(57)【要約】  多孔質セラミック顆粒に骨誘導性材料を担持し、そして生体適合性マトリックス材料と接触させる、骨誘導性合成骨移植片を調製するためのシステム及び方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨誘導性タンパク質；
カルシウムセラミック顆粒及び流動性生体適合性マトリックス材料のうち少なくとも１つ；並びに、
少なくとも１つのチャンバーと、骨誘導性タンパク質、カルシウムセラミック顆粒、及び流動性生体適合性マトリックスのうち１以上をチャンバーに導入するための少なくとも１つの入口とを有する装置；
を含む、複合骨誘導性足場を形成するためのシステム。
【請求項２】
骨誘導性タンパク質が水溶液の状態にある、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
装置が、少なくとも１つのチャンバー内に置かれているか又は少なくとも１つのチャンバーに流体接続している１以上の静的混合要素と、少なくとも１つのチャンバーに少なくとも１つの入口を介して挿入可能な有窓ニードルとを包含する、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
システムが、ヒアルロン酸（ＨＡ）、修飾ＨＡ、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、自己集合性ペプチド、全血、多血小板血漿、骨髄穿刺液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ誘導体、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポロキサマー、及びそれらのコポリマーから成る群より選択される流動性生体適合性マトリックス材料を包含する、請求項１〜３の１項に記載のシステム。
【請求項５】
流動性生体適合性マトリックス材料が、架橋反応及び重合反応のうち少なくとも一方の架橋剤又は触媒と接触したときにゲルを形成する、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
さらにポロゲンを含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
骨誘導性タンパク質が、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、デザイナーＢＭＰ、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項１〜６の１項に記載のシステム。
【請求項８】
システムが顆粒を包含し、該顆粒は多孔質であり、リン酸一カルシウム一水和物、リン酸二カルシウム、リン酸二カルシウム脱水物、リン酸八カルシウム、沈降ヒドロキシアパタイト、沈降非晶質リン酸カルシウム、リン酸一カルシウム、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、焼結ヒドロキシアパタイト、オキシアパタイト、リン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、カルシウム欠乏ヒドロキシアパタイト、及びそれらの組合せを含む群より選択される材料を包含する、請求項１〜７の１項に記載のシステム。
【請求項９】
カルシウムセラミック顆粒を、骨誘導性タンパク質を含む溶液と接触させ、それにより、骨誘導性タンパク質をセラミック顆粒の内側細孔表面と結合させる段階を含む、請求項８に記載のシステムを利用する骨誘導性足場の作製方法。
【請求項１０】
カルシウムセラミック顆粒が少なくとも１つのチャンバー内に置かれ、カルシウムセラミック顆粒を骨誘導性タンパク質を含む溶液と接触させる段階が、入口を介して溶液をチャンバーに流し入れ、溶液中で顆粒をインキュベートし、そして入口を介して溶液をチャンバーの外に流出させることを包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
流動性生体適合性マトリックス材料をチャンバーに流し入れ、それにより顆粒をマトリックスと接触させることをさらに含み、マトリックスはチャンバー内でゲルを形成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
骨誘導性タンパク質を含む溶液が、ゲル化試薬、ゲル化触媒、及び架橋剤のうち少なくとも１つを包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
生体適合性マトリックス、カルシウムセラミック顆粒の内側表面に結合している骨誘導性タンパク質を含み、カルシウムセラミック顆粒はマトリックスに結合している、請求項１０に記載の方法に従って形成される埋込物。
【請求項１４】
骨誘導性タンパク質、並びにカルシウムセラミック顆粒及び生体適合性マトリックス材料のうち１以上の濃度が、埋込物の少なくとも１つの物理的寸法に沿って実質的に一定である、請求項１３に記載の埋込物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本願は、医療機器及び生物学的療法、より詳細には、タンパク質担持マトリックスを包含する骨修復用基材に関する。
関連出願の相互参照
[0001]本願は、Ｖａｎｄｅｒｐｌｏｅｇらによる２０１４年８月２８日提出の米国仮特許出願第６２／０４３３５６号及びＤｅｃｋｅｒらによる２０１５年５月１日提出の米国仮出願第６２／１５５８３５号に対し、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき優先権の利益を主張するものである。上記出願のそれぞれを、全体として本明細書中で参考として援用する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]骨移植は毎年約２００万例の整形外科手術で用いられており、一般に３つの形態のうち１つが選ばれる。自家移植片は、典型的には患者の１部位から摘出され同患者の他の部位に移植される骨からなり、これらの材料は同時に骨伝導性（新骨成長のための足場（scaffold）として働く）であり、骨誘導性（骨芽細胞の成長を促す）であり、骨形成性（新骨を形成する骨芽細胞を含有する）であるため、骨移植片材料の基準である。しかしながら、自家移植片の供給には限界があるため、死体由来の同種移植片の使用が余儀なくされてきた。しかし、同種移植片は宿主−移植片免疫応答を誘発する可能性があり、あるいは、感染症又はプリオン病を伝染させる可能性があり、殺菌又は細胞を除去するための処理がしばしば行われて骨形成性が排除されてしまうため、これらの材料は自家移植片ほど理想的ではない。
【０００３】
[0003]ヒト由来の骨移植片材料の欠点が一因となり、合成骨移植片材料への関心は増大してきている。合成移植片は、典型的には、ペースト又はパテの形態で納品されるカルシウムセラミック及び／又はセメントを含む。これらの材料は骨伝導性であるが、骨誘導性でも骨形成性でもない。それらの有効性を改善するために、合成カルシウム含有材料に、骨誘導性材料、とりわけ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７のような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、あるいは線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、及び／又は形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）のような他の成長因子が担持されてきた。しかしながら、重大な技術的課題によって合成骨移植片代替物への骨誘導性材料の効率的な組み込みは妨げられており、これにより、高品質な骨誘導性合成骨移植片材料の開発は限定されてきた。
【発明の概要】
【０００４】
[0004]本発明では、骨誘導性材料の担持が改善された移植片材料を提供することにより現世代の合成骨移植片の欠点に対処するほか、そのような材料の作製及び使用方法を検討する。１つの観点において、本発明は、骨誘導性材料（該材料は一般に、必ずしもではないが、タンパク質又はペプチドであり、本明細書中に記載する代表的態様では、互換的に「骨誘導性タンパク質」とよばれる）、カルシウムセラミック顆粒及び流動性生体適合性マトリックス材料のうち少なくとも１つ、並びに少なくとも１つのチャンバーと、該タンパク質、顆粒、及び／又はマトリックス材料をチャンバーに導入するための少なくとも１つの入口とを規定する装置を包含する、複合骨誘導性足場を形成するためのシステムに関する。さまざまな場合において、骨誘導性材料は水溶液の状態にあり、及び／又は装置は静的混合要素（例えば、チャンバー内にあるか、チャンバーに流体接続している）を包含する。いくつかの場合、顆粒、骨誘導性材料、及び／又は流動性生体適合性マトリックス材料のうち１以上は、ポロゲンを包含するか、ポロゲンと一緒に足場に統合される。該ポロゲンは、顆粒の平均サイズと同様の平均サイズを有し、浸出性、崩壊性、可溶性であるか、又は分解性である、除去可能な粒子であってもよい。該マトリックスは、所望により、ヒアルロン酸（ＨＡ）、修飾ＨＡ、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、自己集合性ペプチド、全血、多血小板血漿、骨髄穿刺液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ誘導体、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポロキサマー、及びそれらのコポリマー又は組合せから成る群より選択される。顆粒を用いる場合、それは一般に多孔質であり、リン酸一カルシウム一水和物、リン酸二カルシウム、リン酸二カルシウム脱水物、リン酸八カルシウム、沈降ヒドロキシアパタイト、沈降非晶質リン酸カルシウム、リン酸一カルシウム、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、焼結ヒドロキシアパタイト、オキシアパタイト、リン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、カルシウム欠乏ヒドロキシアパタイト、及びそれらの組合せを含む群より選択される材料を包含することができる。骨誘導性材料は、所望により、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、デザイナーＢＭＰ、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、及びそれらの組合せから成る群より選択される。一方、装置は、所望により、足場内に組み込まれる要素の混合を改善するための構造物、例えば、チャンバー内にあるかチャンバーに接続可能な静的混合要素、及び／又はチャンバー内に挿入可能な有窓ニードル（fenestrated needle）を包含する。より詳細に以下に記載する方法を実施し、及び／又は、より詳細に以下に記載する医学的埋込物を形成するために、いくつかの場合には、システムのさまざまな態様を用いることができる。
【０００５】
[0005]他の観点において、本発明は、合成移植片材料の調製方法（必ずしもではないが、上記システムの１つを用いてもよい）であって、例えば、カルシウムセラミック顆粒を、骨誘導性材料を含む溶液と接触させることにより、カルシウムセラミック顆粒に骨誘導性材料を担持するか、カルシウムセラミック顆粒を骨誘導性材料と結合させることを包含する方法に関する。前記溶液は、後続する該顆粒と結合した生体適合性マトリックスの形成を促進する試薬、例えば、ゲル化試薬、ゲル化触媒、及び／又は架橋剤を包含していてもよい。該方法はまた、タンパク質担持カルシウムセラミック顆粒を、タンパク質担持顆粒上に流すことができる生体適合性マトリックス（例えば、タンパク質担持顆粒を含有するチャンバー内に流動性マトリックス材料を流すことにより）に埋め込むことを包含することができる。さまざまな態様において、骨誘導性材料は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、又はデザイナーＢＭＰである。カルシウムセラミック顆粒は、硫酸カルシウム類及びリン酸カルシウム類、例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠乏ヒドロキシアパタイト、又はそれらの組合せをさまざまに包含する一方、生体適合性マトリックス材料は、さまざまな態様において、ヒアルロン酸（ＨＡ）、及びその官能基化又は修飾バージョン、動物性であるかヒト組換え型であるかに関わらないコラーゲン、ゼラチン（動物性又はヒト組換え型）、フィブリン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、自己集合性ペプチド、全血、多血小板血漿、骨髄穿刺液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその誘導体、官能基化又は架橋性合成生体適合性ポリマー、例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポロキサマー、及び当該技術分野で公知の他の感熱性又は逆感熱性ポリマー、並びに上記物質の任意の１以上のコポリマー又は混合物である。生体適合性マトリックス材料は、いくつかの場合には反応性であり、１以上の重合反応及び架橋反応が起こるように誘発して、ゲル又は他のポリマー塊を形成することができる；この場合、反応は所望により３０秒〜５分間かけて行われ、この間に、マトリックス材料を、所望により顆粒上に流す、及び／又は顆粒と混合することができ、これにより、より均質な埋込物の形成が促進される。
【０００６】
[0006]他の観点において、本発明は、上記システム及び／又は方法を用いて形成される埋込物に関連し、該埋込物は、生体適合性マトリックス、カルシウムセラミック顆粒の内側表面（例えば細孔表面）に結合している骨誘導性材料を包含し、該カルシウムセラミック顆粒は、該マトリックスに結合している。好ましい例において、埋込物は実質的に均一であり、すなわち、骨誘導性材料、並びにカルシウムセラミック顆粒及び生体適合性マトリックス材料の１以上の濃度は、埋込物の少なくとも１つの物理的寸法に沿って実質的に一定である。
【０００７】
[0007]さらに他の観点において、本発明は、骨誘導性材料を担持しているか骨誘導性材料と結合しているカルシウムセラミック顆粒を包含する組成物を送達することを含む、患者の処置方法であって、該顆粒が生体適合性マトリックスに埋め込まれている、前記処置方法に関する。さまざまな態様において、骨誘導性材料は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、又はデザイナーＢＭＰである。カルシウムセラミック顆粒は、硫酸カルシウム類及びリン酸カルシウム類、例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠乏ヒドロキシアパタイト、又はそれらの組合せをさまざまに包含する一方、生体適合性マトリックスは、さまざまな態様において、ヒアルロン酸（ＨＡ）、及びその官能基化もしくは修飾バージョン、動物性であるかヒト組換え型であるかに関わらないコラーゲン、ゼラチン（動物性もしくはヒト組換え型）、フィブリン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、自己集合性ペプチド、全血、多血小板血漿、骨髄穿刺液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその誘導体、官能基化又は架橋性合成生体適合性ポリマー、例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポロキサマー、及び当該技術分野で公知の他の感熱性又は逆感熱性ポリマー、並びに上記物質の任意の１以上のコポリマー又は混合物である。
【０００８】
[0008]さらに他の観点において、本発明は、患者を骨誘導性材料で処置するためのキットに関する。該キットは、一般に、カルシウムセラミック顆粒、骨誘導性材料、及び生体適合性足場材料のほか、それらを組み合わせて骨誘導性合成骨移植片を形成するための機械的ツールを包含する。いくつかの場合には、該キットは、顆粒を保持するためのチャンバーと、流体をチャンバーに供給し、及び／又はチャンバーから回収するための入口及び出口とを包含する、容器を包含する。１つのスキームでは、骨誘導性材料を含む液体を入口を介して流し、顆粒を該液体と接触させることにより、顆粒に骨誘導性材料を担持し；その後、該顆粒を生体適合性マトリックス材料と混合するか、又は生体適合性マトリックス材料と接触させる。
【０００９】
[0009]本発明の特定の態様を添付図面により例示する。図は必ずしも一定の縮尺ではなく、本発明の理解に必要ではない細部、又は他の細部をわかりにくくする細部は、省略している場合があることは、理解されるであろう。本発明は、本明細書中に例示する特定の態様に必ずしも限定されないことは、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】[0010]図１Ａ〜１Ｂは、異なるマクロ多孔度を有する本発明の２つの構築物を示す。
【図２】[0011]図２Ａ〜２Ｃは、合成骨誘導性骨移植片材料の代表的調製方法におけるいくつかの段階を示す。
【図３−１】[0012]図３Ａは、有窓ニードルを含む代表的混合装置を示す。図３Ｂは、代表的混合チャンバーにおける流体の流れの方向を例示する。
【図３−２】図３Ｃ〜３Ｎは、骨誘導性因子（ここでは、シアン中のＢＭＰ２）及び生体適合性マトリックスの溶液を顆粒に施用するために、他の点では同様の混合装置にて、ニードルを用いないで作製した足場の横断面図（Ｃ〜Ｈ）、及び中央に位置決めした有窓ニードルを用いて作製した足場の横断面図（Ｉ〜Ｎ）を示す。これらの図は、有窓ニードルが組み込まれていない装置と比較して、溶液を施用するのに有窓ニードルを用いて達成される、骨誘導性材料、顆粒及びマトリックス材料の改善された分布を例示している。
【図４】[0013]図４Ａ〜４Ｂは、混合及び末端のトリミング後の円柱状埋込物（４Ａ）、並びに混合後にシリンジ内に形成した円柱状埋込物（４Ｂ）を示す。
【図５】[0014]図５は、圧縮試験前のレオメーター上の円柱状埋込物の一切片を示す。
【図６】[0015]図６は、さまざまなヒドロゲル組成物の貯蔵剪断弾性率（Ｇ’）及び損失剪断弾性率（Ｇ”）の位相差を比較するグラフである。
【図７】[0016]図７は、各ヒドロゲル組成物が架橋反応を完了するのに要する時間を示すグラフである。
【図８】[0017]図８は、各ヒドロゲル組成物の最大剛性を示すグラフである。
【図９】[0018]図９は、２つの混合シリンジを付着させるためのさまざまなコネクター設計を示す。
【図１０】[0019]図１０Ａ〜１０Ｄは、混合の可能性を試験するために用いた内部混合構造のバリエーションを示す。静的ミキサー設計は、中空管（１０Ａ）、半球形（１０Ｂ）、単一横棒（１０Ｃ）、及び２重横棒（１０Ｄ）を包含する。
【図１１】[0020]図１１Ａ〜１１Ｂは、混合手順の可視化（１１Ｂ）が可能になるように機械的にミル加工した（machine milled）透明プラスチック製コネクターの原型（１１Ａ）を示す。
【図１２】[0021]図１２は、半球形静的ミキサーを包含するコネクター内に蓄積している廃棄材料を示す。
【図１３】[0022]図１３Ａ〜１３Ｂは、２つの混合シリンジに接続している（１３Ｂ）単一横棒の静的ミキサー（１３Ａ）を包含する、３Ｄプリンターで作製したコネクターを示す。
【図１４】[0023]図１４Ａは、試験した各ヒドロゲル組成物の５ｍｍごとの断片の弾性率の平均値を示すグラフである。図１４Ｂは、試験した各ヒドロゲル組成物の５ｍｍごとの断片の密度の平均値を示すグラフである。
【図１５】[0024]図１５は、異なる顆粒濃度で構成されるヒドロゲル組成物の機械的特性のばらつきを示すグラフである。
【図１６】[0025]図１６は、同じ顆粒組成物を含むヒドロゲル組成物の切片間の機械的特性の偏差を示すグラフである。
【図１７】[0026]図１７は、各ヒドロゲル組成物の切片間の蛍光標識アルブミンの正規化強度値を示すグラフである。
【図１８】[0027]図１８は、各ヒドロゲル組成物の蛍光体標識アルブミンの蛍光の偏差を示すグラフである。
【図１９】[0028]図１９は、２０％又は３０％顆粒を包含するヒドロゲル組成物の４つの切片内の、ＡＦ４８８で標識したＢＭＰ−２の正規化強度値を示すグラフである。
【図２０】[0029]図２０Ａ〜２０Ｂは、３０体積％の顆粒を、ＢＭＰ緩衝液に希釈したＢＭＰ−２と一緒に含有する、ヒドロゲル組成物の共焦点像である。
【図２１】[0030]図２１Ａ〜２１Ｂは、ＡＦ４８８標識ＢＭＰ−２からの蛍光発光の平均強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
骨誘導性組成物
[0031]本発明のさまざまな態様に従った埋込物（「構築物」とも称する）は、一般に３つの成分を包含する：カルシウムセラミック又は他の鉱物固体などの骨伝導性材料、骨形成タンパク質などの骨誘導性材料、及び、反応してゲル又は他の塊を形成する流動性生体適合性マトリックス材料。本明細書中で用いる場合、骨伝導性材料は、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨前駆細胞、間葉系幹細胞、並びに、骨格組織を合成及び／又は維持する細胞に分化するか、又はそのような細胞の成長を促進することができる他の細胞を含む、骨芽性細胞の内部成長を促進する任意の材料を表す。本発明の好ましい態様では、骨伝導性材料は、骨伝導性リン酸カルシウムセラミックを含む多孔質顆粒であって、該顆粒上に担持している骨誘導性物質の持続放出がもたらされるように適合されているものである。いくつかの場合には、該顆粒は、骨誘導性物質が吸着又は結合することができる表面を規定するミクロ及びマクロ細孔の両方を包含する。ミクロ細孔及びマクロ細孔はともに、骨誘導性物質が吸着することができる全表面積を増大させるが、細胞による浸潤が可能になるのはマクロ細孔のみである。したがって、ミクロ細孔内の骨誘導性物質は、マクロ細孔に浸潤する細胞によって顆粒が分解されるにつれて、徐々に利用可能になるだけである。
【００１２】
[0032]顆粒は、本発明の埋込物が適所に維持され、骨の形成及び接合に最適な時間間隔（例えば、数日、数週間、又は数カ月）にわたり骨誘導性材料を放出されるのに適した組成及び構造を有する、任意の適した骨伝導性材料で作製することができる。これらの特性は用途によって異なっていることができるが、顆粒としては一般に、限定されるものではないが、リン酸一カルシウム一水和物、リン酸二カルシウム、リン酸二カルシウム脱水物、リン酸八カルシウム、沈降ヒドロキシアパタイト、沈降非晶質リン酸カルシウム、リン酸一カルシウム、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、焼結ヒドロキシアパタイト、オキシアパタイト、リン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、カルシウム欠乏ヒドロキシアパタイト、及びそれらの組合せが挙げられる。
【００１３】
[0033]顆粒の構造に関し、好ましい態様では、顆粒は、（ａ）表面積及び（ｂ）多孔度によって特徴付けられ、これらもまた、本発明の埋込物が適所に維持され、骨の形成及び接合に最適な時間間隔（例えば、数日、数週間、又は数カ月）にわたり骨誘導性材料を放出されるように選択される。多孔度は２つの構成要素を有する：これはミクロ多孔度及びマクロ多孔度で、望ましい顆粒の滞留時間又は骨誘導性材料の放出動態が達成されるように選択することができる。ミクロ多孔度は一般に、比較的狭い平均径を有する細孔であるが、それにもかかわらず、ＢＭＰを配合した溶液などの流体が、ミクロ細孔の表面に直接接触することなくミクロ細孔内へ浸潤することを可能にするのに十分な大きさ（すなわち、過度の表面張力がなく、流体の接近が可能になるのに十分な大きさ）を有する細孔の存在を表す。顆粒に関し、マクロ多孔度は一般に、細胞による浸潤が可能になるサイズを有する細孔の存在を表す。
【００１４】
[0034]骨誘導性材料は一般に、骨芽細胞の発生を刺激し、又は骨芽細胞の活性を向上させ、及び／又は破骨細胞の活性もしくは発生を阻害する、ペプチド及び非ペプチド成長因子を包含する。いくつかの態様では、骨誘導性材料は、ＴＧＦ−βのような形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。より好ましくは、骨誘導性材料は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、又は、Ｂｅｒａｓｉらによる“Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”という表題の米国付与前出願公開第２０１２００４６２２７Ａ１号に記載されているＢＭＰ−ＧＥＲもしくはＢＭＰ−ＧＥＲ−ＮＲキメラＢＭＰのようなデザイナーＢＭＰである。前記出願公開の開示内容の全体を、あらゆる目的に関し本明細書中で参考として援用する。他の態様では、骨誘導性材料は、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、血小板由来成長因子、小分子、ヌクレオチド、脂質、又はここで挙げた因子の１以上の組合せである。
【００１５】
[0035]本発明のさまざまな態様では、生体適合性マトリックスが用いられる。これは、好ましくは、（ａ）顆粒と合わせて用いると、埋め込まれたときに上部にかかる荷重に耐えるのに十分な剛性及び／又は柱強度（column strength）を示し、（ｂ）過度の炎症（すなわち、新骨形性又は骨折の接合を阻害又は妨害するのに十分な炎症）を引き起こさず、骨芽細胞の増殖を阻害せず、又は、顆粒及び／もしくは骨誘導性材料の活性を妨げず、そして（ｃ）新骨の沈着を可能にするのに適した間隔にわたり十分な密着力を有する、任意の適した生体適合性材料であることができる。これに加えて、生体適合性マトリックスは、分解性及び／又は骨伝導性であってもよい。好ましい態様では、生体適合性マトリックスは、反応してゲル又は他の固体塊を形成する流動性前駆体材料から、例えば顆粒の存在下で重合及び／又は架橋することにより作製される。さまざまな態様において、マトリックスとしては、ヒアルロン酸（ＨＡ）、及びその官能基化もしくは修飾バージョン、動物性であるかヒト組換え型であるかに関わらないコラーゲン、ゼラチン（動物性又はヒト組換え型）、フィブリン、キトサン、アルギン酸塩、アガロース、自己集合性ペプチド、全血、多血小板血漿、骨髄穿刺液、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びその誘導体、官能基化又は架橋性合成生体適合性ポリマー、例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポロキサマー、及び当該技術分野で公知の他の感熱性又は逆感熱性ポリマー、並びに上記物質の任意の１以上のコポリマー又は混合物が挙げられる。マトリックス材料がゲル又は他の塊を形成する反応プロセスは、短いが即時的ではないプロセスであることが好ましく、材料が、顆粒上を流れ、及び／又は顆粒と混合されることを可能にし、比較的均質な混合物を形成して、これにより組成的（したがって機械的）に均質な埋込物を生じさせるのに、例えば、３０秒間、１分間、５分間、最大１０分間を要する。
【００１６】
[0036]いくつかの場合には、マトリックス材料は、反応してゲル又は塊を形成するために、１以上の触媒及び共反応物を必要とする。触媒又は共反応物は、マトリックス材料と同時に提供することができ、又はいくつかの場合には、マトリックス材料の導入に先立って提供することができる。一例では、酵素的に触媒された架橋反応を行うために選択したマトリックス材料に要する試薬（過酸化水素）は、顆粒に施用される骨誘導性材料の溶液に含まれた。したがって、ポリマー溶液が顆粒と接触したときに架橋が開始した。他の架橋剤又は重合剤、例えば、過酸化水素、光開始剤、又は２価カチオンを、マトリックス材料の添加前に顆粒に加えることもできる。
【００１７】
[0037]上記骨誘導性材料、顆粒及び生体適合性マトリックスを包含する本発明の埋込物又は構築物は、骨の成長及び接合の促進に合わせた特性、例えば、（ａ）施用に適した骨誘導性材料の放出動態、（ｂ）新骨形性を妨げることなく促進させるのに適した滞留時間、（ｃ）新骨形性に付随して生じる新血管組織を含む、細胞及び組織の浸潤を可能にするマクロ多孔度、並びに（ｄ）埋込物にかかる荷重に耐えるのに十分な剛性及び／又は圧縮抵抗も有する。
【００１８】
[0038]マクロ多孔度に関し、図１は、比較的高い（図１Ａ）及び比較的低い（図１Ｂ）多孔度を有する本発明の構築物を示している。図１の横断面に示されている構築物は組成的には互いに同様であるが、図１Ａの構築物にはポロゲンとしてのサイズを有するスクロース結晶が組み込まれており、図１Ｂの構築物には組み込まれていなかった。理論に拘束されるものではないが、ポロゲンを添加しない場合、構築物の多孔度は顆粒のサイズに伴い変動すると考えられる：用いるセラミック顆粒のサイズが大きいほど、顆粒間の空間は大きくなる。しかしながら、本発明の特定の態様のように、そして図１Ｂに例示するように、セラミック顆粒が３００〜５００μの範囲にある場合、ポロゲンの添加なしでは、顆粒間の細孔は典型的には理想的な多孔度（同様に３００〜５００μ）を下回るであろう。
担持手順
[0039]本発明の合成骨移植片材料は、一般に、顆粒、骨誘導性材料、及び生体適合性マトリックス材料を順次組み合わせることにより調製される。図２Ａ〜２Ｃは、合成骨移植片を調製するための代表的な２段階プロセスを示している。最初に、図２Ａ〜２Ｂに示すように、ＢＭＰのような骨誘導性材料を、例えば、骨誘導性材料が顆粒内のさまざまな表面、例えば内部細孔表面（存在する場合）に付着させるように、該材料を含有する溶液を顆粒上に流すことにより、顆粒に施用する。好ましい態様では、顆粒に施用する溶液の体積は、顆粒を完全に湿潤させるのに十分な体積であり、これにより、確実にすべての表面（内部細孔表面を含む）が骨誘導性材料とインキュベートされる。顆粒のインキュベーションは、さまざまな間隔、温度、圧力（ミクロ細孔の完全な浸潤を促進するのに必要な場合がある）にわたることができ、又は、骨誘導性材料と顆粒の組合せに合うように任意の適した方法で処理することができる。顆粒中への流体の浸潤は、１以上の界面活性剤を包含させることにより促進させてもよい。
【００１９】
[0040]担持段階に続き、顆粒を生体適合性マトリックス中に埋め込む。いくつかの場合には、図２Ｃに示すように、マトリックスを生じる配合物、例えば架橋性プレポリマーを顆粒に施用し、反応させて、マトリックスを形成する。得られる構築物が適したマクロ多孔度（例えば３００〜５００μの細孔）を有するように、ポロゲンを配合物に加えることが好ましい。あらゆるポロゲンを用いることができるが、好ましい態様では、ポロゲンは生体適合性であり、構築物に用いられるセラミック顆粒と同様のサイズを有する粒子として提供され、そして、マトリックスの形成中に置換又は希釈されることがないように、マトリックスを生じる配合物の密度より大きいか、少なくとも実質的にそれ以上である密度を有する。浸出性粒子を用いる場合、それは、生体適合性マトリックスの形成中は固相状態が保たれるように、配合物に対し比較的不溶性であることが好ましい。いくつかの態様では、超音波又は紫外線などの外部エネルギーの施用に応答して崩壊又は溶解するように形成された微小球が用いられ、他の態様では、感熱性（又は逆感熱性）ポリマービーズなどの感熱性ポロゲン粒子がポロゲンとして用いられる。
【００２０】
[0041]構築物の形成後、ポロゲンは、迅速に分解もしくは除去されることができ、又は、構築物が患者に埋め込まれた後であっても、適所に残存することができる。好ましい態様では、ポロゲンは、１週間未満であるが、数時間又は数日にわたりそのままの状態であり続ける。
【００２１】
[0042]上記ポリマー組成物に加えて、又はその代わりに、生体適合性マトリックスは、骨の処置に有用な他の材料、例えば、アクリレートポリマー材料（例えばポリメタクリル酸メチル）、脱塩骨、リン酸カルシウムパテなどを含むことができる。
【００２２】
[0043]いくつかの場合には、顆粒の担持及び／又は生体適合性マトリックス中でのその配置は、最終使用者によってｉｎ  ｓｕｉｔｅで行われる。そのようなｉｎ  ｓｕｉｔｅでの担持は、代表的態様では、顆粒を保持するための容器を包含するキットによって促進され、骨誘導性材料及び／又は生体適合性マトリックスは、その中に流し入れることができる。好ましい態様では、該容器は、入口、出口、及び多数の顆粒を保持するための空間を包含する。１以上の入口及び出口は、例えば雄ルアーチップ又は雌ルアーチップにより、流体源に接続することができる。該キットは、骨誘導性材料の凝集体が組み込まれるのを制限するため、及び／又は顆粒の漏れを防止するための１以上のフィルターと、それを通過して流れてきた材料の混合を改善するための静的ミキサーとを包含していてもよい。これに加えて、１以上の骨誘導性材料及び生体適合性マトリックス材料は、液体形態で例えば予め充填してあるシリンジ中に又は再構成可能な形態で（例えばバイアル中に凍結乾燥又はフリーズドライ形態で再構成のための希釈剤と一緒に）提供することができる。ポロゲンを用いる場合、それは、担持顆粒に施用する直前に生体適合性マトリックスと混合するために別個に供給することができ、あるいは１以上の顆粒、骨誘導性材料（例えば、該材料を含む溶液中のもの）、及び／又は生体適合性マトリックスと、これらの中で安定な場合は、混合することができる。例えば、浸出性ポロゲン粒子（無機塩結晶など）を用いる場合、それは、別個に提供した後、顆粒と骨誘導性材料及び／又は生体適合性マトリックス材料とのインキュベーションに加えることができ、あるいはマトリックス材料を顆粒に施用する前に、希釈剤（例えば水）で湿潤させた凍結乾燥生体適合性マトリックス材料と一緒に提供してもよい；浸出性ポロゲンは、サイズがほぼ同じで、希釈剤に対し比較的不溶性の粒子又は粗粒の形態で提供される。
【００２３】
[0044]本発明のキットを使用するには、使用者は、最初に顆粒を含有する容器を骨誘導性材料を含有する第１の溶液の供給源に接続し、該第１の溶液を容器中及び顆粒上に流す。次に、使用者は第１の溶液の供給源との接続を断ち、生体適合性マトリックス材料を含有する第２の溶液の供給源に接続する。マトリックスの形成後、移植片を取り出し、所望により、例えば埋込物のトリミング及び／又は埋込物中への配合により、患者への埋め込みに備える。
【００２４】
[0045]本発明の特定の原理を、以下の非限定的例により例示する。
【実施例】
【００２５】
実施例１：ヒドロゲルの特性試験
[0046]いくつかの場合には、本開示の機器、システム、及び方法を用いて、ヒドロゲル足場内のリン酸カルシウム顆粒上に骨誘導性材料を均一に担持することができる。考えうるヒドロゲル材料の一つは、チラミン置換ヒアルロン酸（ＨＡ）である。そのようなヒドロゲルの流れ特性を理解するために、図３に示すように特定濃度（５ｍｇ／ｍＬ又は１０ｍｇ／ｍＬ）においてさまざまな架橋性活性チラミン塩基置換（１％、３％、及び５％）を有するヒドロゲルのオシレーション及び流れ試験を、ＡＲ２０００レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、デラウェア州ニューキャッスル）を用いて分析した。ヒドロゲルの動態は、２°、直径４０ｍｍのアルミニウムコーンの下にて、レオメーター表面に９００μＬのヒドロゲルを施して、流れの手順を用いて試験した。各ヒドロゲルの粘度は、一定温度（２５℃）において０〜６０Ｐａの施用剪断応力の範囲に及んでいた。各ヒドロゲルの経時変化を分析するために、６つのヒドロゲル組成物のそれぞれでオシレーション試験を実施した。９００μＬのヒドロゲルを、レオメーターのプラットフォームのアルミニウムコーンの下に加えた。１Ｈｚに保持したオシレーション振動数で１％の一定歪みにて掃引時間２０分で実施した。９０秒後、化学量論的分量の過酸化水素を、以下の式に従った３つの等量でアルミニウムコーンの縁の周囲に加えた：過酸化水素全量（μＬ）＝（０．４９６）（Ｘ）（Ｙ）；式中、Ｘ＝チラミン塩基置換率（すなわち、１％＝１）であり、Ｙ＝ヒドロゲル濃度（すなわち、５ｍｇ／ｍＬ＝５）である。
【００２６】
[0047]反応が進んだら、剪断弾性率Ｇ’及びＧ”、並びにそれらの間の位相差デルタを定量化した。対照として、ヒドロゲルへの変化が過酸化物質の添加によるものであることを確かにするために、過酸化物をヒドロゲルに添加しないでオシレーション試験を実施した。各ヒドロゲルの複素剪断弾性率を、オシレーションデータを用いて以下の式１により得た。
【００２７】
【数１】
2017529208.tif 000002
【００２８】
実施例２：軸方向に均質な埋込物を形成するための有窓ニードルの使用
[0048]図３を参照すると、ＢＭＰ及び流動性マトリックス材料の試験中に直面する課題の１つは、埋込物の形成中にこれらの材料が均一に混合されない点であった。これは、マトリックス中のＢＭＰ及び／又は顆粒の濃度が不均一であるため機械的な破損及び／又は矛盾した生物学的活性を生じやすい可能性がある、比較的不均一な埋込物をもたらした。埋込物の均質性を改善するための手段の１つは、有窓ニードル（図３Ａ）の使用であった。有窓ニードルは、その長さに沿って多くの開口部を包含し、この開口部を通って、顆粒を充填したチャンバー（シリンジ筒など）に溶液を流入させることができた。図３に示す実施例では、閉じた遠位端を有する有窓ニードルを、少なくとも部分的に顆粒を詰めたシリンジ筒などの細長いチャンバーのほぼ中心部に挿入している。その後、蛍光標識ＢＭＰ−２及び過酸化水素（生体適合性マトリックスの架橋に必要とされる試薬）の溶液をニードルに通してチャンバーに流入させた。ＢＭＰ−２／過酸化水素溶液に続いて、官能基化ヒアルロン酸の溶液をニードルに通して顆粒上に流した。あるいは、溶液は、中心に位置する有窓ニードルなしで、シリンジのルアーチップに通して顆粒に連続的に施用した。どちらの場合も、流体は近位から遠位の方向に流した。有窓ニードルがない場合、チャンバーに流入させた溶液は、近位に位置する顆粒に必然的に接触してから、遠位に位置する顆粒に到達していた。対照的に、有窓ニードルでは、チャンバーの長軸全体にわたり、新鮮な溶液と顆粒がほぼ同時に接触することが可能であった。図３Ｃ〜３Ｎに例示するように、有窓ニードルを使用すると、ＢＭＰ／過酸化水素及び生体適合性マトリックスの溶液の比較しうるボーラス施用で達成される分布と比較して、得られる埋込物の半径方向（例えば中心から端）及び軸方向（近位から遠位）の両方に沿って、実質的により均一なＢＭＰ分布（蛍光信号）がもたらされた。
実施例３：均質な埋込物を形成するための静的ミキサーの使用
[0049]生体適合性マトリックス内にＢＭＰ担持顆粒を含む埋込物を作製するために、埋込物の成分を２つのシリンジに入れて、静的ミキサーのコネクターを往復して通過させた。ヒドロゲル材料を一方のシリンジに加え、顆粒、望ましいタンパク質（又は染料）及び０．０９％過酸化水素を他方のシリンジで組み合わせた。その後、システムからの成分の漏れ及び／又は成分の時期尚早の混合が起こり得ないように、混合コネクターを、水平に保持されたシリンジにきつく装着した。ヒドロゲルと顆粒成分を混合するために、最初にヒドロゲルシリンジを、顆粒混合物を含有するシリンジにヒドロゲルが移動するように押し込んだ。その後、顆粒混合物シリンジを、すべての成分が静的ミキサーを通って他のシリンジ内に移動するように押し込んだ。この混合は５秒間かけて１０回行った。このプロセスの間に、機器を軸に沿って回転させて、顆粒の沈降を抑制した。５秒間の混合時間の後、すべての材料がシリンジの底部に流入し、埋込物が硬化するように、機器を垂直に置いた。シリンジの外形及び材料の使用量（１８００μＬ）により、直径１０ｍｍで長さ２０ｍｍの円柱状埋込物が形成した。
実施例４：埋込物の機械的分析
[0050]平行板レオメトリーを用いて、静的混合機器を用いて生産した埋込物の機械的特性を評価した。ＡＲ２０００レオメーターを用いて動的レオロジー試験を実施した。埋込物は、１０ｍｇ／ｍＬ濃度での３％チラミン置換物、トリパンブルー染料、０．０９％過酸化物及び顆粒を混合するために単一横棒設計を用いて作製した（表１）。
【００２９】
【表１】
2017529208.tif 000003
【００３０】
[0051]得られた埋込物（直径１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ）を、４つの厚さ５ｍｍの断片（図４Ａ−Ｂ）に切断した。これらの断片に、切断時にシリンジの開口部にもっとも近い断片に対応するＡから、シリンジの開口部からもっとも遠い断片であるＤまで名前を付けた。乾燥を防ぐために、断片を１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で保存した。各切片の質量を測定し、質量を体積０．３９３ｍＬで割ることにより密度を計算した。直径４０ｍｍのアルミニウム平行板形状を用いて、埋込物の各ディスクに圧縮力を加えた（図５）。レオメーターのプレートを試料上面の１００μｍ上方まで移動させ、試料が５０％歪み（２．５ｍｍ）まで圧縮されるように一定速度（１０μｍ／秒）で下降させた。圧縮力を、レオメーターのプレートの高さの関数として記録した。これらの値に基づき、各試料の真応力及び真歪み曲線を計算した。弾性率をこのグラフの線形領域に基づき計算し、試料全体で比較した。これらの試験を、体積に基づき２０％、２５％及び３０％の顆粒濃度で完了した。対照試験は、顆粒を含まないヒドロゲルと、混合用の幾何学的形状物を有さない中空管コネクターを用いて混合した３０％顆粒濃度のものの試験を包含していた。
実施例５：蛍光プレートリーダーの解析
[0052]蛍光標識アルブミンＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７（ＡＦ６４７）タンパク質（励起波長６７０ｎｍ；発光波長６７０ｎｍ）を用いて埋込物を作製した。単一横棒の原型を用いて、ＰＢＳ中に１：２５０で希釈したアルブミンＡＦ６４７で標識した１０ｍｇ／ｍＬ濃度での３％チラミン置換物、０．０９％過酸化物、及び顆粒を混合した（表１）。成形物を５ｍｍの断片に切断し、機械的試験のデータを収集した後、各断片を、１００μＬのＰＢＳを有する４８ウェルプレートの単一ウェルに入れた。プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ  Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、カリフォルニア州サニーベール）で読んで、５ｍｍの各切片中の蛍光強度を決定した。その後、蛍光強度を、各断片中のアルブミンタンパク質の量で正規化した。アルブミンでの予備試験につづき、ＢＭＰ緩衝液（５０ｍＭグルタミン酸、０．７５％グリシン、ｐＨ３．７５）中に１：１２０で希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８（ＡＦ４８８）標識ＢＭＰ−２（励起波長４８８ｎｍ；発光波長５２０ｎｍ）を用いて埋込物を作製し、同じアプローチを用いて蛍光性を測定した。
実施例６：ヒドロゲルの硬化及び剛性の測定
[0053]相対的な過酸化物結合の硬化時間及び剛性を、さまざまなヒドロゲル（例えば、１％、３％、及び５％チラミン塩基置換；５ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ濃度）について特性決定した。各位相差曲線の規則的な減少は、粘性液体から弾性固体への各ヒドロゲルの進行を示している（図６）。硬化時間は、過酸化物を加えたときから、剪断弾性率の剪断貯蔵Ｇ’（弾性）成分が剪断損失Ｇ”（粘性）成分を超えるまでの期間であった。チラミン塩基置換がより多く、ヒドロゲル濃度がより高いヒドロゲルは、所定のチラミン塩基置換内でより緩慢に硬化した（図７）。もっとも硬化時間が長かったヒドロゲルは、５ｍｇ／ｍＬでの１％置換物、１０ｍｇ／ｍＬでの１％、及び１０ｍｇ／ｍＬで３％置換物であった（表２）。
【００３１】
【表２】
2017529208.tif 000004
【００３２】
[0054]複素剪断弾性率Ｇ＊により、試験ヒドロゲル全体での相対的剛性を決定した。より高濃度を有するヒドロゲルは、所定のチラミン塩基置換内でより大きな複素弾性率を有していた（図８）。最終硬化の剛性がもっとも高いヒドロゲルは、１０ｍｇ／ｍＬでの３％置換物及び１０ｍｇ／ｍＬでの５％置換物であった（図８；表３）。１０ｍｇ／ｍＬで３％置換を有するヒドロゲルを選んだ。
【００３３】
【表３】
2017529208.tif 000005
【００３４】
実施例７：機器の原型作製
[0055]ヒドロゲルの選択に続き、埋込物成分を均一に混合するための機器を開発した。設計プロセスに着手するために、混合機器に関し多数の構想を練った。これらの構想は、決して限定するものではないが、２重筒シリンジ、動翼ミキサー、ローリングチューブ(rolling tube)法及び静的ミキサーを包含していた。ヒドロゲル架橋反応の硬化時間は速いため、撹拌バーでの標準的な混合では、ゲルが混合で剪断される前に顆粒の適切な分布が得られない可能性がある。機能上の設計要件にもっとも合っていたため、静的ミキサーを選んだ。静的ミキサーは操作が単純で、製造費が安く、使い捨て可能であり、廃棄物を最小限に抑えつつ埋込物の成分を均一に混合した。これに加えて、該機器は市販のシリンジと一緒に用いることができるので、新しいシリンジの製造に付随する時間及び費用が削減される。
【００３５】
[0056]静的ミキサーの設計を数回繰り返して行って、最短のシリンジ間距離及び気密嵌合をもたらすコネクターを作製した。以前のバージョンのミキサーは、長すぎたため材料がコネクターの内側に引っかかったり、気密性ではなかったため材料が機器の外に染み出ていた。機械加工バージョン及び３Ｄプリンターで作製したバージョンの機器はどちらも短く気密性であったが、機械加工バージョンはより難しく、再現に時間がかかった。３Ｄプリンターで作製したミキサーを再設計して、ミキサー中の材料の流れが断たれ、これによりヒドロゲルの全体にわたり顆粒が均一に分散されるように形作った、さまざまな内部形状を包含させた。２重横棒及び半球形設計など、いくつかのミキサーでは、材料のすべてを流すことができず、コネクター内に廃棄物材料が残った。一部分において、均一な混合をもたらす一方、材料の大部分を流すことができたため、単一横棒設計を選択した。
【００３６】
[0057]４つの初期の構想から、静的ミキサー設計を選択した。３Ｄプリンターで作製した原型は、既存のシリンジが気密になるように、それらのねじ山がかみ合うように設計した。最初に、ゴム製Ｏリングをミキサーの内側に加えて気密シールを作り出した。さらに設計を変更して、より良好にかみ合うねじ山をもたらして、Ｏリングを不要にした。廃棄物を最小限に抑えるために、ミキサーに接続したときのシリンジの末端間の距離を減少させた。ミキサー形状の経過を図９に示す。図１０Ａ〜１０Ｄに示すように、設計の形状及びねじ山を最終決定した後、さまざまな内部混合構造、例えば、中空管（１０Ａ）、半球形（１０Ｂ）、単一横棒（１０Ｃ）及び２重横棒（１０Ｄ）を作製して、それらの混合能力を試験した。
【００３７】
[0058]３Ｄプリンターの温度限界に起因して、混合機器内での混合を観測するために透明プラスチックを用いることはできなかった。したがって、静的ミキサーの追加的原型を、ねじ山のない市販のシリンジとの圧入シールを有するように透明プラスチックチューブをミル加工することにより作製した（図１１Ａ〜１１Ｂ）。これらの部品により機器を介して混合手順を観測することが可能になるが、機械加工上の制約があるため内部形状の可変性は限定的であった。３Ｄプリンターで作製した原型は、はるかに再現性が高く、生産及び改変するための時間効率が高いことが立証された。最初に、異なる混合形状を、それらによってもたらされる埋込物及び廃棄物を視覚的に比較することにより評価した。比較的大量の廃棄物材料が、２重横棒及び半球形の原型（図１２）の静的ミキサー構成部品に残存していた。したがって、３Ｄプリンターで作製した単一横棒の設計を、機器の最終設計として選んだ（図１３）。
実施例８：得られた構築物の均一性の評価
[0059]ミキサー設計を最終決定した後、生産した足場の均一性及び再現性を試験した。足場の均一な機械的強度により、回復中の骨の均等成長が確実になる。足場の機械的特性が不均一である場合、成長中の骨の強度及び密度も変動する可能性がある。したがって、形成した埋込物の４つの切片の全体にわたり密度及び弾性率を試験した。結果は、所定の足場内の切片の全体にわたり密度は比較的均一であり、偏差は約４％であったことを示している。これに加えて、所定の顆粒濃度の足場は再現性があり、単一組成物の各試験は比較的同等の密度を示し、分散は約５％であった。したがって、該混合機器は、密度分布に関し均一な足場を繰り返し作製することができ、分散が１０％以内という要件を満たしている。ゲルは可撓性であり、断片に切断する間に曲がった可能性があるため、これらの試験中に生じた分散のいくつかは、切片のサイズが不完全であることに起因する可能性がある。
【００３８】
[0060]足場の弾性率を解析した際に、この稠度は見られなかった。３０％顆粒の構築物はより均一な分布をもたらし、他の顆粒濃度で約１１％の偏差が見られたのと比較して、切片全体で約９％の偏差しか示さなかった。さまざまな足場に関し、切片間のこの差異は約２％しかないが、これは、３０％濃度を、切片間で１０％の分散という均一性の要件を満たす唯一のものとして区別するには十分であった。
【００３９】
[0061]３０％顆粒の埋込物は、埋込物間の偏差が約８％で、１０％の分散という再現性の要件を満たしていたが、２０％及び２５％顆粒の埋込物は要件を満たさなかった。足場は、遠位末端（Ｄ）より近位切片（Ａ）の方が比較的低い弾性率を有する傾向があった。これは、より重い顆粒が混合終了時にヒドロゲル中に落下し、その間に足場は架橋を完了するためであろう。この要因があるにもかかわらず、３０％顆粒の埋込物は、均一性及び再現性の両方に関し１０％分散という要件を満たしている。
【００４０】
[0062]均一性の他の尺度は、埋込物の長さ全体にわたる顆粒及びタンパク質の広がりである。埋込物の一部の蛍光強度は、存在するタンパク質の量を示す。これはまた、蛍光タンパク質は顆粒の周囲に局在するので、顆粒の存在を間接的に示す。３０％顆粒濃度は、蛍光強度の均一性において１０％未満の偏差を有する唯一の組成物であることが立証され、３０体積％顆粒が望ましい濃度であることがさらに確認された。選択した内部形状に起因する混合を実証するために、中空管を混合機器として用いる対照試験を、３０％顆粒を用いて行った。２つの対照試験の結果、構築物全体にわたる蛍光強度の偏差は約１２％であった。これは１０％の誤差閾値を満たしておらず、単一横棒の原型の有効性を最適設計として裏付けるものである。０％顆粒の対照構築物濃度は、他の組成物からの同等の切片と比較して、蛍光発光強度において顕著な差異を示した。これは、顆粒がアルブミンタンパク質の局在化において重要な役割を果たし、タンパク質をより小さな領域に統合することを示している。材料及び時間が限られていたためＢＭＰ−２でこの結果の再試験は行わなかったが、アルブミンは、低価格で、生体適合性を有し、同様のリン酸カルシウム結合特性を示すため、申し分のない置換物となる。アルブミンの試験は２回しか行っていないが、ＢＭＰ−２で予備試験したプレートリーダーの結果は、２０％及び３０％顆粒濃度がアルブミンの結果と一致することを示した。
【００４１】
[0063]混合機器及びその使用方法の開発では、最適な足場組成物を決定することが必要であった。混合機器に必要な具体的機能は、均一な機械的特性、ヒドロゲル全体にわたる顆粒の分散、及び顆粒間のタンパク質の分布を有する埋込物をもたらすことであった。均一性は、埋込物間の変動が１０％未満であると定義する。最初の原型を開発した後、さまざまな顆粒濃度の試験により、好ましい範囲を２０〜３０体積％顆粒と認定した。より低い顆粒濃度は、ＢＭＰ結合及び構造支持に関し顆粒が少なすぎた。３０％を超える濃度では、顆粒を結合させるのに利用可能なヒドロゲルの効率が悪くなった。これに加えて、顆粒間のヒドロゲルの体積により、骨形成性細胞及び血管がより迅速に埋込物に浸潤することが可能になる。埋込物をシリンジ内に形成させた場合、先端部の形が悪くなる傾向があった。埋込物が所望の外形及び長さを有することが可能になるように、この層をトリミングした。作業室で、この不完全な外形を有する末端を、埋込物が埋め込み部位に適合する外形になるように切断する。これらの特性を、レオメーターでの圧縮分析、プレートリーダーでの蛍光試験、及び共焦点顕微鏡での画像化により試験した。
実施例９：埋込物内の機械的特性の評価
[0064]得られた構築物の線状断片に沿った弾性率を計算して、機械的強度の勾配を決定した（図１４Ａ）。機械的強度は、構築物の近位（切片Ａ）から遠位（切片Ｄ）領域に向かって低下する傾向があったが、試験した顆粒濃度に関し、切片全体の弾性率及び密度の分散は非常に小さかった（図１４Ｂ）。同じ顆粒濃度の構築物全体の間の偏差を比較して、再現性を決定した。３０％顆粒で構成される構築物は、２０％及び２５％顆粒で作製した構築物と比較して、試験全体で統計的に低い弾性率の偏差をもたらした。２０％、２５％及び３０％の顆粒濃度を含有する得られた足場では、試験全体で密度において約５％の相対的標準誤差が見いだされた（図１５）。同じ顆粒濃度の構築物中の切片間の偏差を比較して均一性を決定した。切片全体での弾性率及び密度の偏差に関し、構築物間で顕著な差異は決定されなかった。３つの密度の偏差はすべて、均一性に関し定義した１０％の誤差閾値未満であった；しかしながら、弾性率の偏差の閾値未満だったのは３０％顆粒濃度だけであった（図１６）。
実施例１０：埋込物のタンパク質分布の評価
[0065]蛍光発光の広がりは、静的バー混合機器で生産した構築物が、それらの切片間に蛍光発光の統計的有意差を有していないことを示した（図１７）。０％顆粒組成物は、他の組成物と比較して統計的に低い蛍光発光強度を有することが示された。３０％顆粒を含有する構築物の蛍光の平均差は約９０％であったが、２０％及び２５％の埋込物ではそれぞれ約１４％及び１６％であった（図１８）。２０％及び３０％顆粒濃度に関するＢＭＰ−２の蛍光の読みは１回しか行っていないが、蛍光の測定値は各濃度のアルブミンの値と同様であった（図１９）。
実施例１１：共焦点顕微鏡法を用いた埋込物のタンパク質含量の評価
[0066]共焦点顕微鏡法を用いて、プレートリーダーの蛍光データの結果を証明した。単一横棒機器の原型を用いて埋込物を作製して、１０ｍｇ／ｍＬのヒドロゲル濃度での３％チラミン置換物、ＢＭＰ緩衝液に１：１２０で希釈したＡＦ４８８標識ＢＭＰ−２、０．０９体積％の過酸化物及び３０体積％の顆粒を混合した。構築物を５ｍｍの断片に切断し、機械的試験を実施した後、各断片を１ｍｍに切断し、上側スライドカバー（elevated slide cover）を用いてスライドガラスに固定し、共焦点顕微鏡下で観測した。各断片の中心及び端からスパン１００μの画像１０枚のスタックを収集し、ＩｍａｇｅＪ画像処理ソフトウェアを用いて解析した。各画像の顆粒及びヒドロゲルの区域の折り畳んだスタック（collapsed stack）の平均蛍光強度を収集した。
【００４２】
[0067]ＢＭＰ−２の共焦点顕微鏡法の最大強度の折り畳んだスタック画像を図２０Ａ〜２１Ｂに示す。タンパク質が顆粒の周囲に集中していることが示されている（矢印参照）。蛍光があまり集中していない区域はヒドロゲルの領域である。これは、各切片の中央及び端のヒドロゲル及び顆粒領域を比較する平均蛍光強度値により確認した（図２１Ａ〜２１Ｂ）。
【００４３】
[0068]予想どおり、画像は、各切片中のタンパク質の存在が各顆粒の周囲に特に局在化していることを示した。蛍光強度は、各画像の顆粒領域及びヒドロゲル領域内の平均強度を計算することにより得た。この手順は単一の埋込物についてしか実施していないが、タンパク質強度は、ヒドロゲル中よりも顆粒中の方がはるかに大きかった。しかしながら、切片の端における蛍光強度測定値のばらつきは、中央により近い位置での測定値と比べ大きかった。
【００４４】
[0069]共焦点画像に見られた予想外の副作用は、各顆粒を包囲するリン酸カルシウムダストの曇りであった。各画像には明澄な部分があり、ここは、タンパク質に結合している顆粒デブリの小片を含有している。この作用は、混合プロセス中に破壊した顆粒、又は長期保存の副作用に起因する可能性がある。このデブリの存在理由、及び、デブリが存在する場合にデブリがｉｎ  ｖｉｖｏで埋込物の性能に対し有するであろう作用を決定するために、さらなる調査が必要である。
【００４５】
[0070]本明細書中に開示するように、用いられるヒドロゲルの特性は、合成骨移植片材料の機能的要件を満たす混合機器の能力に大きな影響を及ぼした。過酸化物架橋反応の終了後は、剪断のリスクがあるため、これ以上埋込物の成分を混合してはならない。混合の潜在力は混合時間が長くなると増大するので、より長い硬化時間は、得られる埋込物のより均一な分布と相関する。ヒドロゲルの特性決定の実験により確認された硬化時間は、試験したヒドロゲルの間の相対的ゲル化速度を提供した。より多くのチラミン塩基置換を有するヒドロゲルは、より迅速な硬化時間を有する傾向があり、より高濃度のヒドロゲルは、置換の百分率の範囲内の他のものと比較してゆっくり硬化した。機器の混合条件下で構築物成分を混合したときの硬化時間は著しく速かったが、試験したヒドロゲル間の相対的反応時間は特性決定手順によって決まっていた。したがって、相対的硬化時間がもっとも長かったヒドロゲル（５ｍｇ／ｍＬでの１％置換物、１０ｍｇ／ｍＬでの１％置換物、及び１０ｍｇ／ｍＬでの３％置換物）は、より迅速に硬化したもの（５ｍｇ／ｍＬでの５％置換物及び１０ｍｇ／ｍＬでの５％置換物）と比べ、該混合機器と一緒に用いるのに適していた。これに加えて、各ヒドロゲルの剪断弾性率を機械的安定性の指標として決定した。臨床状況に移行するために、該混合機器で生産した埋込物は体内で力に耐えなければならない。したがって、剛性が著しく高いヒドロゲル（１０ｍｇ／ｍＬでの３％置換物及び１０ｍｇ／ｍＬでの５％置換物）は、該混合機器と一緒に用いるのに、より適合する。濃度１０ｍｇ／ｍＬで３％チラミン塩基置換を有するヒドロゲルは、混合時間が比較的長く、臨床用途に必要なより高い剛性を有するので、合成骨移植片材料としてもっとも適合していた。
結び
[0071]本明細書中で用いる場合、「及び／又は」という句は、要素の「いずれか又は両方」がそのように等位接続している、すなわち、要素が、いくつかの場合には接続的に存在し、他の場合には非接続的に存在することを意味すると理解すべきである。そうではないと明記されていない限り、「及び／又は」節によって具体的に識別される要素以外の他の要素が、具体的に識別されている要素に関連しているか否かにかかわらず、存在していてもよい。したがって、非限定的例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などの非限定的用語と併せて用いる場合、例えば、１つの態様では、Ｂを含まないＡ（Ｂ以外の要素を包含していてもよい）をさし；他の態様では、Ａを含まないＢ（Ａ以外の要素を包含していてもよい）をさし；さらに他の態様では、Ａ及びＢの両方（他の要素を包含していてもよい）をさすことができる。
【００４６】
[0072]「実質的に〜から成る」という用語は、本明細書中で他に定義しない限り、作用に寄与する他の材料を排除することを意味する。それにもかかわらず、そのような他の材料は、集合的又は個別に、微量に存在していてもよい。
【００４７】
[0073]本明細書に用いる場合、「実質的に」又は「約」という用語は、＋または−１０％（例えば、重量基準又は体積基準）であることを意味し、いくつかの態様では、＋または−５％であることを意味する。本明細書の全体にわたり、「１例」、「ある例」、「１つの態様」又は「ある態様」への言及は、実施例に関連して記載する特定の特徴、構造、又は特性が本技術の少なくとも１例に包含されることを意味する。したがって、本明細書の全体にわたりさまざまな句における「１例において」、「ある例において」、「１つの態様」又は「ある態様」という句の存在は、必ずしもすべてが同じ例をさすわけではない。さらに、特定の特徴、構造、慣例、段階又は特性は、任意の適した方法で該技術の１以上の例に組み合わせることができる。本明細書中に記載する見出しは便宜上のものにすぎず、特許請求する技術の範囲又は意味を制限又は説明するものではない。
【００４８】
[0074]本発明の特定の態様を先に記載した。しかしながら、本発明はそれらの態様に限定されるものではなく、むしろ、本明細書中に明確に記載した内容への追加及び修正も本発明の範囲内に包含されることを意図することに、明確に留意する。さらに、本明細書中に記載するさまざまな態様の特徴は、互いに排他的ではなく、さまざまな組合せ及び順序で、そのような組合せ又は順序が本明細書中で表現されていない場合であっても、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、存在することができる。実際、当業者なら、本明細書中の記載内容の変動、修正、及び他の遂行を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく思いつくであろう。したがって、本発明は、先の例示的解説によってのみ定義されるものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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