(57)【要約】  悪影響または有害な影響を及ぼす可能性のある配列変異体を決定し、かつ臨床的有意性が未知または不確かな変異体をＶＵＳ状態から良性、病原性、または有利な状態に分類できるように、メタボロミクスとコンピューター技術とを組み合わせて用いる方法が記載されている。たとえば、ゲノムシーケンス解析に基づく個別化医療を促進するためのメタボロミクスの使用方法が記載されている。遺伝的変異体の有意性を決定し（または決定を支援し）、かつ個別化医療に使用するための診断的変異体（健康に有害な影響を及ぼす変異体）の同定を可能にするための代謝プロファイルの使用が記載されている。さらに、患者の健康に好影響を及ぼしうる有利な変異体の存在を決定するための代謝プロファイルの使用も記載されている。
2017536543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的変異体の影響を決定する方法であって、前記遺伝的変異体により影響を受ける生化学的経路を同定する工程を含み、同定する工程が、
前記遺伝的変異体を有する被験体から生物学的サンプルの低分子プロファイルを取得する工程と、
前記低分子プロファイルと標準低分子プロファイルとを比較する工程と、
前記変異体により影響を受ける前記低分子プロファイルの生化学的成分を同定する工程と、
前記同定された生化学的成分に関連する１つ以上の生化学的経路を同定し、それにより、前記遺伝的変異体により影響を受ける１つ以上の生化学的経路を同定する工程と、
それぞれの同定された生化学的経路と、それぞれの同定された生化学的経路について前記同定された生化学的経路にマッピングされた１種または複数種の同定された生化学的成分とに関する情報を記憶する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記遺伝的変異体が一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝的変異体が遺伝的構造変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝的構造変異体が、挿入、欠失、再構成、コピー数変異体、および転位を含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記低分子プロファイルが、以下：ＨＰＬＣ、ＴＬＣ、電気化学分析法、質量分析法、屈折率分光法（ＲＩ）、紫外分光法（ＵＶ）、蛍光分析法、放射化学分析法、近赤外分光法（近ＩＲ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、および光散乱分析法（ＬＳ）の１つ以上を用いて取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
遺伝的変異体により影響を受ける生化学的経路を同定する方法であって、
前記遺伝的変異体を有する被験体から取得された生物学的サンプルの低分子プロファイルを生成する工程と、
前記遺伝的変異体により影響を受ける前記低分子プロファイルの生化学的成分を同定する工程と、
前記同定された生化学的成分に関連する１つ以上の生化学的経路を同定し、それにより、前記変異体により影響を受ける生化学的経路を同定する工程と、
前記同定された生化学的経路と、それぞれの同定された生化学的経路に関連する１種または複数種の同定された生化学成分とに関する情報を表示する工程と
を含む、方法。
【請求項７】
遺伝的変異体の影響を決定する方法であって、
前記遺伝的変異体を有する被験体から生物学的サンプルの低分子プロファイルを取得する工程と、
前記低分子プロファイルと標準低分子プロファイルとを比較する工程と、
前記変異体により影響を受ける前記低分子プロファイルの生化学的成分を同定する工程と、
前記同定された生化学的成分に関連する１つ以上の生化学的経路を同定する工程と、
前記同定された生化学的経路と、それぞれの同定された生化学的経路に関連する１種または複数種の同定された生化学成分とに関する情報を記憶する工程と、
前記同定された生化学的経路に関する前記記憶された情報を用いて、前記被験体の前記遺伝的変異体に関連する疾患または障害の存在または尤度を同定し、それにより、前記遺伝的変異体の前記影響を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項８】
遺伝的変異体の影響を決定するためのシステムであって、
複数の生化学的経路を記述するデータの集合であって、それぞれの生化学的経路の記述が、前記生化学的経路に関連する低分子化合物を特定する、データの集合と、
データ取得装置であって、被験体の遺伝的変異体の影響を決定するために前記遺伝的変異体の同定後に試験サンプルを処理し、前記試験サンプルの前記処理が、複数の生化学的化合物のそれぞれについて対照と対比して前記試験サンプル中の生化学的化合物の状態を示唆する結果データを生成する、データ取得装置と、
前記複数の生化学的化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された変異体により影響を受ける１つ以上の生化学的経路を、前記複数の生化学的経路を記述する前記データの集合を用いて前記複数の生化学的化合物の少なくともいくつかを前記１つ以上の生化学的経路に関連付けることにより、同定するために計算デバイス上で実行される解析手段であって、前記１つ以上の同定された生化学的経路が、前記データの集合により記述された前記複数の生化学的経路の一部のみを含み、前記解析手段が、前記同定された生化学的経路と、それぞれの同定された生化学的経路について前記同定された生化学的経路に関連する１種または複数種の生化学的化合物とに関する情報を記憶するために使用される、解析手段と
を含む、システム。
【請求項９】
前記解析手段が、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の同定された生化学的経路の変化に基づいて、前記複数の生化学的化合物の前記少なくともいくつかをランク付けするスコアを生成する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記解析手段が、前記複数の生化学的化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路での少なくとも１つの予想される影響を同定するのに使用される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記解析手段が、前記複数の生化学的化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路での少なくとも１つの予想外の影響を同定するのに使用される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
前記予想外の影響が予想外の悪影響である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
表示デバイスをさらに含み、前記表示デバイスが、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路のリストを表示する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１４】
前記リストが、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路での少なくとも１種の変化した代謝物を同定する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記データ取得装置が、前記試験サンプルに対して液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析、液体クロマトグラフィー−質量分析、またはガスクロマトグラフィー−質量分析の少なくとも１つを行う、請求項８に記載のシステム。
【請求項１６】
前記解析手段が、前記複数の生化学的化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路の変化の意味を解釈するために使用され、前記解釈が、あらかじめ定義された基準セットに基づく、請求項８に記載のシステム。
【請求項１７】
前記解釈がユーザーに表示される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記解釈が記憶される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
前記データの集合がデータベースに記憶される、請求項８に記載のシステム。
【請求項２０】
計算デバイスと共に使用するための媒体であって、遺伝的変異体を同定するためのコンピューター実行可能命令を保持し、前記命令が、
複数の生化学的経路を記述するデータの集合を計算デバイスで提供するための命令であって、それぞれの生化学的経路の記述が、前記生化学的経路に関連する低分子化合物を特定する、命令と、
被験体の遺伝的変異体を決定するためにサンプルに対して解析を行うための命令と、
１つ以上の遺伝的変異体の影響を示唆する結果データを取得するために前記試験サンプルを処理するための命令であって、前記結果データが、複数の生化学的化合物のそれぞれについて、前記遺伝的変異体を有していない対照と対比して前記遺伝的変異体の存在下での生化学的化合物の状態を示唆する、命令と、
前記複数の生化学的化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける１つ以上の生化学的経路を同定するための命令であって、前記同定が、前記複数の生化学的経路を記述する前記データの集合を用いて前記複数の生化学的化合物の少なくともいくつかを前記１つ以上の生化学的経路に関連付けることを含み、１つまたは複数の前記同定された生化学的経路が、前記データの集合により記述された前記複数の生化学的経路の一部のみを含む、命令と、
前記同定された生化学的経路と、それぞれの同定された生化学的経路について前記同定された生化学的経路にマッピングされた１種または複数種の生化学的化合物とに関する情報を記憶するための命令と
を含む、媒体。
【請求項２１】
前記同定が、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路での少なくとも１つの予想される影響を同定する、請求項２０に記載の媒体。
【請求項２２】
前記同定が、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記少なくとも１つ以上の生化学的経路での少なくとも１つの予想外の影響を同定する、請求項２０に記載の媒体。
【請求項２３】
予想外の影響が予想外の悪影響である、請求項２０に記載の媒体。
【請求項２４】
前記命令が、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路のリストを表示するための命令をさらに含む、請求項２０に記載の媒体。
【請求項２５】
前記リストが、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路での少なくとも１つの変化した代謝物を同定する、請求項２０に記載の媒体。
【請求項２６】
前記処理するための命令が、前記試験サンプルに対して液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析、液体クロマトグラフィー−質量分析、またはガスクロマトグラフィー−質量分析の少なくとも１つを行うための命令をさらに含む、請求項２０に記載の媒体。
【請求項２７】
前記命令が、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路の変化の意味を解釈するための命令をさらに含み、前記解釈が、あらかじめ定義された基準セットに基づく、請求項２０に記載の媒体。
【請求項２８】
前記命令が、前記解釈をユーザーに表示するための命令をさらに含む、請求項２７に記載の媒体。
【請求項２９】
前記命令が、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路の前記変化の前記意味の前記解釈を記憶するための命令をさらに含む、請求項２７に記載の媒体。
【請求項３０】
複数の生化学的経路を記述する前記データの集合がデータベースに記憶される、請求項２７に記載の媒体。
【請求項３１】
有意な遺伝的変異体を同定するための方法であって、
複数の生化学的経路を記述するデータの集合を計算デバイスで提供する工程であって、それぞれの生化学的経路の記述が、前記生化学的経路に関連する低分子化合物を特定する、工程と、
１つ以上の遺伝的変異体の存在を決定するために試験サンプルを解析する工程と、
前記試験サンプルに及ぼす前記遺伝的変異体の存在の影響を示唆する結果データを取得するために前記試験サンプルを処理する工程であって、前記結果データが、複数の低分子化合物のそれぞれについて対照と対比して前記試験サンプル中の低分子化合物の状態を示唆する、工程と、
計算デバイスのプロセッサー上で実行される解析手段を用いて、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける１つ以上の生化学的経路を同定する工程であって、前記１つ以上の同定された生化学的経路が、前記データの集合により記述された前記複数の生化学的経路の一部のみを含む、工程と、
それぞれの同定された生化学的経路と、それぞれの同定された生化学的経路について前記同定された生化学的経路にマッピングされた１種または複数種の低分子化合物とに関する情報を記憶する工程と
を含む、方法。
【請求項３２】
前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された遺伝的変異体により影響を受ける１つ以上の生化学的経路の変化の意味をユーザーによる支援なしでプログラムにより解釈する工程をさらに含み、前記解釈が、あらかじめ定義された基準セットに基づく、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
計算デバイスと共に使用するための媒体であって、変異体により影響を受ける化合物を同定するための命令を保持し、前記同定が、
複数の生化学的経路を記述するデータの集合を計算デバイスで提供する工程であって、それぞれの生化学的経路の記述が、前記生化学的経路に関連する低分子化合物を特定する、工程と、
試験サンプル中に存在する前記低分子化合物に及ぼす前記変異体の存在の影響を示唆する結果データを取得するために前記試験サンプルを処理する工程であって、前記結果データが、複数の低分子化合物のそれぞれについて対照と対比して前記試験サンプル中の低分子化合物の状態を示唆する、工程と、
前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された変異体により影響を受ける１つ以上の生化学的経路を同定する工程であって、前記１つ以上の同定された生化学的経路が、前記データの集合により記述された前記複数の生化学的経路の一部のみを含む、工程と、
それぞれの同定された生化学的経路と、それぞれの同定された生化学的経路について前記同定された生化学的経路にマッピングされた１種または複数種の低分子化合物とに関する情報を記憶する工程と
を含む、媒体。
【請求項３４】
前記命令が、前記複数の低分子化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された変異体により影響を受ける前記１つ以上の生化学的経路の変化の意味をユーザーによる支援なしでプログラムにより解釈するための命令をさらに含み、前記解釈が、あらかじめ定義された基準セットに基づく、請求項３３に記載の媒体。
【請求項３５】
遺伝的変異体の影響を決定するためのシステムであって、
１つ以上の疾患または障害に関連する複数の生化学的経路を記述するデータの集合であって、それぞれの生化学的経路の記述が、前記生化学的経路に関連する低分子化合物を特定する、データの集合と、
データ取得装置であって、試験サンプルに及ぼす被験体の遺伝的変異体の影響を決定するために前記遺伝的変異体の同定後に前記試験サンプルを処理し、前記試験サンプルの前記処理が、複数の生化学的化合物のそれぞれについて対照と対比して前記試験サンプル中の生化学的化合物の状態を示唆する結果データを生成する、データ取得装置と、
前記複数の生化学的化合物の少なくともいくつかについて、前記示唆された変異体により影響を受ける１つ以上の生化学的経路を同定するために計算デバイス上で実行される解析手段であって、前記１つ以上の同定された生化学的経路が、前記データの集合により記述された前記複数の生化学的経路の一部のみを含み、前記解析手段が、前記同定された生化学的経路と、それぞれの同定された生化学的経路について前記同定された生化学的経路に関連する１種または複数種の生化学的化合物とに関する情報を記憶するために使用される、解析手段と
を含む、システム。
【請求項３６】
少なくとも１つの同定された生化学的経路が、炭水化物代謝、解糖、生合成、糖新生、クレブス回路、クエン酸回路、ＴＣＡ回路、ペントースリン酸経路、グリコーゲン生合成、ガラクトース経路、カルビン回路、アミノ糖代謝、ブタン酸代謝、ピルビン酸代謝、フルクトース代謝、マンノース代謝、イノシトールリン酸代謝、プロパン酸代謝、デンプンおよびスクロース代謝、エネルギー代謝、酸化的リン酸化、還元的カルボン酸回路、脂質代謝、トリアシルグリセロール代謝、脂肪酸の活性化、ポリ不飽和脂肪酸のβ酸化、他の脂肪酸のβ酸化、α酸化経路、脂肪酸のｄｅ  ｎｏｖｏ生合成、コレステロール生合成、胆汁酸生合成、脂肪酸代謝、グリセロ脂質代謝、グリセロリン脂質代謝、スフィンゴ脂質代謝、アミノ酸代謝、グルタミン酸反応、クレブ・ヘンゼライト尿素回路、シキミ酸経路、フェニルアラニンおよびチロシン生合成、トリプトファン生合成、以下のアミノ酸：アラニン、アスパラギン酸、アルギニン、プロリン、グルタミン酸、グリシン、セリン、トレオニン、ヒスタジン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンのいずれかの代謝および／または分解、アミノ酸の生合成、リシン生合成、トリプトファン生合成、葉酸生合成、葉酸による一炭素プール、パントテン酸およびＣｏＡ生合成、リボフラビン代謝、チアミン代謝、ビタミンＢ６代謝、Ｄ−アラニン代謝、Ｄ−グルタミンおよびＤ−グルタミン酸代謝、グルタチオニン代謝、シアノアミノ酸代謝、Ｎ−グリカン生合成、安息香酸分解、アルカロイド生合成、セレノアミノ酸代謝、プリン代謝、ピリミジン代謝、ホスファチジルイノシトールシグナリング系、神経活性リガンド−レセプター相互作用、エネルギー代謝、酸化的リン酸化、ＡＴＰ合成、光合成、メタン代謝、ホスホグルコン酸経路、酸化還元、電子伝達、酸化的リン酸化、呼吸代謝、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路、ポルフィリン合成経路（ヘム合成）、窒素代謝（尿素回路）、ヌクレオチド生合成、ならびにＤＮＡの複製、転写、および翻訳からなる群から選択される、請求項１、６、７、８、２０、３１、３３、または３５のいずれか一項に記載の方法、システム、または媒体。
【請求項３７】
生化学的成分が、異常である化合物、生化学物質、および代謝物を含む、請求項１、６、または７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記同定された生化学的成分に関連する１つ以上の生化学的経路を同定する工程が、複数の生化学的経路を記述するデータの集合と、計算デバイスのプロセッサー上で実行される解析手段とを用いて、前記同定された生化学的成分を前記１つ以上の生化学的経路にマッピングすることにより行われる、請求項１、６、７、または３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数の生化学的化合物が少なくとも１０種の生化学的化合物を含む、請求項１、６、７、または３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上の生化学的経路がユーザーによる支援なしでプログラムにより同定される、請求項１、６、７、または３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１０種の低分子のそれぞれが１，０００以下の分子量を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記複数の生化学的化合物が少なくとも１０種の生化学的化合物を含む、請求項８または３５に記載のシステム。
【請求項４３】
前記同定された生化学的成分に関連する１つ以上の生化学的経路を同定する工程が、複数の生化学的経路を記述するデータの集合と、計算デバイスのプロセッサー上で実行される解析手段とを用いて、前記同定された生化学的成分を前記１つ以上の生化学的経路にマッピングすることにより行われる、請求項８または３５に記載のシステム。
【請求項４４】
前記１つ以上の生化学的経路がユーザーによる支援なしでプログラムにより同定される、請求項８または３５に記載のシステム。
【請求項４５】
前記複数の生化学的化合物が少なくとも１０種の生化学的化合物を含む、請求項２０または３３に記載の媒体。
【請求項４６】
前記同定された生化学的成分に関連する１つ以上の生化学的経路を同定する工程が、複数の生化学的経路を記述するデータの集合と、計算デバイスのプロセッサー上で実行される解析手段とを用いて、前記同定された生化学的成分を前記１つ以上の生化学的経路にマッピングすることにより行われる、請求項２０または３３に記載の媒体。
【請求項４７】
前記１つ以上の生化学的経路がユーザーによる支援なしでプログラムにより同定される、請求項２０または３３に記載の媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月５日出願の米国仮特許出願第６２／０７５，４４９号明細書および２０１４年１１月６日出願の米国仮特許出願第６２／０７５，９４９号明細書（それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムシーケンス法の全エキソームシーケンシングおよび全ゲノムシーケンシングは、多くのＤＮＡ配列変異（すなわち多型）を明らかにしてきた。これらの遺伝的変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）および構造変異体、たとえば、挿入／欠失（インデル）、コピー数変異体（ＣＮＶ）、転位、配列再構成を含む。ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）は、ＳＮＰとヒト疾患と多くの形質との間の関連を明らかにするために行われてきた。しかしながら、ＧＷＡ研究の焦点は、主に、共通の変異体に向けられており、研究は、共通のヒト疾患の少数の遺伝的成分の有意性の決定に成功したにすぎない。
【０００３】
全ゲノムのいわゆる「次世代シーケンシング」は、疾患および種々のヒト形質の遺伝的基礎の同定を迅速に容易にすることが期待された。これまでに、全ゲノムシーケンシングは、より多くの遺伝的変異体を明らかにしてきた（＞１Ｍの変異体が明らかにされている）。しかしながら、疾患または他の表現型と多くの遺伝的変異体の有意性との関連は、依然として決定されていない。これまでのところ、これらの多くの変異体の適正な解釈は臨床医にとって課題となっている。
【０００４】
シーケンシング法により決定される変異体は、きわめて病原性である「有害なもの」、「おそらく病原性であるもの」、確定されない「臨床的有意性が不確かな変異体」（ＶＵＳ）、「おそらく病原性でないもの」、および「病原性でないもの」または「臨床的有意性がないもの」に分類される［Ｐｌｏｎ，ＳＥ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００８  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２９（１１）：１２８２−１２９１］。中間（ＶＵＳ）のカテゴリーの患者は、一般に追加試験または追跡観察を受けないため、患者の病態の状態に関して確信が得られない。すべての変異体カテゴリーにデータを追加すれば、遺伝的変異体の臨床的有意性をより正確に評価するのに役立つであろう。
【０００５】
挿入または欠失による変異体は、タンパク質のアミノ酸配列にフレームシフトを引き起こしてその構造変化（たとえば、タンパク質のトランケーション、ミスフォールディングなど）をもたらし、したがって、タンパク質の機能の変化または不活性化をもたらす可能性がある。こうしたタイプの変異体は機能アッセイを用いて分類しうる。タンパク質のコード領域のミスセンス突然変異は、特にタンパク質の十分に保存された機能性ドメインに存在する場合、シーケンス解析により解釈可能でありうる。しかしながら、この情報はすべてのタンパク質で利用可能であるとは限らず、すべてのタンパク質が機能アッセイにかけられるとは限らない。機能性病原性変異体の予測および優先順位付けのための計算アルゴリズムおよびデータベース（たとえば、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ、Ａｌｉｇｎ  ＧＶＧＤ、Ｇｒａｎｔｈａｍ  ｓｃｏｒｅ、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔａｓｔｅｒ）が存在するが、依然として十分に有効であるとは言えない。さらに、非コード配列（たとえば、エキソン−イントロン境界、５’および３’非転写領域、５’および３’非翻訳領域、調節配列、たとえば、プロモーター、終止配列など）、ならびに小さいインフレーム挿入および欠失、ならびにアミノ酸変化を生じないヌクレオチド置換の変異体の病理学的影響は評価が困難である。
【０００６】
遺伝的変異体、特にＶＵＳの臨床的関連性の現在の評価方法は、統合研究、たとえば、疾患とＶＵＳとの共分離、有害なトランス突然変異の併発、保因者の個人および家族の健康歴、系統発生的保存のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ評価、および生化学的機能アッセイでのタンパク質修飾の厳密性を必要とする。しかしながら、これらの方法を用いた場合、「バッチ」解析と対比して解析が個別のタンパク質または配列ごとに行われることが多いため、多数の変異体の有意性を評価することは困難である。遺伝的変異体に関して入手可能な情報をより多く有する必要性が存在する。
【０００７】
メタボロミクスは、遺伝的特性、環境、微生物相、および生体異物の影響を明らかにする強力な表現型決定ツールとして次第に認識されてきた。代謝物は、遺伝子機能と非遺伝的因子と表現型エンドポイントとの橋渡しをする生物学的中間プロセスを構成する。そのため、代謝物データを解析することにより、遺伝的変異体の有意性の決定または決定の支援を行うことが可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
疾患の診断または疾患のリスクの決定を行う個別化医療の診察時の全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）および全エキソームシーケンシング（ＷＥＳ）の使用の出現に伴って、病原性の（有害な）影響に関する遺伝的配列変異体（以下では「遺伝的変異体」または単に「変異体」という）の評価およびその際の変異体の有意性の決定を行う包括的方法の必要性が満たされていない。現在の方法は、単一の遺伝子での変異体の影響の評価に限られており、多くの時間と資源を要し、かつ候補遺伝子に及ぼす配列変異体の多くの影響を検出する包括的スクリーニング能力が欠如している。したがって、悪影響または有害な影響を及ぼす可能性のある配列変異体（すなわち「有意な」遺伝的変異体）を決定し、かつ臨床的有意性が未知または不確かな変異体をＶＵＳ状態から良性、病原性、または有利な状態に分類できるようにするより良い方法に対する大きい需要が存在する。本明細書に記載の方法は、メタボロミクスとコンピューター技術とのユニークな組合せを用いてこうした必要性を満たす。
【０００９】
ゲノムシーケンス解析に基づく個別化医療を促進するためのメタボロミクスの使用方法が記載されている。遺伝的変異体の有意性を決定し（または決定を支援し）、かつ個別化医療に使用するための診断的変異体（健康に有害な影響を及ぼす変異体）の同定を可能にするための代謝プロファイルの使用が記載されている。メタボロミックプロファイルは、変異体の中性（良性）のおよび有害な（病原性の）影響の両方に関するデータを含有する。さらに、患者の健康に好影響を及ぼしうる有利な変異体の存在を決定するための代謝プロファイルの使用も記載されている。
【００１０】
一実施形態では、遺伝的変異体により影響を受ける生化学的経路を同定する方法は、変異体を有する被験体から低分子プロファイルを作成する工程と、低分子プロファイルと前記変異体を有していない１つ以上の個体の参照低分子プロファイルとを比較する工程と、変異体により影響を受ける低分子プロファイルの生化学的成分を同定する工程と、前記生化学的成分に関連する生化学的経路を同定し、それにより、変異体により影響を受ける生化学的経路を同定する工程とを含む。
【００１１】
他の実施形態では、診断的変異体を同定する方法は、複数の生化学的経路を記述するデータの集合を計算デバイスで提供する工程を含む。それぞれの生化学的経路の記述は、前記生化学的経路に関連する複数の化合物を同定する。本方法はまた、前記変異体を有する１つ以上の被験体からサンプルを取得する工程と、メタボロミックプロファイルに及ぼす変異体の影響を示唆する結果データを取得するために、メタボロミクス解析法を用いてサンプルを処理する工程とを含む。結果データは、参照（対照）プロファイルと対比して変異体プロファイルの少なくとも１つの化合物の状態を示唆する。本方法はまた、生化学的経路を記述するデータの集合を用いて、示唆された変異体により影響を受ける少なくとも１つの生化学的経路を同定する。この実施形態に関する態様では、変異体のランク付けを可能にするスコアが提供される。
【００１２】
さらに他の実施形態では、診断的変異体を同定する方法は、複数の生化学的経路を記述するデータの集合を計算デバイスで提供する工程を含む。それぞれの生化学的経路の記述は、生化学的経路に関連する複数の化合物を同定する。本方法はまた、前記変異体を有する被験体から取得したサンプルを解析する工程と、メタボロミックプロファイルに及ぼす変異体の影響を示唆する結果データを取得するために、メタボロミクス解析法を用いてサンプルを処理する工程とを含む。結果データは、参照（対照）プロファイルと対比してメタボロミックプロファイルの少なくとも１つの化合物の状態を示唆する。本方法はまた、生化学的経路を記述するデータの集合を用いて、変異体により影響を受ける少なくとも１つの生化学的経路をユーザーによる支援なしでプログラムにより同定する工程を含む。一態様では、変異体のランク付けを可能にするスコアが提供される。
【００１３】
さらなる実施形態では、診断的変異体を決定するためのシステムは、複数の生化学的経路を記載するデータの集合を含む。それぞれの生化学的経路の記述は、生化学的経路に関連する複数の化合物を同定する。システムはまた、メタボロミックプロファイルに及ぼす変異体の影響を示唆する結果データを取得するために、メタボロミクス解析法を用いてサンプルを処理するデータ取得装置を含む。メタボロミクス解析法を用いるサンプル処理は、参照（対照）と対比して得られたメタボロミックプロファイルの少なくとも１つの化合物の状態を示唆する結果データを生成する。システムは、加えて、計算デバイスで実行される解析手段を含む。解析手段は、生化学的経路を記述するデータの集合と共に使用され、少なくとも１つの変異体の示唆された状態により影響を受ける少なくとも１つの生化学的経路を同定する。一態様では、解析手段は、変異体のランク付けを可能にするスコアを提供する。特定の実施形態では、生化学的経路は変異体により影響を受けないこともある。たとえば、変異体の標的が解析対象のサンプルタイプ（たとえば尿サンプル）に存在しない場合、変異体は、メタボロミックプロファイルの生化学的経路のいずれにも影響を及ぼさず、生化学的経路が同定されない可能性がある。さらに、いくつかの場合、変異体は代謝プロファイルの生化学的経路に影響を及ぼさず（たとえば、変異体は中性、良性、またはサイレントな変異体である）、生化学的経路は同定されない。
【００１４】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、メタボロミックプロファイリングを用いて遺伝的変異体の有意性を決定するためのシステム、方法、および装置を含む。有意性は、変異体をカテゴリーに分類することによりおよび／または変異体をランク付けすることにより決定しうる。有意性の割当ては、遺伝的変異体により影響を受ける生化学的成分に基づき、かつ他の因子、たとえば、遺伝的変異体の進化的保存、遺伝的変異体の結果としてタンパク質の構造もしくは機能の変化、または個人もしくは家族の健康歴も含みうる。
【００１５】
有意性スコアは各変異体に対して計算しうる。システム、方法、および装置は、患者または患者の集団のスコアと標準的な低分子プロファイルのスコアとを比較しうる。
【００１６】
記載の方法は、新規な遺伝的変異体の有意性を決定するために使用しうるか、またはすでに同定されている遺伝的変異体の有意性を決定するために使用しうる。遺伝的変異体はまた、有意性の順序によりランク付けしうるか、または有意性により分類しうる。本明細書に記載の方法を用いて生成されるデータは、遺伝的変異体を再分類するために使用しうる（たとえば、未知の有意性の変異体（ＶＵＳ）からおそらく病原性である変異体に、またはＶＵＳからおそらく病原性でも中性でもない変異体に）。かかるデータは、患者の診断および／または治療の決定または決定の支援時に情報を提供すれば、医師または他の医療提供者に有用でありうる。
【００１７】
実施形態は、１つの遺伝的変異体または複数の変異体の有意性を決定する方法を含む。方法は、１つの遺伝的変異体または複数の変異体を有する被験体からサンプルを取得する工程と、サンプル中の複数の低分子のそれぞれの存在もしくは不在またはレベルに関する情報を含む、サンプルの低分子プロファイルを生成する工程とを含む。方法はまた、サンプルの低分子プロファイルと、それぞれのレベルが標準範囲内にある複数の低分子を含む参照低分子プロファイルとを比較する工程と、それぞれ異常レベルを有するサンプル中の低分子のサブセットを同定する工程とを含む。サンプル中の低分子の異常レベルは、低分子の標準範囲外のレベルである。比較および同定は、計算デバイスのプロセッサーで実行される解析手段を用いて行われる。方法は、低分子の同定されたサブセットの異常レベルに基づいて、データベースから診断情報を取得する工程をさらに含む。データベースは、複数の低分子の１つ以上の低分子の異常レベルに関連する情報と、複数の遺伝的変異体のそれぞれの遺伝的変異体に関する情報とを保持する。方法はまた、取得した診断情報を記憶する工程を含む。記憶される診断情報は、異常レベルを有する低分子の同定されたサブセットに関連する少なくとも１つの生化学的経路の同定、異常レベルを有する低分子の同定されたサブセットに関連する少なくとも１つの遺伝的変異体の同定の１つ以上を含みうると共に、さらには異常レベルを有する低分子の同定されたサブセットに関連する少なくとも１つの推奨追跡試験の同定を含みうる。
【００１８】
本発明は、添付の特許請求の範囲に特定的に規定されている。以上に記載の本発明の利点および本発明のさらなる利点は、添付図面と併せて以下の説明を参照すればよりよく理解しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態を実施するのに好適な環境を示す。
【図２】本発明の実施形態を実施するのに好適な代替的な分散環境を示す。
【図３】遺伝的変異体により影響を受ける生化学的経路を同定するために、本発明の例示的な実施形態が従いうる一連の工程のフローチャートである。
【図４】遺伝的変異体により影響を受ける特定の生化学的経路の代謝物データを表示するために、本発明の実施形態により生成しうる分岐鎖アミノ酸生化学的経路の例示的な簡潔な視覚的表示である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
「低分子プロファイル」という表現は、本明細書に記載の方法内でその意図した用途でユーザーに情報を提供するのに必要および／または十分である、被験体のサンプル内の低分子のインベントリー（有形形式もしくはコンピューター可読形式）またはその任意の派生部分を含む。インベントリーは、存在する低分子の量および／またはタイプを含むであろう。必要および／または十分な情報は、「低分子プロファイル」の意図した用途に依存して異なるであろう。たとえば、「低分子プロファイル」は、意図した用途で単一の技術を用いて決定可能であるが、他の意図した用途では、関与する遺伝的変異体、関与する疾患状態、特定のサンプル中に存在する低分子のタイプなどの因子に依存していくつかの異なる技術の使用が必要になることもある。さらなる実施形態では、低分子プロファイルは、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも２０００種の低分子に関する情報を含む。「生化学的プロファイル」、「代謝物プロファイル」、「メタボロミックプロファイル」という用語は、「低分子プロファイル」という用語と同義的に用いられる。いくつかの場合、「プロファイル」という用語は、低分子の前記インベントリーを意味するように用いうる。
【００２１】
低分子プロファイルは、ＨＰＬＣ（Ｋｒｉｓｔａｌ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６３：１８−２５（１９９８））、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、または電気化学的分離技術を用いて取得可能である（国際公開第９９／２７３６１号パンフレット、国際公開第９２／１３２７３号パンフレット、米国特許第５，２９０，４２０号明細書、米国特許第５，２８４，５６７号明細書、米国特許第５，１０４，６３９号明細書、米国特許第４，８６３，８７３号明細書、および米国再発行特許第３２，９２０号明細書を参照されたい）。細胞の低分子の存在の決定または低分子のアイデンティティーの決定を行うための他の技術、たとえば、屈折率分光法（ＲＩ）、紫外分光法（ＵＶ）、蛍光分析法、放射化学分析法、近赤外分光法（近ＩＲ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、光散乱分析法（ＬＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、および液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、ならびに当技術分野で公知の他の方法も単独または組合せで含まれる。
【００２２】
「影響」という用語は、変異体により引き起こされる任意のモジュレーションまたは他の変化を含む。この用語は、生物学的経路またはその一部の活性の増加および活性の低下の両方を含みうる。それは、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方、ならびに／または経路を介するフラックスの増加もしくは減少、ならびに／または経路の代謝物レベルの増加もしくは減少を含む。
【００２３】
「サンプル」または「生物学的サンプル」または「試料」とは、被験体から単離された生物学的物質を意味する。生物学的サンプルは、所望のバイオマーカーを検出するのに好適な任意の生物学的物質を含有しうると共に、被験体からの細胞物質および／または非細胞物質を含みうる。サンプルは、任意の好適な生物学的流体、組織、または細胞、たとえば、血液、血漿、血清、羊水、尿、脳脊髄液、歯肉滲出液、胎盤、皮膚、表皮組織、脂肪組織、大動脈組織、肝臓組織、または細胞サンプルなどから単離可能である。サンプルは、たとえば、血液サンプルを濾紙上にブロットして乾燥させた乾燥血液スポットでありうる。
【００２４】
「被験体」とは、任意の動物を意味するが、好ましくは、哺乳動物、たとえば、ヒト、サル、非ヒト霊長動物、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウサギなどである。前記被験体は、症状を示しうるか（すなわち、遺伝的指標を含めて疾患、病態、もしくは障害の存在もしくはその素因を示唆する１つ以上の特性を有しうるか）、または無症状でありうる（すなわち、前記特性が欠如しうる）。
【００２５】
１種以上のバイオマーカーの「レベル」とは、サンプル中のバイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度を意味する。
【００２６】
「低分子」、「代謝物」、「生化学物質」とは、細胞に存在する有機および無機の分子を意味する。この用語は、大きいタンパク質（たとえば、２，０００，３，０００、４，０００，５，０００、６，０００，７，０００、８，０００，９，０００、または１０，０００を超える分子量を有するタンパク質）、大きい核酸（たとえば、２，０００、３，０００，４，０００、５，０００，６，０００、７，０００，８，０００、９，０００、または１０，０００を超える分子量を有する核酸）、大きい多糖（たとえば、２，０００、３，０００，４，０００、５，０００，６，０００、７，０００，８，０００、９，０００、または１０，０００を超える分子量を有する多糖）などの大きい高分子を含まない。細胞の低分子は、一般的には、細胞質または他のオルガネラ、たとえばミトコンドリアの溶液中に遊離状態で見いだされ、そこでは、さらに代謝可能なまたは高分子と呼ばれる大分子の生成に使用可能な中間体のプールを形成する。「低分子」という用語は、シグナリング分子および食料に由来するエネルギーを使用可能な形態に変換する化学反応の中間体を含む。低分子の例としては、限定されるものではないが、糖、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチド、細胞プロセスで形成される中間体、および細胞内に見いだされる他の低分子が挙げられる。
【００２７】
「異常」、「異常代謝物」、または「異常レベル」とは、規定の標準範囲を上回るかまたは下回るかのいずれかの代謝物または前記代謝物のレベルを意味する。異常代謝物は、希薄な代謝物および／または欠失した代謝物も含みうる。異常代謝物を決定するために任意の統計的方法を使用しうる。限定されるものではないが、例として、いくつかの代謝物では、少なくとも１．５＊ＩＱＲ（四分位間範囲）の外側となるｌｏｇ変換レベルは異常である。他の例として、いくつかの代謝物では、少なくとも３．０＊ＩＱＲの外側となるｌｏｇ変換レベルは、異常として同定される。いくつかの例では、データは、少なくとも１．５＊ＩＱＲの外側となるｌｏｇ変換レベルを異常と仮定して解析され、いくつかの例では、データは、少なくとも３．０＊ＩＱＲの外側となるｌｏｇ変換レベルを異常と仮定して解析される。他の例として、いくつかの代謝物では、＞１または＜−１のＺスコアのｌｏｇ変換レベルを有する代謝物は異常である。いくつかの実施形態において、いくつかの代謝物では、＞１．５または＜−１．５のＺスコアのｌｏｇ変換レベルを有する代謝物は異常である。いくつかの実施形態において、いくつかの代謝物では、＞２．０または＜−２．０のＺスコアのｌｏｇ変換レベルを有する代謝物は異常である。他の実施形態では、Ｚスコアの異なる範囲が異なる代謝物に使用される。いくつかの実施形態では、規定の標準範囲は、ｌｏｇ変換レベルのＩＱＲの代わりにレベルのＩＱＲに基づきうる。さらに他の実施形態では、規定の標準範囲は、ｌｏｇ変換レベルのＺスコアの代わりにレベルのＺスコアに基づきうる。
【００２８】
「外れ値」または「外れ値の値」とは、規定の標準範囲を上回るかまたは下回るかのいずれかのレベルを有する任意の生化学物質を意味する。外れ値の値を決定するために任意の統計的方法を使用しうる。限定されるものではないが、例として、外れ値を同定するために以下の試験：ｔ検定、Ｚスコア、修正Ｚスコア、グラブス検定、ティーティエン・ムーア（Ｔｉｅｔｊｅｎ−Ｍｏｏｒｅ）検定、一般化極値スチューデント化偏差（ＥＳＤ）を使用しうると共に、変換データ（たとえばｌｏｇ変換）または非変換データで実施可能である。
【００２９】
「経路」とは、互いに関連する一連の工程または反応を規定するために一般に用いられる用語である。たとえば、ある反応の産物が後続の反応の基材である生化学的経路である。生化学反応は必ずしも直線的であるとは限らない。より正確には、生化学的経路という用語は、生合成反応および異化反応を含めて代謝に関与する互いに関連する生化学反応のネットワークを含むものと理解される。修飾語のない「経路」は、「スーパー経路」および／または「サブ経路」を意味しうる。「スーパー経路」とは、代謝の広義のカテゴリーを意味する。「サブ経路」とは、より広義の経路の任意のサブセットを意味する。たとえば、グルタミン酸代謝は、アミノ酸代謝の生化学的スーパー経路のサブ経路である。「異常経路」とは、１つ以上の異常生化学物質がマッピングされた経路または個体でのその経路の生化学的距離が集団でのその経路の期待される生化学的距離と比較して大きかった経路（たとえば、個体での経路の生化学的距離が１０％の最高水準にある）を意味する。
【００３０】
「生化学的経路」という用語は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｃｈａｒｔ”に記載の経路または生物の代謝に関与することが知られている他の経路を含む。生化学的経路の例としては、限定されるものではないが、炭水化物代謝（たとえば、限定されるものではないが、解糖、生合成、糖新生、クレブス回路、クエン酸回路、ＴＣＡ回路、ペントースリン酸経路、グリコーゲン生合成、ガラクトース経路、カルビン回路、アミノ糖代謝、ブタン酸代謝、ピルビン酸代謝、フルクトース代謝、マンノース代謝、イノシトールリン酸代謝、プロパン酸代謝、デンプンおよびスクロース代謝など）、エネルギー代謝（たとえば、酸化的リン酸化、還元的カルボン酸回路など）、脂質代謝（たとえば、限定されるものではないが、トリアシルグリセロール代謝、脂肪酸の活性化、ポリ不飽和脂肪酸のβ酸化、他の脂肪酸のβ酸化、α酸化経路、脂肪酸のｄｅ  ｎｏｖｏ生合成、コレステロール生合成、胆汁酸生合成、脂肪酸代謝、グリセロ脂質代謝、グリセロリン脂質代謝、スフィンゴ脂質代謝など）、アミノ酸代謝（たとえば、限定されるものではないが、グルタミン酸反応、クレブ・ヘンゼライト尿素回路）、シキミ酸経路、フェニルアラニンおよびチロシン生合成、トリプトファン生合成、特定のアミノ酸の代謝および／または分解（たとえば、アラニン、アスパラギン酸、アルギニン、プロリン、グルタミン酸、グリシン、セリン、トレオニン、ヒスタジン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、またはイソロイシン代謝および／または分解など）、アミノ酸の生合成（たとえば、リシンおよびトリプトファン生合成など）、葉酸生合成、葉酸による一炭素プール、パントテネートおよびＣｏＡ生合成、リボフラビン代謝、チアミン代謝、ビタミンＢ６代謝、Ｄ−アラニン代謝、Ｄ−グルタミンおよびＤ−グルタミン酸代謝、グルタチオニン代謝、シアノアミノ酸代謝、Ｎ−グリカン生合成、安息香酸分解、アルカロイド生合成、セレノアミノ酸代謝、プリン代謝、ピリミジン代謝、ホスファチジルイノシトールシグナリング系、神経活性リガンド−レセプター相互作用、エネルギー代謝（たとえば、限定されるものではないが、酸化的リン酸化、ＡＴＰ合成、光合成、メタン代謝など）、ホスホグルコン酸経路、酸化還元、電子伝達、酸化的リン酸化、呼吸代謝（呼吸）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路、ポルフィリン合成経路（ヘム合成）、窒素代謝（尿素回路）、ヌクレオチド生合成、ＤＮＡの複製、転写、および翻訳が挙げられる。これら経路の一部および個別の化学反応も含まれる。
【００３１】
「試験サンプル」とは、分析対象の個々の被験体から取得したサンプルを意味する。
【００３２】
「参照サンプル」とは、低分子のレベルの標準範囲の測定に使用されるサンプルを意味する。「参照サンプル」は、年齢、性別、民族性、および／または遺伝的条件が試験被験体によく類似するように選択しうる個別の参照被験体（たとえば、良性変異体のみを有する参照被験体、有害な変異体を有する参照被験体、または研究対象の遺伝子または遺伝子領域に配列変異体を含まない参照被験体）の個別のサンプルを意味しうる。また、「参照サンプル」は、個別の参照被験体の参照サンプルのプールアリコートを含むサンプルをも意味しうる。
【００３３】
「参照低分子プロファイル」または「参照メタボロミックプロファイル」とは、「参照サンプル」を用いて生成して得られたプロファイルを意味する。さらに、「参照低分子プロファイル」という表現は、本明細書に記載の方法内でその意図した用途でユーザーに情報を提供するのに必要および／または十分なプロファイルの低分子に関する情報を含む。参照プロファイルは、存在する低分子の量および／またはタイプを含むであろう。必要および／または十分な情報が参照低分子プロファイルの意図した用途に依存して異なることは、当業者であれば分かるであろう。たとえば、「参照低分子プロファイル」は、意図した用途で単一の技術を用いて決定可能であるが、他の意図した用途では、特定の標的サンプルタイプ、細胞、細胞区画に存在する低分子のタイプ、その細胞区画自体がアッセイされるなどの因子に依存して、いくつかの異なる技術の使用が必要になることもある。使用しうる技術の例は、以上に記載されており、たとえば、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、ｕＨＰＬＣなど、およびそれらの組合せを含む。
【００３４】
「同定」という用語は、参照低分子プロファイルと比較して異常なサンプル低分子プロファイルの生化学的成分を同定する自動および非自動の両方法を含む。「異常」という用語は、参照プロファイルよりも多いまたは少ない量でサンプル低分子プロファイルに存在する化合物を含む。いくつかの場合、前記より多いまたはより少ない量は統計的に有意でありうる。
【００３５】
「成分」という用語は、標準低分子プロファイルと比較して異常量で存在する低分子プロファイルの低分子を意味する。
【００３６】
生化学的成分の同定後、同定された生化学的成分は、たとえば、特定の変異体により影響を受ける特定の経路を正確に示す生化学的経路のデータベースを用いて解析される。生化学的経路が同定されたら、たとえば、有害な影響および有利な影響の両方を含めて、これらの経路をモジュレートする生物学的影響を決定する。
【００３７】
「全ゲノムシーケンシング」または「ＷＧＳ」は、一度に生物のゲノムの完全ＤＮＡ配列を決定するプロセスである。プロセスは、エキソン（タンパク質コードＤＮＡ）およびイントロン（非コードＤＮＡ）のシーケンシングを含む。
【００３８】
「全エキソームシーケンシング」または「ＷＥＳ」は、生物のタンパク質コード遺伝子（すなわち、エキソン）のすべてのＤＮＡ配列を決定するプロセスである。
【００３９】
「標的シーケンシング」または「ＴＳ」は、生物の対象の特定の単離された遺伝子またはゲノム領域のＤＮＡ配列を決定するプロセスである。標的シーケンシングとは、ゲノムまたはエキソームの任意の特定のサブセットのシーケンシングを意味する。
【００４０】
「遺伝的変異体」または「変異体」とは、ＤＮＡ配列変異（たとえば、多型または突然変異）を意味する。これらの遺伝的変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）、ならびに構造変異体、たとえば、挿入／欠失（インデル）、配列再構成、コピー数変異体（ＣＮＶ）、および転位を含む。ＤＮＡ配列の差は、健康、疾患および障害に対する感受性、ならびに病原体および作用剤（たとえば、治療剤、毒素、および毒物）に対する反応に及ぼす影響を含めて、個体に多くの影響を及ぼす。変異体は、「好ましい」（有利な）影響、「悪い」（病原性のおよび／もしくは有害な）影響、「中性の」（良性の、病原性でない、臨床的有意性がない）影響、または「不確かな」（未知の、未決定の）影響を有するものとして分類しうる。
【００４１】
「未知の有意性の変異体」または「不確かな有意性の変異体」または「ＶＵＳ」とは、臨床的影響（存在する場合）が未知または不確かな変異体を意味する。
【００４２】
先端的メタボロミック解析は、少なくとも部分的には、生化学的プロセスに及ぼす変異体の影響に関する詳細な情報を提供するために使用される。変異体間の比較評価は、各変異体の定量的および定性的な特異性を理解する手がかりを提供する。既知の有害な影響を有する変異体の同時解析の結果は、疾患またはそのリスクの診断または診断の支援ならびに治療方針および患者管理の促進を行う変異体の臨床的性能の予測を理解する手がかりを提供可能である。
【００４３】
各変異体の推定有意性を確証するためのユニークな機会を提供する生化学的プロファイリング解析を本明細書に記載する。結果を用いて、ほとんどの有害変異体の決定を達成可能である。結果は、被験体の疾患または障害のリスク（またはそれらの欠如した中性変異体の場合のリスク）を決定するのに有用である。
【００４４】
一実施形態では、遺伝的変異体により影響を受ける生化学的経路を同定する方法は、前記変異体を有する被験体のサンプルの低分子プロファイルを取得する工程と、低分子プロファイルと参照ＷＧＳ低分子プロファイルとを比較する工程と、変異体により影響を受ける低分子プロファイルの生化学的成分を同定する工程と、前記成分に関連する生化学的経路を同定することにより、変異体により影響を受ける生化学的経路を同定する工程とを含む。さらに、経路が悪影響を受けるか（疾患をもたらすかもしくは疾患のリスクを増加させる）または好影響を受けるか（保護効果を有して疾患に対する感受性を減少させる）を決定可能である。
【００４５】
変異体は、シーケンシング（たとえば、患者のＤＮＡの全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）、全エキソームシーケンシング（ＷＥＳ）、標的シーケンシング（ＴＳ））により取得した既存のデータ中に表現されうる。患者はまた、診断された関連疾患および診断時の年齢に関する情報ならびにその家族の対応する疾患／年齢情報（それに加えて、それぞれのかかる家族（たとえば、兄弟姉妹、親、祖父母、おば／おじ、いとこなど）との関係のタイプを示唆するデータ）を含めて、追加データを提供しうる。次いで、関連が懸念される疾患のリストに対して患者の個人歴および家族歴をコンピューターにより解析しうる。
【００４６】
自動および／または半自動の方法、コンピュータープログラム、ならびに記載の方法を実施するための他の関連媒体は、本明細書に説明されている。
【００４７】
図１は、本発明の実施形態を実施するのに好適な環境を示している。計算デバイス２は、生化学的経路を記述するデータの集合４を保持するかまたはそれへのアクセスを可能にする。計算デバイス２は、サーバー、ワークステーション、ラップトップ、パーソナルコンピューター、ＰＤＡ、または１つ以上のプロセッサーを備えて本明細書で考察される解析手段６を実行可能な他の計算デバイスでありうる。生化学的経路を記述するデータの集合４はデータベースに記憶しうる。生化学的経路を記述するデータの集合４は、複数の生化学的経路を記述し、それぞれの生化学的経路の記述は、特定の生化学的経路に関連する複数の化合物を同定する。解析手段６は、好ましくはソフトウェアに実装されるが、代替実装形態では、ロジックはまた、ハードウェアにも実装しうる。解析手段６は、データ取得装置２０から受け取った結果データ２２を操作し解析する。以下でさらに説明されるように、結果データ２２は、変異体を有する個体から取得したサンプルからデータ取得装置２０により処理されている低分子プロファイル３０中の化合物の状態を示唆する。
【００４８】
データ取得装置２０は、低分子プロファイルに及ぼす変異体の影響または非影響を決定するために、変異体を有する１つ以上の被験体のサンプルを処理する。好適には、データ取得装置２０は、以上に記載のように、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、または低分子プロファイルに及ぼす変異体の影響を解析するための他の技術を含みうる。データ取得装置２０による変異体３０を有するサンプルの処理は、対照（たとえば標準低分子プロファイル）と対比して試験サンプル中の少なくとも１種の化合物の状態を示唆する結果データ２２（たとえば低分子プロファイル）を生成する。示唆された状態は、変異体３０の存在の結果として化合物（および関連する生化学的経路）の変化を反映しうる。代替的に、化合物の示唆された状態は、解析されたサンプル中の変異体３０の存在の結果として化合物が変化していないことを反映しうる。変異体のアイデンティティーおよび解析したサンプルのタイプに依存して化合物の変化の欠如が期待および／または所望の結果を表現しうることが分かるであろう。結果データ２２は、計算デバイス２で実行される解析手段６に提供される。理解されるように、結果データを計算デバイス２に転送する方法はいくつか存在する。たとえば、限定されるものではないが、データ取得装置２０と計算デバイス２との間の直接接続もしくはネットワーク接続を用いる方法、またはコンパクトディスクなどの記憶媒体に結果データを保存してから計算デバイス２に転送する方法である。例示が容易になるように、図１は、データ取得装置２０と結果データ２２を伝達しうる計算デバイス２との間の直接接続を表している。多くの他の構成も本発明の範囲内で可能であることは、当業者であれば分かるであろう。
【００４９】
解析手段６は、変異体３０の存在により影響を受ける１つ以上の生化学的経路を同定するために、生化学的経路を記述するデータの集合４と共に１種以上の化合物の状態を示唆する結果データ２２を使用する。この技術の有益な態様は、従来技術で行われるような単に目標を狭く設定した研究ではなく、広範にわたる生化学的経路に及ぼす変異体の影響の研究が可能にする。これにより、評価プロセスでかなり高速かつ早期に変異体の予想通りおよび予想外の両方の影響を同定することが可能である。理解されるように、ゲノム解析プロセスで変異体の影響（悪影響または好影響）を決定することにより、健康に及ぼす遺伝的変異体の影響の理解および解釈を試みる患者および医師に金銭および時間の実質的な節約をもたらしうる。
【００５０】
一実装形態では、結果データ２２と生化学的経路を記述するデータの集合４との比較は、影響を受けた生化学的経路を同定するためにユーザー入力をなんら伴うことなくプログラムにより実施される。代替実装形態では、解析手段６は、比較のためのパラメーターをユーザーに促す。パラメーターは、たとえば、生化学的経路を記述するデータの集合４と比較される結果データ２２に示される化合物の数を限定しうる。代替的に、解析手段６によりユーザーに求められるパラメーターは、検索される生化学的経路を記述するデータの集合４の量を限定しうる。解析手段６によりユーザーに求めうる追加のタイプのユーザー入力およびパラメーターは、当業者が想到するものであり、これは本発明の範囲内であるとみなされる。
【００５１】
以上に述べたように、解析手段６は、変異体３０の存在により影響を受ける１つ以上の生化学的経路を同定するために、生化学的経路を記述するデータの集合４と共に１種以上の化合物の状態を示唆する結果データ２２を使用する。同定された生化学的経路のリスト４２は、計算デバイス２と通信状態の表示デバイス４０に転送されてそれに表示しうる。以下でさらに考察されるように、同定された生化学的経路のリスト４２はまた、同定された生化学的経路の代謝物の変化４２の詳細を列挙しうる４０。代替的に、同定された生化学的経路のリスト１２は、後段の解析またはユーザーへの提示のために記憶装置１０に記憶しうる。例示が容易になるように、記憶装置１０は、図１では計算デバイス２に位置するものとして表されている。計算デバイス２にアクセスしうる他の位置に記憶装置１０を配置しうることが分かるであろう。
【００５２】
解析手段６はまた、影響を受けた生化学的経路の同定された状態の意味を解釈するために使用されるあらかじめ定義された基準８を含みうるかまたは利用しうる。一実装形態では、ユーザーによる入力なしでプログラムにより解釈を提供するために、あらかじめ定義された基準を使用しうる。他の実装形態では、生化学的経路の同定された変化の意味を解釈するために、あらかじめ定義された基準のプログラム適用に加えてさまざまな程度のユーザー入力を使用しうる。さらに他の実装形態では、解析手段６により同定された生化学的経路のリストが提示されたユーザーが解釈をすべて行いうる。以下の表４に示される簡潔な報告を参照してさらに論述されるように、解釈は、同定された代謝物の有意性または生化学的経路の低分子変化に関する情報を提供しうる。あらかじめ定義された基準は、解析手段６にアクセスしうるデータベース中に保持しうる。
【００５３】
図２は、本発明の実施形態を実施するのに好適な代替的な分散環境を示している。第１の計算デバイス１０２は、解析手段１０４を実行するために使用しうる。第１の計算デバイスは、生化学的経路を記述するデータの集合１１２を保持する第２の計算デバイス１１０とネットワーク１５０を介して通信しうる。ネットワーク１５０は、インターネット、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、イントラネット、インターネット、無線ネットワーク、または第１の計算デバイス１０２と第２の計算デバイス１１０とが通信可能ないくつかの他のタイプのネットワークでありうる。第１の計算デバイス１０２の解析手段１０４は、変異体を有する被験体のサンプル１４０の処理の結果データ１３２を生成するデータ取得装置１３０とネットワーク１５０を介して通信しうる。解析手段１０４は、サンプルを取得した被験体の変異体の存在により影響を受ける同定された生化学的経路のリスト１２４を記憶しうる。これは、記憶装置１２２の結果データ１３２と生化学的経路を記述するデータの集合１１２とを処理することにより得られる。記憶装置１２２は、ネットワーク１５０を介してアクセス可能な第３の計算デバイス１２０に位置しうる。図２は、単一の分配構成を表しているにすぎず、多くの他の分配構成が本発明の範囲内で可能であることを認識すべきである。
【００５４】
図３は、代替変異体形（すなわち、同一の遺伝子内の異なる変異体、たとえば、異なるＳＮＰ、挿入、欠失など、対立遺伝子ともいう）により影響を受ける生化学的経路を同定するために本発明の実施形態が従いうる一連の工程のフローチャートである。シーケンスは、生化学的経路を記述するデータの集合へのアクセスにより開始される（工程１６２）。特定の変異体を有する被験体のサンプルを解析してメタボロミックプロファイルを生成し（工程１６４）、このデータをデータ取得装置により処理して以上で考察した結果データを取得する（工程１６６）。次いで、解析手段により結果データと生化学的経路を記述するデータの集合とを用いて、サンプルを採取した被験体の変異体の存在により影響を受ける生化学的経路を同定する（工程１６８）。次いで、影響を受けた生化学的経路のマップまたはリストは、ユーザーに表示しうるかまたはより後段の検索のために記憶しうる（工程１７０）。
【００５５】
本発明の有益な一態様は、研究対象の変異体に関連する影響を示唆する視覚的表示を生成する解析手段の能力である。たとえば、解析手段は、生化学的経路の代謝物データを表示して変異体の存在により影響を受ける生化学物質および生化学的経路を分析者が同定できるようにする生化学的経路のネットワーク（生化学的ネットワーク）の視覚的表示を生成可能である。例示的な表示では、四角は酵素を表し、丸は代謝物を表し、矢印は生化学的経路の反応を表し、塗潰しの丸は患者サンプルで検出された代謝物を表しうる。さらに、丸のサイズは、もしあれば生化学物質のレベルの変化を表しうる。この場合、参照レベルと対比した生化学物質の変化（増加または減少）の大きさは、丸のサイズにより示唆される。たとえば、丸が大きいほど、測定された代謝物レベルと参照レベルとの差は大きい。加えて、塗潰しの丸の色は、参照レベルと対比した生化学物質の変化の方向（増加または減少）を示唆しうる。たとえば、赤丸は、生化学物質の測定レベルの増加を示唆しうると共に、緑丸は、生化学物質の測定レベルの減少を示唆しうる。
【００５６】
図４は、研究対象の変異体により影響を受ける生化学的経路ネットワークの一部を強調表示する例示的な簡潔な視覚的表示を提供する。簡潔な表示は、解析サンプルで個体の変異体の存在により影響を受ける生化学物質のリスト（図示せず）も含む。一実装形態では、代謝物変化のタイプを示唆する目視インジケーターをユーザーに提供しうる。たとえば、１つの色は、特定の生化学的経路の代謝物レベルの増加を示唆するために使用しうると共に、第２の色は、特定の生化学的経路の代謝物レベルの減少を示唆するために使用しうる。同様に、ユーザーに情報を伝えるために色の代わりにまたはそれに加えて他のタイプの目視インジケーターを使用しうる。目視インジケーターの使用は、変異体の全体的影響の素早い認識を促進するという点で本発明のさらなる利点である。たとえば、生化学的経路の代謝物（または低分子）レベルの増加を示すために赤色を使用し、かつ変異体が広範にわたる代謝物レベルの増加を引き起こす場合、ユーザーは、簡潔な報告をチラッと見れば、変異体の影響をすぐに確認できよう。したがって、研究変異体により影響を受ける生化学的経路が多く存在する場合、目視インジケーターは、情報を伝達する効率的な機構を提供する。
【００５７】
図４に例証された簡潔な表示では、四角は酵素を表すために使用され、丸は代謝物を表すために使用され、矢印は生化学的経路の反応を表すために使用され、塗潰しの丸はこの患者サンプルで検出された代謝物を表すために使用される。丸のサイズは参照レベルと対比して代謝物の変化の大きさを表すために使用される（すなわち、丸が大きいほど、参照レベルと比較して代謝物レベルの測定差が大きい）。数は患者サンプルで測定された代謝物を示唆するために次のように使用される。（１）３−ヒドロキシイソ吉草酸、（２）ロイシン、（３）イソロイシン、（４）バリン、（５）３−メチル−２−オキソ吉草酸、（６）４−メチル−２−オキソ吉草酸、（７）α−ヒドロキシイソカプロン酸、（８）３−メチル−２−オキソ酪酸、（９）α−ヒドロキシイソ吉草酸、（１０）イソ吉草酸、（１１）イソバレリルカルニチン、（１２）イソバレリルグリシン、（１３）２−メチルブチリルカルニチン（Ｃ５）、（１４）イソブチリルカルニチン、（１５）チグロイルグリシン、（１６）チグリルカルニチン、（１７）３−ヒドロキシイソ吉草酸、（１８）ブチリルカルニチン、（１９）ヒドロキシイソバレロイルカルニチン、（２０）３−ヒドロキシイソ酪酸、（２１）プロピオニルカルニチン、（２２）３−アミノイソ酪酸、（２３）３−メチルグルタリルカルニチン（Ｃ６）。
【００５８】
本発明の有益な一態様は、研究対象の変異体に関連する影響を示唆する簡潔な報告を生成する解析手段の能力である。以下の表４に示されるのは、変異体の存在により影響を受けると同定された生化学的経路の代謝物データを表示するために解析手段により生成しうる例示的な簡潔な報告である。簡潔な報告は、研究対象の変異体を示唆するタイトルを含む。簡潔な報告は、解析サンプルで個体の変異体の存在により影響を受ける生化学経路のリストも含む。代替変異体形に対応する追加の欄も提供しうる。たとえば、有害変異体と対照および良性変異体と対照の結果を含む欄を提供しうる。欄の結果データは、影響を受けた生化学的経路内の任意の代謝物変化を列挙しうる。
【００５９】
簡潔な報告は、種々の生化学的経路の代謝物レベルの同定された変化の意味を考察する解釈の一部に言及する脚注欄も含みうる。解釈は、解析手段によりプログラムにより生成しうるか、簡潔な報告の残りの部分を見てユーザーにより手動で供給しうるか、または部分的に解析手段によりおよび部分的にユーザーにより生成されるハイブリッドでありうる。
【００６０】
１つ以上の媒体上または媒体内に具現化された１つ以上のコンピューター可読プログラムは、記載の方法を実現しうる。媒体は、フロッピーディスク、ハードディスク、コンパクトディスク、ディジタル多用途ディスク、フラッシュメモリーカード、ＰＲＯＭ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、または磁気テープでありうる。一般的には、コンピューター可読プログラムは、任意のプログラミング言語で実現しうる。使用可能な原語のいくつかの例としては、ＦＯＲＴＲＡＮ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、またはＪＡＶＡ（登録商標）が挙げられる。ソフトウェアプログラムは、オブジェクトコードとして１つ以上の媒体上または媒体内に記憶しうる。ハードウェア加速を使用しうると共に、コードのすべてまたは一部はＦＰＧＡまたはＡＳＩＣで実行しうる。コードは仮想マシンなどの仮想環境で実行しうる。コードを実行する複数の仮想マシンは、単一のプロセッサー上に常駐しうる。コードは、それぞれ２つ以上のコアを有するプロセッサーを用いて実行しうる。
【００６１】
本発明の範囲から逸脱することなく特定の変更形態をなしうるため、以上の説明に含まれるかまたは添付の図面に示される事項はすべて、例示的なものとして解釈され、文字通りの意味ではないことが意図される。図面に示される一連の工程およびアーキテクチャーを本発明の範囲から逸脱することなく変更しうること、および本明細書に含まれる例示が本発明の多数の可能な描写の特異な例であることは、当業者であれば分かるであろう。
【実施例】
【００６２】
Ｉ．一般的方法
Ａ．メタボロミックプロファイリング
メタボロミックプラットフォームは、３つの独立した方法、すなわち、塩基性種に対して最適化した超高性能液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（ＵＨＬＣ／ＭＳ／ＭＳ２）、酸性種に対して最適化したＵＨＬＣ／ＭＳ／ＭＳ２、およびガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）からなるものであった。
【００６３】
Ｂ．サンプル調製
サンプルは必要になるまで−８０℃で貯蔵し、次いで、抽出の直前に氷上で解凍した。自動液体ハンドリングロボット（ＭｉｃｒｏＬａｂ  Ｓｔａｒ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を用いて抽出を行った。その際、１００μｌの各サンプルに４５０μｌのメタノールを添加してタンパク質を沈殿させた。メタノールは、抽出効率の確認を可能にするために４つの回収率標準を含有していた。次いで、各溶液を６７５ストローク／分でＧｅｎｏ／Ｇｒｉｎｄｅｒ２０００（Ｇｌｅｎ  Ｍｉｌｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）により混合し、次いで、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。各サンプルの上清の４つの１１０μｌアリコートを採取し、窒素下で乾燥させ、次いで、真空下で一晩乾燥させた。翌日、１つのアリコートは、（ｐＨ８）で水中の５０μＬの６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムで再構成し、１つのアリコートは、水中の５０μＬの０．１％ギ酸を用いて再構成した。再構成溶媒は両方とも、ＬＣ保持指数をマーキングするためにおよびＬＣ−ＭＳ装置性能を評価するために装置内部標準セットを含有していた。第３の１１０μｌアリコートは、ＧＣ保持指数をマーキングするためにおよび誘導体化プロセスからの回収率を評価するために添加された内部標準を用いて、シクロヘキサン：ジクロロメタン：アセトニトリル（５：４：１）＋５％トリエチルアミン中のＮ，Ｏ−ビストリメチルシリルトリフルオロアセトアミドと１％トリメチルクロロシランとの５０μＬの混合物で処理することにより誘導体化した。次いで、この混合物を真空下で一晩乾燥させ、次いで、乾燥抽出物をキャッピングして５分間振盪し、次いで、６０℃で１時間加熱した。サンプルを冷却し、および短時間遠心していずれの残渣もペレット化し、その後、ＧＣ−ＭＳにより分析した。乾燥後、残留アリコートをシールし、必要に応じてバックアップサンプルとして使用するために−８０℃で貯蔵した。抽出物は、３つの個別の質量分析計、すなわち、正イオンを検出するための超高性能液体クロマトグラフィー−質量分析を利用する１つのＵＰＬＣ−ＭＳシステム、負イオンを検出する１つのＵＰＬＣ−ＭＳシステム、および１つのＴｒａｃｅ  ＧＣ  Ｕｌｔｒａ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ−ＤＳＱガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で分析した。
【００６４】
Ｃ．ＵＰＬＣ法
Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、ＬＣ−ＭＳにより分析した再構成アリコートをすべて分離した。０．１％ギ酸で再構成したアリコートは、水中の０．１％ギ酸（Ａ）およびメタノール中の０．１％ギ酸（Ｂ）からなる移動相溶媒を使用した。６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムで再構成したアリコートは、水中の６．５ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８（Ａ）および９５／５メタノール／水中の６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムからなる移動相溶媒を使用した。ギ酸再構成抽出物および重炭酸アンモニウム再構成抽出物の両方で利用したグラジエントプロファイルは、４分間で０．５％Ｂ→７０％Ｂ、０．５分間で７０％Ｂ→９８％Ｂ、９８％Ｂを０．９分間保持、その後、０．２分間で０．５％Ｂに戻した。流量は３５０μＬ／分であった。サンプル注入体積は５μＬであり、２×ニードルループオーバーフィルを使用した。液体クロマトグラフィー分離は、個別の酸または塩基専用の２．１ｍｍ×１００ｍｍ  Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ粒子サイズカラムを用いて４０℃で行った。
【００６５】
Ｄ．ＵＰＬＣ−ＭＳ法
いくつかの実施例ではＯｒｂｉｔｒａｐＥｌｉｔｅ（ＯｒｂｉＥｌｉｔｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）質量分析計を使用した。ＯｒｂｉＥｌｉｔｅ質量分析計は、ポジティブモードでは８０に設定されたシースガス、１２に設定された補助ガス、および４．２ｋＶに設定された電圧でＨＥＳＩ−ＩＩソースを利用した。ネガティブモードの設定ではシースガスは７５、補助ガスは１５、および電圧は２．７５ｋＶに設定した。両方のモードでソースヒーター温度は４３０℃であり、キャピラリーの温度は３５０℃であった。質量範囲は、４．６トータルスキャン／秒のスキャン速度で９９〜１０００ｍ／ｚであり、１回のフルスキャンと１回の（ＭＳ／ＭＳ）スキャンとを交互に行い、分解能は３０，０００に設定した。Ｆｏｕｒｉｅｒ変換質量分析（ＦＴＭＳ）フルスキャン自動利得制御（ＡＧＣ）ターゲットは、５００ｍｓのカットオフ時間で５×１０５に設定した。イオントラップＭＳ／ＭＳのＡＧＣターゲットは、１００ｍｓの最大フィル時間で３×１０３であった。ポジティブモードでは規格化衝突エネルギーは３２任意単位に設定し、ネガティブモードでは３０に設定した。いずれの方法でも、活性化Ｑは０．３５であり、活性化時間は３０ｍｓであり、さらに分離質量ウィンドウは３ｍ／ｚであった。ＯｒｂｉＥｌｉｔｅでは３．５秒間の継続時間の動的排除設定を可能にした。校正は、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）正イオン校正溶液またはＰｉｅｒｃｅ（商標）ＥＳＩ負イオン校正溶液の注入により毎週行った。
【００６６】
いくつかの実施例では、ＬＣ／ＭＳ分析は、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ−ＩＩ）ソースおよび３５，０００の質量分解能で操作されるＯｒｂｉｔｒａｐ質量アナライザーと連動したＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ高分解能／精密質量分光計を使用した。サンプル抽出物を乾燥させ、次いで、注入およびクロマトグラフィー一貫性を保証するために一定濃度で８種以上の注入標準をそれぞれ含有した酸性または塩基性のＬＣ適合性溶媒で再構成した。個別の専用カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８−２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）を用いて２つの独立した注入を行って、一方のアリコートは酸性正イオン最適化条件を用いて分析し、他方のアリコートは塩基性負イオン最適化条件を用いて分析した。酸性条件で再構成された抽出物は、０．１％ギ酸を含有する水およびメタノールを用いてＣ１８カラムからグラジエント溶出させた。塩基性抽出物は、６．５ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有するメタノールおよび水を用いてＣ１８から同様に溶出させた。第３のアリコートは、１０ｍＭギ酸アンモニウムを有する水およびアセトニトリルからなるグラジエントを用いてＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨアミド２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ）から溶出させた後、負イオン化により分析した。ＭＳ分析は、動的排除を用いてＭＳスキャンとデータ依存性ＭＳ２スキャンとを交互に行い、スキャン範囲は８０〜１０００ｍ／ｚであった。
【００６７】
Ｅ．ＧＣ−ＭＳ法
誘導体化サンプルはＧＣ−ＭＳにより分析した。ジフェニルジメチルポリシロキサン固定相、薄膜溶融シリカカラム、Ｃｒｏｓｓｂｏｎｄ  ＲＴＸ−５Ｓｉｌ、２０μｍの膜厚を有する０．１８ｍｍ  ｉ．ｄ．×２０ｍ（Ｒｅｓｔｅｋ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）に２０：１のスプリット比のスプリットモードで１．０μｌのサンプル体積を注射した。化合物は、キャリヤーガスとしてヘリウムを用いて、かつ初期温度を６０℃で１分間保持し、次いで、１７．１℃／分の速度で２２０℃に上昇させ、続いて、３０℃／分の速度で３４０℃に上昇させ、次いで、この温度に３．６７分間保持することからなる温度勾配を用いて、溶出させた。次いで、後続の注入のために温度を６０℃に低下させて安定化させた。質量分析計は、５０〜７５０質量単位のスキャン範囲、４スキャン／秒、３０７７ａｍｕ／ｓｅｃで電子衝撃イオン化を用いて操作した。デュアルステージ四重極（ＤＳＱ）は、２９０℃のイオン源温度および１８６５Ｖの増倍管電圧に設定した。ＭＳトランスファーラインは３００℃に保持した。ＤＳＱの調整および校正は、最適性能を保証するために毎日実施した。
【００６８】
Ｆ．データ処理および解析
各装置上の各生物学的マトリックスデータセットに対して、各内部標準でピーク面積の相対標準偏差（ＲＳＤ）を計算し、抽出効率、装置性能、カラム健全性、クロマトグラフィー、および質量校正を確認した。これらの内部標準のいくつかは、保持指数（ＲＩ）マーカーとして機能し、保持時間およびアライメントに関してチェックした。ＵＰＬＣ−ＭＳおよびＧＣ−ＭＳシステムに付随するソフトウェアの修正版は、ピーク検出および積分に使用した。この処理の出力は、ｍ／ｚ比、保持時間、および曲線下面積値のリストを生成した。ソフトウェアは、シグナル対ノイズ比、高さ、および幅の閾値を含むピーク検出の基準を特定した。
【００６９】
ＱＣサンプルを含む生物学的データセットは、固定ＲＩ値が割り当てられた内部標準を利用する保持指数に基づいて、クロマトグラフィーによりアライメントさせた。実験ピークのＲＩは、値が変化しないフランキングＲＩマーカー間の線形当てはめを仮定することにより決定される。ＲＩに基づく利益は、サンプルｐＨやカラム製造後年数などの系統誤差により引き起こされる保持時間ドリフトを補正することである。各化合物のＲＩは、その２つの外側保持マーカーとの溶出関係に基づいて指定される。インハウスソフトウェアパッケージを用いて、基準標準およびルーチン検出未知化合物のインハウスライブラリー（化学ライブラリー）に対して積分アライメントピークをマッチングさせた。このライブラリーは、ポジティブ、ネガティブ、またはＧＣ−ＭＳデータ収集法に特有なものである。マッチングは、ＬＴＱおよびＤＳＱデータについて０．４ｍ／ｚ以内のライブラリー基準標準に対するプロスペクティブ同定および実験的プレカーサー質量マッチングで１５０ＲＩ単位以内の保持指数値に基づくものであった。実験的ＭＳ／ＭＳは、基準標準のライブラリースペクトルと比較してフォワードスコアおよびリバーススコアを割り当てた。完全フォワードスコアは、実験スペクトル中のすべてのイオンが適正比で基準標準のライブラリーに見いだされることを示唆し、完全リバーススコアは、すべての基準標準ライブラリーイオンが適正比で実験スペクトル中に存在することを示唆しよう。フォワードスコアおよびリバーススコアを比較して、提案されたマッチングにＭＳ／ＭＳフラグメント化スペクトルスコアを与えた。次いで、すべてのマッチングを分析者が手作業で精査して、以上の基準に基づいて各コールの合格または不合格を決定した。しかしながら、分析者による手作業の精査は必要とされない。いくつかの実施形態では、マッチングプロセスは完全自動化される。
【００７０】
化学ライブラリー、指定化合物およびルーチン検出未知化合物を同定するための積分アライメントピークのマッチング方法、ならびにサンプル中の低分子を同定するためのコンピューター可読コードに関するさらなる詳細は、米国特許第７，５６１，９７５号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだしうる。
【００７１】
Ｇ．品質管理
生物学的サンプルから個別のサンプルのそれぞれのアリコートを組み合わせて技術的レプリケートを作製し、以上に記載したように抽出した。このプールサンプルの抽出物を各装置の各データセットに対して６回注入し、プロセス変動を評価した。追加の品質管理として、５つの水アリコートも各装置のサンプルセットの一部として抽出し、アーチファクト同定のプロセスブランクとして利用した。ＱＣサンプルはすべて、抽出効率および装置性能を評価するためにならびにイオン同定のための保持指数マーカーとして利用するために、装置内部標準を含んでいた。標準は、同位体標識されたものであるか、さもなければ内因性イオンの検出を妨害しないように選択された外因性分子であった。
【００７２】
Ｈ．統計解析
統計解析の一方法は、サンプルで検出された代謝物のそれぞれで「極」値（外れ値）を同定することであった。パーセントフィル（代謝物中に値が検出されたサンプルのパーセント）に基づいて二工程プロセスを実施した。フィルが１０％以下の場合、値が検出されているサンプルにフラグを立てた。フィルが１０％超の場合、欠測値は、観測された最小値に等しい平均値および１に等しい標準偏差を有するランダム正規変数とした。次いで、データをｌｏｇ変換し、第３四分位と第１四分位との差として定義される四分位間範囲（ＩＱＲ）を計算した。次いで、第３四分位よりも１．５＊ＩＱＲ大きい値を上回るかまたは第１四分位よりも１．５＊ＩＱＲ小さい値を下回るものにフラグを立てた。ｌｏｇ変換データも解析して各個体の各代謝物のＺスコアを計算した。個体の代謝物のＺスコアは、所与の代謝物の平均値から標準偏差の何個分離れているかを表す数に相当する。正のＺスコアは、代謝物レベルが平均値を上回っていることを意味し、負のＺスコアは、代謝物レベルが平均値を下回っていることを意味する。
【００７３】
メタボロミクスでは、個別の代謝物の変化にだけでなく関連する代謝物群（たとえば生化学的経路）にも関心が払われる。関連代謝物の解析は、個別の代謝物が単変量解析を用いると統計的有意性のカットオフを見いだせないが、統合すると統計的に有意であることが見いだされる場合に特に有用である。たとえば、０．０７のｐ値を有する８種の代謝物が経路中に存在すると仮定する。ペアワイズ相関が０．９９である場合、統合ｐ値は個別のｐ値に類似していると予想される。しかしながら、代謝物が関連していない場合、フィッシャーのメタ解析［１］のｐ値＝０．０００３。したがって、統合ｐ値は、０．０７（すべて相関＝１）〜０．０００３の範囲内でありうる。したがって、経路が変化するかを形式的に試験することが望ましい。
【００７４】
ゲノミクス経路解析では、データ解析法は、多くの場合、統合ｐ値解析（たとえば、フィッシャーの方法、Ｔａｉｌ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ、Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｒａｎｋ  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）のために経路の個別のメンバーのｐ値を組み合わせることを必要とする。多変量法（たとえば、ホッテリングのＴ２、Ｄｅｍｐｓｔｅｒの検定、Ｂａｉ−Ｓａｒａｎａｄａｓの検定、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ−Ｄｕの検定）は、ＰＣＡを除いて、多くの場合に考慮されない。これらの方法のいくつか、たとえば、ホッテリングのＴ２統計は、標本共分散行列の反転を必要とし、観測数が変数の数よりも少ない場合、典型的にはオミクスデータの場合に可能でない。さらに、これらの結果のいくつかは、さらに大きいサンプルサイズを必要とする漸近的結果に依拠する。そのため、ゲノミクスでは、これらの統計の多くは適用されないであろう。しかしながら、メタボロミクスデータセットは、多くの場合、１，０００未満の変数を有し、生化学的経路の多くは２０種未満の代謝物を含有する。そのため、これらの多変量統計は、多くの場合、メタボロミクスデータに適用可能である。
【００７５】
本発明者らは、これらの方法をインスリン抵抗性に関するヒトメタボロミクスデータセットに適用した。インスリン抵抗性被験体「ＩＲ」（ｎ１＝２６１）とインスリン感受性被験体「ＩＳ」（ｎ２＝１３８）とを比較した。このデータセットは、経路解析の課題の多くを呈する（たとえば、多くの代謝物は複数の経路で生じ、いくつかの経路は検出される代謝物のパーセントが他の経路よりも高い）。この例では、各代謝物は、ＫＥＧＧなどの公共データベースを使用するインハウス専門家により定義される１つの経路に割り当てられた。唯一の代表的代謝物を有する経路は解析から除外した。このデータセットは大きいサンプルサイズを有していたため、各統計に対する順列分布は１０，０００順列から決定した。
【００７６】
表１は、各代謝物に対してウェルチの２サンプルｔ検定を行った結果のまとめを示している。唯一の代謝物が観測された経路を削除した後、３９の経路が残った。表１の第１欄は経路数を示し、第２欄は生化学的経路であり、第３欄は生化学的経路内で本研究により検出された代謝物の数であり、第４欄は比較で有意に変化した代謝物の数であり、第５欄および第６欄は生化学的経路代謝物のｐ値の範囲を表す。すべてのメンバーが０．０５レベルで有意であった経路が１つ存在した（Ｐ０２＝安息香酸代謝）。しかしながら、生化学的経路の有意性を解析する統計的方法を用いて、経路の過半数は表２に示されるように０．０５レベル（多重比較補正前）で有意であった。表２中、ＦＸ＝フィッシャーのχ２分布を用いた統計、ＦＰ＝フィッシャーの順列分布を用いた統計、ＴＳ＝ｔａｉｌ  ｓｔｒｅｎｇｔｈの統計、ＡＲＴＰ＝ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒａｎｋ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ、ＰＣＡ、第１の主成分で２サンプルｔ検定を行った結果、ＨＴ＝ホッテリングのＴ２、ＢＳＮ＝正規近似を用いたＢａｉ−Ｓａｒａｎａｄａｓの統計、ＢＳＰ＝順列分布を用いたＢａｉ−Ｓａｒａｎａｄａｓの統計、ＤＭ＝Ｄｅｍｓｐｓｔｅｒの統計、およびＳＤ＝ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＤｕの統計である。個別の生化学物質の半数未満が０．０５レベルに達成した統計的に有意な経路がいくつか存在する。一例はＰ３７（トリプトファン代謝）であり、その８種の代謝物のうち１つのみは０．０５未満のｐ値を有していたが、Ｔａｉｌ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈを除くすべての統計的検定を用いて経路は有意に変化した。この主な理由の１つは、ペアワイズ相関が非常に低いことである。この場合、ペアワイズ相関の大多数は０．３未満である。全体として、この例では、ｐ値統合法および多変量統計は類似の結果を与える。
【００７７】
【表１】
2017536543.tif 000003
【００７８】
【表２】
2017536543.tif 000004
【００７９】
【表３】
2017536543.tif 000005
【００８０】
実施例１．正常健康の被験体における遺伝的変異体の有意性の決定：疾患の早期指標
他の例として、一患者のＷＥＳデータから、ＩＩ型糖尿病との既知の関連を有するタンパク質プロコリパーゼおよびＴＨＡＤをコードする遺伝子の突然変異が明らかにされた。この患者に関する臨床情報を調べたところ、ＩＩ型糖尿病の家族歴（父親および兄弟）が明らかにされた。この患者のサンプルでメタボロミック解析を行った。全プロファイルは表３に示されている。表３は、各代謝物に対して、基準標準のインハウス化学ライブラリー中のバイオマーカー化合物に対する内部識別子（ＣｏｍｐＩＤ）、代謝物の生化学名生化学的経路（スーパー経路）、生化学的サブ経路、およびサンプル中の代謝物のレベルのＺスコア値を含む。
【００８１】
【表４】
2017536543.tif 000006
【００８２】
【表５】
2017536543.tif 000007
【００８３】
【表６】
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【００８４】
【表７】
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【００８５】
【表８】
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【００８６】
【表９】
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【００８７】
【表１０】
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【００８８】
【表１１】
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【００８９】
【表１２】
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【００９０】
【表１３】
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【００９１】
【表１４】
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【００９２】
【表１５】
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【００９３】
【表１６】
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【００９４】
【表１７】
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【００９５】
【表１８】
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【００９６】
試験サンプルで検出された生化学物質を示すと共に、患者サンプルで変異体の存在により変化した生化学物質を強調する生化学的経路の視覚的表示例を図４に示す。図４の視覚的表示を用いると、変異体により影響を受ける生化学的経路は、影響を受けた生化学物質を示唆する暗色塗潰しの丸の存在およびサイズにより同定可能であることが分かる。丸のサイズは、参照サンプルと対比した試験サンプルの代謝物の変化の大きさを表している。サンプルで有意に変化する（すなわち、増加または低減する）代謝物は、正常レベルの代謝物よりも大きい丸として現れ、変化の大きさは丸のサイズにより示唆される。
【００９７】
分岐鎖アミノ酸代謝に及ぼす変異体の影響は、図４に提示される表示上に示されている。丸の近くの数は、患者サンプルで変化する個別の生化学物質に対応する。変化した代謝物を列挙して変化の生化学的有意性を解釈する簡潔な報告の例は表４に示されている。
【００９８】
ここに例示されるように、糖尿病およびインスリン抵抗性に関連するマーカーは、この患者の試験サンプルのメタボロミック解析により同定された。変異体により影響を受ける選択された代謝物は、表４に例証された簡潔な報告に示されている。こうした影響を受ける生化学物質は、増加したα−ヒドロキシ酪酸、減少した１，５−アンヒドログルシトール、減少したグリシン、およびわずかに増加した分岐鎖アミノ酸代謝物を含む。加えて、グルコースおよび３−ヒドロキシ酪酸（脂肪酸β酸化およびＢＣＡＡ異化の産物）が増加したことから、解糖の破壊および脂質分解の増加に一致してエネルギー代謝の変化が示唆された。まとめると、これらの生化学的シグネチャーは糖尿病の早期指標であることが示唆されたことから、変異体の有害な影響が示唆された。
【００９９】
【表１９】
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【０１００】
【表２０】
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【０１０１】
他の患者では、ＷＥＳは、２つの糖尿病リスク対立遺伝子ＭＡＰＫ８１Ｐ１（ｐ．Ｄ３８６Ｅ）およびＭＣ４Ｒ（ｐＩ２５１Ｌ）に変異体を示した。糖尿病およびインスリン抵抗性に関連する代謝物マーカーおよび生化学的経路に類似の変化がこの患者で見られた。さらに、最近の標的代謝パネルは、この患者の空腹時血中グルコースが前糖尿病範囲にあることを示した。
【０１０２】
実施例２．変異体解析：良性であると決定される変異体
一例として、本明細書に記載の方法は、全エキソームシーケンシング（ＷＥＳ）を用いて検出される塩基対変化の重要性を決定するのに有用であり、患者の診断（すなわち、障害の「確定」または「除外」）を支援した。たとえば、本明細書に記載の方法の結果から、ＷＥＳに基づいて未知の有意性（ＶＵＳ）の変異体が報告された患者では障害の存在を除外し、その際、変異体は有害な影響を有していないと決定した。かかる変異体は、ＶＵＳ〜「良性」または「中性」に再分類される。
【０１０３】
一例として、グリセリン酸尿症で影響を受ける遺伝子ＧＬＹＣＴＫ内にＶＵＳ［ｃ．６７３Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｇ２２５Ｗ）］が報告された。しかしながら、本明細書に記載の方法を用いて、この患者のグリセリン酸レベルは正常であると決定された。変異体は有害な影響を有しておらず、中性であると決定された。
【０１０４】
他の例として、高オルニチン血症−高アンモニア血症−ホモシトルリン血症症候群で影響を受ける遺伝子であるＳＬＣ２５Ａ１５にＶＵＳ［ｃ．７３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇ２４４Ｒ）］を有する患者では、オルニチン、グルタミン、およびホモシトルリンの正常レベルが決定されたことにより、この障害が除外された。変異体は有害な影響を有しておらず、中性であるとみなされた。
【０１０５】
他の例として、グリシン脳症で影響を受ける遺伝子ＧＬＤＣ［ｃ．７１８Ａ＞Ｇ（ｐＴ２４０Ａ）］にＶＵＳが検出された。代謝物グリシンの正常レベルに基づいて、ＶＵＳは中性であると決定された。
【０１０６】
他の例として、フェニルケトン尿症で影響を受ける遺伝子ＰＡＨでＶＵＳ［ｃ．１２２２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ４０８Ｗ）］が検出された。その患者のフェニルアラニンのレベルは正常であると測定され、ＶＵＳは中性であると決定された。
【０１０７】
他の例として、ミトコンドリア欠失症候群で影響を受ける遺伝子ＰＯＬＧでＶＵＳ［ｃ．１６６９Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｅ５５７Ｑ）］が検出された。しかしながら、生化学的乳酸のレベルは正常であり、ＶＵＳは中性であると決定された。
【０１０８】
実施例３．変異体解析：病原性／有害であると決定される変異体
さらなる例として、本明細書に記載の方法の結果は、分子的結果の病原性を裏付けるのに役立った。
【０１０９】
たとえば、一患者のＷＥＳ結果は、サルコシン血症で欠損した遺伝子であるＳＡＲＤＨにヘテロ接合ＶＵＳ［ｃ．４５５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇ１５２Ｄ）］を明らかにした。本明細書に記載の方法を用いて、コリン、ベタイン、ジメチルグリシン、およびサルコシンの有意な上昇が決定された。これらのレベルの上昇は、臨床症状の存在が議論されている代謝障害であるサルコシン血症と一致している。解析結果に基づいて、変異体は病原性であることが確認された。
【０１１０】
他の患者では、リー症候群で影響を受ける遺伝子ＬＲＰＰＲＣにＶＵＳ［ｃ．１９０３Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｖ６３５Ｆ）］が報告された。この患者で乳酸レベルの上昇が測定され、リー症候群の診断と一致していることから、ＶＵＳは有害な変異体として分類すべきであることが示唆される。
【０１１１】
他の患者では、５−フルオロウラシル毒性で影響を受ける遺伝子ＤＰＹＤにＶＵＳ［ｃ．２８４６Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｄ９４９Ｖ］が報告された。この患者でウラシルレベルの上昇が測定され、５−フルオロウラシル毒性の診断と一致している。この結果から、ＶＵＳは有害な変異体として分類すべきであることが示唆された。
【０１１２】
他の例として、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子ＧＡＡに突然変異が患者で報告された。ＧＡＡの突然変異はポンペ病と診断された人々で同定されている。この患者でマルトテトラオース、マルトトリオース、およびマルトースのレベルの上昇が測定され、ポンペ病の診断と一致していることから、突然変異は有害な変異体として分類すべきであることが示唆される。
【０１１３】
他の患者では、アデニロコハク酸リスアーゼをコードしかつＡＤＳＬ欠損で影響を受ける遺伝子ＡＤＳＬに突然変異が報告された。この患者でＮ６−スクシニルアデノシンレベルの上昇が測定され、ＡＤＳＬ欠損の診断と一致している。この結果から、変異体は有害なものとして分類すべきであることが示唆された。
【０１１４】
他の例として、ペルオキシソーム生合成因子をコードする遺伝子ＰＥＸ１に突然変異が患者で報告された。ＰＥＸ１での突然変異は、ペルオキシソーム生合成障害／ツェルヴェーガー症候群スペクトラム障害（ＰＢＤ／ＺＳＳ）と診断された人々で同定されている。ピペコリン酸レベルの上昇およびプラスマロゲン（たとえば、１−（１−エニル−パルミトイル）−２−オレオイル−ＧＰＣ（Ｐ−１６：０／１８：１）、１−（１−エニル−パルミトイル）−２−ミリストイル−ＧＰＣ（Ｐ−１６：０／１４：０）、１−（１−エニル−パルミトイル）−２−アラキドノイル−ＧＰＥ（Ｐ−１６：０／２０：４）、１−（１−エニル−ステアロイル）−２−アラキドノイル−ＧＰＥ（Ｐ−１８：０／２０：４）、１−（１−エニル−パルミトイル）−２−パルミトイル−ＧＰＣ（Ｐ−１６：０／１６：０）、１−（１−エニル−パルミトイル）−２−アラキドノイル−ＧＰＣ（Ｐ−１６：０／２０：４）、１−（１−エニル−ステアロイル）−２−アラキドノイル−ＧＰＣ（Ｐ−１８：０／２０：４）、１−（１−エニル−パルミトイル）−２−パルミトレオイル−ＧＰＣ（Ｐ−１６：０／１６：１））レベルの低下がこの患者で測定され、ＰＢＤ／ＺＳＳの診断と一致している。この結果から、変異体は有害なものとして分類すべきであることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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