(57)【要約】  選択的IL-6-トランス-シグナル伝達阻害剤が、炎症性疾患及びがんを含む種々のIL-6媒介性状態を処置するために使用され得る。この阻害剤は、種々の用量でヒトに安全に投与され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する2つのgp130-Fcモノマーを含むポリペプチドダイマーであって、前記モノマーは、配列番号1の585〜595位におけるアミノ酸に対応するgp130のD6ドメイン、配列番号1の609〜612位におけるアミノ酸を含むFcドメインのヒンジ領域を含み、前記モノマーは、前記gp130部分と前記Fcドメインとの間にリンカーを含まず、好ましくは、前記モノマーは、1又は複数のジスルフィド架橋によって連結され、
a.前記ポリペプチドダイマーは、ポリペプチド1モル当たり6%以下のガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトース、好ましくは3モル%以下、より好ましくは1モル%以下、なおより好ましくは0.5モル%以下のガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトースを含むか、
b.前記ポリペプチドダイマーは、グリカンを含み、前記グリカンの少なくとも52%、好ましくは少なくとも54%、より好ましくは52〜65%の平均は、1若しくは複数のシアル酸残基を含むか、又は
c.両方である、ポリペプチドダイマー。
【請求項２】
前記モノマーが、配列番号1を有する、請求項1に記載のポリペプチドダイマー。
【請求項３】
前記モノマーが、配列番号2を有する、請求項1に記載のポリペプチドダイマー。
【請求項４】
配列番号1を、細胞、好ましくは哺乳動物細胞中で発現させる工程、培養培地中で前記細胞を培養する工程、並びに前記細胞及び/又は細胞培養培地から前記ポリペプチドダイマーを収集する工程によって取得可能であり、好ましくは、前記ダイマーが、精製及び/又は濃縮される、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチドダイマー。
【請求項５】
請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドダイマーを含む組成物であって、
a.前記ポリペプチドダイマーの5%以下が、オリゴマー性凝集体として存在するか、
b.前記組成物が、4.0質量%以下の、配列番号1のポリペプチドに関して配列番号1のポリペプチドのトランケート型であるポリペプチドを含み、好ましくは3%以下、より好ましくは1.5%以下、最も好ましくは1.0%以下の前記ポリペプチドが、オリゴマーとして存在するか、又は
c.両方である、組成物。
【請求項６】
界面活性剤を更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドダイマーを含む組成物又は請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、好ましくは、前記界面活性剤がポリソルベート界面活性剤であり、より好ましくは、前記界面活性剤がポリソルベート20である、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドダイマーを含む組成物又は請求項5から7のいずれか一項に記載の組成物であって、緩衝剤及び糖を更に含み、好ましくは、前記緩衝剤がヒスチジンであり、好ましくは、前記糖がスクロースである、組成物。
【請求項９】
ヒトにおける炎症性疾患又はIL-6媒介性状態の処置における使用のための、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドダイマー又は請求項5から8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記炎症性疾患又はIL-6媒介性状態が、炎症性腸疾患であり、好ましくは、前記処置が、炎症性腸疾患の寛解を誘導する、請求項9に記載の使用のためのポリペプチドダイマー又は組成物。
【請求項１１】
前記炎症性腸疾患が、クローン病又は潰瘍性大腸炎であり、好ましくは、前記処置が、炎症性腸疾患の寛解を維持する、請求項9に記載の使用のためのポリペプチドダイマー又は組成物。
【請求項１２】
前記炎症性疾患若しくはIL-6媒介性状態が、関節リウマチ、乾癬、ブドウ膜炎若しくはアテローム性動脈硬化症である;又は前記炎症性疾患若しくはIL-6媒介性状態が、炎症性腸疾患と関連しない大腸炎であり、好ましくは、前記大腸炎が、放射線大腸炎、憩室性大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、セリアック病、自己免疫性大腸炎、若しくは結腸に影響を与えるアレルギーに起因する大腸炎である、請求項9に記載の使用のためのポリペプチドダイマー又は組成物。
【請求項１３】
非経口投与、好ましくは、静脈内投与又は皮下投与される、請求項9から12のいずれか一項に規定の使用のためのポリペプチドダイマー又は組成物。
【請求項１４】
配列番号1を含むアミノ酸配列を、細胞、好ましくは哺乳動物細胞中で発現させる工程、培養培地中で前記細胞を培養する工程、並びに前記細胞及び/又は細胞培養培地から前記ポリペプチドダイマーを収集する工程を含み、好ましくは、前記ダイマーが、精製及び/又は濃縮される、請求項1又は2に記載のポリペプチドダイマーを産生するための方法。
【請求項１５】
配列番号1をコードする核酸を含む、ベクター。
【請求項１６】
請求項15に記載のベクターを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
IL-6は、例えば、感染及び組織損傷に応答して、造血細胞及び非造血細胞によって産生される多面的サイトカインである。IL-6は、2つの主要なシグナル伝達経路、肝細胞及び特定の白血球上に主に存在する膜結合型IL-6Rを介した、いわゆる古典的リガンド-受容体経路、並びに膜結合型IL-6Rのタンパク分解性切断を起源とする、又は選択的スプライシングを起源とする循環sIL-6Rを介したトランスシグナル伝達経路を介して、その複数の生物学的活性を発揮する。
【０００２】
古典的経路では、IL-6は、限定された範囲の細胞型の表面上の膜結合型IL-6Rに直接結合する。IL-6/IL-6R複合体は、シグナル伝達性gp130受容体タンパク質の事前に形成されたダイマーと会合して、gp130ホモダイマーにおける立体上の変化を引き起こし、それによって、細胞内シグナル伝達カスケードを開始させる。古典的シグナル伝達は、急性炎症防御機構及び重大な生理学的IL-6機能、例えば、腸上皮細胞に対する成長及び再生シグナルを担う。
【０００３】
IL-6R及びgp130の細胞外ドメインは、選択的スプライシングされたmRNAの翻訳によって膜アンカリングドメインなしに生成されて、sIL-6R及びsgp130バリアントを生じ得る。更に、IL-6Rの細胞外ドメインは、Aディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ(ADAM)ファミリー(ヒトでは、ADAM17)の膜結合型プロテアーゼによって取り除かれて、sIL-6Rを生成し得る。トランスシグナル伝達プロセスでは、sIL-6Rは、IL-6に結合して、膜結合型IL-6Rを発現しない多くの細胞型上に存在する膜貫通gp130ダイマーに結合するアゴニスト複合体を形成し、次いで、シグナル伝達兼転写活性化因子(STAT)によるIL-6シグナル伝達が、IL-6に対して通常は応答しない細胞において誘導される。IL-6/sIL-6R複合体の活性は、膜結合型gp130と効果的に競合する、循環中に存在するsgp130の高レベルによって通常は制御される。トランスシグナル伝達は、慢性炎症に主に関与し、疾患促進性粘膜T細胞集団がアポトーシスに進むのを防止することが示されている。
【０００４】
天然のトランスシグナル伝達阻害剤sgp130を模倣するが、より高い結合親和性及び結果としてより強い阻害活性を有する分子を有することが望ましい。更に、最小の毒性及び免疫原性潜在力を有する、ヒトに投与され得る分子を有することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Al-Gwaiz LA、Babay HH (2007)、「The diagnostic value of absolute neutrophil count, band count and morphologic changes of neutrophils in predicting bacterial infections」、Med Princ Pract 16 (5): 344-7頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
選択的IL-6-トランスシグナル伝達阻害剤が、広い投薬量範囲にわたっていずれの顕著な有害効果も伴わずにヒトに投与され得ることが、ここで見出されている。この阻害剤は、免疫原性潜在力と関連する凝集及びグリコシル化パターンを実質的に含まない。更に、阻害剤は、ヒトにおける好ましい半減期を提供する。
【０００７】
本発明は、配列番号1の2つのモノマーを含むポリペプチドダイマーを提供する。好ましくは、モノマーは、1又は複数のジスルフィド架橋によって連結される。好ましくは、ダイマーは、配列番号1のCys623位及びCys626位におけるジスルフィド架橋によって連結される。本発明は、配列番号2の2つのモノマーを含むポリペプチドダイマーも提供する。好ましくは、モノマーは、1又は複数のジスルフィド架橋によって連結される。好ましくは、ダイマーは、配列番号2のCys623位及びCys626位におけるジスルフィド架橋によって連結される。
【０００８】
好ましくは、ポリペプチドダイマーは、ポリペプチド1モル当たり6%以下のガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトースを含むか、及び/又は1若しくは複数のシアル酸残基を有する、少なくとも52%のグリカンを含む。
【０００９】
本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドダイマーを含む組成物も提供する。好ましくは、組成物中のポリペプチドダイマーの5%以下が、オリゴマー性凝集体として存在するか、及び/又は組成物は、10.0質量%、8.0質量%、6.0質量%又は4.0質量%以下の、ポリペプチドのトランケート型(例えば、配列番号1のポリペプチドに関して配列番号1のトランケートされたバージョン、又は配列番号2のポリペプチドに関して配列番号2のトランケートされたバージョン)であるポリペプチドを含む。更に、かかる組成物中のダイマーは、上の段落に記載される特色及び以下に更に詳細に記載される特色を含み得る。
【００１０】
本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドダイマー又は組成物によって本明細書に記載される状態を処置する方法を更に含む。更に、本発明は、本明細書に記載される状態を処置するための医薬の製造のための、本明細書に記載されるポリペプチドダイマー又は組成物の使用を含む。
【００１１】
更に、本発明は、関連するヌクレオチド配列、発現ベクター、ポリペプチドを発現する細胞を包含する、ポリペプチドダイマーを調製する方法、及びポリペプチドを精製する方法を含む。特に、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチド、特に、配列番号1若しくは配列番号2のポリペプチド又は配列番号1若しくは配列番号2に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、図3又は図7のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%同一であり、より好ましくは、配列番号1又は配列番号2のポリペプチドをコードする。好ましくは、ヌクレオチド配列は、図7のヌクレオチド配列である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】IL-6のトランスシグナル伝達経路を示す図である。選択的スプライシングされたmRNA又はタンパク分解性切断から生成されたsIL-6Rは、IL-6に結合して、身体の細胞型の大半上に存在するgp130に結合するIL-6/sIL-6複合体を形成し、細胞内シグナル伝達カスケードを誘導することができる。
【図２】配列番号1の2つのモノマーを含むポリペプチドダイマーは、膜結合型IL-6RへのIL-6結合(古典的シグナル伝達)を妨害しないが、IL-6/sIL-6R複合体に選択的に結合し、トランスシグナル伝達を防止することを示す図である。
【図３】単一のgp130-Fcサブユニットのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す図である。
【図４】発現ベクターpANTVhG1のマップを示す図である。真核生物細胞におけるヒトIgG又は融合タンパク質発現のためのエレメント及び選択のためのエレメント、並びに関連する制限酵素消化部位が示される(縮尺は正確ではない)。エレメントには以下が含まれる:CMV P、サイトメガロウイルス発現プロモーター;ヒトIgG1配列:VH、CH1、ヒンジ、CH2及びCH3;hIgG1ポリA、ヒトIgGポリアデニル化配列;pAT153;複製起点及びアンピシリンに対する細菌耐性のためのAmp遺伝子を含有するpBR322に由来する発現ベクター配列;SV40プロモーター配列;DHFR、ジヒドロ葉酸レダクターゼコード配列;MluI、HindIII、EagI及びSspI制限酵素消化配列;並びにマウスコンセンサスシグナル配列。原核生物の増殖及び選択のためのエレメントの詳細は示していない。
【図５】発現ベクターpFER02のマップを示す図である。真核生物細胞におけるペプチド1発現のためのエレメント及び選択のためのエレメント、並びに関連する制限酵素消化部位が示される(縮尺は正確ではない)。エレメントには以下が含まれる:CMV P、サイトメガロウイルス発現プロモーター;配列番号2、コード配列;hIgG1ポリA、ヒトIgGポリアデニル化配列;pAT153;複製起点及びアンピシリンに対する細菌耐性のためのAmp遺伝子を含有するpBR322に由来する発現ベクター配列;SV40プロモーター配列;DHFR、ジヒドロ葉酸レダクターゼコード配列;MluI、EagI及びSspI制限酵素消化配列;並びにマウスコンセンサスシグナル配列。
【図６Ａ】発現プラスミドpFER02のヌクレオチド配列エレメントを示す図である。
【図６Ｂ】図６Ａの続きである。
【図７】単一のgp130-Fcサブユニットのアミノ酸配列及びCHO細胞における最適なコドン用法に向けて最適化されたヌクレオチド配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一態様は、2つのgp130-Fc融合モノマー(例えば、配列番号1の2つのモノマー)のダイマーを提供する。その活性形態では、配列番号1のポリペプチドは、Cys623及びCys626における2つのジスルフィド連結によって連結されたダイマーとして存在する(図2)。配列番号2は、内因性シグナルペプチドを有するgp130-Fc融合モノマーのアミノ酸配列に対応する。シグナルペプチドは、タンパク質合成の間に除去され、配列番号1のポリペプチドの産生を生じる。
【００１４】
本明細書に記載されるポリペプチドダイマーは、過剰なトランスシグナル伝達を選択的に阻害し(図1)、複数の炎症性疾患に関与する有害なT細胞のアポトーシスを誘導する。ポリペプチドダイマーは、IL-6/sIL-6R複合体を標的化及び中和し、したがって、所望の治療濃度でIL-6トランスシグナル伝達のみを阻害して、古典的シグナル伝達及びその多くの生理学的機能、並びにその急性炎症防御機構をインタクトなままにすると予測される(図2)。ポリペプチドダイマーは、立体障害に起因して古典的IL-6シグナル伝達を妨害することができないと考えられ、Fc部分は、細胞膜中に挿入することができず、gp130部分を、膜結合型IL-6/sIL-6R複合体への結合に利用できないものにする。したがって、ポリペプチドは、全般的IL-6遮断(例えば、トシリズマブ、シルクマブ(sirukumab))と類似した効力を有するが、より少ない副作用を有すると予測される。
【００１５】
本明細書に記載されるポリペプチドダイマーは、好ましくは、配列番号1に対応する配列を有するgp130-Fcモノマーを含む。ある特定の実施形態では、モノマーは、配列番号2に対応する配列を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドダイマーは、配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも90%、95%、97%、98%、99%又は99.5%の配列同一性を有するポリペプチドを含む。好ましくは、ポリペプチドは、gp130のD6ドメイン(特に、アミノ酸TFTTPKFAQGE:配列番号1のアミノ酸585〜595位)、Fcドメインヒンジ領域中のAEGA(配列番号1のアミノ酸609〜612位)を含み、gp130部分とFcドメインとの間にリンカーを含まない。好ましい一実施形態では、本開示は、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する2つのモノマーを含むポリペプチドダイマーを提供し、アミノ酸配列は、gp130のD6ドメイン、Fcドメインヒンジ領域中のAEGAを含み、gp130部分とFcドメインとの間にはリンカーが存在しない。好ましい一実施形態では、本開示は、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する2つのモノマーを含むポリペプチドダイマーであって、アミノ酸配列は、gp130のD6ドメイン、Fcドメインのヒンジ領域中のAEGAを含み、gp130部分とFcドメインとの間にはリンカーが存在せず、好ましくは、モノマーは、1又は複数のジスルフィド架橋によって連結され、より好ましくは、
a.ポリペプチドダイマーは、ポリペプチド1モル当たり6%以下のガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトース、好ましくは3モル%以下、より好ましくは1モル%以下、なおより好ましくは0.5モル%以下のガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトースを含むか、
b.ポリペプチドダイマーは、グリカンを含み、グリカンの少なくとも52%、好ましくは少なくとも54%、より好ましくは52〜65%の平均は、1若しくは複数のシアル酸残基を含むか、又は
c.両方である、ポリペプチドダイマーを提供する。
【００１６】
ポリペプチドは、ガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトース部分を実質的に含まないことが望ましいが、それは、これらの部分が、免疫原性応答と関連するからである。驚くべきことに、本発明のダイマーは、低レベルのかかる部分を有することが見出された。好ましい実施形態では、ポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるポリペプチドモノマー及び/又はダイマー)は、1モルのポリペプチド当たり6%以下のガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトースを含有する。好ましくは、ポリペプチドは、4モル%、3モル%、2モル%、1モル%、0.5モル%、0.2モル%、0.1モル%以下、又は更には検出不能なレベルのガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトース(例えば、WAX-HPLC、NP-HPLC又はWAXによって測定される、好ましくは、WAX-HPLCによって決定される)を含有する。他の実施形態では、ポリペプチドは、質量で、又はモル濃度基準で、グリカンの総量と比較して、6%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%又は更には0.1%未満のガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトースを含有する。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドの半減期を増加させるために、シアル酸付加されることも望ましい。ポリペプチドの各鎖は、10個の推定N-グリコシル化部位を含有し、9つのN-グリコシル化部位は、gp130部分中に位置し、1つのN-グリコシル化部位は、Fc部分中に位置する。したがって、ポリペプチドは、合計20個のグリコシル化部位を含有する。ある特定の実施形態では、ポリペプチド上のグリカンの少なくとも52%又は少なくとも54%の平均、例えば52〜56%の平均が、シアル酸残基を含む(例えば、WAX-HPLC、NP-HPLC又はWAXによって測定される、好ましくは、WAX-HPLCによって決定される)。好ましくは、本発明のポリペプチドは、220kDaのおよその分子量を有し、各93kDAは、10個のN-グリコシル化鎖に由来する更なる約20kDaの分子量を有する。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される複数のポリペプチド(例えば、本明細書に記載される複数のポリペプチドモノマー及び/又はポリペプチドダイマー)を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、組成物中のグリカン基に関して、少なくとも25%(例えば、少なくとも26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%又は40%)の平均のモノ-シアル酸付加されたポリペプチド;少なくとも10%(例えば、少なくとも11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%又は25%)の平均のジ-シアル酸付加されたポリペプチド;少なくとも1%(例えば、少なくとも1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%又は6%)の平均のトリ-シアル酸付加されたポリペプチド;及び/又は少なくとも0.1%(例えば、少なくとも0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%又は1%)の平均のテトラ-シアル酸付加されたグリカンを含む。
【００１９】
オリゴマー性凝集体を生じる、本明細書でオリゴマー化とも呼ばれる、ポリペプチドが凝集する程度を最小化することが、更に望ましい。「オリゴマー性凝集体」とは、本明細書で使用する場合、活性ダイマー化ペプチドは指さない。その代わり、この用語は、少なくとも3つのモノマー(例えば、配列番号1の)凝集体、又はより典型的には、活性ダイマーの少なくとも1つのダイマーを指す。驚くべきことに、本発明のペプチドダイマーは、低レベルの凝集を示すことが見出された。ある特定の実施形態では、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1.5%未満、又は更には1.0%未満のポリペプチドが、オリゴマーとして存在する。オリゴマー含量は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー-多角度光散乱(SEC-MALS)又はSEC-UVによって測定され得る。
【００２０】
好ましくは、ポリペプチドは、その全長形態で存在する(例えば、例えば配列番号1の、2つの全長モノマーを含む)。しかし、細胞培養物は、本明細書で単一gp130形態(SGF)と呼ばれるトランケート型バリアントを産生し得る。SGFは、共有結合した2つの鎖分子であり、一方の鎖は、全長gp130-Fcモノマー(例えば、配列番号1の)を含み、第2の鎖は、トランケート型gp130-Fcモノマー(例えば、配列番号1のトランケーション)を含み、第2の鎖は、Fcドメインを含み、gp130ドメインのほとんど又は全てを欠く(例えば、Fc領域に対してリンカー配列の前で終結する)。今日までの研究は、SGFが不均一なアミノ末端を有しないことを実証している。SGFは、バイオリアクター中で一貫したレベルで形成され得、一旦形成されると、SGFレベルは、精製、加工又は加速貯蔵条件中に容易には変化しない。SGFレベルは、ポリペプチドダイマーの全長形態と類似した物理的-化学的特性に起因して、精製の間に除去することが困難であり、したがって、SGFを除去するための試みは、収量における顕著な減少を生じ得る。驚くべきことに、本発明のダイマーは、ほぼ常に全長であることが見出された。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、4.0質量%、3.0質量%、2.0質量%又は更には1.5質量%以下の、配列番号1のポリペプチドに関して配列番号1のポリペプチドのトランケート型バリエーションであるポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、4.0質量%、3.0質量%、2.0質量%又は更には1.5質量%以下の、配列番号2のポリペプチドに関して配列番号2のポリペプチドのトランケート型バリエーションであるポリペプチドを含む。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、典型的には、非経口投与、例えば、静脈内投与又は皮下投与される。
【００２２】
適切な配合物には、界面活性剤、特に、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート界面活性剤(例えば、ポリソルベート20)を含む配合物が含まれる。配合は、緩衝剤及び糖も含み得る。例示的な緩衝剤は、ヒスチジンである。例示的な糖は、スクロースである。従って、適切な配合は、ポリソルベート20(例えば、0.01〜1mg/mL、0.02〜0.5mg/mL、0.05〜0.2mg/mL)、ヒスチジン(例えば、0.5mM〜250mM、1〜100mM、5〜50mM、10〜20mM)及びスクロース(例えば、10〜1000mM、20〜500mM、100〜300mM、150〜250mM)を含み得る。
【００２３】
適応症
急性炎症では、IL-6は、肝臓において急性期応答を誘導し、急性期タンパク質、特にCRPのカスケードの放出をもたらすことが示されている。炎症の部位におけるアポトーシス好中球によって取り除かれるsIL-6Rと複合体を形成すること、及び得られたIL-6/sIL-6Rトランスシグナル伝達複合体の、内皮細胞上のシグナル伝達因子gp130への結合によって、IL-6は、単球走化性タンパク質(MCP)-1等のケモカインの発現を誘導し、単核細胞を攻撃する。これは、急性炎症の消散、及び適応免疫応答の開始をもたらす。したがって、急性炎症において、IL-6とsIL-6Rとの複合体は、炎症の初期の優勢に好中球性の段階と、炎症の消散も最終的にもたらす、より持続性の単核細胞流入との間での移行を支持する。
【００２４】
例えば、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、関節リウマチ(RA)又は乾癬における慢性炎症は、急性炎症期の消散を獲得した後に組織中で存続する、マクロファージ及びリンパ球等の単核細胞の存在と、組織学的に関連する。慢性炎症性疾患のモデルでは、IL-6は、継続的MCP-1分泌、血管増殖(angio-proliferation)、及びT細胞に対する抗アポトーシス機能の誘導を介して、傷害の部位における単核細胞蓄積に好都合な、有害な役割を有すると思われる。
【００２５】
炎症性腸疾患(IBD)、即ちCD又はUCは、特定の病原体と無関係であると考えられる感受性個体の腸において生じる慢性炎症である。増加した腸透過性を伴う上皮粘膜障壁における変更は、管腔抗原に対する粘膜免疫系の増強された曝露をもたらし、患者における腸免疫系の不適切な活性化を引き起こす。炎症性サイトカインの継続的な過剰な放出を伴う粘膜CD4+Tリンパ球の制御不能な活性化は、病原性胃腸炎症及び組織損傷を誘導する。IBDの病理発生に関与する主要な活性化された免疫細胞は、腸T細胞及びマクロファージであるというコンセンサスがある。
【００２６】
IL-6は、ヒトにおいて、IBDにおける中心的サイトカインであることが示されている。CD及びUCを有する患者は、対照と比較した場合、増加したレベルのIL-6を産生することが見出されており、IL-6レベルは、臨床的活性と相関する。CD患者は、血清中に、増加したレベルのsIL-6R、及び結果として、IL-6/sIL-6R複合体を有することも見出されている。CD及びUCを有する患者由来の外科的結腸検体から得られた粘膜固有層単核細胞は、CD4+T細胞及びマクロファージの両方が、対照と比較して増加した量のIL-6を産生したことを示した。sIL-6Rは、上昇したレベルのIL-6と関連する増加した産生を伴って、マクロファージ及び単核細胞の表面からの取り除きを介して放出されることが見出された。CDを有する患者では、粘膜T細胞は、STAT3、bcl-2及びbcl-xlの活性化を伴う、IL-6トランスシグナル伝達の強い証拠を示した。IL-6トランスシグナル伝達の遮断は、T細胞アポトーシスを引き起こし、これは、IL-6/sIL-6R系が、CDにおいて、アポトーシスに対するT細胞の耐性を媒介することを示している。
【００２７】
したがって、IBD患者では、炎症の永続化をもたらす、粘膜固有層における疾患促進性CD4+T細胞の獲得された蓄積は、抗アポトーシス性IL-6/sIL-6Rトランスシグナル伝達に決定的に依存する。IL-6/sIL-6R複合体に対して作用することによって、本明細書に開示されるポリペプチドは、CD及び他の炎症性疾患を処置する際に有用であると考えられる。
【００２８】
したがって、本発明のポリペプチドは、IL-6媒介性状態を処置できる。IL-6媒介性状態には、炎症性疾患又はがんが含まれる。これに関して、本明細書に記載されるポリペプチド及び組成物は、炎症性疾患、例えば、若年性特発性関節炎、クローン病、大腸炎(例えば、放射線大腸炎、憩室性大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、セリアック病、自己免疫性大腸炎、又は結腸に影響を与えるアレルギーに起因する大腸炎を含む、IBDと関連しない大腸炎)、皮膚炎、乾癬、ブドウ膜炎、憩室炎、肝炎、過敏性腸症候群(IBS)、エリテマトーデス、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病、関節炎、関節リウマチ、喘息、並びに種々の心血管疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症及び血管炎を有する対象に投与され得る。ある特定の実施形態では、炎症性疾患は、糖尿病、痛風、クリオピリン関連周期熱症候群及び慢性閉塞性肺障害からなる群から選択される。
【００２９】
好ましくは、炎症性疾患又はIL-6媒介性状態は、炎症性腸疾患であり、好ましくは、処置は、炎症性腸疾患の寛解を誘導する。好ましくは、炎症性腸疾患は、クローン病又は潰瘍性大腸炎であり、好ましくは、処置は、炎症性腸疾患の寛解を維持する。好ましくは、炎症性疾患又はIL-6媒介性状態は、関節リウマチ、乾癬、ブドウ膜炎又はアテローム性動脈硬化症である。好ましくは、炎症性疾患又はIL-6媒介性状態は、炎症性腸疾患と関連しない大腸炎であり、好ましくは、大腸炎は、放射線大腸炎、憩室性大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、セリアック病、自己免疫性大腸炎、又は結腸に影響を与えるアレルギーに起因する大腸炎である。好ましくは、この炎症性疾患又はIL-6媒介性状態は、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ及び乾癬から、より好ましくは、クローン病及び潰瘍性大腸炎から選択される。
【００３０】
炎症性腸疾患等の炎症性疾患について、処置は、状態の寛解、状態の寛解の維持、又は両方を含み得る。
【００３１】
他の実施形態は、多発性骨髄腫、形質細胞白血病、腎細胞癌、カポジ肉腫、結腸直腸がん、胃(gastric)がん、黒色腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫、多形神経膠芽腫、肺がん(非小細胞肺がん(NSCLC;腺癌及び扁平上皮癌の両方)が含まれるがこれらに限定されない)、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、肉腫、胸腺腫、乳房がん、前立腺がん、肝細胞癌、膀胱がん、子宮がん、膵がん、食道がん、脳がん、頭頚部がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃(stomach)がん、食道がん、肝癌、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、T-ALL、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)及び慢性リンパ性白血病(CLL)、唾液腺癌(salivary carcinoma)又は他のがんを含むがこれらに限定されないがんを処置する方法、がんの重症度を低減させる方法、又はがんを予防する方法を提供する。
【００３２】
本開示の更なる実施形態は、敗血症、骨吸収(骨粗鬆症)、悪液質、がん関連疲労、乾癬、全身型若年性特発性関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、高ガンマグロブリン血症、キャッスルマン病、IgM免疫グロブリン血症、心臓粘液腫及び自己免疫性インスリン依存型糖尿病からなる群から選択される疾患を処置する方法、疾患の重症度を低減させる方法、又は疾患を予防する方法を提供する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「処置」、「処置する」及び「処置すること」とは、本明細書に記載される疾患若しくは障害、又はその1若しくは複数の症状を回復させること、それを軽減すること、その発病を遅延させること、又はその進行を阻害することを指す。一部の実施形態では、処置は、1又は複数の症状が発症した後に投与され得る。他の実施形態では、処置は、症状の非存在下で投与され得る。例えば、処置は、症状の発病の前に、感受性個体に投与され得る(例えば、症状の病歴の観点から及び/又は遺伝因子若しくは他の感受性因子の観点から)。処置は、例えば、それらの再発を予防する又は遅延させるために、症状が消散した後にも継続され得る。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、第2の活性剤と併せて投与され得る。第2の活性剤は、5-アミノサリチル酸、アザチオプリン、5-メルカプトプリン及びコルチコステロイドのうちの1又は複数であり得る。5-アミノサリチル酸、アザチオプリン、5-メルカプトプリン及びコルチコステロイドの投与のための投薬レジームは、当業者に周知である。
【００３５】
産生方法
本発明の更なる一態様は、配列番号1又は配列番号2をコードする核酸分子を含むベクター、並びに前記ベクターを含む細胞を提供する。配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列をコードするDNAは、シグナルペプチドが抗体鎖のアミノ酸配列のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングされ得る。このシグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド(即ち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であり得る。
【００３６】
調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル等の因子に依存し得る。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスLTR、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、CMVプロモーター/エンハンサー)、サルウイルス40(SV40)(例えば、SV40プロモーター/エンハンサー)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))、ポリオーマに由来するプロモーター及び/又はエンハンサー、並びに強い哺乳動物プロモーター、例えば、ネイティブの免疫グロブリンプロモーター及びアクチンプロモーターが含まれる。この宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、細菌又は酵母細胞であり得、好ましくは、この細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等の哺乳動物細胞である。例示的なCHO細胞は、European Collection of Cell Culturesから得られる(CHO)/dhfr-細胞(ECACC、番号9406067)である。
【００３７】
好ましくは、宿主細胞はCHO細胞であり、ポリペプチドをコードする核酸は、CHO細胞における使用のために最適化されたコドンである。好ましくは、ポリペプチドをコードする核酸は、図3又は図7に示される配列である。
【００３８】
本開示は、本発明のポリペプチドを産生するための方法を更に提供する。一実施形態では、ジスルフィド架橋によって連結された配列番号1の2つのモノマーを含むダイマーを産生するための方法が提供され、前記方法は、配列番号1を細胞中で発現させる工程及び前記ポリペプチドを精製する工程を含む。好ましくは、ジスルフィド架橋によって連結された配列番号2の2つのモノマーを含むダイマーを産生するための方法が提供され、前記方法は、配列番号2を細胞中で発現させる工程及びこのポリペプチドを精製する工程を含む。核酸ベクターを導入するための方法は、当業者に公知であり、これには、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション等が含まれる。トランスフェクトされた細胞は、所望のタンパク質を細胞に発現させるために培養される。次いで、細胞及び培養培地が収集され、ポリペプチドダイマーが、例えば、クロマトグラフィーカラム工程(例えば、MAbSelect Sure、SP Sepharose、Capto Q)によって精製される。このダイマーはまた、濃縮され得、及び/又はウイルス低減/不活性化工程で処理され得る。
【００３９】
本発明の更なる一態様は、本明細書に開示される方法によって産生されたポリペプチドダイマーを含む。好ましくは、ダイマーは、本明細書に記載される特徴(例えば、1モルのポリペプチド当たりのガラクトース-アルファ-1,3-ガラクトースの%、シアル化)を有する。本方法によって産生されたダイマーを使用して、適切な組成物を調製することができる。前記組成物は、好ましくは、本明細書に記載される特徴(例えば、低い凝集、トランケーション)を有する。
【実施例】
【００４０】
(実施例1)
ペプチド1(その活性ダイマー化形態での配列番号1のポリペプチド)の調製及び特徴付け
CHO/dhfr-細胞におけるペプチド1のクローニング及び発現
CHO/dhfr-細胞は、European collection of cell cultures(ECACC、番号9406067)から得た。接着性CHO/dhfr-細胞は、葉酸のジヒドロ葉酸への還元、次いで、テトラヒドロ葉酸への還元を触媒する酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)が欠損している。したがって、CHO/dhfr-細胞は、葉酸代謝拮抗薬物、メトトレキサート(MTX)に対する感受性を示す。
【００４１】
このCHO/dhfr-細胞株は、十分に特徴付けられ試験される。ヒト使用のためのバイオ医薬品の産生のための細胞基質としてのCHO/dhfr-親細胞株の安全性は、21 CFRに従って微生物無菌性、マイコプラズマ及び外来性ウイルスについてECACC(Porton Down、UK)が確認した。
【００４２】
cDNA配列の選択及び構築
ペプチド1(配列番号1のポリペプチド配列)のcDNA配列は、gp130の細胞外ドメイン(IL6ST、NCBI遺伝子ID 3572、転写物バリアント1(NP_002175)、アミノ酸23〜617)及びヒトIgG1のFcドメイン(IGHG1、NCBI遺伝子ID 3500、Kabat EU番号付けに従ってアミノ酸221〜447)の配列を使用して、GeneArt AG社(Regensburg、Germany)が、単一のDNA断片として合成した。配列を、CHO細胞における最適なコドン使用に向けて最適化した。3つの十分に特徴付けられた点変異を、Fc部分の下部ヒンジ領域中に導入した。
【００４３】
元のgp130シグナルペプチドを、CHO細胞発現系における既知の効力のマウスIgG重鎖シグナルペプチドで置き換えることによって、cDNA配列を更に改変した。このシグナルペプチドは、タンパク質合成の間に切断される。Fc領域中のIgG1 Cys-Pro-Pro-Cys配列の存在は、Fc領域上のスルフヒドリル残基を介した、一緒になってペプチド1を形成する2つの同一のgp130-Fcサブユニットのダイマー化を生じる。
【００４４】
図3は、ペプチド1の形成に使用したgp130-Fcサブユニットのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【００４５】
マスター細胞バンク(MCB)の選択のための発現プラスミドの構築
ペプチド1cDNAを、以下のように、MTXを用いたトランスフェクタント選択のために、dhfr遺伝子を含むpANTVhG1発現ベクター(Antitope社)中にクローニングした(図4)。第1に、発現ベクターをMluI及びEagI制限酵素で消化して、ペプチド1のcDNAの挿入を可能にした。第2に、ペプチド1コード領域を、OL1425及びOL1426プライマー(Table 1(表1))を使用してPCR増幅し、MluI及びEagI制限酵素を用いて消化した。第3に、消化された断片をゲル精製し、一緒にライゲーションして、pFER02発現ベクターを生成した(図5)。ペプチド1cDNAを、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下に挿入した。
【００４６】
Table 2(表2)は、pFER02発現エレメントの機能を示す。図6は、pFER02発現エレメントのヌクレオチド配列を示す。
【００４７】
【表１】
2017536848.tif 000002
【００４８】
【表２】
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【００４９】
最終的なペプチド1産生性クローンをもたらす細胞株選択プロセス
pFER02ベクターを、ベータ-ラクタマーゼ遺伝子中に位置する単一の認識部位を有する平滑末端制限酵素SspIを用いて直鎖化した。直鎖化したプラスミドを、脂質媒介性トランスフェクションを使用して、5×106のCHO/dhfr-細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション後の24時間に、トランスフェクトされた細胞を、5%透析済胎仔ウシ血清(FCS)及び100nMメトトレキサート(MTX)を補充した培地中で選択した。トランスフェクトされた細胞を、種々の密度でこの培地中に希釈し、96ウェル平底組織培養プレート中に分配した。次いで、細胞を、5% CO2及び37℃で加湿雰囲気中でインキュベートした。新鮮なMTX選択培地を、インキュベーション時間の間一定の間隔で添加して、MTXレベル及び栄養素レベルが一定のままであることを確実にした。
【００５０】
MTX選択を用いた初期細胞株選択
トランスフェクション後数週間にわたって、組織培養プレートを、Genetix CloneSelect(登録商標)Imagerを使用して試験し、>2,000のウェルが、活発に成長しているコロニーを有することが観察された。これらのウェルからの上清をサンプリングし、ELISAによってペプチド1の力価についてアッセイした。このアッセイの結果に基づいて、合計105の最良の発現ウェルを、48ウェルプレート中に拡大増殖させた。合計83の細胞株を、6ウェルプレート又はT-25フラスコ中への拡大増殖のために選択し、これらの細胞株の各々からの上清をサンプリングし、ペプチド1の力価についてアッセイした(ELISA)。これらの結果に基づいて、54の、最適な成長特徴を有する最良の発現細胞株を、T-75又はT-175フラスコ中への拡大増殖のために選択し、コンフルエントなフラスコからの上清をサンプリングし、ペプチド1の力価を定量した(ELISA)。細胞株間の発現レベルの比較により、生産性分析のために選択された38の最良の細胞株の同定が可能になった。生産性を以下のように評価した。
生産性(pg/細胞/日)=((Th-Ti)/((Vh+Vi)/2))/時間
式中、
Thは、回収力価[μg/mL]であり、
Tiは、初期力価[μg/mL]であり、
Vhは、回収時の生存細胞数[×106細胞/mL]であり、
Viは、初期生存細胞数[×106細胞/mL]であり、
時間は、TiとThとの間の経過時間(日)である。
【００５１】
生産性結果(pg/細胞/日)に基づいて、13の細胞株を、遺伝子増幅のために選択した。
【００５２】
ペプチド1細胞株選択のためのMTX駆動性遺伝子増幅
13の選択された細胞株を、漸増濃度のMTX(0.1〜50M)の下での選択圧による第1ラウンドの遺伝子増幅のために選択した。7〜10日後、13の細胞株の各々由来の各ウェルからの上清をサンプリングし、ペプチド1の力価についてアッセイした(ELISA)。高いペプチド1発現レベルを有する各細胞株由来のウェルを、生産性(pg/細胞/日)について評価した。第2ラウンドの遺伝子増幅を、生産性における顕著な増加を示した細胞株由来の合計16のウェルで開始した。
【００５３】
第2ラウンドの遺伝子増幅を、増加したMTX濃度の存在下で実施し、各培養物からの上清をペプチド1の力価についてアッセイした(ELISA)。各細胞株由来の選択されたウェルを拡大増殖させ、生産性を評価した(pg/細胞/日)。増加したMTX選択圧に応答して増加した生産性を有する5つの細胞株を同定した。これら5つの細胞株を、増加したMTX濃度の下での選択圧を使用する第3ラウンドの遺伝子増幅に進めさせ、各ウェルからの上清をペプチド1の力価についてアッセイした(ELISA)。各細胞株について選択されたウェルを拡大増殖させ、生産性(pg/細胞/日)を評価し、高いペプチド1発現を実証している5つの細胞株を選択した。
【００５４】
クローンの限界希釈
限界希釈クローニングを、ペプチド1発現を実証している5つの細胞株に対して実施した。1週間のインキュベーション後、Genetix CloneSelect(登録商標)Imagerを使用してプレートを試験し、シングルコロニーを同定した。希釈クローニングの間の2つの細胞株の成長速度は、特に緩徐であることが注目されたので、これらの細胞株は中断した。合計して、3つの残りの細胞株から、58のクローン性コロニーを、最初に48ウェルプレート中への拡大増殖のために選択し、次いで、MTXの非存在下で、12ウェルプレート、T-25フラスコ及びT-75フラスコを通じて連続的に拡大増殖させた。次いで、58の選択されたクローンの各々を、生産性(pg/細胞/日)について評価し、16のクローンを、懸濁適応及び既知組成培地における成長への適応のために選択した。
【００５５】
既知組成培地における懸濁培養への細胞株の適応
これら16の細胞株を、以下のように、既知組成培地中での懸濁培養に適応させた。接着培養物中の選択された細胞株を、CHO懸濁成長培地(L-グルタミン及びピルビン酸ナトリウム、5%透析済FCS、20mg/L L-プロリン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、1% pluronic F68を含むDMEM高グルコース)中での懸濁、次いで、既知組成懸濁成長培地(Life Technologies Ltd.社(Paisley、UK)からのCD Opti-CHO(登録商標)、2.5%透析済FCS、0.1×ペニシリン/ストレプトマイシン、8mM Glutamax(登録商標))中での懸濁の両方に、最初に適応させた。
【００５６】
懸濁培養に適応したところで、細胞株を、段階的に、無血清既知組成懸濁成長培地(CD Opti-CHO(登録商標)、0.1×ペニシリン/ストレプトマイシン、8mM Glutamax(登録商標))中に切り離した。MTXを、全ての懸濁培養物から取り除いた。適応した株を拡大増殖させ、種細胞バンクを調製した。簡潔に述べると、細胞を、300mLの総容積に拡大増殖させ、細胞密度が0.85×106細胞/mLを超え、生存率が>90%になったときに回収した。更なる3×107細胞を、成長及び生産性分析のために、70mLの懸濁成長培地を含有する新たなフラスコ中に播種した。残りの細胞を、遠心分離によって回収し、適切な容積の凍結培地中に再懸濁して、1×107細胞/mLの細胞懸濁物を得た。バイアルを、-80℃まで下げて凍結させた。次いで、細胞バンクを、長期貯蔵のために液体窒素に移した。
【００５７】
16の細胞株を、無血清適応後に5つのクローンにまで更に精錬した。5つのクローンを、成長(細胞密度及び細胞倍加時間)及び生産性(pg/細胞/日)について評価し、その後、3つのクローンを選択した。1つのクローンを選択して、マスター細胞バンクを作製した。
【００５８】
マスター細胞バンク(MCB)及び作業細胞バンク(WCB)の調製を実施した。事前播種ストック由来の1バイアルを、200バイアルのMCBの調製のために使用し、1バイアルのMCBを、200バイアルのWCBを調製するために使用した。各場合において、バイアルを解凍し、凍結保存培地を遠心分離によって除去した。細胞を再懸濁し、成長培地(CD OptiCHO(登録商標)/4mM L-グルタミン)中の容積において増殖させた。4回の継代をMCBの創出の間に実施し、6回の継代をWCBの創出の間に実施した。
【００５９】
十分な細胞を得たときに、細胞を、凍結保存培地(92.5% CD OptiCHO(登録商標)/7.5% DMSO)中でポリプロピレンバイアル(各々、およそ1.5×107の生存細胞を含有する)中にアリコート化し、漸進的凍結プロセスで少なくとも60分間の期間にわたって-100℃まで温度を低下させることによって凍結保存した。バイアルを、GMP制御されたエリアにおいて、気相液体窒素自動充填コンテナ中に貯蔵する。
【００６０】
薬物物質(DS)製造プロセスの記載
ペプチド1 DS製造プロセスの簡潔な説明は以下のとおりである。WCBバイアルからの細胞を生き返らせ、産生バイオリアクター中への接種の前に、無タンパク質培地を使用して進行性に拡大増殖させた。細胞培養の完了の際に、細胞及び細胞デブリを、培養物の濾過によって除去する。
【００６１】
精製は、3つのクロマトグラフィーカラム工程(MAbSelect Sure、SP Sepharose、Capto Q)、濃縮及びダイアフィルトレーション工程からなり、これは、2つの特異的ウイルス低減/不活性化工程;Triton X-100(エンベロープ型ウイルスの不活性化)処理及びナノ濾過工程(エンベロープ型ウイルス及び非エンベロープ型ウイルスの除去)を含む。
【００６２】
濃縮及びダイアフィルトレーションの後、賦形剤を、DSの配合のために添加する。配合されたペプチド1を、コンテナ中に0.22μm濾過する。
【００６３】
10,000LバッチにおいてCapto Qカラムの代わりに使用したSartobind Phenylカラムは、オリゴマーの存在を低減させる際に有効である。このカラムは、オリゴマー形態のレベルを、平均で2.7%から1%に低減させることができた。
【００６４】
分析方法
グリカン構造分析を、Procognia Limited社(Ashdod、Israel)において実施した。N-グリカンを、PNGase Fを使用してサンプルから放出させ、次いで、2-アミノベンズアミドで標識した。放出されたグリカンを、異なるグリカン形態を生成するために、一連のエキソグリコシダーゼで処理した又は処理しなかった。グリカンを、二次元HPLC分析(NP-HPLC及びWAX)によって分離し、同じ二次元HPLC分析によって分離及び分析した社内調製標準を使用して構築した保持時間データベースとの比較によって同定した。
【００６５】
シアル酸含量
超高圧液体クロマトグラフィー(UPLC)を使用して、シアル酸含量を決定し、ペプチドの同一性を確認した。この方法は、Acquity UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50カラム及び以下の移動相:9:7:84/アセトニトリル:メタノール:水、流速0.3mL/分を使用して実施した。シアル酸を、シアリダーゼによる酵素的切断によって試験サンプルから放出させ、その後、蛍光標識(1,2ジアミノ4,5メチレンジオキシベンゼン二塩酸塩(DMB))を用いて誘導体化した。標識した試験サンプルを、イソクラティック溶出(isocratic elution)を用いたUPLC並びに373nmの励起波長及び448nmの発光波長を用いた蛍光検出によって分離した。試験サンプル中のシアル酸含量を、検量線として実行したN-グリコリルノイラミン酸(NGNA)及びN-アセチルノイラミン酸(NANA)標準と比較して定量した。NGNA及びNANAシアル酸含量を、pmolシアル酸/pmolタンパク質として報告する。
【００６６】
シアル化パターン
弱アニオン交換(WAX)-HPLCを、中性、モノ-、ジ-、トリ-及びテトラ-シアル化グリカンの%の決定に使用した。この方法には、PNGaseを用いた薬物物質からのN-グリカンの酵素的放出、2-アミノベンズアミド(2-AB)を用いた蛍光標識化、Ludger D1カートリッジを使用した脱塩が関与する。シアル酸化グリカンの分離を、20%アセトニトリル/0.5Mアンモニウム形式の勾配を用いて40℃でGlyco Sep Cカラムを使用して、WAX-HPLCによって実施した。蛍光検出を、330nmの励起及び420nmの発光に設定した。参照標準の試験を並行して実施した。中性、モノ-、ジ-、トリ-及びテトラ-シアル化グリカンの%を、WAX-HPLCクロマトグラムから決定し、報告した。
【００６７】
純度、SEC
サイズ排除HPLC(SEC)を使用して、SGF及びオリゴマー形態(活性ダイマーのダイマーから主に構成される)からインタクトな活性ダイマーを分離することによって、薬物物質純度を決定した。インタクトな活性ダイマー分子は、2つの同一のグリコシル化されたタンパク質サブユニット(ヒトIgG1重鎖のFc部分に融合したgp130細胞外ドメイン)からなる。サンプルを、1mL/分の流速及び0.2Mリン酸ナトリウムpH7.0の移動相を用いて、ゲル浸透カラム(TSK G3000SWXL)を使用して分子量に基づいて分離した。カラム溶出物を、280nmでモニタリングした。インタクトな種を、その特徴的な保持時間によって同定し;活性ダイマーの%純度を、総積分ピーク面積の百分率として表す。
【００６８】
オリゴマー形態
オリゴマー形態の百分率を、上に示したSEC法を使用して決定する。オリゴマー形態の百分率を、総積分ピーク面積の百分率として表す。
【００６９】
単一のgp130形態(SGF)
SGFの百分率を、上に示したSEC法を使用して決定した。SGFの百分率を、総積分ピーク面積の百分率として表す。
【００７０】
分析の結果を、Table 3(表3)中に提供する。
【００７１】
【表３】
2017536848.tif 000004
【００７２】
薬物製品(DP)の説明及び組成物
DPは、i.v.注入によって投与される無菌溶液である。DPは、25mM L-ヒスチジン、200mMスクロース及び0.1mgポリソルベート20/mLを含有するpH7.6の等張溶液中15mg/mLの濃度のペプチド1からなる。バイアルは、酸化に対する保護のために窒素でオーバーレイする。製品は、単回使用のために意図され、臨床的投与のための解凍まで、-20℃で貯蔵される。
【００７３】
組成物及びバッチ配合物
薬物製品のためのバッチ配合物を、Table 4(表4)に示す。
【００７４】
【表４】
2017536848.tif 000005
【００７５】
(実施例2)
臨床試験000067(単回用量)
設計
これは、単回用量、プラセボ対照、単盲検、用量無作為化、並行群用量漸増試験であった。試験は2つのパートで実施し、パート1は健康な対象を含み、パート2は、臨床的寛解状態にあるCDを有する患者を含んでいた。その目的は、安全性及び忍容性を試験すること、並びに可能な場合には、ペプチド1の単回投与後の薬理学的効果の徴候を得ることであった。
【００７６】
パート1では、64人の対象が含まれ、そのうち48人(44人の男性、4人の女性)は積極的処置を受け、16人(全て男性)がプラセボを受けた。7つの用量を調査し、30分間(0.75mg、7.5mg、75mg)又は1時間(150mg、300mg、600mg及び750mg)にわたるi.v.注入として投与した。更に、6人の対象が、60mgのペプチド1のs.c.用量を受け、2人の対象が、プラセボのs.c.用量を受けた。ペプチド1を、25mMヒスチジン、200mMスクロース及び0.1mg/mLポリソルベート20中15mg/mLで投与した。
【００７７】
パート2では、24人の患者が含まれ、そのうち18人(11人の男性、7人の女性)は積極的処置(75mg、300mg及び750mg)を受け、6人(4人の男性、2人の女性)はプラセボを受け、全てi.v.で投与した。
【００７８】
結果
ペプチド1のi.v.投与後のPK評価により、0.75mgから750mgの範囲において、AUC及びCmaxの両方について用量比例性が示され、血漿中のCmax濃度は、0.2μg/mLから170μg/mLまでの範囲であった(図3)。クリアランスはおよそ0.13L/時間であり、平均終末相半減期はおよそ4.5日であり、分布容積はおよそ20Lであり、後者は、いくらかの血管外分布を示した。60mgのペプチド1のs.c.投与は、2.3日で1.1μg/mLのCmaxを示し、5.0日の半減期を示した。ペプチド1のs.c.投与後のバイオアベイラビリティは、およそ50%であると計算された。
【００７９】
寛解状態にあるCD患者への75、300及び750mgのi.v.投与は、健康な対象と非常に類似した結果を示した(図4)。AUC及びCmaxは、16、76及び186μg/mL(健康な対象については16、77及び161μg/mL)のCmax濃度と用量比例的であった。クリアランスはおよそ0.13L/時間であり、平均終末相半減期はおよそ4.6日であり、分布容積はおよそ22Lであった。
【００８０】
プラセボ群を含む全ての処置群において有害事象がほとんど生じず、全て軽度又は中等度である、ペプチド1の安全性プロファイルが好ましかった。有害事象の発生率又は頻度における明らかな用量関連の傾向は、観察されなかった。注入を、2人の対象において、1人は軽度(パート1、300mg群)の注入反応に起因し、1人は中等度(パート2、75mg群)の注入反応に起因して、中断した。
【００８１】
バイタルサイン、ECG又は臨床的化学パラメーターには、明らかな用量関連の傾向も処置関連の変化もなかった。
【００８２】
300mg群中の1人の健康な対象は、投与の5〜6週間後の追跡来診において、非中和性の、処置により発生した抗ペプチド1抗体を示した。
【００８３】
全体として、ペプチドは、単回のi.v.用量として最大750mgを静脈内投与した場合、及び単回のs.c.用量として60mgを投与した場合、安全で十分な忍容性を示した。
【００８４】
(実施例3)
臨床試験000115(複数の漸増用量)
設計
これは、ペプチド1の複数の漸増用量の安全性、忍容性及び薬物動態を調査することを目的とした、プラセボ対照、二重盲検、用量群内無作為化、並行群試験であった。調査した用量は、30分間(75mg)又は1時間(300mg及び600mg)にわたってi.v.注入によって4週間にわたって1週間に1回投与した、75、300及び600mgのペプチド1であった。
【００８５】
24(24)人の健康な対象が含まれ、そのうち18人(11人の男性及び7人の女性)は積極的処置を受け、6人(2人の男性及び4人の女性)はプラセボを受けた。
【００８６】
結果
PK評価により、1回目の処置日及び最後の処置日に、単回用量研究における結果と類似した、非常に近い特徴が示された。AUC及びCmaxは、1回目の用量後に19、78及び148μg/mLのCmax濃度、並びに4回目の用量後に19、79及び142μg/mLのCmax濃度で、1回目及び4回目の投薬後に、用量比例的であった(健康な対象では、単回用量について16、77及び161μg/mL;図5)。対応するトラフ値は、3つの用量レベルについて、0.66、2.68、4.56μg/mL並びに0.98、3.95及び7.67μg/mLであった。最後の用量後に計算された平均終末相半減期は、およそ5.5日であった。
【００８７】
プラセボ群を含む全ての処置群において有害事象がほとんど生じず、全て軽度又は中等度である、ペプチド1の安全性プロファイルが好ましかった。有害事象の発生率又は頻度における明らかな用量関連の傾向は、観察されなかった。1人の対象(600mg群)は、軽度の注入反応に起因して休薬させた。
【００８８】
バイタルサイン、ECG又は臨床的化学パラメーターには、明らかな用量関連の傾向も処置関連の変化もなかった。
【００８９】
抗ペプチド1抗体は、いずれの対象においても検出されなかった。
【００９０】
全体として、ペプチド1は、4週間にわたって毎週1回最大600mgをi.v.投与した場合、安全で十分な忍容性を示した。
【００９１】
配列表
配列番号1
Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser Pro Glu Ser Pro Val Val 
1               5                   10                  15      
Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys Val Leu Lys Glu Lys Cys 
20                  25                  30          
Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr Ile Val Trp Lys Thr Asn 
35                  40                  45              
His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr Ile Ile Asn Arg Thr Ala 
50                  55                  60                  
Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser Leu Asn Ile Gln Leu Thr 
65                  70                  75                  80  
Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu Gln Asn Val Tyr Gly Ile 
85                  90                  95      
Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys Pro Lys Asn Leu Ser Cys 
100                 105                 110         
Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys Glu Trp Asp Gly Gly Arg 
115                 120                 125             
Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ser Glu Trp Ala Thr 
130                 135                 140                 
His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg Asp Thr Pro Thr Ser Cys 
145                 150                 155                 160 
Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val Asn Ile Glu Val Trp Val 
165                 170                 175     
Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr Ser Asp His Ile Asn Phe 
180                 185                 190         
Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro Pro His Asn Leu Ser Val 
195                 200                 205             
Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu Lys Leu Thr Trp Thr Asn 
210                 215                 220                 
Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg 
225                 230                 235                 240 
Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile Pro Pro Glu Asp Thr Ala 
245                 250                 255     
Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp Leu Lys Pro Phe Thr Glu 
260                 265                 270         
Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu Asp Gly Lys Gly Tyr Trp 
275                 280                 285             
Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile Thr Tyr Glu Asp Arg Pro 
290                 295                 300                 
Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile Asp Pro Ser His Thr Gln 
305                 310                 315                 320 
Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys Thr Leu Pro Pro Phe Glu 
325                 330                 335     
Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val Thr Leu Thr Arg Trp Lys 
340                 345                 350         
Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala Thr Lys Leu Thr Val Asn 
355                 360                 365             
Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Thr Val Arg Asn Leu Val 
370                 375                 380                 
Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile Pro Ala Cys Asp Phe Gln 
385                 390                 395                 400 
Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala Phe Pro Lys Asp Asn Met 
405                 410                 415     
Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu Ser Val Lys Lys Tyr Ile 
420                 425                 430         
Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala Pro Cys Ile Thr Asp Trp 
435                 440                 445             
Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr Tyr Leu Arg Gly Asn Leu 
450                 455                 460                 
Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val Thr Pro Val Tyr Ala Asp 
465                 470                 475                 480 
Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Lys Gln Ala Pro 
485                 490                 495     
Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys Lys Val Gly Lys Asn Glu 
500                 505                 510         
Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val Asp Val Gln Asn Gly Phe 
515                 520                 525             
Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr Ile Ile Gly Asn Glu Thr 
530                 535                 540                 
Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu 
545                 550                 555                 560 
Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met Ala Ala Tyr Thr Asp Glu 
565                 570                 575     
Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe Thr Thr Pro Lys Phe Ala 
580                 585                 590         
Gln Gly Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
595                 600                 605             
Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
610                 615                 620                 
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
625                 630                 635                 640 
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
645                 650                 655     
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 
660                 665                 670         
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 
675                 680                 685             
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 
690                 695                 700                 
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
705                 710                 715                 720 
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 
725                 730                 735     
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
740                 745                 750         
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
755                 760                 765             
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
770                 775                 780                 
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
785                 790                 795                 800 
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
805                 810                 815     
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
820         
配列番号2
Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Leu Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu 
1               5                   10                  15      
Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser 
20                  25                  30          
Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys 
35                  40                  45              
Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr 
50                  55                  60                  
Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr 
65                  70                  75                  80  
Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser 
85                  90                  95      
Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu 
100                 105                 110         
Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys 
115                 120                 125             
Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys 
130                 135                 140                 
Glu Trp Asp Gly Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu 
145                 150                 155                 160 
Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg 
165                 170                 175     
Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val 
180                 185                 190         
Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr 
195                 200                 205             
Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro 
210                 215                 220                 
Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu 
225                 230                 235                 240 
Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys 
245                 250                 255     
Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile 
260                 265                 270         
Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp 
275                 280                 285             
Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu 
290                 295                 300                 
Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile 
305                 310                 315                 320 
Thr Tyr Glu Asp Arg Pro Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile 
325                 330                 335     
Asp Pro Ser His Thr Gln Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys 
340                 345                 350         
Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val 
355                 360                 365             
Thr Leu Thr Arg Trp Lys Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala 
370                 375                 380                 
Thr Lys Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu 
385                 390                 395                 400 
Thr Val Arg Asn Leu Val Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile 
405                 410                 415     
Pro Ala Cys Asp Phe Gln Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala 
420                 425                 430         
Phe Pro Lys Asp Asn Met Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu 
435                 440                 445             
Ser Val Lys Lys Tyr Ile Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala 
450                 455                 460                 
Pro Cys Ile Thr Asp Trp Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr 
465                 470                 475                 480 
Tyr Leu Arg Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val 
485                 490                 495     
Thr Pro Val Tyr Ala Asp Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala 
500                 505                 510         
Tyr Leu Lys Gln Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys 
515                 520                 525             
Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val 
530                 535                 540                 
Asp Val Gln Asn Gly Phe Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr 
545                 550                 555                 560 
Ile Ile Gly Asn Glu Thr Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu 
565                 570                 575     
Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met 
580                 585                 590         
Ala Ala Tyr Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe 
595                 600                 605             
Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gln Gly Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 
610                 615                 620                 
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 
625                 630                 635                 640 
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 
645                 650                 655     
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 
660                 665                 670         
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 
675                 680                 685             
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 
690                 695                 700                 
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 
705                 710                 715                 720 
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 
725                 730                 735     
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 
740                 745                 750         
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 
755                 760                 765             
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 
770                 775                 780                 
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 
785                 790                 795                 800 
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 
805                 810                 815     
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 
820                 825                 830         
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
835                 840              
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
2017536848.tif 000009
【図３−３】
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【図４】
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【図５】
2017536848.tif 000012
【図６Ａ】
2017536848.tif 000013
【図６Ｂ】
2017536848.tif 000014
【図７−１】
2017536848.tif 000015
【図７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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