(57)【要約】  少なくとも１つのインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト（ＧＬＰ１Ｒアゴニスト）及び／又は二重ＧＬＰ−１受容体／グルカゴン受容体アゴニスト及び／又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分のナノカプセルシステムが開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．  カチオン性荷電ポリマーを含む表面層；及び
ｂ．  場合により、負に荷電したポリマーを含む第二の表面層；及び
ｃ．  少なくとも１つの親油性化合物を含む脂質コア；及び
ｄ．  少なくとも１つの界面活性剤または界面活性剤の混合物；及び
ｅ．  インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト（ＧＬＰ１Ｒアゴニスト）、二重ＧＬＰ−１受容体／グルカゴン受容体アゴニスト、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分
を含む、ナノカプセルシステム。
【請求項２】
カチオン性荷電ポリマーが、ペプチド、ポリアミノ酸、ポリリジン、ポリアルギニン、リキシセナチド、プロタミン及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のナノカプセルシステム。
【請求項３】
負に荷電したポリマーが、ポリシアル酸、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、アルギン酸、ポリグルクロン酸、及びキサンタンガムからなる群より選択される、請求項１に記載のナノカプセルシステム。
【請求項４】
界面活性剤または界面活性剤の混合物が、８より大きい親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項５】
少なくとも１つの界面活性剤または界面活性剤の混合物が、少なくとも１つの脂肪酸でエステル化されたソルビタン及びそのエトキシレート、脂肪酸エステル、脂肪酸塩、トラガカントゴム、胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体並びにポロクサマーからなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項６】
ａ．  少なくとも１つの界面活性剤が、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンイソステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも脂肪酸でエステル化されたソルビタン若しくはそのエトキシレートであるか；
又は
ｂ．  少なくとも１つの界面活性剤が、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリエチレングリコール４０、ジラウリン酸ポリエチレングリコール、モノパルミチン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリエチレングリコール１００、ポリエチレングリコール−１５−ヒドロキシステアレート、Ｄ−アルファ−トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート（ＴＰＧＳ）、オレイン酸トリエタノールアンモニウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、及びドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、オレイン酸ナトリウム、並びにそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される脂肪酸エステルもしくは脂肪酸塩
であるか；
又は
ｃ．  少なくとも１つの界面活性剤が、ポロクサマー１２４、ポロクサマー１８８、ポロクサマー２３７、ポロクサマー２３８（ＨＬＢ  ２８）、ポロクサマー２７８（ＨＬＢ  ２８）、ポロクサマー３３８、ポロクサマー４０７、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択されるポロクサマーであるか；
又は
ｄ．  少なくとも１つの界面活性剤が、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、及びタウロデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選択される胆汁酸塩又は胆汁酸塩誘導体である、
請求項５に記載のナノカプセルシステム。
【請求項７】
界面活性剤または界面活性剤の混合物が、コール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−１５−ヒドロキシステアレート、Ｄ−アルファ−トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート（ＴＰＧＳ）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポロクサマー、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項８】
親油性化合物が、落花生油、綿実油、オリーブ油、ヒマシ油、大豆油、紅花油、ゼラニウム油、ヤシ油、アルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）、オレイン酸、リノール酸、ミリスチン酸イソプロピル、スクアレン、トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリド、リノレオイルマクロゴール−６グリセリド（トウモロコシ油  ＰＥＧ−６エステル）、中鎖トリグリセリド、オレイン酸グリセリル、リノール酸グリセリル、モノオレイン酸グリセロール、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項９】
ａ．  インスリンがヒトインスリンであり；かつ／又は
ｂ．  インスリンアナログが、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングラルギン及びインスリングルリジンまたはそれらのいずれかの混合物からなる群より選択され；かつ／又は
ｃ．  インスリン誘導体が、インスリンデテミル及びインスリンデグルデクからなる群より選択され；かつ／又は
ｄ．  グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト（ＧＬＰ１Ｒアゴニスト）が、エキセンディン−４、リラグルチド、リキシセナチド、デュラグルチド、アルビグルチド、セマグルチド、及びタスポグルチド並びにそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、
請求項１〜８のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム、並びに場合により１つ又はそれ以上のさらなる活性薬剤成分及び場合により１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
凍結乾燥されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム及び／又は請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ａ．  請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム又は請求項１０に記載の医薬組成物；及び
ｂ．  少なくとも１つのさらなる活性薬剤成分；及び場合により
ｃ．  医療デバイス
の１つ又はそれ以上の個別のパッケージを含むキット。
【請求項１３】
ａ．  真性糖尿病の処置における使用のため；かつ／又は
ｂ．  高血糖症の処置における使用のため；かつ／又は
ｃ．  血中グルコースレベルの低下における使用のための、
請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム又は請求項１０に記載の医薬組成物又は請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
皮下、経皮、頬側、経口、肺又は鼻腔投与のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム又は請求項１０に記載の医薬組成物又は請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
それを必要とする被験体において、真性糖尿病を処置する方法又は高血糖症を処置する方法又は血中グルコースレベルを低下させる方法であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム又は請求項１０に記載の医薬組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノカプセルシステム又は請求項１０に記載の医薬組成物を投与するための医療デバイス。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノカプセルシステムを製造するための方法であって、親油性化合物を含有する内部親油性相、及びカチオン性荷電ポリマー、場合により負に荷電したポリマーを含有する外部水相、及び界面活性剤又は界面活性剤の混合物、及び少なくとも１つの活性薬剤成分の乳化を含む、上記方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの活性薬剤成分が、粉末又は水溶液のいずれかとして親油性相中に分散される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの活性薬剤成分が、粉末又は水溶液のいずれかとしていずれかの親油性相中に分散される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序論
本発明は、ナノカプセルシステム、該ナノカプセルシステムを含む医薬組成物、及び該ナノカプセルシステムを含むキットに関する。また本発明は、処置における使用のための前記ナノカプセルシステム、及び処置の関連方法に関する。本発明はまた、前記ナノカプセルを製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
真性糖尿病は、グルコースを利用する能力が多かれ少なかれ完全に喪失される代謝障害である。数十年間、インスリンは真性糖尿病の処置において使用されてきた。いくつかのインスリン製剤、例えばインスリン亜鉛(Zn(II))懸濁液、プロタミンを含有する製剤などが開発された。さらに、活性薬剤成分のインスリン自体が、速効性インスリンアナログ(例えば、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングルリジン)並びに長時間作用性インスリンアナログ及び誘導体(例えば、インスリンデテミル、インスリンデグルデク、インスリングラルギン)を開発することにより改良されてきた。速効性インスリン調製物は通常はインスリンの溶液であるが、長時間作用性インスリン調製物は、亜鉛(Zn(II))塩(例えば、塩化亜鉛)単独の添加により又はプロタミンの添加により又は両方の組み合わせにより沈殿させられた結晶性及び／又は非晶質形態のインスリンを含有する懸濁液であり得る。
【０００３】
インスリンは非経口投与される。インスリンの経口送達のような非侵襲性投与経路が調べられるが、胃腸管における酵素分解、薬物排出ポンプ、腸管粘膜からの不十分で変化しやすい吸収、さらには肝臓における初回通過代謝のようないくつかのハードルがある。
【０００４】
特許文献１(特許文献２)は、少なくとも１つのインスリンペプチド、少なくとも１つの半極性プロトン性有機溶媒及び少なくとも２つの非イオン性界面活性剤を含む液体医薬組成物を開示する。
【０００５】
特許文献３(特許文献４)は、ポリアルギニン塩、陰性リン脂質及び油を含む１μｍ未満の直径を有するナノカプセルを含む活性成分を投与するためのシステムを開示する。
【０００６】
特許文献５(特許文献６)は、油、カチオン性界面活性剤及び特定のポリマーを含むナノカプセルを含む活性成分の投与のためのシステムを開示する。
【０００７】
特許文献７は、活性成分の投与に適したナノカプセルシステムを開示する。
【０００８】
非特許文献１は、生理活性物質（bioactives）の送達のための多価電解質ベースの代替担体に関する。
【０００９】
ナノメートルサイズのシステムにおける活性薬剤成分の組み込みは、溶解度の改善、分解からの保護、又は活性分子のナノカプセル封入又はポリマーコーティング上のその吸着のいずれかによる活性薬剤成分のより多くの浸透をもたらす。さらに、外部バリアを通過して身体内部に達するためのこれらのシステムの能力は、それらのサイズ及びそれらの組成の両方に依存するということも知られている。小さいサイズの粒子は、より大きなサイズと比較して輸送の程度を増加させる。
【００１０】
カチオン性荷電ポリマーを含む表面層、場合により、負に荷電したポリマーを含む第二の表面層、少なくとも１つの親油性化合物を含む脂質コア、適切な界面活性剤、並びにインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)及び二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト及びそのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分を含む代替のナノカプセルシステムが改善された特性を示すということが、驚くべきことに今や見出された。このナノカプセルシステムは、安定で入手しやすく、そしてさらに、親水性及び親油性の両方の異なる種類の活性薬剤成分、特にインスリン、インスリンアナログ及び／又はインスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)及び／又は二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト及び／又はそれらのいずれかの組み合わせの有効な組み合わせを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】US2013/058999
【特許文献２】WO 2011/086093
【特許文献３】US2012/0121670
【特許文献４】WO 2010/7122204
【特許文献５】US 2014/0023703
【特許文献６】WO 2012/095543
【特許文献７】PCT/ES2013/070885
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Shukla et al.；Expert Opinion Drug Delivery、2010、Vol. 7(09)、pp. 993-1011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明のナノカプセルシステムは、以下に関するその特定の挙動のために、薬物の投与及び／又は放出について他のシステムと比較して改善された特性を提供する:
・  活性薬剤成分のカプセル封入／組み合わせ: システムは、ナノ粒子、ミセル、複合体、ナノゲルの割合よりも大きい割合で、親水性又は親油性の１つ又はそれ以上の活性薬剤成分又はアジュバントを含むことができる;
・  活性薬剤成分の放出: 親水性コアだけでなく、ポリマーコーティング層も、その放出速度に対して効果を有し、用途及び必要性に従って有効成分の制御された放出を可能にする;
・  生体液中での安定性: ポリマーコーティングは、脂質コアに高い安定性を与え、これはマイクロ-及びナノエマルションの他のシステムと比べた利点を表す;
・  特定の生物学的表面との特異的相互作用: ポリマーコーティングは、脂質コアに、粘膜表面、さらには上皮及び特定の細胞との相互作用の可能性を与える;
・  例えばプロタミンのカチオン性ポリマーとしての急速な代謝及び排出は、このシステムに薬物動態安全性プロフィールを与え、そして同じプロフィールは、いくらかの他の種類のコーティングを有する他のナノカプセルシステムについては実証することができないものである;
・  凍結乾燥の間の安定性。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
本発明の一実施態様は:
a.  カチオン性荷電ポリマーを含む表面層;
b.  場合により、負に荷電したポリマーを含む第二の表面層;
b.  少なくとも１つの親油性化合物を含む脂質コア;
c.  界面活性剤、界面活性剤の混合物又は少なくとも１つの界面活性剤;及び
d.  インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分を含むナノカプセルシステムに関する。
【００１５】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリリジン、ポリアルギニン、リキシセナチド、プロタミン、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるカチオン性荷電ポリマーを含む表面層を含む。
【００１６】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、ポリ酸及び誘導体、ポリシアル酸、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、アルギン酸、ポリグルクロン酸、及びキサンタンガムの群より選択される負に荷電されたポリマーを含む第二の表面層を含む。
【００１７】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、8より大きい、別の実施態様では9より大きい、10より大きい、11より大きい、12より大きい、13、又は14より大きい親水性-親油性バランス(HLB)を有することを特徴とする、少なくとも１つの界面活性剤又は界面活性剤の混合物を含む。
【００１８】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、少なくとも１つの脂肪酸でエステル化されたソルビタン及びそのエトキシレート、脂肪酸エステル、脂肪酸塩、トラガカントゴム、胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体並びにポロクサマーからなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【００１９】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、ソルビタンモノオレエート(Span（R）80、HLB 4.3)、ソルビタンモノラウレート(Span（R）20、HLB 8.6)、ソルビタンモノステアレート(Span（R）60、HLB 4.7)、ソルビタントリオレエート(Span（R）85、HLB 1.8)、ソルビタンセスキオレエート(Span（R）83、HLB 3.7)、ソルビタンモノパルミテート(Span（R）40、HLB 6.7)、ソルビタンイソステアレート(Span（R）120、HLB 4.7)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ポリソルベート80；Tween（R）80；HLB 15)、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(ポリソルベート20；Tween（R）20；HLB 16.7及びTween 21（R）；HLB 13.3)、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート(Tween（R）40、HLB 15.6)、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(Tween（R）60、HLB 14.9及びTween 61（R）；HLB 9.6)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween81（R）；HLB 10)、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート(Tween 65（R）；HLB 10.5)、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート(Tween 85（R）；HLB 11)、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween（R）20、HLB 16.7及びTween 21（R）；HLB 13.3)又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つの脂肪酸でエステル化されたソルビタン及びそのエトキシラートである、界面活性剤、界面活性剤の混合物又は少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【００２０】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、PEG化脂肪酸エステル及びPEGとの混合物、モノステアリン酸ポリエチレングリコール(HLB 11.6)、ステアリン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリエチレングリコール40 (HLB 17)、ジラウリン酸ポリエチレングリコール400(HLB 9.7)、ジラウリン酸ポリエチレングリコール200(HLB 5.9)、モノパルミチン酸ポリエチレングリコール(HLB 11.6)、ステアリン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリエチレングリコール40(HLB 16.9) ステアリン酸ポリエチレングリコール100(HLB 18.8)、Solutol HS15（R）(HLB 15)、ポリエチレングリコール-15-ヒドロキシステアレート(HLB 14-16)、D-アルファ-トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート(TPGS；HLB 13.2)、オレイン酸トリエタノールアンモニウム(HLB 12)、オレイン酸ナトリウム(HLB 18)、ラウリル硫酸ナトリウム(HLB 40)、オレイン酸トリエタノールアミン(HLB 12)及びドデシル硫酸リチウム(HLB 16-18)、オレイン酸ナトリウム(HLB 18)、ドデシル硫酸ナトリウム(HLB 40)、ラウリル硫酸ナトリウム(HLB 40)又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される脂肪酸エステル又は脂肪酸塩である、界面活性剤、界面活性剤の混合物又は少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【００２１】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、トラガカントゴム(HLB 11.9)である少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【００２２】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、コール酸ナトリウム(HLB 18)、デオキシコール酸ナトリウム(HLB 16)、グリココール酸ナトリウム(HLB 16-18)、タウロコール酸ナトリウム(HLB 16)、タウロデオキシコール酸ナトリウム(HLB 20.1)からなる群より選択される胆汁酸塩及び／又は胆汁酸塩誘導体である、少なくとも１つの界面活性剤、界面活性剤の混合物又は少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【００２３】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、ポロクサマー124 (HLB
16)、ポロクサマー188 (HLB 29)、ポロクサマー237 (HLB 29)、ポロクサマー238 (HLB 28)、ポロクサマー278 (HLB 28)、ポロクサマー338 (HLB 27)、及びポロクサマー407 (HLB 22)からなる群より選択されるポロクサマーである、界面活性剤、界面活性剤の混合物又は少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【００２４】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、脂肪酸及びグリセリドとのそれらのエステル、並びにテルペノイドからなる群より選択される少なくとも１つの親油性化合物を含む脂質コアを含む。
【００２５】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、落花生油、綿実油、オリーブ油、ヒマシ油、大豆油、紅花油、ゼラニウム油、ヤシ油、アルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）、オレイン酸、リノール酸、ミリスチン酸イソプロピル、スクアレン、Miglyol（R）、Labrafil（R）、Labrafac（R）、Peceol（R）、Maisine（R）、トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリド、リノレオイルマクロゴール−６グリセリド（トウモロコシ油  ＰＥＧ−６エステル）、中鎖トリグリセリド、オレイン酸グリセリル、リノール酸グリセリル、モノオレイン酸グリセロール、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの親油性化合物を含む脂質コアを含む。Miglyol（R）(CAS-NO 52622-27-2)は、デカノイル-及びオクタノイルグリセリドの混合物を含有する商品の商標である。INCI名は、「トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリド」である。Labrafil（R）は、オレイルマクロゴール-6グリセリドを含有する商品の商標である。Labrafac（R）は、中鎖脂肪酸トリグリセリドを含有する商品の商標である；同義語は「トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリド」(HLB 1)である。Peceol（R）は、モノオレイン酸グリセロール(40型)を含有する商品の商標である。Maisine（R）は、モノリノール酸グリセロールを含有する商品の商標である。
【００２６】
別の実施態様において、親油性化合物は、スクアレン油、芳香油、シリコーンオイル、精油、不水溶性ビタミン類、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸セチル、ベヘン酸トリデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジオクチル、アントラニル酸メンチル、オクタン酸セチル、サリチル酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコールのケトール、Cerafilos（R）、オレイン酸デシル、乳酸C12-C15アルキル、乳酸セチル、乳酸ラウリル、ネオペンタン酸イソステアリル、乳酸ミリスチル、ステアリン酸イソセチル  ステアロイル、ステアリン酸オクチルドデシル  ステアロイル、炭化水素油、イソパラフィン、流動パラフィン、イソドデカン、ワセリン、アルガンオイル、菜種油、ラー油、ココナツオイル、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、グレープシードオイル、カラシ油、オリーブ油、ヤシ油、分画ヤシ油、落花生油、ひまし油、松の実油、芥子の実油、カボチャの種油、ヌカ油、紅花油、茶油、トリュフオイル、植物油、アンズ油、ホホバオイル、マカダミアオイル、小麦麦芽油、アーモンドオイル、大豆油、ゴマ油、ヘーゼルナッツ油、ヒマワリ油、大麻油、ボアオイル（bois oil）、ククイナッツオイル、アボカドオイル、クルミ油、魚油、ベリーオイル、ジャマイカペッパーオイル、杜松油、種油、アーモンド種子油、アニス油、セロリ種子油、クミン種子油、ナツメグ種子油、バジル葉油、ローリエオイル、シナモン葉油、コモンセージ葉油、ユーカリ葉油、レモンリーフオイル、ティーツリーオイル、オレガノオイル、パチョリ葉油、ミント葉油、松葉油、ローズマリー葉油、スペアミント油、ティーツリー葉油、タイム葉油、カナダ茶葉油、花油、カモミール油、ローマセージ油、丁子油、ゼラニウム花油、ヒソップ花油、ジャスミン花油、ラベンダー花油、マウカ（mauka）花油、マジョラム花油、オレンジ花油、バラ花油、イランイラン花油、樹皮油、経皮樹脂油、シナモン樹皮油、ササフラス樹皮油、桐油、ショウノウ桐油、シーダー桐油、バラ茎油、ビャクダン油、生姜桐油、松脂油、ひまし油、ミルラオイル、果皮油、ベルガモ（Bergamo）果皮油、グレープフルーツ果皮油、レモン果皮油、ライム果皮油、オレンジ果皮油、マンダリン果皮油、根油、バレリアンオイル、オレイン酸、リノール酸、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、オレイン酸エチル、Miglyol（R）、Labrafil（R）、Labrafac（R）、Rylo（R）、Peceol（R）及びMaisine（R）、それらの合成又は半合成誘導体並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、油は落花生油、綿実油、オリーブ油、ヒマシ油、大豆油、紅花油、ヤシ油、α-トコフェロール(ビタミンE)、ミリスチン酸イソプロピル、スクアレン、Miglyol（R）、Labrafil（R）、Labrafac（R）、Peceol（R）及びMaisine（R）又はそれらの混合物からなる群より選択される。より好ましくは、油はMiglyol（R）、スクアレン又はα-トコフェロールである。
【００２７】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、少なくとも１つの親油性化合物を含む脂質コアを含み、ここで親油性化合物は、オレイン酸、トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリド、スクアレン又はアルファ-トコフェロールからなる群より選択される。
【００２８】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、ヒトインスリンである活性薬剤成分を含む。
【００２９】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングラルギン及びインスリングルリジン又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択されるインスリンアナログである活性薬剤成分を含む。
【００３０】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、インスリンデテミル及びインスリンデグルデクからなる群より選択されるインスリン誘導体である活性薬剤成分を含む。
【００３１】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、タンパク質分解に対して安定化されたヒトインスリンである活性薬剤成分を含む。別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、タンパク質分解に対して安定化されたヒトインスリンである活性薬剤成分を含み、ここで該タンパク質分解に対して安定化されたヒトインスリンは、A及びB鎖に少なくとも１つより多くのアミノ酸置換並びに／又はC末端及びN末端の少なくとも１つの欠失もしくは伸長並びに／又は少なくとも１つの官能基化N末端(例えば、ジアルキル化)並びに／又はK(エプシロン)-NH2における少なくとも１つのアシル化並びに／又は少なくとも１つのさらなるジスルフィド結合の少なくとも１つの導入を含有する。タンパク質分解に対して安定化された適切なヒトインスリンは、以下の書類に開示され、これらは参照により加入される: WO2008/034881、WO2008/145721、WO2009/112583、WO2009/115469、WO2012/049307、及びWO2013/093009。一実施態様において、このようなタンパク質分解に対して安定化されたヒトインスリンは、WO 2009/115469に開示されるような、A14E、B25H、B29K(N-エプシロン オクトデカンジオイル（Octodecanedioyl）-ガンマ グルタミン酸-OEG-OEG)、desB30ヒトインスリンである；用語「OEG」は、アミノ酸NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2Hについての略記法である。
【００３２】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、エキセンディン-4、リラグルチド、リキシセナチド、デュラグルチド、アルビグルチド、セマグルチド、及びタスポグルチド又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択されるグルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)である活性薬剤成分を含む。
【００３３】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニストである活性薬剤成分を含む。
別の実施態様において、本発明は、
a.  カチオン性荷電ポリマーを含む表面層;
b.  場合により、負に荷電したポリマーを含む第二の表面層；
c.  少なくとも１つの親油性化合物を含む脂質コア;
d.  界面活性剤、又は少なくとも１つの界面活性剤、又は界面活性剤の混合物；並びに
e.  少なくとも１つのインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)及び／又は二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト及び／又は又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分；並びに
f.  場合により、１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤
を含む医薬組成物に関する。
【００３４】
別の実施態様において、本発明は、
a.  カチオン性荷電ポリマーを含む表面層;
b.  場合により、負に荷電したポリマーを含む第二の表面層；
c.  少なくとも１つの親油性化合物を含む脂質コア;
d.  8より大きい、9より大きい、10より大きい、11より大きい、12より大きい、13より大きい、又は14より大きい親水性−親油性バランス(HLB)
を有することを特徴とする、界面活性剤、又は少なくとも１つの界面活性剤、又は界面活性剤の混合物；並びに
e.  少なくとも１つのインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)及び／又は二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト及び／又は又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分；並びに
f.  場合により、１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤
を含む医薬組成物に関する。
【００３５】
別の実施態様において、本発明に従う医薬組成物は、１つ又はそれ以上のさらなる活性薬剤成分を含む。
【００３６】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステム又は本発明に従う医薬組成物は、凍結乾燥される。
【００３７】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステム又は本発明に従う医薬組成物の１つ又はそれ以上の個別のパッケージ、及び少なくとも１つのさらなる活性薬剤成分、及び／又は医療デバイスを含むキットに関する。
【００３８】
別の実施態様において、本発明のナノカプセルシステム及び／又は本発明に従う医薬組成物及び／又は本発明に従うキットは、真性糖尿病の処置における使用のためのものである。
【００３９】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステム及び／又は本発明に従う医薬組成物及び／又は本発明に従うキットは、高血糖の処置における使用のためのものである。
【００４０】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステム及び／又は本発明に従う医薬組成物及び／又は本発明に従うキットは、血中グルコースレベルの低下における使用のためのものである。
【００４１】
別の実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステム及び／又は本発明に従う医薬組成物及び／又は本発明に従うキットは、皮下、経皮、頬側、経口、肺又は鼻腔投与のためのものである。
【００４２】
別の実施態様において、本発明は、それを必要とする被験体において真性糖尿病を処置する方法に関し、該方法は、本発明に従うナノカプセルシステム又は本発明に従う医薬組成物を投与することを含む。
【００４３】
別の実施態様において、本発明は、それを必要とする被験体において高血糖症を処置する方法に関し、該方法は、本発明に従うナノカプセルシステム又は本発明に従う医薬組成物を投与することを含む。
【００４４】
別の実施態様において、本発明は、それを必要とする被験体において血中グルコースレベルを低下させる方法に関し、該方法は、本発明に従うナノカプセルシステム又は本発明に従う医薬組成物を投与することを含む。
【００４５】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステム又は本発明に従う医薬組成物を投与するための医療デバイスに関する。
【００４６】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、親油性化合物を含有する内部親油性相、及びカチオン性荷電ポリマーを含有する外部水相、及び場合により界面活性剤又は界面活性剤の混合物の乳化を含む。ヒトインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分は、内部親油性相に、外部水相に、又は両方に取り込まれる。場合により、負に荷電したポリマーは、カチオン性ポリマー層の沈着の際に、又はカチオン性ポリマー層上への活性成分の吸着後に外部水相に加えられる。
【００４７】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、親油性化合物を含有する内部親油性相、及びカチオン性荷電ポリマーを含有する外部水相、及び場合により界面活性剤又は界面活性剤の混合物の乳化を含む。ヒトインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分は、内部親油性相中に組み込まれる。ここで、活性薬剤成分は、粉末として、又は水溶液としてのいずれかで親油性相に分散される。
【００４８】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、親油性化合物を含有する内部親油性相、及びカチオン性荷電ポリマーを含有する外部水相、及び場合により界面活性剤又は界面活性剤の混合物の乳化を含む。ヒトインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分は、内部親油性相に組み込まれる。ここで、少なくとも１つの活性薬剤成分は、界面活性剤または界面活性剤の混合物中の界面活性剤のいずれかと複合体化される。
【００４９】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、親油性化合物を含有する内部親油性相、及びカチオン性荷電ポリマー、場合により負に荷電したポリマーを含有する外部水相、界面活性剤又は界面活性剤の混合物、並びにヒトインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分の乳化を含み、ここで少なくとも１つの活性薬剤成分は、粉末として又は水溶液としてのいずれかでいずれかの親油性相に分散され、ここで少なくとも１つの活性薬剤成分は、界面活性剤又は界面活性剤の混合物中の界面活性剤のいずれかと複合体化される。
【００５０】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、以下の工程を含む(一工程溶媒拡散法)：
a)  カチオン性ポリマー、一実施態様ではプロタミン、及び場合により水溶性界面活性剤を含む水溶液を調製する工程;
b)  8より大きい、9より大きい、10より大きい、11より大きい、12より大きい、13、又は14より大きい親水性-親油性バランスを有することを特徴とする溶液、一実施態様では油及び１つ又はそれ以上の界面活性剤を含む溶液を調製する工程;
c)  工程a)及びb)において調製された溶液を撹拌しながら混合し、ナノカプセルが自然発生的に得られる工程；及び
d)  場合により、前工程で得られた混合物から完全に又は部分的に有機溶媒を蒸発させる工程。
【００５１】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、以下の工程(一工程溶媒拡散法)を含む：
a)  カチオン性ポリマー、一実施態様ではプロタミン、及び場合により水溶性界面活性剤を含む水溶液を調製する工程;
b)  油、及び8より大きい、9より大きい、10より大きい、11より大きい、12より大きい、13、又は14より大きい親水性-親油性バランスを有することを特徴とする１つ又はそれ以上の界面活性剤を含む溶液、一実施態様では有機溶液を調製する工程;
c)  工程a)及びb)において調製された溶液を撹拌しながら混合して、ナノカプセルが自然発生的に得られる工程；及び
d)  場合により、前工程において得られた混合物から有機溶媒を完全に又は部分的に蒸発させる工程；及び
e)  ナノカプセルのカチオン性層上に第二の層を形成させるために負に荷電したポリマーを添加する工程。
【００５２】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法(二工程溶媒拡散方法)に関し、該方法は、ポリマーの水溶液を用いるインキュベーションプロセスによりプロタミンでナノエマルションをコーティングすることを含む。
【００５３】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、ここでインキュベーションプロセスは、ナノエマルションをコーティングポリマーの水溶液と混合することを含む。上記ナノエマルションは、少なくとも１つの油、１つ又はそれ以上の界面活性剤、及び水相からなる。水相は、他の界面活性剤、塩及び他の補助剤を含有し得る。
【００５４】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、ここでインキュベーションプロセスは、コーティングポリマーの水溶液とナノエマルションを混合することを含む。上記ナノエマルションは、少なくとも１つの油、8より大きい、9より大きい、10より大きい、11より大きい、12より大きい、13、又は14より大きい親水性-親油性バランスを有することを特徴とする１つ又はそれ以上の界面活性剤、及び水相からなる。水相は、他の界面活性剤、塩、及び他の補助剤を含有し得る。
【００５５】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法（溶媒拡散法）に関し、該方法は以下の工程を含む:
ａ）  油、及び１つ又はそれ以上の界面活性剤を含む溶液、一実施態様では溶液を調製する工程；並びに
ｂ）  工程ａ）で得られた溶液を、水溶性界面活性剤を場合により含有する水相に加え、撹拌し続けてナノエマルションを形成する工程；並びに
ｃ）  場合により、一実施態様において存在している有機溶媒を完全に又は部分的に蒸発させる工程；並びに
ｄ）  工程ｂ）において生じたナノエマルションにカチオン性ポリマーを加える工程。
【００５６】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、以下の工程(溶媒拡散法)を含む:
ａ）  油、及び8より大きい、9より大きい、10より大きい、11より大きい、12より大きい、13、又は14より大きい親水性-親油性バランスを有することを特徴とする１つ又はそれ以上の界面活性剤を含む溶液、実施態様では溶液を調製する工程；並びに
ｂ）  工程ａ）において得られた溶液を、水溶性界面活性剤を場合により含有する水相に加え、そして撹拌し続けてナノエマルションを形成する工程；並びに
ｃ）  場合により、一実施態様では存在している有機溶媒を完全に又は部分的に蒸発させる工程；並びに
ｄ）  カチオン性ポリマーを、工程ｂ）において得られたナノエマルションに加える工程。
【００５７】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、以下の工程(超音波処理法)を含む：
ａ）  油、及び８より大きい親水性−親油性バランスを有することを特徴とする１つ又はそれ以上の界面活性剤を含む溶液、一実施態様では溶液を調製する工程；並びに
ｂ）  工程ａ）において得られた溶液を、水溶性界面活性剤を場合により含有する水相に加え、そして超音波処理する工程；並びに
ｃ）  場合により、一実施態様では存在している有機溶媒を完全に又は部分的に蒸発させる工程；並びに
ｄ）  カチオン性ポリマーを工程ｂ）において生じたナノエマルションに加える工程。
【００５８】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、以下の工程(ホモジナイズ法)を含む：
ａ）  油、及び１つ又はそれ以上の界面活性剤を含む溶液、一実施態様では有機溶液を調製する工程;
ｂ）  工程ａ）において得られた溶液を、水溶性界面活性剤を場合により含有する水相に加え、そしてホモジナイズする工程;
ｃ）  工程ｂ）において得られたエマルションを水で希釈し、そしてホモジナイズする工程;
ｄ）  場合により、一実施態様において存在している有機溶媒を完全に又は部分的に蒸発させる工程;
ｅ）  カチオン性ポリマーを工程ｃ）において生じたナノエマルションに加える工程。
【００５９】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、以下の工程（ホモジナイズ法）を含む：
a)  油、及び8より大きい、9より大きい、10より大きい、11より大きい、12より大きい、13、又は14より大きい親水性-親油性バランスを有することを特徴とする１つ又はそれ以上の界面活性剤を含む溶液を調製する工程；並びに
b)  工程ａ）において得られた溶液を、水溶性界面活性剤を場合により含有する水相に加え、そしてホモジナイズする工程；及び
c)  工程ｂ）において得られたエマルションを水で希釈し、そしてホモジナイズする工程；並びに
d)  場合により、完全に又は部分的に有機溶媒を一定体積まで蒸発させる工程；並びに
e)  カチオン性ポリマーを、工程ｃ）において生じたナノエマルションに加える工程。
【００６０】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、ここで有機溶媒は脂質溶液に導入され、この有機溶媒は、一実施態様では、エタノール、イソプロパノール及びアセトンのような極性溶媒の混合物であり、そしてさらに例えばジクロロメタンのような非極性溶媒を含み得る。油、及び8より大きい親水性−親油性バランスを有することを特徴とする界面活性剤は、この有機相に組み込まれる。一実施態様において、活性薬剤成分もまた組み込まれる。
【００６１】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、ここでプロタミンは、カチオン性ポリマーとして選択され、該方法は以下の工程を含む:
a)  0.05％質量／体積のプロタミンで水溶液２０ｍｌを調製する工程；並びに
b)  １つ又は両方の界面活性剤（コール酸ナトリウム及び／又はPEGステアレート）のエタノール／アセトン溶液からなる親油性相を調製し、それにMiglyol（R）812を加える工程；並びに
c)  工程a)及びb)から生じた溶液を撹拌しながら混合し、ナノカプセルが自然発生的に得られる工程；並びに
d)  場合により、前工程において得られた混合物から有機溶媒を蒸発させる工程。
【００６２】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、ここでポリアルギニンはカチオン性ポリマーとして選択され、該方法は以下の工程を含む:
a)  0.05％質量／体積のポリアルギニン及び0.25％(質量／体積)のポロクサマー188を含有する水溶液２０ｍｌを調製する工程；並びに
b)  １つ又は両方の界面活性剤(ソルビタンモノオレエート及び／又はデオキシコール酸ナトリウム)のエタノール／アセトン溶液からなる親油性相を調製し、それにオレイン酸を加える工程；並びに
c)  工程a)及びb)から生じた溶液を撹拌しながら混合し、ナノカプセルが自然発生的に得られる工程；並びに
d)  場合により、前工程において得られた混合物から有機溶媒を蒸発させる工程。
【００６３】
別の実施態様において、本発明は、以下の工程を含む本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関する:
ａ）  油、及び１つ又はそれ以上の界面活性剤を含む溶液、一実施態様では溶液を調製する工程；並びに
ｂ）  工程ａ）において得られた溶液を、水溶性界面活性を場合により含有する水相に加え、そして撹拌し続けてナノエマルションを形成する工程；並びに
ｃ）  場合により、一実施態様では存在している有機溶媒を完全に又は部分的に蒸発させる工程。
【００６４】
別の実施態様において、本発明は、本発明に従うナノカプセルシステムを製造するための方法に関し、該方法は、それらの初期特徴を維持するように、貯蔵の間それらを保存する目的のために、凍結乾燥のさらなる工程を含む。本発明のナノカプセルのコーティングの性質、さらにはそれらの特徴のために、凍結乾燥の間に抗凍結剤を使用する必要はない。別のさらなる利点は、本発明のナノカプセルシステムは凍結乾燥物の再構成の間に凝集体を形成しないので、凍結乾燥前にコロイド系を希釈する必要がないことである。あるいは、抗凍結剤効果を及ぼすために１つ又はそれ以上の糖を加えることが可能である(抗凍結剤の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：トレハロース、グルコース、スクロース、マンニトール、マルトース、ポリビニルピロリドン(PVP)。凍結乾燥形態において、ナノカプセルは長期間貯蔵することができ、そして必要な場合、単に最適体積の水を加えることにより容易に再生することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図1：A - SIF中、及びB - 1％パンクレアチンを補充したSIF中pH 6.8、37℃でのブランクプロタミンナノカプセルのコロイド安定性。
【図２】図2：インスリングルリジン添加プロタミンナノカプセル(Pr-NC：◆)及びポリシアル酸被覆プロタミンナノカプセル(PSA-Pr NC：■)のSIF、pH 6.8、37℃におけるインビトロ放出プロフィール。
【図３】図3：インスリングルリジン添加プロタミンナノカプセルのFaSSIF pH 6.5、37℃におけるコロイド安定性。
【図４】図4：食餌を与えられた状態での最新の疑似腸液(FeSSIF V2)中のインスリングルリジン添加プロタミンナノカプセルのインキュベート後のサイズ分布曲線の例。A：FeSSIF-V2のみ。B及びC：FeSSIF-V2中でのインキュベーション後それぞれT0及びT4でのインスリングルリジン添加プロタミンナノカプセル。
【図５】図5：A：FeSSIF V2中pH 5.8、37℃でのインスリングルリジン添加プロタミンナノカプセルのコロイド安定性(アッテネータを6に固定、n=3)；B：FeSSIF V2中pH 5.8、37℃でのポリシアル酸でポストコーティングされた（post-coated）インスリングルリジン添加プロタミンナノカプセルのコロイド安定性(アッテネータを6に固定、n=3)。
【図６】図6：FeSSIF V2中pH 5.8、37℃でのインキュベーションの際にプロタミンナノカプセル中にカプセル封入されたインスリングルリジンのタンパク質分解。A： 元のプロトタイプ(ポリシアル酸コーティングの無いプロタミンナノカプセル）及びB ポリシアル酸でポストコーティングされたプロトタイプ。
【図７】図7：インスリングルリジン添加プロタミンナノカプセル(Pr-NC：◆)及びポリシアル酸被覆プロタミンナノカプセル(PSA-Pr NC：■)からのFassif v2、pH 6.5、37℃におけるインスリングルリジンのインビトロ放出プロフィール。
【図８】図8：凍結乾燥の前及び後のインスリングルリジン添加プロタミンナノカプセルの物理化学的特徴。
【図９】図9：グルリジン添加プロタミンナノカプセル(Pr-NC：◆)、ポリシアル酸被覆プロタミンナノカプセル(PSA-Pr NC：■)又はグルリジン溶液(x)のカニューレ挿入された正常血糖ラットへの十二指腸内投与の際の血中グルコースレベルの漸進的変化。(50IU／kgの単回用量、処置された動物の数は、５と12との間で変化し、それらは異なる実験から分類された)。
【図１０】図10：Parg NCの粒径(A)、Z-電位(B)及びEE(C)に対する最終製剤ｐHの影響。
【図１１】図11：インスリン添加非緩衝化PArg NCのコロイド安定性（粒径及び計数率）。DLSのアッテネータは6に固定される。
【図１２】図12：インスリン添加20mM酢酸塩緩衝液ベースのPArg NCのコロイド安定性（粒径及び計数率）。DLSのアッテネータは6に固定される。
【図１３】図13：SIF(pH 6.8)、FaSSIF-V2、(pH 6.5)及びFeSSIF-V2(pH 5.8)中のPArgナノカプセル(表５における製剤E)のコロイド安定性（粒径及び計数率）。
【図１４】図14：FaSSIF-V2媒体における20mM酢酸塩緩衝液ベースのNCのインビトロインスリン放出プロフィール。媒体に放出されたインスリンの量（A)及びNCクリームに残ったインスリンの量(B)。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
詳細な説明
本明細書で使用される単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明確にそうではないと指示していなければ、複数の言及を含む。従って、例えば、「担体（a carrier）」を含有する充填材料（fill material）への言及は１つ又はそれ以上の担体を含み、「添加剤（an additive）」への言及はこのような添加剤の１つ又はそれ以上への言及を含む。
【００６７】
本明細書で使用される用語「活性薬剤成分」(API)は、いくつかの薬理効果を生じ、かつ状態の処置又は予防に使用される、いずれかの薬学的に活性な化学化合物又は生物学的化合物及びいずれかのその薬学的に許容しうる塩及びそれらのいずれかの混合物を含む。例となる薬学的に許容しうる塩としては、限定されないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、マレイン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、クエン酸、酒石酸、パモン酸、ラウリン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、ラウリル硫酸、ナフタレンスルホン酸、リノール酸、リノレン酸などが挙げられる。本明細書で使用される用語「活性薬剤成分」、「薬物」、「活性薬剤」、「活性成分」、「活性物質」及び「薬物」は、同義である、すなわち、同一の意味を有すると意図される。本発明の一実施態様において、活性薬剤成分は抗糖尿病薬である。抗糖尿病薬の例としては、以下が少し挙げられ、これらに限定されない：以下に詳細に機作されるような、インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、GLP-1アナログ、及びGLP-1受容体アゴニスト及び／又は二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト及び／又は又はそれらのいずれかの組み合わせ:
ａ）  インスリン、インスリンアナログ、及びインスリン誘導体
インスリン、インスリンアナログ、及びインスリン誘導体の例としては、限定されないが、短時間作用性インスリン；長時間作用性インスリン；インスリングラルギン(Lantus（R）)、インスリングルリジン(Apidra（R）)、インスリンデテミル(Levemir（R）)、インスリンリスプロ(Humalog（R）／Liprolog（R）)、インスリンデグルデク(Tresiba（R）)、インスリンアスパルト(NovoLog（R）／NovoRapid（R）)、基礎インスリン及びアナログ(例えば、LY2605541、LY2963016)、PEG化インスリンリスプロ、ヒトインスリン(Insuman（R）)が挙げられる;
ｂ）  グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、GLP-1アナログ、及びGLP-1受容体アゴニスト
GLP-1、GLP-1アナログ及びGLP-1受容体アゴニストの例としては、限定されないが、リキシセナチド(AVE0010／ZP10／Lyxumia（R）)、エキセナチド／エキセンディン-4 (Byett
a（R）／Bydureon（R）／ITCA 650)、リラグルチド(Victoza（R）)、セマグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド、デュラグルチド、エキセナチド-XTEN及びグルカゴン-XTEN、並びにポリマー結合GLP-1及びGLP-1アナログが挙げられる。
【００６８】
本発明に従うナノカプセルシステムに組み込まれる活性薬剤成分の比率は、ナノカプセルのシステム成分の総乾燥質量と比較して約50質量％まであり得る。しかし、適切な比率は、各場合において組み込もうとする活性薬剤成分、それが使用される適応症及び投与の効率に依存する。特定の実施態様において、有効成分の比率は、約10質量％まで、好ましくは約5質量％までであり得る。一実施態様において、本発明に従うナノカプセルシステムは、１つより多くの活性薬剤成分を含み、これは、組み込もうとする活性薬剤成分の性質に依存して、同じ溶液に又は別々に溶解され得る。
【００６９】
本明細書で使用される用語「インスリンのアナログ」及び「インスリンアナログ」は、形式的には天然に存在するインスリンの構造、例えばヒトインスリンの構造から、天然に存在するインスリン中に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を削除及び／若しくは交換することにより、かつ／又は少なくとも１つのアミノ酸残基を付加することにより誘導され得る分子構造を有するポリペプチドを指す。付加及び／又は交換されたアミノ酸残基は、コード可能な（codeable）アミノ酸残基又は他の天然に存在する残基又は純粋に合成のアミノ酸残基のいずれでもよい。インスリンのアナログの例としては、限定されないが、以下が挙げられる：
(i). 「インスリンアスパルト」は、プロリンであるヒトインスリンにおけるアミノ酸B28(すなわち、ヒトインスリンのB鎖におけるアミノ酸番号２８)がアスパラギン酸で置き換えられるように組み換えDNA技術により生成される；
(ii). 「インスリンリスプロ」は、ヒトインスリンのB鎖のC末端上の最後から２番目のリジン及びプロリン残基が逆になるように(ヒトインスリン：ProB28LysB29；インスリンリスプロ：LysB28ProB29)組み換えDNA技術により生成される；
(iii). 「インスリングルリジン」は、位置B3のアミノ酸アスパラギンがリジンで置き換えられ、かつ位置B29のリジンがグルタミン酸で置き換えられている点でヒトインスリンと異なる；
(iv). 「インスリングラルギン」は、位置A21のアスパラギンがグリシンで置き換えられ、かつB鎖がカルボキシ末端で２つのアルギニンにより伸長されている点でヒトインスリンと異なる。
【００７０】
本明細書で使用される用語「両親媒性」は、疎水性及び親水性の両方の特性を有する分子、物質、活性薬剤成分、構造又はその部分を指す。
【００７１】
本明細書で使用される用語「水性」は、溶媒が水である溶液及び／又は外部相が水である懸濁液及び／又は連続相が水であるエマルションを指す。
【００７２】
本明細書の記載及び特許請求の範囲全体にわたって使用される語「含む（comprise）」及び「含むこと（comprising）」及び「含む（comprises）」のようなその語の変形は、他の添加物、成分、整数又は工程を排除することを意図されない。
【００７３】
本明細書で使用される用語「カチオン性荷電ポリマー」は、7より大きい、8より大きい、9より大きい、10より大きい、11より大きい、12より大きい、13より大きいpKa及び／又は等電点(IEP)を有するポリマー、タンパク質、ペプチド、及び／又はポリアミノ酸を指し、すなわちこのようなポリマー、タンパク質、ペプチド、及び／又はポリアミノ酸の正味電荷は、中性pH(pH 7)において正である。カチオン性荷電ポリマーの例としては、限定されないが、以下が挙げられる：プロタミン；リキシセナチド；50％より多く、55％より多く、60％より多く、65％より多く、70％より多く、75％より多く、80％より多く、85％より多く、90％より多く、91％より多く、92％より多く、93％より多く、94％より多く、95％より多く、96％より多く、97％より多く、98％より多く、99％より多くのモノマー、100％に等しいモノマーがアルギニンであるポリアミノ酸(例えば、ポリアルギニン)；50％より多く、55％より多く、60％より多く、65％より多く、70％より多く、75％より多く、80％より多く、85％より多く、90％より多く、91％より多く、92％より多く、93％より多く、94％より多く、95％より多く、96％より多く、97％より多く、98％より多く、99％より多くのモノマー、100％に等しいモノマーがリジンであるポリアミノ酸(例えば、ポリリジン)；50％より多く、55％より多く、60％より多く、65％より多く、70％より多く、75％より多く、80％より多く、85％より多く、90％より多く、91％より多く、92％より多く、93％より多く、94％より多く、95％より多く、96％より多く、97％より多く、98％より多く、99％より多くのモノマー、100％に等しいモノマーがヒスチジンであるポリアミノ酸(例えば、ポリヒスチジン)。一実施態様において、活性薬剤成分並びに／又はそれらのアナログ及び／若しくは誘導体はまた、上記活性薬剤成分及び／又はアナログ及び／又は誘導体が７より大きいpKa及び／又は等電点を有する場合、すなわち正味電荷が正である場合に、カチオン性荷電ポリマーであり得る。別の実施態様において、少なくとも１つのインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)並びに／又は二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト並びに／又はそのアナログ及び／若しくは誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分は、カチオン性荷電ポリマーである。pKa及び／又はIEPはいずれも当該分野で公知の方法を使用して計算又は測定することができる。
【００７４】
本明細書で使用される用語「負に荷電されたポリマー」は、7より小さい、6より小さい、5より小さい、4より小さい、3より小さい、2より小さいpKa及び／又は等電点(IEP)を有する、ポリマー、多糖、グルコサミノグリカン、親水コロイド、ゴム、タンパク質、ペプチド及び／又はポリアミノ酸を指し、すなわち、このようなポリマー、多糖、グルコサミノグリカン、親水コロイド、ゴム、タンパク質、ペプチド及び／又はポリアミノ酸の正味電荷は、中性ｐH（pH 7)で負である。負に荷電したポリマーの例としては、限定されないが以下が挙げられる：ポリシアル酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ポリグルクロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、硫酸デキストラン、キサンタンゴム、カラギーナン、ペクチン、アラビアゴム、トラガカントゴム、ポリアクリル酸、ポリグルタミン酸、カルボキシメチルセルロース、アルブミン(pI：4.7)、カゼイン(pI：4.6)、タイプBゼラチン(pI：4.7-5.2)、コラーゲン(pI：4.7-5.2)、ポリアスパラギン酸、50％より多く、55％より多く、60％より多く、65％より多く、70％より多く、75％より多く、80％より多く、85％より多く、90％より多く、91％より多く、92％より多く、93％より多く、94％より多く、95％より多く、96％より多く、97％より多く、98％より多く、99％より多くのモノマー、100％に等しいモノマーがグルタミン酸であるポリアミノ酸；50％より多く、55％より多く、60％より多く、65％より多く、70％より多く、75％より多く、80％より多く、85％より多く、90％より多く、91％より多く、92％より多く、93％より多く、94％より多く、95％より多く、96％より多く、97％より多く、98％より多く、99％より多くのモノマー、100％に等しいモノマーがアスパラギン酸であるポリアミノ酸。
【００７５】
一実施態様において、活性薬剤成分並びに／又はそのアナログ及び／若しくは誘導体はまた、上記活性薬剤成分及び／又はアナログ及び／又は誘導体が7より小さい、6より小さい、5より小さい、4より小さい、3より小さい、2より小さいpKa及び／又は等電点(IEP)を有する場合、すなわち正味電荷が負である場合に負に荷電されたポリマーであり得る。別の実施態様において、少なくとも１つのインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)並びに／又は二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト並びに／又はそのアナログ及び／若しくは誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分は、負に荷電したポリマーである。pKa及び／又はIEPは当該分野で公知の方法を使用して計算又は測定され得る。
【００７６】
本明細書で使用される用語「インスリンの誘導体」及び「インスリン誘導体」は、１つ又はそれ以上の有機置換基（例えば、脂肪酸）がアミノ酸の１つ又はそれ以上に結合されている、天然に存在するインスリン、例えばヒトインスリンの構造から形式的に誘導され得る分子構造を有するポリペプチドを指す。場合により、天然に存在するインスリン中に存在する１つ又はそれ以上のアミノ酸は、欠失されていても、かつ／もしくは非コード化可能（non-codeable）アミノ酸を含む他のアミノ酸で置き換えられていてもよく、又は非コード化可能を含むアミノ酸が、天然に存在するインスリンに付加されていてもよい。インスリンの誘導体の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：
(i).  位置B30におけるC末端スレオニンが除去され、かつ脂肪酸残基(ミリスチン酸)が位置B29におけるリジンのエプシロン−アミノ官能基に結合されている点でヒトインスリンと異なる「インスリンデテミル」
(ii).  最後のアミノ酸がB鎖から欠失されている点で、かつLysB29からヘキサデカン二酸へのグルタミル連結の付加によりヒトインスリンとは異なる「インスリンデグルデク」。
【００７７】
本明細書で使用される用語「速効性インスリン」又は「短時間作用性インスリン」は、インスリン媒介効果が５〜１５分以内に開始し、そして３〜４時間活性であり続けるインスリンアナログ及び／又はインスリン誘導体を指す。速効性インスリンの例としては、限定されないが、以下が挙げられる：(i).インスリンアスパルト；(ii).インスリンリスプロ及び(iii).インスリングルリジン。
【００７８】
本明細書で使用される用語「製剤（formulation）」は、特定の成分を所定の量又は比率で含む製品、さらには特定の成分を特定の量で混合することにより直接又は間接的に得られたいずれかの製品を指す。医薬製剤に関して、この用語は、１つ又はそれ以上の活性薬剤成分、及び不活性成分を含む任意の担体を含む製品、さらには成分のいずれか２つもしくはそれ以上の混合、複合体化もしくは凝集から、又は成分の１つもしくはそれ以上の解離から、又は成分の１つもしくはそれ以上の他の種類の反応もしくは相互作用から、直接的又は間接的に得られるいずれかの製品を包含する。一般に、医薬製剤は、活性薬剤成分を液体担体又は微粉化固形担体と又は両方と均一会合させ、次いで必要な場合、製品を所望の製剤に成形することにより製造される。医薬製剤は、疾患の進行又は状態に対して所望の効果を生じるために十分な活性薬剤成分を含む。本明細書で使用される用語「製剤」は、液剤を指していても、懸濁剤又は乳剤を指していてもよい。本明細書で使用される用語「製剤」及び「組成物」は、同義語であることを意図され、すなわち同じ意味を有する。医薬組成物は、必要に応じて、成分の混合、充填及び溶解を含む製剤技術の従来の技術に従って製造されて、所望の経口、非経口、直腸、経皮又は局所の製品が得られる。
【００７９】
本明細書で使用される用語「GLP-1受容体アゴニスト」は、グルカゴン様ペプチド-1受容体においてアゴニスト活性を有する化合物を指す。GLP-1受容体アゴニストの例としては、限定されないが、以下が挙げられる：エキセナチド／エキセンディン-4、リラグルチド、リキシセナチド、デュラグルチド、アルビグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、rExendin-4、CJC-1134-PC、PB-1023、TTP-054、HM-11260C、CM-3、GLP-1 Eligen、ORMD-0901、NN9924 (OG217SC)、Nodexen、Viador-GLP-1、CVX-096、ZYOG-1、ZYD-1、MAR-701、ZP-3022、CAM-2036、DA-15864、ARI-2651、ARI-2255、エキセナチド-XTEN及びグルカゴン-XTEN、AMX-8089+VRS-859並びにポリマー結合GLP-1及びGLP-1アナログ。
【００８０】
本明細書で使用される用語「二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト」は、GLP-1受容体及びグルカコン（glucacon）受容体の両方でアゴニスト活性を有する化合物を指す。二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニストの例としては、限定されないが、以下が挙げられる：オキシントモジュリン、MAR701、MAR-709、及びBHM081／BHM089／BHM098、ZP2929、OAP-189、TT-401/402、MOD-6030、LAPS-HMOXM25(BHM-034)。
【００８１】
本明細書で使用される用語「ヒトインスリン」は、その構造及び特性が周知であるヒトホルモンを指す。ヒトインスリンは、システイン残基間をジスルフィド架橋により接続された２つのポリペプチド鎖(鎖A及びB)、すなわちA鎖及びB鎖を有する。A鎖は21アミノ酸ペプチドであり、そしてB鎖は30アミノ酸ペプチドであり、２つの鎖は３つのジスルフィド架橋により接続されている：A鎖の位置６及び１１におけるシステイン間の１つ；A鎖の位置７におけるシステインとB鎖の位置７におけるシステインとの間の第二のもの；及びA鎖の位置２０におけるシステインとB鎖の位置１９におけるシステインとの間の第三のもの。
【００８２】
本明細書で使用される用語「親水性」は、水に引きつけられ、そして水又は極性溶媒に溶解することができる、分子、物質、活性薬剤成分、構造又はその部分を指す。
【００８３】
本明細書で使用される用語「挙げられる（including）」は、「限定されないが、挙げられる」ことを意味するために使用される。「挙げられる」及び「限定されないが、挙げられる」は交換可能に使用される。
【００８４】
本明細書で使用される用語「親水性親油性バランス」及び／又は略語「HLB」は、界面活性剤を特徴づけ分類するためのパラメーターを指す。親水性−親油性バランス(HLB)は、最初にGriffin (Griffin、W.C. (1949) J. Soc. Cosmet. Chem. 1:311-26)により1948年に「乳化剤の分子中に存在する親水性及び親油性基のサイズ及び強度のバランス」として定義された。HLBについての尺度は任意である。１の値は純粋なオレイン酸のHLB値に割り当てられ、そして２０の値はオレイン酸ナトリウムに割り当てられた。
【００８５】
本発明において定義されるHLBを計算する方法はDavies法(Davies、J. T. (1957)「A quantitative kinetic theory of emulsion type. I. Physical chemistry of the emulsifying agent. Gas/Liquid and Liquid/Liquid Interfaces」. Proceedings of 2ndInternational Congress Surface Activity、Butterworths、London、pp. 426-38)であり、これは研究中の分子の官能基に基づく。各基は、それらの水中の溶解度に関連する値を与えられ（表１)、値がより高いほど水中でより可溶性である。このようにして、HLBは以下のように計算することができる:
HLB ＝ ７ ＋ m・Hh − n・Hl (方程式１)
ここでmは親水性基の数であり、Hhは親水性基の値であり、nは親油性基の数であり、そしてHlはそれらの値である。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
乳化剤の特定のファミリーについては、方程式１は単純化され得る。例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンエステルについては、エチレンオキシドは親水性基である。このような界面活性剤のHLB値は、Griffinによると、オキシエチレン含有量の質量パーセンテージを５で割ったものに等しい。
HLB ＝ Ｅ／５ (方程式２)
乳化剤の混合物については、HLB値は加成性を適用することにより得られる:
HLB ＝ ΣHLBｉ・fｉ (方程式３)
ここでfiは界面活性剤ｉの質量分率である。
【００８８】
乳化剤以外に、油はHLB値を割り当てられ得る。この場合、油のHLBはより安定なエマルションを生じる乳化剤又は乳化剤の混合物のHLBである。これに関して、Robbers & Bhatia (Robbers、J. E. & V. N. Bhatia (1961) J. Pharm. Sci. 50：708-9)は、油のHLBの迅速な決定のための実験的技術を開発した。この方法で、2つのストックエマルション間にHLB値の範囲を網羅する２つの一連のエマルションが製造される。各ストックエマルションの所望の量を15mL画線遠心管中に秤量して、混合エマルションの合計を10gとした。次いで、このチューブを1500rpmで遠心分離した。最も少ない分離を示すエマルション中の乳化剤のHLB値を、油に必要なHLB値と等しいとみなした。
【００８９】
油のHLBが分かれば、これを使用して乳化剤のHLBを決定することができる。この場合、１つは既知のHLBを有し、かつ他方は未知のHLBのためのものである乳化剤の混合物を使用することが必要である。乳化剤の異なる比率を有する様々な混合物を調製した。最も安定なエマルションをもたらす１つは式
HLB油 ＝ ｘ・HLB1＋ (100−ｘ)・HLB2 (方程式４)
ここでHLB油及びHLB2は既知であり、xは実験的に計算され、そして結果的に、HLB1は方程式４から計算することができる。
【００９０】
Chun及びMartin (Chun、A. H. C. & A. N. Martin (1961) J. Pharm.Sci. 50：732-6)は、水溶性表面活性剤のHLB値の評価のための界面張力法を開発した。界面活性剤の１０分の１パーセントの水溶液を、トルエン上に重ねて界面張力を測定した。界面張力値をHLB値に対してプロットした場合、線形の関係の結果となった。
【００９１】
Huebner (Huebner、V. H.、(1962) Anal. Chem. 34：488-91)は、界面活性剤の相対的極性を決定する迅速な方法を開発した。この方法は、界面活性剤がガス−液体クロマトグラフィーカラムにおける液相として使用される場合のメタノール及びｎ−炭化水素の保持時間の比較に基づく。
【００９２】
Gorman及びHall(Gorman、W. G. & G. D. Hall (1963) J. Pharm.Sci. 52：442-6)は、界面活性剤のlog誘電率及びそのHLB値と線形関係を見出した。
【００９３】
Ben-Et及びTatarsky (Ben-Et、G. & D. Tatarsky (1972) J. Am. Oil Chem. 49：499-500)は、高分解能NMRを用いて様々な市販の非イオン性界面活性剤についてHLB値を決定した。
【００９４】
本明細書で使用される用語「キット」は、以下の１つのパッケージ又は１つもしくはそれ以上の個別のパッケージを含む製品(例えば、薬剤、キットオブパーツ（kit-of-parts）)を指す:
(i). 活性薬剤成分及び少なくとも１つのさらなる活性薬剤成分を含有する医薬製剤並びに場合により医療デバイス。少なくとも１つのさらなる活性薬剤成分は、上記医薬製剤中に存在し得、すなわち、キットは１つ又はそれ以上のパッケージを含み得、ここで各パッケージは、２つ又はそれ以上の活性薬剤成分を含む１つの医薬製剤を含む。さらなる活性薬剤成分もまたさらなる医薬製剤中に存在し得、すなわち、キットは２つ又はそれ上の医薬製剤の個別のパッケージを含み得、ここで各医薬製剤は、１つの活性薬剤成分を含有する；又は(ii). 活性薬剤成分を含有する医薬製剤及び医療デバイス。キットは、１つのパッケージのみを含んでいても、１つ又はそれ以上の個別のパッケージを含んでいてもよい。例えば、キットは、それぞれが規定された医薬製剤を含有する２つ又はそれ以上のバイアルを含有する製品（例えば、薬剤）であり得、ここで各医薬製剤は、少なくとも１つの活性薬剤成分を含有する。例えば、キットは、(i.)規定された医薬製剤を含有するバイアル及び(ii).少なくとも１つのさらなる活性薬剤成分を含有するさらなる錠剤、カプセル剤、散剤又は他の経口投薬形態を含み得る。キットは、医薬製剤及び少なくとも１つのさらなる活性薬剤成分を投与する方法についての指示を含む添付文書さらに含み得る。
【００９５】
本明細書で使用される用語「親油性」は、水分子とそれら自体で相互作用することはできず、かつ非極性溶媒中に主に溶解される分子、物質、有効成分、構造又はそれらの部分を指す。
【００９６】
本明細書で使用される用語「長時間作用性インスリン」は、インスリン媒介効果が0.5〜２時間以内に始まり、そして約２４時間又はそれ以上活性であり続けるインスリンアナログ及び／又はインスリン誘導体を指す。速効性インスリンの例としては、限定されないが、以下が挙げられる：(i).インスリングラルギン；(ii).インスリンデテミル及び(iii).インスリンデグルデク。
【００９７】
本明細書で使用される用語「医療デバイス」は、他の状態の疾患を診断、予防、又は処置するために使用され、かつ身体内又は身体上で薬理作用によりその目的を達成することはない、いずれかの機器、装置、インプラント、インビトロ試薬又は同様のもしくは関連する物品を意味する。本明細書で使用される場合、医療デバイスは、注射器、インスリン注射システム、インスリン注入システム、インスリンポンプ又はインスリンペン型注射であり得る。
【００９８】
本明細書で使用される用語「ナノメートルサイズ」、「ナノカプセル」又は「ナノカプセルシステム」は、1μm未満の平均直径を有し、そして従ってナノシステムの定義に適合する構造：1μm未満のサイズを有するポリマーにもとづいて構成されるコロイドシステムを指し、すなわち、これらは1と999nmとの間、一実施態様では30と500nmとの間のサイズを有する。平均直径は、動的光散乱(DLS)技術により測定されたものを意味し、測定されている粒子と同じ速度で拡散する球体の流体力学直径により定義される。ナノカプセル又はナノカプセルシステムのサイズは、製剤の組成及び状態により主に影響を受け、そして当業者に公知の標準的な方法を使用して測定することができ、これらは実施例のセクションにおいて記載される。これに関連して、検証され得るように、それらのサイズは、全ての場合に得られるナノメートルサイズの製剤、システム中のコーティング化合物の比率を変更しても顕著に変化しない。
【００９９】
そうではないと具体的に示されていなければ、本明細書で使用される接続詞「又は」は、「及び／又は」の包括的な意味で使用され、「いずれか一方（either/or）」の排他的な意味ではない。
【０１００】
本明細書で使用される用語「医薬」は、疾患の医療診断、治療、処置及び／又は予防において意図される使用を指す。
【０１０１】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容しうる」は、動物又はヒトにより生理学的に十分耐容性であることを指す。
【０１０２】
本明細書で使用される用語「ポリアルギニン」は、1〜300KDaの範囲の分子量を有し、8と200との間のアルギニンモノマー数を有するペプチド又はポリアミノ酸を指し、ここでアルギニンモノマーの数は、モノマーの総量の少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％に相当する。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「ポリエチレングリコール」は、以下の構造を有するポリエーテル化合物を指す：H-[O-CH2-CH2)n-OH。本明細書で使用される用語「ポリエチレングリコール」、「ポリエチレンオキシド(PEO)」、及び「ポリオキシエチレン(POE)」は同義であると意図され、すなわち、同じ意味を有する。
【０１０４】
本明細書で使用される用語「ポリリジン」は、1〜300KDaの範囲の分子量を有し、8と200との間のリジン数を有するペプチド又はポリアミノ酸を指し、ここでリジンモノマーの数は、モノマーの総量の少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％に相当する。
【０１０５】
本明細書で使用される用語「プロタミン」は、天然のアルギニンが豊富なポリペプチドのファミリーに属する強い塩基性のペプチドの混合物を指す。これは最初はサケ又は他の種の魚の精子から単離されたが、今では主にバイオテクノロジーにより組み換え体から製造される。これはL-アルギニンモノマーを約70％含み、そして4000〜10000Daの分子量を有する。プロタミンは遊離塩基側鎖を有するアミノ酸を含有するので、特定の緩衝化能を有し、従って緩衝化剤であると考えられる。プロタミンは、硫酸プロタミンとして使用されても塩酸プロタミンとして使用されてもよい。プロタミンは、医薬賦形剤として監督機関により承認されており、そして近年は、その主な適用は、インスリンの持続放出のための製剤におけるものであり：NPH (Neutral Protamine Hagedorn)、さらには活性薬剤成分として、ヘパリン中毒に対する解毒剤としての製造承認を保有する。本明細書で使用される用語「プロタミン」は、プロタミンの水溶性塩さらには水溶性プロタミン誘導体を含む。
【０１０６】
本明細書で使用される用語「界面活性剤」は、製剤の親油性部分及び親水性部分と同時に相互作用することを可能にする構造及び／又は官能基を有する成分を指す。界面活性剤の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ポリソルベート80；Tween 80（R）；HLB 15)、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(ポリソルベート20；Tween 20（R）；HLB 16.7)、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート(Tween（R）60、HLB 14.9及びTween 61（R）；HLB 9.6)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 81（R）；HLB 10)、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート(Tween 65（R）；HLB 10.5)、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート(Tween 85（R）；HLB 11)、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween（R）20、HLB 16.7及びTween 21（R）；HLB 13.3)；PEG化脂肪酸エステル及びPEGとの混合物、モノステアリン酸ポリエチレングリコール(HLB 11.6)、ステアリン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリエチレングリコール40(HLB 17)、ジラウリン酸ポリエチレングリコール400(HLB 9.7)、ジラウリン酸ポリエチレングリコール200(HLB 5.9)、モノパルミチン酸ポリエチレングリコール(HLB 11.6)、ステアリン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリエチレングリコール40(HLB 16.9) ステアリン酸ポリエチレングリコール100(HLB 18.8)、Solutol HS15（R）(HLB 15)、ポリエチレングリコール-15-ヒロドキシステアレート(HLB 14-16)、D-アルファ-トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート(TPGS；HLB 13.2)、トリエタノールアンモニウムオレエート(HLB 12)、オレイン酸ナトリウム(HLB 18)、コール酸ナトリウム(HLB 18)、デオキシコール酸ナトリウム(HLB 16)、ラウリル硫酸ナトリウム(HLB 40)、グリココール酸ナトリウム(HLB 16-18)、オレイン酸トリエタノールアミン(HLB 12)、トラガカントゴム(HLB 11.9)及びドデシル硫酸ナトリウム(HLB 40)；ポロクサマー124 (HLB 16)、ポロクサマー188 (HLB 29)、ポロクサマー237 (HLB 29)、ポロクサマー238 (HLB 28)、ポロクサマー278 (HLB 28)、ポロクサマー338 (HLB 27)、及びポロクサマー407 (HLB 22)、ソルビタンモノオレエート(Span（R）80、HLB 4.3)、ソルビタンモノラウレート(Span（R）20、HLB 8.6)、ソルビタンモノステアレート(Span（R）60、HLB 4.7)、ソルビタントリオレエート(Span（R）85、HLB 1.8)、ソルビタンセスキオラート（sorbitan sesquiolate）(Span（R）83、HLB 3.7)、ソルビタンモノパルミテート(Span（R）40、HLB 6.7)、ソルビタンイソステアレート(Span（R）120、HLB 4.7)、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート(Tween（R）40、HLB 15.6)又はそれらのいずれかの組み合わせ。
【０１０７】
本明細書で使用される用語「処置」は、哺乳動物、例えばヒトの状態又は疾患のいずれかの処置を指し、そしてこれらとしては：(1) 疾患若しくは状態を抑制すること、すなわち、その発達を停止させること、(2) 疾患若しくは状態を軽減することを、すなわち状態を退行させること、又は(3) 疾患の症状を止めることをが挙げられる。
【０１０８】
濃度、量、溶解度、粒径、波長、pH値、質量、分子量、パーセント及び他の数値データは、範囲形式で表されても示されてもよい。当然のことながら、このような範囲形式は、単に利便性及び簡潔さのために使用されるものであり、従って、範囲の限界として明確に記載される数値だけでなく、その範囲に包含される個々の数値又は部分的な範囲を全て、各数値及び部分的な範囲が明確に記載されているかのように含むと柔軟に解釈されるべきである。
【０１０９】
本発明のさらなる実施態様は、以下を含む:
一局面において、本発明は：
ａ．  カチオン性荷電ポリマーを含む表面層；及び
ｂ．  場合により、負に荷電したポリマーを含む第二の表面層；及び
ｃ．  少なくとも１つの親油性化合物を含む脂質コア；及び
ｄ．  少なくとも１つの界面活性剤または界面活性剤の混合物；及び
ｅ．  インスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト（ＧＬＰ１Ｒアゴニスト）、二重ＧＬＰ−１受容体／グルカゴン受容体アゴニスト、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分
を含むナノカプセルシステムを提供する。
【０１１０】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、ペプチド、ポリアミノ酸、ポリリジン、ポリアルギニン、リキシセナチド、及びプロタミンからなる群より選択されるカチオン性ポリマーを含む。
【０１１１】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、ポリシアル酸、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、アルギン酸、ポリグルクロン酸、及びキサンタンガムからなる群より選択される負に荷電したポリマーを含む。
【０１１２】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、８より大きい親水性-親油性バランス(HLB)を有することを特徴とする界面活性剤又は界面活性剤の混合物を含む。
【０１１３】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、少なくとも１つの脂肪酸でエステル化されたソルビタン及びそのエトキシレート、脂肪酸エステル、脂肪酸塩、トラガカントゴム、胆汁酸塩及び胆汁酸塩誘導体並びにポロクサマーからなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、界面活性剤又は界面活性剤の混合物を含む。
【０１１４】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンイソステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも脂肪酸でエステル化されたソルビタン又はそのエトキシレートである少なくとも１つの界面活性剤を含む。一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリエチレングリコール40、ジラウリン酸ポリエチレングリコール、モノパルミチン酸ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリエチレングリコール100、ポリエチレングリコール-15-ヒドロキシステアレート、D-アルファ-トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート(TPGS)、オレイン酸トリエタノールアンモニウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、及びドデシル硫酸ナトリウム並びにそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される脂肪酸エステル又は脂肪酸塩である少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【０１１５】
一局面において、本発明に従うナノカプセルシステムは、コール酸ナトリウム(HLB 18)、デオキシコール酸ナトリウム(HLB 16)、グリココール酸ナトリウム(HLB 16-18)、タウロコール酸ナトリウム(HLB 16)、タウロデオキシコール酸ナトリウム(HLB 20.1)からなる群より選択される胆汁酸又は胆汁酸塩である、少なくとも１つの界面活性剤、界面活性剤の混合物又は少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【０１１６】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、ポロクサマー124、ポロクサマー188、ポロクサマー237、ポロクサマー238 (HLB 28)、ポロクサマー278(HLB 28)、ポロクサマー338、ポロクサマー407、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択されるポロクサマーである少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【０１１７】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、コール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール-15-ヒドロキシステアレート、D-アルファ-トコフェリル ポリエチレングリコール スクシネート(TPGS)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポロクサマー、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む。
【０１１８】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、落花生油、綿実油、オリーブ油、ヒマシ油、大豆油、紅花油、ゼラニウム油、ヤシ油、アルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）、オレイン酸、リノール酸、ミリスチン酸イソプロピル、スクアレン、トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリド、リノレオイルマクロゴール−６グリセリド（トウモロコシ油  ＰＥＧ−６エステル）、中鎖トリグリセリド、オレイン酸グリセリル、リノール酸グリセリル、モノオレイン酸グリセロール、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの親油性化合物からなる群より選択される親油性化合物を含む。
【０１１９】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、ヒトインスリンであるインスリンを含む。
【０１２０】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングラルギン及びインスリングルリジン又はそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択されるインスリンアナログを含む。
【０１２１】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、インスリンデテミル及びインスリンデグルデクからなる群より選択されるインスリン誘導体を含む。
【０１２２】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムは、エキセンディン-4、リラグルチド、リキシセナチド、デュラグルチド、アルビグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択されるグルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)を含む。
【０１２３】
一局面において、本発明は、本発明のナノカプセルシステム及び場合により１つ又はそれ以上のさらなる活性薬剤成分及び場合により１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１２４】
一局面において、本発明のナノカプセルシステム及び／又は本発明の医薬組成物は、凍結乾燥されていることを特徴とする。
【０１２５】
一局面において、本発明は、
ａ．  本発明のナノカプセルシステム又は本発明の医薬組成物；及び
ｂ．  少なくとも１つのさらなる活性薬剤成分；及び場合により
ｃ．  医療デバイス
の１つ又はそれ以上の個別のパッケージを含むキットを提供する。
【０１２６】
一局面において、本発明のナノカプセルシステム及び／又は本発明の医薬組成物及び／又は本発明のキットは、
ａ．  真性糖尿病の処置における使用のため；かつ／又は
ｂ．  高血糖症の処置における使用のため；かつ／又は
ｃ．  血中グルコースレベルの低下における使用のため
のものである。
【０１２７】
一局面において、本発明のナノカプセルシステム及び／又は本発明の医薬組成物及び／又は本発明のキットは、皮下、経皮、頬側、経口、肺又は鼻腔投与のためのものである。
【０１２８】
一局面において、本発明は、それを必要とする被験体において、真性糖尿病を処置する方法及び／又は高血糖症を処置する方法及び／又は血中グルコースレベルを低下させる方法を提供し、該方法は、本発明のナノカプセルシステム又は本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【０１２９】
一局面において、本発明は、本発明のナノカプセルシステムを投与するための医療デバイス及び／又は本発明の医薬組成物を提供する。
【０１３０】
一局面において、本発明は、本発明のナノカプセルシステムを製造するための方法を提供し、該方法は、油性化合物を含有する内部親油性相、及びカチオン性荷電ポリマー、場合により負に荷電したポリマーを含有する外部水相、並びに界面活性剤又は界面活性剤の混合物、並びにヒトインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分の乳化を含む。
【０１３１】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムを製造するための方法は、ヒトインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分が、粉末又は水溶液のいずれかとして親油性相中に分散される方法である。
【０１３２】
一局面において、本発明のナノカプセルシステムを製造するための方法は、ヒトインスリン、インスリンアナログ、インスリン誘導体、グルカゴン様ペプチド-1受容体アゴニスト(GLP1Rアゴニスト)、二重GLP-1受容体／グルカゴン受容体アゴニスト、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの活性薬剤成分が、粉末又は水溶液のいずれかとしていずれかの親油性相中に分散される方法である。
【実施例】
【０１３３】
実施例全体にわたって使用される略号の意味を以下に示す。
1. Pr：本明細書において定義されるプロタミン；以下の実施例において使用される塩は硫酸プロタミン(Yuki Gosei Kogyo Co.、Ltd.)であった。別のプロタミン塩(SIGMA)を使用し、いずれの実施例についても有意な差異はなかった。
2. PArg：ポリアルギニン。以下の実施例において使用されるポリアルギニンは、異なる分子量のものであった(１つはPTS、Spainからの26〜37kDaの塩化物塩であり、そして別の塩化物塩は5〜15kDaのSigma-Aldrichからのものであった)。
3. PEG：ポリエチレングリコール。２つの異なるPEG分子量を有するステアリン酸PEGを使用した：2KDaのPEG鎖を有するSimulsol（R）M52及び5KDaのPEG鎖を有するSimulsol（R）M59(Seppic)。
4. ナノエマルション(NE)：この用語は、１ミクロン未満のサイズを有する、油及び１つ又はそれ以上の適切な界面活性剤を含むエマルションに言及するために実施例において使用される。ナノカプセルとの唯一の差異は、システムの表面にプロタミン／ポリアルギニンが存在しないことである。
5. ナノカプセル(NC)：この用語は、脂質コア、１つ又はそれ以上の適切な界面活性剤及びポリマー及び油性コアの周りの１つ又は２つのポリマー層を含むナノシステム（１ミクロン未満のサイズ）に言及するために実施例及び図面において簡潔さのために使用される。
【０１３４】
実施例１：
実施例１は、それらの物理化学的特性、インスリン添加容量（insulin loading capacity）、インスリン安定性及び放出プロフィールに対するプロタミンナノカプセルの組成の影響に関する。インスリンカプセル封入能（Insulin encapsulation capacity）を、グルリジン及びSanofi-Aventis Deutschland GmbHより提供されるZn-ヘキサマーインスリン(ヒトインスリン)を使用して評価した。
【０１３５】
材料及び方法
この研究において使用される硫酸プロタミンをYuki Gosei Kogyo、Ltd. (Japan)から購入した。安定化界面活性剤、ポリエチレングリコール PEG-ステアレート40および100をSeppic(France)又はCRODAから得た。トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリド(Miglyol（R）812)はSasol Germany GmbH (Germany)又はCremer Oleo Divisionにより提供され、そしてオレイン酸をSigma-Aldrich、Spainから購入した。コロミン酸ナトリウム塩(ポリシアル酸)をNACALAI TESQUE、INC、Japanから購入した。インスリングルリジン及びヒトインスリンをSanofiから入手した。コール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウムをSigma-Aldrich又はDEXTRAから購入し、パンクレアチン4 x USP、トレハロース、スクロース及びTriton-X100をSigma-Aldrich(Spain)から購入した。使用した全ての他の製品は高純度又は試薬等級のものであった。
【０１３６】
ブランクプロタミンナノカプセルを、以下のように溶媒置換技術により製造した：12 mg PEG-ステアレート及び10 mgコール酸ナトリウムをエタノール750μlに溶解し、続いて油、Miglyol（R）又はオレイン酸62.5 μL及びアセトン4.25mlを加えた。この有機相を、0.05 ％質量／体積プロタミンを含む水相10mlにすぐに注いだ。有機溶媒の除去を、真空下でのエバポレーションにより行い(Rotavapor Heidolph、Germany)、一定体積5 mlのナノカプセル製剤を得た。
【０１３７】
インスリン添加(インスリングルリジン又はヒトインスリンのいずれか)プロタミンナノカプセルを、ブランクナノカプセルと同じ手順に従って製造し、ここで有機相は有機溶媒（エタノール及びアセトン）中に溶解された全ての脂質成分を混合することにより製造した。少量(0.05ml)の濃縮インスリン溶液(30mg／ml)を、脂質相に加え、その後それを水相に移した。異なるｐH値のインスリン溶液(インスリングルリジン又はヒトインスリンのいずれかを含有)を、0.01M HCl又は0.01M NaOHのいずれかを加えることにより製造した。
【０１３８】
プロタミンナノカプセルを、30000RPMで１時間(15℃で)超遠心分離(OptimaTML-90K、超遠心分離機、Beckman Coulter、USA)により単離し、そして水に再懸濁して最初の体積又はプロタミン濃度にした。
【０１３９】
特定のプロトタイプの場合、及び膵臓酵素との接触の際のそれらの安定性を増加させるために、プロタミンナノカプセルは、ポリシアル酸から構成されるさらなるコーティング層を備えていた。このために、体積0.5mlのプロタミンナノカプセル(濃度16.3mg／ml)を、体積0.1mlのポリシアル酸溶液とともに濃度1mg／mlでインキュベートした。最終ナノカプセル：ポリシアル酸比は、8.15：0.1 体積／体積であった。ナノカプセルの濃度を、製剤中の全ての成分を考慮して測定した。
【０１４０】
プロタミンナノカプセルの平均直径及び多分散指数(PDI)を、動的光散乱によりゼータサイザーNanoシリーズDTS 1060(Malvern instruments)で、超純水で希釈した後に測定した。ゼータ電位を、レーザー-ドップラー流速計により、サンプルをKCl 1mMで希釈した後に測定した(Zetasizer（R）、NanoZS、Malvern Instruments、Malvern、UK)。
【０１４１】
異なる媒体中での３７℃でのインキュベーションの際のプロタミンナノカプセルの安定性を調べた。媒体は：酵素の存在下及び存在しない場合の人工腸液(SIF) pH 6.8、絶食状態、上部小腸(FaSSIF-V2) pH 6.5及び食餌を与えられた状態、上部小腸(FeSSIF-V2) pH 5.8。0、0.5、1、2及び4時間の時点でのサンプルを集めた。パンクレアチン及びFeSSIF-V2を含むSIFサンプルを、5000 x gで５分間遠心分離して媒体中のパンクレアチンの凝集体を除去した。ナノカプセルのサイズ分布、多分散指数(PDI)及び計数率を、動的光分散によりゼータサイザーNanoシリーズDTS 1060(Malvern instruments)でモニタリングした。
【０１４２】
ブランクナノカプセルのコロイド安定性を、ICHガイドラインにより推奨されるように、６ヶ月の期間の間、異なる温度(4℃、25℃及び37℃)及びRH条件で追跡した。３つの異なるバッチのサンプルを所定の時間間隔で抜き取り、粒径及びゼータ電位を決定し、そして継続したバイアビリティーを確実にするために懸濁液の外観を記載した。
【０１４３】
理論的％インスリン添加を、インスリン(インスリングルリジン又はヒトインスリン)の質量及びナノカプセルの製剤化の間に加えられた全ての成分に関して計算した(方程式1)。インスリンのカプセル封入効率(％)を、直接的な方法を使用して決定し、この方法は、ナノカプセルからのインスリンの抽出を含む。インスリン添加されたナノカプセル(0.1 ml)を、アセトニトリル(0.16 ml)、0.1％ TFA (0.64 ml)及びTriton-X100(0.1 ml)の組み合わせを使用して消化した。次いで、製剤を高スピードでボルテックスして透明アリコートを得た。このアリコート中のインスリン濃度を逆相HPLCにより決定した。最後に、プロタミンナノカプセルの添加容量及び収率％を、それぞれ方程式３及び４を使用して計算した：
【数１】
2017517549.tif 000003
【０１４４】
ナノカプセルからのインスリンのインビトロ放出を、人工腸液(SIF、pH 6.8)中でインキュベートし、そして100rpmで37℃にて振盪することにより決定した。特定の時間間隔(0、0.25、0.5、1、3及び6時間)で、上清を遠心分離により集めた。上清中のインスリン濃度を逆相HPLC法により決定し、そしてナノカプセルから放出されたインスリンの総量を算出した。
【０１４５】
ブランク及びインスリングルリジン添加したプロタミンナノカプセル(1％ 質量／体積)を、5％(質量／体積)のトレハロース又はスクロースの存在下／存在しない場合に凍結乾燥した(Labconco Corp、USA)。凍結乾燥製剤を手動再懸濁により超純水に再懸濁し、そしてそれらの生理化学的特徴を評価した。
【０１４６】
結果
200〜250又は50〜500nm範囲の直径を有するプロタミンナノカプセルの単分散懸濁液を製造し、多分散指数(PDI)が0.3未満であった。これらのナノカプセルのゼータ電位は、使用されたステアリン酸ポリエチレングリコール(PEG)(PEG 40対PEG 100)の種類及び量に依存して＋12 mV／＋30 mVであった。このことは、対応する負に荷電したナノエマルションと比較して、脂質コア周囲のプロタミン殻の存在を示す。
【０１４７】
ステアリン酸PEGは、プロタミンナノカプセルの発達に必須であることが示されていた。このポリマーは、生体媒体中のナノ担体（nanocarriers）の安定性を改善し、そして非特異的オプソニン化を回避するというその利点について知られている。PEGコーティングはまた、ナノ担体に滑りやすい表面を生じ拡散を促進することが示された。このような理由で、我々は、プロタミンナノカプセルの物理−化学的特徴、主に安定性及び粘膜拡散（mucodiffusion）に対するステアリン酸PEG分子量（MW)の影響を評価した。ステアリン酸PEG40(Simusol M52)分子量2 kDa及びステアリン酸PEG100(Simusol M59)分子量5 kDaを比較した。
【０１４８】
【表２】
2017517549.tif 000004
【０１４９】
ナノ担体の生物学的安定性とは、生体媒体への曝露の際の安定性を指す。人工腸液の様々な媒体が文献に記載されており、そしてコロイド担体の安定性を評価するために使用さている。この研究において、最も関連する媒体が選択され比較された。プロタミンナノカプセル(PR-PEG40及びPR-PEG100)を、最初に、単純な人工腸液（SIF)中にて膵臓酵素の存在下又は存在しない場合に３７℃、ｐH6.8で少なくとも4時間インキュベートした。ナノカプセルのサイズ及び計数率は、研究期間の間変化しなかった(図1)。このことは、プロタミン名のカプセルが酵素の存在下又は存在しない場合にSIF中で安定であることを示唆した。
【０１５０】
一般に、PEG 40は、特にプロタミンナノカプセルを、膵臓酵素を補充したSIF中でインキュベートされた場合に、PEG 100と比較してシステムに安定性をより与えるように思われる。膵臓酵素を補充したSIF中でナノカプセルをインキュベートした場合に観察されたサイズのわずかな増加は、酵素がナノカプセルの表面に付着したということを示唆する(図1B)。この酵素付着プロセスはまた、酵素の存在下でのナノカプセルゼータ電位の正から負への変化により支持され得るということを示唆し得る。この現象はさらに裏付けられるべきである。
【０１５１】
室温25℃及び37℃で保存されたナノカプセルは、少なくとも7日目まで安定であった。一方で、4℃で保存されたナノカプセルは、それらの物理化学的特性に有意な変化なく6ヶ月間安定であった。
【０１５２】
プロタミンナノカプセルのサイズ、ゼータ電位及び粘膜拡散は、製剤に加えられたPEG−ステアレートの種類に影響を受けたが、インスリン捕捉効率はこのパラメーターにより影響を受けなかった。さらに、PR-PEG100ナノカプセルがブタ粘液中でほとんど完全に固定化されているということを観察した後、我々は、PR-PEG40ナノカプセルでのインスリンのカプセル封入にさらに焦点を絞った。従ってこのことから、我々はPR-PEG40ナノカプセルに関して報告する。
【０１５３】
インスリン溶解媒体のpHは、捕捉効率に大いに影響を及ぼした。最も高いEE％(60％)は、インスリンを0.01M NaOH、pH 11.4に溶解した場合に得られた(表3)。このことは、このpHでインスリンが正味の負電荷を有するという事実に起因し得、そしてプロタミンと相互作用してより高いEE％をもたらし得る。60％ EEでのナノカプセルの添加容量及び収率％は、それぞれ2.1％及び38％であった。
【０１５４】
胆汁酸塩を含有し、そしてポリシアル酸の追加コーティング層も有するナノカプセルを製造した。これらの最適化アプローチは、特により複雑な媒体(FeSSIF v2)中のナノカプセルの安定性を改善すること、及び関連するペプチドの浸透を増強することを意図したものであった。
【０１５５】
表3aの結果は、有機相中のコール酸ナトリウムの存在が、インスリングルリジンの添加に負の影響を及ぼすが、一方でグリココール酸ナトリウ樹の存在は、許容しうるカプセル封入効率を生じたということを示す。
【０１５６】
【表３】
2017517549.tif 000005
【０１５７】
さらに、ナノカプセルの表面上の酵素の付着を避けることにより酵素の存在下でのナノカプセルの安定性を改善するために、インスリングルリジン添加ナノカプセルをポリシアル酸でポストコーティングした。結果として、ナノカプセルの周りのポリシアル酸コーティングの存在は、サイズ及びPDIに影響を及ぼすことなくナノカプセルのゼータ電位の変化をもたらした(表3b)。
【０１５８】
【表４】
2017517549.tif 000006
【０１５９】
ヒトインスリンもまた、オレイン酸油コアを有するプロタミンナノカプセル中にカプセル封入された。カプセル封入ベイル（encapsulation vales）は胆汁酸塩の種類に依存した(表3c)。
【０１６０】
【表５】
2017517549.tif 000007
【０１６１】
インスリングルリジン添加プロタミンナノカプセル及びポリシアル酸被覆プロタミンナノカプセルのインビトロ放出研究を、ナノシステムをSIF中でインキュベートすることにより行った。図２におけるインビトロ放出プロフィールは、０時間でカプセル封入されたインスリンのうち10％しか放出されなかったことを示す。この放出されたインスリン％は、６時間後に６０％まで増加する。インスリンのこの緩やかな放出プロフィールは、プロタミンナノカプセルが、制御された様式でカプセル封入されたインスリンを放出するということを示唆する。インスリングルリジン添加ナノカプセルは、膵臓酵素の存在下又は存在しない場合にSIF中で安定である。
【０１６２】
インスリングルリジン添加プロタミンナノカプセルの安定性を、胆汁酸塩及びレシチンの潜在的作用を調べるために、より複雑な媒体FaSSIF及びFeSSIF中でさらに決定した。さらに、食餌を与えられた状態の人工腸液媒体(FeSSIF-V2)において、特定量のパンクレアチンを、以前の文献の報告[12]に基づいて加えた。FaSSIF及びFeSSIF媒体中でのインキュベーションの際に、プロタミンナノカプセルのサイズ及び計数率の変化を観察した。FaSSIFにおいて(図3)、サイズの小さな増加が大部分の製剤について観察され、増加は胆汁酸塩を含まないプロトタイプについてより高かった。他方で、改変した食餌を与えられた状態(FeSSIF-V2)において、媒体自体が(図4A)、プロタミンナノカプセルと同様のサイズを示した。このことは、媒体からのピークとプロタミンナノカプセルに対応するピークとを区別することを困難にした(図4B及び4C)。このような状況において、ナノカプセルの安定性を測定する代替の方法は、カプセル封入されたインスリンの安定性を調べることであり得る。図5に示されるように、グリココール酸塩を含有するプロトタイプは、むしろ安定な計数率を示した。いずれの胆汁酸塩も含まないプロトタイプは計数率の減少を示し、これは、このプロトタイプがこの媒体中で凝集することを示唆し得る。しかし、ポリシアル酸の追加のコーティング層は、研究の間中計数率が維持されたので、膵臓酵素の存在下でのプロタミンナノカプセルの安定性を促進する(図5B)。
【０１６３】
図6Aに示されるように、胆汁酸塩を含有するプロトタイプ、コール酸ナトリウム(プロトタイプB)及びグリココール酸ナトリウム(プロトタイプC)は、プロトタイプAと比較した場合に、タンパク質分解からインスリンを有意に保護する。明らかに、ナノカプセルへのグリココール酸塩の組み込みは、プロテアーゼ活性を阻害し、そしてインスリン分解の減少に有意に寄与する。さらに、ポリシアル酸外部コーティングの存在もまた、酵素の存在下でグルリジンを保持するナノカプセルの能力を改善する、すなわちタンパク質分解を最少にする(図6B)。グリココール酸ナトリウムを含有するプロトタイプ(Cプラス、表3b)は、その酵素阻害効果に起因して複合培地中でより安定である。
【０１６４】
さらに、さらなるインビトロ放出研究を、インスリン添加プロタミンナノカプセル及びポリシアル酸被覆プロタミンナノカプセルについてより複雑な媒体(FaSSIF v2)を使用して行った。図２に示されるように、結果は、付加されたインスリンが、人口媒体中のナノカプセルから制御された様式で放出されるというものであった(図7)。
【０１６５】
ブランク及びインスリン添加プロタミンナノカプセルの再懸濁した分散は、予め凍結乾燥したシステムと同様の、物理化学的特性、サイズ及びゼータ電位を示した(図8)。
【０１６６】
我々はまた、ナノカプセルの構成要素の量の、それらの物理化学的特性及び添加特性に対する影響を分析するための研究を行った。表４ａに示される結果は、概して、特性ナノカプセルは変化しないままであるが、しかし、多量のグリココール酸ナトリウム及びPEGst-40の組み込みは、グルリジンの結合効率を低下させる(表4a)。
【０１６７】
【表６】
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【０１６８】
我々はまた、ナノカプセルの特性に対する外部水相のｐHの効果を調査した。対照ナノカプセル（すなわち、ペプチドを含有しない）と対照的に、水相のpHがグルリジンのPI付近(pH 4.75〜5.5)である場合、ペプチドのカプセル封入は増加し、そしてこの増加は粒径の増加を伴うということが観察された(表4B)。全体に、外部相のpHが5.5と6.6との間の場合、ナノカプセルは許容しうるサイズ及びEE ％を有する。
【０１６９】
【表７】
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【０１７０】
グルリジンについて許容しうるサイズ及びEE％を有するプロトタイプB(表4A中)を使用して、1％パンクレアチンを補充したSIFにおける安定性を確認した後に、プロタミンナノカプセルに関するさらなる研究を行った。これらのナノカプセルは、サイズ及び計数率が２時間一定なままであったので、SIF／パンクレアチン中で安定であった。４℃での貯蔵の間のこれらのプロトタイプの安定性研究は継続中である。
【０１７１】
プロタミン及びポリシアル酸被覆プロタミンナノカプセルを、それらの機構的挙動をインビトロ及びインビボの両方で調べるために蛍光マーカーで標識した。この目的のために、プロタミンナノカプセルを、5-TAMRA、SE(5-カルボキシタトラメチルローダミン，スクシンイミジルエステル、単一異性体、Mw= 527.5、λ吸収 = 548 nm、λem／励起 = 570／554 nm)で標識した。硫酸プロタミンは5-TAMRAと共有結合で結合された。この結合体を透析により７２時間精製して遊離TAMRAを除去し、そして凍結乾燥した。プロタミンと5-TAMRAとの間の結合を、紫外可視分光法(UV)及びフーリエ変換赤外分光法(FTIR)を使用して確認した。5-TAMRA-プロタミンにおける1052 cm-1のプロタミンアミドピークの消失及び1277cm-1におけるカルボキサミドピークの出現が5-TAMRAとプロタミンとの結合を裏付けた。最後に、プロタミンナノカプセルを、標準的な方法に従って製造した(表5)。
【０１７２】
【表８】
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【０１７３】
グルリジン添加プロタミン及びポリシアル酸被覆プロタミンナノカプセルのインビボ有効性を決定するために、これらの製剤を、血糖正常雄性スプラーグドーリーラットに十二指腸内カニューレを介してインビボ投与した(250g、6時間絶食、n=5-12)。カプセル封入されたか又は液剤の50IU／kgグルリジンの単回用量を、十二指腸内カテーテルに挿入した針を通してゆっくりと注入することにより最大体積300μlで各動物に投与した。血中グルコースレベルを、glucometer(One Touch Ultra、Johnson and Johnson)を使用して、そして比色分析法(SpinReact)を使用して8時間モニタリングした。同じ製剤を投与された異なる群の動物を、異なる日数処置し、このことが図９に示されるグラフにおいて観察された大きな誤差を説明し得る(1〜3つの個々の実験のプールデータ)。これらの結果は、同じ用量の十二指腸内投与されたグルリジン液剤と比較して両方の製剤が数時間の間血中グルコースレベルの有意な減少を誘導したということを示す。
【０１７４】
実施例２
実施例２は、それらの物理化学的特性及びインスリン添加容量に対するポリアルギニンナノカプセルの組成の影響に関する。インスリンカプセル封入容量を、Sanofi-Aventis Deutschland GmbHにより提供されるZn-ヘキサマーインスリン(ヒトインスリン）を使用して評価した。
【０１７５】
材料及び方法
ポリアルギニン(PArg)ナノカプセルを、以前に記載されたように(M.V. Lozano、G. Lollo、M. Alonso-Nocelo、J. Brea、A. Vidal、D. Torres & M.J. Alonso. Polyarginine nanocapsules：a new platform for intracellular drug delivery. Journal of Nanoparticle Research、2013、15(3) 1515)、改変溶媒置換技術により製造した。脂質相は、油(オレイン酸、Sigma-Aldrich又はCroda)及び界面活性剤(ソルビタンオレエート(Span（R）80、Sigma-Aldrich又はCroda)及びデオキシコール酸ナトリウム、(Sigma-Aldrich又はNew Zealand Pharmaceuticals)からなるものであった。水相は、ポロクサマー188(Sigma-Aldrich又はBASF)と組み合わせた、様々な分子量(26〜37kDaの１つの塩化物塩、PTS、Spain及び5〜15kDaの別の塩化物塩、Sigma-Aldrich)のポリアルギニン(PArg)からなるものであった。
【０１７６】
インスリンのカプセル封入のために、ヒトインスリンを少量の0.01N HCl中で有機相中に組み込んだ。次いで、有機相を、コーティングポリマーとしてポリアルギニンを含有する水相にすぐに移して、ナノカプセルの自発的形成をもたらした。有機溶媒をローター蒸発（rotaevaporation）により除去した。調べた可変パラメーターは水相のpHであった。
【０１７７】
ポリアルギニンナノカプセルの平均直径及び多分散指数(PDI)を、超純水で希釈した後、ータサイザーNanoシリーズDTS 1060 (Malvern instruments)で動的光散乱により測定した。ゼータ電位を、KCl 1mMでサンプルを希釈した後、レーザー-ドップラー流速計により測定した(Zetasizer（R）、NanoZS、Malvern Instruments、Malvern、UK)。
【０１７８】
様々な媒体中で３７℃でのインキュベーションの際のインスリン添加ポリアルギニンナノカプセルの安定性を研究した。媒体は： パンクレアチンの存在下及び存在しない場合の人工腸液(SIF) pH 6.8であった。ナノカプセルのサイズ分布、多分散指数(PDI)及び計数率を、ゼータサイザーNanoシリーズDTS 1060(Malvern instruments)での動的光散乱によりモニタリングした。
【０１７９】
ブランクナノカプセルのコロイド安定性を、２ヶ月間の間異なる温度(4℃、20℃及び37℃)で追跡した。サンプルを所定の時間間隔で抜き取り、そして粒径及びゼータ電位を上記のように決定した。
【０１８０】
インスリン結合有効性(％)を、ナノカプセルからのインスリンの抽出を含む直接的な方法を使用して決定した。インスリン添加ナノカプセル(0.1ml)を、アセトニトリル(0.16ml)、0.1％ TFA(0.64ml)及びTriton-X100(0.1ml)の組み合わせを使用して消化した。次いで、製剤を高スピードでボルテックスして透明なアリコートを得た。このアリコート中のインスリンの濃度を、逆相HPLCにより決定した。インスリン捕捉又は結合効率を、方程式１に従って計算した。インスリン最終添加又は添加容量を、方程式２に従って計算した。
【数２】
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【０１８１】
ナノカプセルからのヒトインスリンのインビトロ放出を、人工腸液(SIF、pH 6.8)中37℃でのインキュベーションで決定した。特定の時間間隔で(0、1、3及び6時間)、上清を遠心分離により集めた。上清中のヒトインスリンの濃度を逆相HPLCにより決定し、そしてナノカプセルから放出されたインスリンの総量を計算した。
【０１８２】
ブランク及びヒトインスリン添加PArgナノカプセル(1％質量／体積)を5％(質量／体積)スクロースの存在下で凍結乾燥した(Labconco Corp、USA)。凍結乾燥された製剤を、手動振盪により超純水に再懸濁させ、そしてそれらの物理化学的特徴を評価した。
【０１８３】
いくつかの製剤において、pH 5.5緩衝液を使用してナノカプセルを製剤化した。緩衝液を、酢酸又はクエン酸の水酸化ナトリウムを用いた25℃での滴定により調製した。
【０１８４】
結果
ブランクナノカプセルの特性を表６に示す。ナノカプセルは、小さいサイズ及び正のゼータ電位を示し、これらの特性はPArg分子量に影響を受けなかった。これらのブランクナノ担体（nanocarriers）はパンクレアチンとともに又は伴わずにSIF中のインキュベーションで安定であった。
【０１８５】
【表９】
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【０１８６】
表７は、インスリン添加PArgナノカプセルの特性を示す。これらの結果は、水性媒体のpHがカプセル封入効率に有意に影響を及ぼしたことを示す。有機相中のデオキシコール酸ナトリウムの同時カプセル封入（co-encapsulation）もまた、添加効率に差異をもたらした。これらの結果は、外部水相及び内部油性コアのイオン性相互作用が添加効率に関連し得るということを示唆する。また、最終製剤ｐHでのインスリンの脱プロトン化は、油へのその親和性を増加させ得、これがより良好な薬物カプセル封入をもたらす。
【０１８７】
【表１０】
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【０１８８】
異なる研究において、ナノカプセルの物理化学的特性における外部水相のｐHの影響を調べた。このために、デオキシコール酸塩を含有するPArgナノカプセルを選択した。図10A、B及びCの結果は、それぞれ粒径、Z電位及びEE％に対する最終製剤ｐHの影響を説明する。結論は、インスリンの等電点に近いpH 5.5が、適切なカプセル封入効率をもたらす最適ｐHであるということであった。
【０１８９】
結果は、PArg NCが4℃、20℃及び37℃で少なくとも2ヶ月間安定であることを示し、それらの物理化学的特徴は有意な変化を示さなかった(図11)。これらのナノカプセルは、水中に十分に再懸濁された5％スクロースを用いて、物理化学的特性を維持して凍結乾燥することができた。
【０１９０】
ナノ粒子懸濁媒体のｐHを制御するために、様々な濃度の多数の緩衝液を検討した。酢酸塩緩衝液は、PArgナノカプセルの物理化学的特性及びインスリン添加の維持の点で適切であることがわかった。表８に示されるように、濃度20mMの酢酸塩緩衝液は、ナノカプセル特性の維持に適切であることがわかった。この製剤についてのカプセル封入効率は88±5％であった。
【０１９１】
【表１１】
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【０１９２】
20mM酢酸塩緩衝液を用いて製造したインスリン添加PArg NCは、少なくとも45日間２０℃で安定であることが見出されたが(図12)、4℃では１週の貯蔵後に凝集の傾向があった。図中の計数率は、NCの濃度を示す。
【０１９３】
インスリンの経口投与に使用しようとするPArgナノカプセルのためのさらなる要件は、それらのコロイド安定性であった。図13に示されるように、PArg NCは、人工腸液(SIF、pH 6.8、European Pharmacopeia、2011)、絶食状態人工腸液(FaSSIF-V2、pH 6.5)及び食餌を与えられた状態の人工腸液(FeSSIF-V2、pH 5.8、酵素を含む)中で良好なコロイド安定性を有する。20mM酢酸塩緩衝液を用いて及び用いずに製造されたナノカプセルは、これらの腸媒体中で同じコロイド安定性を示した。
【０１９４】
インビトロ放出研究を、20mM酢酸塩緩衝液FaSSIF-V2媒体を用いて製造されたPArgナノカプセルについて行った。図14における結果は、22％初期インスリン放出、続いて４時間までの５４％までの緩やかな放出を示す。図13において、残存するインスリンの量は、インキュベーション時間の間ナノカプセル中に保たれていたことも示される。放出されたインスリンの％及びナノカプセル中に保持されたインスリンの％を比較することにより、ナノカプセルからFaSSIF-V2へと放出されると、インスリンの部分的な分解／凝集があるということが推測され得る。これに関係なく、結論は、PArgナノカプセルがカプセル封入されたインスリンの持続放出を提供するということである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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