(57)【要約】  本発明は、転移性播種を予防又は低減する（すなわち、癌細胞の運動性を低減する）ための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、癌に罹患している被験体における転移性播種を予防又は低減する（すなわち、癌細胞の運動性を低減する）ための方法であって、ｉ）被験体から得られたサンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌ及びＥＭＴ促進因子からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルと所定の参照値とを比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルが所定の参照値より高い場合に、治療有効量のＣ１６−セラミド又は誘導体（例えば、Ｃ１６−スフィンゴミエリン及びＣ１６−グリコスフィンゴリピド）を被験体に投与する工程からなる工程を含む、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患している被験体における転移性播種を予防又は低減するための方法であって、ｉ）被験体から得られたサンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌ及びＥＭＴ促進因子からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルと所定の参照値とを比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルが所定の参照値より高い場合に、Ｃ１６−セラミド、Ｃ１６−スフィンゴミエリン及びＣ１６−グリコスフィンゴリピドからなる群より選択される治療有効量の少なくとも１つの化合物を被験体に投与する工程からなる工程を含む、方法。
【請求項２】
被験体が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、脳腫瘍、皮膚癌、直腸癌、胃癌、食道癌、肉腫、気管癌、頭頚部癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、リンパ腫、子宮頸癌、外陰癌、黒色腫、中皮腫、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌腫、肉腫及び軟部組織癌からなる群より選択される癌に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体がトリプルネガティブ乳癌に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＥＭＴ促進因子がＴＧＦベータである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｃ１６−セラミド、Ｃ１６−スフィンゴミエリン又はＣ１６−グリコスフィンゴリピドがリポソームベシクル中に封入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
被験体から得られた腫瘍組織サンプル中にＥＭＴが生じるか否かを決定するための方法であって、ｉ）腫瘍組織サンプル中のＣｅｒＳ６又はＣ−１６セラミドの発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルと所定の参照値とを比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルが所定の参照値よりも低い場合に、腫瘍組織サンプル中にＥＭＴが生じると結論付ける工程を決定することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移性播種を予防又は低減する（すなわち、癌細胞の運動性を低減する）ための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬとしても知られている）は、いわゆる細胞死受容体ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ１としても知られている）に結合する、膜貫通リガンドである。メタロプロテアーゼは、ＣＤ９５Ｌを切断して、可溶性リガンドｃｌ−ＣＤ９５Ｌを産生することができる。膜貫通ＣＤ９５Ｌは、免疫監視及び免疫寛容に関与する強力なアポトーシス誘導因子であり（レビュー３２を参照のこと）、一方、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌはアポトーシスを誘導することができないが、代わりに癌細胞及び活性化Ｔリンパ球の運動性のトリガーとなり１２、１５、３４、炎症を悪化させる２３、３４。膜貫通ＣＤ９５ＬのＣＤ９５への結合は、Ｆａｓ関連死ドメインアダプタータンパク質並びにカスパーゼ−８及び−１０を含有する、死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の形成を導く１４。この複合体は、アポトーシスシグナル伝達の開始において極めて重要な役割を果たす。細胞は、ＤＩＳＣが形成する効率及びＣＤ９５媒介性アポトーシスシグナルを遂行するミトコンドリア誘起アポトーシスシグナルへのそれらの依存に従って、Ｉ型又はＩＩ型として分類され得る１４。ＩＩ型細胞が上皮系統の細胞である一方で、Ｉ型細胞は間葉様であることが以前に示された１。ＩＩ型細胞は、Ｉ型細胞よりもＣＤ９５媒介性アポトーシスシグナルに感受性である。それゆえ、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受けた癌細胞が、それらのアポトーシス機構を再プログラムして、ＣＤ９５媒介性細胞死に抵抗すると結論付けられた１。これらの知見は、本発明者らに、ＥＭＴがｃｌ−ＣＤ９５Ｌに対する細胞応答、すなわち運動性を変化させるか否かを調査することを促した。
【０００３】
スフィンゴ脂質（ＳＬ）は、脂質の１つのクラスに属し、そのメンバーは真核細胞において複数の役割を果たしている。ＳＬは、膜の重要な構造成分であり、細胞の増殖、分化及び死を調節するセカンドメッセンジャーである１０。セラミド（Ｎ−アシル−Ｄ−エリトロ−スフィンゴシン）は、スフィンゴミエリナーゼによるスフィンゴミエリンの加水分解を介して又はセラミド合成酵素（ＣｅｒＳ）媒介性デノボセラミド生合成を介して産生され得る。この経路は、Ｃ１４〜Ｃ２６の鎖長の脂肪酸アシル−ＣｏＡによるスフィンガニンのアシル化によりジヒドロセラミドを産生することを含む。或いは、ＣｅｒＳは、ＳＬ異化作用から誘導されるスフィンゴシンの直接アシル化を介したサルベージ経路によって、セラミドを合成することができる１０。セラミド合成は、６種の哺乳動物ＣｅｒＳタンパク質によって統制されており、その各々が制限されたアシル鎖長を有するセラミドを産生する２０。これらのタンパク質の中で、セラミド合成酵素アイソフォーム６（ＣｅｒＳ６）がごく最近クローニングされた３７。セラミドに関するほとんどの研究は、アポトーシスシグナル伝達に与えるそれらの影響を解析してきたが、これらの脂質はまた脂質ラフトと呼ばれる秩序立った液相の形成を促進し、その蓄積は原形質膜を固くする２８。セラミドは、それらのＮ−アシル鎖がＣ１２よりも長い場合に固いセラミドリッチドメインを形成し５、７、ＣｅｒＳ２−ヌルマウスにおいて秩序立った脂質膜の全体的な減少を導く２９。ＣｅｒＳ２−ヌルマウスにおいては、肝細胞膜の生物物理学的特性（ＳＬ組成の変化と直接関連している増加した流動性２４を含む）が改変されている。更に、高い原形質膜流動性は、腫瘍細胞の増大した遊走／浸潤能と相関しており２２、３０、３３、３９、これらの細胞の増大した変形能に起因し得るだろう２２。これらの観察は、ＥＭＴがＳＬ生合成のレベルを変化させて膜流動性を増加させ、これが次いで、ＥＭＴと関連する表現型変化である細胞遊走を促進する可能性を高める。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の概要：
本発明は、転移性播種を予防又は低減する（すなわち、癌細胞の運動性を低減する）ための方法及び医薬組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の詳細な説明：
電子常磁性共鳴を使用して、ＥＭＴ及びｃｌ−ＣＤ９５Ｌ処置が両方とも原形質膜流動性の増強を導き、これが細胞遊走の誘導に役立ったことを示した。原形質膜の圧密化は、いくつかの要因の中でも、スフィンゴ脂質などの特定の脂質の膜中比率によってモジュレートされる。ＮＣＩ腫瘍細胞株における遺伝子発現の統合解析は、セラミド合成酵素−６（ＣｅｒＳ６）の発現がＥＭＴの間に減少したことを明らかにした。更に、薬理学的及び遺伝学的アプローチは、癌細胞中のＣｅｒＳ６発現／活性のモジュレーションがＣ１６−セラミドのレベルを変化させ、これが次いで、原形質膜流動性及び細胞の運動性に影響を与えたことを証明した。それゆえ、本発明者らは、ＣｅｒＳ６を細胞遊走の調節において極めて重要な役割を果たす新規なＥＭＴ調節遺伝子として同定する。
【０００６】
したがって、本発明の一局面は、癌に罹患している被験体における転移性播種を予防又は低減する（すなわち、癌細胞の運動性を低減する）ための方法であって、ｉ）被験体から得られたサンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌ及びＥＭＴ促進因子からなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルと所定の参照値とを比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルが所定の参照値より高い場合に、Ｃ１６−セラミド、Ｃ１６−スフィンゴミエリン及びＣ１６−グリコスフィンゴリピドからなる群より選択される治療有効量の少なくとも１つの化合物を被験体に投与する工程からなる工程を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１．非毒性量の外因性Ｃ１６：０セラミドによる間葉乳癌細胞の処置は、原形質膜流動性を低下させ、基底及びＣＤ９５媒介性の細胞遊走を抑制する。  Ａ．表示した細胞を、非細胞毒性用量（１μM）のＣ１６：０セラミド（Ｃ１６−Ｃｅｒ）と共に又はそれなしで６０分間プレインキュベートし、次いで、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ（１００ng/mL）と共に又はそれなしで３０分間インキュベートした。ＥＰＲによって膜流動性を評価した。値は、４つの独立した実験の平均±ＳＥＭである（＊、ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意でない）。
【図１Ｂ】Ｂ．表示した細胞を、Ｃ１６：０セラミド（１μM）と共に又はそれなしで６０分間前処理し、次いで、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ（１００ng/mL）と共に又はそれなしで２４時間インキュベートした。ボイデンチャンバーアッセイによって細胞遊走を評価した。バー＝７０μm。膜の下側に遊走したギムザ染色細胞を溶解し、５６０nmにおける吸光度を記録した。値は、３つの独立した実験の平均及びＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
いくつかの実施態様において、被験体は、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、精巣癌、脳腫瘍、皮膚癌、直腸癌、胃癌、食道癌、肉腫、気管癌、頭頚部癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、リンパ腫、子宮頸癌、外陰癌、黒色腫、中皮腫、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌腫、肉腫及び軟部組織癌からなる群より選択される癌に罹患している。したがって、本発明のための方法は、一般に、ＥＭＴが生じる任意のタイプの癌に適用可能である。ある実施態様において、癌は、固形悪性腫瘍である。ある実施態様において、癌は、乳癌、結腸癌又は前立腺癌である。特定の実施態様において、癌は、トリプルネガティブ乳癌である。本明細書において使用される場合、表現「トリプルネガティブ乳癌」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、前記乳癌がホルモンのエストロゲン（ＥＲ陰性）及びプロゲステロン（ＰＲ陰性）に対する受容体、並びにタンパク質ＨＥＲ２に対する受容体を欠損していることを意味する。
【０００９】
いくつかの実施態様において、サンプルは、血液サンプルである。「血液サンプル」とは、多量の全血又はその分画、例えば、血清、血漿などを意味する。
【００１０】
本明細書において使用される場合、用語「ＥＭＴ促進因子」は、上皮間葉転換を促進することができる任意の因子、典型的には、タンパク質を指す。特定の実施態様において、ＥＭＴ促進因子は、ＴＧＦベータである。「ＴＧＦベータ」は、本明細書において使用される場合、ＴＧＦベータ−１、ＴＧＦベータ−２又はＴＧＦベータ−３（Schmierer, B. and Hill, C. (2007) Nat Rev MoI Cell Biol. 8(12): 970-82）又はそのヘテロ二量体を意味する。追加のＥＭＴ促進因子は、限定されないが、タンパク質ＨＧＦ（Lamorte, L. et al (2002)Mol Biol Cell. 13(5): p. 1449-61）、ヘッジホッグ（Hedgehog）（Feldmann, G. et al (2007) Cancer Res. 67(5): p. 2187-96）、Ｗｎｔ（Yook, J. et al (2006) Nat Cell Biol. 8(12): p. 1398-406）、ＩＬ−１（Chaudhuri, V. et al (2007) J Cutan Pathol. 34(2): p. 146-53）、オンコスタチンＭ（Pollack, V. et al (2007) Am J Physiol Renal Physiol. 293(5): p. F1714-26）、ＥＧＦ（Solic, N. and Davies, D. (1997) Exp Cell Res. 234(2): p. 465-76）、アンフィレグリン（Chung, (2005) E. Exp Cell Res. 309(1): p. 149-60）、ＨＢ−ＥＧＦ（Wang, F. et al (2007) Cancer Res. 67(18): p. 8486-93）、ＭＳＰ（Camp, E., (2007) Cancer. 109(6): p. 1030-9）、Ｗｎｔ５ａ（Dissanayake, S. (2007) J Biol Chem. 282(23): p. 17259-71; Ripka, S. (2007) Carcinogenesis. 28(6): p. 1178-87）及びＴＮＦアルファ（Bates, R. and Mercurio, A. (2003) MoI Biol Cell. 14(5): p. 1790-800）を含む。或いは、腫瘍細胞は、細胞にＥＭＴを起こさせるタンパク質、例えば、Ｓｎａｉｌ、Ｚｅｂｌ又はＴＧＦベータを誘導発現するように改変され得る。
【００１１】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＤ９５」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、哺乳動物細胞の表面上に存在する受容体に対するＣＤ９５を指し、これは当初、その同族リガンドであるＣＤ９５Ｌの三量体形態の結合時にアポトーシスを誘導する能力を有することが示された（Krammer,P.H. (2000). CD95’s deadly mission in the immune system. Nature 407, 789-795）。ＣＤ９５はまた、Ｆａｓ又はＡｐｏ−１としても知られている。本明細書において使用される場合、ＣＤ９５Ｌという用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、膜貫通タンパク質であるＣＤ９５の同族リガンドを指す。
【００１２】
本明細書において使用される場合、用語「可溶性ＣＤ９５Ｌ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、膜貫通ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬとしても知られている）の切断によって産生される可溶性リガンドを指す（Matsuno et al., 2001; Vargo-Gogola et al., 2002; Kiaei et al., 2007; Kirkin et al., 2007; 又は Schulte et al., 2007）。用語「血清ＣＤ９５Ｌ」、「可溶性ＣＤ９５Ｌ」、「メタロプロテアーゼ切断ＣＤ９５Ｌ」及び「ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ」は、本明細書にわたり同じ意味を有する。
【００１３】
所定の参照値は、同じ又は類似の年齢範囲の被験体、同じ又は類似の民族の被験体、及び同じ癌重症度を有する被験体を非限定的に含む、集団調査から導出された数又は値に相対的であり得る。そのような所定の参照値は、転移性播種の数学アルゴリズム及び算出指数から得られた集団の統計分析及び／又はリスク予測データから導出され得る。本発明の１つの実施態様において、所定の参照値は、転移性播種を受けていない１つ以上の被験体に由来する対照サンプル中の本発明の選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）のレベルから導出される。更に、適切に保存された歴史的な被験体サンプル中の選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）のレベルのレトロスペクティブ測定は、これらの所定の参照値を確立する際に使用され得る。典型的には、転移性播種を有する被験体における選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）のレベルは、転移性播種が生じなかった被験体において得られた参照値よりも高いと思われる。
【００１４】
いくつかの実施態様において、所定の参照値は、再発及び遠隔転移のリスク、無病生存（ＤＦＳ）及び／又は全生存（ＯＳ）の期間と相関している。したがって、所定の参照値は、典型的には、以下の工程を含む方法を実施することによって決定され得る：
ａ）同じ癌に罹患している被験体からの血液サンプルのコレクションを提供する工程；
ｂ）工程ａ）で提供された各血液サンプルについて、対応する被験体についての実際の臨床成績に関する情報（すなわち、再発及び遠隔転移のリスク、無病生存（ＤＦＳ）及び／又は全生存（ＯＳ）の期間）を提供する工程；
ｃ）一連の任意の定量値を提供する工程；
ｄ）工程ａ）で提供されたコレクション中に含有される各血液サンプルについて、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）のレベルを決定する工程；
ｅ）工程ｃ）で提供された１つの特定の任意の定量値について、前記血液サンプルを２つのグループにそれぞれ分類する工程：（ｉ）前記の一連の定量値中に含有される前記の任意の定量値よりも低いレベルについての定量値を示す血液サンプルを含む第一のグループ；（ｉｉ）前記の一連の定量値中に含有される前記の任意の定量値よりも高い前記レベルについての定量値を示す血液サンプルを含む第二のグループ；それによって、前記の特定の定量値について血液サンプルの２つのグループが得られ、ここで、各グループの血液サンプルが別々に列挙される；
ｆ）（ｉ）工程ｅ）で得られた定量値と（ｉｉ）工程ｆ）で定義された第一及び第二のグループ中に含有される血液サンプルが由来する患者の実際の臨床成績との間の統計的有意性を算出する工程；
ｇ）工程ｄ）で提供された全ての任意の定量値が試験されるまで、工程ｆ）及びｇ）を繰り返す工程；
ｈ）前記の所定の参照値を、工程ｇ）で最も高い統計的有意性（最も有意）が算出された任意の定量値からなるものとして設定する工程。
【００１５】
例えば、１００人の患者の１００個の血液サンプルについて、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルを評価した。１００個のサンプルを、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルに従ってランク付けする。サンプル１は最も高いレベルを有し、サンプル１００は最も低いレベルを有する。第一のグループ分けは、２つのサブセット：一方がサンプルＮｒ１で、他方が９９個の他のサンプルを提供する。次のグループ分けは、一方がサンプル１及び２で、他方が９８個の残りのサンプルなどを提供する（最後のグループ分け：一方がサンプル１〜９９で、他方がサンプルＮｒ１００まで）。対応する癌患者についての実際の臨床成績に関する情報に従って、２つのサブセットの９９個のグループの各々についてカプラン・マイヤー曲線を作成する。また、９９個のグループの各々について、両サブセット間のｐ値を算出した。次いで、最小ｐ値の基準に基づく識別が最も強くなるようにして所定の参照値を選択する。言い換えると、ｐ値が最小である両サブセット間の境界値に対応する選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルを所定の参照値として考慮する。所定の参照値が必ずしも選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）のレベルの中央値というわけではないことに留意すべきである。
【００１６】
したがって、いくつかの実施態様において、所定の参照値は、このように、再発及び遠隔転移の増加したリスクと再発及び遠隔転移の減少したリスク（すなわち、患者のＤＦＳ及びＯＳに関しての予後不良と予後良好）との間の識別を可能にする。実際には、高い統計的に有意な値（例えば、低いＰ値）は、一般に、単一の任意の定量値についてだけではなく、ある範囲の連続した任意の定量値について得られる。したがって、本発明の１つの代替的な実施態様において、明確な所定の参照値を使用する代わりに、ある範囲の値が提供される。それゆえ、最小の統計的に有意な値（有意性の最小閾値、例えば、最大閾値Ｐ値）が任意に設定され、工程ｇ）で算出された統計的に有意な値がより高い（より有意である、例えば、より低いＰ値）ある範囲の複数の任意の定量値が保持され、それによって、ある範囲の定量値が提供される。定量値のこの範囲は、上述したような「カットオフ」値を含む。
【００１７】
例えば、「カットオフ」値のこの特定の実施態様によれば、成績は、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルと同定された値の範囲とを比較することによって決定され得る。ある実施態様において、カットオフ値は、したがって、ある範囲の定量値、例えば、最も高い統計的に有意な値が見出される定量値（例えば、一般に、見出される最小ｐ値）を中心とする定量値からなる。例えば、１〜１０の仮定のスケールで、理想のカットオフ値（最も高い統計的に有意な値）が５であるならば、適切な（典型的な）範囲は、４〜６であり得る。それゆえ、患者は、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルを測定することによって得られた値を比較することによって評価され得、ここで、５より大きい値は、再発及び遠隔転移の増加したリスク（すなわち、予後不良）を表し、５未満の値は、再発及び遠隔転移の減少したリスク（すなわち、予後良好）を表す。別の実施態様において、患者は、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルを測定することによって得られた値を比較し、その値をあるスケールで比較することによって評価され得、ここで、４〜６の範囲を超える値は、再発及び遠隔転移の増加したリスク（すなわち、予後不良）を示し、４〜６の範囲より小さい値は、再発及び遠隔転移の減少したリスク（すなわち、予後良好）を示し、４〜６の範囲内の値は、中程度の発生（すなわち、予後）を示す。
【００１８】
典型的には、被験体がトリプルネガティブ乳癌に罹患している場合、所定の参照値は、可溶性ＣＤ９５Ｌについて、８０pg/ml又は１２０pg/mlであり得る（Malleter M, Tauzin S, Bessede A, Castellano R, Goubard A, Godey F, Leveque J, Jezequel P, Campion L, Campone M, Ducret T, Macgrogan G, Debure L, Collette Y, Vacher P, Legembre P. CD95L cell surface cleavage triggers a prometastatic signaling pathway in triple-negative breast cancer. Cancer Res. 2013 Nov 15;73(22):6711-21）。
【００１９】
本発明によれば、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルの測定は、様々な技術によって実行され得る。典型的には、本方法は、サンプルを、サンプル中の可溶性ＣＤ９５Ｌと選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させることを含み得る。いくつかの態様において、結合パートナーは、抗体（例えば、モノクローナル抗体など）又は更にアプタマーである。
【００２０】
前述のアッセイは、一般に、固体支持体へのパートナー（すなわち、抗体又はアプタマー）の結合を含む。本発明の実施において使用され得る固体支持体は、例えば、ニトロセルロース（例えば、メンブレン又はマイクロタイターウェルの形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロンメンブレン；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどの基材を含む。
【００２１】
選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルは、標準的な免疫診断技術（競合法、直接反応又はサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む）を使用することによって測定され得る。そのようなアッセイは、限定されないが、凝集試験；酵素標識及び酵素媒介イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡなど）；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動法；免疫沈降法を含む。
【００２２】
特定のタンパク質を同定するための典型的な生化学試験は、ＥＬＩＳＡ試験などの標準化された試験フォーマットを用いるが、本明細書において提供される情報は、他の生化学試験又は診断試験の開発に応用してもよく、ＥＬＩＳＡ試験の開発に限定されない（例えば、Molecular Immunology: A Textbook, edited by Atassi et al. Marcel Dekker Inc., New York and Basel 1984, for a description of ELISA tests を参照のこと）。種々の血漿構成成分に対して市販のアッセイの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットが利用可能であることが理解される。それゆえ、マイクロタイタープレートのウェルが選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）を認識する抗体セットでコーティングされている、ＥＬＩＳＡ法を使用することができる。次に、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）を含有するか又は含有する疑いのあるサンプルを、そのコーティングされたウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分な期間のインキュベーション後、プレート（単数又は複数）を洗浄して未結合部分を除去し、検出可能に標識された二次結合分子を加えることができる。二次結合分子は、任意の捕捉されたサンプルマーカータンパク質と反応することを可能にし、プレートを洗浄し、そして当技術分野において周知の方法を使用して二次結合分子の存在を検出する。
【００２３】
選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルを測定することは（イムノアッセイベースの方法を用いて又は用いずに）はまた、化合物の分離：化合物の分子量に基づいた遠心分離；質量及び電荷に基づいた電気泳動；疎水性に基づいたＨＰＬＣ；サイズに基づいたサイズ排除クロマトグラフィー；並びに使用される特定の固相に対する化合物の親和性に基づいた固相アフィニティー法を含み得る。一旦分離したら、前記の１つ又は２つのバイオマーカータンパク質が、その化合物についての公知の「分離プロファイル」（例えば、保持時間）に基づいて同定され得、標準技術を使用して測定され得る。
【００２４】
或いは、分離された化合物は、例えば、質量分析計によって検出及び測定され得る。
【００２５】
典型的には、サンプル中の免疫反応性の選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）のレベルは、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）に特異的なモノクローナル抗体を用いた、二重−抗体「サンドイッチ」技術に基づいたイムノメトリックアッセイによって測定され得る。前記実施態様によれば、選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）の発現レベルを測定するための前記手段は、例えば、ｉ）緩衝液、ｉｉ）選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）と特異的に相互作用するモノクローナル抗体、ｉｉｉ）選択されたバイオマーカー（例えば、可溶性ＣＤ９５Ｌ）に特異的な酵素コンジュゲート抗体及び選択されたバイオマーカーの所定の参照値である。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「セラミド」は、任意のＮ−アシルスフィンゴシンである。セラミドは、スフィンゴシンが脂肪酸アシル−ＣｏＡ誘導体でアシル化されてＮ−アシルスフィンゴシンが形成されているスフィンゴ脂質を含む。セラミドは、天然起源であっても、化学合成されたものであってもよい。したがって、用語「Ｃ１６−セラミド」又は「Ｃ１６：０  セラミド」は、Ｎ−パルミトイル−Ｄ−スフィンゴシンを指す。
【００２７】
本明細書において使用される場合、用語「スフィンゴミエリン」は、ホスホコリン基にコンジュゲートされた任意のＮ−アシルスフィンゴシンを表し、ホスホコリン基はスフィンゴミエリン（Ｎ−アシルスフィンゴシルホスフォリルコリン）の極性頭部基を形成する。スフィンゴシンの第一級アミノ基に結合しているアシル鎖は、飽和であっても不飽和であっても、分岐であっても非分岐であってもよい。１つの実施態様において、アシル鎖は、１２〜２４個の炭素原子（Ｃ１２−Ｃ２４）、時には１４〜２０個の炭素原子を含む。したがって、用語「Ｃ１６−スフィンゴミエリン」又は「Ｃ１６：０  スフィンゴミエリン」は、１６個の炭素のアシル鎖を有するスフィンゴミエリンを指す。Ｃ１６−スフィンゴミエリンは、典型的には、合成又は半合成又は天然起源のＣ１６−スフィンゴミエリンである。
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「グリコスフィンゴリピド」は、オリゴ糖基にコンジュゲートされた任意のＮ−アシルスフィンゴシンを表し、オリゴ糖基はグリコスフィンゴリピドの極性頭部基を形成する。スフィンゴシンの第一級アミノ基に結合しているアシル鎖は、飽和であっても不飽和であっても、分岐であっても非分岐であってもよい。１つの実施態様において、アシル鎖は、１２〜２４個の炭素原子（Ｃ１２−Ｃ２４）を含む。したがって、用語「Ｃ１６−グリコスフィンゴリピド」又は「Ｃ１６：０  グリコスフィンゴリピド」は、１６個の炭素のアシル鎖を有するグリコスフィンゴリピドを指す。Ｃ１６−グリコスフィンゴリピドは、典型的には、合成又は半合成又は天然起源のＣ１６−グリコスフィンゴリピドである。
【００２９】
典型的には、本発明に係るＣ１６−セラミド又は誘導体（Ｃ−１６−スフィンゴミエリン又はＣ１６−グリコスフィンゴリピドなど）は、医薬組成物の形態で投与される。したがって、本発明の別の局面は、１つ以上の賦形剤（添加剤及び／又は希釈剤を含む）と共に製剤化された治療有効量のＣ１６−セラミドを含む医薬組成物を提供する。語句「薬学的に許容し得る」は、本明細書においては、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合いながらも、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を伴うことなく、被験体の組織と接触させて使用するのに適した化合物、物質、組成物及び／又は剤形を指すために用いられる。典型的には、医薬組成物は、固体又は液体形態での投与のために特に製剤化され得、以下のために適合されたものを含む：（１）全身又は局所的な経口投与、例えば、飲薬（水性若しくは非水性液剤又は懸濁剤）、錠剤、ボーラス剤、粉剤、顆粒剤、ペースト剤又はフィルム剤；（２）非経口投与（例えば、皮下、腹腔内、筋肉内又は静脈内注射による）、例えば、無菌液剤又は懸濁剤として；（３）局所塗布（例えば、皮膚に塗布されるクリーム剤、軟膏又はスプレー剤として）；又は（４）膣内又は直腸内、例えば、ペッサリー剤、クリーム剤又はフォーム剤として。
【００３０】
いくつかの実施態様において、Ｃ１６−セラミド、Ｃ１６−スフィンゴミエリン又はＣ１６−グリコスフィンゴリピドは、リポソームベシクル中に封入される。リポソーム及び他の粒子状担体（特に、セラミドが含まれる）の製剤の例は、本明細書の実施例及び米国特許出願公開第2005/0025820号明細書に記載されている。更なる例は、Stover T et al., J Pharmacol Exp Ther., 2003, 307:468-475; 及びStover T C, et al., Clin Cancer Res., 2005, 11 :3465-3474 に記載されている。本発明に係る方法において使用されるリポソームは、典型的には、約１ナノメートル〜約１ミクロンを含めた範囲の粒径（直径）を有する。約１〜１００ナノメートルを含めた範囲の粒径（直径）を有するナノサイズのリポソームが好ましい。リポソームナノ担体が使用される実施態様において、リポソームは、ある内容積を画定する脂質含有壁を有する。更なる粒子状担体は、Ｃ１６−セラミド、Ｃ１６−スフィンゴミエリン又はＣ１６−グリコスフィンゴリピドを送達するのに好適な他のナノ担体を含み、限定されないが、ナノスフェア、ナノデンドリマー、ナノコロイド、ナノドット、ナノカラム及びこれらの組み合わせを含む。リポソーム並びにそれらの調製及び使用に関する方法の更なる記載は、Liposomes: A Practical Approach (The Practical Approach Series, 264), V. P. Torchilin and V. Weissig (Eds.), Oxford University Press; 2nd ed., 2003 に見出され得る。ナノ担体の更なる記載は、S. M. Moghimi et al., Nanomedicine: current status and future prospects, FASEB J. 2005, 19, 311-30 に見出され得る。
【００３１】
語句「治療有効量」は、本明細書において使用される場合、癌細胞の運動性を遮断することによっていくつかの所望の治療効果を生み出すのに効果的な、Ｃ−１６セラミド、Ｃ１６−スフィンゴミエリン又はＣ１６−グリコスフィンゴリピドの量を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の総一日投薬量は、担当医によって正しい医学的判断の範囲内で決定されることが理解される。任意の特定の被験体についての具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物、被験体の年齢、体重、総合的な健康状態、性別及び食事；投与の期間、投与の経路及び用いられる具体的な化合物の排泄速度；処置の持続期間；用いられる具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野において周知の類似の要因を含む様々な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始すること、そして所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、十分に当技術分野の技能の範囲内である。しかしながら、製品の一日投薬量は、成人一人当たり０．０１〜１，０００mg/日の広い範囲にわたって変化し得る。好ましくは、組成物は、処置されるべき被験体に対する投薬量の対症的調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの有効成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの有効成分、好ましくは１mg〜約１００mgの有効成分を含有する。薬物の有効量は、通常、一日当たり０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重、とりわけ一日当たり約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重の投薬量レベルで供給される。
【００３２】
本発明の更なる局面は、被験体から得られた腫瘍組織サンプル中にＥＭＴが生じるか否かを決定するための方法であって、ｉ）腫瘍組織サンプル中のＣｅｒＳ６又はＣ−１６セラミドの発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルと所定の参照値とを比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルが所定の参照値よりも低い場合に、腫瘍組織サンプル中にＥＭＴが生じると結論付ける工程を決定することを含む方法に関する。
【００３３】
組織サンプル中のＣ−１６セラミドのレベルの決定は、当技術分野において周知の任意の方法によって決定され得る。典型的には、当該方法は、サンプルを、腫瘍組織サンプル中のＣ−１６セラミドと選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させることを含み得る。いくつかの局面において、結合パートナーは、抗体（例えば、モノクローナル抗体など）又は更にアプタマーである。或いは、クロマトグラフ法（例えば、ＨＰＬＣ）又は分光分析法（ＩＦＲ、質量分析法）もまた使用され得る。
【００３４】
ＣｅｒＳ６の発現レベルの決定は、様々な技術によって実行され得る。典型的には、本決定は、サンプルを、プローブ、プライマー又はリガンドなどの選択試薬と接触させることを含み、それによって、サンプル中に元々存在する目的の核酸又はタンパク質（すなわち、ＣｅｒＳ６）の存在を検出するか又はその量を測定する。
【００３５】
特定の実施態様において、ＣｅｒＳ６の発現レベルは、被験体から得られた腫瘍組織サンプル中のｍＲＮＡの量を決定することによって行われ得る。
【００３６】
ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、サンプル（例えば、被験体から調製された細胞又は組織）中に含有される核酸は、最初に、例えば溶菌酵素若しくは化学溶液を使用した標準的な方法に従って抽出されるか、又は製造業者の指示書に従って核酸結合樹脂によって抽出される。抽出されたｍＲＮＡは、次いで、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット解析）及び／又は増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出される。特定の実施態様において、ＣｅｒＳ６の発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、典型的には定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲ、更により典型的にはリアルタイム定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。増幅の他の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅法（ＴＭＡ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）及び核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）を含む。
【００３７】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有しかつ本明細書の目的のｍＲＮＡに配列相補性又は相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとしての有用性が見出される。そのような核酸は、同一である必要はないが、典型的には、相当するサイズの相同領域に少なくとも約８０％同一、より典型的には８５％同一、更により典型的には９０〜９５％同一であることが理解される。特定の実施態様において、ハイブリダイゼーションを検出するための適切な手段（検出可能ラベルなど）と組み合わせて核酸を使用することが有利である。蛍光、放射性、酵素又は他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）を含む多種多様な適切な指標が当技術分野において公知である。
【００３８】
プローブは、典型的には、１０〜１０００、例えば１０〜８００、より典型的には１５〜７００、典型的には２０〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅されるべき目的の核酸と完璧に又はほぼ完璧にマッチするように設計された、１０〜２５ヌクレオチド長のより短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、ハイブリダイズする核酸に「特異的」であり、すなわち、これらは、典型的には、高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（最も高い融解温度Ｔｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣに対応する。ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン酸Ｎａである）下でハイブリダイズする。
【００３９】
上の増幅及び検出法において使用される核酸プライマー又はプローブは、キットとして組み立てられ得る。そのようなキットは、コンセンサスプライマー及び分子プローブを含む。好ましいキットはまた、増幅が生じたか否かを決定するのに必要な構成要素を含む。キットはまた、例えば、ＰＣＲ緩衝液及び酵素；陽性対照配列、反応コントロールプライマー；並びに特異的な配列を増幅及び検出するための指示書を含む。
【００４０】
特定の実施態様において、発現レベルは、組織サンプル中のＣｅｒＳ６タンパク質の量を決定することによって決定され得る。特定の実施態様において、本発明の方法は、腫瘍組織サンプルを、腫瘍組織サンプル中に存在するＣｅｒＳ６タンパク質と選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させることを含む。結合パートナーは、ポリクローナル又はモノクローナル、典型的にはモノクローナルであり得る抗体であり得る。別の実施態様において、結合パートナーは、アプタマーであり得る。前記実施態様において、ＣｅｒＳ６の発現レベルを決定するために、当技術分野において周知の免疫化学法を使用することができる。
【００４１】
本発明の１つの実施態様において、所定の参照値は、ＥＭＴが生じなかった対照組織サンプル中の本発明のＣｅｒＳ６又はＣ１６−セラミドのレベルから導出される。更に、これらの所定の参照値を確立する際に、適切に保存された腫瘍組織サンプル中のＣｅｒＳ６又はＣ１６−セラミドのレベルのレトロスペクティブ測定が使用され得る。
【００４２】
いくつかの実施態様において、一旦腫瘍組織サンプル中でＥＭＴが生じることが結論付けられたら、被験体中の転移性播種を予防又は低減するために、上述したような治療有効量のＣ−１６−セラミド、Ｃ−１６−スフィンゴミエリン又はＣ１６−グリコスフィンゴリピドが被験体に投与される。
【００４３】
本発明を、以下の図面及び実施例によって更に説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４４】
材料及び方法
細胞株
血液細胞系統由来のヒト細胞株（Jurkat、ＣＥＭ、Ｈ９、ＨＬ６０、ＳＫＷ６．４、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ４、ＳＲ）を、５％ＣＯ２インキュベーター内、８％（v/v）熱不活化（heat-inactivated）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２mM Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ中、３７℃で培養した。他の癌細胞株全てを、５％ＣＯ２インキュベーター内、８％（v/v）熱不活化ＦＣＳ及び２mM Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中、３７℃で培養した。ヒト腫瘍細胞株のＮＣＩ−６０コレクションは、Charles River Laboratories（Wilmington, MA, USA）から得た。他の細胞は、American Type Culture Collection（LGC Standards, Molsheim, France）から購入した。ヒト白血病Ｔ細胞株Jurkat及びＣＥＭ、リンパ腫Ｔ細胞株Ｈ９、前骨髄球細胞株ＨＬ６０、並びにヒトＢリンパ芽球細胞株ＳＫＷ６．４を、５％ＣＯ２インキュベーター内、８％（v/v）熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２mM Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ中、３７℃で培養した。ヒト乳癌細胞株ｈｓ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ−７５−１及びＭＣＦ７、並びにヒト腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−１、ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６及びヒトグリオーマ細胞株Ｕ２５１を、５％ＣＯ２インキュベーター内、８％（v/v）熱不活化ＦＣＳ及び２mM Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中、３７℃で培養した。全ての細胞は、American Type Culture Collection（LGC Standards, Molsheim, France）から購入した。ヒト乳腺上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａは、自然に不死化するが、形質転換しない。ＬＸＳＮ−Ｋ−ＲａｓＶ１２又は空のベクターを感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞は、Dr. B.H. Park（Baltimore, MD, USA）の好意により提供された１６。ＭＣＦ１０Ａ細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、５％ウマ血清、ＥＧＦ（２０ng/mL）、インスリン（１０μg/mL）、コレラトキシン（１００ng/mL）及びヒドロコルチゾン（０．５μg/mL）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃で増殖させた。ｈＴＥＲＴ、Ｒａｓ及びＡｇＴを担持するレトロウイルスを感染させたＨＭＥＣは、Dr R.A. Weinberg（Cambridge, MA, USA）の好意により提供された４。ｈＴＥＲＴ及びＲａｓによって不死化されたＨＭＥＣをＨＭＥＣ−ＴＲと名付けた。
【００４５】
インビトロ運動性アッセイ
ボイデンチャンバーは、８μmの細孔径を有する膜（Millipore, Molsheim, France）を含有した。膜の水和後、間葉細胞（チャンバー当たり１０５個の細胞）又は上皮細胞（チャンバー当たり３×１０５個の細胞）を、低血清（１％）含有培地中の上部チャンバーに加えた。底部チャンバーを、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ（１００ng/mL）の存在下又は非存在下の低血清（１％）含有培地で満たした。細胞を３７℃で２４時間培養した。遊走を定量化するために、綿棒を使用して膜の上側から細胞を機械的に取り除き、反対側からの遊走細胞をメタノールで固定してギムザ染色した。各実験について、各インサートについて５つの代表写真を撮り、次いで、細胞を溶解して、ギムザ染色の量に相関する５６０nmにおける吸光度を測定した。
【００４６】
ＥＰＲ
以前に記載されている２７ようなＥＰＲを使用したスピン標識法によって膜流動性を決定した。簡潔に述べると、生細胞の原形質膜を、１２−ドキシルステアリン酸（Ｃ−１２位に安定なニトロオキシドラジカル環を有する脂肪酸）（３６μg/mL）を用いて、３７℃で１５分間インキュベートすることによって標識した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、過剰の１２−ドキシルステアリン酸を除去し、周囲温度にて、中心視野３５０９．２５Ｇ、マイクロ波パワー２０mW、マイクロ波周波数９．８６GHz、振幅変調１．７７Ｇ及び変調周波数１００kHzで動作させたBruker Elexsys EPR分光計で、標識したサンプルのＥＰＲスペクトルを取得した。Ｓパラメーターを算出することによってスピン標識した膜の流動性を定量化した。Ｓパラメーターの増加は、膜流動性の減少を反映する（その逆もまた同様）。
【００４７】
イムノブロッテング
細胞を、溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤の混合物を補充した、２５mM ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１％（v/v）Triton X-100、１５０mM ＮａＣｌ及び２mM ＥＧＴＡ）中、４℃で３０分間溶解した。ビシンコニン酸法（Pierce, Rockford, IL, USA）によって製造業者のプロトコールに従ってタンパク質濃度を決定した。タンパク質を８、１０又は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、ニトロセルロース膜（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK）に転写した。５％（w/v）乾燥スキムミルクを含有するＴＢＳＴ（５０mM Tris、１６０mM ＮａＣｌ及び０．０５％（v/v）Tween 20、ｐＨ７．４）（ＴＢＳＴＭ）で膜を１５分間ブロッキングし、次いで、ＴＢＳＴＭで希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ（CliniSciences, Nanterre, France）と共に４５分間インキュベートした。増強化学発光基質キット（ECL RevelBlOt（登録商標）, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France）を使用してタンパク質を可視化した。
【００４８】
結果
ＥＭＴ及びｃｌ−ＣＤ９５Ｌ誘導性の細胞遊走は、増加した膜流動性と相関する
細胞毒性ＣＤ９５Ｌに異なって応答する様々な組織学的起源の２２個の腫瘍細胞株［National Cancer Institute (NCI)］のトランスクリプトミクス解析を使用して、本発明者らは、以前に、Ｉ型細胞は間葉様表現型を示すが、ＩＩ型細胞は上皮様遺伝子特徴を有することを実証した１。Ｃｌ−ＣＤ９５Ｌは、細胞死を誘導しないが細胞運動性のトリガーとなる３４。それゆえ、本発明者らは、ＣＤ９５駆動性の前遊走性刺激（pro-migratory cue）に対する腫瘍細胞の応答をＥＭＴが調節するか否かを調査した。ボイデンチャンバーアッセイを使用して、様々な間葉及び上皮様乳癌細胞で、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌの存在下又は非存在下の細胞運動性を評価した。間葉様細胞は、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌの非存在下で、自然に細孔含有膜を通過して遊走したが、上皮細胞は遊走しなかった。加えて、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ処理は、間葉細胞の遊走を増加させたが、上皮細胞の遊走は増加しなかった。これは、ＣＤ９５媒介性の細胞遊走が後者の細胞で遮断されること及び／又は前者の細胞で促進されることを示唆している。
【００４９】
増加した膜流動性は、腫瘍細胞の浸潤／運動性を促進することができる２２、３０、３３、３９。それゆえ、本発明者らは、次に、多数の一連の腫瘍細胞株の膜脂質パッキング密度を評価した。このために、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）を使用して、膜流動性と逆相関する生物物理パラメーターであるＳパラメーターを定量化した２。Ｓパラメーターは、間葉腫瘍細胞よりも上皮腫瘍細胞で高かった（０．４９６±０．００８８、ｎ＝１７ 対 ０．４６７±０．０２１５、ｎ＝２０、ｐ≦０．００１）が、このことはＥＭＴが膜流動化を導いたことを示している。これを確認すると、Ｓパラメーターは、間葉乳癌細胞よりも上皮乳癌細胞で高かった（０．４７６±０．００６９、ｎ＝６ 対 ０．４６４±０．００４３、ｎ＝６、ｐ＝０．００４３）。加えて、間葉様ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍細胞の膜流動性は、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ処理後に増加した。細胞遊走における原形質膜流動性の役割を決定するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、非細胞毒性用量の膜安定化剤ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）１７又はシクロプロピル脂肪酸エステルＡ２Ｃ（原形質膜を流動化する化合物）３５で前処理した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＵＤＣＡとのプレインキュベーションは、基底膜流動性を顕著ではないがわずかに減少させた。しかしながら、この処理は、原形質膜流動性のＣＤ９５媒介性の増加を無効にした。対照的に、Ａ２Ｃ処理は、基底及びＣＤ９５媒介性の細胞膜流動性の両方を有意に増強した。重要なことに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＣＤ９５媒介性遊走は、ＵＤＣＡ処理によって完全に無効化されたが、Ａ２Ｃ処理によって刺激された。まとめると、これらのデータは、ＥＭＴの間に原形質膜流動性が増加すること、並びにこの生物物理パラメーターがＥＭＴ駆動性及びＣＤ９５媒介性の細胞運動性の両方において極めて重要な機能を有することを示している。
【００５０】
ＥＭＴは、ＣｅｒＳ６のダウンレギュレーションをトリガーする
コレステロール及びＳＬは、原形質膜流動性及び圧密化に関与する。それゆえ、本発明者らは、次に、これらの脂質の生合成に関与する酵素がＥＭＴの間にアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされるか否かを調査した。このために、２２個の腫瘍細胞株のデータを使用してトランスクリプトミクスメタ解析を実施した。これらの細胞株は、上皮様又は間葉様であり２５、そして、ＣＤ９５媒介性アポトーシスシグナルに対する感受性に基づいてそれぞれＩＩ型及びＩ型として以前に分類された１。データを、NCBI Gene Expression Omnibus repository から抽出した。ＳＡＭツール（マイクロアレイの有意性解析）を使用して、ＩＩ型細胞において有意にアップレギュレーションされた１６８個の遺伝子及びＩ型細胞において有意にアップレギュレーションされた５４２個の遺伝子を同定した。更なる解析は、ＣｅｒＳ６（ＬＡＳＳ６としても知られている）の発現が間葉様（Ｉ型）細胞よりも上皮様（ＩＩ型）細胞において有意に高かったことを明らかにした。次に、このインシリコ解析は、ｍＲＮＡで実験的に検証された。このセラミド合成酵素が腫瘍細胞のアポトーシス誘導物質への応答様式にのみ関連したという可能性を排除するために、本発明者らは、次に、上皮又は間葉様遺伝子特徴を示すＮＣＩ細胞株間でＣｅｒＳ６が異なって発現したか否かを評価した２６。Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）（上皮マーカー）及びビメンチン（間葉マーカー）の発現レベルに従って上皮又は間葉様細胞として分類された腫瘍細胞株で実施したインシリコ解析は、ＣｅｒＳ６転写産物のレベルが、間葉様癌細胞において、上皮様遺伝子特徴を示すそれらの対応物と比較して低下したことを確認した。ＥＭＴの間にＣｅｒＳ６発現がダウンレギュレーションされたことを確認するために、本発明者らは、最初に、上皮又は間葉様表現型を示すことが以前に報告されている２４４７個のＮＣＩ−６０腫瘍細胞株において２つのＥＭＴマーカー（すなわち、Ｅ−カドヘリン及びビメンチン）のタンパク質発現レベルを評価した。本発明者らは、これらの腫瘍細胞を、それらのＥ−カドヘリン／ビメンチン比に基づいて３つのグループ：ｉ）高いＥ−カドヘリン発現を伴う上皮グループ、ｉｉ）２つのマーカーを等しく発現したか又はそれらを発現しなかったかのいずれかである未確定グループ、並びにｉｉｉ）高いビメンチン発現を伴う間葉グループにランク分けした。本発明者らの分類をPeterのグループ２４の分類と比較した場合に僅かな相違が見出された。実際に、試験した４７個の腫瘍細胞株の中で、５つ（ＯＳＣＡＲ−５、ＰＣ３、ＳＷ６２０、ＳＲ及びＩＧＲＯＶ−１）だけが２つの研究間で分類の相違を示した。ＣｅｒＳ６のタンパク質発現レベルは、間葉腫瘍細胞と比較して、上皮細胞において有意に増加した。これは、ＣｅｒＳ６が、新規のＥＭＴでレギュレーションされた遺伝子であり、上皮細胞におけるその発現が原形質膜のＳＬ組成を変化させ得ることを示唆している。
【００５１】
ＣｅｒＳ６発現がＥＭＴの間にレギュレーションされたことを確認するために、ＣｅｒＳ６発現のレベルを様々な十分に確立されたＥＭＴモデルで評価した。連続的なレトロウイルス感染を受けて、テロメラーゼ触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）、ＳＶ４０のＴ（大）及びｔ（小）抗原、並びにＨ−Ｒａｓの発癌性対立遺伝子（Ｈ−ＲａｓＶ１２）を発現しており、それによって浸潤性腫瘍細胞へと変換された、初代ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を使用した４、８。上皮（Ｅ−カドヘリン）又は間葉様（ビメンチン）遺伝子特徴を示す乳腺細胞を生じるこの段階的なＥＭＴ細胞モデル系は、ＣｅｒＳ６発現がＥＭＴの間に消滅したことを確認した。これを確認するために、不死のヒト乳腺上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａ及びそのＫ−ＲａｓＶ１２発現対応物でＣｅｒＳ６発現を評価した。ＭＣＦ１０Ａ細胞よりもＭＣＦ１０Ａ−Ｋ−ＲａｓＶ１２細胞において、間葉マーカーのＮ−カドヘリン（ＣＤＨ−２）の発現がより高くかつ上皮マーカーのＥ−カドヘリンの発現がより低かったが、これはＥＭＴを受けた先の細胞と一致した１９。興味深いことに、Ｋ−ＲａｓＶ１２発現によってトリガーされたＥＭＴは、ＣｅｒＳ６のタンパク質レベルの減少を伴った。ＴＧＦ−βによる刺激は、ＭＣＦ１０Ａ及びＨＭＥＣ−ＴＲ乳房上皮細胞にＥＭＴをトリガーすることができる１１。この誘導性ＥＭＴモデルを使用して、ＣｅｒＳ６発現がＥＭＴの間に一貫して低下することを証明した。
【００５２】
乳癌は、腫瘍がゲノム及び臨床的特徴に基づいて様々なサブタイプに分類されている、異種性病理である３１。管腔Ａ型及びＢ型の腫瘍は、Ｅ−カドヘリンなどの上皮マーカーを発現するが、基底様癌細胞は、間葉様表現型を有し、ビメンチン及びＮ−カドヘリンなどのマーカーを発現する２６。重要なことに、予後は、管腔乳房腫瘍を有する患者よりも基底乳房腫瘍を有する患者において不良であり、そして、ＥＭＴは、これらの患者において腫瘍浸潤性及び転移性播種のリスク増加と関連している２６。bc-GenExMinerツール１３を使用した乳癌患者のメタ解析は、ＣｅｒＳ６発現が管腔腫瘍よりも基底腫瘍において低いことを示した。概して、これらのデータは、ＣｅｒＳ６発現がＥＭＴを受けた腫瘍細胞においてダウンレギュレーションされることを強く支持している。
【００５３】
間葉腫瘍細胞中のＣｅｒＳ６の過剰発現は、膜流動性を減少させ、細胞運動性を阻害する
ＥＭＴの間のＣｅｒＳ６の細胞機能を特徴付けるために、２つの間葉乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８においてＣｅｒＳ６を過剰発現させた。ＣｅｒＳ６をコードするレトロウイルスベクターを用いたこれらの細胞の形質導入は、ＣｅｒＳ６を過剰発現する安定な細胞集団を産生した。印象的なことに、ＣｅｒＳ６過剰発現は、間葉マーカービメンチン又は上皮マーカーＥ−カドヘリンの発現レベルを変化させなかったが、このことはＥＭＴがＣｅｒＳ６発現を制御したが、その逆はそうではなかったことを示唆している。ガスクロマトグラフィー及び質量分析法を使用したリピドミック解析は、ＣｅｒＳ６過剰発現が両方の細胞株のＣ１６−セラミド含量を有意に増加させたことを示した。しかしながら、この増加は総セラミド含量を変化させず、このことは、総セラミド含量がＣｅｒＳ６過剰発現細胞において変化しなかったことを保証するように、補償プロセスが機能したことを示唆している。ＣｅｒＳ６発現のモジュレーションは、グリセロリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む）の生合成に必要であるアシル−ＣｏＡプールに影響を与える。それゆえ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞及びそれらのＣｅｒＳ６過剰発現対応物においてこれらの脂質のレベルを評価した。ＣｅｒＳ６過剰発現は、グリセロリン脂質含量に有意に影響を与えなかった。セラミドは、主要な原形質膜ＳＬであるスフィンゴミエリンに代謝され得る。それゆえ、スフィンゴミエリン含量もモニタリングした。ＣｅｒＳ６過剰発現は、スフィンゴミエリンの総量に影響を与えなかったが、Ｃ１６−スフィンゴミエリンのレベルは、対照細胞よりもＣｅｒＳ６過剰発現細胞において有意に高かった。これらの知見は、ＣｅｒＳ６過剰発現がＣ１６：０セラミドの蓄積を導き、これがＣ１６：０スフィンゴミエリンなどのより複雑なＳＬに代謝されることを示す。ＣｅｒＳ６過剰発現は、基底膜流動性をわずかにではあるが有意に低下させ、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌ誘導性の膜流動化を防止した。加えて、これらの間葉様乳癌細胞におけるＣｅｒＳ６過剰発現は、基底細胞運動性を低下させ、ＣＤ９５媒介性の細胞運動性を阻害した。これらの知見は、間葉様腫瘍細胞における異所性ＣｅｒＳ６発現がＣ１６：０セラミド及びその誘導体Ｃ１６：０スフィンゴミエリンのレベルを増加させ、これが次いで、膜流動性を低下させ、細胞運動性を阻害することを示している。
【００５４】
上皮腫瘍細胞におけるＣｅｒＳ６のダウンレギュレーションは、膜流動性を増強させ、細胞遊走を刺激する
ＣｅｒＳ６が膜流動性及び細胞運動性を低下させることを確認するために、薬理学的阻害剤を使用して上皮様乳癌細胞におけるＣｅｒＳ６活性を乱し、原形質膜流動性及び細胞遊走に与えるこの効果を決定した。フモニシンＢ１（ＦＢ１）（Fusarium moniliformeによって産生されるマイコトキシン）は、ＣｅｒＳ活性を選択的に阻害する３６。上皮細胞株ＭＣＦ７を非細胞毒性濃度のＦＢ１で４８時間処理した場合、基底及びＣＤ９５誘導性の膜流動性はわずかにではあるが有意に増加した。加えて、ＦＢ１処理は、基底及びＣＤ９５媒介性の細胞遊走を増強した。これらのデータを確認するために、２つの上皮乳癌細胞ＭＣＦ７及びＴ４７ＤにおいてＣｅｒＳ６発現をダウンレギュレーションした。これらの細胞を、ＧＦＰとＣｅｒＳ６ ｍＲＮＡの異なる領域をターゲットとするｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｅｒＳ６）を同時にコードするレンチウイルスで形質導入した。全てのＭＣＦ７細胞及びＴ４７Ｄ細胞の８０％超を感染させた（ＧＦＰ陽性）。ＦＡＣＳ解析と一致して、いずれかのｓｈＣｅｒＳ６を含有するレンチウイルスで形質導入した後に、ＣｅｒＳ６発現は、ＭＣＦ７細胞において効率的にサイレンシングされ、Ｔ４７Ｄ細胞においてはその程度はより小さかった。更に、ＣｅｒＳ６発現の低下は、Ｅ−カドヘリン及びビメンチンを含むＥＭＴ関連ターゲット遺伝子の発現に影響を与えなかったが、このことは、ＣｅｒＳ６がＥＭＴマスター調節遺伝子でないことを立証する。
【００５５】
リピドミック解析は、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ細胞におけるＣｅｒＳ６発現のダウンレギュレーションがそれらの総セラミド含量を変化させなかったが、Ｃ１６：０セラミドのレベルが有意に低下したことを示した。対照的に、ＣｅｒＳ６発現のダウンレギュレーションは、細胞株に応じて、Ｃ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２４：０又はＣ２４：１セラミドのレベルのわずかな増加と関連した。ＣｅｒＳ６ノックダウンは、これらの上皮癌細胞において、基底及びＣＤ９５媒介性の原形質膜流動性及び細胞遊走を増加させた。注目すべきは、ｃｌ−ＣＤ９５Ｌの前遊走性効果は、ｓｈＣｅｒＳ６処理Ｔ４７Ｄ細胞よりもｓｈＣｅｒＳ６処理ＭＣＦ７細胞において顕著でなかった。これは、ＣｅｒＳ６発現がＴ４７Ｄ細胞よりもＭＣＦ７細胞においてよりダウンレギュレーションされたためであり得、これは、ＣＤ９５誘導細胞運動性を部分的にマスクし得る、ＭＣＦ７細胞の基底運動性の劇的な増加を導いた。概して、これらの知見は、上皮様腫瘍細胞におけるＣｅｒＳ６発現のダウンレギュレーションがＥＭＴに影響を与えることなく細胞遊走を増強させることを実証する。
【００５６】
Ｃ１６−セラミド（ＣｅｒＳ６の産物）は、膜流動性及び細胞遊走を低下させる
最後に、ＣｅｒＳ６過剰発現が細胞膜圧密化を誘導し、それによって細胞遊走を阻害したことを示すために、本発明者らは、その主要脂質産物Ｃ１６−セラミドの影響を評価した。このために、２つの間葉乳癌細胞を、非細胞毒性濃度のＣ１６：０セラミドと２４時間インキュベートし、膜流動性及び細胞運動性を解析した。Ｃ１６：０セラミドの添加は、これらの細胞株において基底のＳパラメーターをわずかに増加させたが（図１Ａ）、膜流動化のＣＤ９５媒介性の増加を完全に阻害した（図１Ａ）。より重要なことに、非細胞毒性濃度のＣ１６−セラミドを含有する培地中で培養した場合に、間葉乳房腫瘍細胞の基底及びＣＤ９５媒介性遊走が悪化した（図１Ｂ）。これらの結果は、外因性Ｃ１６−セラミドが細胞膜に吸着及び保持されることを示し、そしてＣｅｒＳ６過剰発現時に観察されるＣ１６−セラミドの増加したレベルがＣＤ９５媒介性の膜流動化及び細胞遊走の抑制に資することを立証する。
【００５７】
考察：
ＥＭＴは、胚発生における重大なプロセスであり、発癌において部分的に表現型模写され、増加した転移能を有する浸潤性腫瘍を生じ得る。本研究では、本発明者らは、ＥＭＴの間にＣｅｒＳ６発現がダウンレギュレーションされ、増加した原形質膜流動性を導き、これが次いで、細胞遊走を促進することを実証する。
【００５８】
ＥＭＴを受けた細胞は、形態変化及び増加した運動性を示し、これはＥ−カドヘリンなどの上皮マーカーの発現の著しい低下、並びにビメンチン及びＮ−カドヘリンなどの間葉マーカーの増強された発現に関連する。薬理学的及び遺伝学的アプローチを使用して、本発明者らは、ＣｅｒＳ６発現のレベルがＥＭＴ自体に影響を与えないことを示した。これは、グルコシルセラミド合成酵素の薬理学的阻害又はその産物の１つガングリオテトラオシルセラミド（Ｇｇ４）の添加が、細胞運動性をモジュレートし、上皮乳癌細胞株ＭＣＦ−７を含む様々な細胞モデルにおけるＥＭＴ関連遺伝子の発現比率を変化させることを示したHakomoriグループのデータと一致しないようである６。この不一致についての１つの説明は、Ｇｇ４の炭水化物部分の複雑性が、他の未確定分子ターゲットをターゲットとし、それによってＣ１６−セラミド及びＣ１６−スフィンゴミエリンに比べてＥＭＴに対して追加効果を発揮することを可能にすることである。この仮説を支持して、ガングリオシドＧＭ２（その発現はまた、グルコシルセラミド合成酵素活性の阻害によって減少される）は、ＮＭｕＭＧ細胞のＴＧＦ−β誘導ＥＭＴを反転させないが、Ｇｇ４は反転する６。炭水化物部分に加えて、本発明者らの知見は、細胞運動性などの生物的機能においてセラミド及びその誘導体のＣ１６：０脂肪酸鎖が果たす極めて重要な役割についての見識を提供する。
【００５９】
Okazaki及び同僚は、最近、スフィンゴミエリンがＣＸＣＬ１２媒介性の細胞遊走を悪化させることを示した３。今回の研究は、ＣｅｒＳ６過剰発現がＣ１６：０スフィンゴミエリン含量の増加と関連することを示し、それゆえ、本発明者らは、観察された表現型にスフィンゴミエリンが寄与する可能性を排除することができない。しかしながら、ＣＤ９５媒介性の膜流動化及び細胞遊走が、外因性Ｃ１６−セラミドとの短期間（６０分間）のプレインキュベーションによって阻害されると考えれば、Ｃ１６−セラミドそれ自体がＥＭＴの間の膜流動性及び細胞運動性のモジュレーションに寄与するようである。
【００６０】
グリコスフィンゴリピド（ＧＳＬ）は、チロシンキナーゼ受容体９、２１、より具体的には上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体９の活性を調節することによって、様々な細胞シグナル伝達経路をモジュレートする。ｃｌ−ＣＤ９５Ｌが、ＥＧＦ受容体の動員を介した間葉乳房腫瘍細胞におけるホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）誘発性の前遊走性シグナル伝達経路を誘導することを示すという、本発明者らの最近の知見に基づいて１８、本発明者らは、Ｃ１６−セラミドがこのシグナル伝達経路を防止することができるか否かを調査した。ＰＩ３Ｋ活性の特徴であるＡｋｔのセリン４７３におけるリン酸化の解析は、Ｃ１６−セラミドがＣＤ９５媒介性ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路に影響を与えなかったことを実証した。これは、Ｃ１６−セラミドが前遊走性ＣＤ９５媒介細胞シグナル伝達の初期段階に干渉しないことを示す。ＣＤ９５Ｌと原形質膜流動化との間のメカニズム的な関連性は、不明確なままであり、更なる調査が必要である。
【００６１】
Ｃ２−セラミドなどの外因性短鎖セラミドは、プロテインホスファターゼ２Ａの活性化を介してニコチンに応答して肺癌細胞の遊走を阻害する３８。この以前の研究は、Ｃ２−セラミドが細胞遊走に直接影響を与えることを示唆した。しかしながら、著者は、肺細胞の脂質二重層に蓄積するＣ２−セラミドが酸セラミダーゼによって加水分解されて、スフィンゴシンを形成し、これがサルベージ経路に侵入して、ＣｅｒＳ６などのＣｅｒＳの活性を介して新たなセラミドを形成する可能性を排除しなかった。この点で、ニコチンに曝露された肺上皮細胞中のＣｅｒＳ６の活性を調査することは興味深いだろう。
【００６２】
ＣｅｒＳ６発現は、上皮又は間葉様遺伝子特徴を有する様々な癌細胞株において、十分に確定された誘導性ＥＭＴモデルにおいて、また上皮及び間葉様遺伝子特徴を示す管腔又は基底乳癌に罹患している多数の女性において、それぞれモジュレートされた２６。したがって、本発明者らは、ＣｅｒＳ６が発現されない浸潤性基底乳癌を有する女性において、Ｃ１６−セラミド及びその誘導体のレベルのわずかな増加が転移性播種の増大したリスクを低下させる助けとなり得ることを予測する。
【００６３】
参考文献：
本出願を通して、種々の参考文献が、本発明が属する技術状況を記載している。これらの参考文献の開示は、参照によって本開示に援用される。
【００６４】
【表１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【国際調査報告】
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