(57)【要約】  本明細書にて、対象から単離されたサンプル中の抗原特定Ｔ細胞の検出方法及び抗原の免疫活性化エピトープのマッピング方法が開示される。このような方法は、例えば、癌、感染症及び自己免疫疾患などの疾患を治療するための抗原特定Ｔ細胞組成物の作製方法で使用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的Ｔ細胞の検出方法及び前記抗原特異的Ｔ細胞が応答する免疫活性化エピトープの同定方法であって、
（ａ）１つ以上のペプチドを含むエピトーププールを有する対象者由来のＴ細胞を含むサンプルの少なくとも１つのマクロバルク培養物をインビトロでプライミングすることであって、
前記エピトーププール中の各ペプチドは、異なる抗原断片であり；
（ｂ）前記エピトーププール中、前記ペプチドの少なくとも１つに特異的なＴ細胞により、少なくとも１つの活性化サイトカインの前記検出可能な放出が可能な十分な期間、前記マクロバルク培養物を前記エピトーププールにより再刺激することと；
（ｃ）前記マクロバルク培養物中に前記少なくとも１つの活性化サイトカインの存在の有無を検出することであって、
前記培養物中に前記少なくとも１つの活性化サイトカインの前記存在により、前記抗原に特異的なＴ細胞を検出し、抗原特異的Ｔ細胞が応答する免疫活性化エピトープを含むように、前記抗原の前記断片を同定することとを含む、前記方法。
【請求項２】
各エピトーププールは少なくとも２つのペプチドを含む、請求項１に記載の方法であって、
各ペプチドは、前記エピトーププールにおいて少なくとも１つの他のペプチドと同一の重なりアミノ酸配列の領域を共有し、前記エピトーププール中の前記ペプチドが前記抗原の連続領域を共にスパンし、前記培養物中の前記少なくとも１つの活性化サイトカインの前記存在により前記エピトーププール中の前記ペプチドによりスパンされる前記領域を、抗原特異的Ｔ細胞が応答する免疫活性化エピトープを含むと、同定する、前記方法。
【請求項３】
各マクロバルク培養物は、４．５ｘ１０5細胞／ｍＬ／ｍｍ3の密度でＴ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが患者から単離された末梢血単核球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者は疾患を有し、前記抗原は前記疾患に関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患は自己免疫疾患であり、前記抗原は前記自己免疫疾患関連自己抗原である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記自己免疫疾患は多発性硬化症であり、前記自己抗原はミエリンタンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ミエリンタンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン稀突起膠細胞タンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患は腫瘍であり、前記抗原は腫瘍関連抗原である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドは約１６アミノ酸長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
各エピトーププールは少なくとも２つの異なるペプチドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
２つの異なるペプチド間の重なりアミノ酸の前記領域は１２アミノ酸長である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性化サイトカインはＩＦＮγである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性化サイトカインはＥＬＩＳＡによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記エピトーププールは、少なくとも２つのエピトーププールを含むライブラリー由来であり、前記ライブラリーにおいて各エピトーププールについてステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返し行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
エピトーププールの前記ライブラリーは、前記抗原の少なくとも５０％をスパンするペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記検出ステップは、前記マクロバルク培養物中に２つの活性化サイトカインの存在の有無を検出することと、
前記培養物中に両方の活性化サイトカインの前記存在により、前記抗原に特異的なＴ細胞を検出し、前記抗原の前記断片を、前記抗原特異的Ｔ細胞が応答する免疫活性化エピトープを含むと、同定すること、とを含む方法。
【請求項１８】
前記２つの活性化サイトカインは、（ａ）ＩＦＮγ及びＴＮＦａ、（ｂ）ＩＦＮγ及びＩＬ−６、並びに（ｃ）ＴＮＦａ及びＩＬ−６からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
疾患を有する患者の治療用組成物の作製方法であって、
（ａ）前記患者由来のサンプル内に抗原特異的Ｔ細胞を検出することと、前記疾患に関連し、前記抗原特異的Ｔ細胞が請求項１に記載の方法により応答する抗原の免疫活性化エピトープを同定することと、
（ｂ）前記同定された免疫活性化エピトープを有する前記患者から単離されたＴ細胞を伝播すること、とを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記疾患は癌であり、前記抗原は腫瘍関連抗原または癌関連腫瘍特異的抗原である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
最終ステップとして、前記伝播Ｔ細胞を減衰させる前記ステップを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患は自己免疫疾患であり、前記抗原は前記自己免疫疾患関連自己抗原である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法により製造されたＴ細胞を含む組成物。
【請求項２４】
請求項１９に記載の方法により製造された前記組成物を投与することを含む、疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の抗原特異的Ｔ細胞の検出方法、抗原特異的Ｔ細胞が応答する抗原の免疫活性化エピトープの同定方法、例えば、疾患の治療のためのＴ細胞組成物作成のための同方法の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗原に対するＴ細胞応答は、抗原断片のＴ細胞、すなわち、エピトープによる認識が関与し、抗原提示細胞に発現する分子を提示する抗原という文脈で提示される。抗原タンパク質の所定の断片が免疫活性化エピトープであるか否か、すなわち、Ｔ細胞応答を刺激することができるか否かは、多くの場合、抗原提示分子へのその結合特性及びエピトープの特異的アミノ酸と適切なＴ細胞受容体との相互作用に依存する。特に疾患の発病中に、抗原特異的Ｔ細胞を検出すること及び抗原のエピトープがＴ細胞媒介免疫に関与していることを理解することは、免疫応答の指向性調節及びワクチンの開発並びにアレルゲン、自己免疫疾患及び腫瘍の治療の基礎となる。
【０００３】
例えば、自己免疫疾患の場合、ミエリンタンパク質エピトープに対して自己Ｔ細胞の反応性を伴う免疫療法では、ミエリン反応性Ｔ細胞の除去及び／または負の調節での有効性及び多発性硬化症（ＭＳ）患者の潜在的な臨床的利点をもたらすことが明かになった。しかし、各患者のＴ細胞免疫療法では、こうした自己反応性Ｔ細胞のＴ細胞受容体が多様性に富み、かつ異なるＭＳ患者間でそれらのエピトープの特異性が異なるため、個別化する必要がある（Ｖａｎｄｅｖｙｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．．Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５；２５：９５８〜９６８，Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４；１５２：５５８１〜５５９２．  Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９；１６３：３５３０〜３５３８）。
【０００４】
各患者の個別化に加えて、自己免疫疾患に対するＴ細胞免疫療法剤を上手く作製するには、自己反応性Ｔ細胞の検出及び自己反応性Ｔ細胞が結合するエピトープの同定を行う必要がある。抗原の免疫活性化エピトープのマッピング及びの治療用途のＴ細胞クローニングための標準法としては、抗原のプライミングが関与し、一般に、Ｔ細胞と抗原とインキュベーションし、その後、個々の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングすることを含む。その後、細胞を拡張し、ペプチドの特異性に関して、抗原をカバーする個々のペプチドで、クローンをスクリーニングするという、労働集約型の時間がかかる工程によって、アッセイを行う。次に、Ｔ細胞免疫療法で使用するために、免疫刺激に対する陽性を試験するペプチドエピトープを用いて、クローン性Ｔ細胞株を得て拡張させる。
【０００５】
細胞治療方法も、腫瘍、ウイルス及び病原菌に対する宿主免疫反応を向上するために開発されている。これらの細胞療法は、多くの場合、腫瘍または病原体に関連する抗原に特異的な自己Ｔ細胞のエックスビボ活性化及び拡張も伴う。これらの処置の種類の例としては、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞の使用（米国特許第５，１２６，１３２号（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇに発行）を参照のこと）、細胞障害性Ｔ細胞（米国特許第６，２５５，０７３号（Ｃａｉ，ｅｔ  ａｌ．に発行）及び米国特許第５，８４６，８２７号（Ｃｅｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．に発行）を参照のこと）、拡張腫瘍潅流リンパ節細胞（米国特許第６，２５１，３８５号（Ｔｅｉ  ｍａｎに発行）を参照のこと）及びさまざまな他のリンパ球調整物（米国特許第６，１９４，２０７号（Ｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．に発行）を参照されたい；米国特許第５，４４３，９８３号（Ｏｃｈｏａ，  ｅｔ  ａｌ．に発行）；米国特許第６，０４０，１７７号（Ｒｉｄｄｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．に発行）；米国特許第５，７６６，９２０号（Ｂａｂｂｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．に発行））が挙げられる。
【０００６】
しかし、患者から容易に得られるサンプル中でのこのような抗原特異的Ｔ細胞の頻度は低い可能性がある。例えば、ＭＳ患者の末梢血中での自己反応性Ｔ細胞の頻度は、末梢血単核球約１／１０5〜１／１０6（Ｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：１８３〜７；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：５４０〜８）である。Ｔ細胞生成物を作製している間の自己反応性Ｔ細胞の患者サンプルをスクリーニングするときには、この点が課題となる。採血１２０ｍｌでの典型的な収率は、全Ｔ細胞約１００万だからである。
【０００７】
この目的を達成するために、稀な反応性Ｔ細胞を検出し、かつ、頑強な方法でそれらが応答する免疫活性化エピトープを同定するにあたって、十分に感受性のあるアッセイを必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書にて、サンプル中の抗原特定Ｔ細胞の検出方法及び抗原の免疫活性化エピトープの同定方法が開示される。本明細書にて開示したように、こうしたアッセイを開発するために、いくつかの方法を調査したところ、驚くべきことに、Ｔ細胞のマクロバルク培養物が依然として生存可能であることが判明した。したがって、本明細書にて開示された好ましいアッセイ形式では、Ｔ細胞を含むサンプルの「マクロバルク培養物」を使用して、サンプルを高濃度及び高密度でエピトーププールと共に培養し、このプールは、自己抗原のペプチドが重なっていることを含むことが好ましい。
【０００９】
概して、抗原特異的Ｔ細胞の検出方法及び抗原特異的Ｔ細胞が応答する免疫活性化エピトープの同定方法は、以下を含む；（ａ）１つ以上のペプチドを含むエピトーププールを有するＴ細胞を含む対象由来のサンプルの少なくとも１つのマクロバルク培養物をインビトロでプライミングすることであって、エピトーププール中の各ペプチドは、異なる抗原断片であり；（ｂ）エピトーププール中、ペプチドの少なくとも１つに特異的なＴ細胞により検出可能な放出が可能な十分な期間、マクロバルク培養物をエピトーププールにより再刺激することと、（ｃ）マクロバルク培養物中に少なくとも１つの活性化サイトカインの存在の有無を検出すること、であって、培養物中の少なくとも１つの活性化サイトカインの存在により抗原特異的Ｔ細胞が検出され、エピトーププール中のペプチド（複数可）によってスパンされる抗原領域は、抗原特異的Ｔ細胞が応答する免疫活性化エピトープを含むと同定される。一実施形態では、複数のマクロバルク培養物を用いて、成果物を更に精製し、統計分析を行うことができる。好ましい実施形態では、エピトーププールは、少なくとも２つのペプチドを含み、各ペプチドは、エピトーププールにおいて少なくとも１つの他のペプチドと同一であるアミノ酸配列が重なっている領域を共有し、かつエピトーププール中のペプチドは、共に、抗原の連続的領域をスパンする。
【００１０】
一実施形態では、本方法は、以下を含む；（ａ）少なくとも２つのエピトーププールを含むライブラリー由来の異なるエピトーププールを有するＴ細胞を含む対象由来のサンプルの複数のマクロバルク培養物のそれぞれをインビトロでプライミングすることであって、ライブラリー内の各エピトーププールは、それぞれが異なる抗原断片を含む１つ以上のペプチドを含み、（ｂ）十分な期間プライムされるエピトーププールにより、Ｔ細胞を含む各マクロバルク培養物を再刺激して、エピトーププール中、少なくとも１つのペプチドに特異的な活性化Ｔ細胞により、少なくとも１つの活性化サイトカインの検出可能な放出を可能にすることと、（ｃ）複数のマクロバルク培養物のそれぞれにおける活性化サイトカインの存在の有無を検出することとであって、マクロバルク培養物中の活性化サイトカインの存在により、抗原特異的Ｔ細胞を検出し、マクロバルク培養物をプライムし、再刺激するために使用されるエピトーププール中のペプチド（複数可）によってスパンされている抗原の領域はＴ細胞が応答する免疫活性化エピトープ含むと同定すること。好ましい実施形態では、エピトーププールは、少なくとも２つのペプチドを含み、各ペプチドは、エピトーププール中、少なくとも１つの他のペプチドと同一であるアミノ酸配列が重なっている領域を共有し、かつエピトーププール中のペプチドは、共に、抗原の連続的領域をスパンする。一実施形態では、エピトーププールのライブラリーは、抗原の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％をスパンするペプチドを含む。
【００１１】
一実施形態では、マクロバルク培養物は、約２ｘ１０5細胞／ｍＬ／ｍｍ3〜約２ｘ１０6細胞／ｍＬ／ｍｍ3を含む。一実施形態では、マクロバルク培養物は、約４ｘ１０5細胞／ｍＬ／ｍｍ3〜約１ｘ１０6細胞／ｍＬ／ｍｍ3を含み、好ましい実施形態では、マクロバルク培養物は、約５ｘ１０5細胞／ｍＬ／ｍｍ3を含む。
【００１２】
サンプルは、哺乳類から入手することが好ましい。一実施形態では、サンプルは、げっ歯類から入手する。好ましい実施形態では、サンプルは、ヒトサンプルである。別の実施形態では、サンプルは、抗原提示分子を更に含み、これらは可溶性であるか、または抗原提示細胞によって発現され得る。好ましい実施形態では、サンプルは、末梢血単核球細胞のサンプルである。別の好ましい実施形態では、サンプルは、ヒト末梢血単核球細胞である。
【００１３】
好ましい実施形態では、サンプルは、疾患を有する患者から入手し、抗原は疾患と関連がある。一実施形態では、疾患は感染症であり、抗原は、疾患関連感染性病原体から単離される。別の実施形態では、疾患は癌であり、抗原は関連腫瘍または腫瘍特異的抗原である。好ましい実施形態では、疾患は自己免疫疾患であり、抗原は自己免疫疾患関連自己抗原である。最も好ましくは、疾患は多発性硬化症であり、抗原はミエリンタンパク質である。一実施形態では、ミエリンタンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン稀突起膠細胞タンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
ある実施形態では、ペプチドプール中の各ペプチドは、約１０〜約２０のアミノ酸長さ、好ましくは約１６のアミノ酸長である。別の実施形態では、各ペプチドプールは１つ以上のペプチド類を含む。一実施形態では、各ペプチドプールは、少なくとも２つのペプチドを含み、ペプチド間でアミノ酸が重なっている領域は、長さ約４〜約１６、好ましくは１２のアミノ酸長である。
【００１５】
一実施形態では、マクロバルク培養物は、１〜１０日間エピトーププールによってプライミングする。好ましい実施形態では、マクロバルク培養物は、少なくとも５日間エピトーププールによってプライミングする。
【００１６】
一実施形態では、マクロバルク培養物は、追加の抗原提示細胞またはペプチド担持人工ＡＰＣの存在下にて、エピトーププールで少なくとも１２時間再刺激する。好ましい実施形態では、マクロバルク培養物は、少なくとも１日間エピトーププールで再刺激する。
【００１７】
一実施形態では、活性化サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−３５、ＴＮＦα及びＩＦＮγからなる群から選択される。好ましい実施形態では、活性化サイトカインはＩＦＮγである。別の実施形態では、検出ステップは、２つの活性化サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ及びＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ−６、またはＴＮＦα及びＩＬ−６）の存在の有無を検出することを含む。好ましい実施形態では、活性化サイトカイン（複数可）は、フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ  ａｓｓａｙ）、ビード系多重アッセイ及びサイトカイン捕捉アッセイからなる群から選択される方法によって検出される。最も好ましくは、活性化サイトカインは、ＥＬＩＳＡにより検出される。別の実施形態では、活性化サイトカイン（複数可）は、ビード系多重アッセイを介して検出される。
【００１８】
また本明細書で開示されるのは、疾患治療用の組成物の作製方法であって、（ａ）疾患を有する患者において抗原特異的Ｔ細胞を検出すること、及び本明細書で開示される方法により抗原特異的Ｔ細胞が応答する免疫活性化エピトープを同定することであって、Ｔ細胞を含むサンプルは患者から単離されることと、（ｂ）同定された免疫活性化エピトープを有する患者から単離されたＴ細胞を伝播することとを含む。一実施形態では、疾患は癌であり、抗原は関連腫瘍または癌の腫瘍特異的抗原である。本明細書では、こうして作製されたＴ細胞の組成物及び癌などの疾患の処置方法におけるこうした組成物の使用も開示される。このような使用は、治療的有効量のＴ細胞を含む組成物を癌患者に投与することを含む。
【００１９】
一実施形態では、疾患処置のための組成物の作製方法は、最終のステップ（ｃ）として伝播Ｔ細胞を減衰させること、を更に含む。一実施形態では、疾患は自己免疫疾患であり、抗原は自己免疫疾患関連自己抗原である。好ましい実施形態では、自己免疫疾患は多発性硬化症であり、自己抗原はミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質及びミエリン稀突起膠細胞からなる群から選択される。本明細書では、こうして作製されたＴ細胞の組成物及び自己免疫疾患などの疾患の処置方法におけるこうした組成物の使用も開示される。好ましい実施形態では、本明細書に開示の方法によって作製した減衰Ｔ細胞を含む組成物を使用して、自己免疫疾患の処置を行う。このような使用には、治療的有効量の減衰Ｔ細胞を自己免疫疾患患者に投与することを含む。好ましい実施形態では、自己免疫疾患は多発性硬化症であり、自己抗原はミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質及びミエリン稀突起膠細胞からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２つの播種密度での第４日目のＰＢＭＣによるＣＭＶｐｐ６５誘導ＩＦＮγ応答。
【図２】２つの播種密度での第６日目のＰＢＭＣによるＣＭＶｐｐ６５誘導ＩＦＮγ応答。
【図３】キラー細胞として、ＭＳドナー０１１０３４ＰＢＭＣを用いた抗−ミエリンペプチドＩＦＮγ活性。
【図４】キラー細胞として、ＭＳドナー０１１０５４ＰＢＭＣを用いた抗−ミエリンペプチドＩＦＮγ活性。
【図５】免疫優勢破傷風毒素ペプチドエピトープへの応答。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ前の直接エクスビボ対マイクロ培養５日目。データは、四通りのＥＬＩＳｐｏｔウェルの中央値及びＳＤを示す。
【図６】ＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔにより第６日目に検出された健常ドナー０３１０６抗−ミエリンペプチド免疫。データは、四通りのＥＬＩＳｐｏｔウェルの中央値及びＳＤを示す。対照：陰性対照。
【図７】ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔにより第６日目に検出された健常ドナー０３１０６抗−ミエリンペプチド免疫。データは、四通りのＥＬＩＳｐｏｔウェルの中央値及びＳＤを示す。対照：陰性対照。
【図８Ａ】ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔにより第６日目に検出されたＭＳドナー０３１０２抗−ミエリンペプチド免疫。データは、四通りのＥＬＩＳｐｏｔウェルの中央値及びＳＤを示す。（左パネルアッセイ１、右パネルアッセイ２）対照：媒質中の単独での細胞。
【図８Ｂ】ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔにより第６日目に検出されたＭＳドナー０３１０２抗−ミエリンペプチド免疫。データは、四通りのＥＬＩＳｐｏｔウェルの中央値及びＳＤを示す。（左パネルアッセイ１、右パネルアッセイ２）対照：媒質中の単独での細胞。
【図９Ａ】ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔにより第６日目に検出されたＭＳドナー０３１０３抗−ミエリンペプチド免疫。データは、四通りのＥＬＩＳｐｏｔウェルの中央値及びＳＤを示す。（左パネルアッセイ１、右パネルアッセイ２）対照：媒質中の単独での細胞。
【図９Ｂ】ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔにより第６日目に検出されたＭＳドナー０３１０３抗−ミエリンペプチド免疫。データは、四通りのＥＬＩＳｐｏｔウェルの中央値及びＳＤを示す。（左パネルアッセイ１、右パネルアッセイ２）対照：媒質中の単独での細胞。
【図１０】ＭＯＧｍ１６ペプチドプールに対する陽性免疫の検出に及ぼす播種密度及び解離ステップの影響。未処置：マイクロチューブ及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイの双方においてペプチドの不存在下で培養したＰＢＭＣ。データは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにプレーティングされた四通りのウェルの中央値及びＳＤを示す。
【図１１】ＥＬＩＳｐｏｔ「スポット」の形状及び寸法分布−高頻度の反応亢進Ｔ細胞の不正確な定量化同一の設定を用いて、３つのすべてのウェルの計数を行った。
【図１２】ＭＳドナー０３１７１−ミエリンペプチドプールに対する陽性応答を検出するためのＥＬＩＳｐｏｔとｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡとの比較斜影線は、アッセイの検出上限を超え、このため、公式の定量化を行うことなく、陽性応答が示されるｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡデータ点を示す。対照：対照。
【図１３】ＭＳドナー０３１７２−ミエリンペプチドプールに対する陽性応答を検出するためのＥＬＩＳｐｏｔとｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡとの比較斜影線は、アッセイの検出上限を超え、このため、公式の定量化を行うことなく、陽性応答が示されるｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡデータ点を示す。対照：対照。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、サンプル中の抗原特異的Ｔ細胞の検出方法、及び抗原特異的Ｔ細胞が応答する、及び／または特異的である抗原の免疫活性化エピトープ（複数可）の同定方法を提供する。本明細書では、驚くべきことに、免疫細胞のマクロバルク培養物（例えば、高密度で、かつ、互いに極めて接近して細胞を培養しているなど）は、免疫活性化エピトープと接触したとき、培養物中、稀な抗原特異性免疫細胞の検出可能な活性化を助長する環境を提供するという発見が開示される。本明細書で開示される方法は、一般に、１つ以上のペプチドを含むエピトーププールで、Ｔ細胞を含むサンプルのインビトロマクロバルク培養物をプライミングすることを含む。Ｔ細胞を含むマクロバルク培養物をエピトーププールで再刺激し、エピトーププール中の１つ以上のペプチドに特異的であるＴ細胞は、検出可能レベルの活性化サイトカインを分泌することができる。こうした活性化サイトカインの検出は、サンプル中の活性化Ｔ細胞の検出及びエピトーププール中のペプチドによってスパンされる抗原の領域が活性化Ｔ細胞の免疫活性化エピトープを含んでいるという判定と相関する。
【００２２】
免疫系のＴ細胞は、例えば、げっ歯類の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）またはヒトにおけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）など、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に発現する抗原提示分子に錯体化されたペプチドを認識する。Ｔ細胞による抗原認識の特異性は、いくつかのパラメーターによって定義される：１）抗原提示分子に錯体化したペプチドへのＴ細胞受容体のアフィニティー；２）抗原ペプチドの一次配列；及び３）抗原ペプチド内での特定のアミノ酸組み合わせの相乗効果。抗原特異性が高いことがＴ細胞活性化の特徴であると一般に考えられている。したがって、本明細書で使用するとき、抗原特異的Ｔ細胞は、特異的抗原によって活性化されたＴ細胞またはそれらの免疫活性化エピトープを指す。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「エピトープ」としては、抗原提示分子と関連して、Ｔ細胞受容体への特異的結合が可能である抗原の任意のペプチド断片が挙げられる。エピトープ決定基とは、通常、アミノ酸、糖側鎖などの化学的表面活性分子群であり、また、通常、特定の電荷特性など、特定の３次元構造的特性を有する。本明細書で使用するとき、「免疫活性化エピトープ」としては、免疫細胞受容体への特異的結合が可能であり、また、例えば、結合時にＴ細胞などの免疫細胞の活性化が可能である抗原の任意のペプチド断片が挙げられる。
【００２４】
当業者は、Ｔ細胞の活性化は増殖をもたらすことを理解するであろう。したがって、本明細書に記載のエピトーププールによるＴ細胞を含むサンプルのプライミング及び再刺激の双方により、Ｔ細胞の増殖が刺激される。
【００２５】
本明細書で使用するとき、「プライミング」とは、獲得免疫細胞とその特異的抗原との間での初回接触を意味する。したがって、インビトロプライミングは、エピトープによるＴ細胞のインビトロ初回刺激を意味する。好ましい実施形態では、少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも約２日〜１０日間、Ｔ細胞をペプチドプールによりプライミング（例えば、接触、インキュベート、培養など）する。最も好ましくは、Ｔ細胞は、ペプチドプールにより、５日間、プライミングする。
【００２６】
免疫細胞は、抗原（またはそのエピトープ）によりプライミングし、その後、免疫細胞と抗原とを接触させ、本明細書では、この抗原は「再刺激」とも称される。好ましい実施形態では、少なくとも２時間、好ましくは少なくとも約１２時間以上（例えば、２４時間、４８時間または７２時間など）、Ｔ細胞をペプチドプールにより再刺激（例えば、接触、インキュベート、培養など）する。最も好ましくは、Ｔ細胞は、ペプチドプールにより、約１日間、再刺激する。
【００２７】
本発明の別の態様では、目的とする対象から単離されたＴ細胞を含むサンプルを、本明細書に記載の方法によって同定された免疫活性化エピトープと接触させて、エピトープが誘導される抗原に特異的なＴ細胞を伝播する。一実施形態では、約３〜１４日間、好ましくは少なくとも５日間、サンプルを免疫活性化エピトープと接触させる。最も好ましくは、サンプルは、治療的有効量のＴ細胞を提供するのに十分な時間、免疫活性化エピトープと接触させる。
【００２８】
マクロバルク培養物
【００２９】
本発明の一態様では、Ｔ細胞を含むサンプルのマクロバルク培養物はペプチドと接触させ、Ｔ細胞のインビトロプライミング及び／または再刺激が可能になる。本明細書で使用するとき、「マクロバルク培養物」とは、高濃度及び密度で培養している細胞を意味する。このような高濃度及び密度は、例えば、平底またはＵ型底のプレートまたはフラスコではなく、小容量培地及び培養チューブを用いて達成することができる。例えば、２４ウェルプレートに１Ｘ１０6細胞／ｍＬをプレーティングすることとは対照的に、１．５ｍＬ培養チューブにプレートさせて、細胞の密度を増加させてもよい。代表的実施形態において、少なくとも、１Ｘ１０6細胞、好ましくは少なくとも２．５Ｘ１０6細胞、最も好ましくは少なくとも３Ｘ１０6細胞の培地、少なくとも１ｍＬ、好ましくは少なくとも１．５ｍＬに懸濁し、例えば、１．５ｍＬ培養チューブ、最も好ましくは５ｍＬ培養チューブなどの小型培養チューブで培養する。
【００３０】
好ましい実施形態では、サンプルのマクロバルク培養物は、約２ｘ１０5細胞／ｍＬ／ｍｍ3〜約２ｘ１０6細胞／ｍＬ／ｍｍ3を含む。一実施形態では、マクロバルク培養物は、約４ｘ１０5細胞／ｍＬ／ｍｍ3〜約１ｘ１０6細胞／ｍＬ／ｍｍ3を含む。好ましい実施形態では、マクロバルク培養物は、約５ｘ１０5細胞／ｍＬ／ｍｍ3を含む。マクロバルク培養物の使用に加えて、本明細書に記載されるように、細胞培養のために（例えば、Ｔ細胞のペプチドによるプライミング、再刺激、及び伝播など）の標準技術を使用する。
【００３１】
Ｔ細胞を含むサンプル及び／またはＴ細胞は、例えば、げっ歯類、ヒトなどの任意の哺乳類から単離されてもよい。好ましい実施形態では、サンプルは、疾患を有する哺乳類から単離されるか、またはヒトの疾患モデルを提供する。更に好ましい実施形態では、サンプルは、ヒト、最も好ましくは、これらに限定されないが、感染症、癌または自己免疫疾患などの疾患に罹患しているヒトから単離される。
【００３２】
Ｔ細胞を含むサンプル及び／またはＴ細胞は、哺乳類、哺乳類の細胞のインビトロ培養、細胞の凍結サンプルなど由来の新鮮サンプルとして単離させることができる。好適なサンプルとしては、例えば、血液、リンパ液、リンパ節、脾臓、肝臓、腎臓、膵臓、扁桃、胸腺、関節、滑液及びＴ細胞が誘導され得る他の組織を挙げることができる。好ましい実施形態では、Ｔ細胞を含むサンプルは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）として単離される。ＰＢＭＣは、遠心分離法（例えば、軟膜からなど）によって、密度勾配遠心法（例えば、フィコール・ハイパックを介して）によって、パンニング法、アフィニティー単離法、細胞選別法（例えば、１つ以上の細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いて）によって、及び富化したＰＢＭＣ及び／またはＴ細胞をもたらす他の技術によって部分的に精製されてもよい。
【００３３】
代表的一実施形態では、ＰＢＭＣは、標準フィコール・ハイパック方法により血液サンプルから単離される。血液サンプルは、ヘパリンで処理し、Ｆｉｃｏｌｌ溶液に入れた。遠心分離後、回収した細胞はＰＢＳまたはＴ細胞培養培地で洗浄することができる（例えば、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１５％貯留ヒト血清、ＡＩＭ−Ｖ；ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  ＣＴＳなどを補充したＲＰＭＩ１６４０）。既知の技術を使用して、洗浄した細胞は、細胞培養培地で再懸濁するか、または培養チューブに入れて、本明細書に記載されるように、マクロ培養物を形成してもよい。好ましい実施形態では、本明細書で開示される方法は、約４．０ｘ１０5ＰＢＭＣ／ｍＬ／ｍｍ3〜約２Ｘ１０6ＰＢＭＣ／ｍＬ／ｍｍ3の濃度及び密度で末梢血単核球細胞のマクロバルク培養物をプライミングすることを含む。好ましい実施形態では、本明細書で開示される方法は、約４．５ｘ１０5ＰＢＭＣ／ｍＬ／ｍｍ3の濃縮及び密度でＴ細胞を含む末梢血単核球細胞のマクロバルク培養物をプライミングすることを含む。
【００３４】
ペプチド、エピトーププール及びライブラリー
【００３５】
上記のように、本明細書に開示の方法は、Ｔ細胞を含むサンプルのマクロバルク培養物をペプチド（例えば、プライミング及び再刺激ステップ中、エピトーププールの一部であってもよい）と共にインキュベートすることを含む。概して、ペプチドは、約９のアミノ酸長〜約２０のアミノ酸長以上であってもよい。好ましい実施形態では、ペプチドは、約１６のアミノ酸である。エピトーププールまたはエピトープライブラリー中の各ペプチドは、異なる抗原断片（例えば、連続抗原断片と同一のアミノ酸配列を共有する）であってもよい。一実施形態では、各ペプチドは、抗原の連続断片と少なくとも７５％、例えば、約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有し、該断片は、少なくとも７のアミノ酸長であってもよく、また、抗原の全長未満である。
【００３６】
ペプチドは、任意の好適な抗原から誘導することができる。特定の実施形態において、抗原は、少なくとも約４キロダルトン（ｋＤ）、少なくとも約６ｋＤ、または少なくとも約１０ｋＤである。好適な抗原としては、例えば、病原菌から誘導される抗原、自己免疫疾患関連抗原、さまざまな癌と関連した腫瘍関連または腫瘍特異的抗原などを挙げることができる。
【００３７】
例示的実施形態では、抗原は、これらに限定されないが、以下などの腫瘍関連または特定の癌関連の腫瘍特異的抗原である；サイトケラチン、特にサイトケラチン８、１８及び１９；上皮細胞膜抗原（ＥＭＡ）；ヒト胚抗原（ＨＥＡ−１２５）；ＭＢｒｌ、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６及びＴ１６などのヒト乳脂肪球；デスミン；筋特異的アクチン；胎盤アルカリリン酸分解酵素；ベータヒト柔毛膜性生殖腺刺激ホルモン；α−胎児性タンパク質；前立腺特異抗原（ＰＳＡ）；結腸硬癌の癌胎児性抗原；ＨＭＢ−４５；クロモグラニン−Ａ；シナプトフィジン、チロシナーゼなど。
【００３８】
加えて、代表的実施形態では、抗原は病原体から誘導される。非限定例としては、単純ヘルペス−２ウイルスＶＰ１６、破傷風毒素、インフルエンザ血球凝集素、ＨＩＶｇａｇ、サイトメガロウイルスｐｐ６５、ＨＢＶ表面抗原及び他のウイルスのエンベロープ及びコートタンパク質などが挙げられる。
【００３９】
好ましい実施形態では、抗原は、自己免疫疾患関連自己抗原である。自己抗原の非限定的例としては、ミエリン塩基性蛋白質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン稀突起膠細胞タンパク質、アクアポリン４、血小板膜糖蛋白ＩＩｂ−ＩＩＩａ及びＩｂ−ＩＸ、インスリン、プロインスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、熱ショックタンパク質６５（ｈｓｐ６５）、膵島細胞抗原６９（ＩＣＡ６９）、膵島細胞抗原関連タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、ＧＭ２−１ガングリオシド、Ｔｅｐ６９、膵島細胞タンパク質チロシンホスファターゼ及び膵島細胞タンパク質チロシンホスファターゼ誘導３７ｋＤａの自己抗原（ＩＡ−２など）、ｐｈｏｇｒｉｎ、ヒト軟骨細胞糖タンパク質−３９、コラーゲン、コラーゲンＩＩ型、軟骨リンクタンパク質、エズリン、ラディキシン、モエシン、ミコバクテリウム熱ショックタンパク質６、ｄｅｓｍｏｇｌｉｅｎ、β−２−ＧＰＩ、Ｋｕ（ｐ７０／ｐ８０）自己抗原、またはその８０ｋｄのサブユニットタンパク質、核自己抗原Ｌａ（ＳＳ−Ｂ）及びＲｏ（ＳＳ−Ａ）、プロテアソームβ−型サブユニットＣ９、中心体自己抗原ＰＣＭ−１、多発筋炎−強皮症自己抗原（ＰＭ−Ｓｃｌ）、自己抗原ＣＥＮＰ−Ａ、Ｕ５、核小体Ｕ３−及びＴｈ（７−２）リボヌクレオ蛋白質、リボソーム蛋白質Ｌ７、ｈＰｏｐｌ、核マトリックス抗原由来の３６ｋｄのタンパク質、甲状腺ペルオキシダーゼ、及び甲状腺刺激ホルモン受容体、ヒトＴＳＨ受容体、アセチルコリン受容体、筋受容体キナーゼ、または、他の任意の好適な自己抗原が挙げられる。
【００４０】
長い抗原については、重なりペプチドは、ペプチドプールに入れ、少なくとも２つのペプチドプールのライブラリーを形成してもよい。ペプチドプールは、一般に、１つ以上のペプチドを含む。一実施形態では、エピトーププールのライブラリーは、抗原の少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を共にスパンするペプチドを含む。好ましい実施形態では、エピトーププールのライブラリーは、抗原の少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％をスパンするペプチドを含む。
【００４１】
ペプチドプールのペプチドは、典型的には、必須ではないが、約２〜約１５以上のアミノ酸残基が重なっている（すなわち、アミノ酸配列の同一領域を共有する）。好ましい実施形態では、ペプチドプールのペプチドは、少なくとも４つのアミノ酸が重なっている。別の実施形態では、ペプチドプールのペプチドは、約１０のアミノ酸が重なっている。好ましい実施形態では、重なりペプチドは、約１２のアミノ酸が重なっている。例えば、ペプチド「ｎ」は、抗原の残基１〜１６であってもよく、ペプチド「ｎ＋１」は、抗原の残基４〜２０などであってもよい。しかし、当業者は、ペプチドの長さ及びペプチド間で重なる残基量は、抗原の長さ及び／または対象の領域、必要な解像度などに依存して変化し得ることを理解するであろう。
【００４２】
ペプチドをプールに入れる基準は、当業者によって理解されるように、変更してもよい。例えば、一実施形態では、少なくとも約２または約３〜約８の重なりペプチド（例えば、抗原の連続領域をスパンしているなど）のプールが提供される。一実施形態では、２つの重なりペプチドのプールが提供される。好ましい実施形態では、少なくとも６つの重なりペプチドのプールが提供される。
【００４３】
他の実施形態では、ペプチドは、各プール中のペプチドが分かるように、または測定できるように、他の任意の好適な基準によってプールに分けられる。一実施形態では、プール中のペプチドが共に抗原の異なる連続領域にスパンするように、ペプチドをプールに分ける。別の実施形態では、ペプチドは、プール中のペプチドが抗原の異なる連続領域を共にスパンし、かつ第１のプール中の少なくとも１つのペプチドが第２のプール中の少なくとも１つのペプチドと同一の重なりアミノ酸配列の領域を共有し、第１及び第２のプール中のペプチドが、第１のプール中のペプチドによってスパンされた抗原の連続領域及び第２のプール中のペプチドによってスパンされている抗原の連続領域をいずれも含む抗原の連続領域を共にスパンするように、更に選別される。
【００４４】
いずれかの実施形態では、ペプチドは、さまざまな方法で調製することができる。例えば、ペプチドは、自動ペプチド合成装置を使用して合成することができる。また、ペプチドは、手動により合成してもよい。あるいは、ペプチドは、タンパク質分解的切断（例えば、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼなどによる）または特定の化学的切断（例えば、臭化シアンによる）により作製することができる。また、ペプチドは、インビボまたはインビトロでの重なり核酸配列を発現させることによって合成することができ、各核酸配列は、特定のペプチドをコードする。
【００４５】
ペプチドは、Ｔ細胞を含むサンプルのマクロバルク培養物に接触させる前に、任意により単離させ、かつ精製することができる。好適な方法としては、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなど）、遠心分離法、示差溶解度またはペプチドまたはタンパク質の精製用の他の任意の好適な技術が挙げられる。ある実施形態では、ペプチドは、標識して（例えば、放射性ラベル、発光ラベル、化学発光ラベル、アフィニティタグなど）、ペプチドの精製を容易にすることができる。
【００４６】
別の態様では、候補免疫活性化エピトープを同定する方法が提供される。ある実施形態では、候補免疫活性化エピトープは、候補エピトープを同定するために、コンピュータ利用アルゴリズムを使用して同定してもよい。このようなコンピュータプログラムとしては、例えば、ＴＥＰＩＴＯＰＥプログラム（Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６６：６７  １００（１９９７）；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５５５  ６１（１９９９）；Ｍａｎｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８９：８７１  ７６（１９９９）；ｄｅ  Ｌａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１７２５  ２９（１９９９）；Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４７３１  ４１（２０００）を参照されたい）、そのすべての内容全体を参照によって援用される）並びに他のコンピュータ利用アルゴリズムが挙げられる。
【００４７】
候補エピトープの同定用のコンピュータ利用アルゴリズムにより、例えば、非常に大きいタンパク質中、関連タンパク質群（例えば、相同遺伝子、オルソロガス遺伝子または多型変異型）中、非関連タンパク質の混合物中、組織または器官のタンパク質中、生命体のプロテオーム中の単一のタンパク質において候補エピトープを同定することができる。この方法を使用して、潜在的Ｔ細胞エピトープを同定するための効率的かつ感受性のある特異的方法として、既知の候補分子標的の分析に加えて、発現タンパク質（例えば、推定されたオープンリーディングフレームまたはｃＤＮＡライブラリー由来）の配列情報に基づいて、錯体組織または生命体を調べることができる。
【００４８】
候補エピトープの同定後、候補エピトープ（複数可）に対応するペプチドまたはペプチドプールが形成され得る。例えば、候補エピトープが同定されると、候補エピトープまたはそれらの一部をスパンしている重なりペプチドを調製して、Ｔ細胞の刺激を確認することができ、必要に応じて、エピトープの同定を改良することができる。あるいは、候補エピトープの同定用にコンピュータ利用アルゴリズムを使用して同定した複数の候補エピトープを含むペプチドプールを調製することができる。
【００４９】
ペプチドによるＴ細胞を含むマクロバルク培養物の刺激
【００５０】
別の態様では、Ｔ細胞を含むサンプルのマクロバルク培養物をペプチドプールに接触させて、エピトープ特異的方法で、プール中の少なくとも１つのペプチドがＴ細胞に結合し、刺激しているか判断する。このような接触は、プライミングステップ、再刺激ステップ及び伝播ステップ中に発生し得る。いくつかの実施形態では、複数のマクロバルク培養物を使用する。
【００５１】
概して、目的とする対象から単離させたＴ細胞を含むサンプルのマクロバルク培養物は、ペプチドと共に培養し、これは、すなわち、ペプチドプールのライブラリーの一部であるペプチドプール内であってもよい。好ましい実施形態では、対象から単離されたＴ細胞の正確な文脈では、マクロバルク培養物は、ペプチドを提示することができる抗原提示分子を更に含み、可溶性であるか、または細胞に発現してもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、エピトーププールまたは免疫活性化エピトープの存在下においてＴ細胞培地で約１〜１０日間またはそれ以上、プライミング、再刺激、伝播、培養、接触、インキュベートなどを施して、エピトープが誘導される抗原に特異的なＴ細胞の増殖を刺激する。培養及び／またはＴ細胞の生存度（例えば、血清、抗生物質、サイトカイン、共刺激物質受容体アゴニストなど）のために、他の構成成分を任意により培地に補充してもよい。
【００５３】
Ｔ細胞を含むサンプルは、好適な結合条件下でペプチドプール／免疫活性化エピトープと接触させる。一実施形態では、結合条件は、任意の好適なＴ細胞培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ培地）、リン酸塩バッファ生理食塩水、ダルベッコリン酸塩バッファ生理食塩水、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ダルベッコ改変イーグル培地、Ｉｓｃｏｖｅ培地などで３７℃である。培養及び／またはＴ細胞の生存度（例えば、血清、抗生物質、サイトカインなど）のために、任意により他の構成成分を培地に補充してもよい。ペプチドの適切な濃度は、滴定によって測定され得る。一実施形態では、最終濃度約２ｎｇ／ｍＬ〜約１００μ／ｍＬでペプチドプール中の各ペプチドまたは免疫活性化エピトープが添加される。一実施形態では、特に、提示前に更なる工程を必要としないペプチドでは、各ペプチドは２０〜２００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される。より大きいペプチドについては、各ペプチドは、約１０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは２０μｇ／ｍＬの濃度で、添加される。
【００５４】
抗原特異的Ｔ細胞の検出及び免疫活性化エピトープの同定
【００５５】
抗原特異的Ｔ細胞及び結合する免疫活性化エピトープは、Ｔ細胞の活性化を検出することによって同定され得る。異なるペプチドプールと接触するとき、対象由来のＴ細胞を含むサンプルの異なるマクロバルク培養物の活性化状態を比較することによって、抗原の免疫活性化エピトープを含有する１つ以上のペプチドプールが同定され得る。一実施形態では、マクロバルク培養物中の活性化Ｔ細胞の検出により、マクロバルク培養物と共にインキュベートしたエピトーププール中のペプチドによってスパンされている抗原領域が、活性化Ｔ細胞の免疫活性化エピトープを含むと識別する。
【００５６】
ある実施形態では、１つ以上の追加のスクリーニングラウンド（またはサイクル）を実施し、同定ペプチドプール（複数可）中の各ペプチドを使用して、Ｔ細胞を含むサンプルのマクロバルク培養物のスクリーニングを行う。個々のペプチドの分析によって、免疫活性化エピトープ（複数可）は、ペプチド（複数可）として、または１つ以上のペプチドの一部として同定され得る。関連実施形態では、任意により、追加のペプチドを合成して、エピトープ（複数可）を更に定義することができる。例えば、切断ペプチドを調製して、エピトープの同定を改良することが可能である。
【００５７】
Ｔ細胞活性化は、複数の標準活性化基準（例えば、Ｔ細胞増殖の測定、活性化サイトカインの放出、細胞表面活性化マーカーの発現など）のいずれかを検出する及び／または測定するために、既知の方法を使用して測定され得る（例えば、Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：６６６５  ７０（２００１）；Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４２４４  ４９（２０００）；Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １４：３５７（１９９３）；Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：７９９（２００１）を参照されたい；その開示は、本明細書に参照によって援用される）。
【００５８】
好ましい実施形態では、活性化は、既知の活性化サイトカインの存在を検出することによって決定される。非限定例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−３５，ＴＮＦα及びＩＦＮγ、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ、ＴＮＦαなどが挙げられる。好ましい実施形態では、活性化は、１つの活性化サイトカイン、好ましくはＩＦＮγの存在を検出することによって決定される。
【００５９】
別の実施形態では、活性化は、少なくとも第２の既知の活性化サイトカインの存在を検出することによって決定される。第１の活性化サイトカインの活性化レベルが、存在すると考えられるしきい値未満である場合、第２の活性化サイトカインの有無が検出される。このような実施形態では、活性化は、第１及び第２の活性化サイトカインの存在を検出することによって決定され得る。
【００６０】
活性化サイトカインの活性化レベルは、陰性対照培養物（例えば、陰性対照ペプチドとインキュベートしたか、またはペプチドの非存在下でインキュベートしたサンプルのマクロバルク培養物）との比較によって測定されてもよい。概して、活性化サイトカインの活性化レベルは、本明細書に開示の方法によりプライミングされ、かつ再刺激されるマクロバルク培養物の上清中の活性化サイトカインの濃度を陰性対照としてインキュベートしたサンプルのマクロバルク培養物の上清中の活性化サイトカインの濃度と比較することによって測定され得る。活性化レベルは、陰性対照を上回る倍加に関して測定されてもよい。例えば、濃度の１．５倍増は、活性化レベル１．５であると考えられるか、または陰性対照の１０倍増は、活性化レベル１０と考えられ得る。一実施形態では、その活性化レベルが少なくとも約１．２、（例えば、約１．５、約１．８、約２、約２．５、約５、約７．５及び好ましくは少なくとも約１０）である場合、活性化サイトカインの存在が測定される。別の実施形態では、第１活性化サイトカイン及び第２の活性化サイトカインの累積活性化レベルが、少なくとも約１．２、（例えば、約１．５、約１．８、約２、約２．５、約５、約７．５及び好ましくは少なくとも約１０）に到達する場合、第１及び第２の活性化サイトカインが存在していると判断される。
【００６１】
例示的実施形態では、活性化サイトカインの存在の有無は、酵素結合抗体、例えば、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して検出する。好ましい実施形態では、活性化は、ＥＬＩＳＡを用いて測定される。別の好ましい実施形態では、活性化サイトカインの存在の有無は、ビード系アッセイを用いて検出する。
【００６２】
活性化Ｔ細胞を含む組成物及び疾患の処置に同組成物を使用する方法
【００６３】
対象中の抗原特異的Ｔ細胞の検出時及び応答する免疫活性化エピトープの同定時、免疫活性化エピトープは、例えば、疾患の処置に使用するための、抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物の製造方法で使用することができる。
【００６４】
したがって、本明細書に提供するのは、抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物の製造方法である。本方法は、（ａ）疾患を有する患者内において抗原特異的Ｔ細胞を検出すること、及び本明細書に開示の方法で抗原特異的Ｔ細胞が応答する免疫活性化エピトープを同定することであって、Ｔ細胞を含むサンプルは患者から単離され、（ｂ）同定された免疫活性化エピトープを有する患者から単離されたＴ細胞を伝播することとを含む。一実施形態では、Ｔ細胞を伝播して、それを必要とする患者への投与用に治療的有効量のＴ細胞を提供する。
【００６５】
「治療的有効量」または「有効量」は、疾患、障害または病態を治療するために対象に投与したとき、疾患、障害または病態のこうした治療に十分に影響を及ぼす、組成物、化合物、治療法、処置過程の量を意味する。「治療的有効量」は、組成物、化合物、治療法、処置過程、疾患、障害または病態、及びその処置予定の対象の重症度、年齢、重量などに依存して変化し得る。別の実施形態では、本方法は、最終ステップとして、Ｔ細胞を減衰させるステップを更に含む。
【００６６】
また、本明細書においては、上記の方法により作製された抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物も提供される。一実施形態では、本組成物は減衰した抗原特異的Ｔ細胞を含む。好ましい実施形態では、組成物は、治療的有効量の抗原特異的Ｔ細胞を含んで（これは減衰されていてもよく）、癌、感染症、及び自己免疫疾患からなる群から選択される疾患が処置されてもよい。
【００６７】
当業者は、こうした組成物は、癌及び感染症の処置並びにＴ細胞が減衰しているときは自己免疫疾患の処置において特定の有用性が明らかになり得ることを理解するであろう。こうした方法は、本明細書に記載のとおり、治療有効量の抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物を患者に投与することを含む。これらの組成物については、抗原特異的Ｔ細胞は検出され、免疫活性化エピトープは本明細書記載の方法により同定され、抗原は、疾患に関連している。好ましい実施形態では、プライミングステップ、再刺激ステップ及び伝播ステップ用のＴ細胞を含むサンプルは、投与される組成物が自己Ｔ細胞を含むように、処置される予定の患者から単離させる。
【００６８】
一実施形態では、患者は癌を有し、本明細書に開示の方法によって同定された免疫活性化エピトープは、腫瘍関連または癌と関連する腫瘍特異的抗原から誘導される。特定の目的の癌は、腫瘍関連または腫瘍特異的抗原を提示する癌である。このような抗原は、異常な高レベルで、一般的でない文脈で存在してもよいか、または変異形態であってもよい。腫瘍抗原に特異的な自己Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対する宿主Ｔ細胞応答の一部として投与してもよい。
【００６９】
腫瘍抗原の例としては、癌抗原として、サイトケラチン、特にサイトケラチン８、１８及び１９が挙げられる。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胚性抗原（ＨＥＡ−１２５）、ヒト乳脂肪球、ＭＢｒｌ、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４、１７−１Ａ、Ｃ２６及びＴ１６も既知の癌抗原である。デスミン及び筋特異的アクチンは、筋原性肉腫抗原である。胎盤アルカリホスファターゼ、ベータ−ヒト繊毛性性腺刺激ホルモン及びアルファ−胎児性タンパクは、絨毛性腫瘍及び細菌細胞腫瘍抗原である。前立腺特異的抗原は、前立腺癌抗原、結腸腺癌の癌胎児性抗原であるＨＭＢ−４５及びチロシナーゼは、黒色腫関連抗原である。クロモグラニン−Ａ及びシナプトフィジンは、神経内分泌腫瘍及び神経外胚葉腫瘍の抗原である。特に興味深いのは、壊死部分を有する腫瘤を形成する浸潤性腫瘍である。
【００７０】
例えば、化学療法及び放射線治療などの多くの従来の癌療法により、リンパ球集団が激しく低減する。対象の療法によりこの免疫抑制をある程度軽減し、好ましい併用処置過程では、対象治療の前または後に、こうしたリンパ球毒性療法を使用する。
【００７１】
上記の組成物は、更に、病原体への宿主応答の一部として、投与されてもよい。宿主抗ウイルス性機構が上手く働かない場合は、特定のウイルスによる感染症は慢性になる。このような感染症は、長年、または、感染宿主の生存期間に渡って持続し得るか、多くの場合重篤な疾患となる。重篤な罹患及び早期の死に関連する慢性感染としては、２つのヒト肝炎ウイルス、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）及び肝炎Ｃウイルス（ＨＶＣ）を伴う感染症であって、慢性肝炎、肝硬変及び肝癌を引き起こす。人における他の慢性ウイルス感染としては、ヒトレトロウイルス、ＡＩＤＳを引き起こすヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）、及びＴ細胞白血病及び脊髄障害を引き起こすヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２）を有する感染症が挙げられる。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）タイプ１及び２、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）及びヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）を含むヒトヘルペスウイルスによる感染症は通常、宿主機構によって根絶されることはない。病原性原虫（例えば、トリパノソーマ、マラリア及びトキソプラズマ・ゴンディ）、細菌（例えば、マイコバクテリア、サルモネラ菌及びリステリア）、及び菌（例えば、カンジダ）など細胞内で複製される他の病原体による感染症が、宿主防衛機構により除去することができない場合にも、慢性となり得る。
【００７２】
本明細書に開示の組成物は、Ｔ細胞が、病原体から誘導される抗原の同定された免疫活性化エピトープに特異的であるような、慢性病原体感染などの患者に投与することができる。種々のこのような抗原は当技術分野において既知であり、病原体の単離または組換え法による発現で利用可能である。例としては、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＢＶ表面抗原、ウイルスのエンベロープ及びコートタンパク質などが挙げられる。
【００７３】
上記の組成物が減衰したＴ細胞を含むとき、こうした組成物は、Ｔ細胞免疫療法として、それを必要とする患者に投与してもよい。一実施形態では、患者は自己免疫疾患を有し、本明細書に開示の方法によって同定された免疫活性化エピトープは、自己免疫疾患関連自己抗原抗原から誘導される。
【００７４】
自己免疫疾患の非限定例としては、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫ブドウ膜網膜炎、糖尿病、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、腹腔疾患、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患（例えば、橋本甲状腺炎及びグレーブス病）、重症筋無力症、アディソン病、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血及び全身性エリテマトーデスが挙げられる。好ましい実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症である。
【００７５】
自己免疫疾患の免疫療法用のＴ細胞の拡張に有用な自己抗原の例としては、これらに限定されないが、多発性硬化症用のミエリンタンパク質（例えばミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、及びミエリン稀突起膠細胞糖蛋白質）が挙げられる。
【００７６】
強皮症、全身性硬化症及び全身性エリテマトーデスでは、自己抗原としては、例えば、β−２−ＧＰＩ、Ｋｕ（ｐ７０／ｐ８０）またはその８０−ｋｄサブユニットタンパク質、核自己抗原Ｌａ（ＳＳ−Ｂ）及びＲｏ（ＳＳ−Ａ）、プロテアソームβ型サブユニットＣ９、中心体自己抗原ＰＣＭ−１、多発性筋炎−強皮症自己抗原（ＰＭ−Ｓｃｌ）、自己抗原ＣＥＮＰ−Ａ、Ｕ５、核小体Ｕ３−及びＴｈ（７−２）リボ核タンパク質、リボソームタンパク質Ｌ７、ｈＰｏｐｌ及び核マトリックス抗原由来の３６−ｋｄタンパク質が挙げられる。
【００７７】
皮膚の自己免疫疾患について、有用な抗原としては、これらに限定されないが、４５０ｋＤのヒト表皮自己抗原、２３０ｋＤ及び１８０ｋＤの水疱性類天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原（デスモグレイン１）、尋常性天疱瘡抗原（デスモグレイン３）、ＢＰＡｇ２、ＢＰＡｇ１、タイプＶＩＩコラーゲン、瘢痕性類天疱瘡患者のサブセット中における１６８−ｋＤａの粘膜抗原及び２１８−ｋｄ核タンパク質（２１８−ｋｄ  Ｍｉ−２）が挙げられる。
【００７８】
インスリン依存性糖尿病関連自己抗原としては、これらに限定されないが、インスリン、プロインスリン、ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７、熱ショックタンパク質６５（ｈｓｐ６５）、膵島細胞抗原６９（ＩＣＡ６９）、膵島細胞抗原関連タンパク質−チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、ＧＭ２−１ガングリオシド、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、膵島細胞抗原（ＩＣＡ６９）、Ｔｅｐ６９、膵島−細胞タンパク質チロシンホスファターゼ及びＩＡ−２などから誘導される３７−ｋＤａの自己抗原及びフォグリンが挙げられる。
【００７９】
関節リウマチ関連自己抗原としては、これらに限定されないが、ヒト軟骨細胞糖タンパク質−３９、コラーゲン、コラーゲンタイプＩＩ、軟骨リンクタンパク質（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、エズリン、ラディキシン、モエシン及びマイコバクテリア熱ショックタンパク質６が挙げられる。
【００８０】
自己免疫性甲状腺疾患関連自己抗原としては、非限定例として、甲状腺ペルオキシダーゼ、及び甲状腺刺激ホルモン受容体、及びヒトＴＳＨ受容体が挙げられる。
【００８１】
重症筋無力症関連自己抗原としては、これらに限定されないが、アセチルコリン受容体及び筋受容体キナーゼが挙げられる。
【実施例】
【００８２】
実施例１：抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導に関する培養環境、培養時間の評価。マイクロ培養後の稀な抗原特異的Ｔ細胞の検出するための高感度法としてのＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔの評価、及び抗原特異的免疫を検出するための培養第６日目の従来のＥＬＩＳＡの評価及びエピトーププロファイリングアッセイの確立。
【００８３】
実施例１．１：材料と方法
【００８４】
組織培養培地
【００８５】
方法を開発している期間を通して、完全ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が使用され使用前に、２容積％で加熱不活性化貯留ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を補充し、Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を最終濃度２ｍＭになるまで補充した。製造者の指示によって、再構築培地の使用期間を１ヶ月に設定した。
【００８６】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）
【００８７】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、Ｋｅｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮで獲得した健常ドナーのアフェレーシス生成物から得た。ＭＳドナー由来のＰＢＭＣは、ＩＲＢ承認ＯｐｅｘａプロトコールＯＰ−ＢＤ−００７にて、臨床部位で採血として１２０ｍｌを収集した。対象動員、スクリーニング及び採血は、次に述べる２つの臨床部位から収集した：Ｄｒ  Ｇａｚｄａ，Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＬＬＣ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ及びＤｒ  Ｆｏｘ，Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｔｅｘａｓ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ，Ｒｏｕｎｄ  Ｒｏｃｋ，ＴＸ。初期の方法開発には、Ｏｐｅｘａプロトコール２００５．００，Ｐｈａｓｅ  ２ｂ臨床治験指定「ＴＥＲＭＳ」で得た保管されたＰＢＭＣも使用した。
【００８８】
１：２希釈の原料物質／リン酸塩バッファ生理食塩水（ＰＢＳ）にてアフェレーシス及び全血からＰＢＭＣ富化を得て、複数の希釈生成物の３０ｍｌアリコートを５０ｍｌ円錐形チューブに入れ、それぞれは１５ｍｌフィコール−ハイパックプレミアム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有する。フィコール勾配は、２０分間、８００ｇで遠心分離にかけた。単核球は、各チューブの界面から収集し、貯留し、１：５でＰＢＳ中に希釈し、３００ｇで１０分間遠心分離することにより、ＰＢＭＣを洗浄した。製造者の指示書を使用して、細胞を５０ｍｌＰＢＳに再懸濁し、数え、方法開発で使用したか、またはＣＳ１０凍結防御物質（ＢｉｏＬｉｆｅ）中５ｘ１０7／ｍｌまたは２ｘ１０8／ｍｌのＰＢＭＣで凍結保存した。マイナス８０℃にて一晩、速度を制御して凍結するために、Ｃｏｏｌｃｅｌｌ（Ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ）に移動させる前に、細胞をＣｏｏｌｂｏｘ（Ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ）で２〜８℃に維持した。長期保管用にＰＢＭＣを気相液体窒素に移動させた。
【００８９】
全血またはアフェレーシス生成物由来の凍結保存ＰＢＭＣは、３７℃の水浴にて、細胞の４つ以下のバイアルの急速解凍により液体窒素保管から収集し、ＯｐＴｍｉｚｅｒＣＴＳ完全培地５０ｍｌで希釈した。１０ｍｌ完全ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ培地に再懸濁する前に、細胞を２５０ｇで１０分間遠心分離にかけ、その後、数を数え、下流の方法開発のために使用した。
【００９０】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リコール応答を用いるマイクロ培養アッセイの調査
【００９１】
アフェレーシスにより、プレスクリーニングしたＨＬＡ−Ａ２陽性、抗−ＣＭＶ免疫グロブリン反応性の健常ドナーからＰＢＭＣを収集した。ＣＭＶｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）由来の最適化ＨＬＡ−Ａ２結合９−ｍｅｒペプチドは、２０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した完全ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ培地中、２００ｎｇ／ｍｌの濃度で利用し、３日間または５日間のいずれかで、１ｍｌマイクロチューブでＰＢＭＣを刺激した（３５０μｌに対して１ｘ１０6または１ｘ１０6／ｍｌ）。培養の第３日目または第５日目のいずれかに２００ｎｇ／ｍｌペプチドを添加することにより、マイクロ培養を再刺激した。２４時間ペプチドパルス後、上清を収集し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ＩＦＮγ含量のアッセイを行った。
【００９２】
得られたＭＳドナーＰＢＭＣを用いた、マイクロ培養物中での抗−ミエリン免疫の調査
【００９３】
初期の開発では、ＭＢＰ、ＭＯＧ及びＰＬＰの配列を含む１０９ペプチドパネルへの免疫は、ＴＥＲＭＳ臨床治験から得られたＰＢＭＣを用いて調査を行った。ペプチドライブラリーは、１２−ｍｅｒの重なりを有する一連の１６−ｍｅｒのペプチドとして構築した。ペプチドは、各ミエリン抗原のそれぞれのタンパク質配列において、質量を基準にして、線形位置に基づいて、「対」で混合した（質量）。配列表、対混合物及び最終プールを付録として提供する。
【００９４】
２０ＩＵ／ｍｌＩＬ−２を補充し、１μｇ／ｍｌの各ペプチド「対」でパルスして、合計５５マイクロチューブ培養物になる３５０μｌの完全ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ培地において、１．２ｍｌ丸底マイクロ培養チューブあたり１ｘ１０6のＰＢＭＣを樹立した。５日後、１ｘ１０6のＰＢＭＣ、及び適切なペプチド対１μｇ／ｍｌを添加することにより培養物を再刺激した。陰性対照培養には、０日目及び５日目にペプチド刺激の不在下でＰＢＭＣを加えた。第６日目に、培養上清を全培養物から採取し、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＩＦＮγ含量を分析した。
【００９５】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法による培養上清でのＩＦＮγの測定
【００９６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＩＦＮγ含量は、ＯｐｔＥＩＡ  Ａｓｓａｙ希釈剤に加えて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのストレプトアビジン−ＨＲＰによる捕捉抗体及び検出抗体を用いて実施した。製造者の指示書を用いて、ＥＬＩＳＡを実施した。端的にいえば、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートを１：２５０希釈の原捕捉抗体１００μｌ／コーティングバッファ（ｐＨ９．６）でコーティングし、２〜８℃で一晩インキュベートした。プレートは、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ４０５  ９６−ウェルプレート洗浄器を使用して、ＰＢＳで５回洗浄した。タンパク質ブロッキング溶液をウェルあたり１００μｌでウェルにいれ、室温で２時間インキュベートした。プレートをデカントし、容積１００μｌの上清を指定のウェルに添加する前に、吸収組織にブロッティングすることにより、ブロッキング溶液を除去した。いくつかの実験では、ＥＬＩＳＡプレートに添加する前に、上清を倍加希釈で「未希釈」から１：８に希釈した。いずれの場合も、プレートのレイアウトによって、各プレートは、組み換えＩＦＮγの標準曲線を受容して、３００〜２５ｐｇ／ｍｌの範囲を網羅することができる。アッセイ用ＬＬＯＱは、１１．２５ｐｇ／ｍｌに設定した。インキュベーション培養２時間後、１：２５０希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰに錯体化されたビオチン化検出抗体の添加前に、プレートは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳにより７回洗浄した。プレートは、更なる時間、室温にてインキュベートし、その後１４回、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄した。蒸留水２０ｍｌ当たり１つの尿素錠剤及び１つのＯＰＤ錠剤を添加することによって、Ｏ−フェニルジアミン（ＯＰＤ）酵素基質を再構成した。基質溶液１００μｌをすべてのウェルに入れて、室温で暗所にて３０分間インキュベートした。光学密度（ＯＤ）は、ＢｉｏＴｅｋＥＬｘ８００  ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、フィルターを４５０ｎｍに設定して測定した。Ｇｅｎｉｅ  ５  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、ＩＦＮγ標準曲線を作製し、ＯＤ読取り値をＩＦＮγ濃度（ｐｇ／ｍｌ）に変換した。
【００９７】
ＥＬＩＳｐｏｔによるＩＦＮγ分泌細胞の頻度の測定
【００９８】
ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのキット形態に供給した試薬を用いて、９６ウェルプレ−トフォーマットですべてのＥＬＩＳｐｏｔを実施した。使用２４時間前に、ＥＬＩＳｐｏｔプレートを、２〜８℃で１００μｌの１：２５０希釈抗−ＩＦＮγ捕捉抗体でコーティングした。捕捉抗体をデカントして、ＲＰＭＩ培地と１０％  ＦＢＳから構成される２００μｌブロッキング溶液に置き換え、プレートは、更に室温にて２時間インキュベートした。ブロッキング溶液をデカントして、さまざまな実験のＰＢＭＣ調製物（実験デザイン及び手順を参照されたい）を総容量１００μｌで指定ウェルに添加した。必要な場合、容量５０μｌ中の抗原提示（ＡＰＣ）源として、追加の１ｘ１０5ＰＢＭＣを各ウェルに添加した。ペプチドは、容積５０μｌ中８０μｇ／ｍｌの濃度で添加して、アッセイウェル中、最終ペプチド濃度２０μｇ／ｍｌを得た。ＡＰＣまたはペプチドのいずれかを除き（陰性対照）、培地のみ、必要に応じて、細胞懸濁液またはペプチド溶液の量に置き換えた。アッセイの陽性対照としては、キラー細胞及びＡＰＣを収容している対照ウェルを、ＰＨＡ−Ｌ２０μｇ／ｍｌの濃度でペプチドの代わりに５０μｌでパルスした。装填ロードＥＬＩＳｐｏｔプレートは、３７℃で約１８時間インキュベートして、さまざまなマイクロウェルでのＩＦＮγの分泌及び捕捉が可能になった。細胞培養終了時、インキュベーションからプレートを取り外し、蒸留水で２回洗浄し、細胞を溶解して除去し、その後更に５回０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄する。すべての洗浄は、ＢｉｏＴｅｋＥＬｘ４０５プレート洗浄機を用いて実施した。洗浄プレートにアッセイ希釈剤中１：２５０希釈のビオチン化抗−ＩＦＮγ検出抗体１００μｌ／ウェルを入れ、プレートを更に室温にて２時間インキュベートした。その後、１：１００希釈のストックストレプトアビジン−ＨＲＰ／アッセイ希釈剤１００μｌ／ウェルを添加する前に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを７回変えて、再びプレートを洗浄した。次にプレートを１時間室温でインキュベートした。終了時、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで７回洗浄し、その後更にＰＢＳのみで５回洗浄した。ＡＥＣ基質は、アッセイ希釈剤１０ｍｌまでの濃度で１０滴添加することによって調製し、基質溶液１００μｌは各ＥＬＩＳｐｏｔウェルに添加した。約２０分後、発現したスポットが目に見えるようになり、蒸留水で５回洗浄することにより、反応をクエンチさせる。ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェアバージョン５．１．８を用いて、ＣＴＬ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ｒｅａｄｅｒでスポットを数える前に、発現したプレートを一晩空気乾燥させた。
【００９９】
ＥＬＩＳｐｏｔによる抗−破傷風毒素（ＴＴ）応答の定量化
【表１】
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【０１００】
直接エクスビボＥＬＩＳｐｏｔ
【０１０１】
健常ドナー由来のＰＢＭＣを直接、既知の免疫優性決定因子を含有する７つのパネル（ＴＴ１〜ＴＴ７）由来の単一の破傷風毒素ペプチド２０μｇ／ｍｌを補充した完全Ｏｐｔｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ培地２００μｌにおいて２ｘ１０5細胞／ウェルで四通り播種した。ＦＭＯＣ法を用いてペプチドを合成し、９５％ペプチド純度超までＨＰＬＣ精製した。個々のペプチドを最終濃度５ｍｇ／ｍｌまでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸及び／または水で可溶化した。２００ｎｇ／ｍｌのＨＬＡ−Ａ２  ＣＭＶｐｐ６５  ９−ｍｅｒの入った四通りのウェルは、このペプチドへの免疫がこのドナー由来のＰＢＭＣを使用してこれまでに検出された対照リコール抗原として含めた。陰性対照ウェルは、ペプチドの不在下でＰＢＭＣを加えた。ＥＬＩＳｐｏｔプレートは、一晩インキュベートして、その後、スポットを数えることによってＩＦＮγ分泌細胞の算出を行うために上記のように調製した。
【０１０２】
マイクロ培養５日後のＥＬＩＳｐｏｔ
【０１０３】
ＰＢＭＣは、マイクロクラスターチューブに対して１ｘ１０6細胞で５００μｌの量の完全ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ培地に播種した。各チューブに７つのパネル（ＴＴ１〜ＴＴ７）由来の単一の破傷風毒素ペプチド２０μｇ／ｍｌ及び最終濃度５ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を補充した。陰性対照マイクロ培養は、培地及びＩＬ−２中の細胞で構成されるが、いかなるペプチドも不在である。培養５日後、各マイクロチューブの内容物を緩やかに再懸濁し、培養物は、４つのＥＬＩＳｐｏｔウェルで１００μｌアリコートに配分して、アッセイで四通りの複製ウェルを作製した。ウェルは、抗原提示源として、１ｘ１０5ＰＢＭＣを容積５０μｌで更に播種し、ペプチドは、５０μｌ中８０μｇ／ｍｌの濃度で重ね合わせて、ＥＬＩＳｐｏｔ培養物中、最終濃度２０μｇ／ｍｌとした。陰性対照ウェルは、ここでも、ペプチドの不在下で追加のＰＢＭＣを含んだ。３７℃で一晩インキュベートした後、ＥＬＩＳｐｏｔプレートを発現させ、ＩＦＮγスポットを上記のように数えた。
【０１０４】
マイクロ及びマクロ培養及びＥＬＩＳｐｏｔ対Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡを用いた抗ミエリン免疫の定量化
【０１０５】
マイクロ培養後の破傷風毒素ペプチド応答の定量化に使用されるとき、類似のアッセイフォーマットを拡張して、抗−破傷風応答を検出するために利用される７つのペプチドライブラリーとは対照的に、ＭＢＰ、ＭＯＧ及びＰＬＰをコードする５５のペプチド「対」を用いて、抗−ミエリン免疫を調べた。このフォーマットでは、合計５５マイクロチューブに５ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２及び最終濃度２０μｇ／ｍｌの１つのペプチド対が補充された完全ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ培地１ｘ１０6ＰＢＭＣ培養容積５００μｌを作製し、完全ミエリンペプチドライブラリーを網羅した。ＩＬ−２と共にＰＢＭＣで構成されるが、ペプチド不存在下である陰性対照培養を再び同時に行った。
【０１０６】
いずれか１つの抗原源に晒したＰＢＭＣの総数を増加させるために、ペプチドは、「対」で行われる試験とは対照的に、６つのセットにおいて、質量を基準として同等に貯留させ、第０日目にこれらのペプチドプールの２０μｇ／ｍｌを３ｘ１０6  ＰＢＭＣ／１．５ｍｌ  完全ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳの入った滅菌５ｍｌ丸底チューブに添加した。
【０１０７】
培養第５日目に、各マイクロ培養チューブ中の細胞を緩やかに再懸濁し、１００μｌアリコートを四通り、ＥＬＩＳｐｏｔプレートにプレートアウトした。５ｍｌチューブのマクロ培養物については、培地１ｍｌを除去し、アッセイ用のプレーティング前にその細胞を残存している５００μｌ中に再懸濁した。いずれの場合においても、第０日目に利用した適合ミエリンペプチド対またはプール２０μｇ／ｍｌの存在下で、抗原提示源として１ｘ１０5ＰＢＭＣを用いてウェルを再刺激した。一晩インキュベートした後、ＥＬＩＳｐｏｔプレートを発現し、ＩＦＮγスポットを定量化した。いくつかの実験では、全培養物を４つのウェルに均等にプレーティングするのとは対照的に、各ウェルの潜在的スポットの数を減少させ、これによって、スポットの定量化の正確性を改善するように、培養物の１／２及び１／８をそれぞれ２つのウェルにプレーティングした。
【０１０８】
ＥＬＩＳｐｏｔの代替として、ＩＦＮγ分泌細胞の数の定量化とは対照的に、インサイチュ累積ＩＦＮγ分泌を検出する方法としてｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡを調べた。第５日目の培養物をＥＬＩＳｐｏｔウェルと同じ方法で播種した。しかし、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡでは、ＥＬＩＳＡプレートは、あらかじめＥＬＩＳｐｏｔプレートと置き換えた抗−ＩＦＮγ捕捉抗体でコーティングした。一晩インキュベートした後、細胞は０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄してプレートから除去し、このアッセイは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって供給された試薬で発現させし、上記の従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法で使用した。光学密度を再び、細胞の不存在下で、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡで滴定したＩＦＮγの標準曲線を参照して、ＩＦＮγ濃度に換算した。
【０１０９】
いくつかの実験では、ＥＬＩＳｐｏｔまたはｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡアッセイにプレーティングする前に、細胞の「解離ステップ」を培養物に実施した。これは、第５日目に培養チューブを遠心分離（１０分、２５０ｇ）にかけて得て、消耗培地を除去し、その後、０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄し、遠心分離と懸濁（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０Ｕ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ／ＰＢＳ０．５ｍｌで１０分間、３７℃）とを繰り返し行った。遠心分離により解離溶液を除去し、下流アッセイの前に、細胞に０．５ｍｌ完全  ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳを補充した。
【０１１０】
最適化エピトーププロファイリングアッセイ
【０１１１】
５ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充した完全ＯｐＴｍｉｚｅｒ培地１．５ｍｌの入った各１８．５ｍｌＦＡＣＳチューブに３ｘ１０6ＰＢＭＣを播種した。各培養物に１８のペプチドプールのうちの１つを最終濃度２０μｇ／ｍｌになるまで添加する。２つの陰性対照チューブには、ペプチドの不在下で、培地においてＰＢＭＣを加えた。追加のチューブは、第０日目にＰＢＭＣを播種し、その後、第５日目に追加のＰＢＭＣ及びＰＨＡでパルスしたとき、陽性対照として使用される。チューブはいずれもゆるくキャップし、５日間、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。第５日目では、消耗培地を１ｍｌ各チューブから除去し、１ｘ１０6ＰＢＭＣを適合ペプチドプールを補充した総量０．５ｍｌに添加して、最終培養量１ｍｌ中最終濃度２０μｇ／ｍｌとした。陰性対照チューブに、ペプチド不存在下で、０．５ｍｌ培地に１ｘ１０6ＰＢＭＣを入れた。陽性対照（第０日目にペプチドの入っていないチューブから作製する）は、ペプチドに置換したＰＨＡ−Ｌと共に追加の１ｘ１０6ＰＢＭＣを入れて、最終培養物量の１ｍｌ中、最終濃度２μｇ／ｍｌを得た。チューブは、１８〜２４時間、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートする。その後、上清を採取して、「未希釈」から１：８へ二重希釈し、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法に適用する。ＩＦＮγ濃度は、各試験プレートに織り込んだＩＦＮγ標準曲線を参照して報告する。
【０１１２】
「反応性」ペプチドプールに関して陽性とする暫定的定義は、陰性対照の２．５倍を超える１：２希釈の上清、すなわち、常時ペプチドの不存在下で維持したＰＢＭＣ培養物中のＩＦＮγ含量によって定義した。
【０１１３】
実施例１．２：結果
【０１１４】
実施例１．２．１：抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導への培養環境、培養時間の影響
【０１１５】
図１及び図２は、ＨＬＡ−Ａ２によって提示された最適化９−ｍｅｒペプチドを用いて、ＣＭＶｐｐ６５Ｔ細胞リコール応答への時間及び培養条件の影響を示す。高密度（１ｘ１０6ＰＢＭＣ／３５０μｌ）での培養細胞は、培養第４日目及び第６日目の両日に検出された抗原特異的ＩＦＮγの濃度の４〜５倍増となる。２０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を培養物に添加して、Ｔ細胞増殖を支持するために、ＩＦＮγ応答を大きく増大させ、これによって、培養物中にクローン性提示抗−ＣＭＶｐｐ６５反応性Ｔ細胞が増大する。培養物中でちょうど４日後（第３日目の抗原再刺激を含む）に培養し、アッセイした細胞と比較して、合計培養６日間（第５日目の抗原再刺激を含む）に、抗ＣＭＶｐｐ６５  Ｔ細胞応答が大きく増大する。
【０１１６】
図３及び図４は、播種密度及び発生させる最適のＣＭＶｐｐ６５抗原想リコール応答（図２）を作製した培養条件を用いて、１０９ミエリンペプチドライブラリーの対混合物での刺激時の２つのＭＳドナーＰＢＭＣ調製物のＩＦＮγ応答を示す。いずれのドナーも、陰性対照、バックグラウンドの２倍超と定義されるマイクロ培養物のみの培地を上回る有意のＩＦＮγ抗ミエリンペプチド活性を示すことはなかった。ドナー０１１０５４を用いたこのアッセイでは、陰性対照培養物の１つにおいて高バックグラウンド応答で定義されるように「偽陽性」活性の存在が明かになる。
【０１１７】
実施例１．２．２：マイクロ培養後、稀な抗原特異的Ｔ細胞を検出するための高感度法としてのＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔの評価
【０１１８】
透明な抗ミエリンペプチドＩＦＮγ活性を観察できなかったことにより、作製した培養条件が低頻度ミエリン反応性Ｔ細胞レパートリーを支持するのに不十分であるか、または、アッセイ読取り値が、バックグラウンドの陽性応答を示すのに十分な感受性を示さなかったことが示唆される。後者を評価するにあたって、上清中で測定された累積ＩＦＮγ応答とは対照的に、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法の代わりにＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施して、培養物中のＩＦＮγ分泌細胞の頻度を定量化した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、従来、低頻度Ｔ細胞応答を検出するために用いる。加えて、培養物中のバックグラウンド応答をコントロールするために、ＩＬ−２の濃度は、２０ＩＵ／ｍｌから５ＩＵ／ｍｌに低減させた。
【０１１９】
稀なＴ細胞応答を定量化するために、ＥＬＩＳｐｏｔ前の細胞培養の影響を作り出すため、健常ドナー（０３０９４）由来ＰＢＭＣに、文献にこれまでに記載されたような破傷風毒素由来の７つの既知の免疫優性決定因子ペプチドのパネルに対して、直接エクスビボＥＬＩＳｐｏｔを行うようなアッセイを設定した。あるいは、各ペプチドの存在下で細胞培養し、ＥＬＩＳｐｏｔ環境で再刺激後、第５日目にアッセイを繰り返し行った。
【０１２０】
図５は、ＣＭＶｐｐ６５由来のＨＬＡ−Ａ２免疫優性ペプチドに対する免疫は、「リコール」応答として速やかに検出可能であるが、ドナーのＰＢＭＣの直接エクスビボＥＬＩＳｐｏｔでは、ＩＦＮγ分泌抗破傷風毒素Ｔ細胞の存在は検出できないことがわかる。しかし、ＰＢＭＣを各破傷風毒素ペプチドの存在下で５日間細胞培養し、稀なＴ細胞クローンが拡張され、その後ＥＬＩＳｐｏｔを行った場合、特定の応答が得られた。少なくともＴＴ４への応答が「偽陽性」でないことを確認するために、ペプチド及び培養期間２１日を超えて、ドナー細胞のサンプルの追加のＰＢＭＣで、毎週繰り返し再刺激することによってＴＴ４反応性Ｔ細胞株を作製できた。
【０１２１】
候補抗原、すなわち、破傷風毒素のマイクロクラスターチューブ及びＥＬＩＳｐｏｔエンドポイントを確立することで、マイクロ培養物は破傷風応答を検出可能な範囲に増幅することができ、抗ミエリンＴ細胞免疫を調査するために、本アッセイを行った。最初に健常ドナーＰＢＭＣに対して、アッセイを行った。組織バンクに保管された同一供給源からの２つのアッセイを実施して、分析法間分散を示した。図６及び図７は、２つのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ間で、陽性応答を有するペプチドプールを同定する際の不一致を示す。
【０１２２】
共培養マイクロクラスターＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔプラットフォームによる不十分なアッセイ間の変動を確認するにあたって、２つのＭＳドナーから収集したＰＢＭＣに対してアッセイを行った。このアッセイを各ドナーに２回実施し、第２のアッセイでは、凍結保存供給源から同一のＰＢＭＣを利用した。ここでに、データでは、不一致の結果を得た（図８及び図９）。
【０１２３】
任意の１つのペプチド混合物に関して、再現性の欠落、及び四通りのウェルの標準偏差により、四通りのＥＬＩＳｐｏｔシリーズの各メンバーウェルの可能性のある反応性Ｔ細胞の不十分な分布が示唆された。これは、ＥＬＩＳｐｏｔに移動する前に非効率的解離する５日間の細胞培養に応じた、マイクロクラスターチューブ内に形成される凝集体の結果であり得る。また、凝集体が、ＥＬＩＳｐｏｔにおいて、洗浄時に、非効率的にＥＬＩＳｐｏｔウェルから除去される細胞くずにより「偽陽性」データとなり、その後、アッセイにおいて「偽スポット」となる検出抗体の非特異的捕捉となり得る。１つのペプチド混合物に対していずれか１つの四通りのＥＬＩＳｐｏｔへの細胞の分布を改善するために、及び凝集体が「偽陽性」データポイントを生成するリスクを低減するために、最初に、マイクロ培養サンプルを「解離ステップ」に晒し、単一の細胞懸濁液のプレートアウトの可能性を上昇させ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに引き継がれる細胞凝集体及びくず凝集体の数を減少させた。マイクロ培養物の洗浄により、また、細胞プレーティング及び最終分析用の培地中で再懸濁する前に、１０分間、３７℃で１０Ｕ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ／ＰＢＳにて１ｍＭ  ＥＤＴＡで再懸濁することにより、解離ステップが達成された。
【０１２４】
別の懸念は、各ペプチド対によりサンプル化したＰＢＭＣの数に対するキラー細胞の点における抗ミエリンＴ細胞免疫の絶対頻度に関する。１２０ｍｌ採血からのＰＢＭＣの見込み収率に基づいて、アッセイ設計を支持するために、「対」内で混合させた１０９のペプチドライブラリーを使用して、１つのマイクロ培養物当たり１ｘ１０6細胞のＰＢＭＣサンプルサイズを決定した。文献から、末梢血中の抗ミエリンＴ細胞の頻度は、１０5細胞中１〜１０6細胞中１の範囲内であってもよいことが示唆される場合、本サンプルサイズは、小さすぎて、信頼される抗ミエリンＴ細胞免疫の検出を期待できない場合がある。凝集体が最終ＥＬＩＳｐｏｔアッセイに及ぼす影響に加えて、この問題を解決するために、マイクロクラスターチューブ中において、３５０μｌ中１ｘ１０6または３ｘ１０6細胞のいずれかのＰＢＭＣサンプルサイズを含むマイクロ培養においてＰＢＭＣを設置し、前述のように、「対」中でＭＯＧペプチドを混合して、ＭＯＧペプチドライブラリーへの応答を調査した。
【０１２５】
図１０は、初期に１ｘ１０6ＰＢＭＣで播種したマイクロチューブ培養物からのプレーティングＥＬＩＳｐｏｔから、ペプチド混合Ｍ０Ｇｍｌ６に対する「弱い」応答を示すことがわかる。この実験では、解離ステップの適用により、「未処置」培地対照によって定義されるとおり、「偽陽性」の可能性に及ぼす影響を最少にした。しかし、第０日の播種材料として、３ｘ１０6ＰＢＭＣを利用することで、ペプチドプールＭ０Ｇｍｌ６に対して更に頑強な応答となり、未処置対照内のスポットの存在によって定義されるとおり、解離ステップにより「偽陽性」のリスクを除去した。
【０１２６】
上記のデータにより、１つのペプチドプールに対するサンプルサイズの増大が裏付けられる。しかし、１２０ｍｌ採血から採取されるＰＢＭＣの数が限定され、「対」内で混合された１０９のペプチドライブラリーをスクリーニングすることができず、これによって、５５のペプチド「標的」（１つの標的に対してサンプルサイズ３ｘ１０6ＰＢＭＣ）となる。１つのペプチド「標的」に対して３ｘ１０6細胞までＰＢＭＣサンプルサイズを増大できるようにするためには、重なり合ったペプチドライブラリーを混合して、ただの「対」とは対照的に、６のペプチドの「プール」を作製することが必要になる。実際には、ＭＢＰライブラリーは、６のペプチドの６の「プール」から構成される。ＭＯＧについては、ｃ末端プール（ＭＯＧｐ６）を有する６ペプチドの５「プール」は、８のペプチドから成る。最終的には、ＰＬＰは、６のペプチドの５の「プール」から構成され、１つ（ＰＬＰｐ６）は５のペプチドから成る。このシナリオでは、ペプチドファミリーはＭＢＰ、ＭＯＧ及びＰＬＰを包含し、それぞれが全１０９ペプチドライブラリーを包含する６の「標的」からなる。１つのペプチドプール当たりのサンプル細胞数を容易に多くするため（すなわち３ｘ１０6ＰＢＭＣ）、３５０μｌ容積のマイクロクラスターチューブとは対照的に、第０日目に５ｍｌＦＡＣＳチューブ内に容積１．５ｍｌの量の細胞培養物を作製した。この構成により、「マクロバルク」培養物と称される。
【０１２７】
ＥＬＩＳｐｏｔを用いることによる別の懸念は、計算するスポットの「半定量的」性質であった。ＣＴＬ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔソフトウエアを較正して、均一の性質のスポットを認識することができるが、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで形成されたスポットは、形状、寸法及び分布に関して、きわめて可変性であった。これは、図１１に上手く示されている。共培養５日後、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いるため、抗原特異的Ｔ細胞は、不揃いのサイズの大きいスポットとなり、再刺激時のアッセイの１８時間、ＩＦＮγ分泌のそれらの高反応性及びＥＬＩＳｐｏｔウェルでの運動性を示す。ＥＬＩＳｐｏｔウェル内で活性が上昇するにつれて、計算するスポットの精度を低下させた（図１１）。
【０１２８】
ＥＬＩＳｐｏｔ数の正確性を改善するために（特に、陽性シグナルの検出可能性を増大するように、第０日目に播種ＰＢＭＣサンプルサイズを１ｘ１０6から３ｘ１０6のＰＢＭＣへ増大させて）、正確なスポットの計数を容易にするように、細胞希釈ステップを含めてＥＬＩＳｐｏｔを設定した。要約すると、第５日の１．５ｍｌ培養物を遠心分離し、消耗培地を除去し、「細胞解離」ステップを適用し、細胞ペレットを最終的に新鮮培地４００μｌに再懸濁した。ＥＬＩＳｐｏｔプレートの２つのウエル（マクロ培養物の１／２を示す）は、それぞれ、１００μｌで播種した。１００μｌ細胞懸濁液を再び、２つのＥＬＩＳｐｏｔウェルのそれぞれに配置して、原液播種のマクロバルク培養物の１：８希釈を作製する前に、細胞の残部（２００μｌ）を新鮮培地６００μｌで更に希釈した。
【０１２９】
ＥＬＩＳｐｏｔで「サイトカイン分泌細胞」の数を計算する代替として、平行ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡも樹立して、「累積分泌」のＩＦＮγを検出した。アッセイフォーマットは、ニトロセルロースＥＬＩＳｐｏｔプレートではなく、抗ＩＦＮγ抗体コーティングＥＬＩＳＡプレートに細胞をプレートアウトする点を除き、ＥＬＩＳｐｏｔ用と本質的に同一である。ペプチドプールを添加して再刺激後、及びＡＰＣ源としてＰＢＭＣを支持した後、培養の１８時間後細胞を洗浄し、比色分析基質など従来のＥＬＩＳＡとして、プレートを発現させる。この方法の利点は、ＩＦＮγの濃度依存標準曲線に対してＯＤを解釈する場合は、読取り値は実際に定量的である。同じ凍結保存ＰＢＭＣ原料物質からＥＬＩＳｐｏｔ及びｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡアッセイを作製したが、いずれのアッセイも、異なる日に第０日から開始した。
【０１３０】
図１２及び図１３は、好ましいエピトーププロファイリングアッセイを作製する際に、異なる日に設定された同一の細胞原料物質に基づいて独立したアッセイを実施するとき、また、最終読取り値の代替アッセイプラットフォームを適用するときであっても、最初に、個々内における応答ペプチドプールの検出に関して一致していることを示す。データの質の改善は、ほぼ確実に初期培養サイズの増大（すなわち、第０日目に３ｘ１０6対１ｘ１０6ＰＢＭＣ）に関連する。これにより、１０９のペプチドライブラリーを含む重なり配列由来のいずれか１つのペプチドプールの存在下で、共培養の最初の５日間で拡張され得る比較的稀なミエリン反応性Ｔ細胞の捕捉可能性が増大する。
【０１３１】
ＥＬＩＳｐｏｔ及びｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの両者は、検出可能な範囲に関する問題を有する。数の多い大型反応性スポットを有するＥＬＩＳｐｏｔウェルでは、スポット数が２００を超えるとき、正確に定量化することは困難である。Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡは、いくつかのデータポイントで、「範囲外」となり得る約３００ｐｇ／ｍｌの定量上限を有する。この問題を解決するために、いずれのアッセイも播種材料の希釈ステップを含めて設定した（図１２及び図１３）。正確なデータを得るために、均質細胞懸濁液の正確な希釈を必要とし、細胞の「解離ステップ」の導入と、その後「稀な事象」、すなわちミエリン反応性Ｔ細胞のサンプルウェルへの均等な配分が必要とされた。達成可能ではあるが、希釈シリーズによって、マクロバルク培養をかなり操作することとなり、１つがそれぞれ抗原標的ＭＢＰ、ＭＯＧ及びＰＬＰである、合計３つの９６ウェルプレートに播種する。その目的が「高スループット」プラットフォームを設計することであるとき、細胞希釈を実施する錯体及びアッセイの「サイズ」が問題となる。
【０１３２】
実施例１．２．３：抗原特異的免疫を検出するための培養第６日目の従来のＥＬＩＳＡの評価及びエピトーププロファイリングアッセイ（ＥＰＡ）の確立。
【０１３３】
Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡの読取り値は、細胞から分泌され、それによって、アッセイ自体内のインサイチュの周囲の上清から捕捉されるＩＦＮγの濃度である。このため、アッセイ領域内のＩＦＮγ含量を分析するためにキラー細胞数を希釈する代わりに、容易な方法では、キラー細胞を希釈しないが、上清を希釈し、従来のＥＬＩＳＡに第２のアッセイとして適用する。その後、均質細胞懸濁は決定的なものではないため、細胞内「解離ステップ」を回避することができる。第５日目には、ＩＦＮγ含量の定量化のために、上清の採集前にマクロバルク培養の再刺激を培養チューブ自体におおいて直接行うことができ、有意に培養の操作を削減することができる。
【０１３４】
上述のように精製アッセイの最初の試験としては、健常ドナー（３１８３）から破傷風毒素の公開免疫優性ペプチド配列（合計７つのペプチド（ＴＴ１〜ＴＴ７）を包含する）に対する免疫応答を検出するために、４つの独立した演算子による認定を設定した。要約すると、各演算子から、第０日目に１．５ｍｌ培地量で５ｍｌ  ＦＡＣＳチューブに３ｘ１０6ＰＢＭＣの７つの培養を設定し、それぞれ、７つのパネルから１つのペプチドの２０μｇ／ｍｌでパルスした。第５日目に、培養上清１ｍｌを除去し、抗原提示源として１ｘ１０6ＰＢＭＣを添加し、培養物を再びペプチド２０μｇ／ｍｌ／最終培養量１ｍｌでパルスした。一晩インキュベートした後、上清を収集し、従来のＥＬＩＳＡを用いて、ｐｇ／ｍｌに変換した光学密度を用いて、組み換え型ＩＦＮγの標準曲線を参照することにより、ＩＦＮγ含量に関するアッセイを行った。「未希釈」及び希釈１：２、１：４及び１：８に関して、上清のアッセイを行った。
【０１３５】
表１は、陰性対照（ペプチドの不存在下で培養したＰＢＭＣ）を２．５倍上回るように設定したしきい値を上回って測定されたＩＦＮγ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。一致率は、個々のペプチド標的に対する陽性または陰性応答が正確に認識された演算子（合計４つ）の百分率を示す。当然のことながら、陽性応答が検出される場合、上清が滴定されると一致率が低下し、これは、演算子間で検出されるＩＦＮγの絶対濃度の差異を示す。重要なことに、未希釈の上清をアッセイするとき、ＴＴペプチド、ＴＴ３、ＴＴ５、ＴＴ６及びＴＴ７については、４つの演算子間で、陽性活性の１００％一致が明かになっている。ＴＴペプチド、ＴＴ１及びＴＴ２については、非反応性の１００％一致が明かになっている。ＴＴ４のデータは、更に可変的であり、唯一の演算子（ＨＫ）が頑強な応答を検出する。ＴＴ４の再現性がないことは、培養第０日目に開始したと考えられる稀な一次免疫応答が検出されていることを示し得る。
【０１３６】
表１：破傷風毒素ペプチドを用いたエピトーププロファイリングアッセイの演算子間検査
【表２】
2017505447.tif 000004
【０１３７】
データは、陰性対照（ペプチドなし）培養を上回る２．５倍に設定して、陽性しきい値を上回るＩＦＮγ（ｐｇ／ｍｌ）を示す。ＡＬＯＱ：定量化レベルを超える（３１３ｐｇ／ｍｌ）
【０１３８】
追加の２つの演算子により、破傷風毒素ペプチドパネルを有する異なるドナー（０３１９０）由来のＰＢＭＣを用いて、ＥＰＡの更なる検査を行った。表２のデータは、試験上清の１：２希釈点での陰性対照（ペプチドなし）の２．５倍のＩＦＮγの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。「未希釈」上清中に検出されるシグナルと比較したとき、シグナルを滴定可能にする必要があるため、分析にもっとも適切な滴定点として、１：２希釈点を選択した。さらに、弱く、このため、偽陽性の可能性のあるデータは、分析に含まれないよう排除される。データは、ドナー０３１９０の破傷風毒素ペプチドＴＴ３、ＴＴ６及びＴＴ７に対する陽性反応に関する２つの演算子間の１００％一致を示す。
【０１３９】
【表３】
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【０１４０】
データは、上清の１：２希釈点に関して、陰性対照（ペプチドなし）培養を２．５倍上回るように設定した、陽性しきい値を上回るＩＦＮγ（ｐｇ／ｍ）を示す。
【０１４１】
ミエリンペプチドプールを有する好ましいアッセイフォーマットを定量化するために、１つのペプチドプール当たり３ｘ１０6  ＰＢＭＣを第０日目に開始し、第５日目に再刺激し、第６日目に上清のＩＦＮγ含量を定量化した。健常ドナーから誘導される単一のＰＢＭＣ源を使用して、１つの演算子当たり３つの複製ＥＰＡを作製した。表３は、滴定された上清の１：２希釈点からデータをプロットしたとき、ドナー（０３１９０）がＭＯＧｐ６、ＰＬＰｐ１及びＰＬＰｐ４に対して検出可能な応答を有することを示す。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡアッセイのより低いレベルでの定量（ＬＬＯＱ）は１１．２５ｐｇ／ｍｌである。ペプチドなしの対照において、陽性しきい値が応答を２．５倍上回るように再び設定し、これらのアッセイでは、ＬＬＯＱは同等であった。
【０１４２】
表３：ミエリン反応性Ｔ細胞を検出するエピトーププロファイリングアッセイ（ＥＰＡ）の演算子間及びアッセイ間検査。データは、各培養物中の陽性しきい値を上回って検出されたＩＦＮγの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【表４】
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【０１４３】
このドナーの反復性陽性スコアを有する３つの免疫反応性ペプチドプールは、ＭＯＧｐ６、ＰＬＰｐ１及びＰＬＰｐ４であった。２つのもっとも反応の高いペプチドプール（ＰＬＰｐ１及びＰＬＰｐ４）の一致率は１００％であった。ＭＯＧｐ６に対する反応性は弱く、実施した６つのアッセイのうちの５つに検出された。このため、偽陰性データの可能性が存在するが、これは、低い頻度で、反応が低下しているペプチドプールを用いた場合のみである。データを基準にして、１５のペプチドプールは、「非反応性」と考えられる。合計９０培養物（６つのアッセイで１５のペプチドプール）で、２つのみが偽陽性を示した（つまり約２％）。Ｔ細胞免疫療法プロトコールにおいて使用するためにミエリン反応性Ｔ細胞株を上手く作製する能力は、Ｔ細胞伝播用に選択される真の反応性ペプチドプールのみに依存する。ＥＰＡにおいて偽陽性率が非常に低いことにより、抗原特異性を欠くＴ細胞株が作製されるリスクが軽減される。
【０１４４】
実施例１．３
【０１４５】
ミエリンペプチドに対する陽性Ｔ細胞免疫反応性を明らかにするためにサイトカイン検出を使用する例を更に挙げると、エピトーププロファイリングアッセイの上清に対して、さらに詳細な分析を行った。この目的を達成するために、１３のサイトカインを同時に検出するビード系多重アッセイを実施して、ミエリンペプチドに対する多官能性Ｔ細胞免疫をプロファイルした。
【０１４６】
ＥＰＡは、個々の５つのＭＳドナー由来のＰＢＭＣで実施した。従来どおり、追加のＰＢＭＣ及びペプチドで培養物の再刺激の２４時間後、上清を第６日目に収集した。
【０１４７】
多重アッセイ前に、サンプルを遠心分離にかけて細胞くずを除去し、アッセイまでマイナス２０℃で保存した。アッセイ用に調製する際に、試薬はＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｌ７  ｋｉｔで提供され（抗体固定用ビーズ、品質管理サンプル及びサイトカイン標準物質を含む）、それらの適切なバッファ中で再構成させた。提供したアッセイバッファを用いて、ストック標準液から１：４連続希釈を実施することによって標準曲線サンプルを調製した。提供したプレートの全ウェルを２００μＬ  アッセイバッファと共に１０分間インキュベートし、非特異的結合を阻害した。その後、アッセイバッファを廃棄し、適切なマトリクス溶液２５μｌに加えて、各標準液または対照液２５μＬを適切なウェルに添加した。各サンプルウェルに対して、サンプル上清２５μＬと共に、アッセイバッファ２５μＬを添加した。その後、２５μｌ抗体固定用ビーズと共に光から保護し、攪拌しながら、１８時間、４℃ですべてのウェルを培養した。その後、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬ−４０５プレート洗浄機を使用して、プレートを洗浄し、検出抗体溶液を１．５時間適用した。非洗浄プレートには、ストレプトアビジンＰＥ溶液を３０分間適用し、過剰な試薬はすべて直ちに洗浄して除去した。その後、ＭａｇＰｉｘ照度計で捕捉する前に、すべてのウェルにＭａｇＰｉｘランニングバッファ１５０μＬを充填した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  Ａｎａｌｙｓｔソフトウエアを使用して、サンプル中のサイトカイン濃度を定量化した。
【０１４８】
表４に示すように、５つのすべてのドナーは、１つ以上のペプチドプールに対して陽性反応を示した。全ての場合について、ペプチドなし（ＮＰ）対照培養物を使用して、各サイトカインの分泌の基準自然発生レベルを設定した。検出されたアナライトでは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−６は最も速やかに、最も高い頻度で検出された。
【０１４９】
表４：ミエリンペプチドに応答する５つのＭＳドナーサンプルのサイトカインレベル
【表５】
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【０１５０】
多官能性ＭＲＴＣを検出するために、リード活性化サイトカイン候補として、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−６の実用性を確立し、更なる８のＭＳドナーに対して３つのアナライトの多重アッセイを行った。データを表５に示す。
【０１５１】
表５：ミエリンペプチドに応答する８つのＭＳドナーサンプルのサイトカインレベル
【表６】
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【０１５２】
実施例１．４：考察
【０１５３】
方法開発に注力して、信頼のあるプラットフォームを作製して、ＩＦＮγの分泌を示す最終機能的読取りを有するＰＢＭＣ中ミエリン反応Ｔ細胞（ＭＲＴＣ）を検出した。
【０１５４】
２つの主要な考察を示した：
【０１５５】
１）ＰＢＭＣ中の低い頻度のＭＲＴＣ、及び陽性免疫を検出するためのそのサンプルサイズへの影響
【０１５６】
２）個々のペプチドプールに対する陽性免疫の高スループット読取り値が可能になる好ましい検出システム。
【０１５７】
最初の目的は、「対」で１０９のペプチドライブラリーを使用し、５５の「標的」を作製し、それに対するＴ細胞免疫を測定することであった。しかし、１２０ｍｌ採血を原料物質として利用することで、典型的には、１．２億〜１．５億細胞へのアッセイに利用可能なＰＢＭＣの総数が限定され、約１億〜１．２億のＴ細胞を含む。簡素なエクスビボアッセイ（例えばＥＬＩＳｐｏｔ）は、前培養期間がなく、非感受性であり、アッセイ前に抗原特異的Ｔ細胞を拡張することができないことが判明した。５５のペプチド標的を利用して、十分な細胞を維持して、アッセイで培養物を再刺激することができるようにするために、「対」としてのいずれか１つのペプチド混合物に対する免疫に関して、サンプルサイズ１００万のＰＢＭＣのアッセイを行う必要がある。試験にかかわらず、最初のサンプルサイズ１００万ＰＢＭＣを利用したアッセイでは、頑強となることはない。ＭＲＴＣは、「稀な事象」であり、ＰＢＭＣ中、１／１０5〜１／１０6Ｔ細胞が発生していると考えることができ、１つのペプチド混合物またはプール当たりちょうど１００万のＰＢＭＣのサンプルサイズは「偽陰性」データとなる傾向にあると考えられる。こうした制限を回避するために、対とは対照的に６つの群でペプチドを貯留し、１８のペプチド標的のパネルを作製し、それぞれが、「マクロバルク」培養環境中、３００万細胞のＰＢＭＣサンプルサイズに対して評価された。
【０１５８】
陽性抗ミエリン免疫の検出に関して、ＰＢＭＣのマクロバルク培養５日目以降、ＭＢＰ、ＭＯＧ及びＰＬＰを含む１８のペプチドプールの存在下において、全体で、３つのアッセイプラットフォームを評価した。低頻度免疫応答が検出されるその可能性により、てＥＬＩＳｐｏｔを好ましいアッセイであると考えた。しかし、培養５日目までに事前に感作させた免疫を検出するためにアッセイを使用することにより、半定量的データのみ得られた。プレーティング前に細胞の解離に必要とするアッセイに加えて、信頼され得ると考えられるこれらの滴定により、「スポット」を定量化する。代替法として、インサイチュｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡで発現させて、累積ＩＦＮγ分泌を測定した。しかし、ダイナミックレンジを欠いていることにより、細胞は、再び、解離及び滴定により、ＩＦＮγの有意性のある定量化を必要とする。いずれのアッセイも助長するデータとなったが、プラットフォームの複雑性により、それ自体が「高スループット」形式とはならなかった。
【０１５９】
最終のアッセイの構成には、第５日目に培養物の再刺激を行う第０日目の各ペプチドプールに、サンプルサイズ３００万ＰＢＭＣを利用した。上清を第６日目に採取して、従来のＩＦＮγサンドイッチＥＬＩＳＡ法に滴定した。キラー細胞の滴定を回避したこの方法で、アッセイプラットフォームの複雑性を大きく低減した。
【０１６０】
１８のミエリンペプチドプールへの免疫に加えて、破傷風毒素由来の７つの免疫優性ペプチドに対する免疫を試験する演算子間分散、アッセイ間分散に関して、好ましいアッセイプラットフォームを評価した。
【０１６１】
アッセイを設計するときの重要な考察は、「偽陽性」データを検出する可能性が制限されることであった。このために、陽性しきい値は、初めに陰性対照培養物の２．５倍上に設定した。加えて、このしきい値は、ＥＬＩＳＡ内の培養上清の１：２希釈で侵害する必要があった。このようなしきい値を選択することにより、確実に、「未希釈」上清のデータを分析するときのみ陽性と判定され得る弱い応答を、可能性のある「偽陽性」ペプチドの選択肢として選ぶことができない。このようなしきい値では、不定期の「偽陰性」が報告される可能性が保持される（表３を参照されたい）。しかし、Ｔ細胞株を上手く作製することができる、抗原特異免疫を示すように、選択させるペプチドプールが頑強な応答を示すことが最も重要なことである。
【０１６２】
Ｔ細胞ワクチンに対する陽性応答の定義及びペプチドの配分製造
【０１６３】
開発中、任意の１つのペプチドプールに対する陽性応答は、対応する陰性対照培養物中に記録されたものよりも少なくとも２．５倍高い上清の１：２希釈点でＩＦＮγ（ｐｇ／ｍｌ）の濃度を検出することによって定義した。ＩＦＮγの濃度がアッセイの検出上限（３１３ｐｇ／ｍｌ）を超える場合、１：４及び１：８希釈点が範囲内であり、滴定のエビデンスを示す。ＩＦＮγの存在を示す（例えば、所定のレベルを上回る活性レベルを有する）ペプチドプールを利用すると、複数のＴ細胞株は、Ｔ細胞免疫療法として使用するために作製することができる。
【０１６４】
開発が進むにつれて、ＥＰＡ上清の多重のサイトカイン分析の利用は、単一のアナライト（例えば、ＩＦＮγ）の検出と対照的に、ミエリンペプチドプールに対する多官能性Ｔ細胞応答の検出が可能になる。結果として、幅広い反応度のアレイが検出され、その結果、より多くのドナーがミエリンに対して陽性反応を示す。サイトカインの異なる組み合わせを検出することが、異なる疾患に伴うエピトープのプロファイリングに有用となり得ることが想定される。
【０１６５】
表５は、ペプチドなし対照に対する各ドナーの乗数に基づいてミエリンに対する陽性反応を同定するために利用される「活性レベル」を示す。ミエリンペプチドプールに対する陽性反応の選択を裏付けするために、以下の活性レベルにより、１つ以上のサイトカインの存在を決定した。
【０１６６】
１０ｘペプチドなし対照を超えるＩＦＮγ応答のみ。ＩＦＮγによるランク付け
【０１６７】
５ｘペプチドなし対照を超えるＩＦＮγ応答及び５ｘペプチドなし対照を超えるＴＮＦα応答。ＩＦＮγによるランク付け
【０１６８】
５ｘペプチドなし対照を超えるＩＦＮγ応答及び５ｘペプチドなし対照を超えるＩＬ−６応答。
ＩＦＮγによるランク付け。
【０１６９】
５ｘペプチドなし対照を超えるＴＮＦα応答及び５ｘペプチドなし対照を超えるＩＬ−６応答ＴＮＦαによるランク付け
【０１７０】
各ドナーについて、表５は、各陽性ペプチドプールに関して、サイトカインまたは第１及び第２のサイトカインの存在をどのように判定したかを示す。濃度（ｐｇ／ｍｌ）欄は、最も高いランクのサイトカインの濃度及びその関連する活性レベルを示す。多くの場合、ミエリンペプチドプールに対する免疫は、２つ以上のサイトカインの存在によって判定した。８つのうち７つのドナーでは、ＩＦＮγが存在することによってＭＲＴＣ反応性が満たされた。１つのドナー（１４０１００３０〜０３８５６）については、ＩＦＮγの不在下でのＴＮＦ−ａ及びＩＬ−６シグナルの両者の存在によって陽性が満たされる。
【０１７１】
本明細書で言及されるすべての特許及び特許公報は、参照によって本明細書に援用される。
当業者は、前述の明細書を読んだときに、特定の変化形態及び改善形態を思いつくだろう。こうした変化形態及び改善形態はすべて、簡潔性及び可読性のために、本明細書に記載されていないが、適切に次の請求項の範囲内であることを理解すべきである。
【０１７２】
ミエリンペプチド配列、混合物及びプール
【表７】
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【表８】
2017505447.tif 000010
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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