卵胞と外生卵巣卵胞からの生育可能な卵母細胞を、インビトロで成長させる方法とすることができる。
【００９０】
個々の卵巣卵胞は、それらが卵胞腔を含むまで培養することができる。
【００９１】
個々の抽出卵巣卵胞は、０．５ｎｇ／ｍＬ〜２．５ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含む、好適には１ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含む培地で培養することができる。
【００９２】
典型的には、保持膜上の卵母細胞を含有する培養培地を覆って、培養培地から空気を遮断し、第１極体が卵母細胞から放出されるまで培養培地の蒸発または希釈化を防ぐ。培養培地は、培養培地と混ざり合わない液体で覆うことができる。好適には、前記液体は、鉱物油また濾過済み鉱物油などの油である。
【００９３】
本発明は、本発明の第５態様のステップを含む、生育可能な卵母細胞をインビトロで成長させる方法であって、卵巣組織サンプルの皮質組織は内生卵巣卵胞の集合を含まず、卵巣組織サンプルを機械的に引き伸ばすステップの後かつ卵巣組織サンプルを少なくとも２４時間培養するステップの前に、卵巣幹細胞の集合を卵巣組織サンプルの皮質組織に導入し、その結果、卵巣組織サンプルを引き延ばすステップの後、幹細胞の集合の少なくとも部分集合を外生卵巣卵胞の集合に分化させるステップを含む方法に関する、第６態様にまで拡張することができる。
【００９４】
したがって、前記方法は、卵巣幹細胞に由来する外生卵巣卵胞からの生育可能な卵母細胞を、インビトロで成長させる方法であり得る。
【００９５】
本発明の第７態様により、本発明の第１〜第６態様の何れか一つに係る卵巣組織サンプルを調製する方法で用いるための単離卵巣支持体細胞の集合であって、インビトロで単独で培養された場合はシート状の構造を形成する単離卵巣支持体細胞の集合を提供する。
【００９６】
単離卵巣支持体細胞の集合は、卵巣間質細胞型の混合集合であり得る。単離卵巣支持体細胞内の卵巣間質細胞型には、例えば、紡錘状細胞、楕円形細胞、および円形細胞が含まれ得る。単離卵巣支持体細胞の直径は、典型的には、５〜１０μｍであり得る。単離卵巣支持体細胞は、マーカを含む、または発現し得る。単離卵巣支持体細胞は、それらが含む、または発現するマーカにより特定することができる。単離卵巣支持体細胞は、複数のマーカタンパク質を含むまたは発現することができる。複数のマーカタンパク質には、例えば、ＦｏｘＬ２、ＣｏｕｐＴＦＩＩ、ｂＦＧＦが含まれ得る。あるいは、単離支持体細胞は、１つまたは複数のマーカを欠く、または発現しない場合がある。該１つまたは複数のマーカには、例えばＤＤＸ４が含まれ得、単離支持体細胞はそのためＤＤＸ４陰性であり得る。
【００９７】
単離卵巣支持体細胞を卵巣組織サンプルの皮質組織へ導入することは、卵巣の発育に高密度の環境を提供し得ると推測される。活性化卵胞は、卵巣間質細胞の集合によって高密度化された皮質組織の領域に移ることができる。間質細胞と活性化卵胞の間の物理的接触は、活性化卵胞の成長を促進すると考えられる。
【００９８】
典型的には、単離卵巣支持体細胞の集合は、適切な培地に懸濁される。適切な培地には、ＯＳＣ培地（１０％ＦＢＳ、１０μＬ／ｍＬのＮ２サプリメント、１０μＬ／ｍＬの１００Ｘｐｅｎ−ｓｔｒｅｐグルタミン、１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍＬの白血病阻止因子、１０ｎｇ／ｍＬの組換え体ヒト上皮成長因子、１ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子、４０ｎｇ／ｍＬのグリア細胞由来神経栄養因子を補ったＭＥＭα ＧｌｕｔａＭＡＸ）が含まれ得る。
【００９９】
単離卵巣支持体細胞の集合はペレットとして提供され得、それは、本発明の前述の態様の何れか一つの方法で用いる前に、適切な培地に再懸濁する必要がある。
【０１００】
単離卵巣支持体細胞は、処理卵巣間質組織に由来し得る。単離卵巣支持体細胞は、本発明の第１〜第６態様の方法で用いるために卵巣組織サンプルから取り出された間質組織に由来し得る。あるいは、または、加えて、単離卵巣支持体細胞は、他の目的で取り出された処理卵巣間質組織に由来し得る。
【０１０１】
本発明の第８態様では、第１態様に係る卵巣組織を培養する方法で用いるための、培養培地であって、無血清であり、０．５ｎｇ／ｍＬ〜２．５ｎｇ／ｍＬの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）含む、培養培地を提供する。
【０１０２】
好適には、培地は１ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含む。
【０１０３】
例えば、卵巣組織サンプルがウシ卵巣組織サンプルである実施形態では、培養培地は、ウシ血清アルブミン（０．１重量％）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、ベンジルペニシリン（１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）、ウシトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ウシインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＳＨ（１ｎｇ／ｍＬ）、およびアスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地でよい。
【０１０４】
他の例では、卵巣組織サンプルがヒト卵巣組織サンプルである実施形態では、培養培地は、ヒト血清アルブミン（０．１重量％）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、ベンジルペニシリン（１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）、ヒトトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ヒトインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＳＨ（１ｎｇ／ｍＬ）、およびアスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地でよい。
【０１０５】
本発明の第９態様により、本発明の第４、第５、第６態様の単離卵巣卵胞を成長させる方法で用いるための培養培地であって、０．５〜１．５ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含む、培養培地を提供する。
【０１０６】
好適には、培養培地は１ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含む。
【０１０７】
培養培地は、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含み得る。好適には、培養培地は、７５〜１２５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。より好適には、培養培地は、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。
【０１０８】
ＦＳＨの濃度は、単離卵巣卵胞の培養が進行するに従って調整することができる。ＦＳＨの濃度は、単離卵巣卵胞の培養が進行するに従って、上昇させることができる。例えば、培養培地は最初の４８時間は１ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含むが、これは少なくとも次の９６時間では１０ｎｇ／ｍＬまで上昇させ、単離卵巣卵胞を８日間以上培養する場合はさらに１００ｎｇ／ｍＬまで上昇させることができる。
【０１０９】
例えば、卵巣組織サンプルがヒト卵巣組織サンプルである実施形態では、最初の培養培地は、ヒト血清アルブミン（０．１重量％）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、ベンジルペニシリン（１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）、ヒトトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ヒトインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＳＨ（１ｎｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）、Ｋｉｔリガンド（１０μｇ／ｍＬ）、および組換え体アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地であってよく、ＦＳＨの濃度は、最初の４８時間の培養後は１０ｎｇ／ｍＬまで上昇させ、８日間の培養後は１００ｎｇ／ｍＬまでさらに上昇させる。
【０１１０】
エストラジオールを、最初の培養期間の後に培養培地に加えることができる。
【０１１１】
例えば、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬのエストラジオールを、最初の培養期間の後に培養物に加えることができる。
【０１１２】
追加のエストラジオールを、追加の培養期間の後に培養培地に加えることができる。例えば、エストラジオールの濃度は、追加の培養期間後に、１μｇ／ｍＬまで上昇させることができる。
【０１１３】
最初の培養期間は４８時間とすることができ、追加の期間は６日または８日とすることができる。例えば、一実施形態では、１００ｎｇ／ｍＬのエストラジオールを、最初の４８時間の培養期間後に、ＦＳＨの濃度を１ｎｇ／ｍＬから１０ｎｇ／ｍＬへ上昇させると同時に、培養培地に加える。８日間の追加期間の後、卵胞が培養物に残っていた場合、ＦＳＨの濃度を１００ｎｇ／ｍＬまで上昇させると同時に、エストラジオールの濃度を１μｇ／ｍＬまで上昇させた。
【０１１４】
本発明の第１０態様において、本発明の第４、第５、または第６態様の、卵母細胞を成長させる方法で用いるための培養培地であって、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬのＦＳＨを含む培養培地を提供する。
【０１１５】
培養培地は、ピルビン酸ナトリウムを含み得る。培養培地はカナマイシン硫酸塩を含み得る、培養培地は、トランスフェリンを含み得る。培養培地は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）を含み得る。培養培地はエストラジオールを含み得る。培養培地は上皮成長因子（ＥＧＦ）を含み得る。
【０１１６】
好適には、培養培地はＦＳＨ、ピルビン酸ナトリウム、カナマイシン硫酸塩、トランスフェリン、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、およびエストラジオールを含む。
【０１１７】
例えば、培養培地は、ウシ血清アルブミン（０．１重量％）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、カナマイシン硫酸塩（０．０８ｍｇ／ｍＬ）、ウシトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ウシインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＳＨ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（２００ｎｇ／ｍＬ）、エストラジオール（１μｇ／ｍＬ）、およびＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地でよい。
【０１１８】
本発明の実施形態を、ここで、非限定的な例として、添付の図面を参照にして記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】生体内での卵胞／卵母細胞の発育段階を示す図であり、ここでは、「休止」中の原始卵胞のプールが徐々に活性化され一生を通じて成長する。ヒトおよびウシ、つまり単排卵種では、排卵前卵胞は生殖周期（つまり、ヒトでは２８日間で１周期）中に１つだけ形成されるだろう。
【図２】Ａは、本発明により記載する、インビトロでの卵母細胞の発育をサポートするのに求められる４ステップを表現する図である。卵巣組織の平坦細片が、（ａ）培地中で自由に浮遊ながら培養される。卵胞が多層段階に達したら、それを針を用いて機械的に単離し、次に個別に培養する（ｂ）。単離した卵胞の培養は、前胞状段階から胞状段階への発育をサポートする（ｃ）。卵母細胞の成長および発育の最終段階は、卵母細胞−卵丘複合体を胞状卵胞から取り出し（ｄ）、卵母細胞とその周りの体細胞を培養すること（ｅ）により達成される。Ｂは、培養の最初の２段階の後で取り出すことが可能な複合物を強調表示した、インビトロで成長した胞状卵胞の図である。Ｃは、さらなる成長（ステップ３）のために膜上に単離し、次に、２４時間の間、成熟培地に置いた、ヒトインビトロ成長（ＩＶＧ）卵母細胞−卵丘細胞複合体の顕微鏡写真である。Ｄは、成熟し、極体を形成した後のＩＶＧ複合体を示す図であり、中期ＩＩに進んだことを示す。これは、中期ＩＩの卵母細胞の紡錘体（上）および極体が免疫染色されているＥで確認される。
【図３】卵巣組織サンプルを調製して、いわゆる「微細皮質」を産生するステップを示す図である。
【図４】培養系の各段階の顕微鏡写真を示す図であり、ａは培養開始時の微細皮質を、ｂは培養７日後の微細皮質を、ｃは健全な卵母細胞と周りの顆粒膜細胞を示す、ステップ１の終わりのインビトロ成長卵胞の組織切片を、ｄは切開用に用意された成長卵胞の端を示す、ステップ１後の微細皮質を、ｅは周りに莢膜細胞を有する微細皮質から採取した単離成長卵胞を、ｆは卵胞腔の形成を示す、ｖウェルディッシュで成長した単離卵胞を、ｇは卵母細胞−卵丘複合体の取り出しに備えたステップ２の終わりの胞状卵胞を、ｈはさらなる成長のために取り出される四角で囲った卵母細胞−卵丘複合体を有するインビトロ成長胞状卵胞を、ｉは、インビトロ成熟の前に最終培養ステップのために膜に置かれた卵母細胞−卵丘複合体を示す。
【図５】（ｉ）は、ＤＤＸ４でラベル付けし、３０３Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ（商標）を充填した成人ヒト卵巣支持体細胞を示す図である。ヒト卵巣細胞は、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ（商標）（ｅｍ．５３０／３０ｎｍ）の単放射プロファイルを示す（全サンプルの８８．５％）。（ｉｉ）は、インビトロで成長した場合、卵巣支持体細胞の単一細胞懸濁はシートを形成することを示す図であり、これらを採取して卵巣皮質を補うことが可能である。
【図６】ａは、ヒト組織に由来するインビトロ成長卵胞から採取され、発育の最終ステップの間成熟培地に置かれた単離卵母細胞−卵丘複合体を示す図である。極体が形成されており（ａ、ｂ）、これらの卵母細胞が減数分裂を始め、中期ＩＩの紡錘体（ｃ、ｄ）を形成し得ることを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
本発明の種々の実施形態の作成と使用を以下で詳細に論じるが、本発明は、幅広い種々の具体的な文脈で具体化され得る、多くの適用可能な発明概念を提供することが理解されるべきである。本明細書で論じる具体的な実施形態は本発明を作成するまたは用いるための単なる具体的な方法の例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１２１】
本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語を以下で定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関連する分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。「１つ（a）」、「１つ（an）」、および「その（the）」などの用語は単一の実態のみを指すが、具体的な例が例示のために用いられ得る全体クラスも含む。本明細書における用語法は、本発明の具体的な実施形態を記載するために用いられるが、その使用は、特許請求の範囲を概説することを除き、本発明の範囲を限定しない。
【０１２２】
図１〜６に関連して、本発明の実施形態の例を以下に記載する。
【０１２３】
組織調製法
卵巣組織サンプルを、生検によりヒト対象から取得した。卵巣組織サンプルは、典型的には、卵巣組織の一辺上に露出皮質表面を有する皮質組織と、卵巣組織の対向辺上に露出髄質（または間質）表面を有する髄質（または間質）組織を含む。卵巣組織サンプルの表面は、典型的には平坦ではない、または、しわがある。卵巣組織を、３７℃で、ガラスペトリ皿の保持培地（ヒト血清アルブミン（０．３重量％）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ベンジルペニシリン（７５μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（５０μｇ／ｍＬ）を有するライボビッツ（Ｌ−１５）培地）において、光学顕微鏡検査法で調べて皮質組織の表面を下に横たわる間質組織と区別し、組織の損傷および卵巣卵胞の損失を最小にできるようにした。直径が１００μｍ超の卵胞を２５ゲージの針を用いて取り出して、これらの大きい発育卵胞の存在が、皮質組織における他の卵胞の活性化および成長を妨げないようにした。アクセスできない大きい卵胞または特に繊維質の組織はＮｏ．１０のメス刃と細径鉗子を用いて取り出して、組織が避けることを防いだ。
【０１２４】
組織の裂けた、損傷した、または出血性の領域はいずれもＮｏ.１０のメス刃の先を用いて卵巣組織から取り除いた。髄質組織の表面を一番上にし、組織を細径鉗子を用いて保持し、余分な髄質組織をＮｏ．２４のメス刃を用いて取り除いて、皮質表面の上に３ｍｍ厚さの髄質組織の層を残した。
【０１２５】
引き伸ばされゆるんだ卵巣組織（「微細皮質」）の調製
卵巣組織を次に裏返して皮質表面を一番上にした。ここで該組織は平坦にするべきである。組織を次に、組織片の小さい組織または角を保持するように、細径鉗子を用いてしっかりとペトリ皿の基底に固定した。
【０１２６】
Ｎｏ．１０のメス刃の峰を皮質表面に対し４５°に傾け、組織表面に沿ってかかる軽い圧力を用いて、組織を固定点から離れる方向に引き延ばした。これは、組織表面を裂かないように注意しながら何度か繰り返すことができる。皮質表面をまだ一番上にしながら、組織を次に、Ｎｏ．２４のメス刃を皮質組織に対し４５°の切り込み角度で用いて約０．５ｍｍ長さの断片（「微細皮質」）に切断し、確実に、結果として生じる各断片が下に横たわる組織と比較しより大きい皮質表面積を有するようにした。
【０１２７】
個々の組織断片を次に、ウェルごとに３００μＬの培養培地を含有する２４ウェル培養プレート内の別箇のウェルに移した。細い滅菌ｐａｓｔｅｔｔｅ（登録商標）を用いて組織断片を移し、組織の損傷を避けた。
【０１２８】
培養１日目
微細皮質を培地（ヒト血清アルブミン（０．１重量％）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、ベンジルペニシリン（１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）、ヒトトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ヒトインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、組み換えヒト卵胞刺激ホルモン（ｒｈＦＳＨ）（１ｎｇ／ｍＬ）、およびアスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地）に懸濁し、２４時間培養した。卵胞の活性化を表面で観察することが可能である。この最初の２４時間の培養の後、単離卵巣支持体細胞（調製法は以下に記載）を、５μＬあたり２０００〜４０００細胞の濃度で０．２５ｍｍ３の微細皮質に送達して加えた。
【０１２９】
驚くべきことに、発明者らは、微細皮質に単離卵巣支持体細胞を戻すと、卵巣組織断片は成長卵胞の健全性を著しく改善し、単離して生育可能な卵母細胞を産生することが可能な成長卵胞の数を増加させることを発見した。単離卵巣支持体細胞は、成長卵胞が移動するための高密度の間質細胞領域を生じさせることにより健全な卵胞の成長のための育成環境を提供し、そのため卵母細胞の最終的な収率を上昇させる。卵胞が微細皮質卵巣組織断片内で成長する間、追加の間質細胞と１ｎｇ／ｍＬのｒｈＦＳＨが存在することは、成長卵胞の収率を４０〜５５％上昇させる。
【０１３０】
高密度化卵巣支持体細胞懸濁液の調製
この細胞懸濁液は、成長卵胞を取り出した後の卵巣皮質片を分離させることにより調製する。組織薄片（０．２ｍｍ３）を、メスおよび針（サイズおよびゲージ）を用いて調製し、ＢＳＡ（ウシ単離）またはＨＳＡ（ヒト単離）を含有するライボビッツ培地に保持する。単細胞懸濁液への分離の準備のため、組織片を培地から取り出し、浅いペトリ皿に置く。組織を細いハサミの先を用いて非常に小さい切片にし、１．２Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩ／ＩＩを有するＭｇおよびＣａで補ったＨＢＳＳに移す。Ｇｅｎｔｌｅｍａｃｓ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ ｓｅｔをｈ＿ｔｕｍｏｕｒ １、ｈ＿ｔｕｍｏｕｒ ２、およびｈ＿ｔｕｍｏｕｒ＿３のプログラムで連続して走らせることで組織を機械的に分離させる。分離した組織を孔径が低減する一連の細胞フィルタ（１００〜３０μｍ）に通し、２％のＮＧＳ溶液を加えることにより、酵素活性を停止させる。細胞溶液を浅いガラスペトリ皿に移し、光学顕微鏡下で検査して、卵胞または卵母細胞が存在しないことを確かめ、存在する場合は細い滅菌ｐａｓｔｅｔｔｅを用いて取り出す。細胞をここで、３００ｇの細胞懸濁液を５分間、ＭｇおよびＣａを欠き、ＨＳＡおよびＮＧＳ（ブロッキング溶液）を有するＨＢＳＳにおいて遠心分離することにより、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）用に準備する。上澄みを取り除き、細胞ペレットを１ｍＬのブロッキング溶液に再懸濁する。アリコットを第２回のために取り、対照サンプルと残りの細胞懸濁液を再ペレット化する（５分間で３００ｇ）。上澄み液を取り除き、細胞ペレットを抗ウサギＤＤＸ４抗体（ａｂｃａｍ １３８４０、１０に１つ）でラベル付けし、氷の上で１時間インキュベーションする。インキュベーション後、細胞を２回再ペレット化し（５分間で３００ｇ）、次に第２抗体（シアニン３と結合したｄｏｎｋｅｙ抗ウサギＩｇＧ、３００に１つ）でラベル付けし、氷の上で３０分間インキュベーションする。第２抗体インキュベーション後、細胞をペレット化し（５分で３００ｇ）、２度洗浄してから３７℃で３０分間Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ（商標）試薬でラベル付けした。細胞をペレット化し（５分で３００ｇ）、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ（商標）インキュベーション後に１度洗浄し、５００μＬのブロッキング溶液に再懸濁し、ＦＡＣＳにかける。Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ（商標）陽性の細胞と、生殖細胞系マーカＤＤＸ４陰性の細胞を集め、培地に再懸濁する。
【０１３１】
細胞懸濁液を大きい割球針に充填し、微細皮質調製物の２または３か所に２０μＬ微注入する。単独で培養した際、これらの細胞はインビトロで特徴的なシート状構造を形成する（図５等参照）。
【０１３２】
【表１】
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【０１３３】
表１．卵巣環境を高密度化して卵胞の生存と発育を改善するために利用した卵巣支持体細胞（ＯＳＳＣ）の形態学的および分子的特徴の一覧。ＤＤＸ４抗体およびＡｌｄｅｆｌｕｏｒ（商標）でラベル付けし、ＦＡＣＳにかけた卵巣単一細胞懸濁液から集めたＯＳＳＣ。
【０１３４】
高密度化卵巣間質細胞の懸濁液の特徴付け
高密度化卵巣間質細胞の懸濁液内の単離卵巣支持体細胞の集合には紡錘状細胞、楕円形細胞、および円形細胞が含まれることが観察され、これらの細胞の直径は５〜１０μｍだった。単離卵巣支持体細胞は、ＤＤＸ４について陰性であることにより特徴付けられた。
【０１３５】
成長卵胞の単離
微細皮質培養の６〜８日後に、直径が少なくとも８０μｍの卵胞はさらなる成長のために取り出せる状態にあることが観察された。これらの卵胞を２５ゲージの針で切開することにより組織から機械的に取り出した。この段階での酵素の使用は卵母細胞／卵胞の生育能力を損なうため、酵素は用いない。切開後、無傷の基底膜と周囲の莢膜細胞を有する卵胞のみを培養のために選択した。機械的に単離された成長卵胞を、９６ウェルＶ底培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｅｕｒｏｐｅ、オランダ国バトヒューフェドルプ）の１５０μＬの補足済みＭｃＣｏｙ’ｓ培養培地（ヒト血清アルブミン（０．１重量％）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、ベンジルペニシリン（１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）、ヒトトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ヒトインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＦＳＨ（１ｎｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）、Ｋｉｔリガンド（１０μｇ／ｍＬ）、および組換え体アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地）に個別に置く。ＦＳＨ濃度を、単離卵胞培養が進行するに従って調整した。最初の４８時間は１ｎｇ／ｍＬであるＦＳＨを、次の９６時間では１０ｎｇ／ｍＬまで上昇させるとともに、１００ｎｇ／ｍＬのエストラジオールを加えた。卵胞が８日間培養物に残る場合は、ＦＳＨを１００ｎｇ／ｍＬまで上昇させるとともに、１μｇ／ｍＬのエストラジオールを加えた。
【０１３６】
卵胞をさらに６日間、３７℃で５％のＣＯ２を含む加湿空気において個別に培養し、培養培地の半分を一日おき（例えば２日目と４日目）に交換した。４日目までは著しい成長が単離卵胞で観察され、卵胞腔の形成も起きている可能性があった。６日目に最小直径が２００μｍに達した卵胞を、さらなる卵母細胞の発育を可能にするため、卵母細胞−卵丘細胞複合体の取り出しに向け整えた。
【０１３７】
さらなる培養のための、インビトロで成長した無傷な卵胞からの卵母細胞卵丘複合体（ＯＣＣ）の膜への放出
最小直径が２００μｍであるインビトロで成長した卵胞は、卵胞腔を形成している場合も形成していない場合もある。無傷卵胞からのＯＣＣの放出は、ＯＣＣの完全性を保証しなければならない。卵母細胞とその周りの卵丘体細胞の間の接触の消失は卵母細胞の劣化と、インビトロでの成熟の失敗につながるだろう。卵胞からいったん放出されたら、ＯＣＣを支持膜に移し、卵母細胞と周りの細胞の間の物理的接触を維持し、卵母細胞の成長が完了する間、複合体の正しい構造を保証することが重要である。
【０１３８】
インビトロで成長した卵胞を、培養培地から、メモリ付きプラスチックｐａｓｔｅｔｔｅを用いて、あらかじめ温めた保持培地（ヒト血清アルブミン（０．３重量％）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ベンジルペニシリン（７５μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（５０μｇ／ｍＬ）を有するライボビッツ（Ｌ−１５）培地）を含有するガラスペトリ皿に移した。卵胞を細径鉗子を用いて保持し、光学顕微鏡下で調べて卵胞腔の存在を確認した。
【０１３９】
卵胞腔が存在した場合、卵胞腔の壁の一部を形成する、卵胞の基底膜に、２５ゲージの針を用いて穴を開け、ＯＣＣを含有する卵胞流体をペトリ皿に放出させた。放出時、ＯＣＣを、吸引ガラスピペットを用いて、ペトリ皿内の保持媒体から予め温めたＯＣＣ保持培地（ヒト血清アルブミン（０．３重量％）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ベンジルペニシリン（７５μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（５０μｇ／ｍＬ）を有するライボビッツ（Ｌ−１５）培地）に即時に移動させた。
【０１４０】
卵胞腔が見えない場合、卵胞の基底膜のみに穴を開けるように注意しながら、そっと数回穿刺した。２５ゲージの針を２つ用いて、基底膜が裂け中の細胞が露わになるまでゆっくりと引き伸ばした。吸引ガラスピペットを用いて、ＯＣＣが卵胞から外れるまで中の細胞をそっと前後に引っ張った。吸引ガラスピペットを用い、ＯＣＣを保持培地から予め温めたＯＣＣ保持培地に移動させた。
【０１４１】
吸引ガラスピペットを用いて、ＯＣＣをＯＣＣ保持培地から、４ウェル培養プレート中の３００μＬのＯＣＣ培養培地（ヒト血清アルブミン（０．１重量％）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、カナマイシン硫酸塩（０．０８ｍｇ／ｍＬ）、ヒトトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ウシインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＳＨ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（２００ｎｇ／ｍＬ）、エストラジオール（１μｇ／ｍＬ）、およびＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地）のトラックエッチングヌクレポア膜に、膜当たり最大６個の複合体を移した。ほぼ直径が同じ卵母細胞を含有する複合体を同じ膜上で一緒に培養し、卵母細胞の発育、卵丘細胞の拡張、およびその後のインビトロでの成熟が損なわれないようにする。
【０１４２】
複合体それぞれの位置を各膜上で確認し、個々の卵母細胞の直径の測定と各卵丘の広がりを記録した。ＯＣＣを次に、３７℃で５％のＣＯ２を含む加湿空気中でインキュベーションした。
【０１４３】
一日おきに、卵母細胞の直径と卵丘の広がりを測定するとともにＯＣＣ培養培地の半分を交換した。ＯＣＣ培養物の持続期間は、平均卵母細胞直径が１００μｍを超えるように、卵母細胞の直径に左右された。
【０１４４】
卵母細胞の直径が＞１００μｍである場合、膜を細径鉗子を用いてＯＣＣ培養培地から移動させ、２４ウェル培養プレートの１ウェルに１膜ずつ置き、膜をウェルの基底に付着させてから、複合体ごとに３０μＬの卵母細胞成熟培地を注意深く加えた。
【０１４５】
卵母細胞成熟培地は、２ＸＴＣＭ、溶液Ｂ、溶液Ｃ、ＭＱ Ｈ２Ｏをそれぞれ２５：５：０．３：１９．７の比率（ｍｌ）で混ぜた、モル浸透圧濃度２８０〜３００ｍＯｓＭ、ｐＨ７．３〜７．４の混合物である。２ＸＴＣＭは、２０％のＴＣＭ１９９溶液、０．０１重量％のカナマイシン硫酸塩、０．０４重量％のＬ−グルタミンを含み、溶液Ｂはモル浸透圧濃度が４３０〜４４０ｍＯｓＭである２．１重量％のＮａＨＣＯ３水溶液を含み、溶液Ｃはモル浸透圧濃度が５５〜６０ｍＯｓＭの０．３６重量％のピルビン酸溶液（ＭＱ Ｈ２Ｏ）を含む。使用した水は全てＭｉｌｌｉ Ｑ（ＭＱ）水などの１型の超純水であり、培地は使用前に濾過した。結果として生じる成熟培地の４．５ｍＬを０．５ｍＬのヒト血清アルブミンおよびｒｈＦＳＨ（０．５μｇ／ｍＬ）で希釈し、エストラジオール（１μｇ／ｍＬ）および黄体形成ホルモン（５μｇ／ｍＬ）を加えた。
【０１４６】
成熟培地を濾過した鉱物油で覆い、プレートを５％のＣＯ２を含む加湿空気中で２２〜２８時間３８℃でインキュベーションした。第１極体の放出が光学顕微鏡法により可視化され、それを、減数分裂再開の証明となる決定要因として用いた。
【０１４７】
いったん減数分裂再開が確認されたら、卵母細胞をインビトロ受精で用いるために準備した。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
表２．多ステップ培養系におけるヒト卵胞およびウシ卵胞の成熟。*（％）は、ＩＶＧ卵胞総数のうち、インビトロ系において進行が完了した卵胞およびＯＣＣの比率を指す。卵胞腔の存在は、無傷の卵胞における光学顕微鏡法か基底膜破断後のＯＣＣの顕微鏡検査により確認され得る。ＩＶＧヒト卵胞またはウシ卵胞の何れかから放出された卵母細胞の４０％超が、中期ＩＩ（ＭＩＩ）に進むだろう。
【０１５０】
ウシ系への適用
上記方法は、以下の培地を用いてウシ卵巣組織サンプルでも実行することができる。
【０１５１】
インビトロでのウシ卵巣卵胞の活性化、発育、およびウシ卵母細胞の成熟
１．組織保持培地
ウシ血清アルブミン（０．３重量％）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ベンジルペニシリン（７５μｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（５０μｇ／ｍＬ）を有するライボビッツ（Ｌ−１５）培地。
【０１５２】
２．微細皮質培養培地
ウシ血清アルブミン（０．１重量％）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、ベンジルペニシリン（１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）、ウシトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ウシインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＳＨ（１ｎｇ／ｍＬ）、およびアスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地。
【０１５３】
注．ウシ血清、アクチビンＡ、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、７４０−Ｐ、ＧＤＦ−９、およびＢＭＰ１５を個別に、または組み合わせて加えることは、微細皮質培養において禁忌である。組織の生育能力はＦＳＨ濃度の変更により悪影響を受け得る。抗菌インスリン合剤は避けることを推奨する。
【０１５４】
３．単離卵胞培養培地
ウシ血清アルブミン（０．１重量％）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、ベンジルペニシリン（１ｍｇ／ｍＬ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）、ウシトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ウシインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、*ＦＳＨ（１ｎｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）、Ｋｉｔリガンド（１０μｇ／ｍＬ）、および組換え体アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地
【０１５５】
*ＦＳＨ濃度は、単離卵胞培養が進行するに従い調整すべきである。最初の４８時間は１ｎｇ／ｍＬであるＦＳＨを、次の９６時間では１０ｎｇ／ｍＬまで上昇させるとともに、１００ｎｇ／ｍＬのエストラジオールを加える。卵胞が８日間培養物に残る場合は、ＦＳｈを１００ｎｇ／ｍＬまで上昇させるとともに、１μｇ／ｍＬのエストラジオールを加える。
【０１５６】
注．ウシ血清、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、７４０−Ｐ、ＧＤＦ−９、およびＢＭＰ１５を個別に、または組み合わせて加えることは、単離卵胞培養において禁忌である。ＦＳＨ濃度は、卵母体細胞の接触が維持されるように、記載のように調整すべきである。
【０１５７】
４．ウシ卵母細胞−卵丘複合体培養培地
ウシ血清アルブミン（０．１重量％）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（３ｍＭ）、カナマイシン硫酸塩（０．０８ｍｇ／ｍＬ）、ウシトランスフェリン（２．５μｇ／ｍＬ）、セレニウム（４ｎｇ／ｍＬ）、ウシインスリン（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＳＨ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（２００ｎｇ／ｍＬ）、エストラジオール（１μｇ／ｍＬ）、およびＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を有するＭｃＣｏｙｓ ５ａ ＨＥＰＥＳ改変培地。
【０１５８】
ウシ卵母細胞成熟系
系は、ウシ卵母細胞保持培地およびウシ卵母細胞成熟培地を含む。これらは、いくつかの溶液の複合物であり、使用前に新しく準備しなければならない。水は全て、例えばＭｉｌｌｉ Ｑ（ＭＱ）水などの１型の超純水でなければならない。モル浸透圧濃度およびｐＨを最適化させた後、血清を加える前の培地は−２０℃で保存することが可能である。
【０１５９】
ウシ卵母細胞保持培地
それぞれの比率（ｍｌ）が２５：３：１：２１である２ＸＴＣＭ１９９、溶液Ｂ、溶液Ｃ、ＭＱ Ｈ２Ｏ
モル浸透圧濃度２８０〜３００ｍＯｓＭ、ｐＨ７．３〜７．４*
*モル浸透圧濃度およびｐＨは提示の範囲内でなければならない。
使用法：９ｍＬの保持培地を１ｍＬのウシ血清で希釈し、使用前に温める。
【０１６０】
２ＸＴＣＭ１９９
２０％のＴＣＭ１９９溶液、０．０１重量％のカナマイシン硫酸塩、０．０４重量％のＬ−グルタミン
【０１６１】
溶液Ａ
３％ＨＥＰＥＳ−フリー酸、３．２５重量％ＨＥＰＥＳナトリウム塩水溶液
モル浸透圧濃度３８０〜３８５ｍＯｓＭ*
*モル浸透圧濃度は提示の範囲内でなければならない。
【０１６２】
溶液Ｂ
２．１重量％のＮａＨＣＯ３水溶液
モル浸透圧濃度４３０〜４４０ｍＯｓＭ
*モル浸透圧濃度は提示の範囲内でなければならない。
【０１６３】
使用前に保持培地を濾過すること。
【０１６４】
ウシ卵母細胞成熟培地
それぞれの比率（ｍｌ）が２５：５：０．３：１９．７である２ＸＴＣＭ、溶液Ｂ、溶液Ｃ、ＭＱ Ｈ２Ｏ
モル浸透圧濃度２８０〜３００ｍＯｓＭ*、ｐＨ７．３〜７．４*
*モル浸透圧濃度およびｐＨは提示の範囲内でなければならない。
【０１６５】
溶液Ｃ
０．３６重量％のピルビン酸溶液（ＭＱ Ｈ２Ｏ）
モル浸透圧濃度５５〜６０ｍＯｓＭ*
*モル浸透圧濃度およびｐＨは提示の範囲内でなければならない。
使用前に濾過すること。血清およびホルモンを加える前の培地は、−２０℃で保存することが可能である。
使用法：４．５ｍＬのウシ成熟培地を０．５ｍＬのウシ血清で希釈し、ＦＳＨ（０．５μｇ／ｍＬ）、エストラジオール（１μｇ／ｍＬ）および黄体形成ホルモン（５μｇ／ｍＬ）を加える。５％ＣＯ２を含む加湿空気中で、使用前に３８℃まで温める。
【０１６６】
〔参考文献〕
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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