(57)【要約】  本発明は、Ｆｃ融合タンパク質と、融合タンパク質にコンジュゲートされた親水性基を含有する多アーム高分子量ポリマーとを含む、組換えブチリルコリンエステラーゼ融合タンパク質、およびこのようなポリマーを調製する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
両性イオン性ポリマーと共有結合する、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーおよび触媒性ＯＰバイオスカベンジャーからなる群から選択される、有機リン（ＯＰ）バイオスカベンジャーを含んでなるコンジュゲートであって、前記ポリマーが、１つまたは複数のタイプのモノマー単位を含んでなり、少なくとも１つのタイプのモノマー単位が、両性イオン基を含んでなる、コンジュゲート。
【請求項２】
ＯＰバイオスカベンジャーが、アリールジアルキルホスファターゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリールエステラーゼ、パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）、オルガノリン酸アンヒドラーゼ、およびジイソプロピルフルオロホスファターゼ（ＤＦＰａｓｅ）からなる群から選択される、触媒性バイオスカベンジャーである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記ＯＰバイオスカベンジャーが、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）およびブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）からなる群から選択されるコリンエステラーゼを含んでなる、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記コリンエステラーゼが、血漿から精製される、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記コリンエステラーゼが、組換えＤＮＡ技術によって製造される、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記コリンエステラーゼが、ブチリルコリンエステラーゼである、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記ブチリルコリンエステラーゼが、融合タンパク質として非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質に融合される、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質が、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含んでなる、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記Ｉｇドメインが、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣＨ、およびＩｇＧ−ＣＬからなる群から選択される、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１である、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記Ｉｇドメインが、ＩｇＧ−Ｆｃ（配列番号８）である、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記Ｆｃドメインが、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、およびＰ３３１からなる群から選択される位置の１つまたは複数にアミノ酸置換を有する、請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記Ｆｃドメインが、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ置換を有する、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記Ｆｃドメインが、Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃ置換の１つをさらに有する、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
前記置換がＱ３４７Ｃである、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素と前記非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質の間のリンカーをさらに含んでなる、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
前記リンカーが、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＧＳ（配列番号２３）、およびＧＧＧＥＳ（配列番号２４）、および前述のオリゴマーからなる群から選択される、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
前記リンカーが、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１）およびＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２５）からなる群から選択される、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素が、カルボキシルトランケートである、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素が、配列番号１のアミノ酸２９〜５６１を含んでなり、またはそれからなる、請求項１９に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素が、配列番号１のアミノ酸２９〜５６２を含んでなり、またはそれからなる、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素が、配列番号１の残基９４におけるＣがＹである変異を有する、請求項２０および２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
前記ブチリルコリンエステラーゼ融合物が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
前記両性イオン基が、ホスホリルコリンを含んでなる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのタイプのモノマー単位が、２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含んでなる、請求項２４に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのタイプのモノマー単位が、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含んでなる、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
前記ポリマーが、３本以上のアームを有する、請求項２５および２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
前記ポリマーが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２本のアームを有する、請求項２７に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
前記ポリマーが、３、６または９本のアームを有する、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
前記ポリマーが、９本のアームを有する、請求項２９に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が、３００，０００〜１，７５０，０００ダルトンのピーク分子量を有する、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が、５００，０００〜１，０００，０００ダルトンのピーク分子量を有する、請求項３１に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が、６００，０００〜８００，０００ダルトンのピーク分子量を有する、請求項３２に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記ポリマーが、前記コリンエステラーゼのアミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、およびカルボキシル基の少なくとも１つと共有結合する、請求項２８に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
前記スルフヒドリル基が、前記コリンエステラーゼ中のシステイン残基に由来する、請求項３４に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
前記システイン残基が、前記コリンエステラーゼ中のシステインが天然に存在しない位置にある、請求項３５に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
前記コリンエステラーゼが、配列番号２に対応するブチリルコリンエステラーゼ融合物であり、前記システイン残基がアミノ酸６７２にある、請求項３６に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
配列番号１のアミノ酸２９〜５６２を含んでなり、またはそれからなる、ブチリルコリンエステラーゼ酵素。
【請求項３９】
残基９４がチロシンである、請求項３８に記載のブチリルコリンエステラーゼ酵素。
【請求項４０】
組換えＤＮＡ操作によって導入されたシステイン残基をさらに含んでなる、請求項４０に記載のブチリルコリンエステラーゼ酵素。
【請求項４１】
配列番号１３を含んでなる、請求項４０に記載のブチリルコリンエステラーゼ酵素。
【請求項４２】
ブチリルコリンエステラーゼ酵素と非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質とを含んでなる、ブチリルコリンエステラーゼ酵素融合タンパク質。
【請求項４３】
前記非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質が、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含んでなる、請求項４２に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
前記Ｉｇドメインが、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣＨ、およびＩｇＧ−ＣＬからなる群から選択される、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
前記ＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項４４に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
前記ＩｇＧ１ドメインが、ＩｇＧ１−Ｆｃ（配列番号８）である、請求項４５に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
前記Ｆｃドメインが、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、およびＰ３３１からなる群から選択される位置の１つまたは複数にアミノ酸置換を有する、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
前記Ｆｃドメインが、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ置換を有する、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
前記Ｆｃドメインが、Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃ置換の１つをさらに有する、請求項４８に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
前記置換がＱ３４７Ｃである、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素と前記非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質の間のリンカーをさらに含んでなる、請求項４２に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
前記リンカーが、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＧＳ（配列番号２３）、およびＧＧＧＥＳ（配列番号２４）、および前述のオリゴマーからなる群から選択される、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
前記リンカーが、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１）およびＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２５）からなる群から選択される、請求項５２に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素が、カルボキシルトランケートである、請求項５２に記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素が、配列番号１のアミノ酸２９〜５６１を含んでなり、またはそれからなる、請求項５４に記載の融合タンパク質。
【請求項５６】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素が、配列番号１のアミノ酸２９〜５６２を含んでなり、またはそれからなる、請求項５５に記載の融合タンパク質。
【請求項５７】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素が、配列番号１の残基９４におけるＣがＹである変異を有する、請求項５５または５６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
前記融合タンパク質が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項５１に記載のコンジュゲート。
【請求項５９】
請求項１〜５８のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは融合タンパク質のいずれかの有効量を患者に投与するステップを含んでなる、ＯＰ中毒を治療または予防する方法。
【請求項６０】
前記コンジュゲートが、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、病巣内投与または皮内投与によって投与される、請求項５９に記載の治療または予防法。
【請求項６１】
前記コンジュゲートが、筋肉内投与によって投与される、請求項５９に記載の治療または予防法。
【請求項６２】
予期されるＯＰ化合物への曝露の少なくとも７日前に、両性イオン性ポリマーと共有結合する、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーおよび触媒性ＯＰバイオスカベンジャーからなる群から選択されるＯＰバイオスカベンジャーを含んでなる、コンジュゲートを投与するステップを含んでなる、ＯＰ中毒に対する長期予防をもたらす方法であって、前記ポリマーが、１つまたは複数のタイプのモノマー単位を含んでなり、少なくとも１つのタイプのモノマー単位が、両性イオン基を含んでなる、方法。
【請求項６３】
前記ＯＰ化合物が、ＯＰ農薬である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＯＰ化合物が、ＯＰ神経作用剤である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記コンジュゲートが、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも１４日前に投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記コンジュゲートが、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも２１日前に投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記コンジュゲートが、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも３０日前に投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
予期されるＯＰ化合物への曝露の少なくとも１２時間前に、両性イオン性ポリマーと共有結合する、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーおよび触媒性ＯＰバイオスカベンジャーからなる群から選択されるＯＰバイオスカベンジャーを含んでなる、コンジュゲートを投与するステップを含んでなる、ＯＰ中毒に対する迅速な予防をもたらす方法であって、前記ポリマーが、１つまたは複数のタイプのモノマー単位を含んでなり、少なくとも１つのタイプのモノマー単位が、両性イオン基を含んでなる、方法。
【請求項６９】
前記ＯＰ化合物が、ＯＰ農薬である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＯＰ化合物が、ＯＰ神経作用剤である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記コンジュゲートが、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも２４時間前に投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
カルバメート、抗ムスカリン薬、コリンエステラーゼ再賦活薬、および抗痙攣薬から選択される、別の医薬品を投与するステップをさらに含んでなる、請求項１〜７１のいずれかに記載の治療または予防法。
【請求項７３】
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の構造を有する高分子試薬を遊離スルフヒドリル残基を含んでなる生物活性剤と適切な条件下で接触させ、それによってコンジュゲートを提供するステップを含んでなる、コンジュゲートを調製する方法であって、
式中、
Ｐは、分岐または非分岐水溶性ポリマーであり；
Ｌ１は第１のリンカーであり、Ｌ２は第２のリンカーであり、Ｌ３は第３のリンカーであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、−Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル−、（−（ＣＨ２）１〜６−Ｏ−（ＣＨ２）１〜６−）１〜１２−、（−（ＣＨ２）１〜４−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２Ｏ−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−（Ｃ１〜８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−および−（ＣＨ２）０〜３−アリール−（ＣＨ２）０〜３−、結合、および上記の任意の組み合わせからなる群から選択され；
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され；
Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり、Ｒ１およびＲ２の双方がＨではないという条件で、Ｈと、１つまたは複数の塩基性基とからなる群から選択され、塩基性基が、
2017536105.tif 000127
（式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）
2017536105.tif 000128
（式中、Ｒ８およびＲ９は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
2017536105.tif 000129
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６、および１つまたは複数のアルギニン残基からなる群から選択される）
からなる群から選択される、方法。
【請求項７４】
前記生物活性剤が、治療用タンパク質およびアプタマーからなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記生物活性剤が、治療用タンパク質である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記タンパク質が、サイトカイン、酵素、抗体、および抗体断片からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記遊離スルフヒドリル基が、前記タンパク質のシステイン残基によって寄与される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記システイン残基が、天然システイン残基である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記タンパク質が、ＩｇＧ１  Ｆａｂである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記システイン残基が、組換え遺伝子操作によって導入される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
Ｐが、ポリ（酸化アルキレン）、ポリ（ＭＰＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８２】
Ｐが、ポリ（酸化アルキレン）である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
Ｐが、ポリ（酸化エチレン）（ＰＥＧ）である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＰＥＧが分岐している、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記分岐ＰＥＧが、２本のアームを有する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
各枝が、約５〜約４０ｋＤａのＰＥＧ分子量を有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
各枝が、約２０ｋＤａのＰＥＧ分子量を有する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ポリマーが、ポリ（ＭＰＣ）である、請求項７３に記載の方法。
【請求項８９】
前記ポリマーが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２本のアームを有する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ポリマーが、３、６または９本のアームを有する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ポリマーが、９本のアームを有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ポリマーが、３００，０００〜１，７５０，０００ダルトンのピーク分子量を有する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記ポリマーが、５００，０００〜１，０００，０００ダルトンのピーク分子量を有する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ポリマーが、６００，０００〜８００，０００ダルトンのピーク分子量を有する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
Ｌ３が結合であり、Ｒ２がＨであり、Ｒ１が、
2017536105.tif 000130
である、請求項７３に記載の方法。
【請求項９６】
Ｌ２が−（ＣＨ２）１〜６−である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
Ｌ２が−（ＣＨ２）３−である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
2017536105.tif 000131
を含んでなる、ポリマー合成のためのイニシエータであって、
式中、
Ｌ１は第１のリンカーであり、Ｌ２は第２のリンカーであり、Ｌ３は第３のリンカーであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、−Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル−、（−（ＣＨ２）１〜６−Ｏ−（ＣＨ２）１〜６−）１〜１２−、（−（ＣＨ２）１〜４−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２Ｏ−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−（Ｃ１〜８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−および−（ＣＨ２）０〜３−アリール−（ＣＨ２）０〜３−、結合、および上記の任意の組み合わせからなる群から選択され；
Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり、Ｒ１およびＲ２の双方がＨではないという条件で、Ｈと、１つまたは複数の塩基性基とからなる群から選択され、塩基性基は、
2017536105.tif 000132
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
2017536105.tif 000133
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
2017536105.tif 000134
（式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６、および１つまたは複数のアルギニン残基からなる群から選択される）
からなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、同一であるかまたは異なり、
2017536105.tif 000135
および
2017536105.tif 000136
（式中、Ｙは、ＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
からなる群から選択される、イニシエータ。
【請求項９９】
ＹがＢｒである、請求項９８に記載のイニシエータ。
【請求項１００】
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、それぞれ、
2017536105.tif 000137
である、請求項９９に記載のイニシエータ。
【請求項１０１】
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、それぞれ、
2017536105.tif 000138
である、請求項９９に記載のイニシエータ。
【請求項１０２】
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ、
2017536105.tif 000139
である、請求項９９に記載のイニシエータ。
【請求項１０３】
Ｌ３が結合であり、Ｒ２がＨであり、Ｒ１が、
2017536105.tif 000140
である、請求項９８に記載のイニシエータ。
【請求項１０４】
Ｌ２が−（ＣＨ２）１〜６−である、請求項９８に記載のイニシエータ。
【請求項１０５】
Ｌ２が−（ＣＨ２）３−である、請求項１０４に記載のイニシエータ。
【請求項１０６】
ラジカル移転可能原子または基との均等開裂性結合を含んでなるイニシエータ；
遷移金属化合物；および
2017536105.tif 000141
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
2017536105.tif 000142
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
2017536105.tif 000143
（式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６、および１つまたは複数のアルギニン残基からなる群から選択される）
からなる群から選択されるリガンドの存在下で、１つまたは複数のラジカル重合性単量体を重合するステップを含んでなる、重合方法であって、
前記リガンドが前記遷移金属化合物に配位し、
前記遷移金属化合物と前記リガンドが適合されて、前記単量体の重合を開始および伝播させる、重合方法。
【請求項１０７】
前記リガンドが、前記イニシエータに共有結合して、単分子イニシエータリガンドを形成する、請求項１０６に記載の重合方法。
【請求項１０８】
前記単分子イニシエータリガンドが、構造、
2017536105.tif 000144
を有する、請求項１０７に記載の重合方法であって、
式中、
Ｌ１は第１のリンカーであり、Ｌ２は第２のリンカーであり、Ｌ３は第３のリンカーであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、−Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル−、（−（ＣＨ２）１〜６−Ｏ−（ＣＨ２）１〜６−）１〜１２−、（−（ＣＨ２）１〜４−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２Ｏ−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−（Ｃ１〜８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−および−（ＣＨ２）０〜３−アリール−（ＣＨ２）０〜３−、結合、および上記の任意の組み合わせからなる群から選択され；
Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり、Ｒ１およびＲ２の双方がＨではないという条件で、Ｈと、１つまたは複数の塩基性基とからなる群から選択され、塩基性基は、
2017536105.tif 000145
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
2017536105.tif 000146
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
2017536105.tif 000147
（式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６、および１つまたは複数のアルギニン残基からなる群から選択される）
からなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、同一であるかまたは異なり、
2017536105.tif 000148
および
2017536105.tif 000149
（式中、Ｙは、ＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
からなる群から選択される、重合方法。
【請求項１０９】
ＹがＢｒである、請求項１０８に記載の重合方法。
【請求項１１０】
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、それぞれ、
2017536105.tif 000150
である、請求項１０９に記載の重合方法。
【請求項１１１】
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、それぞれ、
2017536105.tif 000151
である、請求項１０９に記載の重合方法。
【請求項１１２】
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ、
2017536105.tif 000152
である、請求項１０９に記載の重合方法。
【請求項１１３】
Ｌ３が結合であり、Ｒ２がＨであり、Ｒ１が、
2017536105.tif 000153
である、請求項１０８に記載の重合方法。
【請求項１１４】
Ｌ２が−（ＣＨ２）１〜６−である、請求項１１３に記載のイニシエータ。
【請求項１１５】
Ｌ２が−（ＣＨ２）３である、請求項１１４に記載のイニシエータ。
【請求項１１６】
前記ラジカル重合性単量体が、オレフィン性不飽和単量体である、請求項１０８に記載の重合方法。
【請求項１１７】
前記不飽和単量体が、ＨＥＭＡ−ＰＣを含んでなる、請求項１１６に記載の重合方法。
【請求項１１８】
前記遷移金属が、低原子価状態にある遷移金属、または少なくとも１つの配位非荷電リガンドが配位した遷移金属の１つであり、前記遷移金属がカウンターイオンを含んでなる、請求項１０８に記載の重合方法。
【請求項１１９】
前記遷移金属が、銅、鉄、ニッケルまたはルテニウムからなる群から選択される、請求項１０８に記載の重合方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表への言及
配列は、参照により援用される、２０１５年１０月１６日に作成された８４，７２７バイトの４７０６７８＿ＳＥＱＬＳＴ．ＴＸＴと命名された、提出ＡＳＣＩＩテキストに提供される。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにその内容全体が参照により援用される、２０１４年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０６５，４７１号の非仮特許出願である。
【背景技術】
【０００３】
１．バイオスカベンジャー
有機リン化合物（ＯＰ）は、ヒトに対して高度に毒性である。ＯＰは１９３０年代に殺虫剤として最初に開発され、ヒトに対する猛毒性は、最終的にそれらの戦闘用神経作用剤としての開発をもたらした。今日、一般的に国際法によって禁止されてはいるものの、ＯＰは、増加の一途を辿る軍事および民事的脅威と考えられている。１９９５年には、東京都の地下鉄網がサリン攻撃を受けて、数十人の乗客が殺害され、多数が負傷した。サリンガスは、最近、シリアでの紛争において、地対地ミサイル上で致死効果を以て使用されたことが報告されている。
【０００４】
サリンなどのＯＰ神経作用剤は、アセチルコリンエステラーゼの強力な阻害剤である。脊椎動物では、アセチルコリンは、神経系からのシグナルを筋肉繊維に伝達するのに使用される神経伝達物質である。常態では、アセチルコリンは、神経細胞から放出されて、筋肉を刺激する。刺激後、アセチルコリンエステラーゼは、アセチルコリンを代謝して筋肉を弛緩させる。しかし、サリンなどのＯＰは、アセチルコリンエステラーゼを不可逆的に阻害して、アセチルコリンの分解を阻害する。ＯＰ神経作用剤は、一般に非常に小さな用量で致死性であり、対象は、一般にある種の窒息で死亡する。致死用量より少ないＯＰを投与された対象は、恒久的な神経障害を発症することもある。さらに、ＯＰ農薬は、未だに幅広く使用されている。ＯＰ農薬は、神経作用剤よりもはるかに低有毒であるが、ヒトに対するＯＰ農薬の毒性は、未だに大きな懸念を与える。
【０００５】
ＯＰ中毒（ｐｏｉｓｉｎｇ）に対する解毒剤および治療薬は、極めて限られている。ＯＰ中毒症状（ｓｙｍｐｔｏｎ）（例えば、振戦）に対する、小分子治療薬がある。しかし、全体的に、これらの治療法は、非常に限定的な利点をもたらす。ムスカリン性ＡＣｈ受容体遮断のためにアトロピンが、かつ痙攣の対症的管理のためにジアゼパムが、投与されてもよい。Ｌｅｅ  Ｅ．Ｃ．（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓａｒｉｎ  ｎｅｒｖｅ  ｇａｓ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２９０：６５９−６６２。さらに、２−プラリドキシム（２−ＰＡＭ）によるオキシム療法は、ＯＰ−ＡＣｈＥ付加物の全てではないが、いくつかを効果的に再活性化し得る。Ｃａｎｎａｒｄ，Ｋ．（２００６）Ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｒｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  ２４９：８６−９４。これらの治療法は、殺虫剤または非常に低用量の神経作用剤などのより低毒性のＯＰの場合は、死亡率を低下させ得るが、それらは、一般に、ＯＰ神経作用剤に対する可能な戦場レベル曝露に関しては、臨床医によって非常に効果がないと見なされる。
【０００６】
予防的な抗ＯＰ療法では、特定の酵素がバイオスカベンジャーとして作用することで、サリンなどのＯＰを解毒することが分かっている。ＯＰが不可逆的に不活性化するのと同じ酵素であるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）（ウシ胎仔血清由来）は、予防的に投与されると、化学戦用に設計された高毒性ＯＰ神経作用剤である、メチルホスホノフルオリド酸３，３−ジメチルブタン−２−イル（ソマン）のＬＤ５０の２〜５倍の攻撃から、アカゲザルを保護できる。Ｗｏｌｆｅ，Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ａｓ  ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｏｍａｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１７：１８９−１９３。
【０００７】
ＡＣｈＥは、多様な範囲のカルボキシルエステルを加水分解する酵素の多重遺伝子群多重遺伝子族である、カルボキシル／コリンエステラーゼ（ＣＥ／ＣｈＥ）の構成要素である。系統群の構成員としては、ＡＣｈＥ、ヒトカルボキシエステラーゼ１（ｈＣＥ１）および２（ｈＣＥ２）、およびブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）が挙げられる。これらの内、ＢＣｈＥは、バイオスカベンジャーとして最大の関心がもたれている。ＢｕＣｈＥは、ヒト血清中の主要なコリンエステラーゼである。近縁関係にある酵素ＡＣｈＥは、はっきりとコリン作動性伝達の主要シナプス調節物質とされているが、ＢＣｈＥの確定的な生理学的役割は、依然として実証されていない。
【０００８】
ＢｕＣｈＥは、触媒的に乱交雑性であり、アセチルコリン（ＡＣｈ）だけでなく、より長鎖のコリンエステル（例えば、その好ましい基質であるブチリルコリン、およびスクシニルコリン）、およびアセチルサリチル酸（アスピリン）およびコカインなどの多様な非コリンエステルもまた、加水分解する。さらに、ＢｕＣｈＥは、大部分の環境発生するＣｈＥ阻害剤、ならびに人造ＯＰ農薬および神経作用剤と結合する。しかし、生理学的に利用可能なレベルの天然ＢｕＣｈＥは、ＯＰに関して何らかの有意義な保護を与えるには低すぎる。
【０００９】
ヒト血清から精製されたＢｕＣｈＥが、ヒトを治療するために使用されている。患者は、筋肉弛緩薬効果およびＯＰ農薬中毒に対抗する、部分的精製ヒトＢｕＣｈＥを成功裏に投与された。Ｃａｓｃｉｏ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ．Ｍｉｎｅｒｖａ  Ａｎｅｓｔｅｓｉｏｌ（Ｉｔａｌｉａｎ）５４：３３７−３４５。しかし、ヒト血清から精製された製品は、もちろん試験され得ない未知の血液媒介性病原体混入の脅威のために、極めて好ましくない。この点において、例えば、血友病を治療するためのＦＶＩＩＩは、今日、組換えＤＮＡ技術によって製造され、７０年代後半および８０年代前半に、数千人の患者がＨＩＶウイルスに感染した後には、もはやヒト血清からは精製されない。さらに、血清精製ＢｕＣｈＥの製造は、利用可能な血清量によって極度に制限される。Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｒａｄｉｏｌ．Ｄｅｆ．３：ｎｉｍｈｓ５０９５。
【００１０】
血清精製ＢｕＣｈＥを使用するのを回避するために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で組換えＢｕＣｈＥ（ｒＢｕＣｈＥ）が製造された。Ｍａｓｓｏｎ，Ｐ．（１９９２）ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｅｄｓ  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ，Ａ．，Ｖｅｌａｎ，Ｂ．（Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ  ４９−５２。しかし、製造されたタンパク質は、非機能性であった。ｒＢｕＣｈＥはまた、哺乳類２９３Ｔ中でも製造された（Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ，Ｃ．Ｖ．ａｎｄ  Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｏ．（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１１９−１２０：５３−６０）およびＣＨＯ（Ｍｉｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｂ．，Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｏ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ａ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１５９２５−１５９３３）。しかし、哺乳類発現系は、十分な量のタンパク質を製造できなかったため、血漿精製ＢｕＣｈＥに対する必要性は排除され得なかった。哺乳類細胞発現系で経験された困難さを考慮して、ヤギβ−カゼインプロモーター制御下にあるヒトＢｕＣｈＥ遺伝子を有する遺伝子組換えヤギが作成され、精製ヤギ乳からｒＢｕＣｈＥが製造できるようにされた。Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４（３４）：１３６０３−１３６０８。しかし、遺伝子組換えヤギｒＢｕＣｈＥが動物において試験されると、ＰＫおよび生物学的利用能結果は、酵素それ自体およびＰＥＧにコンジュゲートされた酵素の双方で、非常に期待外れであった。遺伝子組換えヤギにおいて生産されたｒＢｕＣｈＥは、そのＯＰ中毒予防のための薬剤としての開発を可能にする、血漿から精製された天然ヒトＢｕＣｈＥと同様の滞留時間は、明らかに有しなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、大量に製造され得て優れたＰＫ特性を有する、ＢｕＣｈＥの組換えバージョンと関連バイオスカベンジャーに対する必要性がなおもある。
【００１２】
２．ヨードアセトアミドコンジュゲーション
最初の組換えインスリン製品が１９８２年に認可されて以来、タンパク質およびペプチド治療薬は、多種多様な病態生理学的疾患に対する非常に効力のある治療薬として、成功裏に使用されている。これらの薬物の開発には、過去数十年にわたる組換えＤＮＡ技術における進歩によってはずみがついた。タンパク質治療薬は、一般に２つのカテゴリーの１つに分類される：（１）例えば、インスリンなどの天然タンパク質を模倣して、代替物の役割を果たす生物医薬品、および（２）例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）などの様々な経路の作動薬または拮抗薬の役割を果たすモノクローナル抗体。疾患改善および販売の双方の観点から、タンパク質治療薬が大成功を収めている一方で、多くは、最適以下の生理化学的および薬物動態特性を有することが観察されている。タンパク質治療薬に見られる主な欠点は、物理化学的不安定性、限定的溶解度、タンパク質分解不安定性、短い排出半減期、免疫原性、および毒性である。
【００１３】
タンパク質治療薬の薬物動態特性を改善する１つの取り組みは、生体高分子へのタンパク質のコンジュゲーションである。この点において、例えば、ニューラスタ（登録商標）などの１ダース前後のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲートが、今日現在、認可されている。薬物溶解度の改善、有効性の低下なしに潜在的に毒性が低下される投与頻度の低下、循環寿命の延長、薬物安定性の増大、およびより大きなタンパク質分解抵抗性をはじめとする様々な利点が、タンパク質ＰＥＧ化で観察されている。新規送達形式および投与計画の機会をはじめとする、ＰＥＧ化の商業的利点もまた観察されている。また、ＰＥＧ化は新規化学実体を生じるので、より大きな特許保護の機会もある。
【００１４】
歴史的に、大多数のＰＥＧ化試薬は、タンパク質上のアクセスできるアミン官能基を活用するために開発されている。アミン基は、定義上、全てのタンパク質（すなわち、アミノ末端）に存在し、大多数のタンパク質中には、例えば、Ｌｙｓによって寄与される、２つ以上のアミノ基がある。アミンコンジュゲートＰＥＧタンパク質は、規制当局の認可を受けている。Ａｌｃｏｎｅｌ，Ｓ．Ｎ．Ｓ．，Ｂａａｓ，Ａ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．（２０１１）ＦＤＡ−ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｄｒｕｇｓ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２（７），１４４２。少なくとも２つのアミンＰＥＧタンパク質コンジュゲートが、第一選択治療である。Ｆｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｒ．（２０１０）Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−２ａ  ａｎｄ  Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−２ｂ．Ｄｒｕｇｓ  ７０（２），１４７−１６５；Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｔｒｅｕｈｅｉｔ，Ｍ．Ｊ．（２００８）Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｌａｓｔａ（ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．６０，５０−５８。
【００１５】
しかし、アミンコンジュゲーションに関連するいくつかの問題がある。アミンコンジュゲーションに対して特異的な試薬は、試薬（例えば、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の競合的加水分解反応や、還元アニメーション（ａｎｉｍａｔｉｏｎ）コンジュゲーションに必要なイミン形成中の好ましくない平衡のために、非効率的であることが多い。Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．（２０１１）Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ  ｉｎ  ＩｇＧ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２８，３１２８−３１４３。さらに、ほとんどのタンパク質は、反応で利用できるいくつかのアミン残基を有する。したがって、アミンＰＥＧコンジュゲートは、部位特異的でない傾向があり、最終製品中に異なるＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートの不均一な混合物をもたらす。Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．（２００１）Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２（５），４０５−１７；Ｌｕｘｏｎ，Ｂ．Ａ．，Ｇｒａｃｅ，Ｍ．，Ｂｒａｓｓａｒｄ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｂｏｒｄｅｎｓ，Ｒ．（２００２）Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２４（９）１３６３−１３８３。
【００１６】
タンパク質アミン基を通じたＰＥＧのコンジュゲーションに随伴する様々な欠点は、システインを介してタンパク質をＰＥＧ化する方法の開発をもたらした。確かに、Ｃｙｓを介するポリマーコンジュゲーションは、今日、研究者らによって取られる主要なアプローチの１つである。Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｂ．Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．５４，４５９−５７６；Ｓｔｅｎｚｅｌ，Ｍ．Ｈ．（２０１２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｈｉｏｌｓ：Ｏｌｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ  ｔｏ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｎａｔｕｒｅ’ｓ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋｓ．ＡＣＳ  Ｍａｃｒｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２，１４−１８。タンパク質の表面の遊離システインの数は、リジンを大幅に下回る。遊離システインが欠損している場合、遺伝子操作によって１つまたは複数の遊離システインが添加され得る。Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．（１９９０）Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｔ  ｉｔｓ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，３４３−４６。
【００１７】
アルキルハロゲン化物、エステルアクリレート、およびビニルスルホン試薬をはじめとする、システインを介してポリマーをタンパク質にコンジュゲートさせるための様々な化学的性質が、開発されている。しかし最も多く見られるコンジュゲーション基は、マレイミドである。Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．５４，４５９−７６。マレイミド試薬はチオール基と効率的に反応し、中性ｐＨでコンジュゲートを提供して、タンパク質変性に関連するリスクを低下させる。マレイミドコンジュゲーションは、臨床的に認可されたＰＥＧ薬物中で使用されている。Ｇｏｅｌ，Ｎ．ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｓ．（２０１０）Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ．ｍＡｂｓ  ２（２），１３７−４７。マレイミドは、いくつかの認可された非ＰＥＧコンジュゲートで使用されている。例えば、Ｇｕａｌｂｅｒｔｏ，Ａ．（２０１２）Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  Ｖｅｄｏｔｉｎ（ＳＧＮ−３５），ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ３０−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ２１（２），２０５−１６を参照されたい。
【００１８】
いくつかのマレイミドベースの製品が認可されてはいるものの、いくつかのマレイミド−チオールコンジュゲートは、不安定であることが知られている。この点において、マレイミドベースのコンジュゲートは、交換反応を起こすことが観察されている。Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ  Ｋｉｉｃｋ，Ｋ．Ｌ．（２０１１）Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−Ｔｈｉｏｌ  Ａｄｄｕｃｔｓ  ｉｎ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２２（１０），１９４６−５３；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ  Ｋｉｉｃｋ，Ｋ．Ｌ．（２０１２）Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｔｈｉｏｌ  ａｄｄｕｃｔｓ  ｙｉｅｌｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｈｅｐａｒｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．４（１），１３３。さらに、内在性タンパク質に関して、交換生成物が検出されている。Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｓ．Ｃ．，Ｏｋｅｌｅｙ，Ｎ．Ｍ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．（２００８）Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｎｋｅｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９，７５９−６５；Ｓｈｅｎ，Ｂ．Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（２），１８４−８９。
【００１９】
マレイミドコンジュゲートは、状況によっては不安定であることが知られているので、代替コンジュゲーションストラテジーが用いられている。Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｂ．Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．５４，４５９−５７６。これらの代替アプローチの１つは、
【化１】
2017536105.tif 000003
で示されるような、ヨードアセトアミドベースのコンジュゲーション作用剤の使用である。
【００２０】
ＰＥＧヨードアセトアミドは求核性置換によって遊離チオールと反応し、安定したチオエーテル結合を生じる。チオエーテル結合は、マレイミド化学反応を使用して製造された対応する構造よりも、はるかに安定している。ヨードアセトアミドとチオールの反応は、ｐＨ依存性である。チオールは、概して、チオレートアニオン形態でのみアルキル化される。Ｌｉｎｄｌｅｙ，Ｈ．（１９６０）Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｉｏｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７４，５７７−８４。Ｃｙｓ中のチオールのｐＫ値は、概して８．５＋／−０．５前後であるが、それは、ヨードアセトアミド部分にコンジュゲートされた際の天然タンパク質中のＣｙｓの環境に左右される。Ｋａｌｌｉｓ，Ｇ．ａｎｄ  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８０）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−３２  ａｎｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−３５  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２５５（２１）１０２６１−１０２６６。
【００２１】
ＫａｌｌｉｓおよびＨｏｌｍｇｒｅｎは８．５前後の標準的ｐＫを有するＣｙｓ残基が、中性ｐＨでは、ヨードアセトアミドによって容易にアシル化されず、またヨード酢酸によって容易にアルキル化されないことを観察した。これらの通常のチオールの迅速な反応は、高ｐＨでのみ観察された。タンパク質の高ｐＨへの曝露が、往々にしてタンパク質変性をもたらすことは、当該技術分野で周知である。塩基性または高ｐＨに曝露されたタンパク質の変性は、高度にタンパク質依存性である。いくつかのタンパク質は、高ｐＨに曝露されても生き残ることができる。しかし、多くは恒久的に変性して、活性および／または結合能力の喪失が帰結する。
【００２２】
したがって依然として、生理学的ｐＨでヨードアセトアミドコンジュゲーションを使用して、ポリマーをタンパク質にコンジュゲートさせる方法に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、両性イオン性ポリマーと共有結合する、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーおよび触媒性ＯＰバイオスカベンジャーからなる群から選択される、有機リン（ＯＰ）バイオスカベンジャーを含んでなるコンジュゲートを提供し、ポリマーは、１つまたは複数のタイプのモノマー単位を含んでなり、少なくとも１つのタイプのモノマー単位は、両性イオン基を含んでなる。任意選択的に、ＯＰバイオスカベンジャーは、アリールジアルキルホスファターゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリールエステラーゼ、パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）、オルガノリン酸アンヒドラーゼ、およびジイソプロピルフルオロホスファターゼ（ＤＦＰａｓｅ）からなる群から選択される、触媒性バイオスカベンジャーである。任意選択的に、ＯＰバイオスカベンジャーは、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）およびブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）からなる群から選択されるコリンエステラーゼを含んでなる、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーである。任意選択的に、コリンエステラーゼは、血漿から精製される。任意選択的に、コリンエステラーゼは、組換えＤＮＡ技術によって製造される。任意選択的に、コリンエステラーゼは、ブチリルコリンエステラーゼである。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼは、融合タンパク質として非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質に融合される。任意選択的に、非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含んでなる。任意選択的に、Ｉｇドメインは、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣＨ、およびＩｇＧ−ＣＬからなる群から選択される。任意選択的に、ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。任意選択的に、Ｉｇドメインは、ＩｇＧ−Ｆｃ（配列番号８）である。任意選択的に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、およびＰ３３１からなる群から選択される位置に、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。任意選択的に、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ置換を有する。任意選択的に、Ｆｃドメインは、Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃ置換の１つをさらに有する。任意選択的に、置換はＱ３４７Ｃである。任意選択的に、融合タンパク質は、ブチリルコリンエステラーゼ酵素と非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質の間のリンカーをさらに含んでなる。任意選択的に、リンカーは、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＧＳ（配列番号２３）、およびＧＧＧＥＳ（配列番号２４）、および前述のオリゴマーからなる群から選択される。任意選択的に、リンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１）およびＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２５）からなる群から選択される。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、カルボキシルトランケートである。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、配列番号１のアミノ酸２９〜５６１を含んでなり、またはそれからなる。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、配列番号１のアミノ酸２９〜５６２を含んでなり、またはそれからなる。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、配列番号１の残基９４のＣがＹである変異を有する。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ融合物は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する。
【００２４】
上記コンジュゲートのいずれにおいても、両性イオン基は、ホスホリルコリンを含んでなり得る。任意選択的に、少なくとも１つのタイプのモノマー単位は、２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含んでなる。任意選択的に、少なくとも１つのタイプのモノマー単位は、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含んでなる。任意選択的に、ポリマーは、３本以上のアームを有する。任意選択的に、ポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２本のアームを有する。任意選択的に、ポリマーは、３、６または９本のアームを有する。任意選択的に、コンジュゲートのポリマー部分は、３００，０００〜１，７５０，０００ダルトンのピーク分子量を有する。任意選択的に、コンジュゲートのポリマー部分は、５００，０００〜１，０００，０００ダルトンのピーク分子量を有する。任意選択的に、コンジュゲートのポリマー部分は、６００，０００〜８００，０００ダルトンのピーク分子量を有する。任意選択的に、ポリマーは、コリンエステラーゼのアミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、およびカルボキシル基の少なくとも１つに共有結合する。任意選択的に、スルフヒドリル基は、コリンエステラーゼ中のシステイン残基に由来する。任意選択的に、システイン残基は、コリンエステラーゼ中のシステインが天然に存在しない位置にある。
【００２５】
任意選択的に、コリンエステラーゼは、配列番号２に対応するブチリルコリンエステラーゼ融合物であり、システイン残基はアミノ酸６７２にある。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、配列番号１のアミノ酸２９〜５６２を含んでなり、またはそれからなる。任意選択的に、残基９４はチロシンである。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、組換えＤＮＡ操作によって導入されたシステイン残基をさらに含んでなる。任意選択的に、請求項４１に記載のブチリルコリンエステラーゼ酵素は、配列番号１３を含んでなる。
【００２６】
本発明は、ブチリルコリンエステラーゼ酵素と非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質とを含んでなる、ブチリルコリンエステラーゼ酵素融合タンパク質をさらに提供する。任意選択的に、非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含んでなる。任意選択的に、Ｉｇドメインは、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣＨ、およびＩｇＧ−ＣＬからなる群から選択される。任意選択的に、ＩｇＧは、ＩｇＧ１である。任意選択的に、ＩｇＧ１ドメインは、ＩｇＧ１−Ｆｃ（配列番号８）である。任意選択的に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、およびＰ３３１からなる群から選択される位置に、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。任意選択的に、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ置換を有する。任意選択的に、Ｆｃドメインは、Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃ置換の１つをさらに有する。任意選択的に、置換は、Ｑ３４７Ｃである。任意選択的に、融合タンパク質は、ブチリルコリンエステラーゼ酵素と非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質の間のリンカーを必要とする。任意選択的に、リンカーは、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＧＳ（配列番号２３）、およびＧＧＧＥＳ（配列番号２４）、および前述のオリゴマーからなる群から選択される。任意選択的に、リンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１）およびＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２５）からなる群から選択される。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、カルボキシルトランケートである。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、配列番号１のアミノ酸２９〜５６１を含んでなり、またはそれからなる。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、配列番号１のアミノ酸２９〜５６２を含んでなり、またはそれからなる。任意選択的に、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、配列番号１の残基９４のＣがＹである変異を有する。任意選択的に、融合タンパク質は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する。
【００２７】
本発明は、請求項のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは融合タンパク質のいずれかの有効量を患者に投与するステップを含んでなる、ＯＰ中毒を治療または予防する方法をさらに提供する。任意選択的に、コンジュゲートは、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、病巣内投与または皮内投与によって投与される。任意選択的に、コンジュゲートは、筋肉内投与によって投与される。
【００２８】
本発明は、予期されるＯＰ化合物への曝露の少なくとも７日前に、両性イオン性ポリマーと共有結合する、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーおよび触媒性ＯＰバイオスカベンジャーからなる群から選択されるＯＰバイオスカベンジャーを含んでなる、コンジュゲートを投与するステップを含んでなる、ＯＰ中毒に対する長期予防をもたらす方法をさらに提供し、ポリマーは、１つまたは複数のタイプのモノマー単位を含んでなり、少なくとも１つのタイプのモノマー単位は、両性イオン基を含んでなる。任意選択的に、ＯＰ化合物は、ＯＰ農薬またはＯＰ神経作用剤である。任意選択的に、コンジュゲートは、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも１４日前に投与される。任意選択的に、コンジュゲートは、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも２１日前に投与される。任意選択的に、コンジュゲートは、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも３０日前に投与される。
【００２９】
本発明は、予期されるＯＰ化合物への曝露の少なくとも１２時間前に、両性イオン性ポリマーと共有結合する、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーおよび触媒性ＯＰバイオスカベンジャーからなる群から選択されるＯＰバイオスカベンジャーを含んでなる、コンジュゲートを投与するステップを含んでなる、ＯＰ中毒に対する迅速な予防をもたらす方法をさらに提供し、ポリマーは、１つまたは複数のタイプのモノマー単位を含んでなり、少なくとも１つのタイプのモノマー単位は、両性イオン基を含んでなる。任意選択的に、ＯＰ化合物は、ＯＰ農薬またはＯＰ神経作用剤である。任意選択的に、コンジュゲートは、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも２４時間前に投与される。
【００３０】
上記方法のいずれでも、カルバメート、抗ムスカリン薬、コリンエステラーゼ再賦活薬、および抗痙攣薬から選択される、他の医薬品を投与するステップを含み得る。
【００３１】
本発明は、
【化２】
2017536105.tif 000004
を含んでなる、ポリマー合成のためのイニシエータをさらに提供し、式中、Ｌ１は第１のリンカーであり、Ｌ２は第２のリンカーであり、Ｌ３は第３のリンカーであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、−Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル−、（−（ＣＨ２）１〜６−Ｏ−（ＣＨ２）１〜６−）１〜１２−、（−（ＣＨ２）１〜４−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２Ｏ−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−（Ｃ１〜８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−および−（ＣＨ２）０〜３−アリール−（ＣＨ２）０〜３−、結合、および上記の任意の組み合わせからなる群から選択され；Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり、Ｒ１およびＲ２の双方がＨではないという条件で、Ｈと、１つまたは複数の塩基性基とからなる群から選択され、塩基性基は、
【化３】
2017536105.tif 000005
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化４】
2017536105.tif 000006
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化５】
2017536105.tif 000007
（式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６、および１つまたは複数のアルギニン残基からなる群から選択される）
からなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、同一であるかまたは異なり、
【化６】
2017536105.tif 000008
および
【化７】
2017536105.tif 000009
（式中、Ｙは、ＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
からなる群から選択される。
【００３２】
任意選択的に、ＹはＢｒである。任意選択的に、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ、
【化８】
2017536105.tif 000010
である。
【００３３】
任意選択的に、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ、
【化９】
2017536105.tif 000011
である。
【００３４】
任意選択的に、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ、
【化１０】
2017536105.tif 000012
である。
【００３５】
任意選択的にＬ３は結合であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ１は
【化１１】
2017536105.tif 000013
である。
【００３６】
任意選択的に、Ｌ２は−（ＣＨ２）１〜６−である。任意選択的に、Ｌ２は−（ＣＨ２）３−である。
【００３７】
本発明は、ラジカル移転可能原子または基との均等開裂性結合を含んでなるイニシエータ；遷移金属化合物；
【化１２】
2017536105.tif 000014
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化１３】
2017536105.tif 000015
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化１４】
2017536105.tif 000016
（式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６、および１つまたは複数のアルギニン残基からなる群から選択される）
からなる群から選択されるリガンドの存在下で、１つまたは複数のラジカル重合性単量体を重合するステップを含んでなる、重合方法をさらに提供し、
リガンドは遷移金属化合物に配位し、遷移金属化合物とリガンドは適合されて、単量体の重合を開始および伝播させる。任意選択的に、リガンドは、イニシエータに共有結合して、単分子イニシエータリガンドを形成する。
【００３８】
任意選択的に、単分子イニシエータリガンドは、
【化１５】
2017536105.tif 000017
の構造を有し、式中、Ｌ１は第１のリンカーであり、Ｌ２は第２のリンカーであり、Ｌ３は第３のリンカーであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、−Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル−、（−（ＣＨ２）１〜６−Ｏ−（ＣＨ２）１〜６−）１〜１２−、（−（ＣＨ２）１〜４−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２Ｏ−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−（Ｃ１〜８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−および−（ＣＨ２）０〜３−アリール−（ＣＨ２）０〜３−、結合、および上記の任意の組み合わせからなる群から選択され；Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり、Ｒ１およびＲ２の双方がＨではないという条件で、Ｈと、１つまたは複数の塩基性基とからなる群から選択され、塩基性基は、
【化１６】
2017536105.tif 000018
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化１７】
2017536105.tif 000019
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化１８】
2017536105.tif 000020
（式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６、および１つまたは複数のアルギニン残基からなる群から選択される）
からなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、同一であるかまたは異なり、
【化１９】
2017536105.tif 000021
および
【化２０】
2017536105.tif 000022
（式中、Ｙは、ＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
からなる群から選択される。
【００３９】
任意選択的に、ＹはＢｒである。任意選択的に、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ、
【化２１】
2017536105.tif 000023
である。
【００４０】
任意選択的に、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ、
【化２２】
2017536105.tif 000024
である。
【００４１】
任意選択的に、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ、
【化２３】
2017536105.tif 000025
である。
【００４２】
任意選択的にＬ３は結合であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ１は
【化２４】
2017536105.tif 000026
である。
【００４３】
任意選択的に、Ｌ２は、−（ＣＨ２）１〜６−または−（ＣＨ２）３−である。任意選択的に、ラジカル重合性単量体は、オレフィン性不飽和単量体である。任意選択的に、不飽和単量体は、ＨＥＭＡ−ＰＣを含んでなる。任意選択的に、遷移金属は、低原子価状態にある遷移金属、または少なくとも１つの配位非荷電リガンドが配位した遷移金属の１つであり、遷移金属はカウンターイオンを含んでなる。任意選択的に、遷移金属は、銅、鉄、ニッケルまたはルテニウムからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】経時的にカニクイザル（ｃｙａｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）血漿中に保存された、遺伝子組換えヤギ乳からの完全長ｒｈＢｕＣｈＥ、ｒＢｕＣｈＥ５３４ＧＧＣ（Ｃ６６Ｙ）およびｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）との対比で、血漿由来ｈＢｕＣｈＥの経時的活性を示す。
【図２】カニクイザル（ｃｙａｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）血漿中において、４℃および３７℃でヒト血漿由来ＢｕＣｈＥと比較された、９アーム７５０ｋＤａ  ＨＥＭＡ−ＰＣポリマーにコンジュゲートされたｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）の経時的活性プロットを描写する。
【図３】非コンジュゲートの、３アーム５００ｋＤａ  ＭＰＣポリマーにコンジュゲートされた、９アーム７５０ｋＤａ  ＭＰＣポリマーにコンジュゲートされた、ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）、および血漿由来ｈＢｕＣｈＥの活性、マウスへの注射後における経時的（時間）正規化活性（単位×１０６）。
【図４】ヨードアセトアミドおよびマレイミドを介してＭＰＣポリマーにコンジュゲートした、遺伝子組換えヤギミルク由来完全長ｒｈＢｕＣｈＥの安定性プロファイルを示す。
【図５】修飾（Ｒ１）ヨードアセトアミド部分がある、３アーム２５０ｋＤａのＭＰＣポリマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
Ｉ．概要
本発明は、ホスホリルコリンなどの親水基または両性イオンを有する高分子量（分子量）ポリマーを提供する。本発明に従って、高分子量ポリマーを製造するための方法および新規出発原料もまた提供される。本発明に従って、高分子量ポリマーとコリンエステラーゼのコンジュゲートもまた提供される。国際公開第２０１１／１３０６９４号パンフレットおよび国際公開第／２００７／１００９０２号パンフレットは、あらゆる目的のために本明細書に参照により援用される。
【００４６】
ＩＩ．定義
「コリンエステラーゼ」（ＣｈＥ）は、神経衝撃伝播に関与する酵素ファミリーを指す。コリンエステラーゼは、コリン作動性シナプスにおけるアセチルコリンの加水分解を触媒する。コリンエステラーゼとしては、アセチルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４７】
アセチルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼをはじめとするコリンエステラーゼへの言及は、前駆型コリンエステラーゼおよび成熟コリンエステラーゼ（その中でシグナル配列が除去されたものなど）、活性を有するそれらのトランケート型形態を含み、対立遺伝子変異型および生物種変異型、スプライス変異体によってコードされる変異型、および参照される配列番号に記載されるポリペプチドと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドをはじめとするその他の変異型を含む。変異型は、ＯＰ不活性化活性を示す。コリンエステラーゼは、化学または翻訳後修飾を含有するもの、および化学または翻訳後修飾を含有しないものもまた含む。このような修正としては、ＰＥＧ化、ポリ（ＨＥＭＡ−ＰＣ）の付加、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当該技術分野で公知のその他のポリペプチド修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。トランケート型コリンエステラーゼは、その任意のＮまたはＣ末端短縮形態、特にトランケート型形態であり、ＯＰ不活性化活性を有する。
【００４８】
「アセチルコリンエステラーゼ」（ＡＣｈＥ）は、アセチルコリンをはじめとするアセチルエステルを加水分解でき、その触媒活性が化学抑制剤ＢＷ２８４Ｃ５１によって阻害される、酵素またはポリペプチドを指す。アセチルコリンエステラーゼとしては、血漿由来または組換えアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。アセチルコリンエステラーゼとしては、ヒト起源の、そしてラット、マウス、ネコ、ニワトリ、ウサギ、およびウシ起源であるが、これに限定されるものではない非ヒト起源のアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。代表的ヒトアセチルコリンエステラーゼとしては、配列番号３に記載されるヒトＡＣｈＥが挙げられる。アセチルコリンエステラーゼは、単量体、二量体、および四量体形態をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の形態であり得る。
【００４９】
「ブチリルコリンエステラーゼ」（ＢｕＣｈＥ）は、アセチルコリンおよびブチリルコリンを加水分解でき、その触媒活性が化学抑制剤テトライソプロピル−ピロホスホルアミド（イソ−ＯＭＰＡ）によって阻害される、酵素またはポリペプチドを指す。ブチリルコリンエステラーゼとしては、血漿由来または組換えブチリルコリンエステラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。ブチリルコリンエステラーゼとしては、ラット、マウス、ネコ、ウマ、ニワトリ、ブタ、ウサギ、およびウシをはじめとするが、これに限定されるものではなく、非ヒト起源のいずれかが挙げられる。ブチリルコリンエステラーゼとしてはまた、ヒト由来ブチリルコリンエステラーゼも挙げられる。代表的なヒトブチリルコリンエステラーゼとしては、配列番号１に記載されるヒトＢｕＣｈＥが挙げられる。ブチリルコリンエステラーゼは、単量体、二量体、および四量体形態をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の形態であり得る。
【００５０】
本明細書で同義的に使用される、「有機リン化合物」、「有機リン酸化合物」、「ＯＰ化合物」、および「ＯＰ」は、ホスホリル中心を含有して、１つまたは複数のエステル結合をさらに含有するする化合物を指す。いくつかの態様では、ホスホリル中心におけるリン酸エステル結合および／または追加的な共有結合のタイプが、有機リン化合物を分類する。有機リン化合物としては、有機リン農薬および有機リン神経作用剤が挙げられる。
【００５１】
「有機リン神経作用剤」、「有機リン酸神経作用剤」、または「ＯＰ神経作用剤」は、酵素アセチルコリンエステラーゼの作用を阻害することなどによって、生物の神経系が機能するのを妨害する化合物を指す。神経作用剤は、一般に化学合成によって調製され、吸入、吸収、経口摂取、または別の様式で遭遇されると、高度に毒性である。神経作用剤は、Ｇ神経作用剤およびＶ神経作用剤をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の有機リン化合物であり得る。代表的有機リン神経作用剤としては、タブン（ＧＡ）、サリン（ＧＢ）、ソマ（ＧＤ）、シクロサリン（ＧＦ）、ＶＸ、ロシアンＶＸ（ＶＲ）が挙げられ、非伝統的な神経作用剤（ＮＴＡ）に分類される。
【００５２】
「有機リン農薬」、「有機リン酸農薬」または「ＯＰ農薬」は、害虫および昆虫を駆除するための農薬または殺虫剤として使用され得る（ｕｓｅｄ  ａ  ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）有機リン化合物を指す。有機リン農薬は、アセフェート、アジンホス−メチル、ベンスリド、カズサホス、クロルエトキシホス、クロルピリホス、クロルエトキシホスメチル、クロルチオホス、クマホス、ジアリホス（ｄｉａｌｉｆｌｏｒ）、ジアジノン、ジクロルボス（ｄｉｅｈｌｏｒｖｏｓ）（ＤＤＶＰ）、ジクロトホス（ｄｉｅｒｏｔｏｐｈｏｓ）、ジメトエート、ジオキサチオン、ジスルホトン、エチオン、エトプロプ、エチルパラチオン、フェナミホス、フェニトロチオン、フェンチオン、フォノホス、イサゾホスメチル、イソフェンホス、マラチオン、メトアミドホス、メチダチオン、メチルパラチオン、メビンホス、モノクロトホス、ナレド、オキシデメトンメチル、ホレート、ホサロン、ホスメト、ホスフアミドン、ホステブピリム、ピリミホスメチル、プロフェノホス、プロペタンホス、スルホテップ、スルプロホス、テメホス、テルブホス、テトラクロルビンホス（ｔｅｔｒａｅｈｌｏｒｖｉｎｐｈｏｓ）、トリブホス（ＪＤＥＦ）、およびトリクロルホンをはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の有機リン農薬であり得る。
【００５３】
「有機リン中毒」または「ＯＰ中毒」は、有機リン神経作用剤または有機リン農薬などの有機リン化合物に曝露された生き物に対する、有害または望ましくない効果を指す。
【００５４】
「コリン作動性毒性」は、アセチルコリンエステラーゼの神経作用剤阻害、神経伝達物質アセチルコリンの蓄積、および副交感、交感、運動、および中枢神経系の同時効果によって達成される毒性を指す。コリン作動性毒性は、ミオパシー、精神病、全身麻痺および死亡をもたらし得る。曝露の症状としては、攣縮、震え、分泌過多、麻痺呼吸、痙攣、および最終的には死亡が挙げられる。コリン作動性毒性は、血漿中の循環（活性）コリンエステラーゼレベルを測定することでモニターされ得る。一般に致死性は、コリンエステラーゼ活性が、神経作用剤による結合のために、正常レベルの２０％未満に低下した場合にのみ生じる。
【００５５】
「有機リン曝露関連障害」は、例えば、コリン作動性毒性に起因する、生理学的機能（例えば、運動および認知性機能）に対する、短期（例えば、曝露後数分間から数時間）および長期の（例えば、曝露後１週間から数年間に至る）障害を指す。有機リン曝露関連障害は、頭痛、びまん性筋痙攣、脱力感、過剰な分泌物、悪心、嘔吐、および下痢をはじめとするが、これに限定されるものではない臨床症状によって顕在化し得る。病状は、発作、昏睡、麻痺、呼吸不全、遅延性神経障害、筋力低下、振戦、痙攣、永続的脳異常形態、社会／行動障害、および（例えば、炎症悪化および低血球数によって発症し得る）全身コリン作動性危機に進行し得る。極度な症例は、被毒対象の死亡をもたらし得る。
【００５６】
「有機リンバイオスカベンジャー」または「有機リン酸バイオスカベンジャー」または「ＯＰバイオスカベンジャー」は、有機リン農薬および有機リン神経作用剤をはじめとする有機リン化合物に結合でき、またはそれを加水分解できる酵素である。有機リンバイオスカベンジャーとしては、コリンエステラーゼ、アリールジアルキルホスファターゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリールエステラーゼ、パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）、オルガノリン酸アンヒドラーゼ、およびジイソプロピルフルオロホスファターゼ（ＤＦＰａｓｅ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。有機リンバイオスカベンジャーは、化学量論的有機リンバイオスカベンジャーまたは触媒性有機リンバイオスカベンジャーであり得る。
【００５７】
「化学量論的有機リンバイオスカベンジャー」または「化学量論的ＯＰバイオスカベンジャー」は、酵素の各活性部位が、１：１の化学量論比で有機リン化合物と結合する酵素を指す。化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーとしては、アセチルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼなどのコリンエステラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５８】
「触媒性有機リンバイオスカベンジャー」または「触媒性ＯＰバイオスカベンジャー」は、有機リン化合物を加水分解する酵素を指す。触媒性ＯＰバイオスカベンジャー（ｂｉｓｏｃａｖｅｎｇｅｒｓ）としては、このような酵素内に導入されてそれらがＯＰ化合物を加水分解能力を増大させる組換え変異をはじめとする、アリールジアルキルホスファターゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリールエステラーゼ、パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）、オルガノリン酸アンヒドラーゼ（ａｎｈｙｄｒｙｌａｓｅｓ）、およびジイソプロピルフルオロホスファターゼ（ＤＦＰａｓｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５９】
「アリールジアルキルホスファターゼ」は、有機リン化合物を不活性化または加水分解する、天然または組換え酵素を指す。アリールジアルキルホスファターゼ（ＥＣ３．１．８．１）は、広範な有機リン化合物を加水分解できる金属依存性ＯＰヒドロラーゼのクラスである。アリールジアルキルホスファターゼは、酵素活性のために、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、またはＣｄ２＋などの二価の金属イオンを必要とする。アリールジアルキルホスファターゼとしては、ホスホトリエステラーゼまたはＯＰヒドロラーゼ（ｈｙｄｘｏｌａｓｅｓ）（ＰＴＥまたはＯＰＨ）、パラオクソンヒドロラーゼまたはパラオキソナーゼ、パラチオンヒドロラーゼ（ＰＨ）、ＯｐｄＡ、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、およびアリールエステラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。アリールジアルキルホスファターゼとしては、シュードモナス・ディミニュータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕａｔａ）ＭＧ、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、プレジオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）属種Ｍ６株、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、およびアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）に由来する有機リンヒドロラーゼ；バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種ＪＢＡ３、シュードモナス・ディミニュータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＭＧ、ブレブンジモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｏｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種ＡＴＣＣ２７５５２株、およびスルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）に由来するパラチオンヒドロラーゼ；およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＢ８００およびプレジオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）属種Ｍ６株に由来するメチルパラチオンヒドロラーゼ（ＭＰＨ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的アリールジアルキルホスファターゼ（ａｒｙｌｄｉａｋｙｌｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ）としては、配列番号５に記載されるアリールジアルキルホスファターゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６０】
アリールジアルキルホスファターゼへの言及は、活性を有するそれらのトランケート型形態を含み、対立遺伝子変異型および生物種変異型、スプライス変異体によってコードされる変異型、および上記および配列番号５に記載されるポリペプチドと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドをはじめとする、その他の変異型を含む。変異型は、ＯＰ不活性化活性を示す。
【００６１】
「パラオキソナーゼ」は、有機リン化合物を不活性化または加水分解する、天然または組換え酵素を指す。パラオキソナーゼとしては、天然または組換えパラオキソナーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。非ヒトパラオキソナーゼとしては、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、およびイヌに由来するパラオキソナーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的パラオキソナーゼとしては、ＰＯＮ１（配列番号６）をはじめとするヒトパラオキソナーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
パラオキソナーゼへの言及は、活性を有するそれらのトランケート型形態を含み、対立遺伝子変異型および生物種変異型、スプライス変異体によってコードされる変異型、および配列番号６に記載されるポリペプチドと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドをはじめとする、その他の変異型を含む。変異型は、ＯＰ不活性化活性を示す。パラオキソナーゼは、化学または翻訳後修飾を含有するもの、および化学または翻訳後修飾を含有しないものもまた含む。このような修飾としては、ＰＥＧ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当該技術分野で公知のその他のポリペプチド修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
「ジイソプロピルフルオロホスファターゼ」は、有機リン化合物を不活性化または加水分解する、天然または組換え酵素を指す。ジイソプロピルフルオロホスファターゼとしては、ヨーロッパヤリイカ（Ｌｏｌｉｇｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アルテロモナス属（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）種、シュードアルテロモナス・ハロプランクチス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、マリノモナス・メディテラネア（Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）、ジャンボアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、およびラット老化マーカータンパク質３０に由来するジイソプロピルフルオロホスファターゼ；およびマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、アミコラトプシス・メディテラネイ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ＡＡ４、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４、ストレプトミセス・スビセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｖｉｃｅｕｓ）、およびストレプトミセス・グリセオアウランチアカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）Ｍ０４５に由来する有機リン酸脱水酵素が挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的ジイソプロピルフルオロホスファターゼおよび有機リン酸脱水酵素としては、配列番号７のいずれかに記載されるヨーロッパヤリイカ（Ｌｏｌｉｇｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）に由来するジイソプロピルフルオロホスファターゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
ジイソプロピルフルオロホスファターゼへの言及は、活性を有するそれらのトランケート型形態を含み、対立遺伝子変異型および生物種変異型、スプライス変異体によってコードされる変異型、および配列番号７に記載されるポリペプチドと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドをはじめとする、その他の変異型を含む。変異型は、ＯＰ不活性化活性を示す。
【００６５】
「カルバメート」は、コリンエステラーゼのカルバメート阻害剤である任意の化合物を指す。例示的なカルバメートは、臭化ピリドスチグミンである。
【００６６】
「抗ムスカリン様」は、ムスカリン様アセチルコリン受容体をはじめとする、ムスカリン様受容体に対する競合的拮抗薬である任意の化合物を指す。例示的な抗ムスカリン（ａｎｔｉ−ｍｕｓｃａｒｉｎｉｎｃ）は、アトロピンである。
【００６７】
「コリンエステラーゼ再賦活薬」は、コリンエステラーゼから結合有機リン化合物を放出する、任意の化合物を指す。コリンエステラーゼ再賦活薬としては、コピリジニウムをはじめとするリン再活性化オキシムと、プラリドキシム、トリメドキシム、オビドキシムおよびＨＩ−６、メトキシム、およびジアゼパムをはじめとするが、これに限定されるものではない、ビスピリジニウムアルドキシムとが挙げられる。
【００６８】
「抗痙攣薬」は、痙攣を防ぎまたは逆転させる任意の化合物を指す。
【００６９】
「コンジュゲート」は、ポリマーなどの１つまたは複数の化学的部分と直接または間接的に結合するポリペプチドを指す。
【００７０】
「融合タンパク質」は、１つの核酸分子からのコード配列と別の核酸分子からのコード配列とを含有する、核酸配列によってコードされるポリペプチドを指し、その中でコード配列は、宿主細胞内で融合コンストラクトが転写され翻訳されて、２つのタンパク質を含有するタンパク質が生じるように同一読み枠内にある。２つの分子は、コンストラクト中で隣接し得て、または１、２、３個以上であるが典型的に２５、２０、１５、１０、９、８、７、または６個未満のアミノ酸を含有する、リンカーポリペプチドによって隔てられ得る。融合コンストラクトによってコードされるタンパク質生成物は、融合ポリペプチドまたはタンパク質と称される。融合タンパク質は、２つのタンパク質間を連結する、ペプチドまたはタンパク質を有してもよい。
【００７１】
「半減期」または「排出半減期」または「ｔｌ／２」は、任意の特定の性質または活性が、半分に低下するのに必要な時間を指す。例えば、半減期は、物質（例えば、有機リン化バイオスカベンジャー）が、その活性の最初のレベルの半分を失うのにかかる時間を指す。したがって、半減期は、血漿中の物質の活性を測定することで判定され得て、またはそれは、血漿中の物質の血漿レベルを測定することで判定され得る。例えば、半減期は、薬物が、様々な身体プロセスによって、その最初の体内レベルの半量に低下するのに必要な時間として判定され得る。半減期が長いほど、物質または薬物を身体からパージするのにより長くかかる。半減期の単位は、一般に、時間、分または日数などの時間単位である。
【００７２】
「吸収」は、薬物の血流中への移動を指す。
【００７３】
「生物学的利用能」は、体循環に達する薬物投与量の画分を指す。生物学的利用能は、血流中への薬物吸収の関数である。
【００７４】
「用量」は、治療または予防目的で対象に投与される薬物の分量または量を指す。
【００７５】
「核酸」としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、そしてペプチド核酸（ＰＮＡ）をはじめとするそのアナログ、およびそれらの混合物が挙げられる。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。蛍光性または放射性標識などの検出可能標識などの任意選択的に標識されているプローブまたはプライマーに言及する場合、一本鎖分子が検討される。このような分子は、典型的に、ライブラリーを探索またはプライミングするために、それらの標的が、統計学的に固有のまたは低コピー数（典型的に５未満、一般に３未満）になるような長さである。一般にプローブまたはプライマーは、目的遺伝子と相補的であり、またはそれと同一である配列の少なくとも１４、１６または３０個の連続ヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００個以上の核酸長であり得る。
【００７６】
「ポリペプチドリンカー」または「リンカー」は、２つのポリペプチドを連結するのに使用されるペプチド結合によって連結した、２つ以上のアミノ酸残基を含んでなるポリペプチドである（例えば、ＶＨとＶＬ領域またはＶＨ領域と細胞外トラップセグメント）。このようなリンカーポリペプチドの例は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。代表的リンカーとしては、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＧＳ（配列番号２３）、およびＧＧＧＥＳ（配列番号２４）と、このようなリンカーのオリゴマー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２６））とが挙げられる。
【００７７】
「ポリマー」は、共に連結する一連のモノマー集団を指す。高分子量ポリマーは、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン、ビニルピリジン、ビニルピロリドン、およびビニルエステルなどの酢酸ビニルをはじめとするが、これに限定されるものではないモノマーから調製される。追加的なモノマーが、本発明の高分子量ポリマーで有用である。２つの異なるモノマータイプが使用される場合、２つのモノマータイプは、異なるモノマータイプが共重合されて単一ポリマーを形成することを意味する、「コモノマー」と称される。ポリマーは、直鎖または分岐鎖であり得る。ポリマーが分岐している場合、各ポリマー鎖は、「ポリマーアーム」と称される。イニシエータ部分と連結するポリマーアームの末端は近位端であり、ポリマーアームの成長する鎖末端は遠位端である。ポリマーアームの成長する鎖末端上では、ポリマーアーム末端基は、ラジカルスカベンジャー、または別のであり得る。
【００７８】
「イニシエータ」は、単量体またはコモノマーを使用して重合を開始できる化合物を指す。重合は、従来のフリーラジカル重合であり得て、または好ましくは、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂停止（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＲＡＦＴ）重合またはニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）などの制御／「リビング」ラジカル重合である。重合は、変性移動などの「疑似」制御重合であり得る。イニシエータがＡＴＲＰに適する場合、それは不安定な結合を含有し、それは等方性に切断されて、ラジカル重合を開始できるラジカルであるイニシエータ断片Ｉと、成長するポリマー鎖のラジカルと反応して重合を可逆的に停止させるラジカルスカベンジャーＩ’とを形成し得る。ラジカルスカベンジャーＩ’は典型的にハロゲンであるが、またニトリルなどの有機部分でもあり得る。
【００７９】
「リンカー」は、２つの基を共に連結する化学部分を指す。リンカーは、切断可能または切断不能であり得る。切断可能リンカーは、特に、加水分解性、酵素的切断可能、ｐＨ感受性、感光性、またはジスルフィドリンカーであり得る。その他のリンカーとしては、ホモ二官能性およびヘテロ二機能性リンカーが挙げられる。「連結基」は、生物活性剤への１つまたは複数の結合からなる、共有結合を形成できる官能基である。非限定的な例としては、表１に例示されるものが挙げられる。
【００８０】
「反応基」という用語は、本明細書の用法では、別の化学基と反応して共有結合を形成できる基を指し、すなわち、適切な反応条件下で共有結合的に反応性であり、一般に別の物質への結合点に相当する。反応基は、異なる化合物の官能基と化学的に反応して共有結合を形成できる、本発明の化合物上のマレイミドまたはスクシンイミジルエステルなどの部分である。反応基としては、一般に、求核剤、求電子剤、および光で活性化可能な基が挙げられる。
【００８１】
「機能性作用剤」は、生物活性剤または診断薬を含むと定義される。「生物活性剤」は、任意の作用剤、薬物、化合物、またはそれらの混合物を含むと定義され、それは、特定の生物学的部位（標的化剤）を標的としおよび／または生体内または生体外で実証され得る、いくらかの局所または全身性生理学的または薬理学的効果を提供する。非限定的例としては、薬物、ワクチン、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、二特異性抗体、アビマー、ビタミンおよび補助因子、多糖類、炭水化物、ステロイド、脂質、脂肪、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスコンストラクト、リボザイムなど）が挙げられる。「診断薬」は、組織または疾患の検出またはイメージングができるようにする、任意の作用剤を含むと定義される。診断薬の例としては、放射性標識、フルオロフォア、および染料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８２】
「治療用タンパク質」は、長さにかかわらず、アミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質を指し、それは全体または一部が薬物を構成して、ヒトまたは動物製薬用途で使用され得る。制限なしに、本明細書で開示されるものをはじめとする、多数の治療用タンパク質が知られている。
【００８３】
「ＰＣ」とも表記される「ホスホリルコリン」は、次を指す：
【化２５】
2017536105.tif 000027
式中、＊は結合点を示す。
【００８４】
「ホスホリルコリン含有ポリマー」は、ホスホリルコリンを含有するポリマーである。「両性イオン含有ポリマー」は、両性イオンを含有するポリマーを指す。
【００８５】
ポリ（アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有ポリマーは、単量体としてリン酸２−（アクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルを含有するポリマーを指す。
【００８６】
ポリ（メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有ポリマーは、単量体としてリン酸２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルを含有するポリマーを指す。
【００８７】
特定の単量体タイプを参照して定義されるポリマーは、ホモポリマーであり得て、すなわち特定タイプの単量体がのみ存在し、または共重合体であり得て、その場合、特定タイプの単量体はその他の単量体タイプと共に存在する。共重合体であれば、好ましくは、少なくとも５０、７５または９０％の単量体分子は、特定タイプである。
【００８８】
ポリマーの文脈で、「分子量」は、数平均分子量、または重量平均分子量、またはピーク分子量のいずれかとして表され得る。特に断りのない限り、本明細書での分子量への全ての言及は、ピーク分子量を指す。これらの分子量測定、数平均（Ｍｎ）、重量平均（分子量）、およびピーク（Ｍｐ）は、サイズ排除クロマトグラフィーまたはその他の液体クロマトグラフィー技術を使用して測定され得る。末端基分析の使用または数平均分子量を判定するための束一性（例えば、凍結点低下、沸点上昇、または浸透圧圧力）の測定、または重量平均分子量を判定するための光散乱技術、超遠心、または粘度測定法の使用などの分子量値を測定するためのその他の方法もまた使用され得る。本発明の好ましい実施形態では、分子量は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー−マルチアングル光散乱）によって測定される。本発明の高分子試薬は、典型的に多分散であり（すなわち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量が等しくない）、好ましくは、例えば、ゲル透過クロマトグラフィーによる判定で、約１．５未満などの低い多分散指数（ＰＤＩ）値を有する。その他の実施形態では、多分散性は、より好ましくは約１．４〜約１．２の範囲であり、なおもより好ましくは約１．１５未満、なおもより好ましくは約１．１０未満、さらになおもより好ましくは約１．０５未満、最も好ましくは約１．０３未満である。
【００８９】
「ａ」または「ａｎ」実体という語句は、本明細書の用法では、その実体の１つまたは複数を指し；例えば、化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、１つまたは複数の化合物または少なくとも１つの化合物を指す。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書で同義的に使用され得る。
【００９０】
「約」は、本明細書の用法では、異なる装置、サンプル、およびサンプル調製物の間で、取得された測定値に見られるかもしれない変動を意味する。
【００９１】
「保護される」、「保護形態」、「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）」、および「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）」は、特定の反応条件下で、分子中の特定の化学的反応性官能基の反応を妨げまたは阻止する基（すなわち、保護基）の存在を指す。保護基は、保護される化学反応基のタイプ、ならびに用いられる反応条件、そして存在する場合は、分子中の追加的な反応基または保護基の存在次第で様々である。適切な保護基としては、Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９による論文に見られるものなどが挙げられる。
【００９２】
「アルキル」は、示される炭素原子数を有する、直鎖または分枝の飽和脂肪族ラジカルを指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。その他のアルキル基としては、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。アルキルは、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６、および５〜６などの任意の炭素数を含み得る。アルキル基は、典型的に一価であるが、アルキル基が２つの部分を共に連結する場合などには、二価であり得る。
【００９３】
それぞれ有機ラジカルまたは化合物に関連して、上および下で言及される「低級」という用語は、７個以下、好ましくは４個以下、そして（非分岐として）１または２個の炭素原子がある分岐または非分岐であり得る、化合物またはラジカルを定義する。
【００９４】
「アルキレン」は、少なくとも２つのその他の基を連結する、上で定義されるようなアルキル基、すなわち、二価の炭化水素ラジカルを指す。アルキレンと連結する２つの部分は、アルキレンの同一原子または異なる原子と連結し得る。例えば、直鎖アルキレンは、−（ＣＨ２）ｎの二価のラジカルであり得て、式中、ｎは１、２、３、４、５または６である。アルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンチレン、およびヘキシレンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９５】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（往々にしてアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称される基をはじめとする）の置換基は、以下から選択される多様な基であり得る。−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ、および−ＮＯ２は、数が０から（２ｍ’＋１）に及び、式中、ｍ’は、このようなラジカル中の炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、それぞれ独立して水素、非置換（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリール、１〜３ハロゲンで置換されたアリール、非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリール−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を指す。Ｒ’およびＲ’’が同一窒素原子に付着する場合、それらは窒素原子と組み合わされて５、６、または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことが意図される。「アルキル」という用語は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの基を含む。好ましくは、置換アルキルおよびヘテロアルキル基は、１〜４個の置換基、より好ましくは１、２または３個の置換基を有する。例外は、本発明によって好ましくもあり検討もされる、過ハロゲンアルキル基（例えば、ペンタフルオロエチルなど）である。
【００９６】
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（往々にしてアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称される基をはじめとする）の置換基は、以下から選択されるが、これに限定されるものではない、多様な基の１つまたは複数であり得る。−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、および−ＮＯ２は、数が０から（２ｍ’＋１）に及び、式中、ｍ’は、このようなラジカル中の炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、それぞれ、好ましくは独立して、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば、１〜３ハロゲンで置換されたアリールなど、置換または非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。例えば、本発明の化合物が、２つ以上のＲ基を含む場合、Ｒ基のそれぞれは独立して選択され、２つ以上のこれらの基が存在する場合、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基についても同様である。Ｒ’およびＲ’’が同一窒素原子に付着する場合、それらは窒素原子と組み合わされて５、６、または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことが意図されるが、これに限定されるものではない。「アルキル」という用語は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの水素基以外の基と結合する、炭素原子を含む基を含む。
【００９７】
「アルコキシ」は、酸素原子を有するアルコキシ基の結合点と結合する、あるいはアルコキシ基の２つの炭素を連結する、のいずれかであるアルキル基を指す。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソ−プロポキシ、ブトキシ、２−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが挙げられる。アルコキシ基は、ここに記載される多様な置換基で、さらに置換され得る。例えば、アルコキシ基はハロゲンで置換されて、「ハロ−アルコキシ」基を形成し得る。
【００９８】
「カルボキシアルキル」は、カルボキシ基で置換されたアルキル基（本明細書で定義されるような）を意味する。「カルボキシシクロアルキル」という用語は、カルボキシ基で置換されたシクロアルキル基（本明細書で定義されるような）を意味する。用語アルコキシアルキルは、アルコキシ基で置換されたアルキル基（本明細書で定義されるような）を意味する。「カルボキシ」という用語は、カルボン酸およびそれらのエステルを指すために本明細書で用いられる。
【００９９】
「ハロアルキル」は、一部または全部の水素原子がハロゲン原子で置換された、上で定義されるようなアルキルを指す。ハロゲン（ハロ）は、好ましくはクロロまたはフルオロを表すが、それはまたブロモまたはヨードであってもよい。例えば、ハロアルキルは、トリフルオロメチル、フルオロメチル、１，２，３，４，５−ペンタフルオロ−フェニルなどを含む。「ペルフルオロ」という用語は、全ての利用可能水素がフッ素で置換された、化合物またはラジカルを定義する。例えば、ペルフルオロフェニルは１，２，３，４，５−ペンタフルオロフェニルを指し、ペルフルオロメチルは１，１，１−トリフルオロメチルを指し、ペルフルオロメトキシは、１，１，１−トリフルオロメトキシを指す。
【０１００】
「フルオロ置換アルキル」は、１つ、いくつか、または全ての水素原子が置換されたフッ素アルキル基を指す。
【０１０１】
「シクロアルキル」は、約３〜１２、３〜１０、または３〜７個の環内炭素原子を含有する、環式炭化水素基を指す。シクロアルキル基は、融合、架橋、およびスピロ環状構造を含む。
【０１０２】
「環内」は、サイクリック環構造の一員を構成する原子または原子群を指す。
【０１０３】
「環外」は、付着するがサイクリック環構造を画定しない原子または原子群を指す。
【０１０４】
「環式アルキルエーテル」は、３または４個の環内炭素原子および１個の環内酸素またはイオウ原子を有する、４または５員環アルキル基（例えば、オキセタン、チエタン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン）；または１または２環内酸素またはイオウ原子を有する、６〜７員環アルキル基（例えば、テトラヒドロピラン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロチオピラン、１，３−ジチアン、１，４−ジチアン、１，４−オキサチアン）を指す。
【０１０５】
「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を有する、２〜６個の炭素原子がある直鎖または分岐炭化水素のいずれかを指す。アルケニル基の例としては、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、イソペンテニル、１，３−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，５−ヘキサジエニル、２，４−ヘキサジエニル、または１，３，５−ヘキサトリエニルが挙げられるが、これに限定されるものではない。アルケニル基は、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６、および５〜６個の炭素もまた有し得る。アルケニル基は、典型的に一価であるが、アルケニル基が２つの部分を共に連結する場合などには、二価であり得る。
【０１０６】
「アルケニレン」は、少なくとも２つのその他の基を連結する、上で定義されるようなアルケニル基、すなわち、二価の炭化水素ラジカルを指す。アルケニレンと連結する２つの部分は、アルケニレンの同一原子または異なる原子と連結し得る。アルケニレン基としては、エテニレン、プロペニレン、イソプロペニレン、ブテニレン、イソブテニレン、ｓｅｃ−ブテニレン、ペンテニレン、およびヘキセニレンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０７】
「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を有する、２〜６個の炭素原子がある直鎖または分岐炭化水素のいずれかを指す。アルキニル基の例としては、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、ブタジイニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、イソペンチニル、１，３−ペンタジイニル、１，４−ペンタジイニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジイニル、１，４−ヘキサジイニル、１，５−ヘキサジイニル、２，４−ヘキサジイニル、または１，３，５−ヘキサトリイニルが挙げられるが、これに限定されるものではない。アルキニル基は、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６、および５〜６個の炭素もまた有し得る。アルキニル基は、典型的に一価であるが、アルキニル基が２つの部分を共に連結する場合などには、二価であり得る。
【０１０８】
「アルキニレン」は、少なくとも２つのその他の基を連結する、上で定義されるようなアルキニル基、すなわち、二価の炭化水素ラジカルを指す。アルキニレンと連結する２つの部分は、アルキニレンの同一原子または異なる原子と連結し得る。アルキニレン基としては、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン、ｓｅｃ−ブチニレン、ペンチニレン、およびヘキシニレンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０９】
「シクロアルキル」は、３〜１２個の環原子または示される原子数を有する、飽和または部分不飽和、単環、融合二環または架橋多環アセンブリーを含有する。単環としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルが挙げられる。二環および多環としては、例えば、ノルボルナン、デカヒドロナフタレン、およびアダマンタンが挙げられる。例えば、Ｃ３〜８シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、およびノルボルナンが挙げられる。
【０１１０】
「シクロアルキレン」は、少なくとも２つのその他の基を連結する、上で定義されるようなシクロアルキル基、すなわち、二価の炭化水素ラジカルを指す。シクロアルキレンと連結する２つの部分は、シクロアルキレンの同一原子または異なる原子と連結し得る。シクロアルキレン基としては、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロへキシレン、およびシクロオクチレンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１１】
「ヘテロシクロアルキル」は、３環員〜約２０環員と、Ｎ、Ｏ、およびＳなどの１〜約５個のヘテロ原子とを有する環系を指す。Ｂ、Ａｌ、Ｓｉ、およびＰをはじめとするが、これに限定されるものではない、追加的なヘテロ原子もまた有用であり得る。ヘテロ原子はまた、−Ｓ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−などに酸化され得るが、これに限定されるものではない。例えば、複素環としては、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、インドリニル、キヌクリジニル、および１，４−ジオキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカ−８−イルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１２】
「ヘテロシクロアルキレン」は、少なくとも２つのその他の基を連結する、上で定義されるようなヘテロシクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌａｌｋｙｌ）基を指す。ヘテロシクロアルキルと連結する２つの部分は、ヘテロシクロアルキレンの同一原子または異なる原子と連結し得る。
【０１１３】
「アリール」は、６〜１６個の環炭素原子を含有する、単環または融合二環、三環またはそれ以上の芳香族環アセンブリーを指す。例えば、アリールは、フェニル、ベンジルまたはナフチルであってもよく、好ましくはフェニルである。「アリーレン」は、アリール基から誘導される二価のラジカルを意味する。アリール基は、いずれも任意選択的に、例えば、上で定義されるようにさらに置換されている、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ−アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシ、およびオキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレンから選択される、１、２または３個のラジカル、または１−または２−ナフチル；または１−または２−フェナントレニルによって、一、二または三置換され得る。アルキレンジオキシは、例えば、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシなどのフェニルの２つの隣接する炭素原子に付着する、二価の置換基である。オキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレンもまた、例えば、オキシエチレンまたはオキシプロピレンなどのフェニルの２つの隣接する炭素原子に付着する二価の置換基である。オキシ−Ｃ２〜Ｃ３−アルキレン−フェニルの一例は、２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イルである。
【０１１４】
アリール同様に好ましいのは、ナフチル；フェニル；またはアルコキシ、フェニル、ハロゲン、アルキルまたはトリフルオロメチルによって一または二置換されたフェニルであり、特にフェニル；アルコキシ、ハロゲンまたはトリフルオロメチルによって一または二置換されたフェニルであり、特にフェニルである。
【０１１５】
Ｒとしての置換フェニル基の例は、例えば、複素環中で任意選択的に置換されている、４−クロロフェン−１−イル、３，４−ジクロロフェン−１−イル、４−メトキシフェン−１−イル、４−メチルフェン−１−イル、４−アミノメチルフェン−１−イル、４−メトキシエチルアミノメチルフェン−１−イル、４−ヒドロキシエチルアミノメチルフェン−１−イル、４−ヒドロキシエチル−（メチル）−アミノメチルフェン−１−イル、３−アミノメチルフェン−１−イル、４−Ｎ−アセチルアミノメチルフェン−１−イル、４−アミノフェン−１−イル、３−アミノフェン−１−イル、２−アミノフェン−１−イル、４−フェニル−フェン−１−イル、４−（イミダゾール−１−イル）−フェニル、４−（イミダゾール−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（モルホリン−１−イル）−フェン−１−イル、４−（モルホリン−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（２−メトキシエチルアミノメチル）−フェン−１−イルおよび４−（ピロリジン−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（チオフェニル）−フェン−１−イル、４−（３−チオフェニル）−フェン−１−イル、４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−フェン−１−イル、および４−（ピペリジニル）−フェニルおよび４−（ピリジニル）−フェニルである。
【０１１６】
「アリーレン」は、少なくとも２つのその他の基を連結する、上で定義されるようなアリール基を指す。アリーレンと連結する２つの部分は、アリーレンの異なる原子と連結する。アリーレン基としては、フェニレンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１７】
「アリーレン−オキシ」は、アリーレンと連結する部分の１つが酸素原子を介して連結する、上で定義されるようなアリーレン基を指す。アリーレン−オキシ基としては、フェニレン−オキシが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１１８】
同様に、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は様々であり、０から芳香族環系上の空原子価総数に及ぶ数の−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、ペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびペルフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、式中、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、および（非置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから独立して選択される。
【０１１９】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、式、−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｑ−Ｕ−の置換基で任意選択的に置換されてもよく、式中、ＴおよびＵは、独立して−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または単結合であり、ｑは０〜２の整数である。代案としては、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、式、−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で任意選択的に置換されてもよく、式中、ＡおよびＢは、独立して−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜３の整数である。このように形成された新しい環の単一結合の１つは、二重結合で任意選択的に置換されてもよい。代案としては、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子の置換基の２つは、式、−（ＣＨ２）ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｔ−の置換基で任意選択的に置換されてもよく、式中、ｓおよびｔは独立して０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。−ＮＲ’−および−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−中の置換基Ｒ’は、水素または非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される。
【０１２０】
「ヘテロアリール」は、５〜１６個の環原子を含有する、単環または融合二環または三環式芳香族環アセンブリーを指し、１〜４個の環原子はそれぞれヘテロ原子Ｎ、ＯまたはＳである。例えば、ヘテロアリールとしては、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、または任意のその他のラジカル置換物、特に、例えば、アルキル、ニトロまたはハロゲンによる一または二置換物が挙げられる。ピリジルは、２−、３−または４−ピリジルに相当し、有利には２−または３−ピリジルである。チエニルは、２−または３−チエニルに相当する。キノリニルは、好ましくは２−、３−または４−キノリニルに相当する。イソキノリニルは、好ましくは１−、３−または４−イソキノリニルに相当する。ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルは、好ましくは、それぞれ３−ベンゾピラニルまたは３−ベンゾチオピラニルに相当する。チアゾリルは、好ましくは２−または４−チアゾリルに相当し、最も好ましくは、４−チアゾリルである。トリアゾリルは、好ましくは１−、２−または５−（１，２，４−トリアゾリル）である。テトラゾリルは、好ましくは５−テトラゾリルである。
【０１２１】
好ましくは、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、キノリニル、ピロリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、インダゾリル、またはラジカル置換物、特に一または二置換物のいずれかである。
【０１２２】
本明細書の用法では、「ヘテロアルキル」という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳなどの１〜３個のヘテロ原子を有するアルキル基を指す。Ｂ、Ａｌ、Ｓｉ、およびＰをはじめとするが、これに限定されるものではない、追加的なヘテロ原子もまた有用であり得るも。ヘテロ原子はまた、−Ｓ（Ｏ）−および−Ｓ（Ｏ）２−などに酸化され得るが、これに限定されるものではない。例えば、ヘテロアルキルとしては、エーテル、チオエーテル、アルキル−アミン、およびアルキル−チオールが挙げられる。
【０１２３】
本明細書の用法では、「ヘテロアルキレン」という用語は、少なくとも２つのその他の基を連結する、上で定義されるようなヘテロアルキル基を指す。ヘテロアルキレンと連結する２つの部分は、ヘテロアルキレンの同一原子または異なる原子と連結し得る。
【０１２４】
「求電子剤」は、イオンまたは原子または原子の集まりを指し、それはイオン性であってもよく、求電子中心、すなわち、求核剤と反応できる電子を求める中心を有する。求電子剤（または求電子性試薬）は、反応パートナーからの双方の結合電子を受け入れることで、その反応パートナー（求核剤）と結合を形成する試薬である。
【０１２５】
「求核剤」は、イオンまたは原子または原子の集まりを指し、それはイオン性であってもよく、求核性中心、すなわち、求電子中心を求め、または求電子剤と反応できる中心を有する。求核剤（または求核性試薬）は、双方の結合電子を供与することで、その反応パートナー（求電子剤）と結合を形成する試薬である。「求核基」は、反応基と反応した後の求核剤を指す。非限定的例としては、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロアルコキシなどが挙げられる。
【０１２６】
「マレイミド」は、構造、
【化２６】
2017536105.tif 000028
を有するピロール−２，５−ジオン−１−イル基を指し、
それはスルフヒドリル（例えば、チオアルキル）との反応に際して、構造、
【化２７】
2017536105.tif 000029
を有するＳ−マレイミド基を形成し、式中、「・」は、マレイミド基の結合点を示し、
【化２８】
2017536105.tif 000030
は、元のスルフヒドリル保有基の残部へのチオールのイオウ原子の結合点を示す。
【０１２７】
本開示の目的で、タンパク質およびポリペプチドに見られる「天然アミノ酸」は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびまたはＬ−バリンである。タンパク質に見られる「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸として列挙されたもの以外の任意のアミノ酸である。非天然アミノ酸としては、制限なしに、天然アミノ酸のＤ異性体が挙げられる（混合物は、より正確には、いくらかの天然およびいくらかの非天然アミノ酸とされる。４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、イソデスモシン、５−ヒドロキシリジン、ε−Ｎ−メチルリシン、３−メチルヒスチジンなどのその他のアミノ酸は天然タンパク質に見られるが、それらは一般に、ｍＲＮＡのリボソーム翻訳以外の手段によって導入されるので、本開示の目的ではタンパク質に見られる非天然アミノ酸と見なされる。
【０１２８】
ポリマーの配置、構成または全体的構造に関する「直鎖」は、単一ポリマーアームを有するポリマーを指す。
【０１２９】
ポリマーの配置、構成または全体的構造に関する「分岐」は、イニシエータから伸長する２本以上のポリマー「アーム」を有するポリマーを指す。原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）反応において、イニシエータが用いられてもよい。分岐ポリマーは、２本のポリマー鎖（アーム）、３本のポリマーアーム、４本のポリマーアーム、５本のポリマーアーム、６本のポリマーアーム、７本のポリマーアーム、８本のポリマーアーム、９本のポリマーアーム、１０本のポリマーアーム、１１本のポリマーアーム、１２本のポリマーアームまたはそれ以上を有してもよい。各ポリマーアームは、ポリマー開始部位から伸長する。各ポリマー開始部位は、単量体付加による、ポリマー鎖成長の部位であることができる。例えば、制限なしに、ＡＴＲＰを使用して、イニシエータ上のポリマー開始の各部位は、典型的に、銅ハロゲン化物などの遷移金属化合物によって触媒される可逆的酸化還元過程を受ける、有機ハロゲン化物である。好ましくは、ハロゲン化物は臭素である。
【０１３０】
「薬学的に許容可能な」組成物または「医薬組成物」は、本発明の化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤または薬学的に許容可能な賦形剤群を含んでなる組成物を指す。
【０１３１】
「薬学的に許容可能な賦形剤」および「薬学的に許容可能な担体」は、本発明の組成物に包含され得て、患者に対する顕著な有害な毒物学的効果を引き起こさず、特にヒトにおける治療用途のためにＦＤＡによって認可されたまたは認可可能な賦形剤を指す。薬学的に許容可能な賦形剤の非限定的例としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩水溶液、乳酸加リンゲル、生理スクロース、生理グルコースなどが挙げられる。
【０１３２】
「患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書で提供されるような医薬組成物の投与によって予防または治療され得る、病状に罹患したまたは罹患し易い、生きている生物を指す。非限定的例としては、ヒト、その他の哺乳類、およびその他の非哺乳類動物が挙げられる。
【０１３３】
コンジュゲートは、好ましくは単離形態で提供される。単離されたとは、天然に結合している、またはその製造で使用される混入物から、少なくとも部分的に分離されている目的化学種を意味するが、単離化学種と組み合わされて作用することが意図される、医薬品賦形剤などのその他の成分の存在を必ずしも排除しない。好ましくは、コンジュゲートは、組成物中のサンプル中に存在する優勢な高分子種（すなわち、モル基準）であり、典型的に、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準）を構成する。一般に、単離されたコンジュゲートは、組成物中に存在する、全ての高分子種の８０、９０、９５または９９パーセント以上を構成する。最も好ましくは、コンジュゲートは、組成物が単一高分子種から本質的になるように、本質的に均質に精製される（すなわち、従来の検出法によって組成物中に夾雑種が検出され得ない）。同一重鎖および軽鎖を有するコンジュゲートは同一化学種と見なされるが、それにもかかわらずタンパク質部分上のグリコシル化の多様性、およびコンジュゲートの異なる分子と連結するポリマー部分中の単量体数に多様性があってもよい。
【０１３４】
「有効量」は、同定された疾患または病状の治療、改善、または予防に有用な、または検出可能な治療または阻害効果を示すのに有用な、コンジュゲートされた機能性作用剤の量または医薬組成物の量を指す。効果は、個々の患者で治療前ベースライン測定値と比較して、または治療および対照集団間の転帰における統計的有意差を判定することで、検出され得る。同様に効果的治療計画は、疾患の少なくとも１つの徴候または症状を低下させ、阻害し、または遅延させるのに有効である、本明細書に記載される任意のコンジュゲーション、融合タンパク質またはその他の作用剤の量、頻度、および投与経路の組み合わせを意味する。
【０１３５】
物質の「生物学的半減期」は、生物への物質導入に続いて、生物から物質の半分が除去されるのに要する時間を規定する、薬物動態学的パラメータである。
【０１３６】
配列同一性は、デフォルトギャップパラメータを使用して、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを使用して配列を配列比較することで、または検査、および最大アライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたる配列類似性最大百分率をもたらす）によって、判定され得る。配列同一性の百分率は、比較ウィンドウにわたり２つの最適に整列させた配列を比較し、双方の配列中で同一残基が存在する位置数を判定し、一致位置数を得て、一致位置数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることで、計算される。
【０１３７】
完全長成熟タンパク質の特定の配列番号が提供される場合、残基は、成熟タンパク質の第１の残基について１から開始して、連続して番号付与される（すなわち、任意のシグナルペプチドの残基を考慮しない）。配列番号の変異型または断片中の残基は、配列番号との最大整列と、整列残基を同一番号に割り当てることで、番号付与される。
【０１３８】
「タンパク質」という用語は、その最も広い意味で使用され、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣剤の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結してもよい。別の実施形態では、サブユニットは、例えば、エステル、エーテルなどのその他の結合によって連結してもよい。タンパク質または、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成してもよいアミノ酸の最大数には、いかなる制限も課されない。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短ければ、一般にオリゴペプチドと称される。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドは、一般にポリペプチドまたはタンパク質と称される。
【０１３９】
タンパク質の非限定的例としては、酵素、サイトカイン、向神経性因子、抗体、ペプチド、ホルモン、ＤＮＡ結合タンパク質、アプタマー、ワクチン、毒素、インターロイキン−１（ＩＬ−１α）、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、マクロファージコロニー刺激因子、グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｏｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、甲状腺刺激ホルモン、幹細胞因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、コンセンサスインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−（ＩＦＮ−）、インターフェロン−Ω（ＩＦＮ−Ω）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇ−１）、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、アンギオポエチン様ポリペプチド１（ＡＮＧＰＴＬ１）、アンギオポエチン様ポリペプチド２（ＡＮＧＰＴＬ２）、アンギオポエチン様ポリペプチド３（ＡＮＧＰＴＬ３）、アンギオポエチン様ポリペプチド４（ＡＮＧＰＴＬ４）、アンギオポエチン様ポリペプチド５（ＡＮＧＰＴＬ５）、アンギオポエチン様ポリペプチド６（ＡＮＧＰＴＬ６）、アンギオポエチン様ポリペプチド７（ＡＮＧＰＴＬ７）、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオゲニン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＩ、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−１、毛様体神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子、毛様体神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子受容体、ｃｒｉｐｔｏ、ｃｒｙｐｔｉｃ、サイトカイン誘導好中球走化性因子１、サイトカイン誘導好中球、走化性因子２α、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ドロトレコギンα、サイトカイン誘導好中球走化性因子２β、内皮細胞成長因子、エンドセリン１、表皮成長因子（ＥＧＦ）、エピジェン、エピレギュリン、上皮由来好中球誘引剤、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、線維芽細胞増殖因子１１、線維芽細胞増殖因子１２、線維芽細胞増殖因子１３、線維芽細胞増殖因子１６、線維芽細胞増殖因子１７、線維��細胞増殖因子１９、線維芽細胞増殖因子２０、線維芽細胞増殖因子２１、線維芽細胞増殖因子酸性、線維芽細胞増殖因子塩基性、グリア細胞系由来神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子受容体．α．１、グリア細胞系由来神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子受容体、増殖関連タンパク質、増殖関連プロテインＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮＡｓｅ、フェチュイン、黄体形成（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン、アルテプラーゼ、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第Ｖｉｌａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＦＶ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質、ヘパリン結合表皮増殖因子、肝実質細胞増殖因子、肝実質細胞増殖因子受容体、肝細胞腫由来増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病阻害因子、ソマトロピン、抗血友病（ａｎｔｉｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ）因子、ペグアスパラガーゼ、オルソクローンＯＫＴ３、アデノシンデアミナーゼ、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、白血病阻害因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロポイエチン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、プレＢ細胞成長促進因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、形質転換成長因子α、胸腺（ｈｙｍｉｃ）間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ−タイププラスミノーゲンアクチベーター受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺−刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、レプチン、エンブレル（エタネルセプト）が挙げられる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、タンパク質は抗体である。本明細書の用法では、「抗体」」としては、制限なしに、全抗体、および制限なしに、Ｆａｂをはじめとする任意の抗原結合断片、またはそれらの一本鎖が挙げられる。したがって「抗体」という用語は、制限なしに、抗原に結合する生物学的活性を有する、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含んでなる、任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。このようなものの例は、重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、または任意のその一部、または結合タンパク質の少なくとも１つの部分を含んでなってもよい。「抗体」は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の双方もまた含む。
【０１４１】
抗体の例としては、制限なしに、インフリキシマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、パリビズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトキスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴール、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトキス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アルチヌマブ、アトリズマブ、アトロリミウマブ、トシリズマブ、バピノイズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトキスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドスズ、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、シタツズマブボガトキス、シキスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ＣＲ６２６１、ドアセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトキス、ドロジツマブ、ズリゴツマブ、ズピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴール、エノキズマブ、エノキズマブ、エノチクマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エキスビビルマブ、エキスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、フブタ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、ホントリズマブ、ホラルマブ、ホラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブベドスズ、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ＧＳ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトキス、ムロモナブ−ＣＤ３、ナコロマブタフェナトキス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトキス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトキス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、キリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレズマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトキス、テフィバズマブ、テリモマブアリトキス、テナツモマブ、テフィバズマブ、テリモマブアリトキス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマホドスズ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、およびゾリモマブアリトキスが挙げられる。上記のそれぞれで、本発明は、Ｆａｂならびに完全抗体の使用を検討する。
【０１４２】
ＩＩＩ．バイオスカベンジャーコンジュゲートおよびコンストラクト
ヒト血清から単離されるＢｕＣｈＥは、分子量３４０ｋＤａの球形四量体分子である。Ｈａｕｐｔ  Ｈ，Ｈｅｉｄｅ  Ｋ，Ｚｗｉｓｌｅｒ  Ｏ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗｉｃｋ  ＨＧ．１９６６．Ｉｓｏｌｉｅｒｕｎ  ｕｎｄ  Ｐｈｙｓｉｋａｌｉｓｃｈｃｈｅｍｉｓｃｌｅ  Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ  ｄｅｒ  Ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｕｓ  Ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ．Ｂｌｕｔ．１４：６５−７５。酵素の４つのサブユニットのそれぞれは、５７４アミノ酸長である。それぞれの鎖は、９本のＡｓｎ結合炭水化物鎖を有する。Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ  Ｏ，Ｂａｒｔｅｌｓ  ＣＦ，Ｖａｕｇｈａｎ  ＴＡ，Ｗｏｎｇ  ＣＫ，Ｎｏｒｔｏｎ  ＳＥ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＬＬ．１９８７．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６２：５４９−５５７。
【０１４３】
ＢｕＣｈＥの組換えバージョンを製造するための様々な試みがなされている。しかし、血漿中で観察される支配的な四量体形態は、組換えＤＮＡ技術によって製造されるタンパク質の単なる微量成分であることが判明した。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内のｒｈＢｕＣｈＥｉの発現は、二量体（不安定）（５０〜５５％）、単量体（１５〜４０％）および比較的小さな割合の四量体（１０〜３０％）のタンパク質の混合物を生じる。Ｂｌｏｎｇ  ＲＭ，Ｂｅｄｏｗｓ  Ｅ，Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ  Ｏ．１９９７．Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３２７：７４７−７５７。
【０１４４】
ｈＢｕＣｈＥのＣ末端は、四量体化に関与すると同定されている。Ｃ末端欠失タンパク質の発現は、単量体の排他的産生をもたらす。さらに、Ｂｌｏｎｇらは、酵素活性の喪失なしにＣ末端の最大５０個のアミノ酸が除去され得ることを報告した（上述のように単量体型のみが検出可能）。しかしＣ末端からの５１個のアミノの欠失は、タンパク質の不活性バージョンをもたらし、それは細胞内に保持される（すなわち、分泌されない）。
【０１４５】
ヒトブチリルコリンエステラーゼ（Ｐ０６２７６．１）の６０２個のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。最初の２８個のアミノ酸（ＭＨＳＫＶＴＩＩＣＩＲＦＬＦＷＦＬＬＬＣＭＬＩＧＫＳＨＴ（配列番号２７））は、ｈＢｕＣｈＥの天然リーダー配列を構成する。したがって成熟酵素は、配列ＥＤＤＩＩＩ（配列番号２８）で始まる。
【０１４６】
本発明の態様に従って、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）酵素が提示される。好ましくは、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、ヒト酵素（ｈＢｕＣｈＥ）である。より好ましくは、酵素は、組換えヒト酵素（ｒｈＢｕＣｈＥ）である。
【０１４７】
本発明の好ましい実施形態では、ブチリルコリンエステラーゼ酵素は、１つまたは複数の欠失およびまたはアミノ酸置換を有する。好ましくは、システイン残基は位置６６にある（成熟のＮ末端からの開始は、いくつかのその他の天然または非天然アミノ酸に変更される。より好ましくは、Ｃ６６はチロシンまたはイソロイシンに変換される。最も好ましくは、Ｃ６６はチロシン（Ｃ６６Ｙ）に変換される。
【０１４８】
本発明の態様に従って、ｒｈＢｕＣｈＥのＣ末端欠失が提示される。ｒｈＢｕＣｈＥのＣ末端から、５０個を超えないアミノ酸が欠失していることが好ましい。より好ましくは、ｒｈＢｕＣｈＥのＣ末端から５０個のアミノ酸が欠失し、コンストラクトｒｈＢｕＣｈＥ５２４（５２４個のＮ末端保持アミノ酸を指す）がもたらされる。より好ましくは、ｒｈＢｕＣｈＥのＣ末端から４０個のアミノ酸が欠失し、コンストラクトｒｈＢｕＣｈＥ５３４がもたらされる。好ましくは、欠失変異は、上に記載されたＣ６６変異の１つまたは複数を有する。より好ましくは、欠失変異は、Ｃ６６Ｙ変異を有する。本発明の最も好ましい態様では、Ｃ６６Ｙ変異がある５２４欠失（ｒｈＢＣｈＥ５２４（Ｃ６６Ｙ））のタンパク質配列は、配列番号１１に記載される。本発明の別の最も好ましい態様では、Ｃ６６Ｙ変異がある５３４欠失（ｒｈＢＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ））のタンパク質配列は、配列番号１０に記載される。
【０１４９】
本発明の態様に従って、ポリマーは、ＢｕＣｈＥにコンジュゲートされてもよい。好ましくは、ポリマーは、マレイミドを使用して、Ｃｙｓ残基にコンジュゲートされる。Ｃｙｓ残基は、天然（ｍａｔｕｒａｌｌｙ  ｃｏｕｒｒｉｎｇ）システインであってもよい。本発明のその他の好ましい実施形態では、システイン残基は、タンパク質がポリマーにコンジュゲートされ得るように、ｒｈＢｕＣｈＥ  Ｃ末端欠失の１つに付加され得る。好ましくは、システインは、欠失ｒｈＢｕＣｈＥのＣ末端に付加される。なおもより好ましい実施形態では、システインは、ＧＧＣまたはＧＧＧＣペプチド（配列番号２０）を介して、Ｃ末端に付加される。より好ましい実施形態の１つでは、ペプチドＧＧＧＣ（配列番号２０）は、ｒｈＢｕＣｈＥ５２４（Ｃ６６Ｙ）酵素のＣ末端に付加される（配列番号１２を参照されたい）。別のより好ましい実施形態では、ペプチドＧＧＣは、ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）のＣ末端に付加される（配列番号１３を参照されたい）。
【０１５０】
本発明の態様に従って、ブチリルコリンエステラーゼ酵素断片および非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質断片を有する、ブチリルコリンエステラーゼ融合タンパク質が提示される。本発明の好ましい態様では、ブチリルコリンエステラーゼタンパク質断片は、非ブチリルコリンエステラーゼ断片に対してＮ末端である。好ましくは、非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインである。より好ましくは、Ｉｇドメインは、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣＨ、およびＩｇＧ−ＣＬからなる群から選択される。なおもより好ましくは、ＩｇドメインはＩｇＧ１（配列番号８）に由来する。
【０１５１】
本発明のその他の好ましい実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ配列は、例えば、補体結合およびエフェクター機能を調節するために、様々な様式で修飾され得る。任意選択的に、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、１つまたは複数の変異を有して、エフェクター機能を低下させる。任意選択的に、変異体は、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、およびＰ３３１のアミノ酸位置（ＥＵ番号付与）の１つまたは複数に対する。好ましくはこの点において、ＩｇＧ１  Ｆｃは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓの置換を有する。ＦｃドメインのＣ末端のリジン残基は、時に翻訳後プロセシングによって欠失され得る。したがって、Ｆｃドメインの配列がリジンで終結する場合、リジンは、省かれても省かれなくてもよい。
【０１５２】
本発明の態様に従って、Ｆｃ領域の修飾を導入し、ポリマーコンジュゲーション部位を可能にしてもよい。例えば、ポリマーコンジュゲーション部位であり得る、システイン残基が付加されてもよい。好ましくは、Ｆｃドメインは、Ｑ３４７ＣおよびＬ４４３Ｃからなる群から選択される変異を有する。より好ましくは、変異はＱ３４７Ｃである。
【０１５３】
本発明の態様に従って、融合タンパク質は、好ましくは、ブチリルコリンエステラーゼ酵素と非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質の間のポリペプチドリンカーを含有する。好ましくは、リンカーは、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＧＳ（配列番号２２）、ＧＧＧＳ（配列番号２３）、およびＧＧＧＥＳ（配列番号２４）、および前述のオリゴマーである。より好ましくは、リンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１）およびＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２５）からなる群から選択される。
【０１５４】
本発明の好ましい実施形態では、融合タンパク質のブチリルコリンエステラーゼ酵素は、融合物Ｎ末端の好ましいＣ６６Ｙ変異（ｒｈＢｕＣｈＥ５２４（Ｃ６６Ｙ）またはｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ））と、それに続くリンカーおよびＣ末端の非ブチリルコリンエステラーゼタンパク質配列とを有する、上に記載されたＣ末端切断型の１つである。本発明のより好ましい態様では、融合タンパク質は、Ｎ末端に開始して、上に記載された５２４または５３４Ｃ末端トランケートからなり、Ｃ６６Ｙ変異を有して、リンカーＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２１）に融合され、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓがある、ＩｇＧ１Ｆｃ配列がそれに続く。本発明の最も好ましい実施形態では、融合タンパク質のブチリルコリンエステラーゼトランケートは、ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）である。このコンストラクトのタンパク質配列は、配列番号１５に記載される。本発明の別の非常に好ましい実施形態では、融合物のＦｃ領域は、Ｑ３４７ＣまたはＬ４４３Ｃ変異のどちらかを有する。最も好ましくは、融合物のＦｃ領域は、Ｑ３４７Ｃ変異およびＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓを有する。この好ましい実施形態のタンパク質配列は、配列番号２に示される。
【０１５５】
本発明の別の態様に従って、タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、ポリマーと共有結合する、触媒性ＯＰバイオスカベンジャーまたは化学量論ＯＰバイオスカベンジャーのどちらかであるＯＰバイオスカベンジャーを有することが提示される。好ましくは、ポリマーは両性イオンポリマーであり、ポリマーは１つまたは複数のモノマー単位を有し、モノマー単位の少なくとも１つは両性イオンを有する。触媒性ＯＰバイオスカベンジャーは、典型的に、アリールジアルキルホスファターゼ、有機リン酸ヒドロラーゼ（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリールエステラーゼ、パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）、オルガノリン酸アンヒドラーゼ、およびジイソプロピルフルオロホスファターゼ（ＤＦＰａｓｅ）からなる群から選択される酵素である。
【０１５６】
本発明の一態様では、ＯＰバイオスカベンジャーは、化学量論ＯＰバイオスカベンジャーである。好ましくは、化学量論ＯＰスカベンジャーは、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）およびブチリルコリンエステラーゼからなる群から選択される、コリンエステラーゼである。好ましくは、コリンエステラーゼはＢｕＣｈＥである。
【０１５７】
本発明の態様に従って、ブチリルコリンエステラーゼをはじめとするコリンエステラーゼは、既知の技術によって血清から精製され得る。したがって、本発明の態様に従って、ヒト投与のためのコンジュゲートを調製することが所望される場合、コリンエステラーゼ原料としてヒト血清が使用され得る。代案としては、本発明の別の態様によれば、コリンエステラーゼと、触媒性ＯＰバイオスカベンジャーに関連する様々な酵素とは、組換えＤＮＡ技術を使用して製造される。
【０１５８】
本発明の特定の態様に従って、コリンエステラーゼ（または触媒性ＯＰバイオスカベンジャーと関連する酵素）の製造は、（ｉ）遺伝子操作による組換えＤＮＡの製造、（ｉｉ）例えば、制限なしに、形質移入、電気穿孔またはマイクロインジェクションによる、原核または真核細胞への組換えＤＮＡの導入、そして（ｉｉｉ）前記形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば、構成的または誘導タンパク質の発現、および（ｖｉ）精製タンパク質を入手するための、（ｖ）例えば、培養液からの、または形質転換細胞収集による、タンパク質の単離の技術分野で公知の任意の方法を含む。
【０１５９】
本発明の好ましい態様では、タンパク質は、薬理学的に許容可能なタンパク質分子の産生によって特徴付けられる、適切な原核または真核宿主システム中における、発現によって製造される。真核細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｉｐ、およびＨｅｐＧ２などの哺乳類細胞である。
【０１６０】
なおも別の態様では、タンパク質の調製のために多種多様なベクターが使用され、真核および原核発現ベクターから選択される。原核発現のためのベクターの例としては、制限なしに、ｐｒｅｓｅｔ、ｐｅｔ、およびｐａｄなどのプラスミドが挙げられ、その中では原核発現ベクターで使用されるプロモーターとしては、制限なしに、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤの１つまたは複数が挙げられる。真核発現のためのベクターの例としては、（ｉ）酵母中の発現のための、制限なしに、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、またはＡＵＧ１などのプロモーターを使用した、制限なしに、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴなどのベクター；（ｉｉ）昆虫細胞内の発現のための、制限なしに、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、またはｐｏｌｈなどのプロモーターを使用した、制限なしに、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣなどのベクター；（ｉｉｉ）哺乳類細胞内の発現のための、制限なしに、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβアクチンなどのプロモーターを使用した、制限なしに、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶなどのベクター、および一態様では、制限なしに、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスなどのウイルスシステムに由来するベクターが挙げられる。
【０１６１】
ＢｕＣｈＥのためのアッセイは、技術分野で公知であり（ａｒｅ  ｋｎｏｗ）、ＢｕＣｈＥは酵素の天然基質のイオウアナログである、アセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）の加水分解を効率的に触媒する。Ｓ−ブチリルチオコリン（ＢＴＣＨ）ヨウ化物をはじめとする、その他のチオコリン（ｔｈｉｏｌｃｈｏｌｉｎｅ）基質が使用され得る。加水分解時に、この基質アナログは、酢酸塩とチオコリンを生じる。高度に反応性のジチオビスニトロ−ベンゾエート（ＤＴＮＢ）イオンの存在下では、チオコリンは、可視性で４０５ｎｍにおける吸光度によって定量的にモニターされ得る黄色を生じる。このような技術は、それらの全てが参照により援用される、Ｇ．Ｌ．Ｅｌｌｍａｎ，Ｋ．Ｄ．Ｃｏｕｒｔｎｅｙ，Ｖ．Ａｎｄｒｅｓ，ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｆｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ，“Ａ  ｎｅｗ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７，ｎｏ．２，ｐｐ．８８−９５，１９６１；Ｍ．Ａ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｅ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｈ．Ｗ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ａｎｄ  Ｉ．Ｂ．Ｗｉｌｓｏｎ，“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｒｍａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．８５，ｎｏ．２，ｐｐ．５１９−５２７，１９７８；およびＶ．Ｇｏｒｕｎ，Ｉ．Ｐｒｏｉｎｏｖ，Ｖ．Ｂａｌｔｅｓｃｕ，Ｇ．Ｂａｌａｂａｎ，ａｎｄ  Ｏ．Ｂａｒｚｕ，“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｌｌｍａｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ｃｒｕｄｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．８６，ｎｏ．１，ｐｐ．３２４−３２６，１９７８に記載される。
【０１６２】
本発明の態様に従って、ｈＢｕＣｈＥの内在性リーダーペプチドが、タンパク質の組換え発現のために使用され得る。しかし、より好ましくは、リーダーペプチドは、タンパク質発現のレベルを最大化するために選択されるべきである。好ましい実施形態では、ＣＴＬＡ４リーダーが使用される。最も好ましくは、配列番号に１８記載されるリーダーペプチドが好ましい。
【０１６３】
本発明の好ましい態様に従って、両性イオン性ポリマーは、ホスホリルコリン基を有する単量体から形成される。好ましくは、単量体は、リン酸２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）である。より好ましくは、単量体は、リン酸２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）塩（ＨＥＭＡ−ＰＣ）である。
【０１６４】
バイオスカベンジャーにコンジュゲートされたポリマーは、好ましくは少なくとも２本のポリマーアーム、より好ましくは３本以上のアームを有する。いくらかのポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２本のアームを有する。なおもより好ましくは、ポリマーは、３、６または９本のアームを有する。最も好ましくは、ポリマーは、９本のアームを有する。好ましくは、ポリマーピーク分子量は、３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａである。より好ましくは、ポリマーは、５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。なおもより好ましくは、ポリマーは、６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。特に断りのない限り、分岐ポリマーの分子量は、全てのアームの集合分子量を指す。
【０１６５】
本発明の態様に従ってポリマーをコンジュゲートさせるのに使用され得る、抗体をはじめとするタンパク質上の求核性基としては、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）例えば、リジンなどの側鎖アミン基、（ｉｉｉ）例えば、システインなどの側鎖チオール基、および（ｉｖ）タンパク質がグリコシル化されている、糖ヒドロキシルまたはアミノ基が挙げられるが、これに限定されるものではない。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステルなどの活性エステル、ハロギ酸、および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキルおよびベンジルハロゲン化物；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基をはじめとするポリマーに付着する、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性基と反応して、共有結合を形成できる。抗体をはじめとする多数のタンパク質は、コンジュゲーションで潜在的に使用され得る、システインチオール基を有する。好ましくは、システイン残基は、組換えＤＮＡ技術によって、コンジュゲーションのために付加される。多数のシステイン残基は、還元できる鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋の形態である。ジスルフィド形態のシステイン残基は、一般に、マレイミドなどの試薬との反応のために利用できない。システイン残基はまた、遊離または不対であってもよい。しかし、遊離システイン残基は、様々な媒体中で１つまたは複数の試薬によって、しばしば「キャッピング」されており、コンジュゲーションで利用することができない。システイン残基は、タンパク質が完全にまたは部分的に還元されるように、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤による処理によって、マレイミドなどのリンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性にされてもよい。したがって各システイン架橋は、理論的には、２つの反応性チオール求核剤を形成する。遊離システインの場合、還元によって１つのオール求核剤が形成される。
【０１６６】
用いられる条件次第で、ＴＣＥＰまたはＤＴＴによる還元は、同時の活性喪失と共に、適切なタンパク質折りたたみの喪失をもたらし得る。しかし、活性は、適切な条件下でタンパク質を再折りたたみさせることで回復されてもよい。
【０１６７】
例えば、リジン残基を２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）と反応させ、アミンのチオールへの変換をもたらすことで、リジン残基の変性を通じて、追加的な求核性基が抗体に導入され得る。１、２、３、４つ以上のシステイン残基を導入することで（例えば、１つまたは複数の非天然システインアミノ酸残基を含んでなる変異体を調製することで）、反応性チオール基がタンパク質に導入されてもよい。
【０１６８】
本発明の好ましい態様に従って、ブチリルコリンエステラーゼ融合は配列番号２に対応し、ポリマーへのコンジュゲーションのためのＣｙｓ残基は、アミノ酸６７２にあるものである。
【０１６９】
本発明の態様に従って、ＯＰ中毒の治療または予防法が提示され、その中では、本発明のコンジュゲートまたは融合タンパク質が、効果的治療計画においてそれを必要とする患者に投与される。予防に関して、一般人から無作為選択された個人の対照集団よりも統計学的に有意に高い頻度で、ＯＰ化合物（ＯＰ農薬またはＯＰ神経作用剤のどちらか）に曝露されるであろうまたは曝露されてもよい対象は、本発明を必要とする。例えば、戦場または犯罪状況でＯＰ神経作用剤に曝露されるかもしれない兵士または警察官は、本発明を必要とすることもある。同様に、作物へのＯＰ農薬施用するに関与する労働者は、本発明を必要としてもよく、農薬または神経作用剤の偶発的漏出の対処に関与する労働者についても同様である。防護服およびガスマスクが、曝露予防のために利用可能であるかもしれないが、このような保護的手段は、保護をし損なうこともある。このような失敗の場合、本予防的方法が用いられ得る。
【０１７０】
本発明の好ましい態様では、コンジュゲートまたは融合タンパク質は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、病巣内投与または皮内投与によって投与される。好ましくは、投与は筋肉内投与による。
【０１７１】
本発明の別の態様では、ＯＰ中毒に対する長期予防をもたらす方法が提示され、その中では、ＯＰバイオスカベンジャーを有するコンジュゲートは、両性イオン性ポリマーと共有結合する、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーおよび触媒性ＯＰバイオスカベンジャーからなる群から選択され、ポリマーは１つまたは複数のモノマー単位を有し、両性イオン基を有する少なくとも１つの単量体が、予期されるＯＰ化合物への曝露の少なくとも７日前に投与される。換言すれば、予防的に投与されるこのようなコンジュゲートは、ＯＰ中毒への可能な曝露に対して、少なくとも７日間にわたり効果的である。
【０１７２】
本発明の好ましい態様では、コンジュゲートは、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも１４日前に投与される。より好ましくは、コンジュゲートは、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも２１日前に投与される。より好ましくは、コンジュゲートは、予期されるＯＰ神経作用剤への曝露の少なくとも３０日前に投与される。または別の言い方をすれば、コンジュゲートは、可能なＯＰ曝露に対して、少なくとも１４、２１または３０日間にわたり保護を提供するのに効果的である。
【０１７３】
本発明の別の態様では、ＯＰ中毒に対する迅速な予防をもたらす方法が提示され、その中では、ＯＰバイオスカベンジャーを有するコンジュゲートは、両性イオン性ポリマーと共有結合する、化学量論的ＯＰバイオスカベンジャーおよび触媒性ＯＰバイオスカベンジャーからなる群から選択され、ポリマーは１つまたは複数のモノマー単位を有し、両性イオン基を有する少なくとも１つの単量体が、それを必要とする対象に、予期されるＯＰ化合物への曝露の少なくとも１２時間前に投与される。より好ましくは、コンジュゲートは、予期されるＯＰ化合物への曝露の少なくとも２４時間前に投与される。換言すれば、コンジュゲートは、保護を提供する上で、少なくとも１２または２４時間にわたり効果的である。
【０１７４】
本発明の薬剤組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントまたは担体をさらに含んでなってもよい。
【０１７５】
経口投与に適応された医薬組成物は、カプセルなどの不連続単位として、溶液、シロップまたは懸濁液として（水性または非水性液体中で；または食べられる気泡またはホイップとして；またはエマルションとして）、提示されてもよい。錠剤または硬質ゼラチンカプセルのための適切な賦形剤としては、乳糖、トウモロコシデンプンまたはそれらの誘導体、ステアリン酸またはそれらの塩が挙げられる。軟質ゼラチンカプセルと共に使用される適切な賦形剤としては、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体、または液体ポリオールなどが挙げられる。溶液およびシロップの調製では、使用されてもよい賦形剤としては、例えば、水、ポリオール、および糖が挙げられる。懸濁液の調製では、油（例えば植物油）を使用して、水中油または油中水懸濁液が提供されてもよい。
【０１７６】
担体が固体である経鼻投与に適応された医薬組成物は、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒度を有する粗粉末を含み、それは、嗅剤が鼻吸入される、すなわち鼻近くに保持される粉末容器からの鼻腔を介する迅速な吸入の様式で投与される。経鼻スプレーとしてまたは点鼻薬としての投与のための担体が液体である適切な組成物としては、活性成分の水性または油性溶液が挙げられる。吸入による投与に適応された医薬組成物としては、様々なタイプの定量投与加圧煙霧剤、ネブライザーまたは注入器の手段によって生成されてもよい、微粒子ダストまたはミストが挙げられる。
【０１７７】
非経口投与に適応された医薬組成物としては、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、および溶質を含有して、製剤を意図される受容者の血液と実質的に等張にしてもよい、水性および非水性滅菌注射液；および懸濁剤および増粘剤を含んでもよい、水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。注射液のために使用されてもよい賦形剤としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油が挙げられる。組成物は、例えば密封アンプルおよびバイアルなどの単位用量または多回用量容器内で提示されてもよく、例えば、使用直前における注射用水などの滅菌液体携行（ｌｉｑｕｉｄ  ｃａｒｒｉｅｄ）の添加のみを要する、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で貯蔵されてもよい。即席注射液および懸濁液は、無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製されてもよい。医薬組成物は、実質的に等張であり得て、これは約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ水の浸透圧を意味する。
【０１７８】
一般に、医薬組成物は、保存料、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、付臭剤、塩（本発明の物質は、それ自体が薬学的に許容可能な塩の形態で提供されてもよい）、緩衝液、コート剤または抗酸化剤を含有してもよい。それらは、本発明の物質の他に、治療効果のある作用剤もまた含有してもよい。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、補助剤、または担体との組み合わせで用いられてもよい。このような賦形剤としては、生理食塩水、緩衝食塩水（リン酸緩衝食塩水など）、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１７９】
医薬組成物は、例えば、特に、経口、静脈内、皮下、筋肉内、骨内、鼻腔内経路による投与をはじめとする、患者の疾患治療に効果的である、任意の効果的で便利な様式で投与されてもよい。治療においてまたは予防として、活性薬剤は、注射用組成物として、例えば、好ましくは等張性である滅菌水性分散体として、個人に投与されてもよい。
【０１８０】
哺乳類、特にヒトへの投与では、活性薬剤の１日量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から、典型的に１ｍｇ／ｋｇ前後が予測される。いずれにしても医師が、個人の年齢、体重、性別、および奏効をはじめとする要素に左右される、個人に最も適する実際の用量を決定するであろう。上記用量は、平均的状況の代表例である。もちろん、より高いまたはより低い用量が正当な事例があり得て、このようなものは本発明の範囲内である。
【０１８１】
本発明の物質用量は、治療される疾患または障害、治療される個人の年齢および病状などに応じて広い範囲内で変動し得て、医師が適切な用量を最終的に決定する。
【０１８２】
この投与は、必要な頻度で繰り返されてもよい。副作用が生じた場合、標準的臨床診療に従って、投与量および／または頻度が低下され得る。一実施形態では、医薬組成物は、１〜３０日毎に１回投与されてもよい。
【０１８３】
本発明の医薬組成物は、単独で、または例えば、カルバメート、抗ムスカリン薬、コリンエステラーゼ再賦活薬、および抗痙攣薬などの治療用化合物または分子などのその他の化合物と併用して用いられてもよい。その他の化合物と合わせたこのような投与は、同時、別途または逐次であってもよい。成分は、キットの形態で調合されてもよく、それは必要に応じて取扱説明書を含んでなってもよい。
【０１８４】
好ましくは、本発明の医薬組成物およびもう１つの治療用化合物は、直接（何との対比で？）（ａｓ  ｏｐｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｗｈａｔ？）それを必要とする患者に投与される。
【０１８５】
本発明は、発明の医薬組成物と、経口投与用カプセル、肺投与用吸入器、および非経口投与用注射液をはじめとするが、これに限定されるものではない、投与ビヒクルとを含んでなる部分のキットもまた提供する。
【０１８６】
本明細書の用法では、「治療」という用語は、ヒトまたは非ヒトに動物利益をもたらし得る、何らかの治療計画を含む。「非ヒト動物」の治療は、ウマおよびコンパニオンアニマル（例えば、ネコおよびイヌ）をはじめとする飼育動物、およびヒツジ、イヌ、ブタ、ウシ、およびウマ科をはじめとする家畜／農業動物の構成要員の治療にまで及ぶ。治療は、任意の存在する病状または障害に関する治療であってもよく、または予防的（予防的治療）であってもよい。治療は、遺伝性または後天性疾患の治療であってもよい。治療は、急性または慢性症状の治療であってもよい。
【０１８７】
本発明の態様に従って、高分子試薬を遊離スルフヒドリル残基を含んでなる生物活性剤と適切な条件下で接触させ、それによってコンジュゲートを提供するステップを有する、コンジュゲートを調製する方法が提示され、その中では、高分子試薬は、
【化２９】
2017536105.tif 000031
の構造を有し、式中、Ｐは、分岐または非分岐水溶性ポリマーであり；Ｌ１は第１のリンカーであり、Ｌ２は第２のリンカーであり、Ｌ３は第３のリンカーであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、−Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル−、（−（ＣＨ２）１〜６−Ｏ−（ＣＨ２）１〜６−）１〜１２−、（−（ＣＨ２）１〜４−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２Ｏ−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−（Ｃ１〜８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）０〜２０−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）０〜２０−および−（ＣＨ２）０〜３−アリール−（ＣＨ２）０〜３−、結合、および上記の任意の組み合わせからなる群から選択され；Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択され；Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり、Ｒ１およびＲ２の双方がＨではないという条件で、Ｈと、１つまたは複数の塩基性基とからなる群から選択され、塩基性基は、
【化３０】
2017536105.tif 000032
（式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化３１】
2017536105.tif 000033
（式中、Ｒ８およびＲ９は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化３２】
2017536105.tif 000034
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６、および１つまたは複数のアルギニン残基からなる群から選択される）
からなる群から選択される。
【０１８８】
好ましくは、生物活性剤は、治療用タンパク質およびアプタマーからなる群から選択される。より好ましくは、生物活性剤は、治療用タンパク質である。治療用タンパク質は、好ましくは、サイトカイン、酵素、抗体、および抗体断片である。なおもより好ましくは、治療用タンパク質はＦａｂである。最も好ましくは、ＦａｂはＩｇＧ１である。
【０１８９】
生物活性剤は、治療用タンパク質であり、遊離スルフヒドリル基は、好ましくはタンパク質のシステイン残基によって寄与される。本発明のいくつかの態様では、システイン残基は、天然システイン残基である。代案としては、システイン残基は、組換えＤＮＡ技術を通じて導入される。
【０１９０】
Ｐは、好ましくはポリ（酸化アルキレン）、ポリ（ＭＰＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリンまたはポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）である。より好ましくは、Ｐは、ポリ（酸化アルキレン）である。なおもより好ましくは、Ｐは、より一般的にはポリエチレングリコールまたはＰＥＧとして知られているポリ（酸化エチレン）である。ＰがＰＥＧの場合、ＰＥＧは好ましくは分岐している。好ましくは、分岐ＰＥＧは、２本のアームを有する。各アームは、好ましくは約５〜約４０ｋＤａである。より好ましくは、各アームは、約２０ｋＤａのＰＥＧ分子量を有する。
【０１９１】
水溶性ポリマーに関して、本発明の高分子試薬はまた、少なくとも１つの水溶性ポリマー断片も含んでなる。２〜約２０００個のモノマー単位がある非ペプチド性および水溶性である、水溶性ポリマーは、本発明で特に有用である。適切な水溶性ポリマーの例としては、参照により本明細書に援用される、米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載されるようなポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）などのポリ（アルキレングリコール）、水溶性を有するエチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体、ポリ（オレフィン性アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（糖類）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（ＭＰＣ）およびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）が挙げられるが、これに限定されるものではない。比較的高い水溶性が所望されるいくつかの用途では、水溶性ポリマーは、ポリ（酸化プロピレン）でない。
【０１９２】
本発明の別の態様では、Ｐは、ポリ（ＭＰＣ）である。ポリ（ＭＰＣ）は、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２本のアームを有する。より好ましくは、ポリＭＰＣは、３、６または９本のアームを有する。最も好ましくは、ポリ（ＭＰＣ）は、９本のアームを有する。
【０１９３】
本発明の態様に従って、ポリ（ＭＰＣ）は、好ましくは、３００，０００〜１，７５０，０００ダルトン、より好ましくは５００，０００〜１，０００，０００ダルトン、なおもより好ましくは６００，０００〜８００，０００ダルトンのピーク分子量を有する。
【０１９４】
本発明の好ましい態様に従って、Ｌ３は結合であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ１は、
【化３３】
2017536105.tif 000035
である。
【０１９５】
好ましくは、Ｌ２は、−（ＣＨ２）１〜６−である。より好ましくは、Ｌ２は、−（ＣＨ２）３−である。
【０１９６】
本発明の別の態様では、構造、
【化３４】
2017536105.tif 000036
を有する、ポリマー合成のためのイニシエータが提示され、式中、Ｌ１は第１のリンカーであり、Ｌ２は第２のリンカーであり、Ｌ３は第３のリンカーであり、式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、同一であるかまたは異なり、それぞれ、−Ｃ１〜Ｃ１２アルキル−、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル−、（−（ＣＨ２）１〜６−Ｏ−（ＣＨ２）１〜６−）１〜１２−、（−（ＣＨ２）１〜４−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２Ｏ−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−、（−（ＣＨ２）１〜４−Ｏ−（ＣＨ２）１〜４）１〜１２−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−Ｏ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−（ＣＯ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−Ｏ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（ＣＨ２）１〜１２−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１〜１２−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−、−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−（Ｃ１〜８アルキル）−（Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル）−（Ｃ１〜８アルキル）−、−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）１〜２０−および−（ＣＨ２）０〜３−アリール−（ＣＨ２）０〜３−、結合、および上記の任意の組み合わせからなる群から選択され；Ｒ１およびＲ２は、同一であるかまたは異なり、Ｒ１およびＲ２の双方がＨではないという条件で、Ｈと、１つまたは複数の塩基性基とからなる群から選択され、塩基性基は、
【化３５】
2017536105.tif 000037
（式中、Ｒ１７およびＲ１８は、Ｃ１〜６アルキルであり、好ましくはＲ１７およびＲ１８は、どちらもメチルである）
【化３６】
2017536105.tif 000038
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化３７】
2017536105.tif 000039
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６からなる群から選択される）；
【化３８】
2017536105.tif 000040
（式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、およびＲ１７は、同一であるかまたは異なり、結合、Ｈ、アミノ、アリール６〜１２、およびアルキル１〜６、および１つまたは複数のアルギニン残基からなる群から選択される）
からなる群から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、同一であるかまたは異なり、
【化３９】
2017536105.tif 000041
および
【化４０】
2017536105.tif 000042
（式中、Ｙは、ＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）
からなる群から選択される。
【０１９７】
好ましくは、ＹはＢｒである。Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、好ましくは、それぞれ、
【化４１】
2017536105.tif 000043
である。
【０１９８】
より好ましくは、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ、
【化４２】
2017536105.tif 000044
である。
【０１９９】
なおもより好ましくは、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ、
【化４３】
2017536105.tif 000045
である。
【０２００】
本発明の一態様では、好ましくはＬ３は結合であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ１は、
【化４４】
2017536105.tif 000046
である。
【０２０１】
Ｌ２は好ましくは、−（ＣＨ２）１〜６−である。より好ましくは、Ｌ２は、−（ＣＨ２）３−である。
【実施例】
【０２０２】
ＩＶ．実施例
実施例１  ｒＢｕＣｈＥトランケーション
ＯＰバイオスカベンジャーは、（成熟タンパク質に関して）位置５２４でｈＢｕＣｈＥ酵素をトランケートすることで作成された（ｒｈＢｕＣｈＥ５２４）。さらに、変異Ｃ６６Ｙが導入された。ｒｈＢｕＣｈＥ５２４（Ｃ６６Ｙ）のタンパク質配列は、配列番号１０に示される。ポリマーをｒｈＢｕＣｈＥ５２４（Ｃ６６Ｙ）にコンジュゲートさせるのが望ましければ、ＧＧＣまたはＧＧＧＣ配列（配列番号２０）が末端に付加され得る。ｒｈＢｕＣｈＥ５２４ＧＧＧＣ（Ｃ６６Ｙ）のタンパク質配列は、配列番号１２（「ＧＧＧＣ」は配列番号２０として開示される）に示される。
【０２０３】
もう一つのバイオスカベンジャーは、（成熟タンパク質に関して）位置５３４でｈＢｕＣｈＥをトランケートすることで作成された。ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）の配列は、配列番号１０に示される。システインを使用したポリマーへのコンジュゲーションでは、ＧＧＣは、任意選択的に、末端に付加される。ｒｈＢｕＣｈＥ５３４ＧＧＣ（Ｃ６６Ｙ）のタンパク質配列は、配列番号１３である。
【０２０４】
実施例２  ｒＢｕＣｈＥ融合タンパク質
ｒｈＢｕＣｈＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、上に記載された５３４トランケートを使用して、２つのタンパク質断片間のＧＳリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）（配列番号２１）で、それをＩｇＧ１のＦｃ領域に融合させる、組換え遺伝子操作によって作成された。配列ｒｈＢｕＣｈＥ５３４−Ｆｃは、配列番号１６に示される。Ｃ６６Ｙ変異（ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ）がある融合コンストラクトは、配列番号１７に示される。別のバージョンでは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓの様々なエフェクター機能変異が導入される。ｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ）融合物は、配列番号１５に示される。タンパク質のＦｃ部分に組み込まれ得るもう一つの変異は、ポリ（ＭＰＣ）などのポリマーをタンパク質にコンジュゲートさせるのに使用され得るＱ３４７Ｃである。ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）のタンパク質配列は、配列番号２に示される。
【０２０５】
様々なタンパク質コンストラクトは、真核遺伝子発のための適切なＤＮＡコンストラクトを使用して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で発現される。コンストラクトの組換え発現のために内在性ｈＢｕＣｈＥリーダー配列が使され得る一方で（配列番号１を参照されたい）、その配列が配列番号１８に示されるＣＴＬＡ４リーダーが好ましかった。ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）を発現するのに使用されるＤＮＡ配列は、配列番号９に記載される。
【０２０６】
実施例３  コンストラクトの一過性発現
一過性発現分析は、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｇｉｂｃｏ）内で実施された。いくつかのｒｈＢｕＣｈＥ５２４切断型の発現が、調べられた。一般に、ｒｈＢｕＣｈＥ５２４コンストラクトは、発現されないか、または対応するｒｈＢｕＣｈＥ５３４コンストラクト程には発現されないかのどちらかであった。ｒｈＢｕＣｈＥ５３４コンストラクトに関しては、Ｃ６６Ｙコンストラクトが、この変化のないコンストラクトよりも一般により良く発現されることが分かった。５３４コンストラクトの一過性発現データの概要は、下の表に示される。
【０２０７】
【表１】
2017536105.tif 000047
【０２０８】
実施例４  安定性形質移入体
一過性の発現解析の結果に基づいて、安定性形質転換体は、ｒｈＢｕＣｈＥ５３４ＧＧＣ（Ｃ６６Ｙ）およびｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）から構成された。Ｆｃ融合物の安定性形質移入体は、配列番号２に示されるタンパク質のＮ末端に融合した、配列番号１８に示されるＣＴＬＡ４リーダーを用いる。このコンストラクトのＤＮＡ配列は、配列番号９に記載される。
【０２０９】
実施例５  ＢｕＣｈＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＭＰＣポリマーへのコンジュゲーション
配列番号２に記載のヒトＢｕＣｈＥ−Ｆｃ融合タンパク質が、（以下の実施例６に記載されるように）ＴＣＥＰにより変性され、Ｆｃ鎖の位置３４７に遊離システインチオールが提供されて、制限再生がそれに続いた。次に、ＴＣＥＰ処理ＢｕＣｈＥ−Ｆｃは、下で示されるように、タンパク質に対して１５〜５０倍の過剰なポリマーを使用して７５０ｋＤａポリマーにコンジュゲートされて、コンジュゲートが製造された。
【化４５】
2017536105.tif 000048
【０２１０】
実施例６  ＢｕＣｈＥ−Ｆｃのキャップ除去および再折りたたみ
ＢｕＣｈＥ−Ｆｃ融合物は、ＥＤＴＡ存在下で、３０倍のモル過剰量のＴＣＥＰにより、室温で数時間にわたり室温で還元された。この還元に続いて、タンパク質は、ＵＦ／ＤＦ中のＴＣＥＰ洗浄工程の対象となり、ＴＣＥＰ濃度が約８倍モル過剰量に低下された。さらなるＵＦ／ＤＦおよび希釈が実施され、ＴＣＥＰが１μＭ未満に低下された。次に還元されたＢｕＣｈＥ−Ｆｃが再生され、再生の進行（単量体ＢｕＣｈＥ−Ｆｃの消失と、二量体ＢｕＣｈＥ−Ｆｃの出現によって示される）に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが続いた。再生に続いて、タンパク質のポリマーへのコンジュゲーションが、上述したように実施された。
【０２１１】
実施例７  ポリマーＲ５７４３の合成
下に示されるポリマーＲ５７４３は、次のようにして合成された。
【化４６】
2017536105.tif 000049
【０２１２】
以下の構造を有するＴＦＡ／アミン塩イニシエータ（化合物Ｌ）は、次のようにして合成された。
【化４７】
2017536105.tif 000050
【０２１３】
最初に、以下の構造を有する化合物Ｋが合成された。
【化４８】
2017536105.tif 000051
【０２１４】
窒素下で、２００ｍＬ丸底フラスコ内に、化合物Ｊ（１．９ｇ、２．６７ｍｍｏｌ、３．３当量）
【化４９】
2017536105.tif 000052
および化合物Ｅ（０．５２５ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、１．０当量）（下記参照）
【化５０】
2017536105.tif 000053
が入れられて、ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）、次にジイソプロピルエチルアミン（２．５ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ、１８当量）がそれに続いた。フラスコは、氷浴を使用して０℃に冷却された。これに、約６分間にわたり、プロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中の５０重量％、２．５ｍＬ、４．０４ｍｍｏｌ、５当量）が添加された。
【０２１５】
反応物は室温に加温され、１５分間にわたり撹拌された。反応物は、水（２０ｍＬ）、飽和水性炭酸水素ナトリウム（２０ｍＬ）、および酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加することで、クエンチされた。有機層が分離し、水層が酢酸エチル（７５ｍＬ）で抽出された。合わせた有機層は、飽和水性炭酸水素ナトリウム（３０ｍＬ）、０．５Ｍ水性クエン酸（４０ｍＬ）、水（２５ｍＬ）、および飽和水性塩化ナトリウム（４０ｍＬ）、次に乾燥（硫酸ナトリウム）で洗浄され、濾過されて真空下で濃縮された。さらに精製せずに使用された残渣は、２．０ｇ（０．８０ｍｍｏｌ、９９％）の化合物Ｋをもたらした。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．３６（ｓ，９Ｈ，ＯＣＣＨ３），１．９０（ｓ，５４Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），２．９８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＮＨ），３．０４（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．１８（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．３−３．３７（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２），３．４７−３．５５（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），３．５８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．８７（ｓ，６Ｈ，ｄ室温で３０分間。反応物は、真空下で濃縮された。反応物は、ジクロロメタン（１０ｍＬ）を使用して希釈され、真空下で濃縮された。残渣は、アセトニトリル（１０ｍＬ）を使用して溶解され、シリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）を通じて濾過されて、準備ＨＰＬＣカラムに装入され、水中の６０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸添加）で９８％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸添加）まで、溶出された。生成物を含有する管は貯留され、真空下で濃縮されて冷凍され、凍結乾燥機にのせられた。これは、９９０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、５０％、２工程にわたる）の化合物Ｌを白色粉末としてもたらした。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．９０（ｓ，５４Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），２．９７−３．０（ｍ，８Ｈ，ＣＣＨ２ＮＨおよびＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．１７（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．３（ｑ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ），３．４−３．５９（ｍ，２０Ｈ，ＣＨ２），３．８７（ｓ，６Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ），４．２７（ｓ，１８Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），７．６９−７．８４（ｍ，９Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝ＯおよびＮＨ３＋の双方）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ）／２］＋理論値（Ｃ８４Ｈ１３６Ｂｒ９Ｎ７Ｏ３３＋２Ｈ）／２＝１１９６．６；実測値１１９７．４。
【０２１６】
以下の構造を有するＴＦＡ／アミン塩イニシエータ（化合物Ｐ）は、次のようにして合成された。
【化５１】
2017536105.tif 000054
【０２１７】
２０ｍＬのバイアル内に、化合物Ｌ（４３０ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ、１．０当量）（上記を参照されたい）およびα−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ−ω−カルボキシドデカ（エチレングリコール）（１５４ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ、１．２５当量）が入れられ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）、次にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．０３ｍｍｏｌ、６当量）がそれに続いた。フラスコは、氷浴を使用して０℃に冷却された。これに、約１分間にわたり、プロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中の５０重量％、０．２１５ｍＬ、０．３４３ｍｍｏｌ、２当量）が添加された。反応物は室温に加温され、３０分間にわたり撹拌された。反応物は、水、飽和水性炭酸水素ナトリウム、および酢酸エチルを添加することで、クエンチされた。有機層が分離し、水層が酢酸エチルで抽出された。合わせた有機層は、飽和水性炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ水性クエン酸、水、および飽和水性塩化ナトリウム、次に乾燥（硫酸ナトリウム）で洗浄され、濾過されて真空下で濃縮された。さらに精製せずに使用された残渣は、下に示される、０．６ｇ（０．１９４ｍｍｏｌ）の化合物Ｎをもたらした。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）／２］＋理論値（Ｃ１１１Ｈ１８９Ｂｒ９Ｎ８Ｏ４６＋２Ｈ−Ｂｏｃ）／２＝１４９６．３；実測値１４９７．２。
【化５２】
2017536105.tif 000055
【０２１８】
窒素下で１００ｍＬの丸底内に、化合物Ｎ（０．６ｇ）、ジクロロメタン（４ｍＬ）が添加され、トリフルオロ酢酸（３ｍＬ）がそれに続いた。反応物は、室温で１５分間にわたり撹拌された。反応物は、真空下で濃縮された。残渣は、アセトニトリル（３ｍＬ）を使用して溶解され、シリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）を通じて濾過されて、準備ＨＰＬＣカラムに装入され、５０％水中（０．１％トリフルオロ酢酸添加）の５０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸添加）で９０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸添加）まで、溶出された。生成物を含有する管は貯留され、真空下で濃縮されて冷凍され、凍結乾燥機にのせられた。これは、２００ｍｇ（０．０６４ｍｍｏｌ、３７％、２工程にわたる）の化合物Ｐをもたらした。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１．９０（ｓ，５４Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），２．３（ｂｒ  ｔ，８Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨおよびＣＨ２ＣＨ２Ｃ＝Ｏ），３．０（ｍ，８Ｈ，ＣＣＨ２ＮＨおよびＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．１−３．６（ｍ，８４Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．８７（ｓ，６Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ），４．２７（ｓ，１８Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），７．６−７．８（ｍ，１０Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝ＯおよびＮＨ３＋の双方）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ）／２］＋理論値（Ｃ１０６Ｈ１８１Ｂｒ９Ｎ８Ｏ４４＋２Ｈ）／２＝１４９６．３；実測値１４９６．６。
【０２１９】
実施例８  両性イオン性ポリマーの調製
イニシエータは、典型的に、約１００ｍｇ／ｍＬのＤＭＦ中の原液として調製される。イニシエータおよびリガンド（２，２’−ビピリジル）は、シュレンク管内に装入された。結果として得られた溶液をドライアイス／アセトン混合物を使用して７８°Ｃに冷却し、真空下で１０分間脱気した。管はアルゴン下で再充填され、アルゴン下に保たれる触媒（特に断りのない限りＣｕＢｒ）が、シュレンク（Ｓｃｈｌｅｎｃｋ）管内に導入された（イニシエータ／触媒（ＣｕＢｒ）／リガンド上の原子臭素モル比は１／１／２に維持された）。溶液は、即座に暗褐色になった。シュレンク管は密封され、真空／アルゴンの短い周期で即座にパージされた。ＨＥＭＡ−ＰＣの溶液は、窒素下に保たれるグローブボックス内で調製された規定量の単量体を２００プルーフの脱気したエタノールと混合することで調製された。単量体溶液は、シュレンク管内に、滴下して添加された（カニューレ経由）。温度は、−７８℃に維持された。溶液の泡立ちが収まるまで、反応混合物に完全な真空が少なくとも１０〜１５分間適用された。次に管は、アルゴンで再充填されて、室温に加温された。溶液は撹拌され、重合が進行するにつれて、溶液は粘稠になった。３〜８時間または一晩後、直接曝気してＣｕ（Ｉ）をＣｕ（ＩＩ）に酸化することで、反応物がクエンチされて混合物は青緑色になり、シリカカラムを通過させて銅触媒が除去された。収集された溶液は、回転蒸発によって濃縮され、得られた混合物は、テトラヒドロフランで沈殿され、あるいは水に対して透析され、凍結乾燥がそれに続いて、易流動性の白色粉末が得られた。表２は、本発明に従って製造された例証的なポリマーを記載する。
【０２２０】
【表２】
2017536105.tif 000056
【０２２１】
【表３】
2017536105.tif 000057
2017536105.tif 000058
2017536105.tif 000059
2017536105.tif 000060
【０２２２】
実施例９  マレイミド９アームコンジュゲート可能ポリマーの調製
以下の構造を有するマレイミドコンジュゲート可能９アームポリマー（Ｑ）は、次のようにして合成された。
【化５３】
2017536105.tif 000061
【０２２３】
コンジュゲート可能ポリマーＱは、次のようにして調製された：２０ｍＬバイアル内に、ポリマーＩＤ番号１６０（表２）（５４０ｍｇ、０．０００７ｍｍｏｌ、１．０当量）が入れられて、水（４ｍＬ）を使用して溶解された。これに、０．５Ｍ水性リン酸二ナトリウム（０．４ｍＬ）が添加された。別のバイアル内で、３−マレイミドプロピオン酸、ＮＨＳエステル（０．９３ｍｇ、０．００３５ｍｍｏｌ、５当量）が、テトラヒドロフラン（１ｍＬ）に溶解された。室温で約２分間にわたりＮＨＳエステル溶液がポリマー溶液に添加され、得られた溶液は、３０分間にわたり撹拌された。反応物は水（約１５ｍＬ）で希釈され、シリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ  ４６１２）を通じて濾過されて、３本のＡｍｉｃｏｎ遠心膜透析管（３０，０００ｍｗｃｏ）に均等に入れられた。管は水（それぞれ約５ｍＬ）で希釈されて混合され、遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れられた。濾液が分析のために除去された一方で、残余分は水（約１０ｍＬ／管）で希釈され混合された。遠心分離する手順はさらに５回反復され、その後、残余分が除去され、バイアルに入れられた。Ａｍｉｃｏｎメンブレン管は水（管毎に２×約２ｍＬ）で洗浄され、これは、残余分と合わされた。残余分溶液は、シリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ  ４６１２）を通じて濾過されて冷凍され、凍結乾燥機にのせられた。これは、５０８ｍｇ（９４％）のポリマーＱを白色粉末としてもたらした。
【０２２４】
実施例１０  マレイミド９アームコンジュゲート可能ポリマーの調製
以下の構造を有するマレイミドコンジュゲート可能９アームポリマー（登録商標）が、コンジュゲート可能（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅａｂｌｅ）ポリマーＱについて記述されたのと同一技術を使用して、合成された。
【化５４】
2017536105.tif 000062
【０２２５】
実施例１１  コンジュゲートの活性
ＢｕＣｈＥ酵素活性が、下の表１に記載のコンジュゲートおよび非コンジュゲートタンパク質で測定された。表１中で、ｒＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）はｒｈＢｕＣｈＥ５３４ＧＧＣであり、ｒＢｕＣｈＥ５３４ＦｃはｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）である。
【０２２６】
【表４】
2017536105.tif 000063
【０２２７】
ｒＢｕＣｈＥ（ヤギ乳）は、遺伝子組換えヤギにおいて産生されるｈＢｕＣｈＥを指す。要約すれば、ＢｕＣｈＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、優れた活性を維持した。さらに、活性は、ポリマーへのコンジュゲーション後、良好に維持された。Ｆｃコンストラクトでは、ＭＰＣポリマーへのコンジュゲーション後の活性喪失は、わずか５％であった。
【０２２８】
実施例１２  ＢｕＣｈＥの血漿安定性
ｒＢｕＣｈＥ５３４ＧＧＣ（Ｃ６６Ｙ）（配列番号１３）およびｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ（配列番号２）が、遺伝子組換えヤギｒＢｕＣｈＥに関連する安定性問題を克服するかどうかを判定するために、本発明者らは、カニクイザル（ｃｙｎｏ）血漿中で、ヒト血漿由来ＢｕＣｈＥおよび遺伝子組換えヤギｒｈＢｕＣｈＥ（完全長）と対比して、これらのコンストラクトの安定性を試験した。サンプルは、市販のｃｙｎｏ血漿内に導入され、アリコートが経時的に抜き取られ、エルマン試験によって酵素活性が判定された。図１は、ｒＢｕＣｈＥ５３４ＧＧＣ（Ｃ６６Ｙ））およびｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）の双方の活性が、ｃｙｎｏ血漿中における３７℃でほぼ３５日間の保存中に、良好に保持されたことを示す。これらのコンストラクトは、どちらも標準ヒト血漿精製ＢｕＣｈＥよりもさらに良好に機能した。対照的に、遺伝子組換えヤギ酵素の活性は、経時的に試験終了に向けて５％未満近くまで迅速に低下した。
【０２２９】
ポリマーへのコンジュゲーションが、酵素安定性に影響を及ぼすかどうかもまた判定された。図２は、４℃および３７℃でヒト血漿由来ＢｕＣｈＥと比較された、９アーム７５０ｋＤａ  ＨＥＭＡ−ＰＣポリマーにコンジュゲートされたタンパク質ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃの経時的活性プロットを示す。ポリマーコンジュゲートタンパク質の活性は経時的にいくらか低下するが、低下は、ヒト血漿由来酵素で見られるもの以下である。
【０２３０】
実施例１３  神経作用剤によるＢｕＣｈＥの生体外阻害
本発明のｒＢｕＣｈＥが、神経作用剤に対して有効であるかどうかを判定するために、ＯＰ作用剤の存在下で、コンジュゲートおよび非コンジュゲートの、様々なＢｕＣｈＥバッチが、上に記載されたエルマン試験を使用してアッセイされた：ＧＡ（タブン（ジメチルアミドシアノリン酸エチル））、ＧＢ（サリン（メチルホスホノフルオリド酸プロパン−２−イル））、ＧＤ（ソマン（メチルホスホノフルオリド酸３，３−ジメチルブタン−２−イル））、ＧＦ（シクロサリン（メチルホスホノフルオリド酸シクロヘキシル（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｈｏｎｏｆｌｕｏｒｉｄａｔｅ）））、ＶＸ（Ｖ系神経作用剤（エチル（｛２−［ビス（プロパン−２−イル）アミノ］エチル｝スルファニル）（メチル）ホスフィネート）、およびＶＲ（Ｖ系神経作用剤（Ｎ，Ｎ−ジエチル−２−（メチル−（２−メチルプロポキシ）ホスホリル）スルファニルエタンアミン））。表２は、様々な神経作用剤による、ヒト血漿ｒＢｕＣｈＥ、ｒＢｕＣｈＥ５３４＝ｒＢｕＣｈＥ５３４ＧＧＣ（Ｃ６６Ｙ）、ｒＢｕＣｈＥ５３４−Ｆｃ＝ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）、およびｒＢｕＣｈＥ５３４−Ｆｃ−ポリマー＝ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）−９アーム７５０ｋＤａ  ＨＥＭＡ−ＰＣポリマーの阻害定数Ｋｉを示す。
【０２３１】
【表５】
2017536105.tif 000064
【０２３２】
表を見ても分かるように、コンジュゲートをはじめとするコンストラクトのそれぞれは、標準的ヒト血漿ＢｕＣｈＥと非常に近い。
【０２３３】
実施例１４  ＢｕＣｈＥコンストラクトの生体内薬物動態学
本発明のｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、およびＱ３４７Ｃ）（および対応するコンジュゲート）の生体内薬物動態特性を判定するために、コンストラクトが、Ｃ５７ＢＬ／６背景のホモ接合型カルボキシエステラーゼＥＳ１ノックアウトマウス（−／−）に注射され投与された。Ｄｕｙｓｅｎ，Ｅ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＳ１  Ｐｌａｓｍａ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ（２０１１）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４（１１）１８９１−１８９８。これらのＥＳ１  ＫＯマウスは、血漿カルボキシエステラーゼ活性を完全に欠損しており、それは、ヒトと比較したマウス中における神経作用剤のＬＤ５０を増強することが報告されている。Ｄｕｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．
【０２３４】
下に記載される様々なコンストラクトおよびコンジュゲートの血清安定性は、上でサル血清について記述されたようにして、マウス血清（Ｃ５７ＢＬ／６）中で試験された。結果は同様であった（データ未掲載）。様々なコンストラクトおよびコンジュゲートが、４〜６匹のマウスの群に、０（ゼロ）時間目に静脈内注射された。次に、注射後の様々な時点で、血液のアリコートが動物から抜き取られ、ＢｕＣｈＥの活性が、上述されたようにして測定された。以下は、ＫＯマウスに注射された試験物の概要である。
【０２３５】
【表６】
2017536105.tif 000065
【０２３６】
ＢｕＣｈＥ酵素活性は、採血サンプル中でモニターされ、上記活性データに基づいて正規化された。表１に記載される様々なコンストラクトのｐＫデータは、下で図３に示される。
【０２３７】
実施例１５  ３７℃における緩衝液安定性の比較またはＢｕＣｈＥコンジュゲート（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｒ  ＢｕＣｈＥ）
遺伝子組換えヤギ乳から精製された完全長ｒｈＢｕＣｈｅは、マレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）またはヨードアセトアミドを使用して、天然システインを介してポリマーにコンジュゲートされた。これらの２つの異なるコンジュゲートの安定性が、下の図４で比較された。コンジュゲート安定性を評価するために（ａｓｓｅｓ）、マレイミドおよびヨードアセトアミドベースのコンジュゲートが、３７℃、ｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水中で３０日間インキュベートされた。アリコートが抜き取られて、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって遊離タンパク質が評価された（ａｓｓｅｓｅｄ）。結果は、図４にある。ヨードアセトアミドコンジュゲートは、３０日間にわたり非常に安定しており、ラインは、時間０で設定されたベースライン近くのままであった。対照的に、マレイミドベースのコンジュゲートは、時間０で設定されたベースラインから迅速にはずれた。したがって、本発明に従って、ヨードアセトアミドベースのコンジュゲートが、いくつかのタンパク質で、マレイミドコンジュゲートよりも実質的に（ｓｕｂｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）安定していることを認め得る。マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｔｅ）コンジュゲートの不安定性は、タンパク質依存性である。多数のマレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）コンジュゲートは、かなり安定性である。
【０２３８】
実施例１６  ヤギ由来ｒｈＢｕＣｈＥにコンジュゲートされたマレイミド７５０ｋＤａ  ＭＰＣポリマー
【化５５】
2017536105.tif 000066
マレイミドコンジュゲーションでは、加熱脱保護可能（ｄｅｐｏｒｔｅｃｔａｂｌｅ）マレイミドイニシエータが用いられて、ＭＰＣポリマーがＢｕＣｈＥにコンジュゲートされた。上記構造を有するイニシエータである化合物ＡＡは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６０３０１号明細書（実施例６を参照されたい）に記載されるようにして合成された。
【０２３９】
ＭＰＣポリマーの合成は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６０３０１号明細書）の実施例１１に記載されるようにして実施され、およそ７５０ｋＤａの６アームＭＰＣポリマーが製造された。ポリマーは、米国仮特許出願第６１／８７５，０９９号明細書に記載されるような加熱脱保護によって、コンジュゲーションのために調製された。得られた加熱脱保護ポリマーは、４℃で一晩、ｐＨ７．５のトリス緩衝食塩水中でＴＣＥＰ処理ＢｕＣｈＥにコンジュゲートされた。コンジュゲーションは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによってアッセイされた。コンジュゲートは、ＤＥＡＥクロマトグラフィーによって、遊離タンパク質およびポリマーから精製された。
【０２４０】
実施例１７  ヤギ由来ｒｈＢｕＣｈＥにコンジュゲートされたヨードアセトアミド３アーム２５０ｋＤａ  ＭＰＣポリマー
以下の構造を有するＴＦＡ／アミン塩イニシエータ（化合物Ｂ）は、次のようにして合成された。
【化５６】
2017536105.tif 000067
【０２４１】
最初に、ＢＯＣ保護３アームイニシエータである化合物Ａは、以下の構造を有した。
【化５７】
2017536105.tif 000068
化合物Ａは、次のようにして調製された：窒素下で２５ｍＬ丸底フラスコ内に、ｔｅｒｔ−ブチル２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エチルカルバメート（６６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１．２当量）および（２，２，２−Ｔｒｉ（２−ブロモ−２−メチル−プロピオニルオキシメチル）−エトキシ）−酢酸（参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６０３０１号明細書で製品４．５について記載されるようにして調製された）（１４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．０当量）が入れられ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）、次にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ、５．０当量）がそれに続いた。フラスコは、氷浴を使用して０℃に冷却された。これに、約１分間にわたり、プロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中の５０重量％、０．１６ｍＬ、０．２６ｍｍｏｌ、１．２当量）が添加された。反応物は室温に加温され、１．５時間にわたり撹拌された。反応物は、水を添加することでクエンチされ、次に水および酢酸エチルを使用して、分配された。有機層が分離し、水層が酢酸エチルで抽出された。合わせた有機層は、水、飽和水性炭酸水素ナトリウム、水、０．５Ｍ水性クエン酸、水、次に乾燥（硫酸ナトリウム）で洗浄され、濾過されて真空下で濃縮された。残渣は、シリカゲルカラム（６０ｍＬ）に装入されて、３０％ヘキサン誘導体添加７０％酢酸エチルで溶出された。製品を含有する管は貯留されて真空下で濃縮され、１５０ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ、７７％）の化合物Ａが生じた。
【０２４２】
化合物Ａは脱保護されて、次のようにして化合物Ｂが生じた：窒素下で２０ｍＬ丸底内に、化合物Ａ（１２０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）、ジクロロメタン（２ｍＬ）が添加され、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ、２６．９ｍｍｏｌ、１９２当量）がそれに続いた。反応物は、室温で３０分間にわたり撹拌された。反応物は、ヘキサンジクロロメタン（２０ｍＬ）を使用して希釈され、真空下で濃縮された。反応物は、ヘキサン誘導体（５０ｍＬ）を使用して希釈され、（２回）真空下で濃縮され、２．２ｇ（２．７３ｍｍｏｌ、（残留ジクロロメタンと共に））の化合物Ｂがもたらされた。
【０２４３】
以下の構造を有するポリマーＢ２は、次のようにして調製された。
【化５８】
2017536105.tif 000069
【０２４４】
２０ｍＬバイアル内に、ポリマー１０３（２８０ｍｇ、０．００１２３ｍｍｏｌ、１．０当量）が入れられて、水（２ｍＬ）を使用して溶解された。これに、０．５Ｍ水性リン酸二ナトリウム（０．２ｍＬ）が添加された。別のバイアル内で、ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１．６ｍｇ、０．００５４８ｍｍｏｌ、４．５当量）が、テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）に溶解された。室温で約２分間にわたりＮＨＳエステル溶液がポリマー溶液に添加され、得られた溶液は、７５分間にわたり撹拌された。反応物は、４：１の水：テトラヒドロフラン（ｔｅｒｔａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）（４ｍＬ）で希釈されて、Ａｍｉｃｏｎ遠心膜透析管（３０，０００ｍｗｃｏ）に入れられ、管は、遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れられた。濾液が分析のために除去される一方で、残余分は４：１水：テトラヒドロフラン（ｔｅｒｔａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）（６ｍＬ）で希釈され混合されて、管は遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れられる。濾液が分析のために除去される一方で、残余分は水（８ｍＬ）で希釈され混合されて、遠心分離機（ｒｐｍ３０００）に３０分間入れられる。濾液が分析のために除去される一方で、残余分は水（８ｍＬ）で希釈され混合される。遠心分離する手順はさらに３回反復され、その後、残余分が除去がされ、バイアルに入れられる。Ａｍｉｃｏｎメンブレン管は水（２×約２ｍＬ）で洗浄され、これは残余分と合わされて冷凍され、凍結乾燥機にのれられた。これは、２７０ｍｇｓ（９６％）のポリマーＢを白色粉末としてもたらした。
【０２４５】
ポリマーＢ２は、上述されたように調製された、ＴＣＥＰ処理ｒｈＢｕＣｈＥにコンジュゲートされた。ｒｈＢｕＣｈＥに対しておよそ５倍のモル過剰比率（ｒａｔｉｏｎ）のポリマーＢ２が、およそｐＨ８．５の炭酸ナトリウム緩衝液中で室温で一晩使用された。コンジュゲートは、ＤＥＡＥクロマトグラフィーによって、遊離ポリマーおよびタンパク質から精製された。
【０２４６】
実施例１８  塩基性基を通じた３Ａ−２５０ｋＤａヨードアセトアミドＭＰＣポリマーの増大されたコンジュゲーション
様々な塩基性基がヨードアセトアミド官能基の近くに配置されて、ｒＢｕＣｈＥへのコンジュゲーションを促進するそれらの能力がアッセイされた。
【０２４７】
【表７】
2017536105.tif 000070
【０２４８】
実施例１９  ポリマーＲ４３４１の合成
最初に、以下の構造を有するＲ４１６３が合成された。
【化５９】
2017536105.tif 000071
【０２４９】
下に示される構造の化合物Ｒ３３２９はＪＳｔａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入された。
【化６０】
2017536105.tif 000072
【０２５０】
６ｇのＲ３３２９が、２．８ｇのＴＨＦ中のＮ−ＢＯＣ−２，２’−（エチレンジオキシ）ジエチルアミンと、室温で混合された。これに、８．２ｍｌのジイソプロピルエチルアミンが添加され、７．７ｍｌのプロピルホスホン酸無水物溶液（１．６Ｍ）がそれに続いた。室温で３０分間のインキュベーションに続いて、反応混合物は、ＥｔＯＡｃＭＴＢＥおよび水によって分配された。これに、０．５Ｍクエン酸×１、飽和炭酸水素ナトリウム、および飽和ＮａＣｌによる洗浄が続いた。生成物は、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。Ｒ４１６３は、ＬＣＭＳによって確認された。
【０２５１】
次に、ＢＯＣ基が、Ｒ４６１３から除去された。９．４ｇのＲ４１６３が、６０ｍｌのジクロロメタンに溶解された。これに、６０ｍｌのトリフルオロ酢酸が添加された。室温で１０分間のインキュベーション後。溶液は、乾燥された。固形物質は、水／アセトニトリルおよび下に示されるＲ４１８０に溶解されて、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された。
【化６１】
2017536105.tif 000073
【０２５２】
次に、以下の構造を有する化合物Ｒ４２０３が製造された。
【化６２】
2017536105.tif 000074
【０２５３】
２００ｍｇのＲ４１８０が、２ｍｌのアセトニトリル中で、４３ｍｇのＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨと混合された。これに、２００μｌのジイソプロピルエチルアミンが添加され、１７５μｌのプロピルホスホン酸無水物溶液（１．６Ｍ）がそれに続いた。室温で２０分間のインキュベーションに続いて水が添加され、溶液は５分間にわたり撹拌された。次に溶液は、酢酸によって酸性化され、メタノール中で希釈された。Ｒ４２０３は、ＲＶ−ＨＰＬＣによって精製された。
【０２５４】
イニシエータは、トリフルオロ酢酸によってＢＯＣ官能基を除去してＴＦＡ塩を製造することで、ポリマー合成によって調製された。１７１ｍｇのＲ４２０３は、５００μｌのトリフルオロ酢酸に溶解されて、室温で数分間インキュベートされた。下に示されるＲ４２３５は、ＲＶ−ＨＰＬＣによって精製され、ＬＣＭＳおよびＮＭＲによって確認された。
【化６３】
2017536105.tif 000075
【０２５５】
次にＲ４２３５を使用して、ＭＰＣポリマー合成が開始され、下に示される化合物Ｒ４２５８が製造された。
【化６４】
2017536105.tif 000076
【０２５６】
２５ｍＬのシュレンク管内に、４．８ｍｇの２，２’−ビピリジル、次に４７．７μＬのＤＭＦ中のイニシエータ（Ｒ４２３５）原液（６３μＬのＤＭＦ中の６．３ｍｇのイニシエータ）が装入された。原液を脱気して、次に２．８ｍｇのＣｕＢｒを添加し、脱気して、（ＨＥＭＡ）ホスホリルコリン（ＰＣ））原液を滴下して添加する。反応混合物は、少なくとも１時間にわたり脱気し、３ｐｓｉのＡｒ下で密封する。反応を室温で２０時間進行させる。褐色の呈色：クエンチング、変換および分子量分析のためのサンプリング。凍結乾燥前の４回の透析（ＭＷＣＯは１ｋＤａ）洗浄による精製。
【０２５７】
最後に、孤立した第一級アミン上にヨード酢酸基を付着させることで、Ｒ４３４１が合成された。ポリマーＲ４２５８（１００ｍｇ）は水に溶解されて、それにリン酸緩衝液が添加された。これに、１００μｌのＴＨＦ中の６．５ｍｇ／ｍｌのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液が添加された。さらに５分後、１００μｌのエステルが添加され、反応混合物が室温で３０分間インキュベートされた。水で約１０ｍＬに希釈する。濾過する。遠心透析する（３０ｋＤａカットオフ）。４回再透析する。水で約１０ｍＬに希釈して、濾過し凍結乾燥する：生成物：Ｍｐ：２２１．９ｋＤａ、ＰＤＩ  １．１０。
【０２５８】
実施例２０  ポリマーＲ４１１８の合成
ポリマーＲ４１１８は、下に示される。
【化６５】
2017536105.tif 000077
【０２５９】
最初に、Ｒ４１８０が、上述されたようにして合成された。次にＲ４１８０は、ＲＸＸＸ１を製造するために、以下の反応で使用された。
【化６６】
2017536105.tif 000078
【０２６０】
２００ｍｇのＲ４１８０および１０７ｍｇのＲＸＸＸ１が、アセトニトリル（２ｍｌ）に溶解された。これに、２００μＬのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンおよび１７５μＬのプロピルホスホン酸（ｐｒｏｐｙｌｐｈｏｐｈｏｎｉｃ）酸無水物（酢酸エチル中の５０％）が添加された。この反応混合物は、室温で約３時間インキュベートされた。３ｍｌの水が添加され、溶液は５分間にわたり撹拌された。溶液は、酢酸で酸性化され、１ｍｌのメタノールで希釈された。ＲＸＸＸ１は、ＲＶ−ＨＰＬＣによって精製された。
【０２６１】
ＢＯＣ保護基はＴＦＡによって除去され、ＴＦＡ塩が製造された。１４０ｍｇのＲＸＸＸ１は、１．５ｍｌのジクロロメタンに溶解された。これに、１．５ｍｌのＴＦＡが添加された。この溶液は、室温で約２時間４５分にわたりインキュベートされた。ＴＦＡおよびジクロロメタンは真空蒸発され、固形物質は水中の／アセトニトリルに溶解された。下に示される化合物Ｒ４０３７は、ＲＶ−ＨＰＬＣによって精製され、ＬＣＭＳによって確認された。
【化６７】
2017536105.tif 000079
【０２６２】
次に、イニシエータとしてＲ４０３７を使用して、ＭＰＣポリマーが製造された。１０ｍＬのシュレンク管内に、４．８ｍｇの２，２’−ビピリジル、次に５７．７μＬのＤＭＦ中のイニシエータ（Ｒ４０３７）原液（６２μＬのＤＭＦ中の６．２ｍｇのイニシエータ）が装入された。原液を脱気して、次に２．９ｍｇのＣｕ（Ｉ）Ｂｒを添加し、脱気して、次にエタノール中（４ｍＬのエタノール中の１ｇ）の単量体（２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）ホスホリルコリン（ＰＣ））の原液を滴下して添加する。
【０２６３】
反応混合物を少なくとも１時間にわたり脱気し、３ｐｓｉのＡｒ下で密封する。反応は、室温で一晩（２０時間）進行させる。下に示されるポリマーＲ４０５３は、次にＳＥＣ／ＭＡＬＳの対象となり、１．０７３のＰＤＩおよび２１３．７ｋＤａのＭｐを有することが分かった。
【化６８】
2017536105.tif 000080
【０２６４】
次に、化合物Ｒ４１１８は、Ｒ４０５３をヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることで製造された。１５０ｍｇのポリマーが水中で溶解するまで撹拌されて、リン酸緩衝液が添加された。３ｍｇのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが、４５０μｌのＴＨＦに溶解された。２つの１５０μＬのアリコートに、ＮＨＳエステル溶液を５分間隔で添加する。室温で３０分間撹拌する。水で約１０ｍＬに希釈して、遠心分離し透析する（３０Ｋカットオフ）。約１０ｍＬの水で５回再透析する。
【０２６５】
上清を約１０ｍＬの水に溶解し、濾過して凍結乾燥する：ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：Ｍｐ  ２１５．３ｋＤａ、ＰＤＩ  １．１。
【０２６６】
実施例２１  ポリマーＲ４４４０の合成
最初に、下で示されるように上記参照のＲ４１８０が反応されて、ＢＯＣ保護イニシエータが製造された。
【化６９】
2017536105.tif 000081
【０２６７】
Ｒ４１８０（２００ｍｇ）およびＲ４２４７（１１１ｍｇ）は、２ｍｌのアセトニトリルに溶解された。２００μｌのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（Ｄｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）が添加され、１７５μｌのプロピルホスホン酸無水物がそれに続いた。この溶液は、室温で２５分間インキュベートされた。水を添加し、酢酸、次にメタノールがそれに続く。Ｒ４３０２は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された。アイデンティティーは、ＬＣＭＳによって確認された。
【０２６８】
次に、ＢＯＣ基がＴＦＡによってＲ４３０２から除去されて、下に示されるＲ４３１５が製造された。
【化７０】
2017536105.tif 000082
【０２６９】
１７３ｍｇのＲ４３０２が５００μｌのＴＦＡに溶解されて、室温で８０分間インキュベートされた。溶液は水／アセトニトリルで希釈されて、生成物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された。生成物のアイデンティティーは、ＬＣＭＳおよびＮＭＲによって確認された。
【０２７０】
化合物４３１５がポリマー合成のためのイニシエータとして使用されて、ＭＰＣポリマー（Ｒ４３６７、下に示される）が製造された。２５ｍＬのシュレンク管内に、４．８ｍｇの２，２’−ビピリジル、次に５６．２μＬのＤＭＦ中のイニシエータ（Ｒ４３１５）原液（６８μＬのＤＭＦ中の６．８ｍｇのイニシエータ）が装入された。原液を脱気して、次に２．８ｍｇのＣｕ（Ｉ）Ｂｒを添加し、脱気して、次にエタノール中（４ｍＬのエタノール中の１ｇ）の単量体（｛２−［（２−メチルプロパ−２−エノイル）オキシ］エトキシ｝［２−（トリメチルアミノ）エトキシ］ホスフィン酸）の原液を滴下して添加する。反応混合物を少なくとも１時間にわたり脱気し、３ｐｓｉのＡｒ下で密封する。反応を室温で２０時間進行させる。褐色の呈色：クエンチング、変換および分子量分析のためのサンプリング。凍結乾燥前の４回の透析（ＭＷＣＯは１ｋＤａ）洗浄による精製。得られたポリマーは、ＳＥＣ／ＭＡＬＳによって分析された：ＰＤＩ  １．１およびＭｐ  ２００．７ｋＤａ。
【化７１】
2017536105.tif 000083
【０２７１】
最後に、下に示される化合物Ｒ４４４０が、ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＲ４３６７に共役させることで製造された。１００ｍｇのＲ４３６７が、８００μｌの水に溶解された。これに、８０μｌの０．５ＭｐＨの．４ナトリウムリン酸緩衝液が添加された。緩衝液に、１００μＬの６．５ｍｇ／ｍのＬヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液が添加された。室温で５分間インキュベートし、次にさらに１００μＬを添加して、室温でさらに３０分間インキュベートする。水で約１０ｍＬに希釈して濾過し、遠心し透析する（３０ｋＤａカットオフ）。水から４回再透析する。約１０ｍＬに希釈して、濾過し凍結乾燥する。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ分析：Ｍｐ  ２０６ｋＤａ、ＰＤＩ  １．１。
【化７２】
2017536105.tif 000084
【０２７２】
実施例２２  ポリマーＲ４３４２の合成
最初に、Ｒ４１８０（上記を参照されたい）がＢＯＣ−Ｈｉｓ（３−Ｍｅ）−ＯＨと反応されて、下の反応スキームに示されるＲ４１７６が製造された。
【化７３】
2017536105.tif 000085
【０２７３】
１６５ｍｇのＲ４１８０および５０ｍｇのＢＯＣ−Ｈｉｓ（３−Ｍｅ）−ＯＨが、アセトニトリルに懸濁された。Ｒ４１８０は溶解したが、ＢＯＣ−Ｈｉｓ（３−Ｍｅ）−ＯＨは溶解しなかった。１６５μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが添加されて、酸溶解された。続いて、１４４μｌのポリホスホン酸無水物溶液が添加されて、反応混合物は約１時間インキュベートされた。さらに８０μｌのポリホスホン酸無水物溶液が添加され、反応混合物はさらに４５分間静置された。次に反応混合物は、酢酸で酸性化され、メタノールで希釈された。Ｒ４１７６は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された。
【０２７４】
次に、Ｒ４１７６のＢＯＣ基がＴＦＡによって除去され、下に示される化合物Ｒ４１８２が製造された。１１７ｍｇのＲ４１７６が５００μｌのＴＦＡに溶解されて、室温で１０分間インキュベートされた。次に反応混合物は水／アセトニトリルで希釈され、Ｒ４１８２はＲＶ−ＨＰＬＣによって精製された。
【化７４】
2017536105.tif 000086
【０２７５】
化合物Ｒ４１８２が、ＭＰＣポリマー合成のための基質として使用され、化合物Ｒ４２５９が製造された。２５ｍＬのシュレンク管内に、４．８ｍｇの２，２’−ビピリジル、次に５７．１μＬのＤＭＦ中のイニシエータ（Ｒ４１８２）原液（６８μＬのＤＭＦ中の６．８ｍｇのイニシエータ）が装入された。原液を脱気して、次に２．８ｍｇのＣｕＢｒを添加し、脱気して、次にエタノール中（４ｍＬのエタノール中の１ｇ）の単量体２−ヒドロキシエチルメタクリレートホスホリルコリンの原液を滴下して添加する。反応混合物を少なくとも１時間にわたり脱気し、３ｐｓｉのＡｒ下で密封する。反応を室温で２０時間進行させる。褐色の呈色：クエンチング、変換および分子量分析のためのサンプリング。凍結乾燥前の４回の透析（ＭＷＣＯは１ｋＤａ）洗浄による精製。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：ＰＤＩ＝１．１およびＭｐ＝２２５．７ｋＤａ。
【０２７６】
最後に、化合物Ｒ４２５９は、ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｈｙｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）エステルと反応されて、下に示される化合物Ｒ４３４２が製造された。１００ｍｇのポリマーＲ４２５９が、８００μｌの水に溶解された。これに、５０μｌの０．５ＭのｐＨ７．４リン酸ナトリウム緩衝液が添加された。１００μＬのＴＨＦ中の６．５ｍｇ／ｍＬのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液が添加された。この溶液は、室温で５分間インキュベートされた。追加的な１００μＬの６．５ｍｇ／ｍＬのＮＨＳエステル／ＴＨＦ溶液を添加する。室温で３０分間さらに培養する。水で約１０ｍＬに希釈する。濾過する。遠心透析する（３０ｋＤａカットオフ）。４回再透析する。水で約１０ｍＬに希釈して、濾過し凍結乾燥する。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：Ｍｐ  ２２７．７ｋＤａ、ＰＤＩ  １．１。
【化７５】
2017536105.tif 000087
【０２７７】
実施例２３  ポリマーＲ４４３９の合成
最初に、下で示されるように、上記参照のＲ４１８０が、２−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝−５−（ジメチルアミノ）ペンタン酸トリフルオロ酢酸塩と反応されて、化合物Ｒ４３０１が製造された。
【化７６】
2017536105.tif 000088
【０２７８】
２００ｍｇのＲ４１８０が、２ｍｌのアセトニトリルに溶解された。この溶液が、溶解された１３０ｍｇの２−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝−５−（ジメチルアミノ）ペンタン酸トリフルオロ酢酸塩に添加された。３００μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）が添加され、１７５μｌのプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ溶液）もまた添加された。反応混合物は、室温で約３０分間静置された。追加的な２００μｌのＤＩＰＥＡおよび１００μｌのＴ３Ｐが添加され、反応混合物は、さらに１５分間静置された。混合物は、水、酢酸、およびメタノールで希釈された。Ｒ４３０１は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製され、ＬＣＭＳによって確認された。
【０２７９】
次に、ＢＯＣ保護部分がＴＦＡによってＲ４３０１から除去されて、化合物Ｒ４３１４が製造された。９３ｍｇのＲ４３０１が、５００μｌのＴＦＡに溶解された。反応混合物は、室温で２０分間静置された。その後、反応混合物は水／アセトニトリルで希釈され、Ｒ４３１４はＲＶ−ＨＰＬＣによって精製された。
【０２８０】
次にＲ４３１４は、ＭＰＣポリマーとして製造のための基質として（ｕｓｅｄ  ａ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）使用され、Ｒ４３６６が製造された。２５ｍＬのシュレンク管内に、４．８ｍｇの２，２’−ビピリジル、次に５６．９μＬのＤＭＦ中のイニシエータ（Ｒ４３１４）原液（９２μＬのＤＭＦ中の９．２ｍｇのイニシエータ）が装入された。原液を脱気し、次に２．８ｍｇのＣｕＢｒを添加する、脱気して、次にエタノール中（４ｍＬのエタノール中の１ｇ）の単量体の原液を滴下して添加する。反応混合物を少なくとも１時間にわたり脱気し、３ｐｓｉのＡｒ下で密封する。反応を室温で２０時間進行させる。褐色の呈色：クエンチング、変換および分子量分析のためのサンプリング。凍結乾燥前の４回の透析（ＭＷＣＯは１ｋＤａ）洗浄による精製。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：ＰＤＩ＝１．１、Ｍｐ＝２３３．４ｋＤａ。
【０２８１】
最後に、Ｒ４３６６がヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応されて、Ｒ４４３９（下に示される）が製造された。１００ｍｇのポリマーＲ４３６６が、８００μｌの水に溶解された。これに、８０μｌの０．５ＭｐＨの．４ナトリウムリン酸緩衝液が添加された。これに、１００μｌのＴＨＦ中の６．５ｍｇ／ｍｌのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液。反応混合物は、室温で５分間静置され、この時点でさらに１００μｌのエステルが添加された。反応混合物は、室温でさらに３０分間静置された。水で約１０ｍＬに希釈して濾過し、遠心し透析する（３０ｋＤａカットオフ）。水から４回再透析する。約１０ｍＬに希釈して、濾過し凍結乾燥する。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：Ｍｐ  ２３３．４ｋＤａ、ＰＤＩ  １．１。
【化７７】
2017536105.tif 000089
【０２８２】
実施例２４  Ｒ４４４１の合成
最初に、Ｒ４１０８（上記を参照されたい）がＢＯＣ−Ｄａｂ（Ｍｅ２）−ＯＨ、ＴＦＡ塩と反応されて、下のスキームに示されるＲ４３０８が製造された。
【化７８】
2017536105.tif 000090
【０２８３】
２００ｍｇの４１８０が、２ｍｌのアセトニトリルに溶解された。次に溶液を使用して、１０６ｍｇのＢＯＣ−Ｄａｂ（Ｍｅ２）−ＯＨ、ＴＦＡ塩が溶解された。２００μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）および２６５μｌのプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）が添加された。室温で１５分間インキュベートする。２００μのＤＩＰＥＡおよび１７５μｌのＴ３Ｐをさらに添加して、さらに１５分間インキュベートする。水、次に酢酸を添加する。メタノールで希釈する。ＲＶ−ＨＰＬＣによってＲ４３０８を精製する。ＬＣＭＳによって確認する。
【０２８４】
次に、ＴＦＡによってＢＯＣ保護基を除去し、Ｒ４３３１を提供する。１３５ｍｇのＲ４３０８が、５００μｌのＴＦＡに溶解された。反応混合物は、１５分間静置された。Ｒ４３３１は、ＲＶ−ＨＰＬＣによって精製された。
【０２８５】
次にＲ４３３１は、ポリマー合成のためのイニシエータとして使用されて、ポリマーＲ４３６８が提供された。２５ｍＬのシュレンク管内に、４．８ｍｇの２，２’−ビピリジル、次に５６．２μＬのＤＭＦ中のイニシエータ原液（７１μＬのＤＭＦ中の７．１ｍｇのイニシエータ）が装入された。原液を脱気し、次に２．８ｍｇのＣｕＢｒを添加する、脱気して、次にエタノール中（４ｍＬのエタノール中の１ｇ）の単量体の原液を滴下して添加する。反応混合物を少なくとも１時間にわたり脱気し、３ｐｓｉのＡｒ下で密封し、褐色着色したら反応を室温で２０時間進行させる。次に、反応物は、試料採取、変換、および分子量分析のためにクエンチされた。凍結乾燥前の４回の透析（ＭＷＣＯは１ｋＤａ）洗浄による精製。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ分析：ＰＤＩ＝１．１、Ｍｐ＝２５６．６ｋＤａ。
【０２８６】
最後に、Ｒ４３６８が、ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応されて、下に示されるＲ４４４１が提供された。１００ｍｇのＲ４３６８が、８００μｌの水に溶解された。８０μｌの０．５ＭのｐＨ７．４リン酸ナトリウム緩衝液が添加された。１００μＬの６．５ｍｇ／ｍＬのＮＨＳエステルの溶液を添加する。室温に５分間保ち、次に１００μＬをさらに添加する。３０分間、静置する。水で約１０ｍＬに希釈して濾過し、遠心し透析する（３０ｋＤａカットオフ）。水から４回再透析する。約１０ｍＬに希釈して、濾過し凍結乾燥する。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：Ｒ４４４１  Ｍｐ  ２５６．６ｋＤａ、ＰＤＩ  １．１。
【化７９】
2017536105.tif 000091
【０２８７】
実施例２５  ポリマーＲ４３２０の合成
最初に、上記参照のＲ４１８０がＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｍｅ２）−ＯＨと反応されて、Ｒ４１９６が製造された。
【化８０】
2017536105.tif 000092
【０２８８】
２００ｍｇのＲ４１８０および７４ｍｇのＢＯＣ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｍｅ２）−ＯＨが、２ｍｌのアセトニトリルに溶解された。これに、２００μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）および２０４μｌのプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）が添加された。反応混合物は、室温で１５分間静置された。次に反応混合物は水で希釈され、５分間にわたり撹拌された。最後に反応混合物は、酢酸で酸性化され、メタノールで希釈された。Ｒ４１９６はＲＶ−ＨＰＬＣによって精製され、生成物はＬＣＭＳによって確認された。
【０２８９】
次にＲ４１９６上のＢＯＣ基がＴＦＡによって除去され、下に示される化合物Ｒ４２１１が製造された。１５３ｍｇのＲ４１９６が、５００μｌのＴＦＡに溶解された。溶液は、室温で１５分間静置された。水／アセトニトリルで希釈する。ＲＶ−ＨＰＬＣにより精製する。構造は、ＬＣＭＳおよびＮＭＲによって確認される。
【化８１】
2017536105.tif 000093
【０２９０】
次に、Ｒ４２１１がＭＰＣポリマー製造のための基質として使用され、ポリマーＲ４２５５が製造された。２５ｍＬのシュレンク管内に、４．８ｍｇの２，２’−ビピリジル、次に５７．７μＬのＤＭＦ中のイニシエータ原液（８０μＬのＤＭＦ中の８ｍｇのイニシエータ）が装入された。原液を脱気し、次に２．８ｍｇのＣｕＢｒを添加する、脱気して、次にエタノール中（４ｍＬのエタノール中の１ｇ）の単量体の原液を滴下して添加する。反応混合物を少なくとも１時間にわたり脱気し、３ｐｓｉのＡｒ下で密封する。反応を室温で２０時間進行させる。褐色の呈色：クエンチング、変換および分子量分析のためのサンプリング。凍結乾燥前における、透析（分子量カットオフｉｓ１ｋＤａ）４回洗浄による精製。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：ＰＤＩ  １．０７６、Ｍｐ２０５．３。
【０２９１】
最後に、ポリマーＲ４３２０（下に示される）が、ポリマーＲ４２５５をヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに共役させることで製造された。１００ｍｇのＲ４２５５が、８００μｌの水に溶解された。これに、８０μｌの０．５ＭｐＨの．４ナトリウムリン酸緩衝液が添加された。１００μＬのＴＨＦ中の６．５ｍｇ／ｍＬのＮＨＳエステルの溶液を添加する。５分間にわたり撹拌し、次に、さらに１００μＬのＮＨＳエステル溶液を添加する。室温に３０分間保つ。水で約１０ｍＬ容量に希釈して濾過し、遠心し透析する（３０ｋＤａ分子量カットオフ）。約１０ｍＬに希釈して、４回再透析する。約１０ｍＬに希釈して、濾過し凍結乾燥する。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：Ｍｐ：２２５．７ｋＤａ、ＰＤＩ：１．１。
【化８２】
2017536105.tif 000094
【０２９２】
実施例２６  ポリマーＲ４４３８の合成
最初に、下で示されるように、Ｒ４１８０（上記を参照されたい）が、ＢＯＣ−Ｄａｐ（Ｍｅ２）−ＯＨ  ＴＦＡ塩と反応されて、化合物Ｒ４３００が製造された。
【化８３】
2017536105.tif 000095
【０２９３】
２００ｍｇのＲ４１８０および８６ｍｇのＢＯＣ−Ｄａｐ（Ｍｅ２）−ＯＨＴＦＡ塩が、２ｍｌのアセトニトリルに溶解された。２００μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）および１７５μｌのプロピルホスホン酸無水物溶液（Ｔ３Ｐ）が添加されて、溶液は室温で約１５分間インキュベートされた。さらに４０ｍｇのＢＯＣ−Ｄａｐ（Ｍｅ２）−ＯＨ  ＴＦＡ塩、さらに２００μｌのＤＩＰＥＡ、およびさらに１００μｌのＴ３Ｐが添加され、室温でさらに１０分間のインキュベーションがそれに続いた。水で希釈して、酢酸で酸性化し、次にメタノールで希釈する。Ｒ４３００はＲＶ−ＨＰＬＣによって精製され、ＬＣＭＳによって確認される。
【０２９４】
次に、Ｒ４３００上のＢＯＣ基がＴＦＡによって除去されて、下で示されるＲ４３０７が製造された。
【化８４】
2017536105.tif 000096
【０２９５】
１１８ｍｇのＲ４３００が５００μｌのＴＦＡに溶解されて、反応混合物は２０分間静置された。水／アセトニトリルが添加され、化合物４３０７はＲＦ−ＨＰＬＣによって精製され、ＬＣＭＳによって確認された。
【０２９６】
次に、ＭＰＣポリマー合成のためのイニシエータとしてＲ４３０７が使用された。２５ｍＬのシュレンク管内に、４．８ｍｇの２，２’−ビピリジル、次に５５．５μＬのＤＭＦ中のイニシエータ原液（６８μＬのＤＭＦ中の６．８ｍｇのイニシエータ）が装入された。原液を脱気し、次に２．８ｍｇのＣｕＢｒを添加する、脱気して、次にエタノール中（４ｍＬのエタノール中の１ｇ）の単量体の原液を滴下して添加する。反応混合物を少なくとも１時間にわたり脱気し、３ｐｓｉのＡｒ下で密封する。反応を室温で２０時間進行させる。褐色の呈色：クエンチング、変換および分子量分析のためのサンプリング。透析（ＭＷＣＯは１ｋＤａ）による精製および凍結乾燥手順前の洗浄。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：Ｍｐ  ２３０．８ｋＤａ、ＰＤＩ  １．１。
【０２９７】
最後に、ヨードアセトアミド官能基がＲ４３０７に付加されて、化合物Ｒ４４３８（下に示される）が製造された。１００ｍｇのＲ４３０７が、８００μｌの水に溶解された。これに、８０μｌの０．５ＭｐＨの．４ナトリウムリン酸緩衝液が添加された。次に添加される１００μｌの６．５ｍｇ／ｍｌのＮＨＳエステル溶液が添加されて、室温で５分間のインキュベーションそれに続いた。さらに１００μＬの６．５ｍｇ／ｍＬのＮＨＳエステル溶液を添加し、室温で約４０分間インキュベートする。水で約１０ｍＬに希釈して濾過し、遠心し透析する（３０ｋＤａカットオフ）。水から４回再透析する。約１０ｍＬに希釈して、濾過し凍結乾燥する。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：Ｍｐ  ２３０．８ｋＤａ、ＰＤＩ  １．１。
【化８５】
2017536105.tif 000097
【０２９８】
実施例２７  ポリマーＲ４４５１の合成
最初に、下で示されるように、Ｒ４１８０（上記を参照されたい）が、ＢＯＣ−ｈｏｍｏａｒｇ−ＯＨ．ＨＣｌと反応されて、Ｒ４３６６が製造された。
【化８６】
2017536105.tif 000098
【０２９９】
２００ｍｇのＲ４１８０が、２ｍｌのアセトニトリルに溶解された。この溶液は、部分的に可溶性である８０ｍｇのＢＯＣ−ｈｏｍｏａｒｇ−ＯＨ．ＨＣｌに添加された。１７５μｌのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）が添加され、ＢＯＣ−ｈｏｍｏａｒｇ−ＯＨ．ＨＣｌは全て析出したようであった。しかし、２００μｌのプロピルホスホン酸無水物溶液（Ｔ３Ｐ）が添加されると、全ての固体は溶解した。この反応混合物は、室温で４０分間インキュベートされた。さらに８１ｍｇのＢＯＣ−ｈｏｍｏａｒｇ−ＯＨ．ＨＣＬが添加され、さらに２００μｌのＤＩＰＥＡおよびさらに１７５μｌのＴ３Ｐがそれに続いた。反応混合物は、さらに５０分間インキュベートされた。反応混合物は水で希釈され、Ｒ４３６６はＲＶ−ＨＰＬＣによって精製され、ＬＣＭＳによって確認された。
【０３００】
次に、示されるように、ＢＯＣ基が除去されて、化合物Ｒ４３５４が製造された。
【化８７】
2017536105.tif 000099
【０３０１】
９０ｍｇのＲ４３６６が、５００μｌのＴＦＡに室温で３０分間溶解された。水／アセトニトリルを添加する。ＲＶ−ＨＰＬＣにより精製し、ＬＣＭＳおよびＮＭＲによって確認する。
【０３０２】
次に、ＭＰＣポリマー合成のための基質としてＲ４３５４が使用されて、Ｒ４３８６が製造された。２５ｍＬのシュレンク管内に、４．８ｍｇの２，２’−ビピリジル、次に５８．３μＬのＤＭＦ中のイニシエータ（Ｒ４３５４）原液（７４μＬのＤＭＦ中の７．４ｍｇのイニシエータ）が装入された。原液を脱気し、次に２．８ｍｇのＣｕＢｒを添加する、脱気して、次にエタノール中（４ｍＬのエタノール中の１ｇ）の単量体の原液を滴下して添加する。反応混合物を少なくとも１時間にわたり脱気し、３ｐｓｉのＡｒ下で密封する。反応を室温で２０時間進行させる。褐色の呈色：クエンチング、変換および分子量分析のためのサンプリング。凍結乾燥手順前に、透析（ＭＷＣＯｉｓ３．５ｋＤａ）による精製。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：ＰＤＩ  １．１  Ｍｐ  ２５８．４ｋＤａ。
【０３０３】
最後に、ヨードアセトアミド官能基がＲ４３８６に付加されて、Ｒ４５５１（下に示される）が製造された。１００ｍｇのＲ４３８６が、８００μｌの水に溶解された。これに、８０μｌの０．５ＭｐＨの．４ナトリウムリン酸緩衝液が添加された。１００μｌの６．５ｍｇ／ｍｌのヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液が添加された。室温で５分間インキュベートして、さらに１００μｌのＮＨＳエステルを添加する。
【０３０４】
室温で３０分間インキュベートする。水で約１０ｍＬに希釈して濾過し、遠心し透析する（３０ｋＤａカットオフ）。水から４回再透析する。約１０ｍＬに希釈して、濾過し凍結乾燥する。ＳＥＣ／ＭＡＬＳ：Ｍｐ  ２５８．４ｋＤａ、ＰＤＩ  １．１。
【化８８】
2017536105.tif 000100
【０３０５】
実施例２８  ＰＥＧ試薬の合成
ＰＥＧ試薬は、好都合には、ＮＨＳエステルをアミンを共役させることで製造される。アミン官能基で終結する分岐ＰＥＧは、市販される。例えば、本発明に従って、以下のＰＥＧヨードアセトアミン試薬が使用されてもよい。
【化８９】
2017536105.tif 000101
式中、ｎはＰＥＧ単位の数である。ＰＥＧ試薬Ｒ５００は、好都合には以下の反応によって合成される。
【化９０】
2017536105.tif 000102
【０３０６】
実施例２９  ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｑ３４７Ｃ）の哺乳類発現ベクター、細胞株、および発現最適化
ｒｈＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−Ｆｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｑ３４７Ｃ）コンストラクトを含有するＤＮＡ断片は、ピューロマイシン耐性遺伝子をコードする哺乳類発現ベクターにクローン化される。挿入された配列は、配列番号９に示される。挿入されたＢｕＣｈＥ−Ｆｃ融合物がある発現ベクターは、コンストラクト１４と称される。コンストラクト１４はＣＨＯ細胞に形質移され、安定した形質移入プールが構築された。安定したプールは細胞株開発の対象となり、Ｃ９８と称される安定して形質移入されたクローンが単離された。振盪フラスコ試験が実施されて、製造されるタンパク質量を最大化するために、いずれの培地および条件が使用されるかを判定した。各フラスコの播種密度は、０．４×１０６細胞／ｍｌであった。結果は、下の表２に記載される。
【０３０７】
【表８】
2017536105.tif 000103
【０３０８】
実施例３０  単分子イニシエータ
先のＡＴＲＰイニシエータに共有結合的に付着する塩基性基（例えば、グアニジンまたは三次的アミン）の導入は、リガンドが添加された場合に、このような塩基性基との銅ハロゲン化物化学種（ＣｕＢｒ）の潜在的複合体形成のために、ＡＴＲＰによる重合過程に潜在的干渉をもたらした（２，２’−ビピリジンはｂｐｙと記述される）。本実施例は、このようなイニシエータがある調節製造されるポリマーを得ることを目指す場合に、本発明で特許請求されるこのような塩基性基が、ＡＴＲＰ処理中にリガンドの機能もまた果たし得るか、そしてこのような化合物の使用をスキップできるかどうかを試験する。
【０３０９】
共有結合的に付着する三級アミン基を含有する単分子ＡＴＲＰイニシエータは、スチレンの重合について既に報告されている（ｐｏｌｙｍ．Ｐｒｅｐｒｉｎｔ  ２０１２  ４３（２），ｐ  ２４５）。ビニル性単量体（スチレン、メタクリル酸メチル）のためのＡＴＲＰシステムでこのようなイニシエータを使用する目的は、アミンをイニシエータ上に共有結合的に付着することで、単に、外部作用剤の使用を抑止することであり、生理活性化合物が関与するコンジュゲーション目的のためではなかった。単分子イニシエータの研究は、加熱を要する有機溶剤（トルエン）中のスチレンおよびＭＭＡに対してのみ実施された。著者らによると、分子量の中程度の制御が得られた。より広い範囲分布で、高分子量が達成された。
【０３１０】
ＡＴＲＰ中の処理中のリガンドとしてのグアニジン分子の使用が、グアニジン−ピリジン誘導体（ジメチルエチレングアニジン）メチレンピリジン（ＤＭＥＧｐｙ）または（テトラメチルグアニジン）メチレンピリジン（ＴＭＧｐｙ）として報告された。これらの構造物（ｓｔｒｕｃｔｕｅｓ）は、スチレンおよびメタクリル酸メチルの制御重合のためのＡＴＲＰ処理においてリガンドとして使用されなかった。（１０，０００Ｄａ未満）のみの低分子量ポリマーが得られた。
【化９１】
2017536105.tif 000104
【０３１１】
本実施例は、イニシエータ上に新鮮に導入された基が、上に記載された伝統的なＡＴＲＰ処理に干渉するかどうかを試験たして、ＡＴＲＰ重合処理においてリガンドとして使用される、それらの能力を調べる。
【０３１２】
いかなるｂｐｙ導入もなしに合成された第１のブロックポリ（ＨＥＭＡ−ＰＣ）（ステップ１）が、ポリマー形成および分子量制御について調べられた。このステップに、ｂｐｙ導入および単量体の漸増的添加が続き（ステップ２）、下のスキームに従って、システムの鎖伸長およびリビング性について調べられた。
【化９２】
2017536105.tif 000105
【０３１３】
化合物Ｒ４２３５が、標準として使用された。使用されたその他の化合物の全ての構造は、下に記載される。
【化９３】
2017536105.tif 000106
【０３１４】
使用されたプロトコルは、全てのイニシエータ（ｉｎｉｔａｔｏｒｓ）で同一であった：
リガンドとしてのｂｐｙのない重合プロトコル。ＤＭＦ中の１００ｍｇ／ｍＬとしてのイニシエータの原液は、新鮮に調製された。溶液は分注されて、シュレンク管内の５×１０−６ｍｏｌのイニシエータが導入された。溶液は、２．４８ｍｇのＣｕＢｒ（１．７×１０−５ｍｏｌ）（なしの変化呈色）の添加前に脱気された（ｄｅｇａｓｅｄ）。エタノール中のＨＥＭＡ−ＰＣ（４ｍＬ中の１ｇ）の原液が、滴下して添加された。反応混合物は３ｐｓｉおよび重合の下に置かれて、室温で２０時間室温で進行させた。
【０３１５】
反応物は無色のままであり、いずれの場合にも、アリコートが採取されて、変換および分子量が分析された（ステップ１については下の表を参照されたい）。
【０３１６】
ステップ２では、ｂｐｙがステップ１の粗製混合物に添加されて、溶液（２ｍＬのエタノール中の１ｇ）中の単量体（ＨＥＭＡ−ＰＣ）、および反応混合物内の４．８ｍｇのｂｐｙ（３．１×１０−５モル）の漸増的添加が、それに即座に続いた（褐色の呈色が即座に出現した）。最後のクエンチング前に、反物は密封されて完全に脱気され、均質化されて粘稠になるまで室温で進行された。
【０３１７】
結果は、下の表９に示される。
【０３１８】
【表９】
2017536105.tif 000107
【０３１９】
対照としてのｂｐｙ不在下（化合物Ｒ４２３５）では、ｂｐｙの存在下におけるポリマー形成は得られなかった。リガンドとしてのビピリジルが反応混合物内に導入されて、所望の分子量および高度変換に達した場合にのみ、重合が進行した。
【０３２０】
表に列挙される全てのその他のイニシエータ（化合物Ｒ４３１５、Ｒ４３３４、Ｒ４０３７、Ｒ４３５４、Ｒ４３１４、Ｒ４２１１、およびＲ４１８２）では、重合は、ステップ１の反応物へのいかなるｂｐｙリガンド導入もなしに、全例で進められた。制御分子量は、低いＰＤＩ（１．２以下）によって得られた。ステップ２へのＨＥＭＡ−ＰＣ単量体の漸増的添加によってｂｐｙを添加した場合、褐色の呈色褐色の呈色が即座に出現し、ｂｐｙによる銅化学種の再錯体形成が示唆された。重合は、ステップ１で得られた、所望の分子量および狭い多分散性のポリマー鎖の伸長によって、全例で再開された。
【０３２１】
新鮮に導入された基は、中性ｐＨにおけるコンジュゲーションに関与するだけでなく、ＡＴＲＰにおける効果的リガンドとしての機能もまた果たし得る。このような重合では、外部リガンド（ｂｐｙなどの）の使用は不要である。
【０３２２】
上記または下記で引用される全ての特許提出、ウェブサイト、その他の文献、受入番号などは、あらゆる目的のためにその内容全体を参照によって援用され、あたかもそれぞれの個々の物品が、具体的かつ個別に示されているかのように、参照により組み込まれる。配列の異なるバージョンが、異なる時点で受入番号と関連している場合、本出願の有効出願日における受入番号と関連しているバージョンを意味する。有効出願日は、該当する場合には、実際の出願日または受入番号を参照する優先出願の出願日のより早い方を意味する。同様に、出版物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが、異なる時点で公開されている場合、特に断りのない限り、特許出願書の有効出願日において、最も最近公開されたバージョンを意味する。本発明のあらゆる特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、特に別段の指示がない限り、任意のその他のものと組み合わせて使用され得る。本発明は、明確さおよび理解の目的で、例示および実施例によって若干詳しく説明されたが、添付の特許請求の範囲内で、特定の変更および修正が実施されてもよいことは、明らかであろう。
【０３２３】
配列表
配列番号１（ヒトブチリルコリンエステラーゼＰ０６２７６．１）
【化９４】
2017536105.tif 000108
天然リーダー、Ｃ６６Ｙ変異、およびＣ末端除去ドメインは下線付きである。
配列番号２（好ましいｒＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−ＧＳ１０−Ｆｃ（ｗ／変異）融合物）
【化９５】
2017536105.tif 000109
ＢｕＣｈＥは、ＧＳリンカーがあるＩｇＧ１−Ｆｃに連結（下線）して結合し、野生型からのアミノ酸変化は下線付きである。
配列番号３（ヒトＡＣｈＥ  ＡＡＡ６８１５１．１）
【化９６】
2017536105.tif 000110
リーダーペプチドは下線付きである
配列番号５（アリールジアルキルホスファターゼ［デスルファルキュルス・バールシイ（Ｄｅｓｕｌｆａｒｃｕｌｕｓ  ｂａａｒｓｉｉ）ＤＳＭ２０７５；ＡＤＫ８３７６２．１］）
【化９７】
2017536105.tif 000111
配列番号６（ヒトＰＯＮ  １、Ｐ２７１６９．３）
【化９８】
2017536105.tif 000112
配列番号７（ヨーロッパヤリイカ（Ｌｏｌｉｇｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）Ｑ７ＳＩＧ４．１からのジイソプロピルフルオロホスファターゼ）
【化９９】
2017536105.tif 000113
配列番号８（ヒトＩｇＧ１）
【化１００】
2017536105.tif 000114
配列番号９（ＤＮＡ配列が好ましいＢｕＣｈＥ−ＧＳ１０−Ｆｃ（ｗ／変異）融合物）
【化１０１】
2017536105.tif 000115
配列番号１０（ｒＢｕＣｈＥ５３４）
【化１０２】
2017536105.tif 000116
配列番号１１（ｒＢｕＣｈＥ５２４トランケートｗ／Ｃ６６Ｙ）
【化１０３】
2017536105.tif 000117
配列番号１２（ｒＢｕＣｈＥ５２４ＧＧＧＣトランケートｗ／Ｃ６６Ｙ）
【化１０４】
2017536105.tif 000118
配列番号１３（ｒＢｕＣｈＥ５３４ＧＧＣトランケートｗ／Ｃ６６Ｙ）
【化１０５】
2017536105.tif 000119
配列番号１４（ｒＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−ＧＳ１０−Ｆｃ（ｗｔ）融合）
【化１０６】
2017536105.tif 000120
ＧＳリンカー下線付き。
配列番号１５（ｒＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−ＧＳ１０−Ｆｃ（ｎｏＱ３４７Ｃｗ／エフェクター機能変異）融合物）
【化１０７】
2017536105.tif 000121
ＧＳリンカーおよびエフェクター機能変異に下線が引かれている。
配列番号１６（ｒＢｕＣｈＥ５３４−ＧＳ１０−Ｆｃ（ｗｔ）融合物）
【化１０８】
2017536105.tif 000122
ＧＳリンカー下線付き。
配列番号１７（ｒＢｕＣｈＥ５３４（Ｃ６６Ｙ）−ＧＳ１０−Ｆｃ（ｗｔ）融合物）
【化１０９】
2017536105.tif 000123
ＧＳリンカー下線付き。
配列番号１８（リーダーペプチド）
【化１１０】
2017536105.tif 000124
配列番号１９（ｈＢｕＣｈＥ成熟タンパク質配列）
【化１１１】
2017536105.tif 000125
【図１】
2017536105.tif 000154
【図２】
2017536105.tif 000155
【図３】
2017536105.tif 000156
【図４】
2017536105.tif 000157
【図５】
2017536105.tif 000158
【配列表】
2017536105000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月14日(2017.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブチリルコリンエステラーゼ酵素またはそのトランケーション、および
免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインまたはその断片、を含んでなるタンパク質。
【請求項２】
前記Ｉｇドメインの断片またはその断片が、
ａ．ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣＨ、およびＩｇＧ−ＣＬからなる群から選択される、
ｂ．ＩｇＧ１−Ｆｃを含んでなる、または、
ｃ．配列番号８を含んでなる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記Ｉｇドメインまたはその断片が、
ａ．ＥＵ番号付けによるＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０、およびＰ３３１からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換か、
ｂ．ＥＵ番号付けによるＬ２３４、Ｌ２３５、およびＧ２３７の１つ以上のアミノ酸置換か、
ｃ．ＥＵ番号付けによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換か、
ｄ．ＥＵ番号付けによる、Ｌ２３４Ａのアミノ酸置換か、
ｅ．ＥＵ番号付けによる、Ｌ２３４ＡおよびＧ２３４Ａのアミノ酸置換、
を含んでなる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
さらに、
ａ．前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素またはそのトランケーションと前記Ｉｇドメインまたはその断片とを連結すると共に、両者の間に位置するリンカー、
ｂ．前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素またはそのトランケーションと前記Ｉｇドメインまたはその断片とを連結すると共に、両者の間に位置するリンカーであって、前記リンカーが、G、GG、GGGGS（配列番号２２）、GGGS（配列番号２３）, GGGES（配列番号２４）, GGGSGGGSGGGS（配列番号２１）、およびGGSGGGSGGGS（配列番号２５）からなる群から選択される、
請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ブチリルコリンエステラーゼ酵素またはそのトランケーションは、
ａ．カルボキシルトランケート、
ｂ．配列番号１のアミノ酸２９〜５６１、
ｃ．配列番号１のアミノ酸２９〜５６２、
ｄ．配列番号１の残基９４がＹである配列番号１のアミノ酸２９〜５６１、または
ｅ．配列番号１の残基９４がＹである配列番号１のアミノ酸２９〜５６２、
を含んでなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記プロテインは、
ａ．配列番号２、
ｂ．配列番号２の残基６７２がＱである配列番号２、
ｃ．配列番号１６の残基６６がＹである配列番号１６、
を含んでなる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
ａ．配列番号２の残基５４６〜７７２と結合すると共に、配列番号１の残基２９〜５６１を含んでなるタンパク質と少なくとも８５％が一致し、前記タンパク質がＣ６７２Ｑの点変異を含んでなり、
ｂ．配列番号２のアミノ酸と少なくとも８５％が一致し、
ｃ．配列番号２のアミノ酸と少なくとも９５％が一致し、
ｄ．配列番号２のアミノ酸と少なくとも９８％が一致する、
タンパク質。
【請求項８】
ａ．前記タンパク質が、配列番号２の残基５４６〜７７２と結合すると共に、配列番号１の残基２９〜５６１を含んでなるタンパク質と少なくとも９８％が一致し、前記タンパク質がＣ６７２Ｑの点変異を含み、
ｂ．前記タンパク質が、配列番号２の残基５４６〜７７２と結合すると共に、配列番号１の残基２９〜５６１を含んでなるタンパク質と少なくとも９９％が一致し、前記タンパク質がＣ６７２Ｑの点変異を含み、
ｃ．さらに、配列番号２の残基５４６〜７７２と結合すると共に、配列番号１の残基２９〜５６１を含んでなる、
請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号２のアミノ酸を含んでなり、配列番号２内において、１つ以上の点変異が
（ａ）５６０、
（ｂ）６５５、
（ｃ）６５６、および
（ｄ）６７２
の位置にある、タンパク質。
【請求項１０】
前記１つ以上の点変異がＳ６５６Ａを有する、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記１つ以上の点変異は、配列番号２の５６０、６５５、および６５６における点変異を含んでなる、請求項１０に記載のタンパク質。
【国際調査報告】
2017536105.tif 000159
2017536105.tif 000160
2017536105.tif 000161